(57)【要約】  性質改変基を含んでいるアニリン類又はヘテロアリールアミン類でのペプチド誘導アルデヒド類の還元的アミノ化は、治療に適した新規な、加水分解的に安定なタンパク質コンジュゲートを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)
2009542769.tif 000048
［上式中、
Ｐｒｏｔは、該ぺプチドのアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されるペプチド誘導基を表し、
Ｒ１は、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はアリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表し、
Ｒ２は結合又はリンカーを表し、ここで該リンカーは、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-、-Ｏ-、-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-、-Ｏ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-(ＣＨ２)１-１０-、-Ｏ-(ＣＨ２)３-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-[(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)]１-５ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-Ｃ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)-、-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-３０-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、又は-ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、
2009542769.tif 000049
及びその組合せからなる群から選択されるジラジカルを含み、
Ｒ３は性質改変基を表し；
Ｒ４は水素又はＣ１-６-アルキルを表し；
Ｒ５は-ＣＨ２-又は-Ｃ(＝Ｏ)-を表す］
のコンジュゲートぺプチド又はその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１が、請求項１に記載の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-８-アリーレン、Ｃ１２-１８-アリーレン又はＣ５-１８-ヘテロアリーレンを表す請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が結合、-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、又は
2009542769.tif 000050
を表す請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３が、直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポロキサマー、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド)-グリコリド共重合体、オリゴ糖、ぺプチド、タンパク質、又はその組合せで、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよいものを表す請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、５-６０ｋＤａの分子量の直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコールを表す請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｐｒｏｔが、式
2009542769.tif 000051
［上式中、
Ｒ５は、請求項１に記載の通りであり、
Ｒ６は、水素又は置換されていてもよいα炭素原子である］
のペプチド誘導アルデヒド又はケトンから得ることができる請求項１から５の何れか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ６が水素、Ｃ１-６-アルキル又はＣ１-６-シクロアルキルを表す請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｐｒｏｔが、ぺプチド又はタンパク質のアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されたペプチド誘導基を表し、上記アミノ基がペプチドのＮ末端アミノ基、ペプチド中のリジン残基の側鎖アミノ基、又はペプチド中のグルタミン又はアスパラギン(ＣＯＮＨ２)残基の側鎖アミノ基である請求項１から７の何れか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｐｒｏｔが、成長ホルモン誘導基を表す請求項１から８の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
性質改変基を含むペプチド化合物を製造する方法において、
（ａ）ぺプチド化合物から誘導されたアルデヒド又はケトンを性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンで処理してイミン又はヘミアミナールを生じさせ、
（ｂ）該イミン又はヘミアミナールを、ＮａＣＮＢＨ３のような適切な還元剤で処理して第二級アミンを生じさせる
工程を具備する方法。
【請求項１１】
ペプチド誘導アルデヒド又はケトンを、２-アミノエタノール部分構造を含むペプチド化合物の過ヨード酸塩媒介酸化によって調製する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチド誘導アルデヒドを、１，３-ジアミノ-２-プロパノールで酵素的にアミノ基転移されたペプチドの過ヨード酸塩媒介酸化によって調製する請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンが、式
2009542769.tif 000052
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上に定義した通りである］
のものである請求項１０から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチド誘導アルデヒド又はケトンが、式
2009542769.tif 000053
［上式中、Ｐｒｏｔ、Ｒ５、及びＲ６は上に定義した通りである］
のものである請求項１０から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
式(ＩＩＩ)
2009542769.tif 000054
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上に定義した通りである］の化合物。
【請求項１６】
非コンジュゲート親ペプチドと比較して改善された薬理学的性質を有するコンジュゲートペプチドの製造のための、請求項１５に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
治療に使用するための請求項９に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項９に記載の化合物を含有する薬学的製剤。
【請求項１９】
循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患の治療方法において、請求項９に記載の化合物の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項２０】
循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患の治療のための医薬の製造における請求項９に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された薬理学的性質を有する新規なタンパク質コンジュゲート及び新規な成長ホルモンコンジュゲート、その調製方法、並びに上記コンジュゲートの治療における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の性質を該タンパク質へ共有的にコンジュゲートする基によって改変しうることはよく知られている。かかるコンジュゲーションには、化合物中の他の官能基と反応させてタンパク質にコンジュゲートさせるには幾つかの官能基を必要とする。典型的には、アミノ基、例えばＮ末端アミノ基、リジン中のεアミノ基又はシステインチオール基がアシル化又はアルキル化試薬と組み合わせて使用されている。
化学的に修飾されたタンパク質の生物学的活性は修飾部位に依存するので、特定の部位でコンジュゲートさせるのが望ましいことがしばしばであり、これは位置選択的と呼ばれる。しかしながら、例えばヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)のような成長ホルモンの位置選択的アシル化は、該タンパク質が同様の反応性のリジン残基を９個含み、通常は生成物の混合物が生じるので、困難であり、よって通常は低い収量及び純度でのみ得られる。
【０００３】
タンパク質に対する性質改変基の位置選択的コンジュゲーションを達成するための一方策は、天然のタンパク新生アミノ酸に見出すことができない官能基をタンパク質に生成させることからなる。かかる独特な官能基は、例えばアルデヒド又はケトン、アルキン、又はアジドでありうる。
特に、タンパク質誘導アルデヒド類が、タンパク質への性質改変基のコンジュゲーションに対してしばしば使用されている。このコンジュゲーションは、タンパク質誘導アルデヒドをアルコキシルアミン(Ｒ-Ｏ-ＮＨ２)で処理してオキシムを形成し、ヒドラジン誘導体で処理してヒドラゾン類を形成し、又は２-アミノエタンチオール類で処理してチアゾリジン類を形成することによって達成することができる(例えばZhang及びTam, Analytical Biochemistry 233, 87-93 (1996)；Zatsepin等, Bioconjugate Chemistry 13, 822-830 (2002)を参照)。これらのコンジュゲートさせる官能基は全て加水分解的に不安定であり、酸又は塩基での処理によって、通常のペプチド結合よりも更に速い速度で加水分解されうる(Shao及びTam, J. Am. Chem. Soc. 117, 3893-3899 (1995))。このため、上記のコンジュゲートは水溶液中でゆっくりと分解し、これがその利用性を制限している。
【０００４】
Gaertner等(Bioconjugate Chem. 7, 38-44 (1996))は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)をＩＬ-８、Ｇ-ＣＦＳ及びＩＫＬ-１ｒａに、これらタンパク質のＮ末端にアルデヒドを生成した後、アルコキシアミン官能化ＰＥＧと反応させることによって、コンジュゲートさせる方法を開示している。該アルデヒドは、Ｎ末端アミノ酸残基がセリン又はスレオニンである場合は過ヨード酸塩での酸化によって、又はＮ末端アミノ酸残基がセリンと異なる場合には金属触媒酸化的脱アミノ化によってＮ末端に生成される。
Ｎ末端セリン伸展ヒト成長ホルモンＳｅｒ-ｈＧＨはＷＯ０４／００７６８７に配列番号６６として開示されている。この出願は例えば改善された性質のｈＧＨの多量体形態に関する。
【０００５】
ＵＳ２００４０１２７４１７は、天然成長ホルモンのＰＥＧ誘導アルデヒドでの還元的アルキル化を記載している。該手順では、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基の間の僅かな塩基性の差が利用されている：酸性条件下で、広範なプロトン化がないＮ末端アミノ基でのイミン形成は、リジン側鎖でのイミン形成よりも速いので、Ｎ末端アミノ基の位置選択的ＰＥＧ化を達成することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、式(Ｉ)
2009542769.tif 000002
［上式中、
Ｐｒｏｔは、該ぺプチドのアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されるペプチド誘導基を表し、
Ｒ１は、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はアリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表し、
Ｒ２は結合又はリンカーを表し、ここで該リンカーは、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-、-Ｏ-、-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-、-Ｏ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-(ＣＨ２)１-１０-、-Ｏ-(ＣＨ２)３-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-[(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)]１-５ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-Ｃ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)-、-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-３０-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、又は-ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、
2009542769.tif 000003
及びその組合せからなる群から選択されるジラジカルを含み、
Ｒ３は性質改変基を表し；
Ｒ４は水素又はＣ１-６-アルキルを表し；
Ｒ５は-ＣＨ２-又は-Ｃ(＝Ｏ)-を表す］
のコンジュゲートぺプチド又はその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物を提供する。
【０００７】
本発明は、性質改変基を含むペプチド化合物を製造する方法において、
（ａ）ぺプチド化合物から誘導されたアルデヒド又はケトンを性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンで処理してイミン又はヘミアミナールを生じさせ、
（ｂ）該イミン又はヘミアミナールを、ＮａＣＮＢＨ３のような適切な還元剤で処理して第二級アミンを生じさせる
工程を具備する方法を提供する。
本発明は、式(ＩＩＩ)
2009542769.tif 000004
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上に定義した通りである］
の化合物を提供する。
【０００８】
本発明は治療に使用するための本発明に係る化合物を提供する。
本発明は本発明に係る化合物を含有する薬学的製剤を提供する。
本発明は循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患の治療方法において、本発明に係る化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
本発明は循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患の治療のための医薬の製造における本発明に係る化合物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２の化合物の一回の皮下投薬後の脳下垂体摘出スプラーグドーリーラットの０日目と比較した体重変化。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は親ペプチドと比較して薬理学的性質を改善するために位置選択的にコンジュゲートされた新規ぺプチド及び新規成長ホルモン(ＧＨ)化合物に関する。この開示はこれら化合物の製造と疾患治療のためのその使用に対する方法もまた開示する。本発明のコンジュゲートはペプチド結合よりもより簡単に加水分解されうる基を欠いており、その安定性は従って非コンジュゲートペプチドの安定性と同様である。
本発明によれば、ペプチド誘導アルデヒド類 (又は「ペプチドから誘導されたアルデヒド類」)は綺麗にＰＥＧ誘導アニリン又はヘテロアリールアミンに結合されうる。ペプチド又はタンパク質のリジン側鎖アミノ基又はＮ末端アミノ基のような脂肪族アミンと比較するとアニリン及びヘテロアリールアミンの更に低い塩基性のため、またアニリン-又はヘテロアリールアミン誘導イミン類(芳香族系とのイミン二重結合のコンジュゲーション)の高安定性のため、ペプチドのアルデヒド官能性とアニリン又はヘテロアリールアミンの間の選択的イミン形成が観察される。このイミンの還元により安定なＮ-アルキルアニリン／ヘテロアリールアミンが形成される。
【００１１】
従って、一実施態様では、本発明は、式(Ｉ)
2009542769.tif 000005
［上式中、
Ｐｒｏｔは、該ぺプチドのアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されるペプチド誘導基を表し、
Ｒ１は、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はアリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表し、
Ｒ２は結合又はリンカーを表し、ここで該リンカーは、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-、-Ｏ-、-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-、-Ｏ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-(ＣＨ２)１-１０-、-Ｏ-(ＣＨ２)３-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-[(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)]１-５ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-Ｃ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)-、-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-３０-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、又は-ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、
2009542769.tif 000006
及びその組合せからなる群から選択されるジラジカルを含み、
Ｒ３は性質改変基を表し；
Ｒ４は水素又はＣ１-６-アルキルを表し；
Ｒ５は-ＣＨ２-又は-Ｃ(＝Ｏ)-を表す］
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物を提供する。
【００１２】
非対称なバイラジカルは、双方の可能な方向で他の分子断片に連結可能であるものであり、つまり、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-のようなバイラジカルは、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-と-ＨＮ-(Ｃ＝Ｏ)-の双方を表す。
上記化合物は対応する未コンジュゲートペプチドと比較して改善された薬理学的性質を有している。かかる薬理学的性質の例には機能的インビボ半減期、免疫原性、腎臓濾過、プロテアーゼ保護、及びアルブミン結合が含まれる。
【００１３】
「ぺプチド」なる用語はペプチド結合によって結合された二以上のアミノ酸の配列を意味するものであり、ここで該アミノ酸は天然又は非天然でありうる。該用語は、例えばシステイン架橋のような共有的相互作用、又は非共有的相互作用によって互いに保持された二以上のポリペプチドからなりうるポリペプチド及びタンパク質という用語を包含する。該用語はまた、例えば親油性基、ＰＥＧ又は補欠分子族の結合によって誘導体化されたペプチドをまた含むものである。
「ペプチド誘導アルデヒド(又はケトン)」又は「ペプチドから誘導されたアルデヒド(又はケトン)」は、アルデヒド又はケトン官能基が共有的に結合されたペプチド、又はアルデヒド又はケトン官能基が生成されたペプチドを意味するものである。ペプチド誘導アルデヒド類の調製は当業者によく知られており、これらの既知の手順の任意のものを使用して、ここに開示された発明の実施に必要とされるペプチド誘導アルデヒドを調製することができる。
【００１４】
本明細書において、「アルキル」なる用語は、直鎖状又は分枝状の飽和した一価の炭化水素基を意味する。「アルキレン」という用語は、対応するジラジカルを示す。「低級アルキル」は１から６の炭素原子を有するアルキルで、またＣ１-６-アルキルとして示される。Ｃ１-６-アルキル基には例えばメチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、ｓｅｃ-ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ-ブチル、ｎ-ペンチル、２-メチルブチル、３-メチルブチル、４-メチルペンチル、ｎ-ヘキシル、１，１-ジメチルプロピル、１，２-ジメチルプロピル、２，２-ジメチルプロピル(ネオペンチル)及び１，２，２-トリメチルプロピルが含まれる。
ここで使用される「アリール」なる用語は、例えば６〜８員の原子を有する単環又は多環炭素環式芳香族環基、又は例えば１２〜１８員の原子を有する芳香族環系を示すものである。アリールはまた少なくとも一つの環が芳香族性である炭素環系の部分的に水素化された誘導体を含むものである。このような部分的に水素化された誘導体の例には１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、フルオレニル及び１,４-ジヒドロナフチルが含まれる。
【００１５】
ここで使用される「ヘテロアリール」なる用語は、例えば５〜７員の原子を有する単環又は多環複素環芳香族環基を、又は窒素、酸素及び硫黄から選択される一又は複数のヘテロ原子を含み、例えば７〜１８員の原子を有する芳香族環系基を示すものであり、ここで、Ｎ-オキシド及び一酸化硫黄及び二酸化硫黄は、許容可能な複素環式芳香族置換基であり、例えばフリル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、１,２,３-トリアゾリル、１,２,４-トリアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１,２,３-トリアジニル、１,２,４-トリアジニル、１,３,５-トリアジニル、１,２,３-オキサジアゾリル、１,２,４-オキサジアゾリル、１,２,５-オキサジアゾリル、１,３,４-オキサジアゾリル、１,２,３-チアジアゾリル、１,２,４-チアジアゾリル、１,２,５-チアジアゾリル、１,３,４-チアジアゾリル、テトラゾリル、チアジアジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、プリニル(purinyl)、キナゾリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル(naphthyridinyl)、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、ジアゼピニル、アクリジニル等である。またヘテロアリールは、複素環系の部分的に水素化された誘導体を含むものであるが、但しヘテロ原子を含む少なくとも一つの環は芳香族性である。このような部分的に水素化された誘導体の例は、２,３-ジドロベンゾフラニル、ピロリニル、ピラゾリニル、インドリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル及びオキサゼピニルである。
【００１６】
