(57)【要約】  本発明は、サンプル中の検体の濃度及び／又は検体センサ分子に対する検体の結合キネティクスを決定する方法に関する。これらの目的のために、本発明は、検体と検体センサ分子との間の相互作用を検出することに依存し、後者は微小アレイ状で固体多孔質支持体に物理的に吸着される。本方法は反復循環で実行されることができる。例えば本発明は、少なくとも一つのサンプル中の少なくとも一つの検体を検出する方法であり、少なくとも一つの固体多孔質支持体にその上に配置される少なくとも一つの検体センサ分子を提供するステップ、少なくとも一つの検体を含む少なくとも一つのサンプルに前記支持体を接触させるステップ、前記少なくとも一つの検体センサ分子と前記少なくとも一つの検体との間の特定の相互作用を検出するステップ、前記少なくとも一つのサンプル中の前記少なくとも一つの検体の濃度を決定するステップを有する方法である。
2009545739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのサンプル中の少なくとも一つの検体を検出する方法であって、
a) 少なくとも一つの固体多孔質支持体に、その上に配置される少なくとも一つの検体センサ分子を提供するステップ、
b) 少なくとも一つの検体を含む少なくとも一つのサンプルに、前記支持体を接触させるステップ、
c) 前記支持体及び/又は前記検体センサ分子に非特異的に結合したサンプル成分を除去することが可能な溶液で前記少なくとも一つの支持体をオプションとして洗浄するステップ、
d) 前記少なくとも一つの検体センサ分子と前記少なくとも一つの検体との間の特定の相互作用を検出するステップ、
e) 前記少なくとも一つのサンプル中の前記少なくとも一つの検体の濃度を決定するステップ、
を有する方法。
【請求項２】
前記濃度が、前記検体センサ分子に対する前記検体の結合のリアルタイムキネティクスを測定するために、時間にわたって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記支持体の空隙率が、流体がその中を通過することを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体が、ナイロン、ニトロセルロース、PVDF又はポリエステルサルホンでできている膜からなるグループから選択される膜である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）からｄ）又はそれらのステップのいずれかが複数回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
多数の検体センサ分子が、微小アレイの形で前記支持体上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの検体センサ分子が、検体に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つのサンプルの前記少なくとも一つの検体が、少なくとも一つの検出可能なマーカーによって修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの検出可能なマーカーが、蛍光体、酵素、染料、化学発光化合物、放射性同位元素、金属錯体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、無線周波数伝達物質及び無線発光化合物からなるグループから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検体がタンパク質である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の検体の濃度を決定する方法に関し、当該方法は、検体と検体センサ分子との間の複合体の検出に依存し、後者は固体多孔質支持材に取り付けられている。
【０００２】
本発明はさらに、検体の検体センサ分子への（後者は固体多孔質支持材に取り付けられている）結合効率を決定することによる、検体センサ分子への検体のリアルタイム結合キネティックスを決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子相互作用の検出は、一般的な検査手順と同様に複数の診断検査における必須要素のうちの1つを構成する。このように、数多くの成分から成るサンプル中の特定の検体の存在は、通常、検体と、この検体のみに特異的であることが知られている検体センサ分子との間の相互作用を検出することによって決定される。
【０００４】
同時に、サンプル中の数多くの検体の検出を並行して行うことを可能にする高スループットの検査アッセイに強い関心がある。
【０００５】
そのような高スループットの検査は、様々な化学及び生化学アプリケーションにおいて用いられている小型の検出装置であるいわゆる微小アレイを用いて可能である。
【０００６】
元々、微小アレイ技術は、特定の核酸間相互作用の検出のために開発された。核酸が例えばタンパク質や抗体よりも取り扱うのがはるかに容易であるために、核酸に基づく相互作用を検出するための微小アレイが好んで用いられる。
【０００７】
しかしながら、一方で、タンパク質間相互作用又はタンパク質-DNA間相互作用の高スループットの並列検査を可能にすることを目的とする微小アレイフォーマットが開発された。
【０００８】
ほとんどの微小アレイに基づく検査システムにおいて、一般的に、検体センサ分子（捕捉分子）は、アレイ上で定められた位置に固定され、その後アレイは、検出されるべき検体を含むサンプルと共に培養される。特定の処理ステップの後、検体とそれぞれの検体センサ分子との間の相互作用は、例えば蛍光マーカーを用いることにより視覚化される。
【０００９】
一般的に、微小アレイ基板は、ヌクレオチド配列の容易な固定を可能にするようにガラスカバースライドを用いる。しかしながら、他の固体基板と同様にガラスカバースライドは、タンパク質の複合体三次元確認、及びそれらの異なる疎水性又は親水性特性を考えると、タンパク質固定にとって理想的ではない。ガラスカバースライドは通常、それらが核酸及び/又はタンパク質の固定を可能にするようにコーティングされる。
【００１０】
さらに、検体センサタンパク質と検体との間の有効な相互作用は、結合が主にアレイのそれぞれのスポットへの溶液内での拡散に依存するという点で、従来の微小アレイ基板において妨げられた。これらの問題に対処するために、最近、いわゆる貫流（flow-through）微小アレイチップが開発された。
【００１１】
このアプローチにおいて、DNA又はタンパク質ベースのプローブが例えば化学的に改質された多孔質シリコンウェーハに固定されて、続いてサンプルと共に培養される。基板の多孔質の性質によって、オプションの洗浄溶液と同様に過剰なサンプルは、より容易に除去されることができる。そのような貫流装置の例は、国際特許出願公開第WO03/005013号に例えば記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
けれども、従来の技術は、主にこのようにサンプル中の検体の存在を検出する方法を記載し、例えばサンプル中の検体の濃度、又は検体センサ分子に対する検体の結合キネティックスを決定することにはいかなる注意も払っていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、検査されるべきサンプル中の少なくとも１つの検体の濃度を決定するための方法を提供することである。
【００１４】
また本発明の目的は、サンプル中の検体と検体センサ分子との間のリアルタイム結合キネティックスを決定することを可能にする方法を提供することである。
【００１５】
上述の目的を達成するために、独立請求項1に記載の検出方法が提供される。
【００１６】
本発明の１つの典型的な実施例によれば、少なくとも１つのサンプル中の少なくとも１つの検体を検出する方法が提供され、当該方法は、
a) 少なくとも１つの固体多孔質支持体に、その上に配置される少なくとも１つの検体センサ分子を提供するステップ、
