(57)【要約】核酸分子の配列決定のためのナノプローブおよびナノプローブを使用するための方法を提供する。特定の例において、該プローブは、重合剤と、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと特異的に結合することによって、リンカーから分離することなく、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる化学的部分を有する、１つまたは複数の分子リンカーとを含む。標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との可逆的な結合は、相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出によって示される。かかる化学的部分の１つの例は、非加水分解性ヌクレオチド類似体である。特定の例において、重合剤および化学的部分は、化学的部分の特定の型を特徴とする供与体フルオロフォア、および受容体フルオロフォアなどのタグに関連する。2009519041.tif 000025
2009519041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を配列決定するためのプローブであって、
標的核酸分子に結合すること、および相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように、伸長する前記相補的核酸分子の合成を促進することができる、活性部位を有する重合剤と、
前記重合剤上で離間している１つまたは複数の分子リンカーであって、前記リンカーのうちの１つ以上は、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記リンカーから分離することなく、前記標的核酸分子に可逆的に結合することができる化学的部分を有しており、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との特異的結合は、相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出によって示される、１つまたは複数の分子リンカー
とを含む、プローブ。
【請求項２】
前記化学的部分がヌクレオチド類似体を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド類似体が非加水分解性ヌクレオチド類似体を含む、請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
前記非加水分解性ヌクレオチド類似体が、非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む、請求項２記載のプローブ。
【請求項５】
前記非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体が、非加水分解性であるα−β結合を有する非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む、請求項４記載のプローブ。
【請求項６】
前記化学的部分がモノヌクレオチドである、請求項１記載のプローブ。
【請求項７】
前記モノヌクレオチドが、塩基、３’リボース炭素、２’リボース炭素、またはαリン酸上の前記リンカーに結合される、請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、少なくとも４つの独立したリンカーを含み、それぞれが、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる、異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項２記載のプローブ。
【請求項９】
前記１つまたは複数の分子リンカーが分岐構造を形成し、それぞれの分岐が、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項２記載のプローブ。
【請求項１０】
前記分岐構造が少なくとも４つの分岐を含み、それぞれの分岐が、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項９記載のプローブ。
【請求項１１】
前記重合剤がタグに関連し、前記ヌクレオチド類似体のそれぞれが、前記リンカーが有する特定のヌクレオチド類似体を識別するタグに関連し、前記重合剤に関連する前記タグと、前記ヌクレオチド類似体に関連する前記タグとの相互作用が、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとの前記リンカー上の前記ヌクレオチド類似体の対合を示す前記特性シグナルの放出を誘発する、請求項２記載のプローブ。
【請求項１２】
前記重合剤に関連する前記タグが、それぞれのヌクレオチド類似体に関連する前記タグにより供与体−受容体の対を形成し、それによって、前記供与体−受容体の対の相互作用が、前記特性シグナルの放出を刺激する、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１３】
前記供与体−受容体の対が、前記受容体が反応して前記特性シグナルを放出する刺激を放出する外部刺激を与えることによって刺激される供与体を含む、請求項１２記載のプローブ。
【請求項１４】
それぞれのタグがフルオロフォアを含む、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１５】
前記リンカーが有する特定のヌクレオチド類似体を識別する前記タグのそれぞれが、一意的な放出シグナルを放出する１つまたは複数のフルオロフォアを含む、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の分子リンカーが４つの分子リンカーを含み、それぞれが、前記リンカーから分離することなく前記標的核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる異なる化学的部分と、それぞれの化学的部分に関連する受容体タグとを有し、ここで前記受容体タグが、前記リンカーが有する前記特定の化学的部分を識別し、前記重合剤が供与体タグに関連し、前記標的核酸分子への前記化学的部分の可逆的結合が、前記リンカーが有する前記化学的部分の識別性を示す前記受容体タグの特性シグナルの放出を誘発するように、前記供与体および受容体タグを十分に接近させる、請求項１記載のプローブ。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、前記分子リンカーの絡み合いを抑制するために十分な距離をおいて前記重合剤の周囲に離間し、前記分子リンカーが、前記重合剤の前記活性部位に到達するほど十分に長い、請求項１記載のプローブ。
【請求項１８】
前記分子リンカーが線状ポリマーを含む、請求項１７記載のプローブ。
【請求項１９】
前記ポリマーが核酸を含む、請求項１８記載のプローブ。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤および前記化学的部分との実質上の絡み合いを回避するように、前記重合剤および前記化学的部分を互いに十分な距離をおいて維持する、請求項１記載のプローブ。
【請求項２１】
前記分子リンカーの少なくとも一部は、前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤と前記化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する、請求項１記載のプローブ。
【請求項２２】
前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤と前記化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する前記分子リンカーの少なくとも一部が、分子ロッドを含む、請求項２１記載のプローブ。
【請求項２３】
前記分子リンカーが、テザー（ｔｅｔｈｅｒ）、分子ロッド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項２４】
前記分子ロッドが、少なくとも１０ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む、請求項２３記載のプローブ。
【請求項２５】
十分な剛性を有する前記分子リンカーが、分子ロッドによって連結される少なくとも２つのテザーを含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項２６】
前記テザーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２３記載のプローブ。
【請求項２７】
前記テザーがＥＧから成る、請求項２６記載のプローブ。
【請求項２８】
前記テザーが長さが１８７Å未満である、請求項２６記載のプローブ。
【請求項２９】
前記分子ロッドが４０ヌクレオチドのｄｓＤＮＡ分子を含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項３０】
前記ｄｓＤＮＡ分子が１０〜１５０のヌクレオチドを含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項３１】
前記重合剤が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、または逆転写酵素を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項３２】
前記重合剤が、供与体フルオロフォアに関連する逆転写酵素を含む、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３３】
前記標的核酸分子がＤＮＡであり、かつ前記重合剤がＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼである、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３４】
前記標的核酸分子がＲＮＡであり、かつ前記重合剤が逆転写酵素である、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３５】
前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントである、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３６】
標的核酸分子に結合すること、および相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように、伸長する前記相補的核酸分子の合成を促進することができる活性部位と、
絡み合いを抑制するために前記重合剤上で離間している１つまたは複数の分子リンカーであって、それぞれのリンカーが、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記リンカーから分離することなく核酸分子の前記鋳型鎖に可逆的に結合することができる異なる非加水分解性ヌクレオチド類似体を有している、１つまたは複数の分子リンカーと、
核酸分子の前記鋳型鎖に可逆的に結合することができる前記リンカーが有する前記非加水分解性ヌクレオチド類似体を識別するそれぞれの非加水分解性ヌクレオチド類似体に関連するタグと、
前記リンカーが有する前記非加水分解性ヌクレオチド類似体を識別する特性シグナルを放出するために、前記非加水分解性ヌクレオチド類似体に関連する前記タグと相互に作用する前記ポリメラーゼに関連するタグ
とを含む、重合剤。
【請求項３７】
標的核酸分子の核酸配列を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドプライマーと、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとハイブリダイズし、前記鋳型核酸分子に可逆的に結合する前記化学的部分を置換することによって、伸長している核酸分子に組み込むことができる加水分解性ヌクレオチドの混合物との存在下で、前記標的核酸分子を請求項１記載のプローブに曝露する工程と、
相補的ヌクレオチドと前記分子リンカー上の前記化学的部分との対合を示す複数の前記特性シグナルの放出を含む、一連のシグナルの放出を検出する工程
とを含む、方法。
【請求項３８】
前記重合剤がタグに関連し、前記化学的部分のそれぞれもまた、前記リンカーが有する特定の化学的部分を識別するタグに関連し、前記重合剤に関連する前記タグと、前記化学的部分に関連する前記タグとの相互作用が、相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す前記特性シグナルの放出を誘発する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記重合剤に関連する前記タグが、供与体フルオロフォアを含み、特定の化学的部分を識別する前記タグが、１つまたは複数の受容体フルオロフォアを含み、前記重合剤と、前記標的核酸分子内の前記相補的ヌクレオチドに特異的に結合する前記化学的部分との相互作用が、供与体フルオロフォアによって前記受容体フルオロフォアの励起が可能となるように、前記受容体フルオロフォアを前記供与体フルオロフォアに接近させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナルを検出する工程が、前記受容体フルオロフォアから放出される蛍光性シグナルを検出する工程を含むか、または前記供与体フルオロフォアから放出される蛍光性シグナル内の減少を検出する工程を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
一連のシグナルの前記放出が核酸配列に変換される、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
一連のシグナルの前記放出が発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって生成される、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す前記特性シグナルを放出するために、前記供与体フルオロフォアを励起して前記１つまたは複数の受容体フルオロフォアを励起するシグナルを放出する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記供与体フルオロフォアが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記受容体フルオロフォアが、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、またはそれらの誘導体である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記供与体フルオロフォアが発光分子によって励起される、請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
前記供与体フルオロフォアがＧＦＰであり、かつ前記発光分子が化学発光エクオリンである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記供与体フルオロフォアが発光分子である、請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
前記発光分子がエクオリンである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記重合剤がＧＦＰ−ポリメラーゼである、請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブが基板に固定されている、請求項３７記載の方法。
【請求項５２】
前記重合剤がリンカーによって前記基板に固定されている、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記リンカーが、ストレプトアビジン−ビオチン、ヒスチジン−Ｎｉ、Ｓ−タグ−Ｓ−タンパク質、またはグルタチオン−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸分子または前記オリゴヌクレオチドプライマーが基板に固定されている、請求項３７記載の方法。
【請求項５５】
実質上同時に複数の配列決定反応を行う工程と、前記複数の配列決定反応から一連のシグナルを検出する工程とを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項５６】
複数の重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、所定のパターンで前記基板に直接的または間接的に固定され、一連のシグナルを検出する工程が、そのようなパターン内の所定の位置に対応する核酸分子と前記シグナルとを相関させる工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、規則的なアレイにエッチングされたチャネル内で、前記所定のパターンで前記基板に固定される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、基板上に液滴をマイクロピペットで滴下することによって、前記所定のパターンで前記基板に固定される、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
基板上に液滴をマイクロピペットで滴下する前記工程が、手動または自動アレイヤーを使用して行われる、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
一連のシグナルが電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、前記核酸配列に変換される、請求項３７記載の方法。
【請求項６１】
一連のシグナルがコンピュータ可読媒体に保存される、請求項３７記載の方法。
【請求項６２】
前記標的核酸分子が、対象から取得された生体試料に存在している、請求項３７記載の方法。
【請求項６３】
前記標的核酸分子が細胞内に存在し、前記鋳型核酸分子をオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブに曝露する工程が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの前記細胞への導入を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が対象内に存在し、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの前記細胞への導入が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの対象への投与を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記標的核酸鎖が、疾病に関連する１つまたは複数の突然変異を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項６６】
高ストリンジェンシー条件下で前記標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマーをさらに含むプローブであって、前記プライマーが、分子リンカーを介して前記重合剤に結合される、請求項１記載のプローブ。
【請求項６７】
前記重合剤が重合剤−Ｔｕｓ融合タンパク質を含み、前記分子リンカーがｔｅｒ配列を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項６８】
前記ヌクレオチド類似体に関連する前記タグが、エラーの検出および修正を可能にする、コード化したフルオロフォアの集まりである、請求項１１記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００５年１２月１２日に双方とも出願された米国仮出願第６０／７４９，７２９号および第６０／７４９，８５８号に対する優先権を主張し、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本開示は、プローブ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸分子を配列決定するための方法に関し、研究および臨床的用途における疾病の診断のために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
背景
多数の方法が核酸分子を配列決定するために使用されてきた。従来のマクサムギルバート化学分解法は、ＤＮＡの化学特異的開裂に関与する（Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ７４：５６０，１９７７（非特許文献１））。本方法において、放射能標識化ＤＮＡ分子を、４つの別個の反応混合物内でインキュベートし、それぞれは、特異的識別性（Ｇ、Ａ＋Ｇ、ＣまたはＣ＋Ｔ）の１つまたは２つのヌクレオチドでＤＮＡを部分的に開裂する。得られたＤＮＡフラグメントは、４つの反応のそれぞれを、ゲルの別個のレーンに分けた、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される。ＤＮＡ配列は、ゲルの４つのレーン内でフラグメントの高分子分離を観察することによって、オートラジオグラフィーの後に決定される。
【０００４】
サンガージデオキシ法は、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸およびジデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物を用いた合成プライマーの酵素伸長によって、異なる長さのＤＮＡ分子の生成に関する（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ７４：５４６３，１９７７（非特許文献２））。反応は、ポリアクリルアミドゲル上の４つの平行なレーンに分離され、オートラジオグラフィーの後に配列が決定される。
【０００５】
蛍光ヌクレオチドを使用することにより、放射性ヌクレオチドの必要性がなくなり、ＤＮＡ配列決定を自動化する手段を提供する（例えば、Ａｎｓｏｒｇｅへの米国特許第５，１２４，２４７号（特許文献１）、Ｐｒｏｂｅｒらへの米国特許第５，２４２，７９６号（特許文献２）、Ｐｒｏｂｅｒらへの米国特許第５，３０６，６１８号（特許文献３）、Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｆらへの米国特許第５，３６０，５２３号（非特許文献４）、Ｐｅｔｔｉｔへの米国特許第５，５５６，７９０号（特許文献５）、Ｓｍｉｔｈへの米国特許第５，８２１，０５８号（特許文献６）を参照）。しかしながら、一般に、フルオロフォアを使用する方法は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を今もなお必要とし、従って緩慢であり巨視的である。
【０００６】
蛍光標識ｄＮＴＰを使用するその他の潜在的障壁は、誰も蛍光標識ＤＮＡ分子を完全には合成することができなかったことである。従って、相補的核酸鎖の合成を可能にする配列決定方法は、今もなお必要とされている。
【０００７】
【特許文献１】Ａｎｓｏｒｇｅへの米国特許第５，１２４，２４７号
【特許文献２】Ｐｒｏｂｅｒらへの米国特許第５，２４２，７９６号
【特許文献３】Ｐｒｏｂｅｒらへの米国特許第５，３０６，６１８号
【特許文献４】Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｆらへの米国特許第５，３６０，５２３号
【特許文献５】Ｐｅｔｔｉｔへの米国特許第５，５５６，７９０号
【特許文献６】Ｓｍｉｔｈへの米国特許第５，８２１，０５８号
【非特許文献１】Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ７４：５６０，１９７７
【非特許文献２】Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ７４：５４６３，１９７７
【発明の開示】
【０００８】
概要
本開示は、核酸分子の配列決定に使用できる改良型プローブ、および該プローブを使用する方法を提供する。特定の例において、プローブは、１つまたは複数の遺伝子の転写レベルを決定するために使用することができる。例えば、プローブは、個別のＲＮＡの転写を計数し、それによって細胞内で生成された数の推定を提供するために使用することができる。特定の例において、本明細書に開示するプローブおよび方法は、現在利用可能なマイクロアレイ技術の代替物として使用される。
【０００９】
特定の例において、「Ｍｅｄｕｓａ」と称されるプローブは、１つまたは複数の化学的部分（非加水分解性ヌクレオチドなど）を重合剤に連結する（一部の例では、離間して）、重合剤に結合した１つ以上の（複数など）分子リンカーを有する重合剤を含む。化学的部分は、リンカーから分離することなく、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる。開示する例において、可逆的な組み込みは、重合剤の活性部位で発生する。しかしながら、化学的部分は、成長する核酸鎖に永久に組み込むことができないことが理想的である。標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との特異的な結合は、相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出によって示される。
【００１０】
重合剤は、配列決定される標的核酸分子に結合することができる活性部位を含み、一部の例において、標的核酸分子に相補的な核酸分子の合成を促進することができ、相補的核酸分子は、相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように伸長する。重合剤は、線状鎖（相補的核酸分子など）を形成する化学反応で、モノマー分子（ヌクレオチドなど）を一緒に反応させることができる化合物を含む。例示的な重合剤には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の例において、ポリメラーゼは、ＧＦＰ−ポリメラーゼである。重合剤の選択は、配列決定される核酸に依存しうる。例えば、標的核酸分子がＤＮＡである場合は、重合剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼであってもよいが、標的核酸分子がＲＮＡである場合は、重合剤は、逆転写酵素であってもよい。
【００１１】
リンカーから分離することなく、標的核酸分子の鋳型鎖内で相補的ヌクレオチドと可逆的に結合することができる化学的部分は、非加水分解性ヌクレオチド類似体などのヌクレオチド類似体を含むことができる。かかる類似体は、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと対になることができるが、伸長している相補的核酸鎖に永久に組み込まれることはない。非加水分解性ヌクレオチド類似体は、当技術分野では公知であり、非加水分解性であるα−β結合を有する非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体などの、非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む。
【００１２】
特定の例において、プローブは、少なくとも４つの独立したリンカーを含み、それぞれは、標的核酸分子内の異なるヌクレオチドと特に対合することができるが、伸長している相補的核酸分子に永久に組み込むことができない、異なる化学的部分を有する。その他の例において、プローブは、分岐構造を形成するために結合される複数のリンカーを含み、それぞれの分岐は、標的核酸分子内の異なるヌクレオチドと特に対合することができるが、伸長している相補的核酸分子に永久に組み込まれることはできない、異なる化学的部分を有する。例えば、分岐構造は、１点でのみ重合剤に結合してもよい。
【００１３】
分子リンカーは、重合剤を核酸分子の鋳型（または標的）鎖に可逆的に結合することができる１つまたは複数の化学的部分に連結する。特定の例において、分子リンカーは、標的核酸分子の存在下で、重合剤と化学的部分との相互作用を可能にすると同時に、標的または鋳型核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分との実質上の絡み合いを回避するように、重合剤および化学的部分を互いに十分な距離をおいて維持する。例えば、分子リンカーは、リンカーの絡み合いを抑制するために十分な距離をおいて重合剤の周囲で離間することができ、重合剤の活性部位に到達するほど十分に長い。一部の例において、分子リンカー（または少なくともその一部分）は、標的核酸分子の非存在下で、重合酵素と化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する。
【００１４】
分子リンカー（または、分子リンカーの一部分である分子ロッドなど、その一部）は、標的核酸分子の非存在下で、望ましくない相互作用を回避するために、重合剤と化学的部分とを十分な距離をおいて離間する柔軟性を考慮して十分な長さを有するが、例えば、重合剤が標的核酸分子に結合する場合、重合剤と化学的部分とが互いに、および標的核酸分子と相互に作用しうる十分な柔軟性を保持する。例えば、分子リンカーの少なくとも一部は、分子リンカーの少なくとも一部が、標的核酸分子の非存在下で、重合剤（重合剤に関連するタグなど）と化学的部分との相互作用を減少させるような十分な剛性および長さとなることを可能し、標的核酸分子の存在下で、重合剤と化学的部分との相互作用を可能にする持続長を有することができる。
【００１５】
特定の例において、分子リンカーの全長は、二本鎖または一本鎖核酸分子などのリンカーを構成する１つまたは複数の成分の持続長と異なる（それより長いまたは短いなど）。しかしながら、特定の例において、分子リンカーの全長は、標的核酸分子の存在下で、標的核酸分子と同様に、重合剤と化学的部分との有意な相互作用を可能にすると同時に、有意な相互作用が、標的核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分との間に発生する長さを超えることはない。かかる相互作用は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、重合剤が、供与体フルオロフォアを含み、１つまたは複数の化学的部分が、ＦＲＥＴ対の対応する受容体フルオロフォアを含む場合、受容体発光蛍光を測定することによって測定することができる。その他の例において、重合剤は、標的の非存在下で、化学的部分からフォスターの半径（２２から９０Åのフォスターの半径など）の少なくとも２倍の距離で実質上維持される。
【００１６】
持続長（ｌｐ）は、線状鎖のための平均的局所立体構造であり、任意のセグメントによって画定される方向のすべての鎖セグメントの平均的延在の合計を反映する。従って、持続長は、ポリマー鎖の剛性または弾性の基準である。特定の例において、持続長は、実質的には、平均にして６８．４０度の屈曲で発生する周長距離を測定する屈曲度（従って、鎖の有効弾性）である。従って、持続長は、分子リンカーの組成物に応じて変化する。例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子のための持続長は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のものと異なる。特定の例において、例えば、イオン強度が約０．２Ｍおよび温度が２０℃で、ｄｓＤＮＡは、持続長が約４００〜５００Å（４５０〜５００Åなど）であり、ｄｓＲＮＡは、持続長が約７００〜７５０Åである。特定の例において、ｓｓＤＮＡは、持続長が約４０Å（例えば２０℃）である（Ｃｌｏｓｓｅｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ．Ｓｔａｔ．Ｎｏｎｌｉｎ．Ｓｏｆｔ．Ｍａｔｔｅｒ．Ｐｈｙｓ．６８（６Ｐｔｌ）：０６１９１１，２００３）。特定の例において、ＰＥＧは、持続長が約３．８Åである。
【００１７】
特定の例において、分子リンカーには、核酸のポリマーなどの線状ポリマー、アミノ酸、糖、ＰＥＧ、またはそれらの組み合わせが含まれる。例えば、分子リンカーには、テザー（ｔｅｔｈｅｒ）、分子ロッド、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、十分な剛性の分子リンカーは、分子ロッド、例えば、ｄｓＤＮＡから成る分子ロッドを含むことができる。一部の例において、十分な剛性の分子リンカーには、テザーによって連結される複数の分子ロッド、または分子ロッドによって連結される複数のテザーが含まれる。テザーの特定の一例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から成る（または一部の例においては、構成される）分子である。
【００１８】
標的核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分が相互作用して反応を提供しないように、重合剤および化学的部分を、１つまたは複数の分子リンカーによって空間的に分離した方向に連結することができる。しかしながら、分子リンカーは、重合剤および化学的部分に、所定の条件下で、相互に作用するために互いに十分に接近させ、検出可能なシグナルなどの所定の反応、または標的核酸分子との相互作用を引き起こすことを可能にする。例えば、重合剤または化学的部分に関連するタグのうちの少なくとも１つは、供与体および受容体が、互い十分に接近する場合、供与体フルオロフォアタグによる受容体フルオロフォアタグの励起など、別のタグに十分に接近する場合に活性化されうる。
【００１９】
さらに、本開示は、標的核酸分子に結合することができ、相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように伸長する相補的核酸分子の合成を促進することができる活性部位を含む重合剤を提供する。重合剤は、絡み合いを抑制するために、重合剤上で離間する１つまたは複数の分子リンカーをさらに含み、それぞれのリンカーは、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、リンカーから分離することなく、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる、異なる化学的部分（非加水分解性ヌクレオチド類似体など）を有する。特定の例において、重合剤は、リンカーが有する化学的部分を識別するそれぞれの化学的部分に関連するタグをさらに含む。さらに、ポリメラーゼは、リンカーが有する化学的部分を識別する特性シグナルを放出する化学的部分に関連するタグと相互に作用するタグに関連することができる。
【００２０】
さらに、本開示は、例えば、標的核酸分子の核酸配列を決定するために、開示するナノプローブを使用する方法を提供する。特定の例において、該方法は、特定の標的分子が、試料内に存在するかを決定するために使用され、一部の例において、存在する標的核酸分子の量の定量化を含む。例えば、該方法は、１つまたは複数の核酸突然変異に関連する疾病を有する対象を診断するために、プローブを使用するために提供される。
【００２１】
配列決定は、インビトロまたはインサイチュー（例えば、顕微鏡用スライド上）およびインビボ（例えば、プローブを細胞内に導入し、ｍＲＮＡが生成される時にその配列を観察することによって）で行うことができる。該方法は、いくつかの核酸を分子レベルで同時に配列決定することを可能にする。例えば、複数の配列決定反応は、実質上同時に行うことができ、複数の配列決定反応からのシグナルを検出し、核酸配列に変換することができる。
【００２２】
特定の例において、該方法は、オリゴヌクレオチドプライマー、および標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとの塩基対合に、伸長する核酸分子に組み込まれることができ、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合するリンカーが有する化学的部分を置換することができる加水分解性ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰなど）の混合物の存在下で、標的核酸分子を本明細書に開示するプローブに曝露する工程を含む。一連のシグナルの放出は検出され、シグナルは、相補的ヌクレオチドとのリンカー上の化学的部分の対合を示す複数の特性シグナルの放出を含む。一部の例において、一連のシグナルの放出は、核酸配列に変換される。
【００２３】
特定の例において、重合剤は、タグ（供与体フルオロフォアなど）に関連し、化学的部分（非加水分解性Ａ、Ｔ／Ｕ、ＣまたはＧヌクレオチド類似体など）のそれぞれの異なる型は、リンカーが有する特定の化学的部分を識別する一意的なタグに関連し、重合剤に関連するタグと、化学的部分に関連するタグとの相互作用は、相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出を誘発する。特定の例において、タグは、重合剤または化学的部分に直接結合される。しかしながら、タグは、直接結合される必要はなく、代わりに、リンカー上の化学的部分が、相補的ヌクレオチドと対になる場合、特性シグナルの放出を生成するために、重合剤または化学的部分に十分に接近した分子リンカー上に見ることができる。
【００２４】
例えば、重合剤に関連するタグは、供与体フルオロフォアであってもよく、特定の化学的部分を識別するタグは、１つまたは複数の受容体フルオロフォアを含むことができ、重合剤と合成核酸分子に組み込むことができない化学的部分との相互作用は、供与体フルオロフォアによる受容体フルオロフォアの励起を可能にする供与体フルオロフォアに受容体フルオロフォアを接近させる。かかる例において、シグナルを検出する工程は、受容体フルオロフォアから放出された蛍光性シグナル（または供与体フルオロフォアからの減少された放出シグナル）を検出する工程を含むことができる。特定の例において、該方法は、受容体フルオロフォアではなく、供与体フルオロフォアを特に励起する電磁放射（レーザーなど）源によって、供与体フルオロフォアを励起する工程をさらに含む。あるいは、供与体フルオロフォアは、化学発光分子、例えば、エクオリンである。この例において、化学発光法による供与体フルオロフォアは、必然的に励起状態にあるので、供与体フルオロフォアは、電磁放射源による励起を必要としない。この励起は、標的核酸分子と対合する化学的部分に関連する受容体フルオロフォアを励起するのに十分な距離のみエネルギーを移動させることができる波長で、光を放出する供与体を含む。
【００２５】
特定の例において、プローブは、例えば、ポリメラーゼ成分を基板に結合するリンカー分子を介してアドレス可能な場所で基板に結合または固定される。例となるリンカーには、ストレプトアビジン−ビオチン、ヒスチジン−Ｎｉ、Ｓ−タグ−Ｓ−タンパク質、およびグルタチオン−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。その他の例では、配列決定される標的核酸分子は、例えば、アドレス可能な場所で基板に結合または固定される。特定の例において、オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、５’末端で、基板に固定される。例えば、核酸分子は、５’末端、３’末端、または中間のどこかにより、基板に結合することができる。特定の例において、配列決定反応は、三次元ポリアクリルアミドゲルで行われ、配列決定に必要な試薬のすべては、ゲル内に存在する。
【００２６】