「アリール」及び「ヘテロアリール」の例には、これに限られるものではないが、フェニル、ビフェニル、インデニル、フルオレニル、フェナンスレニル、アズレニル、ナフチル(１-ナフチル、２-ナフチル)、アントラセニル(１-アントラセニル、２-アントラセニル、３-アントラセニル)、チエニル(２-チエニル、３-チエニル)、フリル(２-フリル、３-フリル)、インドリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、チアジアゾリル、オキサトリアゾリル、チアトリアゾリル、キナゾリン、フルオレニル、キサンテニル、イソインダニル、ベンズヒドリル、アクリジニル、チアゾリル、ピロリル(１-ピロリル、２-ピロリル、３-ピロリル)、ピラゾリル(１-ピラゾリル、３-ピラゾリル、４-ピラゾリル、５-ピラゾリル)、イミダゾリル(１-イミダゾリル、２-イミダゾリル、４-イミダゾリル、５-イミダゾリル)、トリアゾリル(１,２,３-トリアゾール-１-イル、１,２,３-トリアゾール-４-イル  １,２,３-トリアゾール-５-イル、１,２,４-トリアゾール-３-イル、１,２,４-トリアゾール-５-イル)、オキサゾリル(２-オキサゾリル、４-オキサゾリル、５-オキサゾリル)、イソオキサゾリル(イソオキサゾ-３-イル、イソオキサゾ-４-イル、イソオキサゾ-５-イル)、イソチアゾリル(イソチアゾ-３-イル、イソチアゾ-４-イル、イソチアゾ-５-イル)チアゾリル(２-チアゾリル、４-チアゾリル、５-チアゾリル)、ピリジル(２-ピリジル、３-ピリジル、４-ピリジル)、ピリミジニル(２-ピリミジニル、４-ピリミジニル、５-ピリミジニル、６-ピリミジニル)、ピラジニル、ピリダジニル(３-ピリダジニル、４-ピリダジニル、５-ピリダジニル)、キノリル(２-キノリル、３-キノリル、４-キノリル、５-キノリル、６-キノリル、７-キノリル、８-キノリル)、イソキノリル(１-イソキノリル、３-イソキノリル、４-イソキノリル、５-イソキノリル、６-イソキノリル、７-イソキノリル、８-イソキノリル)、ベンゾ[ｂ]フラニル(２-ベンゾ[ｂ]フラニル、３-ベンゾ[ｂ]フラニル、４-ベンゾ[ｂ]フラニル、５-ベンゾ[ｂ]フラニル、６-ベンゾ[ｂ]フラニル、７-ベンゾ[ｂ]フラニル)、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル(２-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、３-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、４-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、５-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、６-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、７-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル))、ベンゾ[ｂ]チオフェニル(ベンゾ[ｂ]チオフェン-２-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-３-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-４-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-５-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-６-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-７-イル)、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェニル(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-２-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-３-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-４-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-５-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-６-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-７-イル)、インドリル(１-インドリル、２-インドリル、３-インドリル、４-インドリル、５-インドリル、６-インドリル、７-インドリル)、インダゾール(１-インダゾリル、３-インダゾリル、４-インダゾリル、５-インダゾリル、６-インダゾリル、７-インダゾリル)、ベンズイミダゾリル(１-ベンズイ���ダゾリル、２-ベンズイミダゾリル、４-ベンズイミダゾリル、５-ベンズイミダゾリル、６-ベンズイミダゾリル、７-ベンズイミダゾリル、８-ベンズイミダゾリル)、ベンズオキサゾリル(２-ベンズオキサゾリル、３-ベンズオキサゾリル、４-ベンズオキサゾリル、５-ベンズオキサゾリル、６-ベンズオキサゾリル、７-ベンズオキサゾリル)、ベンゾチアゾリル(２-ベンゾチアゾリル、４-ベンゾチアゾリル、５-ベンゾチアゾリル、６-ベンゾチアゾリル、７-ベンゾチアゾリル)、カルバゾリル(１-カルバゾリル、２-カルバゾリル、３-カルバゾリル、４-カルバゾリル)、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン(５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-１-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-２-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-３-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-４-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-５-イル)、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン(１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-１-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-２-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-３-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-４-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-５-イル)、ベンゾ[１,３]ジオキソール(２-ベンゾ[１,３]ジオキソール、４-ベンゾ[１,３]ジオキソール、５-ベンゾ[１,３]ジオキソール、６-ベンゾ[１,３]ジオキソール、７-ベンゾ[１,３]ジオキソール)、及びテトラゾリル(５-テトラゾリル、Ｎ-テトラゾリル)が含まれる。
【００１７】
ここで使用される「アリーレン」なる用語は、例えば６〜８員の原子(単環の場合)又は例えば１２〜１８員の原子(多環の場合)を有する単環又は多環炭素環式芳香族環から誘導されたジラジカルを示すものである。「アリーレン」の例には、限定されるものではないが、ベンゼン-１，４-ジイル、ナフタレン-１，８-ジイル、１，２-フェニレン、１，３-フェニレン、１，４-フェニレン、１，２-ナフチレン、１，４-ナフチレン、４，４'-ビフェニレン、４，４"-ターフェニレン及び４，４"'-クオーターフェニレン等及び「アリール」の例として挙げた基の任意の対応するジラジカルがまた含まれる。
ここで使用される「ヘテロアリーレン」なる用語は、窒素、酸素、及び硫黄から選択される一又は複数のヘテロ原子を含む、例えば５〜１８員の原子を有する単環又は多環複素環式芳香族環から誘導されたジラジカルを示すものであり、ここでＮ-オキシド及び一酸化硫黄及び二酸化硫黄は許容可能なヘテロ芳香族置換である。ここで使用される「ヘテロアリーレン」の例は、フラン-２，５-ジイル、チオフェン-２，４-ジイル、１，３，４-オキサジアゾール-２，５-ジイル、１，３，４-チアジアゾール-２，５-ジイル、１，３-チアゾール-２，４-ジイル、１，３-チアゾール-２，５-ジイル、ピリジン-２，４-ジイル、ピリジン-２，３-ジイル、ピリジン-２，５-ジイル、ピリミジン-２，４-ジイル、キノリン-２，３-ジイル、２，５-ピリジンジイル、１，２，４-ピラゾール-２，５-ジイル、イミダゾール-１，２-ジイル、チアゾール-２，４-ジイル、(４-フェニルイミダゾール)-４，１’-ジイル及び(３，５-ジフェニル-１，２，４-オキサジアゾール)-４，４”-ジイル等々及び「ヘテロアリール」の例として挙げた基の任意の対応するジラジカルがまた含まれる。
【００１８】
「リンカー」なる用語は分子量１４から５０００の有機ジラジカルを意味するものである。
「性質改変基」なる用語は、当該ペプチドに結合したときにペプチドの物理化学的又は薬理学的性質の一又は複数を変更する化学基を示すものである。かかる性質は、溶解性、組織-及び器官分布、親油性、様々なプロテアーゼによる分解の受けやすさ、アルブミンのような血漿タンパク質への親和性、機能的インビボ半減期、血漿インビボ半減期、平均滞留時間、クリアランス、免疫原性、及び腎臓濾過でありうる。化学基の幾つかのタイプはかかる性質改変効果を有している場合があることはよく知られている。
【００１９】
「機能的インビボ半減期」なる用語は、その通常の意味、すなわち、ペプチド、例えば成長ホルモン、又はコンジュゲートペプチド、例えば成長ホルモンの生物学的活性の５０％が、体／標的器官中に存在している時間、又はペプチド、例えば成長ホルモン、又はペプチド、例えば成長ホルモンのコンジュゲートの活性がその最初の値の５０％である時間で、使用される。機能的インビボ半減期の定量の代替として、「インビボ血漿半減期」、すなわち、除去される前に、ペプチド、例えば成長ホルモン、又はペプチド、例えば成長ホルモンコンジュゲートの５０％が血漿又は血流中を循環している時間を定量してもよい。血漿半減期の定量は、しばしば機能的半減期を測定するよりも簡単で、血漿半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な指標となる。血漿半減期の代替用語には、血清半減期、循環半減期(circulating half-life)、循環性半減期(circulatory half-life)、血清クリアランス、血漿クリアランス、及びクリアランス半減期が含まれる。
【００２０】
インビボ血漿半減期の測定は、文献に記載されているような多くの方法により実施することができる。インビボ血漿半減期の増加は、クリアランス(ＣＬ)の減少、又は平均滞留時間(ＭＲＴ)の増加として定量されうる。適切なアッセイにより測定して親ペプチドのＣＬの７０％未満、例えば５０％未満、例えば２０％未満、例えば１０％未満までＣＬが低下した本発明のコンジュゲートペプチド、例えば成長ホルモンは、増加したインビボ血漿半減期を有していると言える。適切なアッセイにおいて親ペプチドのＭＲＴの１３０％以上、例えば１５０％、例えば２００％以上、例えば５００％以上まで、ＭＲＴが増加した本発明のコンジュゲートペプチド、例えば成長ホルモンは、増加したインビボ血漿半減期を有していると言える。クリアランス及び平均滞留時間は、適切な試験動物を使用し、標準的な薬物動態学的研究において評価することができる。与えられたペプチドに対して適切な試験動物を選択することは当業者の技量の範囲内である。もちろん、ヒトでの試験が最終試験となる。適切な試験動物には、正常なスプラーグドーリー雄ラット、マウス及びカニクイザルが含まれる。典型的には、マウス及びラットには、一回、皮下ボーラス注射し、サルには、一回、皮下ボーラス注射、又は一回、静脈内投与してもよい。注射される量は試験動物に依存する。続いて、ＣＬ及びＭＲＴの評価のために必要に応じて１〜５日の期間をあけて、血液試料を採取する。血液試料は、簡便にはＥＬＩＳＡ技術により分析する。
【００２１】
化合物の「免疫原性」なる用語は、ヒトに投与された場合、体液性、細胞性又はその双方の如何にかかわらず、有害な免疫反応を誘発する化合物の能力を意味する。任意のヒト亜母集団においては、特定の投与されたペプチドに対して感受性を示す個体が存在し得る。免疫原性は、当該分野で知られている一般的な方法を使用し、感受性の個体におけるペプチド及び／又はペプチド反応性Ｔ細胞の存在を定量することにより測定されうる。一実施態様では、本発明のコンジュゲートＧＨは、親ＧＨのその個体に対する免疫原性に対して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％の感受性の個体における免疫原性の低下を示す。他の態様では、免疫原性は、臨床試験における患者集団での典型的な応答のように、同様の被験者集団中での典型的な応答を意味する場合がある。
【００２２】
ここで使用される「プロテアーゼ保護」又は「プロテアーゼ保護された」なる用語は、本発明のコンジュゲートペプチド、例えば成長ホルモンが、親ペプチドよりも、血漿ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対してより耐性があることを示すものである。血漿中に存在するプロテアーゼ及びペプチダーゼ酵素は、循環タンパク質及びペプチド、例えば循環ペプチドホルモン、例えば成長ホルモンの分解に関与していることが知られている。本発明のコンジュゲートペプチドはまたある種の組織及び器官中に存在するプロテアーゼ、例えば肺中に存在するプロテアーゼによる分解に対してより耐性であり得、よって、コンジュゲートペプチドは対応する非コンジュゲートペプチドよりも肺又は鼻送達により適しているであろう。
【００２３】
例えばジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰＩＶ)による分解に対するペプチドの耐性は、次の分解アッセイにより測定される：１００μＬの０．１Ｍのトリエチルアミン-ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中において、ペプチドのアリコート(５ｎｍｏｌ)を、５ｍＵの酵素活性に相当する１μＬの精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶと共に３７℃で１０-１８０分インキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸５μＬを添加して、酵素反応を終結させ、ペプチド分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア(widepore)(３０ｎｍ孔、５μｍの粒子)２５０×４．６ｍｍのカラムに適用し、Siegel等, Regul. Pept. 79, 93-102(1999)及びMentlein等, Eur. J. Biochem. 214, 829-35(1993)に従って、０．１％のトリフルオロ酢酸中アセトニトリルの線形段階的勾配(３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０-２４％のアセトニトリル、１分間は２４-４８％のアセトニトリル)で１ｍｌ／分の流量で溶出させる。ペプチドとその分解産物を、２２０ｎｍ(ペプチド結合)又は２８０ｎｍ(芳香族アミノ酸)の吸光度によりモニターし、標準のものとの関連でそれらのピーク面積を積分することにより定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによるペプチドの加水分解速度は、加水分解されるペプチドが１０％未満になるインキュベート時間で推定される。他の血漿プロテアーゼ又はペプチダーゼに対する耐性は、類似した方法で測定することができる。一実施態様では、ペプチド、例えば成長ホルモンの加水分解速度は、親ＧＨのものの７０％未満、例えば４０％未満、例えば１０％未満である。
【００２４】
哺乳動物種の循環血液中において最も豊富なタンパク質成分は血清アルブミンで、これは通常、全血１００ｍＬ中、約３〜４．５グラムの濃度で存在している。血清アルブミンは約７００００ダルトンの血液タンパク質であり、循環系において、幾つかの重要な機能を有している。それは、血液中に見出される様々な有機分子のトランスポーターとして、血液を通して脂肪酸及びビリルビンのような様々な代謝産物のトランスポーターとして、またその豊富さのため、循環血液の浸透圧調節因子として機能する。血清アルブミンは１週間以上の半減期を有しており、ペプチドの血漿半減期を増加させるための一アプローチは、血清アルブミンに結合する基をペプチドにコンジュゲートさせることであった。アルブミン結合特性は、出典明示によりここに援用されるJ. Med. Chem. 43, 1986-1992 (2000)に記載されているようにして決定されうる。
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質はペプチド化合物の機能的インビボ半減期である。更なる実施態様では、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期は性質改変基のないペプチド化合物と比較して増加する。
【００２５】
機能的インビボ半減期又は血漿半減期に関連して使用される「増加した」なる用語は、ペプチド、例えば成長ホルモンのコンジュゲートの関連半減期が、比較条件下で測定された親ペプチドのものに対して統計的に有意に増加したことを示すために使用される。例えば関連半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は５００％増加しうる。一実施態様では、本発明の化合物は、親ＧＨの半減期に対し、少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約２４時間、より好ましくは少なくとも約７２時間、最も好ましくは少なくとも約７日間の半減期の増加を示す。
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質は、ペプチド化合物のインビボ血漿半減期である。更なる実施態様では、ペプチドのインビボ血漿半減期は、性質改変基を持たないペプチド化合物と比較して増加する。更なる実施態様では、ペプチドのインビボ血漿半減期は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加される。
【００２６】
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリマー又はオリゴマーを表し；あるいはＲ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す。
【００２７】
ここで使用される「ポリマー(多量体)」なる用語は、共有的化学結合によって連結された構造単位と繰り返し単位からなる大きな分子を示すものである。ポリマーは、これらの鎖中のモノマーとして知られる多くの同一、類似、又は相補的な分子サブユニットの繰り返しの点で他の分子とは区別される。モノマーは低分子量から中程度の分子量の小分子であり、互いに重合によって連結される。モノマー間の差は溶解性、柔軟性及び強度のような性質に影響を及ぼしうる。ポリマーは有機又は無機でありうる。本発明で使用されるポリマーの例は、直鎖状又は分枝状のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポロキサマー、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド)-グリコリド共重合体、オリゴ糖、ぺプチド、タンパク質、及びセルロース、デンプン、ヒアルロン酸、寒天、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、又はペントサン又はその組合せから選択される直鎖状又は分枝状オリゴ糖である。
【００２８】
ここで使用される「オリゴマー」なる用語は、共有的化学結合によって連結された構造単位と繰り返し単位からなり、大きな未知数のモノマーからなるポリマーと異なり、比較的小さい既知数のモノマー単位からなる大きな分子を示すものである。
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポロキサマー、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド)-グリコリド共重合体、オリゴ糖、ぺプチド、タンパク質、又はそれらの組合せを表す。
【００２９】
「ポリエチレングリコール」、「Ｐｅｇ」又は「ＰＥＧ」(ポリ(エチレングリコール))は次の構造
2009542769.tif 000007
［上式中、ｎは１より大きい整数であり、その分子量はおよそ１００及びおよそ１００００００Ｄａの間である］
の多分散又は単分散基を意味する。
「ｍＰＥＧ」又は「ｍＰｅｇ」用語は、次の構造
2009542769.tif 000008
[上式中、ｍは１を越える整数である]の多分散又は単分散基を意味する。よって、ｍが９０であるｍＰＥＧは、３９９１Ｄａ、すなわち約４ｋＤａの分子量を有する。同様に、２０ｋＤａの平均分子量を有するｍＰＥＧは４５４の平均ｍを有する。ｍＰＥＧを製造する方法のために、これらの分子はしばしば分子量のある分布を有する。この分布は多分散度により記述される。
【００３０】
ｍのこの分布のため、２０ｋＤａの分子量のｍＰＥＧはまたＭｅＯ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)４００-５００とも呼ばれ、３０ｋＤａの分子量のｍＰＥＧはまたＭｅＯ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)６００-７００とも呼ばれ、４０ｋＤａの分子量のｍＰＥＧはまたＭｅＯ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)８５０-９５０とも呼ばれる。より重いｍＰＥＧ鎖は単一鎖分子として調製することが難しく、よってそれらは分枝ｍＰＥＧとして作製される。特に、４０ｋＤａの分子量のｍＰＥＧはそれぞれ２０ｋＤａのアームを含む分枝ｍＰＥＧとして達成されうる。
ここで使用される「多分散度」なる用語は、高分子化学の分野で知られている重量平均分子量と数平均分子量の比を意味する(例えば"Polymer Synthesis and Characterization", J.A. Nairn, University of Utah, 2003を参照)。多分散度は１以上の数であり、ゲル浸透クロマトグラフィーデータから推定することができる。多分散度が１である場合、生成物は単分散性で、よって単一の分子量を有する化合物から構成されている。多分散度が１を越える場合、それは、そのポリマーの多分散度、すなわち、様々な分子量を有するポリマーの分布が如何に広いかの尺度である。
【００３１】
式、化合物名又は分子構造中における例えば「ｍＰＥＧ２００００」の使用は、ｍＰＥＧが多分散性であり、約２０ｋＤａの分子量を有しているｍＰＥＧ残基を示している。
多分散度は、典型的には、ＰＥＧ又はｍＰＥＧの分子量と共に増加する。２０ｋＤａのＰＥＧ、特に２０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、それが、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。３０ｋＤａのＰＥＧ、特に３０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。４０ｋＤａのＰＥＧ、特に４０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。
【００３２】
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す。
式(Ｉ)において、Ｐｒｏｔは不対電子を有するペプチドであるペプチドモノラジカルを示す。該不対電子はペプチド中のどこに存在してもよいが、主に、ＮＨ基から水素原子を除去することによって得ることができる。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基はＮ末端アミノ基からの水素原子の形式的除去によって形成される。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基はアミノ酸側鎖からの水素原子の形式的除去によって形成される。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基はリジン側鎖のアミノ基からの水素原子の形式的除去によって形成される。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基はグルタミン側鎖のＮＨ２基からの水素原子の形式的除去によって形成される。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基はアスパラギン側鎖のＮＨ基からの水素原子の形式的除去によって形成される。この形式的除去は、当該分野で知られている幾つかの方法の任意のもの、例えば本発明による方法を使用して、実施することができる。
【００３３】
一実施態様では、Ｐｒｏｔは式
2009542769.tif 000009
［上式中、
Ｒ５は上記の通りであり、
Ｒ６は水素又は置換されていてもよいα炭素原子を表す］
のペプチド誘導アルデヒド又はケトンから得ることができる。
一実施態様では、Ｒ６は水素、Ｃ１-６-アルキル又はＣ１-６-シクロアルキルを表す。
本明細書において、「シクロアルキル」なる用語は環状の飽和一価炭化水素基を示すものである。「低級シクロアルキル」は、Ｃ１-６-シクロアルキルとも示される３から６個の炭素原子を有するシクロアルキルである。Ｃ１-６-シクロアルキル基は例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、２-メチル-シクロペンチル、及びシクロヘキシルを含む。
【００３４】
一実施態様では、Ｐｒｏｔは、ぺプチド又はタンパク質のアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されたペプチド誘導基を表し、上記アミノ基がペプチドのＮ末端アミノ基、ペプチド中のリジン残基の側鎖アミノ基、又はペプチド中のグルタミン又はアスパラギン(ＣＯＮＨ２)残基の側鎖アミノ基である。
一実施態様では、Ｐｒｏｔは成長ホルモン誘導基を表す。
「成長ホルモン」又は「ＧＨ」なる用語は、ここでのアッセイＩで定量して成長ホルモン活性を示すタンパク質、又は構造式との関連で使用される場合、かかるタンパク質から誘導される基を示すものである。ｈＧＨはヒト成長ホルモンを示す。アッセイ(Ｉ)においてｈＧＨの２０％以上、例えば４０％以上、例えば６０％以上、例えば８０％以上の活性を示すペプチドが成長ホルモン化合物として定義される。
【００３５】
一実施態様では、Ｐｒｏｔはヒト成長ホルモン誘導基を表す。一実施態様では、Ｐｒｏｔは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)の基である。一実施態様では、ＰｒｏｔはＮ末端アミノ基からの水素原子の除去によって形成される。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基は配列番号１の４０位に対応する位置のグルタミンの側鎖アミノカルボニル基(Ｈ２Ｎ-ＣＯ-)からの水素原子の形式的除去によって形成される。一実施態様では、Ｐｒｏｔ基は配列番号１の１４１位に対応する位置のグルタミンの側鎖アミノカルボニル基(Ｈ２Ｎ-ＣＯ-)からの水素原子の形式的除去によって形成される。
【００３６】
