(57)【要約】  抗ウイルス性局所投与用ゲル製剤は、ゲルキャリア媒体中にループ利尿薬及び強心配糖体の少なくとも一つを含み、同製剤は、利尿剤及び配糖体の少なくとも一つの経皮送達を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルキャリア媒体中に利尿剤及び強心配糖体のうちの少なくとも一つを含む抗ウイルス局所ゲル製剤であって、前記製剤は、前記利尿剤及び前記強心配糖体のうちの少なくとも一方の経皮送達が可能である、製剤。
【請求項２】
前記利尿剤及び前記強心配糖体のうちの少なくとも一方を、表皮基底部の角質層を介して経皮送達可能である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記利尿剤及び前記強心配糖体のうちの少なくとも一方は、経皮吸収可能である、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ゲル媒体の送達機能は、細胞間経路、細胞内経路及びシャント経路のうちの少なくとも一つである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
密封包帯、コーティング又はその他の層と組み合わせられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
少なくとも一つのループ利尿剤が少なくとも一つの強心配糖体との組み合わせにて存在している、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
前記ループ利尿剤が、フロセミド、ブメトラニド、エタクリン酸及びトラゼミドのうちの一つ以上を含む、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
前記利尿剤はフロセミドである、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記強心配糖体は、ジゴキシン、ジギトキシン、メディゴキシン、ラナトシドＣ、プロスシラリジン、ｋストロファンチン、ペルボサイド及びウワバインのうちの一つ以上を含む、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記強心配糖体はジゴキシンである、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記利尿剤及び強心配糖体のうちの少なくとも一方のバイオアベイラビリティは、例えば、０．１乃至５０μｇ／ｃｍ２／時間、好ましくは０．２乃至４０μｇ／ｃｍ２／時間、より好ましくは０．５乃至３０μｇ／ｃｍ２／時間、最も好ましくは１乃至２０μｇ／ｃｍ２／時間における定常状態のフラックスを提供するものである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ゲル媒体は、二相媒体が構造化されたマトリックスであり、主として液相を有する半固形媒体中に配糖体粒子及び利尿剤粒子のうちの少なくとも一方を、増粘剤と共に、若しくは増粘剤を含まない状態にて、含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
皮膚耐性及び角質溶解性のうちの少なくとも一方である、少なくとも一つの賦形剤を更に含む、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
前記賦形剤は、５乃至３０質量％の範囲、好ましくは１０乃至２５質量％の範囲、より好ましくは１５乃至２５質量％の範囲、最も好ましくは約２０質量％の量の尿素を含む、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
前記ゲルキャリア媒体は共溶媒混合物からなる、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記強心配糖体：利尿剤のモル比は、０．１〜１０：３０〜０．１の範囲、好ましくは０．２〜５：２０〜０．２の範囲、より好ましくは０．５〜２．５：２０〜０．５の範囲、最も好ましくは、１：１４〜１のような０．５〜１．５：２０〜１０の範囲である、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
前記ゲルキャリア媒体は、
ｉ）プロピレングリコールのようなアルキレングリコールと、
ｉｉ）水と、
ｉｉｉ）４個までの炭素原子を有するアルカノールのような一水酸基を有するアルカノールと、
ｉｖ）ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールと、
のうちの少なくとも一つを含む、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
請求項１７に記載の成分（ｉ）乃至（ｉｖ）のうちの二つ以上が存在している、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
請求項１７に記載の成分（ｉ）乃至（ｉｖ）のうちの三つ又は四つが存在している、請求項１７又は１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前記成分（ｉ）の量は存在している場合には４０乃至７０体積％の範囲であり、前記成分（ｉｉ）の量は存在している場合には約４０体積％までの範囲であり、前記成分（ｉｖ）の量は存在している場合には約４０体積％までの範囲であり、体積にて表現されている％量は、全製剤の百分率として個々の成分の体積に基づいている、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記（ｉｖ）ポリエチレングリコールは、１００乃至１０００の範囲、好ましくは１５０乃至８００の範囲、より好ましくは２００乃至６００の範囲、最も好ましくは約４００のような３００乃至５００の範囲の平均分子量にて存在している、請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
前記キャリア媒体は、（ｉ）プロピレングリコール、（ｉｉ）滅菌水及び（ｉｉｉ）尿素を含む、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記ゲルキャリア媒体は、（ｉ）プロピレングリコール、（ｉｉ）滅菌水及び（ｉｉｉ）エタノールを含む、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
４００の範囲の平均分子量の（ｉｖ）ポリエチレングリコールを更に含む、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
ｐＨが７未満である、請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
ｐＨが６未満である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
ｐＨが３以下であり、好ましくは４以下であり、最も好ましくは５以下である、請求項１乃至２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
前記製剤は、一つ以上の（ｖｉ）増粘剤を含む、請求項１乃至２７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２９】
前記増粘剤は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ若しくはＵｌｔｒｅｚのようなカルボマー又はヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロース誘導体のうちの一つ以上を含む、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記増粘剤が存在しており前記製剤の全質量の５乃至１５質量％の量のヒドロキシプロピルセルロースからなる、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３１】
ｉ）アルキレングリコールと、
ｉｉ）水と、
ｉｉｉ）一水酸基を有するアルカノールと、を含み、選択的に
ｉｖ）ポリアルキレングリコールを含む、請求項１７乃至３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
（ｉｖ）ポリアルキレングリコールを含む、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３３】
ｉ）プロピレングリコールと、
ｉｉ）エタノールと、
ｉｉｉ）水と、を含み、選択的に
ｉｖ）２００乃至６００の範囲の平均分子量のポリエチレングリコールを含む、請求項３１又は３２に記載の製剤。
【請求項３４】
２０乃至６０質量部の（ｉ）プロピレングリコールと、５乃至６０質量部の水と、１０乃至５０質量部のエタノールと、０乃至２０質量部の、２００乃至６００の範囲の平均分子量のポリエチレングリコールと、を含む、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
強心配糖体とループ利尿薬とのモル比は、ループ利尿薬が過剰のモルにて存在している、請求項３１乃至３４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
強心配糖体とループ利尿薬とのモル比は、１：１２〜１８のような１：１０〜２０の範囲である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記製剤の全質量に基づいて、０．５乃至５質量％の量にてカルボマー増粘剤を含む、請求項３０乃至３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
乳化剤、抗酸化剤、推進剤、着色剤、緩衝剤、保存剤及び接着剤のうちの少なくとも一つを更に含む、請求項１乃至３７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３９】
ＤＮＡウイルス感染症の治療に使用される、請求項１乃至３８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４０】
ヒトパピローマウイルス感染症、例えば、不顕性ＨＰＶ感染症、サブ臨床ＨＰＶ感染症、又は臨床ＨＰＶ感染症の治療に使用される、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４１】
イボの局所治療に使用される、請求項１乃至３９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４２】
ウイルスの細胞内カリウムイオンを低減又は枯渇して、ウイルスの複製を低減又は阻止するために使用される、請求項１乃至４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４３】
ＤＮＡウイルスを治療するために使用される薬剤の調製において使用される、請求項１乃至３８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４４】
前記ＤＮＡウイルスはヒトパピローマウイルスである、請求項４３に記載の製剤。
【請求項４５】
イボの局所投与に使用される薬剤の調製において使用される、請求項４３又は４４に記載の製剤。
【請求項４６】
