(57)【要約】本明細書には、腫瘍リンパ管を選択的に標的化するための、および腫瘍リンパ管を選択的に標的化することを含む組成物および方法が開示される。本発明の目的に従って、本明細書において実施され、広く記載されるように、本発明は、腫瘍リンパ管および／または腫瘍ならびに腫瘍細胞を選択的に標的化するための、また腫瘍リンパ管および／または腫瘍ならびに腫瘍細胞を選択的に標的化することを含む、ペプチド、組成物、コンジュゲート、核酸および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍リンパ管と選択的に結合し、アミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列は以下：
（ａ）ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）または１つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、
（ｂ）ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）または１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、
（ｃ）ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、
（ｄ）ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とをＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、
（ｅ）ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、
（ｆ）ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、
（ｇ）ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、
（ｈ）ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、および
（ｉ）ＸＲＴＸ（配列番号６０）（式中、Ｘは、ＲまたはＫ（配列番号１２〜１５）であり、このアミノ酸配列はＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）またはＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）ではない）、
からなる群から選択される、単離ペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）と少なくとも７０％の配列同一性、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）と６５％の配列同一性、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）と６５％の配列同一性、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）と６５％の配列同一性、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）と６５％の配列同一性、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）と６５％の配列同一性、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）と６５％の配列同一性、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）と６５％の配列同一性、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）と６５％の配列同一性、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）と６５％の配列同一性、ＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）と６５％の配列同一性、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）と６５％の配列同一性またはＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）と６５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、
（ａ）１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）と、
（ｂ）１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）と、
（ｃ）１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）と、
（ｄ）ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）と、
（ｅ）ＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）と
からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）またはＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
最大２５個のアミノ酸の長さを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
４〜２５個のアミノ酸の長さを有する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドと、部分とを含み、腫瘍リンパ管に選択的にホーミングするコンジュゲート。
【請求項８】
前記部分が、治療用部分、検出可能部分、細胞傷害性薬剤、抗リンパ管新生剤、癌化学療法薬、アポトーシス促進性ポリペプチド、グラフト化ポリペプチド、ウイルス、細胞およびリポソームからなる群から選択される、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記部分が細胞傷害性薬剤であって、前記細胞傷害性薬剤がＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号１９）である、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記部分が検出可能部分であって、前記検出可能部分がフルオロフォア、酵素、ビオチン、金属またはエピトープタグである、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
対象において、部分を腫瘍リンパ管に標的化する方法であって、前記対象に、請求項７から１１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記対象のリンパ管においてコンジュゲートの存在を検出することによって、前記対象において癌を検出することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が癌を有しており、前記対象のリンパ管への前記部分の標的化が、前記対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
癌を検出する方法であって、生体サンプルを、請求項７から１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることと、前記サンプルのリンパ管における前記コンジュゲートの存在を検出することとを含む方法。
【請求項１５】
リンパ管において、参照または対照量よりも多い前記コンジュゲートの存在を検出することが、癌の存在を示す、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象において癌を治療する方法であって、前記対象に、請求項７から１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与することを含み、前記コンジュゲートが前記対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害する方法。
【請求項１７】
前記癌が乳癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＸＲＴＸ（配列番号６０）｛式中、ＸはＲまたはＫ（配列番号１２〜１５）である｝、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が子宮頸癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＸＲＴＸ（配列番号６０）｛式中、ＸはＲまたはＫ（配列番号１２〜１５）である｝、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が皮膚癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含む、ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、ＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が前立腺癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が前癌性前立腺癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が悪性前立腺癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象において、正常、前癌性および悪性前立腺状態を決定する方法であって、前記対象由来の生体サンプルを、請求項７から１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を含む方法。
【請求項２４】
ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）もしくはＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）の選択的結合が、前癌性前立腺状態の指標である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）もしくはＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）の選択的結合が、悪性前立腺状態の指標である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）もしくはＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号８）、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号３）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号４）もしくはＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）の選択的結合がないことが、正常前立腺状態の指標である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
腫瘍リンパ管を標的とする薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
（ａ）薬剤の、非癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、非癌性組織を、候補薬剤のライブラリーと接触させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）から非癌性組織と結合しない候補薬剤を集めることと、
（ｃ）薬剤の、癌性または前癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、癌性または前癌性組織を、ステップ（ｂ）において集められた前記候補薬剤と接触させることと、
（ｄ）前記癌性または前癌性組織由来のリンパ管内皮細胞と結合している候補薬剤を集めることと
を含み、前記候補薬剤の、前記癌性または前癌性組織のリンパ管内皮細胞との結合によって、前記候補薬剤が腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定される方法。
【請求項２８】
腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定された候補薬剤を製造することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項３０】
内在化配列をコードする核酸をさらに含む、請求項２９に記載の単離核酸。
【請求項３１】
前記細胞内在化が、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ突然変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロールおよびＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロールからなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の単離核酸。
【請求項３２】
前記核酸が発現制御配列と機能し得る形で連結している、請求項３０または３１に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００６年２月１日に出願された米国仮特許出願第６０／７６４，１７５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金ＰＯｌ  ＣＡ  ８２７１３、ＰＯｌ  ＣＡ  １０４８９８、Ｐ３０  ＣＡ  ３０１９９、ＲＯｌ  ＣＡ  １１５４１０および米国国立癌研究所によって授与された助成金ＤＡＭＤ  １７−０２−１−０３１５、助成金Ｔ３２  ＣＡ７７１０９−０５および米国国防総省によって授与されたＤＡＭＤ  １７−０２−０３０９の元、政府支援を受けて行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管の内膜は高度に多様化している。多数の、おそらくは、すべての、正常組織は、組織特異的「サイン」をその脈管構造に付しており、腫瘍血管は、形態および分子組成の両方において正常血管とは異なっている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、２００２）。腫瘍は血管新生を誘導して腫瘍の増殖に適応し（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０００）、腫瘍血管における変化の多くは、血管新生に関連している（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２００３；ＦｅｒｒａｒａおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００）。さらに、腫瘍血管は、腫瘍の種類に特異的な、またいくつかの病期では、病期特異的な特徴を有し、臓器特異的腫瘍形成の２種のトランスジェニックマウスモデルにおいて、ファージライブラリーのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングによって、血管新生サインを選択的に認識するホーミングペプチドの別個のセットが得られた。ホーミングペプチドはまた、同一腫瘍モデルにおいて、前癌性病変の血管新生血管を、完全に悪性の病変のものと区別することができ（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３；Ｊｏｙｃｅら、２００３）、このことは、血管変化が腫瘍成長の病期を映すことを示す。
【０００４】
リンパ管系は輸出性腕のみを有する第２の血管系を構成する。腫瘍は、頻繁にリンパ管新生を誘導し、ならびに、既存のリンパ管を吸収する（Ｃａｏら、２００４；ＣａｓｓｅｌｌａおよびＳｋｏｂｅ、２００２；Ｓｔａｃｋｅｒら、２００２）。腫瘍は、腫瘍内リンパ管を含む場合もあるが、腫瘍組織の周りにリンパ管の広範囲のネットワークが存在することがより一般的である（Ｊａｃｋｓｏｎら、２００１；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２；Ｐａｄｅｒａら、２００２）。腫瘍内のリンパ管は、存在する場合、通常、液体輸送においては非機能的であり（Ｐａｄｅｒａら、２００２）、間質圧による加圧および内腔内腫瘍細胞による遮断を反映している可能性がある。腫瘍中および腫瘍の周りのリンパ管は、転移の重要なルートである。実際、腫瘍におけるリンパ管発現の、増殖因子によって刺激された増強は、転移を増大させる（非特許文献１；非特許文献２）。逆に、リンパ管新生を阻害することによってリンパ管転移が抑制されるが、通常、腫瘍の増殖には影響を及ぼさない（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｍａｎｄｒｉｏｔａら、（２００１）Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０．６７２−６８２
【非特許文献２】Ｓｋｏｂｅら、（２００１）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，１９２−１９８
【非特許文献３】Ｓａｈａｒｉｎｅｎら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５，３８７−３９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書に開示されるように、腫瘍リンパ管は、腫瘍血管同様、特異的なマーカーを発現するが、これらのリンパ管マーカーは、腫瘍の種類に特異的であり、同一腫瘍における血管マーカーとは異なっている。したがって、早期発見および腫瘍標的化において使用するための、腫瘍リンパ管または前癌性病変中のリンパ管と選択的に結合する組成物および方法が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
簡単な要旨
本発明の目的に従って、本明細書において実施され、広く記載されるように、本発明は、腫瘍リンパ管および／または腫瘍ならびに腫瘍細胞を選択的に標的化するための、また腫瘍リンパ管および／または腫瘍ならびに腫瘍細胞を選択的に標的化することを含む、ペプチド、組成物、コンジュゲート、核酸および方法に関する。
【０００７】
開示される方法および組成物のさらなる利点は、幾分か、以下の説明において示され、幾分かは説明から理解されるか、または開示される方法および組成物の実施によってわかる。開示される方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現されるか、または、得られる。前記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、単に例示され、説明されるものであって、特許請求される本発明を制限するものではないということは理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
詳細な説明
開示される方法および組成物は、特定の実施形態およびそれに含まれる実施例の以下の詳細な説明ならびに図およびそれらの前記の説明および以下の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。
【０００９】
開示される方法および組成物のために使用できる、それらとともに使用できる、それらの調製において使用できるか、またはそれらの生成物である材料、組成物および成分が開示される。これらのおよびその他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、小集団、相互作用、群などが開示される場合には、これらの化合物の、種々の個別のおよび集団的組み合わせおよび順列各々の特定の言及が、明確に開示されない場合もあるが、各々は具体的に考慮され、本明細書に記載されるということは理解される。例えば、ペプチドが開示され、論じられる場合には、ペプチドを含むいくつかの分子に対して行うことができる修飾の数々が論じられ、ペプチドおよび可能である修飾のありとあらゆる組み合わせおよび順列が、特に断りのない限り具体的に考慮される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび組み合わせ分子、Ａ〜Ｄの例が開示される場合には、各々が個別に列挙されない場合であっても、各々は個々におよび集合的に考慮される。したがって、この実施例では、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦおよび組み合わせ例Ａ〜Ｄの開示から、Ａ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜ＥおよびＣ〜Ｆの組み合わせのそれぞれが具体的に考慮され、開示されると考えられなければならない。同様に、これらの任意の小集団または組み合わせも、具体的に考慮され、開示される。したがって、例えば、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦおよび組み合わせ例Ａ〜Ｄの開示から、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜ＦおよびＣ〜Ｅという小群が具体的に考慮され、開示されると考えられなければならない。この概念は、それだけには限定されないが、開示される組成物の作製方法および使用方法におけるステップをはじめとする本願のすべての態様に当てはまる。したがって、実施できる種々のさらなるステップがある場合には、これらのさらなるステップの各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施でき、このような組合せの各々は、具体的に考慮され、開示されると考えられなければならないと理解される。
【００１０】
当業者ならば、日常的な程度の実験、本明細書に記載される方法および組成物の特定の実施形態の多数の等価物を用いて認識するか、または確かめることができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【００１１】
記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬は変わってもよいので、開示される方法および組成物は、これらに限定されないということは理解される。本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、本発明の範囲を制限しようとするものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるということも理解される。
【００１２】
本明細書には、腫瘍リンパ管を選択的に標的化するペプチドが開示される。いくつかの態様では、開示されるペプチドは、リンパ管新生管を選択的に標的化できる。いくつかの態様では、開示されるペプチドは、腫瘍リンパ管上に存在するマーカー選択的に結合できる。いくつかの態様では、開示されるペプチドは、腫瘍および腫瘍細胞上に存在するマーカーと選択的に結合できる。いくつかの態様では、開示されるペプチドは、腫瘍および腫瘍リンパ管上、両方に存在するマーカーと選択的に結合できる。したがって、開示されるペプチドを用いて、例えば、治療部分および／または検出部分などの部分を腫瘍リンパ管、腫瘍、腫瘍細胞および／またはリンパ管新生管に送達できる。また、例えば、対象において腫瘍リンパ管を選択的に標的化する方法、対象において腫瘍細胞を選択的に標的化する方法ならびに腫瘍リンパ管および腫瘍細胞を選択的に標的化する方法が開示される。
【００１３】
腫瘍細胞の転移拡散が、ほとんどの癌関連死亡の根底にある原因である。臨床および病理学的証拠によって、局部／領域性リンパ節へのリンパ管経由の腫瘍の転移拡散が、多数のヒト固形腫瘍の転移性疾患における初期現象であることが確認される。ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄを分泌する腫瘍は、リンパ管上のＶＥＧＦＲ−３を活性化すること、すなわち腫瘍リンパ管新生として知られるプロセスによってリンパ管新生を誘導する。リンパ管新生とは、血管発生または血管新生と同様であると考えられる方法での、既存のリンパ管からのリンパ管の形成である。リンパ管新生はまた、ホメオスタシス、代謝および免疫においても重要な生理学的役割を果たす。リンパ管形成はまた、腫瘍転移、浮腫、リウマチ関節炎、乾癬および正常に機能しない創傷治癒をはじめとするいくつかの病状に関与しているとされている。
【００１４】
本明細書において用いる場合、「標的化ペプチド」とは、細胞などの標的と結合するペプチドまたはポリペプチドである。例えば、標的化ペプチドは、選択的標的化活性を示し得る。本明細書において用いる場合、用語「選択的標的化」または「選択的ホーミング」とは、各々、対照組織におけるペプチドの量よりも、例えば、約２倍以上の、約５倍以上のまたは約１０倍以上の標的組織における化合物または組成物の量をもたらす、開示される組成物などの化合物または組成物の選択的局在を指す。例えば、用語「選択的標的化」および「選択的ホーミング」とは、対照組織への標的化がないことまたはすべての対照組織への標的化がないことと同時に起こる、標的組織における開示される組成物などの化合物または組成物の結合または蓄積を指す場合もある。
【００１５】
Ａ．組成物
腫瘍リンパ管を選択的に標的化する、新規ペプチドおよびコンジュゲートに関する組成物および方法が本明細書に開示される。
【００１６】
１．ペプチド
腫瘍リンパ管、例えば、腫瘍中および腫瘍の周りのリンパ管（腫瘍関連リンパ管と呼ばれ得る）および／またはリンパ管新生管を標的化し、それと結合し、かつ／またはそれにホーミングするペプチドが本明細書に開示される。開示されるペプチドは、腫瘍リンパ管と選択的に結合することが好ましい。開示されるペプチドは、種々の構造を有し得る。例えば、いくつかの形では、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）と少なくとも７０％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００１７】
さらなる例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００１８】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００１９】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１もしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２０】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２１】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２２】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２３】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２４】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２５】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２６】
さらなる一例として、本ペプチドは、ＸＲＴＸ（配列番号５９）であり、ＸがＲまたはＫ（配列番号１２〜１５）であるアミノ酸配列を含み得る。例えば、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
【００２７】
いくつかの態様では、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）からならない。
【００２８】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。いくつかの態様では、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）からならない。
【００２９】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）または少なくとも４個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、ＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。いくつかの態様では、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）からならない。
【００３０】
さらなる一例として、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、ＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）またはＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）からなるものであり得る。
【００３１】