一部の例において、複数のプローブ、プライマー、または核酸分子は、所定のパターン、例えば、アドレス可能な場所で、基板に直接的または間接的に固定される。例えば、薬剤は、規則的なアレイに、またはスライド上に薬剤を含む液滴をマイクロピペット操作することによって、例えば、手動ピペット操作か、もしくは自動アレイヤーを使用し、エッチングされたチャネル内に蒸着することができる。かかる方法は、シグナルが、配列決定反応のそれぞれから検出される場合に、単一の基板上での同時の（または実質上同時の）配列決定を可能にする。一意的な放出シグナルは、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラにより検出することができ、基板上の所定の位置から一連のシグナルを検出し、それらを核酸配列に変換することができる。一意的な放出シグナルは、コンピュータ可読媒体に保存することができる。
【００２７】
本開示の前述のおよびその他の特性および利点は、添付図面への参照によって進められる、以下のいくつかの例の詳細な説明からより明白となるであろう。
【００２８】
配列表
ヌクレオチド塩基の標準略語を使用して、添付の配列表に記載の核酸配列を示す。特定の例において、核酸配列の鎖を１つのみ示すが、相補的鎖は、示された鎖への任意の言及によって含まれると理解される（例えば、ｄｓＤＮＡ分子ロッドの場合）。
【００２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、例示的な標的配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の圧縮版である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜２６は、図２Ｃに示すプローブを作成するために使用することができる配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７〜３０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、および９とそれぞれ置換することができる配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜３８は、ヘアピンループを形成することができる配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９は、例示的な標的配列である。
【００３０】
一部の態様の詳細な説明
略語および用語
本開示をより適切に説明し、本開示を実践する上で当業者の指針となるように、用語および方法の説明を以下に提供する。本明細書で使用される限り、「含む」とは、「包含する」を意味し、単数形「１つの（ａまたはａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形の引例を含む。例えば、「１つの分子リンカー」に対する引例は、１つまたは複数のかかる分子リンカーを含み、「そのプローブ」に対する引例は、１つまたは複数のプローブおよび当業者には公知のその同等物などに対する引例を含む。用語「ｏｒ」とは、文脈による別段の明確な指示がない限り、記載する代替要素の単一の要素、または２つ以上の要素の組み合わせを指す。例えば、句「１つのテザーまたは１つの分子ロッド」とは、１つまたは複数のテザー、１つまたは複数の分子ロッド、または１つまたは複数のテザーと１つまたは複数の分子ロッドの両方の組み合わせを指す。
【００３１】
別段の説明がない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者に一般に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、本開示の実践または検証において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および例は、一例にすぎず、限定することを意図しない。開示のその他の特性および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
Å             オングストローム
ｄｓＤＮＡ    二本鎖ＤＮＡ
ＦＲＥＴ      蛍光共鳴エネルギー移動
ＧＦＰ        緑色蛍光タンパク質
ＬＮＡ        ロックト核酸
ＰＥＧ        ポリエチレングリコール
ＰＮＡ        ペプチド核酸
ＲＴ          逆転写酵素
ｓｓＤＮＡ   一本鎖ＤＮＡ
【００３２】
受容体フルオロフォア：例えば、約４００から９００ｎｍの範囲内（約５００から８００ｎｍの範囲内など）で、供与体フルオロフォアからエネルギーを吸収する化合物。一般に、受容体フルオロフォアは、通常、供与体フルオロフォアの最大吸収波長よりも少なくとも１０ｎｍ長い（少なくとも２０ｎｍ長いなど）波長で光を吸収し、約４００から９００ｎｍに及ぶ波長で最大限の蛍光放射を有する。供与体によって放射されるエネルギーが、受容体を励起することができるように、受容体フルオロフォアは、供与体フルオロフォアの放出と重なる励起スペクトルを有する。理想的には、受容体フルオロフォアは、開示するナノプローブに結合されることができる。
【００３３】
例示的受容体フルオロフォアには、ローダミンおよびその誘導体（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）など）、フルオレセイン誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）など）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）およびシアニン染料が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の例において、受容体フルオロフォアは、塩基などのヌクレオチド類似体、糖、またはヌクレオチドのリン酸（α、β、またはγ）に結合されうる。
【００３４】
特定の例において、受容体フルオロフォアは、Ｄａｂｃｙｌ、Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈからのＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）、Ｅｐｏｃｈ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＥｃｌｉｐｓｅ（商標）Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）などのダーククエンチャーである。かかる例において、供与体フルオロフォアに十分に接近する場合に受容体フルオロフォアからの放出シグナルの増加を検出する代わりに、クエンチャーに十分に接近する場合に、供与体フルオロフォアからの放出シグナルの減少を検出することができる。
【００３５】
活性部位：化学反応が発生するポリメラーゼの領域などの、酵素または抗体の触媒部位。活性部位は、基質との相互作用を可能にする空間的配置に１つまたは複数の残基または原子を含み、後者の反応を発生させる。
【００３６】
結合：複合体の形成など、２つ以上の分子間の連関。一般に、複合体内の分子の結合が強力であるほど、解離の速度は遅くなる。特異的結合とは、薬剤と標的との間の選択的結合を指す。
【００３７】
特異的結合の特定の例には、相補的核酸分子への１つの核酸分子のハイブリダイゼーション、タンパク質（ポリメラーゼなど）と標的タンパク質または核酸分子との連関が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
特定の例において、十分な量、例えば、その結合の検出を可能にする十分な量のタンパク質が核酸分子への非共有化学結合を形成する場合は、タンパク質は、核酸分子に結合することが知られている。
【００３９】
一例において、その結合の検出を可能にする十分な量のオリゴヌクレオチド分子が、塩基対を形成する、または標的核酸分子にハイブリダイズされる場合は、オリゴヌクレオチド分子（プライマーなど）は、標的核酸分子に結合することが観察される。多くの場合、オリゴヌクレオチドとその標的核酸分子との間の結合は、５０％のオリゴヌクレオチドが標的から融解する温度（Ｔｍ）に特徴付けられる。高温（Ｔｍ）は、低温（Ｔｍ）の複合体と比較してより強力または安定した複合体を意味する。
【００４０】
特定の例において、結合は、ナノプローブ上に存在する標識を検出することによって評価される。例えば、供与体と受容体フルオロフォアとの相互作用に続いて生成される蛍光性シグナルは、ナノプローブ上のヌクレオチド類似体と標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとの結合の指標として測定することができる。
【００４１】
化学的部分：分子の部分基または官能基。例は、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、標的核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる、ヌクレオチドなどの薬剤を含む。特定の例において、化学的部分は、分子リンカーを介してプローブに結合され、化学的部分が、標的核酸分子上の相補的ヌクレオチドに特異的に結合する場合、リンカーから分離しない。
【００４２】
化学的部分の特定の例には、非加水分解性ヌクレオチド類似体など、成長する相補的核酸鎖に組み込むことができないヌクレオチド類似体を含むが、これに限定されない。
【００４３】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部、非コードセグメント（イントロン）、および転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡの一片。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡに相補的であり、逆転写酵素を使用して合成することができる。
【００４４】
相補的：二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖は、塩基対の２つの相補的鎖から成る。ＤＮＡ／ＲＮＡに見られるそれぞれの塩基に対して１つの相補的塩基（Ａ／Ｔ、およびＣ／Ｇなど）があるので、任意の単一鎖に対する相補的鎖を決定することができる。
【００４５】
検出：薬剤が存在するか、または存在しないかを決定すること。一部の例において、これは、定量化をさらに含むことができる。例えば、特定の例で開示するプローブを使用すると、例えば、化学的部分が、リンカーから分離されることなく、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに結合するので、化学的部分の検出が可能になる。
【００４６】
巨視的な数の分子（少なくとも１０２３の分子など）が、同時に観察することができるように、検出は大量であってもよい。さらに、検出は、顕微鏡法およびバックグラウンドノイズを減少させる全反射などの技術を使用して、単一の分子からのシグナルの識別を含むことができる。個別の分子のスペクトルは、これらの技術によって取得することができる（Ｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：６２６４−８，１９９６）。
【００４７】
供与体フルオロフォア：エネルギーを受容体フルオロフォアへ移動し、それによって検出可能な蛍光性シグナルを生成することができるフルオロフォアまたは発光分子。一般に、供与体フルオロフォアは、約３００から９００ｎｍ、例えば、約３５０から８００ｎｍの範囲で吸収する化合物である。供与体フルオロフォアは、望ましい励起波長、例えば、約１０３Ｍ−１ｃｍ−１超で、強いモル吸光係数を有する。種々の化合物は、フルオレセイン（およびその誘導体）、ローダミン（およびその誘導体）、ＧＦＰ、フィコエリトリン、ＢＯＤＩＰＹ、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、インド−１、クマリン、ダンシル、テルビウム（およびその誘導体）、およびシアニン染料を含む、供与体蛍光成分として用いることができる。特定の例において、供与体フルオロフォアは、エクオリンなどの化学発光分子である。
【００４８】
電磁放射：電界強度および磁場強度の同時周期的変動によって伝播され、電波、赤外線、可視光線、紫外線、Ｘ線およびガンマ線を含む一連の電磁波。特定の例において、電磁放射は、単色性、方向性、コヒーレンス、偏光および強度の性質を保有することができるレーザーによって放射される。レーザーからのエネルギーが、供与体フルオロフォアを励起するが、受容体フルオロフォアは励起しないように、レーザーは、特定の波長（または波長の比較的狭い範囲にわたり）で光を放射することができる。
【００４９】
放出シグナル：フルオロフォアが、励起波長で光を吸収した後、フルオロフォアから生成される特定の波長の光。
【００５０】
放出スペクトル：フルオロフォアの後に発生するエネルギースペクトルは、光の特定の波長によって励起される。それぞれのフルオロフォアは、特徴のある放出スペクトルを有する。一例において、個別のフルオロフォア（またはフルオロフォアの一意的な組み合わせ）は、ヌクレオチド類似体に関連し、フルオロフォアからの放出スペクトルは、異なるヌクレオチド類似体間を区別するための手段を提供する。
【００５１】
絡み合う：例えば、複雑に入り組んだ塊において、絡み合うこと。特定の例において、ナノプローブの絡み合いは、標的分子の存在下で、化学的部分（ヌクレオチド類似体など）が、標的核酸分子の相補的ヌクレオチドと相互に作用することを減少または阻止する。その他の特定の例において、ナノプローブの絡み合いは、化学的部分（ヌクレオチド類似体など）間、または化学的部分と重合剤間との望ましくない相互作用、例えば、標的核酸分子との相互作用を阻止する相互作用という結果になる。
【００５２】
励起または励起シグナル：フルオロフォアが、光の異なる（より長いなど）波長を放出する状態までフルオロフォアを励起することが必要な特定の波長の光。
【００５３】
フルオロフォア：光の定義済み波長など、特定の刺激に曝露することによって励起される場合、例えば、異なる波長で、光を放出する（蛍光を発する）化合物。
【００５４】
フルオロフォアは、発光化合物の比較的大きい部類の一部である。発光化合物は、冷光を発する光の特定の波長を必要とせず、エネルギーの化学源を使用する化学発光分子を含む。従って、化学発光分子を使用すると、レーザーなどの、外部の電磁放射源の必要性がなくなる。化学発光分子の例には、エクオリンが含まれるが、これに限定されるものではない（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９）。
【００５５】
本明細書に開示するナノプローブに使用することができる特定のフルオロフォアの例は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネートなどのアクリジンおよび誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５二硫酸塩（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−ｌ−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）などのクマリンおよび誘導体、７−アミノ−４−トリフルオロメチルコウルアリン（クマラン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−ｌ−塩化スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよびエオシンイソチオシアネートなどのエオシンおよび誘導体；エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネートなどのエリスロシンおよび誘導体；エチジウム；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）などのフルオレセインおよび誘導体；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン、ピレンブチラートおよびスクシンイミジル１−ピレンブチラートなどのピレンおよび誘導体；リアクティブレッド４（チバクロン-ＲＴＭ、ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ塩化スルホニル、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１およびスルホローダミン１０１（テキサスレッド）の塩化スルホニル誘導体などのローダミンおよび誘導体；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体など、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらへの米国特許第５，８６６，３６６��に記載されている。
【００５６】
その他の適切なフルオロフォアには、約６１７ｎｍで放出するチオール反応性ユーロピウムキレート（ＨｅｙｄｕｋおよびＨｅｙｄｕｋ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８：２１６−２７，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３１５−２２，１９９９）の他に、ＧＦＰ、リサミン（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン、およびキサンテン（Ｌｅｅらへの米国特許第５，８００，９９６号に記載）、ならびにその誘導体が含まれる。一例において、フルオロフォアは、大きなストークシフトタンパク質（Ｋｏｇｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：５７７−８１，２００６を参照）である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）より入手可能なものなど、当業者に公知のその他のフルオロフォアもまた使用することができる。
【００５７】
特定の例において、フルオロフォアは、供与体フルオロフォアまたは受容体フルオロフォアとして使用される。理想的には、フルオロフォアは、標的生体分子に相互に作用するナノプローブの能力を十分に妨害することなく、ナノプローブ要素に結合される能力を有し、光退色に対して安定しており、高量子効率を有する。複数の受容体フルオロフォアが、例えば、単一のナノプローブ上で、または一緒に使用される異なるナノプローブ上で使用される例では、１つのフルオロフォア（または２以上のフルオロフォアの組み合わせ）からの放出が、その他のフルオロフォア（または２つ以上のフルオロフォアの組み合わせ）と区別可能となるように、フルオロフォアは、区別可能な放出スペクトルを有するように有利に選択される。
【００５８】
本明細書に開示するフルオロフォアは、供与体フルオロフォアまたは受容体フルオロフォアとして使用することができる。特に有用なフルオロフォアは、ナノプローブ（例えば、ポリメラーゼ、分子リンカー、またはヌクレオチド類似体に）に結合される能力を有し、光退色に対して安定しており、高量子効率を有する。さらに、１つのフルオロフォア（Ａに関連する１つのものなど）からの放出が、その他のヌクレオチド類似体（Ｔに関連する１つのものなど）に関連するフルオロフォアと区別可能となるように、ヌクレオチド類似体の異なる集まり（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｇ、およびＣに対応するものなど）に関連するフルオロフォアは、区別可能な放出スペクトルを有するように有利に選択される。
【００５９】
フォスター（または蛍光）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）：励起フルオロフォア（供与体）が、低エネルギー光吸収分子（受容体）に励起状態エネルギーを移動する過程。このエネルギー移動は、無放射であり、主として供与体フルオロフォアと受容体フルオロフォアとの間の双極子−双極子相互作用による。このエネルギーは、距離、例えば、１０〜１００Åなど、限定される距離を超えて伝達することができる。ＦＲＥＴ効率は、式中Ｒ０が、ＦＲＥＴ効率が５０％の距離である、１／（１＋（Ｒ／Ｒ０）＾６）に従い低下する。
【００６０】
ＦＲＥＴ対：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に携わることができるフルオロフォアの集まり（対など）。使用可能なＦＲＥＴ対の例を以下に記載する。しかしながら、当業者は、フルオロフォアの他の多数の組み合わせも使用できることを認識するであろう。
【００６１】
ＦＡＭは、波長が４８８ｎｍの光によって最も効率的に励起され、５００から６５０ｎｍのスペクトルで光を放出し、放出極大５２５ｎｍを有する。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸとともに使用するのに適した供与体フルオロフォアである（そのすべては、励起極大５１４ｎｍを有し、ＦＡＭを刺激する光によって有意に刺激されることはない）。
【００６２】
３９９ｎｍで励起され、５１１ｎｍで放出する、ＧＦＰ突然変異体Ｈ９−４０（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９）は、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン、ローダミングリーンおよびオレゴングリーンとともに使用するのに適した供与体フルオロフォアの役割を果たすことができる。さらに、フルオロフォアテトラメチルローダミン、リサミン（商標）、テキサスレッド、およびナフトフルオレセインは、このＧＦＰ突然変異体とともに受容体フルオロフォアとして使用することができる。
【００６３】
フルオロフォア３−（ε−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）は、４８８ｎｍで極大励起され、ひいては、受容体フルオロフォアと使用することができるローダミン誘導体（Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ５およびＲＯＸなど）のための供与体フルオロフォアの役割を果たすことができる（Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４３：１５−２７，１９９６参照）。しかしながら、ＣＹＡおよびＦＡＭは双方とも、同じ波長（４８８ｎｍ）で極大励起されるので、適切なＦＲＥＴ対の例ではない。
【００６４】
ＦＲＥＴ対の１つ特定の例は、ＧＦＰ２およびＹＦＰである。
【００６５】
フルオロフォアが、適切な供与体−受容体ＦＲＥＴ対を作出する、当分野で公知の技術の分光測光法を使用し、当業者は、容易に決定することができる。さらに、Ｇｒａｎｔら（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ１６：２３１−７，２００１）は、本明細書に開示するナノプローブに使用することができるＦＲＥＴ対の特定の例を提供する。
【００６６】
融合タンパク質：本来は結合が見られない２つのアミノ酸配列を含むタンパク質。用語「ＧＦＰ−ポリメラーゼ融合タンパク質」とは、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含むタンパク質を指し、第１のアミノ酸配列は、ＧＦＰ分子（突然変異体または野生型）であり、第２のアミノ酸配列は、ポリメラーゼである。同様に、用語「ＧＦＰ−エクオリン融合タンパク質」とは、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含むタンパク質を指し、第１のアミノ酸配列は、ＧＦＰ分子（突然変異体または野生型）であり、第２のアミノ酸配列は、エクオリンである。ＧＦＰ−エクオリン融合タンパク質は、Ｂａｕｂｅｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２６０−５，２０００、参照により本明細書に組み入れられる）の方法を使用して生成することができる。
【００６７】
これらの融合タンパク質は、式Ｘ−Ｙによって表すことができ、式中、Ｘは、ＧＦＰなどのタグであり、Ｙは、ポリメラーゼなどの重合剤である。一部の例において、アミノ酸鎖は、融合タンパク質の第１および第２のドメインに連結するために使用することができる。
【００６８】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）：Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａにおける蛍光放出源。本明細書で使用される限り、ＧＦＰは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９、およびＴｓｉｅｎとＨｅｉｍへの米国特許第５，７７７，０７９号および第５，６２５，０４８号に記載されるような、野生型タンパク質、およびスペクトルが移動するその突然変異体の双方を指す。特定の例において、ＧＦＰは、レーザーを使用して励起される。その他の例において、ＧＦＰは、エクオリン、例えば、ＧＦＰ−エクオリン融合タンパク質を使用して励起される。
【００６９】
ＧＦＰ−ポリメラーゼ：機能性ＧＦＰ分子および機能性ポリメラーゼの両方を含む組換え型融合タンパク質。ＧＦＰは、ポリメラーゼのＮ−またはＣ−末端、またはポリメラーゼが、有意な重合活性を保持する限り（例えば、相補的核酸鎖の伸長を触媒する能力を保持する）、ポリメラーゼ内のどこにでも位置することができる。さらに、ＧＦＰ−ポリメラーゼは、例えば、精製または基板への結合に役立つように、リンカー（リンカー−ＧＦＰ−ポリメラーゼ）を含むことができる。さらに、例えば、ＬＲＥＴの使用が望ましい場合は、ＧＦＰ−ポリメラーゼはまた、機能性エクオリン配列を含むことができる。
【００７０】
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡの２つの鎖の相補的領域間、またはＤＮＡとＲＮＡとの間に塩基対を形成し、それによって二本鎖分子を形成すること。特定の度合いのストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの方法および組成物の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の長さに応じて変化することになる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション液のイオン強度（Ｎａ＋濃度など）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の度合いのストリンジェンシーに達するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（ｃｈａｐｔｅｒｓ９ａｎｄ１１）に論じられている。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的な集まりであり、これらに限定されるものではない。
【００７１】
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣにて６５℃で１６時間
洗浄２回：              ２×ＳＳＣにて室温（ＲＴ）で各１５分
洗浄２回：              ０．５×ＳＳＣにて６５°Ｃで各２０分
【００７２】
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×〜６×ＳＳＣにて６５℃〜７０℃で１６〜２０時間
洗浄２回：              ２×ＳＳＣにてＲＴで各５〜２０分
洗浄２回：              １×ＳＳＣにて５５℃〜７０℃で各３０分
【００７３】
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣにてＲＴから５５℃で１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：    ２×〜３×ＳＳＣにてＲＴから５５℃で各２０〜３０分
【００７４】
２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウムである。
【００７５】
リンカー：本開示のプローブの基板への結合など、１つの分子を別の分子に結合する構造であり、リンカーの一部分は、基板に機能的に連結され、リンカーの別の部分は、プローブに機能的に連結される。
【００７６】
リンカーの特定の１タイプは、重合剤を１つまたは複数の化学的部分（１つまたは複数のヌクレオチド類似体など）に結合することができる、テザー、ロッド、またはそれらの組み合わせなどの分子リンカーであり、リンカーの一部分は、重合剤に機能的に連結され、リンカーの別の部分は、１つまたは複数の化学的部分に機能的に連結される。
【００７７】
ロックト核酸（ＬＮＡ（商標））：リボヌクレオシドが、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン単位に連結される二環式核酸。この連結は、ヌクレオチド類似体のリボフラノース環の柔軟性を制限し、剛性を有する二環式Ｎ型立体構造にロックされる。さらに、ＬＮＡは、Ａ二本鎖の、より熱力学的に安定した形態から成る立体構造に適合するように、隣接した塩基を誘導する。
【００７８】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置を使用して、標準的なホスホラミダイトの化学的性質によって合成することができる。さらに、ＬＮＡは、その他の核酸類似体と同様にＤＮＡ、ＲＮＡと混合することができる。特例の例において、ＬＮＡは、分子リンカーの一部として含まれる。
【００７９】
発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）：供与体分子が、発光分子であるか、または例えばレーザーの代わりに、発光分子によって励起される、ＦＲＥＴと類似した過程。ＬＲＥＴを使用すると、バックグラウンドの蛍光を減少させることができる。特定の例において、化学発光分子は、外部の電磁放射源の必要性がなく、供与体フルオロフォア（ＧＦＰなど）を励起するために使用することができる。その他の例において、発光分子は、発光分子の励起された共鳴が、１つまたは複数の受容体フルオロフォアを励起する供与体である。
【００８０】
使用できる発光分子の例には、エクオリンおよびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。４７０ｎｍで頂点に達する、エクオリンからの生体発光は、供与体ＧＦＰフルオロフォアを励起するために使用することができる（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９；Ｂａｕｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：７２６０−５）。その後、ＧＦＰは、本明細書に開示する受容体フルオロフォアを励起する。この例において、エクオリンおよびＧＦＰの両方とも、本開示のナノプローブに結合することができる。５５５ｎｍで頂点に達する、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼからの生体発光は、本明細書に開示する受容体フルオロフォアを励起することができる。この例において、ルシフェラーゼおよびＧＦＰの両方とも、本開示のナノプローブに結合することができる。ルシフェラーゼが使用される一部の例において、受容体フルオロフォアの双極子は、ルシフェラーゼ光の偏光と整列する。その他の例において、多数のルシフェラーゼ分子は、ナノプローブに隣接してまたは周囲にさえ整列する。例えば、内部または表面上にルシフェラーゼの多くの分子を有する球体、デンドリマーまたはシートを作出することも可能である。
【００８１】
ナノプローブまたはプローブ：核酸分子を配列決定するために使用できる分子素子。特定の例において、ナノプローブまたはプローブは、受容体および供与体フルオロフォア対などの配列の検出を可能とする１つまたは複数のタグを含む。
【００８２】
核酸分子（または配列）：限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（化学的に合成されるなど）ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー。核酸分子は、二本鎖（ｄｓ）または一本鎖（ｓｓ）であってもよい。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖であってもよい。核酸分子は、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、およびＧなど）を含むことができ、天然ヌクレオチドの類似体もまた含むことができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）内など、ペプチド骨格に連結される塩基の集まりは、核酸分子の置換基として使用することができる。
【００８３】
標的核酸分子は、配列決定される核酸であり、当業者に公知の任意の方法（例えば、Ｕｌｍｅｒへの米国特許第５，６７４，７４３号に記載）によって、精製した形で取得することができる。相補的核酸分子は、標的核酸分子に相補的であり、標的核酸分子を配列決定する場合、伸長される核酸鎖である。
【００８４】
ヌクレオチド：糖および１つまたは複数のリン酸基に連結される、ピリミジン、プリン、またはその合成類似体など、塩基を含むモノマー。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド内の１つのモノマーである。ヌクレオチド配列とは、ポリヌクレオチド内の塩基の配列を指す。
【００８５】
ＤＮＡの主なヌクレオチドは、デオキシアデノシン５’−三リン酸（ｄＡＴＰまたはＡ）、デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰまたはＧ）、デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰまたはＣ）およびデオキシチミジン５’−三リン酸（ｄＴＴＰまたはＴ）である。ＲＮＡの主なヌクレオチドは、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰまたはＡ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰまたはＧ）、シチジン５’−三リン酸（ＣＴＰまたはＣ）およびウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰまたはＵ）である。
【００８６】
ヌクレオチド前駆体の選択は、配列決定される核酸に依存する。鋳型が、一本鎖ＤＮＡ分子である場合は、デオキシリボヌクレオチド前駆体（ｄＮＴＰ）は、ＤＮＡ指令のＤＮＡポリメラーゼの存在下で使用される。あるいは、リボヌクレオチド前駆体（ＮＴＰ）は、ＤＮＡ指令のＲＮＡポリメラーゼの存在下で使用される。しかしながら、配列決定される核酸がＲＮＡである場合、ｄＮＴＰおよびＲＮＡ指令のＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【００８７】
本明細書に開示するヌクレオチドは、例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらへの米国特許第５，８６６，３３６号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている、修飾塩基、修飾糖成分、修飾リン酸骨格を含有するヌクレオチドをさらに含む。しかしながら、かかる修飾形態は、成長する核酸鎖へのヌクレオチドの組み込み、または相補的核酸鎖へのヌクレオチドの結合を可能にさせる。本明細書に記載される修飾形態は、核酸合成の停止をもたらさない。
【００８８】
ヌクレオチドは、構造上の任意の位置で修飾することができる。例には、修飾ヌクレオチド５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ−６−ソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−Ｓ−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２、６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
構造上の任意の位置でヌクレオチドを修飾するために使用できる修飾糖成分の例には、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソース、またはホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホトリエステル、もしくはホルムアセタールまたはその類似体などのリン酸骨格の修飾成分が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
ヌクレオチド類似体：天然塩基、糖、リン酸骨格、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数の修飾を含むヌクレオチド。かかる修飾は、ヌクレオチドが成長する核酸鎖へ組み込まれることが不可能になる可能性をもたらす。特定の例には、非加水分解性ヌクレオチドが含まれる。非加水分解性ヌクレオチドには、αとβリン酸間の酸素が、窒素または炭素と置換されている、モノヌクレオチドおよびトリヌクレオチドが含まれる（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素は、窒素で置換されたαおよびβリン酸との間の酸素でｄＴＴＰを加水分解することはできない（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５：１９３８−４１，１９９２）。
【００９１】
ヌクレオチド類似体の「型」とは、検出される共通する特徴を共有のヌクレオチド類似体の集まりのうちの１つを指す。例えば、ヌクレオチド類似体の集まりは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ類似体（ＤＮＡに対して）またはＡ、Ｕ、ＣおよびＧ類似体（ＲＮＡに対して）の４つの型に分けることができる。この例において、ヌクレオチド類似体のそれぞれの型は、集まりの中でその他のヌクレオチド類似体から区別可能となるように（例えば、蛍光分光法またはその他の光学的手段によって）、１つまたは複数の受容体フルオロフォアなどの一意的なタグに関連付けられる。
【００９２】
「Ｃ」の代わりに使用できる例示的なヌクレオチド類似体は、Ｇ−クランプである（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。Ｇ−クランプは、三環系アミノエチル−フェノキサジン２’−デオキシシチジン類似体（ＡＰ−ｄＣ）である。Ｇ−クランプは、ホスホラミダイトとして入手可能であり、従って、ＤＮＡ構造に合成することができる。かかる類似体は、本明細書で提供されるナノプローブに使用することができる（例えば、図１Ａに示すプローブの化学的部分２２、２４、２６、２８のうちの１つとして、または図１Ｂに示すｄＣＴＰ２２の代用となることができる）。
【００９３】
オリゴヌクレオチド：少なくとも６つのヌクレオチド、例えば、少なくとも９つ、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、またはさらに少なくとも５００のヌクレオチドの長さの直鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）配列。オリゴヌクレオチドは、改変糖成分などの非天然部分、またはホスホロチオアート−オリゴデオキシヌクレオチドなどの糖間の連結を含むことができる。特定の例において、非天然部分を含むオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含むことができる。
