(57)【要約】  本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）感染に対して子ブタを防御するための、ＰＣＶ−２に対するワクチン、およびそのようなワクチンの製造方法に関する。ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）のＯＲＦ−２タンパク質の少なくとも２０マイクログラム／用量を含むワクチンは、子ブタがＰＣＶ−２に対する比較的高い力価のＭＤＡを有する場合であっても、ＰＣＶ−２に対する（したがってＰＭＷＳに対する）防御免疫応答を惹起しうることが判明している。本発明のワクチンは組換えＯＲＦ−２タンパク質を含有することが可能であり、該組換えタンパク質は、好ましくは、昆虫細胞内のバキュロウイルス発現ベクターからの発現により産生され、該バキュロウイルス発現ベクターはＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２遺伝子配列を適当なプロモーターの制御下に含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）のＯＲＦ−２タンパク質を少なくとも２０マイクログラム／用量を含んでなる、ＰＣＶ−２に対するワクチン。
【請求項２】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）のＯＲＦ−２タンパク質を少なくとも５０マイクログラム／用量を含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
ＯＲＦ−２タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１または２記載のワクチン。
【請求項４】
ＯＲＦ−２タンパク質が昆虫細胞内のバキュロウイルス発現ベクターからの発現により産生され、該バキュロウイルス発現ベクターがＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２遺伝子配列を適当なプロモーターの制御下に含有する、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
プロモーターがｐ１０プロモーターである、請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
適切なアジュバントを更に含む、請求項１から５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
アジュバントが油及び水中油型エマルションである、請求項６記載のワクチン。
【請求項８】
アジュバントがビタミンＥを含有する、請求項６または７記載のワクチン。
【請求項９】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）のＯＲＦ−２タンパク質の少なくとも２０マイクログラム／用量で与えられる、ＰＣＶ−２  ＭＤＡ陽性である子ブタをＰＣＶ−２感染に対して防御することを意図したワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子ブタをブタサーコウイルス感染に対して防御するための、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ−２）に対するワクチンおよびそのようなワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＶ−２は、若いブタで見られる離乳後多重全身性消耗症候群（ｐｏｓｔ−ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＭＷＳ）に関連していると考えられている。この疾患は１９９１年にカナダで初めて見出された。その臨床徴候および病理学は１９９７年に公開されており（Ｃｌａｒｋら，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｗｉｎｅ．Ｐｒａｃｔ，１９９７：４９９−５０１，Ｈａｒｄｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｗｉｎｅ．Ｐｒａｃｔ，１９９７：５０３）、進行性消耗、呼吸困難、頻呼吸および時には黄疸を含む。Ｎａｙａｒら（Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７）は、ＰＭＷＳの臨床症状を有するブタにおいてブタサーコウイルスを検出し、ＰＫ−１５細胞の天然生息ウイルスとして認識されている公知ＰＣＶ以外のＰＣＶがＰＭＷＳに関連している可能性があると結論づけた。