(57)【要約】本発明は、乳癌において増加する唾液タンパク質およびＲＮＡ因子を初めて同定するものである。それゆえ、本発明は、唾液中の癌抗原（タンパク質およびＲＮＡ）を調べることによる、乳癌についての診断方法および予後判定を実施する方法を提供する。例えば、被験体における乳癌を診断する方法であって、該方法は、（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーを特異的に検出するアッセイを用いて該被験体由来の唾液試料を分析する工程；ならびに（ｂ）該マーカーが該試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程；を包含することにより乳癌の診断を与える、方法が提供される。
2009510395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における乳癌を診断する方法であって、該方法は、
（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーを特異的に検出するアッセイを用いて該被験体由来の唾液試料を分析する工程；ならびに
（ｂ）該マーカーが該試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程；
を包含することにより乳癌の診断を与える、方法。
【請求項２】
前記アッセイがタンパク質を検出し、該アッセイがＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫組織化学または質量分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アッセイが核酸を検出し、該アッセイが質量分析、ＰＣＲ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、熱サイクル配列決定、キャピラリーアレイ配列決定または固相配列決定である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アッセイが、タンパク質に結合する試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試薬がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイが、核酸に結合する試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬は核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試薬はオリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬はＲＴ−ＰＣＲプライマーセットである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫組織化学、質量分析である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
ＶＥＧＦおよびＥＧＦを特異的に検出するアッセイを用いて、前記被験体由来の唾液試料を分析し、ＶＥＧＦおよびＥＧＦのタンパク質が該試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーがＶＥＧＦのタンパク質またはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーがＥＧＦのタンパク質またはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーがＣＥＡタンパク質またはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
乳癌についての予後判定を与える方法であって、該方法は、
（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーを特異的に検出するアッセイを用いて該被験体由来の唾液試料を分析する工程；ならびに
（ｂ）該マーカーが該試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程；
を包含することにより乳癌についての予後判定を与える、方法。
【請求項１７】
前記アッセイがタンパク質を検出し、該アッセイがＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫組織化学または質量分析である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アッセイが核酸を検出し、該アッセイが質量分析、ＰＣＲ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、熱サイクル配列決定、キャピラリーアレイ配列決定または固相配列決定である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アッセイが、タンパク質に結合する試薬を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記試薬が抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試薬がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試薬が核酸に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記試薬が核酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬はオリゴヌクレオチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬はＲＴ−ＰＣＲプライマーセットである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＣＥＡのタンパク質が前記唾液試料中で発現されているか否かを、ＥＬＩＳＡを用いて判定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ＶＥＧＦおよびＥＧＦを特異的に検出するアッセイを用いて前記被験体由来の唾液試料を分析し、ＶＥＧＦおよびＥＧＦのタンパク質が該試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記マーカーがＶＥＧＦのタンパク質またはＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記マーカーがＥＧＦのタンパク質またはＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記マーカーがＣＥＡのタンパク質またはＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
乳癌に対する治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーを特異的に検出する検定を用いて該被験体由来の唾液試料を分析する工程；ならびに
（ｂ）該マーカーが該試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程、
を包含することにより乳癌に対する治療の有効性をモニタリングする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、仮出願ＵＳＳＮ６０／７１７，１５４（２００５年９月１４日出願）に対する優先権を主張する。仮出願ＵＳＳＮ６０／７１７，１５４は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下で行われた発明の権利に関する記載）
この発明は、政府の支援によりＮＩＨ／ＮＩＤＣＲ認可番号第ＵＯ１  ＤＥ  １５０１８号および同第ＵＯ１  ＤＥ  １６２７５号の下で行われた。政府は、この発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
乳癌は、アメリカ人女性において最も一般的な形態の癌であり、癌死亡の２番目の死因である。２００４年には、およそ２１５，９９０人の女性および１，５００人の男性が浸潤性乳癌と診断され、４０，５８０人がこの疾患によって亡くなったと見積もられた（非特許文献１）。早期検出が年齢調節乳癌死亡率を僅かに減少させると信じられている。しかしながら、身体検査および乳房Ｘ線像を含む、乳癌についての現在の標準的な診断／スクリーニング試験は完全ではないため、早期検出を改良する新規な方法の開発に関する研究が盛んに行われている。
【０００４】
現在の臨床診療では、広範囲の疾患の評価または再発性乳癌の検出にＣＥＡ（癌胎児性抗原）およびＣＡ１５−３またはＣＡ２７−２９等の血清腫瘍マーカーを用いているが、新たな乳癌の検出には用いられていない（非特許文献２）。多くの研究者は、プロテオミクスまたはＤＮＡ／ＲＮＡアレイ等の新たな技術を多数用いて、血液中に新規なマーカーを発見している（非特許文献３〜４）。唾液は容易に入手可能な体液源であるが、唾液を研究しようとする試みが行われることはほとんどなかった。我々は、唾液中の血管新生および腫瘍マーカーのプロファイルが現在乳癌診断に用いられる方法を補うことができると仮定した。この研究では、我々は、特定の成長／腫瘍マーカーのレベルが乳癌と相関するか否かを判定しようと試みた。我々は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）およびＥＧＦ（上皮増殖因子）を研究した。なぜなら、それらが強力な血管新生因子であるからであり、成功裏に標的化された治療剤は、ＦＤＡによって既に認可されているか（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｔａｒｃｅｖａ等）または臨床試験を行っている途中であるかのいずれかである（非特許文献５〜６）。我々はまた、乳癌についてのよく確立された血清腫瘍マーカーであるＣＥＡについても測定を行った。我々は、乳癌患者においては、正常対照と比較して唾液中の上記タンパク質レベルが上昇していることを観察した。
