(57)【要約】  本発明は抗体・薬物複合体の分野に関し、より具体的には、腫瘍及び／又は炎症反応等の疾患の治療及び／又は診断を対象とする抗体・薬物複合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）治療薬又はマーカー、
（２）単独で存在し、或いは、好ましくは標的細胞の近隣又は標的細胞に存在する、少なくとも１つの酵素によって選択的に切断され得るオリゴペプチド、
（３）非内在化抗体、
（４）任意に、治療薬からオリゴペプチドを分離するリンカー基、及び
（５）任意に、オリゴペプチドの切断を可能又は容易にするように、オリゴペプチドから非内在化抗体を分離するスペーサ基
を含んでなる化合物であって、
オリゴペプチドが非内在化抗体に直接的に連結されるか、又はオリゴペプチドの第１付着部位でスペーサ基を介して間接的に連結されており、オリゴペプチドが治療薬に直接的に連結されるか、又はオリゴペプチドの第２付着部位でリンカー基を介して治療薬に間接的に連結されており、非内在化抗体が、全血中に存在する酵素による化合物の切断を阻害する、化合物。
【請求項２】
オリゴペプチドが、腫瘍細胞、腫瘍の間質細胞、腫瘍及び腫瘍転移物の血管新生内皮細胞、腫瘍及び腫瘍転移物に浸潤するマクロファージ、単球、多形核白血球又はリンパ球からなる群より選択される１又は２以上の細胞の環境内に存在する少なくとも１つの酵素によって切断される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
酵素が、ネプリリシン（ＣＤ１０）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、レグマイン、コラーゲナーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、又はマトリックスメタロペプチダーゼからなる群より選択されるペプチダーゼである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
オリゴペプチドが、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｃｙｓ−Ａｒｇ、Ｃｙｓ−Ａｓｐ、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ、Ｉｌｅ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、及びＳｅｒ−Ｌｙｓのうち１又は２以上のアミノ酸対合を含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
オリゴペプチドが、（Ｌｅｕ）ｙ−（Ａｌａ−Ｌｅｕ）ｘ−Ａｌａ−Ｌｅｕ又は（Ｌｅｕ）ｙ−（Ａｌａ−Ｌｅｕ）ｘ−Ａｌａ−Ｐｈｅのうち１又は２以上の配列を含んでなり、Ｌｅｕはロイシン、Ａｌａはアラニン、Ｐｈｅはフェニルアラニンであり、ｙ＝０又は１であり、ｘ＝１，２，又は３である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
オリゴペプチドが、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号１）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）、又はベータ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号４）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号５）、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（配列番号６）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号７）、Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号８）、及びＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号９）のうち１又は２以上の配列を含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
治療薬が、化学剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、抗生物質、又はウィルスからなる群より選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
治療薬が、抗腫瘍治療活性、抗血管形成活性、又は抗炎症活性を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
治療薬が、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、葉酸誘導体、ビンカ・アルカロイド、カリケアマイシン、ミトキサントロン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、リン酸フルダラビン、メルファラン、ブレオマイシン、マイトマイシン、Ｌ−カナバニン、タキソイド、カンプトテシン、９−ジメチルアミノメチル−ヒドロキシ−カンプトテシンヒドロクロリド、プロテアソーム阻害剤、ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、エポチロン、マイタンシノイド、ディスコデルモリド、フォストリエシン、白金誘導体、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン、エピポドフィロトキシン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、インターフェロン・アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、又はＩＧＦ−１アンタゴニストからなる群より選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
スペーサ基が、Ｄ立体配置をなす天然アミノ酸である少なくとも１種のアミノ酸を含んでなる、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
スペーサ基が、Ｄ立体配置をなす少なくとも１種のアミノ酸、好ましくはＤ立体配置をなすセリンを含んでなる、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
癌又は感染性疾患の治療用の医薬組成物の調製における、請求項１から１１のいずれか１項に記載の少なくとも１種の有効量の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体・薬物複合体の分野に関し、より具体的には、腫瘍及び／又は炎症反応等の疾患の治療及び／又は診断を対象とする抗体・薬物複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第９６／０５８６３号パンフレット及び同第００／３３８８８号パンフレットには、その構造が特定の化学修飾及び酵素修飾を受けることにより、インビボ（in vivo）で活性治療化合物（好ましくは抗癌剤）に変換され得る腫瘍活性化型プロドラッグが記載されている。これらのプロドラッグは、オリゴペプチドに連結されて不活性化された抗腫瘍剤であって、かかるオリゴペプチドのサイズによって、薬物が拡散又は輸送により全細胞へと進入するのを防ぐ。かかるオリゴペプチドは、血流中では安定性を維持するが、癌細胞から細胞外に放出された酵素（例えばネプリリシン）に対しては感受性を示す必要がある。これによって、プロドラッグが腫瘍のごく周辺では切断されて活性薬物になる一方、ほとんどの非腫瘍組織の周辺では無傷且つ不活性のまま維持される。しかし、これらのプロドラッグの選択的活性化は、腫瘍細胞によって調節され得る抗原に依存するのではなく、腫瘍の本質的な悪性特性、すなわち、その侵襲性及び血管新生の誘導に直接関連している。
【０００３】
別の潜在的な抗癌剤群として、モノクローナル抗体・治療薬複合体がある（Safavy他、In Drug Targeting in Cancer Therapy, M. Page, ea., 257-275, 2002；Stan他、Cancer Res, 59:115-121, 1999；Florent他、J Med Chem, 41:3572-3581, 1998）。過剰発現した細胞表面抗原、受容体、又はリガンドと結合すると、腫瘍細胞によって特異的に内在化され得る抗体又はペプチドの探求が、主な目標とされてきた（Nielsen他、Pharm. Sci. Technol. Today, 3: 282-291, 2000；Trail他、Cancer Immunol Immunother, 52: 328-337, 2003；Gao他、J Immunol Methods, 274:185-197, 2003; Gao他、Biorg Med Chem, 10: 4057-4065, 2002)。
【０００４】
しかし、この作業は見かけほど容易ではなく、まずは数々の技術的困難を克服しなければならなかった。
【０００５】
ａ）治療薬と抗体との結合が、血液中及び細胞外空間内で安定性を維持するという要件。かかる要件は、抗体とその標的との相互作用前における治療薬の漏れを防止する上で、極めて重要である。よって、安定な共有結合がなにより必要である。
【０００６】
ｂ）担体の連結に対する治療薬の安定性を考えると、治療薬が抗体から解放されるのは、標的細胞上に固定され、細胞内に内在化された後であることが必要とある。抗体は細胞表面抗原のみと相互作用し得ることから、その後の標的細胞による抗体のエンドサイトーシスが、活性化メカニズムを提供し得ることが明らかとなる。実際に、エンドサイトーシス後に抗体・治療薬複合体はリソソームに到達し、かかる細胞小器官内で優勢な酸性ｐＨや、そのヒドロラーゼ含分によって、治療薬の担体からの解放が保証され得る。ここから、治療薬と抗体との間の結合が、１又は２以上のヒドロラーゼに対して、或いは酸性ｐＨに対して感受性であること、また、治療薬がその効力を発揮するよう、サイトゾル及び／又は核内に拡散し得る活性形態で解放されることが必要となる。
【０００７】
ｃ）かかる活性化を達成するために、抗体は、表面抗原と相互作用するとエンドサイトーシスにより取り込まれることが必要となる。僅かなモノクローナル抗体のみがかかる挙動を示す。
【０００８】
ｄ）一般に、細胞表面に存在する腫瘍関連抗原は少数である。
【０００９】
ｅ）抗体の抗原結合特性を妨害しないように抗体に連結し得る治療薬の数は、比較的少ない（５〜１０）。よって、効力の極めて高い治療薬を対象として連結を行うことが重要である。
【００１０】
これらの技術的制約はほとんど克服されている。かかる戦略の臨床的可能性を実証する例の一つとして、急性骨髄性白血病に対して使用される、カリケアマイシンに複合された細胞内在化抗ＣＤ３３抗体Ｐ６７．６が挙げられる。これは結果としてＦＤＡ承認薬Mylotarg（登録商標）（Hamann I, Bioconjug Chem, 13: 40-46, 2002）となった。しかしながら、臨床的に有効な充実性腫瘍治療用のモノクローナル・治療薬複合体は、いまだ開発されていない。
【００１１】
モノクローナル抗体の抗癌治療剤担体としての使用がいまだに直面する問題点として、下記の点が挙げられる。１）細胞表面に接近し得る真の腫瘍特異的抗原は、皆無ではないが、極めて少ない。２）特異的抗原を欠く腫瘍細胞の存在や選択によって、腫瘍が抗体・治療薬複合体の作用を免れる場合がある。抗体・治療薬複合体は、バイスタンダー効果を有する場合でも、その効果は極めて僅かである。これは、目的とする治療薬の細胞内活性や、多くの場合は、細胞内作用部位に対する治療薬の極めて高い親和力に起因する。その結果、非抗原細胞は、周囲の抗原含有細胞の内部で解放された治療薬の効果を免れる可能性が極めて高い。３）腫瘍に到達するモノクローナル抗体の割合は極めて低く、大量の抗体が肝臓及び細網内皮系等の正常組織に蓄積し、細胞内で活性化されて毒性作用を発揮する場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本技術分野の進展にもかかわらず、例えば哺乳動物（例えばヒト）等の新生物疾患（例えば癌、腫瘍、又は炎症性疾患等）の治療用に、改良された治療薬の開発が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、治療薬の標的細胞又は組織内への送達の改良法に使用される新規化合物、この化合物を含んでなる組成物、及びその使用に関する。
【００１４】
より具体的には、この化合物は新規な抗体・治療薬複合体であり、抗体は非内在化抗体であり、治療薬はオリゴペプチド・アームを介して抗体に共有結合される。かかる化合物は数多くの利点をもたらす。例えば、高い作用特異性や、治療薬自体と比べた場合の毒性の低減が挙げられる。本発明は概して、抗体・治療薬複合体で疾患を治療する方法、抗体・治療薬複合体を合成する方法、並びに、抗体・治療薬複合体として有用な化合物、又はこれらの分子の合成に有用な化合物に関する。
【００１５】
従って、本発明の利点は、治療薬（例えば化学療法薬）を抗体の使用によって、標的細胞に対してより選択的に送達することにより得られる。これは通常、標的組織内で過剰発現されたエピトープの認識、並びに、標的組織の細胞によって特異的に細胞外に放出される酵素による活性化を介して行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、オリゴペプチドを介して治療薬に連結された非内在化抗体を含んでなる化合物、及び、標的細胞（例えば腫瘍細胞）に対して治療薬（例えば化学療法薬）をより高選択的に送達するためのかかる化合物の使用を対象とする。かかる送達は通常、標的組織内で過剰発現されたエピトープの認識を介して、また、治療薬と抗体との間のオリゴペプチドを細胞外で特異的に切断することによって行われる。
