(57)【要約】  本発明は、自己免疫関連疾患、より特定すれば分娩後自己免疫疾患を治療するため、哺乳動物にステロイドホルモンを投与することを開示する。最も好ましくは、本発明は、子供の誕生後の初期の開始を有するか又は分娩後の期間に患者において悪化することが知られているこれらのＴｈ−１媒介性（細胞媒介性）自己免疫の臨床症状を予防する又は寛解するため、エストロゲン、エストランジ、エストリオール又はエストロゲンレセプター活性剤を使用する。
2009510070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分娩後患者を女性患者に対して治療することにより自己免疫疾患を予防するか又は改善させる方法であって、エストロゲン又はエストロゲン受容体活性剤である第一の剤を少なくとも一つ、治療上有効な用量にて有効な剤形にて投与することを含む方法。
【請求項２】
自己免疫疾患がＴｈ−１細胞媒介性疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｔｈ−１細胞媒介性疾患が多発性硬化症、乾癬、慢性関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎又はブドウ膜炎を含む群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一の剤がエストリオール、エストロン、１７ベータエストラジオール、芳香族化可能性テストステロン、エストロゲン受容体アルファアゴニスト、及びエストロゲン受容体ベータアゴニストの群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
エストリオールがナイエストリオール、エストリオールスクシネート又はエストリオールスルファメート又はエストリオールジヘキサネートである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
第一の剤がエストリオールであり、そして治療上有効な用量が２４時間あたり約０．００１から約１６ミリグラムである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第一の剤がエストリオールであり、そして治療上有効な用量が２４時間あたり約８ミリグラムである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第一の剤がエストリオールであり、そして治療によりミリリッターあたり約２から約３０ナノグラムの患者血清エストリオール濃度をもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項９】
第一の剤がエストリオールであり、そして治療によりミリリッターあたり約２から約３５ナノグラムの患者血清エストリオール濃度をもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第一の剤がエストリオールであり、そして治療によりミリリッターあたり約２から約１８ナノグラムの患者血清エストリオール濃度をもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
エストロゲンの血清レベルにおける治療結果が妊娠の中期第２三半期から第３三半期の終わりまでの女性のそれらと均等な、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
さらに、少なくとも一つの第二の剤を治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で第一の剤と同時に投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
第二の剤がプロゲステロンであり１日あたり約１００から約２００ミリグラムの用量にて投与されるか、又はプロゲスチンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
第二の剤がグルココルチコイドである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
グルココルチコイドがプレドニゾン又はメチルプレドニゾンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
プレドニゾンが１日あたり約５から約６０ミリグラムの用量にて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
メチルプレドニゾンが１日あたり約１から約２ミリグラムの用量にて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
第二の剤がベータ−インターフェロン、グラチラマーアセテートコポリマー−１、アザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキセート、ミトキサントロン又はシクロスポリンＡを含む群から選択される少なくとも一つの化合物である、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
ベータ−インターフェロンがインターフェロン−ベータ１ａ又はインターフェロン−ベータ１ｂである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
分娩後における多発性硬化症の少なくとも一つの臨床上の兆候を予防するか又は治療する方法であって、８ミリグラムのエストリオールを２４時間ごとに投与することにより疾患を改善させる方法。
【請求項２１】
さらに、少なくとも一つの第２の剤を治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で投与することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
多発性硬化症の臨床上の兆候を呈する分娩後患者を治療することにより疾患を改善する方法であって、約４から約１６ミリグラムの用量のエストリオールを２４時間ごとに；そして約１００から約２００ミリグラムの用量のプロゲステロンを２４時間ごとに投与することを含む方法。
【請求項２３】
多発性硬化症の臨床上の兆候を呈する分娩後患者を治療することにより疾患を改善する方法であって、約４から約１６ミリグラムの用量のエストリオールを２４時間ごとに；そしてグルココルチコイドを投与することを含む方法。
【請求項２４】
多発性硬化症の臨床上の兆候を呈する分娩後患者を治療することにより疾患を改善する方法であって、約４から約１６ミリグラムの用量のエストリオールを２４時間ごとに；そして約０ｍｇから約３０ｍｃｇの用量のインターフェロンベータ−１ａを投与することを含む方法。
【請求項２５】
多発性硬化症の臨床上の兆候を呈する分娩後患者を治療することにより疾患を改善する方法であって、約４から約１６ミリグラムの用量のエストリオールを２４時間ごとに；そして約０ｍｇから約０．２５ｍｇの用量のインターフェロンベータ−１ｂを１日おきに投与することを含む方法。
【請求項２６】
多発性硬化症の臨床上の兆候を呈する分娩後患者を治療することにより疾患を改善する方法であって、約４から約１６ミリグラムの用量のエストリオールを２４時間ごとに；そして約０ｍｇから約２０ｍｇの用量のグラチラマーアセテートコポリマー−１を２４時間ごとに投与することを含む方法。
【請求項２７】
多発性硬化症が多発性硬化症の再発性軽減形態であるか又は二次進行性形態である、請求項３又は２０記載の方法。
【請求項２８】
患者が女性である、請求項１又は２０記載の方法。
【請求項２９】
多発性硬化症の前兆として臨床上孤立した症候群を呈する分娩後患者を予防するか又は治療する方法であって、エストロゲン又はエストロゲン受容体活性剤である第一の剤を少なくとも一つ、治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で投与することにより追加の兆候の多発性硬化症の開始を遅らせることを含む方法。
【請求項３０】
８ミリグラムのエストリオールを２４時間ごとに投与することを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
さらに、少なくとも一つの第二の剤を治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で投与することを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
エストロゲン又はエストロゲン受容体活性剤である少なくとも一つの第一の剤を、治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で、第二の剤に対して次第に分娩後自己免疫疾患患者から減らす方法。
【請求項３３】
自己免疫疾患がＴｈ−１細胞媒介性疾患であり、そして当該疾患が多発性硬化症、慢性関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎、又はブドウ膜炎、又は乾癬である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
第二の剤がベータ−インターフェロン、グラチラマーアセテートコポリマー−１、アザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキセート、ミトキサントロン又はシクロスポリンＡを含む群から選択される少なくとも一つの化合物である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ベータ−インターフェロンがインターフェロン−ベータ１ａ又はインターフェロン−ベータ１ｂである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
分娩後鬱病として知られる臨床上孤立した症候群を呈する分娩後患者を予防するか又は治療する方法であって、エストロゲン又はエストロゲン受容体活性剤である第一の剤を少なくとも一つ、治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で投与することにより追加の兆候の多発性硬化症の開始を遅らせるか又は治療することを含む方法。
【請求項３７】
４から１６ミリグラムのエストリオールを２４時間ごとに投与することを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
疾患の改善が、虚弱性、麻痺、刺痛、視覚喪失、記憶障害、及び極度の疲労の開始の頻度又は苦しさの軽減の何れか一つにより測定される、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
疾患の改善が、ガドリニウム増強病変の数又は容積の低下、Ｔ２病変の蓄積の安定化又は減速化又は萎縮の形成の速度の減速化の何れか一つにより測定される、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
疾患の改善が、Ｔｈ２サイトカインの増加により測定されるか、又はＴｈ１サイトカインの減少が疾患改善に関連している、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
自己免疫疾患の兆候を予防するか又は改善するように患者を治療する方法であって、エストロゲン受容体アルファリガンドを治療上有効な用量にて有効な剤形にて投与することを含む方法。
【請求項４２】
自己免疫疾患が多発性硬化症であり、そしてエストロゲン受容体アルファリガンドによる治療により、自己抗原特異的前炎症性サイトカイン生産の減少、抗炎症性サイトカインの増加、神経系の炎症の減少、脱ミエリンの減少、神経細胞損失の減少、軸索のトランズアクションの減少、白質の病変の減少、軸索の数の損失の減少、神経系単球活性化の減少及び神経系ミクログリア活性化の減少の少なくとも一つをもたらす、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
自己免疫疾患の臨床上の兆候の開始を妨害する方法であって、エストロゲン又はエストロゲン受容体活性剤である第一の剤を少なくとも一つ、治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で投与することにより、自己免疫疾患の少なくとも一つの臨床上の兆候の開始を妨害することを含む方法。
【請求項４４】
ミクログリアの活性の減少、ＣＮＳ炎症の減少、脱ミエリンの少なくとも一つをもたらす、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
神経障害性疾患が多発性硬化症であり、そしてエストロゲン受容体アルファリガンドによる治療により、脱ミエリンの減少、軸索の損失の減少、ニューロンの異常性の減少及び運動障害の減少、再発の減少の少なくとも一つをもたらす、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
多発性硬化症の初期の急性の段階にあると患者が診断される、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
さらに、少なくとも一つの第二の剤を治療上有効な用量にて有効な剤形にて選択された間隔で投与することを含む、請求項４１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はNational Institute of Healthにより授与された助成金番号NS 36680、及びNational Multiple sclerosis Society助成金番号JF 2094, RG 3016, RD3407及び CA1028 の政府支援のもとでなされた。本発明は、National Institutes of Health-National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant からの助成金番号NS 45443 のもとでもなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、自己免疫疾患を治療するためのステロイド療法、及びより特定的には、細胞仲介疾患の治療のためのエストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤である一次剤を投与することに関する。必要に応じて、免疫及び／又は神経系に効果を及ぼす二次剤を同時投与する又は漸減させ（tapered）てもよい。本療法は、分娩後の患者を含む患者で使用することができる。この発明は、疾患を仲介する細胞を含む神経変性疾患及び障害の治療のためのステロイド療法にも関連する。最後に、自己免疫疾患又は神経変性疾患又は障害の総体的症状を示している患者を治療するための少なくとも一つの一次剤及び少なくとも一つの二次剤を含んでいる治療キットが提供される。
【０００３】
背景技術
生殖年齢の間に、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、ぶどう膜炎、重症筋無力症（ＭＧ）、シェーグレン症候群及び橋本甲状腺炎を含む女性特有の自己免疫疾患が多く発症する。例えば、ＭＳは中枢神経系（脳及び脊髄）に影響を及ぼす、慢性及び時には衰弱性の疾患である。ＭＳは世界中の１００万人以上が発症し、及び若年成人特に女性の間で最も一般的な神経疾患である。ＭＳの正確な原因はいまだに不明である。ＭＳは神経系を攻撃し、神経軸索を取り囲むミエリン鞘の破壊を生じる。この脱髄は脱力、視覚障害、平衡感覚喪失及び筋協調低下を起こしうる。ＭＳは異なったパターンを有することが可能であり、時には急性悪化の病状発生後に、患者を相対的には良好な状態のままにしておくが、時には悪化の病状発生後に、持続する進行性能力障害を導く。最悪の場合、該疾患は麻痺又は失明を導き得る。
【０００４】
ステロイドホルモン又は伴性遺伝子遺伝は、これらの自己免疫疾患に対する増強された女性の感受性の原因となることができる。自己免疫疾患に対する感受性にステロイドホルモンが果たす役割は、妊娠、更年期又は外因性ホルモン投与（ホルモン置換（ＨＲＴ）又は経口避妊薬（ＯＲＣ）の形態における）間のような性ホルモンレベルの変化を伴う疾患総体的症状における変化の観察により支持された。例えば、ＭＳ及びＲＡを有する女性は、後期妊娠期間の間に症状の寛解を経験することが報告されている。特に、ＭＳ患者は、妊娠において再発率の減少を示すことが報告されている。
【０００５】
通常、細胞仲介免疫はインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及び腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−ｂ）のＴヘルパー細胞（Ｔｈ１）分泌により仲介される。対照的に、体液性免疫は、インターロイキン（ＩＬ）−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−６を分泌する、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ２）の他の群より仲介される。妊娠の間の体液性免疫（又はＴｈ２−仲介免疫）への全身性シフトが指摘されてきた。妊娠の間、細胞仲介免疫は減少し及び体液性仲介免疫は増加し、それにより胎児生存を促進する。それ故、免疫系におけるこの全身性シフトは、なぜ、ＭＳ及びＲＡを含む細胞仲介疾患が妊娠間に改善されると報告されているのかを説明することができる。
【０００６】
体液性仲介免疫へのシフトが妊娠間に報告されているけれども、このシフトを誘発する機構は不明のままである。一つの可能性は、胎盤によるＴｈ２（又は体液性仲介）サイトカインの局所産生である。別の可能性は、免疫細胞によるＴｈ２サイトカインの産生であり、結果として妊娠間にステロイドホルモンのレベルが変化する。後者の可能性と一致して、インビトロ研究は、ＩＬ−４産生を増加させるステロイドプロゲステロンの能力及びＩＬ−１０産生を増加させるステロイド１７−ベータ−エストラジオールの能力をＴリンパ球応答間に示した。しかしながら、どの細胞機構が自己免疫総体的症状のインビボ寛解に関与しているかは不明のままである。
【０００７】
妊娠間にＭＳに影響することができる可能性のある候補の例には：性ホルモン（エストロゲン、プロゲステロン）、コルチゾール、ビタミンＤ、アルファ−フェトプロテイン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン及び妊娠特異的糖タンパク質が含まれる。
【０００８】
さらに、いくつかの研究は、「早期妊娠因子」と名付けられた独特の妊娠因子が、妊娠間の細胞仲介自己免疫疾患の改善された進行の原因であることを示唆している。他の研究は、マイクロキメリズムの役割を示唆している。さらに他の研究は、妊娠間に胎盤により産生されることが知られているＴＧＦベータ又はエストリオール（Ｅ３）のような局所因子の役割を示唆している。注目すべきは、Ｅ３は妊娠の三番目の三半期でその最も高い血清レベルを示す。しかしながら、ヒトの自己免疫疾患の症状を寛解させることにおけるＥ３の役割は明らかではない。
【０００９】
実験動物における研究は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）及び他のＴｈ１（細胞仲介）自己免疫疾患がマウスにおいて妊娠間に改善されることを確立した。
具体的には、エストリオールの妊娠後期レベル又はエストラジオールの超生理的用量（妊娠レベルの５倍）での治療は、マウスの免疫化により実験的に疾患を誘発させた後の臨床ＥＡＥの発症を遅延させることが示された（Jansson et al. 1994）。しかしながら、エストロゲンがどのように疾患の発症日を遅延させるのか、又は一度総体的症状が起こったこれらの動物において疾患重症度が影響されるかどうかについての研究はない。
【００１０】