その後の刊行物（Ｈａｍｅｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８；Ｍｅｅｈａｎら，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８）はこれらの知見を証明しており、新規病原性ＰＣＶをＰＣＶ−２と命名し、一方、元のＰＫ−１５細胞培養分離体（Ｔｉｓｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２）をＰＣＶ−１と呼ぶべきだと提示された（Ｍｅｅｈａｎら，前掲）。ＰＣＶ−１およびＰＣＶ−２は、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する小さな（１７ｎｍ）二十面体非包膜ウイルスである。ＰＣＶ−２ゲノムの長さは約１７６８ｂｐである。世界の種々の地域に由来するＰＣＶ−２分離体は互いに密接に関連しているらしく、９５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を示す（Ｆｅｎａｕｘら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００）。ＰＣＶのＯＲＦ−２は該ウイルスの推定カプシドタンパク質をコードしている。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は２３３アミノ酸のタンパク質をコードしている。すべてのＰＣＶ−２分離体のＯＲＦ２は９１〜１００％のヌクレオチド配列同一性および９０〜１００％の推定アミノ酸配列同一性を共有している。ＰＣＶ−１とＰＣＶ−２とのＯＲＦ２遺伝子間では、わずか６５〜６７％のヌクレオチド同一性および６３〜６８％のアミノ酸配列同一性が存在するに過ぎない（Ｆｅｎａｕｘら，前掲）。ＰＤＮＳ（ブタ皮膚および腎症症候群）は、ＰＭＷＳとほぼ同時に現れる、養豚業者にとってのもう１つの大きな問題である。ＰＤＮＳの特徴は、通常は耳、脇腹、脚および腿における、出血を伴う赤／褐色の環状皮膚病変である。ＰＣＶ−２関連症候群および疾患の総説はＣｈａｅ．Ｃ（２００５）Ｖｅｔ．Ｊ．１６９  ３２６−３３６に記載されている。
【０００３】
ＰＭＷＳおよびＰＤＮＳのようなＰＣＶ−２関連疾患に対して子ブタを防御するワクチンが必要とされている。しかし、現在のところ、ＰＣＶ−２関連疾患に対する商業的に入手可能なワクチンは存在しない。伝統的には、不活性化全ＰＣＶ−２ウイルスに基づくブタ用の通常のワクチンが想定されるであろう。しかし、ＰＣＶ−２は細胞培養内で高力価までは複製されないため、ＰＣＶ−２の場合には事態は複雑となる。代替手段として、ワクチンを、ＰＣＶ−２に由来する組換え抗原に基づいたものとすることが可能であろう。ＰＣＶ−２タンパク質は種々の発現系において既に発現されている。例えば、Ｌｉｕら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２１，１１５−１２０（２００１））は、ＭＢＰ  Ｈｉｓタグに連結された、ＰＣＶ−２のＯＲＦ−２によりコードされる全タンパク質の融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させている。Ｋｉｍら（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ，３（１），１９−２３，２００２）はＰＣＶ２のＯＲＦ１および２をバキュロウイルス発現系内で発現させている。Ｂｌａｎｃｈａｒｄら（Ｖａｃｃｉｎｅ，２１，４５６５−４５７５，２００３）も、昆虫細胞内のバキュロウイルスに基づく系においてＯＲＦ１およびＯＲＦ２を発現させている。ＰＣＶ−２タンパク質を産生した昆虫細胞を細胞溶解し、ワクチンへと製剤化し、それを使用してＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）子ブタにワクチン接種された。初回−追加投与計画において該タンパク質のいずれか１つが該子ブタに投与された。この場合、ＤＮＡワクチン接種後にサブユニットワクチンが投与された。あるいはもう１つの子ブタ群において、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２タンパク質が２回の注射で子ブタに投与された。しかし、すべての実験は、病原体を有さず従ってＰＣＶ−２に対する母体由来抗体を有さないＳＰＦブタにおいて行われた。
【０００４】