【００９４】
ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）：終止コドンが全くないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。通常、これらの配列は、ペプチドに翻訳可能である。
【００９５】
対合：標的核酸分子上の相補的ヌクレオチドへの化学物質（ヌクレオチド類似体など）の結合など、対に結合する過程。特定の例において、対合は、共有結合の形成をもたらす。その他の例において、対合は、化学結合の形成をもたらすことはない。
【００９６】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）：核酸塩基を有する中性ペプチド様骨格を含む、情報分子の部類であり、従来のオリゴヌクレオチドよりも高い親和性および特異性で、相補的ＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズすることを可能にする。ＰＮＡ分子の構造は、ＤＮＡと類似しており、デオキシリボースリン酸骨格は、ペプチドに見られるものと類似する骨格と置換されている。特定の例において、ＰＮＡは、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに耐性を示す。ＰＮＡは、フルオロフォア（例えば、受容体フルオロフォア）など、Ｎ（５）−末端で官能基を含むことができる。
【００９７】
持続長（ｌｐ）：線状鎖のための平均的局所立体構造であり、任意のセグメントによって画定される方向のすべての鎖セグメントの平均的延在の合計を反映する。特定の例において、持続長は、実質的には、平均にして６８．４０度の屈曲で発生する周長距離を測定する屈曲度（従って、鎖の有効弾性）である。
【００９８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：エチレン化合物のポリマー、Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ。ＰＥＧ付加は、ＰＥＧ構造をその他の分子、例えば、標的または活性化可能な部分などの機能分子に付加する行為である。ＰＥＧは、水、メタノール、ベンゼン、ジクロロメタンに可溶性であり、ジエチルエーテルおよびヘキサンに不溶性である。
【００９９】
開示するナノプローブに使用可能なＰＥＧの特定の例には、３〜５ユニットのスペーサー１８などの１〜７ユニットのスペーサー１８（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、Ｃ３スペーサーホスホラミダイト（１〜１０ユニットなど）、スペーサー９（１〜１０ユニットなど）、ＰＣ（光開裂可能）スペーサー（１〜１０ユニットなど）、（すべてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）が含まれるが、これらに限定されるものではない。その他の例において、開示するナノプローブで使用できるＰＥＧの長さは、ＰＥＧの１から４０のモノマーが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
重合剤：線状鎖またはポリマー鎖の三次元網目構造を形成するために、化学反応内にモノマー分子（ヌクレオチドなど）を一緒に反応させることができる化合物。重合剤の特定の例は、ポリメラーゼ、すなわち核酸鋳型に相補的な核酸鎖を合成する酵素である。核酸分子を配列決定するために使用できるポリメラーゼの例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、特に、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ，逆転写酵素（ＨＩＶ−Ｉ  ＲＴまたはＬｌレトロトランスポゾンの逆転写酵素など）、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、および麦芽ＲＮＡポリメラーゼＩＩが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
ポリメラーゼの選択は、配列決定される核酸に依存する。鋳型が、一本鎖ＤＮＡ分子である場合、ＤＮＡ指令のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを使用することができ、鋳型が、一本鎖ＲＮＡ分子である場合、逆転写酵素（ＲＮＡ指令のＤＮＡポリメラーゼなど）を使用することができる。
【０１０２】
プライマー：短い核酸分子、例えば、プライマーと標的核酸鎖との間にハイブリッドを形成するために、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的標的核酸分子にアニーリングすることができる、少なくとも９のヌクレオチドの配列。プライマーは、ポリメラーゼ酵素によって、標的核酸分子に沿って延在することができる。従って、例えば、プライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸分子をハイブリダイズするように、個別のプライマーは核酸配列決定のために使用することができ、ここでプライマーの配列は標的核酸分子に特異的である。
【０１０３】
特定の例において、プライマーは、配列決定される標的核酸分子に相補的な少なくとも１０の連続ヌクレオチドなど、長さが少なくとも１０のヌクレオチドである。特異性を強化するために、配列決定される標的核酸分子に相補的な少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも３０の連続ヌクレオチドを有するプライマーなど、より長いプライマーを用いることができる。プライマーを調製および使用する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【０１０４】
精製：精製という用語は、絶対的純度を意味せず、むしろ相対的な用語を意図する。従って、例えば、精製ＧＦＰ−ポリメラーゼタンパク質調製物は、ＧＦＰ−ポリメラーゼタンパク質が、細胞内の環境にあるタンパク質より純粋であるものである。特定の例において、ＧＦＰ−ポリメラーゼタンパク質が、調製物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％を表すように、ＧＦＰ−ポリメラーゼタンパク質の調製物は精製されるが、例えば、総タンパク質含有量の９０％または９８％でもよい。
【０１０５】
量子ドット：安定的に蛍光を発し、均一の表面領域を保有し、生体分子（１つまたは複数のナノプローブなど）を結合させるように化学修飾することができる、設計された無機半導体結晶ナノ粒子略球状であるが、本開示のナノプローブに結合される量子ドットは、いずれの形状（球状、管状、錐体状、円錐形、または立方体など）であってもよいが、特に適切なナノ粒子は球状である。
【０１０６】
一般に、量子ドットは、既に記載したように、相対的単分散度（例えば、調製物内量子ドット間で約１０％未満変化する核の直径を有する）で調製することができる（Ｂａｗｅｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８７０６，１９９３）。当技術分野で公知の量子ドットは、例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＴｅ（集合的に「ＣｄＸ」と称される）から成る群から選択される核を有する。
【０１０７】
組換え型：組換え型核酸分子またはタンパク質配列は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの人工的組み合わせによって作出される配列、さもなければ配列の別個のセグメントを有するものである。特定の例において、この人工的組み合わせは、化学合成によって、または核酸もしくはタンパク質配列の単離セグメントの人為的操作、例えば、遺伝子工学技術によって達成される。特定の例において、ｄｓＤＮＡから成る分子ロッドは、組換え型分子である。
【０１０８】
逆転写酵素：一般にＲＮＡを使用するが、鋳型としてＤＮＡを使用することができる鋳型特異的ＤＮＡポリメラーゼ。
【０１０９】
標的核酸分子に可逆的に結合：可逆平衡の状態で存在する一時的結合。例えば、ポリメラーゼの活性部位で相補体へのヌクレオチドの一過性対合を含み、ヌクレオチドは、ポリメラーゼによって形成される核酸分子にヌクレオチドを共有結合的に組み込む化学反応（加水分解または共有結合形成など）を受けない。
【０１１０】
ＲＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡ鋳型に相補的なリボヌクレオチド前駆体の重合を触媒する酵素。
【０１１１】
ロッドまたは分子ロッド：分子リンカーの一部など、ナノプローブの一部の剛性を高めるために、ナノプローブの分子リンカー内に含むことができる構造。分子ロッドは、標的核酸分子の非存在下で、化学的部分、重合剤、またはそれらの組み合わせの相互作用を減少させるように十分な剛性を有する。さらに、分子ロッドは、標的生体分子の存在下で、化学的部分、重合剤、またはそれらの組み合わせが相互に作用することを可能にする長さである。
【０１１２】
特定の例において、分子ロッドは、持続長よりも短い長さを有する分子リンカー内に存在し、それによって、標的生体分子の非存在下で、化学的部分、重合剤、またはそれらの組み合わせの相互作用を有意に減少させる。一例において、ｄｓＤＮＡから成る分子ロッドは、ｄｓＤＮＡの持続長、約１５０のヌクレオチドより短い、１０〜１４０のヌクレオチドの長さを有する。
【０１１３】
例示的な分子ロッドには、ｄｓＤＮＡ分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、カーボンナノチューブ、ロックト核酸分子（ＬＮＡ）、微小管、バクテリア、線形ウイルス粒子、ウイルス尾部繊維、またはその他のタンパク質構造（αヘリックスもしくはβバレルを含むタンパク質成分、またはロイシンジッパー構造などのその他のタンパク質構造など）が含まれるが、これらに限定されるものではない。分子ロッドは、ＤＮＡから構築される立方体または八面体など、三次元分子構造の一部であってもよい（例えば、Ｓｅｅｍａｎ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２９０：６４−９および７２−５，２００４を参照）。特定の例において、分子ロッドは、１０〜１５０のヌクレオチド、１０〜１４０のヌクレオチド、２０〜１００のヌクレオチド、２０〜５０のヌクレオチド、２０〜４０のヌクレオチド、３０〜５０のヌクレオチド、または約２０、３０、または４０のヌクレオチドなど、少なくとも１０のヌクレオチド、少なくとも３５のヌクレオチド、または１５０のヌクレオチドまたはそれ未満のｄｓＤＮＡ分子である。
【０１１４】
試料：核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）など、生体分子を含む試料など生物検体。例示的な試料は、末梢血（または血清などその一部）、尿、唾液、組織生検、頬のぬぐい液、外科標本、微細針吸引物、羊水穿刺試料、および剖検材料に存在するものなど、対象からの細胞または細胞溶解物を含むものである。
【０１１５】
一連のシグナル：相補的ヌクレオチドとの化学的部分の対合を示す、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと化学的部分（ヌクレオチド類似体など）との特異的結合により放出される、光またはスペクトルシグナルなどの電磁シグナルを含む放出シグナルの順次的連続である。特定の例において、一連のシグナルは、一連の受容体フルオロフォア放出シグナルであり、それぞれの一意的なシグナルは、特定の化学的部分に関連する。
【０１１６】
シグナル：情報を提供する物理的性質に備わる検出可能な変化またはインパルス。開示する方法との関連において、例には、光、例えば、特定の量または波長の光などの電磁シグナルが含まれる。特定の例において、シグナルは、光の消失など、物理事象の消滅である。特性シグナルは、ナノプローブ上の特定のヌクレオチド類似体が、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと特異的に結合する場合に期待される特定のシグナルである。例えば、特性シグナルは、ヌクレオチド類似体に結合される、または関連するフルオロフォアによって予想することができる、蛍光タグを付けられた非加水分解性ヌクレオチド類似体から放出される、結果として生じるシグナルであってもよい。
【０１１７】
対象：ヒトならびにウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ、爬虫類および魚などの動物の対象を含む、多細胞性脊椎動物の生命のある生物。
【０１１８】
基板：その他の分子（タンパク質または核酸分子など）を結合または内部に埋め込むことができる材料または表面。特定の例において、基板は、ガラスおよび石英を含む光透過性の生体適合性材料から作出される。例えば、基板は、長さ３ｃｍ×幅１ｃｍ×厚さ０．２５ｃｍのガラス顕微鏡用スライドであってもよい。さらにその他の例において、例えば、ＬＲＥＴが使用される場合、基板は不透明であってもよい。一例において、基板は、ゲルマトリクスである。特定の例において、基板は、放物線フローチャネルプロファイルを有するマイクロ流体デバイスである。
【０１１９】
特定の例において、基板は、その他の分子を結合する前に処理される。例えば、ガラス顕微鏡用スライドを、水中で３０分間超音波処理によって洗浄し、１０％のＮａＯＨ中に３０分間浸し、蒸留水ですすぎ、８０℃で１０分間乾燥または一晩風乾することができる。
【０１２０】
タグ：例えば、分光測光法、フローサイトメトリー、または顕微鏡法によって検出することができる薬剤。例えば、１つまたは複数のタグは、ナノプローブに結合されることができ、それによって核酸分子の配列決定が可能になる。例示的なタグには、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光薬剤、電荷、酵素およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１２１】
テザー：直接的または間接的に、１つまたは複数の化学物質（ヌクレオチド類似体など）を重合剤に連結するために、ナノプローブに含むことができる構造。例えば、１つまたは複数の分子ロッドと組み合わせて、１つまたは複数のテザーは、１つまたは複数の化学物質（ヌクレオチド類似体など）を重合剤に連結するために使用することができる。理想的には、テザーは、標的核酸分子の存在下で、化学物質（ヌクレオチド類似体など）、重合剤、タグ、またはそれらの組み合わせに相互作用させると同時に、テザーが、それ自体と、またはナノプローブのその他の要素とからまる可能性を減少させる長さである。
【０１２２】
例示的なテザーには、ＰＥＧなどの水溶性長連鎖分子、ペプチド（少なくとも３０のアミノ酸のペプチド、例えば、ヘリカーゼをヌクレアーゼに結合するＲｅｃＢタンパク質の７０アミノ酸長の柔軟性のあるテザーの少なくとも３０の連続アミノ酸など（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４３２：１８７−９３，２００４））、糖鎖（２０００〜１４０００の残基など）、脱塩基リン酸ジエステルスペーサー（ＩＤＴ５’ｄＳｐａｃｅｒなど）、炭水化物鎖（少なくとも１０の糖分子）、およびポリカプロラクトン鎖（少なくとも１０のモノマーなど）が含まれる。特定の例において、テザーは、ＰＥＧ、例えば、約２３−１６４Å長のＰＥＧから成る。
【０１２３】
標的核酸配列または分子：事前に選択した核酸分子、例えば、検出または配列が所望されるもの。核酸分子は、精製した形態である必要はない。その他の種々の生体分子もまた、標的核酸分子内に存在することができる。例えば、標的核酸分子は、細胞または生体試料（その他の核酸分子およびタンパク質を含むことができる）内に存在することができる。
【０１２４】
形質転換：形質転換細胞は、分子生物学技術によって核酸分子を導入された細胞である。本明細書で使用される限り、形質転換という用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、注入、およびパーティクルガン加速による裸のＤＮＡの導入を含み、核酸分子をかかる細胞に導入することができるすべての技術を含む。特定の例において、細胞は、本明細書に開示するプローブにより形質転換される。
【０１２５】
十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を画定するために使用される句。
【０１２６】
例には、例えば、１つまたは複数の突然変異を含む標的核酸分子などの標的核酸分子が、試料内に存在するかどうか決定するために、試料内の標的核酸分子の配列決定を可能にするのに十分な条件下で、プローブを試料に接触させる工程が含まれる。
【０１２７】
一意的な放出シグナル：特定のフルオロフォアのための放出スペクトルなど、特定の事象についての情報を伝達する放出シグナルであり、その他のシグナル（その他の放出スペクトルシグナルなど）と区別することができる。標的核酸分子上の相補的塩基との化学的部分の対合が、一意的なシグナルまたはシグナルの組み合わせ（異なる一意的な波長で放出するフルオロフォアなど）をもたらすように、開示する方法に関連する例は、１つまたは複数の個別のフルオロフォアまたはその他のタグを、それぞれの型の化学的部分（Ａ、Ｔ／Ｕ、ＣまたはＧ非加水分解性ヌクレオチド類似体など）に関連させる工程を含む。それぞれの化学的部分は、例では、化学的部分に関連するタグに基づく一意的な放出シグナルを有する。このシグナルは、どの型の化学的部分（Ａ、Ｔ／Ｕ、ＣまたはＧ非加水分解性ヌクレオチド類似体など）が、標的核酸内の相補的ヌクレオチドと対になったか決定するために使用することができ、これらのシグナルは、組み合わせて核酸配列を示す。
【０１２８】
シグナルは、異なる波長のみでなく、一意的なスペクトルを形成する、種々の波長で異なる強度を特徴とすることができる。特に、波長が同じ集まりを有する２つのシグナルは、それらが、特定の波長でいくつかの異なる強度を有する場合に区別することができる。
【０１２９】
一般戦略
標的核酸分子を配列決定するために使用できる、開示するナノプローブは、重合剤、および標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに結合することができる１つまたは複数の化学的部分を離間する１つまたは複数の分子リンカーを含む。一般に、化学的部分は、伸長している核酸分子に永久に組み込むことができない。リンカーは、標的核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分とを所望の距離だけ離間して実質上維持するが、標的生体分子の存在下で、それらが実質上相互に作用しうる、長さおよび柔軟性の組み合わせを有する。さらに、分子リンカーは、分子リンカー同士の絡み合いを実質上回避し、リンカーの末端の化学的部分の絡み合いを実質上回避する。表１は、使用可能な重合剤および化学的部分のいくつかの組み合わせを例示する。さらに、重合剤および化学的部分に関連することができる例示的なタグを提供する。
【０１３０】
（表１）例示的な重合剤／化学的部分／タグの組み合わせ
2009519041.tif 000003
【０１３１】
プローブは、最小距離の外側に重合剤と化学的部分との潜在的な相互作用を維持のみする必要がある。さらに、分子成分の場所が、統計的確率の観点のみから表すことができるので、相互作用の非存在は、絶対的ではなく、代わりに、重合剤と化学的部分との間（および化学的部分自体の間）の望ましくない相互作用を所望のレベルまで減少させる方法において、動的分子運動の制限を意味することが理解される。プライマーの存在下で、重合剤が標的核酸分子に結合すると、分子リンカーの柔軟性は、重合剤と化学的部分とが相互に作用するのに十分となる（例えば、非加水分解性ヌクレオチド類似体と、ポリメラーゼの活性部位との相互作用）。
【０１３２】
核酸分子を配列決定するためのナノプローブ
本開示は、標的核酸分子を配列決定するためのナノプローブを提供する。特定の例において、開示するナノプローブは、インビトロ、エクスビボ、インサイチュー、またはインビボでも使用される。「Ｍｅｄｕｓａ」プローブと称されるプローブには、重合剤、および重合剤上で離間する１つまたは複数の分子リンカーが含まれ、リンカーは、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと特異的に結合することによって、リンカーから分離することなく、核酸分子の鋳型鎖と可逆的に結合することができる化学的部分を有する。標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドへのリンカー上の化学的部分の可逆的な組み込みは、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との対合を示す、特性シグナルの放出（供与体フルオロフォア放出における減少、または受容体フルオロフォア放出における増加）によって示される。
【０１３３】
ポリメラーゼなどの重合剤は、標的核酸分子に結合することができ、相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように伸長する相補的核酸分子の合成を促進することができる活性部位を含む。特定の例において、相補的ヌクレオチドは、標的核酸分子に相補的な伸長している核酸分子に永久に組み込まれることができる加水分解性ヌクレオチドである。例えば、これは、標的核酸分子に可逆的に結合する場合があるが（例えば、相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成することによって）、伸長している相補的核酸分子に永久に組み込むことができない、化学的部分（非加水分解性ヌクレオチド類似体、例えば、非加水分解性ｄＮＴＰなど）と対照的である。
【０１３４】
リンカーから分離することなく、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる化学的部分は、標的核酸分子に相補的な伸長している核酸分子に永久に組み込まれるようにならないものである。例えば、化学的部分は、標的核酸分子の鋳型鎖との１つまたは複数の非共有化学結合（水素結合など）を形成することがあるが、かかる結合は、伸長している鎖に共有結合的に組み込まれる加水分解性ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰなど）、相補的鎖の伸長を可能にするヌクレオチドとの化学的部分の置換を可能にする速度の可逆平衡の状態で存在する。化学的部分は、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと特異的におよび可逆的に結合することができ、化学的部分に関連する受容体標識を、受容体標識を刺激する供与体標識に十分に接近させる。かかる対合は、対になる特定の化学的部分を特徴とするシグナルの放出をもたらすことができる。例えば、結合が、化学的部分の拡散に関係するので、異なる化学的部分のすべては、同一の速度で重合剤の活性部位に最初に結合することがある。しかしながら、異なる化学的部分の放出の動力学が、形成される結合の数および強度に関係するので、標的鎖内の曝露ヌクレオチドに相補的な化学的部分は、その他の化学的部分より強力に結合し、それより長い間活性部位に結合を保つことになる。この結合時間の増加は、対になる特定の化学的部分を特徴とするシグナルの生成および検出を可能にする。
【０１３５】
かかる化学的部分の特定の例は、ヌクレオチド類似体、例えば、非加水分解性ヌクレオチド類似体である。化学的部分は、標的核酸鎖内の相補的ヌクレオチドと対になるために、重合剤の活性部位と相互に作用する化学的部分の能力、および伸長している核酸分子に可逆的に非共有結合する（通常、積み重ねによる）能力を実質上妨害しない任意の手段によって分子リンカーに結合することができる。例えば、化学的部分が、ヌクレオチド類似体である場合、塩基、糖、またはリン酸を介して、分子リンカーに結合することができる。特定の例において、化学的部分がモノヌクレオチドである場合、塩基または３’リボース炭素上の分子リンカーに結合することができる。
【０１３６】
特定の例において、化学的部分を重合剤に結合するのに使用される分子リンカーは、複数の点で重合剤に結合される、複数の個別のリンカーを含む。例えば、それぞれが、標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる、異なる型の化学的部分を有する、少なくとも４つの独立した分子リンカーは、重合剤に結合することができる。特定の例において、それぞれが、標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる、特定の化学的部分に関連する、異なるフルオロフォアまたはフルオロフォアの組み合わせを有する、少なくとも８つの独立した分子リンカーは、重合剤に結合することができる。例えば、８つのリンカーのうちの２つは、ｄＣＴＰを含むことができ、それぞれのｄＣＴＰが、検出可能な別個のシグナルを生成するように、それぞれのｄＣＴＰは、異なる受容体フルオロフォアまたはフルオロフォアの組み合わせに関連する。これは、塩基、この場合はＧの連続が、より容易に区別されることを可能にする。しかしながらその他の例において、分子リンカーは、例えば自由回転を可能とし、それによってリンカーの末端上の化学的部分が、重合剤活性部位への平等なアクセスを有することを可能にする単一の共有結合によって、ある点で重合剤に結合される。例えば、分子リンカーは、１つの場所で重合剤に連結および結合することができる。特定の例において、分子リンカーは、その他の薬剤（リンカーなど）に連結および結合され、次いで重合剤に結合される。化学的部分を重合剤に結合するために使用される分子リンカーは、重合剤に結合される、分岐構造を形成する複数の分子リンカーを含むことができる。例えば、それぞれの分岐は、標的核酸分子内の異なるヌクレオチドと特異的に結合することができる異なる化学的部分を有することができる。特定の例において、分岐構造は、少なくとも４つの分岐を含み、それぞれの分岐は、異なる化学的部分を有する。一部の例において、分岐分子リンカーは、単一の点で重合剤に結合する。
【０１３７】
特定の例において重合剤はタグに関連し、化学的部分のそれぞれは、リンカーが有する特定の化学的部分を識別するタグに関連し、重合剤に関連するタグと、化学的部分に関連するタグとの相互作用は、相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出を誘発する。プローブの要素とのタグの関連は、該要素とのタグの直接的結合を含むことができる。例えば、重合剤は、ＧＦＰ−ポリメラーゼ融合タンパク質であってもよい。同様に、化学的部分が、ヌクレオチド類似体である場合、タグは、ヌクレオチド類似体の塩基、糖、またはリン酸に結合することができる。理想的には、プローブの重合剤または化学的部分へのタグの直接的または間接的結合は、その要素の生物学的活性を有意に抑制しない。例えば、理想的には、重合剤へのタグの結合は、ポリメラーゼ活性を２０％超低下させない。その他の例において、重合剤または化学的部分へのタグの関連は、その要素へのタグの直接的結合を必要としない。例えば、タグは、分子リンカー（例えば、テザー上またはロッド上）など、プローブのその他の部分上にあってもよい。かかる例において、タグは、重合剤の活性部位での化学的部分の検出、および化学的部分と相補的ヌクレオチドとの対合を可能とするように、重合剤または化学的部分へ十分に接近する。
【０１３８】
特定の例において、重合剤に関連するタグは、それぞれの化学的部分に関連するタグにより供与体−受容体の対を形成し、それによって、供与体−受容体の対の相互作用は、特性シグナルの放出を刺激する。一部の例において、供与体は、受容体が特性シグナルを放出するために反応する刺激を放出するために、外部刺激（レーザーまたは化学発光分子など）を加えることによって刺激される。例えば、重合剤に関連するタグは、供与体フルオロフォアであってもよく、化学的部分に関連するタグのそれぞれは、特定の化学的部分に対して一意的な放出シグナルを放出する１つまたは複数の受容体フルオロフォアを含む。
【０１３９】
特定の例において、分子リンカーは、ヌクレオチドなどの線状ポリマーを含む。例えば、分子リンカーは、テザー、ロッド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。分子リンカーは、リンカーの絡み合いを抑制するために十分な距離をおいて重合剤の周囲で離間することができ、化学的部分が重合剤の活性部位に到達するほど十分に長い。さらに、分子リンカーは、標的核酸鎖の非存在下で、重合剤および化学的部分の実質上の絡み合いを回避するように、重合剤および化学的部分を互いから十分な距離をおいて離間して維持することができる。一部の例において、長さが少なくとも持続長と同じくらい長い分子ロッド、例えば、１０〜１５０のヌクレオチドの長さを有するｄｓＤＮＡロッドなど、分子リンカーの少なくとも一部（ロッド）は、標的核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分との相互作用を減少させるのに十分な剛性を有する。特定の例において、分子ロッドは、２０〜１００のヌクレオチド、例えば、４０のヌクレオチドなど、１０から１４０のヌクレオチドのｄｓＤＮＡ配列である。特定の例において、分子ロッドは、１２０オングストローム（Å）長である。
【０１４０】
例えば、分子リンカーの剛性を高めるために、分子リンカーは、分子ロッドによって連結される少なくとも２つのテザーなど、１つまたは複数の分子ロッドを含むことができる。二本鎖ＤＮＡ分子など、分子ロッドの包含は、プローブの剛性を高めるために含まれてもよく、さらに官能基を分離することもできる。例えば、両端にテザーを有する分子ロッドを含む分子リンカーは、化学的部分および重合剤が、ブラウン運動によって移動する少なくとも２つの点を有することができる。すなわち、それぞれが、テザーによって可能となるように、ロッドの末端に対して、化学的部分の可能性のあるすべての場所を表す、少なくとも２つの雲球体があることになる。これらの球体は、ある程度まで交差する。標的核酸分子の非存在下で、ナノプローブは、実質上交差しない球体を有することができる。一部の例において、分子ロッドの２つの末端間の距離は、２つのテザーの長さの合計に満たない。特定の例において、分子ロッドは、標的核酸分子の非存在下で、ナノプローブ上の供与体および受容体フルオロフォア間のＦＲＥＴを減少させるために使用される。
【０１４１】
本明細書に開示する重合剤は、標的核酸分子に結合することができ、かつ相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように伸長する相補的核酸分子の合成を促進することができる活性部位を含む。さらに、重合剤は、絡み合いを有意に回避するのに十分な距離をおいて、重合剤上で離間される１つまたは複数の分子リンカーを含む。それぞれのリンカーは、リンカーから分離することなく、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる、異なる化学的部分（非加水分解性ヌクレオチド類似体など）を有する。重合剤は、例えば、重合剤に関連するタグ、およびリンカーが有する化学的部分を識別するそれぞれの化学的部分に関連するタグなどのタグをさらに含むことができる。ポリメラーゼに関連するタグは、リンカーが有する化学的部分を識別する特性シグナルを放出するために、化学的部分に関連するそれぞれのタグを相互に作用することができる。
【０１４２】
上述のとおり、特定の例において、重合剤（例えば、重合剤に関連するタグ）および化学的部分が、標的生体分子の非存在下で、実質上相互に作用しないように、分子リンカーの長さは、重合剤および化学的部分を互いから十分に離間して維持するものである。例えば、標的分子の存在下または非存在下で、プローブの一部がプローブの１つまたは複数の他の部分と相互に作用するかどうか決定するための方法は、当技術分野では公知である。一例において、特定の長さの分子リンカーが適切であるかどうか決定するために、特定の分子リンカー長を有する本開示のプローブは、本明細書に開示する方法を使用して生成される。特定の例において、複数のプローブが生成され、それぞれは、異なる分子リンカー長を有する。使用するのに適切な分子リンカーの長さを識別するために、供与体フルオロフォアは、分子リンカーの一末端で重合剤に結合され、適切な受容体フルオロフォアは、分子リンカーのもう一方の末端で化学的部分に結合される。特定の例において、供与体および受容体は、ＦＲＥＴ対である。分子リンカーの末端が、互いと相互に作用することができるかどうか決定するために、分子リンカーは、標的核酸分子および適切なプライマーの存在下または非存在下で溶液中に入れることができ、例えば分光測光法または蛍光顕微鏡検査法によって受容体放出蛍光が検出される。特定の例において、標的核酸分子およびプライマーが存在する場合にのみ有意な受容体放出蛍光（例えば、所定の閾値を超える）を生成し、標的核酸分子およびプライマーの非存在下では、バックグラウンドレベルの受容体放出蛍光しか生成しない分子リンカーの長さは、本開示のプローブで使用することができる。対照的に、特定の例において、標的核酸分子およびプライマーが存在する場合には有意な受容体放出蛍光を生成せず、または標的核酸分子およびプライマーの非存在下ではバックグラウンドを有意に超える受容体放出蛍光を生成する分子リンカーの長さは、本開示のプローブには使用されない。一部の実施例において、所望の結果を生み出す分子リンカーの長さは、使用する特定のＦＲＥＴ対に応じて変化することができる。例えば、ＧＦＰ／フルオレセインＦＲＥＴ対がプローブの一部である場合に使用される分子リンカーの長さは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０／ＢＯＤＩＰＹ６３０ＦＲＥＴ対が、プローブの一部である場合に使用される分子リンカーの長さと異なる場合がある。
【０１４３】
標的核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分との相互作用を減少させるために、分子リンカー（またはその部分）は、（標的核酸分子の存在下または非存在下における、化学的部分自体の間での相互作用と同様に）標的核酸分子の非存在下で、分子リンカーが、重合剤（重合剤に関連するタグ）と化学的部分との相互作用を減少させるのに十分に剛性を有することができる持続長を有することができる。テザーなどの分子リンカーのその他の部分は、標的核酸分子の存在下で、重合剤（そのタグなど）と化学的部分との相互作用（または重合剤と標的核酸分子を有する化学的部分との相互作用）を可能にする。
【０１４４】
長さの差異が、望ましくない重合剤と化学的部分との相互作用（または化学的部分自体の間の相互作用）を引き起こすのに不十分である限り、分子リンカーの全長は、分子リンカーの特定の要素に対する持続長と同一であっても異なっていてもよい。例えば、分子リンカーが、特定の持続長を有する分子ロッドを含む場合、分子リンカーは、その持続長より短くてもまたは長くてもよい。さらに、分子ロッド長それ自体は、分子ロッドを生成するために使用されるポリマーの持続長より短くてもまたは長くてもよい。特定の例において、分子リンカーは、分子ロッドを含み、ロッドの全長は、分子ロッドを含む分子の持続長より短い（分子ロッドを含む分子の持続長の０．ｌ倍、０．５倍、または１倍など）。さらにその他の特定の例において、リンカーの長さは、その要素のうちのいずれか１つの持続長より長くてもまたは短くてもよい。例えば、分子ロッドを含む分子リンカーに対して、分子リンカーの全長はせいぜい、分子ロッドを含む分子の持続長より５倍短いまたは長い（分子ロッドを含む分子リンカーの持続長の１〜５倍、１〜４倍、または１〜３倍など）。一例において、分子ロッドは、ｄｓＤＮＡ（持続長は４００〜５００Å）から成り、分子ロッドの長さは、４００〜５００Å（５５０〜７００Åまたは５５０〜１０００Åなど）より長い、または持続長（１００〜３５０Åまたは２００〜３５０Åなど）より短い。
【０１４５】
当業者は、１つの持続長において、ロッドの遠末端は多くの場合、それでも元の方向と同じ方向（６８．４０度）に実質上向いており、この長さのロッド、従って柔軟性は、有用な機能的剛性をそれでも提供することができることを認識するであろう。持続長より長いロッドは、いくつかの用途において受け入れることができる、それ以上の柔軟性を提供する。その他の用途において、リンカーの比較的長い部分は、ブラウン運動、および結合できる標的分子の存在に応じて、部分が一体となる、またはならないようにさせる分子テザーの役割をするために十分に遠く離間するとはいえ、単一のリンカーは、均一の種類の単一の分子から成り（持続長より実質上長い、１０００ｂｐのｄｓＤＮＡなど）、そのリンカーのある部分は、局所的に分子ロッドの役割をし、局所的にナノプローブ機能を提供できるほど十分に近い（例えば、４０ｂｐ）。ＤＮＡのさらなる一部は、例えば、エンハンサー、活性化因子またはリプレッサーを供給するために「ループ」になることができるが、かかる状況は、局所転写因子が、互いに基本的に剛性の有する位置で、ＤＮＡに結合する場合に（例えば、ＧａＩＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓｅｍｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１８：１８９８−９０７，２００４のように）発生する。かかるナノプローブ構造は可能であるが、一般に、本明細書に記載の構造は、持続長より実質上大きくない分子ロッドと、対応する持続長より実質上長い分子テザーとを明確に区別する。実際に見られるｄｓＤＮＡ転写制御機構とは異なり、一般に、本明細書に記載のナノプローブにおいて、分子ロッドおよびテザーは、例えば、ＰＥＧを有するｄｓＤＮＡのように、実質上異なる持続長を有する異なる種類の分子を結合させることによって構築される。
【０１４６】
持続長は、組成に応じて変化する。例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子の持続長は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子のものおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と異なる。例えば、ｄｓＤＮＡは、持続長が４００〜５００Åである。特定の例において、ｓｓＤＮＡは、持続長が約４０Åである。特定の例において、ＰＥＧは、持続長が約３．８±０．０２Åである（Ｋｉｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１：１２３−８，２０００）。
【０１４７】
標的核酸分子の非存在下で、重合剤と化学的部分との相互作用を実質上回避するために（標的核酸分子の存在下または非存在下で、化学的部分自体の間の相互作用と同様に）、かつ標的生体分子の存在下で、重合剤と化学的部分との相互作用が可能となるように、リンカーの長さは、使用される特定の供与体および受容体フルオロフォアに対して、２２から９０Åの距離など、少なくとも、官能基を少なくともフォスターの半径だけ離間して維持するのに十分である。一部の例において、リンカーの長さは、１０から１０００Åの距離など、重合剤と化学的部分との電荷を分離するのに十分である。特定の例において、分子リンカーの全長は、１０から３００Å、１０から２００Å、２０から２００Å、２０から１８７Å、２０から１５０Å、６０から１２０Å、または６０から２００Åなど、約１０から５００Åである。
【０１４８】
