(57)【要約】  本発明は、改良された種類の水溶性緑乃至近赤外（ＮＩＲ）シアニン標識色素を含む生物学的分子の改良コンジュゲートに関する。かかる色素は非対称フルオロ置換ポリメチンであり、高度の光安定性及び低減した色素−色素消光並びに高い蛍光量子収量を示す。かかるコンジュゲートは、インビボ光学イメージング並びに蛍光検出方法のために有用である。また、かかるコンジュゲートを含む医薬組成物、かかる組成物の調製用キット、及びかかるコンジュゲートを用いるインビボイメージング方法も開示される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉの色素コンジュゲート。
［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−ＣｙＤ          （Ｉ）
式中、
ＢＴＭは生物学的ターゲティング部分であり、
ＣｙＤは以下の式ＩＩを有するシアニン色素であり、
【化１】
2009545645.tif 000072
（式中、
Ｑは、１、２又は３つの炭素−炭素二重結合を含み、Ｂとのコンジュゲート系を形成する基であり、
Ｒ１、Ｒ６及びＲ７はＣ１−４アルキル及び−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１から独立に選択され、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はＨ、Ｆ、−ＳＯ３Ｍ１及び−(ＣＦ２)ｍ−Ｆ（式中、ｍは１〜４の値を有する整数である。）から独立に選択され、
Ｍ１はＨ又はＢｃ（式中、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）であり、
ｋは１〜１０の値を有する整数であり、
Ｂはベンゾ［ｂ］ピリリウム発色団、キノリニウム発色団及びアクリジニウム発色団から選択される芳香族発色団であり、
ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つはＦ又は−(ＣＦ２)ｍ−Ｆであることを条件とする。）
ｊは０又は１であり、
Ｌは式−(Ａ)ｍ−（式中、Ａは各々独立に−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基、Ｃ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックである。）を有する合成リンカー基である。
【請求項２】
Ｑが次式の基である、請求項１記載のコンジュゲート。
【化２】
2009545645.tif 000073
（式中、ｎは１、２又は３である。）
【請求項３】
Ｂが以下の式ＩＩａを有する、請求項１又は請求項２記載のコンジュゲート。
【化３】
2009545645.tif 000074
式中、
ＹはＯ＋及びＮ＋−Ｒ８（式中、Ｒ８はＨ、Ｃ１−４アルキル及び−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１から選択される。）から選択され、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇはＱ、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ６−１０アリール、ヘテロアリール、アラルキル、Ｈａｌ、スルフヒドリル、アミノ、Ｃ１−４アルキル置換アミノ、第四級アンモニウム、−ＳＯ３Ｍ１、−ＯＲ９及び−ＣＯＯＲ９（式中、Ｒ９はＨ及びＣ１−４アルキルから選択される。）から独立に選択され、
Ｚは任意の縮合フェニル環を表し、Ｚが存在する場合にはＲｆ及びＲｇはＺ環に結合し、Ｚが存在しない場合にはＲｆ及びＲｇはＹ環に結合し、
ただし、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇの１つはＱであることを条件とする。
【請求項４】
ＹがＯ＋であり、Ｚが存在せず、Ｒｅが請求項２記載のＱ基であって、前記色素が以下の式（ＩＩＩ）を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【化４】
2009545645.tif 000075
【請求項５】
Ｒｂが式−ＮＲ１０Ｒ１１（式中、Ｒ１０及びＲ１１は独立にＨ又はＣ１−４アルキルであるか、或いはＲ１０がＲａと共に又はＲ１１がＲｃと共に追加の飽和又は不飽和六員環を形成し、或いはその両方が追加の飽和又は不飽和六員環を形成する。）のアミノ基である、請求項４記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ＹがＮ＋−Ｒ８であり、Ｚが存在せず、Ｑ基が請求項２に定義された通りであって、前記色素が以下の式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）及び（ＩＶｃ）から選択された構造を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【化５】
2009545645.tif 000076
【請求項７】
ＹがＮ＋−Ｒ８であり、Ｚが存在し、Ｑ基が請求項２に定義された通りであって、前記色素が以下の式（Ｖ）を有する、請求項３記載のコンジュゲート。
【化６】
2009545645.tif 000077
【請求項８】
ｋが３又は４である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つがＦである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも２つがＦであることを条件として、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５がＨ及びＦから選択される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の各々がＦである、請求項１０記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つが−(ＣＦ２)ｍ−Ｆであることを条件として、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５がＨ、Ｆ及び−(ＣＦ２)ｍ−Ｆから選択される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記連結基(Ｌ)ｊが以下の式を有する、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載のコンジュゲート。
−(ＣＨＲ′)ｐ−Ｍ−(ＣＨＲ′)ｒ−
式中、Ｍは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ａｒ−、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ′−及び−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−から選択され、Ｒ′はＨ又はＣ１−４アルキルであり、Ａｒはスルホネートで適宜置換されたフェニレンであり、ｐ及びｒは各々１〜５の値を有する整数である。
【請求項１４】
Ｒ１が−(Ｌ)ｊ［ＢＴＭ］であり、Ｒ６及びＲ７の一方が−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１であり、他方がＣ１−４アルキルである、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
Ｒ１が−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ６及びＲ７の一方が−(Ｌ)ｊ［ＢＴＭ］であり、他方がＣ１−４アルキルである、請求項１３記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
ＢＴＭが
（ｉ）３〜１００アミノ酸長ペプチド、
（ｉｉ）酵素基質、酵素拮抗剤又は酵素阻害剤、
（ｉｉｉ）レセプター結合化合物、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド、及び
（ｖ）オリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメント
から選択される、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
ＢＴＭが３〜１００アミノ酸長ペプチドである、請求項１６記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
以下の式Ｖａ又はＶｂを有する、請求項１７記載のコンジュゲート。
［ＣｙＤ］−(Ｌ)ｊ−［ＢＴＭ］−Ｚ２                （Ｖａ）
Ｚ１−［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−［ＣｙＤ］                （Ｖｂ）
式中、
Ｚ１はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭＩＧであり、
Ｚ２はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢｃ（式中、Ｂｃは請求項１に定義された通りである。）又はＭＩＧであり、
ＭＩＧは、生体適合性基である代謝抑制基であって、ＢＴＭペプチドの酵素代謝を阻止又は抑制する基である。
【請求項１９】
Ｚ１＝Ｚ２＝ＭＩＧである、請求項１８記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載のコンジュゲートを、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性担体と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項２１】
１人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて供給される、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２０又は請求項２１記載の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載のコンジュゲートを無菌固体形態で含んでいて、生体適合性担体の無菌供給物で再構成すれば溶解して所望の医薬組成物を与える、キット。
【請求項２３】
前記無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載のコンジュゲートの製造において有用な官能化色素であって、当該官能化色素は請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に定義された式ＩＩのＣｙＤからなると共に、前記ＣｙＤはさらにＱａ基（式中、Ｑａは請求項１、請求項１６及び請求項１７に定義されたようなＢＴＭへのコンジュゲーションに適した反応性官能基である。）を含む、官能化色素。
【請求項２５】
Ｑａが、カルボキシル、活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択される、請求項２４記載の官能化色素。
【請求項２６】
請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載のコンジュゲートの製造方法であって、
（ｉ）請求項１、請求項１６及び請求項１７に定義されたようなＢＴＭを請求項２４又は請求項２５記載のＱａ官能化ＣｙＤと混合する段階、
（ｉｉ）Ｑａ基とＢＴＭとの反応に適した条件下で前記Ｑａ官能化ＣｙＤを前記ＢＴＭと共にインキュベートして所望のコンジュゲートを得る段階、並びに
（ｉｉｉ）適宜、段階（ｉｉ）の反応混合物からコンジュゲートを分離及び／又は精製する段階
を含んでなる方法。
【請求項２７】
哺乳動物体のインビボ光学イメージング方法であって、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載のコンジュゲート或いは請求項２０又は請求項２１記載の医薬組成物を用いてインビボでのＢＴＭの局在部位の画像を得ることを含んでなる方法。
【請求項２８】
請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載のコンジュゲート或いは請求項２０又は請求項２１記載の医薬組成物が前記哺乳動物体に予め投与されている、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８記載の方法であって、
（ｉ）哺乳動物体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＣｙＤの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）適宜、蛍光検出器で検出された光を濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる方法。
【請求項３０】
段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項２７又は請求項２８記載の方法であって、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳動物体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織は励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルは組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる方法。
【請求項３２】
光学イメージング方法が蛍光内視鏡検査からなる、請求項２７乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
インビボ光学イメージングが、哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は病態の治療のモニタリングを支援するために使用される、請求項２７乃至請求項３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は病態の治療のモニタリングを行う方法であって、請求項２７乃至請求項３２のいずれか１項記載のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法。
【請求項３５】
試料中の検体のアッセイ方法であって、
（ｉ）検体の少なくとも一部を前記検体に対する特異的結合パートナーに結合させて複合体を形成するのに適した条件下で前記検体を前記特異的結合パートナーに接触させる段階であって、前記特異的結合パートナーが請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の色素コンジュゲートからなる段階、
（ｉｉ）標識複合体の放射蛍光を測定する段階、及び
（ｉｉｉ）放射蛍光を前記試料中の前記検体の存在又は量と相関させる段階
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された種類の水溶性赤乃至近赤外（ＮＩＲ）域シアニン標識色素を含む生物学的分子の改良コンジュゲートに関する。かかる色素は非対称フルオロ置換ポリメチンであり、高度の光安定性及び低減した色素−色素消光並びに高い蛍光量子収量を示す。かかるコンジュゲートは、インビボ光学イメージング並びに蛍光検出方法のために有用である。また、かかるコンジュゲートを含む医薬組成物、かかる組成物の調製用キット、及びかかるコンジュゲートを用いるインビボイメージング方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
ポリメチン発色団に基づく蛍光色素は、広い波長域にわたる強い吸収極大によって特徴づけられる。米国特許第６０４８９８２号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ）には、以下の構造（１）のルミネセントシアニン色素が開示されている。
【０００３】
【化１】
2009545645.tif 000002
式中、Ｘ及びＹはＯ、Ｓ及びＣＨ３−Ｃ−ＣＨ３からなる群から独立に選択され、ｍは１〜４の整数であり、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７の少なくとも１つはアミノ、スルフヒドリル又はヒドロキシ求核性化合物との反応性を有する反応基である。上記式のシアニン色素では、複素環系を連結するメチン基の数は色素の吸収極大及び発光極大を画定する。即ち、メチン基の数が３、５及び７となるに従って（それぞれＣｙ（商標）３、Ｃｙ５及びＣｙ７において）、吸収極大は約１００ｎｍずつ上昇する。Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７の対応発光ピークもまた、約１００ｎｍだけ離れている。色素がＮＩＲ範囲内で有用であるためには、複素環式塩基を連結する少なくとも５つのｓｐ２炭素原子（ペンタメチン色素）をアセンブルすることで、６５０ｎｍ以上のＥｍ（ｍａｘ）波長を有する色素を得ることが必要である。
