(57)【要約】  本発明は、D-アラニンおよび/またはD-セリン選択に基づくダイズ(Glycine max)の形質転換のための改善された方法および手段に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製するための方法:
a.  ダイズ細胞または組織に、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を導入するステップ、および
b.  約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体を含む選択培地上で、少なくとも5日間の期間、ステップ(a)のダイズ細胞または組織をインキュベートするステップ、および
c.  ステップ(b)のダイズ細胞または組織を再生培地に移し、該DNA構築物を含むダイズ植物を再生および選択するステップ。
【請求項２】
ダイズにおいて活性なプロモーターが双子葉植物種由来のユビキチンプロモーターもしくはアクチン2プロモーター、またはp-ScBVもしくはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターである、請求項１に記載のいずれかの方法。
【請求項３】
植物ユビキチンプロモーターが、であり、共培養後に選択圧が適用される場合、それは以下のステップのうち1以上を含む、請求項２に記載の方法:
a.  シュート誘導時に選択を行なわない最初のステップ、
b.  シュート誘導期の間に選択を行うステップ、
c.  シュート伸長期を通じて選択を行うステップ。
【請求項４】
ダイズにおいて活性なプロモーターが以下からなる群から選択される、請求項２または３に記載の方法:
(a)  配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(b)  配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50個連続した塩基対の断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列、
(c)  配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有し、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、
(d)  配列番号７または８に記載の配列に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズし、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列。
【請求項５】
以下のステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法:
(a)  ダイズ実生の初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を提供するステップ、および
(b)  トランスジェニックT-DNAを含むリゾビウム科細菌と腋生分裂組織を共培養するステップであって、該トランスジェニックT-DNAが、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を含む、ステップ、
(c)  以下のものを含むシュート誘導および選択培地上に、共培養した腋生分裂組織を移すステップ:
(i)  腋生分裂組織からde novoシュート誘導を誘導するために好適な濃度の少なくとも1種の植物成長因子、および
(ii)  約3 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体、および
(iii)  場合により、リゾビウム科細菌の増殖を阻害するために好適な1種以上の抗生物質、
および該共培養した腋生分裂組織を、少なくとも5日間の期間、前記培地上で、そこからシュートが誘導されて発達するまで培養し、かつ該シュートを単離するステップ、および
(d)  単離したシュートを発根培地に移し、該シュートを該発根培地上で、該シュートが根を形成するまで培養し、さらにそのように誘導された小植物体を成熟植物に再生させるステップであって、該成熟植物がそのゲノムに挿入された該トランスジェニックT-DNAを含む、ステップ。
【請求項６】
D-セリンを代謝できる酵素が、以下からなる群:
(i)  表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼ、
(ii)  表Iに示されるD-セリンアンモニアリアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、
(iii)  表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼの核酸配列に対して少なくとも80％のコード化核酸配列における同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv)  表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、3 mM〜100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択を行うか、
または、D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、
(iii)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼの核酸配列に対して少なくとも80％のコード化核酸配列における同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、3 mM〜100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を、以下からなる群から選択される形式で提供する、請求項５または６に記載の方法:
(i)  実質的に実生全体によって提供される実生の腋生分裂組織、および
(ii)  初生葉またはより高次の葉を、腋生分裂組織が葉の葉柄に結合したままであるように解剖することによって提供される葉の腋生分裂組織、および
(iii)  増殖させた腋生分裂組織。
【請求項８】
ステップ(b)および/または(c)の培地が以下のものを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法:
(a)  約1μM〜約10μM 6-ベンジルアミノプリンの濃度と等価な濃度のサイトカイニンおよび/または
(b)  約0.1μM〜約2μMの範囲のジベレリン酸(GA3)、およびまたは
(c)  少なくとも1種のチオール化合物。
【請求項９】
サイトカイニンが1μM〜10μMの濃度のカイネチンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素が、D-セリンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.18)、D-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3)、およびD-アラニントランスアミナーゼ(EC 2.6.1.21)からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
D-セリンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i)  配列番号２によってコードされるE.coli D-セリンアンモニアリアーゼ、および
(ii)  配列番号２によってコードされる配列に対して少なくとも60％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii)  配列番号１に記載の配列の相補体に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i)  配列番号４または６によってコードされるRhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii)  配列番号４または６によってコードされる配列に対して少なくとも60％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii)  配列番号３または５に記載の配列の相補体に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(i)  約3〜約30 mM D-アラニンを使用すること、
(ii)  約30〜50mM D-セリンを使用すること、および/または
(iii)  約1〜10mM D-セリンを30mM以下のD-アラニンと組み合わせて、好ましくはおよそ5〜7mM D-セリン、例えば7.5mM、および10mM〜20mM D-アラニンを使用すること
によって、脱分化条件下で約3〜4週間にわたり選択を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
dsda遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a.  選択を伴わないシュート誘導で5〜10日間、
b.  5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、
c.  シュート伸長期を通じて2mM〜7mM D-セリン。
【請求項１５】
dao1遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a.  選択を伴わないシュート誘導で5〜10日間、
b.  5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、
c.  シュート伸長期を通じて2mM〜7mM D-アラニン。
【請求項１６】
dao1遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a.  選択を伴わないシュート誘導での5〜10日間、例えば5〜7日間、
b.  5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを加え、かつ5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、例えば3週間、
c.  シュート伸長期を通じて2mM〜7mM、例えば5 mM D-セリンおよび2mM〜7mM、例えば5 mM D-アラニン。
【請求項１７】
DNA構築物の導入をリゾビウム科細菌媒介形質転換によって媒介する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
リゾビウム科細菌が、安全化されたAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes細菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
アグロバクテリウム株が、安全化されたAgrobacterium rhizogenes K599株である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップを含む、ダイズ細胞または植物を作製する方法:
(i)  以下のものを含む第１DNA構築物でダイズ細胞を形質転換するステップ:
(a)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アミノ酸オキシダーゼ酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物であって、第１発現カセットには該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列に隣接している、第１発現構築物、および
(b)  農学的に有益な形質を該植物に付与するために好適な少なくとも1つの第２発現カセットであって、第２発現カセットは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列間に位置しない、第２発現カセット、および
(ii)  植物毒性濃度のD-アラニン、D-セリンまたはその誘導体からなる群から選択される第１化合物で、ステップ(i)の形質転換されたダイズ植物細胞を処理し、該D-アミノ酸オキシダーゼの発現によって該第１化合物に対する耐性を該形質転換植物細胞に付与する該第１DNA構築物をゲノム中に含む植物細胞を選択するステップ、および
(iii)  該形質転換植物細胞のゲノムからの該第１発現カセットの欠失を誘導し、該第１発現カセットを依然として含む植物細胞に対して有毒な濃度のD-イソロイシン、D-バリンおよびその誘導体からなる群から選択される第２化合物で該植物細胞を処理し、それによって、該第２発現カセットを含むが該第１発現カセットを欠いている植物細胞を選択するステップ。
【請求項２１】
(a)  プロモーターが請求項２〜４のいずれか１項と同様に規定され、および/または
(b)  D-アミノ酸オキシダーゼが請求項１１と同様に規定される、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
以下のもの:
(a)  ダイズユビキチンプロモーター; 双子葉植物種由来のアクチン2プロモーターおよびp-ScBVまたはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、およびそれに機能しうるように連結されている
(b)  D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
を含み、かつ、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である、異種ヌクレオチド配列。
【請求項２３】
以下のもの:
(a)  以下からなる群から選択されるプロモーター:
(i)  配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(ii)  配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50個連続した塩基対の断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列、および
(iii)  配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有し、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、および
(iv)  配列番号７または８に記載の配列に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズし、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、
ならびに
(b)  表1に記載のD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
を含み、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である、異種ヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ダイズ植物または細胞において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含むDNA構築物であって、該プロモーターが該酵素をコードする配列に対して異種性であるDNA構築物を含む、ダイズ植物または細胞。
【請求項２５】
請求項DNA １８〜２０のいずれか１項に記載の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ植物または細胞。
【請求項２６】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のダイズ植物の部分または種子。
【請求項２７】
以下のステップを含む、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法:
(a)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現構築物を含む第１構築物で形質転換するステップ、および
(b)  D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない第２選択マーカー遺伝子を含む第２構築物で形質転換するステップ。
【請求項２８】
第２マーカー遺伝子が、ホスフィノトリシン、ジカンバ、グリフォセート、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン-型の除草剤または抗生物質からなる群から選択される少なくとも1つの化合物に対する耐性を付与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
以下を含むダイズ植物:
(a)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む第１発現構築物、および
(b)  D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない選択マーカー遺伝子に関する第２発現構築物。
【請求項３０】
以下のステップを含む、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法:
(a)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物で形質転換し、D-セリンで選択するステップ、および
(b)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物で形質転換し、D-アラニンで選択するステップ。
【請求項３１】
以下を含むダイズ植物:
(a)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物、および
(b)  ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物。
【請求項３２】
以下のステップ:
a.  実生を殺菌するステップ;
b.  3〜10日間、好ましくは5〜8日間、例えば7日間、明所で、実生を育てるステップ;
c.  単葉身の葉を有する上胚軸を子葉の長さまたはそれ以上にまで育てるステップ;
d.  上胚軸を0.5cm〜4cmの範囲; 例えば0.7cm以上、1.0cm以上、または2cm以下まで育てるステップ;
e.  頂端分裂組織を含むすべてのあらかじめ形成された葉を取り出すステップ;
f.  数回の切断により第１セットの葉に位置する節を傷つけるステップ;
g.  傷つけられた節を液体培地中で0.1〜1時間、例えば0.5時間にわたり、アグロバクテリウム混合物と共培養するステップ;
h.  固体共培養培地上で暗所で3〜5日間、節をアグロバクテリウムと共培養するステップ;
i.  外植片を、選択のため、18時間 明/6時間 暗のサイクル条件下、70〜100μE/m2sに、上胚軸の上の第１の節で腋生分裂組織が成長するまで置くステップ;
j.  形質転換前で共培養の2週間後までに形成されたシュートを取り出し、場合により、この期間中に外植片を切断して、より小さい切片にするステップ;
k.  共培養の2〜4週間後に外植片をシュート原基伸長培地に移し、シュートが伸長するまで、死滅組織を除去した後に選択物質を含む新鮮培地に2〜3週間毎に外植片を移すステップ;
l.  外植片からシュート3cm以上を取り出し、根が形成され始めるまで1週間にわたり、発根誘導培地に入れるステップ;
m.  発根したシュートを土壌に移し、育成チャンバー中で2〜3週間ハードニング処理した後に、発根したシュートを温室に移すステップ
のうちの1以上、例えばすべてのステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項の方法。
【請求項３３】
トランスジェニックダイズ植物細胞、トランスジェニックダイズ植物組織、トランスジェニックダイズ植物器官またはトランスジェニックダイズ植物体またはその部分の選択、再生、育成、培養または維持のための組成物であって、トランスジェニックダイズ植物細胞、ダイズ植物組織、ダイズ植物器官またはダイズ植物体またはその部分の選択を可能にするD-アラニン、D-セリン、またはその誘導体の有効量、およびトランスジェニックダイズ生物、トランスジェニックダイズ細胞、トランスジェニック細胞培養物、トランスジェニックダイズ植物体および/またはその部分を含む、組成物。
【請求項３４】
第１セットの葉に位置する節に由来する1個以上の胚形成カルス、およびおよそ5〜10mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む細胞培養物。
【請求項３５】
ダイズ標的組織および、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を含む選択培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、D-アラニンおよび/またはD-セリン選択に基づく、ダイズ(Glycine max)の形質転換のための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ダイズ(Glycine max)はマメ(Fabaceae (Leguminosae))科に属する。ダイズは中国原産であると考えられる。天然にはダイズの野生型はつる植物(viny)であり、そのことは、米国でダイズが乾草作物として最初に導入された理由を説明する。中国、満州(Manchuria)、韓国および日本からの導入は、米国向けの変種の開発に重要であった。より直立した成長、倒伏の低減、および種子サイズの増加等の農学的形質を改善するための現代の育種努力は、ダイズが世界的に重要な作物に発達することに主に関与してきた。穀物として収穫されるこの作物のエーカー数および割合は着々と増加してきた。そして今日、ダイズは主要な世界的穀物である。
【０００３】
栽培ダイズは世界中で実質的な商品価値を有する。世界中で5000万超のヘクタールが100メートルトンを超えるダイズの一年生作物を生産するために使用されていて、その評価額は200億ドルを超える。したがって、この作物の量および品質の改善に有用な科学的方法の開発は、かなりの商業的重要性を有する。ダイズは、タンパク質、油、調味料および化学原料の供給源として広く使用されている。従来の植物育種によって栽培ダイズ種の品質を改善するためにかなりの努力が払われてきた。そして、いくつかの主要な成功が記録されている。しかしながら、従来の植物育種の方法は、あるダイズ種から別のダイズ種への遺伝子および形質の移動に限定されている。
【０００４】
現代の生物工学的研究および開発は、植物遺伝子工学による農産物の改善に有用な技術を提供している。植物遺伝子工学には、所望の遺伝子または遺伝子群を作物植物の遺伝性生殖細胞系に導入して、該遺伝子が、現代農業で使用される優良種に組み込まれるか、または優良種中に含まれうるようにすることが含まれる。遺伝子導入技術によって、改善された耐病性、除草剤耐性、および増加した栄養価を有する新規クラスの優良作物種の開発が可能になる。植物組織に遺伝子を導入するための種々の方法が開発されている。該方法には、高速マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接DNA取り込み、およびアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介遺伝子形質転換が含まれる。双子葉植物に広く使用されているが、粒子衝突、エレクトロポレーション、またはアグロバクテリウム媒介送達を使用するダイズへのDNA送達は困難であることがわかっている。これは、部分的に、ダイズにおいて全能性であることが見出されている細胞が少数であるせいである(Trick 1997)。通常使用される2つの方法は、子葉-節の腋生分裂組織をターゲティングするアグロバクテリウムベースの方法(Hinchee 1988)および成熟接合胚の粒子衝突を使用する方法(Finer 1991)である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
有効な選択物質の欠如は、種々のダイズ形質転換方法の効率における障害の1つである。組織培養選択系の効力は多数の要因に依存し、該要因には、組織タイプ、外植片のサイズ、選択物質の化学的特性および濃度および適用期間が含まれる。最も使用される選択方法はネガティブ選択として知られている。ネガティブ選択では、植物毒性物質(例えば除草剤または抗生物質)に対する耐性を付与する選択マーカーを使用する。これまでに使用されているネガティブ選択マーカーは、主に、ネオマイシン3'-O-ホスホトランスフェラーゼ(nptII)、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT; Bialophos(登録商標)耐性とも称される; bar; de Block 1987; EP 0 333 033; US 4,975,374)、5-エノールピルビルシキマート-3-リン酸シンターゼ(EPSPS; Glyphosate(登録商標)(N-(ホスホノメチル)グリシン)に対する耐性を付与する; およびハイグロマイシンBに限定される。最近、別の選択マーカー系、例えばD-アミノ酸代謝酵素(例えばD-アミノ酸デヒドラターゼまたはオキシダーゼ)に基づく系が、一般的基礎に基づいて報告されている(WO 03/060133; Erikson 2004)。しかしながら、ダイズで使用するためのそのような系の採用および/または最適化はこれまで報告されていない。したがって、本発明の目的は、D-アミノ酸選択に基づく、Glycine max植物を形質転換するための改善された効率的方法を提供することである。この目的を本発明によって達成する。
【０００６】
ダイズの形質転換に関連する問題のいくつかは当技術分野で報告されている方法によって克服されたが、改善に関する重大な必要性が依然として存在する。その理由は、これまでに公知のすべての方法が低〜中程度の形質転換効率、特に再生効率しか有さないからである。アグロバクテリウム媒介形質転換方法の分野において重大な進歩が成されたが、ダイズ植物の形質転換のためのそのような方法の容易さ、速度および効率を促進する改善された方法の必要性が継続的に存在する。したがって、トランスジェニックダイズ植物を作製するプロセスにおいて、より高い全体的効率を有する改善された方法を提供することが本発明の目的であった。この目的を本発明によって解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明の第1の実施形態は、以下のステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製するための方法に関する:
a.  ダイズ細胞または組織に、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を導入するステップ、および
b.  約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体を含む選択培地上で、少なくとも5日間、ステップ(a)のダイズ細胞または組織をインキュベートするステップ、および
c.  ステップ(b)のダイズ細胞または組織を再生培地に移し、該DNA構築物を含むダイズ植物を再生および選択するステップ。
【０００８】
種々のプロモーターがダイズにおいて機能的であると知られており、それらは本発明の方法を実行するために好適であるが、特にユビキチンプロモーターは驚くほど高い選択効率を生じさせることが見出されている。ゆえに、好ましい実施形態では、ダイズにおいて活性なプロモーターは双子葉植物由来のユビキチンプロモーターである。さらに好ましくは、植物ユビキチンプロモーターは、パセリ(Petroselinum crispumまたはLomatium foeniculaceum)ユビキチンプロモーターまたはダイズ(Glycine max)ユビキチンプロモーター、最も好ましくはユビキチンプロモーター(または下記のその誘導体または断片)である。パセリユビキチンおよびダイズユビキチンプロモーターの配列を以下に提供する。プロモーター配列を、その転写特性を重大に改変することなく大きな程度に改変(例えば末端切断、融合、突然変異)できることが当業者に公知である。ゆえに、本発明の好ましい一実施形態では、ダイズにおいて活性なプロモーターは以下のものからなる群から選択される:
(a)  配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(b)  配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50 (好ましくは100または150、より好ましくは200または250、さらにより好ましくは300または500)個連続した塩基対からなる断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列、
(c)  配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性を有し、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列を含む配列、
(d)  配列番号７または８に記載の配列に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いるハイブリダイゼーション(37℃)、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中での洗浄(50〜(好ましくは) 55℃))、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中(37℃)、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中での洗浄(55〜(好ましくは) 60℃))、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中(37℃)、および0.1 x SSC中での洗浄(60〜(好ましくは) 65℃)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズし、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列を含む配列。
【０００９】
好ましくは、本発明の方法は以下のステップを含む:
(a)  ダイズ実生の初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を提供するステップ、および
(b)  トランスジェニックT-DNAを含むリゾビウム科(Rhizobiaceae)細菌と該腋生分裂組織を共培養するステップ(該トランスジェニックT-DNAは、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を含む)、
(c)  以下のものを含むシュート誘導および選択培地上に該共培養した腋生分裂組織を移すステップ:
(i)  該腋生分裂組織からde novo(新規)シュート誘導を誘導するために好適な濃度の少なくとも1種の植物成長因子、および
(ii)  約3 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体、および
(iii)  場合により、リゾビウム科細菌の増殖を阻害するために好適な1種以上の抗生物質、
および該共培養した腋生分裂組織を、少なくとも5日間、前記培地上で、そこからシュートが誘導されて発達するまで培養し、該シュートを単離するステップ、および
(d)  該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートを該発根培地上で、該シュートが根を形成するまで培養し、そのように誘導された小植物体を成熟植物(該植物はそのゲノムに挿入された該トランスジェニックT-DNAを含む)にさらに再生させるステップ。
【００１０】
本発明の好ましい一実施形態では、DNA構築物またはT-DNA (D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる該酵素の該第１発現カセットを含む)は、農学的に有益な形質を該ダイズ植物に付与する少なくとも1つの第２発現構築物をさらに含む。
【００１１】
腋生分裂組織に基づく方法では、種々の供給源由来の外植片組織および/または細胞を使用することができる。好ましくは、初生またはより高次の節の腋生分裂組織を、以下からなる群から選択される形式で提供する:
(i)  実質的に実生全体によって提供される実生の腋生分裂組織、および
(ii)  初生葉またはより高次の葉を、腋生分裂組織が葉の葉柄に結合したままであるように解剖することによって提供される葉の腋生分裂組織、および
(iii)  増殖させた腋生分裂組織。
【００１２】
本発明の(特に腋生分裂組織に基づく方法に関する)好ましい一実施形態では、ステップ(b)(共培養)、および/または(c)(シュート誘導および選択)のうち少なくとも1つの培地は、約1μM〜約10μM 6-ベンジルアミノプリンの濃度と等価の濃度のサイトカイニンを含む。さらにまた、ステップ(b)および/または(c)の少なくとも1つの該培地は、約0.1μM〜約2μMの範囲のジベレリン酸(GA3)をさらに含んでよい。さらに、ステップ(b)および/または(c)の少なくとも1つの該培地は、少なくとも1種のチオール化合物(例えばDTT、またはシステイン)をさらに含む。
【００１３】
D-セリンおよび/またはD-アラニン代謝酵素として使用できる種々の酵素が当業者に公知である。好ましくは、D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素は、D-セリンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.18)、D-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3)、およびD-アラニントランスアミナーゼ(EC 2.6.1.21)からなる群から選択される。より好ましくは、D-セリンを代謝できる酵素は以下の酵素からなる群から選択される:
(i)  配列番号２によってコードされる大腸菌(E.coli) D-セリンアンモニアリアーゼ、および
(ii)  配列番号２によってコードされる配列に対して、少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(ii)  配列番号１に記載の配列の相補体に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中で50〜(好ましくは) 55℃での洗浄)、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中で55〜(好ましくは) 60℃での洗浄)、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.1 x SSC中で60〜(好ましくは) 65℃での洗浄)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素。
【００１４】
これらの酵素に関して、好ましくは、約1 mM〜約100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択が行われる。
【００１５】
また、より好ましくは、D-セリンおよび/またはD-アラニンを代謝できる酵素は以下の酵素からなる群から選択される:
(i)  配列番号４または６によってコードされるRhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii)  配列番号４または６によってコードされる配列に対して、少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii)  配列番号３または５に記載の配列の相補体に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中で50〜(好ましくは) 55℃での洗浄)、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中で55〜(好ましくは) 60℃での洗浄)、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.1 x SSC中で60〜(好ましくは) 65℃での洗浄)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素。
【００１６】
これらの酵素に関して、好ましくは、約1 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択が行われる。
【００１７】
D-アミノ酸または下記の関連化合物に基づく選択スキームを行うための種々の様式が存在する。好ましくは、(例えば一般的方法のステップ(b)または腋生分裂組織に基づく方法のステップ(c)の)選択は、
(i)  約3〜約20 mM D-アラニンおよび/またはD-セリンを使用し、および/または
(ii)  脱分化条件下で約3〜4週間で、
行う。
【００１８】
好ましくは、D-アラニン(例えば唯一の選択化合物として使用される場合)は、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約20 mMの濃度で使用される。好ましくは、D-セリン(例えば唯一の選択化合物として使用される場合)は、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの濃度で使用される。
【００１９】
好ましい一実施形態では、DNA構築物の導入はリゾビウム科細菌媒介形質転換によって媒介される。好ましくは、リゾビウム科細菌は、安全化(disarmed)されたAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes細菌である。より好ましくは、該アグロバクテリウム株は、安全化されたAgrobacterium rhizogenes K599株である。
【００２０】
上述のように、特にユビキチンプロモーターの使用は有益であることが示されていた。以下で提供される構築物は新規であり、本発明を実行するために特に有用である。さらにまた、それらは、さらに他の植物種での使用も提供しうる。したがって、本発明の別の実施形態は、以下のものを含む異種ヌクレオチド配列に関する:
(a)  双子葉植物種由来のユビキチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、およびそれに機能しうるように連結されている、
(b)  D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
但し該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である。
【００２１】
好ましくは、ユビキチンプロモーターは、パセリユビキチンプロモーターまたはダイズユビキチンプロモーターである。上記のように、これらのプロモーターの配列は、その転写能力を変化させることなく、改変することができる。したがって、本発明の別の実施形態は、以下のものを含む異種ヌクレオチド配列に関する:
(a)  以下のものからなる群から選択されるプロモーター:
(i)  配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(ii)  配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50 (好ましくは100または150、より好ましくは200または250、さらにより好ましくは300または500)個連続した塩基対からなる断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列、
(iii)  配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性を有し、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列を含む配列、
(iv)  配列番号７または８に記載の配列に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中で50〜(好ましくは) 55℃での洗浄)、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中で55〜(好ましくは) 60℃での洗浄)、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.1 x SSC中で60〜(好ましくは) 65℃での洗浄)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズし、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列を含む配列、
および
(b)  D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
但し、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、以下に提供される方法によって作製されるダイズ細胞および植物に関する。ゆえに、別の実施形態は、該ダイズ植物または細胞において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含むDNA構築物(その場合、該プロモーターは該酵素をコードする配列に対して異種性である)を含むダイズ植物または細胞に関する。好ましくは、該プロモーターおよび/またはD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素は上記のように定義される。より好ましくは、該ダイズ植物または細胞は、農学的に有益な形質を該ダイズ植物に付与する少なくとも1つの第２発現構築物をさらに含む。本発明の他の実施形態は、該ダイズ植物の部分(非限定的にダイズ種子(ダイズ)を含む)および、食物、飼料、および工業目的でのその使用に関する。
【００２３】
D-アミノ酸オキシダーゼに基づく場合、本発明の方法は組み合わせた選択/マーカー欠失スキームとして使用することができる。使用されるD-アミノ酸に基づき、D-アミノ酸オキシダーゼはネガティブまたは対抗選択マーカーとして働きうる。ゆえに、本発明は、ダイズ細胞および植物(それらは好ましくはマーカーを含まない)を提供するための方法であって、以下のステップを含む方法をさらに提供する:
(i)  以下のものを含む第１DNA構築物でダイズ植物細胞を形質転換するステップ:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、D-アミノ酸オキシダーゼ酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物(その場合、該第１発現カセットは、該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列によって隣接されている)、および
(b)  農学的に有益な形質を該植物に付与するために好適な少なくとも1つの第２発現カセット(その場合、該第２発現カセットは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列間に位置しない)、および
(ii)  植物毒性濃度のD-アラニン、D-セリンまたはその誘導体からなる群から選択される第１化合物でステップ(i)の該形質転換ダイズ植物細胞を処理し、該D-アミノ酸オキシダーゼの発現によって該第１化合物に対する耐性を該形質転換植物細胞に付与する該第１DNA構築物をゲノム中に含む植物細胞を選択するステップ、および
(iii)  該形質転換植物細胞のゲノムから該第１発現カセットの欠失を誘導し、該第１発現カセットを依然として含む植物細胞に対して有毒な濃度のD-イソロイシン、D-バリンおよびその誘導体からなる群から選択される第２化合物で該植物細胞を処理し、それによって、該第２発現カセットを含むが、該第１発現カセットを欠いている植物細胞を選択するステップ。
【００２４】
好ましくは、プロモーター配列およびD-アミノ酸オキシダーゼ酵素は、一般的方法に関して上述される通り定義される。
【００２５】
ダイズに関しては、効率的形質転換系および特に選択マーカーの不足が存在する。この不足により、複数の連続する(subsequent)形質転換に依存するアプローチに特に注意が向けられる。この問題を克服する一方法は、上に挙げる組み合わせの選択およびマーカー欠失方法である。別の方法は、異なる選択系を組み合わせることに基づく。したがって、本発明の別の実施形態は、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現構築物を含む第１構築物で形質転換するステップ、および
(b)  D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない第２選択マーカー遺伝子を含む第２構築物で形質転換するステップ。
【００２６】
好ましくは、該第２マーカー遺伝子は、ホスフィノトリシン(phosphinotricin)、ジカンバ(dicamba)、グリフォセート、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン(imidazolinone)-型の除草剤または抗生物質からなる群から選択される少なくとも1つの化合物に対する耐性を付与する。また、そのような該方法の産物は新規であり、かつ従来技術より発明的に優れている。ゆえに本発明の別の実施形態は、以下のものを含むダイズ植物に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む第１発現構築物、および
(b)  D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない選択マーカー遺伝子に関する第２発現構築物。
【００２７】
異なる選択マーカー系だけでなく、以下に挙げるマーカーと組み合わせることができる。また、本明細書中で提供される異なるマーカーを(前もって欠失させることなく)組み合わせて、連続して多重形質転換を達成することができる。したがって、本発明の別の実施形態は、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物で形質転換し、D-セリンで選択するステップ、および
(b)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物で形質転換し、D-アラニンで選択するステップ。
【００２８】
また、該方法の産物は新規であり、かつ従来技術に対して進歩性があると考えられる。ゆえに本発明の別の実施形態は、以下のものを含むダイズ植物に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物、および
(b)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物。
【００２９】
本発明の他の目的、利点、および特徴は以下の明細書から明らかになる。
【００３０】
全般的定義
国際特許出願WO 03/004659 (RECOMBINATION SYSTEMS AND A METHOD FOR REMOVING NUCLEIC ACID SEQUENCES FROM THE GENOME OF EUKARYOTIC ORGANISMS)、WO 03/060133 (SELECTIVE PLANT GROWTH USING D-AMINO ACIDS)、国際特許出願PCT/EP 2005/002735、国際特許出願PCT/EP 2005/002734 (WO 2005/090581)、出願第60/606,789号(2004年9月2日提出)、および国際出願PCT/EP2005/009366において使用および記載されている教授内容、方法、配列等は、参照によりここに組み入れられる。
【００３１】
略語: BAP - 6-ベンジルアミノプリン; 2,4-D - 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸; MS - ムラシゲ・スクーグ(Murashige and Skoog)培地(Murashige T and Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15, 472-497); NAA - 1-ナフタレン酢酸; MES, 2-(N-モルホリノ-エタンスルホン酸, IAA インドール酢酸; IBA: インドール酪酸; Kan: 硫酸カナマイシン; GA3 - ジベレリン酸; TimentinTM: チカルシリン二ナトリウム/クラブラン酸カリウム。
【００３２】
本発明は上記の特定の方法論、プロトコル、セルライン、植物種または属、構築物、および試薬等に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語法は単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。本明細書および特許請求の範囲で使用される単数形「a」、「and」、および「the」には、文脈上で特に指定されない限り、複数への参照が含まれることに留意する必要がある。ゆえに、例えば、「a vector」への言及は1つ以上のベクターへの言及であり、それには、当業者に公知のその等価物が含まれる、等である。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「約(about)」は、おおよそ(approximately)、概略で(roughly)、およそ(around)、または付近で(in the region of)あることを意味する。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、それは、記載される数値の上下に境界を広げることによってその範囲を修飾する。一般に、本明細書中で使用される用語「約」は、20パーセント、好ましくは10パーセント、より好ましくは5パーセント上または下(高または低)の変動によって指定値の上下で数値を修飾する。
【００３４】
本明細書中で使用される単語「または」とは、特定のリストのいずれか1つのメンバーを意味し、また、該リストのメンバーの任意の組み合わせも含まれる。
【００３５】
「農学的に有益な形質」には、食糧生産または食品(植物部分および植物生成物が含まれる)に有用または有益な植物生体中の任意の表現型が含まれる。非食物農産物、例えば紙、等も含まれる。農学的に有益な形質の部分的リストには、病虫害抵抗性、めざましい成長、発育期間(収穫までの期間)、高い栄養分、新規生育パターン、香味または色、塩、熱、乾燥および寒冷耐性、等が含まれる。好ましくは、農学的に有益な形質に、選択マーカー遺伝子(例えば、形質転換細胞の検出または選択を容易にするためにのみ使用される除草剤または抗生物質耐性をコードする遺伝子)、植物ホルモン(例えば、選択のためにのみ使用されるオーキシン、ジベレリン(gibberllins)、サイトカイニン、アブシシン酸およびエチレン)の生産を生じさせるホルモン生合成遺伝子、またはレポーター遺伝子(例えばルシフェラーゼ、グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT、等))は含まれない。そのような農学的に有益な重要形質には、病虫害抵抗性(例えばMelchers 2000)、めざましい成長、発育期間(収穫までの期間)、高い栄養分、新規生育パターン、香味または色、塩、熱、乾燥、および寒冷耐性(例えばSakamoto 2000; Saijo 2000; Yeo 2000; Cushman 2000)、等の改善が含まれうる。当業者は、前記および他の農学的に有益な形質を付与するよう選択される対象の多数のポリヌクレオチドが存在することを認識している。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸配列」とは、アミノ酸残基を表す略語(abbreviations)、文字(letters)、活字(characters)または単語(words)のリストを表す。本明細書中のアミノ酸は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される、その一般に公知の3文字記号または1文字記号によって表される。同様にヌクレオチドは、その通常許容される1文字コードによって表される。本明細書中で使用される略語は、以下のアミノ酸に関する慣用の1文字コードである: A, アラニン; B, アスパラギンまたはアスパラギン酸; C, システイン; D アスパラギン酸; E, グルタマート, グルタミン酸; F, フェニルアラニン; G, グリシン; H ヒスチジン; I イソロイシン; K, リシン; L, ロイシン; M, メチオニン; N, アスパラギン; P, プロリン; Q, グルタミン; R, アルギニン; S, セリン; T, スレオニン; V, バリン; W, トリプトファン; Y, チロシン; Z, グルタミンまたはグルタミン酸(L. Stryer, Biochemistry, 1988, W. H. Freeman and Company, New Yorkを参照のこと)。本明細書中で使用されるアミノ酸配列内の文字「x」は任意のアミノ酸残基を表しうる。
【００３７】
用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンス形式のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーまたはハイブリッドを表す。特に指定されない限り、特定の核酸配列は、明示的に指定された配列のみならず、保存的に改変されたその変異体(例えば縮重コドン置換)および相補配列を暗黙的に包含する。用語「核酸」は、本明細書中で、「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。
【００３８】
本明細書中で使用されるフレーズ「核酸配列」とは、ヌクレオチドを表す略語、文字、活字または単語の連続したリストを表す。一実施形態では、核酸は、通常100ヌクレオチド長未満の比較的短い核酸である「プローブ」でありうる。核酸プローブは約50ヌクレオチド長〜約10ヌクレオチド長であることが多い。核酸の「標的領域」は、重要であることが特定される核酸の部分である。核酸の「コード領域」は、配列特異的様式で転写および翻訳され、適切な調節配列のコントロール下に置かれると特定のポリペプチドまたはタンパク質になる核酸の部分である。コード領域はそのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードすると考えられる。特に指定されない限り、特定の核酸配列は、明示的に指定された配列のみならず、保存的に改変されたその変異体(例えば縮重コドン置換)および相補配列を暗黙的に包含する。用語「核酸」は、本明細書中で、「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。
【００３９】
用語「目的のヌクレオチド配列」とは、当業者によって、何らかの理由で(例えば改善された品質を付与するために)その操作が望ましいと考えられる任意のヌクレオチド配列を表す。そのようなヌクレオチド配列には、非限定的に、構造遺伝子(例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬物耐性遺伝子、成長因子、等)のコード配列、およびmRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード調節配列、(例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、終結配列、エンハンサー配列、等)が含まれる。目的の核酸配列は、好ましくは、農学的に有益な形質をコードしうる。
【００４０】
用語「アンチセンス」は、標的配列、例えばメッセンジャーRNA (mRNA)配列(該標的配列は、その発現のブロックが該標的配列とのハイブリダイゼーションによって開始されるよう求められる)に相補的な配列を有する核酸を意味すると理解される。
【００４１】
用語「センス」は、標的配列、例えばタンパク質転写因子に結合し、かつ所定の遺伝子の発現に関与する配列、と相同または同一の配列を有する核酸を意味すると理解される。好ましい実施形態では、該核酸は、目的の遺伝子および該目的の遺伝子の発現を可能にする要素を含む。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「相補的」または「相補性」とは、塩基対合則によって関連しているヌクレオチド配列に関して使用される。例えば、配列5'-AGT-3'は配列5'-ACT-3'に相補的である。相補性は「部分的」または「完全な」相補性でありうる。「部分的」相補性は、1個以上の核酸塩基が塩基対合則にしたがって適合しない場合である。核酸間の「完全な」または「完全」相補性は、すべての各核酸塩基が塩基対合則の下に別の塩基と適合している場合である。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して重大な影響を有する。本明細書中で使用される核酸配列の「相補体」とは、その核酸が該核酸配列の核酸に対して完全な相補性を示すヌクレオチド配列を表す。
【００４３】
用語「ゲノム」または「ゲノムDNA」とは、宿主生物の遺伝性遺伝情報を表す。該ゲノムDNAは、核のDNA(染色体DNAとも称される)を含むが、それだけでなく色素体(例えば葉緑体)および他の細胞小器官(例えばミトコンドリア)のDNAを含む。好ましくは用語ゲノムまたはゲノムDNAは核の染色体DNAを表す。
【００４４】
用語「染色体DNA」または「染色体DNA配列」は、細胞周期の状態から独立した細胞核のゲノムDNAとして理解されるものとする。それゆえ、染色体DNAは染色体または染色分体に組織されているかもしれず、凝縮しているか、またはほどけているかもしれない。染色体DNAへの挿入は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)解析、サザンブロット解析、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、およびin situ PCR等の当技術分野において公知の種々の方法によって実証および分析することができる。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「単離された」とは、物質がその元の環境から取り出されていることを意味する。例えば、生存動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系におけるいくつかまたはすべての共存物質から分離されている同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってよく、および/またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分であってよい。それは、そのようなベクターまたは組成物がその元の環境の部分ではないという点で単離されている。好ましくは、核酸に関して使用される場合の用語「単離された」とは、特定したの核酸配列であって、その天然供給源において通常伴う少なくとも1つの混入核酸から分離された核酸配列を表す。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「精製された」とは、その天然環境から取り出され、単離または分離された核酸またはアミノ酸配列の分子を表す。したがって「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、それらが天然に伴う他の成分を少なくとも60％含まず、好ましくは少なくとも75％含まず、より好ましくは少なくとも90％含まない。
【００４７】
「ポリヌクレオチド構築物」とは、組換え法によって少なくとも部分的に作製された核酸を表す。用語「DNA構築物」とは、デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド構築物を表す。該構築物は、一本鎖または - 好ましくは - 二本鎖であってよい。該構築物は環状または線状であってよい。当業者は、DNA構築物の1つを取得する種々の方法に精通している。構築物は、例えばManiatis 1989, Silhavy 1984, およびAusubel 1987に記載の慣用の組換えおよびクローニング技術を用いて製造することができる。
【００４８】
用語「野生型」、「天然」または「天然起源の」とは、生物、ポリペプチド、または核酸配列に関して、該生物が天然に存在するか、または人工的に変更、突然変異、または他の様式での操作が施されていない少なくとも1つの天然に存在する生物において入手可能であることを意味する。
【００４９】
用語「外来遺伝子」とは、実験操作によって細胞のゲノムに導入された任意の核酸(例えば遺伝子配列)を表し、導入遺伝子が天然に存在する遺伝子と比較して何らかの修飾(例えば、点変異、選択マーカー遺伝子の存在、等)を含有する限り、該細胞において見出される遺伝子配列を含んでよい。
【００５０】
用語「異種核酸配列」または「異種DNA」は交換可能に使用され、天然には連結されていないか、または天然には異なる位置で連結されている対象の核酸配列に連結されているか、または連結するよう操作されているヌクレオチド配列を表す。異種DNAは、導入対象の細胞に内因性ではなく、別の細胞から取得されたものである。一般に、必ずではないが、そのような異種DNAは、それが発現される細胞によって通常生産されないRNAおよびタンパク質をコードする。プロモーター、転写調節配列または他の遺伝要素は、(例えばマーカー配列またはam農学的に有益な形質をコードする)別の配列に対して、該2配列がその天然環境において組み合わされていないか、または異なる様式で機能しうるように連結されている場合に、「異種性」であるとみなされる。好ましくは、該配列はその天然環境において機能しうるように連結されていない(すなわち異なる遺伝子に由来する)。最も好ましくは、該調節配列は、その天然環境において隣接していない核酸と、共有結合によって連結されて隣接している。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「導入遺伝子」とは、細胞のゲノムに導入されているか、または人工的に実験操作によって操作されている任意の核酸配列を表す。好ましくは、該配列は、天然に存在する生物と異なるゲノムに帰着する(例えば、該配列は、該生物に内因性である場合、その天然位置と異なる位置に導入されるか、またはそのコピー数が増加または減少している)。導入遺伝子は、「内因性DNA配列」、「外因性DNA配列」(例えば外来遺伝子)、または「異種DNA配列」であってよい。用語「内因性DNA配列」とは、天然に存在する配列と比較してそれが何らかの修飾(例えば、点変異、選択マーカー遺伝子の存在、等)を含有しない限り、その導入対象の細胞において天然に見出されるヌクレオチド配列を表す。
【００５２】
細胞または生物に関して(例えばダイズ植物または細胞に関して)使用される場合の用語「トランスジェニック」または「組換え」とは、導入遺伝子を含有するか、またはそのゲノムが導入遺伝子の導入によって改変されている細胞または生物を表す。トランスジェニック生物または組織は1つ以上のトランスジェニック細胞を含みうる。好ましくは、該生物または組織は、実質的に、トランスジェニック細胞からなる(すなわち、該生物または組織中の80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、最も好ましくは99％を超える細胞がトランスジェニックである)。核酸に関する用語「組換え」とは、核酸が、その天然環境において隣接していない核酸と共有結合によって連結されて隣接していることを意味する。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えDNA技術によって製造されたポリペプチドまたはタンパク質、すなわち所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする組換えDNA構築物によって形質転換された細胞から製造されたポリペプチドまたはタンパク質を表す。組換え核酸およびポリペプチドは、天然にはその状態で存在しないが、人工的な改変、変更、突然変異または別の様式での操作が施されている分子を含んでもよい。
【００５３】
「組換えポリペプチド」は、天然に存在するポリペプチドと配列が少なくとも1個のアミノ酸残基によって異なる天然に存在しないポリペプチドである。該組換えポリペプチドおよび/または核酸を製造するための好ましい方法は、定方向または非定方向突然変異誘発、DNAシャフリングまたは他の再帰組換え(recursive recombination)の方法を含んでよい。
【００５４】
核酸またはアミノ酸配列に関して使用される場合の用語「相同性」または「同一性」とは、配列関連性または相補性の程度を表す。2つ以上の核酸またはアミノ酸配列間の配列関連性を説明するために以下の用語が使用される: (a)「参照配列」、(b)「比較窓」、(c)「配列同一性」、(d)「配列同一性のパーセンテージ」、および(e)「実質的同一性」。
【００５５】
(a)  本明細書中で使用される「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義した配列である。参照配列は、指定配列のサブセットまたは全体であってよく; 例えば、完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメント、または完全cDNAまたは遺伝子配列である。
【００５６】
(b)  本明細書中で使用される「比較窓」は、ポリヌクレオチド配列の連続する指定セグメントを参照し、その場合、比較窓中のポリヌクレオチド配列は、2配列の最適なアライメントに関して、参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して付加または欠失(すなわちギャップ)を含んでよい。一般に、比較窓は少なくとも20個の連続ヌクレオチド長であり、場合により、30、40、50、100、またはそれ以上の長さでありうる。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップが含まれるせいで参照配列に対する類似性が高くなることを回避するために、ギャップペナルティーが典型的に導入され、適合数から差し引かれることを理解する。
【００５７】
比較のための配列のアライメント方法は当技術分野において周知である。ゆえに、任意の2配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, 1988のアルゴリズム; Smith et al. 1981のローカルホモロジーアルゴリズム; Needleman and Wunsch 1970のホモロジーアライメントアルゴリズム; Pearson and Lipman 1988の類似性検索方法(search-for-similarity-method); Karlin and Altschul, 1990のアルゴリズムのKarlin and Altschul, 1993のような変法である。以下の配列比較では、好ましくはアルゴリズム、ヌクレオチド配列に関するBLASTN、タンパク質に関するBLASTXをそれぞれのデフォルトパラメータを用いて使用する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)では、デフォルトとして、ワード長(W) 11、期待値(E) 10、カットオフ 100、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムでは、デフォルトとして、ワード長(W) 3、期待値(E) 10、およびBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, 1989を参照のこと)を使用する。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。アライメントは点検によって手作業で実施してもよい。マルチアライメント(multiple aligments)(すなわち3つ以上の配列のアライメント)は、好ましくは、Clustal Wアルゴリズム(Thompson 1994; 例えばソフトウェアVectorNTITM, バージョン9に含まれる; Invitrogen Inc.)を使用し、スコア行列BLOSUM62MT2を用いて、デフォルト設定(ギャップオープンペナルティー15/19、ギャップエクステンションペナルティー6.66/0.05; ギャップセパレーションペナルティーレンジ8; アライメントディレイの％同一性40; 残基特異的ギャップおよび親水性残基ギャップを使用)で実施される。比較は、好ましくは、BlastNプログラム(バージョン1.4.7またはその後のバージョン)をそのデフォルトパラメータで、または任意の等価なプログラムを使用して行う。「等価なプログラム」とは、目的の任意の2配列に関して、好ましいプログラムによって生成される対応するアライメントと比較された場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基適合および同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムを意図する。BLAST解析を実施するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手可能である。配列同一性パーセントの算出に加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2配列間の類似性についての統計解析を実施する(例えばKarlin & Altschul (1993)を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1尺度は最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、それは、2ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列と参照核酸配列の比較において最小合計確率が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満であれば、試験核酸配列は参照配列に類似しているとみなされる。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と連結する任意のプロセス」が含まれる。(Coombs 1994)。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度(すなわち核酸間の結び付きの強度)は、核酸間の相補性の程度、用いられる条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比等の要因によって影響される。本明細書中で使用される用語「Tm」は「融解温度」を参照して使用される。該融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる温度である。核酸のTmを算出するための式は当技術分野において周知である。標準的参考文献によって示されるように、Tm値の単純な概算は、核酸が1 M NaClの水性溶液中である場合、以下の式によって算出することができる: Tm=81.5+0.41(％G+C) [例えばAnderson and Young, 1985を参照のこと]。他の参考文献には、さらに洗練された算出方法が含まれ、該方法では、Tmの算出に関して、配列特性のみならず構造特性を考慮に入れる。
