(57)【要約】  本発明は、被験体において精神病性障害を診断又はモニタリングする方法に関し、試験生体サンプルを被験体から準備すること、１つ又は複数のスペクトルを与えるために当該試験生体サンプルでスペクトル分析を行うこと、及び１つ又は複数のスペクトルを１つ又は複数の対照スペクトルと比較することを含む。本発明は、統合失調症又は双極性障害などの精神病性障害を診断又はモニタリングする方法にも関し、試験被験体から採取した生体サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、当該バイオマーカーがトランスサイレチン、ＡｐｏＡ１、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及び血漿タンパク質等の芳香族種から成る群から選択される。本発明は、本発明の方法を実施するためのセンサー、バイオセンサー、多重検体パネル、アレイ、アッセイ及びキットにも関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において精神病性障害を診断又はモニタリングする方法であって、
（ａ）前記被験体由来のサンプルを準備すること、
（ｂ）１つ又は複数のスペクトルを得るために前記サンプルに対してスペクトル分析を実施すること、及び
（ｃ）前記１つ又は複数のスペクトルを、１つ又は複数の対照スペクトルと比較することを含む、被験体において精神病性障害を診断又はモニタリングする方法。
【請求項２】
前記スペクトル分析は、ＮＭＲ分光法により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スペクトル分析は、１Ｈ  ＮＭＲ分光法により実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ又は複数の対照スペクトルは、正常対照スペクトルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ又は複数の対照スペクトルは、精神病性障害対照スペクトルを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記比較することは、正常なプロファイル、精神病性障害プロファイル、又は精神病性障害素因プロファイルを有するとしてサンプルのスペクトルを分類することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記比較することは、１つ又は複数の計量化学分析を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記比較することは、パターン認識分析を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記パターン認識分析は、１つ又は複数の監視方法及び／又は非監視方法により実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の非監視方法は、主成分分析（ＰＣＡ）、非線形写像（ＮＬＭ）及びクラスタリング法から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の監視方法は、SIMCA法（soft independent modelling of class analogy）、部分最小二乗（ＰＬＳ）法、ｋ最近隣分析及びニューラルネットワークから選択される、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
スペクトル分析を行い、２回以上被験体から採取したサンプルからスペクトルを提供することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
２回以上前記被験体から採取したサンプル由来のスペクトルを比較することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記比較することは、前記スペクトルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーにおける変動を評価することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被験体において精神病性障害を診断又はモニタリングする方法であって、
（ａ）前記被験体由来のサンプルを準備すること、
（ｂ）１つ又は複数のスペクトルを得るために前記サンプルに対してスペクトル分析を実施すること、
（ｃ）前記１つ又は複数のスペクトルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを検出するために前記１つ又は複数のスペクトルを分析すること、及び
（ｄ）前記１つ又は複数のスペクトルで検出される前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、対照のスペクトルで検出される前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルと比較することを含む、被験体において精神病性障害を診断又はモニタリングする方法。
【請求項１６】
２回以上前記被験体から採取したサンプルからスペクトルを分析して該サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーを定量すること、及び該サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを比較することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
２回以上前記被験体から採取したサンプルにおける前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルの変化を検出することをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ又は複数のバイオマーカーは、配列番号１を含むトランスサイレチンペプチド又はその断片、配列番号２を含むＡｐｏＡ１ペプチド又はその断片、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
精神病性障害又はその素因を診断又はモニタリングする方法であって、被験体から採取したサンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、前記バイオマーカーは、配列番号１を含むトランスサイレチンペプチド又はその断片、配列番号２を含むＡｐｏＡ１ペプチド又はその断片、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される、精神病性障害又はその素因を診断又はモニタリングする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法を含み、精神病性障害を有するか、精神病性障害を有する疑いがあるか、又は精神病性障害に罹りやすい被験体における治療の有効性をモニタリングする方法。
【請求項２１】
２回以上前記被験体から採取したサンプルに存在する前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
２回以上前記被験体から採取したサンプルに存在する前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを比較することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体から採取したサンプルにおける前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、治療の開始前に該被験体から採取した１つ又は複数のサンプル、及び／又は治療の初期段階において該被験体から採取した１つ又は複数のサンプルに存在するレベルと比較することを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
２回以上採取したサンプルにおける前記１つ又は複数のバイオマーカーの量の変化を検出することを含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療は抗精神病性障害治療である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
サンプルに存在する前記１つ又は複数のバイオマーカーの量を１つ又は複数の対照のレベルと比較することを含む、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対照は正常な対照及び／又は精神病性障害対照である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、ＮＭＲスペクトルの分析によって検出される、請求項１４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、ＮＭＲ、ＳＥＬＤＩ（−ＴＯＦ）、ＭＡＬＤＩ（−ＴＯＦ）、１−Ｄゲルベース分析、２−Ｄゲルベース分析、質量分析法（ＭＳ）及びＬＣ−ＭＳベース技法から選択される１つ又は複数の方法によって検出される、請求項１４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、直接又は間接、連結又は非連結の酵素法、電気化学法、分光光度法、蛍光法、発光法、分光法、旋光法及びクロマトグラフィ法、又はＥＬＩＳＡ等の免疫学的方法から選択される１つ又は複数の方法によって検出される、請求項１４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記バイオマーカーは、ＶＬＤＬ及び／又はＬＤＬであり、該バイオマーカーのレベルは、液相化学法、リポタンパク質の分離のための物理的方法及び酵素アッセイから選択される１つ又は複数の方法によって検出される、請求項１４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
血漿タンパク質のレベルは、紫外吸光度法及び比色分析法から選択される１つ又は複数の方法によって検出される、請求項１４〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、該バイオマーカーの直接又は間接的検出のための１つ又は複数の酵素、結合、受容体若しくは輸送タンパク質、抗体、合成受容体又は他の選択的結合分子を含むセンサー或いはバイオセンサーを用いて検出され、前記検出は、電気変換器、光変換器、音響変換器、磁気変換器又は熱変換器に連結される、請求項１４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルは、全血、血清、血漿、又はそれらの抽出物若しくは精製物、又はそれらの希釈物から選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体から採取したさらなるサンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーを定量することを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記さらなる生物学的サンプルは、ＣＳＦ、尿、唾液、又は他の体液、又は呼気、濃縮呼気、又はそれらの抽出物若しくは精製物、或いはそれらの希釈物から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体は薬剤が未投与である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記精神病性障害は統合失調症である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記統合失調症は、偏執型統合失調症、強硬型統合失調症、解体型統合失調症、未分化型統合失調症、及び残遺型統合失調症から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記精神病性障害は双極性障害である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体の臨床的評価又は自己評価をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記臨床的評価はＳＣＩＤ又はグローバル機能スコア評価（global functioning score assessment）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記評価は、前記被験体由来の前記サンプルの採取時の前後で為される、請求項４１又は請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体は女性の被験体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
精神病性障害を有するか、精神病性障害を有する疑いがあるか、又は精神病性障害に罹りやすい被験体において治療物質の有効性をモニタリングする方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法の工程を含む方法。
【請求項４６】
抗精神病物質を同定する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法の工程を含む、方法。
【請求項４７】
精神病促進物質を同定する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法の工程を含む、方法。
【請求項４８】
前記被験体から採取したサンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、前記物質の投与前に該被験体から採取した１つ又は複数のサンプル、及び／又は該物質による治療の初期段階で該被験体から採取した１つ又は複数のサンプルに存在する該バイオマーカーのレベルと比較することを含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
配列番号１を含むトランスサイレチンペプチド又はその断片、配列番号２を含むＡｐｏＡ１ペプチド又はその断片、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される１つ又は複数のバイオマーカーを定量することができる精神病性障害センサー。
【請求項５０】
前記１つ又は複数のバイオマーカーは、直接、間接又は連結した酵素法、分光光度法、蛍光法、発光法、分光法、旋光法及びクロマトグラフィ法から選択される１つ又は複数の方法によって定量することができる、請求項４９に記載のセンサー。
【請求項５１】
酵素、結合、受容体若しくは輸送タンパク質、抗体若しくはその断片、合成受容体、又は前記１つ又は複数のバイオマーカーの直接若しくは間接的な検出のための他の選択的結合分子を該バイオマーカーの直接若しくは間接的な検出のための他の選択的結合分子から選択される成分を含み、該成分は、電気変換器、光変換器、音響変換器、磁気変換器又は熱変換器に連結される、請求項４９又は５０に記載のセンサー。
【請求項５２】
請求項４９に記載される１つ又は複数のバイオマーカーを検出することができるアレイ又は多重検体パネル。
【請求項５３】
精神病性障害を診断及び／又はモニタリングするための請求項４９に記載の１つ又は複数のバイオマーカーの使用。
【請求項５４】
精神病性障害を調節することができる物質を同定する方法であって、被験体に試験物質を投与すること、及び該被験体から採取したサンプルにおいて、請求項４９に記載される１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを検出することを含む、方法。
【請求項５５】
前記サンプルは、全血、血清、血漿、又はそれらの抽出物若しくは精製物、又はそれらの希釈物から成る群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４９に記載されるペプチドバイオマーカーと特異的に結合することができるリガンド。
【請求項５７】
ペプチド又はオプトマーを含む、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５８】
抗体である、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５９】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項５８に記載のリガンド。
【請求項６０】
本明細書に列挙されるリガンドではない、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項６１】
直接又は間接的に検出可能なマーカーで標識される、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６２】
前記検出可能なマーカーは、発光マーカー、蛍光マーカー、酵素マーカー又は放射性マーカーである、請求項６１に記載のリガンド。
【請求項６３】
アフィニティタグで標識される、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６４】
請求項５６〜６３のいずれか１項に記載のリガンドを含むセンサー。
【請求項６５】
請求項５６〜６３のいずれか１項に記載のリガンドを含むアレイ。
【請求項６６】
請求項４９に記載されるペプチドバイオマーカーの生成を刺激、促進、又は活性化することができる物質を同定する方法であって、被験動物に試験物質を投与すること、及び該被験動物に存在する該ペプチドバイオマーカーを検出及び／又は定量することを含む方法。
【請求項６７】
請求項４９に記載されるトランスサイレチンペプチドバイオマーカーの生成を刺激、促進、又は活性化することができる物質を同定する方法であって、試験細胞を試験物質に曝すこと、及び該試験細胞内の又は該試験細胞によって分泌される該ペプチドのレベルをモニタリングすることを含む、方法。
【請求項６８】
前記試験細胞は真核細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記真核細胞は酵母細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエ細胞、両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル細胞）又はシノラブディス・エレガンス（C. elegans）細胞であるか、或いはヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サカナ、齧歯類、又はネズミの細胞である、請求項６７又は６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記動物又は前記細胞は、前記ペプチドを発現することができるように操作した(engineered)非ヒト動物又は細胞である、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
請求項４９に記載されるペプチドバイオマーカーと結合することができるリガンドを同定する方法であって、結合に適切な条件で該ペプチドの存在下において試験物質をインキュベートすること、及び該ペプチドの該試験物質との結合を検出及び／又は定量することを含む、方法。
【請求項７２】
請求項４９に記載されるペプチドバイオマーカーと特異的に結合することができるリガンドを同定する方法であって、該ペプチドの存在下において試験物質をインキュベートすること、及び該ペプチドの該試験物質との特異的な結合を検出及び／又は定量することを含む、方法。
【請求項７３】
精神病性障害又はその素因の処置における、請求項５６〜６３及び６６〜７２のいずれか１項に記載の物質又はリガンドの使用。
【請求項７４】
精神病性障害又はその素因の処置のための医薬製造における、請求項５６〜６３及び６６〜７２のいずれか１項に記載の物質又はリガンドの使用。
【請求項７５】
バイオマーカーが用いられ、前記ペプチドバイオマーカーの組合せである、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーを用いて精神病性障害、特に統合失調症（及び双極性障害）を診断又はモニタリングする方法に関する。バイオマーカー、及びバイオマーカーが利用される方法は、診断を補助し、また精神病性障害の発症及び進行を評価するのに用いることができる。本発明は、臨床スクリーニング、予後の評価、治療の評価における、並びに薬物スクリーニング及び薬物開発のためのバイオマーカーの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
精神病は、重度の精神疾患の症状である。精神病は、任意の特定の精神状態又は身体状態に排他的に関連されるとは限らないが、精神病は、特に統合失調症、双極性障害（躁うつ病）及び重度の臨床的うつ病に関連される。精神病は、基本的な知覚過程、認知過程、情動過程及び判断過程における障害を特徴とする。精神病エピソードに悩む個体は、幻覚（多くの場合、幻聴又は幻視）を体験し、偏執的又は妄想的信念を抱き、人格変化を体験し、支離滅裂な思考（思考障害）を示すことがある。これは、場合によっては行動の異常性又は奇妙性に対する洞察の欠如、社会的相互作用の困難及び日常生活の活動を行う際の機能障害のような特徴を伴うことがある。
【０００３】
精神病は、脳損傷の症例で見られることが珍しくなく、薬物使用後、特に薬物過剰摂取又は慢性使用後に起こる場合があり、或る特定の化合物は、精神病を誘導する可能性がより高い場合があり、個体によっては、他者よりも高い感受性を示す場合がある。幻覚薬の直接的な影響は、薬物が身体から代謝される場合にそれらが和らぐ限りは、通常精神病と分類されない。慢性心理的ストレスもまた、精神病的状態を促進させることが知られているが、正確なメカニズムは不明確である。任意の他の精神疾患の非存在下でストレスにより誘発される精神病は、短期反応精神病として知られている。したがって、精神病は、行動及び体験の複雑な群に関する記述用語である。統合失調症の患者は、長期間精神病を伴わないことがあり、双極性障害又はうつ病の個体は、精神病を伴わない気分症状を有することがある。
【０００４】
幻覚は、外部刺激の非存在下での知覚として定義される。精神病的幻覚は、五感のいずれかで起こり、ほぼ任意の形態を取る可能性があり、単純な感覚（例えば、光、色彩、味、臭い）からより意味ある体験（例えば、完全に形成された動物及び人間を見ること及びそれらと接触すること、声を聞くこと並びに複雑な触感）までを包含し得る。幻聴、特に声を聞くという体験は、精神病の一般的且つ多くの場合顕著な特徴である。幻覚の声は、人について又は人と話すことがあり、別々の人格を伴う数名の話し手を包含することもある。幻聴は、それらが軽蔑的であるか、命令調であるか、又は心が捕らわれている場合に特に苦痛を伴う傾向にある。
【０００５】
精神病は、妄想的又は偏執的信念を包含する場合があり、第１の型及び第２の型に分類される。第１の妄想は、不意に生じ、正常な精神過程の観点では理解できないとみなされるのに対して、第２の妄想は、人の過去又は現在の状況により影響を受けていると理解されることがある、即ち、「現実の」状況の妄想的解釈を表す。
【０００６】
思考障害は、意識的思考に対する根本的な混乱を表すものであり、主として話すこと及び書くことの内容並びに形態に対するその影響により分類される。罹患した人はまた、話すことへの圧力（絶え間なく迅速に話すこと）、発想の脱線又は飛躍（主題の途中で又は不適切に切り換えること）、思考途絶、ろれつが回らない状態（rhyming or punning）を示し得る。
【０００７】
精神病エピソードは、個体間で継続期間が異なり得る。短期反応精神病では、精神病エピソードは、一般的に特異的なストレスの多い生活上の出来事に直接関連されるため、患者は、通常２週間以内に自然に正常な機能を回復する。幾つかの稀な場合では、個体は、何年にもわたって本格的な精神病の状態が続くか、或いはほとんどの場合で起こる弱い精神病的症状（例えば、低度の幻覚）を有する場合がある。
【０００８】
短期精神病エピソードを患う患者は、例えば統合失調症の結果として精神病である人と同じ症状の多くを有することがあり、この事実は、精神病が主として脳内の幾つか特異的な生体系における崩壊であるという概念を支持するのに用いられている。
【０００９】
統合失調症は、人口の最大１％が罹患する主要な精神病性障害である。統合失調症は、男女共に同様の有病率で見られ、多様な文化及び地理的領域全体にわたって見出される。世界保健機関は、統合失調症が身体障害の世界で４番目に主要な原因であり、総ＤＡＬＹ（障害調整生存年）の１．１％及びＹＬＤ（障害生存年数）の２．８％を占めることを見出した。統合失調症の経済費用は、１９９１年では１９０億ＵＳドルを超え、米国における全ての癌の総費用よりも大きいと推定された。早期の診断及び統合失調症の有効な治療は、予後を改善させて、この疾病に関連する費用を低減させるのを補助することができる。
【００１０】
統合失調症の臨床的症候群は、陽性症状（幻覚、妄想、思考の解体及び奇妙な行動）、陰性症状（自発性の損失、感情面での経験及び表現の制限、並びに快楽能力の低減）及び個体間での広範な変動を伴う認知障害を含む個々の臨床的特徴を含む。単一の症状が統合失調症に特有であるのではなく、且つ／又はあらゆる場合に存在するのではない。臨床的症状の均質性の欠如にもかかわらず、統合失調症の現在の診断及び分類は、依然として患者により示される臨床的症状に基づいている。これは主として、統合失調症の原因論が依然として未知であり（実際、ほとんどの精神病の原因論が依然として不明確である）、原因論に基づく分類がいまだに実現できていないためである。統合失調症の臨床的症状は、多くの場合他の神経精神障害及び神経発達障害で観察される症状に類似している。
【００１１】
統合失調症の被験体により示される複雑で多種多様な症状及び他の精神障害に対するそれらの類似性に起因して、統合失調症の現在の診断は、患者の家族歴、個人歴、現在の症状（精神状態検査）及び他の障害の存在／非存在（鑑別診断）の複雑な臨床検査／問診に基づいて行われる。この評価により、「最も見込みある」診断を確立することが可能となり、初期治療計画につながる。統合失調症と診断されるには、患者（少数の例外を除く）は、少なくとも６ヶ月間精神病的「現実の喪失(loss-of-reality)」症状を有し（ＤＳＭ  ＩＶ）、また正常に機能することがより困難になることを示すものとする。
【００１２】
１９９２年に世界保健機関により出版された精神及び行動の障害のＩＣＤ−１０分類（The ICD-10 Classification of Mental and Behavioural Disorders）は、精神衛生状態を診断するのに欧州の精神科医により最も一般的に使用されるマニュアルである。マニュアルは、詳細な診断ガイドラインを提供し、様々な形態の統合失調症：統合失調症、妄想型統合失調症、破瓜型（hebrephrenic）統合失調症、緊張型統合失調症、識別不能型統合失調症、統合失調症後抑うつ、残遺型統合失調症及び単純型統合失調症を規定する。
