(57)【要約】目的の化合物の薬物動力学的運命を決定する新規かつ改良された質量分光測定法が記載される。この方法は、上記化合物をＰＥＧ化する工程、生物学的システムに投与する工程、このシステムから分析物を引抜く工程、および、この分析物を、次いでこの分析物中の上記化合物の存在および／または量について代理するマーカーまたは複数のマーカーとして測定されるＰＥＧイオンへの供給源内イオン化およびフラグメント化に供する工程を含む。
2009507228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源、質量分析器、およびイオン検出器を採用し、そして目的のＰＥＧ化化合物がフラグメント化され、そしてＰＥＧイオンが該化合物のプロキシマーカーとして測定されるタイプの質量分光測定法の方法において、改良が、
１つ以上のｍ／ｚ単位を示すＰＥＧイオンを生じ、次いで、該ＰＥＧイオンが該化合物の運命を決定するためのプロキシマーカーとして用いられるために、該供給源中で該ＰＥＧ化化合物をイオン化およびフラグメント化する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記質量分光測定法のデバイスが、クロマトグラフィーデバイスと前記供給源でインターフェースされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィーデバイスが、液体クロマトグラフィーデバイスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフィーデバイスが、高速液体クロマトグラフィーデバイスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、ポリペプチドダイマーまたはタンパク質ダイマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記供給源が、生物学的サンプルをイオン化する手段を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記供給源が、エレクトロスプレーイオン化供給源であり、そして前記フラグメント化およびイオン化が、該供給源で電圧を操作することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記フラグメント化が、８９、１３３、１７７、および２２１  ｍ／ｚからなる群から選択される１つ以上のメンバーの相対強度を含むＭＳプロフィールを生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物の量を算出するために前記１つ以上のメンバーを用いる工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物の薬物動力学的運命の輪郭を描く方法であって：
（ａ）ＰＥＧ化化合物を提供する工程；
（ｂ）該ＰＥＧ化化合物を、患者または細胞または組織培養に投与する工程；
（ｃ）該ＰＥＧ化化合物の投与の後、該患者または細胞または組織培養から目的の分析物サンプルを引抜く工程；
（ｄ）該分析物サンプルを、供給源、質量分析器、およびイオン検出器を備える質量分光測定法（ＭＳ）システムに与える工程；
（ｅ）１つ以上のＰＥＧイオンを生じるために該供給源で該分析物をフラグメント化およびイオン化する工程；および
（ｄ）該分析物中の該化合物の存在および／または量を決定するために該１つ以上のＰＥＧイオンを測定する工程、を包含する、方法。
【請求項１２】
前記質量分光測定法システムが、前記供給源でインターフェースされるクロマトグラフィーデバイスをさらに備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体クロマトグラフィーデバイスが、液体クロマトグラフィーデバイスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体クロマトグラフィーデバイスが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）デバイスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、ポリペプチドダイマーまたはタンパク質ダイマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記供給源が、ソフトイオン化供給源を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ソフトイオン化供給源が、エレクトロスプレーイオン化供給源である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラグメント化が、８９、１３３、１７７、および２２１  ｍ／ｚからなる群から選択される１つ以上のメンバーの相対強度を含むＭＳプロフィールを生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物の量を算出するために、前記１つ以上のメンバーを用いる工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、薬物動力学的研究における薬物の候補のための代理マーカーの検出に適用されるような質量分光測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
質量分光測定法（ＭＳ）は、基本的に、イオン質量および荷電の関数として電場および／または磁場におけるイオン偏向および／または進行の分離および測定を含む。非特許文献１；非特許文献２。ＭＳ測定は、大部分の化合物について特有であり、そして、代表的にはナノモル〜フェムトモル感度を備えた、種々のサイズの既知および未知の両方の定性的分析および定量的分析の両方で頻繁に用いられる、質量−対−荷電に対してプロットされるイオン強度のヒストグラムを生じる。現在まで、基礎的技法に対する改変例が、例えば、岩中の石油前駆体を測定することによる油堆積物を検出および同定するため、運動選手のステロイドの使用をモニターするため、手術の間の麻酔医による患者の呼吸をモニターするため、スペース中に見い出される分子種の組成を決定するため、ハチミツがコーンシロップをまぜて粗悪にされているか否かを決定するため、バイオテクノロジー産業の発酵プロセスをモニターするため、汚染魚中のダイオキシンを検出するため、環境原因からの遺伝子損傷を決定するため、および半導体材料の元素組成を確立するために首尾良く適用されている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｍｓ．ｏｒｇ／ｗｈａｔｉｓｍｓ／ｐ１．ｈｔｍｌ．を参照のこと。
【０００３】
ＭＳのハードウェアは、サイズ、精巧度、および費用において広く変動するが、本質的にすべては、サンプル入口、イオン化供給源（サンプル入口と一緒で＝「供給源」）、質量分析器、およびイオン検出器を有している。非特許文献３。最も大きな差異のいくつかは、イオン化供給源および質量分析器にある。例示のイオン化供給源は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ；非特許文献４）、大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス−支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ；非特許文献５）、および急速原子ボンバードメント（ＦＡＢ；非特許文献６）を含む。例示の質量分析器は、磁気セクター（非特許文献７）、飛行の時間（ＴＯＦ；非特許文献８）、四極子（非特許文献９；非特許文献１０）、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ；非特許文献１１）を含み、所定の分析器タイプ内でさえ、顕著な差異をもつ。例えば、四極子分析器は、その他に対して機能がある程度より多くまたは少なく精巧化されて、単一の四極子フォーマット、および異なる四極子が直列で組み合わされるタンデム四極子フォーマットで利用可能である。例えば、いくつかの三重四極子形態では、１つの四極子は、アルゴン、キセノンまたはヘリウムのような不活性ガス分子とのイオンの衝突−誘導解離（ＣＩＤ）を実施するために用いられ、その後、得られるフラグメントが、次いで、さらなる四極子検出器を用いて分析される。Ｂａｋｅｒ、上述（非特許文献３）を参照のこと。
【０００４】
過去１０年間に、ＭＳは、通常、このＭＳステップに先立つ種々のクロマトグラフィー精製および分離技法と組み合われている。例は、液体クロマトグラフィー−質量分光測定法（ＬＣ−ＭＳ）であり、そこでは、例えば、生物学的分析物溶液のような化合物の混合物が、さらなる分析のためにＭＳデバイスに流される前にクロマトグラフィーカラムにロードされ、そしてそれで分離され得る。ＥＳＩおよびＡＰＣＩは、これらの適用のために最も一般的である。なぜなら、それらは、ＬＣデバイスから直接来るイオン形成および高流速を可能にするからであり、前者は極性分析物に対してより適切であり、そして後者は非極性分析物に対してより適切である。Ｂａｋｅｒ、上述（非特許文献３）、６９４頁を参照のこと。
