(57)【要約】  本発明は、マイクロチャネル内の核酸を増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流マイクロ流体システムでリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実行する方法およびそのようなシステムでリアルタイムＰＣＲを監視する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアルタイムＰＣＲを実行する方法であって、
ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを連続的に移動させる工程と、
ｂ）前記流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、
ｃ）ＰＣＲを達成するために前記流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、
ｄ）前記流路の前記定められた部分に沿った複数の位置で蛍光シグナルの強度を測定する工程とを含む方法。
【請求項２】
さらに、前記流路内の平均流速を測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記平均流速は、前記流路からの前記蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記平均流速は、前記流路内のマーカーの連続画像を比較することにより測定される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーは、前記試験液中にある請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーは、前記分散媒中にある請求項４に記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記流量を調節してそれぞれのＰＣＲサイクルのタイミングを制御する工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記流量は、前記流路の入口または出口における圧力を調節することにより調節される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光シグナルの前記強度は、ＰＣＲサイクル毎に少なくとも１回測定される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光シグナルの前記強度は、ＰＣＲサイクル毎に少なくとも１回測定される請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光シグナルの前記強度は、ＰＣＲサイクル毎に少なくとも１回測定される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記平均流速は、前記流路からの前記蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記平均流速は、前記流路内のマーカーの連続画像を比較することにより測定される請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーは、前記試験液中にある請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーは、前記分散媒中にある請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度サイクリングを行う工程は、さらに、
ｉ）前記流路の前記定められた部分を第１の温度まで加熱する工程と、
ｉｉ）前記流路の前記定められた部分を第２の温度まで冷却する工程と、
ｉｉｉ）前記流路の前記定められた部分を第３の温度まで加熱する工程とを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の温度は、約８５℃から約１００℃までの範囲にあり、前記第２の温度は、約２０℃から約７０℃までの範囲にあり、前記第３の温度は、約５５℃から約８０℃までの範囲にある請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記流路の前記定められた部分は、ＰＣＲの１０から５０サイクルを完了するのに適した長さを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
流路内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法であって、
ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを移動させる工程と、
ｂ）前記流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、
ｃ）ＰＣＲを達成するために前記流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、
ｄ）前記流路の一部分に沿って反応依存蛍光シグナルの画像をキャプチャする工程と、
ｅ）前記流路内の前記平均流速を測定する工程と、
ｆ）前記試験ボーラスの位置を前記平均流速から試験ボーラスが受ける温度サイクルの数に関係付ける工程とを含む方法。
【請求項２０】
前記平均流速は、前記流路からの前記反応依存蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記平均流速は、前記流路からの反応独立フロー・マーカーの連続画像を比較することにより測定される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応独立フロー・マーカーは、前記試験ボーラス中で予混合される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応独立フロー・マーカーは、前記試験ボーラスと交互にボーラスとして前記流路に導入される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応独立フロー・マーカーは、前記分散媒中で予混合される請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応独立フロー・マーカーからの散乱光は、波長スペクトルにより前記反応依存蛍光から分離され検出されうる請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応独立フロー・マーカーからの散乱光は、蛍光寿命に基づき前記反応依存蛍光から分離され検出されうる請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応独立フロー・マーカーは、さらに、前記試験ボーラスの流れ分散を測定するために使用される請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
反応依存蛍光の前記画像は、ＰＣＲサイクル毎に少なくとも１回キャプチャされる請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
反応依存蛍光の前記画像は、１回分のＰＣＲサイクルの持続時間よりも短い時間スケールで前記流路の長さにわたって走査することにより逐次的にキャプチャされる請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
反応依存蛍光の前記画像は、前記流路に沿って複数の地点からシグナルを同時に取得することによりキャプチャされる請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記流量測定は、前記流量を調節するためのフィードバック・ループの一部となっている請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記流速は、前記流路の定められた部分における試料ボーラスの出入りを検出することで測定される請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
流路内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法であって、
ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを移動させる工程と、
ｂ）同じ流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、
ｃ）前記流路に沿って空間温度帯を施してＰＣＲを達成する工程と、
ｄ）前記ＰＣＲサイクルにおいて固定点に対応する前記流路に沿った固定空間位置で蛍光シグナルを監視する工程と、
ｅ）前記流路内の流体の平均流速を測定する工程と、
ｆ）前記流量を調節して前記ＰＣＲサイクルのタイミングを制御する工程とを含む方法。
【請求項３４】
マイクロ流体デバイス内でリアルタイムＰＣＲを実行するためのシステムであって、
リアルタイムＰＣＲ試薬および少なくとも１つの分散媒を含む少なくとも１つの試験液を含むように構成された少なくとも１つの流路を備えるマイクロ流体デバイスと、
前記マイクロ流体デバイスと一体化されるか、または近位にあり、前記試験液中でリアルタイムＰＣＲを実行するために前記少なくとも１つの流路の定められた部分に沿って前記試験液の温度サイクリングを行うように構成されている、熱移動要素と、
前記マイクロ流体デバイスと一体化されるか、または近位にあり、前記少なくとも１つの流路を照射するように構成されている、照明源と、
前記マイクロ流体デバイスと一体化されるか、または近位にあり、前記少なくとも１つの流路の前記定められた部分に沿った複数の位置で蛍光シグナルを検出するように構成されている、検出器とを備えるシステム。
【請求項３５】
さらに、前記流路内の前記試験液の平均流速を測定するソフトウェア・システムを備える請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記ソフトウェア・システムは、前記流路内の前記蛍光シグナルの連続画像を比較することにより前記試験液の前記平均流速を測定する請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記ソフトウェア・システムは、前記流路内のマーカーの連続画像を比較することにより前記試験液の前記平均流速を測定する請求項３５に記載のシステム。
【請求項３８】
前記マーカーは、前記試験液中にある請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記マーカーは、前記分散媒中にある請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
さらに、前記コンピュータ・システムにより測定された前記平均流速に応答して前記少なくとも１つの流路内で連続的に流れる前記少なくとも１つの試験液の前記流速を制御するための一要素を備える請求項３５に記載のシステム。
【請求項４１】
前記蛍光シグナルは、ＰＣＲサイクル毎に少なくとも１回測定される請求項３４に記載のシステム。
【請求項４２】
前記検出器は、増幅産物からのシグナルおよびマーカーからのシグナルを前記少なくとも１つの流路の前記定められた部分に沿った複数の位置で検出するように構成されている請求項３４に記載のシステム。
【請求項４３】
前記検出器は、前記増幅産物および前記マーカーからのシグナルを独立して検出するように構成されている請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの流路は、複数の流路を含む請求項３４に記載のシステム。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの試験液は、複数の試験液を含む請求項３４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの分散媒は、複数の分散媒を含む請求項３４に記載のシステム。
【請求項４７】
さらに、前記熱移動要素の温度を検出し、前記温度サイクルを制御するためのフィードバック情報を供給するセンサーを備える請求項３４に記載のシステム。
【請求項４８】
さらに、前記増幅産物を分析するための手段を備える請求項４２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャネル内の核酸を増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流マイクロ流体システムでリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実行する方法およびそのようなシステムでリアルタイムＰＣＲを監視する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出は、医薬品、法医科学、工業生産加工、農作物および家畜育種、および他の多くの分野の中核をなすものである。疾病（例えば、癌）、感染性微生物（例えば、ＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝マーカーなどを検出する能力は、疾病の診断および予後診断、マーカー利用選抜、犯罪現場の特徴の正確な同定、工業用微生物を増殖させる能力、および他の多くの技術にとって普遍的技術となっている。
【０００３】
注目する核酸の完全性の測定は、感染または癌の病理学に関係するといってよい。少量の核酸を検出する最も強力な基礎技術の１つは、核酸配列の一部または全部を何回も複製し、次いで増幅産物を分析することである。ＰＣＲは、おそらく、多数のさまざまな増幅技術のうち最もよく知られているものであろう。
【０００４】
ＰＣＲは、ＤＮＡの短い部分を増幅する強力な技術である。ＰＣＲを用いると、単一のテンプレートＤＮＡ分子から開始してＤＮＡの数百万のコピーを素早く作製することができる。ＰＣＲは、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性された鎖のプライマーのアニーリング、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの延長という三相の温度サイクルを含む。このサイクルは、検出され、分析される十分なコピーが得られるまで繰り返される。原理上、ＰＣＲのそれぞれのサイクルで、コピーの数を倍にすることが可能である。実際、それぞれのサイクルの後に行われる乗算は、常に２回未満である。さらに、ＰＣＲサイクリングが続くと、必要な反応剤の濃度が減少するので、増幅されたＤＮＡ産物の集積が、最終的に止まる。ＰＣＲの一般的詳細については、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第３版）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在）（２０００年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．社の共同事業）、（２００５年までの補遺あり）、および「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンディエゴ所在）（１９９０年）を参照のこと。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲとは、典型的にはＰＣＲサイクル毎に１回、反応が進行するとともに増幅されたＤＮＡ産物の集積を測定するために使用される成長する一組の技術のことである。時間の経過とともに産物の蓄積を監視することにより、反応の効率を測定するだけでなく、ＤＮＡテンプレート分子の初期濃度を推定することもできる。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細については、「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら（編集）、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（英国ノリッジ所在）（２００４年）を参照のこと。
