(57)【要約】本発明は、変性性障害を処置するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明はRac1b阻害薬を用いてアミロイドβペプチド関連障害、特にアルツハイマー病を処置する方法に関する。本発明は、発病期を含めて多様な病期にある哺乳動物対象、特にヒト対象に使用できる。本発明は、被験化合物がRac1bを阻害する能力の測定に基づいて、アミロイドβペプチド関連障害の処置に使用するための化合物を製造、同定、選択または最適化する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象において変性性障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物対象においてアミロイドβペプチドの生成を阻害する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法。
【請求項３】
阻害薬化合物がNotch開裂またはBACE活性を実質的に変化させない、請求項１または２の方法。
【請求項４】
アルツハイマー病を処置するための、請求項１または２の方法。
【請求項５】
変性性障害の処置に使用するための候補化合物を製造、同定、選択または最適化する方法であって、被験化合物がRac1bを阻害するかを判定することを含み、Rac1b阻害は被験化合物が変性性障害の処置に使用するための候補化合物であることの指標である方法。
【請求項６】
被験化合物とRac1bを接触させて、該化合物がRac1bを結合するか、またはRac1b依存性の細胞骨格再配列を阻害するかを判定することを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
酸化ストレスの存在または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を検出することを含み、Rac1bの存在はAβ関連-酸化ストレスの存在または素因の指標である方法。
【請求項８】
対象において変性性障害の存在、病期または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を検出することを含み、Rac1bの存在は該障害の存在、病期または素因の指標である方法。
【請求項９】
Rac1aイソ型とRac1bイソ型の比率を測定し、その比率における変動は疾患の素因、存在または病期に関する指標である、請求項８の方法。
【請求項１０】
Rac1aとRac1bを特異的に識別するオリゴヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
Rac1エキソン3bを、または該エキソン3bの保持もしくはスプライシングにより形成されたジャンクション領域を特異的に結合する、5〜60塩基を含む一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
VGETYGKDITSRGKDKPIA（SEQ ID NO:13）内に含まれるエピトープを結合する抗体。
【請求項１３】
SEQ ID NO:13またはその少なくとも5個の連続アミノ酸のエピトープ含有フラグメントを含む、アミノ酸50個未満の長さのポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Rac1b阻害薬を用いて変性性障害を処置するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明はアミロイドβペプチド関連障害、特にアルツハイマー病の処置方法に関する。本発明は、発病期を含めて多様な病期にある哺乳動物対象、特にヒト対象に使用できる。本発明は、被験化合物がRac1bを阻害する能力の測定に基づいて、変性性障害の処置に使用するための化合物を製造、同定、選択または最適化する方法をも提供する。本発明には、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を評価することを含む、対象において変性性障害の存在、病期または性質を検出する方法も含まれる。
【０００２】
アルツハイマー病（AD）は、主に行動および認知の欠損を特徴とする進行性の神経変性性疾患である。AD患者の脳は、細胞外斑であるβアミロイド（Aβ）ペプチドの蓄積、および過剰リン酸化形のタウを含む細胞内神経原線維変化の蓄積を特徴とする。
【０００３】
発病の初期には、Aβ沈着およびタウの過剰リン酸化が、神経細胞の生存を確保するために酸化ストレスに対する代償応答および下流適応として機能する可能性があると提唱されている。しかし、疾患の進行中に両物質の抗酸化活性は酸化促進活性（pro-oxidant activity）へと発展する；これは典型的な機能獲得転換であり、コンホメーション変化およびクリアランス機序の低下を伴う可能性がある。本発明は、酸化ストレスを抑制し、したがって神経細胞の生存率を改善し、かつAβの産生およびタウの過剰リン酸化を抑制する療法介入のための、新たな標的を定める新規な知見を記載する。
【０００４】
本発明者らは、アルツハイマー病を伴う患者と対照の脳生検にDATASを適用した。DATASは特許権を有する遺伝子プロファイリング技術であり(U.S.P. No. 6,251,590)、2つの生理病理学的状況間で異なってスプライシングされた転写体を分析することができる。この分析により、罹患した脳においてRac1遺伝子のエキソン3bのスプライシングが調節異常になり（実施例１）、このため特定のスプライシングイソ型であるRac1bが過剰発現することが明らかになった。Rac1遺伝子は、2種類のタンパク質Rac1aとRac1bをコードする2つのオルタナティブスプライシングされたmRNAを生成する可能性がある（図１）。Rac1bはRac1aの構成性活性化形であり、主に酸化ストレスカスケードの活性化に関与する。したがって、構成性活性化されたRac1bが罹患組織において過剰発現するというこの予想外の所見は、AD患者の脳では健康な個体と比較して酸化ストレスが増大することと一致する。
【０００５】
これは、変性性疾患を伴う患者の脳におけるRac1bの調節異常および発現増大に関する最初の証拠である。
【０００６】
