(57)【要約】本発明は、希乏突起神経膠細胞およびＣＮＳミエリンによって発現される希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）が、希乏突起神経膠細胞およびニューロンの分化および生存に対して負の調節を行なうという知見に基づく。このような知見に基づき、本発明は、一般的に、ＯＭｇｐアンタゴニストの投与により、ニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の生存および分化を促進させる方法に関する。さらに、本発明は、一般的に、ＯＭｇｐアンタゴニストの投与により、脱髄、髄鞘発育不全、希乏突起神経膠細胞／ニューロンの細胞死、軸索の損傷および／または分化と関連する種々の疾患、障害または損傷を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロンを、
（ｉ）可溶性ＯＭｇｐポリペプチド；
（ｉｉ）ＯＭｇｐ抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストの有効量に、
接触させることを含む、ニューロンの分化または生存を促進させるための方法。
【請求項２】
希乏突起神経膠細胞を、
（ｉ）可溶性ＯＭｇｐポリペプチド；
（ｉｉ）ＯＭｇｐ抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストと接触させることを含む、希乏突起神経膠細胞の分化または生存を促進させるための方法。
【請求項３】
哺乳動物においてニューロンの髄鞘形成を促進するための方法であって、その必要がある哺乳動物に、
（ｉ）可溶性ＯＭｇｐポリペプチド；
（ｉｉ）ＯＭｇｐ抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストの有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４】
哺乳動物におけるニューロンの死またはニューロンの分化の欠如と関連する疾患、障害または損傷を処置するための方法であって、その必要がある哺乳動物に、
（ｉ）可溶性ＯＭｇｐポリペプチド；
（ｉｉ）ＯＭｇｐ抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５】
（ｉ）可溶性ＯＭｇｐポリペプチド；
（ｉｉ）ＯＭｇｐ抗体；
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、哺乳動物における髄鞘発育不全または脱髄と関連する疾患、障害または損傷を処置するための方法。
【請求項６】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストが可溶性ＯＭｇｐポリペプチドを含む、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、
（ｉ）ＯＭｇｐシステイン高含有ドメインまたはその断片、バリアントもしくは誘導体、
（ｉｉ）ＯＭｇｐ  ＬＲＲドメインまたはその断片、バリアントもしくは誘導体、
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐセリン／トレオニン高含有ドメインまたはその断片、バリアントもしくは誘導体、および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐドメイン、その断片、バリアントまたは誘導体の少なくとも２種類の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐ領域を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、
（ｉ）ＯＭｇｐシステイン高含有ドメイン、
（ｉｉ）ＯＭｇｐ  ＬＲＲドメイン；
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐセリン／トレオニン高含有ドメイン；および
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＯＭｇｐドメインの少なくとも２種類の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐドメインを欠失している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５４；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５６；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜７５；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜９８；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜１６６；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜１９１；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２１５；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２２８；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜４２５；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜４４０；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜５４；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜５６；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜７５；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸２５〜９８；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸２５〜１６６；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜１９１；
（ｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜２１５；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜２２８；
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸２５〜４２５；
（ｘｘ）配列番号：２のアミノ酸２５〜４４０；
（ｘｘｉ）前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体、および
（ｘｘｉｉｉ）前記ポリペプチド断片またはそのバリアントもしくは誘導体のいずれかの少なくとも２種類の組合せ
からなる群より選択されるポリペプチド断片を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜７５；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜９８；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜１６６；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸５５〜１９１；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸５５〜２１５；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜２２８；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜７５；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜９８；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸５７〜１６６；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸５７〜１９１；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜２１５；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜２２８；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸７９〜９８；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１４７〜１６６；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸１６８〜１９１；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１９２〜２１５；
（ｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１９２〜２２８；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２１６〜４２５；
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸２２９〜４２５；
（ｘｘ）配列番号：２のアミノ酸４２６〜４４０；
（ｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜４２５；
（ｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜４２５；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２１６〜４４０；
（ｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸２２９〜４４０；
（ｘｘｖ）前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体、および
（ｘｘｖｉ）前記ポリペプチド断片またはそのバリアントもしくは誘導体のいずれかの少なくとも２種類の組合せ
からなる群より選択されるポリペプチド断片を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸残基２５〜４２５を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、ＯＭｇｐロイシン高含有ドメインまたはその断片、バリアントもしくは誘導体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜２２８
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜２２８；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜２１５；および
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸５７〜２２８
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが環状ペプチドである、請求項６〜１３いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記環状ペプチドが、そのＮ末端に結合されたビオチン分子およびそのＣ末端に結合されたシステイン残基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記環状ペプチドが、そのＮ−およびＣ末端に結合されたシステイン残基を含み、前記Ｎ末端システイン残基がアセチル化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃ末端システインが、結合されたＮＨ２部分を有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが非ＯＭｇｐ部分をさらに含む、請求項６〜１７いずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記非ＯＭｇｐ部分が、前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドに融合されたポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非ＯＭｇｐ部分が、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製助長部分からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ＯＭｇｐ部分が抗体Ｉｇ部分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体Ｉｇ部分がヒンジおよびＦｃ部分である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドがポリマーにコンジュゲートされている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが、１、２、３または４つのポリマーにコンジュゲートされている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリマーの総分子量が５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストがＯＭｇｐ抗体またはその断片を含む、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＯＭｇｐ抗体またはその断片が、
（ｉ）ＯＭｇｐシステイン高含有ドメイン、
（ｉｉ）ＯＭｇｐ  ＬＲＲドメイン；および
（ｉｉｉ）ＯＭｇｐセリン／トレオニン高含有ドメイン
からなる群より選択されるＯＭｇｐドメインを含むＯＭｇｐポリペプチドに特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＯＭｇｐ抗体またはその断片が、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５４；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５６；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜７５；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜９８；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜１６６；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜１９１；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２１５；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２２８；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜４２５；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜４４０；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜５４；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜５６；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜７５；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸２５〜９８；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸２５〜１６６；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜１９１；
（ｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜２１５；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５〜２２８；
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸２５〜４２５；
（ｘｘ）配列番号：２のアミノ酸２５〜４４０；および
（ｘｘｉ）前記ＯＭｇｐポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体
からなる群より選択されるＯＭｇｐポリペプチド断片を含むポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＯＭｇｐ抗体またはその断片が、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜７５；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜９８；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜１６６；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸５５〜１９１；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸５５〜２１５；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜２２８；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜７５；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜９８；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸５７〜１６６；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸５７〜１９１；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜２１５；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜２２８；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸７９〜９８；：
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１４７〜１６６；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸１６８〜１９１；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１９２〜２１５；
（ｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１９２〜２２８；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２１６〜４２５；
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸２２９〜４２５；
（ｘｘ）配列番号：２のアミノ酸４２６〜４４０；
（ｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸５５〜４２５；
（ｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸５７〜４２５；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２１６〜４４０；
（ｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸２２９〜４４０；
（ｘｘｖ）前記ポリペプチド断片のいずれかのバリアントまたは誘導体；および
（ｘｘｖｉ）前記ポリペプチド断片またはそのバリアントもしくは誘導体のいずれかの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＯＭｇｐポリペプチドを含むポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストが、ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドを含む、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドが、
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）スモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドが、ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０個の塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドがリボザイムである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物が、脱髄、髄鞘発育不全または神経変性を伴う疾患、障害または損傷と診断されている、請求項３〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患、障害または損傷が、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中心性橋融解症（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後の損傷、化学療法の神経病合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、およびベル麻痺からなる群より選択される、請求項３〜５または３９いずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患、障害または損傷が多発性硬化症である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストが、ボーラス注射または長期注入によって投与される、請求項３〜４１６いずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストが中枢神経系内に直接投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストがＭＳの慢性病変内に直接投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）発現制御配列への作動可能な連結を介して前記ＯＭｇｐアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドで、前記ニューロンまたは希乏突起神経膠細胞をトランスフェクトすること、および（ｂ）前記ＯＭｇｐアンタゴニストの発現を可能にすることを含む、請求項１または２いずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）前記哺乳動物に、発現制御配列への作動可能な連結を介して前記ＯＭｇｐアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを投与すること、および（ｂ）前記ＯＭｇｐアンタゴニストの発現を可能にすることを含む、請求項３〜４１いずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターとして投与される、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与が、（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞であって、前記ＯＭｇｐアンタゴニストを発現する培養宿主細胞を提供すること；および（ｂ）前記培養宿主細胞を前記哺乳動物内に、前記ＯＭｇｐアンタゴニストが前記哺乳動物において発現されるように導入することを含む、請求項３〜４１いずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記培養宿主細胞が前記哺乳動物内に、神経系の疾患、障害または損傷の部位またはその近傍に導入される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記培養宿主細胞が、（ａ）レシピエント宿主細胞を請求項４６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４８に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトすること、および（ｂ）前記形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養することを含む方法によって作製される、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記培養宿主細胞が処置対象の哺乳動物由来のものである、請求項４９〜５１いずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストが、神経系の疾患、障害または損傷の部位またはその近傍で、ニューロンまたは希乏突起神経膠細胞の分化の阻害を低減するのに充分な量で発現される、請求項３〜５２いずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＯＭｇｐアンタゴニストが、神経系の疾患、障害または損傷の部位またはその近傍で、ニューロンの髄鞘形成の阻害を低減するのに充分な量で発現される、請求項３〜５３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、およびポックスイルスベクターからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純疱疹ウイルスベクターおよびエプスタイン−バーウイルスベクターからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ベクターが、局所的投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される、請求項４７、４８または５５〜５７いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経生物学、神経学および薬理学に関する。より詳しくは、本発明は、ニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化を促進させる方法、ならびにＯＭｇｐアンタゴニストの投与により、関連するニューロンの疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
外傷および疾患による損傷後、中枢神経系（ＣＮＳ）において、損傷したニューロンは再生しない。損傷後に軸索が再生しないことは、軸索成長阻害因子の存在に起因し得るこのような阻害因子は、主として、ミエリンと会合しており、再生に対する重要な障壁を構成している。軸索成長阻害因子は、ＣＮＳ由来ミエリンおよび、ＣＮＳにおいてミエリンを合成する希乏突起神経膠細胞の原形質膜に存在している（非特許文献１）。
【０００３】
ＣＮＳミエリンは、希乏突起神経膠細胞の細胞膜の複雑な伸長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）である。単一の希乏突起神経膠細胞は、３０以上もの多くの異なるＣＮＳ軸索セグメントがミエリン形成（ｍｙｅｌｉｎａｔｅ）される。希乏突起神経膠細胞膜の伸長部により、軸索が同心状に包まれ、ミエリン鞘が形成されている。緻密な成熟ミエリンは、水和タンパク質の層と並んだ生体分子脂質の平行な層からなる。活発なミエリン合成は、子宮で開始され、人間の一生の最初の２年間継続される。幼児期および青年期の間、より低速で合成が継続されるが、成熟ミエリンのターンオーバーは、成人期を通して、低速で継続される。ミエリンの発生形態および成熟形態はともに、疾患または身体的外傷による損傷を受けやすく、軸索を覆うミエリンの損傷がもたらされる。
【０００４】
ミエリン関連阻害因子は、軸索の連続性の遮断後、インビボでのＣＮＳ軸索再生不足に対する主な寄与因子と思われ、一方で、ＣＮＳにおける他の非ミエリン関連軸索成長阻害因子は、程度は低いがある役割を果たしている可能性がある。このようなミエリン阻害因子は、外傷、脳卒中またはウイルス感染によるニューロンの損傷後の軸索の再生を阻止する（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
希乏突起神経膠細胞上に見られる数種類のミエリン阻害タンパク質は、キャラクタライズされている。ミエリン阻害タンパク質の既知の例としては、ＮｏｇｏＡ（非特許文献５；非特許文献６）、ミエリン会合糖タンパク質（ＭＡＧ）（非特許文献７；非特許文献８）および希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）、非特許文献９）が挙げられる。これらのタンパク質は各々、独立して、ニューロンＮｇＲ１のリガンドであることが示されている（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００２、４１７、９４１−９４４；Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００、４０３、４３９−４４４；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０３、４３４−４３９；Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２００２、２００２年６月２８日にオンラインで発行）。
【０００６】
具体的には、希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）は、約１２０ｋＤの分子量を有し、グリコシル化されており、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質中間アンカーを介して細胞膜に連結されている。ＯＭｇｐは、ほぼ２４アミノ酸残基のリーダー配列と、４つの構造ドメインを含む。該タンパク質のＮ末端部分は、システイン高含有領域（ＣＲ）またはＮ末端ロイシン高含有反復配列（ＬＲＲ）ドメイン（約３２アミノ酸残基長）、続いて約１９０〜２０５アミノ酸残基長に及ぶいくつかのロイシン高含有反復配列（ＬＲＲ）ドメイン（Ｎ−およびＣ末端キャップを含む）を含む。ＯＭｇｐタンパク質は、ほぼ６つのＬＲＲドメインを含む。残りの２つのドメインは、約１９７アミノ酸のセリン−トレオニン高含有（Ｓ／ＴＲ）領域およびＯＭｇｐのＣ末端の約１５アミノ酸の疎水性ＣＯＯＨ−配列である。ＯＭｇｐのＳ／ＴＲ領域は、Ｏ−連結糖鎖に結合し得る部位を有する。当業者には、ドメイン（例えば、ＬＲＲドメイン）の境界および数は、ポリペプチドにおいて、どのタンパク質構造モデル設計プログラムを用いてタンパク質の構造を解析するかに応じて異なり得ることが認識されよう。
【０００７】
ＯＭｇｐは、そのタンパク質内にシステイン高含有領域およびロイシン高含有領域を含むため、ＣＲ−ＬＲＲタンパク質ファミリーの一構成員である。ＣＲドメインおよびＬＲＲドメインは、ＣＲ−ＬＲＲファミリーのタンパク質によって媒介される細胞接着を担うと考えられる。このファミリーのタンパク質の他の例は、血小板糖タンパク質Ｉｂのαおよびβ鎖、ビグリカンおよびカオプチン（ｃｈａｏｐｔｉｎ）である。ＯＭｇｐは、従来より、ＣＮＳのミエリン膜の一成分とみなされている。最近、ＯＭｇｐは、ミエリンの外側表面上に延在して出現する薄い膠細胞膜の一成分であることが見出された（Ｈｕａｎｇら原稿準備中）。
【０００８】
ニューロンの生存、増殖および分化を促進するための分子および方法の未対処の必要性が存在する。特に、ニューロンまたは希乏突起神経膠細胞の細胞死を伴うか、または一般的に神経系に関する疾患、障害または損傷の処置の必要性が存在する。
【０００９】
かかる疾患、障害または損傷としては、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中心性橋融解症（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（Ｇｌｏｂｏｉｄ  ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（クラッベ病）およびウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後の（ｐｏｓｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）損傷、化学療法の神経病合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ならびにベル麻痺が挙げられる。これらの疾患のうち、ＭＳは、最も広範囲で見られ、世界中でほぼ２５０万人の人々が罹患している。
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｂら（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６、５６５−５９５
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｔｉｓら、２００１、Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：１１−１４
【非特許文献３】Ｊｏｎｅｓら、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２７９２−２８０３
【非特許文献４】Ｇｒｉｍｐｅら、２００２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．：２２：３１４４−３１６０
【非特許文献５】Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０３、４３４−４３９
【非特許文献６】Ｇｒａｎｄｐｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００、４０３、４３９−４４４）
【非特許文献７】ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら、１９９４、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：８０５−８１１
【非特許文献８】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、１９９４、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−７６７
【非特許文献９】Ｍｉｋｏｌら、１９８８、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６  ：１２７３−１２７９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な概要）
本発明は、希乏突起神経膠細胞およびＣＮＳミエリンによって発現される希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）（ＯＭｇｐは、文献において、Ｓｐ３７とも示されている）が、希乏突起神経膠細胞およびニューロンの分化、増殖および生存に対して負の調節を行なうという知見に基づく。ＯＭｇｐノックアウトマウスのニューロンは、その野生型同腹子と比べると、生存の増大および早期の分化開始を示した。このような知見に基づき、本発明は、一般的に、ＯＭｇｐアンタゴニストの投与により、ニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の生存および分化を促進させる方法に関する。さらに、本発明は、一般的に、ＯＭｇｐアンタゴニストの投与により、脱髄、髄鞘発育不全、希乏突起神経膠細胞／ニューロンの細胞死、軸索の損傷および／または分化と関連する種々の疾患、障害または損傷を処置する方法に関する。
【００１１】
特定のある実施形態において、本発明は、ニューロンをＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させることを含む、ニューロンの分化、増殖または生存を促進させる方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、希乏突起神経膠細胞をＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させること希乏突起神経膠細胞の増殖、分化または生存を促進させる方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、哺乳動物にＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物においてニューロンの髄鞘形成を促進させる方法を提供する。
【００１４】
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物においてニューロン死または希乏突起神経膠細胞死またはあるいは増殖および／または分化の欠如  と関連する疾患、障害または損傷を処置する方法であって、その必要がある哺乳動物に、ＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、哺乳動物においてミエリンの破壊を伴う疾患、障害または損傷を処置する方法に関する。
【００１６】
上記の方法の種々の実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、ニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成に対して負の調節を行なうＯＭｇｐの能力に干渉する任意の分子であり得る。特定のある実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体もしくはその断片、ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、または２種類以上のＯＭｇｐアンタゴニストの組合せである。
【００１７】
特定のある実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは可溶性ＯＭｇｐポリペプチドである。本発明のある種の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、以下のドメイン：ＯＭｇｐシステイン高含有ドメイン、ＯＭｇｐ  ＬＲＲ、ＯＭｇｐセリン／トレオニン高含有ドメイン、ＯＭｇｐシステイン高含有ドメインのその断片、バリアントもしくは誘導体、ＬＲＲドメインもしくはセリン／トレオニン高含有ドメイン、または前記ＯＭｇｐドメイン、その断片、バリアントもしくは誘導体の少なくとも２種類の組合せを含むか、または欠如したものである。一部のある実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、ボーラス注射または長期注入によって投与される。一部のある実施形態において、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは中枢神経系内に長期投与される。一部のある実施形態において、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドはＭＳの慢性病変内に長期投与される。
【００１８】
他の実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、以下のＯＭｇｐ領域またはドメイン：ＯＭｇｐシステイン高含有ドメイン、ＯＭｇｐ  ＬＲＲドメイン；ＯＭｇｐセリン／トレオニン高含有ドメインの１つ以上を含むＯＭｇｐポリペプチドに結合するＯＭｇｐ抗体またはその断片である。さらに、ＯＭｇｐ抗体またはその断片は、本明細書に記載のＯＭｇｐポリペプチド断片を含むポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。
【００１９】
他の実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはスモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などである。
【００２０】
一部のある実施形態において、該疾患、障害または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中心性橋融解症（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後の損傷、化学療法の神経病合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛またはベル麻痺である。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物に対し、疾患、障害または損傷の部位またはその近傍に、ＯＭｇｐアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含むベクター投与することを含み、その結果、該哺乳動物において該ヌクレオチド配列からＯＭｇｐアンタゴニストが、該損傷の部位またはその近傍におけるニューロンまたは希乏突起神経膠細胞の死、増殖および／または分化の阻害を低減するのに充分な量で発現される、インビボ遺伝子療法により疾患、障害または損傷を処置する方法を含む。特定のある実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純疱疹ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである。一部のある実施形態において、該ベクターは、局所的投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される。
【００２２】
一部のある実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは非ＯＭｇｐ部分を含む融合ポリペプチドである。一部のある実施形態において、非ＯＭｇｐ部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製助長部分からなる群より選択される。一部のある実施形態において、抗体のＩｇ部分はヒンジおよびＦｃ部分である。
【００２３】
一部のある実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体はポリマーにコンジュゲートされている。一部のある実施形態において、該ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される。一部のある実施形態において、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一部のある実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体は、１、２、３または４つのポリマーにコンジュゲートされている。一部のある実施形態において、該ポリマーの総分子量は５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
定義