ＰＣＶ−２により引き起こされるＰＭＷＳおよびＰＤＮＳは４週齢から約１５週齢までに観察されうる。離乳までは子ブタはＰＣＶ−２関連疾患に対して全く安全であり、離乳後になって初めて、子ブタは臨床症状を現す可能性を有するようになるらしい。その結果、子ブタをワクチン接種で防御するためには、理想的には、離乳からそれ以降にわたって子ブタが防御されなければならない。なぜなら、ＰＣＶ−２関連疾患がいつ発症するかは予測できないからである。２回のワクチン接種計画でこれを達成するためには、子ブタが離乳時頃に追加ワクチン接種を受けることが可能となり離乳直後にＰＣＶ−２感染に対する完全な防御を獲得していることが可能となるよう、子ブタは１週齢で初回ワクチン接種を受ける必要がある。子ブタはＰＣＶ−２に対する母体由来抗体（ＭＤＡ）を有している可能性がある（本発明のワクチンでの実験に用いた子ブタにおけるＭＤＡ力価の分布を実施例に記載する）。しかし、母体由来抗体の存在はワクチン接種を妨げることがよく知られている。子ブタは種々のＭＤＡ力価を有しうる。非常に高い受動ＭＤＡ力価はＰＣＶ−２感染に対して子ブタを防御しうる（Ｍｅｒｉａｌ：‘ＰＣＶ−２  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｆｒｏｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｂａｃｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎ”，１８ｔｈ  ＩＰＶＳ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｊｕｎｅ  ２００４，ｐ．９９−１０１）。しかし、より低いＭＤＡ力価を有する子ブタは、相応の齢に達した際（すなわち、離乳後）に、ＰＣＶ−２感染に対して防御されないであろう。野外において見られる大多数であると思われるそれらの子ブタの場合、ＭＤＡ力価は、ＰＣＶ−２感染に対する防御をもたらすには低すぎる一方で、それでも、例えば通常の不活性化ＰＣＶ−２ワクチンでのワクチン接種を妨げるのに十分な程度に高い可能性がある。なぜなら、特に、該ウイルスは細胞培養内で高力価までは増殖し得ないため、不活性化ワクチンは、より少量の抗原しか含有していない可能性があるからである（あるいはワクチン製造において、複雑で長時間を要する濃縮操作が導入されるべきである）。この群の子ブタに対して特に、本発明のワクチンはＰＣＶ−２感染に対する適度な防御をもたらすことが判明している。
【発明の開示】
【０００５】
子ブタを（ＰＣＶ−２に対してＭＤＡ陽性である子ブタでさえも）ＰＣＶ−２による感染に対して防御し、したがって、ＰＣＶ−２関連疾患（最も注目すべきはＰＭＷＳおよびＰＤＮＳ）に対して防御するための方法において使用されうるワクチンが、本発明により提供される。
【０００６】
本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）のＯＲＦ−２タンパク質の少なくとも２０マイクログラム／用量を含むＰＣＶ−２に対するワクチンを提供する。ＰＣＶ−２のＯＲＦ−２タンパク質の少なくとも２０マイクログラム（μｇ）を１用量当たりに含むワクチンは、ＭＤＡの存在下であっても、ＰＣＶ−２感染に対する（したがってまた、ＰＭＷＳおよびＰＤＮＳのようなＰＣＶ−２関連疾患に対する）防御免疫応答を惹起しうることが見出された。好ましくは、該ワクチンは少なくとも５０μｇ／用量、最も好ましくは８０μｇ／用量を含有する。２７５μｇ／用量までの抗原質量を含有する本発明のワクチンでさえも製造可能であり、そのようなワクチンであっても、注射部位における局所反応を惹起しなかった。もちろん、より一層多くのマイクログラム量の抗原を本発明のワクチンのワクチン用量に含有させることは可能であるが、該ワクチンで得られる防御がより高い用量で改善されない場合には、抗原負荷の増加は該ワクチンを必要以上に高価なものとするだけである。また、抗原量の増加は最終的に、注射部位に、許容しえない局所反応を招く可能性があり、これは回避すべきである。抗原質量を測定するための方法は本出願の実験の部に記載されている。
【０００７】
本発明のワクチンは組換えＯＲＦ−２タンパク質を含有しうる。この場合、該組換えタンパク質は、好ましくは、昆虫細胞内でのバキュロウイルス発現ベクターからの発現により産生され、該バキュロウイルス発現ベクターはＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２遺伝子配列を適当なプロモーターの制御下に含有する。本発明のワクチンの製造方法においては、当技術分野で公知の他の適当な発現系も使用されうるが、バキュロウイルス発現系はウイルス抗原の高収率の製造をもたらし、さらにそれは良好な抗原性を示すことが判明している。したがって、該抗原が、例えばウイルス感染細胞培養内で、高濃度で製造できない場合、バキュロウイルス発現系の使用は該抗原を適当なレベルにまで濃縮するための複雑で長時間を要する操作の必要性を排除する。
【０００８】
