(57)【要約】  ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）の活性を長期間維持する安定化されたｈＦＳＨの水性製剤が提供される。本発明の製剤は、グリシン、メチオニン、及び好ましくはポリソルベート２０である非イオン界面活性剤を含有するリン酸緩衝液中に安定化された、治療上有効量のｈＦＳＨを含む水性製剤からなり、ｈＦＳＨの活性を長期間にわたって維持することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）；および
安定剤としての、グリシン、メチオニン、非イオン界面活性剤およびリン酸緩衝液
を含むヒト卵胞刺激ホルモンの水性製剤。
【請求項２】
前記ｈＦＳＨが、天然のｈＦＳＨ又は組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）であることを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記非イオン界面活性剤が、ポリソルベートをベースとする非イオン界面活性剤、ポロキサマーをベースとする非イオン界面活性剤およびこれらの組み合わせより構成される群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項４】
前記非イオン界面活性剤がポリソルベート２０であることを特徴とする請求項３記載の製剤。
【請求項５】
前記グリシンを０．１〜１０％（ｗ／ｖ）含有することを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項６】
前記メチオニンを０．０１〜２．０％（ｗ／ｖ）含有することを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項７】
前記非イオン界面活性剤を０．００１〜０．０２％（ｗ／ｖ）含有することを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項８】
前記リン酸緩衝液の塩濃度が１ｍＭ〜５０ｍＭであり、ｐＨが６．５〜７．５であることを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項９】
保存剤及び／又は等張剤を更に含むことを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
前記保存剤が、ベンジルアルコール、クレゾール、アルキルパラベン又はこれらの混合物であり、前記等張剤が水溶性の無機塩及び／又は糖アルコールであることを特徴とする請求項９記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定化されて、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）の活性を長期間にわって維持するｈＦＳＨの水性製剤に関する。より詳細には、本発明は、グリシン、非イオン界面活性剤及びメチオニンを含有するリン酸緩衝液で安定化された、治療上有効量のｈＦＳＨを含むｈＦＳＨの水性製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）は、黄体生成ホルモン（ＬＨ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）と共同して、生殖機能に欠くことのできない役割を果たす生殖関連ホルモンである。構造的には、ｈＦＳＨは、α−サブユニットとβ−サブユニットの非共有結合性会合によって生成する異質二量体の糖タンパクである。α−サブユニットは９２個のアミノ酸残基から構成され、一方、β−サブユニットは１１１個のアミノ酸残基から構成され、各々は２つのＡｓｎ（アスパラギン）結合の糖鎖付加部位を保有する（非特許文献１）。
【０００３】
１９８０年代までは、ｈＦＳＨの主要な供給源は、出産適齢期の女性の尿から単離された尿由来のＦＳＨであった。更に精製されたタイプの尿由来の高純度ＦＳＨが１９９０年代に導入され、最終的に、組換えＦＳＨが開発されて１９９８年から広く使用されている。ＦＳＨは下垂体から分泌される。ＦＳＨは雌の卵胞の成長及び成熟を刺激する。それ故に、ＦＳＨは、雌の排卵に関与する重要なホルモンであり、無排卵の不妊症女性の不妊治療や人工授精における卵子の吸引／卵子の採取（ＯＰＵ：Ｏｖｕｍ  Ｐｉｃｋｕｐ）に用いられている。
【０００４】
一般に、タンパク質は、半減期が非常に短く、タンパク質の活性の発現に好ましくない温度、水−空気界面、高圧、物理的／機械的応力、有機溶剤、微生物汚染等の種々の因子に曝されると、単量体の凝集、二量体の解離、血管表面への吸着等の変性を受ける。そのため、変性したタンパク質は固有の物理化学的特性及び生理学的活性作用を喪失する。タンパク質の変性は不可逆的であり、従って、一旦変性すると、タンパク質は殆どその本来の特性を元の状態に取り戻すことができない。