特に記載のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本発明の明細書に支配される。状況によって必要とされる場合を除き、単数形の用語は複数形のものを含むものとし、複数形の用語は単数形のものを含むものとする。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許および他の参考文献は、引用によりその全体が、あらゆる目的のために、個々の各刊行物または特許出願が引用により組み込まれて具体的かつ個々に示されているのと同程度に、本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書に記載したものと類似するか同等な方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料を以下に記載する。該材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００２６】
本発明をさらに規定するため、以下の用語および定義を提供する。
【００２７】
用語「ａ」または「ａｎ」のつく存在体は、１つ以上の該存在体をいうことに注意されたい。例えば、「免疫グロブリン分子（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」は、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解されたい。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００２８】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、任意の記載の整数値または整数値の群を含むが、任意の他の整数値または整数値の群を排除しないことを示す。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の治療成果が達成されるのに有効な量をいう。治療成果は、例えば、症状の軽減、生存の延長、運動性の改善などであり得る。治療成果は「治癒」である必要はない。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「予防有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の予防成果が達成されるのに有効な量をいう。典型的には、予防用量は、被験体において疾患前または疾患病期の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」は、非翻訳５’および３’配列、コード配列を含む完全長のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、ならびに該核酸配列の断片、エピトープ、ドメインおよびバリアントを含むものであり得る。ポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されたものであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、単鎖および二本鎖のＤＮＡ、単鎖と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに単鎖と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、単鎖またはより典型的には二本鎖もしくは単鎖と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成されたものであり得る。また、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域で構成されたものであり得る。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖を含有するものであり得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基、例えばイノシンなどが挙げられる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態が包含される。
【００３２】
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド等量式（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結されたアミノ酸で構成されたものであり得、遺伝子にコードされた２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、非天然に存在するアミノ酸）を含有するものであり得る。本発明のポリペプチドは、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法のいずれかによって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、ポリペプチド内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端においてなされ得る。所与のポリペプチドにおいて、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のポリペプチドは多くの型の修飾を含むものであり得る。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝鎖であり得、分岐を伴う、または伴わない環状であり得る。環状で分枝鎖の、および分枝鎖で環状のポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００３３】
用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類縁体」には、本発明のＯＭｇｐアンタゴニストを指す場合、ＯＭｇｐ活性を阻害する能力を少なくとも一部保持している任意のアンタゴニスト分子が含まれる。本明細書に記載するＯＭｇｐアンタゴニストには、ＯＭｇｐアンタゴニストが依然としてその機能を発揮する限り、限定されないが、断片、バリアントまたは誘導体分子が含まれ得る。本発明の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドには、ＯＭｇｐのタンパク質分解的断片、欠失断片および、特に、動物に送達されたとき、より容易に作用部位に達する断片が含まれ得る。ポリペプチド断片は、さらに、天然の該ポリペプチドの抗原性または免疫原性のエピトープ、例えば、線状エピトープならびに３次元エピトープを含む該ポリペプチドの任意の部分を含む。本発明の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、バリアントＯＭｇｐ領域、例えば上記の断片、また、アミノ酸の置換、欠失または挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むものであり得る。バリアントは、自然界に存在するもの、例えば対立遺伝子バリアントなどであり得る。「対立遺伝子バリアント」により、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の択一的な形態が意図される。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しないバリアントは、当該技術分野で知られた変異誘発手法を用いて作製され得る。可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、同類もしくは非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含むものであってもよい。本発明のＯＭｇｐアンタゴニストはまた、誘導体分子を含み得る。例えば、本発明の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、天然のポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように改変されたＯＭｇｐ領域を含むものであり得る。例としては、融合タンパク質およびタンパク質コンジュゲートが挙げられる。
【００３４】
本発明において、「ポリペプチド断片」は、ＯＭｇｐポリペプチドの短いアミノ酸配列をいう。タンパク質断片は、「独立したもの（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、またはより大きなポリペプチド内においてその一部の領域を構成しているものであり得る。本発明のポリペプチド断片の代表例としては、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸および約１００アミノ酸長を含む断片が挙げられる。
【００３５】
抗体または免疫グロブリン。一実施形態において、本明細書に開示する処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニストは、「抗体」もしくは「免疫グロブリン」分子、あるいは免疫特異的もしくは抗原結合断片またはその抗原結合断片、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子または操作された抗体分子もしくは該抗体分子と同様の様式で抗原に結合する断片である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に用いる。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的充分理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版  １９８８）を参照のこと。
【００３６】
以下により詳細に論考するように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別され得る５つに大別される類型のポリペプチドを含む。５つの類型はすべて、明白に本発明の範囲内に含まれ、以下の論考は、一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関し、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がほぼ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。この４つの鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって連結されて「Ｙ」字型になっており、ここで、軽鎖は、「Ｙ」字の開口部から始まり、可変領域全体に続く重鎖と一体になる。
【００３７】
軽鎖および重鎖はともに、構造的および機能的に相同な領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は機能的に用いる。これに関して、軽鎖部分の可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖部分の可変ドメイン（ＶＨ）の両方によって、抗原認識および特異性が決定されることが認識されよう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインによって、分泌、経胎盤運動性、Ｆｃ受容体結合、相補鎖結合などの重要な生物学的特性が付与される。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて大きくなっている。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００３８】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合されたものであり得る。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合されており、２つの重鎖の「テイル」部分は互いに共有結合性ジスルフィド結合によって、または免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞もしくは遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって産生される場合は、非共有結合によって結合されている。重鎖において、そのアミノ酸配列は、Ｙ字型のフォーク型末端のＮ末端から各鎖の末端のＣ末端に向かっている。当業者には、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、これらはいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有することが認識されよう。抗体の「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧまたはＩｇＥに決定されることは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは充分キャラクタライズされており、機能的特殊性を付与することが知られている。これらの類型およびアイソタイプの各々の修飾異形は、本開示に鑑みて当業者に容易に識別可能であり、したがって、本発明の範囲内である。
【００３９】
上記のように、可変領域により、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、これに特異的に結合することが可能になる。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインが結合し、３次元の抗原結合部位を画定する可変領域を形成している。この４つの要素の抗体構造が、Ｙ字型の各アームの末端に存在する抗原結合部位を構成する。より詳しくは、抗原結合部位は、各ＶＨ鎖およびＶＬ鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。場合によっては、例えば、ラクダ科の種由来の、またはラクダ科の免疫グロブリンを元に操作されたある種の免疫グロブリン分子では、完全は免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり、軽鎖がないものであり得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ  Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６  ４４８（１９９３）を参照のこと。
【００４０】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメイン内に存在する６つの「相補性決定領域」あるいは「ＣＤＲ」は、該抗体が水性環境において３次元立体配置をとると抗原結合ドメインが形成されるように特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続配列である。抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残部は、「フレームワーク」領域と呼ばれ、示される分子間の多様性は少ない。フレームワーク領域は、主にβシート配置が採用され、ＣＤＲがループを形成し、これによりβシート構造が連結され、場合によっては、該構造の一部が構成される。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用による正しい向きでのＣＤＲの配置を提供する骨格を形成する機能を果たす。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的表面により、抗体とそのコグネートエピトープとの非共有結合性が促進される。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、精密に規定されているため、当業者により任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ、Ｅ．，ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）；ならびにＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００４１】
しかしながら、ラクダ科の種では、重鎖可変領域（ＶＨＨとよばれる）がＣＤＲ全体を構成する。ラクダ科のＶＨＨ可変領域と慣用的な抗体（ＶＨ）由来のものとの主な違いとしては、（ａ）ＶＨＨの対応する領域と比べてＶＨの軽鎖接触表面のアミノ酸がより疎水性である、（ｂ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ３がより長い、ならびに（ｃ）ＶＨＨ内のＣＤＲ１とＣＤＲ３間にジスルフィド結合が高頻度に存在することが挙げられる。
【００４２】
一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１種類以上の抗体分子に由来する少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１種類以上の抗体分子に由来する少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１種類以上の抗体分子に由来する少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１種類以上の抗体分子に由来する少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１種類以上の抗体分子に由来する少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題の抗原結合分子に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は当該技術分野で知られており、例示的な分子は本明細書に記載している。
【００４３】
本発明における方法のための抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片としては、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨいずれかのドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製される断片、または抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示された結合分子に対する抗Ｉｄ抗体など）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【００４４】
抗体断片、例えば単鎖抗体は可変領域（１つまたは複数）を、単独または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全体もしくは一部分との組合せで含むものであり得る。また、本発明には、同様に可変領域（１つまたは複数）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組合せを含む抗原結合断片が含まれる。本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片は、任意の動物起源、例えば、鳥類および哺乳動物に由来のものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマまたはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は、軟骨質（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）のものであり得る。本明細書で用いる場合、「ヒト」抗体としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体、およびヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは１種類以上のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子組み換えされ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体（後述、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載）が挙げられる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上側、中央および／または下側ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそのバリアントもしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明における使用のための結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むものであり得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明における使用のための結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠くものであり得る。上記に示すように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるように修飾され得ることは、当業者によって理解されよう。
【００４６】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのある種のＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片において、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、該多量体の第２のポリペプチド鎖のものと同一である。あるいはまた、本発明における方法のための重鎖部分含有単量体は同一でない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含み、例えば二重特異性抗体を形成しているものであり得る。
【００４７】
本明細書に開示された診断および処置方法における使用のための結合性ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであり得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含むものであり得る。別の例において、重鎖部分は、一部ＩｇＧ１分子に由来し、一部ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むものであり得る。別の例において、重鎖部分は、一部ＩｇＧ１分子に由来し、一部ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むものであり得る。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分は、少なくとも１つのＶＬまたはＣＬドメインを含む。
【００４９】
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非天然のバリアントをコードする単離された核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列内に、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードタンパク質に導入されるように導入することにより創製され得る。変異は、標準的な手法、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発などによって導入され得る。好ましくは、同類アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行なわれる。
【００５０】
また、本明細書に開示された処置方法における使用のための抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片は、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性に関して示され、または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ未満の解離定数あるいはＫｄを有するものが挙げられる。
【００５１】
本明細書に開示された処置方法における使用のための抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片は、本明細書に記載のＯＭｇｐのアンタゴニストとしての機能を果たす。例えば、本発明における方法のための抗体は、アンタゴニストとしての機能を果たし、ＯＭｇｐポリペプチドの抑制活性を阻止または阻害するものであり得る。
【００５２】
本明細書で用いる場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られたもの、または由来するものであり、定常領域（これは、インタクトなもの、一部分または本発明に従って修飾されたものであり得る）が第２の種から得られたものである任意の抗体を意味すると理解されたい。好ましい実施形態では、標的結合領域または部位が非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）由来のものであり、定常領域がヒトのものである。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「操作された抗体」は、重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが既知の特異性の抗体由来の１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、ならびに必要であれば、部分的なフレームワーク領域置換および配列変化によって改変された抗体をいう。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体由来のものであり得るが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種由来の抗体由来のものであることが想定される。既知の特異性の非ヒト抗体由来の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域内にグラフティングされた操作された抗体を、本明細書では、「ヒト化抗体」という。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のものに移すために、すべてのＣＤＲをドナー可変領域由来の完全なＣＤＲで置換する必要がない場合があり得る。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことが必要なだけである場合があり得る。その説明が、例えば米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に示されていることを考慮すると、これは、常套的な実験法を行なうこと、または機能的な操作もしくはヒト化抗体を得るための試行錯誤の試験のいずれかにより、充分当業者の能力の範囲内である。
【００５４】
本明細書で用いる場合、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は互換的に用いる。これらの用語は、どのような手段であれ（例えば、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段）、２つ以上の要素または成分が互いに連結されていることをいう。「インフレーム融合」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームが維持される様式で連結されて連続的な長いＯＲＦが形成されていることをいう。したがって、得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦにコードされるポリペプチドに対応する２つ以上の（ｔｗｏ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）セグメント（該セグメントは、通常、自然界ではこのように連結されていない）を含む単一のタンパク質である。したがって、リーディングフレームは融合セグメント全体において連続的となるが、該セグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分断されていてもよい。
【００５５】
ポリペプチドとの関連で、「線形配列」または「配列」は、アミノからカルボキシル末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、ここで、配列内で互いに隣接する残基は、そのポリペプチドの一次構造において連続している。
【００５６】
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドをもたらすプロセスをいう。該プロセスとしては、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕現、例えば、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現と安定な発現の両方などが挙げられる。これには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、スモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ  （ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびポリペプチド（１種類または複数種）へのかかるｍＲＮＡの翻訳が含まれる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現には、該生化学物質および任意の前駆物質の創製が含まれる。
【００５７】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」により、診断、予後または治療所望される任意の被験体、特に哺乳動物被験体が意図される。哺乳動物被験体としては、限定されないが、ヒト、家畜、飼養動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシなど）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなど）；イヌ科（例えば、イヌおよびオオカミなど）；ネコ科（例えば、ネコ、ライオンおよびトラなど）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバおよびシマウマなど）；食用動物（例えば、ウシ、ブタおよびヒツジなど）；有蹄動物（例えば、シカおよびキリンなど）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなど）；などが挙げられる。特定のある実施形態において、哺乳動物はヒト被験体である。
【００５８】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少をいう。これは、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、その二本鎖領域においてサイレンシングされた遺伝子の配列に相同なｓｉＲＮＡによって開始される。該遺伝子は、その生物体に対して内因性および外因性であり得、染色体内に組み込まれて存在し得るか、またはゲノム内に組み込まれていないトランスフェクションベクター内に存在させ得る。該遺伝子の発現は、完全に阻害されるか、または一部阻害されるかのいずれかである。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えられ得、標的ＲＮＡの機能は完全または一部であり得る。
希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質−ＯＭｇｐ（Ｓｐ３７）
本発明は、ＯＭｇｐ機能の失効によって、ニューロンおよび希乏突起神経膠細胞は、その生存、増殖および分化が促進されることにより数が増加するという知見に基づく。また、ＯＭｇｐのアンタゴニストは、ニューロンの髄鞘形成を促進し得る。
【００５９】
ヒトＯＭｇｐ遺伝子は、ＮＦ１遺伝子（染色体位置１７ｑ１１〜１２）のイントロン内に位置する。Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：９０６−９１２（１９９１）。ＮＦ１機能の低下をもたらす変異は、神経線維腫、リッシュ結節、カフェ・オ・レ斑、ならびに悪性神経線維肉腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）および視神経膠腫のリスクの増大を特徴とする疾患であるＩ型神経線維腫症をもたらす。
【００６０】
ＯＭｇｐの組織分布および発育時（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）発現が、ヒトＣＮＳミエリンおよびヒツジ希乏突起神経膠細胞（培養状態）において試験された。Ｖｏｕｒｃ’ｈおよびＡｎｄｒｅｓ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．４５：１１５−１２４（２００４）を参照のこと。さらに、発育中の齧歯類におけるＯＭｇｐ  ｍＲＮＡおよびタンパク質を調べる研究が行なわれた。ノザンブロット解析により、マウス脳において、ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡはＰ０からＰ２１まで増加し、次いで減少し、Ｐ２４で安定なレベルに達することが示された（Ｖｏｕｒｃ’ｈおよびＡｎｄｒｅｓ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．４５：１１５−１２４（２００４）。さらに、ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡの一時的発現をラットＣＮＳの発育中において研究し、ＯＭｇｐ遺伝子発現は、出生から生後第６週（Ｐ４２あたり）まで増大するという観察結果を伴った。Ｖｏｕｒｃ’ｈら、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１４４：１５９−１６８（２００３）を参照のこと。また、ＯＭｇｐの一時的発現プロフィールは、新生児ラットの脳から得た希乏突起神経膠細胞の培養物においても観察された。すなわち（Ｉｄ．）、これらの結果は、希乏突起神経膠細胞によるＯＭｇｐ発現が軸索のシグナルに依存しないことを示す。
【００６１】
天然に存在するヒトＯＭｇｐは、１２０ｋＤのグリコシル化されたタンパク質であり、４４０個のアミノ酸（配列番号：２）をコードする遺伝子から発現される。ＯＭｇｐは、Ｎｏｇｏ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＲ）リガンドファミリーの構成員である。ＯＭｇｐの成熟形態は約４０１個のアミノ酸である。ＮｇＲリガンドファミリー他の構成員としては、ミエリン会合糖タンパク質（ＭＡＧ）およびＮｏｇｏが挙げられる。ヒトＯＭｇｐポリペプチドは、ほぼ３２アミノ酸残基長のシステイン高含有（ＣＲ）ドメインまたはＮ末端ＬＲＲドメイン、続いて６または８つのタンデムロイシン高含有反復配列の鎖（Ｎ末端キャップ（ＬＲＲＮＴ）およびＣ末端キャップ（ＬＲＲＣＴ））を含む。予測される反復配列の数は、どのタンパク質コンピュータモデル設計プログラムを使用するかに応じて種々であり得る。ＬＲＲドメインは、ＯＭｇｐタンパク質のほぼ１９０〜２０５個のアミノ酸残基を含む。また、ＯＭｇｐは、約１９７アミノ酸残基長のセリン−トレオニン高含有（Ｓ／ＴＲ）ドメイン（これは、いくつかのＳ／Ｔ高含有反復配列に分かれたものであり得る）を含む（図１）。疎水性ドメインは、該タンパク質のＣ末端へのグリコシホスタジジル（ｇｌｙｃｏｓｙｐｈｏｓｔａｄｉｄｙｌ）イノシトール（ＧＰＩ）結合の結合前に切断される。ＯＭｇｐは、膜貫通ドメインを含まず、ＧＰＩアンカーを介して原形質膜の外側層に結合されている。ＬＲＲドメインは、該タンパク質のグリコシル化部位の大部分を含み、一方、Ｓ／ＴＲドメインは、いくつかの推定Ｏ−およびＮ−糖鎖修飾部位を含む。また、天然に存在するＯＭｇｐタンパク質は、該タンパク質のＮ末端に約２４アミノ酸長のシグナル配列を含む。表１に、配列番号：２または配列番号：４の配列に基づいたアミノ酸残基の数に従ってＯＭｇｐドメインの一覧を示す。
【００６２】
【表１−１】
2009513666.tif 000002
【００６３】
【表１−２】
2009513666.tif 000003
いくつかのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が、ヒトＯＭｇｐについて報告されている。これらの配列を以下に再現する。以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ヒトＯＭｇｐのｍＲＮＡとして報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＢＣ０１８０５０である。
【００６４】
【化１】
2009513666.tif 000004
【００６５】
【化２】
2009513666.tif 000005
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ヒトＯＭｇｐのｍＲＮＡとして報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＮＭ＿００２５４４である。
【００６６】
【化３】
2009513666.tif 000006
【００６７】
【化４】
2009513666.tif 000007
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ヒトＯＭｇｐのｍＲＮＡとして報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号Ｘ５１６９４である。
【００６８】
【化５】
2009513666.tif 000008
【００６９】
【化６】
2009513666.tif 000009
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ヒトＯＭｇｐのｍＲＮＡとして報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＸＭ＿０８３９７９である。
【００７０】
【化７】
2009513666.tif 000010
【００７１】
【化８】
2009513666.tif 000011
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、マウスＯＭｇｐのｍＲＮＡとして報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＮＭ＿０１９４０９である。
【００７２】
【化９】
2009513666.tif 000012
【００７３】
【化１０】
2009513666.tif 000013
ＯＭｇｐのアンタゴニストを用いた処置方法
本発明の一実施形態は、前記ニューロンまたは希乏突起神経膠細胞を、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体およびＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドまたはその任意の組合せからなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の有効量と接触させることを含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなるニューロンまたは希乏突起神経膠細胞の分化、増殖または生存を促進するための方法を提供する。
【００７４】
本発明の一実施形態は、ニューロン死または希乏突起神経膠細胞死または増殖もしくは分化の欠如と関連する疾患、障害または損傷、例えば、多発性硬化症、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病または球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）を、かかる疾患に罹患している哺乳動物において処置する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体およびＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドまたはその任意の組合せからなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなる。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態としては、哺乳動物に対し、疾患、障害または損傷の部位またはその近傍に、分化、増殖および生存の阻害を低減し、髄鞘形成を促進するのに充分な量で投与することを含む、ニューロンまたは希乏突起神経膠細胞の増殖、分化または生存を誘導して、ニューロン、希乏突起神経膠細胞またはミエリンの破壊を伴う疾患、障害または損傷を処置する方法が挙げられる。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態は、髄鞘発育不全または脱髄と関連する疾患、障害または損傷（例えば、多発性硬化症）を、かかる疾患に罹患している哺乳動物において処置する方法であって、哺乳動物に、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体およびＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドまたはその任意の組合せからなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなる方法を提供する。
【００７７】
さらに、本発明は、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体およびＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドまたはその任意の組合せからなる群より選択されるＯＭｇｐアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなる、哺乳動物においてニューロンの髄鞘形成を促進するための方法に関する。
【００７８】
本明細書に開示された処置方法に使用されるＯＭｇｐアンタゴニスト、例えば、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体またはＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドは、ＯＭｇｐの能力を停止、低減、抑制または阻害してニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の増殖、分化および生存に対して負の調節を行なう治療用薬剤として作製および使用され得る。さらに、本明細書に開示された処置方法に使用されるＯＭｇｐアンタゴニストは、ＯＭｇｐの能力を停止、低減、抑制または阻害して希乏突起神経膠細胞によるニューロンの髄鞘形成に対して負の調節を行なう治療用薬剤として作製および使用され得る。
【００７９】
本発明の方法において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、患者に対して、可溶性ＯＭｇｐポリペプチド、ＯＭｇｐ抗体またはＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドの直接投与により投与され得る。あるいはまた、ＯＭｇｐアンタゴニストは、該特異的ＯＭｇｐアンタゴニストをもたらす発現ベクターにより投与され得る。本発明の特定のある実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、（１）移植可能な宿主細胞を、ＯＭｇｐアンタゴニストを発現する核酸（例えば、ベクター）で形質転換またはトランスフェクトすること；および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳動物に、その疾患、障害または損傷の部位に移植することを含む処置方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞は、ＭＳの慢性病変部位に移植され得る。本発明の一部のある実施形態において、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、ＯＭｇｐアンタゴニストをコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトし、取り出された同じ哺乳動物に移植し戻す。該細胞は、移植されたのと同じ部位から取り出されるのがよいが、必要ではない。かかる実施形態は、場合によってはエキソビボ遺伝子療法として知られるものであり、ＯＭｇｐアンタゴニストを連続的に供給し、限定的な期間、作用部位に存在させ得る。