【００１７】
治療薬はオリゴペプチドに直接的又は間接的に連結され、オリゴペプチドは非内在化抗体に直接的又は間接的に連結される。任意により、治療薬とオリゴペプチドとの間にリンカー基が存在してもよい。任意により、治療薬と非内在化抗体との間にスペーサ基が存在してもよい。オリゴペプチドは少なくとも３アミノ酸長であり、好ましくは３〜８アミノ酸長である。好ましくは、本発明の化合物は、標的組織の細胞（例えば腫瘍細胞）によって細胞外に放出された酵素に対してオリゴペプチドが感受性を有し、切断されることを特徴とする。
【００１８】
より具体的には、本発明の化合物は、治療薬の修飾形態であり、幾つかの部分を含んでなる。かかる部分としては、
（１）治療薬又はマーカー、
（２）単独で存在し、或いは、好ましくは標的細胞の近隣又は標的細胞に存在する、少なくとも１つの酵素によって選択的に切断され得るオリゴペプチド、
（３）非内在化抗体
（４）任意により、リンカー基、及び
（５）任意により、スペーサ基
が挙げられる。
【００１９】
非内在化抗体は、切断可能オリゴペプチドの第１付着部位で、切断可能オリゴペプチドに直接的又は間接的に連結される。切断可能オリゴペプチドは前記切断可能オリゴペプチドの第２付着部位で、治療薬に直接的又は間接的に連結される。非内在化抗体と切断可能オリゴペプチドとが間接的に連結される場合には、スペーサ基が存在する。切断可能オリゴペプチドと治療薬とが間接的に連結される場合には、リンカー基が存在する。本発明の化合物の２つの部分の直接的な連結は、２つの部分の間に共有結合が存在することを意味する。非内在化抗体と切断可能オリゴペプチドとは、従って切断可能オリゴペプチドの第１付着部位、例えば切断可能オリゴペプチドのＮ末端で共有化学結合を介して直接的に連結される。切断可能オリゴペプチドと治療薬とが直接的に連結される場合には、これらは切断可能オリゴペプチドの第２付着部位で互いに共有結合される。切断可能オリゴペプチドの第２付着部位は、通常は切断可能オリゴペプチドのＣ末端であるが、切断可能オリゴペプチド上の他の場所であってもよい。化合物の２つの部分の間接的な連結は、２つの部分のそれぞれが連結部分に共有結合されていることを意味する。別の実施形態によれば、本発明の化合物は、非内在化抗体と切断可能オリゴペプチドとの間接的な連結を有する。従って、非内在化抗体はスペーサ基に共有結合され、このスペーサ基は切断可能オリゴペプチドに共有結合されている。別の実施形態によれば、本発明の化合物は切断可能オリゴペプチドと治療薬との間接的な連結を有する。従って、切断可能オリゴペプチドはリンカー基に共有結合され、このリンカー基は治療薬に共有結合される。別の実施形態によれば、本発明の化合物は、非内在化抗体と切断可能オリゴペプチドとの間接的な連結、及び、切断可能オリゴペプチドと治療薬との間接的な連結を有する。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、化合物の方向を逆転し、非内在化抗体が切断可能オリゴペプチドのＣ末端で切断可能オリゴペプチドに直接的又は間接的に連結され、治療薬が切断可能オリゴペプチドのＮ末端に直接的又は間接的に連結されるようにしてもよい。すなわち、かかる別の実施形態によれば、切断可能オリゴペプチドの第１付着部位は、切断可能オリゴペプチドのＣ末端となり、切断可能オリゴペプチドによる第２付着部位は、切断可能オリゴペプチドのＮ末端となる。任意により、スペーサ基が非内在化抗体と切断可能オリゴペプチドとの間に存在してもよい。任意により、リンカー基が治療薬と切断可能オリゴペプチドとの間に任意に存在してもよい。本発明の化合物に関する、かかる別の実施形態は、主要な実施形態と同様に機能する。
【００２１】
非内在化抗体と切断可能オリゴペプチドとの間の「スペーサ基」を介して、また、切断可能オリゴペプチドと治療薬との間の「リンカー基」を介して、間接的な連結が生じることになる。好適なスペーサ及びリンカーとしては、置換型又は無置換型アルキル、置換型又は無置換型ヘテロアルキル、置換型又は無置換型アリール、置換型又は無置換型ヘテロアリール、アルデヒド、酸、エステル、エーテル、チオエーテル、無水物、スルフィドリル又はカルボキシル基、例えばマレイミド誘導体、マレイミドシクロヘキサン誘導体、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドカプロン酸誘導体、及びスクシニミド誘導体から独立して選択される２官能性及び多官能性有機ラジカルが挙げられる。或いは、臭化シアノゲン又は塩化シアノゲン、スクシニミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物等から誘導してもよい。
【００２２】
これらの化合物部分の典型的な方向は以下の通りである：
（非内在化抗体）−（任意のスペーサ基）−（切断可能オリゴペプチド）−（任意のリンカー基）−（治療薬又はマーカー）
【００２３】
本発明の化合物は通常、その切断可能オリゴペプチド部分内で切断され得る。
【００２４】
第一実施形態によれば、本発明の化合物は有効となるべく、通常はインビボ修飾を受けて、標的細胞に進入し得る治療薬又はその活性誘導体を生成する。化合物の切断可能オリゴペプチド部分内における最初の切断によって、切断生成物の１つとして、標的細胞内への輸送を担当する化合物断片を生じさせてもよい。或いは、化合物の輸送担当断片を生じさせるために、１又は２以上のペプチダーゼによる更なる切断が必要になる場合もある。化合物の活性断片又は輸送担当断片は、少なくとも治療薬を有し、標的細胞に進入して治療効果を直接、或いは標的細胞内で更なる変換を受けることによって発揮し得る化合物部分である。
【００２５】
非内在化抗体及び切断可能オリゴペプチドの構造は、血液又は非標的組織中に存在し得る酵素によって化合物のクリアランス及び代謝を制限するように選択され、更には、細胞内への化合物の輸送を制限するように選択される。非内在化抗体は、血液（又は循環構造）又は非標的組織細胞外スペース中のインビボペプチダーゼによる化合物の切断をブロックする。加えて、好ましい電荷やその他の物理特性を化合物に付与する作用を有してもよい。
【００２６】
切断可能オリゴペプチドのアミノ酸配列としては、標的細胞又は標的細胞の周辺の細胞によって放出された少なくとも１つの酵素により切断され易いものを選択することが好ましい。本発明では、種々の長さを有する切断可能オリゴペプチドを有する化合物を使用可能であるが、少なくとも３アミノ酸の切断可能オリゴペプチドが好ましく、３〜８アミノ酸の切断可能オリゴペプチドが特に好ましい。標的細胞としては、腫瘍細胞、腫瘍の間質細胞、内皮細胞、又は炎症反応、特にリウマチ疾患と関連する炎症反応に関与するマクロファージ、好中球、又は単球等の細胞が好ましい。
【００２７】
標的細胞と関連する好ましい酵素は、ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ又はネプリリシン）及びＴＯＰ（チメット・オリゴペプチダーゼ）である。
【００２８】
有利なことには、治療薬を修飾して化合物の形態とすることにより、抗腫瘍治療薬及び／又は抗炎症治療薬を不活性にすることが望ましい。従って、治療薬を修飾して化合物とすることにより、治療薬の副作用の一部を低減することもできる。
【００２９】
本発明の化合物は患者に投与され、安定した形態で血流を介して運ばれ、標的細胞の近傍に来ると抗原に結合し、少なくとも１つの標的組織関連酵素（例えばペプチダーゼ）によって修飾される。酵素活性は正常細胞の細胞外近傍内には最小限にしか存在しないので、切断可能オリゴペプチドは標的組織以外では通常切断されず、或いは切断され難く、また、その輸送担当断片（治療薬を含む）は、正常細胞に到達する場合でも最小限に留まる。
【００３０】
標的細胞（例えば腫瘍）の近傍では、非内在化抗体がその抗原に結合すると、局所環境内の当酵素の存在の増大が、切断可能オリゴペプチドの切断を引き起こす。
【００３１】
第２の実施形態によれば、本発明の化合物は有効となるべく、通常は細胞外で活性の細胞学的存在（すなわち、細胞に進入する必要なしにその生物学的活性を発揮することができる存在、例えば腫瘍壊死因子）である治療薬の一部を生成するインビボ修飾を受ける。本発明の化合物の第２実施形態は、治療薬が標的細胞に進入しないことを除けば、第１の実施形態と同様に機能する。
【００３２】
有利なことには、非内在化抗体のターゲッティング特性と、標的組織関連酵素（例えば腫瘍選択的ペプチダーゼ）による細胞活性化プロセスとの組み合わせは、非内在化抗体の治療的な使用が、標的細胞環境（例えば標的組織）内部に治療薬負荷を選択的に送達するのを可能にする。従って、本発明の抗体・治療薬化合物の治療薬活性化プロセスは、エンドサイトーシス及びリソソームによる取り込みとは独立している。
【００３３】
本発明の化合物は、明らかに大きな利点を有している：
【００３４】
・腫瘍選択的な抗体の選択は、非内在化抗体の要件によって制限されない。
【００３５】
・抗体の相対的選択性は、選択される切断可能オリゴペプチドの相対的選択性によって増加し、完全になる（逆の場合も同じ）。
【００３６】
・本発明の抗体・治療薬化合物はバイスタンダー効果を有する。
【００３７】
・ある実施形態によれば、非内在化抗体は腫瘍細胞自体のみではなく、腫瘍環境の内皮細胞及び間質細胞、並びに細胞外マトリックス成分をも対象とすることができる。
【００３８】
従って、本発明はまず、その対象として、
（１）治療薬又はマーカー、
（２）前記単独で存在し、或いは、好ましくは標的細胞の近隣又は標的細胞に存在する標的組織関連酵素によって選択的に切断することができるオリゴペプチド（「切断可能オリゴペプチド」）、
（３）標的組織の抗原に特異的に結合する非内在化抗体、
（４）任意には、治療薬から切断可能オリゴペプチドを分離するリンカー基、及び
（５）任意には、切断可能オリゴペプチドの切断を可能又は容易にするように、切断可能オリゴペプチドから非内在化抗体を分離するスペーサ基
を含んでなる抗体・治療薬化合物を有する。
【００３９】
そして、切断可能オリゴペプチドは、非内在化抗体に直接的に連結されるか、又は切断可能オリゴペプチドの第１付着部位でスペーサ基を介して間接的に連結され、切断可能オリゴペプチドが治療薬に直接的に連結されるか、又は切断可能オリゴペプチドの第２付着部位でリンカー基を介して、治療薬に間接的に連結される。
【００４０】
「オリゴペプチド」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために、ここでは相互交換可能に使用される。これらの用語は、相応の天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。これらの用語はまた、「抗体」という用語をも含む。
【００４１】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされたアミノ酸、並びに、遺伝コードによってコードされておらず、或いは後に修飾されたアミノ酸、例えばベータ−アラニン、Ｄ−セリン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、又はＲ基（下記定義参照）に結合された炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）、又は修飾主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えばベータアミノ酸、Ｄ立体配置のアミノ酸を維持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。
【００４２】
本発明では参照するアミノ酸を３文字コード又は１文字コードで表す。３文字及び１文字のアミノ酸コードは当業者に周知である。
【００４３】
「抗体」（Ａｂ）は、免疫グロブリン遺伝子又はこれらの断片によってコードされた１又は２以上のペプチド鎖を含んでなるタンパク質であって、抗原のエピトープに特異的に結合し、これを認識するものを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、並びに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパ又はラムダに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、これらはそれぞれ、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを定義する。通常、抗体の抗原結合領域は、特異性及び結合親和性に対して最も重要となる。
【００４４】
抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4等）、ＩｇＡ（ＩｇＡ1及びＩｇＡ2等）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、及びＩｇＹを含んでなる。本明細書に記載の「抗体」という用語は、単鎖抗体、及びこれらの抗原結合断片を含む抗体全体を含むものとする。最も好ましくは、抗体はヒト抗原結合抗体断片であり、例としては、これらに制限されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及び、ＶL又はＶHドメインを含んでなる断片、並びにNanobodies（登録商標）が挙げられる（国際公開第９４／０４６７８号パンフレット参照）。
【００４５】
抗体としては、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物由来のものでよい。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科の動物（例えばラクダ、ラマ）、馬、又はニワトリである。