b) 少なくとも１つの検体を含む少なくとも１つのサンプルに前記支持体を接触させるステップ、
c) 前記支持体及び/又は前記検体センサ分子と非特異的に結合したサンプル成分を除去することが可能な溶液で前記少なくとも１つの支持体をオプションとして洗浄するステップ、
d) 前記少なくとも１つの検体センサ分子と少なくとも１つの検体との間の特定の相互作用を検出するステップ、
e) 前記少なくとも１つのサンプル中の前記少なくとも１つの検体の濃度を決定するステップ、
を含む。
【００１７】
本発明の他の典型的な実施例において、濃度は、時間とともに決定されることができる。この後者の実施例において、検体と検体センサ分子との間の特定の相互作用を検出するときに生成される、時間にわたる信号の発生は、前記検体の前記検体センサ分子への結合のリアルタイムキネティックスを測定するために用いられることができる。検体及び検体センサ分子の性質に応じて、この実施例は、例えば、治療上のタンパク質ベースターゲットへの、化合物ライブラリの小分子の結合を識別及び特徴づけることを可能にすることができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態のうちの1つにおいて、固体多孔質基板は、例えばナイロン、ニトロセルロース、PVDF又はポリエーテルサルホンでできている薄膜のグループから選択される薄膜であることができる。
【００１９】
本発明の特に興味深い態様は、上述のステップb)-d)又はこれらのステップのいずれかが、複数回繰り返される実施例に関する。上記の方法のこの繰り返しの動作は、とりわけ、既知の処理手順によるよりも、検体分子の濃度を高速かつ高い信頼性で決定することができるという利点を持つ。本発明のこの実施例が検体センサ分子に対する検体の結合のリアルタイムキネティックスを決定するために繰り返して用いられる場合、同じことが当てはまる。
【００２０】
本発明のさらに他の実施例は、上述のような固体多孔質基板による方法を実行することに関し、多数の検体センサ分子が、微小アレイの形で前記多孔質基板上に配置される。固体多孔質基板上の既知の検体センサ分子の整然とした位置決め及びその後のサンプルとの培養は、数多くの異なる検体の濃度を並列に決定することを可能にし、本発明の方法の速度及び効率にさらに寄与する。また、同じことは、リアルタイムキネティックスを決定するために有効である。本発明のこの実施例は、ステップb)-d)を複数回に繰り返すことによって、繰り返して実行されることができる。
【００２１】
本発明の特定の好ましい実施の形態において、検体センサ分子は、タンパク質ベースの化合物（例えば抗体、ペプチド、ハプテン、アプタマ、タンパク質又は（細胞表面）受容体）である。
【００２２】
本発明のさらに他の実施例において、本方法は、検体と検体センサ分子との間の相互作用を検出するために、少なくとも１つの検体及び/又は少なくとも１つの検体センサ分子に結合される検出可能なマーカーによって実行されることができる。
【００２３】
検出可能なマーカーが例えば蛍光マーカーである場合、これはまた、サンプル中の検体の濃度及び/又はリアルタイム結合キネティックスを決定するための請求された方法の容易さ、効率及び速度に寄与することができる。
【００２４】
本発明の１つの実施例において、検体センサ分子は、化学リンカーによって、支持体に共有結合で取り付けられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】検体センサ分子として抗体を印刷するための模式的な印刷要求レイアウトを示す図。複数の異なる抗体がニトロセルロース膜に印刷される。抗体は物理的吸着によって薄膜上へ吸着することができる。Cy5標識抗体を含むスポットは、内部較正基準として、及びグリッドを固定するために用いられる。
【図２】図1において概略的に描かれる微小アレイの較正基準の測定を示す図。画像は印刷の直後に撮られた。ソフトウェアの２つの変数（すなわち電流及びフラッシュ長）が、最適な画像を得るために微調整されることができる。この場合には電流が変更された。50mAの電流において、低濃度の内部較正はそれほど見えず、低い信号出力を示す。しかしながら、電流が127.5mAに増加すると、低濃度の内部較正が認識できて、この電流が有用であることを示す。
【図３】図2に記載される微小アレイが100nMのウサギ-抗マウスCy5標識抗体（Rabbit-anti-Mouse-Cy5 labeled antibody）を含むサンプルと共に培養された実験の画像を示す図。それぞれの画像は、薄膜上でサンプルを（1-8回）循環させた後で取得された信号を表す。
【図４】図2及び3と同じ実験に関する図。それぞれの画像は、サイクル5, 6, 7及び8の後の信号を表す。
【図５】図2, 3及び4と同じ実験に関する図。上のパネルは、微小アレイを洗浄せずにサイクル8の後で取得される信号を示す。下のパネルは、PBS 7.4, 0.05% Tween 20による洗浄後の同じ微小アレイの信号を示す。
【図６】抗原C反応性タンパク質（CRP）及び腫瘍壊死因子a（TNFa）の結合をモニタリングするための実験2に用いられた他の微小アレイ印刷レイアウトを示す図。
【図７】捕捉抗体の印刷後の実験2の微小アレイを示す図。
【図８】100nMの濃度における検出された抗原CRPに対して測定された信号の強さを示す図。サイクル数は、「新しい」streptavidineでラベル付けされたCy5の繰り返された使用に関する。「10+w」は、洗浄ステップが最後のサイクルの後に含まれることを示す。
【図９】抗原が加えられなかった対照標準に対する結果を示す図。
【図１０】図8に基づいて計算される信号対雑音比を示す図。
【図１１】実験3に用いられた他の微小アレイ印刷レイアウトを示す図。
【図１２】捕捉抗体の印刷後の実験3の微小アレイを示す図。
【図１３】CRP並びにマーカー（Alexa647及びCy5）の正規化された強度を示す図。
【図１４】TNFa並びにマーカー（Alexa647及びCy5）の正規化された強度を示す図。
【図１５】サイクル回数に依存するCRP検出のキネティックスを示す図。
【図１６】サイクル回数に依存するTNFa検出のキネティックスを示す図。
【図１７】実験4の検出原理を示す図。
【図１８】実験4に用いられた他の微小アレイ印刷レイアウトを示す図。
【図１９】実験4に対する検体結合の正規化された信号の強さを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、一実施例において、少なくとも１つのサンプル中の少なくとも１つの検体を検出する方法を目的とし、当該方法は、
a) 少なくとも１つの固体多孔質支持体に、その上に配置される少なくとも１つの検体センサ分子を提供するステップ、
b) 少なくとも１つの検体を含む少なくとも１つのサンプルに前記支持体を接触させるステップ、
c) 非特異的に前記支持体及び/又は前記検体センサ分子と結合したサンプル成分を除去することが可能な溶液によって前記少なくとも１つの支持体をオプションとして洗浄するステップ、
d) 前記少なくとも１つの検体センサ分子と少なくとも１つの検体との間の特定の相互作用を検出するステップ、
e) 前記少なくとも１つのサンプル中の前記少なくとも１つの検体の濃度を決定するステップ、
を有する。
【００２７】
過去において、サンプル中の検体を検出する方法は、主に特定の化合物がサンプル中に存在するかどうかに関する決定を可能にすることを意図した。しかしながら、検体センサ分子とサンプル中の検体との間の特定の相互作用を検出し、その後サンプル中の検体の濃度を決定するために検体センサ分子と検体との間の相互作用を示す信号を用いるために、固体多孔質支持体に取り付けられる検体センサ分子がサンプルに接触させられる方法は開示されていない。
【００２８】
本発明にとって有用な支持体は、固体かつ多孔質である。本発明のための「多孔質」という用語は、基板が十分に浸透性であり、流体がそれを通過することができることを意味する。好ましい実施の形態において、基板は多孔性であり、低圧から適度な過圧の印加によって流体がそれを通過することを可能にする。