【０００４】
かかる色素におけるポリメチン鎖の延長は、鎖に対する（求核性又は求電子性の）化学的攻撃の機会が増加することで達成され、コンジュゲーションの喪失、色素の光安定性の低下及び低い蛍光量子収量をもたらす。したがって、「ヘテロ芳香族性」の増加した蛍光色素は、同数のメチン基を有する通常のポリメチン色素に比べて利点を提供すると期待できる。
【０００５】
ペンゾピリリウムポリメチンに基づくレーザー適合性ＮＩＲマーカー色素は、米国特許第６７５０３４６号（Ｃｚｅｒｎｅｙ，Ｐ他）に記載されており、これはとりわけ以下の構造（２）の化合物が開示されている。
【０００６】
【化２】
2009545645.tif 000003
式中、Ｒ１〜Ｒ１４基は同一のもの又は相異なるものであり、各々の場合においてＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、或いは炭素原子数１２以下の脂肪族基又は単核芳香族基を表す。これらの基は、置換基として、炭素及び水素に加えて４以下の酸素原子及び０、１若しくは２の窒素原子又は硫黄原子、或いは硫黄原子及び窒素原子を含み得るか、或いは水素又は（炭素、水素及び２以下のスルホン酸基からなる群から選択される）炭素原子数８以下の置換基の１以上が結合した窒素原子を有するアミノ官能基を表す。Ｒ１〜Ｒ１４の少なくとも１つは反応基を含み得る。
【０００７】
最近、Ｗａｇｇｏｎｅｒ他［Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（６），９０９−９１２（２００４）］には、水性溶媒中で良好な光安定性を有する以下のポリフルオロチアジカルボシアニン色素（３）が記載している。この色素は、非フッ素化類似体に比べ、凝集の低減、量子収量の向上、及び光漂白抵抗性の増大を示した。
【０００８】
【化３】
2009545645.tif 000004
カルボシアニン色素のインドリウム環を少なくとも１つの３位に反応基又は共役物質を導入するように修正することが、国際公開第０２／２６８９１号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）に記載されている。国際公開第０２／２６８９１号に従って修正された色素はシアニン色素の自己会合傾向を克服することも報告されており、修正色素で標識された色素コンジュゲートは構造的に類似のカルボシアニン色素で標識されたコンジュゲートより蛍光性が強いことが報告されている。
【０００９】
Ｖｏｍｐｅ他［Ｐｒｏｃ．ＵＳＳＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２７２（３），６１５−６１８（１９８３）］には、メチン鎖の一端にインドリン複素環を有すると共に、他方の環がベンゾオキサゾール、チアゾリン、ピロリン、４−キノリン及びベンゾイミダゾールから選択される非対称ヘプタメチン色素が開示されている。かかる環はＣＦ３基で適宜置換できる。色素と生体分子とのコンジュゲートに関しては、この論文には全く記載がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６０４８９８２号明細書
【特許文献２】米国特許第６７５０３４６号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／２６８９１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗａｇｇｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（６），９０９−９１２（２００４）
【非特許文献２】Ｖｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．ＵＳＳＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２７２（３），６１５−６１８（１９８３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記文献のいずれも、生物学的ターゲティング部分と、本明細書に記載されるようにインドシアニン発色団に結合した１つ又は好ましくは複数のフルオロ置換基を含む非対称ポリメチン色素とのコンジュゲートは開示されていない。
【００１３】
さらに、本発明の色素はインドリウム環系の１位又は３位に結合した１以上のスルホン酸基を有している。本色素は、光安定性の増加及び色素−色素相互作用の低減を示す。輝度の向上をもたらす光安定性の増加及び色素−色素相互作用の低減は、光強度及び関連する光漂白が高いと共に、限定された情報提供蛍光信号を好ましくない組織自発蛍光及びバックグラウンド信号から分離する必要があるインビボ用途（例えば、内視鏡イメージング）のため特に有用である。本色素の向上した化学安定性は、生体内で起こる様々な生化学的過程（例えば、酵素分解）に対する抵抗性の向上をもたらす結果、色素−［生物学的ターゲティング部分］コンジュゲートの代謝に原因する毒性及び／又はイメージング効果喪失を低減させる可能性があると予想される。本色素はまた、例えば動力学的研究のように継続的な励起が要件である蛍光検出を伴うインビトロアッセイ、或いはマイクロアレイスライドを数日間にわたって再分析することが必要となり得るマイクロアレイ分析のためにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、化合物１の光安定性を化合物Ａと比較して示している。
【図２】図２は、化合物２の光安定性を化合物Ｂと比較して示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
第１の態様では、本発明は以下の式Ｉの色素コンジュゲートを提供する。
［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−ＣｙＤ
（Ｉ）
式中、
ＢＴＭは生物学的ターゲティング部分であり、
ＣｙＤは以下の式ＩＩのシアニン色素であり、
【００１６】
【化４】
2009545645.tif 000005
（式中、
Ｑは、１、２又は３つの炭素−炭素二重結合を含み、Ｂとのコンジュゲート系を形成する基であり、
Ｒ１、Ｒ６及びＲ７はＣ１−４アルキル及び−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１から独立に選択され、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はＨ、Ｆ、−ＳＯ３Ｍ１及び−(ＣＦ２)ｍ−Ｆ（式中、ｍは１〜４の値を有する整数である。）から独立に選択され、
Ｍ１はＨ又はＢｃ（式中、Ｂｃは生体適合性陽イオンである。）であり、
ｋは１〜１０の値を有する整数であり、
Ｂはベンゾ［ｂ］ピリリウム発色団、キノリニウム発色団及びアクリジニウム発色団から選択される芳香族発色団であり、
ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つはＦ又は−(ＣＦ２)ｍ−Ｆであることを条件とする。）
ｊは０又は１であり、
Ｌは式−(Ａ)ｍ−（式中、Ａは各々独立に−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基、Ｃ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックである。）を有する合成リンカー基である。
【００１７】
「アルキル」は、炭素原子数１〜４の直鎖又は枝分れ鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチル）である。
【００１８】
「アリール」は、炭素原子数６〜１０の１つの芳香環又は２つの縮合芳香環を含んだ芳香族置換基（例えば、フェニル又はナフチル）であり、適宜１以上の置換基（例えば、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシル）で独立に置換されている。
【００１９】
「アルコキシル」は、Ｃ１−４アルコキシ置換基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシ）である。
【００２０】
「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択し得る１以上のヘテロ原子を含む単環式又は二環式の五員乃至十員複素環系であり、適宜１以上の置換基（例えば、ハロゲン、直鎖又は枝分れＣ１−４アルキル或いはＣ１−４アルコキシル）で独立に置換されている。
【００２１】
「アラルキル」は、前記で定義した通りのアリール基又はヘテロアリール基で置換されたＣ１−４アルキル基である。
【００２２】
「ハロゲン」及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される。
【００２３】
「生体適合性陽イオン」（Ｂｃ）という用語は、イオン化した負荷電基（この場合にはスルホネート基）と共に塩を形成する正に荷電した対イオンを意味する。この場合、前記正に荷電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００２４】
「生物学的ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後、インビボで哺乳動物体の特定部位に取り込まれるか又は特定部位に局在する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の病態に関係するものであるか、或いは器官又は代謝過程がいかに機能しているかを表すものであり得る。ＢＴＭは、好ましくは、線状ペプチド、環状ペプチド又はこれらの組合せであり得る３〜１００アミノ酸長ペプチド又はペプチド類似体、酵素基質、酵素拮抗剤又は酵素阻害剤、合成レセプター結合化合物、オリゴヌクレオチド、或いはオリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメントからなる。
【００２５】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンと別のアミノ酸のカルボキシルとを連結するアミド結合）で連結した２以上のアミノ酸（以下で定義）を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広義に用いられ、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、以下に記載する１種以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、Ｌアミノ酸又はＤアミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）又はアミノ酸模倣体を意味し、天然のものでも純粋な合成品であってもよく、光学的に純粋つまり単一の鏡像異性体（従ってキラルなもの）であってもよいし、鏡像異性体の混合物であってもよい。本明細書では、アミノ酸の慣用三文字略語又は一文字略語を用いる。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを含む［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい。］
好適な酵素の基質、拮抗剤又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体（例えば、フルオロデオキシグルコース）、脂肪酸、或いはエラスターゼ、アンギオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好ましい非ペプチドのアンギオテンシンＩＩ拮抗剤はロサルタンである。好適な合成レセプター結合化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロンその他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２レセプター用リガンド及びトロパンのようなドーパミン輸送体用リガンド、並びにセロトニンレセプター用リガンドがある。
【００２７】
特にインビトロ用途のための別の実施形態では、ＢＴＭは、相補的な特異的結合パートナーと特異的にかつ非共有結合で結合して特異的結合対を形成できるアフィニティタグであり得る。特異的結合対の例には、特に限定されないが、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ポリヒスチジンタグ−金属イオンのニトリロトリ酢酸錯体（例えば、Ｎｉ２＋：ＮＴＡ）がある。相補的な特異的結合パートナーは、標的成分検出のための標識複合体の一成分であり得る。本発明に関しては、互いに特異的結合親和性を有する任意の２種の原子又は分子が使用できる。アフィニティタグの好ましい例は、ビオチン、イミノビオチン及びデスチオビオチンから選択される。
【００２８】
式ＩＩのシアニン色素（ＣｙＤ）は、緑乃至近赤外域の波長（５００〜１２００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の光を用いる光学イメージング方法で直接又は間接に検出できる蛍光色素又は発色団である。好ましくは、ＣｙＤは蛍光性を有する。
【００２９】
好ましくは、Ｑは次式の基である。
【００３０】
【化５】
2009545645.tif 000006
式中、ｎは１、２又は３である。好ましいＮＩＲ色素は、ｎが２又は３になるように選択されたもの、最も好ましくはｎが２であるものである。
【００３１】
ｊは好ましくは１であり、即ち、連結基（Ｌ）が存在している。式Ｉのリンカー基−(Ａ)ｍ−の役割の１つは、ＣｙＤをＢＴＭの活性部位から遠ざけることにあると想定されている。これが特に重要であるのは、ＣｙＤは比較的バルキーであるため、さもないと望ましくない立体相互作用が起こり得るからである。これは、ＣｙＤが活性部位から離れて位置する自由を与える可撓性（例えば、単純アルキル鎖）及び／又はＣｙＤを活性部位から離すように向ける剛性（例えば、シクロアルキル又はアリールスペーサー）を組み合わせることで達成できる。リンカー基の性質はまた、インビボイメージング剤の生体分布を調整するためにも使用できる。即ち、例えばリンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質結合を最小限に抑えるために役立つ。−(Ａ)ｍ−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロック又はアミノ酸残基１〜１０のペプチド鎖からなる場合、リンカー基はインビボでイメージング剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整するために機能し得る。かかる「バイオモディファイアー」リンカー基は、バックグラウンド組織（例えば、筋肉又は肝臓）及び／又は血液からのイメージング剤のクリアランスを促進することで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与えることができる。バイオモディファイアーリンカー基はまた、特定の排出経路（例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由の排出）を有利にするためにも使用できる。
【００３２】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、がラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。適宜、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から市販）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００３３】
【化６】
2009545645.tif 000007
式Ｉは、−(Ｌ)ｊ［ＣｙＤ］部分がＢＴＭの任意の位置に結合し得ることを示している。−(Ｌ)ｊ［ＣｙＤ］部分のためのかかる好適な位置は、インビボで活性部位への結合に係わるＢＴＭ部分から離れた位置にあるように選択される。
【００３４】
好適には、Ｂは以下の式ＩＩａを有する。
【００３５】
【化７】
2009545645.tif 000008
式中、
