(57)【要約】  本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬および免疫メディエーターを含む組成物を投与することにより免疫反応を調節する方法を提供し、このメディエーターは、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現を下方制御し、炎症促進性サイトカインＩＬ−１２の発現を上方制御する。本方法を使用して、癌性状態および感染性疾患の治療目的の処置を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１介在性免疫反応の強化が所望される状態の処置のための組成物であって、当該組成物は、
（ｉ）少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬および
（ｉｉ）前記免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質
を含み、当該阻害が、制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節に起因する、組成物。
【請求項２】
前記免疫調節物質が前記免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害し、前記下流メディエーターが、ホスホイノシチドキナーゼ３、シクロオキシゲナーゼ２、ｐ３８、ＥＲＫ、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２を含む群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫調節物質がホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤がＬＹ２９４００２またはウォルトマンニン（ＷＭＮ）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫調節物質がシクロオキシゲナーゼ２阻害剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記シクロオキシゲナーゼ２阻害剤がセレコキシブ（ＮＳ−３９８）またはロフェコキシブである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫調節物質がＭＡＰキナーゼタンパク質の機能を阻害する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫調節物質が、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤およびＭＥＫ２阻害剤を含む群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｐ３８キナーゼ阻害剤が、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５およびＳＢ２３９０６３からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）阻害剤がＵ０１２６またはＰＤ９８０５９である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤がＬＹ２９４００２またはウォルトマンニン（ＷＭＮ）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫調節物質が、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生を阻害および／またはＩＬ−１２の産生を上方制御する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｔｏｌｌ様受容体作動薬が、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８、Ｒ８３、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの腫瘍特異的抗原をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
腫瘍細胞の生存を強化するよう機能する腫瘍細胞産物を阻害する、調節化合物をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記調節化合物が腫瘍増殖阻害産物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記調節化合物がアポトーシスの発症を促進する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｔｈ１介在性免疫反応の強化が所望される状態の処置のための医薬組成物であって、当該組成物は、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
前記免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質を、薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含み、
当該阻害が、制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節に起因する、医薬組成物。
【請求項１９】
前記免疫調節物質が前記免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記下流メディエーターが、ホスホイノシチドキナーゼ３、シクロオキシゲナーゼ２、ｐ３８、ＥＲＫ、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記Ｔｏｌｌ様受容体作動薬が、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８、Ｒ８３、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む群から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
Ｔｈ１介在性免疫反応の強化が所望される状態を処置または予防する方法であって、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬の治療的に有用な量を投与するステップと、
免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質の治療的に有用な量を投与するステップであって、当該阻害は、制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節に起因するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
Ｔｈ１介在性免疫反応の強化が所望される状態の処置のための、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能を選択的に阻害して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって前記免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節物質
の使用。
【請求項２４】
Ｔｈ１介在性または他のエフェクターの免疫反応の強化が所望される状態の処置のための医薬品の調製における、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能を選択的に阻害して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって前記免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節物質
の使用。
【請求項２５】
癌性または悪性状態を処置するための組成物であって、
（ｉ）免疫反応を開始することができる少なくとも１つの腫瘍特異的抗原を含む組成物であって、前記反応は前記癌性または悪性状態に特異的である組成物、
（ｉｉ）少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
（ｉｉｉ）前記制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって前記免疫反応の抑制を阻害する免疫調節物質
を含む、組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍特異的抗原が、熱ショックタンパク質および癌細胞または癌性状態の個体由来の抗原ペプチドの複合体由来である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫調節物質が前記免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記下流メディエーターが、ホスホイノシチドキナーゼ３、シクロオキシゲナーゼ２、ｐ３８、ＥＲＫ、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫調節物質が、ホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤およびＭＥＫ２阻害剤を含む群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫調節物質がＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生を阻害および／またはＩＬ−１２の産生を上方制御する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記Ｔｏｌｌ様受容体作動薬が、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８、Ｒ８３、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む群から選択される、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
腫瘍細胞の生存を強化するよう機能する腫瘍細胞産物を阻害する調節化合物をさらに含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
癌性または悪性状態を処置する方法であって、それを必要とする被検体に、
抗癌ワクチンまたは抗原断片または少なくとも１つの腫瘍特異的抗原を含むその決定因子を投与するステップと、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬を投与するステップと、
治療的に有用な量の免疫調節物質を投与するステップであって、この免疫調節物質は、制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって前記免疫反応の抑制を阻害するステップと
を含む方法。
【請求項３４】
癌もしくは悪性状態の治療のための医薬品の調製のための、
少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
を含む組成物の使用。
【請求項３５】
癌性状態の処置のためのワクチン組成物であって、
樹状細胞、
少なくとも１つの腫瘍細胞抗原、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
を含む、組成物。
【請求項３６】
前記免疫調節物質が免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記下流メディエーターが、ホスホイノシチドキナーゼ３、シクロオキシゲナーゼ２、ｐ３８、ＥＲＫ、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記免疫調節物質が、ホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤およびＭＥＫ２阻害剤を含む群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記免疫調節物質がＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生を阻害および／またはＩＬ−１２の産生を上方制御する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記Ｔｏｌｌ様受容体作動薬が、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８、Ｒ８３、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む群から選択される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
腫瘍細胞の生存を強化するよう機能する腫瘍細胞産物を阻害する調節化合物をさらに含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
癌性状態の処置のための、
樹状細胞、
少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
の使用。
【請求項４３】
癌性状態の処置のためのワクチン組成物の調製のための、
樹状細胞、
少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
の使用。
【請求項４４】
癌性状態の処置のためのワクチン組成物であって、
樹状細胞、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するような前記サイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
を含む、組成物。
【請求項４５】
前記免疫調節物質が免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記下流メディエーターが、ホスホイノシチドキナーゼ３、シクロオキシゲナーゼ２、ｐ３８、ＥＲＫ、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記免疫調節物質が、ホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤およびＭＥＫ２阻害剤を含む群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
前記免疫調節物質がＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生を阻害および／またはＩＬ−１２の産生を上方制御する、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記Ｔｏｌｌ様受容体作動薬が、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８、Ｒ８３、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む群から選択される、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
腫瘍細胞の生存を強化するよう機能する腫瘍細胞産物を阻害する調節化合物をさらに含む、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
癌性状態の処置のための、
樹状細胞、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
の使用。
【請求項５２】
癌性状態の処置のためのワクチン組成物の調製のための、
樹状細胞、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節によって免疫反応の抑制を阻害する、免疫調節化合物
の使用。
【請求項５３】
癌または感染性疾患の処置に適切な被検体にＴｈ１反応を誘導する方法であって、
エフェクター細胞機能を促進する表現型への樹状細胞の成熟を引き起こすために、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて、ワクチンおよび／またはＴＬＲ作動薬、ならびに自然免疫系の細胞によりＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生を阻害および／またはＩＬ−１２産生を上方制御する免疫調節化合物の存在下で、単離した樹状細胞を疾患特異的抗原に暴露するステップと、
被検体に前記樹状細胞を投与するステップであって、それにより前記被検体に形成される免疫反応が、癌の発症または進行を予防し、あるいは病原体微生物の感染を予防し、それにより感染性疾患を予防するのに十分であるステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、癌または悪性疾患および感染性疾患を予防または処置する新規の組成物および方法に関する。特に、本発明は、１型免疫反応（例えばＴｈ１細胞）の誘導および／または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の破壊を促進する組成物および方法に関する。本発明は、疾患の処置においての本発明の組成物の使用にまでさらに及ぶ。
【０００２】
［背景技術］
自然免疫系細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、機能的に別個のＴｈ１、Ｔｈ２または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞サブタイプへの未感作（ナイーブ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化に関する。保存された微生物分子とＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインテグリン等の病原体認識受容体（ＰＲＲ）の結合を介した未成熟ＤＣの活性化は、成熟およびリンパ節へのホーミングを伴い、そこで、成熟ＤＣは、未感作（ナイーブ）Ｔ細胞に対して抗原（Ａｇ）を提示する。病原体由来分子によるＤＣの活性化は、別個のＴ細胞サブタイプへの未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を制御する重要な役割を果たす。Ｔｈ１細胞は、細胞内感染および腫瘍に対して防御するが炎症性反応および自己免疫疾患にも関連し、一方、Ｔｈ２細胞は、アレルギー性反応に関与する。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２反応を抑制することができる。
【０００３】
正常な免疫応答性の個体における腫瘍進行は、腫瘍抗原を認識する免疫系の障害を反映しているか、または制御性Ｔ細胞の誘導および活性化を介した抗腫瘍免疫反応の破壊の結果である恐れがあり、これは、増殖中の腫瘍の環境によりさらに影響され得る。自然および適応免疫反応を腫瘍に対して誘導することができ、防御エフェクター細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＩＦＮ−ガンマ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージを含む。通常、Ｔ細胞が腫瘍部位に引き付けられた主要な免疫細胞集団を構成する一方、多くの場合、Ｔ細胞は、腫瘍の死滅に効果がなく、証拠はこれが制御性Ｔ細胞機能に起因する可能性を示唆する（Ｗｏｏ、Ｅ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：３２６７）。
【０００４】
転写リプレッサーＦｏｘｐ３を発現し、胸腺由来の成熟Ｔ細胞として出現する天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、自己抗原に対する寛容性を維持し、自己免疫性を予防する重要な役割を果たす（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．２０００．Ｃｅｌｌ  １０１：４５５−４５８）。
【０００５】
ＩＬ−１０を分泌する誘導性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞と呼ばれる）またはＴＧＦ−ベータを分泌する誘導性の制御性Ｔ細胞（Ｔｈ３細胞と呼ばれる）は、病原体および自己抗原に反応して末梢で産生される。天然および誘導性の制御性Ｔ細胞は、病原体誘導性の免疫病理を予防することにより、感染中の宿主に有益なものとなることができる。しかし、病原体による制御性Ｔ細胞の誘導または活性化は、防御免疫を覆す戦略である可能性があり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の枯渇により、特定の感染症における生存を強化することが示されたことも報告されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｋ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｐ．ＭｃＧｕｉｒｋ，２００４．Ｓｅｍｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：１０７−１１７）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇はまた、抗腫瘍免疫性を高めることができる。エフェクター対制御性Ｔ細胞の平衡はまた、増殖中の腫瘍の環境により影響され、この平衡は、腫瘍増殖の消散または進行に関連しうる。したがって、制御性Ｔ細胞を抑制し、より強力なエフェクターＴ細胞反応の発達を可能にした場合、腫瘍に対するワクチンまたは治療は、より効果的でありうる。
【０００６】
Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーは、病原体の侵入を認識し、免疫反応を開始する中心的な役割を果たす。１３種のヒトＴＬＲを現在までに同定している。それぞれは、信号伝達カスケードの活性化につながる別個の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、これは、次々に、転写因子ＮＦ−κＢおよびさらにマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ４２／４４を活性化する。ＴＬＲ−３およびＴＬＲ−４もまた、転写因子であるインターフェロン制御因子３（ＩＲＦ３）の活性化に至る別の経路を活性化し、これは、ＩＦＮ−ベータを含めた遺伝子のサブセットを誘導するインターフェロン感受性反応要素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＩＳＲＥ）に結合する。ＴＬＲは、インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）／ＴＬＲスーパーファミリーと呼ばれる大きなスーパーファミリーの１員であり、これはまた、ＩＬ−１Ｒ１サブグループおよびＴｌＲドメイン含有アダプターサブグループを含有する。３つのサブグループ全ては、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴｌＲ）細胞質ドメインを保有し、これは、信号伝達に不可欠である。ＴＬＲは、細胞外ロイシンリッチリピートを保持し、一方、ＩＬ−１Ｒ１サブグループは、細胞外免疫グロブリンドメインを有する。アダプター分子は、細胞質内に存在し、細胞外領域を含有しない。
【０００７】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬は、腫瘍ワクチンのアジュバントとして臨床試験が行われている。治療の基本は、ＴＬＲ作動薬が１型反応、特にＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１細胞、ＮＫ細胞およびＣＤ８ＣＴＬの活性化を促進する。現在までの結果から、抗腫瘍免疫反応の強化が明らかとなっているが、これらが腫瘍増殖を予防する実際の指標はいまだにない。しかしながら、マウス試験のデータはこれらがいくつかの有効性を有する可能性を示唆する（Ｍｉｃｏｎｎｅｔ，Ｉ．，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：１２１２）。
【０００８】
ワクチン