【００２９】
流体は、溶液、分散、懸濁、エマルション、生体液（例えば血液、血漿、尿など）を含むことができる。流体又は流体サンプルは、例えば、海、湖、川などからの環境サンプルを含むことができる。
【００３０】
流体が薄膜内の孔を通過することを可能にするために、本発明のための「多孔質」という用語は、一般的に、平均して、0.1〜1μm、0.2〜0.8μm、好ましくは0.3〜0.7μm、0.4〜0.6μmの直径の孔を有する基板に関する。特に好ましい孔径は0.45μmである。
【００３１】
さらに、本発明による固体の多孔質基板は、上述の機能及びサイズの孔を持つだけでなく、一般的に、20-80%の空隙率数（すなわち空隙体積と薄膜材料との間の比率）を示す。
【００３２】
本発明のために有用である基板は、もちろん、とりわけポリマー材料、天然又は人工繊維、シリコーン樹脂、フィルタ材料、薄膜及びそれらの複合材から製造されることが、これらの基板を理解する当業者によって知られる。本発明による固体多孔質基板は、酸化アルミニウムから形成されることができない。
【００３３】
もちろん、固体支持体は、特定の用途に応じてあらゆる形状及びサイズで製造されることができる。例えば、平板、薄板、ディスク、フィルム、スレッド、スポットなどを含む。好ましい（但し必須ではない）形状は、好ましくは自動化された診断システムによって扱われることができる平坦な表面を有する形状（例えば薄膜、フィルタ又はマイクロプレート）である。
【００３４】
好ましい実施の形態は、固体支持体として多孔質膜を使用する。これらの薄膜は、ナイロン、ニトロセルロース、PVDF又はポリエーテルサルホンからできていることができる。
【００３５】
そのような薄膜は、商品名Protran、Ultrabind、Immunodyne、Hybond及びBiodyneとして市販されている。Pallから入手可能である、ナイロン補強されたニトロセルロースから成るProtran薄膜が特に好ましい。
【００３６】
大きさは変更することができるが、一実施例において、薄膜は、厚みが0.1〜15mmの間、0.2〜12mmの間、0.33〜11mmの間、0.4〜10mmの間、1〜10mmの間、4〜9mmの間又は約8mmであり、孔径は、0.1〜1μm、0.2〜0.8μm、0.3〜0.7μm、及び0.4〜0.6μmが好ましい。薄膜が例えば上述の負に帯電するナイロン膜の１つである場合にも、これは妥当である。
【００３７】
本発明において有用である検体センサ分子は、検体センサ分子が、基板に配置されている間、一般的に検体として指定されるターゲット構造と特異的に相互作用するためのポテンシャルを保持するという機能を確認する意味において、固体多孔質支持体に配置されていることができる分子である。
【００３８】
様々な検体を含むサンプルが検体センサ分子とともに培養されると、検体センサ分子は、それに対して特異的である検体と優先的に相互作用し、その後検出されることができる特定の相互作用をもたらす。
【００３９】
本発明にとって有用な検体センサ分子は、タンパク質、酵素、レセプター、リガンド、抗原、ハプテン、細胞、細胞断片、小分子、アプタマ及び抗体であることができる。検体センサ分子は、核酸であることができない。
【００４０】
好ましい実施の形態において、本発明の検体センサ分子は、タンパク質ベースの検体センサ分子である。そのような好ましい検体センサ分子は、タンパク質、レセプター、抗体などを含む。一実施例において、検体センサ分子は、抗原であるそれぞれの検体と特異的に結合することが知られている抗体である。
【００４１】
検体センサ分子として用いられる抗体は、マウス、ヒト、ラット、ニワトリ、ヒツジ、ヤギなどを含む、任意の起源であることができ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、F(ab)、ラクダ抗体、ナノボディ(nanobody)などのような、従来技術において一般に知られる全ての種類の抗体を含む。
【００４２】
用いられることができるいろいろな種類の抗体の概要は、とりわけ、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 (e.g. page 17)において見いだされる。さらに、上述のIgA、IgE、IgM、IgG、IgDなどの、あらゆる種類の抗体サブクラスが用いられることができる。この文脈で、Harlow及びLane（上述）が再び参照される。
【００４３】
検体センサ分子は、支持体への共有結合又は非共有結合を介して、任意の上述の固体多孔質支持体の少なくとも一部上に、及び/又はその中に、配置されることができる。
【００４４】
好ましい実施の形態において、抗体は、ニトロセルロース膜上にインクジェット印刷されて、物理的に吸着することができる。印刷された薄膜は、一晩かけて乾燥させられる。印刷された薄膜は、好ましくは、室温で1時間、PBS pH 7.4中の5%BSAによってブロック化されることができ、その後分析される。
【００４５】
支持体と検体センサ分子との間の共有結合は、化学結合が形成されることを意味する。共有結合を目的として、固体多孔質支持体は、支持体と検体センサ分子との間の化学結合の形成を可能にする化学官能基を提供するために官能基化されることができる。
【００４６】
このように例えば抗体が検体センサ分子として用いられて薄膜に共有結合しなければならない場合、カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基などのような官能基を提供する薄膜が用いられることができる。これらの基は続いて、抗体に直接、又はホモ２官能性若しくはヘテロ２官能性であるリンカーを用いて、架橋されることができる。
【００４７】
このように、支持体は、不活性固体多孔質基板を例えばアシルフッ化物官能性を持つポリマーでコーティングすることによって、検体センサ分子に対する化学結合を提供するために活性化されることができる。他の共有結合成分は、無水塩、エポキシド、アルデヒド、ヒドラジド、酸アジ化物、アリールアジド、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアン酸塩、NHSエステル、CNBr、マレイミド、トシレート、tresyl塩化物、マレイン酸無水塩及びカルボニルジイミダゾールに適用可能である（但しそれらに限られない）。
【００４８】
一実施例において、カルボジイミド官能性が、固体多孔質支持体と検体センサ分子（例えば抗体）との間の結合を確立するために用いられることができる。
【００４９】
この目的のために、BiodyneCのような負に帯電するナイロン膜（COOH基を含む薄膜）が、EDAC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩）のようなリンカーによって前処理されることができる。この活性中間体は、続いて、検体センサ分子（例えば抗体）のアミノ基と反応する。
【００５０】
抗体又はタンパク質の結合は、低濃度のEDACを用いることにより生じることができる。
【００５１】
一般的に、EDACのこれらの濃度は、0〜25重量%、0.5〜10重量%、0.5〜8重量%、0.5〜4重量%、0.5〜2重量%の間で変化し、特に1重量%が好ましい。
【００５２】
当業者は、検体センサ分子（例えば抗体）を固体多孔質支持体に接触させる場合、及び検体センサ分子（例えば抗体）をサンプルに接触させる場合に考慮されなければならない反応条件を十分に知っている。典型的な反応条件は、特定の緩衝液、温度、pH条件などに依存する。しかしながら、これらの条件は、固体支持体への検体センサ分子の共有結合に関連して用いられる化学官能性と同様にサンプル、検体及び検体センサ分子の種類に依存し、通常文献から知られて、又は例えば化学架橋剤の製造者によって提供される。
【００５３】
本発明の一実施例では、本方法は、支持体の少なくとも一部上に及び/又はその中に均一に分布する一種類の検体センサ分子のみを含む支持体によって実行されることができる。
【００５４】