最も一般に使用されるバキュロ発現ベクターは、ＳＦ−９、ＳＦ−２１またはＨｉｇｈ５昆虫細胞の昆虫細胞培養と共にしばしば使用されるオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）である。ＳＦ−９およびＳＦ−２１はスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞系であり、Ｈｉｇｈ５細胞はトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）の卵細胞に由来する。ＰＣＶ−ＯＲＦ−２遺伝子は適当なプロモーターの制御下に配置されるべきである。バキュロウイルス発現系において最も一般に使用されるプロモーターは、多角体遺伝子のためのプロモーターおよびｐ１０遺伝子のためのプロモーターであり、このことは、ＯＲＦ−２  ＰＣＶ−２遺伝子配列がバキュロウイルスゲノム内の多角体遺伝子座またはｐ１０遺伝子座における挿入部位に挿入されることを意味する。当技術分野で公知の、同種または異種の他の適当なプロモーターも使用されうる。バキュロウイルス発現系の全態様の詳細な説明はＤ．Ｒ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｌ．Ｋ．ＭｉｌｌｅｒおよびＶ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗによる“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ”（１９９２，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。さらに、バキュロウイルス由来発現ベクターおよび完全発現系が多数の異なる企業から商業的に入手可能である。
【０００９】
本発明のワクチンは更に、適当なアジュバントを含みうる。多数のアジュバント系、例えば、一般に使用される水中油型アジュバント系が当技術分野で公知である。アジュバントにおける使用のための当技術分野で公知の任意の適当な油、例えば無機油が使用されうる。油相は、無機性または非無機性のいずれかである異なる油の適当な混合物をも含有しうる。適当なアジュバントは、場合によっては１以上の油と混合された、ビタミンＥをも含みうる。水中油型アジュバント化ワクチンの水相は抗原物質を含有する。適当な製剤は通常、油相約２５〜６０％（水相４０〜７５％）を含む。適当な製剤の具体例は、水相３０％および油相７０％、またはそれぞれ５０％を含みうる。本発明のワクチンは、当技術分野で公知の任意の適当な経路、例えば筋肉内、皮内または皮下経路により投与されうるが、筋肉内投与が好ましい。
【００１０】
本発明は更に、ＰＣＶ−２  ＭＤＡ陽性である若い子ブタをＰＣＶ−２感染に対して防御することを意図したワクチンの製造方法を提供し、該ワクチンは、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）のＯＲＦ−２タンパク質の少なくとも２０μｇ／用量で与えられる。
【００１１】
本発明の（方法により製造された）ワクチンは、ＰＣＶ−２感染に対して若い子ブタを防御するための方法において使用されうる。本発明のワクチンは、ＰＣＶ−２に対する母体由来抗体（ＭＤＡ）に関して陽性である若い子ブタをもＰＣＶ−２による感染に対して防御するための方法において使用されうる。本発明のワクチンは、子ブタがＰＣＶ−２に対する比較的高い力価のＭＤＡを有する場合でさえも、該子ブタを防御しうることが判明している。欧州全体の種々の飼育場において野外で見られる若い子ブタにおけるＭＤＡ力価の分布を表１に示し、本発明のワクチンによりもたらされた防御を表２に示す。本発明のワクチンは、実施例（表２）において定義される「集合２」に含まれるＭＤＡ力価を有する子ブタへのＰＣＶ−２感染に対する適度な防御をもたらしうることが示されている。この集合に含まれる子ブタは、高いＭＤＡ力価である８〜１２  ｌｏｇ２のＭＤＡ力価を有する。したがって、本発明のワクチンは、１０  ｌｏｇ２または更には１２  ｌｏｇ２（実施例に示されている方法で測定した場合）までの、ＰＣＶ−２に対するＭＤＡ力価を有する若い子ブタを防御するための方法においても使用されうる。欧州全体にわたる種々の飼育場で集めた子ブタの約５５％がこの集合２に含まれることが、表１から認められうる（もちろん、より低いＭＤＡ力価を有し該集団の３２％を含む集合１に含まれる子ブタも本発明のワクチンにより防御される）。したがって、本発明のワクチンは、高いＭＤＡ力価を有する子ブタを含む、野外で見られる子ブタの大多数の防御をもたらすと結論づけられうる。
【００１２】