開示されるペプチドは、任意の適した長さを有し得る。例えば、本ペプチドは、最大２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のアミノ酸という長さを有し得る。開示されるポリペプチドは、例えば、４〜約５０個のアミノ酸の長さであり得る。開示されるポリペプチドは、例えば、約５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４個のアミノ酸の長さ未満であり得る。
【００３２】
例えば、開示されるペプチドは、４〜約１０個のアミノ酸、４〜約１５個のアミノ酸、４〜約２０個のアミノ酸、４〜約２５個のアミノ酸、４〜約３０個のアミノ酸、４〜約３５個のアミノ酸、４〜約４０個のアミノ酸、４〜約４５個のアミノ酸、４〜約５０個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、開示されるペプチドは、５〜約１０個のアミノ酸、５〜約１５個のアミノ酸、５〜約２０個のアミノ酸、５〜約２５個のアミノ酸、５〜約３０個のアミノ酸、５〜約３５個のアミノ酸、５〜約４０個のアミノ酸、５〜約４５個のアミノ酸、５〜約５０個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、開示されるペプチドは、６〜約１０個のアミノ酸、６〜約１５個のアミノ酸、６〜約２０個のアミノ酸、６〜約２５個のアミノ酸、６〜約３０個のアミノ酸、６〜約３５個のアミノ酸、６〜約４０個のアミノ酸、６〜約４５個のアミノ酸、６〜約５０個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、開示されるペプチドは、７〜約１０個のアミノ酸、７〜約１５個のアミノ酸、７〜約２０個のアミノ酸、７〜約２５個のアミノ酸、７〜約３０個のアミノ酸、７〜約３５個のアミノ酸、７〜約４０個のアミノ酸、７〜約４５個のアミノ酸、７〜約５０個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、開示されるペプチドは、８〜約１０個のアミノ酸、８〜約１５個のアミノ酸、８〜約２０個のアミノ酸、８〜約２５個のアミノ酸、８〜約３０個のアミノ酸、８〜約３５個のアミノ酸、８〜約４０個のアミノ酸、８〜約４５個のアミノ酸、８〜約５０個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、開示されるペプチドは、９〜約１０個のアミノ酸、９〜約１５個のアミノ酸、９〜約２０個のアミノ酸、９〜約２５個のアミノ酸、９〜約３０個のアミノ酸、９〜約３５個のアミノ酸、９〜約４０個のアミノ酸、９〜約４５個のアミノ酸、９〜約５０個のアミノ酸の長さを有し得る。
【００３３】
開示されるペプチドは、人工配列であってもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／または組換えによって合成されてもよい。開示されるポリペプチドは、天然に存在しないタンパク質であるペプチドであってもよいし、天然に存在するタンパク質では連続していない、少なくとも２つの配列連続する配列を有するペプチドであってもよい。
【００３４】
開示されるペプチドおよび組成物はまた、２、３またはそれ以上の開示されるペプチドまたはアミノ酸配列の任意の組み合わせを含み得る。したがって、本明細書に開示されるペプチドまたはアミノ酸配列のうち任意の１、２、３またはそれ以上を含むペプチドが開示される。ペプチドは、例えば、単一のアミノ酸鎖（ペプチドの融合物である）として、リンカーを介して、分岐リンカーを介して、任意の適した方法で組み合わせ、個々にまたは一緒に一構造に結合させることができる。また、１以上の別個の機能を有する、１以上の第２のペプチドに融合された、１以上の開示されるペプチドを含む二機能性ペプチドが開示される。このような二機能性ペプチドは、全長分子の異なる部分によって付与される少なくとも２つの機能を有することができ、例えば、腫瘍リンパ管を標的化する能力に加え、アポトーシス促進性活性を示すことができる。
【００３５】
また、各々独立に１以上の開示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２つの開示されるペプチドを含み得る多価ペプチドが開示される。多価ペプチドは、例えば、各々独立に開示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも３、少なくとも５または少なくとも１０のこのようなペプチドを有し得る。いくつかの態様では、多価ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０の同一または同一でないペプチドおよび／またはアミノ酸配列を有し得る。いくつかの態様では、多価ペプチドは、同一のペプチドおよび／またはアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様では、多価ペプチドは、任意の介在アミノ酸によって分離されているか、分離されていない、連続する同一または同一でないペプチドおよび／またはアミノ酸配列を含み得る。
【００３６】
２．コンジュゲート
また、任意の１種以上の本明細書において開示されるペプチドと、１以上の部分とを含むコンジュゲートも本明細書において提供される。通常、部分は、標的細胞（複数の細胞）または組織に対して、所望の効果をもたらすよう作用する物質であり得る。いくつかの態様では、開示されるコンジュゲートは、腫瘍リンパ管、例えば、腫瘍中および腫瘍の周りのリンパ管、および／またはリンパ管新生管を標的化し、それと結合し、かつ／またはそれにホーミングできる。開示されるペプチドは、腫瘍リンパ管と選択的に結合することが好ましい。したがって、例えば、効果は、標的細胞（複数の細胞）または組織の標識化、活性化、抑制または死滅であり得る。
【００３７】
部分は、例えば、治療部分または検出可能部分、細胞傷害性薬剤、抗リンパ管新生剤、癌化学療法薬、アポトーシス促進性ポリペプチド、グラフト化ポリペプチド、ウイルス、細胞またはリポソームであり得る。したがって、部分は、小分子、調合薬、毒素、脂肪酸、検出可能なマーカー、結合タグ、ナノ粒子または酵素であり得る。例えば、開示されるコンジュゲートの部分は、アポトーシス促進性ペプチドであり得る。アポトーシス促進性ペプチドの例として、アミノ酸配列Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号１９）、腫瘍壊死因子（Ｃｕｒｎｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、５６５〜７１頁、２００４）およびタキプレシン（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．６１、２４３４〜８頁、２００１）がある。多数のその他のアポトーシス促進性ペプチドおよび化合物が知られており、開示される組成物、コンジュゲートおよび方法とともに、またそれらにおいて使用できる。
【００３８】
ペプチドにコンジュゲートされ得る小分子および調合薬の例は、当技術分野で公知である。部分は、細胞傷害性小分子または標的細胞を死滅させる薬物であり得る。小分子または薬物は、任意の重要な細胞機能または経路に作用するよう設計できる。例えば、小分子または薬物は、細胞周期を阻害し、タンパク質分解を活性化し、アポトーシスを誘導し、キナーゼ活性を調節し、または細胞骨格タンパク質を修飾できる。任意の既知または新たに発見された細胞傷害性小分子または薬物が、ペプチドとともに使用するために考慮される。
【００３９】
部分は、標的化された細胞を死滅させる毒素であり得る。毒素の限定されない例として、アブリン、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、リシンおよびジフテリア毒素が挙げられる。その他の既知または新たに発見された毒素が、提供されるコンジュゲートとともに使用するために考慮される。
【００４０】
提供されるコンジュゲートにコンジュゲートされ得る脂肪酸（すなわち、脂質）として、ペプチドの、リポソームへの効率的な組み込みを可能にするものが挙げられる。通常、脂肪酸は極性脂質である。したがって、脂肪酸は、リン脂質であり得る。提供されるコンジュゲートは、天然または合成リン脂質のいずれかを含み得る。リン脂質は、飽和または不飽和の一または二置換脂肪酸およびそれらの組み合わせを含有するリン脂質から選択できる。これらのリン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホファチジル（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌ）グリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジルコリン、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏａｍｉｎｅ）、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチックリノレオイルホスファチジルコリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチックリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチックリノレオイルホスファチジン酸であり得る。これらのリン脂質はまた、ホスファチジルコリン（リソホファチジリジル（ｌｙｓｏｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｄｙｌ）コリン）、ホスファチジルセリン（リソホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リソホスファチジルエタノールアミン）、ホファチジル（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌ）グリセロール（リソホスファチジルグリセロール）およびホスファチジン酸（リゾホスファチジン酸）のモノアシル化誘導体であってもよい。これらのリソホスファチジル誘導体中のモノアシル鎖は、パリムトイル（ｐａｌｉｍｔｏｙｌ）、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイルミリストイルまたはミリストレオイルであり得る。リン脂質はまた、合成であってもよい。合成リン脂質は、種々の供給源から市販されており容易に入手可能である。例えば、ＡＶＡＮＴＩＰｏｌａｒ  Ｌｉｐｉ���ｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）。これらの合成化合物は、変化してもよく、また、天然に存在するリン脂質には見られないその脂肪酸側鎖における変化を有してもよい。脂肪酸は、ＰＳまたはＰＣのいずれか、または両方の、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０鎖長である不飽和脂肪酸側鎖を有し得る。合成リン脂質は、その成分として、ジオレオイル（１８：１）−ＰＳ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ、ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣおよびミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを有し得る。したがって、例として、提供されるコンジュゲートは、パルミトイル１６：０を含み得る。
【００４１】
開示されるコンジュゲートの部分は、検出部分であり得る。検出可能な部分／マーカーとして、標的組織または細胞（複数の細胞）を標識または染色するために使用できる任意の物質が挙げられる。検出可能なマーカーの限定されない例として、放射性同位体、酵素、フルオロフォアおよび量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標））が挙げられる。例えば、検出部分は、酵素、ビオチン、金属またはエピトープタグであり得る。その他の既知または新たに発見された検出可能なマーカーが、提供されるコンジュゲートとともに使用するために考慮される。
【００４２】
フルオロフォアは、発光する化合物または分子である。通常、フルオロフォアは、ある波長で電磁エネルギーを吸収し、第２の波長で電磁エネルギーを放出する。代表的なフルオロフォアとして、それだけには限らないが、１，５ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−Ｉメチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）；ＡＢＱ；酸性フクシン；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ−自己蛍光タンパク質−（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ参照のこと）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０（商標）；アリザリン複合体；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；アントロシルステアレート（Ａｎｔｈｒｏｃｙｌｓｔｅａｒａｔｅ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７  ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィン（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）Ｇ；オーロホスフィン（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）；ＢＡＯ  ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；βラクタマーゼ；ＢＦＰブルーシフト化ＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光タンパク質；ＢＦＰ／ＧＦＰ  ＦＲＥＴ；ビマン（Ｂｉｍａｎｅ）；ビスベンゼミド（Ｂｉｓｂｅｎｚｅｍｉｄｅ）；ビスベンズイミド（Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）（ヘキスト）；ビス−ＢＴＣ；ブランコホール（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ）ＦＦＧ；ブランコホール（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ）ＳＶ；ＢＯＢＯ（商標）−１；ＢＯＢＯ（商標）−３；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）４９２／５１５；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）４９３／５０３；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５００／５１０；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）；５０５／５１５；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５３０／５５０；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５４２／５６３；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５５８／５６８；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５６４／５７０；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５７６／５８９；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）５８１／５９１；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）６３０／６５０−Ｘ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）６５０／６６５−Ｘ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）６６５／６７６；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）Ｆｌ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＦＬ  ＡＴＰ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）Ｆｌ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）Ｒ６Ｇ  ＳＥ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＴＭＲ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＴＲ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＴＲ  ＡＴＰ；ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）ＴＲ−Ｘ  ＳＥ；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−１；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−３；ブリリアントスルホフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ−５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン−；カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋色素；カルシウムグリーン−２  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８  Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフロールホワイト（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ）；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）（商標）；カスケードイエロー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ）；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）；ＣＦＰ／ＹＦＰ  ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；セレンテラジン；セレンテラジンｃｐ；セレンテラジンｆ；セレンテラジンｆｃｐ；セレンテラジンｈ；セレンテラジンｈｃｐ；セレンテラジンｉｐ；セレンテラジンｎ；セレンテラジンＯ；クマリンファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭ  Ｉメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣ  ホルマザン；Ｃｙ２（商標）；Ｃｙ３．１  ８；Ｃｙ３．５（商標）；Ｃｙ３（商標）；Ｃｙ５．１  ８；Ｃｙ５．５（商標）；Ｃｙ５（商標）；Ｃｙ７（商標）；Ｃｙａｎ  ＧＦＰ；サイクリックＡＭＰフルオロセンサー（Ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ）（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）；ダンシル（Ｄａｎｓｙｌ）；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルＤＨＰＥ；フッ化ダンシル；ＤＡＰＩ；ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）；ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）２；ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）３’ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドローダミン１２３）；Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（ノンレシオ）；ジＡ（４−Ｄｉ１６−ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−親油性トレーサー；ＤｉＤ（ＤｉＩＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドローダミン１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；Ｉジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（Ｄｉ��Ｃ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；ＤｓＲｅｄ；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；エチジウムブロマイド；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；オイクリシン（Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ）；オイコライト（ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ）；塩化ユウロピウム（１１１）；ＥＹＦＰ；ファストブルー（Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ）；ＦＤＡ；フォイルゲン（パラローザニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ（Ｆｌａｚｏ  Ｏｒａｎｇｅ）；フルオ（Ｆｌｕｏ）−３；フルオ（Ｆｌｕｏ）−４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインジアセテート；蛍光エメラルド；蛍光金（ヒドロキシスチルバミジン）；フルオル−ルビー（Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ）；フルオル（Ｆｌｕｏｒ）Ｘ；ＦＭ１−４３（商標）；ＦＭ４−４６；フラレッド（Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ）（商標）（高ｐＨ）；フラレッド（ＦｕｒａＲｅｄ）（商標）／フルオ（Ｆｌｕｏ）−３；フラ（Ｆｕｒａ）−２；フラ（Ｆｕｒａ）−２／ＢＣＥＣＦ；ゲナクリルブリリアントレッド（Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ）Ｂ；ゲナクリルブリリアントイエロー（Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ）１０ＧＦ；ゲナクリルピンク（Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｐｉｎｋ）３Ｇ；ゲナクリルイエロー（Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｙｅｌｌｏｗ）５ＧＦ；ジーンブレザー（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；ＧＦＰレッドシフト化（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型の非−ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；グロキサリックアシッド（Ｇｌｏｘａｌｉｃ  Ａｃｉｄ）；グラニュラーブルー（Ｇｒａｎｕｌａｒ  ｂｌｕｅ）；ヘマトポルフィリン；ヘキスト３３２５８；ヘキスト３３３４２；ヘキスト３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；インド（Ｉｎｄｏ）−１、高カルシウム；インド（Ｉｎｄｏ）−１低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；イントラホワイト（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ）Ｃｆ；
ＪＣ−１；ＪＯ  ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；レーザープロ（ＬａｓｅｒＰｒｏ）；ラウロダン（Ｌａｕｒｏｄａｎ）；ＬＤＳ  ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ  ７５１（ＲＮＡ）；ロイコホール（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ）ＰＡＦ；ロイコホール（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ）ＳＦ；ロイコホール；（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ）ＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；ルシファーイエロー；リソトラッカーブルー；リソトラッカーブルーホワイト；リソトラッカーグリーン；リソトラッカーレッド；リソトラッカーイエロー；リソセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）ブルー；リソセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）グリーン；リソセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）イエロー／ブルー；マググリーン（Ｍａｇ  Ｇｒｅｅｎ）；マグダラレッド（フロキシン  Ｂ）；マグ−フラ（Ｍａｇ−Ｆｕｒａ）レッド；マグ−フラ（Ｍａｇ−Ｆｕｒａ）−２；マグ−フラ（Ｍａｇ−Ｆｕｒａ）−５；マグ−インド（Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ）−１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリナブルー；Ｉマキシロンブリリアントフラビン（Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ）１０  ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン（Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ）８  ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；マイトトラッカーグリーンＦＭ；マイトトラッカーオレンジ；マイトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾキセジドール（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘｅｄｉｄｏｌｅ）；ノラドレナリン；ヌクレアファストレッド；ｉヌクレアイエロー；ニロサンブリリアントラビン（Ｎｙｌｏｓａｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｌａｖｉｎ）Ｅ８Ｇ；オレゴングリーン（商標）；オレゴングリーン（商標）４８８；オレゴングリーン（商標）５００；オレゴングリーン（商標）５１４；パシフィックブルー；パラローザニリン（フォイルゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−テキサスレッド（レッド６１３）；フロキシンＢ（マグダラレッド）；ホルワイト（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ）ＡＲ；ホルワイト（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ）ＢＫＬ；ホルワイト（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ）Ｒｅｖ；ホルワイト（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ）ＲＰＡ；ホスフィン（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）３Ｒ；フォトレジスト；フィコエリトリンＢ［ＰＥ］；フィコエリトリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロム（Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ）ブルーブラック；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−ＩＰＲＯ−３；プリムリン；プロシオンイエロー；プロピジウムヨーダイド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｌｏｄｉｄ）（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；ピラゾール（Ｐｙｒｏｚａｌ）ブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ  ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ２００；ローダミンＢエクストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン（Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ）；ローダミン：ファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ブリリアントレッド２Ｂ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ブリリアントレッド４Ｇ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ＩブリリアントレッドＢ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）オレンジ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）イエローＬ；ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグロウ（ｓｕｐｅｒ  ｇｌｏｗ）ＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（商標）（ｓｕｐｅｒ  ｇｌｏｗ  ＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；ナトリウムグリーン；スペクトラムアクア（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ）；スペクトラムグリーン（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）；スペクトラムオレンジ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）；スペクトラムレッド（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ）；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢおよびＣ；スルホローダミンエクストラ；ＳＹＴＯ１１；ＳＹＴＯ１２；ＳＹＴＯ１３；ＳＹＴＯ１４；ＳＹＴＯ１５；ＳＹＴＯ１６；ＳＹＴＯ１７；ＳＹＴＯ１８；ＳＹＴＯ２０；ＳＹＴＯ２１；ＳＹＴＯ２２；ＳＹＴＯ２３；ＳＹＴＯ２４；ＳＹＴＯ２５；ＳＹＴＯ４０；ＳＹＴＯ４１；ＳＹＴＯ４２；ＳＹＴＯ４３；ＳＹＴＯ４４；ＳＹＴＯ４５；ＳＹＴＯ５９；ＳＹＴＯ６０；ＳＹＴＯ６１；ＳＹＴＯ６２；ＳＹＴＯ６３；ＳＹＴＯ６４；ＳＹＴＯ８０；ＳＹＴＯ８１；ＳＹＴＯ８２；ＳＹＴＯ８３；ＳＹＴＯ８４；ＳＹＴＯ８５；ＳＹＴＯＸブルー；ＳＹＴＯＸグリーン；ＳＹＴＯＸオレンジ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；テキサスレッド（商標）；テキサスレッド−Ｘ（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）；チアゾールオレンジ；チノポール（Ｔｉｎｏｐｏｌ）ＣＢＳ（カルコフロールホワイト（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ））；ＴＩＥＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；トリカラー（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣテトラメチルローダミンイソチオシアネート；トゥルーブルー（Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅ）；トゥルーレッド（Ｔｒｕ  Ｒｅｄ）；ウルトラライト（Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）；ウラニンＢ；ユビテックス（Ｕｖｉｔｅｘ）ＳＦＣ；ｗｔＧＦＰ；ＷＷ７８１；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；イエローＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ３；ＹＯＹＯ−ｌ；ＹＯＹＯ−３；Ｓｙｂｒグリーン；チアゾールオレンジ（インターキレート色素）���半導体ナノ粒子、例えば、量子ドット；またはケージドフルオロフォア（ｃａｇｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）（光またはその他の電磁エネルギー供給源で活性化され得る）またはそれらの組合せが挙げられる。
【００４３】
部分は、ナノ粒子、例えば、発熱ナノシェルであり得る。本明細書において用いる場合、「ナノシェル」とは、１以上の導電シェル層によって囲まれた、別個の誘電性または半導電コア部分を有するナノ粒子であり得る。米国特許第６，５３０，９４４号が、金属ナノシェルの作製方法および使用方法の教示について、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。ナノシェルは、誘電性または不活性材料、例えば、シリコンのコアを用いて形成し、近赤外線（約８００〜１３００ｎｍ）などの照射を用いて励起され得る高導電性金属などの材料でコーティングできる。ナノシェルは、励起されると、熱を放射する。得られた異常高熱によって周囲の細胞（複数の細胞）または組織を死滅させることができる。ナノシェルのシェルとコアの組み合わせた直径の範囲は、１０から１００ナノメーターの範囲である。近赤外線は、組織を透過するその能力のために有利である。ナノ粒子コーティングおよび標的化される細胞の選択に応じて、その他の種類の照射も使用できる。例として、ｘ線、磁場、電場および超音波が挙げられる。本粒子はまた、特に、赤外拡散光子イメージング法を用いるイメージングを増強するために使用できる。標的化分子は、抗体またはその断片、特定の受容体のリガンドまたは標的化される細胞の表面と特異的に結合するその他のタンパク質であり得る。
【００４４】
部分は、開示されるペプチドと共有結合させることができる。部分は、開示されるペプチドのアミノ末端と結合させることができる。部分は、開示されるペプチドのカルボキシ末端と結合させることができる。部分は、開示されるペプチド内のアミノ酸と結合させることができる。本明細書において提供されるコンジュゲートは、部分と開示されるペプチドとを連結するリンカーをさらに含み得る。開示されるペプチドはまた、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのコーティング分子にコンジュゲートさせることができ（Ｔｋａｃｈｅｎｋｏら、（２００３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１２５、４７００−４７０１参照のこと）、これはペプチドでナノシェルをコーティングするために使用できる。
【００４５】
部分を、開示されるペプチドに架橋するために使用できるタンパク質クロスリンカーは、当技術分野で公知であり、有用性および構造に基づいて規定されており、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、スルホＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンインドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スクシンインドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、スルホＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタルトレート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルトレート）、スルホＥＧＳ（エチレングリーコルビス（スクシンイミジルスクシネート））、ＥＧＳ（エチレングリーコルビス（スルホスクシンイミジルスクシネート））、ＤＰＤＰＢ（１，２−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン）、ＢＳＳＳ（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、スルホＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、スルホＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＮＨＳ  ＬＣ  ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホＮＨＳ  ＬＣ  ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＮＨＳブロモアセテート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート）、ＮＨＳヨードアセテート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート）、ＭＰＢＨ（４−（Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドヒドロクロライド）、ＭＣＣＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ヒドラジドヒドロクロライド）、ＭＢＨ（ｍ−マレイミド安息香酸ヒドラジドヒドロクロライド）、スルホＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣ  ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ（６−アミドカプロエート））、スルホＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブトリルオキシ（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｒｙｌｏｘｙ））スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミドヘキサノエート））、スルホＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｌｏｘｙ）スクシンイミド）、ＤＭＰ（ジメチルピメリミデート（ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）ヒドロクロライド）、ＤＭＳ（ジメチルスベリミダートヒドロクロライリド）、ＭＨＢＨ（ウッズ（Ｗｏｏｄ’ｓ）試薬）（メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミダートヒドロクロライド、９８％）、ＤＭＡ（ジメチルアジピミダートヒドロクロライド）が挙げられる。
【００４６】
開示されるコンジュゲートの部分は、細胞内在化トランスポーターまたは配列であり得る。細胞内在化配列は、当技術分野で既知のまたは新しく発見された任意の内在化配列またはその保存的変異体であり得る。細胞内在化トランスポーターおよび配列の限定されない例として、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ突然変異体）、ブフォリン（Ｂｕｆｏｒｉｎ）ＩＩ、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロールおよびＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）が挙げられる（表１参照のこと）。
【００４７】
【表１−１】
2009525055.tif 000002
【００４８】
【表１−２】
2009525055.tif 000003
したがって、提供されるポリペプチドは、アミノ酸配列、配列番号４４、配列番号４５（Ｂｕｃｃｉ、Ｍ．ら、２０００．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、１３６２−１３６７）、配列番号４６（Ｄｃｒｏｓｓｉ、Ｄ．ら、１９９４．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１０４４４−１０４５０）、配列番号４７（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．ら、２０００．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５５、１６３−１７２）、配列番号４８（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．１９８８．Ｃｅｌｌ  ５５、１１８９−１１９３、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．＆Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｍ．１９８８．Ｃｅｌｌ  ５５、１１７９−１１８８）、配列番号４９（Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｂ．ら、２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、８２４５−８２５０）、配列番号５０（Ｐｏｏｇａ，Ｍ．ら１９９８．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２、６７−７７）、配列番号５１（Ｏｅｈｌｋｅ，Ｊ．ら、１９９８．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４１４、１２７−１３９）、配列番号５２（Ｌｉｎ，Ｙ．Ｚ．ら、１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１４２５５−１４２５８）、配列番号５３（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら、２００３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５、３５２−３５７）、配列番号５４（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｐ．ら、２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９９、８５−９０）、配列番号５５（Ｅｌｍｑｕｉｓｔ，Ａ．ら、２００１．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６９、２３７−２４４）、配列番号５６（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．ら、２００１．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９、１１７３−１１７６）、配列番号５７（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｃ．ら、２０００．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７、６７９−６８６）、配列番号５８（Ｇａｏ，Ｃ．ら、２００２．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０、４０５７−４０６５）または配列番号５９（Ｈｏｎｇ，Ｆ．Ｄ．＆Ｃｌａｙｍａｎ，Ｇ．Ｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０、６５５１−６５５６）をさらに含み得る。提供されるポリペプチドは、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）またはＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、９６８２−９６８６）をさらに含み得る。前記の参照は、ベクターおよび配列を細胞内在化する教示について参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。今日知られているか、または後に同定される任意のその他の内在化配列を、本明細書に開示されるポリペプチドと組合せることができる。
【００４９】
６．ポリペプチドおよびペプチド
ｉ．タンパク質変異体
タンパク質変異体および誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列修飾を含み得る。例えば、アミノ酸配列修飾は、通常、３つのクラスのうち１以上に該等する：置換変異体、挿入変異体または欠失変異体。挿入としては、単一または複数のアミノ酸残基のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに配列内挿入が挙げられる。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシル末端融合のものよりも小さい挿入、例えば、１〜４個程の残基である。免疫原性融合タンパク質誘導体、例えば、実施例に記載されるものは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで架橋することによって、または融合物をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養によって、免疫原性を付与するのに十分なほど大きいポリペプチドを標的配列に融合することによって作製する。欠失は、タンパク質配列からの１個以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。通常、タンパク質分子内の任意の１部位で、わずか約２〜６個の残基が欠失されている。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおける、ヌクレオチドの部位特異的変異、それによる変異体をコードするＤＮＡの生成およびその後の組換え細胞培養物におけるＤＮＡの発現によって調製する。既知配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換突然変異を作製する技術は、周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発がある。アミノ酸置換は、通常、単一残基のものであるが、いくつかの異なる位置で一度に起こる場合もあり、挿入は、通常、約１〜１０個程のアミノ酸残基であり、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、隣接対で作製されること、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入が好ましい。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終構築物に達することができる。突然変異は、配列を読み取り枠から外してはならず、二次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補領域を作製しないことが好ましい。置換変異体とは、少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されているものである。このような置換は、通常、以下の表２に従って作製され、保存的置換と呼ばれる。
【００５０】
【表２】
2009525055.tif 000004
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表２におけるものよりも保存的でない置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはへリックスコンホメーションのような、置換領域中のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖のかさ高さ、の維持に対するその効果がより大幅に異なる残基を選択することによってなされる。通常、タンパク質特性に最大の変化を生じると予測される置換は、（ａ）疎水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルと（もしくは、によって）置換されているもの、（ｂ）システイもしくはプロリンが、任意のその他の残基と（もしくは、によって）置換されているもの、（ｃ）陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルもしくはヒスチジルが、陰性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルと（もしくは、によって）置換されているもの、または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、この場合には、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化部位の数を増大することによって、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンと（もしくは、によって）置換されているものである。
【００５１】
例えば、アミノ酸残基の、生物学的に、および／または化学的に同様である別のものとの置換は、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を、別のものと、またはある極性残基を別のものと置き換えることである。置換として、例えば、ＧＩｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せが挙げられる。各々明確に開示された配列の、このような保存的に置換された変異体は、本明細書に提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。
【００５２】
置換突然変異誘発または欠失突然変異誘発を用いて、Ｎ−グリコシル化のための部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化のための部位（ＳｅｒまたはＴｈｒ）を挿入できる。システインまたはその他の不安定な残基の欠失も望ましいものであり得る。可能性のあるタンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇ、の欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１個を欠失させることまたはグルタミニルまたはヒスチジル残基と置換することによって達成する。
【００５３】
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドにおける、組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパリル残基に翻訳後脱アミドされることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミドされる。その他の翻訳後修飾として、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、場合によっては、Ｃ−末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【００５４】
記載される配列に対して少なくとも６５％、７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、これらのおよびその他のポリペプチドの変異体が具体的に開示される。当業者ならば、２種のタンパク質の相同性を調べる方法は容易に理解している。例えば、相同性は、相同性が最大レベルとなるように２種の配列をアラインした後に算出することができる。
【００５５】
相同性を算出するもう１つの方法は、公開アルゴリズムによって実施できる。比較するための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似の方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施できる。
【００５６】
例えば、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料について、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９、ＪａｅｇｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって、同じ種類の相同性を核酸について得ることができる。
【００５７】
保存的突然変異および相同性についての記載は、任意の組み合わせ、例えば、変異体が保存的突然変異である特定の配列と少なくとも７０％の相同性を有する実施形態において一緒に組合せることができるということは理解される。
【００５８】
本明細書において種々のタンパク質およびタンパク質配列が議論されるように、それらのタンパク質配列をコードできる核酸も開示されるということは理解される。これは、特定のタンパク質配列と関連するすべての変性配列、すなわち、ある特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびに開示される変異体およびタンパク質配列の誘導体をコードする変性核酸を含むすべての核酸を含む。したがって、個々の核酸配列各々は本明細書に記載されていない場合もあるが、実際には、開示されるタンパク質配列によって、ありとあらゆる配列が本明細書に開示され、記載されるということは理解される。
【００５９】
開示されるペプチドに組み込まれ得る多数のアミノ酸およびペプチド類似体があるということは理解される。例えば、多数のＤアミノ酸または表２に示されるアミノ酸とは異なる機能的置換基を有するアミノ酸がある。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、最適なアミノ酸を用いてｔＲＮＡ分子を帯電させ、例えば、アンバーコドンを利用して遺伝子構築物を操作し、類似体アミノ酸を部位特異的な方法でペプチド鎖中に挿入することによって、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（それらのいずれも、少なくともアミノ酸類似体に関連する材料について参照することによって、本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ１３：１９７−２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌら、ＴＴＢＳ、１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ、１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：６７８−６８２（１９９４））。
【００６０】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合によって結合されていない分子を、製造できる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨＨ２ＳＯ-−であり得る（これらおよびその他のものは、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）中、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月）第１巻、３号、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（総説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ、ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）に見ることができ、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましい非ペプチド結合として、−−ＣＨ２ＮＨ−−がある。ペプチド類似体は、結合原子間に２個以上の原子を有し得る、例えば、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸などは理解される。
【００６１】
アミノ酸類似体および類似体およびペプチド類似体は、増強された特性または所望の特性、例えば、より経済的な製造、より大きな化学的安定性、増強された薬剤特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変更（例えば、広範囲の生物学的活性）、抗原性の低下他を有することが多い。
【００６２】
Ｄ−アミノ酸を用いてより安定なペプチドを作製することができるが、これはＤアミノ酸が、ペプチダーゼなどによって認識されないためである。コンセンサス配列の１個以上のアミノ酸の、同一種のＤアミノ酸での系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりのＤ−リジン）を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。システイン残基を用いて、１以上のペプチドを一緒に環化または接続することができる。これは、ペプチドを特定のコンホメーションに拘束するために有益であり得る（参照により本明細書に組み込まれる、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））