しかしながら、本発明の特に好ましい他の実施例において、本方法は、検体センサ分子が空間的に規則的に及び分離されて固体多孔質基板の少なくとも一部上に及び/又はその中に分散され、通常「アレイ」と呼ばれる支持体パターンを確立する支持体によって行われる。
【００５５】
検体センサ分子を支持体上にアレイ状で配置することから結果として生じる利点の１つは、いろいろな種類の検体センサ分子を、それらに応じて既知の配列及び分布でアレイ上に配置することができることである。そのような配列は、サンプル内の複数の検体の並列の検出を可能にする。
【００５６】
一般的に、そのようなアレイは、特定の検体センサ分子に相当するスポットでできている。スポット中の検体センサ分子の識別が知られているので、複雑なアレイを設けることができる。業界標準に従うと、アレイフォーマットは、スポットの数が10〜100000、50〜50000、100〜10000にわたり、又は1000、2000、3000、4000若しくは5000である密度を持つ。
【００５７】
当業者はもちろん、アレイの特定のスポットに対して、定められた量の検体センサ分子がその上に配置されていることができることを十分に知っている。したがって、微小アレイの形で本発明による固体多孔質支持体を提供することが可能であり、微小アレイのスポットは、異なる量のそれぞれの検体センサ分子を含む。そのスポットが異なる量の様々な検体センサ分子を含む微小アレイを提供することは、本方法が検体センサ分子への検体のリアルタイムキネティックス結合挙動の結合を決定するために用いられる場合（下記を参照）に、特に興味深い。
【００５８】
したがってアレイは、固体多孔質基板上のアドレス指定可能な位置における、検体センサ分子、特に生物学的高分子（例えばポリペプチド及び抗体）の配列である。微小アレイは、最小限の量の検体センサ分子及び評価用のサンプルを必要とするように小型化されたアレイである。アレイの中で、各々のアレイ分子は、その位置が少なくとも２次元のアレイ表面の中で確実に及び一貫して決定されることができるという点で、アドレス指定可能である。かくして、規則正しいアレイにおいて、各々の検体センサ分子の位置は、それがアレイ表面に配置される時に検体センサ分子に割り当てられ、そして通常、各々の位置を関連づけるためにキーが提供される。しばしば規則正しいアレイは対称的な格子パターンで配置されるが、サンプルは他のパターン（例えば放射状に配置されたライン又は規則正しいクラスタ）で配置されることができる。
【００５９】
分析センサ分子又は「スポット」の適用の形状は、本発明の性質にとって本質的に重要ではない。したがって、検体センサ分子の微小アレイは、一般に検体ターゲティングポリペプチドの局所的な堆積物を指し、丸い若しくは実質的に丸い領域に限られない。例えば、基本的に矩形（例えばスロットブロットアプリケーション）若しくは三角形、楕円形又は不規則形状の領域であることができるように、ポリペプチドの基本的に正方形の領域が、本発明のアレイによって用いられることができる。スポット自体のサイズ（その中にスポット全体を囲む円形領域の直径）は本発明に重要でないが、それは通常0.1mm〜0.5mmの間である。アレイ自体の形状も本発明にとって重要でないが、それは通常、実質的に平坦であり、一般的な形状において矩形又は正方形である。
【００６０】
微小アレイの作製は、約0.05mm〜10mmの間、より好ましくは0.1mm〜1mmの間のスポット間隔（中心間隔）での、異なるグループの検体センサ分子の配列を指す。
【００６１】
本発明において有用なアレイスポッタと呼ばれるアレイ装置は、現在いろいろな会社から入手可能である。いろいろなスポッティング技術によれば、それらは、接触モード及び非接触モード（インクジェット）アレイ装置に分類されることができる。例えばAffymetrix、Amersham Pharmacia、BioRobotics及びGeneMachineによって製造されるシステムを含む接触モードアレイ装置は、先端が基板に接触するときにサンプルを排出するペン先を用いる。Packard Bioscience（現Perkin Elmer）によって製造されるBioChipArrayerによって代表される非接触モードアレイ装置は、基板上約400μmにおいて、予め吸い込まれたサンプルを排出するために、ピエゾ結晶で制御された先端を使用する。
【００６２】
アレイが用いられる本発明の実施例の利点は、より小さいサンプルサイズ及び反応体積を可能にする小型の支持プラットホームが作成されることができ、規模の倹約及び時間の節約につながることである。加えて、これらの分析器は、従来の微小アッセイフォーマットと同等又はより大きな感度を達成することができる。
【００６３】
本発明のための「検体」という用語は、上述の検体センサ分子によって特異的に認識される分子に関する。検体は、したがって、タンパク質、抗原、ハプテン、小分子、脂質などから成るグループから選択されることができる。最も好ましい検体は、タンパク質又は様々なタンパク質の組み合わせである。
【００６４】
その上に検体センサ分子が好ましくは微小アレイの形で配置されている上述の固体多孔質支持体を少なくとも１つのサンプルに接触させることは、典型的な温度及び条件で固体支持体と共に検体を含むサンプルを培養することによって実行されることができる。
【００６５】
上で述べられたように、オプションとして、支持体及び/又は検体センサ分子と特異的に結合しなかったサンプル成分を除去することが可能な溶液によって支持体を洗浄することができる。
【００６６】
例えばタンパク質の検体検出の間、検査されるべきサンプル成分の検出装置への非特異的な結合が生じる場合があることがよく知られている。この非特異的結合は、支持体及び/又は検体センサ分子に対して生じる場合がある。本発明の一実施例において、非特異的に結合した成分を除去するためのいわゆる洗浄溶液を用いて、検出装置をサンプルに接触させた後、非特異的に結合した成分を除去することによって、そのような非特異的結合に注意を払うことができる。
【００６７】
さらに、本発明の発明者は、本発明の一実施例において、支持体や検体センサ分子への非特異的結合を低減、除去及び/若しくは防止することが可能である溶液又は液体で支持体を処理することが望ましいことを見いだした。液体としてのそのような溶液は、ブロッキング溶液と一般的に呼ばれる。
【００６８】
支持体の上述の要素へのサンプル成分の非特異的結合を低減及び/又は防止することが可能であるブロッキング成分は、一般的に、支持体及び/又は検体センサ分子の性質及び量によって決まる。
【００６９】
ブロッキング成分は、例えばSDS、TritonX 100、TritonX 80、NP-40、Tween-80、Tween 20などのような界面活性剤を含むことができる。他の実施例において、ブロッキング溶液のブロッキング成分は、BSA、FSA、HSA、Casein又はFc末端であることができる。もちろん、上述のブロッキング剤の組み合わせが用いられることもできる。
【００７０】
後者のブロッキング成分、すなわちBSA、HAS、FSA及び特にCaseinが好ましい。
【００７１】
ブロッキング溶液は、ブロッキング緩衝液のような溶液又は液体の形で一般的に適用される。そのような例えばブロッキング緩衝液の更なる成分は、特定の用途によって決まる塩、酸などである。典型的なブロッキング緩衝液は、BSA、FSA、HAS又はCaseinの重量で、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%及び15%又は20%までの濃度の任意の上述の成分から成るPBSpH7.4である。
【００７２】
Casein、BSA、HSAなどの成分がブロッキング溶液の中のブロッキング成分として使われる場合、それらの濃度は一般的に、1〜15%、2〜10%、好ましくは5〜10%の間である。これらの濃度は重量パーセントである。
【００７３】
ブロッキングの時点は異なる場合がある。したがって、薄膜のような支持体は、抗体のような検体センサ分子が支持体に結合する前に、予めブロック化されることができる。支持体は、検体センサ分子が既に薄膜に結合され又は配置された後で、ブロック化されることができる。これは好ましくは、検体センサ抗体が薄膜（例えば上述のナイロン膜）に吸収される場合に構想される。
