(57)【要約】  本明細書には、非天然アミノ酸および非天然アミノ酸を少なくとも１つ含むポリペプチド、ならびに当該非天然アミノ酸およびポリペプチドを作製する方法が開示されている。上記非天然アミノ酸は、それ自体またはポリペプチドの一部であるとき、機能性基として可能な多様なものを含むことができるが、通常は少なくとも１つの芳香族アミン基を有することができる。また、本明細書には、さらに翻訳後修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、上記修飾をするための方法、ならびに上記ポリペプチドを精製する方法も開示されている。通常、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、少なくとも１つのアルキル化アミン基を含んでいる。さらに、上記非天然アミノ酸ポリペプチドおよび修飾型非天然ポリペプチドを使用する方法（治療的使用、診断的使用、および他の生物工学的使用など）が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2009519942.tif 000093
から成る群から選択される化合物またはその塩
（Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである）。
【請求項２】
上記Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記Ｒａがハロゲンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
上記Ｒ１およびＲ２の両方が、ポリペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
上記Ｘが、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルから成る群から選択される生物活性剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
上記Ｘが、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、およびステロイド剤から成る群から選択される薬物である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
上記Ｘが、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから成る群から選択される酵素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
上記Ｘが、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分、キレート部分、電子密度の高い部分、磁性部分、挿入部分、放射性部分、発色部分、およびエネルギー伝達部分から成る群から選択される検出可能な標識である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
上記Ｘが、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルを含んでいるポリマーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
上記ポリマーが、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
上記ポリマーが、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（ハロゲン、アルキルまたは置換アルキル）］ｘ（ｘは２０−１０，０００である）を含んでいる、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
上記ポリマーが、約２から約４０ｋＤａまでの範囲の分子量を有するｍ−ＰＥＧである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
【化２】
2009519942.tif 000094
（Ｘはハロゲンである）
の群から選択される請求項１に記載の化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチド、またはその塩。
【請求項１４】
【化３】
2009519942.tif 000095
の群から選択される請求項１に記載の化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチド、またはその塩。
【請求項１５】
【化４】
2009519942.tif 000096
（Ｘはハロゲンである）
の群から選択される請求項１に記載の化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチド、またはその塩。
【請求項１６】
【化５】
2009519942.tif 000097
の構造を有する化合物、またはその塩
（Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
または、２つのＲ５基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１がＨであるときＲ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるときＲ１はＨではなく；
Ｇはアミン保護基である）。
【請求項１７】
上記アミン保護基が、
【化６】
2009519942.tif 000098
から成る群から選択される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
上記Ｒ１およびＲ２の両方が、ポリペプチドである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
【化７】
2009519942.tif 000099
の構造を有する化合物、またはその塩
（Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ６は、保護されたアルデヒド、またはマスクされたアルデヒドであり、
保護基は、特に限定されないが、
【化８】
2009519942.tif 000100
（Ｘ１のそれぞれは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ａｃ）−、および−Ｎ（ＯＭｅ）−から成る群から選択され、；Ｘ２は、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＳＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）（Ａｃ）、−Ｎ（Ｒ）（ＯＭｅ）、またはＮ３であり、Ｒ’およびＲのそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）を含んでいる）。
【請求項２０】
上記Ｘ１がＯである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
上記Ｒ１およびＲ２の両方が、ポリペプチドである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
【化９】
2009519942.tif 000101
の群から選択される請求項１９に記載の化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチド。
【請求項２３】
【化１０】
2009519942.tif 000102
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる化合物を作製する方法であって、
上記化合物は、少なくとも１つのアルデヒド部分を含んでいる反応物質を少なくとも１つ用いて、少なくとも１つの非天然アミノ酸における芳香族アミノ部分を還元的アルキル化することによって形成され、
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである、方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＲ１およびＲ２が、それぞれＨおよびＯＨである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＲａが、ハロゲンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＲ１およびＲ２が、ポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＸが、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルから成る群から選択される生物活性剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＸが、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、およびステロイド剤から成る群から選択される薬物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＸが、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから成る群から選択される酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸のＸが、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分、キレート部分、電子密度の高い部分、磁性部分、挿入部分、放射性部分、発色部分、およびエネルギー伝達部分から成る群から選択される検出可能な標識である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
上記非天然アミノ酸のＸが、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルを含んでいるポリマーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
上記ポリマーが、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記ポリマーが、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（ハロゲン、アルキルまたは置換アルキル）］ｘ（ｘは２０−１０，０００である）を含んでいる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
上記ポリマーが、約２から約４０ｋＤａまでの範囲の分子量を有するｍ−ＰＥＧである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、
【化１１】
2009519942.tif 000103
の群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、
【化１２】
2009519942.tif 000104
の群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、
【化１３】
2009519942.tif 000105
の群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
【化１４】
2009519942.tif 000106
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドを作製する方法であって、
上記ポリペプチドは、少なくとも１つのアルデヒド部分を含んでいる反応物質を少なくとも１つ用いて、少なくとも１つの非天然アミノ酸における芳香族アミノ部分を還元的アルキル化することによって形成され、
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
または、２つのＲ５基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１がＨであるときＲ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるときＲ１はＨではなく；
Ｇはアミン保護基である、方法。
【請求項３９】
上記アミン保護基が、
【化１５】
2009519942.tif 000107
から成る群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記Ｒ１およびＲ２の両方が、ポリペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの上記アルデヒド部分が、
【化１６】
2009519942.tif 000108
に対応する構造を有する、請求項２３および３８に記載の方法
（Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘである（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）。
【請求項４２】
治療的有効量のポリペプチドを投与する工程を含み、
上記ポリペプチドは、
【化１７】
2009519942.tif 000109
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる、疾患、病気または疾病を治療するための方法
（Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１がＨであるときＲ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるときＲ１はＨではない）。
【請求項４３】
治療的有効量の上記ポリペプチドと一緒に薬学的に許容可能な担体を投与する工程をさらに含んでいる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
上記Ｒ１およびＲ２の両方が、ポリペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
上記Ｘが水溶性ポリマーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
上記Ｘがポリエチレングリコールの誘導体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
上記Ｘが細胞毒性化合物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
上記Ｘが薬物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
上記Ｘが第２ポリペプチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
上記第２ポリペプチドが、非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいるペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
上記ポリペプチドが、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群から選択される治療タンパク質と相同なタンパク質である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、上記ポリペプチド内の特定部位に組み込まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
上記非天然アミノ酸が、翻訳系を用いて組み込まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
上記非天然アミノ酸が、翻訳系および翻訳後修飾系を用いて、上記ポリペプチドに組み込まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが、少なくとも１ヶ月間安定である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが、少なくとも２週間安定である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
患者中に存在するポリペプチドを検出する方法であって、
上記方法は、
【化１８】
2009519942.tif 000110
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる、有効量の相同な非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する工程と、
標識；色素；親和性標識；光親和性標識；スピン標識；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；蛍光団；放射性部分；重原子を組み込んでいる部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；ビオチン；ビオチンの類似体；電子密度の高い基；磁性基；発色団；エネルギー伝達剤；検出可能な標識；放射性伝達物質；およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択される、ポリペプチドにおける指標を検出する工程とを含んでおり、
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；親和性標識；光親和性標識；スピン標識；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；蛍光団；放射性部分；重原子を組み込んでいる部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；ビオチン；ビオチンの類似体；電子密度の高い基；磁性基；発色団；エネルギー伝達剤；検出可能な標識；放射性伝達物質；およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１がＨであるときＲ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるときＲ１はＨではない、方法。
【請求項５８】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、上記ポリペプチド内の特定部位に組み込まれる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
上記非天然アミノ酸が、翻訳系を用いて組み込まれる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
上記非天然アミノ酸が、翻訳系および翻訳後修飾系を用いて、上記ポリペプチドに組み込まれる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、水溶液において少なくとも１ヶ月間安定である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、少なくとも２週間安定である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つの上記非天然アミノ酸が、少なくとも５日間安定である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
上記ポリペプチドが、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群から選択される治療タンパク質と相同なタンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれる、「Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides」と題された米国仮特許出願第６０／７４３，０４１号明細書（２００５年１２月１４日出願）、および、「Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides」と題された米国仮特許出願第６０／７４３，０４０号明細書（２００５年１２月１４日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
〔発明の分野〕
本明細書には、非天然アミノ酸剤を作製ならびに使用する方法および組成物が記載されている。
【０００３】
〔発明の背景〕
非遺伝的にコードされたアミノ酸（つまり、非天然アミノ酸）を、タンパク質に組み込むことができれば、天然に生じる官能基（リジンのイプシロン位の−ＮＨ２、システインのスルフィドリル（−ＳＨ）、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる有益な化学官能基を導入することができる。２０の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸において見られる官能基に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に組み込まれ得る官能基と首尾よく効率的に反応して、安定な連結を形成する特定の化学官能基が知られている。
【０００４】
タンパク質には発見されず、２０の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸に見られる官能基の全てに対して化学的に不活性であり、特定の官能基を含んでいる試薬と効率的かつ選択的に反応して、安定な連結を形成し得る化学官能基を選択的に導入する方法は、現在利用可能である。
【０００５】
〔発明の要旨〕
本明細書には、非天然アミノ酸と非天然アミノ酸ポリペプチドと修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを、作成、精製、特徴づけ、ならびに使用するための方法、組成物、技術および戦略が記載されている。１態様では、方法、組成物、技術および戦略は、非天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸ポリペプチドを誘導体化するためのものである。一実施形態では、上記方法、組成物、技術および戦略は、化学的誘導体化に関し、他の実施形態では生物学的誘導体化に関し、さらに別の実施形態では物理的誘導体化に関し、さらに別の実施形態ではそれら誘導体化の組み合わせに関する。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は位置選択的である。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は位置特異的である。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、非天然アミノ酸含有試薬と、誘導体化試薬との両方において、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論様である。さらなる、または別の実施形態では、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論様に、所望の基を非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる方法が、提供される。さらなる、または別の実施形態では、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論様に、所望の基を非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる戦略、反応混合物、合成条件が提供される。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、室温（ambient temperature）において迅速である。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、水溶液において起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、約４〜約１０のｐＨにおいて起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、約４〜約７のｐＨにおいて起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、約４〜約５のｐＨにおいて起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、約５のｐＨにおいて起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、約４のｐＨにおいて起こる。
【０００６】
１態様では、非天然アミノ酸は、芳香族アミン基の反応性に基づいて、ペプチドおよびタンパク質を化学的に誘導体化するためのものである。さらなる、または別の実施形態では、上記非天然アミノ酸の少なくとも１つがポリペプチドに組み込まれる。すなわち、そのような実施形態は、非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、誘導体化分子と反応することによりアミン連結が生成するように、非天然アミノ酸の側鎖において官能基化されている。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、芳香族アミン側鎖を有するアミノ酸から選択される。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、マスクされた側鎖（マスクされた芳香族アミン基など）を含んでいる。
【０００７】
さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、アリールアミンまたはヘテロアリールアミンから選択される芳香族アミンの側鎖を含んでいる。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、芳香族アミン基を含んでいること以外は、天然アミノ酸と構造的に似ている。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、フェニルアラニンまたはチロシン（芳香族アミノ酸）に似ている。一実施形態では、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸が有する性質とは異なる性質を有している。一実施形態では、そのような異なる性質は、側鎖の化学反応性であり、さらなる実施形態では、この異なる化学反応性によれば、非天然アミノ酸の側鎖はポリペプチドのユニットである間に、同じポリペプチド内の天然アミノ酸ユニットの側鎖が反応を受けないにもかかわらず、当該反応を受けることができる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に直交な化学的性質を有している。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、求核試薬含有部分を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖における求核試薬含有部分が反応を受けることによって、アミンにより誘導体化された（アミン誘導体化型）タンパク質を生成することができる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、求電子試薬含有部分を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖における求電子試薬含有部分が、求核攻撃を受けることによって、アミンにより誘導体化したタンパク質を生成することができる。本段落における上記実施形態の何れかでは、非天然アミノ酸は、ポリペプチドから分離した分子として存在していてもよいし、任意の長さのポリペプチドに組み込まれていてもよい。後者の場合、ポリペプチドは、それから、天然に生じるアミノ酸または非天然アミノ酸をさらに組み込んでもよい。
【０００８】
別の態様では、カルボニルで置換された分子（例えば、アルデヒドおよびケトン）は、アミン連結に基づいて誘導体化された非天然アミノ酸ポリペプチドを製造するためのものである。さらなる実施形態では、アルデヒドで置換された（アルデヒド置換型）分子は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを、誘導体化分子と芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドとの間にアミン連結を形成することにより、誘導体化するために用いられる。さらなる、または別の実施形態では、アルデヒド置換型分子は、以下の物質から選択される基を含んでいる：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、光ケージド部分（a photocaged moiety）、化学線により励起可能な部分、リガンド、光異性体化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、阻害性リボ核酸、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット、ナノ伝達物質、放射線伝達物質、抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、受容体、逆ミセル、ならびにそれらのあらゆる組み合わせ。さらなる、または別の実施形態では、アルデヒド置換型分子は、アルデヒド置換型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸がアルデヒド置換型分子と選択的に反応することができるという、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に対して直交な化学的性質を有している。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、アルデヒド含有分子と選択的に反応する芳香族アミン含有部分を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖における芳香族アミン含有部分は、アルキル化されたアミン誘導体化型タンパク質を生成するような反応を受けることができる。本段落に記載の実施形態に関するさらなる態様では、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、誘導体化分子と非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応から生じるものである。さらなる実施形態には、すでに修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドが、さらに任意に修飾されたものが含まれる。
【０００９】
別の態様では、芳香族アミンで置換された（芳香族アミン置換型）分子（例えば、アリールアミンおよびヘテロアリールアミンなど）は、アミン連結に基づいて、誘導体化された非天然アミノ酸ポリペプチドを製造するためのものである。さらなる実施形態では、芳香族アミン置換型分子は、誘導体化分子とアルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドとの間にアミン連結を形成することによって、アルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドを誘導体化するために用いられる。さらなる、または別の実施形態では、芳香族アミン置換型分子は、以下の物質から選択される基を含んでいる：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、光ケージド部分、化学線により励起可能な部分、リガンド、光異性体化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、阻害性リボ核酸、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット、ナノ伝達物質、放射線伝達物質、抗体酵素、活性錯体活性化剤（activated complex activator）、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、受容体、逆ミセル、ならびにそれらのあらゆる組み合わせ。さらなる、または別の実施形態では、芳香族アミン置換型分子は、芳香族アミン置換型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸が芳香族アミン置換型分子と選択的に反応することができるという、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に対して直交な化学的性質を有している。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、芳香族アミン含有分子と選択的に反応するアルデヒド含有部分を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖におけるアルデヒド含有部分は、アルキル化されたアミン誘導体化型タンパク質を生成するように、反応を受けることができる。本段落に記載の実施形態に関するさらなる態様では、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、誘導体化分子と非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応から生じるものである。さらなる実施形態には、すでに修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドが、さらに任意に修飾されたものが含まれる。
【００１０】
別の態様では、１官能性リンカー、２官能性リンカーおよび多官能性リンカーは、アミン連結に基づいて、誘導体化された非天然アミノ酸ポリペプチドを生成するためのものである。一実施形態では、（２官能性、および多官能性の）分子リンカーは、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを、他の分子に接続するために用いられ得る。別の実施形態では、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、アリールアミン、またはヘテロアリールアミンの側鎖を含んでいる。芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを利用する実施形態では、分子リンカーは、その末端にアルデヒド基を含んでいる。さらなる、または別の実施形態では、アルデヒド置換型リンカー分子は、アルデヒド置換型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー分子である。さらなる実施形態では、語句「他の分子」には、例えば、タンパク質、他のポリマー、および低分子が含まれる。さらなる、または別の実施形態では、アルデヒド含有分子リンカーは、全ての末端に同じかまたは同等の基を含んでいる。これによれば、該アルデヒド含有分子リンカーを芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応させることにより、ホモマルチマー化した芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドが得られる。さらなる実施形態では、ホモマルチマー化は、ホモダイマー化である。さらなる、または別の実施形態では、分子リンカーは、全ての末端に少なくとも１つのアルデヒド基とこれとは異なる基とを含んでいる。これによれば、該分子リンカーを芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応させることにより、ヘテロマルチマー化した芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドが得られる。さらなる実施形態では、ヘテロマルチマー化はヘテロダイマー化である。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸がアルデヒド置換型リンカー分子と選択的に反応することができるという、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に対して直交な化学的性質を有している。本段落に記載の実施形態に関するさらなる態様では、連結された修飾型または非修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、リンカー分子と非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応から生じるものである。さらなる実施形態には、すでに連結された修飾型または非修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドが、さらに任意に修飾されたものが含まれる。
【００１１】
１態様では、本明細書に記載の方法は、芳香族アミンとアルデヒド反応物質との反応を介して、タンパク質をアルキル化されたアミン誘導体化型タンパク質に誘導体化する方法である。この態様には、芳香族アミン含有反応物質およびアルデヒド含有反応物質の還元的アルキル化に基づいて、アルキル化されたアミン誘導体化型タンパク質付加物を生成するようにタンパク質を誘導体化する方法が含まれる。別のまたはさらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、アルデヒドで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子により、芳香族アミン含有タンパク質を誘導体化する方法である。さらに別のまたはさらなる態様では、アルデヒド置換型分子は、タンパク質、他のポリマー（分枝状または非分枝状ポリマー）、および低分子を含んでいてもよい。
【００１２】
別の態様では、本明細書に記載の方法は、芳香族アミン置換型タンパク質の誘導体化用のアルデヒド置換型分子を、化学合成する方法である。一実施形態では、アルデヒド置換型分子は、ペプチド、他のポリマー（分枝状または非分枝状ポリマー）、および低分子を含んでいてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドの誘導体化に適したアルデヒド置換型分子を、調製する方法である。さらなるまたは別の実施形態では、非天然アミノ酸は、インビボでのタンパク質の翻訳中に部位特異的に組み込まれる（なお、上記非天然アミノ酸には芳香族アミン含有非天然アミノ酸が含まれるが、これに限定されない）。さらなる、または代わりの実施形態では、非天然アミノ酸は、リボソームにおける翻訳によって部位特異的に組み込まれる（なお、上記非天然アミノ酸には芳香族アミン含有非天然アミノ酸が含まれるが、これに限定されない）。さらなる、または代わりの実施形態では、非天然アミノ酸は、インビトロでの翻訳中に部位特異的に組み込まれる（なお、上記非天然アミノ酸には芳香族アミン含有非天然アミノ酸が含まれるが、これに限定されない）。さらなる、または別の実施形態では、アルデヒド置換型分子は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、芳香族アミン部分の還元的アルキル化により部位特異的に誘導体化できるものである。これによれば、部位特異的にアルキル化されたアミン誘導体化型ポリペプチドを形成することができる。さらなる、または別の実施形態では、アルデヒド置換型分子を調製する方法は、部位特異的に誘導体化された多種多様なポリペプチドを、入手する手段を提供する。さらなる、または別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、アルデヒドで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を合成する方法である。
【００１３】
別の態様では、本明細書に記載の方法は、アルデヒド含有２官能性リンカーを用いた、芳香族アミン置換型非天然アミノ酸ポリペプチドを化学的に誘導体化する方法である。一実施形態では、還元的アルキル化反応によりアミン連結を生成して、アルデヒド置換型リンカーを芳香族アミン置換型タンパク質に付着させる方法である。さらなる、または別の実施形態では、芳香族アミン置換型非天然アミノ酸は、アリールアミン、またはヘテロアリールアミンで置換された非天然アミノ酸である。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、アルデヒド含有２官能性リンカーを用いて、部位特異的に、および／または、３次元構造を正確に制御することにより、誘導体化される。一実施形態では、上記方法は、分子リンカー（１官能性、２官能性、および多官能性分子リンカー）を芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドに付着させるために用いられる方法であって、該リンカーの末端の少なくとも１つは、アミン連結を介して、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドに連結できるアルデヒド基を含んでいる、方法である。さらなる、または別の実施形態では、上記リンカーは、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを他の分子に接続するために用いられる。なお、他の分子には、例えば、タンパク質、他のポリマー（分枝状または非分枝状ポリマー）、および低分子が含まれる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、２官能性ポリマーである。いくつかの実施形態では、２官能性ポリマーは、第２ポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと同一であり、他の実施形態では、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと異なるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる水溶性ポリマーと連結している、少なくとも２つのアミノ酸を含んでいる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、受容体に対する非天然アミノ酸ポリペプチドの親和性を増加させる、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、非天然アミノ酸ポリペプチドの安定性を増加させる、置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、非天然アミノ酸ポリペプチドの水溶性を増加させる、置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、宿主細胞において製造された非天然アミノ酸ポリペプチドの溶解度を増加させる、置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、置換、付加、または欠失が無いときのアミノ酸ポリペプチドと比べて、プロテアーゼ耐性、血中半減期、免疫原性、および／あるいは発現が調節されている、置換、付加、または欠失を含んでいる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態では、水ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、例えば、対応する受容体の２量体化を阻害するものであり得る。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、該ポリペプチドの結合パートナー、リガンド、または受容体に対する結合を調節する。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、該ポリペプチドの１つ以上の性質または活性を調節する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群から選択される。
【００１８】
さらなる、または別の実施形態では、本明細書に記載の非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチド、および／または、修飾型非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチドは、下記の特性の少なくとも１つを有するものである。（１）芳香族アミンのアミン部分が、１級アミンである、（２）芳香族アミンのアミン部分が、２級アミンである、（３）芳香族アミンの芳香族部分が、ヘテロ芳香族部分である、（４）芳香族アミンの芳香族部分が、アリール部分である、（５）芳香族アミンが、アルデヒドで官能基化された基と反応する、（６）水溶性ポリマーと連結している、（７）ＰＥＧ化されている（ＰＥＧと連結している）、（８）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、治療半減期が増加している、（９）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、血中半減期が増加している、（１０）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、循環時間が増加している、（１１）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、水溶性が増加している、（１２）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、生物学的利用性が増加している、（１３）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、免疫原性が調節されている、（１４）非天然芳香族アミンアミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、生物活性が調節されている、（１５）薬学的組成物の一部である、（１６）細胞培養物から得られる、（１７）化学的に合成される、（１８）ライブラリースクリーニング方法に用いられる、（１９）アレイに用いられる、（２０）タンパク質アレイに用いられる、（２１）遺伝子発現解析に用いられる、（２２）少なくとも１つの薬剤と結合している、（２３）標識と結合している、（２４）色素と結合している、（２５）ポリマーと結合している、（２６）細胞毒性化合物と結合している、（２７）薬物と結合している、（２８）第２のタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチド類似体と結合している、（２９）抗体または抗体断片と結合している、（３０）炭水化物と結合している、（３１）ポリヌクレオチドと結合している、（３２）アンチセンスポリヌクレオチドと結合している、（３３）サッカライドと結合している、（３４）蛍光団と結合している、（３５）化学的に切断可能な基と結合している、（３６）光切断可能な基と結合している、（３７）エネルギー伝達剤と結合している、（３８）放射性ヌクレオチドと結合している、（３９）翻訳後修飾され得る、（４０）還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（４１）約４〜約１０のｐＨの範囲において、還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（４２）翻訳後に還元的アルキル化することにより、部位特異的に誘導体化され得る、（４３）室温において、還元的アルキル化により迅速に翻訳後修飾され得る、（４４）水性条件下において、還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（４５）化学量論的な反応条件により還元的アルキル化によって翻訳後修飾され得る、（４６）ほぼ化学量論的な反応条件により還元的アルキル化によって翻訳後修飾され得る、（４７）化学量論的様の反応条件により還元的アルキル化によって翻訳後修飾され得る、（４８）疾病、疾患または病気を患っている哺乳類を治療するために用いられる、（４９）疾病、疾患または病気を患っているヒトを治療するために用いられる、（５０）疾病、疾患または病気を患っている哺乳類を診断するために用いられる、（５１）疾病、疾患または病気を患っているヒトを診断するために用いられる、（５２）持続放出性組成物の一部である、（５３）アミン部分が、マスクされたアミン部分の翻訳後還元により形成される、（５４）アミン部分が、イミン部分の翻訳後還元により形成される、（５５）アミン部分が、アジド部分の翻訳後還元により形成される、（５６）アミン部分が、ヒドラジンの翻訳後還元により形成される、（５７）アミン部分が、ニトロ部分の翻訳後還元により形成される、（５８）プロドラッグと結合している、（５９）細胞ライセートから得られる、（６０）リボソームにおいて合成される、（６１）約４〜約７のｐＨの範囲において、還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（６２）約４〜約５のｐＨの範囲において、還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（６３）約５のｐＨにおいて、還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（６４）約４のｐＨにおいて、還元的アルキル化により翻訳後修飾され得る、（６５）還元的アルキル化反応において、迅速に反応する、（６６）還元的アルキル化反応において、約１０時間未満で反応する、（６７）還元的アルキル化反応において、約８時間未満で反応する、（６８）還元的アルキル化反応において、約６時間未満で反応する、（６８）還元的アルキル化反応において、約４時間未満で反応する、（６９）還元的アルキル化反応において、約２時間未満で反応する、（７０）還元的アルキル化反応において、約１時間未満で反応する、あるいは、（７１）還元的アルキル化反応において、約３０分未満で反応する。
【００１９】
さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載の非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチド、および／または修飾型非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチドは、上記特性を少なくとも２つ有している。さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載の非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチド、および／または修飾型非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチドは、上記特性を少なくとも３つ有している。さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載の非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチド、および／または修飾型非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチドは、上記特性を少なくとも４つ有している。さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載の非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチド、および／または修飾型非天然芳香族アミンアミノ酸ポリペプチドは、上記特性を少なくとも５つ有している。
【００２０】
さらなる、または別の実施形態では、本明細書に記載のアルデヒドに基づく非天然のアミノ酸ポリペプチド、および／または、アルデヒドに基づく修飾型非天然のアミノ酸ポリペプチドは、以下の特性を少なくとも１つ有するものである。（１）保護またはマスクされたアルデヒド部分を含んでいる、（２）脱保護、または脱マスクされたアルデヒド部分を含んでいる、（３）芳香族アミンと反応できる脱保護、または脱マスクされたアルデヒド部分を含んでいる、（４）複素芳香族アミンと反応できる脱保護、または脱マスクされたアルデヒド部分を含んでいる、（５）還元的アミノ化により、芳香族アミンまたは複素芳香族アミンと反応できる脱保護、または脱マスクされたアルデヒド部分を含んでいる、（６）水溶性ポリマーと結合している、（７）ＰＥＧ化されている、（８）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、治療半減期が増加している、（９）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、血中半減期が増加している、（１０）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、循環時間が増加している、（１１）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、水溶性が増加している、（１２）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、生物学的利用性が増加している、（１３）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、免疫原性が調節されている、（１４）アルデヒドに基づく非天然アミノ酸を有さない対応するポリペプチドと比べて、生物活性が調節されている、（１５）薬学的組成物の一部である、（１６）細胞培養物から得られる、（１７）化学的に合成される、（１８）ライブラリースクリーニング方法に用いられる、（１９）アレイに用いられる、（２０）タンパク質アレイに用いられる、（２１）遺伝子発現解析に用いられる、（２２）還元的アミノ化を介して、薬剤と結合している、（２３）標識と結合している、（２４）色素と結合している、（２５）ポリマーと結合している、（２６）細胞毒性化合物と結合している、（２７）薬物と結合している、（２８）第２のタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチド類似体と結合している、（２９）抗体または抗体断片と結合している、（３０）炭水化物と結合している、（３１）ポリヌクレオチドと結合している、（３２）アンチセンスポリヌクレオチドと結合している、（３３）サッカライドと結合している、（３４）蛍光団と結合している、（３５）化学的に切断可能な基と結合している、（３６）光切断可能な基と結合している、（３７）エネルギー伝達剤と結合している、（３８）放射性ヌクレオチドと結合している、（３９）翻訳後修飾され得る、（４０）還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（４１）約４〜約１０のｐＨの範囲において、還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（４２）翻訳後に還元的アミノ化することにより、部位特異的に誘導体化され得る、（４３）室温において、還元的アミノ化により迅速に翻訳後修飾され得る、（４４）水性条件下において、還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（４５）化学量論的な反応条件により還元的アルキル化によって翻訳後修飾され得る、（４６）ほぼ化学量論的な反応条件により還元的アルキル化によって翻訳後修飾され得る、（４７）化学量論的様の反応条件により還元的アルキル化によって翻訳後修飾され得る、（４８）疾病、疾患または病気を患っている哺乳類を治療するために用いられる、（４９）疾病、疾患または病気を患っているヒトを治療するために用いられる、（５０）疾病、疾患または病気を患っている哺乳類を診断するために用いられる、（５１）疾病、疾患または病気を患っているヒトを診断するために用いられる、（５２）持続放出性組成物の一部である、（５３）プロドラッグと結合している、（５４）細胞ライセートから得られる、（５５）リボソームにおいて翻訳される、（５６）約４〜約７のｐＨの範囲において、還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（５７）約４〜約５のｐＨの範囲において、還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（５８）約５のｐＨにおいて、還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（５９）約４のｐＨにおいて、還元的アミノ化により翻訳後修飾され得る、（６０）還元的アミノ化反応において、迅速に反応する、（６１）還元的アミノ化反応において、約１０時間未満で反応する、（６２）還元的アミノ化反応において、約８時間未満で反応する、（６３）還元的アミノ化反応において、約６時間未満で反応する、（６８）還元的アミノ化反応において、約４時間未満で反応する、（６４）還元的アミノ化反応において、約２時間未満で反応する、（６５）還元的アミノ化反応において、約１時間未満で反応する、あるいは、（６６）還元的アミノ化反応において、約３０分未満で反応する。
【００２１】
さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載のアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチド、および／またはアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチドの修飾型は、上記特性を少なくとも２つ有している。さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載のアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチド、および／またはアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチドの修飾型は、上記特性を少なくとも３つ有している。さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載のアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチド、および／またはアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチドの修飾型は、上記特性を少なくとも４つ有している。さらなる、または代わりの実施形態では、本明細書に記載のアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチド、および／またはアルデヒドに基づく非天然アミノ酸ポリペプチドの修飾型は、上記特性を少なくとも５つ有している。
【００２２】
また、本明細書には、水溶性ポリマーに連結している非天然アミノ酸ポリペプチドを作製する方法も記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、非天然アミノ酸を含んでいる単離されたポリペプチドと、該非天然アミノ酸と反応する部分を含んでいる水溶性ポリマーとを接触させる工程を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーと反応性であるが、２０の一般アミノ酸の何れかと非反応性である。いくつかの実施形態では、水ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。ポリマーの分子量は、ポリマーの分子量は、広範囲（例としては、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ，９０，０００Ｄａ，８５，０００Ｄａ，８０，０００Ｄａ，７５，０００Ｄａ，７０，０００Ｄａ，６５，０００Ｄａ，６０，０００Ｄａ，５５，０００Ｄａ，５０，０００Ｄａ，４５，０００Ｄａ，４０，０００Ｄａ，３５，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａ，２５，０００Ｄａ，２０，０００Ｄａ，１５，０００Ｄａ，１０，０００Ｄａ，９，０００Ｄａ，８，０００Ｄａ，７，０００Ｄａ，６，０００Ｄａ，５，０００Ｄａ，４，０００Ｄａ，３，０００Ｄａ，２，０００Ｄａ，１，０００Ｄａ，９００Ｄａ，８００Ｄａ，７００Ｄａ，６００Ｄａ，５００Ｄａ，４００Ｄａ，３００Ｄａ，２００Ｄａ，および１００Ｄａが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約５００，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール分子は、分枝状ポリマーである。分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ，９０，０００Ｄａ，８５，０００Ｄａ，８０，０００Ｄａ，７５，０００Ｄａ，７０，０００Ｄａ，６５，０００Ｄａ，６０，０００Ｄａ，５５，０００Ｄａ，５０，０００Ｄａ，４５，０００Ｄａ，４０，０００Ｄａ，３５，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａ，２５，０００Ｄａ，２０，０００Ｄａ，１５，０００Ｄａ，１０，０００Ｄａ，９，０００Ｄａ，８，０００Ｄａ，７，０００Ｄａ，６，０００Ｄａ，５，０００Ｄａ，４，０００Ｄａ，３，０００Ｄａ，２，０００Ｄａ，および１，０００Ｄａが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａである。
【００２３】
また、本明細書には、本明細書に記載の非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでいる組成物も記載されている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。また、本明細書には、薬学的に許容可能な担体と、少なくとも１つのアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されたポリペプチドとを含んでいる薬学的組成物も記載されている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、サッカライド部分を含んでいる、いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、サッカライド部分を介して、ポリペプチドと連結している。
【００２４】
また、本明細書には、セレクターコドンを含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞も記載されている。いくつかの実施形態では、上記細胞は、非天然アミノ酸をポリペプチドに置換するための、直交化ＲＮＡシンテターゼおよび／または直交化ｔＲＮＡを含んでいる。いくつかの実施形態では、細胞は細胞培養物であり、別の実施形態では、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類などの多細胞生物の一部である。細胞の実施形態の何れかでは、さらなる実施形態は、非天然アミノ酸ポリペプチドを製造するための、ポリヌクレオチドの発現を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、インビトロにおいて製造される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞ライセートにおいて製造される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、リボソームにおける翻訳によって製造される。
【００２５】
また、本明細書には、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを作製する方法が記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、直交化ＲＮＡシンテターゼ、および／または直交化ｔＲＮＡを含んでいる細胞を、ポリペプチドが発現できる条件下において培養する工程と、上記細胞および／または培地から上記ポリヌクレオチドを精製する工程とを含んでいる。
【００２６】
また、本明細書には、本明細書に記載の非天然アミノ酸のライブラリー、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのライブラリー、または、本明細書に記載の修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドのライブラリー、あるいは、それらを組み合わせたライブラリーが記載されている。また、本明細書には、少なくとも１つの非天然アミノ酸、少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチド、および／または、少なくとも１つの修飾型非天然アミノ酸を含んでいるアレイが記載されている。また、本明細書には、セレクターコドンを含んでおり、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含んでいるアレイが記載されている。本明細書に記載のアレイは、生物における非天然アミノ酸ポリペプチドの製造をスクリーニングするために用いられ得る。このスクリーニングは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を検出するか、または該ポリペプチドの翻訳を検出することにより実施される。
【００２７】
または、本明細書には、本明細書に記載のライブラリーを、所望の活性についてスクリーニングする方法、あるいは、本明細書に記載のアレイを用いて、本明細書に記載のライブラリーをスクリーニングする方法、あるいは、化合物および／またはポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの他のライブラリーを、所望の活性についてスクリーニングする方法が記載されている。また、本明細書には、新規治療剤を開発および発見するためのライブラリーのスクリーニングから得られた上記活性のデータの使用、ならびに、上記治療剤自体が記載されている。
【００２８】
また、本明細書には、ポリペプチドの治療半減期、血中半減期、または循環時間を増加させる方法が記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、天然に生じるポリペプチド中の１つ以上の任意のアミノ酸を少なくとも１つの非天然アミノ酸と置換する工程、および／または、該ポリペプチドに水溶性ポリマーを連結する工程を含んでいる。
【００２９】
また、本明細書には、有効量の薬学的組成物を用いて、治療を必要とする患者を治療する方法が記載されている。該薬学的組成物は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。
【００３０】
本明細書に記載の方法および組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクト、および試薬に限定されるものではなく、変更され得ることを理解されたい。また、本明細書で用いられている専門用語は、特定の実施形態のみを記載するために用いられているのであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本明細書に記載の方法および組成物の範囲の限定を意図していないことを理解されたい。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。
【００３２】
特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の本発明が属する技術における当業者の一人によって、一般的に理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載の方法、装置、および材料と、同等または類似の任意のものを、本明細書に記載の発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を記載する。
【００３３】
本明細書に述べられた全ての出版物および特許は、目下記載される発明に関連して用いられ得る、出版物に記載されたコンストラクトや方法論などを記載および開示することを目的として、それらの全体が参照のために組み込まれる。本明細書において検討された出版物は、本出願の出願日よりも前の開示のみを提供するものである。本明細書では、先行発明の長所または他の如何なる理由によって、本発明らが、上記開示よりも先行している資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
【００３４】
本明細書で用いられるような用語「親和性標識」は、可逆的もしくは不可逆的に別の分子と結合して、これを修飾もしくは破壊するか、またはこれと一緒に化合物を形成する標識のことをいう。例えば、親和性標識には、酵素およびその基質、または抗体およびその抗原が含まれる。
【００３５】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」は、従来の意味において用いられ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子のそれぞれを介して、分子に連結するアルキル基のことをいう。
【００３６】
用語「アルキル」は、それ自体または別の分子の一部として、特に断りの無い限り、炭素原子数が指定された（すなわち、Ｃ１−１０は、１から１０の炭素を意味する）、２価の遊離基および多価の遊離基を含んでいてもよいし、完全飽和、単不飽和、またはポリ不飽和であってもよい、直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素の遊離基（ラジカル）、あるいはそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素の遊離基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、およびシクロプロピルメチル、ならびにｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの同族体と異性体とが挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の２重または３重結合を有しているものである。不飽和アルキル基としては、例えば、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタンジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級同族体および異性体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、下記においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体（「ヘテロアルキル」、「ハロアルキル」および「ホモアルキル」など）を含むことを意味している。
【００３７】
用語「アルキレン」は、それ自体または別の分子の一部として、アルカンから誘導された２価の遊離基を意味し、典型的なものとしては、（−ＣＨ２−）ｎ（ｎは、１から約２４であり得る）が挙げられる。そのような基としては、例えば、１０以下の炭素原子を有する基（−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−など）が挙げられる。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、、一般的に、８以下の炭素原子を有する、鎖がより短いアルキル基またはアルキレン基のことである。また、用語「アルキレン」は、特に断りの無い限り、「ヘテロアルキレン」として以下に記載される基を含むことを意味している。
【００３８】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸、および非天然アミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体のことをいう。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸、ピロリジン、およびセレノシステインである。上記２０の一般アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と基本的な化学構造（例えば、α炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している構造）が同じである化合物のことをいう。上記類似体では、Ｒ基が修飾されていてもよいし（ノルロイシンなど）、またはペプチド骨格が修飾されていてもよいが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造が保たれている。アミノ酸類似体の非限定的な例としては、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどが挙げられる。
【００３９】
アミノ酸が本明細書に示されるときは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）から推薦されている公知の３文字表記、または１文字表記のどちらかが用いられ得る。同様に、ヌクレオチドは、共通に受け入れられている１文字コードにより示され得る。
【００４０】
「アミノ末端修飾基」は、末端アミン基に付着することができる任意の分子のことをいう。例えば、そのような末端アミン基は、高分子の末端に存在し得る。該高分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびポリサッカライドが含まれるが、これらに限定されない。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。例えば、末端修飾基には、ポリエチレングリコール、または血清アルブミンが含まれる。末端修飾基は、高分子の治療特性を修飾する（ペプチドの血中半減期を増加させるなど）ために使用され得る。
【００４１】
「抗体断片」は、全長の形態以外の任意の形態の抗体を意味する。本明細書における抗体断片には、全長の抗体内に存在するより小さい構成要素である抗体、および操作された抗体が含まれる。抗体断片には、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、２重特異性抗体、３重特異性抗体、４重特異性抗体、２官能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、各ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、可変領域、ならびに、代替的な骨格を有する非抗体分子、２特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない（「Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402」）。別の機能的な構造体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一本鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーにより共有的に接続されている免疫グロブリンの重鎖と軽鎖とから構成されているものである（「S-z Huら, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061」）。これらの低分子（Ｍｒ２５，０００）タンパク質は、通常、１ポリペプチド内の抗原に対する特異性と親和性とを保持しており、より大きい抗原特異的分子を構成する有用な基礎的要素となり得る。特に断りの無い限り、用語「抗体」が用いられている記載および請求項は、明らかに「抗体断片」を含んでいる。
【００４２】
本明細書で用いられるような用語「芳香族アミン」は、アミノ部分を含んでいるアリール部分のことをいう。上記アミノ部分には、１級アミン、２級アミン、３級アミン、マスクされたアミン、または保護されたアミンが含まれてもよいが、これらに限定されない。上記３級アミン、マスクされたアミン、または保護されたアミンは、１級アミンまたは２級アミンに変換され得る。また、アミン部分には、アミン部分と同様の化学的特性（化学的反応性など）を有するアミン様部分が含まれてもよい。
【００４３】
本明細書で用いられるような用語「芳香族」または「アリール」は、共役π電子系を有する環を少なくとも１つ有する閉環構造体のことをいい、炭素環式アリール基と複素環式アリール基（あるいは「ヘテロアリール基」または「複素環式芳香族基」）を含んでいる。炭素環式芳香族基または複素環式芳香族基は、５〜２０の環原子を含んでいてもよい。上記用語には、共有結合により連結した単環基、または、融合した多環基（つまり、隣接する１組の炭素原子を共有する環）が含まれる。芳香族基は、置換されていても、あるいは置換されていなくてもよい。「芳香族基」または「アリール基」の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、アントラセニル、およびフェナントラセニルが挙げられる。上記各アリール環系およびヘテロアリール環系のための置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。
【００４４】
要するに、他の用語と組み合わせて用いられるときの用語「芳香族」または「アリール」（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アラルキルが挙げられるが、これらに限定されない）には、上記で定義したようなアリール環およびヘテロアリール環が含まれる。したがって、用語「アラルキル」または「アルカリル」は、アリール基がアルキル基に付着している遊離基を含むことを意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。なお、上記アルキル基（メチレン基が含まれるが、これに限定されない）には、炭素原子がヘテロ原子（酸素原子など）で置換されたアルキル基が含まれる。上記アリール基としては、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
「２官能性リンカー」とも称される「２官能性ポリマー」は、他の部分と特異的に反応して、共有連結または非共有連結を形成することができる２つの官能基を含んでいるポリマーのことをいう。上記部分には、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の側鎖の基、または該天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの側鎖の基が含まれるが、これらに限定されない。例えば、２官能性リンカーでは、一方の官能基は第１ペプチド上の基と反応するものであり、もう一方の官能基は第２ペプチド上の基と反応するものであってもよい。これによれば、第１ペプチド、２官能性リンカーおよび第２ペプチドを含む接合体が形成される。様々な化合物をペプチドに付着させる多くの手法およびリンカー分子は、知られている。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号明細書、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書、米国特許第４，６８０，３３８号明細書、および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照のこと（これらは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。また、「多官能性リンカー」とも称される「多官能性ポリマー」は、他の部分と反応することができる２つ以上の官能基を含んでいるポリマーのことをいう。上記部分には、共有連結あるいは非共有連結を形成するための、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の側鎖の基、または該天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの側鎖の基（アミノ酸の側鎖の基など）が含まれてもよいが、これらに限定されない。２官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さもしくは分子量を有していてもよいし、化合物に連結している１つ以上の分子と、該化合物もしくはそれが結合している分子との間に特定の所望の空間または立体構造を提供するように選択されてもよい。
【００４６】
本明細書で用いられるときの用語「生物学的利用性」は、基質またはその活性部分が、薬剤の形態から送達され、作用部位または全身循環において利用可能になる割合および程度のことをいう。
【００４７】
本明細書で用いられるときの用語「生物活性分子（生物学的に活性な分子）」、「生物活性部分」、または「生物活性剤（生物学的に活性な剤）」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用における任意の物理性質もしくは生物化学性質に影響を与えることができる任意の物質を意味する。上記生物としては、例えば、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特に、本明細書で用いられるような生物活性分子には、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、回復、鎮静、治療、または予防を対象とした任意の物質、あるいは、ヒトまたは動物の身体的もしくは精神的な健康状態を増強するための任意の物質が含まれるが、これらに限定されない。生物活性分子としては、例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法および組成物と一緒に使用するのに適切な生物活性剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および細菌由来の毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で用いられるような用語「生体材料」は、生物に由来する材料のことをいい、例えば、バイオリアクターならびに／または組み換え方法および手法から得られた材料が挙げられるが、これに限定されない。
【００４９】
本明細書で用いられるような用語「生物物理的プローブ」は、分子の構造変化を検出または監視することができるプローブのことをいう。上記分子には、タンパク質が含まれるが、これに限定されない。また、「生物物理的プローブ」は、タンパク質と他の巨大分子との相互作用を検出もしくは監視するために用いられてもよい。生物物理的プローブとしては、例えば、スピン標識、蛍光団、および光活性化可能な基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で用いられるような、「ビオチン模擬体」とも称される用語「ビオチン類似体」は、アビジンおよび／またはストレプトアビジンに高い親和性でもって結合する、ビオチン以外の任意の分子のことである。
【００５１】
用語「カルボキシ末端修飾基」は、末端カルボキシ基に付着することができる任意の分子のことをいう。例えば、そのような末端カルボキシ基は、高分子の末端に存在し得る。該高分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびポリサッカライドが含まれるが、これらに限定されない。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。例えば、末端修飾基には、ポリエチレングリコール、または血清アルブミンが含まれる。末端修飾基は、高分子の治療特性を修飾する（ペプチドの血中半減期を増加させるなど）ために使用され得る。
【００５２】
本明細書で用いられるような「化学的に不安定な基」としても称される用語「化学的に切断可能な基」は、酸、塩基、酸化剤、還元剤、化学的開始剤、またはラジカル開始剤に暴露されることにより、破壊または切断される基のことをいう。
【００５３】
本明細書で用いられるような用語「化学発光性の基」は、加熱を伴わない化学反応の結果、発光する基のことをいう。例えば、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸化剤と、塩基および金属触媒の存在下において反応させることにより、励起状態の産物（３−アミノフタラート（３−ＡＰＡ））が産出される。
【００５４】
本明細書で用いられるような用語「発色団」は、可視の波長、紫外の波長、赤外の波長の光を吸収する分子のことをいう。
【００５５】
本明細書で用いられるような用語「共同因子」は、大分子の作用に必須の原子または分子のことをいう。共同因子には、無機イオン、補酵素、タンパク質、または、酵素の活性に必要な他の因子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、共同因子としては、ヘモグロビン中にあるヘム、クロロフィル中にあるマグネシウム、およびタンパク質にとっての金属イオンが挙げられる。
【００５６】
本明細書で用いられるような「共フォールディング」は、互いに相互作用する少なくとも２つの分子を用いて、折りたたまれていないか、不適切に折りたたまれた分子を、未変性の適切に折りたたまれた分子へ変形させる、処理、反応または方法のことをいう。例えば、「共フォールディング」は、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折りたたまれていないか、不適切に折りたたまれたポリペプチドを、未変性の適切に折りたたまれたポリペプチドへ変形させる処理、反応または方法である。上記ポリペプチドは、天然アミノ酸および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいてもよい。
【００５７】
本明細書で用いられるような「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列を同数の連続的な位置の参照配列とを比較するために用いられる、連続的な位置のうちの何れか１つの区分（セグメント）に関する。そのような連続的な位置には、約２０から約６００の配列ユニット（約５０から約２００の配列ユニットおよび約１０から約１５０の配列ユニットが含まれるが、これに限定されない）から成る群が含まれるが、これらに限定されない。例えば、そのような配列には、配列ユニット（天然アミノ酸および非天然アミノ酸が含まれるが、これに限定されない）を有する、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、およびポリペプチドが含まれる。また、例えば、そのような配列には、対応する配列ユニットであるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドが含まれる。比較のために配列を整列させる方法は、技術的に公知である。比較のための配列の最適な整列を、例えば、（ｉ）「Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c」の局所的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）、（ｉｉ）「Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443」の相同性整列アルゴリズム（homology alignment algorithm）、（ｉｉｉ）「Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444」の類似性方法に関する検索、（ｉｖ）これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（「Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI」におけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、あるいは（ｖ）手動による整列と目視検査と（例えば、「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)」を参照のこと）によって、実施することができる。
【００５８】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために用いられるアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムが挙げられる。これらは、「Altschulら (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」および「Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410」にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを介して、公的に利用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーター、Ｗ、ＴおよびＸにより、整列（アライメント）の感度と速度とが決定される。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２得点集団（「Henikoff & Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」を参照のこと）の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低い複雑性」のためのフィルタを使用することなく実施される。