この調節異常の存在および関係を確認するために、本発明者らは種々の濃度のAβ25-35をラット皮質細胞に用いて、Aβ誘導によるRac1遺伝子のオルタナティブスプライシングの変化を調べた。βアミロイドペプチドAβ42は、ADの脳にみられる老人斑の主成分である。Aβペプチドは神経細胞に作用して酸化ストレスおよび細胞内遊離カルシウム含量の増加を誘導する；これらはAβ毒性および二次的な刺激毒性を仲介するのに必要な事象である。他の機序は、タウのリン酸化増大および遺伝子転写の誘導である。Aβ25-35はAβ42のフラグメントであり、Aβ42の毒性機序を再現するアミノ酸25〜35を含む。ラット皮質初代培養物はAβ中毒に対して感受性であり、その結果、用量依存性で細胞生存率が低下する。図２に示す本発明者らが得た結果は、予想外に、Aβ処理が用量依存性でRac1b mRNAの発現を誘導することを示す。
【０００７】
Rac1bイソ型に対するAβ処理、酸化ストレス、およびRac1遺伝子のオルタナティブスプライシングの調節の間の関連をさらに確認するために、本発明者らはまた、SH-SY5Y神経芽細胞腫細胞にt-ブチルヒドロペルオキシド(TBH)または6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)により酸化ストレスを与えた（実施例３）。本発明者らが得た結果は、酸化ストレスがこの神経細胞系においても用量依存性でRac1b mRNAの発現を誘導することを示す。
【０００８】
Rac1b自体が酸化ストレス経路を誘導するので、βアミロイドペプチド処理後またはTBHもしくは6-OHDA処理後のRac1b発現の誘導は、細胞に対するストレスを増幅すると思われる。これは、神経細胞においてβアミロイドペプチドが酸化ストレスによるものと同様にRac1b発現を誘導する可能性があるという最初の証拠である。
【０００９】
したがって本発明は、Rac1bを神経変性性疾患の療法および診断の標的として考慮できるという最初の証拠を提示する。特に、本発明はRac1b阻害薬が変性性障害の処置に使用するための新規クラスの分子であることを示す。本発明はさらに、Rac1bが変性性障害を処置するための（新規）クラスの化学物質をスクリーニングまたは最適化するのに有用な標的であることを示す。
【００１０】
したがって本発明の１観点は、哺乳動物対象において変性性障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、変性性疾患を処置する医薬組成物を製造するための、Rac1b阻害薬の使用に関する。
【００１２】
本発明の他の観点は、哺乳動物対象においてアミロイドβペプチドの生成を阻害する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法である。
【００１３】
本発明の他の観点は、哺乳動物対象においてNotch開裂またはBACE活性を実質的に変化させずにアミロイドβペプチドの生成を阻害する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法である。
【００１４】
本発明の他の目的は、哺乳動物対象において変性性障害を処置する方法であって、その必要がある対象にその対象におけるRac1b発現（たとえば転写、スプライシングおよび／または翻訳）を低下させるのに有効な量の阻害核酸化合物を投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の他の目的は、哺乳動物対象において変性性障害を処置する方法であって、その必要がある対象にその対象におけるRac1b活性を低下させるのに有効な量の抗体を投与することを含む方法に関する。
【００１６】
本発明の他の目的は、哺乳動物対象において変性性障害を処置する方法であって、その必要がある対象にその対象におけるRac1b活性を低下させるのに有効な量の低分子薬物を投与することを含む方法に関する。
【００１７】
本発明に使用するために、Rac1b阻害薬は、医薬的に許容できるいずれかの担体または賦形剤の存在下で配合することができ、それらを単独で、または組み合わせて（１種類以上）、場合により他のいずれかの有効薬剤（１種類以上）もしくは処置（１種類以上）と共に使用できる。
【００１８】
本発明は、いずれかの哺乳動物対象、好ましくはヒト対象において、多様な変性性障害、特にアミロイドβペプチド関連障害（アルツハイマー病を含む）を処置するために、その障害の種々の病期に使用できる。
【００１９】
本発明はさらに、酸化ストレスの存在または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を検出することを含み、Rac1bの存在はAβ関連-酸化ストレスの存在または素因の指標である方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、対象において変性性障害の存在、病期または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を検出することを含み、Rac1bの存在はその障害の存在、病期または素因の指標である方法に関する。
【００２１】
本発明の他の目的は、候補化合物を製造、同定、選択または最適化する方法であって、候補化合物がRac1bを阻害しうるかを判定する段階を含む方法である。
【００２２】
本発明はまた、変性性障害の処置に使用するための候補化合物を製造、同定、選択または最適化する方法であって、被験化合物がRac1bを阻害するかを判定することを含み、Rac1b阻害は被験化合物が変性性障害の処置に使用するための候補化合物であることの指標である方法に関する。Rac1b阻害は、インビボ、エクスビボまたはインビボで、それ自体は当技術分野で既知の生物学的方法／免疫法を用いて評価することができる。好ましくは化合物をNotch開裂に対するそれらの活性についてさらに評価し、Notch開裂を実質的に変化させない化合物が好ましい。
【００２３】
本発明はまた、Rac1bポリペプチドを特異的に結合する抗体、およびRac1bの遺伝子またはRNAを特異的に結合する核酸分子に関する。
【００２４】
発明の詳細な記述
本発明は特に、変性性障害を伴う対象からの脳組織においてrac1/rac1b比が高度に活性化されたRac1バリアントであるRac1bの出現の方へ偏るという予想外の所見に由来する。したがって本発明は、Rac1を変性性障害に対する療法介入または診断介入および有効化合物開発のための標的として用いる組成物および方法に関する。