適度な防御を得るためには、該ワクチンは、好ましくは、２回のワクチン接種計画で投与され、第１のワクチン接種（初回ワクチン接種）は、第１〜第４週齢、好ましくは離乳前、例えば第１週齢の子ブタに実施される。第２のワクチン接種（追加ワクチン接種）は約３週間後に実施されうる。このようにして、子ブタがＰＣＶ−２感染に対して最も感受性であり従ってＰＭＷＳおよびＰＤＮＳに対して感受性になる離乳の時点の直後に、子ブタはＰＣＶ−２感染に対する完全な防御を獲得することとなる。
【００１３】
実施例：
【実施例１】
【００１４】
（母体由来）ＰＣＶ−２特異的抗体価の測定
ＰＣＶ−２に対する抗体価は以下の方法により測定することが可能である。ＰＫ１５細胞の単層を９６ウェル組織培養プレート上で形成させた。８０％コンフルエントになった時点で、該細胞にＰＣＶ−２の野外分離体を感染させ、該細胞をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２日間インキュベートした。この期間の後、該細胞をエタノール中で固定し、使用するまで２〜８℃で保存した。該細胞の約２０％が感染した場合に、プレートを試験に使用する。与えられた血清のＰＣＶ−２特異的抗体価を測定するために、系列希釈を行い、該エタノール固定細胞上でインキュベートする。３７℃で１時間のインキュベーションの後、該プレートを水道水で洗浄し、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ブタＩｇＧと共にインキュベートすることにより結合抗体を検出する。与えられた血清の力価は、ＰＣＶ−２特異的抗体応答が尚も観察されうる最高希釈度の逆数として表される。
【００１５】
離乳前の子ブタにおけるＰＣＶ−２に対する母体由来抗体価の典型的な分布を表１に示す。
【００１６】
血清は、欧州全体にわたる種々の国の２３２頭の子ブタから集めた。
【００１７】
【表１】
2009507811.tif 000002
【００１８】
表１においては、以下の３つの集合が区別されうる：集合１：８未満の力価を有する子ブタ；集合２：８〜１２の力価を有する子ブタ；および集合３：１３以上の力価を有する子ブタ。集合３においては、母体由来抗体価は、決定的に重要な齢において該子ブタが防御されると予想されるのに十分な程度に高い（Ｍｅｒｉａｌ：‘ＰＣＶ−２  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｆｒｏｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｂａｃｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎ”，１８ｔｈ  ＩＰＶＳ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｊｕｎｅ  ２００４，ｐ．９９−１０１）。一方、集合１においては、母体由来抗体価は、これらの子ブタのほとんどが容易にワクチン接種されうる程度に低い。しかし、集合２においては、該抗体価は、通常のワクチン接種アプローチでは恐らくこの群の大多数を免疫できない大きさである。該子ブタの半分以上はこの集合に含まれると思われるため、ＰＭＷＳを飼育場から排除することを望むならば、この集合の子ブタを防御しうることが最も重要であろう。
【００１９】
母体由来抗体価の存在下のワクチン接種はアジュバントおよび／または高い抗原含量により促進されうることが当技術分野でよく知られている。どのアジュバントまたはどの抗原含量が或る与えられた病原体に対する母体由来抗体価を凌ぎうるかは公知でない。したがって、記載されている実験において、本発明者らは、集合２の子ブタをＰＣＶ−２感染に対して防御するために必要な抗原の最小量を定めることにした。
【実施例２】
【００２０】
ＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２を発現する組換えバキュロウイルスの構築
ＰＣＶ−２ウイルスを、ＰＣＶ非含有ブタ精巣（ＳＴ）細胞を使用して、ＰＭＷＳの臨床的および組織病理学的徴候を示している家畜ブタの肺組織から分離した。該ウイルスをＰＣＶ非含有ＰＫ１５細胞上での５継代により増殖させた。
【００２１】
感染ＰＫ１５細胞上清から精製されたＰＣＶ−２ウイルスの調製物からＤＮＡを分離した。ＢａｍＨ１制限部位を含有するプライマー（フォワードプライマー：ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＡＴ，リバースプライマー：ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＧＴ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  Ｔ）を使用して、公開されている配列に基づいてＯＲＦ−２遺伝子を増幅するために、ＰＣＲを行った。得られたアンプリコンは完全なＯＲＦ−２遺伝子および隣接するＢａｍＨ１制限部位を含む。