細胞内カリウムイオンを低減又は枯渇するために使用する薬剤の調製において使用される、請求項４３乃至４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４７】
ＤＮＡウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法は、被検体に局所用組成物を適用する工程を含み、前記局所用組成物は請求項１乃至３８のいずれか一項に記載の製剤を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は局所製剤に関し、より詳細には、ウイルス感染症の治療に有用な局所製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、その生存を感染した宿主細胞に完全に依存する細胞内寄生体である。最も早くから知られている抗ウイルス薬は、癌の化学療法に使用されるような細胞毒性薬である。宿主細胞の代謝のこれらの阻害剤は、ウイルスのライフサイクルに対して有害な影響を有するであろうということが前提となっていた。非癌患者の場合、細胞毒性薬は宿主に対する毒性が強すぎて、それが有用とはなり得ず、その結果、抗ウイルスの治療にそれらを使用することは非常に制限されていた。
【０００３】
ウイルスに特有の代謝経路を標的とする医薬品はそれ以来研究されてきたが、わずかな成功を収めているのみである。そのような成功を収めた一つの医薬品、アシクログアノシン及びその誘導体が開発された。しかしながら、その臨床での有効性は、狭域のウイルス感染、例えばα−ヘルペスウイルス、に限られている。化学療法が効果を奏しない多くのウイルス感染症がヒトには存在している。
【０００４】
抗ウイルス化学療法は更に、薬物耐性の発生により妨害されている。単純ヘルペスウイルス感染症の治療に対してアヒクロビルを広範囲にて使用した結果、チミジンキナーゼ遺伝子及びポリメラーゼ遺伝子における突然変異を保持する耐性菌が容易に認められることになった。
【０００５】
本発明者らは、広域のウイルス感染症の治療に有用な製剤をここに開発した。薬剤耐性の発生が低いことは、一つの期待できる利点である。従来の抗ウイルス薬、ヌクレオシド類似体及びそれらの誘導体及びプロテーゼ阻害剤は、例えば、ウイルスの複製に必要な生合成と関連していた。しかしながら、本発明の製剤は、細胞内イオン濃度及びその分配を修飾し、かつウイルスＤＮＡ生合成の主要な共同因子を奪取することに別々に介在する。従って、本発明の製剤の適用及び使用において、正常細胞の機能は進行するがウイルスの再生は進行しない地点において宿主細胞の代謝が、意図的ではあるが最小限かつ可逆的に抑制する状態が存在する。
【０００６】
ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）感染症は、世界中において、最も流行している性感染病原性疾患の一つである。アメリカ合衆国のみにおいてさえも、毎年、約５５０万の新たな性器ＨＰＶ感染症の症例があると推定されている。
【０００７】
ヒトパピローマウイルスは、一群のＤＮＡ腫瘍ウイルスであり、ヒト上皮細胞の腫瘍性増殖を引き起こす。１２０を超えるＨＰＶの型が記述されているが、それらのうちの約三分の一は性的な接触を介して広がる。低リスク型ＨＰＶは、性器イボ、皮膚イボ及びイボ（足底イボ贅）のような状態を引き起こす。高リスク型ＨＰＶは、子宮頸部及び肛門部の異形成を引き起こし、可能性としては子宮頸部及び肛門性器の癌のような生命を脅かすような疾病を引き起こすこともある。
【０００８】
ＨＰＶは上皮組織に影響を与える過剰増殖性疾患の領域の発生の原因となる。
例えば、性器イボは、性的な接触を介して広がり、かつ非常に感染性が強い過剰増殖性疾患の一形態である。現在の治療法でも時としてそのイボを除去できるが、そのイボは多くの場合治療後３乃至６ヶ月以内に再び発生するので、その除去が永久的であることは稀である。より大きなイボが存在する場合、全身麻酔下における外科的な手術が必要となり得る。
【０００９】
ＨＰＶ感染症に対する現在の臨床的な治療は病巣の破壊を含む。これらの処置は外科用メス、レーザ、凍結、又は局所的及び／又は病巣内に適用される毒剤（トリクロロ酢酸、フェノール、サリチル酸、ポドフィリン、５−フルオロウラシル、非環状ヌクレオチド及びポドフィロックス）を用いた病巣の切除並びに光線力学療法を使用した切除を含む。
【００１０】
イミキモド及びインターフェロンのような免疫調整剤を局所投与することを含む更なる治療法も試みられてきたが、再発率は非常に高く（通常、５０％を超える）、多くの場合、不顕性感染が検出されず、かつ治療されないままにて進行する。これら不顕性感染は、例えば、環境中の発癌物質及び／又は共同因子、紫外線照射、ホルモン、創傷、免疫低下及びその他のＳＴＤ剤のような種々の健康が優れない場合に特徴的な事象及び作用物質により活性化され、新たな活性を有する臨床上の疾患を発生する。
【００１１】
痛みを伴い、かつ瘢痕を残すような現在の治療法では満足ではなく、特に、現在の治療法は数週間から数ヶ月を要するので、より効果的であり、かつ特異性がある医薬品の開発の緊急の必要性があることは明らかである。
【００１２】
口唇単純ヘルペスの最も広く使用されている抗ウイルス治療はアシクロビルである。しかしながら、局所治療でのアシクロビルの研究は、使用される製剤によってばらつきのある結果となっていた。アシクロビル及びその他ヌクレオシド類似体の治療コストは比較的高い。
【００１３】
ＨＰＶ菌株は、上皮における肉眼にて視認可能な裂傷を介する直接の接触により伝達され、感染部位である基底細胞に侵入する。ＨＰＶ菌株の多くは、イボとして臨床的には顕れる。
【００１４】
性器イボに有用な抗ウイルス治療のみのための、広く使用される局所的かつ有効な処方は存在していない。性器イボは、もっとも感染しやすい性感染症（ＳＴＩ）の一つである。これらの突出物はその他のクラスのイボとは臨床的に区別されており、効果的な治療方法が確立されていない。ＨＰＶはイボから離れた皮膚に感染する。
【００１５】
薬物耐性は免疫低下に苦しむ個人には特に大きな問題となりつつある。例えば、アヒクロビルは一つの代謝事象に作用するので、ウイルスは一つの遺伝子の突然変異にてこの医薬品の影響を克服することができ、そして（疾病又は誘導された薬物に起因する）免疫低下に苦しむ個人は、重篤かつ難治性の疾病の発生が特に起こりやすくなる傾向にある。耐性菌の発生はまた、高用量で連続的に抗ウイルス治療を行っている個人ではさらにより一般的に起こることである。現在の治療は、ＨＳＶ感染症を完全に根絶してはいない。
【００１６】
一般的な足底イボ及び性器イボの治療に使用可能な現在の選択肢は、広くは二つのグループに分けられる：即ち、１．感染した病巣を機械的に除去することを目的とする抗イボ療法、及び２．抗ウイルス剤の介在（根本的な原因を取り去るための直接又は間接的な介在）である。抗イボ療法は通常、大部分の非性器イボ及び幾らかの性器イボに対する一次療法である。外科的手術及び凍結療法のような非化学的な治療並びにポドフィリン、ポドフィロックス、ブレオマイシン、サリチル酸、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ビクロロ酢酸及びトリクロロ酢酸のような化合物を含む、患者に有用な種々の抗イボの選択肢が存在する。いかなる治療の目的も、周囲の健康な皮膚の損傷をできる限り少なくしながら、イボを取り除くことである。上述の作用物質の各々は、細胞を生存させた状態にてウイルスを死滅させるというよりはむしろ細胞もウイルスも破壊してしまうので、有害な影響を与えることになる。
【００１７】
イボの外科的な除去は病巣の迅速な除去を提供し、かつ高い反応率（奏功率）を提供する。しかしながら、この方法は、出血、瘢痕、及び細菌感染の可能性及び局所麻酔の必要性を含む幾らかの欠点を伴う。瘢痕は、最も小さな瘢痕でさえも患者に不快感を与える足底イボにおいては主たる問題である。凍結療法−即ち、個体炭酸又は液体窒素にて３０乃至６０秒間イボを凍結させることは、苦痛を伴い、水ぶくれを生ずる。
【００１８】
更に、凍結療法の完全な奏功率は外科的な手術ほど高くはなく、複数週間にわたって複数回の実施が多くの場合必要になる。
サリチル酸、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドのような非性器イボに利用できる細胞を破壊する複数の製品が存在し、同製品は感染した組織を軟化させ、かつ破壊する。サリチル酸は安全であり中程度の効果があり、しばしば選択される治療法であるが、刺激を伴い、かつ治療期間が長くなる（約３ヶ月）といった幾らかの欠点を有する。これは、患者のコンプライアンスにおいて実質的な影響を有する。
【００１９】
ポドフィロトキシン（ポドフィロックス）は、あまり一般的には使用されていない天然産物ポドフィリン溶液の活性成分である。それは、変異原であり、かつ再発率が高いことからあまり頻繁には使用されていない。ポドフィロトキシンは、性器イボのための自己投与用製剤として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）において承認されている二つの製剤のうちの一つである。この治療に伴う大きな問題点の一つは、イボの領域への応用が制限されることと、その崔奇形の可能性である。
【００２０】
要約すると、本発明の抗イボ治療は一連の効果を有する。一つの治療にて完全に有効であるものはなく、副作用とともに再発率も高い。
抗ウイルス療法は、裏に潜んだ感染を治療することを目的としており、それは抗イボ療法と比較してより理にかなった試みであると思われる。シドホビル、インターフェロン及び間接的にイミキモド、の全てがこの基準にあてはまる。イボの角質化された皮膚層を介して作用部位にこれらの化合物を送達するには限界が存在する。
【００２１】
シチジンの類似体であるシドホビルは全ての宿主のＤＮＡウイルスに対して活性を有し、ＨＰＶ疾病を治療する上で効果的であることが示されている。ＨＰＶ感染症におけるシドホビルの抗ウイルス効果は、アポトーシスの開始によるものであると考えられている（スネック（Ｓｎｏｅｃｋ）ら、２００１年）。この治療は、ＨＰＶ感染症に対しては現在許可されていないが、その全身的な毒性により許可されそうにはない。
【００２２】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、真核細胞におけるウイルス複製を妨害するタンパク質である。ＩＦＮの利点は、その免疫調整特性、抗ウイルス及び抗増殖特性にある。ＩＦＮは良性のイボに対する抗ウイルス薬としてのみ承認されている。ＩＦＮは診療所では日常的には使用されていない。アルフェロン（登録商標）は、１８歳以上の患者にて再発性の性器イボに対して病巣内注射される。それは、約１６６のアミノ酸を含み、１６０００乃至２７０００Ｄａの範囲のインターフェロンαから構成されており、その効果は局所投与用の剤型として制限されているが、それらに関連するひどい副作用といった面を克服するものであろう。
【００２３】
イミキモドはヒトにおいてインターフェロン及びサイトカインを産生する免疫応答調整剤である。臨床的な治験において、この薬物は効果及び安全性を示し、プラセボと比較した５％のイミキモドクリームを用いて、顕著な性器イボの消失が観察された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の発明者らは、ウイルスの再生を妨害し、かつ可能性としては阻止することにより、ＤＮＡウイルス感染症を治療する抗ウイルス局所ゲル製剤をここに発明した。好ましくは、同製剤は、広範囲のＤＮＡウイルス感染症の治療において使用され、その中には治療法が存在していないか、現在の治療法では薬物耐性が構築されてしまうヒトパピローマウイルスも含まれる。