一実施態様では、成長ホルモン誘導基の成長ホルモン部分はｈＧＨの変異体であり、ここで変異体とは、ｈＧＨ配列中の一又は複数のアミノ酸残基を他の天然又は非天然アミノ酸で置換することにより；及び／又は、一又は複数の天然又は非天然アミノ酸をｈＧＨ配列に付加することにより；及び／又はｈＧＨ配列から一又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより得られる化合物であると理解され、ここでこれらの工程の任意のものの後に、場合によっては一又は複数のアミノ酸残基の更なる誘導体化、例えばジペグ化又は多ペグ化成長ホルモン変異体を生じるペグ化を続けてもよい。特に、このような置換は、一つのアミノ酸残基が同じグループからの他のアミノ酸残基、すなわち同様の特性を有する他のアミノ酸残基で置換されるという意味で保存的である。アミノ酸は、それらの特性に基づき、簡便に以下のグループに分けることができる：塩基性アミノ酸(例えばアルギニン、ヒスチジン及びリジン)、酸性アミノ(例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えばグルタミン、ヒスチジン、システイン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えばロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン及びバリン)、芳香族アミノ酸(例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン)及び小アミノ酸(例えばグリシン、アラニン、セリン及びスレオニン)。
【００３７】
一実施態様では、ぺプチドは親ペプチドと比較してＮ末端に約１００アミノ酸残基まで伸展させることができる。かかるＮ末端伸展ぺプチドは式Ｚ-ＸＸ-Ｐｒｏｔとして記載することができ、ここで、Ｚはセリン又はスレオニンを表し、ＸＸは１-５０アミノ酸の任意の配列を表し、Ｐｒｏｔは親ぺプチドを表す。一実施態様では、Ｚはセリンを表す。一実施態様では、ＸＸは、４０まで、例えば２０まで、例えば１０まで、例えば５まで、例えば１、２、３、４又は５アミノ酸残基の配列を表す。一実施態様では、ぺプチドは、配列番号１と比較してＮ末端において１００アミノ酸残基が伸展されたｈＧＨである。特に、上記伸展は、５０まで、例えば４０まで、例えば２０まで、例えば１０まで、例えば５まで、例えば１、２又は３アミノ酸残基までである。
一実施態様では、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。一実施態様では、上記同一性は、ここでアッセイＩで測定して、ｈＧＨの成長ホルモン活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％に合わせられる。
【００３８】
当該分野で知られている「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定される、２又はそれ以上のタンパク質の配列間の関係を意味する。当該分野では、「同一性」は、２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致数によって決定されるタンパク質間の配列の関連度合いをまた意味する。「同一性」は、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム(つまり「アルゴリズム」)によって取り組まれる間隙アラインメント(ある場合)を施した２以上の配列のなかの小さい方の間の完全同一のパーセントを判定する。関連したタンパク質の同一性は、既知の方法により容易に算出することができる。そのような方法には、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDevereux, J編, M. Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo等, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載されているものが含まれる。
【００３９】
同一性を決定するための好ましい方法は、調べられる配列間に最も大きな一致をもたらすように設計される。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＡＰ(Devereux等, Nucl. Acid. Res., 12：387(1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ(Altschul等, J. Mol. Biol., 215：403-410(1990))が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の供給源(BLAST Manual, Altschul等, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschul等,上掲)から公に入手可能である。よく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)もまた同一性を決定するために使用することができる。
【００４０】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を使用して、パーセント配列同一性が決定されることになる２つのペプチドを、その各アミノ酸が最適に一致するように整列させる(アルゴリズムにより決定される「マッチドスパン」)。ギャップ開裂ペナルティ(平均ダイアゴナルの３倍と算出される；「平均ダイアゴナル」は使用されている比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスによるそれぞれの完全アミノ酸一致に割当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸展ペナルティ(通常、ギャップ開裂ペナルティの{分率(１／１０)}である)、並びに比較マトリックス、例えばＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２が、アルゴリズムに併せて使用される。標準的な比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックス用には、Dayhoff等, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3(1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス用には、Henikoff等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89：10915-10919(1992))もアルゴリズムに使用される。
ペプチド配列比較のために好ましいパラメータは、次のものを含む：
アルゴリズム：Needleman等, J. Mol. Biol, 48：443-453(1970)；比較マトリックス：Henikoff等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：10915-10919(1992)のＢＬＯＳＵＭ６２；ＧＡＰペナルティ：１２、ＧＡＰ長ペナルティ：４、類似性の閾値：０。
【００４１】
ＧＡＰプログラムは上記パラメータを用いて有用である。上述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップのペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。
一実施態様では、Ｐｒｏｔは抗体誘導基を表す。一実施態様では、Ｐｒｏｔは抗体の断片から誘導された基を表す。
【００４２】
「抗体」なる用語は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間以上、約４８時間以上、約３、４、５、６、７以上の日数等の有意な期間、あるいは任意の他の関連した機能的に定められた期間(例えば、抗原に対する抗体結合に伴う生理的応答を誘導し、促進し、亢進し、及び／又は調節するのに十分な時間)、典型的な生理学的条件下で抗原に特異的に結合する能力を備えた免疫グロブリン分子又はその何れかの誘導体を示すものである。抗体なる用語はまたダイアボディ及び単鎖抗体を含む。
更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用し、ＶＬ及びＶＨ領域の対が一価分子(単鎖抗体又は単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られている、例えばBird等, Science 242:423-426 (1988)及びHuston等, PNAS USA 85:5879-5883 (1988)を参照)を形成する単一ペプチド鎖としてそれらを生成せしめる合成リンカーにより、結合されうる。かかる単鎖抗体は、別段の記載がないか又は文脈によって明らかでない限り、抗体なる用語内に包含される。単鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディは抗体なる用語内に含まれる。
【００４３】
抗体なる用語には、一般にポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体及びヒト化抗体、及び抗体に対する抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体が含まれることがまた理解されなければならない。
「免疫グロブリン」なる用語は、一対の軽(Ｌ)低分子量鎖と一対の重(Ｈ)鎖のポリペプチド鎖の二つの対からなり、４つ全ての間がジスルフィド結合によって結合した構造的に関連した糖タンパク質のクラスを意味する。免疫グロブリンの構造はよく特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編, 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照。簡単に言えば、各重鎖は典型的には重鎖可変領域(ここではＶＨと略)及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は典型的には３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各軽鎖は典型的には軽鎖可変領域(ここではＶＬと略)及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は典型的には一つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、より保存され、フレームワーク領域(ＦＲｓ)と呼ばれる領域が散在した相補性決定領域(ＣＤＲｓ)とも呼ばれる、高頻度可変領域(又は配列が高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループの形態である高頻度可変領域)に細分されうる。各ＶＨ及びＶＬは典型的には次の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲｓと４つのＦＲｓからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４(またChothia及びLesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)を参照)。
【００４４】
「抗体の断片」又は「抗体断片」なる用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を示すものである。「抗体」なる用語に包含される結合断片の例には、(ｉ)Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；(ｉｉ)Ｆ(ａｂ)２及びＦ(ａｂ')２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片；(ｉｉｉ)ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；(ｉｖ)抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片、(ｖ)ＶＨドメインから本質的になるｄＡｂ断片(Ward等, (1989) Nature 341：544-546)；及び(ｖｉ)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)が含まれる。抗体断片は、酵素開裂、ペプチド合成、及び組換え法のような任意の既知の方法によって提供されうる。
【００４５】
式Ｉの化合物に対する構造式の例は、次のものを含む：
2009542769.tif 000010
【００４６】
式(Ｉ)の化合物の非限定的な例は、
2009542769.tif 000011
及びその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物を含み、ここで、ＧＨは成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモンから形成された基を表し、ＧＨ基はＮ末端アミノ基からの１個の水素原子の除去により形成される。これらの化合物は、Ｓｅｒ-ＧＨ(Ｎ末端が１個のセリンで伸展された成長ホルモン)を過ヨード酸塩媒介酸化した後、得られたアルデヒドを４-アミノベンズアミドと縮合させ、得られたイミンをＮａＣＮＢＨ３又は他の適切な還元剤で還元させることによって調製することができる。
【００４７】
式(Ｉ)の化合物の非限定的な例は、
2009542769.tif 000012
及びその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物を含み、ここで、ｈＧＨ(４０)はヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)における４０位のグルタミンの側鎖アミノカルボニル基(Ｈ２Ｎ-ＣＯ-)からの１個の水素原子の形式的除去によって形成された基を表す。これらの化合物は、ｈＧＨを１，３-ジアミノ-２-プロパノールでトランスグルタミナーゼ媒介アミノ基転移させ、過ヨード酸塩媒介酸化によって式Ｈ-ＣＯ-ＣＨ２-ｈＧＨ(４０)のアルデヒドにした後、４-アミノベンズアミドでイミン形成し、得られたイミンをＮａＣＮＢＨ３又は他の適切な還元剤で還元させることによって調製することができる。
【００４８】
式(Ｉ)の化合物の非限定的な例は、
2009542769.tif 000013
2009542769.tif 000014
及びその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物を含み、ここで、ｈＧＨ(１４１)はヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)における１４１位のグルタミンの側鎖アミノカルボニル基(Ｈ２Ｎ-ＣＯ-)からの１個の水素原子の形式的除去によって形成された基を表す。これらの化合物は、ｈＧＨを１，３-ジアミノ-２-プロパノールでトランスグルタミナーゼ媒介アミノ基転移させ、過ヨード酸塩媒介酸化によって式Ｈ-ＣＯ-ＣＨ２-ｈＧＨ(１４１)のアルデヒドにした後、４-アミノベンズアミドでイミン形成し、得られたイミンをＮａＣＮＢＨ３又は他の適切な還元剤で還元させることによって調製することができる。
【００４９】
ＮａＣＮＢＨ３を適切な還元剤の例としてここに挙げる。しかしながら、イミン類を第二級アミン類に転換させるための還元剤としてＮａＣＮＢＨ３の代替として多くの他の試薬を考えることができる。よって、酸化された炭水化物及びタンパク質から誘導されたイミン類は市販のボラン(ＢＨ３)とピリジンの付加物を用いて水溶液中で還元されている (Hashimoto等, J. Biochem. 123, 468-478 (1998)；Yoshida及びLee, Carbohydr. Res 251, 175-186 (1994))。関連試薬は、ボランと硫化ジメチル、ホスフィン類、亜リン酸エステル、置換ピリジン類、ピリミジン類、イミダゾール類、ピラゾール類、チアゾール類、硫化物、エーテル等々の付加物である。ＮａＣＮＢＨ３に対する更なる代替物は、触媒性水素化(不均一又は均一)、ＮａＢＨ４、(Ehrenfreund-Kleinmann等, Biomaterials 23, 1327-1335 (2002)；Zito及びMartinez-Carrion, J. Biol. Chem. 255, 8645-8649 (1980))、ＮａＨＢ(ＯＡｃ)３(Drummond等, Proteomics 1, 304-310 (2001))、ＮＡＤＰＨ(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートＮＡＤＰの還元型)又は関連ジヒドロピリジン類(Itoh等, Tetrahedron Lett. 43, 3105-3108 (2002))、又はＮａＢＨ４及びＡｃＯＨの混合物である。ＮＡＤＰＨはまた適切な酵素、例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Fisher等, J. Biol. Chem. 257, 13208-13210 (1982))と組み合わせて使用することができる。これらの試薬の各々は、水素形成(ヒドロニウムイオン還元)の速度と比較してイミン還元の高い速度を提供するために、該溶液のｐＨの調節を必要とする。よって、幾つかの試薬は中性又は塩基性反応条件下でイミンを還元しうる一方、他の試薬はより酸性の反応条件を必要としうる。更に、これらの試薬の幾つかは、全ての反応物の溶解性を改善するため又は水の濃度、よってヒドロニウムイオン還元速度を減少させるために、ホルムアミド、ＮＭＰ、アセトニトリル、エチレングリコール、イソプロパノール等々のような共溶媒の使用を必要とする場合がある。
【００５０】
ここで用いられる場合、「プロドラッグ」という用語には、生加水分解性アミド及び生加水分解性エステル、アセタール類、アミナール類、チオアミナール類、チオアセタール類、及びヒドラゾン類が含まれ、ａ)そのようなプロドラッグにおける生分解性官能基が本発明に係る化合物に含まれている化合物、及びｂ)ある与えられた官能基において生物学的に酸化もしくは還元され、本発明に係る薬剤物質を生じる化合物も含まれる。これらの官能基の例には、１,４-ジヒドロピリジン、Ｎ-アルキルカルボニル-１,４-ジヒドロピリジン、１,４-シクロヘキサジエン、ｔｅｒｔ-ブチルなどが含まれる。
【００５１】
ここで使用される場合、「生加水分解性エステル」なる用語は、ａ)親物質の生物学的活性を妨げないが、作用の持続時間、作用の開始等の有利なインビボ特性をその物質に付与するか、あるいはｂ)生物学的には不活性であるが、患者によってインビボで生物学的に活性な成分に容易に転化される薬剤物質(ここでは、本発明に係る化合物)のエステルである。利点とは、例えば、生加水分解性エステルが腸から吸収され、血漿中で本発明に係る化合物に変換されることである。多くのこのような例が当該分野で知られており、例としては、低級アルキルエステル(例えばＣ１-Ｃ４-アルキル)、低級アシルオキシアルキルエステル、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル、アルコキシアシルオキシエステル、アルキルアシルアミノアルキルエステル、及びコリンエステルが含まれる。
ここで使用される場合、「生加水分解性アミド」なる用語は、ａ)親物質の生物学的活性を妨げないが、作用の持続時間、作用の開始等の有利なインビボ特性をその物質に付与するか、あるいはｂ)生物学的には不活性であるが、患者によってインビボで生物学的に活性な成分に容易に転化される薬剤物質(ここでは、本発明に係る化合物)のアミドである。利点とは、例えば、生加水分解性アミドが腸から吸収され、血漿中で本発明に係る化合物に変換されることである。多くのこのような例が当該分野で知られており、例としては、低級アルキルアミド、α-アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、及びアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが含まれる。
【００５２】
本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」なる用語は、患者に有害ではない塩を示すものである。かかる塩には、薬学的に許容可能な酸付加塩、薬学的に許容可能な金属塩、アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸付加塩には、無機酸並びに有機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の代表例には、塩酸、臭素酸、ヨウ素酸、リン酸、硫酸、硝酸等が含まれる。適切な有機酸の代表例には、蟻酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸等が含まれる。薬学的に許容可能な無機もしくは有機酸付加塩の更なる例には、出典明示によりここに援用されるJ. Pharm. Sci. 66, 2 (1977)に列挙された薬学的に許容可能な塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩等が含まれる。アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム塩等々が含まれる。
【００５３】
ここで使用される場合、「溶媒和物」なる用語は溶質と溶媒によって形成された化学量論的に定まった複合体である。
一実施態様では、本発明は、成長ホルモンのようなペプチドの薬理学的性質を改善する方法であって、以下に記載のコンジュゲートペプチドを調製することを含む方法に関する。特に、薬理学的性質の改善は、本明細書の他の部分に記載しているように、機能的インビボ半減期、血漿インビボ半減期、平均滞留時間の増加、又はクリアランスの減少を示すものである。
一実施態様では、本発明は、式(Ｉ)の化合物を製造する方法において、
（ａ）ぺプチド化合物から誘導されたアルデヒド又はケトンを性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンで処理してイミン又はヘミアミナールを生じさせ、
（ｂ）該イミン又はヘミアミナールを適切な還元剤で処理して第二級アミンを生じさせる
工程を具備する方法に関する。
【００５４】
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質は、性質改変基を持たないペプチド化合物と比較した、性質改変基を備えたペプチド化合物の機能的インビボ半減期である。一実施態様では、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期は、性質改変基を持たないペプチド化合物と比較して増加される。更なる実施態様では、ペプチドのおよその機能的インビボ半減期は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加される。
【００５５】
ペプチド誘導アルデヒド類又はケトン類は幾つかの経路によって調製することができる。
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、Ｎ末端アミノ酸としてセリン又はスレオニンを含むペプチドの過ヨード酸塩媒介酸化によって調製される。かかるペプチドは天然ペプチドであるか、又は大腸菌又は他の適切な細胞の標準的な遺伝子改変によって対象ペプチドの所望の組換え変異体を製造することによって、調製されうる。あるいは、Ｎ末端セリン又はスレオニンを含む一又は複数のアミノ酸を、大過剰の上記アミノ酸の存在下で例えばアミノペプチダーゼのような酵素によって、例えばｈＧＨのようなペプチドのＮ末端位置に結合させることができる。ペプチドに加えられるセリン又はスレオニンはＮ末端アミノ酸残基に直接結合させられる必要はない。一又は複数のアミノ酸残基を、セリン又はスレオニンと元のＮ末端の間に挿入することができる。この実施態様では、得られたセリン又はスレオニン含有ぺプチドは式Ｚ-ＸＸ-Ｐｒｏｔ、例えばＺ-ＸＸ-ｈＧＨとして記載することができ、ここで、Ｚはセリン又はスレオニンを表し、ＸＸは１-５０アミノ酸の任意の配列を表し、Ｐｒｏｔはぺプチド、例えば成長ホルモンを表す。一実施態様では、Ｚはセリンを表す。一実施態様では、ＸＸは、４０まで、例えば２０まで、例えば１０まで、例えば５まで、例えば１、２、３、４又は５アミノ酸残基の配列を表す。
【００５６】
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、ペプチドの誘導体の過ヨード酸塩媒介酸化によって調製され、ここで、アスパラギン又はグルタミンの利用可能な側鎖の一又は複数が使用されて一般式Ｈ２Ｎ-ＣＨ２-ＣＨ(Ｒ７)-ＣＨ２-ＮＨ２のアミンがアシル化され、ここで、Ｒ７はＯＨ、ＳＨ、又はＮＨ２を表す。かかるアシル化は、例えばｈＧＨのようなペプチドを、過剰の上記アミンと適切な酵素、例えばグルタミル又はアスパルチルトランスペプチダーゼで処理することにより、選択的に達成することができる。
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、２-アミノエタノール部分構造を含むペプチド化合物の過ヨード酸塩媒介酸化によって調製される。
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒドは、１，３-ジアミノ-２-プロパノールで酵素的にアミノ基転移されたペプチドの過ヨード酸塩媒介酸化によって調製される。
【００５７】
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、一般式ＨＳ-Ｒ８-Ｃ(＝Ｏ)-Ｒ９(ここで、Ｒ８は有機ジラジカルを表し、Ｒ９は水素又は有機基を表す)のチオールを、利用可能なチロシン残基の一つに、文献(S. Ito等, J. Med. Chem. 24, 673-677 (1981))に記載されているようにチロシナーゼ、例えばキノコチロシナーゼによって、カップリングさせることによって調製される。
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒドは、一般式ＨＳ-Ｒ１０-ＣＨ(Ｒ１１)-ＣＨ２-Ｒ１２(ここで、Ｒ１０は有機ジラジカルを表し、Ｒ１１及びＲ１２は互いに独立してＯＨ又は-ＮＨ２を表す)のチオールを、文献(S. Ito等, J. Med. Chem. 24, 673-677 (1981))に記載されているようにしてチロシナーゼ、例えばキノコチロシナーゼによってカップリングさせた後、得られた生成物を過ヨード酸塩媒介酸化して、調製される。
【００５８】
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、側鎖官能基としてケトン又はアルデヒドを含む、非天然αアミノ酸アミドでのペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のアミド形成によって調製される。かかる非天然αアミノ酸アミドを、カルボキシペプチダーゼのような酵素の補助下でペプチドにカップリングさせることができる。