分子リンカーの例には、テザー、分子ロッド、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、分子リンカーは、テザーによって連結される複数の分子ロッド、または分子ロッドによって連結される複数のテザーを含むことができる。ナノプローブ１０が、分子リンカー２０によって連結され、離間される重合剤１２および化学的部分２８を含む、特定の一例を図１Ａに示し、分子リンカー２０は、テザー６８、７０によって連結される分子ロッド６６から構成される。特定の例において、分子ロッドは、約１００から２００Å（約１２０〜１４０Åなど）であり、それぞれのテザーは、約２３から１８７Å（約６０Åなど）である。
【０１４９】
重合剤および化学的部分は、互いに、また標的核酸分子と相互に作用することができ、検出可能なシグナルなど、所定の反応を提供する。重合剤および化学的部分が、標的分子の非存在下で、反応を提供するために相互に作用しないように、重合剤および化学的部分は、分子リンカーによって、空間的に分離した方向に維持することができる。しかしながら、分子リンカーは、重合剤および化学的部分に、所定の条件下で、相互に作用するために互いに十分に接近させ、検出可能なシグナルなどの所定の反応を引き起こすことを可能にする。
【０１５０】
一例において、分子リンカーのそれぞれは、同じ長さであるか、またはほぼ同一の長さである。その他の例において、２つ以上の分子リンカーは、異なる長さである。多様な長さの分子リンカーを有するプローブは、化学的部分の結合頻度を制御するために使用することができる。例えば、ＡおよびＴ非加水分解性ヌクレオチド類似体が、比較的短い分子リンカーに結合されるが、ＣおよびＧ非加水分解性ヌクレオチド類似体が、比較的長い分子リンカーに結合される場合、ＡおよびＴヌクレオチド類似体にとって、重合剤の活性部位に到達し、それによって、より強い放出シグナルを生成することはより容易となる。
【０１５１】
重合剤
Ｍｅｄｕｓａプローブは、重合剤を含む。重合剤は、線状鎖を形成する化学反応で、モノマー分子（ヌクレオチドなど）を一緒に反応させることができる化合物（酵素など）である。
【０１５２】
重合剤の特定の例には、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、およびリボソームが含まれる。ポリメラーゼの選択は、配列決定される核酸に依存する。例えば、鋳型が、一本鎖ＤＮＡ分子である場合、ＤＮＡ指令のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを使用することができ、鋳型が、一本鎖ＲＮＡ分子である場合、逆転写酵素（ＲＮＡ指令のＤＮＡポリメラーゼなど）を使用することができる。
【０１５３】
限定されることがないポリメラーゼの特定の例には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウフラグメントなど）、Ｔａｑポリメラーゼ、逆転写酵素（ＨＩＶ−Ｉ  ＲＴ、例えば、Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２５２５：９，１９８８に開示される一本鎖ＨＩＶ  ＲＴなど）、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、および麦芽ＲＮＡポリメラーゼＩＩが含まれる。
【０１５４】
一例において、ポリメラーゼは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方のために配列を提供するために使用することができるＨＩＶ逆転写酵素であり、化学的部分は、αとβリン酸との間の酸素が、窒素と置換されるヌクレオチド類似体である。かかるヌクレオチド類似体は、標的核酸分子上の相補的ヌクレオチドと結合することができるが、伸長している相補的鎖に組み込むことができない。
【０１５５】
一例において、ポリメラーゼは、修飾ポリメラーゼである。かかる修飾は、ポリメラーゼの生物学的活性を変化させる、例えば、基質の特異性、前進性、または精度を変化させるために使用することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの正確性は、突然変異によって向上させることができる（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８１７５−８４，１９９９）。例えば、かかるポリメラーゼは、折り畳まれていないクロマチン領域と同様に、二本鎖ゲノムＤＮＡを配列決定するために使用することができる。その他の例において、ＤＮＡポリメラーゼの前進性は、ポリメラーゼドメインを非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質（Ｓｓｏ７ｄなど）に共有結合的に連結することによって改善することができる（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（３）：１１９７−２０７，２００４参照）。その他の例において、ＨＩＶ−１のＲＴは、酵素のヌクレオチド結合特異性を変化させるために、Ｋ６５の位置に突然変異を含む。
【０１５６】
本明細書に記載するように、特定の例において、重合剤は、供与体フルオロフォアなどのタグを含む。タグは、ポリメラーゼに直接的に結合される必要はないが（例えば、リンカーを介してポリメラーゼに結合される）、特定の例において、タグはポリメラーゼに結合される。例えば、ＧＦＰ−ポリメラーゼ融合タンパク質は、標準的分子生物学的方法を使用して生成することができる（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４６７１２−９，２００２；およびＫｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１９１５−２０，１９９９参照）。
【０１５７】
従って、ポリメラーゼは、タグの結合を可能にするために、修飾することができる（例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む）。例えば、１つまたは複数のアミノ酸は、タグの結合を可能にするために、当技術分野で公知の標準的方法（ＰＣＲを使用した部位特異的突然変異誘発法など）を使用してＣｙｓと置換することができる。理想的には、ポリメラーゼのアミノ酸配列を変化させることは、相補的核酸分子の合成を促進する能力など、ポリメラーゼの生物学的活性を有意に妨害しない。必要に応じて、溶媒に影響をうけやすいシステイン残基は、セリン残基と置換することができる。例えば、ＨＩＶ  ＲＴ  ｐ６６サブユニットは、フルオロフォアＡｌｅｘａ４８８など、これらの位置でタグの結合を可能にするために、Ｋ２８７ＣまたはＷ２４Ｃに突然変異させることができる（例えば、Ｒｏｔｈｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００：１６５５−６０，２００３およびＫｅｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３０１：１０２９−３９；２０００参照）。
【０１５８】
特定の例において、重合剤は、システイン２８７でＲＴに結合される供与体フルオロフォアを有する突然変異体ＨＩＶ−１  ＲＴ（Ｋ２８７Ｃ）−Ｔｕｓ融合タンパク質である。
【０１５９】
一例において、重合剤は、ストレプトアビジンを含む融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、標準的分子生物学的方法を使用して生成することができる。分子リンカーへのビオチンの結合は、１つまたは複数の分子リンカーをストレプトアビジン−ポリメラーゼ融合タンパク質に結合するために使用することができる。
【０１６０】
一例において、ポリメラーゼは、供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアの両方を含む。両方のフルオロフォアを含むことによって、ポリメラーゼの立体構造内の運動または変化は、例えば、タイミングシグナルのようにモニタリングすることができる。特定の例において、供与体フルオロフォアは、ポリメラーゼの一面（「フィンガー」など）に結合され、受容体フルオロフォアは、ポリメラーゼのその他の面（「サム（ｔｈｕｍｂ）」など）に結合される。ポリメラーゼが閉状態になるに従い、供与体および受容体フルオロフォアは、供与体が受容体を励起し、検出可能な受容体放出シグナルの生成（または検出可能な供与体放出シグナルの減少）をもたらすように、十分に接近させる。ポリメラーゼが開状態になるに従い、供与体が、十分に受容体を励起できず、検出可能な受容体放出シグナルの減少（または検出可能な供与体放出シグナルの増加）をもたらすように、供与体および受容体フルオロフォアは、十分に離間される。受容体からの放出がモニタリングされる場合、シグナルの増加、続く放出シグナルの減少（または供与体発光がモニタリングされる場合は、逆もまた同様）は、タイミングシグナルとして使用することができる。
【０１６１】
特定の例において、供与体フルオロフォアは、ＥＧＦＰ（励起４８４ｎｍ；放出５１０ｎｍ）であり、受容体フルオロフォアは、ＥＹＦＰ（励起５１２ｎｍ；放出５２９ｎｍ）であり、かかる標識ポリメラーゼを含むプローブの４８０ｎｍでの照射は、５１２ｎｍでＥＹＦＰを励起する、５１０ｎｍでのＥＧＦＰの放出をもたらす。
【０１６２】
一例において、ＨＴＶ  ＲＴ  ｐ６６サブユニットは、Ｋ２８７Ｃへの供与体フルオロフォアの結合、およびＷ２４Ｃへの受容体フルオロフォアの結合（または逆もまた同様）を可能にするために、Ｋ２８７ＣまたはＷ２４Ｃへ突然変異させる。これらの２つのアミノ酸残基は、それぞれ、ポリメラーゼのフィンガーおよびサム上にあり、従って、それらの間の距離は、ポリメラーゼの状態に応じて変化することができる。従って、かかるポリメラーゼは、タイミングシグナルを取得するために使用することができる。（２４または２８７の位置の周囲のエピトープに対する抗体は、１つのフルオロフォアが結合されている一方で、他方の結合を阻止するために使用することができる。あるいは、その他の化学的性質は、供与体および受容体フルオロフォアを一意的に結合するために使用することも可能である。）
【０１６３】
表２は、空間移動度が、通常のポリメラーゼ活性の間に最大限度まで変化するＫｌｅｎｔａｑ  １  ＤＮＡポリメラーゼ上のアミノ酸を示す（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯＪ．１７：７５１４−２５，１９９８）。かかる残基は、供与体または受容体フルオロフォアが結合することができる残基の例である。例えば、ＴＲＰ２４は、フィンガー上にあり、ＬＹＳ２８７は、ＨＩＶ−１  ＲＴのサム上にある。ポリメラーゼの開状態から閉状態へ移行の間、それらの距離は、約１５Å変化する。
【０１６４】
（表２）空間移動度が、Ｋｌｅｎｔａｑ  １  ＤＮＡポリメラーゼで変化するアミノ酸
2009519041.tif 000004
【０１６５】
化学的部分
上述のように、分子リンカーを介してポリメラーゼに連結される化学的部分は、標的核酸分子内の曝露相補的ヌクレオチドと対合することによって、リンカーから分離されることなく、鋳型核酸分子に結合することができる薬剤である。例えば、化学的部分は、伸長している相補的鎖に永久に組み込まれることなく、検出可能なシグナルを生成するために十分な時間、ポリメラーゼ活性部位に入る。化学的部分は、活性部位との１つまたは複数の化学結合、伸長している相補的鎖との塩基対、および鋳型核酸との結合を形成することがあるが、かかる結合は、加水分解性ヌクレオチドによる化学的部分の置換を可能にするように可逆的であり、加水分解性ヌクレオチドは、伸長している相補的鎖に非可逆的に組み込まれるようになる。これは、重合剤を１つの塩基ごとに前に進める。化学的部分は、リンカーから除去されないため、プローブを再度使用することができる。
【０１６６】
かかる化学的部分の特定の例には、非加水分解性ヌクレオチド類似体（例えば、非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体）などの、ヌクレオチド類似体、例えば、モノヌクレオチドと同様に、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  ＡＭＰＰＮＰ（Ｂ２２３５６）およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  ＧＭＰＰＮＰ（Ｂ２２３５５）などの、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能なものが含まれる。特定の例において、非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体は、非加水分解性であるα−β結合を有する非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体である。
【０１６７】
非加水分解性ヌクレオチド類似体は、市販されている（例えば、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、α，β−メチレン−ＡＴＰ；α，β−Ｎ−ｄＵＴＰ；α，β−Ｃ−ＧＴＰなど４つすべてのｄＮＴＰ塩基のための非加水分解性類似体を販売している）。さらに、αとβ−リン酸との間に−ＮＨ−または−ＣＨ２−基を含む４つすべてのｄＮＴＰ類似体は、（例えば、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって）商業生産が可能である。
【０１６８】
特定の例において、本明細書に開示するナノプローブは、多数のヌクレオチド（加水分解性ヌクレオチドなど）を含み、それによって、内蔵型配列決定プローブを提供する。これにより、配列決定プローブが、配列内の限定された数の塩基を報告できるようになる。ヌクレオチドは、分子リンカー上に存在することができる。例えば、γ−リン酸上に最初から結合されているヌクレオチドが使用されると、配列決定される核酸分子に組み込まれ、従って、その分子リンカーは、配列決定反応にもはや加わることはない。
【０１６９】
テザー
分子リンカーは、プローブに対する柔軟性を提供することができる、１つまたは複数のテザーを含むことができる。理想的には、テザーは、化学的部分の運動を可能にする、例えば、化学的部分が重合剤と、また標的核酸分子（標的核酸分子上の曝露塩基など）と相互に作用するのに十分な柔軟性がある。テザーの長さは、標的核酸分子の非存在下で、化学的部分と重合剤との相互作用を実質上回避し、標的核酸分子の存在下で、化学的部分と重合剤との相互作用が可能になるのに十分であるべきである。しかしながら、テザーは、理想的には、テザーまたは化学的部分の絡み合い（例えば、互いに、または重合剤と）を引き起こすほど長くはない。特定の例において、テザーは、水溶性であり、非毒性である。
【０１７０】
特定の例において、テザーの長さは、標的核酸分子の非存在下で、化学的部分を分離するのに十分長いが、ナノプローブまたは化学的部分のからまりを引き起こすほど長くはなく、化学的部分に標的核酸分子と、および重合剤との相互に作用させるには十分短い。
【０１７１】
テザーとして使用することができる特定の材料の例には、一本鎖ＤＮＡ分子、糖鎖、ペプチド（ＲｅｃＢタンパク質の２つの部分の間の連結部など）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または本明細書に開示する特性を有する任意のその他の柔軟性のあるポリマーが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の例において、テザーは、２つ以上のこれらの薬剤から構成される。特定の例において、テザーはＰＥＧを含み、一部の例においては、ＰＥＧから成る。
【０１７２】
特定の例において、テザーは、２０〜２００Å、２３〜１８７Å、１００〜１４０Å、または７０〜９４Å、例えば１２０Åなど、約１０〜５００Åである。一例において、テザーは、長さが１８７Å未満である。
【０１７３】
特定の例において、テザーは、２〜４つまたは３〜４つのかかるスペーサーなど、長さが２３．４Åである、１８−原子ＰＥＧスペーサーの３から７つのユニットなどのＰＥＧから成る。ＰＥＧは、非毒性で、柔軟性があり、親水性であり、またＤＮＡ合成の間にスペーサーとして挿入することができる（ＳｙｎｔｈｅＧｅｎ，Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【０１７４】
一例において、テザーは、例えば、１０〜３０のヌクレオチド、１０〜２０のヌクレオチドなど、１０〜４０のヌクレオチド、例えば、１０のヌクレオチド、２０のヌクレオチド、または４０のヌクレオチドの長さを有する、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。特定の例において、ｓｓＤＮＡテザーは、その他の核酸鎖にアニーリングすることができ、それによって、柔軟性のあるテザーを剛性のある分子ロッドに変換する。理想的には、配列は、それ自体、官能基、または分析される試料内の核酸配列に特異的にハイブリダイズしないものである。
【０１７５】
一例において、テザーは、糖鎖である（例えば、１０〜７５、１０〜５０、または２０〜４０のなど、１０〜１００の糖成分の長さを有する）。
【０１７６】
一例において、テザーは、電荷付きテザーを含む分子リンカーの絡み合いを緩和するために、電荷（−ＣＯＯ−または−ＮＨ３＋など）を含む。
【０１７７】
分子ロッド
分子リンカーは、標的核酸分子の非存在下で、化学的部分と重合剤との相互作用（または、例えば、分子リンカーの絡み合いに起因する、標的核酸分子の存在下または非存在下で、化学的部分自体の相互作用）を減少させるために、プローブに十分な剛性を提供することができる、１つまたは複数の分子ロッドを含むことができる。しかしながら、ロッドの長さは、標的核酸分子の存在下で、化学的部分と重合剤との相互作用を可能にするのに十分である。一部の例では、ナノプローブ内の分子ロッドの存在は、絡み合いの可能性を軽減し、重合剤の活性部位への化学的部分の結合の速度を増加することができる。
【０１７８】
開示するナノプローブは、少なくとも２つの分子ロッド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の分子ロッドなど、１つまたは複数の分子ロッドを含むことができる。一例において、１つまたは複数の分子ロッドを使用すると、所要のテザーの長さを減少し、それによって、デバイスの費用および大きさを減少させる。
【０１７９】
特定の例において、分子ロッドは、ｄｓＤＮＡ配列である。ｄｓＤＮＡの長さは、標的核酸分子の存在下で、化学的部分と重合剤との相互作用を可能にするが、標的核酸分子の非存在下で、それらの相互作用を減少させるものである。ナノプローブが供与体および受容体フルオロフォアを含む場合、ｄｓＤＮＡの長さは、標的核酸分子の存在下で、フルオロフォアの相互作用を可能にするが、標的核酸分子の非存在下で、それらの相互作用を減少させるものである。特定の例において、ｄｓＤＮＡ分子ロッドは、４００〜５００Åの持続長にほぼ相当する長さである。しかしながら、ロッドが、標的生体分子の非存在下で、官能基の相互作用を減少させ、分子リンカーの有意な絡み合いを引き起こさない限り、当業者は、より短いまたはより長い長さが使用できることを認識するであろう。特定の例において、ｄｓＤＮＡ分子ロッドは、１５０から２００のヌクレオチド、あるいは、１０〜１４０のヌクレオチド、２０〜１４０のヌクレオチド、２０〜１００のヌクレオチド、２０〜５０のヌクレオチド、３０〜５０のヌクレオチド、または例えば３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５のヌクレオチドなどの３０〜４０のヌクレオチドなど、１０〜１５０のヌクレオチドである。特定の例において、ｄｓＤＮＡ分子ロッドは、少なくとも２０のヌクレオチドなど、少なくとも１０のヌクレオチドである。特定の例において、分子ロッドは、４０の塩基のｄｓＤＮＡである。塩基は、厚さ３．３８Åであり、従って、４０の塩基対は、長さ１３５Åであり、典型的なＦＲＥＴの距離よりも長い。特定の例において、ｄｓＤＮＡの配列は、ＮＡＮＥＶプログラムを使用して選ばれる（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８：５４８−５０，２００５）。
【０１８０】
その他の特定の例において、分子ロッドは、ペプチド骨格ＤＮＡ（ペプチド核酸、ＰＮＡ）またはロックト核酸（ＬＮＡ）など、ＤＮＡの修飾体または変異体を含むＤＮＡ分子から構成される。特定の例において、かかるＤＮＡ変異体は、ヘリックス熱安定性およびヌクレアーゼへの耐性を変化させるために使用される。さらにその他の例において、分子ロッドは、カーボンナノチューブ（例えば、長さが１００〜２００Åであるナノチューブ）から構成される。さらにその他の例において、分子ロッドは、バクテリア、ウイルス粒子、またはウイルス尾部繊維を含む。
【０１８１】
分岐分子リンカー
特定の例において、例えば、図１Ｃに示すように、分子リンカーは、分岐構造を形成する複数の部分から構成される。かかる構造は、本明細書に記載の合成ＤＮＡの一本鎖を適切にアニーリングすることによって作製することができる。
【０１８２】
あるいは、５−Ｍｅ−ｄＣ分岐ホスホラミダイトは、オリゴヌクレオチド合成の際に使用可能である。５−Ｍｅ−ｄＣ分岐ホスホラミダイトが、鎖の中央に組み込まれるように、第１の鎖の合成を行うことができる。その後鎖の端部は覆われ、次いで５−Ｍｅ−ｄＣ分岐は、障害物が除去され、次いで合成は、第２の分岐を開始する。これは、Ｙ形状の分子を作製する。かかる２つの分子は、相補的配列を有するように合成できるので、４つのアームによって中心側面で単一ロッドを形成することができる。該アームにおける配列、およびこれらのアームに相補的なその他のオリゴヌクレオチドの設計を適切に選択することによって、図１Ｃに示すような構造を作製することができる。
【０１８３】
タグ
特定の例において、本明細書に開示のナノプローブは、例えば、標的核酸分子の配列決定を可能にするために、検出可能な標識など、１つまたは複数のタグを含む。使用可能な例示的なタグには、フルオロフォア、化学発光薬剤、および電荷が含まれる。特定の例において、標的核酸分子がキャパシタに接近するに従い、電荷の変化が検出される。
【０１８４】
特定の例において、ナノプローブは、受容体フルオロフォアおよび１つまたは複数の供与体フルオロフォアを含む。ナノプローブ上の単一供与体または単一受容体フルオロフォアのみを示す図において、当業者は、複数のフルオロフォアが、例えば、シグナルを増加させる、またはスペクトルの組み合わせを提供するために、ナノプローブ上に含まれることができることを理解するであろう。理想的には、受容体および供与体フルオロフォアは、標的生体分子の非存在下で、相互作用を減少させる位置でナノプローブに結合される（それによって、検出可能なシグナルを減少させる）。しかしながら、供与体フルオロフォアが、受容体フルオロフォアを励起し、受容体が、特徴のある波長を放出し、それによって検出可能なシグナルを生成するように、標的生体分子の存在下で、重合剤および化学的部分の互いとの、また標的核酸分子上の曝露塩基との相互作用は、受容体および供与体フルオロフォアが相互に作用することを可能にする。
【０１８５】
特定の例において、供与体フルオロフォアは、大きなストークシフトを有する。これは、供与体励起光周波数によって、受容体フルオロフォアの励起を減少させる。さらに、適切な濾過は、励起波長を減少または除去することができ、検出される受容体からの放出スペクトルのみを残す。
【０１８６】
特定の例において、供与体フルオロフォアは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはその変異体であり、例えば、１つまたは複数のＧＦＰ分子は、標準的分子生物学的方法を使用して、重合剤（例えば、ＧＦＰ−ポリメラーゼ融合タンパク質を生成するための）にクローン化することができる。その他の特定の例において、供与体フルオロフォアは、エクオリンなどの化学発光分子である。キレートランタニドは、明るく、大きなストークシフトの、鋭い放出スペクトルを有する非退色発光団を提供し、従って、供与体として使用することができる。供与体フルオロフォアとして化学発光分子を使用することにより、外部光源の必要性がなくなる。ＧＦＰと同様に、エクオリンなどの化学発光分子は、標準的分子生物学的方法を使用して（例えば、エクオリン−ポリメラーゼ融合タンパク質を生成するために）、重合剤にクローン化することができる。
【０１８７】
重合酵素に連結される化学的部分のそれぞれの異なる型は、１つまたは複数のフルオロフォアなど、１つまたは複数の異なるタグに関連することができる。特定の例において、化学的部分のそれぞれの異なる型は、１つまたは複数の異なる受容体フルオロフォアに関連し、供与体フルオロフォア（または重合剤に関連する発光分子）によって励起することができる。
【０１８８】
使用可能な受容体および供与体フルオロフォア対の特定の例には、ＢＯＤＩＰＹとともに使用するために適切な供与体フルオロフォアとしてのＧＦＰ突然変異体Ｈ９−４０（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９）、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、リサミン（商標）、受容体フルオロフォアとしてのテキサスレッドおよびナフトフルオレセイン、およびフルオレセインのための供与体フルオロフォアとしてのフルオロフォア３−（ε−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５、５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）、または受容体フルオロフォアとしてのローダミン誘導体（Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸなど）が含まれるが、これらに限定されるものではない。受容体および供与体フルオロフォア対のその他の特定の例には、７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸（ＤＭＡＣＡ）およびフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−アミノ−４−メチル−３−酢酸クマリン（ＡＭＣＡ）およびフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；ならびにフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８９】
使用可能な蛍光タグの特定に例には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が含まれる。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０は、４３０ｎｍで吸収し、その高ストークシフトのために、５４０ｎｍで遠方に放出し、従って、供与体フルオロフォアとして使用することができる。励起スペクトルは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０の５４０ｎｍ放出ピークに重なるので、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０は、特定の例において、受容体フルオロフォアとしてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ５４６、５５５、５６８、５９４、６４７、およびＢＯＤＩＰＹ６３０とともに使用することができる。
【０１９０】
さらに、供与体および受容体分子は、二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）を使用して設計することができる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：５３９−４５，２００３；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．９：７８９−９８，２００２）。２つの部分的ＧＦＰフラグメントは、相補性、従って蛍光性を与えるために結合する。相補性は、ほんの瞬間だけを要するが、発色団の形成は、ｔ１／２＝３００秒と長い時間を要する。従って、該方法は、ＦＲＥＴより遅くなる可能性がある。発色団は、永久に形成するので、長続きする結果を提供するために、ナノプローブ内で使用することができる。
【０１９１】
一例において、タグは、クエンチャーである。例えば、クエンチャーが、受容体フルオロフォアと組み合わせて使用される場合は、減少した受容体シグナルは、検出可能なシグナルである。その他の例において、クエンチャーは、供与体フルオロフォアと組み合わせて使用され、減少された受容体シグナルは、検出可能なシグナルである。
【０１９２】
量子ドット
一例において、本明細書に開示する１つまたは複数のＭｅｄｕｓａプローブは、量子ドットと称される蛍光ナノ粒子に結合される。量子ドットに結合されるナノプローブは、１つまたは複数の対応する受容体フルオロフォア（例えば、化学的部分に関連する）を含むことができ、量子ドットまたはコーネル（Ｃｏｒｎｅｌｌ）ドット（シリカをコーティングしたフルオロフォア）は、供与体フルオロフォアでありうる。特定の例において、ナノプローブは、直接またはリンカーを介して量子ドットに結合され、例えば、量子ドットをコーティングする抗体の例が挙げられる。
【０１９３】
量子ドットは、有意なＦＲＥＴを回避するために、例えば、十分な長さの分子リンカーとともにつなぐことができる。その他の例において、量子ドットは、量子ドットの表面から有意な距離に化学的部分を保持する分子リンカー（４面体構造など）を使用して繋がれる。その後、ナノプローブ上の化学的部分が、標的核酸分子上の相補的な曝露塩基と対になる場合、化学的部分は、ＦＲＥＴによって検出される。
【０１９４】
基板へのプローブの結合
特定の例において、本開示のプローブは、例えば、リンカーを介して、基板に結合される。従って、基板に結合されるプローブが、本開示によって提供される。
【０１９５】
特定の例において、プローブの重合剤は、ガラスまたはプラスチック材料などの基板に結合される。タンパク質を基板に結合する方法は、当技術分野で公知である。例えば、リンカーは、重合剤を基板に結合するために使用することができる。理想的には、リンカーは、重合剤の生物学的活性を有意に妨害しない。リンカーは、結合の共有結合または非共有手段であることができる。
【０１９６】
一例において、リンカーは、互いに、ポリメラーゼ上の１つの分子（アフィニティータグなど）、基板上の別のものに対して高親和性を有する、分子の対である。かかる高親和性分子には、ストレプトアビジンとビオチン、ヒスチジンとニッケル（Ｎｉ）、ヒスチジンとＳｉ、およびＧＳＴとグルタチオンが含まれる。ポリメラーゼと基板が接触する場合、それらは、高親和性分子の相互作用のために、互いに結合する。例えば、ポリメラーゼは、６Ｘ  Ｈｉｓ−タグ（例えば、標準的分子生物学的方法を使用して）を含むように設計され、その後、Ｓｉを含む表面に結合させることができる（例えば、Ｃｈａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ４：１９６５−７６，２００４参照）。同様に、ポリメラーゼは、Ｓ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはストレプトアビジンを含むように設計することができる。
【０１９７】
その他の例において、リンカーは、非分岐鎖における２つ以上の炭素原子を有する、直鎖または分岐アミノ−またはメルカプト−炭化水素である。例には、アミノアルキル、アミノアルケニルおよびアミノアルキニル基が含まれる。あるいは、リンカーは、長さで１０〜２０の炭素のアルキル鎖であり、Ｓｉ−Ｃ直接的結合により、またはエステル、Ｓｉ−Ｏ−Ｃ、連結により結合される場合がある（参照により本明細書に組み入れられる、Ｆｏｏｔｅへの米国特許第５，６６１，０２８号参照）。その他のリンカーは、Ｐｒｏｂｅｒらへの米国特許第５，３０６，５１８号、コラム１９；Ｗａｒｄらへの米国特許第４，７１１，９５５号、コラム８〜９；Ｍａｔｈｉｅｓらへの米国特許第５，７０７，８０４、コラム６〜７（参照によりすべて本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０１９８】
配列決定のための例示的なナノプローブ
本開示は、１つまたは複数の標的核酸配列を配列決定するために使用できる、ナノプローブの複数の例を提供する。
【０１９９】
本開示のプローブの特定の一例を図１Ａに示す。プローブ１０は、重合剤１２、および化学的部分２２、２４、２６、２８を重合剤１２に結合する、４つの分子リンカー１４、１６、１８、２０を含む。化学的部分２２、２４、２６、２８は、所定の反応において、互いに、または重合剤１２と相互作用することができ、分子リンカー１４、１６、１８、２０は、標的核酸の非存在下で、化学的部分２２、２４、２６、２８を、互いに、また重合剤１２から十分に離間して離して維持する。特定の例において、化学的部分２２、２４、２６、２８は、化学的部分２２、２４、２６、２８の実質上の絡み合いを回避するために、互いに離間する。
【０２００】
一部の例において、プローブ１０は、重合剤１２に関連するタグ３０、および化学的部分２２、２４、２６、２８に関連する異なるタグ３２、３４、３６、３８をそれぞれに含む。プローブ１０は、重合剤１２に直接結合されるタグ３０、および化学的部分２４、２６、２８に直接結合されるタグ３４、３６、３８をそれぞれに示す。対照的に、タグ３２は、化学的部分２２に直接結合されないが、化学的部分２２と標的核酸分子内のその相補的ヌクレオチドとが対になる際にシグナルを放出するために、化学的部分２２に十分に接近しているリンカー１４と結合する。同様に、タグ３０は、リンカーを介して重合剤１２に結合することも可能である。
【０２０１】
分子リンカー１４、１６、１８、２０は、化学的部分２２、２４、２６、２８が、標的核酸分子の非存在下で、互いと、または重合剤１２と実質上相互に作用しない長さおよび／または剛性を有する。しかしながら標的核酸分子の存在下において、分子リンカー１４、１６、１８、２０は、所定の反応において、標的核酸分子の存在下で化学的部分２２、２４、２６、２８が重合剤１２と十分に相互に作用することを可能にする。例えば、化学的部分２２、２４、２６、２８上またはその付近のタグ３２、３４、３６、３８が、重合剤１２のタグ３０と（例えば、タグ３０が、重合剤の活性部位に隣接する場合）、および標的核酸分子と相互に作用して、シグナル（光など）を生成できるように、重合剤１２は、標的核酸分子の存在下で、標的およびその相補的プライマーに結合する。例えば、図１Ｂに示すように、プローブ３９は、標的核酸分子４０（プローブの一部ではない）、および相補的鎖が伸長するその相補的プライマー４２（プローブの一部ではない）に結合することができる。図１Ｂに示すように、標的核酸分子４０上の次のヌクレオチドは、「Ｔ」４４であり、これは相補的化学的部分（本明細書ではモノヌクレオチド「Ａ」２６として示される）と特異的に対になることができる。分子リンカー１８は、重合剤１２の方へ屈曲するほど十分に長くかつ柔軟性があり、モノヌクレオチド「Ａ」２６が相補的鎖４２と可逆的に相互に作用し、相補的ヌクレオチドＴ４４と対になることを可能にする。しかしながら、「Ａ」２６は、相補的鎖４２に永久に組み込まれることはない。代わりに、「Ａ」２６は、配列決定反応において（プローブの一部ではない、その他のヌクレオチドｄＣＴＰ４８、ｄＧＴＰ５０、ｄＴＴＰ５２とともに）存在し、伸長している相補的鎖４２に組む込むことができる、加水分解性ｄＡＴＰ４６（プローブの一部ではない）と置換されることになる。標的核酸分子４０上の「Ｔ」４４との「Ａ」２６の対合は、重合剤１２に関連するタグ３０と、「Ａ」２６に関連するタグ３６との相互作用に起因して、検出可能なシグナルを生成することになる。しかしながら、その他の化学的部分２２、２４、２８は、標的核酸分子４０内の「Ｔ」４４に相補的でないので、検出可能なシグナルを生成するのに十分な時間、重合剤の活性部位に存在しない考えられる。
【０２０２】
図１Ａに示すプローブ１０は、重合酵素１２上の複数の点への複数の分子リンカー１４、１６、１８、２０の結合を示す例である。重合酵素上の単一点への複数の分子リンカーの結合を示す代替の例を図１Ｃに示す。プローブ６０は、重合酵素１２、および「ハブ」の役割をする分子ロッド６２に結合される複数のテザー１４、１６、１８、２０から構成される分子リンカーを含む。分子リンカーは、「ハブ」６２が自由に回転することによって重合酵素１２への平等なアクセスを提供するリンカー６４を介して、ある点で、重合酵素１２に結合される。
【０２０３】
図２Ａ〜Ｄは、核酸分子を配列決定するために使用することができるＭｅｄｕｓａナノプローブを示し、この図において、分子リンカーは、単一点で重合剤に結合される分岐構造である。しかしながら、当業者は、複数の分岐分子リンカーが単一の重合剤に結合可能であることを理解するであろう。
【０２０４】
図２Ａに示すプローブ１００は、分岐構造を有する分子リンカー１０２を含む。分子リンカー１０２は、テザー１０６を介して単一点で重合剤１０４に結合される。分子リンカー１０２は、複数のテザー１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、および複数の分子ロッド１２２、１２４、１２６、１２８を含む。テザー１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０は、プローブに柔軟性を提供し、分子ロッド１２２、１２４、１２６、１２８は、例えば、分子リンカー１０２の分岐の絡み合いを減少させるために剛性を提供する。非加水分解性Ａ１３０、Ｃ１３２、Ｇ１３４、およびＴ１３６類似体として本明細書に示す化学的部分１３０、１３２、１３４、１３６は、テザー１１２、１１４、１１８、１２０の末端で分子リンカー１０２にそれぞれ結合する。例えば、４つの非加水分解性ヌクレオチド類似体１３０、１３２、１３４、１３６は、これらのγ−リン酸によって、アミノ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）テザー１１２、１１４、１１８、１２０に結合させることができる。テザー１１２、１１４、１１８、１２０は、それぞれの断片の自由な回転を可能にするので、４つの化学的部分１３０、１３２、１３４、１３６のそれぞれは、重合剤１０４への平等なアクセスを有することができる。テザー１１２、１１４は、分子ロッド１２６に結合され、テザー１１８、１２０は、分子ロッド１２８に結合される。分子ロッド１２６、１２８は、別の分子ロッド１２４によって結合されるテザー１１０、１１６によって一緒に結合される。分子ロッド１２４はテザー１０８に結合し、テザー１０８は分子ロッド１２２に結合し、分子ロッド１２２はテザー１０６に結合し、テザー１０６は重合剤１０４に結合する。例えば、テザー１０６は、重合剤１０４上のシステインまたは異なる化学修飾された残基を介して重合剤１０４に結合されるアミノ末端を含むことができる。特定の例において、テザー１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０は、ＰＥＧから構成され、分子ロッド１２２、１２４、１２６、１２８は、ｄｓＤＮＡから構成される。必要に応じて、ｄｓＤＮＡは、プローブの適切な構造を確認するために使用することができる、図２Ａに示すような制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなど）を含むことができる。
【０２０５】