【００２６】
本発明によれば、一態様において、ゲルキャリア媒体中に利尿剤及び強心配糖体のうちの少なくとも一方を含む抗ウイルス局所ゲル製剤が提供され、同製剤は同利尿剤及び強心配糖体のうちの少なくとも一方の経皮的送達が可能である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態は、添付した特許請求の範囲の従属請求項に表現されたものである。
利尿剤は、ループ利尿剤、チアジド利尿剤及び／又はスルホニル尿素からなる利尿剤の群から選択された一つ以上のものであり得る。
【００２８】
化学的には、５−（アミノスルホニル）−４−クロロ−２−［（２−フラニルメチル）アミノ］安息香酸として周知であるフロセミドは、Ｎａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ共輸送の阻害剤としても周知であるループ利尿薬である。腎不全による浮腫及び乏尿症に対して現在は投与されており、細胞膜を横断する塩素イオンの輸送を阻害することによりその生理学的効果を発揮する。ヘンレ係蹄上行脚の厚みのある領域は、その利尿効果の主たる作用部位であり、その機構は、厚みのある上行脚においてＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ−共輸送体と結合し、引き続きカリウム排泄を促進し、細胞内カリウムを枯渇した状態とする。
【００２９】
化学的には、３β−［Ｏ−２，６−ジデオキシ−β−Ｄ−リボ−ヘキソピラノシル−（１，４）−Ｏ−２，６−ジデオキシ−β−Ｄ−リボ−ヘキソピラノシル−（１，４）−２，６−ジデドキシ−β−Ｄ−リボ−ヘキソピラノシル］オキシ］−１２ｂ，１４ジヒドロオキシ−５β，１４β−カルド−２０（２２）−エノリドとして周知であるジゴキシンは、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）の葉から得られる強心配糖体である。それはステロイド核を含み、Ｃ１７位に活性に不可欠な不飽和ラクトンと、Ｃ３位に一つ以上の配糖体残基とを備えている。
【００３０】
ジゴキシンの薬理学的活性は、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＡＴＰａｓｅ酵素のαサブユニットの細胞質外面の部位に特異的に結合する能力に関係している（細胞内のナトリウム及びカリウムの濃度を調節する）。これは、細胞内のＮａ＋及びＫ＋の細胞活性輸送ポンプを選択的に阻害し、それによりナトリウム及びカルシウムの細胞内濃度を増大させ、細胞内カリウムの濃度を低減させる。心不全及び上室性不整脈において現在は投薬されている。経口的又は非経口的に投与される場合の臨床上の使用における一つの主要な問題点は、その治療範囲が狭いので、毒性に関係した吐き気及び嘔吐のような副作用の危険性が高いことである。
【００３１】
皮膚用製剤は、皮膚表面、皮膚区画内、又は適用部位に物理的に近接した位置にある関連領域に化合物を送達するようにデザインされた製剤として定義される。皮膚送達系は、高濃度の薬物を全身に分配することなく病的部位に送達することができるので、経口送達（最も一般的な投与経路）と比較して非常に有利である。しかしながら、皮膚を刺激する可能性及び効き目が現れるのが遅いといった欠点もしばしば観察される。本発明は、表皮の基底層に好ましくはジゴキシン及び／又はフロセミドの経皮吸収を可能にする皮膚用製剤を提供することを目的とする。吸収は化合物の生理化学的特性により主として決定されるが、同製剤は、化合物のフラックス（ｆｌｕｘ）を決定する上で重要な役割を果たし得る。
【００３２】
ゲルは、多くの場合小さな独立した粒子を含む材料であり、溶液中に豊富に含まれる半固体の性質の二つの成分系として定義される。一つの特徴的な性質は、固体のような性質を提供する「増粘剤即ち、粘度増強剤」と定義される連続的な構造体の存在である。典型的な極性ゲルにおいて、合成又は天然のポリマーは通常親水性の液体全体にわたって三次元のマトリックスを構築する。ゲルが小さな個々の粒子を含んでいる場合、同ゲルは二相系であり、一方、ゲルが個々の粒子を含んでいない場合、一相系と称される。二相系は、チキソトロピック、即ち、静止した状態では半固体であるが振盪すると液状化する傾向にある。一相系に対するゲル化剤即ち増粘剤として使用される典型的なポリマーは、天然ゴム、カラギーナン、寒天、ペクチンを含む一方、二相系は、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースのような半合成材料及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（カルボマー）及びＣａｂｏｓｉｌ（登録商標）のような合成ポリマーを含む。ゲルは、良好に透過物を放出する傾向にあり、それほど大きくない分子の比較的良好な拡散を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明が図示されるために、当業者にはより簡単に理解され、かつ容易に実施され、非限定的な実施例により純粋に添付した図面が参照される。
ヒトの皮膚の角質層が、局所に適用された薬剤からの経皮吸収における律速段階であることは広く認識されている。ウイルス性イボが広がっている皮膚領域の角質層は非常に異なっており、細胞内への脂質経路が制限された密に詰まった角質細胞から構成されている。それにより、可能性としてはより大きな薬物吸収速度制限能力を備えた角質層を形成する。
【００３４】
局所用製剤を処方化する場合の一つの試みとして、薬理学的な活性を伴わない（そして、皮膚親和性を有する）賦形剤を加えることによりバリア特性を化学的に改質する（バリアの効果を低減する）ことがある。
【００３５】
各々が異なるタイプの抗ウイルス製剤を用いる場合があるが、主たる目的は、作用部位（基底膜と推定する、同基底膜が角化細胞の複製部位であるから）に（相乗的に作用する）ジゴキシン及びフロセミドの両者を理想的には最小限の毒性で効果的な量にて送達可能な局所用製剤を処方化することにある。
【００３６】
これら２つの好ましい薬品は相乗的に作用し、主たる目的はそれらをともに効果を奏する比率にて送達する局所用ゲル製剤を提供することにある。これを達成する効果的な方法は、「均一な系」、即ち単一相製剤を使用することである。更に、構造的なマトリクス（例えばゲル）はより活性的な放出と、賦形剤の相互作用を最小限にすることを可能にする。ゲルの閉塞的な性質はまた、病巣をより効果的にコーティングすることを助ける。
【００３７】
広範囲にわたり利用可能な局所用製剤の賦形剤が存在するが、以下の要因を考慮して好ましいものを選択した。
１．通常の賦形剤の角質溶解活性の程度。
２．ケラチンの「膨潤」の影響。
３．両方の活性成分が水に比較的不溶性であることを考慮した、溶媒中での同活性成分の相対溶解度（比較的低濃度にて熱動力学的活性を高く維持し、よって効果を維持しながらも最小限の毒性を維持すること）。
【００３８】
尿素（ＢＰ、ＥＰ、ＵＳＰ）
尿素はエモリエント剤において一般的に使用され、２乃至２０％の濃度にて角質層の水和が増大し、２０％で角質溶解性になることが示されている。
【００３９】
幾らかの好ましい実施形態において、尿素は２０％にてゲルに加えられ、よって角質層の水和（膨潤における更なる効果）を提供する一方で、緩和な角質溶解効果を同時に与える。
【００４０】
孔を水和することにより、角質層における開口部を介して活性成分の移動を促進し得る。この賦形剤を加える別の利点は、それが天然の代謝産物であり、全身への毒性もなく尿へ排出される点にある。
【００４１】
プルピレングリコール（ＰＧ）（ＢＰ、ＥＰ、ＵＳＰ）
ＰＧは、最も一般的に使用される利用可能な製剤の賦形剤の一つであり、比較的低濃度から中程度の濃度にてしばしば使用される。局所用製剤においてＰＧを使用する主たる理由は、溶媒和試薬として優れた特性を有する点にある。ＰＧはまた角質層中の水分含量を増大し、角質層を通過する透過勾配を促進する。
【００４２】
仮にＰＧが４０乃至７０％の濃度にて使用される場合、角質溶解剤として作用する。ＰＧは最小限に吸収され、いかなる全身性の吸収物も肝臓にて、乳酸、ピルビン酸に酸化される。
【００４３】
滅菌水（ＢＰ、ＥＰ、ＵＳＰ）
膨潤（及び関連する組織の水和）は、そうでなければ密に詰まった角質細胞／ケラチンとなる同角質細胞／ケラチンを介して二つの活性成分の標的となる領域である基底層に最適に送達することを可能とするので大いに好ましいと考えられる。
【００４４】
エタノール（ＥｔＯＨ）（ＢＰ、ＥＰ、ＵＳＰ）
エタノールは多くの場合、製剤中における薬物の溶解性を改善するために、局所用製剤において主として使用される。皮膚にさらすと、脱水、脂質の移動及び比較的高濃度では可能性として「皮膚の亀裂」を引き起こす。
【００４５】
ＰＥＧ平均分子量４００（ＢＰ、ＥＰ、ＵＳＰ）
液体マクロゴールとして周知であるポリエチレングリコール４００は水混和性のビヒクル、共溶媒及び保湿剤であり、皮膚から水分を引き出すであろう。透明な液体であり、わずかにアルコール臭であり、２０℃では１．１３ｇ／ｃｍ３の密度を有し（水＝１）、４０℃にて４３Ｃｓの粘度である。
【００４６】
ＰＥＧ４００はまた、局所用製剤において製剤中の薬物の溶解性を改善することが知られている。ＰＥＧ４００が角質溶解活性を阻害することを示唆する科学的な根拠はないが、同ＰＥＧ４００が皮膚の水和を助けることを示唆する幾らかの根拠は存在する。
【実施例１】
【００４７】
ヒトの硬化した皮膚に対する、賦形剤であるエタノール（ＥｔＯＨ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）及び水（Ｈ２Ｏ）の膨潤効果（即ち、吸収）を、予め秤量した皮膚サンプルをこれらの溶媒に２４時間浸すことにより決定した。次に、皮膚サンプルを取り出し、表面の溶媒を組織からゆっくりと除去し、再び秤量した。水のみが皮膚内にかなりの程度に吸収されたという結果になった。このことから、水はハイドロゲルの形態にてゲル内に組み込まれることが好ましい。また、ポリエチレングリコール／水の溶液中において、ＰＥＧの量が増大すると、硬化した皮膚の膨潤が低減することが明らかになった。従って、ゲル内にかなりの量のＰＥＧを加えることはあまり好ましくない。
【実施例２】
【００４８】
プロピレングリコール（ＰＧ）／水の溶液を調製し、ＰＧが水の膨潤効果に望ましくない影響を与えないことが示された。１００％の水からなる溶液と、ＰＧ及び水の５０：５０溶液との間で、膨潤に有意な差がなかった。従って、ゲルに４０％のＰＧを加えると皮膚の膨潤に影響を与えることなく角質溶解作用が提供できる。
【実施例３】
【００４９】
文献では、２０％の尿素溶液が角質溶解特性を示し、ゲル製剤中へ尿素を加えることは幾らかの実施形態では好ましいことが示されている（尿素はまた、ゲル／クリームのベトつき感を低減する）。プロピレングリコールを４０％に維持しつつ、賦形剤混合物は尿素の量を変更しながら（２０％まで）調製し、膨潤の効果を決定した。尿素は硬化した皮膚の膨潤（水分を取り込む量）に対して有意な程度に有害な効果を与えないことが示された。従って、２０％の尿素をゲルに加えることは同製剤を既知の（しかし最小限の）角質溶解濃度に維持するので、幾らかの実施形態においては好ましい。
【００５０】
これらの結果は、プロピレングリコールが、水のみに起因すると思われる膨潤に影響を与えないことを示す。尿素もまた、取り込みにおいて望ましくない影響を与えないことが示された。これらの結果は、４０％の水と、４０％のプロピレングリコールと、２０％の尿素とを領域に含むゲルは、プロピレングリコール及び尿素の角質溶解特性と、最適な膨潤特性との両方を備えた幾らかの好ましい実施形態を示すことを示唆する。