ＹはＯ＋及びＮ＋−Ｒ８（式中、Ｒ８はＨ、Ｃ１−４アルキル及び−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１から選択される。）から選択され、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇはＱ、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ６−１０アリール、ヘテロアリール、アラルキル、Ｈａｌ、スルフヒドリル、アミノ、Ｃ１−４アルキル置換アミノ、第四級アンモニウム、−ＳＯ３Ｍ１、−ＯＲ９及び−ＣＯＯＲ９（式中、Ｒ９はＨ及びＣ１−４アルキルから選択される。）から独立に選択され、
Ｚは任意の縮合フェニル環を表し、Ｚが存在する場合にはＲｆ及びＲｇはＺ環に結合し、Ｚが存在しない場合にはＲｆ及びＲｇはＹ環に結合し、
ただし、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇの１つはＱであることを条件とする。
【００３６】
式ＩＩａ中、Ｒ８は好ましくは−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１である。
【００３７】
式ＩＩａの好ましい一実施形態は、Ｂがベンゾ［ｂ］ピリリウム発色団であって、ＹがＯ＋であり、Ｚが存在せず、Ｒｅが上述した好ましいＱ基であり、前記色素が以下の式（ＩＩＩ）を有する場合である。
【００３８】
【化８】
2009545645.tif 000009
式ＩＩＩ中、Ｒｂは好ましくは式−ＮＲ１０Ｒ１１（式中、Ｒ１０及びＲ１１は独立にＨ又はＣ１−４アルキルであるか、或いはＲ１０がＲａと共に又はＲ１１がＲｃと共に追加の飽和又は不飽和六員環を形成し、或いはその両方が追加の飽和又は不飽和六員環を形成する。）のアミノ基である。好ましくは、式ＩＩＩのＲｇはＣ１−４アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチル）である。
【００３９】
式ＩＩａの第２の好ましい実施形態は、Ｂがキノリニウム発色団からなっていて、ＹがＮ＋−Ｒ８であり、Ｚが存在せず、Ｑが好ましい基であり、前記色素が以下の式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）及び（ＩＶｃ）から選択された構造を有する場合である。
【００４０】
【化９】
2009545645.tif 000010
式ＩＩａの第３の好ましい実施形態は、Ｂがアクリジニウム発色団であって、ＹがＮ＋−Ｒ８であり、Ｚが存在し、Ｑが上述した好ましい基であり、前記色素が以下の式（Ｖ）を有する場合である。
【００４１】
【化１０】
2009545645.tif 000011
好ましい特徴
本発明の化合物は、色素発色団上に直接又は間接に置換された少なくとも１つのフッ素原子、好ましくは２以上のフッ素原子を含んでいる。一実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）及び（Ｖ）の化合物は、インドール環系においてフッ素原子で置換することができる。したがって、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５基に関し、好ましくは少なくとも１つ、さらに好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つがＦであるように選択される。残りのＲ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５基は、好ましくはＨである。特定の好ましい実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の各々がＦである。本発明の色素のフルオロ置換は、色素の光安定性を向上させることが判明した。
【００４２】
別の実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）及び（Ｖ）の化合物は、インドール環系においてＲ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５位置の１つ、好ましくは２つ以下に式−(ＣＦ２)ｍＦ（式中、ｍは１〜４の値を有する整数である。）のＣ１−４ペルフルオロアルキル置換基を含むことができる。残りのＲ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５基は、好ましくはＨ及びＦから選択される。好ましくは、ペルフルオロアルキル置換基はトリフルオロメチルであり、即ちｍは１である。
【００４３】
本発明のＣｙＤ色素は、２〜４又はそれ以上のスルホン酸基、好ましくは２〜３のスルホン酸基で直接又は間接に置換することができる。これらのスルホン酸基は、式ＩＩの−ＳＯ３Ｍ１及び−(ＣＨ２)ｋＳＯ３Ｍ１置換基から選択される。フッ素で置換されかつ３以上のスルホン酸基を有する色素をＢＴＭの標識のために使用すれば、かかる置換基を有しない色素に比べて色素−色素凝集が低減しかつ光安定性が向上した標識生成物が得られる。このように本発明の好ましい色素で標識されたＢＴＭの蛍光発光強度は、共有結合で結合した色素の数と共に増大する。さらに、インドリニウムの３位をスルホン酸基で置換すれば、色素分子上の総合電荷が増加することに加え、立体的な嵩が増加することでも色素−色素凝集の低減に寄与する。式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）及び（Ｖ）では、好ましい−(ＣＨ２)ｋＳＯ３Ｍ１基は、ｋが３又は４であるもの、即ち−(ＣＨ２)３ＳＯ３Ｍ１及び−(ＣＨ２)４ＳＯ３Ｍ１である。
【００４４】
式Ｉでは、［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−部分は、Ｂ、Ｑ又はＲ１〜Ｒ７基を含むＢＴＭの任意の位置に共有結合で結合される。［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−部分は、既存の置換基（例えば、Ｒ１〜Ｒ７基）に取って代わるか、或いは既存の置換基に共有結合で結合される。好ましくは、［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−部分は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）及び（Ｖ）のＣｙＤのＲ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇ位置の１以上に結合される。［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−部分は、さらに好ましくはＣｙＤのＲ１、Ｒ６及びＲ７の１以上に結合される。最も好ましい一実施形態では、Ｒ１が−(Ｌ)ｊ［ＢＴＭ］であり、Ｒ６及びＲ７の一方が−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１であり、他方がＣ１−４アルキルである。第２の最も好ましい実施形態では、Ｒ１が−(ＣＨ２)ｋ−ＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ６及びＲ７の一方が−(Ｌ)ｊ［ＢＴＭ］であり、他方がＣ１−４アルキルである。ＢＴＭは合成品又は天然品であり得るが、好ましくは合成品である。「合成品」という用語はその通常の意味を有し、即ち、天然の供給源（例えば、哺乳動物体）から単離されるものではなく人造のものを意味する。かかる化合物は、その製造及び不純物プロフィルを完全に制御できるという利点を有している。したがって、天然由来のモノクローナル抗体及びそのフラグメントは、本明細書で使用する「合成品」という用語の範囲外にある。
【００４５】
ＢＴＭは、好ましくは３〜１００アミノ酸長ペプチド、酵素基質、酵素拮抗剤及び酵素阻害剤から選択される。ＢＴＭは、最も好ましくは３〜１００アミノ酸長ペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドである場合、それは好ましくは４〜３０アミノ酸長ペプチドであり、最も好ましくは５〜２８アミノ酸長ペプチドである。
【００４６】
ＢＴＭがペプチドである場合、好ましいかかるペプチドには以下のものがある。
−ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体。
−ＳＴレセプターに結合するペプチド（ここで、ＳＴとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）その他の微生物によって産生される耐熱性毒素をいう。）。
−ラミニンフラグメント、例えば、ＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ。
−白血球集積部位をターゲティングするためのＮ−ホルミルペプチド。
−血小板第４因子（ＰＦ４）及びそのフラグメント。
−例えば、血管形成をターゲティングし得るＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）含有ペプチド［Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎ；１５（６）：５４２−６］、［Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．１９９７ Ｍａｙ；５１（５）：１４１３−７］。
−α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチドフラグメント。α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献中に見出すことができる。α２−抗プラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５（１９９６）］、トロンボスポンジン１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５（１９８４）。
−アンギオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ ２２，９，１０３８−１０４４）及び［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンギオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンギオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド。
−アンギオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
【００４７】
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一方又は両方の末端（好ましくは両方の末端）に代謝抑制基（ＭＩＧ）がコンジュゲートされる。このようにして両方のペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途のために重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてＢＴＭペプチドに対する選択的結合親和性が失われると予想されるからである。「代謝抑制基（ＭＩＧ）」という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端におけるＢＴＭペプチドの酵素（特にペプチダーゼ）代謝を阻止又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基は当業者にとって公知であり、好適には、ペプチドアミン末端に関してはＮ−アシル化基−ＮＨ(Ｃ＝Ｏ)ＲＧ（式中、アシル基−(Ｃ＝Ｏ)ＲＧはＣ１−６アルキル、Ｃ３−１０アリール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックから選択されるＲＧを有する。）から選択される。好適なＰＥＧ基は、リンカー基（Ｌ）に関して後述される。好ましいかかるＰＥＧ基は、式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２（下記）のバイオモディファイアーである。好ましいかかるアミノ末端ＭＩＧ基はアセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００４８】
ペプチドカルボキシル末端に関して好適な代謝抑制基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックがある。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基にとって好適なＭＩＧ基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ１−４アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化したものである。好ましいかかるＭＩＧ基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００４９】
いずれか一方又は両方のペプチド末端がＭＩＧ基で保護される場合、−(Ｌ)ｊ［ＣｙＤ］部分は適宜ＭＩＧ基に結合していてもよい。好ましくは、少なくとも一方のペプチド末端はＭＩＧ基を有しておらず、その位置に−(Ｌ)ｊ［ＣｙＤ］部分が結合することでそれぞれ以下の式Ｖａ又はＶｂの化合物が得られる。
【００５０】
［ＣｙＤ］−(Ｌ)ｊ−［ＢＴＭ］−Ｚ２                （Ｖａ）
Ｚ１−［ＢＴＭ］−(Ｌ)ｊ−［ＣｙＤ］                （Ｖｂ）
式中、
Ｚ１はＢＴＭペプチドのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭＩＧであり、
Ｚ２はＢＴＭペプチドのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢｃ（式中、Ｂｃは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）又はＭＩＧである。
【００５１】
式Ｖａ及びＶｂ中、Ｚ１及びＺ２は好ましくは共にＭＩＧである。Ｚ１及びＺ２にとって好ましいかかるＭＩＧ基は、ペプチド末端に関して上記に記載した通りである。いずれかのペプチド末端におけるＢＴＭペプチドの代謝抑制はこのように−(Ｌ)ｊ［ＣｙＤ］部分を結合することによっても達成できるが、−(Ｌ)ｊ［ＣｙＤ］自体は本発明のＭＩＧの定義範囲外にある。
【００５２】
ＢＴＭペプチドは、適宜、ＣｙＤの容易なコンジュゲーションのために適した側鎖を有しかつリンカー基（Ｌ）の(Ａ)ｍ残基の一部をなす１以上の追加アミノ酸残基を含み得る。好適なかかるアミノ酸残基には、アミン官能化ＣｙＤ色素とのコンジュゲーションのためのＡｓｐ又はＧｌｕ残基、或いはカルボキシ官能化又は活性エステル官能化ＣｙＤ色素とのコンジュゲーションのためのＬｙｓ残基がある。ＣｙＤのコンジュゲーションのための追加アミノ酸残基は、好適にはＢＴＭペプチドの結合領域から離れて位置しており、好ましくはＣ末端又はＮ末端に位置している。好ましくは、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００５３】
合成リンカー基（Ｌ）が存在する場合、それは好ましくは［ＢＴＭ］及びＣｙＤへのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含む。好適なかかる基（Ｑａ）を以下に記載する。Ｌが１〜１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖からなる場合、アミノ酸残基は好ましくはグリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンから選択される。インビボ用途のためには、ＬがＰＥＧ部分を含む一実施形態では、それは好ましくは式Ｂｉｏ１又はＢｉｏ２の単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化で導かれる単位を含む。
【００５４】
【化１１】
2009545645.tif 000012
かかるＰＥＧ様構造は、式Ｂｉｏ１（式中、ｐは１〜１０の整数である。）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり得る。別法として、式Ｂｉｏ２のプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造も使用できる。
【００５５】
【化１２】
2009545645.tif 000013
式中、ｐは式Ｂｉｏ１に関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式Ｂｉｏ２中、ｐは好ましくは１又は２であり、ｑは好ましくは５〜１２である。
【００５６】