【００４６】
本発明はさらに、モノクローナル抗体、免疫吸着ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、インタクト抗体又は単離抗体を含む。
【００４７】
抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はこれよりも多い多重特異性を有し得る。
【００４８】
「インタクト抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）とを含んでなる。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＨＣＶＲ又はＶHと略す）と、重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ1、ＣＨ2及びＣＨ3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここではＬＣＶＲ又はＶLと略す）と、軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＨLからなる。ＶH領域及びＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに分割され、これらには、より保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）が散在している。各ＶH及びＶLは、下記順序：ＦＲ1、ＣＤＲ1、ＦＲ2、ＣＤＲ2、ＦＲ3、ＣＤＲ3、ＦＲ4でアミノ末端からカルボキシル末端まで配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクタ細胞）及び古典的相補系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子に対する、免疫グロブリンの結合を媒介することができる。結合の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶL、ＶH、ＣL及びＣＨ1ドメインからなる一価断片；（ii）Ｆ（ａｂ’）2断片、すなわちヒンジ領域のジスルフィド・ブリッジによって連結された２つのＦａｂ断片を含んでなる二価断片；（iii）ＶHドメインとＣＨ1ドメインとからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶLドメインとＶHドメインとからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶHドメインからなるｄＡｂ断片（Ward他、Nature 341:544-546, 1989)；及び（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００４９】
「単離抗体」は、自然環境の成分から同定、分離、回収された抗体である。好ましい実施形態によれば、抗体は、Lowry法で測定した場合に、９５重量％超の抗体になるまで、最も好ましくは９９重量％超の抗体になるまで精製される。
【００５０】
但し、通常は少なくとも１つの精製工程によって、単離抗体を調製することができる。
【００５１】
「単鎖抗体」又は「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶL及びＶHの抗体融合分子を意味する。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶL及びＶHは別個の遺伝子によってコードされているが、これらのドメインは組み換え法を用いて、合成リンカーによって接合することができる。合成リンカーによって、これらのドメインは単一タンパク質鎖として形成され得る。ここで、ＶL及びＶH領域は対合して一価分子を形成する（別名単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；例えばBird他、Science 242: 423-426, 1988；及びHuston他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988）。「抗体断片」という用語に触れる場合には、かかる単鎖抗体が含まれる。単鎖抗体は組み換え技術又はインタクト抗体の酵素的又は化学的切断によって調製することができる。
【００５２】
「ヒト配列抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された（存在する場合）可変領域及び定常領域を有する抗体を有する。ヒト配列抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を有していてもよい（例えば、インビトロ（in vitro）のランダム又は部位特異的突然変異生成、又はインビボの体細胞変異によって導入された変異体）。かかる抗体は、例えば国際公開第０１／１４４２４号パンフレット及び同第００／３７５０４号パンフレットに記載のように、非ヒト・トランスジェニック動物で発生させることができる。しかし、本明細書に使用される「ヒト配列抗体」という用語には、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系列から誘導されたＣＤＲ配列が、ヒトのフレームワーク配列上にグラフトされた抗体（例えばヒト化抗体）は含まれないものとする。
【００５３】
また、組み換え免疫グロブリンを生成することもできる。Cabilly、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（本文献はその全体が援用により、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）；及び、Queen他、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86：10029-10033, 1989を参照する。
【００５４】
「モノクローナル抗体」は、単一分子組成物の抗体分子調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、単一結合特異性及び特定のエピトープに対する親和性を示す。従って、「ヒト・モノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された（存在するならば）可変領域及び定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を意味する。一実施形態によれば、ヒト・モノクローナル抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子と、不死化細胞に融合された軽鎖トランス遺伝子とを含んでなるゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニック・マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される。「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に制限されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、又はファージ・クローンを含む単一クローンから誘導された抗体を意味し、これが生成される方法を指すものではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージ提示技術の使用等、当業者に知られた種々様々な技術によって調製することができる。「ポリクローナル抗体」は、抗体に対する１つよりも多い（２又は３以上の）種々異なる抗体の調製物を意味する。
【００５５】
かかる調製物には、広範な種類の異なるエピトープに結合する抗体が含まれる。
【００５６】
「キメラ抗体」は、１つの種（一般的にはマウス）に由来するモノクローナル抗体のＦｃ定常領域が組み換えＤＮＡ技術を用いて、別の種（一般的にはヒト）の抗体に由来するＦｃ領域で置換された抗体である。例えば、マウスのモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡが、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するために特異的に選択される制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの同等部分が置換される。ＣＤＲグラフト型抗体は、いわゆる「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、所望の抗原特異性を有するいわゆる「ドナー」抗体に由来するＣＤＲ「グラフト」によって置換される。一般に、ドナー抗体とアクセプター抗体とは、異なる種に由来するモノクローナル抗体であり、典型的には、アクセプター抗体は、（ヒトにおける抗原性を最小限にするために）ヒト抗体であり、この場合、結果として生じるＣＤＲグラフトされた抗体は「ヒト化」抗体と称される。
【００５７】
グラフトは、アクセプター抗体の単一のＶH又はＶL内の単一のＣＤＲ（或いは、単一ＣＤＲの一部）のものであってもよく、或いは、ＶH及びＶLの一方又は両方の内部における複数のＣＤＲ（又はこれらの部分）のものであってもよい。
【００５８】
ＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体を産生する方法は、Queen他の米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，６９３，７６２号の各明細書；及びWinterの米国特許第５，２２５，５３９号明細書に開示されている。これらの全ての内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
「エピトープ」は、普通は特異的な３次元構造特性、並びに、特異的な電荷特性を有する、モノクローナル抗体による特異的な結合が可能である抗原の表面に位置するアミノ酸残基又は糖側鎖等の分子群を意味する。
【００６０】
抗体は、結合親和性に基づいて説明又は特定することもできる。好ましい結合親和性としては、解離定数又はＫdが、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、及び１０-15Ｍ未満のものが挙げられる。
【００６１】
また、本発明には、細胞表面抗原に対する修飾抗体も含まれる。
【００６２】
「修飾抗体」は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体等の抗体において、その一部を除去、付加、或いは置換することにより修飾したものを意味する。例えば、抗体の定常領域を除去し、抗体の半減期（例えば血清半減期）、安定性又は親和性を高め得る定常領域で置換することにより、修飾することができる。
【００６３】
本発明の抗体に２種以上の治療薬又はマーカーをカップリングすることが望ましい場合がある。本発明の抗体を多誘導体化することにより、複数の治療薬又はマーカーの戦略を同時に実行することができ、或いは抗体を複数の視覚化技術用の造影剤として利用することができ、或いは視覚化技術による追跡用に治療用抗体を標識化することができる。一実施形態によれば、複数の治療薬又はマーカー分子が、１つの抗体にカップリングされる。別の実施形態によれば、２種以上の部分を１つの抗体にカップリングしてもよい。この特定の実施形態とは別に、２つ以上の部分を有する本発明の化合物は、種々の方法で調製することができる。本発明の切断可能オリゴペプチドを介して、２つ以上の部分を抗体分子にカップリングしてもよく、或いは、複数の付着部位を提供するリンカー（例えばデンドリマー）を使用してもよい。
【００６４】
有利なことには、切断可能なオリゴペプチドに連結された治療薬の、循環構造内におけるインビボでの半減期を、抗体によって延長することができる。この結果が得られるのは特に、抗体が治療薬の、又は切断可能オリゴペプチドに連結された治療薬の腎排出（この排出はサイズに基づく腎臓による化合物の限外濾過に基づく）を低減する場合、及び／又は、本発明による化合物の肝代謝による分解時である。「半減期を高める」とは、血中の本発明の化合物の平均滞留時間を高めること、又は治療薬自体又はマーカー自体と比較して血液又は血漿中のクリアランスを低減することを意味する。
【００６５】
「循環構造」は、体液、より具体的には血液として定義される。特定の実施形態によれば、「循環構造」は、循環系の組織を含む、哺乳動物の構造である。
【００６６】
本発明の化合物は好ましくは、循環構造において安定である。「循環構造において安定」とは、ヒトの血液中での保存中（約３７℃で約２時間超）に、本発明の抗体・治療薬複合体の約２０％未満、好ましくは約２％未満が循環血液中で（特に酵素によって）分解又は切断され、健常細胞に対して非毒性であり、凝固作用を有さず（すなわち、切断可能オリゴペプチドに連結された治療薬の凝固促進特性を阻害し）、或いはマスキング作用を有する（すなわち、治療薬が化合物から解放されるまで治療薬が細胞に作用するのを防止する）ことを意味する。
【００６７】
有利なことには、抗体は、下記特性のうちの１又は２以上を有していてもよい：（ｉ）切断可能オリゴペプチドの非特異的な切断及び／又は分解を防止し（例えば、全血中に存在する酵素による化合物の切断を阻止し）；（ii）本発明の化合物から放出されるまで治療薬の生物学的作用を阻止し；（iii）本発明の化合物の循環構造内における安定性を高め；（iv）本発明の化合物の水中、血液中及び／又は血清中での安定性を高める。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、抗体のサイズは、約４，０００〜約８００，０００Ｄａ、好ましくは約１０，０００〜約１５０，０００Ｄａとすることが可能である。