【００８０】
本発明の方法によって処置または改善され得る疾患または障害には、ニューロンまたは希乏突起神経膠細胞の死または分化もしくは増殖の欠如に関連する疾患、障害または損傷が含まれる。かかる疾患としては、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中心性橋融解症（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）およびウォーラー変性が挙げられる。
【００８１】
本発明の方法によって処置または改善され得る疾患または障害には、哺乳動物のニューロンの髄鞘発育不全または脱髄に関する疾患、障害または損傷が含まれる。具体的には、ニューロンを囲むミエリンが、存在しないか、不完全であるか、適正に形成されていないか、または悪化しているかのいずれかである疾患および障害。かかる疾患としては、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）（ＭＳの再発性寛解性、続発性進行性および原発性進行性の形態を含む）；進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中心性橋融解症（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎および横断脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｅ  ｍｙｅｌｉｔｉｓ）が挙げられる。
【００８２】
本発明の方法によって処置または改善され得る疾患または障害には、神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）疾患または障害が含まれる。かかる疾患としては、限定されないが、筋萎縮性側索硬化症、ハンティングトン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病が挙げられる。
【００８３】
本発明の方法によって処置または改善され得るさらなる疾患、障害または損傷の例としては、限定されないが、脊髄損傷、慢性ミエロパシーもしくはラデイクロパチー（ｒｅｄｉｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、外傷性脳損傷、運動ニューロン  疾患、軸索剪断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）、挫傷、麻痺、放射線療法後の損傷もしくは他の化学療法の神経病合併症、脳卒中、大裂孔（ｌａｒｇｅ  ｌａｃｕｎｅ）、中程度から大きな血管閉塞、白血球関連障害（ｌｅｕｋｏａｒｉａｏｓｉｓ）、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏（孤立性欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸塩、ニコチン酸欠乏、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ベル麻痺、または軸索の再生が必要とされ得る任意の神経の損傷、再ミエリン形成（ｒｅｍｙｌｉｎａｔｉｏｎ）または希乏突起神経膠細胞の生存、増殖もしくは分化が挙げられる。
可溶性ＯＭｇｐポリペプチド
本発明のＯＭｇｐアンタゴニストには、天然に存在するＯＭｇｐの生物学的機能を阻止、阻害または干渉するポリペプチドが含まれる。具体的には、本発明の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドとしては、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドのその断片、バリアントもしくは誘導体が挙げられる。上記の表１に、ＯＭｇｐポリペプチドの種々のドメインを示す。可溶性ＯＭｇｐポリペプチドとしては、限定されないが、表１および図１に記載のタンパク質の単一または多数のドメインを含むＯＭｇｐポリペプチドが挙げられる。また、本発明の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、ＯＭｇｐドメインを種々の組合せで含む。
【００８４】
可溶性ＯＭｇｐポリペプチドの非限定的な例には、ＯＭｇｐポリペプチドのＬＲＲドメイン、ＣＲドメインまたはＳ／ＴＲドメインの１つ以上を含む、本質的に該ドメインからなる、または該ドメインからなるポリペプチドが含まれる。当業者には、ＯＭｇｐの記載の任意のドメインは、その細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかにさらなる、または少ないアミノ酸を含むものであり得ることが認識されよう。したがって、本発明における方法のための可溶性ＯＭｇｐポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸１〜５４；配列番号２のアミノ酸１〜５６；配列番号２のアミノ酸１〜７５；配列番号２のアミノ酸１〜９８；配列番号２のアミノ酸１〜１６６；配列番号２のアミノ酸１〜１９１；配列番号２のアミノ酸１〜２１５；配列番号２のアミノ酸１〜２２８；配列番号２のアミノ酸１〜４２５；配列番号２のアミノ酸１〜４４０；配列番号：２のアミノ酸２５〜５４；配列番号２のアミノ酸２５〜５６；配列番号：２のアミノ酸２５〜７５；配列番号２のアミノ酸２５〜９８；配列番号：２のアミノ酸２５〜１６６；配列番号２のアミノ酸２５〜１９１；配列番号２のアミノ酸２５〜２１５；配列番号：２のアミノ酸２５〜２２８；配列番号：２のアミノ酸２５〜４２５；および配列番号：２のアミノ酸２５〜４４０を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＯＭｇｐポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、バリアントもしくは誘導体が挙げられる。
【００８５】
可溶性ＯＭｇｐポリペプチドの非限定的な例としては、種々のＬＲＲドメインを含む、本質的に該ドメインからなる、または該ドメインからなるポリペプチドが挙げられる。例えば、配列番号：２のアミノ酸５５〜７５；配列番号：２のアミノ酸５７〜７５；配列番号：２のアミノ酸７９〜９８；配列番号：２のアミノ酸１４７〜１６６；配列番号：２のアミノ酸１６８〜１９１；配列番号：２のアミノ酸１９２〜２１５；および配列番号：２のアミノ酸１９２〜２２８を含む、本質的に該アミノ酸からなる、または該アミノ酸からなるＯＭｇｐポリペプチド。
【００８６】
本発明における方法のためのさらなる可溶性ＯＭｇｐポリペプチドとしては、限定されないが、表１および図１に記載の多数のドメインを種々の組合せで含むＯＭｇｐポリペプチドが挙げられる。したがって、本発明における使用のための可溶性ＯＭｇｐポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号：２のアミノ酸５５〜９８；配列番号：２のアミノ酸５５〜１６６；配列番号：２のアミノ酸５５〜１９１；配列番号：２のアミノ酸５５〜２１５；配列番号：２のアミノ酸５５〜２２８；配列番号：２のアミノ酸５７〜９８；配列番号：２のアミノ酸５７〜１６６；配列番号：２のアミノ酸５７〜１９１；配列番号：２のアミノ酸５７〜２１５；配列番号：２のアミノ酸５７〜２２８；配列番号：２のアミノ酸２１６〜４２５；配列番号：２のアミノ酸２２９〜４２５；配列番号：２のアミノ酸４２６〜４４０；配列番号：２のアミノ酸５５〜４２５；配列番号：２のアミノ酸５７〜４２５；配列番号：２のアミノ酸２１６〜４４０；および配列番号：２のアミノ酸２２９〜４４０を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、バリアントもしくは誘導体が挙げられる。
【００８７】
完全長のＯＭｇｐは、構成的に発現されると、細胞に対して毒性である。したがって、本発明における使用のための可溶性断片は、細胞内で発現されたとき非細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃ）であるか、または誘導プロモーター（例えば、テトラサイクリン調節プロモーター）の制御下で発現され得るかのいずれかである。かかる誘導発現系は当該技術分野で知られており、本明細書にも記載している。
【００８８】
本発明における方法のための本明細書に記載の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは環状であり得る。可溶性ＯＭｇｐポリペプチドの環化により、線状ペプチド立体配座の自由度が低減され、構造的により拘束された分子がもたらされる。多くのペプチド環化方法が当該技術分野で知られている。例えば、ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸残基間のアミド結合の形成による「主鎖対主鎖」環化。「主鎖対主鎖」環化方法としては、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）間のジスルフィド結合の形成が挙げられる。本発明のある種の可溶性ＯＭｇｐペプチドは、そのペプチドのＮ−およびＣ−末端上に修飾を含み、環状ＯＭｇｐポリペプチドを形成しているものである。かかる修飾としては、限定されないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有するシステイン残基およびビオチンが挙げられる。他のペプチド環化方法は、Ｌｉ＆Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１  （２００２）（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００８９】
本発明における方法のための本明細書に記載の環状ＯＭｇｐポリペプチドとしては、限定されないが、Ｃ１ＸＸＮＣ２（式中、Ｘは任意のアミノ酸である、Ｎはアミノ酸の数である、Ｃ１はシステイン残基であり、任意選択で環化を促進する結合部分（例えば、アセチル基またはビオチン）を有する、およびＣ２はシステイン残基であり、任意選択で環化を促進する結合部分（例えば、ＮＨ２部分）を有する）が挙げられる。
【００９０】
本明細書に記載の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、種々の改変、例えば、置換、挿入または欠失などを有するものであり得る。本明細書に記載の配列番号：２のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドの対応する断片もまた想定される。
【００９１】
当該技術分野で知られているように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、第１のポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本明細書において論考する場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるか否かは、当該技術分野で知られた方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア、例えば、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１）を用いて決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴでは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）を用い、２つの配列間の相同性が最良のセグメントが見出される。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用い、特定のある配列が、例えば本発明による参照配列と９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメータは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の完全長全体において計算されるように、および参照配列のアミノ酸の総数の５％までの相同性ギャップが許容されるように設定される。
【００９２】
本発明における方法のための可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、２種類以上の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドの任意の組合せを含むものであり得る。
【００９３】
抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片
本発明における方法のためのＯＭｇｐアンタゴニストにはまた、ＯＭｇｐ活性のアンタゴニストであるＯＭｇｐ特異的抗体または抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体が含まれる。例えば、希乏突起神経膠細胞またはミエリン上に発現されたＯＭｇｐへのある種のＯＭｇｐ抗体の結合により、ニューロンもしくは希乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化の阻害が阻止されるか、またはＣＮＳニューロンの脱髄もしくは髄鞘発育不全が阻止される。
【００９４】
本明細書に記載の方法における使用のためのアンタゴニスト抗体またはその断片は、表１に記載のものなどの１つ以上のＯＭｇｐドメインを含むＯＭｇｐポリペプチドに特異的または優先的に結合する。例えば、ＯＭｇｐシステイン高含有ドメイン、ＬＫＲドメインまたはセリン／トレオニン高含有ドメインを含むポリペプチド。本発明の抗体はまた、ペプチドリンカーによって融合または連結された多数のＯＭｇｐドメインを有するＯＭｇｐポリペプチドに特異的または優先的に結合する。
【００９５】
本明細書に記載の方法における使用のためのある種のアンタゴニスト抗体は、ＯＭｇｐポリペプチド断片またはドメイン（例えば、表１に記載のドメイン）内の特定のエピトープ（１つまたは複数）に特異的または優先的に結合する。かかるＯＭｇｐポリペプチド断片としては、限定されないが、配列番号：２のアミノ酸１〜５６；配列番号：２のアミノ酸１〜２２８；配列番号：２のアミノ酸１〜４２５；配列番号：２のアミノ酸１〜４４０；配列番号：２のアミノ酸２５〜５６；配列番号：２のアミノ酸２５〜２２８；配列番号：２のアミノ酸２５〜４２５；配列番号：２のアミノ酸２５〜４４０；配列番号：２のアミノ酸５７〜２２８；配列番号：２のアミノ酸２２９〜４２５；配列番号：２のアミノ酸４２５〜４４０；配列番号：２のアミノ酸５７〜４２５；配列番号：２のアミノ酸２２９〜４４０のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、または該アミノ酸からなるＯＭｇｐポリペプチドが挙げられる。前記ポリペプチド断片のいずれかのアミノ酸または誘導体と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一のバリアントＯＭｇｐポリペプチドの対応する断片もまた想定される。
【００９６】
他の実施形態において、本発明は、ＯＭｇｐの少なくとも１つのエピトープであって、配列番号：２の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号：２の少なくとも７個、少なくとも９個または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、または該アミノ酸からなる該エピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を含む。記載の配列番号：２の所与のエピトープのアミノ酸は、連続的または線状であり得るが、そうである必要はない。特定のある実施形態において、ＯＭｇｐの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面上に発現された、または可溶性断片として発現された、例えばＩｇＧのＦｃ領域に融合されたＯＭｇｐによって形成される非線状エピトープを含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなる。したがって、特定のある実施形態において、ＯＭｇｐの少なくとも１つのエピトープは、配列番号：２の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００個の連続または非連続アミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、または該アミノ酸からなり、ここで、非連続したアミノ酸は、タンパク質のフォールディングによりエピトープを構成する。
【００９７】
他の実施形態において、本発明は、ＯＭｇｐの少なくとも１つのエピトープであって、上記の配列番号：２の１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の連続または非連続アミノ酸に加えて、該タンパク質を修飾するさらなる部分を含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなる該エピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を含み、例えば、糖鎖部分が、ＯＭｇｐ抗体が該タンパク質の非修飾異形に対するよりも高い親和性で修飾標的タンパク質に結合するように含まれたものであり得る。あるいはまた、ＯＭｇｐ抗体は、標的タンパク質の非修飾異形には全く結合しない。
【００９８】
特定のある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、上記のＯＭｇｐまたは断片もしくはバリアントの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、非関連もしくはランダムエピトープに結合し得るよりも容易に結合する；上記のＯＭｇｐまたは断片もしくはバリアントの少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、関連する類似の相同または類縁のエピトープに結合し得るよりもより容易に結合する；それ自体が上記のＯＭｇｐまたは断片もしくはバリアントのある特定のエピトープに特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害する；または上記のＯＭｇｐまたは断片もしくはバリアントの少なくとも１つのエピトープに対して、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍもしくは約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性結合する。特別な一態様において、該抗体またはその断片は、マウスＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片と比べ、ヒトＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
【００９９】
抗体結合解離定数との関連で用いる場合、用語「約」は、抗体親和性の測定に用いた方法に固有の変動の程度を許容する。例えば、使用する器具類の制度のレベル、測定対象の試料の数に基づく標準誤差および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含し得る。
【０１００】
具体的なある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１または１０−３秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、５×１０−４秒−１、１０４秒−１、５×１０−５秒−１または１０−５秒−１  ５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
【０１０１】
他の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合する。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合する。
【０１０２】
一実施形態において、本発明における方法のためのＯＭｇｐアンタゴニストは、抗体分子、またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片である。特に記載のない限り、本明細書で用いる場合、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的または抗原結合断片、すなわち、抗原特異的または抗原結合断片をいう。一実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性結合分子、結合性ポリペプチド、または抗体（例えば、二重特異性抗体）、ミニボディ、ドメイン欠失抗体、または１つより多くのエピトープ（例えば、１つより多くの抗原もしくは同じ抗原上の１つより多くのエピトープ）に対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態において、二重特異性抗体は、ＯＭｇｐ上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、ＯＭｇｐのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメイン、および第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有する４価抗体であり得る。したがって、４価の二重特異性抗体は、各特異性に対して２価であり得る。
【０１０３】
特定のある実施形態において、本発明は、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一画分が、所望の生化学的特性、例えば、エフェクター機能の低減、非共有結合により二量体化する能力、腫瘍部位に局在する能力の増大、血清半減期の減少、またはほぼ同じ免疫原性の完全体の非改変抗体と比べた場合の血清半減期の増大などがもたらされるように欠失あるいは改変されたＯＭｇｐアンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片の投与を含む。例えば、本明細書に記載の処置方法における使用のためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つ以上のその重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失しており、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失している。
【０１０４】
ＯＭｇｐ抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明における方法のためのＯＭｇｐ抗体、またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸分子を提供する。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は、そのＣＤＲの少なくとも１つまたはそのＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を提供する。あるいはまた、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である、したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、表２に示すポリペプチド配列に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１０６】
【表２−１】
2009513666.tif 000014
【０１０７】
【表２−２】
2009513666.tif 000015
【０１０８】
【表２−３】
2009513666.tif 000016
【０１０９】
【表２−４】
2009513666.tif 000017
【０１１０】
【表２−５】
2009513666.tif 000018
＊Ｋａｂａｔシステム（上記参照）によって決定。
Ｎ＝ヌクレオチド配列、Ｐ＝ポリペプチド配列
当該技術分野で知られているように、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、アミノ酸または核酸配列第１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列と比較することにより決定される。本明細書において論考する場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるか否かは、当該技術分野で知られた方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア、例えば、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１）を用いて決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴでは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）を用い、２つの配列間の相同性が最良のセグメントが見出される。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用い、特定のある配列が、例えば本発明による参照配列と９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメータは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の完全長全体において計算されるように、および参照配列のアミノ酸の総数の５％までの相同性ギャップが許容されるように設定される。
【０１１１】
特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。特定のある実施形態において、ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、そのコードアミノ酸配列が改変されることなく改変される。例えば、該配列は、所与の種におけるコドン使用頻度の改善のため、スプライス部位を除去するため、または制限酵素部位を除去するため（ｔｈｅ  ｒｅｍｏｖｅ）に改変され得る。これらのものなどの配列最適化を実施例に示すが、当業者によく知られており、常套的に行なわれている。
【０１１２】
別の実施形態において、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表２に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３基と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を提供する。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１１３】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上にコードされるＶＨを含む、本質的に該ＶＨからなる、または該ＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片と同じＯＭｇｐエピトープに特異的または優先的に結合するか、または、かかるモノクローナル抗体もしくは断片がＯＭｇｐに結合するのを競合的に阻害する。
【０１１４】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上にコードされるＶＨを含む、本質的に該ＶＨからなる、または該ＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＭｇｐポリペプチドもしくはその断片、またはＯＭｇｐバリアントポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的または優先的に結合する。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、その少なくとも１つのＶＬ−ＣＤＲまたはその少なくとも２つのＶＬ−ＣＤＲが、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を提供する。あるいはまた、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、表３に示すポリペプチド配列に関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１１６】
【表３−１】
2009513666.tif 000019
【０１１７】
【表３−２】
2009513666.tif 000020
【０１１８】
【表３−３】
2009513666.tif 000021
【０１１９】
【表３−４】
2009513666.tif 000022
＊Ｋａｂａｔシステム（上記参照）によって決定。
ＰＮ＝ヌクレオチド配列、ＰＰ＝ポリペプチド配列
特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が表３に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を提供する。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表３に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３群をコードするヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列にコードされている免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を提供する。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２２】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上ににコードされるＶＬを含む、本質的に該ＶＬからなる、または該ＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片と同じＯＭｇｐエピトープに特異的または優先的に結合するか、またはかかるモノクローナル抗体もしくは断片が、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片に結合するのを競合的に阻害する。
【０１２３】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上ににコードされるＶＬを含む、本質的に該ＶＬからなる、または該ＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＭｇｐポリペプチドもしくはその断片、またはＯＭｇｐバリアントポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的または優先的に結合する。
【０１２４】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３からなる群より選択される参照ＶＨポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、配列番号：３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３からなる群より選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含む、本質的に該核酸配列からなる、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドにコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２６】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群より選択される参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＨコード核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。特定のある実施形態において、かかるポリヌクレオチドにコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２７】
別の態様において、本発明は、そのアミノ酸配列が配列番号：３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３からなる群より選択される本発明のＶＨをコードする核酸配列を含む、本質的に該核酸配列からなる、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。本発明は、さらに、その核酸配列が配列番号：１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群より選択される本発明のＶＨをコードする核酸配列を含む、本質的に該核酸配列からなる、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドを含む。特定のある実施形態において、かかるポリヌクレオチドにコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１２８】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上ににコードされるＶＨを含む、本質的にそのことからなる、またはそのことからなる抗体またはその抗原結合断片は、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片と同じＯＭｇｐエピトープに特異的または優先的に結合するか、またはかかるモノクローナル抗体もしくは断片がＯＭｇｐに結合するのを競合的に阻害するか、またはかかるモノクローナル抗体がＯＭｇｐに結合するのを競合的に阻害する。
【０１２９】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上にコードされるＶＨを含む、本質的に該ＶＨからなる、または該ＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＭｇｐポリペプチドもしくはその断片、またはＯＭｇｐバリアントポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的または優先的に結合する。
【０１３０】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４および９２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する参照ＶＬポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９からなる群より選択される参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＬコード核酸を含む、本質的に該核酸からなる、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。特定のある実施形態において、かかるポリヌクレオチドにコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１３１】
別の態様において、本発明は、配列番号：３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４および９２からなる群より選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含む、本質的に該核酸配列からなる、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。本発明は、さらに、配列番号：１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９からなる群より選択される本発明のＶＬをコードする核酸配列を含む、本質的に該核酸配列からなる、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドの使用を含む。特定のある実施形態において、かかるポリヌクレオチドにコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１３２】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上ににコードされるＶＬを含む、本質的に該ＶＬからなる、または該ＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片と同じＯＭｇｐエピトープに特異的または優先的に結合するか、または、かかるモノクローナル抗体もしくは断片がＯＭｇｐに結合するのを競合的に阻害する。
【０１３３】
特定のある実施形態において、上記のポリヌクレオチドの１つ以上ににコードされるＶＬを含む、本質的に該ＶＬからなる、または該ＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＭｇｐポリペプチドもしくはその断片、またはＯＭｇｐバリアントポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的または優先的に結合する。
【０１３４】
任意の上記のポリヌクレオチドは、例えば、コードポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書記載のような他の異種ポリペプチドをコードするさらなる核酸をさらに含むものであり得る。
【０１３５】
また、本明細書の他の箇所により詳細に記載しているように、本発明は、上記のポリヌクレオチドの１つ以上を含むポリヌクレオチドを含む組成物を含む。一実施形態において、本発明は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記第１のポリヌクレオチドが本明細書に記載のＶＨポリペプチドをコードし、前記第２のポリヌクレオチドが本明細書に記載のＶＬポリペプチドをコードする組成物を含む。具体的には、ＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドを含む、本質的に該ポリヌクレオチドからなる、または該ポリヌクレオチドからなる組成物であって、該ＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：３６および３７、４４および４５、５２および５３、６０および６１、６８および６９、７６および７７、８４および８５、９２および９３からなる群より選択される参照ＶＬおよびＶＨポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるポリペプチドをコードする組成物。あるいはまた、それぞれ、配列番号：１６および１７、１８および１９、２０および２１、２２および２３、２４および２５、２６および２７、ならびに２８および２９からなる群より選択される参照ＶＨおよびＶＬ核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドを含む、本質的に該ポリヌクレオチドからなる、または該ポリヌクレオチドからなる組成物。特定のある実施形態において、かかる組成物内の該ポリヌクレオチドにコードされるＶＨおよびＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１３６】
本発明はまた、本明細書の他の箇所に記載のような本発明のポリヌクレオチドの断片を含む。さらに、本明細書に記載のような融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた本発明で想定される。
【０１３７】
該ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られた任意の方法によって作製または製造され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、該抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから合成され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載のようにして）、これは、簡単には、該抗体をコードする配列の一部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、該オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、次いで、ライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０１３８】
あるいはまた、ＯＭｇｐ抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源由来の核酸から作製され得る。ある特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手可能でないが該抗体分子の配列が既知である場合、該抗体をコードする核酸は、適当な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、もしくは該抗体または他のＯＭｇｐ抗体を発現する任意の組織または細胞（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から作製されたｃＤＮＡライブラリー、または該組織または細胞から単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、該配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、または例えば、該抗体または他のＯＭｇｐ抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンが同定される該特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって、化学的に合成され得るか、または得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、次いで、当該技術分野でよく知られた任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクター内にクローニングされ得る。
【０１３９】
ＯＭｇｐ抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されたら、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野でよく知られた方法、例えば、組換えＤＮＡ手法、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどを用いて操作され（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９８）（これらはともに引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の手法を参照のこと）、例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入が作出された異なるアミノ酸配列を有する抗体が作製され得る。
【０１４０】