【０００５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、化学構造ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨのポリマーであり、水溶性であり、そして不揮発性である。可塑剤、潤滑剤、乳化剤、分散剤、湿潤剤および軟膏ベースのような有用性、例えば、非特許文献１２を参照のこと、を有することに加え、ＰＥＧはまた、そうでなければ、所望されない短い半減期、所望されない広範な組織分布、および高い免疫原性を有し得る、ペプチド、タンパク質および小分子薬物に複合体化されるときに有用性を有する。例えば、本出願人が所有する特許文献１；非特許文献１３を参照のこと。
【０００６】
最近、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．のＭａｒｓｈａｌｌ、Ｃ．Ａ．らは、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅにおいて２００４年５月２３〜２７日に開催されたＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５２ｎｄ  ＡＳＭＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  ＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙおよびＡｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓで、伝える所によれば、Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＱｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ三重四極子システムの各々で、イオン化され、フラグメント化され、そして分析されたＰＥＧ−複合体が、伝えられるところでは、ＰＥＧ複合体を用いて当該技術分野における初期に注記された困難性を克服している。Ｍａｒｓｈａｌｌらの手順は、伝える所によれば、質量分析器の第２の四極子中のフラグメント化に依存し、そして良好なノイズに対する信号比を有し、そして平行して行われたイムノアッセイに対して全体で１５倍より大きい感度をもつポリエチレングリコール鎖フラグメントを生じた。Ｍａｒｓｈａｌｌらは、かれらのシステムが、ペプチド運命が別個の代理マーカーとしてそれからフラグメント化されたＰＥＧを用いて間接的に決定され得るように、「低濃度、代表的にはペグ化ペプチドを用いて実施された長い持続放出実験により良好に適した」と結論付けた。
【特許文献１】米国特許第６，７１６，８１１号明細書
【非特許文献１】Ａｂｄｏｕ、Ｈ．Ｍ．ら、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、３４章、６３６〜６３９頁（２０００）
【非特許文献２】Ｓｕｉｚｄａｋ、Ｇ．、ＪＡＬＡ、９：５０〜６３（２００４）
【非特許文献３】Ｂａｋｅｒ、Ｇ．ら、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、７．６、６８０〜６９５頁（２００３）
【非特許文献４】Ｆｅｎｎ、Ｊ．Ｂ．ら、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．、９、３７（１９９０）
【非特許文献５】Ｋａｒａｓ、Ｍ．およびＫｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ｆ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６０、２２９９（１９８８）
【非特許文献６】Ｓｉｕｚｄａｋ、Ｇ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、１１２９０（１９９４）
【非特許文献７】Ｎｉｅｒ、Ａ．Ｏ．、Ｎａｔ．Ｂｕｒ．Ｓｔａｎｄ．Ｃｉｒｃ．（Ｕ．Ｓ．）５２２、２９〜３６（１９５３）
【非特許文献８】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、Ｗ．Ｅ．、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．、６９、６９１（１９４６）
【非特許文献９】Ｐａｕｌ、Ｗ．およびＳｔｅｉｎｗｅｄｅｌ、Ｈ．、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｈ．、８Ａ、４４８〜４５０（１９５３）
【非特許文献１０】Ｙｏｓｔ、Ｒ．Ａ．、およびＥｎｋｅ、Ｃ．Ｇ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１００（７）、２２７４〜５（１９７８）
【非特許文献１１】Ｃｏｍｉｓａｒｏｗ、Ｍ．Ｂ．およびＭａｒｓｈａｌ、Ａ．Ｇ．、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２５、２８２〜２８３（１９７４）
【非特許文献１２】Ｒｅｉｌｌｙ、Ｗ．Ｊ．、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２０版、５５章、１０３６〜１０３７（２０００）
【非特許文献１３】Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｒ．Ｂ．ら（２００１）ＰＥＧ  Ｄｒｕｇ：Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４：１５９〜７１（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書中に示されるように、出願人は、驚くべきことに、より単純で、より安価な単一の四極子ＬＣ−ＭＳシステムを用い、Ｍａｒｓｈａｌｌらと同じことを達成し、これは、例えば、インビボの薬物または複数の薬物の薬物動力学を評価することで大きな有用性を具現化する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
Ｍａｒｓｈａｌｌらの、フラグメント化がタンデム四極子システム中のガスのＣＩＤを用いて主に実施される三重の四極子システムとは異なり、出願人は、それらのフラグメント化の大部分を「供給源内（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）」で実施する。いくつかの好ましい実施形態では、これは、代表的な「ソフト」イオン化供給源、すなわち、代表的にはフラグメント化を最小にするものを、「ハード」イオン化供給源、すなわち、イオン供給源自体でイオン速度および／または熱を調節することによりサンプルをフラグメント化するよう設計されているものに転換することにより達成される。
【０００９】
Ｍａｒｓｈａｌｌらのシステムが、ペプチドへの従来のＰＥＧ結合を企図するのみであるのに対し、出願人のシステムは、伝統的および非伝統的結合の両方、ならびにペプチド薬物および非ペプチド薬物の両方への結合を企図する。
【００１０】
さらに、出願人は、Ｍａｒｃｈａｌｌらによって用いられたものに加え、またはそれに代わって用いられ得る新たなＰＥＧ  ＭＳプロフィールを開示する。
【００１１】
さらになお、出願人の方法では、大部分のフラグメント化は、イオン化ステップで起こり、そしてタンデム三重四極子システムで存在するような分析−濾過ステップ内および／またはその後ではないので、出願人の方法は、理論的に相対的に増大された信号を生じる。
【００１２】
本明細書中で本明細書は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）実施形態を用いて本明細書中で作動して例示されているけれども、当業者は、本発明の思想がこれに制限されずに、しかも、その他のイオン化技法が、類似の効果でイオン化およびフラグメント化を達成するために過度の実験なくして適合され得ることを理解する。
【００１３】
従って、本発明の第１の局面は、ＰＥＧ化化合物の供給源内質量分光測定法フラグメント化を採用し、１つ以上のＰＥＧイオンを生じるシステムまたは方法であることを特徴にし、これらイオンは、次いで、上記化合物の運命を決定するためのプロキキマーカー（単数または複数）として用いられる。
【００１４】
好ましい実施形態では、上記質量分光測定法のデバイスは、クロマトグラフィーデバイス、例えば、液体クロマトグラフィーデバイス、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）デバイスと、供給源でインターフェースされる。
【００１５】
上記ＰＥＧ化化合物は、任意のタイプの化合物、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。いくつかのこのような実施形態では、このポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドダイマーまたはタンパク質ダイマーであり得る。
【００１６】
好ましい実施形態では、上記供給源は、生物学的サンプルをイオン化する手段、例えば、エレクトロスプレーイオン化供給源を含む。
【００１７】
好ましい実施形態では、上記フラグメント化は、８９、１３３、１７７、および２２１  ｍ／ｚからなる群から選択される１つ以上のメンバーの相対強度を含むＭＳプロフィールを生じる。
【００１８】
１つの方法の実施形態は、
（ａ）ＰＥＧ化化合物を提供する工程；
（ｂ）このＰＥＧ化化合物を、患者または細胞または組織培養に投与する工程；
（ｃ）このＰＥＧ化化合物の投与の後、上記患者または細胞または組織培養から目的の分析物サンプルを引抜く工程；
（ｄ）この分析物サンプルを、供給源、質量分析器、およびイオン検出器を備える質量分光測定法（ＭＳ）システムに与える工程；