【００６９】
「非内在化抗体」は、インビボ又はインビトロの生理学的条件（３７℃及びｐＨ７）において、細胞表面抗原と反応し、この場合、受容体／抗原によって媒介されるエンドサイトーシスのプロセスによって、抗原を含有する細胞内に内在化されることはないという特性を有する。
【００７０】
有利なことには、抗体の非内在化特性によって、以下の特性がもたらされる。これらは当業者であれば、独立に追跡調査し、実験から容易に特徴づけることができる。
【００７１】
１）非内在化抗体は、その抗原から解放されるまで長時間（例えば少なくとも約５〜約３０分間）細胞表面に残存し、これは会合定数及び解離定数（すなわち結合親和性）の関数となる。非内在化抗体は、その対応抗原が細胞原形質膜から脱落した場合にも解放され得る。
【００７２】
２）細胞による非内在化抗体の捕捉レベル（「捕捉」とは、所与の瞬間において細胞と会合する抗体量と、標識断片として細胞内で分解され細胞外に放出される抗体量との合計として定義される）が、数分（約５〜約３０分）後に定常レベルに達し、これは４℃及び３７℃でのインキュベーション時に観察されるレベルと大きくは異ならない。
【００７３】
３）非内在化抗体は、受容体／抗原タイプのエンドサイトーシスによって細胞内に内在化されることはない。よってリソソーム系には到達せず、リソソーム酵素により有意に分解されることもない。
【００７４】
４）しかし、非内在化抗体は流体相エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ得る。かかる捕捉は細胞外濃度に線形依存する。これは、３７℃では４℃と比べて僅かながら有意に高い捕捉が達成されること、並びに、抗体の細胞内分解量が少ないことの説明になる。
【００７５】
抗体の非内在化特性を実験で決定するには、前述の非内在化抗体の特性を評価するのが最善である。
【００７６】
例えば、非内在化抗体の固有クラスは、標的組織の細胞外成分の表面、例えば細胞外マトリックスに存在する抗原及びエピトープと相互作用する抗体である。
【００７７】
非内在化抗体の特性決定又は選択を可能にする方法を、以下により詳細に説明する。
【００７８】
主な方法は、非内在化抗体をインビトロで、細胞表面に対応抗原を提示する細胞と一緒に、（当業者に公知の、或いは別途指示された、適切な細胞培地中、３７℃で）インキュベーションするものである。抗体は、蛍光マーカーで標識化され、或いは顕微鏡観察用に標識化された抗−抗体−抗体（anti-antibody-antibodies）によって検出され（免疫蛍光：Starling他、Cancer Resarch 51:2195-2972(1991)；Supra他、Cancer Research 62, 7190-7194(2002)）、或いは定量的調査用に放射性マーカーで標識化される。対照として、同様の物理化学的特性（分子量、等電点）及び生物学的特性（例えば同じＩｇクラス、ＩｇＧタイプ、ＩｇＧ断片、例えばＦａｂ’2、Ｆａｂ、軽鎖又は重鎖、単鎖抗体、例えばNanobodiesなど）を有する、選択された非内在化抗体の非免疫担当類似体を用いて、同じ試験を実施する。非内在化抗体は、以下の基準のうち１又は２以上によって定義することができる。
【００７９】
１．免疫蛍光画像は、非内在化抗体の表面及び周囲分布を示し、細胞内標識顆粒は全く、或いは極めて僅かしか存在しない（すなわち、細胞周囲／細胞外蛍光と比べて、細胞内蛍光が約２０％未満）。対照的に、内在化抗体は多数の細胞内蛍光顆粒（すなわち、細胞周囲／細胞外蛍光と比べて、細胞内蛍光が約８０％超）を示す。
【００８０】
２．抗原結合部位の飽和時及び数分（約５〜約３０分）後、非内在化抗体の細胞捕捉量は、４℃及び３７℃におけるインキュベーション後と著しく異ならない。
【００８１】
３．蓄積の平坦域に達した後、細胞と会合した非内在化抗体は、ｐＨ＜７（好ましくは約４〜約５．５）のインキュベーションによって解放され、細胞表面の抗原複合体を解離し得る。酸性ｐＨでは内在化抗体が細胞内局在化するため、解放可能な内在化抗体の量は著しく低い（少なくとも２０％以上、好ましくは少なくとも１０％）。
【００８２】
４．細胞と一緒に非内在化抗体をインキュベートすると、少量の抗体分解断片及び生成物が生じる。これらの生成物は細胞内に存在するが、細胞透過又はリソソーム区画からのエキソサイトーシスによって細胞を脱出し得る場合には、細胞外媒質にも存在し得る。非内在化抗体に伴って存在する少量（１０％未満）の分解済材料は、非免疫担当抗体に伴って観察されるその量を超えるべきではない。
【００８３】
非内在化抗体の例としては、（ｉ）抗ＣＥＤ抗体；（ii）抗ＣＤ２０抗体（Sapra及びAllen、Cancer Res. 2002, 62, 7190-7194）；（iii）Ｂ７２．３抗体（抗ＴＡＧ−７２）（Cancer Res. 1991, 51, 2965-72）；(iv）ＳｃＦＶ抗Ｐ４Ｇ７、ＶＥＧＦＲ−２（J. Immunol. Methods. 2004, 289, 37-45）が挙げられる。
【００８４】
別の実施形態によれば、米国特許第４，９０６，５６２号明細書及び同第４，９３５，４９５号明細書に開示されているＬ６マウス・モノクローナル抗体から、非内在化抗体を誘導する。Ｌ６は、ヒトの非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌又は卵巣癌から誘導されたヒトの癌細胞によって発現されるガングリオシド抗原に対して活性の非内在化抗体である。Ｌ６を発現させＬ６として同定されたハイブリドーマは、ブダペスト条約に従ってＡＴＣＣに１９８４年１２月６日付けで寄託され、受託番号ＨＢ８６７７のもとに利用可能である。ハイブリドーマを培養し、上記で参照した標準技術を用いて、所期の抗体を単離する。所望の場合には、Ｌ６抗体のキメラ形態が、国際公開第８８／０３１４５号パンフレットに記載されている。
【００８５】
本発明の抗体又は抗体断片を発生させる典型的な方法としては、個体（非ヒト個体、例えばマウス又はウサギ）を精製抗体又は抗原発現細胞で免疫化する手法が挙げられる。抗体又は抗体断片を発生させる多数の技術が、本分野では標準的である。
【００８６】
モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製には、当業者に公知の任意の技術を用いることができる（例えばKohler & Milstein, Nature 256: 495-497(1975)；Kozbor他、Immunology Today 4: 72(1983)；Cole他、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. (1985))。
【００８７】
一般には、例えば、薬物動態的安定性の必要性及び患者に対する毒性全体の低減を適宜考慮しながら、任意の好適な技術によって、本発明の切断可能オリゴペプチドに治療薬を複合することができる。オリゴペプチド部分に治療薬を直接的又は間接的に（例えばリンカー基を介して）カップリングすることができる。例えば、オリゴペプチドを治療薬に直接的に連結する場合は、オリゴペプチドの方向に従ってオリゴペプチドのＮ末端又はＣ末端に、又はオリゴペプチドの任意の他の部位（例えばアミノ酸のうちの１つの側鎖）に、共有結合を生成することができる。治療薬とオリゴペプチドとの直接的な反応は、それぞれが他方と反応し得る官能基を有する場合に可能となる。例えば、好中球、例えばアミノ基又はスルフィドリル基は、カルボニル含有基、例えば無水物又は酸ハロゲン化物と、或いは良好な離脱基（例えばハロゲン化物）を有するアルキル基と反応し得る。或いは、好適な化学リンカー基を使用することもできる。好適なリンカー基としては、置換型又は無置換型アルキル、置換型又は無置換型ヘテロアルキル、及び置換型又は無置換型アリール、アルデヒド、酸、エステル及び無水物、スルフィドリル又はカルボキシル基、例えばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドカプロン酸誘導体、及びスクシニミド誘導体から独立して選択される二官能性及び多官能性又は二価有機ラジカルが挙げられる。或いは、臭化シアノゲン又は塩化シアノゲン、スクシニミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導してもよい。一方ではリンカーと治療薬又はマーカーとの間の共有結合を形成するために使用されるリンカー部分上の官能基と、他方ではリンカーとオリゴペプチド部分との共有結合を形成するために使用されるリンカー部分上の官能基とは、異なるタイプの官能基であってもよく、例としてはアミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、及びカルボキシル基が挙げられる。リンカー部分は、１〜８アミノ酸残基の短い配列を有していてもよく、これはリンカー部分をオリゴペプチドに結合させるシステイン残基を有していてもよい。リンカー基は、オリゴペプチドと標的組織特異的ペプチダーゼとの相互作用に対する妨害を回避するために、治療薬をオリゴペプチドから隔てる。リンカー基は、構成部分又はオリゴペプチド上の置換基の化学反応性を高め、ひいてはカップリング効率を向上させる上でも有用である。化学反応性を高めることにより、本来は使用できなかった、構成部分又は構成部分上の官能基の使用を容易にすることもできる。従って、オリゴペプチドを治療薬に間接的に連結する場合には、リンカー基は複数の機能、例えばオリゴペプチドと治療薬又はマーカーとの間の切断を容易にする機能、オリゴペプチドと治療薬又はマーカーとの間の好適な化学結合手段を提供する機能、本発明の化合物の合成プロセスを改善する機能、治療薬又はマーカーの物質の物理的特性を改善する機能、又は治療薬又はマーカーの物質を細胞内又は細胞外に解放する付加的なメカニズムを提供する機能を有していてもよい。好適な連結化学物質としては、マレイミジル・リンカー、ハロゲン化アルキル・リンカー（オリゴペプチド部分上のスルフィドリルと反応する）、及びスクシニミジル（オリゴペプチド部分上の第１級アミンと反応する）（例えばスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）が挙げられる。オリゴペプチドには複数の第１級アミン及びスルフィドリル基が存在し、付加基を組み換えオリゴペプチド分子内に構成し得る。当業者には明らかなように、ホモ官能性かヘテロ官能性かによらず、様々な二官能性又は多官能性試薬（例えばPierce Chemical Co., Rockford, III.のカタログに記載の試薬）を、リンカー基として採用し得る。例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基又は酸化炭水化物残基を介してカップリングを生じさせることができる（例えば米国特許第４，６７１，９５８号明細書）。臭化シアノゲン又は塩化シアノゲン誘導体基；スクシニミドエステル又はスルホン酸ハロゲン化物のカルボニルジイミダゾール、チオカルボニルジイミダゾール；ホスゲン、チオホスゲン；又は自己再編成可能（又は「自己犠牲」）スペーサ（Schmidt他、2001)を使用することもできる。本発明の化合物の又は化合物の一部から遊離すると細胞毒性部分がより強力となる場合には、切断可能オリゴペプチドの一部に連結された治療薬の細胞内への透過中又は透過時に切断し得るリンカー基、又は、細胞外環境内で経時的に徐々に切断され得るリンカー基を使用することが望ましい場合もある。種々異なる多数の切断可能なリンカー基が報告されている。これらのリンカーからの細胞毒性部分の作用物質の細胞内解放メカニズムとしては、ジスルフィド結合の低減、光不安定性結合への照射、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解、及び酸触媒された加水分解による切断が挙げられる。
【００８８】
本発明に係る「スペーサ基」（存在する場合）は、切断可能オリゴペプチドに非内在化抗体を共有結合する。これは親水性であることが好ましく、また循環構造（例えば血液循環又は血流）内で安定であることが好ましい。
【００８９】
スペーサが「循環構造内で安定」であるとは、循環血液又はヒト血液中で約３７℃で約２時間超保存した場合に分解又は切断されるスペーサが、スペーサの約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約２％未満であることをいう。有利なことには、オリゴペプチドから抗体を分離することにより、好ましくは親水性の性質によって、スペーサ基は、標的細胞に近接するオリゴペプチド又は標的細胞に存在するオリゴペプチドの切断を可能又は容易にする。スペーサ基の有し得る長さ（又はサイズ）は、約１〜約１００アミノ酸、好ましくは約１〜２０と同等のオーダーである。
【００９０】
一般に、オリゴペプチドの抗体への複合は、例えば、任意の好適な技術を用いて、薬物動態的安定性の必要性及び患者に対する毒性全体の低減を適宜考慮しながら行うことができる。
【００９１】