【００１３】
米国精神医学会（Washington, D.C.）により１９９４年に出版された精神障害の診断及び統計マニュアル第四版（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition）（ＤＳＭ  ＩＶ）は、精神衛生問題を類別及び診断するための英国及び米国の両方における医療従事者用の権威ある参考ハンドブックであるとされている。これには、統合失調症、双極性障害及び関連精神病性障害を含む精神衛生障害の診断基準、亜型、関連する特徴並びに識別診断に関する基準が記載されている。
統合失調症に関するＤＳＭ  ＩＶの診断基準
Ａ．特徴的な症状：以下のうちの２つ（又はそれ以上）がそれぞれ１ヶ月（又は首尾よく治療される場合にはそれ未満）の期間の相当部分に存在する：妄想、幻覚、解体した会話（例えば、頻繁な脱線又は支離滅裂）、極めて解体した行動又は緊張病性行動、陰性症状、即ち感情鈍磨、失語又は自発性欠如(avolition)。妄想が奇妙であるか、又は幻覚が人の行動又は思考に関して実況解説をし続ける声、或いは互いに会話している２つ以上の声から構成される場合には、唯一の基準Ａ症状が必要とされる。
Ｂ．社会的／職業的機能不全：障害の発症から相当部分の時間、仕事、対人関係又はセルフケアのような機能の１つ又は複数の主要な領域が、発症前に達成されたレベルを著しく下回る（或いは、発症が幼児期又は思春期である場合、対人的、学問的又は職業的な達成の予測レベルを達成することができない）。
Ｃ．持続期間：障害の連続的な徴候が、少なくとも６ヶ月間存続する。この６ヶ月の期間は、基準Ａを満たす症状（即ち、活動期の症状）の少なくとも１ヶ月（或いは首尾よく治療される場合にはそれ未満）を包含しなくてはならず、前駆症状又は残留症状の期間を包含し得る。これらの前駆期間又は残留期間中、障害の徴候は、単なる陰性症状又は減衰された形態で存在する基準Ａに列挙される２つ以上の症状（例えば、異様な信念、異常な知覚体験）を呈し得る。
Ｄ．統合失調性感情障害及び気分障害の排除：精神病的な特徴を伴う統合失調性感情障害及び気分障害は、（１）大うつ病エピソード、躁病エピソード又は混合エピソードのいずれかが活動期症状と同時に起こっていないため、或いは（２）気分エピソードが活動期症状中に起こる場合に、それらの総持続期間が活動期間及び残留期間の持続期間に対して短いため除外される。
Ｅ．物質／一般的な医学的状態の排除：障害は、物質（例えば、薬物乱用、投薬）の直接的な生理学的影響又は一般的な医学的状態、いわゆる「器質性」脳障害／症候群に起因しない。
Ｆ．広汎性発達障害との関係：自閉症又は別の広汎性発達障害の病歴が存在する場合、統合失調症のさらなる診断は、顕著な妄想又は幻覚も少なくとも１ヶ月間（或いは首尾よく治療される場合にはそれ未満）存在する場合にのみ為される。
統合失調症亜型
１．妄想型：以下の基準が満たされる統合失調症の型：１つ又は複数の妄想（特に、被害内容）を伴う没頭、又は頻発する幻聴。以下のいずれも顕著ではない：解体した会話、解体した行動又は緊張病性行動、又は鈍磨若しくは不適切な感情）。
２．緊張型：臨床像が以下の少なくとも２つを特色とする統合失調症の型：強硬症（ろう屈症を含む）により明らかなような運動不動性又は昏迷過剰運動活動（これは、明らかに無意義であり、外部刺激により影響を受けない）、極度の否定主義（全ての指示に対する明らかに動機のない抵抗又は移動させようとする試みに対する硬直した姿勢の維持）又は無言症、ある態度をとること（不適切な態度又は奇妙な態度を随意にとること）により明らかであるような随意的な動作という奇癖、常同運動、顕著な癖、或いは顕著な顔をゆがめる反響言語又は反響動作。
３．解体型：以下の基準が満たされる統合失調症の型：以下の全てが顕著である：解体した会話、解体した行動、鈍磨又は不適切な感情。基準は、緊張型を満たすものではない。
４．識別不能型：基準Ａを満たす症状が存在するが、基準は、妄想型、解体型又は緊張型を満たすものではない統合失調症の型。
５．残遺型：以下の基準が満たされる統合失調症の型：顕著な妄想、幻覚、解体した会話及び極めて解体した行動又は緊張病性行動の欠如。陰性症状或いは減衰された形態で存在する統合失調症に関する基準Ａに列挙される２つ以上の症状（例えば、異様な信念、異常な知覚体験）の存在により示されるように、障害の継続した徴候が見られる。
統合失調症関連特徴
統合失調症に関連する特徴としては、学習上の問題、自発運動の抑制、精神病、多幸気分、抑うつ気分、身体上の又は性的な機能障害、活動亢進、自責心又は脅迫観念、性的異常行動、異様な／変わった人格又は不審な人格、心配性又は恐がり又は依存的な人格、劇的又は気まぐれ又は反社会的な人格が挙げられる。
【００１４】
多くの障害は、統合失調症に類似するか、又はさらには統合失調症と同じ症状を有する：一般的な病状、せん妄又は認知症に起因する精神病性障害、物質誘導性精神病性障害、物質誘導性せん妄、物質誘導性持続性認知症、物質関連障害、精神病的特徴を伴う気分障害、統合失調性感情障害、特定不能の抑うつ障害、特定不能の双極性障害、緊張病性特徴を伴う気分障害、統合失調症様障害、短期精神病性障害、妄想性障害、特定不能の精神病性障害、広汎性発達障害（例えば、自閉性障害）、解体した会話（意思疎通障害由来）及び解体した行動（注意欠陥／多動性障害由来）を組み合わせた幼児期症状（presentation）、統合失調症性障害、統合失調症的人格障害及び偏執性人格障害。
ＤＳＭ  ＩＶ  躁うつ病／双極性情動障害（ＢＤ）に関する診断カテゴリー
双極性疾病のわずか２つの亜型は、それら自体のＤＳＭカテゴリー、即ち双極性Ｉ及び双極性ＩＩが付与されるのに十分明確に規定されている。
双極性Ｉ：この障害は、躁病エピソード：躁うつサイクルの「高（high）」を特徴とする。概して、この躁状態期間後に、抑うつ状態の期間が続くが、双極性Ｉ個体によっては、大うつ病エピソードを経験しない場合がある。躁病症状又は軽躁病症状及びうつ病症状が同時に起こる混合状態もまた、双極性Ｉ患者に頻繁に見られる（例えば、躁病の思考の早まり(racing thoughts)を伴ううつ病）。また、不快性躁病は一般的であり、これは、怒り及び興奮性を特徴とする躁病である。
双極性ＩＩ：この障害は、大うつ病エピソードが躁病のより穏やかな形態である軽躁病のエピソードと交互に起こることを特徴とする。軽躁病エピソードは、あまり崩壊的でない形態の躁病であり、躁病の低レベルの非精神病性症状（例えば、活力の増大又は通常よりも高揚した気分）を特徴とし得る。軽躁病エピソードは、日常的に活動をする個体の能力に影響を及ぼし得ない。軽躁病に関する基準は、それらのより短い持続期間（１週間ではなくて少なくとも４日）及びより穏やかな重篤性（顕著な機能障害、入院又は精神病性特徴なし）のみが、躁病に関する基準と異なる。
【００１５】
うつ病及び躁病状態の交互のエピソードが２年間続いて、且つ大うつ病又は躁病エピソードに関する基準を満たさない場合、診断は、双極性情動障害のあまり重篤でない形態である気分循環性障害と分類される。気分循環性障害は、２年にわたって診断され、安定期で隔てられ、短期間で軽躁病とうつ病症状とが頻発することを特徴とする。
【００１６】
急速交代型は、個体の気分が、間に安定期をあまり有さずに又は安定期を全く有さずに、間断なく抑うつ状態から軽躁病又は躁病へ変動する場合に見られる。或る年に、大うつ病エピソード、躁病エピソード、混合エピソード又は軽躁病エピソードに関する基準を満たす４回以上のエピソードを有した場合には、人は急速交代型を経験すると言われている。急速交代型の人々によっては、月１回、週１回又はさらには毎日、極性の交代を経験し得る人もいる（場合によっては、超急速交代型と呼ばれる）。
【００１７】
躁病、うつ病、混合気分又は軽躁病の症状が、甲状腺疾患又は卒中のような内科的障害により直接的に引き起こされる場合、現在の診断は、一般的な病状に起因する気分障害である。
【００１８】
躁病気分が、抗うつ薬であるＥＣＴにより、或いはストリートドラッグ（street drug）を使用している個体により引き起こされる場合、診断は、躁病特徴を伴う物質誘導性気分障害である。
【００１９】
双極性ＩＩＩの診断は、自発的ではなくて、抗うつ薬投薬を行った結果として起こる躁病エピソードを類別するのに使用されている。紛らわしいことに、双極性ＩＩＩの診断はまた、大うつ病を伴わずに個体が軽躁病又は気分循環症（即ち、あまり重篤でない躁病）を経験する状況でも使用されている。
躁病
躁うつ病は、２つの別個の且つ正反対の気分状態から構成され、抑うつ状態が躁状態と交互に起こる。ＤＳＭ  ＩＶは、障害が躁病と分類される前に満たさなくてはならない多数の基準を示している。第１の基準は、個体の気分が高揚されているか、開放的であるか、或いは興奮性でなくてはならないことである。気分は、安定期中の個体の通常の感情状態と異なる気分でなくてはならない。相当な期間にわたって顕著な変化が存在しなくてはならない。人は、非常に高揚した状態となり、誇大な発想を有さなくてはならない。人はまた、非常にいらいらするようになる場合があり、同様に態度が「傲慢」であるように見える場合がある。躁病に関する第２の主要な基準は、以下の症状のうち少なくとも３つが相当な度合いで存在した状態でなくてはならないことを強調する：自尊心の誇張、睡眠欲求の減少、多弁の増大、観念の奔逸或いは競合、注意散漫、目標指向活動の増大。喜びをもたらすことができるが、破滅的な結末（性的な事件及び過剰な浪費）を有する場合がある活動における過度の関与。ＤＳＭ  ＩＶにおける躁病に関する第３の基準は、気分の変化が、個体の業務遂行又は日常的な社会活動に参加する能力又は他人との関係に影響を及ぼすのに十分顕著でなくてはならないことを強調する。この第３の基準は、躁病と軽躁病との間の違いを強調するのに使用される。
うつ病
ＤＳＭ  ＩＶは、大うつ病が臨床上規定される多数の基準が存在することを明言している。状態は、少なくとも２週間明白でなくてはならず、以下の症状のうち５つを有さなくてはならない：ほとんど毎日、ほぼ一日中の抑うつ気分、ほとんど毎日、ほぼ全ての活動における興味又は喜びの損失、体重及び食欲の変化、睡眠障害、身体活動の減少、疲労及び活力の損失、倦怠感又は過剰な罪悪感、乏しい集中力、自殺願望。
【００２０】
抑うつ気分及び日常活動における興味の損失は共に、大うつ病を特徴付ける５つの症状のうちの２つとして明白でなくてはならない。躁うつ病の抑うつ気分を患う個体と大うつ病を患うものの症状間を識別することは困難である。気分変調は、単極性うつ病よりもあまり重篤でないうつ病であるが、気分変調はより持続的であり得る。
【００２１】
精神病性障害の正確な診断を達成するのに現在必要とされる長期にわたる過程は、適切な治療の遅延を引き起こすおそれがあり、中期から長期の疾患の転帰に重大な影響を持つ可能性が高い。客観的な診断方法、試験及びツールの開発は、類似した臨床症状を伴う精神病間を識別するのを補助するのに緊急に要される。統合失調症及び／又は双極性障害のような精神病性障害に関する客観的な診断方法及び試験は、疾病の間に個体をモニタリングすること（治療応答、コンプライアンス等）を補助し、また予後を決定する際、並びに薬物スクリーニング及び薬物開発用のツールを提供する際に有用であり得る。
【００２２】
残念なことに、現在のところ、統合失調症又は双極性障害のような精神病性障害に関する標準的で高感度で特異的な試験が存在しない。
【００２３】
統合失調症診断用に現在開発中の生化学試験の１つは、異常なアラキドン酸代謝に起因して、幾つかの統合失調症患者においてナイアシン皮膚試験に応答することができないという観察に基づくナイアシン皮膚紅潮試験である。しかしながら、この試験の特異性及び感受性は、２３％〜８７％の範囲で研究間の極端な不一致を示し、この試験の信頼性及び妥当性は、依然として実証される必要がある。
【００２４】
国際公開特許第ＷＯ０１／６３２９５号は、神経精神学的又は神経学的状態（ＢＡＤ（双極性情動障害）、統合失調症及び血管性認知症を含む）のスクリーニング、診断及び予後の確定のための、これらの状態における治療の有効性をモニタリングするための、及び薬物開発における使用のための方法並びに組成物について記載している。
【００２５】
前頭葉及び側頭葉並びに脳幹神経節の繊細な変化に基づく磁気共鳴映像法又は陽電子射出断層撮影法のような他の技法は、統合失調症を伴う個体患者と正常な比較被験体との間のこれらの報告される違いの実寸は概して小さく、２つの群間で顕著な重複を伴っていたため、個体患者における統合失調症の診断、治療又は予後にとってあまり価値がない。これらの神経画像処理技法の役割は、脳腫瘍又は出血のような統合失調症の症状に付随し得る他の状態の排除に主として限定される。
【００２６】
メタボノミクス研究は、個体の代謝状態の特徴的なパターン又は「フィンガープリント（fingerprint）」を作成するのに使用することができる。生体液のような生体サンプルに関するメタボノミクス研究は、生物体全体の生化学的状態に関する情報を提供する。
【００２７】
「メタボノミクス」は、「病態生理学的刺激又は遺伝子改変に対する生物系の多パラメータ代謝応答の定量測定」として従来定義される。メタボノミクスは、生体サンプル：生体液、細胞及び組織の代謝組成を研究するための１Ｈ  ＮＭＲ分光法の使用から、また複雑なＮＭＲで作成された代謝データ組を解釈及び分類するための並びに有用な生物学的情報を抽出するためのパターン認識（ＰＲ）、エキスパートシステム及び他のケモインフォマティクスを利用する研究から開発された。
【００２８】
生体液及び組織の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、サンプルが一連の生物学的に重要な内因性代謝産物に関して得られる生物体の特徴的な代謝の「フィンガープリント」又はプロファイルを提供する。この代謝プロファイルは、疾患、障害、毒性プロセス又は生体異物（例えば、薬物物質）により特徴的に変化される。生体サンプルにおける代謝産物パターンの定量化可能な差は、疾患又は障害の基礎を成す分子メカニズムに対する情報及び洞察を付与し得ることである。薬物の影響の評価において、各化合物又は化合物類により、生体サンプルにおける内因性代謝産物の濃度及びパターンの特徴的な変化が生じる。
【００２９】
代謝性変化は、多次元空間における座標として生体サンプルにおいて測定される各代謝産物を表す自動コンピュータプログラムを使用して特性化され得る。
【００３０】
メタボノミクス技術は、代謝の先天異常、肝臓及び腎臓疾患、心血管疾患、インスリン抵抗性及び神経変性障害のバイオマーカーを同定するのに使用されている。
【００３１】
症状の複雑なスペクトル及び他の精神障害とのこのスペクトルの類似性だけでなく、経験的な疾患マーカーの欠如のために、統合失調症等の精神病性障害の現行の診断は主観的なままである。重篤な精神病を治療するのにより効果的な薬剤及び診断試験が臨床的に非常に必要とされている。
【００３２】
近年の機能的ゲノミクス研究によって、統合失調症に対する代謝成分は存在するが、代謝的側面の精神病性障害への寄与は十分に理解されていないことが示唆されている。異常な糖調節、脂質代謝及びミトコンドリア機能障害が統合失調症及び情動障害に関係があるという証拠もある８〜１１。しかし、これらの代謝変動が障害自体の原因又は結果であるかどうか、又は薬物治療の結果としてこれらの代謝の変動が起こるか否かは理解されていない。抗神経性障害剤の作用は顕著に脂質異常症と結び付いているが、グルコース代謝の変動の報告よりも前に抗精神病薬ｅｒａが存在しており（Haupt and Newcomer12によって総説された）、長期間の統合失調症患者におけるメタボリック症候群の進行速度を求めることを目的とする近年の報告によって、メタボリック症候群の有病率が抗精神病薬の日用量に逆相関することが見出された１３。
【００３３】
遺伝的環境要因及び非遺伝的環境要因の両方が統合失調症の病状に寄与し、及び／又は症候群の発症を引き起こすことがこれまでに広く受け入れられている。多くの生物学的ストレス要因（ウイルス曝露３、違法薬物の使用４、周産期の発作５等）及び社会的ストレス要因が環境疾患成分であると考えられ、素因の遺伝子型と相互作用する場合が多い。双生児の研究が複雑な障害に関与する遺伝要因及び環境要因を解明するのに特に強力なツールである。これまでの研究によって、統合失調症を発症する可能性は、血縁関係のレベルに高い相関があり、一卵性双生児においては一致率が約３０〜５０％に達することが実証されている１、２。不一致な双生児、即ち双生児の１人が障害を示し、双生児のもう１人が障害を示さない双生児が、これらの成分の幾つかの影響を解明する助けと為り得る。十分な数の不一致な双生児から脳サンプルを得ることが困難であるために、今までのところ統合失調症に関して不一致な一卵性双生児の研究は脳撮像に集中している。双生児の研究では、統合失調症においてほぼ一貫して報告された脳の変動のうちの１つ、即ち側脳室拡張は環境要因に寄与している可能性があることが暗示される６〜７。
【００３４】
容易に入手可能な体液、例えば血液、血漿、血清、尿、唾液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）等に存在するバイオマーカーは、神経病性障害の診断に有用であることが証明され、治療応答及びコンプライアンスを予測及びモニタリングする助けとなり、新規の薬剤標的の同定の補助となり得る。適切なバイオマーカーは、転帰を改善するように、又は病理を予防するように設計された新規の早期治療法又は発症前治療法の開発に重要なツールでもある。
【００３５】
精神障害の逆転又は進行に特異的に対応する早期の変化を検出することができるバイオマーカーの検証は、診療をモニタリング及び最適化するのに必須である。予測因子（predictors）として使用したこれらのバイオマーカーは、危険性の高い個体及び化学介入試験に対する標的集団として有用であり得る疾患の亜群を同定する助けとなり得る一方で、サロゲートエンドポイントとして、バイオマーカーは、現在のところ明白な精神障害の発症をエンドポイントとして用いることができない速度での予防介入の有効性及び費用対効果を評価する潜在性を有している。
【００３６】
トランスサイレチン遺伝子は、チロキシン結合グロブリン及びアルブミンを含むタンパク質の群に属する血漿タンパク質トランスサイレチン（ＴＴＲ）をコードし、これは血中の甲状腺ホルモンを結合し、輸送する。ＴＴＲは、血流から脳へチロキシンを輸送する１５。ＴＴＲは、１２７個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり（１４ｋＤａ）、非共有結合モノマーのテトラマーとして血漿中に存在する。ＴＴＲは脳脈絡叢において、高い速度で発現され、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ放出される。末梢組織において、ＴＴＲは主に肝臓で発現される。脳室ＣＳＦにおいてトランスサイレチンの推定で３％のみ、及び腰部ＣＳＦにおいてトランスサイレチンの１０％のみが血液由来である１６。生理学的条件下で、高分子複合体はレチノールに特異的な輸送タンパク質であるリポカリンレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）と結合するので、ビタミンＡホメオスタシスに重要な生理学的役割を果たす。このことによって、腎臓において低分子量の輸送タンパク質（２１ｋＤａ）の糸球体濾過が低減される。濾過される任意のＴＴＲ又はＲＢＰ分子が、腎近位尿細管の管腔表面上で発現するマルチリガンド受容体であるメガリンと迅速に結合し、それにより内在化する。このように、生理学的条件下で、ＴＴＲ及びＲＢＰは仮にあったとしても微量だけ尿に存在する。トランスサイレチンをコードする遺伝子ＴＴＲは、染色体領域１８ｑ１１．２〜ｑ１２．１にある。
【００３７】
トランスサイレチンはアルツハイマー病及びうつ病に関係している１７。トランスサイレチンは、クロザピンで治療された統合失調症患者がトランスサイレチンのレベルにおいて差を示すことも示している１８。
【００３８】
アポリポタンパク質はリポタンパク質粒子の構造成分、酵素に対する補因子、及び細胞表面受容体に対するリガンドとして脂質輸送で機能する。５つの主要な型のアポリポタンパク質が存在する：ＡｐｏＡ（ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２）、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ（ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４）、ＡｐｏＤ、及びＡｐｏＥ。特に、ＡｐｏＡ１は高濃度リポタンパク質の主要なタンパク質成分であり、ＡｐｏＡ４は腸の脂質吸収で主に作用すると思われ、ＡｐｏＥは、低濃度のリポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を含む異なる細胞受容体との高いアフィニティ相互作用によって、コレステロール及び脂質の輸送及び取り込みを介在する血漿タンパク質である。ＡｐｏＡ１は、心臓保護特性を有し、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病に役割を果たすことが知られている２８、２９。
【００３９】
Wen et al３０は、フェノチアジンによる治療を受けている患者のＡｐｏＡ１のレベルが、健常な個体由来の正常な対照と比べて低いことを開示している。
【００４０】
Middleton et al３１は、アポリポタンパク質遺伝子ファミリークラスターの発現レベルを分析した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４１】
発明の要約
本発明は、疾患関連のメタボリック兆候を特定するために、精神病性障害である統合失調症に関して不一致である一卵性双生児（即ち、双生児のうちの１人が病気に罹り、もう１人が病気に罹っていない）由来、及び健常な双生児の対照組由来の血漿をプロファイルする（profile）１Ｈ  ＮＭＲベースのメタボノミクスのアプローチの結果に一部基づく。
【００４２】
一態様において、本発明は、
（ａ）前記被験体由来のサンプルを準備すること、
（ｂ）１つ又は複数のスペクトルを得るために前記サンプルに対してスペクトル分析を実施すること、及び
（ｃ）前記１つ又は複数のスペクトルを、１つ又は複数の対照スペクトルと比較することを含む、被験体における精神病性障害を診断又はモニタリングする方法を提供する。
【００４３】
本発明は、
（ａ）前記被験体由来のサンプルを準備すること、
（ｂ）１つ又は複数のスペクトルを得るために前記サンプルに対してスペクトル分析を実施すること、
（ｃ）前記１つ又は複数のスペクトルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを検出するために前記１つ又は複数のスペクトルを分析すること、及び
（ｄ）前記１つ又は複数のスペクトルで検出される前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、対照のスペクトルで検出される前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルと比較することを含む、被験体における精神病性障害を診断又はモニタリングする方法をさらに提供する。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は精神病性障害又はその素因を診断又はモニタリングする方法であって、試験被験体から採取した生体サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、当該バイオマーカーは、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される。このような方法は、精神病性障害を有するか、精神病性障害を有する疑いがあるか、又は精神病性障害に罹りやすい被験体における治療（例えば、治療物質）の有効性をモニタリングする方法において用いることができる。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は以下の群：ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される１つ、２つ又は３つのバイオマーカーを検出することができる多重検体パネル又はアレイを提供する。
【００４６】
多重検体パネルは、多くの異なる検体を検出することができる。アレイは多くのサンプルにおいて単一の検体を検出することができるか、又は多重検体アレイとして、サンプルにおいて多くの異なる検体を検出することができる。本発明による多重検体パネル又は多重検体アレイは、本明細書で記載されるように１つ又は複数の代謝バイオマーカーを検出することができ、本明細書に具体的に記載されるもの以外のバイオマーカー（複数可）を検出することができる。
【００４７】
また、必要に応じてキットの使用に関する取扱説明書と共に、本発明による方法を行うのに好適な診断又はモニタリング試験キットが提供される。診断又はモニタリングキットは、本発明による１つ又は複数のバイオセンサーを含んでもよく、単一センサー、又はバイオセンサー、或いはセンサー及び／又はバイオセンサーの組み合わせがこのキットに含まれ得る。診断又はモニタリングキットは、本発明によるパネル又はアレイを含み得る。診断又はモニタリングキットは、本発明によるアレイ又はアレイの組合せを含み得る。
【００４８】
精神病性障害を診断及び／又はモニタリングするために、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの使用がさらに提供される。
【００４９】
精神病性障害を調節することができる物質を同定するために、本発明による方法、センサー、バイオセンサー、多重検体パネル、アレイ又はキットの使用がさらに提供される。精神病性障害を調節することができる物質は、精神病の治療に有用な抗精神病物質、又は精神病を誘導し得る精神病促進物質であり得る。
【００５０】
被験体において精神病性障害を調節することができる物質を同定する方法がさらに提供され、本明細書に記載されるようにモニタリングする方法を含み、特に好ましくは同定する方法が、試験被験体に試験物質を投与すること、及び生体サンプル、好ましくは当該被験体から採取した全血、血清又は血漿サンプルにおいて、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを検出することを含む。
【００５１】
本発明は、統合失調症又はその素因に関するバイオマーカーとして配列番号１で示されるアミノ酸配列又はその断片を含むトランスサイレチンペプチドの使用にも関する。
【００５２】