【非特許文献１】Ｗｏｏｄ  ＷＣ，Ｍｕｓｓ  ＨＢ，Ｓｏｌｉｎ  ＬＪ，Ｏｌｏｐａｄｅ  ＯＩ．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ．Ｉｎ：ＤｅＶｉｔａ  ＶＴ，Ｈｅｌｌｍａｎ  Ｓ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｔ  ＳＡ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；２００５．ｐ．１４１５−７７．
【非特許文献２】Ｃｈｅｕｎｇ  ＫＬ，Ｇｒａｖｅｓ  ＣＲ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＪＦ．Ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ２０００；２６：９１−１０２．
【非特許文献３】Ｐｏｓａｄａｓ  ＥＭ，Ｓｉｍｐｋｉｎｓ  Ｆ，Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ  Ｃ，Ｋｏｈｎ  ＥＣ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ−  ｒｅａｌｉｓｔｉｃ  ｈｏｐｅ？  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５；１６：１６−２２．
【非特許文献４】Ａｎｋｅｒ  Ｐ，Ｍｕｌｃａｈｙ  Ｈ，Ｓｔｒｏｕｎ  Ｍ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｓ  ａ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ？  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；１０３：１４９−５２．
【非特許文献５】Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ  Ｆ，Ｈｕｒｗｉｔｚ  ＨＩ，Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  ＩＩ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  （ＦＵ）／ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ  （ＬＶ）  ｗｉｔｈ  ＦＵ／ＬＶ  ａｌｏｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；２１：６０−５．
【非特許文献６】Ｂｙｒｎｅ  ＢＪ，Ｇａｒｓｔ  Ｊ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２００５；７：２４１−７．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の簡単な要旨）
１つの局面では、本発明は、被験体における乳癌を診断する方法であって、（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーに特異的に結合する試薬と、被験体由来の唾液試料を接触させる工程；ならびに（ｂ）このマーカーが試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程、を包含することにより乳癌の診断を与える、方法を提供する。
【０００６】
別の局面では、本発明は、乳癌の予後判定を与える方法であって、（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーに特異的に結合する試薬と、被験体由来の唾液試料を接触させる工程；ならびに（ｂ）このマーカーが試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程、を包含することにより乳癌の予後判定を与える、方法を提供する。
【０００７】
別の局面では、本発明は、乳癌に対する治療の有効性をモニタリングする方法であって、（ａ）ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの核酸、ならびにＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦのポリペプチドからなる群から選択されたマーカーを特異的に検出するアッセイを用いて被験体由来の唾液試料を分析する工程；ならびに（ｂ）このマーカーが試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程、を包含することにより乳癌に対する治療の有効性をモニタリングする、方法を提供する。
【０００８】
１つの実施形態では、このアッセイは、タンパク質に結合する試薬を含む。別の実施形態では、このアッセイは抗体である試薬を含む。別の実施形態では、この試薬はモノクローナル抗体である。
【０００９】
１つの実施形態では、この試薬は核酸に結合する。別の実施形態では、この試薬は核酸である。別の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、試薬はＲＴ−ＰＣＲプライマーセットである。
【００１０】
１つの実施形態では、このアッセイはタンパク質を検出し、このアッセイはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫組織化学または質量分析である。別の実施形態では、このアッセイは核酸を検出し、このアッセイは質量分析、ＰＣＲ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、熱サイクル配列決定、キャピラリーアレイ配列決定または固相配列決定である。
【００１１】
１つの実施形態では、ＶＥＧＦおよびＥＧＦを特異的に検出するアッセイを用いて、被験体由来の唾液試料を分析し、ＶＥＧＦおよびＥＧＦタンパク質が試料中で過剰発現されているか否かを判定する工程を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
序論
我々は今や、ヒト乳癌に関して唾液試料中のＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＥＧＦ、およびそれらの組み合わせ（ＶＥＧＦとＥＧＦ、ＶＥＧＦとＣＥＡ、ＣＥＡとＥＧＦ、およびＶＥＧＦとＣＥＡとＥＧＦ等）の診断的／予後的な意義を実証した。タンパク質またはＲＮＡのいずれもが唾液中で検出され得る。それゆえ、唾液中でのこれらおよび他の癌抗原の検出は、乳癌および他の癌の診断および予後判定に有用である。早期診断に関しては、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲまたは質量分析等の技術を単独で、またはＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９等の他のマーカーと組み合わせて用いることにより、唾液中の癌抗原（タンパク質および当該タンパク質をコードするＲＮＡ）を調べることができる。抗体、受容体、リガンド、ＲＴ−ＰＣＲ等の任意の特異的プローブを検出に用いることができる。質量分析もタンパク質の検出に用いることができる。このように、本発明を単独でまたは従来の抗原分析を補うものとして用いて乳癌および他の癌の診断を強化することができる。
【００１３】
本発明はまた、ヒト乳癌用血清試料におけるＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＥＧＦ、およびそれらの組み合わせ（ＶＥＧＦとＥＧＦ、ＶＥＧＦとＣＥＡ、ＣＥＡとＥＧＦ、およびＶＥＧＦとＣＥＡとＥＧＦ等）の診断的／予後的な意義も提供する。タンパク質またはＲＮＡのいずれをも唾液中で検出し得る。それゆえ、唾液中でのこれらおよび他の癌抗原の検出は、乳癌および他の癌の診断および予後判定に有用である。早期診断に関しては、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲまたは質量分析等の技術を単独で、またはＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９等の他のマーカーと組み合わせて用いることにより、唾液中の癌抗原（タンパク質および当該タンパク質をコードするＲＮＡ）を調べることができる。抗体、受容体、リガンド、ＲＴ−ＰＣＲ等の任意の特異的プローブを検出に用いることができる。質量分析もタンパク質の検出に用いることができる。このように、本発明を単独でまたは従来の抗原分析を補うものとして用いて乳癌および他の癌の診断を強化することができる。
【００１４】
一般に、上記方法は、特に、乳癌および他の癌の診断または予後判定での用途が見出される。唾液は容易に入手可能な体液源であるが、その癌診断における価値を研究しようとする試みが行われることはほとんどなかった。我々は、特定のタンパク質およびＲＮＡが乳癌患者の唾液中で増加すると仮定した。さらに、乳癌患者におけるタンパク質およびＲＮＡの増加は、無病生存率、全生存率、および転移性癌を含めた予後不良と関連する。
【００１５】
我々の研究には４９人の健常人および４９人の乳癌患者が参加した。唾液中における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ウィルコクソン検定および多重線形回帰モデルを用いて乳癌と唾液ペプチドとの関連性を評価し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線により予測力を分析した。
【００１６】
唾液タンパク質のレベルは癌患者において次のように著しく上昇した：１）ＶＥＧＦ：癌において３．７±１．６に対して、対照において２．１＋１．２ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０００１）；２）ＥＧＦ：３．７±１．７に対して２．１±１．３ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０００１）；および３）ＣＥＡ：８３±３１に対して６６．１±２７．１ｎｇ／ｍｌ（ｐ＝０．０１０６）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、それぞれ、８０％、７７％、および６５％であった。本研究における最良予測は、感度８３％、特異性７４％、およびＡＵＣ８４％で、唾液のＶＥＧＦとＥＧＦの組み合わせで得られた。