【００７４】
サンプル中の少なくとも１つの検体と支持体上の検体センサ分子との間の特定の相互作用を可能にするために、サンプルと検出装置とを接触させた後で、基板及び/又は検体センサ分子と非特異的に相互作用する検体サンプルの非特異的に結合された成分を除去すること及び/又は低減することを意図する上述のいわゆる洗浄ステップをオプションとして含むことができる。この洗浄ステップの後、又は洗浄ステップが省略される場合、検体センサ分子とサンプルの少なくとも１つの検体との間の特定の相互作用の検出が行われる。
【００７５】
ステップd)について、支持体がサンプルと接触した後で、検体センサ分子と検体との間の特定の相互作用は検出されることができることが上で述べられた。
【００７６】
サンプル中の検体と検体センサ分子との間の特定の相互作用を検出する様々な手段が存在する。これは、検体センサ分子としての抗体と、タンパク質又はその抗体によって特異的に認識される典型的な化学化合物のようなサンプル成分との間の相互作用に関して説明される。しかしながら、これらの説明は、本発明のこれらの典型的な実施例に限られていることを決して意味しない。
【００７７】
抗体のような検体センサ分子と検体との間の相互作用の検出は、検出可能なマーカーによって検体を修飾することによって行われることができる。検出可能なマーカーによる検体の修飾は、サンプルに検出装置を接触させる前、サンプルに検出装置を接触させている間、又は検体センサ分子と検体との間の特定の相互作用が生じた後で、行われることができる。
【００７８】
検体は、例えばCy5、Cy3、Texas Red、FITC、Attodye、Cydye、Alexa647などの蛍光成分や、放射性基などによる修飾により、検出可能なマーカーによって修飾されることができる。抗体のような検体センサ分子と例えばCy5でラベル付けされた検体との間の相互作用が生じる場合、サンプルの任意の他のラベル付けされた成分は、洗浄ステップによって除去されることができ、サンプル中の特定の検体の存在は、例えば、検体センサ分子と、その検体センサ分子との相互作用によって検出装置上に保持される検体との間の相互作用から生じる蛍光信号によって、検出されることができる。
【００７９】
誘導銀染色法のような他の方法が、検出のために用いられることができる。他の検出可能なマーカーは、染色を生じさせる酵素反応に依存し、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼがサンプル中の検体に結合されることができ、その後、対応する基質を提供することによって反応が開始されることができ、西洋わさびペルオキシダーゼによって修飾されている検体が検体センサ分子と相互作用した位置における染色を導く。
【００８０】
そのような酵素リンカーは、アルカリ性ホスファターゼ又は化学発光システムをさらに有することができる。リポーター分子とも呼ばれる検出可能なマーカーの更なる例としては、色素、化学発光化合物、金属錯化、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、無線周波伝達物質及び無線ルミネセンス化合物が挙げられるがこれらに限られない。
【００８１】
検体と検体センサ分子との間の相互作用を検出する他の方法が用いられることもできる。例えば、検体センサ分子が抗体である場合、検体はサンプルからこの抗体に特異的に結合されることができる。そして、サンプルの任意の結合していない又は非特異的に結合した成分を除去するために洗浄ステップが用いられる場合、検体の他の部分に対しても特異的である更なる抗体が加えられることができる。この抗体は、例えば検出可能なマーカーに結合されることができる。そのような検出可能なマーカーは、蛍光マーカー（例えばCy5）であることができる。しかしながら、そのようなマーカーは、例えば既知の配列のオリゴヌクレオチドであることもできる。捕捉抗体によって支持体に保持されている検体とのいわゆる二次抗体の相互作用に続いて、このオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のために用いられると、サンプル中の検体の存在が検出されることができる。このいわゆるimmuno PCRは非常に高感度であり、溶液中の微量な検体を確実に検出するために用いられることができる。抗体のような第二の検体センサ分子に依存する上記の検出方法は、「サンドイッチ分析」とも呼ばれる。当業者は、そのような分析を十分に知っている。
【００８２】
さらに他の好ましいアプローチにおいて、第二（検出抗体）は例えばビオチンに結合される。更なるステップにおいて、検体センサ分子-検体-第二抗体の複合体は、streptavidineでラベル付けされた検出可能なマーカー（例えば蛍光マーカー）に接触する。そして蛍光マーカーは、ビオチンラベルを付けられた二次抗体とstreptavidineを介して相互作用することができる。
【００８３】
このアプローチの他の変形例がもちろん可能である。例えば、捕捉抗体のような検体センサ分子は、インクジェットプリンタを用いて多孔質膜に印刷されることができる。その後、印刷された薄膜は、非特異的結合を最小限に抑えるためにブロック化されることができる。例えば、この場合の検体であるターゲットタンパク質を含むサンプルは、直接ラベル付けされる。ラベルは、上述のような、蛍光体、金のビーズ、酵素又はハプテンであることができる。以下に記載される貫流セットアップを用いることにより、ラベル付けされたサンプルは、抗体-抗原結合を可能にするために、薄膜全体に数回ポンピングされる。過剰なラベルは、追加的なオプションの洗浄ステップによって除去される。
【００８４】
さらに他の実施例において、ターゲットタンパク質であることができる検体は、インクジェットプリンタを用いることにより、多孔質膜上へ印刷される。印刷された薄膜は非特異的結合を最小限に抑えるためにブロック化され、そして、ターゲットタンパク質を含むサンプルは、検体と結合することができるいくつかのオプションとしてラベル付けされた抗体と混合される。ラベルは、例えば蛍光体であることができる。オプションとして、洗浄ステップが、非特異的に結合された抗体又はラベルを薄膜から除去するために適用される。またオプションとして、結合された抗体をターゲットとする第２ラベル抗体との培養ステップが実行されることができる。上述のオプションの変形例は組み合わせられることができる。そして抗原-抗体1又は抗原-抗体1-抗体2結合は、蛍光信号を検出することが例えば可能である検出セットアップによって視覚化され、複合体の定量化は、較正基準（下記を参照）を用いることにより実行される。この後者の実施例は実際には競争アッセイである。入力サンプル中の高濃度のターゲットタンパク質は、薄膜上の低い信号を与える。さらに、第１の捕捉抗体の量は、サンプル中のタンパク質ターゲットの数と比べて過剰にならないように、慎重に最適化されなければならない。
【００８５】
もちろん、検体センサ分子と検体との間の特定の相互作用は、マーカーなしでも検出されることができる（すなわちいわゆる「ラベル無し」検出）。これは、例えばBiacoreシステムによって実行されることができる。
【００８６】
上で述べたように、検体センサ分子がアレイフォーマットで支持体上に配置されている場合、本発明による方法は、サンプルの並列処理及び１つ又は複数のサンプル中の数多くの検体の並列検出を可能にするために用いられることができる。各々の検出スポットが特定の検体に特異的な異なる検体センサ分子に対応することができるので、固体多孔質支持体がサンプルと共に培養され、上記のように処理された後で、そのような検出スポットから生じている信号は、サンプル中の検体の存在を示す。
【００８７】
本発明による方法における最後のステップe)では、サンプル中の検体の濃度が決定される。
【００８８】
濃度の決定は、ステップd)について上述されたような検体センサ分子と検体との間の特定の相互作用の検出に応じて生成される信号に主に依存する。
【００８９】