７．核酸
本明細書において開示されるペプチドのうちいずれかをコードする単離核酸も、本明細書において提供される。内在化配列をコードする核酸をさらに含む本明細書において開示されるペプチドのうちいずれかをコードする単離核酸も、本明細書において提供される。例えば、細胞内在化は、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ突然変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロールおよびＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロールからなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。
ｉ．ヌクレオチドおよび関連分子
開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代用物で構成され得る。これらおよびその他の分子の限定されない例が、本明細書に論じられている。例えば、ベクターが細胞において発現される場合には、発現されたｍＲＮＡは、通常、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵからなるということは理解されている。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因的な送達によって細胞または細胞環境中に導入される場合には、アンチセンス分子が、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類似体からなることが有利であるということも理解される。
【００６３】
ヌクレオチドとは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、そのリン酸部分と糖部分を介して一緒に連結され、ヌクレオシド間結合を作製することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの限定されない例として、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）がある。当技術分野で利用可能であり本明細書において利用可能である、これらの種類の分子の多数の変異体がある。
【００６４】
ヌクレオチド類似体とは、塩基、糖またはリン酸部分のいずれかに何らかの種類の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドの修飾は、当技術分野では周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニンならびに糖またはリン酸部分の修飾が挙げられる。当技術分野で利用可能であり本明細書において利用可能である、これらの種類の分子の多数の変異体がある。
【００６５】
ヌクレオチド代用物とは、ヌクレオチドと同様の機能的特性を有するが、リン酸部分を含まない分子であり、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。ヌクレオチド代用物とは、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に連結される分子である。ヌクレオチド代用物は、適当な標的核酸と相互作用する場合に、二重らせん型構造に合わせることができる。当技術分野で利用可能であり本明細書において利用可能である、これらの種類の分子の多数の変異体がある。
【００６６】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に、その他の種類の分子（コンジュゲート）を連結し、例えば、細胞取り込みを増大させることも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と化学的に連結できる。このようなコンジュゲートとして、それだけには限らないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３−６５５６）。当技術分野で利用可能であり本明細書において利用可能である、これらの種類の分子の多数の変異体がある。
【００６７】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用とは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代用物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との少なくとも１種の相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代用物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代用物のＣ２、Ｎ１およびＣ６位、およびピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代用物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【００６８】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用とは、二本鎖ＤＮＡの主溝において曝露されている、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で起こる相互作用である。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
８．細胞送達系
また、本明細書において開示されるポリペプチドをコードする核酸を含み、核酸が、発現制御配列と機能し得る形で連結しているベクターも提供される。核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞に送達するために使用できるいくつかの組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、大部分は、２つのクラスに分けられる：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系。例えば、核酸は、いくつかの直接送達系、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドによって、または細胞もしくは陽イオン性リポソームなどの担体における遺伝物質の移動によって送達できる。トランスフェクションのための適当な手段、例えば、ウイルスベクター、化学的トランスフェクタントまたは物理的−機械的方法、例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５−１４６８、（１９９０）およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ、３５２、８１５−８１８、（１９９１）によって記載されている。このような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される組成物および方法とともに使用するために容易に適用可能である。特定の場合には、本方法は、大きなＤＮＡ分子を用いて特別に機能するよう改変される。さらに、これらの方法を用い、担体の標的化特徴を用いることによって特定の疾患および細胞集団を標的化することができる。
ｉ．核酸ベースの送達系
トランスファーベクターは、遺伝子を細胞に送達するために（例えば、プラスミド）、または遺伝子を送達するための遺伝子戦略の一環として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一環として使用される任意のヌクレオチド構築物であり得る（Ｒａｍら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８、（１９９３））。
【００６９】
本明細書において用いる場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸を、分解せずに細胞中に輸送する物質であり、プロモーターを含み、送達される細胞において遺伝子の発現をもたらす。ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロナルトロフィック（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルス、シンドビスおよびその他のＲＮＡウイルス、例えば、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスが挙げられる。また、ベクターとして使用するのに適したものにするこれらのウイルスの特性を共有する、任意のウイルスファミリーも開示される。レトロウイルスとして、マウスマロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス、ＭＭＬＶおよびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、その他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子負荷量、すなわち、トランス遺伝子またはマーカー遺伝子を保持でき、この理由のために、よく用いられるベクターである。しかし、それらは非増殖性細胞においてはそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業がしやすく、高力価を有し、エアゾール製剤で送達でき、非分裂細胞をトランスフェクトできる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、熱安定性であり、室温で保存できる。ウイルス抗原によって誘発される、宿主生物の免疫応答応を抑制するよう遺伝子操作されているウイルスベクターが開示される。この種の例示的ベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を保持し得る。
【００７０】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入する化学または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子を導入するための能力）を有し得る。通常、ウイルスベクターは、複製およびキャプシド形成に必要な、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、逆方向末端反復配列、およびウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターとを含む。ウイルスは、ベクターとして遺伝子操作される場合には、通常、１以上の初期遺伝子が除去され、除去されたウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノム中に挿入される。この種の構築物は、最大約８ｋｂの外来遺伝物質を保持し得る。除去された初期遺伝子の必要な機能は、通常、トランスに初期遺伝子の遺伝産物を発現するよう遺伝子操作された細胞株によって供給される。
ａ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意の種類、サブファミリー、属または指向性を含む、レトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２２９−２３２、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、（１９８５）によって記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子療法にレトロウイルスベクターを用いる方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；およびＭｕｌｌｉｇａｎ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されており、それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
レトロウイルスは、本質的に、核酸積荷を詰め込んでいるパッケージである。核酸積荷は、それとともにパッケージングシグナルを保持し、これによって、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に確実にパッケージングされる。パッケージシグナルのほかに、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスに必要とされるいくつかの分子もある。通常、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。通常、標的細胞へ導入される外来ＤＮＡによって置き換えられるのは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、通常、パッケージコートに組み込むためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始を示す配列、逆転者に必要なエレメント、例えば、逆転写のｔＲＮＡプライマーと結合するためのプライマー結合部位、ＤＮＡ合成の際のＲＮＡ鎖の切り換えを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２鎖の合成のプライミング部位として働く３’ＬＴＲの５’のプリンリッチ配列および宿主ゲノムへの挿入のためのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲの末端近くの特定の配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の除去により、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写されることとなり、複製の際に、新規レトロウイルス粒子中にパッケージングされることが可能となる。核酸のこの量は、各転写物の大きさに応じて１種〜多数の遺伝子を送達するのに十分である。インサート中に、正または負の選択マーカーを、その他の遺伝子とともに含むことが好ましい。
【００７２】
ほとんどのレトロウイルスベクターにおいて、複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、ベクターは、通常、パッケージング細胞株中にそれらを入れることによって作製される。パッケージング細胞株とは、複製およびパッケージング機構を含むが、パッケージングシグナルはいずれも欠いているレトロウイルスを用いてトランスフェクトまたは形質転換されている細胞株である。選択したＤＮＡを保持するベクターが、これらの細胞株にトランスフェクトされると、ヘルパー細胞によってシスに提供される機構によって、注目する遺伝子を含有するベクターが、複製され、新規レトロウイルス粒子中にパッケージングされる。この機構に関するゲノムは、必要なシグナルを欠くためにパッケージングされない。
ｂ．アデノウイルスベクター
複製に欠陥のあるアデノウイルスの構築は、記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてこれらのウイルスを用いる利益は、初期感染細胞内において複製できるが、新規感染性ウイルス粒子を形成できないので、その他の細胞種に広がる範囲が制限されているということである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質およびいくつかのその他の組織部位への直接的な、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に高効率の遺伝子導入を達成することがわかっている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｃｅｌｌ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、野生型または複製に欠陥のあるアデノウイルスと同様の方法で、特異的な細胞表面受容体と結合し、その後、ウイルスが受容体媒介性エンドサイトーシスによってインターナライズされることによって遺伝子形質導入を達成する（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【００７３】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されているアデノウイルスに基づいたものであり得、これらのビリオンは、ヒト２９３細胞株などの細胞株において作製される。もう１つの好ましい実施形態では、アデノウイルスゲノムからＥ１およびＥ３遺伝子の両方が除去される。
ｃ．アデノ随伴ウイルスベクター
もう１つの種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づいている。この欠陥パルボウイルスは、多数の細胞種に感染でき、ヒトにとって非病原性であるために、好ましいベクターである。ＡＡＶ種のベクターは、約４〜５ｋｂを輸送でき、野生型ＡＡＶは、染色体１９に安定に挿入されることがわかっている。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この種のベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって製造されるＰ４．１Ｃベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋおよび／またはマーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードする遺伝子を含み得る。
【００７４】
もう１つの種類のＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、異種遺伝子と機能し得る形で連結している、細胞特異的発現に向かわせるプロモーターを含む少なくとも１種のカセットをフランキングする１対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。これに関連して、異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスにとって天然でない、任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
【００７５】
通常、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域は欠失されており、その結果、安全で、非細胞傷害性のベクターとなっている。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその修飾物は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞傷害性は付与せず、プロモーターは細胞特異的発現に向けさせる。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する材料について参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００７６】
したがって、開示されるベクターは、実質的な毒性を伴わない哺乳類染色体への組み込みが可能であるＤＮＡ分子を提供する。
【００７７】
ウイルスおよびレトロウイルスに挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。一般に、プロモーターとは、転写開始部位に対して、相対的に固定された位置にある場合に機能する、ＤＮＡの配列または複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
ｄ．大きな負荷量のウイルスベクター
大きなヒトヘルペスウイルスを用いる分子遺伝学的実験によって、大きな異種ＤＮＡ断片をクローニングし、増殖させ、ヘルペスウイルスの感染に関して許容状態の細胞において確立することができる手段が提供された（Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ８：３３−４１、１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ５：６３３−６４４、１９９９）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒト異種ＤＮＡ＞１５０ｋｂの断片を特定の細胞に送達する可能性を有する。ＥＢＶ組換え体は、エピソームＤＮＡとして感染Ｂ細胞中にＤＮＡの大きな断片を維持することができる。個々のクローンによって担持された最大３３０ｋｂのヒトゲノムインサートは、遺伝的に安定であるようであった。これらのエピソームの維持には、ＥＢＶの感染の間、構成的に発現される特定のＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１が必要である。さらに、これらのベクターを、トランスフェクションに使用でき、これでは多量のタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一時的に作製できる。ヘルペスウイルスアンプリコン系はまた、ＤＮＡ＞２２０ｋｂの断片をパッケージングし、エピソームとしてＤＮＡを安定に維持できる細胞に感染させるためにも用いられている。
【００７８】
その他の有用な系として、例えば、複製および宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
ｉｉ．非核酸ベースの系
開示される組成物は、種々の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物は、エレクトロポレーションによって、またはリポフェクションによって、またはリン酸カルシウム沈殿によって送達できる。選択される送達機構は、幾分かは、標的化される細胞の種類、送達が、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こるかどうかに応じて変わる。
【００７９】
したがって、組成物は、リポソーム、例えば、陽イオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）または陰イオン性リポソームなどの脂質を含み得る。リポソームは、必要に応じて、特定の細胞の標的化を容易にするためのタンパク質をさらに含み得る。化合物および陽イオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的組織への末梢から中心へ向かう血液に投与してもよいし、気道の標的細胞へと気道に吸い込まれてもよい。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、化合物は、特定の細胞種、例えば、マクロファージを標的化できるマイクロカプセル、または特定の速度または投与量のために、マイクロカプセルからの化合物の拡散もしくは化合物の送達が設計されているマイクロカプセルの成分として投与できる。
【００８０】
外来ＤＮＡの対象の細胞への投与および取り込み（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を含む上記の方法では、細胞への組成物の送達は、種々の機構を介すものであり得る。一例として、送達は、市販のリポソーム調製物、例えば、リポフェクチン、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、スーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびトランスフェクタム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ならびに当技術分野で標準的な手順にしたがって開発されたその他のリポソームを用いる、リポソームを介するものであり得る。さらに、開示される核酸またはベクターは、エレクトロポレーションによってｉｎ  ｖｉｖｏで送達でき、それに関する技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能であり、または、ソノポレーション機器（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）によって送達できる。
【００８１】
物質は溶液中であっても、懸濁液中であってもよい（例えば、微粒子、リポソームまたは細胞中に組み込まれていてもよい）。通常、受容体は、構成的であるか、またはリガンドによって誘導されるエンドサイトーシスの経路に関与している。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、酸性化エンドソームを通過し、ここで受容体は選別されて、細胞表面に再循環し、細胞内に貯蔵されるようになるか、またはリソソームにおいて分解される。内在化経路は、種々の機能、例えば、栄養分の取り込み、活性化されたタンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解ならびに受容体レベルの調節を果たす。多数の受容体は、細胞種、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの結合価およびリガンド濃度に応じて２以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９−４０９（１９９１））。
【００８２】
宿主細胞ゲノムに組み込まれる予定の、細胞に送達される核酸は、通常、組み込み配列を含む。これらの配列は、特に、ウイルスベースの系が用いられる場合には、ウイルス関連配列であることが多い。これらのウイルス組み込み系はまた、非核酸ベースの送達系、例えば、リポソームを用いて送達される場合には、送達される予定の核酸に組み込まれ、その結果、送達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組み込まれる。
【００８３】
宿主ゲノム中に組み込むための、その他の一般的な技術として、例えば、宿主ゲノムを用いた相同組換えを促進するよう設計された系が挙げられる。これらの系は、通常、ベクター核酸と標的核酸間の組換えが起こり、送達される核酸が宿主ゲノム中に組み込まれるようにする、宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、発現される予定の核酸をフランキングする配列に頼る。これらの系および相同組換えを促進するために必要な方法は、当業者には知られている。
ｉｉｉ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ
上記のように、本組成物は、薬学的に許容される担体において投与でき、当技術分野で周知の種々の機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど）によって、対象の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏで送達できる。
【００８４】
ｅｘ  ｖｉｖｏ法を用いる場合には、当技術分野で周知の標準プロトコルに従って、細胞または組織を、身体の外側に採取し、維持してもよい。本組成物は、任意の遺伝子導入機構、例えば、リン酸カルシウム媒介性遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームなどによって細胞に導入できる。次いで、導入された細胞を注入（例えば、薬学的に許容される担体中で）してもよいし、または細胞もしくは組織種についての標準的な方法によって対象に同位に移植して戻してもよい。対象への種々の細胞の移植または注入のための標準的な方法は、公知である。
ｉｖ．発現系
細胞に送達される核酸は、通常、発現制御系を含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御に役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含む。一般に、プロモーターとは、転写開始部位に対して、相対的に固定された位置にある場合に機能する、ＤＮＡの配列または複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
ａ．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの好ましいプロモーター制御転写は、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳類プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ１８：３５５−３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連する種に由来するプロモーターも本明細書において有用である。
【００８５】