【０００６】
現在、増幅されたＤＮＡの存在を示すいくつかの異なるリアルタイム検出化学物質が存在する。これらの化学物質の大部分は、ＰＣＲ過程の結果として特性を変化させる蛍光指示薬に依存する。こうした検出化学物質としては、二本鎖ＤＮＡに結合した後に蛍光収率を高めるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）がある。他のリアルタイム検出化学物質では、フェルスター型共鳴エネルギー移動ＦＲＥＴを利用するが、これは、色素の蛍光収率が他の光吸収部分またはクエンチャーへの近さに強く依存する減少である。これらの色素およびクエンチャーは、典型的には、ＤＮＡ配列特異的プローブまたはプライマーに付着する。ＦＲＥＴベースの検出化学物質としては、加水分解プローブおよび立体配座プローブがある。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブなど）では、ポリメラーゼ酵素を使用して、オリゴヌクレオチド・プローブに付着したクエンチャー色素分子からレポーター色素分子を切断する。立体配座プローブ（分子ビーコンなど）では、オリゴヌクレオチドに付着した色素を使用し、その蛍光放射は、標的ＤＮＡにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドに立体構造変化が生じると変化する。
【０００７】
リアルタイムＰＣＲを実行する多数の市販の計測器が存在する。利用可能な計測器の例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７５００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｌｃｅｒ、およびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０がある。これらの計測器の試料容器は、典型的には少なくとも体積１０μｌの試料液を必要とする閉管である。特定のアッセイにより検出可能なテンプレートＤＮＡの最低濃度が、１マイクロリットル当たり１分子のオーダーであった場合、利用可能な計測器の検出限界は、１試料チューブ当たり標的数十個のオーダーとなるであろう。したがって、単一分子感度を達成するためには、１〜１０００ｎｌとより少ない試料量を試験するのが望ましい。
【０００８】
つい最近、例えば、マイクロ流体デバイス内の増幅反応を伴う、ＰＣＲおよび他の増幅反応を実行する多くの高生産性アプローチが開発されたが、それとともに、それらのデバイス内またはデバイス上の増幅された核酸を検出し、分析する方法も開発された。増幅に関する試料の温度サイクリングは、通常、２つの方法のうちの１つでなされる。第１の方法では、試料液がデバイス内に導入され、時間の経過とともに温度サイクリングが行われ、これは従来のＰＣＲ計測器と非常によく似ている。第２の方法では、ポンプを使い、試料液が空間的に変化する温度帯に連続的に送り込まれる。
【０００９】
例えば、Ｌａｇａｌｌｙら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３：５６５−５７０（２００１年））では、２８０ｎｌのＰＣＲチャンバ内で単一のテンプレートＤＮＡを増幅し、検出することを実証している。産物の検出は、キャピラリー電気泳動法を使用してポストＰＣＲ処理された。他方、Ｋｏｐｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０４６−１０４８（１９９８年））では、蛇行流路が９５℃（変性）、７２℃（伸長）、および６０℃（アニーリング）の３つの一定温度帯を通過するガラス基板を使用して連続流ＰＣＲを実証している。７２℃の温度帯は、中央領域に配置され、９５℃から６０℃まで進む間に短時間のうちに通過されなければならなかった。検出は、ゲル電気泳動法を使用してポストＰＣＲ処理された。このＰＣＲ技術は、反応槽の表面全体を加熱することに基づいていないため、反応速度は、加熱／冷却速度ではなく、流量により決定される。これらの参考文献のいずれも、ＰＣＲ反応のリアルタイム監視については説明していなかった。
【００１０】
Ｐａｒｋら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５：６０２９−６０３３（２００３年））は、３つの温度制御ブロックの周りにらせん状に巻かれたポリイミドコーティング溶融シリカ毛管を使用する連続流ＰＣＲデバイスを説明している。試料量は、２μｌであった。検出は、ゲル電気泳動法を使用してポストＰＣＲ処理された。非透明性のポリイミドの代わりにＰＴＦＥでコーティングされた毛管を使用することによりリアルタイムＰＣＲ用に計測器を適合させることが可能であるという言及がなされていた。Ｈａｈｎら（ＷＯ２００５／０７５６８３）も参照のこと。
【００１１】
Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒら（米国特許第６，９６０，４３７号）は、３つの温度帯を有する回転流路を備えるマイクロ流体デバイスを説明している。試料を導入し、ポンプを使って回転する形でそれらの温度帯に送り込むために、多数の一体化された弁およびポンプが使用される。
【００１２】
Ｋｎａｐｐら（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）は、単一分子増幅を行えるマイクロ流体デバイスを説明している。複数の直線的平行流路を有する平面状ガラスチップが開示されている。標的ＤＮＡとＰＣＲ試薬の混合物が、これらの流路内に注入される。第１の実施形態では、これらの流路はこの混合物で満たされ、流れが停止される。次いで、流路の全長に対し温度サイクリングが実行される。温度サイクリングが完了した後、ＤＮＡが増幅された蛍光領域を検出するために、これらの流路の撮像が行われる。第２の実施形態では、ＰＣＲ混合物の流れは、温度サイクリングの実行とともに増幅帯を連続的に通過し、増幅帯の下流で蛍光が検出される。サイクリングに費やされる時間を変える、サイクリングの下で移動する距離を変える、などにより、異なる増幅度が得られる。この方法が、時間の経過による個々の試料要素進行状況を監視するのではなく、別々の連続的な試料要素について条件（実行されるサイクルなど）を変えることは注目に値する。
【００１３】
この技術はいずれも、連続流デバイス内で単一標的分子感度をリアルタイム反応監視機能と組み合わせていない。したがって、少量の試料を用いて効率よく正確に実行されうるリアルタイムＰＣＲの堅牢な高生産性方式が必要である。これらの方法は単一標的分子感度を有し、比較的少ない量のＰＣＲ試薬を使用し、温度サイクリングに少ないエネルギーを使用することが望ましいであろう。本発明は、本発明の説明を検討した後明らかになるこれらおよび他の特徴を備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／８０６，４４０号
【特許文献２】ＷＯ２００５／０７５６８３
【特許文献３】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号
【特許文献５】米国特許第６，４８２，３６４号
【特許文献６】米国特許第６，０４２，７０９号
【特許文献７】米国特許第６，２８７，５２０号
【特許文献８】米国特許第６，２３５，４７１号
【特許文献９】米国特許第６，１４９，８７０号
【特許文献１０】米国特許第５，８６９，００４号
【特許文献１１】米国特許第６，４４０，７２２号
【特許文献１２】米国特許出願第２００５／００４２８３９号
【特許文献１３】米国特許第５，９２５，５１７号
【特許文献１４】米国特許第６，１５０，０９７号
【特許文献１５】米国特許第６，０３７，１３０号
【特許文献１６】米国特許第６，５４４，７３２号
【特許文献１７】米国特許第６，８５５，５５１号
【特許文献１８】米国特許第６，４４４，４６１号
【特許文献１９】米国特許第６，４０６，８９３号
【特許文献２０】米国特許第６，３９１，６２２号
【特許文献２１】米国特許第６，３０３，３４３号
【特許文献２２】米国特許第６，１７１，８５０号
【特許文献２３】米国特許第５，９３９，２９１号
【特許文献２４】米国特許第５，９５５，０２９号
【特許文献２５】米国特許第５，９６５，４１０号
【特許文献２６】米国特許第７，０１５，０３０号
【特許文献２７】米国特許米国公開特許出願第２００４／０１８０３４６号
【特許文献２８】ＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ９８／００２３１号
【特許文献２９】米国特許第５，２７１，７２４号
【特許文献３０】米国特許第５，２７７，５５６号
【特許文献３１】米国特許第５，３７５，９７９号
【特許文献３２】ＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ９４／０５４１４号
【特許文献３３】ＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ９７／０２３５７号
【特許文献３４】米国公開特許出願第２００２／００１９０５９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第３版）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在）（２０００年）
【非特許文献２】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．社とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．社の共同事業）、（２００５年までの補遺あり）
【非特許文献３】「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンディエゴ所在）（１９９０年）
【非特許文献４】「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら（編集）、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（英国ノリッジ所在）（２００４年）
【非特許文献５】Ｌａｇａｌｌｙら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３：５６５−５７０（２００１年））
【非特許文献６】Ｋｏｐｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０４６−１０４８（１９９８年））
【非特許文献７】Ｐａｒｋら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５：６０２９−６０３３（２００３年））
【非特許文献８】ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ所在）、１９８７年）
【非特許文献９】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在）、２００１年）
【非特許文献１０】Ｙｅｎ（「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」８１：１０９７〜１１４２頁、２００１年）
【非特許文献１１】Ｃａｌｖｅｒｔら（「Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」１３７：６０３〜６１２頁、２００２年）
【非特許文献１２】Ｂｏｌａｎｄ  （「Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」２  Ｓｕｐｐ．１：Ｓ１２〜Ｓ１９頁、２００２年）
【非特許文献１３】「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ」、ＣｏｌｅｍａｎおよびＴｓｏｎｇａｌｉｓ（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ所在）、２００１年
【非特許文献１４】Ｚｈｕら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６６：１９４１〜１９４８頁、１９９４年）
【非特許文献１５】Ｌｅｏｎｅら（「Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ」２６：２１５０〜２１５５頁、１９９５年）
【非特許文献１６】ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（「Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：３０３〜３０８頁、１９９６年）
【非特許文献１７】ＢｌｏｋおよびＫｒａｍｅｒ（「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ」１１：１８７〜１９４頁、１９９７年）
【非特許文献１８】Ｈｓｕｉｈら（「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」３４：５０１〜５０７頁、１９９７年）
【非特許文献１９】Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２７９：１２２８〜１２２９頁、１９９８年）
【非特許文献２０】Ｓｏｋｏｌら（「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９５：１１５３８〜１１５４３頁、１９９８年）
【非特許文献２１】Ｔｙａｇｉら（「Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１６：４９〜５３頁、１９９８年）
【非特許文献２２】Ｂｏｎｎｅｔら（「Ｐｒｏｔ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」９６：６１７１〜６１７６頁、１９９９年）
【非特許文献２３】Ｆａｎｇら（「Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ」１２１：２９２１〜２９２２頁、１９９９年）
【非特許文献２４】Ｍａｒｒａｓら（「Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ」１４：１５１〜１５６頁、１９９９年）
【非特許文献２５】Ｖｅｔら（「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」９６：６３９４〜６３９９頁、１９９９年）
【非特許文献２６】Ｎｅｌｓｏｎら（「Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ」１７：７１８７〜７１９４頁、１９８９年）
【非特許文献２７】Ｂｒｕｃｈｅｚら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８１：２０１３〜２０１６頁、１９９８年）
【非特許文献２８】ＷａｒｒｅｎおよびＮｉｅ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８１：２０１６〜２０１８頁、１９９８年）
【非特許文献２９】Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２７１：９３３〜９３７頁、１９９９年）
【非特許文献３０】ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ」２２：１８５９〜１８６２頁、１９８１年）
【非特許文献３１】Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（「Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ」１２：６１５９〜６１６８頁、１９８４年）