（ｅ）１つ以上のＰＥＧイオンを生じるために上記供給源で上記分析物をフラグメント化およびイオン化する工程；および
（ｄ）上記分析物中の上記化合物の存在および／または量を決定するために上記１つ以上のＰＥＧイオンを測定する工程を包含する。
【００１９】
この方法の特定の実施形態は、例えば、先行する局面で記載されるような多くの形態をとり得る。
【００２０】
採用される特定のポリマーは、必ずしもＰＥＧである必要はなく、追跡されることが所望される目的の任意のその他の分子に複合体化され得る任意の分子であり得、このポリマー部分が予測可能なサイズのイオンフラグメントにフラグメント化され得る。薬物および薬物の候補の運命マッピングが本明細書で例示される好ましい実施形態であるけれども、本発明はまた、その他の領域で、例えば、環境評価および毒物学研究で有用性を有することが期待される。
【００２１】
当業者は、以下の論議で本発明の、これらならびにその他の局面および実施形態を必然的に認識する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、ＭＳを用いる複合体化薬物の薬物動力学的運命研究のためのプロキシマーカーとしてのＰＥＧの使用を特徴にするけれども、その他のポリマー、例えば、ポリアルキルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体などがまた、プロキシマーカーとして適切であり得ることは明瞭である。
【００２３】
ＰＥＧおよび薬物のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）
１．定義
薬物：疾患またはその他の病気に対して生物学的効果を示す、ペプチド、タンパク質、小分子、およびそれらの組み合わせ。
【００２４】
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨもしくはＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨ、またはＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨの略。本明細書で規定されるように、この用語はまた、例えば、リジンもしくは末端アミン活性ＰＥＧエステル、およびスルフヒドリルもしくはマレイミドのようなチオール−選択的ＰＥＧ試薬、ビニルスルフォン、およびその他のチオール（例えば、スイテインへの結合のため）を含む、１つ以上の官能性を保持する種々のＰＥＧ誘導体を含む。例示の市販され入手可能な種は、例えば、以下に記載されるような、種々の異なる分子量（変動するｎ）にある、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ；以前はＳｈｅａｒｗａｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．）から入手可能であるものを含む。本発明に好ましいのは、約２００〜１００，０００ダルトン、より好ましくは４００〜４０，０００ダルトンのＰＥＧである。
モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＯＨまたはＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−ＳＨ（ＭｅＰＥＧ−ＳＨ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、ここで、−ＮＨＳは、ヒドロキシスクシンイミド：
【００２５】
【化１】
2009507228.tif 000003
であり、
モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピオネート（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルブタノエート（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−スンシンイミジルα−メチルブタノエート（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＣＨ３ＣＯ２−ＮＨＳ）、
ｍＰＥＧ−カルボキシメチル−３−ヒドロキシブタノン酸−ヒドロキシスクシンイミド、
【００２６】
【化２】
2009507228.tif 000004
モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、
【００２７】
【化３】
2009507228.tif 000005
ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭｅＰＥＧ２−ＮＨＳ）、例えば、
ｍＰＥＧ−チオエステル、例えば、
【００２８】
【化４】
2009507228.tif 000006
モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）、
モノメトキシポリエチレングリコール−ブチルアルデヒド、
【００２９】
【化５】
2009507228.tif 000007
ｍＰＥＧ−アセトアルデヒドジエチルアセタール、
【００３０】
【化６】
2009507228.tif 000008
ｍＰＥＧ−マレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）、
【００３１】
【化７】
2009507228.tif 000009
ｍＰＥＧ−フォーク状（Ｆｏｒｋｅｄ）マレイミド（ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２）、
【００３２】
【化８】
2009507228.tif 000010
ｍＰＥＧ−ビニルスルフォン、ｍＰＥＧ
【００３３】
【化９】
2009507228.tif 000011
ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ
【００３４】
【化１０】
2009507228.tif 000012
ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ
【００３５】
【化１１】
2009507228.tif 000013
Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ
【００３６】
【化１２】
2009507228.tif 000014
ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ
【００３７】
【化１３】
2009507228.tif 000015
Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ
【００３８】
【化１４】
2009507228.tif 000016
ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）：１つ以上のＰＥＧ分子または試薬の目的の化合物、例えば、薬物への官能基を経由する化学的結合または共役。下記セクション３の共役を参照のこと。
【００３９】
２．ＰＥＧ選択
ＰＥＧは、これらの用語が当該技術分野で公知であるように、線状、分岐または複数アームであり得る。線状ＰＥＧは、１官能性、ホモ２官能性、またはヘテロ２官能性のいずれかである。線状１官能性ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−Ｘ）は、ＰＥＧの１つの端部に１つの反応性部分を有し、他方の端部は非反応性と考えられる（代表的には、メトキシまたはブロッキング基で末端がキャップされている）。線状ホモ２官能性ＰＥＧ（Ｘ−ＰＥＧ−Ｘ）は、ＰＥＧの各端部に同じ反応性部分を含む。線状ヘテロ２官能性ＰＥＧ（Ｘ−ＰＥＧ−Ｙ）は、ＰＥＧの各端部に異なる反応性部分を含む。分岐ＰＥＧ（ＰＥＧ２−Ｘ）は、中央コアに結合した２つのＰＥＧを含み、この中央コアからつながれた反応性部分が延びる。フォーク状ＰＥＧ（ＰＥＧ−Ｘ２）は、中央コアから延びる２つ以上のつながれた反応性部分を有する１つの端部をもつＰＥＧを含む。
【００４０】
用いられる特定のＰＥＧの分子量は重要であり、そしてそれに複合体化される薬物のサイズおよび性質の関数である。一般に、適切なサイズのＰＥＧを選択する際に、以下の一般性を心に留めるべきである：ＰＥＧの血清半減期は、ＰＥＧ  ＭＷが５ｋＤａ〜１９０ｋＤａに増加するとき、ＭＷ＞３０ｋＤａまたは分子サイズ＞８ｎｍを有するＰＥＧおよびＰＥＧ−複合体について、２０〜２４時間での血清半減期期間の除去で、約１８分から約２０時間まで延びる。Ｎａｋａｏｋａ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ４６：２５３〜２６１（１９９７）；Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｂ．Ｍ．、Ｔ．Ｈ．Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ、およびＨ．Ｄ．Ｈｕｍｅｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３４：Ｆ４４５（１９７８）．ＰＥＧの腎臓クラアランス速度は、正常腎臓における糸球体濾過速度によって制御される。腎臓糸球体の血管壁は，血液循環を通じ腎臓中に蓄積し得るイオン性および非イオン性物質に対するフィルターとして機能する。これら分子の排泄は，分子サイズ（３〜５ｎｍ）および電気荷電の関数であり得る。腎臓の糸球体濾過は、タンパク質については６６〜６８ｋＤａより小さく（荷電および分子サイズに起因する）、そしてＰＥＧにつては＜３０ｋＤａ（非イオン性のランダムコイル分子についてのみ分子サイズに起因する）である。ＰＥＧの短い線状ストランドは高いクリアランス速度を有するが、大きな線状ＰＥＧ、複数アームＰＥＧ、およびＰＥＧ化タンパク質は、より遅いクリアランス速度を有する。腎臓クリアランス速度におけるこの差異は、構造サイズにおける増加、水力学的容量、および分子の総荷電における変化が原因であり得る。ＭＷ＜５０ｋＤａをもつＰＥＧは、代表的には、腎臓クリアランスに類似である、増加するＭＷとともに減少した肝臓クリアランス有し、ＭＷ＞５０ｋＤａのとき、肝臓クリアランスは増加する。Ｉｋｅｄａ、Ｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８３：６０１〜６０６（１９９４）。