別の研究において、ＥＡＥ疾患重症度を、疾患発症前か又は後のエストリオールでの治療により軽減できることが示された。エストリオール（Ｅ３）の５ミリグラム又は１５ミリグラムの９０日放出ペレットによるＥＡＥマウスの治療は、ＥＡＥマウスにおいて疾患重傷度を減少させるのみでなく、自己抗原特異的体液性免疫を増強し、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−１０の産生を増加させ、及び炎症及び脱髄を軽減したことを示した。重要なことには、該疾患におけるこれらの変化は、後期妊娠間に生じるエストリオールレベルと同様の血清エストリオールレベルを得ることが示された用量（５ｍｇ）により誘発されたことである（Kim et al., Neurology, 50(4 Supp. 4):A242-245, April 1998, FASEB Journal 12(4):A616, March 1998 及び Neurology 52(6): 1230-1238, April 1999; 本明細書において援用される）。それ故、これらの変化は、ステロイドホルモン及び特にエストリオールは、ＥＡＥ動物モデルにおける自己免疫性反応の寛解に関与することができることを示唆している。
【００１１】
他のグループは後に、ＥＡＥマウスにおける自己免疫性反応を軽減するためのＴＣＲタンパク質での治療の効果をエストロゲンが増強することを示した。Offner, et al. FASEB Journal 14(6):A1246, April 2000; Int. Journal of MoI. Medicine 6 (Supp. 1): S8, October 2000 及び Journal of Clin. Invest. 105(10):1465-1472, May 2000 。さらに、動物研究において、エストロゲンがマウスにおけるＥＡＥに開始を抑制すること（Ito, et al. Journal of Immunology, 167(1): 452-52, 2001 ）、及びエストロゲンの推定発情間期レベルは、マウスにおいて活性ＥＡＥのいくつかの徴候を減少させたことが示された。Bebo et al. Journal of Immunology 166(3): 2080-9, 2001 。
【００１２】
しかしながら、ＥＡＥ及びＭＳの原因及び疾患進行は同一ではなく、それ故、エストロゲン単独が、ヒト患者における自己免疫応答を寛解することにおいて効果的であるかは不明である。実際、エストロゲンの妊娠用量が自己免疫疾患を有するヒトにおいて保護的であるかどうかは未知であるのみでなく、マウスにおいてさえ、エストロゲンの低用量が保護的であるかどうかも明らかではない。例えば、一部によりメスマウスの卵巣摘出術はＥＡＥ疾患を悪化させることが報告されているが（Matejuk et al., 2001）、一方、他の者は卵巣摘出術が疾患重症度には影響しないことを報告している（Kim et al., 2001; Voskuhl and Palaszynski, 2001a; Voskuhl and Palaszynski, 2001b ）。それ故、月経周期間に存在するような低レベルのエストロゲンがマウスにおいてさえ保護的であるかどうかは、議論の余地のあるところである。
【００１３】
現在までのヒトからのデータは、いずれの自己免疫疾患の治療においても、ステロイドの明瞭な利点を示していない。ヒトにおいて、性ホルモンの混合物を含有する利用可能なホルモン療法（ＨＲＴ及びＯＣＰを含んで）は、いくつかの自己免疫疾患を改善するが、一方、その他の疾患を悪化させる。
【００１４】
例えば、女性が性ステロイドのせいで保護されている又は総体的症状又は再発率が減少しているという決定的な証拠はない。１つの研究は、健康な女性における経口避妊薬の過去の使用は、ＭＳを発症するその後のリスクに影響しないことを指摘している（Hernan et al. 2000）。さらに、別の研究は、現在の使用者におけるＭＳの発生率は未使用者と比較して減少していないことを見出した（Thorogood and Hannaford, 1998）。それ故、経口避妊薬中のエストロゲンの低用量は、介入性使用間の一時的でさえもＭＳの免疫病原性を寛解するには十分なタイプ又は用量ではない。１つの研究において、よくても、前から存在するＭＳ症状（再発率とは対照的に）が月経前期間に悪化し、そして経口避妊薬の使用がこの悪化を減少させることができるという主観的印象を患者は有した（ZorgdragＥＲαnd De Keyser, 1997 ）。重要なことには、ＭＳ再発に対する経口避妊薬療法の影響についての報告の欠如は、妊娠間に観察されたことと好対照である。
【００１５】
対照的に、女性は非妊娠状態と比較して妊娠の間はＭＳを発症するリスクがより低いことが示されている（RunmarkＥＲαnd Andersen, 1995）。妊娠の間に起こるホルモン性及び非ホルモン性（上にリストした）の多数の変化のため、妊娠の有利な効果の原因は性ステロイドのゆらぎに関係することができる、又は関係していてもよい。この１０年に妊娠がＭＳを減少させることも報告されている（Abramsky, 1994; Birk et al. 1990; Birk et al, 1998; Damek and Shuster, 1997; RunmarkＥＲαnd Andersen, 1995; Confavreux et al., 1998）。これらの研究は、妊娠の後半が再発の有意な減少に関連し、一方、分娩後に再発のリバウンド増加があることを示した。対照的に、ＯＣＰ及びＨＲＴ間にこうした効果が存在しないことは、低レベルの性ステロイドは、これらの症状を治療するには適切ではないことを示している。
【００１６】
さらに、ＨＲＴで治療された関節リウマチの女性は、それらの総体的症状の有意な改善を示さなかった。DaSilva and Hall, Baillieres Clinical Rheumatology 1992, 6:196-219; Bijlsma et al. Journal of Repro. Imm. 28(3-4):231-4, 1992; Hall et al. Annals of the Rheumatic Disease, 53(2): 112-6, 1994 。
【００１７】
それ故、月経周期間に天然に、又はＯＲＴ及びＨＲＴで観察される低用量のホルモンが、自己免疫疾患の総体的症状を寛解するに効果的であるとは示されなかった。このことは、ＭＳを有する女性が、妊娠後期間に減少した再発率を有するという観察にもかかわらなかった。それ故、特定の自己免疫疾患の治療において療法的であり、一方、望まれない副作用を最小化するホルモン及び治療用量を同定する挑戦が行われてきた。明らかに、ヒトにおけるステロイド投与の用量及び方法は、ステロイドホルモンへの患者の長期に渡る暴露の毒性効果のため、実験動物におけるステロイド治療とは異なっている。特に、ステロイドホルモンの長期暴露を必要とする女性において乳癌又は子宮内膜癌を誘発することについての臨床的関心がある。
【００１８】
エストロゲンの作用は、主として核エストロゲンレセプター（ＥＲ）、ＥＲアルファ及びＥＲベータにより仲介されるが、非ゲノム性膜効果が以前に記載されている。本来、ＥＲアルファ及びＥＲベータは各々特有の組織分布を有していると考えられており、それにより選択的エストロゲンレセプターモディファイアーの使用を介した手段を提供している。しかしながら、ＥＲアルファ及びＥＲベータ間の関係は複雑になってきており、ほとんどの組織が、これらのレセプターの各々をいくらかの検出できるレベルで発現している。２つのレセプターは、所与の組織内の同一細胞に、時には同時に局在し、及びある時には同時に局在していない。さらに、いくつかの組織において該２つのレセプターは相乗的に作用することが示されているが、一方、他の組織においてこれらは拮抗的に作用する。しかしながら、ＭＳ及び他の自己免疫性及び神経変性疾患に対するＥＲアルファ及びＥＲベータによるいずれの選択的効果もまだ試験されていない。さらに、ＥＡＥにおけるエストロゲンによる直接及び間接神経保護機構は、相互に排他的である必要はなく、まだ十分に調査されていない。機構にかかわらず、ＥＡＥでエストロゲンが神経保護的であることの発見は、ＭＳならびに循環しているエストロゲンが非常に高い場合である妊娠におけるエストロゲン治療に関連している。実際、複数の妊娠は、ＭＳにおける長期能力障害蓄積の減少と関連していた（RunmarkＥＲαnd Andersen, 1995; Damek and Shuster, 1997）。ＭＳにおける能力障害に影響を与えるには、免疫変調治療による５年に至るまでの連続治療が必要とされるのが公知であるので、妊娠の第３三半期の一時的抗炎症性効果が、長期能力障害を改善することは必ずしも期待されるわけではない。エストロゲン治療の効力は、予防的療法として、神経変性が起こる前のその早期投与に決定的に依存しているようであるが（Mulnard et al., 2000）、この療法的尺度はいまだ探索されていない。
【００１９】
さらに、ＭＳに加えて神経変性疾患及び障害は、実質的な臨床的問題を含んでなり、それに対し、現存する治療は該疾患及び障害の総体的症状を寛解すること又は進行を防止することにおいて無効であった。
【００２０】
エストロゲン治療は、以前にパーキンソン病、小脳失調症、脳卒中及び脊髄損傷を含む多様な神経変性疾患モデルにおいて神経保護的であることが示されている（LＥＲαnth et al., 2000; Dubai et al., 2001; Wise et al., 2001; Jover et al., 2002; Rau et al., 2003; Sierra et al., 2003; Sribnick et al., 2003, 2005 ）。エストロゲンは親油性であり、容易に血液脳関門を通過し、直接的に神経保護的である可能性を有する（Brinton, 2001; Garcia-Segura et al., 2001; Wise et al., 2001）。ニューロンのエストロゲン仲介保護は、興奮毒性及び酸化ストレスによって誘発される神経変性を含む多様な神経変性のインビトロモデルにおいて示されている（Behl et al., 1995; Goodman et al., 1996; Behl et al., 1997; Harms et al., 2001）。エストロゲンはグルタミン酸誘発アポトーシスを減少させ、及び１次皮質ニューロンにおける電気生理学的機能を保存することも示されている（Sribnick et al., 2003, 2004）。加えて、インビトロ研究は、損傷へのアストロサイト応答を変調するエストロゲンの能力を示し（Azcoitia et al., 1999; Garcia-Segura et al., 1999）、及び細胞毒性からオリゴデンドロサイトを保護した（Sur et al., 2003; Cantarella et al., 2004; Takao et al., 2004）。しかしながら、神経保護に関与するエストロゲン及びエストロゲンレセプターサブタイプは十分に探索されていない。
【発明の開示】
【００２１】
発明の要旨
本発明の一般的目的は、自己免疫関連疾患、より特定的には、臨床総体的症状が妊娠の第３期間に改善することが示されている多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性甲状腺炎、ぶどう膜炎及び他の自己免疫疾患を含む、Ｔｈ１仲介（細胞仲介）自己免疫疾患を治療するために、哺乳動物にステロイドホルモンを投与する方法を提供することである。
【００２２】
該方法は、ＭＳを含む自己免疫疾患と、又は発症するリスクを有すると診断された分娩後患者の治療も含むことができる。該方法は、ＭＳを含む神経変性疾患と、又は発症するリスクを有すると診断された患者の治療も含むことができる。
【００２３】
本発明の一つの側面に従うと、エストロゲン又はエストロゲンレセプター有効組成物である一次剤の選択された用量及び経路を用いる自己免疫関連疾患の治療を提供することにより、これらの目的が達成される。該一次剤は、エストロゲンの効果を模倣するアゴニストのようなエストロゲンレセプター選択的リガンドを含むことができる。
【００２４】
本発明の一つの側面に従うと、経口投与を介して、約４〜１６ミリグラム／日又はより具体的には１日１度約８ミリグラムを含んでなるエストリオールの療法的有効量を患者に提供することにより、これらの目的が達成される。
【００２５】
本発明の別の側面に従うと、プロゲステロン、グルココルチコイド及び／又は自己免疫疾患を治療するために使用される公知の又は実験薬剤のような、療法的有効量の二次活性剤と組み合わされた療法的有効量の一次剤を提供することにより、これらの目的が達成される。
【００２６】
本発明の一つの側面に従うと、本発明は、多発性硬化症を含む自己免疫及び／又は神経変性疾患又は障害の臨床症状を予防又は寛解するため、抗炎症性及び／又は神経保護効果を有するエストロゲンレセプターアルファリガンドを含んでなる一次剤の使用を含んでなる。
【００２７】
本発明の一つの側面に従うと、本発明は、多発性硬化症を含む自己免疫及び／又は神経変性疾患又は障害の臨床症状を予防又は寛解するため、神経保護効果を有するエストロゲンレセプターベータリガンドを含んでなる一次剤の使用を含んでなる。
【００２８】
本発明の上記の及び多くの他の特色及び伴う利点は、付随する図面と併せて考慮した場合、以下の詳細な説明の考慮から明らかになるであろう。
好ましい態様の詳細な説明
この説明は制限的意味でとらえるべきではなく、単に本発明の一般原理を例示する目的で行われている。この詳細な説明の節の表題及び全体の組立は、便宜上のみの目的のためであり、本発明を制限することは意図されていない。
【００２９】
一般に、本発明は、自己免疫疾患の臨床症状を示す哺乳動物を治療する方法を含んでおり、選択された間隔で、有効な剤形での療法的に有効用量の一次剤を投与することを含んでなる。該治療は、疾患の総体的症状を軽減すること及び／又は進行を減じることを目的とする。本発明の好ましい態様において、ＭＳ（再発寛解又は二次進行型患者）と臨床的に診断されたヒト患者を毎日８ミリグラムのエストリオールの経口製剤で治療し、寛解された総体的症状を得た。
【００３０】
自己免疫疾患の寛解とは、治療のいずれかの観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、疾患の総体的症状の遅延された発症又は進行、いくつか又はすべての臨床的症状の重症度の軽減、又は全体の健康の改善により証明し得る。
【００３１】
例えば、自己免疫疾患の臨床症状を有する患者は、以下の症状のいくつか又はすべてにしばしば悩まされている：既存の症状の悪化（関節リウマチにおける関節痛のような）、新規症状の出現（関節リウマチにおいて冒された新規関節）又は増加した一般化された衰弱及び疲労。ＭＳ患者は特に以下の症状を患っている：衰弱、しびれ、刺痛、視覚の喪失、記憶困難及び極端な疲労。それ故、ＭＳにおいての疾患の寛解には、衰弱、しびれ、刺痛、視覚の喪失、記憶困難及び極端な疲労の発症の頻度又は重症度の減少が含まれるであろう。脳のイメージング（ＭＲＩ）上、疾患の寛解はガドリニウム増強病変の数又は容積の減少、Ｔ２病変の蓄積の安定化又は遅延、及び／又は萎縮形成の速度の遅延により証明されるであろう。免疫学的には、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０のような）の増加、Ｔｈ１サイトカイン（インターフェロンガンマのような）の減少が疾患寛解に関連するであろう。
【００３２】
患者は、自己免疫疾患を発生するリスクを有することを示している判断基準を発現することもできる。これらの患者は臨床総体的症状の発症を遅らせるために予防的に治療することができる。より具体的には、最初のエピソードからなる症候群（clinically  isolated syndromes ）（ＣＩＳ）を最初に示す患者は、本発明で概説した治療パラダイム（paradigm）を使用して治療することができる。これらの患者は、ＭＳと一致する少なくとも一つの臨床事象を有したが、定義された診断は別の時点での一つを超える臨床事象を必要とするので、ＭＳ診断の完全な基準には適合していない（McDonald et al., 2001）。本発明の治療は、臨床的に定義されたＭＳの発生を少なくとも予防すること又は遅延することにおいて有利である。
【００３３】
一次剤
本発明に有用な一次剤はステロイドホルモン、より特定的には、エストロゲン又はステロイド性又は非ステロイド性エストロゲンレセプター活性剤である。最も好ましくは、該一次剤はコハク酸エストリオール、ジヘキサン酸エストリオール又はスルホン酸エストリオールのようなエストリオール（エストラ−ｌ，３，５（１０）−トリエン−３，１６，１７−トリオール）、Ｅ３、である。しかしながら、該一次剤は、エストロン（Ｅｌ）又はエストロンの前駆体又は類似体、１７−ベータ−エストラジオール（Ｅ２）又は１７−ベータ−エストラジオールの前駆体（芳香化可能テストステロンを含んで）又は類似体、又はエストランジであることができる。
【００３４】
該一次剤は、エストロゲンレセプターアルファ又はベータで活性であるＥｌ、Ｅ２又はＥ３の代謝物又は誘導体であってもよい。代謝物又は誘導体は、Ｅｌ、Ｅ２又はＥ３と同様のコア構造を有することができるが、一つ又はそれより多くの環位置で一つ又はそれより多くの異なった基（例えば、ヒドロキシル、ケトン、ハライドなど）を有していてもよい。本明細書において援用される、Brattsandにより、WO97/08188又は米国特許第6,043,236号に記載されているもののような、エストロゲンレセプターで有効である合成ステロイドも本発明において有用である。
【００３５】
該一次剤は、エストロゲンレセプターアルファ又はベータ、アゴニスト及び／又はアンタゴニストであることもできる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、エストロゲンレセプターアルファ又はベータサブタイプの少なくとも一つに結合し、及び／又は活性又は結合に変化を起こすステロイド又は非ステロイド剤であることができる。例えば、ＥＲアルファ及びＥＲベータの特異的アゴニストは本発明において有用であることができる（Fritzmeier, et al.）。これらのアゴニストの用量は、ステロイド薬理学の当業者には公知の方法論により、妊娠間及びエストリオールでの治療間に観察されたものと同様の疾患に対する効果を達成するように滴定することができる。
【００３６】
これらのエストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤のいずれか一つ又は組み合わせは、選択された自己免疫疾患を治療するために使用することができる。エストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤の選択は、患者への治療の二次的副作用を考慮して行い得る。例えば、エストリオールを１７−ベータ−エストラジオールに関して選択でき、なぜなら、エストリオールは最小の子宮内膜増殖しか起こさず、及び乳癌の増加したリスクとは関連しない。最小の子宮内膜増殖は長時間作用型のエストリオール誘導体、ナイエストリオールが使用された場合に観察される。実際、エストリオールはインビボでエストロゲンレセプターへの１７−ベータ−エストラジオールの結合に対する部分アンタゴニスト作用を有し、エストリオールは、過去のある時点で乳癌の治療及び予防に対する治療剤として考えられていた。
【００３７】
一次剤の療法的に有効な用量
一次剤の療法的に有効な用量とは、基礎レベルより上の、及び好ましくは妊娠レベル又は妊娠レベルより上の血清濃度に上昇させるのに十分な用量である。最も好ましくは、一次剤の療法的に有効な用量は、第二又は第三の三半期の女性におけるその剤のステロイドホルモンレベルに等しい血清レベルを患者に生じるように選択される。
【００３８】