【非特許文献３２】Ｃｈｏｗら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８２：３９６〜３９９頁、１９９８年）
【非特許文献３３】Ｚｈａｎｇら（「Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ」７１：１１３８〜１１４５頁、１９９９年）
【非特許文献３４】Ｗｅｉｓｓ（「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、第７版」Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ（マサチューセッツ州レディング所在）、２００４年）
【非特許文献３５】Ｗｅｉｓｓ（「Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、第５版」Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ（マサチューセッツ州レディング所在）、２００１年）
【非特許文献３６】Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ（「Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｏｎｌｉｎｅ：  Ｈｏｗ  ｔｏ  Ｌｏｃａｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｌｕｓｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  Ｙｏｕ  Ｎｅｅｄ」、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｏｄａｙ（ニュージャージー州メドフォード所在）、１９９８年）
【非特許文献３７】Ｅｖｅｒｉｔｔ（「Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州所在）、１９９８年）
【非特許文献３８】Ｋｏｔｚ（「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、ｖｏｌ．１〜９＋付録、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９８８年）
【非特許文献３９】ＤｉｌｌｏｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（「Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９８４年）
【非特許文献４０】ＴａｂａｃｈｎｉｃｋおよびＦｉｄｅｌｌ（「Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ニューヨーク州所在）、１９９６年）
【非特許文献４１】Ｂｏｘら（「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｒｓ」、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９７８年）
【非特許文献４２】Ｃｏｒｎｅｌｌ（「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ」、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９９０年）
【非特許文献４３】Ｊｏｈｎ（「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ」、ＳＩＡＭ（フィラデルフィア所在）、１９９８年）
【非特許文献４４】ＧｉｂａｓおよびＪａｍｂｅｃｋ（「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｋｉｌｌｓ」、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（カリフォルニア州セバストポル所在）、２００１年）
【非特許文献４５】Ｐｅｖｚｎｅｒ（「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）、２０００年）
【非特許文献４６】Ｄｕｒｂｉｎら（「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（英国ケンブリッジ所在）、１９９８年）
【非特許文献４７】ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ（「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｂａｓｉｃｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（フロリダ州ボーカ・ラトーン所在）、２０００年）
【非特許文献４８】Ｇ．Ｉ．Ｔａｙｌｏｒ（「Ｐｒｏｃ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ」Ａ  ２１９：１８６（１９５３年））
【非特許文献４９】Ｒ．Ａｒｉｓ（「Ｐｒｏｃ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ」Ａ  ２３５：６７（１９５６年））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、マイクロチャネル内の核酸を増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流マイクロ流体システムでリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実行する方法およびそのようなシステムでリアルタイムＰＣＲを監視する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
そこで、第１の態様において、本発明は、リアルタイムＰＣＲを実行する方法を提供し、この方法は、ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを連続的に移動させる工程と、ｂ）流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）ＰＣＲを達成するために流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、ｄ）流路の定められた部分に沿った複数の場所で蛍光シグナルの強度を測定する工程とを含む。一実施形態では、流路はマイクロチャネルまたはマイクロ流体流路であり、その流路の寸法は、試験液中に元々存在している単一ＤＮＡ分子の増幅および検出を行える十分な小ささである。他の実施形態では、試験液は、すべての必要なリアルタイムＰＣＲ試薬を含むことを除き分散媒と実質的に同じである。リアルタイムＰＣＲ試薬混合物は、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素、塩、緩衝液、表面不動態化剤などを含むことができる。それに加えて、リアルタイムＰＣＲ混合物は、非特異的蛍光ＤＮＡ検出分子、配列特異的蛍光ＤＮＡプローブ、またはマーカーを含むことができる。追加の一実施形態では、分散媒は、不混和流体である。分散媒の目的は、一方の試験ボーラスから他方の試験ボーラスへの物質移動を遅らせることである。分散媒の他の目的は、流路内の流体流を追跡するために使用されうるボーラス間の区別可能な遷移を行わせることである。分散媒は、マーカーを含むことができる。
【００１８】
一実施形態では、流路の定められた部分に沿った熱移動要素を使用して温度サイクリングが行われる。他の実施形態では、熱移動要素は、流路の定められた部分全体において温度サイクリングを行う。つまり、温度サイクリングを行うために、一定温度帯が使用される。他の実施形態では、適切にプログラムされたコンピュータが、熱移動要素の温度サイクリングを制御する。一実施形態では、熱移動要素の温度が検出され、コンピュータにフィードバックされる。これらの実施形態によれば、温度変化が時間によるＰＣＲプロファイルに従うように流路の長さ分（反応帯）に加熱と冷却が行われる。試験ボーラスは、反応帯の上流端から下流端にボーラスが流れるときに必要なＰＣＲサイクル数が達成されるような流量（流速）でこの反応帯にポンプで通される。
【００１９】
他の実施形態では、蛍光シグナルの強度は、ＰＣＲ温度サイクルにおいて特定の時刻および／または温度で測定される。追加の実施形態では、蛍光シグナルの強度は、ＰＣＲサイクル毎に１回測定される。他の実施形態では、蛍光シグナルの強度が測定される複数の配置が、流路の定められた部分全体である。他の実施形態では、蛍光シグナルの強度に関するデータは、適切にプログラムされたコンピュータにより処理される。他の実施形態では、流路の長さに沿った少なくとも１つの蛍光シグナルの画像が作成される。他の実施形態では、画像キャプチャは、連続的温度サイクリング周期で繰り返し実行される。画像が作成されるか、または蛍光シグナルの強度が複数ピクセル・アレイ検出器を使用して測定されうる。静止メカニズムまたは走査メカニズムまたはその両方を使用して、画像キャプチャを行える。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、流路内の液体の平均流速を監視することを含むリアルタイムＰＣＲを実行する方法を提供する。本発明の態様によれば、この方法は、第１の態様で述べたような工程を含み、さらに、ｅ）流路内の流体の平均流速を測定する工程をも含む。流路内の流速を監視することにより、時間により変化する試験ボーラスの配置が測定され、これにより、試験ボーラスで生じたＰＣＲサイクルの数を識別することができる。
【００２１】
一実施形態では、流体の平均流速は、流路からの反応依存蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される。第２の実施形態では、流体の平均流速は、流路内のマーカー（つまり、反応独立マーカー）の連続画像を比較することにより測定される。マーカーの使用には、リアルタイムＰＣＲシグナルが検出可能でない場合でも、流量はそのまま検出可能であるという利点がある。潜在的マーカーの例は、色素、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、散乱金属粒子、超微粒気泡、および当技術分野者に知られているようなものである。一実施形態では、マーカーは、試験液中に存在する。マーカーが試験液中に存在する場合、これは、ＰＣＲ化学反応に悪影響を及ぼすことがあってはならない。他の実施形態では、マーカーは、分散媒中に存在する。さらに他の実施形態では、マーカーは、試験ボーラスと直列に並ぶ別のボーラスである。追加の実施形態では、マーカーは、励起波長、発光スペクトル、寿命、および当技術分野でよく知られているようなものなどにより、蛍光シグナルから分離し検出することが可能である。さらに他の実施形態では、蛍光シグナルの強度またはマーカーの連続画像に関するデータは、適切にプログラムされたコンピュータにより処理される。これらの実施形態により、平均流速は、連続するＰＣＲサイクルから取った画像を比較することにより決定される。さらに他の実施形態では、流速は、反応帯入口検出器および体積流量計を使用して測定されうる。流速は、例えば、流路の寸法を知り、体積流量を測定することにより推定されうる。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、流路内の液体の流速を監視することと、必要に応じて流速を調節して試験液または試験試料が受けるＰＣＲサイクリングの持続時間を制御することを含むリアルタイムＰＣＲを実行する方法を提供する。本発明の態様によれば、この方法は、第２の態様で述べたような工程を含み、さらに、ｆ）流体の流速を調節してＰＣＲサイクリングの持続時間を制御する工程を含む。一実施形態では、流速は、試験液が流路の定められた部分を通っている間に所望のＰＣＲサイクル数が完了するように監視および調節される。つまり、流速は、ＰＣＲサイクリングの持続時間を決定するように調節される。他の実施形態では、この監視および調節は、適宜プログラムされたコンピュータにより実行される。さらに他の実施形態では、流量は、流路の投入端の圧力を調節することにより調節される。追加の実施形態では、流量は、流路の産出端の圧力調節真空を調節することにより調節される。他の実施形態では、流量は、シリンジ・ポンプなどのポンプを調節することにより調節される。
【００２３】
第４の態様において、本発明は、流路内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法を提供し、この方法は、ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを移動させる工程と、ｂ）前記流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）ＰＣＲを達成するために流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、ｄ）流路の一部分に沿って反応依存蛍光シグナルの画像をキャプチャする工程と、ｅ）流路内の平均流速を測定する工程と、ｆ）試験ボーラスの位置を平均流量から試験ボーラスが受ける温度サイクルの数に関係付ける工程とを含む。一実施形態では、平均流速は、流路からの反応依存蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される。第２の実施形態では、平均流速は、流路からの反応独立フロー・マーカーの連続画像を比較することにより測定される。反応独立フロー・マーカーは、（ｉ）試験ボーラス内で予混合されるか、（ｉｉ）試験ボーラスと交互にボーラスとして流路に導入されるか、または（ｉｉｉ）分散媒内で予混合されうる。他の実施形態では、反応独立フロー・マーカーからの散乱光は、波長スペクトルにより反応依存蛍光から分離され検出されうる。代替実施形態では、反応独立フロー・マーカーからの散乱光は、蛍光寿命に基づき反応依存蛍光から分離され検出されうる。他の実施形態では、反応独立フロー・マーカーは、さらに、試験ボーラスの流れ分散を決定するために使用される。さらに他の実施形態では、反応依存蛍光の画像は、少なくともＰＣＲサイクル毎に１回キャプチャされる。一実施形態では、反応依存蛍光の画像は、１回分のＰＣＲサイクルの持続時間よりも短い時間スケールで流路の長さにわたって走査することにより逐次的にキャプチャされる。代替実施形態では、反応依存蛍光の画像は、流路に沿って複数の地点からシグナルを同時に取得することによりキャプチャされる。他の実施形態では、流速測定は、流速を調節するためのフィードバック・ループの一部である。さらに他の実施形態では、流速は、流路の定められた部分における試料ボーラスの出入りを検出することで測定される。
【００２４】
第５の態様において、本発明は、流路内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法を提供し、この方法は、ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを移動させる工程と、ｂ）同じ流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）流路に沿って空間温度帯を施してＰＣＲを達成する工程と、ｄ）ＰＣＲサイクルにおいて固定点に対応する流路に沿った固定空間位置で蛍光シグナルを監視する工程と、ｅ）流路内の流体の平均流速を測定する工程と、ｆ）流量を調節してＰＣＲサイクルのタイミングを制御する工程とを含む。一実施形態では、流路のいくつかの部分に沿った熱移動要素を使用して温度サイクリングが行われる。他の実施形態では、熱移動要素は、流路のいくつかの部分において温度サイクリングを行う。他の実施形態では、適切にプログラムされたコンピュータが、熱移動要素の温度サイクリングを制御する。一実施形態では、熱移動要素の温度が検出され、コンピュータにフィードバックされる。これらの実施形態によれば、ＰＣＲ温度プロファイルに従うように流路の一部に加熱と冷却が施される。試験ボーラスは、反応帯の上流端から下流端にボーラスが流れるときに必要なＰＣＲサイクル数が達成されるような流量（流速）でこの反応帯にポンプで通される。本発明のこの態様における流路内の流速を監視することにより、ＰＣＲサイクル周期の持続時間が決定されうる。