【００４１】
３．ＰＥＧ複合体
ＰＥＧは、例えば、以下の一般ＰＥＧ試薬、薬物結合部位、および連結を用いて当該技術分野で一般に公知のように薬物に結合され得る。
【００４２】
【表１】
2009507228.tif 000017
例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ａ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：６２〜６９（１９９５）を参照のこと；また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｃａｔａｌｏｇ．ｐｄｆおよび本明細書中の論議を参照のこと。
【００４３】
ＰＥＧエステルは、一般に、反応体の特定の相対分子量に依存して、ｐＨ８〜９．５、室温で３０分以内にリジンまたはアミン保有化合物に結合され得る。薬物あたり１〜１０モル量の反応体が一般的であり、ｐＨの増加とともに反応の速度が増加し、そしてｐＨの低下とともに反応の速度が減少する。
【００４４】
ＰＥＧアルデヒドは、シアノボロハイドライドナトウリムなどのような還元剤の存在下で一級アミンと還元的アミノ化反応を受ける。その他の親電子的に活性化される基とは異なり、ＰＥＧ保有アルデヒド基は、代表的には、温和な条件下（ｐＨ５〜１０、６〜３６時間）で、アミンとのみ反応する。ｍＰＥＧアルデヒドはまた、ポリビニルアルコールのヒドロキシル基とアセタール結合を形成するために用いられている。ＢｕｔｙｒＡＬＤと生物学的に活性な薬剤のアミン基との間のＰＥＧ化は、二級アミン結合を提供するための還元的アミノ化を含む。当該技術分野で周知のように、アミンは、窒素原子に結合する有機基の数に従って、１級、２級、または３級として分類される。還元的アミノ化は、ＰＥＧと生物学的に活性な薬剤との間のイミン結合（−Ｃ＝Ｎ；別名  Ｓｃｈｉｆｆ塩基）の形成、その後の２級アミン結合を提供するためのイミンの還元を含む。この還元ステップは、通常、還元剤、例えば、シアノボロハイドライドナトリウムの添加により達成される。
【００４５】
スルフヒドリル−選択的ＰＥＧ試薬、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、およびチオールは、その他のチオール含有化合物、例えば、アミノ酸システインと反応する。ＰＥＧ−チオール試薬の使用は、タンパク質およびペプチドのシステイン側鎖へのジスルフィド−架橋ポリマー複合体を形成する。チオール基へのマイレイミドの結合は高度に特異的であり、そしてそれ故有用な反応であり、その他の官能基の存在下、温和な条件下で生じる。代表的な反応条件は、ｐＨ７〜８、わずかにモル過剰のＰＥＧ、および室温で０．５〜２時間の反応である。立体的に妨害されたスルフヒドリル基について、反応時間は、顕著により長くあり得る。ビニルスルホンおよびマレイミド基は、ｐＨ７付近でスルフヒドリル基との反応に選択的である。アミン基との反応は、より高いｐＨで進行するが、なお相対的に遅い。マレイミドは、ビニルスルホンより反応性である。
【００４６】
２官能性試薬ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳおよびＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬもまた、例えば、最初アミノ基をＮＨＳエステルに結合することにより、次いで、スルフヒドリル基を結合することによる架橋剤として用いられ得る。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳの利点は、ビニルスルホンの加水分解安定性が、それを、アミン−ＰＥＧ化、次のチオール−ペグ化のための代替の候補にすることである。ヘテロ官能性ＰＥＧは、つなぎ、架橋、および複合体化の可能性を提供する。代表的には、ＮＨＳエステルが、最初、アミン含有部分に結合される。アミンの保護および結合が、次いで、実施される。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはその他の一般の酸での処理により容易に除去され得る。Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳは、Ｆｍｏｃ保護を好む顧客のために提供される。
【００４７】
前述のＰＥＧ試薬および反応へのさらなる理解および洞察は：Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｍ．Ｄ．ら、「ポリ（エチレングリコール）の加水分解により分解可能な炭酸誘導体」、米国特許第６，５４１，０１５号、２００３年４月１日；Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｍ．Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、およびＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、「インサイチュで生成されるポリ（エチレングリコール）アセトアルデヒド水和物を用いる還元的アミノ化。キトサンおよびリゾチームへの適用」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４６〜１４４９（１９９８）；Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｍ．Ｄ．ら、「ポリ（エチレングリコール）アルデヒド水和物および関連ポリマーならびにアミンを改変することにおける適用」、米国特許第５，９９０，２３７号、１９９９年、１１月２３日；Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ｍ．Ｄ．ら、「立体的に妨害されたポリ（エチレングリコール）アルカノール酸およびその誘導体」、米国特許第６、４９５，６５９号、２００２年１２月１７日；Ｂｕｃｋｍａｎｎ、Ａ．ら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）；Ｃｏｒｄｅｓ、Ａ．およびＭ−Ｒ．Ｋｕｌａ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．３７６：３７５（１９８６）；Ｅｉｄｅｌｍａｎ、Ｏ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０（Ｃｅｌｌ  Ｐｙｓｉｏｌ  ２９）：Ｃ１０９４（１９９１）；Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｒ．Ｊ．およびＮ．Ｖ．Ｋａｒｔｒｅ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３（１９９０）；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｒ．Ｂ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１０１〜１６１（２０００）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）；Ｋｉｎｓｌｔｅｒ、Ｏ．Ｂ．ら、「Ｎ−末端が化学的に改変されたタンパク質組成物および方法」、米国特許第５、８２４、７４８号、１９９８年１０月２０日；Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．およびＡ．Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ、「基部反応基をもつポリ（エチレングリコール）誘導体」、ＷＯ９９／４５９６４、１９９９年９月１６日；Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３０（２）：３５６（１９８９）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．ら、「分子および表面への結合のための複数アームの１官能性ポリマー」、米国特許第５，９３２，４６２号、１９９９年、８月３日；Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．