【０００５】
特に、ｈＦＳＨのように、２つの異なったサブユニットから構成される異質二量体構造からなり、かつ、毎回数百マイクログラム（μｇ）未満の微量で投与されるタンパク質は、水溶液中での二量体の解離によるタンパク質の喪失や血管内面へのタンパク質の吸着など、タンパク質の比較的高い喪失に関連した問題を抱えている。解離したタンパク質は自身の生理学的活性を喪失し、解離した単量体は急速に凝集しやすくなる。更に、血管の内面に吸着したタンパク質も、変性の過程を経ることにより急速に凝集しやすくなる。タンパク質が人体に投与されると、このように変性したタンパク質は、体の中で天然のタンパク質に対する抗体生成の原因となるかも知れない。従って、興味のあるタンパク質を十分に安定した状態で投与すべきである。この目的を達成するために、溶液中でのタンパク質の変性を防止する方法の開発に多くの研究がなされてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
幾つかのタンパク質調合薬は、凍結乾燥（凍結乾燥法）により安定性の問題を克服してきた。一例として、特許文献１には、ポリカルボン酸又はその塩、好ましくはクエン酸と、スクロース等の非還元性の二糖類とで安定化されたゴナドトロピン（例えば、ＬＨ，ＴＳＨ，ＦＳＨ，ｈＣＧ等）を含む、凍結乾燥した製剤が開示されている。特許文献２には、スクロースとグリシンの組み合わせにより安定化されたＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧを含む、凍結乾燥した製剤が開示されている。しかし、凍結乾燥した製品は、その使用に先だって、再構成するために注射用の水（ＷＦＩ）に溶解しなければならないという不便さがある。更に、凍結乾燥した製品の製造法は、凍結乾燥工程を必要とし、それ故に、例えば大規模の凍結乾燥機を使用するといった多額の投資の必要性に迫られる。
【０００７】
かかる制約に対処する代替の手段として、溶液状態のタンパク質に安定剤を添加することによって、タンパク質の安定性を改善することができる。有用なタンパク質の安定剤の例として、界面活性剤、血清アルブミン、多糖類、アミノ酸、ポリマー、塩等が知られている（非特許文献２〜４）。しかし、個々のタンパク質の独特の物理化学的特性を考慮に入れて、最も好適な安定剤を選択し使用すべきであり、異なったタンパク質安定剤の併用は、個々の安定剤間の競合作用及び有害反応に起因して、期待される効果とは対照的に副作用をもたらすことがある。更に、個々のタンパク質安定剤は、対応するタンパク質の安定化に好ましい特定の濃度範囲にある（非特許文献４）ので、溶液中に存在するタンパク質に好結果をもたらす安定化には、細心の注意と多くの努力を要する。
【０００８】
その一方で、特許文献３には、安定化させる量のポリカルボン酸又はその塩、安定化させる量のチオエーテル化合物、非還元性の糖類及び非イオン界面活性剤から構成される溶液にゴナドトロピン（例えば、ＬＨ，ＴＳＨ，ＦＳＨ，ｈＣＧ等）を溶解させて調製される、ゴナドトロピンの安定した液状製剤が開示されている。この技術によれば、ポリカルボン酸又はその塩の最も好ましい形態としてクエン酸ナトリウムが記載されており、製剤は１．４７％のクエン酸ナトリウムを含有する。クエン酸ナトリウムの１％水溶液はｐＨ２．２の強酸性を示す（非特許文献５）。クエン酸又はその塩がその注射の際投与部位に激しい痛みを誘発する賦形剤であることは、当該技術分野において広く知られている。患者の都合上、当業者はクエン酸又はその塩の使用を差し控えている。特許文献３に記載された技術は、医薬製剤に１．４７％のクエン酸ナトリウムを含有することによって引き起こされる薬剤投与部位の痛みに起因して、患者に迷惑をかけるという問題を抱えている。
【０００９】
特許文献４には、安定剤として、ポリアルコール又は非還元性の糖類、好ましくはマンニトールを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で安定化されたｈＣＧを含む、液状医薬組成物が開示されている。この技術の適用可能性は、毎回１０，０００ＩＵを超える高用量で用いられるｈＣＧ液状製剤に限定され、一日の用量として７５〜２５０ＩＵという微量で用いられるＦＳＨ液状製剤については試験が行われていない。
【００１０】
以上の先行技術をみても分かるように、ｈＦＳＨの活性を長期間安定に維持できる新規な液状製剤の開発には緊急の必要性がある。
