(57)【要約】  本発明は色素体形質転換（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ）植物細胞のチラコイド内腔における組換えタンパク質の発現のための構築物および方法に関する。さらに、本発明は、チラコイド内腔において関心のある遺伝子を発現する色素体形質転換植物細胞および植物に関する。
2009507507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写方向に機能的に互いに連結された、
ａ）植物色素体において機能的であるプロモーター、
ｂ）ｃ）の核酸配列に翻訳的に融合した核コード化タンパク質からのメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ペプチドをコードする異種核酸配列、
ｄ）場合によって、植物細胞の色素体において活性であるターミネーター
を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項２】
内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列が、チラコイド膜を横切る移動のためにＳｅｃ依存性経路またはＴａｔ経路を利用する核コード化タンパク質に由来する、請求項１記載のキメラ遺伝子。
【請求項３】
ペプチドをコードする異種核酸配列がアプロチニンタンパク質をコードする、請求項１〜２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４】
形質転換する植物のプラストームにおける配列に相同である少なくとも２つの配列を含有し、該相同配列が請求項１から３のいずれか１項記載の少なくとも１つのキメラ遺伝子に隣接することを特徴とする、植物色素体の形質転換のために設計されたベクター。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項記載の少なくとも１つのキメラ遺伝子を含有することを特徴とする色素体形質転換（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ）植物細胞。
【請求項６】
請求項５記載の色素体形質転換植物細胞を含んでなる色素体形質転換植物および／またはその後代。
【請求項７】
藻類、ウキクサ科植物（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属植物、ジャガイモ、トマトまたはダイズ植物である、請求項６記載の色素体形質転換植物および／またはその後代。
【請求項８】
請求項５記載の植物細胞を含んでなる、請求項６から７のいずれか１項記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項９】
ａ）請求項１から２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子で色素体を形質転換する工程、
ｂ）該キメラ遺伝子の発現およびシグナルペプチドの後続の切断のための適当な条件下に、該形質転換色素体を含む植物細胞を増殖させる工程
を含んでなる、植物細胞における関心のあるタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
ａ）異種核酸配列が非メチオニンＮ末端ペプチドをコードする請求項１から２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子で色素体を形質転換すること、
ｂ）該キメラ遺伝子の発現およびシグナルペプチドの後続の切断のための適当な条件下に、該形質転換色素体を含む植物細胞を増殖させること
を含んでなる、植物色素体における非メチオニンＮ末端ペプチドの製造方法。
【請求項１１】
該非メチオニンＮ末端タンパク質がアプロチニンである、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項５記載の色素体形質転換植物細胞から、または請求項６から７のいずれか１項記載の色素体形質転換植物および／またはその後代から、または請求項８記載の色素体形質転換植物の収穫可能な部分から、関心のあるペプチドを抽出する工程を含んでなる、関心のあるペプチドの製造方法。
【請求項１３】
関心のあるペプチドがアプロチニンである、請求項１２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素体形質転換（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ；プラストーム形質転換））植物細胞のチラコイド内腔組換えタンパク質の発現のための構築物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物色素体（葉緑体、アミロプラスト、エチオプラスト、有色体など）は、プロ色素体として公知の共通の前駆体に由来し、アミノ酸、複合糖質、脂肪酸および色素のような重要な化合物の産生をもたらす。一般に、植物細胞は、単コピーおよび重複ＤＮＡセグメントを含有する小さな１２０〜１６０キロベースの環状色素体ゲノムの５００〜１０，０００コピーを含有する。したがって、非常に高レベルの外来遺伝子発現および全可溶性細胞タンパク質の４０％までの範囲の組換えタンパク質の蓄積をもたらしうる関心のある特定の遺伝子の２０，０００コピーまでを含有するよう植物細胞を操作することが可能である（Ｄｅ  Ｃｏｓａら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，７１−７４）。さらに、葉緑体トランスジェニック系統においては、核トランスジェニック植物より１６９倍高い転写産物の蓄積が認められるにもかかわらず、遺伝子サイレンシングは報告されていない（Ｌｅｅら，２００３，Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１１，１−１３）。また、ほとんどの植物の色素体は母系遺伝する。その結果、核内で発現される異種遺伝子とは異なり、色素体内で発現される異種遺伝子は花粉伝播しない。したがって、これは環境におけるトランスジーン（導入遺伝子）の拡散および隣接植物へのその伝播のリスクを低減する。
【０００３】
葉緑体は、３つの異なる可溶性相を含む構造上複雑な細胞小器官である。葉緑体は、膜間腔を取り囲む二重の包膜で包まれている。主要な可溶性相はストロマであり、これは炭素固定、アミノ酸合成および多数の他の経路の場となる。主要な膜は、広範な相互連結性チラコイドネットワークであり、この部位において光が捕捉され、ＡＴＰが合成される。チラコイド膜は第３の可溶性相（チラコイド内腔）を封入しており、これは多数の外因性光合成タンパク質および他の多数のものを収容している（Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，２００１，Ｔｒａｆｆｉｃ  ２：２４５−２５１）。
【０００４】
該細胞小器官においては少数の葉緑体タンパク質がコードされ合成されるに過ぎない。ほとんどは核内でコードされ、細胞質ゾルにおいて前駆体として合成され、翻訳後に葉緑体小区画の１つへ輸入される。これは特異的細胞ソーティングシグナルを要し、これは、横断される必要がありうる異なる膜系の存在により、特に複雑化していることがある。
【０００５】
タンパク質を葉緑体のチラコイド内腔へ指向させるための２つの異なる分泌経路が特徴づけされている。第１の経路は、細菌におけるＳｅｃＹＥＧ輸出メカニズムに関連したＳｅｃ依存性経路である。第２の経路は、トランジット（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチドにおける２つの保存された連続的アルギニンにより特徴づけられるｐＨ依存性メカニズム［Ｔａｔ（二重アルギニントランスロカーゼ）経路］である。Ｓｅｃ経路により該内腔へ指向するタンパク質は一般に、折り畳まれていない状態で移動し、一方、Ｔａｔ経路により輸入されるタンパク質は、折り畳まれた状態で移動しうる。いずれの経路で内腔へ輸入されるタンパク質も、該トランジットペプチドのカルボキシル近位部分を除去するチラコイドプロセシングプロテアーゼによりプロセシングされる（Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，ｔｒａｆｆｉｃ  ２００１，２：２４５−２５１）。
【０００６】