インビボ用途のための第２の実施形態では、リンカー基がＰＥＧ又はペプチド鎖を含まない場合、好ましいＬ基は、２〜１０の原子、最も好ましくは２〜５の原子、特に好ましくは２又は３の原子を含む−(Ａ)ｍ−部分を構成する結合原子の主鎖を有している。２つの原子を含む最小リンカー基主鎖は、いかなる望ましくない相互作用も最小限に抑えられるようにＣｙＤを十分に引き離すという利点を与える。
【００５７】
インビトロ用途のためには、連結基Ｌは好ましくは次式のものから選択される。
【００５８】
−(ＣＨＲ′)ｐ−Ｍ−(ＣＨＲ′)ｒ−
式中、Ｍは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ａｒ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ′−及び−Ｃ(Ｏ)Ｏ−から選択され、Ｒ′はＨ又はＣ１−４アルキルであり、Ａｒはスルホネートで適宜置換されたフェニルであり、ｐ及びｒは１〜５の値を有する整数である。特に好ましい連結基は、Ｍが−ＣＨ２−及び−ＣＯＮＨ−から選択されるものである。
【００５９】
市販されていないＢＴＭペプチドは、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されているような固相ペプチド合成法によって合成できる。
【００６０】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のコンジュゲートを哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性担体と共に含んでなる医薬組成物を提供する。
【００６１】
「生体適合性担体」とは、コンジュゲートを懸濁又は好ましくは溶解できる流体、特に液体であって、組成物が生理学的に認容できるもの、つまり毒性も耐え難い不快感も伴わずに哺乳類の身体に投与することができるようなものである。生体適合性担体は好適には注射可能な担体液であり、例えば、発熱物質を含まない注射用の滅菌水、食塩液のような水溶液（これは注射用の最終製剤が等張性又は非低張性となるように調整するのに都合がよい）、１種以上の張度調節物質（例えば血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えばグルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えばソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えばグリセロール）その他の非イオン性ポリオール材料（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液である。好ましくは、生体適合性担体媒質は発熱物質を含まない注射用水又は等張食塩水である。
【００６２】
コンジュゲート及び生体適合性担体は各々、無菌健全性及び／又は放射能安全性、さらに適宜ヘッドスペースの不活性ガス（例えば、窒素又はアルゴン）を維持できるとともに、注射器又はカニューレでの溶液の添加及び吸引も行うことのできる密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。かかる容器として好ましいのは、セプタムシールバイアルであり、気密クロージャをオーバーシール（通常はアルミニウム製）と共にクリンプオンする。蓋は、無菌健全性を維持したまま皮下注射針で１回又は複数回穿刺するのに適したもの（例えば、クリンプオン式セプタムシールクロージャー）である。かかる容器は、所望に応じて（例えばヘッドスペースガス又は脱気溶液の変更のため）真空に蓋が耐えるとともに、酸素や水蒸気のような外部雰囲気ガスを侵入させずに減圧のような圧力変化に耐えるという追加の利点がある。
【００６３】
好ましい多用量用容器は、患者の複数回分の用量を収容した単一バルクバイアル（例えば容積１０〜３０ｃｍ３のもの）からなり、臨床症状に応じて製剤の有効期間中様々な時間間隔で１回分の用量を臨床グレードの注射器に吸引することができる。プレフィルド型注射器は患者の１回分の用量つまり「単位用量」を収容するように設計され、そのため好ましくは使い捨てその他臨床用に適した注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００６４】
かかる医薬組成物は、抗菌保存剤、ｐＨ調整剤、充填剤、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を適宜含んでいてもよい。「抗菌保存剤」という用語は、細菌、酵母又はカビなどの有害微生物の増殖を阻害する薬剤を意味する。抗菌保存剤はまた、使用する用量に応じてある程度の殺菌作用を示すこともある。本発明の抗菌保存剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌保存剤は、投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分における有害微生物の増殖の防止にも適宜使用できる。好適な抗菌保存剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌保存剤はパラベン類である。
【００６５】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のための許容範囲（約ｐＨ４．０〜１０．５）内に収まるようにするのに有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を適宜独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００６６】
「充填剤」という用語は、製造及び凍結乾燥時における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適な充填剤には、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００６７】
第２の態様の医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に付属する試薬並びにコンジュゲートに接触する装置部分（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる部品及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００６８】
第２の態様の医薬組成物は、好ましくは第３の態様に関して以下に記載するようなキットから製造される。
【００６９】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様のコンジュゲートを無菌固体形態で含んでおり、第２の態様に記載したような生体適合性担体の無菌供給物で再構成すれば溶解して所望の医薬組成物を与えるキットを提供する。
【００７０】
その場合、コンジュゲート及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。凍結乾燥物は、次いで所望の生体適合性担体を用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬組成物を与えるように設計されている。
【００７１】
コンジュゲートの好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬組成物に関して（上記で）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を適宜含んでいてもよい。
【００７２】
第４の態様では、本発明は、第１の態様のコンジュゲートの製造において有用な官能化色素を提供する。前記官能化色素は、式ＩＩのＣｙＤからなると共に、前記ＣｙＤがさらにＱａ基（式中、ＱａはＢＴＭへのコンジュゲーションに適した反応性官能基である。）を含むものである。Ｑａ基は、ＢＴＭの相補的な官能基と反応することでＣｙＤとＢＴＭとの間に共有結合を形成するように設計されている。ＢＴＭの相補的な官能基は、ＢＴＭの固有部分であってもよいし、或いは当技術分野で公知のように二官能性化合物でＢＴＭを誘導体化することによって導入してもよい。好ましくは、ＢＴＭは誘導体化なしに使用され、したがってＱａ基は好ましくは反応基である。
【００７３】
表１に、反応基及びその相補的な対応基を示す。
【００７４】
【表１】
2009545645.tif 000014
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計されたカルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール及びヒドロキシベンゾトリアゾールである。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステルである。
【００７５】
タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などのＢＴＭ中に存在する官能基の例には、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル（アルデヒド及びケトンを含む）ならチオホスフェートがある。好適なＱａ基は、カルボキシル、活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選択できる。好ましくは、Ｑａはカルボン酸の活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド又はハロアセトアミドである。
【００７６】
相補的な基がアミン又はヒドロキシルである場合、Ｑａは好ましくは活性化エステルであり、特に好ましいかかるエステルには以下のものがある。
【００７７】
【化１３】
2009545645.tif 000015
ＣｙＤ上の好ましいかかる置換基は、アルキルカルボン酸（好ましくは５−カルボキシペンチル基）の活性化エステルである。好ましいかかるエステルには以下のものがある。
【００７８】
【化１４】
2009545645.tif 000016
相補的な基がチオールである場合、Ｑａは好ましくは以下のものから選択される。
【００７９】
【化１５】
2009545645.tif 000017
シアニン色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ他［Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチドＢＴＭは、末端位置で標識することができ、或いは別法として１以上の内部位置で標識することができる。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例に関しては、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ − Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ．（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドにおいて部位特異的標識を達成するためのプロトコルが利用できる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【００８０】
本発明のＣｙＤ色素は、
（ａ）以下の式（Ａ）の第１の化合物と、
【００８１】
【化１６】
2009545645.tif 000018
（式中、Ｒ１〜Ｒ７基は第１の態様に関して（上記で）定義した通りである。）
（ｂ）以下の式（ＩＩａ）の第２の化合物と、
【００８２】
【化１７】
2009545645.tif 000019
（式中、Ｒａ〜Ｒｇ、Ｙ及びＺは第１の態様に関して（上記で）定義した通りである。）
（ｃ）第１の化合物と第２の化合物とのコンジュゲート結合Ｑの形成に適した第３の化合物（Ｃ）と
の反応を含む方法によって製造できる。
【００８３】
かかる方法では、中間化合物（Ａ）、（ＩＩａ）及び（Ｃ）を二段階方法で反応させることができる。この方法では、まず、無水酢酸の存在下で式（Ａ）のインドリウム化合物を結合の形成に適した化合物（Ｃ）（例えば、適宜に置換されたＮ，Ｎ′−ジフェニルホルムアミジン又はマロンアルデヒドジアニル）と反応させて２−アニリノビニル又は４−アニリノ−１，３−ブタジエニル第四級塩を生成することで中間化合物が生成される。この中間第四級塩を、適宜に反応性のメチル基を有するベンゾ［ｂ］ピリリウム、キノリニウム又はアクリジニウム部分のような芳香族複素環と反応させればよい。好適には、かかる反応は無水酢酸及び酢酸カリウムの存在下において周囲温度で実施される。
【００８４】
複素環系を連結するポリメチン結合を形成するための別の中間体も知られており、例えば、Ｈａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９６４）に記載されている。本発明のＣｙＤ色素は、適宜、極性又は無極性溶媒中における化合物の溶解性を高めるために付加し得る荷電基又は極性基を含むように修正することができる。かかる修正の例としては、カルボン酸基をエステル及びアミド基に転化させればよい。また、ヨウ化メチルのようなハロゲン化アルキル、ブタンスルトン又はω−ハロアルキルカルボン酸を用いてキナルジン、レピジン及びアクリジンのＮ−アルキル化を実施すればよい。
【００８５】
Ｃｙ（商標）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄの商標である。
【００８６】
第５の態様では、本発明は、第１の態様のコンジュゲートの製造方法であって、
（ｉ）第１の態様で定義したＢＴＭを第４の態様のＱａ官能化ＣｙＤと混合する段階、
（ｉｉ）Ｑａ基とＢＴＭとの反応に適した条件下で前記Ｑａ官能化ＣｙＤを前記ＢＴＭと共にインキュベートして所望のコンジュゲートを得る段階、並びに
（ｉｉｉ）適宜、段階（ｉｉ）の反応混合物からコンジュゲートを分離及び／又は精製する段階
を含んでなる方法を提供する。
【００８７】
タンパク質の共有結合標識は、通例、水性緩衝媒質（好適にはｐＨ９．０の重炭酸塩緩衝液）中において周囲温度で通例１時間にわたり実施される。通常、反応は暗所で実施される。標識タンパク質は、例えば、固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）及び溶離剤としてリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって未反応色素から分離できる。ＢＴＭの多重標識のためには、色素とＢＴＭとの量又は濃度比をそれに応じて調整すべぎである。
【００８８】
上記の標識方法に加えて、本発明は二段階標識方法にも関する。それによれば、第１の段階では、第４の態様のＱａ官能化ＣｙＤを抗体、タンパク質、ＤＮＡプローブなどの一次成分に結合し、それによって一次成分を標識する。次いで、標識方法の第２の段階では、蛍光標識された一次成分を二次成分（例えば、抗体が特異性を示す抗原）検出用のプローブとして使用する。
【００８９】
好ましくは、コンジュゲートの製造方法は、
（ｉ）ＢＴＭのアミン官能基を式Ｙ１−(Ｌ)ｊ−［ＣｙＤ］の化合物と反応させるか、
（ｉｉ）ＢＴＭのカルボン酸又は活性エステル官能基を式Ｙ２−(Ｌ)ｊ−［ＣｙＤ］の化合物と反応させるか、或いは
（ｉｉｉ）ＢＴＭのチオール官能基を式Ｙ３−(Ｌ)ｊ−［ＣｙＤ］の化合物と反応させる
ことを含む。式中、ＢＴＭ、ＭＩＧ、Ｌ、ｊ及びＣｙＤは上記に定義した通りであり、Ｙ１はカルボン酸基、活性エステル基、イソチオシアネート基又はチオシアネート基であり、Ｙ２はアミン基であり、Ｙ３はマレイミド基である。
【００９０】
Ｙ２は、好ましくは第一又は第二アミン基であり、最も好ましくは第一アミン基である。段階（ｉｉｉ）では、ＢＴＭのチオール基は好ましくはシステイン残基に由来する。
【００９１】
段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）では、ＢＴＭはＣｙＤ誘導体と反応する可能性のある他の官能基を適宜有していてもよいが、これは所望の部位のみで化学反応が選択的に起こるように適当な保護基で保護される。「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から適宜に選択される。好適なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジル及びＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。好ましいチオール保護基はＴｒｔ及びＡｃｍである。
【００９２】