例えば、正常女性月経周期の間、エストラジオールレベルは約３５０ｐｇ／ｍｌ血清の範囲である。妊娠の間、約１０，０００〜約３５，０００ｐｇ／ｍｌ血清へのエストラジオールレベルの約１００倍の増加がある（Correale, et al. Journal of Immunology 161:3365 (1998)及びGilmore, et al. Journal of Immunology 158:446）。対照的に、非妊娠状態での月経周期間、エストリオールレベルは検出不可能である。エストラジオールレベルは妊娠の間に３，０００〜３０，０００ｐｇ／ｍｌ（３〜３０ｎｇ／ｍｌ）のレベルに連続的に上昇する（www.il-st-acad-sci.org/steroid1.html#se3t）。
【００３９】
一次剤がエストリオールである一つの態様において、好ましい用量は毎日約４〜１６ミリグラムであり、より具体的には、毎日約８ミリグラムである。この態様において、血清レベルは、好ましくは、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌに達し、約１０〜約３５ｎｇ／ｍｌ、又は最も好ましくは、約２０〜３０ｎｇ／ｍｌに達することができる（Sicotte et al. Neurology 56:A75）。いくつかの態様において、エストロン（Ｅ１）レベルは、好ましくは、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは、約１０〜３５ｎｇ／ｍｌに達する。いくつかの態様において、エストラジオール（Ｅ２）レベルは、好ましくは、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは、約５〜１８ｎｇ／ｍｌに達する（DeGroot and Jameson, 1994）。
【００４０】
一次剤の用量は、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢及び体重、患者が摂取している他の医薬及び担当医により通常考慮される他の因子に依存して、個々の患者について選択することができ、特定の患者について最も適切なように個々の投与計画及び用量レベルを決定する。
【００４１】
細胞仲介自己免疫疾患のための他の公知の又は実験的治療は、感染と戦う患者の能力を減少させること、及びエストロゲン治療では起こりえない肝臓又は心臓毒性を誘発することを含んで、患者に対して著しいリスク及び副作用を有する化学療法的免疫抑制剤であることから、一次剤のこのグループの使用は少なくとも有利である。ＭＳに使用される他の剤はこれらの副作用を起こさないが、インフルエンザに似た症状又は胸苦しさが付随する。さらに、これらの従来使用された剤は、毎日から週１回の範囲の頻度での注射を伴うので、局所皮膚反応が付随する。
【００４２】
剤形
剤形に含まれている一次剤の療法的に有効な用量は、選択された一次剤のタイプ及び投与の様式を少なくとも考慮することにより選択される。剤形は、薬学分野の当業者には公知であるように、患者への処方を容易にするための補助剤及び薬学的に許容できる担体を含む、他の不活性成分と組み合わされた活性一次剤を含むことができる。剤形は、一次剤が患者の組織内へ入ることを起こすのに適したいずれの形態であってもよい。
【００４３】
一つの態様において、一次剤の剤形は経口製剤（液体、錠剤、カプセルなど）であり、それは摂取された場合、上昇した血清エストロゲンレベルを生じる。経口製剤は、希釈剤、結合剤、時間放出剤、滑沢剤及び崩壊剤を含む慣用的担体を含んでなることができる。
【００４４】
本発明の他の態様において、該剤形は経皮適用のための局所製剤（ローション、クリーム、軟膏など）で提供することができる。もしくは、該剤形は経腟又は経直腸的適用のための座剤などで提供することができる。
【００４５】
エストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤がこれらの剤形で送達し得ることは、現在利用可能な療法（例えば、ＭＳについて）が、使用者にとって不便であり及び治療についての患者服薬遵守を減少させることを導く注射用であることから、有利である。非注射用剤形は、インフルエンザに似た症状（特にベータインターフェロン）及び脂肪萎縮症を導くことができる注射部位反応（特に、酢酸グラチラマー共重合体−１）を含む副作用を患者にしばしば起こす現在の注射治療よりもさらに有利である。
【００４６】
しかしながら、追加の態様において、該剤形は皮下、静脈内、筋肉内に又は呼吸系を介して適用されるべき製剤を可能にすることもできる。
二次活性剤
二次剤のいずれか一つ又は組み合わせを、一次剤と共に剤形中に含ませることができる。もしくは、二次剤のいずれか一つ又は組み合わせを、一次剤とは独立して、しかし免疫学的疾患の治療のために少なくとも二つの剤へ患者が暴露されるように時間的に同時に投与することができる。
【００４７】
二次剤は、好ましくは、患者の兆候を減じるための第１と相乗的に作用し、彼らの免疫疾患の治療のための少なくとも２つの剤に暴露される。
二次剤は、好ましくは、自己免疫疾患の総体的症状を軽減するために一次剤と相乗的に作用する免疫療法剤である。二次剤はエストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤の効果を増強する、エストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤の効果を減少させる、又はエストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤により影響される系とは異なった系に影響するように選択することができる。
【００４８】
二次活性剤は、免疫系の活性又は機能の変化を起こす免疫療法剤を含む。
一つの態様において、二次剤はプロゲステロン、前駆体、類似体又はプロゲステロンレセプターアゴニスト又はアンタゴニストの療法的有効量であることができる。最も好ましくは、該二次剤は毎日投与される１００−２００ミリグラムのプロゲステロンである。エストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤治療と組み合わされたプロゲステロンは、限定されるわけではないが、子宮内膜増殖及び乳癌を含む、長期エストロゲン暴露に付随するリスクに対して患者を保護することにおいて少なくとも有利である。
【００４９】
別の態様において、二次剤は、グルココルチコイド、前駆体、類似体又はグルココルチコイドレセプターアゴニスト又はアンタゴニストの療法的有効量であることができる。例えば、プレドニゾンを、最も好ましくは１日当たり約５〜６０ミリグラムの用量範囲で投与することができる。また、メチルプレドニゾン（Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ）を、最も好ましくは１日当たり約１〜２ミリグラムの用量範囲で投与することができる。グルココルチコイドは現在、この用量範囲内で、ＭＳにおける再発病状発生及び症候性ＲＡを治療するために使用される。
【００５０】
他の態様において、二次剤は、免疫療法化合物群から選択することができる。例えば、ベータインターフェロン（Avonex（登録商標）（インターフェロン−ベータ１ａ）、Rebiff（登録商標）（Seronoより）；Biogen,Betaseron（登録商標）（インターフェロン−ベータ１ｂ）Berlex,Schering）、酢酸グラチラマー共重合体−１（Copaxone（登録商標）;Teva),抗新生物（ミトキサントロンのような；Novatrone（登録商標）Lederle Labs）、ヒトモノクローナル抗体（ナタリズマブのような；Antegren（登録商標）Elan Corp.及びBiogen Inc.）、免疫抑制剤（ミコフェノール酸モフェチルのような；CellCept（登録商標）Hoffman-LaRoche Inc.）、パクリタキセル（Taxol（登録商標）；Bristol-Meyers Oncology)、シクロスポリン（シクロスポリンＡのような）、コルチコステロイド（プレドニゾン及びメチルプレドニゾンのようなグルココルチコイド）、アザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキサート、クラドリビン、４−アミノピリジン及びチザニジン及びナタリズマブ（Tysabri）。
【００５１】
これらの治療のために現在の療法的使用と一致する例としては、約０〜約３０ｍｇの用量で、Avonex（登録商標）を週に１回筋肉内に注射することができる。約０〜約０．２５ｍｇの用量で、Betaseron（登録商標）を２日に１回皮下に注射することができる。約０〜約２０ｍｇの用量で、Copaxone（登録商標）を毎日皮下に注射することができる。最後に、臨床試行データに基づいて決定されるべき療法用量及び間隔でRebiff（登録商標）を注射することができる。さらに、これらの二次剤は、エストリオール又はＥＲアルファ又はベータレセプターリガンドのような一次剤と組み合わせて、用量を増加して、一定で又は減少させて使用することができる。しかしながら、用量及び投与の方法は、エストロゲン治療と併用したこれらの療法の効果を最大にするように改変することができる。用量は、自己免疫疾患を診断すること及び治療することにおける当業者には公知である基準を使用して改変することができる。
【００５２】
好ましくは、二次剤は、ＭＳ患者を含む自己免疫疾患を有する患者を治療するために現在使用されている用量範囲で投与されるであろう。もしくは、該二次剤は、該一次剤との相乗的または重複した生理学的効果のため、減少した用量で又は減少した頻度で投与することができる。
【００５３】
好ましくは、自己免疫疾患の総体的症状を示している患者は上記の剤（二次剤を伴った又は伴わないエストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤）で治療される。最も好ましくは、限定されるわけではないが、妊娠の第二又は第三三半期間に観察されるパターンを反映することを含む、少なくとも治療計画間の総体的症状の改善を特色とする自己免疫疾患を患者は示す。
【００５４】
分娩後患者の治療
最近の臨床研究において、妊娠間、特に第三三半期における再発率の劇的な減少が注目され、分娩３ヶ月後のリバウンド増加を伴っている（赤ちゃんを産んだ患者のような、誕生日から１年後までを含む）。ＥＡＥモデルを使用した確認動物試験に加え、これらのデータは、性ステロイドが自己免疫疾患進行及び総体的症状に著明な効果を有し、及び末梢及びおそらく中枢神経系を有髄化すること及び再有髄化することに効果を有することを示唆する。
【００５５】
本発明の別の態様において、本発明は自己免疫疾患の症状を発現している又はリスクを有する女性分娩後患者を治療する又は該疾患から予防するためのステロイド療法の方法を含むことができる。本発明は自己免疫疾患の少なくとも一つの症状を有すると診断された対象を治療する又は該疾患から予防する方法を含むことができ、該症状を軽減し及び／又は該疾患の進行を遅くする。本発明に従った方法は、細胞仲介疾患の治療のため、エストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤である一次剤を投与することを含んでなることができる。本発明はさらに、免疫系に影響する二次剤での治療を含むことができ、それは同時投与しても又は漸減させてもよい。他の態様において、該用量での及び該剤形中での、一次剤、一次剤及び二次剤の組み合わせの使用は、自己免疫疾患について上述したように行われる。
【００５６】
本発明の一つの態様において、ＭＳ（再発寛解又は二次進行型患者）と臨床的に診断されたヒト分娩後患者は、毎日８ミリグラムのエストリオールの経口製剤で治療することができ、寛解された総体的症状を得た。加えて、患者には出産後にエストリオール又はエストロゲンを投与することができ、次ぎにCopaxone のような慣用的ＦＤＡ認可療法へ漸減させる。
【００５７】
分娩後自己免疫疾患の寛解とは、治療のいずれかの観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、疾患の総体的症状の遅延された発症又は進行、いくつか又はすべての臨床的症状の重症度の軽減、又は全体の健康の改善により証明し得る。
【００５８】
例えば、自己免疫疾患の臨床症状を有する患者は、以下の症状のいくつか又はすべてにしばしば悩まされている：既存の症状の悪化（関節リウマチにおける関節痛のような）、新規症状の出現（関節リウマチにおいて冒された新規関節）又は増加した一般化された衰弱及び疲労。多発性硬化症患者は特に以下の症状を患っている：衰弱、しびれ、刺痛、視覚の喪失、記憶困難及び極端な疲労。それ故、多発性硬化症においての疾患の寛解には、衰弱、しびれ、刺痛、視覚の喪失、記憶困難及び極端な疲労の発症の頻度又は重症度の減少が含まれるであろう。脳のイメージング（ＭＲＩ）上、疾患の寛解はガドリニウム増強病変の数又は容積の減少、Ｔ２病変の蓄積の安定化又は遅延、及び／又は萎縮形成の速度の遅延により証明されるであろう。免疫学的には、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０のような）の増加、Ｔｈ１サイトカイン（インターフェロンガンマのような）の減少が疾患寛解に関連するであろう。
【００５９】
患者は、自己免疫疾患を発生するリスクを有することを示している判断基準を発現することもできる。これらの患者は臨床総体的症状の発症を遅らせるために予防的に治療することができる。より具体的には、最初のエピソードからなる症候群（clinically  isolated syndromes ）（ＣＩＳ）を最初に示す患者は、本発明で概説した治療パラダイム（paradigm）を使用して治療することができる。これらの患者は、ＭＳと一致する少なくとも一つの臨床事象を有したが、定義された診断は別の時点での一つを超える臨床事象を必要とするので、ＭＳ診断の完全な基準には適合していない（McDonald et al., 2001）。本発明の治療は、臨床的に定義されたＭＳの発生を少なくとも予防すること又は遅延することにおいて有利である。
【００６０】
ＥＲアルファレセプターアゴニストである一次剤での治療
一つの態様において、本発明は多発性硬化症を含む自己免疫疾患の臨床症状を予防する又は寛解する抗炎症性及び神経保護効果を有するエストロゲンレセプターアルファリガンド（アゴニストのような）を含んでなる一次剤の使用を含んでなる。
【００６１】
上記のように、多発性硬化症は炎症性、神経変性疾患であり、それに対しては実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）がモデルである。エストロゲンでの治療は、抗炎症性及び神経保存機構を介してＥＡＥの重症度を減少させることが示された。より最近、エストロゲンレセプターアルファ（ＥＲアルファ）リガンドは臨床的ＥＡＥにおいてエストロゲン仲介保護を再現できることが決定された。以下の実施例に記載されているように、高度に選択的なＥＲアルファアゴニスト（プロピルピラゾールトリオール）でのＥＡＥ治療は、野生型及びＥＲベータノックアウトマウス両方において臨床疾患を寛解したが、ＥＲアルファノックアウトマウスでは寛解されず、疾患の間、ＥＲアルファリガンドはＥＲアルファ選択性をインビボで維持したことを示唆している。抗炎症性及び神経保護効果には、減少した自己抗原特異的炎症促進性サイトカイン産生、増加した抗炎症性サイトカイン、減少した神経系炎症、減少した脱髄、ニューロン喪失の減少、軸索相互作用の減少、減少した白質病変、減少した軸索数喪失、減少した神経系単球活性化及び減少した神経系ミクログリア活性化が含まれる。実施例５及び６及び図５〜１０を参照されたい。
【００６２】
神経変性疾患／障害を有する患者の治療
本発明の別の態様において、本発明は、ＭＳを含む神経変性疾患及び障害の治療を含んでなる。本発明は神経変性疾患又は障害の少なくとも一つの臨床症状と診断された又は示す対象を治療する又はそれを予防する方法を含むことができる。
【００６３】
本発明に従った方法は、該疾患又は障害を予防する、頻度を減少させる、又は症状の重症度及び／又は進行を減少させるため、選択された間隔で、有効剤形中に療法的に有効な用量で一次剤を投与することを含んでなることができる。
【００６４】
一つの具体的態様において、本方法は、毎日８ミリグラム（経口製剤中のような）のエストリオールを投与することを含んでなることができ、寛解された総体的症状を得る。一つの他の態様において、本方法は二次剤としてエストロゲン及びプロゲスチン又はプロゲステロンの組み合わせで該患者を治療することを含んでなることができる。他の態様において、該用量での及び該剤形中での、一次剤、一次剤及び二次剤の組み合わせの使用は、自己免疫疾患について上述したように行われる。
【００６５】
他の態様において、該一次剤はエストロゲンレセプターベータアゴニストのようなエストロゲンレセプターベータリガンドを含んでなることができる。ＥＡＥ動物モデルにおいて、エストロゲンレセプターベータアゴニストは、減少した脱髄、減少した軸索喪失、減少したニューロン異常及び減少した運動機能障害及び減少した再発を含む、有意な神経保護効果を有することが見いだされた。以下の実施例６及び図１１〜１８を参照されたい。
【００６６】
本発明が有効であることができる神経変性疾患及び障害には、限定されるわけではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、前頭側頭型認知症（ピック病）、プリオン病及びハンチントン病が含まれる。エストロゲン又はエストロゲンレセプター活性剤での薬理学的結果に基づいて治療できるであろう追加の障害には、限定されるわけではないが、脳虚血、突発性パーキンソン病、局所性又は薬剤誘発パーキンソン症候群、アルツハイマー病及び異なった起源の脳認知症症候群、ハンチントン舞踏病、ＡＩＤＳ脳症のような感染誘発神経変性障害、クロイツフェルト・ヤコブ病、麻疹及びヘルペスウイルス及びボレリア症により誘発される脳症、肝性、アルコール性、低酸素性、低又は高血糖性脳症ならびに溶剤又は医薬品により誘発される脳症のような代謝性中毒性神経変性障害、種々の起源の変性網膜障害、外傷的誘発脳及び骨髄損傷、医薬、毒素、病原性毒素及び薬物の投与及び／又は中止後のようなさまざまな起源の脳興奮性亢進症状、精神的及び外傷的誘発脳興奮性亢進状態、代謝、薬物、毒素性及び感染性誘発多発神経炎及び多神経炎及び気管支痙攣効果のような末梢神経系の神経変性症候群が含まれる。
【００６７】
キット
本発明の別の側面において、診療所で治療している医師又は自己投与治療のために処方をうけた患者による使用のためにキットが提供される。本発明のキットは、患者の臨床症状のために適切な用量及び剤形の、少なくとも一つの一次剤及び一つの二次剤を含む。
【００６８】
該キットの第一の態様において、該一次剤は約４〜１６ミリグラムの量のエストリオールであり、及び該二次剤は約１００〜約２００ミリグラムの量のプロゲステロンである。このキットの第二の態様において、該一次剤は約４〜１６ミリグラムの量のエストリオールであり、及び該二次剤はプレドニゾン（１日当たり約５〜６０ミリグラム）又はメチルプレドニゾン（１日当たり１〜２ミリグラム）のようなグルココルチコイドである。
【００６９】
本発明の第三の態様において、該一次剤は約４〜１６ミリグラムの量のエストリオールであり、及び該二次剤はBetaseron（登録商標）約０．２５ミリグラム又はAvonex（登録商標）３０ｍｇの量のベータインターフェロンである。該キットの第四の態様において、該一次剤は約４〜１６ミリグラムの量のエストリオールであり、及び該二次剤はCopaxone（登録商標）約２０ミリグラムの量の酢酸グラチラマー共重合体である。
【００７０】
該キットは、好ましくは、治療している医師又は自身の自己免疫疾患を治療している患者による使用のための説明書も含む。こうした情報は、少なくとも一次剤用量及び二次剤用量の投与のためのスケジュールを含むであろう。
【００７１】
本発明は上で好ましい態様に関して説明してきたが、上記好ましい態様への多数の改変及び／又は追加が、当業者には容易に明らかになるであろう。