一般に、感染性疾患に対するワクチンは、抗原特異的エフェクターＴ細胞の産生を介して感染に対する防御的な（予防的な）免疫性を与え、これは、中和抗体の産生を促進し、病原体に対して細胞性免疫を媒介する。これらの反応は、記憶ＴおよびＢ細胞の産生に続き呼び起こされることができ、ワクチン配合中のアジュバントにより定量的および定性的に影響される。アジュバントは、抗原製剤に添加された外因性の免疫調節物質またはウイルスもしくは細菌ワクチンを減弱または不活性化させた内因性構成物質であってよく、これは、非特異的にＴＬＲおよび他の病原体認識受容体との相互作用を介して自然免疫反応を活性化する。ＬＰＳ、ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ポリＩＣならびにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含めた全菌体を含めたＴＬＲ作動薬は、全てアジュバント活性を有し、エフェクターＴ細胞および共注入された抗原に対する抗体反応を促進する。
【０００９】
抗炎症性サイトカイン阻害剤
シクロオキシゲナーゼ２（Ｃｏｘ−２）阻害剤は、種々の癌に対する適度な効果を有する治療として使用されることが知られている。Ｃｏｘ−２は、炎症性刺激により誘導される酵素であり、この刺激は、新生物組織内のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の合成を誘導する。ＰＧＥ２は、ＩＬ−１０の潜在的な誘導物質である。Ｃｏｘ−２は、血管形成、細胞増殖を強化し、アポトーシス抵抗性の細胞を作製し、これにより、腫瘍増殖におけるＣｏｘ−２選択的阻害剤（例えばセレコキシブおよびＮＳ−３９８）の効果について説明することができる。
【００１０】
ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、炎症性疾患における臨床試験が行われており、これまでＥＲＫおよびｐ３８が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞の細胞死および生存に関与していると考えられてきた。
【００１１】
本発明者らは、免疫系の既知の調節物質の特定の組み合わせの投与により、これらの調節物質の効果を相乗的に強化することができ、これが、本発明者らによる改良された治療組成物の同定につながり、この組成物が、炎症促進性免疫反応を阻害することができる抗炎症性反応を抑制することにより癌性条件および感染性疾患の処置および／または予防に有用であるという画期的な発見をした。
【００１２】
制御性Ｔ細胞は、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ等の抗炎症性サイトカインを発現することが知られており、このようなサイトカインの発現は、免疫反応を抑制することが知られている。制御性Ｔ細胞はまた、細胞間接触により免疫反応を抑制する。抑制された免疫反応が癌性細胞の発達に対抗するものである場合、免疫反応の抑制は、腫瘍増殖の増加を生じうる。結果的に、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ等の抗炎症性サイトカインあるいは制御性Ｔ細胞の阻害剤は、抗癌治療または感染性疾患処置、特にワクチンの効果を改良することに有用である。
【００１３】
［発明の開示］
本発明の第１の態様において、Ｔｈ１−介在性免疫反応の強化が所望される状態の処置のための組成物を提供し、当該組成物は、
（ｉ）少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬および
（ｉｉ）免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質を含み、この阻害は、制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節に起因することを含む。
【００１４】
抑制された抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータであってよい。上方制御された炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１２またはインターフェロンガンマ、ＩＬ−１およびＴＮＦ−ベータ等のいくつかのさらなる炎症促進性サイトカインであってよい。
【００１５】
炎症促進性サイトカインの上方制御は、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）等のエフェクター細胞により媒介される炎症性反応を促進するよう作用する。
【００１６】
免疫調節物質は、抗炎症性免疫反応の媒介に関与し、または抗炎症性免疫反応を媒介する経路に関与する少なくとも１つの分子を抑制または阻害する阻害性化合物である。
【００１７】
抗炎症性反応は、サイトカインＩＬ−１０の産生およびＴｈ１またはＴｈ３細胞等のＴｒｅｇ細胞の産生を特徴とする。
【００１８】
適切なＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生の阻害および／またはＩＬ−１２の上方制御は、自然免疫系の細胞、例えば樹状細胞において調節される。
【００１９】
適切な免疫調節物質は、ＩＬ−１０産生の抑制またはＩＬ−１０機能の阻害を引き起こす。免疫調節物質は、ＴＧＦ−ベータの機能の抑制または阻害をさらに引き起こす。このサイトカイン反応の調節（ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータ）および特に、自然免疫系の細胞のサイトカイン発現プロフィールの調節は、免疫抑制活性を有するＴ細胞のサブセットであるＴｒｅｇ細胞の誘導を阻害するよう作用する。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの調節に加えて、本発明の化合物は、抗炎症性効果を誘導することが知られているさらなるサイトカインの発現を調節することができる。
【００２０】
免疫調節化合物は、制御性Ｔ細胞と免疫系の他の細胞との間の直接の細胞間接触をさらに抑制することができ、その中で、この機構により媒介される炎症促進性免疫反応の抑制を防止する。
【００２１】
「制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害」とは、そのように阻害された制御性Ｔ細胞が、炎症促進性免疫反応を抑制することができず、または抗炎症性免疫反応、特に直接の細胞間接触による媒介をすることができないことを意味する。
【００２２】
本明細書において定義されるように、サイトカインの産生の増加に関連して使用される場合の「上方制御」という語句は、そのサイトカインの活性または発現が休止細胞に認められるものに比べ大きいことを意味する。
【００２３】
本明細書において定義されるように、サイトカインの産生の低下に関連して使用される場合の「抑制」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められるものに比べ小さいことを意味する。
【００２４】
本明細書において定義されるように、サイトカインの産生の阻害に関連して使用される場合の「阻害」という語句は、サイトカインの活性または発現が休止細胞に認められる活性または発現濃度に比べた場合に阻害または実質的に阻害されていることを意味する。
【００２５】
一実施形態において、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬は、当業者に公知であるいずれの適切なＴＬＲ作動薬であってもよい。ＴＬＲ作動薬は、ＴＬＲに対する結合親和性および特異性を有し、これは、その結合がＴＬＲを活性化し、下流の信号伝達を媒介するよう作用する。
【００２６】
ＴＬＲ作動薬は、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９の少なくとも１つに特異的な結合を有することができる。適切なＴＬＲ作動薬の具体的な例として、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。さらに、上記のＴＬＲ作動薬に対する適切な類似体もまた使用することができ、この場合、前記類似体は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体を活性化するよう機能する。
【００２７】
適切な免疫調節物質は、免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する化合物である。適切な調節作用は、標的に選択性である。阻害剤を、標的の活性を阻害するために有効な量において提供する。適切に阻害されている活性とは、選択的に阻害された分子の、信号伝達および信号調節に関与する能力であり、これは、抗炎症性反応に寄与することができる。
【００２８】
さらなる実施形態において、免疫調節物質は、ＭＡＰキナーゼタンパク質、Ｃｏｘ−２、ＥＲＫ、ｐ３８またはｐｌ３Ｋの少なくとも１つの阻害剤の少なくとも１つを含むことができる。
【００２９】
適切な免疫反応は、制御性Ｔ細胞の誘導を促進する抗炎症性反応または自然免疫反応である。一実施形態において、免疫調節物質は、ＭＡＰキナーゼタンパク質またはＭＡＰキナーゼ経路の阻害剤であり、適切には選択的阻害剤である。ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）は、細胞性反応、炎症および増殖に関与するタンパク質である。
【００３０】
ｐ３８キナーゼ（ｐ３８）は、ＭＡＰキナーゼのストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）群の一員である。哺乳類細胞において、ｐ３８キナーゼ信号伝達経路は、ストレスに対する細胞の反応に関与し、さらに、アポトーシスの上方制御の役割を有することが知られる。ｐ３８キナーゼの活性化は、ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＣｏｘ−２等の炎症性反応の原因となる分子の産生を増加することが知られている。
【００３１】
一実施形態において、阻害剤は、ｐ３８キナーゼ阻害剤である。阻害剤は、少なくとも１つのｐ３８キナーゼのアイソフォームの機能を阻害するよう作用する。それゆえ、この阻害剤は、ｐ３８信号経路の機能を阻害するよう作用する。好ましくは、ｐ３８キナーゼ阻害剤は、ＳＢ２０３５８０または薬理学的に許容される塩またはその溶媒和物あるいはその類似体であり、この場合、類似体は、ｐ３８阻害活性を有する。別法として、阻害剤は、ＳＢ２２００２５もしくはＳＢ２３９０６３または薬理学的に許容される塩またはその溶媒和物あるいはその類似体であり、この場合、類似体はｐ３８キナーゼ阻害剤活性を有する。
【００３２】
ＥＲＫ（細胞外制御性キナーゼ）は、細胞の成長および増殖を制御するＭＡＰキナーゼ群である。
【００３３】
一実施形態において、阻害剤は、ＥＲＫ阻害剤であり、適切には選択的ＥＲＫ阻害剤である。好ましくは、ＥＲＫ阻害剤は、Ｕ０１２６もしくは薬理学的に許容される塩またはその溶媒和物あるいはその類似体であり、この場合、類似体は、ＥＲＫ阻害剤活性を有する。別法として、阻害剤は、ＰＤ９８０５９またはその類似体であってよく、この場合、類似体は、ＥＲＫ阻害活性を有する。さらなる実施形態において、ＥＲＫ阻害剤は、ｐ３８阻害性化合物を併用して提供される。
【００３４】
さらなる実施形態において、免疫調節物質は、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２等のさらなるＭＡＰキナーゼの阻害剤であってよく、これは、ＭＡＰキナーゼ由来の下流点にてＴｈ１信号伝達経路に存在し得る転写因子を阻害または遮断する化合物であってよい。このような転写因子の例は、ｃ−Ｆｏｓである。
【００３５】
さらなる実施形態において、免疫調節物質は、ホスホイノシチドキナーゼ３阻害剤であり、適切には選択的阻害剤である。ホスホイノシチドキナーゼ３（ｐｌ３Ｋ）は、細胞の寿命を制御するプロトオンコジーンである。
【００３６】
一実施形態において、ｐｌ３Ｋ阻害剤は、ＬＹ２９４００２、薬理学的に許容される塩またはその溶媒和物あるいはその類似体であり、この場合、類似体は、ｐｌ３Ｋ阻害活性を有する。別法として、ｐｌ３Ｋ阻害剤は、ウォルトマンニン（ＷＭＮ）であってよい。
【００３７】
さらなる実施形態において、免疫調節物質は、Ｃｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ２）阻害剤である。適切なＣｏｘ−２阻害剤は、セレコキシブ（セレブレックス（ＮＳ−３９８）、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ベクストラ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ、Ｍｅｒｃｋ）または薬理学的に許容される塩またはその溶媒和物あるいはその類似体であり、この場合、類似体は、Ｃｏｘ−２阻害剤活性を有する。適切なＣｏｘ−２阻害剤は、選択的阻害剤である。
【００３８】
Ｃｏｘ−２阻害剤の投与は、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータを産生する誘導性の制御性Ｔ細胞またはＦｏｘｐ３を発現する天然の制御性Ｔ細胞の誘導を阻害することにより免疫反応をＴｈ１経路に偏らせる。それに応じて、本発明の本態様においてＴＬＲ作動薬とＣｏｘ−２阻害剤の共投与は、天然および誘導性の制御性Ｔ細胞の両方を阻害するよう作用することができる。
【００３９】
本発明者らは、驚くことに、ＴＬＲ作動薬とともに投与される場合、Ｃｏｘ−２の阻害が抗炎症性サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの産生を抑制することを認めた。さらに、Ｃｏｘ−２阻害剤はまた、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬で刺激後、ＩＬ−２７ｍＲＮＡの産生を誘導することが示され、さらに、樹状細胞によりＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５の産生を増加させる一方、ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現は低下させることが示された。
【００４０】
組成物は、少なくとも１つの腫瘍特異的抗原をさらに含むことができる。腫瘍特異的抗原は、癌性細胞または癌性状態の個体から単離した熱ショックタンパク質と、抗原ペプチドとの間で形成される複合体由来であってよい。
【００４１】
一実施形態において、組成物は、癌性細胞の増殖を強化するよう機能する腫瘍細胞産物を阻害する化合物をさらに含むことができる。このような化合物は、例えば、薬剤耐性ができることにより、またはアポトーシス抵抗性ができることにより腫瘍の生存を延長する結果となりうる。このような化合物の例は、当業者により公知である。
【００４２】
本明細書において定義される「Ｔｈ１介在性免疫反応の強化が所望される状態」は、癌性または悪性状態であってよく、あるいはさらに前記状態は、感染性疾患であってよい。このような状態の例は、以降に記載する。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、Ｔｈ１介在性免疫反応の強化のための医薬組成物を提供し、この組成物は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節化合物を含み、この阻害は、制御性Ｔ細胞の機能の選択的な阻害に起因し、または薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに、少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節を引き起こす。
【００４４】
一実施形態において、免疫調節物質は、制御性Ｔ細胞の機能を選択的に阻害し、そのため、これらは、細胞間接触により媒介される炎症促進性免疫反応を抑制することができない。
【００４５】
一実施形態において、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を、調節物質により阻害し、または抑制する一方、炎症促進性サイトカインＩＬ−１２の産生を強化する。
【００４６】
適切な免疫調節物質は、免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する化合物であり、特に、ＭＡＰキナーゼタンパク質の阻害剤であってよい。阻害剤は、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２の阻害剤、ｐｌ３Ｋ阻害剤あるいはＣｏｘ−２阻害剤の少なくとも１つであってよい。
【００４７】
適切なＴＬＲ作動薬は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。
【００４８】
一実施形態において、Ｔｈ１免疫反応の強化は、医薬組成物を癌性または悪性状態あるいは感染性疾患の処置または予防に使用することを可能にする。
【００４９】
一実施形態において、組成物は、腫瘍増殖および発達を阻害し、または腫瘍増殖を強化するよう機能する産物またはメディエーターの機能を阻害し、または抑制する、さらなる調節化合物を含むことができる。このような調節化合物は、例えば、腫瘍の生存を延長する結果となるいくつかの分子または経路の機能を阻害し、または抑制することができる。例えば、調節化合物は、腫瘍細胞の薬剤耐性を阻害し、またはそのアポトーシス抵抗性を阻害することができる。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、Ｔｈ１介在性免疫反応の強化が所望される状態の処置または予防方法を提供し、本方法は、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬の治療的に有用な量を投与するステップと、
免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質の治療的に有用な量を投与するステップであって、この阻害は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害か、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つ炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節を引き起こすことに起因するステップ
を含む。
【００５１】
一実施形態において、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を、免疫調節物質により阻害し、または抑制する一方、炎症促進性サイトカインＩＬ−１２の産生を強化する。
【００５２】
適切な免疫調節物質は、少なくともＩＬ―１０の機能の抑制または阻害を引き起こす。調節物質は、ＴＧＦ−ベータの機能の抑制または阻害をさらに引き起こすことができる。このサイトカイン反応および特に自然免疫系の細胞のサイトカイン発現プロフィールのこの調節は、Ｔｒｅｇ細胞、すなわち、サプレッサー活性を有するＴ細胞のサブセットの誘導を阻害するよう作用する。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの調節に加えて、本発明の化合物は、抗炎症性効果を誘導することが知られるさらなるサイトカインまたはメディエーターの発現を調節することができる。
【００５３】
さらに、免疫調節物質は、ＩＬ−１２の発現または機能的活性の増加を媒介することができる。ＩＬ−１、ＴＮＦ−ベータまたはＩＦＮ−ガンマ等のさらなる炎症促進性サイトカインの上方制御もまた認めることができる。
【００５４】
適切なＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生の阻害および／またはＩＬ−１２の上方制御を、自然免疫系の細胞、例えば樹状細胞において調節する。
【００５５】
適切には、免疫調節物質は、免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する化合物であり、特にＭＡＰキナーゼタンパク質の阻害剤であってよい。阻害剤は、ｐ３８阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２阻害剤、ｐｌ３Ｋ阻害剤あるいはＣｏｘ−２阻害剤の少なくとも１つであってよい。
【００５６】
適切なＴＬＲ作動薬は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。
【００５７】
一実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物を被検体に共投与する。別法として、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節物質を個別にまたは続けて投与し、本実施形態において、投与方法は、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節物質において異なっていてよい。
【００５８】
一般に、被検体は、哺乳類動物である。さらなる実施形態において、被検体は、ヒトである。
【００５９】
本発明を使用して、あらゆる既知の癌性または悪性状態を処置する処置または予防方法を提供する。癌性または悪性状態は、以下を含むことができる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体細胞腫（ｐｉｎｅａｌｏｍａ）、血管芽細胞腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経種（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症および重鎖疾患（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）。
【００６０】
本発明の組成物、医薬組成物および方法を感染性疾患の処置に使用する場合、このような状態は、以下を含むがそれだけに限定されない：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、リーシュマニア、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、マラリア、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、またはＣ型肝炎ウイルス。
【００６１】
本発明のさらに追加の態様は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節物質を含む組成物の使用を提供し、この免疫調節物質は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、またはＴｈ１−介在性免疫反応の強化が所望される状態の処置のために、少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【００６２】
一実施形態において、状態は、悪性または癌性状態である。さらなる実施形態において、状態は、感染性疾患である。
【００６３】
一実施形態において、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を免疫調節物質により阻害し、または抑制する一方、炎症促進性サイトカインＩＬ−１２の産生を強化する。
【００６４】
適切な免疫調節物質は、少なくともＩＬ−１０の機能の抑制または阻害を引き起こす。調節物質は、ＴＧＦ−ベータの機能の抑制または阻害をさらに引き起こしうる。このサイトカイン反応の調節および特に、自然免疫系の細胞のサイトカイン発現プロフィールの調節は、制御性Ｔ細胞、すなわちサプレッサー活性を有するＴ細胞のサブセットの誘導を阻害するよう作用する。ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの調節に加えて、本発明の化合物は、抗炎症性効果を誘導することが知られているさらなるサイトカインまたはメディエーターの発現を調節することができる。調節物質はまた、制御性Ｔ細胞による細胞間接触抑制を阻害することができる。
【００６５】
さらに、免疫調節物質は、ＩＬ−１２の機能的活性の発現の増加を調節することができる。ＩＬ−１、ＴＮＦ−ベータまたはＩＦＮ−ガンマ等のさらなる炎症促進性サイトカインの上方制御もまた、認めることができる。
【００６６】
適切なＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生の阻害および／またはＩＬ−１２の上方制御を、自然免疫系の細胞、例えば樹状細胞において調節する。