【００２５】
変性性障害
変性性障害という用語には、いずれかの神経変性性障害、特にアミロイドβペプチド関連障害が含まれる。これらには、具体的にはアミロイドβペプチド、特にAβ40および／またはAβ42産生の増加または異常に起因または関連するすべての障害が含まれる。
【００２６】
アルツハイマー病(AD)は、進行性の記憶および認知能力の喪失を特徴とする最も一般的な神経変性性障害である。ADの病因は、アミロイド斑、すなわち細胞内神経原線維変化の存在、および顕著な細胞死を特徴とする。βアミロイドペプチド(Aβ)は、ADの脳にみられる老人斑の主成分である。脳における42-アミノ酸型のAβ（Aβ42）の過剰産生、細胞内蓄積、凝集および沈着は、早期発症型の家族性ADに関連する。さらに、細胞外Aβ42はインビトロおよびインビボで神経細胞に対して有毒であると思われる（Selkoe, D. J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766に概説）。Aβは、膜内在性タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質(APP)が少なくとも2つの翻訳後経路でタンパク質分解されることにより生成する。APPのアミロイド形成性開裂は、β-セクレターゼ(BACE)により開始するAPPの逐次プロセシングであり、これが内腔ドメイン内または細胞表面にあるAPPを開裂してAβのN末端を生成する。この開裂により、数種類の膜結合したタンパク質分解C末端フラグメント(CTF)、たとえば99残基のβ-CTF（C99とも呼ばれる）、および分泌型のAPPエクトドメインsAPPβが生成する。その後、γ-セクレターゼによるCTFの膜内開裂によりAβのC末端が生成して、Aβ40またはAβ42が産生される。残基40-42における開裂はγ-開裂と呼ばれ、残基49-52における開裂はε-開裂と呼ばれる。Aβ生成を妨げるAPPの非アミロイド形成性開裂は、主に細胞形質膜で起きると考えられている反応において、α-セクレターゼ、ディスインテグリンならびにメタロプロテイナーゼ10 (ADAM-10)およびADAM-17により仲介される。α-セクレターゼによるこのタンパク質分解開裂はAβ領域内で起き、主要なプロセシング生成物である可溶性APP (sAPPα)、および残留型の膜結合10-kDa CTF（CTFα；C83とも呼ばれる）を産生する。C99と同様に、C83はγ-セクレターゼの基質であり、これは開裂して非アミロイド原性p3フラグメントを生成する。APPは、それの細胞質ゾルドメインを開裂するカスパーゼ活性の基質でもある。
【００２７】
したがって、そのようなアミロイドβペプチド関連障害の例には、下記よりなる群から選択されるいずれかの疾患または状態が含まれる：アルツハイマー病（たとえば、アルツハイマー病の発症の阻止または遅延を補助するため、アルツハイマー病の進行の遅延を補助するため、軽度認知障害(MCI)を伴う患者を処置して、MCIからADへ進行すると予想される患者においてアルツハイマー病の発症を阻止または遅延させるため）、軽度認知障害(MCI)、ダウン症候群、ダッチ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、脳アミロイド血管障害およびそれの潜在予後（たとえば単発性または再発性の大脳葉出血）、下記を含む変性性認知症：血管由来と変性由来の混合型認知症、パーキンソン病関連認知症、進行性核上麻痺関連の認知症、皮質基底変性関連の認知症、または散在性レーヴィ小体型のアルツハイマー病。
【００２８】
処置
本発明に関して、用語”処置”または”処置する”には、治療処置および予防処置の両方が含まれる。特に、本発明化合物は疾患のごく初期、または早期発症前、または疾患が著しく進行した後に使用できる。用語”処置”または”処置する”は特に、患者における負荷の軽減、たとえば疾患発症または疾患進行の阻止または遅延、対象における認知機能または記憶の回復または増強、酸化ストレスの軽減、APPプロセシングの遅延などを表わす。
【００２９】
Rac1b
Rac1は、RhoおよびCdc42などのRhoファミリーに属する低分子GTP結合タンパク質である。これらの低分子Gタンパク質は、GTP/GDP交換により活性化され、遺伝子発現、細胞骨格再配列、および小胞／分泌転送など、広範な細胞機能を調節する。次いで、活性化されたCDC42またはRacがPAK Ser/Thrキナーゼファミリーを活性化する。最近の研究により、Rhoはストレスファイバーの形成に関与し、一方、活性化されたCdc42はアクチン束を含有する細い指状突起であるフィロポディアの形成を誘導し、Racは細胞端に沿ってしばしば形成されるカーテン状の突起であるラメリポディアまたはラッフル（ruffle）の形成を調節することが示された（概説についてはHall, 1998, Science 279, 509-514を参照）。脳において、低分子Gタンパク質は神経細胞の形態変化に関与し、成長円錐、軸索、樹状突起幹および樹状突起棘に局在する（van Leeuwen, F.N., van Delft, S., Kain, H.E., van der Kammen, R.A., and Collard, J.G. (1999) Nat. Cell Biol. 1, 242-248）。ADの脳では、病的プロセスおよび神経細胞変性に関連して、特定の神経細胞集団において神経細胞のCdc42/Racが年齢相応の制御と比較してアップレギュレートされている（Zhu, X., Raina, A.K., Boux, H., Simmons, Z. L., Takeda, A., and Smith, M.A. (2000) Int. J. Dev. Neurosci. 18, 433-437）。成熟した脳には、神経細胞膜のラフト（raft）ドメインにRac1が存在するが、RhoもCdc42も存在しない（Kumanogoh, H., Miyata, S., Sokawa, Y., and Maekawa, S. (2001) Neurosci. Res. 39, 189-196）。さらに、先入観のない最近の定量プロテオミクス研究により、Rac1がラフト関連タンパク質であると解明された（Foster, L. J., De Hoog, C. L., and Mann, M. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci U S A 100, 5813）。他の研究により、Rac1の活性化に伴ってそれが脂質ラフト内へ急速に補充され、一方、Cdc42はラフト内へ補充されないがラフト関連部分により活性化されること、また、より重要な、Rac1は細胞膜へのゴルジ由来脂質ラフトの組込みおよび輸出を調節するが、RhoもCdc42もそれらを調節しないことが示された（Field, K. A., J. R. Apgar, E. Hong-Geller, R. P. Siraganian, B. Baird, and D. Holowka. (2000) Mol. Biol. Cell 11, 3661 ; Rozelle, A. L., L. M. Machesky, M. Yamamoto, M. H. Driessens, R. H. Insall, M. G. Roth, K. Luby-Phelps, G. Marriott, A. Hall, and H. L. Yin. 2000 Curr. Biol. 10:311）。
【００３０】
Rac1bはRac1の特定のスプライシング形態であり、この場合エキソン3bが保持されている。Rac1bの配列およびエキソン3bの配列（SEQ ID NO:12のヌクレオチド51-170を参照）を本明細書に示す。これらの配列は公開遺伝子ライブラリーにおいても入手できる。
【００３１】
本発明に関して、用語Rac1b RNAは、コード配列または非コード配列のいずれであっても、成熟したものまたはそうでなくても、最終的にRac1bポリペプチドを発現するいかなるRNA配列をも表わす。
【００３２】
用語”Rac1遺伝子”は、Rac1bポリペプチドをコードするいかなる核酸をも表わす。それはゲノムDNA(gDNA)、相補的DNA(cDNA)、合成または半合成DNA、mRNA、合成RNAなどであってもよい。それは、当業者に既知の方法、たとえば人為的合成、増幅、酵素開裂、ライゲーション、組換えなどにより、生物源、入手可能な配列または市販材料を用いて製造された、組換えまたは合成核酸であってもよい。Rac1遺伝子は本発明によれば多様な形で存在しうるが、一般に二本鎖形で存在する。Rac1遺伝子の配列は、特定のデータバンク、たとえば著名なものではRefSeq,n°NM_009007において入手できる。本発明によれば、他のRac1遺伝子配列を試料もしくはコレクションから単離でき、または合成できる。
【００３３】
用語Rac1bポリペプチドは、特にエキソン3bがコードするアミノ酸を含むいずれかのRac1ポリペプチドを表わす。用語Rac1bポリペプチドには、広義には、たとえば多型性、変異、挿入などにより生じた、前記に同定した配列の生物活性形天然バリアントも含まれる。
【００３４】
Rac1b阻害薬
本発明に関して、用語”Rac1b阻害薬”は、Rac1bの活性または発現を抑制または遮断するいずれかの化合物または処置を表わす。より好ましいRac1b阻害薬は、Rac1b依存性の細胞骨格再配列を阻害する化合物である。最も好ましいRac1b阻害薬は選択的阻害薬であり、たとえばそれらはRac1b特異的ドメイン、特にエキソン3bの全体または一部と結合または反応することができる。好ましいRac1b阻害薬は、本質的にcdc42および／またはRhoAに直接には影響を与えない；すなわちそれぞれcdc42および／またはRhoAと実質的に相互作用しない。
【００３５】
そのようなRac1b阻害薬の具体例には、Rac1bまたはそのドメイン、特にエキソン3bまたはそのドメインを特異的に結合する、いずれかの化合物が含まれる。そのような結合化合物には、たとえばいずれかの阻害核酸、たとえばアンチセンスRNA、リボザイム、iRNA、siRNA、ssRNA、マイクロRNAなど、またはいずれかの対応するDNA、PNAなどが含まれる。そのような阻害核酸は、好ましくはエキソン3bまたはRac1遺伝子の全体または一部に対して相補的な配列を含み、これにより細胞におけるその転写または翻訳を阻止、遮断または抑制する。そのような阻害オリゴヌクレオチドの具体例を、本明細書中において後記に開示する。
【００３６】
そのようなRac1b阻害薬の他の例は、Rac1bを結合する抗体（またはそのフラグメントもしくは誘導体）である。そのような抗体は、一般にRac1のエキソン3bがコードするアミノ酸内に含まれるエピトープを結合する。抗体はポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体であってもよい。抗体フラグメントには、たとえばFabフラグメント、Fab'2フラグメント、CDR領域などが含まれる。抗体誘導体には、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二官能性抗体などが含まれる。
【００３７】
Rac1b阻害薬は特に、Rac1bのエキソン3b内に含まれる（すなわち、それに完全または部分的に含まれる）エピトープを特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体（またはその誘導体もしくはフラグメント）である。よりさらに好ましくは、本発明はSEQ ID NO:13内に含まれるエピトープを特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体（またはその誘導体もしくはフラグメント）に関する。
【００３８】
本発明の他の観点は、SEQ ID NO:13を含むポリペプチドでヒト以外の哺乳類を免疫化することにより産生された、Rac1bを特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体（またはその誘導体もしくはフラグメント、たとえばCDR配列）である。本発明の他の目的は、SEQ ID NO:13またはその少なくとも5個の連続アミノ酸のエピトープ含有フラグメントを含む、ポリペプチドである。より具体的には、本発明の目的は、SEQ ID NO:13またはその少なくとも5個の連続アミノ酸のエピトープ含有フラグメントを含む、アミノ酸50個未満の長さのポリペプチドである。
【００３９】