【００５１】
局所的な剤型を開発し、任意のインビトロの放出試験又は透過試験を実施する前に、期待できる薬物と溶媒の候補となり得るものの物理的及び化学的特性についての情報を得るために予備処方の研究を実施することは重要である。とりわけ、ビヒクル中での、そして皮膚に存在する種々の相中での透過物の溶解性は、透過の相対速度を決定する。
【００５２】
典型的には、皮膚に適用される場合、活性成分又は透過物は、溶媒又はビヒクルに溶解又は分散した状態にて存在しているであろう。皮膚内に存在している透過物の濃度は通常輸送速度を制御するが、その特定の濃度は、皮膚表面に存在するビヒクルに存在する透過物の溶解度（即ち、熱動力学的活性）に依存する。
【実施例４】
【００５３】
ジゴキシン及びフロセミド透過薬物の相対的な溶解度を、一連の通常の溶媒／賦形剤にて評価した。溶解度は皮膚表面の平均温度である３２℃にて試験した。次に、二つの活性成分の最適な量を送達する好ましいゲル製剤を得るために、インビトロの放出及び透過に対して好ましい透過物及び溶媒の組み合わせを決定するべく結果を使用した。
【００５４】
一般的な手順
金属性スパーテルを使用して、各モデル透過物の少量を１．５ｍｌのバイアル中に別々に入れた（約５０ｍｇで、バイアルの約１／４を占める）。次に、バイアルを予め較正された電子天秤に別々に移し、次に風袋を秤量した。次に、各溶媒の正確な１ｇ（重量／容量ｗ／ｖ）を目盛り付１０００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットを使用してバイアル中に慎重に加え、質量が必要とされる１ｇに近くなったときに１０００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットを２００μｌ及び２０μｌのＧｉｌｓｏｎピペットと交換して、より少量の溶媒を正確に置き換えることを可能にした。この手順は、試験される種々の溶媒により示される、異なる密度を説明するために慎重に実施した。
【００５５】
溶解度の実施例を３２℃にて実施されることを考慮した場合、溶媒をバイアルに加える前に、全ての溶媒を、デジタル温度読み取り付のサーモスタットにて制御されるインキュベータ中にて指定された温度にて温度を平衡状態とした（これは、溶媒とともにインキュベータ内に温度計を配置することにより確認した）。また、透過物を含む対応するバイアル中への溶媒の秤量は、適切な実験温度にて電子天秤にて実施した。
【００５６】
溶媒の各々に薬物を加えないものを負の対照バイアルとした。透過物／溶媒の各組み合わせに対して、合計４回反復して実施した。
全ての溶媒を正確に秤量すると、バイアルを血球回転器内に固定した。ここでもこの手順は所定の温度にて実施した。インキュベータを使用して、３２℃の一定温度を維持した。安定した一定の温度を確実に維持するために温度計の読み取り値は定期的に記録した。
【００５７】
飽和溶解度の実施例の開始にあたって、溶媒内に過剰の薬物が存在することを確認するために、即ち、透明な溶液というよりはむしろ視認可能な固体粒子又は懸濁物であるかどうかを確認するために、バイアルを定期的に調べた。バイアルに粒子が存在していない場合には、特殊な透過物溶媒の組み合わせを得るために、完全な飽和状態となるまで、そこに更なる量の透過物を加えた。バイアルを合計２４時間攪拌した。
【００５８】
過剰の固体の存在及び平衡に達したとの仮定を確認するべく最終的な視認による検査をした後に、バイアルをすぐに遠心分離機に移して１２５００ｒｐｍにて１０分間回転させた。遠心分離機は温度が予め３２℃の平衡状態となっていた。バイアルを遠心分離することにより、飽和した透過物溶媒と過剰の透過物とを分離し、その際過剰の固体はバイアルの底部にペレットとして形成されていた。
【００５９】
次に、上澄液の７５０μｌ（約７５％）を別のバイアル（予め暖められたもの）に移し、遠心分離機にて１２５００ｒｐｍにて１０分間２回目の回転をさせた。これにより、Ｇｉｌｓｏｎピペットを使用して上澄液を除去する際に生じていたピペットからのいかなる過剰の粒子状物質も存在しないことを確実にした。ピペットを含む使用した全ての器具を確認するために非常に注意を払い、透過物の溶解度において、温度による僅かな変化の可能性をも回避するために、使用前にはチップは対応する温度にて平衡状態とした。次に、予め暖められたピペットのチップを用いてバイアルをサンプリングし、ＨＰＬＣにてすぐに分析した。
【実施例５】
【００６０】
個々の溶媒の各々における透過物のそれぞれの初期溶解度の実施例にて得られた結果から、既に述べたように、以下の共溶媒混合物を使用したことを除いては同様の手順にて更なる溶解度の実施例を実施した。
【００６１】
第一の共溶媒混合物：４０：４０：２０        プロピレングリコール：水：尿素
（最大角質溶解効果）
第二の共溶媒混合物：５０：４０：１０        ＰＧ：ＥｔＯＨ：水
（最大ジゴキシン効果）
第三の教養培混合物：５０：２０：２０：１０  ＰＧ：ＥｔＯＨ：ＰＥＧ４００：水
（最大Ｆｒｕ／最適ジゴキシン）
図１乃至５は溶解度試験の各々から得られた結果を示す。図６及び７は比較を強調する。図１乃至３に示した溶解度試験の結果は活性成分フロセミド（Ｆ）及びジゴキシン（Ｄ）のいずれも水には比較的不溶性であるが、それらの溶解度はプロピレングリコール（ＰＧ）の存在下では増大することを示した。尿素の存在は活性成分Ｆ及びＤのいずれの溶解度も低減した。
【００６２】
個々の溶媒の各々における透過物の溶解度試験から、ジゴキシンはエタノール及びプロピレングリコール中にて最も高い溶解度を有し、ＰＥＧ４００及び水にて比較的低い溶解度を有することが明らかとなった。フロセミドは、ＰＥＧ４００中にて突出した最大溶解度を有し、ＰＧ及びエタノールにて比較的良好な溶解度を、水にて低い溶解度を有することが明らかとなった。
【００６３】
４０：４０：２０（ＰＧ：水：尿素）共溶媒混合物（基本型）中でのフロセミドの存在下におけるジゴキシンの最高溶解度は、それぞれ４３３及び５９７９μｇ／ｍｌであった。
【実施例６】
【００６４】
診療所内にて患者に適用した場合、患者の組織が非常に水を含んだ状態となり、一症例では、「イボ」の病巣が１６週間後には完全に消失したことを観察した。基本型の製剤は、一般的に膨潤し、病巣が破裂していることは視認できたが、製剤内のＤ及びＦのレベルが増大（最大化）することにより、製剤に対する反応時間の提案された修正が必要である。
【００６５】
第一の共溶媒混合物（４０：４０：２０のＰＧ：水：尿素）は第二の共溶媒混合物（５０：４０：１０のＰＧ：ＥｔＯＨ：水）より角質溶解性がはるかに大きく、かつ「イボ」組織を介して活性成分の送達が可能である（インビトロ透過試験により確認されている）と思われるが、製剤内の化学的な活性成分はウイルスの位置に効果的な量にて分散するためには不十分であると仮説された。また、これは製剤中に水の存在により悪化され、水を含んだ病巣は、親油性のジゴキシン及びフロセミドの進入に対して更なるバリアとして存在すると仮説される。
【００６６】
第二及び第三のゲル共溶媒混合物（５０：４０：１０のＰＧ：ＥｔＯＨ：水及び５０：２０：２０：１０のＰＧ：ＥｔＯＨ：ＰＥＧ：水）に関連する溶解度試験から、ジゴキシンの濃度を主として最大化させるように特異的に設計された共溶媒混合物（５０：４０：１０）はまたフロセミドの濃度も最大化する（ＰＥＧ４００を含んだゲル製剤以上である）。これに基づき、「ＭＡＸジゴキシン」ゲルをインビトロ放出試験に供した。
【００６７】
第二のＭＡＸジゴキシン共溶媒混合物において、ジゴキシンの溶解度は４３３μｇ／ｍｌから６２６７μｇ／ｍｌまで増大した（約１５倍）。フロセミドの溶解度もまた、５９７９μｇ／ｍｌから９５００１μｇ／ｍｌまで増大した（約１６倍）。透過溶解度におけるこの予想外の増加は、複数の要因によるものであった：
・４０％のエタノールを加えたこと；
・系から尿素を除いたこと；
・Ｈ２Ｏの含量を８％に低減したこと。
【００６８】
製剤から尿素を取り除いたことは、修正ゲル製剤の角質溶解性を低減するものと思われる。しかしながら、この要因を相殺するために、ＰＧ含量を５０％まで増大した。
皮膚科用製剤からの皮膚への透過物の送達を最適化するための一つの手段は、送達系における透過物の熱動力学的活性、即ち「化学的能力」を改善することである。皮膚を横断して皮膚内へ透過物を最適に放出し、結果として最適に送達することは、通常、熱動力学的活性がその最も高い達成レベル、即ち、飽和時（＝１）に得られる。飽和レベルより上であること（薬物結晶化効果）及び飽和レベルより下であること（より低い化学的能力）により、製剤からの放出が低減し、よって皮膚を横断しての送達が低減する。従って、局所用製剤において熱動力学的な活性レベル１を達成することは、皮膚への透過物の送達を最適にするには望ましい。各種共溶媒混合物中において飽和を達成するのに必要とされるジゴキシン及びフロセミドのそれぞれのレベルは、溶解度試験によって検討した。その他の製剤の要因もまた熱動力学に加えて考慮する必要がある。というのは、例えばフロセミドは化学的性質という点では両親媒性であり、よって製剤のｐＨの影響が性能を左右するからである。
【実施例７】
【００６９】
このような現象及びその他の事項を検討するために、数種類の異なるゲルのバッチを製剤化して、これらのパラメータがインビトロにおいてジゴキシン及びフロセミドの放出特性において与える影響を検証した。
【００７０】
例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９８１ＮＦ  Ｃａｒｂｏｐｏｌ及びＵＬＴＲＥＺのようなカルボマー、セルロース誘導体、ヒドロキシプロピルセルロースのような異なる種類のゲル増粘剤の効果を、適切な増粘剤としてまた検討した。
【００７１】
増粘剤の種類（及び「所望の」粘度を得るために必要とされるそれぞれのａｍ）に加えて、ゲルのｐＨをｐＨ５、７及び９に修正した際の効果を調べた。
最後に、透過物のモル比、即ちジゴキシン：フロセミドを１：１及び１：１４のモル比に変更した効果を調べた。これらの選択の背景にある論理的根拠についてここでは述べる。
【００７２】
論理的根拠１：４０：４０：２０共溶媒混合物中にて１：１のモル比にあるジゴキシン及びフロセミドの飽和溶液を含むゲル製剤
この論理的根拠の基となるものは、イボの二成分薬物治療の効果が１：１（等モル）の送達に基づいているという仮定（周知の相乗効果を正当に与えるもの）であった。これは、ゲル共溶媒混合物（４０：４０：２０の水：プロピレングリコール：尿素）中にジゴキシン及びフロセミドの飽和溶液を別々に処方化し、二つの薬物の等モル量が溶液中に含まれるように所定の容量にて両者を混合することにより得られた。
【００７３】
４０：４０：２０（ＰＧ：水：尿素）共溶媒混合物中のジゴキシンの飽和限界値は４３３μｇ／ｃｍ３（飽和溶解度の結果のセクションを参照されたい）であった。溶液中のモル数は、４３３／７８０．９＝０．５５μｍｏｌ／ｃｍ３である。共溶媒中のフロセミドの飽和限界値は５９７９μｇ／ｃｍ３である。溶液中のモル数は、モル５９７９／３３０．７＝１８．１μｍｏｌ／ｃｍ３である。従って、１：１のモル比とするには、１ｃｍ−３の等モルのフロセミド溶液に対して、１８．１／０．５５＝３２．９ｃｍ−３の飽和したジゴキシン溶液が必要である。ジゴキシンの飽和溶液及びフロセミドの飽和溶液を３３：１の体積比となるようにそれぞれ混合することにより、１：１モル比にて両者を含む溶液が得られる（しかしながらこれは混合中に溶液から薬物の低下がない場合にのみ当てはまる−実験的には薬物低下が認められた場合もある）。この場合両方の薬物は飽和した状態であり、よって最も高い熱力学的活性である。