ゲル電気泳動後、該アンプリコンを切り出し、精製した。ついで、精製されたＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２断片をＢａｍＨ１で消化し、ＢａｍＨ１で消化されたｐＡｃＡＳ３（Ｖｌａｋら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９  ３１２−３２０）内に連結した。このプラスミドは挿入部位の上流にｐ１０プロモーターを含有していて、ｐ１０プロモーターの制御下の外来遺伝子の発現を可能にする。ＴＯＰ  １０Ｆ’細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を該連結混合物で形質転換し、正しい構築物を含有するクローンをそれらの配列に基づいて選択した。陽性クローンを増殖させ、導入プラスミドＤＮＡを再び、配列決定により再試験した。
【００２２】
トランスフェクションの前に、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ；Ｍａｒｔｅｎｓら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５２  １５−１９に記載されている）をＢｓｕ３６Ｉで消化した。このウイルスにおけるＢｓｕ３６Ｉ部位はｐ１０遺伝子座内の唯一の制限部位である。
【００２３】
ついで、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＵＳＡ）を使用して、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）を導入プラスミドおよびＢｓｕ３６Ｉ消化ＡｃＮＰＶバキュロウイルスＤＮＡでトランスフェクトした。該トランスフェクションの上清をトランスフェクションの３日後に集め、プラーク精製をＳｆ９細胞上で行った。プラークを増殖させ、得られたウイルスを、分離されたウイルスＤＮＡの配列決定により、ならびに抗ＰＣＶ−２ウサギおよびブタ血清を使用するＳｆ９細胞上の免疫蛍光により、ＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２遺伝子の挿入に関してスクリーニングした。
【００２４】
「マスターシード」と称される組換えバキュロウイルスＢａｃＰＣＶ−２−ＯＲＦ−２のシード（種）を調製した。マスターシード、およびＳｆ９細胞上でのマスターシードの５継代物を、分離されたＤＮＡの配列決定およびＳｆ９細胞上の免疫蛍光により、ＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２遺伝子の安定な挿入に関して試験した。該ウイルス調製物中の感染性ウイルスの量を測定するために、力価測定を行った。力価測定はＳｆ９細胞上で行った。バキュロウイルス特異的ＣＰＥ、および／またはポリクローナルウサギ抗ＰＣＶ−２免疫血清を使用するＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２特異的免疫蛍光を観察することにより、力価を読み取った。
【００２５】
組換えＡｃＮＰＶバキュロウイルスＢａｃＰＣＶ−２−ＯＲＦ−２のプラーク精製マスターシードが産生されたことが示された。マスターシードおよびＳｆ９細胞上でのマスターシードからの５継代体の配列決定および免疫蛍光により判断されるとおり、この構築物はＳｆ９細胞上でｐ１０プロモーターの制御下でＰＣＶ−ＯＲＦ−２タンパク質を安定に発現した。
【実施例３】
【００２６】
ＰＣＶ−２抗原の産生
発現産物の最大量を得るために、組換えＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２タンパク質を得るための条件を最適化するための予備実験を行った。すべての実験は、２８℃で懸濁培養内のスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）２１（Ｓｆ２１）細胞を使用して行った。マスターシードからの４継代レベルのＢａｃＰＣＶ−２−ＯＲＦ−２ウイルスを感染に使用した。最適化された産生のためには、感染時の細胞密度は１．４×１０６細胞／ｍｌであり、感染多重度（ＭＯＩ）は０．０１であり、感染後に培養を６日間継続した。得られた混合物を発現産物回収物と称することとした。最適化条件下の発現を１年の間に別々の実験において５回行った。
【００２７】