【００５９】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、２つの配列間における類似性を統計解析することができる（例えば、「Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787」を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムから提供される類似性の尺度の１つは、最小総和確率（Ｐ（Ｎ））である。この最小総和確率は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における適合が偶然に生じる確率を示すものである。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小総和確率が、約０．２未満、約０．０１未満、または約０．００１未満であるならば、核酸は、参照配列と類似していると考えられる。
【００６０】
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、天然および非天然のアミノ酸と天然および非天然核酸配列、ならびにそれらの組み合わせに適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一な天然および非天然のアミノ酸をコードする核酸配列のことか、または天然および非天然の核酸配列が、天然および非天然のアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。例えば、遺伝コードの縮重により、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの何れかにコドンを変化させることができる。このような核酸の変種は「サイレント変種」であり、保存的に修飾された変種の１つである。よって、例えば、天然または非天然のポリペプチドをコードする、本明細書における全ての天然または非天然の核酸配列は、該天然または非天然の核酸のサイレント変種として可能性のある全てのものを表している。当業者の一人は、機能的に同一の分子が得られるように、天然または非天然の核酸における各コドンを修飾することができると認識している（なお、このときのコドンには、ＡＵＧ（メチオニンに対する通常唯一のコドン）およびＴＧＧ（トリプトファンに対する通常唯一のコドン）は除かれる）。したがって、天然および非天然のポリペプチドをコードする天然および非天然の核酸の各サイレント変種は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【００６１】
アミノ酸配列に関して言えば、コードされた配列において１つの天然および非天然のアミノ酸、または数％の天然および非天然のアミノ酸を、変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、上記変更が、化学的に類似のアミノ酸による天然および非天然アミノ酸の置換、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の欠失になるとき、「保存的に修飾されたバリアント」である。機能的に類似の天然アミノ酸を示す保存的な置換の一覧は、技術的に公知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本明細書に記載の方法および組成物における多形態バリアント、種間の同族体、および対立遺伝子に加えられるとともに、それらを排除するものではない。
【００６２】
機能的に類似のアミノ酸を示す保存的な置換の一覧は、当業者に公知である。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる（例えば、「Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition(December 1993))」を参照のこと）：
（１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；ならびに、
（８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
【００６３】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体または他の用語との組み合わせにおいて、特に断らない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環化型を表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルには、飽和環連結、部分的不飽和環連結、および完全不飽和環連結が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子を、ヘテロ環が分子の残部に付着する位置に配置することができる。ヘテロ原子には、酸素、窒素、または硫黄が含まれてもよいが、これらに限定されない。シクロアルキルとしては、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。また、上記用語は、２環構造および３環構造などの多環構造を含んでいる。同様に、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自体または他の分子の一部として、ヘテロシクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、用語「シクロアルキレン」は、それ自体または他の分子の一部として、シクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味する。
【００６４】
本明細書で用いられるような用語「シクロデキストリン」は、少なくとも６つから８つのグルコース分子の環形態から成る環状の炭水化物のことをいう。環の外側の部分は、水溶性基を含んでおり、環の中心には、低分子を収容することができる比較的に非極性の空洞が形成されている。
【００６５】
本明細書で用いられるような用語「細胞毒性」は、細胞を害する化合物のことをいう。
【００６６】
本明細書で用いられるような「変性剤」は、ポリマーの可逆的なアンホールディングを引き起こす任意の化合物または材料のことをいう。例えば、「変性剤」は、タンパク質の可逆的なアンフォールディングを引き起こしてもよい。変性剤の強さは、特定の変性剤の性質と濃度との両方により決定される。変性剤としては、例えば、カオトロピック性物質、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、またはそれらの組み合わせが挙げられる。適切なカオトロピック性物質としては、例えば、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。界面活性剤には、例えば、強界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエステル（ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎといった界面活性剤など）、またはサルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）など）、非イオン性の弱い界面活性剤（ジギトニンなど）、陽イオン性の弱い界面活性剤（Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなど）、イオン性の弱い界面活性剤（コール酸ナトリウム、またはデオキシコール酸ナトリウムなど）、あるいは、両性イオン性の界面活性剤（スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）、および３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）など）が含まれてもよいが、これらに限定されない。有機溶媒および水混和性溶媒には、例えば、特に限定されないが、アセトニトリル、低級アルカノール（特にＣ２−Ｃ４のアルカノール（エタノールまたはイソプロパノールなど））、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２−Ｃ４のアルカンジオール（エチレングリコールなど）が含まれており、これらを、変性剤として用いてもよい。リン脂質としては、例えば、天然に生じるリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールなど）、または合成リン脂質誘導体もしくはバリアント（ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書に用いられるような用語「検出可能な標識」は、分析技術を用いて、観察可能であってもよい標識のことをいう。なお、分析技術としては、例えば、蛍光、化学発光、電子スピン共鳴、紫外／可視吸収分光法、質量分析法、核磁気共鳴、磁気共鳴、および電気化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書に用いられるような用語「ジカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−Ｃ（Ｓ）−から選択される少なくとも２つの部分を含んでいる基のことをいい、例えば、１，２−ジカルボニル基、１，３−ジカルボニル基、および１，４−ジカルボニル基、ならびに、少なくとも１つのケトン基、および／または少なくとも１つのアルデヒド基、および／または少なくとも１つのエステル基、および／または少なくとも１つのカルボン酸基、および／または少なくとも１つのチオエステル基を含んでいる基が挙げられるが、これらに限定されない。上記ジカルボニル基には、ジケトン、ケトアルデヒド、ケト酸、ケトエステル、およびケトチオエステルが含まれる。また、上記基は、直鎖状分子、分枝状分子、または環状分子の一部であってもよい。
【００６９】
本明細書で用いられるような用語「薬物」は、疾病または病気の予防、診断、緩和、治療、または回復に用いられる任意の物質のことをいう。
【００７０】
本明細書で用いられるような用語「色素」は、発色団を含んでいる、可溶性で着色性の物質のことをいう。
【００７１】
本明細書で用いられるような用語「有効量」は、投与される化合物または薬剤の量であって、治療される疾病または病気の１つ以上の症状をある程度軽減するのに十分な量のことをいう。この結果、疾病の兆候、症状もしくは原因の減少および／または緩和、あるいは生物系における他の任意の所望の変化がもたらされる。投与される薬剤または化合物は、特に限定されないが、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる。予防、増強、および／または治療的処置のために、上記天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物を投与することができる。任意の個々の場合における適切な「有効」量を、用量増加試験などの技術を用いて、決定してもよい。
【００７２】
本明細書で用いられるような用語「電子密度の高い基」は、電子ビームが照射されたときに、電子を散乱する基のことをいう。そのような基には、モリブデン酸アンモニウム、次硝酸ビスマスヨウ化カドミウム、９９％、カルボヒドラジド、塩化第２鉄６水和物、ヘキサメチレンテトラミン、９８．５％、無水インジウム３塩化物、硝酸ランタン、酢酸鉛３水和物、クエン酸鉛３水和物、硝酸鉛、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、リンタングステン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、プロテイン銀ストロング（Ａｇ含有量：８．０−８．５％）、シルバーテトラフェニルポリフィリン（Ｓ−ＴＰＰＳ）、塩化金酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド（ＴＳＣ）、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、および硫酸バナジルが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書で用いられるような「エネルギー伝達剤」は、別の分子からエネルギーを寄与または受容することができる分子のことをいう。例えば、蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）は、蛍光ドナー分子の励起状態のエネルギーが、非励起状態のアクセプター分子に非照射的に移転された後、該アクセプター分子が、寄与されたエネルギーをより長波長の蛍光として放出するという、双極子間作用である。
【００７４】
「増強する」または「増強」は、所望の効果を効力または持続時間について、増加もしくは延長することを意味する。例えば、治療剤の効果を「増強すること」は、疾病、疾患または病気の治療の間に、治療剤の効果を効力または持続時間について、増加もしくは延長できることをいう。本明細書で用いられるような「増強有効量」は、疾病、疾患または病気の治療のときに、治療剤の効果を増強するのに十分な量のことをいう。患者に使用される場合、この使用に関する有効量は、疾病、疾患または病気の重症度および治療単位（ｃｏｕｒｓｅ）、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。
【００７５】
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統発生領域（phylogenetic domain）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物のことをいう。真核生物としては、例えば、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類など）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物および藻類など）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫目、および原生生物などが挙げられる。
【００７６】
本明細書で用いられるような用語「脂肪酸」は、約Ｃ６以上の長さの炭化水素の側鎖を有するカルボン酸のことをいう。
【００７７】
本明細書で用いられるような用語「蛍光団」は、励起によって光子を放出することにより、蛍光を放つ分子のことをいう。
【００７８】
本明細書で用いられるような用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」、および「化学反応部分」は、化学反応が起こる分子の一部またはユニットのことをいう。上記用語は、化学技術的にある程度同義であり、ある機能または活性を行使するとともに、他の分子と反応する分子の一部を示すために本明細書において用いられる。
【００７９】
用語「ハロゲン」には、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が含まれる。
【００８０】
本明細書で用いられるような用語「ハロアシル」は、ハロゲン部分を含んでいるアシル基のことをいい、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書で用いられるような用語「ハロアルキル」は、ハロゲン部分を含んでいるアルキル基のことをいい、例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアルキル」は、アルキル基および少なくとも１つのヘテロ原子から成る直鎖状、分枝状または環状の炭化水素遊離基、あるいはそれらの組み合わせのことをいう。上記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳから成る群から選択される原子である。なお、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてもよいし、ヘテロ原子である窒素原子は、必要に応じて４級化されていてもよい。ヘテロ原子であるＯ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、または、アルキル基が分子の残部と付着する位置に配置されてもよい。例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３，−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３，−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３，−ＣＨ２−ＣＨ２，−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３，−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３，−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３，−Ｓｉ（ＣＨ３）３，−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３，および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、２以下のヘテロ原子は、隣接していてもよく、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３が挙げられる。
【００８３】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキルに由来する２価の遊離基のことをいい、例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基では、同一のまたは異なるヘテロ原子を、鎖の末端の一方または両方に配置することができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの連結基では、連結基の配向性は、連結基の一般式が書かれた方向によって示されるわけではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【００８４】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアリール」または「複素環式芳香族」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を少なくとも１つ含んでいるアリール基のことをいう。なお、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてもよいし、ヘテロ原子である窒素原子は、必要に応じて４級化されていてもよい。ヘテロアリール基は、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着していてもよい。ヘテロアリール基としては、例えば、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。
【００８５】
本明細書で用いられるような用語「ホモアルキル」は、炭化水素基であるアルキル基のことをいう。
【００８６】
本明細書で用いられるような用語「同一」は、同じである２つ以上の配列またはサブ配列に関する。また、本明細書で用いられるような用語「実質的に同一」は、配列を、（ｉ）比較ウィンドウに対して最も対応するように比較および整列させたとき、あるいは、（ｉｉ）（ａ）比較アルゴリズムを用いるか、もしくは（ｂ）手動による整列と目視検査とによって、測定されるような指定領域について比較および整列させたとき、同じである配列ユニットについてある百分率を有する２つ以上の配列に関する。例えば、配列ユニットが、指定領域に渡って、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一であるならば、２つ以上の配列は「実質的に同一」であり得る。そのような百分率は、２つ以上の配列の「同一性の百分率」を記載するものである。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５−１００の配列ユニットである領域に渡って、または長さが約５０の配列ユニットである領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、配列全体に渡って、存在し得る。また、この定義は、試験配列の相補体にも関する。例えば、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が同じであるとき、同一であり、また、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が、指定領域に渡って、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一であるならば、「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５−１００アミノ酸である領域に渡って、または長さが約５０アミノ酸である領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、ポリペプチド配列の配列全体に渡って、存在し得る。また、例えば、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じであるとき同一であり、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が、指定領域に渡って、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一であるならば、「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５−１００の核酸である領域に渡って、または長さが約５０の核酸である領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、ポリヌクレオチド配列の配列全体に渡って、存在し得る。
【００８７】
配列比較では、通常、１つの配列を、試験配列が比較される参照配列として採用する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列と参照配列とを、コンピューターに入力し、必要であればサブ配列の座標を指定してから、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムの初期パラメーターを用いてもよいし、あるいは、代わりのパラメーターを設定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【００８８】
本明細書で用いられるような「挿入基」とも称される用語「挿入剤」は、分子の分子内空間、または分子間の分子内空間に、挿入することができる化学物質のことをいう。例えば、挿入剤または挿入基は、ＤＮＡの２重螺旋の積層された塩基へと挿入する分子であってもよい。
【００８９】
本明細書で用いられるような用語「単離」は、興味のある構成要素の、興味の無い構成要素からの分離または除去をいう。単離された物質は、乾燥状態もしくは半乾燥状態のどちらか、または溶液（水溶液など）に対して溶解した状態であってもよい。単離された構成要素は、均質な状態であってもよいし、あるいは単離された構成要素は、薬理学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでいる薬学的組成物の一部であってもよい。純度と均質性とは化学的技術を用いて決定され得る。該化学的技術としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、興味のある構成要素が単離され、調製物に優勢種として存在するとき、該構成要素は、実質的に精製されているとして本明細書に記載される。本明細書で用いられるような用語「精製」は、興味のある構成要素の純度が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上であることに関してもよい。例えば、核酸またはタンパク質が、天然の状態において結合している細胞の構成要素の少なくともいくつかから遊離しているとき、または、核酸もしくはタンパク質が、それらのインビボまたはインビトロの産物の濃度よりも高く濃縮されているとき、該核酸またはタンパク質は単離されているといえる。また、例えば、遺伝子は、該遺伝子に隣接し、興味のある遺伝子以外のタンパク質をコードする翻訳領域から分離されているとき、単離されているといえる。
【００９０】
本明細書で用いられるような用語「標識」は、化合物の物理的分布を検出および／または監視することができるために、化合物に組み込まれ、容易に検出される物質のことをいう。
【００９１】
本明細書で用いられるような用語「連結」は、リンカーの官能基と別の分子との間の化学反応から形成された、結合もしくは化学部分のことをいう。上記結合には、共有連結および非共有結合が含まれてもよいが、これらに限定されない。また、上記化学部分には、エステル、カーボネート、イミン、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルソエステル、ペプチド連結、およびオリゴヌクレオチド連結が含まれてもよいが、これらに限定されない。加水分解に安定な連結は、連結が実質的に水中において安定であり、（例えば、長期間、ことによると無期限の生理的条件下において）有用なｐＨ値において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の連結は、連結が水中または水溶液中（例えば、血液）において分解可能であることを意味する。酵素に不安定または分解性の連結は、連結が１つ以上の酵素により分解され得ることを意味する。例えば、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、分解性の連結を、ポリマーの骨格、またはポリマーの骨格と該ポリマー分子の末端にある１つ以上の官能基との間のリンカー基に含んでいてもよい。そのような分解性の連結には、ＰＥＧカルボン酸または活性型ＰＥＧカルボン酸と生物活性剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル連結が含まれるが、これに限定されない。上記エステル基は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物活性剤を放出するものである。他の加水分解可能な連結としては、例えば、カーボネート連結、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン連結、アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル連結、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン連結、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール連結、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル連結、（例えば、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とにより形成されるペプチド連結、および（例えばポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（phosphoramidite）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とにより形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。
【００９２】
本明細書で用いられるような「培養基」は、細胞ならびに／あるいは該細胞から発現および／または分泌された産物の、成長や収集に用いられる任意の培地のことをいう。そのような「培養基」には、任意の宿主細胞を支持し得るまたは含み得る、溶液、固体、半固体、または剛性の支持体が含まれるが、これらに限定されない。また、上記宿主細胞には、例えば、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳類の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物の宿主細胞、E. coliまたはPseudomonasの宿主細胞、および細胞含有物が挙げられる。上記「培養基」は、特に限定されないが、宿主細胞が成長し、ポリペプチドが分泌された培養基を包含している。さらに、そのような培養基は、増幅工程の前もしくは後の培養基を含んでいる。また、上記「培養基」には、宿主細胞のライセートを含むバッファまたは試薬が包含される。例えば、細胞内に製造されたポリペプチドおよび宿主細胞は、該ポリペプチドが放出されるために、溶解または破壊される。
【００９３】
本明細書で用いられるような用語「代謝産物」は、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドが、代謝されたときに形成される、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの誘導体のことをいう。用語「活性型代謝産物」は、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドが、代謝されたときに形成される、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの活性型誘導体のことをいう。
【００９４】
本明細書で用いられるような用語「代謝」は、生物が特定の物質を変化させるための過程の総体に関する。そのような過程には、加水分解反応、および酵素により触媒される反応が含まれるが、これらに限定されない。代謝についてのさらなる情報は、「The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)」から入手され得る。例えば、（１）天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを、宿主に投与して、該宿主からの組織試料を分析するか、あるいは、（２）天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを、インビトロにおいて肝細胞と一緒にインキュベートして、生じた化合物を分析することによって、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾型天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの代謝産物を同定してもよい。
【００９５】
本明細書で用いられるような用語「金属キレート剤」は、金属と一緒に金属錯体を形成する分子のことをいう。例えば、そのような分子は、中心の金属イオンと２以上の配位結合を形成してもよいし、さらに環構造を形成してもよい。
【００９６】
本明細書で用いられるような用語「金属含有部分」は、金属イオン、金属原子または金属粒子を含む基のことをいう。そのような部分には、シスプラチン、キレートされた金属イオン（ニッケル、鉄およびプラチナなど）、および金属ナノ粒子（ニッケル、鉄、およびプラチナなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
本明細書で用いられるような用語「重原子を組み込んでいる部分」は、通常は、炭素よりも重い原子のイオンを組み込んでいる基のことをいう。そのようなイオンまたは原子には、シリコン、タングステン、金、鉛、およびウランが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書で用いられるような用語「修飾（または修飾型）」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドに変更が存在することをいう。天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドを合成後に修飾することによって、あるいは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドを翻訳後に修飾することによって、そのような変更または修飾を得てもよい。「（修飾型）」の形態は、話題になっている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが、必要に応じて修飾されていること、つまり、話題としている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが、修飾されていてもよいし、もしくは修飾されていなくてもよいということを意味する。
【００９９】
本明細書で用いられるような用語「調節された血中半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾型生物活性分子の循環半減期における正の変化または負の変化のことをいう。例えば、修飾型生物活性分子としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、血中半減期は、生物活性分子または修飾型生物活性分子を投与した後の様々な時点の血液試料を採取して、各試料における上記生物活性分子または修飾型生物活性分子の濃度を決定することにより測定される。血清中の濃度と時間との相互関係から、血中半減期を計算することができる。例えば、調節された血中半減期は、投与計画を改善すること、または毒性効果を避けることが可能になり得るように、血中半減期が増加されていてもよい。血清におけるそのような増加は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。
【０１００】
本明細書で用いられるような用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾型生物活性分子の治療的有効量の半減期の正の変化または負の変化のことをいう。例えば、修飾型生物活性分子としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。治療半減期は、投与後の様々な時点における上記分子の薬物動態学的性質および／または薬力学的性質を測定することにより測定される。治療半減期が増加すると、特定の有利な投与計画もしくは特定の有利な総用量を利用することや、あるいは、望ましくない効果を避けることができる。例えば、治療半減期の増加は、効力の増加、標的に対する修飾された分子の結合の増加もしくは減少、未修飾の分子における作用の別のパラメーターまたは機構の増加もしくは減少、あるいは酵素（プロテアーゼなど）による分子の破壊の増加もしくは減少に起因する。
【０１０１】
本明細書で用いられるような用語「ナノ粒子」は、粒径が約５００ｎｍから約１ｎｍである粒子のことをいう。
【０１０２】
本明細書で用いられるような用語「ほぼ化学量論的」は、非天然アミノ酸ポリペプチドの芳香族アミンの側鎖における水素の数に対する、化学反応に参加している化合物のモル比が、約０．７５〜約１．５であることをいう。例えば、１級の芳香族アミンは、水素を２つ有しており、２級アミンは水素を１つ有している。
【０１０３】
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統発生領域の真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidaなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または、系統発生領域の古細菌(例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など)など)に属していてもよい。
【０１０４】
「非天然アミノ酸」は、２０の一般アミノ酸のうちの１つ、セレノシステイン、もしくはピロリジンではないアミノ酸のことをいう。用語「非天然アミノ酸」と同義的に用いてもよい他の用語は、「非天然にコードされたアミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「非天然に生じたアミノ酸」、およびそれらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。用語「非天然アミノ酸」には、天然にコードされたアミノ酸（２０の一般アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが含まれるが、これらに限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって天然に生じるが、それ自体は翻訳複合体により成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸が含まれるが、これに限定されない。天然にコードされていない天然に生じるアミノ酸としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用語「非天然アミノ酸」には、天然に生じないが、合成によって入手され得るか、もしくは非天然アミノ酸の修飾によって入手され得るアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または２本鎖の形態のポリマーのことをいう。例えば、上記核酸および核酸のポリマーには、（ｉ）参照核酸と同様の結合性質を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの類似体、（ｉｉ）、オリゴヌクレオチドの類似体（ＰＮＡ；ペプチド核酸（peptidonucleic acid））、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホチオエート、およびホスホロアミデートなど）（ｉｉｉ）それらの保存的に修飾されたバリアント（縮重コドンの置換体など）、相補的配列、および明確に示された配列、が含まれるが、これらに限定されない。例えば、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより、縮重コドンの置換体を得ることができる（「Batzerら Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)」、「Ohtsukaら J. Biol. Chem. 260:2605- 2608 (1985)」および、「Rossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)」）。
【０１０６】
本明細書で用いられるような用語「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる、化合物または材料のことをいう。例えば、酸化剤には、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（oxidized erythreitol）、および酸素が含まれるが、これらに限定されない。多種多様な酸化剤が、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適切であることは、当業者に、直ちに明らかである。
【０１０７】
本明細書で用いられるような用語「光親和性標識」は、露光されることにより、標識が親和性の対象とする分子と連結を形成する基を有する標識のことをいう。例えば、上記連結は、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。
【０１０８】
本明細書で用いられるような用語「光ケージド部分」は、ある波長光が照射されることにより、他のイオンまたは分子と共有結合または非共有結合する基のことをいう。
【０１０９】
本明細書で用いられるような用語「光切断可能な基」は、露光されることにより、破壊される基のことをいう。
【０１１０】
本明細書で用いられるような用語「光架橋剤」は、露光されることにより、２つ以上の単量体分子または多量体分子と反応して共有連結または非共有連結を形成する、２つ以上の官能基を含んでいる化合物のことをいう。
【０１１１】
本明細書で用いられるような用語「光異性体化可能な部分」は、光の照射により、ある異性体から別の異性体へ変化する基のことをいう。
【０１１２】
本明細書で用いられるような用語「ポリアルキレングリコール」は、直鎖状または分枝状のポリエーテルポリオール重合体（polymeric polyether polyol）のことをいう。そのようなポリアルキレングリコールには、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。他の典型的な実施形態は、例えば、商業的な供給業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”(2001)」など）に記載されている。例えば、上記ポリエーテルポリオール重合体の平均分子量は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間である。例えば、上記ポリエーテルポリオール重合体には、特に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間が含まれる。上記ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ，９０，０００Ｄａ，８５，０００Ｄａ，８０，０００Ｄａ，７５，０００Ｄａ，７０，０００Ｄａ，６５，０００Ｄａ，６０，０００Ｄａ，５５，０００Ｄａ，５０，０００Ｄａ，４５，０００Ｄａ，４０，０００Ｄａ，３５，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａ，２５，０００Ｄａ，２０，０００Ｄａ，１５，０００Ｄａ，１０，０００Ｄａ，９，０００Ｄａ，８，０００Ｄａ，７，０００Ｄａ，６，０００Ｄａ，５，０００Ｄａ，４，０００Ｄａ，３，０００Ｄａ，２，０００Ｄａ，１，０００Ｄａ，９００Ｄａ，８００Ｄａ，７００Ｄａ，６００Ｄａ，５００Ｄａ，４００Ｄａ，３００Ｄａ，２００Ｄａ，および１００Ｄａが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態では、上記ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、上記ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、上記ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、上記ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、上記ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ポリマーである。分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（１００，０００Ｄａ，９５，０００Ｄａ，９０，０００Ｄａ，８５，０００Ｄａ，８０，０００Ｄａ，７５，０００Ｄａ，７０，０００Ｄａ，６５，０００Ｄａ，６０，０００Ｄａ，５５，０００Ｄａ，５０，０００Ｄａ，４５，０００Ｄａ，４０，０００Ｄａ，３５，０００Ｄａ，３０，０００Ｄａ，２５，０００Ｄａ，２０，０００Ｄａ，１５，０００Ｄａ，１０，０００Ｄａ，９，０００Ｄａ，８，０００Ｄａ，７，０００Ｄａ，６，０００Ｄａ，５，０００Ｄａ，４，０００Ｄａ，３，０００Ｄａ，２，０００Ｄａおよび１，０００Ｄａが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの間である。
【０１１３】
本明細書で用いられるような用語「ポリマー」は、繰り返されているサブユニットから構成される分子のことをいう。そのような分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライド、またはポリアルキレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーのことをいい、これら用語は本明細書では同義で用いられる。つまり、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、また、その逆の場合もあり得る。上記用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマーだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。また、上記「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」には、アミノ酸残基がペプチド結合により連結されている、アミノ酸鎖の長さが任意のもの（例えば全長のタンパク質）が含まれる。
【０１１５】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然アミノ酸が翻訳によりペプチド鎖に組み込まれた後に生じる、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾のことをいう。そのような修飾には、インビボの共翻訳修飾、インビトロの共翻訳修飾（無細胞翻訳系など）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書で用いられるような用語「プロドラッグ」は、インビボまたはインビトロにおいて親薬物へと変換される薬剤のことをいう。上記プロドラッグの利点としては、（ｉ）親薬物と比べて投与が容易であること、（ｉｉ）プロドラッグは、経口投与されることによって、生物的に利用できることがあるが、親薬物はそうではないこと、ならびに（ｉｉｉ）プロドラッグは、親薬物と比べて、薬学的組成物における溶解度が改善されていることなどが挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグには、活性型薬物の薬理学的に不活性な誘導体、または活性型薬物の活性が減少している誘導体が含まれる。生理化学的性質、生物薬剤学的性質、薬物動態学的性質などの薬物の性質を操作することによって、所望の作用部位に到達する薬物または生物活性分子の量が調節されるように、生物活性プロドラッグを設計してもよい。プロドラッグは、酵素反応または非酵素反応を経て、体内で活性化薬物に変換される。プロドラッグの生理化学的性質は、改善されていもよい。例えば、プロドラッグの溶解度が向上されていてもよいし、送達特性が増強されていてもよいし（例えば、特定の細胞、組織、臓器、または配位子を特異的に標的としてもよい）、薬物の治療的価値が改善されていてもよい。
【０１１７】
本明細書で用いられるような用語「予防的有効量」は、治療される疾病、病気または疾患の症状の１つ以上をある程度、軽減し得る、少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチド、または少なくとも１つの修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物の患者に適用される量のことをいう。そのような予防的適用では、そのような量は、患者の健康状態および体重などに依存し得る。当業者は、上記予防的有効量を、定石の実験（用量増加臨床試験など）により決定すると考えられる。
【０１１８】
本明細書で用いられるような用語「保護」は、「保護基」、すなわち、ある反応条件下において化学的に反応性の官能基（化学反応官能基）の反応を阻止する部分が存在することをいう。保護される化学反応基の種類に依存して、保護基は変更され得る。例えば、（ｉ）化学反応基がアミンまたはヒドラジドである場合、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成る群から選択されてもよいし、（ｉｉ）化学反応基がチオールである場合、保護基は、オルソピリジルジスルフィドであってもよいし、（ｉｉｉ）化学反応基がカルボン酸（ブタン酸またはプロピオン酸など）またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）であってもよい。
【０１１９】
例えば、封鎖基／保護基は、以下の化合物から選択されてもよい。
【０１２０】
【化１】
2009519942.tif 000002
また、保護基には、感光性基（ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃなど）、および技術的に公知の他の保護基が含まれるが、これらに限定されない。他の保護基は、「Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999」に記載されている。なおこの文献の全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
本明細書で用いられるような用語「放射性部分」は、自発的に放射線を放つ核を有する基のことをいう。上記放射線は、ヘリウムの核であるアルファ粒子、電子であるベータ粒子、または高エネルギー光子であるガンマ粒子などである。
【０１２２】
本明細書で用いられるような用語「反応性化合物」は、適切な条件下において、別の原子、分子または化合物と反応性である化合物のことをいう。
【０１２３】
「宿主細胞」とも称される用語「組み換え宿主細胞」は、外因性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞のことをいう。外因性のポリヌクレオチドを細胞に挿入するために用いられる方法としては、特に限定されないが、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配、または組み換え宿主細胞を作成する技術的に公知の他の方法などが挙げられる。例えば、そのような外因性のポリヌクレオチドは、非統合型のベクター（プラスミドなど）であってもよいし、あるいは、宿主のゲノムに統合されるものであってもよい。
【０１２４】
本明細書で用いられるような「酸化還元活性化剤」は、別の分子を酸化または還元する分子のことをいう。なお、別の分子の酸化または還元により、酸化還元活性化剤は、還元または酸化される。例えば、酸化還元活性化剤は、フェロセン、キノン、Ｒｕ２＋／３＋錯体、Ｃｏ２＋／３＋錯体、およびＯｓ２＋／３＋錯体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本明細書で用いられるような用語「還元剤」は、還元される化合物に電子を追加することができる化合物もしくは材料のことをいう。還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、スルヒドリル基を還元状態に維持し、分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させるために、上記還元剤を用いてもよい。
【０１２６】
本明細書で用いられるような「リフォールディング」は、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、未変性の立体構造もしくは適切に折りたたまれた立体構造に変形させる任意の処理、反応または方法のことを記述するものである。例えば、リフォールディングによって、ジスルフィド結合含有ポリペプチドは、ジスルフィド結合に関して、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、未変性の立体構造もしくは適切に折りたたまれた立体構造に変形させられる。上記ジスルフィド結合含有ポリペプチドは、天然アミノ酸ポリペプチドであってもよいし、非天然アミノ酸ポリペプチドであってもよい。
【０１２７】
本明細書で用いられるような用語「樹脂」は、高分子量で不溶性のポリマービーズのことをいう。例えば、そのようなビーズを、固相ペプチド合成の支持体として、あるいは精製前に分子が付着する部位として用いてもよい。
【０１２８】
本明細書で用いられるような用語「サッカライド」は、一連の炭水化物のことをいい、例えば、糖、モノサッカライド、オリゴサッカライド、およびポリサッカライドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
本明細書で用いられるような語句「〜に対する選択的なハイブリダイズ」または「〜に対する特異的なハイブリダイズ」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下において、特定のヌクレオチド配列にのみ、分子が結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。
【０１３０】
本明細書で用いられる用語「スピン標識」は、電子スピン共鳴分光法により検出することができ、別の分子に付着することができる、不対の電子スピンを示す原子または原子の基（すなわち安定な常磁性の基）を含んでいる分子のことをいう。そのようなスピン標識分子には、ニトリル遊離基、または窒素酸化物が含まれるが、これらに限定されない。また、上記スピン標識は、シングルスピン標識であってもよいし、ダブルスピン標識であってもよい。
【０１３１】
本明細書で用いられるような用語「化学量論的」は、非天然アミノ酸ポリペプチドの芳香族アミンの側鎖における水素の数に対する、化学反応に参加している化合物のモル比が、約０．９〜約１．１であることをいう。例えば、１級の芳香族アミンは、水素を２つ有しており、２級アミンは水素を１つ有している。
【０１３２】
本明細書で用いられるような用語「化学量論様」は、反応条件または添加物の存在の変化により、化学量論的または略化学量論的になる化学反応のことに関する。上記反応条件の変化には、温度の上昇、またはｐＨの変化が含まれるが、これらに限定されない。上記添加剤には、促進剤が含まれるが、これに限定されない。
【０１３３】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」は、低イオン強度および高温度の条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または他の核酸模擬体、あるいはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションのことをいう。例えは、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）中のプローブが標的とするサブ配列とハイブリダイズし得るが、該複合混合物中の他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存する。また、環境が異なれば、ストリンジェントな条件も異なる。例えば、配列が長くなるほど、特異的にハイブリダイズするための温度は高くなる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件には、（ｉ）既定のイオン強度とｐＨとにおいて、特異的な配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低いこと、（ｉｉ）ｐＨが約７．０から約８．３であるときに、塩濃度が約０．０１Ｍから約１．０Ｍであり、温度が、短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチドのプローブ）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドよりも長いプローブ）については少なくとも約６０℃であること、（ｉｉｉ）ホルムアミドなどの不安定化剤の添加、（ｉｖ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳにおいて、４２℃でインキュベーションするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において、６５℃で、約５分から約１２０分の間洗浄することが含まれるが、これらに限定されない。例えば、バックグラウンドに対して陽性シグナルが少なくとも約２倍であるとき、選択的もしくは特異的なハイブリダイゼーションが検出できたといえるが、これに限定されない。核酸のハイブリダイゼーションの豊富な指針は、「Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, ‘Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays’ (1993)」に見られる。
【０１３４】
本明細書で用いられるような用語「被検体」は、治療、観察もしくは実験の対象である動物のことをいう。例えば、被検体は、ヒトなどを含む哺乳類であってもよいが、これに限定されない。
【０１３５】
本明細書で用いられるような用語「実質的な精製」は、普通は精製前の興味のある構成要素と付いているか、または相互作用している他の構成要素から、興味のある構成要素が実質的もしくは本質的に遊離していてもよいことをいう。例えば、興味のある構成要素の調製物が、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の不純な構成要素を含んでいるとき、「実質的に精製された」といってもよい。したがって、「実質的に精製された」興味のある構成要素は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の純度を有していてもよい。例えば、組み換え技術により製造される天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの場合、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、自然の細胞または宿主細胞から精製されてもよい。天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、調製物が（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満の不純物を含んでいるとき、「実質的に精製された」といってもよい。例えば、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、宿主細胞によって組み換え製造されるとき、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％またはそれ以下で存在していてもよい。例えば、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、宿主細胞によって組み換え製造されるとき、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、培地に、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約ｌｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約ｌ０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌまたはそれ以下で存在していてもよい。例えば、「実質的に精製された」天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、またはそれ以上の純度を有していてもよい。上記純度は、特に限定されないが、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって、決定される。
【０１３６】
「不干渉性置換基」とも称される用語「置換基」は、分子上の別の基を置き換えるために用いられ得る。そのような基には、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ５−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ５−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ５−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルフォニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ｍは１から８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環遊離基、置換複素環遊離基、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルキルチオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（各ｍは１〜８である）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。上記の各Ｒ基には、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、あるいはアルカリルが含まれるが、これらに限定されない。置換基が、左から右に書くという従来の化学式により記載されている場合、該置換基は、右から左に書かれた構造に由来する化学的に同一の置換基を同じく含んでいる。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同じである。
【０１３７】
例えば、アルキルおよびヘテロアルキル遊離基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとして称される基など）のための置換基には、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、および−ＮＯ２が含まれるが、これらに限定されない。上記の各Ｒ基には、水素、置換または非置換のヘテロアルキル基、置換または非置換のアリール基（１−３のハロゲンで置換されたアリール基など）、置換あるいは非置換のアルキル基、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基またはアラルキル基が含まれるが、これらに限定されない。２つのＲ基が同じ窒素原子に付着しているとき、それらは窒素原子と結合して、５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ２は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルなどを包含することを意味する。
【０１３８】
例えば、アリール基およびヘテロアリール基のための置換基には、特に限定されないが、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルが含まれ、上記置換基の数は、０から芳香環系の開放原子価の総数の範囲である。上記の各Ｒ基には、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールおよびヘテロアリールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
本明細書で用いられるような用語「治療的有効量」は、疾病、病気もしくは疾患をすでに患っている患者に投与される、少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチド、および／または少なくとも１つの修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物の量であって、治療される上記疾病、病気もしくは疾患の症状の１つ以上を回復するか、該症状の進行を少なくとも部分的に停止するか、あるいは該症状をある程度緩和するのに十分な量のことをいう。上記組成物の有効性は、状態（疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性など）、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。例えば、治療的有効量を、定石の実験（用量増加臨床試験など）により決定してもよい。
【０１４０】
本明細書で用いられるような用語「チオアルコキシ」は、酸素原子を介して分子に連結する硫黄含有アルキル基のことをいう。
【０１４１】
用語「熱融解温度」またはＴｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度において）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
【０１４２】
本明細書で用いられるような用語「毒性部分」は、危害または死をもたらし得る化合物のことをいう。
【０１４３】
本明細書で用いられるような用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾病または病気の症状の軽減、柔和もしくは改善、さらなる症状の予防、症状の根本的な代謝の原因の改善もしくは予防、疾病もしくは病気の阻害（例えば、疾病もしくは病気の発達の抑制）、疾病もしくは病気の緩和、疾病もしくは病気の回復の誘導、疾病もしくは病気によって引き起こされた状態の緩和、あるいは疾病もしくは病気の症状の停止が含まれる。用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」には、予防的処置および／または治療的処置などが含まれる。
【０１４４】
本明細書で用いられるような用語「水溶性ポリマー」は、水溶性の溶媒に可溶性である任意のポリマーのことをいう。そのような水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポチエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそれらのＣ１−Ｃ１０のモノアルコキシもしくはモノアリールオキシ誘導体（これらは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（デキストラン  サルフェートなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンの断片、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、血清アルブミン、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（aspartamide）など、ならびに、それらの混合物が挙げられる。例えば、そのような水溶性ポリマーを天然アミノ酸ポリペプチドもしくは非天然アミノ酸ポリペプチドに連結させることにより、例えば、以下のような変化が生じる。すなわち、未修飾の形態のものと比べたときの血中半減期の増加もしくは調節または治療半減期の増加もしくは調節、免疫原性の調節、物理的会合特性（凝集および多量体形成など）の調節、受容体結合性の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合性の変更、および、受容体の２量体化および多量体化の変更など。また、上記水溶性ポリマーは、それ自体生物活性を有していても、有していなくてもよい。
【０１４５】
他に指示しない限り、当業者に公知の質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来方法が採用される。
【０１４６】
本明細書に示された化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）には、同位体で標識された化合物が含まれる。この同位体で標識された化合物は、１つ以上の原子が、天然に一般的に発見される原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する原子で置換されていることを除いて、本明細書に示された様々な式および構造にて詳述されている化合物と同一である化合物のことである。本化合物に組み込まれ得る同位体には、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、および塩素の同位体が含まれ、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなどが挙げられる。本明細書に記載の特定の同位体で標識された化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）は、組織分布アッセイの基質および／または薬物に有用である。さらに、重水素（つまり２Ｈ）などの同位体で置換することにより、インビボの半減期の増加もしくは必要用量の減少などの代謝安定性が向上し、これによって、特定の治療的利点を得ることができる。
【０１４７】
本明細書における化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）のいくつかは、不斉炭素を有しているため、鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在することができる。ジアステレオマーの混合物を、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶などの公知の方法により、物理化学的な違いに基づいて、それぞれのジアステレオマーに分けることができる。鏡像異性体の混合物を適切な光活性化合物（アルコールなど）と反応させて、該混合物をジアステレオマーの混合物に変換し、ジアステレオマーを分けてから、それぞれのジアステレオマーを対応する純粋な鏡像異性体に変換する（例えば加水分解する）ことにより、鏡像異性体を分けることができる。全ての上記異性体（ジアステレオマー、鏡像異性体、およびそれらの混合物など）は、本明細書に記載の組成物の一部として、考慮される。
【０１４８】
別の、またはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）は、プロドラッグの形態にて用いられる。別の、またはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）は、所望の効果（所望の治療効果など）を引き起こすために使用される代謝産物を製造する必要がある生物に投与されることにより、代謝される。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸および修飾型もしくは非修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの活性代謝産物である。
【０１４９】
本明細書に記載の方法および製剤には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドのＮ酸化物、結晶の形状（多形体としても知られている）、または薬学的に許容可能な塩の使用が含まれる。ある実施形態では、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在してもよい。全ての互変異性体は、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの範囲に含まれる。さらに、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、薬学的に許容可能な溶媒（水およびエタノールなど）と一緒になった溶媒和物の形態で存在してもよいし、薬学的に許容可能な溶媒と一緒になっていない非溶媒和の形態で存在してもよい。また、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの溶媒和物の形態も、本明細書に開示されていると考慮される。
【０１５０】
本明細書における上記化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）のいくつかは、互変異性体のいくつかの形態にて存在してもよい。そのような互変異性体の全ては、本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。また、例えば、本明細書における任意の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）のエノール−ケトの形態も、本明細書に開示の組成物の一部として考慮される。
【０１５１】
本明細書における化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物のどれか１つを製造するための試薬が挙げられる）のいくつかは、酸性であり、薬学的に許容可能な陽イオンと塩を形成し得る。本明細書における上記化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が挙げられる）のいくつかは、塩基性であり得、したがって、薬学的許容可能な陰イオンと塩を形成し得る。二塩などの全ての塩が、本明細書に記載の組成物の範囲に含まれる。また当該塩を従来の方法によって調製することができる。例えば、酸性物質と塩基性物質とを、水性の媒体、非水性の媒体、または部分的に水性の媒体において、接触させることにより、塩を調製することができる。また、塩は、（ろ過する、非溶媒により沈殿させた後にろ過する、溶媒を蒸発させる、あるいは、水溶液の場合に凍結乾燥するという）技術の少なくとも１つを用いて、回収される。
【０１５２】
塩としては、例えば、（１）無機酸または有機酸から形成される酸付加塩、（２）親化合物に存在する酸性のプロトンが、金属イオンで置換されたとき、または有機塩基に配位結合するときに形成するときに形成される塩が挙げられる。上記無機酸としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などが挙げられる。上記有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトニック酸（glucoheptonic acid）、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸（tertiary butylacetic acid）、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、およびムコン酸などが挙げられる。上記金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンなどが挙げられる。上記有機塩基として許容可能なものは、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ−メチルグルカミンなどが挙げられる。無機塩基として許容可能なものは、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１５３】
塩を参照するとき、当該塩には、塩の溶媒付加形態の塩または結晶形態の塩（特に、溶媒和物または多形態）が含まれることを理解されたい。溶媒和物は、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒を含んでいる。また、溶媒和物は、結晶化の過程の間に形成されることが多い。水和物は、溶媒が水のときに形成され、アルコラートは、溶媒がアルコールのときに形成される。多形態には、化合物の基本的な組成は同じであるが、結晶の凝集配置が異なるものが含まれる。各多形態は、一般的に、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学特性、電気的特性、安定性、ならびに、可溶性を有している。様々な要因（再結晶溶媒、結晶化速度、および保存温度など）により、単結晶を優先的に形成することができる。
【０１５４】
〔図面の簡単な説明〕
以下の詳細な説明では、我々の方法、組成物、装置および器具の原理を利用した実施形態が説明のために記載されており、詳細な説明と添付の図面とを参照することによって、本方法および本組成物の特徴および利点が、さらに理解されてもよい。
【０１５５】
図１は、本明細書に記載の方法、組成物および技術を用いて修飾されるポリペプチドを、選択および設計するための方法の非限定的な態様を、説明する図である。
【０１５６】
図２は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１５７】
図３は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。図３に限っては、Ｘはハロゲンを表す。
【０１５８】
図４は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１５９】
図５は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６０】
図６は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。図６に限っては、Ｘはハロゲンを表す。
【０１６１】
図７は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６２】
図８は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６３】
図９は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。図９に限っては、Ｘはハロゲンを表す。
【０１６４】
図１０は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６５】
図１１は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６６】
図１２は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６７】
図１３は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６８】
図１４は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸が含んでいるアミン部分は、マスクされているおよび／または保護されているが、マスクされていないおよび／または脱保護されたアミン部分に変換され得るものである。また、当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１６９】
図１５は、本明細書に記載の非天然アミノ酸の非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸では、アルデヒド含有試薬により還元的アミノ化されるアミン側鎖が、マスクされているおよび／または保護されている。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１７０】
図１６は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を有するポリペプチドに対して、アルデヒド含有試薬を用いて還元的アルキル化することによって、形成された化合物の非限定的な具体例を示す図である。
【０１７１】
図１７は、本明細書に記載の、芳香族により保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸の非限定的な具体例を示す図である。当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを作成、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術、および戦略の何れかに用いられてもよいし、あるいは組み込まれてもよい。
【０１７２】
図１８は、保護された／マスクされた前躯体を、翻訳後に脱保護する／脱マスクすることによって、アルデヒド含有非天然アミノ酸を有するポリペプチドを形成した後に、芳香族アミン含有試薬を用いて還元的アミノ化することについての非限定的な具体例を示す図である。
【０１７３】
図１９は、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位選択的な還元的アルキル化および還元的アミノ化の非限定的な具体例を示す図である。
【０１７４】
図２０は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）およびベンズアルデヒド（ＩＩ）による還元型ウロテンション（urotension）−ＩＩ（ＵＴ−ＩＩ−ＳＨ）の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１７５】
図２１は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるウロテンション（urotension）ＩＩ−（ＵＴ−ＩＩ）の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１７６】
図２２は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（isobutaldehyde）（ＩＩＩ）、およびピバルアルデヒド（ＩＶ）によるペプチドのＸＴ−８の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１７７】
図２３は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（isobutaldehyde）（ＩＩＩ）、およびピバルアルデヒド（ＩＶ）によるペプチドのＳＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１７８】
図２４は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（isobutaldehyde）（ＩＩＩ）、およびピバルアルデヒド（ＩＶ）によるペプチドのＨＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１７９】
図２５は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、およびイソブチルアルデヒド（isobutaldehyde）（ＩＩＩ）によるペプチドのＷＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８０】
図２６は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるペプチドのＮＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８１】
図２７は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるペプチドのＲＸＴ−１０の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８２】
図２８は、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８３】
図２９は、異なるアルデヒド（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８４】
図３０は、異なるアルデヒド（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８５】
図３１は、アルデヒドおよび１，３−ジケトン（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の競合反応と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８６】
図３２は、アルデヒドおよび１，２−ジケトン（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によるペプチドのＮＸＴ−９の競合反応と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８７】
図３３は、アルデヒドおよびケトン（Ｉ）〜（Ｖ）によるペプチドのＭＸＴ−９の競合反応と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８８】
図３４は、ＭＸＴ−９−Ｎ３をＭＸＴ−９ＮＨ２（Ｉ）に還元した後に、アルデヒドおよびベンズアルデヒドによるＭＸＴ−９ＮＨ２の還元的アルキル化によって生じた化合物（ＩＩ）〜（ＩＩＩ）と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【０１８９】
図３５は、本明細書に記載の芳香族アミン含有非天然アミノ酸のＰＥＧ化、およびＮ末端ＰＥＧ化による、ペプチドのＰＥＧ化の非限定的な具体例と比較とを示す図である。
【０１９０】
図３６は、ペプチドに組み込まれる芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、ＰＥＧ化するために使用されるＰＥＧアルデヒド試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９１】
図３７は、Ｎ末端の還元的アルキル化による、ＭＴ−９のＰＥＧ化の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９２】
図３８は、ＭＸＴ−９に組み込まれる芳香族アミン含有非天然アミノ酸の還元的アルキル化による、ＭＸＴ−９のＰＥＧ化の非制限的な具体例を示す図である。
【０１９３】
図３９は、ｈＧＨおよびＩＦＮαに組み込まれる芳香族アミン含有非天然アミノ酸の還元的アルキル化による、ｈＧＨおよびＩＦＮαのＰＥＧ化の非制限的な具体例を示す図である。
【０１９４】
図４０は、ＰＥＧ化された様々なｈＧＨの電気泳動ゲルの非限定的な具体的画像を示す図である。
【０１９５】
〔発明の詳細な説明〕
＜Ｉ．序論＞
近年、タンパク質の部位特異的修飾に関連する多くの制限を克服する見込みのある、タンパク質科学における完全に新しい技術が報告された。具体的には、原核生物であるEschrichia coli（E. coli）（例えば、「L.Wangら(2001),Science292:498-500」）、および真核生物であるSacchromyces cerevisiae（S. cerevisiae）（例えば、「J.Chinら, Science 301: 964-7(2003)」）のタンパク質生合成機構に、新規の構成要素が加えられた。これにより、インビボにおいて、タンパク質へ非遺伝的にコードされたアミノ酸を組み込むことがが可能になった。これまでにない化学的、物理的または生物学的性質を有する多数の新たなアミノ酸が、この手法によって、アンバーコドン、ＴＡＧに反応して、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母においてタンパク質へ高い忠実性でもって効率的に組み込まれた。例えば、「J.W.Chinら, (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027」（その全体が参照によって組み込まれる）、「J.W.Chin,& P.G.Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137」（その全体が参照によって組み込まれる）、「J.W.Chinら, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024」（その全体が参照によって組み込まれる）、および、「L. Wang,& P.G.Schultz, (2002), Chem. Comm.,1:1-11」（その全体が参照によって組み込まれる）を参照のこと。なお、上記新たなアミノ酸としては、例えば、光親和性標識されたアミノ酸、光異性化性（photoisomerizable）アミノ酸、光架橋性アミノ酸（例えば「Chin, J. W.ら. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 99:11020-11024」、および「Chin, J. W.ら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027」を参照のこと）、重原子含有アミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸が挙げられる。これらの研究では、（１）タンパク質中に存在せず、（２）２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸において存在する全ての官能基に対して化学的に不活性であり、（３）使用したときに、選択的かつ効率よく反応して安定な共有連結を形成し得る化学官能基を選択的且つ定石通りに導入できることが証明された。
【０１９６】
＜ＩＩ．概要＞