【００７４】
論理的根拠２：４０：４０：２０共溶媒混合物中に１：１４のモル比でジゴキシン及びフロセミドを組み合わせた飽和溶液を含むゲル製剤
この論理的根拠の基となるものは、混合物中にて両方の薬物がそれぞれに最大量にて化学量論の制御なくして得られることによる。本質的に、両薬物が過剰に存在していることは、各成分が他方の存在下において飽和して平衡を確立するであろう。より「バケット（ｂｕｃｋｅｔ）化学」的アプローチではあるが、最終結果は、前者の論理的根拠よりも、臨床における効果において優れていることが明らかになるであろう。
【００７５】
各々の薬物の過剰量を共溶媒混合物に加え、その後ＨＰＬＣ分析すると、ジゴキシン：フロセミドのモル比が１：１４となった。このモル比は、共溶媒混合物内に互いに存在している各透過物の相対的な化学ポテンシャルにより達成され得る。モル比は、ある点において、論理的根拠１とは非常に異なるものではあるが、ここでも各透過物は飽和した状態にあり、よって最も高いレベルの熱動力学的活性となるであろう。更に、ジゴキシンが二つの活性成分のうちでより効果があると仮定すると、過剰のフロセミドはナトリウム／カリウムポンプの作用部位において有利であろう。ｐＨ変化はジゴキシンの放出において最小限の影響しか与えないであろうと仮定した。その理由はジゴキシンが中性分子であることによる。
【００７６】
以下の表は、引き続くインビトロ放出試験に使用されるべく製造された異なる種類のゲル及び使用した各成分（ｗ／ｗ）の比率を詳述する。
【００７７】
【表１】
2009507008.tif 000002
【００７８】
ゲルの各々は実験に基づいた処方である。
【実施例８】
【００７９】
ゲル調製
全ての計算は、異なる製剤の共溶媒混合物の相対的な比率に基づいている。異なるゲル製剤の各々に、全ｗ／ｗ製剤混合物のパーセントとして増粘剤を最後に加えた。
【００８０】
以下に、「修正ＭＡＸジゴキシン」ゲルの調製を順に記載する。その他のゲルの全てについても、前述の表に記載した適切な成分を使用することを除いては、同様の手順にて製造した。全てのゲルの製造は、ＧＬＰの基準にて実施した。ｐＨの調整は、増粘剤を加えた後に、ＮａＯＨ又は酢酸の適量を加えることにより実施した。尿素を含むこれらのゲルに対して、所定量の尿素は、共溶媒の各々を混合した後であって、透過物を加える前に加えた。
【００８１】
無菌の１リットルのガラス製ビーカー中にて、最初に２５０ｇのプロピレングリコールを２００ｇのエタノール及び５０ｇの水と混合することにより（５０：４０：１０の比率にて構成される）、「ＭＡＸ  Ｄｉｇ」ゲル製剤を調整した。予め較正された電子天秤にて量を正確に量り、マグネチックスターラを使用して連続的に混合した。過剰量のフロセミド及びジゴキシンを共溶媒混合物に加え、ジゴキシン及びフロセミドの両者の確実に飽和された溶液を得た。（溶媒の蒸発を止めるために）直ぐにビーカーをパラフィルムでシールし、室温にて一晩連続的に攪拌した。次に、得られた懸濁液を２５，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、得られた飽和状態の共溶媒混合物から過剰のフロセミド及びジゴキシン薬物を分離した。得られた飽和溶液を、予め電子天秤上に置いた別の無菌の１リットルビーカーに移した。その際、過剰の透過物が移されないように注意を払い、飽和溶液の全量を記録した。電子天秤を使用して、飽和溶液全量の８．０ｗ／ｗ％に相当するＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）を秤量した。
【００８２】
飽和した共溶媒混合物を（オーバーヘッドスターラを使用して）強く攪拌しながら、スパーテルを使用してＨＰＣを５分間にわたりゆっくりと加えた。ＨＦＣが完全に分散したことを確認する視認検査後、ゲル製剤を含む容器を血液チューブ回転子上に一晩置いて、ＨＰＣゲル網目構造を形成させた。結果として均一なバッチのゲル製剤が得られた。５０：２０：２０：１０のプロピレングリコール：エタノール：ＰＥＧ４００：水の共溶媒混合物からなるゲル製剤を得るために、より小さなスケールにてこの手順を繰り返した。
【００８３】
ジゴキシン及びフロセミドアンプルからゲルを製剤化するために、等量のジゴキシンアンプル（６２．５ｍｇ／ｍｌ）及びフロセミドアンプル（２０ｍｇ／ｍｌ）を電子天秤にて正確に秤量した。アンプルを混合すると、エタノールの全量が減少する（ジゴキシンアンプルのみがエタノールを含んでいるので）。これを補償するために（ジゴキシンをフロセミドと合わせた場合にジゴキシンが析出しないようにするために）、２ｇのフロセミドと混合される２ｇのジゴキシンの各々に２００μｌのエタノールも加えた。ここでも８ｗ／ｗ％のＨＰＣを加え、上記した同様の手順にて溶液を放置してゲルを形成した。
【実施例９】
【００８４】
インビトロ放出
インビトロ放出試験は、局所薬物製剤の性能を調べるために一般的に使用される技術である。ＦＤＡのような規制機関により指示されているように基本的な必要事項である。本発明者らは、既存の方法における不備が排除されている近年開発された改善されたインビトロモデルを使用した。
【００８５】
拡散試験は、全てがガラス製のＦｒａｎｚ型のセルを使用して実施した（レセプター相の公称容積、３ｍｌ）。開始する前にナイロン製のシート状の膜をレセプターの媒体（適切な共溶媒混合物）中に２４時間浸した。次に膜をレセプター液から取り出して、表面を乾燥し、レセプター区画の予めグリースを塗ったフランジ上に注意深く配置した。次にドナーチャンバを対応するレタプター区画の上部に配置し、その位置にてピンチクランプにて締め付けた。各レセプター区画にマイクロスターラを加えた。ＰＢＳ及びより粘度の高いＰＥＧ４００に対するこの技術の効果を、溶液で満たしたレセプター区画に少量の染料を適用することにより予め確認した。
【００８６】
加えたゲルの量がドナーチャンバの最上部に達するまで、適切なドナーキャップの各々に製剤を加えることにより、無限用量を加えた。次に予めグリースを塗ったカバースリップを各ドナーチャンバの上部に配置し、閉塞した気密シールを形成した。次にレセプター区画を適切に脱気した共溶媒混合物（４０：４０：２３の水：プロピレングリコール：尿素，５０：４０：１０のＰＧ：ＥｔＯＨ：水又は１０％ＥｔＯ／緩衝溶液−塩濃度はアンプル中に存在しているものと同じである）で満たし、サーモスタットにて制御された水浴中のマルチ攪拌プレート中にセルを置いた。同水浴中では、膜の表面の温度は３２℃に維持されている。２００μｌのサンプルを１、２、４、６、１２及び２４時間にて採種し、適切な温度かつ平衡状態の共溶媒混合物を代わりに加えた。各処置に対して全部で６回実施した。
【実施例１０】
【００８７】
ＨＰＬＣ分析
２つの活性成分の分離及び検出のためのデュアルＨＰＬＣ分析法を開発した。ＨＰＬＣ分析法は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｇｓｏｒｂ  ５μｍ  Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００ＨＰＬＣを使用して実施した。移動相は４０：３０：３０の水：ＭｅＯＨ：ＭＥＣＮから構成されている。ＵＶ検出器は２００ｎｍに設定し、２０μｌの注入量を使用した。流速は１ｍｌ／分であり、ランタイムは１０分であり、かつフロセミドの保持時間は典型的には３．２分であり、ジゴキシンは５．４分であった。標準検量線は比較的同じ比率の溶媒又は共溶媒混合物を含んだ標準溶液（０．１，１，１０，２０，４０，８０及び１００μｇ／ｍｌの範囲）から構成した。Ｆ（２．６分に観察される最初のピーク）及びＤ（５．２分に観察される二番目のピーク）の分離及び検出のためのデュアルＨＰＬＣアッセイを示すクロマトグラフが得られた。このクロマトグラフはＤ及びＦを含んだ組み合わせた標準溶液の注入により得られた（両者とも５０μｇ／ｍｌの濃度）。
【００８８】
結果を図８乃至１４に示す。
各ゲルから生成したインビトロ放出データの要約（図８乃至１１まで）
【００８９】
【表２】
2009507008.tif 000003
【００９０】
各ゲルから生成したインビトロ放出データの要約（図１２乃至１４まで）
【００９１】
【表３】
2009507008.tif 000004
【００９２】
データ処理
Ｑ２４：
この値は、２４時間におけるレセプター相へ放出された単位面積当たりの活性成分の全濃度である（μｇ／ｃｍ２）。
【００９３】
フラックス
これは、単位面積当たり、単位時間当たりに放出された活性成分の濃度である（μｇ  ｃｍ／ｈ）。Ｑ２４を２４で割ることにより算出される。
【００９４】
放出速度：
これは、時間（時間）プロットの平方根から得られる線の勾配である（μｇ／ｃｍ２  ｈ０．５）。Ｒ２値も報告され、線の稀少さ（ｒａｒｉｔｙ）を示す。
【００９５】
適用量％：
レセプター相に存在する活性成分の量を適用された用量のパーセントとして算出した。ドナー相が一定の２ｇのゲルを含んでいると仮定している。
【００９６】
局所用のクリーム、ゲル、軟膏のヒトの皮膚を介する経皮透過を試験するインビトロ試験でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）レセプター相を使用することは日常的なこととなっている。ＰＢＳレセプター相は皮膚の内部及びその下側にある条件と類似した生理学的な溶質条件を提供するためにデザインされている。多くの異なる他のレセプター相もインビトロ試験において使用されており、ＨＢＳ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０％仔牛血清）及びｔｒｉｚｍａベース４５ｍＭ（４０ｍＭコール酸ナトリウム）である４つの異なるレセプター相を一つの独立した試験に使用した、。
【００９７】
しかしながら、インビトロ放出試験の主たる目的は、局所用製剤からの活性成分の放出の定量的なデータを得ることである。
例示された両方のゲルは、インビトロ放出系において改善された同じものを使用した。同放出系において、局所用製剤に含まれる共溶媒及びレセプター相の含量は、いずれも、４０：４０：２０の水：プロピレングリコール：尿素ゲル混合物であった。製剤中において、従来のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）共溶出物の賦形剤に代えてレセプター相として４０：４０：２０のゲル混合物を使用することにより、ドナーからのフロセミド及びジゴキシンの総転移のみを最小限にすることができる。また、セルを組立てる前にこの混合物中に膜を浸すことは、正味の移動が活性成分のみであることを確実にした。
【００９８】
レセプター相において観察されたフロセミド及びジゴキシンの最大濃度はそれぞれ、５４３．６０μｇ／ｍｌ及び４２．４７μｇ／ｍｌであり、いずれもその飽和溶解度（前述の溶解度試験から得られた結果）よりもかなり低かった。従って、実験の間、シンク状態は維持された。
【００９９】
時間（時間）の平方根としてプロットした場合、フロセミド及びジゴキシンから得られた放出グラフは良好な線形の関係を示した。算出されたＲ２値は、１：１４のゲルからのｐＨ５、７及び９においてフロセミドは０．９９９３、０．９９７４、０．９９９３であり、１：１４のゲルからのｐＨ５、７及び９においてジゴキシンは０．９８３６、０．９９６１、０．９７４２であり、１：１のゲルからは、フロセミド及びジゴキシンはそれぞれ０．９８４４及び０．９９８１であった。これは、選択されたナイロン製の放出膜が両製剤に対して最小限／ゼロの速度制限効果を生ずることを示唆する。