ヒトRac1bタンパク質に対する抗体は、当技術分野で一般に既知の方法により調製できる。たとえばポリクローナル抗体は、このタンパク質を単独で、または適切なタンパク質に結合させてヒト以外の動物に注射することにより産生させることができる。適切な期間の後、動物から採血し、血清を回収し、当技術分野で既知の方法により精製する（参照：Paul, W.E. ”Fundamental Immunology”, 第2版, Raven Press, ニューヨーク, p.176, 1989; Harlow et al, ”Antibodies: A laboratory Manual”, CSH Press, 1988 ; Ward et al, Nature 341 (1989) 544）。モノクローナル抗体は、たとえば骨髄腫細胞への免疫B-リンパ球の融合を伴うKohler-Millstein法（Kohler-Millstein, Galfre, G., and Milstein, C, Methods Enz. 73 p. 1 (1981)）により調製できる。たとえば、前記の抗原をヒト以外の適切な哺乳類（たとえばマウス）にポリクローナル抗体応答が血清中に検出されるまで注射してもよい。この哺乳類を再びブースター処理し、それの脾臓を摘出し、骨髄腫との融合を多様な方法に従って実施することができる。個々の生存ハイブリドーマ細胞を、まずそれらが免疫抗原を結合する能力により、次いでそれらがrac1bを細胞から免疫沈降させる能力により、抗rac1b抗体の分泌について試験することができる。
【００４０】
療法用途
本発明の特定の目的は、哺乳動物対象において変性性障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法に関する。好ましくは、本発明化合物はその対象におけるAPPプロセシングを低下させるのに有効な量で投与される。
【００４１】
本発明の他の観点は、哺乳動物対象においてアミロイドβペプチドの生成を阻害する方法であって、その必要がある対象にその対象におけるAPPプロセシングを低下させるのに有効な量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法である。
【００４２】
本発明の他の観点は、哺乳動物対象においてNotch開裂またはBACE活性を実質的に変化させずにアミロイドβペプチドの生成を阻害する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法である。
【００４３】
本発明の特定の目的は、哺乳動物対象においてアルツハイマー病障害を処置する方法であって、その必要がある対象にその対象におけるAPPプロセシングを低下させるのに有効な量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法に関する。
【００４４】
本発明の他の観点は、哺乳動物対象においてNotch開裂またはBACE活性を実質的に変化させずにアミロイドβペプチドの生成を阻害する方法であって、その必要がある対象に有効量のRac1b阻害薬を投与することを含む方法である。
【００４５】
本発明に使用するために、本発明化合物は少なくとも１種類の本発明化合物および医薬的に許容できるビヒクルまたは担体を含む医薬組成物の形であってもよい。本発明化合物は、固体または液体剤形を含めた多様な剤形、たとえばカプセル剤、錠剤、ゲル剤、液剤、シロップ剤、懸濁液剤、散剤、エアゾル剤、軟膏剤などに配合することができる。
【００４６】
本発明のこのような医薬組成物は、生理的に許容できる希釈剤、充填剤、滑沢剤、賦形剤、溶剤、結合剤、安定剤などを含有することができる。本発明組成物中に使用できる希釈剤には、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、乳糖、セルロース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、粉糖、および持続放出錠用のヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)が含まれるが、これらに限定されない。本発明組成物中に使用できる結合剤には、デンプン、ゼラチン、および充填剤、たとえばショ糖、グルコース、デキストロースおよび乳糖が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明組成物中に使用できる天然および合成のガムには、アルギン酸ナトリウム、ガッチガム（ghatti gum）、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンおよびビーガム（veegum）が含まれるが、これらに限定されない。本発明組成物中に使用できる賦形剤には、微結晶性セルロース、硫酸カルシウム、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、乳糖、およびショ糖が含まれるが、これらに限定されない。使用できる安定剤には、多糖類、たとえばアラビアゴム、寒天、アルギン酸、グァーガムおよびトラガント、amphotsics、たとえばゼラチン、ならびに合成および半合成ポリマー、たとえばカルボマー（carbomer）樹脂、セルロースエーテルおよびカルボキシメチルキチンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
使用できる溶剤には、リンガー液、水、蒸留水、水中の50%ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール（そのまま、または水中）、リン酸緩衝化生理食塩水、平衡塩類溶液、グリコール、および他の一般的な液体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明化合物を投与する量および投与計画は、剤形、投与様式、処置される状態、および処置される患者の特性によって異なるであろう。したがって、最適療法濃度はその時点および場所でルーティン実験により決定するのが最良であろう。
【００５０】
本発明による化合物は、腸内に使用することもできる。経口では、本発明による化合物を10μg〜300 mg/日/kg体重の割合で投与するのが適切である。必要量を１回以上で投与できる。経口投与に適切な剤形は、たとえばカプセル剤、錠剤、ゲル剤、エアゾル剤、丸剤、糖衣剤、シロップ剤、懸濁液剤、乳剤、液剤、散剤および顆粒剤である；好ましい投与方法は、1〜約500 mgの有効物質を含有する適切な剤形の使用にある。