【００１７】
定義
「ＶＥＧＦ」、「ＣＥＡ」、および「ＥＧＦ」とは、以下である核酸（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ）、ならびにポリペプチド、多型改変体、対立遺伝子、変異体、および種間ホモログをいう：（１）好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００個またはそれより多くのアミノ酸からなる領域にわたって、参照核酸によってコードされたポリペプチドまたは本明細書中に記載のアミノ酸配列に対して約６０％のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、またはそれよりも大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）参照アミノ酸配列、その免疫原性フラグメント、およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体（例えば、ポリクロナール抗体）に特異的に結合する；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照アミノ酸配列をコードする核酸およびその保存的に改変された改変体と特異的にハイブリダイズする；（４）好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００個またはそれより多くのヌクレオチドからなる領域にわたって、参照核酸配列に対して約９５％よりも高い、好ましくは、約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類（例えば、ヒト）；げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは任意の哺乳類を含むがこれらに限定されない哺乳類に由来するものである。本発明の核酸およびタンパク質は、天然に存在する分子および組み換え分子の両方を包含する。ＶＥＧＦのタンパク質配列は、例えば、アクセッション番号ＮＰ＿００１０２０５３７号により提供され；ＥＧＦのタンパク質配列は、例えば、アクセッション番号ＮＰ＿９５８４３９号により提供される。ＣＥＡのタンパク質配列は、例えば、アクセッション番号ＣＡＡ４４０７６号により提供される。これらの抗原の切断型および選択的スプライス型は定義に含まれる。
【００１８】
「癌」とは、固形癌およびリンパ癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、および肝臓癌（肝細胞癌、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫、および大細胞リンパ腫）およびホジキンリンパ腫を含む）、白血病、および多発性骨髄腫を含む、ヒトの癌および癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病等をいう。
【００１９】
「治療処置」および「癌療法」とは、化学療法、ホルモン療法、放射線療法、および免疫療法をいう。
【００２０】
「過剰発現する」、「過剰発現」または「過剰発現された」という用語は、相互互換的に、正常細胞と比較して、（通常は癌細胞内で）検出可能により高いレベルで転写または翻訳されるタンパク質をいう。この用語は、正常細胞と比較したときの、転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、細胞局在（例えば、細胞小器官、細胞質、細胞核、細胞表面）、ならびにＲＮＡおよびタンパク質安定性による過剰発現を含む。過剰発現は、ｍＲＮＡを検出するための従来技術（すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション）またはタンパク質を検出するための従来技術（すなわち、ＥＬＩＳＡ、免疫組織学化学的技術、質量分析）を用いて検出できる。過剰発現は、正常細胞と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超えるものであり得る。特定の場合には、過剰発現は、正常細胞と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍またはそれよりも高いレベルの転写または翻訳である。
【００２１】
「癌関連抗原」または「腫瘍特異性マーカー」もしくは「腫瘍マーカー」という用語は、正常細胞と比較して、細胞内で発現されるか、癌細胞の表面で発現されるか、または癌細胞により分泌される、癌の診断、予後判定、および癌細胞に対する薬剤の優先的ターゲッティングに有用な分子（典型的には、タンパク質またはＲＮＡ等の核酸）を相互互換的にいう。しばしば、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞内で過剰発現（例えば、正常細胞と比較して１倍過剰発現、２倍過剰発現、３倍過剰発現またはそれより高く過剰発現）される細胞表面分子である。しばしば、癌関連抗原は、癌細胞内で不適切に合成される細胞表面分子（例えば、正常細胞上で発現される分子と比較して欠失、付加または変異を含む分子）である。しばしば、癌関連抗原は、癌細胞の細胞表面上でもっぱら発現され、正常細胞の表面では合成も発現もされない。例示される細胞表面腫瘍マーカーとしては、乳癌についてのタンパク質ｃ−ｅｒｂＢ−２およびヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）、前立腺癌についてのＰＳＭＡ、ならびに乳癌、卵巣癌および結腸直腸癌を含む多くの癌における炭水化物ムチンが挙げられる。
【００２２】
マーカーを単独で用いてもよく、または本明細書中に開示の用途（例えば、メラノーマ診断または予後判定）のいずれかについての他のマーカーと組み合わせて用いてもよいことが当業者によって理解される。
【００２３】
「生物学的試料」は、生検試料および剖検試料等の組織の切片、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片を包含する。そのような試料としては、血液および血液分画または血液製剤（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球等）、痰、組織、培養細胞（例えば、初代培養物、外植片、および形質転換細胞）、大便、尿等が挙げられる。生物学的試料は、典型的には、真核生物、最も好ましくは、哺乳類（例えば、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）；ウシ；イヌ；ネコ；げっ歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス）；ウサギ）またはトリ；爬虫類；もしくは魚類から得られる。
【００２４】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の同じ配列もしくは部分配列をいうか、あるいは後述するデフォルトのパラメータでＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いるか、または手動によるアラインメントおよび目視検査（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照されたい）により測定したときに特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）または指定領域にわたって最大対応になるように比較およびアラインメントした場合、特定の領域にわたって約６０％同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性）の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列もしくは部分配列をいう。そして、そのような配列を「実質的に同一」と呼ぶ。この定義はまた、テスト配列のコンプライメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）をいうか、またはそれに適用され得る。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。後述するように、好適なアルゴリズムはギャップ等を計上し得る。好ましくは、同一性は、少なくともアミノ酸またはヌクレオチド約２５個分の長さの領域、より好ましくは、アミノ酸またはヌクレオチド５０〜１００個分の長さの領域にわたって存在する。
【００２５】
配列比較については、典型的には、１つの配列が、テスト配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト配列および参照配列をコンビュータに入力し、部分配列座標を必要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、既定のプログラムパラメータを用いるか、または代替的なパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００２６】
本明細書中において用いる場合、「比較ウインドウ」は、２０〜６００、一般的には、約５０〜約２００個、より一般的には、約１００〜約１５０個からなる群から選択された数連続する位置のいずれか１つのセグメントに対する参照であって、２つの配列を最適にアラインメントした後、１つの配列を同数の連続位置の基準配列に対して比較可能である参照を含む。比較のために配列アラインメントを行う方法は当該分野では周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，ＰＲＯＣ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンビュータインプリメンテーションによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動によるアラインメントおよび目視検査によって（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７−２００５，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照されたい）行うことができる。
