(57)【要約】  Ｌ−アルギニンを生産する微生物、およびこれを用いたＬ−アルギニン生産方法を開示する。前記微生物は、コリネバクテリウム属菌株の変異株であるコリネバクテリウムグルタミカム(corynerbacterium glutamicum)ＣＪＲ０５００である。このＬ−アルギニン生産方法は、変異株コリネバクテリウムグルタミカムＣＪＲ０５００を発酵培地で３０℃で１６時間活性化させた後、活性された変異株をさらに７２時間振とう培養することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アルギニンを生産し、α−アミノ酪酸、カナバニンおよびアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する、コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＪＲ０５００（受託番号ＫＣＣＭ−１０７４１Ｐ）。
【請求項２】
請求項１によるコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＪＲ０５００（受託番号ＫＣＣＭ−１０７４１Ｐ）を発酵培地で３０℃で１６時間活性化させた後、さらに７２時間振とう培養することを含む、Ｌ−アルギニンの生産方法。
【請求項３】
Ｌ−トリプトファンの添加によって生育がさらに促進される、請求項１に記載の変異株ＣＪＲ０５００（受託番号ＫＣＣＭ−１０７４１Ｐ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アルギニンを生産する微生物およびこれを用いてＬ−アルギニンを生産する方法に係り、より詳しくは、コリネバクテリウム属菌株の変異株であって、α−アミノ酪酸に耐性を有し、トリプトファンによって生育が促進される、Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウムグルタミカム(corynerbacterium glutamicum)ＣＪＲ０５００、およびこれを用いたＬ−アルギニン生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アルギニンは、医薬品、食品、その他の動物飼料などに広く用いられる準必須天然アミノ酸の一種である。Ｌ−アルギニンは、肝機能促進剤、脳機能促進剤、男性不妊治療剤、総合アミノ酸製剤などとして使用されている。また、Ｌ−アルギニンは、魚肉団子添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用として最近脚光を浴びている物質である。
【０００３】
従来の生物学的発酵法によるＬ−アルギニンの生産方法は、炭素源、窒素源から直接Ｌ−アルギニンを生産する方法であって、グルタミン酸生産菌株であるブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム属微生物から誘導された変異株を用いる方法（日本特開昭５７−１６３４８７、特開昭６０−８３５９３、特開昭６２−２６５９８８）、細胞融合によって生育改善されたアミノ酸生産菌株を用いる方法（日本特開昭５９−１５８１８５）、組み換え遺伝子で形質転換された菌株を用いる方法（日本特開昭６３−７９５９７、米国特許４７７５６２３）などがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、グルタミン酸生産株を用いて従来の菌株より高い収率のＬ−アルギニン生産菌株を得るための研究中に、グルタミンを生合成する経路を強化する場合にアルギニン生産能を高めるものと期待した。これは、アルギニン生合成の際にグルタミン酸１分子とグルタミン１分子が必要であるという経路上の特性に起因したもので、アミノ酸の一つであるイソロイシンの類似体としてのα−アノミ酪酸に対する耐性を持つ菌株がグルタミン生産能を高めるためである（韓国特許公開特２００２−００３８２０４号）。したがって、スルファグアニジンおよびＯ−ジアゾールアセチル−Ｌ−セリンに耐性を持つグルタミン酸を生産するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０６８０（韓国特許公告第９１−７８１８号）を母菌株としてα−アミノ酪酸、カナバニン、アルギニンヒドロキサメートに対する耐性変異株を求めた結果、α−アミノ酪酸に対して耐性を持たない菌株より高い収率でＬ−アルギニンを生産するという事実を見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、Ｌ−アルギニンを生産し、α−アミノ酪酸、カナバニン、アルギニンヒドロキサメートに対する耐性を持つコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＪＲ０５００を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記変異株を発酵培地で活性化させた後、さらに振とう培養することを特徴とする、Ｌ−アルギニンの生産方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、Ｌ−トリプトファンの添加によってアルギニン発酵時間が短縮されることを特徴とする、変異株ＣＪＲ５００を提供することにある。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明を実施するための最善の様態
