(57)【要約】  抗ポリユビキチンモノクローナル抗体、及び当該抗体の使用法が提供される。
2009519716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項２】
第一リジン連鎖が第二リジン連鎖と異なる場合に、第一リジン連鎖を含む第一ポリユビキチンを特異的に結合し、第二リジン連鎖を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項３】
リジン６-連鎖性ポリユビキチン、リジン１１-連鎖性ポリユビキチン、リジン２７-連鎖性ポリユビキチン、リジン２９-連鎖性ポリユビキチン、リジン３３-連鎖性ポリユビキチン、リジン４８-連鎖性ポリユビキチン、又はリジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記第一ポリユビキチンがリジン４８-連鎖性である、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記第二ポリユビキチンがリジン６３-連鎖性である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記第一ポリユビキチンがリジン６３-連鎖性である、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
前記第二ポリユビキチンがリジン４８-連鎖性である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
第一リジン連鎖を含む第一ポリユビキチンと第二リジン連鎖を含む第二ポリユビキチンをともに特異的に結合する単離された抗体であって、該第一リジン連鎖が第二リジン連鎖と異なり、該抗体はモノユビキチンを特異的に結合せず、該抗体は、第一ポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比較して、実質的に減少した結合親和性で第二ポリユビキチンを結合する、抗体。
【請求項９】
リジン４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合し、モノユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項１０】
それぞれ配列番号：１−２５、１５１−１７５、２６５−２７９、３９２−４５９及び６９５−７０４；配列番号：２７−５１、１７７−２０１、２８１−２９５、４６１−５２８および７０６−７１５；配列番号：５３−７７、２０３−２２７、２９７−３１１、５３０−５９７および７１７−７２６；及び配列番号：３１３−３２７および７２８−７３７のいずれかのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一の高頻度可変(ＨＶＲ)配列を含んでなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８２５)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがバリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｅがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｆがチロシンであり、アミノ酸ｇがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８２６)を含み、このときアミノ酸ｋがセリンであり、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そして、アミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ'を含み、このときアミノ酸ｂ'がグルタミン酸、セリン、グリシンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｃ'がグリシン、チロシン、セリンおよびアスパラギンから選択され、アミノ酸ｄ'がチロシン、セリン、リジン、フェニルアラニンおよびグルタミン酸から選択され、アミノ酸ｅ'がセリン、チロシン、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｆ'がグルタミン、チロシン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｇ'がグリシン、セリン、チロシン、メチオニンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｈ'がグリシン、アラニン、プロリンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｉ'がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アラニンおよびロイシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸ｊ'がフェニルアラニンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｋ'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸ｌ'がチロシンである、請求項９に記載の抗体。  
【請求項１２】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８２７)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシンであり、アミノ酸ｅがセリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｆがチロシンであり、アミノ酸ｇがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８２８)を含み、このときアミノ酸ｋはセリンであり、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがチロシンであり、アミノ酸ｎがセリンであり、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがセリンであり、アミノ酸ｒがチロシンであり、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンであり、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そしてアミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ'(配列番号：８２９)を含み、このときアミノ酸ｂ'がセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｃ'がチロシンであり、アミノ酸ｄ'がセリンであり、アミノ酸ｅ'がチロシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｆ'がセリン、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンおよびヒスチジンから選択され、アミノ酸ｇがグルタミン酸、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｈ'がアラニンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｉ'がロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｊ'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸ｋ'がチロシンである、請求項９に記載の抗体。  
【請求項１３】
アミノ酸配列 ｍ' ｎ' ｏ' ｐ' ｑ' ｒ' ｓ' ｔ' ｕ' ｖ' ｗ'(配列番号：８３０)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなり、このときアミノ酸ｍ'がグルタミンであり、アミノ酸ｎ'がグルタミンであり、アミノ酸ｏ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｐ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｑ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｒ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｔ'がロイシン、セリン、プロリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕ'がプロリンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｖ'がフェニルアラニン、イソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、そして、アミノ酸ｗ'がスレオニンである、請求項９に記載の抗体。 
【請求項１４】
配列番号：７２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項９に記載の抗体。  
【請求項１５】
図１０Ａおよび１０Ｂのクローンａｐｕ０１、ａｐｕ０２、ａｐｕ０３、ａｐｕ０４、ａｐｕ０５、ａｐｕ０６、ａｐｕ０７、ａｐｕ０８、ａｐｕ０９、ａｐｕ１０、ａｐｕ１１、ａｐｕ１２、ａｐｕ１３、ａｐｕ１４又はａｐｕ１５に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項１１に記載の抗体。  
【請求項１６】
図１６Ａのクローンａｐｕ２.０１、ａｐｕ２.０２、ａｐｕ２.０３、ａｐｕ２.０４、ａｐｕ２.０５、ａｐｕ２.０６、ａｐｕ２.０７、ａｐｕ２.０８、ａｐｕ２.０９又はａｐｕ２.１０に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１７】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および図１０Ｃのクローンａｐｕ０１、ａｐｕ０２、ａｐｕ０３、ａｐｕ０４、ａｐｕ０５、ａｐｕ０６、ａｐｕ０７、ａｐｕ０８、ａｐｕ０９、ａｐｕ１０、ａｐｕ１１、ａｐｕ１２、ａｐｕ１３、ａｐｕ１４又はａｐｕ１５に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および図１６Ｂのクローンａｐｕ２.０１、ａｐｕ２.０２、ａｐｕ２.０３、ａｐｕ２.０４、ａｐｕ２.０５、ａｐｕ２.０６、ａｐｕ２.０７、ａｐｕ２.０８、ａｐｕ２.０９又はａｐｕ２.１０に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号：２６９のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２８５のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：３０１のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：３１７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項９に記載の抗体。  
【請求項２０】
配列番号：７０１のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７１２のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号；７２３のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７３４のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項２１】
リジン６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項２２】
それぞれ配列番号：８１−８９、２２９−２３９、３２９−３３６、５９９−６２９、７３９−７４８および７８９−７９９；配列番号：９１−９９、２４１−２５１；３３８−３４５、６３１−６６１、７５０−７５９および８０１−８１１；配列番号：１０１−１０９、２５３−２６３、３４７−３５４、６６３−６９３、７６１−７７０および８１３−８２３；及び配列番号：３５６−３６３および７７２−７８１のいずれかのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一の高頻度可変性(ＨＶＲ)配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３１)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがバリン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｅがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｆがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｇがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ'(配列番号：８３２)を含み、このときアミノ酸ｋはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｏがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｐがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そして、アミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ' ｐ' ｑ' ｒ' ｓ' ｔ' ｕ' ｖ'を含み、このときアミノ酸ｂ'がセリン、グルタミン酸、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｃ'がグリシン、チロシン、イソロイシン、グルタミンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｄ'がチロシン、メチオニン、グリシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｅ'がチロシン、アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニンおよびプロリンから選択され、アミノ酸ｆ'がチロシン、トリプトファン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｇ'がグルタミン、チロシン、セリン、フェニルアラニンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｈ'がグリシン、スレオニン、トリプトファン、リジンおよびプロリンから選択され、アミノ酸ｉ'がチロシン、アラニン、トリプトファン、グルタミン酸、プロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｊ'がトリプトファン、イソロイシン、チロシンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｋ'がトリプトファン、チロシン、グリシンおよびアスパラギン酸から選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｌ'がチロシン、セリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｍ'がチロシン、アスパラギン酸およびセリンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｎ'がチロシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｏ'がスレオニン、セリン、バリン、グリシンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｐ'がグリシン、アスパラギン酸、セリン、メチオニンおよびチロシンから��択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｑ'がチロシン、アラニンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｒ'がチロシン、ロイシンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｓ'がグリシンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｔ'がメチオニンおよびロイシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｕ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｖ'がチロシンである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３３)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸ｅがセリン、リジンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｆがセリン、トリプトファン、グリシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸ｇがセリン、アスパラギンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｈがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ' ｂ'(配列番号：８３４)を含み、このときアミノ酸ｋがアラニンであり、アミノ酸ｌがチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｍがイソロイシンであり、アミノ酸ｎがセリン、アラニンおよびグルタミンから選択され、アミノ酸ｏがプロリンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがロイシン、チロシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｓがセリン、スレオニンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｔはスレオニンであり、アミノ酸ｕはセリン、アスパラギン、リジンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｖがチロシンであり、アミノ酸ｗがアラニンであり、アミノ酸ｘがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｙがセリンであり、アミノ酸ｚがバリンであり、アミノ酸ａ'がリジンであり、そしてアミノ酸ｂ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ'(配列番号：８３７)を含み、このときアミノ酸ｃ'がセリンであり、アミノ酸ｄ'がアルギニンであり、アミノ酸ｅ'がグルタミン酸であり、アミノ酸ｆ'がチロシンであり、アミノ酸ｇ'がチロシンであり、アミノ酸ｈ'がアルギニンであり、アミノ酸ｉ'がトリプトファンであり、アミノ酸ｊ'がチロシンであり、アミノ酸ｋ'がスレオニンであり、アミノ酸ｌ'がアラニンであり、アミノ酸ｍ'がイソロイシンであり、アミノ酸ｎ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｏ'がチロシンである、請求項２１に記載の抗体。  
【請求項２５】
アミノ酸配列 ｗ' ｘ' ｙ' ｚ' Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇを含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなり、このときアミノ酸ｗ'がグルタミンであり、アミノ酸ｘ'がグルタミンであり、アミノ酸ｙ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｚ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ａがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ｂがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ｃがプロリン、セリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸Ｄがセリン、プロリンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Ｅがロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Ｆがフェニルアラニン、バリン、スレオニンおよびイソロイシンから選択され、そして、アミノ酸Ｇがアルギニン、スレオニンおよびフェニルアラニンから選択される、請求項２１に記載の抗体。 
【請求項２６】
アミノ酸配列Ｑ-Ｑ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｌ-Ｆ-Ｔ(配列番号：７７２)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。  
【請求項２７】
図１１Ａおよび１１Ｂのクローンａｐｕ１７、ａｐｕ１８、ａｐｕ１９、ａｐｕ２０、ａｐｕ２１、ａｐｕ２２、ａｐｕ２３およびａｐｕ２４に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項２３に記載の抗体。  
【請求項２８】
図１７Ａのクローンａｐｕ２.１１、ａｐｕ２.１２、ａｐｕ２.１３、ａｐｕ２.１４、ａｐｕ２.１５、ａｐｕ２.１６、ａｐｕ２.１７、ａｐｕ２.１８、ａｐｕ２.１９およびａｐｕ２.２０に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、及び図１１Ｃのクローンａｐｕ１７、ａｐｕ１８、ａｐｕ１９、ａｐｕ２０、ａｐｕ２１、ａｐｕ２２、ａｐｕ２３およびａｐｕ２４に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２５に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、及び図１７Ｂのクローンａｐｕ２.１１、ａｐｕ２.１２、ａｐｕ２.１３、ａｐｕ２.１４、ａｐｕ２.１５、ａｐｕ２.１６、ａｐｕ２.１７、ａｐｕ２.１８、ａｐｕ２.１９およびａｐｕ２.２０に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２６に記載の抗体。
【請求項３１】
配列番号：３３０のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：３３９のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：３４８のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：３５７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。  
【請求項３２】
配列番号：７３９のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５０のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６１のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７２のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。 
【請求項３３】
配列番号：７４０のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５１のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６２のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７３のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。  
【請求項３４】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３５)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸ｅがリジンおよびメチオニンから選択され、アミノ酸ｆがスレオニン、メチオニン、アスパラギン、アルギニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｇがグリシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｈがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ' ｂ'(配列番号：８３６)を含み、このときアミノ酸ｋがアラニンであり、アミノ酸ｌがチロシンであり、アミノ酸ｍがイソロイシンであり、アミノ酸ｎがセリン、イソロイシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸ｏがプロリンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがロイシン、チロシン、アスパラギン酸、セリンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｒがグリシンであり、アミノ酸ｓがトリプトファン、バリン、セリン、アスパラギン、アルギニンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｔはスレオニンである、アミノ酸ｕはアルギニン、アスパラギン、バリン、スレオニン、セリンおよびリジンから選択され、アミノ酸ｖがチロシンであり、アミノ酸ｗがアラニンであり、アミノ酸ｘがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｙがセリンであり、アミノ酸ｚがバリンであり、アミノ酸ａ'がリジンであり、そしてアミノ酸ｂ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ'(配列番号：８３７)を含み、このときアミノ酸ｃ'がセリンであり、アミノ酸ｄ'がアルギニンであり、アミノ酸ｅ'がグルタミン酸であり、アミノ酸ｆ'がチロシンであり、アミノ酸ｇ'がチロシンであり、アミノ酸ｈ'がアルギニンであり、アミノ酸i'がトリプトファンであり、アミノ酸ｊ'がチロシンであり、アミノ酸ｋ'がスレオニンであり、アミノ酸ｌ'がアラニンであり、アミノ酸ｍ'がイソロイシンであり、アミノ酸ｎ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｏ'がチロシンである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項３５】
図２３Ａおよび２３Ｂのクローンａｐｕ３.０１、ａｐｕ３.０２、ａｐｕ３.０３、ａｐｕ３.０４、ａｐｕ３.０５、ａｐｕ３.０６、ａｐｕ３.０７、ａｐｕ３.０８、ａｐｕ３.０９、ａｐｕ３.１０および３．１１に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項３４又は請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
配列番号：７４４のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５５のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６６のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。
【請求項３８】
配列番号：７９５のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：８０７のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：８１９のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２１に記載の抗体。
【請求項３９】
配列番号：７０１のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７１２のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７２３のＨＶＲ-Ｈ３配列、および配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、および配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７３４のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項４０】
請求項１から３９のいずれかの抗体と同じポリユビキチン上の抗原決定基に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項４１】
ポリユビキチンへの結合について請求項１から３９のいずれかの抗体と競合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項４２】
前記抗体がポリユビキチン化されたタンパク質に特異的に結合する、請求項１から３９のいずれか一に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体がポリユビキチン化されたタンパク質の分解を阻害する、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を調節する、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を阻害する、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を刺激する、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４７】
請求項１から３９のいずれかに記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項４８】
請求項４７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１から３９のいずれかに記載の抗体を産生することができる細胞株。
【請求項５１】
抗体が産生される条件下で抗体をコードする核酸分子を含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、請求項１から３９のいずれかに記載の抗体の産生方法。
【請求項５２】
請求項１から３９のいずれかに記載の抗体の有効量と薬学的に受容可能な担体とを含有してなる組成物。
【請求項５３】
試料を請求項１から３９のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化されたタンパク質の存在を同定する方法。
【請求項５４】
請求項１から３９のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者のポリユビキチンの調節不全が関連する疾患又は症状の治療のための方法。
【請求項５５】
前記患者が哺乳類の患者である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記患者がヒトである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患が、癌、筋疾患、ユビキチン経路関連の遺伝的疾患、免疫性／炎症性の疾患および神経学的疾患から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記疾患が、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リデル症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病およびパジェット病から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含有すると思われる試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法であって、該試料を請求項１から３９のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体に曝し、そして、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質への少なくとも一の抗体の結合を決定することを含んでなる方法。
【請求項６０】
試料を請求項１から３９のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中の非ポリユビキチン化タンパク質からポリユビキチン化タンパク質を分離する方法。
【請求項６１】
細胞を請求項１から３９のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、細胞でのポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法。
【請求項６２】
試料を請求項１から３９のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、試料でのポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法。ユビキチン分子の第一アミノ酸位の第一リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第一ポリユビキチンに特異的に結合し、該抗体がユビキチン分子の第二アミノ酸位の第二リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第二ポリユビキチンに特異的に結合せず、このとき該第一および該第二のアミノ酸位が異なる、単離された抗体。
【請求項６３】
前記抗体がリジン-６３連鎖性ポリユビキチンのエピトープに結合する、請求項２１に記載の単離された抗体。
【請求項６４】
前記エピトープは、リジン-６３連鎖性ポリユビキチンの第二ユビキチンサブユニットと第一ユビキチンサブユニットの両方に残基を含む、請求項６３に記載の単離された抗体。
【請求項６５】
前記エピトープが、Ｇｌｕ-１８、Ｐｒｏ-１９、Ｓｅｒ-２０、Ａｓｐ-２１、Ｔｈｒ-５５、Ｌｅｕ-５６、Ｓｅｒ-５７、Ａｓｐ-５８、Ａｓｎ-６０、Ｉｌｅ-６１、及びＧｌｎ-６２から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項６４に記載の単離された抗体。
【請求項６６】
前記エピトープが、Ｌｅｕ-８、Ｔｈｒ-９、Ｇｌｕ-３４、Ｇｌｙ-３５、Ｉｌｅ-３６、Ｐｒｏ-３７、Ａｓｐ-３９、Ｇｌｎ-４０、Ｌｅｕ-７１、Ａｒｇ-７２、Ｌｅｕ-７３、Ａｒｇ-７４、Ｇｌｙ-７５から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項６４に記載の単離された抗体。
【請求項６７】
前記エピトープが、Ｇｌｕ-１８、Ｐｒｏ-１９、Ｓｅｒ-２０、Ａｓｐ-２１、Ｔｈｒ-５５、Ｌｅｕ-５６、Ｓｅｒ-５７、Ａｓｐ-５８、Ａｓｎ-６０、Ｉｌｅ-６１、及びＧｌｎ-６２から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基と、Ｌｅｕ-８、Ｔｈｒ-９、Ｇｌｕ-３４、Ｇｌｙ-３５、Ｉｌｅ-３６、Ｐｒｏ-３７、Ａｓｐ-３９、Ｇｌｎ-４０、Ｌｅｕ-７１、Ａｒｇ-７２、Ｌｅｕ-７３、Ａｒｇ-７４、及びＧｌｙ-７５から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項６４に記載の単離された抗体。
【請求項６８】
請求項１から３９及び６３から６７のいずれか一に記載の抗体の抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗ポリユビキチン抗体の分野、および特にモノユビキチンに特異的に結合せず、異なるイソペプチド結合を有するポリユビキチンを区別することができる抗ポリユビキチン抗体に関する。
【０００２】
（背景）
ユビキチンは、多種多様な細胞経路において重要な調整の役割を有する小タンパク質である。中でもタンパク質分解でのユビキチンの役割は最も周知であり、標的タンパク質にユビキチンが共有結合するとその標的タンパク質が２６Ｓのプロテアソームによって認識され、破壊される(Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000)を参照)。様々なシグナル伝達経路のプロテインキナーゼ制御はユビキチン化とも相関している(Sun and Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16: 119-126 (2004)を参照)。例えば、ＩκＢキナーゼによるＩκＢのリン酸化により、ＩκＢのユビキチン化とその後の２６Ｓのプロテアソームによる分解が促される；ＩκＢはＮＫκＢのインヒビターであるので、ＩκＢの分解はＮＫκＢを活性化する(Ghosh and Karin, Cell 109 (Suppl.): S81-S96 (2002)；Palombella等, Cell 78: 773-785 (1994))。また、ユビキチン化はＤＮＡ修復を媒介する(Sun and Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16:119-126 (2004)を参照)。ＤＮＡが損傷されると、増殖性細胞核抗原(ＰＣＮＡ)のモノユビキチン化により、ＤＮＡが破壊されていてもＤＮＡを合成することができる損傷耐性ポリメラーゼが活性化される(Stelter and Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003)。ユビキチン化が伴うことが知られている他の生理学的なプロセスには、細胞分裂、細胞増殖、細胞移動、及びアポトーシス／細胞死が含まれる(Johnson, Nat. Cell Biol. 4: E295-E298 (2002)；Pickart, Mol. Cell. 8: 499-504 (2001))。
【０００３】
標的タンパク質への７６アミノ酸タンパク質であるユビキチンの共有結合は、３-工程酵素法である(Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001))。第一に、ユビキチン-活性化酵素Ｅ１は、ＡＴＰ依存性反応においてユビキチン-Ｅ１チオエステルを形成する。第二工程において、ユビキチンは、ユビキチン-Ｅ１チオエステルから、ユビキチンコンジュゲート酵素(Ｅ2)ファミリのメンバーに転移される。第三工程では、ユビキチン-プロテインリガーゼ(Ｅ３)の援助により、ユビキチンのカルボキシル末端と標的タンパク質上のリジン残基のεアミノ基との間にイソペプチド結合が形成される。デユビキチナーゼと呼ばれる酵素は標的タンパク質からユビキチン部分を取り除く(Guterman and Glickman, Curr. Prot. Pep. Sci. 5: 201-210 (2004))。重要な制御分子としてのユビキチンの役割に注目すると、ヒトゲノムはユビキチン化又は脱ユビキチン化に関与する多くの異なるタンパク質を有する。今までのところ少なくとも４０の異なるＥ2ｓ、５００の異なるＥ３、及び８０の異なるデユビキチナーゼが同定されている(Wong等, Drug. Discov. Today 8: 746-754 (2003))。
【０００４】
ユビキチンは７つのリジン残基(Ｌｙｓ6、Ｌｙｓ22、Ｌｙｓ27、Ｌｙｓ33、Ｌｙｓ29、Ｌｙｓ48およびＬｙｓ63)を含有するため、ユビキチン自体がユビキチン化の標的タンパク質として役立ちうる(Peng等, Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003)；Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004))。ユビキチンタンパク質のユビキチン化の際に産生される分子はポリユビキチン分子と呼ばれ、２以上のユビキチン成分を含みうる。ユビキチンのユビキチン化は理論的には７つのリジン残基のいずれかで生じており(Peng等, Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003))、異なる種のポリユビキチンはユビキチン内の異なるリジン残基へのイソペプチド結合を有している。２つのユビキチン部分よりも大きな単一のポリユビキチン部分は１より多い種類のリジン連鎖を有する可能性がある。いくつかの研究から、Ｅ2酵素があるユビキチン分子と他のユビキチン分子との間で作製される種類のリジン連鎖に影響することが示されている(Tenno等, Genes to Cells 9: 865-875 (2004)；Deng等 (2000); Hofmann and Pickart (2001))。ポリユビキチンおよびユビキチンは、遊離分子として存在するし、標的タンパク質と共有結合して存在する。
【０００５】
ユビキチンのように、ポリユビキチンの関与は、細胞内輸送、エンドサイトーシス、遺伝子発現／サイレンシング、タンパク質分解、キナーゼ活性化、翻訳、及びＤＮＡ修復を含む多くの細胞性プロセスに見られる(Hoege等, Nature 419:135-141 (2002)；Spence等, Mol. Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995)；Hofmann and Pickart, Cell 96: 645-653 (1999)。しかしながら、ポリユビキチンおよびポリユビキチン化は、同じ経路のモノユビキチン及びモノユビキチン化と著しく異なる生理学的役割を有しうる。例えば、ＤＮＡ損傷後のＰＣＮＡのモノユビキチン化により誤りがちなＤＮＡポリメラーゼの活性化が生じるのに対して、モノユビキチン化が観察される同定された残基でのＰＣＮＡのポリユビキチン化により誤りのないＤＮＡ修復が生じる(Stelter and Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003)；Hoege等, Nature 419:135-141 (2002)；Spence等, Mol. Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995)；及びHofmann and Pickart, Cell 96: 645-653 (1999))。
【０００６】
さらに、異なるリジン連鎖を有するポリユビキチンは異なる生理学的役割を有するようである。最も研究されている２つはＬｙｓ４８-連鎖性とＬｙｓ６３-連鎖性のポリユビキチンであり、この２つの構造的研究により、異なるリジン-連鎖性ポリユビキチンは著しく異なる立体構造を有しているので、選択した結合パートナーと異なる相互作用を可能にすることが示唆されている(Tenno等, Genes to Cells 9: 865-875 (2004))。典型的に、Ｌｙｓ４８-連鎖性ポリユビキチンによる共有結合的修飾はタンパク質分解の標的タンパク質を明らかにするが、Ｌｙｓ４８-連鎖性ポリユビキチンもタンパク質分解性でない方法で特定のタンパク質を調節しうるという証拠がいくつかある(Chau等, Science 243: 1576-1583 (1989)；Finley等, Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994)；Flick等, Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004))。それに対して、Ｌｙｓ６３-連鎖性ポリユビキチンは、ＤＮＡ修復(Ｋ６３Ｒ-ユビキチンを発現する酵母細胞はＤＮＡ修復を欠失する)、キナーゼ活性化、細胞内輸送、及び翻訳を含む様々な非タンパク質分解性の細胞内経路に関係している(Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004)；Hicke and Dunn, Annu Rev. Cell Dev. Biol. 19: 141-172 (2003)；Spece等, Mol. Cell Biol. 15: 1265-1273 (1995)；Ulrich, Eukaryot. Cell 1: 1-10 (2002)；Spence等, Cell 102: 67-76 (2000)；Seibenhener等, Mol. Cell. Biol. 24(18): 8055-8068 (2004))。ある具体例では、synphilin-1は通常、プロテアソーム非依存的な方法でパーキンによるＫ６３-連鎖性ポリユビキチンにてユビキチン化されるが、synphilin-1は交互にＫ４８-連鎖性ポリユビキチンによるユビキチン化による破壊の標的となりうる(Lim等, J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005))。パーキンソン病患者の分析により、synphilin-1のＫ６３-ポリユビキチン化がこの病気に関係するレビー小体封入対の形成に伴うことが示される(Lim等, J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005))。
【０００７】
他のリジン-連鎖性ポリユビキチンは、これらを区別することが難しいので、広範囲に大規模に研究されていない。今までの研究は、一又は複数のリジンが除去されている変異したユビキチンを発現する細胞、特定の結合の酵素的に合成したポリユビキチン、又はある種のポリユビキチンと他種のポリユビキチンとを区別するための質量分析法などの技術に頼っている。これらの方法のそれぞれは、特定のリジン-連鎖性ポリユビキチンの正常な生理学的性質の分析に不適当であるか面倒なものである。モノユビキチンとは対照的にポリユビキチンに特異的である抗体が存在するのに対して(Fujimoro等, FEBS Lett. 349: 173-180 (1994))、異なるリジン連鎖のポリユビキチン間を区別することができる抗体はまだない。
【０００８】
驚くべきことではないが、様々な細胞性プロセスに重要な役割があるので、ユビキチンおよびポリユビキチンも多くの疾患に関係していた(Argiles, Ubiquitin and Disease, R. G. Landes (1998)を参照)。筋消耗にユビキチン調節不全が観察される(Mitch and Goldberg, New Engl. J. Med. 335: 1897-905 (1996)；Bodine等, Science 294: 1704-1708 (2001))。遺伝病の中には、嚢胞性線維症(Ward等, Cell 83: 121-127 (1995))、アンジェルマン症候群(Kishino等, Nature Genet. 15: 70-73 (1997))およびリデル症候群(Staub等, EMBO J 16: 6325-6336 (1997))を含む異常なユビキチン活性に関連しているものがある。また、ユビキチンは免疫及び炎症性の応答に役割がある。例えば、細胞外ユビキチンはサイトカインのような働きがあることが明らかになっており、末梢血単核細胞のエンドトキシンに対するＴＮＦα応答を阻害し、エンドトキシン応答性低下を制御する(Majetschak等, Blood 101: 1882-1890 (2003)；Ciechanover, EMBO J 17: 7151-7160 (1998))。また、ユビキチンとポリユビキチンはヒトの血清中に見られ、寄生虫病やアレルギー疾患を有する患者の血清では両分子のレベルが高い(Takada等, Clinical Chem. 43: 1188-1195 (1997))。
【０００９】