【００２７】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に適したアルゴリズムの好適な例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書中に記載のパラメータとともに、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために用いられる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公然と入手可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列内の長さがＷの短いワードであって、データベース配列内の同じ長さのワードとアライメントした際に、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすワードを特定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記参照）。これら最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットは、累積アライメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対の一致残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対する罰則スコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコア行列を用いて累積スコアを算出する。累積アライメントスコアが最高到達値から数量Ｘだけ低下した場合；負のスコアを有する残基アライメントが１つ以上累積したことにより累積スコアが０以下になった場合；またはいずれかの配列の最後に達した場合には、各方向におけるワードヒットの伸長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、既定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３および期待値（Ｅ）１０を既定値として用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＲＯＣ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を既定値として用いる。
【００２８】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖または二本鎖の形態のポリマー、ならびにそれらの相補体をいう。この用語は、合成、天然由来、および非天然由来のものであって、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を有する核酸を含む。そのような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホン酸メチル、キラルホスホン酸メチル、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換物）および相補配列を、明示した配列とともに、暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択した（または全ての）コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと相互互換的に用いられる。
【００３０】
特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」、および癌抗原の切断型をコードする核酸配列を暗黙のうちに含む。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス変異または切断型によってコードされたあらゆるタンパク質を暗黙のうちに含む。「スプライス改変体」は、その名前が示唆するように、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。異なる（代替の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするように、転写後に最初の核酸転写産物をスプライスしてもよい。スプライス改変体を産生する仕組みは異なるが、エキソンの選択的スプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸から派生した代替のポリペプチドもこの定義に含まれる。スプライス産物の組み換え型を含むスプライシング反応によるあらゆる産生物がこの定義に含まれる。核酸は、５’末端または３’末端で切断され得る。ポリペプチドは、Ｎ末端側終端部またはＣ末端側終端部で切断され得る。切断されたバージョンの核酸配列またはポリペプチド配列は、天然に存在してもよく、または組み換えにより作製されてもよい。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうように本明細書中において相互互換的に用いられる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然由来のアミノ酸ポリマーおよび非天然由来のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００３２】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合しているα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。そのような類似体は、修飾されたＲ基を有する（例えば、ノルロイシン）かまたは修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物をいう。
【００３３】
本明細書中において、アミノ酸は、一般に知られる３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかで言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられた１文字コードで言及され得る。
【００３４】
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンによって指定される全ての位置で、このコドンを、コードしたポリペプチドを変更することなく記述された対応するコドンのいずれかへと変更し得る。そのような核酸バリエーションは、保存的に改変されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」である。本明細書中のポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列はまた、この核酸の可能なサイレントバリエーションのすべてを記述する。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変することにより機能的に同一の分子を得ることができることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、発現産物に対しては記載された各配列において暗示的であるが、実際のプローブ配列に対しては暗示的でない。
【００３５】
アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされる配列内の単一のアミノ酸または低い百分率のアミノ酸を変更、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、変更によりあるアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸とが置換された「保存的に改変された改変体」であることを認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的な置換表は当該分野では周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えてのものであり、それらを除外しない。
【００３６】
以下の８つのグループの各々は、相互に保存的に置換されるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
【００３７】
「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的な手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度が高い試薬、酵素（例えば、一般にＥＬＩＳＡで用いられるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または、例えば、ペプチドに放射性標識を組み込むことにより検出可能にすることができるかもしくはペプチドと特異的に反応する抗体の検出に用いることができる、ハプテンおよびタンパク質が挙げられる。
【００３８】
「組み換え」という用語は、例えば、細胞または核酸、タンパク質またはベクターを参照して用いた場合、この細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更により改変されているか、またはこの細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。よって、例えば、組み換え細胞は、その細胞の天然（非組み換え）型では見られない遺伝子を発現するか、そうでなければ異常に発現されるか、過少発現されるかもしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００３９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、典型的には、核酸の複雑な混合物中で、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なったものである。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きがＴｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度のｐＨでは、特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）濃度下で）標的と相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列とハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡して占有される）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤を添加することにより達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、正のシグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は次のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳで４２℃にてインキュベートするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃にてインキュベートして、６５℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄する。