図１は、本明細書に記載の組成物、方法および技術の概要を示す図である。ある水準において、芳香族アミンまたは複素芳香族アミンを有する、非天然アミノ酸もしくは修飾型非天然アミノ酸の少なくとも１つを製造および使用するための道具（方法、組成物、技術）が、本明細書に記載されている。複素環式芳香族基には、フラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、イミダゾール、チアゾール、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、ベンゾチアゾール、チアゾロピリジン、オキサゾール、ベンゾキサゾール、オキサゾロピリジン、チアゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、ベンゾキサジン、およびベンゾチアジンが含まれるが、これらに限定されない。上記非天然アミノ酸は、以下の機能性基をさらに含んでいてもよい。当該機能性基としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分（photocaged moiety）；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤（activated complex activator）、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
図１に示されたように、１態様では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の方法、組成物および技術を用いて、修飾されるポリペプチドを選択および設計する方法である。新規ポリペプチドは、例えば、ハイスループットスクリーニング過程の一部として、または、研究者の興味に基づいて、新規に（de novo）設計されてもよい。新規ポリペプチドが、ハイスループットスクリーニング過程の一部として新規に設計される場合は、非常に多数のポリペプチドが設計、合成、および／または試験され得る。また、新規ポリペプチドは、公知の、または部分的に特徴づけられているポリペプチドの構造に基づいて設計されてもよい。例えば、科学界は、後述する成長ホルモン遺伝子のスーパーファミリーを精力的に研究しているが、新規ポリペプチドは、この遺伝子のスーパーファミリーのメンバーの構造に基づいて設計され得る。本明細書には、置換および／または修飾されるアミノ酸を選択する原理が別々に記載されている。また、本明細書には、採用される修飾の選択についても、記載されており、この選択は、実験者または最終使用者の必要性に合うように用いることができる。該必要性には、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、生物学的利用性、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物活性の調節、または循環時間の延長）が含まれてもよいが、これらに限定されない。また、上記修飾には、例えば、ポリペプチドへのさらなる官能基の提供、タグ、標識、または検出可能なシグナルのポリペプチドへの組み込み、ポリペプチドの単離性質の簡単化、および上記修飾のあらゆる組み合わせが含まれる。
【０１９８】
また、本明細書には、芳香族アミンまたは複素芳香族アミンを有しているか、あるいはそれらを含むように修飾され得る非天然アミノ酸が記載されている。複素環式芳香族基には、フラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、イミダゾール、チアゾール、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、ベンゾチアゾール、チアゾロピリジン、オキサゾール、ベンゾキサゾール、オキサゾロピリジン、チアゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、ベンゾキサジン、およびベンゾチアジンが含まれるが、これらに限定されない。この態様には、上記非天然アミノ酸を製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。本明細書に記載の別の態様では、上記非天然アミノ酸の少なくとも１つをポリペプチドに組み込むための方法、戦略および技術が記載されている。また、この態様には、上記非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる上記ポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。また、この態様には、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、少なくとも部分的に、製造するために用いられ得るオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）を製造、精製、特徴づけ、および使用するための組成物および方法が含まれる。また、この態様には、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、少なくとも部分的に、製造するために用いられ得る上記オリゴヌクレオチドを発現することができる細胞を製造、精製、特徴づけ、および使用するための組成物および方法が記載されている。
【０１９９】
したがって、本明細書には、芳香族アミンまたは複素芳香族アミンを有する非天然アミノ酸もしくは修飾型非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいるポリペプチドが、提供および記載されていている。複素環式芳香族基には、フラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、イミダゾール、チアゾール、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、ベンゾチアゾール、チアゾロピリジン、オキサゾール、ベンゾキサゾール、オキサゾロピリジン、チアゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、ベンゾキサジン、およびベンゾチアジンが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、芳香族アミンまたは複素芳香族アミンを有する非天然アミノ酸もしくは修飾型非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいるポリペプチドは、該ポリペプチドのいくつかの位置に、翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。上記実施形態では、複素環により修飾された非天然アミノ酸は、特に限定されないが、フラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、イミダゾール、チアゾール、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、ベンゾチアゾール、チアゾロピリジン、オキサゾール、ベンゾキサゾール、オキサゾロピリジン、チアゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、ベンゾキサジン、およびベンゾチアジンを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、細胞機構を介して生じるものであり、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、および糖脂質連結修飾などが挙げられる。多くの場合、上記細胞機構に基づく翻訳後修飾は、ポリペプチドの天然に生じるアミノ酸の部位において生じるが、ある実施形態では、上記細胞機構に基づく翻訳後修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸の部位において生じる。
【０２００】
他の実施形態では、翻訳後修飾は、細胞機構を利用しないが、その代わり、機能性基は、第２反応基を含んでいる以下の分子と、第１反応基を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸（芳香族アミンまたは複素芳香族アミンの官能基を含んでいる非天然アミノ酸など）とを、還元的アルキル化の方法を利用して結合させることにより提供される。上記分子としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、上記第２反応基は、カルボニル含有基であってもよく、例えば、アルデヒドおよびケトンが挙げられる。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞において、インビボで作製される。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、インビトロで作製される。また、この態様には、上記翻訳後修飾された非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる上記ポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。
【０２０１】
また、本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術の範囲には、上記翻訳後修飾の何れかを製造するために、ポリペプチドの一部である非天然アミノ酸と反応することができる試薬が含まれる。上記非天然アミノ酸は、芳香族アミン基、複素芳香族アミン基、またはそれらの保護された形態のもののどれか１つを含んでいる。一般的に、翻訳後修飾された非天然アミノ酸が生じた場合、この非天然アミノ酸は、さらなる修飾反応を受け得る還元的アミノ化されたアルデヒドまたはケトンを少なくとも１つ含んでいる。また、この態様には、上記非天然アミノ酸に対して、上記翻訳後修飾をすることができる上記試薬を製造、精製、特徴づけ、および使用する方法が含まれる。
【０２０２】
特定の実施形態では、タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボで作製された翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。当該翻訳後修飾は、通常は別の宿主細胞により作製されないものである。特定の実施形態では、タンパク質は、ある真核細胞によりインビボで作製された翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。当該翻訳後修飾は、通常は別の真核細胞種により作製されないものである。上記翻訳後修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、および糖脂質連結修飾などが挙げられる。一実施形態では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結を介した、アスパラギンに対するオリゴサッカライドの結合を含んでいる（例えば、オリゴサッカライドは、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含んでいる場合）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン連結、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン連結、ＧｌｃＮＡｃ−セリン連結、ＧｌｃＮＡｃ−トレオニン連結を介した、セリンまたはトレオニンに対するオリゴサッカライドの結合を含んでいる（例えば、当該オリゴサッカライドは、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含んでいる）。分泌シグナル配列としては、例えば、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌での発現のために５’が最適化された真核細胞の分泌シグナル配列、新規の分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列、およびファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列としては、例えば、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩ、およびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、ならびにトランスポゾンに由来するシグナル配列ｂｌａが挙げられる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在化の配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／またはＧＳＴ融合などを含んでいてもよい。また、この態様には、上記翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる上記ポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。他の実施形態では、グリコシル化された非天然アミノ酸ポリペプチドは、グリコシル化されていない形態のものから製造される。グリコシル化される非天然アミノ酸ポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のものは、以下の方法から製造されてもよい。すなわち、（１）単離された、または実質的に精製された、もしくは精製されていないグリコシル化された非天然アミノ酸ポリペプチドからオリゴサッカライド基を化学的もしくは酵素的に除去する工程を含んでいる方法、（２）グリコシル化させない宿主において非天然アミノ酸ポリペプチドを製造する工程を含んでいる方法（そのような宿主には、原核生物、上記ポリペプチドをグリコシル化しないように操作されているか、あるいは突然変異させられた真核細胞が含まれる）、（３）通常は上記なポリペプチドをグリコシル化する真核細胞によって、上記非天然アミノ酸ポリペプチドが製造される細胞培養液に、グリコシル化阻害剤を導入する工程を含んでいる方法、（４）あるいはあらゆる上記方法の���み合わせ。また、本明細書には、標準的にグリコシル化される非天然アミノ酸ポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のものが含まれる。ここで、「標準的なグリコシル化」は、天然に生じるポリペプチドがグリコシル化される条件下にて製造されるときの、ポリペプチドのグリコシル化を意味する。勿論、標準的にグリコシル化される非天然アミノ酸ポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のものは、未精製の形態のものであってもよいし、実質的に精製された形態のものであってもよいし、あるいは単離された形態のものであってもよい。
【０２０３】
特定の実施形態では、タンパク質は、インビトロで作製された翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。当該翻訳後修飾は、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的である。上記翻訳後修飾としては、例えば、還元剤を用いた、カルボニル含有試薬による、芳香族アミン基または複素芳香族アミン基の還元的アルキル化が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、上記翻訳後修飾としては、例えば、還元剤を用いた、アルデヒド含有試薬による、芳香族アミン基または複素芳香族アミン基の還元的アルキル化が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、上記翻訳後修飾には、シアノホウ化水素ナトリウムの還元剤を用いた、アルデヒド含有試薬による、芳香族アミン基または複素芳香族アミン基の還元的アルキル化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、芳香族アミン、複素芳香族アミン、またはそららの保護された形態のものを有する非天然アミノ酸を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、あるいは１０以上含んでいてもよい。非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる場所が、タンパク質に存在し得る。特定の実施形態では、天然発生型のタンパク質に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が非天然アミノ酸で置換されている。また、該非天然は、芳香族アミン、複素芳香族アミン、またはそれらの保護された形態のものを含んでいる非天然アミノ酸ではない、非天然アミノ酸を１つ以上含んでいてもよい。
【０２０５】
本明細書に記載および提供されている方法と組成物とは、芳香族アミン、複素芳香族アミン、またはそれらの保護された形態のものを含んでいる非天然アミノ酸を、少なくとも１つ含有しているポリペプチドを、含んでいる。少なくとも１つの上記非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することによって、例えば、２０の一般的に生じるアミノ酸とは反応しないが、１以上の非天然アミノ酸との特異的な化学反応に関与する接合化学反応を、活用することができる。アミノ酸側鎖がそのように組み込まれる工程を含んでいる上記特異的な化学反応は、存在する特定の官能基または置換基に適切な、還元的アルキル化といった化学的方法が含まれるが、これに限定されない。組み込まれた後に、天然にコードされたアミノ酸に存在する特定の官能基または置換基に適切な、当業者に公知の化学的方法を利用して、アミノ酸側鎖を修飾することができる。
【０２０６】
本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、多種多様な官能基、置換基または部分を有する物質と、以下の他の物質との接合体を提供する。すなわち、他の物質としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
本明細書に記載の組成物、方法、技術、および戦略の別の態様は、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの何れかを、研究または使用するための方法である。この態様には、例えば、修飾型もしくは非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドもしくはタンパク質を含んでいる、ポリペプチドから利益を受ける、治療的使用、診断的使用、アッセイに基づく使用、工業的使用、美容的使用、植物生物学的使用、環境への使用、エネルギー生産への使用、および／または軍事使用が含まれる。
【０２０８】
＜ＩＩＩ．ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の場所＞
本明細書に記載の方法および組成物は、１つ以上の非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みを含んでいる。１つ以上の非天然アミノ酸は、ポリペプチドの活性を阻害しない１つ以上の特定の位置に組み込まれてもよい。このことは、「保存的」置換をすること、および／または、活性に必須ではない箇所に非天然アミノ酸を挿入することによって達成することができる。「保存的」置換をするということは、例えば、疎水性アミノ酸を非天然もしくは天然の疎水性アミノ酸で置換する、かさ高いアミノ酸を非天然もしくは天然のかさ高いアミノ酸で置換する、親水性アミノ酸を非天然もしくは天然の親水性アミノ酸で置換するなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
広範な生物学的および構造的手法は、ポリペプチド内における非天然アミノ酸による置換を目的とした所望の部位の選択に採用され得る。ポリペプチド鎖のあらゆる部位は、非天然アミノ酸を組み込むための選択に好適であり、かつ選択は、合理的な設計に基づいていてもよいか、あらゆる目的、または特に所望ではない目的に関する無作為の選択によってもよい。所望の部位の選択は、あらゆる所望の性質、または活性を有する非天然アミノ酸ポリペプチド（さらに修飾され得るか、非修飾のままであり得る）の産生を目的とし得る。当該あらゆる所望の性質または活性の例としては、アゴニスト、スーパーアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、パートナーとの結合に対する結合の調節物質、結合パートナー活性調節物質、結合パートナー高次構造調節物質、ダイマー形成もしくはマルチマー形成、本来の分子と比較して活性もしくは性質に対して変化がないこと、またはポリペプチドの物理的もしくは化学的性質（例えば、可溶性、凝集、または安定性）を操作することなどが挙げられる。例えば、ポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置は、当該分野において公知の、点変異分析、アラニン走査、または相同物スキャニング法を用いて同定され得る。アラニン走査突然変異誘発、または相同物スキャニング突然変異誘発によって、生物活性に重要であるとして同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存した、非天然にコードされたアミノ酸による置換にとって、良好な候補物であり得る。また代替可能に、生物活性に重要であるとして同定された部位は、この場合もやはり、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存した、非天然にコードされたアミノ酸による置換にとって、良好な候補物であり得る。他の代替可能物は、ポリペプチドの各位置における、非天然アミノ酸を用いた連続する置換を簡単に行い、かつポリペプチドの活性に対する影響を観察するためのものである。非天然アミノ酸を用いたあらゆるポリペプチドへの置換に関する位置を選択するあらゆる手段、技術、または方法が、本明細書に記載の方法、技術および組成物に好適に使用される。
【０２１０】
また、欠失を含むポリペプチドの天然に生じる突然変異体の構造および活性を調査して、非天然アミノ酸による置換に対して耐性があると思われるタンパク質の領域を決定することができる。非天然アミノ酸による置換に対して耐性がないと思われる残基が排除されると、残りの位置のそれぞれにおいて計画される置換の影響を、関連するポリペプチド、ならびにあらゆる会合するリガンドまたは結合タンパク質の３次元構造から調査することができる。多くのポリペプチドのＸ線結晶学的な、およびＮＭＲの構造は、タンパク質および核酸の大分子の３次元構造データを含む集中化されたデータベースである、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）において利用可能である。その上に、３次元構造データが利用できない場合には、モデルは、ポリペプチドの２次構造および３次構造の調査から作製されてもよい。このようにして、非天然アミノ酸により置換され得るアミノ酸位置の同定は、容易に行われ得る。
【０２１１】
非天然アミノ酸の組み込みの例示的な部位としては、（１）受容体に結合する可能性のある領域、または結合タンパク質もしくはリガンドと結合する領域以外の部位、（２）完全にもしくは部分的に溶媒に露出し得る部位、（３）近くの残基との水素結合相互作用がないか、もしくは最小である部位、（４）近くの反応性残基に最小限で露出される部位、および（５）特定のポリペプチドとその会合受容体、リガンドもしくはタンパク質との３次元結晶構造から予想したときに、柔軟性が高い領域内であってもよい部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
広範な非天然アミノ酸は、ポリペプチドにおける所定の位置に対して置換され得るか、所定の位置に組み込まれ得る。一般的に、特定の非天然アミノ酸は、会合するリガンド、受容体、および／または結合タンパク質を有するポリペプチドの３次元結晶構造の調査、保存的な置換に関する好ましさ（例えば、アリールに基づく非天然アミノ酸（例えば、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐに対するｐ−アセチルフェニルアラニン、またはＯ−プロパルギルチロシンの置換））、ならびにポリペプチドタンパク質に導入することを所望する特異的な接合化学的性質に基づく組み込みを目的として選択される。
【０２１３】
一実施形態では、当該方法は、タンパク質へ第１反応基を含んでいる非天然アミノ酸を組み込む工程と、以下の分子と当該タンパク質とを接触させる工程とをさらに包含する。ここで、上記分子としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これにら限定されない。ある種の実施形態では、第１反応基は、芳香族基におけるアミン部分であり、かつ第２反応基は、アルデヒドである。これによれば、アミン基は、還元剤（例えば、シアノホウ化水素ナトリウム）の存在下において、アルデヒドと接触させられると、還元的アルキル化される。他の実施形態では、第１反応基は、複素芳香族アミンにおけるアミン部分であり、かつ第２反応基は、アルデヒドである。これによれば、還元剤（例えば、シアノホウ化水素ナトリウム）の存在下において、アルデヒドと接触させられると、還元的アルキル化される。
【０２１４】
いくつかの場合において、非天然アミノ酸の置換または組み込みは、他の生物学的性向に影響を与える、ポリペプチド内における他の付加、置換または欠失と組み合わせられる。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ポリペプチドの安定性（例としては、タンパク質分解性分解に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強し得るか、適切な受容体、リガンドおよび／または結合タンパク質に対するポリペプチドの親和性を増強し得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞において発現されるときに（例として挙げられるが、これに限定されない）、ポリペプチドの可溶性を増強し得る。いくつかの実施形態では、天然にコードされるアミノ酸、非天然アミノ酸による置換用の部位は選択され、これに加えて、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の組み換え宿主細胞において発現した後のポリペプチドの可溶性を増強させることを目的とする、非天然アミノ酸の組み込み用の他の部位が選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、会合するリガンド、結合タンパク質および／または受容体分子に対する親和性を調節するか（例としては、増強または低減するが、これに限定されない）、受容体ダイマー化を調節するか、受容体ダイマーを安定化するか、循環半減期を調節するか、放出または生物学的利用性を調節するか、精製を容易にするか、または投与の特定の経路を改善または変更するかのいずれかである、他の付加、置換または欠失を含んでいる。同様に、ポリペプチドは、化学的もしくは酵素的な切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（例としては、ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓが挙げられるが、これらに限定されない）、または検出（例としては、ＧＦＰが挙げられるが、これに限定されない）か、精製か、組織もしくは細胞膜を介する輸送か、プロドラッグの放出もしくは活性化か、サイズの低下か、もしくはポリペプチドの他の特徴かのいずれかを改善する、他の親和性に基づく配列（例としては、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどが挙げられるが、これらに限定されない）もしくは親和性に基づく結合分子（例としては、ビオチンが挙げられるが、これに限定されない）を含んでいてもよい。
【０２１５】
＜ＩＶ．例としての成長ホルモンスーパーファミリー＞
本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の種類、分類またはファミリーに限定されない。実際に、ほとんどあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されている少なくとも１つの修飾非天然アミノ酸、または非修飾非天然アミノ酸を含むように、設計または修飾され得る。単なる一例として、当該ポリペプチドは、以下の物質から成る群から選択される治療タンパク質と相同であり得る：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質（four-helical bundle protein）、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（neurturin）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン（paracitonin）、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン（pleiotropin）、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−��ＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。
【０２１６】
従って、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーについての以下の記述は、説明を目的とし、しかも単なる一例として提供され、かつ本明細書に記載されている方法、組成物、戦略および技術の範囲を制限するようなものではない。さらに、本出願におけるＧＨポリペプチドへの言及は、ＧＨスーパーファミリーにおけるあらゆる構成要素の例として総称を使うことを意味する。従って、ＧＨポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書に記載されている修飾および化学反応が、本明細書に特に載せられているものを含めた、ＧＨスーパーファミリーのあらゆる構成要素に等しく適用され得ることは、理解される。
【０２１７】
以下のタンパク質：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチン  Ｍ、繊毛状の神経栄養因子、白血病抑制因子、アルファ  インターフェロン、ベータ  インターフェロン、イプシロン  インタフェロン、ガンマ  インターフェロン、オメガ  インターフェロン、タウ  インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびカージオトロフィン−１（cardiotrophin-1）（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパーファミリー」）は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質を含む（「Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」、「Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)」）。今後、遺伝子のクローニングおよび配列決定を経て、当該遺伝子ファミリーの更なる構成要素が同定されるであろうということが、予想される。ＧＨスーパーファミリーの各一員は、それらのアミノ酸またはＤＮＡ配列の同一性が通常、限られているにもかかわらず、類似した二次および三次構造を有する。共通の構造的特徴によって、遺伝子ファミリーの新しい構成要素を迅速に同定することができる。また、本明細書に記載されていたり、参照により組み込まれていたりする非天然アミノ酸に関する方法、および組成物に、当該共通の構造的特徴を同様に適用可能である。
【０２１８】
多くのサイトカイン（例としては、Ｇ−ＣＳＦ（「Zinkら, FEBS Lett.314:435 (1992); Zinkら, Biochemistry 33:8453 (1994); Hillら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)」）、ＧＭ−ＣＳＦ（「Diederichs, K.,ら Science 154: 1779-1782 (1991); Walterら, J. MoI. Biol. 224:1075-1085 (1992)」）、ＩＬ−２（「Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992)」）、ＩＬ−４（「Redfieldら, Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powersら, Science 256:1673-1677 (1992)」）、およびＩＬ−５（「Milburnら, Nature 363: 172-176 (1993)」）が挙げられる）の構造は、Ｘ線回折およびＮＭＲ調査によって決定されている。そして、上記多くのサイトカインの構造は、有意な一次配列の相同性がないにもかかわらず、ＧＨ構造が顕著に保存されていることを示す。インターフェロンは、モデリングおよび他の研究（「Leeら, J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgoloら, Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnanら, Structure 4:1453 (1996); Klavsら, J. MoI. Biol. 274:661 (1997) 」）に基づいて、当該ファミリーの一員であると考えられる。エリスロポエチンは、モデリングおよび突然変異誘導法の研究（「Boisselら, J. Biol. Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wenら, J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994) 」）に基づいて、当該ファミリーの一員であると考えられる。インターフェロン（ＩＮＦ）（例えば、アルファ、ベータ、オメガ、タウ、イプシロン、およびガンマ  インターフェロン）だけでなく、多数の更なるサイトカインおよび成長因子（例としては、繊毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、オンコスタチン  Ｍ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる）は、当該ファミリーに属する（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and Ihle (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS」において概説された）。現在、上記のサイトカインおよび成長因子のすべては、一つの大きい遺伝子ファミリーを構成すると考えられている。
【０２１９】
共有する類似した二次および三次構造に加えて、当該ファミリーの一員は、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために、細胞表面受容体をオリゴマー形成する必要があるという性質を共有している。ＧＨおよびＥＰＯなどが含まれるいくつかのＧＨファミリーの一員は、一種類の受容体に結合し、かつそれのホモダイマーを形成させる。ＩＬ−２、ＩＬ４、およびＩＬ−６などが含まれる他のファミリーの一員は、２種類以上の受容体に結合し、かつその受容体のヘテロダイマーまたはそれよりも高次の集合体を形成させる（「Davisら, (1993) Science 260: 1805-1808; Paonessaら, (1995) EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」）。突然変異誘導法の研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカインおよび成長因子が、複数の、通常２つの受容体結合部位を含み、かつそれらの同種の受容体に連続的に結合することを示している（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthewsら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476」）。ＧＨのように、これらの他のファミリーの一員にとって主要な受容体結合部位は、主として４つのアルファヘリックスおよびＡ−Ｂループに存在する。受容体結合に関与する、ヘリカルバンドルにおける特定のアミノ酸は、当該ファミリーの一員の間で異なる。ＧＨスーパーファミリーの一員と相互作用する細胞表面受容体のほとんどは、構造的に関連し、かつ第２の大きな複数の遺伝子のファミリーを構成する。例えば、参照によって組み込まれる米国特許出願第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと。
【０２２０】
ＧＨスーパーファミリーの多様な一員の変異に関する研究から、通常、アルファヘリックスに結合したループが、受容体結合に関与しない傾向があるという一般的な結論が得られた。特に、短いＢ−Ｃループは、すべてではないがほとんどのファミリーの一員において、受容体結合に必須ではないと思われる。従って、ＧＨスーパーファミリーの各一員において、該Ｂ−Ｃループは、本明細書に記載されているような非天然アミノ酸で置換され得る。また、Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（およびＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０のような一員のＤ−Ｅループ）は、非天然アミノ酸で置換され得る。また、ヘリックスＡに近接した、および最後のヘリックスに遠位のアミノ酸は、受容体結合に関与しない傾向があるので、非天然アミノ酸を導入するための部位であり得る。いくつかの実施形態では、ループ構造内のあらゆる場所（例えば、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸）で、非天然アミノ酸は置換される。いくつかの実施形態では、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸において、非天然アミノ酸は置換される。
【０２２１】
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびベータ  インターフェロンなどを含むＧＨファミリーの特定の一員は、Ｎ−連結および／またはＯ−連結の糖を含む。上記タンパク質における糖鎖形成部位は、ほぼ例外なくループ領域に生じ、かつアルファヘリックスバンドルには生じない。ループ部位は、一般的に受容体結合に関与せず、かつ該部位は糖基による共有結合性の結合のための部位であるので、該部位は、非天然アミノ酸の置換を上記タンパク質に導入するための有用な部位であり得る。タンパク質においてＮ−およびＯ−結合の糖鎖形成部位を含んでいるアミノ酸は、これらのアミノ酸が表面に露出しているので、非天然アミノ酸置換のための部位となり得る。従って、天然のタンパク質は、これらの部位において該タンパク質に付着する嵩高い糖基を許容でき、かつ糖鎖形成部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
【０２２２】
今後、ＧＨ遺伝子ファミリーの付加的な一員が、おそらく発見されるであろう。ＧＨスーパーファミリーの新しい一員は、予想されるタンパク質配列の、コンピューターを使った二次および三次構造解析を経て同定され得る。ＧＨスーパーファミリーの一員は、通常、非螺旋形のアミノ酸（ループ部位）によって結合される、４つか５つの両親媒性のヘリックスを持つ。該タンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、該タンパク質のＮ末端に疎水性のシグナル配列を含んでいる。また上記のような後日発見されたＧＨスーパーファミリーの一員は、本明細書に記載の方法および組成物の中に含まれる。
【０２２３】
＜Ｖ．非天然アミノ酸＞
非常に広範囲の非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸が以下の４つの性質のうち少なくとも１つを有する限りは、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適しているといえる：
（１）非天然アミノ酸の側鎖上における少なくとも１つの官能基が、遺伝的にコードされる２０の一般アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）の化学反応性に対して直交な、特性および／または活性および／または反応性の少なくとも１つを有する；
（２）導入された非天然アミノ酸が、遺伝的にコードされた２０の一般アミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である；
（３）上記非天然アミノ酸が、（好ましくは天然に生じるアミノ酸と相応の安定性を有しているか、または典型的な生理的条件下において）ポリペプチドに安定に組み込まれてもよく、さらに好ましくはそのような組み込みは、インビボの系によって生じてもよい；ならびに、
（４）非天然アミノ酸は、芳香族アミンもしくは複素芳香族アミン、または官能基を含んでおり、上記官能基は、試薬を用いた反応によって、芳香族アミンもしくは複素芳香族アミンに変換され得る官能基であり、上記変換は、好ましくは非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの生物学的性質を破壊しない条件において起こるか（もちろん、生物学的性質のそのような破壊が修飾／変換の目的である場合を除く）、上記変換は約４と約１０との間のｐＨにおける水性条件に生じることができるか、あるいは、上記変換では、非天然アミノ酸における反応部位が求核性部位である。本明細書に記載されている組成物および方法とともに使用され得る非天然アミノ酸に関する性質を満たすアミノ酸の、例証的な非限定的な例が、図面および本明細書の全体に渡って示されている。あらゆる多くの非天然アミノ酸は、ポリペプチドに導入され得る。また、非天然アミノ酸は、保護もしくはマスクされた芳香族アミンまたは複素芳香族アミンであってもよく、ここで、脱保護もしくは脱マスクすることによって、保護もしくはマスクされた芳香族アミンまたは複素芳香族アミンは、芳香族アミンまたはヘテロアミンに変換される。
【０２２４】
本明細書に記載されている組成物、および方法における使用に好適であり得る興味のある非天然アミノ酸の例としては、光活性化可能な架橋剤を含んでいるアミノ酸、スピン標識したアミノ酸、蛍光性アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージドアミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含んでいるアミノ酸、糖鎖付加アミノ酸（例えば、糖置換されたセリン）、他の炭水化物を用いて修飾したアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含んでいるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能および／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて伸長した側鎖を有するアミノ酸（例としては、ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（例としては、約５以上のまたは１０以上の炭素が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）、炭素連結した糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含んでいるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、サッカライド部分を含んでいる。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニルＬ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、天然に生じるアミノ酸とサッカライドとの間におけるＮ−またはＯ−連結が、通常には天然に見られない共有連結（例としては、アミン連結などが挙げられるが、これに限定されない）によって置き換えられている例が挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例は、天然に生じるタンパク質に通常は見られないサッカライド（例えば、２−デオキシ−グルコース、および２−デオキシガラクトースなど）を含んでいる。
【０２２６】
非天然アミノ酸を介してタンパク質に組み込まれ得る化学部分は、多様な利点およびタンパク質の操作を提供する。例えば、重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データの位相調整に有用であり得る。また、非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的な組み込みは、重原子用の位置の選択に選択性および柔軟性を与える。光活性化非天然アミノ酸（例としては、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（例としては、フェニルアジドが挙げられるが、これに限定されない）側鎖を有するアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない）は、例えば、効率的なインビボおよびインビトロにおけるタンパク質の光架橋を可能にする。光活性化非天然アミノ酸の例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。それから、光活性化非天然アミノ酸を有するタンパク質は、光活性化基供給の（photoreactive group-providing）一時的な制御の励起によって、自由自在に架橋され得る。１例を挙げると、非天然アミノ酸のメチル基は、核磁気共鳴および振動分光法（例として挙げられるが、これらに限定されない）を利用される、局所的な構造および動態のプローブとしての同位体標識されたメチル基（例として挙げられるが、これに限定されない）により置換され得る。
【０２２７】
‐Ａ．非天然アミノ酸（アルキル化芳香族アミン基）の構造および合成‐
求核反応性基（例えば、単なる一例として、芳香族アミン基（２級アミン基および３級アミン基が挙げられる）、マスクされた芳香族アミン基（容易にアミン基に変換され得る）、または保護された芳香族アミン基（脱保護によって芳香族アミン基と同様の反応性を有する））を有する非天然アミノ酸は、多様な反応（例としては、アルデヒド含有試薬を用いた還元的アルキル化反応が挙げられるが、これに限定されない）を介した、分子を連結する多様な反応を可能にする。そのような芳香族アミン含有非天然アミノ酸は、一般式（Ａ）
【０２２８】
【化２】
2009519942.tif 000003
の構造を有するアミノ酸を含んでいる。ここで、
【０２２９】
【化３】
2009519942.tif 000004
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、ｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか；またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
または、２つのＲ５基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈは、アルキル、または置換アルキルである。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
構造：
【０２３０】
【化４】
2009519942.tif 000005
は、（本明細書におけるすべての例において示されるように）、「Ａ」、「Ｂ」、「ＮＨ−Ｍ」および「Ｒａ」の相対的な配向性を示しておらず；むしろこれらの４つの特徴は、本明細書における例によって例証されているように、（この構造の他の特徴点とともに）化学的に安定な様式において配向され得る。
【０２３１】
一般式（Ａ）の構造を有する芳香族アミン部分を含んでいる、非天然アミノ酸は、一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）、一般式（ＩＶ）および一般式（Ｖ）の構造を有する非天然アミノ酸を包含する。
【０２３２】
【化５】
2009519942.tif 000006
（Ａ’のそれぞれは、独立して、ＣＲａ、Ｎまたは、
【０２３３】
【化６】
2009519942.tif 000007
から成る群から選択され、かつＡ’の２つまでは、
【０２３４】
【化７】
2009519942.tif 000008
であり、残りのＡ’は、ＣＲａ、またはＮから選択されてもよい）。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、またはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２３５】
一般式（Ａ）の構造を有する芳香族アミン部分を含んでいる、非天然アミノ酸の非限定的な例は、一般式（ＶＩ）および一般式（ＶＩＩ）の構造を有する非天然アミノ酸を包含する。
【０２３６】
【化８】
2009519942.tif 000009
（Ｇは、アミン保護基であり、特に限定されないが、
【０２３７】
【化９】
2009519942.tif 000010
を含んでいる）。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２３８】
芳香族アミン部分を含んでいる非天然アミノ酸は、以下の構造
【０２３９】
【化１０】
2009519942.tif 000011
を有する（Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか；またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２４０】
一般式（Ａ）の構造を有する芳香族アミン部分を含んでいる、非天然アミノ酸の他の非限定的な例は、図２−１０に示されている。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２４１】
一般式（Ａ）の化合物の合成の非限定的な例は、図１１−１３に示されている。そのような例は、芳香族アミン部分を含んでいる非天然アミノ酸の合成を示しており、ここで、作り出される芳香族アミン部分は、１級アミンまたは２級アミンである。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２４２】
図１４には、一般式（Ａ）の構造を有する芳香族アミン含有非天然アミノ酸の非限定的な形成が示されている。なお、同図では、単なる一例として、一般式（Ａ）の非天然アミノ酸が、非天然アミノ酸の芳香族部分における保護された、またはマスクされたアミン部分の還元によって形成され得ることが示されている。そのような保護された、またはマスクされたアミン部分の例としては、イミン、ヒドラジン、ニトロまたはアジドの置換体が挙げられるが、これらに限定されない。そのような保護された、またはマスクされたアミン部分の還元に使用される薬剤の例としては、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、ＮａＢＨ４、ＮａＢＣＮＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。芳香族部分における保護された、またはマスクされたアミン部分を含んでいる、そのような非天然アミノ酸は、一般式（Ｂ）
【０２４３】
【化１１】
2009519942.tif 000012
の構造を有する。ここで、
【０２４４】
【化１２】
2009519942.tif 000013
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、かつｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｙは、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−ＮＨＲ’、−ＣＲ’＝ＮＲ’、−ＮＯ２、または−Ｎ３であり、
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。
構造：
【０２４５】
【化１３】
2009519942.tif 000014
は、（本明細書におけるすべての例において示されるように）、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｙ」および「Ｒａ」の相対的な配向性を示しておらず；むしろこの構造のこれら４つの特徴は、本明細書における例によって例証されているように、（この構造の他の特徴点とともに）化学的に安定な様式において配向されていてもよい。
【０２４６】
一般式（Ｂ）の構造を有する芳香族アミン部分を含んでいる非天然アミノ酸は、一般式（ＶＩＩＩ）、一般式（ＩＸ）、一般式（Ｘ）および一般式（ＸＩ）の構造を有する非天然アミノ酸を包含する。
【０２４７】
【化１４】
2009519942.tif 000015
また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。また、そのような非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチドに翻訳において組み込まれ、かつそれから、非天然アミノ酸ポリペプチドの一部として一般式（Ａ）の構造を有する非天然アミノ酸を形成するための還元によって、翻訳後修飾される。その上、一般式（Ｂ）の構造を有する非天然アミノ酸は、ポリマー、多糖、ポリヌクレオチド、または化学合成されたポリペプチドに組み込まれてもよく、かつそれから、ポリマー、多糖、ポリヌクレオチド、または化学合成されたポリペプチドの一部として一般式（Ａ）の構造を有する非天然アミノ酸を形成するために還元されてもよい。一般式（Ａ）の構造を有するそのような組み込み非天然アミノ酸は、それから、任意に還元的アルキル化され得る。
【０２４８】
保護された、またはマスクされたアミン部分を有するそのような非天然アミノ酸の非限定的な例は、図１５に示されている。
【０２４９】
‐Ｂ．非天然アミノ酸（アルキル化芳香族アミン基）の構造および合成‐
求核性反応基（例えば、単なる一例として、芳香族アミン基（例としては、２級アミン基、３級アミン基が挙げられる）、マスクされた芳香族アミン基（容易に芳香族アミン基に変換され得る）、または保護された芳香族アミン基（脱保護によって芳香族アミン基と同様の反応性を有する））を有する非天然アミノ酸は、多様な反応（例としては、アルデヒド含有試薬を用いた還元的アルキル化反応が挙げられるが、これに限定されない）を介して分子を連結する多様な反応を可能にする。そのようなアルキル化非天然アミノ酸は、一般式（Ｃ）
【０２５０】
【化１５】
2009519942.tif 000016
の構造を有するアミノ酸を含んでいる：ここで、
【０２５１】
【化１６】
2009519942.tif 000017
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、かつｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか；またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
または、２つのＲ５基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈは、アルキル、または置換アルキルである。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
構造
【０２５２】
【化１７】
2009519942.tif 000018
は、（本明細書におけるすべての例において示されるように）、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｎ（Ｍ）ＣＨ２Ｒ５」および「Ｒａ」の相対的な配向性を示しておらず；むしろこれらの４つの特徴は、本明細書における例によって例証されているように、（この構造の他の特徴点とともに）化学的に安定な様式において配向され得る。
【０２５３】
一般式（Ｃ）の構造を有する芳香族アミン部分を含んでいる非天然アミノ酸は、一般式（ＸＩＩ）、一般式（ＸＩＩＩ）、一般式（ＸＩＶ）、一般式（ＸＶ）および一般式（ＸＶＩ）の構造を有する非天然アミノ酸を包含する。
【０２５４】
【化１８】
2009519942.tif 000019
（Ａ’のそれぞれは、独立して、ＣＲａ、Ｎまたは、
【０２５５】
【化１９】
2009519942.tif 000020
から成る群から選択され、かつＡ’の２つまでは、
【０２５６】
【化２０】
2009519942.tif 000021
であり、残りのＡ’は、ＣＲａまたはＮから選択されてもよい）。
また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２５７】
一般式（Ｃ）の構造を有する芳香族部分を含んでいる、非天然アミノ酸の他の非限定的な例は、図８−１０に示されている。また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２５８】
一般式（Ｃ）の化合物は、カルボニル含有試薬（例えば、単なる一例として、ケトン、エステル、チオエステル、およびアルデヒド）を用いた、一般式（Ａ）の化合物の還元的アルキル化によって形成され得る。単なる一例として、そのようなアルデヒド含有試薬は、
【０２５９】
【化２１】
2009519942.tif 000022
に対応する構造を有していてもよい。ここで、Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘである（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）。
【０２６０】
一般式（Ｂ）の構造を有する他の非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている非限定的な例である。
【０２６１】
【化２２】
2009519942.tif 000023
（Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか；またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈは、アルキル、または置換アルキルである）。
【０２６２】
一般式（Ｃ）の構造を有する以下の非天然アミノ酸は、本明細書に記載されているアルキル化非天然アミノ酸の非限定的な例である。
【０２６３】
【化２３】
2009519942.tif 000024
また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ任意に還元的アルキル化されていてもよい。
【０２６４】
一般式（Ｃ）のアミノ酸を含んでいる、非天然アミノ酸ポリペプチドの非限定的な合成例は、図１５に表されている。ポリペプチドに含まれる一般式（Ｂ）の非天然アミノ酸のマスクされたアミン部分が、最初に還元されると、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれた一般式（Ａ）の非天然アミノ酸が生じる。それから、そのような芳香族アミン部分は、上述したカルボニル含有試薬により還元的アルキル化されることにより、一般式（Ｃ）の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが生じる。また、そのような反応は、合成ポリマー、多糖、またはポリヌクレオチドに組み込まれた非天然アミノ酸に適用され得る。その上に、そのような反応は、組み込まれていない非天然アミノ酸に適用され得る。単なる一例として、マスクされたアミン部分の還元に使用される還元剤の例としては、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、およびＮａＢＨ４が挙げられるが、これらに限定されない。単なる一例として、還元的アルキル化は、約４から約７のｐＨを有する水性の緩衝液において、穏やかな還元剤（例えば、単なる一例として、シアノホウ化水素ナトリウム（ＮａＢＣＮＨ３））を用いて、起こり得る。なお、他の還元剤（例としては、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、ＮａＢＨ４が挙げられるが、これらに限定されない）を、還元的アルキル化に使用してもよい。
【０２６５】
図１６に示されているのは、上述したカルボニル含有試薬を用いた一般式（Ａ）の非天然アミノ酸に含まれる第２の芳香族アミン部分の還元的アルキル化による、一般式（Ｃ）のアミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸ポリペプチドの非限定的な合成例である。当該還元的アルキル化により、３級芳香族アミン部分を有する非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが生じる。また、そのような反応は、合成のポリマー、多糖、またはポリヌクレオチドに組み込まれた非天然アミノ酸に適用され得る。その上にまた、そのような反応は、組み込まれていない非天然アミノ酸に適用され得る。単なる一例として、還元的アルキル化は、約４から約７のｐＨを有する水性の緩衝液において、および穏やかな還元剤（例えば、単なる一例として、シアノホウ化水素ナトリウム（ＮａＢＣＮＨ３））を用いて、生じ得る。なお、他の還元剤（例としては、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、ＮａＢＨ４が挙げられるが、これらに限定されない）を、還元的アルキル化に使用してもよい。
【０２６６】
また、一般式（Ｃ）の化合物は、少なくとも２つのカルボニル部分（例としては、ジケトン、ケトアルデヒド、およびジアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない）を含んでいる試薬を用いた、一般式（Ａ）の化合物の還元的アルキル化によって形成され得る。例えば、そのような試薬は、
【０２６７】
【化２４】
2009519942.tif 000025
に対応する構造を有していてもよい（Ｒ１のそれぞれは、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケン、任意に置換されたアルキン、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換された複素環、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールから選択され；
Ｒ５は、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’−であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルである）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；ｎは１、２または３である）。
【０２６８】
‐Ｃ．非天然アミノ酸（アミノ化アミノ酸）の構造および合成‐
求核性反応基（例えば、単なる一例として、アルデヒド基、マスクされたアルデヒド基（容易にアルデヒド基に変換され得る官能基である）、または保護されたアルデヒド基（脱保護によって芳香族アミン基と同様の反応性を有する））を有する非天然アミノ酸は、多様な反応（例としては、アミン含有試薬を用いた還元的アミノ化反応が挙げられるが、これに限定されない）を介して分子を連結する多様な反応を可能にする。そのようなアミノ化非天然アミノ酸は、一般式（Ｄ）
【０２６９】
【化２５】
2009519942.tif 000026
の構造を有するアミノ酸を含む。ここで、Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’は独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈは、アルキル、または置換アルキルであり；
【０２７０】
【化２６】
2009519942.tif 000027
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳである。
構造：
【０２７１】
【化２７】
2009519942.tif 000028
は、（本明細書におけるすべての例において示されるように）、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｒａ」、ならびに直線および曲線によって表される他の置換体の相対的な配向性を示しておらず；むしろこれらの４つの特徴は、本明細書における例によって例証されているように、（この構造の他の特徴点とともに）化学的に安定な様式において配向され得る。
【０２７２】
保護されたアルデヒド部分を含んでいる非天然アミノ酸の一実施形態は、一般式（Ｅ）
【０２７３】
【化２８】
2009519942.tif 000029
の構造を有する（Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ６は、アルデヒド、保護されたアルデヒド、またはマスクされたアルデヒドであり、
保護基は、特に限定されないが、
【０２７４】
【化２９】
2009519942.tif 000030
（Ｘ１のそれぞれは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ａｃ）−、および−Ｎ（ＯＭｅ）−から成る群から選択され、；Ｘ２は、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＳＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）（Ａｃ）、−Ｎ（Ｒ）（ＯＭｅ）、またはＮ３であり、Ｒ’およびＲのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）を含んでいる）。
また、そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよいか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。また、そのような非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれてもよく、さらにそれから、脱保護によって翻訳後修飾されて、「インサイチュー」においてアルデヒド基を形成した後に、芳香族アミン含有試薬を用いたアルデヒドの還元的アミノ化によって、非天然アミノ酸ポリペプチドの一部として一般式（Ｄ）の構造を有する非天然アミノ酸を形成する。その上にまた、一般式（Ｅ）の構造を有する非天然アミノ酸は、ポリマーまたはポリヌクレオチドに組み込まれてもよく、さらに脱保護によって「インサイチュー」においてアルデヒド基を形成した後に、芳香族アミン含有試薬を用いたアルデヒドの還元的アミノ化によって当該ポリマーまたはポリヌクレオチドの一部として、一般式（Ｄ）の構造を有する非天然アミノ酸を形成してもよい。
【０２７５】
保護されたアルデヒド部分を含んでいるそのような非天然アミノ酸の非限定的な例は、図１７に示されている。
【０２７６】
一般式（Ｅ）の化合物のアルデヒド基を脱保護した後に、一般式（Ｄ）の化合物が形成された後に、芳香族アミン含有試薬を用いた一般式（Ｄ）の化合物の還元的アミノ化がなされてもよい。そのような芳香族アミン含有試薬は、
【０２７７】
【化３０】
2009519942.tif 000031
に対応する構造を有する。ここで、
【０２７８】
【化３１】
2009519942.tif 000032
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、かつｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、または置換アルカリルである。
【０２７９】
図１８に示されている、一般式（Ｄ）のアミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸ポリペプチドの非限定的な合成例では、ポリペプチドに含まれる一般式（Ｅ）の非天然アミノ酸の保護されたアルデヒド部分が、まず、脱保護されることにより、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれたアルデヒド部分を有する非天然アミノ酸が生じる。それから、当該アルデヒド部分は、上述した芳香族アミン含有試薬により還元的にアミノ化されて、一般式（Ｄ）の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが生じる。また、そのような反応は、合成のポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれた非天然アミノ酸に適用され得る。さらに、そのような反応は、組み込まれていない非天然アミノ酸に適用され得る。一例として、保護されたアルデヒドは、酸触媒脱保護によって脱保護される。単なる一例として、還元的アミノ化は、約４から約７のｐＨを有する水性緩衝液において、穏やかな還元剤（例えば、単なる一例として、シアノホウ化水素ナトリウム（ＮａＢＣＮＨ３））を用いて、起こり得る。なお、他の還元剤（例としては、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、およびＮａＢＨ４が挙げられるが、これらに限定されない）を、還元的アルキル化に使用してもよい。
【０２８０】
図１９に示されているのは、一般式（Ａ）の非天然アミノ酸の芳香族アミン部分の還元的アルキル化による、一般式（Ｃ）の非天然アミノ酸の形成の例示的な説明、および一般式（Ｅ）の非天然アミノ酸における脱保護されたアルデヒド部分の還元的アミノ化による、一般式（Ｄ）の非天然アミノ酸の形成の例示的な説明である。図１９に描かれているのは、還元的アルキル化反応の特異性および選択性であり、一般式（Ａ）の非天然アミノ酸の芳香族アミン部分だけが還元的アルキル化されるとが、他のアミン部分、チオール、およびジスルフィド結合は使用される反応条件では、還元されないか、または反応しない。また、図１９に描かれているのは、還元的アミノ化の特異性および選択性であり、一般式（Ｅ）の非天然アミノ酸の脱保護されたアルデヒド部分だけが還元的にアミノ化されるが、他のカルボン酸塩部分、チオール、およびジスルフィド結合は使用される反応条件では、還元されないかまたは反応しない。そのような選択的、部位特異的な誘導体化、還元的アルキル化、または還元的アミノ化は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、ポリペプチド／タンパク質のペグ付加、ポリペプチド／タンパク質の部位特異的な接合、プロドラッグの設計、ポリペプチド／タンパク質の糖鎖付加、ポリペプチド／タンパク質のダイマライゼーション、ポリペプチド／タンパク質の低分子接合体、ならびに抗体の低分子薬物接合体を設計するための、ポリペプチド／タンパク質の修飾を可能にし得る。
【０２８１】
還元的アルキル化反応または還元的アミノ化反応を用いた、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の修飾は、以下のいずれかまたはすべての利点を有する。第１に、芳香族アミンが、約４から約１０の範囲のｐＨにおいて、アルデヒドおよびケトンを含んでいるカルボニル含有化合物により還元的アルキル化されることにより、置換アミン連結（２級アミン連結および３級アミン連結など）が生じる（なお、ある種の実施形態では、上記ｐＨの範囲は、約４から約７である）。第２に、これらの反応条件において、天然に生じるアミノ酸の側鎖が不活性であるので、化学反応は、非天然アミノ酸に対して選択的である。このため、芳香族アミン部分、または脱保護されたアルデヒド部分含有非天然アミノ酸を組み込んでいるポリペプチド（例えば組み換えタンパク質）を部位特異的に誘導体化することができる。従って、そのような誘導体化ポリペプチドおよび誘導体化タンパク質を、特定の均質な産物として調製することができる。第３に、通常、ポリペプチドに組み込まれているアミノ酸の芳香族アミン部分と、アルデヒド含有試薬とを反応させるのに必要な穏やかな条件は、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（当然、反応の目的がそうような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。同様に、通常、ポリペプチドに組み込まれ、かつ脱保護されているアミノ酸のアルデヒド含有部分と、芳香族アミン含有試薬とを反応させるのに必要な穏やかな条件は、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（当然、反応の目的がそうような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。第４に、反応は室温において急速に起こり、このため、高温において不安定である多くの種類のポリペプチド、または試薬を使用することができる。第５に、反応は水性条件において容易に起こり、このため、非水性溶液とあらゆる程度で不適合性なポリペプチドおよび試薬を使用することができる。第６に、試薬に対するポリペプチドまたはアミノ酸の割合が、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的であるときでさえ、反応は容易に生じるので、この結果、有効量の反応産物を得るために過剰の試薬を加える必要がなくなる。第７に、生じたアミンは、反応物質のアミンおよびカルボニルの部分の設計に依存して、位置選択的および／または位置特異的に産生され得る。最後に、アルデヒド含有試薬を用いた芳香族アミンの還元的アルキル化、およびアミン含有試薬を用いた還元的アミノ化は、生物学的条件において安定なアミン連結（例としては、２級アミン連結および３級アミン連結が挙げられる）を生成する。
【０２８２】
図２０に示されているのは、システイン残基に隣接するアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化の特異性および選択性の非限定的な例である。プロピオンアルデヒド（Ｉ）、またはベンズアルデヒド（ＩＩ）を用いた、還元されたウロテンシン−ＩＩ（ＵＴ−ＩＩ−ＳＨ）の還元的アルキル化は、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成され、かつ遊離チオール基が反応しなかったことを証明している。また、図２０には、約反応速度が２時間であり、かつ還元されたウロテンシン−ＩＩ（ＵＴ−ＩＩ−ＳＨ）とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。その上に、ＵＴ−ＩＩ−ＳＨ、Ｉ、およびＩＩに関するＭＳのデータが表されている。
【０２８３】
図２１に示されているのは、システイン残基に隣接するアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化の特異性および選択性の非限定的な例である。プロピオンアルデヒド（Ｉ）、またはベンズアルデヒド（ＩＩ）を用いた、ウロテンシンーＩＩ（ＵＴ−ＩＩ）の還元的アルキル化は、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成され、かつジスルフィド結合が反応しなかったことを証明している。また、図２１には、反応速度が約２時間であり、かつウロテンシン−ＩＩ（ＵＴ−ＩＩ）とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であるが示されている。その上に、ＵＴ−ＩＩ、Ｉ、およびＩＩに関するＭＳのデータも示されている。
【０２８４】
末端のアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化の特異性および選択性の非限定的な例が、図２２にさらに示されている。ここで、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）を用いた、ペプチド  ＸＴ−８の還元的アルキル化は、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成され、かつジスルフィド結合が反応しなかったことを証明している。また、図２２に示されているのは、約２時間であった反応速度であり、かつＸＴ−８とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることである。その上に、ＸＴ−８、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに関するＭＳのデータも示されている。
【０２８５】
多様なＮ末端アミノ酸と隣接するアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化の特異性および選択性の非限定的な例が、図２３−２７にさらに示されている。図２３には、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）を用いた、ペプチド  ＳＸＴ−９（Ｎ末端セリン）の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、かつＳＸＴ−９とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。その上に、図２３では、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成されたこと、ジスルフィド結合が反応しなかったこと、およびＮ−Ｓｅｒ残基が選択性に最小の影響を与えることが、証明されている。その上に、ＳＸＴ−９、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに関するＭＳのデータも示されている。
【０２８６】
図２４には、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）を用いた、ペプチド  ＨＸＴ−９（Ｎ末端ヒスチジン）の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、かつＨＸＴ−９とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。また、図２４では、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成されたこと、ジスルフィド結合が反応しなかったこと、およびＮ−Ｈｉｓ残基が選択性に最小の影響を与えることが、証明されている。その上に、ＨＸＴ−９、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに関するＭＳのデータも示されている。
【０２８７】
図２５には、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）を用いた、ペプチド  ＷＸＴ−９（Ｎ末端トリプトファン）の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、かつＷＴ−８とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることを示す。また、図２５では、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成されたこと、ジスルフィド結合が反応しなかったこと、およびＮ−Ｔｒｐ残基が選択性に最小の影響を与えることが、証明されている。その上に、ＷＸＴ−９、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに関するＭＳのデータも示されている。
【０２８８】
図２６には、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）を用いた、ペプチド  ＮＸＴ−９（Ｎ末端アスパラギン）の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、かつＮＸＴ−９とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。また、図２６では、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成されたこと、ジスルフィド結合が反応しなかったこと、およびＮ−Ａｓｎ残基が選択性に最小の影響を与えることが、証明されている。その上に、ＮＸＴ−９、Ｉ、およびＩＩに関するＭＳのデータも示されている。
【０２８９】
図２７には、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）を用いた、ペプチド  ＲＸＴ−１０（Ｎ末端アルギニン）の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、かつＲＸＴ−１０とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。また、図２７では、１つの産物がそれぞれの反応から優勢に形成されたこと、ジスルフィド結合が反応しなかったこと、およびＮ−Ａｒｇ残基が選択性に最小の影響を与えることが、証明されている。その上に、ＲＸＴ−１０、Ｉ、およびＩＩに関するＭＳのデータも示されている。
【０２９０】
ペプチドにおけるアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化反応の特異性、および選択性の非限定的な例が、図２８に示されている。図２８には、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）を用いた、ペプチド  ＡＸＴ−１１の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、かつＡＸＴ−１１とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。その上に、図２８では、１つの産物が、それぞれの反応物質から優勢に形成されたこと、ジスルフィド結合が反応しなかったこと、およびＮ−Ａｌａ残基が選択性に最小の影響を与えることが、証明されている。また、ＡＸＴ−１１、Ｉ、ＩＩに関するＭＳデータも示されている。
【０２９１】
多様なアルデヒド含有試薬を用いたペプチドにおけるアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化反応の特異性、および選択性の非限定的な例が、図２９−３０に示されている。図２９には、多様なアルデヒド含有試薬を用いたペプチド  ＡＸＴ−１１の還元的アルキル化の反応速度は約５時間であり、ＡＸＴ−１１とそれぞれのアルデヒド含有試薬と間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。また、図２９では、１つの産物がそれぞれの反応物質から優勢に形成されたこと、およびジスルフィド結合が反応しなかったことが、証明されている。また、ＡＸＴ−１１、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩに関するＭＳデータも示されている。図３０には、多様なヘテロアルデヒド含有試薬を用いたペプチド  ＡＸＴ−１１の還元的アルキル化の反応速度は約５時間であり、ＡＸＴ−１１とそれぞれのアルデヒド含有試薬と間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。その上に、図２９では、１つの産物がそれぞれの反応物質から優勢に形成されたこと、およびジスルフィド結合が反応しなかったことが、証明されている。また、ＡＸＴ−１１ＩＶ、Ｖ、およびＶＩに関するＭＳデータも示されている。
【０２９２】
図３１−３３は、ペプチドにおけるアミノ酸残基上の芳香族アミン部分の還元的アルキル化反応の特異性、および選択性の非限定的な例を示す。上記芳香族アミン部分は、アルデヒド含有試薬、ケトン含有試薬、またはこれらの混合物のいずれかと、反応させられている。図３１には、アルデヒド含有試薬を用いたペプチド  ＡＸＴ−１１の還元的アルキル化の反応速度は約２時間であり、ＡＸＴ−１１とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であることが示されている。その上に、図３１では、使用された反応条件においてアルデヒド含有試薬のみが芳香族アミン部分と反応したこと、および１つの産物のみが優勢に形成されたことが証明されている。この場合も同様に、ジスルフィド結合が反応しなかった。図３３では、アルデヒド含有試薬、ケトン含有試薬、またはこれらの混合物を用いた、ペプチド  ＭＸＴ−９の還元的アルキル化は、使用された反応条件において、アルデヒド含有試薬のみが芳香族アミン部分と反応したこと、および１つの産物のみが優勢に形成されたことが、証明されている。この場合も同様に、ジスルフィド結合は、反応しなかった。
【０２９３】
ペプチドにおける保護された（またはマスクされた）芳香族アミン部分の脱保護（または脱マスク）と、それに続く多様なアルデヒド含有試薬を用いた生じた芳香族アミン部分の還元的アルキル化とが、図３４に示されている。ＴＣＥＰを用いたペプチド  ＭＸＴ−９−Ｎ３上のアジドの還元は、ペプチド  ＭＸＴ−９Ｎ２（Ｉ）上の主な芳香族アミン部分を生じた。それから、プロピオンアルデヒド（Ｉ）、またはベンズアルデヒド（ＩＩ）を用いた、続くＭＸＴ−９Ｎ２の還元的アルキル化は、対応するアルキル化ペプチドを産出した。図３４は、保護された、またはマスクされたアミン基を含んでいる非天然アミノ酸の組み込みの後に、芳香族アミン部分を形成する能力を証明している。また、反応速度が約１時間であること、ＭＸＴ−９Ｎ２とそれぞれのアルデヒド含有試薬との間における関係が化学量論的、またはほぼ化学量論的であること、１つの産物が優勢に形成されること、およびチオール基が反応しなかったことが、示されている。
【０２９４】
‐Ｄ．非天然アミノ酸の細胞の取り込み‐
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への取り込みを目的として（例として挙げられるが、これに限定されない）、非天然アミノ酸を設計および選択するときに考慮される１つの課題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性ではないかもしれないを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取り込まれるならば、これを評価する急速なスクリーニングが行われ得る。例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、「Protein Arrays」と題された米国特許出願公開第２００４／１９８６３７号明細書、および「Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785 」における、例えば、毒性アッセイを参照のこと。取り込みは、多様なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞の取り込み経路に受け容れられる非天然アミノ酸の設計ための代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
【０２９５】
‐Ｅ．非天然アミノ酸の生合成‐
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を産生するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸用の生合成方法は、天然に（例としては、細胞内が挙げられるが、これに限定されない）は存在し得ないが、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加、または存在する宿主細胞経路の修飾によって宿主細胞において任意に生成される。追加の新しい酵素は、任意に、天然に生じる酵素または人工的に発展させた酵素である。例えば、ｐ‐アミノフェニルアラニンの生合成（「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットにおける一例に示されているように）は、他の生物に由来する公知の酵素の組み合わせの追加を基にしている。これらの酵素に関する遺伝子は、当該遺伝子を含んでいるプラスミドを用いた細胞の形質転換によって真核細胞に導入され得る。細胞において発現した場合に、該遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意に添加されるこの種の酵素の例は、以下の例において与えられる。追加の酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見出される。また、人工的に発展させた酵素は、同様の方法において細胞の中に任意に加えられる。この方法において、細胞性機構、および細胞資源は、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