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はその断片を含む、統合失調症に関するトランスサイレチンペプチドのバイオマーカーをさらに提供する。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症又はその素因を診断又はモニタリングする方法であって、試験被験体由来の生体サンプルに存在する配列番号１のアミノ酸配列又はその断片を含むトランスサイレチンペプチドのバイオマーカーを検出及び／又は定量することを含む方法を提供する。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、トランスサイレチンペプチドのバイオマーカーと特異的に結合することができる天然に存在する又は化学合成した化合物等のリガンドを提供する。本発明によるリガンドは、トランスサイレチンペプチドのバイオマーカーと特異的に結合することができるペプチド、抗体、又はその断片、或いはアプタマー又はオリゴヌクレオチドを含み得る。抗体は、トランスサイレチンペプチドのバイオマーカーと特異的に結合することができるモノクローナル抗体又はその断片であり得る。本発明によるリガンドは、発光マーカー、蛍光マーカー、酵素マーカー又は放射性マーカー等の検出可能なマーカーで標識され得る。代替的には又は付加的には、本発明によるリガンドは、アフィニティタグで標識され得る。好ましくは、本発明によるリガンドは、本明細書に記載されるように、トランスサイレチンペプチドのバイオマーカーと特異的に結合することができる、ペプチド、抗体又はその断片、或いはアプタマー又はオリゴヌクレオチドを含み、このリガンドは表１に列挙された群から選択された抗体、或いはＴ３、Ｔ４（甲状腺ホルモン）、ビタミンＡ（血清レチノール結合タンパク質と間接的に相互作用することによって）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、ノルアドレナリン酸化生成物、及びプテリン、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ポリハロゲン化ビフェニル及び甲状腺ホルモン様化合物等の環境汚染物質、キサントン誘導体又は天然フラボノイド及び合成フラボノイドから成る群から選択されたリガンドではない。
【００５５】
本発明は、統合失調症又はその素因を診断する方法であって、試験被験体由来の生体サンプルにおいて、配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含むＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーを検出及び／又は定量することを含む方法を提供する。
【００５６】
統合失調症に関するバイオマーカーは、疾患進行を遅らせるか、又は止める新規の標的及び薬剤分子の発見に対する標的である。ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーのレベルは、障害及び薬剤応答の指標となるので、ＡｐｏＡ１バイオマーカーはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおける新規の治療化合物の同定に有用である。したがて、本発明のＡｐｏＡ１バイオマーカーは、本発明によるＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの活性を促進するか、又は生成を活性化する化合物をスクリーニングする方法に利用することができる。
【００５７】
このように、本発明のさらなる態様において、ＡｐｏＡ１バイオマーカーペプチドの生成を刺激又は促進することができる物質又はリガンドであって、当該バイオマーカーが統合失調症又はその素因の治療のための薬物の製造において配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含む、物質又はリガンドの使用が提供される。ＡｐｏＡ１バイオマーカーペプチドの活性を刺激することができる物質又はリガンドであって、当該バイオマーカーが統合失調症又はその素因の治療のための薬物の製造において配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含む、物質又はリガンドの使用も提供される。
【００５８】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含むペプチドの活性又は生成を刺激、促進又は活性化することができる物質又はリガンドを、それを必要とする患者に投与することを含む、統合失調症を治療する方法にも関する。
【００５９】
正常な対照のレベルに比べて、試験生体サンプルにおいて低いレベルの血漿タンパク質バイオマーカーは、精神病性障害、特に統合失調症、双極性障害、又はその素因の存在の指標となる。
【００６０】
本発明に従ってモニタリング及び診断する方法は、障害若しくはその素因の存在を確認するのに、発症及び進行を評価することによって障害の進行をモニタリングするのに、又は障害の改善又は再発を評価するのに有用である。モニタリング及び診断する方法は、臨床スクリーニング、予後、治療選択の評価、治療的有用性の評価のため、即ち薬剤スクリーニング及び薬剤開発のための方法にも有用である。
【００６１】
効果的に診断及びモニタリングする方法は、正確な診断を確立すること、最も適切な治療の迅速な同定を可能にすること（これにより、有害な薬剤の副作用に不必要に曝されるのを緩和すること）、「ダウンタイム（down-time：休止時間）」及び再発率を低減することによって、予後を改善させる潜在性のある非常に強力な「患者の解決策」を提供する。
【００６２】
治療の有効性をモニタリングする方法は、ヒト被験体及び非ヒト被験体（例えば動物モデル）における現行の治療及び新規の治療の治療有効性をモニタリングするのに用いることができる。これらのモニタリング方法は、新規の薬剤物質及び物質の組合せのスクリーニングに組み込むことができる。
【００６３】
ペプチドバイオマーカーのレベルの調節は、統合失調症又はその素因の状態の指標として有用である。経時的なペプチドバイオマーカーのレベルの低減が、発症又は進行、即ち障害の悪化の指標となる一方で、ペプチドバイオマーカーのレベルの増大は、障害の改善又は寛解を示す。
【００６４】
統合失調症に関するバイオマーカーの同定によって、診断手順及び治療計画が統合される。現在、効果的な治療の決定が大幅に遅れ、今日まで薬剤応答の評価を迅速に行うことは不可能である。従来、抗統合失調症治療の多くは、所与の治療アプローチのために数週間から数ヶ月続く治療試験が必要である。本発明のペプチドバイオマーカーの検出を用いて、臨床試験における参加の前に被験体をスクリーニングすることができる。バイオマーカーは、治療応答、応答不良、好ましくない副作用プロファイル、薬物治療コンプライアンスの程度及び適当な血清薬剤レベルの達成を示す手段を提供する。バイオマーカーを用いて、全ての向精神薬薬物治療で起こる主な問題である不都合な薬物応答の警告を発することができる。応答の評価を用いて、用量を微調整し、処方薬物の数を最小限にし、効果的な治療の実現の遅れを縮め、不都合な薬物応答を回避することができるので、バイオマーカーは、個別の脳治療の開発に有用である。このように、本発明のバイオマーカーをモニタリングすることによって、患者のケアは、障害及び患者のファーマコゲノミクスプロファイルによって求められた要求を正確に合わせるように調整することができ、したがって、バイオマーカーを用いて、最適な用量を滴定し、正の治療応答を予測し、重篤な副作用の危険性が高い患者を同定することができる。
【００６５】
バイオマーカーベースの試験は、「新規な」患者の第一線の評価を提供し、現行の主観的手段を用いては達成することができない時間枠内で精度よく、正確で迅速な診断のための客観的手段を提供する。
【００６６】
さらに、診断バイオマーカー試験は、「前駆期」におけるファミリーメンバー又は患者、即ち顕性統合失調症を発症する危険性が高いファミリーメンバー又は患者を同定するのに有用である。このことは、適切な治療、例えば低用量の抗精神病薬、又は予防手段、例えばストレス、不正薬剤使用、又はウイルス感染等のリスク管理要因を開始させる。これらのアプローチは、転帰を改善し、障害の顕性発症を予防し得ると認識されている。
【００６７】
バイオマーカーモニタリング方法、バイオセンサー及びキットは、再発は疾患の真の解明又は疾患の悪化によるものであるか否か、患者のコンプライアンスの低下又は物質の乱用によるものであるか否かを医師が判断することができる患者のモニタリングツールとして不可欠でもある。薬理学的治療が不十分に評価される場合、治療は回復するか、又は増大し得る。真に解明された疾患に関して適切な場合、治療の変化が与えられ得る。バイオマーカーは障害の状態に感受性があるので、薬剤治療又は物質乱用の効果の指標を提供する。
【００６８】
本発明のバイオマーカーに基づくハイスループットスクリーニング技術、例えばアレイフォーマットで構成された本発明の使用及び方法は、潜在的に有用な治療化合物、例えばバイオマーカーの発現を調節することができる、天然化合物、合成化合物（例えばコンビナトリアルライブラリ由来）、ペプチド、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、又はそれらの断片等のリガンドの同定に関するバイオマーカーをモニタリングするのに好適である。
配列表情報
配列番号１  ヒトのトランスサイレチンのアミノ酸配列
PLMVKVLDAV RGSPAINVAV HVFDKAADDT WEPFASGKTS 
ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK ALGISPFHEH AEVVFTANDS 
GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE
配列番号２  ＡｐｏＡ１
1 mkaavltlav lfltgsqarh fwqqdeppqs pwdrvkdlat vyvdvlkdsg rdyvsqfegs
61 algkqlnlkl ldnwdsvtst fsklreqlgp vtqefwdnle keteglrqem skdleevkak
121 vqpylddfqk kwqeemelyr qkveplrael qegarqklhe lqeklsplge emrdrarahv
181 dalrthlapy sdelrqrlaa rlealkengg arlaeyhaka tehlstlsek akpaledlrq
241 gllpvlesfk vsflsaleey tkklntq
本明細書に記載される２つ以上のバイオマーカーは組合せて用いられてもよい。特定のバイオマーカーに関して本明細書で記載されるような本発明のそれぞれの態様は、本明細書に記載される任意の他のバイオマーカーに等しく適用可能であり得る。さらに統合失調症に対する任意の参考文献は、別の精神病に等しく適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
発明の説明
「バイオマーカー」という用語は、プロセス、事象又は状態の特有の生物学的指標又は生物学的に誘導された指標を意味する。ペプチドバイオマーカーを診断方法、例えば臨床スクリーニング及び予後評価に、並びに特定の治療上の処置に応答する可能性が最も高い患者を同定するために治療の結果をモニタリングするのに、並びに薬剤のスクリーニング及び開発に用いることができる。バイオマーカー及びその使用は、新規の薬剤治療の同定に、及び薬剤治療に関する新規の標的の発見に役立つ。
【００７０】
トランスサイレチンペプチドバイオマーカーという用語は、成熟全長ヒトトランスサイレチンペプチドを含む。好ましいトランスサイレチンペプチドのバイオマーカー（配列番号１）は、ヒトトランスサイレチンタンパク質であるか、又はそれに由来する。配列番号１のペプチドは、前駆体で見出されるようなシグナル（リーダー）配列を含まない分泌形態である。例えば両方ともＣＳＦサンプルで見出されたＴＴＲの一般的な修飾であるＳ−システイン化及びＳ−グルタチオン化（S-gluthanionylated）されたトランスサイレチンであるトランスサイレチンアイソフォーム及び誘導体も含まれる。配列番号１で示されるようなペプチドバイオマーカーは、統合失調症の初めて発症した精神病の特徴を有する個体でより低いレベルで存在することが見出され、したがってこのバイオマーカーは、統合失調症又はその素因を診断及びモニタリングするマーカーとして有用である。本発明によれば、バイオマーカーは配列番号１で示されるアミノ酸配列又はその断片を含み得る。例えば、バイオマーカーは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１つ又は複数の断片（複合断片（multiple fragments））を含み得る。
【００７１】
ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーという用語は、成熟した全長のヒトＡｐｏＡ１ペプチドを含む。好ましいＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーは配列番号１で示される。配列番号２（図１３）で示されるようなペプチドバイオマーカーは、正常な対照に比べて、統合失調症の初めて発症した精神病の特徴を有する薬剤が未投与の個体において低減したレベルで存在することが見出される。したがってこのバイオマーカーは、統合失調症又はその素因を診断するマーカーとして有用である。
【００７２】
本明細書で用いられるような薬剤が未投与の患者という用語は、任意の統合失調症治療物質で治療していない個体を意味する。したがって好ましい実施形態では、本発明は試験サンプルが試験被験体由来であり、試験被験体が最初に発症した薬剤が未投与の個体であり、サンプルは、被験体に任意の抗統合失調症治療薬の投与前に採取される方法に関する。対照サンプルは正常な個体由来のサンプルであるのが好ましい。
【００７３】
正常な対照におけるレベルに比べて、試験サンプルにおけるより低いレベルのＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーが、統合失調症又はその素因の存在の指標となる。正常な対照に比べて試験サンプルにおける等しいか、又はより高いレベルの上記ペプチドが、統合失調症又はその素因の欠如の指標となる。
【００７４】
本明細書で用いられるような「診断」という用語は、統合失調症又はその素因の同定、確認、及び／又は特徴付けを包含する。本明細書で用いられるような「素因」という用語は、被験体が現在のところ障害を示していないが、やがては障害に罹る傾向にあることを意味する。本発明による診断方法は、障害又はその素因の存在を確認するのに有用である。診断方法は、臨床スクリーニング、予後、治療選択の評価、治療的有用性の評価のため、即ち薬剤スクリーニング及び薬剤開発のための方法にも有用である。
【００７５】
本発明のモニタリング方法を用いて、精神病性障害の発症、進行、安定、改善、及び／又は再発をモニタリングすることができる。
【００７６】
本明細書で用いられるような「精神病性障害」という用語は、精神病が認識されている症状である障害に関し、これには、神経精神病性障害（心因性うつ病及び他の精神病エピソード）及び神経発生障害（特に自閉症スペクトル障害）、神経変性障害、うつ病、躁病、及び特に統合失調症（偏執型統合失調症、強硬型統合失調症、解体型統合失調症、未分化型統合失調症、及び残遺型統合失調症）並びに双極性障害が挙げられる。
【００７７】
本発明の方法で試験され得る生体サンプルとしては、全血、血清若しくは血漿、尿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、又は他の体液（糞便、涙液、滑液、痰）、呼気（例えば、濃縮呼気として）、又はそれら由来の抽出物若しくは精製物、或いはそれらの希釈物が挙げられる。生体サンプルとしては、生被験体由来の、又は死後に採取した組織ホモジネート、組織切片及び生検標本も挙げられる。例えば適切に希釈又は濃縮されれば、サンプルを調製することができ、常法で保存される。
【００７８】
多くの分光技法を用いて、本発明に従ってスペクトルを生成することができ、これにはＮＭＲ分光法及び質量分析法が含まれる。好ましい方法では、スペクトル分析はＮＭＲ分光法、好ましくは１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって行われる。１つ又は複数のスペクトルを生成し、一連のスペクトルを測定してもよく、これには小分子に関して１つのスペクトル、及びマクロ分子プロファイルに関して別のスペクトルが含まれる。得られたスペクトルをスペクトル編集技法にかけることができる。一次元又は二次元ＮＭＲ分光法を行うことができる。
【００７９】
複雑な生体混合物を研究するのにＮＭＲ分光法を用いる利点は、測定が最小限のサンプル調製で（通常、５〜１０％のＤ２Ｏを添加するのみで）為されることが多く、全生体サンプルの詳細な分析プロファイルを得ることができる。
【００８０】
一般的には、サンプル容量は標準プローブで０．３〜０．５ｍｌ、及びマイクロプローブでわずか３μｌと低い。フローインジェクション法を用いると、単一ＮＭＲスペクトルの検出（acquisition）は迅速で効果的である。通常、水のＮＭＲ共鳴を抑制する必要がある。
【００８１】
高分解能ＮＭＲ分光法（特に１Ｈ  ＮＭＲ)が特に適している。１Ｈ  ＮＭＲ分光法を用いる主な利点は、方法の速度（スペクトルが５〜１０分で得られる）、最小限のサンプル調製に対する要求性、及び代謝産物がＮＭＲ実験の検出限界を超えて存在し、非交換性水素原子を含む場合にのみ、これらの構造型に関わらず、生体液中の全ての代謝産物に関する非選択的な検出を与えるという事実である。
【００８２】
体液のＮＭＲ研究は、最大限の拡散及び感受性を得るために利用可能な最高の磁場で等しく行うべきであり、ほとんどの１Ｈ  ＮＭＲ研究は、４００ＭＨｚ以上、例えば６００ＭＨｚで行われる。
【００８３】
通常、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを帰属するために、標準物質（authentic materials）の対照スペクトルで、及び／又は参照標準物質のサンプルへの標準的な添加によって、比較が為される。利用される対照スペクトルは、正常な被験体由来の生体サンプルのスペクトル分析によって発生する正常な対照スペクトル、及び／又は精神病性障害の被験体由来の生体サンプルのスペクトル分析によって発生する精神病性障害の対照スペクトルであり得る。
【００８４】
通常、帰属のさらなる確認を、他のＮＭＲ法の適用から求め、これには例えば二次元（２Ｄ）ＮＭＲ法、特にＣＯＳＹ（相関分光法）、ＴＯＣＳＹ（全相関分光法）、ＨＭＢＣ（異核多重結合相関）、ＨＳＱＣ（異核単一量子コヒーレンス）、及びＨＭＱＣ（異核多重量子コヒーレンス）等の逆検出異核相関法、２Ｄ  Ｊ分離（ＪＲＥＳ）法、スピンエコー法、緩和編集、分散編集（例えば、分散編集ＴＯＣＳＹ等の１Ｄ  ＮＭＲ及び２Ｄ  ＮＭＲ）、及び多重量子フィルタリングが含まれる。
【００８５】
スペクトルの正常な及び／又は精神病性障害の対照スペクトルとの比較によって、試験スペクトルは正常なプロファイル、精神病性障害プロファイル、又は精神病性障害素因プロファイルを有するものに分類することができる。
【００８６】
スペクトルの比較は、スペクトル全体又はスペクトルの選択された領域で行うことができる。スペクトルの比較は、正常なスペクトルプロファイルからの偏差に関与するスペクトル領域の変動の評価、及び特に、これらの領域内の１つ又は複数のバイオマーカーの変動の評価を伴い得る。
【００８７】
血漿等の生体液の１Ｄ−ＮＭＲスペクトル及び２Ｄ−ＮＭＲの両方からの生化学的情報の理解における限定要因は、これらの複雑性にある。これらの複雑な多パラメータのデータを比較及び研究するのに最も効果的な方法は、コンピューターベースの「パターン認識」（ＰＲ）法及びエキスパートシステムと組合せた１Ｄ  ＮＭＲ又は２Ｄ  ＮＭＲのメタボノミクスのアプローチを採用することである。
【００８８】
メタボノミクスのアプローチの有用性が十分に確立されているが、その完全な潜在性は未だに引き出されていない。代謝変動はわずかであることが多く、特にデータが非常に複雑である場合（例えばＮＭＲスペクトル）、強力な分析法が特定の検体の検出に必要となる。
【００８９】
試験集団由来の分析データ（例えばＮＭＲスペクトル）のメタボノミクス法（これは、多変量統計分析及びパターン認識（ＰＲ）技法、並びに任意にデータフィルタリング技法を利用する）によって正確な数学モデルが得られ、これは後で試験サンプル又は被験体を分類するのに、及び／又は診断に用いることができる。
【００９０】
スペクトルの比較には、スペクトルの１つ又は複数のケモメトリクス分析が含まれ得る。「ケモメトリクス」という用語は、パターン認識（ＰＲ）法及び化学数値データに対する関連の多変量統計アプローチの使用を記載するのに適用される。したがって、比較は、１つ又は複数の管理方法及び／又は非管理方法によって行うことができる１つ又は複数のパターン認識分析法を含み得る。
【００９１】
パターン認識（ＰＲ）法を用いて、データ組の複雑性を低減し、科学的仮説を立てて、仮説検定を行うことができる。一般に、パターン認識アルゴリズムの使用によって、複雑系を規定するパラメータのノイズ又はランダム変動によってあいまいになる可能性がある複雑系における幾つかの非ランダム挙動の同定、及び幾つかの方法による解釈が可能になる。また、用いられるパラメータ数は、ヒト脳では三次元以下で最良となる規則性又は不規則性の可視化が困難と為り得る程、非常に大きい可能性がある。
【００９２】
通常、測定される記述子（descriptors）の数は３を大幅に超え、つまり単純な散布図を用いても、サンプル間の類似性又は相違性を可視化することは全くできない。パターン認識法を用いて、例えば言語学、フィンガープリント、化学及び心理学にわたる多くの異なる種類の問題を広く特徴付けている。
【００９３】
本明細書に記載の方法に関して、パターン認識は、分光データを分析し、これによりサンプルを分類して、観察された測定値の範囲に基づき、幾つかの従属変数の値を予測するために、パラメトリック及び非パラメトリックの両方の多変量統計を使用することである。２つの主なアプローチがある。一連の方法は「非管理(unsupervised)」と呼ばれ、これらによって単純に合理的な方法でデータの複雑性が低減し、また人間の目で判別できるディスプレイのプロットが生じる。他のアプローチは「管理(supervised)」と呼ばれ、それによって既知の分類又は転帰によるサンプルの訓練組（training set）を用いて数学モデルを作製し、それからこれを独立検証データ組で評価する。
【００９４】
非管理技法は、任意の固有のクラスタリングがデータ組内に存在するか否かを確立するのに用いられ、多くは次元縮小によって、これらの特性に従って、任意の他の独立した知識とは関係なく、例えばサンプル群の予備知識なしでサンプルをマッピングする方法から成る。非管理方法の例としては、主成分分析（ＰＣＡ）、非線形写像（ＮＬＭ）及び階層的クラスタ分析等のクラスタリング法が挙げられる。
【００９５】
最も有用で容易に適用される非管理ＰＲ技法のうちの１つは主成分分析（ＰＣＡ）である（例えばKowalski et al., 1986を参照されたい）。主成分（ＰＣ）は、開始変数の適切な重み付け係数との線型結合から作製される新たな変数である。これらのＰＣの特性は、（ｉ）それぞれのＰＣが他のＰＣ全てと（相関なく）直交し、（ｉｉ）第１のＰＣが、データ組の変数の最大部分（情報量）を含み、後のＰＣがそれに応じてより低い量の変数を含むというようなものである。
【００９６】
次元縮小技法であるＰＣＡは、それぞれがＫ次元（記述子ベクトル）の値で記載されたｍ個の対象又はサンプルを取り、記述子ベクトルの線形組み合わせである一組の固有ベクトルを抽出する。固有ベクトル及び固有値がデータの共分散行列の対角化によって得られる。固有ベクトルは、主成分（ＰＣ）と呼ばれる直交プロッティング軸の新たな組と考えられ得る。データの体系的変動の抽出は、データ行列の分散構造及び共分散構造の投影及びモデル化によって達成される。一次軸はデータの最大変動を示す単一の固有ベクトルであり、主成分１（ＰＣ１）と呼ばれる。固有値を減らすことでランク付けした続くＰＣは、連続的に変動性が低くなることを示している。ＰＣで示されていないデータの変動は残差分散と呼ばれ、このモデルがデータにどの程度適合するかどうかを示す。ＰＣ上への記述子ベクトルの投影はスコアとして定義され、これはサンプル又は対象間の関係を表す。グラフ表示では（「スコアプロット」又は固有ベクトル投射）、同様の記述子ベクトルを有する対象又はサンプルが共にクラスターにグループ化される。別のグラフ表示はローディングプロットと呼ばれ、これはＰＣを個々の記述子ベクトルと結び付けて、ＰＣの評価に対するそれぞれの記述子ベクトルの重要性及びこのＰＣにおける記述子ベクトル間の関係性の両方を示す。実際、ローディング値は単純に、元の記述子ベクトルがＰＣと共に形成する角度のコサインである。
【００９７】
このプロットの元々の値近くにある記述子ベクトルがＰＣにおける情報をほとんど保有していない一方で、元々の値から離れた記述子ベクトル（高ローディング）は解釈するにあたって重要である。
【００９８】
したがって、初めの２つ又は３つのＰＣスコアのプロットが、それぞれ二次元又は三次元におけるデータ組の情報量の点で「最良の」表示を与える。最初の２つの主成分スコアのプロット、ＰＣ１及びＰＣ２は二次元におけるデータの最大の情報量を提供する。このようなＰＣ図を用いて、例えば代謝応答の類似性に基づく薬剤及び毒素に対する固有のクラスタリング挙動、及びしたがって作用メカニズムを可視化することができる。当然ながら、クラスタリング情報はより低いＰＣにおいて得られ、これらを分析することもできる。
【００９９】
別の非管理パターン認識法である階層クラスター分析は、幾つかの多次元空間において互いに「近い」ということで類似しているデータ点のグループ化を可能にする。個々のデータ点は、例えば特にＮＭＲスペクトルの帰属されたピークに対するシグナル強度であり得る。「類似マトリクス」Ｓは、要素ｓｓｉｊ＝１−ｒｉｊ／ｒｉｊｍａｘ’（式中、ｒｉｊはｉ点とｊ点との間の点間距離（例えば、ユークリッド点間距離）であり、ｒｉｊｍａｘは全ての点における最大の点間距離である）で構成されている。
【０１００】
したがって最も遠い点の対は、ｒｉｊがｒｉｊｍａＸと等しいので、ｓｉｊが０と等しくなる。逆に、最も近い点の対は、１に近づく最大ｓｉｊを有する。類似マトリクスは、最も近い点の対でスキャンされる。点の対は分離距離で報告され、それにより２つの点が検出され、単一の連結した点に置き換わる。次いで、このプロセスを１つの点のみが残るまで繰り返し反復する。多くの異なる方法を用いて、２つのクラスターがどのように連結するかどうかを確定することができ、これには最近隣法（単一リンク法としても知られる）、最遠隣法、セントロイド法（セントロイドリンク、増分リンク、メジアンリンク、グループ平均リンク、及び柔軟リンク変動を含む）が含まれる。
【０１０１】