オリゴペプチドを好適な抗体部分に直接的又は間接的に（例えばスペーサ基を介して）カップリングし得る。オリゴペプチドと抗体との直接的な反応は、それぞれが他方と反応し得る官能基を有するときに可能である。例えば、好中球、例えばアミノ基又はスルフィドリル基は、カルボニル含有基、例えば無水物又は酸ハロゲン化物と、又は良好な離脱基を含有するアルキル基（例えばハロゲン化物）と反応し得る。或いは、好適な化学スペーサ基を使用することもできる。一方ではスペーサと抗体との間の共有結合を形成するために使用されるスペーサ部分上の官能基と、他方ではスペーサとオリゴペプチド部分との共有結合を形成するために使用されるスペーサ部分上の官能基とは、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、及びカルボキシル基を含む、異なるタイプの官能基であってもよい。スペーサ部分は、スペーサ部分がオリゴペプチドにそれを介して結合するシステイン残基を任意に含む、１〜４アミノ酸残基の短い配列を含んでよい。好適なスペーサ基としては、置換型又は無置換型アルキル、置換型又は無置換型ヘテロアルキル、及び置換型又は無置換型アリール、アルデヒド、酸、エステル及び無水物、スルフィドリル又はカルボキシル基、例えばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドカプロン酸誘導体、及びスクシニミド誘導体から独立して選択される二官能性及び多官能性又は二価有機ラジカルが挙げられる。或いは、臭化シアノゲン又は塩化シアノゲン、スクシニミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導してもよい。スペーサ基は、その結合能力に対する妨害を回避するために、及び／又は、オリゴペプチドの切断を容易にするために、オリゴペプチドから抗体を隔てるのを可能にする。スペーサ基は、オリゴペプチド又は抗体上の置換基の化学反応性を高め、ひいてはカップリング効率の向上に寄与し得る。化学反応性を高めることにより、本来は使用できなかった、構成部分又は構成部分上の官能基の使用を容易にすることもできる。
【００９２】
本発明によるスペーサは、アミノ酸の配列；ペプチド模倣薬；擬ペプチド；ペプトイド；置換型アルキル、アリール、又はアリールアルキル鎖；ポリアルキルグリコール；多糖；ポリオール；ポリカルボキシレート；及びポリ（ヒドロ）エステルから選択される、少なくとも１つの基からなるか、或いはかかる基を含んでなる。本発明の別の実施形態によれば、スペーサは、これらの基のうちの少なくとも２種の組み合わせからなるか、或いはかかる組み合わせを含んでなる。
【００９３】
本発明の有利な実施形態によれば、スペーサは、立体配置Ｌ又はＤを成す天然アミノ酸、遺伝コードを有していないアミノ酸、又は、循環構造内に存在する酵素（例えばペプチダーゼ）によって認識することができないアミノ酸、例えばベータ−又はガンマ−アミノ酸などを含んでなる群から選択される、約１〜約１００個、好ましくは約１〜約２０個、極めて好ましくは約２〜約１０個の、同一又は異なるアミノ酸からなるか、又はかかるアミノ酸を含んでなる。「立体配置Ｄを成す天然アミノ酸」は、遺伝コードによって正常にコードされているが、天然の状態で立体配置Ｌを成す代わりに立体配置Ｄを成すアミノ酸として定義されている。一般に、遺伝コードを有していないアミノ酸は、合成によって調製し得るか、又は天然源から誘導し得る。
【００９４】
立体配置Ｄを成す天然アミノ酸の中で好ましいのは、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リシン、Ｄ−アルギニン、及びＤ−ヒスチジンから選択される親水性アミノ酸である。特に好ましい立体配置Ｄを成すアミノ酸は、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンである。
【００９５】
本発明の好ましい方法によれば、スペーサ基は、（ｌ−セリン）ｘ、（ｄ−セリン）ｘ、又は（ｌ−トレオニン）ｘ（ｄ−トレオニン）ｘから選択される同一のアミノ酸の配列を含んでなるか、又はかかる配列から成り、ｘは整数約１〜約２０、好ましくは約２〜約１５、より好ましくはｘ＝４，８又は１２である。
【００９６】
「アルキル」という用語は、単独で、或いは他の置換基の一部として、特に断りがない限り、直鎖又は分枝鎖、又は環状炭化水素基、又はこれらの組み合わせを意味する。これは完全飽和型、単又は多不飽和型のいずれであってもよく、二価及び多価基を含んでいてもよく、所定の炭素原子数（即ちＣ1〜Ｃ10は炭素数１〜１０を意味する）を有する。飽和型炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、及びｎ−オクチルなど同族体及び異性体が挙げられる。不飽和型アルキル基は、１又は２以上の二重結合又は三重結合を有する基である。不飽和型アルキル基の例の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、及び高級同族体及び異性体が挙げられる。また、「アルキル」という用語は、特に断りのない限り、下でより詳細に定義されるアルキル誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むものとする。炭化水素基に限定したアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【００９７】
「アルキレン」という用語は、単独で、或いは他の置換基の一部として、アルカンから誘導される二価基を意味し（例としては、限定されるものではないが、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2によって示される基が挙げられる）、さらには「ヘテロアルキレン」として下に記される基も含む。通常、アルキル（又はアルキレン）基は炭素原子数が１〜２４であるが、炭素原子数が１０以下の基が本発明では好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」とは、短鎖アルキル又はアルキレン基であり、一般には炭素原子数８以下である。「ヘテロアルキル」という用語は、特に断りがない限り、単独で、或いは別の用語との組み合わせで、定められた数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳを含んでなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる、安定した直鎖又は分枝鎖、又は環状炭化水素基、又はこれらの組み合わせを意味する。この場合、窒素、炭素、及び硫黄原子が酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置、又はアルキル基が分子の残部分に結合する位置に存在し得る。例としては、ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ2ＳＣＨ2−ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2、Ｓ（Ｏ）ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、ＣＨ−ＣＨＯＣＨ3、Ｓｉ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2ＣＨ＝ＮＯＣＨ3、及びＣＨ＝ＣＨＮ（ＣＨ3）ＣＨ3が挙げられる。最大２つのヘテロ原子が、例えばＣＨ2ＮＨＯＣＨ3及びＣＨ2ＯＳｉ（ＣＨ3）3のように、連続していてもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語も、単独で、或いは別の置換基の一部として、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。例えば、限定されるものではないが、ＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2及びＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2によって示される基が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子が鎖末端の一方又は両方を占めていてもよい（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、及びアルキレンジアミノなど）。「ヘテロアルキル」及び「ヘテロアルキレン」という用語には、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体が含まれる。さらに、アルキレン連結基及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれている方向は、連結基の方向を示すものではない。
【００９８】
「低級」という用語は、「アルキル」又は「ヘテロアルキル」という用語との組み合わせにおいて、炭素原子数１〜６の部分を意味する。
【００９９】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、従来通りの意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して、分子の残部分に付着されたアルキル基を意味する。
【０１００】
一般に「アシル置換基」も上記基から選択される。ここで使用される「アシル置換基」は、本発明の化合物の多環核に付着される基であって、本発明の化合物の多環核に直接的又は間接的に付着されたカルボニル炭素の価数を満たす基を意味する。
【０１０１】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、単独で、或いは別の置換基の一部として、特に断りがない限り、それぞれ、置換型又は無置換型「アルキル」、及び置換型又は無置換型「ヘテロアルキル」の環状変更形を表す。
【０１０２】
さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、複素環が分子の残部分に結合する位置に、ヘテロ原子が存在していてもよい。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、及びシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、ピペラジニル、及び２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【０１０３】
環状構造のヘテロ原子及び炭素原子は酸化されていてもよい。
【０１０４】
「ハロ」及び「ハロゲン」のという用語は、単独で、或いは別の置換基の一部として、特に断りがない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。
【０１０５】
さらに、「ハロアルキル」等の用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含む意である。例えばハロ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルという用語は、例えばトリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、及び３−ブロモプロピルなどを含むものとする。「アリール」という用語は、特に断りがない限り、単環、又は縮合又は共有結合された多環（好ましくは１〜３環）であることが可能である置換型又は無置換型の多不飽和型芳香族炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜４つのヘテロ原子を含有するアリール基（又は環）を意味し、窒素、炭素、及び硫黄原子は任意には酸化され、窒素原子は任意には四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部分に付着し得る。アリール及びヘテロアリール基の例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルが挙げられる。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下の許容し得る置換基の群から選択される。「アリール」及び「ヘテロアリール」には、１又は２以上の非芳香族環系がアリール又はヘテロアリール系に縮合され、或いは他の形式でこの系に結合されている環系も含まれる。
【０１０６】
簡便のため、「アリール」という用語は、他の用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、及びアリールアルキル）との組み合わせで使用する場合には、上記のようなアリール環及びヘテロアリール環の両方を含む。このように「アリールアルキル」は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子によって置換されているアルキル基（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、及び３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むアルキル基に、アリール基が付着されている基（例えばベンジル、フェネチル、及びピリジルメチルなど）を含むものとする。
【０１０７】
上記用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）は各々、示された基の置換及び無置換双方の形態を含む。それぞれのタイプの基に対する好ましい置換基を下に挙げる。
【０１０８】
アルキル及びヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）に対する置換基は一般に、それぞれ「アルキル置換基」及び「ヘテロアルキル置換基」と呼ばれ、これらは、ゼロから（２ｍ’＋１）までの範囲の数（ｍ’はかかる基内の炭素原子総数である）の、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝ＮＯＲ’、ＮＲ’Ｒ”、ＳＲ’、−ハロゲン、ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、Ｓ（Ｏ）Ｒ’、Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ”、ＮＲＳＯ2Ｒ’、ＣＮ及びＮＯ2から選択される種々の基のうちの１又は２以上であることが可能である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、及びＲ””はそれぞれ好ましくは独立して、水素、置換型又は無置換型ヘテロアルキル、置換型又は無置換型アリール、例えば１〜３つのハロゲンで置換されたアリール、置換型又は無置換型アルキル、アルコキシ、又はチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含むときには、Ｒ基のそれぞれは独立して、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、及びＲ””の基のうち２つ以上が存在する場合の各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、及びＲ””と同様に選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に付着されるとき、これらは、この窒素と合体することにより、５、６、又は７員環を形成し得る。例えば−ＮＲ’Ｒ”は、例えば１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。