【００２５】
第６の態様では、本発明は、本明細書で説明されている方法を実施するように適合されたシステムおよび／またはキットを提供する。これらのシステムおよび／またはキットは、本明細書の方法工程を実施するためのシステム・インストラクション（例えば、コンピュータ内に、またはコンピュータ可読媒体内に、例えば、システム・ソフトウェアとして、具現化される）を備えることができる。試料を保存し、移動させ、アリコートを取り、または希釈するための流体操作要素、例えば、マイクロ流体操作要素、および検出器要素も、本明細書のシステムおよびキットのコンポーネントとすることができる。それに加えて、梱包材料、一体化要素（例えば、計測器ケース、電源など）、システムおよびキットを使用するためのインストラクションなども、本発明の特徴であるとしてよい。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の試験液の温度サイクリングを行うようにそれぞれ構成されている１つまたは複数の増幅流路を備えるマイクロ流体デバイスを具備するシステムを提供する。（複数の）流路の定められた部分に沿って温度サイクリングを行うための熱移動要素も、含まれる。熱移動要素は、マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にある。マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にある照明源も含まれ、この照明源は、（複数の）流路を照射するように構成されている。マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にある検出器も含まれ、この検出器は、（複数の）流路内の増幅産物および／またはマーカーを検出するように構成されている。一実施形態では、検出器は、異なるシグナルを有する２つ以上の検出可能なマーカーから独立にシグナルを検出することができ、例えば、２つ以上の波長範囲の蛍光または他の放射を同時に検出できる検出器がそうである。システムは、（複数の）流路内の連続的に移動する試験液および分散媒の流量を制御するための１つまたは複数の要素とともに、流量を監視、制御してそれぞれのＰＣＲサイクルのタイミングを制御するためのシステム・インストラクションまたはソフトウェアを含む。典型的には、システムは、熱移動要素の温度を検出し、温度サイクルを制御するためのフィードバック情報を供給するセンサーを備える。典型的には、このシステムは、さらに、増幅産物および／またはマーカーの検出のタイミングなどのデータを生成し、処理し、（複数の）流路内の試験液の配置を監視するなどのためのシステム・ソフトウェアを備える。
【００２７】
第２の実施形態では、システムは、さらに、試料を複数の試験液に分けて希釈する希釈モジュールとともに、希釈モジュールが試料のアリコートを複数の試験液に分ける仕方を説明するシステム・インストラクションも備えることができる。希釈モジュールは、マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にあるものとしてよい。
【００２８】
システムは、適宜、本明細書で説明されている方法工程のどれかを実行するためのインストラクション付きのソフトウェアを備える。例えば、システムは、温度サイクリングを受ける試験液の１つまたは複数から送られてくるシグナルに対し１つまたは複数の統計的または確率論的解析を実行する統計的または確率論的システム・ソフトウェアを備えることができる。例えば、統計的または確率論的解析は、ポアソン解析、モンテカルロ解析、遺伝的アルゴリズムの応用、ニューラル・ネットワーク学習、マルコフ・モデリング、隠れマルコフ・モデリング、多次元的尺度構成法、ＰＬＳ分析、および／またはＰＣＡ分析を含むことができる。統計的または確率論的解析は、適宜、試料中の注目する核酸の濃度、割合、または個数を定量的に決定することを含む。
【００２９】
システムはさらに、適宜、希釈モジュールにより希釈されるまで試料を保存しておく試料保存モジュール、試料保存モジュールから試料を取り出し、希釈モジュールに送出する試料取り出しモジュールなどの流体操作または保存機能の特徴を備えることができる。これらの特徴は、適宜、流体の連続流（例えば、試料を含む）をシステムに通すように設計されている（これにより、試料処理効率が高まる）。システムは、さらに、増幅産物を分析するための手段およびシステムも備えることができる。一実施形態では、システムは、検出器により検出されるような増幅産物により占有される再現可能なシグナル形状、長さ、幅、体積、または面積と（ａ）試験液の１つに存在する注目する核酸のコピーの個数、または試料中に存在する注目する核酸のコピーの個数、もしくはその両方または（ｂ）試料中に存在する（複数の）増幅産物の同定または（ｃ）当技術分野で知られ、使用されている他の分析パラメータとの相関性を求めるシステム・ソフトウェアを備えることができる。
【００３０】
上記の方法またはシステムの多くは、併用することができる。本発明の追加の特徴は、以下の説明を検討した後で明らかになるであろう。
【００３１】
この特許のファイルは、カラー写真で作製された少なくとも１つの図面を含む。（複数の）カラー写真を含むこの特許のコピーは、特許商標庁に申し込み、必要な手数料を支払って入手できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態によるリアルタイムＰＣＲアーキテクチャのブロック図である。
【図２】本発明の一実施形態によるリアルタイムＰＣＲマイクロ流体システムの略図である。
【図３Ａ】図２のシステムからのデータ処理によるセンサー出力画像を示す図である。
【図３Ｂ】図２のシステムからのデータ処理によるセンサー出力画像を示す図である。
【図４】本発明の他の実施形態によるリアルタイムＰＣＲマイクロ流体システムの略図である。
【図５】本発明による図４のシステムからのセンサー出力データを示す図である。
【図６】本発明のさらに他の実施形態によるマイクロ流体デバイス内のリアルタイムの定量的ＰＣＲに使用されるシステムの図である。
【図７】本発明の一実施形態による動作モードを例示するプロセス図である。
【図８Ａ】流れ条件の下でのマイクロ流体流路内のＰＣＲ産物の増大を示す蛍光シグナルの画像である。
【図８Ｂ】図８Ａからのマイクロチャネルに沿ったマーカーの強度のプロットである。
【図９Ａ】流れ条件の下でのマイクロ流体流路内のＰＣＲ産物の増大を示す蛍光シグナルの画像である。
【図９Ｂ】図９Ａからのマイクロチャネルに沿った緑色シグナルの強度のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、マイクロチャネル内の核酸を増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流マイクロ流体システムでリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実行する方法およびそのようなシステムでリアルタイムＰＣＲを監視する方法に関する。
【００３４】
断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が関係している技術分野の当技術分野者に通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと類似のまたは同等の多数の方法および材料はどれも、本発明を実施する際に使用することができるが、好ましい材料および方法について以下で説明する。
【００３５】
図１は、本発明の一実施形態によるリアルタイムＰＣＲアーキテクチャのブロック図である。システムは、試験液貯蔵槽１０１を備え、これは、上述のように、それぞれのウェルが異なる試験液、例えば、試験試料を含む、マイクロタイター・プレートなどの複数の試験液を含む貯蔵槽であってよい。システムは、さらに、分散媒貯蔵槽１０２を備える。一実施形態では、試験液は、すべての必要なリアルタイムＰＣＲ試薬を試験液が含むことを除き分散媒と実質的に同じである。リアルタイムＰＣＲ試薬混合物は、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素、塩、緩衝液、表面不動態化剤などを含むことができる。それに加えて、リアルタイムＰＣＲ混合物は、非特異的蛍光ＤＮＡ検出分子、配列特異的蛍光ＤＮＡプローブ、またはマーカーを含むことができる。追加の実施形態では、分散媒は、不混和流体（油、フッ素化液体、または他の非水性または疎水性溶媒など）である。分散媒の目的は、一方の試験ボーラスから他方の試験ボーラスへの物質移動を抑止することである。分散媒の他の目的は、流路内の流体流を追跡するために使用されうるボーラス間の区別可能な遷移を行わせることである。一実施形態では、分散媒は、マーカーを含むことができる。
【００３６】
一実施形態では、試験液および分散媒は、スイッチ１０４を通してマイクロチャネル１０３内に導入される。マイクロチャネルの寸法は、試験液中に元々存在している単一ＤＮＡ分子の増幅および検出を行えるくらい十分に小さい。マイクロチャネル１０３は、単一マイクロチャネルであるか、またはマイクロ流体デバイスの一部である複数のマイクロチャネルのうちの１つとしてよい（図２、４、および６に示されているものなど）。スイッチ１０４は、分散媒および試験液がマイクロチャネル１０３内に逐次的に交互に導入されるように主制御および処理コンピュータ１０５の制御下にある。マイクロチャネル１０３内に導入される試験液および分散媒の体積は、マイクロチャネル１０３を通して移動するときに、それらの間の配合が最小になるように選択される。
【００３７】
連続的な多数の反応（または逐次反応）は、こうして、分散媒によりそれぞれ分離されるマイクロチャネル１０３を通して異なる試験液の連続的移動の結果として同じマイクロチャネル１０３内で実行されうる。マイクロチャネル１０３が、マイクロ流体デバイス内の複数のマイクロチャネルのうちの１つである場合、マイクロ流体デバイスのマイクロチャネル内で多数の反応を並列に実行することもできる。マイクロチャネル１０３を通る分散媒および試験液の流量は、ポンプ・メカニズム１０６により制御される。ポンプ・メカニズム１０６は、マイクロチャネル１０３内の試験液および分散媒の流量を調節するために主制御および処理コンピュータ１０５の制御下にある。流量は、試験液がマイクロチャネル１０３を通過するときに所望の数のＰＣＲサイクルが実行されるように調節される。
【００３８】
ポンプ・メカニズム１０６は、マイクロチャネル１０３の上流側または入口の陽圧により、またはマイクロチャネル１０３の下流側または出口の陰圧により、試験液および分散媒の流量を調節することができる。一実施形態では、差圧は、約１ｐｓｉであるが、他の差圧も使用できる。マイクロチャネル１０３の長さは、試験液がマイクロチャネル１０３の反応帯内を移動するときに、例えば、ＰＣＲの１０から５０サイクル、またはそれらの間の任意の数などの所望の数のＰＣＲサイクルの完了に適した長さである。マイクロチャネル１０３の反応帯は、ＰＣＲサイクルの実行のため温度サイクリングが行われるマイクロチャネルの領域である。典型的には、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、３０〜３５、３０〜４０、または３５〜４０のＰＣＲサイクルが標準増幅反応について実行される。所望の数のＰＣＲサイクルを実行するためのマイクロチャネル１０３の長さは、さらに、逐次的にマイクロチャネル１０３内を交互移動する試験液および分散媒の体積に依存する。例えば、反応帯が、４０ｍｍである場合、試験液の最小体積は、マイクロチャネル１０３の反応帯内で１ｍｍを占有し、試験液の最大体積は、マイクロチャネル１０３の反応帯内で２０ｍｍを占有する。したがって、この非制限的例では、最低１個の試料と最大２０個の試料が、マイクロチャネル１０３の反応帯内を試験液が移動するときに増幅されうる。もちろん、マイクロチャネルの長さおよび試料体積は、任意の数の試料を増幅するように選択されうる。
【００３９】
試験液がマイクロチャネル１０３内を移動するときに、ＰＣＲサイクルに適した温度となるように温度を制御し、温度サイクリングを行うために温度制御システム１０７がシステムに備えられている。ＰＣＲサイクルに適した温度は、当技術分野者によく知られており、約８５℃から約１００℃までの範囲内の第１の温度、約２０℃から約７０℃までの範囲内の第２の温度、および約５５℃から約８０℃までの範囲内の第３の温度を含むことができる。温度制御システム１０７は、マイクロチャネル１０３またはマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルと一体化されるか、または近位にある。温度制御システム１０７は、加熱器１０８、冷却器１０９、温度センサー１１０、および温度コントローラ１１１を備える。温度コントローラ１１１は、温度センサー１１０から温度情報を収集し、温度情報に基づき制御信号を生成する。制御信号は、所望のＰＣＲサイクルに対しマイクロチャネル１０３内で温度サイクルを実行するように、加熱器１０８または冷却器１０９に送られる。温度コントローラ１１１は、主制御および処理コンピュータ１０５の制御下にあり、試験液がマイクロチャネル１０３を通るときに、所望の数のＰＣＲサイクルが実行されるように温度サイクリングが行われる。異なる試験液における異なるＰＣＲ反応は、マイクロチャネル１０３内の連続流により、マイクロチャネル１０３内で次々に逐次的に進行する。
【００４０】
一実施形態では、加熱および冷却は、適切な温度の空気を吹き付けることにより実行されうる。他の実施形態では、加熱および冷却は、水または流体槽を循環させることにより実行されうる。追加の実施形態では、加熱および冷却は、当技術分野者によく知られているペルチェ効果素子により実行されうる。電流が横切る、異種金属の接合点により、小さな表面を冷却または加熱することが可能である。ペルチェ素子の温度プローブにより、電気強度に比例して、電力を調節することが可能であり、それにより温度を調節することが可能である。さらに他の実施形態では、金属ブロックが、熱移動要素として使用され、金属ブロックと接触する熱伝冷却器を備える。この金属ブロックは、例えば、アルミニウムなどの、適切な熱移動特性を有する金属（または金属合金）から作ることができる。金属ブロックからの光の後方散乱を低減するために、好ましくは黒色に塗装されるか、または陽極酸化処理される。ＰＣＲサイクルに対する温度は、この熱移動ユニットの適当な時間間隔で平衡しうる。例えば、ＰＣＲサイクルに対する温度は、約１〜２秒またはさらにはそれ以上の速さで平衡しうる。
【００４１】
一実施形態では、温度制御システム１０７は、マイクロチャネル１０３の定められている部分全体、つまりＰＣＲサイクルが実行されるマイクロチャネル１０３のその部分で温度サイクリングを行う。マイクロチャネル１０３のこの定められた部分は、反応帯とも呼ばれる。そこで、この実施形態では、温度サイクリングを行うために、一定温度帯が使用される。適切にプログラムされたコンピュータが、熱移動要素の温度サイクリングを制御する。この実施形態によれば、温度変化が時間によるＰＣＲプロファイルに従うように流路の長さ分（反応帯）に加熱と冷却が行われる。試験ボーラスは、反応帯の上流端から下流端にボーラスが流れるときに必要なＰＣＲサイクル数が達成されるような流量（流速）でこの反応帯にポンプで通される。
【００４２】