【００６７】
適切なＴＬＲ作動薬は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。
【００６８】
適切には、免疫調節物質は、免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する化合物であり、特にＭＡＰキナーゼタンパク質の阻害剤であってよい。阻害剤は、ｐ３８阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２阻害剤、ｐｌ３Ｋ阻害剤あるいはＣｏｘ−２阻害剤の少なくとも１つであってよい。
【００６９】
本発明のさらに追加の態様は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節物質の使用を提供し、この免疫調節物質は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、またはＴｈ１−介在性または他のエフェクター免疫反応の強化が所望される状態の処置のための医薬品の調製において、少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【００７０】
一実施形態において、状態は、悪性または癌性状態である。さらなる実施形態において、状態は、感染性疾患である。
【００７１】
適切な免疫調節物質は、免疫反応の下流メディエーターの機能を阻害する化合物であり、特に、ＭＡＰキナーゼタンパク質の阻害剤であってよい。阻害剤は、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２の阻害剤、ｐｌ３Ｋ阻害剤あるいはＣｏｘ−２阻害剤の少なくとも１つであってよい。
【００７２】
適切なＴＬＲ作動薬は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ポリＩＣ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、フラジェリン、ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＰＧ−オリゴデオキシヌクレオチド）、イミキモド、Ｒ８３８およびＲ８３７を含むがそれだけに限定されない。さらに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の全菌体もまた、ＴＬＲ作動薬（Ｔｏｌｌ作動薬）として作用することができる。
【００７３】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、抗癌または黒色腫ワクチンの効果の改良にまで及ぶ。抗癌ワクチン構成物質（例えば腫瘍特異的ワクチン）および制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生を阻害する免疫調節化合物をともに含む組成物は、驚くことに、本発明者らにより、癌および悪性状態の処置に予想外に効果的な組成物を提供するものとして同定された。
【００７４】
一般に、タンパク質等の非生物材料のワクチン接種は、Ｔｈ１またはＴｈ２反応のどちらかである、抗体反応およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞反応につながる。一方で、一般に、生物ウイルスまたは細胞内細菌等の生物材料を用いたワクチン接種または感染は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応につながる。Ｔｈ１およびＣＴＬ反応は、癌、病原体ウイルスおよび細胞内細菌に対する防御において重要である。Ｔｈ２反応は、細胞外細菌および寄生虫に対する防御において重要である。
【００７５】
したがって、本発明のさらなる態様は、以下を含む癌性または悪性状態の処置のための組成物を提供する；
（ｉ）癌性または悪性状態に特異的である免疫反応を開始することができる少なくとも１つの腫瘍特異的抗原を含む組成物と、
（ｉｉ）少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬、および、
（ｉｉｉ）制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する免疫調節物質。
【００７６】
少なくとも１つの腫瘍特異的抗原を含む適切な組成物が、癌ワクチン、または少なくとも１つの抗原（Ａｇ）を含有するワクチン構成物質である。さらに、腫瘍特異的抗原は、特異的腫瘍型の代表的なものである既知の腫瘍抗原であってよい。
【００７７】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載されている。
【００７８】
サイトカイン反応および特に免疫系細胞のサイトカイン発現プロフィールの調節は、制御性Ｔ細胞の誘導を阻害するよう作用する。これは、ＩＬ−１０の抑制または阻害により媒介することができる。
【００７９】
癌ワクチンは、いくつかの適切なワクチンまたはワクチン断片、例えば、全細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、サブユニットワクチンまたはペプチドワクチンであってよい。
【００８０】
ＩＬ−１０の産生に対する抗原とともに共投与される免疫調節化合物は、サイトカインＩＬ−１２の産生をさらに上方制御することができる。ＩＬ−１２は、免疫反応を「Ｔｈ１」経路の下流に偏らせるよう作用する。さらなる場合において、ＩＬ−１０の阻害剤は、特異的にＩＬ−１２産生を誘導しないが、これは、間接的にＩＬ−１０の産生の低下に起因しうる。
【００８１】
典型的に、Ｔｈ１免疫反応の誘導は、制御性Ｔ細胞免疫反応の破壊を伴う。
【００８２】
本発明のさらなる態様は、癌性または悪性状態の処置または予防のための医薬組成物を提供し、この組成物は、免疫反応を開始することができる少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、少なくとも１つのＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物ならびに薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む。
【００８３】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【００８４】
一実施形態において、腫瘍特異的抗原は、癌ワクチンまたはワクチン構成物質由来である。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、癌性または悪性状態の処置方法を提供し、本方法は、
少なくとも１つの腫瘍特異的抗原を含む抗癌ワクチンまたは抗原断片あるいはその決定基を投与し、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬を投与し、
少なくとも１つの免疫調節化合物の治療的に有用な量を投与するステップを含み、
この免疫調節化合物は、自然免疫系の細胞によるＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの阻害および／またはＩＬ−１２の上方制御を介したサイトカイン反応を調節する。
【００８６】
適切には、調節物質は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【００８７】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【００８８】
一般に、被検体は、哺乳類動物である。さらなる実施形態において、被検体は、ヒトである。
【００８９】
本発明のさらに追加の態様は、少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物を含む組成物の使用を提供し、この免疫調節化合物は、癌もしくは悪性状態の処置において、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現を調節して免疫反応の抑制を阻害する。
【００９０】
本発明のさらに追加の態様は、少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物を含む組成物の使用を提供し、この免疫調節化合物は、癌もしくは悪性状態の処置のための医薬品の調製において、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現を調節して免疫反応の抑制を阻害する。
【００９１】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【００９２】
一般に、被検体は、哺乳類動物である。さらなる実施形態において、被検体は、ヒトである。
【００９３】
さらなる態様において、本発明は、癌性細胞または癌性状態を有する個体から単離した熱ショックタンパク質を含むワクチン組成物およびこれに非共有結合により複合化される抗原ペプチドにまで及ぶ。この熱ショックタンパク質−抗原ペプチド複合体（ＨＳＰ−Ａｇ）を個体に投与し、抗原ペプチドに関する免疫反応を誘導することができる。本発明者らは、驚くことに、Ｃｏｘ−２阻害剤等の免疫系を阻害するよう作用する免疫メディエーターの共投与がＨＳＰに複合化された抗原に対する免疫反応の強化を生じることを同定した。ＨＳＰ−Ａｇ複合体の単離により、抗原が、抗原提示細胞により処理され、抗原を非自己であると認識する場合に免疫反応を開始するように免疫系に提示されることを可能にするだろう。
【００９４】
このようなＨＳＰ−Ａｇ複合体の例は、熱ショックタンパク質ＨＳＰ−７０と腫瘍特異的ペプチドとの間の複合体である。このような態様において、本発明は、以下を含む癌性または悪性状態の処置のための組成物を提供する；
（ｉ）抗原ペプチドと複合化された熱ショックタンパク質および
（ｉｉ）制御性Ｔ細胞機能の選択的な阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節から免疫反応の抑制を阻害する免疫調節化合物。
【００９５】
適切には、免疫調節物質は、自然免疫系の細胞によるＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの阻害および／またはＩＬ−１２の上方制御を介してサイトカイン反応を調節する。
【００９６】
サイトカイン反応および特に免疫系細胞のサイトカイン発現プロフィールの調節は、制御性Ｔ細胞の誘導を阻害するよう作用する。
【００９７】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【００９８】
適切には、熱ショックタンパク質に複合化される抗原は、腫瘍特異的抗原であり、癌性細胞由来である。
【００９９】
免疫調節物質がＣｏｘ−２阻害剤である場合、ＨＳＰ−７０抗原複合体およびＣｏｘ−２阻害剤の投与は、樹状細胞上のＣＤ８０発現の強化を生じる。
【０１００】
一実施形態において、ＨＳＰ−６０／抗原複合体は、樹状細胞ＨＳＰ−７０ワクチンの形態で提供される。
【０１０１】
本発明の本態様は、癌性細胞または癌性状態に感染した宿主から得られる異なる熱ショックタンパク質の使用にまで及ぶ。したがって、熱ショックタンパク質は、ＨＳＰ−６０、ＨＳＰ−９０およびｇｐ９６であってよいが、前述に制限されず、当業者に公知のあらゆる適切な熱ショックタンパク質にまで及ぶことができる。
【０１０２】
本発明のさらに追加の態様は、癌性または悪性状態の処置の使用において、腫瘍特異的抗原と複合化された熱ショックタンパク質と、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬と、免疫調節物質との使用を提供し、この免疫調節物質は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【０１０３】
さらなる態様において、本発明は、悪性または癌性状態の処置のための医薬品の調製における、腫瘍特異的抗原と複合化された熱ショックタンパク質と、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬と、免疫調節物質との使用にまで及び、この免疫調節物質は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【０１０４】
樹状細胞ワクチン
樹状細胞（ＤＣ）は、有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、外来または自己抗原に特異的な未感作Ｔリンパ球を刺激する独自の能力を有する。
【０１０５】
樹状細胞は、骨髄で産生され、事実上の体内の全ての組織に血流を介して移動する。これらの細胞は、通常、胸腺、リンパ節および脾臓等のリンパ器官の構造的区画で見つかる。しかし、これらはまた、血流および他の体組織においても見つかる。樹状細胞は、適宜、抗原を捕捉し、免疫反応が開始される流入領域リンパ節に移動する。
【０１０６】
樹状細胞は、ペプチドを処理し、主要組織適合（ＭＨＣ）−ペプチド複合体を介して、抗原特異的未感作Ｔリンパ球に提示する。
【０１０７】
本発明は、本発明の化合物および方法を成熟樹状細胞の特定のサブセットの産生を誘導するための使用にまで及び、この成熟樹状細胞は、Ｔｈ１およびＣＴＬ等の細胞型により媒介されるエフェクターＴ細胞反応を促進する表現型およびサイトカイン発現プロフィールを有し、さらに制御性Ｔ細胞の産生を抑制する。骨髄性およびリンパ球性樹状細胞群は、ともに本発明に有用である。
【０１０８】
樹状細胞を調節して、Ｔｈ１細胞プロフィールおよびさらにＣＴＬ反応を誘導するサイトカインプロフィールを発現するようにこれらの表現型を修飾することが望ましい。このような樹状細胞のサブセットの誘導は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの産生を特徴とする未成熟樹状細胞の産生を避けるよう作用し、このようなサイトカインプロフィールは、制御性Ｔ細胞の産生、またはＣＤ８０あるいはＣＤ８６の発現は高いがＣＤ４０の発現は低い結果を生じる。
【０１０９】
本発明は、樹状細胞ワクチンにまでさらに及ぶ。上文に定義された組成物を癌性状態または感染性疾患に関連するこのような治療を必要とする個体に予防または治療目的の処置を提供するために投与することができる。一般に、感染性疾患に対する免疫反応を媒介するワクチン組成物を個体の感染を予防するために予防的に投与する。しかし、この例外として、Ｃ型肝炎およびＨＩＶ等の感染性疾患に対するワクチンという点において、この場合、ワクチンを治療目的で投与する。しかし、一般に、個体の免疫低下状態のため、一般に、治療様式において感染性疾患ワクチンを投与することは、望ましくない。
【０１１０】
ワクチンを癌性状態の個体に関連して投与する場合、一般に、ワクチンは、腫瘍細胞または腫瘍細胞由来の抗原を含むワクチンとして治療目的で投与する。
【０１１１】
本発明者らは、癌性状態の処置に関連して樹状細胞ワクチンの有用性を同定している。さらに、本発明者らは、驚くことに、樹状細胞、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節物質を含むワクチン組成物の投与が、効果の高い治療を提供することを同定している。
【０１１２】
それに応じて、本発明のさらなる態様は、以下を含む癌性状態の処置のためのワクチン組成物にまで及ぶ：
樹状細胞、
少なくとも１つの腫瘍細胞抗原、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する免疫調節化合物。
【０１１３】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【０１１４】
適切には、樹状細胞は、樹状細胞の養子移入により提供され、これを、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬の存在または非存在下において腫瘍特異的抗原でパルスし、ＩＬ−１０を阻害するように作用する免疫調節化合物は、癌性または悪性状態あるいは感染性疾患に対して有効であってよいＴｈ１細胞反応を誘導するよう作用することができる。適切な樹状細胞は、未成熟表現型のものである。
【０１１５】
一実施形態において、少なくとも１つの腫瘍抗原を、抗原と複合化された熱ショックタンパク質を投与することにより提供することができる。抗原性タンパク質と複合化された熱ショックタンパク質は、癌性細胞、または癌性状態を有する個体由来であってよい。
【０１１６】
本発明のさらなる態様は、癌性または悪性状態の処置方法を提供し、本方法は、それを必要とする被検体に、
腫瘍特異的抗原の存在下においてパルスされた樹状細胞を投与し、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬を投与し、および
免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質の治療的に有用な量を投与し、この阻害は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節に起因する、
ステップを含む。
【０１１７】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【０１１８】
本発明のさらに追加の態様は、癌性状態の処置のために、樹状細胞、少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物の使用を提供し、この免疫調節化合物は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または、少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【０１１９】
本発明のさらに追加の態様は、癌性状態の処置のためのワクチン組成物の調製において、樹状細胞、少なくとも１つの腫瘍特異的抗原、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物の使用を提供し、この免疫調節化合物は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【０１２０】
本発明者らは、樹状細胞ワクチンを癌性または悪性状態の処置のために個体に投与することができることをさらに同定し、この場合、腫瘍特異的抗原を、組成物として提供しないが、この場合、抗原は、樹状ワクチン組成物を投与する個体由来の腫瘍特異的抗原である。
【０１２１】
したがって、本発明のさらなる態様は、以下を含む癌性状態の処置のためのワクチン組成物を提供する：
樹状細胞、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および
制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する免疫調節化合物。
【０１２２】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【０１２３】
本発明のさらなる態様は、癌性または悪性状態の処置方法を提供し、本方法は、それを必要する被検体に、
腫瘍特異的抗原の存在下においてパルスされた樹状細胞を投与し、および
免疫反応の抑制を阻害する少なくとも１つの免疫調節物質の治療的に有用な量を投与し、この阻害は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節に起因する、
ステップを含む。
【０１２４】
適切な免疫調節化合物は、上文に記載される。
【０１２５】
本発明のさらに追加の態様は、癌性状態の処置のために、樹状細胞、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物の使用を提供し、この免疫調節化合物は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【０１２６】
本発明のさらに追加の態様は、癌性状態の処置ためのワクチン組成物の調製において、樹状細胞、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体作動薬および免疫調節化合物の使用を提供し、この免疫調節化合物は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害を介して、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節により免疫反応の抑制を阻害する。
【０１２７】
したがって、本発明のさらに追加の態様は、癌または感染性疾患の処置に適切な被検体のＴｈ１反応を誘導するための方法を提供し、本方法は、
ワクチンおよび／またはＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物の存在下において疾患特異的抗原に単離した樹状細胞を暴露し、この調節化合物は、ｅｘ  ｖｉｖｏの自然免疫系の細胞によりＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生を阻害および／またはＩＬ−１２産生を上方制御し、エフェクター細胞機能を促進する表現型への樹状細胞の成熟を引き起こし、
樹状細胞を被検体に投与し、それにより被検体に産生された免疫反応が十分に、癌の発症または進行を予防し、あるいは病原性微生物による感染を予防し、それにより感染疾患を予防する、
ステップを含む。
【０１２８】
本発明の本態様の一実施形態において、樹状細胞は、被検体にとって自己である。一実施形態において、樹状細胞は、成熟樹状細胞である。
【０１２９】
適切な疾患特異的抗原は、腫瘍特異的抗原である。
【０１３０】
適切なＴＬＲ作動薬および免疫調節化合物は、上文に記載される。
【０１３１】
さらに追加の態様は、癌または感染性疾患の治療のための医薬品の調製における、樹状細胞の使用に関し、これを、ワクチンおよび／またはＴＬＲ作動薬および免疫反応の抑制を阻害する免疫調節化合物にｅｘ  ｖｉｖｏで暴露し、この阻害は、制御性Ｔ細胞機能の選択的阻害に起因し、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節を引き起こす。
【０１３２】
本発明の本態様の他の実施形態において、樹状細胞は、あらゆる他の適切な抗原提示細胞と置き換えることができる。このような適切な抗原提示細胞は、マクロファージ、単球およびＢ細胞である。さらなる実施形態において、樹状細胞の調節は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生じる。
【０１３３】
好ましい実施例において、抗原提示細胞、好ましくは再投与される樹状細胞は、被検体に対して自己である。典型的には、被検体は、ヒトである。
【０１３４】
本発明のさらなる態様において、癌、悪性状態または感染性疾患の予防または処置のための組成物を提供し、その組成物は、
（ｉ）感染性疾患、癌または悪性状態に対して特異的に形成することができる免疫反応に対するワクチンまたはワクチン構成物質の存在下においてパルスされる樹状細胞、
（ｉｉ）ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬等のアジュバントおよび
（ｉｉｉ）免疫反応の抑制を阻害する化合物であって、この阻害が制御性Ｔ細胞の機能の選択的阻害、または少なくとも１つの抗炎症性サイトカインを抑制し、少なくとも１つの炎症促進性サイトカインを上方制御するようなサイトカイン発現の調節を引き起こす化合物に起因し、ならびに
薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体
を含む。
【０１３５】
適切には、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの産生の阻害および／またはＩＬ−１２の上方制御を自然免疫系の細胞、例えば、樹状細胞において調節する。
【０１３６】
一実施形態において、樹状細胞を、熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞等の全細胞癌ワクチンおよびＴＬＲ作動薬ＣｐＧならびにＭＡＰキナーゼであるＥＲＫに対する阻害剤として作用する化合物を用いて処置する。さらなる実施形態において、ＥＲＫ阻害剤は、ｐ３８阻害剤、ｐｌ３Ｋ阻害剤またはＣｏｘ−２阻害剤と置き換えることができる。
【０１３７】
さらなる実施形態において、ＤＣは、癌細胞または感染性疾患に感染した細胞由来のＨＳＰ−７０でパルスすることができ、前記ＤＣを、さらに、抗炎症性サイトカインの産生を阻害する化合物に暴露する。具体的な一例は、Ｃｏｘ−２阻害剤の投与であり、これは、ＩＬ−１０を阻害および／または天然のＴｒｅｇの発現を阻害するよう作用することができる。