ら、「プロピオン酸またはブタノール酸で一置換されたポリ（エチレングリコール）および関連ポリマーならびに生物工学適用のためのその機能的誘導体」、米国特許第５，６７２，６６２号、１９９７年９月３０日；Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）；Ｈｅｒｍａｎ、Ｓ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５：２０３〜２０９（１９９４）；Ｋｏｇａｎ、Ｔ．Ｐ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）；Ｌａｌａｎｏｓ、Ｇ．Ｒ．およびＪ．Ｖ．Ｓｅｆｔｏｎ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．２４：６０５５（１９９１）；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ、Ｃ．ら、「タンパク質修飾のための分岐モノメトキシポリ（エチレングリコール）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：６２〜６９（１９９５）；Ｎａｇａｏｋａ、Ｓ．ら、「抗トロンボゲン形成生物医療材料」、米国特許第４，４２４，３１１号、１９８４年１月３日；Ｎａｋａｍｕｒａ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１６７９２（１９８６）；Ｏｋａｄａ、Ｈ．およびＩ．Ｕｒａｂｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３６：３４（１９８７）；Ｏｌｓｏｎ、Ｋ．ら、ポリ（エチレングリコール）、化学および生物学的適用、Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、１９９７、１７０〜１８１；Ｐｉｌｌａｉ、Ｖ．Ｎ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４５：５３６４（１９８０）；Ｒｏｍａｎｉ、Ｓ．ら（１９８４）、ペプチドおよびタンパク質の化学、Ｗ．Ｖｏｅｌｔｅｒら、編、第２巻、２９頁、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ；Ｉｓｈｉ、Ｙ．およびＳ．Ｓ．Ｌｅｈｒｅｒ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５０：７５（１９８６）；Ｓａｗｈｎｅｙ、Ａ．Ｓ．、Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ、およびＪ．Ａ．Ｈｕｂｂｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１（１９９３）；Ｓｅｐｕｌｃｈｒｅ、Ｍ．ら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８４：１８４９（１９８３）；Ｔｏｐｃｈｉｅｖａ、Ｉ．Ｎ．ら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．２４：８９９（１９８８）；Ｕｒｒｕｔｉｇｏｉｔｙ、Ｍ．およびＪ．Ｓｏｕｐｐｅ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２：１４５（１９８９）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  １２：１９７〜２０７（１９９７）；Ｗｉｒｔｈ、Ｐ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９：１３３（１９９１）；Ｙａｎｇ、Ｚ．、Ａ．Ｊ．Ｍｅｓｉａｎｏ、Ｓ．Ｖｅｎｋａｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｓ．Ｈ．Ｇｒｏｓｓ、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、およびＪ．Ｒｕｓｓｅｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：４８４３（１９９５）；Ｙｏｋｏｙａｍａ、Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２７５（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．およびＧ．Ｂａｒａｎｙ、Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍ．５：２２７（１９９０）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．ら（１９８５）、ペプチド：構造および機能、Ｖ．Ｊ．ＨｒｕｂｙおよびＫ．Ｈ．Ｋｏｐｐｌｅ、編、２５７頁、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．およびＣ．Ｌｅｅ、「ポリ（エチレングリコール）化学：生物工学的および生物医療的適用」、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、編、Ｐｌｅｎｕｍ、ＮＹ、１９９２、２１章；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５（１９９５）；およびＺｈａｏ、Ｘ．およびＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、ポリ（エチレングリコール）化学および生物学的適用、Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、編、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、１９９７、４５８〜４７２；Ｚｈａｏ、Ｘ．およびＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４５０〜１４５８（１９９８）���見い出され得、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。
【００４８】
当業者が認識するように、特定の複合体化条件は、薬物の正確な化学的性質、所望の程度のＰＥＧ化、および用いられる特定のＰＥＧ試薬に依存して変動する。ＰＥＧ試薬の選択において考慮する因子は：（１）結合のための所望の官能の点（アミン、カルボキシル、Ｎ−末端、チオールなど）；（２）加水分解安定性、活性、薬物動力学、複数のＰＥＧ種、位置−ＰＥＧ異性体、および複合体の免疫原性；および（３）分析の適合性を含む。
【００４９】
４．ＰＥＧ化産物の精製
合成の後、ＰＥＧ化化合物は、当該技術分野で公知の種々の標準的な技法の任意の１つ以上、例えば、抽出、沈殿／（再）結晶化、電気泳動、クロマトグラフィー、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ技法を用いて精製され得る。前述の参考文献の多くはまた、これら技法の詳細を記載し、これらは、精製されたＰＥＧ化薬物が投与される患者または細胞または組織培養への投与およびそれからの一時的サンプリングの後、ならびに本発明によるＭＳ技法におけるフラグメント化およびソーティングの前に、繰り返され、そして／または改変され得る。
【００５０】
５．ＰＥＧ複合体化薬物の処方および投与
本発明のＰＥＧ化薬物の処方および投与は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（最新版）、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（最新版）に記載されるように、ならびに前述の参考文献中でさらに論議および記載されるように、当該技術分野で周知の技法に従って行われ得る。投与の正確な処方および様式は、薬物自体の特定の化学的性質および安定性、意図される生物学的作用の部位、およびこの薬物がどのように処方されるかに依存する。それ故、本発明の薬物は、例えば、非経口（Ｉ．Ｖ．）、経口、局所、エアロゾル、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸、膣、腫瘍内、または腫瘍周辺投与を含む種々の技法によって処方および投与され得る。多くの適用では、非経口投与が好ましい。薬学的組成物は、特定化合物の所望の溶解度を達成するための従来のｐＨ操作、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸作製、すりつぶし、乳化、カプセル化、包括または凍結乾燥および水和の１つ以上を利用して製造され得る。薬学的に受容可能な組成物は、薬学的に用いられ得る調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む、１以上の生理学的に受容可能な塩もしくはキャリアを用いて処方され得る。注入のためには、上記薬剤は、水溶液、好ましくは、各々が当該技術分野で周知であるような、Ｈａｎｋｓの溶液、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、または生理学的塩溶液のような、生理学的に適合性の緩衝液中に処方され得る。経粘膜投与には、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が、処方物中に用いられる。このような浸透剤は、当該技術分野で一般に公知である。
【００５１】