【０２９６】
種々の方法が、生合成経路に使用するための、または存在する経路を発展させるための新規な酵素の産生に利用可能である。例えば、Maxygen, Inc.(www.maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能である）によって開発されたような（例として挙げられるが、これに限定されない）、反復的な組み換えは、新規の酵素および経路の開発に、任意に使用される。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391」、および「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Genencor（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能である）によって開発されたDesignPath（登録商標）は、代謝経路設計（例としては、細胞においてＯ‐メチル‐Ｌ‐チロシンを作り出す経路の設計が挙げられるが、これに限定されない）に任意に使用される。この技術は、新しい遺伝子の組み合わせ（例としては、機能的なゲノミクスを介して同定された遺伝子が上げられるが、これに限定されない）、ならびに分子進化および設計を用いて、宿主生物に存在する経路を再コンストラクションする。また、Diversa Corporation（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能である）は、新しい経路を作り出すための（例として挙げられるが、これに限定されない）、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを迅速にスクリーニングする技術を提供する。
【０２９７】
典型的に、本明細書に記載されている設計された生合成経路を用いて産生された非天然アミノ酸は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度（例としては、天然の細胞における量があげられるが、これに限定されない）に産生されるが、他のアミノ酸の濃度に影響する、または細胞性の資源を使い果たす程ではない。この方法においてインビボにおいて生成される通常の濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を含んでいるプラスミドを用いて、細胞が形質転換され、非天然アミノ酸が生成されると、インビボにおける選択は、リボソームタンパク質の合成および細胞増殖の両方に対して、非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、任意に使用される。
【０２９８】
‐Ｆ．その他の合成方法論‐
本明細書に記載されている非天然アミノ酸は、当該技術について説明されている方法論を用いて、または本明細書に記載されている技術を用いて、またはこれらの組み合わせによって合成され得る。補足として、所望の官能基を作り出すために組み合わせられ得る、多様な出発物質となる求電子試薬および求核試薬を提供する表を以下に示す。なお、与えられる情報は例示的であり、かつ本明細書に記載されている合成技術を制限するものではないことを意図されている。
【０２９９】
【表１】
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一般的に、炭素求電子試薬は、補完的な求核試薬（例としては、炭素求核試薬が挙げられる）による作用に影響を受けやすい。ここで、作用する求核試薬は、求核試薬と求電子試薬との間に新しい結合を形成するために炭素求電子試薬に対して電子対をもたらすものである。
【０３００】
適切な炭素求核試薬の例としては、アルキル、アルケニル、アリールおよびアルキニルのグリニャール（Grignard）、有機リチウム、有機亜鉛、アルキル−、アルケニル−、アリール−およびアルキニル−スズ試薬（有機スズ化合物（organostannanes））、アルキル−、アルケニル−、アリール−およびアルキニル−ボラン試薬（有機ホウ素化合物および有機ボロネート（organoboronate））が挙げられるが、これに限定されない。これらの炭素求核試薬は、水または極性有機溶媒において動力学的に安定であるという利点を有する。他の炭素求核試薬の例としては、リンイリド、エノール、エノラート試薬が挙げられる。これらの炭素求核試薬は、合成有機化学の当業者によく知られている前駆体から比較的に容易に生成されるという利点を有する。炭素求電子試薬との接合に使用されるときに、炭素求核試薬は、炭素求核試薬と炭素求電子試薬との間に新たな炭素−炭素結合を生み出す。
【０３０１】
炭素求電子試薬に対するカップリングに好適な非炭素求核試薬の例としては、１級アミンおよび２級アミン、チオール、チオレート（thiolate）およびチオエーテル、アルコール、アルコキシド、アジド、ならびにセミカルバジドなどが挙げられる。炭素求電子試薬との接合に使用されるとき、これらの非炭素求核試薬は、通常、異種原子連結（Ｃ−Ｘ−Ｃ）を生じる（Ｘは異種原子（例えば、酸素または窒素）である）。
【０３０２】
＜ＶＩ．非天然アミノ酸を有するポリペプチド＞
本明細書に記載されている組成物および方法は、ポリペプチドへの少なくとも１つの非天然アミノ酸の組み込みを提供する。非天然アミノ酸は、ポリペプチドにおけるあらゆる位置（例としては、ポリペプチドのあらゆる末端位置、またはあらゆる内部位置が挙げられる）に存在し得る。ポリペプチドに非天然アミノ酸を組み込む目的の１つが、ポリペプチドの活性および／または三次元構造の破壊ではない限り、非天然アミノ酸は、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドの活性および／または三次元構造と比較して、ポリペプチドの活性および／または三次構造を破壊しないことが好ましい。さらに、ポリペプチドへ非天然アミノ酸の組み込むことによって、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／またはポリペプチドの三次構造がある程度に、当該活性および／または三次構造の破壊を完全に引き起こすことなく、修飾され得る。例えば、ポリペプチドの活性の修飾には、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、生物学的利用性、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物活性の調節、または循環時間の延長）、ポリペプチドへのさらなる機能性基の付与、ポリペプチドへのタグ、標識または検出可能なシグナルの組み込み、ポリペプチドの単離性質の簡単化、ならびに上述した修飾のあらゆる組み合わせが挙げられる。活性および／または三次構造の上記修飾は、しばしば上記組み込みをもたらすことの目的の１つであるが、当然にポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みはまた、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／または三次構造にほとんど影響を与えなくてもよい。同様に、非天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物、当該ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を作製する方法、当該ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を精製、単離、および特徴づける方法、ならびに当該ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を使用する方法は、この開示内容の範囲内にあることが考慮される。さらに、本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドはまた、他のポリペプチド（単なる一例としては、非天然アミノ酸ポリペプチドまたは天然に生じるアミノ酸ポリペプチドが挙げられる）と連結され得る。
【０３０３】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドは、生合成的または非生合成的に産生され得る。生合成的に産出する方法は、翻訳系（細胞の翻訳系または無細胞翻訳系）を利用したあらゆる方法（例としては、以下の構成要素：ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ、およびリボソームの少なくとも１つの使用が挙げられる）を意図している。非生合成的に産出する方法は、翻訳系を利用しないあらゆる方法を意図しており、この方法は、固体ペプチド合成方法（solid state synthetic method）、固相ペプチド合成方法、少なくとも１つの酵素を利用する方法、および少なくとも１つの酵素を利用しない方法にさらに分られてもよく、その上に、あらゆるこの小区分は重複していてもよく、かつ多くの方法はこれらの小区分の組み合わせを利用し得る。
【０３０４】
本明細書に記載されている方法、組成物、戦略、および技術は、特定の種類、分類、またはファミリーのポリペプチドまたはタンパク質に限定されない。実際に、ほとんどあらゆるポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含み得る。単なる一例として、ポリペプチドは、以下から成る群から選択される治療タンパク質と相同であり得る：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレ���トキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。また、非天然アミノ酸ポリペプチドは、成長ホルモンスーパーファミリーのあらゆるポリペプチド構成要素と相同であり得る。芳香族アミン部分を含んでいる非天然アミノ酸を組み込み得るペプチド／タンパク質の非限定的な例は、図２０−３４に示される。
【０３０５】
非天然アミノ酸は、この開示内容の他の場所に記載されているようにさらに修飾され得るか、非天然アミノ酸は、さらなる修飾なしで使用され得る。ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みは、多様な目的（例としては、タンパク質構造および／または機能の変化の修正、大きさの変更、酸性度の変更、求核性の変更、水素結合の変更、疎水性の変更、プロテアーゼ標的部位の接触性の変更、部分に対する標的化の変更（例としては、タンパク質アレイ用が挙げられるが、これに限定されない）などが挙げられるが、これらに限定されない）のためになされ得る。非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、増強された、もしくはまさに完全に新しい、触媒性または生物物理学的性質を有する。単なる一例として、以下の性質がタンパク質への非天然アミノ酸の包含によって任意に修飾される：毒性、体内分布、構造的性質、分光の性質、化学的および／または光化学的性質、触媒能、半減期（例としては、血清中半減期が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに共有結合的なまたは非共有結合的な（例として挙げられるが、これらに限定されない）他の分子との反応性など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を、含有している組成物は、新規の治療、診断、触媒酵素、工業的触媒、結合タンパク質（例としては、抗体が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびにタンパク質の構造および機能（例として挙げられるが、これらに限定されない）の研究に有用である（例として挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。
【０３０６】
さらに、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分の側鎖は、ポリペプチドに対して広範な付加的な機能性基を提供することができ、限定されるようなものではなく単なる一例として、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分の側鎖は、以下のうちのあらゆるものを含み得る：標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせ。
【０３０７】
１態様において、組成物は、少なくとも１（例としては、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上が挙げられるが、これらに限定されない）の非天然アミノ酸を有する少なくとも１つのタンパク質を含んでいる。非天然アミノ酸は、同じであり得る、または異なり得る（例としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の異なる場所がタンパク質に存在し得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。他の態様において、組成物は、非天然アミノ酸により置換されているタンパク質に存在する少なくとも１つ（ただし、全てではない）の特定の天然アミノ酸を有する、タンパク質を含んでいる。２以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、非天然アミノ酸は、同一であり得るか、または異なり得る（例としては、当該タンパク質が２種類以上の非天然アミノ酸を含み得るか、または２の同じ非天然アミノ酸を含み得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。３以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、非天然アミノ酸は、同じであり得るか、または異なり得る。
【０３０８】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドの実施形態は、固相ペプチド合成方法を介して（例えば、固体樹脂上において）、液相ペプチド合成方法によって、および／または酵素の補助なしで、化学的に合成され得るが、本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドの他の実施形態は、細胞膜、細胞抽出物、もしくはライセートの系を介した、またはインビボの系を介した（例えば、原核細胞または真核細胞の細胞機構を用いた）、合成を可能にする。さらなるまたは付加的な実施形態では、本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドの重要な特徴の１つは、それらがリボソームを利用して合成され得ることである。本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドの、さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、酵素の補助なしで固体樹脂の組み合わせによって、リボソームの補助を介して、インビトロの系を介して、インビボの系を介して、またはこれらのあらゆる組み合わせで合成され得る。
【０３０９】
リボソームおよび／またはインビボの系を介した、非天然アミノ酸ポリペプチドの合成は、固体樹脂上において、または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸ポリペプチドとは異なる、利点および特性を有する。これらの利点または特性は、異なる不純物プロファイルを含む。リボソームを利用した系および／またはインビボの系は、利用した生物系に由来する不純物（例としては、宿主細胞タンパク質、膜部分および脂質が挙げられるが、これらに限定されない）を有するのに対し、固体樹脂を利用したおよび／または酵素の補助なしの系からの不純物プロファイルは、合成手法に使用された、有機溶媒、保護基、樹脂材料、カップリング試薬および他の化学物質を含んでいる。その上に、リボソームの使用および／またはインビボの系を介して合成された、非天然アミノ酸ポリペプチドの同位体の型は、供給原料の同位体の型を正確に反映するのに対し、固体樹脂上においておよび／または酵素の補助なしで合成された、非天然アミノ酸ポリペプチドの同位体の型は、合成に使用されたアミノ酸の同位体の型を正確に反映する。さらに、リボソームおよび／またはインビボの系の使用を介して合成された非天然アミノ酸ポリペプチドは、アミノ酸のＤ−異性体が実質的になく、および／またはポリペプチドの構造に内部システインアミノ酸を組み込むことができ、および／または内部アミノ酸欠失ポリペプチドをまれに提供する。これに対し、固体樹脂を介しておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸ポリペプチドは、高い含有量のアミノ酸のＤ−異性体、低い含有量の内部システイン、および／または高い割合の内部アミノ酸欠失ポリペプチドを有する。さらに、当業者は、固体樹脂を介しておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸ポリペプチドから、リボソームおよび／またはインビボの系の使用によって合成された非天然アミノ酸ポリペプチドを区別することができる。
【０３１０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載の方法は、
【０３１１】
【化３２】
2009519942.tif 000034
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる化合物またはその塩を作製する方法であって、上記化合物は、少なくとも１つのアルデヒド部分を含んでいる反応物質を少なくとも１つ用いて、芳香族アミン部分を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸における芳香族アミノ部分を還元的アルキル化することによって形成され、
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである、方法である。
【０３１２】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＲ１およびＲ２が、それぞれＨおよびＯＨである、化合物またはその塩を作製する方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＲａがハロゲンである、化合物を作製する方法である。他の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＲ１およびＲ２の両方が、ポリペプチドである、化合物またはその塩を作製する方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＸが、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルから成る群から選択される生物活性剤である、化合物またはその塩を作製する方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＸが、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子およびステロイド剤から成る群から選択される薬物である、化合物またはその塩を作製する方法である。他の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＸが、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから成る群から選択される酵素である、化合物またはその塩を作製する方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＸが、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分、キレート部分、電子密度の高い部分、磁性部分、挿入部分、放射性部分、発色部分、およびエネルギー伝達部分から成る群から選択される検出可能な標識である、化合物またはその塩を作製する方法である。さらなる実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸のＸが、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルを含んでいるポリマーである、化合物またはその塩を作製する方法である。
【０３１３】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ポリマーがポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、化合物またはその塩を作製する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ポリマーが−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（ハロゲン、アルキルまたは置換アルキル）］ｘである（ｘは２０−１００００である）、化合物またはこれらの塩を作製する方法である。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ポリマーが約２から約４０ｋＤａまでの範囲の分子量を有するｍ−ＰＥＧである、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
【０３１４】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、
【０３１５】
【化３３】
2009519942.tif 000035
（Ｘはハロゲンである）
の群から選択される、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、
【０３１７】
【化３４】
2009519942.tif 000036
の群から選択される、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
【０３１８】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、
【０３１９】
【化３５】
2009519942.tif 000037
（Ｘはハロゲンである）。
の群から選択される、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
【０３２０】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、
【０３２１】
【化３６】
2009519942.tif 000038
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる化合物または、その塩を作製する方法であって、上記化合物は、少なくとも１つのアルデヒド部分を含んでいる反応物質を少なくとも１つ用いて、芳香族アミノ部分を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸における芳香族アミノ部分を還元的アルキル化することによって形成され；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
または、２つのＲ５基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１がＨであるとき、Ｒ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるとき、Ｒ１はＨではなく；
Ｇはアミン保護基である、方法である。
【０３２２】
いくつのかの実施形態では、当該アミン保護基が、
【０３２３】
【化３７】
2009519942.tif 000039
から成る群から選択される、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２の両方がポリペプチドである、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのアルデヒド部分が、
【０３２５】
【化３８】
2009519942.tif 000040
と対応する構造を有する、化合物またはそれらの塩を作製する方法であって、Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘである（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）、方法である。
【０３２６】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、
【０３２７】
【化３９】
2009519942.tif 000041
の構造を有する化合物またはそれらの塩を作製する方法である（Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（ｋは、１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ６は、保護されたアルデヒドまたはマスクされたアルデヒドであり、
保護基は、特に限定されないが、
【０３２８】
【化４０】
2009519942.tif 000042
（Ｘ１のそれぞれは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ａｃ）−、および−Ｎ（ＯＭｅ）−から成る群から選択され、；Ｘ２は、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＳＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）（Ａｃ）、−Ｎ（Ｒ）（ＯＭｅ）、またはＮ３であり、Ｒ’およびＲのそれぞれは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）を含んでいる）。
【０３２９】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｘ１がＯである、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｒ１およびＲ２の両方がポリペプチドである、化合物またはそれらの塩を作製する方法である。
【０３３０】
＜ＶＩＩ．核酸およびオリゴヌクレオチドを含んでいる、組成物および方法＞
‐Ａ．本明細書における使用のための一般的な組み換え核酸方法‐
本明細書に記載されている方法および組成物の多くの実施形態では、興味のあるポリペプチド（単なる一例としては、ＧＨポリペプチドが挙げられる）をコードする核酸は、単離され、クローニングされ、しばしば組み換え法を用いて変更される。そのような実施形態は、例えば、特に限定されないが、タンパク質の発現に、またはバリアント、誘導体、発現カセット、もしくは他の発現カセットに由来する他の配列の生成の間に使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモーターに発現可能に連結される。
【０３３１】
また、本明細書には、非天然アミノ酸ポリペプチドを製造することができる細胞が記載されている。ポリペプチド内の少なくとも１つの上記非天然アミノ酸は、芳香族アミン部分、またはマスクされたもしくは保護されたアルデヒド部分を有する側鎖を含んでいるものである。少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチドを生合成する細胞は、本明細書に記載されている技術、方法、組成物および戦略か、これらの変形かを用いて産生され得る。
【０３３２】
非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドをコードする核酸配列を、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成して、それから、関連のあるアミノ酸残基の、導入（例えば、組み込みまたは置換）をもたらすか、除去する（例えば、欠失または置換）ように核酸を変更してもよい。核酸配列は、従来の方法に従った部位特異的突然変異誘発法によって、簡便に修飾され得る。代替可能に、核酸配列は、化学合成によって（例としては、オリゴヌクレオチド合成機を用いる化学合成が挙げられるが、これに限定されない）、調製されてもよい。当該化学合成では、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸配列に基づいて設計される。オリゴヌクレオチドの設計の際には、組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞に有利に働くコドンを選択することが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードする多様な小さいオリゴヌクレオチドは、合成され、かつＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応によって集められ得る。例えば、「Baranyら, Proc. Natl. Acad. ScL 88: 189-193 (1991) 」；米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照のこと。
【０３３３】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、組み換え遺伝学の分野においてよくある技術を利用する。本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法および組成物に使用する通常の方法を開示する、基本的なテキストの例としては、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd 5 ed. 2001)」；「Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)」；および「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら, eds., 1994)」が挙げられる。
【０３３４】
分子生物学的技術について説明するテキストの例としては、「Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzvmology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)」「Sambrookら, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.). Vol. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)」、「Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (「Ausubel」)」が挙げられる。これらのテキストは、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、および多くの他の関連する話題（例としては、非天然アミノ酸、直交化ｔＲＮＡ、直交化シンテターゼ、およびこれらの対を含むタンパク質の産生にとってのセレクターコドンを含んでいる、遺伝子またはポリヌクレオチドの生成が挙げられるが、これらに限定されない）について述べている。
【０３３５】
多様な種類の突然変異誘発法は、多様な目的のため（例としては、新規なシンテターゼまたはｔＲＮＡを産生するため、ｔＲＮＡ分子を突然変異するため、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異するため、ｔＲＮＡのライブラリーを産生するため、シンテターゼのライブラリーを産生するため、セレクターコドンを産生するため、興味のあるタンパク質またはポリペプチドに非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するためが挙げられるが、これらに限定されない）に、本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法および組成物において使用される。突然変異誘導法の例としては、部位特異的突然変異誘発法、無作為の点突然変異誘発法、相同性組み換え、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の反復的な突然変異誘発法方法、キメラコンストラクション、鋳型を含むウラシルを用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発法、ホスホロチオネート修飾ＤＮＡ突然変異誘発法、またはギャップドデュプレックスＤＮＡ（gapped duplex DNA）を用いた突然変異誘発法など、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。付加的な適切な方法の例としては、点不適合修復、修復欠損のある宿主株を用いた突然変異誘発法、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発法、全体の遺伝子合成による突然変異誘発法、および二本鎖破壊修復などが挙げられる。また、キメラコンストラクションに関与する（例として挙げられるが、これに限定されない）、突然変異誘発法は、本明細書に記載されているアミノ酸に関する方法および組成物に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発法は、天然に生じる分子、または変更もしくは突然変異された天然に生じる分子の、公知の情報（例としては、配列、配列比較、物理的な性質、または結晶構造などが挙げられるが、これらに限定されない）によって誘導され得る。
【０３３６】
本明細書に見られるテキストおよび例は、これらの手法について説明している。付加的な情報が、引用された以下の公報および参考文献に見られる：「Lingら, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): - 157-178 (1997)」；「Daleら, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996) 」；「Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985)」；「Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1 193- 1201(1985)」；「Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)」；「Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)」；「Kunkelら, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)」；「Bassら, Mutant Trp repressors with new DNA- binding specificities, Science 242:240-245 (1988)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 -derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide- directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)」;「Taylorら, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985) 」；「Taylorら, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985) 」；「Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Net I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679- 9698 (1986)」；「Sayersら, 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988) 」;「Sayersら, Strand specific cleavage of phosphor othioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814」；「Kramerら, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984) 」;「Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex 5 DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)」；「Kramerら, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988) 」；「Fritzら, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988) 」；「Kramerら, Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carterら, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431 -4443 (1985) 」；「Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)」；「Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986) 」；「Wellsら, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)」；「Nambiarら, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)」；「Sakmar and Khorana, Total synthesis and 5 expression of a gene for the alpha subunil of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988) 」；「Wellsら, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985) 」；「Grundstroemら, Oligonucleotide- directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) 」；「Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:7177-7181 (1986)」；「Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)」；「Sieberら, Nature Biotechnology, 19:456- 460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994) 」および「I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) 」。上述した多くの方法に関する付加的な詳細は、多様な突然変異誘発法方法とともに異常処理にとって有用な調整についても説明している、「Methods in Enzymology Volume 154」に見られ得る。
【０３３７】
また、本明細書に記載されている方法および組成物は、直交化ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介した非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みに対する、真核宿主細胞、非真核宿主細胞、および生物の使用を包含する。宿主細胞は、本明細書に記載されているポリペプチドに対応するポリヌクレオチド、または本明細書に記載されているポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを含んでいるコンストラクト（例としては、本明細書に記載されているポリペプチドに対応するベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）が挙げられるが、これに限定されない）を用いて、遺伝子組み換えされる。上記遺伝子組み換えの例としては、形質転換、形質導入またはトランスフェクトが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、直交化ｔＲＮＡ、直交化ｔＲＮＡシンテターゼ、および誘導体化されるタンパク質にとってのコーディング領域は、所望の宿主細胞において機能的である遺伝子発現制御エレメントと動作可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または接合されたポリヌクレオチドの形態であり得る。ベクターは、標準的な方法（例としては、エレクトロポレーション（「Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985) 」）、ウイルスベクターによる感染、および／または小さなビーズもしくは粒子のいずれかの中か表面上における核酸を用いた低分子による高速弾丸侵入（high velocity ballistic penetratrion）（「Kleinら, Nature 327.70-73 (1987) 」））によって細胞および／または微生物に導入される。
【０３３８】
操作された宿主細胞は、スクリーニング段階、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択といった活動に適するように修飾された、従来の培養液において培養され得る。これらの細胞は、遺伝子導入生物の中に、任意に培養され得る。（例えば、その後に核酸を単離するための）細胞の単離および培養などに関する他の有用な文献の例としては、「Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York」、およびこれらに引用されている参考文献、「Payneら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY」、「Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlin Heidelberg New York)」、ならびに「Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL」が挙げられる。
【０３３９】
細胞に標的の核酸を導入する多様なよく知られている方法は利用可能であり、これらの方法のいずれかを、本明細書に記載されている方法および組成物に使用することができる。これら方法の例としては、ＤＮＡを含む細菌の原形質体と受容細胞の融合、エレクトロポレーション、粒子衝撃法（projectile bombardment）、およびウイルスベクターを用いた感染（以下にさらに詳しく述べる）などが挙げられる。細菌細胞は、本明細書に記載されているポリペプチドに対応するＤＮＡコンストラクトを含んでいるプラスミドの数を増幅するために使用され得る。細菌は、対数増殖期まで成長され、当該細菌内のプラスミドは、当該分野に周知の多様な方法によって単離される（例えば、Sambrookを参照のこと）。また、細菌からのプラスミドの精製を目的とするキットが、市販されている（例えば、EasyPrep（登録商標）、FlexiPrep（登録商標）（いずれもPharmacia Biotechが提供している）；StrataClean（登録商標）（Stratageneが提供している）；およびQIAprep（登録商標）（Qiagenが提供している）を参照のこと）。それから、単離され、かつ精製されたプラスミドは、他のプラスミドを産生するためにさらに操作されるか、細胞のトランスフェクトに使用されるか、または生体に感染させるために関連するベクターに組み込まれる。典型的なベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現を制御するために有用なプロモーターを含んでいる。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物、または原核生物、またはその両方の系（例としては、シャトルベクターが挙げられるが、これに限定されない）において、カセットの複製を許容する配列、ならびに原核生物および真核細胞の両方の系にとっての選択マーカーを含む、通常の発現カセットを任意に含んでいる。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製および組み込みに好適である。「Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)」；「Robertsら, Nature. 328:731 (1987)」；「Schneider, E.ら, Protein Expr. Purif. 6(l)-10-14 (1995)」；（すべて上述の）「Ausubel」、「Sambrook」、「Berger」を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージの一覧表が、提供される（例えば、ＡＴＣＣによって公開されている「The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Ghernaら (eds)」）。また、配列決定、クローニング、ならびに分子生物学の他の態様、および基礎をなす理論的な考察のための、別の基本的手法は、「Watsonら (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. 」に見られる。また、本質的にあらゆる核酸（および標準的かまたは非標準的な、ほとんどあらゆる標識核酸）は、あらゆる多様な市販の出所（例えば、the Midland Certified Reagent Company(Midland, TX mcrc.com),The Great American Gene Company(Ramona、CA、ワールドワイドウェブのgenco.comにおいて利用可能である)、ExpressGen Inc.（Chicago,IL,ワールドワイドウェブのexpressgen.comにおいて利用可能である）、Operon Technologies Inc.（Alameda, CA）および多くの他社）が提供して、特別にまたは通常に注文され得る。
【０３４０】
‐Ｂ．セレクターコドン‐
本明細書に記載されている方法および組成物に包含されるセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝学的なコドンの枠組みを拡張する。例えば、セレクターコドンの例としては、固有の３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えば、終止コドン（例としては、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン、またはオパールコドン（ＵＧＡ）が挙げられるが、これらに限定されない））、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドン（rare codon）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入され得るセレクターコドンの数は、広範である（例としては、所望のポリペプチドの部分を少なくともコードする単一のポリヌクレオチドにおける１以上、２以上、３以上、４、５、６、７、８、９、１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０３４１】
一実施形態では、本方法は、インビボにおいて１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むための、終止コドンであるセレクターコドンの使用を含んでいる。例えば、終止コドン（例としては、ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を認識する、Ｏ−ｔＲＮＡは産生され、当該Ｏ−ｔＲＮＡは所望の非天然アミノ酸によりＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に生じる宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによって認識されないものである。従来の部位特異的な突然変異誘発法は、興味のあるポリペプチドにおける興味のある部位に、終止コドン（例としては、ＴＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を導入するために使用され得る。例えば、「Sayers, J.R.,ら (1988), 5’-3’ Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802」を参照のこと。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび興味のあるポリペプチドをコードする核酸がインビボにおいて組み合わせられると、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに応じて組み込まれ、その結果、特定の位置に非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが生じる。
【０３４２】
また、非天然アミノ酸は、レアコドンによりコードされ得る。例えば、インビボでのタンパク質合成反応においてアルギニン濃度が低下すると、アルギニンのレアコドンであるＡＧＧは、アラニンによりアシル化される合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが証明されている。例えば、「Maら, Biochemistry. 32:7939 (1993)」を参照のこと。この場合において、上記合成ｔＲＮＡは、Escherichia coliにおいて微量種として存在する天然に生じるｔＲＮＡ  Ａｒｇと競合する。いくつかの生物は、すべてのトリプレットコドンを使用するわけではない。Micrococcus luteusの割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロの転写／翻訳の抽出物における、アミノ酸の挿入に使用されている。例えば、「Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997) 」を参照のこと。本明細書に記載の構成要素は、インビボにおいてこれらのレアコドンを使用するために生成され得る。
【０３４３】
インビボにおける非天然アミノ酸の組み込みは、真核細胞を有意に乱すことなくなされ得る。例えば、ＵＡＧコドンに関する抑圧効率は、Ｏ−ｔＲＮＡと、真核細胞の放出因子との間の競合に依存するので、抑圧効率は、例えば、特に限定されないがＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳの発現レベルの増加によって修飾され得る。なお、上記Ｏ−ｔＲＮＡには、アンバーサプレッサーｔＲＮＡが含まれるが、これに限定されない。また、上記放出因子は、終止コドンと結合し、リボソームから成長しているペプチドの放出を開始するものであり、例としては、ｅＲＦが挙げられるが、これに限定されない。
【０３４４】
また、セレクターコドンは、延長されたコドン（延長コドン）（例としては、４塩基以上のコドン（例えば、４塩基、５塩基、６塩基以上のコドン）が挙げられるが、これらに限定されない）を含んでいる。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されている方法および組成物の特徴は、フレームシフト抑圧に基づく、延長コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは、同じタンパク質に１つまたは複数の非天然アミノ酸（例として挙げられるが、これらに限定されない）を挿入可能である。例えば、アンチコドンループ（少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループなど）を有する、突然変異されたＯ−ｔＲＮＡ（例としては、特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない）の存在下において、４塩基以上のコドンが単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態では、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン（例として挙げられるが、これらに限定されない）を翻訳可能である。見込みのある４塩基コドンが２５６あるので、複数の非天然アミノ酸は、４塩基以上のコドンを用いて、同じ細胞において翻訳され得る。「Andersonら, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology. 9:237-244」；「Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of ‘Shifty’ Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769」を参照のこと。
【０３４５】
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を用いた、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、「Maら, (1993) Biochemistry. 32:7939」、および「Hohsakaら, (1999) L Am. Chem. Soc. 121: 34」を参照のこと。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロにおいて、ストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンおよびリジンＮＢＤ誘導体を同時に組み込むために使用された。例えば、「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 12194」を参照のこと。Ｍｏｏｒらは、インビトロの研究にて、ＵＡＧＮコドンを抑圧するというＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体の能力を調べた（ＮはＵ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）。そして、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより、４塩基のＵＡＧＡが、１３〜２６％の効率でもって、０または−１フレームにおける解読がほとんどなく、解読され得ることを発見した。例えば、「Mooreら, (2000) J. Mol. Biol., 298:195」を参照のこと。一実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく延長コドンは、本明細書に記載の方法および組成物に、使用され得る。これによれば、他の望ましくない部位におけるミスセンスのリードスルーと、フレームシフト抑圧とを減少することができる。
【０３４６】
また、所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（または稀にしか使用しない）場合に、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンの１つを含むことができる。例えば、この例としては、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡが欠如している系、および／または３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０３４７】
セレクターコドンは、非天然塩基対を任意に含んでいる。これらの非天然塩基対は、存在する遺伝アルファベットをさらに拡張する。塩基対を１つ追加することにより、３塩基コドンの数が６４から１２５まで増加する。第３の塩基対の性質の例としては、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる高い忠実度を伴ったＤＮＡへの効率的な酵素的組み込み、および新生の非天然塩基対の合成後における効率的な連続するプライマー伸張が挙げられる。本方法および本組成物に適合し得る非天然塩基対の記述の例としては、例えば、「Hiraoら, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182」が挙げられ、かつまた、「Wu, Y.,ら (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630」を参照のこと。他の関連する公報は、以下に載せられている。
【０３４８】
インビボにおける使用法に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、かつリン酸化されて、対応する３リン酸塩を形成する。その上に、増加した遺伝情報は、安定であり、かつ細胞性の酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒおよびその他によるこれまでの試みは、もっとも注目すべき例であるイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対という、基準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対における水素結合様式とは異なる、水素結合様式を巧く活用した。例えば、「Switzerら, (19S9) J. Am. Chem. Soc, 111 :8322; and Piccirilliら, (1990) Nature, 343:33」；「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」を参照のこと。これらの塩基は、通常、ある程度に天然塩基と誤対合し、かつ酵素的に修復され得ない。Ｋｏｏｌおよび共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合と入れ替わって、塩基対の形成を生じることができることを証明した。例えば、「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」、および「Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825」を参照のこと。上述した条件のすべてを満たす非天然塩基対を開発する試みにおいて、Schultz、Romesbergおよび共同研究者は、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、かつ研究している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対より安定であることが見出されており、かつEscherichia coliのＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノー酵素（ＫＦ）によって、ＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、「McMinnら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 11585-6」；および「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274」を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に対して十分な効率性および選択性を伴って、ＫＦによって合成され得る。例えば、「Ogawaら, (2000) J Am. Chem. Soc, 122:8803」を参照のこと。しかし、両方の塩基は、さらなる複製に対してターミネーターとして作用する。近年、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対の複製に使用され得るように、発展されている。その上に、７ＡＩ．自己対は、複製され得る。例えば、「Taeら, (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:7439」を参照のこと。また、Ｃｕ（ＩＩ）との結合によって安定な対を形成する新規な金属塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙが、開発されている。例えば、「Meggersら, (2000) J. Am. Chem. Soc 122:10714」を参照のこと。延長コドンおよび非天然コドンは、天然コドンに対して本来的に直交であるので、本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法は、この性質を活かして非天然アミノ酸用の直交化ｔＲＮＡを生成し得る。
【０３４９】
また、翻訳回避系（ｔranslational bypassing system）が、所望のポリペプチドにおける非天然アミノ酸の組み込みに使用され得る。翻訳回避系において、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、この配列はタンパク質に翻訳されない。当該配列は、リボソームに当該配列を跳び越し、かつ挿入の下流にある翻訳を再開させる合図としての機能を果たす構造を含んでいる。
【０３５０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物における興味のあるタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸によってコードされている。典型的に、核酸は、少なくとも１のセレクターコドン、少なくとも２のセレクターコドン、少なくとも３のセレクターコドン、少なくとも４のセレクターコドン、少なくとも５のセレクターコドン、少なくとも６のセレクターコドン、少なくとも７のセレクターコドン、少なくとも８のセレクターコドン、少なくとも９のセレクターコドン、少なくとも１０またはそれ以上のセレクターコドンを含んでいる。
【０３５１】
興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、非天然アミノ酸の組み込みための１以上のセレクターコドンを含めるために、当業者に公知の方法、および本明細書の「突然変異誘発法および他の分子生物学技術」の項目に記載されている方法を用いて、突然変異誘発され得る。例えば、興味のあるタンパク質に関する核酸は、１以上の非天然アミノ酸の組み込みを提供する１以上のセレクターコドンを含めて、突然変異誘発される。本明細書に記載されている方法および組成物は、あらゆる変形（例としては、例えば、非天然アミノ酸を含んでいる突然変異体、あらゆるタンパク質の型が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。同様に、本明細書に記載されている方法および組成物は、対応する核酸（例えば、１以上の非天然アミノ酸をコードする１以上のセレクターコドンを有する核酸）を包含する。
【０３５２】
興味のあるタンパク質（単なる一例として、ＧＨポリペプチドが挙げられる）をコードする核酸分子は、ポリペプチドのあらゆる所望の位置にシステインを導入する突然変異誘発を容易にし得る。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を、興味のあるタンパク質に導入するために、広く使用される。ポリペプチドの所望の位置にシステインを組み込む好適な方法は、当該技術においてよく知られている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載の方法、および標準的な技術）。
【０３５３】
＜ＶＩＩＩ．非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成＞
本明細書に記載されているポリペプチドは、天然に生じる系にコードされないアミノ酸を追加または置換する、修飾されたｔＲＮＡおよび修飾されたｔＲＮＡシンテターゼを用いて、インビボにおいて生成され得る。
【０３５４】
天然に生じる系にコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを生成する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および「Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs」と題された米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性のシンテターゼおよびｔＲＮＡと独立して機能する（そして、このためにときに「直交」と呼ばれる）翻訳機構の生成を含んでいる。一実施形態では、翻訳系は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み；当該ポリヌクレオチドが対応するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、またはＲＮＡウイルスベクターから生じ得るｍＲＮＡであってもよく；さらに、当該ポリヌクレオチドは、非天然アミノ酸の組み込み用に予定された部位と対応するセレクターコドンを含んでいる。翻訳は、上述したセレクターコドンに特異的な、非天然アミノ酸を含んでいるｔＲＮＡを、さらに含み；さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、アミノアシル化される。さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、直交化ｔＲＮＡおよび直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、以下：上述したポリヌクレオチド（典型的にＤＮＡの形態において）を含んでいるプラスミド、上述したポリヌクレオチド（典型的にＤＮＡの形態において）を含んでいるゲノムＤＮＡ、または上述したポリヌクレオチドが組み込まれている（さらなる実施形態では、組み込みが安定な組み込みである）ゲノムＤＮＡのうちの少なくとも１つを含んでいる。翻訳系のさらなるまたは付加的な実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群から選択される。翻訳系のさらなるまたは付加的な実施形態では、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、リボソームによって合成される。
【０３５５】
さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる。典型的に、Ｏ−ＲＳは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを、翻訳系において好ましくアミノアシル化し、かつＯ−ｔＲＮＡは、当該系において他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。従って、翻訳系は、当該系において産生されるタンパク質に非天然アミノ酸を、コードされるセレクターコドンに応じて挿入して、コードされるポリペプチドにおける位置にアミノ酸を「置換する」。
【０３５６】
広範な直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡは、ポリペプチドに特定の合成アミノ酸を挿入することについて、当該技術分野において説明されており、かつ一般的に本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドを産生する、本明細書に記載されている方法に好適である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、「Wang, L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) 」、および「Zhang, Z.ら, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)」に記載されている。例示的なＯ−ＲＳまたはこれらの一部は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている、ポリヌクレオチド配列にコードされており、かつアミノ酸配列を含む。また、Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、参照によって本明細書に組み込まれる、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および「Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA- aminoacyl tRNA synthetase pairs」と題された米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。その上に、その全体が参照によって組み込まれる「Mehlら in J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939」、および「Santoroら Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048」には、ポリペプチドへのｐ−アミノフェニルアラニンの組み込みのための、スクリーニング方法、およびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびｔＲＮＡ分子について議論している。
【０３５７】
本明細書に記載さている方法に使用する、例示的なＯ−ｔＲＮＡの例としては、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（出願番号１０／１２６，９３１）に開示されているような配列番号１−３のヌクレオチド配列が挙げられる。特定の非天然アミノ酸に対して特異的な、例示的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮシンテターゼ対は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（出願番号１０／１２６，９２７）に記載されている。S. cerevisiaeにおいてケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を組み込む、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡは、「Chin, J. W.ら, Science 301: 964-967 (2003) 」に記載されている。
【０３５８】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然アミノ酸をコードする特定のコドンの選択に関与する。あらゆるコドンが使用され得るが、一般的にＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現されている細胞においてまれにしか使用されないか、または決して使用されないコドンを選択することが好ましい。例えば、例示的なコドンとしては、ナンセンスコドン（例えば、終止コドン（アンバー、オーカー、およびオパール）、４または５塩基コドン、ならびにまれにしか使用されないか、または使用されない他の天然の３塩基コドン）が挙げられる。
【０３５９】
特定のセレクターコドンは、当該分野に公知の突然変異誘発法（例としては、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、配列をコードするポリヌクレオチドにおける適切な位置に組み込まれ得る。
【０３６０】
非天然アミノ酸の組み込みに用いることができる、タンパク質生合成機構の構成要素（Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および直交化Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対など）を生成する方法は、「Wang, L.ら, Science 292: 498-500 (2001)」、「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)」、および「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。非天然アミノ酸をインビボにおいて組み込むための方法と組成物とは、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）に記載されている（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、生物のインビボでの翻訳系に使用される直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法も、参照によって本明細書に組み込まれる、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および「Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA- aminoacyl tRNA synthetase pairs」と題された米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。その上に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットには、ケトアミノ酸の組み込み用の直交化ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。参照によって本明細書に組み込まれる、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットには、真核宿主細胞における非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の直交化ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。
【０３６１】
少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｂ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、および／または、（ｃ）非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択して、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは、非天然にコードされたアミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、方法である。上記第１生物は、例えば、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）、あるいは、真核生物である。上記（ｃ）工程では、必要に応じて、陰性選択により、活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択してもよい。
【０３６２】
一実施形態では、ＲＳは、不活性型ＲＳである。活性型ＲＳを突然変異させることにより、不活性型ＲＳを生成することができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、または少なくとも約１０、あるいはそれ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸（アラニンなど）に突然変異させることにより、不活性型ＲＳを生成することができる。
【０３６３】
技術的に公知の様々な技術を用いて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを生成することができる。そのような技術として、例えば、（１）ＲＳについてのタンパク質の３次元構造に基づく合理的設計、または（２）無作為的技術もしくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異誘発法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法、多様性を生成する組み換え突然変異誘発法、キメラコンストラクト、合理的設計、および本明細書に記載の方法または技術的に公知の方法によって、ＲＳの突然変異体を生成することができる。
【０３６４】
一実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、活性型メンバー（例えば、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性型メンバー）について、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）する工程は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陽性選択またはスクリーニングマーカーと、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーとを複数の細胞へ導入する段階、（ｉｉ）選択剤の存在下において、複数の細胞を成長させる段階、ならびに（ｉｉｉ）選択および／またはスクリーニング剤の存在下において、陽性選択またはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、生存する（または特定の反応を示す）細胞を同定して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを含んでいる陽性選択された細胞の一部（ｓｕｂｓｅｔ）を提供する段階を含んでいる。上記陽性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。上記セレクターコドンは、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンである。また、必要に応じて、選択剤および／またはスクリーニング剤の濃度を、変更することができる。
【０３６５】
１態様では、陽性選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、該ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。必要に応じて、陽性選択マーカーは、β−ラクタマーゼであり、セレクターコドンは、該β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。別の態様では、陽性スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーなど）を含んでいる。
【０３６６】
一実施形態では、非天然アミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングする工程は、（ｉ）陽性選択またはスクリーニングからの活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールと一緒に、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーを、第２生物の複数の細胞に導入する段階、ならびに（ｉｉ）非天然アミノ酸とスクリーニングまたは選択剤とが補充された第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸と選択またはスクリーニング剤とが補充されていない第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない、細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記陰性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）である。例えば、ＣＡＴ同定のプロトコールは、必要に応じて、適切なＯ−ＲＳ組み換え体を決定するときの陽性選択および／または陰性スクリーニングとしての役割を果たす。例えば、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるＣＡＴを含み、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるか、または含んでいない成長プレート上において、クローンのプールは複製される。したがって、非天然アミノ酸を含んでいるプレートにおいて、排他的に成長するコロニーは、組み換えＯ−ＲＳを含んでいると見なされる。１態様では、選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度は、変更される。いくつかの態様では、第１生物と第２生物とは、異なっている。よって、第１生物および／または第２生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。他の実施形態では、スクリーニングマーカーは、蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいる。
【０３６７】
別の実施形態では、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、プールをスクリーニングまたは選択する工程（陰性選択する工程など）は、（ｉ）陽性選択の工程（ｂ）からの、ＲＳの突然変異体の活性型のプールを単離する段階、（ｉｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーと、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールとを、第２生物の複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉｉ）非天然アミノ酸が補充されていない第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、上記非天然アミノ酸が補充されている第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない細胞を同定して、上記非天然アミノ酸に特異的な組み換えＯ−ＲＳを少なくとも１つ有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーは、例えば、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子など）である。１態様では、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを含んでいる。そのような実施形態は、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンが２つ以上のセレクターコドンを含んでおり、第１生物と第２生物とが異なっているということを含んでいてもよい。第１生物と第２生物とは、それぞれ、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。また、いくつかの態様は、陰性選択マーカーが、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子（該遺伝子は少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）を含んでいるということを包含している。他の態様では、スクリーニングマーカーは、必要に応じて蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいるということを包含している。本明細書における実施形態では、スクリーニングおよび／または選択は、必要に応じて、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシーが変更されることを含んでいる。
【０３６８】
一実施形態では、少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離する工程、（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳ（必要に応じてＯ−ＲＳの突然変異体）の第２組を生成する工程、ならびに、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含んでいるＯ−ＲＳの突然変異体が得られるまで、上記（ｂ）工程と（ｃ）工程とを繰り返す工程を、さらに含んでいてもよい。必要に応じて、（ｄ）工程‐（ｆ）工程は、繰り返される（例えば少なくとも約２回）。１態様では、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳの突然変異体の第２組は、突然変異誘発法によって生成されてもよい。該突然変異誘発法としては、例えば、ランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、組み換え、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０３６９】
上記方法における、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方などを含んでいる選択／スクリーニング工程のストリンジェンシーは、必要に応じて、選択／スクリーニングのストリンジェンシーを変更する段階を含んでいる。別の実施形態では、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方は、レポーターを使用する段階を含んでおり、該レポーターは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により検出されるか、または発光により検出されるものである。必要に応じて、上記レポーターは、ファージディスプレイ、または細胞表面などに提示される。また、上記レポーターは、非天然アミノ酸またはその類似体に関する親和性または触媒活性に基づいて選択される。一実施形態では、シンテターゼの突然変異体は、ファージディスプレイ、または細胞表面に提示される。
【０３７０】
組み換え直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）に由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からのＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）により、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）して、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識するとともに、第２生物からのＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される、方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、ならびに／あるいは、天然のユニークな３塩基コドン、および／もしくは非天然塩基を含んでいるか、またはナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含んでいるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、またはオパール終止コドンである。一実施形態では、組み換えＯ−ｔＲＮＡの直交性は、改善されている。いくつかの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡが、修飾の必要なく、第２生物から第１生物へ必要に応じて移入されることが好ましい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは、同じであるか、異なっている。さらに、第１生物と第２生物とは、必要に応じて、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacteriumなど）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、必要に応じて、非天然アミノ酸によりアミノアシル化されるものであり、該非天然アミノ酸は、天然にまたは遺伝子操作によって、インビボにおいて生合成されるものである。非天然アミノ酸は、少なくとも第１生物または第２生物の成長培養基に、必要に応じて加えられる。