さらに、プローブ１００は、重合剤１０４に関連するタグ１３８、およびそれぞれの化学的部分１３０、１３２、１３４、１３６に関連する異なるタグ１４０、１４２、１４４、１４６をそれぞれに含む。プローブ１００において、タグ１３８、１４０、１４２、１４４、１４６は、重合剤１０４または化学的部分１３０、１３２、１３４、１３６に直接的には結合されない。代わりに、タグ１３８、１４０、１４２、１４４、１４６は、分子リンカー１０６、１１２、１１４、１１８、１２０の一部に位置する。プローブ１００は、標的核酸分子１５０にハイブリダイズされる、プライマー１４８に結合することが示されている。しかしながら、プライマー１４８および標的核酸分子１５０は、プローブ１００の一部ではない。分子ロッド１２２、１２４、１２６、１２８は、例えば、標的核酸分子１５０の非存在下で、化学的部分１３０、１３２、１３４、１３６と重合剤１０４との相互作用を減少させるために、または標的核酸分子１５０の非存在下で、タグ１３８とタグ１４０、１４２、１４４、１４６との相互作用を減少させるために、剛性を提供することができる。さらに、相補的化学的部分が、重合剤１０４の結合ポケット内の標的核酸分子１５０に結合される場合、分子ロッド１２２、１２４、１２６、１２８は、３つの非相補的化学的部分の相互作用を減少させる。
【０２０６】
プローブ１００の変異体を図２Ｂに示す。さらに、プローブ２００は、分岐構造を有する分子リンカー２０２を含むが、該分岐構造は、より対称的である。例えば、プローブ１００において、化学的部分のうちの１つ（１３０など）が、重合剤１０４の活性部位に結合される場合、別の化学的部分のうちの１つ（１３２など）は、その他の化学的部分（１３４、１３６など）よりも近い。これは、例えば供与体および受容体フルオロフォアが、プローブ１００に含まれる場合、バックグラウンドシグナルを増加させることがある。対照的に、プローブ２００は、すべての化学的部分の、重合剤への同一のアクセスを可能にする。
【０２０７】
分子リンカー２０２は、テザー２０６を介して単一点で重合剤２０４に結合される。分子リンカー２０２は、複数のテザー２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、および複数の分子ロッド２１６、２１８、２２０、２２２、２２４を含む。テザー２０６、２０８、２１０、２１２、２１４は、プローブに柔軟性を提供し、分子ロッド２１６、２１８、２２０、２２２、２２４は、例えば、分子リンカー２０２の分岐の絡み合いを減少させるために、剛性を提供する。非加水分解性Ａ２２６、Ｃ２２８、Ｇ２３０、およびＴ２３２類似体として本明細書に示す化学的部分２２６、２２８、２３０、２３２は、テザー２０８、２１０、２１２、２１４の末端で分子リンカー２０２にそれぞれ結合される。例えば、４つの非加水分解性ヌクレオチド類似体２２６、２２８、２３０、２３２は、これらのγ−リン酸塩によって、アミノ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）テザー２０８、２１０、２１２、２１４に結合させることができる。テザー２０６、２０８、２１０、２１２、２１４は、それぞれのＭｅｄｕｓａ「アーム」の自由な回転を可能にするので、４つの化学的部分２２６、２２８、２３０、２３２のそれぞれは、重合剤２０４への平等なアクセスを有する。テザー２０８、２１０は、分子ロッド２１６、２１８にそれぞれ結合され、分子ロッド２１６、２１８は、分子ロッド２２０に結合される。特定の例において、分子ロッド２１６、２１８、２２２、２２４は、それぞれ２０ヌクレオチドのｄｓＤＮＡである。さらに、分子ロッド２２０は、テザー２１２および２１４にそれぞれ結合される、分子ロッド２２２、２２４に結合される。分子ロッド２２０は、重合剤２０４に結合される、テザー２０６に結合される。特定の例において、テザー２０６、２０８、２１０、２１２、２１４は、ＰＥＧから構成され、分子ロッド２１６、２１８、２２０、２２２、２２４は、ｄｓＤＮＡから構成される。必要に応じて、ｄｓＤＮＡは、プローブの適切な構造を確認するために使用することができる、図２Ｂに示すような制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなど）を含むことができる。一例において、重合剤２０４は、分子ロッド２２０内にｔｅｒ  ＤＮＡ部位を含むことによって、分子リンカーに結合され、ここでは重合剤２０４は、ポリメラーゼ−Ｔｕｓ融合タンパク質である。ｔｅｒ  ＤＮＡ部位は、Ｔｕｓタンパク質に特異的に結合することになる。これによって、テザー２０６の必要性がなくなる。
【０２０８】
さらに、プローブ２００は、重合剤２０４に関連するタグ２３４、およびそれぞれの化学的部分２２６、２２８、２３０、２３２に関連する異なるタグ２３６、２３８、２４０、２４２をそれぞれ含む。プローブ２００において、タグ２３４、２３６、２３８、２４０、２４２は、重合剤２０４または化学的部分２２６、２２８、２３０、２３２に直接的には結合されない。代わりに、タグ２３４、２３６、２３８、２４０、２４２は、分子リンカー２０６、２０８、２１０、２１２、２１４の一部に位置する。プローブ２００は、標的核酸分子２４４にハイブリダイズされる、プライマー２４２に結合することが示されている。しかしながら、プライマー２４２および標的核酸分子２４４は、プローブ２００の一部ではない。分子ロッド２１６、２１８、２２０、２２２、２２４は、例えば、標的核酸分子２４４の非存在下で、化学的部分２２６、２２８、２３０、２３２と重合剤２０４との相互作用を減少させるために、または標的核酸分子２４４の非存在下で、タグ２３４とタグ２３６、２３８、２４０、２４２との相互作用を減少させるために、剛性を提供することができる。例えば、分子ロッド２２０は、標的核酸分子２４４の非存在下で、分子リンカー２０２の個別の分岐をタグ２３４から離れた状態で維持することができる。さらに、相補的化学的部分が、重合剤２０４の結合ポケット内の標的核酸分子２４４に結合される場合、分子ロッドは、３つの非相補的化学的部分の相互作用を減少させる。
【０２０９】
プローブ１００および２００の変異体を図２Ｃに示す。さらに、プローブ３００は、分岐構造を有する分子リンカー３０２を含む。プローブ３００は、分子ロッド／テザー（ＤＮＡ／ＰＥＧ鎖など）につき１つのアミノ基のみを使用してプローブを構築するための、ＤＮＡハイブリダイゼーションの使用法を示す。分子リンカー３０２は、分子ロッド３１０によって結合される、テザー３０６、３０８を介して単一点で重合剤３０４に結合される。分子リンカー３０２は、複数のテザー３０６、３０８、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６および複数の分子ロッド３１０、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４を含む。テザー３０６、３０８、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６は、プローブに柔軟性を提供し、分子ロッド３１０、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４は、例えば、分子リンカー３０２の分岐の絡み合いを減少させるために剛性を提供する。非加水分解性Ａ３４６、Ｃ３４８、Ｇ３５０、およびＴ３５２類似体として本明細書に示す化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２は、テザー３１８、３１２、３２６、３２０の末端で分子リンカー３０２にそれぞれ結合される。例えば、４つの非加水分解性ヌクレオチド類似体３４６、３４８、３５０、３５２は、これらのγ−リン酸によって、アミノ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）テザー３１８、３１２、３２６、３２０に結合させることができる。テザー３１４、３１６、３２２、３２４は、それぞれのセグメントの自由な回転を可能にするので、４つの化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２のそれぞれは、重合剤３０４への平等なアクセスを有する。特定の例において、テザー３０６、３０８、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６は、ＰＥＧから構成され、分子ロッド３１０、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４は、ｄｓＤＮＡから構成される。必要に応じて、ｄｓＤＮＡは、プローブの適切な構造を確認するために使用することができる、図２Ｃに示すような制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなど）を含むことができる。
【０２１０】
さらに、プローブ３００は、重合剤３０４に関連するタグ３５４、およびそれぞれの化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２に関連する異なるタグ３５６、３５８、３６０、３６２をそれぞれ含む。プローブ３００において、タグ３５４、３５６、３５８、３６０、３６２は、重合剤３０４または化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２に直接的には結合されない。代わりに、タグ３５４、３５６、３５８、３６０、３６２は、分子リンカー３１０、３３４、３２８、３４４、３３８の一部に位置する。さらに、図２Ｃ（両方向矢印）は、例えば、退色によってシグナルの喪失を軽減するために、複数のタグが、いかにそれぞれの化学的部分（複数のフルオロフォアまたはデンドリマーなど）に関連できるかを示す。例えば分子ロッド３３４は、１つのタグのみを含むｓｓＤＮＡの代わりに、複数のタグ３６４を含むｓｓＤＮＡとのＤＮＡハイブリダイゼーションによって形成することができる。プローブ３００は、標的核酸分子３６８にハイブリダイズされる、プライマー３６６に結合することが示されている。しかしながら、プライマー３６６および標的核酸分子３６８は、プローブ３００の一部ではない。分子ロッド３１０、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４は、例えば、標的核酸分子３６８の非存在下で、化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２と重合剤３０４との相互作用を減少させるために、または標的核酸分子３６８の非存在下で、タグ３５４とタグ３５６、３５８、３６０、３６２との相互作用を減少させるために、剛性を提供することができる。さらに、相補的化学的部分が、重合剤３０４の結合ポケット内の標的核酸分子３６８に結合される場合、分子ロッドは、３つの非相補的化学的部分の相互作用を減少させる。
【０２１１】
プローブ３００の変異体を図２Ｄに示す。プローブ４００が分子リンカー４０２を含むことを除き、プローブ４００は、プローブ３００と同一であり、単一のタグの代わりに、複数の種類のタグは、それぞれの化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２に関連する。例えば、化学的部分３４６は、タグ４０４、４０６に関連し、化学的部分３４８は、タグ４０４、４０８に関連し、化学的部分３５０は、タグ４０４、４１０に関連し、および化学的部分３５２は、タグ４０６、４０８、４１０に関連する。いくつかのタグを使用することによって、化学的部分と標的核酸鎖内のその相補的塩基とが対合すると放出されるシグナルに修正を加えることができる。例えば、タグが、受容体フルオロフォアである場合は、プローブ４００は検出を可能にし、一部の例において、フルオロフォア退色の修正、または１つまたは複数の分子リンカー分岐の喪失を可能にする。プローブ４００は、標的核酸分子３６８にハイブリダイズされる、プライマー３６６に結合することが示されている。しかしながら、プライマー３６６および標的核酸分子３６８は、プローブ４００の一部ではない。
【０２１２】
図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｄに示す化学的部分がヌクレオチド類似体である例において、ヌクレオチド類似体は、糖の３’ヒドロキシルで、もしくはリン酸（α、β、またはγリン酸など）で、または重合剤の活性部位もしくは相補的塩基対合への特異的結合を妨害しないヌクレオチド上の任意の点で、塩基によって分子リンカーに結合することができる。図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｄに示す化学的部分は、異なる化学的部分（図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｄに示すように）であってもよく、または、同じ化学的部分（この場合、それぞれの型の化学的部分を有するナノプローブは、配列決定反応に含まれ得る）であってもよい。特定の例において、図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｄに示す重合剤に関連するタグは、供与体フルオロフォアであり、それぞれの化学的部分に関連するタグは、受容体フルオロフォアを含む。例えば、複数の型の化学的部分が、同一のプローブ上にある場合は、それぞれの化学的部分は、一意的な受容体フルオロフォアまたはフルオロフォアの組み合わせに関連することができる。
【０２１３】
ナノプローブの生成
多くの方法が開示されたナノプローブを生成するために利用可能である。例えば、タグを別の分子に結合させる方法は公知である。さらに、ＤＮＡ−ＰＥＧ構造を生成する方法は公知である。特定の方法が本明細書に提供されるが、本開示はこれらの方法に限定されない。
【０２１４】
ＤＮＡ／ＰＥＧの合成および結合
分子リンカーが１つまたは複数のＤＮＡ分子ロッドおよび１つまたは複数のＰＥＧテザーを含む例において、以下の方法を使用することができる。任意の所望の配列のＤＮＡを、様々な市販のソース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ、Ｓｉｇｍａなど）から入手することができる。ＤＮＡの配列は、ＮＡＮＥＶプログラムを使用して生成することができ、これは「核酸ナノ構造の設計のための発展的方法」を使用する（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８：５４８−５０，２００５）。本プログラムは、所望の構造のみハイブリダイゼーションにより形成されるように、ナノプローブおけるＤＮＡ配列を設計するために使用することができる。特定の例において、ＰＥＧテザーは、標準フォスフォラミダイト「スペーサー」として分子リンカー内のどこにでも組み込まれる。ＤＮＡ配列においてどこでもアミノ基を導入することも可能である。
【０２１５】
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの適切な使用により、ナノプローブは、ＤＮＡ／ＰＥＧリンカーにつき１つのアミノ基のみを使用して、構築することができる。これは、例えば、図１Ａに示されるように、ナノプローブ上のフルオロフォアまたはタンパク質を結合させるためにアミノ基を使用することを可能にする。
【０２１６】
一例において、ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２−ｄＮＴＰは、ポリメラーゼが結合したビーズまたは別の基板を使用して、ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２から離れて精製される。ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２−ｄＮＴＰは、ポリメラーゼに結合するが、ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２は結合しない。
【０２１７】
化学的部分へのタグの結合
タグは、化学的部分に結合させることができる。例えば、化学的部分が、ヌクレオチド類似体である場合、タグは、塩基、糖、α、β、またはγリン酸に結合することができる。
【０２１８】
化学的部分への分子リンカーの結合
化学的部分は、分子リンカーに結合させることができる。例えば、化学的部分がヌクレオチド類似体である場合、分子リンカーは、塩基、糖（例えば、糖の３´ヒドロキシルで）、α、β、またはγリン酸に結合することができる。理想的には、そのような結合は、化学的部分の、重合剤の活性部位に結合する能力、または相補的ヌクレオチド塩基と対になる能力を阻害しない。化学的部分を分子リンカーに結合させる方法は当技術分野において公知であり、開示される方法は、特定の方法に限定されない。例えば、分子リンカーをγリン酸に結合させるために、５’アミノ変性剤  Ｃ６  ＴＦＡを利用することができる（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸおよびＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡより入手可能）。ヌクレオチド類似体をリンカーに結合させるために使用可能な別の方法は、米国特許第６，９３６，７０２号に開示される（参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２１９】
重合剤への分子リンカーの結合
一例において、１つまたは複数の分子リンカーは、ｔｅｒ  ＤＮＡ部位に結合させるためにＴｕｓタンパク質を使用して、重合剤に結合される。例えば、Ｔｕｓタンパク質は、標準的なクローニング技術を使用して、重合剤に融合させることができる。分子リンカー部分は、ｔｅｒ  ＤＮＡ部位を含むことができ、これはＴｕｓタンパク質に特異的に結合する。Ｔｕｓ−ｔｅｒ結合切断定数は、１０−１３Ｍである（Ｎｅｙｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：５０１−２６，２００５）。
【０２２０】
タンパク質リンカー
特定の例において、分子リンカーは、ｓｅｒ−ｇｌｙなどの柔軟性のあるタンパク質鎖から成る。例えば、分子リンカーを形成する柔軟性のあるループを有するように重合剤を拡張することができる。鎖は、ポリメラーゼを継続させるためにループして戻る。例えば、リシンまたはシステインなどのアミノ酸に結合することにより、化学的部分（ｄＮＴＰなど）を酵素的に付加することができる。ポリメラーゼは、特定の分子リンカーを認識し、適切な塩基を結合する。例えば、結果が非加水分解性である場合、結合は通常のｄＮＴＰ上にある。一例において、ポリメラーゼおよび柔軟性のある分子リンカーは、改変されたポリメラーゼに対する遺伝子を有するファージの表面上に発現する。特定のｄＮＴＰは、例えば、３’末端上でカラムなどの固体支持体に結合することができる。改変されたポリメラーゼを発現するファージは、ｄＮＴＰへのポリメラーゼの結合を可能にする条件下で、固体支持体と接触する。これは、改変されたポリメラーゼを発現するファージの選択を可能にする。改変されたポリメラーゼは、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰおよびエクオリンなどの供与体フルオロフォアをさらに含むことができる。
【０２２１】
標的核酸分子を配列決定する方法
本開示は、２つ以上の標的核酸分子などの標的核酸分子を同時に配列決定する方法を提供する。配列決定は、インビトロ、エクスビボ、インサイチュー（例えば、対象から取得された生体試料を使用して）、またはインビボ（例えば、細胞内で配列決定することにより）で実施することができる。特定の例において、標的核酸鎖は、疾病に関連する１つまたは複数の突然変異を含む。
【０２２２】
特定の例において、標的核酸分子は、対象から取得される。例えば、標的核酸分子は、対象から取得した生体試料に存在することができる。別の例において、標的核酸分子は、対象内に存在し、鋳型核酸分子のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブへの曝露は、対象の細胞へのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの導入を含む。
【０２２３】
特定の例において、標的核酸分子の核酸配列を決定する方法は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび加水分解性ヌクレオチドの混合物の存在下で標的核酸分子を本明細書に開示される１つまたは複数のプローブに曝露する段階を含む。加水分解性ヌクレオチドは、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと対合することによって、伸長する核酸分子に組み込まれ、標的核酸分子上の相補的ヌクレオチドに可逆的に結合する化学的部分を置換することができる。加水分解性ヌクレオチドは、化学的部分に置換される場合、これは、１塩基先に重合剤を進める。化学的部分は、伸長する相補鎖に永久的には組み込まれないため、重合酵素の活性部位によって、最終的に拡散する。一連のシグナルの発光が検出され、特性シグナルの発光は、リンカー上の化学的部分とその相補的ヌクレオチドとの対合を示す。そのような特性シグナルはまた、どの加水分解性ヌクレオチドが、標的核酸分子に相補的である伸長する核酸分子に次に組み込まれるかを示すことができる。特定の例において、一連のシグナルの発光は、核酸配列に変換される。一部の例において、一連のシグナルの発光は、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって生成される。特定の例において、一連のシグナルの発光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで検出され、核酸配列に変換される。一連のシグナルはまた、コンピュータ可読媒体に保存することもできる。化学的部分はリンカーから除去されないため、プローブを再度使用することができる。
【０２２４】
従って、非標識加水分解性ヌクレオチドは、伸長する鎖に組み込まれる唯一のものであるため、本方法は、伸長する相補的核酸分子に蛍光標識ヌクレオチドを組み込む問題を解決する。得られる相補的核酸分子は、正常ヌクレオチドを含む。
【０２２５】
特定の例において、重合剤はタグに関連し、化学的部分のそれぞれはまた、リンカーが有する特定の化学的部分を識別するタグに関連し、ここで、重合剤に関連するタグと、化学的部分に関連するタグとの相互作用は、化学的部分と相補的ヌクレオチドとの対合を示す特性シグナルの発生を誘発する。上記に記載されるように、タグは、重合剤および化学的部分に直接結合することができるか、または、分子リンカーに間接的に関連する、例えば、重合剤または化学的部分に十分に接近して分子リンカー上に存在することができるかのいずれかである。
【０２２６】
一部の例において、重合剤に関連するタグは、供与体フルオロフォアを含み、特定の化学的部分を識別するタグは、１つまたは複数の受容体フルオロフォアを含む。重合剤と化学的部分との十分な相互作用、例えば、重合剤内の活性部位での化学的部分の存在、および標的核酸鎖上での化学的部分と相補的ヌクレオチドとの対合は、受容体フルオロフォアを供与体フルオロフォアの近傍に到達させ、供与体フルオロフォアによる受容体フルオロフォアの励起を可能にする。かかる例において、シグナルを検出する段階は、受容体フルオロフォアから放出された蛍光性シグナル（蛍光の増加など）を検出する段階、または供与体フルオロフォアから放出された蛍光性シグナル（蛍光の減少など）を検出する段階を含むことができる。特定の例において、供与体フルオロフォアはＧＦＰであり、受容体フルオロフォアは、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、またはその誘導体である。別の特定の例において、供与体フルオロフォアは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０であり、受容体フルオロフォアは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、５６８、５９４、および６４７である。
【０２２７】
タグの１つが供与体フルオロフォアである一部の例において、本方法は、リンカー上の化学的部分とその相補的ヌクレオチドとの対合を示す特性シグナルを放出するように１つまたは複数の受容体フルオロフォアを刺激する励起シグナルを放出させるため、供与体フルオロフォアを励起する段階をさらに含む。例えば、供与体は、例えば、特定の波長の電磁放射を放出するレーザーによって提供される光、または狭い範囲内の波長の光のコヒーレントビームなどの電磁放射を使用して、励起することができる。その他の例において、供与体は、発光分子（エクオリンなど）によって励起される。一部の例において、供与体は継続的に励起される。しかしながら、すべての供与体フルオロフォアが外部源による励起を必要とするわけではない。例えば、化学発光による供与体分子は、外部源による励起を必要としない。理想的には、供与体フルオロフォアの励起源は、受容体フルオロフォアを著しく励起しない。
【０２２８】
分子リンカー上の特定の化学的部分（非加水分解性Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴアナログなど）とその相補的ヌクレオチドとの対合を示す特性シグナルの発光は、核酸配列に変換することができる。例えば、各化学的部分がその相補的ヌクレオチドと対合し、顕微鏡の視野において放出される場合、一連の発光シグナルが取得される。例えば、発光シグナルは、顕微鏡対物レンズで収集することができ、化学的部分に関連するそれぞれのタグに対する完全な発光スペクトルは、分光光度計により生成される。完全な発光スペクトルは、顕微鏡の視野において、それぞれの化学的部分がその相補的ヌクレオチドと対合する場合、化学的部分に関連するそれぞれのタグに対して、ＣＣＤカメラなどの検出デバイスにより取得される。ＣＣＤカメラは、発光スペクトルを収集し、一連の電荷にスペクトルを変換する。シグナルスペクトルとそれぞれのクラスの化学的部分上のタグに対するスペクトルとの間の最小二乗適合などのアルゴリズムを使用して、顕微鏡の視野において、それぞれの核酸について一連の発光スペクトルを核酸配列に変換するために、それぞれの化学的部分の対合についての電荷をコンピュータにより記録することができる。
【０２２９】
多くの異なるアルゴリズムは、発光スペクトルを核酸配列に変換するために使用することができるが、この特定の例は１つのアプローチを例示する。４つの蛍光スペクトル（Ａｎｍ、Ｃｎｍ、ＧｎｍおよびＴ／Ｕｎｍ）は、巨視的測定から生成される。試料から、未知のノイズスペクトル（Ｓｎｍ）が生成される。未知のスペクトルは、非加水分解性アナログの相対的比率を示す４つの重量、ａ、ｃ、ｇおよびｔ／ｕのみを有する４つの既知のスペクトルの合計であると考えられる。従って、５２０ｎｍ〜５２３ｎｍで、これは、５つの等式をもたらす。
Ａ５２０＊ａ＋Ｃ５２０＊ｃ＋Ｇ５２０＊ｇ＋Ｔ５２０＊ｔ＝Ｓ５２０
Ａ５２１＊ａ＋Ｃ５２１＊ｃ＋Ｇ５２１＊ｇ＋Ｔ５２１＊ｔ＝Ｓ５２１
Ａ５２２＊ａ＋Ｃ５２２＊ｃ＋Ｇ５２２＊ｇ＋Ｔ５２２＊ｔ＝Ｓ５２２
Ａ５２３＊ａ＋Ｃ５２３＊ｃ＋Ｇ５２３＊ｇ＋Ｔ５２３＊ｔ＝Ｓ５２３
Ａ５２４＊ａ＋Ｃ５２４＊ｃ＋Ｇ５２４＊ｇ＋Ｔ５２４＊ｔ＝Ｓ５２４
【０２３０】
例えば、Ａ５２０などの既知の値を代入し、最小二乗線形回帰を使用することによって、未知の値ａ、ｃ、ｇ、およびｔ／ｕを求める。
【０２３１】
この特定の例において、重合剤に関連する供与体フルオロフォアは、ＧＦＰ  Ｈ９−４０であり、以下の通り、化学的部分は受容体フルオロフォアに関連する：非加水分解性Ａは、ＢＯＤＩＰＹで標識され；非加水分解性Ｔは、フルオレセインで標識され；非加水分解性Ｃは、ローダミンで標識され；非加水分解性Ｇは、オレゴングリーンで標識される。別の例において、ポリメラーゼに関連する供与体フルオロフォアは、Ｈ９−４０であり、以下の通り、化学的部分は受容体フルオロフォアに関連する：非加水分解性Ａは、テトラメチルローダミンで標識され；非加水分解性Ｔ／Ｕは、ナフトフルオレセインで標識され；非加水分解性Ｃは、リサミンで標識され；非加水分解性Ｇは、テキサスレッドで標識される。それぞれの異なる型の化学的部分とその相補的塩基との対合を検出することができるように、それぞれの受容体フルオロフォアの発光スペクトルがモニタリングされ、それぞれのフルオロフォアのスペクトルは互いに区別することができる。
【０２３２】
未知のタグの相対的比率を決定する過程は、「線形アンミキシング法」として公知である（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：１２７２，１２７４−６，１２７８，２００１）。ナノプローブの収集がヌクレオチド配列の混合を与えることができる一方、個別のナノプローブは、主に単一のヌクレオチド配列を与える。もし、ナノプローブの収集が、一定時期同期化され、または、同時にただ１つの加水分解性ヌクレオチドを付加することにより配列に沿ってそれらを進めることによって（フローセルにおけるように）、収集が実質的に単一の配列を報告する。配列における塩基の相対的比率は、配列ロゴ技術により示すことができる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６０９７−１００，  １９９０）。
【０２３３】
特定の例において、配列決定反応の１つまたは複数の要素は、ガラス、プラスチック、または金属基板などの基板に結合する、または固定される。例えば、プローブ、標的核酸、またはプライマーは、基板に固定することができる。上記に記載されるように、プローブは、重合剤を介して基板に結合することができる。核酸分子（標的核酸またはプライマーなど）は、５’末端、３’末端または内部で、基板に結合することができる。
【０２３４】
本方法は、実質的に同時に複数の配列決定反応を行う段階と、複数の配列決定反応から一連のシグナルを検出する段階とを含むことができる。例えば、複数の重合剤、鋳型核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーは、所定のパターンで基板に直接または間接的に固定することができる。一連のシグナルを検出する段階は、シグナルを、そのようなパターン内の所定の位置に対応する核酸分子に相関させる段階を含むことができる。重合剤、鋳型核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーは、基板上に液滴を微量ピペッティングすることにより、規則的なアレイにエッチングされたチャネル内で、所定のパターンで基板に固定することができる。
【０２３５】
一部の例において、配列決定反応中に存在するヌクレオチドのレベルは、制御される。例えば、プローブは、付加された加水分解性ヌクレオチドの非存在下で、プライマーおよび標的核酸分子とともにインキュベートされる。生成したシグナルは、標的核酸分子上に露出したヌクレオチドを示し、従って、付加されるべき次のヌクレオチドを示す。そのようなヌクレオチドは、その後、付加され、１つまたは複数の位置だけ先にプローブを進める。ヌクレオチドは、除去され（例えば、洗浄により）、サイクルを反復する。
【０２３６】
図１Ｂは、開示されたプローブが核酸分子を配列決定するためにどのように使用され得るかについて、特定の例を提供する。開示された任意のプローブは、プローブ３９と置換することができることを当業者は理解するであろう。本方法は、非標識加水分解性ヌクレオチド４６、４８、５０、５２（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；またはＲＮＡポリメラーゼについてはＮＴＰなど）の混合物の存在下で、標的核酸配列４０をオリゴヌクレオチドプライマー４２およびプローブ３９（または、図１Ａ〜Ｂおよび２Ａ〜Ｄに示されるものなど、本明細書に示される他の任意のプローブ）に接触させる段階を含むことができる。配列決定される核酸分子４０（ナノプローブの部分ではない）の非存在下で、検出可能なシグナルはほとんどない。重合剤１２が、プライマー４２において標的核酸配列４０に結合する場合、塩基４４（本明細書では、「Ｔ」）は、標的鎖４０上に露出される。分子リンカー１４、１６、１８、２０は、ブラウン運動によって移動し、末端の化学的部分２２、２４、２６、２８を、重合剤１２の活性部位における標的核酸分子４０上に露出した塩基４４に接近させ、対合させることができる。分子リンカー１４、１６、１８、２０の末端の化学的部分２２、２４、２６、２８は、塩基４４に結合するために競争するが、４つの化学的部分の１つだけ（この場合、２６）が、露出した塩基４４に相補的である。不正確な対合が非相補的化学的部分（この場合、２２、２４、２８）により生じる場合、その化学的部分（この場合、２２、２４、または２８）は、迅速に離れる。しかしながら、正確な対合が生じる場合（本例において、相補的化学的部分２６）、正確な化学的部分は、重合剤１２の活性部位において相当な時間滞留し、相補的塩基４４と対合する。この間、相補的化学的部分２６上の対応するタグ３６（受容体フルオロフォアなど）は、タグ３０に対する重合剤１２に関連するタグ３０（供与体フルオロフォアなど）に十分に接近してタグ３６と相互作用し、それによって、そのような化学的部分２６に対して特性シグナル（受容体発光シグナルなど）を生成する。タグ３２、３４、３６、３８のそれぞれは、区別できる発光シグナルを生成する。すべての化学的部分２２、２４、２６、２８は、活性部位の内外に拡散するが、露出した塩基４４に相補的である化学的部分２６に関連するタグ３６は、活性部位を最も長い時間占有するため、シグナルを独占し、適切に相補的塩基４４と対合することができる。化学的部分２２、２４、２６、２８は、伸長する核酸鎖４２に付加できないため、重合剤の活性部位における化学的部分が非標識加水分解性ヌクレオチド（この場合、４６）に置換されない限り、鎖は伸長しない。従って、検出可能なシグナルは、伸長する相補鎖４２に組み込まれるべき次の非標識加水分解性ヌクレオチド（この場合、４６）を示す。適切な加水分解性ヌクレオチド４６は、伸長する相補鎖４２に最終的に組み込まれ、重合剤１２は１つ先の位置に進む。これにより、標的核酸４０上で次の相補的塩基が露出し、サイクルを反復する。変化する発光シグナルは、標的ヌクレオチド配列に対応する。加水分解性ヌクレオチド４６が組み込まれるステッピング過程中、供与体シグナルのみが放出される。
【０２３７】
特定の例において、重合剤１２は、顕微鏡スライドなどの基板に（例えば、リンカーにより）結合される。基板は、顕微鏡のステージに取り付けることができる。特定の例において、配列決定反応は、水性の環境で生じ、例えば、ガラスのカバースリップで覆うことにより、乾燥を避けるために密閉することができる。かかる例において、配列決定される核酸４０は、アニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマー４２を有し、固定された重合剤１２により結合される。配列決定反応を開始するために、非標識加水分解性ヌクレオチド４４、４６、４８、５０の混合物は、ナノプローブとともに付加される。配列決定反応は、上記に記載されるように進行する。配列決定のためのすべての必要な成分が常に供給され、利用可能であるため、外部のポンプデバイスまたはリザーバーは必要としない。
【０２３８】
従って、本方法は、シグナルが核酸分子の大集団を代表する電気泳動ゲル上のパターンなどの高分子事象をモニタリングすることにより配列決定する代わりに、分子レベルにおいて標的核酸分子上の相補的ヌクレオチドに可逆的に結合する化学的部分の対合をモニタリングすることにより核酸分子を配列決定することを可能にする。大きな視野と組み合わせた本方法を使用して、毎秒最大７５０塩基対の配列決定速度で、同時に、１０００以上のＤＮＡ分子を配列決定することが可能であり、これは高速のＤＮＡポリメラーゼの速度である（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９８７，ｐａｇｅ１１０）。コピー／配列決定されるそれぞれのＤＮＡ分子、およびそれに関連するプローブは、重合剤媒介反応が生じる視野の特定の部分に対応し得る。
【０２３９】
配列決定速度の改変
特定の例において、核酸配列決定の速度は制御される。例えば、配列決定反応は、０〜３０℃、例えば、４℃、または室温（２０〜２５℃など）の低温で実施され、配列決定速度を減少させることができる。これらの低温で、重合剤は、低温で適切に機能することができるものであってよい。この温度範囲は、より狭いスペクトル線、従って、より高い解読複雑性を可能にする。低温は、スペクトルを鋭くし、解読するためのさらに明確なスペクトルを可能にする。重合反応を阻害する可能性があるため、冷凍を避ける。別の例において、配列決定速度を減少させるために、配列決定反応を実施する環境は、２０％のＦｉｃｏｌ７０中の９．９５ｃＰの粘度などの粘性にさらされる。さらに、ポリメラーゼを遅延させる１つまたは複数の突然変異を含むポリメラーゼなどの突然変異体ポリメラーゼを、配列決定速度を減少させるために使用することができる。配列決定速度はまた、配列決定反応中に存在する遊離の加水分解性ヌクレオチド（ｄＮＴＰなど）の濃度によって制御することもでき、遊離のｄＮＴＰの濃度の減少は、重合速度を減少させる。
【０２４０】
圧縮配列
特定の例において開示される方法は、圧縮配列を提供する。つまり、標的配列がある列において２つ以上の同一塩基を含む場合、本方法は、２つ以上の同一塩基間の差異を検出しない可能性があり、それによって、圧縮配列を生成する。例えば、大腸菌の配列の初めの３０塩基である
2009519041.tif 000005
は、類似塩基の列を除去することにより、
2009519041.tif 000006
と圧縮され、
2009519041.tif 000007
を生じる。
【０２４１】
そのような圧縮配列は一意的であるため、さらに使用可能である。例えば、大腸菌由来のＲＮＡが配列決定され、上記の配列３を生じる場合、ＲＮＡの位置は、上記の配列３を全大腸菌ゲノムの圧縮されたバージョンと比較することにより決定することができる。全ヒトゲノムが配列決定される場合、本方法は、個別のｍＲＮＡ分子を直接計数するために使用することができる。第１の工程は、全ヒトゲノム配列を圧縮することである。その後、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、またはその他のプログラムを用い、本開示の配列決定方法により得られた結果を使用して、圧縮されたヒトゲノム配列を検索する。本方法は、ハイスループット分析に対する巨視的処理を必要とせず、遺伝子発現の研究のために極めて有用である。
【０２４２】
しかしながら、完全な、非圧縮配列の検出を可能にする方法を提供する。例えば、正確な化学的部分（正確な塩基など）が活性部位にある場合のみ、重合剤は、活性部位に近づく。ポリメラーゼ部分の距離の変化は、例えば、ＦＲＥＴにより測定できる。このタイミングシグナルは、重合剤にタグを含むことによって生成することができ、タグの運動は検出される。例えば、重合剤は、供与体および受容体フルオロフォアの対を含むことができ、重合剤の開閉は、フルオロフォアの相互作用により検出可能なシグナル（供与体による受容体の励起、検出することができる得られた受容体発光）を生じる。タイミングシグナルの検出は、取り込みを示すので、２つの塩基が同一である場合であっても、２つの塩基が新生ＤＮＡポリマーに付加されていることが明らかである。
【０２４３】
完全な、非圧縮配列を検出するために使用することができる別の方法は、フローセルのように、薬剤を付加および除去することができるシステムにおいて、配列決定反応を実施することである。例えば、プローブは、表面（ビーズなど）、および付加したプライマー／標的核酸分子に結合することができる。フローは、４つの加水分解性塩基（ｄＮＴＰなど）のいずれも提供することができる。化学的部分は、標的核酸分子上の相補的塩基と対合するので、得られるシグナルは、次に付加する必要がある加水分解性塩基を示す。そのような加水分解性塩基は、配列決定反応に加えられ、プローブは、１つ先の塩基に進む。加水分解性塩基はその後除去され、過程は反復される。集団において、プローブは、次の不足塩基への指数関数的遷移を示し、停止する。従って、集団は、時間とともにモニタリングすることができる。付加される２つの塩基がある場合、遷移はより遅くなる。つまり、付加した塩基の数は、遷移の半減期を測定することにより決定することができる。
【０２４４】