第２の実施形態では、温度制御システム１０７は、空間温度帯をマイクロチャネル１０３に沿って施し、ポリメラーゼ連鎖反応を行わせる。一態様では、マイクロチャネル１０３のいくつかの部分またはマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルに沿った熱移動要素を使用して温度サイクリングが行われる。他の態様では、熱移動要素は、マイクロチャネル１０３のいくつかの部分において温度サイクリングを行う。適切にプログラムされたコンピュータが、熱移動要素の温度サイクリングを制御する。この実施形態によれば、ＰＣＲ温度プロファイルに従うように流路の一部に加熱と冷却が施される。試験ボーラスは、反応帯の上流端から下流端にボーラスが流れるときに必要なＰＣＲサイクル数が達成されるような流量（流速）でこの反応帯にポンプで通される。
【００４３】
本発明の一実施形態には、増幅産物を検出し、マイクロチャネル１０３内の試験液の流量を監視する光学的撮像システム１１２が含まれる。一実施形態では、光学的撮像システム１１２は、好ましくは１つまたは複数の励起源１１３、１つまたは複数の光学系／フィルタ１１４、および１つまたは複数の検出器１１５を備える蛍光撮像システムである。一実施形態では、励起源１１３で所望の波長の光を発生し、リアルタイムＰＣＲにおいて増幅産物を検出するために使用される標識を励起し、および／またはマイクロチャネル１０３内の試験液の流量を監視するために存在しうるマーカーを検出する。光学系／フィルタ１１４は、光線を形成し、かつ／または光を励起源１１３からマイクロチャネル１０３上の適切に位置に導くために使用される。光学系／フィルタ１１４は、さらに、望ましくない波長の光を除去するか、または到達検出器１１５からの後方散乱を低減するように光をフィルタリングするために使用される。リアルタイムＰＣＲで使用される標識を励起する所望の波長は、使用される正確な標識および／またはマーカー、例えば、挿入色素、分子ビーコン、量子ドット、またはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに依存するが、これらの波長は当技術分野者によく知られている。同様に、正確な標識および／またはマーカーの放射波長は、当技術分野者によく知られている。検出器１１５は、励起された標識および／またはマーカーの放射波長を検出し、放射光の強度を測定する。光学的撮像システム１１２は、好ましくは、マイクロ流体デバイス内の複数のマイクロチャネルを区別することができる。
【００４４】
光学的撮像システム１１２は、マイクロチャネル１０３またはマイクロ流体デバイスのマイクロチャネル内の複数の位置で、例えば、ＰＣＲサイクル毎に少なくとも１回などの所望の時間間隔で放射光の強度を測定するように光学的／蛍光撮像システム１１２に指令する主制御および処理コンピュータ１０５の制御の下にある。検出器１１５は、放射光の強度のシグナルまたは画像を生成し、増幅産物の分析および試験液の流量の監視のために、それを主制御および処理コンピュータ１０５に送る。検出器１１５は、複数ピクセル・アレイ検出器（ＣＣＤ検出器など）および／または離散単一ピクセルまたは非撮像検出器を備えることができる。検出器１１５は、マイクロチャネル１０３またはマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルと一体化されるか、または近位にあるものとしてよい。検出器１１５は、静止型でもよいが、走査型でもよい。検出器１１５は、意味のある結果を取得し、マイクロチャネル１０３内の流体流の監視を行うために適切な解像度を有していなければならないが、これは特に、流体がマイクロチャネル１０３内を連続的に移動しているからである。
【００４５】
上述のように、リアルタイムＰＣＲ混合物は、非特異的蛍光ＤＮＡ検出分子（挿入色素など）、配列特異的蛍光ＤＮＡプローブ（分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、または量子ドット・プローブなど）、またはフロー・マーカー（量子ドットなど）を含んでいてよく、また分散媒は、フロー・マーカーを含むことができる。一実施形態では、光学的撮像システム１１２は、ＤＮＡ検出分子またはプローブからの蛍光の強度（つまり、蛍光シグナルの強度）を検出し、かつ／またはマーカーの蛍光を検出するために使用される。マーカーの蛍光は、分散媒から試験液を線引きするために使用することができ、また試験液もしくは分散媒の流速を測定し、監視するためにも使用できる。蛍光シグナルの強度は、増幅産物を検出し、増幅産物の量を測定し、試験液中に存在する元の分子の個数を測定し、またリアルタイムＰＣＲについて当技術分野者によく知られている操作などを行うために使用されうる。蛍光シグナルの強度は、さらに、試験液の流速を測定し、監視するためにも使用されうる。
【００４６】
一実施形態では、蛍光シグナルの強度は、ＰＣＲ温度サイクルにおいて特定の時刻および／または温度で測定される（例えば、蛍光シグナルが撮像される）。他の実施形態では、蛍光シグナルの強度は、ＰＣＲサイクル毎に１回測定される。画像をキャプチャする最適な時間は、使用される化学物質による。例えば、増幅産物を検出するために挿入色素が使用される場合、ＰＣＲサイクルの伸長フェーズの終わりに画像がキャプチャされなければならない。増幅産物を検出するためにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが使用される場合、ＰＣＲサイクルの任意の時刻に画像がキャプチャされうる。主制御および処理コンピュータ１０５は、所望の時刻および温度で撮像するようにプログラムできる。さらに他の実施形態では、蛍光シグナルの強度は、複数の位置で測定される。蛍光シグナルの強度が測定される複数の位置は、マイクロチャネルの異なる部分であってよい。蛍光シグナルの強度が測定される複数の位置は、マイクロチャネルの定められた部分全体（つまり、反応帯）であってよい。他の実施形態では、流路の長さに沿った少なくとも１つの蛍光シグナルの画像が作成される。他の実施形態では、画像キャプチャは、連続的温度サイクリング周期で繰り返し実行される。画像が作成されるか、または蛍光シグナルの強度が複数ピクセル・アレイ検出器（ＣＣＤまたはＣＭＯＳイメージセンサー）または単一のピクセル検出器を使用して測定されうる。螢光は、光ファイバー／レンズの組合せなどの大きな視野角を持つ結像光学系および／または小さな視野角を持つ光学系を使用して集光されうる。静止メカニズムまたは走査メカニズムまたはその両方を使用して、画像キャプチャを行える。蛍光シグナルの強度に関するデータは、適切にプログラムされたコンピュータにより処理される。
【００４７】
試験液がマイクロチャネル１０３内を移動し、所望の回数のＰＣＲサイクルを完了した後、試験液は、適宜、ポストＰＣＲ分析器１１６に送ることができる。ポストＰＣＲ分析器１１６は、ＰＣＲ増幅産物上で使用されうる分析技術を含むことができる。このような技術は、限定はしないが、配列決定法、電気泳動法、プロ−ビング法、溶融曲線分析法などを含む。
【００４８】
本発明によるマイクロチャネル内のリアルタイムＰＣＲに使用されるシステムの例は、図２、４、および６に概略が示されている。図２には、複数のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイス２０１を備えるリアルタイムＰＣＲシステム２００が例示されている。マイクロチャネル内の流体に対し重力の影響があるため、マイクロ流体デバイス２０１は、好ましくは、試験液および分散媒が概ね水平な方向に流れるように配向される。しかし、マイクロ流体デバイス２０１は、分散媒および試験液が、垂直方向を含む他の方向に流れるように配向されうる。熱移動要素は、マイクロ流体デバイス２０１の近位に配置される。光学的撮像システムは、照射レーザー２０２およびマイクロ流体デバイス２０１内のマイクロチャネルに適切な（複数の）励起波長を照射するためのビーム形成レンズ２０３を備える。光学的撮像システムは、さらに、（複数の）放射波長をフィルタリングし、後方散乱を低減するためのフィルタ２０４および複数ピクセル・アレイ検出器２０５を備える。リアルタイムＰＣＲシステム２００は、さらに、適宜レンズ２０７を備えることもできる。このシステムを使用するデータ処理によるセンサー出力画像が図３Ａおよび３Ｂに示されている。図３Ａは、１００ｎＭ  ＦＡＭ蛍光色素で満たされた８個の平行なマイクロ流体チャネルの二次元画像を示している。図３Ｂは、図３Ａの注目するボックス３０１の領域のプロファイル・プロットを示している。
【００４９】
図４には、複数のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイス４０１を備えるリアルタイムＰＣＲ用のシステム４００が例示されている。熱移動要素（図に示されていない）は、マイクロ流体デバイス４０１の近位に配置される。光学的撮像システムは、照射レーザー４０２およびマイクロ流体デバイス４０１内のマイクロチャネルに適切な（複数の）励起波長を照射するためのビーム形成レンズ４０４を備える。光学的撮像システムは、さらに、（複数の）放射波長をフィルタリングし、後方散乱を低減するためのフィルタ４０５およびＣＣＤ検出器４０６を備える。リアルタイムＰＣＲシステム４００は、さらに、適宜レンズ４０３を備えることもできる。このシステムを使用した５１２ピクセル直線ＣＣＤアレイ・センサーからのセンサー出力データが、図５に示されている。このセンサー出力データを示すために、マイクロチャネルは、１００ｎＭ  ＦＡＭ蛍光色素で満たされる。ピークは、マイクロチャネルからの蛍光のあることを示している。この実施形態では、レーザー光線および検出器の視野角は、マイクロチャネルの長さに関して走査され、これにより、蛍光を流路に沿った位置の関数として測定する。
【００５０】
複数の蛍光体から多色感知を行うことができるマイクロ流体デバイス内のリアルタイムＰＣＲに有用なシステムは、図６に例示されている。この実施形態では、リアルタイムＰＣＲシステム６００は、好ましくは複数のマイクロチャネル、およびマイクロ流体デバイス６０２の近位に配置されている熱素子（図に示されていない）を備えるマイクロ流体デバイス６０２を備える。この実施形態は、さらに、多色励起光をマイクロ流体デバイス６０２内の流路に送るための、例えば、赤色と青色の光などの複数波長の光を放射することができる光源６０８を備える。この実施形態の一態様では、光源６０８は、異なる波長の光を放射する複数のＬＥＤを備える。リアルタイムＰＣＲシステム６００は、さらに、励起フィルタ６０７、および複数の励起波長の光（赤色光および青色光など）を通す二重帯域通過干渉フィルタ６０５を備える。システム６００は、さらに、例えば、増幅産物中の蛍光体およびフロー・マーカー中の異なる蛍光体から放射光を集光し、検出器６０４に向けて送るためのレンズ６０１も備える。一実施形態では、励起光を遮蔽し、蛍光体からの蛍光を通す放射フィルタ６０６も備えられる。検出器６０４は、例えば、ＣＭＯＳイメージセンサーなどの多色感知を行える複数ピクセル・アレイとすることができる。
【００５１】
好ましい一実施形態では、システム６００は、さらに、多色の同時撮像を可能にする検出器６０４上にＲＧＢ色を配列するカラー・フィルタ・アレイ６１０を備える。カラー・フィルタ・アレイ６１０は、例えば、ベイヤー・フィルタとすることが可能である。本発明の多色システムでは、多色の同時撮像が可能であり、これにより、例えば、異なる蛍光体を使用してＤＮＡおよびフロー・マーカーの検出を行える。
【００５２】
本明細書で説明されているシステムは、マイクロチャネル内でリアルタイムＰＣＲを実行する方法、およびマイクロチャネル内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法に特に適合される。本発明による方法の一実施形態では、試験液のボーラスが連続的にマイクロチャネル内に移動される。試験液は、上述のようなリアルタイムＰＣＲ試薬を含む。分散媒は、マイクロチャネル内で連続的に移動される。分散媒は、試験ボーラスと逐次交互に移動する。ＰＣＲを達成するためにマイクロチャネルの定められた部分において温度サイクリングが行われる。蛍光シグナルの強度は、マイクロチャネルの定められた部分に沿った複数の位置で測定される。そこで、この実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲを実行する方法は、ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを連続的に移動させる工程と、ｂ）流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）ＰＣＲを達成するために流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、ｄ）流路の定められた部分に沿った複数の場所で蛍光シグナルの強度を測定する工程とを含む。
【００５３】
一実施形態では、流路の定められた部分に沿った熱移動要素を使用して温度サイクリングが行われる。他の実施形態では、熱移動要素は、流路の定められた部分全体において温度サイクリングを行う。つまり、温度サイクリングを行うために、一定温度帯が使用される。他の実施形態では、適切にプログラムされたコンピュータが、熱移動要素の温度サイクリングを制御する。一実施形態では、熱移動要素の温度が検出され、コンピュータにフィードバックされる。これらの実施形態によれば、温度変化が時間によるＰＣＲプロファイルに従うように流路の長さ分（反応帯）に加熱と冷却が行われる。試験ボーラスは、反応帯の上流端から下流端にボーラスが流れるときに必要なＰＣＲサイクル数が達成されるような流量（流速）でこの反応帯にポンプで通される。
【００５４】
他の実施形態では、蛍光シグナルの強度は、ＰＣＲ温度サイクルにおいて特定の時刻および／または温度で測定される。追加の実施形態では、蛍光シグナルの強度は、ＰＣＲサイクル毎に１回測定される。他の実施形態では、蛍光シグナルの強度が測定される複数の配置が、流路の定められた部分全体である。他の実施形態では、蛍光シグナルの強度に関するデータは、適切にプログラムされたコンピュータにより処理される。他の実施形態では、流路の長さに沿った少なくとも１つの蛍光シグナルの画像が作成される。他の実施形態では、画像キャプチャは、連続的温度サイクリング周期で繰り返し実行される。画像が作成されるか、または蛍光シグナルの強度が複数ピクセル・アレイ検出器を使用して測定されうる。静止メカニズムまたは走査メカニズムまたはその両方を使用して、画像キャプチャを行える。
【００５５】
本発明による方法の第２の実施形態では、リアルタイムＰＣＲの実行は、マイクロチャネル内の流体の流量（流速）を監視することを含む。液体は、試験液または分散媒としてよい。流路内の流量を監視することにより、時間により変化する試験ボーラスの配置が測定され、これにより、試験ボーラスで生じたＰＣＲサイクルの数を識別することができる。そこで、この実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲを実行する方法は、ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを連続的に移動させる工程と、ｂ）流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）ＰＣＲを達成するために流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、ｄ）流路の定められた部分に沿った複数の場所で蛍光シグナルの強度を測定する工程と、ｅ）流路内の流体の平均流量を測定する工程とを含む。
【００５６】