したがって、報告された連結性が系統樹（クラスタリングの可視化を可能にする樹状チャート）としてプロットされ、増大する分離距離対（言い換えれば低減する類似性の対）サンプル間の連結性を示す。系統樹において、分枝長は様々なクラスター間の距離と比例関係にあり、したがって隣の一サンプルと結び付く分枝の長さはそれらの類似性の尺度となる。このように、同様のデータ点はアルゴリズムで特定することができる。
【０１０２】
分析の管理方法は、２つ以上のサンプル群間の分離を最適化するのに、訓練組のサンプルデータに対して与えられる群情報を用いる。これらの技法としては、SIMCA法（soft independent modelling of class analogy）、部分最小二乗（ＰＬＳ）法、例えば潜在判別分析に対する投影（ＰＬＳ  ＤＡ）、ｋ−最近隣分析及びニューラルネットワークが挙げられる。ニューラルネットワークは、モデル化データの非線形方法である。訓練組のデータを用いて、データの構造を「学習する」アルゴリズムを開発し、複雑な機能に対処することができる。幾つかの種類のニューラルネットワークは、スペクトル情報から毒性又は疾患を首尾よく予測するのに適用されている。
【０１０３】
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）等の統計技法を用いて、データを分析することもできる。
【０１０４】
スペクトル分析を伴う本発明の方法を行い、被験体から２回以上採取した生体サンプルからスペクトルが与えられ得る。被験体から２回以上採取した生体サンプル由来のスペクトルを比較して、別々に（different occasions）採取されたサンプルのスペクトル間の違いを明らかにすることができる。該方法には、生体サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを定量するために試験被験体からの２回以上採取した生体サンプルからのスペクトルの分析、及び２回以上採取した生体サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを比較することが含まれる。
【０１０５】
本発明の診断及びモニタリング方法は、精神病性障害を有するか、有する疑いがあるか、又はそれに素因がある被験体に投与される治療物質の有効性をモニタリングするのに、及び抗精神病物質又は精神病促進物質を同定するのに、精神病性障害の予後を評価する方法に有用である。このような方法は、被験体から採取した試験生体サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、物質の投与前の被験体から採取した１つ又は複数のサンプル、及び／又は物質による処理中の初期段階で被験体から採取した１つ又は複数のサンプルに存在するレベルと比較することを含み得る。さらに、これらの方法は、２回以上被験体から採取した生体サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーのレベルの変化を検出することを含み得る。
【０１０６】
本発明の方法、特にスペクトル分析を用いるものにおいて、特に生体サンプルが血液又は血液由来、例えば血漿又は血清である場合、適切な１つ又は複数のバイオマーカーは、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される。
【０１０７】
１Ｈ  ＮＭＲベースの代謝研究において、罹患及び非罹患の統合失調症の双生児両方の脂質プロファイルの変動を同定している。脂質レベルが、罹患した女性の双生児に対するグローバル機能スコア（global function score）で強く関連付けることを見出した。
【０１０８】
精神病性障害、特に統合失調症のこれらのバイオマーカーは、２１組の統合失調症に関して不一致の一卵性双生児及び８組の年齢を合わせた健常な対照双生児由来の血漿サンプルを研究するのにコンピューター制御したパターン認識分析と共に１Ｈ  ＮＭＲ分光法を用いる広範な代謝プロファイリング分析によって同定された。全てのサンプルが標準条件下で得られ、人口動態及び臨床詳細に関して注記された。
【０１０９】
これらの研究の結果は、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質に関連する芳香族領域由来のシグナルが、統合失調症に関して不一致の一方が病気でもう一方が健常な双生児（ill and healthy co-twins）を健常な対照双生児と区別する最も重要な因子であることを示す。ＶＬＤＬ及びＬＤＬレベルが統合失調症ではない正常な対照双生児に比べて、統合失調症に関して不一致の双生児において上昇することが見出された。不一致な双生児において、罹患した双生児は、羅患してない不一致な双生児で見られるレベルより上昇したＶＬＤＬ及びＬＤＬレベルを有していた。この区別は女性の双生児で非常に顕著であった。ＶＬＤＬ／ＬＤＬシグナルとグローバル機能スコア（ＤＳＭＩＶ、Ａｘｉｓ  Ｖ）との密接な相関性が統合失調症を患う女性の双生児で見出された。不一致な双生児は、正常な対照双生児よりも低い血漿タンパク質レベルを有し、血漿タンパク質の最大の低減は罹患双生児で見出された。
【０１１０】
統合失調症に関して不一致な双生児における脂質及び芳香族領域で観察される変化によって、代謝障害と統合失調症の病因との間の関係が示唆される。抗精神病薬物の効果は全てが無視できるという訳ではないが、共に健常な双生児が推測上の「素因」特性を示すという事実によって、これらの変化が薬物の人為的結果というよりは、疾患に関連しているということが暗示される。ＶＬＤＬ、ＬＤＬの増大及び芳香族領域（血漿タンパク質）の低減は、正常な個体と、精神病性障害の個体との間で区別することができる代謝バイオマーカーを構成している。
【０１１１】
また罹患した女性の双生児の脂質プロファイルは、グローバル機能スコア（Global Functioning Scores）（ＧＡＦ）と高い相関があることも見出された。ＧＡＦスコアは精神科医による主観的判断に基づいている。ＶＬＤＬ及びＬＤＬ脂質バイオマーカーのレベルの上昇と、ＧＡＦスコアとの間の相関関係によって、統合失調症（及び双極性障害）等の精神病性障害の診断及びモニタリングのための主観的なＧＡＦスコアを確認及び実証する客観的な手段が与えられる。
【０１１２】
本発明に従って診断又はモニタリングする方法は、試験被験体から２回以上採取した生体サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含み得る。比較は、２回以上採取したサンプルにおけるバイオマーカーのレベル間ですることができる。２回以上採取したサンプルにおけるバイオマーカーのレベルのあらゆる変化を評価することができる。バイオマーカーのレベルの調節は、精神病性障害又はその素因の症状の指標として有用である。
【０１１３】
生体サンプル、好ましくは血漿におけるＶＬＤＬ又はＬＤＬのレベルの経時的な増大は、障害の発症又は進行、即ち悪化の指標である一方で、ＶＬＤＬ又はＬＤＬのレベルの低減は、障害の改善又は寛解を示す。
【０１１４】
生体サンプル、好ましくは全血、血漿、又は血清のサンプルにおける血漿タンパク質のレベルの経時的な低減は、障害の発症又は進行、即ち悪化の指標である一方で、血漿タンパク質のレベルの増大は、障害の改善又は寛解を示す。
【０１１５】
本発明による方法は、試験被験体から採取される生体サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、治療の開始前に試験被験体から採取される１つ又は複数のサンプル及び／又は治療の初期段階で試験被験体から採取される１つ又は複数のサンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルと比較することを含み得る。このような方法は、２回以上で採取されるサンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーの量の変化を検出することを含み得る。本発明の方法は、特に抗精神病治療の評価において特に有用である。
【０１１６】
本発明による診断又はモニタリングの方法は、試験被験体から採取される試験生体サンプルにおいて１つ又は複数のバイオマーカーを定量化すること、及び上記試験サンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを１つ又は複数の対照のものと比較することを含み得る。対照は、正常対照及び／又は精神病性障害対照から選択され得る。本発明の方法で使用される対照は、正常な被験体由来の正常対照サンプルに見出されるバイオマーカーのレベルである正常なバイオマーカーレベル、正常なバイオマーカー範囲、統合失調症、双極性障害、関連精神病性障害又はそれらに対する診断された傾向を有する被験体由来のサンプル中のレベル、統合失調症マーカーレベル、双極性障害マーカーレベル、関連精神病性障害マーカーレベル、統合失調症マーカー範囲、双極性障害マーカー範囲及び関連精神病性障害マーカー範囲から成る群から選択される１つ又は複数の対照であり得る。
【０１１７】
生体サンプルは、被験体の余寿命又はその一部にわたる間隔で採取され得る。適切に、診断又はモニタリングを受ける被験体からサンプルを採取する間に経過する時間は、３日、５日、１週、２週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１２ヶ月である。サンプルは、抗統合失調症治療又は抗双極性障害治療のような抗精神病治療の前に、及び／又は抗精神病治療中に、及び／又は抗精神病治療後に採取され得る。
【０１１８】
バイオマーカーのレベルの測定は、患者から採取される生体サンプル、又はサンプルの精製物若しくは抽出物、或いはそれらの希釈物におけるバイオマーカーの量を同定するのに適した任意の方法により実施することができる。サンプルに存在するバイオマーカーのレベルを測定することは、サンプルに存在するバイオマーカーの濃度を測定することを含み得る。このような定量は、サンプルで直接、又はその抽出物、若しくはその希釈物で間接的に行うことができる。本発明の方法では、生体サンプル（好ましくは、全血、血漿又は血清である）におけるバイオマーカーの濃度を測定することのほかに、バイオマーカーの濃度は、試験被験体から採取される種々の生体サンプル、例えばＣＳＦ、尿、唾液又は他の体液（糞便、涙液、滑液、痰）、呼気（例えば、濃縮呼気として）、又はそれら由来の抽出物若しくは精製物、或いはそれらの希釈物において試験され得る。また、生体サンプルとして、生被験体由来の又は死後に採取した組織ホモジネート、組織切片及び生検標本が挙げられる。サンプルは、通常の方法で調製されて、例えば、適切な場合には希釈又は濃縮されて、保管され得る。
【０１１９】
バイオマーカーレベルは、ＮＭＲ（核磁気共鳴）等の分光分析又は質量分析法（ＭＳ）、ＳＥＬＤＩ（−ＴＯＦ）、ＭＡＬＤＩ（−ＴＯＦ）、１−Ｄゲルベース分析、２−Ｄゲルベース分析、液体クロマトグラフィ（例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又は低速液体クロマトグラフィ（ＬＰＬＣ））、薄層クロマトグラフィ及びＬＣ−ＭＳベース技法から成る群から選択される１つ又は複数の方法により測定され得る。適切なＬＣ  ＭＳ技法としては、ＩＣＡＴ（登録商標）(Applied Biosystems, CA, USA)又はｉＴＲＡＱ（登録商標）(Applied Biosystems, CA, USA)が挙げられる。
【０１２０】
バイオマーカーの測定は、直接的又は間接的検出方法により実施され得る。バイオマーカーは、酵素、結合、受容体若しくは輸送タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー又はオリゴヌクレオチド、或いは任意の合成化学受容体又はバイオマーカーと特異的に結合することが可能な化合物のようなリガンド（複数可）との相互作用により、直接又は間接的に検出され得る。リガンドは、発光標識、蛍光標識又は放射性標識及び／又はアフィニティタグのような検出可能な標識を保有し得る。
【０１２１】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリで産生された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いられるような「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、いわゆる抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子も表す。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又は免疫グロブリン分子の任意のサブクラスであり得る。
【０１２２】
本明細書中に記載するような代謝産物バイオマーカーは、従来の化学的方法又は酵素的方法（これらは、直接又は間接的であってもよく、且つ／又は結合されていなくてもよい）、電気化学法、蛍光法、発光法、分光光度法、蛍光技法、発光技法、分光法、旋光法、クロマトグラフィ（例えば、ＨＰＬＣ）又は類似の方法により適切に測定される。
【０１２３】
酵素的方法に関して、反応における基質の消費、又は反応の生成物の生成は、測定の手段として直接又は間接的に検出され得る。
【０１２４】
ＶＬＤＬ及びＬＤＬバイオマーカーを検出し、脂質相化学法（ポリアニオン界面活性剤／洗浄剤の組合せによる免疫分離及び分離）、リポタンパク質の分離のための物理的方法（例えば電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、及びクロマトグラフィ）を含む様々な検出システムを用いてレベルを測定することができ、これは、酵素検定法、例えばコレステロールエステラーゼ−コレステロールオキシダーゼ（ペルオキシダーゼ）酵素アッセイ、及びＮＭＲ等の間接的な方法と共に行うことができる。
【０１２５】
正常な個体において、血清／血漿におけるＶＬＤＬ及びＬＤＬレベルは一般的に、それぞれそれぞれＶＬＤＬ及びＬＤＬに対して８５ｍｇ／ｄｌ±１５％及び３０ｍｇ／ｄｌ±１０％であり、したがってこれらを上回るレベルが精神病性障害、特に統合失調症、双極性障害、又はそれらの素因の診断である。
【０１２６】
血漿タンパク質等の芳香族種バイオマーカーを検出し、紫外線吸光度法及びブラッドフォードアッセイ等の比色分析法、ローリーアッセイ、及びＢＣＡアッセイ（これらに限定されない）を含む方法を用いてレベルを測定することができる。
【０１２７】
好ましくは、本発明のバイオマーカーは、質量分析系技法、クロマトグラフィに基づく技法、（直接又は間接的な測定法による）酵素検出システムを用いて、又は例えば電流測定、電位差測定、伝導度測定、電気抵抗、磁気、光学、音響又は熱の変換器を備えるセンサーシステムと共にセンサーを用いて検出及び測定される。
【０１２８】
センサーは、物理的、化学的、又は生物学的検出システムを組み込み得る。センサーの一例は、バイオセンサー、即ち例えばオリゴヌクレオチドプローブ若しくはアプタマー等の核酸、又は酵素、結合タンパク質、受容体タンパク質、輸送タンパク質若しくは抗体等のタンパク質に基づく生体認識システムを伴うセンサーである。
【０１２９】
バイオセンサーは、バイオマーカーの検出のための免疫学的方法、電気、熱、磁気、光学（例えばホログラム）又は音響の技法を組み込むことができる。このようなバイオセンサーを用いて、生体サンプルに見出される予測濃度で標的バイオマーカーを検出することができる。
【０１３０】
本発明の方法は、臨床スクリーニング、予後の評価、治療の結果をモニタリングすること、特定の治療上の処置に応答する可能性が最も高い患者を同定することに、薬物スクリーニング及び開発に、並びに薬物治療に関する新たな標的の同定を補助するのに適している。疾患に特異的な重要なバイオマーカーの同定は、診断手順及び治療体制の統合の中心となる。
【０１３１】
本発明の方法は、被験体における精神病性障害を診断及び／又はモニタリングする１つ又は複数の評価をさらに含み得る。評価は、認められた評価プロトコル、例えばグローバル機能スコア（ＧＡＦ）又はＳＣＩＤに従って臨床医によって行われる臨床評価であってもよく、及び／又は被験体による自己評価を伴ってもよい。評価尺度を用いて、診断及び／又はモニタリングを補助することができる。ＧＡＦ及びＳＣＩＤは、臨床医の問診に基づきは評価される。グローバル機能スコア等の評価は被験体由来の試験生体サンプルの採取時（即ち採取と同じ日）又はその前後（即ち採取の数日以内）で為されることが好ましい。これは、ＶＬＤＬ及びＬＤＬレベルが、グローバル機能スコアによって決定された臨床評価と非常に密接な逆の相関関係を有することが見出された女性の被験体を診断及びモニタリングするツールとして特に有用である。
【０１３２】
本明細書で記載されるような予測バイオマーカーを用いて、センサー及びバイオセンサー等の適切な診断ツールを本発明の方法及び使用に従って開発することができ、センサー又はバイオセンサーを用いて１つ又は複数のバイオマーカーを検出及び定量することができる。
【０１３３】
本発明によるセンサー又はバイオセンサーは、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種の群から選択される１つ、２つ、又は３つのバイオマーカーを定量することができる精神病性障害のセンサー又はバイオセンサーである。
【０１３４】
センサー又はバイオセンサーは、バイオマーカーの検出に関して本明細書中で記載するような検出方法及びシステムを組み込んでもよい。センサー又はバイオセンサーは、電気技術（例えば、電流測定検出系、電位差測定検出系、伝導度測定検出系又はインピーダンス検出系）、熱技術（例えば、変換器）、磁気技術、光技術（例えば、ホログラム）又は音響技術を用いてもよい。本発明によるセンサー又はバイオセンサーでは、１つ、２つ、又は３つのバイオマーカーのレベルが、直接、間接的な、又は連動した、酵素技法、分光光度技法、蛍光技法、発光技法、分光技法、旋光技法及びクロマトグラフィ技法から選択される１つ又は複数の方法により検出することができる。特に好ましいセンサー又はバイオセンサーは、直接的に又は介在物質を介して間接的に用いられるか、或いは電気変換器、光変換器、音響変換器、磁気変換器若しくは熱変換器に連結され、結合タンパク質、受容体タンパク質又は輸送タンパク質を用いて使用される１つ又は複数の酵素を含む。このようなバイオセンサーを用いる１つ又は複数の酵素を含む。このようなバイオセンサーを用いて、生体サンプルで見出される予測濃度で標的バイオマーカーのレベルを検出することが可能である。
【０１３５】
本発明のバイオマーカー（複数可）は、「スマート」ホログラム又は高周波数音響システムに基づく技術を組み込んでいるセンサー又はバイオセンサーを用いて検出することができ、このようなシステムは、「バーコード」又はアレイ配置に特に従うものである。
【０１３６】
スマートホログラムセンサー（Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK）では、ホログラフィック画像が、バイオマーカーと特異的に反応するように感作される薄いポリマーフィルム中に保管される。露光時に、バイオマーカーはポリマーと反応して、ホログラムにより表示される画像の変化をもたらす。試験結果の読み出しは、光輝度、画像、色彩及び／又は画像の位置の変化であり得る。定性的用途及び半定量的用途に関して、センサーホログラムは目で読み取ることができ、したがって検出機器の必要性が取り除かれる。定量測定が必要な場合は、単色センサーを用いてシグナルを読み取ることができる。サンプルの不透明度又は色彩は、センサーの操作を妨害しない。センサーのフォーマットは、幾つかの物質の同時検出のための多重化を可能にする。可逆性センサー及び不可逆性センサーは、種々の要件を満たすように設計することができ、対象の特定バイオマーカーの連続的なモニタリングが実現可能である。
【０１３７】
適切に、本発明のバイオマーカーの検出用のバイオセンサーが連結され、即ち、このバイオセンサーは、生体分子認識を適切な手段と組み合わせて、サンプルにおけるバイオマーカーの存在の検出又は定量化をシグナルに変換する。バイオセンサーは、例えば病棟、外来、手術室、自宅、現場及び職場における「代替地」診断試験に適応させることができる。
【０１３８】
本発明のバイオマーカーを検出するためのバイオセンサーとしては、音響センサー、プラズモン共鳴センサー、ホログラフィックセンサー及びマイクロエンジニアリング(microengineered)センサーが挙げられる。刷り込み(Imprinted)認識要素、薄膜トランジスタ技術、磁気音響共鳴機器及び他の新規音響電気システムが、本発明のバイオマーカーの検出用のバイオセンサーで用いられ得る。
【０１３９】
本発明のバイオマーカーの検出及び／又は定量化を伴う方法は、卓上装置を用いて実施することができるか、或いは研究室ではない環境で、例えば診療所で又は患者の寝床の傍で用いることができる使い捨てのプラットホーム、診断用のプラットホーム又はモニタリング用のプラットホームに組み込ませることができる。本発明の方法を実施するのに適したセンサー又はバイオセンサーとしては、光学式読取装置又は音響読取装置を備える「クレジット」カードが挙げられる。センサー又はバイオセンサーは、収集されたデータを解釈のために医師へ電子的に送信させるように設計することができ、したがってｅ−神経内科(e-neuromedicine)の基盤を形成し得る。
【０１４０】
正常な対照におけるレベルに比べて、試験生体サンプルのＶＬＤＬ及び／又はＬＤＬバイオマーカーのレベルがより高いことが精神病性障害、特に統合失調症、双極性障害又はそれらの素因の存在を示している。
【０１４１】
本発明は、試験被験体由来の試験生体サンプルにおいて、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列又はその断片を含むトランスサイレチンペプチドバイオマーカーを検出及び／又は定量すること、及び当該試験サンプルに存在するペプチドのレベルを、１つ又は複数の対照と比較することも含む。
【０１４２】
本発明は、試験被験体由来の試験生体サンプルにおいて、配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含むＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーを検出及び／又は定量すること、及び当該試験サンプルに存在するペプチドのレベルを、１つ又は複数の対照と比較することをさらに含む。
【０１４３】
本発明の方法に用いられる対照は、正常な被験体由来の正常な対照サンプルで見出されたバイオマーカーのレベル、正常なバイオマーカーレベル、又は正常なバイオマーカー濃度範囲から成る群から選択される１つ又は複数の対照であり得る。
【０１４４】
好適には、試験サンプル及び正常な対照サンプルは、同じ種類のサンプルであり、例えば試験血清サンプルにおけるレベルが対照の血清サンプルにおけるレベルと比較される。
【０１４５】
統合失調症又はその素因を診断する好ましい方法は、
（ａ）試験生体サンプルに存在する配列番号１又は配列番号２又はそれらの断片を含むペプチドバイオマーカーの量を定量すること、及び
（ｂ）上記試験サンプルの上記ペプチドの量を、正常な被験体由来の正常な対照生体サンプルに存在する量と比較すること
を含む。
【０１４６】
正常な対照におけるレベルと比べて、試験サンプルにおけるトランスサイレチンペプチドバイオマーカーのレベルがより低いことは、統合失調症又はその素因の存在を示している。正常な対照に比べて、試験サンプルにおける当該ペプチドのレベルが同程度か、又はより高いことは、統合失調症の非存在及び／又はその素因の非存在を示す。
【０１４７】
効果的な診断方法及びモニタリング方法は、正しい診断を確立すること、最も適切な治療の迅速な同定を可能にすること（これにより、有害な薬剤の副作用に不必要に曝されるのを緩和すること）、「ダウンタイム」及び再発率を低減させることによって、予後を改善させる潜在性のある非常に強力な「患者の解決策」を提供する。
【０１４８】
このような障害を有するか、このような障害を有する疑いがあるか、又はその素因がある疑いがある被験体において統合失調症に対する治療の有効性をモニタリングする方法も提供され、これには、好ましくは、当該被験体由来の生体サンプルに存在する配列番号１のアミノ酸配列又はその断片を含むトランスサイレチンペプチドを検出及び／又は定量することが含まれる。方法をモニタリングする際、試験サンプルは２回以上採取し得る。この方法は、試験サンプルに存在するバイオマーカーのレベルを、１つ又は複数の対照、並びに／或いは例えば治療の開始前に同じ試験被験体から及び／又は治療の初期段階で同じ試験被験体からより早期に採取した１つ又は複数の前試験サンプルと比較することをさらに含み得る。この方法は、様々な回数採取した試験サンプルにおけるバイオマーカーのレベルの変化を検出することを含み得る。
【０１４９】
本発明は、被験体における統合失調症に対する治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）好ましくは、上記被験体から採取した試験生体サンプルに配列番号１のアミノ酸配列又はその断片を含むトランスサイレチンペプチドバイオマーカーの量を定量すること、及び
（ｂ）上記試験サンプルにおける上記ペプチドの量を、１つ又は複数の対照及び／又は同じ試験被験体からより早期に採取した１つ又は複数の前試験サンプルに存在する量と比較することを含む方法を提供する。
【０１５０】
同じ試験被験体からより早期に採取したこれまでの試験サンプルにおけるレベルに比べて、試験サンプルにおけるペプチドバイオマーカーのレベルの増大は、有利な効果、例えば障害、疑いがある障害、又はその素因に対する上記の治療の安定化又は改善の指標となる。
【０１５１】
治療の有効性をモニタリングする方法を用いて、ヒト被験体及び非ヒト動物（例えば動物モデル）における現行の治療及び新規の治療の治療有効性をモニタリングすることができる。これらのモニタリング方法は、新規の薬剤物質及び物質の組合せに関するスクリーニングに組み込むことができる。
【０１５２】
好適には、診断又はモニタリングを受ける被験体からサンプルを採取する間に経過する時間は、３日、５日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１２ヶ月である。サンプルは抗統合失調症の治療前、及び／又は治療中、及び／又は治療後に採取され得る。サンプルは被験体の余寿命にわたる間隔又はその一部で採取することができる。
【０１５３】
サンプルに存在するバイオマーカーの量の定量は、サンプルに存在するペプチドバイオマーカーの濃度を求めることを含み得る。検出及び／又は定量は、サンプルで直接、又はその抽出物若しくはその希釈物で間接的に行ってもよい。
【０１５４】