【００５９】
高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、0.15 M NaCl、72℃、約15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、0.2 X SSC洗浄、65℃、15分間である(SSCバッファーの説明に関してはManiatis, 下記を参照のこと)。高ストリンジェンシーの洗浄に先行して、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために低ストリンジェンシーの洗浄が行われることが多い。例えば100を超えるヌクレオチドの二重鎖に関する中ストリンジェンシーの洗浄の例は、1 X SSC、45℃、15分間である。例えば100を超えるヌクレオチドの二重鎖に関する低ストリンジェンシーの洗浄の例は、4〜6 X SSC、40℃、15分間である。短いプローブ(例えば約10〜50ヌクレオチド)では、ストリンジェントな条件は、典型的に、約1.5 M未満、より好ましくは約0.01〜1.0 MのNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度(pH 7.0〜8.3)を含み、温度は典型的に少なくとも約30℃であり、長いプローブ(例えば50を超えるヌクレオチド)では少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドを加えることによって達成してもよい。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブに関して観察されるシグナル 対 ノイズ比の2倍(またはそれ以上)のシグナル 対 ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重度を使用して作製された場合に生じる。
【００６０】
非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのTmに等しいように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター時に100を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに関する高度にストリンジェントな条件の例は、50％ホルムアミドであり、例えば、50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および0.1 x SSC中で60〜65℃での洗浄である。典型的な低ストリンジェンシーの条件には、30〜35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝液を用いて37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (20 X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M クエン酸三ナトリウム)中で50〜55℃での洗浄が含まれる。典型的な中ストリンジェンシーの条件には、40〜45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および0.5 X〜1 X SSC中で55〜60℃での洗浄が含まれる。
【００６１】
目的のハイブリダイゼーション条件に関連するハイブリダイゼーション条件を参照する場合の用語「等価の」は、該ハイブリダイゼーション条件および目的のハイブリダイゼーション条件が、同一の範囲の相同性パーセント(％)を有する核酸配列のハイブリダイゼーションを生じさせることを意味する。例えば、目的のハイブリダイゼーション条件が、第１核酸配列と、該第１核酸配列に対して80％〜90％の相同性を有する他の核酸配列のハイブリダイゼーションを生じさせる場合、別のハイブリダイゼーション条件は、この他のハイブリダイゼーション条件もまた、該第１核酸配列と、該第１核酸配列に対して80％〜90％の相同性を有する該他の核酸配列のハイブリダイゼーションを生じさせるならば、目的のハイブリダイゼーション条件と等価であると考えられる。
【００６２】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、当業者は、低または高ストリンジェンシーの条件を構成するために多数の等価な条件を使用してよいことをよく承知している; プローブの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)および標的の性質(DNA、RNA、塩基組成、溶液中に存在するか、または固定されているか、等)および塩の濃度および他の成分(例えばホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在または不存在)等の要因を考慮し、上に列挙される条件と異なるが等価な低または高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件を生成するためにハイブリダイゼーション溶液を変化させてよい。当業者は、より高いストリンジェンシーが、非特異的結合を低減または排除するために好ましく、一方、より低いストリンジェンシーが、異なる相同性を有する、より多数の核酸配列を検出するために好ましいことを承知している。
【００６３】
用語「遺伝子」とは、何らかの様式でポリペプチドの発現を調節可能な適切な調節配列に機能しうるように連結されているコード領域を表す。遺伝子には、コード領域(オープンリーディングフレーム、ORF)の前(上流)および後ろ(下流)のDNAの非翻訳調節領域(例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサー、等)が含まれ、ならびに、適用可能であれば、個々のコード領域(すなわちエキソン)間の介在配列(すなわちイントロン)が含まれる。本明細書中で使用される用語「構造遺伝子」は、後に特定ポリペプチドの特徴を示すアミノ酸の配列に翻訳されるmRNAに転写されるDNA配列を意味するものとする。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「コード領域」とは、構造遺伝子に関して使用される場合、mRNA分子の翻訳の結果生じる新生ポリペプチド中に見出されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を表す。真核生物では、該コード領域は、5'側で開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」によって境界され、3'側で停止コドンを指定する3つのトリプレット(すなわちTAA、TAG、TGA)のうちの1つによって境界される。イントロンを含有することに加えて、ゲノム形式の遺伝子は、RNA転写物上に存在する、該配列の両5'および3'末端に位置する配列を含んでもよい。これらの配列は「フランキング」配列または領域と称される(これらのフランキング配列は、mRNA転写物上に存在する非翻訳配列の5'または3'側に位置する)。5'フランキング領域は、遺伝子の転写をコントロールするか、またはそれに影響する調節配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーを含有しうる。3'フランキング領域は、転写の終結、転写後の切断およびポリアデニル化を導く配列を含有しうる。
【００６５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」および「タンパク質」は本明細書中で交換可能に使用され、連続したアミノ酸残基のポリマーまたはオリゴマーを表す。
【００６６】
用語「遺伝子組換え生物(genetically-modified organism)」または「GMO」とは、導入遺伝子DNAを含む任意の生物を表す。典型的な生物には、植物、動物および微生物が含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「植物」とは、大部分が、植物発生の任意の段階で存在する構造に分化している複数の植物細胞を表す。そのような構造には、1以上の植物器官が含まれ、それには、非限定的に、果実、シュート、茎、葉、花弁、等が含まれる。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「細胞(cell)」または「植物細胞(plant cell)」は単一細胞を表す。用語「細胞群(cells)」は細胞集団を表す。該集団は、1細胞タイプを含む純粋な集団であってよい。同様に、該集団は2以上の細胞タイプを含んでよい。本発明では、細胞集団が含む細胞タイプの数に制限はない。該細胞は同期または非同期であってよい。本発明の意義内の植物細胞は、(例えば懸濁培養中で)単離されているか、または植物組織、植物器官または任意の発生段階の植物中に含まれる。
【００６９】
植物に関する用語「器官」(すなわち「植物器官」)は植物の部分を意味し、例えば根、果実、シュート、茎、葉、葯、がく片、花弁、花粉、種子、等を含みうる(がそれらに限定されないものとする)。
【００７０】
植物に関する用語「組織」(すなわち「植物組織」)は、植物の分化および未分化組織を含めた複数の植物細胞の配置を意味する。植物組織は植物器官(例えば植物葉の表皮)の部分を構成しうるが、腫瘍組織(例えばカルス組織)および培養中の種々のタイプの細胞(例えば単一細胞、プロトプラスト、胚、カルス、プロトコーム(protocorm)様体、等)をも構成しうる。植物組織は、in planta、器官培養、組織培養、または細胞培養状態であってよい。
【００７１】
用語「染色体DNA」または「染色体DNA配列」は、細胞周期の状態から独立した細胞核のゲノムDNAとして理解されるものとする。それゆえ、染色体DNAは染色体または染色分体に組織されているかもしれず、凝縮しているか、またはほどけているかもしれない。染色体DNAへの挿入は、例えばPCR解析、サザンブロット解析、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、およびin situ PCR等の当技術分野において公知の種々の方法によって実証および分析することができる。
【００７２】
本明細書中で使用される用語「構造遺伝子」は、後に特定ポリペプチドの特徴を示すアミノ酸の配列に翻訳されるmRNAに転写されるDNA配列を意味するものとする。
【００７３】
用語「発現」は遺伝子産物の生合成を表す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写および - 場合により - 後のmRNAから1以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００７４】
本明細書中で使用される用語「発現カセット」または「発現構築物」は、プロモーター配列および - 場合により - 該核酸配列の発現を促進する追加の要素(例えばターミネーターおよび/またはポリアデニル化配列等)と機能しうるように連結されて発現される任意の核酸配列の組み合わせを意味するものとする。
【００７５】
本明細書中で使用される「プロモーター」、「プロモーター要素」、または「プロモーター配列」とは、転写の開始を導く(すなわち、ヌクレオチド配列のmRNAへの転写をコントロール可能な)、ヌクレオチド配列の5'末端のヌクレオチド配列を表す。プロモーターは、典型的に、必ずではないが、目的のヌクレオチド配列の5' (すなわち上流)に(例えば構造遺伝子の転写開始部位に近接して)位置し、該目的のヌクレオチド配列のmRNAへの転写をコントロールし、RNAポリメラーゼおよび転写の開始のための他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。プロモーター配列は、下流遺伝子の発現を駆動するために必要であるが、常に十分であるわけではない。一般に、真核生物のプロモーターには、転写開始(キャップ)部位(慣例により+1と番号付けされる)の約10〜30 bp 5'側のコンセンサス5'-TATAAT-3' (TATA)ボックスに相同な特徴的DNA配列が含まれる。キャップ部位の3'側の塩基は正の番号を付与され、キャップ部位の5'側の塩基は負の番号を受ける。該番号はキャップ部位からの距離を反映する。別のプロモーター成分、CAATボックスはTATAボックスの約30〜70 bp 5'側に見出されることが多く、標準型5'-CCAAT-3'に対する相同性を有する(Breathnach 1981)。植物では、CAATボックスはAGGAボックスとして公知の配列によって置換されることがある。それは、トリプレットG(またはT)NGに対称的にフランキングしているアデニン残基を有する領域である(Messing 1983)。転写に対する調節性の影響を付与する他の配列はプロモーター領域内に見出すことができ、キャップ部位から1000 bpまたはそれ以上5'側の範囲まで伸長する。プロモーターを参照する場合の用語「構成的」は、該プロモーターが、刺激(例えば熱ショック、化学物質、光、等)の不存在下で機能しうるように連結されている核酸配列の転写を導くことが可能であることを意味する。典型的に、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織において導入遺伝子の発現を導くことが可能である。
【００７６】
調節制御(Regulatory Control)とは、排他的ではないが、主に、転写開始部位の上流(5'側)に位置するDNA配列要素によって誘導される遺伝子発現のモジュレーションを表す。調節は、環境刺激に対して全か無か応答を生じさせうるか、または遺伝子発現レベルの変動を生じさせうる。本発明では、熱ショック調節要素は、急な温度上昇に応答して、下流遺伝子発現のレベルを一過性に高めるよう機能する。
【００７７】
ポリアデニル化シグナルはmRNAプロセシングを実行可能な任意の核酸配列を表し、通常、mRNA前駆体の3'末端にポリアデニル酸区画を付加することによって特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルDNAセグメントは、それ自体、天然に存在するか、または合成の、いくつかの供給源由来のセグメントの複合物であってよく、ゲノムDNAまたは、RNAから誘導されたcDNA由来であってよい。ポリアデニル化シグナルは、標準形5'-AATAA-3'に対する相同性の存在によって通常認識されるが、距離の変動、部分的「リードスルー」、および複数縦列した標準配列はめずらしくない(Messing 1983)。標準「ポリアデニル化シグナル」が、実は、ポリアデニル化自体ではなく転写終結を生じさせることが認識されるべきであろう(Montell 1983)。
【００７８】
熱ショック要素は、急な温度上昇のストレスに応答して遺伝子発現を調節するDNA配列を表す。該応答は、下流遺伝子の発現レベルの一過性増強にもかかわらず、即時型であるとみなされる。熱ショック遺伝子に関する最初の仕事はショウジョウバエ(Drosophila)を用いて行われたが、植物を含めた多数の他の種(Barnett 1980)がストレスに対して類似の応答を示した。熱ショック要素の必須の主成分は、コンセンサス配列5'-CTGGAATNTTCTAGA-3' (配列中、N=A, T, C, またはG)を有し、転写開始部位の上流の残基-66〜-47 bp間の領域中に位置することがショウジョウバエにおいて報告された(Pelham 1982)。このコンセンサス配列の化学合成オリゴヌクレオチドコピーは、熱ショック誘導能を付与する点で天然配列に取って代わることができる。
【００７９】
リーダー配列とは、転写開始部位と翻訳開始部位の間に位置する約100ヌクレオチドを含むDNA配列を表す。リーダー配列内で具現化されているのはリボソーム結合部位を指定する領域である。
【００８０】
イントロンまたは介在配列とは、本明細書では、コード配列(エキソン)とともに転写されるが、その後、成熟mRNAの形成時に除去されるDNA配列の領域を表す。イントロンは、転写配列内のどこにでも存在し、同一のまたは異なる遺伝子のコード配列間、遺伝子のコード配列内(そのアミノ酸配列を中断および分割する)、およびプロモーター領域内(翻訳開始部位の5'側)に存在しうる。最初の転写物中のイントロンは切除され、コード配列が同時にかつ正確に連結されて成熟mRNAが形成される。イントロンおよびエキソンの連結部はスプライス部位を形成する。イントロンの塩基配列はGUで始まり、AGで終わる。多数の高等真核生物において同一のスプライシングシグナルが見出される。
【００８１】
用語「機能しうるような連結」または「機能しうるように連結されている」は、例えば、調節要素(例えばプロモーター)と、発現対象の核酸配列、および適切であれば、追加の調節要素(例えばターミネーター)の連続的配置であって、各調節要素がその目的の機能を果たし、該核酸配列の発現を可能にするか、改変するか、促進するか、または別の様式でそれに影響することができるような配置を意味すると理解されるものとする。該発現は、センスまたはアンチセンスRNAに関する該核酸配列の配置に依存して生じる。この目的を達成するために、化学的意味での直接連結が必ずしも必要であるわけではない。遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列は、より遠い位置から、または実に他のDNA分子から、標的配列に対してその機能を発揮することもできる。好ましい配置は、組換え発現対象の核酸配列が、プロモーターとして機能する配列の後ろに位置し、該2配列が互いに共有結合によって連結されている配置である。プロモーター配列と、組換え発現対象の核酸配列の間の距離は、好ましくは200塩基対未満、特に好ましくは100塩基対未満、非常に特に好ましくは50塩基対未満である。機能しうるような連結、および発現カセットは、(例えばManiatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990に)報告されている慣例の組換えおよびクローニング技術を用いて作製することができる。ただし、追加の配列、- 例えば- 制限酵素の特異的切断部位を有するリンカーとして、またはシグナルペプチドとして機能する配列を、該2配列の間に配置してもよい。配列の挿入によって、融合タンパク質の発現を生じさせることもできる。好ましくは、プロモーターと、発現対象の核酸配列の連結からなる発現カセットをベクター組込み形式で存在させ、例えば形質転換によって植物ゲノムに挿入することができる。
【００８２】
本明細書中で使用される用語「形質転換」とは、細胞への遺伝物質(例えば導入遺伝子)の導入を表す。細胞の形質転換は安定なまたは一過性の形質転換であってよい。用語「一過性形質転換」または「一過性に形質転換された」とは、宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組込みが存在しない状態での細胞への1以上の導入遺伝子の導入を表す。一過性形質転換は、例えば酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって検出することができる。該検定では、1以上の導入遺伝子によってコードされるポリペプチドの存在を検出する。あるいは、一過性形質転換は、本明細書中で実証される、導入遺伝子(例えばuid Agene)によってコードされるタンパク質(例えばβ-グルクロニダーゼ)の活性を検出することによって検出することができる[例えば、GUS酵素の存在下で青色沈殿を生じさせるX-glucで染色することによってGUS酵素活性の組織化学アッセイ; およびGUS-Light kit (Tropix)を使用するGUS酵素活性の化学発光アッセイ]。用語「一過性形質転換体」とは、1以上の導入遺伝子が一過性に組み入れられている細胞を表す。対照的に、用語「安定な形質転換」または「安定に形質転換された」とは、細胞のゲノムへの1以上の導入遺伝子の導入および組込みを表し、好ましくは染色体組込みおよび減数分裂による安定な遺伝性を生じさせる。細胞の安定な形質転換は、細胞のゲノムDNAと、1以上の導入遺伝子に結合可能な核酸配列のサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出することができる。あるいは、細胞の安定な形質転換は、導入遺伝子配列を増幅するための細胞のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応によって検出してもよい。用語「安定な形質転換体」とは、ゲノムDNA (色素体および核のDNAが含まれる)に安定に組み込まれている1以上の導入遺伝子を有する細胞を表し、好ましくは核の染色体DNAへの組込みである。ゆえに、安定な形質転換体は、安定な形質転換体由来のゲノムDNAが1以上の導入遺伝子を含有するのに対して、一過性形質転換体由来のゲノムDNAが導入遺伝子を含有しない点で一過性形質転換体と区別される。形質転換にはまた、染色体外(epichromosomal)複製および遺伝子発現を伴う植物ウイルスベクターの形式での植物細胞への遺伝物質の導入が含まれ、それは減数分裂の安定性に関して様々な特性を示す。形質転換にはまた、染色体外複製および遺伝子発現を伴う植物ウイルスベクターの形式での植物細胞への遺伝物質の導入が含まれ、それは減数分裂の安定性に関して様々な特性を示す。好ましくは、用語「形質転換」には、染色体組込みおよび減数分裂による安定な遺伝性を生じさせる植物細胞への遺伝物質の導入が含まれる。
【００８３】
用語、細菌に「感染している」および細菌の「感染」とは、細菌内に含有される核酸配列が標的生物学的サンプルの1以上の細胞に導入されるような条件下で標的生物学的サンプル、(例えば細胞、組織、等)と細菌を共にインキュベートすることを表す。
【００８４】
用語「アグロバクテリウム」とは、土壌伝播性、グラム陰性、桿状植物病原性細菌を表し、該細菌はクラウンゴールを生じさせる。用語「アグロバクテリウム」には、非限定的に、Agrobacterium tumefaciens、(典型的に、感染植物においてクラウンゴールを生じさせる)、およびAgrobacterium rhizogenes (感染宿主植物において毛状根疾患を生じさせる)株が含まれる。植物細胞にアグロバクテリウムが感染すると、概して、感染細胞によるオパイン(例えばノパリン、アグロピン(agropine)、オクトピン等)の生産が生じる。そして、ノパリンの生産を生じさせるアグロバクテリウム株(例えばLBA4301, C58, A208株)は「ノパリン型」アグロバクテリウムと称され; オクトピンの生産を生じさせるアグロバクテリウム株(例えばLBA4404, Ach5, B6株)は「オクトピン型」アグロバクテリウムと称され; アグロピンの生産を生じさせるアグロバクテリウム株(例えばEHA105, EHA101, A281株)は「アグロピン型」アグロバクテリウムと称される。
【００８５】
用語「衝突する」、「衝突」、および「微粒子銃衝突」とは、標的生物学的サンプル(例えば細胞、組織、等)に向けて粒子を加速して、該標的生物学的サンプル中の細胞の細胞膜に傷をつけ、および/または該標的生物学的サンプルへ粒子を侵入させるプロセスを表す。微粒子銃衝突のための方法は当技術分野において公知であり(例えばUS 5,584,807 (該文献の内容は参照により本明細書中に組み入れられる)、市販されている(例えばヘリウムガス駆動微粒子加速装置(PDS-1000/He)(BioRad))。
【００８６】
植物組織を参照する場合の用語「微小創傷(microwounding)」とは、該組織における微視的な創傷の導入を表す。微小創傷は、例えば本明細書中に記載の粒子衝突によって達成してよい。
【００８７】
本明細書中で使用される「形質転換効率」または「形質転換頻度」は、標準的実験条件(すなわち外来DNAと接触させる細胞の量、送達DNAの量、DNA送達のタイプおよび条件、一般培養条件等に関して標準化または正規化された条件)下で回収される形質転換細胞(または個々の形質転換細胞から育てられたトランスジェニック生物)の数によって測定することができる。例えば、腋生分裂組織の単離外植片が形質転換の出発材料として使用される場合、形質転換頻度は、形質転換された100単離外植片あたりに取得されるトランスジェニック植物系列の数として表現することができる。
【００８８】
用語「分裂組織(meristem)」または「分裂組織細胞(meristematic cells)」または「分裂組織(meristematic tissue)」は交換可能に使用することができ、茎または根の先端で見出されるような、継続的に分裂して新規細胞を形成する未分化植物組織を意味するものとする。用語「節」または「葉節」は、葉が結び付いているか、結び付いていた茎上の点を意味するものとする。用語「節間部」は、茎上の2つの節の間のセクションまたは部分を意味するものとする。用語「葉柄(petiole)」は、葉が茎に結び付いている柄を意味するものとし、葉柄(leaf-stalk)とも称される。用語「腋芽」は、保護鱗屑に包まれていることがあり、未発達のシュート、葉、または花を含有することがある、茎または枝分れに沿った小さい突起を意味するものとし; 側芽とも称される。用語「胚軸(hypocotyl)」は、子葉(seed leaves)(cotyledons)と根の間の茎の部分を意味するものとする。用語「葉腋(leaf axil)」は、葉と、それが支えられている茎の間の角度を意味するものとする。腋芽は葉腋に存在する。用語「子葉(cotyledon)」は、シュート時に、種子中にとどまるか、または出現し、拡大し、緑色になる種子植物の胚の葉を意味するものとし; 子葉(seed leaf)とも称される。胚軸(embryo axis)は子葉間に位置し、珠孔に最も近い末端付近でそれらに結び付いている。
【００８９】
用語「脱分化」、「脱分化処理」または「脱分化前処理」は、植物組織の分化した細胞を脱分化培地上で培養することによって、未組織の成長を示すカルス等の細胞集合を得るプロセスを意味する。より具体的には、本明細書中で使用される用語「脱分化」は、植物体の範囲の特定の機能を有さずに高速に分裂する細胞を形成するプロセスを意味するものとする。これらの細胞は、種々の植物組織に発達するその能力に関して高い潜在力を有することが多い。好ましくは、該用語は、分化または特殊化した組織から、より多能性または全能性(例えば胚性)形式への復帰を意味するものとする。脱分化は植物組織の再設定(まず未分化の非特殊化細胞への復帰およびその後の新規の異なる進路)を生じさせうる。本明細書中で使用される用語「全能性」は、植物全体を形成するために必要とされるすべての遺伝情報および/または細胞情報を含有する植物細胞を意味するものとする。脱分化は、特定の植物成長調節物質(例えばオーキシンおよび/またはサイトカイニン化合物)によって、特にその特定の組み合わせおよび/または濃度によって、開始させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
発明の詳細な説明
本発明は、D-アミノ酸選択系に基づく、種々のダイズ、Glycine max、の直接的な生殖細胞遺伝形質転換のための方法である。本発明の第1の実施形態は、トランスジェニックダイズ植物を作製するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
a.  ダイズ細胞または組織に、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を導入するステップ、および
b.  約3 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体を含む選択培地上で、少なくとも5日間、ステップ(a)のダイズ細胞または組織をインキュベートするステップ、および
c.  ステップ(b)のダイズ細胞または組織を再生培地に移し、該DNA構築物を含むダイズ植物を再生および選択するステップ。
【００９１】
共培養後に適用される選択圧は、一実施形態において、1以上の以下のステップを含む:
a.  シュート誘導時に選択を行なわない最初のステップ;
b.  シュート誘導期の間に選択を行うステップ,
c.  シュート伸長期を通じて選択を行うステップ。
【００９２】
好ましくはD-ala濃度は、培地、例えばSIM培地等の培地に添加された場合、40mM以下、より好ましくは30mM以下である。さらに、該濃度は、一実施形態では、およそ2mM、3mM、または5mM以上、より好ましくはおよそ10mMである。ゆえに、一実施形態では、該濃度は、選択培地中の7.5〜20mM D-alaの範囲である。10mM未満のD-セリンの濃度と組み合わせて、D-ala濃度は好ましくは30mM以下、さらにより好ましくは20mM以下である。当業者は、このデータから出発して、D-alaまたはD-alaおよびD-ser濃度を個別の各選択スキームの具体的条件に適合させる方法を承知している。例えば、別の培地、別のシュート齢、別のインキュベーション時間または別の構築物等が使用される場合に該濃度は変動しうる。例えば、強力なプロモーターの使用に例えば起因して、酵素の発現率または活性が高いと、より高濃度のD-alaおよび/またはD-serを使用することが可能になる。ゆえに、一実施形態では、選択は、シュート伸長中の1〜10mM、好ましくは7.5mM未満、より好ましくは2〜5mMの範囲のD-Ala、例えばおよそ3 mM D-Alaと組み合わせて、シュート誘導中のおよそ5〜20mMの範囲のD-Ala、例えば10〜15 mMであるべきであろう。ゆえに、一実施形態では、選択は、シュート伸長中の1〜10mM、好ましくは7.5mM未満、より好ましくは2〜5mMの範囲のD-Ser、例えばおよそ3 mM D-Serと組み合わせて、シュート誘導中のおよそ5〜20mMの範囲のD-Ser、例えば10〜15 mMであるべきであろう。ゆえに、一実施形態では、選択は、シュート伸長中の1〜10mM、好ましくは7.5mM未満、より好ましくは2〜5mMの範囲のD-SerおよびD-Ala、例えばおよそ3 mM D-SerおよびD-Alaと組み合わせて、シュート誘導中のおよそ5〜20mMの範囲のD-SerおよびD-Ala、例えば10〜15 mMであるべきであろう。例えば、選択は
(i)  約3〜約30 mM D-アラニンを使用すること;
(ii)  約30〜50mM D-セリンを使用すること、および/または
(iii)  約1〜10mM D-セリンを30mM以下のD-アラニンと組み合わせて、好ましくはおよそ5〜7mM D-セリン、例えば7.5mM、および10mM〜20mM D-アラニンを使用すること
によって、脱分化条件下で約3〜4週間にわたって行う。したがって、一実施形態では、dsda遺伝子で形質転換した後の選択は以下のステップを含む:
a.  選択を伴わないシュート誘導での5〜10日間、例えば7日間,
b.  5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを伴うシュート誘導培地上で2〜4週間、例えば3週間;
c.  シュート伸長期を通じて2mM〜7mM、例えば5 mM D-セリン。
【００９３】
したがって、他の実施形態では、dao1遺伝子で形質転換した後の選択は以下のステップを含む:
a.  選択を伴わないシュート誘導での5〜10日間、例えば6〜7日間,
b.  5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを伴うシュート誘導培地上で2〜4週間、例えば3週間;
c.  シュート伸長期を通じて2mM〜7mM、例えば5 mM D-アラニン。
【００９４】
さらに、dao1遺伝子で形質転換した後の選択は例えば以下のステップを含む:
a.  選択を伴わないシュート誘導での5〜10日間、例えば5〜7日間,
b.  5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを伴い、かつ5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを伴うシュート誘導培地上で2〜4週間、例えば3週間;
c.  シュート伸長期を通じて2mM〜7mM、例えば5 mM D-セリンおよび2mM〜7mM、例えば5 mM D-アラニン。
【００９５】
一実施形態では、本発明の方法は、1以上の、例えばすべての、以下のステップを含む:
a.  実生を殺菌するステップ;
b.  3〜10日間、好ましくは5〜8日間、例えば7日間、明所で、実生を育てるステップ;
c.  単葉身の葉を有する上胚軸を子葉の長さまたはそれ以上にまで育てるステップ;
d.  上胚軸を0.5cm〜4cmの範囲; 例えば0.7cm以上、1.0cm以上、または2cm以下まで育てるステップ
e.  頂端分裂組織を含むすべてのあらかじめ形成された葉を取り出すステップ
f.  数回の切断により第１セットの葉に位置する節を傷つけるステップ
g.  傷つけられた節を液体培地中で0.1時間〜1時間、例えば0.5時間にわたり、アグロバクテリウム混合物と共培養するステップ
h.  固体共培養培地上で暗所で3〜5日間、節をアグロバクテリウムと共培養するステップ;
i.  外植片を、選択のため、18時間 明/6時間 暗のサイクル条件下、70〜100microE/m2sで、上胚軸の上の第１の節で腋生分裂組織が成長するまで(till de axillary merstems growth at the first node above the epicotyl)置くステップ;
j.  形質転換前で共培養の2週間後までに形成されたシュートを取り出し、場合により、この期間中に外植片を切断して、より小さい切片にするステップ;
k.  共培養の2〜4週間後に外植片をシュート原基伸長培地に移し、シュートが伸長するまで、死滅組織を除去した後に選択物質を含む新鮮培地に2〜3週間毎に外植片を移すステップ;
l.  外植片からシュート3cm以上を取り出し、根が形成され始めるまで1週間にわたり、発根誘導培地に入れるステップ;
m.  発根したシュートを土壌に移し、育成チャンバー中で2〜3週間ハードニング処理した後に、発根したシュートを温室に移すステップ。
【００９６】
したがって、dsdA遺伝子を使用する本発明の方法は、好ましい1ステップにおいて、形質転換のための外植片としてGylcine max由来のシュート腋生分裂組織を使用することを含む。特に、A. rhizogenes SHA017またはA. tumefaciens株を形質転換に使用することができ、好ましくはA. rhizogenes SHA017、例えば下記K599株を使用する。一実施形態では、感染は、およそ30分間、例えば25〜35分間の範囲で、室温で、例えば18℃〜25℃未満の範囲、好ましくは20℃〜23℃の範囲で行われる。一実施形態では、ODはおよそ1.5であってよい。さらに、共培養は、好ましくはおよそ5日間、例えば3〜8日間の範囲、より好ましくは4または5日間、好ましくは暗所で、例えば23℃〜27℃、好ましくは24℃〜25℃で行われる。形質転換した外植片の回収は、一実施形態では、およそ5〜およそ8日間、例えば6または7日間、好ましくは明所で、例えばおよそ25℃または23℃〜27℃、好ましくは24℃〜26℃で行われる。すでに上述し、かつさらに後述するように、シュート/カルス開始中の選択は、例えば3 mM〜10 mM D-serの濃度で、好ましくはおよそ7.5mM D-serで、または本明細書中に記載の他の好適な濃度および組成で、およそ3週間、例えば15〜24日間、好ましくは20〜22日間、好ましくは明所で、および例えばおよそ25℃または23℃〜26℃、好ましくは24℃〜25℃でありうる。さらにまた、シュート伸長/カルス再生中の選択ステップは、例えば3 mM〜10 mM D-serの濃度で、好ましくはおよそ5mM D-serで、または本明細書中に記載の他の好適な濃度および組成で、およそ4〜5週間、例えば25〜35日間、好ましくはおよそ30日間、好ましくは明所で、および例えばおよそ25℃または23℃〜26℃、好ましくは24℃〜25℃で行うことができる。発根ステップは、選択を伴わないか、または非常に少量の選択しか伴わずに、例えばおよそ0mM D-serで、およそ1〜2週間、例えば5〜10日間、好ましくは明所で、および例えば23℃〜27℃、好ましくは24℃〜25℃で行うことができる。