【特許文献１】米国特許第５，２７０，０５７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５０，３９０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９２９，０２８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，７０６，６８１号明細書
【非特許文献１】Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ，１９９８，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．６，ｐｐ８６２−８８１
【非特許文献２】Ｊｏｈｎ  Ｇｅｉｇｅｒｔ，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，４３，Ｎｏ．５，２２０−２２４，１９８９
【非特許文献３】Ｄａｖｉｄ  Ｗｏｎｇ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．，Ｏｃｔｏｂｅｒ，３４−４８，１９９７
【非特許文献４】Ｗｅｉ  Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１８５，１２９−１８８，１９９９
【非特許文献５】Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ、第２版  第１２４頁
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は以上の問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）の活性を長期間にわって維持する安定化したｈＦＳＨの水性製剤を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
本発明の態様によれば、治療上有効量のヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）と、安定剤として、グリシン、メチオニン、非イオン界面活性剤及びリン酸緩衝液とを含む、ｈＦＳＨの水性製剤を提供することによって、上記及び他の目的を達成することができる。
即ち、本発明の製剤によれば、ｈＦＳＨは、グリシン、メチオニン及び非イオン界面活性剤を含有するリン酸緩衝液で安定化され、ｈＦＳＨの活性を長期間にわたって維持することができる。
【００１３】
ｈＦＳＨの供給源として、本発明の水性製剤は、体内に存在する天然のｈＦＳＨ、又は、組換え技術を用いて、動物細胞から生じ、単離され、精製される組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）を使用することができる。従って、本発明において使用できるｈＦＳＨは、天然及び合成タイプを含むあらゆる種類のｈＦＳＨを包含する。
【００１４】
本発明の水性製剤は安定剤の成分としてグリシンを含む。溶液状態のグリシンは、ｈＦＳＨ周囲の多数の水分子を集めることが可能であり、これにより、ｈＦＳＨを構成する数多くのアミノ酸の中でも最外部の親水性アミノ酸を更に安定化させ、その結果ｈＦＳＨを安定化させることができる（前出の非特許文献４）。グリシンの含有量は、０．０１〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲にあり、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜５％（ｗ／ｖ）である。
【００１５】
本発明の製剤は安定剤の別の成分としてメチオニンを含む。メチオニンは、水溶液中のｈＦＳＨの酸化を防止することによりｈＦＳＨの安定化に役立つ（前出の非特許文献４）。メチオニンの含有量は、０．００１〜２％（ｗ／ｖ）の範囲にあり、好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００１６】
本発明の製剤は、また、安定化による血管表面へのｈＦＳＨの吸着を防止するために、非イオン界面活性剤を含む。ここで、非イオン界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低下させ、これにより、疎水性表面へのタンパク質の吸着又は凝集を防止する。本発明で使用され得る非イオン界面活性剤の好ましい例としては、ポリソルベートをベースとする非イオン界面活性剤、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）をベースとする非イオン界面活性剤を挙げることができる。これらの非イオン界面活性剤は、単独で又はこれらを組み合わせて使用することができる。ポリソルベートをベースとする非イオン界面活性剤が特により好ましい。特定のポリソルベートをベースとする非イオン界面活性剤の例としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０を挙げることができる。