一つの様態として、本発明は、Ｌ−アルギニンを生産し、α−アミノ酪酸、カナバニンおよびアルギニンヒドロキサメートに耐性を持つコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＪＲ０５００に関する。
【０００９】
変異株を誘導する方法は、次のとおりである。スルファグアニジンおよびＯ−ジアゾールアセチル−Ｌ−セリンに耐性を持つコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０６８０に一般な変異処理方法としてのＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ：N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin）処理を施した後、α−アミノ酪酸、カナバニンおよびアルギニンヒドロキサメートの添加された最小培地（注１）に塗抹してそれぞれに対して５００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌで耐性を持つ菌株を獲得した。
【００１０】
次に、変異株を誘導する方法をさらに詳しく説明する。活性化培地（注２）で１６時間培養し、活性化された菌株を１２１℃で５分間滅菌した種培地（注３）で１４時間培養した後、このうち５０ｍＬを１００ｍＭのクエン酸緩衝溶液で洗浄し、ＮＴＧを最終濃度が２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した後、２０分間処理し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液で洗浄した。ＮＴＧの処理された菌株を最小培地（注１）に塗抹して死滅率を求めた結果、死滅率は８５％であった。α−アミノ酪酸、カナバニン、アルギニンヒドロキサメートに対する共通耐性変異株を求めるために、ＮＴＧの処理された菌株を、カナバニン、アルギニンヒドロキサメート、α−アミノ酪酸がそれぞれ５００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌで添加された最小培地（注１）に塗抹し、３０℃で５日間培養してカナバニン、アルギニンヒドロキサメート、α−アミノ酪酸の共通耐性変異株を求めた。求められた耐性変異株をアルギニン生産培地（注４）で７２時間振とう用三角フラスコに培養し、アルギニンが生産されるカナバニン、アルギニンヒドロキサメート、α−アミノ酪酸の耐性変異株を選別し、これをコリネバクテリウムグルタミカムＣＪＲ０５００と命名した。
【００１１】
本出願人は、前記微生物コリネバクテリウムグルタミカムＣＪＲ０５００を、第３者に一般分譲できるように韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００６年３月１５日付けで受託番号ＫＣＣＭ−１０７４１Ｐで寄託した。
【００１２】
他の様態として、本発明は、前記変異株を発酵培地で３０℃で１６時間培養して活性化させた後、さらに７２時間振とう培養することを特徴とする、Ｌ−アルギニンの生産方法に関する。このような方法によれば、Ｌ−アルギニンの生産がさらに増加した（実施例１）。
【００１３】
別の様態として、本発明は、Ｌ−トリトファンの添加によってアルギニン発酵時間が短縮されることを特徴とする、変異株ＣＪＲ０５００に関する。
【００１４】
Ｌ−トリプトファンを添加する場合、アルギニンの発酵時間がさらに短縮されて同一の時間内にＬ−トリプトファンを添加していない場合よりさらに多量のＬ−アルギニンを生産することができる（実施例３）。
【００１５】
本発明の微生物の特性は、次のとおりである。
【００１６】
（注１）最小培地：ブドウ糖１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第１カリウム０．１％、尿素０．１％、チアミン０．０００１％、ビオチン２０μｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．０
【００１７】
（注２）活性化培地：肉汁１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母エキス０．５％、寒天２％、ｐＨ７．２
【００１８】
（注３）種培地：ブドウ糖５％、バクトペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス１％、ビオチン３μｇ／Ｌ、尿素０．４％、ｐＨ７．０
【００１９】
（注４）アルギニン生産培地：ブドウ糖４．０％、硫酸アンモニウム３％、尿素０．３％、第１リン酸カリウム０．１％、第２リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２５％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸出液）２．０％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
【００２０】
ＮＴＧを用いた突然変異誘導方法によってアルギニン生産性が向上した、カナバニン、アルギニンヒドロキサメート、α−アミノ酪酸の耐性株であるコリネバクテリウムグルタミカムＣＪＲ０５００のカナバニン、アルギニンヒドロキサメートおよびα−アミノ酪酸に対する耐性は、次のとおりである（表１）。
【表１】