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、リジン側鎖アミノ基と比較して塩基性が低いＮ末端アミノ基を用いることによって、続いてアルデヒド又はケトンに転換され得る部分を含む化合物でのＮ末端アミノ基の位置選択的アルキル化によって、得られる(ＵＳ２００４０１２７４１７を参照)。
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンはアセタール又はヘミアセタールの加水分解によって調製される。
【００５９】
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、該ペプチドを生産する遺伝子改変又は未改変生物に、アルデヒド又はケトン官能基を含む非天然アミノ酸を供給することによって調製され、ここで、上記アミノ酸はペプチドに導入された後、非天然アミノ酸が導入されたペプチドが単離され精製される。これは、例えば文献(Tsao等, J. Am. Chem. Soc. 128, 4572-4573 (2006)、及びそこで引用された文献)に記載されているように、変異ｔＲＮＡシンテターゼによってまた達成できる。この方法の使用は、その位置を所望の通りに選択できるあるコドンに非天然アミノ酸が導入されるので、性質改変基が非天然アミノ酸として挿入される位置についての制御を提供する。一実施態様では、上記非天然アミノ酸は(アセチルフェニル)アラニン又は(ホルミルフェニル)アラニンである。一実施態様では、ペプチドをコードするｍＲＮＡはフェニルアラニンをコードする少なくとも一つのコドンを含む。
【００６０】
ペプチド誘導アルデヒド又はケトンのペプチド部分は、性質改変基へのコンジュゲーションが望ましい任意のぺプチドでありうる。よって、ぺプチドは治療的に効果的なペプチドであり得る。科学文献及び特許文献には、無数の治療的に効果的で興味深いペプチドがあり、かかるペプチドの性質改変が治療的な利点又は他の利点をもたらしうることはよく知られている。例えば、多くのこれらのペプチドに対して機能的インビボ半減期の増加は興味深いが、本明細書の他の部分に記載されるように、改変するのが興味深い性質の他の例も存在する。当業者であれば、本発明による誘導体化からどのペプチドが恩恵を受けるかを決定することができるであろう。よって、本発明の方法と化合物は、選択されたペプチドの性質によっては制限されない。
【００６１】
一実施態様では、ペプチドは成長ホルモンである。一実施態様では、ペプチドはヒト成長ホルモンである。一実施態様では、ペプチドは配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)である。一実施態様ではｍ成長ホルモン誘導基の成長ホルモン部分は本明細書の他の部分に記載されたｈＧＨの変異体である。一実施態様では、ぺプチドは、本明細書の他の部分に記載された親ペプチドと比較してＮ末端に約１００までのアミノ酸残基が伸展されたヒト成長ホルモンのような成長ホルモンである。一実施態様では、ぺプチドは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、例えばＮ末端が一つの残基で伸展され、該残基がセリン又はスレオニンである配列番号１のアミノ酸配列を有する成長ホルモンである。一実施態様では、該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有している。一実施態様では、上記同一性は、ここでのアッセイＩで定量してｈＧＨの成長ホルモン活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えばグルタミル８０％と対をなしている。
【００６２】
一実施態様では、成長ホルモンぺプチドは、配列番号１において４０位に対応する位置でアルデヒド又はケトン官能基で誘導体化され、他の実施態様では、成長ホルモンぺプチドは、配列番号１において１４１位に対応する位置でアルデヒド又はケトン官能基で誘導体化される。この位置選択的誘導体化は、１，３-ジアミノ-２-プロパノールとのｈＧＨのトランスグルタミナーゼ媒介カップリングと続く対応するアルデヒドへのアミノ基転移ｈＧＨの過ヨード酸塩媒介酸化のような、上述の適切な方法の使用により得ることができる。一実施態様では、ＧＨは、Ｓｅｒ-ＧＨの過ヨード酸塩媒介酸化によってアルデヒドに転換される。
一実施態様では、Ｐｒｏｔは抗体誘導基を表す。一実施態様では、Ｐｒｏｔは抗体の断片から誘導された基を表す。
ペプチド誘導アルデヒド又はケトンのペプチド部分は、例えば標準的なタンパク質合成法を使用する合成のような、ペプチドの性質に依存する多くの異なった方法で調製することができる。しかしながら、一実施態様では、適切な核酸コンストラクトを宿主へ導入した後に適切な宿主で発現される。
【００６３】
ここで使用される場合、「核酸コンストラクト」なる用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡ由来の任意の核酸分子を示すものである。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖であり得、興味あるペプチドをコードする完全な又は部分的なヌクレオチド配列に基づいている核酸セグメントを示すものである。コンストラクトは場合によっては他の核酸セグメントを含んでいてもよい
対象のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、適切には、例えば、標準的な方法(J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照)に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによって、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、ペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ由来でありうる。一実施態様では、成長ホルモンのようなペプチドをコードするＤＮＡ配列はヒト由来であり、つまりヒトゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから誘導される。特に、ＤＮＡ配列は、ヒト由来であり得、例えば特定のヒト器官又は細胞型又はヒトゲノムＤＮＡから誘導された遺伝子からのｃＤＮＡでありうる。
【００６４】
ペプチドをコードする核酸コンストラクトはまた確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859 - 1869 (1981)に記載されているホスホラミダイト法、又はMatthes等, EMBO Journal 3, 801 - 805 (1984)に記載されている方法によって合成的に調製することもできる。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。
更に、核酸コンストラクトは、標準的な方法に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来(適切な場合)の断片、全核酸コンストラクトの様々な部分に対応する断片を結合させることによって調製された混合合成及びゲノム、混合合成及びｃＤＮＡ又は混合ゲノム及びｃＤＮＡ由来のものであってもよい。
核酸コンストラクトは、例えばＵＳ４６８３２０２又はSaiki等, Science 239, 487 - 491 (1988)に記載されたように、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【００６５】
一実施態様では、核酸コンストラクトはＤＮＡコンストラクトであり、該用語は次において核酸コンストラクトの例として使用される。
対象のペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトは組換えベクター中に挿入されうる。ＤＮＡコンストラクトが挿入される組換えベクターは、簡便に組換えＤＮＡ法を施すことができる任意のベクターであり得、ベクターの選択はしばしばそれが導入される宿主細胞に依存する。よって、ベクターは自己複製ベクター、つまりその複製が染色体複製からは独立している染色体外体として存在するベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。
ベクターは、対象のペプチドをコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な更なるセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターでありうる。一般に、発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され、又は双方のエレメントを含みうる。「作用可能に連結」という用語は、セグメントが、それらがその意図された目的に対して調和して機能し、例えば転写がプロモーターで始まり、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を通して進行するように、配置されていることを示している。
プロモーターは選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞に対して相同又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうる。
【００６６】
哺乳類細胞において成長ホルモンのようなペプチドをコードするＤＮＡの転写を促す適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター(Subramani等, Mol.Cell. Biol. 1, 854-864  (1981))、ＭＴ-１(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter等, Science 222, 809-814 (1983))又はアデノウイルス２主要後期プロモーターである。
昆虫細胞における使用に関して適切なプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター(ＵＳ４７４５０５１；Vasuvedan等, FEBS Lett. 311, 7-11 (1992))、Ｐ１０プロモーター(J.M. Vlak等, J. Gen. Virology 69, 765-776 (1988))、Autographa californica多核体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター(ＥＰ３９７４８５)、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター(ＵＳ５１５５０３７；ＵＳ５１６２２２２)、又はバキュロウイルス３９Ｋ遅延性-初期遺伝子プロモーター(ＵＳ５１５５０３７；ＵＳ５１６２２２２)である。
【００６７】
酵母宿主細胞における使用に関して適切なプロモーターの例には、酵母の解糖遺伝子(Hitzeman等, J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980)；Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419-434 (1982))又はアルコール脱水素酵素遺伝子(Young等, Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender等編), Plenum Press, New York, 1982)のプロモーター、又はＴＰＩ１(ＵＳ４５９９３１１)又はＡＤＨ２-４ｃ (Russell等, Nature 304, 652-654 (1983))プロモーターが含まれる。
糸状菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーター(McKnight等, The EMBO J. 4, 2093 - 2099 (1985))又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ. オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ. ニガー中性α-アミラーゼ、Ａ. ニガー酸安定性α-アミラーゼ、Ａ. ニガーないしはＡ. アワモリのグルコアミラーゼ(ｇｌｕＡ)、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ. オリゼーアルカリプロテアーゼ、Ａ. オリゼートリオースリン酸イソメラーゼ、又はＡ.ニデュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。好適なものは、ＴＡＫＡ-アミラーゼ及びｇｌｕＡプロモーターである。
【００６８】
細菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)ＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージλＰＲプロモーターないしはＰＬプロモーターないしは大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが含まれる。
また、成長ホルモンのようなペプチドをコードするＤＮＡ配列は、必要であれば、適切なターミネーター、例えば、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter等, op cit.)又は(カビ宿主に対して)ＴＰＩ１(Alber及びKawasaki, op. cit.)又はＡＤＨ３(McKnight等, op. cit.)ターミネーターに作用可能に連結される。ベクターは更にポリアデニル化シグナルのようなエレメント(ＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域)、転写エンハンサー配列(例えばＳＶ４０エンハンサー)及び翻訳エンハンサー配列(例えばアデノウイルスＶＡ ＲＮＡｓをコードするもの)を含みうる。
【００６９】
組換えベクターは、問題の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を更に含みうる。かかる配列の例は、(宿主細胞が哺乳動物細胞である場合)ＳＶ４０複製起点である。
宿主細胞が酵母菌である場合、ベクターの複製を可能にする好適な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターの複製を可能にする配列は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ複合体コード遺伝子及び複製起点である。
また、ベクターは、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞中の欠損を補う遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)ＴＰＩ遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 125-130 (1985)に記載)、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に耐性を与えるものを含む。糸状菌では、選択可能マーカーにはａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれる。
【００７０】
ペプチドを宿主細胞の分泌経路へと方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる)を組換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列は、正しいリーディングフレームでペプチドをコードするＤＮＡ配列と連結される。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列の５'に通常位置させられる。分泌シグナル配列は、ペプチドに通常付随するものであってもよく、又は別の分泌ペプチドをコードする遺伝子からのものであってもよい。
酵母細胞からの分泌に関して、分泌シグナル配列は、発現したペプチドを細胞の分泌経路へ効率的に方向付ける任意のシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドは、天然に生じるシグナルペプチド、又はその機能的な部分であってもよいし、又は合成ペプチドであってもよい。適切なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド(ＵＳ４８７０００８を参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchle等, Nature 289, pp. 643-646 (1981)を参照)、修飾したカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(L.A. Valls等, Cell 48, pp. 887-897 (1987)を参照)、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(国際公開第８７／０２６７０号参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド(M. Egel-Mitani等, Yeast 6, pp. 127-137 (1990)を参照)であることが見出されている。
【００７１】
酵母での効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列も、シグナル配列の下流とペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されうる。リーダーペプチドの機能は、発現されたペプチドを小胞体からゴルジ体へ、更に培養培地への分泌のために分泌小胞へ誘導することである(すなわち、細胞壁を越えて、又は少なくとも細胞膜を通過して酵母菌の細胞膜周辺腔へのペプチドの輸出)。リーダーペプチドは酵母α-因子リーダーでありうる(その使用は例えばＵＳ４５４６０８２、ＥＰ１６２０１、ＥＰ１２３２９４、ＥＰ１２３５４４及びＥＰ１６３５２９に記載されている)。あるいは、リーダーペプチドは合成リーダーペプチドであってもよく、それは天然には見い出せないリーダーペプチドであると言える。合成リーダーペプチドは、例えば、国際公開第８９／０２４６３号又は国際公開第９２／１１３７８号に記載のようにして構築されうる。
【００７２】
糸状菌での使用について、シグナルペプチドは、簡便に、アスペルギルスｓｐ.アミラーゼないしはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイリパーゼないしはプロテアーゼをコードする遺伝子、又はフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼをコードする遺伝子由来でもよい。シグナルペプチドは、Ａ. オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ. ニガー中性α-アミラーゼ、Ａ. ニガー酸安定性アミラーゼ、又はＡ. ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子由来であることが好ましい。
昆虫細胞での使用の場合、シグナルペプチドは、簡便には昆虫遺伝子(国際公開第９０／０５７８３号を参照)、例えば、lepidopteran Manduca sextaの脂質動員ホルモン前駆物質シグナルペプチド(ＵＳ５０２３３２８参照)から誘導されうる。
対象のペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター及び場合によってターミネーター及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲートして、複製に必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は、当業者によく知られている(例えば上掲のSambrook等, op.cit.を参照)。
【００７３】
ＤＮＡコンストラクト又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、コードされたペプチドを生産することができる任意の細胞であり得、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞を含む。
培養の際に、ＧＨを生産することが可能である細菌性宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばＢ. スブチリス(B. subtilis)、Ｂ. リチェニホルミス(B. licheniformis)、Ｂ. レンタス(B. lentus)、Ｂ. ブレビス(B. brevis)、Ｂ. ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、Ｂ. アルカロフィルス(B. alkalophilus)、Ｂ. アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、Ｂ. コアグランス(B. coagulans)、Ｂ. サーキュランス(B. circulans)、Ｂ. ロータス(B. lautus)、Ｂ. メガテリム(B. megatherium)又はＢ. サリンジエンシス(B. thuringiensis)などのバシラス属の株、又はＳ. リビタンス(S. lividans)又はＳ. ミュリナス(S. murinus)などのストレプトマイセス、又はエシェリキア・コリ(大腸菌)などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって又はそれ自体知られている方法でコンピテント細胞を用いて行ってもよい(上掲のSambrook等を参照)。
【００７４】
大腸菌のような細菌中でペプチドが発現されると、ペプチドは、典型的には不溶性顆粒(封入体としても知られている)として細胞質で保持されうるか、又は細菌性分泌配列によって細胞膜周辺腔に誘導されうる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収されて変性された後に、変性剤を希釈することによってペプチドが再フォールディングされる。後者の場合、ペプチドは、例えば超音波処理又は浸透圧ショックにより細胞を崩壊させて細胞膜周辺腔の内容物を放出させて、ペプチドを回収することによって細胞膜周辺腔から回収されうる。
適切な哺乳動物細胞株の例はＣＯＳ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０)、ＢＨＫ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６３２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)、ＣＨＬ(ＡＴＣＣ ＣＣＬ３９)又はＣＨＯ(ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１)細胞株である。哺乳動物細胞に形質移入し、細胞中に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は例えばKaufman及びSharp, J. Mol. Biol. 159, 601 - 621 (1982)；Southern及びBerg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 - 341 (1982)；Loyter等, PNAS USA 79, 422 - 426 (1982)；Wigler等, Cell 14, 725 (1978)；Corsaro及びPearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)、Graham及びvan der Eb, Virology 52, 456 (1973)；及びNeumann等, EMBO J. 1, 841 - 845 (1982)に記載されている。
【００７５】
好適な酵母細胞の例には、サッカロマイセスｓｐｐ.又はシゾサッカロマイセスｓｐｐ.の細胞、特にサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はサッカロマイセス・クリヴェリ(Saccharomyces kluyveri)の菌株が含まれる。異種性のＤＮＡにより酵母細胞を形質転換して、そこから異種性タンパク質を生産する方法は、例えば米国特許第４５９９３１１号、米国特許第４９３１３７３号、米国特許第４８７０００８号、米国特許第５０３７７４３号及び米国特許第４８４５０７５号に記載され、これらの全ては出典明示によってここに援用される。形質転換細胞は、選択可能マーカー、一般的に薬剤耐性又は特定の栄養分、例えばロイシンの非存在下での生育能によって決定される表現型により選択可能である。酵母における使用に好適なベクターは、米国特許第４９３１３７３号に開示されるＰＯＴ１ベクターである。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列はシグナル配列及び場合によってリーダー配列、例えば上記のものの後にあってもよい。好適な酵母細胞の更なる例は、Ｋ. ラクチス、ハンゼヌラ、例えばＨ. ポリモルファ(H. polymorpha)といったクリベロマイセス属、又はＰ.パストリスなどのピキア属の菌株である(Gleeson等, J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 (1986)；ＵＳ４８８２２７９を参照)。
【００７６】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルスｓｐｐ.、パンカビｓｐｐ.、フザリウムｓｐｐ.又はトリコデルマｓｓｐ.、特にＡ. オリゼー、Ａ.ニデュランス又はＡ. ニガーの菌株の細胞である。ペプチドの発現のためのアスペルギルスｓｐｐ.の使用は、例として欧州特許第２７２２７７号及び欧州特許第２３００２３号に記述される。Malardier等 Gene 78, 147-156 (1989)に記載のように、例えばＦ. オキシスポラム(F. oxysporum)の形質転換が実施されてもよい。 