一実施形態では、流体の平均流速は、流路からの反応依存蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される。第２の実施形態では、流体の平均流速は、流路内のマーカー（つまり、反応独立マーカー）の連続画像を比較することにより測定される。マーカーの使用には、リアルタイムＰＣＲシグナルが検出可能でない場合でも、流量はそのまま検出可能であるという利点がある。潜在的マーカーの例は、色素、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、散乱金属粒子、超微粒気泡、および当技術分野者に知られているようなものである。一実施形態では、マーカーは、試験液中に存在する。マーカーが試験液中に存在する場合、これは、ＰＣＲ化学反応に悪影響を及ぼすことがあってはならない。他の実施形態では、マーカーは、分散媒中に存在する。さらに他の実施形態では、マーカーは、試験ボーラスと直列に並ぶ別のボーラスである。追加の実施形態では、マーカーは、励起波長、発光スペクトル、寿命、および当技術分野でよく知られているようなものなどにより、蛍光シグナルから分離し検出することが可能である。さらに他の実施形態では、蛍光シグナルの強度またはマーカーの連続画像に関するデータは、適切にプログラムされたコンピュータにより処理される。これらの実施形態により、平均流速は、連続するＰＣＲサイクルから取った画像を比較することにより決定される。さらに他の実施形態では、流量は、反応帯入口検出器および流速計を使用して測定されうる。流速は、例えば、流路の寸法を知り、体積流量を測定することにより推定されうる。
【００５７】
本発明による方法の第３の実施形態では、リアルタイムＰＣＲの実行は、マイクロチャネル内の流体の流量（流速）を監視することと、必要に応じて流量を調節して試験液が受けるＰＣＲサイクリングの持続時間を制御することとを含む。そこで、この実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲを実行する方法は、ａ）流路内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを連続的に移動させる工程と、ｂ）流路内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）ＰＣＲを達成するために流路の定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、ｄ）流路の定められた部分に沿った複数の場所で蛍光シグナルの強度を測定する工程と、ｅ）流路内の流体の平均流速を測定する工程と、ｆ）流体の流量を調節してＰＣＲサイクリングの持続時間を制御する工程とを含む。
【００５８】
一実施形態では、流量は、試験液が流路の定められた部分を通っている間に所望のＰＣＲサイクル数が完了するように監視および調節される。つまり、流量は、ＰＣＲサイクリングの持続時間を決定するように調節される。他の実施形態では、この監視および調節は、主制御および処理コンピュータ１０５などの適宜プログラムされたコンピュータにより実行される。さらに他の実施形態では、流量は、流路の投入端の圧力を調節することにより調節される。追加の実施形態では、流量は、流路の産出端の圧力調節真空を調節することにより調節される。他の実施形態では、流量は、シリンジ・ポンプなどのポンプを調節することにより調節される。一実施形態では、流量は、試験液がマイクロチャネルの反応帯内を移動するときに所望の回数のＰＣＲサイクルが実行されるように監視および調節される。例えば、マイクロチャネルの反応帯が３０ｍｍであり、３０回のＰＣＲサイクルを実行することが望ましい場合、１ｍｍ／サイクルの流量が達成され維持されるように流量が監視される。それぞれのＰＣＲサイクルの長さは、３０から６０秒のオーダーであるため、マイクロチャネル内の流速は、この例ではかなり低速である。
【００５９】
図７は、本発明の一実施形態により流体が流路内を移動するときに流体の流速を調節するための動作モードを例示するプロセス図である。この実施形態では、流速を調節するために、閉ループ・フィードバックが使用される。第１に、流路内の流体は、ポンプ圧設定点で、例えば、ポンプ・メカニズム１０６などの調節済み圧力ポンプを作動させることにより移動される。流体が流路内を移動すると、ＰＣＲ温度プロファイルが、流路の定められた部分に対し実行される。ＰＣＲ温度サイクルにおける適切な時刻に、システムは、流路の内容物の１つまたは複数の画像を取り込む。これらの画像データおよび取り込み時刻は、後で分析できるように、例えば、主制御および処理コンピュータ１０５などのデータベースに格納される。２つの連続画像が得られない場合、温度サイクリングおよび画像取り込みが、圧力設定点を変えることなく繰り返される。２つの連続画像が得られる場合、これらの画像は、比較され、これにより、流体が流路に沿ってどれだけ遠くまで移動したかを決定することができる。平均変位を経過した時間で割ると、平均流速が求められる。測定された流速と所望の流速との間に差がある場合、ポンプ圧設定点は、所望の流速が得られるように自動的に調節され、プロセスが繰り返される。測定された流速と所望の流速との間に差がない場合、ポンプ圧設定点は同じままであり、プロセスが繰り返される。
【００６０】
上述のシステムは、マイクロチャネル内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法に特に適合される。一実施形態によれば、マイクロチャネル内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法は、ａ）マイクロチャネル内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを移動させる工程と、ｂ）前記マイクロチャネル内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）ＰＣＲを達成するためにマイクロチャネルの定められた部分において温度サイクリングを行う工程と、ｄ）マイクロチャネルの一部分に沿って反応依存蛍光シグナルの画像をキャプチャする工程と、ｅ）マイクロチャネル内の平均流量を測定する工程と、ｆ）試験ボーラスの位置を平均流量から試験ボーラスが受ける温度サイクルの数に関係付ける工程とを含む。
【００６１】
一実施形態では、平均流量は、流路からの反応依存蛍光シグナルの連続画像を比較することにより測定される。第２の実施形態では、平均流量は、流路からの反応独立フロー・マーカーの連続画像を比較することにより測定される。反応独立フロー・マーカーは、（ｉ）試験ボーラス内で予混合されるか、（ｉｉ）試験ボーラスと交互にボーラスとして流路に導入されるか、または（ｉｉｉ）分散媒内で予混合されうる。他の実施形態では、反応独立フロー・マーカーからの散乱光は、波長スペクトルにより反応依存蛍光から分離され検出されうる。代替実施形態では、反応独立フロー・マーカーからの散乱光は、蛍光寿命に基づき反応依存蛍光から分離され検出されうる。他の実施形態では、反応独立フロー・マーカーは、さらに、試験ボーラスの流れ分散を決定するために使用される。さらに他の実施形態では、反応依存蛍光の画像は、少なくともＰＣＲサイクル毎に１回キャプチャされる。一実施形態では、反応依存蛍光の画像は、１回分のＰＣＲサイクルの持続時間よりも短い時間スケールで流路の長さにわたって走査することにより逐次的にキャプチャされる。代替実施形態では、反応依存蛍光の画像は、流路に沿って複数の地点からシグナルを同時に取得することによりキャプチャされる。他の実施形態では、流量測定は、流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である。さらに他の実施形態では、流量は、流路の定められた部分における試料ボーラスの出入りを検出することで測定される。
【００６２】
他の実施形態によれば、マイクロチャネル内のポリメラーゼ連鎖反応の進行状況を監視する方法は、ａ）マイクロチャネル内のリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液のボーラスを移動させる工程と、ｂ）同じマイクロチャネル内の分散媒を、順次試験ボーラスと交互に、移動させる工程と、ｃ）マイクロチャネルに沿って空間温度帯を施してＰＣＲを達成する工程と、ｄ）ＰＣＲサイクルにおいて固定点に対応するマイクロチャネルに沿った固定空間位置で蛍光シグナルを監視する工程と、ｅ）マイクロチャネル内の流体の平均流量を測定する工程と、ｆ）流量を調節してＰＣＲサイクルのタイミングを制御する工程とを含む。
【００６３】
一実施形態では、流路のいくつかの部分に沿った熱移動要素を使用して温度サイクリングが行われる。他の実施形態では、熱移動要素は、流路のいくつかの部分において温度サイクリングを行う。他の実施形態では、図１に例示されている主制御および処理コンピュータなどの、適切にプログラムされたコンピュータが、熱移動要素の温度サイクリングを制御する。一実施形態では、熱移動要素の温度が検出され、コンピュータにフィードバックされる。これらの実施形態によれば、ＰＣＲ温度プロファイルに従うように流路の一部に加熱と冷却が施される。試験ボーラスは、反応帯の上流端から下流端にボーラスが流れるときに必要なＰＣＲサイクル数が達成されるような流量（流速）でこの反応帯にポンプで通される。本発明のこの態様における流路内の流量を監視することにより、ＰＣＲサイクル周期の持続時間が決定されうる。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、さらに、上述した方法を実施するように適合されたシステムおよび／またはキットを提供する。上で例示されているように、これらのシステムおよび／またはキットは、本明細書の方法工程を実施するためのシステム・インストラクション（例えば、コンピュータ内に、またはコンピュータ可読媒体内に、例えば、システム・ソフトウェアとして、具現化される）を備えることができる。試料を保存し、移動させ、アリコートを取り、または希釈するための流体操作要素、例えば、マイクロ流体操作要素、および検出器要素も、本明細書のシステムおよびキットのコンポーネントとすることができる。それに加えて、梱包材料、一体化要素（例えば、計測器ケース、電源など）、システムおよびキットを使用するためのインストラクションなども、本発明の特徴であるとしてよい。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の試験液の温度サイクリングを行うようにそれぞれ構成されている１つまたは複数の増幅流路（マイクロチャネル）を備えるマイクロ流体デバイスを具備するシステムを提供する。（複数の）流路の定められた部分に沿って温度サイクリングを行うための熱移動要素も、含まれる。熱移動要素は、マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にある。マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にある照明源も含まれ、この照明源は、（複数の）流路を照射するように構成されている。マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にある検出器も含まれ、この検出器は、（複数の）流路内の増幅産物および／またはマーカーを検出するように構成されている。一実施形態では、検出器は、異なるシグナルを有する２つ以上の検出可能なマーカーから独立にシグナルを検出することができ、例えば、図６に例示されているシステムなどの、２つ以上の周波数の蛍光または他の放射を同時に検出できる検出器がそうである。システムは、（複数の）流路内の連続的に移動する試験液および分散媒の流量を制御するための１つまたは複数の要素とともに、流量を監視、制御してそれぞれのＰＣＲサイクルのタイミングを制御するためのシステム・インストラクションまたはソフトウェアを含む。典型的には、システムは、熱移動要素の温度を検出し、温度サイクルを制御するためのフィードバック情報を供給するセンサーを備える。典型的には、このシステムは、さらに、増幅産物および／またはマーカーの検出のタイミングなどのデータを生成し、処理し、（複数の）流路内の試験液の配置を監視するなどのためのシステム・ソフトウェアを備える。
【００６６】
一実施形態では、システムは、さらに、試料を複数の試験液に分けて希釈する希釈モジュールとともに、希釈モジュールが試料のアリコートを複数の試験液に分ける仕方を説明するシステム・インストラクションも備えることができる。希釈モジュールは、マイクロ流体デバイスと一体であるか、または近位にあるものとしてよい。
【００６７】
一実施形態では、システムは、適宜、本明細書で説明されている方法工程のどれかを実行するためのインストラクション付きのソフトウェアを備える。例えば、システムは、温度サイクリングを受ける試験液の１つまたは複数から送られてくるシグナルに対し１つまたは複数の統計的または確率論的解析を実行する統計的または確率論的システム・ソフトウェアを備えることができる。例えば、統計的または確率論的解析は、ポアソン解析、モンテカルロ解析、遺伝的アルゴリズムの応用、ニューラル・ネットワーク学習、マルコフ・モデリング、隠れマルコフ・モデリング、多次元的尺度構成法、部分的最小二乗ＰＬＳ分析、および／または主成分分析ＰＣＡを含むことができる。統計的または確率論的解析は、適宜、試料中の注目する核酸の濃度、割合、または個数を定量的に決定することを含む。これらの統計的評価法は、診断または予後診断に関連する存在量または割合と診断または予後診断との相関性を求めるために使用できる。
【００６８】
一実施形態では、システムはさらに、適宜、希釈モジュールにより希釈されるまで試料を保存しておく試料保存モジュール、試料保存モジュールから試料を取り出し、希釈モジュールに送出する試料取り出しモジュールなどの流体操作または保存機能の特徴を備えることができる。これらの特徴は、適宜、流体の連続流（例えば、試料を含む）をシステムに通すように設計されている（これにより、試料処理効率が高まる）。システムは、さらに、増幅産物を分析するための手段およびシステム・ソフトウェアも備えることができる。一実施形態では、システムは、検出器により検出されるような増幅産物により占有される再現可能なシグナル形状、長さ、幅、体積、または面積と（ａ）試験液の１つに存在する注目する核酸のコピーの個数、または試料中に存在する注目する核酸のコピーの個数、もしくはその両方または（ｂ）試料中に存在する（複数の）増幅産物の同定または（ｃ）当技術分野で知られ、使用されている他の分析パラメータとの相関性を求めるシステム・ソフトウェアを備えることができる。
【００６９】
本発明の方法で増幅され、検出されうる注目する核酸は、本質的にどのような核酸であってもよい。多数の核酸およびアミノ酸の配列（逆翻訳により核酸配列を導出できる）が利用可能である。１０万もの知られている核酸を同定する試みはなされておらず、本発明の方法でそのどれをも検出できる。知られている核酸に対する共通配列リポジトリとしては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩがある。他のリポジトリは、インターネットを検索することにより容易に見つけられる。核酸は、ＲＮＡ（例えば、増幅はＲＴ−ＰＣＲを含む）またはＤＮＡ（例えば、増幅はＰＣＲを含む）、またはその類似体（例えば、合成核酸またはその類似体の検出用）とすることができる。核酸の変異、例えば、突然変異、単一ヌクレオチド多型ＳＮＰ、対立遺伝子、アイソタイプ、フラグメント、全長核酸、単位複製配列などが検出されうる。さらに、本発明は、定量的であるため、これらの方法により発現量、フラグメンテーション、または遺伝子コピー数の変異を検出することができる。
【００７０】
一般に、本発明の方法は、注目する核酸について患者から、例えば、患者の体液および／または排泄物から抽出された試料をスクリーニングする際に特に有用である。これは、比較的大量のそのような物質から抽出された試料を本発明の方法でスクリーニングできるからである（このような物質の除去は、比較的非侵襲的でもある）。注目する核酸（例えば、癌細胞中に存在する）は、試料の関係する核酸集団の１％以下（例えば、注目する遺伝子の対立遺伝子の約１％、０．１％、０．００１％、０．０００１％以下）を容易に含むことができる。したがって、全血、血清、血漿、排泄物、尿、膣分泌物、射精液、滑液、バイオプシー、脳脊髄液、および羊水、痰、唾液、リンパ液、涙液、汗、または尿などは、本発明の方法により希な核酸またはフラグメンテーションについて容易にスクリーニングすることができるが、本質的に注目するどのような組織についてもいえる。これらの試料は、典型的には、インフォームド・コンセントに従って、標準的医療検査室手法により患者から採取される。