葉緑体のチラコイド内腔は、それが酸化安定性を増強する点およびプロテアーゼにおけるその特有の含有量の点で或る組換えタンパク質の蓄積に最適となりうる植物細胞区画である（Ｚ．Ａｄａｍｓら，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ７  Ｎ°１０，２００２）。それにもかかわらず、組換えタンパク質の指向化および蓄積に関してはほとんど注目されてこなかった。
【０００７】
米国特許第６，５１２，１６２号において、融合ｐｅｔＡ：：アプロチニンタンパク質を植物細胞チラコイド膜へ指向化させるために、アプロチニンコード配列がｐｅｔＡ遺伝子に融合されている。ＰｅｔＡは、葉緑体チラコイド膜における膜貫通配置、チラコイド空間内のＮ末端領域およびストロマにおける１５アミノ酸のＣ末端配列を有するポリペプチドとして報告されているシトクロムｆ（ｐｅｔＡ）タンパク質をコードする葉緑体ゲノムからの遺伝子である（ＳＪ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ  ８２  ｐｐ  ７９５５−７９５９，１９８５）。したがって、アプロチニンコード配列がシトクロムｆ（ｐｅｔＡ）のコード配列の３’末端に連結された融合ｐｅｔＡ：：アプロチニンタンパク質はアプロチニンをストロマ内へ指向するはずである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、関心のあるペプチドを葉緑体のチラコイド内腔内へ明確かつ確実に指向させる方法および手段が尚も必要とされている。
【０００９】
本発明は、核コード化タンパク質由来の内腔指向性シグナル配列を使用して、葉緑体ゲノム内に組込まれたトランスジーンによりコードされる組換えタンパク質を葉緑体のチラコイド内腔へ指向させるのに有用な核酸配列を初めて提供するものである。
【００１０】
そのような方法は、酸化還元特性、プロテアーゼ含有量およびフォールディング（折り畳み）活性の点で特有の特性を有する細胞区画内に大量の組換えタンパク質を蓄積させるために葉緑体ゲノム内に組込まれたトランスジーンの高レベル発現を利用するものである。
【００１１】
また、この方法により、植物葉緑体において非メチオニンＮ末端を有する組換えタンパク質を製造することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の主題は、転写方向に機能的に互いに連結された、
ａ）植物色素体において機能的であるプロモーター、
ｂ）ｃ）の核酸配列に翻訳的に融合した核コード化タンパク質からのメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列、
ｃ）ペプチドをコードする異種核酸配列、
ｄ）場合によって、植物細胞の色素体において活性であるターミネーター
を含んでなるキメラ遺伝子である。
【００１３】
葉緑体チラコイド内腔区画へ指向される核コード化タンパク質は、ストロマ指向性シグナルペプチドと内腔指向性シグナルペプチドとから構成される特徴的な二成分トランジットペプチドを有する。ストロマ指向化情報は該トランジットペプチドのアミノ近位部分に存在する。内腔指向性シグナルペプチドは該トランジットペプチドのカルボキシル近位部分に存在し、該内腔へ指向させるための情報の全てを含有する。内腔指向性化シグナルペプチドは細菌シグナルペプチドに対して強い類似性を示し、荷電Ｎ末端ドメイン、疎水性コアおよびより極性のＣ末端ドメイン（これは末端切断部位に対して−３および−１の位置の短鎖残基で終結する）に分けられうる（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０，５３５−５４５，１９８９）。
【００１４】
内腔指向性シグナルペプチドを核コード化タンパク質から該タンパク質のアミノ酸配列または対応遺伝子の核酸配列に基づいて推定することは当業者によく知られている。
【００１５】
非限定的な一例として、ＳｉｇｎａｌＰ（シグナルＰ）（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔ．８：５８１−５９９，１９９７）は、内腔タンパク質の内腔指向性シグナルペプチドおよび二成分トランジットペプチドを推定するための適当な手段である。行うもう１つの方法は、核コード化タンパク質の細胞内位置の大規模な推定を可能にするソフトウェアＴａｒｇｅｔＰ（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３００：１００５−１０１６，２０００）を使用すること、およびＴａｒｇｅｔＰにより推定された葉緑体タンパク質を二重（ｔｗｉｎ）アルギニンモチーフに関して手動検索により研究することである（Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈら，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８：２４９−２６４，２００３）。
【００１６】
高等植物葉緑体のプロテオミクスにおける最近の研究は、本発明において潜在的に使用可能な内腔指向性シグナルペプチドを有する多数の核コード化内腔タンパク質の同定を達成している（Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈら，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴ  ４８０：２７１−２７６，２０００；Ｐｅｌｔｉｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：３１９−３４１，２０００；Ｂｒｉｃｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５０３：３５０−３５６，２００１）。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からの約８０個のタンパク質ならびにホウレンソウおよびエンドウからの相同タンパク質がＫｉｅｓｅｌｂａｃｈら，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８：２４９−２６４，２００３により報告されている。特に、この刊行物（これを参照により本明細書に組み入れることとする）の表２は、アクセッション番号により特定された、葉緑体内腔からの８５個のタンパク質を開示している。また、イネゲノムの最近公開されたドラフト（ｄｒａｆｔ）形態（Ｇｏｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：９２−１００，２００２）は、本発明において使用されうる適当な内腔指向性シグナルペプチド源である。
【００１７】
色素体における通常の翻訳はメチオニンから開始されることが当業者によく知られている。核コード化タンパク質からの内腔指向性シグナルペプチドはＮ末端アミノ酸としてメチオニンを有する又は有さない可能性がある。本発明においては、メチオニンをコードするＡＴＧ翻訳開始コドンは、内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸分子の５’末端においてインフレームで融合しているまたはそのような内腔指向性シグナルペプチドがメチオニンから開始しない場合にはＮ末端アミノ酸により置換されている。
【００１８】
内腔指向性シグナルペプチドをコートする核酸分子は、例えば植物由来のゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーから単離されうる。あるいは、それらは組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ）または化学合成により製造されうる。そのような核酸分子の特定および単離は、本発明の分子またはこれらの分子の一部を使用することにより、あるいは場合によってはこれらの分子の逆相補鎖を例えば標準的な方法によるハイブリド形成により行うことが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。本発明のメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドは、当業者によく知られた技術、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｏｌａｎ  Ｃ編，Ｎｅｗ  Ｙｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されているような方法を用いて、核コード化タンパク質から入手しうる。