【００９７】
1.  本発明のDNA構築物
1.1  本発明の第１発現構築物
第１発現構築物は、ダイズにおいて活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む。好ましくは該プロモーターは該酵素をコードする配列に対して異種性である。ダイズ植物において活性なプロモーターおよびD-アラニンおよび/またはD-セリン代謝酵素は下で詳細に定義される。
【００９８】
1.1.1  D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素
当業者は、D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝するために好適な多数の配列を承知している。用語「D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素」は、好ましくは、対応するL-アミノ酸(すなわちD-アラニンおよび/またはD-セリン)および - より好ましくは - さらに任意の他のD-および/またはL-またはアキラルなアミノ酸の変換に関する活性の、少なくとも2倍(少なくとも100％高い)、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも5倍、さらにより好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍または100倍の活性でD-アラニンおよび/またはD-セリンを変換および/または代謝する酵素を意味する。
【００９９】
好ましくは、D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素は、D-セリンアンモニアリアーゼ(D-セリンデヒドラターゼ; EC 4.3.1.18; 以前のEC 4. 2.1.14)、D-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3)、およびD-アラニントランスアミナーゼ(EC 2.6.1.21)からなる群から選択される。より好ましくは、D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素は、D-セリンアンモニアリアーゼ(D-セリンデヒドラターゼ; EC 4.3.1.18; 以前のEC 4. 2.1.14)、およびD-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3)からなる群から選択される。用語「D-セリンアンモニアリアーゼ」(D-セリンデヒドラターゼ; EC 4.3.1.18; 以前のEC 4. 2.1.14)は、D-セリンからピルビン酸およびアンモニアへの変換を触媒する酵素を意味する。触媒される反応には、おそらく、最初の水の除去(ゆえに該酵素は元々EC 4.2.1.14として分類されている)、およびその後のC-N結合の分解による生成物の異性化および加水分解が含まれる。好適な酵素の例についてはhttp://www.expasy.org/enzyme/4.3.1.18を参照のこと。用語「D-アラニントランスアミナーゼ」(EC 2.6.1.21)は、D-アラニンと2-オキソグルタル酸からピルビン酸およびD-グルタミン酸への反応を触媒する酵素を意味する。D-グルタミン酸は、D-アラニンより植物に対して毒性がずっと低い。http://www.expasy.org/enzyme/2.6.1.21。
【０１００】
用語D-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3; 略語DAAO, DAMOX, またはDAO)は、- 好ましくは - 基質として酸素(O2)を用い、副産物として過酸化水素(H2O2)を生産することによってD-アミノ酸を2-オキソ酸に変換する酵素を表す(Dixon 1965a,b,c; Massey 1961; Meister 1963)。DAAOは、the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)によってEC (Enzyme Commission)番号EC 1.4.3.3を用いて説明されうる。一般に、EC 1.4.3.3.クラスのDAAO酵素は、中性および塩基性D-アミノ酸からその対応するケト酸への酸化を触媒するFADフラビン酵素である。DAAOは、真菌および脊椎動物において特徴付けられ、配列決定されている。それらはペルオキシソーム中に位置することが知られている。DAAOでは、保存ヒスチジンは酵素の触媒活性に関して重要であることが示されている(Miyano 1991)。本発明の好ましい実施形態では、DAAOは以下のコンセンサスモチーフを含むタンパク質を表す: [LIVM]-[LIVM]-H*-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-x-G-x5-G-x-A。この式中、括弧内に記載のアミノ酸残基はそれぞれの位置の選択残基を表し、xは任意のアミノ酸残基を表し、指数はそれぞれの数の連続アミノ酸残基を示す。個々のアミノ酸残基に関する略語は、上で定義されるその標準IUPAC意義を有する。D-アミノ酸オキシダーゼ(EC番号1.4.3.3)は種々の生物から単離することができ、該生物には、非限定的に、ブタ、ヒト、ラット、酵母、細菌または真菌が含まれる。生物の例は、Candida tropicalis、Trigonopsis variabilis、Neurospora crassa、Chlorella vulgaris、およびRhodotorula gracilisである。好適なD-アミノ酸代謝ポリペプチドは、例えば酵母(例えばRhodotorula gracilis)、真菌、または動物由来の真核生物の酵素であってよく、または例えばEscherichia coli等の細菌由来の原核生物の酵素であってよい。好適な酵素の例についてはhttp://www.expasy.org/enzyme/1.4.3.3を参照のこと。
【０１０１】
D-アミノ酸を代謝する好適なポリペプチドの例を表1に示す。該酵素をコードする核酸配列は、データベースから(例えばGenbank Acc.-No. U60066, A56901, AF003339, Z71657, AF003340, U63139, D00809, Z50019, NC_003421, AL939129, AB042032の下に)入手可能である。上で実証されるように、異なる数種由来のDAAOが特徴付けられていて、基質親和性がわずかに異なることが示されている(Gabler 2000)が、一般にそれらは広い基質特異性を示し、すべてのD-アミノ酸を酸化的に脱アミノ化する。
【０１０２】
2009529863.tif 000002
2009529863.tif 000003
【０１０３】
この関連で特に好ましいのは、酵母Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides)由来のdao1遺伝子(EC: 1.4. 3.3: GenBank Acc.-No.: U60066)およびE. coli遺伝子dsdA (D-セリンデヒドラターゼ(D-セリンデアミナーゼ)[EC: 4.3. 1.18; GenBank Acc.-No.: J01603]である。dao1遺伝子は二重機能マーカーとして使用できるために特に有益である(国際特許出願PCT/EP 2005/002734; WO 2005/090581を参照のこと)。
【０１０４】
好適なD-アミノ酸代謝酵素にはまた、上で例示されるポリペプチドの断片、突然変異体、誘導体、変異体および対立遺伝子が含まれる。好適な断片、突然変異体、誘導体、変異体および対立遺伝子は、上で定義されるD-アミノ酸代謝酵素の機能的特性を保持するものである。突然変異体、変異体または誘導体を得るための配列の変更は、核酸中の1個以上のヌクレオチドの1以上の付加、挿入、欠失または置換に基づき、該変更は、該核酸がコードするポリペプチド中の1個以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換を生じさせる。当然、コードされるアミノ酸配列に差異を生じさせない核酸の変更も含まれる。
【０１０５】
本発明の方法に関して、より好ましくは、D-セリンを代謝できる酵素は以下の酵素からなる群:
(i)  配列番号２によってコードされるE.coli D-セリンアンモニアリアーゼ、および
(ii)  配列番号２によってコードされる配列に対して、少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii)  配列番号１に記載の配列の相補体に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中で50〜(好ましくは) 55℃での洗浄)、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中で55〜(好ましくは) 60℃での洗浄)、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.1 x SSC中で60〜(好ましくは) 65℃での洗浄)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択が行われる。脱分化条件下での総選択時間は、好ましくは、約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは3〜4週間である。
【０１０６】
したがって、一実施形態では、本発明の方法において、D-セリンを代謝できる酵素は以下の酵素からなる群:
(i)  表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼ,
(ii)  表Iに示されるD-セリンアンモニアリアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％(好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％)の同一性および同じ酵素活性を有する酵素;
(iii)  表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼの核酸配列に対して、少なくとも80％(好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％)のコード核酸配列の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv)  表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素,
から選択され、かつ、3 mM〜100 mM; 好ましくは4〜10mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択が行われるか;
または、D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素は以下の酵素からなる群:
(i)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも80％(好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％)の同一性および同じ酵素活性を有する酵素;
(iii)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼの核酸配列に対して、少なくとも80％(好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％)のコード核酸配列の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv)  表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素,
から選択され、かつ、3 mM〜100 mM; 好ましくは4〜10mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択が行われる。
【０１０７】
D-セリンアンモニアリアーゼの関連で「同じ活性」とは、D-セリンを、好ましくは最も好ましい基質として、代謝できることを意味する。代謝とは、上で規定されるリアーゼ反応を意味する。
【０１０８】
また、本発明の方法に関して、より好ましくは、D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素は以下の酵素からなる群:
(i)  配列番号４または６によってコードされるRhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii)  配列番号４または６によってコードされる配列に対して、少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性および同じ活性を有する酵素、および
(iii)  配列番号３または５に記載の配列の相補体に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中で50〜(好ましくは) 55℃での洗浄)、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中で55〜(好ましくは) 60℃での洗浄)、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.1 x SSC中で60〜(好ましくは) 65℃での洗浄)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択が行われる。好ましくは、D-アラニン(例えば唯一の選択化合物として使用される場合)は、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約20 mMの濃度で使用される。好ましくは、D-セリン(例えば唯一の選択化合物として使用される場合)は、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの濃度で使用される。脱分化条件下での総選択時間は、好ましくは、約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは3〜4週間である。
【０１０９】
D-アミノ酸オキシダーゼの関連で「同じ活性」とは、広範囲のD-アミノ酸(好ましくは少なくともD-セリンおよび/またはD-アラニン)を代謝することができることを意味する。代謝とは、上で規定されるオキシダーゼ反応を意味する。
【０１１０】
特定配列の突然変異体および誘導体は、1以上の特性(Ki、基質特異性等)が改善されているが、D-セリンおよびまたはD-アラニンに関する代謝活性を依然として含む酵素をも含みうる。そのような配列およびタンパク質はまた、突然変異原性および組換え原性(recombinogenic)手順、例えばDNAシャフリングから派生した配列およびタンパク質を包含する。そのような手順を用いて、1以上の異なるコード配列を操作して、所望の特性を有する新規ポリペプチドを創出することができる。この様式では、実質的配列同一性を有し、かつin vitroまたはin vivoで相同組換えされうる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作製する。候補酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、DNAシャフリングプロトコルを用いてモジュレートすることができる。DNAシャフリングは、DNA分子中に、好ましくはランダムに、突然変異または再配置を高速に、容易に、かつ効率的に導入するか、または2以上のDNA分子間のDNA配列の交換を好ましくはランダムに作製するための方法である。DNAシャフリングから得られるDNA分子はシャッフルされたDNA分子であり、それは少なくとも1つの鋳型DNA分子から派生した天然に存在しないDNA分子である。シャッフルされたDNAは、鋳型DNAによってコードされる酵素と比べて改変された酵素をコードし、好ましくは、鋳型DNAによってコードされる酵素と比べて改変された生物学的活性を有する。DNAシャフリングは再帰組換えおよび突然変異のプロセスに基づいてよく、関連遺伝子のプールをランダムに断片化し、次いでポリメラーゼ連鎖反応様プロセスによって該断片を再構築することによって実施することができる。例えばStemmer 1994 a,b; Crameri 1997; Moore 1997; Zhang 1997; Crameri 1998; US 5,605,793, US 5,837,458, US 5,830,721およびUS 5,811,238を参照のこと。シャッフルされたDNAによってコードされる、得られたdsdA-またはdao-様酵素は、元の型の酵素と異なるアミノ酸配列を有しうる。配列同一性の典型的な範囲は上で規定される。
【０１１１】
本発明のD-アミノ酸代謝酵素は、植物細胞のサイトゾル、ペルオキシソーム、または他の細胞内区画において発現されうる。D-アミノ酸代謝酵素の区画化は、DAAOポリペプチドをコードする核酸配列を、輸送ペプチドをコードする配列と融合して、融合タンパク質を作製することによって達成してよい。そのような輸送ペプチドを伴わずに発現された遺伝子産物は、概してサイトゾル中に蓄積する。
【０１１２】
1.1.2  ダイズ植物用のプロモーター
1.1.2.1  一般的プロモーター
本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、DNA配列(例えば構造遺伝子)の転写を導くDNA配列を意味するものとする。典型的に、プロモーターは、遺伝子の5'領域の、構造遺伝子の転写開始部位に近接して位置する。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写率は誘導物質に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導物質によって調節されない。また、プロモーターは、組織特異的または組織優先様式で、特定組織タイプ(群)、例えば葉、根または分裂組織中で関連コード領域を転写する際にのみ活性であるように調節されうる。
【０１１３】
用語「ダイズ植物において活性なプロモーター」は、植物由来かどうかにかかわらず、少なくとも1ダイズ細胞、組織、器官または植物において、発生中の少なくとも一時点で、または脱分化条件下で、機能しうるように連結されているヌクレオチド配列の転写を誘導可能な任意のプロモーターを意味する。そのようなプロモーターは、非植物プロモーター(例えば、植物ウイルスまたはアグロバクテリウム由来)または植物プロモーター、好ましくは双子葉植物プロモーターであってよい。当業者はダイズ植物における使用に好適であるかもしれないいくつかのプロモーターを承知している。この関連で、発現は、例えば、構成的、誘導性または発生依存的であってよい。以下のプロモーターが好ましい。
【０１１４】
(a)  構成的プロモーター
「構成的」プロモーターとは、多数の、好ましくはすべての、組織において植物発生の実質的期間にわたって、好ましくは植物発生期間のすべての時点で、発現を保証するプロモーターを表す。その例には、CaMV (カリフラワーモザイクウイルス) 35Sプロモーター(Franck 1980; Shewmaker 1985; Gardner 1986; Odell 1985)、19S CaMVプロモーター(US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey 1989)、Rubisco小サブユニット(SSU)プロモーター(US 4,962,028)、レグミンBプロモーター(GenBank Acc. No. X03677)、アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼのプロモーター、TRデュアルプロモーター、アグロバクテリウム由来のOCS (オクトピンシンターゼ)プロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(US 5,683,439)、液胞ATPアーゼサブユニットのプロモーター、pEMUプロモーター(Last 1991); MASプロモーター(Velten 1984)、Arabidopsis thalianaニトリラーゼ-1遺伝子のプロモーター(GenBank Acc. No.: U38846, ヌクレオチド3862〜5325または5342)、および、さらに別の、植物での構成的発現を伴う遺伝子のプロモーターが含まれる。
【０１１５】
他の好適な構成的プロモーターはアクチンプロモーターである。双子葉植物由来のいくつかのアクチンプロモーターの配列は、Genbankで開示されているゲノム配列に基づいて入手可能である(例えば: AY063089 (Arabidopsis thalianaアクチン8遺伝子); AY096381 (Arabidopsis thalianaアクチン2遺伝子; AY305730: (Gossypium hirsutumアクチン8遺伝子); AY305724 (Gossypium hirsutumアクチン2遺伝子); AF111812 (Brassica napusアクチン遺伝子))。異種性発現でのそれらのプロモーターの使用はバナナアクチンプロモーターに関して報告されている(US20050102711)。Anら[Plant J 1996 10(1):107-121]は、Act2およびAct8 mRNAが、葉、根、茎、花、花粉、および長角果で強く発現されることを報告した。キメラGUS構築物はほとんどの栄養組織で発現されるが、種皮、胚軸、雌ずい群、または花粉嚢では発現がほとんど検出されなかった。
【０１１６】
(b)  組織特異的または組織優先プロモーター
さらにまた、種子に関する特異性を有するプロモーター、例えばファゼオリンプロモーター(US 5,504,200; Bustos 1989; Murai 1983; Sengupta-Gopalan 1985)、2Sアルブミン遺伝子のプロモーター(Joseffson 1987)、レグミン(legumine)プロモーター(Shirsat 1989)、USP (未知の種子タンパク質)プロモーター(Baeumlein 1991a)、ナピン(napin)遺伝子プロモーター(US 5,608,152; Stalberg 1996)、スクロース結合タンパク質のプロモーター(WO 00/26388)またはレグミンB4プロモーター(LeB4; Baeumlein 1991b; Becker 1992)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)オレオシンプロモーター(WO 98/45461)、およびアブラナ属(Brassica) Bce4プロモーター(WO 91/13980)が好ましい。さらに、葉特異的および光誘導性プロモーター、例えばcabまたはRubisco由来のプロモーター(Simpson 1985; Timko 1985); 葯特異的プロモーター、例えばLAT52由来のプロモーター(Twell 1989b); および小胞子優先プロモーター、例えばapg由来のプロモーター(Twell 1983)が好ましい。
【０１１７】
(c)  化学誘導性プロモーター
発現カセットは、化学誘導性プロモーター(レビュー論文: Gatz 1997)を含有してもよい。化学誘導性プロモーターを用いて、植物における外因性遺伝子の発現を特定の時点でコントロールすることができる。そのようなプロモーター、例えばPRP1プロモーター(Ward 1993)、サリチル酸誘導性プロモーター(WO 95/19443)、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター(EP 0 388 186)、テトラサイクリン(tetracyclin)誘導性プロモーター(Gatz 1991; Gatz 1992)、アブシシン酸誘導性プロモーター(EP 0 335 528)またはエタノール-シクロヘキサノン誘導性プロモーター(WO 93/21334)を同様に使用することができる。グルタチオン-SトランスフェラーゼアイソフォームII遺伝子(GST-II-27)のプロモーターもまた好適である。該プロモーターはセーフナー(safeners)、例えばN,N-ジアリル-2,2-ジクロロアセトアミド(W0 93/01294)を外因的に適用することによって活性化することができ、かつ、単子葉および双子葉の両植物の多数の組織において機能しうる。本発明において利用できる別の典型的な誘導性プロモーターには、銅に応答するACE1系由来のプロモーター(Mett 1993); またはベンゼンスルホンアミド除草剤セーフナーに応答するトウモロコシ由来のIn2プロモーター(Hershey 1991; Gatz 1994)が含まれる。植物が通常応答しない誘導物質に応答するプロモーターを利用することができる。典型的な誘導性プロモーターはステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターであり、その転写活性は副腎皮質ステロイドホルモンによって誘導される(Schena 1991)。
【０１１８】
特に好ましいのは構成的プロモーターである。さらにまた、プロモーターを、発現対象の核酸配列に機能しうるように連結してよく、該プロモーターは別の植物組織または他の生物、例えばE. coli細菌での発現を可能にする。好適な植物プロモーターは、原理的に、すべての上記プロモーターである。
【０１１９】
1.1.2.2  好ましいプロモーター配列
種々のプロモーターがダイズにおいて機能的であることが知られており、本発明の方法を実行するために好適であるが、特にユビキチンプロモーター(特にパセリユビキチンプロモーター)は驚くほど高い選択効率を生じさせることが見出されている。ゆえに、好ましい実施形態では、ダイズにおいて活性なプロモーターは植物ユビキチンプロモーターである。より好ましくは、植物ユビキチンプロモーターはパセリ(Petroselinum crispumまたはLomatium foeniculaceum)ユビキチンプロモーターまたはダイズユビキチンプロモーターであり、より好ましくはパセリユビキチンプロモーターである。上述のように、特にパセリユビキチンプロモーターは、外来性(adventitious)であり、かつ、一貫して高い形質転換効率を生じさせることが示されている。これらのプロモーターの性能が優れている理由は未知である。しかしながら、最適な選択は、標的組織の関連細胞(後に脱分化し、トランスジェニック植物に再生する)において、適切な時点でかつ適切な濃度(効率的選択を保証するために十分に高い濃度であるが、細胞に対する潜在的な負の影響を予防できないほど高くない濃度)に、選択マーカーが発現されることを必要とすることが知られている。ユビキチンプロモーター(特にパセリユビキチンプロモーター)の優れた機能および有効性はまた、ダイズ細胞が、それらに課される選択圧を耐え抜くために、ダイズに外因性(非ネイティブ)の十分な量のD-アラニンおよび/またはD-セリン代謝酵素(例えばDSDAまたはDAOタンパク質)を有する必要性を示すかもしれない。これらの効果は、プロモーターおよびマーカーの特定の組み合わせが他より優れている等のように、プロモーターおよび/またはマーカー依存的であってよい。ゆえに、ユビキチンプロモーターは、ダイズにおいてD-アミノ酸代謝酵素の発現を駆動するための標準プロモーターとして使用することができる。
【０１２０】
以下に挙げる構築物は新規であり、本発明を実行するために特に有用である。さらにまた、それらは、さらに他の植物種での使用を提供しうる。したがって、本発明の別の実施形態は、以下のものを含む異種ヌクレオチド配列に関する:
(a)  双子葉植物種由来のユビキチンプロモーター、およびそれに機能しうるように連結されている
(b)  D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
但し、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である。
【０１２１】
双子葉植物由来のいくつかのユビキチンプロモーターが報告されている(Callis 1989, 1990)。双子葉植物、例えばジャガイモ(Garbarino 1992)、タバコ(Genschick 1994)、トマト(Hoffman 1991)、パセリ(parsely)(Kawalleck 1993; WO03/102198, 参照により本明細書中に組み入れられる)、シロイヌナズナ(Callis 1990; Holtorf 1995; UBQ8, GenBank Acc.- No: NM_111814; UBQ1, GenBank Acc.- No: NM_115119; UBQ5, GenBank Acc.- No: NM_116090)由来のプロモーターが報告されている。
【０１２２】
一般に、本明細書中で使用される用語「ユビキチンプロモーター」は、ユビキチン、またはユビキチン様、遺伝子の開始コドン、またはマップされた転写開始部位、から5000塩基対(bp)上流までのゲノムDNAの領域を意味する。ユビキチンはすべての真核細胞で見出される豊富な76アミノ酸ポリペプチドである。ユビキチンをコードするいくつかの異なる遺伝子が存在し、アミノ酸レベルでのそれらの相同性はかなり高い。例えば、ヒトおよびマウスは、ユビキチンをコードする多数の異なる遺伝子を有し、その各遺伝子は異なる染色体座に位置する。機能的に、すべてのユビキチン遺伝子は、細胞のユビキチン依存性タンパク質分解の機構において決定的な役割を果たす。各ユビキチン遺伝子はその発現を駆動するプロモーターを伴う。ユビキチンプロモーターは、ユビキチン、またはユビキチン様、遺伝子の開始コドン、またはマップされた転写開始部位、から5,000 bp上流までのゲノムDNAの領域である。用語「植物ユビキチン調節系」とは、植物(好ましくはパセリ)ユビキチン遺伝子の翻訳開始部位の5'側の約2 kbヌクレオチド配列を表し、転写の開始、転写の調節、発現レベルのコントロール、ストレス遺伝子の誘導およびストレスに応答した発現の増強を導く配列を含む。プロモーターおよび調節機能をともに含む調節系は、遺伝子発現の調節制御またはモジュレーションを提供するDNA配列である。したがって、本発明の双子葉植物由来のユビキチンプロモーターは、植物ユビキチン調節系を含むDNA断片(好ましくは約0.5〜2 kbの長さ)であり、該調節系は、転写開始部位を含むプロモーター、および - 好ましくは - 該転写開始部位の5'側に位置する1以上の熱ショック要素、および - 好ましくは - 該転写開始部位の3'側に位置するイントロンを含有し、その場合、該調節系はダイズでの発現を調節可能である。
【０１２３】
好ましくは、ユビキチンプロモーターは、パセリユビキチンプロモーターまたはダイズ(Glycine max)ユビキチンプロモーターである。パセリおよびダイズユビキチンの配列を下記に挙げる(それぞれ配列番号５および６)。開示配列は含んでいる。
【０１２４】
プロモーター配列を、その転写特性を重大に改変することなく大きな程度に改変(例えば末端切断、融合、突然変異)できることが当業者に公知である。したがって、本発明の別の実施形態は、パセリユビキチンまたはダイズユビキチンプロモーターの誘導体または断片を含む異種ヌクレオチド配列に関する。これらは合成配列(すなわちそのような配列として天然に存在しない)であるか、または他の植物種由来のオルソロガス配列であってよい。ゆえに、本発明の別の実施形態は、以下のものを含む異種ヌクレオチド配列に関する:
(a)  以下のものからなる群から選択されるプロモーター:
(i)  配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(ii)  配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50 (好ましくは100または150、より好ましくは200または250、さらにより好ましくは300または500)個連続した塩基対からなる断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列、
(iii)  配列番号７または８に記載の配列に対して、少なくとも60％(好ましくは70％または75％、より好ましくは80％または85％、さらにより好ましくは90％または95％、最も好ましくは98％)の同一性を有し、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列を含む配列、
(iv)  配列番号７または８に記載の配列に対して(好ましくは、30〜(好ましくは) 35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC (好ましくは1x SSC)中で50〜(好ましくは) 55℃での洗浄)、より好ましくは40〜(好ましくは) 45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.5 X〜1 X SSC (好ましくは0.5x SSC)中で55〜(好ましくは) 60℃での洗浄)、および最も好ましくは50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃で、および0.1 x SSC中で60〜(好ましくは) 65℃での洗浄)と等価または等しい条件下で)ハイブリダイズし、かつダイズにおけるプロモーター活性を有する配列を含む配列、
および
(b)  D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
但し、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である。
【０１２５】
ダイズ植物における「プロモーター活性」とは、ダイズ植物の、またはダイズ植物に由来する、少なくとも1細胞または組織において、機能しうるように連結されている核酸配列の転写を実現する能力を意味する。好ましくは、それは、ほとんどの組織およびほとんどの発生段階での発現を可能にする構成的転写活性を意味する。
【０１２６】