別の例において、本開示のプローブは、基板に結合され、標的核酸およびそのプライマーに結合される。そのような例において、プローブは、それぞれの化学的部分に関連する同一のタグ（同一の受容体フルオロフォア、または受容体フルオロフォアの組み合わせなど）を含む。重合剤はまた、タグ（供与体フルオロフォアなど）に関連する。非標識加水分解性ヌクレオチドは、例えば、同時に１つの型を付加することができる。非標識加水分解性ヌクレオチドの非存在下で、化学的部分は活性部位にとどまり、検出可能なシグナル（受容体フルオロフォア発光など）を生成する。その後、非標識加水分解性ヌクレオチドの１つが付加される。不正確な非標識加水分解性ヌクレオチドが付加される場合、これは化学的部分を置換せず、従って、検出可能なシグナルは有意に変化しない。対照的に、正確な非標識加水分解性ヌクレオチドが付加される場合、これは化学的部分を置換し、従って、検出可能なシグナルを有意に変化させる（例えば、受容体発光の減少または供与体発光の増加など）。回復のタイミングは、伸長する相補鎖に付加される非標識加水分解性ヌクレオチドの数に依存するため、２つの非標識加水分解性ヌクレオチドが付加される場合、１つの非標識加水分解性ヌクレオチドが付加される場合と比べ、検出可能なシグナルが回復するのに時間を要する。従って、４つの非標識加水分解性ヌクレオチドを通じて循環することにより、完全な配列を得ることができる。
【０２４５】
完全な、非圧縮配列を検出するために使用することができるさらに別の方法は、ナノプローブ上の化学的部分上の受容体フルオロフォアとは異なる受容体フルオロフォアを特異的に活性化する供与体フルオロフォア（重合剤に結合された第２の供与体フルオロフォアなど）を有するナノプローブを使用することである。配列決定される核酸は、受容体フルオロフォア（第２の供与体フルオロフォアにより励起するものなど）を有する少なくとも１つのヌクレオチドにおいて標識される。ナノプローブは、配列決定される核酸分子に沿って進むため、ポリメラーゼ上の供与体と受容体標識された鋳型核酸分子との間の距離は、変化するシグナルを与える。従って、ナノプローブが２つの同一塩基上に進む場合、受容体から供与体へのシグナルが同時に変化するため、これらを区別することができる。
【０２４６】
単一の塩基の進行は、物理的に決定することができる（Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：８０１，２００６）。そのような方法は、本明細書に開示されるＭｅｄｕｓａナノプローブと組み合わせることができる。ＤＮＡに沿って進むことは、３．４Å工程（０．３４ｎｍ）により、および約３４度の回転（３６０°あたり１０．６ｂｐ）により検出することができる。回転は、配列決定される核酸（ＤＮＡなど）に結合された分子リンカー上に蛍光検出器を設置することによって、増幅することができる。ＤＮＡは回転するため、３４°回転は、より長いアームで、より長い距離を移動する。アームが長いほど、変化が大きい。ポリメラーゼ（本明細書に提供されるＭｅｄｕｓａシーケンサーなど）が移動するか、ＤＮＡが移動するかのどちらかである。（Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：８０１，２００６の方法を使用して）移動するポリメラーゼを観察することができる。移動する標的核酸分子は、標的核酸分子を標識することにより（例えば、ＤＮＡ結合ＧＦＰ融合タンパク質を結合することにより）検出することができる。標識された標的核酸分子は回転するため、標識の回転は、それにより、ステッピングの検出を可能にする。標的核酸分子が回転する場合に偏光の角度が変わるように標識が標的核酸分子に密に結合する場合、これは、標的核酸分子に対して移動するポリメラーゼの検出を可能にする。回転は、それぞれの位置からの光子の数を変える。ＧＦＰ−ＤＮＡ結合タンパク質は、ポリメラーゼがそれを過ぎて、またはヌクレオソーム様物体を通じて読み込むために除去することができるように（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに対して観察されているように）、結合される。
【０２４７】
標的核酸分子（標的ＤＮＡ分子など）の運動を検出するために使用することができる別の方法は、標的核酸分子に沿って、あるいは標的核酸分子周辺のいずれかに結合するナノプローブを使用することである。結合する場合、偏光したＦＲＥＴシグナルが生じる。分子リンカーは、柔軟性のある、または硬性であることができる。硬性分子リンカーは、ＤＮＡから離れて検出点を移動させることができ、レバー分子リンカーを増加させる。別の例は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ  ＤＮＡ検出器」を使用することである。これは、２つのアームがＤＮＡの対面上で標的ＤＮＡ分子に結合する硬性交差型形状分子である。中央の柔軟性のあるヒンジは、リンカーが互いに近接する場合にＦＲＥＴシグナルが生成され検出されるように、２つの分子リンカーをＤＮＡに結合することを可能にする。このデバイスは、ＤＮＡなどの標的核酸分子に結合しない場合、有意な検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成しない。結合する場合、ＦＲＥＴシグナルは検出され、ＭｅｄｕｓａシーケンサーがＤＮＡを移動する場合、これは変化する偏光シグナルを生成するＤＮＡ周辺を移動する。
【０２４８】
使用することができるさらに別の方法は、ＤＮＡをエチジウムブロマイドなどのＤＮＡ挿入色素と接触させることである。双極子は、ポリメラーゼが通過する場合に回転する。あるいは、ピロロｄＣは、内部蛍光標識としてＤＮＡに組み込むことができる。ＤＮＡが回転するにつれて、ピロロｄＣからのシグナルは、偏光角を吸収し放出する双極子が変化するため、変化する。この双極子軸の変化は、検出することができるシグナル（例えば、エチジウムブロマイドまたはピロロｄＣ由来）の変化を生じる。
【０２４９】
インビボ配列決定
特定の例において、１つまたは複数のＭｅｄｕｓａプローブが細胞に導入され、それによって、生細胞内での配列決定を可能にする。例えば、開示されたプローブは、生成されたｍＲＮＡの配列を観察するために（例えば、プローブが重合剤として逆転写酵素を含む場合）使用することができる。特定の例において、本方法は、遺伝的疾病または癌を診断するために使用される。
【０２５０】
細胞に薬剤を導入する方法は、当技術分野で公知である。一例において、１つまたは複数のＭｅｄｕｓａプローブはリポソームに組み込まれ、これは当技術分野で公知の標準的方法を使用して細胞に導入される。別の例において、プローブは、例えば、Ｓｏｋｏｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１５３８−４３，１９９８）の方法を使用して、細胞に直接注入される。特定の例において、細胞は、ヒトなどの哺乳類の対象から取得される。例えば、細胞は、血液サンプル（またはその画分）または頬スワブなど、対象の生体試料から取得することができる。
【０２５１】
細胞に存在するヌクレオチドは、成長する相補鎖（ｄＮＴＰなどの加水分解性ヌクレオチド）に組み込まれるものである。プライマーはまた、プローブと共に細胞に導入することもできる。特定の例において、プライマーは、例えば分子リンカーを介して、重合剤に結合される。特定の例において、プライマーの配列は、標的配列に基づいて決定される。例えば、特定の突然変異が標的配列に存在するか否かを決定することが目標である場合、プライマー配列は、Ｍｅｄｕｓａプローブをそのような配列に誘導するために使用することができる。あるいは、プライマーが任意の配列に結合するように普遍的塩基から成ることができる（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９１１−４，２０００を参照）。
【０２５２】
特定の例において、成熟ＲＮＡ上の選択的スプライシング変異体が識別される。
【０２５３】
実施例１
タグ付きポリメラーゼ
本実施例は、フルオロフォアまたは発光分子（例えば、供与体フルオロフォア）などの少なくとも１つのタグを含むポリメラーゼを生成するために使用できる方法を記載する。特定のフルオロフォアまたは発光分子を記載するが、その他のタグは類似方法を使用してポリメラーゼに結合することができることを当業者は理解するであろう。
【０２５４】
タグの一般的な結合
タグは、標準組換え技術を使用して重合剤に結合させることができる。一般に、タグは、重合剤のＮまたはＣ末端に置かれる。しかしながら、タグはまた、重合剤内の任意のアミノ酸、例えば、タンパク質表面に露出したアミノ酸に結合させることもできる。理想的には、タグ結合は、重合剤の重合活性を著しく妨害しない。例えば、融合重合剤タンパク質は、伸長する核酸分子にヌクレオチドを組み込む能力をさらに有するであろう。
【０２５５】
融合タンパク質の生成方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ１７，１９８９を参照）。タグポリメラーゼ組換え融合タンパク質を調製するために、タグおよびポリメラーゼをコード化した配列を含むベクターを構成することができる。配列は、所望のタグポリメラーゼ組換え融合タンパク質を生成するために順序付けされる。本ベクターは、大腸菌などのバクテリアで発現され、タンパク質は精製される。精製法は、結合したタグに依存することができる。例えば、アフィニティータグはまた、重合剤に結合させる場合、細菌溶解物は、融合タンパク質にあるタグに対して高アフィニティーを有する樹脂を含むカラムに加えられる。溶解物を加え、タグ付き融合タンパク質を結合させた後、非結合タンパク質を流出し、続いて融合タンパク質を溶出する。
【０２５６】
あるいは、タグを、化学的方法を使用して重合剤に結合させることができる。例えば、タグは、Ｃｙｓ残基に結合させようとする場合、タグは、マレイミドなどのチオール反応性化合物を使用して、重合剤に結合させることができる。
【０２５７】
アフィニティータグ
一例において、アフィニティータグは、ＧＦＰ−ポリメラーゼタンパク質などの重合剤に結合され、その精製およびその後の基板への結合に役立つ（実施例７を参照）。アフィニティータグの例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ストレプトアビジン、Ｓ−タグ、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む。当業者に公知の他のタグをまた使用することもできる。市販のベクターは、１つまたは複数のアフィニティータグを含む。これらのベクターは、直接使用することができ、または必要に応じて、タグをコード化した配列は、ＰＣＲを使用してベクターから増幅し、その後、上記重合剤を含むベクターなどの異なるベクターに連結することができる。
【０２５８】
６または１０の連続したヒスチジン（Ｈｉｓ）残基部分は、金属イオンのための高アフィニティーを有する。Ｈｉｓ−６またはＨｉｓ−１０部分は、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して重合剤に結合させることができる。ＧＦＰ−Ｈｉｓ（Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：２３４４−９，１９９７）およびタンパク質−ＧＦＰ−Ｈｉｓ組換えタンパク質の生成は、前述されている（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１１：９７−１０１，１９９７）。Ｈｉｓを含有する融合タンパク質は、Ｐａｂｏｒｓｋｙら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３４：６０−５，１９９６）に記載されるように精製することができる。手短に言えば、細胞溶解物から得られたタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを使用してＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロース（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に固定化される。非結合タンパク質を洗浄除去した後、例えば、８ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液を使用して、結合組換えタンパク質は、例えば１００〜５００ｍＭの高濃度のイミダゾールを含む同一の緩衝液を使用して溶出される。
【０２５９】
Ｓ−タグシステムは、膵臓リボ核酸分解酵素Ａ由来のＳ−タンパク質と１５アミノ酸Ｓ−タグペプチドの相互作用に基づく。Ｓ−タグ付きタンパク質の精製キットに加えて、Ｓ−タグ融合タンパク質を生成するためのいくつかのベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されている。例えば、ベクターｐＥＴ２９ａ−ｃおよびｐＥＴ３０ａ−ｃを使用することができる。Ｓ−タグ融合タンパク質は、Ｓ−タグ融合タンパク質を保持するＳ−タンパク質アガロースビーズを使用して、細胞溶解物をインキュベートすることにより精製される。非結合タンパク質を洗浄除去した後、融合タンパク質は、Ｓ−タグペプチドを残す部位特異的プロテアーゼを有するアガロースビーズの培養により放出される。
【０２６０】
アフィニティータグストレプトアビジンは、非常に高いアフィニティーでＤ−ビオチンに結合する。ストレプトアビジン−融合タンパク質を生成するベクターおよびこれらのタンパク質を精製する方法は、ＳａｎｔｏおよびＣａｎｔｏｒに記載されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７６：５７１−７，１９９１、参照により本明細書に組み込まれる）。融合タンパク質を精製するために、細胞溶解物は、２−イミノビオチンアガロースカラムに加えられ（その他のビオチンを含有するカラムを使用してもよい）、非結合タンパク質を洗浄除去した後、融合タンパク質は、例えば、６Ｍ尿素、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）を使用して溶出される。
【０２６１】
酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、グルタチオンに対する高アフィニティーを有する。ＧＳＴ（ｐＧＥＸ）を含有するプラスミド発現ベクターは、Ｓｍｉｔｈへの米国特許第５，６５４，１７６号およびＳｈａｒｒｏｃｋｓ（Ｇｅｎｅ，１３８：１０５−８，１９９４）に開示される。ｐＧＥＸベクターは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販される。細胞溶解物は、グルタチオン−アガロースビーズでインキュベートされ、洗浄後、融合タンパク質は、例えば、５ｍＭ還元したグルタチオンを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して、溶出される。ＧＳＴ−重合剤の融合タンパク質の精製後、ＧＳＴ部分は、特定のタンパク質分解的切断により放出できる。ＧＳＴ−融合タンパク質は不溶性である場合、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＴｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ  ジチオスレイトールまたは０．０３％のＮａＤｏｄＳＯ４などのグルタチオン−アガロースに結合するために分離しない可溶化剤において、タンパク質が可溶化する場合、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ＧＳＴ−融合タンパク質を可溶化するために使用される他の方法は、ＦｒａｎｇｉｏｎｉおよびＮｅｅｌにより記載される（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：１７９−８７，１９９３）。
【０２６２】
組換えＧＦＰ−ポリメラーゼ
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ＧＦＰの中央にアミノ酸により形成された発色団を含む。野生型ＧＦＰは、５０８ｎｍで発光を生成するために３９３ｎｍまたは４７６ｎｍで励起される。ＧＦＰ突然変異体は、励起および発光スペクトルのどちらかを有する。ＧＦＰ突然変異体Ｈ９−４０は、３９８ｎｍで単一吸収のみを有し、５１１ｎｍで放出する。赤方移動ＧＦＰ突然変異体ＲＳＧＦＰ４（Ｄｅｌａｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：１５１−４，１９９５）は、４９０ｎｍで励起し、５０５ｎｍで発光する。青方移動ＧＦＰ突然変異体ＢＦＰ５は、３８５ｎｍで吸収し、４５０ｎｍで放射する（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１７３：１３−７，１９９６）。
【０２６３】
重合剤は、当業者に公知の組換え技術により、ＧＦＰ−ポリメラーゼなどの融合タンパク質を生成するためにＧＦＰに結合することができる。野生型または突然変異体ＧＦＰ遺伝子配列およびポリメラーゼ配列を挿入することができる多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むプラスミド（ｐＧＦＰなど）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から市販されている。
【０２６４】
手短に言えば、ポリメラーゼＤＮＡおよびＧＦＰプラスミドの双方は、センス方向において、ＧＦＰプラスミドのＭＣＳにポリメラーゼの挿入を可能にする適切な制限酵素で消化される。得られたフラグメントは、連結され、大腸菌などのバクテリアで発現される。発現した組換えＧＦＰ−ポリメラーゼは、その後、当業者に公知の方法を使用して精製される。ＧＦＰは、ポリメラーゼのＮまたはＣ末端で、またはその間のどこでも（露出したＣｙｓ残基など）、置くことができる。理想的には、ＧＦＰ−ポリメラーゼは、重合活性およびＧＦＰの蛍光特性を保持する。
【０２６５】
組換えＧＦＰ−エクオリン−ポリメラーゼ
組換えＧＦＰ−エクオリン−ポリメラーゼは、当業者に公知の方法、例えば、Ｂａｕｂｅｔらにより開示された方法を使用して、生成することができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２６０−５，２０００、参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２６６】
手短に言えば、エクオリンｃＤＮＡ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ２９５７１）、ポリメラーゼＤＮＡ、およびＧＦＰプラスミドは、センス方向において、ＧＦＰプラスミドのＭＣＳにエクオリンおよびポリメラーゼの挿入を可能にする適切な制限酵素で消化される。得られたフラグメントは、連結され、大腸菌などのバクテリアで発現される。発現した組換えＧＦＰ−エクオリン−ポリメラーゼは、その後、上記のように精製される。また、アフィニティータグを、加えることもできる。
【０２６７】
ＧＦＰ、エクオリン、およびポリメラーゼ配列の順序付けは、最適化することができる。配列決定のための最適特性を有することを決定するために、得られるＧＦＰ−エクオリン−ポリメラーゼを試験する。そのような特性は、タンパク質精製の容易さ、生成されるタンパク質量、放出した化学発光シグナル量、励起後放出した蛍光性シグナル量、ＧＦＰおよびエクオリンの蛍光特性の最小変化、およびポリメラーゼ活性量を含むことができる。
【０２６８】
ポリメラーゼへのフルオロフォア結合
ＧＦＰ−ポリメラーゼ融合タンパク質を生成する代替物として、その他のフルオロフォアを使用することができる。特定の例において、蛍光標識された重合剤は、高蛍光収率を有し、重合剤の生物学的活性を保持し、主として、核酸分子の相補的鎖を合成する能力を有する。重合剤は、従って、重合剤の機能を維持するために最大ではない蛍光収率を有する。反応染料でタンパク質を標識化する方法は、当業者には公知である。さらに、分子プローブ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）などのそのような蛍光染料の製造者は、そのような反応を実施するために指示を提供する。１つまたは複数のフルオロフォアの重合剤への接合に続き、非接合染料は、例えば、ゲルろ過、透析またはその組み合わせにより除去することができる。
【０２６９】
例えば、アミン反応性フルオロフォアは、重合剤に結合することができる。使用可能なアミン反応性プローブの例は、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミン、テキサスレッドおよびそれらの誘導体を含むがそれらに限定されない。そのような染料は、Ｎ末端で遊離アミンと同様に、ポリメラーゼ内のリジン残基に結合するであろう。アミン反応性フルオロフォアの反応は、通常ｐＨ７〜１０の範囲のｐＨ値で開始する。
【０２７０】
あるいは、チオール反応性プローブは、蛍光標識されたポリメラーゼを生成するために使用することができる。タンパク質では、チオール基は、システイン残基に存在する。チオールを伴うフローライト反応は、化学的に安定したチオエステルを得るために、生理学的ｐＨ領域（ｐＨ６．５〜８．０）において、室温で、または室温以下で、通常迅速に行われる。使用可能なチオール反応性プローブの例には、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、クマリン、ローダミン、テキサスレッドおよびそれらの誘導体を含むがそれらに限定されない。
【０２７１】
アルコール（セリン、トレオニン、およびチオシン残基）、カルボン酸およびグルタミンを含むタンパク質の他の官能基は、エーテルフルオロフォアをポリメラーゼに接合するために使用することができる。
【０２７２】
ポリメラーゼに結合することができる別のフルオロフォアは、ＡｌｌｅｎおよびＢｅｎｋｏｖｉｃにより記載されるように、４−［Ｎ−［（ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−ｌ，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤ）である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，２８：９５８６）。
【０２７３】
実施例２
タグ付き化学的部分
本実施例は、１つまたは複数のタグを非加水分解性ヌクレオチド類似体（例えば、ｄＮＭＰまたはｄＮＤＰ）などの化学的部分に結合する方法を記載する。さらに、当業者は、市販のタグ付き化学的部分は、本開示のプローブに使用することができることを認識するであろう。
【０２７４】
１つまたは複数の受容体フルオロフォアなどのタグは、化学的部分のいずれの部分にも結合することができる。例えば、化学的部分がヌクレオチド類似体である場合、タグは、塩基、糖質、またはリン酸（α、β、またはγ−リン酸など）に直接的または間接的に結合することができる。理想的には、そのような結合は、鋳型鎖に可逆的結合し、標的核酸鎖において相補的ヌクレオチドと対にする化学的部分の能力を阻害しない。さらに、理想的には、タグは、検出可能なシグナルを提供するために化学的部分に結合することができる。
【０２７５】
一例において、受容体フルオロフォアなどのタグは、リンカー分子により化学的部分に間接的に結合される。例えば、ストレプトアビジン連鎖を使用することができる。連鎖は、ペプチダーゼ感受性である場合があり、発光後、タグを放出させることができ、シグナルは、標的核酸鎖における化学的部分とその相補的塩基との間の対合の結果として検出される。Ｈｏｂｂｓらへの米国特許第５，０４７，５１９号および第５，１５１，５０７号（参照により本明細書に組み入れられる）は、ヌクレオチドをフルオロフォアから単離するためにリンカーの使用を教示する。リンカーの例は、直鎖アルキレン、Ｃ１−Ｃ２０を含み、任意的に、二重鎖結合、三重結合、アリール基またはＮ、ＯまたはＳなどのヘテロ原子を含んでもよい。ジラジカル部分の置換基は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、エステル、エーテル、アミン、アミドまたはクロロ基を含むことができる。
【０２７６】
Ｊｅｎａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅは、ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、ｄＣＭＰＣＰＰ、ＴＭＰＣＰＰ、ｄＧＭＰＮＰＰ、ｄＡＭＰＮＰＰ、ｄＣＭＰＮＰＰ、およびＴＭＰＮＰＰなどの加水分解性ではない複数の異なるヌクレオチド類似体を提供し、αリン酸とβリン酸の間の酸素の代わりにＣは、ＣＨ２基を示し、Ｎは、ＮＨ基を示す。
【０２７７】
化学的部分のそれぞれ異なる型（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰなど）に関連するタグが異なる供与体フルオロフォアの例において、理想的には、重合剤に供与体フルオロフォアを励起するために使用される周波数は、受容体フルオロフォアの励起スペクトルに有意に重複するとは言えない。しかしながら、各化学的部分は、供与体フルオロフォアからの発光が受容体フルオロフォアを励起するように、重合剤に結合される供与体フルオロフォアの発光スペクトルを重複する励起スペクトルを有する少なくとも１つの受容体フルオロフォアを保有しなければならない。さらに、化学的部分のそれぞれの型（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰなど）は、それぞれの型（ｓｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰなど）がその他の型（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰなど）と区別できる発光シグナル（発光スペクトルなど）を有するように、結合した一意的なタグ（または一意的な組み合わせのタグ）を有するであろう。故に、「Ａ」に相補的である化学的部分は、「Ｃ」、「Ｇ」、または「Ｔ」に相補的である化学的部分と異なる発光シグナルを発し、「Ｃ」に相補的である化学的部分は、「Ｔ」、「Ｇ」、または「Ａ」に相補的である化学的部分と異なる発光シグナルを発し、「Ｇ」に相補的である化学的部分は、「Ｃ」、「Ａ」、または「Ｔ」に相補的である化学的部分と異なる発光シグナルを発し、および「Ｔ」に相補的である化学的部分は、「Ｃ」、「Ｇ」、または「Ａ」に相補的である化学的部分と異なる発光シグナルを発するだろう。ＲＮＡの場合、本例において、Ｕは、Ｔの代わりに機能するだろう。
【０２７８】
タグ付きの化学的部分が、標的核酸に相補的ヌクレオチドと組み合わせることができることを確実にするのに役立てるために、タグ付きの化学的部分は、例えば、タグが受容体フルオロフォアである場合、蛍光分光光度計を使用して試験することができる。
【０２７９】
オリゴヌクレオチドが４つの塩基突出を持つｄｓＤＮＡを形成するためにそれ自体にアニーリングするように、Ｔｍ値が高いヘアピンを含む５’フルオレセイン標識付きのオリゴヌクレオチドを合成する（Ｌｙａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９：４８９２−４９００，２００１）。ヘアピンオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの上の鎖および下の鎖の正確な等モル量を可能にし、それは、いずれのアニーリング調製工程を必要としない。ポリメラーゼは、突出部を埋めることができ、付加される次の塩基は、ｄＴＴＰである。本オリゴヌクレオチドの一バージョンにおいて、３’末端は、Ｃｙ３に接合されるｄＴＴＰを使用して１つの塩基により延長することができるヒドロキシル末端を有する正常ｄＣを有する。埋めることにより、フルオレセインは、Ｃｙ３に近く、ＦＲＥＴは、蛍光分光光度計を使用して２つのフルオロフォア間で測定される。これは、ポリメラーゼがＤＮＡに結合し、与条件下で、重合化することができることを示す。ジデオキシＣ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）で終わる別の５’フルオレセイン標識付きオリゴヌクレオチドが合成される。末端平滑化反応条件（Fill in reaction condition）は、第１オリゴヌクレオチドと同様に設定される。ポリメラーゼが存在する場合、ＦＲＥＴは、５’フルオレセインと、ジデオキシターミネーション化されたオリゴヌクレオチドに共有結合できないｄＴＴＰ−Ｃｙ３との間で観測される。ポリメラーゼなしでは、ＦＲＥＴは観測されず、（ポリメラーゼが存在する場合）観測したＦＲＥＴは、ＤＮＡヘアピン上のその相補塩基にＣｙ３−ｄＴＴＰを保持するポリメラーゼにより生じることを示す。これらの同一条件下で、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰはＦＲＥＴから離れ競合しないが、ｄＴＴＰは競合し、不正確なものではなく、正確な次のヌクレオチドを結合させるためのポリメラーゼ−ヘアピン複合体による選択を示す。
【０２８０】
実施例３
化学的部分へのリンカーの結合
本実施例は、図１に示すように、それぞれの分子リンカー１４、１６、１８、２０への化学的部分２２、２４、２６、２８の結合など、リンカー（ＰＥＧなど）を化学的部分（ヌクレオチド類似体など）に結合するために使用することができる方法を記載する。
【０２８１】
テザー末端は、アミノ基を含むことができ、ホスホラミダイト連結を介して非加水分解性のｄＮＴＰアナログのγ−リン酸に結合することができる。
ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＤＮＡ−ＮＨ２＋ＰＰＮＰ−デオキシリボヌクレオチド→
ＤＮＡ−ＰＥＧ−ＤＮＡ−ＮＨ−ＰＰＮＰ−デオキシリボヌクレオチド
式中ＰＰＮＰは、α，β−Ｐ−Ｏ−Ｐ結合は、イミド基、Ｐ−Ｎ−Ｐにより置換されることを意味する。反応は、１Ｍ  １−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ｐＨ６．５、２０°Ｃで１０〜１２時間、使用する（Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７４：４５６−７８，１９９６）。
【０２８２】
さらに、Ｊｅｎａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅは、アミノ基（γ−［（８−アミノオクチル）−イミド］−ｄＵＴＰ）で終わるγリン酸に結合されるテザーを有するｄＵＴＰを提供する。
【０２８３】
実施例４
例示的分子リンカー
本実施例は、特異な屈曲を有する例示的な分子リンカーを記載する。これは、プローブが極めて特異な運動をしか有さないことを可能にし、絡み合いの可能性を取り除くことができる。
【０２８４】
特定の実施例において、分子リンカーは、隆起を有するｄｓＤＮＡ、欠損した塩基、またはｄｓＤＮＡ内のニック（例えば、中央部付近または中央部で）を含む。別の実施例において、ｄｓＤＮＡは、両鎖における同一位置で短いＰＥＧテザーを含む（図３）。このような分子リンカーは、分子リンカーの柔軟性および剛性をさらに制御するために使用することができる。例えば、屈曲は、重合剤の活性部位に化学的部分の先端を誘導するために分子リンカーの屈曲部を方向付けるための特定角度の範囲で設計することができる。特定の実施例において、ｄｓＤＮＡの３’および５’末端の双方は、回転を避けるためにポリメラーゼに結合される。
【０２８５】
実施例５
核酸分子を配列決定するためのプローブ
本実施例は、標的核酸分子を配列決定するために使用することができる特定のプローブを記載する。特定のフルオロフォア、分子リンカー、およびポリメラーゼが記載されるが、これらへの変化は、本明細書の教示に基づいて行うことができることを当業者は理解するであろう。
【０２８６】
設計は、図２Ｃに基づくが、ポリメラーゼへの分子リンカーの結合方法は、テザー３０６、ｄｓＤＮＡ３１０、およびテザー３０８を除去することにより変更される。ｄｓＤＮＡ３３６は、いかなる切断もなく、Ｔｕｓタンパク質に対する結合部位（ｔｅｒ）を含む連続ｄｓＤＮＡにより置換される。Ｔｕｓタンパク質は、ＨＩＶ−１  ＲＴ（例えば、実施例１に記載される方法を使用して）に翻訳的に融合される。
【０２８７】
ＤＮＡ配列は、ＮＡＮＥＶプログラムを使用して設計され、図２Ｃに示される制限酵素認識部位が唯一であることを確保するために確認された。さらに、ＭａｅＩＩＩ制限酵素認識部位は、ｔｅｒ配列に必然的に出現し、これは、プローブにおいて、唯一である。使用したＴｕｓ配列は、９つの既知のＴｕｓ部位からのコンセンサス塩基である。ある対のｓｓＤＮＡ配列が互いに相補的であり、いくつかの配列が図２Ｃに示される制限酵素認識部位を含む制限を考慮し、ＮＡＮＥＶプログラムが、構造を進化させるために使用された。
【０２８８】
ＮＡＮＥＶは、ｄｓＤＮＡ鎖の名前に単一文字を使用する。小文字（ａ、ｃ、ｇ、ｔ、ｅ、ｈ、ｂ、ｐ、ｍ）は、大文字（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｅ、Ｈ、Ｂ、Ｐ、Ｍ）で標識化された対応するｓｓＤＮＡにハイブリダイズされるｓｓＤＮＡのセグメントを示す。「ハブ」部分がそれらを切断する制限酵素により命名される（Ｅ、Ｈ、Ｂ、Ｐ、Ｍ）が、それぞれのｄｓＤＮＡの分岐は、対応する非加水分解性塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）により命名される。例えば、非加水分解性アデノシン３４６を有する分岐３３４に関しては、１つのオリゴヌクレオチドは、３５６−３３４−１ａと称され、フルオロフォア３５６に結合される。３５６−３３４−１ａは、３３２−３１６−３３４−３１８−３４６−１１Ｅ−２Ａと共にアニーリングする。
【０２８９】
ＮＡＮＥＶを使用して設計された１４のｄｓＤＮＡ部分を表３に示す。
【０２９０】
（表３）ナノプローブを生成するための配列
2009519041.tif 000008
【０２９１】
これらの１４の成分のいくつかは、ＰＥＧにより接合され、１０のオリゴヌクレオチドを生成するために適切なフルオロフォアに結合される。ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）またはＭｉｄｌａｎｄ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）は商業的に１０のオリゴヌクレオチドを以下のように合成することができる。
2009519041.tif 000009
ここで［フルオロフォア３５６］は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ（ＴＭ）−Ｘ（最大吸収：５７４ｎｍ、最大発光：５９４）「緑色」である。
2009519041.tif 000010
ここで［フルオロフォア３５８］は、Ｃｙ３（ＴＭ）（最大吸収：５５０ｎｍ、最大発光：５６４）「青色」である。
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ここで［フルオロフォア３６０］は、テキサスレッド（登録商標）−Ｘ（最大吸収：５９８ｎｍ、最大発光：６１７）「黄色」である。
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ここで［フルオロフォア３６２］は、Ｃｙ５（商標）（最大吸収：６４８ｎｍ、最大発光：６６８）「赤色」である。
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【０２９２】
４つの非加水分解性のｄＮＴＰは、合成される（例えば、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより）：ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、ｄＣＭＰＣＰＰ、およびＴＭＰＣＰＰであり、ここでＣはαとβリン酸との間で酸素の代わりにＣＨ２基を示す。ここで留意すべきは、古い用語ＴＭＰＣＰＰは、ｄＴＭＰＣＰＰ、つまりデオキシリボ−ＴＭＰＣＰＰを意味することである。（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅはまた、ｄＧＭＰＮＰＰ、ｄＡＭＰＮＰＰ、ｄＣＭＰＮＰＰ、およびＴＭＰＮＰＰを提供することができ、ここでＮは、αとβリン酸の間の酸素の代わりのＮＨ基を示す。ここで留意すべきは、古い用語ＴＭＰＮＰＰは、ｄＴＭＰＮＰＰ、つまりデオキシリボ−ＴＭＰＮＰＰを意味することである。）
【０２９３】
標識およびオリゴヌクレオチドの役割が逆であることを除き、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＴＲ００３０．１「修正および標識オリゴヌクレオチド５’リン酸基」から得られる以下の反応プロトコルを使用して、それぞれの非加水分解性のｄＮＴＰを、対応するオリゴヌクレオチド分岐におけるアミノ基にそのγリン酸により共有結合させる。
【０２９４】
１．１０μｌの反応緩衝液に非加水分解性のｄＮＴＰを溶解する。（Ｐｉｅｒｃｅ社により推奨される反応緩衝液は、「ＥＤＴＡ入りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２などの反応緩衝液である。意図した反応を妨害する、１０ｍＭより多いリン酸を含有するＰＢＳの使用を避けなければならない。その他のアミンを含まないおよびカルボン酸を含まない緩衝液を代用することができるが、反応をクエンチする１級アミンを含むＴｒｉｓを避けなければならない。」）
２．オリゴヌクレオチドを１０μｌの０．１Ｍイミダゾール、ｐＨ６中に溶解し、１ｍＭの最終濃度にする。
３．１．２５ｍｇ（６．５２ｍｉｃｒｏｍｏｌ）のＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．２２９８０）を量り、微小遠心管に入れる。
４．ＥＤＣを含む前記管に７．５μｌの調製した非加水分解性のｄＮＴＰを加え、直ちに５μｌのオリゴヌクレオチド／イミダゾール溶液を加える。
５．内容物が完全に溶解するまで前記管をボルテックスし、その後内容物を収集するために該管を少しの間、遠心分離する。
６．さらに２０μｌの０．１Ｍイミダゾール、ｐＨ６をさらに加える。
７．室温で一晩反応物をインキュベートする。
８．１０％のポリアクリルアミドゲルに反応生成物から未反応のオリゴヌクレオチドを分離する。
【０２９５】
ＤＮＡポリメラーゼへの結合能力により生成物を精製することも可能である。初めに、サイズ排除カラムまたは透析を使用して未反応ヌクレオチドを除去する。次に、ＨＩＶ−１  ＲＴまたは結合した別のポリメラーゼ（例えば、ニッケルカラムへのヒスチジン−６タグ結合を有するＨＩＶ−１  ＲＴ）を有するカラムを作製する。鋳型ＤＮＡおよびアニーリングしたプライマーＤＮＡを追加することができる。本ポリメラーゼカラムは、ヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを、テザーヌクレオチドを持たない未反応のオリゴヌクレオチドと比較して、遅延させなければならない。上記のカルボジイミド架橋結合反応の詳細は、ＣｈａｔｔｅｒｊｉおよびＧｏｐａｌで得られる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７４：４５６−７８，１９９６）。本プロトコルは、それぞれのオリゴヌクレオチドについて別々に実施される。
【０２９６】
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【０２９７】
これにより以下の構造が構築される。
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【０２９８】