【実施例】
【００７２】
実施例１
方法：試験デザイン
６ヶ月の治療前期間、経口エストリオール（８ミリグラム／日）を服用する６ヶ月治療期間及び６ヶ月の治療後期間の間、毎月の脳ＭＲＩにクロスオーバーデザインを使用し、示したように臨床及び実験室評価を行った（図１Ａ）。
【００７３】
組み入れ基準
臨床的に定義されたＭＳを有し、年齢１８〜５０、０〜６．５のＥＤＳＳを有し、少なくとも６ヶ月はインターフェロンベータ及び共重合体−１を受けていず、及び少なくとも３ヶ月はステロイド治療を受けていない女性が適格であった。Ｔ２強調脳ＭＲＩスクリーニングで少なくとも５ｃｍ３の病変量が必要とされた。妊娠した又は看護を受けている、経口避妊薬又はホルモン置換療法を受けている、又は血栓症、腫瘍又は婦人科疾患の病歴を有する、又は全リンパ節照射、モノクローナル抗体、Ｔ細胞ワクチン接種、クラドリビン又は骨髄移植で過去に治療された対象は除外した。
【００７４】
患者
臨床的に定義されたＭＳを有する１２人の女性患者が登録された。６人はＲＲ疾患を有し、及び６人はＳＰ疾患を有していた。６人のＲＲはすべて、及び６人のＳＰ患者の内４人が全１８ヶ月の研究期間を完了した。１人のＳＰ患者は、外部神経学者による強直性痙攣についてのステロイドによる長期治療のため、及び別の患者は治療後期間にも治療されることを望んだために研究を中止した。全研究を完了した１０人の患者は、平均年齢は４４歳（２８〜５０歳の範囲）であり、及び平均ＥＤＳＳは３．３（１．０〜６．５の範囲）であった。ＳＰ患者についての平均ＥＤＳＳは５．０であり、一方、ＲＲ患者についての平均ＥＤＳＳは２．２であった。ＲＲ患者においては１８ヶ月の試験が延長され、それにより治療を再設定した。
【００７５】
投薬
最初の治療フェーズについては、UCLA Pharmacuetical Services により、微粒子化U.S.P.グレードエストリオール粉末（Medisca, Inc., Plattsburg, NY）がカプセル内に封入された。ＲＲ患者での延長再治療フェーズの間、１人を除いて全員がエストリオール（８ミリグラム／日）＋プロゲステロン（１００ミリグラム／日）のカプセルを受け、一方、子宮摘出を受けていた１人のＲＲ患者はエストリオール（８ミリグラム／日）のみを受けた（Women's Internation Alpha rmacy, Madison, Wis.）。
【００７６】
臨床及び安全性尺度
研究を通して、神経学者クルツケ（ＲＶ）によるクルツケの拡大機能障害状態スケール（ＥＤＳＳ）を使用して対象を評価した。各来院時、研究看護士（ＲＫ）はペーストオーディトリーシリアルアディションテスト（paced auditory serial addition test）（ＰＡＳＡＴ）及び９−ホールペグテスト（9-hole peg test）を行った。ＳＭＡｌ２、コレステロールパネル、血球数及びホルモンレベル（エストリオール、エストラジオール、エストロン、ＬＨ、ＦＳＨ、コルチゾール、プロゲステロン）を調べるため採血した。血清中のエストリオールレベルは、製造元の説明書（Oxford Biomedical, Oxford, Mich.）に従って、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【００７７】
遅延型過敏症応答（ＤＴＨ）
破傷風（Tetanus Toxoid, Wyeth Laboratories, Marietta, PA）及びカンジダ（Candin, Allermed Laboratories, San Diego, CA)に対するＤＴＨは２つの時点で試験し、一度は研究３ヶ月目の治療前期間及び一度は研究１２ヶ月目の治療期間の終わりであった（図１ａ）。６人の非処置、健康な対照女性の群も、同一の時間間隔（９ヶ月）をあけて２回試験した。前腕の前側表面に皮内で０．１ｍｌの各溶液を注射した。各注射部位の硬化を４８時間後に読み取った。各部位を２回測定し、１回は垂直に、１回は水平に測定して平均を記録した。同一の看護士（ＲＫ）がすべての注射を行い、両方の時点ですべての対象のすべての応答を読み取った。
【００７８】
逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応
ヘパリン処理静脈血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、冷凍保存した。ＰＢＭＣは、２回の治療前時点及び２回の治療時点間の所与の患者分から同時にＰＢＭＣを解凍した。全ＲＮＡを単離し、ＤＮＡを除去し、及びｍＲＮＡを逆転写した。ＩＦＮガンマ及びアクチンの両方を同一のｃＤＮＡから増幅したが、しかしながら、アクチンの増幅に先立ってはｃＤＮＡを１：９で希釈した。増幅は、ＩＦＮγ及びアクチンプライマー配列（Life Technologies, Rockville, Md.）を使用し、１ｍＭ  MilligramsCl2中で行った。相補的ＤＮＡは３５サイクル増幅した：４５秒＠９５℃、６０秒＠５４℃及び４５秒＠７２℃。ＰＣＲ生成物は、臭化エチジウム含有１．５％アガロースゲルで分離し、デンシトメトリーを実行した。
【００７９】
ＭＲＩ
スキャンは１．５Ｔ  G.E. スキャナーで実施した。得られたパルス配列はガドリニウム（Omniscan  ０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）を用いる又は用いないＴ１強調スキャン及びＰＤ／Ｔ２強調スキャンであった。デジタル化画像データは、さらなる処理のためにＳＧＩワークステーション（Silicon Graphics, Inc）に移された。新規及び全ガドリニウム増強病変の数及び容積は、半自動化閾値に基づいた技術を使用して（Display, Montreal Neurological Institute)、１人の経験のあるオペレーター（ＮＳ）により決定された。オペラーターには患者がＲＲ又はＳＰ疾患を有するかどうかは知らされなかった。Ｔ２容積を計算するため、頭蓋骨取り除き、ｒｆ補正及び空間規格化後に、注文に応じて半自動化された、閾値に基づいた、シード拡張アルゴリズムが使用されて病変容積が決定される。すべてのスキャンは、患者がＲＲ又はＳＰ疾患を有するかどうかを知らされていない同一の技術員により計数された。
【００８０】
統計解析
１サンプル、対応のあるｔ−検定（paired,t test）を、治療前と比較した治療間のＤＴＨ応答、ＩＦＮガンマレベル及びＰＡＳＡＴ認知試験スコアのパーセント変化の有意性を確認するために使用した。ノンパラメトリックウィルコクソンの符号付順位和検定を、６ヶ月ベースライン期間及び各治療期間、治療後期間及び再治療期間の間の、ＭＲＩ上の病変数及び容積の増強における統計的比較のために使用した。
【００８１】
結果
エストリオールレベル及び許容性
治療及び再治療間の血清エストリオールレベルは、妊娠６ヶ月の女性で観察されたレベルに近かったが、妊娠８．５ヶ月の女性よりも低かった（図１Ｂ）。以前の報告と一致し、エストリオールは月経周期異常でのみよく許容された。ＬＨ、ＦＳＨ、コルチゾール、プロゲステロン、エストラジオール及びエストロンを含むいずれの検査値にも有意な変化はなかった。
【００８２】
免疫応答
破傷風及びカンジダに対する皮膚試験を治療前期間に１回及び治療期間の終わりに１回実施して、治療によりそれらが減少していないかどうかを決定した。破傷風に対するＤＴＨ応答は、治療前ベースラインである研究３ヶ月目のＤＴＨ応答と比較して、患者がエストリオールを投与されて６ヶ月目である研究１２ヶ月目では有意に（Ｐ＝０．００６）減少した（図２Ａ）。カンジダに対するＤＴＨ応答は、より不定に減少した。
【００８３】
ＩＦＮガンマは、Ｔｈ１応答に対する特徴的なサイトカインである。それ故、治療前及び治療期間の間に患者からエキソビボで誘導された非刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＦＮガンマレベルを評価した。６人のＲＲ患者において、ＩＦＮガンマのレベルは、ベースライン治療前レベル（３及び６ヶ月目）と比較して、９ヶ月目（エストリオール治療の３ヶ月後）で不定に減少し、そして次ぎに、研究１２ヶ月目（エストリオール治療の６ヶ月後）で有意に減少した（Ｐ＝０．００３）（図２Ｂ）。対照的に、４人のＳＰ患者においてはＩＦＮガンマの減少はなかった。これらのデータは、ＲＲ患者の免疫系は、ＳＰ患者と比較して、Ｔｈ１応答を減少させることを目的とする治療をより受け入れるという概念と一致している。また、エストリオール治療がＰＭＢＣによるサントカイン産生を改変しうるという観察は、免疫組織及び細胞中のエストロゲンレセプターアルファ及びベータを示している報告と一致する。
【００８４】
ＭＲＩ
ＭＳ患者における再発率に対する妊娠の保護効果及びガドリニウム増強病変と再発との関連に基づいて、エストリオール治療は、連続脳ＭＲＩで増強されている病変の減少に見られるように抗炎症効果を有するらしいという仮説を我々は立てた。６ヶ月目の治療前ベースライン期間と比較し、全１０人のＭＳ患者（６ＲＲ、４ＳＰ）についての増強病変の総容積及び数が治療期間の間に減少した。群において全体としてのこの改善は、ＲＲ（ＳＰではなく）群におけるエストリオール治療の有利な効果によりもたらされた（図３Ａ及び３Ｂ）。ＲＲ群におけるエストリオール治療の治療効果がそれ故、さらに詳細に試験された。ＲＲ患者の治療の最初の３ヶ月以内に、全増強病変容積中央値は７９％減少し（Ｐ＝０．０２）、及び数は８２％減少した（Ｐ＝０．０９）（図３Ｃ及び３Ｄ）。治療の次の３ヶ月間でも減少し続け、病変容積は８２％減少し（Ｐ＝０．０１）、数は８２％減少した（Ｐ＝０．０２）。治療後期間において、全増強病変容積及び数の中央値は、治療を止めた最初の３ヶ月で不定になった後、治療後期間の最後の３ヶ月でほとんどベースラインレベルに戻った。４ヶ月の再治療延長フェーズの間、本来のベースラインと比較して、増強病変容積は再び８８％減少し（Ｐ＝０．００８）、及び数は、今回は４８％再び減少した（Ｐ＝０．０４）（図３Ｃ及び３Ｄ）。新規増強病変容積及び数の中央値の変化は、全病変数及び容積中央値と同様のパターンに従った（図３Ｅ及び３Ｆ）。
【００８５】
全群についてのＴ２病変容積中央値は１５．３ｃｍ３（６．１〜３３．８の範囲）であり、ＲＲ及びＳＰ群間でＴ２容積中央値の有意な相違はなかった。増強病変データと一致して、連続Ｔ２病変容積は、エストリオール治療はＲＲ患者に最も有益である傾向があったことを明らかにした。ＲＲ群において、Ｔ２病変容積中央値は、６ヶ月の治療期間の間は安定であり（０％変化）、６ヶ月の治療期間の間に増加し（７．４％より高く）、及び次ぎに、４ヶ月の再治療延長期間中に減少した（２．０％より低く）。
【００８６】
臨床測定
再発はわずかであり、研究の間に有意な変化を示さなかった。６人のＲＲ患者において、再発は１人が治療前の期間に、１人が治療期間中に、２人が治療後期間中に起こり、再治療期間では起こらなかった。ＳＰ患者において再発は起こらなかった。ＥＤＳＳ及び９ホールペグテストスコアは研究の間、有意な変化を示さなかった（表１）。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
興味深いことに、ＰＡＳＡＴ認知試験スコアはＲＲ群において有意に改善されたが、ＳＰ群では改善されなかった（図４）。ＲＲ患者におけるＰＡＳＡＴスコアのこの改善はベースラインと比較した治療間で１４．０％であり、統計的有意性に到達していた（Ｐ＝０．０４）。試験間の長時間の間隔（９ヶ月）のため、及び試験の別バージョンが各患者に使用されたため、この改善が完全に反復された試験の実施効果のためであることはありそうもない。ＲＲ  ＭＳ患者のＰＡＳＡＴスコアに対するエストリオール治療のこの有益な効果は、手術閉経期女性におけるエストロゲン置換療法及びアルツハイマー病における高用量エストロゲン治療の有益な効果を記述している以前の報告と一致している。Sicottte, et al. Treatment of Woman with Multiple Sclerosis Using Pregnancy Hormone Estradiol: A Pilot Study. Neurology, 56 (8 Supp. 3):A75, April 2001, 及びSicottte, et al. Treatment of Multiple Sclerosis with the Pregnancy Hormone Estradiol, Neurology 2002，投稿中、はその全体が本明細書において援用される。
【００８９】
実施例２
エストロゲン治療と組み合わされたプロゲステロンは子宮内膜増殖及び癌に対する保護を示した。実際、エストロゲンは子宮を有するいずれの女性においても、「対立しない」様式で長期間与えることは不可能である。それ故、１２人の患者の内の７人は、１８ヶ月の研究の完了後、エストリオールを残すことを欲した。これらの患者は、１日当たり８ミリグラムのエストリオール及び１００ミリグラムのプロゲステロンの投与に戻した。本研究の延長フェーズは治療後フェーズの完了後に始まった。これらの延長フェーズは４ヶ月持続した。各７人の患者は、４ヶ月の延長フェーズの間、毎月ＭＲＩを測定した。加えて、各７人の患者は、このフェーズの終了時点で神経学的に試験し、及び血清学的な研究を行った。８ミリグラムのエストリオール治療と組み合わされた１００ミリグラムのプロゲステロンで既知の負の効果は気付かれなかった。
【００９０】
実施例３
試験的臨床試行において、非妊娠女性ＭＳ患者をエストリオールで治療し、血清中に妊娠レベルを誘導した。この治療はプロトタイプインビボＴｈＩ応答、遅延型過敏症応答を減少させ、ならびにＴｈ１（ＴＮＦα、ＩＦＮγ）を減少させ及び末梢血単球細胞によるＴＨ２（ＩＬ５、ＩＬ１０）サイトカイン産生を増加させた（Siotte et al., 2002; Soldan et al., 2003）。また、連続脳磁気共鳴画像（ＭＲＩ）上のガドリニウム増強病変は、＞８０％減少した（Sicotte et al., 2002）。脳ＭＲＩ上の増強病変活性はＭＳの再発についての推定バイオマーカーであるので、これらの報告を一緒にすると、再発寛解ＭＳ（ＲＲＭＳ）における妊娠の抗炎症効果を再び繰り返すことができることを示唆している。
【００９１】
実施例４
３３歳の白人女性患者が、再発寛解多発性硬化症を有していると診断された。最初の子供（現年齢７）を出産後、該患者はCopaxoneのみで治療され、６週で再発した。第二子（現年齢３）を出産後、該患者は再びCopaxoneのみで治療され、この時は４．５ヶ月で再び再発した。続いての妊娠後、分娩後再発を予防する試みとして、該患者は８ｍｇエストリオール／日で治療された。
【００９２】
患者の第三子（現在６ヶ月）の誕生後、前のようにCopaxoneでの治療を再開した。しかしながら、分娩後１０日目に、彼女は経口剤形のエストリオール８ｍｇ／１日を摂取しはじめた。該患者は分娩後６ヶ月の間再発がなく、神経学的検査では、最小の能力障害（ＥＤＳＳ＝１）の他は変化していなかった。増強ＭＳ病変を検出するためのガドリニウムを使用する月に一度の脳ＭＲＩは、再発よりも炎症性疾患活性についてより敏感であるので、該患者は分娩後４、５及び６ヶ月目に連続して月に一度のＭＲＩを行った。４ヶ月目には増強はなく、５ヶ月目に一つの小さな増強病変のみ、及び６ヶ月目に前月からの単一病変の小さな残余の、弱まった増強のみであった。新規増強は６ヶ月目では観察されなかった。Ｔ２病変全体量は通して安定であった。
【００９３】
該患者は、子宮内膜を安定化させるため及び避妊のため、１０日目から１日当たりプロゲステロンミニピル（ノルエチンドロン、毎日０．３５ｍｇ）、１ピルを使用していたにもかかわらず、不規則な月経出血が増加した。３及び６ヶ月目での子宮超音波は、過形成を示唆するわけではない不安定なライニングと一致する薄い（厚くない）子宮内膜を示した。該患者は２週間プロゲステロンミニピルを２倍にし、子宮内膜を安定化させた。その他の点では有害な事象は報告されていない。
【００９４】
実施例５
動物
８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスはTaconic（Germantown, NY)から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに１６世代戻し交配したＥＲαＫＯマウスは、Dennis Lubahn 博士（University of Missouri, Columbia, MO）（Lubahn et al., 1993）から親切にも供与された。Ｆ１６クロスからの野生型リッターメートをＥＲαＫＯ対応対照として使用した。Jan Ake Gustafsson 博士から親切にも供与されたＥＲβＫＯマウス（Karolinska Institute, Stockholm, Sweden) （Krege et al., 1998）をＣ５７６ＢＬ／６に８世代戻し交配した。これらのクロスからの野生型リッターメートをＥＲβＫＯ対応対照として使用した。動物はNational Institutes of Health により設定されたガイドライン下に収容し、University of California, Los Angeles Chancellor's Animal Research Committee及びPublic Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals に従って実験を実施した。
【００９５】
試薬
ＰＰＴはTocris Bioscience（Ellisville, MO）から購入し、及びＥ２はSigma- Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。薄液膜、ミグリオール８１２Ｎは、Sasol North America（Houston, TX）から購入した。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、アミノ酸３５〜５５、はChiron Mimotopes（San Diego, CA）により＞９８％の純度で合成された。
【００９６】
ＥＡＥ
活性ＥＡＥ誘導は、以前に記載されているように（Suen et al., 1997; Liu et al., 2003）、完全フロイントアジュバント中、自己抗原ＭＯＧペプチド、アミノ酸３３〜５５（３００μｇ／マウス）及びミオバクテリウム・ツベルクローシス（５００μｇ／マウス）を含有する乳濁液の皮下注射により確実なものにした。マウスは以下に記載されているようにホルモン処置を行い、以前に記載されているように（Pettinelli and McFarlin, 1981）、標準ＥＡＥ類別スケールを使用してＥＡＥ疾患重症度について毎日モニターした。簡単には、毎日、各マウスについての臨床スコアを決定し、各マウスは標準０〜５スケール：０、無影響；１、尾がぐにゃぐにゃしていること（limpness）；２、うまく転がれない；３、部分麻痺；４、完全麻痺；及び５、瀕死；を使用して類別化した。毎日、所与の処置群内のすべてのマウスの臨床スコアの平均を決定し、それにより該群についての平均臨床スコアを得る。何匹かのマウスは、疾患誘導後４０日まで臨床的に追跡し、他は機構的研究のためにより早く、ビヒクル処置群では臨床徴候の発現１〜２日後（疾患誘導１６〜１９日後）に殺した。
【００９７】
処置
イソフルラン麻酔メスマウスを卵巣切除し、１０日間回復させた。油性ビヒクル単独、エストラジオール又はＰＰＴによる毎日の処置はＥＡＥ免疫化７日前に始めた。エストラジオール及びＰＰＴは、１０％エタノール及び９０％油性液に溶解し、マウス当たり、エストラジオールは０．０４ｍｇ／ｋｇ／日（Jansson et al., 1994）及びＰＰＴは１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（Harris et al., 2002）の最終最適濃度とした。エストラジオール、ＰＰＴ又はビヒクル単独は中央バックラインに沿った、毎日の皮下注射により与え、全疾患持続期間について続けた（疾患誘導後４０日まで）。