したがって、本発明で利用されるユビキチンプロモーターは、配列番号７または８に記載のプロモーターの断片またはその誘導体であってもよい。断片には、必須でない配列が除去されている配列番号７または８に記載のプロモーターの末端切断型が含まれる。短縮プロモーター配列は高い利点を有する。その理由は、それらは取り扱いが容易であり、その遺伝子発現プロファイルが最適化されることがあるからである。短縮または末端切断プロモーターを作製するための、効率的で標的化された1手段は、プロモーター配列内の推定調節要素の特定に依存する。これは、類似の組織特異的様式または発生的に固有の様式で発現されることが知られているプロモーター配列と比較することによって開始することができる。類似の発現パターンを有するプロモーター間で共有される配列は、転写因子の結合候補である可能性が高く、ゆえに、発現パターンをもたらす要素である可能性が高い。これらの推定調節要素の確認は、各推定調節領域の欠失分析およびその後の、各構築物に機能的に取り付けられているレポーター遺伝子のアッセイによる各欠失構築物の機能解析によって達成することができる。そのように、出発プロモーター配列が提供されると、該出発プロモーターの任意のいくつかの異なる欠失突然変異体を容易に作製することができる。(例えば配列番号７または８に記載の)ユビキチンプロモーターの機能的に等価な断片はまた、必須の配列を欠失させることなく、必須でない配列を除去するか、または欠失させることによって得ることができる。転写調節ヌクレオチド配列をその必須の転写媒介要素にせばめる作業は、in vitroでトライアルアンドアロー(trial-and-arrow)欠失突然変異によって、またはin silicoでプロモーター要素検索ルーチンを使用して実現することができる。プロモーター活性に必須の領域は、特定の公知のプロモーター要素のクラスターを示すことが多い。そのような分析は、利用可能なコンピュータアルゴリズム、例えばPLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements"; Higo 1999)、BIOBASEデータベース"Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig; Wingender 2001)またはデータベースPlantCARE (Lescot 2002)を使用して実施することができる。好ましくは、本発明の転写調節ヌクレオチド配列の1つの、機能的に等価な断片は、配列番号７または８に記載の転写調節ヌクレオチド配列の少なくとも100塩基対、好ましくは少なくとも200塩基対、より好ましくは少なくとも500塩基対を含む。より好ましくは、この断片は指定配列の3'末端から出発する。
【０１２７】
特に好ましいのは、mRNAの5'非翻訳領域をコードする領域を欠失させ、ゆえに(非転写)プロモーター領域のみを提供することによって得られる転写調節ヌクレオチド配列の等価な断片である。5'非翻訳領域は当技術分野において公知の方法(例えば5'-RACE解析)によって容易に決定することができる。
【０１２８】
ユビキチンプロモーターに加えて、ダイズにおけるD-アミノ酸耐性を達成するために他のプロモーターが好適であると示されている。これらのプロモーターには、シロイヌナズナアクチン2プロモーターおよびnosプロモーターが含まれる。しかしながら、形質転換効率はユビキチンプロモーターの場合よりかなり低効率である。
【０１２９】
1.1.3  追加の要素
本発明の発現カセット(またはこれらが含まれるベクター)には、ダイズ植物において活性なプロモーター(例えばユビキチンプロモーター)に加えて、追加の機能的要素および遺伝子制御配列を含ませてよい。用語「機能的要素」または「遺伝子制御配列」は広義に理解されるものとし、本発明の発現カセットの実現または機能に対して効果を有するすべての配列を表す。例えば、遺伝子制御配列は転写および翻訳を改変する。遺伝子制御配列は報告済みである(例えばGoeddel 1990; Gruber 1993および該文献で引用される参考文献)。
【０１３０】
好ましくは、本発明の発現カセットは、(例えばD-アミノ酸代謝酵素をコードする)核酸配列の5'上流の、ダイズ植物において活性なプロモーター(例えばユビキチンプロモーター)、および3'下流のターミネーター配列およびポリアデニル化シグナルおよび、適切であれば、追加の通例の調節要素(各事例で、発現対象の核酸配列に機能しうるように連結されている)を包含する。
【０１３１】
遺伝子制御配列および機能的要素は、さらにまた、5'非翻訳領域、イントロンまたは遺伝子の非コード3'領域、例えばアクチン-1イントロン、またはAdh1-Sイントロン1、2および6を包含する(一般的参考文献: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994))。それらは遺伝子発現の調節に重要な役割を果たすことが実証されている。そして、5'非翻訳配列が異種遺伝子の一過性発現を増強できることが実証されている。言及することができる翻訳エンハンサーの例は、タバコモザイクウイルス5'リーダー配列(Gallie 1987)等である。さらにまた、それらは組織特異性を促進しうる(Rouster 1998)。
【０１３２】
遺伝子制御配列として好適なポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナル、好ましくはAgrobacterium tumefaciens由来のT-DNAポリアデニル化シグナルに本質的に相当するポリアデニル化シグナルである。特に好適なターミネーター配列の例は、OCS (オクトピンシンターゼ)ターミネーターおよびNOS (ノパリンシンターゼ)ターミネーターである。
【０１３３】
本発明の遺伝子成分および/または発現カセットには、追加の機能的要素を含ませてよい。機能的要素には、例えば、(D-アラニンまたはD-セリン代謝酵素に加えて)選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子が含まれる(がそれらに限定されないものとする)。選択可能でかつスクリーニング可能なマーカーには、以下のマーカーが含まれる。
【０１３４】
(a)  ネガティブ選択マーカー; すなわち、殺生物性化合物、例えば代謝阻害剤(例えば2-デオキシグルコース-6-リン酸, WO 98/45456)、抗生物質(例えばカナマイシン、G 418、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン)または除草剤(例えばホスフィノスリシンまたはグリフォセート)に対する耐性を付与するマーカー。特に好ましいネガティブ選択マーカーは、除草剤に対する耐性を付与するマーカーである(詳細に関しては下記の同時形質転換セクションを参照のこと)。
【０１３５】
(b)  ポジティブ選択マーカー; すなわち、非形質転換植物と比較して形質転換植物に生育上の利点を付与するマーカー、例えばEbinuma et al. 2000a,b、およびEP-A 0 601 092に記載の遺伝子および方法。
【０１３６】
(c)  対抗選択マーカー; すなわち、該マーカーを含む定義した欠失配列を有する生物を選択するために好適なマーカー(Koprek 1999)。その例には、シトシンデアミナーゼcodA (Schlaman 1997)が含まれる。
【０１３７】
(d)  レポーター遺伝子; すなわち、(色または酵素活性によって)容易に定量可能なタンパク質をコードするマーカー(Schenborn 1999)。緑色蛍光タンパク質(GFP) (Sheen 1995; Haseloff 1997; Reichel 1996; Tian 1997; WO 97/41228; Chui 1996; Leffel 1997)が好ましく、β-グルクロニダーゼ(GUS)は特に非常に好ましい(Jefferson 1987a,b)。
【０１３８】
本発明のベクターに含ませてよい機能的要素には、以下の要素が含まれる。
【０１３９】
(i)  本発明の発現カセットまたはベクターの例えばE. coli中での複製を保証する複製起点。言及することができる例はORI (DNA複製の起点)、pBR322 oriまたはP15A ori (Maniatis, 1989)である,
(ii)  1以上の核酸配列の挿入を可能にし、かつ促進するためのマルチクローニング部位(MCS),
(iii)  相同組換え、マーカー欠失、または宿主生物のゲノムへの挿入を可能にする配列。cre/lox (Sauer 1998; Odell 1990; Dale 1991)、FLP/FRT (Lysnik 1993)、またはAc/Ds系(Wader 1987; US 5,225,341; Baker 1987; Lawson 1994)に基づく方法は、宿主生物のゲノムからの特定DNA配列の - 適切であれば組織特異的および/または誘導性の - 除去を可能にする。この関連で制御配列は特定のフランキング配列(例えばlox配列)を意味し、後に該配列は(例えばcreリコンビナーゼを用いる)除去を可能にする(さらに国際特許出願PCT/EP 2005/002734; WO 2005/090581を参照のこと)),
(iv)  植物ゲノムへの導入および組込みのための植物細胞でのアグロバクテリウム媒介導入を可能にする要素、例えば境界配列、例えばT-DNAの右側または左側境界またはvir領域。
【０１４０】
1.2.  第２発現カセット
好ましくは、標的植物のゲノムに挿入されるDNA構築物は少なくとも1つの第２発現カセットを含み、該カセットはダイズ植物に農学的に重要な形質を付与する。これは、選択マーカー、形質遺伝子、アンチセンスRNAまたは二本鎖RNAの発現によって達成することができる。当業者は、この関連で、例えば食物および飼料の品質を高めるために、化学物質、ファインケミカルまたは医薬品(例えばビタミン、油、炭水化物; Dunwell 2000)を製造するために、利用することができ、除草剤に対する耐性を付与するか、または雄性不稔性を付与する多数の配列を承知している。さらにまた、成長、収量、ならびに非生物的および生物的ストレス因子(例えば真菌、ウイルスまたは昆虫等)に対する抵抗性を高めることができる。有益な特性は、タンパク質を過剰発現させることによって、または例えば対応するアンチセンス(Sheehy 1988; US 4,801,340; Mol 1990)または二本鎖RNA (Matzke 2000; Fire 1998; Waterhouse 1998; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364)を発現させることにより内因性タンパク質の発現を減少させることによって、付与することができる。
【０１４１】
これらの配列の発現のために、ダイズにおける遺伝子の発現に好適なすべてのプロモーターを使用することができる。好ましくは、該第２発現構築物は、D-アミノ酸代謝酵素を発現するために使用されるプロモーターと同一のプロモーターを含まない。発現は、例えば、構成的、誘導性または発生依存的であってよい。双子葉植物、例えばダイズでの発現に関して種々のプロモーターが公知であり、当技術分野において公知である(詳細に関しては上を参照のこと)。
【０１４２】
2.  本発明の形質転換および選択方法
2.1  植物材料の供給源および調製
本明細書中で開示される形質転換手順に種々の植物材料を使用することができる。そのような植物材料には、非限定的に、例えば葉、根、未成熟および成熟胚、花粉、分裂組織、花序、カルス、プロトプラストまたは植物細胞の懸濁物が含まれる。
【０１４３】
形質転換のための植物材料は、実質的に任意のダイズ種または植物から取得または単離することができる。特に好ましいのは、Jack、Resnik、Williams 82、Corsoy、Crawford、Hutcheson、KunitzおよびChampからなる群から選択されるダイズ植物である。追加の好適なダイズ種は、学問的および商業的な両組織、- 例えば - the University of Guelph (Ontario Agricultural College; 例えばダイズ種RCAT Staples, Westag 97, RCAT Bobcat, OAC Prudence, OAC Woodstock, OAC 9908)、またはDarylandまたはSoygeneticsのダイズ種から入手可能である。追加の好適な種は、PI548402 (Peking), PI437654 (Er-hejjan), PI438489 (Chiquita), PI507354 (Tokei 421), PI548655 (Forrest), PI548988 (Pickett), PI88788, PI404198 (Sun Huan Do), PI404166 (Krasnoaarmejkaja), Hartwig, Manokin, Doles, Dyer, およびCusterである。
【０１４４】
すべて当業者に周知の、異なるダイズ外植片に基づく(例えば子葉節に基づく)いくつかの形質転換および再生方法が当技術分野で報告されているが、本発明の方法は、好ましくは、腋生分裂組織に基づき、より好ましくは、それはダイズ植物の第１またはより高次の葉節に由来する。初生またはより高次の節の腋生分裂組織は実生の腋生分裂組織によって提供され、後の形質転換(例えばアグロバクテリウム共培養)ステップで使用することができる。
【０１４５】
好ましくは、本発明の方法は以下のステップを含む:
(a)  ダイズ実生の初生またはより高次の葉節の腋生分裂組織を提供するステップ、および
(b)  トランスジェニックT-DNAを含むリゾビウム科細菌と該腋生分裂組織を共培養するステップ(該トランスジェニックT-DNAは、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を含む)
(c)  以下のものを含むシュート誘導および選択培地上に該共培養した腋生分裂組織を移すステップ:
(i)  該腋生分裂組織から新規シュート誘導を誘導するために好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、および
(ii)  約3 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体、および
(iii)  場合により、リゾビウム科細菌の増殖を阻害するために好適な1種以上の抗生物質、
および該共培養した腋生分裂組織を、少なくとも5日間、同培地上で、そこからシュートが誘導されて発達するまで培養し、かつ該シュートを単離するステップ、および
(d)  該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートを該発根培地上で、該シュートが根を形成するまで培養し、さらにそのように誘導された小植物体を成熟植物(該植物はそのゲノムに挿入された該トランスジェニックT-DNAを含む)に再生させるステップ。
【０１４６】
腋生分裂組織に基づく方法では、種々の供給源由来、好ましくは初生またはより高次の葉節由来の外植片組織および/または細胞を使用することができる。初生葉節は、根から葉へ向かう方向に移動した場合に、子葉節(すなわち子葉の葉が結合しているか、または結合していた茎上の点)のすぐ次の節(すなわち葉が結合しているか、または結合していた茎上の点)である。より高次の葉節は、初生葉節に続くすべての葉節であり、例えば第２、第３、第４等の葉節である。初生葉節の腋生分裂組織が好ましい。
【０１４７】
好ましくは、初生またはより高次の節の腋生分裂組織を、以下からなる群から選択される形式で提供する:
(i)  実質的に実生全体によって提供される実生の腋生分裂組織、および
(ii)  初生またはより高次の葉を、腋生分裂組織が葉の葉柄に結び付いたままであるように解剖することによって提供される葉の腋生分裂組織、および
(iii)  増殖させた腋生分裂組織。
【０１４８】
初生またはより高次の節の腋生分裂組織を提供し、種々の形式で後のアグロバクテリウム共培養ステップにおいて使用することができる。
【０１４９】
(a)  方法A: 実生の腋生分裂組織: 実生全体またはその実質的部分(例えば根を欠いた実生または一方もしくは両方の子葉を有さない実生)を用い、アグロバクテリウムを接種し、シュート誘導培地(SIM)上に置くことができる。好ましくは、実質的な実生全体は、以下からなる材料の群から選択される:
(i)  実生全体、および
(ii)  根が除去されている実生、および
(iii)  一方または両方の子葉が除去されている実生、および
(iv)  根および一方または両方の子葉が除去されている実生、および
(v)  根、両子葉および上胚軸の部分が除去され、上胚軸の部分に結合している腋生分裂組織が残っている実生。
【０１５０】
(b)  方法B: 葉の腋生分裂組織: 初生またはより高次の葉を、腋生分裂組織が葉の葉柄に結合したままであるように解剖し、アグロバクテリウム溶液に浸し(アグロバクテリウムを接種し)、共培養培地上で共培養し、シュート誘導培地(SIM)上に置く。外植片のサイズが小さいことおよびシュートのめざましい成長は形質転換細胞の選択に好都合なはずであるが、それでは現行の形質転換方法論においては問題が生じる。
【０１５１】
(c)  方法C: 増殖させた腋生分裂組織: 出芽した(好ましくは約) 7日齢の実生から、胚軸および両子葉の一方および半分または部分を各実生から除去する。そして該実生を増殖培地上に2〜4週間置く。該実生はいくつかの分枝シュートを生じ、それから外植片が得られる。第１〜第４葉節由来の腋生の節を切り出すことができる。各実生から平均3〜4個の外植片を得ることができる。
【０１５２】
上で指摘される供給源に加えて、他の供給源が腋生分裂組織に好適でありうる。これらの供給源は、例えばダイズ実生に由来する、より制限された外植片、例えば上胚軸および初生葉節のみであってよい。明らかに、そのような制限された(すなわち小さい)外植片は、初生の節から得ることができるが、さらに、より高次の節(例えば第２およびより高次の節)からも同様に得ることができる。
【０１５３】
本方法に必要とされる期間は、他のアグロバクテリウム媒介形質転換プロトコルと比較して非常に低減される。生存可能な表現型陽性のダイズシュートを手順の開始から4〜6週間で回収することができる。さらにまた、本発明の方法は非常に遺伝子型および栽培品種に非依存的である。
【０１５４】
形質転換プロセスの出発材料は通常ダイズ種子である。該種子を最初に殺菌し、- 場合により - やわらかくするために十分に湿らせる。そして該種子をシュート培地上に置き、約4〜10日間、好ましくは約5〜8日間、および最も好ましくは約7日間の期間、シュートさせる。増殖させた腋生分裂組織および葉の腋生分裂組織の方法では、上胚軸は好ましくはこの時点で約0.5 cmであり、実生の腋生分裂組織の方法では、概して0.5〜2 cmである。好ましくはシュートは非常に明るい条件(>100μM m-2s-1)下で25℃で実行する。
【０１５５】
2.2  形質転換手順
2.2.1  一般的技術
本発明のDNA構築物は、該DNA構築物が挿入されているベクターを使用して好都合に細胞に導入することができる。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルスまたはアグロバクテリウムである。有益な実施形態では、プラスミドベクターを用いて発現カセットを導入する。好ましいベクターは、宿主ゲノムへの発現カセットの安定な組込みを可能にするベクターである。
【０１５６】
DNA構築物は、形質転換と称される手順である当業者に公知のいくつかの手段のいずれかによって標的植物細胞および/または生物に導入することができる。ダイズに好適な種々の形質転換手順が報告されている。
【０１５７】
例えば、DNA粒子衝突等の弾道的方法(ballistic methods)を使用してDNA構築物を植物細胞に直接導入するか、または細胞のエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション等の技術を使用してDNA構築物を導入することができる。粒子媒介形質転換技術(「微粒子銃」としても知られる)は、例えばEP-A1 270,356; US 5,100,792, EP-A-444 882, EP-A-434 616; Klein 1987; Vasil 1993; およびBecker 1994に記載されている。これらの方法は、小さいビーズまたは粒子のマトリックス内または表面上に核酸を伴う小さい粒子による細胞の貫通を含む。微粒子銃PDS-1000 Gene Gun (Biorad, Hercules, CA)では、ヘリウム圧を使用して、DNAでコーティングされた金またはタングステンマイクロキャリアを標的細胞に向けて加速する。このプロセスは、植物を含めた生物由来の広範囲の組織および細胞に適用可能である。他の形質転換方法もまた、当業者に公知である。
【０１５８】
他の技術には、マイクロインジェクション(WO 92/09696, WO 94/00583, EP-A 331 083, EP-A 175 966, Green 1987)、ポリエチレングリコール(PEG)媒介形質転換(Paszkowski 1984; Lazzeri 1995)、リポソームベースの遺伝子送達(WO 93/24640; Freeman 1984)、エレクトロポレーション(EP-A 290 395, WO 87/06614; Fromm 1985; Shimamoto 1992)が含まれる。
【０１５９】
植物細胞へのDNAのインジェクションまたはエレクトロポレーションの場合、形質転換対象のDNA構築物はいかなる特定の必要条件を満たす必要もない(実際、「裸の」発現カセットを利用することができる)。pUCシリーズのプラスミド等の単純なプラスミドを使用することができる。
【０１６０】
2.2.2  土壌伝播性細菌媒介形質転換(共培養)
これらの「直接」形質転換技術に加えて、かつさらに好ましくは、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes等の土壌伝播性細菌を用いる細菌感染によって形質転換を実行することもできる。
【０１６１】
2.2.2.1  菌株、ベクター、および共培養条件の選択
ダイズゲノムへのDNA (例えばT-DNA)の導入に使用される土壌伝播性細菌はリゾビウム科の任意の種であってよい。リゾビウム科は、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、シノリゾビウム属(Sinorhizobium)、およびアロリゾビウム属(Allorhizobium)を含み、それらは該細菌科内の属であり、リボソーム特性に基づいてプロテオバクテリアのアルファ-2サブクラスに含まれている。この科のメンバーは好気性でグラム陰性である。該細胞は、通常桿状(0.6-1.0μm x 1.5-3.0μm)であり、単独または対で存在し、内生胞子を有さず、1〜6個の周毛性鞭毛によって運動性である。炭水化物含有培地上での増殖期間中にかなりの細胞外多糖粘液が通常生産される。特に好ましいのは、リゾビウム科、例えばSinorhizobium meliloti、Sinorhizobium medicae、Sinorhizobium fredii、Rhizobium sp. NGR234、Rhizobium sp. BR816、Rhizobium sp. N33、Rhizobium sp. GRH2、Sinorhizobium saheli、Sinorhizobium terangae、Rhizobium leguminosarum biovar trifolii、Rhizobium leguminosarum biovar viciae、Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli、Rhizobium tropici、Rhizobium etli、Rhizobium galegae、Rhizobium gallicum、Rhizobium giardinii、Rhizobium hainanense、Rhizobium mongolense、Rhizobium lupini、Mesorhizobium loti、Mesorhizobium huakuii、Mesorhizobium ciceri、Mesorhizobium mediterraneium、Mesorhizobium tianshanense、Bradyrhizobium elkanni、Bradyrhizobium japonicum、Bradyrhizobium liaoningense、Azorhizobium caulinodans、Allobacterium undicola、Phyllobacterium myrsinacearum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium vitis、およびAgrobacterium rubiである。Broothaerts (2005)に記載の菌株および方法もまた好ましい。
【０１６２】
単系の性質のアグロバクテリウム、アロリゾビウムおよびリゾビウムならびにそれらの共通の表現型の遺伝的限界は、それらを単一の属、リゾビウムに合併することを支持する。Agrobacterium tumefaciensおよびAgrobacterium rhizogenesおよびそれらの種々のオパイン型クラスの差異を含むアグロバクテリウム株の分類および特徴付けは当技術分野において周知の慣例である(例えばLaboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, 3rd edition. (2001) Schaad, Jones, and Chun (eds.) ISBN 0890542635; 例えば該文献で公開されているMooreらの論文を参照のこと)。最近の分析では、その植物病原特性よる分類が理にかなっていないかもしれないことが示されている。したがって、ゲノム解析および比較に基づく、より高度な方法(例えば16S rRNAシークエンシング; RFLP, Rep-PCR, 等)が、種々の菌株の関連性を解明するために使用される(例えばYoung 2003, Farrand 2003, de Bruijn 1996, Vinuesa 1998を参照のこと)。アグロバクテリウムK599株の関連性を実証する2つの方法によるアグロバクテリウム属のメンバーの系統発生上の関連性はLlob 2003に発表されている。
【０１６３】
アグロバクテリウムだけでなく他の土壌伝播性細菌もまた、それらがTi-またはRi-プラスミドのT-DNA導入に適切な機能的要素を有することを条件として(provided that they the relevant functional elements for the T-DNA transfer of a Ti- or Ri-plasmid)、T-DNA導入を媒介可能であることが当技術分野において公知である(Klein & Klein 1953; Hooykaas 1977; van Veen 1988)。
【０１６４】
好ましくは、土壌伝播性細菌はアグロバクテリウム属の土壌伝播性細菌である。本明細書中で使用される用語「アグロバクテリウム」は、土壌伝播性、グラム陰性、桿状植物病原性細菌を表す。アグロバクテリウムの種、Agrobacterium tumefaciens (syn. Agrobacterium radiobacter)、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubiおよびAgrobacterium vitisは、Allorhizobium undicolaとともに、比較16S rDNA解析に基づいて、すべてのリゾビウム種を含む単系群を形成する(Sawada 1993, Young 2003)。アグロバクテリウムは植物病原種を含む人工属である。
【０１６５】
本明細書中で使用される用語Ti-プラスミドは、アグロバクテリウム中で複製可能であり、かつその天然の「武装した(armed)」形式でアグロバクテリウム感染植物中でクラウンゴールを媒介するプラスミドを表す。植物細胞にアグロバクテリウムの天然の「武装した」形式のTi-プラスミドが感染すると、概して、感染細胞によるオパイン(例えばノパリン、アグロピン、オクトピン等)の生産が生じる。そして、ノパリンの生産を生じさせるアグロバクテリウム株(例えばLBA4301, C58, A208株)は「ノパリン型」アグロバクテリウムと称され; オクトピンの生産を生じさせるアグロバクテリウム株(例えばLBA4404, Ach5, B6株)は「オクトピン型」アグロバクテリウムと称され; アグロピンの生産を生じさせるアグロバクテリウム株(例えばEHA105, EHA101, A281株)は「アグロピン型」アグロバクテリウムと称される。安全化された(disarmed)Ti-プラスミドとは、そのクラウンゴール媒介特性を欠いているが、その他の点では植物感染のための機能を提供するTi-プラスミドとして理解される。好ましくは、該「安全化された」プラスミドのT-DNA領域を、境界配列以外に、機能的内部Ti-配列が植物ゲノムに導入されないように改変した。好ましい実施形態では、- バイナリーベクター系とともに使用する場合 - T-DNA領域全体(T-DNA境界を含む)を欠失させる。
【０１６６】
本明細書中で使用される用語Ri-プラスミドは、アグロバクテリウム中で複製可能であり、かつその天然の「武装した」形式でアグロバクテリウム感染植物中で毛状根疾患を媒介するプラスミドを表す。植物細胞にアグロバクテリウムの天然の「武装した」形式のRi-プラスミドが感染すると、概して、感染細胞によるオパイン(形質転換植物細胞で生産される特定のアミノ糖誘導体、例えばアグロピン、ククモピン、オクトピン、ミキモピン等)の生産が生じる。Agrobacterium rhizogenes株は、伝統的に、A. tumefaciens株と同様にサブクラスに分類される。最も一般的な菌株は、アグロピン型の菌株(例えばRi-プラスミドpRi-A4によって特徴付けられる)、マンノピン型の菌株(例えばRi-プラスミドpRi8196によって特徴付けられる)およびククモピン型の菌株(例えばRi-プラスミドpRi2659によって特徴付けられる)である。いくつかの他の菌株はミキモピン型の菌株(例えばRi-プラスミドpRi1723によって特徴付けられる)である。ミキモピンおよびククモピンは立体異性体であるが、pRiプラスミド間でヌクレオチドレベルでの相同性は見出されなかった(Suzuki 2001)。安全化されたRi-プラスミドとは、その毛状根疾患媒介特性を欠いているが、その他の点では植物感染のための機能を提供するRi-プラスミドとして理解される。好ましくは、該「安全化された」RiプラスミドのT-DNA領域を、境界配列以外に、機能的内部Ri-配列が植物ゲノムに導入されないように改変した。好ましい実施形態では、- バイナリーベクター系とともに使用する場合 - T-DNA領域全体(T-DNA境界を含む)を欠失させる。
【０１６７】
A. tumefaciensおよびA. rhizogenesのTiおよびRiプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝的形質転換の担う遺伝子を保持する(Kado 1991)。ベクターはアグロバクテリウムTi-またはRi-プラスミドに基づき、植物ゲノムへの天然のDNA導入系を利用する。この非常に発達した寄生の部分として、アグロバクテリウムはそのゲノム情報の規定部分(T-DNA; 左側および右側境界と称される約25 bp反復が隣接している)を植物細胞の染色体DNAに導入する(Zupan 2000)。いわゆるvir遺伝子(元のTi-プラスミドの部分)の複合作用によって、該DNA導入が媒介される。この天然系の利用に関して、元の腫瘍誘導遺伝子(「安全化されたベクター」)を欠いているTi-プラスミドが開発された。さらなる改善、いわゆる「バイナリーベクター系」では、T-DNAをシャトルベクターに組み入れることによってTi-プラスミドの他の機能的要素(例えばvir遺伝子)から物理的に分離し、それにより容易な取り扱いが可能になった(EP-A 120 516; US 4,940,838)。これらのバイナリーベクターは、(その境界配列を有する安全化されたT-DNAに加えて)、アグロバクテリウムおよびE. coliの両者での複製のための原核生物の配列を含む。アグロバクテリウム媒介形質転換の利点は、概して、境界が隣接するDNAのみがゲノムに導入され、かつ優先的な1コピーのみが挿入されることである。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介遺伝子導入のための方法の説明は当技術分野において公知である(Miki 1993; Gruber 1993; Moloney 1989)。
【０１６８】
ゆえに、アグロバクテリウム媒介形質転換では、(例えば発現カセットを含む)遺伝子組成物を特定のプラスミドに、シャトルまたは中間ベクターに、またはバイナリーベクターに組み込む。TiまたはRiプラスミドを形質転換に使用しようとする場合、TiまたはRiプラスミドT-DNAの少なくとも右側境界、ほとんどの場合は右側および左側境界が、導入対象の発現カセットに、フランキング領域の形式で連結されている。好ましくはバイナリーベクターを使用する。バイナリーベクターはE.coliおよびアグロバクテリウムの両細菌で複製可能である。それらは、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカー(例えば導入対象の発現カセットの挿入用)を含んでよく、それに右側および左側T-DNA境界配列が隣接している。それらをアグロバクテリウムに直接導入することができる(Holsters 1978)。選択マーカー遺伝子により、形質転換アグロバクテリウムの選択が可能になり、例えば、それはカナマイシンに対する耐性を付与するnptII遺伝子である。この場合、宿主生物として働くアグロバクテリウムは、vir 領域を含むプラスミドをすでに含有すべきであろう。後者は、T-DNAを植物細胞に導入するために必要とされる。このように形質転換されたアグロバクテリウムを植物細胞の形質転換に使用することができる。植物細胞を形質転換するためのT-DNAの使用は集中的に研究および報告されている(EP 120 516; Hoekema 1985)。
【０１６９】
一般的なバイナリーベクターは、P-型プラスミドRK2に由来するpRK252 (Bevan 1984)またはpTJS75 (Watson 1985)等の「広宿主範囲(broad host range)」-プラスミドに基づく。ほとんどのこれらのベクターはpBIN19の誘導体である(Bevan 1984)。種々のバイナリーベクターが公知であり、そのいくつかが市販されている。例えばpBI101.2またはpBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA)である。追加のベクターは、サイズおよび取り扱いに関して改善された(例えばpPZP; Hajdukiewicz 1994)。改善されたベクター系はWO 02/00900にも記載されている。
【０１７０】
好ましくは、土壌伝播性細菌はアグロバクテリウム科に属する細菌であり、より好ましくは安全化されたAgrobacterium tumefaciensまたはrhizogenes株である。好ましい実施形態では、本発明の実施に使用されるアグロバクテリウム株には、オクトピン株、例えばLBA4404またはアグロピン株、例えばEHA101またはEHA105が含まれる。DNA導入に好適なA. tumefaciensの株は、例えばEHA101[pEHA101] (Hood 1986)、EHA105[pEHA105] (Li 1992)、LBA4404[pAL4404] (Hoekema 1983)、C58C1[pMP90] (Koncz & Schell 1986)、およびC58C1[pGV2260] (Deblaere 1985)である。他の好適な株はノパリン株Agrobacterium tumefaciens C58である。他の好適な株は、A. tumefaciens C58C1 (Van Larebeke 1974)、A136 (Watson 1975)またはLBA4011 (Klapwijk 1980)である。別の好ましい実施形態では、土壌伝播性細菌は、Agrobacterium rhizogenes K599株の安全化された変異株(NCPPB 2659)である。そのような菌株は、2004年9月2日提出の米国仮出願第60/606,789号、および国際出願PCT/EP2005/009366 (参照によりここに全体が組み入れられる)に記載されている。