一般的に、最初に、その上に検体センサ分子が配置された支持体を、支持体上の検体センサ分子と特異的に結合することが可能な検体を含むサンプルに接触させ、検体センサ分子の濃度は既知である。この特定の検体に対して既知の異なる濃度を有するサンプルを用いることにより、及び例えば異なる量の検体センサ分子及び検体に例えば結合する蛍光マーカーのスポットを有する微小アレイを用いることにより、特定の蛍光信号の強さがサンプル内の検体の既知の濃度に関連づけられるいわゆる較正又は基準曲線を確立する。
【００９０】
実際の測定の第２のステップにおいて、その濃度が分かっていない検体を含むサンプルが測定される。これらのサンプルは、説明された本発明による方法で処理されて、例えば検体が、較正曲線を確立するために用いられたものと同じ識別性の蛍光マーカーによって今回もラベル付けされる場合、蛍光信号が記録される。この蛍光信号は、それから上述の較正曲線との比較によって、サンプルの濃度に関連づけられることができる。
【００９１】
当業者はもちろん、例えば、サンプルが支持体に接触し、サンプルが、支持板上の相互作用のために利用可能な検体センサ分子よりも多くの検体を含んでいる場合に生じる飽和効果を、蛍光信号が受けることを知っている。そのような場合には、不飽和蛍光信号が達成される状況に達するまで、段階的に検体サンプルを希釈する。
【００９２】
サンプル中の検体の濃度を決定するための他の実施例は、当業者に知られている。
【００９３】
例えば化学的又は酵素反応が比色反応によって検体と検体センサ分子との間の相互作用を検出するために用いられる場合、較正又は基準曲線は、検体の濃度が既知であるサンプルによって確立されることができる。続いて、本発明による上述の方法が実行され、取得された比色値から濃度が計算される。また当業者は、まだ飽和レベルに達していない比色信号のみが考慮されていることを保証しなければならないことが分かっている。
【００９４】
サンプル内の検体の濃度を決定するための上述の方法の利点のうちの１つは、サンプルが多孔質支持体に接触することである。支持体が多孔質なので、サンプルは支持体を通過することができ、サンプルの全ての非特異的に結合された成分を高速かつ効率的に除去することを可能にし、一旦、検体と検体センサ分子との間の特定の相互作用が検出されると、全体的に増強された信号対雑音比をもたらす。
【００９５】
さらに、多孔質膜の使用は、本発明の有利な及び好ましい実施例を可能にし、すなわち、上記の方法は、上述のステップb)-d)を複数回繰り返すことによって、繰り返して実行される。
【００９６】
好ましくはステップb)〜d)は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10回、最高で30回繰り返される。特に好ましい繰り返し回数は、約8〜12サイクルである。繰り返しの接触、オプションの洗浄、及び検体センサ分子と検体との間の特定の相互作用の検出は、例えば循環して固体多孔質支持体上でサンプルをポンピングすることによって促進されることができる。循環は、ポンピングに加えて又はその代わりに、吸引を利用することによって促進されることができる。もちろん、当業者は、例えば洗浄ステップが含まれる場合、支持体上でサンプルを変わらずにポンピングするための開口をどのように適応させるべきかについて知っている。これは、バルブによってサンプルのようなそれぞれのソース及び洗浄バッファソースに切り替えられることができるラインを使用することによって例えば実行されることができる。
【００９７】
支持体上にサンプルを繰り返し適用することは、検体センサ分子と検体との間の相互作用を検出する際の大幅に増強された信号対雑音比につながる。これは、例えば少なくとも20秒、少なくとも30秒、少なくとも40秒、少なくとも50秒、少なくとも60秒、少なくとも2分、少なくとも3分又は少なくとも5分の接触又は培養期間によって繰り返しサイクルが中断される場合に、特にあてはまる。上記のサイクルの数が利用されることができる。サンプルの繰り返しの適用は、新しいサンプル及び/又は一度すでに薄膜を通過したサンプル（すなわち最初の通過の「貫流」）の繰り返しの追加を含む。
【００９８】
「繰り返しサイクル」という用語は、必ずしもステップb)〜d)の全ての繰り返しを指すものではない。代わり、「繰り返しサイクル」という用語は、これらのステップb)〜d)のいずれか又はそれらのサブステップを指すことができる。例えば、多孔質膜上でサンプルを多数回循環させる代わりに、薄膜上で洗浄溶液を繰り返し適用すなわち循環させることができる。
【００９９】
同様に、支持体上で検出可能なマーカーを繰り返し循環させることができる。これは好ましくは、streptavidineラベルを付けられた蛍光マーカーが、ビオチンラベルを付けられた二次抗体を検出するために用いられる場合である。
【０１００】
もちろん、上述の循環ステップ（すなわちサンプル、洗浄溶液及び/又は検出可能なマーカーの循環）の組み合わせが用いられることもできる。
【０１０１】
理論に束縛されることなく、上述の培養期間によって好ましくは中断される繰り返しサイクルは、サンプルの非特異的に結合された成分の効率的な除去につながる検体と検体センサ分子との間の繰り返されるオン及びオフ反応によって、検体センサと検体との間の相互作用を検出するときの信号対雑音比を増加させ、特定の相互作用に対する選択圧に有利に働く。
【０１０２】
さらに、サンプルを支持体に繰り返し接触させるおかげで、方法が繰り返しサイクルで実行されずに、一度の培養とオプションとしての洗浄ステップのみが含まれる状況と比較して、効率的な検出のために必要とされている培養期間全体が大幅に低減されるようである。
【０１０３】
したがって、本発明は、上記のように繰り返して実行される場合、例えば抗体とその抗原との間の免疫反応を検出するために必要とされる時間が、例えば場合薄膜上の培養が実行されない場合、最大で3.5時間続く場合がある従来の所要時間から15分まで低減されることができるという利点を持つ。培養ステップが含まれる場合、５回のポンプサイクルのための全体のアッセイ時間は約45分であることができる。本発明による方法の繰り返しの動作は、ポンピング及び/又は吸引手段による様々な手段によって達成されることができ、それらの手段は、支持体上の及びそれを通したサンプル及びオプションの洗浄溶液の制御可能かつ一定の流動を可能にするので好ましい。
【０１０４】
本発明の他の実施例は、サンプル中の検体の濃度が時間にわたって決定される状況に関する。
【０１０５】
時間にわたって結合された割合を決定することで、その検体センサ分子への検体の結合のリアルタイムキネティックスを測定することが可能になる。検体センサ分子への検体の結合のリアルタイムキネティックスを決定する場合、信号を検体の濃度に変換することができる。結合曲線の種類に応じて、会合速度定数、解離速度定数及び検体センサ分子密度（すなわち表面積あたりの検体センサ分子の数）を知ることが必要である。会合及び解離定数は、別途決定されることができる。捕捉分子密度は、堆積した濃度及びボリューム並びにスポットの直径から決定されることができる。あるいは、既知の濃度の検体分子と共に培養するときに、会合又は解離速度定数を決定することができる。特定の相互作用を検出するために、上述の検出可能なマーカー（例えば蛍光分子）に再び依存することができる。
【０１０６】
一旦、検体センサ分子への検体の結合のキネティックスを反映する結合曲線を確立すると、未知の濃度の検体を含むサンプルは固体支持体に接触させられることができ、検体と検体センサ分子との間の特定の相互作用の検出は、時間にわたって再びモニタリングされることができる。異なる既知の濃度のサンプルに対して取得された異なる標準曲線により未知の濃度のサンプルの曲線形状を決定することによって、検体センサ分子への検体の結合の結合キネティックスパラメータだけでなく、サンプル内の検体の濃度も推定することができる。
【０１０７】