また、いくつかのユビキチンが媒介する経路の調節不全は癌に関与する(Spataro等, Br. J. Cancer 77: 448-55 (1998)；Beckmann等, Hum. Mutat. 25: 507-12 (2005))。例えば、ヘテロダイマーユビキチンリガーゼＢＲＣＡ1-ＢＡＲＤ1の突然変異は乳癌と関係しており(Hashizume等, J. Biol. Chem. 276: 14537-40 (2001))、ユビキチン経路によって分解されるＭｙｃの能力を破壊する突然変異は、ｃ-Ｍｙｃの発癌能力を活性化し(Salghetti等, EMBO J. 18: 717-726 (1999))、発癌性相関と関係のないものであるｃ-Ｊｕｎは制御されない増殖が生じるので、形質転換したｖ-Ｊｕｎはユビキチン化も分解もされない(Ciechanover, EMBO J. 17: 7151-7160 (1998)；Trier等, Cell 78: 787-798 (1994))。
【００１０】
ユビキチンおよびポリユビキチンは、特に神経学的疾患において研究されている(Chung等, TINS 24(11 Suppl.) S7-S14 (2001))。ハンチントン病、脊髄小脳失調症、プリオン脳症、ピック病、レビー小体病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病に蓄積する封入対、小体、及び神経原線維変化は、モノ及び／又はポリユビキチンについて免疫陽性染色される(Alves-Rodrigues等, Trends Neurosci. 21: 516-520 (1998)；Cammarata等, Neurosci Lett. 156: 96-98 (1993)；Kalchman等, J. Biol. Chem. 271: 19385-94 (1996)；Holmberg等, Human Mol. Genet. 7: 913-918 (1998)；Yedidia等, EMBO J. 20: 5383-91 (2001)；Mori等, Science 235: 1641-44 (1987)；Leigh等, Acta Neuropathol. (Berl.) 79: 61-72 (1989)；及びKuzuhara等, Acta Neuropathologica 75: 345-353 (1988))。様々な形態のパーキンソン病は、デユビキチナーゼであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１(ＵＣＨ-Ｌ１)の突然変異と関係していたのに対して(Leroy等, Nature 395: 451-452 (1998))、他の形態のパーキンソン病は、ユビキチンコンジュゲート酵素であるＵｂｃＨ７と相互作用してsynphilin-1をユビキチン化することが知られているＥ２-依存性ユビキチン-タンパク質リガーゼであるパーキンの不活性化突然変異と関係していた(Shimura等, Nature Genet. 25: 302-305 (2000)、Zhang等, Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 13354-13359 (2000)；Lim等, J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005))。両タイプの突然変異により異常なタンパク分解性プロセシングとタンパク質の不適当な凝集が生じる(McNaught等, Nature Rev. Neurosci. 2: 589-594 (2001)を参照)。また、ＵＣＨ-Ｌ1突然変異は、ハンチントン舞踏病によって分かれることが明らかとなっている(Naze等, Neurosci. Lett. 328: 1: 1-4 (2002))。突然変異型のユビキチンはポリユビキチン鎖に高率に組み込まれているが、一度形成された脱ユビキチン化に抵抗性があるので、潜在的に正常な細胞性タンパク質分解性のプロセシング系を優位に阻害することが、アルツハイマー病の脳において同定された(Lam等, Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9902-9906 (2000))。
【００１１】
リジン連鎖が異なるポリユビキチン間を区別することができる組成物及び方法をゆうするだけでなく、ユビキチン及びポリユビキチンが媒介する経路を標的とする及び調節する際に有効な組成物及び方法を有することが有利であることは明らかである。本明細書において提供される本発明はこのような組成物および方法に関する。
【００１２】
特許文献及び出版物を含む、本明細書中で引用したすべての参考文献は、その全体が出典明記によって援用される。
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、ポリユビキチンに結合する及び／又はポリユビキチンと関係する生物学的活性を制御することができる新規の抗体を提供する。
ある実施態様では、ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体が提供される。ある実施態様では、第一リジン連鎖が第二リジン連鎖と異なる場合に、第一リジン連鎖を含む第一ポリユビキチンを特異的に結合し、第二リジン連鎖を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記抗体はさらに、リジン６-連鎖性ポリユビキチン、リジン１１-連鎖性ポリユビキチン、リジン２７-連鎖性ポリユビキチン、リジン２９-連鎖性ポリユビキチン、リジン３３-連鎖性ポリユビキチン、リジン４８-連鎖性ポリユビキチン、又はリジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する。
【００１４】
ある実施態様では、第一Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合し、ポリユビキチンの異なるリジン-連鎖性型(すなわち、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンでないもの)を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記第二ポリユビキチンがＫ６３-連鎖性ポリユビキチンである。
ある実施態様では、第一Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合し、ポリユビキチンの異なるリジン-連鎖性型(すなわち、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンでないもの)を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記第二ポリユビキチンがＫ４８-連鎖性ポリユビキチンである。
【００１５】
ある実施態様では、第一リジン連鎖を含む第一ポリユビキチンと第二リジン連鎖を含む第二ポリユビキチンをともに特異的に結合する単離された抗体であって、該第一リジン連鎖が第二リジン連鎖と異なり、該抗体はモノユビキチンを特異的に結合せず、該抗体は、第一ポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比較して、実質的に減少した結合親和性で第二ポリユビキチンを結合する抗体を提供する。
ある実施態様では、リジン４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合し、モノユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、前記抗体はさらに、それぞれ配列番号：１−２５、１５１−１７５、２６５−２７９、３９２−４５９及び６９５−７０４；配列番号：２７−５１、１７７−２０１、２８１−２９５、４６１−５２８および７０６−７１５；配列番号：５３−７７、２０３−２２７、２９７−３１１、５３０−５９７および７１７−７２６；及び配列番号：３１３−３２７および７２８−７３７のいずれかのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一の高頻度可変(ＨＶＲ)配列を含んでなる。ある実施態様では、前記抗体はさらに、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８２５)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがバリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｅがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｆがチロシンであり、アミノ酸ｇがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８２６)を含み、このときアミノ酸ｋがセリンであり、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そして、アミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ'を含み、このときアミノ酸ｂ'がグルタミン酸、セリン、グリシンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｃ'がグリシン、チロシン、セリンおよびアスパラギンから選択され、アミノ酸ｄ'がチロシン、セリン、リジン、フェニルアラニンおよびグルタミン酸から選択され、アミノ酸ｅ'がセリン、チロシン、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｆ'がグルタミン、チロシン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｇ'がグリシン、セリン、チロシン、メチオニンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｈ'がグリシン、アラニン、プロリンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｉ'がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アラニンおよびロイシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸ｊ'がフェニルアラニンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｋ'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸ｌ'がチロシンである。ある実施態様では、前記抗体はさらに、図１０Ａおよび１０Ｂのクローンａｐｕ０１、ａｐｕ０２、ａｐｕ０３、ａｐｕ０４、ａｐｕ０５、ａｐｕ０６、ａｐｕ０７、ａｐｕ０８、ａｐｕ０９、ａｐｕ１０、ａｐｕ１１、ａｐｕ１２、ａｐｕ１３、ａｐｕ１４又はａｐｕ１５に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる。
【００１６】
ある実施態様では、抗体は、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８２７)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシンであり、アミノ酸ｅがセリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｆがチロシンであり、アミノ酸ｇがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８２８)を含み、このときアミノ酸ｋはセリンであり、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがチロシンであり、アミノ酸ｎがセリンであり、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがセリンであり、アミノ酸ｒがチロシンであり、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンであり、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そしてアミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ'(配列番号：８２９)を含み、このときアミノ酸ｂ'がセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｃ'がチロシンであり、アミノ酸ｄ'がセリンであり、アミノ酸ｅ'がチロシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｆ'がセリン、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンおよびヒスチジンから選択され、アミノ酸ｇがグルタミン酸、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｈ'がアラニンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｉ'がロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｊ'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸ｋ'がチロシンである。ある実施態様では、前記抗体はさらに、図１６Ａのクローンａｐｕ２.０１、ａｐｕ２.０２、ａｐｕ２.０３、ａｐｕ２.０４、ａｐｕ２.０５、ａｐｕ２.０６、ａｐｕ２.０７、ａｐｕ２.０８、ａｐｕ２.０９又はａｐｕ２.１０に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる。
【００１７】
ある実施態様では、抗体はさらに、アミノ酸配列 ｍ' ｎ' ｏ' ｐ' ｑ' ｒ' ｓ' ｔ' ｕ' ｖ' ｗ'(配列番号：８３０)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなり、このときアミノ酸ｍ'がグルタミンであり、アミノ酸ｎ'がグルタミンであり、アミノ酸ｏ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｐ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｑ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｒ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｔ'がロイシン、セリン、プロリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕ'がプロリンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｖ'がフェニルアラニン、イソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、そして、アミノ酸ｗ'がスレオニンである。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および図１０Ｃのクローンａｐｕ０１、ａｐｕ０２、ａｐｕ０３、ａｐｕ０４、ａｐｕ０５、ａｐｕ０６、ａｐｕ０７、ａｐｕ０８、ａｐｕ０９、ａｐｕ１０、ａｐｕ１１、ａｐｕ１２、ａｐｕ１３、ａｐｕ１４又はａｐｕ１５に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、アミノ酸配列Ｑ-Ｑ-Ｓ-Ｓ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｌ-Ｉ-Ｔ(配列番号：７２８)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。ある実施態様では、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および図１６Ｂのクローンａｐｕ２.０１、ａｐｕ２.０２、ａｐｕ２.０３、ａｐｕ２.０４、ａｐｕ２.０５、ａｐｕ２.０６、ａｐｕ２.０７、ａｐｕ２.０８、ａｐｕ２.０９又はａｐｕ２.１０に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。
【００１８】
ある実施態様では、リジン４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：２６９のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２８５のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：３０１のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：３１７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。ある実施態様では、リジン４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的を結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：７０１のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７１２のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号；７２３のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７３４のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。ある実施態様では、リジン４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：７０１のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７１２のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号；７２３のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７３４のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。
【００１９】
ある実施態様では、リジン６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体を提供する。ある実施態様では、抗体はさらに、それぞれ配列番号：８１−８９、２２９−２３９、３２９−３３６、５９９−６２９、及び７３９−７４８；配列番号：９１−９９、２４１−２５１；３３８−３４５、６３１−６６１、及び７５０−７５９；配列番号：１０１−１０９、２５３−２６３、３４７−３５４、６６３−６９３、及び７６１−７７０；及び配列番号：３５６−３６３および７７２−７８１のいずれかのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一の高頻度可変性(ＨＶＲ)配列を含んでなる。ある実施態様では、抗体は、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３１)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがバリン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｅがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｆがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｇがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ'(配列番号：８３２)を含み、このときアミノ酸ｋはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｏがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｐがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そして、アミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ' ｐ' ｑ' ｒ' ｓ' ｔ' ｕ' ｖ'を含み、このときアミノ酸ｂ'がセリン、グルタミン酸、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｃ'がグリシン、チロシン、イソロイシン、グルタミンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｄ'がチロシン、メチオニン、グリシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｅ'がチロシン、アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニンおよびプロリンから選択され、アミノ酸ｆ'がチロシン、トリプトファン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｇ'がグルタミン、チロシン、セリン、フェニルアラニンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｈ'がグリシン、スレオニン、トリプトファン、リジンおよびプロリンから選択され、アミノ酸ｉ'がチロシン、アラニン、トリプトファ��、グルタミン酸、プロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｊ'がトリプトファン、イソロイシン、チロシンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｋ'がトリプトファン、チロシン、グリシンおよびアスパラギン酸から選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｌ'がチロシン、セリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｍ'がチロシン、アスパラギン酸およびセリンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｎ'がチロシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｏ'がスレオニン、セリン、バリン、グリシンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｐ'がグリシン、アスパラギン酸、セリン、メチオニンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｑ'がチロシン、アラニンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｒ'がチロシン、ロイシンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｓ'がグリシンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｔ'がメチオニンおよびロイシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｕ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｖ'がチロシンである。ある実施態様では、前記抗体はさらに、図１１Ａおよび１１Ｂのクローンａｐｕ１７、ａｐｕ１８、ａｐｕ１９、ａｐｕ２０、ａｐｕ２１、ａｐｕ２２、ａｐｕ２３およびａｐｕ２４に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる。
【００２０】
ある実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３３)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸ｅがセリン、リジンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｆがセリン、トリプトファン、グリシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸ｇがセリン、アスパラギンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｈがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８３４)を含み、このときアミノ酸ｋがチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリン、アラニンおよびグルタミンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンであり、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがロイシン、チロシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリン、スレオニンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリン、アスパラギン、リジンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚ'がリジンであり、そしてアミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ'(配列番号：９０８)を含み、このときアミノ酸ｂ'がグルタミン酸であり、アミノ酸ｃ'がチロシンであり、アミノ酸ｄ'がチロシンであり、アミノ酸ｅ'がアルギニンであり、アミノ酸ｆ'がトリプトファンであり、アミノ酸ｇ'がチロシンであり、アミノ酸ｈ'がスレオニンであり、アミノ酸ｉ'がアラニンであり、アミノ酸ｊ'がイソロイシンであり、アミノ酸ｋ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｌ'がチロシンである。ある実施態様では、前記抗体は、図１７Ａのクローンａｐｕ２.１１、ａｐｕ２.１２、ａｐｕ２.１３、ａｐｕ２.１４、ａｐｕ２.１５、ａｐｕ２.１６、ａｐｕ２.１７、ａｐｕ２.１８、ａｐｕ２.１９およびａｐｕ２.２０に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる。
【００２１】
ある実施態様では、抗体は、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３５)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸ｅがリジンおよびメチオニンから選択され、アミノ酸ｆがスレオニン、メチオニン、アスパラギン、アルギニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｇがグリシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｈがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ' ｂ'(配列番号：８３６)を含み、このときアミノ酸ｋがアラニンであり、アミノ酸ｌがチロシンであり、アミノ酸ｍがイソロイシンであり、アミノ酸ｎがセリン、イソロイシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸ｏがプロリンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがロイシン、チロシン、アスパラギン酸、セリンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｒがグリシンであり、アミノ酸ｓがトリプトファン、バリン、セリン、アスパラギン、アルギニンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｔはスレオニンである、アミノ酸ｕはアルギニン、アスパラギン、バリン、スレオニン、セリンおよびリジンから選択され、アミノ酸ｖがチロシンであり、アミノ酸ｗがアラニンであり、アミノ酸ｘがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｙがセリンであり、アミノ酸ｚがバリンであり、アミノ酸ａ'がリジンであり、そしてアミノ酸ｂ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ'(配列番号：８３７)を含み、このときアミノ酸ｃ'がセリンであり、アミノ酸ｄ'がアルギニンであり、アミノ酸ｅ'がグルタミン酸であり、アミノ酸ｆ'がチロシンであり、アミノ酸ｇ'がチロシンであり、アミノ酸ｈ'がアルギニンであり、アミノ酸i'がトリプトファンであり、アミノ酸ｊ'がチロシンであり、アミノ酸ｋ'がスレオニンであり、アミノ酸ｌ'がアラニンであり、アミノ酸ｍ'がイソロイシンであり、アミノ酸ｎ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｏ'がチロシンである。ある実施態様では、前記抗体は、図２３Ａおよび２３Ｂのクローンａｐｕ３.０１、ａｐｕ３.０２、ａｐｕ３.０３、ａｐｕ３.０４、ａｐｕ３.０５、ａｐｕ３.０６、ａｐｕ３.０７、ａｐｕ３.０８、ａｐｕ３.０９、ａｐｕ３.１０および３．１１に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる。
【００２２】
ある実施態様では、抗体は、アミノ酸配列 ｗ' ｘ' ｙ' ｚ' Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇを含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなり、このときアミノ酸ｗ'がグルタミンであり、アミノ酸ｘ'がグルタミンであり、アミノ酸ｙ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｚ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ａがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ｂがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ｃがプロリン、セリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸Ｄがセリン、プロリンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Ｅがロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Ｆがフェニルアラニン、バリン、スレオニンおよびイソロイシンから選択され、そして、アミノ酸Ｇがアルギニン、スレオニンおよびフェニルアラニンから選択される。ある実施態様では、前記抗体は、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、及び図１１Ｃのクローンａｐｕ１７、ａｐｕ１８、ａｐｕ１９、ａｐｕ２０、ａｐｕ２１、ａｐｕ２２、ａｐｕ２３およびａｐｕ２４に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。ある実施態様では、前記抗体は、アミノ酸配列Ｑ-Ｑ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｌ-Ｆ-Ｔ(配列番号：７７２)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。ある実施態様では、前記抗体は、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、及び図１７Ｂのクローンａｐｕ２.１１、ａｐｕ２.１２、ａｐｕ２.１３、ａｐｕ２.１４、ａｐｕ２.１５、ａｐｕ２.１６、ａｐｕ２.１７、ａｐｕ２.１８、ａｐｕ２.１９およびａｐｕ２.２０に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。ある実施態様では、前記抗体は、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる。
【００２３】
ある実施態様では、リジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：３３０のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：３３９のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：３４８のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：３５７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。ある実施態様では、リジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：７３９のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５０のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６１のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７２のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。ある実施態様では、リジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：７４０のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５１のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６２のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７３のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。ある実施態様では、リジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：７４４のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５５のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６６のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。ある実施態様では、リジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する単離された抗体であって、モノユビキチンを特異的に結合せず、配列番号：７９５のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：８０７のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：８１９のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる抗体を提供する。
【００２４】
ある態様では、前記のいずれかの抗体と同じポリユビキチン上の同じ抗原決定基に結合する単離された抗体であり、モノユビキチンに特異的に特異的に結合しない。ある態様では、前記のいずれかの抗体とポリユビキチンへの結合について競合する単離された抗体であり、モノユビキチンに特異的に特異的に結合しない。
【００２５】
ある態様では、前記いずれかの抗体はポリユビキチン化されたタンパク質に特異的に結合する。ある態様では、前記抗体はさらに、ポリユビキチン化されたタンパク質の分解を阻害する。ある態様では、前記抗体はさらに、少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を調節する。ある態様では、前記抗体はさらに、少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を阻害する。ある態様では、前記抗体はさらに、少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を刺激する。
【００２６】
ある態様では、本発明の抗体をコードする核酸分子を提供する。ある態様では、前記核酸を含んでなるベクターを提供する。ある態様では、前記ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ある態様では、本発明の抗体を産生することができる細胞株を提供する。ある態様では、抗体が産生される条件下で抗体をコードする核酸分子を含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、本発明の抗体の産生方法を提供する。ある態様では、本発明の抗体の有効量と薬学的に受容可能な担体とを含有してなる組成物を提供する。
【００２７】
ある態様では、試料を本発明の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化されたタンパク質の存在を同定する方法を提供する。ある態様では、本発明の少なくとも一の抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者のポリユビキチンの調節不全が関連する疾患又は症状の治療のための方法を提供する。ある態様では、前記患者は哺乳類の患者である。ある態様では、前記患者はヒトである。ある態様では、前記疾患は、癌、筋疾患、ユビキチン経路関連の遺伝的疾患、免疫性／炎症性の疾患および神経学的疾患から選択される。ある態様では、前記疾患は、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リデル症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病およびパジェット病から選択される。
【００２８】
ある態様では、ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含有すると思われる試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法であって、該試料を本発明の少なくとも一の抗体に曝し、そして、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質への少なくとも一の抗体の結合を決定することを含んでなる方法を提供する。
ある態様では、試料を本発明の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中の非ポリユビキチン化タンパク質からポリユビキチン化タンパク質を分離する方法を提供する。
【００２９】
ある態様では、細胞を本発明の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、細胞でのポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法を提供する。
ある態様では、試料を本発明の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、試料でのポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法を提供する。
【００３０】
他の実施態様では、リジン-６３連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合し、該リジン-６３連鎖性ポリユビキチンのエピトープに結合する単離された抗体を提供する。ある態様では、前記エピトープには、リジン-６３連鎖性ポリユビキチンの第二ユビキチンサブユニットと第一ユビキチンサブユニットに残基が含まれる。他のこのような態様では、前記エピトープは、Ｇｌｕ-１８、Ｐｒｏ-１９、Ｓｅｒ-２０、Ａｓｐ-２１、Ｔｈｒ-５５、Ｌｅｕ-５６、Ｓｅｒ-５７、Ａｓｐ-５８、Ａｓｎ-６０、Ｉｌｅ-６１、及びＧｌｎ-６２から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む。他のこのような態様では、前記エピトープは、Ｌｅｕ-８、Ｔｈｒ-９、Ｇｌｕ-３４、Ｇｌｙ-３５、Ｉｌｅ-３６、Ｐｒｏ-３７、Ａｓｐ-３９、Ｇｌｎ-４０、Ｌｅｕ-７１、Ａｒｇ-７２、Ｌｅｕ-７３、Ａｒｇ-７４、Ｇｌｙ-７５から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む。他のこのような態様では、前記エピトープは、Ｇｌｕ-１８、Ｐｒｏ-１９、Ｓｅｒ-２０、Ａｓｐ-２１、Ｔｈｒ-５５、Ｌｅｕ-５６、Ｓｅｒ-５７、Ａｓｐ-５８、Ａｓｎ-６０、Ｉｌｅ-６１、及びＧｌｎ-６２から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基と、Ｌｅｕ-８、Ｔｈｒ-９、Ｇｌｕ-３４、Ｇｌｙ-３５、Ｉｌｅ-３６、Ｐｒｏ-３７、Ａｓｐ-３９、Ｇｌｎ-４０、Ｌｅｕ-７１、Ａｒｇ-７２、Ｌｅｕ-７３、Ａｒｇ-７４、及びＧｌｙ-７５から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む。
【００３１】
ある実施態様では、ユビキチン分子の第一アミノ酸位の第一リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第一ポリユビキチンに特異的に結合し、該抗体がユビキチン分子の第二アミノ酸位の第二リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第二ポリユビキチンに特異的に結合せず、このとき該第一および該第二のアミノ酸位が異なる、単離された抗体を提供する。本発明の抗体は多くの形態でありうる。例えば、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体でありうる。ある実施態様では、本発明の抗体はヒト抗体ではなく、例えばゼノマウスで産生された抗体ではない(例えば、国際公開第９６／３３７３５号に記載)。本発明の抗体は完全長又はその断片であってもよい(例えば、抗原結合成分を含む断片)。他の実施態様では、本発明は上記の抗体のいずれかの抗原結合断片を提供する。
【００３２】
(発明を実施するための形態)
一般的技術
特に示さない限り、本発明の実施には、当業者の技量内にある分子生物学(組換え技術を含む)、細菌学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を用いる。このような技術は、文献、例えば「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」第3版(Sambrook等, 2001)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel等編, 1987, 及び定期更新物)；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」(Mullis等編, 1994)；PCR2:A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor編(1995)); Harlow及びLane, 編 (1988 Antibodies, A Laboratory Manual; 「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988；及び「Phage Display: A Laboratory Manual」(Barbas等、2001)に十分に説明されている。
【００３３】
定義
本明細書において使用する「ユビキチン」及び「モノユビキチン」という用語は互換可能に使用され、アミノ酸６、アミノ酸２２、アミノ酸２７、アミノ酸２９、アミノ酸３３、アミノ酸４８、及び／又はアミノ酸６３に少なくとも１のリジン残基を有する７６アミノ酸タンパク質と実質的に同じ天然ヒト及び合成ユビキチンの全ての種と定義される。
本明細書において使用する「ポリユビキチン」という用語は、ユビキチンの異なる重合体連鎖のヒト及び合成クラスに含まれる天然ヒト及び合成のユビキチン重合体鎖として定義され、それらには、限定されるものではないが、Ｋ６連鎖性ポリユビキチン、Ｋ２２連鎖性ポリユビキチン、Ｋ２７連鎖性ポリユビキチン、Ｋ２９連鎖性ポリユビキチン、Ｋ３３連鎖性ポリユビキチン、Ｋ４８連鎖性ポリユビキチン及びＫ６３連鎖性ポリユビキチンが含まれる。ポリユビキチンは、どのような長さを有してもよく、少なくとも２のユビキチン部分を含む。ポリユビキチンは、元来一本鎖タンパク質として発現されるユビキチンのタンデムリピートとは区別される。
【００３４】
本明細書において使用する「Ｋ＊-連鎖性ポリユビキチン」及び「Ｌｙｓ＊連鎖性ポリユビキチン」という用語は互換可能であり、１のユビキチン部分のＣ末端と別のユビキチン部分の位置＊のリジンの間に少なくとも１のイソペプチド結合を含むポリユビキチン分子を指す。例えば、「Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン」は、「Ｌｙｓ６３-連鎖性ポリユビキチン」と互換可能に使用され、これらの用語はいずれも、分子中のユビキチン部分の一方のＣ末端と、他方のユビキチン部分の位置６３のリジンの間にイソペプチド結合を含むポリユビキチン分子を指す。
【００３５】
本明細書において使用する、第１リジン連鎖が第２リジン連鎖と「異なる」という表現は、１のユビキチン部分と別のユビキチン部分の間の第１リジン連鎖が、１のユビキチン部分と別のユビキチン部分の間の第２リジン連鎖とは異なるリジン残基（例えば、Ｋ６、Ｋ２２、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８、及び／又はＫ６３）を含むことを示唆する。
本明細書において使用する、「ユビキチン経路」という用語は、ユビキチン及び／又はポリユビキチンを含む細胞又は再構成されたインビトロ中の生化学的経路を指す。
【００３６】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。一実施態様では、タンパク質は、(１)例えばローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、一部の実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００３７】
本明細書で使用する「抗ユビキチン抗体」及び「抗モノユビキチン抗体」という用語は互換可能に使用され、ユビキチン分子に対する特異的結合能を有する抗体を指す。
本明細書で使用する「抗ポリユビキチン抗体」という用語は、ポリユビキチン分子に対する特異的結合能を有する抗体を指す。
【００３８】
本明細書で使用する「抗Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン抗体」とは、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに対する特異的結合能を有する抗体を指す。
本明細書で使用する「抗Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン抗体」とは、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに対する結合能を有する抗体を指す。
【００３９】
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」、「等価な」、又は「実質的に等価な」という句は、当業者が２つの数値(例えば、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値、抗ウイルス効果等)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
【００４０】
ここで用いる「実質的に減少」、又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