ＯＭｇｐ抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されたものであり得る。例えば、ＯＭｇｐ抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、単鎖および二本鎖のＤＮＡ、単鎖と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに単鎖と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、単鎖またはより典型的には二本鎖もしくは単鎖と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成されたものであり得る。また、ＯＭｇｐ抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域で構成されたものであり得る。ＯＭｇｐ抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖を含むものであり得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基、例えばイノシンなどが挙げられる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態が包含される。
【０１４１】
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非天然のバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列内に、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードタンパク質に導入されるように導入することにより創製され得る。変異は、標準的な手法、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発などによって導入され得る。好ましくは、同類アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行なわれる。
【０１４２】
Ｖ．ＯＭｇｐ抗体ポリペプチド
本発明は、さらに、ＯＭｇｐ抗体を構成する単離されポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のＯＭｇｐ抗体は、ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン分子に由来するＯＭｇｐ特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指定するタンパク質「に由来」するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ある特定のアミノ酸配列を有するを有する該ポリペプチドの起源をいう。場合によっては、ある特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、該出発配列のものと本質的に同一であるアミノ酸配列またはその一部分であって、該一部分が少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸からなるものであるアミノ酸配列、またはあるいは、当業者が該出発配列にその起源を有すると同定可能なアミノ酸を有する。
【０１４３】
一実施形態において、本発明は、そのＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つまたはそのＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的に該重鎖可変領域からなる、または該重鎖可変領域からなる単離されたポリペプチドを提供する。あるいはまた、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、上記の表２に示す群に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表２にはＫａｂａｔシステムによって規定されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ規定、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって規定されるＶＨ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。特定のある実施形態において、該ＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１４４】
別の実施形態において、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が表２に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３基と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的に該重鎖可変領域からなる、または該重鎖可変領域からなる単離されたポリペプチドを提供する。特定のある実施形態において、該ＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が表２に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３基と、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲ内の１、２、３、４、５または６個のアミノ酸置換以外は同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的に該重鎖可変領域からなる、または該重鎖可変領域からなる単離されたポリペプチドを提供する。より大きなＣＤＲ、例えばＶＨ−ＣＤＲ−３において、さらなる置換は、ＶＨ−ＣＤＲを含むＶＨがＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する限り、ＣＤＲになされたものであり得る。特定のある実施形態において、該アミノ酸置換は同類である。特定のある実施形態において、該ＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１４６】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：配列番号：３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３からなる群より選択される参照ＶＨポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＨポリペプチドを含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる単離されたポリペプチドを含む。特定のある実施形態において、ＶＨを含む抗体または抗原結合断片ポリペプチドは、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１４７】
別の態様において、本発明は、配列番号：３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３からなる群より選択されるＶＨポリペプチドを含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる単離されたポリペプチドを含む。特定のある実施形態において、ＶＨを含む抗体または抗原結合断片ポリペプチドは、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１４８】
特定のある実施形態において、上記のＶＨポリペプチドの１つ以上を含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる抗体またはその抗原結合断片は、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片と同じＯＭｇｐエピトープに特異的または優先的に結合するか、または、かかるモノクローナル抗体もしくは断片がＯＭｇｐに結合するのを競合的に阻害する。
【０１４９】
特定のある実施形態において、上記のＶＨポリペプチドの１つ以上を含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＭｇｐポリペプチドもしくはその断片、またはＯＭｇｐバリアントポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的または優先的に結合する。
【０１５０】
別の実施形態において、本発明は、そのＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つまたはそのＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的に該軽鎖可変領域からなる、または該軽鎖可変領域からなる単離されたポリペプチドを提供する。あるいはまた、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示されたモノクローナルＯＭｇｐ抗体由来の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、上記の表３に示すポリペプチドに関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表３にはＫａｂａｔシステムによって規定されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ規定、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって規定されるＶＬ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。特定のある実施形態において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１５１】
別の実施形態において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が表３に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的に該軽鎖可変領域からなる、または該軽鎖可変領域からなる単離されたポリペプチドを提供する。特定のある実施形態において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１５２】
別の実施形態において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が表３に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３群と、任意の１つのＶＬ−ＣＤＲ内の１、２、３、４、５または６個のアミノ酸置換以外は同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的に該重鎖可変領域からなる、または該重鎖可変領域からなる単離されたポリペプチドを提供する。より大きなＣＤＲにおいて、さらなる置換は、ＶＬ−ＣＤＲを含むＶＬがＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する限り、ＶＬ−ＣＤＲになされたものであり得る。特定のある実施形態において、該アミノ酸置換は同類である。特定のある実施形態において、ＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１５３】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号：３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４および９２からなる群より選択される参照ＶＬポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＬポリペプチドを含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる単離されたポリペプチドを含む。特定のある実施形態において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、配列番号：３６、４４、５２、６０、６８、７６、８４および９２からなる群より選択されるＶＬポリペプチドを含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる単離されたポリペプチドを含む。特定のある実施形態において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１５５】
特定のある実施形態において、上記のＶＬポリペプチドの１つ以上を含む、本質的に該ポリペプチドからなる抗体またはその抗原結合断片は、３５−Ｅ０８、３６−Ａ０８、３６−Ｈ０６、３８−Ｂ０２、３８−Ｆ１１、３８−Ｈ０２、３８−Ｈ１１および３９−Ｆ０９からなる群より選択される参照モノクローナル抗体断片と同じＯＭｇｐエピトープに特異的または優先的に結合するか、または、かかるモノクローナル抗体もしくは断片がＯＭｇｐに結合するのを競合的に阻害する。
【０１５６】
特定のある実施形態において、上記のＶＬポリペプチドの１つ以上を含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＭｇｐポリペプチドもしくはその断片、またはＯＭｇｐバリアントポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的または優先的に結合する。
【０１５７】
他の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号：３６および３７、４４および４５、５２および５３、６０および６１、６８および６９、７６および７７、８４および８５、９２および９３からなる群より選択される参照ＶＬおよびＶＨポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％または１００％同一であるＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを含む、本質的に該ポリペプチドからなる、または該ポリペプチドからなる。特定のある実施形態において、これらのＶＨおよびＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、ＯＭｇｐに特異的または優先的に結合する。
【０１５８】
任意の上記のポリペプチドは、さらなるポリペプチド、例えば、コードポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書記載のような他の異種ポリペプチドをさらに含むものであり得る。さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書の他の箇所に記載のようなポリペプチド断片を含む。さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のような融合ポリペプチド、Ｆａｂ断片および他の誘導体を含む。
【０１５９】
また、本明細書の他の箇所により詳細に記載しているように、本発明は、上記のポリペプチドを含む組成物を含む。
【０１６０】
また、本明細書に開示されたＯＭｇｐ抗体ポリペプチドは、それが誘導された天然に存在する結合性ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように修飾されたものであり得ることは当業者に理解されよう。例えば、指定したタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その出発配列と類似したもの、例えば一定の同一性割合を有するものであり得、例えば、その出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であり得る。
【０１６１】
さらにまた、「非必須」アミノ酸領域に同類置換または変更をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失または挿入がなされたものであり得る。例えば、指定したタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１つ以上の個々のアミノ酸置換、挿入または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上の個々のアミノ酸置換、挿入または欠失以外はその出発配列と同一であり得る。指定したタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１つ以上の個々のアミノ酸置換、挿入または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上の個々のアミノ酸置換、挿入または欠失以外はその出発配列と同一であり得る。他の実施形態において、指定したタンパク質に由来するポリペプチドｏｒ  アミノ酸配列は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１５個以下、または２０個以下の個々のアミノ酸置換、挿入または欠失以外はその出発配列と同一であり得る。特定のある実施形態において、指定したタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その出発配列に対して１〜５、１〜１０、１〜１５または１〜２０個の個々のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する。
【０１６２】
本発明のある種のＯＭｇｐ抗体ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む、本質的に該アミノ酸配列なる、または該アミノ酸配列なる。しかしながら、ある種のＯＭｇｐ抗体ポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する１つ以上の連続アミノ酸を含む。例えば、本発明のＯＭｇｐ抗体は、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分または抗原結合領域を含むものであり得る。別の例において、１つ以上のマウス由来アミノ酸が、非マウス抗体ポリペプチド、例えば、ＯＭｇｐ抗体の抗原結合部位に存在し得る。別の例において、ＯＭｇｐ抗体の抗原結合部位は完全にマウスのものである。特定のある治療適用用途において、ＯＭｇｐ特異的抗体、またはその抗原結合断片、バリアントもしくは類縁体は、該抗体が投与される動物において免疫原性とならないように設計される。
【０１６３】
特定のある実施形態において、ＯＭｇｐ抗体ポリペプチドは、通常抗体と会合しないアミノ酸配列または１つ以上の部分を含む。例示的な修飾を以下により詳細に記載する。例えば、本発明の単鎖ｆｖ抗体断片は、フレキシブルリンカー配列を含むものであり得るか、または修飾されて機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素もしくは標識）が付加されたものであり得る。
【０１６４】
本発明における方法のためのＯＭｇｐ抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含む、本質的に融合タンパク質なる、または融合タンパク質なるものであり得る。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位、および少なくとも１つの異種部分（すなわち、自然界では通常連結されない部分）を有する免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むキメラ分子である。そのアミノ酸配列は、一緒にして融合ポリペプチドになる別々のタンパク質に通常存在するものであってもよく、または同じタンパク質に通常存在するが融合ポリペプチド内で新たな構成で配列されるものであってもよい。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係にコードされたポリヌクレオチドを創製もしくは翻訳することにより創製され得る。
【０１６５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される用語「異種」は、該ポリヌクレオチドがポリペプチドが比較対象の存在体（ｅｎｔｉｔｙ）の残部と異なる存在体に由来していることを意味する。例えば、本明細書で用いる場合、ＯＭｇｐ抗体、またはその抗原結合断片、バリアントもしくは類縁体に融合される「異種ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来するものである。
【０１６６】
「同類アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で規定されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン，システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド内の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられている。別の実施形態において、アミノ酸鎖が、側鎖ファミリーの構成員と順序および／または組成が異なる構造的に類似した鎖で置き換えられていてもよい。
【０１６７】
あるいはまた、別の実施形態において、変異は、免疫グロブリンコード配列の全部または一部に沿って、飽和変異誘発などによって無作為に導入されたものであり得、得られた変異体は、本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのＯＭｇｐ抗体に組み込まれ得、所望の抗原、例えばＯＭｇｐに結合するその能力についてスクリーニングされ得る。
【０１６８】
本明細書に記載の治療方法における使用のためのある種のＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片において、Ｆｃ部分は、当該技術分野で知られた手法を用いて、エフェクター機能が減少するように変異され得る。例えば、定常領域ドメインの（点変異もしくは他の手段による）欠失または不活化により、循環修飾抗体のＦｃ受容体結合が低減され、それにより、腫瘍局在が増大され得る。他の場合では、本発明と整合する定常領域の修飾が、相補鎖結合を抑制し、したがって、コンジュゲートされた細胞毒素の血清半減期および非特異的会合が低減されることがあり得る。定常領域のまた他の修飾を用い、抗原特異性または抗体柔軟性の増大による局在の増強が可能となるように、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分が修飾され得る。該修飾で得られる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的効果、例えば、腫瘍局在、生体分布および血清半減期などは、必要以上の実験を行なうことなく、よく知られた免疫学的手法を用いて容易に測定および定量され得る。
【０１６９】
本明細書に開示された診断および治療方法における使用のための抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片の修飾形態は、完全前駆体または親抗体から当該技術分野で知られた手法を用いて作製され得る。例示的な手法を、本明細書においてより詳細に論考する。
【０１７０】
特定のある実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片の可変領域および定常領域の両方が完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当該技術分野で知られた本明細書に記載の手法を用いて作製され得る。例えば、ある特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、該抗原を、抗原刺激に応答してかかる抗体を産生するように変更されているが、その内因性遺伝子座は障害されているトランスジェニック動物に投与することにより作製され得る。かかる抗体を作製するために使用され得る例示的な手法は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の手法が当該技術分野で知られている。完全ヒト抗体は、種々のディスプレイ手法、例えば、本明細書の他の箇所により詳細に記載しているようなファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイ系によって同様に作製され得る。
【０１７１】
本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片は、当該技術分野で知られた手法を用いて作製または製造され得る。特定のある実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組換えにより作製」されたもの、すなわち、組換えＤＮＡ手法を用いて作製されたものである。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な手法は、本明細書の他の箇所でより詳細に論考している。
【０１７２】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片には、例えば、該抗体がそのコグネートエピトープに特異的に結合するのが妨げられないような該抗体への任意の型の分子の共有結合によって修飾された誘導体が含まれる。例えば、限定を意図しないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／阻害基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体が挙げられる。任意の数多くの化学的修飾が、既知の手法、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであり得る。
【０１７３】
好ましい実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片は、処置対象の動物、例えばヒトにおいて有害な免疫応答を惹起しない。一実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片は、当該技術分野で認められた手法を用いて、その免疫原性が低減されるように修飾されている（ｂｅ）。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫処置（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）されたものであり得るか、またはキメラ抗体が作製され得る。これらの型の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体から誘導される。これは、種々の方法、例えば、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフティングしてキメラ抗体を作製すること；（ｂ）保持もしくは必須フレームワーク残基を有するもしくは有しない非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域内にグラフティングすること；または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってこれをヒト様部分で「覆う（ｃｌｏａｋ）」ことによって達成され得る。かかる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１９０，３７０号（これらはすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１７４】
脱免疫処置はまた、抗体の免疫原性を減少させるために使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「脱免疫処置」には、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変が含まれる（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体由来のＶＨおよびＶＬ配列を解析し、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基との関連でエピトープの位置を示す各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終の抗体の活性を改変するリスクの少ない選択的アミノ酸置換を同定するために解析される。アミノ酸置換の組合せを含む一連の選択的ＶＨおよびＶＬ配列が設計され、このような配列は、続いて、一連の結合性ポリペプチド、例えば、本明細書に開示された診断および処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的もしくは抗原結合断片内に組み込まれ、次いで、機能について試験される。典型的には、１２〜２４種のバリアント抗体が作製および試験される。次いで、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む不完全な重鎖および軽鎖の遺伝子が、発現ベクター内にクローニングされ、続いて、そのプラスミドが完全体の抗体産生のために細胞株内に導入される。次いで、該抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較し、最適なバリアントが同定される。
【０１７５】
本発明における方法のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその断片は、当該技術分野で知られた任意の適当な方法によって作製され得る。ポリクローナル抗体は、当該技術分野でよく知られた種々の手順によって作製され得る。例えば、ＯＭｇｐ免疫特異的または抗原結合断片は、種々の宿主動物、例えば、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどに投与され、該抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生成が誘導され得る。宿主の種に応じて、免疫学的応答を増大させるために種々のアジュバントが使用され得、限定されないが、フロイント（完全および不完全）、無機質ゲル（例えば水酸化アルミニウムなど）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなど）、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどが挙げられる。かかるアジュバントもまた、当該技術分野でよく知られている。
【０１７６】
モノクローナル抗体は、多種多様な当該技術分野で知られた手法を用いて、例えば、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ手法、またはその組合せを使用して作製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られ、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１（１９８１）（前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されたものなどのハイブリドーマ手法を用いて作製され得る。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、ハイブリドーマ手法により作製された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、単一のクローン、例えば、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンに由来する抗体をいい、その作製方法をいうのではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ手法により作製される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、多種多様な当該技術分野で知られた手法を用いて、例えば、ハイブリドーマおよび組換えおよびファージディスプレイ手法を用いて作製され得る。
【０１７７】
当該技術分野で認められたプロトコルを用い、一例において、抗体は哺乳動物において、関連する抗原（例えば、精製ＯＭｇｐ抗原またはかかる抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの多数回の皮下注射または腹腔内注射によって生成させる。この免疫処置により、典型的には、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答が惹起される。生じた抗体は、動物の血清から回収してポリクローナル調製物が提供され得るが、多くの場合、リンパ球を脾臓、リンパ節または末梢血から単離してモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を提供することが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得る。
【０１７８】
このよく知られた方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原が注射された哺乳動物由来の比較的寿命の短い、または死ぬ運命のリンパ球が、不死化腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、したがって、Ｂ細胞の不死化のものであって、かつ遺伝子にコードされた抗体を産生し得るハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」が生成される。得られたハイブリッドは、単一の抗体の形成のために、特定の遺伝子を含む個々の系統による選択、希釈および再成長によって単一の遺伝子系統に分離される。これは、純粋な親遺伝子に関して所望の抗原に対して均一な抗体を産生し、「モノクローナル」と呼ばれる。
【０１７９】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１種類以上の物質を含有する適当な培養培地に播種し、培養する。当業者には、ハイブリドーマの形成、選択および培養のための試薬、細胞株および培地がいくつかの供給源から市販されており、標準化されたプロトコルが充分確立されていることが認識されよう。一般的に、ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生成についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、インビトロアッセイ、例えば、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などによって測定される。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ５９−１０３（１９８６））によって培養してもよい。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から慣用的な精製手順、例えば、例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーなどによって分離され得ることはさらに認識されよう。
【０１８０】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の手法によって作製され得る。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を用い、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって作製され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、重鎖の可変領域、軽鎖定常領域およびＣＨ１ドメインを含む。
【０１８１】
当業者にはまた、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡはまた、抗体ファージライブラリーから誘導され得ることが認識されよう。特に（Ｉｎ  ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）、かかるファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイさせるために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例えば、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合させたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインである。例示的な方法は、例えば、ＥＰ  ３６８  ６８４  Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１  （２０００）；ＮａｇｙらＮａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１  （２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６８２  （２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３  （２００２）（その各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には、大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の作製、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えが記載されている。別の実施形態において、ディスプレイ基盤としてバクテリオファージに代用するため、リポソームディスプレイが使用され得る（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７  （２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０  （２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１  （２００１）を参照のこと）。また別の実施形態において、細胞表面ライブラリーが、抗体についてスクリーニングされ得る（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１  （２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１  （２０００））。かかる手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ手法の代替法を提供する。
【０１８２】
ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、これをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトもしくはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。特定のある実施形態において、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖリンカーによりＰＣＲによって互いに連結し、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）内にクローニングする。該ベクターを大腸菌内にエレクトロポレーションし、該大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例えばＦｄおよびＭ１３であり、通常、ＶＨまたはＶＬ領域がファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えにより融合される。目的の抗原（すなわち、ＯＭｇｐポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。
【０１８３】
抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されたものが挙げられる。
【０１８４】
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、単離され、完全体の抗体（例えば、ヒト抗体）または任意の他の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、任意の所望の宿主、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより作製するための手法もまた、当該技術分野で知られた方法、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されたものなどを用いて採用され得る。
【０１８５】
単鎖Ｆｖおよび抗体を作製するために使用され得る手法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが挙げられる。一部の用途、例えば、ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイでは、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を使用することが好ましいことがあり得る。キメラ抗体は、抗体の種々の部分が異なる動物種に由来している分子、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などである。キメラ抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変するため、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換されている。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られた方法、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル設計により抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列比較により特定の位置の非通常フレームワーク残基を同定することによって同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。抗体は、さまざまな当該技術分野で知られた手法、例えば、ＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ  ２３９，４００；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面処理（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ５９２，１０６；ＥＰ  ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を用いてヒト化され得る。
【０１８６】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、さまざまな当該技術分野で知られた方法、例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照のこと。
【０１８７】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現する能力を持たないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体が、マウス胚性幹細胞内に無作為に、または相同組換えによって導入され得る。あるいはまた、ヒト可変領域、定常領域および多様な領域が、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞内に導入され得る。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えにより、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々に、または同時に非機能的となり得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生が抑制される。修飾された胚性幹細胞を拡大培養し、胚盤胞内にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニックマウスを通常の様式で、選択した抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部分を用いて免疫処置する。該抗原に対して指向されるモノクローナル抗体は、免疫処置したトランスジェニックマウスから、慣用的なハイブリドーマ手法を用いて得られ得る。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中、再配列し、続いて、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、かかる手法を用い、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの手法の概説については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの手法ならびにかかる抗体を作製するためのプロトコルの詳細な論考については、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）などの企業は、上記のものと類似した手法を用い、選択した抗原に対して指向されるヒト抗体を提供することに従事する場合があり得る。