【００４０】
コードするポリペプチドが実質的に同一であれば、ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸であっても、それらは実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号で許容される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例としては、３７℃にて４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳのバッファー中でのハイブリダイゼーション、および４５℃にて１×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。正のハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して同様のストリンジェンシーの条件を提供し得ることを容易に認識する。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなるガイドラインが多数の参考文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（上記参照）において提供される。
【００４１】
ＰＣＲに関しては、低ストリンジェントな増幅には約３６℃の温度が代表的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃〜４８℃の間で変化してもよい。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅に関しては、約６２℃の温度が代表的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて、約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅の両方について典型的なサイクル条件としては、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間続くアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間の伸長相が挙げられる。低ストリンジェンシー増幅反応および高ストリンジェンシー増幅反応のプロトコルおよびガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓら、（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）において提供される。
【００４２】
「抗体」とは、抗原を特異的に結合して認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドをいう。認識された免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する、γ、μ、α、δまたはεに分類される。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性に最も重要である。
【００４３】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００４４】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによる消化によって産生された多数の充分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。よって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と連結した軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏和な条件下で還元されてヒンジ領域内のジスルフィド結合を壊すことにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３を参照されたい）。種々の抗体フラグメントはインタクトな抗体の消化に関して規定されるが、当業者は、そのようなフラグメントを、化学的にまたは組み換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成してもよいことを理解する。よって、本明細書中において用いる場合、抗体という用語は、抗体全体の改変によって産生された抗体フラグメント、または組み換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成された抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体フラグメントも包含する（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照されたい）。
【００４５】
例えば、組み換え抗体、モノクローナル抗体またはポリクロナール抗体等の抗体の調製には、当該分野で公知の多くの技術を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）の７７〜９６ページ；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；およびＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）を参照されたい）。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローン化することができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローン化し、組み換えモノクローナル抗体を産生するために用いられ得る。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーは、ハイブリドーマまたは形質細胞からも作製され得る。重鎖および軽鎖の遺伝子産物を無作為に組み合わせることにより、異なる抗原特異性を有する大規模な抗体プールが作製される（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版、１９９７）を参照されたい）。本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために、単鎖抗体または組み換え抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を適合させることができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳類等の他の生物体を用いてヒト化抗体またはヒト抗体を発現してもよい（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原と特異的に結合する、抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）を参照されたい）。抗体はまた、二重特異性、すなわち、２つの異なる抗原を認識可能にすることができる（例えば、ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭ��Ｏ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）；およびＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照されたい）。抗体はまた、ヘテロ結合体、例えば、共有結合により結合された２つの抗体、またはイムノトキシンとすることができる（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；およびＥＰ０３０８９を参照されたい）。
【００４６】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化する方法は当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と呼ばれ、これは、典型的には、移入可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って、対応するヒト抗体の配列をげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することにより行われ得る（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい）。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に決してインタクトではないヒト可変ドメインが人以外の種に由来する対応配列により置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実用的には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体である。