【００５１】
本発明による化合物は、静脈内、皮下または筋肉内への注入または注射のための液剤または懸濁液剤の形で非経口投与することもできる。その場合、本発明による化合物は一般に約10μg〜10 mg/日/kg体重の割合で投与される；好ましい投与方法は、約0.01〜1 mg/mlの有効物質を含有する液剤または懸濁液剤の使用からなる。
【００５２】
本発明による化合物は、硝子体内または眼窩後方注射のための液剤または懸濁液剤の形で眼内に投与することもできる。その場合、本発明による化合物は一般に約10μg〜10 mg/日/kg体重の割合で投与される；好ましい投与方法は、約0.01〜1 mg/mlの有効物質を含有する液剤、懸濁液剤またはゲル剤の使用からなる。
【００５３】
本発明化合物は、CNS障害を処置するための他の既知の薬剤と実質的に同様な様式で使用できる。投与量は、１回量、多数回量または１日量のいずれであっても、使用する特定の化合物（化合物の力価が異なるので）、選択する投与経路、レシピエントの体格、疾患のタイプ、および患者の状態の性質に応じて異なるであろう。投与量は明確な制限を受けるわけではないが、通常はそれの目的とする薬理作用および生理作用を達成するのに有効な量、または有効薬物が代謝放出された際に投与配合物から生成した薬理活性をもつ遊離形のモル規準でそれと同等な量であろう。CNS障害処置の分野の熟練した内科医または医師が、多大な実験なしに、本発明化合物を効果的に投与するのに適切なプロトコルを確認できるであろう。
【００５４】
本発明化合物は多様な経路で、一般に経口経路、または注射、たとえば局所注射もしくは全身注射により投与できる。経口、静脈内、腹腔内または皮下投与が好ましいが、他の投与経路、たとえば筋肉内、皮内なども使用できる。さらに、適切であれば反復注射を実施してもよい。
【００５５】
本発明の他の観点は、変性性障害、特にアルツハイマー病を伴う哺乳動物対象においてアミロイドβペプチドの生成を阻害する医薬組成物を製造するための、Rac1b阻害薬の使用に関する。
【００５６】
本発明の他の観点は、アルツハイマー病の処置に用いる医薬組成物を製造するための、Rac1b阻害薬の使用である。
【００５７】
薬物スクリーニング
本発明は、Rac1bをAPPプロセシングおよびAβ生成の調節に初めて関連づけた。したがって本発明は、Rac1bが変性性疾患の処置に用いる薬物のスクリーニングのために有用な標的であることを示す。
【００５８】
これに関して、本発明の特定の目的は、アミロイドβペプチド関連障害の処置に使用するための候補化合物を製造、同定、選択または最適化する方法であって、被験化合物がRac1bを阻害するかを判定することを含み、Rac1阻害は被験化合物がアミロイドβペプチド関連障害の処置に使用するための候補化合物であることの指標である方法に関する。Rac1b阻害は、インビボ、エクスビボまたはインビボで、それ自体は当技術分野で既知の多様な生物学的アッセイ法に従って評価することができる。
【００５９】
特定の態様において本発明方法は、被験化合物とRac1b（またはそのフラグメントであって、一般にエキソン3bの全体もしくは一部を含むもの）を接触させて、その化合物がRac1bまたはそのフラグメントを結合するかを判定することを含む。
【００６０】
他の特定の態様において本発明方法は、被験化合物とRac1bを接触させて、その化合物がRac1b依存性の細胞骨格再配列を阻害するかを判定することを含む。
【００６１】
特定の態様において、Rac1b阻害はエフェクターPAKlプルダウンアッセイ（effector PAKl pulldown assay）を用いて評価される。
【００６２】
より好ましくは、本発明化合物はさらに他の標的、特にNotchプロセシング経路（たとえばNotch開裂）、BACE、または他の低分子GTP結合タンパク質（たとえばCdc42および／またはRhoA）に対する化合物の活性について評価される。最も好ましい化合物は、Notch開裂を実質的に変化させず、ならびに／あるいはBACEを実質的に直接阻害せず、ならびに／あるいはCdc42および／またはRhoAを実質的に直接阻害しないものである。
【００６３】
これらのアッセイはインビトロでいずれか適切な装置において実施でき、多様な化合物を平行して、または混合物中においてアッセイすることができる。
【００６４】
診断
本発明はさらに、酸化ストレスの存在または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を検出することを含み、Rac1bの存在は酸化ストレスの存在または素因の指標である方法に関する。
【００６５】
本発明はさらに、対象において変性性障害の存在、病期または素因を検出する方法であって、対象からの試料においてRac1bの存在または（相対）量を検出することを含み、Rac1bの存在はその障害の存在、病期または素因の指標である方法に関する。
【００６６】
より好ましい態様において、前記方法はRac1aイソ型とRac1bイソ型の比率を測定することを含み、その比率における変動は疾患の素因、存在または病期に関する指標である。より具体的には、本発明はSEQ ID NO:1〜8もしくは12のいずれかまたはその相補鎖を含む核酸分子あるいは対応するポリペプチドの存在を検出することを含む。それらの核酸分子およびポリペプチド、ならびにそのいずれかの特有のフラグメントまたは類似体；それらのポリペプチドに特異的に結合する抗体、および特異的な核酸プローブまたはプライマーも、本発明の特定の目的である。
【００６７】
検出はそれ自体は当技術分野で既知の方法、たとえば増幅、ハイブリダイゼーション、配列決定、免疫学的方法などに従って実施できる。これに関して本発明は、Rac1aとRac1bを特異的に識別する特定のオリゴヌクレオチドを開示し、これらは本発明の特定の目的である。それらのオリゴヌクレオチドは、好ましくはエキソン3bのスプライシングもしくはエキソン3bの保持により形成されたジャンクション領域を結合し、および／またはエキソン3b自体に結合する。そのようなオリゴヌクレオチドの例をSEQ ID NO:9〜11に提示する。本発明は、Rac1エキソン3bを、またはエキソン3bの保持もしくはスプライシングにより形成されたジャンクション領域を特異的に結合するいずれかのオリゴヌクレオチド（好ましくは、一本鎖の、5〜60塩基、より好ましくは5〜50、5〜40、10〜30、10〜25塩基を含むもの）を含む。