一般に、エンハンサーとは、転写開始部位から固定されていない距離にあって機能し、転写単位の５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ３３：７２９（１９８３））ならびにコード配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にある場合もある。それらは、通常、１０〜３００ｂｐの間の長さであり、シスに機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含むことが多い。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサーは、遺伝子の発現の調節を決定する。現在、哺乳類遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）、一般的な発現には、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。好ましい例として、複製起点の後側の（ｂｐ１００−２７０）ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。
【００８６】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、その機能を誘発する光または特定の化学的事象のいずれかによって、特異的に活性化できる。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。また、γ照射などの照射に対する曝露またはアルキル化化学療法薬によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法がある。
【００８７】
特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用し、転写される転写単位の領域の発現を最大にすることができる。特定の構築物では、特定の時間に、特定の種類の細胞においてのみ発現されようとも、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、すべての真核細胞種において活性である。この種の好ましいプロモーターとして、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）がある。その他の好ましいプロモーターとして、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＲがある。
【００８８】
すべての特定の調節エレメントはクローニングし、メラノーマ細胞などの特定の細胞種において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用できるということがわかっている。グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞において選択的に発現させるために用いられてきた。
【００８９】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域もまた、転写終結部位も含む。転写単位もポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の１つの利益は、転写単位が、ｍＲＮＡのようにプロセッシングされ、輸送される可能性を高めるということである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。トランス遺伝子構築物において、相同ポリアデニル化シグナルを用いることが好ましい。特定の転写単位では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００個の塩基を含む。また転写される単位が、その他の標準配列を単独で、または上記の配列と組合せて含み、構築物の発現の形または安定性を改善することも好ましい。
ｂ．マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、送達されると発現されているかどうかを調べるために用いられる。好ましいマーカー遺伝子として、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子がある。
【００９０】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択マーカーであり得る。哺乳類細胞のための適した選択マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）およびピューロマイシンがある。このような選択マーカーが哺乳類宿主細胞にうまく導入されると、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択圧下におかれた場合に生存できる。２つの広く用いられる別個のカテゴリーの選択計画がある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補給培地から独立して増殖する能力を欠く突然変異細胞株の使用に基づく。２つの例として、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞がある。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素を添加せずに増殖する能力を欠く。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路のための特定の遺伝子を欠くので、補給培地において、不足しているヌクレオチドが供給されない限り生存できない。培地に補給する代替法として、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、そのようにして、その増殖必要条件を変更することがある。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補給培地では生存できない。
【００９１】
第２のカテゴリーは、優性選択であり、これは、任意の細胞種において用いられ、突然変異細胞株の使用を必要としない選択スキームを指す。これらのスキームは、通常、宿主細胞の増殖を停止する薬物を用いる。新規遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択で生存する。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を用いる。３つの例では、細菌遺伝子を真核生物制御下で用い、適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンそれぞれに対する耐性を伝える。その他のものとして、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピューロマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が挙げられる。
９．配列類似性
本明細書において用いる場合、用語相同性および同一性は類似性と同様のことを意味するということは理解される。したがって、例えば、２種の非天然配列間で単語相同性の使用が用いられる場合には、必ずしも、これら２種の配列間の進化上の関係を示すものではなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目しているということが理解される。２種の進化上関連のある分子間の相同性を調べるための多数の方法が、進化上関連しているかどうかに関わらず、配列類似性を調べる目的で任意の２種以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用されている。
【００９２】
一般に、本明細書に開示される遺伝子およびタンパク質の任意の公知の変異体および誘導体またはそれに伴うものを規定するための１つの方法は、特定の既知配列に対する相同性の点で変異体および誘導体を規定することによることは理解されている。本明細書に開示される特定の配列のこの同一性も、本明細書において別の場所で論じられている。一般に、本明細書に開示される遺伝子およびタンパク質の変異体は、通常、規定の配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの相同性を有する。当業者ならば、２種のタンパク質または核酸、例えば、遺伝子の相同性を調べる方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最高レベルとなるよう、２種の配列をアラインした後に算出できる。
【００９３】
相同性を算出するもう１つの方法は、公開アルゴリズムによって実施できる。比較するための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似の方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施できる。
【００９４】
例えば、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料について参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９、ＪａｅｇｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって、同じ種類の相同性を核酸について得ることができる。通常、任意の方法を使用でき、特定の例では、これらの種々の方法の結果は異なり得るということは理解されるが、当業者ならば、これらの方法のうち少なくとも１つで同一性が見られる場合には、配列は規定の同一性を有するといわれることは理解し、本明細書に開示される。
【００９５】
例えば、本明細書において用いる場合、別の配列に対して特定の相同性パーセントを有すると列挙された配列とは、上記の任意の１以上の算出方法によって列挙された相同性を有すると算出された配列を指す。例えば、Ｚｕｋｅｒ算出方法を用いて、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合には、たとえ、任意のその他の算出方法によって、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有さないと算出される場合にも、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると本明細書において定義される。もう１つの例として、Ｚｕｋｅｒ算出法、およびＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ算出法の両方を用いて、第１の配列が、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合に、たとえ、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ算出法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ算出法、Ｊａｅｇｅｒ算出法または任意のその他の算出法によって、第１の配列が８０パーセントの相同性を有さないと算出される場合にも、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると本明細書において定義される。さらにもう１つの例として、算出方法の各々を用いて（実際には、異なる算出方法が異なる算出された相同性パーセンテージをもたらすことは多いが）、第１の配列が、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合に、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると本明細書において定義される。
１０．ハイブリダイゼーション
用語ハイブリダイゼーションは、通常、少なくとも２種の核酸分子、例えば、プライマーまたはプローブおよび遺伝子間の配列によってもたらされる相互作用を意味する。配列によってもたらされる相互作用とは、２種のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体間にヌクレオチド特異的に生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列によってもたらされる相互作用である。通常、配列によってもたらされる相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で生じる。２種の核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知のいくつかの状態およびパラメータによって影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨおよび反応の温度は、２種の核酸分子がハイブリダイズしようともしなくとも、すべて影響を及ぼす。
【００９６】
２種の核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者には周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として規定できる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップのいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分が、そのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）でのハイブリダイゼーションと、それに続く、洗浄温度がＴｍよりも約５℃〜２０℃低いように選択された温度および塩濃度の組合せでの洗浄を含み得る。温度および塩条件は、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルが、注目する標識された核酸にハイブリダイズされ、次いで、種々のストリンジェンシーの条件下で洗浄される予備実験において経験的に容易に決定される。ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについては、ハイブリダイゼーション温度は、通常、より高い。条件を、上記のように用いて、または当技術分野で公知のように用いてストリンジェンシーを達成できる（少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する物質について参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７、１９８７）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションの好ましいストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中、約６８℃（水性溶液中）と、それに続く、６８℃での洗浄であり得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が低下するにつれ、さらに、変異性が検討される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて、必要に応じて、しかるべく低下させることができる。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、すべて当技術分野で公知のように、所望の相同性が高まるにつれ、高相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて、必要に応じて、しかるべく高めることができる。
【００９７】
選択的ハイブリダイゼーションを規定するもう１つの方法は、もう一方の核酸と結合している一方の核酸の量（パーセンテージ）を調べることによる。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、非制限核酸と結合している場合であり得る。通常、非制限プライマーは、例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。この種のアッセイは、制限および非制限プライマーの両方が、例えば、それらのｋｄよりも１０倍または１００倍または１０００倍低いか、または、一方のみの核酸分子が１０倍または１００倍または１０００倍であるか、一方または両方の核酸分子がそのｋｄを上回る条件下で実施できる。
【００９８】
選択的ハイブリダイゼーションを規定するもう１つの方法は、所望の酵素的操作を進めるためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素的に操作されたプライマーのパーセンテージを調べることによる。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、酵素的操作を進める条件下で、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが酵素的に操作される場合であり、例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合に、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長される場合である。好ましい条件としてまた、製造業者によって示唆されるもの、または当技術分野で酵素が操作を行うのに適当であると示されるものが挙げられる。
【００９９】
相同性と同様に、２種の核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを調べるために、本明細書において開示される種々の方法があることは理解される。これらの方法および条件は、２種の核酸分子間で異なるパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供し得るが、特に断りのない限り、任意の方法のパラメータを満たすことは十分であるということは理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要であり、ハイブリダイゼーションが、これらの方法のいずれか１種における必要なパラメータ内で起こる限り、本明細書に開示されると考慮される。
【０１００】
当業者は、組成物または方法が、ハイブリダイゼーションを集合的にまたは単一に調べるためのこれらの基準のいずれか１種を満たす場合には、本明細書に開示される組成物または方法であると理解するということは理解される。
１１．抗体
また、本明細書に開示されるペプチドまたはポリペプチドのいずれかと特異的に結合する抗体も本明細書に開示される。用語「抗体」は、本明細書において広い意味で用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。用語「抗体」には、無傷の免疫グロブリン分子に加え、それらが本明細書に開示されるポリペプチドと相互作用するその能力について選択される限り、それらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマーおよびヒトおよびヒト化型の免疫グロブリン分子またはその断片も含まれる。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な集団の抗体から得られた抗体を指す。すなわち、集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットで存在し得る天然に存在する突然変異の可能性を除いて同一である。本明細書において、モノクローナル抗体とは、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であるが、鎖の残りの部分が、別の種に由来するか、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、相同である「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を、それらが所望のアンタゴニスト活性を示す限り、具体的に含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照のこと）。
【０１０２】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を作製する任意の手順を用いて作製できる。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものを用いて調製できる。ハイブリドーマ法では、通常、マウスまたはその他の適当な宿主動物を、免疫化剤で免疫化して、免疫化剤と特異的に結合する抗体を産生するか、産生できるリンパ球を導く。あるいは、例えば、本明細書に記載されるＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−共受容体複合体を用いて、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。
【０１０３】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）に記載されるものを用いて作製してもよい。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定できる。抗体または活性な抗体断片のライブラリーはまた、例えば、Ｂｕｒｔｏｎらの米国特許第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂａｓらの米国特許第６，０９６，４４１号に記載されるファージディスプレイ技術を用いて作製し、スクリーニングできる。
【０１０４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法も一価の抗体を調製するのに適している。抗体の、その断片、特に、Ｆａｂ断片を作製するための消化は、当技術分野で公知のルーチン技術を用いて達成できる。例えば、消化は、パパインを用いて実施できる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、通常、Ｆａｂ断片と呼ばれる、各々単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片をもたらす。ペプシン処理は、２つの抗原組合せ部位を有し、依然として抗原と架橋できる断片をもたらす。
【０１０５】
これらの断片は、その他の配列と結合しているか否かに関わらず、抗体または抗体断片の活性は、修飾されていない抗体または抗体断片と比較して、大幅に変更されないか、損なわれていないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換またはその他の選択された修飾を含み得る。これらの修飾は、例えば、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去／付加するために、その生物寿命を増大するために、その分泌特徴を変更するために、いくつかのさらなる特性を提供し得る。いずれの場合にも、抗体または抗体断片は、その同属抗原との特異的結合などの生物活性特性を有さなくてはならない。抗体または抗体断片の機能的または活性領域は、タンパク質の特定の領域の突然変異誘発と、それに続く、発現および発現されたポリペプチを調べることによって同定できる。このような方法は、当業者には容易にわかり、抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的突然変異形成を含み得る（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４、１９９２）。
【０１０６】
本明細書において用いる場合、用語「抗体（単数形）」または「抗体（複数形）」とは、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指す場合もある。多数の非ヒト抗体（例えば、マウス、ラットまたはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて天然に抗原性であり、したがって、ヒトに投与した場合に、望ましくない免疫応答を引き起こし得る。したがって、方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が、望ましくない免疫応答を誘発する機会を低減するのに役立つ。
【０１０７】
開示されるヒト抗体は、任意の技術を用いて調製できる。ヒトモノクローナル抗体を作製する技術の例として、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７、１９８５）によって、およびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５、１９９１によって記載されるものが挙げられる。ヒト抗体（およびその断片）はまた、ファージディスプレイライブラリーを用いて製造できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１）。
【０１０８】
開示されるヒト抗体はまた、トランスジェニック動物から得ることができる。例えば、免疫化に応じて、ヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック、突然変異マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３）参照のこと）。具体的には、これらのキメラおよび生殖系列突然変異マウスの抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし、ヒト生殖系列抗体遺伝子アレイの、このような生殖系列突然変異体マウスへの導入の成功は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生をもたらす。所望の活性を有し得る抗体は、本明細書に記載されるＥｎｖ−ＣＤ４−共受容体複合体を用いて選択される。
【０１０９】
抗体ヒト化技術は、通常、抗体分子の１種以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の使用を含む。したがって、非ヒト抗体のヒト化型（またはその断片）は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワーク中に組み込まれた、非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含む、キメラ抗体または抗体鎖（またはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などのその断片、または抗体のその他の抗原結合部分）である。
【０１１０】
ヒト化抗体を作製するには、レシピエント（ヒト）抗体分子の１種以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基を、所望の抗原結合特徴（例えば、特定のレベルの特異性および標的抗原の親和性）を有することがわかっているドナー（非ヒト）抗体分子由来の１種以上のＣＤＲ由来の残基と置換する。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基と置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基と、場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、通常、抗体定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト抗体のものの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１１１】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野では周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒ、および共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することによって作製できる。ヒト化抗体を製造するために使用できる方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）および米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）に記載されている。
１２．薬剤担体
開示される組成物は、薬学的に許容される担体と組合せて治療上使用できる。「薬学的に許容される」とは、生物学的にか、または別の点で、望ましくないものでない材料を意味し、すなわち、材料を、何らかの望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、または材料が含まれる薬学的組成物のその他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、対象に、核酸またはベクターとともに投与できる。担体は、当業者には周知であるが、対象における有効成分のいかなる分解も最小にするよう、またいかなる副作用も最小にするよう当然選択される。
【０１１２】
適した担体およびその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９５に記載されている。通常、製剤を等張にするために、適当な量の薬学的に許容される塩が製剤において用いられる。薬学的に許容される担体の例として、それだけには限らないが、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、約５〜約８が好ましく、約７〜約７．５がより好ましい。さらなる担体として、徐放性製剤、例えば、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここで、マトリックスは造形品、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子の形である。当業者には当然のことながら、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて特定の担体がより好ましいものであり得る。  
【０１１３】