色素をアミノ酸及びタンパク質にコンジュゲートする方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）並びにＦｌａｎａｇａｎ他［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７５１−７５６（１９９７）］、Ｌｉｎ他［ｉｂｉｄ，１３，６０５−６１０（２００２）］及びＺａｈｅｅｒ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，１（４），３５４−３６４（２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をＢＴＭにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。
【００９３】
本発明のＣｙＤ色素の一層具体的な例を以下の表２、表３及び表４に示す。
【００９４】
【表２】
2009545645.tif 000020
2009545645.tif 000021
【００９５】
【表３】
2009545645.tif 000022
2009545645.tif 000023
【００９６】
【表４】
2009545645.tif 000024
第６の態様では、本発明は、哺乳動物体のインビボ光学イメージング方法であって、第１の態様のコンジュゲート又は第２の態様の医薬組成物を用いてインビボでのＢＴＭ局在部位の画像を得ることを含んでなる方法を提供する。
【００９７】
「光学イメージング」という用語は、緑乃至近赤外域（波長５００〜１２００ｎｍ）内の光との相互作用に基づいて、病気の検出、ステージング又は診断、病気進展の追跡、或いは病気治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（編）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ ＆ Ｐｏｇｕｅ（編）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ＆ Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＣＣに示されている。
【００９８】
緑乃至近赤外域の光は、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長を有する。光学イメージング方法は、好ましくは蛍光内視鏡検査である。第６の態様の哺乳動物体は、好ましくは人体である。コンジュゲートの好ましい実施形態は、第１の態様に関して（上記で）記載した通りである。特に、使用するＣｙＤ色素は蛍光性、光安定性、２０ｎｍを超えるストークスシフト、高い量子収量、及び水溶性を有することが好ましい。
【００９９】
第６の態様の方法では、コンジュゲート又は医薬組成物は、好ましくは前記哺乳動物体に予め投与されている。「予め投与されている」とは、臨床医の関与の下で医薬品を例えば静脈内注射によって患者に投与する段階がイメージングに先立って既に実施されていることを意味する。この実施形態は、ＢＴＭが関係している哺乳動物体の病態のインビボ診断イメージング用の診断薬を製造するための、第１の実施形態のコンジュゲートの使用を含んでいる。
【０１００】
第６の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明の薬剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光は色素分子を励起する。励起光によって生じるＣｙＤからの蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。イメージング剤は、病気領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、病気領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて得られ、そうすればリアルタイムイメージングが可能である。
【０１０１】
励起用の波長は、使用する特定のＣｙＤ色素に応じて変化する。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ハロゲン光源或いはキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。適宜、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【０１０２】
好ましいＦＲＩ方法は以下の段階を含んでなる。即ち、
（ｉ）哺乳動物体内の検査対象組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＣｙＤの励起によって生じるイメージング剤からの蛍光を蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器で検出された光を適宜濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記検査対象組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる。段階（ｉ）では、励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。段階（ＩＩＩ）では、検出される光は好ましくは濾光される。特に好ましいＦＲＩ方法は蛍光内視鏡検査である。
【０１０３】
第６の態様の別のイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）を使用する。これは、組織内におけるＩＭの検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＣｙＤが、画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。
【０１０４】
ＦＤＰＭ方法は以下のようなものである。即ち、
（ａ）不均質組成を有する前記哺乳動物体の光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露してイメージング剤を励起する段階であって、組織は励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルは組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる。
【０１０５】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくはイメージング剤の取込みに対応し、好ましくはさらにイメージング剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含む。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及びイメージング剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、イメージング剤濃度に無関係である。
【０１０６】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ｉｉ）推定値の関数として計算発光を求め、（ｉｉｉ）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（ｉｖ）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含む。定量化は、好ましくは、組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含む。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含む。
【０１０７】
第６の態様の光学イメージングは、好ましくは哺乳動物体の病態の管理を支援するために使用される。「管理」という用語は、病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は治療のモニタリングでの使用を意味する。病態は、好適にはイメージング剤のＢＴＭが関係するものである。病態は、好ましくは体表付近又は体腔内に位置しているか、或いは外科的処置で露出させることができる。
【０１０８】
好適な光学イメージング方法のさらなる詳細は、Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ他［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］によって総説されている。
【０１０９】
第７の態様では、本発明は、哺乳動物体の病気進行の検出、ステージング、診断、モニタリング又は病態の治療のモニタリングを行う方法であって、第６の態様のインビボ光学イメージング方法を含んでなる方法を提供する。
【０１１０】
さらに他の態様では、本発明は、試料中の検体のアッセイ方法であって、
（ｉ）検体の少なくとも一部を前記検体に対する特異的結合パートナーに結合させて複合体を形成するのに適した条件下で前記検体を前記特異的結合パートナーに接触させる段階であって、前記特異的結合パートナーが第１の態様の色素コンジュゲートからなる段階、
（ｉｉ）標識複合体の放射蛍光を測定する段階、及び
（ｉｉｉ）放射蛍光を前記試料中の前記検体の存在又は量と相関させる段階
を含んでなる方法を提供する。
【０１１１】
一実施形態では、アッセイ方法は試料中の検体を測定するための直接アッセイである。適宜、アッセイ混合物中に既知又は推定阻害剤化合物を含めることができる。この場合、測定結果は既知又は推定阻害剤の生物学的活性と相関し得る。第２の別の実施形態では、アッセイは競合アッセイであり得る。この場合、検体及びコンジュゲートの両方と特異的に結合し得る結合パートナー上の限られた数の結合部位に対し、検体を含む試料は蛍光コンジュゲートと競争する。試料中の検体の量（又は濃度）が増加すれば、特異的結合パートナーに結合する式ＩＩの蛍光コンジュゲートの量は減少する。蛍光信号を測定し、標準曲線からの内挿によって検体の濃度を求めることができる。
【０１１２】
さらに他の実施形態では、結合アッセイは二段階フォーマットを使用することができる。この場合、適宜不溶性支持体に結合させてもよい第１の成分を第２の成分に結合させて特異的結合複合体を形成し、次いでこれを第３の成分に結合させる。このフォーマットでは、第３の成分は第２の成分又は特異的結合複合体に特異的に結合することができる。第２の成分又は第３の成分のいずれかが本発明のコンジュゲートであり得る。その例には「サンドイッチ」アッセイがある。この場合、特異的結合対の一方の成分（例えば、第１の抗体）を表面（例えば、マルチウェルプレートのウェル）にコートする。第１の抗体に抗原を結合した後、蛍光標識された第２の抗体をアッセイ混合物に添加して抗原−第１の抗体複合体と結合させる。蛍光信号を測定し、標準曲線からの内挿によって抗原の濃度を求めることができる。
【０１１３】
検体−特異的結合パートナー対の例には、特に限定されないが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／レセプター、酵素／基質又は補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質がある。互いに特異的結合親和性を有する任意の分子が使用できるので、本発明の蛍光色素は特異的結合対の一方の成分を標識するために使用でき、次いでそれを他方の成分への結合の検出に使用できる。
【０１１４】
本発明の化合物はまた、複数の蛍光色素を複数の相異なる一次成分（例えば、抗体）に共有結合で結合し、各一次成分は異なる二次成分（例えば、抗原）に対して特異的であり、二次成分の混合物中における複数の二次成分の各々を確認するために役立つ検出方法でも使用できる。このような使用方法では、一次成分の各々を、他の一次成分を標識するために使用する色素分子に比べて異なる吸光及び発光波長特性を有する蛍光色素で別々に標識する。次いで、標識された一次成分を二次成分（例えば、抗原）を含む調製物に添加し、一次成分をそれが選択性をもったそれぞれの二次成分に結合させる。
【０１１５】
分析への干渉を防止するため、例えば洗浄によって調製物から未反応のプローブ物質を除去する。次いで、特定の蛍光化合物の吸収波長を含む一定範囲の励起波長に調製物を暴露する。次に、励起波長の光線を選択しかつ蛍光の波長を選択するためのフィルター又はモノクロメーターを有する蛍光顕微鏡又は他の蛍光検出装置（例えば、フローサイトメーター又は蛍光分光光度計）を用いて、使用した蛍光化合物に対応する発光波長の強度を測定する。蛍光の強度は、特定の標識一次成分と結合した二次成分の量を表す。マルチパラメーター蛍光研究を行うための公知技法には、例えば、マルチパラメーターフローサイトメトリーがある。若干の場合には、単一の励起波長を用いて、各々が異なる波長の蛍光を生じる混合物中の２種以上の物質から蛍光を励起することができる。各標識化学種の量は、それぞれの発光波長において個々の蛍光強度を検出することで測定できる。所望ならば、吸光方法も使用できる。
【０１１６】
本発明の検出方法は、蛍光性の一次成分の生成が可能である任意の系に適用できる。例えば、適当な反応性をもった蛍光化合物をＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントにコンジュゲートし、次いで得られたコンジュゲートをＤＮＡ又はＲＮＡの相補的な標的ストランドに結合させる。次いで、適当な蛍光検出装置を用いて結合した蛍光性コンジュゲートの存在を検出することができる。
【０１１７】
以下の実施例及び図面を参照することで本発明をさらに例証する。
【０１１８】
実施例１〜実施例７は、上述した成分（ＩＩａ）及び（Ｃ）と反応させて本発明の色素を得ることができる本発明の式Ａの各種フッ素化色素前駆体の合成法を示す。実施例８及び実施例９は、実施例１〜実施例７の前駆体とのカップリングに適した式（ＩＩａ）のベンゾ［ｂ］ピリリウム化合物を示す。実施例１０は、複素環式Ｎ原子のＮアルキル化によって４−スルホブチル置換基を導入する方法を示す。実施例１１〜実施例２３は、本発明の式ＩＩＩ、ＩＶｂ及びＩＶｃの色素を示す。実施例１１〜実施例１８は、本発明のペンタメチン色素の合成法を示す。実施例１９〜実施例２１は、本発明のトリメチン色素の合成法を示す。実施例２２及び実施例２３は、本発明のヘプタメチン色素の合成法を実証する。実施例２４及び実施例２５は、ＮＨＳエステル（Ｑａ基）で置換された本発明の色素を示す。実施例２６は、フッ素化色素が一般に非フッ素化色素類似体に比べて高い光漂白抵抗性を示すことを実証する光安定性研究を示す。同じ期間にわたって光に暴露しなかった対照試料は、吸光度の低下を示さなかった。実施例２７は、本発明の色素のＲＧＤペプチドコンジュゲートの合成法を示す。
【０１１９】
図１及び図２は、本発明の色素の向上した光安定性を示す。
【０１２０】
略語
ＤＭＦ：        ジメチルホルムアミド
ＨＡＴＵ：      Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′                −テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ：      高速液体クロマトグラフィー
ＮＨＳ：        Ｎ−ヒドロキシスクンイミド
ＮＭＭ：        Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：        １−メチル−２−ピロリジン
ＬＣ−ＭＳ：    液体クロマトグラフィー質量分析法
ＴＦＡ：        トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ：        薄層クロマトグラフィー
【実施例１】
【０１２１】
実施例１：４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１２２】
【化１８】
2009545645.tif 000025
１．１  ５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸ナトリウム
【０１２３】
【化１９】
2009545645.tif 000026
水素化ナトリウム（６０ｗｔ％、１２ｇ≡０．３ｍｏｌ ＮａＨ）を乾燥ＤＭＦ（１００ｍｌ）中にスラリー化した。得られた懸濁液を撹拌しながら０℃に冷却した。これにエチル２−メチルアセトアセテート（５０ｇ、０．３４６ｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を、温度を１０℃未満に保ちかつ泡立ちを抑制するようにして滴下した。添加の完了及び水素発生の停止後、混合物を透明な淡黄色溶液が得られるまで温水浴中で温めた。これを再び０℃に冷却した。１，４−ブタンスルトン（４５ｇ、０．３３ｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を、温度を１０℃未満に保ちながら１５分かけて添加した。添加の完了後、混合物を５０℃で１６時間加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発乾固し、残留物を水とジエチルエーテルとの間に分配させた。水性層を保持する一方、有機層を新鮮な水で抽出し、次いで廃棄した。合わせた水性抽出液を新鮮なエーテルで洗浄し、次いで真空下で蒸発させることで、標記化合物をろう状固体として得た。δＨ（２７０ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）４．２３（２Ｈ，ｑ）、２．９（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、２．２６（３Ｈ，ｓ）、２．０−１．６（６Ｈ，ｍ）、１．３６（３Ｈ，ｓ）及び１．２６（３Ｈ，ｔ）。