【００９８】
灌流
マウスをイソフルランで深く麻酔し、氷冷０．９％生理食塩水、続いて１０％ホルマリンで経心的に灌流した。脊髄柱を除去し、１０％ホルマリン中で一夜、後固定し、２０％スクロース含有ＰＢＳ溶液で凍結保護した。該柱から脊髄を除去し、３部分（頚部、胸部及び腰部）に切断し、ゼラチン／スクロース混合物中に包埋した。ゼラチン中の脊髄領域はさらに後固定し、２０％スクロース中で保存した。スライディングミクロトームで浮遊性切片（２５μｍ厚）を冠状に切断し、ＰＢＳ中で連続的に集めた。
【００９９】
子宮重量
マウスを殺した後、以前に記載されているように、各子宮を抽出し、脂肪、結合組織及び過剰体液を除去して各子宮重量を得た（Frasor et al., 2003）。
【０１００】
免疫応答
脾臓を、灌流前の深い麻酔の間に採取した。脾細胞は２５μｇ／ｍｌの自己抗原、ＭＯＧペプチド３５〜５５で刺激した。４８及び７２時間後に上清を採取し、以前に記載されているように、ＴＮＦα、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）インターロイキン−６（ＩＬ６）及びＩＬ５のレベルをサイトメトリックビーズアレイ（cytometric bead array）（BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA）により決定した（Liu et al., 2003）。
【０１０１】
組織病理学及び免疫組織化学
連続切片をスライドにマウントし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ニスル（Nissl）又はルクソール（Luxol）ファーストブルー（ＬＦＢ）−クレシル紫で染色した。連続切片は免疫組織化学によっても試験した。簡単には、２５μｍ浮遊性切片を０．３％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳで透過処理し、１０％正常ヤギ血清でブロックした。白質免疫染色は、透過処理及びブロッキングの前に９５％エタノール／５％酢酸で１５分、切片を処理することにより増強された。特異的細胞型及び構造を検出するため、２％ＮＧＳを含有するＰＢＳ溶液中、切片を一次抗体と室温で２時間、そして次ぎに４０℃で一夜プレインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：抗β３チューブリン及び抗神経フィラメント−ＮＦ２００［モノクローナル（Chemicon, Temecula, CA）；ポリクローナル（Sigma Biochemical）]、抗ニューロン特異的核タンパク質（ＮｅｕＮ）、抗ＣＤ４５（Chemicon）、抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；Chemicon）及び抗Ｍａｃ３（BD Biosciences, Pharmingen）。第二抗体工程は、ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ及びＣｙ５（Vector Laboratories and Chemicon）にコンジュゲートされた抗体での標識により実行した。ＩｇＧ対照実験がすべての一次抗体について実施されたが、これらの条件下、染色は観察されなかった。細胞数を評価するため、核染色剤、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；２ｎｇ／ｍｌ；Invitrogen, Eugene, OR）を、第二抗体添加後の最終洗浄前に加えた。切片をスライドにマウントし、乾燥し、Fluoromount G（Fisher Scientific, Hampton, NH）中でカバースリップをのせた。
【０１０２】
顕微鏡検査
共焦点顕微鏡（TCS-SP; Leica, Mannheim, Germany）又はカメラに連結されたPlan Fluor対物レンズ（DP7O; Olympus）を備えた蛍光顕微鏡 （BX51WI; Olympus, Tokyo, Japan）を使用して、染色切片を試験及び撮影した。デジタル画像は、Leica共焦点及びDP70カメラソフトウェアーを使用して集め及び分析した。画像はAdobe Photoshop（Adobe Systems, San lose, CA)を使用して整理した。
【０１０３】
定量化
免疫染色結果を定量するため、脊髄レベルＴ１〜Ｔ５からの切片、各動物から６、処置群当たりｎ＝３のマウスで、処置群当たり総計で１８の切片を試験した。画像はDP7O Imageソフトウェアー及びDP70カメラ（両方ともOlympusから）を使用して顕微鏡下で捕捉した（４Ｘ、１０Ｘ又は４０Ｘ）。各実験の組からのすべての写真に、同一の光強度及び露光時間を適用した。脊髄の同一領域からの画像が比較され（Ｔｌ〜Ｔ５）、描かれた全灰白及び白質領域から別々に獲得された。前角の中央領域が灰白質分析のための中心であり、一方、前角の外側領域が白質分析のための中心であった。６つの灰白質及び６つの白質の画像を、各処置群中の３匹の動物からのＴ１〜Ｔ５切片（１００μｍ離れて）の２つの部位から集めた。すべての画像をグレースケールに変換し、次ぎにhttp://rsb.info.nih.gov/ii からダウンロードしたＩｍａｇｅ  Ｊバージョン１．２９（NIH Imageのウィンドウバージョン）での密度測定により分析した。固定０〜１６０の閾値範囲を選択して正常脊髄切片中の染色シグナルを強調し、この範囲内の全領域を測定し、平均し、そして比較した。
【０１０４】
ＥＡＥ誘導後の浸潤性細胞の総数の増加を、全白質中のＤＡＰＩ＋核の密度測定により測定した。ニューロンを全灰白質中の平方ミリメートル当たりのＮｅｕＮ＋／β３−チューブリン＋／ＤＡＰＩ＋細胞を計数することにより定量した。白質及び灰白質両方の評価が、そのＴ１〜Ｔ５脊髄切片に存在する。４０Xでのレーザー走査型共焦点顕微鏡スキャンを、レベルＴ１〜Ｔ５前角に対応するＭａｃ３＋／β３−チューブリン＋免疫染色脊髄切片で実施した。各実験の結果は、マウス当たり４つの一側性レベルから平均し（１００μｍ離れて、各処置群で３匹のマウス、処置群当たり総計で１２の切片）、健康対応対照と比較した平均倍数変化として表現された。
【０１０５】
統計分析
ＥＡＥ疾患重症度は、フリードマンテストを使用して群間で比較し、組織病理学的変化は、１ｘ４ＡＮＯＶＡを使用して評価し、及び子宮重量及びサイトカインレベルは、以前に記載されているように（Dalai et al., 1997）、スチューデントｔ検定を使用して処置群間を比較した。
【０１０６】
結果
ＥＲαリガンドでの処置は、ＥＡＥ間にインビボでＥＲαについて高度に選択的なままである。
【０１０７】
我々のＲＡＥ実験に使用するためのＥＲα選択的リガンドの用量は、対照組織（子宮）に公知の生物学的応答を誘導することができた。子宮重量におけるエストロゲン誘発増加は、ＥＲαにより仲介されることが以前に示されており、このインビボ処置に必要とされるＥＲαリガンドＰＰＴの用量が記載されている（Frasor et al., 2003）。子宮重量を増加させることが以前に示されている用量（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）でのＰＰＴの毎日の皮下注射は、疾患誘発４０日後に、ＥＡＥを有するメスＣ５７ＢＬ／６マウスの子宮重量の有意な増加を生じた、図１Ａ。この技術への感受性は、偽手術された、ビヒクル処置マウスと比較された卵巣切除マウスの子宮重量の減少により示された。エストラジオールの高用量（血清に妊娠レベルを誘導する）の注射での処置は陽性対照として働き、一方、ビヒクル単独の注射での処置は陰性対照として働く。この用量のＰＰＴのインビボ選択性をさらに示すため、ＥＲα又はＥＲβノックアウトマウスのＰＰＴ処置間に子宮栄養応答も試験した。子宮重量の有意な増加がＰＰＴ処置ＥＲβノックアウトマウスで観察されたが（図１Ｂ）、ＥＲαノックアウトマウスでは観察されなかった（図１Ｃ）。合わせると、ＥＲαリガンドＰＰＴの投与のこの方法は、陽性対照組織に、インビボで期待された生物学的応答を誘発することをこれらのデータは示している。
【０１０８】
図５は、ＥＲα選択的リガンドでの処置がＥＡＥの間インビボで高度に選択的であることを示している結果を表している。図５Ａに示されたように、ＥＲαリガンドＰＰＴでの処置は子宮重量に期待された生物学的応答を誘発した（ｙ軸＝グラムでの子宮重量）。子宮重量は、１０ｍｇ／ｋｇ／日で毎日皮下注射として与えられたＰＰＴとともに増加した。偽手術と比較された卵巣摘出術での子宮重量の減少は、エストロゲンレベルの相違に関連する子宮重量の相違を検出することにおける該技術の感受性を示している。後期妊娠レベルのエストラジオールを誘導することが公知のエストラジオールの用量での処置が、子宮重量の増加についての陽性対照として使用され、一方、ビヒクル単独での処置が陰性対照として働いた。示されたホルモンでのＥＡＥ処置の間、３５〜４０日目に子宮を除去した（偽手術ビヒクル、ｎ＝６；ＯＶＸビヒクル、ｎ＝１２；ＯＶＸエストラジオール、ｎ＝１８；ＯＶＸ  ＰＰＴ、ｎ＝１８）。ＯＶＸ  ＰＰＴ及びＯＶＸエストラジオールを、各々ＯＶＸビヒクルと比較した、＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＷＴ＜野生型。図５Ｂに示されたように、子宮重量を図５Ａのように卵巣切除したＥＲβノックアウトマウスで試験した。ＥＲβノックアウトマウスにおいて、子宮重量はＰＰＴ処置で増加した（ＯＶＸビヒクル、ｎ＝９；ＯＶＸエストラジオール、ｎ＝１２；ＯＶＸ  ＰＰＴ、ｎ＝１２）。ＯＶＸ  ＰＰＴ及びＯＶＸ  エストラジオールを、各々ＯＶＸビヒクルと比較した、＊＊＊ｐ＜０．０００１。図５Ｃに示されたように、子宮重量を図５Ａのように卵巣切除したＥＲαノックアウトマウスで試験した。ＥＲαノックアウトマウスにおいて、子宮重量はＰＰＴ処置で増加しなかった、（ＯＶＸビヒクル、ｎ＝６；ＯＶＸエストラジオール、ｎ＝４；ＯＶＸ  ＰＰＴ、ｎ＝６）。
【０１０９】
ＥＲαリガンドでの処置はＥＡＥの臨床重症度を軽減する
上記の用量及び投与の方法を使用し、ＥＡＥの臨床経過に対するその効果についてＰＰＴ処置を評価した。卵巣切除ＭＯＧ３５〜５５ペプチド誘発活性ＥＡＥを有するＣ５７ＢＬ／６野生型メスマウスをＥＲα選択的リガンドＰＰＴで処置した。ＰＰＴ処置は、ＥＡＥの臨床重症度を有意に減少させた（図６Ａ）。エストラジオールの注射での処置が陽性対照として働き、一方、ビヒクル単独の注射での処置が陰性対照として働いた。卵巣切除ＥＲβノックアウトＣ５７ＢＬ／６メスマウスが活性ＥＡＥの間、ＰＰＴで処置された場合、臨床疾患重症度も有意に減少した（図６）。これらのデータは、ＥＲβの存在がＰＰＴでの処置により仲介される疾患保護に必要とされないことを示している。対照的に、活性ＥＡＥが誘発された卵巣切除ＥＲαノックアウトマウスへ投与された場合、ＰＰＴ処置及びビヒクル処置ＥＲαノックアウトマウスを比較した時に平均臨床スコアに相違がないことで証明されたように（図６Ｃ）、ＰＰＴ処置の疾患寛解効果は消失した。同様の結果が、卵巣切除メスの代わりに去勢オスマウスを使用した場合に得られ（データは示されていない）、去勢オスマウスにおける臨床ＥＡＥのエストロゲン仲介改善が、ＥＲαノックアウトにおいて取り消されていることを示している以前の出版文献と一致している（Liu et al., 2003）。ＥＲαノックアウトメスマウスは高い循環エストラジオールレベルを有し；それ故、このマウスにおけるエストロゲン無応答性は、ＥＲα遺伝子修飾又は４週での卵巣摘出前のマウスのエストロゲン歴に起因するかもしれない。オスＥＲαノックアウトマウスはエストラジオールの高い循環レベルを有しておらず、メス及びオスＥＲαノックアウト両方における同様の結果は、マウスのエストロゲン歴ではなく、ＥＲα遺伝子修飾を観察された効果のもっともありそうな原因としている。
【０１１０】
これらのデータは、ＥＡＥのエストロゲン仲介保護は高度に選択的なＥＲαリガンドでの処置により繰り返されること、及びこの保護はＥＲβとの相互作用に依存しないことを示している。
【０１１１】
図６。ＥＲα選択的リガンドでの処置は、ＥＡＥの臨床重症度を軽減するために十分である。図６Ａに示したように、ＥＡＥ臨床重症度はＰＰＴで処置された卵巣切除野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスで減少した。ビヒクル（陰性対照）、エストラジオール（陽性対照）又はＰＰＴ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）の注射による卵巣切除マウスの毎日の処置が始まり、次ぎに７日後、活性ＥＡＥをＭＯＧ３５〜５５ペプチドで誘発した。平均臨床スコアは、ビヒクル処置と比較してエストラジオール及びＰＰＴ処置マウスの両方で有意に低下した（ｐ＜０．０００１、フリードマンテスト）。データは総計で５回の繰り返された実験を代表するものである。図６Ｂに示したように、ＰＰＴ処置によるＥＡＥの平均臨床スコアの減少は、ＥＲβの存在には依存しない。Ａのように、卵巣切除、ＥＲβノックアウトＣ５７ＢＬ／６メスマウスをＰＰＴ、エストラジオール又はビヒクルで処置した。平均臨床スコアは、ビヒクル処置と比較してエストラジオール及びＰＰＴ処置マウスの両方で有意に低下した（ｐ＜０．０００１、フリードマンテスト）。データは総計で３回の繰り返された実験を代表するものである。図６Ｃに示したように、ＥＡＥ間のインビボでのＰＰＴ処置は、ＥＲαについて高度に選択的なままである。卵巣切除メスＥＲαノックアウトＣ５７ＢＬ／６マウスを図６Ａのように処置した。ＥＲαノックアウトマウスにおいて、平均臨床スコアはビヒクル処置と比較してＰＰＴ処置で有意に異なっていなかった。ＰＰＴ処置野生型マウスは、実験内のＰＰＴ処置効果についての陽性対照として働く。データは総計で３回の繰り返された実験を代表するものである。エラーバーは、所与の処置群内の、マウス間の臨床スコアの可変性を示している、各処置群当たりｎ＝５マウス。
【０１１２】
ＥＲαリガンドでの処置は自己抗原特異的炎症促進性サイトカイン産生を減少させる
ＥＲαノックアウトマウスを使用して、疾患の保護及び炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦα及びＩＦＮγ）の減少の両方がＥＲαに依存していることが以前に示されているので、我々は次ぎにＥＲαリガンドでの処置が炎症促進性サイトカイン産生を減少させることができるかどうかを決定した。図７に示されているように、ＰＰＴ処置はＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ６産生を有意に減少させた。興味深いことに、Ｔｈ２サイトカインＩＬ５の産生がエストロゲン処置で増加したこと、及びこれは部分的に、しかし完全にではなく、ＥＲαノックアウトで消失していることを我々は以前に示した（Liu et al., 2003）。本研究において、野生型マウスがＥＲαアゴニストＰＰＴで処置された場合、処置はＩＬ５産生を有意に増加させた。一緒にすると、これらのデータは、ＥＲαアゴニストでの処置は、ＥＡＥ免疫病変形成に関して抗炎症的であろう、末梢免疫系における自己抗原特異的免疫応答間のサイトカイン産生の変化を誘導することを示している。図７に示されているように、ＥＲαリガンドでの処置は、ＥＡＥを有する卵巣切除野生型Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス中の末梢免疫細胞による炎症促進性サイトカイン産生を減少させる。ＥＡＥは図６のように誘発され、次ぎに疾患誘発４０日後、マウスを殺し、ＭＯＧ３５〜５５刺激脾細胞によるサイトカイン産生を決定した。ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ６レベルはＰＰＴ処置で有意に減少したが、一方、ＩＬ５レベルはＰＰＴ処置で増加した。エラーバーは、所与の処置群内の、マウス間の臨床スコアの可変性を示している、各処置群当たりｎ＝５マウス。データは３回の繰り返された実験を代表するものである。＊ｐ＜０．０５。
【０１１３】
ＥＲαリガンドでの処置はＥＡＥにおける炎症及び脱髄を減少させる
ＥＲαリガンドＰＰＴでの処置がＥＡＥの臨床経過に対するエストロゲン処置の保護的効果を繰り返し、及び末梢における自己抗原特異的免疫応答に関して抗炎症性であったことを観察しているので、次ぎに、ＥＡＥマウスのＣＮＳにおける炎症及び脱髄に対するＰＰＴでの処置の効果を確かめた。ＥＡＥの急性期（ビヒクル処置マウスにおいて臨床徴候の発生１〜２日後）での卵巣切除Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脊髄切片を炎症及び脱髄について評価した。すべての処置群のマウスを同一時点で殺し、平行したそれらの実験を可能にした。ビヒクル処置ＥＡＥと比較し、ＥＲαリガンドＰＰＴ又はＥ２での処置により炎症及び脱髄の両方が顕著に減少した（図４）。正常健康対照と比較されたＨ＆Ｅ染色ビヒクル処置ＥＡＥマウスは、脊髄中に多数の多巣性から癒着している炎症細胞浸潤物を有した。浸潤物は軟膜中、軟膜中の血管周囲及び白質の実質中にも存在した（図４Ａ）。炎症細胞浸潤物は蒼白及び空胞化と関連し、脱髄と一致している。ＤＡＰＩ＋細胞の計数による白質細胞密度の定量は、ビヒクル処置ＥＡＥ群における浸潤物の６０％の増加を明らかにした。対照的に、エストラジオール及びＰＰＴ処置マウスの両方とも検出可能な炎症を有せず、白質細胞密度は正常対照中の密度と同様であった（図４Ｄ）。
【０１１４】
ミエリン喪失の程度は、ルクソールファーストブルーにより評価し、ＭＢＰ免疫染色におり確認した。ルクソールファーストブルー染色は、炎症細胞浸潤物の部位での脱髄を明らかにした（図４Ｂ）。また、ビヒクル処置脊髄切片の脊髄後柱領域のミエリン染色は、正常対照、Ｅ２及びＰＰＴ処置切片と比較して有意により少ないＭＢＰ免疫染色を有していた、図４Ｃ。ルクソールファーストブルー染色脊髄切片の密度分析による脱髄の定量は、ビヒクル処置ＥＡＥマウスにおいてミエリン密度の２５％減少を明らかにした。対照的に、エストラジオール及びＰＰＴ処置マウスの両方とも正常対照の密度と有意に異なっていないミエリン密度を有する、より少ない脱髄であった（図８Ｅ）。
【０１１５】
図８に示されたように、ＥＲαリガンドでの処置は、ＥＡＥを有するマウスの脊髄における炎症及び脱髄を減少させた。図８Ａにおいて、正常（健康対照）、ならびにビヒクル、Ｅ２及びＰＰＴ処置ＥＡＥマウスからの代表的Ｈ＆Ｅ染色胸部脊髄切片（倍率４Ｘ）が示されている。ビヒクル処置ＥＡＥマウスの脊髄は、軟膜及び白質、血管周囲及び白質の実質における炎症の多巣性から癒着している領域を示している（炎症の領域は矢印で示されている）。Ｅ２か又はＰＰＴ処置ＥＡＥ脊髄において炎症は観察されなかった。図８Ｂに示されたように、脊髄の脊髄後柱（Ａにおける四角）のルクソールファーストブルー染色において（倍率４０Ｘ）、ビヒクル処置ＥＡＥ切片のみで白質中の強い脱髄が見られた。図８Ｃに示されたように、抗ＭＢＰ免疫染色脊髄後柱は、ビヒクル処置ＥＡＥ切片のみで白質中の脱髄を示した。図８Ｄに示されたように、ＥＡＥの誘導後の浸潤性細胞の総数の増加が、描かれた白質全体（背側、外側及び腹側の脊髄索を含んで）のＤＡＰＩ＋細胞を計数することにより半定量化され、正常のパーセンテージとして示されている。ビヒクル処置ＥＡＥマウスは、健康正常対照と比較して白質細胞密度に有意な増加を有したが、一方、Ｅ２処置及びＥＲαリガンド（ＰＰＴ）処置群は有しなかった。図８Ｅに示されたように、脱髄の程度がルクソールファーストブルーで胸部脊髄切片を染色することにより比較された。ミエリン密度は正常のパーセンテージとして示されている。ビヒクル処置ＥＡＥマウスは、正常対照と比較して、描かれた白質全体においてミエリン密度の有意な減少を有していたが、一方、Ｅ２処置及びＰＰＴ処置群は有していなかった。マウス数、処置群当たり３匹；マウス当たりのＴ１〜Ｔ５切片数、６；処置群当たりの切片の総数、１８。＊＊正常と比較して統計学的に有意（ｐ＜０．００１）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。データは、各処置でＥＡＥマウスの別の組についてその全体を繰り返した実験を代表している。