ポリソルベート２０が特により好ましい。ポリソルベート２０は臨界ミセル濃度が比較的低い。従って、ポリソルベート２０は、低濃度でもタンパク質の表面吸着を低下させる又は防止するだけでなく、タンパク質の化学分解を阻止する。水性製剤における高濃度非イオン界面活性剤の使用は適当でない。これは、高濃度での非イオン界面活性剤の使用は干渉効果をもたらし、そのため、ＵＶ分光法又は等電点電気泳動法（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）等の分析法を用いてタンパク質の濃度測定又は安定性評価を行うと、タンパク質の安定性を正確に評価することが困難になるからである。それ故に、本発明の水性製剤は、０．１％（ｗ／ｖ）未満の低濃度で、より好ましくは０．００１〜０．０２％（ｗ／ｖ）の範囲で非イオン界面活性剤を含有する。
【００１７】
本発明の水性製剤はリン酸緩衝液を含有する。緩衝溶液を構成するリン酸の濃度は、好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭの範囲にある。緩衝溶液のｐＨは、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲にある。
【００１８】
以上例示したグリシン、メチオニン、非イオン界面活性剤及びリン酸緩衝液以外にも、本発明の製剤は、本発明の所望の効果に悪影響を及ぼさない限り、当該技術分野において公知の他の成分又は物質を任意に含むことができる。例えば、製剤は、タンパク質の調合薬に保存剤として慣用のベンジルアルコール、クレゾール、アルキルパラベン等を任意に更に含むことができる。
必要に応じて、製剤は等張剤を更に含むことができる。特定の等張剤の例としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の水溶性無機塩や、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、マンノース、マルトース、トレハロース、グルコース、グリセロール、ラフィノース、スクロース等の糖アルコールなどを挙げることができる。以上の物質は単独で又はこれらを組み合わせて使用することができる。
【実施例】
【００１９】
以下に、次の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ提示されるもので、本発明の範囲及び精神を限定するものとして解釈してはならない。
【００２０】
実施例１〜３：ｈＦＳＨ水性製剤の調製
グリシン、メチオニン及びポリソルベート２０をリン酸溶液１０ｍＭに添加し、次いでｈＦＳＨを１５０ＩＵ／ｍＬの濃度となるように添加して、ｈＦＳＨの水性製剤を調製した。このようにして調製した溶液の１ｍＬ／バイアルを３ｍＬのガラス製バイアルにアリコートした後密封し、それぞれ４℃及び２５℃で保存した。各実施例で調製された水性製剤の組成表を下記の表１に示す。
【００２１】
比較例１：添加剤なしのｈＦＳＨ水性製剤の調製
ｈＦＳＨを１５０ＩＵ／ｍＬの濃度でリン酸溶液１０ｍＭに添加した。このようにして調製した１ｍＬ／バイアルの溶液を３ｍＬのガラス製バイアルにアリコートした後密封し、それぞれ４℃及び２５℃で保存した。
【００２２】
【表１】
2009509953.tif 000002
【００２３】
実験例１：ｈＦＳＨ水性製剤の安定性試験
実施例１〜３及び比較例１の水性製剤を４℃で０、３、６ヶ月及び２５℃で０、２、４、６ヶ月保存した後、それぞれの期間後に、ｈＦＳＨの回収率（％）、ｈＦＳＨの単量体への解離度（％）及びｈＦＳＨの純度（％）をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定し、ｈＦＳＨのα−サブユニットの酸化度（％）をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。このようにして得られた結果をそれぞれ下記の表２〜５に示す。  
【００２４】
【表２】
2009509953.tif 000003
【００２５】
【表３】
2009509953.tif 000004
【００２６】
【表４】
2009509953.tif 000005
【００２７】
表２から分かるように、実施例１〜３の製剤は、４℃及び２５℃で製剤を６ヶ月保存した時のｈＦＳＨの回収率が９５％を超えたが、比較例１の製剤については、同じ条件下でのｈＦＳＨの回収率は低かった（約６０％）。更に、表３から分かるように、実施例１〜３の製剤は、４℃及び２５℃で製剤を６ヶ月保存した時のｈＦＳＨの単量体への解離度が５％未満であったが、比較例１の製剤については、同じ条件下でのｈＦＳＨの単量体への解離度は著しく増大した（１０％超）。更に、表４から分かるように、実施例１〜３の製剤は、４℃及び２５℃で製剤を６ヶ月保存した時のｈＦＳＨの純度が９５％を超えたが、比較例１の製剤については、同じ条件下でのｈＦＳＨの純度は低かった（８０％台に低下）。これらの結果から、本発明に従ってグリシン、メチオニン及びポリソルベート２０を含むｈＦＳＨ水性製剤は、血管内面へのタンパク質の吸着によるタンパク質の喪失及び変性を防止すると共に、構成する単量体へのタンパク質の解離を防止し、ｈＦＳＨを長期間安定化させることが理解され得る。