【０１００】
ＰＨ変化に伴う放出特性の相違
ゲルのｐＨが増大するにつれて、フロセミド及びジゴキシンのいずれも放出速度が順次減少した。ｐＨ５におけるフロセミドは１２４．５１μｇｃｍ−２ｈ０．５の放出速度であったが、ｐＨ９では、同放出速度は４３．３８９μｇｃｍ−２ｈ０．５に低減し、ほとんど３倍の低減であった。放出速度における低減は、ジゴキシンに対しては更に大きく、ｐＨ５においては放出は１０．１８μｇｃｍ−２ｈ０．５であったが、ｐＨ９では０．８６μｇｃｍ−２ｈ０．５に低減し、１２倍の低減であった。
【０１０１】
ジゴキシンが中性の透過物であるならば、ｐＨの増大に伴う放出の低減という結果はゲルの物理化学的特性によるものである（ゲルの増粘特性がｐＨの変化を介して影響を受けていると考えられるので）。フロセミドは化学的には両親媒性であり、ｐＨの変化に伴う放出速度の変化がより小さいことが説明できるであろう。
【０１０２】
これらの結果は、両方の透過物に対する最適な同時放出特性を得るためにはｐＨ５にてゲルを製剤化することを支持するであろう。
異なる透過化学量論のゲル間の放出特性における相違
インビトロ放出試験は、フロセミドのジゴキシンに対する相対的化学量論により区別される二つのゲル間の相違も調べるために更に行った。第一のゲルは、１：１のジゴキシン：フロセミドのモル比を有し、「論理的根拠１」に記載されたように製剤化した。第二のゲルは、１：１４のジゴキシン：フロセミドのモル比を有し、「論理的根拠２」に記載されたように製剤化した。両ゲルは７のｐＨにて製剤化した。ゲルからの両方の活性成分の放出における大きな相違は明らかであった。
【０１０３】
１：１４のゲルは、フロセミドでは７７．４８２μｇｃｍ−２ｈ０．５の放出速度であり、４３０μｇｃｍ−２ｈ０．５の放出速度であった。しかしながら、１：１ゲルにより得られた放出速度は、フロセミドでは、７．１８μｇｃｍ−２ｈ０．５とかなり低く、ジゴキシンでは３．４８μｇｃｍ−２ｈ０．５と同様に低かった。これは、それぞれ１０．８倍及び１．２倍の低減である。この結果は、二つの製剤の適用した用量に起因する。
【０１０４】
２４時間において、両方の修正ゲル製剤（ＵＬＴＲＥＺ及びＨＰＣ）からのフロセミド及びジゴキシンの量は、アンプルゲル製剤から放出された対応する量よりもかなり高かった。２４時間において、修正製剤は、ジゴキシンに関しては類似した量の放出を示したが、ＨＰＣ増粘ゲル製剤は、Ｕｌｔｒｅｚ製剤よりもほぼ１．５倍多いフロセミドを放出した。
【０１０５】
３つのゲルに対してジゴキシン放出速度を観察した場合、Ｕｌｔｒｅｚ製剤は２７４μｇｃｍ−２ｈ０．５の最も高い放出速度を示し、それに続いてＨＰＣ製剤が２４５μｇｃｍ−２ｈ０．５の類似した放出速度であったが、アンプルゲル製剤は８．１μｇｃｍ−２ｈ０．５とかなり低い放出速度であった。
【０１０６】
３つのゲルからのフロセミドの放出速度に関して、最も高い放出速度は、２６７３μｇｃｍ−２ｈ０．５であったＨＰＣ製剤から観察され、それに続いて、ＵＬＴＲＥＺ製剤からは１５２７μｇｃｍ−２ｈ０．５とかなり低い放出速度であり、ここでもアンプル製剤からはかなり低い放出速度であった。
【０１０７】
ゲルの各々により示された全体の放出特性に関し、ＨＰＣ及びＵｌｔｒｅｚ増粘製剤からのジゴキシンの放出速度は類似していたが、フロセミドの放出速度はＨＰＣゲルではかなり高く、全体として、ＨＰＣ増粘ゲルはＵｌｔｒｅｚゲルよりも優れていた。アンプルゲル製剤の性能は、両方の修正ゲル製剤と比較した場合顕著に低かった。
【０１０８】
これらの製剤からのフロセミド及びジゴキシンの同時共放出に対して最も好ましい製剤は、８％のＨＰＣで粘度が増強された５０：４０：１０共溶媒混合物中のｐＨ５における１：１４のジゴキシン：フロセミドであることがこれらの結果より結論付けられる。
【０１０９】
共溶媒混合物中の相対的な角質溶解性に関する相違により、どの製剤がヒトの硬化した皮膚を介して最も多くの量のジゴキシン及びフロセミドを送達するかを決定するために、インビトロ透過実験を実施することは重要である。
【０１１０】
「硬化した皮膚」のインビトロ透過性
【実施例１１】
【０１１１】
拡散セルを使用してインビトロ透過データを得ることは、局所薬製剤の性能を試験するために一般的に使用されている技術である。
透過実験は、ドナー相とレセプター相の間に足底の硬化した皮膚を組み込んだ全てがガラスからなるフランツ型セルを使用して実施した。約０．６ｃｍの直径の硬化した皮膚の切片を、使用するべくカスタマイズされた「フランツ」セルに適合するために必要であった。次に、インビトロ透過試験を、ゲル処置あたり５つのセルを使用して実施した。合計で１５個以上のセルを同時に実施することはなかった。各レセプター区画にマイクロスターラを加えた。無限用量のゲル（約１ｇ）を、シリンジによって各ドナー区画に加え、ＰＥＧ４００を、各々におけるレセプター相として使用し、それにより流体力学境界効果及び組織膨潤効果を制限する適度な「シンク」条件を可能にした。適用したゲルはガラス製のカバースリップを用いて閉塞され、サーモスタットにより制御された水浴中に皮膚の温度を３２℃に維持しながらセルを攪拌した。２００μｌのサンプルを、１，３，６，１２，２４，３６，４８，７２，９６，１２０及び１４４時間（全部で６日）にて採取し、温度が平衡状態にあるレセプター相と置き換えた。各ゲルに対して合計で５回繰り返した。全てのサンプルはＨＰＬＣにて直ぐに分析した。
【０１１２】
初期インビトロ透過試験は、以下の基本型のゲルにて実施した。
１）基本型ゲル
４０：４０：２０（ＰＧ：水：尿素）におけるｐＨ５での１：１４（ジゴキシン：フロセミド）（１．５％カルボマー−９８１ＮＦ）
引き続くインビトロ透過試験は、以下の修正ゲルにて実施した。
【０１１３】
２）ＭＡＸジゴキシンゲル
５０：４０：１０（ＰＧ：ＥｔＯＨ：水）におけるｐＨ５（８％ＨＰＣ）での１：１４（ジゴキシン：フロセミド）
３）最大フロセミド（最適ジゴキシンゲル）
５０：２０：２０：１０（ＰＧ：ＥｔＯＨ：ＰＥＧ４００：水）におけるｐＨ５（８％ＨＰＣ）での１：１４（ジゴキシン：フロセミド）
４）ジゴキシン及びフロセミドアンプルゲル
ジゴキシンアンプルから得られた２ｇの溶液を、フロセミドアンプルから得られた２ｇの溶液と混合して、２００μｌのエタノールを加えた。ここでも、８ｗ／ｗ％のＨＰＣをゲルを増粘するために加えた。
【０１１４】
データ処理
各ゲルにおけるジゴキシン及びフロセミドの両方の定常状態のフラックスは累積透過グラフの直線状の領域の勾配から算出した。破過時間（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｉｍｅ）はレセプター相において最初に透過物が検出された地点から得られた（各透過物のＭＤＬに依存する）。遅延時間は透過した累積量（定常状態のフラックス）の直線領域をＸ軸（時間）まで外挿することにより算出した。
【０１１５】
結果（基本型ゲル）
図１６乃至２０はゲルの無限用量からの足底の硬化した皮膚を介するフロセミド及びジゴキシンの透過グラフを示す。
【０１１６】
【表４】
2009507008.tif 000005
【０１１７】
結論（基本型ゲル）
ｐＨ５．５において、製剤はフロセミド及びジゴキシンの最大放出速度を示すことが以前の研究にて実証されていた。この研究は、硬化した皮膚を介する透過により両薬物を送達するための製剤の能力を評価した。
【０１１８】
ジゴキシンの破過時間は約３６時間であり、フロセミドは約６時間であった。これらの相違は幾つかの事項を反映していると仮説される：
１）製剤中においてフロセミドが相対的により高い濃度であること（従って、推進力）
２）前者に、より弱い発色団が存在することにより、ジゴキシン（８８ｎｇ）がフロセミド（３ｎｇ）に対して検出限界が低いこと
３）透過物の分子量の顕著な相違（フロセミド３３０．７  ジゴキシン７８０．９）
４）硬化膜のバリア特性
皮膚の物理的特性に関して、この研究では平均の厚みが０．９２ｍｍである比較的厚いヒト足底の硬化した皮膚を使用したことは明らかである。ゲル製剤からの二つの透過物の透過を研究するために、これが（ＨＰＶを包囲する実際のイボ病巣組織に対する）最も可能性のある代替物であると考える。これまでの「膨潤」試験にて明らかなように、この研究にて使用される組織も質量が増大し、それは水を含むこと及びそれによる足底の硬化した皮膚内の角質層の膨潤によるものであることが示された。平均増加質量パーセントは、４３％であった。
【０１１９】
全体として、フロセミドは足底の硬化した皮膚を介する典型的な透過グラフを示した（図１６）。１２０乃至３１２時間の間にて一次速度過程が観察され、それから１３．８３±１．１８μｇ／ｃｍ２／時間の定常状態のフラックスが算出された。ジゴキシンに対しても典型的な透過グラフが得られた。定常状態は１４４時間にて得られ、１．１４±０．２８μｇ／ｃｍ２／時間のフラックスを算出した（図１７）。フロセミド及びジゴキシンの相対的な定常状態フラックスは、透過物の物理的特性によるのみならず、製剤の相対的な角質溶解効果によるものである。
【０１２０】
図１９は、両薬物のモル透過を示す。フロセミド及びジゴキシンの比率（約１０：１）は製剤中において見られる薬物のモル比（１４：１）からはそれほどは異なってはいない。ゲル中においてフロセミドがより高濃度であることは、透過した薬物の相対的なパーセントに反映される（図１８）。フロセミドはジゴキシンと比較してかなり低い分子量を有するので、フロセミドが透過する傾向がより大きいことが予測される。これは、算出された見かけの定常状態フラックス値に反映される（表１）。しかしながら、この効果は透過物の物理的特性によるのみならず、製剤の角質溶解効果により作製された相対的な（そして、一時的な）孔のサイズに関するものでもある。作出された孔の特定の直径／三次元の形状は透過物の分子量に対して、ジゴキシンよりはむしろフロセミドの透過を容易にするであろう。
【０１２１】
これらの結果から、ｐＨ５にて、１．５％のＣａｒｂｏｐｏｌ９８１ＮＦで粘度が増強された水、プロピレングリコール及び尿素（４０：４０：２０）を含むゲル製剤は硬化した皮膚を介してフロセミド及びジゴキシンを成功裏に送達するであろう、ということが結論付けられ得る。これらの結果は、ゲルのような局所製剤はパピローマウイルスを制御する上において有用であろうということを示唆している。
【０１２２】
この研究からの結果は、この特殊なゲル製剤内に含有されたフロセミド及びジゴキシンがヒト足底の硬化した皮膚を介して送達され、ＨＰＶに関連した皮膚の症状の治療に有用であることを受け入れさせる根拠を提供する。
【０１２３】
結果−修正ゲル
図２１及び２２は、３つの異なるゲル製剤の各々の約１ｇからの足底の硬化した皮膚を介するフロセミド及びジゴキシンのそれぞれの累積透過グラフを示す。
【０１２４】
図２３及び２４は、基本型ゲルからと、修正ＭＡＸジゴキシンゲルからとの、ジゴキシン及びフロセミドの累積透過の直接の比較を与える。
【０１２５】
【表５】
2009507008.tif 000006
【０１２６】
結論（修正ゲル）
この研究は、ヒトの硬化した皮膚を介してフロセミド及びジゴキシンの両方を同時に送達するための３つの（修正）ゲル製剤の能力を試験した。硬化した皮膚を介して活性成分を送達する種々のゲルの能力の潜在的な差異を強調するために、原型となる基本型ゲル製剤に対する修正ゲル製剤により得られた透過データの比較を行った。
【０１２７】