【０１８８】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導（ｇｕｉｄｅｄ）選択」と呼ばれる手法を用いて作製され得る。このアプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用い、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。米国特許第５，５６５，３３２号もまた参照のこと。
【０１８９】
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡが、慣用的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定され得る。単離およびサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として供される。単離したら、該ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、次いで、これを、他の場合では免疫グロブリンを産生しない原核生物または真核生物の宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などにトランスフェクトする。より詳しくは、単離されたＤＮＡ（これは、本明細書に記載のような合成のものであり得る）を用い、Ｎｅｗｍａｎら、米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日に出願）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、抗体の製造のために、定常および可変配列をクローニングし得る。本質的に、これは、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を必然的に伴う。この目的のための好適なプライマーもまた、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下により詳細に論考するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、臨床用および市販用の免疫グロブリン供給物を提供するために比較的大量に培養され得る。
【０１９０】
具体的な一実施形態において、重および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較して配列超多様性の領域を決定することによって相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列が同定されるように検査され得る。常套的な組換えＤＮＡ手法を用いて、１つ以上のＣＤＲがフレームワーク領域内に挿入され得、例えば、非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域内に挿入され得る。フレームワーク領域は、天然に存在するものであっても、コンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧についてはＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組合せによって作製されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド（例えば、ＯＭｇｐ）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域においてなされ得、好ましくは、該アミノ酸置換は、抗体のその抗原に対する結合を改善するものである。さらに、かかる方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製するため、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドに対する他の改変が本発明に包含され、当該技術分野の技量の範囲内である。
【０１９１】
また、「キメラ抗体」の作製のために開発された、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。本明細書で用いる場合、キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えば、ヒト化抗体などである。
【０１９２】
あるいはまた、単鎖抗体の作製について記載された手法（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を、単鎖抗体の作製に適合させてもよい。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖断片をアミノ酸橋絡を介して連結し、単鎖抗体をもたらすことにより形成される。また、大腸菌内での機能的Ｆｖ断片の合成のための手法も使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１９３】
ＯＭｇｐアンタゴニスト抗体はまた、内因性免疫グロブリンを産生する能力を持たないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において生成されたヒト抗体または実質的にヒト抗体であり得る。（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号および同第５，５８９，３６９号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異型マウスにおける抗体の重鎖連結領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞系変異型マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原刺激するとヒト抗体の産生がもたらされる。ＳＣＩＤマウスを用いる別の好ましいヒト抗体の作製手段は、は、米国特許第５，８１１，５２４号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。このようなヒト抗体と関連する遺伝物質もまた、本明細書に記載のようにして単離および操作され得ることは認識されよう。
【０１９４】
組換え抗体を作製するためのまた別の非常に効率的な手段が、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この手法により、サル可変ドメインとヒト定常配列を含む霊長類化抗体の生成がもたらされる。この参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、この手法はまた、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号および同第５，７５６，０９６号（これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９５】
別の実施形態では、リンパ球を顕微操作によって選択し、種々の遺伝子を単離し得る。例えば、免疫処置した哺乳動物から末梢血単核細胞を単離し、約７日間インビトロで培養し得る。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングされ得る。陽性ウェルの細胞が単離され得る。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによって、または該細胞を本発明体媒介型（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）溶血斑形成法において同定することにより単離され得る。Ｉｇ産生Ｂ細胞をチューブ内に顕微操作し得、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅し得る。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクター内にクローニングされ、発現のために細胞（例えば、真核生物または原核生物の細胞）内にトランスフェクトされ得る。
【０１９６】
あるいはまた、抗体産生細胞株は、当業者によく知られた手法を用いて選択および培養され得る。かかる手法は、さまざまな実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。これに関して、後述の本発明における使用に適した手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）（増補版を含む）に記載されている。
【０１９７】
本明細書に開示された治療方法における使用のための抗体は、抗体合成のための当該技術分野で知られた任意の方法によって、特に、化学合成または好ましくは本明細書に記載の組換え発現手法によって作製され得る。
【０１９８】
本発明の範囲には、抗原結合ＤＮＡ配列のあらゆる対立遺伝子、バリアントおよび変異がさらに包含されることはさらに認識されよう。
【０１９９】
よく知られているように、ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から、標準的な手法、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿の後、遠心分離またはクロマトグラフィーを行なうことなどによって単離され得る。望ましい場合は、ｍＲＮＡは全ＲＮＡから標準的な手法によって、例えば、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーなどによって単離され得る。好適な手法は当該技術分野で熟知されている。
【０２００】
一実施形態において、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、よく知られた方法に従い、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて同時または別々のいずれかで作製される。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公表された重鎖および軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始され得る。上記のように、ＰＣＲはまた、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、そのライブラリーが、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブなど）によってスクリーニングされ得る。
【０２０１】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、細胞から当該技術分野で知られた手法を用いて単離され、例えば、組換えＤＮＡ手法に関する前述の参考文献に詳細に示された標準的なよく知られた手法に従って制限マッピングされ、配列決定され得る。もちろん、該ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の解析中の任意の時点で本発明により合成されたものであってもよい。
【０２０２】
抗体、またはその断片、誘導体もしくは類縁体、例えば、ＯＭｇｐアンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要とされる。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその一部分（好ましくは、該重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子の生成のためのベクターが、当該技術分野でよく知られた手法を用い、組換えＤＮＡ手法によって作製され得る。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法を本明細書に記載する。当業者によく知られた方法が、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。このような方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成手法およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。かかるベクターには、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれ得（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、重鎖または軽鎖の全体の発現のために、該抗体の可変ドメインがかかるベクター内にクローニングされ得る。
【０２０３】
該発現ベクターは宿主細胞に、慣用的な手法によって導入され、次いで、トランスフェクト細胞を慣用的な手法によって培養し、本明細書に記載の方法における使用のための抗体を産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において共発現され得、これは以下に詳述する。
【０２０４】
さまざまな宿主−発現ベクター系が、本明細書に記載の方法における使用のための抗体分子を発現させるために利用され得る。かかる宿主−発現系は、目的のコード配列が作製され、続いて精製される媒体を表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、本発明の抗体分子をインサイチュで発現し得る細胞もまた表す。このようなものとしては、限定されないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌など（例えば、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核生物の細胞（特に、完全体の組換え抗体分子の発現のための）が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと合わせたものは、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０２０５】
細菌系において、いくつかの発現ベクターが、発現される抗体分子の意図される用途に応じて好都合に選択され得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のため、大量のかかるタンパク質が産生されるべきである場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指令するベクターが望ましかろう。かかるベクターとしては、限定されないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８  （Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））（これは、抗体コード配列が個々にベクター内に、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域とインフレームにライゲートされたものであり得る）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））；などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合の後、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２０６】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして典型的に使用される。該ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で成長する。その抗体コード配列は、該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置されたものであり得る。
【０２０７】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系の発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合因子、例えば、後期プロモーターおよび三連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートされ得る。このキメラ遺伝子は、次いで、アデノウイルスゲノム内にインビトロまたはインビボ組換えによって挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）内への挿入により、感染宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現する能力をもつ組換えウイルスがもたらされる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルも必要とされ得る。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらにまた、開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズ（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）でなければならない。このような外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方のさまざまな起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２０８】
また、挿入配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質生成物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、該タンパク質
の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセッシングならびにタンパク質および遺伝子産物の修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするため、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のため、一次転写物の適正なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる哺乳動物宿主細胞としては、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正常乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げられる。
【０２０９】
長期間で抗収率の組換えタンパク質の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株は、操作されたものであり得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御され得るＤＮＡで形質転換させ得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を１〜２日間、富化培地中で培養し得、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体内にプラスミドを安定に組み込み、培養されて増殖巣を形成するのを可能にし、次いで、該増殖巣をクローニングおよび拡大培養して細胞株とし得る。この方法は、細胞株を操作して抗体分子を安定に発現させるのに好都合に使用され得る。
【０２１０】
いくつかの選択系、例えば限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））が使用され得、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子：ｄｈｆｒ、これは、メトトレキサートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５  （Ｍａｙ、１９９３）；ならびにｈｙｇｒｏ、これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４）の選択の根拠として使用され得る。使用され得る組換えＤＮＡ手法の一般に当該技術分野で知られた方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに第１２章および第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２１１】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（概説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害因子のレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅される領域は抗体遺伝子と関連しているため、該抗体の産生もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２１２】
宿主細胞は、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクター本発明の２つの発現ベクターとともにコトランスフェクトされ得る。該２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むものであってもよい。あるいはまた、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを使用してもよい。かかる状況では、軽鎖は、過剰の毒性の遊離重鎖を回避するため、好都合には重鎖の前に配置される（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを構成するものであり得る。
【０２１３】
本発明の抗体分子が組換えにより発現されたら、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対する親和性およびサイズ排除（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）可溶性、または任意の他のタンパク質の標準的な精製手法によって精製され得る。あるいはまた、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、ＵＳ２００２  ０１２３０５７  Ａ１に開示されている。
【０２１４】
一実施形態において、本発明における方法のための結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失した合成の定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定のある実施形態において、適合性の修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠失構築物（ΔＣＨ２構築物）またはバリアントを含む。他の実施形態では、短鎖の連結ペプチドが該欠失ドメインと置換され、可変領域に対して柔軟性および運動の自由度がもたらされたものであり得る。当業者には、かかる構築物は、抗体の異化作用の割合に対するＣＨ２ドメインの調節特性のため、特に好ましいことが認識されよう。
【０２１５】
特定のある実施形態において、本明細書に開示された方法における使用のための修飾抗体はミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で報告された方法を用いて作製され得る（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照のこと）。
【０２１６】
別の実施形態において、本明細書に開示された方法における使用のための修飾抗体は、当該技術分野で知られたＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）（例えば、ＷＯ  ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）を用いて誘導され得る。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインが欠失され、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターが得られるように操作された。
【０２１７】
一実施形態において、本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニスト抗体またはその断片は、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または単量体サブユニット間の会合が許容される限り１個ですらあるアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域において、単一のアミノ酸の変異が、実質的にＦｃ結合を低減し、それにより腫瘍局在を増大させるのに充分であり得る。同様に、モジュレートする対象のエフェクター機能（例えば、相補鎖結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの当該部分を単純に欠失させることが望ましい場合があり得る。定常領域のかかる部分欠失により、被験体定常領域ドメインと関連する他の望ましい機能が損なわれないまま、抗体の選択した特性（血清半減期）が改善され得る。さらに、上記において示唆したように、開示した抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを向上させる１つ以上のアミノ酸の変異または置換による合成のものであり得る。これに関して、修飾抗体の立体配置および免疫原性のプロフィールを実質的に維持したまま、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によってもたらされる活性を破壊することが可能であり得る。また他の実施形態は、エフェクター機能などの望ましい特性を増強するため、またはより多くの細胞毒素もしくは糖鎖結合をもたらすための、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。かかる実施形態において、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製させることが望ましい場合があり得る。
【０２１８】
本発明はまた、ＯＭｇｐポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはその断片である本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）のバリアント（誘導体を含む）を含む、本質的に該バリアントからなる、またはバリアントからなる抗体の使用を提供する。当業者に知られた標準的な手法、例えば、限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発を用いて、変異が、結合分子をコードするヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、該バリアント（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３に対する５０アミノ酸未満の置換、４０アミノ酸未満の置換、３０アミノ酸未満の置換、２５アミノ酸未満の置換、２０アミノ酸未満の置換、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸置換、または２アミノ酸未満の置換をコードするものである。「同類アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基が、電荷が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。電荷が同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン，システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいはまた、変異は、コード配列の全部または一部に沿って無作為に、例えば、飽和変異誘発などによって導入され得、得られた変異体は生物学的活性についてスクリーニングされ、活性を保持している変異体が同定され得る。
【０２１９】
例えば、変異を抗体分子のフレームワーク領域内のみ、またはＣＤＲ領域内のみに導入することが可能である。導入された変異は、サイレントまたは中性のミスセンス変異であり得る、すなわち、抗体の抗原結合能力に対する効果を全くまたはほとんど有しない。このような型の変異は、コドン使用頻度を最適化するため、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいはまた、非中性のミスセンス変異により、抗体の抗原結合能力が改変され得る。最もサイレントで中性のミスセンス変異の位置は、おそらくフレームワーク領域内であり、一方、最も非中性のミスセンス変異の位置は、おそらくＣＤＲ内であるが、これは絶対要件ではない。当業者であれば、所望の特性（例えば、抗原結合活性の改変がない、または結合活性の改変がない（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変更）など）を有する変異体分子を設計し、試験することができよう。変異誘発後、コードタンパク質は常套的に発現され得、該コードタンパク質の機能的および／または生物学的活性が、本明細書に記載の手法を用いて、または当該技術分野で知られた手法を常套的に修正することにより測定され得る。
融合タンパク質およびコンジュゲートポリペプチドおよび抗体
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐポリペプチドおよび抗体は、さらに、Ｎ−もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換えにより融合されたもの、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的にコンジュゲートされたもの（共有結合性および非共有結合性コンジュゲーションを含む）であり得る。例えば、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、検出アッセイにおける標識およびエフェクター分子として有用な分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素など）に、組換えにより融合されたもの、またはコンジュゲートされたものであり得る。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ  ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ  ３９６，３８７を参照のこと。
【０２２０】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドおよび抗体としては、修飾された誘導体、すなわち、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体がＯＭｇｐの生物学的機能を阻害することが妨げられないような共有結合による任意の型の分子の修飾された誘導体が挙げられる。例えば、限定を意図しないが、本発明のＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、既知の保護基／阻害基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾されたものであり得る。任意の数多くの化学的修飾が、既知の手法、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであり得る。
【０２２１】
本明細書に開示された処置方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸、すなわちペプチド等量式で構成されたものであり得、２０種類の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含むものであり得る。ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法によって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端、または糖鎖などの部分においてなされ得る。所与のＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体において、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体は多くの型の修飾を含むものであり得る。ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、例えばユビキチン化の結果として分枝鎖であり得、分岐を伴う、または伴わない環状であり得る。環状で分枝鎖の、および分枝鎖で環状のＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、翻訳後天然プロセスから生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２））
を参照のこと。
【０２２２】
本発明はまた、ＯＭｇｐ機能を阻害するＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体融合体を含む、本質的に該融合体からなる、または該融合体からなる融合タンパク質を提供する。好ましくは、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能のために有用であるか、またはＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドもしくは抗体を標的化するのに有用である。本発明の特定のある実施形態において、可溶性ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチド、例えば、ＬＲＲドメイン、ＣＲドメイン、Ｓ／ＴＲドメインを含むＯＭｇｐポリペプチドまたはその成熟タンパク質全体（配列番号：２のアミノ酸２５〜４２５に対応する）が、異種ポリペプチド部分に融合され、ＯＭｇｐアンタゴニスト融合ポリペプチドが形成される。ＯＭｇｐアンタゴニスト融合タンパク質および抗体は、種々の目的、例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官もしくは組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、容易な精製、およびより高いアビディティを達成するために使用され得る。達成すべき目的（１つまたは複数）に応じて、異種部分は、不活性または生物学的に活性であり得る。また、これは、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドもしくは抗体に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能なように選択され得る。これらの他の目的を達成するための異種部分は当該技術分野で知られている。
【０２２３】
ＯＭｇｐアンタゴニスト融合ポリペプチドまたは抗体の発現に対する択一法として、選択した異種部分を予め形成し、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に化学的にコンジュゲートすることができる。ほとんどの場合において、選択した異種部分は、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に融合されたものであれ、コンジュゲートされたものであれ、同様に機能する。したがって、異種アミノ酸配列の以下の論考において、特に記載のない限り、異種配列は、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に融合タンパク質の形態で、または化学的コンジュゲートとして連結され得ることを理解されたい。
【０２２４】
ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体などの薬理学的に活性なポリペプチドは、多くの場合、急速なインビボクリアランスを示し、体内で治療有効濃度を達成するためには、大用量が必要とされる。また、約６０ｋＤａより小さなポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これは、場合よっては腎臓毒性をもたらす。ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体などの比較的小さいポリペプチドの融合またはコンジュゲーションは、かかる腎臓毒性のリスクを低減または回避するために使用され得る。種々の異種アミノ酸配列、すなわち、治療用ポリペプチドのインビボ安定性、すなわち血清半減期を増大させるためのポリペプチド部分または「担体」が知られている。
【０２２５】
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素的もしくは免疫学的機能の欠如のため、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ断片が異種部分として一般に使用されている。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に教示されたものなどの方法および材料の適用により、ＨＳＡは、ＯＭｇｐ部分のおかげで薬理学的活性を示すとともに、有意に増大したインビボ安定性（例えば、１０倍〜１００倍高い）を示すＯＭｇｐアンタゴニスト融合ポリペプチドまたは抗体またはポリペプチド／抗体コンジュゲートを形成するために使用され得る。ＨＳＡのＣ末端は、可溶性ＯＭｇｐ部分のＮ末端に融合され得る。ＨＳＡは天然に分泌されるタンパク質であるため、ＨＳＡシグナル配列は、融合タンパク質を真核生物、例えば、哺乳動物の発現系において産生させる場合に、細胞培養培地中への可溶性ＯＭｇｐ融合タンパク質の分泌を得るために利用され得る。
【０２２６】
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）の構築に有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいはまた、他のシグナル配列が使用され得る。例えば、Ｗａｔｓｏｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔内で切断される。これにより、Ｆｃ領域および可溶性ＯＭｇｐ部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌がもたらされる。
【０２２７】
一部のある実施形態において、該ＤＮＡ配列は、分泌カセットと可溶性ＯＭｇｐ部分の間のタンパク質分解的切断部位をコードするものであり得る。かかる切断部位により、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解的切断がもたらされ、したがってＦｃドメインが標的タンパク質から分離され得る。有用なタンパク質分解的切断部位としては、タンパク質分解的酵素、例えば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼＫなどによって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２２８】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込まれ得る。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、これは、免疫融合体ＤＮＡの転写がヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下に置かれたものである。例えば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；およびＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照のこと。適切な宿主細胞が、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされ得、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドの発現および分泌のために使用され得る。典型的に使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０２２９】
一実施形態において、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合される。ＯＭｇｐ−Ｆｃ融合体の潜在的な利点としては、可溶性、インビボ安定性および多価、例えば二量体化が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいはまた、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）  であり得る。ＩｇＧ  Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域が一般的に使用される。一実施形態において、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域において始まり、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に画定する配列（すなわち、残基２１６、Ｋａｂａｔシステムに従って重鎖定常領域の最初の残基を１１４とする）、または他の免疫グロブリンの類縁の部位が融合体に使用される。融合が行なわれる正確な部位は重要ではない；具体的な部位はよく知られており、分子の生物学的活性、分泌または結合特性が最適化されるように選択され得る。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築するため、および発現させるための材料および方法は当該技術分野で知られており、必要以上の実験を行なうことなく、可溶性ＯＭｇｐ融合体を得るために適用され得る。本発明の一部の実施形態では、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載のものなどのＯＭｇｐ融合タンパク質が用いられる。
【０２３０】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、通常は不必要であり、かつ本発明の方法に使用されるＦｃ融合タンパク質において望ましくないエフェクター機能を示す。したがって、特定の結合部位を、典型的には、分泌カセットの構築の際にＦｃ領域から欠失させる。例えば、軽鎖との共発現は不必要であるため、重鎖結合タンパク質の結合部位であるＢｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））を、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させ、その結果、この部位により免疫融合体の効率的な分泌が干渉されない。ＩｇＭ内に存在するものなどのなどの膜貫通ドメイン配列もまた一般的に、欠失されている。
【０２３１】
ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ほとんどの場合で使用される。あるいはまた、免疫グロブリンγのその他のサブクラス（γ−２、γ−３およびγ−４）のＦｃ領域が、分泌カセットにおいて使用され得る。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、一般的に分泌カセットにおいて使用され、ヒンジ領域の少なくとも一部分、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域が含まれる。一部のある実施形態において、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域はＣＨ２欠失Ｆｃであり、これは、ヒンジ領域の一部分およびＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）に記載されている。一部のある実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域が使用される。
【０２３２】
ＯＭｇｐ−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築され得る。立体配置の一例では、可溶性ＯＭｇｐ部分のＣ末端がＦｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合されている。わずかに異なる立体配置では、短鎖ポリペプチド（例えば２〜１０個のアミノ酸）が融合体内の可溶性ＯＭｇｐ部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間に組み込まれている。かかるリンカーにより立体配座の柔軟性がもたらされ、これにより、状況によっては生物学的活性が改善され得る。ヒンジ領域の充分な部分がＦｃ部分において保持されている場合、ＯＭｇｐ−Ｆｃ融合は二量体化し、したがって２価の分子が形成される。単量体Ｆｃ融合の均一な集団では、単一特異的な２価二量体が得られる。各々が異なる特異性を有する２種類の単量体Ｆｃ融合の混合物では、二重特異性の２価二量体が得られる。
【０２３３】
対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含有する任意のいくつかの架橋剤を用いて、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドを血清アルブミンに連結させ得る。適当なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳおよびＧＭＢＳが挙げられる。他の適当なリンカー、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。保護または非保護チオールをスルフヒドリル基との反応に提供して還元可能な連結を生成させるリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡおよびＳＡＴＰが挙げられる。かかる試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０２３４】
コンジュゲーションは、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を伴うものである必要はない。例えば、可溶性ＯＭｇｐ−アルブミン融合体は遺伝子操作手法を用いて得られ得、この場合、可溶性ＯＭｇｐ部分は、血清アルブミン遺伝子に、そのＮ末端、Ｃ末端または療法で融合される。
【０２３５】
可溶性ＯＭｇｐポリペプチドは異種ペプチドに、可溶性ＯＭｇｐ部分の精製または同定を助長するために融合され得る。例えば、市販のクロマトグラフィー媒体を用いた精製を助長するため、ヒスチジンタグが可溶性ＯＭｇｐポリペプチドに融合され得る。
【０２３６】
本発明の一部のある実施形態において、可溶性ＯＭｇｐ融合構築物は、細菌内での可溶性ＯＭｇｐ部分の産生を増強するために使用される。かかる構築物には、通常、高レベルで発現および／または分泌される細菌タンパク質が、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして使用される。例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照のこと。
【０２３７】
可溶性ＯＭｇｐ部分を適当な融合パートナーのアミノおよびカルボキシ末端に融合させることにより、２価または４価の形態の可溶性ＯＭｇｐポリペプチドが得られ得る。例えば、可溶性ＯＭｇｐ部分をＩｇ部分のアミノおよびカルボキシ末端を融合させると、２つの可溶性ＯＭｇｐ部分を含む２価の単量体ポリペプチドが生成され得る。このような単量体の２つが二量体化すると、Ｉｇ部分のおかげで、４価形態の可溶性ＯＭｇｐタンパク質が得られる。かかる多価形態は、標的に対する結合親和性の増大ために使用され得る。多価形態の可溶性ＯＭｇｐはまた、可溶性ＯＭｇｐ  部分をタンデムに配置してコンカテマーを形成することにより得られ得、これは、単独で使用され得るか、または融合パートナー（例えば、ＩｇもしくはＨＳＡなど）と融合され得る。
コンジュゲートポリマー（ポリペプチド以外）
本発明の一部のある実施形態は、１つ以上のポリマーがＯＭｇｐポリペプチドまたは抗体にコンジュゲート（共有結合により連結）された可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたはＯＭｇｐ抗体を伴う。かかるコンジュゲーション適したポリマーの例としては、ポリペプチド（上記）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。典型的には、必ずしもそうではないが、ポリマーは、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたはＯＭｇｐ抗体に、以下：可溶性、安定性またはバイオアベイラビリティの１つ以上を改善する目的でコンジュゲートされる。
【０２３８】
ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体へのコンジュゲーションに一般的に使用されるポリマーの類型は、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、最も高頻度に使用される。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４または５つのＰＥＧポリマーを、各ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートさせると、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体単独と比べて、血清半減期を増大させ得る。ＰＥＧ部分は、非抗原性で本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるＰＥＧ部分は分枝鎖または非分枝鎖であり得る。
【０２３９】
ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合されるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は種々であり得る。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少なくなる。通常、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合されるポリマーの総質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖が結合されると、その鎖の分子量は、一般的に２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖が結合されると、各鎖の分子量は、一般的に１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖が結合されると、分子量は、一般的に７〜１４ｋＤａである。
【０２４０】
ポリマー、例えばＰＥＧは、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に、該ポリペプチド上の任意の適当な露出した反応性基を介して連結され得る。露出した反応性基（１つまたは複数）は、例えば、Ｎ末端アミノ基もしくは内部リシン残基のεアミノ基または両方であり得る。活性化されたポリマーは、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体上の任意の遊離アミノ基と反応し、これに共有結合によって連結され得る。ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体の遊離カルボン酸基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化糖鎖部分およびメルカプト基（利用可能な場合）もまた、ポリマー結合のための反応性基として使用され得る。
【０２４１】
コンジュゲーション反応では、ポリペプチド濃度に応じて、ポリペプチド１モルあたり約１．０〜約１０モルの活性化されたポリマーが、典型的に使用される。通常、選択される比率は、反応の最大化と、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体の所望の薬理学的活性を障害し得る副反応（多くの場合、非特異的）の最小化との均衡を表す。好ましくは、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体の少なくとも５０％の生物学的活性（例えば、任意の本明細書に記載のアッセイまたは当該技術分野で知られたアッセイにおいて示される）が保持され、最も好ましくは、ほぼ１００％が保持される。
【０２４２】
ポリマーはＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体に、慣用的な化学反応を用いてコンジュゲートされ得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分が、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体のリシンのεアミノ基にカップリングされ得る。リシン側鎖への連結は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）などにより行なわれ得る。好適なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーが、スクシンイミジル部分の代わりに使用され得る。このようなものとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。条件は、通常、反応の選択性および程度が最大限となるように最適化される。かかる反応条件の最適化は、当業者の技量の範囲内である。
【０２４３】
ＰＥＧ化は、当該技術分野で知られた任意のＰＥＧ化反応によって行なわれ得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）、ならびに欧州特許出願ＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（もしくは類縁の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行なわれ得る。
【０２４４】
アシル化によるＰＥＧ化は、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体の反応を伴う。任意の反応性ＰＥＧ分子がＰＥＧ化に使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧは、高頻度に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書で用いる場合、「アシル化」には、限定されないが、以下の型の治療用タンパク質と水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタンなどとの連結が含まれる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｌｅｍ．５：１３３−１４０、１９９４を参照のこと。反応パラメータは、一般的に、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドを損傷または不活化し得る温度、溶媒およびｐＨ条件が回避されるように選択される。
【０２４５】
一般的に、連結結合はアミドであり、典型的には、生じる生成物の少なくとも９５％がモノ−、ジ−またはトリ−ＰＥＧ化のものである。しかしながら、より高度にＰＥＧ化された種が一部、使用した具体的な反応条件に応じた量で形成され得る。任意選択で、精製されたＰＥＧ化種は混合物から、特に未反応種から慣用的な精製方法、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィーおよび電気泳動などによって分離される。
【０２４６】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般的に、還元剤の存在下での、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体との反応を伴う。また、ＰＥＧ化が実質的にＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基でのみを好都合となるように（すなわち、モノＰＥＧ化タンパク質）、反応条件を操作してもよい。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれの場合も、ＰＥＧ基は、典型的には該タンパク質に−ＣＨ２−ＮＨ−基によって結合される。特に−ＣＨ２−基に関して、この型の結合は「アルキル」結合として知られている。
【０２４７】
Ｎ末端標的化モノＰＥＧ化生成物を作製するための還元性アルキル化による誘導体化では、誘導体化に利用可能な異なる型の一次アミノ基（リシン対Ｎ末端）差示的反応性が利用される。反応は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基とのｐＫａの差を利用することが可能なｐＨで行なわれる。かかる選択的誘導体化によって、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される、すなわち、ポリマーとのコンジュゲーションが主としてタンパク質のＮ末端で起こり、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基など）の有意な修飾は起こらない。
【０２４８】
アシル化およびアルキル化両方のアプローチに使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、典型的には、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾されたものであり、そのため、本発明の方法に提供された場合に重合度が制御され得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水安定性であるか、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。該ポリマーは分枝鎖または非分枝鎖であり得る。アシル化反応では、選択されるポリマー（１種類または複数種）は、典型的には単一の反応性エステル基を有する。還元性アルキル化では、選択されるポリマー（１種類または複数種）は、典型的には単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、水溶性ポリマーは、これらが、通常、哺乳動物組換え発現系によってより簡便に作製されるため、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。
【０２４９】
ＰＥＧ化された可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたは抗体の作製方法は、一般的に、（ａ）ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体をポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と、分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合された状態になる条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応生成物（１種類または複数種）を得る工程を含む。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知パラメータおよび所望される結果に基づき、個々の場合で決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比率が大きいと、一般的に、  より高いパーセンテージでポリＰＥＧ化生成物がもたらされる。
【０２５０】
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー／可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたはＯＭｇｐ抗体を作製するための還元的アルキル化は、一般的に、（ａ）可溶性ＯＭｇｐタンパク質ｏｒポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と、該ポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基のペンニップ（ｐｅｎ−ｎｉｔ）選択的修飾に適したｐＨの還元性アルキル化条件下で反応させる工程；および（ｂ）反応生成物（１種類または複数種）を得る工程を含む。
【０２５１】
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー／可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたはＯＭｇｐ抗体のためには、還元性アルキル化反応条件は、該ポリペプチドまたは抗体のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を許容するものである。かかる反応条件は、一般的に、リシン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基の間にｐＫａの差をもたらす。本発明の目的のためには、ｐＨは、一般的に３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０２５２】
可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたは抗体は、タグ、例えば、その後タンパク質分解によって放出され得る一部分を含むものであり得る。したがって、リシン部分は、まず、低分子量リンカー（例えば、トラウト試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）、これは、リシンおよびＮ末端の両方と反応する）で修飾されたＨｉｓ−タグ反応させ、次いで、該Ｈｉｓタグを放出させることにより選択的に修飾され得る。その結果、該ポリペプチドは、チオール反応性頭部（ｈｅａｄ）基  （例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離もしくは保護ＳＨ）を含有するＰＥＧで選択的に修飾され得る遊離ＳＨ基を含む。
【０２５３】
トラウト試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を設定する任意のリンカーで置き換えられ得る。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置き換えられ得る。同様に、該タンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳもしくはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ得、得られた生成物を遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させ得る。
【０２５４】
一部のある実施形態では、ポリアルキレングリコール部分を、ＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドまたは抗体のシステイン基にカップリングさせる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いて行なわれ得る。
【０２５５】
任意選択で、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたは抗体はポリエチレン−グリコール部分に、不安定結合を介してコンジュゲートさせる。不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断にて切断され得る。例えば、該結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断され得る。
【０２５６】
反応は、生物学的に活性な物質と不活性ポリマーとの反応に使用される任意の適当な方法によって、一般的には約５〜８、例えば、ｐＨ５、６、７または８のｐＨ（反応性基がＮ末端のαアミノ基上に存在する場合）で行なわれ得る。一般的に、該方法は、活性化されたポリマーの調製、およびその後に、タンパク質を該活性化されたポリマーと反応させて製剤化に適した可溶性タンパク質を作製することを伴う。
ＯＭｇｐポリヌクレオチドアンタゴニスト
具体的なある実施形態は、ＯＭｇｐをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含むＯＭｇｐポリヌクレオチドアンタゴニストの有効量を投与することを含む、脱髄または髄鞘発育不全障害の処置方法を含む。ＯＭｇｐポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＯＭｇｐの発現を抑制する（ノックダウン）。ＯＭｇｐポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、限定されないが、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉが挙げられる。典型的には、かかる結合分子は、動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）  を参照のこと）、が、かかる結合分子はまた、宿主細胞に取り込まれ、インビボで発現されたポリヌクレオチドからもインビボで発現され得る。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８）のまた参照のこと
ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現をいう。具体的には、ＲＮＡｉは、標的遺伝子を、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を介して特定のｍＲＮＡ（例えば、ＯＭｇｐ）相互作用することによりサイレンス化する。次いで、ｄｓ  ＲＮＡ複合体は、細胞に分解に標的化される。さらなるＲＮＡｉ分子としては、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；また低分子干渉ヘアピンが挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループに連結された標的遺伝子由来のセンスおよびアンチセンス配列を含む。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質内に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。ＲＮＡｉのＲＮＡを発現させるためには、Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターが使用され得る。
【０２５７】
ＲＮＡｉは、その「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−  ９７４７、２００１）。ショウジョウバエ細胞無含有ライセートにおける生化学的研究により、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエイターは、２１〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることが示されている。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法に好都合に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られるＲＮアーゼによるｄｓＲＮＡのプロセッシングにより誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６、２００１）。ｓｉＲＮＡ二本鎖生成物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体））と称される多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に集合（ｒｅｃｒｕｉｔ）されると思われる。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに誘導され、そこでｓｉＲＮＡ二本鎖と配列特異的に相互作用して触媒的に切断を媒介すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６、２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０、２００１）。
【０２５８】
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を解析するため、および哺乳動物細胞の必須遺伝子を同定するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３、２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５、２００１）（非限定的な一例として、ニューロン（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９、２００２）。ＲＮＡｉはまた、治療モダリティ、例えば、ウイルス（例えば、限定されないが、ポリオウイルス）の感染、複製および／または増殖の阻害または阻止（Ｇｉｔｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０、２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１、２００２）、ならびに癌遺伝子の発現の低減について評価されている。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（ツメガエル）の胚における遺伝子発現をモジュレートするため（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０、２００２；およびＺｈｏｕ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９、２００２）、ならびに生後のマウスにおける遺伝子発現をモジュレートするため（Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８、２００２）、ならびに成体トランスジェニックマウスにおいて導入遺伝子発現を低減するため（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９、２００２）に使用されている。細胞培養物およびインビボでのｓｉＲＮＡの有効性および特異性を測定するための方法が報告されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４、２００２；Ｌａｓｓｕｓら、Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３、２００２；およびＬｅｉｒｄａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８、２００２を参照のこと）。
【０２５９】
ＲＮＡｉを媒介する分子、例えば限定されないが、ｓｉＲＮＡは、インビトロでの化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９、２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７、２００２）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６、２００２；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２、２００２）、および大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを用いた二本鎖ＲＮＡの加水分解  （Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７、２００２）によって作製され得る。
【０２６０】
ｓｉＲＮＡ分子はまた、２つのオリゴヌクレオチドの互いへのアニーリングによっても形成され得、典型的には、二本鎖部分と単鎖部分の両方を含む以下の一般構造を有する。
【０２６１】
【化１１】
2009513666.tif 000023
式中、Ｎ、ＸおよびＹはヌクレオチドである；ＸはＹに水素結合する；「：」は、２つの塩基間の水素結合を意味する；ｘは、１〜約１００の値を有する自然数の整数である；ならびにｍおよびｎは独立して、０〜約１００の値を有する自然数の整数である。一部のある実施形態において、Ｎ、ＸおよびＹは独立して、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵである。天然に存在しない塩基およびヌクレオチドが、特に、合成ｓｉＲＮＡの場合に存在し得る（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング産物）。二本鎖の中央部分は、「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有する。単鎖部分は突出端であり、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有する。図示された突出端は３’突出端であるが、５’  突出端を有する分子もまた本発明の範囲内である。また、突出端のないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、ならびにコアの一方側には突出端を有するが他端にはないもの（例えば、ｍ＝０およびｎ＞１、またはその逆）も本発明の範囲内である。
【０２６２】
最初は、ＲＮＡｉ手法は、哺乳動物系に容易に適用可能であるとは思われていなかった。これは、哺乳動物では、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、アポトーシスカスケードおよび細胞死がもたらされるためである（Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３、１９９７）。また、長い間、ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞においてインターフェロンカスケードを活性化し、また、それにより細胞生理機能の改変がもたらされ得ることが知られている（Ｃｏｌｂｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３、１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７、１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２、１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５、１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２、１９６６）。しかしながら、ＰＫＲおよびインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡ媒介型活性化には、約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡが必要とされる。対照的に、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを引き起こすことが知られている（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７、２００１）。したがって、長鎖ｄｓＲＮＡを実質的に含まない短鎖ＲＮＡを作製することにより、長鎖ｄｓＲＮＡ分子に伴う望ましくない非特異的効果が回避され得ることが予測される。
【０２６３】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６、２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０、２００１；Ｃｕｌｌｅｎ、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９、２００２；Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：９７４２−９７４７、２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２、１９９９；Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０、１９９９；Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９、１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １３：６７−７３、２００２；Ｐａｒｒｉｓｈら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  （６：１０７７−１０８７、２０００；Ｒｏｍａｎｏら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （６：３３４３−３３５３、１９９２；Ｔａｂａｒａら、Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２、１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５、２００１。
【０２６４】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８、２００２）により、ヘアピン状に折り畳まれた低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉを行なうための手段として使用された。したがって、かかる低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本発明の方法に好都合に使用される。機能的ｓｈＲＮＡの幹およびループの長さは種々である。幹の長さは、約２５〜約３０ｎｔの任意の範囲であり得、ループの大きさは、４〜約２５ｎｔの範囲であり得、サイレンシング活性に影響しない。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮアーゼのｄｓＲＮＡ産物と類似しており、任意の事象において、特定の遺伝子の発現の阻害に対して同じ能力を有すると考えられる。
【０２６５】
本発明の一部のある実施形態において、ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現される。
【０２６６】
アンチセンス手法は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または三重らせんの形成により遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス手法は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８）  に論考されている。三重らせんの形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００（１９９１）に論考されている、該方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づくものである。
【０２６７】
例えば、ＯＭｇｐをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり、それにより標的タンパク質の転写および生成が妨げられるように設計される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡにインビボでハイブリダイズし、標的ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。
【０２６８】
一実施形態において、ＯＭｇｐ遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部分が転写され、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成される。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡをもたらす限り、エピソームのまま維持されていても、染色体に組み込まれた状態であってもよい。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ手法方法によって構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または脊椎動物細胞での複製および発現に使用されることが当該技術分野で知られたその他のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用することが当該技術分野で知られた任意のプロモーター（例えば、本明細書の他の箇所に記載のものなど）によるものであり得る。
【０２６９】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は、好ましいが必要ではない。ＯＭｇｐをコードするＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖が形成され得るか、または三重らせん形成がアッセイされ得るのに充分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、塩基ミスマッチが多くなる。これは、安定な二本鎖（または場合によっては三重らせん）を含み、依然として該鎖を形成するものであり得る。当業者には、ハイブリダイズした複合体の融解点を測定するための標準的な手順の使用によって、許容されるミスマッチの程度を確認することができよう。
【０２７０】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドン（該コドンを含む）までの５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害において最も効率的に機能を果たすはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効ことが示されている。一般的に、Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。したがって、５’または３’いずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドが、ＯＭｇｐの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補鎖を含むものであるのがよい。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率性の低い翻訳阻害因子であるが、本発明に従って使用され得る。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるのがよく、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的なある態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２７１】
本明細書に開示された治療方法における使用のための（ｆｏｒ  ｕｓｅ）ポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはキメラ混合物もしくは誘導体、またはその修飾異形、単鎖または二本鎖であり得る。該オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖が修飾され、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどが改善されたものであってもよい。該オリゴヌクレオチドは、他の懸垂基、例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体のインビボでの標的化のため）、または細胞膜を通過する輸送を助長する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照のこと）もしくは血液脳関門を通過する輸送を助長する薬剤（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレート剤などを含むものであり得る（例えば、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）。この目的のため、該オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などにコンジュゲートされ得る。
【０２７２】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むものであり得、該修飾塩基部分は、限定されないが、５フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−  ２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−  メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン，ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−  チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル，ウラシル−５−  オキシ酢酸  メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸  （ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される。
【０２７３】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含むものであり得る。
【０２７４】
また別の実施形態において、本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類縁体を含む群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸主鎖を含むものである。
【０２７５】
また別の実施形態において、本明細書に開示された治療方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、この場合、通常の状況とは逆に、鎖は互いに平行である（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。該オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０２７６】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られた標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されたものなど）の使用によって合成され得る。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールド・ポア・ガラスポリマー支持体の使用によって作製され得る（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などである。