【００７１】
増幅に先立って、核酸は、利用可能な方法、例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ所在）、１９８７年）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在）、２００１年）、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２００５年まで更新）において教示されている方法により、適宜試料から精製される。さらに、細胞または他の試料から核酸を精製するためのキットは多数市販されている（例えば、両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）、およびＱｉａｇｅｎ社の  ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）を参照のこと）。それとは別に、例えば、アリコートを取り希釈した後に、単純に、試料に対し増幅操作を直接行うこともできる。単一分子検出の利点の１つは、反応における試料成分が低濃度であるため核酸精製の必要性が減じる点である。つまり、試料を希釈することで、注目する核酸を反応混合物中に分配するのと同時に不要な成分の存在量を減らせる。
【００７２】
本明細書の方法で検出される注目する核酸のクラスの１つは、癌に伴うものである。癌に関連する核酸は、本発明の方法、例えば、過剰発現または突然変異したポリペプチド増殖因子（例えば、ｓｉｓ）、過剰発現または突然変異した増殖因子受容体（例えば、ｅｒｂ−Ｂ１）、過剰発現または突然変異した、Ｇタンパク質などのシグナル変換タンパク質（例えば、Ｒａｓ）、または非受容体型チロシン・キナーゼ（例えば、ａｂｌ）、または過剰発現または突然変異した調節タンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｊｕｎ、ｆｏｓなど）、および／または類似物をエンコードする方法で検出されうる。好ましい一実施形態では、注目する特定の、または任意の核酸がフラグメンテーションの量に関してスクリーニングされ、高いフラグメンテーションは一般に正常細胞のアポトーシスに関連し、低いフラグメンテーションは、例えば、癌細胞の腐肉形成に関連する。一般に、癌は、シグナル変換分子および対応する癌遺伝子産物、例えば、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびＭｅｔをエンコードする核酸、ならびに転写活性化因子および抑制因子、例えば、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、および／または核内受容体に結合することが多い。俗に細胞の「分子警官」と呼ばれるｐ５３は、特に関連性があり、知られているすべての癌の約５０％は、ｐ５３における１つまたは複数の遺伝子病変に帰着できる。
【００７３】
癌に関連のある遺伝子のクラスの１つは、核ホルモン受容体のクラスであり、詳しく記述されており、また、発癌活性をもたらすようにそれらの受容体を修飾する機序が解決されている。例えば、甲状腺ホルモン作用の生理学的および分子的機序は、Ｙｅｎ（「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」８１：１０９７〜１１４２頁、２００１年）とそこに引用されている参考文献において検討されている。知られており、適切に特徴付けられている核内受容体は、グルココルチコイド（ＧＲ）、アンドロゲン（ＡＲ）、電解質コルチコイド（ＭＲ）、プロゲスチン（ＰＲ）、エストロゲン（ＥＲ）、甲状腺ホルモン（ＴＲ）、ビタミンＤ（ＶＤＲ）、レチノイド（ＲＡＲおよびＲＸＲ）、およびエイコサノイドを結合するペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ＰＰＡＲに対するものを含む。いわゆる「オーファン核受容体」は、核内受容体スーパーファミリの一部でもあり、ステロイド受容体および甲状腺受容体などの古典的核内受容体と構造的に相同である。これらの受容体をエンコードする核酸、またはその発癌形態は、本発明の方法で検出されうる。現在利用可能なすべての薬品治療の約４０％は、核内受容体および／またはその発癌形態のアゴニストまたはアンタゴニストであり、分析の対象としてそれらの受容体（およびそのコードする核酸）の相対的重要度を強調する形になっている。
【００７４】
癌に関連する注目する核酸のクラスの１つは、例えば、排泄物から抽出された試料中の結腸癌の診断に用いられるものである。結腸癌は、散発性または遺伝性であるよく見られる疾病である。結腸癌のさまざまなパターンの分子的機序は、ある程度詳しく知られている。一般に、胚性突然変異は、遺伝性結腸癌症候群に由来するが、体細胞変異の蓄積は、散発性結腸癌に由来する。アシュケナージ系ユダヤ人の間では、以前には多型として考えられていた突然変異が、家族性結腸癌の原因となりうる。遺伝子の少なくとも３つの異なるクラスの突然変異、つまり癌遺伝子、サプレッサ遺伝子、およびミスマッチ修復遺伝子が、結腸癌疫学において説明されている。例示的な１つの核酸は、ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、つまりフィブロネクチンとの相同性を有する細胞接着分子をエンコードする。結腸癌の追加の形態は、常染色体優性遺伝子、つまり病変を含むｈＭＳＨ２である。家族性大腸腺腫症は、染色体＃５のＭＣＣ遺伝子座に病変を有する結腸癌の他の形態である。結腸癌の詳細については、Ｃａｌｖｅｒｔら（「Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」１３７：６０３〜６１２頁、２００２年）および引用されている参考文献を参照のこと。排泄物中に検出されうるさまざまな結腸癌および結腸癌マーカーに関しては、例えば、Ｂｏｌａｎｄ  （「Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」２  Ｓｕｐｐ．１：Ｓ１２〜Ｓ１９頁、２００２年）および引用されている参考文献を参照のこと。他の癌と同様に、Ｒａｓおよびｐ５３などの癌との相関性を有するさまざまな他の遺伝子の突然変異は、癌の有用な診断指標である。他の態様では、本発明の方法を使用するフラグメンテーション・レベルの検出は、結腸癌の検出において特に役立ちうる。例えば、便試料から取り出せる患者全ＤＮＡの量は少ないので、本発明の増幅の態様は、ＤＮＡを調べる上で有益であると考えられる。正常な結腸のライニングから腐肉形成された細胞から得たＤＮＡは、一般的に、例えば、長さが約１００塩基対の複数のフラグメントに分解されるが、結腸腫瘍細胞から結腸内腔内に入るＤＮＡは、一般的にはフラグメント化されないままとしてよい。便試料中の特定の閾値を超える一部のフラグメント化されていない核酸の存在を検出することは、結腸癌の存在に相関しうる。
【００７５】
子宮頸癌は、例えば、膣分泌物から得られる試料中のもう１つの検出対象である。子宮頸癌は、ヒト乳頭腫ウイルスにより引き起こされることがあり、また２つの癌遺伝子Ｅ６およびＥ７を有する。Ｅ６は、ｐ５３に結合し、ｐ５３を取り除き、Ｅ７は、ＰＲＢと結合し、ＰＲＢを取り除く。ｐ５３の消失とＥ２Ｆ／ＤＰ増殖因子の制御されない作用は、ｐＲＢの調節なしで、子宮頸癌を引き越す機序の１つである。さらに、結腸癌と同様に、膣スワブ中の特定の閾値を超える一部のフラグメント化されていない核酸の存在を検出することは、子宮頸癌の存在に相関しうる。
【００７６】
本発明の方法による検出の他の対象は、例えば、涙液から抽出された試料中の網膜芽細胞腫、および例えば、ＣＳＦ中の、または組織標本採取により得られた神経線維腫症１型を含む。他の多くの癌形態が知られており、本発明の方法を使用して、例えば、関連する遺伝子病変、フラグメンテーションの割合、または注目している全長核酸の絶対濃度を検出することにより見つけることができる。該当する病変またはフラグメンテーション値を検出することにより検出されうる癌は、リンパ、血液、胃、腸、結腸、睾丸、膵臓、膀胱、頸部、子宮、皮膚、および関連する遺伝子病変またはフラグメンテーション閾値が存在する本質的に他のすべてのものの癌を含む。この話題については、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ」、ＣｏｌｅｍａｎおよびＴｓｏｎｇａｌｉｓ（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ所在）、２００１年を参照のこと。
【００７７】
同様に、病原体または感染性微生物からの核酸は、例えば、伝染性真菌、例えば、アスペルギルス属またはカンジダ種、細菌、特に病原菌（およびもちろん、病原性であるその特定の菌株）のモデルの役目を果たす大腸菌、さらにはブドウ球菌（例えば、黄色ブドウ球菌）、または連鎖球菌（例えば、肺炎球菌）などの医学上重要な細菌、胞子虫類（例えば、マラリア原虫）、根足虫（例えば、エントアメーバ属）および鞭毛虫（トリパノソーマ属、リーシュマニア属、トリコモナス属、ジアルジア属など）などの原虫、（＋）ＲＮＡウイルス（例として、ポックスウイルス、例えば、ワクチニア・ウイルス、ピコルナウイルス、例えば、ポリオ、トガウイルス、例えば、風疹、フラビウイルス属、例えば、ＨＣＶ、およびコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えば、ラブドウイルス、例えば、ＶＳＶ、パラミクソウイルス、例えば、ＲＳＶ、オルトミクソウイルス、例えば、インフルエンザ、ブンヤウイルス属、およびアレナウイルス属）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、レオウイルス属）、ＲＮＡからＤＮＡへのウイルス、つまり、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶ、ならびにＢ型肝炎などの特定のＤＮＡからＲＮＡへのウイルスなどのウイルスについて、本発明の方法により検出可能である。本発明の単一および低コピー増幅の方法は、多くの場合、例えば、生（全長核酸を有する）と死、さらに溶解された病原体（フラグメント化された核酸を有する）を識別するために細菌感染からの浸出液中で使用することができる。
【００７８】
アミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコース・イソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシル・トランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えば、ｐ４５０ｓ）、リパーゼ、リグニン・ペルオキシダーゼ、ニトリル・ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、アミノ基転移酵素、およびヌクレアーゼなどの酵素（例えば、工業用酵素）をエンコードするさまざまな核酸も、本明細書の方法により検出されうる。同様に、虫害抵抗性タンパク質（例えば、Ｃｒｙタンパク質）などの農業関係のタンパク質、デンプン、および脂質産生酵素、植物および昆虫毒、毒素抵抗性タンパク質、マイコトキシン解毒タンパク質、植物成長酵素（例えば、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）、およびホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）カルボキシラーゼも、検出されうる。
【００７９】
標準もしくはマイクロ流体の流体操作アプローチ（またはその組合せ）を使用して、試料のアリコートを取り、かつ／または試料希釈できる。希釈／アリコート分配を行う標準的な流体操作アプローチは、例えば、ピペットで試料から適切な量を取りマイクロタイター・トレイ内に入れ、適切な希釈液を加えることを含む。これらの操作は、手作業で、または例えば、マイクロタイター・トレイ内の希釈液を連続的に使用するように設計されている操作装置などの利用可能な高生産性流体操作装置を使用して実行されうる。高生産性機器（例えば、自動ピペッターおよびロボット・マイクロタイター・トレイ操作機能を組み込んでいる）が好ましいが、それは、本発明では、注目する試料のアリコートを何回も作り、使用することを考えているからである。
【００８０】
流体操作のための多数の自動化システムが、市販されており、本発明の文脈において試料のアリコートを取り、かつ／または試料を希釈するのに使用できる。例えば、さまざまな自動化システムが、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（現在は、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（マサチューセッツ州ホプキントン所在）から販売されており、典型的には、例えば、ロボットおよび流体操作モジュールを備える。同様に、例えば、マイクロタイター・トレイ操作のためにさまざまな実験室システムで使用される、ふつうのＯＲＣＡ（登録商標）ロボットも、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州フラートン）から市販されている。いずれの場合も、従来の高生産性システムは、本発明の方法を実施する際に、マイクロ流体システム（例えば、従来のシステムは、試料のアリコートを取ってマイクロタイター・トレイ内に入れるために使用することができ、そこからマイクロ流体システムは物質を引き出すことができる）の代わりに、またはそれと併せて使用できる。
【００８１】
マイクロ流体システムは、本発明に都合よく応用できる好ましい流体操作および増幅技術を備える。上述のような典型的な実施形態では、マイクロスケールのキャビティ（少なくとも１つの次元が約５００μＭ未満であり、多くの場合約１００μＭ未満である流路、チャンバなど）のネットワークを含むマイクロ流体デバイス内に試料が引き込まれ、キャビティ（例えば、流路および／またはチャンバ）のネットワーク内で試料が混合され、希釈され、アリコートが取られ、あるいは他の何らかの方法で操作される。例えば、マイクロスケール・デバイスは、マイクロスケール・デバイスの本体構造から外に向かって延びる、ネットワークと流体で連絡する、１つまたは複数の毛管を備えることができる。一実施形態では、陰圧（真空）が毛管に加えられ、流体が容器（例えば、マイクロタイター・トレイ上のウェル）からネットワーク内に引き込まれる。このプロセスは、複数の毛管流路を備えるデバイスを使用することにより多重化され、これにより、多数の試料をネットワーク内に引き込み、同時に処理することができる。それとは別に、複数の試料が、マイクロ流体デバイス内に逐次引き込まれ、同時処理および分析のために複数の流路の内部に送り込まれうる。また乾燥した試料との試料インターフェースは、この基本システムを使用して、例えば、毛管から流体を部分的に、または完全に追い出して、試料を水和させてから、試料をマイクロ流体デバイス内に引き込むことにより実行されうる（流体は、典型的には毛管先端の懸滴として試料と接触し、次いで毛管内に引き戻される）。いずれかのアプローチについては、さらに、米国特許第６，４８２，３６４号、第６，０４２，７０９号、第６，２８７，５２０号、および第６，２３５，４７１号を参照のこと。本質的にどのような流体操作（アリコート分配、希釈、加熱、および冷却）も、利用可能な方法を使用してネットワーク内で実行できる。マイクロスケール・デバイス内の希釈およびアリコート分配操作に関する詳細は、特許文献、例えば、米国特許第６，１４９，８７０号、第５，８６９，００４号、および第６，４４０，７２２号で説明されている。混合／希釈されるか、アリコート分配される試料および成分は、ピペッター要素を通して、またはデバイスそれ自体にある反応成分貯蔵槽から、または一般にその両方で、マイクロスケール・デバイス内に持ち込まれうる。例えば、試料は、ピペッター流路を通してマイクロ流体デバイス内に入れられ、希釈され、（複数の）デバイス希釈および／または試薬貯蔵槽から通常の試薬を供給されうる。遺伝子座特異試薬（例えば、増幅プライマー対）は、デバイス上のウェル内に入れることができるか、またはデバイスから離して、例えば、マイクロタイター・プレート内に保管されうる（この場合、これらはピペッター流路でアクセスできる）。これらの操作のどれか、またはすべてが、連続的または停止流フォーマットで実行されうる。