研究した３つの製剤から、ヒトの硬化した皮膚を介するフロセミド及びジゴキシンの最大送達は「ＭＡＸ」ジゴキシンゲル製剤から観察され、次いで最大フロセミドゲルが続き、ジゴキシン／フロセミドアンプルゲル製剤からはフロセミド及びジゴキシンの最小送達が観察された。図２１及び２２を参照。
【０１２８】
「ＭＡＸ」ジゴキシンゲルと基本型ゲルとから送達されたジゴキシン及びフロセミドの量を比較すると、有意な差が観察された。「Ｍ」ジゴキシンゲルでは、１４４時間で、６２０μｇ／ｃｍ２のフロセミドと１０１μｇ／ｃｍ２のジゴキシンが透過した。しかしながら、基本型ゲルでは、１４４時間で、５７４μｇ／ｃｍ２のフロセミド及び３０μｇ／ｃｍ２のジゴキシンのみが透過し、それぞれ１．１倍及び３．３６倍の減少であった。
【０１２９】
加えて、原型となる基本型ゲルでは、ジゴキシンの破過時間は約３６時間であり、フロセミドは約６時間であった（表１を参照）。しかしながら、「ＭＡＸ」ジゴキシンゲル製剤から得られた破過時間は極めて早く、ジゴキシンもフロセミドも１時間であった。
【０１３０】
これらの相違点は幾つかの事項を反映すると仮定される：
１）比較的高濃度（よって推進力）の主としてはジゴキシンが、そしてまたフロセミドが製剤中に存在すること
２）前者に更に弱い発色団が存在することにより、フロセミド（３ｎｇ）に対してジゴキシン（８８０ｎｇ）の検出限界が低いこと
３）透過物の分子量が顕著に異なること（フロセミド３３０．７，ジゴキシン７８０９）
４）硬化膜のバリア特性
皮膚の物理的特性に関して、この研究では比較的厚いヒト足底の硬化した皮膚を使用したことは明らかである。ゲル製剤からの二つの透過物の透過を研究するために、これが（ＨＰＶを包囲する実際のイボ病巣組織に対する）最も可能性のある代替物であると考える。
【０１３１】
フロセミド及びジゴキシンは足底の硬化した皮膚を透過する「典型的な」透過グラフを示した（図２）。「ＭＡＸ」ジゴキシンゲル製剤では、一次速度過程がフロセミドでは７２乃至１４４時間にて、ジゴキシンでは４８乃至１２０時間にて観察され、よって、定常状態フラックスは６．７５９μｇ／ｃｍ２／時間及び１．０１５μｇ／ｃｍ２／時間と算出された。
【０１３２】
これらの結果から、８％ＨＰＣで粘度が増強された５０：４０：１０のプロピレングリコール：エタノール：水を含むゲル製剤はヒトの硬化した皮膚を介するフロセミド及びジゴキシンの同時送達を可能にすると結論付けられ得る。修正「ＭＡＸ」ジゴキシンゲル製剤から得られた透過データは、原型となる基本型製剤と比較した場合、両透過物における相対的な透過特性を顕著に改善することを強調している。これらの結果から、そのようなゲルの典型的な適用は、パピローマウイルスを抑制する上で有用であることが示唆される。
【０１３３】
結果は、この特殊なゲル製剤に含有されるフロセミド及びジゴキシンがヒト足底の硬化した皮膚を透過して送達され、かつＨＰＶに関連した皮膚症状の治療に有用であるという強力な根拠を提供する。
【０１３４】
上記実施形態に加えて、以下の更なる実施例は、その他のゲル製剤がどのように調製及び使用され得るかを示す。
既に述べたように、本明細書の文脈において、二つの特に効果的な薬物はジゴキシン及びフロセミドであるものとして示されており、それらの５０％プラーク阻害濃度（ＩＣ５０）の実施例を以下に示した（表Ａ）。ＩＣ５０は、異なる薬物を比較する際に、抗ウイルス薬の効力の有用性及び利便性に対して頻繁に引用される指標である。別々に使用した場合、ジゴキシン及びフロセミドのいずれも広範囲のウイルスの複製を明らかに阻害した。
【０１３５】
【表６】
2009507008.tif 000007
【０１３６】
しかしながら、抗ウイルス活性の代替的な指標は、これらの薬物の実際の効力を示す。我々が称するところのイオン性反ウイルス療法（ＩＣＶＴ）は非感染ウイルス蛋白質の合成も許容し、かつこれらの蛋白質はＩＣ５０の決定の根拠を形成する細胞病理学における変化（細胞変性作用）を部分的に引き起こすので、これらの薬物の効力はＩＣ５０の決定により過小評価される。これに代えて、代替的な指標は感染した細胞により形成される感染性ウイルス粒子の全体数を測定する。
【０１３７】
例えば、ジゴキシンを使用した、単純ヘルペスウイルスの４０％から６０％の間のプラーク形成の阻害、即ち、ＩＣ５０の効果（図２５のグラフの上側の線）は、感染性ウイルス粒子形成の９０％から９９％までの阻害に対応する（図２５のグラフの下側の線）。
【０１３８】
ジゴキシン及びフロセミドを別々に使用した、別のウイルス、即ち、ネコのヘルペスウイルスに対しては、それらのＩＣ５０の値の各々はウイルス複製をほぼ完全に阻害した（表Ｂ）。感染性ウイルスの産生は９８．５％（ジゴキシン）及び９９．５％（フロセミド）まで低減されたが、依然として低レベルのウイルスの複製、即ち、１．５％（フロセミド）及び０．５％（ジゴキシン）のウイルスの複製が存在する。
【０１３９】
【表７】
2009507008.tif 000008
【０１４０】
しかしながら、この残りの部分、即ち、低レベルのウイルスの複製を、薬物の組み合わせを使用することにより効果的に排除することが可能である。組み合わせられた場合の抗ウイルス効果は、薬物を別々に適用した場合より大きい、即ち薬物は相乗効果を示す（表Ｃ）。
【０１４１】
【表８】
2009507008.tif 000009
【０１４２】
従って、ウイルスの複製は、９９．９９９９９％低減された。
その他のウイルスの複製、例えば、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）も、組み合わせた薬物を使用することにより最も効果的に阻害された。しかしながら、ＶＺＶは非常に細胞結合型のウイルスであるために関与する感染性ＶＺＶ粒子の詳細な数を定量することは不可能である。代わりに、ウイルスプラーク形成における個々のＩＣ５０及び組み合わせた場合のＩＣ５０の効果を比較した（表Ｄ）。
【０１４３】
フロセミド及びジゴキシンは、各々の対応するＩＣ５０にて、それぞれがＶＺＶプラーク形成を阻害した：約５０％と期待していたように、フロセミド３３／６１プラーク、ジゴキシン２１／６１プラークであった。しかしながら、それらのＩＣ５０にて両方の薬物を組み合わせにて適用した場合、ＶＺＶのプラーク形成は、低い感染多重度（低度ＭＯＩ）にて完全に阻害した。実際に、ＶＺＶプラーク形成は、試験した系における１００倍も感染したウイルス、即ち高度ＭＯＩにおいても完全に阻害した。この効力指標を使用して、薬物は、組み合わせて使用した場合には１００倍以上の効力であった。
【０１４４】
【表９】
2009507008.tif 000010
【０１４５】
小部分のＩＣ５０の組み合わせた場合の効果の比較は、二つの薬物の単独の場合と組み合わせた場合の相対的な効力を比較することによる別の指標を提供する。以下のアデノウイルスを使用する例において、組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすために使用される量は、各薬物のＩＣ５０の４分の１のみで十分であった（図２６）。
【０１４６】
同様の現象は、別の強力な細胞結合型ウイルスであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）でも認められ、二つの薬物を組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすためには、各薬物のＩＣ５０の３分の１のみで十分であった（図２７）。
【０１４７】
要約すると、ジゴキシン及びフロセミドは、ＩＣＶＴに適用した場合には相乗効果を示した。抗ウイルス活性のこの独特の機構（ＩＣＶＴ）により、標準的なＩＣ５０の指数は、増加した組み合わせた効果がこの指標を用いて明らかになってはいるが、
実際の薬物の効力より過小評価される。
【０１４８】
最も顕著なことに、感染性ウイルスの産生は、薬物を組み合わせて使用した場合には９９．９９９９９％まで低減する。
ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシン（ＩＶ）の溶解度及びＩＣＶＴ効力の比較
１）ＩＣＶＴ活性（ＩＣＶＴ−ｉｖｉｔｉｅｓ）（イオン性反ウイルス療法−活性）の比較
１）一連の更なる実験は、ＩＣＶＴ処置、比較「ＩＣＶＴ活性（イオン性反ウイルス療法−活性）」におけるこれらのクラスの化合物の適合性に関する更なる証拠を提供するために実施した。ジゴキシン及びジギトキシン溶液は、粉末から、７０％エタノール１ｍｌ当たり２５０μｇの濃度に調製した。それらのＩＣＶＴ活性を、「標準」ジゴキシン調製物、即ち、１０％エタノール１ｍｌ当たり２５０μｇにて供給されているＩＶラノキシンと比較した。
【０１４９】
粉末及びラノキシン（円形）（図２７Ａ）から調製されたジゴキシンのＩＤ５０値は６０ｎｇ／ｍｌと非常に類似していた。ジギトキシン（四角形）は、３０ｎｇ／ｍｌのＩＤ５０を用いた場合僅かに良好であるように思われた。
【０１５０】
２）溶解度の比較
ジゴキシン及びジギトキシンの飽和溶液を９０％エタノールで調製し、そのＩＣＶＴ活性を「標準」ジゴキシン調製物、即ちラノキシンと比較した。
【０１５１】
粉末から調製したジゴキシン溶液はラノキシン（円形）と同程度に効果的であった（図２８）。
ジギトキシン（四角形）はここでもジゴキシンより効果的であった。
【０１５２】
ジギトキシンはジゴキシンより可溶性であり、９０％エタノール飽和溶液の調製物（１７．５ｍｇ／ｍｌ）は、エタノールの眼内安全濃度（２．５％）において、４８６μｇ／ｍｌの最大濃度にて使用することが可能となろう。
【０１５３】
ジゴキシンは、６２．５μｇ／ｍｌの濃度にてこれまでに使用した。
４８６μｇ／ｍｌは約８倍も濃縮されており、仮にジギトキシンが実際に２倍の効力があるとすれば、これまでの用量の１６倍も効果的であるものを使用することが可能になるであろう。無論、このより高濃度のものの毒性についても試験する必要がある。
【０１５４】
３）ＩＣＶＴ活性の比較
ジゴキシンとジギトキシンの新たな溶液を粉末から７０％エタノール１ｍｌ当たり２５０μｇの濃度に調製し、それらのＩＣＶＴ活性を、それらの相対的な効力を更に調べるために、「標準」ジゴキシン調製物、即ち、ＩＶラノキシンと比較した。結果を図２９に示す。
【０１５５】
上記の例に加えて、以下の更なる実施形態は、フロセミド及びジゴキシンのそれぞれ個別の効果及び組み合わせによる効果を、インビトロにおける水疱瘡ウイルスの複製及びＭＲＣ５細胞の複製及び代謝において示す。
【０１５６】
１．１．ＭＲＣ５
ヒト胎児肺組織由来の細胞系であるＭＲＣ５細胞（ヤコブス（Ｊａｃｏｂｓ）ら、１９７０年）をバイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）から入手した。細胞を１０（ｖ／ｖ）％仔牛血清（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）を補充したイーグル培地（ライフテクノロジーズ社）中にて増殖させた。ＭＲＣ５細胞は水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）原料製品に対して使用し、ＶＺＶ複製におけるイオン性反ウイルス効果を検討する実験にて使用した。
【０１５７】
１．２．細胞形態
正常細胞において許容される薬物最大濃度を、薬物含有培地におけるコンフルエントに達していない培養物を７２時間培養することにより決定した。細胞は位相差顕微鏡を使用して直接調べた。
【０１５８】
１．３．細胞複製
細胞の複製を可能にする薬物最大濃度を、７２時間後の細胞を採取し、かつ計数して、同様に決定した。細胞数における１０倍の増加は、正常細胞の複製の典型であるとみなした（７２時間において最小でも３つの集団で倍加）。