【０２７７】
本明細書に開示された治療方法における使用のためのポリヌクレオチド組成物は、触媒性ＲＮＡまたはリボザイムをさらにを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４日公開）；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指示される位置でで切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の配列の２つの塩基：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は当該技術分野でよく知られており、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）  により充分に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率が増大し、非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積が最小限となるように操作される。
【０２７８】
アンチセンスアプローチの場合ように、本明細書に開示された診断および治療方法における使用のためのリボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などの改善のため）で構成されたものであり得、ＯＭｇｐをインビボで発現する細胞に送達され得る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物を、アンチセンスコードＤＮＡの導入について上記と同様にして細胞内に導入してもよい。好ましい送達方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターなど）の制御下でのリボザイム「コード」ＤＮＡ構築物を伴い、その結果、トランスフェクト細胞は、内因性ＯＭｇｐメッセージを破壊し、翻訳を阻害する充分な量のリボザイムを産生する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるため、効率性に必要とされる細胞内濃度はより少ない。
ベクター
ＯＭｇｐアンタゴニストをコードする核酸を含むベクターもまた、本発明における方法のためのアンタゴニストを生成させるために使用され得る。かかる核酸を作動可能に連結させるベクターおよび発現制御配列の選択は、所望される機能的特性（例えば、タンパク質発現）および形質転換させる宿主細胞に依存する。
【０２７９】
作動可能に連結されたコード配列の発現の調節に有用な発現制御エレメントは当該技術分野で知られている。例としては、限定されないが、誘導プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられる。誘導プロモーターが使用される場合、これは、例えば、栄養状態の変更、または温度、宿主細胞媒体の変更によって制御され得る。誘導プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、β−アクチンプロモーター、およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。
【０２８０】
ベクターは、原核生物レプリコン、すなわち、細菌宿主細胞において自律複製および染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列を含むものであり得る。かかるレプリコンは当該技術分野でよく知られている。また、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、その発現により、薬物耐性などの検出可能なマーカーが付与される遺伝子を含むものであり得る。細菌薬物耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０２８１】
原核生物レプリコンを含むベクターはまた、細菌宿主細胞におけるコード遺伝子配列の発現を指令するための原核生物またはバクテリオファージのプロモーターを含むものであり得る。細菌宿主と適合性であるプロモーター配列は、典型的には、発現対象のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有するプラスミドベクターにおいて提供される。かかるプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適当な原核生物宿主が、本発明の方法に使用されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させるために使用され得る。
【０２８２】
本発明の目的のためには、数多くの発現ベクター系が使用され得る。例えば、一類型のベクターでは、動物ウイルス、例えば、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどに由来するＤＮＡエレメントが利用される。他のものでは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン性の系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡがその染色体に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、原栄養体栄養素要求株宿主に殺生剤耐性（例えば、抗生物質）または重金属（例えば、銅など）に対する耐性を提供するものであり得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連結させるか、または同じ細胞に共形質転換によって導入するかのいずれかであり得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらなるエレメントもまた、ｍＲＮＡの至適合成に必要とされ得る。このようなエレメントとしては、シグナル配列、スプライスシグナル、および転写プロモーター、エンハンサー、または終止シグナルが挙げられ得る。
【０２８３】
一実施形態において、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ、Ｉｎｃ．のプロプライエタリ（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）発現ベクター（ＮＥＯＳＰＬＡと称する（米国特許第６，１５９，７３０号））が使用され得る。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含む。このベクターは、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションすると非常に高レベル発現がもたらされ、その後、Ｇ４１８含有培地での選択およびメトトレキサート増幅がもたらされることが見出されている。もちろん、真核生物細胞内での発現を誘発し得る任意の発現ベクターが、本発明に使用され得る。適当なベクターの例としては、限定されないが、プラスミド  ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌおよびｐＺｅｏＳＶ２  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）  が挙げられる。さらなる真核生物細胞発現ベクターが当該技術分野で知られており、市販されている。典型的には、かかるベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含む。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０２８４】
一般に、多くの数の形質転換細胞を、適当に高レベルのアンタゴニストを発現するものについてスクリーニングすることは、常套的な実験法であり、これは、例えばロボットシステムによって行なわれ得る。
【０２８５】
哺乳動物宿主細胞発現に高頻度に使用される調節配列としては、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス系エレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス由来（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄｍ１Ｐ））、ポリオーマ由来ならびに強力な哺乳動物プロモーター（例えば、天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーター）などが挙げられる。ウイルス系調節エレメントおよびその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ、米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ、米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｈｅｒ、米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０２８６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子を有するものであり得る。選択可能なマーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が助長される（例えば、Ａｘｅｌ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞に対して薬物（例えば、Ｇ４１８など）、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性が付与される。高頻度に使用される選択可能なマーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
【０２８７】
ＯＭｇｐアンタゴニストをコードするベクターは、適当な宿主細胞の形質転換ために使用され得る。形質転換は、任意の適当な方法によるものであり得る。哺乳動物細胞内への外因性ＤＮＡの導入方法は当該技術分野でよく知られており、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（１種または複数種）のカプセル封入、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。また、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入され得る。
【０２８８】
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適した慣用的な方法によってなされ得る。原核生物宿主細胞形質転換には、エレクトロポレーションおよび塩処理法が使用され得る（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、エレクトロポレーション、カチオン系脂質または塩処理法が使用され得る。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−  ４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照のこと。
【０２８９】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、最も好ましくは哺乳動物起源のものである。当業者なら、発現させる所望の遺伝子産物に最良に適する具体的な宿主細胞株を優先的に決定することができよう。例示的な宿主細胞株としては、限定されないが、ＮＳＯ、ＳＰ２  細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原によるＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞株は、典型的には、市販の供給元Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公表された文献により入手可能である。
【０２９０】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、既知の手法を用いて増強され得る。例えば、グルタミンシンテセーゼ（ＧＳ）系は、ある種の条件下での発現を増強するために一般に使用される。例えば、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号および同第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照のこと。
【０２９１】
宿主細胞
本発明の方法における使用のためのＯＭｇｐアンタゴニストの発現のための宿主細胞は、原核生物または真核生物のものであり得る。例示的な真核生物宿主細胞としては、限定されないが、酵母および哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５８）、および乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられる。他の有用な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセスである。
遺伝子療法
ＯＭｇｐアンタゴニストは、哺乳動物、例えばヒト患者において、ニューロンおよび／または希乏突起神経膠細胞生存、増殖および分化の促進、あるいはニューロンの髄鞘形成の促進が治療上有益なであり得る神経系の疾患、障害または損傷の処置に対する遺伝子療法アプローチを用いてインビボで産生させ得る。これは、適当な発現制御配列に作動可能に連結された適当なＯＭｇｐアンタゴニストコード核酸の投与を伴う。一般的に、このような配列は、ウイルスベクター内に組み込まれる。かかる遺伝子療法に好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠陥ウイルスベクターであり得る。そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠失を有するアデノウイルスベクターが典型的に使用される。アデノウイルスベクターが使用される場合、該ベクターは、通常、選択可能なマーカー遺伝子を有しない。
【０２９２】
医薬組成物
本発明の方法に使用されるＯＭｇｐアンタゴニストは、哺乳動物、例えばヒトへの投与のための医薬組成物に製剤化され得る。本発明の方法に使用される医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂などを含む。
【０２９３】
本発明の組成物は、任意の適当な方法によって、例えば、非経口、脳室内、経口で、吸入スプレー剤によって、局所的、経直腸、経鼻、口内、経膣で、または埋入レザーバによって投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内および頭蓋内注射または注入手法を含む。先に記載のように、本発明のＯＭｇｐアンタゴニスト（ａｎａｔｇｏｎｉｓｔ）は、神経系において作用し、ニューロンおよび／または希乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進させる。したがって、本発明の方法では、ＯＭｇｐアンタゴニストは、これが血液脳関門を通過するような様式で投与される。この通過は、ＯＭｇｐアンタゴニスト分子自体の本質的な物理化学的特性のため、医薬製剤中の他の成分ため、または機械的デバイス、例えば、ニードル、カニューレもしくは血液脳関門を破る外科用器具などの使用のためであり得る。ＯＭｇｐアンタゴニストが本質的に血液脳関門を通過しない分子である場合、例えば、通過を助長する部分との融合体の場合、好適な投与経路は、髄腔内ならびに頭蓋内、例えば、ＭＳの慢性病変内への直接的なものである。ＯＭｇｐアンタゴニストが本質的に血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は、以下に記載する種々の経路の１つ以上によるものであり得る。一部の方法では、抗体が、徐放性の組成物またはデバイス（例えば、ＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイスなど）として投与される。血液脳関門を通過する送達は、担体分子、例えば、抗Ｆｃ受容体、トランスフェリン、抗インスリン受容体または毒素コンジュゲートまたは浸透増強因子などによって増強され得る。
【０２９４】
本発明の方法に使用される組成物の滅菌された注射用形態は、水性または油性の懸濁剤であり得る。このような懸濁剤は、当該技術分野で知られた手法に従って、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化され得る。滅菌された注射用調製物はまた、非毒性の非経口に許容され得る希釈剤または溶媒中（例えば、懸濁剤として１，３−ブタンジオール中）の滅菌された注射用液剤または懸濁剤であり得る。許容され得るビヒクルおよび溶媒のうち、使用され得るものは、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌された固定油は、溶媒または懸濁媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、任意のブランドの固定油、例えば、合成モノ−またはジ−グリセリドが使用され得る。脂肪酸、例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などは、注射用剤の調製に有用である。これらは、天然の薬学的に許容され得る油類、例えば、オリーブ油またはヒマシ油など、特にそのポリオキシエチル化形態である。これらの油性液剤または懸濁剤はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースまたは薬学的に許容され得る投薬形態（例えば、乳剤および懸濁剤）の製剤化一般に使用される同様の分散剤を含むものであり得る。他の一般に使用される界面活性剤、例えば、などＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび薬学的に許容され得る固形、液状または他の投薬形態の製造に一般に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ向上剤もまた、製剤化の目的に使用され得る。
【０２９５】
非経口製剤は、単回ボーラス投与、注入または負荷ボーラス投与、その後の維持投与であり得る。このような組成物は、特定された一定期間または種々の期間、例えば、１日１回ならびに「必要に応じて」の基準で投与され得る。
【０２９６】
本発明の方法に使用されるある種の医薬組成物は、許容され得る投薬形態、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤で経口投与され得る。また、ある種の医薬組成物は、経鼻的エーロゾルまたは吸入によって投与され得る。かかる組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させる吸収促進剤および／または他の慣用的な可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【０２９７】
単一の投薬形態を作製するために担体材料と合わされ得るＯＭｇｐアンタゴニストの量は、処置される宿主、使用されるアンタゴニストの型および具体的な投与様式に応じて異なる。該組成物は、単回用量、反復用量または確立された期間にわたる注入物として投与され得る。投薬レジメンはまた、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）がもたらされるように調整され得る。
【０２９８】
本発明の方法では、ＯＭｇｐアンタゴニストの「治療有効量」または「予防有効量」が使用される。かかる治療有効量または予防有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別および体重などの要素に従って異なり得る。治療有効量または予防有効量はまた、任意の毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が上回るものである。
【０２９９】
任意の具体的な患者のための具体的な投薬量および処置レジメンは、さまざまな要素、例えば、使用される具体的なＯＭｇｐアンタゴニスト、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌ならびに投与期間、排泄率、併用薬物、ならびに処置対象の具体的な疾患の重症度に依存する。医療従事者によるかかる要素の判断は、当業者の技量の範囲内である。その量もまた、処置対象の個々の患者、投与経路、製剤の型、使用される化合物の特性、疾患の重症度および所望される効果に依存する。使用量は、当該技術分野でよく知られた薬理学的および薬物動態原則によって決定され得る。
【０３００】
本発明の方法において、ＯＭｇｐアンタゴニストは、一般的に、神経系に脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）または髄腔内で、例えば、ＭＳの慢性病変内に長期投与される。本発明の方法による投与のための組成物は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量のＯＭｇｐアンタゴニストポリペプチドが投与されるように製剤化され得る。本発明の一部のある実施形態において、投薬量は０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。一部のある実施形態において、投薬量は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【０３０１】
ＯＭｇｐアンタゴニスト抗体での処置のためには、投薬量は、例えば約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、ｌｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）（宿主の体重あたり）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の方法では、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿ポリペプチド濃度が達成されるように、また一部の方法では、２５−３００μｇ／ｍｌが達成されるように調整される。上記の範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内であることが意図される。被験体検体には、かかる用量が、毎日、１日毎、毎週または経験的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、ある期間にわたる（例えば、少なくとも６ヶ月間）反復投与での投与を含む。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間に１回、または１ヶ月に１回または３〜６  ヶ月に１回の投与を含む。例示的な投薬スケジュールとしては、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇを連続毎日、３０ｍｇ／ｋｇを１日毎または６０ｍｇ／ｋｇを毎週が挙げられる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２種類以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は、表示した範囲内のものである。
【０３０２】
特定のある実施形態において、被験体は、ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子で処置され得る。核酸の用量は、患者１人あたり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇ  ＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１回の投与あたり１０〜１００またはそれ以上のビリオン種々である。
【０３０３】
補助的な活性化合物もまた、本発明の方法に使用される組成物に組み込まれ得る。例えば、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたは融合タンパク質は、１種類以上のさらなる治療用薬剤とともに共製剤化および／または共投与され得る。
【０３０４】
本発明には、選択した標的組織へのＯＭｇｐアンタゴニストの任意の適当な送達方法が包含され、水性液剤のボーラス注射または制御放出系の埋入が挙げられる。制御放出埋入の使用により、反復注射の必要性が低減される。
【０３０５】
本発明のＯＭｇｐアンタゴニストは、多くの状況で投与され得る。単回投薬間の間隔は、毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的ポリペプチドまたは標的分子血中レベルの測定に示される不定期であり得る。あるいはまた、本発明のＯＭｇｐアンタゴニストは徐放性製剤として投与され得、この場合、必要とされる投与頻度は少なくなる。投薬量および頻度は、患者におけるＯＭｇｐアンタゴニストの半減期に応じて異なる。可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたはＯＭｇｐ抗体、その断片、バリアントもしくは誘導体の半減期はまた、安定なポリペプチドまたは一部分、例えば、アルブミンまたはＰＥＧとの融合により延長され得る。一般に、ヒト化抗体が最も長い半減期を示し、次いでキメラ抗体および非ヒト抗体である。一実施形態において、本発明のＯＭｇｐアンタゴニストは、非コンジュゲート形態で投与され得る。別の実施形態において、本発明のＯＭｇｐアンタゴニストは、コンジュゲート形態で多数回投与され得る。さらに別の実施形態では、本発明のＯＭｇｐアンタゴニストは、非コンジュゲート形態、次いでコンジュゲート形態（またはその逆）で投与され得る。
【０３０６】
本発明の方法に使用されるＯＭｇｐアンタゴニストは、化合物を直接脳内に注入するための種々の埋入物が知られており、神経障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。このようなものとしては、ポンプを用いた脳内への長期注入、定位固定移植、一次間質カテーテル、永続的頭蓋内カテーテル埋入、および外科的移植生分解性埋入物が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌら、上記；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、「Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；第６６章、第５７７〜５８０頁、Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」、Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら、「Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【０３０７】
該組成物はまた、化合物の適当な送達または支持体系としての機能を果たす生体適合性の担体材料中に分散されたＯＭｇｐアンタゴニストを含むものであり得る。徐放性担体の好適な例としては、坐剤またはカプセル剤などの成形体の形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋入可能なマイクロカプセル型徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）が挙げられる。
【０３０８】
本発明の一部のある実施形態において、ＯＭｇｐアンタゴニストは患者に、脳の適切な領域への直接注入によって投与される。例えば、Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。代替的な手法が利用可能であり、本発明によるＯＭｇｐアンタゴニストの投与に適用され得る。例えば、カテーテルまたは埋入物の定位固定配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを用いてなされ得る。コンピュータ断層撮影（ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＴ）スキャン、１２０ｍｌのオムニペイクの注入、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌ、２ｍｍ切片厚により、３次元多面処理計画（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が可能となり得る。この装置によって、磁気共鳴画像法による試験に基づく計画によって明白な標的の立体配置のためのＣＴおよびＭＲＩ標的情報を合併することが可能となる。
【０３０９】
ＧＥ  ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）での使用のために改良されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定系（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．、Ｄｅｃａｔｕｒ、ＧＡ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定系（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）は、この目的のために使用され得る。したがって、埋入物をモニタリングする際、ＢＲＷ定位固定フレームの環状のベースリングが患者の頭蓋に装着され得る。ベースプレートに挟持されたグラファイトロッドローカライザーフレームにより、連続ＣＴ切片が（標的組織）領域全体に３ｍｍ間隔で得られ得る。コンピュータ処理された計画プログラムが、グラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いて、ＶＡＸ  １１／７８０  コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｙｎａｒｄ、Ｍａｓｓ．）にて実行され、ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間がマッピングされ得る。
【０３１０】
本明細書に記載の脱髄または髄鞘発育不全障害の処置の方法は、典型的にはインビトロで試験され、次いでインビボで、ヒトでの使用前に許容され得る動物モデルにおいて、所望の治療活性または予防活性について試験される。好適な動物モデル、例えば、トランスジェニック動物は当業者によく知られている（ｗｉｌｌ  ｋｎｏｗｎ）。例えば、ＯＭｇｐアンタゴニストの増殖、分化および生存効果を実証するためのインビトロアッセイは本明細書に記載している。軸索の髄鞘形成に対するＯＭｇｐアンタゴニストの効果は、実施例に記載のようにしてインビトロで試験され得る。最後に、インビボ試験は、本明細書に記載のように、ＯＭｇｐアンタゴニストを発現するトランスジェニックマウスを創製することにより、または
ＯＭｇｐアンタゴニストをマウスまたはラットのモデルに投与することにより行なわれ得る。
【実施例】
【０３１１】
実施例１
ＯＭｇｐは、中枢神経系で特異的に発現される
種々のラットおよびヒト組織をＯＭｇｐの発現について調べた。ヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  （ＢＤ  ＭＴＮＴＭ）Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびラットの多組織ノザンブロット（カタログ番号ＲＢ２０３０、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を購入し、これらは、種々の組織型の由来のｍＲＮＡ含んでいた。脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、脾臓、胃および精巣由来のメッセンジャーＲＮＡをＯＭｇｐ  ｍＲＮＡ転写について調べた。前述のブロットとともに使用したＯＭｇｐプローブは、以下のプライマー：
【０３１２】
【化１２】
2009513666.tif 000024
を用いてＰＣＲによって作製した。
【０３１３】
ノザンブロットを、３２Ｐ標識ＯＭｇｐプローブ（上記のＰＣＲ反応産物）と６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、ブロットを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３回、次いで、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに露光し、ｍＲＮＡレベルをオートラジオグラフィーによって可視化した。試験した１２種の組織型のうち、脳組織のみがＯＭｇｐを発現した。ヒトノザンブロットの結果を図２に示す。
ＯＭｇｐはラット脳および脊髄において発育時に調節される。
【０３１４】
ＲＴ−ＰＣＲを用い、ラット発育中の脳および脊髄において異なる時点でのＯＭｇｐの発現を調べた。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｈａら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして行なった。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは、上記のノザン実験に使用したＯＭｇｐプローブの創製に使用したプライマーと同じであった（すなわち、  配列番号：１０および１１）。
【０３１５】
ラットの脳および脊髄の両方において、ＯＭｇｐ発現は、ラットが発育するにつれて増大する。ラットが成体期（１ヶ月齢）時点までに、ＯＭｇｐ発現は、その最高レベルとなる。図３参照。実際、第１４日胚（Ｅ１４）では、脳内でのＯＭｇｐ発現は検出不可能である。第１８日胚（Ｅ１８）までに、ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡは、わずかに脳内に検出される。ラットの脳および脊髄の両方において、生誕（Ｐ０）が生後の第８日（Ｐ８）の間でＯＭｇｐ  ｍＲＮＡ一定の発現が起こるようであり、成体期にＯＭｇｐ  ｍＲＮＡの最大レベルとなる。図３参照。
【０３１６】
実施例２
ＯＭｇｐノックアウトマウスの創製
ＯＭｇｐは、希乏突起神経膠細胞およびニューロンによって発現される。ニューロンにおけるＯＭｇｐの役割および希乏突起神経膠細胞機能をさらに調べるため、ＯＭｇｐ遺伝子座がヌルであるマウスを創製した。
【０３１７】
ＯＭｇｐノックアウトマウスは、Ｓｃｈｉｅｍａｎｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：２１１１−２１１４（２００１））に記載のＯＭｇｐの単一エキソンコード配列全体を標的化するＧＦＰ／Ｎｅｏ（緑色蛍光タンパク質／ネオマイシン）置換ベクターを用いて作製した。マウスゲノム１２９／  ＳｖＪ  ＤＮＡをラムダゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃  ９４６３１３；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から単離した。９．９ｋｂ  Ｎｏｔｌ−ＥｃｏＲＶ  断片をｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）内にサブクローニングし、次いで、細菌内での相同組換えによって標的化し、ｅＧＦＰレポーター遺伝子およびネオマイシン抗生物質遺伝子をＯＭｇｐの開始ＡＴＧコドンに挿入した。最終構築物は、ＯＭｇｐの１〜１２９９ｎｔの単一エキソンコード配列全体が欠失したものであった。図４Ａ参照。
【０３１８】
次いで、この構築物を用いて、Ｖ６．５胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈから入手）のＯＭｇｐ遺伝子座を標的化した。正しく標的化された細胞を、Ｘｂａｌ消化ＥＳ細胞ＤＮＡによるサザンブロッティングによって同定し、Ｃ５７Ｂ１／６胚盤胞に注射し、キメラマウスを作製した。キメラをＣ５７Ｂ１／６マウスと交配し、ヘテロ接合型創始マウスを作製した。
【０３１９】
マウスの遺伝子型を、テイルＤＮＡの３プライマーＰＣＲによって決定した。フォワードプライマー
【０３２０】
【化１３】
2009513666.tif 000025
（配列番号：１２）ならびに２種類のリバースプライマー
【０３２１】
【化１４】
2009513666.tif 000026
（配列番号：１３）および
【０３２２】
【化１５】
2009513666.tif 000027
（配列番号：１４）により、２０７ｂｐの野生型ＰＣＲ産物および４９６ｂｐの変異体対立遺伝子ＰＣＲ産物が３５サイクル反応（９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒）で得られた。解析したＯＭｇｐヌルマウスは、１２９ＳｖＪ、Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンド混合のものであった。
【０３２３】
次いで、ヌルマウスを、脳および脊髄試料からＯＭｇｐ  ｍＲＮＡを産生するその能力について試験した。ＲＴ−ＰＣＲをＳｈａら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５）に記載のようにして、以下のプライマー：
【０３２４】
【化１６】
2009513666.tif 000028
を用いて行なった。
【０３２５】
図４Ｂは、４匹の別々の同腹子マウスの脊髄および脳のＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を示す。マウス１およびマウス２は、検出可能なレベルのＯＭｇｐ転写物を産生したが、ノックアウトマウスは、脳および脊髄においてＯＭｇｐを産生しなかった。図４Ｂ参照。
【０３２６】
ＯＭｇｐがノックアウトマウスにおいて欠損していることをさらに確認するため、ＯＭｇｐ、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＭＡＧタンパク質発現を、野生型およびＯＭｇｐヌルマウスにおけるウエスタンブロットによって試験した。脳および脊髄組織由来の全タンパク質ライセートを、４〜２０％勾配ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、次いで、標準的な手順を用いてニトロセルロースに移した。ブロットを、ＯＭｇｐ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃウサギ番号２２３および２２４）、Ｎｏｇｏ−Ａ（ＡＢ５６６４Ｐ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）ならびにＭＡＧ（ＯＭＧ（Ｋ−２１）：ｓｃ−１４５２４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に対するウサギポリクローナル抗体でプローブ探索した。Ｎｏｇｏ−ＡおよびＭＡＧタンパク質はともに、野生型およびＯＭｇｐヌルマウスに存在した。図５参照。しかしながら、ＯＭｇｐタンパク質は、野生型マウスでのみ検出可能であり、ＯＭｇｐノックアウトマウスではそうでなく、したがって、ＯＭｇｐはこれらのマウスで産生されないことが確認された。
【０３２７】
実施例３
ＯＭｇｐノックアウトマウス細胞培養物における海馬ニューロン数の増加
ＯＭｇｐノックアウトマウスおよび野生型マウスを第１５日胚のときに致死させ、その脳を取り出した。皮質、海馬および小脳から細胞を、以下のプロトコルに従って単離した。該プロトコルでは海馬についてのみ言及するが、マウス脳の他の部分の単離にも同じプロトコルを同様に使用した。ポリ−Ｌ−リシンコートカバーガラスを２４ウェル組織培養皿に配置し、３００μｌのプレーティング培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、１×Ｂ２７、５０μＭグルタミン酸を含有する神経基礎培地）を各ウェルに添加した。３〜４ｍｌのＳ−ＭＥＭを６０ｍｍのシャーレ（１シャーレに２つの脳）に添加し、シャーレを氷上に維持した。海馬をマウス脳から切除し、次いで、小片に細分した。細分された海馬を、１０粒の海馬あたり２ｍｌのＳ−ＭＥＭを入れた１５ｍｌ容チューブ内に移した。トリプシンを０．１％の終濃度まで添加した。チューブを３７℃の水浴中で３分毎に手で振りながら１０分間インキュベートした。ＤＮアーゼＩを０．０５〜０．１ｍｇ／ｍｌの終濃度で海馬に添加した。１０％ＦＢＳを含む等容量のＤＭＥＭを同様に添加した。１０ｍｌ容ピペットで上下に１０回ピペッティングすることにより、海馬細胞を解離させた。チューブを２〜３分間放置して、非解離組織片をチューブの底部に沈降させた。上清みを新たなチューブに移し、１１００ｒｐｍで３分間スピンさせ、すべての細胞を回収した。細胞をプレーティング培地中に再懸濁させ、計数し、２．５×１０４細胞を２４ウェル組織培養プレートの各ウェル内にプレーティングした。０．５〜１ｍｌの培養培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、１×Ｂ２７を含有する神経基礎培地）を各ウェルに添加した。海馬ニューロンを３日間培養した。
【０３２８】
第３日目、ＯＭｇｐノックアウトマウス由来の培養物中の海馬ニューロンを、野生型海馬ニューロン培養物と比較した。細胞を抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（ニューロンを同定するため）およびＤＡＰＩ（核を染色するため）で染色し、正常な核を有する細胞を顕微鏡下で計数した。野生型海馬の細胞培養物は、ＯＭｇｐノックアウトマウスの細胞培養物よりも少ない細胞を含んでいた。野生型海馬の細胞培養物は、フィールドあたり約２０より少し少ない正常な核を有する細胞を含むが、ＯＭｇｐノックアウト海馬の細胞培養物は、フィールドあたりほぼ約３０の正常細胞を含んでいた。図６Ｂ参照。
【０３２９】
次いで、同じ細胞培養物をアポトーシス細胞について調べた。野生型およびＯＭｇｐノックアウトの海馬ニューロン培養物を、アポトーシスマーカーであるカスパーゼ−３アポトーシスを受けている細胞について染色した。ＯＭｇｐ海馬ニューロン培養物は、野生型ニューロン培養物と比べて、アポトーシスを受けている細胞が少なかった。野生型ニューロン培養物の約３０％が第３日にアポトーシスを受けていた。しかしながら、海馬ニューロンの培養細胞は、約２５％のみが第３日にアポトーシスを受けていた。図６Ａ参照。
【０３３０】
さらに、ＯＭｇｐノックアウトマウスから単離された海馬ニューロンはまた、野生型マウスと比べて、グルコース枯渇に対する抵抗性の増大を示す。これらの結果は、細胞培養物において、ＯＭｇｐノックアウトマウスがＯＭｇｐタンパク質を発現するマウスと比べて生存が増大することを示す。
【０３３１】
実施例４
ＯＭｇｐノックアウトマウス由来の培養海馬ニューロンは、早期に神経突起伸長を示す
ＯＭｇｐノックアウトマウスおよび野生型マウス由来の海馬ニューロンを上記のような組織培養において２４時間培養し、次いで、神経突起の長さおよびプロセッシングを受けたニューロンの数について調べた。細胞をＤＡＰＩおよび抗β−チューブリンＩＩＩ抗体で染色した。各ニューロンの長さを顕微鏡下でピクセル単位で測定し、次いで、フィールドあたりの平均を求めた。ＯＭｇｐノックアウトマウス由来の海馬ニューロンの長さは、野生型マウス由来のニューロンの長さの３倍超であった。図７Ａ参照。
【０３３２】
さらに、プロセッシングを受けたニューロンを各培養物において顕微鏡下で計数した。野生型マウス由来のニューロン培養物では、細胞のほぼ１５％がプロセッシングを受けていた。しかしながら、ＯＭｇｐノックアウトマウス由来のニューロン培養物では、細胞の約２５％がプロセッシングを受けていた。図７Ｂ参照。
【０３３３】
これらのデータは、ＯＭｇｐヌルマウスのニューロンが早期の分化開始を示すこと、およびＯＭｇｐがニューロンの分化の阻害においてある役割を有することを示す。