【０１１６】
ＥＲαリガンドでの処置はＥＡＥにおいて神経保護的である
ＥＡＥを有するマウスのＰＰＴ処置により誘発される有意な抗炎症性効果を考慮に入れて、ニューロン及び軸索の完全性の保存を試験した。ニスル染色組織学及び抗ＮｅｕＮ／β３チューブリン免疫標識の組み合わせを使用して、ニューロンを同定及び半定量化し、及び神経フィラメント抗体（抗ＮＦ２００）を使用して軸索を同定した。ＥＡＥの急性フェーズ（ビヒクル処置マウスにおいて臨床徴候の発生１〜２日後）で、ＥＡＥマウスのすべての処置群の胸部脊髄切片を、灰白質中のＮｅｕＮ＋／β３チューブリン＋ニューロン及び白質中のＮＦ２００軸索について評価した。正常、健康、年齢及び性対応対照マウス（図９Ｂ）と比較し、ビヒクル処置ＥＡＥマウス（図９Ｂ）においては早期時点で、灰白質中のニューロン染色（ＮｅｕＮ＋／Ｎｉｓｓｌ＋）の驚くべき減少が起こった。ビヒクル処置ＥＡＥマウスの灰白質中のニューロン染色におけるこの有意な減少は、エストラジオール（図９Ｃ）か又はＥＲαリガンド（図９Ｄ）で処置したＥＡＥマウスでは観察されなかった。灰白質中のＮｅｕＮ＋細胞の定量で、正常対照と比較したビヒクル処置ＥＡＥマウス中の有意な喪失が確認され、一方、エストラジオール及びＰＰＴ処置マウスは、正常対照と差違のないＮｅｕＮ＋細胞数を有していた（図９Ｅ）。
【０１１７】
図９に示されたように、ＥＲαリガンドでの処置は、ＥＡＥを有するマウス脊髄の灰白質におけるニューロン染色を保存した。図９Ａ〜Ｄは、各々が臨床徴候の発生１〜２日後のＥＡＥ間の非常に早期に殺された、正常健康対照マウス（Ａ）、ビヒクル処置ＥＡＥ（Ｂ）、Ｅ２処置ＥＡＥマウス（Ｃ）及びＥＲαリガンド（ＰＰＴ）処置ＥＡＥマウス（Ｄ）に由来する、ｉにおいてはＮｅｕＮ（赤）及びｉｉにおいてはニスルで染色した、胸部脊髄切片の倍率４Ｘでの分割画像である。ｉｉｉ、ｉの白い点線による方形領域により示された領域のＮｅｕＮ＋（赤）及びβ３チューブリン＋（緑）同時標識ニューロンの４０Ｘでの合併された共焦点スキャン。ｉｖ、ｉｉの黒い方形のニスル染色領域の４０Ｘ倍率。正常対照（図９Ａ）と比較して、ビヒクル処置ＥＡＥマウス（図９Ｂ）の後角、中間ゾーン及び前角で、ＮｅｕＮ＋免疫染色及びニスル染色の減少が観察された。Ｂｉｉｉ中の白い矢印は、ＮｅｕＮ＋染色の喪失を示している。対照的に、エストラジオール（図９Ｃ）か又はＰＰＴ（図９Ｄ）で処置されたＥＡＥマウスは、ＮｅｕＮ及びニスル染色を保った。Ｔ１〜Ｔ５切片の描かれた全灰白質中のニューロンの定量後、正常対照と比較したビヒクル処置ＥＡＥマウスにおいて、ＮｅｕＮ＋免疫標識ニューロンは有意に減少したが（ほぼ２５％）、Ｅ２及びＰＰＴ処置ＥＡＥマウスは正常対照と統計的に相違していなかった（図９Ｅ）。マウス数、処置群当たり３匹；マウス当たりのＴ１〜Ｔ５切片数、６；処置群当たりの切片の総数、１８。＊＊正常と比較して統計学的に有意（ｐ＜０．００１）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。データは、各処置でＥＡＥマウスの別の組についてその全体を繰り返した実験を代表している。
【０１１８】
神経フィラメントについての免疫染色（ＮＦ２００）は、正常マウス脊髄内の軸索の明瞭な同定を生じる（図１０Ａ）。ＣＤ４５染色について陽性の領域おいては、正常対照と比較し、ビヒクル処置ＥＡＥマウスでは白質中の軸索ＮＦ２００染色（ＮＦ２００＋）に有意な減少が起こり、ＥＡＥでの炎症性白質病変内の軸索切断についての以前の観察と一致している（Wujek et al., 2002）。エストラジオールか又はＥＲαリガンドで処置されたＥＡＥマウスは、軸索ＮＦ２００＋染色の減少は示さず、ＣＤ４５について偶発的に単一細胞が陽性であったのみである（図１０Ａ）。白質中の軸索数の定量は、ビヒクル処置ＥＡＥマウスで有意な喪失が確認されたが、エストラジオールか又はＥＲαリガンドで処置されたＥＡＥマウスでは、有意な軸索損失は起こらなかった（図１０Ｃ）。これらの免疫組織学的データは、これらの処置による白質中のＨ＆Ｅによる顕著に減少した炎症性病変の観察と一致する（図８Ａ）。とりわけ、ＥＡＥのこの早期時点での、炎症性病変を欠く白質領域中の軸索数の喪失はなく（ビヒクル処置ＥＡＥ群でさえも）、それによりＥＡＥのこの早期時点では、これらの領域の白質トラクトのウォーラー変性の証拠は提供されない。
【０１１９】
ＥＲαリガンドでの処置はＥＡＥを有するマウスの白及び灰白質中のミクログリア／単球活性化を減少させる
灰白質軸索病態がＭＳ患者の皮質で記載されており、密接に相反する活性ミクログリア及び尖端樹状突起を鞘に収めること、神経炎及びニューロン周核体により特徴づけられている（Peterson et al., 2001）。ＥＡＥにおける脊髄の灰白質中のＮｅｕＮ＋／β３チューブリン＋／ニスル＋神経染色の減少についての我々の観察を考慮すると、次ぎに我々はこの灰白質中のミクログリアの反応について追求する。ミクログリア／単球は、ミクログリア及び成熟単核貪食細胞の表面に存在し、ＬＡＭＰ−２（リソソーム関連膜タンパク質２）／ＣＤ１０７ｂと等価であるリソソーム抗原、Ｍａｃ３で染色し、及び切片を抗Ｂ３チューブリンで同時免疫標識した（図１０Ｂ）。著しいＭａｃ３＋反応性が、ビヒクル処置群において臨床徴候の発生からほんの１〜２日後の、ＥＡＥのこの非常に早期時点での、マウスの灰白質中に観察された。ＭＡＣ３＋細胞のほとんどが、活性ミクログリアと同様の形態学を示した（図１０Ｂ、差し込み図）。それらは、減少した及び中断したβ３−チューブリン染色を有する灰白質ニューロンのすぐ近くに、及び直接接触していた（図１０Ｂ）。対照的に、平行して殺され及び試験された、ＥＲαリガンドＰＰＴか又はエストラジオールで処置されたＥＡＥマウスは、いくらかのしかし有意に少ない免疫反応性しか有していない（図１０Ｂ）。ＭＡＣ３＋細胞の定量は、Ｅ２及びＰＰＴ処置脊髄を、ビヒクル処置ＥＡＥマウスからのものと比較した場合、〜６５％の減少を明らかにした（図１０Ｄ）。
【０１２０】
図１０に示されたように、ＥＲαリガンドでの処置はＥＡＥを有するマウスの白質及び灰白質中のＣＤ４５＋及びＭａｃ３＋細胞を減少させた。図１０Ａに示されたように、図９で使用されたマウスからの胸部脊髄切片をＮＦ２００（緑）及びＣＤ４５（赤）で共免疫染色した（倍率１０Ｘ）。示されているのは、正常対照、ビヒクル処置ＥＡＥ、Ｅ２処置ＥＡＥ又はＥＲαリガンド（ＰＰＴ）処置ＥＡＥマウスからの白質及び灰白質を含む部分画像である。ＬＦ、白質の側索；ＧＭ、灰白質。ビヒクル処置ＥＡＥ脊髄は、正常対照と比較してＣＤ４５＋細胞の大きな領域を有し、白質での減少したＮＦ２００軸索染色が付随し、一方、エストラジオール及びＥＲαリガンド処置ＥＡＥマウスは、偶発的なＣＤ４５陽性のみを有し、無傷のＮＦ２００軸索染色が伴った。図１０Ｂに示されたように、同一マウスからの連続切片もβ３チューブリン（緑）及びＭａｃ３（赤）で共染色され、共焦点顕微鏡により倍率４０Ｘでスキャンされた、図１０Ａの点線の方形領域で示された前角の切片が伴っている。ビヒクル処置ＥＡＥマウスは、正常対照マウスと比較して、前角灰白質中に著しく増加したＭａｃ３染色を示し、これらのＭａｃ３＋細胞のほとんどがミクログリアの形態学を有している（差し込み図、倍率１００Ｘ）。それらはニューロン構造物を取り囲んでいた（白い矢印）。対照的に、Ｅ２及びＥＲαリガンド（ＰＰＴ）処置ＥＡＥ脊髄切片は、ビヒクル処置ＥＡＥマウスと比較してより少ないＭａｃ３免疫染色を示した。図１０Ｃに示されたように、定量後、白質中の神経フィラメント染色軸索数は、正常マウスと比較してビヒクル処置ＥＡＥマウスにおいて有意に低く、一方、Ｅ２及びＰＰＴ処置ＥＡＥマウスは軸索数の有意な減少を示さなかった。＊＊正常と比較して統計学的に有意（ｐ＜０．００１）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。図１０Ｄ、Ｍａｃ３Ｘ細胞は密度測定により分析し、ビヒクル処置群のパーセンテージとして表されている。ビヒクル処置ＥＡＥマウスと比較して、Ｅ２処置及びＰＰＴ処置の両方とも、灰白質中に有意に低いＭａｃ３＋免疫活性を有した。マウス数、処置群当たり３匹；マウス当たりのＴ１〜Ｔ５切片数、４；処置群当たりの切片の総数、１２。＊＊正常と比較して統計学的に有意（ｐ＜０．００１）；１ｘ４ＡＮＯＶＡ。データは、各処置でＥＡＥマウスの別の組についてその全体を繰り返した実験を代表している。
【０１２１】
実施例６．エストロゲンレセプター（ＥＲ）ベータの神経保護効果
方法
動物
メス野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ならびに、Ｃ５７ＢＬ１６バックグラウンドのメスＥＲＪ３１（０マウス、８週齢、はlaconic（Germantown, NY）から得た。野生型ＳＩｌＬメスマウス、Ｓ週齢、は，Harlan laboratories (Indianapolis, IN）から得た。動物は、National Institutes of Health に示されたガイドラインに従って、及びUniversity of California Los Angeles Office for the Protection of Research Subjects and the Chancellor's Animal Research Committee により命令されたように維持された。
【０１２２】
試薬
プロピルピラゾールトリオール（ＰＰｔ）及びジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）、ＥＲα及びＥＲＩ３アゴニストは、それぞれ，Tocris Bioscience（Ellisville, MO）から購入した。エストラジオールはSigma- Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。薄液膜、ミグリオール８１２Ｎは、Sasol North America（Houston, TX）から購入した。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、アミノ酸３５〜５５、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチド１３９〜１５１及び７９〜１９１及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド８３〜１０２はMimotopes（Clayton, Victoria, Australia）により＞９８％の純度で合成された。
【０１２３】
投薬を評価するための子宮重量
各子宮重量をエストロゲンアゴニストの投薬を評価するための陽性対照として使用した。ビヒクル、エストラジオール、ＰＰＴ又はＤＰＮ、ならびにＩＴＴとＤＰＮの組み合わせの皮下注射を１日１回、卵巣切除マウスに示された用量で１０日間にわたって与えた。麻酔後、記載されているように、子宮を抽出し、脂肪、結合組織及び過剰体液を除去して子宮重量を得た。
【０１２４】
ＥＡＥ間のホルモン操作
イソフルラン麻酔下でメスマウスを卵巣切除し、７〜１０日間回復させた。ビヒクル、エストラジオール、ＰＰＴ又はＤＰＮの毎日の皮下注射をＥＡＥ免疫化に先立つ７日目から開始し、全疾患持続を通して続けた。エストラジオールは０．０４ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で、ＤＰＮは８ｍｇ／ｋｇ／日で及びＩＴＴは１０ｍｇ／ｋｇ／日で送達した。ビヒクル単独処置は１０％エタノール及び９０％ミグリオールから構成されていた。
【０１２５】
ＥＡＥ誘発
記載したように、完全フロイントアジュバント中の、３００μｇのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、アミノ酸３５〜５５、及び５００μｇのミオバクテリウム・ツベルクローシスで免疫化することにより活性ＥＡＥを誘発した。記載したように、完全フロイントアジュバント中の、１００μｇのプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチド、アミノ酸１３９〜１５１及び１００μｇのミオバクテリウム・ツベルクローシスで、ＳｉＴマウスに活性ＥＡＥを誘発した。マウスをモニターし、標準０〜５ＥＡＥ類別化スケール：０、無影響；１、尾がぐにゃぐにゃしていること（limpness）；２、うまく転がれない；３、部分麻痺；４、完全麻痺；及び５、瀕死；に従って臨床疾患重症度について毎日類別化した。毎日、所与の処置群内のすべてのマウスの臨床スコアの平均を決定し、それにより該群についての平均臨床スコアを得る。何匹かのマウスは、疾患誘導後５０日まで臨床的に追跡し、他は機構的研究のため疾患誘導後１９日目により早く殺し、ビヒクル処置群での臨床徴候の発現４〜６日後に対応している。
【０１２６】
ロータロッド試験
運動挙動は、ロータロッド装置(Med Associates me, St. Albans, VT）を使用し、各マウスについて週２回まで試験した。簡単には、動物を回転している水平シリンダー上に最大で２００秒置いた。落下することなくシリンダー上をマウスが歩いている時間を記録する。各マウスは３〜３０ｒｐｍの速度で及びいずれか所与の日に３回の試験を与えられた。３回の試験を平均し、個々のマウスについて単一の値を報告し、そして次ぎに所与の処置群内のすべての動物について平均した。免疫化（０日目）に先立った、最初の２日の試験日は練習試行として働いた。
【０１２７】
免疫応答
脾臓を、灌流に先だった深い麻酔の間又は安楽死後に採取した。脾細胞は２５μｇ／ｍｌの示された自己抗原で刺激し、記載されているように、標準Ｈ３取り込みアッセイを使用して増殖を評価した。４８及び７２時間後に上清を採取し、記載されているように、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−５のレベルをサイトメトリックビーズアレイ（BD Biosciences）により決定した。
【０１２８】
灌流
マウスをイソフルランで深く麻酔し、氷冷０．９％生理食塩水、続いて１０％ホルマリンで経心的に灌流した。脊髄柱を除去し、１０％ホルマリン中で一夜、後固定し、２０％スクロース含有ＰＢＳ溶液で凍結保護した。該柱から脊髄を除去し、３部分（頚部、胸部及び腰部）に切断し、ゼラチン／スクロース混合物中に包埋した。ゼラチン中の脊髄領域はさらに後固定し、２０％スクロース中で保存した。スライディングミクロトームで浮遊性切片（２５μｍ厚）を冠状に切断し、ＰＢＳ中で連続的に集めた。
【０１２９】
組織病理学及び免疫組織化学
連続切片をスライドにマウントし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）又はニスルで染色した。連続切片は免疫組織化学によっても試験した。簡単には、２５μｍ浮遊性切片を０．３％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳで透過処理し、１０％正常ヤギ血清でブロックした。白質免疫染色は、透過処理及びブロッキングに先だって９５％エタノール／５％酢酸で１５分、切片を処理することにより増強された。特異的細胞型及び構造を検出するため、２％ＮＧＳを含有するＰＢＳ溶液中、切片を一次抗体と室温で２時間、そして次ぎに４０℃で一夜プレインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：抗β３チューブリン及び抗神経フィラメント−ＮＦ２００（モノクローナル（Chemicon）；ポリクローナル（Sigma Biochemical）]、抗ニューロン特異的核タンパク質（ＮｅｕＮ）、抗ＣＤ４５（Chemicon）及び抗ＭＷ（Chemicon）。第二抗体工程は、ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ及びＣｙ５（Vector Laboratories and Chemicon）にコンジュゲートされた抗体での標識により実行した。ＩｇＧ対照実験がすべての一次抗体について実施されたが、これらの条件下、染色は観察されなかった。細胞数を評価するため、核染色剤、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩、ＤＡＰＩ（２ｎｇ／ｍｌ；Molecular Probes）を、第二抗体添加後の最終洗浄前に加えた。切片をスライドにマウントし、乾燥し、Fluoromount G（Fisher Scientific）中でカバースリップをのせた。
【０１３０】
顕微鏡検査
共焦点顕微鏡（Leica TCS-SP, Mannheim, Germany）又はカメラに連結されたPlan Fluor対物レンズ（DP7O; Olympus）を備えた蛍光顕微鏡 （BX51WI; Olympus, Tokyo, Japan）を使用して、染色切片を試験及び撮影した。デジタル画像は、Leica共焦点及びDP70カメラソフトウェアーを使用して集め及び分析した。画像はAdobe Photoshop（Adobe Systems, San lose, CA)を使用して整理した。
【０１３１】
定量化
免疫染色結果を定量するため、脊髄レベルＴ１〜Ｔ５からの切片、各動物から６、処置群当たりｎ＝３のマウスで、処置群当たり総計で１８の切片を試験した。画像はDP7O Imageソフトウェアー及びDP70カメラ（両方ともOlympusから）を使用して顕微鏡下で捕捉した（４Ｘ、１０Ｘ又は４０Ｘ）。各実験の組からのすべての写真に、同一の光強度及び露光時間を適用した。脊髄の同一領域からの画像が比較され（Ｔｌ〜Ｔ５）、描かれた全灰白及び白質領域から別々に獲得された。前角の中央領域が灰白質分析のための中心であり、一方、前角の外側領域が白質分析のための中心であった。６つの灰白質及び６つの白質の画像を、各処置群中の３匹の動物からのＴ１〜Ｔ５切片（１００μｍ離れて）の２つの部位から集めた。すべての画像をグレースケールに変換し、次ぎにhttp://rsb.info.nih.gov/ii からダウンロードしたＩｍａｇｅ  Ｊバージョン１．２９（NIH Imageのウィンドウバージョン）での密度測定により分析した。固定０〜１６０の閾値範囲を選択して正常脊髄切片中の染色シグナルを強調し、この範囲内の全領域を測定し、平均し、そして比較した。
【０１３２】
ＥＡＥ誘導後の浸潤性細胞の総数の増加を、全白質中のＤＡＰＩ＋核の密度測定により測定した。ニューロンを全灰白質中のｍｍ２当たりのＮｅｕＮ＋／β３チューブリン＋／ＤＡＰＩ＋細胞を計数することにより定量した。白質及び灰白質両方の評価が、そのＴ１〜Ｔ５脊髄切片に存在する。４０Ｘでのレーザー走査型共焦点顕微鏡スキャンを、レベルＴ１〜Ｔ５前角に対応するＭａｃ３＋／β３チューブリン＋免疫染色脊髄切片で実施した。各実験の結果は、記載されているように、マウス当たり４つの一側性レベルから平均し（１００μｍ離れて、各処置群で３匹のマウス、処置群当たり総計で１２の切片）、健康対応対照と比較した平均倍数変化として表現された。
【０１３３】
統計分析
ＥＡＥ臨床疾患重症度は、フリードマンテストを使用して処置群間で比較し；組織病理学的変化は、１ｘ４ＡＮＯＶＡを使用して評価し；子宮重量、増殖応答及びサイトカインレベルは、スチューデントｔ検定を使用して処置群間を比較し、及びロートロッド上の時間はＡＮＯＶＡを使用して処置群間で比較した。
【０１３４】
結果
ＥＲα及びＥＲβリガンドの選択された用量は陽性対照組織、子宮に公知の生物学的応答を誘発する