薬剤担体は、当業者には公知である。これらの最も一般的なものは、ヒトへの薬物の投与のための標準担体、例えば、滅菌水、生理食塩水および生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液である。組成物は、筋肉内投与または皮下投与してもよい。その他の化合物は、当業者によって用いられる標準手順に従って投与する。
【０１１４】
薬剤組成物は、選択した分子に加え、担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存料、界面活性剤など含み得る。薬剤組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの１種以上の有効成分を含み得る。
【０１１５】
非経口投与用製剤として、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。好ましいビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガーまたは固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルは、流動体および栄養素補充剤および電解質補充剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などを含む。保存料およびその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなども存在し得る。
【０１１６】
局所投与用製剤として、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ジェル剤、液滴剤、座剤、スプレー剤、液体および粉末が挙げられる。従来の薬剤担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるか、または望ましい場合がある。
【０１１７】
経口投与用組成物としては、散剤または顆粒剤、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェ剤または錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤も望ましいものであり得る。
【０１１８】
いくつかの組成物は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基およびモノ−、ジ−、トリアルキル、およびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与できる。
【０１１９】
物質は、溶液中であっても、懸濁液中であってもよい（例えば、微粒子、リポソームまたは細胞中に組み込まれていてもよい。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドを介して特定の細胞種に標的化され得る。以下の参照は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２：４４７−４５１、（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５−２８１、（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８：７００−７０３、（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、４：３−９、（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１−４２５、（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７−８０、（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４２：２０６２−２０６５、（１９９１））。「ステルス」およびその他の抗体コンジュゲートリポソームなどのビヒクル（例えば、結腸癌へ標的化する脂質媒介性薬物）、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球によって方向付けられる腫瘍標的化およびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスグリオーマ細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特異的タンパク質を腫瘍組織に標的化するこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４−６２２０、（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１０４：１７９−１８７、（１９９２））。通常、受容体は、構成的であるか、またはリガンドによって誘導されるエンドサイトーシスの経路に関与している。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、酸性化エンドソームを通過し、ここで受容体は選別されて、次いで、細胞表面に再循環し、細胞内に貯蔵されるようになるか、またはリソソームにおいて分解される。内在化経路は、種々の機能、例えば、栄養素取り込み、活性化されたタンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解ならびに受容体レベルの調節を果たす。多数の受容体は、細胞種、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの結合価およびリガンド濃度に応じて、２以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９−４０９（１９９１））
Ｂ．方法
１．標的化
対象において、１種以上の部分を、腫瘍リンパ管に標的化する方法が本明細書に提供される。本方法は、対象に、本明細書に開示されるペプチドの任意の１種以上と、１種以上の部分とを含むコンジュゲートを投与することを含み得る。１種以上の部分は、本明細書に開示されるものなどの検出部分であり得る。したがって、本方法は、対象のリンパ管におけるコンジュゲートの存在を検出することによって対象において腫瘍を検出することをさらに含み得る。
【０１２０】
１種以上の部分は、本明細書に開示されるものなどの治療部分であり得る。したがって、対象が癌を有する場合には、対象の腫瘍リンパ管への部分の標的化は、対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害し得る。
【０１２１】
２．検出
癌を検出する方法も提供される。本方法はまた、生体サンプルを、本明細書に開示されるペプチドのうち任意の１種以上と、１種以上の部分とを含むコンジュゲートと接触させることと、サンプルのリンパ管におけるコンジュゲートの存在を検出することとを含み得る。開示される方法のいくつかの態様では、参照または対照量よりも、リンパ管におけるコンジュゲートの存在を１種以上多く検出することが、癌の存在を示す。
【０１２２】
３．処理
癌を治療する方法も提供される。本方法は、対象に、本明細書に開示されるペプチドのうち任意の１種以上と、１種以上の部分とを含むコンジュゲートを投与することを含み得る。１種以上の部分は、治療部分であり得る。したがって、いくつかの態様では、コンジュゲートは、対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害する。コンジュゲートは、腫瘍リンパ管のアポトーシスを誘導する。いくつかの態様では、コンジュゲートは、腫瘍のアポトーシスを誘導する。
【０１２３】
開示される方法の癌は、乳癌であり得る。したがって、開示される方法のポリペプチドは、ＸがＲまたはＫ（配列番号１２〜１５）であるアミノ酸配列ＸＲＴＸ（配列番号５９）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１６）、ＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）、１、２または３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＮＫＲＴＲＧＧＣ（配列番号１８）を含み得る。
【０１２４】
開示される方法の癌は、子宮頸癌であり得る。したがって、開示される方法のポリペプチドは、ＸがＲまたはＫ（配列番号１２−１５）であるアミノ酸配列ＸＲＴＸ（配列番号５９）、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）を含み得る。
【０１２５】
開示される方法の癌は、皮膚癌であり得る。したがって、開示される方法のポリペプチドは、アミノ酸配列ＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、１つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号：２）、１つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫ（配列番号２）、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）、ＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＳＤＧＫＰＶＳ（配列番号３）、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）を含み得る。
【０１２６】
開示される方法の癌は、前立腺癌であり得る。したがって、開示される方法のポリペプチドは、アミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号：６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を含み得る。
【０１２７】
開示される方法の癌は、前癌性前立腺癌であり得る。したがって、開示される方法のポリペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を含み得る。
【０１２８】
開示される方法の癌は、悪性前立腺癌であり得る。したがって、開示される方法のポリペプチドは、アミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）を含み得る。
【０１２９】
開示されるコンジュゲートを用いて、癌などの制御されない細胞増殖が起こる任意の疾患を治療できる。種々の種類の癌の限定されないリストは以下のとおりであり得る：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌腫、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、グリオーマ、高悪性度グリオーマ、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、メラノーマ、腺腫、低酸素性腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫または肉腫、転移性癌または一般的な癌。
【０１３０】
開示される組成物を用いて治療できる癌の代表的であるが、限定されないリストは、以下のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、メラノーマ、口、咽頭、喉頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌および上皮癌、腎臓癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌、精巣癌、結腸および腎臓癌、前立腺癌または膵臓癌。
【０１３１】
４．診断
対象において、正常、前癌性および悪性前立腺状態を調べる方法も提供する。本方法は、対象由来の生体サンプルを、ポリペプチドが、アミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、ＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を含む、本明細書において開示されるコンジュゲートと接触させることを含み得る。
【０１３２】
開示される方法のいくつかの態様では、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）またはＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）の選択的結合が、前癌性前立腺状態の指標である。
【０１３３】
開示される方法のいくつかの態様では、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）またはＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）の選択的結合が、悪性前立腺状態の指標である。
【０１３４】
開示される方法のいくつかの態様では、ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、１つもしくは２つの非保存的アミノ酸置換と、１、２もしくは３つの保存的アミノ酸置換とを含むＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）またはＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号８）、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号３）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号４）またはＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）、１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）または１、２もしくは３つの非保存的アミノ酸置換と、１、２、３もしくは４つの保存的アミノ酸置換を含むＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）の選択的結合がないことが、正常前立腺状態の指標である。
【０１３５】
５．スクリーニング
腫瘍リンパ管を標的とする薬剤を同定する方法も提供される。この方法は、例えば、
（ａ）薬剤の非癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、非癌性組織を、候補薬剤のライブラリーと接触させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）から非癌性組織と結合しない候補薬剤を集めることと、
（ｃ）薬剤の、癌性または前癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、癌性または前癌性組織を、ステップ（ｂ）において集められた候補薬剤と接触させることと、
（ｄ）癌性または前癌性組織由来のリンパ管内皮細胞と結合している候補薬剤を集めることと
を含み得、候補薬剤の、癌性または前癌性組織のリンパ管内皮細胞との結合によって、候補薬剤が腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定される。
【０１３６】
例えば、候補薬剤のライブラリーは、ファージライブラリー由来であり得る。
【０１３７】
開示される方法は、腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定された候補薬剤を製造することをさらに含み得る。
【０１３８】
６．投与
本明細書において開示される組成物、例えば、開示されるペプチドおよびコンジュゲートは、局所治療が望まれるか、全身治療が望まれるかに応じて、また治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与できる。例えば、組成物は経口によって、非経口によって（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射）、吸入によって、体外で、局所に（例えば、経皮、眼部に、経膣的に、経直腸的に、鼻腔内に）などで投与できる。
【０１３９】
本明細書において用いる場合、「局所鼻腔内投与」とは、組成物の、鼻孔の片方または両方を通る鼻および鼻腔中への送達を意味し、噴霧機構または液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化を介した送達を含み得る。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達による鼻または口を介したものであり得る。送達はまた、挿管によって呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接であってもよい。
【０１４０】
組成物の非経口投与は、用いる場合には、通常、注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射の前の液体中の懸濁液の溶液に適した固体形として、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形で調製できる。非経口投与のための、より最近改定されたアプローチは、一定の投与量が維持されるような持続放出または徐放性システムの使用を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号参照のこと。
【０１４１】
必要な組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、治療されているアレルギー性疾患の重篤度、用いられる個々の核酸またはベクター、投与様式などに応じて、対象毎に変わる。したがって、どの組成物についても正確な量を指定することは不可能である。しかし、当業者によって、本明細書における教示をかんがみて、日常的な実験のみを用いて、適当な量を調べることができる。したがって、組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールは、経験的に定めることができ、このような決定を行うことは当技術分野の技術の範囲内である。組成物の投与の有用な投与量範囲は、所望の効果を引き起こすのに十分なほど大きいものである。投与量は、副作用、例えば、不要な交差反応、アナフィキラシー反応などを引き起こすほど多くしてはならない。一般に、投与量は、患者における年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路またはその他の薬物がレジメン中に含まれるかどうかで変わり、当業者ならば、決定することができる。投与量は、何らかの逆の徴候の場合には、個々の医師によって調整することができる。投与量は変わる場合があり、１日または数日間、毎日１以上の用量投与で投与してもよい。所与の種類の医薬製剤の適当な投与量についての指針は、文献に見ることができる。
【０１４２】
例えば、単独で用いられる開示されるペプチドの標準的な１日投与量は、上記の因子に応じて、１日あたり、約１μｇ／体重１ｋｇ〜最大１００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲またはそれ以上であり得る。
【０１４３】
開示される組成物の投与後、当業者に周知の種々の方法で治療部分の効力を評価できる。例えば、当業者ならば、組成物が腫瘍増殖を低減させるか、リンパ管新生のさらなる増大を防ぐことを観察することによって、本明細書に開示される組成物は、対象における癌の治療または阻害において有効であると理解されよう。
【０１４４】
Ｃ．キット
上記の材料ならびにその他の材料は、開示された方法を実施するのに、または実施を補助するのに有用なキットとして任意の適した組合せで一緒にパッケージングできる。所与のキット中のキット成分を、開示される方法において一緒に使用するよう設計、および適応されている場合には有用である。例えば、ペプチドと、ペプチドを部分と連結するための手段とを含む、コンジュゲート、例えば、本明細書に開示されるものを製造するためのキットが開示される。キットはまた、コンジュゲートを調製するためのプロトコルを含み得る。
【０１４５】
Ｄ．用途
開示される組成物は、研究手段として種々の方法で使用できる。その他の用途は開示されており、開示内容から明らかであり、および／または当業者によって理解される。
【０１４６】
Ｅ．組成物を作製する方法
本明細書に開示される組成物および開示される方法を実施するのに必要な組成物は、特に断りのない限り、その個々の試薬または化合物について当業者に公知の任意の方法を用いて作製できる。
【０１４７】
１．核酸合成
例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準的な化学合成法を用いて作製してもよいし、酵素法または任意のその他の公知の方法を用いて製造してもよい。このような方法は、標準酵素消化と、それに続く、ヌクレオチド断片単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）第５、６章参照のこと）から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡのモデル８７００自動化シンセサイザーまたはＡＢＩモデル３８ＯＢ）を用いるシアノエチルホスホラミダイト法による純粋に合成的な方法に及び得る。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成法はまた、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）、（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５：６１０−６２０（１９８０）、（ホスホトリエステル方法）に記載されている。タンパク質核酸分子は、公知の方法、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載されるものを用いて作製できる。
【０１４８】
２．ペプチド合成
開示されるタンパク質を製造する１つの方法は、タンパク質化学技術によって２以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを用い、現在利用可能な実験装置を用いて化学的に合成できる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。当業者ならば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドは、例えば、標準的な化学反応によって合成できることは容易に理解される。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成でき、合成樹脂から切断されないのに対し、ペプチドまたはタンパク質のその他の断片は、合成でき、続いて、樹脂から切断され、それによって、その他の断片では官能基によってブロックされている末端基が曝露される。これら２種の断片は、ペプチド縮合反応によって、そのカルボキシルおよびアミノ末端で、それぞれペプチド結合を介して共有結合によって結合し抗体またはその断片を形成できる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｉｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．、ＮＹ（少なくともペプチド合成に関連する材料について参照することによって本明細書に組み込まれる）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで独立に合成される。これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、単離すると、同様のペプチド縮合反応によって、連結させてペプチドまたはその断片を形成することができる。
【０１４９】
例えば、クローニングされたか、または合成されたペプチドセグメントの酵素的ライゲーションによって、相対的に短いペプチド断片が結合されて、より大きいペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインが生じるのが可能となる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然の化学的ライゲーションを利用して、短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成によって構築することができる。この方法は、２段階化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１のステップは、保護されていない合成ペプチド-チオエステルの、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、チオエステルが結合している中間体が最初の共有結合産物として得られる。反応条件を変更しなくても、この中間体は、自然発生的迅速分子内反応を受けて、ライゲーション部位で天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０１５０】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントを、化学的に連結するが、ここで、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合は、非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、ＭらＳｃｉｅｎｃｅ、２５６：２２１（１９９２））。この技術は、十分な生物活性を有する、タンパク質ドメインの類似体ならびに多量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０１５１】
Ｆ．定義
特に断りのない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、開示される方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料を、本方法および組成物の実施または試験において使用できるが、特に有用な方法、装置および材料は、記載されるとおりである。本明細書に引用される刊行物およびそのために引用される材料は、参照により、具体的に本明細書に組み込まれる。本明細書において、本発明が、先行発明によって、このような開示内容に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきものはない。いずれの参照文献も先行技術を構成するという承認は行われていない。参照文献についての議論は、その著者が主張することを提示し、出願人は、引用される文書の正確度および妥当性を厳密に調べる権利を留保する。
【０１５２】
本明細書において、また添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「冠詞」および「不定冠詞」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数の言及を含むということは留意しなければならない。したがって、例えば、「ペプチド」と不定冠詞を付していう場合、複数のこのようなペプチドを含み、「ペプチド」と定冠詞を付していう場合、１種以上のペプチドおよび当業者に公知のその等価物などの言及である。
【０１５３】
「任意の」または「場合により」とは、その後に記載される事象、環境または材料が生じるか、存在する場合もあるし、生じないか、存在しない場合もあるということ、および記載は、事象、環境または材料が生じるか存在する場合および生じないか存在しない場合を含むということを意味する。
【０１５４】
本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値、および／または〜「約」別の特定の値として表され得る。このような範囲が表される場合には、別の実施形態は、１つの特定の値および／または〜その他の特定の値を含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって「近似値」として表される場合には、特定の値は別の実施形態を形成すると理解される。範囲の各々の終点は、その他の終点に関連して、およびその他の終点とは独立に、の両方で重要であることはさらに理解される。本明細書に開示されるいくつかの値があり、各値は、その値に加え、「約」その特定の値として本明細書に開示されるということも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合には、「約１０」も開示される。当業者ならば適切に理解するであろうが、値が開示される場合には、その値「以下」、「その値以上」および値間のあり得る範囲も開示されるということも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合には、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。本願を通じて、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点および開始点およびデータ点の任意の組合せの範囲を表すということも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示される場合には、１０および１５より大きい、１０および１５以上の、１０および１５未満の、１０および１５以下の、ならびに１０および１５と同等、ならびに１０〜１５の間が開示されると考慮されると理解される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されると理解される。例えば、１０および１５が開示される場合には、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【０１５５】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの単語の変形、例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含んでいるが制限されない」を意味し、例えば、その他の添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しない。