【０１７１】
バイナリーベクターまたは任意の他のベクターを、一般的なDNA組換え技術によって改変し、E. coli中で増殖させ、例えばエレクトロポレーションまたは他の形質転換技術によってアグロバクテリウムに導入することができる(Mozo 1991)。
【０１７２】
アグロバクテリウムは、当技術分野において公知の様式で培養および使用される。ベクターを含むアグロバクテリウム株を、例えば、適切な抗生物質(例えば50 mg/lスペクチノマイシン)を補充したYEP培地(5 g/l酵母抽出物, 10 g/lペプトン, 5 g/l NaCl, 15 g/l寒天, pH 6.8; 実施例２を参照のこと)上で3日間培養する。ループを用いて細菌を固体培地から回収し、再懸濁する。本発明の好ましい実施形態では、-80℃で凍結されたアリコートを使用して、アグロバクテリウムの培養を開始する。種々のダイズ腋生分裂組織外植片組織のアグロバクテリウム処理では、好ましくは細菌を共培養培地(CCM)に再懸濁する。感染、直接接触期間、および共培養に使用されるアグロバクテリウムの濃度を変化させる必要があるかもしれない。そして、一般にアグロバクテリウム濃度の範囲はOD600 0.1〜3.0である。好ましくは、種々の腋生分裂組織外植片に関して、以下の濃度のアグロバクテリウム懸濁液を使用する。  
(a)  方法A (実生の腋生分裂組織): 約OD600 = 0.5〜約3, 好ましくは約OD600 = 1〜2。
【０１７３】
(b)  方法B (葉の腋生分裂組織): 約OD600 = 0.1〜約1, 好ましくは約OD600 = 0.125〜0.5。
【０１７４】
(c)  方法C (増殖させた腋生分裂組織): 約OD600 = 0.2〜約1.5, 好ましくは約OD600 = 0.5〜0.8。
【０１７５】
そして数分間〜数時間、典型的に約10分間〜3時間、好ましくは約0.5時間〜1時間、外植片にアグロバクテリウム培養を接種する。過剰の培地を排出し、Agrobacterium tumefaciens株では約1〜約6日間、好ましくは約3〜約5日間、Agrobacterium rhizogenes株では約2〜約3日間、好ましくは暗所で、アグロバクテリウムを分裂組織と共培養することが可能である。このステップの期間中に、アグロバクテリウムはダイズ腋生分裂組織中のいくつかの細胞に外来遺伝子構築物を導入する。通常、このステップの期間中に選択化合物は存在しない。
【０１７６】
2.2.2.2  形質転換効率を向上させるための改変
植物防御応答(フェノール酸化等)に起因する組織壊死を減少させることができるエチレンインヒビター(例えば硝酸銀)、フェノール吸収化合物(ポリビニルピロリドン等, Perl 1996)または酸化防止剤(チオール化合物, 例えばジチオスレイトール, L-システイン等, Olhoft 2001)を共培養培地に補充すると、アグロバクテリウム媒介形質転換の効率をさらに改善することができる。
【０１７７】
植物防御応答(フェノール酸化等)に起因する組織壊死を減少させることができる酸化防止剤(例えばジチオスレイトール)、またはチオール化合物(例えばL-システイン, Olhoft 2001; US2001034888)を共培養培地に補充すると、アグロバクテリウム媒介形質転換の効率をさらに改善することができる。別の好ましい実施形態では、共培養培地は、好ましくはナトリウムチオールサルファート(sodium thiolsulfate)、ジチオスレイトール(dithiotrietol)(DTT)およびシステインからなる群から選択される少なくとも1種のチオール化合物を含む。好ましくは、その濃度は、約1 mM〜10mMの範囲のL-システイン、0.1 mM〜5 mMの範囲のDTT、および/または0.1 mM〜5 mMの範囲のナトリウムチオールサルファートである。
【０１７８】
標的組織および/またはアグロバクテリウムは、アグロバクテリウム共培養の前またはアグロバクテリウム共培養の期間中にフェノール化合物で処理してよい。本発明の範囲内で好適な「植物フェノール化合物」または「植物フェノール類」は、正の走化性応答を誘発可能な単離された置換フェノール分子、特にTi-プラスミドを含有するAgrobacterium sp.、特にTi-プラスミドを含有するAgrobacterium tumefaciens中のvir遺伝子発現の増加を誘導可能なものである。好ましい植物フェノール化合物はアセトシリンゴン(3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシアセトフェノン)である。特定の化合物、例えばオスモプロテクタント(osmoprotectants)(例えば、好ましくは約200〜1000 mg/Lの濃度のL-プロリンまたはベタイン)、植物ホルモン(phytohormes)(とりわけNAA)、オパイン、または糖は、植物フェノール化合物と組み合わせて添加されると相乗的に作用する。
【０１７９】
Agrobacterium tumefaciensに関する特に好適な誘導条件が報告されている(Vernade 1988)。アグロバクテリウムを用いる形質転換の効率は、例えば減圧浸潤(WO 00/58484)、熱ショックおよび/または遠心分離、硝酸銀の添加、超音波処理等の当技術分野で公知の多数の他の方法によって高めることができる。
【０１８０】
好ましくは、本発明の方法は、以下の群から選択される1以上の追加のステップを含む:
(a1)  共培養の前、共培養中または共培養の直後に外植片を傷つけるステップ、および
(b1)  ステップ(b)後の該共培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウムの増殖を阻害するために好適な少なくとも1種の抗生物質、および - 場合により - 少なくとも1種の植物成長因子を含む培地(該培地は、好ましくは、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を欠いている)に移すステップ、および、
(b2)  ステップ(b)および - 場合により(b1) - 後の該腋生、分裂組織を、少なくとも1種の植物成長因子を含むシュート誘導培地(SIM)(該シュート誘導培地は、好ましくは、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を欠いている)上で、さらにインキュベートするステップ、および
(c1)  ステップ(cまたはb2)後の該シュートを、以下のものを含むシュート伸長培地に移すステップ:
(i)  シュート伸長を可能にするために好適な濃度の少なくとも1種の植物成長因子、および
(ii)  場合により、約3〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体、
および、該移動させたシュートを該シュート伸長培地上で、該シュートが少なくとも約2 cmの長さに伸長するまで培養するステップ。
【０１８１】
本発明の好ましい実施形態では、腋生分裂組織を傷つける(ステップ(a1))。創傷は本発明の方法に関して以下の少なくとも2つの増強効果を有すると考えられる:
(i)  創傷はアグロバクテリウム感染および遺伝子導入効率を促進し、
(ii)  創傷は、おそらく分裂組織の連結を分裂させることによって新規シュート誘導の効率を高め、外植片組織から発生するシュートの数を顕著に増加させる。
【０１８２】
創傷は、アグロバクテリウムでの接種(共培養)前、接種中または接種後でありうる。有益な両効果を達成するために、創傷は、好ましくは、共培養前または共培養中、より好ましくは共培養前に行う。多数の創傷方法を使用することができ、該方法には、例えば、切断、擦過(abrading)、突き通し(piercing)、つつき(poking)、微細な粒子または加圧液体の貫通、プラズマ創傷、高圧の適用、または超音波処理が含まれる。創傷は、物体、例えば非限定的に、メス、ハサミ、針、研磨物、エアブラシ、粒子、電気遺伝子銃、または音波を使用して実施することができる。共培養ステップの効率を高めるための別の代替法は減圧浸潤(Bechtold 1998; Trieu 2000)である。
【０１８３】
2.3  共培養後の処理
共培養後、洗浄および/または適切な抗生物質での処理によって土壌伝播性細菌を除去することが好ましい。したがって、共培養ステップ後に使用される培地、例えばステップ(b1)、(b2)、および/または(c1)において使用される培地は、好ましくは、殺菌剤(抗生物質)を含有する。このステップは、非形質転換細胞の増殖を終わらせるか、または少なくとも遅延させ、残留アグロバクテリウム細胞を死滅させるためのステップである。したがって、好ましくは、本発明の方法は以下のステップを含む:
(b1)  ステップ(b)後の該共培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウムの増殖を阻害するために好適な少なくとも1種の抗生物質、および - 場合により - 少なくとも1種の植物成長因子を含む培地(該培地は、好ましくは、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を欠いている)に移すステップ、および、
【０１８４】
使用対象の好ましい抗生物質は、例えば、カルベニシリン(500 mg/Lまたは - 好ましくは - 100 mg/L)またはTimentinTM (GlaxoSmithKline; 好ましくは約250〜500 mg/Lの濃度で使用され; TimentinTMはチカルシリン二ナトリウムおよびクラブラン酸カリウムの混合物であり; TimentinTM 0.8 gはクラブラン酸50 mgをチカルシリン750 mgとともに含有する)である。化学的に、チカルシリン二ナトリウムはN-(2-カルボキシ-3,3-ジメチル-7-オキソ-4-チア-1-アザビシクロ[3.2.0]ヘプタ-6-イル)-3-チオフェンマロンアミド酸二ナトリウム塩(N-(2-Carboxy-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]hept-6-yl)-3-thio-phenemalonamic acid disodium salt)である。化学的に、クラブラン酸カリウムは(Z)-(2R, 5R)-3-(2-ヒドロキシエチリデン)-7-オキソ-4-オキサ-1-アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-2-カルボン酸カリウムである。
【０１８５】
2.4  選択
アグロバクテリウム媒介技術は、典型的に、標的組織中の非常に限られた数の細胞への遺伝子送達を生じさせる。特にダイズでは、形質転換効率(選択を伴わない)が概して非常に低い。この問題は、本明細書中で提供されるD-アラニンおよび/またはD-セリン代謝酵素に基づく選択プロトコルによって克服される。ゆえに、共培養および - 場合により - 回復ステップ(下記参照のこと)後に、標的組織(例えば腋生分裂組織)を選択培地上に移してインキュベートする。
【０１８６】
新たに形質転換された(共培養した)外植片を、共培養(ステップ(b)または(b1))後、約1時間〜約10日間、好ましくは1日〜8日間、より好ましくは約4〜約7日間の一定期間、選択化合物(植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体)を欠く培地上でインキュベートすることが好ましい。該選択化合物に対して信頼できる耐性レベルを確立するためには、形質転換細胞および組織に対してでさえ、選択化合物による意図されない損傷を予防するためにいくらかの時間が必要である。したがって、本発明の方法には、選択化合物を用いずに実行される、共培養と選択の間のステップを含ませることができる。この回復期間中にシュート誘導(下記参照のこと)をすでに開始してもよい。
【０１８７】
選択培地は、植物毒性濃度(すなわち非形質転換細胞の増殖を終わらせるか、または少なくとも遅延させる濃度)のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を含む。本明細書中で使用される用語「植物毒性の」、「植物毒性」または「植物毒性効果」は、植物または植物細胞の生理学に対する任意の測定可能な負の影響を意味するものとし、該影響は、(非限定的に)例えば増殖の低減または障害、光合成の低減または障害、細胞分裂の低減または障害、再生(例えば、細胞培養物、カルス、またはシュート等からの成熟細胞の再生)の低減または障害、稔性の低減または障害等を含む症状を生じさせる。植物毒性は、例えば壊死またはアポトーシス等の影響をさらに含む。好ましい実施形態では、該植物毒性化合物で処理されなかった植物と比較して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％の増殖または再生能の低減が生じる。
【０１８８】
選択に使用される具体的化合物は、どのマーカータンパク質が発現されるかに依存して選択される。例えば、E.coli D-セリンアンモニアリアーゼを使用する場合、D-セリンを含む培地上で選択が行われる。Rhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼが使用される場合、D-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択が行われる。
【０１８９】
D-アミノ酸が使用されるという事実は、L-アミノ酸構造またはL-アミノ酸の存在を除外しない。いくつかの適用では、(例えばコストの理由で) D-およびL-アミノ酸のラセミ混合物(または豊富なD-アミノ酸含量を有する混合物)を適用することが好ましい。好ましくは、D-アミノ酸と、対応するL-エナンチオマーの比は、少なくとも1:1、好ましくは2:1、より好ましくは5:1、最も好ましくは10:1または100:1である。D-アラニンの使用は、L-エナンチオマーの妨害性のまたは有害な影響を伴うことなく、D-およびL-アラニンのラセミ混合物を適用することができる利点を有する。したがって、改善された実施形態では、D/L-アラニンのラセミ混合物を化合物として使用する。
【０１９０】
D-アラニンまたはD-セリンに関する用語「誘導体」は、D-アラニンまたはD-セリンのそれぞれのD-アミノ酸構造を含むが、化学的に改変されている化学物質を意味する。本明細書中で使用される用語「D-アミノ酸構造」(例えば「D-セリン構造」)は、D-アミノ酸、ならびに化合物の機能的活性を維持するD-アミノ酸のアナログ、誘導体およびミメティクスを含むものとする。本明細書中で使用される「誘導体」はまた、化合物上の1個以上の反応基が置換基で誘導体化されている形式のD-セリンまたはD-アラニンを表す。使用されるD-アミノ酸は、アミノ末端またはカルボキシ末端修飾基または側鎖の修飾によって改変することができる。アミノ末端修飾基は、- 例えば - 以下からなる群から選択される: フェニルアセチル, ジフェニルアセチル, トリフェニルアセチル, ブタノイル, イソブタノイル ヘキサノイル, プロピオニル, 3-ヒドロキシブタノイル, 4-ヒドロキシブタノイル, 3-ヒドロキシプロピオノイル, 2,4-ジヒドロキシブチロイル, 1-アダマンタンカルボニル, 4-メチルバレリル, 2-ヒドロキシフェニルアセチル, 3-ヒドロキシフェニルアセチル, 4-ヒドロキシフェニルアセチル, 3,5-ジヒドロキシ-2-ナフトイル, 3,7-ジヒドロキシ-2-ナフトイル(3,7-dihydroxy-2-napthoyl), 2-ヒドロキシシンナモイル, 3-ヒドロキシシンナモイル, 4-ヒドロキシシンナモイル, ヒドロシンナモイル, 4-ホルミルシンナモイル, 3-ヒドロキシ-4-メトキシシンナモイル, 4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナモイル, 2-カルボキシシンナモイル, 3,4,-ジヒドロキシヒドロシンナモイル, 3,4-ジヒドロキシシンナモイル, トランス-シンナモイル, (±)-マンデリル, (±)-マンデリル-(±)-マンデリル, グリコリル, 3-ホルミルベンゾイル, 4-ホルミルベンゾイル, 2-ホルミルフェノキシアセチル, 8-ホルミル-1-ナフトイル(8-formyl-1-napthoyl), 4-(ヒドロキシメチル)ベンゾイル, 3-ヒドロキシベンゾイル, 4-ヒドロキシベンゾイル, 5-ヒダントインアセチル, L-ヒドロオロチル, 2,4-ジヒドロキシベンゾイル, 3-ベンゾイルプロパノイル, (±)-2,4-ジヒドロキシ-3,3-ジメチルブタノイル, DL-3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクチル, 3-(2-ヒドロキシフェニル)プロピオニル, 4-(2-ヒドロキシフェニル)プロピオニル, D-3-フェニルラクチル, 3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル, L-3-フェニルラクチル, 3-ピリジルアセチル, 4-ピリジルアセチル, イソニコチノイル, 4-キノリンカルボキシル, 1-イソキノリンカルボキシルおよび3-イソキノリンカルボキシル。カルボキシ末端修飾基は、- 例えば - アミド基、アルキルアミド基、アリールアミド基およびヒドロキシ基からなる群から選択される。本明細書中で使用される「誘導体」には、それぞれのD-アミノ酸構造の化学構造を模倣し、かつ該D-アミノ酸構造の機能的特性を保持する分子が含まれるものとする。アミノ酸またはペプチドアナログ、誘導体およびミメティクスを設計するアプローチは当技術分野において公知である(例えばFarmer 1980; Ball 1990; Morgan 1989; Freidinger 1989; Sawyer 1995; Smith 1995; Smith 1994; Hirschman 1993を参照のこと)。他の修飾候補には、N-アルキル(またはアリール)置換、または主鎖架橋によるラクタムおよび他の環状構造の構築が含まれる。他の誘導体には、C末端ヒドロキシメチル誘導体、O-修飾誘導体(例えばC末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル)、N末端修飾誘導体、例えばアルキルアミドおよびヒドラジド等の置換アミドが含まれる。さらにまた、D-アミノ酸構造を含む除草剤化合物を使用してよい。そのような化合物は例えばUS 5,059,239に記載されていて、それには、N-ベンゾイル-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-DL-アラニン、N-ベンゾイル-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-DL-アラニンメチルエステル、N-ベンゾイル-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-DL-アラニンエチルエステル、N-ベンゾイル-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-D-アラニン、N-ベンゾイル-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-D-アラニンメチルエステル、またはN-ベンゾイル-N-(3-クロロ-4-フ
ルオロフェニル)-D-アラニンイソプロピルエステルが含まれる(がそれらに限定されないものとする)。
【０１９１】
選択化合物(植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体)は他の物質と組み合わせて使用してよい。適用目的では、選択化合物はまた、製剤化技術分野で慣習的に使用される補助剤とともに使用してよく、したがって、公知の様式で、例えば乳剤、塗布可能なペースト、直接スプレー可能または希釈可能な溶液、希釈エマルジョン、水和剤、可溶性粉末、粉塵、顆粒化物、およびさらに例えばポリマー物質中のカプセル化物に製剤化される。使用対象の組成物の性質と同様に、適用方法、例えばスプレー、噴霧、散粉、散乱、コーティングまたは流し込みは、意図される目的および一般的な状況にしたがって選択される。しかしながら、より好ましくは、選択化合物を培地に直接適用する。選択化合物の原液を作製し、選択効率を損なうことなく室温で長期間保存できると有益である。
【０１９２】
選択化合物(すなわちD-アラニン、D-セリン、その誘導体またはその任意の組み合わせ)の最適な濃度は、形質転換に使用される標的組織に非常に依存しうるが、一般に(および好ましくは腋生分裂組織の形質転換に関して)、D-アラニン、D-セリンまたはその誘導体の総濃度(すなわち混合物の場合は合計)は約0.5 mM〜約100 mMの範囲である。例えばE.coli D-セリンアンモニアリアーゼが使用される場合、好ましくは約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの濃度の(例えば寒天で固化されたMS培地プレートに組み入れられた)D-セリンを含む培地上で選択が行われる。Rhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼが使用される場合、好ましくは約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの総濃度の(例えば寒天で固化されたMS培地プレートに組み入れられた)D-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択が行われる。好ましくは、D-アラニン(例えば唯一の選択化合物として使用される場合)は、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約20 mMの濃度で使用される。好ましくは、D-セリン(例えば唯一の選択化合物として使用される場合)は、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約70 mM、より好ましくは約2 mM〜約50 mM、最も好ましくは約3 mM〜約15 mMの濃度で使用される。
【０１９３】
また選択期間は、使用される標的組織および使用される再生プロトコルに依存して変動しうる。(選択化合物の存在に基づく)選択圧は、シュート誘導、シュート伸長、および発根を含む再生プロセス全体に関して維持される。
【０１９４】
一般に、選択期間は、少なくとも約5日間、好ましくは少なくとも約14日間である。より具体的には、脱分化条件(すなわちカルスまたはシュート誘導)下での総選択期間は、約1〜約10週間、好ましくは約3〜7週間、より好ましくは約3〜4週間である。しかしながら、脱分化条件下での選択を、長くて70日間使用することが好ましい。好ましくは、約3〜約20 mM D-アラニンおよび/またはD-セリンを使用して、約3〜4週間、脱分化条件下で選択が行われる。選択期間の中間で、1回以上、外植片を新鮮な選択培地に移すことができる。本明細書中で提供される具体的プロトコルでは、2回の選択培地ステップ(例えば新規選択培地に1回移動)を使用することが好ましい。好ましくは、ステップの選択は2ステップで行われ、約14〜20日間の第１選択ステップを使用し、そして、さらに14〜20日間、第１選択培地と本質的に同じ組成を有する第２選択培地に生存細胞または組織を移す。しかしながら、単一ステップの選択を適用することも可能である。D-アミノ酸代謝酵素の存在は、追加のマーカーの使用を除外しない。
【０１９５】
2.5  稔性ダイズ植物の再生
共培養ステップ(および随意の回復ステップ)後、共培養した外植片を、少なくとも1種の植物成長因子を含むシュート誘導培地上でインキュベートする。該シュート誘導培地上でのインキュベーションは、共培養ステップの直後に(すなわちアグロバクテリウムの増殖を阻害するためのステップ(b1)と並行して)または他の中間ステップ、例えば(b1)(アグロバクテリウムの増殖を阻害する)および/または(b2)(選択化合物を伴わない再生; 下記参照のこと)後に開始することができる。
【０１９６】
シュート誘導(および/またはシュート伸長)に使用される培地には、好ましくは、1種以上の植物成長調節物質、例えばサイトカイニン化合物(例えば6-ベンジルアミノプリン)および/またはオーキシン化合物(例えば2,4-D)等を補充する。本明細書中で使用される用語「植物成長調節物質」(PGR)は、植物の増殖および発生を調節できる天然に存在する化合物または合成(天然に存在しない)化合物を意味する。PGRは、単独で、または互いにもしくは他の化合物(例えば糖、アミノ酸)と一緒になって作用しうる。用語「オーキシン」または「オーキシン化合物」は、細胞の伸長および分裂、維管束組織の分化、果実成長、不定根の形成、エチレンの生産を刺激し、かつ - 高濃度で - 脱分化(カルス形成)を誘導する化合物を含む。最も一般的な天然に存在するオーキシンはインドール酢酸(IAA)であり、それは根および茎において極方向に輸送される。合成オーキシンは近代農業において広範に使用されている。合成オーキシン化合物には、インドール-3-酪酸(IBA)、ナフチル酢酸(NAA)、および2,4-ジクロルフェノキシ酢酸(2,4-D)が含まれる。シュート形成を誘導する化合物には、非限定的に、IAA、NAA、IBA、サイトカイニン、オーキシン、カイネチン、グリフォセート、およびチアジアズロン(thiadiazuron)が含まれる。用語「サイトカイニン」または「サイトカイニン化合物」は、細胞分裂、子葉の拡大、および側芽の成長を刺激する化合物を含む。それらは切断葉の老化を遅延させ、オーキシン(例えばIAA)とともに、根およびシュートの形成に影響しうる。サイトカイニン化合物には、例えば、6-イソペンテニルアデニン(IPA)および6-ベンジルアデニン/6-ベンジルアミノプリン(BAP)が含まれる。
【０１９７】
本発明の(特に腋生分裂組織に基づく方法に関する)一実施形態では、ステップ(b)(共培養)、および/または(c)(シュート誘導および選択)の少なくとも1つの培地は、好ましくは約1μM〜約10μM 6-ベンジルアミノプリンの濃度と等価な濃度の、サイトカイニン(例えば6-ベンジルアミノプリン(BAP)等)を含む。シュート誘導培地では、約1〜約3μMのBAP濃度が好ましい。好ましくは、BAP濃度はせいぜい5μMである。
【０１９８】
したがって、一実施形態では、1種以上の植物ホルモンまたはサイトカイニンを共培養の期間中に培地に加える。好ましくは、植物ホルモンまたはサイトカイニンの濃度は0.1〜20マイクロモル濃度の範囲であり、より好ましくは1〜10マイクロモル濃度の範囲である。しかしながら、当業者は、提供データから出発して、実施される実験の具体的条件、例えば使用される培地、インキュベーション期間、温度、外植片の性質、等に濃度を適合させる方法を承知している。一実施形態では、BAPは、例えばおよそ1〜およそ10マイクロモル濃度の範囲、例えばおよそ7.5マイクロモル濃度の濃度を有する。一実施形態では、好ましくはおよそ1マイクロモル濃度〜10マイクロモル濃度の範囲、例えばおよそ1、3、5、または7.5マイクロモル濃度のカイネチンを使用する。1〜8マイクロモル濃度の範囲、例えば7.5マイクロモル濃度のカイネチンが好ましい。
【０１９９】
別の好ましい実施形態では、ステップ(b)、(b1)、(b2)、および/または(c)の少なくとも1つの培地はサイトカイニンを含む。
【０２００】
さらにまた、ステップ(b)、(b1)、(b2)、(c)および/または(c1)の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも(b)および(c1)の培地は、約0.1μM〜約2μMの範囲のジベレリン酸(GA3)を含むことが特に好ましい。
【０２０１】
別の好ましい実施形態では、ステップ(b)、(b1)、(b2)、および(c)の少なくとも1つの培地は、好ましくはナトリウムチオールサルファート、ジチオスレイトール(DTT)およびシステインからなる群から選択される、少なくとも1つのチオール化合物を含む。好ましくは、その濃度は、約1 mM〜10mMの範囲のL-システイン、0.1 mM〜5 mMの範囲のDTT、および/または0.1 mM〜5 mMの範囲のナトリウムチオールサルファートである。
【０２０２】
外植片を該シュート誘導培地上で、シュートが発達するまで、インキュベートする。形成されるシュート原基は、通常、サイズが0.3 cmしかない。シュート原基の形成は、シュート誘導培地上で約1週間で開始され、平均で、そのようなシュート開始は約3〜4週間続き、最大サイズに達する。したがって、共培養した外植片を該シュート誘導培地上で約2〜6週間、好ましくは約3〜4週間インキュベートする。
【０２０３】
上記のように、シュート誘導および後の再生ステップは、好ましくは選択条件下で(例えば、シュート誘導培地、シュート伸長培地、発根培地に約3〜100 mMの濃度のD-セリンまたはD-アラニンを補充して)実行する。
【０２０４】
この培地上で約1〜約4週間、好ましくは約7日間の期間、シュートが発達するまで、組織を育てる。シュート形成は、処理および共培養条件に依存して、約1〜約2週間で開始される。
【０２０５】
好ましい実施形態では、形質転換前に形成されたすべてのシュート原基を共培養の約1週間後まで除去し、分裂組織の新規成長を刺激する。これは、一次形質転換体におけるキメラ現象を低減し、かつトランスジェニック分裂組織細胞の増幅を高めるために役立つ。この期間中に、外植片を切断して小さい切片に(すなわち上胚軸を切断することによって外植片から節を分離)してよく、しなくてもよい。
【０２０６】
SIM培地(好ましくは選択あり)上で2〜4週間(またはシュートの塊が形成されるまで)置いた後、外植片をシュート伸長(SEM)培地に移す。該培地は(シュート原基の)シュート伸長を刺激する。この培地は選択化合物を含有してもしなくてもよいが、好ましくは選択化合物(例えば約3〜約20 mMの濃度のD-セリン)を含有する。この培地上で約1〜約8週間の期間、組織を育てる。伸長したシュートの頻度および長さは、SEM中のホルモンレベル、特にGAの影響を受ける。
【０２０７】
本発明の別の好ましい実施形態では、ステップ(c1)および/または(d)の少なくとも1つの培地は、約0.01 mg/l (0.057 M)〜約1 mg/l (5.7μM)の範囲のインドール酢酸(IAA)、および/または約0.1μM〜約4μMの範囲のジベレリン酸(GA3)、および/または約0.5μM〜約6μMの範囲のトランス-ゼアチンリボシド酸を含む。
【０２０８】
好ましくは、毎2〜3週間後に、慎重に死滅組織を除去した後に外植片を新鮮なSEM培地(好ましくは選択化合物を含有する)に移す。外植片はまとまったまま、小片に断片化されず、ある程度健康なままである。好ましくは、外植片が死滅するか、またはシュートが伸長するまで、外植片を継続して移動させる。
【０２０９】
伸長したシュートは、シュート伸長培地に移した約4〜8週間後に、回収できる状態になっている。シュートを表現型の規則性および健康に関して評価し、伸長した茎(約1インチまたは2 cm)および完全な三出葉形成を有するシュートのみを回収する。
【０２１０】
回収されたシュートを発根培地上に置いて、根の形成を誘導する。根の形成は約1〜4週間かかる。その後、該植物を土壌に移し、完全成熟まで育てることができる。発根培地は選択化合物を含有してもよい(明らかに好ましいわけでもない)。好ましくは、伸長したシュート(長さが3 cmより長い)を取り出し、発根培地(RM)に約1週間置く(方法B)か、または栽培品種に依存して約2〜4週間置き(方法C)、その時点で根が形成され始める。根を有する外植片の場合、それらを直接土壌に移す。発根したシュートを土壌に移し、育成チャンバー中で2〜3週間ハードニング処理した後に、温室に移す。この方法を使用して得られた再生植物は稔性であり、平均で500種子/植物を生産した。
【０２１１】
この技術によって創出されたT0植物はトランスジェニック植物であり、かなりの収量で定期的に回収される。方法Cでは、増殖させた腋生分裂組織プロトコルを使用するダイズ小植物体の平均再生期間は、外植片接種から14週間である。したがって、この方法は速い再生期間を有し、それは稔性の健康なダイズ植物を生じさせる。
【０２１２】
マーカー遺伝子を発現する形質転換した植物材料(例えば細胞、組織または小植物体)は、非形質転換野生型組織の増殖を抑制する濃度の対応する選択化合物の存在下で成長可能である。得られた植物は、通例の様式で栽培および交配することができる。2以上の世代を育てて、ゲノムの組込みが安定かつ遺伝性であるよう保証すべきであろう。本発明の他の重要な態様には、開示されている方法によって作製されたトランスジェニック植物の子孫、ならびにそのような子孫に由来する細胞、およびそのような子孫から得られる種子が含まれる。
【０２１３】
本発明の別の実施形態は、以下に提供される方法によって作製されるダイズ細胞および植物に関する。ゆえに、別の実施形態は、該ダイズ植物または細胞において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含むDNA構築物(その場合、該プロモーターは該酵素をコードする配列に対して異種性である)を含むダイズ植物または細胞に関する。好ましくは、プロモーターおよび/またはD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素は上記のように定義される。より好ましくは、該ダイズ植物または細胞は、農学的に有益な形質を該ダイズ植物に付与する少なくとも1つの第２発現構築物をさらに含む。本発明の他の実施形態は、該ダイズ植物の部分(非限定的にダイズ種子(ダイズ)を含む)および、食物、飼料、および工業目的でのその使用に関する。
【０２１４】
好ましい一実施形態では、ダイズ植物は、Jack、Resnik、Williams 82、Corsoy、Crawford、Hutcheson、KunitzおよびChampからなる群から選択される。追加の好適なダイズ種は、学問的および商業的な両組織、- 例えば - the University of Guelph (Ontario Agricultural College; 例えばダイズ種RCAT Staples, Westag 97, RCAT Bobcat, OAC Prudence, OAC Woodstock, OAC 9908)、またはDarylandまたはSoygeneticsのダイズ種から入手可能である。追加の好適な種は、PI548402 (Peking), PI437654 (Er-hejjan), PI438489 (Chiquita), PI507354 (Tokei 421), PI548655 (Forrest), PI548988 (Pickett), PI88788, PI404198 (Sun Huan Do), PI404166 (Krasnoaarmejkaja), Hartwig, Manokin, Doles, Dyer, およびCusterである。
【０２１５】
本発明の他の実施形態は、本発明のダイズ植物の部分、器官、細胞、果実、および他の再生材料に関する。好ましい部分は、組織、細胞、花粉、胚珠、根、葉、種子、小胞子、および栄養部分(vegetative parts)からなる群から選択される。
【０２１６】
得られたトランスジェニック植物は自家受粉するか、または他のダイズ植物と交配することができる。T1種子を回収し、乾燥させ、種子袋に適切なラベルを付けて適切に保存する。2以上の世代を育てて、ゲノムの組込みが安定かつ遺伝性であるよう保証すべきであろう。例えばT1またはT2世代におけるトランスジェニックイベントは、異なる導入遺伝子を組み合わせるためのプレ育種ハイブリダイゼーションプログラム(遺伝子スタッキング)に関与しうる。本発明の他の重要な態様には、開示されている方法によって作製されたトランスジェニック植物の子孫、ならびにそのような子孫に由来する細胞、およびそのような子孫から得られる種子が含まれる。