【０１３８】
発明の詳細な説明
未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞は、エフェクターＴｈ１またはＴｈ２あるいはＴｒｅｇ細胞に分化することができ、これらの別個のサブタイプの選択的誘導は、樹状細胞（ＤＣ）の成熟状態および自然免疫系の細胞により分泌された制御性サイトカインを含めた多くの因子により決定されるようである。ある種の病原体由来の免疫調節分子、例えばＴＬＲリガンドは、Ｔｈ１細胞の誘導を促進する。他に、病原体由来分子、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のＦＨＡおよびＣｙａＡならびにＣＴは、選択的に、またはＴｈ２細胞とともにのいずれかでＴｒ細胞の誘導を促進する。エフェクターＴ細胞と同時のＴｒｅｇ細胞の誘導は、宿主の防御的戦略であり、過剰なＴｈ１またはＴｈ２反応を制御し、それにより感染誘導性炎症および免疫病理を制限することができる。ＴＬＲリガンドによるＴｈ１細胞の誘導は、これらのＩＬ−１２促進能および、特にマクロファージおよびＤＣなどの自然細胞由来のＩＬ−２７産生によるものである。しかし、ＴＬＲリガンドもまた、マクロファージ由来のＩＬ−１０産生を誘導することや、Ｔｈ２促進ＴＬＲ−２作動薬Ｐａｍ３Ｃｙｓが、ＤＣ由来のＩＬ−１０産生を誘導することが明らかにされた。
【０１３９】
本発明の発明者らは、近年、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞が、抗腫瘍免疫性を覆し、腫瘍増殖を促進する恐れがあることを明らかにした。これらは、バイスタンダー抗原に対するＴ細胞反応が、増殖しているＣＴ２６腫瘍の領域の抗原を用いて皮下に免疫化したマウスにおいて抑制されることを明らかにした。増殖している腫瘍のＴ細胞は、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘｐ３のｍＲＮＡを発現し、腫瘍または流入領域リンパ節に浸潤しているＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の高頻度のものがＩＬ−１０を分泌し、低頻度のものがＩＦＮ−ガンマを分泌する。ＩＬ−１０分泌性マクロファージおよび樹状細胞もまた、増殖している腫瘍に浸潤した。ＣＤ８＋ＣＴＬ反応は、肺転移のマウスにおいて検出不能であり、ＣＴ２６結腸癌細胞を皮下に注射後、弱く、一過性であったが、抗ＩＬ−１０および抗ＴＧＦ−ベータの存在下において強化された。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ４＋またはＣＤ２５＋Ｔ細胞の除去は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生を顕著に強化し、皮下の腫瘍の体積および肺転移を低下させ、生存を強化した。対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の除去はＣＴＬ反応を抑制し、皮下腫瘍の進行を促進したが、肺転移は低下した。これらの所見は、腫瘍の増殖がＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを分泌するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の誘導または動員を促進し、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞反応を抑制することを示唆する。しかし、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを発現するＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞もまた、肺の免疫抑制的な環境により動員または活性化され、この場合、これらは、抗腫瘍免疫の誘導を抑制したのであろう。
【０１４０】
本発明の発明者らは、ＴＬＲ作動薬の投与がＩＬ−１０分泌性Ｔｒｅｇ細胞およびＴｈ１細胞を同時に誘導することを以前に明らかにした。ＴＬＲリガンドは、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０またはＩＬ−１０のみを分泌するＴ細胞を誘導した。さらに、ＩＬ−１０分泌性Ｔｒ１およびＩＬ−１０ならびにＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１様Ｔｒｅｇ細胞のこれらの別個の集団は、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生を抑制し、ＴＬＲリガンドが制御性およびエフェクターＴ細胞の別個の集団を同時に誘導することを示唆する。自然ＩＬ−１２およびＩＬ−１０は、それぞれＴｈ１およびＴｒｅｇ１細胞の誘導に関することが以前に報告された。本発明者らは、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９リガンドが、ＤＣ由来のＩＬ−１０ならびにＩＬ−１２産生を活性化することを明らかにした。さらに、ＴＬＲリガンドは、ＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導し、ＥＲＫおよびＰ３８の阻害剤は、樹状細胞由来のＴＬＲリガンド誘導性ＩＬ−１０を抑制し、ＩＬ−１２産生を強化した。
【０１４１】
理論に制約されることを望まないが、本発明の発明者らは、ｐ３８阻害剤、ｐｌ３Ｋ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤および／またはＣｏｘ−２阻害剤が、自然細胞（例えば、樹状細胞）によるＩＬ−１０産生を抑制し、ＩＬ−１２を強化することによりＴＬＲ作動薬および／またはＨＳＰ７０ワクチンの効果を強化し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞ではなく、Ｔｈ１およびＣＴＬの誘導を促進する。これは、Ｔｒｅｇ細胞の誘導および活性化に関連する抗腫瘍免疫反応の破壊を制限する。
【０１４２】
定義
本明細書において使用される「Ｔ細胞」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という語句はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。
【０１４３】
本発明に関連する「被検体」は、ヒト、霊長類および家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）等の哺乳類動物；マウス、ウサギ、ラットおよびモルモット等の実験動物；イヌおよびネコ等のペット動物を含み、包含する。
【０１４４】
処置／治療
本明細書において、「処置」という語句は、ヒトまたは非ヒト動物に役立つことができるあらゆる方法を言及するために使用される。処置は、存在する状態に関してであってよく、または予防（予防的処置）であってよい。処置は、治癒、緩和または予防的効果を含むことができる。
【０１４５】
さらに具体的には、本明細書において、「治療的」および「予防的」処置への言及は、最も広義の内容として考慮される。「治療的」という語句は、被検体を完全に回復するまで処置することを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」は、被検体が最終的に疾患状態にならないことを必ずしも意味しない。
【０１４６】
したがって、治療的および予防的処置は、特定の状態の症状の緩和または特定の状態を発症する危険を予防あるいはそうでなければ低下させることを含む。「予防的」という語句は、特定の状態の重症度または発症の低下として考慮することができる。「治療的」も存在する状態の重症度を低下させることができる。
【０１４７】
投与
本発明において使用される有効成分を同被検体に個別に投与することができ、または医薬組成物として共投与することができる。一般に、医薬組成物は、目的の投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を含むだろう。
【０１４８】
有効成分（場合により、医薬組成物の形態）をいくつかの適切な経路を介して処置の必要な患者に投与することができる。正確な用量は、より詳細には以下に記載されているように、多くの因子に応じて決定されるだろう。
【０１４９】
適切な一投与経路は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、例えば点滴パッチの使用を含む）である。他の適切な投与経路は、経口、経直腸、経鼻、局所（経頬および舌下を含む）、注入、経膣、皮内、腹腔内、頭蓋内、鞘内および硬膜外投与あるいは例えばネブライザーまたは吸入器による経口または鼻吸入を介する投与、あるいは移植を含む（がそれだけに限定されない）。
【０１５０】
静脈内注射において、有効成分は、発熱物質のない非経口的に許容される水溶液の形態であり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する。当業者は、例えば、等張性ベヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液を使用して適切な溶液を調節することができるだろう。必要な場合、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含むことができる。
【０１５１】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形態であってよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含むことができる。一般に、液体医薬組成物は、液体担体、例えば、水、石油、動物または植物油、鉱油あるいは合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液あるいはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含むことができる。
【０１５２】
組成物はまた、ミクロスフィア、リポソーム、他の微粒子送達系または血液を含めた特定の組織に入れる徐放性製剤を介して投与することができる。徐放性担体の適切な例として、シェア製品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、座剤またはマイクロカプセルがある。移植可能またはマイクロカプセル状の徐放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号または欧州特許出願第００５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２（１）：５４７−５５６，１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）またはエチレンビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，１９８１およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，１９８２）を含む。
【０１５３】
上記の技法およびプロトコールおよび本発明において使用することができる他の技法およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，２０００）ＩＳＢＮ  ０−９１２７３４−０４−３およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＩＳＢＮ  ０−６８３３０５−７２−７に見つけることができ、これらの開示全体を参照として本明細書に組み込む。
【０１５４】
医薬組成物
上記の通り、本発明は、癌性または悪性状態および／または感染性疾患の処置、特に、Ｔｈ１免疫反応の誘導およびＴｒｅｇ免疫反応の抑制あるいは阻害のための医薬組成物にまで及ぶ。
【０１５５】
本発明における医薬組成物および本発明に準じる使用において、有効成分に加えて、薬理学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に公知の他の材料を含むことができる。このような材料は、非毒性であるものとし、有効成分の効果を干渉しないものとする。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に応じて決定し、これは、例えば、経口、静脈内、経鼻または経口もしくは鼻吸入を介してよい。製剤は、液体、例えば、ｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理食塩溶液または凍結乾燥もしくは冷凍乾燥粉末であってよい。
【０１５６】
用量
組成物は、「治療的有効量」または「所望量」において個体に投与することが好ましく、これは、個体に十分に有益であることを示す。
【０１５７】
本明細書において定義されるように、「有効量」という語句は、所望の反応を少なくとも部分的に得るために、または発症を遅延もしくは進行を阻害または処置された特定の状態の発症または進行を完全に停止するために必要な量を意味する。
【０１５８】
量は、処置される被検体の健康および身体的状態、処置される被検体の分類群、所望される防御の程度、組成物の配合、医学的状況および他の関連因子の評価に応じて変化する。量は、相対的に広範囲であり、これは、定期的な試験を介して決定することができることが期待される。
【０１５９】
処置の処方、例えば、用量等の判断は、最終的には一般開業医、内科医または他科の医師の責任の範囲および判断であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および実施者に公知の他の因子を考慮する。
【０１６０】
最適用量は、例えば、年齢、性別、体重、処置される状態の重症度、投与される有効成分および投与経路を含めた多くのパラメーターに基づいて内科医により決定されることができる。
【０１６１】
広範囲の用量を適用することができる。患者を考慮して、例えば、薬剤約０．１ｍｇ〜約１ｍｇを１日当たり体重ｋｇ当たりで投与することができる。投与方法を調節して、至適治療反応を提供することができる。例えば、数分割投与を１日毎、週毎、月毎または他の適切な間隔で投与することができ、または用量を、状況の緊急を示す場合、比例的に減量することができる。
【０１６２】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は全て、本発明の分野の当業者により通常、理解される意味を有する。
【０１６３】
本明細書を通して、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」という語句はまたは「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」もしくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」等の変形は、明記された整数または整数群の包括を意味するが、いくつかの他の整数もしくは整数群を排除しないことが理解されるだろう。
【０１６４】
本発明は、ここで、説明の目的において提供され、本発明を限定するように解釈されることを意図しない以下の実施例を参照し、さらに図を参照して記載される。
【実施例】
【０１６５】
マウス
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ（ビスター、オックスフォードシャー（Ｏｘｏｎ）、英国）から購入した。ＤＯ．１１．１０ＯＶＡ  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを施設内で飼育した。全てのマウスを特定の病原体を含有しない状態下において管理し、アイルランド保健局（Ｉｒｉｓｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の規制およびガイドラインに準拠した。
【０１６６】
腫瘍株
ＣＴ２６結腸癌由来の細胞株を、１０％熱不活性化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０で維持し、皮下（ｓ．ｃ．）で惹起した場合、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて固体腫瘍により維持した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞株を、１０％熱不活性化ＦＣＳで補充したＤＭＥＭで維持し、ｓ．ｃ．で惹起した場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて固体腫瘍を形成した。他に明記されない限り、両実験モデルにおいてマウスに２×１０５個の腫瘍細胞を注射した。
【０１６７】
腹膜マクロファージ
腹腔を加温培地５ｍｌで洗浄した。細胞をペトリ皿に載せ、付着しない細胞を２時間後に除去した。次いで付着細胞を１０６／ｍｌで蒔いた。
【０１６８】
熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞
Ｂ１６腫瘍細胞を４３℃にて１時間インキュベートした。次いで細胞を２０Ｋ  Ｇｙで照射後、３７℃にて４時間インキュベートした。細胞を１：１の比にてＢＭＤＣに添加した。
【０１６９】
非関連抗原に対する増殖およびサイトカイン反応における腫瘍の影響
Ｄ０１１．１０マウスに、２００μｇのＯＶＡのみまたは２×１０５個のＣＴ２６細胞とともに側腹部にｓ．ｃ．注射した。マウスを７日後にＯＶＡ２００μｇでブーストし、１４日後にリンパ節細胞懸濁液を調製し、ＯＶＡ（５０、１５０および５００μｇ／ｍｌ）で９６マイクロタイター丸底プレートに５％ＣＯ２、３７℃、２×１０６個／ｍｌにて培養した。３日後、上清を取り出し、ＩＦＮ−ガンマ濃度を２部位ＥＬＩＳＡ法により決定した。培養４日後、２μＣｉ３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を各ウェルに添加した。プレートをさらに６時間後インキュベートし、その後、細胞をフィルターマットに回収し（Ｔｏｍｔｅｃ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  ９６  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ  Ｍ）、ｃｐｍをベータカウンター（１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ、Ｗａｌｌａｃ）を使用して決定した。
【０１７０】
免疫化
マウスをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；５μｇ）、ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮ（２５μｇ）、ＬＰＳ（２０μｇ）、ポリＩＣ（２５μｇ）死菌体Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（１×１０９）またはコレラ毒素（ＣＴ）（１０ｎｇ）を用いてｓ．ｃ．で免疫した。
【０１７１】
Ｅｘ  ｖｉｖｏのサイトカイン反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００μｌ中ＣｐＧ（１０μｇ）またはＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（１００μｇ）のどちらかを側腹部に注射した。流入領域鼠径リンパ節を２および６時間後に取り出し、ふるいにかけ、ＰＢＳ１ｍｌに再懸濁した。ＥＬＩＳＡ法により、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータにおいて、Ｓ／Ｎを測定した一方、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＬ−１０およびＩＬ−２７ｐ２８を測定した。
【０１７２】
抗原特異的サイトカイン産生
免疫化７日後に取り出されたリンパ節または脾臓細胞（２×１０６個／ｍｌ）をＫＬＨ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下、超音波処理したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または培地のみで培養した。上清を７２時間後に取り出し、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を決定した。
【０１７３】
抗原特異的Ｔ細胞株
ＫＬＨ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、抗原（１０μｇ／ｍｌＫＬＨ）および抗原提示細胞の存在下で脾臓またはリンパ節細胞を刺激することにより、ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮを用いて免疫したマウスの脾臓またはリンパ節から樹立した。特定の場合において、抗ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−１２および抗ＩＬ−１０を培養開始時に添加した。抗原再刺激２〜３回後に樹立した細胞株をＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣの存在下で培養し、上清のＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度を３日後にＥＬＩＳＡ法により決定した。リンパ節細胞を抗原（ＫＬＨまたはいくつかの実験においてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原）の存在下で培養し、６日後に細胞を細胞内染色した。
【０１７４】
サプレッサーアッセイ
ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮを用いて免疫したマウス由来の脾臓細胞をＩＬ−１２の存在下においてＫＬＨとともに培養し、ＫＬＨ特異的Ｔｈ１型Ｔ細胞株を産生した。ＩＬ−１０を分泌し、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−４を少量または全く分泌しないＴｒ１型細胞株を抗ＩＦＮ−ガンマの存在下において最初の培養によりＫＬＨおよびＣｐＧを用いて免疫したマウスから樹立した。ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０を発現したＴｈ１Ｔｒ型Ｔ細胞株を、ＫＬＨおよびＣｐＧで免疫したマウス由来の脾臓細胞を、抗原及びＡＰＣの存在下で、サイトカインまたは抗体を添加せずに培養することにより、樹立した。Ｔｈ１細胞株（１×１０５個／ｍｌ）をＡＰＣ（照射された脾臓細胞；２×１０６個／ｍｌ）およびＫＬＨのみで、または１：３、１：１または３：１の比のＴｒ１またはＴｈ１Ｔｒ細胞の存在下において培養した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマ濃度をＥＬＩＳＡ法により調べた。Ｔｈ１細胞のみの反応を基準とした結果を表す。
【０１７５】
ＤＣ活性化
骨髄由来の未成熟ＤＣ（ＢＭＤＣ）を、抽出した骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）で１０日間培養することにより、産生した。ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのどちらか由来のＢＭＤＣを１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＴＬＲ作動薬、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ザイモサン、ＬＰＳ、フラジェリン、ポリＩＣ、ＣｐＧ−ＯＤＮまたは培地のみでインキュベートした。阻害試験において、活性化した細胞を、ＭＥＫ１／２（ＥＲＫ）阻害剤Ｕ０１２６（１．２５〜５μＭ）、Ｃｏｘ−２阻害剤ＮＳ−３９８（０．１〜１０μＭ）またはｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（０．１〜１０μＭ）で前処置した（１時間）。ＢＭＤＣはまた、種々の濃度のＢ１６の上清（Ｓ／Ｎ）で２４時間処置した。Ｂ１６Ｓ／Ｎを、Ｂ１６細胞５×１０５個／ｍｌを１週間増殖させ、使用済み培地を除去することにより調製した。６または２４時間後、上清を取り出し、サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法により決定し、または細胞をホモジナイズし、得られたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【０１７６】