【０１５６】
本願を通じて、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示内容は、本願が関連する最新技術をより十分に説明するために、参照によりその全体が本願に組み込まれる。開示される参照文献は、参照が頼られる文において議論されるものに含まれる物質について参照することによって、本明細書に個々に、および具体的に組み込まれる。
【０１５７】
本明細書において、用語「標的化」または「ホーミング」とは、標的とされない化合物または組成物と比較した、ある部位またはある位置での標的とされる化合物または組成物、例えば、開示される組成物の選択運動、結合および／または蓄積を指し得る。例えば、対象へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与に関連して「標的化」または「ホーミング」とは、非標的組織、細胞および／または構造と比較した、標的組織、標的細胞および／または標的構造中のまたは標的組織、標的細胞および／または標的構造での、化合物または組成物、例えば、開示される組成物の選択運動、結合および／または蓄積を指し得る。
【０１５８】
本明細書において用いる場合、用語「標的組織」とは、対象への投与後に、標的とされる化合物または組成物、例えば、開示される組成物の蓄積のための意図される部位を指す。例えば、目下、開示される主題の方法は、子宮内膜症を含む標的組織を用いる。
【０１５９】
本明細書において用いる場合、「対象」とは、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生生物および任意のその他の生物または核酸を有する実体を含むが、それだけには限らない。対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモットまたはげっ歯類）、サカナ、トリまたは爬虫類または両生類であり得る。対象は無脊椎動物、より具体的には、節足動物（例えば、昆虫および甲殻類）であり得る。この用語は、特定の年齢または性別を表さない。したがって、成体および新生対象ならびに胎児が、雄であろうと雌であろうと対象とされる。患者とは、疾患または障害に罹患している対象である。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。子宮内膜症および子宮内膜症細胞に関連して、対象は、子宮内膜症および／または子宮内膜症細胞を有するか、有し得る対象であると理解される。
【０１６０】
「治療」とは、疾患、病状または障害を、治癒、寛解、安定化または予防する目的をもった患者の医学的管理を意味する。この用語は、積極的治療、すなわち、疾患、病状または障害の改善に明確に向けられた治療を含み、また、原因治療、すなわち、関連した疾患、病状または障害の原因の除去に向けられた治療を含む。さらに、この用語は、対症療法、すなわち、疾患、病状または障害の治癒よりも症状の緩和のために設計される治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病状または障害の発生を最小化または部分的阻害もしくは完全阻害に向けられる治療、支持療法、すなわち、関連する疾患、病状または障害の改善に向けられた別の特定の治療の捕捉となるために用いられる治療を含む。
【実施例】
【０１６１】
Ｇ．実施例
以下の実施例は、当業者に提供するために出されており、本明細書において特許請求される化合物、組成物、製品、装置および／または方法がどのように製造され、評価されるかの完全な開示および説明を含み、純粋に例示しようとするものであって、開示内容を制限しようとするものではない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保しようとする努力を行ったが、いくらかの誤差および偏差が考慮されなければならない。特に断りのない限り、パーセントは重量によるパーセントであり、温度は℃においてまたは周囲温度であり、圧力は大気圧か大気圧付近である。
【０１６２】
１．実施例１
ｉ．実験手順
細胞株、マウスおよび腫瘍：以下の細胞株は、１０％  ＦＣＳで補給されたＤＭＥＭで維持された：Ｃ８１６１ヒトメラノーマ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌、ＫＲＩＢヒト骨肉種およびヒト前立腺癌細胞ＰＰＣｌ、ＤＵ１４５。ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞株は、１０％  ＦＣＳを補給した、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含む、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。Ｍ１２ヒト前立腺癌細胞株は、５μｇ／ｍｌインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．２μＭデキサメタゾン、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ）および５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した（Ｂａｅら、１９９８）。腫瘍を作製するために、１×１０６個の腫瘍細胞を、ヌードＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５６ＢＬ／６マウスに、皮下（Ｃ８１６１、ＫＲＩＢおよびＰＰＣｌ）または同所に（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＰＰＣ１、ＤＵ１４５、Ｍ１２およびＬＮＣａＰ）注入した。トランスジェニックマウス腫瘍モデルは、ＴＲＡＭＰ前立腺癌、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ乳癌およびＫ１４−ＨＰＶ１６子宮頸癌を含んでいた。
【０１６３】
子宮頸部癌発生を開始するために、雌のＫ１４−ＨＰＶ１６マウス（Ａｒｂｅｉｔら、１９９４）を１７β−エストラジオール（Ｅ２；（Ａｒｂｅｉｔら、１９９６；Ｇｉｒａｕｄｏら、２００４）で処理した。簡単には、１ヶ月齢の処女雌トランスジェニック（ヘテロ接合体Ｋ１４−ＨＰＶ１６、１２０３＃１）および非トランスジェニック（ＦＶＢ／ｎ）マウスを、イソフルランを用いて麻酔し、Ｅ２を０．０５ｍｇの用量で６０日間にわたって送達する連続放出ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）を、背側の皮膚に皮下移植した。その後、全部で６ヶ月のホルモン治療のために、ペレットを３および５ヶ月齢で移植した。Ｋ１４−ＨＰＶ１６マウスは、ＦＶＢ／ｎバックグラウンドで維持した（ＦＶＢ／ｎ；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。マウスは、実験室のマウスの注意を規定するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）制度的ガイドラインに従って、維持した。動物実験は、ＵＣＳＦまたはＴｈｅ  Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物研究委員会によって承認された。
【０１６４】
ファージライブラリーおよびスクリーニング：Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ４１５−１ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ）でのＮＮＫによってコードされるＣＸ７Ｃライブラリーディスプレイは、先に記載されたように調製した（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）。ファージ選択および確認は、記載されている（Ｈｏｆｆｍａｎ、２００４）。前癌性前立腺病変および前立腺腫瘍の腫瘍リンパ管を標的化するペプチドの選択のために２段階手順を設計した。第１に、ファージライブラリーを、正常前立腺由来の細胞とともにインキュベートし、正常前立腺と結合するファージを取り去る。第２に、抗ポドプラニン磁性ビーズを用いてリンパ管内皮細胞を単離した。２〜３ラウンドのｅｘ  ｖｉｖｏ選択と、２〜３ラウンドのｉｎ  ｖｉｖｏ選択を実施した。ｅｘ  ｖｉｖｏ選択のために、ＴＲＡＭＰマウスの腫瘍のない同腹仔の正常前立腺、１４〜１６週齢のＴＲＡＭＰマウスの前癌性前立腺および２５〜２８週齢のＴＲＡＭＰマウスの腫瘍組織から細胞懸濁液を調製した。コラゲナーゼＩＡ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を用いて組織を分散させた。約１×１０７個の正常前立腺細胞を、５×１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）の、ＣＸ７ＣペプチドライブラリーをディスプレイするＴ７ファージとともに４℃で３時間インキュベートした。サンプルを、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（正常前立腺を取り去ったファージライブラリー）を回収し、次いで、４℃で、前癌性前立腺組織または前立腺腫瘍に由来する５×１０７個の細胞とともに一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、結合していないファージを除去し、ラット抗マウスポドプラニンとともに４℃で４５分間インキュベートし、０．５％  ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ポドプラニン陽性細胞を、Ｍ４５０ヒツジ抗ラットＩｇＧダイナビーズ（Ｍ４５０；Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を用いて単離した。ポドプラニン陽性細胞集団と結合しているファージを救出し、大腸菌で増幅させた。Ｉｎ  ｖｉｖｏファージライブラリースクリーニングは、記載されるとおりに実施した（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）。
【０１６５】
ファージのホーミング特異性：ファージのＩｎ  ｖｉｖｏホーミング特異性を、記載されるとおりに試験した（Ｈｏｆｆｍａｎ、２００４）。簡単には、腫瘍を保有するマウスに麻酔し、５×１０９ｐｆｕのファージを静脈注射した。７分後、マウスを、０．５％  ＢＳＡを含有するＰＢＳを用い、心臓を通ってかん流した。各マウスから腫瘍および対照臓器を解剖し、ファージを救出し、力価を測定した。組織学的分析のために、ファージの注射後、マウスを、４％  ＰＦＡで３０分間かん流した。ファージ免疫染色のために、組織をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．に包埋し、５μｍの切片を調製した。
【０１６６】
抗体および免疫組織学：マウスＰｒｏｘ−１に対するウサギ抗血清を作製するための特注免疫化は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって実施された。ニュージーランドホワイトウサギを、Ｐｒｏｘ−１タンパク質のＧＳＴ−Ｃ−末端断片の融合タンパク質を用いて免疫化した。抗体は、融合タンパク質でアフィニティー精製し、ＧＳＴで吸収させた。得られた抗体調製物（１．８ｍｇ／ｍｌ）は、ＥＬＩＳＡにおいて融合タンパク質に対して１：１０，０００という力価を与えた。組織切片の、抗−Ｐｒｏｘ−１抗体での免疫蛍光染色により、核染色のパターンを得た。記載される（Ｊｏｙｃｅら、２００３；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）凍結組織切片の免疫組織学的染色には、リンパ管マーカー抗−ＬＹＶＥ−１（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）および抗ポドプラニン（Ｔ．ＰｅｔｒｏｖａおよびＫ．Ａｌｉｔａｌｏによって親切にも提供された）、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ラット抗マウスＭＥＣＡ−３２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギポリクローナル抗Ｔ７ファージおよびラット抗−マウスＶＥＧＦＲ３に対する抗体を用いた。対応する二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした：それぞれ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８ヤギ抗ラットまたはウサギＩｇＧ（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４ヤギ抗ラットまたはウサギＩｇＧ（１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４ロバ抗マウスまたはヤギＩｇＧ（１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８ロバ抗マウスまたはヤギＩｇＧ（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。スライドを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含む、ベクタシールドマウント媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ）でマウントした。血管も、フルオレセインにコンジュゲートしている、リコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）レクチン（ＰＢＳ２００μｌ中１００μｇのレクチン；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を静脈内注入することによって可視化した。フルオレセイン標識ペプチドの組織分布（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４）は、ペプチド（ＰＢＳ２００μｌ中、１００〜１５０μｇ）をマウスに静脈内注入することによって調べた。注入されたペプチドは、３０分〜２時間循環可能であり、４％パラホルムアルデヒドを用い、心臓の左心室を通してマウスをかん流した。組織は解剖し、ＯＣＴ包埋媒体（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ）中で凍結した。免疫組織学的分析のために凍結切片を調製した。
【０１６７】
ペプチド合成：ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用い、固相シンセサイザーで合成した。ペプチドは、ＨＰＬＣによって精製し、質量分析によって確認した。フルオレセインがコンジュゲートしているペプチドは、記載されるとおりに合成した（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４）。ＬＳＤペプチドおよびＲＥＡペプチドは、アポトーシス促進性モチーフＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２とのキメラとして合成した（配列番号１９；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。
【０１６８】
トランスフェクションおよびファージ結合アッセイ：２９３Ｔ細胞を、ＣＸＣＲ４をコードするプラスミド（Ｈｅｌｂｉｇら、２００３）またはＶＥＧＦＲ２（Ｂｏｒｇｅｓら、２０００）を用い、ＦｕＧｅｎｅ  ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてトランスフェクトした。簡単には、プラスミド（１０μｇ）を、９００μｌの無血清ＤＭＥＭおよび５０μｌのＦｕＧｅｎｅと混合し、室温で１５分間インキュベートし、その後、細胞に混合物を加えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＥＤＴＡを用いて剥離し、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。ファージ（５×１０９ｐｆｕ）をトランスフェクトされた細胞とともにインキュベートし、結合しているファージを救出し、力価を測定した。競合結合アッセイのために、ファージを細胞とともにインキュベートする際に同族ペプチド（１５０μｇ／ｍｌ）または抗体（５０μｇ／ｍｌ）を加えた。腫瘍保有マウス前立腺癌モデルの標的化されるアポトーシス促進性ペプチド治療。１×１０６個のＰＰＣ１ヒト前立腺癌細胞をマウス前立腺に注入することによって同所異種移植された前立腺腫瘍を確立した。播種の１５日後、マウスに、Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２−ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号４１）、Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号１９）およびＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）の等モル混合物またはＰＢＳを静脈注射した。１００μｇ／用量／マウスの隔週注射を３週間行った。メラノーマモデル、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０６個のＣ８１６１ヒトメラノーマ細胞を皮下注射した。平均腫瘍容積が約１００ｍｍ３に達した時点で治療を開始した。大きさの合う腫瘍を有するマウスを、３群に無作為に分けた。治療群には、腫瘍ホーミングペプチドのアポトーシス促進性モチーフ（Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２−ＣＬＳＤＣＧＫＲＫＣ；配列番号４２）とのキメラを与えた。対照群には、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）およびＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号１９）の等モル混合物またはＰＢＳ単独を与えた。腫瘍を保有するマウスには、２００μｇ／用量／マウスを、３週間の間、週１回静脈注射した。マウスを体重減少についてモニターし、実験の最後に腫瘍を解剖し、秤量した。組織学的分析を実施して、腫瘍リンパ管および血管の密度を評価した。ここで報告される動物実験は、Ｔｈｅ  Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物研究委員会によって承認された。
【０１６９】
ヒト癌由来組織切片のファージオーバーレイ：ヒト前立腺腫瘍試料の凍結切片を、Ｄｒ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｍｅｒｃｏｌａ（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から得た。これらの切片（５μｍ）を、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ中、５％正常ヤギ血清および０．５％  ＢＳＡ）とともに、室温で１時間プレインキュベートし、希釈ブロッキングバッファー（１：１０）で３回洗浄し、切片上でファージ（３×１０９ｐｆｕ）を４時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウサギ抗ファージ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加え、ファージを２時間インキュベートした。これらのスライドを洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧとともに１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（ＶＥＣＴＯＲ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いてスライドをマウントした。
【０１７０】
統計分析：結果の統計分析にはスチューデントの検定を用いた。棒図表は、平均および標準偏差を示す。
ｉｉ．結果
Ｃ８１６１メラノーマにおけるリンパ管のファージ標的化：第１の標的としてＣ８１６１ヒトメラノーマを選択したが、これはヌードマウスにおいて、この細胞株を用いて作製した腫瘍の異種移植片が、乳癌ではリンパ管内皮細胞と結合する（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）ホーミングペプチド、ＬｙＰ−１によって認識されないリンパ管を含むためである。実験計画は、メラノーマ関連リンパ管に関して類似の特異性を有するリンパ管ホーミングペプチドが、同定され得るかどうかを調べることを目的とした。プロトコルは、腫瘍リンパ管を認識するペプチドを得る可能性を増大するよう改変した。ファージディスプレイライブラリーを、全Ｃ８１６１腫瘍組織の細胞懸濁液とともにインキュベートし、ファージが結合するのを可能にし、次いで、免疫磁性ビーズを用い、これらの細胞と結合している任意のファージに沿って運ばれるリンパ管内皮細胞を単離した。この濃縮ステップによって、非組換えファージよりも、単離細胞と２５０倍より効率的に結合するファージプールが得られた（図９Ａ）。濃縮されたファージプールを、その後のｉｎｖｉｖｏラウンドに用いて、Ｃ８１６１異種移植片腫瘍にホーミングするファージを選択した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの２ラウンドの選択によって、ファージの４０倍濃縮物が生じた（図９Ｂ）。試験された、それぞれの対照臓器では濃縮がなかった。
【０１７１】
ファージプール選択の第２のｉｎ  ｖｉｖｏラウンドから得た４８のファージクローンは、最高頻度と思われる５つのクローンを含んでおり、これらをさらに分析した。関連アミノ酸配列ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）およびＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）を有するペプチドをディスプレイする２つのクローンが、Ｃ８１６１腫瘍から調製した細胞懸濁液と結合し、より強い結合剤、ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）は対照ファージより１００倍多く結合した。Ｃ８１６１腫瘍を保有するヌードマウスへのファージの静脈注射は、両ファージとも腫瘍に選択的にホーミングし；ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）は、ＣＬＤＧＧＲＰＫＣ（配列番号５）の約２倍高効率であると示した（ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）の結果は図１Ａに示されている）。ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４）ペプチド（以下では、ＬＳＤとして言及される）をさらなる研究のために選択した。ＬＳＤファージのホーミング能力を立証することは、ディスプレイされるペプチド配列によるものであり、ペプチドをフルオレセインがコンジュゲートしているペプチドとして化学合成し、このコンジュゲートをＣ８１６１腫瘍マウスに静脈注射した。２時間循環させた後、腫瘍内においてこのペプチドが検出されたが、対照臓器においては検出されなかった。リンパ管マーカー、ポドプラニン、Ｐｒｏｘ−１、ＬＹＶＥ−１およびＶＥＧＦＲ３での組織切片の染色により、ＬＳＤ蛍光の、それらとの共局在化が示されたが（図１Ｃ）、血管マーカー、ＭＥＣＡ−３２およびＣＤ３１との共局在化はなかった。定量化により、ペプチドについて陽性であるリンパ管の８５％が、ポドプラニンについて同様に陽性であるということが示された
ＬＳＤファージの、その他の種類の癌、例えば、先に記載されたリンパ管ホーミングペプチド、ＬｙＰ−１によって認識されるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植片（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）へのホーミングをさらに調べた。静脈注射されたＬＳＤファージは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍に感知できるほどにはホーミングしなかった（下記参照のこと）。これらのデータは、ＬＳＤ−ペプチドが、Ｃ８１６１メラノーマにおいてリンパ管に選択的にホーミングするということを示す。
【０１７２】
ＦＩＴＣ−ＬＳＤ（１５０μｇ）を腫瘍マウスに静脈注射し、２時間循環させた。組織学的分析のために、腫瘍および種々の組織を採取し処理した。腎臓に、２、３のＬＳＤ蛍光のスポットが見られ、腫瘍を除く（図１Ｂ−Ｄ）、すべてのその他の組織は陰性であった。
【０１７３】
前癌性病変および前立腺の腫瘍におけるリンパ管ファージ標的化：腫瘍関連リンパ管は臓器特異的サインを有し得るという主張をさらに一般化するために探求し、ｄｅ  ｎｏｖｏ前立腺癌発生のＴＲＡＭＰトランスジェニックマウスモデルにおいてリンパ管ホーミングペプチドを選択した（Ｈｓｕら、１９９８）。このモデルでは、免疫組織化学分析法により、前癌性病変および腫瘍の両方と関連する豊富なリンパ管が示された。この系では、前癌性病変を評価することが可能であるので、このような病変のリンパ管を、十分に発達した腫瘍のものと識別する可能性も探究した。
【０１７４】
ＴＲＡＭＰモデルにおいて、十分に発達した腫瘍に選択的にホーミングするペプチドを単離するために、まず、ファージライブラリーを、正常前立腺由来の細胞懸濁液で前処理して、正常前立腺と結合するファージの存在量を減少させた。次いで、正常前立腺を取り去ったライブラリーを、２５〜２８週齢のＴＲＡＭＰマウスの腫瘍から免疫精製されたリンパ管内皮細胞での２ラウンドのｅｘ  ｖｉｖｏ選択によって濃縮した。３回のその後のｉｎ  ｖｉｖｏ選択ラウンドによって、腫瘍ホーミングについてほぼ５０倍濃縮を示すファージプールが得られた。５種のペプチド配列が、このプールにおいて２回以上表された。アミノ酸配列ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、ＣＳＭＳＡＫＫＫＣ（配列番号７）およびＣＫＴＲＶＳＣＧＶ（配列番号８）を有するこれらのファージクローンのうち３種が、腫瘍由来細胞懸濁液との強い結合を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらに試験した。静脈注射されたＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）ファージは、非組換えファージに対して、ＴＲＡＭＰ腫瘍において５０倍濃縮されることとなったが、その他の２種のファージは、約３０倍の濃縮を示した。ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（ＲＥＡ；配列番号６）をさらなる研究のために選択した。
【０１７５】
前癌性リンパ管を認識するペプチドをスクリーニングするために、まず、ファージライブラリーを、正常前立腺由来の細胞懸濁液で処理し、次いで、取り去ったライブラリーを、前癌性病変を含有する前立腺（１４〜１６週齢マウス）由来の免疫精製リンパ管内皮細胞懸濁液で濃縮した。逐次ｅｘ  ｖｉｖｏ選択によって、標的細胞との結合について６０倍濃縮されファージプールが得られ、その後のｉｎ  ｖｉｖｏ選択において前癌性病変を含む前立腺へのホーミングについての３０倍濃縮が得られた。配列決定された６４のクローン（第２のｅｘ  ｖｉｖｏラウンドおよび第３のｉｎ  ｖｉｖｏラウンドから各３２クローン）の間での頻繁な出現に基づくｉｎ  ｖｉｖｏホーミングの評価のために、５つのファージクローンを選択した。
【０１７６】
これらのうち、アミノ酸配列ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）を有する３つのクローンが、前癌性前立腺病変由来の細胞懸濁液と結合した。これらの候補を、ｉｎ  ｖｉｖｏで個別にさらに試験した。ファージによってディスプレイされたペプチドＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号９）、ＣＳＧＧＫＶＬＤＣ（配列番号１１）およびＣＡＳＬＳＣＲ（配列番号１０）は、非組換えファージと比べて、それぞれ、前癌性ＴＲＡＭＰ病変に対して２４、１４および１２倍の濃縮を示した。ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（ＡＧＲ；配列番号９）をさらなる研究のために選択した。
【０１７７】
ＲＥＡおよびＡＧＲペプチドの特異性を評価するために、ファージを前癌性病変または腫瘍のいずれかを用いてＴＲＡＭＰマウスに、または正常前立腺を用いて腫瘍のない（トランス遺伝子陰性）雄の同腹仔に静脈注射した。結果は、ＲＥＡファージは腫瘍にホーミングするが、前癌性病変または正常前立腺にはホーミングせず（図２Ａ）、ＡＧＲファージは前癌性病変にのみホーミングする（図２Ｂ）ということを示した。どちらのファージも、リンパ節、腎臓、肺、皮膚または胃を含めたその他の組織において、非組換え対照ファージよりも高いレベルで見られなかった。