該抗原は該細胞内に存在していたため、細胞および上清の両方を含有する全回収物を、該細胞の少なくとも９０％が破壊される程度の音波処理に付した。ついで、音波処理された回収物のバッチにおける生組換えウイルスを、連続的攪拌下、ｐＨ７．５、３７℃で７２時間にわたり、３３ｍＭ  バイナリー（Ｂｉｎａｒｙ）エチレンイミン（ＢＥＩ）で不活性化した。不活性化後、１．６倍モル過剰のチオ硫酸ナトリウムの添加によりＢＥＩを中和した。中和後、細胞残渣および多角体を６００ｇで１０分間の低速遠心分離により除去した。得られた上清を不活性化ウイルス懸濁液を称することとした。回収物を無菌性に関して、および不活性化の完全性に関して調べた。不活性化の完全性は、不活性化ウイルス懸濁液をＳｆ９細胞上で２週間継代しバキュロウイルス特異的ＣＰＥの非存在を目視検査することにより試験した。
【００２８】
ＢＥＩでの処理の後に完全に不活性化された８．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌのバキュロウイルス力価が得られたことが示された。
【実施例４】
【００２９】
ＰＣＶ−２抗原の量の測定
低速遠心分離の前および後の不活性化懸濁液のサンプル、ならびに親導入ウイルスの細胞培養上清サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）．Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５）の方法による変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動に付した。４〜１２％の勾配のゲルを使用し、これをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００３０】
ウエスタンブロット法を行う場合には、該ゲルからのタンパク質をナイロン膜上に電気泳動的にトランスファーし、ＰＢＳ中の脱脂乳でブロッキングし、ＰＣＶ−２の野外分離体に対して産生された希釈されたポリクローナルブタ血清と反応させた。
【００３１】
得られた不活性化ウイルス懸濁液の抗原含量の尺度として、この懸濁液の１マイクロリットル（μｌ）を同様にしてゲル上で泳動させ、一方、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ．ｃａｔ．ｎｏ．Ａ−２１５３）の系列希釈物を参照体として同じゲル上で並べて泳動させた。不活性化ウイルス懸濁液内のＯＲＦ−２遺伝子産物の定量を、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ（ＳｙｎＧｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ．ｖ．３．０６．０２）を使用するコンピューター解析およびカメラ捕捉イメージングを用いる該ＢＳＡ参照体の密度とＰＣＶ−２含有サンプルの密度との比較により行った。
【００３２】
低速遠心分離の前および後の不活性化回収物を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動分離により比較したところ、遠心分離前の物質は、３０および２６．８ｋＤａの見掛け分子量（ＭＷ）の、ほぼ等しい密度の２つの主要バンドを与えたが、遠心分離後の物質はその低いほうのバンドのみを含有していた。親導入ウイルスを該組換えウイルスと共に泳動させたところ、該親導入ウイルスはそれらの２つのバンドのうちの高いほうのバンドのみを含有し、このことは、低いほうのバンドがＰＣＶのＯＲＦ−２であり、高いほうのバンドが、遠心分離後に除去された多角体であったことを示している。低いほうの２６．８ｋＤａのバンドの正体をウエスタンブロット法により更に確認したところ、３０ｋＤａのバンドではなくこのバンドが、ＰＣＶ−２野外ウイルスに対して産生されたポリクローナルブタ血清と反応することが示された。
【００３３】
ＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２の発現レベルを５つの別々の実験において測定した。各場合において、その量は、該試験の検出限界を十分に超えるものであり、特に、不活性化ウイルス懸濁液１ミリリットル（ｍｌ）当たり４０〜５５０マイクログラム（μｇ）の範囲であった。
【実施例５】
【００３４】
ＭＤＡ陽性の若い子ブタにおけるワクチン取り込みに対するＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２の量の影響
種々のＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２抗原含量のワクチンを製剤化し、それらを使用して、ＰＣＶ−２に対する種々のレベルの母体由来抗体（ＭＤＡ）を有する若い子ブタにワクチン接種した。３週間隔で２回のワクチン接種を行った。初回ワクチン接種の５〜６週間後に該抗原に対する血清応答を測定した。これらのデータから、ＭＤＡの存在下の該ワクチンの取り込みに対する抗原含量の影響を算出した。
【００３５】