【００１９】
核コード化タンパク質は、２つの異なる分泌経路によりチラコイド膜を横切って葉緑体チラコイド内腔区画内へ指向されうる。第１の経路はＳｅｃ依存性経路であり、第２の経路はＴａｔ経路である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８，２０９−２２１，１９９８；Ｃｌｉｎｅら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，１−２６，１９９６）。本発明者らは、Ｓｅｃ依存性経路を利用して核コード化タンパク質から生じる又はＴａｔ経路を利用して核コード化タンパク質から生じる内腔指向性シグナルペプチドが本発明に適していることを示した。
【００２０】
したがって、本発明は、内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列が、チラコイド膜を横切る移動のためにＳｅｃ依存性経路またはＴａｔ経路を利用する核コード化タンパク質に由来する、前記のキメラ遺伝子に関する。
【００２１】
本発明の１つの実施形態においては、メチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列は、
ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸分子、
ｃ）配列番号１または３に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子、
ｄ）ａ）またはｃ）に記載の核酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、８０％または９０％の同一性を有する核酸配列を有する核酸分子、
ｅ）遺伝暗号の縮重によりａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に記載の核酸分子の配列から逸脱したヌクレオチド配列を有する核酸分子、ならびに
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に記載の核酸分子の断片、対立遺伝子変異体および／または誘導体に相当する核酸分子
よりなる群から選ばれる。
【００２２】
本発明において、「同一性」なる語は、％で表された、他のタンパク質／核酸のアミノ酸／ヌクレオチドと一致するアミノ酸／ヌクレオチドの数を意味すると理解されるべきである。同一性は、好ましくは、コンピュータープログラムの助けにより配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を他のタンパク質／核酸と比較することにより決定される。互いに比較される配列が、異なる長さを有する場合には、長いほうの配列と共通の短いほうの配列を有するアミノ酸の数が同一性の比率を決定するよう、同一性が決定されるべきである。好ましくは、同一性は、よく知られており公に利用可能であるコンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（１９９４），４６７３−４６８０）により決定される。ＣｌｕｓｔａｌＷは、Ｊｕｌｉｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ＤＥ）およびＴｏｂｙ  Ｇｉｂｓｏｎ（Ｇｉｂｓｏｎ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ＤＥ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｅｙｅｒｈｏｆｓｔｒａｓｓｅ  １，Ｄ  ６９１１７  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにより公に利用可能なものにされている。ＣｌｕｓｔａｌＷは、ＩＧＢＭＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  ｅｔ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ，Ｂ．Ｐ．１６３，６７４０４  Ｉｌｌｋｉｒｃｈ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ；ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／）およびＥＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を含む種々のインターネットサイトから、ならびにＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫ）の全てのミラーインターネットサイトもダウンロード可能である。好ましくは、本発明のタンパク質と他のタンパク質との間の同一性を決定するためには、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータープログラムのＶｅｒｓｉｏｎ  １．８を使用する。それを行う際には、以下のパラメータを設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝１，ＴＯＰＤＩＡＧ＝５，ＷＩＮＤＯ  Ｗ＝５，ＰＡＩＲＧＡＰ＝３，ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０，ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ＝０．０５，ＧＡＰＤＩＳＴ＝８，ＭＡＸＤＩＶ＝４０，ＭＡＴＲＩＸ＝ＧＯＮＮＥＴ，ＥＮＤＧＡＰＳ（ＯＦＦ），ＮＯＰＧＡＰ，ＮＯＨＧＡＰ。好ましくは、例えば本発明の核酸分子のヌクレオチド配列と他の核酸分子のヌクレオチド配列との間の同一性を決定するためには、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータープログラムのＶｅｒｓｉｏｎ  １．８を使用する。それを行う際には、以下のパラメータを設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝２，ＴＯＰＤＩＡＧＳ＝４，ＰＡＩＲＧＡＰ＝５，ＤＮＡＭＡＴＰＪＸ：ＩＵＢ，ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０，ＧＡＰＥＸＴ＝５，ＭＡＸＤＩＶ＝４０，ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮＳ：ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ。
【００２３】
本発明において、「機能的に互いに連結された」または「機能的に連結された」なる語は、成分キメラ遺伝子の特定されている要素が、コード配列の発現を可能にする単位として機能するよう互いに連結されていることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の発現を促進しうる場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている、と表現される。本発明において、「機能的に互いに連結された」なる語は、プロモーターがコード配列に直接的には連結されていないポリシストロン配置の場合を包含する。
【００２４】