【００４１】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
【００４２】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって測定する(Chen,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかしながら、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は、好ましくは分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)��測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定される。
【００４３】
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかしながら、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は、好ましくは分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定される。
【００４４】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「組換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００４５】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル��はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００４６】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００４７】
「抗体」(Ａｂ)及び「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、一般に抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、骨髄腫では高レベルで産出される。
【００４８】
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
【００４９】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００５０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００５１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖Ｆｖ種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００５２】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００５３】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００５４】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)に概説されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された融合大分子の一部であり得る。
【００５５】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ほぼインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００５６】
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、及び多ければその殆ど又は全てを保持する。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００５７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler等、Nature, 256:495 (1975); Harlow等、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Clackson等、Nature, 352:624-628 (1991); Marks等、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu等、J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee等、J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 及びLee等、J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)）、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術（例えば、WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits等、Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann等、Year in Immunol. 7:33 (1993); 米国特許第５５４５８０７号; 同第５５４５８０６号; 同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号; 同第５６３３４２５号; 同第５６６１０１６号; Marks等、Bio.Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg等、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild等、Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照）が含まれる。
【００５８】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
【００５９】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００６０】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これら高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
カバットループ    ＡｂＭ       Chothia       接触
L1   L24-L34      L24-L34      L26-L32      L30-L36
L2   L50-L56      L50-L56      L50-L52      L46-L55
L3   L89-L97      L89-L97      L91-L96      L89-L96
H1   H31-H35B     H26-H35B     H26-H32      H30-H35B
(カバット番号付け)
H1   H31-H35      H26-H35      H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2   H50-H65      H50-H58      H53-H55      H47-H58
H3   H95-H102     H95-H102     H96-H101     H93-H101
【００６１】
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）と、ＶＨの２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等、上掲に従って番号を付した。
【００６２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語およびその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【００６３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００６４】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公報９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
【００６５】
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００６６】
「阻止(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、ほぼ又は完全に阻害する。
本明細書において使用する「アゴニスト」抗体は、対象とするポリペプチドの機能活性の少なくとも一つを模倣する抗体である。
【００６７】
「疾患」とは、本発明の抗体を用いた治療が有益である任意の状態である。これには、慢性及び急性の疾患、又は対象疾患に哺乳動物がかかりやすい病的状態を含む疾病が含まれる。ここで治療される疾患の非限定的例には、癌、筋疾患、ユビキチン経路関連遺伝的疾患、免疫性／炎症性疾患、神経障害、及びその他のユビキチン経路に関連する疾患が含まれる。
「細胞増殖不全」及び「増殖不全」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。ある実施態様では、細胞増殖不全は癌である。
【００６８】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「癌増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」という用語はここで意味するように互いに排除するものではない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌、白血病及びその他リンパ球増殖性疾患、並びに頭頸部癌の様々なタイプが含まれる。
【００６９】
「筋疾患」という用語は、筋肉を有する動物の、健常な筋肉の機能を著しく低減するような骨格筋及び／又は平滑筋の劣化又は弱化を典型的な特徴とする生理学的状態を指す又は表わす。筋疾患の例には、これらに限定されるものではないが、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アイザックス症候群、全身硬直症候群、家族性周期性四肢麻痺、ミオパチー、横紋筋融解症、筋萎縮症、及び様々なタイプの筋力低下及び筋固縮が含まれる。
【００７０】
「ユビキチン経路関連遺伝的疾患」という用語は、ユビキチン経路の異常機能を典型的な特徴とする遺伝子に基づく疾患、又は同異常機能によって起こる遺伝子に基づく疾患を指す又は表わす。ユビキチン経路関連遺伝的疾患の例には、これらに限定されるものではないが、嚢胞性繊維症、アンジェルマン症候群、及びリドル症候群が含まれる。
【００７１】
「神経障害」又は「神経疾患」という用語は、神経組織の劣化又は神経組織中の細胞間の通信の悪化を典型的特徴とする、哺乳動物の中枢及び／又は末梢神経系の疾患又は不全を指す又は表わす。神経障害の例には、これらに限定されるものではないが、神経変性疾患、例えば非限定的に、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー、（アルツハイマー病、及び核上性麻痺を含むがこれらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含むがこれらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性疾患（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮毛症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群を含むがこれらに限定されない）、認知症（ピック病、及び脊髄小脳失調症を含むがこれらに限定されない）が含まれる。
【００７２】
「炎症性疾患」及び「免疫疾患」という用語は、異常な免疫性機構及び／又は異常なサイトカインシグナル伝達により引き起こされる疾患を指す又は表わす。炎症性疾患及び免疫疾患の例には、これらに限定されるものではないが、自己免疫疾患、免疫不全症候群、及び過敏症が含まれる。ここで「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織から生じ、個体自身の組織に対する非悪性の疾病又は疾患のことである。ここでの自己免疫疾患は、悪性又は癌性の疾病又は状態、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除く。自己免疫疾病又は疾患の例には、限定されるものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)(ループス腎炎、皮膚ループスを含むがこれらに限定されない)；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レノー症候群；自己免疫甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェールゲン症候群；若年発症糖尿病；及び結核に典型的に見出されるサイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型高血圧に関連した免疫反応、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾病；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症性疾患；多臓器損傷症候群；溶血性貧血(限定されるものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血を含む)；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性疾病；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；クレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；スティフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
【００７３】
免疫不全症候群の例には、これらに限定されるものではないが、毛細血管拡張性運動失調症、白血球粘着不全症、リンパ球減少症、異常ガンマグロブリン血症、ＨＩＶ又はデルタレトロウイルス感染、分類不全型免疫不全症、重症複合免疫不全症、貪食殺菌機能障害、無ガンマグロブリン血症、ディジョージ症候群、及びウィスコット・アルドリッチ症候群が含まれる。過敏症の例には、これらに限定されるものではないが、アレルギー、喘息、皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、ヴィスラー症候群、及び血小板減少性紫斑病が含まれる。
【００７４】
ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、炎症及び／又は組織／器官の損傷の防止又は減少、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾病又は疾患の進行を遅延化させるために使用される。
【００７５】
「個体」は脊椎動物である。特定の実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これらに限定されるものではないが、家畜（例えばウシ）、スポーツ用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌ及びウマ）、霊長類、マウス及びラットが含まれる。特定の実施形態では、脊椎動物はヒトである。
治療目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家畜、並びに動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を類意味する。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００７６】
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び個体に所望する反応を引き出すための物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００７７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビロール、MARINOL（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン（HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピ��ーロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)（GEMZAR(登録商標)）；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標）；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；���ノレルビン（NAVELBINE(登録商標)）；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称）、及びＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いる治療形悪の略称）
が含まれる。
【００７８】
またこのような「化学療法剤」の定義に含まれるものには、癌の増殖を促進するホルモンの影響を調節、低減、遮断又は阻害するように働く抗ホルモン剤で、多くの場合全身性の治療の形態のものがある。それらはそれ自体がホルモンであり、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方制御（ＥＲＤ）、卵巣を抑制又は停止させる機能を有する薬剤、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、リュープロリド酢酸塩、ゴセレリン酢酸塩、ブセレリン酢酸塩及びトリプトレリン；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミド等のその他抗アンドロゲン；及び副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾールを含む。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロン酸等のビスホスホネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標）、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロン酸、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロン酸、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロン酸、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロン酸、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロン酸、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｌｆ、Ｈ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；ラパチニブditosylate（GW572016としても知られるＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）及び上記のものの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体を含む。
【００７９】
組成物とその作製方法
本発明は、ポリユビキチンに特異的に結合するが、モノユビキチンには結合しない抗体を提供する。具体的には、第１のリジン連鎖を有するポリユビキチンに対する結合能を有するが、第２の、異なるリジン連鎖を有するポリユビキチンに対する結合能を有さない抗体が提供される。
【００８０】
一態様において、本発明は、配列番号１−２５、８１−８９、１５１−１７５、２２９−２３９、２６５−２７９、３２９−３３６、３９２−４５９、５９９−６２９、６９５−７０４、７３９−７４８及び７８９−７９９のうちの少なくとも一つの配列を有するＨＶＲ−Ｈ１領域を含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号２６、９０、１７６、２４０、２８０、３３７、４６０、６３０、７０５、７４９及び８００より選択されたＨＶＲ−Ｈ１領域コンセンサス配列を含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号２７−５１、９１−９９、１７７−２０１、２４１−２５１、２８１−２９５、３３８−３４５、４６１−５２８、６３１−６６１、７０６−７１５、７５０−７５９及び８０１−８１１のうちの少なくとも１つの配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２領域抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号５２、１００、２０２、２５２、２９６、３４６、５２９、６６２、７１６、７６０及び８１２から選択されたＨＶＲ−Ｈ２領域コンセンサス配列を含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号５３−７７、１０１−１０９、２０３−２２７、２５３−２６３、２９７−３１１、３４７−３５４、５３０−５９７、６６３−６９３、７１７−７２６、７６１−７７０及び８１３−８２３のうちの少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域を含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号７８、１１０、２２８、２６４、３１２、３５５、５９８、６９４、７２７、７７１及び８２４から選択されたＨＶＲ−Ｈ３領域コンセンサス配列を含んでなる抗体を提供する。
【００８１】
一態様では、本発明は、配列番号１−２６、８１−９０、１５１−１７６、２２９−２４０、２６５−２８０、３２９−３３７、３９２−４６０、５９９−６３０、６９５−７０５、７３９−７４９及び７８９−８００の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１領域と、配列番号２７−５２、９１−１００、１７７−２０２、２４１−２５２、２８１−２９６、３３８−３４６、４６１−５２９、６３１−６６２、７０６−７１６、７５０−７６０及び８０１−８１２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２領域とを含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１−２６、８１−９０、１５１−１７６、２２９−２４０、２６５−２８０、３２９−３３７、３９２−４６０、５９９−６３０、６９５−７０５、７３９−７４９及び７８９−８００の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１領域と、配列番号５３−７８、１０１−１１０、２０３−２２８、２５３−２６４、２９７−３１２、３４７−３５５、５３０−５９８、６６３−６９４、７１７−７２７、７６１−７７１及び８１３−８２４の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域とを含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号２７−５２、９１−１００、１７７−２０２、２４１−２５２、２８１−２９６、３３８−３４６、４６１−５２９、６３１−６６２、７０６−７１６、７５０−７６０及び８０１−８１２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２領域と、配列番号５３−７８、１０１−１１０、２０３−２２８、２５３−２６４、２９７−３１２、３４７−３５５、５３０−５９８、６６３−６９４、７１７−７２７、７６１−７７１及び８１３−８２４の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域とを含んでなる抗体を提供する。
【００８２】
一態様では、本発明は、配列番号３１３−３２７、３５６−３６３、７２８−７３７及び７７２−７８１の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３領域を含んでなる抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号３２８、３６４、７３８及び７８２より選択されるＨＶＲ−Ｌ３領域コンセンサス配列を含んでなる抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号３１３−３２８、３５６−３６４、７２８−７３８及び７７２−７８２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ-Ｌ３領域を含んでなり、更に配列番号１−２６、８１−９０、１５１−１７６、２２９−２４０、２６５−２８０、３２９−３３７、３９２−４６０、５９９−６３０、６９５−７０５、７３９−７４９及び７８９−８００；配列番号２７−５２、９１−１００、１７７−２０２、２４１−２５２、２８１−２９６、３３８−３４６、４６１−５２９、６３１−６６２、７０６−７１６、７５０−７６０及び８０１−８１２；並びに配列番号５３−７８、１０１−１１０、２０３−２２８、２５３−２６４、２９７−３１２、３４７−３５５、５３０−５９８、６６３−６９４、７１７−７２７、７６１−７７１及び８１３−８２４よりそれぞれ選択される、少なくとも一つのＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２又はＨＶＲ−Ｈ３配列を含んでなる抗体を提供する。
【００８３】
一態様では、本発明は、以下の内の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又は４つ全てを含んでなる抗体を提供する：
(i) 配列番号１−２６、８１−９０、１５１−１７６、２２９−２４０、２６５−２８０、３２９−３３７、３９２−４６０、５９９−６３０、６９５−７０５、７３９−７４９及び７８９−８００の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列；
(ii) 配列番号２７−５２、９１−１００、１７７−２０２、２４１−２５２、２８１−２９６、３３８−３４６、４６１−５２９、６３１−６６２、７０６−７１６、７５０−７６０及び８０１−８１２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列；
(iii) 配列番号５３−７８、１０１−１１０、２０３−２２８、２５３−２６４、２９７−３１２、３４７−３５５、５３０−５９８、６６３−６９４、７１７−７２７、７６１−７７１及び８１３−８２４の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列；並びに
(iv) 配列番号３１３−３２８、３５６−３６４、７２８−７３８及び７７２−７８２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列。
【００８４】
一態様では、本発明は、Ｋ４８連鎖性ポリユビキチンに対し、高い親和性で特異的に結合するが、K６３連鎖性ポリユビキチンにはそれよりも実質的に小さい親和性で結合する抗体であって、以下の内の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又は４つ全てを含んでなる抗体を提供する：
(i) 配列番号１−２６、１５１−１７６、２６５−２８０、３９２−４６０及び６９５−７０５の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列；
(ii) 配列番号２７−５２、１７７−２０２、２８１−２９６、４６１−５２９及び７０６−７１６の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列；
(iii) 配列番号５３−７８、２０３−２２８、２９７−３１２、５３０−５９８及び７１７−７２７の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列；並びに
(iv) 配列番号３１３−３２８及び７２８−７３８の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列。
【００８５】
一態様では、本発明はＫ６３連鎖性ポリユビキチンに対し、高い親和性で特異的に結合するが、Ｋ４８連鎖性ポリユビキチンにはそれよりも実質的に小さい親和性で結合する抗体であって、以下の内の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又は４つ全てを含んでなる抗体を提供する：
(i) 配列番号８１−９０、２２９−２４０、３２９−３３７、５９９−６３０、７３９−７４９及び７８９−８００の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列；
(ii) 配列番号９１−１００、２４１−２５２、３３８−３４６、６３１−６６２、７５０−７６０及び８０１−８１２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列；
(iii) 配列番号１０１−１１０、２５３−２６４、３４７−３５５、６６３−６９４、７６１−７７１及び８１３−８２４の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列；
(iv) 配列番号３５６−３６４及び７７２−７８２の内の少なくとも一つの配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列。
【００８６】
図２、３、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７及び２２に示すように、配列番号１−７８、８１−１０６−１４９、１５１−３６４、３９２−７８２及び７８９−８２４のアミノ酸配列には個々のＨＶＲ（すなわちＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ３）に関して番号を付けた。後述するように、この番号付けは、カバット番号付けシステムと整合している。一実施形態において、本発明の抗体は、上記配列（ｉ）〜（ｉｖ）の内の１、２、３又は全てを含み、ＨＶＲ−Ｌ１及び／又はＨＶＲ−Ｌ２はカバット・コンセンサス配列（例えば配列番号７９（ＨＶＲ−Ｌ１）及び８０（ＨＶＲ−Ｌ２））を含む。
【００８７】
一態様では、本発明は、図２、３、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７及び２２に示すように、重鎖ＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、図１０、１１、１６及び１７に示す軽鎖ＨＶＲ配列を更に含む。
本発明の抗体の一部の実施形態は、下記の配列番号７８３に示すように、ヒト化４Ｄ５抗体（huMAb4D5-8）（HERCEPTIN（登録商標）Genentech, Inc．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）（米国特許第６４０７２１３号及びLee等、J． Mol． Biol (2004), 340(5):1073-93においても言及される）の軽鎖可変ドメインを含む。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107（配列番号７８３）（ＨＶＲ残基を下線で示す）
【００８８】
一実施形態において、huMAb4D5-8軽鎖可変ドメイン配列は、位置２８、３０、３１、５３、６６及び９１の一つ以上（それぞれ、上記に太字及び斜体で示されたＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ及びＨｉｓ）において修飾される。一実施形態において、修飾されたhuMAb4D5-8配列は、位置２８にセリン、位置３０にセリン、位置３１にセリン、位置５３にセリン、位置６６にＧｌｙ及び／又は位置９１にセリンを含む。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、下記の配列番号７８４に示される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107（配列番号７８４）（ＨＶＲ残基を下線で示す）
huMAb4D5-8に関する置換された残基は、上記に太字及び斜体で示される。
【００８９】
特定のリジン連鎖を含むポリユビキチンに対する結合活性が実質的に保持されるならば、本発明の抗体はいかなる適切なフレームワーク可変ドメイン配列をも含むことができる。例えば、一部の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含んでなる。これらの抗体の一実施形態において、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体の一部の実施形態において、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は、７８はＡである。一実施形態において、これらの抗体はhuMAb4D5-8（HERCEPTIN（登録商標）Genentech, Inc．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）（米国特許番号６４０７２１３号及び同第５８２１３３７、及びLee等、J． Mol． Biol． (2004), 340(5):1073-93においても言及される）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施形態において、これらの抗体は、ヒトкI軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。一実施形態において、これらの抗体は、列番号７９、８０、３１３−３２８、３５６−３６４、７２８−７３８及び７７２−７８の軽鎖ＨＶＲ配列配の内の少なくとも１、２又は全てを含む。一実施形態において、これらの抗体は、米国特許番号６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号に記載されているような、huMAb4D5-8の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態において、これらの抗体は、huMAb4D5-8（配列番号７８３及び７８４）（HERCEPTIN（登録商標）Genentech, Inc．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）（米国特許番号６４０７２１３及び５８２１３３７、及びLee等、J． Mol． Biol． (2004), 340(5):1073-93においても言及されている）（及びLee等）の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９０】
一実施形態において、本発明の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１１１−１２９、１３８−１４１、１４６−１４９及び８３９−８９５の内の少なくとも一つを含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列は、それぞれ、配列番号１−２６、８１−９０、１５１−１７６、２２９−２４０、２６５−２８０、３２９−３３７、３９２−４６０、５９９−６３０、６９５−７０５、７３９−７４９、及び７８９−８００；２７−５２、９１−１００、１７７−２０２、２４１−２５２、２８１−２９６、３３８−３４６、４６１−５２９、６３１−６６２、７０６−７１６、７５０−７６０及び８０１−８１２；並びに５３−７８、１０１−１１０、２０３−２２８、２５３−２６４、２９７−３１２、３４７−３５５、５３０−５９８、６６３−６９４、７１７−７２７、７６１−７７１及び８１３−８２４から選択される。一実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３０−１３３、１３４−１３７、１４２−１４５及び８９６−９０７の内の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１配列は配列番号７９であり、ＨＶＲ−Ｌ２配列は配列番号８０であり、ＨＶＲ−Ｌ３配列は配列番号３１３−３２８、３５６−３６４、７２８−７３８及び７７２−７８２の少なくとも一つより選択される。
【００９１】
一実施形態において、本発明の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１１１−１２９及び８３９−８９５の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列はそれぞれ配列番号１、２７及び５３である（クローン４８−１）。同様に、他の実施形態では、クローン４８−２から４８−１１８まで、クローン６３−１から６３−５１まで、Ｆａｂ  ａｐｕ０１からａｐｕ２４まで、Ｆａｂ  ａｐｕ２．０１からａｐｕ２．２０まで、及びクローンａｐｕ３．０１から３．１１までの各々の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は配列番号１１１−１２９及び８３９−８９５の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列は図２、３、８−１１、１４−１７及び２２の各クローン又はＦａｂについて特に列挙される配列である。一実施形態において、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３０−１３３及び８９６−９０７の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列は、それぞれ配列番号７９、８０及び３１３である（Ｆａｂ  ａｐｕ０１）。同様に、他の実施形態では、Ｆａｂ  ａｐｕ０１からａｐｕ２４まで、及びＦａｂ  ａｐｕ２．０１からａｐｕ２．２０までの各々の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３０−１３３及び８９６−９０７の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７９であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号８０であり、ＨＶＲ−Ｌ３配列は、図１０、１１Ｃ、１６Ｂ及び１７Ｂの各々のＦａｂについて特に列挙される配列である。
【００９２】
一実施形態において、本発明の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３８−１４１の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列はそれぞれ配列番号１、２７及び５３である（クローン４８−１）。同様に、他の実施形態では、クローン４８−２から４８−１１８まで、クローン６３−１から６３−５１まで、Ｆａｂ  ａｐｕ０１からａｐｕ２４まで、Ｆａｂ  ａｐｕ２．０１からａｐｕ２．２０まで及びクローンａｐｕ３．０１−３．１１の各々の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３８−１４１の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列は図２、３、８−１１、１４−１７及び２２の各クローン又はＦａｂについて特に列挙される配列である。一実施形態において、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３４−１３７の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号７９、８０及び３１３である（Ｆａｂ  ａｐｕ０１）。同様に、他の実施形態では、Ｆａｂ  ａｐｕ０１からａｐｕ２４まで及びＦａｂ  ａｐｕ２．０１からａｐｕ２．２０までの各々の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１３４−１３７の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７９であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号８０であり、ＨＶＲ−Ｌ３配列は、図１０、１１Ｃ、１６Ｂ及び１７Ｂの各Ｆａｂについて特に列挙される配列である。
【００９３】
一実施形態において、本発明の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１４６−１４９の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列は、それぞれ配列番号１、２７及び５３である（クローン４８−１）。同様に、他の実施形態では、クローン４８−２から４８−１１８まで、クローン６３−１から６３−５１まで、Ｆａｂ  ａｐｕ０１からａｐｕ２４まで、Ｆａｂ  ａｐｕ２．０１からａｐｕ２．２０まで及びクローンａｐｕ３．０１から３．１１までの各々の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１４６−１４９の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列は、図２、３、８−１１、１４−１７及び２２の各クローン又はＦａｂについて特に列挙される配列である。一実施形態において、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１４２−１４５の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列は、それぞれ配列番号７９、８０及び３１３である（Ｆａｂ  ａｐｕ０１）。同様に、他の実施形態では、Ｆａｂ  ａｐｕ０１からａｐｕ２４まで及びＦａｂ  ａｐｕ２．０１からａｐｕ２．２０までの各々の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は、配列番号１４２−１４５の少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号７９であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号８０であり、ＨＶＲ−Ｌ３配列は、図１０、１１Ｃ、１６Ｂ及び１７Ｂの各Ｆａｂについて特に列挙される配列である。
【００９４】
一実施形態において、本発明の抗体は、所望の標的結合親和性を得るために親和成熟抗体である。一実施形態において、高い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１アミノ酸位置２９、３０、３３及び３４に置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ２アミノ酸位置５２及び５２ａに置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ３アミノ酸位置９９、１００、１００ａ及び１００ｂに置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ３アミノ酸位置９５−１００、１００ａ及び１００ｂに置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ３アミノ酸位置９１及び９６に置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１アミノ酸位置２９−３４に置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ２アミノ酸位置５０、５２、５２ａ、５３−５６及び５８に置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ３アミノ酸位置９５−１００、１００ａ、１００ｂ及び１００ｃに置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｌ３アミノ酸位９１−９５、９５ａ及び９５ｂに置換を含む。
【００９５】
別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１アミノ酸位置２９−３４に置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ２アミノ酸位置５０、５２、５４、５６及び５８に置換を含む。別の実施例では、高い親和性でＫ６３連鎖性ポリユビキチンと特異的に結合するが、それよりも実質的に低い親和性でＫ４８連鎖性ポリユビキチンと結合する本発明の親和成熟抗体は、ＨＶＲ−Ｈ３アミノ酸位置９５−１００、１００ａ、１００ｂ及び１００ｃに置換を含む。
【００９６】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２６５、２８１及び２９７の配列を含む重鎖可変ドメインを含んでなる。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７９、８０及び３１３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２６５、２８１及び２９７の配列を含む重鎖可変ドメインと、更に、配列番号７９、８０及び３１３の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含んでなる。他の実施形態において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図２、３、８、９、１０、１１、１４−１７及び２２に記載の、該当するクローン番号のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変ドメインを含んでなる。他の実施形態において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、配列番号７９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｌ２配列、及び図１０、１１、１６及び１７に記載の当該クローン番号のＨＶＲ−Ｌ３配列を含んでなる。他の実施形態において、特定のクローン番号に対応する本発明の抗体は、図２、３、８、９、１０、１１、１４−１７及び２２に記載の、該当するクローン番号のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変ドメインと、更に配列番号７９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｌ２配列、及び図１０、１１、１６及び１７に記載の当該クローン番号のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００９７】
一態様では、本発明は、ポリユビキチンに対する結合について上述の抗体のいずれかと競合する抗体を提供する。一態様では、本発明は、上述の抗体のいずれかと同じポリユビキチン上の抗原決定基に結合する抗体を提供する。
本願明細書において示されるように、本発明の抗体は、特定のリジン連鎖を有する単離されたポリユビキチンと特異的に結合する。本願明細書において示されるように、そのポリユビキチンを異種タンパク質に付着させるとき、本発明の抗体も特定のリジン連鎖を有するポリユビキチンと特異的に結合する（例えば実施例３及び４を参照）。
【００９８】