ステップb)〜d)又は任意のこれらのステップが複数回繰り返される場合、検体センサ分子への検体の結合のリアルタイムキネティックスの決定は大幅に改善されることができ、測定のために必要とされる時間は低減されることができる。この文脈において、上述の本発明による方法の繰り返しの動作が参照される。もちろん、本方法の繰り返しの動作は、上述のように培養及び接触期間によって中断されることができる。
【０１０８】
本発明のための複数の有用なアプリケーションが存在する。したがって、上記の方法は、例えば血液サンプル中の特定の抗原を検出する免疫反応のために用いられることができる。そして上記の方法は、診断目的のために用いられることができる。上記の方法の特定の利点は、サンプル中の特定の検体の存在を検出することを可能にするだけでなく、比較的短い時間スパンでその濃度を決定することを可能にすることである。
【０１０９】
さらに、上記の方法は、検体センサ分子への検体の結合のリアルタイムキネティックスを決定するために用いられることができる。それで、上記の方法は、例えば細胞受容体のような治療的に興味深いターゲットと相互作用することが可能である化合物ライブラリ中の例えば小分子化合物を検出するためだけでなく、小分子とそのターゲットタンパク質との間の相互作用の結合キネティックスを決定するためにも用いられることができる。
【０１１０】
したがって、本発明は、サンプル内の検体の存在及び濃度を決定するために用いられることができ、サンプルは、異なるソース（例えば環境ソース、血液、リンパ液など）から取り出される。
【０１１１】
さらに及び/又はあるいは、検体センサと検体分子との間の相互作用のリアルタイムキネティックスを決定することに関する本発明の実施例によって、本発明の方法は、検体センサ分子に対するサンプル中の検体の存在及び結合挙動を決定するために用いられることができる。
【０１１２】
本発明の別の実施例において、少なくとも１つのサンプル中の少なくとも１つの検体を検出する方法は、
a) 少なくとも１つの固体多孔質支持体に、その上に配置される少なくとも１つの検体センサ分子を提供するステップ、
b) 少なくとも１つの検体を含む少なくとも１つのサンプルに前記支持体を接触させるステップ、
c) 前記支持体及び/又は前記検体受容体分子に非特異的に結合したサンプル成分を除去することが可能な溶液によって前記少なくとも１つの支持体をオプションとして洗浄するステップ、
d) 前記少なくとも１つの検体センサ分子と少なくとも１つの検体との間の特定の相互作用を検出するステップ、
e) 検体センサ分子への検体のリアルタイム結合キネティックスを決定するステップ、
を有する。
【０１１３】
例えばステップb)〜d)（又はこれらのいずれか）が上述のように複数回再び繰り返される場合、及びオプションの培養期間が十分短く保たれる場合、サンプル中に存在する検体は、過剰に存在する可能性がある検体センサ分子と完全に直ちに反応することができない。この状況において、すなわち本方法が繰り返して行われる場合、検体と検体センサ分子との間の特定の相互作用を検出する信号は、時間にわたって各々のサイクルの後で記録されることができる。ますます多くの検体が繰り返されるサイクルに応じて検体センサ分子に結合するので、信号強度の増加が観察され、信号強度は、一旦検体センサ分子への検体の結合が飽和に達すると横ばいになる。本方法をこのように繰り返して実行し、各々が特定の検体の異なる既知の濃度を有する異なるサンプルを利用する場合、時間にわたる検体センサ分子への検体の異なる量での結合キネティックスを反映する較正又は標準曲線を計算することができる。
【０１１４】
同一の条件、すなわち同数の繰り返しサイクル並びにオプションの培養及び洗浄期間の下で、未知の濃度の検体を含むサンプルにより本方法を繰り返す場合、時間にわたる検体センサ分子への検体の結合挙動を反映する時間曲線に対する信号を取得する。したがって、未知の濃度のサンプル中の検体の結合キネティックスをモニタリングして、同時に検体の濃度を決定することが可能である。
【０１１５】
以下において、本発明が特定の実験例を考慮して説明される。しかしながらこれらの例は、決して本発明をその範囲に関して制限することを意図しておらず、むしろ、いくつかのその例示的な実施例によって本発明を説明するのに役立つ。
【実施例１】
【０１１６】
抗体を印刷する薄膜の作製
微小アレイフォーマットでの固体多孔質支持体を取得するために、ニトロセルロース膜が用いられた。それぞれの抗体は、インクジェットプリンタを使用してこの薄膜上に配置された。
【０１１７】
図1に、取得された微小アレイの模式的な画像が示される。Cy5のような蛍光ラベルを含む抗体は、検体が結合されるかどうかに関係なく、適切な励起に応じて蛍光信号をもたらす。これらの検体センサ分子は、微小アレイのエッジ及びコーナを識別し、結果として生じる蛍光を測定するのに用いられる検出装置の較正のための内部標準を提供するために用いられる。
【０１１８】
微小アレイ上の検体の検出
次いで、上述した微小アレイは、PBS pH7.4中のタンパク質分解酵素フリーの5重量％のBSAによって、一晩、ブロック化された。続いて、図2に示される画像が取得された。127.5mA及び50mAの値は、光学系のLEDを駆動するための異なる電流で画像が撮られたことを示す。
【０１１９】
第２のステップにおいて、300μlのラビット-抗マウスCy5標識抗体（100nM）が、第１チャンバ中の微小アレイに加えられた。微小アレイは、約1分間、サンプルと共に培養された。その後、サンプルは、中間の洗浄ステップなしで、さまざまな回数、微小アレイの上でポンピングされた。各々の培養ステップの後、サンプル中の検体（すなわちラビット-抗マウスCy5標識抗体）と検体センサ分子（すなわちヤギ-抗ラビット抗体）との間の相互作用がモニタされ、フィリップスが開発したLED機構（波長ｅｘ／ｅｍ：６５０／６７０nm）による励起の後、画像を撮った。培養時間は、各々のサイクルに対して約１分であった。
【０１２０】
図３は、サイクル１、２及び４の後の画像を示す。図４は、サイクル５、６、７及び８の後で記録された画像を示す。図５の下のパネルは、最後のサイクル（サイクル8）の後に、PBS pH 7.4, 0.05重量%のTween 20によって微小アレイを3回洗浄する場合に得られる結果を示す。図５の上のパネルは、洗浄を伴わない場合の同じ画像を示す。
【０１２１】
最後の画像から、ラビット-抗マウスCy5標識抗体とヤギ-抗ラビット抗体との間の相互作用が発生したことが明らかに分かる。さらに、より多くのヤギ-抗ラビット抗体が微小アレイ上に配置されていた場合に、少ない量が微小アレイに配置されていた場合よりも、明らかに強い信号を見ることができる。
【実施例２】
【０１２２】
この例では、信号強度に関する検出可能なマーカーの繰り返されるサイクルの影響が検査された。
【０１２３】
微小アレイ印刷レイアウト
図6で示す微小アレイ印刷レイアウトが用いられた。微小アレイは上記の通りに生成された。Cy5標識抗体が再び内部標準を表す。
【０１２４】
実験準備：
以下の捕捉抗体（検体センサ分子）、抗原（検体）及び第２の検出抗体が用いられた。Streptavidineでラベル付けされたCy5が、検出のために用いられた。PBSは常にPBS pH 7.4を指す。PBSTは常に、PBS pH 7.4, 0.0％ Tween 20を指す。
【表１】
2009545739.tif 000003
【０１２５】
これらの成分は、以下の濃度で用いられた。
【０１２６】
捕捉抗体
マウス-抗ヒトCRP
700nM  3.5μl ストック + 296.5μl PBS 5％グリセロール
マウス-抗ヒトTNFα
700nM  63μlストック + 237μl PBS 5% グリセロール
Cy5ラベル付ロバ-抗ヒツジ
700nM  21μlストック + 279 μl PBS 5% グリセロール
200nM  6μlストック + 294 μl PBS 5% グリセロール
【０１２７】
抗原
CRP／TNFα抗原
100nM  8.2μl ストック CRP + 34μl TNFα + 1957.8μl PBS 1% BSA p.f.
100pM  2μlの100 nM溶液 + 1998μl PBS 1% BSA p.f.
ブランク  PBS 1% BSA p.f.