【０１０９】
置換基に関する上記考察から、当業者には明らかなように、「アルキル」という用語は、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えばＣＦ3及びＣＨ2ＣＦ3）及びアシル（例えばＣ（Ｏ）ＣＨ2、Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、及びＣ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3など）を含むものとする。
【０１１０】
アルキル基に関した記載したのと同様に、アリール置換基及びヘテロアリール置換基は一般にそれぞれ、「アリール置換基」及び「ヘテロアリール置換基」と呼ばれ、例えばゼロから芳香環系上の開いた原子価までの範囲の数の、ハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝ＮＯＲ’、ＮＲ’Ｒ”、ＳＲ’、−ハロゲン、ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、Ｓ（Ｏ）Ｒ’、Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ”、ＮＲＳＯ2Ｒ’、ＣＮ及びＮＯ2、Ｒ’、Ｎ3、−ＣＨ（Ｐｈ）2、フルオロ（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルから変更・選択され、この場合Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、及びＲ””はそれぞれ好ましくは独立して、水素、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル及びヘテロアルキル、無置換型アリール及びヘテロアリール、（無置換型アリール）−（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、及び（無置換型アリール）オキシ−（Ｃ1−Ｃ4）アルキルである。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含むときには、例えば、Ｒ基のそれぞれは独立して、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、及びＲ””の基のうち２つ以上が存在する場合の各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、及びＲ””と同様に選択される。
【０１１１】
本発明の化合物の重要な部分は、切断可能オリゴペプチドである。「切断可能オリゴペプチド」は、標的組織関連酵素によって、好ましくは、標的細胞（例えば腫瘍細胞）（の環境内）に近接してのみ又は標的細胞（例えば腫瘍細胞）にのみ存在する、又は好ましくは細胞（例えば腫瘍細胞）（の環境内）に近接して又は好ましくは標的細胞（例えば腫瘍細胞）に存在する酵素によって選択的に切断し得るオリゴペプチドを意味する。「切断可能オリゴペプチド」は、化合物の残りの部分から治療薬又はマーカーを切断することにより、治療薬又はマーカーの活性化を可能にする。
【０１１２】
「標的細胞」は、より具体的には、病理に関与する細胞であって、治療活性又は診断活性の標的として好適な細胞として定義される。かかる標的細胞としては、一次又は二次腫瘍細胞（転移物）、一次又は二次腫瘍の間質細胞、腫瘍及び腫瘍転移物の血管新生内皮細胞、腫瘍及び腫瘍転移物に浸潤するマクロファージ、単球、多形核白血球、及びリンパ球又は多核物質からなる群の１種又は２種以上の細胞を含んでなるか、或いはかかる細胞からなることが好ましい。
【０１１３】
「標的組織」は、標的細胞自体（例えば腫瘍細胞）だけでなく、標的細胞の環境内の任意の細胞、内皮細胞及び間質細胞、並びに腫瘍環境の細胞外マトリックス成分をも含んでなる。
【０１１４】
「選択的に切断可能」又は「選択的に切断された」は、切断されるべき配列によって決定付けられる切断として定義される。切断されるべき配列は、標的細胞の環境内に存在する酵素によって認識されることが好ましく、この配列は循環構造内では、又は非標的細胞に近接したところでは、僅かしか分解されず、又は全く分解されない。「標的細胞の環境内」という表現は、その酵素が単独で、或いは、好ましくは標的細胞の近傍又は標的細胞に存在することを意味する。なお、念のため述べておくと、たとえ切断が標的細胞の近傍又は標的細胞のみで行われる訳でないとしても、標的細胞の近傍又は標的細胞で切断が好適に（又は大部分が、又は大抵の場合）行なわれるという事実があれば、その切断は選択的である。標的細胞の近傍又は標的細胞において、その生物の他の部分と比べて酵素がより高い濃度で存在するならば、その切断は選択的である。
【０１１５】
「標的組織関連酵素」は、標的組織又は標的組織の近環境内の組織の細胞によって放出されるか、又は標的細胞を取り囲む細胞外媒質中のこれらの標的細胞によってのみ放出される膜酵素又は酵素として定義される。本発明の一実施形態によれば、標的組織が腫瘍である場合、酵素は、ネプリリシン（ＣＤ１０）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、レグマイン、コラーゲナーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、又はマトリックスメタロペプチダーゼ（これらの酵素は当業者に周知である）を含んでなる群、又はこれらからなる群より選択し得る。
【０１１６】
酵素は、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、及びリソソーム酵素の群から選択される１種又は２種以上の酵素を含んでなるか、或いはかかる酵素からなる。
【０１１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、酵素は腫瘍細胞、腫瘍の間質細胞、血管新生内皮細胞、マクロファージ、又は単球のペプチダーゼである。
【０１１８】
切断可能オリゴペプチドのアミノ酸配列の選択は、標的細胞の環境内に存在する特異的酵素に基づく。
【０１１９】
切断可能オリゴペプチドは好ましくは、約２〜約１０個のアミノ酸、好ましくは約３〜約７個のアミノ酸を含んでなるか、或いはかかるアミノ酸からなる。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、オリゴペプチドは、下記アミノ酸配列（好ましくは立体配置Ｌ）のうちの１又は２以上を含んでなるか、或いはかかる配列からなる：Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｃｙｓ−Ａｒｇ、Ｃｙｓ−Ａｓｐ、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ、Ｉｌｅ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、及びＳｅｒ−Ｌｙｓ。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、オリゴペプチドは下記配列（好ましくは立体配置Ｌ）のうちの１又は２以上を含んでなるか、或いはかかる配列からなる：（Ｌｅｕ）ｙ−（Ａｌａ−Ｌｅｕ）ｘ−Ａｌａ−Ｌｅｕ又は（Ｌｅｕ）ｙ−（Ａｌａ−Ｌｅｕ）ｘ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（Ｌｅｕはロイシンであり、Ａｌａはアラニン、Ｐｈｅはフェニルアラニンであり、ｙ＝０又は１であり、且つｘ＝１，２又は３である）。
【０１２２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、オリゴペプチドは、下記配列（好ましくは立体配置Ｌ）のうちの１又は２以上を含んでなるか、或いはかかる配列からなる：Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号１）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）、又はベータ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号４）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号５）、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（配列番号６）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号７）、Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号８）、及びＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号９）。
【０１２３】
但し、当業者には、腫瘍細胞の特異的酵素によって選択的に切断し得る他のアミノ酸配列も公知である。例えば、国際公開第００／３３８８８号パンフレット（第１３〜１５頁に記載されたアミノ酸配列を参照）、国際公開第０１／６８１４５号パンフレット（配列番号１〜２１０に記載されたアミノ酸配列を参照）、国際公開第０１／９５９４３号パンフレット（第１６〜１８頁に記載されたアミノ酸配列を参照）、国際公開第０２／００２６３号パンフレット（第１６頁の表１に記載されたアミノ酸配列を参照）、国際公開第０２／１００３５３号パンフレット（配列番号１〜３６に記載されたアミノ酸配列を参照）、国際公開第０２／０７７７０号パンフレット（第３頁に記載されたアミノ酸配列を参照）、又は国際公開第９９／２８３４５号パンフレット（配列番号１〜１２５に記載されたアミノ酸配列を参照）（これらの文献はその全体が、あらゆる目的のために、援用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【０１２４】
本発明に係る酵素は、治療薬の解放、又は切断可能オリゴペプチドの一部に連結された治療薬の解放を可能にするように、切断可能オリゴペプチドを選択的に切断し得る。「切断可能オリゴペプチドの一部に連結された治療薬の解放」は、下記例によって説明される。切断可能オリゴペプチドが、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの配列を有するアミノ酸であり、治療薬がドキソルビシン（この場合、切断可能オリゴペプチドに直接的に連結された治療薬は、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンである）であり、酵素がＣＤ１０（ネプリリシン）である場合、この酵素はＡｌａ−Ｌｅｕ−ＡｌａとＬｅｕとの間でアミノ酸配列を切断し、こうしてＬｅｕ−ドキソルビシン生成物（すなわち治療薬の一部（又は部分））を解放する。例えば国際公開００／３３８８８号パンフレットを参照されたい。生成物は従って、「切断可能オリゴペプチドの一部に連結された治療薬」として定義される。
【０１２５】
「血液外再活性化」又は「血液外区画における再活性化」は、血液以外の任意の器官又は組織（例えば健常又は腫瘍）内に存在する、好ましくは標的細胞に存在する特異的なエンドペプチダーゼによって、本発明の化合物におけるオリゴペプチドの切断として定義される。オリゴペプチド（例えばペプチド）を切断することにより、治療薬の活性形態が解放される。
【０１２６】
当業者であれば、酵素の基質特異性を特徴づけるために、Handbook of Proteolytic Enzymes (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, 及びJ. F. Woessner編、Academic Press, 1998；本文献はその全体が、あらゆる目的のために、援用により本明細書に組み込まれる）を参照し得る。
【０１２７】
「治療薬」は、治療上有効量で存在すると、哺乳動物に対する所期治療効果をもたらし、また標的細胞表面上に又は標的細胞内部にその作用部位が配置されるか又はその効果が発揮される化合物を意味するものとする。例えば、当治療薬は下記群：化学剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、抗生物質、及びウィルスから選択される物質を含んでなるか、或いは、かかる物質からなる。
【０１２８】