【００６８】
Rac1の完全なヒトゲノム配列は、NCBIにおいて寄託番号AJ132695で入手できる。エキソン3bは、その配列のヌクレオチド位置18413〜18530に相当する；その配列を以下に位置18361から18600まで再現する（SEQ ID NO:12）（エキソン3bは太字）：
【００６９】
【化１】
2009525305.tif 000002
【００７０】
本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、RNA分子内のRac1bエキソン3bとフランキング配列の間のジャンクション領域に特異的にハイブリダイズする配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは一般にエキソン3bの5'末端または3'末端に特異的な少なくとも5個のヌクレオチドのドメインを含み、これはそれぞれエキソン3bのこの5'末端または3'末端をフランキングする配列に特異的な少なくとも5個のヌクレオチドのドメインに直接融合している。これに代わる本発明のオリゴヌクレオチドは、エキソン3bのスプライシングにより形成されるジャンクション領域、すなわち下記の標的ジャンクションに特異的にハイブリダイズする：tctacgtaag。そのようなオリゴヌクレオチドは、試料中のRac1bを増幅し、またはその存在もしくは（相対）量を検出するための、プライマーまたはプローブとして使用でき、本発明の特定の目的である。本発明の他の特異的オリゴヌクレオチドは、エキソン3b内（すなわちSEQ ID NO:12の残基51〜170）に含まれる配列にハイブリダイズする。
【００７１】
本発明の他の観点および利点を以下の実施例に開示する。これらは説明であって、本発明の範囲を限定するものではないとみなすべきである。引用したすべての刊行物または出願の全体を本明細書に援用する。
【００７２】
実施例
実施例１：ADの脳からのrac1b DATASシグナチャーの同定
発現プロファイリング試験のためのDATAS法（DATAS特許番号6251590）を用いて、十分に解明されたAD患者および健康な対照の前前頭皮質に存在するオルタナティブRNAスプライシング事象を比較した。対照被験者らは認知症でなく、年齢相応であり、プロファイリング試験において加齢性の変化とmRNA安定性関連の変化を選別するための類似の死後遅延（post-mortem delay）を有していた。
【００７３】
Rac1の変化の同定
同定したクローンには、RAS関連C3ボツリヌス基質1 (Rac1)に対応するmRNAのフラグメント5つが含まれており、これは、ADに罹患している患者の脳におけるrac1のスプライシング事象の調節異常を指摘する。
【００７４】
これらのDATASフラグメントは下記のものである：EXH-NADC4422-01、長さ354 (SEQ ID NO l)、EXH-NADC4506-01 (SEQ ID NO 2)、長さ344、EXH-NADC4513-01、長さ354 (SEQ ID NO 3)、EXH-NADC4524-01、長さ354 (SEQ ID NO4)、EXH-NADC4531-01、長さ348 (SEQ ID NO 5)、EXH-NADC4534-01、長さ356 (SEQ ID NO 6)、およびEXH-NADC4550-01、長さ353 (SEQ ID NO 7)。これらのDATASフラグメントはクラスター、すなわちクラスター13983 2 (SEQ ID NO 8)中に組織化しており、これは番号NM_006908で呼ばれるRefSeqバンク配列のヌクレオチド246〜782に相当する。この領域には、RefSeqバンク配列においてNM_006908と呼ばれる転写体バリアントRac1b中に存在するオルタナティブスプライシングされた57 bp領域が含まれる(エキソン3b)（図１）。
【００７５】
実施例２：Aβによるrac1bスプライシングの誘導
ラット初代皮質細胞培養物はAβ毒性に対して感受性である；その神経毒性は、カルシウム恒常性調節異常、ROSの蓄積、二次的な刺激毒性、およびカスパーゼ活性化など、多様な機序を伴う（Zhang et al, J Neurochem 1996, 67 (4) 1595-1606）。Aβペプチドを100% HFIP (1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール)に溶解し、次いで乾固し、100% DMSOに再懸濁し、フェノールレッドを含有しないDMEM/F12中に再希釈する。この溶液を37℃で72時間のインキュベーションにより熟成させ、次いでAβオリゴマーを7日培養物に24時間添加する。24時間のインキュベーション後、細胞をRNA抽出のためにトリゾール（Trizol）により処理する。下記のプライマーを用いる入れ子型PCR法をrac1b増幅に使用した：
【００７６】
【化２】
2009525305.tif 000003
【００７７】
下記のプロトコルの第１PCRに従い、プライマーnm_006908_Flおよびnm_006908_Rlを用いて、Rac1を増幅した。これらの条件で、rac1bは1回のPCR増幅後にはその量が少ないためゲル上に検出されず、入れ子型PCRにおいてプライマーnm_006908_F2およびnm_006908_Rlを用いると容易に検出された。
【００７８】
逆転写(Transcriptor逆転写酵素, Roche)は、ランダムプライマーp(dN)6 (Invitrogen)、l mMのdNTP混合物、1単位/μlのRNAse OUTリボヌクレアーゼ阻害薬(Invitrogen)および0.5単位/μlのTranscriptor逆転写酵素を用いて実施された。第１PCRは、Platinum(登録商標)高適合度(High Fidelity)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を、0.2 mMのdNTP混合物、1.5 mMのMgSO4、0.25μMの各プライマー(nm_006908_Flおよびnm_006908_Rl)、および0.1単位/μlのPlatinum(登録商標)高適合度Taqと共に用いて、下記の増幅30サイクルで実施された：変性：94℃で30秒間、アニーリング：60℃で１分間、連鎖延長：68℃で１分間。PCRアンプリコンをMicroSpinTM S-300 HRカラム(Amersham Biosciences)により精製し、PCRマスターミックス(Promega)および0.2μMの各プライマー(nm_006908_F2およびnm_006908_Rl)を用いて、下記のPCR増幅30サイクルで第２PCRを実施した：変性：94℃で30秒間、アニーリング：60℃で１分間、連鎖延長：72℃で１分間。PCR生成物を1.5%アガロースゲル上で分離した。