【００４７】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部が変更、置換、または交換されてその結果、抗原結合部位（可変領域）が異なるかまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を与える完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物等）と結合した抗体分子であるか；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が変更されるか、異なるかまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で置換または交換された抗体分子である。
【００４８】
１つの実施形態では、上記抗体は、「エフェクター」部分と接合される。エフェクター部分は、放射性標識もしくは蛍光標識等の標識部分を含む任意数の分子か、または治療部分であり得る。１つの局面では、上記抗体は、タンパク質の活性を調節する。
【００４９】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」またはタンパク質もしくはペプチドについて言及する際に「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、しばしば、タンパク質および他の生体物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の不均一集団においてタンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。よって、指定された免疫アッセイ条件下において、特定された抗体が、バックグラウンドの少なくとも２倍で、より典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍で特定のタンパク質と結合する。そのような条件下での抗体との特異結合には、その特定のタンパク質に対する特異性について選択された抗体が必要である。例えば、ポリクロナール抗体を選択することにより、選択した抗原には特異的に免疫反応性であるが、他のタンパク質には免疫反応性ではないポリクロナール抗体のみを得ることができる。この選択を、他の分子と交差反応する抗体を除外することにより達成してもよい。種々の免疫アッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応を示す抗体を選択してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを慣用的に用いて、タンパク質に特異的に免疫反応を示す抗体を選択する（特異免疫学的反応性を判定するために使用可能な免疫アッセイフォーマットおよび条件の記載に関しては、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。
【００５０】
診断法および予後判定法
本発明は、野生型、切断型または選択的スプライス型を含む、唾液試料中のＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦまたはそれらの組み合わせ等の癌抗原（タンパク質、または当該タンパク質をコードするＲＮＡのいずれか）を検査することにより癌を診断する方法を提供する。診断は、患者において本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルを決定して、そのレベルと基準線または範囲とを比較することを伴う。典型的には、基準線値は、癌を患っていない健常人における本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに典型的な値であって、唾液または血清もしくは血液等の他の生物学的試料を用いて測定された値である。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの基準線範囲からの変動（上方または下方のいずれか）は、その患者が癌を有するか、または癌を発症する危険性があることを示す。
【００５１】
本明細書中において用いる「予後判定を与える」という用語は、転移、無病生存率、全生存率等の予測を含め、乳癌等の癌の考え得る経過および結果の予測を与えることをいう。これらの方法を用いて、例えば、癌がまだ早期の病期にあるか否か、または積極的療法の効果がない病期まで癌が進行しているかどうかを示すことにより癌治療に適した療法を案出することにも用いることができる。
【００５２】
アッセイにおいて抗体試薬を用いて、当業者に公知の多数の免疫アッセイのいずれかを用いて患者試料におけるＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの発現レベルを検出することができる。免疫アッセイ技術およびプロトコルは、ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ，”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｒｏｖｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，１９９７；およびＧｏｓｌｉｎｇ，”Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００において一般に記載されている。競合的免疫アッセイおよび非競合的免疫アッセイを含む種々の免疫アッセイ技術を用いることができる。例えば、Ｓｅｌｆら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：６０−６５（１９９６）を参照されたい。免疫検定という用語は、酵素増幅免疫測定法（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡ）、および微粒子酵素免疫アッセイ（ＭＥＩＡ）等の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）；キャピラリー電気泳動免疫アッセイ（ＣＥＩＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）；蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）；および化学発光アッセイ（ＣＬ）を含むがこれらに限定されない技術を含む。所望であれば、そのような免疫アッセイを自動化することができる。免疫アッセイをレーザー誘起蛍光法とともに用いることもできる。例えば、Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：２１８４−９３（１９９７）；Ｂａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６９９：４６３−８０（１９９７）を参照されたい。フローインジェクションリポソーム免疫アッセイおよびリポソーム免疫センサー等のリポソーム免疫アッセイも本発明での使用に適している。例えば、Ｒｏｎｇｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０４：１０５−１３３（１９９７）を参照されたい。さらに、タンパク質／抗体複合体の形成により光散乱が増加し、それがマーカー濃度の関数としてピーク速度シグナルに変換される比濁アッセイは、本発明の方法での使用に適している。比濁アッセイは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，ＣＡ；Ｋｉｔ＃４４９４３０）により市販されており、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｉｎｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：２６１−２７６（１９８９））を用いて行うことができる。
【００５３】
核酸への抗体の特異的免疫結合は、直接または間接的に検出することができる。直接標識は、抗体に付着させた、蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性核種などを含む。ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）で標識した抗体を用いることができる。核酸に特異的な化学発光抗体を用いる化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度非放射性検出に適している。蛍光色素で標識した抗体も適している。蛍光色素の例としては、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、およびリサミンが挙げられるがこれらに限定されない。間接標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等、当該分野で周知の種々の酵素を含む。例えば、４５０ｎｍで検出可能な過酸化水素の存在下で可溶性生成物を生じる発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ検出系を用いることができる。例えば、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生じる発色性基質ｐ−ニトロフェニルリン酸塩とともにアルカリホスファターゼ検出系を用いることができる。同様に、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生じる発色性基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともにβ−ガラクトシダーゼ検出系を用いることができる。尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等の基質とともにウレアーゼ検出系を用いることができる。
【００５４】
直接標識または間接標識からのシグナルは、例えば、分光光度計を用いた発色性基質からの色検出；１２５Ｉ検出用γ線測定器等の放射線測定器を用いた放射線検出；または蛍光計を用いた特定の波長の光の下での蛍光発光検出により分析できる。酵素結合抗体の検出には、ＥＭＡＸ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）等の分光光度計を製造者の指示に従って用いることにより定量分析を行うことができる。所望であれば、本発明のアッセイを自動化またはロボット制御することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【００５５】