ＤＣ移入実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の活性化ＢＭＤＣをＣｐＧ（５μｇ）およびＫＬＨ（５μｇ）でインキュベートし、Ｃｏｘ−２（ＮＳ−３９８：５μＭ）、ｐ３８（ＳＢ２０３５８０：１μＭ）およびＥＲＫ（Ｕ０１２６：５μＭ）に対する阻害剤とともに前処置した。処置された細胞２．５×１０５個を各フットパッドに注入した。膝窩リンパ節および脾臓を５日後に取り出し、単一細胞懸濁液をＫＬＨ（２、１０、５０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。Ｓ／Ｎを３日後に取り出し、ＥＬＩＳＡ法により、アリコートのＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０を測定した。
【０１７７】
腫瘍実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍でｓ．ｃ．で惹起し、処置されたＢＭＤＣ（１〜５×１０５個）を腫瘍部位に３日目から開始して１週間間隔で３回ｓ．ｃ．注射で処置した。ＢＭＤＣを、ＣｐＧ（５μｇ／ｍｌ）とともに、熱ショックされ：照射されたＢ１６腫瘍細胞と、またはＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（５μＭ）またはＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６（５μＭ）のどちらかで２４時間負荷した。マウスの腫瘍増殖を定期的にモニターした。
【０１７８】
調節されたＤＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞の活性化
ＢＡＬＢ／ｃ由来ＤＣをＯＶＡクラスＩＩペプチド（５μｇ）とともにインキュベートした。同時に、細胞をＣｐＧ（１０μｇ）またはｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（１または５μＭ）のどちらかおよびＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６（５μＭ）で２４時間刺激した。次いで、Ｄ０１１．１０ＯＶＡ−ＴＣＲ  Ｔ細胞をＢＭＤＣ（１０：１）に添加した。上清を３および１１日後に取り出し、ＥＬＩＳＡ法により、アリコートのＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマを測定した。
【０１７９】
直接腫瘍治療
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０５個の腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、３、５および７日目にＣｐＧ（１０または２０μｇ）、Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（１００または５００μｇ）またはその併用のいずれかで腫瘍部位にｓ．ｃ．注射した。マウスの腫瘍増殖および生存を定期的にモニターした。腫瘍径をキャリパーにより二次元で測定し、以下の式により決定した：（幅２×長）×π／６、式中、幅はより小さい値である。腫瘍長が１５ｍｍ以上を測定した場合マウスを屠殺した。
【０１８０】
ウェスタンブロット分析
ＤＣを、ＴＬＲリガンドとともに１×１０６個／ｍｌで１５分〜８時間培養した。特定の実験において、ＥＲＫまたはｐ３８阻害剤をＴＬＲリガンドの１時間前に添加した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、リン酸化ｐ３８（ｐｐ３８；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マサチューセッツ州、米国）またはリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）に特異的な抗体および西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体でブロットした。ニトロセルロースをストリップし、全ｐ３８または全ＥＲＫに特異的な抗体でプローブした。
【０１８１】
磁気細胞分離によるＴ細胞の精製
細胞懸濁液をリンパ節、肺または外科手術により取り出した腫瘍から調製した。組織試料を培地で洗浄し、外科用メスの刃で微細に切断し、ハンクス平衡塩溶液中コラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ）０．１％溶液で３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を７０μｍ細胞濾過器に通し、赤血球を溶解した。細胞を洗浄し、計数し、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１０μｌを有するＭＡＣＳ緩衝液９０μｌに再懸濁し、４〜８℃にて１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍｌ）を各試料に添加後、３００×ｇにて１０分間遠心分離した。次いで、各試料をＭＡＣＳ緩衝液５００μｌに再懸濁し、ＡｕｔｏＭａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して分離した。
【０１８２】
フローサイトメトリーによる分析および細胞内サイトカイン染色
単一細胞懸濁液をリンパ節、肺および腫瘍から調製した。肺および腫瘍を、０．１％コラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ）を有するハンクス平衡塩溶液で消化した。細胞をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で１時間刺激後、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）を３７℃にて４時間添加した。細胞をＣＤ４（Ｃａｌｔａｇ）、ＣＤ８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１ｃ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはＦ４／８０（Ｃａｌｔａｇ）のいずれかに特異的な抗体で再懸濁した。次いで、細胞を固定培地Ａ（Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、  Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μｌで固定した。細胞を透過性培地Ｂ（Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、  Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μｌおよび抗ＩＬ−１０または抗ＩＦＮ−ガンマ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）５μｌでインキュベートし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）のＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を使用して免疫蛍光を分析した。
【０１８３】
逆転写酵素−ＰＣＲ
ＲＮＡを脾臓、肺、ＬＮまたは腫瘍細胞またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかからＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＯｌｉｇｏｄＴ（１２〜１８）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。
マウスＴＧＦ−ベータに特異的なプライマー（センス−ＡＧＡＣＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＡＴＴＣＡ、アンチセンス−ＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＴＡＧＴＡ）、ＩＬ−１０（センス−ＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＡＡＣＣＧＡＣ、アンチセンス−ＴＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＡＣＡＣＣ）、Ｆｏｘｐ３（センス−ＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＣＣＣＣＴＡ、アンチセンス−ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＧ）、Ｃｏｘ−２（センス−ＧＴＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡ、アンチセンス−ＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴ）、ＩＰ−１０（センス−ＣＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＴＡＣＡＧ、アンチセンス−ＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＡＧ、ＩＬ−２３ｐ１９（センス−ＴＣＴＣＧＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣ、アンチセンス−ＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＡＧＴＣ）、ＩＬ−１５（センス−ＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＴＡ、アンチセンス−ＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴ）およびベータ−アクチン（センス−ＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＧ、アンチセンス−ＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＧＣ）をｃＤＮＡ試料２μｇとともに使用し、ペルチェサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）を使用してＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で増幅した。
【０１８４】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、タンパク質分解中に産生される多岐にわたる細胞ペプチドと結合している。いくつかの細胞（例えば、腫瘍細胞）由来のＨＳＰ調製物は、その細胞のペプチドレパートリーを含有する。ＨＳＰペプチド複合体を用いたワクチン接種は、ペプチドに対するＴ細胞反応を産生する。
【０１８５】
ＨＳＰ７０腫瘍ペプチド複合体の精製
Ｂ１６腫瘍細胞（１×１０６個）をＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、１４日後、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出した。腫瘍は、その体積の４倍の低張性緩衝液（２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ＰＭＳＦ  ｐＨ７．１）中でホモジナイズした後、１００，０００ｇにて遠心分離し、上清を回収した。試料を緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸塩、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）にＰＤ１０カラムを用いて変更した。試料を緩衝液Ｄで均衡させたＡＤＰアガロースカラム（５ｍｌ）に直接適用した。カラムを０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液Ｄで洗浄後、タンパク質アッセイによりタンパク質をさらに検出することができなくなるまで緩衝液Ｄのみで洗浄した。最後にカラムを、３ｍＭＡＤＰを含有する緩衝液Ｄで室温にて３０分間インキュベートし、続いて、同緩衝液（２５ｍｌ）で溶出した。ＨＳＰ７０を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用し、定量した。調製物の純度を銀染色ゲルで、特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング法により特異性を評価した。
【０１８６】
［実施例１］  ＣＴ２６腫瘍増殖は、非関連抗原に対するＴ細胞反応を阻害する
材料および方法
ＤＯ．１１．１０マウスにＯＶＡ（２００μｇ）単独で、または２×１０５個のＣＴ２６細胞とともに、ｓ．ｃ．注射した。マウスを７日後にＯＶＡ２００μｇでブーストし、１４日後にリンパ節細胞をＯＶＡで再刺激し、増殖（図１Ａ）を４日後に検討し、ＩＦＮ−ガンマ（図１Ｂ）濃度を３日後に取り出した上清で決定した。結果は、１群当たりマウス５匹の平均±ＳＤであり、３点測定した。ＯＶＡ対ＯＶＡ＋ＣＴ２６、ＡＮＯＶＡにより＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１８７】
結果
腫瘍増殖中に適応免疫反応が効率的に産生しないのは、増殖している腫瘍により作製された免疫抑制環境に起因する可能性を調べるために、本発明者らは、非関連抗原に対するＴ細胞反応における増殖している腫瘍の影響を検討した。ＯＶＡ−ＴＣＲＴｇマウスにＣＴ２６細胞の存在下または非存在下においてＯＶＡでｓ．ｃ．注射し、マウスを７日後にＯＶＡでブーストし、１４日後に屠殺した。流入領域リンパ節を取り出し、ＯＶＡ−特異的Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を調べた。ＣＴ２６細胞およびＯＶＡで惹起されたマウスは、ＯＶＡのみを注射したマウスと比較した場合、ＯＶＡ−特異的Ｔ細胞増殖が有意に減少した（図１Ａ）。ＣＴ２６細胞の共投与もまた、リンパ節のＯＶＡ−特異的ＩＦＮ−ガンマ産生を有意に低下させ（図１Ｂ）、増殖しているＣＴ２６腫瘍が特に注射部位にて他の抗原に対する免疫反応を抑制することを明らかにした。
【０１８８】
［実施例２］  増殖している腫瘍により誘導された免疫抑制サイトカイン産生
材料および方法
ＲＮＡを、培養ＣＴ２６細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲをＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ−１５およびＩＰ−１０に特異的なプライマーを使用して行った（図２Ａ）。培養されたＣＴ２６細胞の上清のＴＧＦ−ベータタンパク質をＥＬＩＳＡ法により定量した（図２Ｂ）。ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたＣＴ２６細胞またはホモジナイズしたｓ．ｃ．ＣＴ２６腫瘍を担持するマウスから摘出した固体ＣＴ２６腫瘍（マウス５匹からプールされたＲＮＡ）から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲをＩＬ−１０およびベータアクチンに特異的なプライマーを使用して行った（図２Ｃ）。結果は、３回の実験の代表値である。
【０１８９】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）にｉ．ｖ．（図３Ａ）またはｓ．ｃ．（図３Ｂ）のどちらかでＣＴ２６細胞を注射した。リンパ節（ＬＮ）およびｓ．ｃ．腫瘍塊（Ｔ）または肺を未感作（Ｎ）および腫瘍惹起１４日後の腫瘍担持マウス（Ｔ）から取り出した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気細胞分離を使用して単離し、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲをＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータに特異的なプライマーを使用して行った。
【０１９０】
結果
腫瘍増殖中の免疫抑制の可能性のあるメディエーターを検討するために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された腫瘍およびｅｘ  ｖｉｖｏで増殖している腫瘍の炎症促進性および抗炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現を検討した。培養されたＣＴ２６腫瘍細胞のサイトカインｍＲＮＡ発現の検討は、抗炎症性サイトカイン、ＴＧＦ−ベータのｍＲＮＡ発現を明らかにした（図２Ａ）。さらに、ＴＧＦ−ベータタンパク質を増殖している腫瘍の上清中に検出した（図２Ｂ）。Ｃｏｘ−２、ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ−１５およびＩＰ−１０ｍＲＮＡもまたＣＴ２６細胞により発現した（図２Ａ）が、本発明者らは、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７ｐ２８、ＩＬ−２７ＥＢ１３、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−ガンマのｍＲＮＡ発現を検出できなかった（データは図示せず）。ＰＭＡで細胞を刺激した後でもｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された腫瘍中（図２Ａ）にＩＬ−１０ｍＲＮＡを検出することができなかったが（データは図示せず）、ｅｘ  ｖｉｖｏの腫瘍塊においては検出され（図２Ｃ）、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を浸潤している細胞がＩＬ−１０を分泌したことを示唆した。
【０１９１】
次いで、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲにより、腫瘍塊、肺および流入領域リンパ節のＴ細胞のＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ発現を検討した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＴ２６肺転移を有するマウスの肺および頸部リンパ節からと、ＣＴ２６細胞をｓ．ｃ．注射したマウスの固体腫瘍および鼠径リンパ節から精製した。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの恒常的発現は、未感作マウスのリンパ節と比較した肺のＣＤ４＋Ｔ細胞において高値であった。ＩＬ−１０発現は、未感作マウスの肺のＴ細胞に見つかったものに比較し、腫瘍担持マウスの肺のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞はともにかなり強化されたが、肺転移を有するマウスの頸部リンパ節のＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現はほとんど変化しなかった（図３Ａ）。さらに、ＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ発現は、未感作の対照マウスと比較した場合、ＣＴ２６肺転移担持マウスの肺から精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ともに顕著に高く、リンパ節ではほとんど変化がなかった（図３Ｃ）。高ＩＬ−１０発現もまた、ＣＴ２６をｓ．ｃ．注射されたマウス由来の固体腫瘍から精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞において検出された（図３Ｂ）。ＣＴ２６細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起１４日後のマウス鼠径リンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＧＦ−ベータｍＲＮＡ発現がわずかに増加した（図３Ｂ）。しかし、鼠径リンパ節において、ＴＧＦ−ベータ発現の高い恒常的な発現があった。これらの所見は、ＣＴ２６腫瘍の増殖が、すでに免疫抑制的な肺の環境を強化し、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ発現性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍部位への浸潤を促進することを示唆する。
【０１９２】
［実施例３］  Ｆｏｘｐ３発現を、ＣＴ２６腫瘍塊内のＣＤ４＋Ｔ細胞において強化する
材料および方法
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、静脈内（ｉ．ｖ．）（図３Ａ）または皮下（ｓ．ｃ．）（図３Ｂ）のどちらかでＣＴ２６を注射した。リンパ節（ＬＮ）およびｓ．ｃ．腫瘍塊（Ｔ）を、未感作（Ｎ）および腫瘍惹起１４日後の腫瘍担持マウス（Ｔ）から取り出した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気細胞分離を使用して単離し、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲをＦｏｘｐ３に特異的なプライマーを使用して行った。
【０１９３】
結果
ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを発現するＴ細胞が増殖中の腫瘍に蓄積することが明らかになったので、本発明者らは、天然のＴｒｅｇ細胞が腫瘍部位に動員される可能性を検討した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、鼠径リンパ節、およびｓ．ｃ．モデルの固体腫瘍、および肺転移モデルの表在性リンパ節と肺から精製し、ＲＴ−ＰＣＲを、Ｆｏｘｐ３に特異的なプライマーを使用して行った。肺転移モデルにおいて、Ｆｏｘｐ３発現は、未感作マウス由来の同組織と比較した腫瘍担持マウスの肺および流入領域リンパ節から精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞において顕著に強化された（図３Ａ）。また、Ｆｏｘｐ３発現は、ｓ．ｃ．腫瘍塊に浸潤しているＣＤ４＋Ｔ細胞にも検出された（図３Ｂ）。肺モデルと違い、Ｆｏｘｐ３発現は、ｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスの流入領域リンパ節において強化されなかった。Ｆｏｘｐ３発現は、未感作または腫瘍担持マウス由来の組織のいずれのＣＤ８＋Ｔ細胞においても検出されなかった。
【０１９４】
［実施例４］  高頻度のＩＬ−１０分泌性ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞ならびに低頻度のＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞は、増殖している腫瘍に浸潤する
材料および方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスに２×１０５または３×１０５個のＣＴ２６結腸癌細胞をそれぞれｓ．ｃ．またはｉ．ｖ．のどちらかで注射した。固体ｓ．ｃ．腫瘍または肺を示された日に切除した。細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激し、表面ＣＤ４、ＣＤ８および細胞内ＩＬ−１０ならびにＩＦＮ−ガンマに特異的な抗体で標識し、免疫蛍光分析を行った（図４Ａ）。
【０１９５】
結果