少なくとも一つの抗ポリユビキチン抗体、又は抗ポリユビキチン抗体をコードする配列を含む少なくとも一つのポリヌクレオチドを含んでなる組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、医薬品組成物とすることができる。本明細書で使用する場合、組成物は、一つ以上のポリユビキチンと結合する一つ以上の抗体か、又は一つ以上のポリユビキチンと結合する一つ以上の抗体をコードする配列を含む一つ以上のポリヌクレオチドを含んでなる。これらの組成物は、公知の適切な担体、例えばバッファーを含む製薬的に許容可能な賦形剤等を更に含むことができる。
単離された抗体及びポリヌクレオチドも提供される。特定の実施形態では、単離された抗体及びポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
【００９９】
一実施形態において、抗ポリユビキチン抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ポリユビキチン抗体の断片（例えばFab、Fab'−SH及びF（ab'）2断片）が提供される。これらの抗体断片は、酵素消化等の従来の手段によって作成することができるか又は組換え体技術によって生成することができる。このような抗体断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体でもよい。これらの断片は、後述する診断及び治療目的に有用である。
【０１００】
ファージディスプレイライブラリを用いた抗ポリユビキチン抗体の生成
対象とする抗体が得られるファージディスプレイライブラリを生成するための様々な方法が従来技術に既知である。対象とする抗体の一生成法では、Lee等、J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載されているファージ抗体ライブラリを使用する。
本発明の抗ポリユビキチン抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて同定することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収／溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗ポリユビキチン抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのFv配列、及びKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いての全長抗ポリユビキチン抗体クローンの構築によって得ることができる。
【０１０１】
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変(V)領域である軽(VL)及び重(VH)鎖で形成され、その双方には、３つの超可変ループ又は相補鎖決定領域(CDRs)が存在する。可変ドメインは、Winterら，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、VH及びVLが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Fv(scFv)断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているFab断片のいずれかとしてファージ上に機能的に表示することができる。ここで用いられているように、scFvコード化ファージクローン、及びFabコード化ファージクローンは、総称して「Fvファージクローン」又は「Fvクローン」と呼ぶ。
【０１０２】
VH及びVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって分離してクローンし、ファージライブラリにおいてランダムに組み換えられることが可能であり、それは、Winterら，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することが可能である。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして、Griffithsら，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のようにどんな免疫化もせずに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一のソースを提供することが可能である。最終的には、天然ライブラリは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、及びランダム配列を有するPCRプライマーを利用して高度可変CDR3領域をコードし、インビトロでの再配列を完成させることによって合成的に作製することができる。
【０１０３】
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質pIIIへの融合によって、抗体断片を表示するのに用いられる。この抗体断片は、一本鎖Fv断片として表示することが可能であり、そのVH及びVLドメインは、例えば、Marksら，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のような、又は、例えば、Hoogenboomら，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、１つの鎖はpIIIと融合し、もう一方の鎖は、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上に表示されるようになるFabコートタンパク質構造のアセンブリがある細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるFab断片のように、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている。
【０１０４】
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗ポリユビキチンクローンに有利になるように偏ったライブラリが望ましい場合には、検体をポリユビキチンで免疫化して抗体応答を生成させ、そして、脾臓細胞及び／又は循環B細胞又は他の末梢血リンパ球(PBL)を、ライブラリ構築のために回収する。一実施態様では、ポリユビキチン免疫化により、ポリユビキチンに対するヒト抗体を産生するB細胞が生じるように、抗ヒトポリユビキチンクローンに好ましいヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(及び、機能的な内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおける抗ヒトポリユビキチン抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下の（ＩＩＩ）（ｂ）の章に記載する。
【０１０５】
抗ポリユビキチン反応細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を利用してポリユビキチン特異的膜結合抗体を発現するB細胞を単離すること、例えば、ポリユビキチンアフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識ポリユビキチンへの細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器(FACS)によって得ることができる。
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び／又はB細胞又は他のPBLの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、ポリユビキチンが免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を被検体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０１０６】
抗体可変遺伝子セグメント(VH及びVLセグメントを含む)をコードする核酸を、興味の対象の細胞から回収して増幅した。再配列したVH及びVL遺伝子ライブラリの場合では、その所望するDNAは、Orlandiら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムDNA又はmRNAを単離し、再配列したVH及びVL遺伝子の5'及び3'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なV遺伝子レパートリーを作製することができる。このV遺伝子は、Orlandiら, (1989)及びWardら，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Vドメインをコードするエクソンの5'末端のバックプライマーとJセグメントに基づいた前方向プライマーにより、cDNA及びゲノムDNAから増幅することが可能である。しかしながら、cDNAからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jonesら，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastryら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandiら(1989)又はSastryら(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。特定の実施形態では、例えば、Marksら，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrumら，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在するすべての入手可能なVH及びVL配列を増幅するために、各V遺伝子ファミリーを標的にしたPCRプライマーを用いて、そのライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅DNAのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandiら(1989)に記載のように、又はClacksonら，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによるさらなるPCR増幅によって、PCRプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
【０１０７】
合成的に再配列したV遺伝子のレパートリーは、V遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトVH遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定(Tomlinsonら, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、そしてマッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(H1及びH2ループのすべての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのH3ループをコードするPCRプライマーによる多様なVH遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。VHレパートリーは、また、Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いH3ループに焦点を合わせたすべての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトVκ及びVλセグメントはクローニング及び配列決定がなされ(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。VH及びVLフォールドの範囲及びL3及びH3の長さに基づく合成的V遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。DNAをコードするV遺伝子の増幅に続いて、生殖系のV遺伝子セグメントは、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
【０１０８】
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でVH及びVL遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefeら, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouseら, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組み換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のFabフラグメントが利用される。ナイーブのVH及びVLレパートリーは、１つはファージミドへ、そして他はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリの大きさが、存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、VH及びVL遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組み換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリは、良好な親和性(約１０-8MのKｄ-1)の多くの多様な抗体を提供する。
【０１０９】
別法として、このレパートリーは、例えばBarbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように、同じベクターへ連続してクローニングするか、又は、Claksonら, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにPCR後に、クローニングすることでアセンブリすることができる。PCRアセンブリは、また、柔軟なペプチドスペーサーをコードしているDNAとVH及びVL DNAを連結させて、単鎖のFv(scFv)レパートリーを形成することに利用することができる。さらに他の技術では、「細胞内でのPCRアセンブリ」は、Embletonら, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、PCRによってリンパ球内のVH及びVL遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
ライブラリのスクリーニングは、いずれかの既知の技術によって行うことができる。例えば、ポリユビキチンを使用して、吸着プレートの壁をコーティングし、吸着プレートに固定した宿主細胞上に発現させることができるか、細胞選別に使用することができるか、ビオチンにコンジュゲートさせて、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズにて捕捉することができるか、又はファージディスプレイライブラリをパニングするための何れかの既知の方法に使用することができる。
【０１１０】
ファージライブラリサンプルを、少なくとも一部のファージ粒子を吸収剤と結合させるのに適した条件下で、固定化したポリユビキチンに接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度等を含むこの条件は、生理的条件に近似するように選択される。固体ファージに結合させるファージを洗浄し、次いで、Barbas等、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載のように酸により、Marks等、J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載のようにアルカリにより、或いは、例えばClackson等、Nature, 352: 624-628 (1991)の抗原競合法に類似の手順での、ポリユビキチン抗原競合により、溶出する。ファージは、単一回の選択で２０〜１，０００倍に濃縮することができる。更に、濃縮ファージを細菌培養で増殖させ、更なる選択回を行うことができる。
選択の効率は、洗浄の間の解離の動力学、及び単一のファージ上の多数の抗体断片が同時に抗原と結合できるかどうかを含む、多数の要因によって決まる。短時間の洗浄、多価のファージディスプレイ、及び固体相の抗原の高いコーティング密度により、速い解離動態（及び弱い結合親和性）を有する抗体を保持することができる。密度が高いことは、多価の相互作用によりファージを安定させるだけでなく、解離したファージの再結合に有利である。遅い解離動態（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択を、長時間の洗浄及びBass等、Proteins, 8: 309-314 (1990)及びWO 92/09690に記載のような単価ファージディスプレイ、並びにMarks等Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載のような抗原の低いコーティング密度によって促進することができる。
【０１１１】
ポリユビキチンのために、異なる親和性のファージ抗体間で選択を行うことが、親和性の差異がわずかであっても、可能である。しかしながら、選択された抗体をランダムに変異させることにより（例えば、上記親和性成熟技術の一部において行われるように）、多数の変異が生じ、大部分が抗原に結合し、且つ少数に親和性の向上が生じると思われる。ポリユビキチンが制限されている場合、珍しい高親和性ファージを計算することができた。親和性の高い変異体全てを保持するため、過剰ビオチン標識したポリユビキチンであるが、ポリユビキチンの標的モル親和性定数より低いモル濃度でビオチン標識したポリユビキチンを用いてファージをインキュベートすることができる。次いで、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズで高親和性結合ファージを捕捉することができる。このような「平衡捕捉」により、結合の親和性に従って抗体を選択することができ、その際の感受性は、親和性の低い、過剰なファージの２倍に過ぎない親和性を有する変異クローンを単離可能なものである。固体相に結合したファージの洗浄に使用する条件を操作して、解離動態に基づく識別を行なうこともできる。
【０１１２】
抗ポリユビキチンクローンは、活性により選択することもできる。一実施形態では、本発明はポリユビキチンリガンドとポリユビキチンとの結合を遮断するが、ポリユビキチンリガンドと第２のタンパク質との結合を遮断しない抗ポリユビキチン抗体を提供する。そのような抗ポリユビキチン抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上記Ｂ（Ｉ）（２）に記載のように、ファージライブラリから抗ポリユビキチンクローンを単離し、場合によって、単離されたファージクローンの集団を、当該集団を適切な細菌宿主中で増殖させることにより増幅すること、（２）それぞれ、所望の遮断活性及び非遮断活性を有する、ポリユビキチン及び第２タンパク質を選択すること、（３）抗ポリユビキチンファージクローンを吸収してポリユビキチンを固定すること、（４）過剰な第２タンパク質を使用して、第２タンパク質の結合決定基と重複するか、同決定基と共有されるポリユビキチン結合決定基を認識するすべての望ましくないクローンを溶出すること、及び（５）（４）の後に吸収されたままのクローンを溶出することにより、選択することができる。場合によって、所望の遮断／非遮断特性を有するクローンを、本明細書に開示される選択手順を１回以上繰り返すことにより、更に濃縮することができる。
【０１１３】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順により容易に単離及び配列決定することができる（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡテンプレートから対象の重鎖及び軽鎖コード化領域を特異的に増幅させるように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより）。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに配置し、次いで当該ベクターを、大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は他の場合には免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞等の宿主細胞に形質移入し、よって組換え宿主細胞中に所望のモノクローナル抗体の合成を得る。抗体コード化ＤＮＡの細菌における組換え発現に関する参考文献には、Skerra等、Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)が含まれる。
本発明のＤＮＡコード化Ｆｖクローンを、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列をKabat等、上掲から得ることができる）と組み合わせ、完全長又は部分長の重鎖及び軽鎖を形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用できること、及びそのような定常領域は任意のヒト又は動物の種から採取できることを理解されたい。「ハイブリッド」の完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード化配列を形成するために、一の動物（例えばヒト）の種の可変ドメインＤＮＡから採取し、次いで別の動物種の定常ドメインＤＮＡに融合させるＦｖクローンは、本明細書で使用する「キメラ」抗体及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡ由来のＦｖクローンをヒトの定常領域ＤＮＡに融合させ、全ヒトの完全長又は部分長重鎖及び／又は軽鎖のコード化配列を形成する。
【０１１４】
ナイーブのライブラリ(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中度の親和性(約１０６〜１０７M-1のKd-1)である可能性があるが、Winterら(1994), 上掲に記載のように第二番目のライブラリから構築して遊離することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkinsら, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGramら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leungら, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、１つ又はそれより多いCDRをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のFvクローンにおいて、対象のCDRまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるPCRを利用して、そしてより高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟をおこなうことが可能である。国際公開9607754(1996年3月14日に公開)は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marksら, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化供与体から得られた天然で発生するVドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたVH又はVLドメインを組み換えること、及び数回のチェーン・シャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０-9Mの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１１５】
抗ポリユビキチン抗体を生成する他の方法
更に、抗体を生成して親和性を評価する他の方法が従来技術に既知であり、例えばKohler等、Nature 256: 495 (1975)；米国特許第４８１６５６７号；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986；Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987；Munson等、Anal. Biochem., 107:220 (1980)；Engels等、Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)；Abrahmsen等、EMBO J., 4: 3901 (1985)；Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)；Morrison等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)に記載されている。
【０１１６】
概略的方法
概して、本発明は、一以上のポリユビキチン活性の部分的又は全体的遮断が所望されるポリユビキチン媒介性障害の治療に有用な抗ポリユビキチン抗体を提供する。一実施態様では、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、癌の治療に使用される。別の実施態様では、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体は、上記のような筋疾患の治療に使用される。別の実施態様では、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体は、上記のような神経障害の治療に使用される。別の実施形態では、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、遺伝的疾患の治療に使用される。別の実施形態では、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体は、免疫異常／炎症性疾患の治療に使用される。
本発明の抗ポリユビキチン抗体の独特の特性は、わずらわしい過度の遺伝子操作又は質量分析等の生物物理学的方法を実施することなく、ポリユビキチンの異なるリジン連鎖形態を区別するのに特に有用である。本発明の抗ポリユビキチン抗体は、インビトロ及びインビボの両方において特定のリジン連鎖性ポリユビキチンの機能及び活性を特徴付けるために使用することができる。本発明の抗ポリユビキチン抗体は、疾病の進行及び病因における特定のリジン連鎖性ポリユビキチンの役割を決定するのにも使用することができる。更に、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、一以上の特定のリジン連鎖性ポリユビキチンが、抗ポリユビキチン抗体が特異的でないポリユビキチンの正常な活性に干渉することなく、異常制御されるか又は異常に機能する疾病の治療に使用することができる。
【０１１７】
別の態様では、本発明の抗ポリユビキチン抗体を、特定のリジン連鎖性のポリユビキチンの検出及び単離を行うため、例えば、細胞集団、及び所定の一細胞における、ポリユビキチンの密度及び分布の決定、並びにポリユビキチンの存在又は量に基づく細胞選別を含む、様々な細胞種類及び組織におけるポリユビキチン発現の検出を行うための試薬として使用できる。
また別の態様では、本抗ポリユビキチン抗体は、本発明の課題の抗体と類似の遮断活性パターンを有するポリユビキチンアンタゴニストの開発に有用である。例えば、本発明の抗Ｋ４８連鎖性ポリユビキチン抗体を使用して、同じＫ４８連鎖性ポリユビキチンの結合特性及び／又はＫ４８連鎖性ポリユビキチン媒介経路遮断能を有するほかの抗体を決定及び同定することができる。同様に、本発明の抗Ｋ６３連鎖性ポリユビキチン抗体を使用して、同じＫ６３連鎖性ポリユビキチンの結合特性及び／又はＫ６３連鎖性ポリユビキチン媒介経路の遮断能を有するほかの抗体を決定及び同定することができる。
【０１１８】
更なる実施例として、本発明の抗ポリユビキチン抗体を使用して、線形及び立体エピトープを含め、ここに例証する抗体とほぼ同じポリユビキチンの抗原決定基(一又は複数)に結合する他の抗ポリユビキチン抗体を同定することができる。
本発明の抗ポリユビキチン抗体を、ポリユビキチンを用いる生理学的経路に基づくアッセイに使用することにより、一以上の特定のリジン連鎖を有するポリユビキチンに対する一以上の結合パターンでの結合の遮断に同様の製薬的効果を示す、そのような一以上のリジン連鎖を有するポリユビキチンの小分子アンタゴニストをスクリーニングすることができる。例えば、Ｋ４８連鎖性ポリユビキチンが、標的とする特定のタンパク質のプロテアソーム分解に関与していることが知られている（例えば、Chau等、Science 243: 1576-1583 (1989); Finley et等、Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick等、Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004)参照）ことから、抗Ｋ４８連鎖性ポリユビキチン抗体は、候補となる一以上の小分子アンタゴニストの活性を、当該経路における抗Ｋ４８連鎖性ポリユビキチン抗体の活性と比較することにより、Ｋ４８連鎖性ポリユビキチン媒介性標的プロテアソーム分解の小分子アンタゴニストを同定するためのスクリーニングに使用することができる。同様に、別の実施例では、Ｋ６３連鎖性ポリユビキチンがＤＮＡ修復に関与することが知られている（例えば、Pickart及びFushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004)参照）ことから、ＤＮＡ修復経路をアンタゴナイズする抗Ｋ６３連鎖性ポリユビキチン抗体の活性を、同じＤＮＡ修復経路におけるＫ６３連鎖性ポリユビキチンの一以上の候補小分子アンタゴニストの活性と比較することができる。同様に、別の実施例では、Ｋ６３連鎖性ポリユビキチンはパーキンソン病のレビー小体の形成に関与していることが知られている（例えば、Lim et等、J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)参照）ことから、抗Ｋ６３連鎖性ポリユビキチン抗体の、レビー小体の形成をアンタゴナイズする活性を、レビー小体の形成のアンタゴナイズにおける、Ｋ６３連鎖性ポリユビキチンの一以上の候補となる小分子アンタゴニストの活性と比較することができる。
【０１１９】
候補抗体の生成は、ハイブリドーマ技術、及び結合分子のファージディスプレイライブラリのスクリーニング等の、本明細書に記載の技術を含め、当技術分野において常套的な技術を用いて達成することができる。これらの方法は従来技術において確立されている。
簡潔に説明すると、本発明の抗ポリユビキチン抗体は、一又は複数の所望の活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原に吸収され、それによってライブラリーの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンを抗原から溶出することができ、抗原吸収／溶出のサイクルを繰り返すことによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗ポリユビキチン抗体は、対象のファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて対象のファージクローン由来のFv配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いて完全長抗ポリユビキチン抗体クローンを構築することにより、得ることができる。国際公開第０３／１０２１５７号パンフレット及びその引用文献も参照されたい。
【０１２０】
一実施態様では、本発明の抗ポリユビキチン抗体はモノクローナルである。また、ここに提供される抗ポリユビキチン抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ及びＦ(ａｂ')２断片、並びにそれらの変形形態も本発明の範囲に含まれる。これらの抗体断片は、酵素消化等の常套的な手段により作製することができるか、又は組換え技術により生成することができる。このような抗体断片は、キメラ、ヒト又はヒト化とすることができる。これらの断片は、本明細書に定める実験、診断及び治療の目的に有用である。
モノクローナル抗体は、ほぼ同種の抗体の集団から得ることができる。つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量だけ存在する可能性のある天然に発生する突然変異を別にすれば同一である。従って、形容詞「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。
本発明の抗ポリユビキチンモノクローナル抗体は、Kohler等、Nature, 256:495 (1975)によって最初に開示されたハイブリドーマ法を含む、従来技術に既知の様々な方法を用いて作製することができるか、或いは組換えＤＮＡ法によって作製することができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号)。
【０１２１】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。宿主細胞は、限定するものではないが、原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞を含む。この目的のために、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの定常領域を含め、いずれかのアイソタイプの定常領域を使用することができ、そのような定常領域は何らかのヒト又は動物種から採取することができる。
【０１２２】
原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
【０１２３】
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモーターを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
【０１２４】
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモーター-シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモーターを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１２５】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０１２６】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本発明の抗体は、発現されるポリペプチド成分の量的な比を変更することにより、分泌されて適切に集合体化(アセンブル)された本発明の抗体の産出を最大化することができる発現系を用いても生成することができる。このような変更は、少なくとも部分的にはポリペプチド成分の翻訳強度を同時に変更することにより行われる。
【０１２７】
翻訳の強度を変更するための一つの技術は、Simmons等による米国特許第５８４０５２３号に開示されている。この方法は、シストロン内の翻訳開始領域(ＴＩＲ)の変異体を利用する。任意のＴＩＲについて、一連のアミノ酸又は核酸配列変異体を一定の範囲の翻訳強度を有するように作成することができ、これにより特定の鎖に所望の発現レベルが得られるようにこの因子を調節する便利な手段が提供される。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を変更しうるコドンの変化を起こす常套的な変異原性技術により生成することができる。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列における変化はサイレントである。ＴＩＲにおける変更は、例えば、シャイン・ダルガノ配列の数又はスペーシングの変更、並びにシグナル配列の変更を含みうる。変異シグナル配列を生成するための一つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変更しない(つまり、変化がサイレントである)コード化配列の始めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変更することにより達成することができる。加えて、いくつかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンは、１番目及び２番目の位置を複数有しており、これによって前記バンクの作製が複雑になり得る。変異原性の方法は、Yansura等(1992)METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
【０１２８】
一実施形態では、含有される各シストロンについて一定の範囲のＴＩＲ強度を有する一組のベクターを生成する。この限定された組により、各鎖の発現レベル、及び種々のＴＩＲ強度の組み合わせにおける所望の抗体産物の産出を比較することができる。ＴＩＲ強度は、Simmons等による米国特許第５８４０５２３号に詳細に記載されているレセプター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度の比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲを選択し、本発明の発現ベクターコンストラクトと組み合わせる。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第５６３９６３５号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１２９】
抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【０１３０】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、限定するものではないが、約２０℃から約３９℃、約２５℃から約３７℃の範囲、及び約３０℃を含む温度範囲で増殖が起こる。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは約６．８から約７．４、又は約７．０とすることができる。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモーターが用いられる場合、プロモーターの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモーターが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。一実施態様では、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
【０１３１】
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一態様では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、例えば約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(一般的炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【０１３２】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【０１３３】
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【０１３４】
抗体精製
一実施態様では、ここで生成される抗体タンパク質を更に精製することにより、更なるアッセイ及び使用のためにほぼ同種の調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark 等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、或いは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムとすることができる。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着をできるだけ防ぐように、グリセロールなどの試薬でコートされる。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させることができる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０１３５】
真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター及び転写終末因子。
【０１３６】
(i) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。通常選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
【０１３７】
(ii) 複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
【０１３８】
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１３９】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、例えば、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞 (例として、ATCC CRL-9096)を含む。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１４０】
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常、宿主生物体によって認識され、対象のポリペプチドをコードする核酸(例えば抗体)に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、或いは熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節されうる。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下におけるマウス細胞内のヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するReyes等、Nature 297:598-601 (1982)も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１４１】
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強され得る。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、通常プロモーターから５'位に位置している。
【０１４２】
(vi) 転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１４３】
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファーローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１４４】
(viii) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ),(Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),Ｓｉｇｍａ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４５】
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１４６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティークロマトグラフィーは一般に許容可能な精製技術である。プロテインＡ等のアフィニティー試薬の適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液を、例えばｐＨ約２．５−４．５、一般的には低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィーにより、必要な精製ステップを更に行う。
一般に、研究、試験及び臨床用に使用される抗体を調製するための技術及び方法は従来技術において既に確立されており、上記と合致している及び／又は対象とする特定の抗体について当業者により適切とみなされることに注意されたい。
【０１４７】
活性アッセイ
本発明の抗体は、従来技術に既知の様々なアッセイにより、その物理的／化学的特性及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された抗体は、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含むがこれらに限定されない一連のアッセイにより、更に特徴付けることができる。
必要に応じて、抗体の生物学的活性が分析される。一部の実施態様では、本発明の抗体の抗原結合活性について試験する。従来技術に既知の、本発明に使用可能な抗原結合アッセイには、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイ等のあらゆる直接的又は競合的結合アッセイを含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
一実施態様では、本発明は、全てではないが幾つかのエフェクター機能を有する変更された抗体を考慮し、この抗体は、抗体のインビボ半減期が重要であり、更に特定のエフェクター機能(補体又はＡＤＣＣなど)が不要又は有害である多くの用途の好ましい候補となる。特定の実施態様では、抗体のＦｃ活性を測定して、所望の特性だけが維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している(すなわちＡＤＣＣ活性を欠損していると思われる)が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを仲介する第一細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現し、その一方で単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの一例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes 等のPNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいてインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等、J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【０１４９】