「薬学的に受容可能な塩」は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、およびプロタミン亜鉛の塩を含む薬学産業で一般に用いられる、非毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩をいい、これらは、当該技術分野で周知の方法によって調製される。この用語はまた、非毒性の酸付加塩を含み、これらは、一般に、本発明の化合物を適切な有機または無機酸と反応することにより調製される。代表的な塩は、塩酸塩、臭素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシレート（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）などを含む。
【００５２】
「薬学的に受容可能な酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および性質を保持し、そして生物学的ではないか、またはそうでなければ所望されないのではないような塩をいい、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸のような有機酸と形成される。
【００５３】
「薬学的または治療的に受容可能なキャリア」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、そして宿主または患者に毒性でないキャリア媒体をいう。
【００５４】
本発明の組成物に適用されるとき「治療的−または薬学的に−有効な量」は、所望の生物学的結果を誘導するに十分な組成物の量をいう。その結果は、症状、徴候、または疾患の原因、または生物学システムの任意のその他の所望の改変の緩和であり得る。
【００５５】
６．分析物および分析物獲得および調製
本発明の薬物が、生物学的システム、例えば、細胞または組織培養または患者に投与された後、分析物サンプルは、このシステムから種々の時間で引き抜かれ得、薬物の進行または薬物動力学的運命をエクスビボでモニターする。細胞および組織培養には、薬物に依存して、これは、培養滲出液などのいくらかを引抜くことなど、細胞を溶解すること、およびフェノールまたはフェノール：クロロホルムでのさらなる有機抽出、または薬物を濃縮するための沈殿ステップの有りまたはなしで、溶解液からサンプルをとることを内含する。滲出液または細胞抽出物の他に、このサンプルはまた、例えば、血液、尿、唾液またはその他の流体サンプルであり得、本発明によるフラグメント化および検出技法にサンプルを提示する前に類似の沈殿および／または有機抽出を受ける。
【００５６】
７．液体クロマトグラフィー
クロマトグラフィーは、一方は通常静止または不動の、そして他方は流動性または移動する２つの混合できない相の間の溶質の異なる親和性に依存する分子混合物を分離するための一群の方法を含む。一般的にいえば、５つの異なるクロマトグラフィーの様式−吸着、分配、イオン交換、サイズ排除、および親和性があり、これらは、異なる化合物の分子量、形状、サイズ、溶解度、ｐＫａ、疎水性、荷電および極性の１つ以上における差異を利用する。例えば、Ｂａｉｌｅｙ、Ｌ．Ｃ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、３３章を参照のこと。本発明の特に好ましい実施形態では、分析物は、ＭＳを用いるさらなる分離／評価の前に、クロマグラフィー分離デバイス上を移動される。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明は、化合物の混合物を保持する液体分析サンプルを受け得る液体クロマグラフィー（ＬＣ）技法を企図し、そしてこれら化合物を上記に記載の原理に基づき分離する。好ましくは、そして速度および効率のために、用いられる技法は、高速液体クロマグラフィー（ＨＰＬＣ）であり、ここで、移動相は、高圧、例えば、１０００〜５０００ｐｓｉの下にあり、代表的には５０ｕｍ以下の粒子直径をもつパックされたカラムを通じて押される。
【００５８】
吸着原理に基づく場合、このカラムは、親和性の増加する順で、例えば、シュークロース、スターチ、イヌリン、タルク、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、マグネシア、シリカゲル、ケイ酸マグネシウム、アルミナ、および活性炭でパックされる。移動相のための溶媒選択は、溶質の性質および静止相に対して選択され、そして代表的には溶出親和性（ｅｌｕｏｔｒｏｐｉｃ）値、すなわち、アルミナ上の単位表面積あたりの吸着の相対的エネルギーに従って選択される。例えば、非常に極性の化合物の群がシリカゲルを用いて分離されるべき場合、溶媒は、溶質と表面との間の強力な誘引に打ち勝つに十分極性でなければならず、または非常に大きな保持時間が生じる。より弱い極性の溶質の混合物が分析されるべき場合、より弱い溶媒が、カラム上のより長い滞留時間および相の間のより大きな平衡を許容するために用いられなければならない。相対的溶解度、誘電性値および溶出親和性値をもつ例示の溶媒は、以下の表Ｂに示される。
【００５９】
【表２−１】
2009507228.tif 000018
【００６０】
【表２−２】
2009507228.tif 000019
当業者は、前述の溶媒およびそのグラジエントの異なる組み合わせがまた分離を行うために用いられ得ることを認識する。
【００６１】
分画に基づく場合、表Ｂに記載される同じ溶媒の使用を含む類似の原理が、しかし、２つの様式：順相および逆相で適用される。順相様式では、静止相は極性物質であり、そして移動相は非極性である。これらの状況の下、極性化合物は優先して遅延され、そして非極性物質はより迅速に溶出する。逆相クロマグラフィーでは、静止相は非極性（例えば、オクタデシルシリル、「ＯＤＳ」）であり、そして移動相は極性、通常、水、メタノールおよび／またはアセトニトリルの混合物である。非極性化合物は、このシステムによってより強力に保持され、極性溶質が最初に溶出する。当業者は、分離効率がまた、カラム長さおよび直径に依存することを認識する。
【００６２】
上記の技法を用い、これは、必要に応じて、当該技術分野で公知であり、そして市販され入手可能であるように、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ８、およびＣ１８のサイズ排除カラムの使用と組み合わされ得、標準物を流し、そして異なる溶出時点でのこれら種の存在についてアッセイすることにより所定の分子種の保持時間を決定することが可能である。例えば、純粋なＰＥＧ化薬物、非ＰＥＧ化薬物およびＰＥＧ反応体（単数または複数）を流し得、保持時間を決定し、これは、次に、生物学的分析物溶液中のこれらの保持時間を予測するために用いられ得る。一旦、保持−溶出プロフィールが知られると、サンプルは、互いに整合され、そして便利に、さらなる分析のために本発明のＭＳシステムに流され得る。
【００６３】
質量分光測定法
１．定義
原子質量単位（ａｍｕ）：ダルトン（Ｄａ）に相当する。１ａｍｕ＝１Ｄａ＝１．６６５４０２×１０−２７＋／−０．５９ｐｐｍ。
【００６４】
分析器：イオンが、それらのｍ／ｚ比に基づき分離される質量分光測定器の領域。
【００６５】
平均質量：分子中の原子の同位体質量の平均の合計。
【００６６】
衝突活性化解離：別名、衝突誘導解離、これは、これによって前駆体イオンが、中性ガスとの衝突を受けるようにされ、制御されたフラグメント化を生成する技法である。
【００６７】
一定中性損失走査：これによって、予備選択された質量の中性フラグメントを失ったイオンが、四極子タンデム質量分光測定器の第２の分析器をオフセットすることにより検出される技法（例えば、リン−セリンまたは−スレオニンからのｍ／ｚ４９または９８、リンチロシンからのｍ／ｚ４０または８０の損失）。第２の分析器を走査するこのオフセット方法は、質量を、所定の中性質量を失ったこれらの「前駆体」イオンのみに割り当てる。注記：この技法は、ナノスプレーとして予備分離のないサンプルを分析できる。
【００６８】
娘イオン（旧）：産物イオン（新）と同意語であり、特定の親イオンから生成される電気的に荷電したフラグメントイオンである。
【００６９】
ダルトン（Ｄａ）：単位分子量と同一である。しばしば、生物学者によって、キロダルトンおよび短縮されたｋＤａとして表現される。このダルトンおよび原子質量単位（ＡＭＵまたはａｍｕ）は、両方が質量の単位であり、そして本質的に同じである：１ａｍｕ＝１Ｄａ＝１．６６５４０２×１０−２７ｋｇ＋／−０．５９ｐｐｍ。しかし、それらは、異なる文脈で伝統的に用いられる：平均同位体質量を取り扱うとき、化学両論的算出で一般に用いられるとき、Ｄａが好まれ；質量分光測定法では、各元素の主要同位体をいう質量は、ａｍｕまたはｕで用いられ、そして表現される。イオン荷電Ｚ＝１のとき、Ｄａまたはａｍｕは、ｍ／ｚに等価である（別名、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｔｈ））。
【００７０】
正確（別名、的確）な質量：プロトンおよび中性子プラス核結合エネルギーの合計。
【００７１】
完全質量走査：四極子タンデム質量測定器の第１ステージにおけるすべてのイオンの分析。
【００７２】
グラムモル：グラムで表現された分子のＡｖａｇａｄｒｏ数。
【００７３】
グラム分子量、別名モル質量：１モル（６．０２×１０２３分子）のグラム重量。
【００７４】
グラム原子重量：１グラム原子（６．０２×１０２３原子）のグラム重量。
【００７５】
同位体：（通常）１だけ質量が異なる同じ原子数をもち、そしてほぼ同一の化学的性質を所有する原子。
【００７６】