検出及び／又は定量は、患者由来の生体サンプル、又は生体サンプルの抽出物若しくはその希釈物の精製物における特定のタンパク質の存在及び／又は量を同定するのに好適な任意の方法で行うことができる。本発明の方法では、定量は、サンプル（複数可）におけるペプチドバイオマーカーの濃度を測定することによって行うことができる。本発明の方法で試験し得る生体サンプルとしては、脳脊髄液（ＣＳＦ）、全血、血清、尿、唾液、又は他の体液（排泄物、涙液、滑液、唾液）、例えば濃縮呼気のような呼気、又はそれらの抽出物若しくは精製物、又はそれらの希釈物が挙げられる。生体サンプルとしては、生被験体由来の、又は死後に採取した組織ホモジネート、組織切片及び生検標本も挙げられる。好ましくは、サンプルはＣＳＦ又は血清である。サンプルは、例えば、適切に希釈又は濃縮され、通常の方法で保存された場合に調製することができる。
【０１５５】
トランスサイレチンペプチドバイオマーカーの検出及び／又は定量は、ペプチドバイオマーカー、又はその断片、例えばＣ末端が切断された断片、及び／又はＮ末端が切断された断片の検出によって行うことができる。断片は好適には、４アミノ酸長より長い。好ましくは、断片は約６〜約５０アミノ酸長の範囲である。
【０１５６】
バイオマーカーは、例えばＳＥＬＤＩ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって直接検出することができる。代替的には、バイオマーカーは、バイオマーカーと特異的に結合することができる、抗体又はそのバイオマーカー結合断片等のリガンド（複数可）、或いは他のペプチド、或いはリガンド、例えばアプタマー、或いはオリゴヌクレオチドとの相互作用を介して、直接又は間接的に検出することができる。リガンドは、発光標識、蛍光標識、若しくは放射性標識等の検出可能な標識、及び／又はアフィニティタグを保有し得る。リガンドとしては、例えば
（１）ｉｎ  ｖｉｖｏ：Ｔ３、Ｔ４（甲状腺ホルモン）、ビタミンＡ（血清レチノール結合タンパク質と相互作用することによって間接的に）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、ノルアドレナリン酸化生成物、及びプテリン
（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（それらのほとんどは薬理学的作用物質）：幾つかの非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ポリハロゲン化ビフェニル等の環境汚染物質、及び甲状腺ホルモン様化合物、キサントン誘導体、並びに天然フラボノイド及び合成フラボノイドが挙げられる。他のリガンドは、表１で列挙されるような抗体であり得る。
【０１５７】
例えば、検出、モニタリング、診断及び／又は定量に関する方法は、ＳＥＬＤＩ（−ＴＯＦ）、ＭＡＬＤＩ（−ＴＯＦ）、１−Ｄゲルベース分析、２−Ｄゲルベース分析、質量分析法（ＭＳ）、ＬＣベース技法及びＬＣ−ＭＳベース技法から成る群から選択される１つ又は複数の方法によって行うことができる。適切なＬＣ−ＭＳ技法には、ＩＣＡＴ（登録商標）（Applied Biosystems, CA, USA）、又はｉＴＲＡＱ（登録商標）（Applied Biosystems, CA, USA）が含まれる。液体クロマトグラフィ（例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又は低速液体クロマトグラフィ（ＬＰＬＣ））、薄層クロマトグラフィ、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分光法も用いることができる。
【０１５８】
本発明による診断方法又はモニタリング方法は、ＳＥＬＤＩ  ＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ及び質量分析法を用いた他の方法によって生体サンプル、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）又は血清を分析し、配列番号１若しくは配列番号２又はその断片を含むペプチドバイオマーカーの存在又はレベルを検出することを含み得る。このような技法は、相対的定量及び絶対的定量に、及び本発明によるバイオマーカーの存在し得る他のバイオマーカーとの比率を評価するのに用いてもよい。これらの方法は、臨床的スクリーニング、予後、治療結果をモニタリングすること、薬剤のスクリーニング及び開発に関して特定の治療的処置に応答がある可能性が最も高い患者を同定すること、及び薬剤治療に対する新規の標的の同定にも好適である。
【０１５９】
表面増強レーザーイオン消失イオン化（Surface enhanced laser deionization ionization）（ＳＥＬＤＩ）質量分析法は、所定の状態、例えば薬剤治療及び疾患に対する、体液及び組織におけるタンパク質及びペプチドの特有の「指紋（fingerprint）」を同定するのに強力なツールである１９。この技術は、タンパク質／ペプチドを捕捉するのにタンパク質チップ、並びに１０００Ｄａ未満の小分子及びペプチドから最大５００ｋＤａのタンパク質までの範囲に及ぶ化合物の質量を定量及び算出するのに飛行時間型質量分析計（ｔｏｆ−ＭＳ）を利用する。タンパク質／ペプチドパターンの定量化可能な違いは、多次元空間座標として、生体液スペクトルで測定されたタンパク質／ペプチドをそれぞれ表すコンピュータにより自動化されたプログラムを用いて統計的に評価することができる。このアプローチは、バイオマーカーの同一性を知ることなく、診断ツールとして用いることができるような臨床的バイオマーカーの発見といった分野で最も成功を収めている。ＳＥＬＤＩシステムは、単独の実験で数百のサンプルを作動させる能力も有している。加えて、ＳＥＬＤＩ質量分析法由来のシグナルは全て、（プロテアーゼ消化を必要とする幾つかの他のプロテオミクス技術とは異なり）天然のタンパク質／ペプチドに由来し、これによって所定の状態の生理機能を直接反映する。
【０１６０】
トランスサイレチンペプチドバイオマーカーの検出及び／又は定量は、免疫学的認識、ペプチド認識、アプタマー認識、又は合成物質認識に基づく任意の方法を用いて行うことができる。例えばこの方法は、トランスサイレチンペプチドバイオマーカー、例えば配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含む、又はそれらから成るペプチドと特異的に結合することができる抗体、又はその断片を伴い得る。ヒトＴＴＲと結合する好適な抗体が市販されており、表１に列挙される。
【０１６１】
【表１】
2009516156.tif 000003
【０１６２】
好適な免疫学的方法としては、ペプチドバイオマーカー上の異なるエピトープを認識する２つの抗体を用いてペプチドバイオマーカーの検出が行われるサンドイッチＥＬＩＳＡ等（実施例参照）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接又は競合酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法及び任意の粒子ベースの免疫測定（例えば、金、銀、又はラテックス粒子、磁性粒子、又はＱドットを用いる）等のサンドイッチ免疫測定法が挙げられる。免疫学的方法は、例えばマイクロタイタープレート又はストリップフォーマットで行うことができる。
【０１６３】
試験被験体由来の試験サンプルに存在する配列番号１のトランスサイレチンバイオマーカーペプチド又はその断片の量を測定する本発明の方法及び使用において、正常な個体由来の正常な対照サンプルで見出されるレベルに比べて、試験サンプルにおけるバイオマーカーペプチドのより低いレベルの検出は、試験被験体における統合失調症又はその素因を示す指標となる。例えば血清において、統合失調症又はその素因を有する試験被験体由来のサンプルで検出される、配列番号１のトランスサイレチンペプチド、その断片、又はその誘導体の量は一般的に、正常な対照サンプルで見出されるトランスサイレチンペプチドの量より少なくとも１５％少ない。前頭前野では、トランスサイレチン発現の低減は約４０％である。ＣＳＦサンプルでは、その低減は正常な対照サンプルのＴＴＲレベルに比べて約２０％である。
【０１６４】
本発明によれば、例えば質量分析法又は他の好適な技法を用いて、対照のペプチド又はタンパク質のレベルを参照に、配列番号１のＴＴＲペプチド又はその断片の低減を評価することもできる。このようなペプチドは、統合失調症に関する別のバイオマーカーであり得る。
【０１６５】
試験被験体由来の試験サンプルに存在する配列番号２のＡｐｏＡ１バイオマーカーペプチド又はその断片の量、レベル、又は濃度を測定する本発明の方法及び使用において、正常な個体由来の正常な対照サンプルで見出されるレベルに比べて、試験サンプルにおけるバイオマーカーペプチドのより低いレベルの検出は、試験被験体における統合失調症又はその素因を示す指標となる。例えば、統合失調症又はその素因を有する試験薬剤が未投与の被験体由来の試験サンプルで検出した配列番号２のペプチドのレベルは一般的に、正常な対照サンプルで見出されるペプチドの量より少なくとも約１０％〜約８０％、好ましくは約１８％〜約６０％低い。
【０１６６】
本発明の方法で試験され得る生体サンプルとしては、脳脊髄液（ＣＳＦ）、全血、血清、血漿、赤血球、肝細胞、尿、唾液、又は他の組織液若しくは体液（排泄物、涙液、滑液、痰）、例えば濃縮呼気のような呼気、或いはそれらの抽出物又は精製物、或いはそれらの希釈物が挙げられる。生体サンプルとしては、生被験体由来又は死後に採取した組織ホモジネート、組織切片及び生検標本も挙げられる。サンプルは、例えば、適切に希釈又は濃縮され、通常の方法で保存された場合に調製することができる。
【０１６７】
統合失調症又はその素因を有する試験薬剤が未投与の被験体由来の血清サンプルにおいて、本発明の方法に従って検出及び／又は定量した配列番号２を含むＡｐｏＡ１バイオマーカーペプチド又はその断片のレベルは、正常な対照血清サンプルで見出されるペプチドの量より約１０％〜約２５％、好ましくは約１８％低い。
【０１６８】
統合失調症又はその素因を有する試験薬剤が未投与の被験体由来の赤血球サンプルにおいて、本発明の方法に従って検出及び／又は定量した配列番号２を含むＡｐｏＡ１バイオマーカーペプチド又はその断片のレベルは、正常な対照赤血球サンプルで見出されるペプチドの量より好ましくは約５０％〜約７０％、好ましくは約６０％低い。
【０１６９】
統合失調症又はその素因を有する試験薬剤が未投与の被験体由来の肝細胞において、本発明の方法に従って検出及び／又は定量した配列番号２を含むＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーペプチド又はその断片のレベルは、正常な対照肝細胞サンプルで見出されるペプチドの量より好ましくは約２０％〜約４０％、好ましくは約３０％低い。
【０１７０】
統合失調症又はその素因を有する試験薬剤が未投与の被験体由来のＣＳＦサンプルにおいて、本発明の方法に従って検出及び／又は定量した配列番号２を含むＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーペプチド又はその断片のレベルは、正常な対照ＣＳＦサンプルで見出されるペプチドの量より好ましくは約２０％〜約４０％、好ましくは約３０％〜約３５％低い。
【０１７１】
ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの検出及び／又は定量は、ペプチドバイオマーカー、又はその断片、例えばＣ末端若しくはＮ末端が切断された断片の検出によって行うことができる。断片は好適には、４アミノ酸長より大きい。
【０１７２】
バイオマーカーは、例えばＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって直接検出することができる。代替的にはバイオマーカーは、抗体若しくはそのバイオマーカー結合断片等の任意の天然、生物学的に誘導された、又は合成リガンド（複数可）、或いは他のペプチド、或いはバイオマーカーと特異的に結合することができるリガンド、例えばアプタマー又はオリゴヌクレオチド又は化学合成した結合パートナーによる相互作用によって、直接又は間接的に検出することができる。本発明の方法で用いられるリガンドは、発光標識、着色標識、金属標識、磁性標識、蛍光標識又は放射性標識等の検出可能な標識、及び／又はアフィニティタグ（例えばＡｒｇタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、ＤｓｂＡ、ｃ−ｍｙｃタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡＴタグ、Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、又はチオレドキシン）を保有し得る。マーカーはナノ粒子も含み得る。量子ドット（Ｑドット）を用い得る。Ｑドットは、数ナノメートルサイズのコア／シェルＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ結晶であり、生体分子と結合することができる。
【０１７３】
リガンドは、アップコンバートしたリン光体（phosphor）で標識することもできる。アップコンバートしたリン光体は、抗体等の生物学的に活性なプローブで合成及びコーティングすることができる一様にサブミクロンなアップコンバートしたリン光体の微粒子である。リン光体は、近赤外光による励起の際に可視光を放出する物質である。
【０１７４】
リガンドの性質に応じて、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、チャネリングアッセイ（例えば、生体分子と結合するＬＯＣＩ（登録商標）ラテックス粒子を用いる発光酸素チャネリング等）、又は近接アッセイを検出に用いることができる。
【０１７５】
さらに、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、標識を用いない検出ツールとして用い得る。
【０１７６】
検出及び／又は定量は、ＬＣ、ＵＰＬＣ、ＣＺＥ、ＳＥＬＤＩ（−ＴＯＦ）、ＭＡＬＤＩ（−ＴＯＦ）、１−Ｄゲールベース分析、２−Ｄゲルベース分析、例えばディファレンスゲル電気泳動（Differential In Gel Electrophoresis）（２Ｄ−ＤＩＧＥ）、質量分析法（ＭＳ）及びＬＣ−ＭＳベースの技法から成る群から選択される１つ又は複数の方法によって行うことができる。適切なＬＣ−ＭＳ技法としては、ＩＣＡＴ（登録商標）（Applied Biosystems, CA, USA）、又はｉＴＲＡＱ（登録商標）（Applied Biosystems, CA, USA）が挙げられる。液体クロマトグラフィ（例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又は低速液体クロマトグラフィ（ＬＰＬＣ））、薄層クロマトグラフィ、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分光法も用いることができる。
【０１７７】
本発明に従って診断する方法は、ＳＥＬＤＩ  ＴＯＦ又はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦによって生体サンプル、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清又は血漿を分析し、配列番号２のペプチドバイオマーカー又はその断片の存在又はレベルを検出することができる。
【０１７８】
ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの検出及び／又は定量は、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーと特異的に結合することができる抗体又はその断片、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその断片から成るペプチドに対する抗体又はその断片が関与する免疫学的方法を用いて行うことができる。好適な免疫学的方法としては、ペプチドバイオマーカーの検出がペプチドバイオマーカー上の異なるエピトープを認識する２つの抗体を用いて行われるサンドイッチＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接若しくは競合酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はその任意の修正形態若しくは任意の実施形態、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法及び任意の粒子ベースの免疫測定（例えば、金、銀、又はラテックス粒子、磁性粒子、又はＱドットを用いる）等のサンドイッチ免疫測定法が挙げられる。免疫学的方法は、例えばマイクロタイタープレート又はストリップフォーマットで行うことができる。
【０１７９】
本発明によるバイオセンサーは、ペプチドバイオマーカーと特異的に結合することができる本明細書に記載されるようなリガンド（複数可）を含み得る。このようなバイオセンサーは、本発明のペプチドを検出及び／又は定量するのに有用である。
【０１８０】
ペプチドバイオマーカーと特異的に結合することができる本明細書に記載されるようなリガンドを含むアレイ、パターン又はシグネチャー（signature）も提供される。
【０１８１】
本発明の方法を行うための診断キット又はモニタリングキットが提供される。このようなキットは好適には、ペプチドバイオマーカーの検出及び／又は定量のために、本明細書で記載されるようなリガンド、並びに／或いは任意にキットの使用のための取扱説明書と共に、本明細書で記載されるようなバイオセンサー及び／又はアレイを含む。
【０１８２】
本発明によって、天然であっても化学的に合成されてもよい、好適にはペプチド、抗体若しくはその断片、アプタマー又はオリゴヌクレオチドである、本明細書で記載されるようなリガンドの使用、或いはペプチドバイオマーカー又はその断片を検出及び／又は定量するための本発明のバイオセンサー、又は本発明のアレイ、又は本発明のキットの使用も提供される。この使用において、検出及び／又は定量は、ＣＳＦ、全血、血清、涙液、尿、唾液、又は他の体液、例えば濃縮呼気のような呼気、或いはその抽出物又は精製物、或いはその希釈物等の生体サンプルで行うことができる。
【０１８３】
したがって、本発明のさらなる態様において、本発明によるペプチド、抗体若しくはその断片、又はアプタマー又はオリゴヌクレオチドであり得る、本明細書に記載されるようなリガンドの使用、或いはペプチドバイオマーカーの生成を刺激、促進、又は活性化することができる物質を同定するための本発明によるバイオセンサー、又は本発明によるアレイ、又は本発明によるキットの使用が提供される。
【０１８４】
また、好ましくは、被験動物に試験物質を投与すること、及び被験体由来の試験サンプルに存在するペプチドバイオマーカーのレベルを検出及び／又は定量することを含む、被験体において配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列又はそれらの断片を含むペプチドバイオマーカーの生成を刺激、促進、又は活性化することができる物質を同定する方法も提供される。
【０１８５】
任意の好適な動物は、例えば、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ゼブラフィッシュ、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、齧歯類（例えばテンジクネズミ、ラット又はマウス）、昆虫（例えばショウジョウバエ）、両生類（例えばアフリカツメガエル）又はシノラブディス・エレガンス（C. elegans）等の被験非ヒト動物として用いられ得る。
【０１８６】
試験物質は、抗統合失調症治療薬（これに限定されない）等の既知の化学物質又は薬学的物質であり得るか、或いは試験物質は、新規の合成若しくは天然化学物質（chemical entity）、又は２つ以上の上記の物質の組合せであり得る。
【０１８７】
試験細胞を試験物質に曝すこと、及び当該試験細胞内の、又は当該試験細胞で分泌されたペプチドバイオマーカーのレベルをモニタリングすることを含む、被験体において、好ましくは配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列又はそれらの断片を含むペプチドバイオマーカーの生成を刺激、促進、又は活性化することができる物質を同定する方法が提供される。試験細胞は原核生物であり得るが、真核細胞が細胞ベースの試験法に利用されることが好ましい。好適には、真核細胞は酵母細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエ細胞、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル由来）、シノラブディス・エレガンス細胞であるか、又はヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、齧歯類又はネズミ由来の細胞である。
【０１８８】
潜在的な治療的に使用される物質を同定する方法において、ヒトのトランスサイレチンポリペプチドを発現することができる非ヒト動物又は細胞を用い得る。
【０１８９】
スクリーニング方法は、結合に適切な条件でペプチドバイオマーカーの存在下で試験物質をインキュベートすること、及びペプチドの当該試験物質との結合を検出及び／又は定量することを含む、本発明によるペプチドバイオマーカーと結合することができるリガンドを同定する方法も包含する。
【０１９０】
例えば、アレイ、パターン、又はシグネチャーフォーマットで構成された、本発明のバイオマーカー、使用及び方法に基づくハイスループットスクリーニング技術は、潜在的に有用な治療化合物、例えばバイオマーカーと結合することができる、天然化合物、合成化合物（コンビナトリアルライブラリ由来）、ペプチド、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はその断片等のリガンドの同定のためのバイオマーカーシグネチャーをモニタリングするのに好適である。
【０１９１】
本発明の方法は、例えばチップ上のアレイ、パターン、若しくはシグネチャーフォーマットで、又はマルチウェルアレイとして行うことができる。上記のように、質量分析法等の他の技法も用いることができる。方法は、単独の試験、又は複数の同一試験、又は複数の異なる試験でプラットフォームに適合させることができ、ハイスループットフォーマットで行うことができる。本発明の方法は、診断を確認又は除外する、及び／又はさらに症状を特徴付けるために１つ又は複数の付加的な異なる試験を行うことを含み得る。
【０１９２】
本発明はさらに、同定方法若しくはスクリーニング方法、又は本発明の使用によって同定されるか、或いは同定することができる物質、例えばリガンドを提供する。このような物質は、ペプチドバイオマーカーの活性を直接若しくは間接的に、刺激、促進、又は活性化することができるか、或いはペプチドバイオマーカーの生成を刺激、促進、又は活性化することができる。物質という用語は、直接ペプチドバイオマーカーと結合せず、ペプチドバイオマーカーの発現を直接誘導するか、又は機能を促進若しくは活性化するが、その代わりにペプチドバイオマーカーの発現を間接的に誘導するか、或いはペプチドバイオマーカーの機能を促進／活性化する物質が含まれる。物質という用語にはリガンドも含まれ、本発明のリガンド（例えば、天然化合物若しくは合成化合物、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、抗体又は抗体断片）は、ペプチドバイオマーカーと結合、好ましくは特異的に結合することができる。
【０１９３】
本発明はさらに、統合失調症又はその素因の治療において、本発明による物質又はリガンドの使用を提供する。
【０１９４】
薬物として、本発明による物質の使用も提供される。
【０１９５】
さらに統合失調症又はその素因の治療のための薬物の製造における本発明による物質の使用が提供される。
【０１９６】
統合失調症又はその素因を診断又はモニタリングするためのキットが提供される。好適には、本発明によるキットは、任意にキットの使用のための取扱説明書と共に、ペプチドバイオマーカーに特異的なリガンド、ペプチドバイオマーカー、対照、試薬、及び消耗品の群から選択される１つ又は複数の構成要素を含み得る。
【０１９７】
本発明のバイオマーカーの治療的な使用に関して本明細書で用いられるような「治療すること」又は「治療」という用語は、闘病目的での患者の管理又はケアを示し、例えば症状又は合併症の発症を防ぐ（即ち、予防）ための無症候性の個体への活性物質の投与が含まれる。
【０１９８】
また、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの生成を促進することができる統合失調症の治療物質を同定する方法が提供され、この方法は、当該物質を試験被験体に投与すること、及び当該試験被験体においてＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーのレベルを検出及び／又は定量することを含む。別の実施形態では、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの活性を促進することができる統合失調症の治療物質を同定する方法が提供され、この方法は、当該物質を試験被験体に投与すること、及び当該試験被験体においてＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの活性を検出及び／又は定量することを含む。ＡｐｏＡ１バイオマーカーペプチドのレベル又は活性の増大は、その物質が統合失調症の治療物質であることを示す。好ましくは、これらの方法によるＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーは、配列番号２、その断片又は非ヒトＡｐｏＡ１ホモログを含む。
【０１９９】
本明細書で用いられるような「治療物質」という用語は、治療、即ち治癒／有益な（curative/beneficial）特性を有し、且つ統合失調症を治療して、その症状を緩和するか、又は統合失調症の発症を防ぐ物質を定義する。したがって、この物質は統合失調症の治療に用いられる。
【０２００】
統合失調症の治療物質を同定する方法による上記試験被験体は、任意の好適な動物、好ましくは非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、齧歯類（例えばテンジクネズミ、ウサギ、ラット又はマウス）、昆虫（例えばショウジョウバエ）、両生類（例えば、アフリカツメガエル）又はシノラブディス・エレガンスであり得る。
【０２０１】
試験物質は、抗統合失調症治療薬（これに限定されない）等の既知の化学物質若しくは薬学的物質、又は既知の抗精神病薬であり得るか、或いは試験物質は、新規の合成若しくは天然化学物質、又は２つ以上の上記の物質の組合せであり得る。
【０２０２】