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開93/16185；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【０１５０】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を含む。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が従来技術に既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「重要な」残基と呼ばれ、一般に「重要な」可変ドメインに由来する。ヒト化は、基本的にヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature, 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基が、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１５１】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖いずれも、抗原性を減らすために重要である。いわゆる「最良に適合する(ベストフィット)」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Sims等(1993)J. Immunol. 151:2296; Chothia等(1987)J. Mol. Biol. 196:901)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta等(1993)J. Immunol., 151:2623)。
更には、抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが一般に好ましい。この目的を達成するために、一方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当技術分野の当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の、有望な三次元立体配置的構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンの、その抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このように、レシピエント及び重要な配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的とする抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原の結合に対する影響に、直接的に且つ最も有意に関わっている。
【０１５２】
ヒト抗体
本発明のヒト抗ポリユビキチン抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ポリユビキチン抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
【０１５３】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性および特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（1993年4月1日公開のPCT特許出願WO 93/06213を参照）。伝統的なCDR移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のFR又はCDR残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０１５４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト抗体ないしヒト化抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の一つは特定のリジン連鎖を含むポリユビキチンに対するものであり、他は他の任意の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの異なるリジン連鎖を含む２つの異なるポリユビキチンに結合しうる。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１５５】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組み換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が1993年5月13日に公開の国際公報93/08829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なる実施形態によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は、例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。特定の実施形態では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１５６】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１５７】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報91/00360、国際公報92/00373及び欧州特許第03089号)等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１５８】
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合するだけでなく、ヒト胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１５９】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１６０】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。二量化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。一実施形態では、多価抗体は、例えば、３ないし８、又は４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(例えば２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、少なくとも２つ(例えば４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有することができる。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０１６１】
抗体変異体
一部の実施態様では、ここで記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトに達するまでなされるが、その最終コンストラクトは所望の特徴を有する。アミノ酸変化は、配列を作製する時点で対象とする抗体のアミノ酸配列に導入してもよい。
突然変異のための好ましい位置にある抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg、asp、his、lys及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(例えばアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１６２】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つ抗体又は細胞障害ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドの抗体のＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Ａに示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表Ａに「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【０１６３】
表Ａ
2009519716.tif 000003
【０１６４】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
(１)無極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(２)無電荷極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(３)酸性：Asp (D), Glu (E)
(４)塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(２)中性の親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(３)酸性：Asp、Glu；
(４)塩基性：His、Lys、Arg；
(５)鎖配向に影響する残基：Gly、Pro； 及び
(６)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このような置換された残基も、保存的置換部位か、残存する(非保存的)部位に、導入することができる。
【０１６５】
一つの種類の置換による変異体は、親抗体(例えばヒト化抗体又はヒト抗体)の一以上の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる開発用に選択される結果として得られた変異体の生物学的特性は、それらが生成された親抗体と比べて変更(例えば改善)される。このような置換による変異体を生成する便利な方法では、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を使用する。簡単には、複数の高頻度可変領域部位(例えば６〜７の部位)を変異させることにより、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子III産物)の少なくとも一部への融合物として、糸状のファージ粒子から表示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるように、その生物的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、系統的変異導入法(例えばアラニンスキャニング)を行って、抗原結合に有意に貢献する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又は付加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析することにより、抗体と抗原との接触点を同定することが有効である。このような接触残基隣接残基は、従来技術に既知の技術による置換の候補であり、それにはここに説明するものが含まれる。そのような変異体が生成されたら、本明細書に記載のものを含む従来技術に既知の技術を用いて変異体パネルのスクリーニングを行い、更なる開発のために一以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を選択することができる。
【０１６６】
従来技術に既知の様々な方法により、本抗体の、アミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を調製した。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異バージョンのカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体のＦｃ領域に一以上のアミノ酸修飾を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一以上のアミノ酸位置に一のアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域)を含みうる。
本明細書及び従来技術の教示によれば、一部の実施態様では、本発明の抗体は、対応する野生型の抗体と比較した場合、例えばＦｃ領域内に、一以上の変更を有すると考えられる。それでも、これらの抗体は、その野生型の同等物と比較した場合、治療的有効性に必要なほぼ同一の特性を保持している。例えば、国際公開第９９／５１６４２号等に記載されているように、Ｆｃ領域に、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)に変化(つまり効果の改善又は低減)をもたらす特定の変更を実施することが考慮される。Ｆｃ領域の変異体の他の例に関し、Ducan及びWinterによるNature 322:738-40 (1998)；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドのインターフェースに変更を含む抗体を提供し、この場合前記変更によりヘテロ二量体化が促進及び／又は増長される。これらの変更には、第１のＦｃポリペプチドへの隆起の導入及び第２のＦｃポリペプチドへの空洞の導入を含み、前記隆起が前記空洞に配置可能であることにより、第１及び第２のＦｃポリペプチドの複合が促進される。このような変更を有する抗体の生成方法は、米国特許第５７３１１６８号に記載のように、従来技術に既知である。
【０１６７】
免疫コンジュゲート
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞障害剤にコンジュゲートした抗体を含んでなる、免疫コンジュゲート又は抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を提供する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体-薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05；Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等 (編), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許第１３９１２１３号；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１６８】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体-放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等 (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等 (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)を、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療について試験する。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ-２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療用に試験する。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等 (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１６９】
免疫コンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を本明細書中(上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害剤の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-
１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０１７０】
メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０１７１】
メイタンシノイド薬剤分子の例示的な実施態様には、以下の構造を有するＤＭ１；ＤＭ３及びＤＭ４が含まれる。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１７２】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述の非特許文献に開示されている。メイタンシノイドは、限定するものではないが、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体を含む。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号１０／９６０，６０２(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国公開特許第１０／９６０６０２号に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
【０１７３】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。カップリング剤には、限定されるものではないが、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。一実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１７４】
アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第５６６３１４９号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第０２／０８８１７２号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願の米国公開特許第１０／９８３３４０号に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
【０１７５】
例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥ及びＭＭＡＦである。それ以外の例示的実施態様には、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ、及び様々なリンカー成分(後述で更に説明)であるＡｂ-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ、Ａｂ-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ、Ａｂ-ＭＣ-ＭＭＡＥ及びＡｂ-ＭＣ-ＭＭＡＦが含まれる。
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、US 5635483; US 5780588；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願の米国公開特許第１０／９８３３４０号も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
【０１７６】
カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１７７】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【０１７８】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１７９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
【０１８０】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米国公開特許第１０／９８３３４０号を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０１８２】
例示的なリンカー構成成分の構造を以下に示す(ここで、波形の線はＡＤＣの他の構成成分への共有結合の部位を示す)：
2009519716.tif 000004
2009519716.tif 000005
2009519716.tif 000006
【０１８３】
更なる例示的なリンカー構成成分及び略号は以下のものを含む(ここで、抗体(Ａｂ)及びリンカーが示されており、ｐは１〜約８である)：
2009519716.tif 000007
2009519716.tif 000008
2009519716.tif 000009
【０１８４】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
【０１８５】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【０１８６】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１８７】
抗体(Ａｂ)-ＭＣ-ＭＭＡＥは、本明細書中に提供される何れかの抗体と以下のMC-MMAEとのコンジュゲートにより調製されうる。抗体は、ｐＨ８．０の５００ｍＭ ホウ酸ナトリウムと５００ｍＭ 塩化ナトリウムに溶解して、過剰量の１００ｍＭ ジチオトレイトール(ＤＴＴ)で処理した。３７℃で３０分インキュベートした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂で溶出することによって、バッファーを交換して、１ｍＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳにて溶出した。溶液の２８０ｎｍの吸光度とＤＴＮＢ (Aldrich, Milwaukee, WI)と反応させて４１２ｎｍの吸光度の測定によるチオール濃度から減少した抗体濃度を決定することによって、チオール／Ａｂ値を調べる。ＰＢＳに溶解した減少した抗体を氷上で冷やす。薬剤リンカー試薬であるマレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)、すなわちＭＣ-ＭＭＡＥをＤＭＳＯに溶解して、濃度がわかっているアセトニトリルと水にて希釈して、冷やした減少した抗体２Ｈ９を含むＰＢＳに添加する。およそ１時間後に、過剰量のマレイミドを添加して反応を止め、反応していない抗体チオール基を覆った。反応混合物を遠心限外濾過によって、濃縮し、２Ｈ９-ＭＣ-ＭＭＡＥを精製して、ＰＢＳのＧ２５樹脂による溶出によって、脱塩して、無菌条件下で０．２ｍｍのフィルターに濾過して、保存のために凍結した。
【０１８８】
抗体-ＭＣ-ＭＭＡＦは、Ａｂ-ＭＣ-ＭＭＡＥの調製のためのプロトコールによるＭＣ-ＭＭＡＦと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製されうる。
抗体-ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥは、Ａｂ-ＭＣ-ＭＭＡＥの調製のためのプロトコールによるＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦは、Ａｂ-ＭＣ-ＭＭＡＥの調製のためのプロトコールによるＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-ＳＭＣＣ-ＤＭ１は、以下のＳＭＣＣ-ＤＭ１と本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。精製された抗体は、(スクシンイミジル４(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、ＳＭＣＣリンカーを導入する。具体的には、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中で、７．５モル等量のＳＭＣＣ(ＤＭＳＯ中に２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍｌ)にて２０ｍｇ／ｍｌの抗体を処理した。室温のアルゴン下で２時間撹拌した後に、反応混合物を、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５にて平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。
【０１８９】
このようにして調製される抗体-ＳＭＣＣは、５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で希釈して、最終濃度およそ１０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｍＭのＤＭ１の溶液を含むジメチルアセトアミドにて反応させる。反応は、１６．５時間に亘り、室温、アルゴン下にて撹拌して行う撹拌して行う。コンジュゲート反応混合物は、ｐＨ６．５の１×ＰＢＳによるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲル濾過カラム(１．５×４．９ｃｍ)にろ過する。２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度で測定されるように、抗体に対するＤＭ１薬剤の比率(ｐ)はおよそ２〜５でありうる。
Ａｂ-ＳＰＰ-ＤＭ１は、本明細書中で提供される何れかの抗体と以下のＳＰＰ-ＤＭ１とのコンジュゲートにより調製される。精製された抗体は、ジチオピリジル基を導入するために、Ｎ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノエートによって、誘導体化される。ＮａＣｌ(５０ｍＭ)及びＥＤＴＡ(１ｍＭ)を含有する４４．７ｍｌの５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー(ｐＨ６．５)中の抗体(３７６．０ｍｇ、８ｍｇ／ｍｌ)を、ＳＰＰ(２．３ｍｌ エタノール中に５．３のモル等量)にて処理した。室温、アルゴン下にて９０分間インキュベートした後、抗応混合物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡバッファーにて平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムにろゲル濾過する。抗体含有分画をプールして、アッセイした。抗体の修飾の程度は、上記の通りに決定される。
【０１９０】
抗体-ＳＰＰ-Ｐｙ(およそ１０ｍｍｏｌの解放可能な２-チオピリジン基)を上記の３５ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５にて希釈して、およそ２．５ｍｇ／ｍｌの終濃度にした。次いで、ＤＭ１(１．７等量、１７ｍｍｏｌｅ)を含む３．０ｍＭのジメチルアセトアミド(ＤＭＡ、最終反応混合物中３％v/v)を抗体溶液に添加する。およそ２０時間、室温、アルゴン下にて反応を行う。反応物を、３５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて平衡化したセファクリルＳ３００ゲル濾過カラム(５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ)に流す。流速はおよそ５．０ｍｌ／分でよく、６５の分画(各々２０．０ｍｌ)を回収する。抗体分子当たりの結合されるＤＭ１薬剤分子の数(ｐ')は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定して決定し、抗体当たりのＤＭ１薬剤成分をおよそ２〜４としてもよい。
抗体-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１は、本明細書中に示される何れかの抗体と以下のＢＭＰＥＯ-ＤＭ１とのコンジュゲートにより調製される。抗体を、ビスマレイミド試薬ＢＭ(ＰＥＯ)４ (Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、ＢＭ(ＰＥＯ)４を５０％のエタノール／水混合液に１０ｍＭの濃度になるまで溶解して、およそ１．６ｍｇ／ｍｌ(１０マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に１０倍のモル過剰量を加え、１時間反応させて、抗体-リンカー中間生成物である２Ｈ９-ＢＭＰＥＯを形成させることにより達成される。１５０ｍＭのＮａＣｌバッファーと０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６のゲル濾過(HiTrap column, Pharmacia)によって、過剰なＢＭ(ＰＥＯ)４を取り除く。およそ１０倍のモル過剰ＤＭ１を、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解して、２Ｈ９-ＢＭＰＥＯ中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、ＰＢＳでゲル濾過ないし透析を行って反応していないＤＭ１を取り除く。ＰＢＳのＳ２００カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された２Ｈ９-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１に供給する。
【０１９１】
抗体誘導体
本発明の抗体を更に変更し、従来技術に既知で容易に入手可能な非タンパク質性成分を更に含有させる。一実施態様では、抗体の誘導体化に適した成分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１，３-ジオキソラン、ポリ-１，３，６-トリオキサン、エチレン／マレイン無水物共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムな共重合体)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水に対する適性を有しており、製造するのに有利である。ポリマーは任意の分子量を有することができ、分枝していてもしていなくともよい。抗体に付着しているポリマーの数は変動し、複数のポリマーが付着している場合、それらは同じ分子であるか、又は異なる分子である。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が決まった条件の下に治療に使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない検討材料に基づいて決定される。
別の実施形態では、放射線照射に暴露することにより選択的に加熱することができる非タンパク質性部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam等, Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)）。照射はどのような波長のものでもよく、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、非タンパク質性の部分を抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。
【０１９２】
薬学的製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osool, A. Ed. (1980))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９３】
ここでの製剤は、限定しないが、互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものを含め、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物も含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１９４】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１９５】
使用
本発明の抗体を、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法に用いてもよい。本発明の抗体をアンタゴニストとして使用し、インビトロ、エキソビボ及び／又はインビボにおいて、特定の抗原活性を部分的又は完全に遮断することができる。更に、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種由来の抗原活性を中和することができる。従って、本発明の抗体を使用することにより、抗原を含む細胞培養物、或いはヒト被験者又は本発明の抗体と交差反応する抗原を有する他の哺乳類の被験体(例えばチンバンジー、ヒヒ、マモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス)において特定の抗原活性を阻害することができる。一実施態様では、本発明の抗体は、抗体に抗原を接触させて抗原活性を阻害することにより、抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子である。
一実施態様では、本発明の抗体は、抗原活性が有害な疾患に罹患している被験体の抗原を阻害する方法に使用することができる。この方法では、本発明の抗体を被験体に投与することにより、被験体の抗原活性を阻害する。一実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子であり、被験体はヒト被験者である。或いは、被験体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現している哺乳動物とすることができる。更には、対象は、(例えば、抗原の投与によるか、又は抗原導入遺伝子の発現により)抗原が導入された哺乳動物でもよい。本発明の抗体は、治療的目的のためにヒト被験者に投与することができる。更に、獣医学的な目的のために、又はヒトの疾病の動物モデルとして、当該抗体に交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物(例えば霊長類、ブタ又はマウス)に本発明の抗体を投与することができる。動物モデルに関して言えば、このようなモデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る(例えば、投与量及び時間経過の試験)。本発明の抗体は、ポリユビキチン及びポリユビキチン化したタンパク質の異常発現及び／又は活性に関連する疾病、障害又は症状を、治療、阻害、進行を遅延、再発を予防／遅延、寛解、或いは予防に使用することができ、前記疾病、障害又は症状には、癌、筋疾患、ユビキチン経路に関連する遺伝的疾患、免疫異常／炎症性疾患、神経障害、及びその他ユビキチン経路に関連する疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９６】
一態様では、本発明の阻止抗体は、特定のリジン連鎖を有するポリユビキチンに特異的であり、特定のリジン連鎖を有するポリユビキチンと、ポリユビキチンと相互作用するタンパク質との相互作用による遮断又は妨害により、正常なポリユビキチン活性を阻害し、それによって対応するシグナル伝達経路及びその他関連分子又は細胞イベントを阻害する。
ある実施態様では、一の細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤(例えばメイタンシノイド、又はカリケアマイシン)、放射性同位元素、又はＲＮＡ分解酵素ないしＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０１９７】
本発明の抗体は、単独で、又は、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、及び／又はアジュバント／治療薬(例えばステロイド)と同時に投与してもよい。例えば、本発明の抗体は、治療計画において、例えば癌、筋疾患、ユビキチン経路に関連する遺伝的疾患、免疫異常／炎症性疾患、神経障害、及びその他ユビキチン経路に関連する疾患を含む、本明細書に記載するいずれかの疾病の治療において、抗炎症薬及び／又は消毒薬と組み合わせてもよい。上記の併用治療には、併用投与(２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される)及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療(一又は複数)の前及び／又はその後に投与することができる。
本発明の抗体(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
【０１９８】
抗体の調製及び投与において、本発明の抗体の結合標的の位置を考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合、本発明の特定の実施形態では、結合標的が位置する細胞に導入される抗体又はその抗原結合断片が提供される。一実施形態では、本発明の抗体は、細胞内に細胞内抗体として発現させることができる。本明細書で使用する「細胞内抗体(intrabody)」という用語は、Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); U.S. Patent Nos. 6,004,940 and 6,329,173; U.S. Patent Application Publication No. 2003/0104402, and PCT Publication No. WO2003/077945に記載のように、標的分子に特異的に結合することができる、細胞内で発現される抗体又はその抗原結合タンパク質を指す。細胞内抗体の細胞内発現は、標的細胞内に、所望の抗体をコードする核酸又はその抗原結合タンパク質（当該抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子に通常関連付けられる野生型リーダー配列及び分泌性シグナルを欠いている）を導入することにより達成することができる。細胞に核酸を導入するための何らかの標準的方法を使用することができ、これらの方法には、限定するものではないが、微量注入、弾道的注入、電気泳動、リン酸カルシウム沈降、リポソーム、及び対象の核酸を有するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びワクシニアベクターによる形質移入が含まれる。本発明の抗ポリユビキチン抗体の全部又は一部をコードする一以上の核酸を標的細胞に送達することにより、ポリユビキチンに細胞内で結合し、一以上のポリユビキチン媒介性細胞経路を調節できる、一以上の細胞内抗体を発現させることができる。
別の実施形態では、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の送達を増強する特定の特徴を有することができるか、又はそのような特徴を有するように修飾することができる。これを達成する技術は従来技術に既知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている（例えば、米国特許第６７０３０１９号参照）。リポフェクション又はリポソームも、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に対する結合能を有するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができる、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。例えば、Marasco等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。
【０１９９】
標的細胞への修飾因子ポリペプチドの移入は、従来技術に既知の方法によって増強することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来の配列のような特定の配列は、細胞膜全体に異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例えば、Chen等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329参照。
結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施形態は、血液脳関門を横切る抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増大に関連しており、これにより抗体又は抗原結合断片を脳に容易に導入できる。血液脳関門が完全に保持されているとき、そこに分子を搬送するための複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
【０２００】
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送する物理的方法には、限定するものではないが、血液脳関門を完全に包囲すること、又は血液脳関門に開口部を形成することが含まれる。包囲法には、限定するものではないが、脳への直接注入（例えば、Papanastassiou等、Gene Therapy 9: 398-406 (2002)）、間質性注入／対流強化送達（例えば、Bobo等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)参照）、及び脳への送達装置の移植（例えば、Gill等、Nature Med. 9: 589-595 (2003)；及びGliadel WafersTM, Guildford Pharmaceutical参照）が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定するものではないが、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８０８６号参照）、浸透圧（例えば、高浸透圧性マンニトールの投与による（Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)））、例えば、ブラジキニン又はパーミアライザーＡ−７による透過性化（例えば、米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号参照）、及び抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号）が含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体又は抗原結合断片を封入すること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２５３１３号参照）、及び低密度リポプロテイン粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０４３５４号参照）、又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３１６９２号参照）中の抗体又は抗原結合断片をコーティングすることが含まれる。
【０２０１】
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送するレセプター及びチャネルに基づく方法には、限定するものではないが、グリココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増大させること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号参照）、カリウムチャネルを活性化させること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号参照）、ＡＢＣ薬の搬送を抑制すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号参照）、抗体をトランスフェリンでコーティングし、一以上のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号参照）、及び抗体のカチオン化（例えば、米国特許第５００４６９７号参照）が含まれる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
【０２０２】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０２０３】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２０４】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示す一般的な説明により、様々な他の実施態様が実施しうることは理解される。
【実施例】
【０２０５】
実施例１：第一世代抗ポリユビキチン抗体の単離と性質決定
Ａ) ライブラリ分類
ナイーブ抗体ライブラリからのファージを、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン又はＫ６３-連鎖性ポリユビキチンを模倣するイソペプチド結合を含む固定した合成ペプチドに対して結合選別を行った。６ラウンドの選別の後に濃縮は観察されなかった。合成ペプチドを長くして、ナイーブ抗体ライブラリを再びスクリーニングした。またしても６ラウンドの結合選別の後に濃縮は観察されなかった。  
ナイーヴＹＳ-Ｂ抗体ライブラリからのファージを、異なる公知のユビキチンイソペプチド結合を有するポリユビキチン鎖に対して、４ラウンドの結合選別を行った。ＹＳ-Ｂ抗体ライブラリは、３つすべての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲ３にランダムなアミノ酸を含有し(米国公開特許第２００５-０１０６６６７号を参照)、ヒト化抗体４Ｄ５をベースとしている。
【０２０６】
酵素的に合成した３〜７ユニット長の完全長Ｋ４８-連鎖性又はＫ６３-連鎖性のポリユビキチン鎖(Boston Biochem)を、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート(NUNC)に固定した。５μｇ／ｍｌのＫ４８-連鎖性又はＫ６３-連鎖性のポリユビキチンを含む５０ｍＭ 炭酸バッファ、ｐＨ９．６にてプレートを終夜をかけてコートした。リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にてコートプレートを洗浄し、ＰＢＳにて０．２％の濃度のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)又はカゼインにて反応を止めた。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)にて２５℃でプレートを洗浄した。１００μｌの１０１２ファージ／ｍｌの分類バッファ(ＢＳＡ又はカゼイン、０．２％のＰＢＳＴ)とともに各ウェルを室温で２時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳＴにて８回洗浄して非結合ファージを除去した。結合したファージは０．１Ｍ ＨＣｌとともに１０分間インキュベートして溶出し、溶離液を２Ｍ トリス塩基にて中和した。溶出したファージを、Ｍ13-ＫＯ7ヘルパーファージ(New England Biolabs)を添加した大腸菌ＸＬ１-ブルー(Stratagene)において増やした。
前のラウンドで用いた同じ標的に対する更なる選別ラウンドに、増幅したファージを用いた。選別ラウンド２〜４では、対抗選択として分類バッファに１０μｇ／ｍｌ ユビキチンを含めた。また、ラウンド３および４は付加的な対抗選択がある場合とない場合の両方で分類した：Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン選別では１０μｇ／ｍｌ Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン又はＫ６３-連鎖性ポリユビキチン選別では１０μｇ／ｍｌ Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンのいずれか。
【０２０７】