糸状菌を宿主細胞として用いる場合、宿主染色体にＤＮＡコンストラクトを簡便に組み込んで組換え宿主細胞を得ることによって、ＤＮＡコンストラクトにて形質転換されうる。ＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持される傾向が強いので、一般的にこの組み込みは有用であると思われる。ＤＮＡコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、一般的な方法、例えば相同又は異種組換えによって実施されうる。
【００７７】
昆虫細胞の形質転換とそこでの異種ペプチドの生産は、その全てが出典明示によりここに援用されるＵＳ４７４５０５１；ＵＳ４８７９２３６；ＵＳ５１５５０３７；５１６２２２２；ＥＰ３９７４８５に記載されたようにして実施することができる。 宿主細胞として使用される昆虫細胞株は、好適には鱗翅類細胞株、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞又はイラクサギンウワバ細胞(ＵＳ５０７７２１４を参照)。培養条件は好適には、例えば ＷＯ８９／０１０２９又はＷＯ８９／０１０２８、あるいは上述の文献の何れかに記載されている。
上述の形質転換され又は形質移入された宿主細胞はついで対象のペプチドの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養され、その後、得られたペプチドは培養物から回収される。
細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖させるために適切な任意の一般的な培地、例えば、適切なサプリメントを含む最小培地又は複合培地でありうる。適切な培地は、商業的サプライヤーから入手でき、あるいは刊行された処方(例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ中)に従って調製することができる。ついで、細胞により産生されたペプチドは、対象の特定のペプチドに依存して、遠心分離又は濾過により宿主細胞を培地から分離すること、上清もしくは濾過物のタンパク性成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムで沈殿させること、様々なクロマトグラフィー処理、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することなどを含む一般的な手順により培養培地から回収されうる。
【００７８】
本発明に係る方法の使用によって得ることができるコンジュゲートペプチド、例えば成長ホルモンは、そう望まれる場合には、他の手段によってまた誘導体化されうる。かかる更なる誘導体化は、本発明の方法の工程の使用前、使用中又は使用後に実施されうる。かかる更なる誘導体化のタイミングの決定は当業者の技量の範囲内である。使用されるペプチドはまた本発明によってコンジュゲートされる部位又は部位群に加えて、一又は複数の更なる位置で性質改変基と既にコンジュゲートされうる。
【００７９】
一実施態様では、性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンは、式
2009542769.tif 000015
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上で定義した通りである］のものである。
一実施態様では、Ｒ２は結合、-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、又は
2009542769.tif 000016
を表す。
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質は、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期である。更なる実施態様では、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期は、性質改変基のないペプチド化合物と比較して増加する。
一実施態様では、ペプチドのおよその機能的インビボ半減期は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加する。
【００８０】
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質は、ペプチド化合物のインビボ血漿半減期である。更なる実施態様では、ペプチドのインビボ血漿半減期は、性質改変基のないペプチド化合物と比較して増加する。更なる実施態様では、ペプチドのインビボ血漿半減期は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加する。
【００８１】
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリマー又はオリゴマーを表し；あるいはＲ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す。
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す。
【００８２】
一実施態様では、ペプチド誘導アルデヒド又はケトンは、式
2009542769.tif 000017
［上式中、
Ｐｒｏｔは上に記載した通りであり、
Ｒ５は、-ＣＨ２-又は-Ｃ(＝Ｏ)-であり、
Ｒ６は、水素又は置換されていてもよいα炭素原子である］のものである。
一実施態様では、Ｒ５は-ＣＨ２-を表す。一実施態様では、Ｒ５は-Ｃ(＝Ｏ)-を表す。一実施態様では、Ｒ６は水素、Ｃ１-６-アルキル又はＣ１-６-シクロアルキルを表す。一実施態様では、Ｒ６は水素、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルを表す。一実施態様では、Ｒ６は水素又はメチルを表す。
【００８３】
本発明は、式(ＩＩＩ)
2009542769.tif 000018
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上で定義した通りである］
の化合物を提供する。
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質は、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期である。更なる実施態様では、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期は、性質改変基のないペプチド化合物と比較して増加する。
一実施態様では、性質改変基によって改変される性質は、ペプチド化合物のインビボ血漿半減期である。更なる実施態様では、ペプチドのインビボ血漿半減期は、性質改変基のないペプチド化合物と比較して増加する。更なる実施態様では、ペプチドのインビボ血漿半減期は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加する。
【００８４】
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリマー又はオリゴマーを表し；あるいはＲ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す。
一実施態様では、Ｒ３は、酸性又は負電荷官能基(例えばカルボキシル基、テトラゾリル基、アシルスルホニル基、ホスホニル基、ボロン酸基、ホスフェート、サルフェート等々)、塩基性又はカチオン性官能基(例えばアミノ基、アンモニウム基、ホスホニウム基)、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す。
【００８５】
一実施態様では、本発明は、非コンジュゲートペプチドと比較して改善した薬理学的性質を備えたコンジュゲートペプチドの製造における式(ＩＩＩ)に係る化合物の使用を提供する。更なる実施態様では、コンジュゲーションは本発明の方法を使用して実施される。
一実施態様では、上記成長ホルモンはヒト成長ホルモンである。
一実施態様では、上記成長ホルモンは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
一実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有している。一実施態様では、上記同一性は、ここでのアッセイＩで定量したｈＧＨの成長ホルモン活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％と対をなす。
一実施態様では、上記改善された薬理学的性質はペプチドの増加した機能的インビボ半減期である。
Ｐｒｏｔが成長ホルモンを表し、成長ホルモン活性を示す式(Ｉ)の化合物は、よって、循環成長ホルモンの量の増加から恩恵を受ける疾患又は状態の治療に使用されうる。
【００８６】
従って、本発明は本発明のコンジュゲート成長ホルモンを含有する薬学的組成物を提供する。一実施態様では、コンジュゲート成長ホルモンは、１０-１５ｍｇ成長ホルモン／ｍｌから２００ｍｇ成長ホルモン／ｍｌ、例えば対応する１０-１０ｍｇ成長ホルモン／ｍｌから５ｍｇ成長ホルモン／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、本発明の薬学的組成物は２．０〜１０．０のｐＨを有する。組成物はバッファー系、保存料(類)、等張剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び界面活性剤を更に含有しうる。本発明の一実施態様では、医薬組成物は水性組成物、すなわち水を含有する組成物である。このような組成物は典型的には溶液又は懸濁液である。更なる実施態様では、薬学的組成物は水溶液である。「水性組成物」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する組成物を示すものである。同様に「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する溶液を示し、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する懸濁液を示すものである。
【００８７】
一実施態様では、薬学的組成物は凍結乾燥組成物であり、これに医師又は患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する。
一実施態様では、薬学的組成物は事前の溶解の必要がない使用準備が整った乾燥組成物(例えば凍結乾燥又はスプレードライ)である。
一実施態様では、薬学的組成物は本発明の成長ホルモンコンジュゲートの水溶液とバッファーを含有し、ここで前記成長ホルモンコンジュゲートは０．１-１００ｍｇ成長ホルモン／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在しており、前記組成物は約２．０から約１０．０のｐＨを有している。
【００８８】
一実施態様では、薬学的組成物のｐＨは、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、及び１０．０からなるリストから選択される。
【００８９】
一実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００９０】
一実施態様では、組成物は薬学的に許容可能な保存料を更に含有する。更なる実施態様では、保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択される。一実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、保存料は、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、保存料は、１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における保存料の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００９１】
一実施態様では、薬学的組成物は等張剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えばＬ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択される。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを含む単糖類、二糖類、又は多糖類、又は水溶性グルカン類のような任意の糖を使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは少なくとも一つの-ＯＨ基を有するＣ４-８炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖類又は糖アルコールは個々に又は組合せて使用することができる。糖又は糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を使用して得られる安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、使用される量に決まった制限はない。一実施態様では、糖又は糖アルコール濃度は約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌの間である。一実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の一実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における等張剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００９２】
一実施態様では、薬学的組成物はキレート剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択される。一実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一実施態様では、キレート剤は２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中におけるキレート剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
一実施態様では、薬学的組成物は安定剤を更に含有する。薬学的組成物中における安定剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００９３】
本発明の薬学的組成物は、組成物の保存中にペプチドによる凝集体の形成を減少させる十分な量の薬剤を更に含みうる。「凝集体形成」なる用語とは、可溶性のままでありうるオリゴマーか、溶液から沈殿する大きな可視できる凝集体の形成を生じるペプチド分子間の物理的相互作用のことである。「貯蔵中」とは、ひとたび調製された液体薬学的組成物又は組成物が直ぐには患者に投与されないことを意図する。むしろ調製後に、液体形態、凍結状態、又は患者への投与に適した液体形態又は他の形態へ後で再構成するための乾燥形態で貯蔵のために包装される。「乾燥形態」とは、液体薬学的組成物又は組成物が、フリーズドライ(すなわち凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照)、スプレードライ(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), PP.491-676；Broadhead等, Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206 (1992)；及びMumenthaler等, Pharm. Res. 11：12-20 (1994))、又はエアードライ(Carpenter及びCrowe Cryobiology 25：459-470(1988)；及びRoser Biopharm. 4：47-53 (1991))の何れかによって乾燥されることを意図する。一実施態様では、上記薬剤はアミノ酸塩基である。「アミノ酸塩基」なる用語は、アミノ酸又はアミノ酸の組合せのことであり、任意の与えられたアミノ酸はその遊離塩基形態又はその塩形態で存在する。アミノ酸の組合せが使用される場合、アミノ酸の全てがその遊離塩基形態で存在し得、全てはその塩形態で存在し得、あるいは幾らかがその遊離塩基形態で存在しうる一方、他のものはその塩形態で存在する。一実施態様では、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸のような荷電側鎖を担持しているものである。特定のアミノ酸(例えばメチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物)の任意の立体異性体(つまりＬ又はＤ異性体、又はそれらの混合体)又はこれら立体異性体の組合せ又はグリシン又は有機塩基、例えば限定されるものではないがイミダゾールは、特定のアミノ酸又は有機塩基がその遊離塩基形態又はその塩形態の何れかで存在している限り、本発明の薬学的組成物中に存在しうる。一実施態様では、アミノ酸のＬ立体異性体が使用される。一実施態様では、Ｌ立体異性体が使用される。また本発明の組成物はこれらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されうる。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵中にペプチドによる凝集体形成を減少させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体のことである。適切なアルギニン類似体には、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチルＬ-アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似体には、エチオニン及びブチオニンが含まれ、適切なシステイン類似体にはＳ-メチル-Ｌ-システインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様、アミノ酸類似体はその遊離の塩基形態又は塩形態で組成物中に導入される。本発明の一実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、ペプチドの凝集を防止又は遅延させるのに十分な濃度で使用される。
【００９４】
一実施態様では、薬学的組成物は、治療剤として作用するペプチドが、酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を含むペプチドである場合、メチオニン残基がメチオニンスルホキシドへ酸化するのを阻害するためにメチオニン(又は他の硫酸アミノ酸又はアミノ酸類似体)を更に含有する。「阻害する」なる用語は、メチオニンが酸化された種の経時的な最小の蓄積のことである。メチオニンの酸化を阻害することはペプチドをその正しい分子形態に保持することになる。メチオニンの任意の立体異性体(Ｌ又はＤ異性体)又はその任意の組合せを使用することができる。付加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に受け入れられるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物がわずか約１０％から約３０％のメチオニンスルホキシドしか含まないことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に加えられるメチオニンの比が約１：１から約１０００：１、例えば１０：１から約１００：１の範囲であるようにメチオニンを添加することによって達成することができる。
【００９５】
一実施態様では、薬学的組成物は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。一実施態様では、安定剤はポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ３３５０)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体(例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ及びＨＰＭＣ)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノール、及び異なった塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の他の実施態様を構成する。
本発明の薬学的組成物はまたその中の治療的に活性なペプチドの安定性を更に向上させる付加的な安定剤を含有しうる。安定剤には、限定されるものではないが、メチオニンの酸化からペプチドを保護するメチオニン及びＥＤＴＡと、凍結融解又は機械的剪断に伴う凝集からペプチドを保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００９６】
一実施態様では、薬学的組成物は界面活性剤を更に含有する。一実施態様では、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えばプルロニック(Pluronic)(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトン(Triton)Ｘ-１００のようなポロキサマー類)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体(トゥイーン類、例えばＴｗｅｅｎ-２０、Ｔｗｅｅｎ-４０、Ｔｗｅｅｎ-８０及びＢｒｉｊ-３５)、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチン及びリン脂質(例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質誘導体(例えばジパルミトイルホスファチジン酸)及びリゾリン脂質誘導体(例えばパルミトイルリゾホスファチジル-Ｌ-セリン及びエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスフェートエステル)並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び極性頭部基、つまり、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾体、及びグリセロリン脂質(例えばセファリン類)、グリセロ糖脂質(例えばガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えばセラミド類、ガングリオシド類)、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵白リゾレシチン、フシジン酸誘導体(例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等々)、長鎖脂肪酸及びその塩(例えばオレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの荷電アミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ(ドキュセート・ナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセート・カルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセート・カリウム、ＣＡＳ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスル���ネート、アニオン性(アルキル-アリール-スルホネート)一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤(例えばＮ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート類、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤(第４級アンモニウム塩基)(例えば臭化セチル-トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム)、非イオン性界面活性剤(例えばドデシルβ-Ｄ-グルコピラノシド)、エチレンジアミンへプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを連続付加して誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン類(例えばテトロニックス(Tetronic's))から選択することができ、あるいは該界面活性剤はイミダゾリン誘導体又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的組成物中における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００９７】
その他の成分が本発明の薬学的組成物中に存在することもありうる。そのような更なる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又は他のタンパク質)及び双性イオン(例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンのようなアミノ酸)が含まれうる。そのような付加的な成分は、当然ながら、本発明の薬学的組成物の全体の安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
本発明に係る成長ホルモンコンジュゲートを含む薬学的組成物は、そのような治療を必要とする患者の幾つかの部位に投与され得、例えば局所的部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収をバイパスする部位、例えば動脈、静脈、心臓への投与、及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下、筋肉又は腹部への投与である。
【００９８】
本発明に係る薬学的組成物の投与は、幾つかの投与経路、例えば舌、舌下、頬、口、経口、胃及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、そのような治療を必要としている患者に投与されうる。
本発明の薬学的組成物は、幾つかの投薬形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、コート錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、眼用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注射液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツ硬化、インサイツ沈殿、インサイツ結晶化のもの、輸液、及び移植片として投与されうる。