本発明はさらに、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの生成を刺激又は促進することができる統合失調症の治療物質を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供し、前記方法は試験細胞を試験物質に曝すこと、及び当該試験細胞内の、又は当該試験細胞により分泌された上記バイオマーカーペプチド若しくはその断片のレベルの増大を検出することを含む。ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの活性を刺激又は促進することができる統合失調症の治療物質を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法も提供され、前記方法は、試験細胞を試験物質に曝すこと、及び当該試験細胞内の、又は当該試験細胞により分泌された上記バイオマーカーペプチド若しくはその断片の活性の増大を検出することを含む。好ましくは、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によるＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーは、配列番号２、その断片、又は非ヒトＡｐｏＡ１ホモログを含む。
【０２０３】
好適には、真核細胞は酵母細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエ細胞、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル由来）、シノラブディス・エレガンス細胞から選択し得るか、又はこの細胞はヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、齧歯類又はネズミ由来の細胞であり得る。
【０２０４】
潜在的な治療に使用される物質を同定する方法において、ヒトのＡｐｏＡ１ポリペプチドを発現することができる非ヒト動物又は細胞を用い得る。代替的には、非ヒト細胞は、それらの内因性ＡｐｏＡ１を発現し得る。
【０２０５】
スクリーニング方法は、本発明によるＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーと結合することができるリガンドを同定する方法も包含し、結合に適切な条件でペプチドバイオマーカーの存在下で試験物質をインキュベートすること、及びペプチドの当該試験物質との結合を検出及び／又は定量することを含む。
【０２０６】
本発明の方法によって同定される物質も提供される。
【０２０７】
本発明による方法を行うための診断キット又はモニタリングキットが提供される。このようなキットは好適には、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの検出及び／又は定量のために、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーに特異的に結合することができる本明細書で記載されるようなリガンド、並びに／或いは任意にキットの使用のための取扱説明書と共に、本明細書で記載されるようなバイオセンサー及び／又はアレイを含む。別の態様では、本発明は、統合失調症又はその素因を診断又はモニタリングするためのキットを提供する。好適には、本発明によるキットは、任意にキットの使用のための取扱説明書と共に、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーに特異的なリガンド、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカー、ＡｐｏＡ１ペプチドバイオマーカーの構造／形態模倣体、対照、試薬、及び消耗品の群から選択される１つ又は複数の構成要素を含み得る。
【０２０８】
本発明の方法は、例えばチップ上の多重検体パネル若しくはアレイフォーマットで、又はマルチウェルアレイとして行うことができる。方法は、単独の試験、又は複数の同一試験、又は複数の異なる試験でプラットフォームに適合させることができ、ハイスループットフォーマットで行うことができる。本発明の方法は、診断を確認又は除外する、及び／又はさらに精神病状態を特徴付けるために１つ又は複数の付加的な異なる試験を行うことを含み得る。
【実施例】
【０２０９】
本発明は、以下で与えられる実施例を参照してさらに理解される。
［実施例１］
【０２１０】
２１組の統合失調症に関して不一致な一卵性双生児及び１６人の適合した対照双生児由来の血漿サンプルは、Dr Fuller Torrey（Stanley Medical Research Institute, Bethesda, USA）によって標準化された条件下で回収した。研究の参加者は全て、記入済みのインフォームドコンセントを提出し、元の研究は、施設内倫理委員会（Institutional Review Board）によって承認を受けた。それぞれの個体のＧＡＦは、ＳＣＩＤ面接（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲに関する構造化臨床面接（Structured Clinical Interview for DSM-IV-TR））（ＳＣＩＤ）を行った２人の面接官の合意によって得られた。ＳＣＩＤは、臨床的評価尺度であり、信頼性のあるＤＳＭ−ＩＶの精神科診断を行う臨床医、研究者、及び研修医を補助するように設計された半構造化診断面接を伴う。同様の食事をし、共にホテルに滞在した両方の双生児によって午前中に行われたリンパ採取アフェレーシス（aphoresis）手順の一部として両方の双生児から同時に血漿を得た。血漿サンプル（５０μｌ）は、１Ｈ  ＮＭＲ分析のための調製にＤ２Ｏを添加することによって最終容量５００μｌにした。血漿サンプルは、ＮＭＲフィールド周波数ロック（field-frequency lock）のための１０％Ｄ２Ｏを含む等張食塩溶液を添加することによって最終容量５５０μｌまで希釈した。
【０２１１】
双生児サンプルをアリコートで分割し、−８０℃で保存した。サンプルは、ＮＭＲスペクトルを得る前に３回を超える凍結融解サイクルを受けることはなかった。全ての実験を盲検化条件及びランダム条件で行った。血漿サンプル（５０μｌ）は、１Ｈ  ＮＭＲ分析のための調製にＤ２Ｏを添加することによって最終容量５００μｌにした。血漿サンプルは、ＮＭＲフィールド周波数ロックのための調製に１０％Ｄ２Ｏを含む等張食塩溶液を添加することによって最終容量５５０μｌまで希釈した。
血漿サンプルの１Ｈ  ＮＭＲ分光法：
水の共鳴の抑制を達成するのに、予備飽和（pre-saturation）パルス系列を用いて全てのサンプルに対して標準的な１−Ｄ  ６００ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲスペクトルが得られた（パルス系列：緩和遅延−９０°−ｔ１−９０°−ｔｍ−９０°−取得  ＦＩＤ、Bruker Analytische GmbH, Rheinstetten, Germany）。このパルス系列では、二次高周波照射が、２ｓの緩和遅延及び混合期間（ｔｍ＝１００ｍｓ）（ｔ１は３μｓで固定）中に水共鳴周波数で特に適用された。通常、２５６個の過渡状態が、６０００Ｈｚのスペクトル幅及びスキャン１回当たり１．３６ｓの取得時間で、３００Ｋで３２Ｋデータ点に対して得られた。フーリエ変換に先立って、自由誘導減衰（ＦＩＤ）を、０．３Ｈｚの線幅拡大に相当する指数重み関数で乗じた。
データ整理及びパターン認識手順：
患者及び対照に由来する生体液内及び生体液間の代謝変動性を効率的に評価するために、ソフトウェアプログラムＡＭＩＸ（混合物の分析バージョン２．５（Analysis of MIXtures version 2.5）、Bruker Rheinstetten, Germany）を用いて、スペクトルをデータ整理して、ＳＩＭＣＡ−Ｐ（バーション１０．５、Umetrics AB, Umea, Sweden）にエクスポートして、そこで一連の多変量統計分析を行った。最初に、スペクトルプロファイルにおける固有の類似性の存在を明確に認識するために、主成分分析（ＰＣＡ）をデータに適用させた。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの分類が外因性の混入物により影響を受ける場合、これらのシグナルを含有するスペクトル領域は、統計分析から取り去った。統合失調症患者と適合対照との間を識別するバイオマーカーを確認するために、潜在構造判別分析に対する投影（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いた。必要に応じて、社会科学者向けの統計学的パッケージ（Statistical Package for Social Scientists）（ＳＰＳＳ／ＰＣ  １３、SPSS, Chicago）を用いて、データを一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に付した。Ｆ比がＰを０．０５未満とする場合、個々の群平均間の比較は、Ｐ＝０．０５の有意レベルでダネットＴ３検定によって為された。
結果
２１組の統合失調症に関して不一致な一卵性双生児及び１６人の適合した対照双生児由来の血漿の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルに基づくＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットによって、罹患した双生児及び罹患していない双生児と、年齢を適合させた対照双生児が区別された。（図１Ａ及び図１Ｂ）。ローディング係数は、ＶＬＤＬ（０．９２〜０．８８ｐｐｍ及び１．２８〜１．３２ｐｐｍ）、ＬＤＬ（０．８４〜０.８８ｐｐｍ及び１．２４〜２８ｐｐｍ）及び芳香族群（約δ７．５、最も代表的な血漿タンパク質）由来の共鳴が分離に顕著に関与していた（表３、図１Ｃ）ことを示した。統合失調症の双生児は、対照の双生児に比べて、血漿のＶＬＤＬシグナル（１．２８〜１．３２ｐｐｍ）において２３％（ｐ＝０．０１５、ＡＮＯＶＡ）の増大を示した。対応する罹患していない双生児は、増大した１．２８〜１．３２ｐｐｍのシグナルを有していたも見出されたが、差は罹患していない群に関しては有意なものではなかった（ｐ＝０．１８、ＡＮＯＶＡ）。３つの群におけるＬＤＬレベルは、ＶＬＤＬシグナルのものと同様の傾向を示していたが、これも統計的な有意差には達していなかった（データ示さず）。さらに、不一致な統合失調症双生児は、約７．５ｐｐｍの芳香族シグナルで表された低い血漿タンパク質レベルを有していた（罹患した双生児及び罹患していない双生児のそれぞれに関して、１４％減少及び８％減少、ｐ＜０．０１）。群間のＨＤＬシグナル（０．６〜０．７ｐｐｍ）には差が見られなかった。さらなる分析によって、女性の双生児のさらに多くの顕著な区別が示された（図２）。群を区別した鍵となるケミカルシフトを表３に示す。興味深いことに、女性の罹患した双生児と、健常で不一致な双生児との間のＰＬＳ−ＤＡ分析単独によって、不一致な双生児を対照双生児から有意に分離したものと同じスコア及びローディングプロットが不一致な双生児自身の分離に関与していることが示された。このことは、同定された代謝の変動が純粋な疾患関連のシグネチャであることを意味している。さらに、１．２４〜１．２８ｐｐｍ（主にＬＤＬ）のシグナルは、ＤＳＭ  ＩＶ第Ｖ軸のグローバル機能評定（Global Assessment of Functioning）（ＧＡＦ）尺度（Ｒ２＝０．６２、図３）から得られたスコアと強い相関があり、精神病性障害の患者の機能障害を評価する最も広く用いられる方法の１つである。格付けは、重度の機能障害を表す１〜１０の格付けと、優れた機能を示す９０以上の格付けとで１〜１００の尺度で行われる（ＤＳＭＩＶ、Moos et al., 2002）。女性の双生児の血漿のＶＬＤＬシグナル（１．２８〜１．３２ｐｐｍ）もＧＡＦスコアと強い相関を示す（Ｒ２＝０．５４、図３）。全ての双生児又は男性の双生児単独を考慮した場合、相関は見出されなかった（データ図示せず）。年齢は、疾患関連の化学シフトに影響を与えないと考えられた。しかし、抗精神病薬曝露（フルフェナジン（fluphenezine）等価物として測定される）も女性の双生児それぞれのＧＡＦスコア及び代謝シグネチャと相関があった。
【０２１２】
一方で、統合失調症に関して不一致な男性の双生児に由来する血漿の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのＰＬＳ−ＤＡスコアの対応するプロットは、罹患した双生児と、罹患していない双生児との間のあまり顕著でない区別を示した（図４Ａ）。女性の双生児とは異なり、ローディング係数によって、血漿タンパク質に対応する芳香族領域からの共鳴が、男性の双生児間の分離に主に関与することが示された（図４Ｂ）。男性の双生児に関して、グルコースシグナルと、抗精神病治療、年齢、病気の期間、薬物乱用及びＧＡＦスコア（データ図示せず）との間には相関が見出されなかった。男性の対照双生児と、罹患していない双生児との間に有意な差は見出されなかった（図４Ａ）。
実施例１の考察
本研究は、統合失調症に寄与する遺伝因子及び環境因子の役割を調べるために、１Ｈ  ＮＭＲを用いて、合計４２人の統合失調症に関して不一致な一卵性双生児及び１６人の適合した対照双生児の代謝血漿プロファイルを試験した。この結果によって、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び芳香族領域由来のシグナルが、統合失調症に関して不一致な病気の双生児及び健常な双生児を、対照双生児と区別する最も重要な因子であることが示されている。興味深いことに、この区別は女性の双生児に関してより一層顕著であった。
【０２１３】
概して、同様の代謝変化が、男性及び女性の統合失調症の双生児で観察され、女性群では、潜在的な素因疾患シグネチャが罹患していない双生児で見出された。このことは女性の双生児に関してより大きな遺伝的負荷を示唆し得る。統合失調症における顕著な性差は十分に確立した事実であり、女性の統合失調症患者は平均してより後期に発症し、良好な予後を有する。このことがエストロゲンの保護効果に寄与している。急性精神病エピソードを患う女性は、エストロゲンレベルの低下を示している（Huber et al., 2005）。エストロゲンは神経保護性質を有することが知られており、興奮毒性及び酸化ストレスに関与する細胞死を低減し得る。
【０２１４】
統合失調症を患う女性双生児において、変動は疾患の重症度、及び典型的な抗精神病薬の曝露に強い関連があり、このことが環境因子及び薬剤効果の寄与を評価することを難しくしている。しかし、幾つかの一連の証拠によって、同様の変化が罹患していない双生児で確認され、また抗精神病薬が、罹患した女性の双生児におけるグローバル機能スコアとの相関が見出されなかったことから、この効果は薬剤効果ではないことが示唆された。
【０２１５】
この研究において最も興味深い知見の１つは、女性の被験体におけるＶＬＤＬ／ＬＤＬシグナルとグローバル機能スコア（ＤＳＭＩＶ、第Ｖ軸）との密接な関係である。明らかにこのことは、主観的に得られた（subjectively-derived）臨床的格付けスコアと、客観的なバイオマーカーとの間の強い相関を示す最初の報告であり、したがってこれらのバイオマーカーは、診断の補助として及び臨床応答を確立するのに有用である。
【０２１６】
【表２】
2009516156.tif 000004
【０２１７】
【表３】
2009516156.tif 000005
［実施例２］
【０２１８】
総数１３９個のＣＳＦサンプル（８０人の対照及び５９人の初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者）由来のＣＳＦサンプルの広範囲なタンパク質／ペプチドプロファイリング分析を、コンピューターによるパターン認識分析と組合せてＳＥＬＤＩ質量分析法を用いて行った。高い有意性及び再現性がある違いが、年齢を適合させた対照と比べて、妄想型統合失調症と診断された、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者から得られたサンプルで見出された。
【０２１９】
【表４】
2009516156.tif 000006
【０２２０】
【表５】
2009516156.tif 000007
【０２２１】
【表６】
2009516156.tif 000008
【０２２２】
【表７】
2009516156.tif 000009
【０２２３】
臨床サンプル
ケルン大学医学部倫理委員会（The Ethical committee of the Medical Faculty of the University of Cologne）は、この研究のプロトコル、並びにサンプルの採取及び分析に関する手順を審査及び承認した。研究の参加者は全て、記入済みのインフォームドコンセントを提出した。臨床研究は全て、ヘルシンキ宣言で表された原則に従って行われた。ＣＳＦ及び血清サンプルは、妄想型統合失調症の初期エピソード、又は病気の期間から短期精神病性障害（ＤＳＭ−ＩＶ  ２９５．３０又は２９８．８、ｎ＝５９）と診断された、薬剤が未投与の患者から、及び人口統計的に適合させた健常なボランティア（ｎ＝８０）から採取した（表４及び表５）。８人の統合失調症個人及び８人の十分に適合させた対照個人の灰白質由来の新鮮凍結前頭前野組織（ブロードマン領域９）は、スタンレー財団神経病理学コンソーシアム（Neuropathology Consortium of the Stanley brain collection）（スタンレー医学研究所（Stanley Medical Research Institute）, USA）から得られた。
ＳＥＬＤＩ分析のためのＣＳＦサンプルの調製
それぞれのＣＳＦサンプル５μｌを、様々なｐＨ条件で異なる化学特性のチップに適用した。分離されたピークの数及び分離に基づき、強いアニオン交換Ｑ１０チップにおいてｐＨ９．０で、最適条件を選択した。簡潔には、振盪器（振動数＝６００ｒｐｍ）において１０分間室温で、結合緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を用いて２回、アレイスポットを事前に活性化させた。結合緩衝組成物５０μｌを、それぞれのタンパク質スポットに添加した後、ＣＳＦサンプル５μｌを添加した。タンパク質チップを室温で６０分間振盪器においてインキュベートした。チップを結合緩衝液で２回、Ｈ２Ｏで１回洗浄し、それから空気乾燥させた。その後、０．６μｌの５０％アセトニトリル中の１００％飽和シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）及び０．５％トリフルオロ酢酸でチップを２回連続処理した。チップをＣｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップリーダー（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップシステムシリーズ４０００）で分析した。それぞれのサンプルを２回分析して、別個に発現したタンパク質を同定する際の再現性を確認した。
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析
アレイをＣｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップシステムシリーズ４０００（Ciphergen Biosystems, USA）で分析した。タンパク質の質量スペクトルが、１８００任意単位のレーザー強度で平均２５４個のレーザーショットを用いることによって生成した。データ獲得のための検出サイズ範囲は３〜２００ｋＤａであった。レーザーは１０ｋＤａで焦点を合わせた。アレイ表面上で捕捉されたそれぞれのタンパク質の質量対荷電比（ｍ／ｚ）は、外部較正標準（Ciphergen Biosystems、USA）に従って求められた：ウシインスリン（５７３３．６Ｄａ）、ヒトユビキチン（８５６４．８Ｄａ）、ウシシトクロムｃ（１２２３０．９Ｄａ）、ウシスーパーオキシドジスムターゼ（１５５９１．４Ｄａ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（４３２４０Ｄａ）及びＢＳＡ(６６４１０Ｄａ）。データは、プロテインチップデータ分析ソフトウェアバージョン３．０及びＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア３．０（Ciphergen Biosystems、USA）で分析した。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア３．０を用いて全てのスペクトルを蓄積し、定量化した質量ピークを自動検出した（autodetect）。ピークの標識が、０．２％の質量ウィンドウによるセカンドパス（second-pass）ピーク選択を用いることによって達成され、推測されたピークが与えられた。全てのスペクトルのピーク情報は、さらなる統計分析のためにエクスポートされた。
ペプチド及びタンパク質の同定
統合失調症に特異的なペプチドの同定は、精製工程（オンチップのいずれか（either on-chip）)、その後のＣ１８Ｚｉｐ−Ｔｉｐ精製の組合せによって行われた。典型的に、それぞれの対照群及び統合失調症群由来のＣＳＦサンプル１０μｌをｐＨ９．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）でＱ１０タンパク質チップに供した。チップと結合したタンパク質／ペプチドは、ピペッティングにより、溶離緩衝液（３０％アセトニトリル、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０））５μｌで溶離し、製造業者のマニュアルに従い、Ｃ１８  Ｚｉｐｔｉｐを用いて脱塩した。０．１％ギ酸／５０％水性アセトニトリル（２μｌ）で溶離したペプチドは、統合失調症患者由来のＣＳＦサンプルにおけるピークを確認するするためのＭＡＬＤＩ質量分析法によってさらに試験した。また溶離したペプチドは、de novoシークエンシングのために、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（Applied Biosystems, USA）と連結したＣ１８ナノカラムに入れた。
【０２２４】
タンパク質バイオマーカーのために、ＣＳＦタンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィ（ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ、Ciphergen Biosystems, USA）、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの組合せによって、プールしたＣＳＦから精製した。適合させた質量の周りのバンドを切断し、１／３の切断タンパク質バンド由来のタンパク質をこれまでに記載した方法２０を用いて受動的に溶離して、スペクトルにおける質量を確認した。室温で一晩、残りのタンパク質バンドをトリプシン（１：５０、Promega, UK）でゲル内（in-gel）消化した。それから、得られたペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Applied Biosystems, USA）を用いてシークエンシングした。
【０２２５】
タンパク質のＳ−システイン化又はＳ−グルタチオン化アイソフォーム（ｉｎ  ｖｉｖｏで精製されるアイソフォームである）を、β−メルカプトエタノールを用いたオンチップ還元の前後のスペクトルを比較することによって確認した。要するに、ＣＳＦタンパク質及びペプチドの結合を上記のように行い、最終工程でそれぞれのスポットを１ｍＭのＨＥＰＥＳ  １００μｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。それから、チップ上のタンパク質及びペプチドを室温で３０分間、１／４０のβ−メルカプトエタノール（１μｌ）で還元した。水１ｍｌをそれぞれのスポット上に加え、蒸発させた。この手順を２回繰り返した。それからマトリクスを加え、プロテインチップリーダー（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップシステムシリーズ４０００）を用いてデータを得た。
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるヒトの血清サンプルにおけるトランスサイレチンの定量分析
サンプルを−８０℃から解凍し、実験を行なう前に１０分間ボルテックスした。全てのサンプルを臨床条件が分からないように分析した。全ての生化学的分析が完了するまで、全ての被験体のアイデンティティは、コード番号でわからなくした。
【０２２６】
トランスサイレチン標準（Sigma, UK）、対照及び患者由来のヒト血清サンプルは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（Sigma, UK）で１０００倍に希釈した。それから、トランスサイレチン標準及びサンプルをＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ（商標）, Denmark）上に置き、１時間インキュベートした。全てのサンプルは二重で試験した。洗浄緩衝液で洗浄後（ＰＢＳ中の０．０３％  Ｔｗｅｅｎ２０）、プレートを６０分間、５％脱脂粉乳粉末で遮断した。トランスサイレチン抗体（DakoCytomation, Denmark,２．５％脱脂粉乳粉末中で１：５００に希釈した）１００μｌを６０分間９６ウェルプレートでインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した後、二次抗体（抗ウサギＨＰＰ結合ＩｇＧ（Cell Signalling, UK、１：２０００）１００μｌをそれぞれのウェルに加え、６０分間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄後、基質（ＴＭＢ  Ｏｎｅ溶液, Promega）１００μｌをそれぞれのウェルに加え、混合物を室温で１０分間インキュベートした。プレートを４５０ｎｍで読み取った（BIO-RAD,モデル６８０）。
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析に関するヒトの脳サンプルの調製及びウェスタンブロッティングを行うための詳細はこれまでに記載されてきた２１。要するに、当量のタンパク質（１つのサンプル当たり３０μｇ）を１０％のポリアクリルアミドゲル上に電気泳動的に分離し、ニトロセルロースに移した後、４℃で一晩、３％ミルク−ＰＢＳ中に一次抗体（抗トランスサイレチン, DakoCytomation）でインキュベートした後、室温で１時間、二次抗体（ＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（Cell Signaling,１：２５００）でインキュベートした。増感化学発光法（ＬｕｍｉＧｌｕＴＭ, Cell Signaling）を用いて、ブロットからシグナルを検出した。タンパク質の負荷及び転移の一貫性は、Ｐｏｎｓｅａｕ  Ｓ染色で求められた。