本発明のキメラ遺伝子は、当業者によく知られた技術、特にＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｏｌａｎ  Ｃ編，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されているような方法を用いて、種々の成分から構築されうる。厳密にどの調節要素を該キメラ遺伝子に含有させるかは、それを機能させようとする植物および色素体のタイプに左右されるであろう。当業者であれば、どの調節要素が機能し、与えられた植物体内へのタンパク質の産生を向上させうるかを決定しうるであろう。一例として、該遺伝子の上流にシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）コンセンサス配列ＧＧＡＧＧが配置されうる。その代わりに又はそれに加えて、プロモーターと該遺伝子との間に５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が挿入されうる（Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ  Ｐ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，６０１−６０６）。より高いレベルのトランスジーンの色素体内発現には５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）調節シグナルの使用が一般に必要であると当業者により認識されている（Ｄｅ  Ｃｏｓａ  Ｂ．，Ｍｏａｒ  Ｗ．，Ｌｅｅ  Ｓ．Ｂ．，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．およびＤａｎｉｅｌｌ  Ｈ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，７１−７４）。可能な５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは当業者によく知られている。一例として、ｐｓｂＡ遺伝子のプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４のヌクレオチド１５９６−１８１９）は内因性５’ＵＴＲを含む。１６ＳリボソームオペロンＰｒｒｎのプロモーターがｒｂｃＬ遺伝子のリボソーム結合部位領域（５’ＵＴＲ  ｒｂｃＬ）に結合されうる。
【００２５】
植物細胞の色素体において機能的であるプロモーターとしては特に、例えば、ＰＳＩＩのＤ１ポリペプチドをコードするｐｓｂＡ遺伝子（Ｓｔａｕｂら，１９９３  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２（２）：６０１−６０６）、およびリボソームＲＮＡオペロンを調節する構成的Ｐｒｒｎプロモーター（Ｓｔａｕｂら，１９９２  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：３９−４５）が挙げられうる。原則として、色素体（ｐｌａｓｔｏｍｉｃ）植物遺伝子または細菌遺伝子から得られる任意のプロモーターが機能しうるであろう。所望の発現様式（構成的または誘導性）を得るためには、入手可能なプロモーターのいずれを選択すべきかが、当業者により認識されるであろう。
【００２６】
本発明に好適なプロモーターは、リボソーム結合部位を与えるようｒｂｃＬ遺伝子の５’非翻訳配列の一部に連結された、タバコのＰｒｒｎプロモーターである（Ｓｖａｂら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：９１３−９１７）。
【００２７】
もう１つの好適なプロモーターは、ＰＳＩＩのＤ１ポリペプチドをコードする、ｐｓｂＡ遺伝子の光依存性プロモーターである（Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ  Ｐ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，６０１−６０６）。
【００２８】
植物細胞色素体において活性であるターミネーターとしては特に、例えば、ｐｓｂＡ遺伝子、ｒｂｃＬ遺伝子（ＲｕＢｉｓＣＯの大サブユニットをコードする）およびｒｐｓ１６遺伝子（タバコリボソームタンパク質をコードする）のターミネーターが挙げられうるであろう（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２０４３−２０４９；Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ  Ｐ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，６０１−６０６）。
【００２９】
本発明においては、「翻訳的に融合した」なる語は、翻訳されると単一のポリペプチドをコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの産生を転写の際にもたらす単一のオープンリーディングフレームを核酸配列が表すよう核酸配列が融合していることを意味するものとする。
【００３０】
本発明においては、核コード化タンパク質からのメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列は異種核酸配列に翻訳的に融合しており、このことは、この第２の核酸配列が、内腔指向性シグナルペプチドをコードする第１の核酸配列に天然では融合していないことを意味する。
【００３１】
本発明の１つの実施形態においては、内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列に融合したペプチドをコードする異種核酸配列は真核生物に由来する。
【００３２】
本発明のもう１つの実施形態においては、メチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドおよび／または異種核酸分子をコードする核酸配列は、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の葉緑体コドン使用頻度に基づいて葉緑体発現が最適化されるよう設計される。ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の葉緑体コドン使用頻度はｗｗｗ．Ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎで入手可能であり、コドンの分布は葉緑体コドン使用頻度表（Ｎａｋａｍｕｒａら，２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２９２）における頻度に従いコード配列全体にわたって各アミノ酸残基に無作為に帰属される。
【００３３】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、ペプチドをコードする異種核酸配列は、非メチオニンＮ末端を有するペプチドをコードする。
【００３４】
ペプチドをコードする異種核酸分子は、例えば真核生物または他の起源から得られたゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーから単離されうる。あるいは、それらは組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ）または化学合成により製造されうる。このような核酸分子の特定および単離は、本発明の分子またはこれらの分子の一部を使用することにより、あるいは場合によってはこれらの分子の逆相補鎖を例えば標準的な方法によるハイブリダイゼーションにより行うことが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００３５】
本発明の更にもう１つの実施形態において、ペプチドをコードする異種核酸配列はアプロチニンタンパク質をコードする。アプロチニンは、ウシの器官または組織、例えば膵臓、肺または肝臓から抽出されうるプロテアーゼインヒビターである。アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミンおよびカリクレインを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害することが公知であり、心筋梗塞、ショック症候群、高フィブリン溶解性および急性膵炎の治療ならびに心臓手術に関連した出血の軽減のために治療的に使用される（Ｂｉｄｓｔｒｕｐら，１９８９，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．４４：６４０−６４５）。アプロチニンの核酸およびアミノ酸配列はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬデータベース（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓおよびＥＭＢＬ支所−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔの共同）にアクセッション番号Ｐ００９７４として見出されうる。
【００３６】