次に、３３２−３１６−３３４−３１８−３４６−１１Ｅ−２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）；３４０−３２２−３３８−３２０−３５２−１４Ｐ−８Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）；３５０−３２６−３４４−３２４−３４２−６Ｇ−１３Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）；３４８−３１２−３２８−３１４−３３０−４Ｃ−１２Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；３５６−３３４−１ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；３５８−３２８−３ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；３６０−３４４−５ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；３６２−３３８−７ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；３３２−３３６−３４２−９ｅＭｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；３４０−３３６−３３０−１０ｐｍｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１０のオリゴヌクレオチドが、図２Ｃに示されるプローブの分子リンカー３０２を形成するため、一緒にハイブリダイズされる。分子リンカー３０２はその後ゲル電気泳動、排除カラムまたはショ糖密度勾配により精製される。得られた分子リンカー３０２の構造は、５つの制限酵素を単独でおよび組み合わせて用いて消化して、ポリアクリルアミドゲル上で生成物を観測することにより、試験することができる。
【０２９９】
大腸菌由来のｔｕｓ（終結利用因子）遺伝子は、ｐＢＡＤ３３ｔｕｓにクローン化された（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２６５：９４１−５３，２００１，Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．７７：４１２１−３０，１９９５）。ＨＩＶ−１  ＲＴ  ｐ６６サブユニットは、すべての溶媒利用しやすいシステイン残基はセリン残基に置換し（Ｃ３８ＳおよびＣ２８０Ｓ）、２８７のリジンを唯一のシステインに置きかえる（Ｋ２８７Ｃ）（Ｋｅｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１：１０２９−３９，２０００）。２８７の唯一のシステインは、ポリメラーゼの「サム（ｔｈｕｍｂ）」にあり、ポリメラーゼの活性部位に近いが、ＤＮＡ結合または活性部位を阻害しないように十分遠く離れている。Ｔｕｓタンパク質はわずか２つのシステイン、ＣＹＳ９９およびＣＹＳ２５５、があり、双方は完全に埋められているため（ＰＤＢ  １ＥＣＲ  Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８３：５９８−６０３，１９９６）、露出したシステインを避けるためにＴｕｓを遺伝子操作する必要はない。Ｔｕｓは、突然変異ＨＩＶ−１  ＲＴを用いた翻訳による融合の際に、クローン化される。
【０３００】
ＨＩＶ−１  ＲＴ（ＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １ＲＴＤ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１６６９−１６７５，１９９８）およびＤＮＡに結合したＴｕｓ結合（１ＥＣＲ  Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８３：５９８−６０３，１９９６）の三次元構造に見られるように、双方のタンパク質のＮおよびＣ末端は、活性部位から十分距離を置いて表面にあるので、２つのタンパク質の融合は、それらの構造または機能を阻害しない。ＲｅｃＢタンパク質の２つの部分を結合する親水性ポリペプチド（ＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １Ｗ３６，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４３２：１８７−９３，２００４）は、ＴｕｓをＨＩＶ−１  ＲＴに接続してＴｕｓ−ＨＩＶ−１  ＲＴを生成するために使用される。
【０３０１】
当業者は、ＴｕｓかＨＩＶ−１  ＲＴタンパク質のどちらかが融合物のＮ末端に置かれ、それらは入れ替え可能であることを認識するであろう。当業者はまた、分離に役立てるために構造のいずれかの末端に６−ヒスチジンタグを置くことができることを認識するであろう。ＴｕｓのＮ末端の６−ヒスチジンタグは、結合にほとんど影響がないが、ＨＩＶ−１のＣ末端の６−ヒスチジンタグは、ポリメラーゼ活性に既知の影響を全く与えない。
【０３０２】
供与体フルオロフォアは、マレイミド標識試薬フルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ製造者の使用説明書を使用）を使用することにより、Ｔｕｓ−ＨＩＶ−１  ＲＴにおいて唯一のシステインに結合する。この供与体フルオロフォアは、上記の４つの受容体の対のそれぞれとＦＲＥＴの対を形成する。当業者はまた、相対シグナル強度を必要に応じて調整するために、対応するオリゴヌクレオチドに追加の受容体フルオロフォアを加えることができることも認識するであろう。当業者は、フルオロフォアの多くの他の組み合わせが可能であることを認識するであろう。
【０３０３】
完成したプローブを生成するためにＴｕｓ−ＨＩＶ−１  ＲＴタンパク質をコアに加える。プローブはその後ゲル電気泳動、排除カラムまたはショ糖密度勾配により精製される。最終プローブ構造は、５つの制限酵素で単独でおよび組合せにより消化し、ポリアクリルアミドゲルの生成物を観測することにより、確認することができる。
【０３０４】
第２の実施例において、逆転写酵素は、そのエラー頻度を低減するためにＦ２２７Ａの定方向突然変異誘発により改変される（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８１７５−８４，１９９９）。第３の実施例において、それが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）リンカー配列の場合と同様、ＴｕｓとＨＩＶ−１  ＲＴとの間の結合は、決定される。使用した古典的な配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であるが、ファージディスプレイ技術は、その他の組み合わせを得るために使用することができる（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５６８２−６，１９９６；Ｈｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：４０５−１０，１９９８）。
【０３０５】
当業者は、多くの他の組み合わせが本願開示のナノプローブに対して可能であることを認識するであろう。
【０３０６】
実施例６
核酸分子を配列決定するためのコード化したプローブ
本実施例は、複数のフルオロフォアがそれぞれの非加水分解性のヌクレオチド類似体に関連する、実施例５に記載されるプローブの変異体を記載する。フルオロフォアの特定の組み合わせを記載するが、その他の組み合わせを使用することができることを当業者は理解するであろう。そのようなプローブは、それぞれの化学的部分に関連する受容体フルオロフォアの光退色の検出を可能にし、特定の実施例において、そのような光退色の修正を可能にする。
【０３０７】
プローブの化学的部分のそれぞれが単一受容体フルオロフォアにのみ関連する場合、その受容体フルオロフォアは、退色により失い、受容体発光シグナルはその受容体フルオロフォアから検出されない。この光退色した受容体フルオロフォアからシグナルがない場合、シグナルの喪失が、光退色によるものであるか否か、または一続きの標的配列がその塩基を単に持たないか否かを識別することは困難である。それぞれの化学的部分に２つ以上のタグを関連させることにより、フルオロフォアの退色は、検出することができ、一部の実施例において修正されることができる。
【０３０８】
図２Ｄに示されるプローブは、化学的部分３４６、３４８、３５０、３５２のそれぞれに関連する複数のタグ４０４、４０６、４０８、４１０を含む。複数の受容体フルオロフォアの含有は、退色により、または分子リンカー部分の喪失により、フルオロフォアの喪失の検出を可能にする。
【０３０９】
図２Ｄでは、異なるタグ３５４、４０４、４０６、４０８、４１０は、Ｈａｍｍｉｎｇエラー修正コードに類似のコードを形成する。これらのタグのいずれか１つが光退色により破壊される場合、得られるシグナルは、損傷を受けていないプローブにより生成されたものとは異なる。例えば、供与体３５４が破壊される場合、その後、供与体発光は、生成されず、他のフルオロフォアのどれも励起されない。そのようなプローブからの配列データは無視することができる。プローブの「Ａ」アームは、２つの受容体フルオロフォア４０４および４０６を有する。相補的Ｔがポリメラーゼ結合部位の標的ＤＮＡにある場合、双方のフルオロフォアは、供与体３５４により励起される。これは、その他の３つのアームに比べて一意的なスペクトルを生成する。つまり、Ａは、４０４、４０６に関連し、Ｃは、４０４、４０８に関連し、Ｇは、４０４、４１０に関連し、Ｔは、４０６、４０８、４１０に関連する。ロッド３３４のフルオロフォア４０４は、光退色化され、その後、Ａアームは、４０６のスペクトルのみを含むシグナルを報告する。これは、損傷を受けていないＡのシグナルおよびその他の３つのアームにより生成されるシグナルとは異なる。従って、記録コンピュータは、プローブが損傷され、終了しなければならないプローブから読み取るシグナルを決定することができる。Ｔアーム３３８は３つのフルオロフォアを有するため、フルオロフォア４０８および４１０の双方が同時に破壊される可能性が低い。従って、４０６からのスペクトルのみを含むシグナルは、標的ヌクレオチドへのＡアームの結合によって生じる可能性が高い。従って、コンピュータは、読み込みを終了する前に配列の次の塩基が実際にはＡであることを推定することができる。つまり、コンピュータは、エラー検出およびエラー修正を実施することができる。
【０３１０】
ロッド３３４上のフルオロフォア４０６が破壊された場合、受信したシグナルは、スペクトル４０４のみで構成される。スペクトル４０４はまた、ロッド３２８上のフルオロフォア４０８を退色することにより、またはロッド３４４上のフルオロフォア４１０を退色することにより生成されることもできる。従って、シグナル４０６を発出したアームを、明確に決定することができない。この場合、ＤＮＡ配列を読み込むコンピュータは、エラーが生じることを含むことができるが、エラーを修正することができないと結論づけることができる。この時、Ｍｅｄｕｓａからの読み込みは終了する。
【０３１１】
ロッド３２８または３４４上のフルオロフォアの破壊は、ロッド３３４上のフルオロフォアの破壊と類似の結果を生じる。これらの全ての場合、共通のフルオロフォア４０４が破壊される場合、あるエラーが検出され、そのエラーは、修正されることができる。４０４でないその他のフルオロフォア（つまり、ロッド３３４、３２８、３４４上のそれぞれフルオロフォア４０６、４０８、４１０）が破壊される場合、あるエラーが検出され、エラーは、修正されることができない。一度エラーが検出され、修正されると、第二のエラーが不明確な結果を生じるため、配列決定は、終了する。
【０３１２】
ロッド３３８上の３つのフルオロフォア４０６、４０８、４１０のいずれかは、光退色され、その後残った２つのフルオロフォアはさらに、一意的なシグナルを生じる。例えば、フルオロフォア４０６が破壊され、その後Ｔアームが標的ヌクレオチド上のＡに結合する場合、シグナルは、フルオロフォア４０８および４１０からのスペクトルで構成される。これらのスペクトルは単独で損傷していないプローブにより生成されないため、あるエラーが検出され、そのエラーは、修正されることができる。この場合、その他の３つのアームのように、第二のエラーが不明確な結果を生じるため、エラー修正後、配列決定は、終了される。
【０３１３】
その他のコード化スキームは、本明細書に開示されるプローブに対して可能であり、４つ以上のフルオロフォアを有するスキームを含む。当業者は、種々のコード化スキームにより検出され、修正されることができるエラー数を予測することができる。しかしながら、図２Ｄに示されるものは、実施する４つのフルオロフォアのみ必要とする。図２Ｃに示されるような基本プローブは、十分な配列データを作製するために４つのフルオロフォアを使用するが、４つのフルオロフォアのみの冗長再配列は、エラーを検出し、修正するプローブの構築を可能にする。プローブ設計は、フルオロフォアの交換を可能にするため、図２Ｃに示されるように、ｓｓＤＮＡ３６４とｓｓＤＮＡ３３４を交換でき、基本非コード化のプローブが構築されると、図２Ｄに示されるようにコード化したプローブを作製することを可能にする。実施例５において、コード化プローブは、オリゴヌクレオチド３５６−３３４−１ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、３５８−３２８−３ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、３６０−３４４−５ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、および３６２−３３８−７ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）が以下の４つのオリゴヌクレオチドにより置換される場合を除いて、構築される。
2009519041.tif 000016
「青色」「赤色」
2009519041.tif 000017
「青色」「黄色」
2009519041.tif 000018
「青色」「緑色」
2009519041.tif 000019
「赤色」「黄色」「緑色」
ここで［フルオロフォア４０４］はＣｙ３（登録商標）（最大吸光度：５５０ｎｍ、最大発光：５６４）「青色」（図２Ｃのフルオロフォア３５８に対応）であり、［フルオロフォア４０６］は、Ｃｙ５（登録商標）（最大吸光度：６４８ｎｍ、最大発光：６６８）「赤色」（図２Ｃのフルオロフォア３６２に対応）であり、［フルオロフォア４０８］は、テキサスレッド（登録商標）−Ｘ（最大吸光度：５９８ｎｍ、最大発光：６１７）「黄色」（図２Ｃのフルオロフォア３６０に対応）であり、［フルオロフォア４１０］は、ローダミンレッド（商標）−Ｘ（最大吸光度：５７４ｎｍ、最大発光：５９４）「緑色」（図２Ｃのフルオロフォア３５６に対応）である。
【０３１４】
実施例７
基板へのプローブまたは核酸分子の結合
本実施例は、顕微鏡用スライドまたはゲルマトリクスなどの基板への実施例１において生成されたタグ標識された重合剤（例えば、実施例５および６のプローブ部分）、または核酸分子を結合するために使用することができる方法を記載する。配列決定反応中、配列決定される標的核酸分子、オリゴヌクレオチドプライマー、またはプローブは、基板（例えば、顕微鏡の視野において）に結合することができる。
【０３１５】
核酸の結合
基板への核酸（例えば、配列決定される標的核酸分子またはオリゴヌクレオチドプライマー）を結合するいくつかの方法が使用できる。核酸分子は、５’または３’末端、または中間のどこかにより、基板に結合させることができる。例えば、５’ビオチン化プライマーを、合成し（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ２２：１８５９−６２，１９８１；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５４：２８７−３１３，１９８７）、ストレプトアビジンをコーティングした基板表面に付着することができる（Ｈｕｌｔｍａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４９３７−４６，１９８９）。別の例において、核酸分子は、Ｈａらにより記載されるように、アミノプロピルシラン化された（ＡＰＳ）ガラス上で乾燥することができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：６２６４−６８，１９９６、参照により本明細書に組み入れられる）。リンカーを介してオリゴヌクレオチドプライマーを基板に結合する方法は、Ｃｈｅｅｓｅｍａｎへの米国特許第５，３０２，５０９号に開示され、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１６】
さらに他の例において、核酸分子は、活性シリル部分を核酸分子に結合することにより（例えば、Ｋｕｍａｒらにより開示された方法を使用することにより（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：ｅ７１，２０００））、修飾されていない基板に交差結合する。手短に言えば、シランは、以下のように核酸に結合される。メルカプトシラン［（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン］を酢酸ナトリウム（３０ｍＭ、ｐＨ４．３）またはクエン酸ナトリウム（３０ｍＭ、ｐＨ４）などの反応緩衝液により５ｍＭの保存液にまで希釈する。メルカプトシランによる５’−チオール−標識ヌクレオチドの結合に対して、１ｎｍｏｌのヌクレオチドを、１０〜１２０分間、室温で２０μｌの同一の緩衝液中の５ｎｍｏｌのメルカプトシランと反応させる。反応混合物を、直接使用するか、またはガラスの顕微鏡用スライドなどの基板に固定化のために所望の濃度に反応緩衝液で希釈する。５’−アクリル−標識オリゴヌクレオチドは、同一工程を使用して、メルカプトシランに結合される。
【０３１７】
５’−チオール−標識ヌクレオチドは、ヘテロ二官能性リンカーＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはスクシンイミジル−６−（ヨードアセチル−アミノ）−ヘキサノエート（ＳＩＡＸ）の存在下で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のアミノシラン［（３−アミノプロピル）−トリメトキシシラン］で結合される。ヌクレオチド（最終濃度５〜５０μＭ）は、１０μｌのＤＭＳＯ中で２．５ｎｍｏｌのアミノシラン（エタノール中で５ｍＭの溶液から添加）および２．５ｎｍｏｌの二官能性試薬（ＤＭＳＯ中の５ｍＭの原液から添加）と混合され、反応は、１〜２時間、室温で進行させた。
【０３１８】
アクリル−標識オリゴヌクレオチド（５０〜５００ｐｍｏｌ）は、１０μｌの３０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．３中の２５ｎｍｏｌのアクリルシラン（γ−メタクリルオキシプロピル−トリメトキシシラン）と混合させる。過硫酸アンモニウム（Ｈ２Ｏ中１０％）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）は、それぞれ最終濃度０．５および２％まで添加され、混合物は、３０分間、室温で反応させた。
【０３１９】
抱合反応後、反応混合物は、シラン化した核酸と称され、基板へのスポッティングのために直接使用することができる。シラン化核酸を、スライドガラス上に手動で（１２０ｎｌ／スポット）または自動アレイヤー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ，Ｗｏｂｕｒｎ．ＵＳＡ）（１ｎｌ／スポット）でスポットすることができる。水溶液中の核酸を、スライドガラス上にスポット後、１５分間、室温で加湿チャンバ内に保持し、５０℃で５分間乾燥させ、非共有結合核酸を除去するために沸騰水に３０秒間浸し、ハイブリダイゼーション前に窒素で乾燥させることができる。ＤＭＳＯ中のヌクレオチドは、スライドガラス上にスポット後、室温で１５分間放置し、５０℃で１０分間乾燥させる。これらのスライドは、ＤＭＳＯ（３×２分）、エタノール（３×２分）および沸騰水（２分）で連続的に洗浄され、その後の使用のために窒素で乾燥させる。
【０３２０】
オリゴヌクレオチドプライマーなどの基板に結合させる核酸分子に相補的核酸分子をハイブリダイズするために、ハイブリダイズされた核酸分子は、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）中の２０ｎＭと１μＭとの間まで希釈される。ハイブリダイゼーションは、加湿器中のカバースリップ下で、３７℃で３０分間一晩行われる。非ハイブリダイズおよび非特異的核酸分子は、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含む５×ＳＳＣで洗浄され（３×１分）、続いて０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（２×１５分）を含む１×ＳＳＣで洗浄することにより除去される。
【０３２１】
試料核酸分子などのより長い核酸分子をハイブリダイズする場合、ハイブリダイゼーションを、０．１％のＳＤＳおよび１μｇ／μｌの酵母ｔＲＮＡを有する３×ＳＳＣ中で、６５℃で４時間実施することができる。スライドを、その後室温で０．１％のＳＤＳを含む１×ＳＳＣ（３×２分）および０．１％のＳＤＳ（３×５分）を含む０．１×ＳＳＣで洗浄する。
【０３２２】
洗浄後、スライドは、窒素ガスで乾燥させることができる。同一の基板上で反復したハイブリダイゼーションが望ましい場合、基板は、１分間、水中で煮沸され、次のハイブリダイゼーション反応に進む前に窒素ガスで乾燥させる。
【０３２３】
３’末端で核酸を結合するために、末端トランスフェラーゼを、その分子を「テール」に使用することができる。
【０３２４】
プローブの結合
本開示のプローブを、重合剤を介して基板に結合、または固定することができる。例えば、ストレプトアビジン−ポリメラーゼ融合タンパク質を生成することができ（例えば、実施例１に記載される方法を使用して）、その後例えば、ＭａｚｚｏｌａおよびＦｏｄｏｒにより記載されるように、ビオチン化基板に添付することができる（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６８：１６５３−６０，１９９５）または、Ｉｔａｋｕｒａらの（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１５０４−１０，１９９３）。
【０３２５】
重合剤を基板に結合する他の方法は、当業者には周知である。例えば、原子間力顕微鏡の顕微鏡チップは、基板の表面を化学変化させるために使用してもよい（Ｔｒａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：３０−１，１９９５）。あるいは、重合剤が６〜１０の連続的なヒスチジン残基を含む場合、ニッケルコーティングした基板に結合する。例えば、Ｐａｂｏｒｓｋｙら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：６０−５，１９９６）は、ニッケルをプラスチック基板に結合するための方法を記載する。手短に言えば、マイクロタイターポリスチレンプレートを満たすために、１００μｌのＮ，Ｎ−ビス［カルボキシメチル］リシン（ＢＣＭＬ）を、それぞれのウェルに添加（０，１Ｍ  ＮａＰＱ４中に１０ｍＭ  ＢＣＭＬ、ｐＨ８）し、室温で一晩インキュベートする。プレートは、その後、２００μｌの０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ブロッキングされ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ中の３％  ＢＳＡ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）、一連の緩衝液で洗浄される。第１に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  イミダゾール、０．０５％  Ｔｗｅｅｎで、第２に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎで、第３に、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で、最後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄される。次に、プレートを、２０分間室温で、１０ｍＭ  ＮｉＳＯ４でインキュベートする。最後に、プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、その後５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄する。
【０３２６】
基板へのプローブのランダム結合は、低濃度のプローブで十分でなければならない。視野においてシグナルを配列決定するための密充てんを可能にするために、プローブを、整理されたアレイにおいて、二次元の基板表面に配列することができる。プローブは、Ｍuｌｌｅｒらにより記載されるようにマイクロメータの間隔で間隔をあけることができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２７２−３，  １９９５、参照により本明細書に組み入れられる）。さらに、幅約５０μｍ、深さ約１０〜２０μｍのチャネルのパターンを基板において形成し、Ｆｏｏｔｅへの米国特許第５，６６１，０２８号に記載されるように、標準フォトリソグラフィー過程を使用し、続いて化学的ウェットエッチングを使用することができる（参照により本明細書に組み入れられる）。非常に小さいチャネルを、ナノリソグラフィー技法を使用して生成することができる。２０ｎｍにわたる穴またはチャンバの穴の密度が高い周期的配列は、Ｐａｒｋらの方法による窒化ケイ素でコーティングされた基板に製造される（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１４０１−４，１９９７、参照により本明細書に組み入れられる）。それぞれのチャンバにおいて、単一配列決定反応を実施する。プローブはまた、基板の表面上にプローブを含む液滴を微量ピペットにより規則的なアレイにおいて基板に結合することもできる。液滴を、例えば、ガラスのカバースリップで、蒸発を防止するために覆うことができる。
【０３２７】
ゲルマトリクス中の包埋
プローブまたは核酸分子を二次元表面に結合するための代替案として、それらを三次元ゲルマトリクスに包理することができる。例えば、プローブ、核酸分子、またはその双方は、凝固できる液体マトリクスに添加され、その中に薬剤を捕捉する。この型のマトリクスの例は、例えば、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロース（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）などのアガロースおよびアクリルアミドを含む。
【０３２８】
実施例８
異なる長さのロッドを持つフルオロフォア間の距離の算定
上記に記載されるように、開示されたナノプローブは、例えば、テザー、例えば、ＰＥＧから構成されるテザーを含むロッドなどの分子ロッドを介して化学的部分に結合される重合剤を含むことができる（例えば、図１Ａの分子リンカー１４、１６、１８を参照）。しかしながら、それらを分離し続ける力がない、遊離型ＰＥＧ鎖のそれぞれは、一点周辺の集団を形成するために凝縮する。従って、ナノプローブへの１つまたは複数の分子ロッドの添加（例えば、図１Ａの分子リンカー２０に示されるように）は、重合剤および化学的部分をさらに分離するため、またはフルオロフォアまたはプローブ上の他のタグをさらに分離するために含むことができる。
【０３２９】
本実施例は、ＦＲＥＴシグナルが例えば、ｄｓＤＮＡから構成することができる分子ロッドの長さによりいかに影響されるかを決定するために使用されるコンピュータシュミレーションを記載する。図１Ａの分子リンカー２０は、シュミレーションの状況を示す。２つのテザー６８、７０は、ロッド６６に結合され、フルオロフォア３８と３０との距離が測定される。シュミレーションの目的のために、重合剤１２、フルオロフォア３０、部分２８およびフルオロフォア３８はすべて点物体であると考えられる。単一テザーのために、テザーは、非常に薄く（それ自体と交差する問題がない）とすれば、テザーの末端の結合点からの距離は三次元において、ランダムウォークである。それぞれの一次元において、これは小さいランダム工程の合計であり、ガウス分布を得る。三次元において、それは、Ｍａｘｗｅｌｌ球対称ガス分布である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ，１４８：８３−１２３，１９９１）。個別の分子が特定の方向および距離の状態にあるため、所定の分離を有する２つの該分布の共通集合を統合することだけは適切ではない。この理由から、明示シュミレーションを実施した。
【０３３０】
該方法を要約するために、それぞれのロッドの長さに対して、２つのテザーを伸長し、チップ間の距離およびその後、ＦＲＥＴ効率を算出した。本シュミレーションにおいて、プログラムＢｉｔｅ（二重テザー）によりコード化されると、２つのポリマーは、固定ロッドの末端に結合された。それぞれのポリマーは、一連のランダム工程により生成され、ロッド末端から開始する。工程の大きさは、鎖の持続長により与えられる。ＰＥＧに対して、持続長は、３．８±０．０２Åである。それぞれの工程の方向は、無作為に選ばれた。ＦＲＥＴシグナルは、無作為に延長された鎖のそれぞれの対について算出された。このシグナルは、ＦＲＥＴ効率によるテザー鎖末端ＲおよびＦＲＥＴ半径Ｒ０との間の最終距離の関数である。
Ｅ＝１／（（Ｒ／Ｒ０）６＋１）（１）
【０３３１】
プログラムにより使用されるパラメータは、持続長、テザーＬの長さ、およびテザー点を分離するロッドの長さＤを含む。本過程は、図４に示される分布を得るために１，０００回繰り返された。
【０３３２】
距離がＲ、フルオロフォア間がＲ０である場合、転移効率は、５０％である。例えば、Ｒ０＝６０Åを有するＦＲＥＴの対に対して、それは典型的な距離であり、図４Ａ−Ｆの１２０Åのテザーの長さは、ロッドの長さの異なる効果を示す。ロッドの長さが０である（図４Ｅおよび４Ｆ）テザーは、共有点周辺に集まり（図４Ｅ）、大きいＦＲＥＴシグナルをもたらす（図４Ｆ）。ロッドの長さが６０Åに増加する場合（図４Ｃ）、ＦＲＥＴ分布シグナルは散らばる（図４Ｄ）。時々、２つの末端が閉じ、いくつかのＦＲＥＴを観測される。著しくは、ロッドの長さが１２０Åである場合（図４Ａおよび４Ｂ）、ＦＲＥＴシグナルはほぼ完全に排除される（図４Ｂ）。テザーの長さがロッドの長さの２倍である場合、これが生じるので、テザーの多くの潜在的な重複があり、テザーが標的に結合することを可能にする。さらに、ＦＲＥＴシグナルは、ほとんど検出できない。これらの結果は、分子リンカーのロッドを含む特定の利点を示す。
【０３３３】
実施例９
異なる長さのテザーを持つＦＲＥＴ
本実施例は、ＦＲＥＴシグナル上のテザーの長さを変更する効果を決定するために使用される方法を記載する。
【０３３４】
Ｂｉｔｅプログラムは、種々のテザーの長さで起動された（図５）。左上（図５Ａ）において、非常に短い２Åのテザーは、方程式（１）に与えられる基本ＦＲＥＴ曲線をもたらす。テザーの長さが、２から６０Å、１２０Åおよび１４０Åに増加する場合（図５Ｂ、ＣおよびＤ）、基本ＦＲＥＴ曲線は維持するが、分布は、さらに散らばる。約１２０Åの分子ロッドの長さおよび１２０Åのテザーについては、テザーが大いに重複することができたが、ＦＲＥＴはほとんどない。従って、約１２０Åの分子ロッドおよび１２０Åのテザーの使用により、２つのテザーが標的分子の結合により１つになるまで、ほとんどＦＲＥＴがない。
【０３３５】
２４０Åの長さであるテザーでさえ（図５Ｄ）、分布の右側は、１２０Åの長さのテザーを有するものとほぼ同一である（図５Ｃ）。つまり、テザーの長さは、ＦＲＥＴの結果にあまり差異をもたらさないが、分子ロッドの長さは、有意な効果を有する。
【０３３６】
要約すれば、テザーの長さは、ＦＲＥＴにほとんど効果がないが、分子ロッドの長さは有意に差異を示した。ナノプローブの分子リンカーにおいてロッドを含み、テザーが標的に到達するのに十分過ぎる長さの場合でさえ、ＦＲＥＴは、ほとんど検出できないレベルまで減少する。対照的に、標的の存在下で、ＦＲＥＴシグナルは大きい場合がある。これは、標的の存在または非存在に基づいて出力シグナルに強い分子スイッチを提供する。ナノプローブのための有用なロッド−テザーの結合の実施例は、１２０Åのロッド、また２つの１２０Åのテザーを使用する。これらは、都合よくロッドを作製するためのｄｓＤＮＡの４０のヌクレオチド、テザーを作製するためのそれぞれ２３Åの５つから６つのＰＥＧ１８スペーサーで構築される。
【０３３７】
分子ナノプローブの作用を理解する上で、２つの時間スケールを考慮することができる。分子振動、ピコ秒の時間スケールに、テザーは、多種多様の可能性を調べ、分子ロッドにより分離される２つのテザーチップの結合部は長時間をかけて出現する。例えば、本過程は、分子振動より長い規模の数桁、例えば、１００ミリ秒を取ることができた。１００ミリ秒は、分子運動の見解から長い時間ではあるが、それはヒトの時間スケールでは１秒の１／１０に過ぎない。従って、分子プローブを使用する検出過程は、極めて迅速であると考えられる。
【０３３８】
実施例１０
肉眼的なＭｅｄｕｓａシーケンサーの使用
本実施例は、本明細書に記載される肉眼的なプローブの使用方法を記載する。例えば、これらの方法は、単一分子検出の報告なしにＭｅｄｕｓａプローブの特性を決定するために使用することができる。
【０３３９】
一時的滞留事象を観測するために、実施例２に記載されるものなどのヘアピンＤＮＡを使用することができる。使用することができるヘアピンオリゴヌクレオチドの概略図を、図７に例示する。図７の上部は、５’突出部（４つの塩基対など）および蛍光供与体標識（円）を有するヘアピンオリゴヌクレオチドを示す。自由拡散ｄＴＴＰは、ＦＲＥＴ受容体（六角形）で標識化される。標識化ｄＴＴＰが、ポリメラーゼ（楕円）によってヘアピンに保持される場合、下部は、供与体と受容体との間のＦＲＥＴを示す。ヘアピンは、次に読まれる塩基として「Ａ」を露出する小さい突出部を有するように設計される。オリゴヌクレオチドは、５’末端上に供与体フルオロフォアを有する。一部の例において、この制御ＤＮＡは、受容体フルオロフォア標識化されたｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）により埋められる。これは、ＦＲＥＴおよび受容体発光シグナルをもたらす。
【０３４０】
次に読まれる塩基として「Ａ」および５’末端上の供与体フルオロフォア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、５’末端上のＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ４８８を有する）を露出する小さい５’突出部（４つの塩基）を有する単一ヘアピンＤＮＡ分子の測定は、画像相関分光法（ＩＣＳ）を使用して得られた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用して、このヘアピンオリゴヌクレオチドの１ｎＭの試料を画像化した。標識ＤＮＡの低濃度は、共焦点の体積（約１フェムトリットル）あたり１つのみのフルオロフォアであることを確実にした。
【０３４１】
次に読まれる塩基として「Ａ」、５’末端上の供与体フルオロフォア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８）、および共有結合した３’受容体標識ｄＵＴＰ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４−ｄＵＴＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）を露出する小さい５’突出部（４つの塩基）を有するヘアピンＤＮＡ分子の測定が実施された。ＦＲＥＴは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭプレートリーダーを使用して、約２００ｎＭのオリゴヌクレオチドの濃度で、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ  ＮＬＯ共焦点システムを使用してさらに低濃度（１０ｎＭオリゴ）で、観測された。従って、この共焦点法を、ヌクレオチド滞留を検出するために使用してもよい。
【０３４２】
遊離Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５標識ヌクレオチドおよび次に読まれる塩基として「Ａ」および５’末端上のフルオロフォア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を露出する小さい突出部（４つの塩基）を有するヘアピンＤＮＡ分子の双方の測定が蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を使用して、実施された。標識ヘアピン分子は、ヘアピンオリゴヌクレオチドの質量が高いため、標識ヌクレオチドよりもさらにゆっくりと拡散した。従って、ＦＣＳ法は、ヌクレオチド滞留を検出するために使用してもよい。
【０３４３】
例えば、次に読まれる塩基としてヌクレオチド（「Ａ」または「Ｇ」など）および供与体フルオロフォアを露出する小さい突出部（４つの塩基など）を含む３’末端および５’末端上にジデオキシヌクレオチド（ｄｄＣなど）を有するヘアピンオリゴヌクレオチドを使用することができる（図７を参照）。このヘアピンオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼにより伸長できず、受容体−標識ｄＮＴＰは、ヘアピンオリゴヌクレオチドに結合できないため、それは、開示した配列決定のプローブの非加水分解性アーム用のモデルである。そのような伸長できないオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼポケットに滞留するヌクレオチドを観測するために、ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチド（標識ｄＮＴＰなど、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−標識ｄＵＴＰまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−標識ｄＣＴＰなどの受容体−標識ｄＵＴＰ）の存在で画像化することができる。ポケット／鋳型へ結合するヌクレオチドは、溶液中の遊離型ヌクレオチドよりもさらにゆっくりと拡散する。例えば、一致するヌクレオチドと鋳型に相補的でないものとの画像比較を、滞留をモニタリングするために実施することができ、一致したヌクレオチドは、一致しないものよりも長く滞留する。例えば、塩基が特異的に結合するが、非共有結合しないことを示すために、受容体標識ｄＵＴＰの存在の滞留事象の発生は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＧＴＰによる競争により影響が少ないようであるが、ｄＵＴＰとの競争により大幅に減少するはずである。
【０３４４】
異なる滞留時間は、標識化した非相補的塩基（例えば、同位置に標識を有する塩基）を使用して示すことができる。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ/Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのｄＣＴＰおよびｄＵＴＰ上の蛍光標識はすべて、Ｃ５の位置に結合される。
【０３４５】
一部の例において、ヘアピンＤＮＡは、離散配置において、個別の分子に滞留するヌクレオチドの測定を許可することにより、表面に結合するためのビオチンを含む。