【０１２４】
１．２  ５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
【０１２５】
【化２０】
2009545645.tif 000027
（１．１からの）５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸ナトリウムを、ＴＬＣが反応の完了を示すまで（約３時間）、濃塩酸（２００ｍｌ）中において９０℃で加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、エタノール／ジクロロメタン混合物）で精製することで４９．６ｇの標記化合物を得た。δＨ（２７０ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）２．９（２Ｈ，ａｐｐ ｔ）、２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．２（３Ｈ，ｓ）、１．８−１．３（６Ｈ，ｍ）及び１．１８（３Ｈ，ｄ）。
【０１２６】
１．３  ２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３Ｈ−インドール
【０１２７】
【化２１】
2009545645.tif 000028
２，３，４，５−テトラフルオロアニリン（１．７５ｇ、０．０１Ｍ）を濃ＨＣｌ（２８０ｍｌ）に溶解した。フラスコを−１０℃に保ち、ＮａＮＯ２（１当量）の水（１０ｍｌ）溶液を滴下し、次いで塩化スズ（ＩＩ）（３．４ｇ）の濃ＨＣｌ（４０ｍｌ）溶液を滴下した。反応物を周囲温度に戻し、１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去することで、粗２，３，４，５−テトラフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩を黄色の固体（７ｇ）として得た。これを酢酸（５０ｍｌ）に再溶解し、次いで５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（６ｇ）を添加した。溶液を１４０℃で２時間加熱して、微細な橙色の沈殿を含む橙色の溶液を得た。溶媒を蒸発させて褐色のガムを得、これから標記生成物を逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ、水／アセトニトリル勾配）によって単離した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３５４。
【０１２８】
１．４  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１２９】
【化２２】
2009545645.tif 000029
（１．３からの）四フッ素化インドール（１５０ｍｇ、４．２×１０−４ｍｏｌ、１当量）を窒素下において６−ブロモヘキサン酸（１５ｇ、０．０７３ｍｏｌ、２６０当量）と共に１４０℃で２４時間加熱した。最終反応混合物をジエチルエーテルでトリチュレートし、真空下で乾燥して褐色の塊を得た。ＬＣ−ＭＳにより、主成分は標記化合物であると確認された。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝４７０。
【実施例２】
【０１３０】
実施例２：４−［３−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１３１】
【化２３】
2009545645.tif 000030
２．１  ６−（４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−３−イル）ヘキサン酸
【０１３２】
【化２４】
2009545645.tif 000031
２，３，４，５−テトラフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩（２ｇ）に７−メチル−８−オキソノナン酸（３ｇ）及び酢酸（５０ｍｌ）を添加し、混合物を１４０℃で５時間加熱した。冷却後、揮発分をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を水（１０ｍｌ）に溶解し、濾過し、分取ＨＰＬＣにより２ショットで精製して標記化合物を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３３２。
【０１３３】
２．２  ４−［３−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１３４】
【化２５】
2009545645.tif 000032
６−（４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−３−イル）ヘキサン酸（６００ｍｇ）にブタンスルトン（４ｍｌ）を添加し、混合物を１４０℃で一晩加熱した。冷却後、混合物を水（４ｍｌ）で希釈し、濾過し、分取ＨＰＬＣで精製して標記化合物を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝４６８。
【実施例３】
【０１３５】
実施例３：４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，６−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１３６】
【化２６】
2009545645.tif 000033
３．１  ４，６−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール
【０１３７】
【化２７】
2009545645.tif 000034
酢酸（２０ｍｌ）中の３，５−ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩（１ｇ）に５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（１．６ｇ）を添加し、溶液を一晩加熱還流した。揮発分をロータリーエバポレーターで除去して粗生成物を得、その５０ｍｇを分取ＨＰＬＣで精製した。関連画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して標記生成物（１９ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３１７。
【０１３８】
３．２  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，６−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１３９】
【化２８】
2009545645.tif 000035
４，６−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール（非精製材料０．８ｇ）に６−ブロモヘキサン酸（１．６ｇ）を添加し、溶液を１４０℃で２日間加熱した。冷却後、生成物をアセトニトリルで希釈し、分取ＨＰＬＣで精製した。関連画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して所望生成物（１１０ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝４３２。
【実施例４】
【０１４０】
実施例４：４−［３−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−４，６−ビス（トリフルオロメチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１４１】
【化２９】
2009545645.tif 000036
４．１  ４，６−ビス（トリフルオロメチル）−２，３−ジメチル−３−（５−カルボキシペンチル）−３Ｈ−インドール
【０１４２】
【化３０】
2009545645.tif 000037
酢酸（２０ｍｌ）中の３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニルヒドラジン塩酸塩（１ｇ）に７−メチル−８−オキソノナン酸（０．６６ｇ）を添加し、溶液を５時間加熱還流した。揮発分をロータリーエバポレーターで除去して粗生成物を得、その１ｍｌを分取ＨＰＬＣで精製した。関連画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して所望生成物（１７ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３９５。
【０１４３】
４．２  ４，６−ビス（トリフルオロメチル）−２，３−ジメチル−３−（５−カルボキシペンチル）−３Ｈ−インドール（非精製材料３００ｍｇ）にブタンスルトン（３ｍｌ）を添加し、溶液を１４０℃で１日間加熱した。冷却後、生成物を水で抽出し、分取ＨＰＬＣで精製した。関連画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して所望生成物（１９ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝５３２。
【実施例５】
【０１４４】
実施例５：４−［３−（５−カルボキシペンチル）−６−フルオロ−２，３−ジメチル−４−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１４５】
【化３１】
2009545645.tif 000038
５．１  ６−（４−トリフルオロメチル−６−フルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−３−イル）ヘキサン酸
【０１４６】
【化３２】
2009545645.tif 000039
３−トリフルオロメチル−５−フルオロフェニルヒドラジン（２ｇ）に７−メチル−８−オキソノナン酸（３ｇ）及び酢酸（５０ｍｌ）を添加し、混合物を１４０℃で５時間加熱した。冷却後、揮発分をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を水（１０ｍｌ）に溶解し、濾過し、分取ＨＰＬＣで精製して所望生成物（６００ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３４６。
【０１４７】
５．２  ４−［３−（５−カルボキシペンチル）−６−フルオロ−２，３−ジメチル−４−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１４８】
【化３３】
2009545645.tif 000040
６−（４−トリフルオロメチル−６−フルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−３−イル）ヘキサン酸（６００ｍｇ）に１，４−ブタンスルトン（４ｍｌ）を添加し、混合物を１４０℃で一晩加熱した。冷却後、混合物を水（４ｍｌ）で希釈し、濾過し、分取ＨＰＬＣで精製して所望生成物（８００ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝４８３。
【実施例６】
【０１４９】
実施例６：４−［１−（５−カルボキシペンチル）−６−フルオロ−２，３−ジメチル−４−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１５０】
【化３４】
2009545645.tif 000041
６．１  ４−トリフルオロメチル−６−フルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール
【０１５１】
【化３５】
2009545645.tif 000042
３−トリフルオロメチル−５−フルオロフェニルヒドラジン（２ｇ）に５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（３ｇ）及び酢酸（６０ｍｌ）を添加し、混合物を１４０℃で５時間加熱した。その後、揮発分をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を水（１０ｍｌ）に溶解し、濾過し、分取ＨＰＬＣで精製して所望生成物（７９０ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３６８。
【０１５２】
６．２  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−６−フルオロ−２，３−ジメチル−４−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１５３】
【化３６】
2009545645.tif 000043
４−トリフルオロメチル−６−フルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール（７９０ｍｌ）にブタンスルトン（１０ｍｌ）を添加し、混合物を１４０℃で一晩加熱した。混合物を水（４ｍｌ）で希釈し、濾過し、分取ＨＰＬＣで精製して所望生成物（１ｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝５０５。
【実施例７】
【０１５４】
実施例７：４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１５５】
【化３７】
2009545645.tif 000044
７．１  ５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール
【０１５６】
【化３８】
2009545645.tif 000045
酢酸（６０ｍｌ）中の２，４−ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩（２ｇ）に５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（４．５ｇ）を添加し、溶液を２時間加熱還流した。揮発分をロータリーエバポレーターで除去して粗生成物を得、それをフラッシュクロマトグラフィー（ＲＰ−１８シリカ、溶離剤として水／アセトニトリル混合物）で精製した。（ＬＣ−ＭＳで確認した）関連画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して所望生成物（６ｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３１７。
【０１５７】
７．２  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１５８】
【化３９】
2009545645.tif 000046
５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール（１．０ｇ）に６−ブロモヘキサン酸（５ｇ）を添加し、溶液を１４０℃で２日間加熱した。冷却後、生成物をジエチルエーテルでトリチュレートしてスラリーを得た。固形分を濾過によって集め、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥して粗生成物を得た。これをさらに分取ＨＰＬＣで精製して標記生成物（３００ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝４３２。
【実施例８】
【０１５９】
実施例８：２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジメチルアミノ−４−メチルクロメニリウムテトラフルオロボレート
【０１６０】
【化４０】
2009545645.tif 000047
８．１  ２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−オン