本発明においては、アプロチニンタンパク質は配列番号６として特定される。該異種核酸配列が、アプロチニンタンパク質に匹敵する生物活性を示すアプロチニンタンパク質の断片を含有するペプチドをコードする、または配列番号６に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、本発明のキメラ遺伝子は、本発明のもう１つの実施形態である。
【００３７】
本発明の他の実施形態においては、該異種核酸配列は、配列番号５の配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列を有する。
【００３８】
他の分子と相同でありこれらの分子の誘導体を構成する該核酸分子または該ポリペプチドは一般には、同じ生物学的機能を示し修飾を含有するこれらの分子の変異体である。この目的には、修飾は、酵素活性に関与しないアミノ酸残基上に存在しうる。
【００３９】
本発明においては、該核酸分子またはそれによりコードされるポリペプチドの生物学的機能は、例えばＮα−ベンゾイル−Ｄ，Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩アッセイ（Ｌａｖｅｎｓら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６６（１），９３−１０２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎ°Ｂ  ４８７５；該製造業者のマニュアルに従うアッセイ）のようなインビトロ試験を用いて、該ポリペプチドまたは該核酸分子によりコードされるポリペプチドがセリンプロテアーゼを阻害する能力により評価されうる。変異、例えば突然変異は天然様態で生じることが可能であり、あるいは突然変異誘発により導入されることが可能である。また、該変異体は、合成により作製された配列でありうる。対立遺伝子変異体は、天然に存在する変異体、および合成により作製された変異体または組換えＤＮＡ技術により得られた変異体でありうる。遺伝暗号の縮重により本発明の核酸分子から逸脱した核酸分子は誘導体の特別の形態を構成する。
【００４０】
遺伝暗号の縮重により天然分子のヌクレオチド配列とは異なる配列を有する、アプロチニンをコードする異種核酸分子を含むキメラ遺伝子も、本発明の主題である。
【００４１】
酵素活性の改変を伴う変異体アプロチニンをコードする異種核酸分子を含むキメラ遺伝子も本発明の主題である。
【００４２】
本発明はまた、形質転換する植物のプラストームにおける配列に相同である少なくとも２つの配列を含有し、該相同配列が本発明の少なくとも１つのキメラ遺伝子に隣接することを特徴とする、植物色素体の形質転換のために設計されたベクターに関する。
【００４３】
これらの配列（一方は成分キメラ遺伝子の上流（ＬＨＲＲ）、もう一方は下流（ＲＨＲＲ））は、隣接領域ＬＨＲＲおよびＲＨＲＲを含む、プラストームの遺伝子間領域内の二重相同組換えを可能にする。
【００４４】
本発明のそれらの２つの相同組換え配列は、プラストームの非コード（遺伝子間）配列においてキメラ遺伝子が挿入されるよう、連続的でありうる。特定の実施形態においては、この配列は色素体リボソームＲＮＡのオペロンの一部である。もう１つの特定の実施形態においては、該非コード配列はｒｂｃｌ遺伝子（これはｒｕＢｉｓＣＯの大サブユニットをコードする）の３’末端を含み、もう一方の相同配列はａｃｃＤ遺伝子（これはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニットの１つをコードする）の５’末端を含む。更により詳しくは、ＬＨＲＲ断片はタバコプラストームのヌクレオチド５７７６４−５９２９１に対応する（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら，１９８６−Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４）。ＲＨＲＲ断片はタバコプラストームのヌクレオチド５９２９９−６０５３６に対応する。
【００４５】
色素体の形質転換を達成するためには、形質転換用ＤＮＡは、ストロマに到達する前に細胞壁、細胞膜および細胞小器官の二重膜を横切らなければならない。この点で、色素体ゲノムを形質転換するために最も一般に用いられる技術は粒子射撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）の技術である（ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｆｅｂ  １，９０（３）：９１３−９１７）。高速微小発射体を使用する色素体トランスフェクションは単細胞藻類クラミドモナス・レインハルドティイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）において初めて行われた（Ｂｏｙｎｔｏｎら，１９８８）。現在、高等植物において、色素体の安定な形質転換がタバコ、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）において一般に行われている（ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，８５２６−８５３０；ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｆｅｂ  １，９０（３）：９１３−９１７）。イネ（Ｋｈａｎ  Ｍ．Ｓ．およびＭａｌｉｇａ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，９１０−９１５）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｓｉｋｄａｒら，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １８：２０−２４）、ジャガイモ（Ｓｉｄｏｒｏｖら，１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９（２）：２０９−２１６）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら，１９９９，ＷＯ  ００／３９３１３）およびトマト（Ｒｕｆら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，８７０−８７５）からのプラスチドの形質転換が報告されている。稔性色素体形質転換植物がタバコ、トマト、ジャガイモおよびダイズに関して得られている（ＷＯ  ０４／０５３１３３）。最近、ウキクサ色素体の形質転換が報告された（ＷＯ  ０５／００５６４３）。
【００４６】
形質転換色素体および細胞、すなわち、プラストーム内にキメラ遺伝子が取り込まれたもの（すなわち、色素体形質転換細胞）を選択するために、選択マーカーが使用されうる。それは、稔性ホモプラスミック（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）色素体形質転換植物を得ることをも可能にする。「ホモプラスミック」なる語は、細胞の全てが同種類のプラストームおよびそのプラストームのみを含有することを意味する。色素体形質転換植物は、すべてのそれらの細胞が形質転換プラストームのコピーのみを含有する場合、ホモプラスミックである。
【００４７】