選別ラウンド２〜４がポリユビキチン対抗選択を欠いた場合のそれらのクローンでは、個々のクローンを、カルベニシリンおよびＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージを添加した４００μｌの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて生育させた。それらの培養物の上清をハイスループットファージＥＬＩＳＡに用いて、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン、ユビキチンおよびＢＳＡに対する結合についてクローンをスクリーニングした。すべてのクローンはＤＮＡ配列分析を行った。ＨＶＲを含む一部の重鎖を配列決定し、重鎖高頻度可変領域の分析を行った。Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン又はＫ４８-連鎖性及びＫ６３-連鎖性の両方のポリユビキチンを認識するクローンの重鎖高頻度可変領域を図２Ａ-Ｃに示す。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン又はＫ４８-連鎖性及びＫ６３-連鎖性の両方のポリユビキチンを認識するクローンの重鎖高頻度可変領域を図３Ａおよび3Ｂに示す。各クローンの軽鎖ＨＶＲは配列決定しなかったが、ＹＳ-Ｂライブラリの性質に基づき、ＨＶＲ-Ｌ１及びＨＶＲ-Ｌ２の配列は不変であると予測されたのに対して、ＨＶＲ-Ｌ３配列はクローン特異的であることが予測された。ライブラリ設定に従うと、ＨＶＲ-Ｌ1配列はＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ(配列番号：７９)であり、ＨＶＲ-Ｌ２配列はＳＡＳＳＬＹＳ(配列番号：８０)である。すべてのクローンは、同じ重鎖および軽鎖フレームワーク配列を有した(図６を参照)。
選別ラウンド２〜４において、クローンの異なる一群は、１０μｇ／ｍｌの異なるリジン連鎖のポリユビキチン(Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン又はＫ６３-連鎖性ポリユビキチン)による対抗選択を含んだ。１４選別ランドから溶出したファージの１０μｌを用いて、２０分間の大腸菌ＣＪ２３６の成長に影響を与え、次いでカルベニシリンを含有する固形アガー上で終夜生育させた。カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを添加した１５ミリリットルの２ＹＴ培養液をプレートに加え、ファジミドを含有するＣＪ２３６細胞を再懸濁した。Ｍ１３-ＫＯ７ヘルパーファージを加えた。撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした後、２．５ｍｌの懸濁液をカルベニシリンおよびカナマイシンを添加した２５０ｍｌの２ＹＴ培養液に加えた。懸濁液を終夜生育させた。
【０２０８】
ファージはポリエチレングリコール沈殿にて回収し、キュンケルＤＮＡはＭ13スピンキット(Qiagen)を用いて単離した。１μｇのキュンケル鋳型を、オリゴヌクレオチドＦ１５６０-２(TCTTGTGACAAAACTCACCATCACCATCACCATCACTA GGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTT) (配列番号：１５０)によるキュンケル突然変異誘発法に用いた(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)。突然変異誘発反応物を大腸菌ＸＬ１-ブルに形質転換させ、カルベニシリンを含有する固形アガー上で終夜生育させた。次いで、個々のクローンをピックアップし、上記のように生育し、上記の通りにファージＥＬＩＳＡにおいてＫ４８-連鎖性及びＫ６３-連鎖性のポリユビキチン、モノユビキチン、ＢＳＡ、及び抗ペンタＨｉｓ抗体(Qiagen)に対してスクリーニングした。Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに特異的である、又はＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的であることが同定されたクローンをＤＮＡ配列分析した。高頻度可変領域ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３のアミノ酸配列を図８Ａ-Ｃ(Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに特異的)および図９Ａおよび９Ｂ(Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的)に示す。各クローンの軽鎖ＨＶＲは配列決定しなかったが、ＹＳ-Ｂライブラリの性質に基づき、ＨＶＲ-Ｌ１及びＨＶＲ-Ｌ２の配列は不変であると予測されたのに対して、ＨＶＲ-Ｌ３配列はクローン特異的であることが予測された。ライブラリ設定に従うと、ＨＶＲ-Ｌ１配列はＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ(配列番号：７９)であり、ＨＶＲ-Ｌ２配列はＳＡＳＳＬＹＳ(配列番号：８０)である。すべてのクローンは、同じ重鎖および軽鎖フレームワーク配列を有した(図６を参照)。
【０２０９】
(B) Ｆａｂ産生
Ｆａｂ産生のために、ペンタヒスチジンタグ陽性の特定のクローンからのファージ上清を用いて大腸菌ＦＦ３４Ｂ８に感染させた。この大腸菌ＦＦ３４Ｂ８はＸＬ１と交配させて選択固形培地にて培養することによって３４Ｂ８株にＦ’エピソームを付加した細胞株である。感染した細胞をカルベニシリンを含有する固形アガー上に塗り拡げ、終夜生育させた。ファジミドを含有するＦＦ３４Ｂ８の単一クローンをプレートからピックアップし、カルベニシリンを含有するＬＢ中で３７℃で終夜生育させた。次いで、これらの培養物を用いて５００ｍｌのカルベニシリンを含有する完全ＣＲＡＰ培地(３.５７ｇ (ＮＨ４)２ＳＯ４、０.７１ｇ クエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１.０７ｇ ＫＣｌ、５.３６ｇ 酵母抽出物(certified)、５.３６ｇ Hycase SF (Sheffield)、ＫＯＨを加えてｐＨを７．３に調整し、超純水にて８７２ｍｌに量を調節し、オートクレーブにかけ、５５℃まで冷まし、Ｌ当たり１１０ｍｌの１Ｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７.３、１１ｍｌの５０% グルコース、及び７ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４を加えた)に播き、撹拌しながら３０℃で２４時間生育した。遠心分離を行って細胞を回収し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。各細胞ペレットを０．２ｍｇ／ｍｌ ライソザイム及び０．３Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼIを含有する３５ｍｌの冷却洗浄バッファ(ＰＢＳ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ)に再懸濁してＦａｂを精製した。再懸濁した細胞ペレットを５０ｍｌの遠心チューブに移し、素早くボルテックスにかけ、２５℃に４５分置いた。ペレットを遠心分離して、溶菌液を４℃の洗浄バッファにて予め平衡化した１ｍｌのプロテインＧ-セファロースカラムに添加した。５０ｍｌの冷却洗浄バッファにてカラムを洗浄し、３ｍｌの０．１Ｍ 酢酸にて溶出し、１５０μｌの２Ｍ トリス塩基にて中和した。溶出したＦａｂをＰＢＳにバッファ交換し、Centriprep 10遠心フィルター(Millipore)を用いて濃縮した。結果として生じたＦａｂ濃度を分光光度的に決定した(１ＯＤ２８０ｎｍ＝１．５５ｍｇ／ｍｌ)。濃縮したＦａｂを４℃で保存した。
【０２１０】
各ＦａｂをＥＬＩＳＡタンパク質アッセイに含め、上記のように、Ｋ４８-連鎖性及びＫ６３-連鎖性のポリユビキチンに対する相対的な親和性を決定し、Ｆａｂがモノユビキチン又はＢＳＡと反応しないことを確認した。Ｆａｂ ａｐｕ０１−１５は、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに対するよりＫ４８-連鎖性ポリユビキチンに対してより大きな特異性を有していた。Ｆａｂ ａｐｕ１７−ａｐｕ２４は、ＥＬＩＳＡにおいてＫ４８-連鎖性ポリユビキチンに対するよりＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに対してより大きな特異性を示した。Ａｐｕ１６はＦａｂとして産生されなかった。
すべてのＦａｂをＤＮＡ配列分析した。Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合した各々のＦａｂの高頻度可変領域ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３のアミノ酸配列を図１０Ａ-Ｃに示す。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合した各々のＦａｂの高頻度可変領域ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３のアミノ酸配列を図１１Ａ-Ｃに示す。各Ｆａｂの重鎖および軽鎖フレームワーク配列を図６に示す。ライブラリ設定(上で、配列番号：７９および８０が、知る)に記載の、第一２の軽鎖高度変異部（ＨＶＲ-Ｌ１およびＨＶＲ-Ｌ２）は、各々のクローンで同一だった。
【０２１１】
(C) 単離したＦａｂの親和性分析
ユビキチンおよびそのリジン-連鎖性型に対する選択されたＦａｂ(上記のセクション(Ｂ)を参照)の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)３０００システム(Biacore)を用いた表面プラスモン共鳴で測定した。およそ１００共鳴単位のユビキチン、Ｋ４８-連鎖性ないしはＫ６３-連鎖性ジユビキチン、又はＫ４８-連鎖性ないしはＫ６３-連鎖性ポリユビキチン(鎖長３〜７)を、製造業者が提供するアミンカップリングプロトコールを用いたＣＭ５チップの異なるフローセルに固定した。各実験において、フローセル１を活性化し、タンパク質を固定せずにエタノールアミンにで反応を止め、参照、減算に用いた。ａｐｕ０１からａｐｕ２４それぞれのＦａｂタンパク質の段階希釈物(１．６−１００ｎＭ)を各フローセルに対して注入した(総量５０μｌ、流速２５μｌ／分)。各フローセルのシグナルを記録し、参照シグナルを減算した。解離期間(５分)の後、チップ表面を１３μｌの２０ｍＭ ＨＣｌにて再生した。Ｆａｂ ａｐｕ０９およびａｐｕ１８の例示的な結合曲線を図１２および１３に示す。図１２に示すように、Ａｐｕ０９はＫ４８-連鎖性ポリユビキチンに結合するが、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンには結合しない。図１３Ａは、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに対するａｐｕ１８の結合曲線を示す。いくつかの結合が観察されるが、それは実質的に、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに観察される結合よりも少ない(図１３Ｂ)。各Ｆａｂについて同様の分析を行った。
反応速度定数と結合定数は製造業者によって提供されるソフトウェアを用いた非線形回帰分析によって同時に算出し、表Ｂに示した。表Ｂの「ＮＢ」なる文字は示した相互作用に結合が検出されなかったことを示す。表Ｂの「ｎｄ」なる文字は示した相互作用にデータが測定されなかったことを示す。結果から、ジユビキチンへの結合についての特定のＦａｂの反応速度定数がポリユビキチンへの結合についてのものと非常に類似していることが示される。ゆえに、Ｆａｂは、２つのユビキチン成分間の特定のイソペプチド結合を認識するように思われる。  
【０２１２】
表Ｂ：ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析によって測定される抗ポリユビキチンＦａｂの反応速度定数
2009519716.tif 000010
＊既に得られたＫ６３-連鎖性ジユビキチン相互作用の反応速度定数を確認したＡｐｕ１８の２回目のＢｉｓｃｏｒｅ分析。 
【０２１３】
(D) ウエスタンブロット
テトラユビキチン(必要に応じてＫ４８-連鎖性又はＫ６３-連鎖性)とジユビキチン(Ｋ４８-連鎖性又はＫ６３-連鎖性)(Boston Biochem)をポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレンに電気的ブロッティングにより転移させた。０．５％ Qiagenブロッキング試薬(Qiagen)中でメンブレンを４℃で終夜インキュベートして、メンブレン上の非特異的結合部位をブロックした。ブロックしたメンブレンをminiblotter装置にお配置した。Ｆａｂクローン(１μｇ／ｍｌ)を、０．５％ Qiagenブロッキング試薬(Qiagen)中のメンブレンの連続切片にアプライした。１時間のインキュベート期間の後、メンブレンを洗浄した。メンブレンに結合した抗ユビキチン抗体を、製造業者の指示に従ってＨＲＰ-コンジュゲート抗ペンタヒスチジン抗体(Qiagen)を用いて明らかにした。
クローンａｐｕ０１からａｐｕ１５から産生されたＫ４８-連鎖性ポリユビキチン特異的Ｆａｂは、ニトロセルロースに固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに特異的に結合した(図１９Ｂを参照)。クローンａｐｕ１７からａｐｕ２４から産生されたＫ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的Ｆａｂの、ニトロセルロースメンブレン上に固定したＫ６３-連鎖性ポリユビキチンへの結合は観察されなかった(図１９Ａを参照)。  
【０２１４】
実施例２：第二世代抗ポリユビキチン抗体の単離と性質決定
Ｆａｂディスプレイの第二世代ライブラリは、予め同定されたクローンａｐｕ０５(Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン選別)およびａｐｕ１８(Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン選別)をコードするファジミドから構築した(図１０および１１を参照)。これらのクローンからのファージを用いてＣＪ２３６細胞に感染させ、キュンケルＤＮＡ鋳型を調製した。その後、それらの鋳型に停止コドンを挿入するように突然変異させ、以下のように停止含有鋳型をライブラリ構築に用いた。
【０２１５】
２つの異なるスキームに従ってＦａｂ ａｐｕ０５を突然変異させて、２つの異なるａｐｕ０５-由来のライブラリを作製した。第一ライブラリではＨＶＲ-Ｈ３のみを突然変異させた。まず、ＨＶＲ-Ｈ３をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後４つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを利用した突然変異誘発を行った。すべての場合での停止コドンコード化オリゴヌクレオチドはCGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３６５)であった。初めの３つの突然変異原性オリゴヌクレオチドは３つの順列の同じ所望の配列であり、その１チロシン残基を固定し、各々の残るチロシン残基をＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化した(このときＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＴに対応し、ＳはＧ又はＣに対応する)。位置１００ｂのアミノ酸は、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択し、位置１００ａのアミノ酸は、グリシンおよびアラニンから選択し、そして、残りのアミノ酸はソフトランダム化した。この場合のソフトランダム化は、特定のヌクレオチド位は示した塩基が占める頻度の７０％であり、他の３塩基のうちの１つが占める頻度の１０％であったことを示す。このようなソフトランダム化が特定の塩基に含まれるオリゴヌクレオチドでは、ソフトランダム化の存在は塩基の位置での数字によって示す。「５」なる数は、塩基アデニンがその位置で７０％の頻度で存在し、一方塩基グアニン、シトシン及びチミジンがそれぞれ１０％の頻度で存在することを示す。同様に、「６」なる数はグアニン、「７」はシトシン、「８」はチミジンを指し、それぞれの場合において、他の３つの塩基それぞれは１０％の頻度でしか存在しない。初めの３つの突然変異原性オリゴヌクレオチド配列は、CGTCTATTATTGTGCTCGC567TAC567NNSNNS567GSTWTSGACTA CTGGGGTCAAGG (配列番号：３６７)、CGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567TACNNS567 GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３６８)、及びCGTCTATTATTGTGCTCGC567 NNS567NNSTAC567GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３６９)であった。４つ目の突然変異原性オリゴヌクレオチドには、ＮＮＳ混合コドンセットを用いた位置９６、９８及び９９のチロシンのランダム化；位置１００ｂのアミノ酸のフェニルアラニン、メチオニン、ロイシンおよびイソロイシンからの選別；位置１００ａのアミノ酸のグリシン及びアラニンからの選別、そして上記のソフトランダム化命名法に従った、他のそれぞれの位置でのソフトランダム化を含めた。４つ目のオリゴヌクレオチドの配列はCGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567NNSNNS567GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３７０)であった。
【０２１６】
第二ａｐｕ０５ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３を突然変異させた。ＨＶＲ-Ｈ１を修飾して、位置３０及び３３のセリンをＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化した(ＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＴに対応し、ＳはＧ又はＣに対応する)；位置２９のアミノ酸は、アミノ酸フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択しそして位置３４のアミノ酸は、イソロイシンおよびメチオニンから選択した。ａｐｕ０５ＨＶＲ-Ｈ１を突然変異させるために用いたオリゴヌクレオチドは、GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (配列番号：３７１)及びGCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNSTACTCTNNSATSCACTGGGTGC GTCAGG (配列番号：３７２)であった。ＨＶＲ-Ｈ２を修飾して、位置５２をＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化し、位置５２ａのアミノ酸はプロリン及びセリンから選択した。ＨＶＲ-Ｈ２を突然変異させるために用いたオリゴヌクレオチドは、GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３７３)及びGGCCTGGAATGGGTTGCATCTATCNNSYCTTACTACTCTTACACCTCTTATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３７４)であった。ＨＶＲ-Ｈ３を修飾して、位置９９のチロシン及び位置１００のセリンをＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化し、位置１００ａのアミノ酸はグリシンおよびアラニンから選択し、そして位置１００ｂのアミノ酸はフェニルアラニン、メチオニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択した。ＨＶＲ-Ｈ３を突然変異させるために用いたオリゴヌクレオチドは、CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３６５)及びCGTCTATTATTGTGCTCGCTCTTACTCTTACNNSNNSGSTWTSGACTACTGGGGTCA AGG (配列番号：３７５)であった。ＨＶＲ-Ｌ３を修飾して、ＮＮＳ混合コドンセットに従って位置Ｓ９１をランダム化し、位置Ｉ９６はフェニルアラニン、イソロイシン及びバリンから選択した。ＨＶＲ-Ｌ３を突然変異させるために用いたオリゴヌクレオチドは、CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC (配列番号：３７６)及びCGCAACTTATTACTGTCAGCAANNSTCTTACTCTTCTCTGDTTACGTTCGGACAGGGTACC (配列番号：３７８)であった。
【０２１７】
６つの異なるａｐｕ１８-由来のライブラリは、ａｐｕ１８の６つの異なる突然変異誘発スキームによって作製した。第一ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ３のみを突然変異させた。まず、ＨＶＲ-Ｈ３をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後７つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを利用した突然変異誘発を行った。すべての場合での停止コドンコード化オリゴヌクレオチドは、CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３６６)であった。初めの６つの突然変異原性オリゴヌクレオチドは６つの順列の同じ所望の配列であり、その２つのチロシン又はトリプトファン残基を固定し、各々の残るチロシン及びトリプトファン残基をＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化した(このときＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＴに対応し、ＳはＧ又はＣに対応する)。位置１００ｃのアミノ酸はフェニルアラニン、メチオニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択し、位置１００ｂのアミノ酸はグリシンおよびアラニンから選択し、そして上記のソフトランダム化命名法に従って残りのアミノ酸はソフトランダム化した初めの６つの突然変異原性オリゴヌクレオチド配列は、CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACTAC565NNSNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３７９)、CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSNNS565TGGTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３８０)、CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACBBS565NNSTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３８１)、CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565TGGNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３８２)、CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACNNS565TGGNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３８３)、及びCGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565NNSTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３８４)であった。７つ目の突然変異原性オリゴヌクレオチドには、ＮＮＳ混合コドンセットを用いた位置９６、９７及び１００のチロシンのランダム化；位置１００ｂのアミノ酸のフェニルアラニン、メチオニン、ロイシンおよびイソロイシンからの選別；位置１００ｃのアミノ酸のフェニルアラニン、メチオニン、ロイシンおよびイソロイシンからの選別；位置１００ｂのアミノ酸のグリシン及びアラニンからの選別、そして上記のソフトランダム化命名法に従った他のそれぞれの位置でのソフトランダム化を含めた。７つ目のオリゴヌクレオチドの配列は、CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSNNS565NNSNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (配列番号：３８５)であった。
【０２１８】
第二ａｐｕ１８ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ２のみを突然変異させた。まず、ＨＶＲ-Ｈ２をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後４つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを利用した突然変異誘発法を行った。すべての場合での停止コドンコード化オリゴヌクレオチドは、GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３７３)であった。初めの３つの突然変異原性オリゴヌクレオチドは３つの順列の同じ所望の配列であり、その１チロシン残基を固定し、各々の残るチロシン残基と位置５２のセリンをＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化し(このときＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＴに対応し、ＳはＧ又はＣに対応する)、位置５２ａのアミノ酸はプロリンおよびセリンから選択し、位置５５のアミノ酸はグリシンおよびセリンから選択し、位置５１のイソロイシンと位置５７のスレオニンを固定し、そして上記のソフトランダム化命名法に従って、残りのアミノ酸をソフトランダム化した。初めの３つの突然変異原性オリゴヌクレオチド配列は、GGCCTGGAATGGGTTGCATACATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３８６), GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTTACNNSRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３８７)、及びGGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTNNSTACRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３８８)であった。４つ目の突然変異原性オリゴヌクレオチドには、ＮＮＳ混合コドンセットを用いた位置５０、５３及び５４のチロシンのランダム化；位置５２ａのアミノ酸のフェニルアラニンおよびセリンからの選別；位置５５のアミノ酸のグリシンおよびセリンからの選別；位置５１および５７それぞれのイソロイシンおよびスレオニン残基の固定；そして上記のソフトランダム化命名法に従った他のそれぞれの位置でのソフトランダム化を含めた。４つ目のオリゴヌクレオチドの配列は、GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３８９)であった。
第三ａｐｕ１８ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３を突然変異させた。第二ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ２に行った修飾と同様に、同じ４つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ２を修飾した。第一ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ３に行った修飾と同様に、同じ初めの６つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ３を修飾した。
【０２１９】
第四ａｐｕ１８ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３を突然変異させた。第一ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ３に行った修飾と同様に、同じ初めの６つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ３を修飾した。まず、ＨＶＲ-Ｈ３をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後１つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発を行った。ＨＶＲ-Ｌ３内の、位置９１及び９４のチロシンと位置９５ａのセリンをＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化し、位置９５ｂのロイシンはフェニルアラニン、イソロイシンおよびバリンから選択し、位置９２、９３及び９５のセリンは上記のソフトランダム化命名法に従ってソフトランダム化した。ＨＶＲ-Ｌ３の突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC (配列番号：３７６)及びCGCAACTTATTACTGTCAGCAANNS567567NNS567NNSCTGDTTACGTTCGGACAGGGTACC (配列番号：３９０)であった。
第五ａｐｕ１８ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ１およびＨＶＲ-Ｈ２を突然変異させた。第二ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ２に行った修飾と同様に、同じ４つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ２を修飾した。ＨＶＲ-Ｈ１は停止コドンを含むように修飾し、位置３０のセリンと位置３３のチロシンをＮＮＳ混合コドンセットを用いてランダム化し、位置２９のアミノ酸はフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択し、位置３４のアミノ酸はイソロイシン及びメチオニンから選択し、位置３１と３２のアミノ酸は、上記のソフトランダム化命名法に従ってソフトランダム化した。ＨＶＲ-Ｈ１の突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (配列番号：３７１)及びGCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNS567567NNSATSCACTGGGTGCGTCAGG (配列番号：３９１)であった。
第六ａｐｕ１８ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｌ３を突然変異した。第五ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ１に行った修飾と同様に、同じ突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ１を修飾した。第二ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ２に行った修飾と同様に、同じ４つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ２を修飾した。第四ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｌ３に行った修飾と同様に、同じ突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｌ３を修飾した。
【０２２０】
各々の２つのａｐｕ５-由来のライブラリと各々の６つのａｐｕ１８-由来のライブラリの突然変異誘発反応物を、電気穿孔法によってエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ-１に形質転換させた。細胞を、ＳＯＣ培地中で撹拌しながら３７℃で３０分間かけて回復させた。２０μｌの細胞含有ＳＯＣ培地を用意し形質転換体の数を決定し、次いで残りをカルベニシリンと１０１０／ｍｌのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する５００ｍｌの２ＹＴに移した。撹拌しながら３７℃に４５分間置いた後、培養物にカナマイシンを添加して、撹拌しながら３７℃で終夜生育させた。各ライブラリに対する形質転換体の数は１０９より多かった。ファージを回収して、遠心及びＰＥＧ沈殿により培養物から濃縮し、その後選別のラウンドに用いた。
【０２２１】
実施例１(Ａ)に記載のように、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンを異なるＭａｘｉｓｏｒｐプレート(NUNC)に固定した。分類バッファに３μＭのモノユビキチンを加えた１ラウンドでは、各ライブラリをそのそれぞれの標的(２つのａｐｕ０５-由来のライブラリではＫ４８-連鎖性ポリユビキチン、６つのａｐｕ１８-由来のライブラリではＫ６３-連鎖性ポリユビキチン)に対して別々に分類した。溶出したファージを増幅して、更なる分類ラウンドのためにプールした(２プール、１つは各々のリジン-連鎖性ポリユビキチン標的のためのもの)。
その後の選別ラウンドは溶液-段階分類とした。ファージプールを、溶液-分類バッファ(０．０５％ Superblock (Pierce)を含むＰＢＳＴ)中でビオチン化(スルホ-ＮＨＳ-ビオチン、Pierce)ポリユビキチン鎖とともに室温で１〜２時間インキュベートした。混合物を溶液-分類バッファにて５倍から１０倍に希釈し、ビオチン化ポリユビキチンを短い間(５分)捕獲するためにニュートラビジン-コートウェルに加えた。非ビオチン化ポリユビキチン鎖を含有する反応は、バックグラウンドファージ結合をモニターするためのコントロールとした。プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、０．１Ｍ ＨＣｌにて１０分間溶出した。
【０２２２】
ストリンジェンシーは３つの方法：ビオチン化ポリユビキチンの濃度によって；過剰な非ビオチン化ポリユビキチンを添加してニュートラビジン-コートウェル上に捕獲する前に結合について競合させることによって；及び、競合の継続期間によって調節した。各分類ラウンドでは、３０μｇ／ｍｌの濃度の他の結合のポリユビキチンとモノユビキチンを第一インキュベーション工程の間の分類バッファに加えた。溶液分類の第一ラウンドは、ファージと室温で１時間インキュベートした２０ｎＭのビオチン化ポリユビキチンを用いた。次いで、混合物を溶液-分類バッファにて１０倍に希釈し、ニュートラビジン-コートウェルを用いて５分間捕獲した。第二ラウンドでは、ラウンド１のようにファージを２０ｎＭのビオチン化ポリユビキチンにて平衡化したが、１５分の解離速度選別のために３０μｇ／ｍｌの非ビオチン化ポリユビキチン(Ｋ４８選別ではＫ４８-連鎖性、Ｋ６３選別ではＫ６３-連鎖性)を含む溶液-分類バッファにて１０倍に希釈し、その後ニュートラビジンコートウェル上で捕獲した。溶液分類の第三ラウンドは第２ラウンドに記載のように行ったが、さらに、５ｎＭ ビオチン化ポリユビキチンと３０分の解離速度選別を含んだ。１ラウンドのプレート分類と３ラウンドの溶液分類の後、記載のように、第二世代から選択される個々のクローンを９６ウェルフォーマットで生育させた。ファージＥＬＩＳＡにて個々のクローンをスクリーニングし、配列決定した。
溶液分類の第一ラウンドの後、ａｐｕ０５ベースのライブラリでは４０倍以下の濃縮が、ａｐｕ１８ベースのライブラリでは７倍以下の濃縮が観察された(表Ｃを参照)。第二選別の後には、Ｋ４８-特異的クローンではさらに１１倍、Ｋ６３-特異的クローンではさらに３倍濃縮された(緩慢な解離速度の場合には溶液分類)(表Ｃを参照)。３回目の選別により(親和性分類と解離速度分類)、Ｋ４８-特異的クローンでは１８倍濃縮し、Ｋ６３-特異的クローンでは４倍濃縮した(表Ｃ参照)。
【０２２３】
表Ｃ：第二世代抗ポリユビキチン抗体ライブラリ溶液分類の結果
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【０２２４】
Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合した異なるクローンが６８個同定された；これらのクローンをＤＮＡ配列分析した。これらのクローンのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を図１４Ａ-Ｆに示す。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合した異なるクローンが３１個同定された；これらのクローンもまた、配列分析を行った。これらのクローンのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を図１５Ａ-Ｃに示す。Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンの特異的クローンそれぞれの軽鎖ＨＶＲは配列決定しなかったが、ａｐｕ０５とａｐｕ１８と同様に、ＨＶＲ-Ｌ１とＨＶＲ-Ｌ２の配列は不変であることが予測され、ＨＶＲ-Ｌ３配列はクローン特異的であることが予測される。ライブラリ設定に従うと、ＨＶＲ-Ｌ１配列はＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ(配列番号：７９)であり、ＨＶＲ-Ｌ２配列はＳＡＳＳＬＹＳ(配列番号：８０)である。すべてのクローンは、同じ重鎖および軽鎖フレームワーク配列を有した(図６参照)。
実施例１に記載のように、最も大きな結合が観察された２０のクローン(１０のＫ４８-連鎖性ポリユビキチン-特異的及び１０のＫ６３-連鎖性ポリユビキチン-特異的)をＦａｂとして産生した。Ｆａｂ ａｐｕ２.０１からａｐｕ２.２０をＤＮＡ配列分析した。これらのクローンのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３配列を図１６ＡおよびＢ(Ｋ４８-特異的Ｆａｂ)および図１７ＡおよびＢ(Ｋ６３-特異的Ｆａｂ)に示す。
【０２２５】
Ｆａｂ ａｐｕ２.０１からａｐｕ２.２０をＥＬＩＳＡタンパク質アッセイに含め、Ｋ４８-連鎖性及びＫ６３-連鎖性のポリユビキチンに対する相対的な親和性を決定し、Ｆａｂがモノユビキチン又はＢＳＡと反応しないことを確認した(図１８参照)。このアッセイにおいて、Ａｐｕクローン２．１１および２．１２は、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに対して、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンに対する親和性の３００倍の親和性を示した。Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンと比較してＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに対する親和性において、Ａｐｕ２.２０および２．１６はわずかではあるが明らかに異なっていた(それぞれおよそ３０倍とおよそ１０倍)。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン又はジユビキチンへのクローンａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０の結合は検出されなかった。
既に実施例１(Ｃ)に記載のように、各ＦａｂもＢＩＡｃｏｒｅによって分析した。得られた反応速度定数と結合定数を表Ｄに示す。表Ｄの「ＮＢ」なる文字は、示した相互作用について結合が検出されなかったことを示す。  
【０２２６】
表Ｄ：ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって測定される抗ポリユビキチンＦａｂの反応速度定数
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【０２２７】
ａｐｕ０５に基づくＦａｂのいくつかはＫ４８-連鎖性ジユビキチンに対するａｐｕ０５に対応するＦａｂより低いＫｄを有し、ポリユビキチンに強い結合を示した。各々のａｐｕ２.１１−２.２０ ＦａｂはＫ６３-連鎖性ポリユビキチンだけでなく、程度は小さいがＫ４８-連鎖性ジユビキチンにも結合した。ａｐｕ２.１３のみはａｐｕ１８より低いＫｄを有していたが、Ｋ４８-連鎖性ジユビキチンに対するＫｄはａｐｕ１８のＫｄよりも大きかった。ａｐｕ２.１１、２.１２、２.１６および２.２０の各々は、Ｋ４８-連鎖性ジユビキチンに対するＫｄと、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに対するＫｄの比率がａｐｕ１８より良好であった。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに対するａｐｕ１８ベースのＦａｂの結合について観察された反応速度定数は、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンへの結合について観察されたものと類似していた。
【０２２８】
また、ニトロセルロースメンブレンに固定したポリユビキチンに特異的に結合する各Ｆａｂの能力は、既に実施例１(Ｄ)に記載のようにウェスタンブロットによって評価した。Ｋ４８及びＫ６３のいずれかの結合を含むテトラユビキチン、テトラユビキチンと逆のリジン連鎖を含むジユビキチン(例えば、Ｋ４８-連鎖性テトラユビキチンを用いる場合にはＫ６３-連鎖性ジユビキチン、又はＫ６３-連鎖性テトラユビキチンを用いる場合にはＫ４８-連鎖性ジユビキチン)、及びモノユビキチンをニトロセルロースメンブレンに固定し、Ｆａｂ ａｐｕ２.０１−２.２０を３つすべての固定した分子を認識する能力について評価した(図２０Ａ及び２０Ｂ)。モノユビキチンを特異的に認識したＦａｂはなかった。ａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０のそれぞれは固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンを特異的に認識したが、固定したＫ６３-連鎖性ジユビキチンを認識しなかった(図２０Ａ参照)。Ｋ４８-連鎖性テトラユビキチン調製物にトリユビキチン、ペンタユビキチン及びオクタユビキチン種の混合を示すブロットには様々な他の結合が見られた。ａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０は固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンを特異的に認識したが、固定したＫ４８-連鎖性ジユビキチンを認識しなかった(図２０Ｂ参照)。
【０２２９】
実施例３：内因性ポリユビキチン化タンパク質への抗ポリユビキチン抗体の結合
今までの実験によって、近位のＴＮＦレセプター１(ＴＮＦＲ１)シグナル伝達複合体の１４０ｋＤの必須メディエーターであるレセプター共役タンパク質(ＲＩＰ)の活性がポリユビキチン化によって調節されていることが示されていた(Wertz等, Nature 430: 694-699 (2004))。ＲＩＰがＫ６３-連鎖性ポリユビキチン鎖とポリユビキチン化される場合、ＴＮＦＲ1によるシグナル伝達が促される。Ａ２０のＮ末端の脱ユビキチン化によるＲＩＰからのＫ６３-連鎖性ポリユビキチン鎖の除去と、Ａ２０ Ｃ末端のユビキチンリガーゼ機能によるＫ４８-連鎖性ポリユビキチン鎖への置換により、ＲＩＰが不活性化され、プロテアソームの分解のためにそれを標的とする。このメカニズムは、Ｋ４８-連鎖性又はＫ６３-連鎖性のポリユビキチンのみを形成することができる変異ユビキチンを発現する細胞株を用いて解明された。
本発明の２つの抗Ｋ４８-連鎖性及び抗Ｋ６３-連鎖性のポリユビキチン結合タンパク質が持つ、ＴＮＦ処理後の異なる時点でＨｅＬａ Ｓ３細胞に存在するＲＩＰの異なるポリユビキチン化型を特異的に認識する能力を評価した。４リットルのおよそ１．５×１０６細胞／ｍｌのＨｅＬａ Ｓ３細胞を２１μＭ ＭＧ-１３２で処理した。処理後すぐに、主な培養物から１リットルの細胞を取り出し、遠心分離によって回収し、２００ｍｌのＰＢＳにて洗浄し、再び遠心分離した。この試料をゼロ時間点として用いた。細胞培養物の残りの３リットルは１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦで処理した。１リットルの細胞を取り出し、回収して、２００ｍｌのＰＢＳにて洗浄し、ＴＮＦによる処理後５、１５及び２５分にそれぞれ再び遠心分離した。各時点の細胞を３０ｍｌのＩＰ溶解バッファ(ＬＢ)(２０ｍＭ トリスｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ-１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５μＭ ＭＧ-１３２、１０ｍＭ ＮＥＭ、各々３０μｌの脱リン酸化酵素インヒビター混合液１及び２(Sigma)、及び完全プロテアーゼインヒビタータブレット(Roche))中で溶解し、回転させながら４℃で２０〜６０分インキュベートした。各々の溶解物を５０ｍｌの遠心チューブに移し、１００００×ｇで５分間、２回繰り返してペレット化した。各時点からの溶解物のタンパク質濃度を概算した。各溶解物(規準化したタンパク質濃度の各時点ごとに３０ｍｌ)を１ｍｌのブロックしていないプロテインＡ／Ｇビーズとともに４℃で１．２５〜１．５時間インキュベートした。ビーズおよび細片を、２０００回転数／分で５分間遠心分離して溶解物から分離した。直接的なウェスタンブロット分析のために各溶解物から試料を取り出し、残りの量を−８０℃で凍結させた。
【０２３０】
４つの１６ｍｌの各溶解物を得た。各試料に、２５ｍＭ ＭＧ-１３２と２０μｌ ＮＥＭを加えた。２つの試料をそれぞれ、２．４μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦＲ1抗体と組み合わせた。他の２つの試料をそれぞれ、２．４μｇ／ｍｌのコントロール抗体(抗ｍｙｃ)と組み合わせた。すべての試料を回転させながら４℃で２時間インキュベートし、その後ブ１５０μｌのブロックしていないプロテインＡビーズの５０％スラリーを加えた。試料を回転させながら４℃でさらに５時間インキュベートした。試料を遠心分離によってペレット状にし、１５ｍｌのＬＢにて１回、１０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ含有ＬＢにて２回、１０ｍｌのＬＢにて２回ビーズを洗浄した。洗浄したビーズを１．２５ｍｌのＬＢに再懸濁し、微量遠心管チューブに移した。チューブに総量９５０μｌが含まれるように各試料を吸引し、尿素中６Ｍの各試料の終濃度となるように３６０ｍｇの固形尿素を各試料に加えた。試料を緩やかに撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。各試料のビーズを遠心分離によってペレット状にした。各上清の一部をウェスタンブロット分析のために取っておき、各試料の残りの上清(およそ１ｍｌ／試料)を解離希釈バッファ(１％ Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００、０.５% デオキシコール酸、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.２、及び完全プロテアーゼインヒビター混合液(Roche))にて１０ｍｌに希釈した。
【０２３１】