増殖している腫瘍のＩＬ−１０分泌性およびＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の存在を明らかにしたので、本発明者らは、細胞内サイトカイン染色を使用して、腫瘍増殖中の肺または腫瘍塊に動員されるエフェクター対制御性Ｔ細胞の相対的な頻度を検討した。マウスをＣＴ２６細胞でｓ．ｃ．またはｉ．ｖ．で惹起し、腫瘍を３または１４日後に取り出し、細胞内サイトカイン染色を、表面ＣＤ４またはＣＤ８を標識したＴ細胞のＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマについて行った。非常に高頻度（２４〜３７％）のＩＬ−１０分泌性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＴ２６転移を担持するマウスの肺およびＣＴ２６細胞をｓ．ｃ．注射したマウスの腫瘍塊で検出された（図４Ａ）。対照的に、ＩＦＮ−ガンマの分泌は、ＣＤ４＋Ｔ細胞で６〜７％およびＣＤ８＋Ｔ細胞で９〜２７％であった（図４Ａ）。
【０１９６】
［実施例５］  ＩＬ−１０分泌性マクロファージおよびＤＣは、増殖している腫瘍に浸潤する
材料および方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスに３×１０５個のＣＴ２６結腸癌細胞をｉ．ｖ．注射し、肺を未感作マウス（０日目）または腫瘍惹起３日および１４日後のマウスから取り出した。細胞を表面ＣＤ１１ｃおよびＦ４／８０および細胞内ＩＬ−１０に特異的な抗体で標識し、免疫蛍光分析を行った（図４Ｂ）。
【０１９７】
結果
自然のＩＬ−１０は、マクロファージおよびＤＣにより分泌され、末梢において未感作Ｔ細胞由来の誘導性Ｔｒｅｇ細胞の分化に重要な役割を果たすことが報告された。ＣＴ２６転移の発達中の肺へのＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞の動員を明らかにしたので、それゆえ、本発明者らは、これが肺におけるＩＬ−１０産生マクロファージまたはＤＣの動員および活性化に関与する可能性を検討した。マウスをＣＴ２６細胞でｉ．ｖ．惹起し、肺および頸部リンパ節を３または１４日後に取り出し、細胞内サイトカイン染色を表面ＣＤ１１ｃまたはＦ４／８０を標識した細胞において行った。肺のＣＴ２６腫瘍の発達は、肺に対するマクロファージおよびＤＣの動員に関連し、これらの自然細胞の高い割合がＩＬ−１０を分泌した（図４Ｂ）。肺のＣＤ１１ｃ＋細胞の割合は、未感作マウスの１１％から腫瘍惹起３日および１４日後のそれぞれ１７％および３４％まで増加し、一方、Ｆ４／８０＋細胞の割合は、未感作マウスの１２％から腫瘍惹起１４日後の２７％まで増加した。さらに、腫瘍惹起１４日後に浸潤マクロファージの７９％および浸潤ＤＣの３８％がＩＬ−１０を分泌した。対照的に、ＤＣ１１ｃ＋およびＦ４／８０＋細胞の割合は、未感作対照マウスと比較した場合、腫瘍惹起３日および１４日後のリンパ節において低下した。さらに、非常に低頻度のこれらの細胞が、ＩＬ−１０を分泌し、これは、腫瘍惹起後に顕著に変化しなかった。
【０１９８】
［実施例６］  Ｂ１６細胞は、樹状細胞およびマクロファージのＣｏｘ−２発現を誘導する
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄由来樹状細胞または腹腔マクロファージを種々の希釈のＢ１６上清で２４時間インキュベートした。細胞をホモジナイズし、得られたｍＲＮＡを、Ｃｏｘ−２特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより分析し、ベータアクチン発現と比較した。Ｂ１６上清を、Ｂ１６細胞５×１０５個／ｍｌを１週間増殖させ、使用済み培地を除去することにより調製した。
【０１９９】
結果
Ｃｏｘ−２阻害剤は癌の処置において使用され、様々な成功をもたらした。Ｃｏｘ−２およびＣｏｘ−２により誘導されたＰＧＥ２は、Ｆｏｘｐ３発現性の制御性Ｔ細胞を促進することに関与していた。本発明者らは、ＣＴ２６腫瘍がＣｏｘ−２ｍＲＮＡを発現することをすでに示した。本明細書において、本発明者らは、腫瘍細胞もマクロファージおよび樹状細胞のＣｏｘ−２発現を誘導することができる可能性を、Ｂ１６腫瘍細胞株を使用して検討した。増殖しているＢ１６細胞由来の上清を用いた骨髄由来ＤＣまたは腹腔マクロファージの刺激は、ＤＣおよびマクロファージのＣｏｘ−２ｍＲＮＡ発現を誘導した（図５）。それゆえ、腫瘍細胞は、Ｃｏｘ−２を発現するだけでなく、自然免疫系の細胞のＣｏｘ−２の発現も誘導する。
【０２００】
［実施例７］  ＣｐＧ−ＯＤＮは、樹状細胞およびマクロファージのＣｏｘ−２発現を誘導する
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来ＤＣおよび腹腔マクロファージを種々の濃度のＣｐＧで２４時間インキュベートした。細胞をホモジナイズし、得られたｍＲＮＡを、Ｃｏｘ−２特異的プライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより分析し、ベータアクチン発現と比較した。
【０２０１】
結果
ＣｐＧ−ＯＤＮを、腫瘍の治療として、および感染性疾患ワクチンのアジュバントとして調べている。これらの可能性は、自然免疫反応、特にＩＬ−１２を、および結果として樹状細胞およびマクロファージ等の自然免疫細胞とＴＬＲ９との相互作用を介した適応免疫を強化する能力に基づく。しかし、ＴＬＲ信号伝達は、ＩＬ−１２産生等の免疫性サイトカインの誘導に制限されず、他のメディエーターも活性化することができる。本発明者らは、自然免疫細胞のＣｏｘ−２誘導におけるＣｐＧの影響を調べた。ＣｐＧは、樹状細胞およびマクロファージのＣｏｘ−２ｍＲＮＡ発現の用量依存的な誘導を誘導した（図６）。Ｃｏｘ−２が、脈管形成および抗炎症性反応に寄与することができるため、これは、腫瘍治療または癌あるいは感染性疾患のワクチンのアジュバントとして望ましくない。
【０２０２】
［実施例８］  ＴＬＲリガンドは、制御活性を有するＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔｈ１細胞を誘導する
材料および方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳのみ、ＫＬＨ（５μｇ）またはＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮ（２５μｇ）、ＬＰＳ（１μｇ）、ポリＩＣ（２５μｇ）、死菌体Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ全細胞ワクチン（Ｐｗ）またはＣＴ（１０ｎｇ）を用いてｓ．ｃ．で免疫した。７日後、マウスの流入領域リンパ節細胞をＫＬＨ（５０μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により、３日後に決定した（図７）。
【０２０３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞株をＫＬＨで免疫化したマウスから樹立し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣで刺激した（図８Ａ）。株６および７を最初に抗ＩＦＮ−ガンマの存在下において抗原で刺激して、培養液を模倣し（および複数の再培養ステップで洗浄することにより除去し）ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の増殖を防止した。Ｔ細胞株を、抗原およびＡＰＣの刺激により、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０産生について調べた（図８Ａ）。
【０２０４】
ＰＢＳ（対照）またはＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮで免疫化したマウス由来のリンパ節細胞をＫＬＨ（５０μｇ／ｍｌ）で刺激し、６日後、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで６時間再刺激した（図８Ｂ）。ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）を最後の４時間に添加した。免疫蛍光分析を、ＣＤ４＋細胞上にゲーティング後の細胞内ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマにおいて行った（図８Ｂ）。
【０２０５】
高濃度のＩＦＮ−ガンマを分泌し、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を低濃度分泌し、または全く分泌しないＴｈ１細胞株をＩＬ−１２および抗ＩＬ−１０の存在下においてＴ細胞を培養することにより、ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮで免疫化したマウスから樹立した（図８Ｃ）。ＩＬ−１０を分泌し、およびＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−４を低濃度または全く分泌しないＴｈ１型細胞株を、抗ＩＦＮ−ガンマの存在下において最初の培養により樹立し、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞株（Ｔｈ１Ｔｒと呼ぶ）の混合物をサイトカインまたは抗体を添加することなく、抗原およびＡＰＣとともに培養することにより樹立した。Ｔｈ１細胞株は、ＡＰＣおよび抗原のみまたは１：３、１：１または３：１の比のＴｒ１またはＴｈ１Ｔｒ細胞の存在下において培養した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマ濃度をＥＬＩＳＡ法により調べた（図８Ｃ）。Ｔｈ１細胞のみの反応を基準として結果を表す。
【０２０６】
結果
ＴＬＲリガンド、例えばＣｐＧまたはＬＰＳは、選択的にＴｈ１反応を誘導し、または特定のＴＬＲ−２作動薬の場合、Ｔｈ２反応を誘導することが広く報告されている。本発明者らは、モデルバイスタンダー抗原であるＫＬＨに対するＴ細胞反応に関するＴＬＲリガンドの役割を検討した。ＫＬＨのみを用いた免疫化は、ＩＬ−１０および低濃度ＩＬ−４を分泌するがＩＦＮ−ガンマは分泌しないＴ細胞を生成した。ＴＬＲリガンド、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ＬＰＳまたはポリＩＣの共投与は、高濃度のＩＦＮ−ガンマを分泌するがＩＬ−４を低濃度または検出不能な程度分泌するＴ細胞である、Ｔｈ１細胞の誘導と一致するサイトカインプロフィールを産生する（図７）。
【０２０７】
しかし、ＩＦＮ−ガンマに加え、顕著なＩＬ−１０（しかしＩＬ−４は検出されず）もまた、ＴＬＲリガンドの存在下においてＫＬＨで免疫されたマウスの抗原刺激性リンパ節細胞由来の上清に検出された（図６）。死菌体Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびｐｅｒｔｕｓｓｉｓ全細胞ワクチンは、強力なアジュバント活性を有する。本明細書において、本発明者らは、死菌体Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓが共投与抗原であるＫＬＨに対する、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマを分泌する抗原特異的Ｔ細胞の誘導を促進することを発見した。対照的に、本発明者らが以前に示したＣＴを用いた免疫は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を誘導し、ＫＬＨ特異的ＩＬ−４およびＩＬ−１０産生を強化した。
【０２０８】
免疫されたマウス由来のＫＬＨ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株の産生は、ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮ（図８Ａ）を用いた免疫が、ＩＦＮ−ガンマのみまたはＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０を分泌するＴ細胞を産生したことを示した。抗原およびＣｐＧ−ＯＤＮまたはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓで免疫したマウスから産生されたＴ細胞株を抗ＩＦＮ−ガンマの存在下において最初にｅｘ  ｖｉｖｏでリンパ節を培養することにより産生する場合（これは、次いでいくつかの洗浄ステップおよびいくつかの再培養ステップにより除去された）、これらのＴ細胞は、ＩＬ−１０を分泌するが、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−４を分泌しない（図８Ａ）。これらの所見は、Ｔｈ１−促進アジュバントもまたＩＬ−１０分泌性Ｔｈ１型Ｔ細胞およびＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマを分泌するＴ細胞を産生することを示唆し、これらは、Ｔｈ１Ｔｒ細胞と呼ばれている。ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮで免疫化されたマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色もまた、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−１０のみまたはＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０を分泌する細胞の別個の集団を明らかにし（図８Ｂ）、このＴＬＲ作動薬が、Ｔｈ１およびＴｒ１細胞および両方のサイトカインを分泌する別個の集団の誘導を促進することが確認された。
【０２０９】
次に、本発明者らは、ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮを用いて免疫することにより誘導された、抗原特異的ＩＬ−１０またはＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の、樹立したＫＬＨ特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞株に対するサプレッサー機能を検討した。このＴｈ１細胞株は、ＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮで免疫化されたマウスから樹立され、抗原およびＡＰＣの刺激に対して高濃度のＩＦＮ−ガンマを分泌する。ＩＬ−１０を分泌するが、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−４を分泌しないＴｈ１細胞もまた、抗ＩＦＮ−ガンマ中和抗体の存在下において最初の培養によりＫＬＨおよびＣｐＧ−ＯＤＮで免疫したマウスの脾臓細胞から増殖した。これらのＴｒ１細胞は、３：１、１：１および１：３の比のＴｈ１細胞によりＩＦＮ−ガンマ産生を顕著に抑制し、この場合、最も高い発現は、Ｔｒ１細胞数が最も多い時に認められた（図８Ｃ）。ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０を分泌するＴｈ１Ｔｒ細胞もまた、ＩＦＮ−ガンマ分泌を抑制するが、１：１および３：１の比のみにおいてである。これらの所見は、エフェクターＩＦＮ−ガンマ分泌性細胞を誘導するのに加え、ＣｐＧ−ＯＤＮが、同時にサプレッサー活性を有するＴ細胞の誘導を促進することを示唆した。
【０２１０】
［実施例９］  ＴＬＲリガンドは、ＥＲＫおよびｐ３８の活性化を介してＤＣＩＬ−１０産生を誘導する
材料および方法
ＤＣを１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４（Ｐａｍ３）、ザイモサン（Ｚｙｍ）、ポリＩＣ、ＬＰＳ、フラジェリン（Ｆｌａｇ）、ＣｐＧ−ＯＤＮの存在下または培地のみでインキュベートした。２４時間後、上清を取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＮＴ、検査せず（図９）。
【０２１１】
ＤＣをＭＥＫ１／２阻害剤（Ｕ０１２６）で１時間プレインキュベート後、培地のみまたはＰａｍ３Ｃｙｓ、ザイモサン、ＬＰＳ、フラジェリンまたはＣｐＧ−ＯＤＮ（１または５μｇ／ｍｌ）で１５分間インキュベートした。細胞を溶解し、ウェスタンブロット法をリン酸化ＥＲＫ１およびリン酸化ＥＲＫ２に特異的な抗体を使用して行った（図１０Ａ）。ＤＣを培地のみ（０）またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で０．５、１、２、４、８または１２時間刺激した。ウェスタンブロット法をリン酸化ＥＲＫまたはｐ３８に特異的な抗体を使用して行った（図１０Ｂ）。ブロットをストリップし、全ＥＲＫまたはｐ３８に特異的な抗体で再プローブした。ＤＣを培地のみ（対照）、Ｕ０１２６（１．２５〜５μＭ）（図１０Ｃ）またはｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（ＳＢ；０．１〜１０μＭ）（図１０Ｄ）で、ＣｐＧ−ＯＤＮ（５μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）または培地のみを添加する前に１時間プレインキュベートし、２４時間後、ＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＤＭＳＯで処置した細胞を陰性対照として使用した。
【０２１２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄由来ＤＣをＣｐＧのみ（１０μｇ）またはｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（低：１μＭ、高：５μＭ）あるいはＥＲＫ阻害剤ＵＯ１２６（５μＭ）で２４時間インキュベートした。上清を取り出し、アリコートをＥＬＩＳＡ法により、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−６について測定した（図１１）。
【０２１３】
結果
ＴＬＲリガンドおよびＴＬＲリガンドを含む死菌体Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓがＴｒ細胞およびＴｈ１細胞を誘導することを明らかにしたので、本発明者らは、これがＤＣによるＩＬ−１０およびＩＬ−１２の同時誘導を反映する可能性について検討した。本発明者らは、検討したＴＬＲリガンド、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ−２）、ザイモサン（ＴＬＲ−２）、ポリＩＣ（ＴＬＲ−３）、ＬＰＳ（ＴＬＲ−４）、フラジェリン（ＴＬＲ−５）およびＣｐＧ−ＯＤＮ（ＴＬＲ−９）がそれぞれ未成熟骨髄由来ＤＣのＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０ならびにＩＬ−１２ｐ７０の産生を誘導することを発見した（図９）。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の誘導は、それぞれＥＲＫおよびｐ３８信号伝達に関連し、それゆえ、本発明者らは、ＴＬＲ誘導性サイトカイン産生においてこれらのＭＡＰキナーゼの役割を検討した。本発明者らは、検討したＴＬＲリガンドがそれぞれＤＣのＥＲＫリン酸化を誘導することを発見した（図１０Ａ）。ＬＰＳ誘導性ＥＲＫリン酸化は、３０分にて最大値となったが、８時間まで明らかであった（図１０Ｂ）。ＴＬＲリガンドを阻害するＭＥＫ１／２阻害剤であるＵ０１２６を用いたプレインキュベーションは、ＥＲＫリン酸化（図１０Ａ）を誘導し、ＣｐＧ−ＯＤＮまたはＬＰＳで刺激されたＤＣからのＩＬ−１０産生を抑制した（図１０Ｃ）。ＭＥＫ１／２阻害剤は、ＩＬ−１２ｐ７０産生を強化した。この効果は、ＩＬ−１０−／−マウス由来のＤＣにおいても保持されており、ＩＬ−１０産生の低下に続くものではないことを示唆した（データは図示せず）。ＴＬＲリガンドもまた、ＤＣのｐ３８のリン酸化を誘導した。特定のｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０を用いたＤＣのプレインキュベーションは、ＬＰＳまたはＣｐＧ−ＯＤＮに対する反応においてＩＬ−１０を阻害、および／またはＩＬ−１２ｐ７０産生を強化した（図１０Ｄおよび図１１）。本発明者らはまた、ｐ３８およびＥＲＫ阻害剤の併用がＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０産生をさらに抑制し、ＩＬ−１２ｐ３５を強化するが、ＩＬ−６において効果がないことを発見した（図１１）。ＥＲＫおよびｐ３８は、ＥＲＫ促進ＩＬ−１０およびｐ３８促進ＩＬ−１２で別々にＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を制御することができることを以前に示唆している。しかし、本発明者らの所見は、ＩＲＦ−５−欠損マウス（Ｔａｋａｏｋａ，Ａ．，Ｈ．Ｙａｎａｉ，Ｓ．Ｋｏｎｄｏ，Ｇ．Ｄｕｎｃａｎ，Ｈ．Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｔ．Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｓ．Ｉ．Ｋａｎｏ，Ｋ．Ｈｏｎｄａ，Ｙ．Ｏｈｂａ，Ｔ．Ｗ．Ｍａｋ，ａｎｄ  Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ．２００５．Ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＲＦ−５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ）およびＮＦ−κＢ阻害剤（Ｋａｂａｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｔ．Ｈｏｎｄａ，Ｙ．Ｎｕｎｏｋａｗａ，ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｃｈｉ．２００４．Ａ  ｎｅｗ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ａ  ＴＨ１  ｔｙｐｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７８：３６−���０）を使用する最近の報告と併用し、ＴＬＲリガンドがＭＡＰキナーゼである、ＥＲＫおよびｐ３８を介してＩＬ−１０を活性化する一方、ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＲＦ−５およびＮＦ−κＢ経路を利用することを示唆する。
【０２１４】
［実施例１０］  ｐ３８、ＥＲＫおよびＣｏｘ−２阻害剤の、外来抗原およびＣｐＧで刺激された樹状細胞への添加は、Ｔｈ１の誘導能を強化し、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制する
材料および方法
ＢＡＬＢ／ｃの骨髄由来ＤＣをＯＶＡクラスＩＩペプチド（５μｇ）とともにインキュベートした。同時に、細胞をＣｐＧ（１０μｇ）のみまたはｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（低：１μＭ、高：５μＭ）あるいはＰ３８阻害剤およびＥＲＫ阻害剤ＵＯ１２６（５μＭ）のいずれかで２４時間刺激した。Ｄ０１１．１０ＯＶＡ−ＴＣＲＴｇマウスから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＤＣ（１０：１）で刺激し、上清を抗原刺激３日後に取り出し、ＩＬ−１０およびＩＦＮガンマは、ＥＬＩＳＡ法により定量した（図１２）。
【０２１５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来ＤＣを培地のみ（−）、ＫＬＨ（５μｇ）およびＣｐＧ（５μｇ）ならびに、Ｃｏｘ−２（ＮＳ−３９８：５μＭ）、ｐ３８（ＳＢ２０３５８０：１μＭ）、ＥＲＫ（ＵＯ１２６：５μＭ）に対する阻害剤の示された組み合わせでインキュベートした。２．５×１０５個の処置された細胞を５７ＢＬ−６マウスの各フットパッドに注入した。膝窩リンパ節および脾臓を５日後に取り出し、単一細胞懸濁液をＫＬＨ（２、１０、５０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。上清を３日後に取り出し、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した（図１３）。
【０２１６】
結果