選択マーカーとして使用されうる遺伝子としては特に、例えば、２つのキメラ遺伝子、すなわち、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与するアミノグリコシド３”−アデニルトランスフェラーゼをコードするａａｄＡ遺伝子（Ｓｖａｂら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：９１３−９１７）、およびカナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｃａｒｒｅｒら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１：４９−５６）が挙げられうる。他の適当な候補選択マーカーには、ベタインアルデヒドに対する耐性を付与する遺伝子、例えば、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（Ｄａｎｉｅｌｌら，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３９：１０９−１１６）、また、除草剤耐性を付与する遺伝子、例えば、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８（４）：１０６２）、およびグリフォセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）に対する耐性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（ＵＳ  ５  １８８  ６４２）が含まれる。あるいは、レポーター遺伝子、すなわち、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）（Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ  Ｐ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，６０１−６０６）またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ，Ｓｉｄｏｒｏｖら，１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９（２）：２０９−２１６）のような容易に同定される酵素をコードする遺伝子、色素をコードする遺伝子、または色素産生を調節する酵素をコードする遺伝子が使用されうる。そのような遺伝子は特許出願ＷＯ  ９１／０２０７１、ＷＯ  ９５／０６１２８、ＷＯ  ９６／３８５６７、ＷＯ  ９７／０４１３０およびＷＯ  ０１／６４０２３に記載されている。
【００４８】
選択マーカーをコードする遺伝子は、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与するアミノグリコシド３”−アデニルトランスフェラーゼをコードするａａｄＡ遺伝子（Ｓｖａｂら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：９１３−９１７）でありうる。
【００４９】
したがって、本発明はまた、転写方向に機能的に互いに連結された、色素体において活性であるプロモーター配列、ペプチドをコードする異種核酸配列と翻訳的に融合した核コード化タンパク質からのメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列、および場合によって、植物細胞の色素体において活性であるターミネーターを含む核酸分子がプラストーム内に組込まれている色素体形質転換植物細胞または色素体形質転換植物および／またはそれらの後代に関する。
【００５０】
本発明のもう１つの実施形態においては、内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列に融合したペプチドをコードする異種核酸配列は真核生物に由来する。
【００５１】
本発明はまた、ウキクサ科植物（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属植物、ジャガイモ植物、トマト植物、ダイズ植物または藻類である色素体形質転換植物および／または後代に関する。
【００５２】
特定の実施形態においては、本発明の色素体形質転換植物はタバコ植物である。
【００５３】
もう１つの実施形態においては、本発明は、本発明の植物細胞を含有する、本発明の植物の収穫可能な植物部分、例えば葉に関する。
【００５４】
本発明はまた、
ａ）転写方向に機能的に互いに連結された、色素体において活性であるプロモーター配列、ペプチドをコードする異種核酸配列と翻訳的に融合した核コード化タンパク質からのメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列、および場合によって、植物細胞の色素体において活性であるターミネーターを含む少なくとも１つのキメラ遺伝子で植物細胞を形質転換し、
ｂ）工程ａ）で得られた植物細胞から植物を再生させ、
ｃ）必要に応じて、工程ｂ）で得られた植物から更なる植物を製造する、本発明の色素体形質転換植物の製造方法に関する。
【００５５】
工程ａ）で得られた植物細胞は、当業者に公知の方法により、例えば、“Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”１９９９，Ｒ．Ｄ．Ｈａｌｌ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８９６０３−５４９−２に記載の方法を用いて、完全（ｗｈｏｌｅ）植物へと再生されうる。
【００５６】
本発明の方法の工程ｃ）の更なる植物の製造は、例えば、栄養繁殖（例えば、挿し木、塊茎を使用して、または完全植物の再生およびカルス培養により）または有性繁殖により行われうる。したがって、有性繁殖は、好ましくは、制御された条件下で行われる。すなわち、特定の特性を有する選択された植物を互いに交配させ繁殖させる。
【００５７】
本発明は更に、本発明のキメラ遺伝子で色素体を形質転換し、該キメラ遺伝子の発現およびシグナルペプチドの後続の切断のための適当な条件下、該形質転換色素体を含む植物細胞を増殖させる工程を含んでなる、植物細胞における関心のあるタンパク質の製造方法に関する。
【００５８】
本発明は更に、
ａ）転写方向に機能的に互いに連結された、色素体において活性であるプロモーター配列、ペプチドをコードする異種核酸配列（該異種核酸配列は非メチオニンＮ末端ペプチドをコードする。）に翻訳的に融合した核コード化タンパク質からのメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列、および場合によって、植物細胞の色素体において活性であるターミネーターを含むキメラ遺伝子で色素体を形質転換する工程、
ｂ）該キメラ遺伝子の発現およびシグナルペプチドの後続の切断のための適当な条件下、該形質転換色素体を含む植物細胞を増殖させる工程を含んでなる、植物色素体における非メチオニンＮ末端ペプチドの製造方法に関する。
【００５９】
本発明は更に、該非メチオニンＮ末端タンパク質がアプロチニンである、植物色素体における非メチオニンＮ末端ペプチドの前記製造方法に関する。
【００６０】
本発明は更に、本発明の色素体形質転換植物細胞から、あるいは本発明の色素体形質転換植物および／またはその後代から、あるいは本発明の色素体形質転換植物の収穫可能な部分から、関心のあるペプチドを抽出する工程を含んでなる、関心のあるペプチドの製造方法に関する。
【００６１】
好ましくは、そのような方法は、関心のあるペプチドを抽出する前に、栽培された植物および／またはそのような植物の部分、例えば葉を収穫する工程をも含む。最も好ましくは、この方法は更に、本発明の植物を、収穫前に栽培する工程を含む。
【００６２】
本発明は更に、関心のあるペプチドがアプロチニンである、関心のあるペプチドの前記製造方法に関する。
【００６３】
アプロチニンの抽出方法は当業者に公知である。アプロチニンを単離するためには、一般に沈殿方法および／またはＤＥＡＥ−セルロースもしくはアフィニティ技術を用いるクロマトグラフィーを含む多数の方法が利用可能である。そのような方法の具体例は米国特許第５，１６４，４８２号およびＪ．Ｄ．Ａｌｔｍａｎら，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，４（５）：５９３−６００に記載されている。
【００６４】
本発明は、何ら限定的ではない以下の実施例により具体的に例示される。
【実施例１】
【００６５】
チラコイド膜を横切る移動のためにＳｅｃ依存性経路を利用するメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列
Ｓｅｃ依存性経路により内腔へ分泌されるタンパク質をコードする未知機能のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴ５ｇ５２９７０遺伝子を、Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈら，２００３，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８：２４９−２６４において特定されている内腔タンパク質から選択した。シグナルペプチドの切断後にアミノ末端に正電荷（アルギニンまたはリシン）を有する内腔タンパク質から、この遺伝子を選択した。そのような予備選択は、融合タンパク質の更なる厳密なプロセシングおよびアルギニンから始まるアミノ酸配列を有するアプロチニンの除去の可能性を改善するために行った。メチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列に翻訳的に融合される異種核酸配列に応じて、予備選択を行わないことがまたは別の基準に基づく予備選択が行われ得る。