各試料を２つの５ｍｌ用量に分けた。一部を、ｆａｂ型からＩｇＧ型に再編成してあった２．５μｇのａｐｕ２.１６にて処理し、他方を、ｆａｂ型からＩｇＧ型に再編成してあった２．５μｇのａｐｕ２.０７にて処理した。両方の試料に５０μｌのプロテインＡビーズを加え、試料を４℃で５時間インキュベートした。プロテインＡビーズをペレット化し、TNFR1 LBに３回洗浄し、洗浄工程の間微量遠心管に移した。試料バッファをすべての試料に加え、各試料(既にウェスタンブロット分析のために取っておいた試料を含む)を還元し、１０％ トリス／gly １．５ｍｍ １０ウェルNovex(登録商標)ゲル(Invitrogen)に流した。流した後、製造業者の指示に従ってゲルのタンパク質をInvitrolonTMＰＶＤＦメンブレン(Invitrogen)に移した。５％ ＰＢＳ-Ｔにてメンブレンをブロックし、抗ＲＩＰモノクローナル抗体(Becton Dickinson)にて室温で終夜プローブした。次いで、ブロットを洗浄し、ＨＲＰ-コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体(Cappel)にてプローブし、洗浄し、試薬に曝して化学発光を活性化し、フィルムに露光させた。結果を図２１Ａおよび２１Ｂに示す。図２１Ａは、初めにＴＮＦＲ１又は抗ｍｙｃにて免疫沈降し、その後ａｐｕ２.１６ ＩｇＧ(Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン選択)にて免疫沈降した試料を含有するブロットを表す。図２１Ａに示すように、ＲＩＰは抗ｍｙｃコントロール試料においてもゼロ時点試料においても可視化されない。ＲＩＰバンドは、５分の試料において最も強く、次いで１５分および２５分の試料において有意に減少していた。図２１Ｂは、初めにＴＮＦＲ１又は抗ｍｙｃにて免疫沈降し、その後ａｐｕ２.０７ ＩｇＧ(Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン選択)にて免疫沈降した試料を含有するブロットを表す。図１２Ｂに示すように、抗ｍｙｃコントロールレーンにおいてはＲＩＰが観察されなかった。このブロットのＲＩＰレベルは時間につれて増加し、２５分時点の試料において最も強かった。このデータは、ＴＮＦＲ１によるシグナル伝達の際に、ＲＩＰはまずＫ６３-連鎖性ポリユビキチン化して、続いてジユビキチン化されてＡ２０によってＫ４８-連鎖性ポリユビキチン化されるという以前の結論と一致する。ゆえに、本発明の抗体は特異的に結合して、細胞においてポリユビキチン化していたＫ６３-連鎖性ポリユビキチン化ポリペプチドとＫ４８-連鎖性ポリユビキチン化ポリペプチドとを区別することが可能であった。
【０２３２】
実施例４：第三世代抗ポリユビキチン抗体の単離と性質決定
Ｆａｂディスプレイの第三世代のライブラリは、既に同定されたクローンａｐｕ２.１６(Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン-選択)をコードするファジミドから構築した(実施例２と図１７Ａ及び１７Ｂを参照)。クローンからのファージを用いてＣＪ２３６細胞に感染させ、キュンケルＤＮＡ鋳型を調製した。その後、その鋳型に停止コドンを挿入するように突然変異させ、以下のように停止含有鋳型をライブラリ構築に用いた。
３つの異なるスキームに従ってＦａｂ ａｐｕ２.１６を突然変異させて、３つの異なるａｐｕ２.１６-由来のライブラリを作製した。第一ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ１およびＨＶＲ-Ｈ２を突然変異させた。ＨＶＲ-Ｈ１をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後１つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを利用した突然変異誘発を行った。停止コドンコード化オリゴヌクレオチド配列は、GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (配列番号：３７１)であった。突然変異原性オリゴヌクレオチドにより、ＮＮＳ混合コドンセットを用いて、位置２９のイソロイシンはフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリンから選択され、位置３４のイソロイシンはメチオニン及びイソロイシンから選択され(このときＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＴに対応し、ＳはＧ又はＣに対応する)、そして、アミノ酸Ｋ３０、Ｔ３１、Ｇ３２およびＬ３３がソフトランダム化された。この場合のソフトランダム化は、特定のヌクレオチド位は示した塩基が占める頻度の７０％であり、他の３塩基のうちの１つが占める頻度の１０％であったことを示す。このようなソフトランダム化が特定の塩基に含まれる以下のオリゴヌクレオチドでは、ソフトランダム化の存在は塩基の位置での数字によって示す。「５」なる数は、塩基アデニンがその位置で７０％の頻度で存在し、一方塩基グアニン、シトシン及びチミジンがそれぞれ１０％の頻度で存在することを示す。同様に、「６」なる数はグアニン、「７」はシトシン、「８」はチミジンを指し、それぞれの場合において、他の３つの塩基それぞれは１０％の頻度でしか存在しない。ａｐｕ３.１６ ＨＶＲ-Ｈ１を突然変異させるために用いるオリゴヌクレオチド配列は、GCAGCTTCTGGCTTCAACNTC556577668788ATSCACTGGGTGCGTCAGG (配列番号：７８５)であった。
【０２３３】
また、ＨＶＲ-Ｈ２をキュンケル鋳型に停止コドンを含むように修飾し、その後３つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを利用した突然変異誘発を行った。すべての場合での停止コドンコード化オリゴヌクレオチドは、GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：３７３)であった。３つの突然変異原性オリゴヌクレオチドは２つの順列の第一所望の配列であり、１つは第二所望の配列であった。第一所望の配列には、ＮＮＳ混合コドンセット(上記)を用いて位置５０及び５４のいずれかを１つ固定し１つランダム化したチロシン残基；位置５１(イソロイシン)、５２ａ(プロリン)、５３(チロシン)、５５(グリシン)および５７(スレオニン)の固定した残基；そして、位置Ｓ５２、Ｓ５６およびＳ５８のソフトランダム化(上記のソフトランダム化スキームに従う)を含めた。第二所望の配列には、位置５１(イソロイシン)、５２ａ(プロリン)、５３(チロシン)、５５(グリシン)および５７(スレオニン)の固定した残基；ＮＮＳ混合コドンセット(上記)を用いた位置５０及び５４のチロシンのハードランダム化、そして、位置Ｓ５２、Ｓ５６およびＳ５８のソフトランダム化(上記のソフトランダム化スキームに従う)を含めた。
ａｐｕ２.１６ ＨＶＲ-Ｈ２を突然変異するために用いたオリゴヌクレオチドは、GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATC567CCGTACTACGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：７８６)、GGCCTGGAATGGGTTGCATACATC567CCGTACNNSGGT567 ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：７８７)、及びGGCCTGGAATGGGTTGCANNS ATC567CCGTACNNSGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (配列番号：７８８)であった。
【０２３４】
第二ａｐｕ２.１６ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３を突然変異させた。第一ａｐｕ２.１６ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ２に行った修飾と同様に、同じ停止コドン含有オリゴヌクレオチドと同じ３つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ２を突然変異させた。第一ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ３に行った修飾(実施例２に記載)と同様に、同じ停止コドン含有オリゴヌクレオチドと同じ６つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ３を突然変異させた。
第三ａｐｕ２.１６ライブラリでは、ＨＶＲ-Ｈ１およびＨＶＲ-Ｈ３を突然変異させた。第一ａｐｕ２.１６ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ１に行った修飾と同様に、同じ停止コドン含有オリゴヌクレオチドと突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ１を突然変異させた。第一ａｐｕ１８ライブラリにおいてＨＶＲ-Ｈ３に行った修飾(実施例２に記載)と同様に、同じ停止コドン含有オリゴヌクレオチドと同じ６つの突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いてＨＶＲ-Ｈ３を突然変異させた。  
【０２３５】
３つそれぞれのａｐｕ２.１６-由来ライブラリの突然変異誘発反応物を、電気穿孔法によってエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ-１に形質転換させた。細胞を、ＳＯＣ培地中で撹拌しながら３７℃で３０分間かけて回復させた。２０μｌの細胞含有ＳＯＣ培地を用意し形質転換体の数を決定し、次いで残りをカルベニシリンと１０１０／ｍｌのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含有する５００ｍｌの２ＹＴに移した。撹拌しながら３７℃で４５分間インキュベートした後、培養物にカナマイシンを添加して、撹拌しながら３７℃で終夜生育させた。各ライブラリに対する形質転換体の数は１０９より多かった。ファージを回収して、遠心及びＰＥＧ沈殿により培養物から濃縮し、その後選別のラウンドに用いた。
実施例１(Ａ)に記載のように、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート(NUNC)に固定したＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに対して別々に分類した。ストリンジェンシーは３つの方法：ビオチン化ポリユビキチンの濃度によって；過剰な非ビオチン化ポリユビキチンを添加してニュートラビジン-コートウェル上に捕獲する前に結合について競合させることによって；及び、競合の継続期間によって調節した。各分類ラウンドでは、３μＭ モノユビキチンと３０μｇ／ｍｌ Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンをインキュベーション工程の間の分類バッファに加えた。溶出したファージを増やして、分類の更なるラウンドのためにプールした。その後の選別ラウンドは溶液-段階であった。溶液分類の第一ラウンドには、室温で１時間ファージプールとインキュベートした１００ｎＭ ビオチン化(スルホ-ＮＨＳ-ビオチン、Pierce)ポリユビキチンを含めた。次いで、混合物を溶液-分類バッファ(０．０５％ Superblock (Pierce)を含むＰＢＳＴ)にて１０倍に希釈し、ニュートラビジンコートウェルを用いて５分間キャプチュアした。非ビオチン化ポリユビキチン鎖を含有する反応は、バックグラウンドファージ結合をモニターするためのコントロールとした。プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、０．１Ｍ ＨＣｌにて１０分間溶出した。第二溶液-分類ラウンドでは、ラウンド１のようにファージを３０ｎＭのビオチン化ポリユビキチンにて平衡化したが、５分の解離速度選別のために３０μｇ／ｍｌの非ビオチン化ポリユビキチン(Ｋ６３-連鎖性)を含む溶液-分類バッファにて１０倍に希釈し、その後ニュートラビジンコートウェル上で捕獲した。  
溶液分類の第一ラウンドの後、ａｐｕ２.１６ベースの組み合わせライブラリに関して６．５倍の濃縮が観察された(表Ｅを参照)。緩慢な解離速度についての第二溶液分類の後に、さらに１０倍の濃縮が観察された(表Ｅを参照)。
【０２３６】
表Ｅ：第三世代抗ポリユビキチン抗体ライブラリ溶液分類の結果
2009519716.tif 000013
【０２３７】
１ラウンドのプレート分類と２ラウンドの溶液分類の後、第三世代から選択される個々のクローンを９６ウェルフォーマットで生育させ、実施例２に記載のようにファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。配列決定によって７２の異なるクローンが同定された。これらのクローンのうちの１２は、ファージＥＬＩＳＡアッセイにおいてＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに対して最も大きな特異性を示した(図２２)。これら１２のクローンをａｐｕ３.０１−３．１２と称し、これらのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を図２３Ａおよび２３Ｂに示す。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的クローンそれぞれの軽鎖ＨＶＲは配列決定しなかったが、ＨＶＲ-Ｌ１とＨＶＲ-Ｌ２の配列は不変であることが予測され、ＨＶＲ-Ｌ３配列はａｐｕ２.１６のものと同一であることが予測された。ライブラリ設定に従うと、ＨＶＲ-Ｌ1配列はＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ(配列番号：７９)であり、ＨＶＲ-Ｌ2配列はＳＡＳＳＬＹＳ(配列番号：８０)であった。すべてのクローンは、同じ重鎖および軽鎖フレームワーク配列を有した(図６を参照)。
Ａｐｕ２.０７(実施例２と図１６Ａおよび１６Ｂを参照))とａｐｕ３.０７(上記と図２３Ａおよび２３Ｂを参照)はヒトＩｇＧのように、ＣＨＯ細胞又は２９３細胞において発現された。ヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードする適当なｐＲＫ哺乳動物発現ベクターのキュンケル突然変異誘発によって発現コンストラクトを作製した(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10(1990))。標準的な方法を用いた親和性クロマトグラフィによってＩｇＧを精製した。
【０２３８】
ニトロセルロースメンブレンに固定した適当な結合のポリユビキチンに特異的に結合する各ＩｇＧの能力は、ウェスタンブロットによって評価した。Ｋ４８-又はＫ６３-連鎖性のポリユビキチンとモノユビキチン(Boston Biochem)を、４−２０％のトリス-グリシンポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)に流した。ゲルの内容物をエレクトロブロッティングによってニトロセルロースに移した。ニトロセルロースメンブレン上の非特異的結合部位は、０.１％ Ｔｗｅｅｎ-２０を含有するトリス緩衝生理食塩水(ＴＢＳＴ)に溶解した５％ 無脂粉乳中で１時間ブロックした。次いで、Ｋ４８-特異的又はＫ６３-特異的抗体を、２μｇ／ｍｌ(ａｐｕ２．０７ ＩｇＧ)又は１μｇ／ｍｌ(ａｐｕ３.０７ ＩｇＧ)の濃度でブロットに加え、結合を促すために１時間インキュベートした。ポジティブコントロールとして、１ブロットはウサギ抗ユビキチン抗体(Sigma)とともにインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴにて洗浄して、５％ 無脂粉乳を含有するＴＢＳＴにて１：１００００に希釈したペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇ Ｆｃ(ＩＣＮ)又はペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ウサギＩｇ(Amersham)によって結合した抗体を検出した。１時間後に、ブロットをＴＢＳＴで洗浄して、ペルオキシダーゼ活性を明らかにするためにSuper Signal West Dura試薬(Pierce)を用いて反応させた。結果を図２４Ａ−２４Ｄに示す。
【０２３９】
予測されたように、aｐｕ２.０７ ＩｇＧは、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンとＫ４８-連鎖性のトリユビキチンからヘプタユビキチンを特異的に認識したが(図２４Ａ)、固定したＫ６３-連鎖性ポリユビキチン試料のいずれかには結合しなかった。同様に、ａｐｕ３.０７ ＩｇＧは、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンとＫ６３-連鎖性のトリユビキチンからヘプタユビキチンを特異的に認識したが(図２４Ｂ)、固定したＫ４８-連鎖性ポリユビキチン試料のいずれにも結合しなかった。固定されたモノユビキチンに結合したＩｇＧもなかった。各ＩｇＧの感受性を評価するために、様々な濃度の固定したＫ４８-連鎖性及びＫ６３-連鎖性のテトラユビキチン(２５〜１０００ｎｇ／レーン)を用いて更なるウェスタンブロット分析を行った(図２４Ｃ及び２４Ｄ)。５０ｎｇの固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンと同じくらいわずかなａｐｕ２.０７ ＩｇＧしか検出されず、さらに、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンには特異的に結合しなかった(図２４Ｃ)。５０ｎｇの固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンと同じくらいわずかなａｐｕ３.０７ ＩｇＧしか検出されず、さらに、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンには特異的に結合しなかった(図２４Ｄ)。いずれの場合においても、固定されたテトラユビキチンの量が増加すると、観察される結合が増えた。
【０２４０】
ＩｇＧが内因性ポリユビキチン化タンパク質を検出することが可能だったかどうかを決定するために、タンパク質溶解物を、２０μＭのプロテアソームインヒビターＶｅｌｃａｄｅ(登録商標)(ボルテゾミブ)による４時間の処理を行った場合と行わなかった場合のヒト胚性腎細胞株である２９３Ｔから調製した。４−２０％ トリス-グリシンポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ-ＰＡＧＥによって溶解物を分解し、上記のようにウェスタンブロットを行った。結果を図２５に示す。Ｖｅｌｃａｄｅ(登録商標)処理のある場合とない場合の両方においてポリクローナル抗ユビキチン抗体(Sigma)により、多くの高分子量タンパク質(最も左のレーン)が検出された。ａｐｕ２.０７ ＩｇＧは異なる分子量の多くのタンパク質に結合し(最も右のレーン)、固定した未処理の溶解物に対するよりも固定したベルケイド(velcade)処理溶解物に対してより多くの結合が観察された。ａｐｕ３.０７ ＩｇＧでは全体的に有意に少ない結合が観察された(中央のレーン)。これはＫ６３-ポリユビキチン化タンパク質に結合することが予測され、ベルケイド処理と未処理のレーンとの間に見かけの結合の違いはなかった。Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン化は、タンパク質分解のために細胞内タンパク質を標的とすることが知られている(Chau等, Science 243: 1576-1583 (1989)；Finley等, Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994)；Flick等, Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004))。ゆえに、ａｐｕ２.０７ ＩｇＧの結果は、タンパク質分解性プロセシングが阻害された場合、溶解物中に残るＫ４８-ポリユビキチン化タンパク質の量が増加し、これによって未処理の試料よりもａｐｕ２.０７ ＩｇＧによる結合が増加したと解釈できた。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン化は分解のためにタンパク質を標的とすることが知られていない(Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004)；Hicke and Dunn, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19: 141-172 (2003)；Spece等, Mol. Cell Biol. 15: 1265-1273 (1995)；Ulrich, Eukaryot. Cell 1: 1-10 (2002)；Spence等, Cell 102: 67-76 (2000)；Seibenhener等, Mol. Cell. Biol. 24(18): 8055-8068 (2004))。ゆえに、ａｐｕ ３.０７ ＩｇＧの結果は、プロテアソームの阻害によりＫ６３-ポリユビキチン化タンパク質が集積されなかったと解釈できた。 
【０２４１】
実施例５：抗Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンに対するＦａｂ結合の構造的分析
ポリユビキチンと抗Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン ｆａｂの相互作用をさらに理解するために、抗Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン ｆａｂ ａｐｕ２.１６を、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンと共結晶化した。１μｌのａｐｕ２.１６溶液(１０ｍＭ トリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０中１５ｍｇ／ｍｌ)と１μｌのウェル溶液(０．１Ｍ ＬｉＣｌ、０．１Ｍ トリスｐＨ８．２、１Ｍ クエン酸塩)を用いた懸滴において結晶を大きくした。各滴下に０．５μｌの０．１Ｍの塩化第二銅を加え、各滴下を線状に播いた。数日にわたって結晶クラスターを大きくし、単一の回析用結晶が得られるように操作してもよい。分子置換により構造を測定した。１００Ｋで生データを集め、ＨＫＬ２０００によって処理した。結晶は、ａ＝１７７．７Å、ｂ＝９４．９Å、ｃ＝９７．９Å、そしてβ＝１０７の細胞寸法と、非対称性ユニットの２つの複合体を有するＣ２空間群に属した。プログラムPhaserとヒト化４ｄ５ ｆａｂ断片の変異体の配位を用いた分子置換により構造を解析した(４Ｄ５ではＰＤＢ：ＰＤＢコード１ＦＶＥ)。プログラムCootにモデル構築を行い、Refmac5を用いて構造を改良した。構造の分解は３．１Åである。複合体は２４．５％のＲおよび３０．４％のＲｆｒｅｅに改善した。
ａｐｕ２.１６とＫ６３-連鎖性ジユビキチンとの間の相互作用を図２６Ａ−２６Ｃに示す。構造的エピトープは、ｆａｂを結合する際に溶媒にアクセス可能な表面領域の少なくとも２５％を埋没する、および／またはｆａｂの重鎖又は軽鎖の４．５Åの範囲内に複数のある原子を有する残基の組合せである。Ｋ６３を呈するユビキチン鎖は鎖Ａであり、Ｃ末端を呈するユビキチン鎖は鎖Ｂである。Ｆａｂ軽鎖残基は鎖Ｌに属し、ｆａｂ重鎖残基は鎖Ｈに属する。以下の表の残基番号の前に鎖番号を付し、ｆａｂ残基を順に番号付けする。
【０２４２】
表Ｆ：ａｐｕ２.１６-Ｋ６３-連鎖性ジユビキチン結合境界面に位置する残基
2009519716.tif 000014
【０２４３】
表Ｆ及び、図２６Ｂに濃い灰色で示すように、ａｐｕ２.１６に結合した場合に、ａｐｕ２.１６の４．５Åの範囲内に位置した残基は、Ｋ６３-ジユビキチンＢ鎖に１３残基、Ｋ６３-ジユビキチンＡ鎖に１１残基あった。表Ｆ及び、図２６Ｃに濃い灰色で示すように、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチン分子に結合した場合に、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンの３．５Åの範囲内に位置した残基は、ａｐｕ２.１６重鎖に１４残基、ａｐｕ２.１６軽鎖に８残基あった。このデータから、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチン上の２つの間の相互作用を媒介すると思われる残基には、Ａ鎖ではＧｌｕ-１８、Ｓｅｒ-２０、Ｌｅｕ-５７及びＡｓｐ-５８が含まれ、Ｂ鎖ではＰｒｏ-３７、Ａｒｇ-７４及びＧｌｙ-７５が含まれる。興味深いことに、抗体はＫ６３-Ｇｌｙ ７６結合と親密に相互作用することなく、結合に隣接するジユビキチン複合体の表面の相互作用を介して特異性を導いている。
【図面の簡単な説明】
【０２４４】
【図１】ユビキチンの一次構造および特定のポリユビキチンイソペプチド結合の略図を示す。図１Ａは、ヒトのユビキチンのアミノ酸配列(配列番号：３７７)を示し、リジン残基を太字で下線を引いて示した。図１Ｂは、第一ユビキチン分子のリジン-４８又はリジン-６３と第二ユビキチン分子のＣ末端グリシン残基との間で形成される結合の模式図を示す。
【図２Ａ−Ｃ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。識別子「４８」は、抗体分子がＫ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識したことを示す。識別子「ｂｏｔｈ」は、抗体分子がＫ４８-連鎖性ポリユビキチンとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンの両方を認識したことを示す。識別子「ａｌｌ」は、抗体分子がＫ４８-連鎖性ポリユビキチンとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンの両方並びにモノユビキチンを認識したことを示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図３Ａ−Ｂ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。識別子「６３」は、抗体分子がＫ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識したことを示す。識別子「ｂｏｔｈ」は、抗体分子がＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとＫ４８-連鎖性ポリユビキチンの両方を認識したことを示す。識別子「ａｌｌ」は、抗体分子がＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとＫ４８-連鎖性ポリユビキチンの両方並びにモノユビキチンを認識したことを示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図４Ａ−Ｂ】以下に示す配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す。  可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク(図４Ａおよび４Ｂ)：ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１１１、８３９、８５８および８７７)。ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１１２−１１４、８４０−８４２、８５９−８６１および８７８−８８０)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１１５、８４３、８６２および８８１)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１１６−１１８、８４４−８４６、８６３−８６５および８８２−８８４)。ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１１９、８４７、８６６および８８５)。ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１２０−１２２、８４８−８５０、８６７−８６９および８８６−８８８)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１２３、８５１、８７０および８８９)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１２４−１２５、８５２−８５３、８７１−８７２および８９０−８９１)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１２６、８５４、８７３および８９２)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１２７−１２９、８５５−８５７、８７４−８７６および８９３−８９５)。
【図５】以下に示す配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す。  可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク(図５)：ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３０、８９６、９００および９０４)。ヒトＶＬκサブグループIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３１、８９７、９０１および９０５)。ヒトＶＬκサブグループIIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３２、８９８、９０２および９０６)。ヒトＶＬκサブグループIVコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３３、８９９、９０３および９０７)。
【図６】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖および重鎖のフレームワーク領域配列を表す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。
【図７】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖および重鎖の修飾／変異フレームワーク領域配列を表す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。
【図８Ａ−Ｃ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図９Ａ−Ｂ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ1、Ｈ2およびＨ3を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図１０Ａ−Ｃ】実施例１(Ｂ)に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された抗ポリユビキチン抗体分子ａｐｕ０１−ａｐｕ１５の重鎖及び軽鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図１１Ａ−Ｃ】実施例１(Ｂ)に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された抗ポリユビキチン抗体分子ａｐｕ１７−ａｐｕ２４の重鎖及び軽鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図１２】実施例１(Ｃ)に記載のように、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析を用いて観察した、様々な濃度の抗ポリユビキチンＦａｂ ａｐｕ０９とＫ４８-連鎖性ないしはＫ６３-連鎖性のポリユビキチンとの間の結合相互作用を示す。
【図１３】実施例１(Ｃ)に記載のように、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析を用いて観察した、様々な濃度の抗ポリユビキチンＦａｂ ａｐｕ１８とＫ４８-連鎖性ないしはＫ６３-連鎖性のポリユビキチンとの間の結合相互作用を示す。
【図１４Ａ−Ｆ】実施例２に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する、Ｆａｂ ａｐｕ０５の配列に基づいた第二世代の抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ０５の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。太字は、抗体が実施例２に記載するファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて強い結合を示したことを示す。
【図１５Ａ−Ｃ】実施例２に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する、Ｆａｂ ａｐｕ１８の配列に基づいた第二世代の抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ１８の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。太字は、抗体が実施例２に記載するファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて強い結合を示したことを示す。
【図１６Ａ−Ｂ】実施例２に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン(ａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０)を特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された、突然変異させたａｐｕ０５由来のＦａｂ分子の重鎖高頻度可変領域のアミノ酸配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ０５の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。
【図１７Ａ−Ｂ】実施例２に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン(ａｐｕ２.１１−ａｐｕ２.２０)を特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された、突然変異させたａｐｕ１８由来のＦａｂ分子の重鎖高頻度可変領域のアミノ酸配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ１８の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。
【図１８】Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン、モノユビキチンおよびウシ血清アルブミンに対する各々の第二世代のＦａｂ ａｐｕ２.０１−２.２０の結合が評価された実施例２に記載のファージＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図１９Ａ】実施例１に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対する、クローンａｐｕ０１からａｐｕ１５から産生されたＦａｂの結合を示す。
【図１９Ｂ】実施例１に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。固定したＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに対する、クローンａｐｕ１８からａｐｕ２４から産生されたＦａｂの結合の欠如を示す。
【図２０】実施例２に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図２０Ａは、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０の結合と、固定したＫ６３-連鎖性ジユビキチンに対する結合の欠如を示す。図２０Ｂは、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ２.１１−ａｐｕ２.２０の結合と、固定したＫ４８-連鎖性ジユビキチンに対する結合の欠如を示す。
【図２１】実施例３に記載の、ＲＩＰのユビキチン化状態を検出するための免疫沈降実験からのウエスタンブロットを示す。図２１Ａのブロットは、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン化タンパク質を捕獲するためにａｐｕ２.１６ ＩｇＧによって免疫沈降した試料を含む。図２１Ｂのブロットは、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン化タンパク質を捕獲するためにａｐｕ２.０７ ＩｇＧによって免疫沈降した試料を含む。両方のブロットは抗ＲＩＰ抗体にて染色した。
【図２２】Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン、モノユビキチンおよびウシ血清アルブミンに対する各々の第三世代のクローンａｐｕ３.０１−３.１２の結合が評価された実施例４に記載のファージＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図２３Ａ−Ｂ】実施例４に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン(ａｐｕ３.０１−ａｐｕ３.１２)を特異的に認識する突然変異させたａｐｕ２.１６由来のクローンの重鎖高頻度可変領域のアミノ酸配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ1、Ｈ2およびＨ3を示す。識別子「ＮＤ」は配列が決定されなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がａｐｕ２.１６の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。
【図２４Ａ−Ｂ】実施例４に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図２４Ａは、固定したＫ４８-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチンに対するａｐｕ２.０７の結合と、固定したＫ６３-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチン又はモノユビキチンに対する結合の欠如を示す。図２４Ｂは、固定したＫ６３-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチンに対するａｐｕ３.０７ ＩｇＧの結合と、固定したＫ４８-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチン又はモノユビキチンに対する結合の欠如を示す。
【図２４Ｃ−Ｄ】実施例４に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図２４Ｃは、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ２.０７の濃度依存的な結合と、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンに対する結合の欠如を示す。図２４Ｄは、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ３.０７ ＩｇＧの濃度依存的な結合と、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対する結合の欠如を示す。
【図２５】実施例４に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図は、ベルケイド(登録商標)で処理した２９３Ｔ細胞(＋)又は未処理の２９３Ｔ細胞(−)の固定した溶解物に対する抗ユビキチンポリクローナル抗体、ａｐｕ２.０７ ＩｇＧ、およびａｐｕ３.０７ ＩｇＧの結合を示す。
【図２６Ａ】結晶学的分析によって測定した、本発明のＫ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的ｆａｂとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとの間の相互作用を示す。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的ｆａｂであるａｐｕ２.１６とＫ６３-連鎖性ジユビキチンとの間で形成された複合体を示す。Ａｐｕ２.１６は図の下方にリボン線図で示し、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンは図の上方に球状形状で示す。
【図２６Ｂ−Ｃ】結晶学的分析によって測定した、本発明のＫ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的ｆａｂとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとの間の相互作用を示す。図２６Ｂは、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンの表面を表し、ｆａｂの４．５Å内の残基を濃い灰色で着色し、対象の残基を標識した。図２６Ｃは、ａｐｕ２.１６の表面を表し、Ｋ６３-連鎖性ユビキチンダイマーの４．５Å内の残基を濃い灰色で着色した。ＣＤＲを標識した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月3日(2008.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一リジン連鎖が第二リジン連鎖と異なる場合に、第一リジン連鎖を含む第一ポリユビキチンを特異的に結合し、第二リジン連鎖を含む第二ポリユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項２】
リジン６-連鎖性ポリユビキチン、リジン１１-連鎖性ポリユビキチン、リジン２７-連鎖性ポリユビキチン、リジン２９-連鎖性ポリユビキチン、リジン３３-連鎖性ポリユビキチン、リジン４８-連鎖性ポリユビキチン、又はリジン６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記第一ポリユビキチンがリジン４８-連鎖性である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記第二ポリユビキチンがリジン６３-連鎖性である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記第一ポリユビキチンがリジン６３-連鎖性である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記第二ポリユビキチンがリジン４８-連鎖性である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
第一リジン連鎖を含む第一ポリユビキチンと第二リジン連鎖を含む第二ポリユビキチンをともに特異的に結合する単離された抗体であって、該第一リジン連鎖が第二リジン連鎖と異なり、該抗体はモノユビキチンを特異的に結合せず、該抗体は、第一ポリユビキチンに対する抗体の結合親和性と比較して、実質的に減少した結合親和性で第二ポリユビキチンを結合する、抗体。
【請求項８】
リジン４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に結合し、モノユビキチンを特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項９】
それぞれ配列番号：１−２５、１５１−１７５、２６５−２７９、３９２−４５９及び６９５−７０４；配列番号：２７−５１、１７７−２０１、２８１−２９５、４６１−５２８および７０６−７１５；配列番号：５３−７７、２０３−２２７、２９７−３１１、５３０−５９７および７１７−７２６；及び配列番号：３１３−３２７および７２８−７３７のいずれかのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一の高頻度可変(ＨＶＲ)配列を含んでなる、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８２５)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがバリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｅがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｆがチロシンであり、アミノ酸ｇがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８２６)を含み、このときアミノ酸ｋがセリンであり、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そして、アミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ'を含み、このときアミノ酸ｂ'がグルタミン酸、セリン、グリシンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｃ'がグリシン、チロシン、セリンおよびアスパラギンから選択され、アミノ酸ｄ'がチロシン、セリン、リジン、フェニルアラニンおよびグルタミン酸から選択され、アミノ酸ｅ'がセリン、チロシン、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｆ'がグルタミン、チロシン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｇ'がグリシン、セリン、チロシン、メチオニンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｈ'がグリシン、アラニン、プロリンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｉ'がフェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アラニンおよびロイシンから選択されるか又は存在せず、アミノ酸ｊ'がフェニルアラニンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｋ'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸ｌ'がチロシンである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８２７)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシンであり、アミノ酸ｅがセリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｆがチロシンであり、アミノ酸ｇがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸iがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ'(配列番号：８２８)を含み、このときアミノ酸ｋはセリンであり、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがチロシンであり、アミノ酸ｎがセリンであり、アミノ酸ｏがチロシンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがセリンであり、アミノ酸ｒがチロシンであり、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンであり、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そしてアミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ'(配列番号：８２９)を含み、このときアミノ酸ｂ'がセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｃ'がチロシンであり、アミノ酸ｄ'がセリンであり、アミノ酸ｅ'がチロシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｆ'がセリン、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンおよびヒスチジンから選択され、アミノ酸ｇがグルタミン酸、セリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｈ'がアラニンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｉ'がロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｊ'がアスパラギン酸であり、そして、アミノ酸ｋ'がチロシンである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