この種の化合物の製法は、国際公開第９２／０９６６１号（Ｔｅｌｆｅｒ他）、実施例１に記載されている。この方法に従い、３−ジメチルアミノフェノール（４．４ｇ、０．０３２ｍｏｌ）及びメチル４，４−ジメチル−３−オキソペンタノエート（８．８ｇ、０．０５６ｍｏｌ）を窒素下において１８０℃（Ｗｏｏｄｓ金属浴）で４０時間撹拌した。反応混合物を冷却し、ジクロロメタン／ヘキサンに溶解し、酢酸エチル／ヘキサン混合物を用いてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した。収量５．４１ｇ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝２４６。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：３４７、２９４、２６３及び２１５ｎｍ。
【０１６１】
８．２  ２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジメチルアミノ−４−メチルクロメニリウムテトラフルオロボレート
この化合物の製法は、国際公開第９２／０９６６１号（Ｔｅｌｆｅｒ他）、実施例３に記載されている。２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−オン（２．４５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の乾燥テトラヒドロフラン（２４ｍｌ）溶液に、臭化メチルマグネシウム（３Ｍエーテル溶液４．５ｍｌ、１３．５．５ｍｍｏｌ）を窒素下において０℃で滴下した。反応混合物を２５℃で１７時間撹拌し、次いで氷水中に注ぎ込んだ。テトラフルオロホウ酸（４８ｗｔ％水溶液、５ｍｌ）を添加し、混合物を短時間撹拌し、次いでジクロロメタン（１００ｍｌ＋２×２５ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で少量になるまで蒸発させた。酢酸エチル（１００ｍｌ）を添加し、蒸発を継続することで、生成物を黄色の固体として得た。これをさらに多くの酢酸エチル中にスラリー化し、濾過によって集め、真空下で乾燥した。収量２．９７ｇ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝２４４。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：４６８、２８７及び２１９ｎｍ。
【実施例９】
【０１６２】
実施例９：１１−ｔｅｒｔ−ブチル−９−メチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１２−イウムテトラフルオロボレート
【０１６３】
【化４１】
2009545645.tif 000048
３−ジメチルアミノフェノール出発原料の代わりに８−ヒドロキシユロリジンを使用した点を除き、実施例８に記載した方法と同様な方法でこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝２９６。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：４８６、３５９、２９９、２７５及び２２８ｎｍ。
【実施例１０】
【０１６４】
実施例１０：ブタンスルトンによるキナルジン、レピジン及びアクリジンのＮ−アルキル化のための一般的方法
ブタンスルトンでキナルジン類、レピジン類及び９−メチルアクリジン類をＮ−アルキル化してＮ−（４−スルホナトブチル）誘導体を生成することは、米国特許第６５７９７１８号（Ｙｕｅ他）に記載された方法と同様な方法によって実施できる。通例、窒素ヘテロ芳香族化合物とブタンスルトン（過剰）の混合物を撹拌しながら最高１４０℃で最大２４時間加熱する。室温まで冷却した後、混合物を酢酸エチル又はジエチルエーテルでトリチュレートしてＮ−アルキル化生成物を得、これを色素合成で直接使用する。以下の実施例には典型的な合成例が記載される。
【０１６５】
４−（４−メチルキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート
【０１６６】
【化４２】
2009545645.tif 000049
レピジン（２．８６ｇ）及び１，４−ブタンスルトン（５ｍｌ）を混合し、６５℃で１７時間加熱すると、その間に白色固体が析出した。混合物を周囲温度まで放冷した後、混合物をエーテルで希釈し、固体を濾過によって集め、新鮮なエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して標記化合物（３．１４ｇ）を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝２８０。
【実施例１１】
【０１６７】
実施例１１：４−［（４Ｅ）−４−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝キノリン−１（４Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
１１．１  ４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−４−［アセチル（フェニル）アミノ］ブタ−１，３−ジエニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１６８】
【化４３】
2009545645.tif 000050
４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１、１．５ｇ）を無水酢酸（３３ｍｌ）及び酢酸（１７ｍｌ）中のマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）・ＨＣｌ（１．０ｇ）と混合し、１２０℃で１７時間加熱した。次いで、得られた濃黄色の溶液を直接使用してペンタメチン色素例を製造した。
【０１６９】
１１．２  ４−［（４Ｅ）−４−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝キノリン−１（４Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１７０】
【化４４】
2009545645.tif 000051
４−（４−メチルキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（実施例１０、１５０ｍｇ）及び酢酸カリウム（１．０ｇ）を含むフラスコに、実施例１１．１からの溶液のアリコート（５．０ｍｌ）を添加した。得られた混合物を周囲温度で２４時間撹拌した後、１００ｍｌの撹拌酢酸エチルに添加した。析出した固体を濾過によって集め、酢酸エチル及びエーテルで洗浄し、空気乾燥した。次いで、粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製して標記色素を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７８３。Ｃ３７Ｈ４３Ｎ２Ｆ４Ｏ８Ｓ２＋に関する正確な質量：７８３．２３９７、実測Ｍ＋ ＠７８３．２４０８（１．４ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６０７ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６０８ｎｍ；発光λｍａｘ＝７２４ｎｍ。
【実施例１２】
【０１７１】
実施例１２：４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝キノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート（化合物２）
【０１７２】
【化４５】
2009545645.tif 000052
４−（２−メチルキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（１５０ｍｇ）を使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７８３。Ｃ３７Ｈ４３Ｎ２Ｆ４Ｏ８Ｓ２＋に関する正確な質量：７８３．２３９７、実測Ｍ＋ ＠７８３．２４１９（２．８ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：５９８ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６００ｎｍ；発光λｍａｘ＝６８０ｎｍ。
【実施例１３】
【０１７３】
実施例１３：４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝−６−メチルキノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１７４】
【化４６】
2009545645.tif 000053
４−（２，６−ジメチルキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（１５０ｍｇ）を使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７９７。Ｃ３８Ｈ４５Ｎ２Ｆ４Ｏ８Ｓ２＋に関する正確な質量：７９７．２５５３、実測Ｍ＋ ＠７９７．２５８８（４．３ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：５８６ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝５９８ｎｍ；発光λｍａｘ＝６７８ｎｍ。
【実施例１４】
【０１７５】
実施例１４：４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝−６−フルオロキノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１７６】
【化４７】
2009545645.tif 000054
４−（２−メチル−６−フルオロキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（６０ｍｇ）を酢酸カリウム（４００ｍｇ）及び実施例１１．１からの溶液（２．０ｍｌ）と共に使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝８０１。Ｃ３７Ｈ４２Ｎ２Ｆ５Ｏ８Ｓ２＋に関する正確な質量：８０１．２３０３、実測Ｍ＋ ＠８０１．２３２１（２．３ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６０７ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６１６ｎｍ；発光λｍａｘ＝６８３ｎｍ。
【実施例１５】
【０１７７】
実施例１５：４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝−７−フルオロキノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１７８】
【化４８】
2009545645.tif 000055
４−（２−メチル−７−フルオロキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（６０ｍｇ）を酢酸カリウム（４００ｍｇ）及び実施例１１．１からの溶液（２．０ｍｌ）と共に使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝８０１。Ｃ３７Ｈ４２Ｎ２Ｆ５Ｏ８Ｓ２＋に関する正確な質量：８０１．２３０３、実測Ｍ＋ ＠８０１．２３１８（１．９ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６１４ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６１６ｎｍ；発光λｍａｘ＝６８５ｎｍ。
【実施例１６】
【０１７９】
実施例１６：４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ペンタ−２，４−ジエニリデン｝−７−クロロキノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１８０】
【化４９】
2009545645.tif 000056
４−（２−メチル−７−クロロキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（６０ｍｇ）を酢酸カリウム（４００ｍｇ）及び実施例１１．１からの溶液（２．０ｍｌ）と共に使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝８１７／８１９。（３５Ｃｌを含む）Ｃ３７Ｈ４２Ｎ２ＣｌＦ４Ｏ８Ｓ２＋に関する正確な質量：８１７．２００７、実測Ｍ＋ ＠８１７．２０３９（３．９ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６２７ｎｍ。
【実施例１７】
【０１８１】
実施例１７：４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（化合物１）
【０１８２】
【化５０】
2009545645.tif 000057
２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジメチルアミノ−４−メチルクロメニリウムテトラフルオロボレート（実施例８．２、１６５ｍｇ）を使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７４７。Ｃ３９Ｈ４７Ｎ２Ｆ４Ｏ６Ｓ＋に関する正確な質量：７４７．３０９１、実測Ｍ＋ ＠７４７．３０５５（４．８ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：７０２ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝７０１ｎｍ；発光λｍａｘ＝７３６ｎｍ。
【実施例１８】
【０１８３】
実施例１８：４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１１−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，９Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１８４】
【化５１】
2009545645.tif 000058
１１−ｔｅｒｔ−ブチル−９−メチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１２−イウムテトラフルオロボレート（実施例９、１９０ｍｇ）をを使用した点を除き、実施例１１．２と同様にしてこれを製造した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７９９。Ｃ４３Ｈ５１Ｎ２Ｆ４Ｏ６Ｓ＋に関する正確な質量：７９９．３４０４、実測Ｍ＋ ＠７９９．３４１２（１．０ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６９９ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６９８ｎｍ；発光λｍａｘ＝７４８ｎｍ。
【実施例１９】
【０１８５】
実施例１９：４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−イリデン］プロプ−１−エニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（化合物３）
【０１８６】
【化５２】
2009545645.tif 000059
４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１、６０ｍｇ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジメチルアミノ−４−メチルクロメニリウムテトラフルオロボレート（実施例８、８０ｍｇ）、トリエチルオルトホルメート（０．５ｍｌ）及びピリジン（１．０ｍｌ）を混合し、１２０℃で３時間加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を分取ＨＰＬＣに付し、青色色素画分を回収した。追加の分取ＴＬＣ（シリカ、メタノール（１５）：酢酸エチル（８５））により、分析的に純粋な試料を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７２１。Ｃ３７Ｈ４５Ｎ２Ｆ４Ｏ６Ｓ＋に関する正確な質量：７２１．２９３４、実測Ｍ＋ ＠７２１．２９４６（１．６ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６１７ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６１６ｎｍ；発光λｍａｘ＝６４１ｎｍ。