ＴＬＲリガンドは、樹状細胞およびマクロファージ由来のＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を強化する。さらに、自然免疫細胞由来のＩＬ−１２およびＩＬ−１０産生は、Ｔｈ１およびＴｒｅｇ細胞それぞれの誘導を促進する。これは、アジュバントとしてのＴＬＲ作動薬によるＴｈ１およびＴｒｅｇ細胞の同時誘導を説明する。本明細書において、本発明者らは、ｐ３８またはＥＲＫ阻害剤あるいはこれらの両方とＣｐＧとの併用がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて外来抗原に対するＴｈ１を強化し、Ｔｒ誘導を抑制することを示す。ＤＣをＯＶＡペプチドのみまたはＣｐＧあるいはｐ３８阻害剤存在下またはＰ３８およびＥＲＫ阻害剤存在下においてＣｐＧで刺激後、これを使用して、ＤＯ１１．１０ＯＶＡ  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスの脾臓から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した。Ｔ細胞サイトカイン産生を１回または２回の抗原刺激後に検討した。結果は、ＣｐＧの存在下において、ＯＶＡを用いてパルスされたＤＣは、ＩＬ−１０およびＩＦＮガンマ分泌性Ｔ細胞を誘導し、これは、Ｔｈ１およびＴｒｅｇ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ誘導に一致することを示す（図１２）。ｐ３８阻害剤の添加により、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞の誘導が抑制され、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞の誘導が強化された。これを、ＥＲＫ阻害剤の添加によりさらに強化された。
【０２１７】
次に、本発明者らは、ＣｐＧ活性化樹状細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞反応誘導におけるｐ３８、ＥＲＫおよびＣｏｘ−２阻害剤の影響について検討した。骨髄由来ＤＣを、ＫＬＨのみ、またはＣｐＧのみあるいはｐ３８、ＥＲＫおよびＣｏｘ−２阻害剤の組み合わせで刺激後、マウスにｓ．ｃ注射した。流入領域リンパ節および脾臓を５日後に取り出し、細胞を抗原（ＫＬＨ）で刺激し、サイトカイン産生を評価した。データは、抗原を用いてパルスしたＤＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞を誘導したことを明らかにした（図１３）。マウスに注射する前に、ＣｐＧおよび抗原で刺激中のＤＣへのｐ３８またはＣｏｘ−２阻害剤の添加は、ＤＣのＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞誘導能を強化する一方、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞を抑制した。ＥＲＫ阻害剤は、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制したが、Ｔｈ１細胞も抑制した。ＥＲＫ、ｐ３８およびＣｏｘ−２阻害剤の併用は、ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を完全に抑制するが、ＩＦＮ−ガンマ分泌性Ｔ細胞も減少させた。これらの所見は、ｐ３８およびＣｏｘ−２阻害剤がＴｈ１を強化し、アジュバントとしてのＴＬＲ作動薬と外来抗原に対するＴｒｅｇ細胞誘導を抑制する。ＥＲＫ阻害剤もまた、ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を抑制した。
【０２１８】
［実施例１１］  Ｃｏｘ−２阻害剤は、ＴＬＲ作動薬誘導性ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ産生を抑制し、自然ＩＬ−１２およびＩＬ−２７産生を強化する
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣｐＧ（１０μｇ）またはＣｐＧおよびＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（１００μｇ）のいずれかを側腹部に注射した。流入鼠径リンパ節を２および６時間後に取り出し、ふるいにかけ、ＰＢＳ１ｍｌに再懸濁した。細胞を取り出し、上清のＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した（図１４）。
【０２１９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣｐＧ（１０μｇ）のみまたは種々の濃度のＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（５、５０または５００μｇ）のどちらかを側腹部に注射した。６時間後、流入鼠径リンパ節を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞をホモジナイズし、得られたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＬ−２７およびＩＬ−１０の発現において分析し、ベータアクチン発現と比較した（図１５）。
【０２２０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来ＤＣをＣｐＧ（１０μｇ）および種々の濃度のＣｏｘ−２阻害剤ＮＳ−３９８とともに２４時間インキュベートした。上清を取り出し、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した（図１６）。
【０２２１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来ＤＣをＣｐＧ（１０μｇ）および種々の濃度のＣｏｘ−２阻害剤ＮＳ−３９８とともに２４時間インキュベートした。細胞をホモジナイズし、得られたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＬ−１０およびＩＬ−２７ｐ３８特異的プライマーを使用して分析し、ベータアクチン発現と比較した（図１７）。
【０２２２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来ＤＣをＣｐＧ（１０μｇ）または、１または１０μＭのＣｏｘ−２阻害剤ＮＳ−３９８とともに２４時間インキュベートした。細胞をホモジナイズし、得られたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５またはＩＬ−１２ｐ４０特異的プライマーを使用して分析し、ベータアクチン発現と比較した（図１８）。
【０２２３】
結果
本発明者らは、腫瘍細胞がＣｏｘ−２を発現し、腫瘍上清およびＣｐＧが自然免疫細胞のＣｏｘ−２発現を誘導することを見つけたため、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの樹状細胞からのＴＬＲ作動薬誘導性サイトカイン発現におけるＣｏｘ−２阻害剤の影響を検討した。マウスにＣｐＧのみ、またはＣｏｘ−２阻害剤とともに、ｓ．ｃ．で注射し、リンパ節を６時間後に取り出し、サイトカイン産生を評価した。ＣｐＧ注射は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの産生を誘導し、これは、Ｃｏｘ−２阻害剤の共投与により抑制された（図１４）。ＩＬ−１０ｍＲＮＡのＣｐＧ誘導性発現もまた、Ｃｏｘ−２阻害剤の共投与により、マウスにおいて抑制され、一方、ＩＬ−２７ｍＲＮＡ発現は強化された（図１５）。ＣｐＧを用いたＤＣのＩｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０の産生を誘導した。培養物へのＣｏｘ−２阻害剤の添加は、ＩＬ−１０を抑制し、ＩＬ−１２産生を強化した（図１６）。ＣｐＧもまた、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２７ｐ２８ｍＲＮＡの発現を誘導し、これは、Ｃｏｘ−２阻害剤の添加により強化された（図１７および１８）。対照的に、ＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現はＣｏｘ−２阻害剤により抑制された。これらの観察は、２つの別個のＣｏｘ−２阻害剤が、抗炎症性およびＴｒｅｇ促進性サイトカインの抑制能を有する一方、Ｔｈ１細胞の誘導を方向付ける制御性サイトカインを強化することを明らかにする。それゆえ、ＴＬＲ作動薬およびＣｏｘ−２阻害剤の併用は、ｉｎ  ｖｉｖｏで外来性抗原および腫瘍抗原に対する自然および適応エフェクター反応を刺激するための効果的な方法である。
【０２２４】
［実施例１２］  Ｃｏｘ−２阻害剤およびＣｐＧの併用治療は、腫瘍増殖を抑制する
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起させ、３、５および７日目にＣｐＧ（１０μｇ）、Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（１００μｇ）またはその両方の併用で腫瘍部位にｓ．ｃ．注射した。マウスの腫瘍増殖を定期的にモニターした（図１９）。
【０２２５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起させ、３、５および７日目にＣｐＧ（２０μｇ）、Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（５００μｇ）またはその両方の併用で腫瘍部位にｓ．ｃ．注射した。腫瘍の体積を定期的にモニターした（図２０）。
【０２２６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個の腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起させ、３、５および７日目にＣｐＧ（２０μｇ）、Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（５００μｇ）またはその両方の併用で腫瘍部位にｓ．ｃ．注射した。マウスの腫瘍および生存を定期的にモニターした（図２１）。
【０２２７】
結果
本発明者らは、マウス腫瘍モデルを使用して、Ｃｏｘ−２阻害剤を併用したＴＬＲ作動薬の治療効果を評価した。マウスを、Ｂ１６腫瘍を用いてｓ．ｃ．で惹起させ、未処置のまま、または３、５および７日目にＣｐＧ（１０μｇ）を、場合によりＣｏｘ−２阻害剤（セレコキシブ１００μｇ）とともに、あるいはＣｏｘ−２阻害剤のみで腫瘍部位にｓ．ｃ．注射した。Ｃｏｘ−２阻害剤のみの処置は、腫瘍増殖を強化し、ＣｐＧのみは、ほとんど効果がなかった（図１９）。しかし、ＣｐＧおよびＣｏｘ−２阻害剤の併用は、腫瘍増殖の著しい低下を生じた。これらの試験を、より高用量のＣｐＧ（２０μｇ）およびＣｏｘ−２阻害剤（５００μｇ）を使用して繰り返した。高用量のＣｐＧは、腫瘍増殖を低下させるが、防御効果は、Ｃｏｘ−２阻害剤の治療を併用した場合、顕著に改善された（図２０）。ＣｐＧのみまたはＣｏｘ−２阻害剤のみに比べ、ＣｐＧおよびＣｏｘ−２阻害剤の防御効果はまた、腫瘍非含有マウスの生存曲線および数から明らかに証明された（図２１）。未処置のマウスは、全て４５日以内に死亡し、ＣｐＧのみで処置したマウスは、全て５５日以内に死亡した。Ｃｏｘ−２阻害剤で処置したマウスの２０％は生存し、一方、ＣｐＧおよびＣｏｘ−２阻害剤で処置したマウスの４０％が生存した。
【０２２８】
［実施例１３］  Ｃｏｘ−２またはＥＲＫ阻害剤は、腫瘍に対する樹状細胞ワクチン接種の治療効果を強化する
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、３日目から腫瘍部位に１週間間隔で、処置されたＤＣ（１〜５×１０５個）を３回ｓ．ｃ．注射で処置した。ＤＣを熱ショックされ／照射されたＢ１６腫瘍細胞およびＣｐＧ（５μｇ／ｍｌ）のみまたはＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（５μＭ）もしくはＥＲＫ阻害剤ＵＯ１２６（５μＭ）のどちらかとともに２４時間パルスした。マウスの腫瘍増殖を定期的にモニターした（図２２）。１１匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を２×１０４個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、腫瘍惹起３、１０および１７日後に、処置されたＤＣ（１〜５×１０５個）を３回（腫瘍部位にｓ．ｃ．）注射で処置した。ＤＣをＨＳＰ−７０（５μｇ／ｍｌ）のみまたはＣｏｘ−２阻害剤ＮＳ３９８（５μＭ）との併用のどちらかで２４時間インキュベートした。マウスの腫瘍増殖および生存を定期的にモニターした。角括弧内の図は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ検定の有意差を表す（図２３）。
【０２２９】
骨髄由来ＤＣを培地のみ（対照）、ＨＳＰ７０ワクチン（５ｍｇ／ｍｌ）、Ｃｏｘ−２阻害剤ＮＳ３９８（５ｍＭ）、ＨＳＰ７０およびＣｏｘ−２阻害剤またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）でインキュベートした。２４時間後、細胞を抗ＣＤ８０およびＣＤ１１Ｃ抗体で標識し、細胞蛍光分析を行った。結果は、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ集団でゲートした細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す（図２４）。
【０２３０】
結果
癌におけるこれらの潜在的治療効果に加えて、ＴＬＲ作動薬は、アジュバント特性を有し、病原体または腫瘍抗原で誘導された免疫反応を強化する。ＴＬＲ作動薬ＣｐＧが自然細胞由来のＩＬ−１０産生を強化することができ、結果としてＴｒｅｇ細胞を誘導し、これは、癌または感染性疾患ワクチンの逆効果を生じる恐れがあることが示された。本発明者らは、驚くことに、これらがＣｏｘ−２またはＥＲＫ阻害剤の共投与により腫瘍ワクチンの効果を改良することができることを示した。腫瘍の免疫抑制環境により影響される（図１に示す）腫瘍抗原およびアジュバントを用いた直接免疫を使用するよりむしろ、本発明者らの手法は、阻害剤を場合により有するＣｐＧの存在下において抗原でパルスした樹状細胞を使用することであった。本発明者らは、全細胞腫瘍ワクチンとして熱ショックされ、照射されたＢ１６細胞を使用し、これをＣｏｘ−２またはＥＲＫ阻害剤の存在下または非存在下においてＤＣおよびＣｐＧとともにインキュベートした。ＣｐＧ存在下において腫瘍抗原でパルスされた樹状細胞の治療的免疫化は腫瘍増殖に影響しなかった（図２２）。しかし、Ｃｏｘ−２またはＥＲＫ阻害剤の存在下においてＢ１６抗原およびＣｐＧでパルスしたＤＣを用いた免疫化は、腫瘍増殖の速度を顕著に遅延させた。
【０２３１】
本発明者らは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−７０ワクチンを用いた治療的免疫化の効果におけるＣｏｘ−２阻害剤の影響もまた検討した。
【０２３２】
このＢ１６腫瘍からの精製により調製されたＨＳＰ−７０ワクチンは、マウスのＢ１６腫瘍に対して予防的免疫化に効果があることを以前に示しているが、増殖している腫瘍を有するマウスの治療に投与された場合ほとんど効果がなかった。本明細書において、本発明者らは、Ｃｏｘ−２阻害剤の存在下または非存在下においてＨＳＰ−７０ワクチンで樹状細胞をパルス後、Ｂ１６腫瘍惹起３、１０および１７日後に細胞を移入した。Ｃｏｘ−２阻害剤のみでパルスしたＤＣの投与は、防御効果がなかった（図２３）。さらに、ＨＳＰ−７０ワクチンのみでパルスしたＤＣを用いた免疫化は、パルスしなかったＤＣの投与により示されたものに比べマウスの生存または腫瘍非含有マウスの数を強化しなかった。しかし、Ｃｏｘ−２阻害剤の存在下においてＨＳＰ−７０ワクチンでパルスしたＤＣを用いて治療的に免疫化したマウスにおいて、腫瘍非含有動物の数が最も多く（７７％）および生存率が最も高かった（７７％）。これらの所見は、Ｃｏｘ−２阻害剤およびＨＳＰ−７０ワクチンの併用がどちらかのみの治療に比べ癌治療の効果を顕著に改善したことを明らかにした。
【０２３３】
ＤＣ活性化におけるＣｏｘ−２およびＨＳＰ７０の効果の検討は、Ｃｏｘ−２のみまたはＨＳＰ７０のみのどちらもＣＤ８０発現を強化しなかったが、一方、併用により、ＬＰＳで実現したものと同一濃度のＣＤ８０平均蛍光強度が顕著に強化された（図２４）。これらの所見は、ＨＳＰ７０およびＣｏｘ−２阻害剤の併用が樹状細胞を成熟させ、どちらかの分子のみでは認められなかった効果を示唆する。
【０２３４】
［実施例１４］  ＥＲＫ、Ｃｏｘ−２またはｐ３８の阻害は、樹状細胞のＴＬＲ作動薬誘導性ＰＧＥ２を抑制する
材料および方法
骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）をＣｐＧ（５μｇ）またはＥＲＫ阻害剤、Ｕ０１２６（５μＭ）またはその両方でｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間刺激した。上清を取り出し、ＰＧＥ２濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＡＮＯＶＡによるＣｐＧ＋ｐ３８阻害剤対ＣｐＧ  ＊＊ｐ＜０．０１（図２５）。
【０２３５】
骨髄由来ＤＣをＣｐＧ（５μｇ）のみまたはＣｏｘ−２阻害剤であるＮＳ−３９８の存在下において刺激した。２４時間後、上清を取り出し、ＰＧＥ２濃度（図２６（ａ））をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＡＮＯＶＡによるＣｐＧ＋ｐ３８阻害剤対ＣｐＧ  ＊ｐ＜０．０５。
【０２３６】
骨髄由来ＤＣを熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞で４時間処置後、ＣｐＧ（５μｇ）、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭ）またはその両方で２４時間刺激した。上清を取り出し、ＰＧＥ２濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＡＮＯＶＡによるＣｐＧ＋ｐ３８阻害剤対ＣｐＧ  ＊ｐ＜０．０５（図２７）。
【０２３７】
結果
図２５は、ＥＲＫ活性化の抑制が樹状細胞によるＣｐＧ誘導性ＰＧＥ２産生を反転させることを示す。
【０２３８】
図２６（ａ）は、Ｃｏｘ−２産生の抑制が樹状細胞によるＣｐＧ誘導性ＰＧＥ２産生を反転させることを示す。
【０２３９】
図２７は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化の抑制が樹状細胞によるＣｐＧ誘導性ＰＧＥ２産生を反転させることを示す。
【０２４０】
［実施例１５］  Ｃｏｘ−２阻害剤は、樹状細胞によるＴＬＲ作動薬誘導性ＩＬ−１０産生を抑制する
材料および方法
骨髄由来ＤＣをＣｐＧ（５μｇ）のみまたはＣｏｘ−２阻害剤であるＮＳ−３９８の存在下において刺激した。２４時間後、上清を取り出し、ＩＬ−１０の濃度（図２６（ｂ））をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＡＮＯＶＡによるＣｐＧ＋ｐ３８阻害剤対ＣｐＧ  ＊ｐ＜０．０５。
【０２４１】
結果
図２６（ｂ）は、Ｃｏｘ−２産生の抑制が樹状細胞によるＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０産生を反転させることを示す。
【０２４２】
［実施例１６］  ｐ３８の阻害は、腫瘍細胞ワクチンおよびＴＬＲ作動薬で刺激された樹状細胞により、ＩＬ−１０を抑制し、ＩＬ−１２産生を強化する
材料および方法
骨髄由来ＤＣを、４時間、熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞で４時間処置後、ＣｐＧ（５μｇ）、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭ）またはその両方で刺激した。上清を２４時間後に取り出し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。ＡＮＯＶＡによるＣｐＧ＋ｐ３８阻害剤対ＣｐＧ  ＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０２４３】
結果
図２８は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化の抑制が、樹状細胞によるＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０を反転させる一方、ＩＬ−１２産生を強化することを示す。ＩＬ−２３産生は、ｐ３８阻害剤により影響されなかった。
【０２４４】
［実施例１７］  ｐ３８の阻害は、樹状細胞ワクチンならびに腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスした樹状細胞の治療効果を強化する
材料および方法
骨髄由来ＤＣを、４時間、熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞で４時間処置後、培地のみまたはｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（５μＭ）で２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いて皮下（ｓ．ｃ．）で惹起し、惹起後３、１０および１７日目に腫瘍部位に注射により５×１０５個のＤＣで処置した。腫瘍増殖を定期的にモニターした。結果は、個々のマウスの腫瘍の体積を表す（図２９）。
【０２４５】
骨髄由来ＤＣを、４時間、熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞で４時間処置後、ＣｐＧ（５μｇ）のみまたはｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（５μＭ）の存在下で２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞でｓ．ｃ．で惹起し、惹起後３、１０および１７日目に腫瘍部位に注射により５×１０５個のＤＣで処置した。腫瘍増殖を定期的にモニターした。結果は、個々のマウスの腫瘍の体積を表す（図３０）。
【０２４６】
骨髄由来ＤＣを、熱ショックされ／照射されたＢ１６細胞で４時間処置後、培地のみ、ＣｐＧ（５μｇ）、ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭ）またはｐ３８阻害剤のみで２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞でｓ．ｃ．で惹起し、惹起後３、１０および１７日目に腫瘍部位に注射により５×１０５個のＤＣで処置した。マウスの生存を定期的にモニターした。括弧内の数字は、対照群に対する統計的有意差を表す（図３１）。
【０２４７】
結果
図２９は、ｐ３８阻害剤が、全腫瘍死細胞で活性化された樹状細胞を含む腫瘍ワクチンの防御効果を強化することを示す。
【０２４８】
図３０は、ｐ３８阻害剤が、ＴＬＲ作動薬ＣｐＧの存在下において全腫瘍死細胞で活性化した樹状細胞を含む腫瘍ワクチンの防御効果を強化することを示す。
【０２４９】
図３１は、ｐ３８阻害剤が全腫瘍死細胞のみで、またはＴＬＲ作動薬ＣｐＧの存在下において活性化された樹状細胞を含むワクチンの治療的投与後のマウスの生存を強化することを示す。
【０２５０】
［実施例１８］  全腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスした樹状細胞を用いた治療は、腫瘍におけるＴ細胞のＩＦＮ−ガンマ産生を強化する
材料および方法
骨髄由来ＤＣを、熱ショックされ／照射されたＢ１６腫瘍細胞で４時間処置後、培地のみまたはＣｐＧ（５μｇ）で２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、惹起後３および１０日目に腫瘍部位に注射により５×１０５個のＤＣで処置した。
【０２５１】
腫瘍を１５日目に抽出し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内ＩＬ−１７およびＩＦＮ−ガンマを、ＦＡＣＳを使用して免疫蛍光分析により決定した。
【０２５２】
結果
図３２は、ｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスへの腫瘍死細胞およびＣｐＧでパルスした樹状細胞の治療的投与が増殖している腫瘍におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋T細胞により産生されるＩＦＮ−ガンマの頻度を強化することを示す。