ＥＡＥ実験を始める前に、我々の投薬計画それぞれでの処置の間に、公知のインビボ応答が起こるかどうかを評価するため、子宮応答を使用した。エストロゲン処置は主としてＥＲαを介して子宮重量を増加させることが公知であり、及びＥＲβリガンドジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）での処置が、ＥＲα仲介子宮重量増加に拮抗できることも示されている。ＥＲαリガンドプロピルピラゾールトリオール（ＰＰＴ）を卵巣切除Ｃ７ＢＬ／６メスに１０日間、最適（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又は最適以下（３．３ｍｇ／ｋｇ／日）用量で与えると、ビヒクル処置と比較して、有意な子宮重量の増加が観察された（図１１）。ＥＲβリガンドＤＰＮについては、全虚血の動物モデルにおいて神経保護的であることが示されている用量が選択された。このＤＰＮ用量（８ｍｇ／ｋｇ／日）をＰＰＴ処置と組み合わせて与えた場合、ＰＰＴ処置により仲介された子宮重量の増加が有意に減少した。ＥＲα及びＥＲβリガンドの投与は、陽性対照組織に公知の生物学的応答を誘発する。Ｃ５７ＢＬＩ６マウスを卵巣切除し、次ぎにＥＲα又はＥＲβリガンドの示された用量で、毎日の皮下注射として１０日間処置し、子宮重量に対するこの投与計画の効果を決定する。図１１に示されたように、ビヒクル処置対照と比較し、１０ｍｇ／ｋｇ／日及び３．３ｍｇ／ｋｇ／日、両方のＰＰＴ処置で子宮重量が増加した。ＤＰＮ単独、８ｍｇ／ｋｇ／日での処置は、子宮重量には何の効果もないが、このＤＰＮ用量は、ＰＰＴ、３．３ｍｇ／ｋｇ／日、仲介子宮重量増加に拮抗する。各処置群、ｎ＝４。＊はｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定を示す。
【０１３５】
これらのデータは、ＥＲα及びＥＲβリガンド送達の該方法及び用量が、陽性対照組織、子宮にインビボで公知の生物学的応答を誘発することを示している。
臨床ＥＡＥに対するＥＲα及びＥＲβリガンドでの処置の差動効果
ＥＡＥ間のＥＲα及びＥＲβ処置間の効果を比較及び対比した。卵巣切除Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスにおいてＭＯＧ３５〜５５ペプチドでの活性ＥＡＥ誘発に先立った１週間、ＥＲαリガンドを投与した場合、標準ＥＡＥ類別スケールにより測定された臨床疾患が完全に抑止された、ｐ＜０．０００１（図１２Ａ）。このことは、このＥＡＥモデルでの我々の以前の発見（上記）、ならびに他の者によるＳＪＬマウスでの養子（adoptive）ＥＡＥにおける発見と一致している。対照的に、ＥＲβリガンド処置は疾患の早期（疾患誘導後２０日目まで）には有意な効果を有していないが、疾患の後期（２０日目以降）には有意な保護効果を有することが示されたｐ＜０．００１（図１２Ｂ）。
【０１３６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける活性ＥＡＥでＥＲβリガンドＤＰＮを使用する保護効果は、別のＥＲβリガンド（ＷＡＹ−２０２０４１）がＳＪＬマウス中の養子ＥＡＥに効果を示さないことを考えれば驚くべきことであった。ＷＡＹ−２０２０４１はＥＲαと比較してＥＲβに対して２００倍の選択性を有し、一方ＤＮＰは７０倍の選択性を有していることが示されているので、ＤＮＰは、我々の研究においてインビボでＥＲβに対して十分に選択的ではないことが可能であった。ＥＡＥ間のＤＮＰのインビボ選択性を評価するため、ＤＮＰをＥＲβＫＯマウスに投与した。ＤＮＰが活性ＥＡＥを有する卵巣切除ＥＲβＫＯＣ５７ＢＬ／６マウスに投与された場合、該処置はもはや保護的ではなかった（図１２Ｃ）。これらのデータは、使用された用量で、ＥＡＥ間のＥＲβに対するＤＰＮのインビボ選択性を示している。
【０１３７】
これらの結果を一緒にすると、ＥＲαリガンドでの処置はＥＡＥの過程を通して邦語的であり、一方、ＥＲβリガンドでの処置は、急性早期フェーズ後、該疾患の後期フェーズの間に保護的であることを示している。
【０１３８】
ＥＡＥを有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける自己抗原特異的サイトカイン産生に対するＥＲα及びＥＲβリガンドでの処置の差動効果
ＥＲα対ＥＲβリガンドでの処置間の相違をさらに調べるため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥの早期及び後期両段階間の自己抗原特異的サイトカイン産生を評価した。ＥＲαリガンド処置は、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ６）のレベルを有意に減少させたが、一方、ＥＡＥの早期（図１２Ｄ）及び後期（図１２Ｆ）両段階間に抗炎症性サイトカインＩＬ５を増加させた。対照的に、ＥＲβリガンド処置は、早期（図１２Ｅ）か又は後期（図１２Ｇ）時点で、すべての測定されたサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ６及びＩＬ５）においてビヒクル処置と統計的に相違していなかった。ＥＲα対ＥＲβ選択的リガンドでの処置は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、慢性ＥＡＥ及び自己抗原特異的免疫応答に対する差動効果を有する。卵巣切除Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、活性ＥＡＥの間、ＥＲリガンドの毎日の皮下注射を行い、標準ＥＡＥ類別化スケールを使用して類別した。図１２Ａ、ビヒクル処置マウスと比較したＰＰＴ処置マウスの平均臨床スコアは、全疾患過程の間で有意に減少した、ｐ＜０．０００１、フリードマンテスト。各処置群はｎ＝４を有しており、データは５回繰り返した実験の総数を表している。図１２Ｂ、ビヒクル処置マウスと比較したＤＰＮ処置マウスは、疾患の早期（疾患誘導後２０日目まで）においては有意に異なっていなかったが、後期ＥＡＥの間（疾患誘導後３０日目以降）有意に改善されるようになった、ｐ＜０．００１、フリードマンテスト。各群におけるマウス数は、ビヒクル、ｎ＝４；エストラジオール、ｎ＝４；ＤＰＮ、ｎ＝８であった。データは２回繰り返された実験を代表するものである。ＥＡＥ間のインビボでのＤＰＮ処置はＥＲβに対して高度に選択的なままであった。活性ＥＡＥを有する卵巣切除ＥＲβ１（０Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける臨床スコアは、ＤＰＮ処置とビヒクル処置を比較した場合、相違はなかった。各処置群はｎ＝４を有し、データは２回繰り返された実験を代表するものである。エストラジオール処置マウスは各実験における処置効果の陽性対照として働いた（図Ａ〜Ｃ）。
【０１３９】
疾患誘発後１９日目（図１２Ｄ、Ｅ）又は４０日目（図１２Ｆ、Ｇ）に、マウスを殺し、ＭＯＯ３５〜５５刺激脾細胞によるサイトカイン産生を決定した。ＩＴＴ処置は、早期の間、有意にＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ６を減少させ、ＩＬ５を増加させた。
【０１４０】
ＥＡＥ（図１２Ｄ）及び後期ＥＡＥ図１２。対照的に、ＥＡＥ疾患の早期段階（図１２Ｅ）又は後期（１）段階では、測定されたサイトカインレベルにおいて、ＤＰＮ処置で有意な相違は見られなかった。エラーバーは所与の処置群内の、個々のマウスについてのサイトカイン値の可変性を示している、各処置群についてｎ＝４マウス。データは各時点についての２〜５実験の代表である（図Ｄ−Ｇ）。ＩＬ１０については、ビヒクルと比較して、ＥＲαか又はＥＲβリガンド処置では相違は観察されず、一方、ＩＬ４及びＩＬ１２レベルはとても低くて検出できなかった（示されていない）。
【０１４１】
これらの結果は、ＥＲαリガンド処置が自己抗原特異的免疫応答の間にサイトカイン産生の好ましい変化を誘発する一方、ＥＲβリガンド処置は誘発しないことを示している。
ＥＲβリガンドでの処置はＥＡＥを有するＳＪＬマウスにおいて臨床再発を減少させるが自己抗原特異的免疫応答を変化させない
次ぎに、ＳＪＬマウスにおけるプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）１３９〜１５１誘発活性ＥＡＥを、ＤＰＮか又はビヒクル対照で処置した。発生率、発症の日又はピーク臨床スコアに相違はなかったが、ビヒクル処置（１０／１３、７７％）と比較して、ＤＰＮ処置マウス（５／１３、３３％）においては再発の有意な減少があった、Ｐ＜０．０１。これらの再発は疾患誘発後、３６〜５２日目に起こった。とりわけ、以前の報告は、疾患誘発後最初の２７日のみを追跡し、ＳＪＬマウスにおけるＥＡＥにおいて、ＥＲβリガンドＷＡＹ−２０２０４１は保護的ではないことを述べており、持続は急性ＥＡＥの最初の病状発生のみを含んでおり、その時点ではＤＰＮ処置の効果は観察されない。
【０１４２】
このＥＡＥモデルにおける免疫応答を次ぎに評価した。ＰＬＰ１３９〜１５１誘発ＥＡＥを有するＳＪＬマウス中のエピトープ拡散は以前に記載されているので、疾患開始自己抗原（ＰＬＰ１３９〜１５１）に対する免疫応答を、ならびに可能なエピトープ拡散自己抗原（ＰＬＰ１７９〜１９１及びＭＢＰ８３〜１０２）への応答を評価した。疾患開始自己抗原への免疫応答については、ビヒクル処置と比較して、ＥＲβリガンド処置の有意な効果はなく（図１３）、及びビヒクル処置ＥＡＥマウスでさえもエピトープ拡散は起こらず、エピトープ拡散を検出していないいくつかの報告と一致している。
【０１４３】
図１３、ＥＲβ選択的リガンドでの処置は、ＥＡＥを有するＳＪＬマウスにおいて末梢免疫細胞には影響しなかった。活性ＥＡＥは、ビヒクル，ＤＰＮか又はエストラジオールで処置された卵巣切除ＳＪＬメスマウスにおいて、ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドで誘発した。疾患誘発後５２日目に、マウスを殺し、疾患開始抗原（ＰＬＰ１３９〜１５１）ならびに可能なエピトープ拡散抗原（ＰＬＰ１７８〜１９１及びＭＢＰ８３〜１０２）に対する脾臓免疫応答を評価した。３つの処置群における唯一の検出可能な応答は疾患開始抗原（ＰＬＰ１３９〜１５１）へのものであり、一方可能なエピトープ拡散抗原への応答は検出不能であった。ビヒクル処置群と比較したＤＰＮ処置群においては、ＰＬＰ１３９〜１５１特異的応答の間の増殖又はサイトカイン（ＴＮＦα又はＬＥＮγ）産生において、有意な相違は観察されなかった。エストラジオール処置は免疫応答に対する処置効果の陽性対照として働き、ビヒクル処置と比較した場合、増殖応答ならびにＴＮＦα及びＩＦＮγサイトカイン産生の減少を示しており、以前の報告と一致する。エラーバーは所与の処置群内の、個々のマウスについてのサイトカイン値の可変性を示し、各処置群についてｎ＝４マウス、及びデータは２回繰り返された実験を代表する。
【０１４４】
これらのデータを合わせると、ＥＲβリガンド処置は、ＥＡＥを有するＳＷマウスにおいて再発の減少を仲介するが、再発に対するこの効果の機構には、サイトカイン産生又はエピトープ拡散に対する有意な効果は含まれていないことを示している。
【０１４５】
ＥＲαリガンド（しかしＥＲβリガンドではない）での処置はＥＡＥにおいてＣＮＳ炎症を減少させる
神経病理学におけるＥＲα対ＥＲβリガンドの効果の比較を評価した。ＥＡＥの早期（１９日目）及び後期（４０日目）段階の両方で、ビヒクル、ＥＲα又はＥＲβリガンドで処置されたマウスからの脊髄切片を炎症及び脱髄について評価した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色において、ビヒクル処置Ｃ５７ＢＬ／６ＥＡＥマウスは、健康対照と比較して広範な白質炎症を早期（図１４Ａ）及び後期（図１４Ｃ）の両方の時点で有していた。ビヒクル処置ＥＡＥと比較して、この炎症はＥＲαリガンドＰＰＴでの処置で有意に減少した。対照的に、早期及び後期の両方の時点で、ＥＲβリガンド処置群には広範な白質炎症が存在していた。ＤＡＰＩ＋細胞を計数することによる白質細胞密度の定量は、ＥＡＥの早期段階のＥＲαリガンド処置マウスは、ビヒクル処置ＥＡＥと比較して、胸部脊髄の白質中の炎症に有意な（ｐ＜０．００１）減少を有していたが、一方、ＤＰＮ処置ＥＡＥマウス中の白質細胞密度はビヒクル処置における該密度とは有意に相違していなかったことを明らかにした、図１４Ｂ。後期時点での定量化は、ＥＲαリガンド処置での炎症の減少は、ビヒクルと比較してより少ないが、しかしまだ有意（ｐ＜０．０５）であり、一方、ＥＲβリガンド処置における炎症は、ビヒクル処置の炎症と相違がなかったことを明らかにした、図１４Ｄ。
【０１４６】
抗ＣＤ４５及び抗ＮＩＦ２００抗体を使用する二重免疫組織化学を、それぞれ炎症細胞及び軸索を染色するために使用した。ＥＲαリガンド処置ＥＡＥマウスは、ビヒクル処置ＥＡＥと比較して、白質中のより少ないＣＤ４５染色を有した。ＣＤ４５染色におけるこの減少は、ＥＡＥの早期時点で最も顕著であり（図１４Ｅ）、一方、後期時点では、ビヒクル処置におけるよりもまだ少なくはあるが、いくらかのＣＤ４５染色がＥＲαリガンド処置で検出可能であった（図１４Ｆ）。対照的に、ＥＲβリガンド処置ＥＡＥマウスは、早期又は後期時点の全体において、白質中の減少したＣＤ４５染色を有していなかった。
【０１４７】
加えて、ビヒクル処置ＥＡＥマウスの灰白質中の細胞のＣＤ４５染色が、早期又は後期の両時点で観察され、これらの細胞は、活性ミクログリアを示唆する形態学を有しており（図１３Ｅ及びＦ挿入図）、ＥＲαリガンド処置（しかしＥＲβリガンド処置ではない）は灰白質中のこのＣＤ４５染色を減少させた。
【０１４８】
これらのデータを合わせると、ＥＲαリガンド処置（しかしＥＲβリガンド処置ではない）は、ＥＡＥを有するマウスのＣＮＳ中の炎症を減少させる。とりわけ、ＥＲβリガンド処置でのＣＮＳ炎症減少の欠如は、末梢の自己抗原特異的免疫応答に対するＥＲβリガンド処置の免疫変調効果の欠如と一致していた（図１２）。
【０１４９】
ＥＲαリガンド及びＥＲβリガンド両方での処置は、ＥＡＥにおける白質中の脱髄及び軸索切断を減少させる
ミエリン喪失の程度を、次ぎに胸髄の脊髄後柱のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）免疫染色により評価した。広範な脱髄が、ビヒクル処置ＥＡＥマウスの炎症細胞浸潤物の部位で起こったが、一方、より少ない脱髄しかＥＲα及びＥＲβリガンド処置では起こらなかった（図１５Ａ、Ｃ）。ＭＢＰ免疫染色脊髄切片の密度分析による脱髄の定量は、正常対照と比較して、ビヒクル処置ＥＡＥマウスにおけるミエリン密度の、早期及び後期時点でそれぞれ、３２％（ｐ＜０．０１）及び３４％（ｐ＜０．００５）の減少を明らかにした（図１７Ｂ、Ｄ）。ミエリン染色は比較的ＥＲα及びＥＲβリガンド処置マウスの両方で、疾患の早期及び後期時点の両方で保存されており、減少範囲は７〜１９％であり、健康な対照と有意に相違していない。
【０１５０】
抗ＮＦ２００抗体での染色は、正常対照と比較して、疾患の早期及び後期時点の両方での、ビヒクル処置マウスの白質中の軸索喪失を明らかにし、一方、ＥＲαリガンド及びＥＲβリガンド処置の両方で、ビヒクル処置ＥＡＥマウスにおける喪失と比較してより少ない軸索喪失を生じた（図１５Ｅ、Ｇ）。脊髄前索でのＮＦ２００染色の定量は、健康対照と比較して、ビヒクル処置ＥＡＥにおいて、早期及び後期時点でそれぞれ４９±１２％（ｐ＜０．０１）及び４０±８％（ｐ０．００５）の減少を明らかにした（図１５Ｆ、Ｈ）。ＥＲαリガンド及びＥＲβリガンド処置ＥＡＥマウスにおける軸索数は、健康対照の数と比較して有意に減少した。
【０１５１】
図１５。ＥＲαリガンド及びＥＲβリガンドでの処置は各々、ＥＡＥを有するマウスの脊髄の白質中のミエリン塩基性タンパク質免疫活性及び予備軸索病理学を保存した。胸髄の脊髄後柱切片が、抗ＭＢＰ（赤色）で免疫染色された図１４のマウスから１０Ｘの倍率で画像化された。疾患誘発後１９日目（図１５Ａ）及び４０日目（図１５Ｃ）に、ビヒクル処置マウスは正常対照と比較し、減少したＭＢＰ免疫反応性を有し、一方、ＰＰＴ処置ＥＡＥ及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスは、比較的保存されたＭＢＰ染色を示した。定量化後（図１５Ｂ、Ｄ）、脊髄後柱中のＭＢＰ免疫反応性は、正常マウスと比較して、ビヒクル処置ＥＡＥマウスでは有意に低かったが、一方、ＰＰＴ及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスは有意な減少を示さなかった。ミエリン密度は正常のパーセントとして示されている。正常と比較して統計学的に有意（＊ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００５）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。
【０１５２】
抗ＮＦ２００（緑、ｉ）及び抗ＭＢＰ（赤、ｉｉ）で同時免疫染色された図１５のマウスからの胸部脊髄切片の前索の一部を４０Ｘの倍率で画像化した。より小さな（ｉ）及び（ｉｉ）パネルの合併された画像が（ｉｉｉ）に示されている。赤いミエリン鞘により取り囲まれた特有の緑色の軸索中心が、疾患誘発後１９日目（図１５Ｅ）及び４０日目（図１５Ｇ）からの正常対照、ＰＰＴ及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスで見ることが可能である。ビヒクル処置マウスは、減少した軸索数及びミエリン、ならびに局所的脱髄（白い星印）及び軸索の喪失を示している。定量化後（図１５Ｆ、Ｈ）、白質中の神経フィラメント染色軸索数は、正常マウスと比較して、ビヒクル処置ＥＡＥマウスで有意に少なかったが、一方、ＰＰＴ及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスは、軸索数の有意な減少は示さなかった。軸索数は正常のパーセントとして示されている。正常と比較して統計学的に有意（＊ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００５）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。
【０１５３】
これらのデータを合わせると、ＥＲαリガンド処置はＥＡＥの間、白質中の炎症、脱髄及び軸索切断を減少させ、一方、ＥＲβリガンド処置は炎症を減少させないが、それにもかかわらず、脱髄及び軸索切断を減少させることが可能であった。
【０１５４】
ＥＲαリガンド及びＥＲβリガンド両方での処置は、ＥＡＥを有するマウスの灰白質中のニューロン病変を減少させた。
上記実施例５において、ニューロン異常は驚くことにＥＡＥの早期（１５日目）に起こることが示され、それはエストラジオールか又はＰＰＴでの処置により防止された。ＥＲβリガンド処置が、ＥＡＥの早期（１９日目）及び後期（４０日目）時点の両方でニューロン完全性を保存するかどうかを試験した。灰白質中のニューロンのニスル染色組織学及び抗ＮｅｕＮ／β３チューブリン免疫標識の組み合わせを使用し、ＥＡＥの早期及び後期時点の両方で、同定及び定量化した。灰白質中のニューロン染色の減少が、正常対照と比較した、ビヒクル処置ＥＡＥマウスにおいて、両方の時点で起こったが、一方、灰白質中のニューロン染色は、早期及び後期時点で、ＥＲαか又はＥＲβリガンドで処置したＥＡＥマウスではよく保存されていた（図１６Ａ、Ｃ）。灰白質中のＮｅｕＮ＋細胞の定量は、正常対照と比較した、ビヒクル処置ＥＡＥマウスにおいて、早期及び後期時点でそれぞれ、４１±１３％（ｐ＜０．０５）及び３１±８％（ｐ＜０．０５）減少を示し、一方、ＰＰＴ及びＤＰＮ処置マウスは、わずかに少ないＮｅｕＮ＋細胞数を有したが、健康対照の数とは有意に異なっていなかった（図１６Ｂ、Ｄ）。
【０１５５】