【００９９】
本発明の薬学的組成物は、ＧＨコンジュゲートの安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、また患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤デリバリー系及び先端薬剤デリバリー系に更に配合され、又は結合されうる。担体、薬剤デリバリー系及び先進薬剤デリバリー系の例には、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えばサーモゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶及びそれらの分散液、脂質-水系における相挙動の当業者によく知られているＬ２相とそのディスパージョン、ポリマーミセル、多相エマルション、自己乳化、自己マイクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、及びデンドリマーが含まれる。
【０１００】
本発明の薬学的組成物は、全てが当業者によく知られた装置である例えば定量吸入器、乾燥パウダー吸入器及びネブライザーを使用し、ＧＨコンジュゲートを肺に投与するための固形物、半固形物、パウダー及び溶液の組成物に有用である、
本発明の薬学的組成物は、制御された徐放性、持続性、遅延及び持続放出薬物デリバリー系の組成物に特に有用である。より詳細には、限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出及び徐放系(双方の系は、投与数を何倍も低下させる)組成物に有用である。更により好ましくは、皮下投与される制御放出及び徐放系である。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系及び組成物の有用な例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
【０１０１】
本発明の組成物に有用な徐放系の製造方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編 Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Composition and Delivery(MacNally, E.J.編 Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【０１０２】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジによる皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は輸液ポンプにより実施することができる。更なる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態でＧＨコンジュゲートを投与するための溶液又は懸濁液であってもよい組成物にある。更なる選択肢としては、本発明のＧＨコンジュゲートを含む薬学的組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
【０１０３】
「安定化された組成物」なる用語は、物理的な安定性が増し、化学的な安定性が増し、又は物理的及び化学的安定性が増した組成物を意味する。
ここで使用されるペプチド組成物の「物理的安定性」という用語は、熱機械的ストレスへのペプチドの暴露及び／又は疎水性表面及び界面のような不安定化している界面及び表面との相互作用の結果としてのペプチドの生物学的に不活性な及び／又は不溶性の凝集体を形成するペプチドの傾向を意味する。ペプチド水性組成物の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)中に満たした組成物を機械的／物理的ストレス(例えば攪拌)に様々な時間の間、異なった温度で暴露した後に視覚検査及び／又は濁度測定によって評価される。組成物の視覚検査は暗い背景中において鋭く集光された光下で実施される。組成物の濁りは例えば濁度を０から３の尺度(濁りを示さない組成物が視覚スコア０に相当し、昼光で可視できる濁りを示す組成物は視覚スコア３に相当する)でランク付けすることにより特徴付けされる。組成物は、昼光下で可視できる濁りを示す場合にタンパク質凝集に対して物理的に不安定であると分類される。あるいは、組成物の濁りは当業者によく知られている簡単な濁度測定によって評価することができる。ペプチド水性組成物の物理的安定性はペプチドの立体構造状態の分光学的薬剤又はプローブを使用してまた評価することができる。プローブは好ましくはペプチドの非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。ペプチド構造の小分子分光学的プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴはアミロイド線維の検出に広く使用されている蛍光染料である。線維と、おそらくは他のタンパク質立体配置もまた存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、線維ペプチド形態に結合したとき約４８２ｎｍで増強した発光を生じる。未結合のチオフラビンＴは本質的にはその波長で非蛍光である。
【０１０４】
天然から非天然状態までのペプチド構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、ペプチドの露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、一般には、その天然状態のペプチドの３次構造内に埋められているが、ペプチドがアンフォールドされ又は変性が始まると、露出するようになる。これらの小分子の分光学的プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光学的プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【０１０５】
ここで使用されるペプチド組成物の「化学的安定性」なる用語は、天然ペプチド構造と比較して潜在的に少ない生物学的効力及び／又は潜在的に増加した免疫原性を持つ化学的変性産物の形成に至るペプチド構造中の共有結合の破壊又は新しい共有結合の形成を含む化学反応に耐える該ペプチドの能力を意味する。天然ペプチドのタイプと性質及びペプチドがさらされる環境に応じて、様々な化学的変性産物が形成されうる。適切な基にコンジュゲートされた場合、本発明のペプチドは、対応する非コンジュゲートペプチドよりも顕著により化学的に安定であり得る。
殆どのペプチドは、脱アミド化を受ける傾向があり、これはグルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて遊離のカルボン酸を形成するプロセスである。他の変性経路は、アミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用を通して二以上のペプチド分子が互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及び多量体変性産物の形成に至る高分子量転換産物の形成を含む(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, New York 1992)。(例えばメチオニン残基の)酸化は化学的変性の他の変形例として挙げることができる。ペプチド組成物の化学的安定性は、異なった環境条件への暴露後に様々な時点において化学的変性産物の量を測定することによって評価することができる(変性産物の形成は例えば温度上昇によってしばしば加速され得る)。それぞれ個々の変性産物の量は、様々なクロマトグラフィー法(例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用して分子サイズ及び／又は電荷に応じて変性産物を分離することによりしばしば決定される。
【０１０６】
よって、上に概説したように、「安定化された組成物」とは増加した物理的安定性、増加した化学的安定性、又は増加した物理的及び化学的安定性を有する組成物を意味する。一般に、組成物は、有効期限に達するまで(推奨された使用及び貯蔵条件に応じて)使用及び貯蔵中に安定でなければならない。
一実施態様では、成長ホルモンコンジュゲートを含有する薬学的組成物は、６週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
一実施態様では、４週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間である。
一実施態様では、成長ホルモンコンジュゲートを含有する薬学的組成物は、４週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
一実施態様では、成長ホルモンコンジュゲートを含有する薬学的組成物は、２週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
【０１０７】
述べたように、Ｐｒｏｔが成長ホルモンを表し、成長ホルモン活性を示す式(Ｉ)の化合物(又はそのような化合物を含有する薬学的組成物)は、よって、循環成長ホルモンの量の増加から恩恵を受ける疾患又は状態の治療に使用されうる。
従って、本発明は治療に使用される本発明の化合物を提供する。
本発明はまた循環成長ホルモンの量の増加から恩恵を受ける疾病、症状又は疾患を治療する方法であって、本発明の化合物の治療的に有効な量を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；ＳＧＡで出生した低身長小児；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重(ＶＬＢＷ)で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又は内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨の中又はその骨折；例えば手、膝又は肩等の腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受けるか又は受けた患者；人工股関節置換手術又は円板置換手術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎の補綴固定術後の患者；例えばネイル、スクリュー及びプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；待機的大手術後の患者、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；衝撃的な損傷を受けた軟骨；勃起不全；繊維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド治療による低身長症を治療するための方法を提供するものであり、該方法は、式(Ｉ)の化合物の治療的有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む。
【０１０９】
「治療」及び「治療する」なる用語は、症状、疾病又は疾患に抗することを目的として、患者の管理又は世話をすることを意味する。該用語は、症状又は合併症を軽減、又は疾患、疾病又は病状の進行を遅延化、症状及び合併症を軽減又は緩和し、及び／又は疾患、疾病又は病状を治癒し又は除去し、並びに病状を予防するための活性な化合物の投与等、患者が被っている与えられた病状に対するあらゆる種類の治療を含むものであり、ここで予防とは、疾患、病状又は疾病に抗することを目的として、患者を管理又は世話することと理解され、兆候又は合併症の発症を防止する活性化合物の投与が含まれる。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトであるが、またイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ及びブタ等の動物を含んでもよい。
化合物の「治療的有効量」は、与えられた疾患及びその合併症の臨床症状を治癒、軽減又は部分的に抑えるのに十分な量を意味するものである。これを達成するのに十分な量が「治療的有効量」として定義される。各目的のための有効量は、疾患又は傷害の重症度並びに体重、性別、年齢及び患者の一般的症状に依存するであろう。適切な用量の決定は、値のマトリックスを構築し、マトリックス中の異なった点を試験することにより、常套的な実験を使用してなすことができ、これは全て熟練した医師又は獣医の通常の技量内のものであることが理解される。
【０１１０】
一実施態様では、本発明の化合物は非経口投与によって投与される。典型的な非経口投与量は、投与当たり１０-９ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な投与量は、投与当たり約０．００００００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。正確な投与量は、例えば徴候、医薬、投与頻度及び方式、性別、年齢、及び治療される患者の一般的病状、治療される疾患又は病状の性質及び重篤度、治療の所望される効果及び当業者には明らかな他の要因に依存するであろう。
典型的な投薬頻度は、毎日２回、毎日１回、隔日、週２回、週１回又はさらに長い投与間隔とされる。本発明のコンジュゲートペプチドの半減期は長いため、長い投与間隔、例えば週２回、週１回、又はそれ以上の長い投与間隔の投薬計画が、本発明の特定の実施態様である。
【０１１１】
一実施態様では、上記投与は、２日毎に又はより長い間隔をあけて実施される。
一実施態様では、上記投与は、１週間に１回又はより長い間隔をあけて実施される。
一実施態様では、上記投与は、１ヶ月に１回に又はより長い間隔をあけて実施される。
一実施態様では、上記症状、疾病又は疾患は、ＡＩＤＳ患者における消耗、下垂体腫瘍によるＧＨ欠乏、及びＧＨ欠乏による小児の成長不良、腎不全、ターナー症候群、及びプラダー・ウィリー症候群から選択される。
一実施態様では、本発明は、筋肉組織、神経組織又は創傷の治癒の加速；損傷を受けた組織への血流の加速又は改善；又は損傷を受けた組織における感染速度の低減のための方法であって、治療的有効量の式(Ｉ)の化合物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける症状、疾病又は疾患の治療のための医薬の製造における本発明の化合物の使用をまた提供する。
【０１１２】
一実施態様では、上記症状、疾病又は疾患は、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；ＳＧＡで出生した低身長小児；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重(ＶＬＢＷ)で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又は内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨の中又はその骨折；例えば手、膝又は肩等の腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受けるか又は受けた患者；人工股関節置換手術又は円板置換手術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎の補綴固定術後の患者；例えばネイル、スクリュー及びプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；待機的大手術後の患者、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；衝撃的な損傷を受けた軟骨；勃起不全；繊維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド治療による低身長症から選択される。
【０１１３】
一実施態様では、上記疾患は、ＡＩＤＳ患者における消耗、下垂体腫瘍によるＧＨ欠乏、及びＧＨ欠乏による小児の成長不良、腎不全、ターナー症候群、及びプラダー・ウィリー症候群から選択される。
多くの疾患を、同時に投与されるか又は連続的に投与される治療において一を越える医薬を使用して治療する。従って、上述の疾患の一つの治療のための治療方法において上記疾患の治療において通常使用される一又は複数の他の治療的に活性な化合物と併用して式(Ｉ)の化合物を使用することは本発明の範囲内にある。同様に、上記疾患の医薬の製造において、上述の疾患の一つの治療において通常使用される他の治療的に活性な化合物と併用して式(Ｉ)の化合物を使用することはまた本発明の範囲内にある。
【０１１４】
次は本発明の実施態様の列挙である：
実施態様１：式(Ｉ)
2009542769.tif 000019
［上式中、
Ｐｒｏｔは、該ぺプチドのアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されるペプチド誘導基を表し、
Ｒ１は、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はアリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表し、
Ｒ２は結合又はリンカーを表し、ここで該リンカーは、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-、-Ｏ-、-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-、-Ｏ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、-(ＣＨ２)１-１０-、-Ｏ-(ＣＨ２)３-ＮＨ-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ-[(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(＝Ｏ)]１-５ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-Ｃ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-、-(ＣＨ２)１-３０Ｃ(＝Ｏ)-、-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)１-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、-(ＣＨ２)０-３０Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)１-３０-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ(＝Ｏ)-(ＣＨ２)０-３０-、又は-ＮＨ(ＣＨ２)２-３０-、
2009542769.tif 000020
及びその組合せからなる群から選択されるジラジカルを含み、
Ｒ３は性質改変基を表し；
Ｒ４は水素又はＣ１-６-アルキルを表し；
Ｒ５は-ＣＨ２-又は-Ｃ(＝Ｏ)-を表す］
のコンジュゲートぺプチド又はその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物。
実施態様２：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ５-２２-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様１に記載の化合物。
実施態様３：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ６-１８-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様２に記載の化合物。
実施態様４：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ４-１６-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様３に記載の化合物。
実施態様５：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ６-８-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様４に記載の化合物。
実施態様６：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ５-２２-アリーレンを表す実施態様１から５の何れかに記載の化合物。
実施態様７：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１８-アリーレンを表す実施態様６に記載の化合物。
実施態様８：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１４-アリーレンを表す実施態様７に記載の化合物。
実施態様９：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ５-２２-ヘテロアリーレンを表す実施態様１から５の何れかに記載の化合物。
実施態様１０：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１８-ヘテロアリーレンを表す実施態様９に記載の化合物。
実施態様１１：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよいＣ６-１４-ヘテロアリーレンを表す実施態様１０に記載の化合物。
実施態様１２：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-８-アリーレン、Ｃ１２-１８-アリーレン又はＣ５-１８-ヘテロアリーレンを表す実施態様１から５の何れかに記載の化合物。
実施態様１３：Ｒ１が、フェニレン又はピリジレン基を表す実施態様１２に記載の化合物。
実施態様１４：Ｒ１が、１，４-フェニレンを表す実施態様１３に記載の化合物。
実施態様１５：Ｒ２が結合、-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、又は
2009542769.tif 000021
を表す実施態様１から１４の何れかに記載の化合物。
実施態様１６：Ｒ２が-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-を表す実施態様１５に記載の化合物。
実施態様１７：性質改変基によって改変される性質が、ペプチド化合物の機能的インビボ半減期である実施態様１から１６の何れかに記載の化合物。
実施態様１８：ペプチド化合物の機能的インビボ半減期が、性質改変基を持たないペプチド化合物と比較して増加される実施態様１７に記載の化合物。
実施態様１９：ペプチドのおよその機能的インビボ半減期が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加される実施態様１８に記載の方法。
実施態様２０：Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリマー又はオリゴマーを表し；あるいは
Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す実施態様１から１９の何れかに記載の化合物。
実施態様２１：Ｒ３が、直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポロキサマー、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド)-グリコリド共重合体、オリゴ糖、ぺプチド、タンパク質、又はその組合せで、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよいものを表す実施態様２０に記載の化合物。
実施態様２２：Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、セルロース、デンプン、ヒアルロン酸、寒天、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、又はペントサン又はその組合せから選択される直鎖状又は分枝状オリゴ糖を表す実施態様２１に記載の化合物。
実施態様２３：Ｒ３が５-６０ｋＤａの分子量の直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコールを表す実施態様２１に記載の化合物。
実施態様２４：Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す実施態様２０に記載の化合物。
実施態様２５：Ｒ３が、ＣＨ３-(ＣＨ２)１０-３０-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１０-３０-、又はＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１０-３０-を表す実施態様２４に記載の化合物。
実施態様２６：Ｒ３が
2009542769.tif 000022
から選択される実施態様２０に記載の化合物。
実施態様２７：Ｒ３が、Ｍｅ-(ＣＨ２)１２-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１４-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１６-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１８-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１２-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１３-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１４-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１５-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１６-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１７-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１８-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１４-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１５-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１６-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１７-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１８-、(５-テトラゾリル)２ＣＨ-(ＣＨ２)１４-、