【０２１７】
2.6  子孫の作製
トランスジェニック植物(本発明のDNA構築物を含む)の形質転換、選択および再生後、子孫を作製する。該子孫は、- 切除プロモーターの活性のせいで - 切除を受け、マーカー配列(群)およびエンドヌクレアーゼの発現カセットを含まない。
【０２１８】
子孫は有性または無性繁殖によって作製することができる。無性繁殖は、当技術分野において周知の技術による体細胞胚形成の導入によって実現することができる。好ましくは、有性繁殖/受精によって子孫を作製する。受精は、自家受粉(selfing (self-pollination))または他のトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物との交配によって実現することができる。本発明のトランスジェニック植物は、ここに母系または父系植物として機能しうる。受精プロセス後、種子を回収し、シュートさせ、成熟植物に育てる。切除プロセスを受けた子孫の単離および特定は、植物発生の任意の段階で行うことができる。該特定のための方法は当技術分野において周知であり、該方法には、- 例えば - (例えばネガティブ選択マーカーに関しては)PCR解析、ノーザンブロット、サザンブロット、または表現型スクリーニングが含まれる。
【０２１９】
子孫は1コピー以上の農学的に有益な形質遺伝子を含みうる。好ましくは、該形質遺伝子を1コピーしか含まない子孫を単離する。
【０２２０】
上記トランスジェニック生物に由来する細胞、細胞培養物、部分 - 例えば、トランスジェニック植物体の場合、根、葉等 -、およびトランスジェニック繁殖材料(例えば種子または果実)もまた本発明に基づく。
【０２２１】
ヒトまたは動物が消費できる本発明に記載の遺伝子改変植物は、例えば直接または本質的に公知の加工後に、食物または飼料として使用することもできる。ここで、トランスジェニック植物の作製時に導入されることが多い、例えば抗生物質および/または除草剤に対する耐性の欠失は、顧客の容認、さらにまた製品の安全性の理由で意味をなす。
【０２２２】
本発明のさらなる発明主題は、食物または飼料、医薬品またはファインケミカルの製造のための、本発明に基づく上記トランスジェニック生物およびそれらに由来する細胞、細胞培養物、部分 - 例えばトランスジェニック植物体の場合、根、葉等 -、およびトランスジェニック繁殖材料、例えば種子または果実の使用に関する。ファインケミカルとは、酵素、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸、天然および合成香料、芳香および着色剤を意味すると理解される。トコフェロールおよびトコトリエノールの製造、およびカロテノイドの製造が特に好ましい。形質転換宿主生物の培養、および宿主生物または培養培地からの単離は、当業者に公知の方法によって実施される。例えば抗体またはワクチン等の医薬品の製造が報告されている(例えばHood 1999; Ma 1999)。
【０２２３】
3.  追加の修飾
3.1  対抗選択およびその後のマーカー欠失
D-アミノ酸代謝酵素に関する第１発現構築物は、好ましくは、特に該酵素が、ネガティブ選択および対抗選択の両者に関して(すなわち二重機能マーカーとして)使用できるD-アミノ酸オキシダーゼである場合に、後のマーカー欠失を可能にするように構築することができる。D-アミノ酸オキシダーゼに基づく場合、本発明の方法は組み合わせの選択/マーカー欠失スキームとして使用することができる。使用されるD-アミノ酸に基づいて、D-アミノ酸オキシダーゼはネガティブまたは対抗選択マーカーとして働くことができる。そのような方法はPCT/EP 2005/002734 (WO 2005/090581)に詳細に記載されている。該文献は、参照によりここに全体が組み入れられる。
【０２２４】
この目的のために、第１発現カセットは、好ましくは、該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列に隣接している。本発明のこの実施形態では、二重機能マーカーとして、すなわち(使用される基質に依存して)ネガティブ選択マーカーおよび対抗選択マーカーであることがともに可能であるマーカーとして機能するD-アミノオキシダーゼ(DAAO)の特性を利用する。D-セリンおよびD-アラニン等のD-アミノ酸(植物に対して非常に植物毒性であり、D-アミノ酸オキシダーゼによって「無毒化」される)と対照的に、D-バリンおよびD-イソロイシンは野生型植物に対して無毒であるが、D-アミノ酸オキシダーゼDAAOを発現している植物によって有毒化合物に変換される。DAAO発現がD-セリンおよびD-アラニンの毒性を緩和したが、D-イソロイシンおよびD-バリンを有毒にする代謝変化を誘導したという知見は、該酵素が植物において基質依存的で二重機能の選択マーカーを提供できることを示す。
【０２２５】
したがって、本発明の別の実施形態は、ダイズ細胞および植物(それらは好ましくはマーカーを含まない)を提供するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
(i)  以下のものを含む第１DNA構築物でダイズ植物細胞を形質転換するステップ:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アミノ酸オキシダーゼ酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物(その場合、該第１発現カセットは、該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列に隣接している)、および
(b)  農学的に有益な形質を該植物に付与するために好適な少なくとも1つの第２発現カセット(但し、該第２発現カセットは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列間に位置しない)、および
(ii)  植物毒性濃度のD-アラニン、D-セリンまたはその誘導体からなる群から選択される第１化合物でステップ(i)の該形質転換ダイズ植物細胞を処理し、該D-アミノ酸オキシダーゼの発現によって該第１化合物に対する耐性を該形質転換植物細胞に付与する該第１DNA構築物をゲノム中に含む植物細胞を選択するステップ、および
(iii)  該形質転換植物細胞のゲノムから該第１発現カセットの欠失を誘導し、該第１発現カセットを依然として含む植物細胞に対して有毒な濃度のD-イソロイシン、D-バリンおよびその誘導体からなる群から選択される第２化合物で該植物細胞を処理し、それによって、該第２発現カセットを含むが、該第１発現カセットを欠いている植物細胞を選択するステップ。
【０２２６】
好ましいプロモーターおよびD-アミノ酸オキシダーゼ配列は上述されている。
【０２２７】
好ましくは、第１発現カセットの欠失は当技術分野において公知の種々の手段によって実現することができ、該手段には、非限定的に1種以上の以下の方法が含まれる:
(a)  配列特異的リコンビナーゼによって誘導される組換え、但し、該第１発現カセットは、対応する組換え部位によって隣接され、該フランキング組換え部位間の組換えによってゲノムからその中間の配列が欠失するようになっている、
(b)  好ましくは、配列特異的エンドヌクレアーゼによって引き起こされる相同配列間の配列特異的二本鎖切断によって誘導される、該第１発現カセットに隣接している相同配列AおよびA'間の相同組換え、但し、該相同配列AおよびA'は、AおよびA'間の相同組換えを保証するために十分な長さおよび相同性を有し、かつ - AおよびA'間の組換え時に - 該第１発現カセットが該植物のゲノムから切除される配向を有する。
【０２２８】
当業者は、欠失/切除を組み合わせて、D-アミノ酸オキシダーゼ二重機能選択マーカーを含む本発明のDNA構築物を用いるメカニズムを誘導する種々の手段を利用可能である。好ましくは、本発明の方法において利用できるリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼを、以下からなる群から選択される方法によって発現させることができる:
(a)  植物プロモーターに機能しうるように連結されているリコンビナーゼまたは配列特異的エンドヌクレアーゼの発現のための第２発現カセットを、好ましくは特異的欠失を可能にする該配列に隣接されている該第１発現カセットとともに、該DNA構築物に組込む方法、
(b)  植物プロモーターに機能しうるように連結されているリコンビナーゼまたは配列特異的エンドヌクレアーゼの発現のための第２発現カセットを、形質転換のための標的材料として使用される植物細胞または植物に組込み、それによってマスターセルラインまたは細胞を作製する方法、
(c)  植物プロモーターに機能しうるように連結されているリコンビナーゼまたは配列特異的エンドヌクレアーゼの発現のための第２発現カセットを別のDNA構築物に組込み、該別のDNA構築物を該第１DNA構築物との同時形質転換によって該植物細胞に形質転換する方法、
(d)  植物プロモーターに機能しうるように連結されているリコンビナーゼまたは配列特異的エンドヌクレアーゼの発現のための第２発現カセットを植物細胞または植物に組込み、該植物細胞または植物を本発明のDNA構築物を含む植物と後に交配する方法。
【０２２９】
別の好ましい実施形態では、欠失/切除のメカニズムを、二重機能マーカーの時期尚早の欠失/切除を妨げるように誘導または活性化することができる。好ましくは、ゆえに、好ましく使用される配列特異的リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼの発現および/または活性を、好ましくは以下からなる群から選択される方法によって誘導および/または活性化することができる:
(a)  該リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする配列を誘導性プロモーターに機能しうるように連結することによる誘導性発現、
(b)  リガンド結合ドメインを含む、改変されたリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用することによる誘導性の活性化、但し、該改変されたリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼの活性は、該リガンド結合ドメインに対する結合活性を有する化合物の処理によって改変することができる。
【０２３０】
好ましくは、このような本発明の方法は、選択マーカーを含まない植物細胞または植物をもたらす。
【０２３１】
本発明の別の発明主題は、本発明の方法での使用に好適なDNA構築物に関する。本発明の範囲内での使用に好適なDNA構築物は、好ましくは以下のものを含む:
(a)  ダイズ植物において活性なプロモーター(上で定義される; 好ましくはユビキチンプロモーター)と機能しうるように連結されているD-アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸配列を含む第１発現カセット(但し、該第１発現カセットは、該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列に隣接している)および
(b)  農学的に有益な形質を該植物に付与するために好適な少なくとも1つの第２発現カセット(但し、該第２発現カセットは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列間に位置しない)。
【０２３２】
好ましいプロモーターおよびD-アミノ酸オキシダーゼ配列は上に記載されている。
【０２３３】
マーカー欠失/切除を保証するために、本発明のDNA構築物に含まれるD-アミノ酸オキシダーゼのための発現カセット(第１発現構築物)は、配列特異的リコンビナーゼのための組換え部位に隣接（フランキング）していて、該フランキング組換え部位間で誘導される組換えによって、該第１発現カセットがゲノムから欠失されるようになっている。好ましくは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列は、以下からなる配列の群から選択される:
(a)  該フランキング組換え部位間の組換えによって中間の配列がゲノムから欠失されるように配置されている配列特異的リコンビナーゼのための組換え部位、および
(b)  AおよびA'間の相同組換えを保証するために十分な長さおよび相同性を有し、かつ - AおよびA'間の組換え時に - その中間の配列をゲノムから欠失させる配向を有する相同配列AおよびA'。
【０２３４】
好ましくは、該構築物は、該配列間に位置する配列特異的ヌクレアーゼのための少なくとも1つの認識部位を含み、それにより該第１発現カセットの特異的欠失が可能になる(特に上記変異体bに関して)。
【０２３５】
当技術分野において公知の種々の組換え部位および対応する配列特異的リコンビナーゼが存在する。それらを本発明の目的で使用することができる。当業者は、組換えによって導入された核酸配列の部位特異的除去ための種々の系に精通している。それらは主に配列特異的リコンビナーゼの使用に基づく。種々の配列特異的組換え系が報告されていて、例えばバクテリオファージP1のCre/lox系(Dale1991; Russell 1992; Osborne 1995)、酵母FLP/FRT系(Kilby 1995; Lyznik 1996)、MuファージGinリコンビナーゼ、E. coli PinリコンビナーゼまたはプラスミドpSR1のR/RS系(Onouchi 1995; Sugita 2000)である。また、attP部位およびバクテリオファージラムダリコンビナーゼに基づく系を使用することもできる(Zubko 2000)。本明細書中に記載の方法と組み合わせるために好適な追加の方法はWO 97/037012およびWO 02/10415に記載されている。
【０２３６】
好ましい実施形態では、二重マーカー配列の欠失/切除を、配列特異的二本鎖切断によって誘導される相同組換えによって欠失させる。その基本原理はWO 03/004659に開示されている。該文献は参照によりここに組み入れられる。この目的では、第１発現構築物(二重機能マーカーをコードする)は相同配列AおよびA'によって隣接されていて、その場合、該相同配列は、AおよびA'間の相同組換えを保証するために十分な長さおよび相同性を有し、かつ - AおよびA'間の組換え時に - ゲノムからの第１発現カセットの切除を生じさせる配向を有する。さらにまた、該相同配列によって隣接されている配列は、配列特異的DNA二本鎖切断誘導酵素、好ましくは配列特異的DNAエンドヌクレアーゼ、より好ましくは誘導性エンドヌクレアーゼ、最も好ましくはI-SceI、I-CeuI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreIおよびI-ChuIまたはリガンド結合ドメインを有するそのキメラからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断の部位特異的誘導のための少なくとも10塩基対の少なくとも1つの認識配列をさらに含む。
【０２３７】
エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼのための発現カセット(植物プロモーターに機能しうるように連結されている配列特異的リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼを含む)を本発明のDNA構築物中に含ませてよい。好ましくは、該第２発現カセットは、特異的欠失を可能にする該配列によって隣接されている該第１発現カセットとともに含まれる。
【０２３８】
別の好ましい実施形態では、該配列特異的リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼの発現および/または活性は、二重機能マーカーが、ネガティブ選択マーカーとしてのその作用が依然として必要である期間中に時期尚早に欠失/切除されることを回避するために、誘導および/または活性化することができる。好ましくは誘導/活性化は、以下からなる群から選択される方法によって実現することができる:
(a)  該リコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする配列を誘導性プロモーターに機能しうるように連結することによる誘導性発現、
(b)  リガンド結合ドメインを含む、改変されたリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用することによる誘導性の活性化、但し、該改変されたリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼの活性は、該リガンド結合ドメインに対する結合活性を有する化合物の処理によって改変することができる。
【０２３９】
本発明の追加の実施形態は、本発明のDNA構築物を含むトランスジェニックベクターに関する。本発明のDNA構築物またはベクターを含むトランスジェニック細胞または非ヒト生物である。好ましくは、該細胞または非ヒト生物は、農学的に有用な植物細胞または植物、好ましくは植物である。
【０２４０】
本発明は、マーカーを含まないトランスジェニック細胞および生物、好ましくは植物の作製を、高い効率を有し、正確に予測できる様式で、可能にする。
【０２４１】
D-アラニン、D-セリン、またはその誘導体に関する、化合物の選択、濃度、適用様式についての、対抗選択ステップ(ii)に関する好ましい選択は、一般的選択スキームの関連で上に記載されている。
【０２４２】
対抗選択ステップ(iii)では、D-イソロイシンまたはD-バリン構造を含む化合物の群から化合物を選択する。より好ましくは、D-イソロイシンおよびD-バリンからなる群から化合物を選択する。最も好ましくは、対抗選択に使用される化合物または組成物はD-イソロイシンを含む。細胞培養培地を介して適用される(例えば、寒天で固化された培地プレートに組み入れられている)場合、約0.5 mM〜約100 mM、好ましくは約1 mM〜約50 mM、より好ましくは約10 mM〜約30 mMの濃度のD-イソロイシンを使用することができる。細胞培養培地を介して適用される(例えば、寒天で固化された培地プレートに組み入れられている)場合、約1〜約100 mM、好ましくは約5〜50 mM、より好ましくは約15 mM〜約30 mMの濃度のD-バリンを使用することができる。
【０２４３】
ゆえに、上記方法を使用して、マーカーを含まないダイズ植物を創出することが可能になる。本明細書中で使用される、細胞または生物に関する用語「マーカーを含まない」または「選択マーカーを含まない」とは、農学的に有益な形質をコードする遺伝子と組み合わせて該細胞または生物に導入された機能的選択マーカータンパク質(発現カセットbによってコードされる; 上で定義される)を発現できない細胞または生物を意味するものとする。該選択マーカータンパク質をコードする配列が、部分的または - 好ましくは - 完全に不在であってよい。さらにまた、それに機能しうるように連結されているプロモーターが、部分的にまたは完全に不在であることによって機能不全であってもよい。しかしながら、得られた植物は、選択マーカーとして機能しうる他の配列を含んでよい。例えば、該植物は、農学的に有益な形質として、除草剤耐性を付与する遺伝子を含んでよい。しかしながら、得られた植物はいずれの選択マーカーをも含まないことが最も好ましい。
【０２４４】
本開示内容を考慮すると、本発明の種々の追加の態様および実施形態が当業者に自明になる。本明細書中に記載のすべての文献は、参照によりその全体がここに組み入れられる。本発明の特定の態様および実施形態を、以下、一例として、下記図面を参照して説明する。
【０２４５】
3.2  遺伝子スタッキング（stacking）
ダイズに関して、効率的形質転換系および特に選択マーカーの不足が存在する。この不足により、複数の連続する形質転換に依存するアプローチに特に注意が向けられる。この問題を克服する一方法は、上に挙げる組み合わせの選択およびマーカー欠失方法である。別の方法は、異なる選択系を組み合わせることに基づく。本発明の方法および組成物は、連続する形質転換を可能にする。D-セリンおよび/またはD-アラニン代謝酵素は他の選択マーカーおよび選択系と適合し、それらを妨害しない。したがって、別の選択マーカーを含む既存のトランスジェニック植物を本発明の構築物で形質転換するか、または本発明の方法によって得られた(D-セリンおよび/またはD-アラニン代謝酵素に関する発現構築物を含む)植物を別のマーカーで連続して形質転換することが可能である。したがって、本発明の別の実施形態は、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーター(好ましくは上で定義されるユビキチンプロモーター)およびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現構築物を含む第１構築物で形質転換するステップ、および
(b)  D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない第２選択マーカー遺伝子を含む第２構築物で形質転換するステップ。
【０２４６】
好ましくは、該第２マーカー遺伝子は、(非D-アミノ酸)代謝阻害剤(例えば2-デオキシグルコース-6-リン酸, WO 98/45456)、抗生物質(例えばカナマイシン、G 418、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン)または除草剤(例えばホスフィノスリシン、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン-型除草剤、またはグリフォセート)等の殺生物性化合物に対する耐性を付与するネガティブ選択マーカーである。その例は以下のものである:
-  ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT; ビアロホス(Bialophos)(登録商標)耐性とも称される; bar; de Block 1987; Vasil 1992, 1993; Weeks 1993; Becker 1994; Nehra 1994; Wan & Lemaux 1994; EP 0 333 033; US 4,975,374)
-  グリフォセート(登録商標)(N-(ホスホノメチル)グリシン)に対する耐性を付与する5-エノールピルビルシキマート-3-リン酸シンターゼ(EPSPS)(Shah 1986; Della-Cioppa 1987a,b)
-  グリフォセート(登録商標)分解酵素(グリフォセート(登録商標)オキシドレダクターゼ; gox),
-  ダラポン(登録商標)不活性化デハロゲナーゼ(deh)
-  スルホニル尿素-および/またはイミダゾリノン-不活性化アセト乳酸シンターゼ(ahasまたはALS; 例えば、S4、XI12、XA17、および/またはHra突然変異を例えば有する突然変異型ahas/ALS変異体)
- ブロモキシニル(登録商標)分解ニトリラーゼ(bxn)
- 例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする、カナマイシン-またはジェネティシン(G418)耐性遺伝子(NPTII; NPTI)(Fraley 1983; Nehra 1994)
-  ハイグロマイシンに対する耐性を媒介するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)(Vanden Elzen 1985)
-  ジヒドロ葉酸レダクターゼ(Eichholtz 1987)。
【０２４７】
種々のネガティブ選択マーカー遺伝子に関して種々のタイムスキームを使用することができる。耐性遺伝子(例えば除草剤に対する耐性遺伝子)の場合、好ましくは、約4週間のカルス誘導期全体およびそれ以降の、再生に入って少なくとも4週間、選択を適用する。そのような選択スキームはすべての選択方式に適用することができる。さらにまた、発根を含む再生スキーム全体にわたっても選択を続けることが(明らかに好ましいわけではないが)可能である。例えば、ホスフィノトリシン耐性遺伝子(bar, PAT)を選択マーカーとして用いる場合、約1〜50 mg/lの濃度のホスフィノトリシンまたはビアラホスを培地に含ませてよい。
【０２４８】
好ましくは、該第２マーカーは、ホスフィノトリシン、ジカンバ、グリフォセート、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン-型除草剤からなる群から選択される少なくとも1化合物に対する耐性を付与する。
【０２４９】
また、そのような該方法の産物は新規であり、かつ従来技術より発明的に優れている。ゆえに本発明の別の実施形態は、以下のものを含むダイズ植物に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーター(好ましくは上で定義されるユビキチンプロモーター)およびそれに機能しうるように連結されている、D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む第１発現構築物、および
(b)  D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない選択マーカー遺伝子に関する第２発現構築物。
【０２５０】
好ましくは、該第２マーカー遺伝子は上で定義され、最も好ましくは、ホスフィノトリシン、ジカンバ、グリフォセート、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン型除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物に対する耐性を付与する。
【０２５１】
以下の組み合わせが特に好ましい:
-  ホスフィノスリシンに対する耐性を付与する選択マーカーでの第１形質転換、およびその後のdsdA選択マーカー遺伝子での第２形質転換;
-  ホスフィノスリシンに対する耐性を付与する選択マーカーでの第１形質転換、およびその後のdao1選択マーカー遺伝子での第２形質転換;
-  dsdA選択マーカー遺伝子での第１形質転換、およびその後のホスフィノスリシンに対する耐性を付与する選択マーカーでの第２形質転換;
-  dao1での第１形質転換、およびその後のホスフィノスリシンに対する耐性を付与する選択マーカーでの第２形質転換。
【０２５２】
D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない選択マーカー遺伝子に関する第２発現構築物を用いたスタッキングに加えて、dsdAおよびdao1遺伝子をさらにスタッキングすることができる。例えば、dsdA遺伝子およびD-セリンを選択物質として使用して第１選択を行い、その後、dao1遺伝子およびD-アラニンを選択物質として使用して第２選択を行うことができる。したがって、本発明の別の実施形態は、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物に連続して形質転換するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているdsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物で形質転換し、D-セリンで選択するステップ、および
(b)  該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているdao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物で形質転換し、D-アラニンで選択するステップ。
【０２５３】
また、該方法の産物は新規であり、かつ従来技術に対して進歩性を有すると考えられる。ゆえに本発明の別の実施形態は、以下のものを含むダイズ植物に関する:
(a)  該ダイズ植物において活性なプロモーター(好ましくは上で定義されるユビキチンプロモーター)およびそれに機能しうるように連結されているdsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物、および
(b)  該ダイズ植物において活性なプロモーター(好ましくは上で定義されるユビキチンプロモーター)およびそれに機能しうるように連結されているdao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物。
【０２５４】
より好ましくは、該第１および該第２発現構築物に関するプロモーターは同一(identical)でも同一物(the same)でもない。2つの発現カセットを含む上述の構築物では、ダイズ植物において活性な2つのプロモーターが同一ではないことが好ましい。好ましくは一方のプロモーター(例えばD-アラニンおよび/またはD-セリン代謝酵素の発現のためのプロモーター)は上で定義されるユビキチンプロモーターであり、他方のプロモーターはアクチンプロモーターである。
【０２５５】
本明細書中で開示および特許請求される、すべての組成物および方法は、本開示内容を考慮して、過度の実験を要することなく、実施および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、思想および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物、方法および、方法のステップにおいてまたはステップの順序において変更を適用してよいことが当業者に自明である。より具体的には、本明細書中に記載の物質の代わりに、化学的にも生理学的にも関連している特定の物質を用いて、同一または類似の結果を達成できることが自明である。当業者に自明のすべてのそのような類似の代用および改変は、特許請求の範囲によって規定される本発明の思想、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。本明細書中に記載のすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術水準を示す。すべての刊行物および特許出願は、個々の各刊行物または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に指定されているのと同程度に、参照により本明細書中に組み入れられる。
【０２５６】
さらに、本発明は、トランスジェニックダイズ植物細胞、トランスジェニックダイズ植物組織、トランスジェニックダイズ植物器官またはトランスジェニックダイズ植物またはその部分の選択、再生、育成(growing)、培養または維持のための組成物であって、トランスジェニックダイズ植物細胞、ダイズ植物組織、ダイズ植物器官またはダイズ植物またはその部分の選択を可能にする有効量のD-アラニン、D-セリン、またはその誘導体を含む組成物、およびトランスジェニックダイズ生物、トランスジェニックダイズ細胞、トランスジェニック細胞培養物、トランスジェニックダイズ植物および/またはその部分、ならびに、第１セットの葉に位置する節に由来する1以上の胚形成カルスおよびおよそ5〜10mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む細胞培養物に関する。
【０２５７】
本発明はまた、ダイズ標的組織および、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を含む選択培地に関する。
【０２５８】
本明細書中で示されるプロモーターデータは、パセリユビキチンがうまく働き(2％ TE)、かつScBVおよびイントロンを含むScBV (すなわちp-ScBV-iSuc UDP)がともに類似の効率1.4％で働いたことを示す。Glycine maxユビキチンもまた良好な効率を示した(構築物RLM434; 形質転換効率5％; ほんの60個の外植片)。ゆえに、例えば、強力な構成的プロモーターがdsdaまたはdao1と組み合わせて使用される。強力な構成的プロモーターは、例えばアクチン2プロモーター、35Sまたは19Sプロモーター、ならびに上記ユビキチンプロモーター、例えばPcUbiまたはGmUbiプロモーター、またはp-ScBVまたはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターである。nos または「スーパープロモーター(superpromoter)」は、特に何らかの組織特異的発現に関して、同様に好適でありうる。ゆえに、一実施形態では、本発明は、dsdaまたはdao1遺伝子に機能しうるように連結されているPcUbiプロモーターを含み、かつ/またはdsdaまたはdao1遺伝子に機能しうるように連結されているp-ScBVまたはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターを含む構築物に関する。
【０２５９】
配列
1. 配列番号１    Escherichia coli D-セリンデヒドラターゼ[dsdA]をコードするヌクレオチド配列
2. 配列番号２    Escherichia coli D-セリンデヒドラターゼ[dsdA]をコードするアミノ酸配列
3. 配列番号３    Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) D-アミノ酸オキシダーゼをコードするヌクレオチド配列
4. 配列番号４    Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) D-アミノ酸オキシダーゼをコードするアミノ酸配列
5. 配列番号５    Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) D-アミノ酸オキシダーゼをコードする、コドン最適化されたヌクレオチド配列
6. 配列番号６    Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) D-アミノ酸オキシダーゼをコードするアミノ酸配列
7. 配列番号７    内部イントロン(406 - 993)を有する5'非翻訳領域の部分を含むパセリ(Petroselinum crispum) UBI4-2プロモーター; トータルの長さ996 bp
8. 配列番号８    内部イントロン(1519 - 2031)を有する5'非翻訳領域の部分を含むダイズ(Glycine max)ユビキチンプロモーター; トータルの長さ2031 bp
9. 配列番号９    人工構築物: Bar-SeldaバイナリーベクターRLM407: LB> <p-NOS::c-BAR::t-NOS p-PcUBI4-2::c-dsdA/na::t-NOS> RB>
10. 配列番号１０    人工構築物: RLM274のT-DNAインサート, RLM407型Bar-GUSバイナリーベクター: LB> <p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
11. 配列番号１１    人工構築物: RLM254のT-DNAインサート, RLM407型Selda-GUSバイナリーベクター: LB> <p-sTPT::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
12. 配列番号１２    人工構築物: REW008のT-DNAインサート, Bar-GUSバイナリーベクター: LB> <p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
13. 配列番号１３    人工構築物: RET063のT-DNAインサート, RLM407型Selda-GUSバイナリーベクター: LB> <p-AtAct2i::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