ＭＡＬＤＩ：マトリックス支援、レーザー脱着イオン化。レーザーと、通常、分析物と同時結晶化されるとき、イオン化および脱着プロセスを支援するこのレーザーの波長の近傍の吸収を有する通常結晶有機酸である添加された溶質との組み合わせた使用。
【００７７】
質量欠損：公称と正確な質量との間の差異。１の例外があり、核の実際の質量は、形成のエネルギーに起因してそれに寄与する遊離中性子およびプロトンの質量の合計とは常に異なる。この質量欠損は、正の値および負の値の両方をとり得る。
【００７８】
質量分光測定法：（新）通常、イオン信号の直接増幅による、イオンの荷電に対する質量の比（ｍ／ｚ）の測定。
【００７９】
質量分光学：（旧）感光性ガラスプレートを用いる質量スペクトルの記録を記載するために用いられる用語。
【００８０】
分子質量、別名分子量：炭素１２．０００００に対する原子量の合計。それ故、プロトンの質量は１．００７２；水素の質量は１．００７８．
モノ同位体質量：分子中の原子の最も軽い安定な同位体の正確または的確な質量の合計。
【００８１】
公称質量：原子中の核子の全体合計（原子質量数とも呼ばれる）。
【００８２】
Ｍ／Ｚまたはｍ／ｚまたはｍ／ｅ：別名、「Ｔｈｏｍｐｓｏｎ」（Ｔｈ）：イオンに関する元素価の正確な整数倍数である「ｚ」または「ｅ」をもつイオンの荷電に対する質量の比。それは、単位値、１、２、３．．．などをとる。イオンに関する実際の正味の荷電は、ｚｅとして与えられ、ここで、ｅ＝１．６０２×１０−１９Ｃｏｕｌｏｍｂである。荷電は、電子の獲得または損失によって、またはプロトンまたは金属イオンの獲得または損失によって生じ得る。
【００８３】
ナノスプレー：２０〜５０ナノリットル／分の大きさの低い流れを達成するために引っ張られ、そして被覆されたガラスキャピラリーを利用する特別のタイプの電子スプレー。
【００８４】
親イオン（旧）：前駆体イオン（新）と同意語であり、それからフラグメントが生成され、そして分析されるイオンである。親イオンは、電気的に荷電された分子イオンまたは分子イオンの荷電されたフラグメントであり得る。
【００８５】
正確度％：（真の質量−観察質量）／真の質量×１００。しばしば、百万あたりの部数（ｐｐｍ）で表現され、例えば、０．０１％正確度＝１００ｐｐｍである。これ故、１０００ダルトンのペプチドに対する１００ｐｐｍの誤りは、０．１ダルトンである。
【００８６】
供給源後崩壊分析：別名ＰＳＤ、この技法は、ＭＡＬＤＩプロセスの間のイオンの内部エネルギーにおける増加を利用する。十分なエネルギーとともにフラグメントに供給源を去ったイオンは、「準安定性」イオンと称される。通常、場−フリー領域で生じるフラグメント化は、このフラグメントのイオンを検出器で焦点にもたらすために段階的様式でリフレクトロン（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）の電圧に対する供給源の比を調節することによりリフレクトロンを用いて分析され得る。ＰＳＤ／ＣＡＤ方法を生成するための衝突セルともまた組み合わされる。
【００８７】
前駆体イオン走査：単一またはタンデム四極子モードで実施されるか否かに依存して、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）とも呼ばれる。この方法は、それらの検出のための目的のイオンによる特定の特徴的損失を利用する。例として、ＳＩＭモードでは、四極子分析器は、このイオンのｍ／ｚ特徴をもつフラグメントのみを通過するよう設定される。それ故、標的イオンが供給源中に存在するときのみ、信号が検出される。四極子の走査は必要でないので、これは、非常に高感度の技法である。
【００８８】
四極子分析器：それによってＲＦおよびＤＣ場が所定のｍ／ｚのイオンのビームを通過するための安定性の領域を生成するために用いられる４つの極の物理的配列。この四極子は、しばしば、質量フィルター（２、３）と称される。
【００８９】
分解能：類似の質量の２つのイオンの分離の量。
【００９０】
解像力：類似の質量の２つのイオンを分離する機器の能力。一般に、これは、いくつかの方法で測定され得る。（１）１０％谷（ｖａｌｌｅｙ）。これは、２つのピーク質量が１０％の谷によって分離されるときこれらの間の差異としてとられる。（２）５％幅。これは、質量単位において５％幅によって割られるピーク質量として表現される、ベースラインの上のその高さの点５％でのピーク幅としてとられ、そして１０％谷の定義に本質的に等価であると考えられる。（３）全幅、半分質量（ＦＷＨＭ）。これは、ベースラインの上の点５０％でピークの幅によって割られるピーク質量により得られる値である。これは、通常、１０％谷の定義の２倍の大きさの数を与える。
【００９１】
供給源：イオン化が起こる質量分光測定器の物理的部分。
【００９２】
調査走査（専門用語）：所定量だけ異なるイオンの選択的フラグメント化を可能にする技法をいう。この方法は、中性損失実験の四極子／飛行の時間の等価物である。
【００９３】
タンデム質量分光測定法：質量分析の精緻な形態であり、それによって、第１ステージの分析器中のイオンのｍ／ｚ値に従って分離されるイオンが、フラグメント化および第２の分析器中で分析されるフラグメントについて選択される。
【００９４】
トンプソン（Ｔｈ）：ときどき、ｍ／ｚの無次元値のために用いられる。ここでｍは質量であり、そしてｚは、整数値として荷電の数、例えば、１、２、３．．．を表す。
【００９５】
統一された質量スケール：ＩＵＰＡＣ＆ＩＵＰＡＰ（１９５９〜１９６０）炭素の最も豊富な形態の質量の１／１２に等しい      単位値で同意された無次元数。
【００９６】
２．概説
質量分光測定法では、中性物質、例えば、分析物がイオン化照射を受け、そして得られるイオンの質量が、それらを静電気的に、次いでそれらの質量−荷電比（ｍ／ｚ）を基礎にしてそれらをソートおよらび測定する分析器にそらすことによって決定される。このプロセスを容易にすることは、サンプルが相対的に高圧から相対的に低圧に推進されるように減圧の維持である。図１は、存在する種々のＭＳシステムの共通の構成要素を示し、方向の意味で、１  サンプル入口、２  イオン化供給源、３  分析器、および４検出器を含む。図２は、ＥＩ／磁性分析器の実施形態を示す。図３は、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムを示す。
【００９７】
多くの異なるイオン化技法、例えば、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）、大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーダー脱着／イオン化（ＭＬＬＤＩ）、急速原子／イオンボンバードメント（ＦＡＢ）、電子イオン化（ＥＩ）、および化学的イオン化が存在するけれども、本発明の好ましい実施形態は、ＥＳＩを採用する。図３を参照のこと。ＥＳＩは、液体溶液からガス状イオン化分子を直接生成し、そして電場の存在下、高度に荷電した液滴の微細なスプレーを生成することにより作動する。サンプル溶液は、約７００〜５０００Ｖの電位で維持される金属ノズルの先端部でスプレーされる。
【００９８】
出願人は、ＥＳＩの間の電圧の操作が、イオン化を許容するのみならず、ＰＥＧ化産物の８９、１３３、１７７、および２２１ａｍｕの予測可能なＰＥＧ成分へのフラグメント化を容易にすることを発見した。供給源の電圧を操作することにより、１つ以上の先行するａｍｕスパイクについてまた、選択的に選択し得る。これらは、次いで、個々に、または集合的に、イオン化およびフラグメント化の前に生物学的分析物中の薬物の量のプロキシ（代理）または代用の尺度として用いられ得る。
【００９９】
とにかく、電位が付与されるノズルは、溶液を荷電された小滴の微細にスプレーに分散する。乾燥ガス、熱、または両方が、大気圧でこれら小滴に付与され、溶媒を蒸発させ、荷電密度、および同様に荷電された粒子間の得られるクーロン反発における結果としての増加をともなう。これが表面張力を超えるとき、これら荷電された粒子は、質量分析器の減圧に至る静電気的レンズに向かって散乱する。代表的には、上記ノズルは、汚染の可能性を最小にし、そしてイオンの選択性を最大にするように分析器に対して直交して位置決めされる。
【０１００】
上記プロセスで用いられる溶媒は、目的の化合物の溶解度、溶媒の揮発度、およびプロトンを寄付する溶媒の能力に依存する。代表的には、メタノール、５０／５０メタノール／水、または５０／５０アセトニトリル／水のようなプロトン性の主な溶媒が用いられ、その一方、非プロトン性共溶媒、例えば、水またはイソプロパノール中の１０％ＤＭＳＯが、化合物溶解度を改善するために用いられる。
【０１０１】
どのようにイオン化が生じるかにかかわらず、得られるイオンは、代表的には、減圧圧力下で質量分析器中に供給され、そして静電気的および／または磁力を用いて荷電および質量によって分離される。四極子機器が最も一般的である。それらは、代表的には、１つの対が１つの横断方向電場軸（Ｘ）を規定し、そして別の対が別の横断方向電場軸（Ｙ）を規定するように配列された４つの実質的に平行のロッドからなる電場フィルターを有する。１つの場は高周波（ＲＦ）場であり、そして他方は直流（ＤＣ）場であり、その各々は、これら平行ロッドの長さの横断方向に走る。三重の四極子ＭＳ形態では、３つの四極子が連続的に整列され、代表的には、中央の四極子は、それがイオン性化合物のより小さなイオン性化合物および産物への計画的なフラグメント化を生成するよう設計されている衝突チャンバーとして供される限りで特有にされている。例えば、ＭａｒｓｈａｌｌのＡｂｓｔｒａｃｔを参照のこと。
【０１０２】