上記抗体は、磁性またはクロマトグラフィーマトリックス粒子等の種々の固形支持体、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、棒、スポンジ、紙、ウェル等の物理的形態のいくつかの固形基材材料または膜（例えば、プラスチック、ナイロン、紙）の上に固定することができる。１つの抗体または複数の抗体を固形担体上にアレイ状にコーティングすることによりアッセイストリップを調製することができる。次いで、このストリップを試験試料に浸漬し、洗浄および検出工程を介して素早く処理して、着色した点等の測定可能なシグナルを生成することができる。
【００５６】
あるいは、プローブ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアレイ、およびプライマー等の核酸結合分子をアッセイに用いて、患者試料中のＶＥＧＦ、ＣＥＡ、およびＥＧＦの差次的ＲＮＡ発現を検出することができる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）。１つの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲは、当該分野で公知の標準的な方法に従って用いられる。別の実施形態では、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ等のＰＣＲアッセイを用いて核酸およびそれらの改変体を検出することができる。他の実施形態では、ｑＰＣＲおよび核酸マイクロアレイを用いて核酸を検出することができる。選択された癌バイオマーカーと結合する試薬は、当業者に公知の方法または市販購入した方法に従って調製することができる。
【００５７】
サザン解析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはマーカーコード配列の一部に相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーション（例えば、スロットブロットハイブリダイゼーション）に基づく任意の別の方法等の慣用技術を用いて核酸の分析を行うことができ、そしてこれはまた本発明の範囲内にある。適用可能なＰＣＲ増幅技術は、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌらおよびＩｎｎｉｓら（上記）に記載されている。一般的な核酸ハイブリダイゼーション法は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９に記載されている。複数の核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の増幅またはハイブリダイゼーションは、マイクロアレイに配置されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列から行うこともできる。マイクロアレイ法は、Ｈａｒｄｉｍａｎ，”Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ”，ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，２００３；およびＢａｌｄｉら、”ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｆｒｏｍ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ”，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２に一般に記載されている。
【００５８】
マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分析、配列分析、および電気泳動分析を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の技術を用いて核酸マーカーおよびそれらの改変体の分析を行うことができる。ＰＣＲに基づく分析の非限定的な例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＴａｑｍａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイが挙げられる。配列分析の非限定的な例としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、キャピラリーアレイＤＮＡ配列決定、熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６−６３３（１９９２））、固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３：３９−４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析等の質量分析を用いた配列決定（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３８１−３８４（１９９８））、およびハイブリダイゼーションによる配列決定が挙げられる。Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：６１０−６１４（１９９６）；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：５４−５８（１９９８）。電気泳動解析の非限定的な例としては、アガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動等のスラブゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、および変性勾配ゲル電気泳動が挙げられる。他の核酸改変体検出方法としては、例えば、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．からのＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヘテロ二本鎖移動度アッセイ、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析、一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮＵＰＥ）およびパイロシーケンシングが挙げられる。
【００５９】
本明細書中に記載のアッセイにおいて検出可能部分を用いることができる。必要な感度、抗体との結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な機器類および廃棄条件に応じて標識を選択して、多種多様な検出可能部分を用いることができる。適切な検出可能部分としては、放射性核種、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、テトラロージミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリン等）、腫瘍関連プロテアーゼにより活性化される自己消光蛍光化合物（ａｕｔｏｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
有用な物理フォーマットは、複数の異なるマーカーの検出のために複数の個別のアドレス可能位置を有する表面を含む。そのようなフォーマットとしては、マイクロアレイおよび特定のキャピラリーデバイスが挙げられる。例えば、Ｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６：３２９−３４０（２００２）；米国特許第６，０１９，９４４号を参照されたい。これらの実施形態では、個別の表面位置の各々は、１つ以上の検出用マーカーを各位置に固定する抗体を含んでもよい。表面は、表面の個別の位置に固定された１つ以上の個別の粒子（例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子）を代替的に含んでもよく、ここで、マイクロ粒子は、１つ以上の検出用マーカーを固定する抗体を含む。他の有用な物理フォーマットとしては、棒、ウェル、スポンジ等が挙げられる。
【００６１】
分析は各種物理フォーマットで行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を用いて、多数の試験試料の処理を容易にすることができる。あるいは、単一の試料フォーマットを開発することにより時宜よく診断または予後判定を容易にすることができる。
【００６２】
あるいは、本発明の抗体または核酸プローブを顕微鏡用スライド上に固定した患者試料に適用することができる。結果得られた抗体染色またはインサイチューハイブリダイゼーションパターンは、当該分野で公知の種々の光または蛍光顕微鏡法のいずれか１つを用いて可視化することができる。
【００６３】
タンパク質または核酸の分析は、例えば、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）単独により、またはこれを質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、タンデムＭＳ等）と組み合わせることによっても達成することができる。
【００６４】
組成、キットおよび統合システム
本発明は、本発明のポリペプチドまたは当該ポリヌクレオチドの核酸に特異的な抗体を用いて本明細書中に記載のアッセイを実施するための組成、キットおよび統合システムを提供する。
【００６５】
本発明の診断アッセイを実施するためのキットは、典型的には、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体または核酸配列を含むプローブ、ならびにプローブの存在を検出するための標識を含む。このキットは、本発明のポリペプチドをコードするいくつかの抗体またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦを認識する抗体、ＣＥＡを認識する抗体、およびＥＧＦを認識する抗体の混合物）を含んでもよい。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本願発明を例示するために提供され、限定するために提供されるのではない。