2009542769.tif 000023
から選択される実施態様２０に記載の化合物。
実施態様２８：Ｒ４が水素を表す実施態様１から２７の何れかに記載の化合物。
実施態様２９：Ｒ４がＣ１-６-アルキルを表す実施態様１から２７の何れかに記載の化合物。
実施態様３０：Ｒ５が-ＣＨ２-を表す実施態様１から２９の何れかに記載の化合物。
実施態様３１：Ｒ５が-Ｃ(＝Ｏ)-を表す実施態様１から２９の何れかに記載の化合物。
実施態様３２：
2009542769.tif 000024
から選択される構造式を有する実施態様１に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物。
実施態様３３：Ｐｒｏｔが、式
2009542769.tif 000025
［上式中、
Ｒ５は、上に記載の通りであり、
Ｒ６は、水素又は置換されていてもよいα炭素原子である］
のペプチド誘導アルデヒド又はケトンから得ることができる実施態様１から３２の何れかに記載の化合物。
実施態様３４：Ｒ６が水素、Ｃ１-６-アルキル又はＣ１-６-シクロアルキルを表す実施態様３３に記載の化合物。
実施態様３５：Ｒ６が、水素、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルを表す実施態様３４に記載の化合物。
実施態様３６：Ｒ６が、水素又はメチルを表す実施態様３５に記載の化合物。
実施態様３７：Ｐｒｏｔが、ぺプチド又はタンパク質のアミノ基(-ＮＨ２)からの水素原子の形式的除去によって生成されたペプチド誘導基を表し、上記アミノ基がペプチドのＮ末端アミノ基、ペプチド中のリジン残基の側鎖アミノ基、又はペプチド中のグルタミン又はアスパラギン(ＣＯＮＨ２)残基の側鎖アミノ基である実施態様１から３６の何れかに記載の化合物。
実施態様３８：Ｐｒｏｔが、Ｎ末端アミノ基からの１個の水素原子の除去によって形式的に生成されるペプチド基を表す実施態様３７に記載の化合物。
実施態様３９：Ｐｒｏｔが、ペプチド中のリジン残基の側鎖アミノ基からの１個の水素原子の除去によって形式的に生成されるペプチド基を表す実施態様３７に記載の化合物。
実施態様４０：Ｐｒｏｔが、ペプチド中のグルタミン又はアスパラギン残基の側鎖アミノ基からの１個の水素原子の除去によって形式的に生成されるペプチド基を表す実施態様３７に記載の化合物。
実施態様４１：Ｐｒｏｔが、成長ホルモン誘導基を表す実施態様１から４０の何れかに記載の化合物。
実施態様４２：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様４１に記載の化合物。
実施態様４３：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様４２に記載の化合物。
実施態様４４：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様４３に記載の化合物。
実施態様４５：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様４４に記載の化合物。
実施態様４６：Ｐｒｏｔが、ヒト成長ホルモン誘導基を表す実施態様４１に記載の化合物。
実施態様４７：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン誘導基を表す実施態様４６に記載の化合物。
実施態様４８：Ｐｒｏｔが、成長ホルモン誘導基を表す実施態様４０に記載の化合物。
実施態様４９：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様４８に記載の化合物。
実施態様５０：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様４９に記載の化合物。
実施態様５１：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様５０に記載の化合物。
実施態様５２：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様５１に記載の化合物。
実施態様５３：Ｐｒｏｔがヒト成長ホルモン誘導基を表す実施態様４８に記載の化合物。
実施態様５４：Ｐｒｏｔが配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト成長ホルモン誘導基を表す実施態様５３に記載の化合物。
実施態様５５：Ｐｒｏｔ基が、配列番号１の４０位に対応する位置のグルタミンの側鎖アミノカルボニル基 (ＮＨ２-ＣＯ-)からの１個の水素原子の除去によって形式的に生成されるペプチド基を表す実施態様４８から５４の何れかに記載の化合物。
実施態様５６：Ｐｒｏｔ基が、配列番号１の１４１位に対応する位置のグルタミンの側鎖アミノカルボニル基 (ＮＨ２-ＣＯ-)からの１個の水素原子の除去によって形式的に生成されるペプチド基を表す実施態様４８から５４の何れかに記載の化合物。
実施態様５７：ペプチドがアッセイ(Ｉ)においてｈＧＨの活性の少なくとも２０％の活性を有する実施態様４１から５６の何れかに記載の化合物。
実施態様５８：ペプチドがアッセイ(Ｉ)においてｈＧＨの活性の少なくとも４０％の活性を有する実施態様４１から５６の何れかに記載の化合物。
実施態様５９：ペプチドがアッセイ(Ｉ)においてｈＧＨの活性の少なくとも６０％の活性を有する実施態様４１から５６の何れかに記載の化合物。
実施態様６０：ペプチドがアッセイ(Ｉ)においてｈＧＨの活性の少なくとも８０％の活性を有する実施態様４１から５６の何れかに記載の化合物。
実施態様６１：ぺプチドが、
2009542769.tif 000026
2009542769.tif 000027
である実施態様１に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ及び溶媒和物。
実施態様６２：Ｐｒｏｔが抗体誘導基を表す実施態様１から４０の何れかに記載の化合物。
実施態様６３：Ｐｒｏｔが抗体断片から誘導された基を表す実施態様１から４０の何れかに記載の化合物。
実施態様６４：性質改変基を含むペプチド化合物を製造する方法において、
（ａ）ぺプチド化合物から誘導されたアルデヒド又はケトンを性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンで処理してイミン又はヘミアミナールを生じさせ、
（ｂ）該イミン又はヘミアミナールを、ＮａＣＮＢＨ３のような適切な還元剤で処理して第二級アミンを生じさせる
工程を具備する方法。
実施態様６５：性質改変基を持たないペプチド化合物と比較したときに性質改変基を含むペプチド化合物の性質改変基によって改変される性質がペプチド化合物の機能的インビボ半減期である実施態様６４に記載の方法。
実施態様６６：ペプチド化合物の機能的インビボ半減期が、性質改変基を持たないペプチド化合物と比較して増加する実施態様６５に記載の方法。
実施態様６７：ペプチドのおよその機能的インビボ半減期が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加される実施態様６６に記載の方法。
実施態様６８：性質改変基を含むペプチド化合物が、実施態様１から６３の何れかに記載の化合物である実施態様６４から６７の何れかに記載の方法。
実施態様６９：ペプチド誘導アルデヒド又はケトンを、２-アミノエタノール部分構造を含むペプチド化合物の過ヨード酸塩媒介酸化によって調製する請求項６４から６８の何れかに記載の方法。
実施態様７０：ペプチド誘導アルデヒド又はケトンを、アセタール又はヘミアセタールの加水分解によって調製する請求項６４から６８の何れかに記載の方法。
実施態様７１：ペプチド誘導アルデヒドを、Ｎ末端アミノ酸としてセリン又はスレオニンを含むペプチドの過ヨード酸塩媒介酸化によって調製する請求項６４から６８の何れかに記載の方法。
実施態様７２：ペプチド誘導アルデヒドを、１，３-ジアミノ-２-プロパノールで酵素的にアミノ基転移されたペプチドの過ヨード酸塩媒介酸化によって調製する実施態様６４から６８の何れかに記載の方法。
実施態様７３：ペプチド誘導アルデヒド又はケトンを、該ペプチドを生産する遺伝子改変又は未改変生物にアルデヒド又はケトン官能基を含む非天然アミノ酸を与えて、該アミノ酸をペプチド中に導入した後、非天然アミノ酸が導入されたペプチドを単離し生成することにより調製する実施態様６４から６８の何れかに記載の方法。
実施態様７４：非天然アミノ酸が (アセチルフェニル)アラニン又は(ホルミルフェニル)アラニンである実施態様７３に記載の方法。
実施態様７５：ペプチドをコードするｍＲＮＡがフェニルアラニンをコードする少なくとも一つのコドンを含む実施態様７３又は実施態様７４に記載の方法。
実施態様７６：性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンが、式
2009542769.tif 000028
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は実施態様１に定義した通りである］
のものである実施態様６４から７５の何れかに記載の方法。
実施態様７７：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ５-２２-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様７６に記載の方法。
実施態様７８：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ６-１８-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様７７に記載の方法。
実施態様７９：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ４-１６-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様７８に記載の方法。
実施態様８０：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ６-８-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様７９に記載の方法。
実施態様８１：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ５-２２-アリーレンを表す実施態様７６から８０の何れかに記載の方法。
実施態様８２：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１８-アリーレンを表す実施態様８１に記載の方法。
実施態様８３：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１４-アリーレンを表す実施態様８２に記載の方法。
実施態様８４：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ５-２２-ヘテロアリーレンを表す実施態様７６から８０の何れかに記載の方法。
実施態様８５：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１８-ヘテロアリーレンを表す実施態様８４に記載の方法。
実施態様８６：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよいＣ６-１４-ヘテロアリーレンを表す実施態様８５に記載の方法。
実施態様８７：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-８-アリーレン、Ｃ１２-１８-アリーレン又はＣ５-１８-ヘテロアリーレンを表す実施態様７６から８０の何れかに記載の方法。
実施態様８８：Ｒ１が、フェニレン又はピリジレン基を表す実施態様８７に記載の方法。
実施態様８９：Ｒ１が、１，４-フェニレンを表す実施態様８８に記載の方法。
実施態様９０：Ｒ２が結合、-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、又は
2009542769.tif 000029
を表す実施態様７６から８９の何れかに記載の方法。
実施態様９１：Ｒ２が-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-を表す実施態様９０に記載の方法。
実施態様９２：Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基で置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリマー又はオリゴマーを表し；あるいは
Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基で置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す実施態様７６から９１の何れかに記載の方法。
実施態様９３：Ｒ３が、直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポロキサマー、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド)-グリコリド共重合体、オリゴ糖、ぺプチド、タンパク質、又はその組合せを表す実施態様９２に記載の方法。
実施態様９４：Ｒ３が、セルロース、デンプン、ヒアルロン酸、寒天、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、又はペントサン又はその組合せなどから選択される直鎖状又は分枝状オリゴ糖を表す実施態様９３に記載の方法。
実施態様９５：Ｒ３が５-６０ｋＤａの分子量の直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコールを表す実施態様９３に記載の方法。
実施態様９６：Ｒ３が、ＣＨ３-(ＣＨ２)１０-３０-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１０-３０-、又はＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１０-３０-を表す実施態様９２に記載の方法。
実施態様９７：Ｒ３が
2009542769.tif 000030
から選択される実施態様９２に記載の方法。
実施態様９８：Ｒ３が、Ｍｅ-(ＣＨ２)１２-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１４-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１６-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１８-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１２-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１３-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１４-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１５-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１６-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１７-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１８-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１４-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１５-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１６-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１７-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１８-、(５-テトラゾリル)２ＣＨ-(ＣＨ２)１４-、
2009542769.tif 000031
から選択される実施態様９８に記載の方法。
実施態様９９：性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンが
2009542769.tif 000032
から選択される実施態様７６に記載の方法。
実施態様１００：ペプチド誘導アルデヒド又はケトンが、式
2009542769.tif 000033
［上式中、Ｐｒｏｔは実施態様１に記載の通りであり、
Ｒ５は-ＣＨ２-又は-Ｃ(＝Ｏ)-であり、
Ｒ６は水素又は置換されていてもよいα炭素原子を表す］
のものである実施態様６４から９９の何れかに記載の方法。
実施態様１０１：Ｒ５が-ＣＨ２-を表す実施態様１００に記載の方法。
実施態様１０２：Ｒ５が-Ｃ(＝Ｏ)-を表す実施態様１００に記載の方法。
実施態様１０３：Ｒ６が水素、Ｃ１-６-アルキル又はＣ１-６-シクロアルキルを表す実施態様１００から１０２の何れかに記載の方法。
実施態様１０４：Ｒ６が水素、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルを表す実施態様１０３に記載の方法。
実施態様１０５：Ｒ６が水素又はメチルを表す実施態様１０４に記載の方法。
実施態様１０６：上記ぺプチドが成長ホルモンである実施態様６４から１０５の何れかに記載の方法。
実施態様１０７：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様１０６に記載の方法。
実施態様１０８：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様１０７に記載の方法。
実施態様１０９：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様１０８に記載の方法。
実施態様１１０：Ｐｒｏｔが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸の成長ホルモン誘導基を表す実施態様１０９に記載の方法。
実施態様１１１：ペプチドがここでのアッセイＩで定量してｈＧＨの成長ホルモン活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％を有している実施態様１０６から１１０の何れかに記載の方法。
実施態様１１２：上記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである実施態様１０６に記載の方法。
実施態様１１３：上記成長ホルモンが配列番号１のアミノ酸配列を含む実施態様１０６に記載の方法。
実施態様１１４：成長改変基が配列番号１の４０位に対応する位置でペプチドにコンジュゲートされる実施態様１０６から１１３の何れかに記載の方法。
実施態様１１５：成長改変基が配列番号１の１４１位に対応する位置でペプチドにコンジュゲートされる実施態様１０６から１１３の何れかに記載の方法。
実施態様１１６：式(ＩＩＩ)
2009542769.tif 000034
［上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は実施態様１に定義した通りである］
の化合物。
実施態様１１７：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ５-２２-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様１１６に記載の化合物。
実施態様１１８：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ６-１８-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様１１７に記載の化合物。
実施態様１１９：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ４-１６-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様１１８に記載の化合物。
実施態様１２０：Ｒ１が、Ｃ１-６-アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、又はＣ６-８-アリール基で置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレンを表す実施態様１１９に記載の化合物。
実施態様１２１：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ５-２２-アリーレンを表す実施態様１１６から１２０の何れかに記載の化合物。
実施態様１２２：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１８-アリーレンを表す実施態様１２１に記載の化合物。
実施態様１２３：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１４-アリーレンを表す実施態様１２２に記載の化合物。
実施態様１２４：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ５-２２-ヘテロアリーレンを表す実施態様１１６から１２０の何れかに記載の化合物。
実施態様１２５：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-１８-ヘテロアリーレンを表す実施態様１２４に記載の化合物。
実施態様１２６：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよいＣ６-１４-ヘテロアリーレンを表す実施態様１２５に記載の化合物。
実施態様１２７：Ｒ１が、上述の通りに置換されていてもよい、Ｃ６-８-アリーレン、Ｃ１２-１８-アリーレン又はＣ５-１８-ヘテロアリーレンを表す実施態様１１６から１２０の何れかに記載の化合物。
実施態様１２８：Ｒ１が、フェニレン又はピリジレン基を表す実施態様１２７に記載の化合物。
実施態様１２９：Ｒ１が、１，４-フェニレンを表す実施態様１２８に記載の化合物。
実施態様１３０：Ｒ２が結合、-Ｃ(＝Ｏ)-、-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-、又は
2009542769.tif 000035
を表す実施態様１１６から１２９の何れかに記載の化合物
実施態様１３１：Ｒ２が-Ｃ(＝Ｏ)-ＮＨ-を表す実施態様１３０に記載の化合物。
実施態様１３２：性質改変基によって改変される性質がペプチド化合物の機能的インビボ半減期である実施態様１１６から１３１の何れかに記載の化合物。
実施態様１３３：ペプチド化合物の機能的インビボ半減期が、性質改変基を持たないペプチド化合物と比較して増加する実施態様１３２に記載の化合物。
実施態様１３４：ペプチドのおよその機能的インビボ半減期が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加される実施態様６６に記載の化合物。
実施態様１３５：Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状ポリマー又はオリゴマーを表し；あるいは
Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、直鎖状又は分枝状Ｃ１０-Ｃ９０アルキル基を表す実施態様１１６から１３４の何れかに記載の化合物。
実施態様１３６：Ｒ３が、直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポロキサマー、ポリ(乳酸)、ポリ(ラクチド)-グリコリド共重合体、オリゴ糖、ぺプチド、タンパク質、又はその組合せで、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよいものを表す実施態様１３５に記載の化合物。
実施態様１３７：Ｒ３が、酸性又は負電荷官能基、塩基性又はカチオン性官能基、又はその組合せで置換されていてもよい、セルロース、デンプン、ヒアルロン酸、寒天、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、又はペントサン又はその組合せから選択される直鎖状又は分枝状オリゴ糖を表す実施態様１３６に記載の化合物。
実施態様１３８：Ｒ３が５-６０ｋＤａの分子量の直鎖状又は分枝状ポリエチレングリコールを表す実施態様１３６に記載の化合物。
実施態様１３９：Ｒ３が、ＣＨ３-(ＣＨ２)１０-３０-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１０-３０-、又はＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１０-３０-を表す実施態様１１６から１３５の何れかに記載の化合物。
実施態様１４０：Ｒ３が
2009542769.tif 000036
から選択される実施態様１３５に記載の化合物。