統計分析
主成分分析（ＰＣＡ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）及びＰＬＳを含む多重統計分析を利用して、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓからのデータ出力をまとめた。ＰＬＳモデルの感受性及び特異性を推測できるように、ホールドアウト交差確認を３回行った。それぞれ３回のホールドアウト交差確認において、サンプルのうちの３分の１を無作為に選択し検証データを作成して、残りのサンプルを訓練データとして用いた。全ての多重分析をＳＩＭＣＡ−Ｐ＋１０（Umetrics AB, Sweden）を用いて行った。感受性は、全ての陽性を検出する真陽性の割合として定義され、特異性は全ての陰性を検出する真陰性の割合として定義される。必要に応じて、社会科学者向けの統計パッケージ（ＳＰＳＳ／ＰＣ＋、SPSS, Chicago）を用いてｔ検定を行った。
初めて発症し、薬剤が未投与の妄想型統合失調症患者におけるＣＳＦタンパク質／ペプチドプロファイルの変動
最初の実験セットにおいて、４１人の初めて発症し、薬剤が未投与の妄想型統合失調症患者及び４０人の人口統計的に適合させた健常なボランティア由来のＣＳＦサンプルのタンパク質／ペプチドプロファイルは、ＳＥＬＤＩ質量分析法を用いて行った。ＣＳＦタンパク質及びペプチドは、ｐＨ９．０でＱ１０（強いアニオン交換）チップを用いてプロファイリングした。健常なボランティアのＣＳＦタンパク質／ペプチドプロファイルの例は図５Ａに示される。このＱ１０タンパク質チップ結合条件下で、シグナル対ノイズ比が５を超える約７５個のピークを容易に検出することができる。ＣＳＦサンプルのＳＥＬＤＩスペクトルに基づくＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットによって、健常なボランティアと、初めて発症し、薬剤が未投与の妄想型統合失調症患者との間で明らかな区別が示された（図５Ｂ及び図５Ｃ）。同様の結果が、主成分分析を用いて見出された（データ示さず）。ローディングプロットによって、１３６００〜１４０００Ｄａのピークのクラスターにおける有意な減少が示された。ホールドアウト交差確認に基づくこのモデルの感受性及び特異性はそれぞれ、８０％及び９５％であった（表７）。
トランスサイレチンとしての１３．６〜１４ｋＤａのタンパク質クラスターの同定
１３．６〜１４．１ｋＤａのタンパク質クラスターは４つのピークを含んでおり（図６Ｂ）、その内の３つが初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦにおいて一貫してダウンレギュレーションしていた（ｐ＜０．０１、図６Ｂの下のパネル）。研究によって、これらのピークが、トランスサイレチンタンパク質のＳ−システイン化又はＳ−グルタチオン化誘導体２２、２３、血流から脳にチロキシンを輸送する甲状腺ホルモン結合タンパク質に由来し得ることが示唆されている。室温でβ−メルカプトエタノールを用いて行ったＣＳＦペプチド／タンパク質のオンチップ還元は、１３７４１、１３８７５、及び１３９２３Ｄａの３つのピークが１つのピークに還元され（図６Ｃ）、これにより３つのピークは同じタンパク質に由来していたことが確認されたことを示した。タンパク質を同定するために、健常なボランティア及び統合失調症患者由来の１組のＣＳＦサンプルをアニオン交換カラム（ＨｙｐｅｒＤ）に適用し、ｐＨ９〜ｐＨ３の緩衝液で溶離した。主要なバンドである約１３〜１５ｋＤａはｐＨ３分画で溶離した（図６Ｄの左のパネル）。バンドからタンパク質を溶離すること、及び質量と適合させるためにＮＰ２０チップ上を走らせることによって、バンドがＳＥＬＤＩスペクトルにおける約１３．６〜１４ｋＤａのピーククラスターであることを確認した（図６６Ｅ）。それから、このタンパク質はトリプシンで消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてシークエンシングした。このタンパク質をトランスサイレチンとして同定した（図６Ｄの右のパネル）。
同じ被験体由来の血清サンプル、及び統合失調症患者由来の前頭前野組織におけるトランスサイレチンのダウンレギュレーション
脳室ＣＳＦにおいて３％のトランスサイレチン及び腰部ＣＳＦにおいて１０％のトランスサイレチンが血液に由来していることが推測されている。統合失調症患者におけるＣＳＦで見出された血液のトランスサイレチンの変化に対する寄与を評価するために、図５及び図８（人口統計に関しては表４及び表５を参照されたい）で研究された同じ個体から採取した（ＣＳＦを採取したのと同時に）血清のトランスサイレチンレベルをＥＬＩＳＡを用いて調べた。血清におけるトランスサイレチンの中程度であるが、有意な減少が、対照に比べて統合失調症患者で見出された（１５％の減少、ｐ＝０．０００７、ｔ検定）（図７Ａ）。しかし、同じ個体由来のＣＳＦと血清のトランスサイレチンとの間に相関が見出されず、このことはトランスサイレチンレベルがＣＳＦ及び血清で独立して調節されることを示唆していた（図７Ｂ）。トランスサイレチンレベルは、ＣＳＦ及び血清サンプルの両方で減少した。しかし、ＣＳＦのトランスサイレチンレベルと血清のトランスサイレチンレベルとの相関は存在しない。
【０２２７】
興味深いことに、ウェスタンブロットを用いて、対照に比べて統合失調症患者由来の死後の前頭前野におけるトランスサイレチンの約４０％のダウンレギュレーションが見出された（図７Ｃ）。
独立したサンプルセットにおけるタンパク質／ペプチドバイオマーカーの検証
図５におけるバイオマーカーモデルは、さらなる１８人の初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者及び４０人の人口統計的に適合した健常なボランティアから成る独立したサンプルセットを用いて検証した。これらのサンプルは、これまでに記載された実験と同じ条件を用いて試験した。ＰＬＳ−ＤＡスコア及びローディングプロットは、１３６００〜１４０００のタンパク質のクラスター内で図５で見出されたのと非常に類似した結果を示した（図８）。このことは、ＣＳＦタンパク質及びペプチドにおけるこれらの同定された変動は一貫した所見であり、したがって統合失調症の早期の病態生理を本当に反映することができることを示唆している。このモデルの感受性及び特異性はそれぞれ９５％及び９８％であった（表７）。
実施例２の考察
合計８１個のＣＳＦサンプルのＳＥＬＤＩスペクトルの最初の分析（４１人の統合失調症、４０人の対照）によって、健常なボランティアのサンプルとは異なる、初めて発症し、薬剤が未投与の妄想型統合失調症患者由来のサンプルの特異的な分布が示された（図５Ｂ、図５Ｃ及び図５Ｄ）。ＣＳＦのタンパク質／ペプチドプロファイルは、妄想型統合失調症患者で特徴的に変化することが見出され、鍵となる変動は約１４ｋＤａのトランスサイレチンのダウンレギュレーションであった。これらの統合失調症に特異的なタンパク質／ペプチドの変化は、同じ条件を用いて独立したサンプルセット（ｎ＝５８）で反復／検証した（図８）。両方の実験がそれぞれ、９５／９８％の驚くほど高い特異性（真陰性率）及び８０／９０％の感受性を達成した（表７）。このことは、実質的に対照サンプルが統合失調症群と一集団になることがなかったことを意味する（図５Ｂ及び図５Ｃ）。高い診断妥当性及び結果として行う治療的介入のために、実際に疾患に罹っているこれらの個体の正確な同定が最も重要である。
【０２２８】
トランスサイレチンの中程度であるが、一貫した低減が、初めて発症した統合失調症患者由来のＣＳＦで見られた。この研究でＣＳＦサンプルが調べられたのと同じ個体から採取した血清サンプルにおけるＥＬＩＳＡ結果は、血清におけるトランスサイレチンレベルの約１５％の低減（ｐ＝０．０００７、ｔ検定、図７Ａ）を示したが、血清のトランスサイレチンのレベルと、ＣＳＦトランスサイレチン由来のＳＥＬＤＩシグナルとの間の相関が存在せず、これにより、肝臓由来のトランスサイレチンがＣＳＦにおけるダウンレギュレーションに寄与し得ないことが示唆された（図７Ｂ）。摘出したヒツジの脳を灌流させる実験では、全ての新たに合成されたトランスサイレチンが、脈絡叢から脳室へ分泌されたことが示された。このタンパク質の合成は、チロキシンの輸送に必要である１６。したがって、ＣＳＦにおけるトランスサイレチンのレベルの低減によって、統合失調症患者の脳におけるチロキシン輸送の低下が示唆される。実際、統合失調症患者由来の死後脳組織におけるトランスサイレチンタンパク質のダウンレギュレーションを示すこの研究で見出された結果（図７Ｃ）はさらにこの考えを支持している。甲状腺機能障害は統合失調症２４、２５、及び実際には障害と遺伝的に結びつく可能性がある他の精神病性障害２６の患者で比較的一般的であることに注目すべきである。さらに、重度の甲状腺機能低下症及び甲状腺機能亢進症の患者において、精神病の症状が発生する可能性があり、臨床像が統合失調症としばしば類似しており２７、このことはＣＮＳ甲状腺機能の増大と結び付き得ることを意味している。興味深いことに、クロザピンの長期間投与が、ラットの海馬及び大脳皮質においてトランスサイレチン発現を誘導することが示され１８、本明細書の結果を考慮すると、クロザピンがＣＮＳチロキシン機能を高めることを意味し、統合失調症の早期の病態生理におけるトランスサイレチンの臨床的関連性を支持する。
【０２２９】
ＳＥＬＤＩ質量分析法の適用は、妄想型統合失調症の早期診断に効果的な手段を提供し得る。
［実施例３］
【０２３０】
臨床サンプル
サンプルの採取及び分析の手順を含むこの研究のプロトコルは、倫理委員会によって承認された。インフォームドコンセントは全ての参加者によって記入され提出されて、ヘルシンキ宣言で表された原則に従って臨床研究が行われた。最初のエピソードである妄想型統合失調症患者、又は病気の期間から短期精神病性障害と診断された薬剤が未投与の患者から（ＤＳＭ−ＩＶ  ２９５．３０又は２９８．８、ＣＳＦに関してｎ＝４１、血清に関してｎ＝３５、表８）、及び人口統計的に適合させた健常なボランティアから（ＣＳＦに関してｎ＝４０、血清に関してｎ＝６３、表８）ＣＳＦ及び血清サンプルを採取した。
【０２３１】
死後研究のために、新鮮凍結した前頭前野組織（ブロードマン領域９、８人の統合失調症個人及び８人の十分に適合させた対照個人）及び肝臓サンプル（１５人の統合失調症及び１５人の十分に適合させた対照）を得た。人口統計の詳細は表８で列挙される。
【０２３２】
赤血球（ＲＢＣ）実験のために、合計４０個の血液サンプル（７人の始めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者、及び１３人の代表的ではない抗精神病薬で治療した統合失調症患者、並びに２０人の人口統計的に適合させた健常なボランティア、人口統計の詳細に関しては表８を参照されたい）は、同じサンプルの採取手順を用いて２つのセンターから収集した。
【０２３３】
【表８】
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【０２３４】
ＲＢＣサンプルの調製
細胞の分離及びタンパク質抽出の前に、血液サンプルを抗凝固剤ＥＤＴＡチューブに回収した（下記を参照されたい）。ＲＢＣを精製するために、４０ｍｌの新鮮採血をＰＢＳ４０ｍｌで希釈した。希釈した血液を、半分の量の密度勾配分離媒体（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）−１０７７, Sigma）上にゆっくりと積層させ、１０分間７５０×ｇで遠心分離した。それから、分離したＲＢＣをチューブの底部から回収し、−８０℃で凍結させた。ＲＢＣを４℃で１５分間、１：５の比で赤血球溶解緩衝液（Qiagen, UK）によって溶解した。タンパク質を−２０℃で一晩メタノール中の１００ｍＭの酢酸アンモニウムを用いて沈降させることによって抽出し、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche, Switzerland）を含有するＡＳＢ１４緩衝液(８Ｍの尿素、２％ＡＳＢ１４、５ｍＭの酢酸マグネシウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００（ｐＨ８））、及びホスファターゼ阻害剤（１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのソディウムオルトバナデート、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、及び５０ｍＭのフッ化ナトリウム）で再懸濁した。タンパク質濃度を界面活性剤相溶性（detergent-compatible）タンパク質アッセイキット（BioRes）を用いて求めた。非常に多量に存在するタンパク質であるヘモグロビンは、ＺＯＯＭ（登録商標）ＩＥＦ精留器（Invitrogen）を用いてＲＢＣプロテオームから最初に前分画した。これは溶液相等電点フォーカシング（ＩＥＦ）を用いて等電点（ｐｌ）に基づいて、細胞溶解物を再現性よく分画化する単純で便利な方法である。Ｈｂを含有する６．２〜１０のｐｌで分画化されたタンパク質は廃棄した。それぞれの個別の患者／対照由来の残りの分画（ｐｌ  ３〜６．２）をプールし、タンパク質を酢酸アンモニウム析出によって再抽出し、２Ｄ−ＤＩＧＥ分析にかけた。
２Ｄ−ＤＩＧＥ分析
肝臓サンプルの２Ｄ−ＤＩＧＥ分析は、２４ｃｍ（ｐＨ４〜７）のＩＤＧ  ＤｒｙＳｔｒｉｐｓを用いて行った。詳細な手順はこれまでに記載されているようなものである（１８）。
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いたＣＳＦタンパク質プロファイリング及びタンパク質バイオマーカー同定
それぞれのＣＳＦサンプル５μｌを、様々なｐＨ条件で異なる化学特性のタンパク質チップに適用した。分離するピークの数及び分離に基づき、強いアニオン交換Ｑ１０チップにおいてｐＨ９．０で、最適条件を選択した。簡潔には、振盪器（振動数＝６００ｒｐｍ）において１０分間室温で、結合緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を用いて２回、アレイスポットを事前に活性化させた。結合緩衝液５０μｌを、それぞれのスポットに添加した後、ＣＳＦサンプル５μｌを添加した。タンパク質チップを室温で６０分間振盪器においてインキュベートし、それからチップを結合緩衝液で２回、Ｈ２Ｏで１回洗浄して、空気乾燥させた。その後、０．６μｌの５０％アセトニトリル中の１００％飽和シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）及び０．５％トリフルオロ酢酸でチップを２回連続処理した。チップをＣｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップリーダー（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップシステムシリーズ４０００）を用いて分析した。それぞれのサンプルを２回分析して、別個に発現したタンパク質を同定する際の再現性を確認した。タンパク質／ペプチドの質量スペクトルが、１８００任意単位のレーザー強度で平均２５４個のレーザーショットを用いることによって生成した。データ獲得のための検出サイズ範囲は３〜２００ｋＤａであった。レーザーは１０ｋＤａで焦点を合わせた。アレイ表面上で捕捉されたそれぞれのタンパク質の質量対荷電比（ｍ／ｚ）は、外部較正標準（Ciphergen Biosystems、USA）に照らし合わせて求められた：ウシインスリン（５７３３．６Ｄａ）、ヒトユビキチン（８５６４．８Ｄａ）、ウシシトクロムｃ（１２２３０．９Ｄａ）、ウシスーパーオキシドジスムターゼ（１５５９１．４Ｄａ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（４３２４０Ｄａ）及びＢＳＡ(６６４１０Ｄａ）。データは、プロテインチップデータ分析ソフトウェアヴァージョン３．０及びＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア３．０（Ciphergen Biosystems, USA）で分析した。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア３．０を用いて全てのスペクトルを蓄積し、定量化した質量ピークを自動検出した。ピークの標識が、０．２％の質量ウィンドウによるセカンドパスピーク選択を用いることによって達成され、推測されたピークが与えられた。ピーク情報の統計分析は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア３．０を用いて行われた。
【０２３５】
タンパク質バイオマーカーの同定のために、ＣＳＦタンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィ（ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ、Ciphergen Biosystems, USA）、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの組合せによって、プールしたＣＳＦから精製した。ＳＥＬＤＩピークに対応すると予測されたバンドをゲルから取り除き、室温で一晩、ゲルバンドをトリプシン（１：５０、Promega, UK）でゲル内に消化した。それから、得られたペプチド混合物をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（ＱＳＴＡＲ、Applied Biosystems, USA）で分析し、マスコットソフトウェア（Matrix Science, London）を用いたデータベース検索でタンパク質を同定した。対象のタンパク質であるゲルバンドを確認するために、抗体捕捉実験を行った。要するに、抗体２μｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ｝をＲＳ１００反応チップ表面に結合させた後、製造業者のプロトコルに従って室温で２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によってブロッキングした。それから、ＣＳＦサンプル５μｌを結合した抗体を有するか、又は有しないスポットに直接適用し、１時間インキュベートした。ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）１０μｌで５回の洗浄の後、チップをＣｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップシステムシリーズ４０００で分析した。
ウェスタンブロット分析
脳組織のウェスタンブロット分析はこれまでに記載されている（３２）。要するに、タンパク質濃度を求めた後、最終濃度が４ｍｇ／ｍｌになるまで、サンプルをサンプル緩衝液（Invitrogen）で希釈した。タンパク質３０μｇをそれぞれのウェルに入れ、陽性対照としてのＡｐｏＡ１標準（Sigma）と平行して、４％〜１２％のＳＤＳプレキャストゲル（Invitrogen）で分離した。分離したタンパク質は室温でニトロセルロース膜上に移した。ニトロセルロース膜は、室温で６０分間ブロッキング溶液（５％乾燥脱脂粉乳）でインキュベートした後、４℃で一晩、抗ヒトＡｐｏＡ１ポリクローナル抗体（１：１０００）（CalBiochem）でインキュベートした。膜を洗浄緩衝液で４回洗浄し、それから室温で１時間ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Cell Signalling,１：５０００）でインキュベートした。化学発光法による可視化（GE Heathcare）を用いて、シグナルを可視化した。
ＥＬＩＳＡ
血清サンプルを無作為に選び、全ての生化学的分析が完了するまで、全ての被験体の素性をコード番号で分からなくした。患者及び対照被験体由来のヒトの血清サンプルと平行して、ＡｐｏＡ１標準（Sigma, UK）をリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ, Sigma, UK）で１：１０００に希釈した。それから、ＡｐｏＡ１標準及びサンプルをＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ（商標）, Denmark）に置き、１時間インキュベートした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、６０分間、プレートをＰＢＳ中の５％乾燥脱脂粉乳粉末でブロッキングした。ＡｐｏＡ１一次抗体（ウサギ）（CalBiochem, UK、１：１０００）１００μｌを、６０分間９６ウェルプレートでインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した後、それぞれのウェルに抗ウサギ二次抗体（Cell Signalling, UK、１：２０００）１００μｌ加えて、６０分間インキュベートした。全てのインキュベートは室温で振盪器（６００ｒｐｍ）において行われた。最後に、洗浄緩衝液で４回洗浄した後、基質（ＴＭＢ  Ｏｎｅ溶液, Promega）１００μｌをそれぞれのウェルに加えて、室温で１０分間インキュベートした。プレートを４５０ｎｍでプレートリーダー（BIO-RAD,モデル６８０）によって読み取った。社会科学者向けの統計パッケージ（ＳＰＳＳ／ＰＣ＋、SPSS, Chicago）を用いてｔ検定によって、血清サンプルの統計分析を行った。全ての測定は独立した実験で繰り返した。
【０２３６】
【表９】
2009516156.tif 000011
［実施例４］
【０２３７】
ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）及びＴＴＲ（トランスサイレチン）タンパク質の変化は、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦで最初に同定された。両方ともＣＳＦにおいて有意にダウンレギュレーションされたことが見出された。
【０２３８】
本実施例は、血清中のＡｐｏＡ１及びＴＴＲの変化を研究した。このように、両方のタンパク質に関するＥＬＩＳＡ分析が確立され、２７人の統合失調症（初めて発症し、薬剤が未投与）及び４８人の健常なボランティアの血清を研究した。両方のタンパク質が、統合失調症の血清で有意に低減したことが見出された（ａｐｏＡ１：約１８％、ｐ＝０．０００３９及びＴＴＲ：約１５％、ｐ＝０．０００７）。図１３を参照されたい。
【０２３９】
【表１０】
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【０２４０】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１Ａ】図１、統合失調症に関して不一致な一卵性双生児及び対照の双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。（Ａ）一組の統合失調症に関して不一致な代表的な双生児由来の血漿サンプルの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの一部（灰色は罹患した双生児（co-twin）及び黒色は罹患していない双生児）は、脂質領域における−（ＣＨ２）ｎ脂質及びＣＨ３脂質の変化を示す。（Ｂ）および（Ｃ）ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、１Ｈ  ＮＭＲ血漿スペクトルで求められるように、対照の双生児と、統合失調症に罹患していない双生児及び羅患した双生児との違いを示す。羅患していない双生児は、対照と統合失調症の双生児との間の中間位置を示す。
【図１Ｂ】図１、統合失調症に関して不一致な一卵性双生児及び対照の双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。（Ａ）一組の統合失調症に関して不一致な代表的な双生児由来の血漿サンプルの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの一部（灰色は罹患した双生児（co-twin）及び黒色は罹患していない双生児）は、脂質領域における−（ＣＨ２）ｎ脂質及びＣＨ３脂質の変化を示す。（Ｂ）および（Ｃ）ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、１Ｈ  ＮＭＲ血漿スペクトルで求められるように、対照の双生児と、統合失調症に罹患していない双生児及び羅患した双生児との違いを示す。羅患していない双生児は、対照と統合失調症の双生児との間の中間位置を示す。
【図１Ｃ】図１、統合失調症に関して不一致な一卵性双生児及び対照の双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。（Ａ）一組の統合失調症に関して不一致な代表的な双生児由来の血漿サンプルの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの一部（灰色は罹患した双生児（co-twin）及び黒色は罹患していない双生児）は、脂質領域における−（ＣＨ２）ｎ脂質及びＣＨ３脂質の変化を示す。（Ｂ）および（Ｃ）ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、１Ｈ  ＮＭＲ血漿スペクトルで求められるように、対照の双生児と、統合失調症に罹患していない双生児及び羅患した双生児との違いを示す。羅患していない双生児は、対照と統合失調症の双生児との間の中間位置を示す。
【図２Ａ】図２、統合失調症に関して不一致な女性の双生児及び女性の対照双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。女性の一卵性双生児のＰＬＳ−ＤＡスコアのプロット（図２Ａ）は、１Ｈ  ＮＭＲ血漿スペクトルで求められるように、対照双生児と、罹患していない双生児と、統合性失調症の双生児との明らかな違いを示す。ローディングプロットは、ＬＤＬ（０．８６及び１．２６）、ＶＬＤＬ（０．９及び１．３）並びに芳香族領域（〜７．５）が、分離に寄与する鍵となる化学シフトであることを示す。図１Ｃと図２Ｂは高度の類似性がある。
【図２Ｂ】図２、統合失調症に関して不一致な女性の双生児及び女性の対照双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。女性の一卵性双生児のＰＬＳ−ＤＡスコアのプロット（図２Ａ）は、１Ｈ  ＮＭＲ血漿スペクトルで求められるように、対照双生児と、罹患していない双生児と、統合性失調症の双生児との明らかな違いを示す。ローディングプロットは、ＬＤＬ（０．８６及び１．２６）、ＶＬＤＬ（０．９及び１．３）並びに芳香族領域（約７．５）が、分離に寄与する鍵となる化学シフトであることを示す。図１Ｃと図２Ｂは高度の類似性がある。