【０１７８】
静脈注射後の、フルオレセインがコンジュゲートしたＲＥＡおよびＡＲＧペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ分布によって、ファージ結果が確認された。前立腺腫瘍に蓄積されたＲＥＡペプチドは、ポドプラニン陽性リンパ管と９０％の重複を示したが、前癌性病変、正常前立腺または対照臓器は陰性であった。ＡＧＲペプチドは、前癌性ＴＲＡＭＰ病変に選択的にホーミングしたが、前立腺腫瘍、正常前立腺組織において、または対照組織において見られるペプチドはほとんどまたは全くなかった。
【０１７９】
具体的には、前癌性前立腺組織および腫瘍組織を、それぞれ１４〜１６および２５〜２８週齢のＴＲＡＭＰマウスから得た。凍結切片を、ウサギ抗マウスＬＹＶＥ−１で染色することによってリンパ管を可視化し、ラット抗マウスＭＥＣＡ−３２で血管を染色した。フルオレセイン標識ＲＥＡペプチド（１５０μｇ）をＴＲＡＭＰ腫瘍マウスに静脈注射し、２時間後、組織学的分析のために腫瘍および種々の対照組織を採取した。ＦＩＴＣ−ＲＥＡは、皮膚、肺、胃または脳では検出されなかった。肝臓および腎臓は、ＴＲＡＭＰ腫瘍よりもかなり低いレベルの蛍光を含んでいた。フルオレセイン標識したＡＧＲペプチド（１５０μｇ）を、１４〜１６週齢のＴＲＡＭＰマウスに静脈注射し、２時間後、組織学的分析のために腫瘍および種々の対照組織を採取した。皮膚、肺、胃、脳または心臓では、ＦＩＴＣ−ＡＧＲは検出されなかった。腎臓は、前癌性病変よりもかなり低いレベルの蛍光を含んでいた。
【０１８０】
ＲＥＡおよびＡＲＧペプチドの、脈管構造との関連を研究するために、ファージまたはフルオレセイン標識されたペプチドを、ＴＲＡＭＰマウスに静脈注射し、ファージおよびペプチド局在を、抗体で位置が特定されるリンパ管および血管マーカーと比較した。ファージおよびその同族ペプチドは、それぞれの病変においてリンパ管マーカーポドプラニン、ＶＥＧＦＲ３、ＬＹＶＥ−１およびＰｒｏｘ−１との実質的な共局在化を各々示したが、その局在化は、血管マーカーＣＤ３１およびＭＥＣＡ−３２のものとは全く異なっていた。
【０１８１】
子宮頸癌中のリンパ管に対するホーミングペプチド：皮膚癌を発生するＫ１４−ＨＰＶ１６トランスジェニックマウスにおいて、異形成皮膚病変に対するホーミングペプチドを同定した（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３）。このペプチドＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号１７）は、乳癌においてリンパ管および腫瘍細胞を選択的に認識するＬｙＰ−１（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ；配列番号１６）と類似している（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２）。この類似性のために、ＣＮＲＲＴＫＡＧＣペプチド（ＬｙＰ−２；配列番号１７）も腫瘍リンパ管を認識するかどうかが問われた。ＬｙＰ−１およびＬｙＰ−２ペプチドを、Ｋ１４−ＨＰＶ１６マウスの皮膚および子宮頸癌において試験した。雌のＫ１４−ＨＰＶ１６マウスは、エストロゲンで処理すると、自発的に発生する皮膚癌に加え、子宮頸癌を発生する（Ａｒｂｅｉｔら、１９９６）。これらのマウス（Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２マウス）は、ヒト癌を模倣する様式の腫瘍の進行ステップを通して両臓器において腫瘍を発生する（Ａｒｂｅｉｔら、１９９６；Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９９６；Ｇｉｒａｕｄｏら、２００４）。これらのマウスの前癌性子宮頸部病変（頸部上皮内腫瘍、ＣＩＮとも呼ばれる）および腫瘍は、多量のリンパ管を含むことが、リンパ管マーカーの免疫染色によって検出された。
【０１８２】
ＬＹＶＥ−１陽性構造は、癌腫およびＣＩＮ−３病変の両方において見られた。別のリンパ管マーカー、Ｐｒｏｘ−１を用いて同様の結果が得られた。原倍率：１００×；挿入図、４００×。図１１Ｂは、Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２マウスにおいて、フルオレセイン標識されたＬｙＰ−２ペプチドが子宮頸癌にホーミングすることを示す。ＦＩＴＣ−ＬｙＰ−２ペプチド（１００μｇ）を、腫瘍保有マウスに静脈注射し、２時間後、組織学的分析のために組織を処理した。正常子宮頸部、皮膚、肝臓または脳では蛍光は、ほとんどまたは全く見られなかった。
【０１８３】
静脈注射されたＬｙＰ−２ファージは、子宮頸部において前癌性および悪性病変の両方に強いホーミングを示したが、正常子宮頸部にはホーミングしなかった（図３）。フルオレセイン標識されたＬｙＰ−２ペプチドはまた、子宮頸部病変において蓄積し、ＬＹＶＥ−１およびポドプラニンと共局在化した（８２％重複）が、ＭＥＣＡ−３２とは共局在化しなかった。さらに、間質中に散乱した細胞の偶発的病巣を標識したところ、いくつかの明らかな細胞内局在があったが、これらの細胞の正体は現在のところ未解決である。正常子宮頸部では、またはその他の対照組織では、リンパ管または非脈管細胞のいずれかにおいてペプチド蓄積は観察されなかった（図１１Ｂ）。ＬｙＰ−２はまた、雄および雌のマウスの皮膚において、異形成および扁平上皮癌と関連するリンパ管にホーミングしたが、正常皮膚リンパ管にはホーミングしなかった。
【０１８４】
種々の種類の腫瘍に対するリンパ管ホーミングペプチドの特異性：メラノーマ、前立腺または子宮頸部のリンパ管にホーミングするファージによってディスプレイされたペプチドを単離し、それらが腫瘍関連リンパ管脈管構造の共通の決定基または臓器／腫瘍選択的サインを認識したかどうかを問うた。これらのペプチドの起源および特異性は、表３に示されている。種々の腫瘍モデルに由来するリンパ管ホーミングペプチドを、その他の腫瘍のリンパ管を認識するその能力について試験した。静脈注射されたＬＳＤファージは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞株由来の異種移植腫瘍にホーミングしなかった（図４）。このファージはまた、乳房もしくは前立腺のトランスジェニックマウス腫瘍に、またはＰＰＣ１ヒト前立腺癌異種移植片に感知できるほどにホーミングせず、起こりうる低レベルのホーミングがトランスジェニック皮膚癌およびＫＲＩＢヒト骨肉種異種移植片に向けて見られた。フルオレセインで標識されたＬＳＤペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ注射と、それに続く、ペプチド分布の組織学的分析は、ファージ結果とよく一致した。Ｃ８１６１由来腫瘍、ペプチド選択されるモデルにおいて、強いＬＳＤペプチド蛍光が見られた。Ｃ８１６１腫瘍は、２種の異なる遺伝的背景を表すヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６）において陽性であった。ファージデータと一致して、ＫＲＩＢ腫瘍は、蛍光ペプチドについて弱い陽性であり、皮膚癌を含むその他の腫瘍は陰性であった。これらの結果は、ＬＳＤペプチドは、Ｃ８１６１メラノーマ由来腫瘍においてリンパ管を選択的に認識するということを示す。
【０１８５】
【表３−１】
2009525055.tif 000005
【０１８６】
【表３−２】
2009525055.tif 000006
ＴＲＡＭＰモデルにおいて同定された、ＲＥＡファージはまた、ヒト前立腺癌細胞株ＰＰＣ１、Ｍ１２、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰから得た細胞を、ヌードマウスに同所に播種することによって得られた異種移植片にホーミングした（図５Ａ）。これらの異種移植された腫瘍もまた、フルオレセインがコンジュゲートしたＲＥＡペプチドについて陽性であった。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｃ８１６１およびＫＲＩＢ異種移植片、ならびにＭＭＴＶ−ＰｙＭＴまたはＫ１４−ＨＰＶ１６マウスにおいて生じるｄｅ  ｎｏｖｏ乳癌および皮膚癌は、それぞれ、ＲＥＡ結合について陰性であった（図５Ａ）。Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２マウスの子宮頸部腫瘍は、ＲＥＡペプチド結合についてわずかに陽性であったが、前立腺腫瘍よりは著しく少ない。免疫組織化学分析法により、ＦＩＴＣ−ＲＥＡペプチドは、複数のヒト前立腺腫瘍由来細胞株から生じた同所前立腺腫瘍異種移植片においてリンパ管と共局在することが示された；このペプチドは、Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２子宮頸部腫瘍により少ない程度でホーミングした。興味深いことに、ＲＥＡファージは、ＰＰＣ１の皮下異種移植片に、同じ腫瘍細胞株の同所異種移植片よりも効率的にはホーミングしなかった（図１０Ａ）。ＲＥＡ−ファージは、ＰＰＣ１腫瘍由来細胞懸濁液と強力に結合したが、培養ＰＰＣ１細胞とは結合しなかった（図９Ｅ）。したがって、ＲＥＡは、前立腺癌リンパ管を主に認識すると思われる。
【０１８７】
組織切片のファージオーバーレイを用いることによって、ＲＥＡペプチドがヒト前立腺癌を認識するかどうかかも評価した。リンパ管マーカーＰｒｏｘ−１およびポドプラニンに対する抗体を用いる免疫組織化学的染色により、ヒト前立腺腫瘍において多量のリンパ管が示された。ＲＥＡファージを用いる、２種の原発性ヒト前立腺癌から得た組織切片のオーバーレイにより、このファージは、ヒト前立腺腫瘍のリンパ管を認識することが示された。ＡＧＲファージは、ヒト腫瘍切片と結合しなかった。
【０１８８】
種々の種類の前癌性病変における、ＡＧＲペプチドのホーミングペプチド特異性をプロファイリングするために、それぞれ前立腺新生物、子宮頸部新生物または乳房新生物を発生し、続いて、明らかな癌に進行する、３種のトランスジェニックマウスモデルを用いた：ＴＲＡＭＰ、Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ。ＡＧＲファージ（図２Ｂおよび５Ｂ）および蛍光ペプチドは両方とも、ＴＲＡＭ前悪性病変を好み、その他の２種のモデルでは、同様の病変または悪性腫瘍へのファージのホーミングはほとんどないか、ペプチドの検出可能なホーミングはなかった（図５Ｂ）。
【０１８９】
ＬｙＰ−１およびＬｙＰ−２は異なる特異性を有する：ＬｙＰ−１およびＬｙＰ−２ペプチドの同様のアミノ酸配列を考え、それらが両方とも腫瘍リンパ管と結合するという事実、それらの特異性を比較した。驚くベきことに、これらのペプチドは、異なる腫瘍を認識する。両ペプチドが、Ｋ１４−ＨＰＶ１６皮膚癌リンパ管にホーミングするが、ＬｙＰ−１ファージは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍にホーミングするが、子宮頸部腫瘍にはホーミングしないのに対し、反対のことがＬｙｐ−２に当てはまる（図６）。ファージは、正常子宮頸部にも、正常乳房にもホーミングしなかった。特異性においてこれらの相違を確認するために、一方のペプチドがフルオレセインコンジュゲートであり、もう一方がローダミンとコンジュゲートされているよう、逆もまた同様に、ペプチドを同時に注射した。両ＬｙＰ−２コンジュゲートが子宮頸部腫瘍にホーミングしたのに対し、ＬｙＰ−１コンジュゲートはどちらもそうではなかった。同じコンジュゲートを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスにおいて試験した場合には反対の結果が得られた。これらのデータは、異なる種類の腫瘍では、２種のＬｙＰペプチドについて異なる結合部位が存在するということを示す。
【０１９０】
ホーミングペプチド受容体候補の同定：ペプチドと相同な配列を含むタンパク質は、ペプチドによって認識される受容体の天然リガンドに相当し得る（Ｊｏｙｃｅら、２００３）。本明細書に記載されるペプチドを用いたデータベース検索によって、いくつかの相同性が示され（表４）、そのうちの１つ：ＬＳＤペプチドの、間質細胞由来の因子１（ＳＤＦ−１）またはＣＸＣＬ１２として知られるケモカインとの相同性は際立っていた（図７Ａ）。ＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＲ４受容体のリガンドである。２９３Ｔ細胞を、ＣＸＣＲ４  ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトすることによって、細胞が、偽のトランスフェクトされた細胞またはＶＥＧＦＲ２を用いてトランスフェクトされた細胞よりも１６倍より効率的にＬＳＤファージと結合可能となった（図７Ｂ）。対照として用いたＬｙＰ−１ファージは、ＣＸＣＲ４によってトランスフェクトされた細胞と結合しなかった。同族ＬＳＤペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＬＳＤファージの、ＣＸＣＲ４によってトランスフェクトされた細胞との結合を阻害した（図７Ｃ）。これらのデータは、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系は、ＬＳＤペプチドのＣ８１６１リンパ管との結合に関与しているということを示す。
【０１９１】
【表４】
2009525055.tif 000007
ペプチドの相同配列を含むマウスおよびヒトタンパク質を同定するために、ペプチドを、短いほぼ正確なマッチに関するオプションを用い、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースに対してＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索を用いることによって分析した。しかし、ＬＳＤ相同性（ＣＬＳＤＧＫ；配列番号２）は、プロ−ＣＸＣＬ１２のシグナルペプチド切断部位に及び、したがって、成熟ケモカインでは表されない（Ｎａｇａｓａｗａら、１９９４；Ｔａｓｈｉｒｏら、１９９３）。それにもかかわらず、ＣＸＣＲ４のトランスフェクションによる特定の結合能力の誘導により、このケモカイン受容体が、ＬＳＤリンパ管ホーミングペプチドの結合標的として直接的または間接的に関係していると見なされる。リンパ管ホーミングペプチドコンジュゲートは、腫瘍リンパ管を破壊する：血管の腫瘍にホーミングするペプチド、Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号１９）の、アポトーシス誘導性ペプチドとのコンジュゲートは、血管新生内皮細胞に対して選択的に細胞傷害性であり、実証可能な抗腫瘍活性を有する（Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。腫瘍リンパ管を認識するペプチドを用いて、それらのリンパ管を標的化できるかどうかを調べるために、ＲＥＡおよびＬＳＤペプチドを、Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号１９）とのコンジュゲートとして合成し、ＰＰＣ１またはＣ８１６１異種移植片を保有するマウスを全身治療した。
【０１９２】
ＲＥＡコンジュゲートを用いる治療は、ＰＰＣ１腫瘍において腫瘍リンパ管の数を低減させたのに対し、結合していない混合物は、ＰＢＳ対照と比較して効果がなかった（図８Ａ）。コンジュゲートは、腫瘍血管密度（図８Ａ）または腫瘍増殖（図８Ｂ）に対しては効果がなかった。同様のリンパ管密度の低減が、ＬＳＤコンジュゲートで治療されたＣ８１６１腫瘍マウスにおいて得られた。
【０１９３】
【数１】
2009525055.tif 000008
【０１９４】
【数２】
2009525055.tif 000009
【０１９５】
【数３】
2009525055.tif 000010
【０１９６】
【数４】
2009525055.tif 000011
【０１９７】
【数５】
2009525055.tif 000012
【０１９８】
【数６】
2009525055.tif 000013
【０１９９】
【数７】
2009525055.tif 000014
【０２００】
【数８】
2009525055.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
本明細書に組み込まれ、その一部を成す、付随する図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を示し、説明とともに、開示される方法および組成物の原理を明らかにするのに役立つ。
【図１】Ｃ８１６１メラノーマリンパ管を認識するホーミングペプチドを示す図である。ＬＳＤ−ファージのＣ８１６１異種移植片へのホーミング。Ｃ８１６１異種移植片腫瘍を保有するマウスに、ＬＳＤファージクローン（２×１０９ｐｆｕ）を静脈注射し、７分間循環させた。腫瘍および対照組織から回復されたファージ力価が示されている。Ｃ８１６１腫瘍組織におけるファージ蓄積は、正常組織においてよりも有意に高かった。正常組織に対してＰ＜０．０３、最大ファージ取込み、皮膚；（ｎ＝３）。
【図２】ＴＲＡＭＰマウスの前立腺において、病期特異的ペプチドによって、前癌性病変と腫瘍が識別され、病期特異的ペプチドがリンパ管と共局在化することを示す図である。腫瘍または前癌性病変を保有するＴＲＡＭＰマウスにおいて、また正常前立腺を有する、腫瘍のないＴＲＡＭＰマウスの同腹仔において、ＴＲＡＭＰ腫瘍（ＲＥＡ）への、またはＴＲＡＭＰ前癌性病変（ＡＧＲ）へのホーミングについてスクリーニングすることによって単離されたファージを個々に調べた。ＴＲＡＭＰマウスに、ファージまたはフルオレセインがコンジュゲートしているペプチドを静脈注射し、凍結組織切片におけるファージ力価測定または免疫組織化学によって、ファージの局在性を研究した。蛍光を調べることによって組織切片中のペプチドを検出した。ＲＥＡ−ファージ（Ａ）はＴＲＡＭＰ腫瘍に蓄積するのに対し、ＡＧＲファージ（Ｂ）は前癌性病変に選択的にホーミングする。腫瘍組織と前癌性組織の間の相違は、両ペプチドについて有意であった（Ｐ＜０．０１、ｎ＝３〜６）原倍率：４００×。
【図３】ＬｙＰ−２ペプチドが、Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２トランスジェニックマウスにおいて子宮頸部の前癌性病変および腫瘍中のリンパ管へホーミングすることを示す図である。ＬｙＰ−２ファージ（１．５×１０９ｐｆｕ）を、ＣＩＮ−３病変または子宮頸部の腫瘍を保有するマウスに静脈注射し、示された組織からのファージ力価を調べた。腫瘍および異形成病変において、正常子宮頸部よりも有意に多くのＬｙＰ−２ファージが蓄積した（Ｐ＜０．００５；ｎ＝３）。
【図４】ＬＳＤペプチドの腫瘍種特異性を示す図である。図１におけるように、ファージの、６種の腫瘍へのＩｎ  ｖｉｖｏホーミングを調べた（ｎ＝３〜６）。強いファージホーミングは、Ｃ８１６１腫瘍においてのみ観察された。ＫＲＩＢ異種移植片腫瘍は、ファージおよびペプチドホーミングについてわずかに陽性であったが、Ｃ８１６１腫瘍へのファージホーミングは、これまたはその他の腫瘍のいずれよりも有意に高かった（Ｐ＜０．００５）。
【図５】種々の種類の腫瘍および前癌性病変におけるＲＥＡおよびＡＧＲペプチドのホーミング特異性を示す図である。ＲＥＡ−ファージ（Ａ）の、１１種の腫瘍へのｉｎ  ｖｉｖｏホーミングを調べた（ｎ＝３〜６）。ＴＲＡＭＰマウスの前立腺腫瘍において、またＰＰＣ１、Ｍ１２、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰヒト前立腺癌異種移植片腫瘍において有意のファージホーミングが観察された。５種の前立腺癌のうち４種（ＤＵ１４５が例外であった）は、その他の種類の腫瘍よりも有意に多くのＲＥＡファージを蓄積した（Ｐ＜０．０３）。Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２マウスにおける子宮頸部腫瘍は、わずかに陽性であった。図５Ｂは、ＣＩＮ−３病変または腫瘍を有する、ＴＲＡＭマウス、Ｋ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２マウス（ｎ＝３）における、また異形成病変または乳房腫瘍を有するＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスにおける、静脈注射されたＡＧＲファージのｉｎ  ｖｉｖｏホーミングを示す。ＡＧＲファージは、ＴＲＡＭＰ前癌性病変に、その他の腫瘍モデルにおける匹敵する病変よりも有意に多くホーミングし（Ｐ＜０．０３）、ＴＲＡＭＰ病変は、ＡＧＲペプチドホーミングについて強度に陽性である。ＭＭＴＶＰｙＭＴ異形成乳房病変は、ＡＧＲペプチド結合について弱陽性である。
【図６】ＬｙＰ−１およびＬｙＰ−２ペプチドの腫瘍−ホーミング特異性の差異を示す図である。ＬｙＰ−１およびＬｙＰ−２ファージを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌異種移植片またはＫ１４−ＨＰＶ１６／Ｅ２腫瘍を保有するマウスに（ｎ＝３）静脈注射した。組織を採取し、２時間後、組織学的分析のために処理した。ＬｙＰ−１は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍にホーミングするが、ＬｙＰ−２は、子宮頸癌および前癌性病変にホーミングする。前癌性病変へのファージホーミングは、両モデルにおける対応する腫瘍よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。
【図７Ａ】ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を用いるトランスフェクションが、ＬＳＤペプチドの結合能力を増大させることを示す図である。図７Ａは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースに対してＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索することによって、プロ−ＣＸＣＬ１２の残基１７〜２２にＬＳＤペプチドとの相同領域が見られたことを示す。図７Ｂは、ＬＳＤファージが、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と結合するが、ＶＥＧＦＲ２または空ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞とは結合しないことを示す（Ｐ＜０．０１）。図７Ｃは、ＬＳＤペプチド（１５０μｇ／ｍｌ）が、ＬＳＤ−ファージの、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞との結合を阻害することを示す（Ｐ＜０．０３）。ＬＳＤ−ファージとともにＬＳＤペプチドを、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた細胞と同時インキュベートした。３回の別個の実験から得られた平均および標準偏差が示されている。
【図７Ｂ】ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を用いるトランスフェクションが、ＬＳＤペプチドの結合能力を増大させることを示す図である。図７Ａは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースに対してＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索することによって、プロ−ＣＸＣＬ１２の残基１７〜２２にＬＳＤペプチドとの相同領域が見られたことを示す。図７Ｂは、ＬＳＤファージが、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と結合するが、ＶＥＧＦＲ２または空ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞とは結合しないことを示す（Ｐ＜０．０１）。図７Ｃは、ＬＳＤペプチド（１５０μｇ／ｍｌ）が、ＬＳＤ−ファージの、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞との結合を阻害することを示す（Ｐ＜０．０３）。ＬＳＤ−ファージとともにＬＳＤペプチドを、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた細胞と同時インキュベートした。３回の別個の実験から得られた平均および標準偏差が示されている。
【図７Ｃ】ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を用いるトランスフェクションが、ＬＳＤペプチドの結合能力を増大させることを示す図である。図７Ａは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースに対してＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索することによって、プロ−ＣＸＣＬ１２の残基１７〜２２にＬＳＤペプチドとの相同領域が見られたことを示す。図７Ｂは、ＬＳＤファージが、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と結合するが、ＶＥＧＦＲ２または空ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞とは結合しないことを示す（Ｐ＜０．０１）。図７Ｃは、ＬＳＤペプチド（１５０μｇ／ｍｌ）が、ＬＳＤ−ファージの、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞との結合を阻害することを示す（Ｐ＜０．０３）。ＬＳＤ−ファージとともにＬＳＤペプチドを、ＣＸＣＲ４を用いてトランスフェクトされた細胞と同時インキュベートした。３回の別個の実験から得られた平均および標準偏差が示されている。
【図８】アポトーシス促進性ペプチドと連結しているホーミングペプチドを用いて、腫瘍関連リンパ管を標的化することを示す図である。ＰＰＣ１同所異種移植マウス（１０匹のマウス／群）を、１００μｇ／用量／マウス／隔週のＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２−ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号６）、当モル量のカップリングしていないペプチドで、またはビヒクル（ＰＢＳ）で全身治療した。終了時に、腫瘍重量を記録し、免疫組織化学分析用に凍結組織切片を調製した。Ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２−ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号４１）キメラペプチドは、腫瘍リンパ管数を大幅に減少させた（Ｐ＜０．０１）ことが、ポドプラニン染色から調べられた（Ａ）が、血管数（Ａ；ＭＥＣＡ−３２染色）および腫瘍容積（Ｂ）は影響を受けなかった。
【図９】Ｃ８１６１異種移植片腫瘍中のリンパ管へのペプチドホーミングについてのファージライブラリースクリーニングを示す図である。図９Ａは、ｅｘ  ｖｉｖｏ選抜を示す。ＣＸ７Ｃファージライブラリー（５×１０１０ｐｆｕ）を、Ｃ８１６１異種移植片腫瘍に由来する５×１０７個の細胞とともに、４℃で一晩インキュベートした。磁性ビーズ上に捕獲された抗マウスポドプラニンを用いて、リンパ管内皮細胞を単離した。リンパ管内皮細胞に結合されていたファージを救出し、その後のスクリーニングのために増幅させた。３ラウンドのｅｘ  ｖｉｖｏ選抜によって、非組換えファージを用いて得られたバックグラウンドと比較して、ファージが２５０倍濃縮された。図９Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ選抜を示す。３回目のｅｘ  ｖｉｖｏ選抜ラウンドから得られた濃縮されたファージプールを、Ｃ８１６１腫瘍マウスの尾静脈に注射した。腫瘍組織からファージを回収し、増幅させ、選抜を反復した。２回のｉｎ  ｖｉｖｏラウンドにおいて非組換えファージと比較して４０倍濃縮が得られた。
【図１０】ヌードマウスにおける、ＲＥＡファージの、同所対皮下異種移植ＰＰＣ１腫瘍へのホーミングの比較を示す図である。ＲＥＡファージ（５×１０９ｐｆｕ）を尾静脈によって腫瘍マウスに注射した。７分間循環させた後、結合しているファージを腫瘍および種々の対照臓器から回収し、力価測定した（同所対皮下腫瘍についてＰ＜０．０３；ｎ＝３）。図１０Ｂは、ＲＥＡ−ファージが、ＰＰＣ１腫瘍由来の細胞懸濁液と結合するが、培養ＰＰＣ１細胞とは結合しないことを示す。
【図１】
2009525055.tif 000016
【図２】
2009525055.tif 000017
【図３】
2009525055.tif 000018
【図４】
2009525055.tif 000019
【図５】
2009525055.tif 000020
【図６】
2009525055.tif 000021
【図７Ａ】
2009525055.tif 000022
【図７Ｂ】
2009525055.tif 000023
【図７Ｃ】
2009525055.tif 000024
【図８】
2009525055.tif 000025
【図９】
2009525055.tif 000026
【図１０】
2009525055.tif 000027
【配列表】
2009525055000001.app
【国際調査報告】
2009525055.tif 000028
2009525055.tif 000029
2009525055.tif 000030