【０３３４】
実施例５
ＯＭｇｐノックアウトマウスのニューロンは、脊髄損傷後、生存の増大を示す
野生型マウスおよびＯＭｇｐノックアウトマウスを、記載のようにして脊髄損傷（ＳＣＩ）に供した。簡単には、背側片側切断をＴ６／Ｔ７において行ない、主要背内側および小背側面の皮質脊髄路（ＣＳＴ）成分を完全に分断した。外科用マイクロメスを用いて、脊髄を表面から１．８ｍｍの深さで定位的に離断させた。試験の最後に、マウスに麻酔し、ヘパリン加生理食塩水を、その後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を噴門を越えて（ｔｒａｎｓ−ｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流した。脊髄を取り出し、パラフィン中に包埋し、１０μｍ切片を組織学的解析のために切り出した。
【０３３５】
ＳＣＩ後のアポトーシス細胞死を定量するため、動物をＳＣＩの２８日後に安楽死させ、抗活性化カスパーゼ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて染色した。また、ニューロンを同定するために抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で切片を染色した。
【０３３６】
本発明者らは、ＳＣＩの３日後、吻（ｒｏｓｔｒａｌ）および尾（ｃａｕｄａｌ）の両方の離断部位で活性化カスパーゼ−３染色を観察し、ニューロンと共局在していた。活性化カスパーゼ−３−陽性ニューロンの数は、ＳＣＩの２８日後、野生型マウスと比べてＯＭｇｐノックアウトマウスにおいて有意に少なかった。カスパーゼ−３−陽性細胞の数を、野生型およびＯＭｇｐノック脊髄切片の両方において定量した。病変の中心から種々の距離の細胞を計数した。図８Ｂに示すように、ＯＭｇｐノックアウトマウスは、有意に少ないカスパーゼ−３−陽性細胞を含んでいた。
【０３３７】
さらに、病変部位のニューロンの数をＯＭｇｐノックアウトマウスおよび野生型マウスについて定量した。ニューロンを同定するために抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で切片を染色し、脊髄病変の中心から種々の距離のニューロンを計数した。ＯＭｇｐノック−マウスは、野生型マウスと比べて有意により多くのニューロンを有していた。図８Ａ参照。
【０３３８】
これらのデータは、ＯＭｇｐノックマウスでは、ＯＭｇｐを発現する野生型マウスと比べて、ＳＣＩ後、ニューロンの細胞生存が増大することを示す。総合すると、これらのデータは、ＳＣＩ後のニューロンの生存の阻害における内因性ＯＭｇｐの役割を示す。
【０３３９】
実施例６
ＯＭｇｐノックアウトマウスにおける脊髄損傷後の機能回復
野生型マウスおよびＯＭｇｐノックアウトマウスを脊髄損傷（ＳＣＩ）に供した。すべての実験は、混合Ｃ５７ＢＬ／６および１２９ＳｖＪ系統由来の８週齢の雌マウスにおいて行なった。すべての手順は、実験動物の管理と使用のためのＮＩＨのＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された指針に従って行なった。
【０３４０】
マウスをキシラジンと混合されたケタミン（９０μｇケタミン／９．９μｇキシラジン／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の注射によって麻酔した。背中の毛を剃毛し、ベタジンおよび７０％エタノールの綿球（ＢＤ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ）で拭いた。ドレープ（３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）を用いて動物を覆い、正中切開を胸椎において行なった。傍脊柱筋を脊柱から分離して引っ込め、背側椎弓切除術を胸椎Ｔ１０において行なった。外科用マイクロメス（１５０、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて完全に離断した。鉗子を用いて脊柱をわずかに持ち上げた位置に保持し、脊髄の吻断端（ｓｔｕｍｐ）と尾断端の間に明白な分離が認められるまで脊髄を背側表面から腹側表面に数回切開した。Ｉｎｍａｎら、Ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｒｅｅｖｅ−Ｉｒｖｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（２００３）を参照のこと。
【０３４１】
ジェルフォームの小片を該離断部上に重ねた。次いで、離断部の横で２針で筋肉を閉じた。次いで、皮膚を創傷クリップによって閉じた。すべての手順は、外科用顕微鏡下で行なった。加熱室において動物を麻酔から回復させた。ブプレノルフィン（０．１μｇ／ｋｇ、１日２回、ｓｃ）を２日間投与した。ベイトリル（エンロフロキサシン  ２．５μｇ／ｋｇ、１日２回、ｓｃ）を１４日間投与した。初期用量のブプレノルフィンおよびベイトリルを術前に投与した。動物の膀胱を膀胱機能が戻るまで１日２回発現（ｅｘｐｒｅｓｓ）させた。
【０３４２】
ＳＣＩ  損傷からの回復を、移動運動スコアリング法に対するＢａｓｓｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）を用いて定量した（Ｂａｓｓｏ  Ｄ．Ｍ．，ら「Ｔｈｅ  Ｂａｓｓｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）ｆｏｒ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｆｉｖｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ」  Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ（近刊）およびＢａｓｓｏ  ＆  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｊ．Ｒｅｈａｂ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４０：Ｓ３、１２（２００３）参照、これらはともに、引用により本明細書に組み込まれる）。ＢＭＳスケールは、マウス用に特別に開発されたものである。Ｅｎｇｅｓｓｅｒ−Ｃｅｓａｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２２：１５７−１７１（２００５）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ＢＭＳスケールは、オープンフィールド移動運動器機能の評価である。そのスケールは０〜９であり、一例の以下のとおりである：０＝足首運動なし；１＝わずかな足首運動；２＝広範な足首運動；３＝体重の補助、または時々、頻繁もしくは連続的な背側足踏みを伴って、もしくは伴わずに足の足底がつくが足底の足踏みはない。ＢＭＳスケールの充分な説明は、Ｅｎｇｅｓｓｅｒ−Ｃｅｓａｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２２：１５７−１７１（２００５）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）をみるとよい。ＯＭｇｐノックアウトマウスおよび野生型マウスを、ＢＭＳスコアの増加によって示される脊髄損傷後の機能の回復、および軸索の免疫組織化学的染色によって観察される軸索再生についてモニターした。ＯＭｇｐノックアウトマウスは、野生型マウスと比べ、ＳＣＩ後に移動運動の増大を示した。図９参照。
【０３４３】
実施例７
ＯＭｇｐノックアウトマウスにおける脊髄損傷後のＲｈｏ不活性化
ＯＭｇｐがＲｈｏＡ経路に影響するか否かを調べるため、ＯＭｇｐノックアウトマウス由来の脊髄セグメントの細胞ライセートにおけるＲｈｏＡ  ＧＴＰレベルを、野生型マウス由来の対応する脊髄セグメントにおけるレベルと比較した。マウスを、実施例６に記載のようにして脊髄損傷に供するか、非損傷状態とした。ＲｈｏＡ  ＧＴＰのレベルをウエスタンブロッティングによって測定した。ＲｈｏＡ  ＧＴＰの有意な低減が、ＳＣＩに供したＯＭｇｐノックアウトマウスにおいて見られた。図１０Ａおよび１０Ｂ参照。これらの結果は、ＯＭｇｐ機能の減衰により、ＲｈｏＡ  ＧＴＰの下方調節によって軸索再生が誘導され得ることを示す。
【０３４４】
実施例８
インビトロ希乏突起神経膠細胞生存／増殖／分化アッセイ
希乏突起神経膠細胞は、Ａ２Ｂ５前駆細胞（これはＡ２Ｂ５を発現する）から、ミエリン形成前希乏突起神経膠細胞（これはＯ１およびＯ４を発現する）への分化、および最終的な成熟ミエリン形成希乏突起神経膠細胞（これは、Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰを発現する）へと、いくつかの発育段階を経て成熟する。したがって、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰマーカーの存在および非存在をモニタリングすることにより、所与の細胞の発育段階を調べること、および希乏突起神経膠細胞生物学におけるＯＭｇｐの役割をさらに評価することが可能である。希乏突起神経膠細胞生物学の一般的な概説については、例えば、Ｂａｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）を参照のこと。
【０３４５】
種々のＯＭｇｐアンタゴニストの存在下での希乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化を試験するため、Ａ２Ｂ５＋希乏突起神経膠細胞を種々の濃度のＯＭｇｐアンタゴニストまたは対照で３日間処理する。分化を評価するため、Ａ２Ｂ５＋細胞を、４ウェルスライドチャンバ内のＦＧＦ／ＰＤＧＦ無含有増殖培地（１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＮＴＦおよび１５ｎＭトリヨード−Ｌ−サイロニンを補給）にプレーティングし、漸増濃度のＯＭｇｐアンタゴニストまたは対照で直ちに処理する。４８時間（ＲＮＡｉを７２時間）後、培養物をＯ４に対する抗体で染色し、Ｏ４＋および成熟Ｏ４＋  希乏突起神経膠細胞の総数を定量する。試料は２連で解析する。
【０３４６】
成熟希乏突起神経膠細胞は、インビトロで約４８〜７２時間の半減期を有し、細胞は、典型的には７２時間後にアポトーシスを受ける。成熟希乏突起神経膠細胞の生存率の増大は、対照処理細胞と比べた細胞バイアビリティ染色によって判断する。また、ＭＢＰ発現も、成熟希乏突起神経膠細胞のマーカーとしてモニターする。
【０３４７】
実施例９
インビトロニューロン生存アッセイ
種々のＯＭｇｐアンタゴニストの存在下でニューロンの生存、増殖および分化を試験するため、ニューロン培養物を種々の濃度のＯＭｇｐアンタゴニストまたは対照で処理する。等数のラットＰ６小脳顆粒ニューロンを、１２ウェル細胞培養ポリＤ−リシンコートプレート各ウェル内に、ＯＭｇｐアンタゴニストの存在下または非存在下でプレーティングする。ニューロン培養物を１〜７日間３７℃および５％ＣＯ２で維持する。３日後、ニューロン生存を物理的外観によってモニターする。例えば、核物質が凝縮した丸い細胞体の存在および／または神経突起伸長部の存在［ニューロン特異的マーカーであるβ−チューブリンＩＩＩの存在によって測定］。また、各ウェル内の細胞の数を、ＤＡＰＩによる核の染色によって計数する。
【０３４８】
実施例１０
ラット脊髄損傷モデル
脊髄損傷（「ＳＣＩ」）は、以下のような、既報の方法（Ｌｉ，Ｓ．らＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４、１０５１１−１０５２０（２００４））を変形した背側オーバーヘミセクション（ｏｖｅｒ−ｈｅｍｉ−ｓｅｃｔｉｏｎ）によって誘発する。麻酔した雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（７週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に術前無痛法を施し（ブプレノルフィン／ブプレネックス（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）、０．０５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）、鎮静させ（ミダゾラム、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）、胸椎６／７において背側ヘミセクションを行ない、主要背内側と背側面皮質脊髄路（ＣＳＴ）を完全に離断する。皮質脊髄路（ＣＳＴ）の背側および背外側成分を完全に離断し、ＣＳＴの腹側部分をそのままにしておく。
【０３４９】
後脚機能を、Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）オープンフィールドスコアリング法（Ｅｂｙ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１５３３６−１５３４２（２０００）、引用により本明細書に組み込まれる）を用いて定量する。ＣＳＴ離断直後、髄腔内カテーテルをＴ７のクモ膜下腔内に挿入し、注入型（ｐｒｉｍｅｄ）浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００４型、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ）に接続し、皮下空間内に挿入する。浸透圧ミニポンプにより、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧアイソタイプ対照タンパク質（５ｍｇ／ｍｌ）またはモノクローナルＯＭｇｐアンタゴニスト抗体、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたはＲＮＡｉ分子（約５ｍｇ／ｍｌ）を、連続的に０．２５μｌ／ｈの速度で５週間にわたって送達する。ラットを、ＢＢＢスコアの増加によって示される脊髄損傷後の機能の回復、ならびに軸索の免疫組織化学的染色によって観察される軸索再生および軸索退縮についてモニターする。
【０３５０】
実施例１１
インビトロ髄鞘形成アッセイ
抗ＯＭｇｐアンタゴニスト抗体、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドおよびＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ）の髄鞘形成における役割を、脊髄神経節（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ）（ＤＲＧ）ニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の共培養物を種々のＯＭｇｐアンタゴニストで個々に処理し、免疫組織化学およびウエスタンブロッティングによって髄鞘形成について試験することにより、インビトロで調べる。これらの研究では、まず、ＤＲＧニューロンおよび希乏突起神経膠細胞の初代培養物を作製することが必要である。
【０３５１】
雌Ｌｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットＥ１４〜Ｅ１７胚の脊髄神経節を、Ｐｌａｎｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６０８３−９１（２００２）に記載のようにして培養する。切開したＤＲＧをポリ−Ｌ−リシンコートカバーガラス上に（１００μｇ／ｍｌ）２週間プレーティングする。細胞を、第２〜６日にフルオロデオキシウリジンの存在下でおよび第８〜１１日に、１×Ｂ２７、１００ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＮＬＡ培地中でインキュベートする。
【０３５２】
雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓの生後第２日（Ｐ２）ラットの希乏突起神経膠細胞を、Ｃｏｎｎ、Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１９９０）に記載（変形を伴う）のようにして以下のとおりに培養する。簡単には、前脳をＰ２ラットから摘出し、冷ＨＢＳＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に入れる。組織断片を１ｍｍ片に切断し、３７℃１５分間、０．０１％トリプシンおよび１０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ中でインキュベートする。解離した細胞をポリ−Ｌ−リシンコートＴ７５組織培養フラスコ上にプレーティングし、２０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中、３７℃で１０日間培養する。Ａ２Ｂ５陽性希乏突起神経膠細胞を、フラスコを一晩、２００ｒｐｍで３７℃にて振盪することにより回収する。Ａ２Ｂ５希乏突起神経膠細胞を、７日間、２５ｍＭ  Ｄ−グルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌヒトアポトランスフェリン、５μｇ／ｍｌウシ膵臓インスリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム、１０ｎＭヒドロコルチゾン、１０ｎＭ  Ｄ−ビオチン、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦおよびＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養する。次いで、細胞をトリプシン処理によって回収する。次いで、細胞をＤＲＧニューロンとともに、１、３、１０または３０μｇ／ｍｌの抗ＯＭｇｐモノクローナル抗体、可溶性ＯＭｇｐポリペプチドまたは陰性対照抗体の存在または非存在下、２％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＮＬＡ培地中で共培養する。培養培地を交換し、種々のＯＭｇｐアンタゴニストを３日毎に補給する。３７℃で３０日後、共培養した細胞を、神経フィラメンについて免疫組織化学的染色（「ＩＨＣ」）によって染色し、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体での染色で軸索を確認され、または抗ＭＢＰ抗体での染色で希乏突起神経膠細胞で確認される。また、共培養した細胞を溶解し、ウエスタンブロット  解析に供してＭＢＰを定量する。
【０３５３】
実施例１２
ＯＭｇｐアンタゴニストを用いたインビボ希乏突起神経膠細胞生存、ニューロン生存および髄鞘形成アッセイ  
成体野生型のＣ５７Ｂ１／６雄マウスにクプリゾン（０．２％、粉砕マウス飼料とともに粉砕、重量基準）を６週間与え、脳梁内に脱髄を誘導する（Ｍｏｒｅｌｌ  Ｐら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２２０−７（１９９８）に記載の方法に従う）。簡単には、抗ＯＭｇｐモノクローナルアンタゴニスト抗体、ＯＭｇｐ可溶性のポリペプチドまたはＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ）を脱髄脳梁内に、クプリゾン摂取の第２週、第２．５週および第３週に後述する方法によって定位固定注射する。対照マウスには、同じ間隔で対照含有滅菌培地を定位固定注射する。クプリゾン摂取の６週間後、マウスを２、４および６週間、通常の食餌に戻し（粉砕マウス飼料のみ）、再髄鞘形成させる。
【０３５４】
ＯＭｇｐアンタゴニストモノクローナル抗体、ＯＭｇｐ可溶性のポリペプチド、ＯＭｇｐアンタゴニストポリヌクレオチドおよび対照は、以下のようにして送達する。クプリゾン処置マウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、定位固定術（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）用に設計された固定装置に配置する。頭皮を切開し、滅菌化合物を、１０ｍｌ容ハミルトンシリンジにより、定位固定座標を用いてブレグマの０．７ｍｍ後部および０．３ｍｍ側方に１．７ｍｍの深さで野生型レシピエントマウスの急性的脱髄脳梁内に片側注射する（１ｍｌのＨＢＳＳ中１μＭ）（Ｍｅｓｓｉｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３：３１３−１８（１９９９））。さらなる対照レシピエントマウスに、化合物を含有しないＨＢＳＳを定位固定注射する。頭蓋の開口部にジェルフォームを充填し、該領域にペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を綿球で塗布し、傷口を縫合する。注射後、実験の週毎にマウスを致死させ、その脳を取り出し、分子生化学的および組織学的解析用に加工処理する。
【０３５５】
処置を受けた動物由来希乏突起神経膠細胞およびニューロンを、次いで、成熟希乏突起神経膠細胞生存の増大（ＣＣ１抗体染色に基づいて）、ニューロンの生存（ＮｅｕＮまたはβ−チューブリンＩＩＩ染色に基づいて）および抗ＭＢＰタンパク質抗体またはルクソールファーストブルーを用いたＩＨＣによる軸索髄鞘形成について検査した。
【０３５６】
実施例１３
ＯＭｇｐ形質転換細胞のインビボ移植
脊髄損傷におけるＯＭｇｐの生物学的機能を調べるため、皮質の初代培養細胞（混合培養物）をＯＭｇｐ発現するレトロウイルスまたはレトロウイルス対照に感染させ、ラット脊髄の損傷中心点内への送達を行なう。２×１０６細胞を導入し、ラットを第１０日に致死させる。脊髄を４％パラホルムアルデヒド中に一晩固定し、次いで、７０％エタノール、続いて９５％エタノール中で脱水させる。組織試料をパラフィン内に包埋する。切片（１０ミクロン厚）を免疫組織化学的染色に使用する。希乏突起神経膠細胞生存および軸索髄鞘形成を、ＯＭｇｐを受けた損傷ラットにおいてモニターする。
【０３５７】
実施例１４
ＯＭｇｐ発現のＯＭｇｐ特異的ＲＮＡｉノックダウン
ＯＭｇｐ特異的ＲＮＡｉを用いて、希乏突起神経膠細胞の前駆細胞におけるＯＭｇｐ発現を消去し、ＯＭｇｐがどのように希乏突起神経膠細胞の増殖および分化に寄与するかを調べる。５０，０００個のＡ２Ｂ５希乏突起神経膠細胞の前駆細胞を、以下のようにて作製したＯＭｇｐ特異的ＲＮＡｉ配列または対照ＲＮＡｉを有するレンチウイルスに感染させる。
【０３５８】
種々の種に由来するＯＭｇｐ  ＤＮＡ配列を比較し、スモールヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の候補に使用するための相同な領域を見出す。ＯＭｇｐ  ＲＮＡｉのレンチウイルス発現のための構築物は、当該技術分野で知られた方法およびｐＬＬ３．７ベクターを用いて構築する。ｐＬＬ３．７ベクター、さらなる方法論およびウイルス作製は、Ｒｕｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３、４０１−０６（２００３）に記載されている。
【０３５９】
レンチウイルスを作製する前に、ｐＬＬ３．７由来のＤＮＡ、またはｐＬＬ３．７内の候補ｓｈＲＮＡを、マウスＯＭｇｐ−ＨＡタグ化プラスミドとともに５対１の比で６ウェル形式のＣＨＯ細胞内にコトランスフェクトする。ノックダウンは、トランスフェクトＣＨＯ細胞ライセートからのＯＭｇｐ−ＨＡタグのウエスタンブロット検出、ならびに２連のウェルから調製した全ＲＮＡのノザンブロットによって解析する。ブロットをＯＭｇｐ  ｃＤＮＡの断片を用いてプローブ探索する。アッセイは、トランスフェクション後に４８時間行なう。
【０３６０】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を担持するＲＮＡｉレンチウイルスを、ＲｕｂｉｎｓｏｎらＩｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｉｔｈｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｒ  ＯＭｇｐ  ＲＮＡｉに記載のようにして作製する。分化に対するＲＮＡｉの効果を定量するため、ＧＦＰ発現希乏突起神経膠細胞を計数する。
【０３６１】
希乏突起神経膠細胞の富化集団を雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ  Ｐ２ラットから、Ｃｏｎｎ、Ｍｅｉｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１９９０）（変形を伴う）のようにして以下のとおりに培養する。簡単には、前脳を切開し、ハンクスの緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れる。組織を１ｍｍ断片に切断し、３７℃で１５分間０．０１％トリプシンおよび１０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ中でインキュベートする。解離した細胞をポリ−Ｌ−リシンコートＴ７５組織培養フラスコ上にプレーティングし、３７℃で１０日間、２０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地中で培養する。希乏突起神経膠細胞前駆体（Ａ２Ｂ５＋）を、フラスコを一晩２００ｒｐｍで３７℃にて振盪することにより回収すると、９５％純粋な集団が得られる。培養物を、ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に１週間維持する。ＦＧＦ／ＰＤＧＦの除去により、Ａ２Ｂ５＋細胞が、３〜７日後にＯ４＋ミエリン形成前希乏突起神経膠細胞に分化すること、ならびに７〜１０日後にＯ４＋およびＭＢＰ＋成熟希乏突起神経膠細胞に分化することが可能になる。これらの分化状態は、形態の変化から視覚的に容易にわかる。Ａ２Ｂ５＋細胞は、形状が二極性であり、Ｏ４＋ミエリン形成前希乏突起神経膠細胞は、より長くてより枝分れしたプロセッシングを有し、ＭＢＰ＋成熟希乏突起神経膠細胞は、プロセッシング間でミエリンシート構造を含む。
【０３６２】
Ａ２Ｂ５希乏突起神経膠細胞の前駆細胞をＯＭｇｐ  ＲＮＡｉを含むレンチウイルスに感染させる。得られた細胞を３日間培養し、Ｏ４−陽性（希乏突起神経膠細胞分化のマーカー）希乏突起神経膠細胞の数を計数する。内因性ＯＭｇｐ発現は、ＯＭｇｐ  ＲＮＡｉレンチウイルスによる感染によって低減され、ＲＴ−ＰＣＲによって確認される。
【０３６３】
実施例１５
ＯＭｇｐ特異的モノクローナル抗体の作製
免疫原性のＯＭｇｐ本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗ＯＭｇｐ抗体は、以下の方法および手順を用いて作製される。
【０３６４】
Ａ．抗体スクリーニングアッセイ
１．ＥＬＩＳＡアッセイ
ＯＭｇｐ−Ｆｃ（０．５μｇ、５０μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．０中）を、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（ＮｕｎｃＴＭ）の各ウェルに添加する。次いで、プレートを３７℃で１時間または４℃で１６時間インキュベートする。プレート上の非特異的結合部位を、０．１％ＢＳＡ、０．１％オボアルブミン、０．１％（５％（ｗ／ｖ）無脂肪粉ミルク、１５０ＭＭ  ＮＡＣＥ中）および０．００１％アジドを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を用いて阻止する。血清またはハイブリドーマ上清みの希釈物（例えば、連続３倍希釈物）を、プレートの各列全体に添加し、２５℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄後、５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）の１：１０，０００希釈物を、各ウェルに添加し、さらに１時間インキュベートする。３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させ、２Ｍ硫酸で停止させる。色強度を分光測光器にて４５０ｎｍでモニターする。
【０３６５】
２．ＦＡＣＳアッセイ
ＣＯＳ−７細胞を０．１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で、供給元が示すようにして標識する。等量のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ標識対照細胞を、洗浄したＯＭｇｐ−ＣＯＳ−７細胞（完全長のＯＭｇｐまたはその断片を発現するＯＭｇｐ発現ベクターの一過的トランスフェクションによって作製）と、抗ＯＭｇｐ試験血清またはハイブリドーマ上清みとのインキュベーション前に混合する。５０マイクロリットルの細胞混合物を、９６ウェルＶ字底ポリスチレン製プレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８７７、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の各ウェル内に分注し、１００μｌのマウス血清、ハイブリドーマ上清みまたは対照抗ＯＭｇｐ抗体を添加する。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、５０μｌのフィコエリトリン−コンジュゲート親和性純粋Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を含むＰＢＳとともにインキュベートする。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する２００μｌのＰＢＳ中に懸濁し、さらにＦＡＣＳ解析に供する。あるいはまた、ＯＭｇｐ−ＣＯＳ−７細胞をマウス血清またはハイブリドーマ上清みと混合し、次いで、Ｒ−フィコエリトリン−コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体で処理した後、標準的なＦＡＣＳ解析を行なう。
【０３６６】
Ｂ．  マウスモノクローナル抗ＯＭｇｐ抗体のハイブリドーマ作製
８週齢の雌ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、２週間に１回、５０μｇのＯＭｇｐ−Ｆｃを含有するエマルジョンで腹腔内免疫処置するか、または５０μｇのＯＭｇｐ−Ｆｃおよび５０μｌの完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するエマルジョンで腹腔内免疫処置する。さらに、実施例２に記載のＯＭｇｐノックアウトマウスを免疫処置すると、抗ＯＭｇｐ抗体が産生され得る。免疫処置マウスから血清を、最初の免疫処置前、ならびに第２回および第３回目の免疫処置の１週間後に回収し、抗ＯＭｇｐ抗体力価をＯＭｇｐ発現ＣＯＳ−７細胞において、上記のようにしてＦＡＣＳアッセイによって測定する。追加免疫の最終用量を、３回目の免疫処置後、ハイブリドーマ融合を開始する３日前に与える。
【０３６７】
種々のＯＭｇｐペプチドで免疫処置したマウス由来の血清を、ＥＬＩＳＡによって上記のようにしてスクリーニングする。ＯＭｇｐ発現ＣＯＳ−７細胞に特異的に結合する抗体について陽性であるマウスを、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって上記のようにして確認し、致死させる。脾細胞を該マウスから単離し、ＦＬ６５３骨髄腫（Ｉｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫のＡＰＲＴ誘導体、１０％ＦＢＳ、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２０ｍｇ／ｍｌ  ８−アザグアニンを含有するＤＭＥＭ中に維持）に、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ編  Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｒ．Ｈ．、ＭｃＫｅａｒｎ、Ｔ．Ｊ．およびＢｅｃｈｔｏｌ、Ｋ．Ｂ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）に記載のようにして融合させる。融合細胞を２４−または４８−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）内にプレーティングし、アデニン、アミノプテリンおよびチミジン（ＡＡＴ、Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）を含有する培養培地を供給する。ＡＡＴ耐性培養物を、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって上記のようにして、ＯＭｇｐ−ＣＯＳ−７細胞またはＯＭｇｐ−Ｆｃのいずれかに対する結合についてスクリーニングする。陽性ハイブリドーマを、限界希釈によってさらにサブクローニングする。
【０３６８】
ＯＭｇｐ−Ｆｃで免疫処置したマウスから作製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株を単離する。特定のモノクローナル抗体の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）をコードするポリヌクレオチドを、以下の方法によりＰＣＲによって単離し、クローニングし、配列解析に供する。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いてハイブリドーマ細胞から抽出し、単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを、標準的な条件を用いてＲＴ−ＰＣＲ  によって作製する。プライマーのカクテルをＲＴ−ＰＣＲに使用する。好ましい一組のプライマーとしては、その５’がシグナル配列にハイブリダイズし、その３’末端がＦＲ４／定常ドメイン接合部の３’で定常ドメインにハイブリダイズするプライマーが挙げられる。これにより、モノクローナル抗体のＮ末端とＶ／Ｃ接合部に関して曖昧さのないインタクトな可変ドメインの増幅が可能になる。当業者には、異なる鋳型の増幅および異なるＰＣＲ条件では、プライマーの組を変更する必要があることが認識されよう。場合によっては、高い存在度の非産生性メッセージ（例えば、融合パートナー由来のＣＤＲ３−ＦＲ４フレームシフト非産生性軽鎖）または非特異的な非産生性メッセージの存在がもたらされ、可変鎖のクローニングが複雑となり得る。解決策の１つは、真正の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）精製抗体のＮ末端配列データを用いて、縮重しているプライマーを設計してクローニングを可能にすることである。あるいはまた、「ユニバーサルフレームワーク」プライマー、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ  ８６：３８３３（１９８９）に記載のもの（これは、可変ドメインのＮ−およびＣ−末端が「固定（ｆｉｘ）されている」（すなわち、ＦＲ１のＮ末端とＦＲ４のＣ末端がプライマー決定される）などを使用してもよい。
【０３６９】
さらに、より有効なプライマーを設計するための配列データは、ゲル精製され、次いで配列決定されたバルクＲＴ−ＰＣＲ産物から得られ得る。該ＰＣＲ産物はまた、例えば、ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングされ、次いで配列決定され得る。配列データは、多数の独立したサブクローンまたはゲル精製された断片から得られ、コンセンサス配列が確実に確証される。
【０３７０】
重鎖可変ドメインのＮ−およびＣ−末端が真正であり、プライマー決定されないことを確認するため、縮重しているシグナル配列プライマーおよび定常ドメイン３’プライマーを用いて別のＰＣＲ反応を行なう。縮重しているシグナル配列プライマーの設計は、上記の「ユニバーサルフレームワーク  プライマー」を用いたＰＣＲ反応からのコンセンサス推定ＦＲｌ配列でクエリー（ｑｕｅｒｙ）を行なったＧｅｎｂａｎｋ齧歯類の配列データベースのＴＦＡＳＴＡ検索から誘導されるベストヒットのシグナル配列に基づいて行なう。このＰＣＲにより、完全なマウス重鎖可変ドメインを有する産物がもたらされる。
【０３７１】
上記のようにして同定された完全なマウス可変ドメインを（必要に応じて、制限部位を導入するためにサイレント変異誘発とともに）、ＢＩＩＢヒトＩｇＧ１およびκ定常ドメインｃＤＮＡとともに使用し、それぞれ、キメラ重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを構築する。完全長の免疫グロブリンｃＤＮＡを、次いで、ＢＩＩＢ発現ベクター（これは、ｐＮＥ００１と呼ばれ、市販のＥＢＶ哺乳動物細胞エピソーム発現ベクターｐＣＥＰ４の誘導体である）内にサブクローニングする。重鎖および軽鎖の発現ベクターを２９３−ＥＢＮＡ細胞内にコトランスフェクトする。一過的トランスフェクト細胞由来のならし培地のウエスタンブロット解析（ヒトＩｇＧ特異的試薬でプローブ探索）により、キメラＯＭｇｐ−ｈｕＩｇＧ１、κｍＡｂの発現が確認される。
Ｃ．ファージディスプレイによる抗ＯＭｇｐモノクローナル抗体の同定
抗ＯＭｇｐモノクローナル抗体Ｆａｂ断片は、Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：３４４−３４８（２００５）；Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１９４−２０５（２００３）；およびＫｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）（これらはすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のファージディスプレイライブラリーから同定および単離され得る。
【０３７２】
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  Ｆａｂ−ファージディスプレイライブラリーＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤはヒト化合成抗体可変領域を含み、これを、標準的なＥＬＩＳＡおよびＩＨＣスクリーニング法によって組換えヒト可溶性ＯＭｇｐ−Ｆｃタンパク質に対してスクリーニングする。例えば、Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ、Ｒ．、Ｆｒｉｓｃｈ、Ｃ．およびＵｒｂａｎＭ、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＨｕＣＡＬ（登録商標）」．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２巻  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  １３−５２（２００４）を参照のこと。ＯＭｇｐに特異的に結合するＦａｂ−ファージを精製およびキャラクタライズする。単離されたＦａｂ−ファージを、さらなる解析のために選択する。
【０３７３】
概要および要約のセクションではなく、詳細な説明のセクションが、特許請求の範囲の解釈に用いられることが意図されることを認識されたい。概要および要約のセクションは、本発明者（１名または複数）によって想定される本発明の例示的な実施形態の１つ以上を示すものであり得るが、すべてを示すものではなく、したがって、本発明および添付の特許請求の範囲をなんら限定することを意図しない。
【０３７４】
前述の本発明を、明確な理解を目的とする例示および実施例によって、ある程度詳細に記載したが、当業者には、本発明の教示に鑑み、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対して一定の変更および修正が行なわれ得ることは容易に理解されよう。
【０３７５】
本明細書に挙げたすべての刊行物および特許出願は、引用によって、個々の各刊行物または特許出願が、あたかも具体的に個々に示されているのと同程度に、本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３７６】
【図１】図１は、成熟希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）の模式図である。この図は、該タンパク質内の３つの主なドメインならびに該タンパク質を脂質膜にテザーリングするＧＰＩ−アンカーを示す。
【図２】図２は、種々のヒト組織におけるＯＭｇｐ発現についてプローブ探索したノザンブロットである。ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡは、脳組織内のみにおいて検出されている。
【図３】図３は、種々の発育時点でのラットの脳および脊髄におけるＯＭｇｐ転写を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡ転写は、成体の脳および脊髄の両方において最大である。ＯＭｇｐ発現は、第１４日胚（Ｅ１４）の脳では検出可能でなく、第１８日胚（Ｅ１８）では非常に低い。
【図４】図４Ａは、ＯＭｇｐノックアウトマウスを創製するためのストラテジーを示す。ＯＭｇｐコード配列全体を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）／ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）発現カセットに置き換えた。図４Ｂは、ＯＭｇｐノックアウトマウスの遺伝子型を確認するためのＲＴ−ＰＣＲ実験の結果である。野生型の脳および脊髄組織に、ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡが存在する。ＯＭｇｐノックアウトマウスの脳および脊髄組織には、ＯＭｇｐ  ｍＲＮＡは検出されなかった。
【図５】図５は、野生型およびＯＭｇｐノックアウトマウスの脳および脊髄由来のタンパク質試料のウエスタンブロットの結果を示す。野生型マウスにはＯＭｇｐ、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＭＡＧが存在するが、ＯＭｇｐノックアウトマウスでは、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＭＡＧのみが存在する。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、野生型およびＯＭｇｐノックアウトマウス由来の海馬ニューロン培養物におけるアポトーシス細胞および正常な核を有する細胞の数を示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、野生型およびＯＭｇｐノックアウトマウス由来の海馬ニューロン培養物における神経突起の長さおよびプロセッシングを受けた（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｂｅａｒｉｎｇ）ニューロンの数を示すグラフである。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、野生型およびＯＭｇｐノックアウトマウスにおける、実施例５に記載のニューロンの数および脊髄損傷部位近傍のカスパーゼ−３−陽性細胞の数を示すグラフである。
【図９】図９は、脊髄の完全な離断後の、野生型（＋／＋）およびＯＭｇｐノックアウトマウス（−／−）の機能回復の改善を示すグラフである。移動運動のＢａｓｓｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）を用いて移動運動を評価した。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＯＭｇｐノックアウトマウスにおける脊髄損傷（ＳＣＩ）後のＲｈｏ活性化の減少を示す。図１０Ａは、野生型の損傷および非損傷マウスと、ＯＭｇｐノックアウトの損傷および非損傷マウスとを比較したＲｈｏＡ  ＧＴＰを示すイムノブロットである。図１０ＢはＲｈｏＡ  ＧＴＰの定量であり、レベルは全Ｒｈｏで標準化している。データを平均±ＳＥＭで示す。＊ｐ＜０．０５。
【図１】
2009513666.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009513666.tif 000040
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