【００６６】
ＳｉｇｎａｌＰソフトウェア（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔ．８：５８１−５９９，１９９７）を使用して、ＡＴ５ｇ５２９７０によりコードされるタンパク質の二成分トランジットペプチドを推定した。葉緑体内への輸入を可能にするこの二成分トランジットペプチドの推定アミノ末端配列を欠失させ、翻訳開始部位としてメチオニンを付加して、配列番号２に示されるＬＳＰ１配列を得た。
【実施例２】
【００６７】
チラコイド膜を横切る移動のためにＴａｔ経路を利用するメチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列
Ｔａｔ経路により内腔へ分泌されるイムノフィリン様タンパク質をコードする未知機能のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴ１ｇ２０８１０遺伝子を、Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈら，２００３，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８：２４９−２６４において特定されている内腔タンパク質から選択した。シグナルペプチドの切断後にアミノ末端に正電荷（アルギニンまたはリシン）を有する内腔タンパク質から、この遺伝子を選択した。このような予備選択は、融合タンパク質の更なる厳密なプロセシングおよびアルギニンから始まるアミノ酸配列を有するアプロチニンの除去の可能性を改善するために行った。メチオニンＮ末端内腔指向性シグナルペプチドをコードする核酸配列に翻訳的に融合される異種核酸配列に応じて、予備選択を行わないことがまたは別の基準に基づく予備選択を行われ得る。
【００６８】
ＳｉｇｎａｌＰソフトウェア（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔ．８：５８１−５９９，１９９７）を使用して、ＡＴ１ｇ２０８１０によりコードされるタンパク質の二成分トランジットペプチドを推定した。葉緑体内への輸入を可能にするこの二成分トランジットペプチドの推定アミノ末端配列を欠失させ、翻訳開始部位としてメチオニンを付加して、配列番号４に示されるＬＳＰ２配列を得た。
【実施例３】
【００６９】
ＬＳＰ／アプロチニン融合タンパク質のコード配列
タバコ色素体コドン使用頻度（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｉｐ／ｃｏｄｏｎ）に基づいて葉緑体発現を最適化するために、アプロチニンのアミノ末端において融合したＬＳＰ１またはＬＳＰ２をコードする合成配列（それぞれＬＳＰ１：：アプロチニンおよびＬＳＰ２：：アプロチニンと称される）を設計した。該コドンの分布を、葉緑体コドン使用頻度表におけるそれらの頻度に従い各アミノ酸残基に無作為に帰属した。
【実施例４】
【００７０】
葉緑体形質転換ベクターｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１
ＬＳＰ１：：アプロチニンおよびＬＳＰ２：：アプロチニンコード配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に由来する葉緑体形質転換ベクター内に導入して、それぞれベクターｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１を得た。ｐＡＰＲ２０を図１に示す。ｐＡＰＲ２１は、ＬＳＰ１の代わりにＬＳＰ２を含有すること以外はｐＡＰＲ２０と同一である。これらのベクターは、ｒｂｃＬ遺伝子ａｃｃＤ遺伝子との間の該トランスジーンの指向化組込みを可能にするタバコプラストーム由来の領域ＬＨＲＲ−Ｎｔ（１）およびＲＨＲＲ−Ｎｔ（１）を含有する。該ＬＨＲＲ断片はタバコプラストームのヌクレオチド５７７６４−５９２９１に対応する（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら，１９８６−Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４）。該ＲＨＲＲ断片はタバコプラストームのヌクレオチド５９２９９−６０５３６に対応する。キメラ選択マーカー遺伝子ａａｄＡは、ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ（１９９３）に記載されているとおり、スペクチノマイシンに対する耐性をコードする。その発現は、１６Ｓリボソームオペロンのプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４からのＰｒｒｎ（ｐ）−Ｎｔ：ヌクレオチド１０２５６１−１０２６７７）およびそれに続くｒｂｃＬ遺伝子のリボソーム結合部位（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４からの５’ＵＴＲｒｂｃＬ−Ｎｔ：ヌクレオチド５７５６９−５７５８４）の制御下に置かれる。転写ターミネーター３’ｐｓｂＡ−Ｎｔ（２）はｐｓｂＡ遺伝子（逆配向のＧｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４からのヌクレオチド１４６−５３３）に由来する。ＬＳＰ：：アプロチニン融合コード配列はｐｓｂＡ遺伝子のプロモーター（逆配向のＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ０００４４からのＰｐｓｂＡ−Ｎｔ（２）：ヌクレオチド１５９６−１８１９）の制御下に置かれる。転写ターミネーター３’ｒｂｃＬ−Ｎｔ（２）はｒｂｃＬ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｚ０００４４からのヌクレオチド５９０３６−５９２４６）に由来する。該ベクターの残りの要素はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに由来する。
【実施例５】
【００７１】
葉緑体の形質転換
ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ；タバコ）（品種ＰＢＤ６）植物を、スクロース（３％）およびフィトアガー（ｐｈｙｔａｇａｒ）（７g／ｌ）で補足されたＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２）上に無菌条件下で栽培した。３〜５ｃｍの葉の背軸側を、Ｆｉｎｅｒら（１９９２）に記載のモデルに従い研究室内で組み立てたパーティクルガンを使用して射撃した。ベクターｐＡＰＲ２３のＤＮＡ（射撃当たり５マイクログラム）を、ＣａＣｌ２（０．８〜１．０Ｍ）およびスペルミジン（１４〜１６ｍＭ）の存在下、金粒子上に吸着させた。処理した葉を、ナフタレン酢酸（ＡＮＡ  ０．０５ｍｇ／ｌ）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ  ２ｍｇ／ｌ）で補足された同じＭＳ培地上に２日間配置した。ついで該葉を平均５ｍｍの長さの正方形に切り、５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシン塩酸塩で補足された前記ホルモン含有培地上で色素体形質転換事象の選択のために培養した。葉断片を１０日ごとに新鮮な選択培地上で継代培養した。４〜６週間後、退色した外植体上に現れた緑色のカルスまたは小植物を単離し、ホルモンの非存在下で５００ｍｇ／ｌ  塩酸スペクチノマイシンで補足されたＭＳ培地（３％  スクロースおよび７ｇ／ｌ  フィトアガー）に移した。ついで、再生されたシュートを、根づいた後で温室へ移した。
【実施例６】
【００７２】
選択された系統のＰＣＲ分析