【０１２８】
第２の検出抗体
マウス-抗ヒトCRP／マウス-抗ヒトTNFα
66,7 nM CRP + 6.67 nM TNFα 58.8 μl CRP + 20 μl TNFα+ 9921.2 μl PBS
検出抗体は、すべてビオチンによってラベル付けされた。
【０１２９】
検出システム 
Cy5ラベル付きストレプトアビジン
1:1000  10μlストック+ 9990μl PBS
【０１３０】
微小アレイを培養して相互作用を検出するための手順は以下の通りだった。実験は、繰り返して実行された。
-膜上にアレイを印刷
-アレイの画像を撮影
-1000μl PBS + 5% BSAによって1時間（室温（RT）、暗所）、アレイをブロック化
-回収率を決定するためにアレイの画像を撮影
-アレイに500μｌの抗原溶液を加える
-真空を開放して、流体が完全に除去されるまで待つ
-更に4回これを繰り返す
-500μlのPBSをピペットで取ることによってアレイを洗浄する
-真空を開放して、流体が完全に除去されるまで待つ
-更に2回これを繰り返す
-500μlの検出抗体溶液をアレイに加える
-真空を開放して、流体が完全に除去されるまで待つ
-更に4回これを繰り返す
-前の通りPBS-Tによって3回アレイを洗浄する
-アレイの画像を撮る
-500μlのStrep-Cy5溶液をアレイに加える
-真空を開放して、流体が完全に除去されるまで待つ
-すべてのアレイの画像を撮る
-必要な回数、最後の3つのステップを繰り返す
【０１３１】
図7は、印刷の直後のアレイを示す。下表において、捕捉抗体に対する回収率値が示され、それらは、200nM及び700nMのロバ-抗ヒツジCy5標識内部標準に基づいて算出される。
【表２】
2009545739.tif 000004
【０１３２】
結果
図8及び9は、ブランクに対してと同様に、異なる濃度の結合したC反応性タンパク質（CRP）、腫瘍壊死因子a（TNFa）に対して、反復サイクル（すなわち最後の洗浄ステップを含む10回）の後で測定された正規化された強度を示す。図10は、図8及び9に基づいて決定されるCRP及びTNFaの信号対雑音（S/N）比を示す。
【０１３３】
実験は、分析が15分で効率的に行われることができることを示す。
【実施例３】
【０１３４】
この例では、検出可能なマーカーの影響が調査された。更に、微小アレイを通した貫流サイクルと同様に、ポンピングの効果が調査された。
【０１３５】
微小アレイ印刷レイアウト
図11で示す微小アレイ印刷レイアウトが用いられた。微小アレイは上記の通りに生成された。Cy5標識抗体が再び内部標準を表す。
【０１３６】
実験準備：
以下の捕捉抗体（検体センサ分子）、抗原（検体）及び第２の検出抗体が用いられた。Streptavidineでラベル付けされたCy5が検出のために用いられた。PBSは常にPBS pH 7.4を指す。PBSTは常に、PBS pH 7.4, 0.0% Tween 20を指す。
【表３】
2009545739.tif 000005
【０１３７】
これらの成分は以下の濃度において用いられた。
【０１３８】
捕捉抗体
マウス-抗ヒトCRP
8μM  20 μl ストック + 180 μl PBS
マウス-抗ヒトTNFα
3.33μM  純粋なストック
Cy5標識ロバ-抗ヒツジ
200nM  6μl ストック + 294μl PBS 5% グリセロール
500nM  15μl ストック + 285μl PBS 5% グリセロール
700nM  21μl ストック + 279μl PBS 5% グリセロール
【０１３９】
抗原、第２の検出抗体
100nM  8.2μlストックCRP + 34μlストックTNFα+ 1906.1μl PBS 1% BSA
100pM  1.9μlの上記の溶液+ 1946.3μl PBS 1% BSA
100fM  1.9μlの上記の溶液+ 1946.3μl PBS 1% BSA
ブランク  1948.2μl PBS 1% BSA
次をすべての溶液に加える。
66.7 nM  11.8μlストックCRP検出抗体
66.7 nM  40μlストックTNFα検出抗体
【０１４０】
検出抗体は、ビオチンによってすべてラベル付けされた。
【０１４１】
検出システム
1:1000  10μlストック ストレプトアビジン-Cy5 + 1990μl PBS 
1:1000  10μlストック ストレプトアビジン-A647 + 1990μl PBS
微小アレイを培養して、相互作用を検出するための手順は、以下の通りだった。実験は繰り返して実行された。
-アレイを印刷
-アレイの画像を撮る
-この実験のために、ナイロン膜アレイが用いられる
-500μl/ウェル PBS + 5% BSAによって、1時間、アレイをブロック化する
-PBST中でアレイを3 * 5分間洗浄して、回収率を決定するために画像を撮る
-異なる濃度の抗原及び検出抗体500μlと共に他のアレイを5分間培養する。それから、膜が乾燥するまで、真空を適用する。
-次にストレプトアビジン染料を２分間培養する。それから再び膜が乾燥するまで真空を適用する。すべての膜の画像を撮る。
-flow-throughを5分間培養する。その後膜が乾燥するまで真空を適用し、画像を撮る。更に3ステップこれを繰り返す。
-新しいストレプトアビジン染料溶液を5分間培養する。その後、膜が乾燥するまで真空を適用する。画像を撮る。
-500μlの PBS-Tをピペットで取ることによって膜を洗浄し、膜が乾燥するまで真空を適用する。2回これを繰り返して、画像を撮る。
【０１４２】
したがって、サイクルは以下のように要約されることができる。
サイクル1：5分の抗原+検出抗体、次の2分のストレプトアビジン染料
サイクル2 - 4：5分の貫流
サイクル5：5分の新しいストレプトアビジン染料
サイクル5 + w：3回のPBS-T（膜での培養なし）
【０１４３】
図11は、印刷直後のアレイを示す。下表において、200nM、500nM及び700nMロバ-抗ヒツジCy5標識内部標準に基づいて算出された捕捉抗体ごとの回収率値が示される。
【表４】
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【０１４４】
結果
図12は、回収率を決定するためのブロッキングの後に撮られた微小アレイの画像を示す。図13及び14は、異なる濃度及び染料でのCRP及びTNFaに対しての正規化された強度を示す。図15及び16は、さまざまなサイクルに依存したCRP及びTNFaの検出のキネティクスを示す。
【０１４５】
結果は、イムノアッセイが短い時間スケールで実行されることができ、ポンピング、真空の適用及び特定のステップの反復動作が、測定される信号の強さに影響することができることを明らかに示す。
【実施例４】
【０１４６】
この例では、700nMのヤギ抗ウサギ抗体が、ナイロン膜に印刷された。この膜は、100nMのウサギ-抗マウス-Cy5（図17を参照）によって培養された。培養のために、検体溶液は、5回、膜を通じてポンピングされた。実験は、三通り実行された。
【０１４７】
微小アレイ印刷レイアウト
図18で示す微小アレイ印刷レイアウトが用いられた。微小アレイは上記のように生成された。Cy5標識抗体が再び内部標準を表す。
【０１４８】
結果
図19は、検体溶液の反復循環によって、正規化された信号の強さが増加することを示す。
【０１４９】
３つの主要な結論を、上記の実験から導き出すことができる。
【０１５０】
第１に、微小アレイ上でのサンプルの急速な循環によって、検体と検体センサ分子との間の相互作用の効率的な検出のために必要とされる時間を著しく減らすことが可能である。上記の実験1において、膜の培養が行われない場合、信号を検出するための所要時間は約10分かかった。これは、最高3.5時間に達する場合があるこの種のアプリケーションのために従来技術において典型的に必要である時間スパンと対照的である。
【０１５１】
第２に、例えば図5において得られた信号を、予め決定された標準較正曲線と比較することにより、ラビット-抗マウスCy5標識抗体の濃度を決定することができる。これは、同様に他の実験にあてはまる。
【０１５２】
第３に、各々のサイクルにわたる、すなわち時間にわたる信号強度の進行をモニタすることによって、実際に、検体（実施例1の場合はラビット-抗マウスCy5標識抗体）の、その捕捉抗体に対する結合キネティクスを決定することができ、実施例1ではヤギ-抗ラビット抗体である捕捉抗体は微小アレイの上に異なる濃度で配置され、異なる時点において異なる信号強度及び強さをもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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