前記治療薬は、好ましくは抗腫瘍、抗血管形成、又は抗炎症治療活性を有する薬剤である。この薬剤は、標的（例えば受容体）又は細胞外又は細胞内作用部位を有し得る。これは、透過ペプチド配列、例えば米国特許出願第１０／２３１，８８９号明細書に記載された配列をふくむこともできる。例えば治療薬は、抗腫瘍治療活性を有する下記薬剤群から選択される薬剤を含んでなるか、或いはかかる薬剤からなる：ビンカ・アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン；タキサン又はタキソイド、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、１０−デアセチルタキソール、７−エピ−タキソール、バッカチンIII、キシロシルタキソール；アルキル化剤、例えばイフォスファミド、メルファラン、クロロアミノフェン、プロカルバジン、クロラムブシル、チオホフオルアミド、ブスルファン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、マイトマイシンＣを含むマイトマイシン、ニトロソ−尿素、及びこれらの誘導体（例えばエストラムスチン、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、フォテムスチン）；白金誘導体、例えばシスプラチンなど（例えばカルボプラチン、オキサリプラチン）；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ラルチトレキセド、シトシンアラビノシド（又はシタラビン）、アデノシンアラビノシド、ゲムシタビン、クラドリビン、ペントスタチン、フルダラビンホスフェート、ヒドロキシ尿素；トポイソメラーゼＩ又はIIの阻害剤、例えばカンプトテシン誘導体（例えばイニノテカン及びトポテカン又は９−ジメチルアミノメチル−ヒドロキシ−カンプトテシンヒドロクロリド）、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシド）、アムサクリン；ミトキサントロン；Ｌ−カナバニン；抗生物質剤、例えばアントラサイクリン、及び例えばアドリアマイシン又はドキソルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ルビダゾン、ピラルビシン、ゾルビシン、及びアクラルビシン、アントラサイクリンの類似体、及び例えばエピアドリアマイシン（４’ エピアドリアマイシン又はエピルビシン）及びミトキサントロン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤを含むアクチノマイシン、ストレプトゾトシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、コンブレタスタチン；Ｌ−アスパラギナーゼ；ホルモン；アロマターゼの純粋阻害剤；アンドロゲン、ＬＨ−ＲＨの類似アンタゴニスト；サイトカイン、例えばインターフェロン・アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、ＩＧＦ−１アンタゴニスト（インスリン様成長因子）；プロテアソーム阻害剤；ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、エポチロン；マイタンシノイド；ディスコデルモリド；フォストリエシン；抗体；チロシンキナーゼの阻害剤、例えばＳＴＩ５７１（メシル酸イマチニブ）；エンドスタチン；タンパク質、ペプチド、及び抗炎症サイトカイン。
【０１２９】
「マーカー」は、腫瘍又はその他の医学的状態、例えば診断、腫瘍の進行、及び腫瘍細胞によって分泌される因子のアッセイの特性決定において有用な化合物を意味するものとする。マーカーはさらに、酵素、抗体、蛍光又は燐光化学分子、及びシンチグラフィにおいて使用し得る分子として定義される。マーカーの例としては、クマリン、７−アミド−トリフルオロメチルクマリン、パラニトロアニリド、８−ナフチルアミド及び４−メトキシナフチルアミド、フルオロセイン、ビオチン、ローダミン、テトラメチルローダミン、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、放射性同位体としてシンチグラフィにおいて使用される物質、及びこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【０１３０】
「癌」という用語は、制御できない異常な細胞増殖、罹患細胞が局所的に広がるか、又は血流及びリンパ系を通って他の身体部位に広がる（すなわち転移する）能力、並びに、多数の特徴的な構造上及び／又は分子上の特色のうちのいずれかによって特徴づけられる数多くの疾患のうちのいずれかを意味する。「癌性細胞」又は「癌細胞」は、分化を欠くことが可能であり、侵襲及び転移が可能な特異的構造特性を有する細胞として理解される。癌の例は、乳房、肺、脳、骨、肝臓、腎臓、結腸、及び前立腺癌である（De Vita, V.他（編）, 2005, Cancer Principles and Practice of Oncology、第６版、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA;この参考文献を、あらゆる目的のために、全体として援用により本明細書に組み込まれる）。
【０１３１】
別の実施形態によれば、本発明には、本発明の化合物の、医薬的に許容し得る塩基付加塩又は酸付加塩、水和物、溶媒和物、前駆体、代謝物、又は立体異性体も含まれる。
【０１３２】
「医薬的に許容し得る塩」という用語は、本明細書中に記載された化合物上に見いだされる具体的な置換基に応じて、相対的に非毒性の酸又は塩基で調製された、本発明の化合物の塩を含む。本発明の化合物が相対的に酸性の官能基を含有する場合、かかる化合物の中性形態を十分な量の所期塩基と、ニートの状態で又は好適な不活性溶媒中で接触させることにより、塩基付加塩を得ることができる。医薬的に許容し得る塩基付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、又はマグネシウム塩、又は同様の塩を含む。本発明の化合物が相対的に塩基性の官能基を含有する場合、かかる化合物の中性形態を、十分な量の所期酸と、ニートの状態で又は好適な不活性溶媒中で接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。医薬的に許容し得る酸付加塩の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、又は亜リン酸などから誘導された塩、並びに、相対的に非毒性の酸、例えば酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリスルホン酸、クエン酸、酒石酸、及びメタンスルホン酸などから誘導された塩を含む。また、アミノ酸、例えばアルギン酸などの塩、及び有機酸、例えばグルクロン酸又はガラクツロン酸などの塩も含まれる（例えばBerge他、「Pharmaceutical Salts」、Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19参照）。本発明の或る特定の化合物は、化合物が塩基付加塩又は酸付加塩に変換されるのを可能にする塩基性及び酸性双方の官能基を含有する。
【０１３３】
本発明の別の実施形態はまた、活性成分として、本発明の少なくとも１種の化合物を含んでなる、或いはかかる化合物からなる組成物である。
【０１３４】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、生物学的製品、医薬品、化粧品、農業用製品、診断用製品、又は追跡用製品を製剤・調製するために、かかる組成物を使用することを意図する。
【０１３５】
医薬組成物の治療上有効な投与量を、好ましくは非経口で、より好ましくは静脈内で患者に投与することに関与する、医学的状態の治療方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３６】
このように、患者の治療方法は、本発明の治療上有効量の化合物を患者に投与することを含む。
【０１３７】
「治療」は、疾患又は障害、疾患又は障害の症状、又は疾患に向かう傾向を治し、癒し、和らげ、取り除き、変更し、軽減し、改善し、改良し、又はこれに作用するという目的で、疾患又は障害（例えば癌、又は転移癌）、疾患又は障害の症状、又は疾患又は障害に向かう傾向を有する患者に、本発明の組成物又は化合物を投与することを含む。本発明の方法を用いた癌又は転移癌の「治療」は、任意の客観的又は主観的パラメータ、例えば症状の寛解；鎮静；減少、又は患者に対する疾患状態の耐容性の増大；変性又は衰退速度の鈍化；又は変性最終点の衰弱性低下を含む、癌の治療又は改善又は予防を意味する。症状の治療及び改善は、医師による試験の結果を含む客観的又は主観的パラメータに基づくことができる。従って、「治療」という用語は、新生物疾患と関連する症状又は状態の発生を予防又は遅延、緩和、又は停止又は阻害するために、本発明の化合物又は薬剤を投与することを含む。「治療効果」という用語は、疾患、疾患の症状、又は患者における疾患の副作用を低減、排除、又は予防することを意味する。
【０１３８】
本発明の別の態様において、本発明の化合物は、癌、新生物疾患、腫瘍、炎症性疾患、及び感染性疾患を含む多くの医学的状態の治療のために概ね有用である。治療するための好ましい疾患の例は、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳腫瘍、及び膵臓癌である。より具体的には、いくつかの特定の腫瘍タイプがＣＤ１０に対して陽性であることが識別されているので、これらの腫瘍タイプの治療は、本明細書中で教示された化合物を用いると特に有利である。特に、下記腫瘍タイプのうちの１つのための治療を行うことができる：Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、ホジキン・リンパ腫及び非ホジキン・リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキット・リンパ腫を含むリンパ腫、メラノーマ、眼メラノーマ、皮膚メラノーマ、結腸腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺腺癌、肝臓癌、移行上皮癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌、及び結腸癌。
【０１３９】
本発明はまた、細胞増殖性及び／又は分化疾患、骨代謝関連障害、免疫障害、造血障害、心臓血管疾患、肝臓障害、腎臓障害、筋障害、神経障害、血液障害、ウィルス疾患、疼痛又は代謝障害を含んでなる群から選択される障害を治療又は予防するための薬剤、好ましくは癌を治療するための薬剤を製造するための、本発明の化合物の使用に関する。
【０１４０】
好ましい実施形態によれば、本発明は、医薬的に許容し得るビヒクル、ベクトル、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせることができる、本発明による少なくとも１種の化合物を含んでなるか、或いはかかる化合物からなる医薬的製剤を含む。ビヒクル、ベクトル、希釈剤、又は賦形剤に言及するときの「医薬的に許容し得る」という用語は、相互交換可能に使用され、これらの材料が、組成物の投与を禁止する程度に望ましくない生理学的効果をもたらすことなしにヒトに投与し得ることを表す。
【０１４１】
医薬的に有効量の、本発明による化合物で患者を治療し得る。本発明の好ましい実施形態によれば、患者はヒトの患者である。「医薬的に有効量」又は「有効量」は、研究員又は担当医師によって予期される、組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発し得る量を意味する。
【０１４２】
上記組成物は、治療を改善し、また範囲を広げるために本発明による化合物との関連において使用することが当業者に周知である少なくとも１種の他の医薬的活性成分又は少なくとも１種のアジュバント、例えばビタミン、抗酸化剤を含むこともでき、又はこれと組み合わせることもできる。
【０１４３】
本発明の組成物は、これらの毒性が極めて低いか、又は毒性がない点で特に有用である。
【０１４４】
本発明による医薬的製剤は、疾患又は障害に対する予防目的又は治療目的で、インビボで使用し得る。本発明による医薬的製剤を使用し得る疾患又は障害の例としては、ウィルス感染症、癌、転移、細胞アポトーシス障害、変性疾患、組織虚血、感染性疾患又はウィルス、バクテリア、又は真菌特質、炎症障害、及び病理学的血管新生が挙げられる。
【０１４５】
本発明による化合物の投与は、治療薬に対して許容される、当業者に広く知られている投与方法のうちのいずれかによって行うことができる。これらの方法の例としては、経口、鼻腔、非経口による全身投与、又は例えば経皮手段、さもなければ例えば頭蓋内外科的経路による中枢投与、さもなければ眼内投与による局所投与が挙げられる。
【０１４６】
経口投与は、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤（遅延放出又は持続放出作用を有する製剤を含む）、丸剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、色素、懸濁液、シロップ、及びエマルジョンによって行うことができる。この提示形態は、腸内バリヤの通過に特に適している。
【０１４７】
非経口投与は、一般には皮下、筋内、又は静脈内注射によって、又は灌流によって行われる。注射可能な組成物は、懸濁液又は溶液又は液体中に即座に溶解するのに適した固形物形態で、標準的な形で調製し得る。
【０１４８】
非経口投与のためには、一定投与レベルの維持を保証する徐放又は持続放出系の装置を使用することが可能である。鼻腔内投与のためには、当業者に周知である好適な鼻腔内用ビヒクルを使用することが可能である。
【０１４９】
経皮投与のためには、当業者に周知である経皮用皮膚パッチを使用することが可能である。経皮放出系が連続投与を可能にする。他の好ましい局所用製剤の例としては、クリーム、薬用軟膏、ローション、エアロゾル・スプレイ及びゲルが挙げられる。
【０１５０】
提供される投与方法に基づいて、本発明の化合物は、固形、半固形、又は液状の形態を成すことができる。
【０１５１】