タバコ葉緑体ゲノム内の予想位置におけるトランスジーンの存在を調べるために、スペクチノマイシン上で選択された、ｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１で生じた第１の事象を、ＰＣＲにより分析した。プライマー（１）および（２）の、異なる２対を、この分析に使用した。第１対（１）は予想位置における組込みの確認を可能にし、一方のプライマーは、形質転換ベクターｐＡＰＲ２０またはｐＡＰＲ２１内に存在するＬＨＲＲ断片の前のｒｂｃＬ遺伝子内に結合し（ｏｒｂｃＬ５２Ｆ：５’−ａｔｇｔｃａｃｃａｃａａａｃａｇａｇａｃｔａａａｇｃ−３’）、もう一方のプライマーはＡＡＤＡコード領域の開始部位に逆配向で結合する（ａａｄＡ１０Ｒ：５’−ｇｔｔｇａｔａｃｔｔｃｇｇｃｇａｔｃａｃｃｇｃｔｔｃ−３’）。約１．８ｋｂの増幅産物が認められれば、該組込みが証明されたことになる。第２対（２）は、ＬＳＰ：：アプロチニン融合体を含む断片の増幅を可能にし、一方のプライマーはｐｓｂＡプロモーターの末端に結合し（ｐｓｂＡ２３０Ｆ：５’−ｔｔｔｇｔａｇａａａａｃｔａｇｔｇｔｇｃｔｔｇｇｇ−３’）、もう一方のプライマーはターミネーター３’ｒｂｃＬに逆配向で結合する（５’−ａｔｇｔｃａｃｃａｃａａａｃａｇａｇａｃｔａａａｇｃ−３’）。約５５０ｂｐの増幅産物が認められたら、該タバコ葉緑体ゲノム内にＬＳＰ：：アプロチニン発現カセットが存在することが証明されたことになる。該増幅は３０サイクル（９４℃で４５秒間、５４℃で６０秒間、７５℃で１２０秒間）よりなるものであった。３つの選択された事象（ＡＰＲ２０−１−２，  ＡＰＲ２１−１９−１，  ａｎｄ  ＡＰＲ２１−１９−２）に関するＰＣＲ反応は前記の２対のプライマーのそれぞれに関して陽性であり、このことは、それらが色素体形質転換体であり、予想どおり、ｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１の、組込まれた発現カセットを有することを示している。
【実施例７】
【００７３】
アプロチニンのウエスタンブロット分析
アプロチニンの発現を変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続くウエスタンブロットにより分析した。抽出バッファーとしてＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  ０，５％、グリセロール  １０％（ｐＨ８）を使用して、全可溶性タンパク質を、トランスジェニック事象の液体窒素中で破砕された葉物質から抽出した。ついで、ブラッドフォードアッセイにより定量された各抽出物からの２０マイクログラムの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％  アクリルアミド）により分離し、ＰＶＤＦ膜上に移した。標準量のアプロチニン（２００ｎｇ；Ｓｉｇｍａ）および野生型タバコからの抽出物も該実験に含めた。移した後の該膜を、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）の説明に従いブロッキング試薬でブロッキングし、ついでアプロチニンに対するマウスモノクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、該膜を、アルカリホスファターゼに結合した、マウス免疫グロブリンに対する第２のモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５６２）と共にインキュベートした。Ｂｉｏｒａｄのキット（Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ）を使用して免疫複合体の顕色を行い、生じた化学発光をフィルム上に記録した。この実験の結果は、どちらのタイプの構築物（ｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１）に関しても、ＬＳＰ：：アプロチニン融合タンパク質がプロセシングされ切断されることを明らかに示している。なぜなら、真正標準アプロチニンと厳密に同じ位置に泳動する、ウエスタンブロット上で唯一のバンドが視認されうるからである。したがって、Ｓｅｃ（ｐＡＰＲ２０系統）またはＴａｔ（ｐＡＰＲ２１系統）経路によりアプロチニンを内腔へ導く、選択されたシグナルペプチドは、高い効率で切断される。発現のレベルはｐＡＰＲ２１系統に関しては全可溶性タンパク質の約０．１〜０．２％、ｐＡＰＲ２０系統に関しては約０．５％と推定される。
【実施例８】
【００７４】
組換えアプロチニンのエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ分析
組換えアプロチニンを、ＰＢＳバッファー中、ｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１ベクターから生じた事象のトランスジェニック葉から抽出し、モノクローナル抗体を使用して免疫精製した。単離されたタンパク質をジプチプ（ｚｉｐｔｉｐｅｄ）して塩を除去し、ロニクス（ｌｏｎｉｃｓ）ＥＰ−１０＋ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置で分析した。それぞれｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１に対応するサンプルのＬＣ／ＭＳエレクトロスプレークロマトグラムをアプロチニン標準のＬＣ／ＭＳエレクトロスプレークロマトグラムと比較した。ｐＡＰＲ２０に対応するサンプルのＬＣ／ＭＳエレクトロスプレークロマトグラムは３．３１分の保持時間においてピークを示している。多重荷電イオンから得られた平均分子量は６５３２±２ダルトンである。標準アプロチニンと比較した質量における差は１６ダルトン、すなわち、酸素の質量である。単離されたアプロチニンは酸化されているらしい。ｐＡＰＲ２１に対応するサンプルのＬＣ／ＭＳエレクトロスプレークロマトグラムは３．３６分の保持時間においてピークを示している。多重荷電イオンから得られた平均分子量は６５１６±１ダルトンである。質量スペクトルは標準アプロチニンに酷似している。
【００７５】
これらの実験は、Ｎ末端のアルギニンから開始する成熟アプロチニンとシグナルペプチドとの間の予想部位においてイン・プランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）で切断が生じること、およびそれがアミノ酸レベルで真正アプロチニンに対応していることを明らかに示している。サンプルｐＡＰＲ２０における１６の余剰質量は１つの残基（おそらく、唯一のコード化メチオニン）の酸化に対応するものであろう。
【実施例９】
【００７６】
組換えアプロチニンはトリプシンに結合する
トランスジェニック葉緑体において産生された組換えアプロチニンが活性コンホメーションの状態にあるかどうかを調べるために、ベクターｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１で作製された系統からの葉物質の抽出物をＰＢＳバッファー中で調製し、全可溶性タンパク質の２０マイクログラムに相当するサンプルを種々の量のトリプシン（０、２８、１１２、４５０または１８００ナノグラム）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ついでサンプルを非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、アプロチニンに対するモノクローナル抗体を使用してウエスタン分析を行った。この分析は、どちらのタイプの抽出物に関しても、サンプルにトリプシンを加えた直後に、より高い分子量のバンドが突然出現したことを示している。この新たなバンドはトリプシンに対するアプロチニンの複合体に対応する。十分なトリプシンを加えた場合には、遊離アプロチニンは残存せず、該複合体のみが検出される。この実験は、ベクターｐＡＰＲ２０およびｐＡＰＲ２１での色素体形質転換において産生された組換えアプロチニンの全体性が、トリプシンプロテアーゼに結合しうる活性コンホメーションの状態であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】プラスミドｐＡＰＲ２０の地図。
【図１】
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【国際調査報告】
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