実施態様１４１：Ｒ３が、Ｍｅ-(ＣＨ２)１２-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１４-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１６-、Ｍｅ-(ＣＨ２)１８-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１２-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１３-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１４-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１５-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１６-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１７-、(５-テトラゾリル)-(ＣＨ２)１８-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１４-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１５-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１６-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１７-、ＨＯ２Ｃ-(ＣＨ２)１８-、(５-テトラゾリル)２ＣＨ-(ＣＨ２)１４-、
2009542769.tif 000037
から選択される実施態様１１６から１３５の何れかに記載の化合物。
実施態様１４２：
2009542769.tif 000038
から選択される実施態様１１６に記載の化合物。
実施態様１４３：非コンジュゲート親ペプチドと比較して改善された薬理学的性質を有するコンジュゲートペプチドの製造のための、実施態様１１６から１４２の何れかに記載の化合物の使用。
実施態様１４４：上記コンジュゲートペプチドがコンジュゲート抗体又は抗体断片である実施態様１４３に記載の使用。
実施態様１４５：上記コンジュゲートペプチドがコンジュゲート成長ホルモンである実施態様１４３に記載の使用。
実施態様１４６：上記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである実施態様１４５に記載の使用。
実施態様１４７：上記改善された薬理学的性質が増加した機能インビボ半減期である実施態様１４３から１４６の何れかに記載の使用。
実施態様１４８：ペプチドのおよその機能的インビボ半減期が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、又は３０日増加される１４７に記載の使用。
実施態様１４９：治療に使用するための実施態様４１から６１の何れかに記載の化合物。
実施態様１５０：実施態様４１から６１の何れかに記載の化合物を含有する薬学的製剤。
実施態様１５１：循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患を治療する方法において、実施態様４１から６１の何れかに記載の化合物又は実施態様１５０に記載の薬学的製剤の治療的有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
実施態様１５２：上記投与が二日毎又はより長い間隔で実施される実施態様１５１に記載の方法。
実施態様１５３：上記投与が一週間毎又はより長い間隔で実施される実施態様１５２に記載の方法。
実施態様１５４：上記投与が一ヶ月毎又はより長い間隔で実施される実施態様１５３に記載の方法。
実施態様１５５：上記疾患が、ＡＩＤＳ患者における消耗、下垂体腫瘍によるＧＨ欠乏、及びＧＨ欠乏による小児の成長不良、腎不全、ターナー症候群、及びプラダー・ウィリー症候群から選択される実施態様１５１から１５４の何れかに記載の方法。
実施態様１５６：循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患の治療のための医薬の製造における実施態様４１から６１の何れかに記載の化合物の使用。
実施態様１５７：上記疾患が、ＡＩＤＳ患者における消耗、下垂体腫瘍によるＧＨ欠乏、及びＧＨ欠乏による小児の成長不良、腎不全、ターナー症候群、及びプラダー・ウィリー症候群から選択される実施態様１５６に記載の使用。
【０１１５】
ここに引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているのと同じ程度に、出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
その全ての可能な変形例における上述の要素の任意の組合せは、ここに特段示されない限り又は明らかに文脈が矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【０１１６】
発明を記述する際に使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び同様の指示対象は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーしていると解されるものである。
ここでの値の範囲の記載は、特段示されない限り、その範囲内にある各別個の値に個々に言及する省略表現法となるものであることを単に意味し、各別個の値はそれがここに個々に記載されているかの如く明細書に取り込まれる。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供すると考えることができる)。
【０１１７】
ここに記載される全ての方法は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、任意の適当な順で実施することができる。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に別段の記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も、明示的に記載していない限り、如何なる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
【０１１８】
他に言及しない又は前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含んでいる」等の用語を使用する本発明の任意の態様又は実施態様のここでの記載は、その特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含む」本発明の類似した態様又は実施態様をサポートすることを意図したものである(例えば、特定の要素を含むものとしてここに記載されている組成物は、他に言及しない限り又は前後関係ではっきりと矛盾していないならば、その要素からなる組成物をまた記載しているものと理解すべきである)。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
【実施例】
【０１１９】
次の略語を使用する：
Boc：           tert-ブチルオキシカルボニル
Bt：            １-ベンゾトリアゾリル
DBU：           １,８-ジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ-７-エン
DCM：           ジクロロメタン、塩化メチレン
DIPEA：         ジイソプロピルエチルアミン
DMF：           Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
DMSO：          ジメチルスルホキシド
EDAC：           Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
Fmoc：          ９-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU：          ２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル-)-１,１,３,３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt：          Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾール,１-ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMP：           Ｎ-メチルピロリドン
HPLC：          高圧液体クロマトグラフィー
Pmc：           ２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル
r.t.            室温
Su：            スクシンイミジル
TFA：           トリフルオロ酢酸
TSTU：          Ｏ-(１-スクシンイミジル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
【０１２０】
ＮＭＲスペクトルをBruker３００ＭＨｚ及び４００ＭＨｚ機器で記録した。ＨＰＬＣ-ＭＳをPerkin Elmer機器(ＡＰＩ１００)で実施した。
Merck-Hitachi(HibarＴＭ RT 250-4, LichrosorbＴＭ RP 18, 5.0μm, 4.0x250mm, 勾配溶出, 30分以内に20%〜80%のアセトニトリル水, 1.0ml/分, 254nmで検出)製及びWaters(SymmetryＴＭ, C18, 3.5μm, 3.0x150mm, 勾配溶出, 15分以内に5%〜90%のアセトニトリル水, 1.0ml/分, 214nmで検出)製のＨＰＬＣシステムを使用した。
【０１２１】
一般的方法(Ａ)
本発明に係る式(Ｉ)の化合物は次のようにして調製することができる：
2009542769.tif 000039
水及び任意の双極性溶媒のような適切な溶媒中のペプチド誘導アルデヒドの溶液を、酢酸、水、及び任意の双極性溶媒、例えばＮＭＰ又はＤＭＦの混合物中の性質改変基誘導アニリン又はヘテロアリールアミンの溶液に加える。得られた混合物をしばらくの間、例えば１から７０時間、静置し、場合によっては酢酸を添加して酸性にしたＮａＣＮＢＨ４の水溶液を添加する。得られた混合物を振るか又は室温で１-６０時間静置する。バッファー(ｐＨ≧７)を添加し、標準的な精製によって式(Ｉ)の化合物を得る。「双極性溶媒」なる用語は６．０より大きい比誘電率を有する溶媒を言う。
【０１２２】
実施例１
ｍＰｅｇ(４０ｋ)でＮ末端(１位)がペグ化されたヒト成長ホルモン
(Ａ)：Ｓｅｒ-ｈＧＨの調製
Ｚｂａｓｉｃドメインと融合して野生型ｈＧＨを発現するＳｅｒ-ｈＧＨアナログ発現プラスミドを、ｐＮＮＣ１３(Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨ)をベースとして作製した。
ＭＶＤＮＫＦＮＫＥＲＲＲＡＲＲＥＩＲＨＬＰＮＬＮＲＥＱＲＲＡＰＩＲＳＬＲＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＲＡＱＡＰＫＹＲＧＧＳＤＤＤＤＫＳＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ。
更なるＳｅｒを、次の一対のプライマーを用いたＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)ＸＬ部位特異的突然変異誘発キットによって、成熟ｈＧＨの第一アミノ酸であるＰｈｅの前に挿入した：
５’末端： ｐＮＮＣ１３ Ｓｅｒ-Ｆ
５’-ＧＧＡＴＣＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＡａｇｃＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣ-３’
及び
３’末端： ｐＮＮＣ１３ Ｓｅｒ-Ｒ
５’-ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡｇｃｔＴＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＣ-３’。
【０１２３】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をｐＥＴ１１ａ-Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-Ｓｅｒ-ｈＧＨによって形質転換させた。単一のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを有する１００ｍｌのＬＢ培地中に播種し、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が０．６に達したとき、細胞培養温度を３０℃まで低下させ、細胞を３０℃で４時間、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細菌細胞を３０００ｇで１５分の遠心分離によって収集した(Eppendorf centrifuge 5810R)。細胞ペレットを細胞溶解バッファー(２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００)に再懸濁させ、細胞を３０ｋｐｓｉでの細胞破壊によって破壊した(Constant Cell Disruption Systems)。可溶化液を１００００ｇで３０分の遠心分離によって清澄にした。上清を保存し、精製に使用し、ペレットを捨てた。
【０１２４】
Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-Ｓｅｒ-ｈＧＨを、段階勾配溶出(バッファーＡ：２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７；バッファーＢ：２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７、１ＭのＮａＣｌ)を使用してＳＰ-セファロースで精製した。タンパク質をついでＳｅｒ-ｈＧＨの放出のためにエンテロペプチダーゼを使用して切断した。Ｓｅｒ-ｈＧＨをブチルセファロース４ＦＦカラムで更に精製して、Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋドメイン及びエンテロペプチダーゼ(バッファーＡ：１００ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５；バッファーＢ：１００ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、２ＭのＮａＣｌ、線形勾配を使用した)から生成物を分離した。Ｓｅｒ-ｈＧＨの最終生成物をバッファー交換し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３，ｐＨ７．８から凍結乾燥させた。
【０１２５】
(Ｂ)４-(Ｂｏｃ-Ａｍｉｎｏ)ベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)
2009542769.tif 000040
ＤＣＭ(４０ｍｌ)中のｍＰｅｇ(４０ｋ)-アミン(ＮＯＦ社製のＧＬ２-４００ＰＡ；５．０ｇ、０．１２５ｍｍｏｌ)溶液に、４-Ｂｏｃ-アミノ安息香酸(０．３１ｇ、１．３１ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ水和物(０．２５ｇ、１．６３ｍｍｏｌ)、ＥＤＡＣ(０．４４ｇ、２．３０ｍｍｏｌ)、及び最後にＤＩＰＥＡ(２．０ｍｌ)を加えた。室温で７０時間撹拌した後、アミノメチルポリスチレン(５ｇ；およそ１ｍｍｏｌ／ｇ)を加えた。３時間の撹拌後に、混合物を濾過し、ポリスチレンをＤＣＭで洗浄し、組み合わせた濾液を濃縮し、Ｅｔ２Ｏを加えて生成物を沈殿させた。ＤＣＭに溶解させ、Ｅｔ２Ｏで沈殿させ、濾過を二回繰り返した。固形物をＤＣＭに溶解させ、酸性イオン交換樹脂(Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ １５；１０ｇ、ＤＣＭ＋ＭｅＯＨで洗浄)を加えた。混合物を０．５時間撹拌し、濾過し、生成物を、Ｅｔ２Ｏでの沈殿によって濾液から単離した。減圧下で乾燥させて５ｇの表題化合物を得た。
【０１２６】
(Ｃ)４-アミノベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)
2009542769.tif 000041
４-(Ｂｏｃ-アミノ)ベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)(１００ｍｇ、２．５μｍｏｌ)にＤＣＭ(１０ｍｌ)及びＴＦＡ(１０ｍｌ)を加えた。０．５時間後に混合物を濃縮し、残留物をＥｔＯＨで２回共蒸発させた。一晩真空で乾燥させた後、残留物をＤＣＭと共に小さいバイアルに移し、濃縮し、水(０．６６ｍｌ)＋ＡｃＯＨ(０．６６ｍｌ)に溶解させた。この溶液を、酸化されたＳｅｒ-ｈＧＨのペグ化に使用した。
【０１２７】
(Ｄ)Ｓｅｒ-ｈＧＨのグリオキサリル-ｈＧＨへの酸化
2009542769.tif 000042
次の溶液を調製した：
バッファーＡ： トリエタノールアミン(２７０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ)、３-メチル  チオプロパノール(５８０ｍｇ、５．４６ｍｍｏｌ)、水(４０ｍｌ)。
バッファーＢ： ３-メチルチオプロパノール(１．２ｇ)＋水(８０ｍｌ)。
過ヨード酸塩： ＮａＩＯ４(４８．１ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ)＋水(１．０ｍｌ)。
ＳｅｒｈＧＨ(５０ｍｇ、２．３μｍｏｌ)をバッファーＡ(５．０ｍｌ)に溶解させ、過ヨード酸塩溶液(０．５ｍｌ)を加えた。室温で２０分間静置した後、混合物を透析管(Ａｍｉｃｏｎ；カットフォフ５０００)に移し、バッファーＢで４回透析した。残留物をバッファーＢで希釈して０．６ｍｌにし、ＮＭＰ(０．６ｍｌ)を加えた。
【０１２８】
(Ｅ)酸化Ｓｅｒ-ｈＧＨの４-アミノベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)での還元的アミノ化
2009542769.tif 000043
酸化されたＳｅｒ-ｈＧＨの水溶液を、その調製の直後に、４-アミノベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)の溶液に加え、得られた混合物を室温でゆっくりと回転させた。１時間後、ＮａＣＮＢＨ３(２０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３と１５μｌのＡｃＯＨの０．５ｍｌの水中への１００μｌ溶液)を加えた。混合物を暗室で室温に維持した。４２時間後、混合物を、トリエタノールアミン(２ｇ)と水(４ｍｌ)の混合物に少しずつ加えた。クロマトグラフィーによる精製によって表題化合物を得た。
【０１２９】
実施例２
ｍＰｅｇ(４０ｋ)で１４１位がペグ化されたヒト成長ホルモン
(Ａ)１，３-ジアミノ-２-プロパノールでのｈＧＨのアミノ基転移
2009542769.tif 000044
ｈＧＨ(２００ｍｇ、９μｍｏｌ)をリン酸バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１４ｍｌ)に溶解させた。得られた溶液を、リン酸バッファー(５０ｍＭ、１ｍｌ、ｐＨ８．０)中の１，３-ジアミノプロパン-２-オール(３７８ｍｇ、４ｍｍｏｌ)の溶液と混合し、希塩酸を用いてｐＨを８．０に調整した。リン酸バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍｌ)に溶解させたトランスグルタミナーゼ(ＴＧａｓｅ、１８ｍｇ、〜４０Ｕ)の溶液を加え、容量をリン酸バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．０)の添加によって２０ｍｌに調節し、０．２Ｍの１，３-ジアミノプロパン-２-オールの濃度にした。得られた溶液を３７℃で４時間インキュベートした。
【０１３０】
温度をついで室温まで低下させ、Ｎ-エチルマレイミドを１ｍＭの最終濃度まで加えた。１時間後、混合物を１０容量のトリスバッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．５)で希釈した。
溶液を、溶出剤Ａ(５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５)で前もって平衡にしたＭｏｎｏＱ  １０／１００ＧＬカラム(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号１７-  ５１６７-０１)に充填した。溶出を６３分かけて、溶出剤Ａ中、０％から１００％の溶出剤Ｂ(５０ｍＭのトリス、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５)の勾配で２．５ｍｌ／分の流量で実施した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて画分を集め、Ｍａｌｄｉ-Ｔｏｆ分析を、選択した画分について実施した。Ｍａｌｄｉ-Ｔｏｆ質量分析に従って予想された分子量を与える最大のピークに対応する画分をプールした。このプールは、ＣＥ；方法Ａ及びにＷＯ２００５０７０４６８に記載されたペプチドマッピング実験によって定量して、６０：４０の比で、ｈＧＨ及びＮε１４１-(２-ヒドロキシ-３-アミノプロピル)ｈＧＨの混合物を含んでいた。
【０１３１】
(Ｂ)１，３-ジアミノ-２-プロパノールでアミノ基転移したｈＧＨの酸化
2009542769.tif 000045
次の溶液を調製した：
バッファーＢ：３-メチルチオプロパノール(１．２ｇ＋水(８０ｍｌ)。
過ヨード酸塩：ＮａＩＯ４(４８．１ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ)＋水(１．０ｍｌ)
トリエタノールアミンバッファー(４．７ｍｌ)中の１，３-ジアミノ-２-プロパノール(５５ｍｇ(２．５μｍｏｌ)アミノ基転移＋４５ｍｇの未修飾ｈＧＨ)でアミノ基転移させたｈＧＨの溶液に、３-メチルチオプロパノール(７０μｌ)とついで過ヨード酸塩溶液(０．５５ｍｌ)を加えた。２０分後、混合物をバッファーＢで希釈し、バッファーＢで４回透析した。残留物をバッファーＢで０．６ｍｌまで希釈し、２つのバイアルに均等に分配した。
【０１３２】
(Ｃ)酸化されアミノ基転移されたｈＧＨの４-アミノベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)での還元性アミノ化
2009542769.tif 000046
４-(Ｂｏｃ-アミノ)ベンゾイルｍＰｅｇ(４０ｋ)(７５ｍｇ、１．８８μｍｏｌ)にＤＣＭ(１０ｍｌ)及びＴＦＡ(１０ｍｌ)を加えた。３０分後、混合物を濃縮し、残留物をＥｔＯＨで２回共蒸発させた。真空で一晩乾燥させた後、残留物を、水(０．５ｍｌ)とＡｃＯＨ(０．５ｍｌ、８．３ｍｍｏｌ)の混合物に再溶解させた。
酸化されアミノ基転移されたｈＧＨＴ((Ｂ)を参照)の一バイアルの内容物をＮＭＰ(０．３ｍｌ)で希釈しＰＥＧ溶液に加えた。１時間後、水(０．５ｍｌ；ｃ＝７００ｍＭ)及びＡｃＯＨ(０．０１５ｍｌ)に溶解させたＮａＣＮＢＨ３溶液(０．０５ｍｌのＮａＣＮＢＨ３溶液(２２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ；Ｍｗｔ：６２．８ｇ／ｍｏｌ)；この溶液は使用前に調製した)を加えた。６６時間後、トリエタノールアミン(１．７ｇ、１１．４ｍｍｏｌ)と水(２ｍｌ)の混合物に添加して中和し、生成物をクロマトグラフィーにより精製した；９ｍｇの表題化合物が得られた。
【０１３３】
薬理学的方法
アッセイ(Ｉ) 成長ホルモン活性を測定するＢＡＦ-３ＧＨＲアッセイ
ＢＡＦ-３細胞(骨髄由来のマウスプロ-Ｂリンパ球系細胞)は、元々は成長及び生存に対してＩＬ-３依存性であった。ＩＬ-３は、ＧＨが刺激時に活性化する同じ媒介物質であるＪＡＫ-２及びＳＴＡＴを活性化する。ヒト成長ホルモンレセプターの形質移入後、細胞株を、成長ホルモン依存性細胞株中に形質転換した。このクローンを使用し、ＢＡＦ-３ＧＨＲの生存に対する様々な成長ホルモン試料の効果を評価することができる。
ＢＡＦ-３ＧＨＲ細胞を、５％のＣＯ２、３７℃で２４時間、飢餓培地(成長ホルモンを含まない培養培地)中で増殖させた。
細胞を洗浄し、飢餓培地に再懸濁させ、プレートに播種した。その細胞に異なる濃度の１０μｌの成長ホルモン化合物又はヒト成長ホルモン又はコントロールを添加し、プレートを５％のＣＯ２、３７℃で６８時間インキュベートした。
【０１３４】
アラマーブルー(登録商標)を各ウェルに添加し、細胞を更に４時間インキュベートした。アラマーブルー(登録商標)はレドックス指示剤であり、これは細胞代謝に固有の反応により還元され、よって生存細胞数の間接的な測定値を与える。
最後に、細胞の代謝活性を、蛍光プレートリーダーで測定した。サンプルの吸光度は、成長ホルモン化合物又はコントロールで刺激されない細胞のパーセントで表し、濃度-反応曲線から活性(５０％で細胞を刺激する化合物の量)を算出することができた。
2009542769.tif 000047
【０１３５】
インビトロ安定性の決定のためのアッセイ
様々なバッファー中の本発明の化合物の溶液を１日から３０日の間、２０-４０℃でインキュベートする。試料をＨＰＬＣ及び質量分析によって分析して、バッファー、温度及び時間の関数として分解の度合いとタイプを決定する。
【０１３６】
脳下垂体摘出スプラーグドーリーラットにおけるインビボ用量応答研究
実施例２の化合物のインビボ用量応答環系を、脳下垂体摘出スプラーグドーリーラットにおいて研究した。脳下垂体摘出ラットは、成長ホルモン欠乏のよく知られ認められた動物モデルであり、脳下垂体の外科的除去後には成長ホルモンの生産は生じない。これはまたヒトにおける成長ホルモン欠乏の他の重要な臨床的特徴であるインスリン様増殖因子-１(ＩＧＦ-１)の循環量低下を生じる。
脳下垂体摘出は９０-１００ｇの重さの４週齢の雄ラットについて実施した。外科後３-４週で００-１１０ｇの重さになった動物を実験に入れた。外科後３-４週間の間１０％を越える体重増加があった動物は研究には入れなかった。
６０匹の脳下垂体摘出スプラーグドーリーラットを、各グループ１０匹で６の投薬グループに無作為に割り当てた。一つのグループはビヒクルだけを受け、未処理コントロールグループとした。残りの５つのグループは、首に単一の皮下投与でそれぞれ実施例２の化合物を１、５、１５、５０及び１５０ｎｍｏｌ受けた。体重を１週間、午前８-１０時の間に毎日測定した。データは７日の間、投薬の日(０日目)と比較した体重増加として提供され、図１に提供する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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