【図３】図３、グローバル機能スコア（ＤＳＭ  ＩＶ、Ｖ軸）と２つの鍵となる化学シフト（Ａ  １．２４〜１．２８ｐｐｍ、Ｂ  １．２８〜１．３２ｐｐｍ）との間の逆相関が主に、女性の双生児の血漿におけるＬＤＬ及びＶＬＤＬレベルに対応する。Ｒ２はそれぞれのプロットで示される。
【図４Ａ】図４、統合失調症である男性の不一致な双生児及び統合失調症ではない男性の不一致な双生児並びに男性の対照双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、（Ａ）男性の対照双生児と罹患していない男性の双生児との間の違いを示していないが、統合失調症の双生児は、男性の対照双生児及び男性の不一致な双生児との中程度の違いを示す。グルコースレベル（３．２〜３．９ｐｐｍ）並びに芳香族領域（約７．９ｐｐｍ）及び１．０４〜１．０６〜１．１２ｐｐｍ領域由来のシグナルが、ローディングプロットで示されるような分離に関する主要な寄与因子であることが見出された（Ｂ）。
【図４Ｂ】図４、統合失調症である男性の不一致な双生児及び統合失調症ではない男性の不一致な双生児並びに男性の対照双生児由来の血漿サンプルの代謝分析。ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、（Ａ）男性の対照双生児と罹患していない男性の双生児との間の違いを示していないが、統合失調症の双生児は、男性の対照双生児及び男性の不一致な双生児との中程度の違いを示す。グルコースレベル（３．２〜３．９ｐｐｍ）並びに芳香族領域（約７．９ｐｐｍ）及び１．０４〜１．０６〜１．１２ｐｐｍ領域由来のシグナルが、ローディングプロットで示されるような分離に関する主要な寄与因子であることが見出された（Ｂ）。
【図５Ａ】図５、ＳＥＬＤＩ質量分析法を用いて、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦサンプルのタンパク質／ペプチドプロファイリング。Ａ：アニオン交換チップ（Ｑ１０、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を用いた典型的なＣＳＦタンパク質／ペプチドスペクトルは、健常なボランティアではｍ／ｚ範囲は約１００００〜１５０００を示す。Ｂ：  ＳＥＬＤＩスペクトル由来のタンパク質／ペプチドのピーク強度をＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡモデルを用いて分析した。３Ｄ  ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、健常なボランティア（黒色）及び治療していない薬剤が未投与の統合失調症の患者（灰色）のクラスターを示す。Ｃ：及びＤ  ＰＬＳ−ＤＡスコア及びローディングプロット。このスコアのプロットは（Ｂ）と類似しているが、最初の２つの成分を用いて、健常な対照と患者とを区別した。（Ｄ）で示されたローディングプロットは、（Ｃ）における分離に最も寄与している鍵となるタンパク質／ペプチドピークを示す。
【図５Ｂ】図５、ＳＥＬＤＩ質量分析法を用いて、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦサンプルのタンパク質／ペプチドプロファイリング。Ａ：アニオン交換チップ（Ｑ１０、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を用いた典型的なＣＳＦタンパク質／ペプチドスペクトルは、健常なボランティアではｍ／ｚ範囲は約１００００〜１５０００を示す。Ｂ：  ＳＥＬＤＩスペクトル由来のタンパク質／ペプチドのピーク強度をＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡモデルを用いて分析した。３Ｄ  ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、健常なボランティア（黒色）及び治療していない薬剤が未投与の統合失調症の患者（灰色）のクラスターを示す。Ｃ：及びＤ  ＰＬＳ−ＤＡスコア及びローディングプロット。このスコアのプロットは（Ｂ）と類似しているが、最初の２つの成分を用いて、健常な対照と患者とを区別した。（Ｄ）で示されたローディングプロットは、（Ｃ）における分離に最も寄与している鍵となるタンパク質／ペプチドピークを示す。
【図５Ｃ】図５、ＳＥＬＤＩ質量分析法を用いて、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦサンプルのタンパク質／ペプチドプロファイリング。Ａ：アニオン交換チップ（Ｑ１０、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を用いた典型的なＣＳＦタンパク質／ペプチドスペクトルは、健常なボランティアではｍ／ｚ範囲は約１００００〜１５０００を示す。Ｂ：  ＳＥＬＤＩスペクトル由来のタンパク質／ペプチドのピーク強度をＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡモデルを用いて分析した。３Ｄ  ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、健常なボランティア（黒色）及び治療していない薬剤が未投与の統合失調症の患者（灰色）のクラスターを示す。Ｃ：及びＤ  ＰＬＳ−ＤＡスコア及びローディングプロット。このスコアのプロットは（Ｂ）と類似しているが、最初の２つの成分を用いて、健常な対照と患者とを区別した。（Ｄ）で示されたローディングプロットは、（Ｃ）における分離に最も寄与している鍵となるタンパク質／ペプチドピークを示す。
【図５Ｄ】図５、ＳＥＬＤＩ質量分析法を用いて、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦサンプルのタンパク質／ペプチドプロファイリング。Ａ：アニオン交換チップ（Ｑ１０、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を用いた典型的なＣＳＦタンパク質／ペプチドスペクトルは、健常なボランティアではｍ／ｚ範囲は約１００００〜１５０００を示す。Ｂ：  ＳＥＬＤＩスペクトル由来のタンパク質／ペプチドのピーク強度をＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡモデルを用いて分析した。３Ｄ  ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、健常なボランティア（黒色）及び治療していない薬剤が未投与の統合失調症の患者（灰色）のクラスターを示す。Ｃ：及びＤ  ＰＬＳ−ＤＡスコア及びローディングプロット。このスコアのプロットは（Ｂ）と類似しているが、最初の２つの成分を用いて、健常な対照と患者とを区別した。（Ｄ）で示されたローディングプロットは、（Ｃ）における分離に最も寄与している鍵となるタンパク質／ペプチドピークを示す。
【図６Ａ】図６、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦにおけるトランスサイレチンの３つの異なる形態のダウンレギュレーションを示す図である。６〜１７ｋＤａ内の健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦスペクトルの例を（Ａ）に示す。矢印で示されたピーククラスターを（Ｂ）で拡大している。それぞれのサブピークの統計的な詳細は以下の表に列挙される。室温におけるβ−メルカプトエタノールによるＣＳＦペプチド／タンパク質のオンチップ還元は、１３７４１Ｄａ、１３８７５Ｄａ、及び１３９２３Ｄａの３つのピークが１つのピークに還元したことを示し（Ｃ）、これらのピークは同じタンパク質の異なるＳ−システイン化誘導体であることを示唆する。同一性を同定するために、健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦサンプルを、アニオン交換カラム（ＨｙｐｅｒＤ）に適用し、ｐＨ９〜ｐＨ３の緩衝液で溶離した。主要なバンドはｐＨ３分画で約１４〜１５ｋＤａで溶離した（Ｄ、左側のパネル）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてトランスサイレチンとしてバンドを同定し（Ｄ、右側のパネル）、配列のカバー率（sequence coverage）が示される。さらに、バンドからタンパク質を溶離し、ＮＰ２０チップ上を走らせ、質量に適合させることによって、このバンドがスペクトルにおける約１３．５〜１４ｋＤａのピーククラスターであることが確認された（Ｅ）。
【図６Ｂ】図６、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦにおけるトランスサイレチンの３つの異なる形態のダウンレギュレーションを示す図である。６〜１７ｋＤａ内の健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦスペクトルの例を（Ａ）に示す。矢印で示されたピーククラスターを（Ｂ）で拡大している。それぞれのサブピークの統計的な詳細は以下の表に列挙される。室温におけるβ−メルカプトエタノールによるＣＳＦペプチド／タンパク質のオンチップ還元は、１３７４１Ｄａ、１３８７５Ｄａ、及び１３９２３Ｄａの３つのピークが１つのピークに還元したことを示し（Ｃ）、これらのピークは同じタンパク質の異なるＳ−システイン化誘導体であることを示唆する。同一性を同定するために、健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦサンプルを、アニオン交換カラム（ＨｙｐｅｒＤ）に適用し、ｐＨ９〜ｐＨ３の緩衝液で溶離した。主要なバンドはｐＨ３分画で約１４〜１５ｋＤａで溶離した（Ｄ、左側のパネル）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてトランスサイレチンとしてバンドを同定し（Ｄ、右側のパネル）、配列のカバー率（sequence coverage）が示される。さらに、バンドからタンパク質を溶離し、ＮＰ２０チップ上を走らせ、質量に適合させることによって、このバンドがスペクトルにおける約１３．５〜１４ｋＤａのピーククラスターであることが確認された（Ｅ）。
【図６Ｃ】図６、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦにおけるトランスサイレチンの３つの異なる形態のダウンレギュレーションを示す図である。６〜１７ｋＤａ内の健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦスペクトルの例を（Ａ）に示す。矢印で示されたピーククラスターを（Ｂ）で拡大している。それぞれのサブピークの統計的な詳細は以下の表に列挙される。室温におけるβ−メルカプトエタノールによるＣＳＦペプチド／タンパク質のオンチップ還元は、１３７４１Ｄａ、１３８７５Ｄａ、及び１３９２３Ｄａの３つのピークが１つのピークに還元したことを示し（Ｃ）、これらのピークは同じタンパク質の異なるＳ−システイン化誘導体であることを示唆する。同一性を同定するために、健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦサンプルを、アニオン交換カラム（ＨｙｐｅｒＤ）に適用し、ｐＨ９〜ｐＨ３の緩衝液で溶離した。主要なバンドはｐＨ３分画で約１４〜１５ｋＤａで溶離した（Ｄ、左側のパネル）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてトランスサイレチンとしてバンドを同定し（Ｄ、右側のパネル）、配列のカバー率（sequence coverage）が示される。さらに、バンドからタンパク質を溶離し、ＮＰ２０チップ上を走らせ、質量に適合させることによって、このバンドがスペクトルにおける約１３．５〜１４ｋＤａのピーククラスターであることが確認された（Ｅ）。
【図６Ｄ】図６、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦにおけるトランスサイレチンの３つの異なる形態のダウンレギュレーションを示す図である。６〜１７ｋＤａ内の健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦスペクトルの例を（Ａ）に示す。矢印で示されたピーククラスターを（Ｂ）で拡大している。それぞれのサブピークの統計的な詳細は以下の表に列挙される。室温におけるβ−メルカプトエタノールによるＣＳＦペプチド／タンパク質のオンチップ還元は、１３７４１Ｄａ、１３８７５Ｄａ、及び１３９２３Ｄａの３つのピークが１つのピークに還元したことを示し（Ｃ）、これらのピークは同じタンパク質の異なるＳ−システイン化誘導体であることを示唆する。同一性を同定するために、健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦサンプルを、アニオン交換カラム（ＨｙｐｅｒＤ）に適用し、ｐＨ９〜ｐＨ３の緩衝液で溶離した。主要なバンドはｐＨ３分画で約１４〜１５ｋＤａで溶離した（Ｄ、左側のパネル）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてトランスサイレチンとしてバンドを同定し（Ｄ、右側のパネル）、配列のカバー率（sequence coverage）が示される。さらに、バンドからタンパク質を溶離し、ＮＰ２０チップ上を走らせ、質量に適合させることによって、このバンドがスペクトルにおける約１３．５〜１４ｋＤａのピーククラスターであることが確認された（Ｅ）。
【図６Ｅ】図６、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来のＣＳＦにおけるトランスサイレチンの３つの異なる形態のダウンレギュレーションを示す図である。６〜１７ｋＤａ内の健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦスペクトルの例を（Ａ）に示す。矢印で示されたピーククラスターを（Ｂ）で拡大している。それぞれのサブピークの統計的な詳細は以下の表に列挙される。室温におけるβ−メルカプトエタノールによるＣＳＦペプチド／タンパク質のオンチップ還元は、１３７４１Ｄａ、１３８７５Ｄａ、及び１３９２３Ｄａの３つのピークが１つのピークに還元したことを示し（Ｃ）、これらのピークは同じタンパク質の異なるＳ−システイン化誘導体であることを示唆する。同一性を同定するために、健常なボランティア及び統合失調症の患者由来のＣＳＦサンプルを、アニオン交換カラム（ＨｙｐｅｒＤ）に適用し、ｐＨ９〜ｐＨ３の緩衝液で溶離した。主要なバンドはｐＨ３分画で約１４〜１５ｋＤａで溶離した（Ｄ、左側のパネル）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてトランスサイレチンとしてバンドを同定し（Ｄ、右側のパネル）、配列のカバー率（sequence coverage）が示される。さらに、バンドからタンパク質を溶離し、ＮＰ２０チップ上を走らせ、質量に適合させることによって、このバンドがスペクトルにおける約１３．５〜１４ｋＤａのピーククラスターであることが確認された（Ｅ）。
【図７】図７、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者の血清及び統合失調症患者由来の前頭前野の死後組織におけるトランスサイレチンレベル。ＣＳＦタンパク質プロファイルを図５及び図８で測定した同じ患者由来の血清サンプルがこの研究に含まれていた。図７Ａは、統合失調症患者における血清トランスサイレチンのレベルが、対照の被験体に比べて約１５％有意に減少したことを示す。データは、平均±Ｓ．Ｄ．＊ｐ＝０．００７（ｔ検定）で示される。図７Ｂは、血清トランスサイレチンと、２組目のサンプルにおける１つのトランスサイレチンアイソフォーム（ｍ／ｚ＝１３７４１）由来のＣＳＦ  ＳＥＬＤＩシグナルとの間に相関関係がないことを示す（人口統計に関しては表５を参照のこと）。ＣＳＦにおける他のアイソフォーム由来のシグナルと比較すると、同様の結果が見出された（データ図示せず）。図７Ｃは、５人の統合失調症患者及び５人の対照被験体の前頭前野におけるトランスサイレチン発現の約４０％の減少を示す。人口統計の詳細に関しては、表６を参照されたい。
【図８】図８、１８人の初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者及び４０人の健常なボランティアを含む独立した検証サンプル組からのＣＳＦタンパク質／ペプチドプロファイルのＰＬＳ−ＤＡ分析。このサンプル組の人口統計の詳細は表５に列挙される。ＰＬＳ−ＤＡスコアのプロットは、患者（黒色）と健常なボランティア（灰色）との間の分離を示していた。ローディングプロットは、最初の実験で見出された１３６００〜１４０００の間のトランスサイレチンタンパク質シグナルを示す（図５を参照のこと）。
【図９】図９、初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者におけるＣＳＦ  ＡｐｏＡ１レベルのダウンレギュレーション。Ａ：強いアニオン交換（Ｑ１０）プロテインチップアレイを用いて、ＣＳＦタンパク質及びペプチドをプロファイリングした。代表的なＣＳＦ  ＳＥＬＤＩスペクトルは、質量対電荷比が４０００ｍ／ｚ〜７００００ｍ／ｚのタンパク質／ペプチドのプロファイルを示す。Ｂ：１４個の代表的なスペクトルのゲル図は、対照に比べて、統合失調症サンプルにおいてａｐｏＡ１タンパク質（約２８ｋＤａ）が低減する（約３５％、ｐ＝０．００００１）ことを示す。隣接ヒストグラムは、ＡｐｏＡ１レベルの平均±ＳＤを示す（初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者由来の４１個のＣＳＦサンプルを４０個の適合した対照サンプルと比較した）。Ｃ：約２８ｋＤａのピークをゲル精製し（矢印）、切り出したタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてシークエンシングした（右側のパネル）。太字で示される配列のカバー率は、公開されたＡｐｏＡ１アミノ酸配列の一部に対応する。Ｄ：このバンドは、抗ＡｐｏＡ１抗体オンチップ（ＲＳ−１００  プロテインチップ）により、ＣＳＦサンプルにおけるタンパク質を免疫捕捉することによって、スペクトルにおいて約２８ｋＤａのピーククラスターであることが確認された。ＣＳＦサンプルを、抗ＡｐｏＡ１抗体と結合するか（下方のパネル)、又は結合しない（上方のパネル）ＲＳ−１００チップに適用した。チップと結合したタンパク質をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。捕捉したＡｐｏＡ１タンパク質は２８ｋＤａのｍ／ｚで示される。Ｅ：ウェスタンブロット分析は、８人の統合失調症患者及び８人の健常なボランティアの前頭前野におけるＡｐｏＡ１発現を示す。ダウンレギュレーションに対する傾向が観察された（約３２％、ｐ＝０．０７、ｔ検定）。タンパク質ローディングはブロットの下に示される。
【図１０】図１０、統合失調症患者（ｎ＝１５）及び対照（ｎ＝１５）由来の肝臓の２−Ｄ  ＤＩＧＥ分析。Ａ：肝臓タンパク質抽出物の典型的な２Ｄゲル画像。ＡｐｏＡ１タンパク質（対応するスポットは矢印で示される）は、有意に変化したタンパク質のうちの１つであった。Ｂ：ＡｐｏＡ１レベルが、統合失調症患者由来の肝臓で有意に低減したことが見出された（約３０％、ｐ＝０．０１７）。ヒストグラムは、相対的に標準化された存在量の平均±ＳＤを示す。Ｃ：ゲルスポット由来のトリプシン化ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、３つのペプチド断片がａｐｏＡ１タンパク質に由来することを示していた。マスコットのスコア及び配列カバー率は表に示される。
【図１１】図１１、ＡｐｏＡ１タンパク質の発現の低下を示す、統合失調症患者（ｎ＝２０）及び対照（ｎ＝２０）由来の赤血球（ＲＢＣ）の２−Ｄ  ＤＩＧＥ分析。Ａ：ヘモグロビンタンパク質の優性発現を示す（ｐＩ約７）未分画ＲＢＣプロテオームの典型的な２Ｄゲル画像。Ｂ：Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配によって優性タンパク質（即ちヘモグロビン）を取り除いた後の典型的な２Ｄゲル画像。矢印及びスポットは、ゲル上のａｐｏＡ１スポットの位置を示す。Ｃ：ＡｐｏＡ１レベルが統合失調症患者由来のＲＢＣで有意に低減したことが見出された（約６０％、ｐ＝０．００３４）。ヒストグラムは相対的に標準化された存在量の平均±ＳＤを示す。Ｄ：ゲルスポットからのトリプシン化ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、８つのペプチド断片がＡｐｏＡ１タンパク質に由来することを明らかにした。マスコットのスコア及び配列カバー率は表に示される。
【図１２】図１２、統合失調症における血清ＡｐｏＡ１レベルのダウンレギュレーション。Ａ：初めて発症し、薬剤が未投与の統合失調症患者（ｎ＝３５）及び健常なボランティア（ｎ＝６５）の血清におけるａｐｏＡ１レベルのＥＬＩＳＡ分析を示す。統合失調症患者及び対照におけるａｐｏＡ１濃度の平均値±Ｓ．Ｄ．が示される。ｐ＝０．０００３９（ｔ検定）。Ｂ：ＣＳＦの相関分析及び同じ個体由来の血清のＡｐｏＡ１レベル。対照群又は患者群のいずれにおいても血清とＣＳＦとの間に全く相関は見出されなかった。
【図１３】図１３、約８９％の高感受性及び約７３％の高い特異性が、ＰＣＡ分析で２つのバイオマーカーを組合せることで達成することができることを示す。
【図１４】図１４、約８９％の高感受性及び約７３％の高い特異性が、ＰＣＡ分析で２つのバイオマーカーを組合せることで達成することができることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月18日(2008.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精神病性障害又はその素因を診断又はモニタリングする方法であって、被験体から採取したサンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、前記バイオマーカーは、配列番号１を含むトランスサイレチンペプチド又はその断片、配列番号２を含むＡｐｏＡ１ペプチド又はその断片、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及び血漿タンパク質等の芳香族種から選択される、精神病性障害又はその素因を診断又はモニタリングする方法。
【請求項２】
被験体から採取したサンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含む、精神病性障害を有するか、精神病性障害を有する疑いがあるか、又は精神病性障害に罹りやすい被験体における治療の有効性をモニタリングする方法、ここで該バイオマーカーは請求項１に記載のものである。
【請求項３】
被験体から採取したサンプルに存在する１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含む、抗精神病物質を同定する方法、ここで該バイオマーカーは請求項１に記載のものである。
【請求項４】
前記被験体から採取したサンプルにおける前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを、治療の開始前に該被験体から採取した１つ又は複数のサンプル、及び／又は治療の初期段階において該被験体から採取した１つ又は複数のサンプルに存在するレベルと比較することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
２回以上採取したサンプルにおける前記１つ又は複数のバイオマーカーの量の変化を検出することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルに存在する前記１つ又は複数のバイオマーカーの量を１つ又は複数の対照のレベルと比較することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記対照は正常な対照及び／又は精神病性障害対照である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、ＮＭＲ、ＳＥＬＤＩ（−ＴＯＦ）、ＭＡＬＤＩ（−ＴＯＦ）、１−Ｄゲルベース分析、２−Ｄゲルベース分析、質量分析法（ＭＳ）及びＬＣ−ＭＳベース技法、直接又は間接、連結又は非連結の酵素法、電気化学法、分光光度法、蛍光法、発光法、分光法、旋光法及びクロマトグラフィ法、及びＥＬＩＳＡ等の免疫学的方法から選択される１つ又は複数の方法によって検出される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーは、ＶＬＤＬ及び／又はＬＤＬであり、該バイオマーカーのレベルは、液相化学法、リポタンパク質の分離のための物理的方法及び酵素アッセイから選択される１つ又は複数の方法によって検出される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、該バイオマーカーの直接又は間接的検出のための１つ又は複数の酵素、結合、受容体若しくは輸送タンパク質、抗体、合成受容体又は他の選択的結合分子を含むセンサー或いはバイオセンサーを用いて検出され、前記検出は、電気変換器、光変換器、音響変換器、磁気変換器又は熱変換器に連結される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、全血、血清、血漿、ＣＳＦ、尿、唾液、又は他の体液、又は呼気、濃縮呼気、又はそれらの抽出物若しくは精製物、或いはそれらの希釈物から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体は薬剤が未投与である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記精神病性障害は統合失調症であり、好ましくは、偏執型統合失調症、強硬型統合失調症、解体型統合失調症、未分化型統合失調症、及び残遺型統合失調症から選択される、請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記精神病性障害は双極性障害である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体の臨床的評価又は自己評価をさらに含み、好ましくは、ＳＣＩＤ又はグローバル機能スコア評価（global functioning score assessment）から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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