代表的な四極子デバイスでは、イオン化および／またはフラグメント化サンプル種は、負の減圧圧力下でロッドの長さを移動する。移動の経過の間に、上記のような異なる静電場によることに基づき、適正な質量：荷電（ｍ／ｚ）値のイオンのみが、その後検出されるべき全ロッド長さを首尾よく移動するように作動される。１つの対のロッドは、低すぎるｍ／ｚ比のイオンをなくする「高パス」フィルターとして機能し、そしてロッドの他方の対は、高すぎるｍ／ｚ比のイオンをなくする「低パス」フィルターを構成する。
【０１０３】
稼動し得る少なくとも２つの質量分光測定法のモードが存在する。１つは、「ＳＩＭ」モードであり、これは、Ｓｉｇｎａｌ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒモードの略である。ＳＩＭモードでは、単一イオンまたはフラグメントが、ＬＣ／ＭＳ中で化合物の濃度をモニターまたは測定するために追跡される。他方の共通のモードは、「Ｓｃａｎ」モードであり、そこでは、各時間データ点における所定範囲の質量スペクトルがＬＣ／ＭＳ稼動の間に測定される。出願人は、単純定量について、ＳＩＭモードが、Ｓｃａｎモードより高感度かつ選択的であることを見い出した。
【実施例】
【０１０４】
化合物合成および調製
生物学的に活性な量のＰＥＧ化ペプチドダイマーは、本出願人が所有する２００４年５月１２日に出願された出願ＵＳＳＮ１０／８４４，９６８（ＵＳ２００５１３７３２９）、およびこれもまた、２００４年５月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８８（ＷＯ２００４１０１６００）に記載されるように本質的に合成され、そして調製され、これらは、本明細書中に参考として援用される。
【０１０５】
化合物投与
上記化合物は、次いで、０．０５ｍｇ／ｋｇ（ｋｇ体重あたり０．０５ｍｇの化合物）〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲でラットに静脈内投与される。［この一般的スキームはまた、その他の動物、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、イヌ、サルなど、およびその他の投与経路、例えば、皮下、鼻、または肺を経由して作動する。］
血漿抽出
血液サンプル（標本に依存して、約３００ｕｌ〜１０ｍＬ）を、次いで、種々の時点で引抜き（例えば、５分、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４８時間、１７２時間、１９６時間など）、そしてこれらサンプルをヘパリンと混合し、そしてサンプリング後、直ちに遠心分離される（例えば、８０００ｒｐｍで１０分間）。サンプルを、次いで、個々の標識されたバイアルに移し、そして必要とされるまで−２０℃に維持される。
【０１０６】
ＨＰＬＣ／ＭＳ／サンプル調製
１）１セットのサンプルを室温に持ち出す。
２）血漿サンプルを３０秒間ボルテックスする。
３）１００μｌの血漿サンプルを深いウェルの９６プレートに移す。
４）サンプルウェルあたり２００μｌの酸性化アセトニトリル（０．１％ギ酸）を添加する。
５）プレートをシールし、そしてプレートをシェーカーに２分間置く。
６）４０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離する。
７）ウェルあたり２００μｌの上清をフィルタープレートに移し、そして２分間遠心分離する。
８）収集プレートから７５μｌのサンプルを最終分析プレートに移し、そして７５μｌの移動相Ａ（０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏ）を添加する。
【０１０７】
ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ機器使用
ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００
ＭＳ／ＭＳ：ＳｃｉｅｘからのＡＰＩ−４０００質量分光計
カラム：Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによるＰＬＲＰ−Ｓ  １０００Å  ８μｍ  ５０×２．１ｎｎ。
【０１０８】
ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法
移動相Ａ：０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ギ酸／アセトニトリル
流速：３００μｌ／分
カラム温度：３５℃
グラジエント
時間            移動相Ｂ
０〜０．５分      ２５％
６．０分          ９５％
８．０分          ９５％
８．１分          ２５％
１５．０分        ２５％。
【０１０９】
任意の単一の四極子、イオントラップまたは三重四極子または供給源内（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）フラグメント化能力を備えたその他の質量分光器が、次いで、ＰＥＧ化化合物検出のために用いられ得る。出願人は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ／ＭＳＤ単一四極子質量分光器をホジティブモードで用いた。フラグメント化器＝２００、ゲインＥＭＶ＝１０、ＳＩＭ解像度＝低、スプレーチャンバーガス温度＝３５０℃、乾燥ガス＝９ｌ／分、噴霧器圧力＝４０ｐｓｉｇ、Ｖｃａｐ（ポジティブ）＝３５００Ｖ、ＳＩＭ  Ｉｏｎ＝４４ｎ＋１、ｎ＝２、３、４、５．．．、ＳＩＭ  Ｉｏｎは、８９、１３３、１７７、２２１、２６４、などであり得る。
【０１１０】
以下のスペクトルは、本発明の有用性を示す。第１は、標準的な質量スペクトルパラメーターを用いるＰＥＧ化化合物の質量スペクトルである。第２は、本発明による供給源内フラグメント化の質量スペクトルであり、これは、顕著により明確および認識可能であるピークを有する。これらの特定のスペクトルは、生物学的投与およびサンプリングの前にとられたエクスビボのサンプリングから生成された。
【０１１１】
【表３】
2009507228.tif 000020
各々のＰＥＧフラグメントのピークの大きさは、複合体化された化合物、例えば、薬物または薬物候補のモル量に比例するので、その化合物の量および運命は、経時的に簡便に追跡され得る。
【０１１２】
前述の実施例は、制限的ではなく、そして本発明の種々の局面および実施形態の単なる代表例である。
【０１１３】
引用されるすべての文献およびウェブ頁は、それらの全体が本明細書中に参考として援用され、そして本発明が関係する技術分野のレベルの指標であるが、いずれもが先行技術であることを認めるものではない。当業者は、本発明が目的を実施し、そして陳述される結果および利点、ならびにその中に内在するものを得るために良好に適合されることを容易に認識する。記載される方法および組成物は好ましい実施形態を示し、例示であり、そして本発明の範囲に対する制限としては意図されない。
【０１１４】
特定の改変およびその他の使用が当業者に生じ、そして特許請求の範囲によって規定される本発明の思想内に包含される。本明細書中に記載される試薬は、市販され入手可能であるか、または当業者に公知の慣用の手順を用いて過度の実験なくして容易に産生可能であるかのいずれかである。
【０１１５】
本明細書中に適切に例示によって記載される本発明は、本明細書中に詳細に開示されていない任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下で実施され得る。それ故、例えば、本明細書中の各事例において、任意の用語「包含する」、「本質的になる」、および「からなる」は、他の２つの用語のいずれかで置換され得、特許法の下、異なる意味を与える。採用された用語および表現は、説明の用語として用いられ、そして制限ではなく、そしてこのような用語および表現の使用において、示され、および記載される特徴またはその一部分の任意の等価物を排除する意図はない。種々の改変が、請求項に記載される本発明の範囲内で可能であることが認識される。それ故、本発明は、好ましい実施形態によって詳細に開示されているけれども、開示される本発明中の思想の必要に応じた特徴、改変および変更が当業者によって参照され、しかも、このような改変および変更は、明細書および添付の請求項によって規定されるような本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【０１１６】
さらに、本発明の特徴または局面が、マーカッシュ群またはその他の代替の群分けの表現で記載されている場合、当業者は、本発明はまた、それによって、マーカッシュ群またはその他の群のメンバーの任意の個々のメンバーまたは亜群、そして個々のメンバーの排除の表現で記載されていることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１のＡ〜Ｄは、質量分光測定器の共通の供給源、分析器、および検出器構成要素を示す絵入りの図である。
【図２】図２は、ＥＩ／磁場分析器を示す。
【図３】図３のＡおよびＢは、２つのＬＣ／ＭＳ実施形態を示し、図３のＣ〜Ｅは、３つのエレクトロスプレーイオン化実施形態を描写する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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