【００７９】
結果
Aβ処理がrac1bのmRNAレベルに与える影響を調べるために、皮質細胞を種々の濃度のAβに24時間曝露し、逐次、プライマーnm_006908_Flおよびnm_006908_Rl、次いでプライマーnm_006908_F2およびnm_006908_Rlを用いる入れ子型PCR法において、rac1bを特異的に増幅させた。GAPDHを対照として増幅させた。独立した2つの培養物において得た結果は、11.25および22.5μMのAβ濃度でみられた用量依存性のrac1b mRNA蓄積を示す（図２）。これは、Aβがrac1/rac1b比を変化させ、これによりrac1スプライシングがオルタナティブエキソン3bを取り込む方へ偏っていることを指摘する。したがって、低濃度のAβが、選択的下流シグナル伝達により、優先的にGTP結合する高活性化Rac1バリアントの出現を刺激する。
【００８０】
実施例３：酸化ストレスによるrac1bスプライシングの誘導
SKNSHサブクローンSH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)は、酸化ストレス仲介神経毒性または神経保護を研究するために広く受け入れられているモデルである（Zuo et al. 1995）。有機ヒドロペルオキシドであるt-ブチルヒドロペルオキシド(TBH)は、H2O2の安定類似体である。TBHは、ROS生成、レドックス平衡失調の喪失、ミトコンドリアシトクロムc放出およびカスパーゼ-3活性化により開始する一連の事象により、アポトーシスを誘導する。
【００８１】
パーキンソン病の動物モデルの作製に古典的に用いられているカテコールアミン特異的神経毒素6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)は、ドーパミンのヒドロキシル化類似体であり、カテコールアミン作動性細胞のアポトーシスをもたらす。この神経毒素はアポトーシスを誘導し、その毒性はROS産生に関連する。幾つかの機序を伴うと思われる：(1)自動酸化による反応性酸素ROSの生成、(2)モノアミンオキシダーゼによる脱アミノ後の過酸化水素生成、(3)ミトコンドリア複合体IおよびIVの直接阻害ならびにタンパク質分解ならびにユビキチン-プロテアソーム系活性化（Youdim et al. 2001）。
【００８２】
ROS産生がrac1/rac1b比に影響を与えることができるかを調べるために、SH-SY5Y細胞を指示した濃度の種々のROS誘導剤に24時間曝露し、LDHアッセイ(Cytotox96, Promega)により細胞生存率を測定した。
【００８３】
SH-SY5Y細胞を24ウェルプレート(ATGC, フランス)に細胞3*105個/ウェルの初期密度で接種した。24時間後、細胞を指示した濃度の種々のROS誘導薬で処理した。24時間のインキュベーション後、LDHアッセイを実施して細胞の生存率を明らかにし、RNA抽出のために細胞をトリゾールにより処理した。
【００８４】
結果
ROS産生作用剤TBHおよび6-OHDAがrac1およびrac1bのmRNAレベルに与える影響を調べるために、SH-SY5Y細胞を指示した濃度の種々のROS誘導剤に24時間曝露し、プライマーnm_006908_Flおよびnm_006908_Rlを用いてrac1およびrac1bを同時増幅し、あるいは逐次、プライマーnm_006908_Flおよびnm_006908_Rl、次いでプライマーnm_006908_F2およびnm_006908_Rlを用いる入れ子型PCR法においてrac1bを特異的に増幅させた。GAPDHを対照として増幅させた。
【００８５】
平行して、細胞生存率をモニターするために同一細胞についてLDHアッセイを実施した。
【００８６】
結果は、両毒素についてrac1レベルは酸化ストレスに際して変化しないことを示す（図３）。これに対し、rac1bの用量依存性蓄積が毒性下濃度のTBHおよび6-OHDAを用いた場合に両方ともみられる。これは、低レベルの酸化ストレスが同様にrac1/rac1b比を変化させ、これによりrac1スプライシングがオルタナティブエキソン3bを取り込む方へ偏り、したがってRac1の高活性化バリアントRac1bの出現が刺激されることを指摘する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】rac1 (NM 006908)およびrac1b (NM 006908)遺伝子の構成図である。矢印はPCRプライマーを示し、3bはrac1b中の追加エキソン3bを示す。
【図２】βアミロイドペプチドによるRac1bの誘導を示す。ラット初代皮質細胞を指示した用量のAβで24時間処理した。示したアガロースゲルは、この細胞におけるrac1およびrac1bのPCR増幅を表わす。
【図３】種々の酸化ストレスによるRac1bの誘導を示す：A：ヒドロペルオキシドであるt-ブチルヒドロペルオキシド(TBH)；B：6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)。ヒストグラムは、指示した用量のTBHまたは6-OHDAで24時間処理したSH-SY5Y細胞の細胞生存率をLDHアッセイにより測定したものを表わす。図示したアガロースゲルは、この細胞におけるrac1およびrac1bのPCR増幅を表わす。
【図１】
2009525305.tif 000004
【図２】
2009525305.tif 000005
【図３】
2009525305.tif 000006
【配列表】
2009525305000001.app
【国際調査報告】
2009525305.tif 000007
2009525305.tif 000008
2009525305.tif 000009
2009525305.tif 000010
2009525305.tif 000011