【実施例２０】
【０１８７】
実施例２０：４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−イリデン］プロプ−１−エニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１８８】
【化５３】
2009545645.tif 000060
４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例７、１００ｍｇ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジメチルアミノ−４−メチルクロメニリウムテトラフルオロボレート（実施例８、１００ｍｇ）、トリエチルオルトホルメート（０．５ｍｌ）及びピリジン（１．０ｍｌ）を混合し、１２０℃で３時間加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣに付し、青色色素画分を回収した。追加の分取ＴＬＣ（シリカ、メタノール（１５）：酢酸エチル（８５））により、分析的に純粋な試料を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝６８５。Ｃ３７Ｈ４７Ｎ２Ｆ２Ｏ６Ｓ＋に関する正確な質量：６８５．３１２３、実測Ｍ＋ ＠６８５．３１０９（２．０ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６２６ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６２７ｎｍ；発光λｍａｘ＝６４７ｎｍ。
【実施例２１】
【０１８９】
実施例２１：４−［２−［（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１１−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，９Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イリデン）プロプ−１−エニル］−１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１９０】
【化５４】
2009545645.tif 000061
４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例７、１００ｍｇ）、１１−ｔｅｒｔ−ブチル−９−メチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１２−イウムテトラフルオロボレート（実施例９、１２０ｍｇ）、トリエチルオルトホルメート（１．０ｍｌ）及びピリジン（２．０ｍｌ）を混合し、１２０℃で３時間加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を分取ＨＰＬＣに付し、青色色素画分を回収した。追加の分取ＴＬＣ（シリカ、メタノール（１５）：酢酸エチル（８５））により、分析的に純粋な試料を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７３７。Ｃ４１Ｈ５１Ｎ２Ｆ２Ｏ６Ｓ＋に関する正確な質量：７３７．３４３６、実測Ｍ＋ ＠７３７．３４３３（０．４ｐｐｍ）。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６３９ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝６３９ｎｍ；発光λｍａｘ＝６６３ｎｍ。
【実施例２２】
【０１９１】
実施例２２：４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ヘプタ−２，４，６−トリエニリデン｝−６−メチルキノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
２２．１  ４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−６−［アセチル（フェニル）アミノ］ヘキサ−１，３，５−トリエニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１９２】
【化５５】
2009545645.tif 000062
４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例７、０．３ｇ）を無水酢酸（６．７ｍｌ）及び酢酸（３．４ｍｌ）中のグルタコンアルデヒドビス（フェニルイミン）・ＨＣｌ（２００ｍｇ）と混合し、１２０℃で１７時間加熱した。次いで、得られた濃赤色の溶液を直接使用してヘプタメチン色素例を製造した。
【０１９３】
２２．２  ４−［（２Ｅ）−２−｛（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−２−イル］ヘプタ−２，４，６−トリエニリデン｝−６−メチルキノリン−１（２Ｈ）−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１９４】
【化５６】
2009545645.tif 000063
２１．１からのヘプタメチン半色素溶液２ｍｌに、４−（２，６−ジメチルキノリニウム−１−イル）ブタン−１−スルホネート（６０ｍｇ）及び酢酸カリウム（４００ｍｇ）を添加した。得られた混合物を周囲温度で一晩撹拌した後、過剰の酢酸エチル中に沈殿させた。粗生成物色素を濾過によって集め、水／アセトニトリルに再溶解し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して標記色素を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７８７。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：６６１ｎｍ。蛍光（ＭｅＯＨ）：発光λｍａｘ＝８００ｎｍ。
【実施例２３】
【０１９５】
実施例２３：４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−［［２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１９６】
【化５７】
2009545645.tif 000064
２１．１からのヘプタメチン半色素溶液２ｍｌに、２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ジメチルアミノ−４−メチルクロメニリウムテトラフルオロボレート（実施例８、６５ｍｇ）及び酢酸カリウム（４００ｍｇ）を添加した。得られた混合物を周囲温度で一晩撹拌した後、過剰の酢酸エチル中に沈殿させた。粗生成物色素を濾過によって集め、水／アセトニトリルに再溶解し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して標記色素を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝７３７。ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：８２９ｎｍ。
【実施例２４】
【０１９７】
実施例２４：４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−７−（ジメチルアミノ）−４Ｈ−クロメン−４−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０１９８】
【化５８】
2009545645.tif 000065
化合物１（実施例１７、２０ｍｇ）を音波処理でＤＭＦ（１ｍｌ）及びＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解した。得られた溶液にＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１０ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５μｌ）を添加し、次いで反応物を周囲温度で１時間撹拌した。ＴＬＣ（シリカ、メタノール（２０）：ジクロロメタン（８０）、Ｒｆ ＳＭ遊離酸≒０．３、Ｒｆ ＳＭ ＮＨＳエステル≒０．５）によって反応の完了を確認した。次いで、この混合物を酢酸エチル（２０ｍｌ）とジエチルエーテル（２０ｍｌ）の混合物中にフィルターを通して滴下することで沈殿を得た。これを遠心によって集め、新鮮な酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥して２５ｍｇの生成物を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝８９６。
【実施例２５】
【０１９９】
実施例２５：４−［２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１１−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，９Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル］−１−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【０２００】
【化５９】
2009545645.tif 000066
カルボキシ色素４−［２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１１−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，９Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１８、１６ｍｇ）を音波処理でＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。得られた溶液にＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１０ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５μｌ）を添加し、次いで反応物を周囲温度で１時間撹拌した。ＴＬＣ（シリカ、メタノール（２０）：ジクロロメタン（８０）、Ｒｆ ＳＭ遊離酸≒０．２５、Ｒｆ ＳＭ ＮＨＳエステル≒０．５）によって反応の完了を確認した。次いで、この混合物を酢酸エチル（２０ｍｌ）とジエチルエーテル（２０ｍｌ）の混合物中にフィルターを通して滴下することで沈殿を得た。これを遠心によって集め、新鮮な酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥して１８ｍｇの生成物を得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、Ｍ＋＝８４４。
【実施例２６】
【０２０１】
実施例２６：本発明の色素の光安定性
以下に記載するようにして光安定性研究を実施した。各試験色素を、０７〜１．２Ａｕの吸光度読みが得られるようにメタノール：水の１：１混合物又は水に溶解した。次いで、各溶液をさらに２つのバイアルに分割した。一方の色素溶液バイアルは、実験の進行中、対照試料（「暗試料」）として暗環境に保った。他方は強い光源（Ｗａｌｌａｃライトボックス；１２９５−０１３）に暴露した。試料を光源から２２ｃｍ上方に保ち、光に連続的に暴露した。各試料のＵＶ／可視スペクトルを６日間の試験期間にわたり一定間隔で測定した。各測定点に関しては、同一のキュベット及び分光光度計を使用した。暗所に保った対照試料に関しては、実験の開始時及び終了時にＵＶ／可視吸収スペクトルを測定した。各試験は二重に実施した。
【０２０２】
化合物１（実施例１７のＣｙ５Ｆピリリウム色素）の光安定性を、対応する非フッ素化類似体であるＣｙ５ピリリウム（化合物Ａ）と比較して調べた。
【０２０３】
【化６０】
2009545645.tif 000067
化合物２（実施例１２のＣｙ５Ｆキノリニウム色素）の光安定性を、非フッ素化類似体であるＣｙ５キノリニウム（化合物Ｂ）と比較して調べた。
【０２０４】
【化６１】
2009545645.tif 000068
各実験に関するデータを正規化し、図１及び図２に示すようにプロットした。
【０２０５】
さらなる実施例では、蛍光信号の光安定性を測定した。化合物３（実施例１９のフッ素化Ｃｙ３Ｆピリリウム）の光安定性を、非フッ素化類似体であるＣｙ３ピリリウム（化合物Ｃ）と比較して調べた。
【０２０６】
【化６２】
2009545645.tif 000069
これらの色素を、色素のλｍａｘで１Ａｕの吸光度読みが得られるようにメタノール：水の１：１混合物に溶解し、次いで蛍光測定のため２０倍に希釈した。Ｋａｒｌ Ｓｔｏｒｔｚ Ｘｅｎｏｎ １７５光源を用いて、試料を１００％強度で３０分間露光した。加熱を避けるため、キュベットは露光しながら水浴中に保った。Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｖａｒｉａｎ）蛍光分光光度計、１ｃｍキュベット、ｅｘ／ｅｍスリット５ｎｍを用いて蛍光測定を行った。
【０２０７】
化合物３は暗対照の０．９４という向上した光安定性を示したのに対し、非フッ素化類似体（化合物Ｃ）は対照の０．７９という最大蛍光強度を有していた。
【実施例２７】
【０２０８】
実施例２７：色素−ＲＧＤペプチドコンジュゲート（コンジュゲート１及びコンジュゲート２）の合成
コンジュゲート１
【０２０９】
【化６３】
2009545645.tif 000070
コンジュゲート２
【０２１０】
【化６４】
2009545645.tif 000071
標準的な固相ペプチド合成法を用いて示したペプチドをアセンブルした。クロロアセチル化ペプチドを固体支持体から切断し、溶液中で環化させたところ、まずチオエーテル橋が形成され、次いでジスルフィド橋が形成された。
【０２１１】
化合物１（実施例１７、０．００１８ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（０．５ｍＬ）に溶解し、ＮＭＭ（１μＬ）を添加し、次いでＨＡＴＵ（０．８ｍｇ、０．００２２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を暗所で５分間撹拌し、次いでＲＧＤペプチドアミン（２．３ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（０．５ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次いで５０℃で２時間加熱した。
【０２１２】
実施例１８の色素を用いて、コンジュゲート２を同様に製造した。
【０２１３】
色素−ペプチドコンジュゲートをＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５０×４．６ｍｍ、５ミクロン、１１０Å、Ａ＝水／０．１％ギ酸、Ｂ＝ＭｅＣＮ／０．１％ギ酸、勾配１０分で５〜９５）によって検出した。コンジュゲート１は保持時間＝５．７３、ｍ／ｚ＝９９４[ＭＨ]２＋を有しており、コンジュゲート２は保持時間＝６．１０、ｍ／ｚ＝１０２０[ＭＨ]２＋を有していた。コンジュゲート１に関しては、次いで反応混合物を５％ＭｅＣＮ／水（５ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０２１４】
精製及び特性決定
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で５〜６０％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ及びＢ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２）１５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ６５０ｎｍ、生成物保持時間：３２．６０分）によって精製することで純粋な色素−ペプチドコンジュゲートを得た。純粋な生成物を分析ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５０×４．６ｍｍ、５ミクロン、１１０Å、Ａ＝水／０．１％ギ酸、Ｂ＝ＭｅＣＮ／０．１％ギ酸、勾配１０分で５〜９５）によって分析した。コンジュゲート１は保持時間＝５．７３、ｍ／ｚ＝９９４[ＭＨ]２＋を有していた。
【図１】
2009545645.tif 000078
【図２】
2009545645.tif 000079
【国際調査報告】
2009545645.tif 000080
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