【０３７１】
１態様では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）する工程（（ｂ）工程）は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のライブラリーとを、第２生物からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの直交化ｔＲＮＡまたは非機能的なｔＲＮＡを含んでいるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを含有している生存細胞を選択する段階を含んでいる。また、上記毒性マーカー遺伝子の代わりに、毒物もしくは静止剤の産生を引き起こす遺伝子、または生物にとって必須の遺伝子を用いてもよい（ただし、これらマーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）。例えば、細胞密度比の比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
【０３７２】
別の態様では、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含んでいてもよい。上記方法の別の実施形態では、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子であり、該リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含んでいる。必要に応じて、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含んでいてもよい。
【０３７３】
一実施形態では、導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）により、アミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングする工程は、Ｏ−ＲＳと一緒に陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールとを、第２細胞からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、抗生物質などの選択またはスクリーニング剤の存在下において成長した、生存細胞またはスクリーニングされた細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供する段階を含んでいてもよい。該少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、陽性マーカー遺伝子によりコードされた翻訳産物へ、少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、アミノ酸を挿入するものである。上記陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、生物に必須の遺伝子、または毒物の解毒を引き起こす遺伝子を含んでいる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのアンバー終止コドンなど）を含んでいるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。別の実施形態では、選択またはスクリーニング剤の濃度が、変更される。
【０３７４】
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を生成する方法が提供される。該方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）により、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーを陰性選択またはスクリーニングして、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでいる。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２生物からのＲＳにより効率的に認識されず、そして、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。また、上記方法は、（ｄ）第３生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを選択またはスクリーニングして、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、ならびに（ｆ）非天然アミノ酸の非存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、非天然アミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳと、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡとを含んでいる、方法である。本方法によって製造される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対が含まれる。特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対には、例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳの対（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳの対など）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳの対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳの対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳの対などが含まれる。さらに、上記方法は、第１生物および第３生物が、同じであること（例えばMethanococcus jannaschiiであること）を含んでいる。
【０３７５】
また、本明細書に記載の方法には、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法が含まれる。この方法は、第１生物から単離されたか、または第１生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）およびｔＲＮＡと、マーカー遺伝子とを、第２生物からの細胞の第１組に導入する工程、上記マーカー遺伝子とｔＲＮＡとを、第２生物からの複製した細胞の組に導入する工程、ならびに、上記複製した細胞の組では生存できないが、上記第１組では生存する細胞について選択するか、上記複製した細胞の組では特定のスクリーニング反応を示さないが、上記第１組では特定のスクリーニング反応を示す細胞をスクリーニングする工程を含んでおり、上記第１組と複製した細胞の組とは、選択またはスクリーニング剤の存在下において成長させられ、生存細胞またはスクリーニングされた細胞は、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を含んでいる、方法である。一実施形態では、比較および選択またはスクリーニングする工程は、インビボでの相補性試験（complementation assay）を含んでいる。選択またはスクリーニング剤の濃度は、変更可能である。
【０３７６】
本明細書に記載の生物は、様々な生物および様々な組み合わせを含んでいる。一実施形態では、上記生物は、必要に応じて、原核生物である。該原核生物としては、例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなどが挙げられる。代わりに、上記生物は、必要に応じて真核生物を含んでいる。該真核生物としては、例えば、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの複雑な生物）、藻類、原生生物、菌類（酵母など）、または動物（例えば哺乳類、昆虫、節足動物）などが挙げられる。
【０３７７】
‐Ａ．非真核生物および真核生物における発現‐
この項に開示される技術は、本明細書に記載される非天然アミノ酸ポリペプチドの非真核生物および真核生物における発現に対して適用され得る。
【０３７８】
クローン化されたポリヌクレオチドの高水準な発現量を得るために、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を導く強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、さらにタンパク質をコードする核酸用であれば、翻訳開始に関するリボソーム結合部位を含んでいる、発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌性プロモーターは、例えば「Sambrookら」および「Ausubelら」に記載されている。
【０３７９】
ポリペプチド発現のための細菌性発現系は、例えば、E.coli、Bacillus sp. 、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、およびSalmonellaにおいて利用できる(「Palvaら Gene 22:229-235(1983)」、「Mosbachら Nature 302:543-545(1983)」)。当該発現系のためのキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も同様に市販されている。直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（本明細書の別の項に記載される）がポリペプチドを発現するために利用される場合、発現のための宿主細胞は、該宿主細胞の直交型の構成要素を使用する能力に基づいて選択される。典型的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（B. brevisまたはB. subtilis、もしくはStreptomycesが挙げられるが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（E.coli、またはPseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putidaが挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに酵母およびその他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含んでいる細胞は、本明細書に記載されているように用いることができる。
【０３８０】
本明細書に記載されているように真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、有用かつ大量に合成する能力を提供する。ある態様において組成物は、例えば少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、またはそれ以上の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを任意に含有しているか、あるいはインビボにおけるポリペプチド製造方法（組み換えタンパク質の製造および精製の詳細については本明細書において提供する）によって得られる量を含有している。別の態様において、タンパク質は、例えば、特に限定されないが、細胞ライセート、緩衝液、薬理学的な緩衝液、またはその他の液体懸濁液（特に限定されないが、約１ｎｌから約１００Ｌまで、またはそれ以上のどの量も含む）中に、特に限定されないが、少なくとも１０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも５０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも７５μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも２００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも２５０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも５００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１ｍｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１０ｍｇ／Ｌまたはそれ以上という濃度で、組成物に任意に存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる真核細胞において、タンパク質の大量生産（例えば、インビトロにおける翻訳のような、その他の方法によって一般的に生産される量よりも多い量）は、本明細書に記載される方法、技術、および組成物の特徴である。
【０３８１】
本明細書に記載されているような真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を、有用かつ大量に合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、特に限定されないが、細胞抽出物、細胞ライセート、細胞培地、および／または緩衝液などにおいて、少なくとも１０μｇ／Ｌ、少なくとも５０μｇ／Ｌ、少なくとも７５μｇ／Ｌ、少なくとも１００μｇ／Ｌ、少なくとも２００μｇ／Ｌ、少なくとも２５０μｇ／Ｌ、少なくとも５００μｇ／Ｌ、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、少なくとも３ｍｇ／Ｌ、少なくとも４ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６ｍｇ／Ｌ、少なくとも７ｍｇ／Ｌ、少なくとも８ｍｇ／Ｌ、少なくとも９ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、またはそれ以上のタンパク質濃度で製造することができる。
【０３８２】
１．発現系、培養、および単離
この項に開示される技術は、本明細書に記載される非天然アミノ酸ポリペプチドの発現系、培養、および単離に適用できる。非天然アミノ酸ポリペプチドは、いくつかの適切な発現系において発現されればよい。そのような発現系としては、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、および細菌が挙げられるが、これらに限定されない。主な発現系の詳細については、本明細書において提供する。
【０３８３】
（酵母）
本明細書で用いられる用語「酵母」は、非天然アミノ酸ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する能力がある種々の酵母を含むことを意図している。当該酵母としては、例えば、ascosporogenous酵母（Endomycetales）、basidiosporogenous酵母、およびFungi imperfecti （Blastomycetes）の群に属する酵母が挙げられる。ascosporogenous酵母は、SpermophthoraceaeおよびSaccharomycetaceaeという２つのファミリーに分けられる。後者は４つのサブファミリーから成っており、Schizosaccharomycoideae （例えば、Schizosaccharomyces属）、Nadsonioideae、Lipomycoideae、およびSaccharomycoideae（例えば、Pichia属、Kluyveromyces属、およびSaccharomyces属）である。basidiosporogenous酵母としては、Leucosporidium属、Rhodosporidium属、Sporidiobolus属、Filobasidium属、およびFilobasidiella属を含む。Fungi imperfecti（Blastomycetes）の群に属する酵母としては、Sporobolomycetaceae（例えば、Sporobolomyces属およびBullera属）、ならびにCryptococcaceae（例えば、Candida属）という２つのファミリーに分けられる。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、Pichia属、Kluyveromyces属、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、およびCandida属内の種としては、特に限定されないが、P. pastoris、P. guillerimondii、S. cerevisiae、S. carlsbergensis、S. diastaticus、S. douglasii、S. kluyveri、S, norbensis、S. oviformis、K. lactis、K. fragilis、C. albicans、C. maltosa、およびH. polymorphaが挙げられる。これらは、本明細書に記載される方法、技術、および組成物に用いられる。
【０３８５】
非天然アミノ酸ポリペプチド発現のための適切な酵母の選択は、当業者の技術範囲にある。発現のための酵母宿主を選択するとき、適切な宿主としては、例えば、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さが認められるものであればよい。酵母は、一般的に様々な供給源から入手可能であり、例えば、Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics University of California (Berkeley, CA)、およびThe American Type Culture Collection(「ATCC」)(Manassas,VA) などから入手できる。
【０３８６】
用語「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組み替えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容体として使用し得るか、または使用されている酵母を含む。この用語は、組み替えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け容れている、元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致しなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、非天然アミノ酸ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３８７】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主中への形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、S.cerevisiae（「Sikorskiら, Genetics(1998)122:19」、「Itoら, J. Bacteriol. (1983) 153:163」、「Hinnenら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929」）、C.albicans（「Kurtzら, Mol.Cell.Biol.(1986)6:142」）、C.maltosa（「Kunzeら, J.Basic Microbiol.(1985)25:141」）、H.polymorpha（「Gleesonら, J.Gen.Microbiok. (1986)132:3459」、「Roggenkampら, Mol.Gen.Genet. (1986)202:302」）、K.fragilis（「Dasら, J.Bacteriol. (1984)158:1165」）、K.lactis（「De Louvencourtら, J.Bacteriol(1983)154:737」、「Van den Bergら, Bio/Technology(1990)8:135」）、P.guillerimondii（「Kunzeら, J.Basic Microbiol.(1985)25:141」）、P.pastoris（米国特許出願第５，３２４，６３９号明細書、米国特許出願第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許出願第４，８３７，１４８号明細書、「Creggら, Mol.Cell.Biol. (1985)5:3376」）、Schizosaccharomyces pombe(「Beachら,Nature(1982)300:706」）、A.nidulans（「Ballanceら, Biochem.Biophy.Res.Commum. (1983)112:284-89」、「TiburnらGene(1983)26:205-221」、および「YeltonらProc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-74」）、A.niger（Kelly and Hynes,EMBO J. (1985)4:475-479)、T.reesia（欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書）、および糸状菌（例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium（国際公開第９１／００３５７号パンフレット）など）に対して開発された。なお、各文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３８８】
酵母ベクターの制御配列は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）などの遺伝子から得られるプロモーター領域が挙げられるが、これに限定されない。また、酸性ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子は、有用なプロモーター配列を提供し得る（「Miyanoharaら,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80:1」）。酵母宿主とともに用いるのに適切な他のプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（「Hitzemanら, J. BIOL. CHEM. (1980)255:12073」）、および他の解糖系の酵素（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびグルコースリン酸イソメラーゼ（「Hollandら,BIOCHEMISTRY(1978)17:4900」、「Hessら,J.ADV.ENZYME REG.(1969)7:149」））が含まれ得る。増殖条件によって転写が制御されるという付加的な利点を有する、酵母の誘導性プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素にとってのプロモーター領域を含んでもよい。酵母発現への使用に適切なベクターおよびプロモーターが、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書にさらに記載されている。
【０３８９】
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモーターとともに用いてもよい。さらに、合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能してもよい。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモーターの転写活性化領域につなぎ、合成混成プロモーターを作製してもよい。上記混成プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許出願第４，８８０，７３４号明細書および米国特許出願第４，８７６，１９７号明細書を参照すればよく、これらの文献は引用によって本明細書に組み込まれる。混成プロモーターの他の例としては、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列から成るプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系の酵素遺伝子の転写活性領域と組み合わされる。欧州特許出願公開第０１６４５５６号明細書を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する、非酵母系の天然に存在するプロモーターを含んでいてもよい。
【０３９０】
酵母発現ベクターの一部を構成し得る他の制御要素はとしては、例えばＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（「HollandらJ.BIOL.CHEM.(1981)256:1385」を参照のこと）が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適している。酵母中で使用するのに適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐｌ遺伝子である。「Tschumperら, GENE(1980)10:157」、「Kingsmanら, GENE(1979)7:141」を参照のこと。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖能を欠如している酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
【０３９１】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、例えば、アルカリイオンによって処理された無傷の酵母宿主細胞またはスフェロプラストのいずれかの形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、「Hsiaoら, PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829」および「Van Solingenら, J.BACT. (1977)130:946」に記載の方法にしたがって、実施され得る。しかし、例えば、核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合によってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も、「SAMBROOKら, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)」に通常に記載されているように、使用され得る。その後、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
【０３９２】
酵母宿主細胞中において異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知の技術である。一般的に、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許出願第６，３６１，９６９号明細書、米国特許出願第６，３１２，９２３号明細書、米国特許出願第６，１８３，９８５号明細書、米国特許出願第６，０８３，７２３号明細書、米国特許出願第６，０１７，７３１号明細書、米国特許出願第５，６７４，７０６号明細書、米国特許出願第５，６２９，２０３号明細書、米国特許出願第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許出願第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、国際公開第９０／１０２７７号パンフレット、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６号明細書を参照のこと。また、「Gellissenら, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(1-2):79-93」、「Romanosら, YEAST(1992)8(6):423-488」、「Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185:3-7」を参照のこと。上記文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３９３】
標準の供給バッチ発酵方法（standard feed batch fermentation method）を用いて、増幅段階の間に酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。この発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路または発現制御の様式の差異を説明するために適用されてもよい。例えば、Saccharomyces酵母宿主の発酵は、１つのグルコース飼料、複合的な窒素源（カゼイン加水分解物など）および複数のビタミン補助物を必要としてもよい。これに対し、メチル栄養性（methylotrophic）酵母であるP.pastorisは、グリセロール、メタノール、および微量ミネラル試料を必要としてもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを必要とする。例えば、米国特許出願第５，３２４，６３９号明細書、「Elliottら,J.PROTEIN CHEM.(1990)9:95」、および「Fieschkoら, BIOTECH.BIOENG.(1987)29:1113」を参照のこと。なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３９４】
しかし、上記発酵方法は、使用される酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長限界栄養素（通常は炭素）を、増幅段階の間に発酵槽に添加して、最大限の成長を可能にしてもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培地を用いてもよい。例えば、Ｐｉｃｈｉａとともに用いるのに適した発酵培地は米国特許出願第５，３２４，６３９号明細書および米国特許出願第５，２３１，１７８号明細書に記載されており、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０３９５】
（バキュロウイルス感染昆虫細胞）
用語「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組み換えベクターまたはトランスファーＤＮＡの受容体として用いることができるか、または用いられている昆虫をいう。この用語は、トランスフェクトされた元々の昆虫宿主細胞の子孫を含む。形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、非天然アミノ酸ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３９６】
ポリペプチド発現にとって適した昆虫細胞の選択は、当業者に公知である。いくつかの昆虫種は、当該分野において十分に説明されており、且つ、Aedes asgypti、Bombyx mori、Drosophia melanogaster、Spodoptera frugiperdaおよびTrichoplusia niなどが市販されている。発現用の昆虫宿主の選択において、適切な宿主としては、特に、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さを有することが示されている宿主であってもよい。昆虫は、Insect Genetic Stock Center、Department of biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA)およびthe American Type Cuture Collection(「ATCC」)(Manassas,VA) を含む、様々な供給源から入手することができるが、これらに限定されない。
【０３９７】
一般的に、バキュロウイルスに感染した昆虫の発現系の構成要素は、バキュロウイルスのゲノム断片、および発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位の両方を含んでいるトランスファーベクター（通常は細菌性プラスミド）、当該トランスファーベクターにおけるバキュロウイルスに特異的な断片に対して、相同な配列を有する（これにより、バキュロウイルスゲノムに対する異種遺伝子の相同組み換えが可能になる）野生型バキュロウイルス、ならびに、適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含んでいる。ベクターのコンストラクション、細胞のトランスフェクション、プラークの選択、または培養における細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は公知であり、かつこれらの技術が記載されている手引書が利用可能である。
【０３９８】
異種遺伝子をトランスファーベクターに挿入した後に、該ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、当該ベクターと当該ウイルスゲノムとが組み換えを起こす昆虫宿主細胞に、トランスフェクションする。パッケージングされた組み換えウイルスが発現され、且つ組み換え体プラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系にとっての材料および方法は、例えば、Invitrogen(Carlsbad,CA) が提供している、キットの様式において市販されている。これらの技術は、「SUMMERS AND SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No.1555(1987)」において記載されており、引用によって本明細書に組み込まれる。また、「RICHARDSON,39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)」、「AUSUBELら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)」、「KING AND POSSEE,THE BACULOVIRUS SYSTEM:A LABORATORY GUIDE(1992)」および「O’REILLYら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)」を参照のこと。
【０３９９】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、以下の参考文献に記載されており、当該技術は本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドを製造するために適用され得る。例えば、米国特許出願第６，３６８，８２５号明細書、米国特許出願第６，３４２，２１６号明細書、米国特許出願第６，３３８，８４６号明細書、米国特許出願第６，２６１，８０５号明細書、米国特許出願第６，２４５，５２８号明細書、米国特許出願第６，２２５，０６０号明細書、米国特許出願第６，１８３，９８７号明細書、米国特許出願第６，１６８，９３２号明細書、米国特許出願第６，１２６，９４４号明細書、米国特許出願第６，０９６，３０４号明細書、米国特許出願第６，０１３，４３３号明細書、米国特許出願第５，９６５，３９３号明細書、米国特許出願第５，９３９，２８５号明細書、米国特許出願第５，８９１，６７６号明細書、米国特許出願第５，８７１，９８６号明細書、米国特許出願第５，８６１，２７９号明細書、米国特許出願第５，８５８，３６８号明細書、米国特許出願第５，８４３，７３３号明細書、米国特許出願第５，７６２，９３９号明細書、米国特許出願第５，７５３，２２０号明細書、米国特許出願第５，６０５，８２７号明細書、米国特許出願第５，５８３，０２３号明細書、米国特許出願第５，５７１，７０９号明細書、米国特許出願第５，５１６，６５７号明細書、米国特許出願第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０２６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照すればよく、各文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０４００】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは公知であり、例えば、バキュロウイルスのAutographacalifornica核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、ヘルパー非依存性のウイルスベクターである昆虫の発現およびトランスファーベクターを含む。この系に由来するウイルス発現ベクターは、一般的に、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウイルスの強力なポリヒドリン（polyhedrin）遺伝子プロモーターを利用する。一般的には、「O’Reillyら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)」を参照のこと。
【０４０１】
外来の遺伝子をバキュロウイルスのゲノムに挿入する前に、上記構成要素（プロモーター、リーダー（必要に応じて）、関連のあるコード配列、および転写終結配列を含んでいる）は、中間トランス配列コンストラクト（intermediate transplacement construct）（トランスファーベクター）に集められる。中間トランス配列コンストラクトは、レプリコンにおいてしばしば維持される。このレプリコンは、例えば、細菌などの宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）といったものである。レプリコンは複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主における当該レプリコンの維持を可能にする。より具体的には、プラスミドは、ポリヒドリンポリアデニル化シグナル（「Miller,ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42:177)」およびE.coliにおける選択および増殖に関する、原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点とを含有する。
【０４０２】
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。このベクターでは、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、ＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（「Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)」を参照のこと）。他の市販されているベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。
【０４０３】
異種遺伝子を挿入した後に、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に同時トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための具体的な方法は、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」、「Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31」を参照のこと。２重交差型相同組み換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に、挿入してもよい。また、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位に挿入してもよい。例えば、「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」を参照のこと。
【０４０４】
トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより達成してもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。また、その代わりに、リポソームを用いて、昆虫細胞に組み換え発現ベクターとバキュロウイルスとをトランスフェクションしてもよい。例えば、「Liebmanら., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36」、「Gravesら, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050」、「Nomuraら, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570」、「Schmidtら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323」、「Siffertら, NATURE GENETICS (1998) 18:45」、「TILKINSら, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) 」、「Caiら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263」、「Dolphinら, NATURE GENETICS (1997) 17:491」、「Kostら, GENE (1997) 190:139」、「Jakobssonら, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203」、「Rowlesら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376」、「Revereyら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10」、「Stanleyら, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121」、「Siskら, J. VlROL. (1994) 68(2):766」、および「Pengら, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274」を参照のこと。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン（Cellfectin（登録商標））、およびリポフェクチン（Lipofectin（登録商標））（Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Kitts, NAR (1990) 18(19):5667」、および「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。
【０４０５】
バキュロウイルス発現ベクターは、たいていは、バキュロウイルスプロモーターを含んでいる。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウイルスのプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
【０４０６】
感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。有用なプロモーター配列の例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「FRIESENら, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)」、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「Vlakら, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765」）が挙げられる。
【０４０７】
新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性の組み換えバキュロウイルスにパッケージングされる。その後、成長したプラークが当業者に公知の方法により精製されもよい。「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」を参照のこと。
【０４０８】
組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発されている。例えば、とりわけAedes aegypti（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、Bombyx mori（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、Drosophila melanogaster（ＡＴＣＣ番号１９６３）、Spodoptera frugiperda、およびTriclioplusia niのための組み換えバキュロウイルスが開発されている。「Wright, NATURE (1986) 321:718」、「Carbonellら, J. VlROL. (1985) 56:153」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」を参照のこと。一般的には、「Fraserら, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225」を参照のこと。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Sf9(Spodoptera frugiperda)（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Sf21(Spodoptera frugiperda)(Invitrogen Corp.,カタログ番号11497-013 (Carlsbad, CA))、Tri-368(Trichopulsia ni)、およびHigh-Five(登録商標)BTI-TN-5B1-4(Trichopulsia ni)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０９】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現とのための細胞および培地は、市販されている。また、細胞培養技術は、当業者に公知である。
【０４１０】
（E. Coli、Pseudomonas species、および他の原核生物）
細菌における発現技術は、当業者に公知である。細菌宿主における使用を目的とした様々なベクターが、利用可能である。これらベクターは、１コピーベクター、またはコピー数が少ない多コピーベクター（低多コピーベクター）、もしくはコピー数が多い多コピーベクター（高多コピーベクター）であってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現に役立ち得る。ベクター、多くのベクターの商業的な有効性に関する豊富な文献、ならびにベクターおよびベクターの制限酵素地図およびベクターの特徴について記載している手引書も同等に考慮して、本明細書では、これ以上論じる必要は無い。よく知られているように、ベクターは、通常は選択を可能にするマーカーを含んでいる。このマーカーは、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫を提供し得るものである。しばしば、異なる特徴を提供する複数のマーカーが存在する。
【０４１１】
細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が始まる隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。オペレーターは、負に調節される（誘導性の）転写を可能にする。すなわち、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を阻害してもよい。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によりもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも近位に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、代謝活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰは、Escherichia coli(E. coli)のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（「Raibaudら, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173」）。したがって、制御された発現は、正または負のいずれかであってもよく、これによって転写を増強または減少させてもよい。
【０４１２】
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーターを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（「Changら, NATURE (1977) 198:1056」）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる（「Goeddelら, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057」、「Yelvertonら, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731」、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる。また、β‐ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモーター系（「Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes.” In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) 」）、バクテリオファージ・ラムダのＰＬ（「Shimatakeら, NATURE (1981) 292:128」）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する（なお、これら文献は、引用によって本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の好ましい方法は、例えばポリペプチド産物を高レベルに誘導するためのＴ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用する。そのようなベクターの例は、特に限定されないが、ｐＥＴ２９のシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、および国際公開第９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、引用によって本明細書に組み込まれる）。そのような発現系は、宿主細胞の生存能力または成長パラメーターに支障をきたすことなく、宿主において、ポリペプチドを高レベルに産生する。
【０４１３】
さらに、天然に生じることのない合成プロモーターは、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、他の細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列とつないで、合成混成プロモーターを形成してもよい（米国特許出願第４，５５１，４３３号明細書（なお、この文献は、引用によって本明細書に組み込まれる））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃオペロン配列とから成る、混成ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである。なお、混成ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターはリプレッサーによって調節される（「Amannら, GENE(1983)25:167」、「de Boerら, PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80:21」）。さらに、細菌プロモーターは天然に生じる非細菌由来のプロモーターが含まれ得る。非細菌由来のプロモーターは細菌ＲＮＡポリメラーゼとの結合能を有しており、転写を開始することができる。天然に生じる非細菌由来のプロモーターは、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルな発現を産出するために、共通ＲＮＡポリメラーゼと結合させることができる。バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合プロモーター系の一例である（「Studierら, J.MOL.BIOL(1986)189:113」、「TaborらProc Natl.Acad.Sci.(1985)82:1074」）。さらに、混成プロモーターは、バクテリオファージプロモーターと、E. coliのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
【０４１４】
また、機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン‐ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（「Shineら, NATURE (1975) 254:34」）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とE. coliの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間で塩基対を形成することにより、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられている（「Steitzら “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) 」）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位により発現すること（「Sambrookら “Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989」）。
【０４１５】
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡにとっての受容物として使用されてもよい、または使用されている細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされている元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０４１６】
ポリペプチドの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、良好な封入体形成能、低いタンパク質分解活性、良好な分泌能力、良好な溶解性タンパク質生成能力、および全体的に強健さを有することが示されている宿主であってもよい。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手可能であり、例えば、「Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメーターが、極めてよく知られており、強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は非病原性であるから、安全性と環境の観点から商業的に重要である。本明細書に記載の方法の一実施形態では、E. coli宿主としては、例えば、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ、またはその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法の別の実施形態では、E. coli宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−など）である。別の実施形態では、細菌宿主はPseudomonas種（P.fluorescens、P.aeruginosaおよびP.putida）である。Pseudomonas株としては、例えば、P.fluorescens次亜種Ｉ、ＭＢ１０１株（Dow Chemical）が挙げられる。
【０４１７】
組み換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、当該組み換え宿主細胞株がポリペプチドの産生に適切な条件下において培養される。宿主細胞株の培養方法は、利用される天然の発現コンストラクトと宿主細胞の性質とに依存する。組み換え宿主株は、通常、技術的に公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源を含む液体培養基にて培養される。さらに、該液体培養基は、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および技術的に公知の他のタンパク質性の培養補助物を含んでいてもよい。また、宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物の成長を阻害するための抗生物質、もしくは抗真菌剤、および／または発現ベクターを含む宿主細胞を選択するための抗生物質などの化合物を、任意に含んでいてもよい。
【０４１８】
組み換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養され得る。ポリペプチドが細胞内に蓄積する場合、細胞は収集されるか、または、バッチ式もしくは連続式において培養液上清が収集される。原核生物の宿主細胞での製造については、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。
【０４１９】
一実施形態では、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは組み換え系における発現の後に、精製される。ポリペプチドは、技術的に公知の様々な方法によって、宿主細胞または細胞培地から精製されてもよい。通常、細菌宿主細胞中に産生された多くのポリペプチドは、難溶性であっても不溶性（封入体の形態において）であってもよい。一実施形態では、アミノ酸の置換はポリペプチドにおいて容易に行われ得る。このアミノ酸の置換は、技術的に公知の方法を利用して、組み換えにより製造されたポリペプチドの溶解度の増加を目的として選択される。不溶性のポリペプチドの場合、当該ポリペプチドは宿主細胞ライセートから遠心分離またはろ過によって回収されればよく、続いて、細胞のホモジナイゼーションが行われてもよい。難溶性ポリペプチドの場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などを含む組成物は、部分的に可溶性のポリペプチドの沈殿を引き起こすために加えられてもよい。その後、沈殿したタンパク質は、遠心分離またはろ過によって好都合に回収されてもよい。組み換え宿主細胞は、当該分野において公知の様々な方法によって、細胞内部から封入体を放出させるために、分離またはホモジナイズされてもよい。宿主細胞の分離またはホモジナイゼーションは公知の技術を用いて実施されればよく、例えば、酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション、または高圧放出崩壊を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法の一実施形態では、高圧放出技術を、E. coli宿主細胞の崩壊に使用することにより、ポリペプチドの封入体を放出させてもよい。ポリペプチドの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これにより、可溶化、器械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量が最大にする。
【０４２０】
それから、不溶性のまたは沈殿したポリペプチドは、当該技術にとって公知の、多くの適切な可溶化試薬のいずれかを用いて可溶化されてもよい。例えば、ポリペプチドは尿素またはグアニジン塩酸塩を用いて可溶化される。都合よく扱いやすい大きさのバッチを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたポリペプチドの容積は、最小化されるべきである。組み換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチで成長され得るとき、この要因は、大規模な工業的設定において重要であり得る。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてポリペプチドを製造するとき機械および容器か、タンパク質産物自体かのいずれかを損傷するおそれのある過酷な化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、過酷な変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ポリペプチド封入体の可溶化に使用できることが、本明細書に記載および包含される方法に示されている。尿素の使用は、ポリペプチドの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ポリペプチドの封入体を効率的に可溶化する。
【０４２１】
可溶性ポリペプチドの場合、ペプチドは細胞膜周辺腔に、または培地に分泌され得る。また、可溶性ペプチドは宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性ペプチドを濃縮することが望ましいことがある。本明細書に記載されるような標準的な技術は、細胞ライセートまたは培地などからの可溶性ペプチドの濃縮に使用され得る。また、当業者に公知の標準的な技術は、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ペプチドの放出に使用されてもよい。
【０４２２】
ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は、好ましく除去される。融合配列の除去は、例えば、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得るが、これらに限定されない。融合配列の酵素的除去は、当該分野において公知の方法を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、当業者にとって明らかなような酵素の選択によって特定される。化学的切断は、例えば、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬などの試薬を用いて果たされ得る。切断されたポリペプチドは、よく知られた方法によって、切断された融合配列から必要に応じて精製される。そのような方法は、融合配列およびポリペプチドの個性および性質によって決定される。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換グラフィー、もしくは透析、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２３】
また、ポリペプチドは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製されることが好ましい。ＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去さえ得る。一実施形態では、ＤＮＡは核酸沈殿剤（例えば、硫酸プロタミンであるが、これに限定されない）を用いた沈殿によって除去される。ポリペプチドは標準的な公知の方法（例えば、遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない。）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ポリペプチドがヒトの治療に用いられ、本明細書に記載の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減する設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要素となる。
【０４２４】
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（例としては、発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
【０４２５】
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのヒト様式は、当該分野における標準的な方法を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞ライセートは、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、所望の容積まで濃縮または希釈されてもよいし、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液の中に透析されてもよい。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる精製は、原型の形態からジアミド化され、かつ短縮されたポリペプチドの形態の分離を含む。
【０４２６】
以下に示す方法のいずれかは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチド精製に採用され得る。そのような方法としては、例えばアフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（例としては、DEAE SEPHAROSEを用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（特に限定されないが、SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられる）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（特に限定されないが、例えば調整用の等電点電気泳動法を含む）；差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出が挙げられる。
【０４２７】
本明細書に記載の方法および組成物の範囲にあるポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドにとっての結合パートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、当業者に知られ、かつ使用される標準的な手法に従って、部分的または実質的に均質に精製される。したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、当該分野においてよく知られた多くの方法（例としては、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などを含んでいてもよく、またそれらのいずれかの組み合わせであってもよいが、これらに限定されない）によって、修復および精製され得る。タンパク質をリフォールディングする工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される最終的な精製工程において採用され得る。一実施形態では、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用され得る。所望のように、部分的にまたは均質になるまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、アッセイの構成要素、治療学、予防法、診断学、研究試薬として、および／または抗体生成用の抗原としてであるが、これらに限定されない）に関して、必要に応じて使用される。
【０４２８】
本明細書に言及されている他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折りたたみ方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、「R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)」、「Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N.Y. (1990) 」、「Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.」、「Bollagら (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY」、「Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY」、「Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY」、および「Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ」ならびにこれらに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない）。
【０４２９】
真核生物宿主細胞または非真核生物宿主細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを産生することの１つの利点は、通常、ポリペプチドがそれらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかしながら、本明細書に記載の方法および組成物の一実施形態では、合成、発現および／または精製の後に、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することがある。本明細書に記載の方法および組成物の別の実施形態では、発現タンパク質は必要に応じて変性され、且つその後復元される。この随意的な変性および復元は、当該分野において公知の方法によって成し遂げられるものであり、特に限定されないが、関連するポリペプチドに対するシャペロニンの添加によって、およびカオトロピック剤（特に限定されないが、例えば塩酸グアニジン）においてタンパク質を可溶化することによって、ならびにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを用いることによって成し遂げられる。
【０４３０】
一般的に、発現したポリペプチドを変性および還元して、その後に、ポリペプチドを好ましい立体構造へリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、このリフォールディングは、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシャペロニンを関連する翻訳産物に添加することによって成し遂げられ得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法は、当業者によく知られている（上述した参考文献、「Debinskiら(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070」、「Kreitman an Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585」、および「Bucherら(1992)Anal.Biochem.,205:263-270」を参照のこと）。Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，らは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、還元剤（例としては、酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されてもよいし、またはそうでなければ、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現産物と接触するように移動させられてもよい。また、その逆もあり得る。
【０４３１】
非天然アミノ酸ポリペプチドを原核生物において産生する場合、そのように産生されるポリペプチドは、誤って折りたたまれることがある。このため、ポリペプチドの生物活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物活性は、「リフォールディング」によって復帰され得る。一実施形態では、誤って折りたたまれたポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化（ポリペプチドも不溶性である場合に）、アンフォールディングおよび還元されることによってリフォールディングされ得る。穏やかなカオトロープ濃度において、ジスルフィド結合の強化を可能にする、酸化剤（例えば、酸素、クリスチン（crystine）またはクリスタミン（crystamine））が添加される。折りたたまれていない、または誤って折りたたまれたポリペプチドは、当該分野において公知の標準的な方法（例えば、米国特許出願第４，５１１，５０２号明細書、米国特許出願第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許出願第４，５１２，９２２号明細書に記載の方法、これらの文献は、引用によって本明細書に組み込まれる）を用いてリフォールディングされ得る。また、ポリペプチドは、他のタンパク質と共同して折りたたまれて、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーを形成し得る。リフォールディングまたは共同折りたたみの後に、ポリペプチドは、さらに精製されてもよい。
【０４３２】
非天然アミノ酸ポリペプチドの精製は、様々な技術（例として、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられ、またそれらのいずれかの組み合わせであってもよいが、これら技術に限定されない）を用いて達成され得る。また、さらなる精製は、精製されたタンパク質の乾燥工程または沈殿工程を含んでいてもよい。
【０４３３】
精製の後、非天然アミノ酸ポリペプチドは、当該分野において公知の、様々な方法（例として、ダイアフィルトレーションおよび透析が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかによって異なる緩衝液の中で交換されてもよく、および／または濃縮されてもよい。１つの精製されたタンパク質として提供されるｈＧＨは、凝集しやすく、且つ沈殿しやすくてもよい。いくつかの実施形態では、精製された非天然アミノ酸ポリペプチドは少なくとも９０％の純度であればよい（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、またはドデシル硫酸−ポリアクリルアミドナトリウムゲル電気泳動，ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される）。別の実施形態では、精製された非天然アミノ酸ポリペプチドは少なくとも９５％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度またはそれ以上の純度であればよい。非天然アミノ酸ポリペプチドの純度の正確な数値にかかわらず、非天然アミノ酸ポリペプチドは、医薬品として利用するのに十分な純度であるか、またはさらなる処理（例えば、ＰＥＧのような水溶性ポリマーとの結合）にとって十分な純度である。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチド分子は、他の活性成分またはタンパク質（賦形剤、担体および安定剤、血清アルブミンなど）が存在していない治療剤として用いられ得る。また、いくつかの実施形態では非天然アミノ酸ポリペプチド分子は他のポリペプチドまたはポリマーと複合されてもよい。
【０４３５】
２．非天然アミノ酸ポリペプチドの精製
（一般的な精製方法）
この項に開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの一般的な生成に適用できる。様々な単離工程のうちいずれか１つは、所望のポリペプチドを含んでいる細胞ライセート抽出、培地、封入体、宿主細胞の周辺孔、宿主細胞の細胞質、または他の材料であるか、またはいずれかの単離工程から得られるポリペプチドの混合物において実施され得る。この単離工程としては、特に限定されないが、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＰＲ−ＨＰＬＣ」）、発泡床吸収（expanded bed absorption）が挙げられる。これらは、いずれかの方法の組み合わせおよび／またはいずれかの方法の繰り返しであってもよく、いずれかの適切な順序において行われればよい。
【０４３６】
本明細書に記載されている技術の実施に使用される設備、および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録器、および全体のシステムは、、Applied Biosystems(Foster City, CA)、Bio-Rad Laboratories, Inc.(Hercules, CA)、およびAmersham Biosciences, Inc.(Piscataway, NJ)から市販されている。クロマトグラフィーの材料（例としては、交換基質材料、溶剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）は、そのようは企業から入手可能である。
【０４３７】
本明細書に記載されているカラムクロマトグラフィー手法における平衡および他の工程（例えば、洗浄および溶出）は、特殊な設備（例えば、ポンプ）を用いてより速く実施され得る。市販のポンプの例としては、ヒルロードポンプＰ−５０（ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）  Ｐｕｍｐ  Ｐ−５０）、ペリスタルティックポンプＰ−１（Peristaltic Pump P-1）、ポンプＰ−９０１（Pump P-901）、およびポンプＰ−９０３（Pump P-903)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３８】
フラクションコレクターとしては、例えばレディフラック  フラクションコレクター（REDIFRAC Fraction Collector）、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター、ならびにスーパーフラック  フラクションコレクター（SUPERFRAC(登録商標) Fraction Collector)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、ミキサーはｐＨまたは直線濃度勾配を形成するために利用可能である。工業的に利用可能なミキサーとしては、勾配ミキサーＧＭ−１およびＩＮ−Ｌｉｎｅミキサー（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）が挙げられる。
【０４３９】
クロマトグラフィー過程は、あらゆる市販のモニターを用いて観察され得る。当該モニターは、ＵＶ、蛍光、ｐＨ、および導電率のような情報を集めるために用いればよい。検出器の例としては、モニターＵＶ−１（Monitor UV-1）、ユニコードＳ  ＩＩ（UVICORD(登録商標) S II）、モニターＵＶ−Ｍ  ＩＩ（Monitor UV-M II）、モニターＵＶ−９００（Monitor UV-900）、モニターＵＰＣ−９００（Monitor UPC-900）、モニターｐＨ／Ｃ−９００（Monitor pH/C-900）、およびコンダクチビティーモニター（Conductivity Monitor）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。実際に、全体のシステムは、市販されており、例えばアクタシステムズ（AKTA(登録商標) systems）などは、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ）から市販されている。
【０４４０】
本明細書に記載の方法および組成物の一実施形態では、例えばポリペプチドを、得られた精製ポリペプチドを尿素中で第１変性させることによって、還元および変性して、続いて、適切なｐＨにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含むＴＲＩＳ緩衝液に希釈させてもよい。別の実施形態では、ポリペプチドを約２Ｍ〜約９Ｍの範囲の濃度の尿素において変性させ、続いて、約５．０〜約８．０の範囲のｐＨにおけるＴＲＩＳ緩衝液において希釈する。その後、この実施形態のリフォールディング混合物を、インキュベートする。一実施形態では、リフォールディング混合物を、室温において４〜２４時間、インキュベートする。還元され且つ変性されたポリペプチド混合物を、その後さらに単離または精製してもよい。
【０４４１】
本明細書に述べられているように、第１のペプチド混合物のｐＨは、次のあらゆる単離工程を実施する前に調節されればよい。また、第１のペプチド混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物は、当該分野において公知の技術を用いて濃縮され得る。さらに、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物を含む溶出緩衝液は、当業者によく知られた技術を用いて、次の単離工程に好適な緩衝液に交換され得る。
【０４４２】
（イオン交換クロマトグラフィー）
この項に開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのイオン交換クロマトグラフィーに適用できる。一実施形態では、必要に応じて工程を追加するのであれば、イオン交換クロマトグラフィーは第１のポリペプチド混合物について実施されればよい。一般的に、「ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES AND METHODS(カタログ番号18-1114-21, Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))」を参照のこと。市販のイオン交換カラムとしては、ハイトラップ（HITRAP（登録商標））カラム、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））カラム、およびハイロード（HILOAD（登録商標））カラム（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）が挙げられる。そのようなカラムは、強い陰イオン交換体（例えば、Ｑセファロースファーストフロウ（Q SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow），Ｑセファロースハイパフォーマンス（ Q SEPHAROSE(登録商標) High Performance）、およびＱセファロースＸＬ（ Q SEPHAROSE(登録商標) XL））；強い陽イオン交換体（例えば、ＳＰセファロースハイパフォーマンス（SP SEPHAROSE(登録商標) High Performance），  ＳＰセファロースファーストフロウ（SP SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow）、およびＳＰセファロースＸＬ（ SP SEPHAROSE(登録商標) XL））；弱い陰イオン交換体（例えば、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow)）；および弱い陽イオン交換体（例えば、ＣＭセファロースファーストフロウ（CM SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow)）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を利用している。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたポリペプチドを単離するために、精製過程のあらゆる工程において、ポリペプチドに対して実施されてもよい。陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、任意の適切な陽イオン交換基質を用いて実施され得る。陽イオン交換基質としては、例えば、繊維質の、多孔質の、非多孔質の、微小粒状の、ビーズ状の、または架橋された陽イオン交換基質材料が挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン交換基質の材料としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリル、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上記材料のうちのいずれかの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン交換基質への当該ポリペプチドの組み込みに続いて、実質的に精製されたポリペプチドは、基質からポリペプチドを取り除くのに十分高いｐＨ、またはイオン強度を有する緩衝液と接触することによって溶出されてもよい。十分に精製されたポリペプチドの高いｐＨ溶離において用いるのに適した緩衝液としては、特に限定されないが、少なくとも約５ｍＭ〜約１００ｍＭまでの濃度範囲に亘る、クエン酸、リン酸、ギ酸、酢酸、ＨＥＰＥＳ、およびＭＥＳ緩衝液が挙げられる。
【０４４３】
（逆相クロマトグラフィー）
この項において開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの逆相クロマトグラフィーに適用できる。ＲＰ−ＨＰＬＣは当業者に公知の適切な手順に従って、タンパク質を精製するために実施されてもよい。例えば、「Pearsonら, ANAL BIOCHEM.(1982)124:217-230(1982)」、「Riverら, J.CHROM.(1983)268:112-119」、「Kunitaniら, J.CHROM.(1986)359:391-402」を参照のこと。ＲＰ−ＨＰＬＣは実質的に精製されたポリペプチドを単離するために、ポリペプチドに対して実施されればよい。この点に関して、多種多様な長さ（例としては、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０まで、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０まで、または少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８までの長さが挙げられるが、これらに限定されない）を有するアルキル官能基を用いた、シリカ誘導体化樹脂が使用され得る。代替可能に、ポリマー化樹脂が使用され得る。例えば、スチレンポリマー樹脂である、TosoHaas Amberchrome CG1000sd樹脂が使用され得る。また、多種多様なアルキル鎖を有するシアノ樹脂またはポリマー樹脂が、使用され得る。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒（例えば、エタノール）を用いて洗浄され得る。イオン対化剤および有機緩和剤（例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、またはエタノール）を含む適切な溶出緩衝液が、ポリペプチドをＰＲ−ＨＰＬＣカラムから溶出するために、使用され得る。最も一般的に使用されるイオン対化剤の例としては、酢酸、蟻酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロブチル酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶出は、分離時間の短縮、およびピーク幅の縮小に好ましい勾配条件を有する、１つ以上の勾配条件または定組成条件を用いて実施され得る。他の方法は、異なる溶媒濃度範囲を有する２の勾配の使用に関する。本明細書における使用に適した溶出緩衝液の例としては、酢酸アンモニウム溶液およびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４４】
（疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術）
この項において開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製に適用できる。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ポリペプチドに対して実施されてもよい。一般的に、「HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES AND METHODS(カタログ番号18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))」を参照すればよく、これは引用によって本明細書に組み込まれる。適切なＨＩＣ基質の例としては、特に限定されないが、アルキル置換基質もしくはアリール置換基質が挙げられる。そのような基質としては、例えば、アガロース、架橋型アガロース、セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）充填剤を含む、置換ブチル基、置換ヘキシル基、置換オクチル基、または置換フェニル基質（例として、アガロース基質、架橋アガロース基質、セファロース基質、セルロース基質、シリカ基質、デキストラン基質、ポリスチレン基質、ポリ（メタクリレート）基質が挙げられる））、および混合形態の樹脂が挙げられる。混合形態の樹脂としては、例えば、ポリエチレンアミン樹脂または、置換ブチル基もしくは置換フェニル基ポリ（メタクリレート）充填剤が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィーに関する市販の原料の例としては、ハイトラップ（HITRAP（登録商標））、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））、およびハイロード(HILOAD(登録商標))カラム（Amersham Biosciences Piscataway,NJ）が含まれるが、これに限定されない。簡単に説明すると、装填の前に、ＨＩＣカラムは、当業者に公知の標準的な緩衝液（例えば、酢酸溶液／塩化ナトリウム溶液、または硫酸アンモニウムを含むＨＥＰＥＳ）を用いて、平衡化され得る。硫酸アンモニウムは、ＨＩＣカラムを組み込むための緩衝液として用いられてもよい。それから、ポリペプチドの装填の後に、カラムは、不要な物質を取り除くための標準的な緩衝液と条件とを用いて、洗浄され得るが、ポリペプチドはカラムに保持されている。ポリペプチドはカラム容積の約３倍から約１０倍の標準的な緩衝液（例えば、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液）を用いて溶出され得る。例えば、リン酸カリウムを用いた減少直線塩勾配は、ポリペプチド分子の溶出に使用され得る。その後、この溶出物は、例えばダイアフィルトレーション、または限外ろ過といったろ過によって濃縮されてもよい。ダイアフィルトレーションは、ポリペプチドを溶出に使用される塩を除くために利用され得る。
【０４４５】
（他の精製技術）
この項に開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの他の精製技術に適用できる。さらに、別の単離工程には次の方法を用いる。例えば、ゲルろ過（「GEL FILTRATION:PRINCIPLES AND METHODS(カタログ番号18-1022-18,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,)」引用によって本明細書に組み込まれる）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（好適な基質の例としては特に限定されないが、例えばＨＡウルトロゲル  ハイリソリューション（HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)）、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（CHT Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)）、バイオーゲルＨＴＰヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HTP Hydroxyapatite(BioRad)）が挙げられるが、これらに限定されない）、ＨＰＬＣ、発泡床吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥などを用いたさらに他の単離工程は、あらゆる過剰の塩を除去、および次の単離工程もしくは最終的な製剤の調合でさえ好適な緩衝液に交換するために、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆる続くこれらの混合物に対して実施され得る。実質的に精製されたポリペプチドを含むポリペプチドの収率は、本明細書に記載されるような多種多様な技術を用いて、本明細書に記載されている各工程において、監視されてもよい。また、そのような技術は、最後の単離工程の後に、実質的に精製されたポリペプチドの収率を評価するために使用され得る。例えば、ポリペプチドの収率は、様々なアルキル鎖長（例えば、シアノＰＲ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ）を有する様々な逆相高圧液体クロマトグラフィーだけでなく、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過のいずれかを用いて、監視されてもよい。
【０４４６】
いくつかの実施形態では、各精製工程の後におけるポリペプチドの収率は、各精製工程の開始物質におけるポリペプチドの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％であればよい。
【０４４７】
純度は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような標準的な技術によって測定されればよく、またウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによって測定されてもよい。例えば、ポリクローナル抗体は、陰性対照酵母発酵および陽イオン交換回収から単離されたタンパク質に対して生成され得る。抗体は、宿主細胞タンパク質の汚染の存在に対するプローブに使用され得る。
【０４４８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料であるＶｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）はシリカゲル粒子からなり、その表面はＣ４−アルキル鎖を持つ。タンパク質性不純物からのポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度における差異に基づいている。溶出は、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配によって行われる。調製用ＨＰＬＣは、ステンレススチールカラム（２．８〜３．２リットルのＶｙｄａｃ  Ｃ４カラムを用いて充填されている）によって行われる。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Hydroxyapatite Ultrogel）溶出は、添加するトリフルオロ酢酸によって酸性にされ、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラム上でに装填される。希釈されたトリフルオロ酢酸においてアセトニトリル勾配を洗浄および溶出するために用いられる。画分は回収され、直ちにリン酸緩衝液によって中和される。ＩＰＣ制限内のポリペプチド画分はプールされる。
【０４４９】
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなるデアエセファロース（DEAE Sepharose(Pharmacia)）材料は、セファロースビーズの表面と共有結合される。ＤＥＡＥ基に対するポリペプチドの結合は、イオン相互作用によって媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後に、残存する不純物は低ｐＨの酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって除去される。その後、カラムは中性のリン酸緩衝液を用いて洗浄され、ポリペプチドは上昇したイオン強度を有する緩衝液を用いて溶出される。カラムはデアエセファロースファーストフロウ（DEAE Sepharose fast flow）が充填している。カラム容積は、３〜１０ｍｇのポリペプチド／ｍｌのゲルの範囲におけるポリペプチドの装填を保障するために調節される。カラムは、水および平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）によって洗浄される。ＨＰＬＣ溶離の貯留された画分は取り込まれ、カラムは均衡化緩衝液を用いて洗浄される。その後、カラムは平衡化緩衝液による洗浄に続いて、洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）によって洗浄される。続いて、ポリペプチドは溶出緩衝液（塩化ナトリウム）を用いてカラムから溶出され、主要な溶出プロファイルに従って１つの画分に回収される。デアエセファロース（DEAE Sepharose）カラムの溶出物は、特定の伝導性に調節される。その結果得られる製剤は、テフロン（Teflon）（登録商標）ボトルの中に無菌的にろ過され、−７０℃において保存される。
【０４５０】
付加的な方法としては、特に限定されないが、例えばエンドトキシンを除去する工程が挙げられる。エンドトキシンは、グラム陰性の宿主細胞（例えば、Escherichia coli）の外膜上に位置するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低減させる方法は、特に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびこれらの方法の組み合わせなどが挙げられる。修飾または付加的な方法は、混入物質（例えば、関連するポリペプチドから得られる共に混合するタンパク質）を除去するために要求されてもよい。エンドトキシンレベルを計測する方法は、当業者に知られており、例えば、リムルスアメーバリセート（Limulus Amebocyte Lysate）（ＬＡＬ）アッセイが挙げられるがこれに限定されない。
【０４５１】
さらなる方法および手順は、例えば、タンパク質染色法と一緒になったＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティング、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、調製用等電点電気泳動（isoelectric focusing）、分析陰イオン交換、等電点電気泳動（chromatofocusing）、および円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ポリペプチドに生合成的に導入され、これによって非天然アミノ酸ポリペプチドが作製される。別の実施形態では、当該アミノ酸はポリペプチド内の特定部位に組み込まれる。別の実施形態では、当該アミノ酸は翻訳系によってポリペプチドに組み込まれる。別の実施形態では、当該翻訳系は：（ｉ）上記ポリペプチドをコードし、上記アミノ酸が組み込まれる予め設計された部位に対応するセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチドと、（ｉｉ）上記アミノ酸を含み、上記セレクターコドンに対して特異的であるｔＲＮＡとを含んでいる。当該翻訳系の別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは翻訳系において産生されるｍＲＮＡである。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、上記ポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドまたはファージを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、上記ポリヌクレオチドを含んでいるゲノムＤＮＡを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれている。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然のコドン、５塩基コドン、および４塩基コドンから成る群から選択されるセレクターコドンに対して特異的なｔＲＮＡを含んでいる。当該翻訳系の別の実施形態では、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、上記アミノ酸によりアミノアシル化されたｔＲＮＡを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系には、ｔＲＮＡに対して特異的なアミノアシルシンテターゼを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系には直交化ｔＲＮＡおよび直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、ポリペプチドはリボソームによって合成され、さらなる実施形態では翻訳系は、細菌細胞、古細菌細胞、および真核細胞から成る群から選択される細胞を含んでいる、インビボにおける翻訳系である。別の実施形態では、細胞はEscherichia coli細胞、酵母細胞、Pseudomonas種由来の細胞、哺乳類細胞、植物細胞、または昆虫細胞である。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、細菌細胞、古細菌細胞、または真核細胞由来の細胞抽出物を含んでいる、インビトロにおける翻訳系である。別の実施形態では、細胞抽出物は、Escherichia coli細胞、Pseudomonas種由来の細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、または昆虫細胞に由来する。別の実施形態では、少なくとも一部のポリペプチドは、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成、もしくはそれらの組み合わせによって合成される。一方、別の実施形態では、ポリペプチドと別のポリペプチドとの連結反応をさらに含む。別の実施形態では、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、以下の治療タンパク質と相同なタンパク質であるポリペプチドに生合成的に組み込まれ得る：すなわち、治療タンパク質は、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡ���−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、���ロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群から選択される。
【０４５３】
‐Ｂ．インビボにおける翻訳後修飾‐
真核細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドを製造した場合、当該ポリペプチドは真核細胞の翻訳後修飾を含んでいてもよい。ある実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、且つ、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。なお、翻訳後修飾は、原核細胞によってなさず、真核細胞によってインビボにおいてなされるものである。例えば、翻訳後修飾としては、特に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質連結修飾、グリコシル化などが挙げられる。一態様において、翻訳後修飾には、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結による、オリゴサッカライド（例えば、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられるが、これに限定されない）とアスパラギンとの結合を含む。真核細胞のタンパク質のＮ−連結されたオリゴサッカライドについて、いくつかの例を記載した表１を参照のこと（別の残基も存在し得るが、示されていない）。別の態様において、翻訳後修飾には、ＧａｌＮＡｃセリン連結またはＧａｌＮＡｃトレオニン連結、もしくはＧｌｃＮＡｃセリン連結またはＧｌｃＮＡｃトレオニン連結による、オリゴサッカライド（特に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられる）と、セリンまたはトレオニンとの結合を含む。
【０４５４】
【表２】
2009519942.tif 000043
さらに別の態様において、翻訳後修飾は、前躯体のタンパク質分解プロセシング（カルシトニン前躯体、カルシトニン遺伝子置換ペプチド前躯体、プレプロパラチロイドホルモン、プロインスリン、プレプロ−オピオメラノコルチン（prepro-opiomelanocortin）、プロ−オピオメラノコルチン（pro-opiomelanocortin）が挙げられるが、これらに限定されない）、マルチサブユニットタンパク質への集合または高分子集合、細胞中の別の部位への翻訳（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官、または分泌経路を経由することもあるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分泌、または、局在性配列、エピトープ標識、ＦＬＡＧ標識、ポリヒスチジン標識、あるいはＧＳＴ融合などを含む。
【０４５５】
非天然アミノ酸の利点の１つは、非天然アミノ酸は付加分子を加えるために用いられ得る、付加的な化学部分が存在することである。これらの修飾は、真核細胞または非真核細胞のインビボにおいて、あるいはインビトロにおいて行われ得る。このように、いくつかの実施形態では翻訳後修飾は、非天然アミノ酸を介して生じる。例えば、翻訳後修飾は求核−求電子反応によってなされる。多くの反応は、一般に求核と求電子との反応パートナー間での共有結合形成（特に限定されないが、α−ケモカインと、ヒスチジンまたはシステイン側鎖との反応）を含むタンパク質の選択的修飾のために利用される。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性の残基の数および近接性によって決定される。本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の方法を用いて作製されたポリペプチドにおいて、他のより選択的な反応を用いることができる。そのような反応としては、特に限定されないが、インビトロおよびインビボにおける、非天然ケトアミノ酸と、ヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応が挙げられる。例えば、「Cornishら, (1996)J.Am.Chem.Soc.,118:8150-8151」、「Mahalら, (1997)Science,276:1125-1128」、「Wangら(2001) Science,292:498-500」、「Chinら, (2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027」、「Chinら, (2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024」、「Wangら, (2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61」、「Zhangら, (2003)Biochemistry42:6735-6746」、および「Chinら, (2003) Science,301:964-7」を参照のこと。これによれば、多くの試薬（蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体および細胞毒性分子など）により、実質的に任意のタンパク質を選択的に標識することができる。また、「Glycoprotein synthesis」と題された米国特許出願第６，９２７，０４２号明細書（２００３年１月１６日出願）も参照のこと（なお上記特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、翻訳後修飾（アジドアミノ酸を介した翻訳後修飾など）を、シュタウディンガーライゲーションにより（例えば、トリアリールホスフィン試薬を用いて）作製することができる。例えば、「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24」を参照のこと。
【０４５６】
＜ＩＸ．非天然アミノ酸ポリペプチドを製造するための代替系＞
いくつかの戦略が、非組み換え宿主細胞、突然変異を起こした宿主細胞、または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むために採用されている。この項に開示されている代替系は、非天然アミノ酸の製造に適用することができる。一例として、例えば、Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒなどの反応性側鎖を有するアミノ酸を誘導体化することにより、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変化する。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むための簡易な方法を提供する。酵素ライゲーションおよびペプチド断片の天然の化学ライゲーションにおける近年の発展によれば、より大きなタンパク質を作ることが可能である。例えば、「P.E.Dawson and S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem.,69:923(2000)」を参照のこと。化学的ペプチドライゲーションおよび天然の化学ライゲーションは、米国特許出願第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレットおよび国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されており、これらは本明細書において参照により組み込まれる。所望の非天然アミノ酸により化学的にアセチル化されるサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質合成を補助することが可能な抽出物に、インビトロにおいて付加されるような、一般的なインビトロにおける生合成方法は、実質的にあらゆるサイズの様々なタンパク質に１００を超える非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために利用されている。例えば、「V.W.Cornish,D.Mendel and P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34:621(1995)」、「C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science 244 182-188(1989)」および「J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111 8013-8014(1989)」を参照のこと。広範囲の官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究用のタンパク質に導入される。
【０４５７】
選択圧力組み込み（selective pressure incorporation）と呼ばれるインビボにおける方法は、野生型シンテターゼの無差別さを利用するために開発された。例えば、「N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder and R.Huber,FASEB J.,13:41(1999)」を参照のこと。細胞に特定の天然アミノ酸を供給する適切な代謝経路が断たれている栄養要求性株は、制限された濃度の天然アミノ酸を含む最少培地において培養されると同時に、標的遺伝子の発現が抑制されている。安定した増殖期の開始において、天然アミノ酸が使い果たされて、非天然アミノ酸の類似体と置き換えられる。組み換えタンパク質の発現誘導は、結果として、非天然の類似体を含むタンパク質の蓄積を生じる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍ、およびｐ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれ、容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２の特徴的な肩を示し（例えば、「C.Minks,R.Huber,L.Moroder and N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000)」を参照のこと）、トリフルオロメチオニンは、１９Ｆ  ＮＭＲによってチトオリゴサッカライドリガンドとの相互作用を研究するためのバクテリオファージＴ４リソザイムにおいて、メチオニンとの置き換えに使用され（例えば、「H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997) 」を参照のこと）、トリフルオロロイシンがロイシンの代わりに組み込まれた結果として、ロイシンジッパータンパク質の向上した熱安定性および化学安定性を生じる（例えば、「Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 40:1494 (2001) 」を参照のこと）。さらに、セレノメチオニンおよびテルロメチオニンは、様々な組み換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶学における相の溶解を容易にする。例えば、「W.A.Hendrickson,J.R.Horton and D.M.Lemaster,EMBO J,9:1665(1990)」、「J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda and M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283(1994)」、「N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann and R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995)」、および「N.Budisa,W.Kambrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder and R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616(1997)」を参照のこと。また、アルケンまたはアルキン官能基を有するメチオニン類似体は効率的に取り込まれ、化学的方法によりタンパク質のさらなる修飾を可能にする。例えば、「J.C.M.van Hest and D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428:68(1998)」、「J.C.M.van Hest,K.L.Kiick and D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.,122:1282(2000)」および「K.L.Kiick and D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000)」、米国特許出願第６，５８６，２０７号明細書、米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照のこと（なお、これらは引用によって本明細書に組み込まれる）。
【０４５８】
この方法の成功は、通常、タンパク質翻訳の忠実度を保障するために高い選択性を要求するアミノアシル‐ｔＲＮＡによる、非天然アミノ酸類似体の認識に依存する。この方法の範囲を拡張する１つの方法は、アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩和することであるが、このことが達成された事例の数は限られていた。例えば、Escherichia coliのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＡｌａ２９４をＧｌｙで置き換えることにより、基質結合ポケットの大きさが向上し、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によってｔＲＮＡＰｈｅがアシル化されることになる。「M.Ibba,P.Kast and H.Henecke,Biochemistry,33:7107(1994)」を参照のこと。この突然変異体ＰｈｅＲＳを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株は、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、「M.Ibba and H Hennecke,FEBS Lett.,364:272(1995)」および「N.Sharma,R.Furter,P.Kast and D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467:37(2000)」を参照のこと。同様に、Escherichia coliのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位に近い、Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒの点突然変異体は、チロシンよりもアザチロシンが高効率に組み込まれることを可能にする。「F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soll and S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)」を参照のこと。
【０４５９】
インビボにおいて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む他の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは、識別が不可能なので、同種の天然アミノ酸と構造的に類似しているアミノ酸を活性化する。この誤りは、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡから間違って入ったアミノ酸を脱アシル化する、別の部位において補正される。シンテターゼの校正活性が無効であれば、誤って活性化される構造的な類似体は、校正機能を逃れて組み込まれ得る。この方法は、近年、ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｖａｌＲＳ）を用いて証明されている。例えば、「V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel and P.Marliere,Science,292:501(2001)」を参照のこと。ｖａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、またはアミノブチレート（Ａｂｕ）を用いてｔＲＮＡｖａｌを誤ってアミノアシル化し、これらの非同種のアミノ酸は、続いて校正領域によって加水分解される。Escherichia coli染色体のランダム変異誘発の後に、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異を有するEscherichia coli突然変異株が、選択される。この校正に欠損のあるＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌにＣｙｓを間違って入れる。Ａｂｕは構造的にＣｙｓ（Ａｂｕでは、Ｃｙｓの‐ＳＨ基が‐ＣＨ３と置換されている）と似ているので、ＶａｌＲＳ突然変異体はまた、この突然変異体がＡｂｕ存在下において増殖されるとき、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析により、約２４％のバリンが本来のタンパク質におけるバリンの位置おいて、Ａｂｕによって置換されていることが示された。
【０４６０】
また、固相合成法および半合成法は、新規のアミノ酸を含む数多くのタンパク質の合成を可能にする。例えば、以下の刊行物：「Crick,F.H.C,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code forproteins.Nature,192:1227-1232(1961)」、「Kaiser,E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins includeing enzymes,Acc Chem Res,22:47-54(1989)」、「Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.t.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,109:3808-3810(1987)」、「Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptide:backbone-engineered HIV protease,Sience,256(5054):221-225(1992)」、「Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,11(3):225-301(1981)」、「Offord,R.E.Protein engineering by chemical means? Protein Eng.,1(3):151-157(1987)」、および「Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C.,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183):243(1994)」、および上記刊行物で引用されている参考文献を参照のこと。
【０４６１】
化学的な修飾は、共同因子、スピン標識、およびオリゴヌクレオチドを含む様々な非天然の側鎖を、インビトロにおいてタンパク質に導入するために使用される。例えば、「Corey,D.R.,Schulz,P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403(1987)」、「Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modificaion of enzymatic specificity,Annu.Rev Biochem,54:565-595(1985)」、「Kaiser,E.T., Lawrence D.S.Chemical mutation of enzyme active sites,Science,226(4674):505-511(1984)」、「Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24):6392-6401(1968)」、「Polger,L.(ed).,M.L.Bender,A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154(1966)」、および「Polack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites,Science,224(4881):1038-1040(1988)」を参照のこと。
【０４６２】
また、化学修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡｓを利用する生物合成方法は、インビトロにおいて合成されたタンパク質に、いくつかの生物物理的プローブを組み込むために用いられている。以下の刊行物：「Brunner, J.New Photolabeling and crosslinking method,Annu.Ruv Biochem,483-514(1993)」、および「Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl.Acad.Sci,8604-8608(1986)」、および該刊行物において引用されている参考文献を参照のこと。
【０４６３】
これまで、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、所望のアンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に加えることによって、非天然アミノ酸が、インビトロにおいてタンパク質に、部位特異的に組み込まれ得ることが示されている。これらの試みによって、２０の一般アミノ酸の多くを、構造的に近縁な相同物に置換することができる（例えば、特定のアミノ酸について栄養要求性の株を用いて、フェニルアラニンをフルオロフェニルアラニンに置換することができる）。例えば、「Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method for site-specific Incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188(1989) 」、「M.W.NowakらScience268:439-42(1995)」、「Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989)」、「N.BudisaらFASEB J.13:41-51(1999)」、「Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,Methods in Enz.,vol.202,301-06(199)」、および「Mendel,D.,Cornish,V.W.& Schultz,P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24,435-62(1995)」を参照のこと。
【０４６４】
例えば、終止コドン（ＵＡＧ）を認識するサプレッサーｔＲＮＡが調製されて、該サプレッサーｔＲＮＡが、非天然アミノ酸によって化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的突然変異誘発法は、終止コドン（ＴＡＧ）を、タンパク質の遺伝子における興味部位に導入するために使用される。例えば、「Sayers, J.R.,Schmidt,W.Eckstein, F. 5’ -3’ Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791- 802 (1988)」を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと突然変異遺伝子とが、インビトロにおける転写／翻訳系に組み合わせられたとき、非天然アミノ酸は、特定位置にそのアミノ酸を含んでいるタンパク質を生じさせるＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。〔３Ｈ〕−Ｐｈｅを用いた実験、およびα−ヒドロキシ酸による実験は、望ましいアミノ酸のみがＵＡＧコドンによって特定された部位で取り込まれ、このアミノ酸がタンパク質中のどの別の部位でも取り込まれることはないことを実証した。例えば、「上記Ｎｏｒｅｎら」、「Kobayashiら(2003)nature Structural Biology 10(6):425-432」、および「Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporasion of novel backbone structures into proteins,Science,197-200(1992)」を参照のこと。
【０４６５】
マイクロインジェクション技術は、タンパク質への非天然アミノ酸を組み込みに用いられている。例えば、「M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty and H.A.Lesser,Science,268:439(1995)」、および「D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)」を参照のこと。ゼノプスの卵母細胞は、インビトロにおいて作製された２種類のＲＮＡとともに取り込まれた。そのようなＲＮＡとは、興味のあるアミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。卵母細胞の転写機構は、ＵＡＧによって特定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法によって、インビトロ発現系では通常には受け容れられない、膜タンパク質全体のインビボにおける構造的−機能的研究が可能になる。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動によって距離を測るための、タキキニン  ニューロキニン−２受容体に対する蛍光性アミノ酸の組み込み（例えば、「G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel and A.Chollet,J.Biol.Chem.,271:19991(1996)」を参照のこと）、イオンチャンネルにおける表面露出残基を同定するためのビオチニル化アミノ酸の組み込み（例えば、「J.P.Gallivan,H.A.Lester, and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997)」を参照のこと）、実時間におけるイオンチャンネルの立体構造変化を観察するための、ケージ化チロシン類似体の利用（例えば、「J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty and H.A.Lester,Neuron,20:619(1998)」を参照のこと）、および、ゲート開閉機序の精査のために、イオンチャネル骨格を変化させるための、アルファヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、「P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999) 」、および「T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001)」を参照のこと。
【０４６６】
インビボにおいて、非天然アミノ酸をタンパク質へ直接組み込むための能力は、特に限定されないが、高収量の変異体タンパク質、技術的な簡便性、細胞もしくは可能であるのなら生物の細胞における突然変異タンパク質を研究するための能力、および薬物治療におけるこれら突然変異タンパク質の利用といった様々な利点を提供する。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性、および他の性質を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含める能力は、タンパク質の機能を精査し、且つ新規な性質を有する新しいタンパク質または組織を作り出すような、タンパク質の構造を合理的かつ体系的に操作する能力を、著しく拡大することができる。
【０４６７】
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込むための１つの試みでは、酵母のアンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ対が、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性、Ｐｈｅ栄養要求株であるEscherichia coli株に用いられた。例えば、「R.Futher,Protein Sci.,7:419(1998)」を参照のこと。
【０４６８】
また、無細胞（インビトロにおいて）翻訳系を用いて、所望のポリヌクレオチドの発現を得ることが可能であってもよい。翻訳系は、細胞または無細胞であってもよく、また原核細胞の翻訳系または真核細胞の翻訳形であってもよい。細胞の翻訳系としては特に限定されないが、例えば、所望の核酸配列がｍＲＮＡに転写することが可能であり、ｍＲＮＡが翻訳されることが可能である透過性細胞または細胞培養物などの、すべての細胞調製物が挙げられる。無細胞の翻訳系は、市販されており、多くの異なるタイプおよび系は公知である。無細胞系の例としては、特に限定されず、Escherichia coliライセートおよび真核細胞ライセート（例えば、麦芽抽出物、昆虫細胞ライセート、ウサギ網状赤血球ライセート、ウサギ卵母細胞ライセート、およびヒト細胞ライセートなど）が挙げられる。タンパク質がグリコシル化、リン酸化、または別の方法によって修飾される場合、このような修飾のほとんどが真核細胞系においてのみ可能であるので、真核細胞の抽出物またはライセートが好ましいこともある。これらの抽出物およびライセートのうちいくつかは市販されている（Promega、Madison,Wis、Strategene、La Jolla,Calif、Amersham、Arlington Heights,Ill、GIBCO/BRL、Grand Island,N.Y）。例えば、ミクロゾーム膜を含む犬の膵エキスなどの膜形成抽出物が市販されており、それは、分泌タンパク質を翻訳するのに有用である。鋳型としてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）、または鋳型としてＤＮＡ（インビトロ転写とインビトロ翻訳との組み合わせ）のいずれかを含むことができるこれらの系において、インビトロ合成はリボソームによって管理される。相当な労力が無細胞タンパク質発現系の開発に注がれている。例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74:309-316(2001)」、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000)」、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology Progress,16,385-390,(2000)」、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,66:180-188,(1999)」、および「Patnaik,R.and J.R.Swartz,Biotechniques24,862-868,(1998)」、米国特許第６，３３７，１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書、国際公開第００／５５３５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照のこと。非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸発現に適用され得る別のアプローチは、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術を含む。例えば、「R.Roberts and J.Szostak,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94 12297-12302(1997)」、「A.FrankelらChemistry&Biology 10,,1043-1050(2003)」を参照のこと。このアプローチにおいて、ピューロマイシンと連結するｍＲＮＡの鋳型は、リボソーム上のペプチドへ翻訳される。例えば、１つ以上のｔＲＮＡ分子が修飾されている場合、非天然アミノ酸もまたペプチドに組み込まれ得る。最後のｍＲＮＡコドンが読み取られた後に、ピューロマイシンは当該ペプチドのＣ−末端を捕捉する。例えば、生じたｍＲＮＡ−ペプチド接合体が、インビトロアッセイにおいて関連する性質を有することが見られるとき、その個性はｍＲＮＡ配列から容易に明らかにされ得る。このようにして、所望の性質を有するポリペプチドを同定するために、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのライブラリーをスクリーニングし���もよい。つい最近、精製成分を用いたインビトロリボソーム翻訳が、非天然アミノ酸により置換されたペプチドの合成を可能にすることが報告されている。例えば、「A.ForsterらProc.Natl Acad.Sci.(USA)100 6353(2003)」を参照のこと。
【０４６９】
また、再構成された翻訳系が用いられてもよい。精製される翻訳因子の混合物は、タンパク質、およびライセート、または精製される翻訳因子（例えば、開始ファクター−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３、伸張因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、または終末因子など）によって補完されるライセートの組み合わせ体にｍＲＮＡを首尾よく翻訳するために用いられている。また、無細胞系は、ｍＲＮＡおよび翻訳されたｍＲＮＡの中に転写される系（例えば、参照によって具体的に組み込まれる「分子生物学（F.M.Ausubelら著、Willey Interscience,1993)」におけるCurrent Protocolを参照のこと）に、ＤＮＡが導入される転写／翻訳系を組み合わせてもよい。真核細胞の転写機構に転写されるＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡの形態、またはある翻訳機構において有利となり得る、成長したｍＲＮＡを付随させた５’−エンドキャップ（７−メチルグアノシン）且つ３’−エンドポリＡの形態に転写されればよい。例えば、キャップされたｍＲＮＡｓは、網状赤血球溶解機構において高い効率で翻訳される。
【０４７０】
ｔＲＮＡは、例えば、化学的アミノアシル化または酵素的アミノアシル化などの、いずれかの方法または技術を用いて、所望のアミノ酸によってアミノアシル化されればよい。
【０４７１】
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼまたは他の酵素分子（例えば、リボザイム）によって達成されればよい。用語「リボザイム」は、「触媒ＲＮＡ」と同義である。Ｃｅｃｈおよび共同研究者は、触媒（リボザイム）として作用することができる、自然発生のＲＮＡｓの存在を実証した（「Cech, 1987, Science, 236:1532-1539、McCorkleら 1987, Concepts Biochem. 64:221-226」）。しかしながら、これら天然のＲＮＡ触媒は、分解およびスプライシングのためのリボ核酸基質で作用することが示されているのみであるとはいえ、リボザイムの人工発生という近年の発展は、様々な化学的反応へと触媒のレパートリーを拡大している。研究では、ＲＮＡ分子自身の（２’）３’−末端上でアミノアシル−ＲＮＡ結合に触媒作用を及ぼすことができるＲＮＡ分子（「Illangakekareら1995 Science 267:643-647」）、および１つのＲＮＡ分子から他のＲＮＡ分子までアミノ酸を輸送できるＲＮＡ分子（「Lohseら 1996, Nature 381:442-444」）を同定している。
【０４７２】
本明細書に参照によって組み込まれている米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書には、リボザイムをコンストラクトする方法と、天然にコードされた、および非天然にコードされたアミノ酸による、ｔＲＮＡｓのアミノアシル化における上記リボザイムの使用とが記載されている。ｔＲＮＡｓをアミノアシル化できる酵素分子（特に限定されないが、リボザイムが挙げられる）の基質固定形態は、アミノアシル化生成物の効率的な親和性精製を可能にし得る。適切な基質の例としては、アガロース、セファロース、および電磁ビーズが挙げられる。生成物およびアミノアシル化に対するリボザイムの基質固定形態の利用は、「Chemistry and Biology 2003,10:1077-1084」および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載され、本明細書において参照によって組み込まれる。
【０４７３】
化学的なアミノアシル化方法としては、特に限定されないが、Ｈａｃｈｔおよび共同研究者らによって紹介される方法（Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517)、およびShultz,Chamberlin,Dougherty他、によって紹介される方法(Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621 ; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A: Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991 ; Nowak, M. W.ら Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E.ら J. Biol. Chem. 19.96, 271, 23169; Hohsaka, T.ら J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34）が挙げられる。これらは、アミノアシル化におけるシンテターゼの利用を避けるために、本明細書において参照によって組み込まれる。当該方法または他の化学的にアミノアシル化する方法は、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するために用いられてもよい。
【０４７４】
触媒ＲＮＡを生成する方法は、ランダム化されたリボザイム配列の分離プールを生成する工程、当該プールにおいて方向付けられた発生を行う工程、所望のアミノアシル化活性について上記プールをスクリーニングする工程、および所望のアミノアシル化活性を示すリボザイムの配列を選択する工程を含んでいてもよい。
【０４７５】
リボザイムは、例えば、ＧＧＵモチーフおよびＵ−ｒｉｃｈ領域などのアシル化活性を促進するモチーフおよび／または領域を含むことができる。例えば、Ｕ−ｒｉｃｈ領域はアミノ酸基質の認識を容易にすることが可能であり、ＧＧＵモチーフはｔＲＮＡの３’末端によって塩基対を形成することができることが報告されている。また、ＧＧＵモチーフ、モチーフおよびＵ−ｒｉｃｈ領域は、アミノ酸とｔＲＮＡとを両方同時に認識することを容易にし、これにより、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を容易にする。
【０４７６】
リボザイムは、ｔＲＮＡｓｎＣＣＣＧと接合された、部分的にランダム化されたｒ２４ｍｉｎｉを用いて、インビトロにおいて選択し、その後、活性型クローンに発見されるコンセンサス配列を体系的に操作することによって生成することができる。この方法によって得られる典型的なリボザイムは「Ｆｘ３リボザイム」と称され、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載される。その内容は、本明細書に参考によって組み込まれる。Ｆｘ３リボザイムは、同種の非天然アミノ酸によって蓄えられる様々なアミノアシル−ｔＲＮＡｓ合成の多目的な触媒として機能する。
【０４７７】
基質での固定化は、アミノアシル化ｔＲＮＡｓの効率的な親和性精製を可能にするために利用されてもよい。適切な基質の例としては、特に限定されないが、アガロース、セファロース、および電磁ビーズが挙げられる。リボザイムは、ＲＮＡの化学的構造の利点（ＲＮＡのリボース上の３’−シス−ジオールが、樹脂上でＲＮＡの固定化を容易にするために、対応するジアルデヒドを産出するための過ヨウ素酸によって酸化され得る）を利用することにより、樹脂上に固定され得る。多様な種類の樹脂には、例えば、安価なヒドラジド樹脂を用いることができる。このヒドラジド樹脂において、還元的アミノ化は樹脂とリボザイムとの間の不可逆連結を相互作用させる。アミノアシルｔＲＮＡの合成は、カラム上でのアミノアシル化技術によって効率的に促進することができる。「KouroullisらMethod 2005、36:239-4」には、カラムに基づくアミノアシル化系が記載されている。
【０４７８】
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は、様々な方法で達成され得る。適切な方法の１つとして、緩衝液（例えば、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを有するナトリウム酢酸溶液、５０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、または水で希釈されたＥＤＴＡ（ｐＨ７．０））によってカラムからアミノアシル化ｔＲＮＡを溶出する方法がある。
【０４７９】
アミノアシル化ｔＲＮＡが翻訳反応に加えられると、当該翻訳反応によって作製されたポリペプチドの所定の位置に、ｔＲＮＡをアミノアシル化しているアミノ酸が組み込まれ得る。本発明に係るアミノアシル化ｔＲＮＡｓにおける翻訳系の例としては、特に限定されないが、細胞ライセートが用いられる。細胞ライセートは、入力ｍＲＮＡからポリペプチドをインビトロにおいて翻訳するために必要な反応要素を提供する。当該反応要素の例としては、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡｓ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始および伸張因子、ならびに翻訳に関連するさらなる因子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、翻訳系はバッチ式の翻訳または区分化された翻訳であってもよい。バッチ式の翻訳系は、１つの区分において反応要素を組み合わせる。一方、区分化あされた翻訳系は、翻訳効率を阻害する可能性がある反応産物から、翻訳反応要素を分離する。当該翻訳系は市販されている。
【０４８０】
さらに、一連の転写／翻訳系は、対応するｍＲＮＡへ入力ＤＮＡの双方の転写を可能にするものであり、これは反応要素によって次々に翻訳される。一連の転写／翻訳系の例としては、例えば、高速翻訳系（RTS、Roche Inc.）が市販されている。この系は、例えばリボソームおよび翻訳因子などの翻訳要素を供与するＥ．ｃｏｌｉライセートを構成する混合物を含む。さらに、ＲＮＡポリメラーゼは、翻訳に利用するｍＲＮＡ鋳型に入力ＤＮＡの転写のために含まれる。ＲＴＳは反応区分間に挿入される膜によって、反応要素の細分化を利用できる。この反応区分としては、供給／消費区分および転写／翻訳区分が挙げられる。
【０４８１】
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、その他の試薬によって実施されればよく、そのような試薬としては、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒抗体、多機能タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８２】
Ｓｔｅｐｈａｎは、「Scientist 2005 Oct 10、pages 30-33」において、タンパク質中に非天然にコードされたアミノ酸を組み込むためのさらなる方法を記載している。Ｌｕらは、「Mol Cell. 2001 Oct、8(4):759-69」において、タンパク質を非天然アミノ酸（発現されたタンパク質結合）を含む合成ポリペプチドと化学的に結合させる方法を記載している。
【０４８３】
＜Ｘ．ポリペプチドの非天然アミノ酸要素の翻訳後修飾＞
方法、組成物、技術および戦略は、インビボにおけるタンパク質の翻訳中に、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために開発されている。天然アミノ酸の側鎖の化学的性質に対して直交する化学的性質の側鎖を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、この技術は、組み換えタンパク質の部位特異的な誘導対化を可能にさせる。結果として、タンパク質を誘導体化する、本明細書に記載の方法、組成物、技術および戦略の主な利点としては、規定された均質な生成物として、直ちに調製され得ることである。しかしながら、本明細書に記載の方法、組成物、反応混合物、技術および戦略は、インビボにおけるタンパク質翻訳技術によって形成されるが、例えば、インビボのタンパク質翻訳技術によって形成される非天然アミノ酸ポリペプチドに限定されず、インビトロの技術、発現されるタンパク質ライゲーション、化学合成、リボザイムを基にした技術（例えば、本明細書の「代替系における発現」と表題される項を参照のこと）などの、いかなる技術によって形成される非天然アミノ酸ポリペプチドをも含む。
【０４８４】
組み換えタンパク質への非天然アミノ酸ポリペプチドの組み込み能は、インビトロ、またはインビボどちらかにおいて生じる、翻訳後の誘導体化のために実施されてもよい化学反応を広く拡大する。より具体的には、ポリペプチドの非天然アミノ酸部位において、アルキル化アミン連結（２級アミン連結または３級アミン連結が含まれる）を形成する、アルデヒドなどのカルボニル含有化合物と芳香族アミンとの、還元的アルキル化または還元的アミノ化を利用した、タンパク質の誘導体化は、いくつかの利点を提供する。まず第１に、天然に生じるアミノ酸は、（ａ）カルボニル基と反応することによりアルキル化芳香族アミンを形成して、その結果２級アミン連結または３級アミン連結を形成することができる、芳香族アミン基を含まない。また、（ｂ）芳香族アミン基は、アルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）を形成するような、カルボニル含有基と反応できる。したがって、アルキル化アミンを形成するように作られた試薬は、ポリペプチドの非天然アミノ酸要素と部位特異的に反応することがある（言うまでもなく、非天然アミノ酸および対応する試薬は、アルキル化アミンおよび対応するアミン連結を形成するように作られていることを想定する）。当該部位特異的な誘導体化を図１９〜３４に示す。ここで、芳香族アミンを含んでいる側鎖は、プロトン化したアミンまたはイミダゾール部位を含んでいる側鎖全体にわたって、優先的に還元的アルキル化される。第２に、当該アルキル化された芳香族アミンは、生物学的環境下で安定なアミン連結を有する。これは、当該連結が治療への応用にとって有効な候補であるということを示唆している。第３に、当該アミン連結の安定性は、連結が形成された非天然アミノ酸の固有性（例えば、官能基および／または構造）に基づいて操作することができる。いくつかの実施形態では、アルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）と、非天然アミノ酸ポリペプチドとの連結の分解半減期は、１時間未満であり、別の実施形態では１日未満であり、別の実施形態では２日未満であり、別の実施形態では１週間未満であり、別の実施形態では１週間よりも長い。さらに別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）は、生物学的環境下で少なくとも４週間安定している。さらに別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）は、生物学的環境下で少なくとも３週間安定している。さらに別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）は、生物学的環境下で少なくとも２週間安定している。さらに別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）は、生物学的環境下で少なくとも１週間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で少なくとも６日間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で少なくとも５日間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で少なくとも４日間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で少なくとも３日間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で少なくとも２日間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で少なくとも１日間安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で２４時間まで安定している。別の実施形態では、アルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で１２時間まで安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で６時間まで安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で３時間まで安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で２時間まで安定している。別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、生物学的環境下で１時間まで安定している。さらに別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）は、弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定しており、別の実施形態では、生じたアルキル化アミン（例えば、２級アミンまたは３級アミン）連結は、弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定している。別の実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは約２〜約８の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、ｐＨ約２〜約６で少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約２〜約４の間のｐＨにおいて、少なくとも１日間安定している。別の実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、約６〜約１０の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約４〜約８の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約４〜約１０の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定している。別の実施形態では、非天然アミノ酸ポリペプチドは、約２〜約５の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約３〜約７の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約３〜約１０の間のｐＨにおいて少なくとも１日間安定している。別の実施形態では、本明細書に記載の戦略、方法、組成物および技術を用いた、アルキル化アミンの合成（例えば、非天然アミノ酸ポリペプチドとの２級アミン連結または３級アミン連結を含む）は、分解半減期を、例えば、治療上の利用（例えば、持続放出）、診断上の利用、商業的生成物、産業上の利用、または軍事上の利用のために要求される必要なものに、変更するために変えてもよい。
【０４８５】
上述した非天然アミノ酸ポリペプチドは、特に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、および結合タンパク質（抗体および抗体断片があるが、これに限定されない）に有用であるとともに、タンパク質の構造や機能の研究などに有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。上述した非天然アミノ酸ポリペプチドに関する別の利用としては、アッセイに基づく利用、化粧品利用、植物生物学利用、環境利用、エネルギー生産利用および／または軍事利用が挙げられる。また一方、上述した非天然アミノ酸ポリペプチドは、新たな、または修飾された機能性基を組み込むために、さらなる修飾を受けることができる。この機能性基としては、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、生物学的利用性、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物活性の調節、または循環時間の延長）、ポリペプチドへのさらなる機能性基の提供、ポリペプチドへのタグ、標識、または検出可能なシグナルのを組み込み、ポリペプチドの単離性質の簡単化、および上述した修飾のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０４８６】
本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の、特定のタイプ、クラス、あるいはファミリーに限定されるものではない。実際に、事実上すべてのポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでもよい。単なる一例として、ポリペプチドは：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ���ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群から選択される治療タンパク質と相同であり得る。また、非天然アミノ酸ポリペプチドは、成長ホルモンスーパーファミリーのいかなるポリペプチドメンバーと相同であってもよい。
【０４８７】
上記修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸組成物へのさらなる機能性基の組み込みを含んでいる。上記機能性基としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【０４８８】
したがって、例えば、次のアミノ酸のいずれか１つを含んでいる非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の方法および組成物によってさらに修飾されてもよい。
（ａ）
【０４８９】
【化４１】
2009519942.tif 000044
ここで、
【０４９０】
【化４２】
2009519942.tif 000045
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａ基のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、ｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか；またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。当該非天然アミノ酸としては、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０４９１】
【化４３】
2009519942.tif 000046
（Ａ’のそれぞれは、独立して、ＣＲａ、Ｎまたは、
【０４９２】
【化４４】
2009519942.tif 000047
から選択され、かつＡ’の２つまでは、
【０４９３】
【化４５】
2009519942.tif 000048
であり、残りのＡ’は、ＣＲａまたはＮから選択されてもよい）。さらに、当該非天然アミノ酸としては、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０４９４】
【化４６】
2009519942.tif 000049
（Ｇはアミン保護基であり、特に限定されないが、
【０４９５】
【化４７】
2009519942.tif 000050
を含んでいる）。
（ｂ）
【０４９６】
【化４８】
2009519942.tif 000051
ここで、
【０４９７】
【化４９】
2009519942.tif 000052
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、ｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｙは、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−ＮＨＲ’、−ＣＲ’＝ＮＲ’、−ＮＯ２、または−Ｎ３であり；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。さらに、当該非天然アミノ酸は、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸を包含する。
【０４９８】
【化５０】
2009519942.tif 000053
（ｃ）
【０４９９】
【化５１】
2009519942.tif 000054
ここで、
【０５００】
【化５２】
2009519942.tif 000055
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、かつｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。当該非天然アミノ酸は、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０５０１】
【化５３】
2009519942.tif 000056
（Ａ’のそれぞれは独立して、ＣＲａ、Ｎ、または、
【０５０２】
【化５４】
2009519942.tif 000057
から選択され、かつＡ’の２つまでは、
【０５０３】
【化５５】
2009519942.tif 000058
であり、残りのＡ’は、ＣＲａまたはＮから選択されてもよい）。
（ｄ）
【０５０４】
【化５６】
2009519942.tif 000059
（Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４ともしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ６は、保護されたアルデヒド、またはマスクされたアルデヒドであり、
保護基は、特に限定されないが、
【０５０５】
【化５７】
2009519942.tif 000060
（Ｘ１のそれぞれは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ａｃ）−、および−Ｎ（ＯＭｅ）−から成る群から選択され、；Ｘ２は、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＳＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）（Ａｃ）、−Ｎ（Ｒ）（ＯＭｅ）、またはＮ３であり、Ｒ’およびＲのそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）を含んでいる）。
（ｅ）
【０５０６】
【化５８】
2009519942.tif 000061
（Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’は独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、かつｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
【０５０７】
【化５９】
2009519942.tif 000062
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳである）。
【０５０８】
本明細書に記載の方法および組成物の一態様では、組成物は、翻訳後修飾されている非天然アミノ酸を、特に限定されないが、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０つ、またはそれ以上を有するポリペプチドを少なくとも１つ含んでいる。翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる場所が、タンパク質に存在し得る。別の態様では、組成物は、ポリペプチドに存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が、翻訳後修飾された非天然アミノ酸と置き換えられているポリペプチドを含んでいる。翻訳後修飾された非天然アミノ酸を１つ以上有する、特定のポリペプチドに関しては、翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、全く同一であてもよいし、または異なっていてもよい（ポリペプチドが、２つ以上の異なる種類の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、また、２つ以上の同一の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいてもよい）。２つ以上の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を有する特定のポリペプチドに関しては、翻訳後修飾された非天然アミノ酸は同一であってもよいし、異なっていてもよいし、または、同じ種類の複数の翻訳後修飾された非天然アミノ酸と、少なくとも１つの異なる翻訳後修飾された非天然アミノ酸との組み合わせであってもよい。
【０５０９】
‐Ａ．１回の翻訳後修飾工程を用いて、非天然アミノ酸ポリペプチドを翻訳後修飾する方法：芳香族アミン含有非天然アミノ酸と、カルボニル含有試薬との還元的アルキル化反応‐
天然アミノ酸の側鎖は強い求核部分が欠落している。それゆえ、求核側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、芳香族アミン基または置換芳香族アミン基を含んでいるアミノ酸）の組み込みは、カルボニル含有試薬（例えば、アルデヒド含有試薬を含む）へ求核付加と、その後の還元反応によって、この側鎖の部位特異的なアルキル化を可能にする。この還元的アルキル化反応は、アミン連結（例えば、２級アミン連結および３級アミン連結）を生じさせる。
【０５１０】
誘導体化方法、および／または、さらなる修飾方法は、還元的アルキル化工程の前、あるいは還元的アルキル化工程の後に精製されている、天然に発生したポリペプチドまたは化学的に合成されたポリペプチドによって行われる。さらに、誘導体化方法、および／または、さらなる修飾方法は、当該修飾の前または後に精製されている、合成ポリマー、多糖類、またはポリヌクレオチドにおいて行われてもよい。
【０５１１】
ポリペプチドの翻訳後修飾は、アルデヒド含有試薬による芳香族アミン含有ポリペプチドの還元的アルキル化に基づいており、異なる利点を有する。第１に、芳香族アミンが、約４から約１０の範囲のｐＨにおいて、還元試薬（例えば、ＮａＢＣＮＨ３）と、アルデヒドおよびケトンを含んでいるカルボニル含有化合物とにより還元的アルキル化されることにより、２級アミン連結または３級アミン連結が生じる（なお、ある種の実施形態では、上記ｐＨの範囲は、約４から約７である）。他の還元剤としては、特に限定されないが、ＴＣＥＰ，Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、およびＮａＢＨ４が挙げられる。第２に、これらの反応条件において、天然に生じるアミノ酸の側鎖が不活性であるので、化学反応は、非天然アミノ酸に対して選択的である。このため、芳香族アミン部分、または脱保護されたアルデヒド部分を含んでいる非天然アミノ酸を組み込んでいるポリペプチド（例えば組み換えタンパク質）を部位特異的に誘導体化することができる。従って、そのような誘導体化ポリペプチドおよび誘導体化タンパク質を、特定の均質な産物として調製することができる。第３に、通常、ポリペプチドに組み込まれているアミノ酸の芳香族アミン部分と、アルデヒド含有試薬とを反応させるのに必要な穏やかな条件は、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。同様に、通常、ポリペプチドに組み込まれ、かつ脱保護されているアミノ酸のアルデヒド含有部分と、芳香族アミン含有試薬とを反応させるのに必要な穏やかな条件は、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（当然、反応の目的がそうような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。第４に、反応は室温において急速に起こり、このため、高温において不安定である多くの種類のポリペプチド、または試薬を使用することができる。第５に、反応は水性条件において容易に起こり、このため、非水性溶液とあらゆる程度で不適合性なポリペプチドおよび試薬を使用することができる。第６に、試薬に対するポリペプチドまたはアミノ酸の割合が、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的であるときでさえ、反応は容易に生じるので、この結果、有効量の反応産物を得るために過剰の試薬を加える必要がなくなる。第７に、生じたアミンは、反応物質のアミンおよびカルボニルの部分の設計に依存して、位置選択的および／または位置特異的に産生され得る。最後に、アルデヒド含有試薬による芳香族アミンの還元的アルキル化、およびアミン含有試薬を用いた還元的アミノ化は、生物学的条件において安定なアミン連結（例としては、２級アミン連結および３級アミン連結が挙げられる）連結を生成する。
【０５１２】
例えば、以下の非天然アミノ酸は、本明細書に記載されるアルデヒド含有試薬によって還元的アルキル化されてもよい。
（ａ）
【０５１３】
【化６０】
2009519942.tif 000063
ここで、
【０５１４】
【化６１】
2009519942.tif 000064
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａ基のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、ｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか；またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。当該非天然アミノ酸は、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸を包含する：
【０５１５】
【化６２】
2009519942.tif 000065
（Ａ’のそれぞれは、独立して、ＣＲａ、Ｎまたは、
【０５１６】
【化６３】
2009519942.tif 000066
から選択され、かつＡ’の２つまでは、
【０５１７】
【化６４】
2009519942.tif 000067
であり、残りのＡ’は、ＣＲａまたはＮから選択されてもよい）。さらに、当該非天然アミノ酸は、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸を包含する：
【０５１８】
【化６５】
2009519942.tif 000068
（Ｇはアミン保護基であり、特に限定されないが、
【０５１９】
【化６６】
2009519942.tif 000069
を含んでいる）。
（ｂ）
【０５２０】
【化６７】
2009519942.tif 000070
ここで、
【０５２１】
【化６８】
2009519942.tif 000071
は、単環式アリール環、２環式アリール環、多環式アリール環、単環式ヘテロアリール環、２環式ヘテロアリール環、および多環式ヘテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、かつｎは０、１、２、３、４、５または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。当該非天然アミノ酸は、特に限定されないが、以下の構造を有するアミノ酸を包含する：
【０５２２】
【化６９】
2009519942.tif 000072
（Ａ’のそれぞれは独立して、ＣＲａ、Ｎ、または、
【０５２３】
【化７０】
2009519942.tif 000073
から選択され、かつＡ’の２つまでは、
【０５２４】
【化７１】
2009519942.tif 000074
であり、残りのＡ’は、ＣＲａまたはＮから選択されてもよい）。当該還元的アルキル化反応は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを、モノアルキル化された芳香族アミン含有非天然アミノ酸、またはジアルキル化された芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいる、非天然アミノ酸ポリペプチドに翻訳後修飾する。
【０５２５】
当該芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの種類としては、芳香族アミン含有非天然アミノ酸のポリペプチド内の位置が、アルデヒド含有試薬が芳香族アミン基と反応することが可能であり、且つ、ポリペプチドの三次構造を破壊するような、修飾型非天然アミノ酸を生成することができない位置である限り、実質的に制限されるものではない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。
【０５２６】
一例として、本明細書に記載の芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応し、且つ、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するために用いられ得るカルボニル含有試薬には、以下の構造：
【０５２７】
【化７２】
2009519942.tif 000075
を有するアルデヒド含有化合物が含まれる。ここで、Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５２８】
さらに、例えば、本明細書に記載される芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応し、且つ、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するために用いられ得るカルボニル含有試薬には、以下の構造
【０５２９】
【化７３】
2009519942.tif 000076
を有するジカルボニル含有化合物（例えば、ジケトン、ケトアルデヒド、およびジアルデヒド）が含まれる（Ｒ１のそれぞれは、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケン、任意に置換されたアルキン、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換された複素環、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールから選択され；