【００６７】
（実施例１：唾液タンパク質因子は乳癌患者において増加する）
患者および方法
被験体
被験体の募集および試料採取を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄのガイドラインの範囲内で行った。癌グループについての算入基準は次のとおりであった：１）インフォームドコンセントを行うことが可能であること；２）妊娠も授乳もしていないこと；３）活発な口腔／歯髄疾患がないこと；４）非メラノーマ皮膚癌、子宮頸内癌腫または腺腫等の良性腫瘍を除いて、非乳房悪性腫瘍を以前（２年以内）に有したことがないかまたは同時に有していないこと；および５）乳癌と診断されていること。これらの患者は、腫瘍を摘出する確定的な手術前に登録された。対照被験体は、ＵＣＬＡのデンタルセンターおよび医療センターの両方から募集した健康なボランティアであった。
【００６８】
唾液採取
無刺激全唾液試料を予め確立されたプロトコル（７〜８）を用いて採取した。被験体には、採取の少なくとも３０分前は飲食も喫煙も口腔衛生手順もしないように求めた。口紅を拭き取り、被験体は口を水で一度ゆすいだ。典型的には、患者は、およそ５〜１０ｍｌの唾液を提供した。次いで、試料を、４℃にて２，６００ｇで１５分間遠心分離した。次いで、上清を使用時まで−８０℃で保管した。なお、１ｕｌのアプロチニン、１０ｕｌのＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）および３ｕｌのオルトバナジン酸ナトリウム（全てＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手）を含有するプロテアーゼ阻害剤混合物を１ｍｌ唾液試料の各々に添加した。
【００６９】
ＥＬＩＳＡ解析
酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による唾液タンパク質の測定を製造者の指示に従って行った。ＶＥＧＦおよびＥＧＦ用のＥＬＩＳＡをＲ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入し、ＣＥＡをＢｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。最低検出可能レベルは次のとおりであった：ＶＥＧＦについて９ｐｇ／ｍｌ、ＥＧＦについて０．７ｐｇ／ｍｌ、ＣＥＡについて１．５ｎｇ／ｍｌ。付属の試料希釈液を使用した希釈は次のとおりであって：ＶＥＧＦについて１：８、ＥＧＦについて１：２５、ＣＥＡについて１：４。シグナルをＢＩＯＴＥＫマイクロプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で読み取った。
【００７０】
データ解析
ペプチド発現レベルと乳癌との関連性を評価するために、唾液因子の平均値および標準偏差を各被験体群ごとに別々に算出し、ウィルコクソン検定により単純な群比較解析を行なった。年齢、民族性、癌／正常グループを独立変数として構築した３つのペプチドの各々に関する回帰モデル等の、年齢および民族性の潜在的影響（結果は示さず）を考慮するために複数の回帰分析も行った。
【００７１】
各ペプチドの予測力を評価するために、ペプチド発現を独立変数とし、癌／対照グループを従属変数とした単純なロジスティックモデルで受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を行った。ロジスティック回帰モデルにおいて各種タンパク質の組み合わせが含まれることをテストするステップワイズ選択法から選択した最良なモデルでＲＯＣ曲線解析を繰り返し行った。次いで、ＲＯＣ曲線の数値積分により曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。最大ＡＵＣを有する因子またはそれらの組み合わせが乳癌検出の最大予測力を有すると特定した。唾液増殖因子のテストをまた、感度（疾患を有すると検出された人の割合）および特異性（疾患を有さず陰性と見なされた人の割合）等の尺度を用いて評価した。
【００７２】
結果
被験体の特徴
全ての被験体は女性であった。表１は、４９人の対照被験体および４９人の乳癌患者の特徴を要約している。健常対照群と癌被験体との間には喫煙、糖尿病、肝炎、およびＨＩＶの状態について有意な差はなかった。対照群の平均年齢は乳癌患者よりも低かった（４１．４±１２．４歳対５４．８±１１．２歳、ｐ＜０．０００１）。人種も有意な因子であった（ｐ＝０．０１１６）。癌グループでは、４人は０期（ＤＣＩＳ−原位置での管癌）しか有さなかった。４２の浸潤性癌の症例のうち、次に示すように３例以外の全てが最終的な病理学的病期を有していた：局所再発が１例、１期が１４例、２期が１４例、３期が７例（そのうち１例は、新補助化学療法後の唾液採取時に残存ＤＣＩＳがあっただけである）、および４期が３例。
【００７３】
唾液タンパク質レベル
乳癌および対照グループにおけるＶＥＧＦ、ＥＧＦおよびＣＥＡに関する唾液レベルを表２に示す。ウィルコクソン検定は、乳癌患者と対照グループとの間において、これら３つの唾液タンパク質の各々の発現レベルに有意差があることを示す。複数回帰分析も年齢および民族性の影響を調整した後、これら３つの唾液タンパク質各々と癌との間に有意に明らかな関連性が残るという一貫した結果を示している。
【００７４】
各唾液タンパク質個々およびそれらの組み合わせの予測力を判断するために、我々はまず、ステップワイズモデル選択法により最良なロジスティック回帰モデルを見つけた。この方法は、ＶＥＧＦタンパク質およびＥＧＦタンパク質をともに含むロジスティックモデルがそのデータに最も適合することを明らかにした。次いで、表３の最良な組み合わせで各タンパク質を用いてロジスティックモデルについて別々にＲＯＣ解析を行った。ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、およびＣＥＡのＡＵＣは、それぞれ、８０％、７７％、６５％であった。感度および特異性は次のとおりであった：ＶＥＧＦについて７４％および７３％、ＥＧＦについて７８％および６８％、ＣＥＡについて７０％および５６％。最良な組み合わせは、感度８３％、特異性７４％、ＡＵＣ  ８４％の、唾液ＶＥＧＦ＋ＥＧＦであった。対応するＲＯＣ曲線を図１に示す。
【００７５】
考察
ここで、我々は、健常対照被験体と比較して、乳癌患者の唾液中でＶＥＧＦおよびＣＥＡのレベルが有意に上昇したことを最初に報告する。最も強力な血管新生因子ＶＥＧＦは、以前に健常個体の唾液中で検出されている（９〜１０）。また、我々は、ＥＧＦレベルの上昇も観察しており、これはスペインのＮａｖａｒｒｏグループの発表とも一貫している（１１）。米国では、Ｓｔｒｅｃｋｆｕｓグループが、対照被験体に対して癌被験体の唾液中でＨｅｒ−２およびＣＡ１５−３のレベルが上昇することを報告している（１２〜１３）。２５人の乳癌患者に関する別の研究は、唾液Ｈｅｒ−２が治療前の値と治療後の値とで有意差を示すことを示した（１４）。
【００７６】
唾液中で血管新生因子が増加するという知見は、血管新生の過程、すなわち、新たな血管の形成が乳房腫瘍の成長および転移において重要な役割を果たすという事実と一貫している（１５）。多くの血管新生因子が同定されて配列決定されて以来、我々は、それらの因子のうちのいずれかのレベルが体液中で検出可能であるか、およびそれらのレベルが癌の診断およびモニタリングと何らかの臨床的関連性を有するのかをいち早く問いかけてきた（１６〜１７）。これら血管新生分子は、腫瘍細胞自体により放出されるか（１８）、または細胞外マトリックスから動員されるか、および／または腫瘍内に補充されるマクロファージ等の宿主細胞により放出されるかのいずれかである。我々の研究室および他の施設による研究により、血管新生因子が乳癌患者の血清および尿中で有意に増加し得ることが示された。特定の血管新生因子のレベルが腫瘍の疾患の病期と相関することが示された（１９）。
【００７７】
我々の研究は、ＮＣＩ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＥＤＲＮ）により規定されるガイドラインに沿ったフェーズＩＩ検証研究（ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）を構成する（２０）。次のステップは、多数の新たな乳癌の症例および対照被験体を用いたフェーズＩＩＩ盲検検出試験（ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｂｌｉｎｄｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ）を実施して、ＶＥＧＦ、ＥＧＦおよびＣＥＡが確固としたものであるかを判定することにより予測して、対照群からの唾液を乳癌患者からの唾液から識別することである。
【００７８】
【表１】
2009510395.tif 000003
【００７９】
【表２】
2009510395.tif 000004
【００８０】
【表３】
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【００８１】
【表４−１】
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【００８２】
【表４−２】
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本明細書中に記載の実施例および実施形態は例示のみを目的とするものであり、それらに関する各種修正または変更は当業者には示唆されており、本願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。本明細書中に引用されるあらゆる刊行物、特許、および特許出願の全てを、あらゆる目的のために本明細書中において参考として援用する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】対照被験体および乳癌患者由来の検体における唾液のＶＥＧＦ値およびＥＧＦ値のＲＯＣ曲線。ＲＯＣ曲線下面積８４％。
【図１】
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【国際調査報告】
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