【０２５３】
［実施例１９］  Ｂ１６ワクチン、ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤で処置した樹状細胞を用いた治療がＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を強化するが、腫瘍塊内の制御性Ｔ細胞の頻度を低下させる
材料および方法
骨髄由来ＤＣを、熱ショックされ／照射されたＢ１６腫瘍細胞で４時間処置後、培地のみ、ＣｐＧ（５μｇ）、ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭ）またはｐ３８阻害剤のみで２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、惹起後３および１０日目に腫瘍部位に注射により５×１０５個のＤＣで処置した。腫瘍を１５日目に抽出し、腫瘍塊内のＣＤ４＋（Ａ）およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（Ｂ）の割合を、特異的抗体を用いた免疫蛍光分析により決定し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０２５４】
結果
図３３は、ｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスに、腫瘍死細胞およびＣｐＧとともにｐ３８阻害剤でパルスした樹状細胞の治療的投与が、増殖している腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞の動員を強化し、Ｆｏｘｐ３を発現している制御性Ｔ細胞の動員を抑制することを示す。
【０２５５】
［実施例２０］  ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤の経腫瘍（ｐｅｒｔｕｍｏｕｒａｌ）注射が生存を増加する
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、ＣｐＧ（２５μｇ）、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５０μｇ）またはその両方を惹起後３、５および７日目に腫瘍部位に注射した。マウスの生存を定期的にモニターした。
【０２５６】
結果
図３４は、ｐ３８阻害剤の存在下におけるＣｐＧの治療的投与がＣｐＧまたはｐ３８阻害剤のみでの治療後に認められたものに比べｓ．ｃ．Ｂ１６腫瘍を有するマウスの生存を強化することを示す。
【０２５７】
［実施例２１］  ｐｌ３Ｋ阻害剤は、腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスした樹状細胞の治療効果を強化し、増殖している腫瘍を有するマウスの生存の強化を導く
材料および方法
骨髄由来ＤＣを、最初に、熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで４時間パルス後、ＣｐＧ（５μｇ／ｍｌ）のみまたはｐｌ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニン（２．５μＭ）とともに２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、惹起後３、１０および１７日目に５×１０５個の処置されたＤＣを腫瘍部位に注射した。腫瘍増殖を定期的にモニターし、各群の平均をプロットした（図３５）。
【０２５８】
骨髄由来ＤＣを、最初に、熱ショックされ、照射されたＢ１６腫瘍細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで４時間パルス後、ＣｐＧ（５μｇ／ｍｌ）のみまたはｐｌ３キナーゼ（ｐｌ３Ｋ）阻害剤ウォルトマンニン（２．５μＭ）とともに２４時間刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、惹起後３、１０および１７日目に５×１０５個の処置されたＤＣを腫瘍部位に注射した。生存において、腫瘍増殖を定期的にモニターした（図３６）。
【０２５９】
結果
結果は、Ｐｌ３キナーゼの存在下において腫瘍死細胞およびＣｐＧでパルスしたＤＣの治療的投与が、腫瘍細胞およびＣｐＧまたはｐｌ３Ｋ阻害剤のみでパルスしたＤＣに比べ、治療効果が大きかったことを示す（図３５）。さらにＰｌ３キナーゼの存在下において腫瘍死細胞およびＣｐＧでパルスしたＤＣの治療的投与が、腫瘍細胞およびＣｐＧまたはｐｌ３Ｋ阻害剤のみでパルスしたＤＣでの治療後に認められたものに比べｓ．ｃ．Ｂ１６腫瘍を有するマウスの生存を強化した（図３６）。
【０２６０】
［実施例２２］  アジュバントとしてのＣｐＧと併用するｐ３８阻害剤は、無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンの防御効果を強化する
材料および方法
マウスを無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチン（ＪＮＩＨ−３；ＦＨＡおよび無毒化されたｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素を含む）０．０２ヒト用量のみを用いて、あるいはＣｐＧ（５μｇ）またはＣｐＧおよびｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（５０μＭ）存在下において、２回（０および４週）腹腔内（ｉ．ｐ．）で免疫した。マウスを２週間後にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのエアロゾルで惹起した。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染は、惹起後０、３、７、１４および２１日目にマウス４匹の群の肺におけるＣＦＵ計数により追跡した。肺を無菌で取り出し、氷上で、１％カゼインを有する滅菌生理食塩水１ｍｌ中でホモジナイズした。個々の肺の未希釈および段階希釈したホモジネート（１００μｌ）をＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ寒天プレートに３回スポットし、３７℃にて５日間のインキュベーション後にＣＦＵ数を算出した。検出限界は、およそ０．６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／肺であった。
【０２６１】
結果
図３７は、低用量の無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンは、アジュバントとしてＣｐＧを添加した時でも、マウスにおける防御性が低いが、ｐ３８阻害剤の共投与が防御効果を顕著に強化することを示す。ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤の存在下においてワクチンで免疫されたマウスの肺のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓＣＦＵは、顕著に低下した。
【０２６２】
［実施例２３］  アジュバントとしてＣｐＧを配合された無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンに対する反応において、ｐ３８阻害剤は、ＩＦＮ−ガンマを強化し、ＩＬ−１０を低下する
材料および方法
マウスを無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチン（ＦＨＡおよび無毒化されたｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素を含むＪＮＩＨ−３）０．０２ヒト用量のみを用いて、あるいはＣｐＧ（５μｇ）またはＣｐＧおよびｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５０μＭ）の存在下において２回（０および４週）非経口により免疫した。マウスを２週間後にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのエアロゾルで惹起した。惹起前後に取り出された脾臓単核細胞（２×１０６個／ｍｌ）をＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の精製線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）またはＰＭＡ（２５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）および抗マウスＣＤ３（１μｇ／ｍｌ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、米国）とともに、あるいは陰性対照として培地のみを用いて３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。上清を７２時間後に取り出し、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマ濃度を２部位ＥＬＩＳＡ法により決定した（図３８）。
【０２６３】
マウスを無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチン（ＦＨＡおよび無毒化されたｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素を含むＪＮＩＨ−３）のみあるいはＣｐＧ（５μｇ）またはＣｐＧおよびｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（５０μＭ）の存在下において２回（０および４週）ｉ．ｐ．免疫した。マウスを２週間後にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのエアロゾルで惹起した。惹起１４日後に取り出された脾臓単核細胞（２×１０６個／ｍｌ）をブレファルジンＡの存在下において、ＰＭＡ（２５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。４時間後、細胞内ＩＬ−１０を、特異的抗体を使用して免疫蛍光分析により決定し、ＦＡＣＳにおいて分析した（図３９）。
【０２６４】
結果
結果は、ｐ３８阻害剤が、アジュバントとしてのＣｐＧとともに無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンで免疫後のＩＦＮ−ガンマを強化し、ＩＬ−１０反応を低下させたことを示した（図３８および図３９）。
【０２６５】
［実施例２４］  アジュバントとしてＣｐＧを配合された無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンへのｐ３８阻害剤の添加は、マウスのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ惹起後の局所ＩＬ−１ベータを強化する
材料および方法
マウスを非細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチン（ＦＨＡおよび無毒化されたｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素を含むＪＮＩＨ−３）のみあるいはＣｐＧ（５μｇ）またはＣｐＧおよびｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５０μＭ）の存在下において２回（０および４週）ｉ．ｐ．免疫した。マウスを２週間後にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのエアロゾルで惹起した。惹起４時間後に肺を取り出し、ホモジナイズし、ＩＬ−１ベータ濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。
【０２６６】
結果
図４０は、ワクチン接種中のｐ３８の阻害が免疫化マウスのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ惹起後の局所炎症性反応を強化することを示す。アジュバントとしてＣｐＧを配合された無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンへのｐ３８阻害剤の添加は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ惹起後の肺の局所ＩＬ−１ベータを強化した。
【０２６７】
［実施例２５］  腫瘍ワクチン、ＴＬＲ作動薬およびｐ３８阻害剤を用いた治療的免疫化は、マウスのＢ１６腫瘍増殖を低下させる
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、ベヒクルのみ（未処置）、熱ショックされ照射されたＢ１６腫瘍細胞（１×１０６個）のみまたはＣｐＧ（１０μｇ）とともに、あるいはＣｐＧおよびｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（５０μｇ）とともに、惹起後３、５および７日目に腫瘍部位に注射した。マウスの腫瘍増殖を定期的にモニターした。
【０２６８】
結果
結果（図４１）は、ｐ３８阻害剤の存在下においてアジュバントとしてＣｐＧを有する死腫瘍ワクチンを用いた治療的免疫が、Ｂ１６ワクチンのみまたはＢ１６ワクチンおよびＣｐＧによる治療後に認められたものに比べｓ．ｃ．Ｂ１６腫瘍を有するマウスの生存を強化することを示す。
【０２６９】
［実施例２６］  ＩＬ−１０欠損マウスにおいて、腫瘍増殖は、顕著に悪化しない
Ｃ５７ＢＬ／６またはＩＬ−１０欠損マウスを２×１０５個のＢ１６腫瘍細胞を用いてｓ．ｃ．で惹起し、１７日後に腫瘍径を評価した。結果は、マウス５匹／群における平均の腫瘍の体積である。
【０２７０】
結果
結果（図４２）は、腫瘍増殖がＩＬ−１０欠損マウスにおいて顕著に悪化しないことを示す。それゆえ、ＩＬ−１０は、抗炎症性反応の媒介における、単独のメディエーターではないことを示す。
【０２７１】
本明細書において参照した全ての文書は、参照として本明細書に組み込まれる。当業者には、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の記載された実施例の種々の修正および変更が明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関して記載しているが、請求項に記載される本発明が、このような具体的な実施形態に過度に制限されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の修正は、本発明により包含されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】図１は、ＣＴ２６腫瘍細胞がバイスタンダー抗原に対するＴ細胞の増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することを示す。
【図２】図２は、ＣＴ２６腫瘍細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＧＦ−ベータを、およびｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１０を分泌することを示す。
【図３】図３は、腫瘍に浸潤しているＴ細胞の、強化されたＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよびＦｏｘｐ３ｍＲＮＡ発現を示す。
【図４−１】図４は、腫瘍部位のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０産生を示す。
【図４−２】図４は、腫瘍部位のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１０産生を示す。
【図５】図５は、腫瘍上清が樹状細胞およびマクロファージのＣｏｘ−２発現を誘導することを示す。
【図６】図６は、ＣｐＧがＤＣおよび腹腔マクロファージのＣｏｘ−２発現を誘導することを示す。
【図７】図７は、Ｔｈ１促進性ＴＬＲリガンドが、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞も誘導することを示す。
【図８−１】図８は、ＴＬＲリガンドが制御性Ｔ細胞の誘導を促進することを示す。
【図８−２】図８は、ＴＬＲリガンドが制御性Ｔ細胞の誘導を促進することを示す。
【図９】図９は、ＴＬＲリガンドがＤＣ由来のＩＬ−１０およびＩＬ−１２産生を刺激することを示す。
【図１０−１】図１０は、ＤＣのＴＬＲリガンド誘導性ＩＬ−１０産生がＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化を介して媒介されることを示す。
【図１０−２】図１０は、ＤＣのＴＬＲリガンド誘導性ＩＬ−１０産生がＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化を介して媒介されることを示す。
【図１０−３】図１０は、ＤＣのＴＬＲリガンド誘導性ＩＬ−１０産生がＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化を介して媒介されることを示す。
【図１１】図１１は、ｐ３８阻害剤のみまたはＥＲＫ阻害剤との併用がＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０を抑制する一方、ＩＬ−１２産生を増加させることを示す。
【図１２】図１２は、ｐ３８のみ、またはＥＲＫ阻害剤と併用の、外来抗原およびＣｐＧで刺激された樹状細胞への添加が、Ｔｈ１の誘導能を強化し、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制することを示す。
【図１３】図１３は、ｐ３８、ＥＲＫおよびＣｏｘ−２阻害剤の、外来抗原およびＣｐＧで刺激された樹状細胞への添加が、Ｔｈ１の誘導能を強化し、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞の誘導を抑制することを示す。
【図１４】図１４は、Ｃｏｘ−２の阻害がｉｎ  ｖｉｖｏのＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを抑制することを示す。
【図１５】図１５は、Ｃｏｘ−２の阻害がＣｐＧ誘導性ＩＬ−２７ｍＲＮＡを強化する一方、流入領域リンパ節のＩＬ−１０ｍＲＮＡを低下させることを示す。
【図１６】図１６は、Ｃｏｘ−２の阻害がＣｐＧ誘導性ＩＬ−１０を抑制する一方、ＤＣによるＩＬ−１２ｐ４０産生を増加させることを示す。
【図１７】図１７は、Ｃｏｘ−２の阻害がＣｐＧ誘導性ＩＬ−２７ｍＲＮＡを強化する一方、ＤＣのＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現を低下させることを示す。
【図１８】図１８は、Ｃｏｘ−２の阻害がＣｐＧ誘導性ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡ発現を強化する一方、ＤＣのＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現を低下させることを示す。
【図１９】図１９は、Ｃｏｘ−２阻害剤およびＣｐＧの併用による治療が腫瘍増殖を低下させることを示す。
【図２０】図２０は、Ｃｏｘ−２阻害剤が腫瘍増殖におけるＣｐＧの治療効果を強化することを示す。
【図２１】図２１は、Ｃｏｘ−２阻害剤およびＣｐＧの併用治療が腫瘍惹起後のマウスの生存を強化することを示す。
【図２２】図２２は、Ｃｏｘ−２またはＥＲＫ阻害剤が、樹状細胞腫瘍ワクチンの治療効果を強化することを示す。
【図２３】図２３は、Ｃｏｘ−２阻害剤が、樹状細胞ＨＳＰ−７０ワクチンの治療効果を強化することを示す。
【図２４】図２４は、Ｃｏｘ−２阻害剤およびＨＳＰ７０ワクチンの併用がＤＣ上のＣＤ８０発現を強化することを示す。
【図２５】図２５は、ＥＲＫの阻害が樹状細胞のＴＬＲ作動薬誘導性ＰＧＥ２を抑制することを示す。
【図２６】図２６は、Ｃｏｘ−２阻害剤が樹状細胞によるＴＬＲ作動薬誘導性ＰＧＥ２およびＩＬ−１０産生を抑制することを示す。
【図２７】図２７は、ｐ３８の阻害がＣｐＧ誘導性ＰＧＥ２産生を低下させることを示す。
【図２８−１】図２８は、ｐ３８の阻害が腫瘍ワクチンおよびＴＬＲ作動薬で刺激された樹状細胞によるＩＬ−１０を抑制し、ＩＬ−１２産生を強化することを示す。
【図２８−２】図２８は、ｐ３８の阻害が腫瘍ワクチンおよびＴＬＲ作動薬で刺激された樹状細胞によるＩＬ−１０を抑制し、ＩＬ−１２産生を強化することを示す。
【図２９】図２９は、ｐ３８の阻害が樹状細胞ワクチンの治療効果を強化することを示す。
【図３０−１】図３０は、ｐ３８の阻害が腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスされた樹状細胞の治療効果を強化することを示す。
【図３０−２】図３０は、ｐ３８の阻害が腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスされた樹状細胞の治療効果を強化することを示す。
【図３１】図３１は、ｐ３８阻害剤の存在下において、腫瘍細胞ワクチンでパルスされた樹状細胞ワクチンの治療投与後のマウスの生存が強化したことを示す。
【図３２】図３２は、全腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスされた樹状細胞を用いた治療が腫瘍のＴ細胞ＩＦＮ−ガンマ産生を強化することを示す。
【図３３−１】図３３は、Ｂ１６ワクチン、ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤で処置された樹状細胞を用いた治療がＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を強化するが腫瘍塊内の制御性Ｔ細胞の頻度を低下させることを示す。
【図３３−２】図３３は、Ｂ１６ワクチン、ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤で処置された樹状細胞を用いた治療がＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を強化するが腫瘍塊内の制御性Ｔ細胞の頻度を低下させることを示す。
【図３４】図３４は、ＣｐＧおよびｐ３８阻害剤の経腫瘍性注射が生存を高めることを示す。
【図３５】図３５は、ｐｌ３Ｋ阻害剤が腫瘍ワクチンおよびＣｐＧでパルスされた樹状細胞の治療効果を強化することを示す。
【図３６】図３６は、腫瘍ワクチン、ＣｐＧおよびｐｌ３キナーゼ阻害剤でパルスされた樹状細胞の移入が増殖している腫瘍を有するマウスの生存を強化することを示す。
【図３７】図３７は、アジュバントとしてのＣｐＧと併用するｐ３８阻害剤が無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンの防御効果を強化することを示す。
【図３８】図３８は、ｐ３８阻害剤は、アジュバントとしてＣｐＧを配合した無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンに対する反応においてＩＦＮ−ガンマを強化し、ＩＬ−１０を低下させることを示す。
【図３９】図３９は、アジュバントとしてＣｐＧを配合した無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンに対する反応においてｐ３８阻害剤がＩＬ−１０を低下させることを示す。
【図４０】図４０は、アジュバントとしてＣｐＧを配合した無細胞ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンへのｐ３８阻害剤の添加が、マウスのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ惹起後に局所ＩＬ−１ベータを強化することを示す。
【図４１】図４１は、腫瘍ワクチン、ＴＬＲ作動薬およびｐ３８阻害剤を用いた治療的免疫がマウスにおけるＢ１６腫瘍増殖を低下させることを示す。
【図４２】図４２は、腫瘍増殖がＩＬ−１０欠損マウスにおいて顕著に悪化しないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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