アミノ酸配列 ｍ' ｎ' ｏ' ｐ' ｑ' ｒ' ｓ' ｔ' ｕ' ｖ' ｗ'(配列番号：８３０)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなり、このときアミノ酸ｍ'がグルタミンであり、アミノ酸ｎ'がグルタミンであり、アミノ酸ｏ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｐ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｑ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｒ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｔ'がロイシン、セリン、プロリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕ'がプロリンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｖ'がフェニルアラニン、イソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、そして、アミノ酸ｗ'がスレオニンである、請求項８に記載の抗体。 
【請求項１３】
配列番号：７２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項８に記載の抗体。  
【請求項１４】
図１０Ａおよび１０Ｂのクローンａｐｕ０１、ａｐｕ０２、ａｐｕ０３、ａｐｕ０４、ａｐｕ０５、ａｐｕ０６、ａｐｕ０７、ａｐｕ０８、ａｐｕ０９、ａｐｕ１０、ａｐｕ１１、ａｐｕ１２、ａｐｕ１３、ａｐｕ１４又はａｐｕ１５に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項１０に記載の抗体。  
【請求項１５】
図１６Ａのクローンａｐｕ２.０１、ａｐｕ２.０２、ａｐｕ２.０３、ａｐｕ２.０４、ａｐｕ２.０５、ａｐｕ２.０６、ａｐｕ２.０７、ａｐｕ２.０８、ａｐｕ２.０９又はａｐｕ２.１０に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および図１０Ｃのクローンａｐｕ０１、ａｐｕ０２、ａｐｕ０３、ａｐｕ０４、ａｐｕ０５、ａｐｕ０６、ａｐｕ０７、ａｐｕ０８、ａｐｕ０９、ａｐｕ１０、ａｐｕ１１、ａｐｕ１２、ａｐｕ１３、ａｐｕ１４又はａｐｕ１５に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１７】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および図１６Ｂのクローンａｐｕ２.０１、ａｐｕ２.０２、ａｐｕ２.０３、ａｐｕ２.０４、ａｐｕ２.０５、ａｐｕ２.０６、ａｐｕ２.０７、ａｐｕ２.０８、ａｐｕ２.０９又はａｐｕ２.１０に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号：２６９のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２８５のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：３０１のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：３１７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項８に記載の抗体。  
【請求項１９】
配列番号：７０１のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７１２のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号；７２３のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７３４のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項８に記載の抗体。
【請求項２０】
リジン６３-連鎖性ポリユビキチンに特異的に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項２１】
それぞれ配列番号：８１−８９、２２９−２３９、３２９−３３６、５９９−６２９、７３９−７４８および７８９−７９９；配列番号：９１−９９、２４１−２５１；３３８−３４５、６３１−６６１、７５０−７５９および８０１−８１１；配列番号：１０１−１０９、２５３−２６３、３４７−３５４、６６３−６９３、７６１−７７０および８１３−８２３；及び配列番号：３５６−３６３および７７２−７８１のいずれかのＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３およびＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一の高頻度可変性(ＨＶＲ)配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３１)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがバリン、イソロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｅがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｆがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｇがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｈがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そして、アミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ'(配列番号：８３２)を含み、このときアミノ酸ｋはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｌがイソロイシンであり、アミノ酸ｍがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｎがプロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｏがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｐがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｑがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｓはスレオニンであり、アミノ酸ｔはセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｕがチロシンであり、アミノ酸ｖがアラニンであり、アミノ酸ｗがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｘがセリンであり、アミノ酸ｙがバリンであり、アミノ酸ｚがリジンであり、そして、アミノ酸ａ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｂ' ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ' ｐ' ｑ' ｒ' ｓ' ｔ' ｕ' ｖ'を含み、このときアミノ酸ｂ'がセリン、グルタミン酸、グリシンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｃ'がグリシン、チロシン、イソロイシン、グルタミンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｄ'がチロシン、メチオニン、グリシンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｅ'がチロシン、アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニンおよびプロリンから選択され、アミノ酸ｆ'がチロシン、トリプトファン、セリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｇ'がグルタミン、チロシン、セリン、フェニルアラニンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｈ'がグリシン、スレオニン、トリプトファン、リジンおよびプロリンから選択され、アミノ酸ｉ'がチロシン、アラニン、トリプトファン、グルタミン酸、プロリンおよびセリンから選択され、アミノ酸ｊ'がトリプトファン、イソロイシン、チロシンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｋ'がトリプトファン、チロシン、グリシンおよびアスパラギン酸から選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｌ'がチロシン、セリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｍ'がチロシン、アスパラギン酸およびセリンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｎ'がチロシンおよびアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｏ'がスレオニン、セリン、バリン、グリシンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｐ'がグリシン、アスパラギン酸、セリン、メチオニンおよびチロシンから��択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｑ'がチロシン、アラニンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｒ'がチロシン、ロイシンおよびグリシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｓ'がグリシンであるかまたは存在せず、アミノ酸ｔ'がメチオニンおよびロイシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸ｕ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｖ'がチロシンである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３３)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸ｅがセリン、リジンおよびバリンから選択され、アミノ酸ｆがセリン、トリプトファン、グリシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸ｇがセリン、アスパラギンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｈがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ' ｂ'(配列番号：８３４)を含み、このときアミノ酸ｋがアラニンであり、アミノ酸ｌがチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアラニンから選択され、アミノ酸ｍがイソロイシンであり、アミノ酸ｎがセリン、アラニンおよびグルタミンから選択され、アミノ酸ｏがプロリンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがロイシン、チロシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｒがセリンおよびグリシンから選択され、アミノ酸ｓがセリン、スレオニンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｔはスレオニンであり、アミノ酸ｕはセリン、アスパラギン、リジンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｖがチロシンであり、アミノ酸ｗがアラニンであり、アミノ酸ｘがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｙがセリンであり、アミノ酸ｚがバリンであり、アミノ酸ａ'がリジンであり、そしてアミノ酸ｂ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ'(配列番号：８３７)を含み、このときアミノ酸ｃ'がセリンであり、アミノ酸ｄ'がアルギニンであり、アミノ酸ｅ'がグルタミン酸であり、アミノ酸ｆ'がチロシンであり、アミノ酸ｇ'がチロシンであり、アミノ酸ｈ'がアルギニンであり、アミノ酸ｉ'がトリプトファンであり、アミノ酸ｊ'がチロシンであり、アミノ酸ｋ'がスレオニンであり、アミノ酸ｌ'がアラニンであり、アミノ酸ｍ'がイソロイシンであり、アミノ酸ｎ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｏ'がチロシンである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２４】
アミノ酸配列 ｗ' ｘ' ｙ' ｚ' Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇを含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなり、このときアミノ酸ｗ'がグルタミンであり、アミノ酸ｘ'がグルタミンであり、アミノ酸ｙ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｚ'がセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ａがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ｂがセリンおよびチロシンから選択され、アミノ酸Ｃがプロリン、セリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸Ｄがセリン、プロリンおよびチロシンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Ｅがロイシンおよびフェニルアラニンから選択されるかまたは存在せず、アミノ酸Ｆがフェニルアラニン、バリン、スレオニンおよびイソロイシンから選択され、そして、アミノ酸Ｇがアルギニン、スレオニンおよびフェニルアラニンから選択される、請求項２０に記載の抗体。 
【請求項２５】
アミノ酸配列Ｑ-Ｑ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｙ-Ｓ-Ｓ-Ｌ-Ｆ-Ｔ(配列番号：７７２)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。  
【請求項２６】
図１１Ａおよび１１Ｂのクローンａｐｕ１７、ａｐｕ１８、ａｐｕ１９、ａｐｕ２０、ａｐｕ２１、ａｐｕ２２、ａｐｕ２３およびａｐｕ２４に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項２２に記載の抗体。  
【請求項２７】
図１７Ａのクローンａｐｕ２.１１、ａｐｕ２.１２、ａｐｕ２.１３、ａｐｕ２.１４、ａｐｕ２.１５、ａｐｕ２.１６、ａｐｕ２.１７、ａｐｕ２.１８、ａｐｕ２.１９およびａｐｕ２.２０に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２８】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、及び図１１Ｃのクローンａｐｕ１７、ａｐｕ１８、ａｐｕ１９、ａｐｕ２０、ａｐｕ２１、ａｐｕ２２、ａｐｕ２３およびａｐｕ２４に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、及び図１７Ｂのクローンａｐｕ２.１１、ａｐｕ２.１２、ａｐｕ２.１３、ａｐｕ２.１４、ａｐｕ２.１５、ａｐｕ２.１６、ａｐｕ２.１７、ａｐｕ２.１８、ａｐｕ２.１９およびａｐｕ２.２０に記載のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２５に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号：３３０のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：３３９のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：３４８のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：３５７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。  
【請求項３１】
配列番号：７３９のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５０のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６１のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７２のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。 
【請求項３２】
配列番号：７４０のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５１のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６２のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７３のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。  
【請求項３３】
ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一の配列を含んでなり、該ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｉ ｊ(配列番号：８３５)を含み、このときアミノ酸ａがグリシンであり、アミノ酸ｂがフェニルアラニンであり、アミノ酸ｃがアスパラギンであり、アミノ酸ｄがイソロイシン、バリンおよびロイシンから選択され、アミノ酸ｅがリジンおよびメチオニンから選択され、アミノ酸ｆがスレオニン、メチオニン、アスパラギン、アルギニンおよびイソロイシンから選択され、アミノ酸ｇがグリシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｈがチロシン、イソロイシン、ロイシンおよびフェニルアラニンから選択され、アミノ酸ｉがイソロイシンおよびメチオニンから選択され、そしてアミノ酸ｊがヒスチジンであり、該ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列 ｋ ｌ ｍ ｎ ｏ ｐ ｑ ｒ ｓ ｔ ｕ ｖ ｗ ｘ ｙ ｚ ａ' ｂ'(配列番号：８３６)を含み、このときアミノ酸ｋがアラニンであり、アミノ酸ｌがチロシンであり、アミノ酸ｍがイソロイシンであり、アミノ酸ｎがセリン、イソロイシンおよびスレオニンから選択され、アミノ酸ｏがプロリンであり、アミノ酸ｐがチロシンであり、アミノ酸ｑがロイシン、チロシン、アスパラギン酸、セリンおよびトリプトファンから選択され、アミノ酸ｒがグリシンであり、アミノ酸ｓがトリプトファン、バリン、セリン、アスパラギン、アルギニンおよびチロシンから選択され、アミノ酸ｔはスレオニンである、アミノ酸ｕはアルギニン、アスパラギン、バリン、スレオニン、セリンおよびリジンから選択され、アミノ酸ｖがチロシンであり、アミノ酸ｗがアラニンであり、アミノ酸ｘがアスパラギン酸であり、アミノ酸ｙがセリンであり、アミノ酸ｚがバリンであり、アミノ酸ａ'がリジンであり、そしてアミノ酸ｂ'がグリシンであり、該ＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列 ｃ' ｄ' ｅ' ｆ' ｇ' ｈ' ｉ' ｊ' ｋ' ｌ' ｍ' ｎ' ｏ'(配列番号：８３７)を含み、このときアミノ酸ｃ'がセリンであり、アミノ酸ｄ'がアルギニンであり、アミノ酸ｅ'がグルタミン酸であり、アミノ酸ｆ'がチロシンであり、アミノ酸ｇ'がチロシンであり、アミノ酸ｈ'がアルギニンであり、アミノ酸i'がトリプトファンであり、アミノ酸ｊ'がチロシンであり、アミノ酸ｋ'がスレオニンであり、アミノ酸ｌ'がアラニンであり、アミノ酸ｍ'がイソロイシンであり、アミノ酸ｎ'がアスパラギン酸であり、そしてアミノ酸ｏ'がチロシンである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項３４】
図２３Ａおよび２３Ｂのクローンａｐｕ３.０１、ａｐｕ３.０２、ａｐｕ３.０３、ａｐｕ３.０４、ａｐｕ３.０５、ａｐｕ３.０６、ａｐｕ３.０７、ａｐｕ３.０８、ａｐｕ３.０９、ａｐｕ３.１０および３．１１に記載のものに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列に対応するＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項３４又は請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号：７４４のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７５５のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７６６のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。
【請求項３７】
配列番号：７９５のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：８０７のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：８１９のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７７７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項２０に記載の抗体。
【請求項３８】
配列番号：７０１のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７１２のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：７２３のＨＶＲ-Ｈ３配列、および配列番号：７９のＨＶＲ-Ｌ１配列、および配列番号：８０のＨＶＲ-Ｌ２配列、および配列番号：７３４のＨＶＲ-Ｌ３配列を含んでなる、請求項８に記載の抗体。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれかの抗体と同じポリユビキチン上の抗原決定基に結合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項４０】
ポリユビキチンへの結合について請求項１から３８のいずれかの抗体と競合し、モノユビキチンに特異的に結合しない単離された抗体。
【請求項４１】
前記抗体がポリユビキチン化されたタンパク質に特異的に結合する、請求項１から３８のいずれか一に記載の抗体。
【請求項４２】
前記抗体がポリユビキチン化されたタンパク質の分解を阻害する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を調節する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を阻害する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が少なくとも一のポリユビキチンが媒介するシグナル伝達経路を刺激する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４６】
請求項１から３８のいずれかに記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項４７】
請求項４６に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４８】
請求項４７に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４９】
請求項１から３８のいずれかに記載の抗体を産生することができる細胞株。
【請求項５０】
抗体が産生される条件下で抗体をコードする核酸分子を含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、請求項１から３８のいずれかに記載の抗体の産生方法。
【請求項５１】
請求項１から３８のいずれかに記載の抗体の有効量と薬学的に受容可能な担体とを含有してなる組成物。
【請求項５２】
試料を請求項１から３８のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化されたタンパク質の存在を同定する方法。
【請求項５３】
請求項１から３８のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者のポリユビキチンの調節不全が関連する疾患又は症状の治療のための方法。
【請求項５４】
前記患者が哺乳類の患者である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記患者がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、癌、筋疾患、ユビキチン経路関連の遺伝的疾患、免疫性／炎症性の疾患および神経学的疾患から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患が、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リデル症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病およびパジェット病から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質を含有すると思われる試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質の存在を決定する方法であって、該試料を請求項１から３８のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体に曝し、そして、試料中のポリユビキチン又はポリユビキチン化タンパク質への少なくとも一の抗体の結合を決定することを含んでなる方法。
【請求項５９】
試料を請求項１から３８のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させることを含んでなる、試料中の非ポリユビキチン化タンパク質からポリユビキチン化タンパク質を分離する方法。
【請求項６０】
細胞を請求項１から３８のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、細胞でのポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法。
【請求項６１】
試料を請求項１から３８のいずれか一に記載の少なくとも一の抗体と接触させ、そして、細胞に対する該接触工程の効果を評価することを含んでなる、試料でのポリユビキチンの機能及び／又は活性を決定する方法。ユビキチン分子の第一アミノ酸位の第一リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第一ポリユビキチンに特異的に結合し、該抗体がユビキチン分子の第二アミノ酸位の第二リジン残基への少なくとも一のイソペプチド結合を含む第二ポリユビキチンに特異的に結合せず、このとき該第一および該第二のアミノ酸位が異なる、単離された抗体。
【請求項６２】
前記抗体がリジン-６３連鎖性ポリユビキチンのエピトープに結合する、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項６３】
前記エピトープは、リジン-６３連鎖性ポリユビキチンの第二ユビキチンサブユニットと第一ユビキチンサブユニットの両方に残基を含む、請求項６２に記載の単離された抗体。
【請求項６４】
前記エピトープが、Ｇｌｕ-１８、Ｐｒｏ-１９、Ｓｅｒ-２０、Ａｓｐ-２１、Ｔｈｒ-５５、Ｌｅｕ-５６、Ｓｅｒ-５７、Ａｓｐ-５８、Ａｓｎ-６０、Ｉｌｅ-６１、及びＧｌｎ-６２から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項６３に記載の単離された抗体。
【請求項６５】
前記エピトープが、Ｌｅｕ-８、Ｔｈｒ-９、Ｇｌｕ-３４、Ｇｌｙ-３５、Ｉｌｅ-３６、Ｐｒｏ-３７、Ａｓｐ-３９、Ｇｌｎ-４０、Ｌｅｕ-７１、Ａｒｇ-７２、Ｌｅｕ-７３、Ａｒｇ-７４、Ｇｌｙ-７５から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項６３に記載の単離された抗体。
【請求項６６】
前記エピトープが、Ｇｌｕ-１８、Ｐｒｏ-１９、Ｓｅｒ-２０、Ａｓｐ-２１、Ｔｈｒ-５５、Ｌｅｕ-５６、Ｓｅｒ-５７、Ａｓｐ-５８、Ａｓｎ-６０、Ｉｌｅ-６１、及びＧｌｎ-６２から選択される第一ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基と、Ｌｅｕ-８、Ｔｈｒ-９、Ｇｌｕ-３４、Ｇｌｙ-３５、Ｉｌｅ-３６、Ｐｒｏ-３７、Ａｓｐ-３９、Ｇｌｎ-４０、Ｌｅｕ-７１、Ａｒｇ-７２、Ｌｅｕ-７３、Ａｒｇ-７４、及びＧｌｙ-７５から選択される第二ユビキチンサブユニットに少なくとも一の残基を含む、請求項６３に記載の単離された抗体。
【請求項６７】
請求項１から３８及び６２から６６のいずれか一に記載の抗体の抗原結合断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
【図１】ユビキチンの一次構造および特定のポリユビキチンイソペプチド結合の略図を示す。図１Ａは、ヒトのユビキチンのアミノ酸配列(配列番号：３７７)を示し、リジン残基を太字で下線を引いて示した。図１Ｂは、第一ユビキチン分子のリジン-４８又はリジン-６３と第二ユビキチン分子のＣ末端グリシン残基との間で形成される結合の模式図を示す。
【図２Ａ−Ｃ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。識別子「４８」は、抗体分子がＫ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識したことを示す。識別子「ｂｏｔｈ」は、抗体分子がＫ４８-連鎖性ポリユビキチンとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンの両方を認識したことを示す。識別子「ａｌｌ」は、抗体分子がＫ４８-連鎖性ポリユビキチンとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンの両方並びにモノユビキチンを認識したことを示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図３Ａ−Ｂ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。識別子「６３」は、抗体分子がＫ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識したことを示す。識別子「ｂｏｔｈ」は、抗体分子がＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとＫ４８-連鎖性ポリユビキチンの両方を認識したことを示す。識別子「ａｌｌ」は、抗体分子がＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとＫ４８-連鎖性ポリユビキチンの両方並びにモノユビキチンを認識したことを示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図４Ａ−Ｂ】以下に示す配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す。  可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク(図４Ａおよび４Ｂ)：ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１１１、８３９、８５８および８７７)。ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１１２−１１４、８４０−８４２、８５９−８６１および８７８−８８０)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１１５、８４３、８６２および８８１)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１１６−１１８、８４４−８４６、８６３−８６５および８８２−８８４)。ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１１９、８４７、８６６および８８５)。ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１２０−１２２、８４８−８５０、８６７−８６９および８８６−８８８)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１２３、８５１、８７０および８８９)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１２４−１２５、８５２−８５３、８７１−８７２および８９０−８９１)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１２６、８５４、８７３および８９２)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：１２７−１２９、８５５−８５７、８７４−８７６および８９３−８９５)。
【図５】以下に示す配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す。  可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク(図５)：ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３０、８９６、９００および９０４)。ヒトＶＬκサブグループIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３１、８９７、９０１および９０５)。ヒトＶＬκサブグループIIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３２、８９８、９０２および９０６)。ヒトＶＬκサブグループIVコンセンサスフレームワーク(配列番号：１３３、８９９、９０３および９０７)。
【図６】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖および重鎖のフレームワーク領域配列を表す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。
【図７】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖および重鎖の修飾／変異フレームワーク領域配列を表す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。
【図８Ａ−Ｃ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図９Ａ−Ｂ】実施例１(Ａ)に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ1、Ｈ2およびＨ3を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図１０Ａ−Ｃ】実施例１(Ｂ)に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された抗ポリユビキチン抗体分子ａｐｕ０１−ａｐｕ１５の重鎖及び軽鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図１１Ａ−Ｃ】実施例１(Ｂ)に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された抗ポリユビキチン抗体分子ａｐｕ１７−ａｐｕ２４の重鎖及び軽鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。
【図１２】実施例１(Ｃ)に記載のように、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析を用いて観察した、様々な濃度の抗ポリユビキチンＦａｂ ａｐｕ０９とＫ４８-連鎖性ないしはＫ６３-連鎖性のポリユビキチンとの間の結合相互作用を示す。
【図１３Ａ−Ｂ】実施例１(Ｃ)に記載のように、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析を用いて観察した、様々な濃度の抗ポリユビキチンＦａｂ ａｐｕ１８とＫ４８-連鎖性ないしはＫ６３-連鎖性のポリユビキチンとの間の結合相互作用を示す。
【図１４Ａ−Ｆ】実施例２に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する、Ｆａｂ ａｐｕ０５の配列に基づいた第二世代の抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ０５の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。太字は、抗体が実施例２に記載するファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて強い結合を示したことを示す。
【図１５Ａ−Ｃ】実施例２に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチンを特異的に認識する、Ｆａｂ ａｐｕ１８の配列に基づいた第二世代の抗ポリユビキチン抗体分子の重鎖ＨＶＲループ配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ１８の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。太字は、抗体が実施例２に記載するファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて強い結合を示したことを示す。
【図１６Ａ−Ｂ】実施例２に記載の、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン(ａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０)を特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された、突然変異させたａｐｕ０５由来のＦａｂ分子の重鎖高頻度可変領域のアミノ酸配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ０５の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。
【図１７Ａ−Ｂ】実施例２に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン(ａｐｕ２.１１−ａｐｕ２.２０)を特異的に認識し、ペンタヒスチジンに特異的な抗体によって認識された、突然変異させたａｐｕ１８由来のＦａｂ分子の重鎖高頻度可変領域のアミノ酸配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列であるＬ３を示す。識別子「ｎ．ｐ．」は、あるクローンが示す位置のアミノ酸を有さなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がＦａｂ ａｐｕ１８の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。
【図１８】Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン、モノユビキチンおよびウシ血清アルブミンに対する各々の第二世代のＦａｂ ａｐｕ２.０１−２.２０の結合が評価された実施例２に記載のファージＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図１９Ａ】実施例１に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対する、クローンａｐｕ０１からａｐｕ１５から産生されたＦａｂの結合を示す。
【図１９Ｂ】実施例１に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。固定したＫ６３-連鎖性ポリユビキチンに対する、クローンａｐｕ１８からａｐｕ２４から産生されたＦａｂの結合の欠如を示す。
【図２０】実施例２に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図２０Ａは、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ２.０１−ａｐｕ２.１０の結合と、固定したＫ６３-連鎖性ジユビキチンに対する結合の欠如を示す。図２０Ｂは、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ２.１１−ａｐｕ２.２０の結合と、固定したＫ４８-連鎖性ジユビキチンに対する結合の欠如を示す。
【図２１】実施例３に記載の、ＲＩＰのユビキチン化状態を検出するための免疫沈降実験からのウエスタンブロットを示す。図２１Ａのブロットは、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン化タンパク質を捕獲するためにａｐｕ２.１６ ＩｇＧによって免疫沈降した試料を含む。図２１Ｂのブロットは、Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン化タンパク質を捕獲するためにａｐｕ２.０７ ＩｇＧによって免疫沈降した試料を含む。両方のブロットは抗ＲＩＰ抗体にて染色した。
【図２２】Ｋ４８-連鎖性ポリユビキチン、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン、モノユビキチンおよびウシ血清アルブミンに対する各々の第三世代のクローンａｐｕ３.０１−３.１２の結合が評価された実施例４に記載のファージＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図２３Ａ−Ｂ】実施例４に記載の、Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン(ａｐｕ３.０１−ａｐｕ３.１２)を特異的に認識する突然変異させたａｐｕ２.１６由来のクローンの重鎖高頻度可変領域のアミノ酸配列を示す。図は、重鎖ＨＶＲ配列であるＨ1、Ｈ2およびＨ3を示す。識別子「ＮＤ」は配列が決定されなかったことを示す。アミノ酸位は本明細書中に示すカバット番号付けシステムに従って番号付けする。陰を付けた部分は、配列がａｐｕ２.１６の対応するＨＶＲ配列のアミノ酸配列と同一であることを示す。
【図２４Ａ−Ｂ】実施例４に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図２４Ａは、固定したＫ４８-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチンに対するａｐｕ２.０７の結合と、固定したＫ６３-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチン又はモノユビキチンに対する結合の欠如を示す。図２４Ｂは、固定したＫ６３-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチンに対するａｐｕ３.０７ ＩｇＧの結合と、固定したＫ４８-連鎖性トリユビキチンからヘプタユビキチン又はモノユビキチンに対する結合の欠如を示す。
【図２４Ｃ−Ｄ】実施例４に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図２４Ｃは、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ２.０７の濃度依存的な結合と、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンに対する結合の欠如を示す。図２４Ｄは、固定したＫ６３-連鎖性テトラユビキチンに対するａｐｕ３.０７ ＩｇＧの濃度依存的な結合と、固定したＫ４８-連鎖性テトラユビキチンに対する結合の欠如を示す。
【図２５】実施例４に記載のウェスタンブロッティング実験の結果を表す。図は、ベルケイド(登録商標)で処理した２９３Ｔ細胞(＋)又は未処理の２９３Ｔ細胞(−)の固定した溶解物に対する抗ユビキチンポリクローナル抗体、ａｐｕ２.０７ ＩｇＧ、およびａｐｕ３.０７ ＩｇＧの結合を示す。
【図２６Ａ】結晶学的分析によって測定した、本発明のＫ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的ｆａｂとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとの間の相互作用を示す。Ｋ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的ｆａｂであるａｐｕ２.１６とＫ６３-連鎖性ジユビキチンとの間で形成された複合体を示す。Ａｐｕ２.１６は図の下方にリボン線図で示し、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンは図の上方に球状形状で示す。
【図２６Ｂ−Ｃ】結晶学的分析によって測定した、本発明のＫ６３-連鎖性ポリユビキチン特異的ｆａｂとＫ６３-連鎖性ポリユビキチンとの間の相互作用を示す。図２６Ｂは、Ｋ６３-連鎖性ジユビキチンの表面を表し、ｆａｂの４．５Å内の残基を濃い灰色で着色し、対象の残基を標識した。図２６Ｃは、ａｐｕ２.１６の表面を表し、Ｋ６３-連鎖性ユビキチンダイマーの４．５Å内の残基を濃い灰色で着色した。ＣＤＲを標識した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６Ａ】
2009519716.tif 000065
【国際調査報告】
2009519716.tif 000066
2009519716.tif 000067
2009519716.tif 000068
2009519716.tif 000069
2009519716.tif 000070