図１６。ＥＲαリガンド及びＥＲβリガンドでの処置は各々、ＥＡＥを有するマウスの脊髄の灰白質中のニューロン染色を保存した。疾患誘発後１９日目（早期、図１６Ａ）か又は４０日目（後期、図１６Ｃ）にそれぞれ殺した、正常健康対照マウス、ビヒクル処置ＥＡＥ、ＥＲαリガンド（ＰＰＴ）処置ＥＡＥ及びＥＲβリガンド（ＤＰＮ）処置ＥＡＥマウスに由来する、（ｉ）ＮｅｕＮ＋（赤）及び（ｉｉ）ニスルで染色された胸部脊髄切片の４Ｘ倍率での分割画像。パネル（ｉｉｉ）は（ｉ）で点線の方形により示された領域からの、ＮｅｕＮ＋（赤）及び（β３チューブリン＋（緑）同時標識ニューロンの４ＯＸでの合併共焦点スキャンである。パネル（ｉｖ）は、（ｉｉ）で黒の方形のニスル染色領域の４０Ｘ倍率である。ＮｅｕＮ＋免疫染色及びニスル染色の減少は、正常対照と比較したビヒクル処置ＥＡＥマウスの後角、中間域及び前角で観察された。パネル（ｉｉｉ）の白い矢印は、ＮｅｕＮ＋染色の喪失を示している。対照的に、ＰＰＴか又はＤＰＮで処置されたＥＡＥマウスは、保存されたＮｅｕＮ及びニスル染色を有していた。Ｔ１〜Ｔ５切片の描かれた全灰白質中のニューロンの定量により、正常対照と比較し、ビヒクル処置ＥＡＥマウス中のＮｅｕＮ＋免疫標識ニューロンは、１９日目（図１６Ｂ）でほとんど４１％、４０日目（図１６Ｄ）でほとんど３１％有意に減少したが、一方、ＰＰＴ及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスは正常対照から統計学的に異なっていなかった。マウス数、処置群当たり３匹；マウス当たりのＴ１〜Ｔ５切片数、６；処置群当たりの切片の総数、１８。正常と比較して統計学的に有意（＊ｐ＜０．０５）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。データは、各処置でＥＡＥマウスの別の組についてその全体を繰り返した実験を代表している。
【０１５６】
神経病理からの保護はＥＲβにより仲介される
ＣＮＳ神経病理に対するインビボでのＤＰＮ処置の効果が本当にＥＲβを介して仲介されるかどうかを確認するため、次ぎに、ＤＰＮ処置ＥＲβ欠損ＥＡＥマウスの白質及び灰白質神経病理を評価した。疾患誘導後３８日目に、炎症、脱髄及び軸索数の減少が白質に存在したが、一方、ニューロン染色はビヒクル処置ＥＡＥマウスの灰白質中で減少した（図１７）。野生型マウスのＤＰＮ処置間に観察されたミエリン、軸索数及びニューロン染色の保存（図１５、１６）と対照的に、ＥＲβノックアウトマウスのＤＰＮ処置はこの白質及び灰白質病変を防ぐのを失敗した（図１７）。
【０１５７】
図１７。ＥＡＥ間の神経病理からのＤＰＮ処置仲介保護はＥＲβに依存する。図１７Ａに示されたように、疾患誘導後４０日目で、ＥＲβノックアウト対照マウス、ＥＡＥを有するビヒクル処置ＥＥβノックアウト及びＥＡＥを有するＤＰＮ処置ＥＲβノックアウトからの胸髄の脊髄後柱切片の前索の一部が、抗ＮＦ２００（緑、ｉ）及び抗ＭＢＰ（赤、ｉｉ）で同時免疫染色された後に４０Ｘの倍率で画像化された。合併画像はパネルｉｉｉに示されている。ＥＲβノックアウト対照切片は、図１８の野生型正常対照と同様の強いＮＦ２００及びＭＢＰ免疫染色を示したが、一方、ビヒクル及びＤＰＮ処置ＥＡＥ切片は減少したミエリン及び軸索染色を有していた。図１７Ｂは、（ｉ）ＮｅｕＮ（赤）及び（ｉｉ）ニスルで染色された、図１７Ａのマウスに由来する胸部脊髄切片の、４Ｘの倍率での分割画像であり、ＥＡＥを有するビヒクル処置及びＤＰＮ処置ＥＲβノックアウトマウスの両方が灰白質中のニューロン喪失を示した。（図１７Ｃ〜Ｆ）白質細胞密度、ミエリン密度、軸索数及びＮｅｕＮ＋細胞の定量は、ＤＰＮ処置は、ＥＲβノックアウトマウスにおけるＥＡＥ間に、白質及び灰白質病変を防止しなかったことを明らかにした。マウス数＝処置群当たり３匹；マウス当たりのＴ１〜Ｔ５切片数＝６；処置群当たりの切片の総数＝１８。正常と比較して統計学的に有意（＊＊ｐ＜０．００１）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。これらのデータは、ＥＡＥ間のインビボでのＤＰＮ処置により仲介される直接神経保護効果はＥＲβを介して仲介されることを示している。
【０１５８】
ＥＲβリガンドでの処置は運動能力の回復を誘発する
ＥＲβリガンドでの処置がＥＡＥにおいて神経保護的であることが発見されたので、この神経保護的効果の臨床的意義を評価した。脊髄損傷において頻繁に使用される臨床転帰、ロータロッド能力を使用した。ビヒクル処置Ｃ５７ＢＬ／６ＥＡＥマウスは、疾患誘発後１２日目に始まる、ロータロッド上に残ることが可能な秒数の突然の及び一貫した減少を示した（図１８Ａ）。この能力障害は、ビヒクル処置ＥＡＥマウスにおいては観察期間の残りを通して残った。対照的に、ＥＲβリガンド処置マウスは、１２日目に始まる、ロータロッド装置に残ることができる秒数の突然の減少を有しているが、ＥＡＥ間のその後は、３０〜４０日目にそれらはロータロッド上に残る能力を有意に回復した。これらのデータは、ＥＲβリガンド処置は、ＥＡＥ間の疾患の後の時点で、運動能力の機能的臨床回復を誘発することを示している。
【０１５９】
最後に、ＤＰＮ処置でのロータロッド能力の改善がＥＲβを介して仲介されるかどうかを評価するため、ＥＲβＫＯメスマウスでロータロッド能力研究を実施した。ＤＰＮ処置でのＥＡＥ間後期のロータロッド能力の改善は、ＥＲβＫＯではもはや観察されなかった（図１８Ｂ）。
【０１６０】
図１８。ＥＲβ選択的リガンドでの処置は、ＥＡＥ間後期に、運動機能の回復を生じる。ＥＡＥを有する卵巣切除Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスがＤＰＮで処置され、ロータロッド装置上の運動能力について評価した。図１８Ａに示されたように、ロータロッド上平均時間は、ビヒクル及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスの両方とも疾患誘発後１２日目に突然減少し、３０日目後に、ＤＰＮ処置群は運動機能の有意な回復を示したが、一方、ビヒクル処置は改善しなかった。＊ｐ＜０．０１及び＊＊ｐ＜０．００５、ＡＮＯＶＡ、エストラジオール処置が処置効果の陽性対照として働いた。各処置群のマウスの数、ビヒクルｎ＝４；ＤＰＮ  ｎ＝８；エストラジオールｎ＝４。データは２回繰り返された実験を代表する。図１８Ｂに示されたように、野生型マウスのＤＰＮ処置で観察された改善とは対照的に、ＤＰＮ処置ＥＲβＫＯマウスにおいての疾患の後期には改善は観察されなかった。再び、ビヒクルは陰性対照として働き、及びエストラジオールは処置効果の陽性対照として働いた。各処置群中のマウスの数、ビヒクルｎ＝４；ＤＰＮ  ｎ＝４；エストラジオールｎ＝４。
【０１６１】
これらのデータは、疾患後期の運動能力のＤＰＮ誘発回復が、ＥＲβを介して仲介されたことを示している。
締めくくりとして、本発明の具体的例示的態様が上に開示されてきたことが注目される。しかしながら、本発明はこれらの具体的態様に限定されないことを理解すべきである。
【０１６２】
従って、本発明は上で詳細に説明されてきた的確な態様に限定されない。特許請求の範囲に関しては、用語「手段」が機能的記述に続いて使用されないかぎり、特許請求の範囲は35 U.S.C １１２節の第６項に従って解釈されるべきではないことが出願人の意図である。
【０１６３】
本明細書は本発明の特定の態様を記述してきたが、発明概念から離れることなく当業者は本発明の変形を企てることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１ａは実施例１に記載した試験設計を模式的に描いたものであり；図１ｂは、妊娠、エストリオール治療（Ｔｘ）及び治療前（Ｔｘ前レベル）間のヒト血清レベルを描いている棒グラフである。
【図２】図２ａは、破傷風及びカンジダに対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を描いている棒グラフであり；図２ｂは治療群間のＩＦＮガンマのレベルを描いている棒グラフである。
【図３】図３ａ〜ｆは、治療前、エストリオール治療及び治療後期間の各月で評価された、連続的大脳ＭＲＩでの各患者のガドリニウム増強病変容積を描いている棒グラフである。
【図４】図４は、治療前と比較した、エストリオールでの治療間のＰＡＳＡＴスコアにおける平均パーセント変化を描いている棒グラフである。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、対照（ビヒクル）で治療された野生型（ＷＴ）、ＥＲベータノックアウト（ＫＯ）又はＥＲアルファＫＯマウス、エストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ）又はエストラジオール処置動物の子宮重量を示している棒グラフである（ｙ軸＝グラムでの子宮重量）。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、対照（ビヒクル）で治療された野生型（ＷＴ）、ＥＲベータノックアウト（ＫＯ）又はＥＲアルファＫＯマウス、エストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ）又はエストラジオール処置動物における、臨床スコアに対するＥＲアルファ選択的リガンドの効果を示している棒グラフである。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ＥＡＥを有する卵巣切除した野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスにおける末梢免疫細胞による炎症促進性サイトカイン産生を示している棒グラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｅは、ＥＡＥを有するマウスの脊髄におけるエストロゲンレセプターアルファリガンド減少炎症及び脱髄の種々の測定を示している。図８Ａは、正常又は治療マウス（ビヒクル、エストラジオール（Ｅ２）又は  エストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ））からの胸部脊髄切片であり；図８Ｂは、８Ａに示したものと同一切片の背部脊柱のルクソールファースト青染色拡大領域を示しており（４０倍）；図８Ｃは、８Ａに示したものと同一切片の背部脊柱の抗ＢＭＰ免疫染色拡大領域を示しており；図８Ｄは、治療群での白質細胞数を示している棒グラフであり；及び図８Ｅは治療群でのミエリン密度を示している棒グラフである。
【図９】図９Ａ〜Ｅは、ＥＡＥを有するマウスの脊髄におけるエストロゲンレセプターアルファリガンド減少炎症及び脱髄の種々の測定を示している。図９Ａ〜Ｄは、各治療群（正常、ビヒクル、エストラジオール（Ｅ２）又はエストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ））のマウスに由来した、ｉにおいてはＮｅｕＮ＋（赤）及びｉｉにおいてはＮｉｓｓｌで染色した胸部脊髄切片の４ｘの倍率での分割画像である。図９Ｅは、描かれた灰白質中のＮｅｕＮ＋免疫標識されたニューロン数を示している棒グラフである。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、ＥＡＥを有するマウスの脊髄におけるエストロゲンレセプターアルファリガンド減少炎症及び脱髄の種々の測定を示している。図１０Ａ及びＢは、各治療群（正常、ビヒクル、エストラジオール（Ｅ２）又はエストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ））のマウスに由来した、ＮＦ２００（緑）及びＣＤ４５（赤）で同時免疫染色した、図５に示した胸部脊髄切片の１０ｘの倍率での画像である。図１０Ｃは、軸索数を示している棒グラフであり、及び図１０Ｄは、Ｍａｃ−３細胞密度測定を示している棒グラフである。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、野生型（ＷＴ）、エストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ）及びエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ）治療動物の子宮重量を示している棒グラフである（ｙ軸＝グラムでの子宮重量）。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｄは、野生型（ＷＴ）、エストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ）及びエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ）治療動物の臨床スコアに対する影響を示している棒グラフである。
【図１２−２】図１２Ｅ〜Ｇは、野生型（ＷＴ）、エストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ）及びエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ）治療動物の臨床スコアに対する影響を示している棒グラフである。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、増殖又はサイトカイン産生に対するエストロゲンレセプター選択的リガンド（ＤＰＮ）、ビヒクル又はエストラジオールでの治療の効果を示している棒グラフである。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｄは、ＥＡＥを有するマウスの脊髄におけるエストロゲンレセプターアルファリガンド減少炎症及び脱髄の種々の測定を示している。図１４Ａ及びＣは、正常又は治療マウス（ビヒクル、エストロゲンレセプターアルファ（ＰＰＴ）又はエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ））からの早期及び後期胸部脊髄切片であり；図１４Ｂは各治療群についての早期白質細胞密度を示しており；図１４Ｄは各治療群についての後期白質細胞密度を示している。
【図１４−２】図１４Ｅ〜Ｆは、ＥＡＥを有するマウスの脊髄におけるエストロゲンレセプターアルファリガンド減少炎症及び脱髄の種々の測定を示している。１４Ｅ及びＦは、各治療群のマウスに由来した、ＮＦ２００（緑）及びＣＤ４５（赤）で同時免疫染色された１０ｘの倍率での早期及び後期切片を示している。
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｈは、ＥＡＥマウスの脊髄中の、ＭＢＰのエストロゲンレセプターアルファ及びベータリガンド保存及び予備軸索病態の種々の測定を示している。図１５Ａ及びＣは、各治療群（正常、ビヒクル、エストロゲンアルファリガンド（ＰＰＴ）又はエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ））からの早期及び後期時点に由来する、ＮｅｕＮ（赤）で染色された胸部脊髄切片の１０ｘの倍率での画像である。図１５Ｅ及びＧは、各治療群（正常、ビヒクル、エストロゲンアルファリガンド（ＰＰＴ）又はエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ））からの早期及び後期時点に由来する、抗ＮＦ２００（緑、ｉ）及び抗ＢＭＰ（赤、ｉｉ）で同時免疫染色された胸部脊髄切片の画像であり、ｉｉｉでは合併されて示されており；図１５Ｂ及びＤは、それぞれ早期及び後期のミエリン密度を示している棒グラフであり、一方、図１５Ｆ及びＨは、それぞれ早期及び後期の軸索数を示す棒グラフである。
【図１５−２】図１５Ａ〜Ｈは、ＥＡＥマウスの脊髄中の、ＭＢＰのエストロゲンレセプターアルファ及びベータリガンド保存及び予備軸索病態の種々の測定を示している。図１５Ａ及びＣは、各治療群（正常、ビヒクル、エストロゲンアルファリガンド（ＰＰＴ）又はエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ））からの早期及び後期時点に由来する、ＮｅｕＮ（赤）で染色された胸部脊髄切片の１０ｘの倍率での画像である。図１５Ｅ及びＧは、各治療群（正常、ビヒクル、エストロゲンアルファリガンド（ＰＰＴ）又はエストロゲンレセプターベータリガンド（ＤＰＮ））からの早期及び後期時点に由来する、抗ＮＦ２００（緑、ｉ）及び抗ＢＭＰ（赤、ｉｉ）で同時免疫染色された胸部脊髄切片の画像であり、ｉｉｉでは合併されて示されており；図１５Ｂ及びＤは、それぞれ早期及び後期のミエリン密度を示している棒グラフであり、一方、図１５Ｆ及びＨは、それぞれ早期及び後期の軸索数を示す棒グラフである。
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、ＥＡＥを有するマウスの脊髄における灰白質の神経染色のエストロゲンレセプターアルファ及びベータリガンド保存の種々の測定を示している。図０Ａ〜Ｄは、各治療群（正常、ビヒクル、エストラジオール（Ｅ２）又はエストロゲンレセプターアルファリガンド（ＰＰＴ））のマウスに由来した、ｉにおいてはＮｅｕＮ＋（赤）及びｉｉにおいてはＮｉｓｓｌで染色した胸部脊髄切片の４ｘの倍率での分割画像である。図９Ｅは、描かれた灰白質中のＮｅｕＮ＋免疫標識されたニューロン数を示している棒グラフである。
【図１７−１】ＥＡＥ間の神経病理からのＤＰＮ処置仲介保護はＥＲβに依存する。図１７Ａに示されたように、疾患誘導後４０日目で、ＥＲβノックアウト対照マウス、ＥＡＥを有するビヒクル処置ＥＥβノックアウト及びＥＡＥを有するＤＰＮ処置ＥＲβノックアウトからの胸髄の脊髄後柱切片の前索の一部が、抗ＮＦ２００（緑、ｉ）及び抗ＭＢＰ（赤、ｉｉ）で同時免疫染色された後に４０Ｘの倍率で画像化された。合併画像はパネルｉｉｉに示されている。ＥＲβノックアウト対照切片は、図１８の野生型正常対照と同様の強いＮＦ２００及びＭＢＰ免疫染色を示したが、一方、ビヒクル及びＤＰＮ処置ＥＡＥ切片は減少したミエリン及び軸索染色を有していた。図１７Ｂは、（ｉ）ＮｅｕＮ（赤）及び（ｉｉ）ニスルで染色された、図１７Ａのマウスに由来する胸部脊髄切片の、４Ｘの倍率での分割画像であり、ＥＡＥを有するビヒクル処置及びＤＰＮ処置ＥＲβノックアウトマウスの両方が灰白質中のニューロン喪失を示した。
【図１７−２】図１７Ｃ〜Ｆ：白質細胞密度、ミエリン密度、軸索数及びＮｅｕＮ＋細胞の定量は、ＤＰＮ処置は、ＥＲβノックアウトマウスにおけるＥＡＥ間に、白質及び灰白質病変を防止しなかったことを明らかにした。マウス数＝処置群当たり３匹；マウス当たりのＴ１〜Ｔ５切片数＝６；処置群当たりの切片の総数＝１８。正常と比較して統計学的に有意（＊＊ｐ＜０．００１）、１ｘ４ＡＮＯＶＡ。これらのデータは、ＥＡＥ間のインビボでのＤＰＮ処置により仲介される直接神経保護効果はＥＲβを介して仲介されることを示している。
【図１８】ＥＲβ選択的リガンドでの処置は、ＥＡＥ間後期に、運動機能の回復を生じる。ＥＡＥを有する卵巣切除Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスがＤＰＮで処置され、ロータロッド装置上の運動能力について評価した。図１８Ａに示されたように、ロータロッド上平均時間は、ビヒクル及びＤＰＮ処置ＥＡＥマウスの両方とも疾患誘発後１２日目に突然減少し、３０日目後に、ＤＰＮ処置群は運動機能の有意な回復を示したが、一方、ビヒクル処置は改善しなかった。＊ｐ＜０．０１及び＊＊ｐ＜０．００５、ＡＮＯＶＡ、エストラジオール処置が処置効果の陽性対照として働いた。各処置群のマウスの数、ビヒクルｎ＝４；ＤＰＮ  ｎ＝８；エストラジオールｎ＝４。データは２回繰り返された実験を代表する。図１８Ｂに示されたように、野生型マウスのＤＰＮ処置で観察された改善とは対照的に、ＤＰＮ処置ＥＲβＫＯマウスにおいての疾患の後期には改善は観察されなかった。再び、ビヒクルは陰性対照として働き、及びエストラジオールは処置効果の陽性対照として働いた。各処置群中のマウスの数、ビヒクルｎ＝４；ＤＰＮ  ｎ＝４；エストラジオールｎ＝４。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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