14. 配列番号１４    人工構築物: RET019のT-DNAインサート, RLM407型Selda-GUSバイナリーベクター: LB> <p-AtAct2i::c-dao1/pa::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
15. 配列番号１５    人工構築物: RET017のT-DNAインサート, RLM407型Selda-GUSバイナリーベクター: LB> <p-NOS:c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
16. 配列番号１６    人工構築物: RET015のT-DNAインサート, RLM407型Selda-GUSバイナリーベクター: LB> <p-NOS:c-dao1/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>
17. 配列番号１７    第１イントロン(955 - 1397)を有するArabidopsis thaliana アクチン2プロモーター領域; トータルの長さ: 1408ヌクレオチド。
【実施例】
【０２６０】
実施例:
特に指定しない限り、すべての化学物質はMallinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA), Phytotechnology Laboratories (Shawnee Mission, KS, USA), EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ, USA), Alfa AesarおよびSigma (St. Louis, MO, USA)から入手した。
【０２６１】
A.  培地において使用される原液:
1.  B5主要塩(10×原液)
a.  0.25 M KNO3 (硝酸カリウム)
b.  0.01 M CaCl2*2H2O (塩化カルシウム)
c.  0.01 M MgSO4*7H2O (硫酸マグネシウム)
d.  0.01 M (NH4)2SO4 (硫酸アンモニウム)
e.  0.01 M NaH2PO4*H2O (リン酸ナトリウム)
【０２６２】
2.  B5微量塩(100×原液)
a.  5 mM H3BO3 (ホウ酸)
b.  10 mM MnSO4*H2O (硫酸マンガン)
c.  0.7 mM ZnSO4*7H2O (硫酸亜鉛)
d.  0.45 mM KI (ヨウ化カリウム)
e.  0.1 mM Na2MoO4*2H2O (モリブデン酸)
f.  0.01 mM CuSO4*5H2O (硫酸銅)
g.  0.01 mM CoCl2*6H2O (塩化コバルト)
【０２６３】
3.  B5ビタミン(100×原液)
a.  0.055 M ミオ-イノシトール
b.  0.8 mM ニコチン酸
c.  0.5 mM ピリドキシン-HCl
d.  3 mM チアミン-HCl
【０２６４】
4.  MS主要塩(10×原液)
a.  0.2 M NH4NO3 (硝酸アンモニウム)
b.  0.2 M KNO3 (硝酸カリウム)
c.  30 mM CaCl2*2H2O (塩化カルシウム)
d.  15 mM MgSO4*7H2O (硫酸マグネシウム)
e.  12.5 mM KH2PO4 (リン酸カリウム)
【０２６５】
5.  MS微量塩(100×原液)
a.  10 mM H3BO3 (ホウ酸)
b.  13 mM MnSO4*H2O (硫酸マンガン)
c.  3 mM ZnSO4*7H2O (硫酸亜鉛)
d.  0.5 mM KI (ヨウ化カリウム)
e.  0.1 mM Na2MoO4*2H2O (モリブデン酸)
f.  0.01 mM CuSO4*5H2O (硫酸銅)
g.  0.01 mM CoCl2*6H2O (塩化コバルト)
【０２６６】
6.  MSIII鉄(100×原液)
a.  10 mM FeSO4*7H2O (硫酸第１鉄)
b.  10 mM C10H14O8Na2N2*2H2O (NaEDTA)
【０２６７】
B.  培地の組成
特に記載しない限り、本発明の方法について全3種の好ましい外植片組織に関して以下の培地を使用することができる。
【０２６８】
1.  25 x 100mmペトリ皿またはPlantconTM (Sigma)培養ボックス中のシュート培地GM (固体):
a.  1X B5主要塩,
b.  1X B5微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  2％ ショ糖,
e.  1X B5ビタミン,
f.  5 uM BAP (随意),
g.  0.8％ 精製寒天(Sigma);
h.  pH 5.8
【０２６９】
2.  三角フラスコまたは15 x 100mmペトリ皿中のYEP培地(固体および液体):
a.  10 g/L バクトペプトン(Difco; Becton Dickinson & Co., Cockeysville, MD, USA),
b.  5 g/L 酵母抽出物(Difco),
c.  5 g/L NaCl,
d.  選択のための適切な抗生物質,
e.  1.2％ 粒状寒天(Difco)固体のみ;
f.  pH 7.0
【０２７０】
3.  25 x 100mmペトリ皿中の増殖培地MODPROP (固体): (方法C)
a.  1X MS主要塩,
b.  1X MS微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  1X B5ビタミン,
e.  3％ ショ糖
f.  0.22〜1.12 mg/L (1μM〜5μM) BAP (好ましくは約1μM)
g.  0.8％ 精製寒天(Sigma)
g.  pH 5.8
【０２７１】
4.  共培養培地CCM (液体):
a.  1/10 X B5主要塩,
b.  1/10 X B5微量塩,
c.  1/10 X MSIII鉄,
d.  1 X B5ビタミン
e.  3％ ショ糖,
f.  20 mM 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES; MW=213.26 g/Mol),
g.  200μM アセトシリンゴン(AS),
h.  0.72μM〜1.44μM GA3 (ジベレリン酸; Mw=346.38 g/Mol)
i.  BAP (6-ベンジルアミノプリン; MW=225.25 g/mol): 7.5μM
j.  方法Cのみ: 400 mg/L L-システイン(3.3 mM) (Sigma)
k.  pH 5.4
【０２７２】
5.  15 x 100mmペトリ皿中の共培養培地CCM (固体):
a.  1/10X B5主要塩,
b.  1/10X B5微量塩,
c.  1/10X MSIII鉄,
d.  1X B5ビタミン,
e.  3％ ショ糖,
f.  20 mM 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)
g.  200μM アセトシリンゴンAS,
h.  0.72μM〜1.44μM GA3 (ジベレリン酸; Mw=346.38 g/Mol)
i.  BAP (6-ベンジルアミノプリン; MW=225.25 g/mol): 7.5μM
j.  チオール化合物,
(i).  100〜1000 g/L L-システイン(MW=121.16 g/Mol; Sigma); 好ましくは、方法BおよびCでは: 400 mg/L L-システイン(3.3 mM); 方法Aでは: 1 g/l (8.25 mM) L-システイン
(ii).  0〜1 mMまたは154.2 mg/L DTT (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA),
(iii).  0〜1 mM ナトリウムチオールサルファート無水物(158.1 mg/L)またはナトリウムチオールサルファート五水和物245 mg/L (Mallinckrodt, Paris, KY, USA), 方法Aでは: 1 mM ジチオスレイトール(dithiothrietol), 1 mM チオ硫酸ナトリウム
k.  0.5％ 精製寒天;
l.  pH 5.4
【０２７３】
6.  洗浄培地Modwash (液体):
a.  1X B5主要塩,
b.  1X B5微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  3％ ショ糖,
e.  1X B5ビタミン
f.  30 mM MES,
g.  350 mg/L TimentinTM
h.  pH 5.6
【０２７４】
6.  シュート誘導培地SIM (液体):
a.  1X B5主要塩,
b.  1X B5微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  1X B5ビタミン,
e.  3％ ショ糖,
f.  3mM MES,
g.  1μM〜7.5μM (好ましくは1μM) BAP
h.  250 mg/L TimentinTM
i.  0.8％ 精製寒天;
j.  pH 5.6
【０２７５】
5.  20 x 100mmペトリ皿中のシュート誘導培地SIM (固体):
a.  1X B5主要塩,
b.  1X B5微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  1X B5ビタミン,
e.  3％ ショ糖,
f.  3 mM MES,
g.  1μM〜7.5μM (好ましくは約1μM) BAP
h.  5μM カイネチン
i.  250 mg/L TimentinTM
j.  適切であれば選択化合物,
k.  0.8％ 精製寒天;
l.  pH 5.6
【０２７６】
7.  20 x 100mmペトリ皿中のシュート伸長培地SEM (固体):
a.  1X MS主要塩,
b.  1X MS微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  1X B5ビタミン,
e.  3％ ショ糖,
f.  3mM MES,
g.  50 mg/L L-アスパラギン(0.378 mM),
h.  100 mg/L L-ピログルタミン酸(0.775 mM),
i.  0.1 mg/L IAA (0.57μM),
j.  0.5 mg/L GA3 (1.44μM),
k.  1 mg/L トランス-ゼアチンリボシド(2.85μM),
l.  250 mg/L TimentinTM
m.  適切であれば選択化合物,
n.  0.8％ 精製寒天;
o.  pH 5.6
【０２７７】
7.  25 x 100mmペトリ皿またはPlantconTM (Sigma)培養ボックス中の発根培地RM (固体):
a.  1/2 X B5主要塩,
b.  1/2 X B5微量塩,
c.  1X MSIII鉄,
d.  2％ ショ糖,
e.  3mM MES,
f.  1 mg/L (5μM) インドール酪酸(IBA, Mw=203.24 g/Mol)
g.  g.0.8％ 精製寒天; 方法Cのみ: 250 mg/L Timentin
h.  pH 5.6。
【０２７８】
実施例１: ダイズ種子の殺菌および発芽
実質的に任意のダイズ品種の任意の種子を本発明の方法で使用することができる。種々のダイズ栽培品種(Jack、Williams 82、およびResnikを含む)がダイズ形質転換に好適である。蓋をきつくはめたデシケーター中で漂白剤(5.25％次亜塩素酸ナトリウム) 100 mlに12N HCl 3.5 mlを滴加することによって生成された塩素ガスを含むチャンバー中でダイズ種子を殺菌する。チャンバー中に24〜48時間入れた後、種子を取り出し、約18〜20個の種子を25 x 100mmペトリ皿中の5μM 6-ベンジルアミノプリン(BAP)を含むかまたは含まない固体GM培地上に置く。BAPを加えない実生はより伸長し、根が発生し、特に第２および側根形成が生じる。BAPは短くて頑丈な実生を形成させることによって実生を強化する。
【０２７９】
明所(>100μM/m2s)で25℃で育てた7日齢実生を3-外植片タイプのための外植片材料に使用する。この時点で、種皮は割れていて、単葉の葉を有する上胚軸は、最低でも、子葉の長さまで育っている。上胚軸は、子葉節組織を避けるために少なくとも0.5 cmであるべきであろう(ダイズ栽培品種および種子ロットは発生期間が様々であるため、該シュート段階の説明は具体的な発芽時間よりも正確である)。
【０２８０】
実施例２: アグロバクテリウム培養物の増殖および調製
アグロバクテリウム培養物は、所望のバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウム(例えばA. tumefaciensまたはA. rhizogenes)を固体YEP増殖培地上にストリークし、コロニーが出現するまで(約2日間) 25℃でインキュベートすることによって調製する。TiまたはRiプラスミド、バイナリーベクター、および細菌染色体上に存在する選択マーカー遺伝子に依存して、YEP固体および液体培地でのA. tumefaciensおよびrhizogenes選択のために様々な選択化合物を使用する。形質転換法には種々のアグロバクテリウム株を使用することができる。
【０２８１】
約2日後、単一コロニーを(滅菌つまようじで)つつき、抗生物質を含む50 mlの液体YEPにそれを接種し、0.8〜1.0の範囲のOD600 に達するまで(約2日間) 175 rpm (25℃)で振とうする。形質転換のための作業用グリセロールストック(15％)を調製し、1 mlのアグロバクテリウムストックを1.5 mlエッペンドルフチューブに分け入れ、-80℃で保存する。
【０２８２】
外植片接種の前日に、500 ml三角フラスコ中で200 mlのYEPに5μl〜3 mlの作業用アグロバクテリウムストックを接種する。OD600が0.8〜1.0の範囲になるまでフラスコを25℃で一晩振とうする。ダイズ外植片を調製する前に、20℃で5,500 x gで10分間の遠心分離によってアグロバクテリウムをペレットにする。ペレットを液体CCMに再懸濁して所望の密度(OD600 0.5〜2.0)にし、室温で少なくとも30分間置いた後に使用する。
【０２８３】
実施例３: 外植片調製および共培養(接種)
この時点で実生は、少なくとも0.5 cmの、一般的には0.5〜2 cmの範囲の伸長した上胚軸を有する。長さ4 cmまで伸長した上胚軸が成功裏に使用されている。次いで以下のような外植片を調製する:
(i)  いくつかの根を有するか、または有しない、
(ii)  部分的、一方または両方の子葉を有し、頂端分裂組織を含むすべてのあらかじめ形成された葉は除去され、第１セットの葉に位置する節を、鋭利なメスを使用して数回カットして損傷させる。
【０２８４】
節でのこのカットは、アグロバクテリウム感染を誘発するだけでなく、腋生分裂組織細胞を分散させ、あらかじめ形成されたシュートを損傷させる。創傷および調製後、外植片をペトリ皿中で脇に置き、次いで液体CCM/アグロバクテリウム混合物と30分間共培養する。そして外植片を液体培地から取り出し、固体共培養培地を含む15 x 100 mmペトリプレート上の滅菌ろ紙の上に置く。傷ついた標的組織を、それらが培地と直接接触するように配置する。
【０２８５】
実施例４: シュート誘導
暗所で25℃で3〜5日間の共培養後に、外植片を液体SIM培地中で(過剰のアグロバクテリウムを除去するために)すすいだ後、固体SIM培地上に置く。標的組織が培地と直接接触するように約5個の外植片を配置する。最初の2週間の期間中に、選択培地を用いるかまたは用いずに外植片を培養することができる。好ましくは、選択を伴わないSIM上に外植片を1週間移す。
【０２８６】
3M 微細孔テープ(3M, St. Paul, Minnesota, USA)でプレートをラップし、平均25℃の温度で18時間 明/6時間 暗のサイクル条件下で70〜100μE/m2sで2週間育成チャンバーに入れる。種々の光強度および波長、選択方式、およびSIMをこの外植片に関して試験した。標的領域(例えば上胚軸の上の第１の節の腋生分裂組織)でde novoシュート成長が生じるまで選択を伴うかまたは伴わないSIM培地上に外植片を置いたままにする。この期間中に新鮮な培地への移動を行うことができる。約1週間後に、選択を伴うかまたは伴わないSIMから選択を伴うSIMへ外植片を移す。この時点で、実生外植片について初生葉節でかなりのde novoシュートの発達が起こっている。
【０２８７】
好ましくは、形質転換前に形成されたすべてのシュートを共培養の2週間後まで除去し、分裂組織からの新規成長を刺激する。これは、一次形質転換体におけるキメラ化を低減し、かつトランスジェニック分裂組織細胞の増幅を高めるために役立つ。この期間中に、外植片を切断して小さい切片に(すなわち上胚軸を切断することによって外植片から節を分離)してもしなくてもよい。
【０２８８】
実施例５: シュート伸長
SIM培地(好ましくは選択を伴う)上で2〜4週間(またはシュートの塊が形成されるまで)置いた後、外植片を、シュート原基のシュート伸長を刺激するであろうSEM培地に移す。この培地は選択化合物を含有してもしなくてもよい。
【０２８９】
その後2〜3週間毎に、死滅組織を慎重に除去した後に、外植片を新鮮なSEM培地(好ましくは選択を含有する)に移す。外植片はまとまったまま、小片に断片化されず、ある程度健康なままであるべきである。外植片が死滅するか、またはシュートが伸長するまで、外植片を継続して移動させる。>3 cmに伸長したシュートを取り出し、約1週間RM培地に置くと、その時点で根が形成され始める。根を有する外植片の場合は、それらを直接土壌に移す。発根したシュートを土壌に移し、育成チャンバー中で2〜3週間ハードニング処理した後に、温室に移す。この方法を使用して得られた再生植物は稔性であり、平均で500個の種子/植物体を生産した。
【０２９０】
Agrobacterium tumefaciensとの5日間の共培養後の一過性GUS発現は、実生の腋生分裂組織外植片上で、特に外植片調製時に傷つけた領域において、広範囲におよぶ。選択を伴わないシュート誘導培地に外植片を入れ、初生葉節がシュート誘導および再生にどのように応答するかを観察した。これまでのところ、70％を超える外植片がこの領域で新規シュートを形成した。GUS遺伝子の発現はSIM上で14日後に安定であり、これはT-DNAがダイズゲノムに組込まれていることを意味する。さらに、予備実験では、SIM上で3週間後に形成されるGUS陽性シュートの形成が生じた。
【０２９１】
実施例６: 接種されていない実生の腋生分裂組織外植片に関する死滅曲線
アグロバクテリウム非感染ダイズ組織に関するD-セリン毒性についての死滅曲線を腋生分裂組織外植片に関して実施した。30個の外植片を実施例１で上述したようにして調製し、0 mM、3μM、30μM、300μM、3 mM、30 mM、または60 mM D-セリンのいずれかを含有するSIM上で合計4週間培養した。この期間の後、新規シュート原基を有する外植片のパーセント、すなわち複数シュートの出現率、をカウントした。この実験では、3〜30 mMの範囲で再生の減少が生じ、60 mM D-セリンに暴露された外植片に関して30％の再生しか観察されなかった(図１)。
【０２９２】
実施例７: アグロバクテリウムで接種された実生の腋生分裂組織外植片に関するD-セリンについての死滅曲線
3種のダイズ栽培品種に関する実生の腋生分裂組織(SAM)のD-セリン選択についての死滅曲線を、シュート誘導レベルでアグロバクテリウム感染を行うか行わずに実施した。各栽培品種に関して、10個の外植片を切断し、A. tumefaciens株AGL1/pREW008 (dsdA遺伝子なしコントロール)を接種し、10個の外植片にAGL1/pRET017 (nosP-dsda-nosT)を接種し、5個の外植片には接種しなかった。共培養後、0、10、30、50、または70 mM D-セリンを含むシュート誘導培地にSAM外植片を移した。シュート誘導で4週間の後の外植片の生存を記録し、適切なD-セリン選択レベルが30〜50 mMの範囲であることを見出した(図２)。
【０２９３】
実施例８ａ: 接種した腋生分裂組織外植片に関するD-セリンでの死滅曲線の確立
シュート誘導および伸長期間中の選択の有効レベルを確立するために、広い範囲のD-セリン濃度を最初に調査した。実施例１および３に上述するようにして、Dairyland栽培品種98043の7日齢の実生からダイズ腋生分裂組織外植片を調製した。
【０２９４】
Super Vir pSB1プラスミドを含み、かつバイナリープラスミドpRET017またはpREW008を含有するAgrobacterium rhizogenes株SHA017を実施例２に記載されるようにして調製した。pRET017はnosP-c-dsdA/na-nosTおよびpPcUBI-gusINT-nosTを含有する(実施例９)。pREW008はnosP-bar-nosTおよびpPcUBI-gusINT-nosTを含有し、コントロールベクターとして使用された(実施例９)。
【０２９５】
実施例４に上述されるようにして外植片を取扱った。選択を伴わないシュート誘導培地(SIM)培地上で1週間の後に、0〜15 mMから30〜45 mMまでに及ぶ種々の濃度のD-セリンを含有するSIM培地に外植片を移した。すべての再生外植片(シュート床(shoot pad))を、3および6週間のインキュベーション後に3 mM D-セリンを含有するシュート伸長培地(SEM)に移した。伸長シュートを発根培地(RM)培地に移し、GUS発現およびTaqman解析によってスクリーニングした。
【０２９６】
2009529863.tif 000004
【０２９７】
2009529863.tif 000005
【０２９８】
シュート誘導培地中の漸増レベルのD-セリンは、再生してシュート床を形成させた外植片のパーセンテージを減少させた(図３)。形成されたシュート床のサイズはD-セリンのレベルが増加するにつれて減少した。さらに、褐色のもろいカルスの形成はD-セリン濃度の増加につれて増加した。シュート誘導期間中にdsdA含有(RET017)およびコントロール(REW008)構築物の間でシュート床の形態に差異はほとんど観察されなかった(図３)。シュート誘導期間中に30または45mM D-Serから生じた外植片に関して3mM D-Serでのシュート伸長は起こらなかった。シュート誘導期間中に15mM D-Serに暴露された外植片からはほとんどシュートが伸長しなかった(データは示していない)。実験の全体にわたって行われたGUSアッセイでは、シュート床中のGUS陽性セクターがシュート誘導培地中で3週間の後に両pRET017およびpREW008から生じたことが示された。GUSアッセイおよびTaqman (uidAおよびdsdA)解析は、シュート誘導期間中に15mM D-セリンで形成されてシュート伸長時に3 mM D-セリンに移された、少数の伸長したシュートに関してすべて陰性であった。シュート誘導期間中の15mM D-セリンより高い濃度でのインキュベーション後に、伸長したシュートは観察されなかった。
【０２９９】
実施例８ｂ: 初生葉節の外植片を使用するD-アラニンおよびD-アラニン/D-セリン死滅曲線
7.5 mM D-セリンを伴う場合および伴わない場合のD-アラニン選択についての死滅曲線の作成を、dao1を選択マーカー遺伝子として使用する将来の実験のために行った。D-アラニンおよびD-セリンの両者を代謝できるdao1遺伝子に関して、D-アラニンおよびD-セリンの使用の組み合わせをさらに実施した。バイナリープラスミドRET019 (Pactin-dao1, Pubi-gus)およびREW008 (Pnos-bar, Pubi-gus)をそれぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして使用し、Agrobacterium rhizogenes株SHA017pSB1を使用してT-DNAをダイズ内に動員した。
【０３００】
外植片にアグロバクテリウムを接種し、5日間共培養した後、選択を伴うか伴わないシュート誘導培地上に1週間移した。この期間の後、選択を伴う新規SIM上に外植片を移した。
【０３０１】
実験1では、以下の濃度: 0、3、7.5、10、20、30、および50 mMでD-アラニンをSIM培地に加えた。
【０３０２】
実験2では、同濃度のD-アラニンを7.5 mM D-セリンとともに加えた。
【０３０３】
実験計画は以下の通りであった: T(処理)1: 7個の外植片にREW008を接種し、1週間回復させる; T2: 7個の外植片にREW008を接種し、回復させない。
【０３０４】
実験の結果を表2bに示す。再生頻度は外植片が共培養直後に30 mM D-アラニンに暴露されるまで70％未満に低下しない。この低下は、回復を伴う外植片では20 mM D-アラニンまで観察されなかった。D-セリンと組み合わせた場合、外植片は、7.5〜10 mMの範囲のより低い濃度で再生の減少を示す。
【０３０５】
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【０３０６】
実施例９: dsdAおよびdao1遺伝子を評価するために使用される形質転換ベクター
dsdAまたはdao1遺伝子を含有するいくつかの形質転換ベクターを作製した。bar選択マーカーを含む構築物を形質転換実験のコントロールとして使用した(表3)。Gatewayバックグラウンドを有するpLM407およびpLM274を除き、ほとんどのベクターを、pSUN3バイナリーベクターをバックグラウンドとして使用して開発した(表3)。DSDAタンパク質は基質としてD-セリンのみを使用し、より広範囲のD-アミノ酸、例えばD-SerおよびD-Alaを酵素的に酸化するDAO1タンパク質とは対照的である。
【０３０７】
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【０３０８】
実施例１０ａ: 異なるプロモーターの下でdsdAまたはdao1遺伝子を使用した場合のD-セリン選択の効果
実施例１および３に上述されるように、Dairyland栽培品種93061の7日齢の実生からダイズ腋生分裂組織外植片を調製した。
【０３０９】
Super Vir pSB1プラスミドを含み、かつ表3に記載のバイナリープラスミドを含有するAgrobacterium rhizogenes株SHA017を実施例２に記載されるようにして調製した。
【０３１０】
実施例４に記載されるように外植片を取扱った。選択を伴わないシュート誘導培地(SIM)上で1週間の後に、7.5 mM D-セリンを含有するSIMに外植片を移した。すべての再生外植片(シュート床)を、3および6週間のインキュベーション後に5 mM D-セリンを含有するシュート伸長培地(SEM)に移した。伸長したシュートを発根培地(RM)培地に移し、GUS発現および/またはTaqman解析によってスクリーニングした。
【０３１１】
表4に記載されるように、パセリユビキチンプロモーターはdsdA遺伝子の発現を駆動するためにより効果的に働く。uidAレポーター遺伝子の遺伝子発現解析に基づいて、パセリユビキチンプロモーターはダイズの腋生の実生において高度に構成的なプロモーターであることが知られている。シロイヌナズナアクチンプロモーターもまた、dsdA遺伝子を使用した場合にダイズ細胞に対して耐性レベルの発現を付与することができたが、パセリユビキチンプロモーターより顕著に低い効率であった(表4)。NOSまたはSTPTプロモーターの制御下でdsdA遺伝子を使用した場合にトランスジェニックシュートは得られていない。シロイヌナズナアクチンおよびNOSプロモーターはdao1/ko遺伝子を使用した場合にダイズ細胞に対して耐性レベルを付与することができた。この場合、NOSプロモーターおよびdao1/ko遺伝子の組み合わせは、AtActin::dao1/koと比較した場合に2倍高い効率を有するようである。
【０３１２】
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【０３１３】
ダイズは、dsdA選択系を用いてトランスジェニック植物を選択するために、高度に構成的なプロモーターを必要とするようである。パセリユビキチンプロモーターの使用は、Arabidopsis thalianaアクチンまたはSTPプロモーター等の双子葉植物において通常使用される他のプロモーターよりも一貫して高い形質転換効率をもたらす。これらのプロモーターと比較して、パセリユビキチンプロモーターを用いた場合の形質転換効率は顕著に高かった。最適な選択には、(後に脱分化および再生してトランスジェニック植物になる)標的組織の関連細胞における適切な時点でかつ適切な濃度での選択マーカーの発現を必要とすることが知られている。
【０３１４】
実施例１０ｂ: SELDA選択およびプロモーター-dsdaの組み合わせ
形質転換効率に対する、dsda遺伝子を駆動するプロモーターの効果を形質転換プロトコルにおいて試験した。4つのプロモーター-dsdaの組み合わせ(処理)であるRLM407、RLM431、RLM432、RLM433、および最低でも50個の外植片/処理を用いて、経時的に6回反復する実験(2人の研究者での切断実験)を完了した(表4a)。反復のうちの2回にはRLM254を含め、1回の反復にはRLM434を含めた。外植片を調製し、30分間にわたる6回の処理(A. rhizogenes株SHA017/pSB1中に保有されるプラスミド)のうちの1つにランダムに分けた。接種後、5μMカイネチンを含有する固体共培養培地上で暗所で5日間外植片を共培養した。以下のD-セリン選択形式を用いて上記のようなプロトコルにしたがった: 選択を伴わないシュート誘導で1週間、7.5 mM D-セリンを伴うシュート誘導培地上で3週間、その後のシュート伸長期を通じた5 mM D-セリン。外植片あたり1個のシュートのみを取り出して、クローンの再生を排除した。推定上の形質転換体について、定量的PCR (TaqMan)を使用してdsda遺伝子の存在を確認し、式: [(dsda陽性のTaqManによって確認された独立イベントの数/接種した外植片の総数(n))×100]を使用して形質転換効率(TE)を算出した。
【０３１５】
試験したすべてのプロモーター-dsdaの組み合わせからトランスジェニックイベントを回収した(表4b)。ユビキチン-dsdaの組み合わせを含有する構築物、RLM407およびRLM434は、この研究において最も高い形質転換効率をもたらした。
【０３１６】
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【０３１７】
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【０３１８】
実施例１１: 2つの選択マーカー: dsdAおよびbarの比較
2つの選択系、すなわちdsdA/D-セリンと、bar/ホスフィノスリシンでの形質転換効率を比較するために形質転換実験を行った(表5)。バイナリーベクターLM407は、pPcUbiおよびpNosプロモーターの下にそれぞれdsdAおよびbarの両選択マーカーを保有する。ベクターLM274は、pNosプロモーターの制御下にbar遺伝子を有し、ホスフィノスリシン選択と組み合わせてダイズの腋生の形質転換方法とともに成功裏に使用されている。
【０３１９】
実施例１および３に上述されるようにして、Dairyland栽培品種93061の7日齢の実生からダイズ腋生分裂組織外植片を調製した。
【０３２０】
Super Vir pSB1プラスミドを含み、かつ表3に記載のバイナリープラスミドを含有するAgrobacterium rhizogenes株SHA017を実施例２に記載されるようにして調製した。
【０３２１】
実施例４に記載されるようにして外植片を取扱った。選択を伴わないシュート誘導培地(SIM)上で1週間の後に、7.5 mM D-セリンまたは3 mg/lホスフィノスリシンを含有するSIMに外植片を移した。すべての再生外植片(シュート床)を、SIM中での3週間のインキュベーション後に5 mM D-セリンまたは5mg/lホスフィノスリシンを含有するシュート伸長培地(SEM)に移した。伸長シュートを発根培地(RM)培地に移し、Taqman解析によってスクリーニングした。
【０３２２】
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【０３２３】
D-セリン選択を伴って同じ構築物pRLM407を使用した場合に2倍の形質転換効率が得られた。しかしながら、これは形質転換に使用された小規模の数の外植片を示していることは言及する価値がある。
【０３２４】
実施例１１: SELDA選択および共培養ホルモン
第１の実験では、実験計画に、反復あたり4つの異なる共培養培地(処理)および処理あたり最低で50個の外植片を用いる経時的な10回の反復(3人の研究者による切断実験)を含めた。ホルモンであるBAPを以下の4つのホルモンのうちの1つ: 7.5μM BAP、1.0μMカイネチン、5.0μMカイネチン、または7.5μMカイネチンで置き換えたことを除いて、上記のようにして固体共培養物を調製した。
【０３２５】
第２の実験では、実験計画に、反復あたり5つの異なる共培養培地(処理)および処理あたり最低で50個の外植片を用いる経時的な3回の反復(1人の研究者による切断実験)を含めた。BAPを、以下の5つのホルモンのうちの1つ: 7.5μM BAP、1.0μMカイネチン、3μMカイネチン、5μMカイネチン、または7μMカイネチンで置き換えることによって固体共培養物を調製した。
【０３２６】
両実験では、外植片を調製し、ベクターRLM407を保有するSHA017/pSB1を含有する50 mLの液体共培養培地を用いて30分間接種した後、それぞれ4つまたは5つの固体共培養培地処理のうちの1つにランダムに配置した。以下のD-セリン選択形式を用いて上記のようなプロトコルにしたがった: 選択を伴わないシュート誘導で1週間、7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で3週間、その後のシュート伸長期を通じて5 mM D-セリン。外植片あたり1個のシュートのみを取り出して、クローンの再生を排除した。推定上の形質転換体について、定量的PCR (TaqMan)を使用してdsda遺伝子の存在を確認し、式: [(dsda陽性のTaqManによって確認された独立イベントの数/接種した外植片の総数(n))×100]を使用して形質転換効率(TE)を算出した。
【０３２７】
両実験では、すべての試験処理からトランスジェニックイベントを回収した(表6および7)。さらに、共培養培地中にカイネチンが存在すると、外植片をBAPの存在下で共培養した場合よりも高い平均形質転換効率がもたらされた。
【０３２８】
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【０３２９】
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【０３３０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０３３１】
【図１】図１は、接種されていない実生の腋生分裂組織外植片に関する死滅曲線である(栽培品種98822)。
【図２】図２は、アグロバクテリウムで接種された実生の腋生分裂組織外植片に関するD-セリンについての死滅曲線である。
【図３】図３は、D-セリン上で3週間の時点でのシュート誘導である。A.  SHA07/pSB1/ET017; 上段:15mM, 中段:30mM, 下段:45mM D-Ser。B.  SHA07/pSB1/EW008; 上段:15mM, 中段:30mM, 下段:45mM D-Ser
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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