固形組成物、例えば錠剤、丸剤、自由な状態又はカプセル内に含まれた粉剤又は顆粒剤の場合、活性成分は、賦形剤、例えば：ａ）希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、及び／又はグリシン；ｂ）潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール；ｃ）バインダー、例えばケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、澱粉糊、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ソーダ及び／又はポリビニルピロリドンを含有するカルボキシメチルセルロース；必要な場合、ｄ）崩壊剤、例えば澱粉、寒天、アルギン酸、又はそのナトリウム塩、又は発泡性混合物；及び／又はｅ）吸収剤、着色剤、着香剤及び甘味剤と組み合わせることができる。
【０１５２】
半固形組成物、例えば座剤の場合、賦形剤は例えば、脂肪エマルジョン又は懸濁液であることが可能であり、或いは、ポリアルキレングリコール、例えばポリプロピレングリコールを基剤とし得る。
【０１５３】
液状組成物、特に注射方向の組成物、又は軟質カプセル内に含まれるべき組成物は、例えば、医薬的に純粋な溶媒、例えば水、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の食塩溶液、生理的血清、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、及び油中における本発明による化合物の溶解、分散などによって調製し得る。
【０１５４】
本発明による化合物は、リポソーム又はリポプレックス・タイプの放出系の形態、例えば小型単層ベシクル、大型単層ベシクル、及び多層ベシクルの形態で投与し得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成し得る。
【０１５５】
本発明による組成物は、滅菌することができ、及び／又は非毒性アジュバント及び補助物質、例えば保存、滅菌、湿潤又は乳化のための薬剤；溶解を促進する薬剤；及び浸透圧を調節するための塩及び／又は緩衝剤のうちの１種又は２種を含有し得る。さらに、これらの組成物は治療的に利点をもたらす他の物質を含有していてもよい。組成物はそれぞれ、当業者に良く知られた混合、顆粒化、又は塗布の標準的プロセスによって調製される。
【０１５６】
本発明による化合物の投与量は、患者のタイプ、種族、年齢、体重、性別、及び医学的状態；治療されるべき状態の重症性；投与方法；患者の腎臓及び肝臓機能の状態、及び使用される特定の化合物又は塩の性質、を含む種々のファクターに応じて選択される。通常の経験を持った医師又は獣医師ならば、治療されるべき医学的状態の進行を予防、妨害又は停止するために有効量の所期化合物を容易に決定し処方することになる。
【０１５７】
上記医薬組成物のいずれも、約０．１〜約９９％、好ましくは約１〜約７０％の活性成分を含有し得る。
【０１５８】
例えば、非経口投与される場合、本発明による化合物の有効なレベルは、体重１ｋｇ及び１日当たり、約０．００２ｍｇ〜５００ｍｇとなる。
【０１５９】
本発明による化合物は、単回一日投与形態で投与することができ、或いは、１日当たり２、３、４又は５回以上に分けて総一日投与量を投与することもできる。
【０１６０】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明による少なくとも１種の化合物を含んでなる、又はかかる化合物からなる、インビトロで使用するための診断薬が提供される。この実施形態による化合物はこの場合マーカーを有することになる。かかる診断薬はインビボで使用することもできる。
【０１６１】
別の実施形態によれば、本発明は、前記診断薬を含んでなる診断キットを意図する。より具体的には、診断キットは、１又は２以上の容器内に、本発明による所定の量の組成物を含んでなる。
【実施例】
【０１６２】
本発明の更なる利点及び特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。これらは例示のために供するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。また、これらの実施例では、添付の図面を参照する。
【０１６３】
当然ながら、本発明は上記例示における具体的な記載とは異なる形で実施してもよい。上述の教示内容に照らして、本発明の多数の修正及び改変が可能であり、これらは従って添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１６４】
実施例１．  非内在化抗体の特性決定
１．１  抗体の3Ｈ標識化
リシンの還元的メチル化によってＮａＢ3Ｈ4で抗体を標識化する（Means及びFeeney, Biochemistry, 7:2192-2201, 1968）。典型的には、約５００ｄｐｍ／ｎｇの比放射能を得る。
【０１６５】
１．２  抗体の細胞結合
細胞を２５ｃｍ2フラスコ内で密集するまで成長させ、次いで過剰の3Ｈ標識抗体と一緒に２ｍｌの培地内で、４８時間（最大時間）にわたってインキュベートする（４℃又は３７℃）。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞を２ｍｌの培地で２回、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回、４℃又は室温ですすぐ。次いで細胞をｐＨ１１．３に調節された１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム１ｍｌ中で溶解し、続いて超音波によって破壊し、タンパク質に関して（標準として血清アルブミンを用いて）アッセイし、適宜のカクテル（実施例えばAqualuma, Lumac LSC, Groningen, the Netherlands)中に試料を分散させた後の関連放射能に関して、試料クエンチングのための自動補正を有するシンチレーション・カウンター内でアッセイする。
【０１６６】
１．３  抗体の細胞内消化
３７℃での試験（１．２に記載のように実施）のために、培地タンパク質の沈殿及び遠心分離後に１５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸中に溶解可能な3Ｈ標識の量を測定することにより、培地の細胞内抗体消化をさらに分析する。対照として、3Ｈ標識抗体を含有する培地を、３７℃で並行して、しかし細胞の不在においてインキュベートする。
【０１６７】
１．４  抗体の細胞捕捉
細胞によって捕捉された抗体の量は、細胞と会合する抗体量と、細胞によって消化された量との和によって得られる。
【０１６８】
１．５  抗体の細胞プロセッシングの顕微鏡試験
抗体を含有する培地と一緒に、細胞培養皿内のカバースリップ上で３日間にわたって４℃又は３７℃で、抗原含有細胞を培養した。インキュベーション後、細胞を培地で２回すすぎ、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで室温で５分間にわたって、ＰＢＳ中の４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで固定した。膜を透過性にするために、ＰＢＳ中の０．１％（ｖ／ｖ）Triton X-100の存在において室温で４分間にわたって細胞をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。透過性にされた細胞を次いで、ペルオキシダーゼに複合された特異的「抗抗体」抗体の存在において３時間にわたって室温でインキュベートする。ジアミノベンジジン及びＨ2Ｏ2をペルオキシダーゼのための基質として使用する（Graham及びKarnovsky, J. Histochem. Cytochem., 14: 291-302, 1966）。オーバースリップをヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、光学顕微鏡による試験前に載置した。
【０１６９】
１．６  抗体非内在化のＦＡＣＳ分析
３７℃で１時間にわたって、抗体を含有する２ｍｌのＰＢＳ中で、細胞をインキュベートする。細胞を次いで低温（４℃）ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で培地内でインキュベートし、０、４、及び１８時間後、１０5個の細胞試料を氷浴に移し、ＰＢＳで２回洗浄し、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合「抗抗体」抗体と一緒に、４℃で１時間にわたってインキュベートする。低温ＰＢＳで２回洗浄した後、１０4個の細胞の表面蛍光をＦＡＣＳフロー・サイトメーターで測定する。３７℃での１８時間（最大時間）にわたるインキュベーション後、細胞の安定な表面標識によって、抗体の非内在化が示される。
【０１７０】
１．７  抗体の細胞捕捉のｐＨ依存性
ｐＨの関数としての、3Ｈ標識抗体に結合された細胞の解離を推定するために、２５ｃｍ2フラスコ内の密集培地を、3Ｈ標識抗体の存在において４℃又は３７℃で１時間にわたってインキュベートする。次いで、細胞を低温培地で１回、４℃ですすぎ、低温ＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中の種々異なるｐＨ値（２；３；４；４．５；５；５．５；６及び７）の１０ｍＭのクエン酸緩衝剤と一緒に、１０分間にわたって４℃でインキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、細胞関連放射能及びタンパク質を上記のようにアッセイする（§１．２参照）。
【０１７１】
実施例２．  非内在化抗体−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン化合物の合成
２．１  Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの合成
５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のドキソルビシンＨＣｌ（Meiji、日本国）（４００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（５００ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３８１μｌ、３．１０ｍｍｏｌ）の溶液を１０分間にわたって攪拌した。この反応混合物に、２ｍｌのＤＭＦ中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）を液滴状（３４０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を室温（ＲＴ）で２時間にわたって攪拌した。
【０１７２】
粗生成物を０℃のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（７０ｍｌ）にゆっくりと（最小５分間にわたって）添加した。赤い沈殿物を次いで濾過し、真空下（２００ｍＢａｒ）で一晩にわたって乾燥させた。
【０１７３】
２５ｍｌのＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン（５７８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ中の１０％のピペリジン２．５ｍｌ（５０モル当量）を添加した。反応物を５分間にわたって室温で攪拌した。この溶液には、ｐＨ制御（ｐＨ＝３）下において４℃で、乳酸ナトリウム１０％（ｗ／ｖ）水溶液３２．５ｍｌをゆっくりと添加した。粗生成物を、凍結乾燥前に、Ｃ１８  ＯＤＳ−Ａ  ＹＭＣゲル及び逆相調製ＨＰＬＣを用いて精製した。
【０１７４】
２．２  非内在化抗体−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの合成
タンパク質中の１モル当量のリシン残基に対して４モル当量の無水コハク酸を使用して、非内在化抗体（Ｈ2Ｏ中５０ｍｇ／ｍｌ）をコハク酸化した。無水コハク酸を液滴状に添加し、ｐＨを、ＮａＯＨ  １Ｎを添加することにより、７．５に調節した。
【０１７５】
過剰の無水コハク酸を除去するために、コハク酸化非内在化抗体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して４℃で２４時間にわたって透析した（緩衝剤を４回交換した）。
【０１７６】
コハク酸化非内在化抗体（３５０ｍｇ）を０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝剤中で２ｍｇ／ｍｌに希釈し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び、１ｍｌのＨ2Ｏ中に希釈された８０モル当量のＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンを添加した。３００モル当量のＥＣＤＩ（エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドクロル水和物、SIGMA）を活性化剤として２段階で添加した。反応は２４時間にわたってｐＨ制御（ｐＨ＝８）下で、４℃で行われた。
【０１７７】
カップリング反応の生成物を、Ｓｅｐ−パック装置を使用して精製した。
【０１７８】
過剰のＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンを、室温で３０分間にわたって、チャコール混合物中で除去した。複合体を０．２２μｍ装置を介して濾過し、４℃で貯蔵した。
【配列表】
2009529522000001.xml
【国際調査報告】
2009529522.tif 000005
2009529522.tif 000006
2009529522.tif 000007