種々の抗原希釈物を調製し、当技術分野で一般に使用されているような水中油型アジュバントと１：１（ｖ／ｖ）混合した。ついで１〜４週齢で、同腹子をいくつかの群に分け、種々の量のＰＣＶ−２−ＯＲＦ−２タンパク質を含有するワクチンで筋肉内処理し、またはワクチン接種しなかった。３週間後にワクチン接種を繰返した。以下の群を得た：１〜１４μｇのＰＣＶ−２  ＯＲＦ−２タンパク質／用量でワクチン接種された１１４頭の子ブタ（群１）、２０および８０μｇ／用量でワクチン接種された８５頭の子ブタ（群２）。
【００３６】
血液を初回ワクチン接種時およびその５〜６週間後に採取した。血清を調製し、ＰＣＶ−２抗体に関して免疫蛍光により検査した。このためには、９６ウェル組織培養プレート内のＰＫ１５細胞の単層にＰＣＶ−２の野外分離体を感染させた。２日間の培養の後、該細胞の約２０〜３０％が感染し、この時点で該単層をエタノール中で固定し、使用するまで２〜８℃で保存した。力価を測定するために、試験血清の系列希釈物を該細胞上で３７℃で１時間インキュベートし、該プレートの洗浄の後、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｎｏｒｄｉｃ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共に３７℃で１時間インキュベートすることにより結合抗体を検出した。ＰＣＶ−２特異的蛍光が尚も観察されうる最高希釈度の逆数として力価を決定した。すべての動物に関して、１回目の採血と２回目の採血との間に抗体価の減少が確認された。この期間中に抗体価が減少しなかった又は増加した場合には、それに関わる動物において該ワクチンが取り込まれたとみなされた。一方、ＰＣＶ−２特異的抗体価が減少した場合には、ワクチン接種は成功せず該ワクチンは取り込まれなかったとみなされた。
【００３７】
種々のワクチン用量の取り込みをワクチン接種時の母体由来抗体価と関連づけることにより、十分な量の子ブタにワクチン接種するのに必要な最小抗原質量を決定することができた。この分析の結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2009507811.tif 000003
【００３９】
この表において、「ワクチン取り込み」は、子ブタのワクチン接種が、追加ワクチン接種の１週間後に初回ワクチン接種時のＰＣＶ−２特異的力価と等しい又はそれ以上のＰＣＶ−２特異的抗体価をもたらしたことを意味する。すべてのそのような場合において、該ワクチンはＰＣＶ−２に対する能動的血清応答を惹起したことが示されており、この場合、子ブタはＰＣＶ−２感染に対して防御されたとみなされうる。しかし、追加ワクチン接種の１週間後の力価が初回ワクチン接種時より小さい子ブタにおいては、該ワクチンは免疫応答を誘導できず、母体由来抗体の自然な減少が観察された。これはやがて、これらの動物をＰＣＶ−２感染に対して感受性にすることになる。この表から示されるとおり、集合１（ＭＤＡ力価＜７）において１４マイクログラム以下のワクチン用量を使用した場合、該動物の９０％はワクチン接種によりセロコンバージョンを引き起こし、したがって防御されたとみなされうる。一方、集合２（ＭＤＡ＞７かつ＜１３）においては、１４マイクログラム以下の用量でワクチン接種された動物の１７％のみがセロコンバージョンを引き起こし、防御された。この群においては、１７頭の動物は１３以上の力価を有し、したがって、この場合、それらの自然獲得ＰＣＶ−２特異的母体由来抗体により既に防御されていた。したがって、合計１１４頭の子ブタのこの群においては、４８頭（４２％）のみが防御され、１７頭の子ブタは既に高い母体由来抗体価を有し、集合１および２の３１頭がセロコンバージョンを引き起こしたと結論づけられうる。２０マイクログラム／用量以上でワクチン接種された群においては、有意に、より多数の動物が防御され、集合１の全動物および集合２の動物の７６％がＰＣＶ−２に対してセロコンバージョンを引き起こし、したがって防御された。これに、１３以上のＭＤＡ力価を有する子ブタを加えて、この群の子ブタの８８％が防御されたことが判明した。
【００４０】
動物の約８０％以上が防御された場合に家畜群の防御が得られることから、ＰＣＶ−２感染の結果に対して家畜群を効率的に防御するためにはＰＣＶ−２に対するワクチンの抗原質量は少なくとも２０μｇでなければならないと結論づけられうる。
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月7日(2008.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009507811000001.app
【国際調査報告】
2009507811.tif 000004
2009507811.tif 000005
2009507811.tif 000006