2009542255.tif 000002
【００２１】
一方、最小培地でＬ−トリプトファンの濃度別生育度を確認した結果、表２に示すように、コリネバクテリウムグルタミカムＣＪＲ０５００がＬ−トリプトファンを要求するという事実を確認することができる。
【表２】
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【００２２】
発明の様態
以下、本発明の内容を実施例によってより詳細に説明する。但し、これらの実施例は、本発明の内容を理解するために例示的に説明するためのもので、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
使用菌株：ＫＦＣＣ−１０６８０、ＣＪＲ０５００
発酵培地（注４と同様）：ブドウ糖４．０％、硫酸アンモニウム３％、尿素０．３％、第１リン酸カリウム０．１％、第２リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２５％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸出液）２．０％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２。
【００２４】
発酵方法および結果：前記発酵培地２４ｍＬを２５０ｍＬの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の種培地（注３）で１６時間培養し、活性化された菌株を接種（１ｍＬ）して３０℃で７２時間振とう培養した。発酵終了液の結果は、次のとおりである（表３）。
【表３】
2009542255.tif 000004
【実施例２】
【００２５】
使用菌株：ＫＦＣＣ−１０６８０、ＣＪＲ０５００
発酵培地：ブドウ糖１０．０％、硫酸アンモニウム４％、尿素０．３％、第１リン酸カリウム０．１％、第２リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２５％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸出液）２．０％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
【００２６】
発酵方法および結果：前記発酵培地２４ｍＬを２５０ｍＬの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の種培地（注３）で１６時間培養し、活性化された菌株を接種（１ｍＬ）して３０℃で７２時間振とう培養した。発酵終了液の結果は、次のとおりである（表４）。次の結果より、α−アミノ酪酸に対する耐性を持つ耐性変異株が、耐性を持たない菌株よりさらに高い収率でＬ−アルギニンを生産するという事実が分かる。
【表４】
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【実施例３】
【００２７】
使用菌株：ＫＦＣＣ−１０６８０、ＣＪＲ０５００
発酵培地：ブドウ糖１０．０％、硫酸アンモニウム４％、尿素０．３％、第１リン酸カリウム０．１％、第２リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２５％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸出液）２．０％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
【００２８】
発酵方法および結果：前記発酵培地２４ｍＬを２５０ｍＬの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の種培地（注３）で１６時間培養し、活性化された菌株を接種（１ｍＬ）して３０℃で６４時間振とう培養した。発酵終了液の結果は、次のとおりである（表５）。次の結果より、トリトファン添加の際にＣＪＲ０５００変異株の生育が促進されてさらに短時間内に高い収率でＬ−アルギニンを生産するという事実が分かる。
【表５】
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【００２９】
上述したように、α−アミノ酪酸に耐性を持つコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＪＲ０５００は、Ｌ−アルギニン生産性がさらに増加した。また、Ｌ−トリプトファンを添加する場合には、アルギニンの発酵時間が短縮されて同一の時間内にさらに多量のＬ−アルギニンを生産することができるため、非常に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
上述したように、α−アミノ酪酸に耐性を持つコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＪＲ０５００は、Ｌ−アルギニン生産性がさらに増加した。また、Ｌ−トリプトファンを添加する場合には、アルギニンの発酵時間が短縮されて同一の時間内にさらに多量のＬ−アルギニンを生産することができるため、非常に有用である。
【００３１】
【表６】
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【国際調査報告】
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