Ｒ５は、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’−であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルである）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；ｎは１、２または３である）。
【０５３０】
芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応し得るカルボニル含有試薬の種類は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸のポリペプチド内の位置が、カルボニル含有試薬が芳香族アミン基と反応することができ、且つ、ポリペプチドの三次構造を破壊するような、修飾型非天然アミノ酸を生成することができない位置である限り、実質的に制限されるものではない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。当該カルボニル含有試薬としては、少なくとも１つのアルデヒド部分を含んでいる試薬、および少なくとも２つのアルデヒド部分を含んでいる試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３１】
さらに、アルデヒド部分と芳香族アミン部分との間の反応は容易であり、当該還元的アルキル化反応は次の性質のうち少なくとも１つを有する：（ｉ）約４から約７のｐＨ範囲において起こること、（ｉｉ）生物学的環境下で安定なアミン連結を生成すること、（ｉｉｉ）部位特異的であること、（ｉｖ）ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しないこと、（ｖ）室温で迅速に生じること、（ｖｉ）水性環境で迅速に生じること、（ｖｉｉ）芳香族アミン部分を含有する非天然アミノ酸と、アルデヒド含有試薬との比率が、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的であるときに直ちに生じること、および（ｖｉｉｉ）位置選択的および／または位置特異的であること。還元的アルキル化反応の直交性は、位置選択性および／または位置特異性をもたらし、これにより、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド内の他のアミノ酸に影響を及ぼすことなく、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位特異的な翻訳後修飾が可能になる。
【０５３２】
ポリペプチド内の芳香族アミン含有非天然アミノ酸を還元的アルキル化する方法の実施形態を、図２０〜３４に示す。ある実施形態は、カルボニル含有試薬（アルデヒド含有試薬を含む）により、ポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、１回還元的アルキル化して、２級アミン部分を生成することを含んでいるのに対し、別の実施形態は、カルボニル含有試薬（アルデヒド含有試薬を含む）により、ポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、２回還元的アルキル化して、３級アミン部分を生成することを含んでいる。さらに、いくつかの実施形態は、少なくとも２つのカルボニル基を有する試薬により、ポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、１回還元的アルキル化して、２級アミン部分を生成することを含んでいる。また、別の実施形態は、少なくとも２つのカルボニル基を有する試薬により、ポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、２回還元的アルキル化して、３級アミン部分を生成することを含んでいる。これら説明用の実施形態では、アルデヒド含有試薬は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと還元剤（例えば、シアノホウ化水素ナトリウム）との緩衝液（ｐＨ約４〜約７）へ加えられる。反応は室温において進行し、生じたアルキル化芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。
【０５３３】
別の実施形態では、複数のリンカー化学物質は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと、部位特異的に反応し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるリンカー法は、少なくとも１つのリンカー末端（１官能性、２官能性、または多官能性）において、カルボニル基（アルデヒド基を含む）を含んでいるリンカーを使用する。芳香族アミン含有ポリペプチドと、アルデヒド誘導体化リンカーとの還元的アルキル化は、安定なアミン連結を生成する。また、ヘテロ官能性リンカーとして知られる（例えば、１以上の他の連結化学物質を有するカルボニル（例えば、アルデヒド））、２官能性リンカーおよび／または多官能性リンカーは、非天然アミノ酸ポリペプチドへの異なる分子（例えば、別のポリペプチド、ポリ核酸、ポリマー、または低分子）の部位特異的な結合を許容する。その一方、ホモ官能性リンカー（例えば、すべての末端が、カルボニル（アルデヒドを含む）で置換されているリンカー）として知られる１官能性リンカーは、芳香族アミン非天然アミノ酸ポリペプチドの、部位特異的なダイマー化、またはオリゴマー化を容易にする。本明細書に記載されるインビボにおける翻訳技術とこのリンカー技術とを組み合わせることによって、化学合成されたタンパク質の三次元構造を特定することが可能になる。
【０５３４】
‐Ｂ．２つの翻訳後修飾工程を用いて、非天然アミノ酸ポリペプチドを翻訳後修飾する方法：芳香族アミン含有非天然アミノ酸を形成した後に、芳香族アミン含有非天然アミノ酸とカルボニル含有試薬との還元的アルキル化反応を行う‐
芳香族アミン含有アミノ酸は、カルボニル含有試薬（アルデヒド含有試薬を含む）による還元的アルキル化の前に、ポリペプチドに翻訳によって組み込まれ得る。別の方法では、芳香族アミン含有アミノ酸の前躯体（例えば、置換された芳香族部分を有するアミノ酸）は、ポリペプチドに翻訳によって組み込むことが可能であり、続いて、カルボニル含有試薬による還元的アルキル化の前に、芳香族アミン含有アミノ酸に変換される。前者の方法が１回の翻訳後修飾を含むのに対し、後者の方法は２回の翻訳後修飾を含む。誘導体化方法、および／またはさらなる修飾法は、これら修飾法の前または後に精製され得る、天然に生成されたポリペプチドあるいは化学合成されたポリペプチドに対して行われ得る。さらに、誘導体化方法、および／またはさらなる修飾方法は、これら修飾法の前または後に精製され得る、合成ポリマー、ポリサッカライド、またはポリヌクレオチドにおいて行われてもよい。
【０５３５】
例えば、以下の非天然アミノ酸は、芳香族アミン含有アミノ酸を生成するために還元され得る：
【０５３６】
【化７４】
2009519942.tif 000077
ここで、
【０５３７】
【化７５】
2009519942.tif 000078
は、単環式アリール環、二環式アリール環、多環式アリール環、単環式へテロアリール環、二環式へテロアリール環、および多環式へテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立してＨ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２−、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、ｎは０、１、２、３、４、５、または６である）；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｙは、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−ＮＨＲ’、−ＣＲ’＝ＮＲ’、−ＮＯ２、または−Ｎ３であり；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。当該非天然アミノ酸は、特に限定されないが、以下の構造：
【０５３８】
【化７６】
2009519942.tif 000079
を有するアミノ酸を含んでいる。
【０５３９】
天然ポリペプチド、合成ポリマー、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド、または化学合成ポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸を還元的に生成することに関する実施形態を、図１４および１５に示す。いくつかの実施形態には、１級芳香族アミン含有非天然アミノ酸へのイミン置換基の還元、２級芳香族アミン含有非天然アミノ酸へのイミン置換基の還元、１級芳香族アミン含有非天然アミノ酸へのヒドラジンアミン置換基の還元、２級芳香族アミン含有非天然アミノ酸へのヒドラジンアミン置換基の還元、１級芳香族アミン含有非天然アミノ酸へのニトロ置換基の還元、および１級芳香族アミン含有非天然アミノ酸へのアジド置換基の還元が含まれる。これら説明用の実施形態では、置換された芳香族部分は、ｐＨが約４〜約７の緩衝液において還元される。還元剤としては、特に限定されないが、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、ＮａＢＨ４またはＮａＢＣＮＨ３が使用される。この反応は室温において進行し、生じた芳香族アミン含有非天然アミノ酸天然ポリペプチド、合成ポリマー、ポリサッカライド、ポリヌクレオチドまたは化学合成されたポリペプチドが、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【０５４０】
置換された芳香族部分含有アミノ酸の還元から生成される、当該芳香族アミン含有アミノ酸の還元的アルキル化は、「セクションＡ：１回の翻訳後修飾工程を用いて、非天然アミノ酸ポリペプチドを翻訳後修飾する方法：芳香族アミン含有非天然アミノ酸とカルボニル含有試薬との還元的アルキル化反応」に記載されている。保護された（またはマスクされた）アミンの還元によって生成される芳香族アミン含有アミノ酸の還元的アルキル化に関する実施形態を、図１５および３４に示す。還元的アルキル化工程は、ポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸を還元的に生成する、第１の翻訳後修飾工程の後に行われる。還元的アルキル化は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを、アルキル化された芳香族アミン含有非天然アミノ酸を有する非天然アミノ酸ポリペプチドに修飾する、第２の翻訳後反応である。当該翻訳後修飾または組み込み後修飾は、合成ポリマー、ポリサッカライド、ポリヌクレオチドまたは化学合成されたポリペプチドに組み込まれた芳香族アミン含有アミノ酸に適用されてもよい。
【０５４１】
当該芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの種類は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸のポリペプチド内の位置が、カルボニル含有試薬（アルデヒド含有試薬を含む）が芳香族アミン基と反応することができ、且つ、ポリペプチドの三次構造を破壊するような、修飾型非天然アミノ酸を生成することができない位置である限り、実質的に制限されるものではない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。
【０５４２】
一例として、本明細書に記載される芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応し、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するために用いられ得るアルデヒド含有試薬は、次の構造：
【０５４３】
【化７７】
2009519942.tif 000080
を有する化合物である。ここで、Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５４４】
さらに、例えば、本明細書に記載される芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応し、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するために用いられ得るカルボニル含有試薬は、以下の構造：
【０５４５】
【化７８】
2009519942.tif 000081
を有するジカルボニル含有化合物（例えば、ジケトン、ケトアルデヒド、およびジアルデヒド）である。ここで、Ｒ１のそれぞれは、独立して、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケン、任意に置換されたアルキン、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換された複素環、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールから選択され；
Ｒ５は、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’−であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルである）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；ｎは１、２または３である。
【０５４６】
芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応し得るカルボニル含有試薬の種類は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸のポリペプチド内の位置が、カルボニル含有試薬（アルデヒド含有試薬を含む）が芳香族アミン基と反応することができ、且つ、ポリペプチドの三次構造を破壊するような、修飾型非天然アミノ酸を生成することができない位置である限り、実質的に制限されるものではない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。当該カルボニル含有試薬には、特に限定されないが、少なくとも１つのカルボニル部分を含んでいる試薬、および／または少なくとも２つのカルボニル部分を含んでいる試薬が包含される。
【０５４７】
さらに、カルボニル部分（例えば、アルデヒド部分）と、芳香族アミンとの間の反応は容易であり、当該還元アルキル化反応は、次の性質のうち、少なくとも１つを有する：（ｉ）約４から約７のｐＨ範囲において起こること、（ｉｉ）生物学的環境下で安定なアミン連結を生成すること、（ｉｉｉ）部位特異的であること、（ｉｖ）ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しないこと、（ｖ）室温で迅速に生じること、（ｖｉ）水性環境で迅速に生じること、（ｖｉｉ）芳香族アミン部分を含有する非天然アミノ酸と、アルデヒド含有試薬との比率が、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的であるときに直ちに生じること、および（ｖｉｉｉ）位置選択的および／または位置特異的であること。還元的アルキル化反応の直交性は、位置選択性および／または位置特異性をもたらし、これにより、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド内の他のアミノ酸に影響を及ぼすことなく、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位特異的な翻訳後修飾が可能になる。
【０５４８】
いくつかの実施形態は、カルボニル含有試薬により芳香族アミン部分を、１回還元的アルキル化して、２級アミン部分を生成することを含んでいる。これに対し、別の実施形態は、２つのカルボニル含有試薬により芳香族アミン部分を、２回還元的アルキル化して、３級アミン部分を生成することを含んでいる。この実施形態におけるカルボニル含有試薬は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。さらに、いくつかの実施形態は、少なくとも２つのカルボニル基を有する試薬により、芳香族アミン部分を１回還元的アルキル化して、２級アミン部分をすることを含んでいる。また、別の実施形態は、少なくとも２つのカルボニル基を有する試薬により、芳香族アミン部分を、２回還元的アルキル化して（二重還元的アルキル化と称される）、環式の第３のアミン部分を生成することを含んでいる。これらの実施形態では、アルデヒド含有試薬は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと還元剤（例えば、シアノホウ化水素ナトリウム）との緩衝液（ｐＨ約４〜約７）へ加えられる。反応は室温において進行し、生じたアルキル化芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されてもよい。これらの実施形態では、カルボニル含有試薬は、天然ポリペプチド、合成ポリマー、ポリサッカライド、ポリヌクレオチドまたは化学合成されたポリペプチドの芳香族アミン含有非天然アミノ酸と、還元剤（例えば、ＮａＢＣＮＨ３、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、およびＮａＢＨ４）との緩衝液（ｐＨ約４〜約７）へ加えられる。反応は室温において進行し、生じたアルキル化された芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【０５４９】
別の実施形態では、複数のリンカー化学物質は、芳香族アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと部位特異的に反応し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるリンカー法は、少なくとも１つのリンカー末端（単官能性、２官能性、または多官能性）に、カルボニル基（アルデヒド基を含む）を含んでいるリンカーを使用する。芳香族アミン含有ポリペプチドと、アルデヒド誘導体化リンカーとの還元的アルキル化は、安定なアミン連結を生成する。また、ヘテロ官能性リンカーとして知られる（例えば、１つ以上の他の連結化学物質を有するアルデヒド）、２官能性リンカーおよび／または多官能性リンカーは、非天然アミノ酸ポリペプチドへの異なる分子（例えば、別のポリペプチド、ポリ核酸、ポリマー、または低分子）の部位特異的な結合を許容する。その一方、ホモ官能性リンカー（例えば、すべての末端がアルデヒドで置換されているリンカー）として知られる１官能性リンカーは、芳香族アミン非天然アミノ酸ポリペプチドの、部位特異的なダイマー化、またはオリゴマー化を容易にする。本明細書に記載されるインビボにおける翻訳技術とこのリンカー技術とを組み合わせることによって、化学合成されたタンパク質の三次元構造を特定することが可能になる。
【０５５０】
‐Ｃ．２つの翻訳後修飾工程を用いて、非天然アミノ酸ポリペプチドを翻訳後修飾する方法：保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸の脱保護した後に、アルデヒド含有非天然アミノ酸と芳香族アミン含有試薬との還元的アミノ化を行う‐
マスクされた求核性側鎖または保護された求核性側鎖を有する非天然アミノ酸を組み込まれたポリペプチドでは、側鎖に対する部位特異的な還元的アミノ化を行うことができる。当該非天然アミノ酸は、マスクされたカルボニル基または保護されたカルボニル基を含んでいる（例えば、マスクされたアルデヒド基を有するアミノ酸、または保護されたアルデヒド基を有するアミノ酸）。これによれば、利用可能なアルデヒド含有側鎖への芳香族アミンの求核付加によって、アルデヒドのマスクされていない部分、または保護されていない部分において、部位特異的な還元的アミノ化が達成される。この還元的アミノ化反応によって、アミン連結（２級アミン連結および３級アミン連結を含む）が生成される。誘導体化方法、および／またはさらなる修飾方法は、還元的アミノ化工程の前または後に精製されている、天然に生成されたポリペプチド、あるいは化学合成ポリペプチドに対して行われ得る。さらに、誘導体化方法、および／またはさらなる修飾方法は、これら修飾法の前または後に精製されればよい合成ポリマー、ポリサッカライド、またはポリヌクレオチドに対して行われ得る。
【０５５１】
一例として、以下に示す非天然アミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれ得るマスクされた／保護されたアルデヒド部分含有アミノ酸の一種である。当該非天然アミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれてから、脱マスク／脱保護され、その後、アルデヒド含有側鎖が還元的アミノ化されることにより、アミン連結が生成する。
【０５５２】
【化７９】
2009519942.tif 000082
（Ｌは、任意であり、存在するときは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｑは、任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−から成る群から選択されるリンカーであり、Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３とＲ４とまたは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲから成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｒ６は、保護されたアルデヒド、またはマスクされたアルデヒドであり、
保護基は、特に限定されないが、
【０５５３】
【化８０】
2009519942.tif 000083
（Ｘ１のそれぞれは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ａｃ）−、および−Ｎ（ＯＭｅ）−から成る群から選択され、；Ｘ２は、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＳＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）（Ａｃ）、−Ｎ（Ｒ）（ＯＭｅ）、またはＮ３であり、Ｒ’およびＲのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）を含んでいる）。当該非天然アミノ酸は塩の形態であってもよいし、あるいは非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、またはポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。また、当該非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれてから、インサイチューでアルデヒド基を形成するように脱保護されることによって翻訳後修飾され、その後、上記アルデヒドが芳香族アミン含有試薬により還元的アミノ化されてもよい。さらに、一般式（Ｅ）の構造を有する非天然アミノ酸は、ポリマーまたはポリヌクレオチドの中に組み込まれ、インサイチューでアルデヒド基を形成するように脱保護されてから、上記アルデヒドが芳香族アミン含有試薬により還元的アミノ化されてもよい。
【０５５４】
一例を挙げると、本明細書に記載される脱マスクされた／脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸と反応する芳香族アミン含有試薬は、以下の構造：
【０５５５】
【化８１】
2009519942.tif 000084
を有する化合物である。ここで、
【０５５６】
【化８２】
2009519942.tif 000085
は、単環式アリール環、二環式アリール環、多環式アリール環、単環式へテロアリール環、二環式へテロアリール環、および多環式へテロアリール環から成る群から選択され；
Ａは、独立してＣＲａまたはＮであり；
Ｂは、独立してＣＲａ、Ｎ、ＯまたはＳであり；
Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３であり、ｎは０、１、２、３、４、５、または６である）
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５は、Ｌ−Ｘであり（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。当該試薬には、以下の構造：
【０５５７】
【化８３】
2009519942.tif 000086
を有する化合物が含まれる。これらの化合物は、（天然または化学合成された）アルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチド、合成ポリマー、ポリサッカライド、またはポリヌクレオチドをさらに修飾するために用いてもよい。
【０５５８】
これらの還元的アミノ化反応は、脱マスク／脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドを、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいる、非天然アミノ酸ポリペプチドに翻訳後修飾する。当該芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの種類としては、脱マスク／脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸のポリペプチド内の位置が、芳香族アミン含有試薬が利用可能なアルデヒド基と反応することが可能であり、且つ、ポリペプチドの三次構造を破壊するような、修飾型非天然アミノ酸を生成することができない位置である限り、実質的に制限されるものではない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる）。
【０５５９】
さらに、アルデヒド部分と芳香族アミン部分との反応は容易であり、当該還元的アミノ化反応は、次の性質のうち少なくとも１つを有する：（ｉ）約４から約７のｐＨ範囲において起こること、（ｉｉ）生物学的環境下で安定なアミン連結を生成すること、（ｉｉｉ）部位特異的であること、（ｉｖ）ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しないこと、（ｖ）室温で迅速に生じること、（ｖｉ）水性環境で迅速に生じること、（ｖｉｉ）芳香族アミン部分を含有する非天然アミノ酸と、アルデヒド含有試薬との比率が、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的であるときに直ちに生じること、および（ｖｉｉｉ）位置選択的および／または位置特異的であること。還元的アミノ化反応の直交性は、位置選択性および／または位置特異性をもたらし、これにより、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド内の他のアミノ酸に影響を及ぼすことなく、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位特異的な翻訳後修飾が可能になる。
【０５６０】
ポリペプチドの脱マスクされたアルデヒド含有非天然アミノ酸、または脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸を、還元的アミノ化する実施形態を、図１８に示す。また、いくつかの実施形態は、芳香族アミン含有試薬によって、ポリペプチドの脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸を、１回還元的アミノ化して、２級アミン部分を生成することを含んでいる。さらに、いくつかの実施形態は、カルボニル含有非天然アミノ酸は、少なくとも２つの脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド基を含み、芳香族アミン含有試薬によって、ポリペプチドの上記カルボニル含有非天然アミノ酸を、還元的アミノ化して、環式の３級アミン部分を生成することを含んでいる。また、別の実施形態は、同一のまたは異なる２つの芳香族アミン含有試薬により、ポリペプチドにおける、少なくとも２つのアルデヒド基を含んでいる脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸を、２回還元的アミノ化して、２つの２級アミン部分を生成することを含んでいる。これらの実施形態では、芳香族アミン含有試薬は、脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドと、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ、Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、ＬｉＡｌＨ４、Ｂ２Ｈ６、ＮａＢＨ４またはＮａＢＣＮＨ３）との緩衝液（ｐＨ約４〜約７）へ加えられる。反応は室温において進行し、生じたアミノ化されたアルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【０５６１】
別の実施形態では、複数のリンカー化学物質は、脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドと部位特異的に反応し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるリンカー法は、少なくとも１つのリンカー末端（１官能性、２官能性、または多官能性）に芳香族アミン基を含んでいるリンカーを使用する。芳香族アミン誘導体化リンカーと、脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド含有ポリペプチドとの還元的アミノ化は、安定なアミン連結を生成する。また、ヘテロ官能性リンカーとして知られる（例えば、１つ以上の他の連結化学物質を有する芳香族アミン）、２官能性リンカーおよび／または多官能性リンカーは、非天然アミノ酸ポリペプチドへの異なる分子（例えば、別のポリペプチド、ポリ核酸、ポリマー、または低分子）の部位特異的な結合を許容する。その一方、ホモ官能性リンカー（例えば、すべての末端が芳香族アミンで置換されている）として知られる１官能性リンカーは、脱マスクまたは脱保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸ポリペプチドの、部位特異的なダイマー化、またはオリゴマー化を容易にする。本明細書に記載されるインビボにおける翻訳技術とこのリンカー技術とを組み合わせることによって、化学合成されたタンパク質の三次元構造を特定することが可能になる。
【０５６２】
‐Ｄ．さらなる機能性基の追加の例：非天然アミノ酸ポリペプチドと結合する高分子ポリマー‐
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾は、本明細書に記載の組成物、方法、技術および戦略を用いてもたらされ得る。これらの修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸組成物へのさらなる機能性基の組み込みを含んでいる。当該機能性基としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物、方法、技術および戦略が、（必要ならば、本明細書の記載から当業者が実現可能な適切な修飾を伴った）他の機能性基（上述した機能性基が含まれるが、これらに限定されない）の追加に適用できるという理解に基づき、本明細書に記載の組成物、方法、技術および戦略の非限定的な例として、以下の説明では、高分子ポリマーを非天然アミノ酸ポリペプチドに追加する方法について述べる。
【０５６３】
多種多様な高分子ポリマーおよび他の分子は、非天然アミノ酸ポリペプチド（または対応する天然アミノ酸ポリペプチド）の生物学的性質を調節するため、および／または非天然アミノ酸ポリペプチド（または対応する天然アミノ酸ポリペプチド）へ新規な生物学的性質を提供するために、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドと結合され得る。これら高分子ポリマーは、非天然アミノ酸、または非天然アミノ酸の任意の機能性置換基、あるいは、非天然アミノ酸に追加された任意の置換基または官能基によって非天然アミノ酸ポリペプチドと連結することが可能である。
【０５６４】
水溶性ポリマーは、（天然または合成の）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライドまたは合成ポリマーに組み込まれる非天然アミノ酸と連結され得る。水溶性ポリマーは、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸、または非天然アミノ酸の任意の官能基または置換基、あるいは非天然アミノ酸に追加された任意の官能基または置換基によって、連結され得る。ある例では、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、水溶性ポリマーと連結される１つ以上の非天然アミノ酸、および水溶性ポリマーと連結される１つ以上の天然アミノ酸を含んでいる。親水性ポリマーと生物活性分子との共有結合は、水溶性の上昇（例えば、生理的環境において）、生物学的利用性、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、または生物活性分子（例えば、タンパク質、ペプチド、および特定の親水性分子）の循環時間の延長を行うための１つの手段であるといえる。当該親水性ポリマーのさらに重要な性質には、例えば生体適合性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如が含まれてもよい。最終生成品の治療上の利用にとって、薬学的に好ましいポリマーが利用され得る。
【０５６５】
親水性ポリマーの例としては、特に限定されないが、ポリアルキルエーテルおよびポリアルキルエーテルのアルコキシキャップ類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレン／プロピレングリコール、および、それらのメトキシキャップまたはエトキシキャップされた類似体が挙げられ、特にポリオキシエチレングリコールが好ましい。また、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られている）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルキルエーテル、ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、ならびにポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよびその誘導体）、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリシアリック酸およびその類似体、親水性ペプチド配列、ポリサッカライドおよびその誘導体（例えば、デキストラン、およびカルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸、アミノデキストランなどのデキストラン誘導体）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース）、キチンおよびその誘導体（例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン）、ヒアルロン酸およびその誘導体、スターチ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、アルブミン、プルランおよびカルボキシメチルプルラン、ポリアミノ酸およびその誘導体（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅｓ））、無水マレイン酸共重合体（例えば：スチレン無水マレイン酸共重合体、ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸共重合体）、ポリビニルアルコール、それらの共重合体、それらの三元重合体、それらの混合物、およびそれらの誘導体が挙げられる。水溶性ポリマーは、特に限定されないが、直線状、分岐鎖状、または分枝状のいずれかの構造形態であればよい。いくつかの実施形態では、約２から約３００までの末端を有する水溶性ポリマーの骨格が、特に有用である。多官能性ポリマー誘導体は、２つの末端のそれぞれが、同一の官能基、または異なる官能基と結合されている直線状のポリマーを含んでいるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。ポリマーの分子量は広い範囲におよぶものであってもよく、特に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間、またはそれ以上の分子量を含む。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａおよび１００Ｄａを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は分枝状のポリマーである。分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの間である。当業者は、実質的な水溶性骨格に関する上述の例示は、決して包括的ではないただの一例にすぎず、また、上記性質を有するすべてのポリマー材料が、本明細書に記載の方法および組成物に利用するのに適しているとして検討されていることを理解するであろう。
【０５６６】
上述したように、親水性ポリマーの一例としては、人工移植において、または毒性および免疫原性のない生体適合性が重要となる他の用途において、薬学的に広範囲に亘って用いられている、ＰＥＧと省略されるポリ（エチレングリコール）である。本明細書に記載されている、ポリマー：ポリペプチドの実施形態では、親水性ポリマーの例としてＰＥＧが用いられるが、当該実施形態では他の親水性ポリマーを同様にしてもよいと理解される。
【０５６７】
ＰＥＧは、市販されている水溶性ポリマー、または当該技術分野において公知の方法（例えば、「Sandler and Karo,Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161」を参照のこと）に従って、エチレングリコールの開環重合によって調製され得る水溶性ポリマーとして公知である。ＰＥＧは、一般的に透明、無色、無臭、水に可溶、熱に対して安定、多くの化学製剤に対して不活性、加水分解または劣化しないものであり、一般的に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性があるとみなされている。すなわち、ＰＥＧは、危害を加えることなく生体組織または有機体と共存できる。より具体的には、ＰＥＧは実質的に免疫原性がなく、このことは、ＰＥＧが生体において免疫応答を引き起こす傾向にはないことを示す。生体において、いくつかの望ましい機能を有する分子（例えば、生物活性剤）とＰＥＧとが結合する場合、ＰＥＧは当該生物活性剤をマスクする傾向にあり、任意の免疫応答を緩和または除去することができるので、生物は上記生物活性剤の存在に耐えることができる。ＰＥＧ接合体は、実質的な免疫応答を引き起こしたり、凝固または他の望ましくない影響をもたらしたりする傾向はない。
【０５６８】
用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧのサイズまたは末端での修飾には関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために、幅広く用いられる。非天然アミノ酸ポリペプチドと連結するようなＰＥＧは、一般式：ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙにより表わされ得る。上記一般式において、ｎは２から１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾（特に限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基を含む）である。用語「ＰＥＧ」は、特に限定されないが、例えば、２官能性ＰＥＧ、マルチアームドＰＥＧ、誘導体化されたＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ（各鎖の分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａである）、垂れ下がった（ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ（例えば、ポリマー骨格へ垂れ下がっている１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連するポリマー）、または分解可能な連結を有するＰＥＧを含んでいる形態のいずれかのポリ（エチレングリコール）を含んでいる。一実施形態では、ｎが約２０〜約２，０００であるＰＥＧは、本明細書に記載の方法および組成物において用いるのに適している。いくつかの実施形態では、水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間、またはそれ以上の広い範囲におよんでもよく、特に限定されない。ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａおよび１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ポリマーである。分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの間である。多様なＰＥＧの分子は、特に限定されないが、「the Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog」に記載されており、本明細書において参照によって組み込まれる。
【０５６９】
この文献における末端官能基の具体的な例は、Ｎ−スクシニミジル炭酸（N- succinimidyl carbonate）（例えば、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、米国特許出願第５，４６８，４７８号明細書を参照のこと）、アミン（例えば、「Buckmannら, Makromol. Chern. 182:1379 (1981)」、「Zalipskyら, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)」を参照のこと）、ヒドラジド（例えば、「Andreszら, Makromol. Chem. 179:301 (1978)」を参照のこと）、スクシニミジルプロピオン酸（succinimidyl propionate）およびスクシニミジルブタン酸（succinimidyl butanoate)(例えば、「Olsonら, in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181 , Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997」、米国特許出願第５，６７２，６６２号明細書を参照のこと）、スクシニミジルコハク酸（例えば、「Abuchowskiら, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)」および「Joppichら, Makromol. Chem. 180:1381 (1979)」）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許出願第４，６７０，４１７号明細書を参照のこと）、ベンゾトリアゾール炭酸（benzotriazole carbonate）（例えば、米国特許出願第５，６５０，２３４号明細書を参照のこと）、グリシジルエーテル（例えば、「Pithaら, Eur. J Biochem. 94:11 (1979)」、「Ellingら, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)」を参照のこと）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、「Beauchampら, Anal. Biochem. 131 :25 (1983)」、「Tondelliら, J. Controlled Release 1:251 (1985)」を参照のこと）、ｐ−ニトロフェニル炭酸（例えば、「Veroneseら, Appl.Biochem. Biotech., 11 : 141 (1985)」：および「Sartoreら, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)」を参照のこと）、アルデヒド（例えば、「Harrisら, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)」、米国特許出願第５，８２４，７８４号明細書、米国特許出願第５，２５２，７１４号明細書を参照のこと）、マレイミド（例えば、「Goodsonら, Bio/Technology 8:343 (1990)」、「Romaniら, in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)」、および「Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)」を参照のこと）、オルトピリジルジスルフィド（例えば、「Woghirenら, Bioconj. Chem. 4:314(1993)」を参照のこと）、アクリロール（acrylol）（例えば、「Sawhneyら, Macromolecules, 26:581 (1993)」を参照のこと）、ビニルスルフォン（例えば、米国特許出願第５，９００，４６１号明細書を参照のこと）が挙げられる。上記参考文献および特許文献はすべて本明細書中に参考によって組み込まれる。
【０５７０】
ある場合には、ＰＥＧの末端の１つは、ヒドロキシまたはメトキシを有して終結している。すなわち、ＸはＨあるいはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。別の場合では、ＰＥＧの末端の１つは反応性基を有して終結していてもよい。これにより、２官能性ポリマーを形成する。一般的な反応性基は、（１）２０の一般アミノ酸において見られる官能基（例えば、マレイミド基、活性型炭酸塩（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル）、活性型エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ｐ−ニトロフェニルエステル）、およびアルデヒド）と反応するために通常用いられる反応性基、ならびに、（２）２０の一般アミノ酸に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に存在する相補的な官能基（例えば、芳香族アミン基）と特異的に反応する官能基と反応するために通常用いられる反応性基を含むことができる。
【０５７１】
なお、上記一般式においてＹとして示されるＰＥＧのもう一方の末端は、非天然アミノ酸によって、ポリペプチド（合成または天然）、ポリヌクレオチド、ポリサッカライド、または合成ポリマーと、直接的または間接的に接着する。Ｙがアルデヒド基である場合、アルデヒド含有ＰＥＧ試薬は、ポリペプチド内の芳香族アミン含有非天然アミノ酸と反応して、アミン連結によってポリペプチドと連結されるＰＥＧ基を形成することができる。適切な反応条件、精製方法、および精製試薬としては、例えば、本明細書中および添付の図３５において記載される。図３５は、ペプチドに組み込まれているアミノ酸の芳香族アミン部分の還元的アルキル化に基づく、Ｎ−末端のＰＥＧ化とＰＥＧ化との比較を示す概略図である。この図は、天然ペプチドのＰＥＧ化に使用された反応条件では、当該ＰＥＧ化は、末端アミンにおいてのみ容易に達成されるのに対し、芳香族部分を含んでいる非天然アミノ酸が組み込まれている非天然ペプチドのＰＥＧ化に使用された反応条件では、当該ＰＥＧ化は、プロトン化された末端アミンにおいて任意の反応が起こることなく、非天然アミノ酸が配列に組み込まれている部分において達成され得ることを示している。ＰＥＧ化される部位は、芳香族アミン部分を含有する非天然アミノ酸が組み込まれている部分に依存する。当該部位は、末端部位であってもよく、またペプチド配列内のどの部位であってもよい。
【０５７２】
本明細書に記載の組成物、方法、技術および戦略とともに用いら得る、ＰＥＧ試薬の種類または分類の一例として、図３６には、芳香族アミン含有非アミノ酸ポリペプチドと反応して、アミン連結によってＰＥＧ基と連結される非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することができる、アルデヒド含有ＰＥＧ試薬の例を示すが、これに限定されない。また、図３６は、芳香族アミン含有非アミノ酸ポリペプチドと反応してＰＥＧ基と連結される非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することができる、分枝状アルデヒド含有ＰＥＧ試薬を示す。
【０５７３】
また、異なる分子とＰＥＧポリマーの各末端とを接着することが望ましいとき、ヘテロ２官能性誘導体が特に有用である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの１つの末端は、ＰＥＧとペプチドとの間にアミン連結を形成するために、非天然アミノ酸に存在する芳香族アミン基と反応し得るアルデヒド部分を含んでいるのに対し、ＰＥＧのもう一方の末端は、適切な薬剤による処理によって、さらなる反応を受けることのある別の機能性基を含んでいる。当該機能性基には、様々な求電子試薬（例えば、カルボニル含有試薬）に対して求核試薬として作用し得るアミン基が含まれ得る。
【０５７４】
このように、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、非天然アミノ酸の側鎖によって、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））と連結される。本明細書に記載される非天然アミノ酸の方法および非天然アミノ酸組成物は、ＰＥＧ誘導体によりタンパク質を選択的修飾するための極めて効率的な方法を提供する。この効率的な方法は、
セレクターコドンに応じてタンパク質へ非天然アミノ酸を選択的に組み込み、その後に、適切な反応性ＰＥＧ誘導体により、上記非天然アミノ酸を修飾する工程を含んでいる。なお、上記非天然アミノ酸には、特に限定されないが、２０の天然に組み込まれるアミノ酸には見られない官能基または置換基を含んでいるアミノ酸が含まれる）。様々な公知の化学的手順は、タンパク質に水溶性ポリマーを組み込むために、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の方法および非天然アミノ酸組成物とともに利用するのに適している。
【０５７５】
ポリマー骨格は、直線状または分枝状であってもよい。分枝状ポリマー骨格は当該分野において一般的に知られている。通常、分枝状ポリマーは分枝の中心となるコア部分（中心枝コア部分）、および、当該コア部分と連結される複数個の直線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、様々なポリオール（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）へエチレンオキシドを付加することにより調製され得る、分枝形態において用いられる。上記コア部分は、いくつかのアミノ酸（例えばリジン）から生じることもできる。分枝状ポリ（エチレングリコール）を、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍという一般式で表わすことができる。ここで、Ｒはコア部分（例えばグリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトール）に由来し、ｍは枝の数を表わす。例えば、その全体を本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許出願第５，９３２，４６２号明細書、米国特許出願第５，６４３，５７５号明細書、米国特許出願第５，２２９，４９０号明細書、米国特許出願第４，２８９，８７２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、および国際公開第９３／２１２５９号パンフレットに記載されている、マルチアームドＰＥＧ分子を、ポリマー骨格として用いることが可能である。
【０５７６】
また、分枝状ＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎで表わされる分岐状ＰＥＧの形態で存在することができる。ここで、Ｙは連結基であり、Ｚは規定の長さの原子鎖によってＣＨと連結される、活性化された末端基である。さらに、別の分枝形態であるペンダント型のＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端よりもむしろＰＥＧ骨格に沿って、反応性基（例えば、カルボキシル）を有する。図３６は、本明細書に記載の方法に利用される、分枝状のアルデヒド含有ＰＥＧ試薬の例を示すが、これに限定されない。
【０５７７】
また、これらＰＥＧの形態に加えて、弱い連結または分解可能な連結を骨格に有するポリマーを調製することができる。例えば、加水分解の影響を受けるエステル連結をポリマー骨格に有するＰＥＧを調製することができる。以下に示すように、この加水分解の結果、ポリマーが開裂されて、低分子量の断片が生じる：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−  ＋  Ｈ２Ｏ  →  ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ  ＋  ＨＯ−ＰＥＧ−
用語「ポリ（エチレングリコール）」または「ＰＥＧ」には、特に限定されないが、本明細書において開示される技術として知られるすべての形態を表わし、あるいは含んでいるということが当業者に理解される。ポリマーの分子量は、広範囲におよんでいてもよく、特に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、またはそれ以上の分子量を含む。ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａであってもよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。
【０５７８】
ＰＥＧの望ましい特性を最大限にするために、ＰＥＧポリマーまたは生物活性分子と接着されるポリマーの、全分子量および水和状態は、ＰＥＧポリマー結合と特に関連のある有利な性質（例えば、上昇された水溶性、および増加された循環半減期）を与えるために、十分に高くなければならず、さらにもとの分子の生物活性に悪影響を及ぼすことのない必要がある。
【０５７９】
本明細書に記載の方法および組成物は、実質的に均質なポリマー：タンパク質接合体分子を生成するために使用され得る。ここで用いられる、「実質的に均質」とは、ポリマー：タンパク質接合体分子が、全タンパク質のうち半分よりも多くあるように観察される、ということを意味する。このポリマー：タンパク質接合体は生物活性を有しており、本明細書において提供される、本明細書における「実質的に均質」ＰＥＧ化ポリペプチド調製物は、均質な調製物の利点（例えば、例えば、臨床適用の際に、ロット間の薬物動態を容易に予測できること）を十分示すほど均質なものである。
【０５８０】
また、当業者は、ポリマー：タンパク質接合体の混合物を調製することを選択してもよい。このとき、本明細書において提供される利点としては、混合物に包含させるために、モノポリマー：タンパク質接合体の比率が選択され得ることである。このように、必要に応じて、当業者は、様々な数（すなわち２、３、４など）のポリマー部分が接着されている様々なタンパク質の混合物を調製し、上記接合体と本明細書に記載の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質接合体とを組み合わせて、モノ−ポリマー：タンパク質接合体を所定の割合で有する混合物を得てもよい。
【０５８１】
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子との比は、反応混合物におけるこれらの濃度と同様に、変えてもよい。一般的に、最適比（余分な未反応のタンパク質またはポリマーを最小限にする、という反応効率の観点における）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量、および利用可能な反応性基の有効な数によって決定すればよい。分子量に関して言えば、一般にポリマーの分子量が大きくなるほど、タンパク質と結合され得るポリマー分子の数は少なくなる。また、これらのパラメーターを最適にする場合に、枝分かれしているポリマーを考慮すべきである。一般的に、分子量が大きくなるにつれ（または、枝分かれが多くなるにつれ）、ポリマー：タンパク質比は大きくなる。
【０５８２】
本明細書において使用されるような、疎水性ポリマー：ポリペプチド／タンパク質接合体を熟慮する場合、「治療的有効量」の項では、患者に対して望ましい効果を与える量についてさらに言及する。この有効量は人によって異なり、要因（例えば、全般的な患者の身体条件および治療に当たっての基礎条件）の数に依存する。現行の組成物の治療的有効量は、市販の材料および公知の方法を用いて、当業者に容易に確認され得る。
【０５８３】
本明細書に記載されている、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、または非修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドと連結される水溶性ポリマーの数（すなわちＰＥＧ化またはグリコシル化の程度）は、薬理特性、薬理動態特性、または薬効特性（例えば、インビボにおける半減期）の変化をもたらす（特に限定されないが、増加または減少）ように調節することができる。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドの半減期は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント増加し、非修飾型ポリペプチドの２倍、５倍、１０倍、５０倍、または少なくとも１００倍以上、増加する。
【０５８４】
いくつかの実施形態では、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、ＰＥＧ骨格と直接連結される末端アルデヒド部分を含んでいる、ＰＥＧ誘導体によって修飾される。別の実施形態では、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、末端アルデヒド部分を含んでいる分枝状ＰＥＧ誘導体によって修飾される。当該分枝状ＰＥＧ誘導体の各鎖は、約１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有しており、別の実施形態では、この分子量は約５〜２０ｋＤａの範囲である。
【０５８５】
いくつかの実施形態では、アルデヒド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｈ
ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（例えば、平均分子量は５〜４０ｋＤａ）である。ポリマーの分子量は広範囲であってよく、特に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、またはそれ以上であってもよい。ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲内であればよく、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。
【０５８６】
別の実施形態では、芳香族アミンアミノ酸を含有しているポリペプチドは、末端アルデヒド部分を含んでいる分枝状ＰＥＧ誘導体によって修飾され、これによって、アミン連結が生じる。当該分枝状ＰＥＧ誘導体の各鎖は、約１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有している（別の実施形態では、ＭＷは約５〜２０ｋＤａの範囲である）。分枝鎖状ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであればよく、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａである。
【０５８７】
ＰＥＧの機能性化およびＰＥＧの接合体について、いくつかの考察およびモノグラフが得られる。例えば、「Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985)」、「Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)」、「Wongら, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992)」、「Delgadoら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)」、「Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)」を参照のこと。
【０５８８】
また、ポリマーの活性化法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許出願第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許出願第５，２１９，５６４号明細書、米国特許出願第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号パンフレットから入手可能であり、これらは活性化されたポリマーと酵素（特に限定されないが、結合因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素輸送分子（米国特許出願第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（「Veroneseら, App. Biochem. Biotech. 11 : 141-52 (1985)」））との接合に関するものである。これらは、本明細書においてその全体が参照によって組み込まれる。
【０５８９】
必要ならば、疎水性クロマトグラフィーにより得られた、本明細書に記載されているＰＥＧ化された非天然アミノ酸は、当該技術分野における当業者に周知である１つ以上の方法によってさらに精製され得る。そのような手段としては特に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE SEPHAROSEを用いる）、シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（特に限定されないが、SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられる）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（特に限定されないが、例えば調整用の等電点電気泳動法を含む）；差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、または抽出が挙げられる。見かけの分子量は、球形タンパク質基準との比較によるＧＰＣを用いて算出されてもよい（「Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.)IRL Press 1989, 293-306」）。非天然アミノ酸ポリペプチド：ＰＥＧ接合体の純度は、タンパク質分解（トリプシン開裂を含むが限定されない）を行った後に、質量分析をすることによって評価できる。「Pepinsky RBら, J. Pharmcol & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)」。
【０５９０】
末端アミン部分の還元的アルキル化による天然ポリペプチドのＰＥＧ化は、非天然アミノ酸における芳香族アミン部分のＰＥＧ化に要される時間よりも、さらに時間がかかる。また、非天然アミノ酸におけるＰＥＧ化法は部位特異的であり、非天然アミノ酸が組み込まれているポリペプチドのどの部位でも起こり得る。図３７は、約５０％のＰＥＧ化をするために、ｐＨ５において少なくとも２時間を要する、化学量論的またはほぼ化学量論的な比率を用いる、ペプチドＭＴ−９の末端アミンのＰＥＧ化を示す。比較として、図３８には、芳香族アミン部分を含有するアミノ酸（特に限定されないが、ｐＡＦ２（ｐ−アミノ−フェニルアラニン）が挙げられる）を含んでいるペプチドのＰＥＧ化の例を示すが、これに限定されない。図３８におけるＭＴ−９は、ｐＨ４で約１時間反応させた後に、化学量論的またはほぼ化学量論的な比率において、２０ｋＰＥＧアルデヒドまたは４０ｋＰＥＧアルデヒドによって、ほぼ完全にＰＥＧ化される。
【０５９１】
これは、芳香族アミン部分を含有するアミノ酸の還元的アルキル化を用いた、ＰＥＧ化有益な特性を実証している。この特性としては、例えば、選択性（芳香族アミン含有アミノ酸でのみのＰＥＧ化）、高速の反応時間（１２時間に対して約１時間）、過剰なＰＥＧアルデヒド試薬よりも、むしろ化学量論的またはほぼ化学量論的な比率（したがって、より少ない試薬を用いる）、および特異的（Ｎ−末端のみのＰＥＧ化に対して、芳香族アミン部分含有アミノ酸の還元的アルキル化によるＰＥＧ化は、ペプチド配列のどこでも起こり得る）を含む。
【０５９２】
図３９は、ｈＧＨ（「ヒト成長ホルモン」）のＰＥＧ化の例を示すが、これに限定されない。この図において、ｈＧＨタンパク質の３５位のチロシン残基は、芳香族アミン部分含有アミノ酸（特に限定されないが、ｐＡＦ２（ｐ−アミノ−フェニルアラニン）を含む）と翻訳によって置き換えられており、それから、アルデヒド部分含有ＰＥＧによって還元的アルキル化される。また、図３９は、ＩＦＮαのＰＥＧ化の例を示すが、これに限定されない。この図において、芳香族アミン部分含有アミノ酸（特に限定されないがｐＡＦ２を含む）は、ＩＦＮα配列に組み込まれ、続いてアルデヒド部分を含有する分枝鎖状ＰＥＧによって還元的アルキル化される。
【０５９３】
本明細書に記載されているポリペプチドの非天然アミノ酸と連結される水溶性ポリマーは、制限無く、さらに誘導体化または置換されてもよい。
【０５９４】
‐Ｅ．部位特異的誘導体化を用いた修飾の他の例‐
図２０〜３４には、ポリペプチド／タンパク質の選択的、部位特異的な誘導体化の例を示すが、これに限定されない。この図において、芳香族アミン部分（ｐＡＦ２（ｐ−アミノ−フェニルアラニン）を含むが限定されない）の還元的アルキル化は、他の側鎖基（例えばリジン）、またはいずれかの末端基の誘導体化よりも優先的に生じる。この選択的、部位特異的な誘導体化は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、ポリペプチド／タンパク質の特異的ＰＥＧ化、プロドラッグ設計、ポリペプチド／タンパク質グリコシル化、ポリペプチド／タンパク質ダイマー化、ポリペプチド／タンパク質の低分子薬剤接合体、および抗体の低分子薬剤接合体を設計するようにポリペプチド／タンパク質を修飾することができる。
【０５９５】
‐Ｆ．血清アルブミンの親和性の増強‐
また、様々な分子が、血中半減期を調節するために、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに融合され得る。いくつかの実施形態では、分子は、動物において内因性血清アルブミンの親和性を高めるために、本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドと連結、あるいは融合させられる。
【０５９６】
例えば、ある場合には、ポリペプチドとアルブミン結合配列との組み換え融合体が作製される。一般的なアルブミン結合配列としては、例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇから得られるアルブミン結合ドメイン（「Makridesら,J. Pharmacol. Exp. Ther 277:534-542 (1996)」および「Sjolanderら,J, Immunol. Methods 201 :115-123 (1997)」を参照）が挙げられ、またアルブミン結合ペプチドは、例えば、「Dennisら, J. Biol. Chem. 277:35035-35043(2002)」に記載されているペプチドを含む。
【０５９７】
別の実施形態では、本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、脂肪酸によってアシル化される。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、「Kurtzhals,ら, Biochem. J. 312:725-731 (1995)」を参照のこと。
【０５９８】
別の実施形態では、本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンを含むが、これに限定されない）と直接融合される。血清アルブミンまたは別の血清要素との結合を調節するために、多種多様な他の分子は、本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドと連結され得ることを、当業者は理解する。
【０５９９】
‐Ｇ．本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのグリコシル化‐
本明細書に記載の方法および組成物は、サッカライド残基を有する、１つ以上の非天然アミノ酸を組み込んでいるポリペプチドを含んでいる。サッカライド残基は、天然（Ｎ−アセチルグルコサミンを含むが、限定されない）または非天然（３−フルオロガラクトシダーゼを含むが、限定されない）のどちらであってもよい。サッカライドは、Ｎ−連結されたグリコシド連結、またはＯ−連結されたグリコシド連結（特に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリン）、あるいは非天然連結（特に限定されないが、複素環（例えば、窒素含有複素環、Ｃ−連結されたグリコシドまたはＳ−連結されたグリコシドの連結、あるいはこれに相当するもの））のどちらかによって非天然アミノ酸ポリペプチドと連結されてもよい。
【０６００】
サッカライド（例えば、グリコシル）部分は、インビボまたはインビトロのどちらかで非天然アミノ酸ポリペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態では、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、アルデヒド基により誘導体化されたサッカライドによって修飾され、アミン連結によって連結される、対応するグリコシル化されたポリペプチドが生成する。別の実施形態では、保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸は、脱保護されると、芳香族アミン基により誘導体化されたサッカライドによって修飾され、アミン連結によって連結される、対応するグリコシル化されたポリペプチドが生成する。非天然アミノ酸と結合させてから、非天然アミノ酸ポリペプチドとのオリゴサッカライド結合を生成するように、グリコシルトランスフェラーゼまたは他の酵素による処理によって、サッカライドをさらに変化させてもよい。例えば、「H. Liuら. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)」を参照のこと。
【０６０１】
‐Ｈ．連結基の使用と、ポリペプチドのダイマーおよびマルチマーなどへの適用‐
非天然アミノ酸ポリペプチドへ直接的に機能性基を付加することに加えて、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分は、まず多官能性（例えば、２官能性、３官能性、４官能性）リンカー分子によって修飾されればよく、それから、さらに修飾される。すなわち、少なくとも１つの多官能性リンカー分子の末端は、ポリペプチドにおいて少なくとも１つの非天然アミノ酸と反応性を示し、少なくとも１つの多官能性リンカーのもう一方の末端は、さらなる官能基化に利用できる。多官能性リンカーのすべての末端が同一であるならば、結果として、非天然アミノ酸ポリペプチドのホモマルチマーが形成され得る（化学量論条件に依存している）。多官能性リンカーの末端が異なる化学反応性を有するのであれば、結果として、少なくとも１つの多官能性リンカー基の末端は、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合し、当該リンカー基のもう一方の末端は、以下の異なる機能性基と続けて反応し得る：例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。
【０６０２】
多官能性リンカー基は、次の一般構造を有する：
【０６０３】
【化８４】
2009519942.tif 000087
（Ｘのそれぞれは、アルデヒドまたは芳香族アミンであり；
Ｌのそれぞれは、独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群より選択され、Ｒ’は独立してＨ、アルキル、置換アルキルであり；
Ｌ１は任意であり、存在する場合には−Ｃ（Ｒ’）ｐＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−であり（ｐは０、１、または２である）；
Ｗはアルデヒドまたは芳香族アミンであり；、ｎは１〜３である）。
【０６０４】
また、本明細書に記載の方法および組成物は、ポリペプチドの組み合わせ（例えば、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマー（例えば、トリマー、テトラマーなど））を提供する。一例として、以下の説明では、ＧＨスーパーファミリーメンバーを中心に進める。しかしながら、この項に記載される方法、技術および組成物は、ダイマーおよびマルチマーの形態において利益をもたらし得る、他の任意のポリペプチドにも、事実上適用され得る。なお、他の任意のポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受��体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンが挙げられる。
【０６０５】
したがって、本明細書に記載の方法、技術、および組成物に包含されるのは、ポリペプチド骨格と直接的に、またはリンカーを介して、別のＧＨスーパーファミリーメンバーまたはそのバリアント、あるいは非ＧＨスーパーファミリーメンバーである他のポリペプチドまたはそのバリアントと結合する、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドである。モノマーと比較して分子量が増加するために、ＧＨスーパーファミリーメンバーのダイマー接合体またはマルチマー接合体は、新規な、あるいは望ましい性質を示す。当該性質には、例えば、モノマーのＧＨスーパーファミリーと比べて、異なる薬理学的性質、薬物動態学的性質、または薬力学的性質、あるいは、調節された治療半減期、または調節された血しょう半減期が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、ＧＨスーパーファミリーメンバーのダイマーは、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体のダイマー化を調節する。別の実施形態では、本明細書に記載されているＧＨスーパーファミリーメンバーのダイマーまたはマルチマーは、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体アンタゴニスト、アゴニスト、あるいは調節因子として作用し得る。
【０６０６】
いくつかの実施形態では、ＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドは、例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド連結またはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド連結を介して、直接的に連結される。いくつかの実施形態では、連結されたＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド、および／または、連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、ダイマーを促進するために、異なる非天然アミノ酸を含んでいる。例えば、特に限定されないが、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドである、第１のＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または、連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、アルデヒド含有非天然アミノ酸を含んでいる、第２のＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドと接合されており、これらポリペプチドを還元的アルキル化によって反応させることにより、この２つのポリペプチドの間にアミン連結が形成される。
【０６０７】
別の方法では、２つのＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、リンカーを介して連結される。ヘテロ２官能性リンカーまたはホモ２官能性リンカーは、同一の一次配列または異なる一次配列を有し得る、２つのＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーのポリペプチドを連結するために用いることができる。ある場合において、ＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーのポリペプチドをつなぐために用いられているリンカーは、２官能性ＰＥＧ試薬であってもよい。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、アレイ型構造を有する水溶性２官能性リンカーを提供するものである。当該アレイ型構造は：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端にアルデヒド含有部分、および、ｂ）ポリマー骨格の第２の末端に少なくとも第２の官能基を含んでいる。第２の官能基は、第１の官能基と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第２の官能基は第１の官能基と反応しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、少なくとも１つの枝を有する分枝状分子構造を含んでいる水溶性組成物である。例えば、分枝状分子構造は、樹状である可能性もある。
【０６０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、以下の構造を有する水溶性活性化ポリマーとの反応によって形成される、１つ以上のＧＨスーパーファミリーメンバー含んでいるマルチマーを提供する：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
ここで、ｎは約５〜約３，０００であり、ｍは２〜１０、Ｘはカルボニル（アルデヒドを含む）含有部分であり得る。また、Ｒはキャッピング基、官能基、あるいは脱離基であり、Ｘのように同一であってもよいし、または異なっていてもよい。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾールエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボン酸、１−ベンゾトリアゾールカルボン酸、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリル酸、メタクリル樹脂、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン（ｄｉｏｎｅｓ）、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ならびにケトンから成る群から選択される官能基である。
【０６１０】
‐Ｉ．機能性基を付加する例：ポリペプチドの単離性の簡単化‐
天然または非天然アミノ酸ポリペプチドは、多くの原因（例えば、ポリペプチドの溶解性または結合性）のために試料から単離することが困難なこともあり得る。例えば、治療に使用するためにポリペプチドを調製するとき、当該ポリペプチドは、ポリペプチドを過剰生産するように設計されている組み換え機構から単離されてもよい。しかしながら、ポリペプチドの溶解性または結合特性のために、望ましい水準の純度に達することは、しばしば困難であると分かる。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および戦略は、この問題への解決策を提供する。
【０６１１】
本明細書に記載されている方法、組成物、技術および戦略を用いて、当業者の１人は、所望のポリペプチドと相同なアルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成し得る。ここで、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、改良された単離特性を有する。いくつかの実施形態では、同質な非天然アミノ酸ポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている、１つの非天然アミノ酸の構造に組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部に組み込まれ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０６１２】
いくつかの実施形態では、生合成的に生成されるとき、生じた非天然アミノ酸は、すでに望ましい改良された単離特性を有する。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、改良された単離特性をもたらす基とのアミン連結を含んでいる。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために、さらに修飾される。ここで、当該修飾は改良された単離特性をもたらす基とのアミン連結を提供する。いくつかの実施形態では、当該基は非天然アミノ酸と直接連結し、別の実施形態では当該基は、非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。いくつかの実施形態では、当該基は１つの化学反応によって非天然のアミノ酸と連結され、別の実施形態では、一連の化学反応は、当該基と非天然アミノ酸とを連結するために必要とされる。好ましくは、改良された単離特性をもたらす基は、非天然アミノ酸ポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０６１３】
さらなる実施形態では、生じた非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、改良された単離特性から利益を得ることのできるのであれば、実質的にどのポリペプチドにも適用できる。そのようなポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキ���ン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンを含む。
【０６１４】
さらなる実施形態では、改良された単離特性をもたらす基は、ポリペプチドの水溶性を改良し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドの結合特性を改良し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドへの新たな結合特性を提供する（単なる一例として、ビオチン基またはビオチン結合基を含むが限定されない）。当該基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態では、この基は本明細書に記載されている水溶性ポリマー（例えば、本明細書に記載されているＰＥＧポリマー群のいずれか）から選択される。
【０６１５】
‐Ｊ．機能性基を付加する例：ポリペプチドの存在の検出‐
天然または非天然アミノ酸ポリペプチドは、いくつかの原因（例えば、ポリペプチドと迅速に結合し得る試薬または標識の不足）のために、試料（インビボの試料、およびインビトロの試料を含む）において検出することが難しいこともある。本明細書に記載されている方法、組成物、技術、および戦略は、この状況への解決策を提供する。
【０６１６】
本明細書に記載の方法、組成物、技術、および戦略を用いて、当業者の１人は、所望のポリペプチドと相同なアルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成し得る。ここで、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、インビボの試料、およびインビトロの試料中の上記ポリペプチドの検出が可能である。いくつかの実施形態では、相同な非天然アミノ酸ポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の１つの構造に組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部に組み込まれ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０６１７】
いくつかの実施形態では、生合成的に生成したとき、生じた非天然アミノ酸は、すでに望ましい検出特性を有している。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は改良された検出特性をもたらす基とのアミン連結を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するためにさらに修飾される。ここで、当該修飾は、改良された検出特性をもたらす基とのアミン連結を提供する。いくつかの実施形態では、当該基は、非天然アミノ酸と直接連結され、また別の実施形態では当該基は、非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。いくつかの実施形態では、当該基は１つの化学反応によって非天然アミノ酸と連結され、別の実施形態では、一連の化学反応は当該基と非天然アミノ酸とを連結するために必要とされる。好ましくは、改良された検出特性をもたらす基は、非天然アミノ酸ポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０６１８】
さらなる実施形態では、生じた非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、インビボの試料、およびインビトロの試料において検出される必要のある、他のどのポリペプチドにも実質的に適用できる。そのようなポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球���性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンが挙げられる。
【０６１９】
さらなる実施形態では、改良された検出特性をもたらす基は、標識、色素、親和性標識、光親和性標識、スピン標識、蛍光団、放射性部分、重原子を組み込んでいる部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、発色団、エネルギー伝達剤、検出可能な標識、および上記のあらゆる組み合わせから成る群から選択される。
【０６２０】
‐Ｋ．機能性基を付加する例：ポリペプチドの薬効性の改善‐