【０１５９】
１．４．ＭＴＴ（ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイ
ＭＴＴアッセイは、抗ウイルス法及びプロトコル（キンチントン（Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ），２０００年）に記載したように実施した。
【０１６０】
１．５．水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）
ＶＺＶのエレン菌株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。
１．６．ＶＺＶモノレイヤープラーク阻害アッセイ
ＶＺＶ感染細胞は、５ｃｍのペトリ皿内のＭＲＣ５細胞の予め形成されたモノレイヤーに、感染細胞懸濁液の５ｍｌを接種して、７２時間、又はウイルスのｃｐｅが最適となるまで培養することにより、試験した。細胞をホルモル生理食塩水で固定し、カルボルフクシンで染色した。
【０１６１】
２．結果
２．１．インビトロでのＶＺＶ複製におけるフロセミドの効果
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のフロセミドはＭＲＣ５細胞により十分に耐えられ、細胞形態及び複製された細胞において有害な効果は認められなかった。フロセミドは、この濃度にて、ＶＺＶプラーク形成を５０％阻害した。
【０１６２】
フロセミドＩＤ５０：１．０ｍｇ／ｍｌ［表Ｅ］
ＶＺＶの複製は、２．０ｍｇ／ｍｌ濃度におけるフロセミドにより完全に阻害された。
２．２．インビトロでのＶＺＶ複製におけるジゴキシンの効果
０．０５μｇ／ｍｌ濃度のジゴキシンはＭＲＣ５細胞により十分に耐えられ、細胞形態及び複製された細胞において有害な効果は認められなかった。ジゴキシンは、この濃度にて、ＶＺＶプラーク形成を５０％阻害した。
【０１６３】
ジゴキシンＩＤ５０：０．０５μｇ／ｍｌ［表Ｅ］
ＶＺＶ複製は、０．１μｇ／ｍｌの濃度におけるジゴキシンにより完全に阻害された。
２．３．インビトロでのＶＺＶ複製におけるフロセミド及びジゴキシンの効果
ＶＺＶ複製は、フロセミド及びジゴキシンの組み合わせたものにより、それらの個々のＩＤ５０濃度にて完全に阻害された［表Ｅ］。組み合わせられた用量では、ＭＲＣ５細胞により等しく耐えられ、細胞形態及び複製された細胞において有害な効果は認められなかった。
【０１６４】
インビトロでの水痘帯状疱疹ウイルスに対する、フロセミド及びジゴキシンの個々の効果及び組み合わせによる効果［表Ｅ］
ＮＢ。隣接する感染多重度（ＭＯＩ）の間では１０倍の差が存在した。
【０１６５】
【表１０】
2009507008.tif 000011
【０１６６】
２．４．ＭＲＣ５細胞の複製におけるフロセミドの効果
未感染のＭＲＣ５細胞は、ＶＺＶのＩＤ５０と同じ濃度である１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のフロセミドの存在下にて正常の産生にて複製した。
【０１６７】
２．５．ＭＲＣ５細胞の複製におけるジゴキシンの効果
未感染のＭＲＣ５細胞は、ＶＺＶのＩＤ５０と同じ濃度である０．０５μｇ／ｍｌの濃度のジゴキシンの存在下にて正常の産生にて複製した。
【０１６８】
２．６．ＭＲＣ５細胞の複製におけるフロセミド及びジゴキシンの効果
未感染のＭＲＣ５細胞は、フロセミド及びジゴキシンの両者がそれぞれのＶＺＶのＩＤ５０の濃度にて存在している場合、正常の産生までとはいかなかったが、複製した。これらの濃度にて、ＶＺＶの複製は完全に阻害された。
【０１６９】
２．７  ＭＲＣ５細胞の代謝におけるフロセミド及びジゴキシンの効果
ＭＲＣ５細胞の代謝におけるフロセミド及びジゴキシンの効果をＭＴＴアッセイにて調べた。フロセミド又はジゴキシンを、それぞれのＶＺＶのＩＤ５０の濃度にて培養した未感染の細胞において、代謝は正常レベルであった。フロセミド及びジゴキシンの両者がそれぞれのＶＺＶのＩＤ５０の濃度にて存在しているもので培養した未感染の細胞においても正常な代謝であった。これらの濃度において、組み合わせたものは、ＶＺＶ複製を完全に阻害した（２．３）。
【０１７０】
上記した実施例に加えて、以下の更なる実施形態は、代替的な利尿剤及び強心配糖体の効果を示す。
チアジド（ヒドロクロロチアジド及びメトラゾン）、スルホニル尿素（トルブタミド）、スルホナミド（フロセミド、アセタゾラミド、ブメタニド、トラセミド及びエタクリン酸）及びカリウム保持性利尿剤（アミロリド）の実施例についてＩＣＶＴ活性を試験した。強心配糖体であるジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン及びストロファンチンＧについても試験した。
【０１７１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を使用して、標準的なプラーク阻害アッセイを使用して、５０％のプラーク阻害用量（ＩＤ５０）を決定した。試験を容易にするために種々の溶媒が必要とされるが、これらの溶媒は時として、その濃度によっては組織培養物に対して有害であった。ある種の化合物は強力なＩＣＶＴ活性を誘引し（フロセミド、ジゴキシン、ラノキシン及びジギトキシン）、そしてそれらは高希釈、即ち溶媒の毒性が排除される実験条件下においても活性を示した。
【０１７２】
その他の化合物は「ボーダーライン」のＣＶＩ活性のみを誘引した。これらの化合物（アセタゾラミド、トルブタミド及びヒドロクロロチアジン）は同じ試験系（即ち、プラーク阻害アッセイ）にて代替的な溶媒を使用して更なる試験をし、別のもの（ブメタニド、トラセミド、トルブタミド及びヒドロクロロチアジド）は、ウイルスの産生における影響を決定するべく、ＩＣＶＴ活性に対する更に感受性の高い試験を実施した。ウイルスの産生における強心配糖体ジゴキシン及びストロファンチンの効果もまたこのアッセイにて試験した。
【０１７３】
【表１１】
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【０１７４】
上記したデータはその他の利尿剤及び強心配糖体もＩＣＶＴ効果を示すことを示す。その他の利尿剤及び強心配糖体を使用することが、ＨＰＶのようなＤＮＡウイルス感染の治療のための局所投与用ゲル製剤の文脈において可能であることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】３２℃における種々の溶媒中でのジゴキシンのみの飽和溶解度を示す。
【図２】３２℃における同じ溶媒中でのフロセミドの飽和溶解度を示す。
【図３】共溶媒混合物４０ＰＧ：４０水：２０尿素からなる基本型イボゲル製剤におけるフロセミド及びジゴキシンの３２℃での飽和溶解度を示す。
【図４】修正共溶媒混合物５０ＰＧ：４０ＥｔＯＨ：１０Ｈ２Ｏを含む提唱されたイボゲル製剤における、フロセミド及びジゴキシンの別々の飽和溶解度及び組み合わせた場合の飽和溶解度を示す。
【図５】共溶媒混合物５０ＰＧ：２０ＥｔＯＨ：２０ＰＥＧ４００：１０Ｈ２Ｏを含むゲル製剤におけるフロセミド及びジゴキシンの飽和溶解度を示す。
【図６】図３において参照された基本型のゲル混合物及び図４において参照された修正共溶媒混合物との間のフロセミド溶解度の差を示す。
【図７】基本型４０：４０：２０共溶媒混合物及び修正５０：４０：１０共溶媒混合物との間のジゴキシン溶解度の差を示す。
【図８】ゲルからのジゴキシン薬物の放出におけるｐＨの影響、特に、ｐＨ５、７及び９における１４：１のモル比のゲルから得られるジゴキシンのインビトロ放出グラフを示す。
【図９】ｐＨ５、７及び９における１４：１のモル比のゲルから得られるフロセミドのインビトロ放出グラフを示す。
【図１０】ｐＨ７における１４：１及び１：１のカルボマーゲルからのジゴキシンのインビトロ放出グラフを示す。
【図１１】ｐＨ７における１４：１及び１：１（Ｆ：Ｄ）のカルボマーゲルからのフロセミドのインビトロ放出グラフを示す。
【図１２】Ｕｌｔｒｅｚカルボマーで粘度が増強されている修正ゲル製剤を用いた、ジゴキシン及びフロセミドのインビトロ放出グラフを示す。
【図１３】ＨＰＣで粘度が増強されている修正ゲル製剤を用いた、ジゴキシン及びフロセミドのインビトロ放出グラフを示す。
【図１４】ＨＰＣで粘度が増強されているアンプルゲル製剤を用いた、ジゴキシン及びフロセミドのインビトロ放出グラフを示す。
【図１５】Ｕｌｔｒｅｚ又はＨＰＣで粘度が増強されたｐＨ５の製剤でのゲル１：１４（Ｄ：Ｆ）からのジゴキシン及びフロセミドのインビトロ放出の比較を示す。
【図１６】基本型ゲルに関する、ヒト足底の硬化した皮膚を透過するフロセミドの累積透過を示す。
【図１７】基本型ゲルに関する、ヒト足底の硬化した皮膚を透過するジゴキシンの累積透過を示す。
【図１８】基本型ゲルに関する、ヒト足底の硬化した皮膚を透過するジゴキシン及びフロセミドの累積透過を示す。
【図１９】基本型ゲルに関する、ヒト足底の硬化した皮膚を透過するジゴキシン及びフロセミドの累積透過グラフをモル量として示す。
【図２０】基本型ゲルに関する、ヒト足底の硬化した皮膚を透過するジゴキシン及びフロセミドの累積透過グラフを適用量％として示す。
【図２１】３種類のゲル製剤からのヒトの硬化した皮膚を透過するフロセミドのインビトロ透過を示す。
【図２２】図２１に記載の３種類のゲル製剤からのヒトの硬化した皮膚を透過するジゴキシンのインビトロ透過を示す。
【図２３】ヒトの硬化した皮膚を透過するフロセミドのインビトロ透過を、修正ＭＡＸジゴキシンゲル製剤と比較した基本型ゲル製剤で示す。
【図２４】ヒトの硬化した皮膚を透過するジゴキシンのインビトロ透過を、修正ＭＡＸジゴキシンゲル製剤と比較した基本型ゲル製剤で示す。
【図２５】ジゴキシンを使用した、単純ヘルペスウイルスの４０％から６０％の間のプラーク形成の阻害、即ち、ＩＣ５０の効果及び感染性ウイルス粒子形成の９０％から９９％までの阻害を示す。
【図２６】アデノウイルスを使用する例において、組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすために使用される量は、各薬物のＩＣ５０の４分の１のみで十分であることを示す図である。
【図２７】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）において、二つの薬物を組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすためには、各薬物のＩＣ５０の３分の１のみで十分であることを示す図である。
【図２７Ａ】ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシンのＩＣＶＴ効力を比較するグラフである。
【図２８】ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシンのＩＣＶＴ効力を比較するグラフである。
【図２９】ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシンのＩＣＶＴ効力を比較するグラフである。
【図３０】ＩＤ５０の濃度のジゴキシン及びＩＤ５０の濃度のフロセミドの単独の場合及び組み合わせた場合のＶＺＶの阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２７Ａ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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