【００２８】
【表５】
2009509953.tif 000006
【００２９】
表５から分かるように、実施例１〜３の製剤は、４℃及び２５℃での製剤の保存が６ヶ月まではほぼ８％台のα−サブユニットの酸化度を示したが、一方、比較例１即ち添加剤なしの製剤は、２５℃での製剤の６ヶ月の保存では高いα−サブユニットの酸化度を示した（約１５％）。これらの結果から、本発明に従ってグリシン、メチオニン及びポリソルベート２０を添加した水性製剤は、長期間の保存の際に生じることのあるｈＦＳＨの酸化を防止する安定した水性製剤であることが理解され得る。
【００３０】
実施例４，５：高濃度ｈＦＳＨ水性製剤の調製
グリシン、メチオニン、ポリソルベート２０、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及びラクトースをリン酸溶液（ｐＨ７．０）１０ｍＭに添加し、次いでｈＦＳＨを濃度が８３３ＩＵ／ｍＬとなるように添加して、ｈＦＳＨの水性製剤を調製した。このようにして調製した溶液を１ｍＬのガラス製プレフィルドシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に０．５ｍＬ／シリンジで注入し、その後２５℃で保存した。このようにして調製された水性製剤の組成表を下記の表６に示す。
【００３１】
比較例２〜４：高濃度ｈＦＳＨ水性製剤の調製
グリシン、ポリソルベート２０及びベンジルアルコールをリン酸溶液（ｐＨ７．０）１０ｍＭに添加し、次いで、メチオニンを添加することなく塩化ナトリウム及びラクトースを任意に添加し、ｈＦＳＨの水性製剤を調製した。このようにして調製した溶液を１ｍＬのガラス製プレフィルドシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に０．５ｍＬ／シリンジで注入し、その後２５℃で保存した。このようにして調製された水性製剤の組成表を下記の表６に示す。
【００３２】
【表６】
2009509953.tif 000007
【００３３】
実験例２：高濃度ｈＦＳＨ水性製剤の安定性試験
実施例４，５及び比較例２〜４の水性製剤を２５℃で０、２、４、６ヶ月保存した後、それぞれの期間後に、ｈＦＳＨの純度（％）をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定し、ｈＦＳＨのα−サブユニットの酸化度（％）をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。このようにして得られた結果を下記の表７に示す。
【００３４】
【表７】
2009509953.tif 000008
【００３５】
表７から分かるように、安定剤成分として、グリシン、メチオニン及びポリソルベート２０を含む実施例４，５の製剤については、ｈＦＳＨの純度が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定したように、室温（２５℃）での６ヶ月の保存までは９０％超を示し、α−サブユニットの酸化度が、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定したように１０％未満を示し、従って、これらの製剤が安定化されたｈＦＳＨ製剤であること示している。更に、保存剤としてのベンジルアルコールの添加は、ｈＦＳＨの安定性にさほどの影響を及ぼさなかった。一方、比較例２〜４の製剤は、９０％超の優れた純度を示すが、α−サブユニットの酸化度が１０％を大幅に超えて高く、従って、これらの製剤が安定でないこと示している。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上の説明から明らかなように、本発明の水性製剤は、ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）の活性を長期間にわたって安定に維持することができる。
本発明の好ましい実施の形態を説明のために開示したが、当業者ならば、添付の特許請求の範囲に開示した通りの発明の範囲及び精神から逸脱することなく、各種の変形や、追加及び置換が可能であることを認識するであろう。
【国際調査報告】
2009509953.tif 000009
2009509953.tif 000010