天然または非天然アミノ酸は、特定の疾患、疾病または病気を発症している患者に対して、いくらかの治療効果をもたらし得る。この治療効果は、様々な要因に依存し得るものであり、例えば：ポリペプチドの安全プロフィール、ならびにポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質、および／または薬力学的性質（例えば、水溶性、生物学的利用性、血中半減期、薬学的半減期、免疫原性、生物活性、または循環時間）が挙げられる。さらに、ポリペプチドに機能性基の付加を提供すること（例えば、細胞毒性化合物または薬剤の結合）は、有効であり、また、本明細書に記載されているホモマルチマーおよびヘテロマルチマーを形成するために、さらなるポリペプチドと結合することが望ましいこともある。この修飾は、元のペプチドの活性および／または三次構造を破壊するものではないことが好ましい。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および戦略は、これらの問題に対する解決策を提供する。
【０６２１】
本明細書に記載の方法、組成物、技術、および戦略を用いて、当業者の１人は、所望のポリペプチドと相同なアルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成し得る。ここで、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、改良された治療特性を有する。いくつかの実施形態では、同質な非天然アミノ酸ポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の１つのコンストラクトに組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部位置において組み込まれ、且つ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０６２２】
いくつかの実施形態では、生合成的に生成するとき、生じた非天然アミノ酸は、すでに望ましい治療特性を有する。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は改良された治療特性をもたらす基とのアミン連結を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するためにさらに修飾される。ここで、当該修飾は、改良された治療特性をもたらす基とのアミン連結を提供する。いくつかの実施形態では、当該基は、非天然アミノ酸と直接連結され、また別の実施形態では当該基は、非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。いくつかの実施形態では、当該基は１つの化学反応によって非天然アミノ酸と連結され、別の実施形態では、一連の化学反応は当該基と非天然アミノ酸とを連結するために必要とされる。好ましくは、改良された治療特性をもたらす基は、非天然アミノ酸ポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０６２３】
さらなる実施形態では、生じた非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、改良された治療特性から利益を得ることのできるのであれば、実質的にどのポリペプチドにも適用できる。そのようなポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキ���ン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンが挙げられる。
【０６２４】
さらなる実施形態では、改良された治療特性をもたらす基は、ポリペプチドの水溶性を改良し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドの結合特性を改良し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドへの新たな結合特性を提供する（単なる一例として、ビオチン基またはビオチン結合基を含むが限定されない）。当該基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態では、この基は本明細書に記載されている水溶性ポリマー（例えば、本明細書に記載されているＰＥＧポリマー基のいずれか）から選択される。さらなる実施形態では、当該基は細胞毒性化合物であり、別の実施形態では、当該基は薬剤である。さらなる実施形態では、連結された薬剤または細胞毒性化合物は、目的とする治療位置へ薬剤または細胞毒性化合物を輸送するために、非天然アミノ酸ポリペプチドから開裂され得る。別の実施形態では、この基は、第２のポリペプチドである（例えば、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドであり、さらに言えば、例えば第１の非天然アミノ酸ポリペプチドと同一のアミノ酸構造を有するポリペプチドである）。
【０６２５】
さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、修飾されたアルキル化アミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの生物学的利用性が向上している。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの安全プロフィールが向上している。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの水溶性が向上している。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの治療半減期が増加している。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの血中半減期が増加している。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの循環時間が延長している。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの生物活性が調節されている。さらなる実施形態では、アルキル化されたアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同な天然アミノ酸ポリペプチドに対して、ポリペプチドの免疫原性が調節されている。
【０６２６】
＜ＸＩ．修飾型ポリペプチドの治療上の利用＞
便宜上、この項に記載されている「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドは、一般的に、および／または特定の例を伴って説明されている。しかしながら、この項に記載されている「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドは、この項において提供される一般的な説明または特定の例のみに限定されるものではない。むしろこの項に記載の「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドは、一般式（Ａ）−（Ｅ）および（Ｉ）−（ＸＶＩ）の範囲内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含んでいる、すべての「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドに対して等しく適用される。例えば、一般式（Ａ）−（Ｅ）および（Ｉ）−（ＸＶＩ）の範囲内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸には、本明細書、特許請求の範囲及び図面に記載の一般式（Ａ）−（Ｅ）および（Ｉ）−（ＸＶＩ）の範囲内に含まれる、あらゆる下位の一般式または特定の化合物が挙げられる。
【０６２７】
本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチド（そのホモマルチマーおよびヘテロマルチマーを含む）は、多様な利用が見出されており、特に限定されないが：治療上の使用、診断上の利用、分析を基にした利用、工業的利用、化粧品利用、植物生物学上の利用、環境利用、エネルギー生産利用、および／または軍事利用を含む。以下に、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの治療上の利用における例を提供するが、これに限定されない。
【０６２８】
本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、疾患、疾病または病気という広い範囲の治療に有効である。本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチド生成物を投与した結果、ヒトにおいて市販されているポリペプチド調製物によって実証された活性の何れか１つが得られる。修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチド生成物の平均量は変更してもよく、特に医師の推奨および指示に従うべきである。修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチド生成物の的確な量は、治療される病気の正確な症例、治療している患者の健康状態、および組成物に含まれる他の含有成分などの要因に、優先的に従う事項である。投与量は、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドによる治療に基づき、当業者の１人によって容易に決定され得る。
【０６２９】
（Ａ．投与および薬学的組成物）
本明細書に記載の「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチド（そのホモマルチマーおよびヘテロマルチマーを含む）は、多様な利用が見出されており、特に限定されないが：治療上の使用、診断上の利用、分析を基にした利用、工業的利用、化粧品利用、植物生物学上の利用、環境利用、エネルギー生産利用、および／または軍事利用を含む。以下に、「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドの治療上の利用における例を提供するが、これに限定されない。
【０６３０】
本明細書に記載の「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドは、疾患、疾病または病気という広い範囲の治療に有効である。本明細書に記載の「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物を投与した結果、ヒトにおいて市販されているポリペプチド調製物によって実証された活性の何れか１つが得られる。「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物の平均量は変更してもよく、特に医師の推奨および指示に従うべきである。「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物の的確な量は、治療される病気の正確な症例、治療している患者の健康状態、および組成物に含まれる他の含有成分などの要因に、優先的に従う事項である。投与量は、「修飾型または非修飾型の」非天然アミノ酸ポリペプチドによる治療に基づき、当業者の１人によって容易に決定され得る。
【０６３１】
本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチド（特に限定されないが、シンテターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質など）は、治療上の利用のために任意で使用され、特に限定されないが、適切な薬学的担体と組み合わせて用いられる。当該組成物は、例えば、本明細書に記載されているような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの治療上の有効量、および薬学的に許容可能な担体あるいは賦形剤を含んでいる。当該担体または賦形剤としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、投与に適した形態に作製される。一般的に、タンパク質の投与方法は当該分野において公知であり、本明細書に記載されているような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの投与に適用できる。
【０６３２】
本明細書に記載されているような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドを１つ以上含有する治療組成物は、当該分野において公知の方法に従って、有効性および組織代謝の確認、ならびに投与量の評価をするために、インビボおよび／またはインビトロの１つ以上の疾患モデル動物に任意に試験される。とりわけ、投与量は、天然アミノ酸相同物に対する非天然アミノ酸の活性、安定性、または他の適切な測定（例えば、１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたポリペプチドと、天然アミノ酸ポリペプチドとの比較）によって、最初に決定され得る（例えば、適切なアッセイにおいて）。
【０６３３】
投与は、分子を血液または組織細胞に最終的に接触させるために用いられる、通常の任意の投与経路を介して行われる。本明細書に記載されているような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、１つ以上の任意の薬学的に許容可能な担体とともに、任意の適切な様式において投与される。患者に対して、本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドを投与するのに適した方法は利用できるが、一方、１つ以上の投与経路は、特定の組成物を投与するために用いることが可能であり、しばしば特定の投与経路は、別の投与経路よりも、より迅速、且つより効果的な作用または反応を提供し得る。
【０６３４】
薬学的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物によって部分的に決定され、同様に、組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。したがって、本明細書に記載されている薬学的な組成物の適切な製剤は、幅広く存在する。
【０６３５】
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチド、および当該ポリペプチドを含有する組成物は、タンパク質またはポリペプチドにとって適した、従来の任意の投与経路によって投与されればよく、非経口（例えば、皮下注射または点滴、あるいは注射または注入の他の形態を含むが限定されない）を含むが特に限定されない。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドを含有するポリペプチドの薬学的組成物は、いくつかの投与経路によって投与されてもよい。この投与経路としては経口、静脈注射、腹腔内注射、筋内注射、経皮投与、皮下注射、局所注射、舌下投与または直腸投与経路を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、リポソームを介して投与され得る。この投与経路および特定の製剤は、一般的に当該分野において公知である。本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドは単独で、または別の適切な構成要素（例えば、薬学的な担体）と組み合わせてもよい。
【０６３６】
また、単独または別の適切な構成要素との組み合わされた、本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、吸入器を介して投与されるように、噴霧剤として作製され得る（例えば、それらは「霧状」になり得る）。噴霧剤は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような圧縮可能な噴射剤に収められ得る。
【０６３７】
非経口投与（例えば、関節内注射（接合部に）、静脈注射、筋内注射、皮内注射、腹腔内注射、および皮下注射によって）に適した製剤は、水性および非水性の等張性無菌注入溶液、および水性および非水性の無菌懸濁液を含んでいる。当該等張性無菌注入溶液は、酸化防止剤、緩衝剤、および製剤投与の対象者の血液と等張の製剤が溶かされた溶剤を含んでいてもよい。当該無菌懸濁液は、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存料を含んでいてもよい。パッケージ化された核酸製剤は、単回投与または多回投与の密閉した容器（例えば、プラスチック容器およびガラス容器）の中に含まれ得る。
【０６３８】
非経口投与および静脈注射は、好ましい投与方法である。とりわけ、現在使用中の製剤とともに、天然アミノ酸の相同治療組成物においてすでに利用されている投与経路（特に限定されないが、ＥＰＯ、ＩＦＮ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｓ、インターロイキン、抗体、および／または、タンパク質に由来する他のどんな薬剤にも利用される、一般的な方法が挙げられる）は、本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドにとって好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０６３９】
本明細書に記載されている組成物および方法の範囲において、患者に対して投与される投与量は、患者が長期にわたって有益な治療反応を示すのに十分な量である。投与量は、特定の製剤の有効性、使用される修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性、または血中半減期、および患者の健康状態によって決定されるとともに、処置される患者の体重または体表面積によっても決定される。また、投与量の大小は、投与する特定の製剤、または特定の患者に投与する製剤に付随して起こる、いかなる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０６４０】
病気（特に限定されないが、ガン、遺伝的疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど）の治療または予防において投与される製剤の有効量を決定する際に、医師は、血しょうの循環量、製剤の毒性、病気の進行を評価し、および／または、関連する場合は、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の生成を評価する。
【０６４１】
例えば、７０ｋｇの患者に対して投与される投与量は、一般的に、現在使用中の治療組成物の投与量と同様の範囲であるが、関連する組成物の活性または血中半減期の変化によって調節される。本明細書に記載されている薬学的製剤は、周知慣用な治療（例えば、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性製剤の投与、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物応答調節物質など）のいずれかによって、治療条件を補うことができる。
【０６４２】
投与に関して、本明細書に記載されている薬学的組成物は、関連する製剤のＬＤ−５０またはＥＤ−５０によって決定づけられる比率、および／または、各種濃度（例えば、健康な患者の大半および全体に適用されるような濃度を含むが、特に限定されない）において、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの任意の副作用の観測によって決定づけられる比率において投与される。投与は、単回投与または多回投与によって達成され得る。
【０６４３】
製剤を投与されている患者が、発熱、悪寒、または筋肉痛の症状を訴える場合、この患者に、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の痛み／熱を調節する製剤を適切に投与する。発熱、筋肉痛、または悪寒などの、製剤投与に対する反応を示す患者は、当該製剤を投与する３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または特に限定されないがジフェニドラミンのいずれかを事前に投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤と即座に反応しないより激しい悪寒および筋肉痛に対して用いられる。
【０６４４】
本明細書に記載されているような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、被検体となる哺乳動物に直接投与され得る。投与は、被検体にポリペプチドを導入するために使用される、通常の任意の投与経路によるものである。本明細書に記載されているような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、経口、直腸、局所的、吸入（特に限定されないが噴霧剤を介する）、口腔（下の舌（sub-lingual）を含むが限定されない）、膣筋、非経口（特に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸腔内、腹腔内、脳内、動脈内または静脈内）、局所的（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を含む））、および経皮的な投与に適したものを含むが、任意の特定の症状における、最も適切な投与経路は、治療されている病状の性質および重傷度に依存する。投与は、局所的または体系的になされ得る。製剤は、単回投与または多回投与の密閉した容器（例えば、プラスチック容器およびガラス容器）に含まれ得る。本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体を含んでいる、単回投与可能な形態（特に限定されないが、溶剤、懸濁液、または乳化剤を含む）の混合物に生成され得る。また、本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドは、持続注入（特に限定されないが、例えば浸透ポンプのような小型ポンプを用いる）、単回ボーラス、または持続放出性薬剤によって投与され得る。
【０６４５】
投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張にさせる溶液を含み得る、水性および非水性の溶液、等張性無菌溶液、ならびに、懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る、水性および非水性の無菌懸濁液を含む。溶液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒、および上述した種類の錠剤から生成され得る。
【０６４６】
凍結乾燥法は、関連するタンパク質製剤から水を取り除くことによって、タンパク質を保存している、一般的に使用される技術である。凍結乾燥法、または材料乾燥工程である凍結乾燥では、まず、材料を氷結させ、それから、氷溶剤または氷結した溶剤が真空環境下における昇華によって取り除かれる。賦形剤は、凍結乾燥工程の間に安定性を高めるため、および／または、貯蔵下において凍結乾燥された生成物の安定性を改良するために、事前に凍結乾燥された製剤に含まれてもよい。「Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa ら. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)」を参照のこと。
【０６４７】
また、薬剤の噴霧乾燥法は、当該技術分野の当業者に周知である。例えば、「Broadhead, J. ら., ‘The Spray Drying of Pharmaceuticals,’ in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)」を参照のこと。低分子薬剤に加えて、様々な生物材料が噴霧乾燥されており、これらは：酵素、血清、血漿、微生物、および酵母を含む。噴霧乾燥法は、１つの工程において、薬学的製剤溶液を、良質な、ほこりのない、また凝固粉末に変えることができるため、有用な技術である。基本的な技術には、以下の４つの工程を含む：ａ）噴霧器中での給水溶液の噴霧化、ｂ）噴霧空気の接触、ｃ）噴霧器の乾燥、およびｄ）乾燥空気から乾燥された生成物の分離。米国特許出願第６，２３５，７１０号明細書、および米国特許出願第６，００１，８００号明細書では、その全体が本明細書において参照として引用されており、噴霧乾燥法による組み換えエリスロポエチンの製造が記載されている。
【０６４８】
本明細書において記載されている薬学的組成物には、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤が含まれてもよい。薬学的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物によって部分的に決定されており、同様に、組成物の投与に用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドに対しては、薬学的組成物の多種多様な適切な製剤（薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を任意に含んでいる）が存在する（例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)」、「Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、 Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980」、および「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)」を参照のこと）。適した担体としては、コハク酸含有緩衝剤、リン酸、ボラート（ｂｏｒａｔｅ）、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、イミダゾール、酢酸、重炭酸、およびその他の有機酸が挙げられる。他の有機酸としては：酸化防止剤（特に限定されないが、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（特に限定されないが、約１０残基未満）、タンパク質（特に限定されないが、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、疎水性ポリマー（特に限定されないが、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（特に限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、またはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸、またはリジン）、サッカライド類、二糖類、およびその他の糖質（特に限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、キレート剤（特に限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデンテート２ナトリウム（edentate disodium））、二価金属イオン（特に限定されないが、亜鉛、コバルト、または銅）、糖アルコール（特に限定されないが、マンニトール、またはソルビトール）、塩形成対イオン（salt-forming counter ions）（特に限定されないが、ナトリウム）、および／または非イオン性界面活性剤（特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）および他のプルロニック酸）を含む。また、他のプルロニック酸としては、プルロニック酸Ｆ６８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８）またはＰＥＧを含む。適切な界面活性剤としては、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）に基づくポリエーテルを含み、例えば、（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）またはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、例えば、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）またはその組み合わせが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓおよびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（いずれも登録商標：ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ社、ワイアンドット、ミシガン州）として、市販されている。これ��は米国特許出願第４，８２０，３５２号明細書においてさらに記載されており、本明細書において、その全体が参照によって組み込まれている。他のエチレン／ポリプロピレンブロック重合体は、適切な界面活性剤であってもよい。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ＰＥＧ化された非天然アミノ酸ポリペプチドを、１つ以上の応力（例えば、攪拌によってもたらされる圧力など）に対して安定化するために用いられ得る。上記のいくつかは、「充填剤」と称されることもある。また、いくつかは、「等張化重合調整剤（tonicity modifiers）」と称されることもある。また、抗菌防腐剤は、安定性および抗菌効果をもたらすために適用され得る。適切な防腐剤としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン（ｐａｒａｂｅｎｅ）、クレゾール、およびフェノール、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０６４９】
本明細書に記載の修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドには、水溶性ポリマー（例えば、持続放出系によって、または持続放出系の一部によって投与され得るＰＥＧ）と連結される非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる。持続放出組成物は、加工品の形態（特に限定されないが、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過ポリマー材料を含むが、これに限定されない。持続放出材料は、生体適合性を有する材料から得られるものであり、例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（「Langer ら., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267- 277 (1981)」、「Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)」）、エチレンビニル酢酸（上記「Langerら」）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第１３３９８８号明細書）、ポリラクチド（ポリラクチック酸）（米国特許出願第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第５８４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコリック酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸およびグリコリック酸の共重合体）ポリアンヒドリド、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（「U. Sidman ら., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)」）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン酸、ポリサッカライド、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコンが挙げられる。また、持続放出組成物は、リポソームに取り込まれる化合物を含む。この化合物を含んでいるリポソームは、本来知られる方法によって生成される：独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書、「Eppstein ら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」、「Hwang ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」、欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書、欧州特許出願公開３６，６７６号明細書、欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書、日本特許出願公開（Japanese Pat. Appln.）第８３−１１８００８号明細書、米国特許出願第４，４８５，０４５号明細書、米国特許出願第４，６１９，７９４号明細書、米国特許出願第５，０２１，２３４号明細書、および米国特許出願第４，５４４，５４５号明細書、ならびに欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書において知られる方法によって作製される。
【０６５０】
リポソームに取り込まれるポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書、「Eppstein ら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」、「Hwang ら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」、欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書、欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書、欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書、日本特許出願公開第８３−１１８００８号明細書、米国特許出願第４，４８５，０４５号明細書、米国特許出願第４，６１９，７９４号明細書、米国特許出願第５，０２１，２３４号明細書、および米国特許出願第４，５４４，５４５号明細書、ならびに欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書において記載される方法によって生成することができる。リポソームの組成および大きさは公知であり、当業者の１人によって経験的に容易に決定され得る。リポソームのいくつかの例は、「Park JWら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995)」、「Lasic D and Papahadjopoulos D (eds)」、「MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)」、「Drummond DC,ら., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed) CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)」、「Park JW,ら., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002)」、「Nielsen UBら, Biochim. Biophys. Acta 1591(l-3) :109-l 18 (2002)」、「Mamot Cら, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)」に記載されている。
【０６５１】
本明細書に記載されている組成物、製剤および方法の範囲において、患者に対して投与される投与量は、患者に長期にわたって有益な反応をもたらすのに十分であるようにすべきである。一般的に、非経口によって１回毎に投与される、本明細書に記載されるような、修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸ポリペプチドの全薬学的有効量は、患者の体重当り、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲内であるが、この値は治療上の判断に従うものである。また、投与回数は、治療上の判断に従うものであり、その回数は、ヒトへの利用を認可された、市販の生成物よりも多くても少なくてもよい。一般的に、本明細書に記載されるようなポリマー：ポリペプチド接合体（例えば、ＰＥＧ化されたポリペプチド）は、上述した投与経路のいずれかによって投与され得る。
【０６５２】
いくつかの実施形態では、疾患、病気、または疾病を治療するための方法は、治療的有効量のポリペプチドを投与する工程を含み、上記ポリペプチドは、
【０６５３】
【化８５】
2009519942.tif 000088
から成る群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる（Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２、または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；Ｒ１がＨであるときＲ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるときＲ１はＨではない）。
【０６５４】
別の実施形態では、疾患、病気、または疾病を治療するための方法は、治療的有効量のポリペプチドと一緒に薬学的に許容可能な担体を投与する工程をさらに含んでいる。疾患、病気、または疾病を治療するための方法のさらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２の両方がポリペプチドである。いくつかの実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、Ｘは水溶性ポリマーである。別の実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、Ｘはポリエチレングリコールの誘導体である。さらなる実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、Ｘは細胞毒性化合物である。いくつかの実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、Ｘは薬物である。
【０６５５】
いくつかの実施形態では、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、Ｘは第２ポリペプチドである。別の実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、第２ポリペプチドは非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいるペプチドである。
【０６５６】
いくつかの実施形態では、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、ポリペプチドは、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ��腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群から選択される治療タンパク質と相同なタンパク質である。
【０６５７】
別の実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、上記ポリペプチド内の特定部位に組み込まれる。いくつかの実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、ポリペプチドはリボソームによって合成される。いくつかの実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、水溶液において少なくとも１ヶ月間安定である。別の実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、少なくとも２週間安定である。いくつかの実施形態における、疾患、病気、または疾病を治療するための方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、少なくとも５日間安定である。
【０６５８】
さらなる実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法は、有効量の相同な非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する工程を含んでおり、当該非天然アミノ酸ポリペプチドは、
【０６５９】
【化８６】
2009519942.tif 000089
の群から選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ有している（Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群から選択され（ｋは１、２または３である）；
Ｍは、Ｈまたは−ＣＨ２Ｒ５であるか、またはＭ−Ｎ−Ｃ（Ｒ５）部分は、４員環から７員環の構造を形成してもよく；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−Ｎ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルケニレンもしくは置換アルケニレン）−（アリールもしくは置換アリール）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）であるか（Ｒ’’のそれぞれは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’である）；
または、Ｒ５はＬ−Ｘであるか（Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択され、Ｌは、任意であり、存在するときは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群から選択されるリンカーである）；
あるいは、Ｒ５およびあらゆるＲａは、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；Ｒ１がＨであるときＲ２はＯＨではないか、またはＲ２がＯＨであるときＲ１はＨではない）。
【０６６０】
別の実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸がポリペプチド内の特定部位に組み込まれる。いくつかの実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、非天然アミノ酸が、翻訳系を用いて組み込まれる。いくつかの実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、非天然アミノ酸が、翻訳系および翻訳後修飾系を用いて、上記ポリペプチドに組み込まれる。別の実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、水溶液において少なくとも１ヶ月間安定である。いくつかの実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、少なくとも２週間安定である。別の実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、少なくとも１つの非天然アミノ酸が、少なくとも５日間安定である。
【０６６１】
いくつかの実施形態における、患者中に存在するポリペプチドを検出する方法では、上記ポリペプチドは：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、��瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群から選択される、治療タンパク質と相同なタンパク質である。
【０６６２】
〔実施例〕
以下の実施例では、芳香族アミン含有アミノ酸の合成方法について説明する。
【０６６３】
（実施例１ａ：３−クロロ−４−アミノ−フェニルアラニンの合成）
３−クロロ−４−アミノ−フェニルアラニンは、図１１に示す方法に従って合成した。
【０６６４】
（実施例１ｂ：３−ヨード−４−アミノ−フェニルアラニンの合成）
３−ヨード−４−アミノ−フェニルアラニンは、図１１に示す方法に従って合成した。
【０６６５】
（実施例１ｃ：３−メトキシ−４−アミノ−フェニルアラニンの合成）
３−メトキシ−４−アミノ−フェニルアラニンは、図１２に示す方法に従って合成した。
【０６６６】
（実施例１ｄ：３−フルオロ−４−アミノ−フェニルアラニンの合成）
３−フルオロ−４−アミノ−フェニルアラニンは、図１２に示す方法に従って合成した。
【０６６７】
（実施例１ｅ：Ｎ−メチル−ｐ−アミノ−フェニルアラニンの合成）
Ｎ−メチル−ｐ−アミノ−フェニルアラニンは、図１３に示す方法に従って合成した。
【０６６８】
（実施例１ｆ：Ｎ−エチル−ｐ−アミノ−フェニルアラニンの合成）
Ｎ−エチル−ｐ−アミノ−フェニルアラニンは、図１３に示す方法に従って合成した。以下の実施例において、修飾型ポリペプチドをクローニングおよび発現させて、その後に、翻訳後修飾を行う方法について説明する。
【０６６９】
（実施例２：ｈＧＨのＰＥＧ化）
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、修飾型ポリペプチドのクローニングおよび発現が、詳しく述べられている。直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる、導入された翻訳系は、非天然アミノ酸を含有するポリペプチドの発現に使用される。Ｏ−ＲＳは、非天然アミノ酸によって、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、次々にポリペプチドに非天然アミノ酸を挿入する。修飾型遺伝子、および（所望の非天然アミノ酸に対して特異的な）直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡの対を含んでいるプラスミドを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換によって、ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的な組み込みが可能になる。形質転換後のＥ．ｃｏｌｉは、０．０１−１００ｍＭの範囲の特定の非天然アミノ酸を含む培養液において３７℃において成長させられると、高い忠実度、および効率で修飾型ポリペプチドを発現する。非天然アミノ酸を含んでいる、ヒスチジンタグが付加されたポリペプチドは、封入体または凝集体として、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において生成される。凝集体は、６ＭのグアニジンＨＣｌにおいて変性されることにより、可溶化されて親和性精製される。５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ  ＣｕＳＯ４、および２％（Ｗ／Ｖ）サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）において、一晩４℃で透析することによって、リフォールディングが実施される。それから、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣＩ、２ｍＭのＣａＣｌ２においてポリペプチドを透析し、続いて、ヒスチジンタグを除去した（「Boissel ら., (1993) 268:15983- 93」を参照のこと）。ポリペプチドの精製方法は、当該技術分野において公知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などによって確認される。
【０６７０】
例として、ｐ−アミノフェニルアラニンが３５位のチロシンと置き換えられているｈＧＨポリペプチド（Ｈ６−ｈＧＨ  Ｙ３５ｐＡＦ２）を、ｈＧＨ、および非天然アミノ酸の直交化ｔＲＮＡシンテターゼ−直交化ｔＲＮＡ対をコード化するコンストラクトを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において生成した。発現したタンパク質を、ＩＭＡＣクロマトグラフィーおよびＩＥＸクロマトグラフィーを用いて精製した。このタンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｇ／Ｌグリシン、５ｇ／Ｌマンニトール、ｐＨ７．０の中で透析し、その後３５０ｍＭに濃縮した。試料のｐＨを、１０％酢酸によってｐＨ４．０に調節した。
【０６７１】
Ｈ６−ｈＧＨ  Ｙ３５ｐＡＦ２の翻訳後修飾は、各種ＰＥＧアルデヒドを用いてｐ−アミノフェニルアラニンを還元的アルキル化することによって、ＰＥＧ化されたＨ６−ｈＧＨ  Ｙ３５ｐＡＦ２が実施された。該ＰＥＧ化方法の例としては、特に限定されず、図３９に概略を示しており、さらに本明細書において以下に記載する：１００μｌのＰＥＧ化反応は、２０Ｋ、３０Ｋ、および４０ＫのＰＥＧアルデヒドを用いて設定した。ＰＥＧアルデヒドは、ｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液に溶かされた。各反応では、ＰＥＧ対タンパク質のモル比が１：１であり、ＤＭＦに溶解されたＮａＣＮＢＨ３対タンパク質のモル比は５：１であった。反応は、４℃または室温のどちらかでインキュベートされ、３、４、６、および１６時間後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析された。得られたペプチドのゲル電気泳動を図４０に示す。
【０６７２】
以下の実施例において、図２０〜３４に示す翻訳後修飾を用いたポリペプチドの修飾方法について説明する（なお、Ｘは、ｐ−アミノフェニルアラニンである）。
【０６７３】
（実施例３ａ：プロピオンアルデヒドおよびベンズアルデヒドによる還元されたウロテンシン−ＩＩ（urotensin-II）（ＵＴ−ＩＩ−ＳＨ）の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または０．２５ｍＭベンズアルデヒド）と、０．２５ｍＭの還元されたウロテンシンとの混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は、以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、０−５０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６７４】
（実施例３ｂ：プロピオンアルデヒドおよびベンズアルデヒドによるウロテンシン−ＩＩ（urotensin-II）（ＵＴ−ＩＩ）の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または０．２５ｍＭのベンズアルデヒド）および０．２５ｍＭのウロテンシンの混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は、以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６７５】
（実施例３ｃ：プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒド、イソブチルアルデヒド（isobutaldehyde）、およびピバルアルデヒドによるペプチドＸＴ−８の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または、０．２５ｍＭベンズアルデヒド、０．２５ｍＭのイソブチルアルデヒド、あるいは０．２５ｍＭのピバルアルデヒド）および０．２５ｍＭのＸＴ−８の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は、以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６７６】
（実施例３ｄ：プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒド、イソブチルアルデヒド）、およびピバルアルデヒドによるペプチドＳＸＴ−９の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または、０．２５ｍＭのベンズアルデヒド、０．２５ｍＭのイソブチルアルデヒド、あるいは０．２５ｍＭのピバルアルデヒド）および０．２５ｍＭのＳＸＴ−９の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６７７】
（実施例３ｅ：プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒド、イソブチルアルデヒド、およびピバルアルデヒドによるペプチドＨＸＴ−９の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または、０．２５ｍＭのベンズアルデヒド、０．２５ｍＭのイソブチルアルデヒド、あるいは０．２５ｍＭのピバルアルデヒド）および０．２５ｍＭのＨＸＴ−９の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６７８】
（実施例３ｆ：プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒド、およびイソブチルアルデヒドによるペプチドＷＸＴ−９の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または、０．２５ｍＭのベンズアルデヒドあるいは０．２５ｍＭのイソブチルアルデヒド）および０．２５ｍＭのＷＸＴ−９の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６７９】
（実施例３ｇ：プロピオンアルデヒドおよびベンズアルデヒドによるペプチドＮＸＴ−９の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または０．２５ｍＭのベンズアルデヒド）および０．２５ｍＭのＮＸＴ−９の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８０】
（実施例３ｈ：プロピオンアルデヒドおよびベンズアルデヒドによるペプチドＲＸＴ−１０の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または０．２５ｍＭのベンズアルデヒド）および０．２５ｍＭのＲＸＴ−１０の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８１】
（実施例３ｉ：プロピオンアルデヒドおよびベンズアルデヒドによるペプチドＡＸＴ−１１の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭのプロピオンアルデヒド（または０．２５ｍＭのベンズアルデヒド）および０．２５ｍＭのＡＸＴ−１１の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８２】
（実施例３ｊ：３−フェニルプロパノール、２−フェニルアセトアルデヒド、または桂皮アルデヒドによるペプチドＡＸＴ−１１の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭの３−フェニルプロパノール（または、０．２５ｍＭの２−フェニルアセトアルデヒドあるいは０．２５ｍＭの桂皮アルデヒド）および０．２５ｍＭのＡＸＴ−１１の混合物に加え、５時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８３】
（実施例３ｋ：１Ｈ−イミダゾール−５−カルバルデヒド、チオフェン−２−カルバルデヒド、ピコリンアルデヒド、またはキノリン−４−カルバルデヒドによるペプチドＡＸＴ−１１の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２５ｍＭの１Ｈ−イミダゾール−５−カルバルデヒド（または、０．２５ｍＭのチオフェン−２−カルバルデヒド、０．２５ｍＭのピコリンアルデヒド、あるいは０．２５ｍＭのキノリン−４−カルバルデヒド）および０．２５ｍＭのＡＸＴ−１１の混合物に加え、５時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８４】
（実施例３ｌ：ベンズアルデヒド、１−フェニルブタン−１，３−ジオン、またはベンズアルデヒドおよび１−フェニルブタン−１，３−ジオンの混合物によるペプチドＡＸＴ−１１の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２０ｍＭのベンズアルデヒド（または、０．２０ｍＭの１−フェニルブタン−１，３−ジオン、あるいは０．２０ｍＭのベンズアルデヒドと０．２０ｍＭの１−フェニルブタン−１，３−ジオンとの混合物）および０．２０ｍＭのＡＸＴ−１１の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８５】
（実施例３ｍ：ベンズアルデヒド、１−フェニルプロパン−１，２−ジオン、またはベンズアルデヒドおよび１−フェニルプロパン−１，２−ジオンの混合物によるペプチドＮＸＴ−９の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２０ｍＭのベンズアルデヒド（または、０．２０ｍＭの１−フェニルプロパン−１，２−ジオン、あるいは０．２０ｍＭベンズアルデヒドと０．２０ｍＭ  １−フェニルプロパン−１，２−ジオンとの混合物）および０．２０ｍＭのＮＸＴ−９の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８６】
（実施例３ｎ：ベンズアルデヒド、アセトフェノン、ベンズアルデヒドとアセトフェノンとの混合物、ベンズアルデヒドとプロピオンアルデヒドとの混合物、またはベンズアルデヒドとブタン−２−オンとの混合物によるペプチドＭＸＴ−９の還元的アルキル化）
ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２０ｍＭのベンズアルデヒド（または、０．２０ｍＭのアセトフェノン、０．２０ｍＭのベンズアルデヒドと０．２０ｍＭのアセトフェノンとの混合物、０．２０ｍＭのベンズアルデヒドと０．２０ｍＭのプロピオンアルデヒドとの混合物、あるいは０．２０ｍＭのベンズアルデヒドと０．２０ｍＭのブタン−２−オンとの混合物）および０．２０ｍＭのＭＸＴ−９の混合物に加え、２時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８７】
（実施例３ｏ：ＭＸＴ−９−Ｎ３の還元後に続いて起こる、プロピオンアルデヒドまたはベンズアルデヒドによるペプチドＭＸＴ−９−ＮＨ２の還元的アルキル化）
ＭＸＴ−９−Ｎ３の混合物を、ペプチドＭＸＴ−９−ＮＨ２を生じるＴＣＥＰによって還元した。ｐＨ４において、ＮａＣＮＢＨ３（３当量）の混合物を、０．２０ｍＭのプロピオンアルデヒド（または、０．２０ｍＭのベンズアルデヒド）および０．２０ｍＭのＭＸＴ−９−ＮＨ２の混合物に加え、１時間反応させた。生成混合物の分析は以下の条件に従ってＨＰＬＣによって行った。すなわち、５−６０％Ｂ（Ａ、水に溶かされた０．０５％のＴＦＡ；Ｂ、水に溶かされた６０％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡ）、流速：１．５ｍＬ／分、カラム：Zorbax Extend C18、３．５ｍ、４．６×５０ｍｍである。
【０６８８】
以下の実施例では、インビボまたはインビトロにおける治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドと、インビボまたはインビトロにおける治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドとを測定し、比較する方法を説明する。
【０６８９】
（実施例４：非天然アミノ酸ポリペプチドの活性および親和性の測定）
この実施例では、非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、および非天然アミノ酸ポリペプチドの、その受容体、結合パートナー、またはリガンドに対する親和性の測定について述べる。
【０６９０】
非天然アミノ酸ポリペプチド受容体、結合パートナー、またはリガンドに対するタンパク質は、通常の当業者に周知の方法に従って発現および単離される。Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）システムは、非天然アミノ酸ポリペプチドとその受容体との結合を分析するために使用される。同様に、結合パートナーおよびリガンドは、このアッセイにおいて使用され得る。
【０６９１】
製造業者に推奨されている、標準アミンカップリング法を用いて、約６００〜８００ＲＵの水溶性受容体は、Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）ＣＭ５チップの上に固定化される。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に溶解されている、各種濃度の野生型（天然）アミノ酸ポリペプチドまたは（修飾型）非天然アミノ酸ポリペプチドは、流速４０μｌ／分で４〜５分間、表層に投与され、投与後の１５分間分離が観察された。表層は、４．５ＭのＭｇＣｌ２の１５秒のパルスによって再生される。再生を１００回繰り返したとしても、観察される結合親和性の損失は、極めて少なく、１−５％である。固定化された受容体を有しない参照セルは、任意の緩衝バルク効果および非特異的結合を差し引くために用いられる。
【０６９２】
（修飾型）非天然アミノ酸ポリペプチドの滴定実験から得られた動的結合のデータは、BiaEvaluation 4.1 software（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））を用いて処理される。平行解離定数（Ｋｄ）は個々の比率定数（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）の割合として計算される。
【０６９３】
非天然アミノ酸ポリペプチドの受容体、結合パートナー、またはリガンドを発現する安定細胞株は樹立される。細胞は、受容体、結合パートナー、またはリガンドｃＤＮＡを含んでいるコンストラクトとにより、エレクトロポレーションされる。トランスフェクションされた細胞は、クローニング前に４８時間回復させられ得る。受容体、結合パートナー、またはリガンドを発現する形質転換体は、受容体に対する抗体を用いて表面染色することによって同定され、ＦＡＣＳアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）で分析される。安定にトランスフェクションされた細胞クローンは、所望の形質転換体を繰り返しサブクローニングすることによって、樹立される。当該細胞は、細胞結合アッセイにおいて使用される。
【０６９４】
２つ組の（３×１０６）細胞は、各種濃度（容積：１０μｌ）の未標識非天然アミノ酸ポリペプチドまたは陰性対照ポリペプチドの非在下または存在下、および１２５Ｉ−（修飾型）非天然アミノ酸ポリペプチド（約１００，０００ｃｐｍまたは１ｎｇ）の存在下において、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中で、０℃で９０分間インキュベートされる（全量：１２０μｌ）。細胞は、その後再び懸濁され、３５０μｌプラスチック遠心分離管内の氷冷された２００μｌのＦＣＳ上に積層され、遠心分離にかけられる（１，０００ｇ、１分）。ペレットは遠心管の末端を切断することによって採集され、ペレットおよび上澄みはガンマ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ社）において別々に計測される。
【０６９５】
特異的な結合（ｃｐｍ）は、競合相手の非在下におけるすべての結合（２回の平均値）から非特異的な結合を引いたものとして測定される。非特異的な結合は、使用されるそれぞれの細胞の種類に応じて測定される。実験は１２５Ｉ−（修飾型）非天然アミノ酸ポリペプチドの調製液と同じものを用いて別の日に行うことで、内部的な一貫性を示すべきである。１２５Ｉ−（修飾型）非天然アミノ酸ポリペプチドは、受容体、結合タンパク質、またはリガンド生成細胞との結合を実証する。この結合は、未標識非天然アミノ酸ポリペプチドにより用量依存的に阻害されるが、陰性対照ポリペプチドによっては阻害されない。
【０６９６】
（実施例５：治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドのインビボにおける検討）
治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド、治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチド、および緩衝液が、マウスまたはラットに投与される。その結果、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドでは、治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドと比べて、活性が優れていること、および半減期が延長していることが示される。
【０６９７】
（実施例６：治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドならびにそのバリアントの、接合体および非接合体のインビボにおける半減期の測定）
すべての動物実験は、ＡＡＡＬＡＣに認定された設備、およびSt. Louis UniversityのInstitutional Animal Care and Use委員会によって認可されたプロトコールに基づき実施される。ラットは、１２時間毎の明／暗サイクルに設定した室内において、個々のケージに収容される。動物は、認可された飼料（Purina rodent chow 5001）および水へのアクセスを提供される。
【０６９８】
（実施例７：薬物動態の検討）
治療活性を有する各修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの質は、動物実験開始前に、３つのアッセイを用いて測定される。治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの純度は、非還元条件下において、ＭＥＳ  ＳＤＳ移動緩衝液を用いて、４〜１２％のアクリルアミドＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを流動させることによって検査される（Invitrogen社、Carlsbad、CA）。ゲルは、クマシーブルーによって染色される。治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド接合体は、デンシトメトリースキャンに基づく、９５％の純度よりも高い。治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドそれぞれの内毒素の値は、Charles River Laboratories(Wilmington, MA)から入手できるＫＴＡ２キットを用いて、動態ＬＡＬアッセイによって検査されており、これにより、１回の投与につき、当該内毒素は５ＥＵよりも少ないことが分かっている。治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの生物活性は、ポリペプチドの生物活性を特徴付ける、細胞アッセイによって評価される。
【０６９９】
治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの薬物動態学的性質は、Charles River Laboratoriesから入手されるSprague-Dawleyラット（雄、２６１〜４２５ｇ）において、当該非天然アミノ酸ポリペプチド同士、および治療活性のある天然アミノ酸ポリペプチドと比較される。カテーテルは、血液採取のため、頚動脈に外科的に挿入される。カテーテルの挿入に成功した後に、動物は投与前に治療群（１群：３〜６匹）に割り当てられる。動物は、１ｍｇ／ｋｇの化合物を含む０．４１〜０．５５ｍｌ／ｋｇの投与量で、皮下に投与される。血液サンプルは、留置カテーテルを介して各時点において、ＥＤＴＡコートされたマイクロ遠心分離チューブの中に集められる。血しょうは遠心分離後に集められ、分析するまでは−８０℃で貯蔵される。化合物の濃度は、BioSource International(Camarillo, CA)またはDiagnostic Systems Laboratories (Webster, TX)から入手できる抗体サンドイッチＥＬＩＺＡキットを用いて測定される。濃度は投与される類似体に対応するスタンダードによって計算される。薬物動態学的パラメーターは、モデル化プログラムWinNonlin(Pharsight社, version 4.1)によって評価される。リンナーアップ／ログダウン（linear-up/log-down）台形積分を用いた非分画分析が使用されており、これにより、濃度データが一律に加重される。このデータは、その後、Ｃｍａｘ：最大濃度、末端ｔ１／２：末端半減期、ＡＵＣ０＞ｉｎｆ：無限大と推定される濃縮時間曲線に基づく領域、ＭＲＴ：滞留時間という意味、Ｃｌ／ｆ：見かけの総量、血漿クリアランス、およびＶｚ／ｆ：終末期間の分布における見かけの体積を得るためにプロットされる。
【０７００】
（実施例８：薬力学の検討）
Sprague-Dawleyラット(雄)は、Charles River Laboratoriesから入手できる。動物は３週間馴化飼育され、その間、天然アミノ酸ポリペプチドによる生物特性が観察される。上記生物特性の変化が許容可能な水準である動物が、治療群へ無作為に抽出される。ラットは、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドのボーラス投与量または日用量のいずれかを皮下に投与される。研究の初めから終わりまで、ラットは毎日連続して麻酔、流血、および、（適用可能な場合には）投与されており、さらに相関がある生物特性が測定される。血液は、ヘパリン添加毛細血管チューブを用いて、眼窩洞から採取され、ＥＤＴＡコートされたマイクロ遠心分離チューブの中に収められる。血しょうは遠心分離によって単離され、分析まで−８０℃で貯蔵される。血漿濃度は、ラットにおける１回の皮下投与量に従って得られる。
【０７０１】
（実施例９：治療活性を有する修飾型天然アミノ酸ポリペプチドの安全性および／または有効性に関する、ヒトでの臨床試験）
（目的）
皮下投与される、修飾型治療活性のある非天然アミノ酸ポリペプチドの安全性および薬物動態と、治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドの安全性および薬物動態とを比較すること。
【０７０２】
（患者）
この調査に参加した１８人の健康な志願者は、年齢が２０〜４０歳であり、体重が６０〜９０ｋｇである。被験者は、血液学または血清化学、陰性の尿薬物中毒のスクリーニング検査、ＨＩＶスクリーニング検査、およびＨＢｓ抗原に関して、臨床的に重大な異常を示す検査値を有しない。被験者らは、高血圧、主な血液病のいずれかの病歴、重篤な肝臓疾患、腎臓疾患、心臓血管疾患、胃腸疾患、泌尿器疾患、代謝疾患、または神経疾患の病歴、貧血または発作性疾患の病歴、細菌由来または哺乳動物由来の産物、ＰＥＧ、あるいはヒト血清アルブミンに対する既知の感受性、習慣的且つ過剰なカフェイン含有飲料の消費、本調査を開始する３０日以内に別の臨床試験に参加しているか、または輸血あるいは献血されている、本調査を開始する３ヶ月以内に治療活性のある天然アミノ酸ポリペプチドを曝露されている、本調査を開始する７日以内に病気を発症している、および本調査を開始する１４日以内に、調査前の身体検査または臨床検査値において顕著な異常を有する、というどの兆候も有するべきではない。すべての被験者は、安全性に対する評価が可能であり、薬物動態分析のためのすべての血液採取物は、予定通りに収集される。すべての試験は、制度倫理委員会の承認および患者の同意を得て実施される。
【０７０３】
（研究計画）
本研究は第１段階であり、健康な男性志願者に対する、１施設の非盲検による任意に抽出した２つの区間の交差試験である。１８人の被験者は、２つの治療配列群のうち１つを任意に与えられる（９人／群）。治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドは、等量の治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを用いた、大腿上方におけるボーラス皮下注射として、２回に分けられた投与期間の間中投与される。さらなる投与、投与回数、または別のパラメーターが望まれるとき、これらのことは、別の被験者群を含ませることによって、本研究に加えられてもよい。各投与期間は、１４日目の流失期間で分けられる。被験者は、各２つの投与期間の前に少なくとも１２時間、および各２つの投与期間の後に７２時間、研究施設に拘束されるが、投与期間中は拘束されない。また、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドに関して試験するために、追加の投与、投与回数、または別のパラメーターが存在するのであれば、さらなる被験者群が加えられてもよい。
【０７０４】
（血液サンプリング）
連番の血液は、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドまたは治療活性を有する非天然アミノ酸ポリペプチドの投与前後に、直接血管に穴を開けることによって取り出される。血清中の治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチド濃度または治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチド濃度の測定のための静脈血サンプル（５ｍＬ）は、投与前の約３０、２０、および１０分（３つの基準サンプル）、および投与後の約３０分および１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０、および７２時間で得られる。それぞれの血清サンプルは２つのアリコート単位に分けられる。すべての血清サンプルは−２０℃で貯蔵される。血清サンプルはドライアイスの状態で出荷される。空腹時の臨床検査試験（血液学、血清化学、および尿検査）は、１日目の最初の投与前、４日目の朝、１６日目の投与される前、および１９日目の朝に迅速に実施される。
【０７０５】
（生物分析法）
ＥＬＩＺＡキット法（Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX）が、血清中の濃度を測定するために用いられる。
【０７０６】
（安全性の測定）
生命兆候は、１日目および１６日目それぞれの投与前、およびこれらの投与後６、２４、４８、ならびに７２時間経過時点で速やかに記録される。安全性の測定は、有害事象発生率および有害事象の種類、ならびに臨床検査試験における基準値からの変化に基づく。さらに、生命兆候（例えば、血圧）の測定における検査前からの変化、および身体検査の結果が測定される。
【０７０７】
（データ分析）
投与後の血清中濃度値は、投与後のそれぞれの値から差し引くことによって、投与前の基準濃度に対して補正される。ここで、基準濃度とは、投与前３０分、２０分、および１０分に採取された３つのサンプルから得られる値を平均化することによって求められる。投与前に採取されたサンプルの血清中濃度がアッセイの定量化値を下回る場合、この濃度は平均値の算出には含まれない。薬物動態学的パラメーターは、基準濃度に対して補正された血清中濃度データから求められる。薬物動態学的パラメーターは、最新版のＢｌＯＡＶＬソフトウェアを用いて、ＶＡＸ  ８６００コンピュータシステム（Digital Equipment社）上のモデル独立法（model independent methods）によって算出される。このシステムでは、次の薬物動態パラメーターが求められる。すなわち、血清中濃度ピーク（Ｃｍａｘ）、血清中濃度ピークに達する期間（Ｔｍａｘ）、線形台形法則の利用によって算出される、０時から最終血液採取時（ＡＵＣ０−７２）までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）、および消失速度定数から算出された末端消失半減期（ｔ１／２）である。消失速度定数は、対数−直線濃度−期間プロットの末端直線領域における、連続したデータポイントの直線回帰によって算定される。薬物動態学的パラメーターの標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）は、各処理に対して算出されるものを意味する。パラメーター平均値の比（保存された公式／保存されていない公式）が、算出される。
【０７０８】
（安全性の結果）
有害事象発生率は、治療群全体に均等に分散される。臨床検査試験または血圧測定の基準値あるいは調査前の値から、臨床的に著しい変化はみられず、また、身体検査の結果および生命兆候想定において調査前からの注目すべき変化はみられない。２つの治療群に関する安全性は、類似しているであろう。
【０７０９】
（薬物動態の結果）
治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドまたは治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドを１回投与された後の１８人すべての被験者において、平均血清中の治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドまたは治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドの濃度−時間プロフィール（基準値に対して補正されていない）が、測定された各時点において比較される。すべての被験者は、投与前に正常な生理的範囲内の基準濃度を有するべきである。薬物動態学的パラメーターは、投与前の平均基準濃度に対して補正された血清データから割り出されることによって、ＣｍａｘおよびＴｍａｘが求められる。治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドのＴｍａｘの平均値は、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドのＴｍａｘの平均値よりも著しく短い。治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドの末端半減期の値は、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの末端半減期と比較して、著しく短い。
【０７１０】
本発明は、健康な男性を被験者として実施されるが、別の患者集団において、同様の吸収特性および安全プロフィールが予測され得る。別の患者集団としては、例えば、ガンまたは慢性腎不全を発症している男性あるいは女性患者、小児腎不全患者、自己貯血式プログラムにおける患者、または選択的手術を予定している患者が挙げられる。
【０７１１】
結論として、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを皮下に投与する１回の投与量は、安全且つ健康な男性被験者がよく耐え得る。有害事象の比較発症率、臨床検査値、生命兆候、および生理学的試験の結果に基づく、治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドと、治療活性を有する天然アミノ酸ポリペプチドとの安全プロフィールは均等である。治療活性を有する修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドは、潜在的に患者および医療提供者に大きな臨床利用性をもたらす。
【０７１２】
本明細書に記載された実施例および実施形態は説明のみを目的としており、且つそれらの様々な改良および変更は、当業者に示唆されるとともに、本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書に引用された刊行物、特許および特許出願のすべては、参照によって、すべての目的に対してその全体が本明細書に組み込まれる。
【０７１３】
【表３】
2009519942.tif 000090
2009519942.tif 000091
2009519942.tif 000092
【図面の簡単な説明】
【０７１４】
【図１】本明細書に記載の方法、組成物および技術を用いて修飾されるポリペプチドを、選択および設計するための方法の非限定的な態様を、説明する図である。
【図２】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図３】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図４】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図５】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図６】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図７】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図８】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図９】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図１０】本明細書に記載の非天然アミノ酸の様々な非限定的な具体例を示す図である。
【図１１】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図１２】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図１３】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図１４】本明細書に記載の非天然アミノ酸の非限定的な具体例を示す図である。
【図１５】本明細書に記載の非天然アミノ酸の非限定的な具体例を示す図である。
【図１６】芳香族アミン含有非天然アミノ酸を有するポリペプチドに対して、アルデヒド含有試薬を用いて還元的アルキル化することによって、形成された化合物の非限定的な具体例を示す図である。
【図１７】本明細書に記載の、芳香族により保護されたアルデヒド含有非天然アミノ酸の非限定的な具体例を示す図である。
【図１８】保護された／マスクされた前躯体を、翻訳後に脱保護する／脱マスクすることによって、アルデヒド含有非天然アミノ酸を有するポリペプチドを形成した後に、芳香族アミン含有試薬を用いて還元的アミノ化することについての非限定的な具体例を示す図である。
【図１９】非天然アミノ酸ポリペプチドの部位選択的な還元的アルキル化および還元的アミノ化の非限定的な具体例を示す図である。
【図２０】プロピオンアルデヒド（Ｉ）およびベンズアルデヒド（ＩＩ）による還元型ウロテンション（ｕｒｏｔｅｎｓｉｏｎ）−ＩＩ（ＵＴ−ＩＩ−ＳＨ）の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２１】プロピオンアルデヒド（Ｉ）およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるウロテンション（ｕｒｏｔｅｎｓｉｏｎ）ＩＩ−（ＵＴ−ＩＩ）の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２２】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＩＩＩ）、およびピバルアルデヒド（ＩＶ）によるペプチドのＸＴ−８の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２３】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＩＩＩ）、およびピバルアルデヒド（ＩＶ）によるペプチドのＳＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２４】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、イソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＩＩＩ）、およびピバルアルデヒド（ＩＶ）によるペプチドのＨＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２５】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、ベンズアルデヒド（ＩＩ）、およびイソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＩＩＩ）によるペプチドのＷＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２６】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるペプチドのＮＸＴ−９の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２７】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるペプチドのＲＸＴ−１０の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２８】プロピオンアルデヒド（Ｉ）、およびベンズアルデヒド（ＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図２９】異なるアルデヒド（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図３０】異なるアルデヒド（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の還元的アルキル化と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図３１】アルデヒドおよび１，３−ジケトン（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によるペプチドのＡＸＴ−１１の競合反応と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図３２】アルデヒドおよび１，２−ジケトン（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によるペプチドのＮＸＴ−９の競合反応と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図３３】アルデヒドおよびケトン（Ｉ）〜（Ｖ）によるペプチドのＭＸＴ−９の競合反応と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図３４】ＭＸＴ−９−Ｎ３をＭＸＴ−９ＮＨ２（Ｉ）に還元した後に、アルデヒドおよびベンズアルデヒドによるＭＸＴ−９ＮＨ２の還元的アルキル化によって生じた化合物（ＩＩ）〜（ＩＩＩ）と、対応するＨＰＬＣのクロマトグラムとの非限定的な具体例を示す図である。
【図３５】本明細書に記載の芳香族アミン含有非天然アミノ酸のＰＥＧ化、およびＮ末端ＰＥＧ化による、ペプチドのＰＥＧ化の非限定的な具体例と比較とを示す図である。
【図３６】ペプチドに組み込まれる芳香族アミン含有非天然アミノ酸を、ＰＥＧ化するために使用されるＰＥＧアルデヒド試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【図３７】Ｎ末端の還元的アルキル化による、ＭＴ−９のＰＥＧ化の非限定的な具体例を示す図である。
【図３８】ＭＸＴ−９に組み込まれる芳香族アミン含有非天然アミノ酸の還元的アルキル化による、ＭＸＴ−９のＰＥＧ化の非制限的な具体例を示す図である。
【図３９】ｈＧＨおよびＩＦＮαに組み込まれる芳香族アミン含有非天然アミノ酸の還元的アルキル化による、ｈＧＨおよびＩＦＮαのＰＥＧ化の非制限的な具体例を示す図である。
【図４０】ＰＥＧ化された様々なｈＧＨの電気泳動ゲルの非限定的な具体的画像を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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