【０３４６】
滞留をモニタリングするために使用することができる別の例示的な構築物を図８に示す。本実施例において、受容体−標識ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰなど）は、カルボジイミド交差−リンカーを介してリンカー上の１級アミンにトリホスフェートの５’γ−ホスフェートを結合することによるなど、リンカーを介してヘアピンオリゴヌクレオチドに結合する。これは、単一リンカーまたはＭｅｄｕｓａの「アーム」を生成する。中間設計において、２つまたは３つのテザー化アームを追加することができる。さらに、アームを、ポリメラーゼに結合することができ、ポリメラーゼを、表面に結合することができる。ポリメラーゼは、遊離型ヌクレオチド三リン酸を付加することにより、ヘアピンＤＮＡに沿って進むように誘導されることができる。例えば、付加される第１塩基がｄＣＴＰである場合、付加される第２塩基は、ｄＴＴＰであり、「アーム」は、標識ｄＵＴＰを含み、ｄＣＴＰなしにほとんどシグナルがないはずである。しかしながら、ｄＣＴＰが付加される場合、ポリメラーゼは進み、ＤＮＡ供与体を伴うＦＲＥＴにアーム上に標識ｄＵＴＰを可能にする。複数の「アーム」を有するＭｅｄｕｓａシーケンサーを使用して、滞留時間は、テザー化ＤＮＡに塩基を連続的に付加することにより測定することができる。それぞれの塩基が溶液に添加される場合、予測した単一分子スペクトルが観測される。本過程を、リアルタイムで観測でき、単一ヌクレオチド工程を示す。例えば、単一分子検出法は、この構築物を利用してヌクレオチド滞留を検出するために使用されることができる。
【０３４７】
上記に記載されるヘアピンＤＮＡ分子を使用して、ＦＲＥＴは、ＥｃｏＲＩなどの制限酵素（ＧＡＡＴＴＣは、Ｆｉｓ部位で配列内である）でヘアピンを切断するまたはＤＮａｓｅ  Ｉを使用することにより生じることを示すことも可能であり、ＦＲＥＴは減少すべきである。第二オリゴヌクレオチドは、ジデオキシＣを伴う３’末端でＣを置換するので、次の塩基は、共有結合できない。オリゴヌクレオチドと蛍光ｄＴＴＰとの混合は、ＦＲＥＴを起こさない。ポリメラーゼの付加は、蛍光ｄＴＴＰを結合させ、ＦＲＥＴを起こす。ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰは、競合しないが、蛍光ｄＴＴＰからのＦＲＥＴは、その後、規定のｄＴＴＰとは離れて競合することができる。これらの方法を、ｄＴＴＰがポリメラーゼにおいて、滞留することを示すのに使用することができる。
【０３４８】
進歩的には、より複雑な構築物を検討することができ、完全なＭｅｄｕｓａプローブをもたらす。例えば、ＰＥＧを、上記に記載されるように、ヘアピンオリゴヌクレオチドの５’末端に付加することができ、フルオロフォアおよびＴをもたらす。これは、現在、実験的構築物の一部であるため、遊離型蛍光ｄＴＴＰを必要としない場合を除いて、本質的には、上記のように使用することができる単一アームのＭｅｄｕｓａプローブである。第２アームを、ヘアピンの５’末端から伸長した単一鎖ＤＮＡにハイブリダイズされるＤＮＡのストレッチを使用することにより構築物に付加することができる。
【０３４９】
完全なＭｅｄｕｓａプローブを、フルオロフォアを結合することなく最初のヘアピンを使用して試験することができる。
2009519041.tif 000020
ヘアピンは、３’末端で付加される塩基が一意的な順において、４つのｄＮＴＰから成るように設計される。示される設計において、突出部を埋めるために付加される塩基は、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰである。
【０３５０】
ヘアピンは、いかなるｄＮＴＰなしに、Ｍｅｄｕｓａ分子とともに混合され、蛍光分光計に溶液を置く。付加される次の塩基はＴであるため、Ｍｅｄｕｓａプローブは、Ｔシグナルを生成する。このシグナルは、溶液中で利用可能な追加のヌクレオチドがないため、安定している。すべてのＭｅｄｕｓａプローブは、同一のシグナルを与え、結果が肉眼的に読み込まれることを可能にする。正しい操作を実施しないいずれのＭｅｄｕｓａプローブは、バックグラウンドシグナルを与えるため、これは個別のＭｅｄｕｓａプローブのエラー率を見積もるための手段を提供する。
【０３５１】
結果は、鋳型鎖がＴを含むことを示す。つまり、Ｍｅｄｕｓａプローブは、配列の一塩基を読む。Ｔがプローブにより報告される塩基であるため、溶液にｄＴＴＰを付加することができ、スペクトルを再度決定することができる。Ｃは、現在ポケット内にあるため、やがて、スペクトルは、変わり、Ｇシグナルを与える。従って、Ｍｅｄｕｓａプローブは、配列の第２塩基を報告する。これらの方法を使用して報告された配列は、簡潔である。つまり、突出部が、互いに隣接した同種のいくつかの塩基を含んだ場合、プローブは、単一塩基を報告するのみである。
【０３５２】
以下のように方法が進み、初めから再度開始する。
【０３５３】
１つの塩基により埋められたヘアピンへのｄＴＴＰの付加が、得られる。
2009519041.tif 000021
この時、Ｍｅｄｕｓａプローブは、Ｇシグナルを報告する。
【０３５４】
２つの塩基により埋められた以下のヘアピンへのｄＧＴＰの付加が、得られる。
2009519041.tif 000022
この時、Ｍｅｄｕｓａプローブは、Ｃシグナルを報告する。
【０３５５】
３つの塩基により埋められたヘアピンへのｄＣＴＰの付加は、以下を得る。
2009519041.tif 000023
最後に、Ｍｅｄｕｓａプローブは、Ａシグナルを報告する。
【０３５６】
ヘアピンに完全に埋められたものへのｄＡＴＰの付加は、以下を得る。
2009519041.tif 000024
【０３５７】
すべての４つのヌクレオチドは、この時点で溶液中にある。ヘアピンが完全に埋められたので、Ｍｅｄｕｓａプローブは、シグナルを生成するのを停止する。
【０３５８】
従って、これらの方法は、すべて４つのＭｅｄｕｓａアームおよび単一分子検出システムを必要とせず、配列を完成する状態もテストすることができる。
【０３５９】
実施例１１
顕微鏡システム
本実施例は、本明細書に開示されるプローブを使用して標的核酸分子を配列決定するために使用することができる顕微鏡システムを記載する。
【０３６０】
顕微鏡
全反射（ＴＩＲ）蛍光顕微鏡検査法は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅら（Ｎａｔｕｒｅ，３８８：３３８，１９９７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５８：４９，１９９９）、Ｆｕｎａｔｓｕら（Ｎａｔｕｒｅ，３７４：５５５，１９９５）、Ｗｅｉｓｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３：１６７６，１９９９）およびＳｃｈｕｔｔら（米国特許第５，０１７，００９号）により記載された方法およびデバイスを使用して、使用することができる。ＴＩＲは、屈折率が高い物質を通ってその物質と屈折率がより低い第２物質の接合部分の方へ臨界角未満で光が誘導される場合に生じる光学現象である。この状況において、すべての光は、短距離のみの第２物質に伝播する顕微鏡のエバネセント波を除いて、接合部分から後方へ反射する。特定の例において、ＴＩＲおよび単一分子の検出は、通常の蛍光顕微鏡における単一光ファイバーを使用して実施される（例えば、Ｆａｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１：３１０１−５，１９９９、Ｘｕ  ａｎｄ  Ｙｅｕｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１１０６−９，１９９７、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，ＡｎａｌＣｈｅｍ，７２：４６４０−５，２０００、およびＬｅｖｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：６８２−６，２００３を参照）。
【０３６１】
ＴＩＲ蛍光顕微鏡検査法において、第１物質は、ガラス基板であり、第２物質は、水またはアッセイ法が実施される別の水媒体である。蛍光標識物質が接合部分に接近する場合、エバネセント波のフィールド内で、蛍光分子は、励起することができ、検出された蛍光は、上部液にその後発散する。ＴＩＲは、優勢なシグナル対雑音比を生じ、試料の薄層のみが露出されるため、蛍光分子の光退色を減少する。
【０３６２】
光退色を減少する方法は、当技術分野で公知であり、開示された方法は、特定の還元方法に限定されない。一例において、共焦点顕微鏡法を、フルオロフォアの光退色を減少させるために使用することができる。共焦点レーザーの一例は、Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＴＣＳ−ＳＰ（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。共焦点レーザーは、配列決定用ポリメラーゼに照射し、リザーバの残りの部分を暗いままにしておく。これを達成するために、初めにポリメラーゼのために利用可能なボリューム全体を走査することができ、そのため、機能するポリメラーゼを含むそれらの小さい領域を露出するためのみに顕微鏡のプログラムを作成することができる。共焦点顕微鏡法は、三次元において、反応を配列決定するために使用することができる（米国特許第６，９８２，１４６号を参照）。共焦点顕微鏡法は、関心対象ではない平面を含まず、採用される配列の総数を増加することを可能にする。これは、実施され、視野あたりに検出されるより多くの配列決定反応をさらに可能にする。
【０３６３】
近接場光学顕微鏡（ＮＳＯＭ）はまた、本明細書に開示された配列決定法に使用することもできる。ＮＳＯＭのためのいくつかの方法およびデバイスが記載される（米国特許第５，１０５，３０５号およびＰＣＴ公報国際公開公報第９７／３０３６６号）。ＮＳＯＭにおいて、可視光よりも小さい直径を有する開口は、試料の表面への近接近（１波長未満など）に位置付けられ、表面上を走査される。光は、プローブの末端において、そのような開口により放出されるか、または収集されることができる。機械的手段または圧電手段は、試料に対してプローブを移動するために提供される。試料と相互に作用する光は、例えば、分光光度計、およびＣＣＤカメラなどにより収集され、検出される。検出された光シグナルの強度は、試料に対するプローブ位置に応じて、デジタルデータの形で典型的に格納される。格納データを核酸配列に変換することができる。ＮＳＯＭは、サブ波長解像による光学的測定を可能にし、ＦＲＥＴを測定でき、溶液中で十分作用する（Ｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：６２６４−８，１９９６）。標準顕微鏡は、Ｎａｎｏｎｉｃｓ  Ｌｔｄ．で市販されているデバイス（Ｍａｌｈａ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）を使用して近接場光学顕微鏡に変換することができる。
【０３６４】
ＮＳＯＭの一利点は、試料の高解像度を取得できることである。しかしながら、プローブは、基板表面を走査するため、常にモニタリングすることができる配列決定反応数は減少する。この減少の補正に役立てるために、追加のヌクレオチド率を溶液の粘度を増加するか（例えば、ＰＥＧ、Ｆｉｃｏｌｌ、グリセロール、またはその組み合わせを含むことにより、溶液への適切な濃度で）または温度の減少することにより、減少することができる。
【０３６５】
Ｋａｉｒｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃは、蛍光画像顕微分光光度計（ＦＩＭＳ）を提供する。この顕微鏡は、視野において、すべてのピクセルに対して蛍光発光スペクトルを生成する。従って、一意的な発光スペクトルは、相補的核酸鎖に添加される場合、それぞれのヌクレオチドに対して生成される。
【０３６６】
その他の例において、該方法は、例えば、ＦａｎｇおよびＴａｎ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１：３１０１−５、参照により本明細書に組み入れられる）により開示されたシステムを使用して、単一分子検出（ＳＭＤ）を可能にする。簡単に言えば、本システムにおいて、光ファイバーは、溶液に精査するために使用される（例えば、水性の環境または固体表面で）。光ファイバーは、全反射を有し、蛍光分子をエバネント波により励起させるために表面に近づけることを可能にする。フルオロフォアにより生成された蛍光性シグナルは、強化した電荷結合素子（ＩＣＣＤ）ベースの顕微鏡システムにより検出される。光ファイバーを、Ｎｅｗｐｏｒｔ社から購入することができる（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）。
【０３６７】
さらに他の例において、ＳＭＤは、Ｕｎｇｅｒらにより開示される方法を使用して、実施することができる（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９９，２７：１００８−１４、参照により本明細書に組み入れられる）。簡単に言えば、水銀ランプの励起およびＣＣＤカメラを有する標準蛍光顕微鏡を使用して、単一蛍光分子を、分子が希釈により十分に分離される場合、空中および水溶液中で観察することができる。
【０３６８】
光退色の減少
光退色を減少させる方法は、当技術分野で公知であり、開示される方法は、特定の還元方法に限定されない。一例において、共焦点顕微鏡法を、フルオロフォアの光退色を減少させるために使用することができる（上記記載）。光退色を減少するために使用することができる別の手段は、例えば、Ｋｉｔａｍｕｒａら（Ｎａｔｕｒｅ，３９７：１２９，１９９９）、ＯｋａｄａおよびＨｉｒｏｋａｗａ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３：１１５２，１９９９）、Ｈａｒａｄａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：４９，１９９０）に記載されるように、脱酸素剤システムを含む溶液中に試料をインキュベートすることである。溶液の例は、１％のグルコース、０．０５ｍｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼおよび０．１ｍｇ／ｍｌのカタラーゼ、ならびに０．５％の２−メルカプトエタノール、４．５ｍｇ／ｍｌのグルコース、２１６μｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ、３６μｇ／ｍｌのカタラーゼ、緩衝液中の２ｍＭのＡＴＰを含む。
【０３６９】
光退色を減少するために使用することができる一方法は、カルシウムリン酸でフルオロフォア（また、分子点として知られる）の表面を覆うことである。例えば、６０ｎｍのナノ粒子内に閉じ込められる場合、フルオロフォアは、非常に安定していて、有意には遅延しない。本プローブに関して、表面上に１つのアミノ基を有する約０．５〜２ｎｍ（１ｎｍ〜２ｎｍなど）の小ナノ粒子（またはその他の一意的な結合点）を使用することができる。例えば、アミノ基を有するテザー化フルオロフォア（ナノプローブ上の所望の位置にフルオロフォアの結合を可能にするため）は、表面を覆われ、ナノプローブに結合することができる。層化は、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基とともにフルオロフォアをインキュベートし、その後、カルシウムまたはアルミニウムを付加することにより、達成することができる。ホスフェートＨ２ＰＯ４−の付加において、別の層が形成される。一部の例において、金は、フルオロフォアの表面を覆うために使用される。得られる粒子は、保護被覆に加えて蛍光を強化すると考えられるプラズモン共鳴を有する（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：１−２４，２００１を参照）。
【０３７０】
光退色を減少するさらに他の方法は、本明細書に開示されるナノプローブシーケンサーおよび金属島へ隣接した標的核酸分子の設置（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：１−２４，２００１）およびＴｒｏｌｏｘにおけるインキュベーションを含む（Ｒａｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３：８９１−３，２００６）。
【０３７１】
電磁放射線源
特定の例では、電磁放射線は、レーザーにより放出される。使用するレーザーの選択は、使用する特定の供与体フルオロフォアによって決まる。供与体フルオロフォアを励起するためにレーザー光線の波長を選択する。例えば、野生型ＧＦＰおよびＦＩＴＣは、４８８ｎｍでアルゴンレーザーにより励起することができる。Ｈ９−４０  ＧＦＰ突然変異体を励起するために、４００ｎｍで（Ｎｉｃｈｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）または４０４ｎｍで（Ｐｏｗｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｒｏｃｋ，ＡＲ）放射する青色レーザーダイオードを使用することができる。当業者に公知の他の電磁放射線源、例えば、ＨｅＮｅレーザーおよび水銀ランプなどを使用することができる。
【０３７２】
流体工学
流体走査システムの使用は任意である。簡素化のために、すべての必要な試薬を添加し、次に乾燥を避けるためにガラスのカバースリップまたは１滴の油でチャンバを密閉することを選んでもよい。あるいは、ヌクレオチド含有の溶液の遅いフローは、ヌクレオチドを補給し、生成物（ジホスフェート）を除去するために提供されることができる。そのようなシステムは、ヌクレオチドの使用を増加するが、定常状態条件を維持し、連続する配列の長さを増加することができる。
【０３７３】
蛍光顕微鏡の段階である液体の処理を実施するコンピュータチップを構築することができる。マイクロマシンおよびマイクロ流体デバイスおよびナノリットルの大きさの液体試料の分配の方法は、前述されている（Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：３９９−４０１，１９９８；Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：４８４−７  １９９８）。
【０３７４】
検出器
検出器は、分光光度計により生成された発光スペクトルの獲得を可能にする。
【０３７５】
ＣＣＤカメラを、画像を獲得するための検出器として使用することができる。分光光度計により生成された発光スペクトルは、ＣＣＤカメラにより収集され、この入力を電荷に変換する。電荷は、ＣＣＤ出力によりシグナルに変換される。得られるシグナルは、それぞれの型のヌクレオチド（Ａ、Ｔ／Ｕ、ＣまたはＧ）に関連する特性シグナルとして、デジタル化され、デジタルデータはコンピュータのハードドライブなどのメモリに獲得される。獲得されたデータの合計は、その後、ヌクレオチド配列に処理される。ＣＣＤカメラは、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を含む多くの供給元から市販されている。
【０３７６】
１０００×１０００ピクセルフィールド（例えば、Ｋｏｄａｋ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ＤＣＳ  ５２０デジタルカメラ）、またはさらに４０９６×４０９６ピクセルフィールド（例えば、Ｋｏｄａｋ  １６．８ｉ、ＫＡＦ１６８００）以上を含むカラーＣＣＤカメラにより、それは、最大毎秒７５０塩基の速度で、１０００もの数の核酸を同時に配列決定することが可能である。従って、本明細書に開示されるプローブによる分子配列決定は、１日で全体の染色体またはゲノムを配列決定する可能性がある。ポリメラーゼが通常の六角形配列に配置される場合、約１７ピクセルがそれぞれのポリメラーゼに使用可能である。
【０３７７】
あるいは、フィルターを含む単色ＣＣＤまたはスペクトルを含むその他の手段を使用することができる。バックグラウンドノイズを低減するために、いずれのＣＣＤカメラを冷却してもよい。
【０３７８】
核酸の配列決定が行われる割合を、多くの因子により制御することができる。温度の上昇により（耐熱性ポリメラーゼおよびロッド用のＰＮＡを使用して）、またはＨＰＬＣなどの場合、高圧で反応が進むことにより高速を得ることができる。より粘性のある溶液を生成することにより、反応温度を下げることにより、利用できる反応性ヌクレオチドをほとんど有しないことにより、または利用できる遊離型の非加水分解性、非蛍光ｄＮＴＰを有することにより、反応速度を落とすことができる。重合率は、ＣＣＤ統合率およびコンピュータ記録時間を越えないように、このように制御されることがある。従って、重合率は、蛍光性シグナルがＣＣＤによりさらに確実に読み込まれ、コンピュータにより解釈されるように、このように制御される。
【０３７９】
一例において、該方法は、直接コンピュータに入力する配列決定シグナルを生成するクローズドチャンバデバイスにおいて実施される。該方法は、核酸分子の大集団を代表する電気泳動ゲル上のパターンなど高分子事象をモニタリングすることにより、核酸を配列決定する代わりに、分子レベルにおいて標的核酸分子のその相補的ヌクレオチドとの化学的部分の対合をモニタリングすることにより、核酸分子を配列決定する。反応が開始すると、さらなる液体の処理は必要ない（が、必要に応じて追加されることができる）。従って、機械は、操作中肉眼で見える可動部がなく、迅速な配列決定を促進することができる。
【０３８０】
ＣＣＤカメラの代替物として、光電子増倍管または増倍化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）を使用することができる。
【０３８１】
一例において、超電導物質は、ＦＲＥＴシグナルを検出するために使用される。超電導物質ベースの光検出器は、光子の損失がほとんどない単一分子からの全スペクトルを得る次の高感度検出器である。一部の例において、超電導物質は、その転移温度にもたらされる。これは、超電導物質が超電導を損失する温度である。光子が超電導物質に衝突する場合、それは光子エネルギーに比例して超電導を損失する。従って、それは、個別の光子を検出することができるだけでなく、エネルギーに比例するため、光の頻度を与えることもできる（ｈｖにより）。検出器の個別のピクセルは、デバイスを通して電圧を入れることによる遷移で、維持することができる。デバイスの温度が高すぎる場合、抵抗は増加し、電流は減少し、温度は再度減少する。
【０３８２】
シグナルの増加
光退色の減少に加えて、検出したシグナルを増加する方法は、当技術分野で公知である。例えば、フルオロフォア付近の金属島の使用に加えて、高開口数顕微鏡対物レンズを使用することができる（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８：１−２４，２００１）。金属島は、光退色を減少させ、光子数を約１００倍に増加させるライフタイムを減少させる。
【０３８３】
一例において、鏡は、フルオロフォアの上方に配置される。別の例において、試料は、放物面反射鏡により取り囲まれ、それにより焦点でＦＲＥＴシグナルを増加させる。例えば、Ｋａｒｔａｌｏｖら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４０：８５−９０，２００６）は、放物線フローチャネルプロファイルを有するマイクロ流体デバイスを提供する。そのようなデバイスは、本明細書に開示される方法において使用することができる。一例において、マイクロ流体デバイスのチャネルは、反応物質を有し、レーザーは、フルオロフォアを励起するためにデバイスの全長に向ける。一例において、全反射（ＴＩＲ）は、フルオロフォアを励起するために使用される。
【０３８４】
実施例１２
コンピュータシステム
本明細書に開示される方法は、パソコンで実行するコンピュータプログラムのコンピュータ実行可能命令の一般状況で実施することができる。一般に、プログラムモジュールは、ルーチン、プログラム、コンポーネント、データ構造などを含み、特定のタスクを実施、または特定の抽象データ型を実行する。さらに、該方法が、携帯デバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサを用いるまたはプログラマブル家庭用電化製品、ミニコン、メインフレームコンピュータなどを含む他のコンピュータシステム構成で実行されることを当業者は、理解するであろう。本明細書に開示される方法はまた、タスクが通信ネットワークを介してリンクされている遠隔処理デバイスにより実施される分散コンピューティング環境において実行することができる。分散コンピューティング環境において、プログラムモジュールは、ローカルおよび遠隔メモリ記憶装置の双方に、位置してもよい。
【０３８５】
本明細書に開示される方法の本実装プラットフォームは、ユーザーインターフェースとしてＵｎｉｘを含む少なくとも１ギガバイトのメインメモリ、１ギガバイトのハードディスクドライブを有するＳｕｎコンピュータで実行されるシステムである。アプリケーションソフトは、Ｐａｓｃａｌ、Ｊａｖａまたは他のコンピュータ言語で書かれている。
【０３８６】
特定の例において、Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９１：１９４１−５１，２００６）は、獲得したＦＲＥＴデータを分析し、特性化するために使用される。
【０３８７】
特定の例において、線形アンミキシング法は、獲得したＦＲＥＴデータを分析し、特性化するために使用される。線形アンミキシング法は、そのスペクトルの一因になる個々のフルオロフォア量を決定するために所与のスペクトルから後方へ作用する過程である（例えば、Ｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８９：２７３６−４９，２００５を参照）。例えば、９９％のＡ、１％のＴ、０％のＧ、０％のＣがあることを決定する場合、塩基がＡであることを示唆する。
【０３８８】
実施例１３
プローブを使用する配列決定
本実施例は、本開示のプローブを使用して、種々のソースから核酸を配列決定するための方法を記載する。特定の方法が提供されるが、方法の変化が可能であることを当業者は理解するであろう。
【０３８９】
本実施例において、図１Ｂに示されるプローブを参照する。しかしながら、本明細書に開示されるいずれかのプローブを、本プローブに置換できることを当業者は理解するであろう。本実施例において、重合剤１２は、フルオレセイン−ＨＩＶ−１−逆転写酵素（従って、タグ３０はフルオレセインである）であり、化学的部分２２、２４、２６、２８は、非加水分解性ｄＣＭＰＣＰＰ、ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、およびＴＭＰＣＰＰであり、化学的部分に関連するタグ３２、３４、３６、３８は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、ローダミンレッドである。
【０３９０】
配列決定反応は、５μＭのプローブ、５μＭのプライマー、１ｎｇ−１μｇの標的核酸配列（１μｇの試料核酸など）、および２００μＭの各ｄＮＴＰを含み、その反応は、Ａｍｂｉｏｎ  ＨＩＶ  ＲＴ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴにおいて実施される。一例において、標的核酸は、対象の生体試料から獲得される。特定の例において、反応は、４５℃で進む。
【０３９１】
本実施例において、供与体フルオロフォアは、フルオレセインである。従って、配列決定反応は、供与体を励起する光の波長を放射するレーザーなど（アルゴンレーザーの４８８ｎｍなど）によって、励起することができる。
【０３９２】
配列決定反応物は、フルオレセインポリメラーゼ１２をプライマー／標的核酸配列に結合することができ、標的核酸鎖上で非加水分解性ｄＣＭＰＣＰＰ、ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、およびＴＭＰＣＰＰ  ２２、２４、２６、２８を現在露出されたヌクレオチド４４と対にすることができる状態下で、インキュベートされる。フルオレセインポリメラーゼがオリゴヌクレオチド４２によりプライミングされる標的ＤＮＡまたはＲＮＡ４０に結合する場合、分子リンカー１４、１６、１８、２０のそれぞれは、非加水分解性ｄＣＭＰＣＰＰ、ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、およびＴＭＰＣＰＰ  ２２、２４、２６、２８をフルオレセインポリメラーゼ１２の活性部位ポケットに入れるために柔軟に伸長することができる。従って、正確に対にされた非加水分解性ｄＡＭＰＣＰＰ  ２６は、長い間ポリメラーゼ活性部位ポケットに維持される（非相補的非加水分解性２２、２４、２８と比較して）。対応する受容体フルオロフォア３６は、供与体フルオロフォアフルオレセイン３０に近いので、２つの間にＦＲＥＴがあり、それによって、非加水分解性ｄＣＭＰＣＰＰ、ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、およびＴＭＰＣＰＰ  ２２、２４、２６、２８が、配列決定された標的鎖において、相補的塩基とともに現在対合することを示すスペクトル出力を生成する。
【０３９３】
配列決定された標的鎖４０において相補的塩基４４とともに現在対合する受容体フルオロフォア３６からの発光シグナルを検出する。例えば、反応は、蛍光顕微鏡下で、または共焦点顕微鏡により観測することができ、顕微鏡は、使用されるそれぞれの受容体フルオロフォアのスペクトルを獲得することができる。
【０３９４】
非加水分解性ｄＣＭＰＣＰＰ、ｄＧＭＰＣＰＰ、ｄＡＭＰＣＰＰ、およびＴＭＰＣＰＰ  ２２、２４、２６、２８（本実施例において２６）は、最終的には、加水分解性の非標識ヌクレオチド（この場合、ｄＡＴＰ、４６）により活性部位において置換され、伸長する相補的鎖に組み込まれる。これは、標的核酸分子４０において１塩基先にプローブを進める。これは、標的核酸分子４０における次の塩基を露出し、反応は上記に記載されるように反復される。プローブ上の相補的非加水分解性ヌクレオチド類似体が露出した塩基とともに対になる場合、受容体発光シグナルを検出する。従って、プローブは、標的分子のヌクレオチド配列を示すシグナルを変化する時間を生成する。
【０３９５】
例えば、得られる発光シグナルは、図６に示されるように、一連のパルスを生成することがある。図は、デジタルエレクトロニクスおよびコンピュータのためのクロックパルスに類似する。時間は、横軸に沿って示し、種々のシグナルの強度は、横線に与えられる。標的配列は、上部の５’  Ａ  Ｃ  Ｇ  Ｔ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  ３’ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）に沿って与えられる。それぞれの塩基に対する１つの直線がある。４つの蛍光標識非加水分解性ヌクレオチド類似体からの異なったスペクトルシグナルは、標的鎖上の対応する相補的塩基に変換される。ポリメラーゼを閉じる場合に（本明細書に記載されるように、ポリメラーゼは、ポリメラーゼの開口および閉口をモニタリングするタグを含むことができる）、一番下の線ＣＬＯＳＥが示す。標的核酸鎖上のそれぞれの塩基がプローブ上の相補的非加水分解性ヌクレオチド類似体と対になる場合、対応するシグナルが出現する。実際のデータは、示されるものよりも騒々しく、時間の長さは、定期的ではない可能性がある。一対のＴが図６に示されるように出くわす場合、それらのシグナルは、ノイズのため、はっきりと識別できないことがある。しかしながら、ポリメラーゼは、第２のＴを承認するために開閉しなければならないため、ＣＬＯＳＥシグナルは、２つのＴシグナルがある読み込みによりクロッキングを提供する。
【０３９６】
一例において、該方法は、対象が疾病に関連する突然変異などの標的核酸配列において突然変異を有するかどうか決定するために使用される。
【０３９７】
多くの異なる配列を、同時に決定することができる。開示される方法の１つの応用は、プラスミドの配列決定である。ランダムな切り目をプラスミドに導入後、ＤＮＡは、固定したプローブを含む基板に添加される。全プラスミドは、その後、多くの点から配列決定される。コンピュータは、すべての配列のトラックを保持し、完全なプラスミド配列にそれらを自動的に組み立てる。
【０３９８】
別の使用法は、無作為に化学的に合成した核酸の領域を配列決定するためのものである。使用されるプライマーは、無作為領域外付近の位置に対して特異的である。無作為化された核酸は、固定されたポリメラーゼの領域に置かれる。本方法は、同時に無作為化実験の全結果を獲得することを可能にし、それにより、時間と費用を節約する。
【０３９９】
ニックトランスレーションは、未知の核酸上の配列決定を開始するために使用することができる。
【０４００】
実施例１４
一塩基多型の検出
本明細書に開示されるプローブは、未知塩基のちょうど上流の配列を用いるシークエンサーを対象にすることにより、一塩基多型（例えば、Ｔｗｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２７：３５−４４，２００４を参照）を決定するために使用することができる。ｄＮＴＰは、提供されない。Ｍｅｄｕｓａプローブは、プライマーの末端に置き、未知の塩基を報告する。費用削減のために、４つよりも少ないアームを持ち、故に、より少ない塩基を識別する特殊プローブは、多くのアッセイ法が求められる特定の場合に使用することができた。
【０４０１】
実施例１５
臨床的応用
本実施例は、本明細書に開示される方法がいかに病理学的標本の分析のために使用できるかを記載する。対象から得た標本のソースは、末梢血、尿、唾液、組織生検、微細針吸引物、外科標本、羊水穿刺標本、組織切片、頬標本、および剖検材料を含むことがある。
【０４０２】
特定の例において、生体試料は、試料中の存在する核酸分子を保存する状態で、スライドガラスなどの基板に取り付けられている。あるいは、核酸は、試料から分離し、その後、実施例１３に記載される方法に従うことができる。例えば、細菌染色体および突然変異体を含むヒト遺伝子を配列決定する本方法を使用することができる。本明細書に記載される技術を使用して、ウイルス性の病原菌および／または細菌性の病原菌の存在は、ウイルス性の核酸配列および／または細菌性の核酸配列の存在により検出することができる。さらに、本明細書に開示される方法は、プライマー、プローブ、および４つの非標識加水分解性ヌクレオチドを薄い組織切片に付加することにより元の場所で核酸配列を可能にする。
【０４０３】
一例において、該方法は、正常、前癌状態、および１つまたは複数の癌に対する癌細胞の生成した遺伝的分析結果に使用される。例えば、これらのそれぞれの細胞型からのｃＤＮＡライブラリは、癌細胞の遺伝的分析結果を決定するために配列決定される。開示された方法は、クローニングのない、従来の配列、またはマイクロアレイに直接遺伝子発現データを獲得するために使用することができる。これは、時間と費用を削減することができ、従って決定される組織の型を追加することができる。
【０４０４】
一例において、生体試料は、例えば、多数の標本からの多数の標本を含む組織マイクロアレイなどの組織を含む。そのようなアレイは、多数の対象から多数の標本、または同一の対象から多数の標本のスクリーニングを可能にする。
【０４０５】
本開示の原則を適用できる多数の可能な実施形態を考慮して、例示した実施例が特定の実施例のみであることを認識し、開示の範囲の制限としてとらえるべきではない。むしろ、開示の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。従って、これらの特許請求の範囲およびその精神に付随する本発明としてすべて特許請求する。
【図面の簡単な説明】
【０４０６】
【図１】図１Ａは、化学的部分を重合剤に結合する４つの分子リンカーを有する重合剤を含むナノプローブを示す概略図である。図１Ｂは、標的核酸鎖、相補的プライマー、および標的核酸鎖内の相補的ヌクレオチドと化学的部分のうちの１つとの対合に結合されるナノプローブを示す概略図である。図１Ｃは、テザーを介してポリメラーゼ上の単一点で結合される分子リンカーによって作製される「ハブ」に連結される化学的部分を有する重合剤を含むナノプローブを示す概略図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、種々の異なる構成をなして単一場所で重合剤に結合される分子リンカーを有するナノプローブの概略図である。
【図３】図３は、ｄｓＤＮＡおよびＰＥＧから構成される分子リンカーを例示する概略図である。
【図４】図４Ａ〜図４Ｆは、いくつかの分子ロッドの長さにおいて、フルオロフォアとＦＲＥＴとの間の距離を示すグラフである。ロッドは、２つのテザーを有し、ＦＲＥＴは、テザーの先端の間で測定される。これは、コンピュータシミュレーションである。テザーは、長さ１２０Åであり、ＰＥＧ（３．８Å）の持続長を有するセグメントから成る。（ＥおよびＦ）ロッドは、長さ０Åである。（ＣおよびＤ）ロッドは、長さ６０Åである。（ＡおよびＢ）ロッドは、長さ１２０Åである。データは、ｂｉｔｅプログラムを使用して生成され、ｇｅｎｈｉｓおよびｇｅｎｐｉｃプログラムを使用してグラフ化された。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、種々のロッドの長さにおけるＦＲＥＴでのテザーの長さの効果を示すグラフである。ＦＲＥＴの距離、Ｒ０は６０Åである。それぞれのグラフは、ロッドの長さに対するＦＲＥＴの効率を示す。色は、ナノプローブが特定のＦＲＥＴシグナルを与える周波数に対応する。（Ａ）テザーは、長さ２Åであり、（Ｂ）テザーは、長さ６０Åであり、（Ｃ）テザーは、長さ１２０Åであり、（Ｄ）テザーは、長さ２４０Åである。図４のグラフのデータは、０Å、６０Åおよび１２０Åのロッドの長さにおいて垂直部分を得ることによって、図５の左下方（例えば、テザーの長さが１２０Åである図５Ｃ）から取得することができる。データは、ｂｉｔｅプログラムを使用して生成され、ｇｅｎｈｉｓおよびｄｅｎｐｌｏのプログラムを使用してグラフ化された。
【図６】図６は、標的配列の結果の例を示すパターンである。
【図７】図７は、（上部）５’突出部および蛍光供与体標識（円）を有するヘアピンオリゴヌクレオチド、ならびに３’ジデオキシヌクレオチドを例示する概略図である。自由拡散ｄＴＴＰは、ＦＲＥＴ受容体（六角形）で標識化される。標識化ｄＴＴＰは、突出部の第１の塩基に結合することができるが、ｄＴＴＰは、オリゴヌクレオチドに組み込まれることはできない。標識化ｄＴＴＰが、ポリメラーゼ（楕円）によってヘアピンに保持される場合、下部は、供与体と受容体との間のＦＲＥＴを示す。この居留は、例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）など、当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。
【図８】図８は、（上部）３’末端でジデオキシヌクレオチドとともに終了し、５’末端付近で供与体フルオロフォアを有するヘアピンオリゴヌクレオチドを例示する概略図である。受容体標識化ｄＴＴＰは、ＰＥＧテザーを介して結合される。突出部内の第１の塩基はＡであるが、テザーｄＴＴＰは、「Ａ」に接近して滞留することはなく、ＦＲＥＴは、わずかに発生、または全く発生しないはずである。下部は、ＤＮＡポリメラーゼ（楕円）が、ＤＮＡヘアピンに結合する場合、テザーｄＴＴＰは、酵素ＤＮＡポケット内に滞留するはずであり、２つのフルオロフォア間にＦＲＥＴを発生させることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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