【００８２】
マイクロ流体デバイスは、典型的には、反応アセンブリ（反応混合物のアセンブリ）、温度サイクリング、および撮像（検出）工程における光学系の「キュベット」としての作用を含む、複数の機能を実行する。反応アセンブリでは、加熱が開始する前の最後の最後に組み合わされる反応混合物成分（特に、マグネシウムおよび酵素）のアセンブリが行われる。これは、「ホット・スタート」と呼ばれ、特異性の利点を有する。温度サイクリングでは、システムは、適宜、一定の流体移動と一連の連続的な温度変化の両方をもたらす。撮像時に、高データ転送速度ＣＣＤ検出器、複数ピクセル・アレイ検出器、または光ファイバー・ボール・ヘッド・レンズ検出器は、例えば、定量化の方法に適したダイナミックレンジをもたらすうえで有用である。
【００８３】
本発明を実施する際に使用されうる流体操作のあらゆる側面を実行する市販のシステムが利用可能である。例には、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（マサチューセッツ州ホプキントン所在）が市販している２５０  ＨＴＳシステムおよびＡＩＭ  ９０  ＳＥが含まれる。これらのシステムでは、直列の連続的な流れで実験を行い、「チップ・ツー・ワールド」インターフェース、またはシッパーと呼ばれるサンプル・アクセス・システムを使用し、このシッパーを通して、マイクロウェル・プレート内の物質が、チップに取り付けられた１つまたは複数の毛管に少しずつ吸い込まれ、チップの流路内に引き込まれる。そこで、注目する成分と混合され、処理および結果検出工程が実行される。例えば、米国特許出願第２００５／００４２８３９号を参照のこと。
【００８４】
従来の流体操作またはマイクロ流体アプローチ（またはその両方）が使用されるかどうか関係なく、アリコート分配および／または希釈事象は、特定の結果が得られるように実行されうる。例えば、試料は、それぞれのアリコートで等しく希釈されるか、それとは別に、個々のアリコートが、区別を付けて希釈されうる（例えば、希釈系列が作成されうる）。それらのアリコート自体は、システムにより使用される流体操作アプローチに適切な量であるとしてよく、例えば、マイクロ流体アプローチでは１００ｎＬ、１０ｎＬ、またはさらには１ｎＬ以下のマイクロタイター・プレートに対し数マイクロリットルのオーダーである。
【００８５】
これらのアリコートは、関連する核酸の高い、または低いコピー数を有するように選択されうる（例えば、低いコピー数のアリコートでは、関連する核酸の５０以下、一般には２５以下、通常は１０以下、多くの場合５以下、２以下、または１以下のコピー数）。生成されるアリコートの数は、試料のサイズと実行者が望む定量的情報の量に依存する。例えば、希な核酸の単純検出が望ましい場合、アリコートの１つにおける核酸を検出するために、十分に低いかつ／または単一のコピー数のアリコートが試料から作られる。さらに定量的情報が必要な場合、例えば、所定の信頼値で信頼できる統計的情報をもたらすように十分なコピーが作成される。いずれの場合も、これは、１アリコートから１０９以上のアリコートまでのどれか、例えば、１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１，０００，０００，０００またはそれ以上のアリコートを含むことができる。本発明により注目する核酸について作成され、評価されうるアリコートの数には理論的限界はないが、システムの効率および試料のサイズに関しては実用上の配慮がある（効率が低ければ低いほど、所定の時間に分析できるアリコートの数は少なくなり、試料サイズが大きければ大きいほど、試料から作ることができるアリコートの数は増える）。マイクロ流体アプローチを使用することで、試薬使用量（および付随する試薬コスト）を最低限に抑えられる。適宜増幅を行っている間を含む、試料および試薬の連続流を形成するようにシステムをフォーマットすることにより、本発明のシステムは、注目する核酸に対する多くの異なる試料を探索するプロセスの速度を大幅に高められる。同様に、停止流アプローチが使用される場合、ＰＣＲ反応からの信号の同時処理を使用して、注目する核酸に対する試料を探索するプロセスの速度を高めることができる。以下の実施例では、モデル試料のポアソン統計量の妥当な定量的情報をもたらすために、それぞれの希釈範囲に対しアリコートが約１５０あれば十分であった。明らかに、これらの方法では使用するアリコートを増減することもできる。
【００８６】
本発明の方法は、試料またはアリコートからの注目する１つの核酸および適宜１つまたは複数の追加の核酸の１つまたは複数の配列を増幅することを含む。増幅された核酸の検出を容易にするためにリアルタイムＰＣＲおよび／またはリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコン・ベース・プローブ、または量子ドット・ベース・プローブ）が使用される。
【００８７】
当技術分野者であれば、一般的に、これらの増幅法の詳細を熟知していると期待される。これらの増幅法に関する詳細は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在）、２００１年）、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ニューヨーク州所在）、２００５年まで更新）、「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら（編集）（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（英国ノリッジ所在）、２００４年）で説明されている。
【００８８】
一態様では、リアルタイムＰＣＲは、例えば、蛍光標識を使用して、本明細書で説明されているようなさまざまなアリコートまたは反応混合物に対し実行される。蛍光標識は、単一種有機分子に限定されるべきではなく、無機分子、有機分子および／または無機分子の多分子混合物、結晶、ヘテロポリマーなどを含むことが認識されている。好適な蛍光標識は、例えば、ＤＮＡ結合色素、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、または量子ドットにより形成されうる。増幅産物（二本鎖である）は、溶液中の色素分子を結合して、錯体を形成する。適切な色素を使用することで、溶液中で遊離している色素分子と増幅産物に結合されている色素分子とを区別することが可能である。例えば、いくつかの色素は、増幅産物に結合されたときのみ蛍光を発する。好適な色素の例には、限定はしないが、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ユタ州ソルトレークシティー所在）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）、およびＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州カールズバッド所在）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、クロモマイシン、アクリジン・オレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｔｏｔｏ−１、Ｙｏｙｏ−１、およびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニリンドールＨＣＬ）が含まれる。挿入色素の使い方に関する追加の詳細は、Ｚｈｕら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６６：１９４１〜１９４８頁、１９９４年）で説明されている。
【００８９】
分子ビーコンＭＢは、適切なハイブリダイゼーション条件の下で自己ハイブリダイズしてステム・アンド・ループ構造を形成する、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡである。ＭＢは、標識およびクエンチャーを、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡの末端に有し、それにより、分子内ハイブリダイゼーションを許す条件の下で、標識は、典型的には、クエンチャーにより消光される（または少なくともその蛍光性を変えられる）。ＭＢが分子内ハイブリダイゼーションを示さない条件の下では（例えば、標的核酸に、例えば、増幅時に単位複製配列の一領域に結合されたとき）、ＭＢ標識は消光されない。
【００９０】
ＭＢを作り、使用する標準的方法に関する詳細は、文献において明確に述べられており、ＭＢは、多くの市販の試薬供給元のものを利用できる。さらに、例えば、Ｌｅｏｎｅら（「Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ」２６：２１５０〜２１５５頁、１９９５年）、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（「Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：３０３〜３０８頁、１９９６年）、ＢｌｏｋおよびＫｒａｍｅｒ（「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ」１１：１８７〜１９４頁、１９９７年）、Ｈｓｕｉｈら（「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」３４：５０１〜５０７頁、１９９７年）、Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２７９：１２２８〜１２２９頁、１９９８年）、Ｓｏｋｏｌら（「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９５：１１５３８〜１１５４３頁、１９９８年）、Ｔｙａｇｉら（「Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１６：４９〜５３頁、１９９８年）、Ｂｏｎｎｅｔら（「Ｐｒｏｔ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」９６：６１７１〜６１７６頁、１９９９年）、Ｆａｎｇら（「Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ」１２１：２９２１〜２９２２頁、１９９９年）、Ｍａｒｒａｓら（「Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ」１４：１５１〜１５６頁、１９９９年）、およびＶｅｔら（「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」９６：６３９４〜６３９９頁、１９９９年）も参照のこと。ＭＢの構造および使用に関する追加の詳細は、特許文献、例えば、米国特許第５，９２５，５１７号、第６，１５０，０９７号、および第６，０３７，１３０号で説明されている。
【００９１】
ＭＢは、リアルタイム、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ中、または他の核酸増幅反応中を含む、核酸の検出および定量化を行うための安定した試薬である（例えば、ＭＢは、形成しながら標的を検出するために使用されうる）。Ｃｒｕａｃｈｅｍ（ｃｒｕａｃｈｅｍ．ｃｏｍ）、Ｏｓｗｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．（英国所在、ｏｓｗｅｌ．ｃｏｍ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州カールズバッド所在、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド所在、ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）およびＧｏｒｉｌｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＬＬＣ（カリフォルニア州アラメダ所在）を含む、さまざまなメーカーが、標準および特注の分子ビーコンを生産している。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラジョラ所在）社のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ＫｉｔｓならびにＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＳＡ（ベルギー所在、ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ）およびｌｓｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ（オランダ所在、ｉｓｏｇｅｎ．ｃｏｍ）のさまざまなキットなど、分子ビーコンを利用するさまざまなキットも市販されている。
【００９２】
ＭＢ成分（例えば、蛍光体またはクエンチャーにより標識されたものを含む、オリゴ）は、従来の方法を使用して合成されうる。例えば、オリゴまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）は、標準的な方法を使用して市販の自動化オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ合成装置で合成できる。標識は、自動合成時に、または前に説明されている合成後反応によりオリゴに付着させることができ、例えば、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（「Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：３０３〜３０８頁、１９９６年）および米国特許第６，０３７，１３０号および第５，９２５，５１７号を参照のこと。官能化されたオリゴの合成の追加の詳細については、Ｎｅｌｓｏｎら（「Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ」１７：７１８７〜７１９４頁、１９８９年）を参照のこと。標識／クエンチャーは、例えば、制御多孔性ガラス・カラムを使用して、例えば、クエンチャー（例えば、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニル部分（ＤＡＢＳＹＬ））を導入することにより、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡに導入することができる。例えば、クエンチャーは、自動合成時にオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することができ、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）のスクシンイミジルエステルは、付着部が第１級アミノ基である場合に使用することができ、４−ジメチルアミノフェニルアゾ−フェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）は、付着部がスルフィドリル基である場合に使用できる。同様に、フルオレセインは、ヌクレオシドをフルオレセインで置き換えたフルオレセインホスホラミダイトを使用するか、またはスペーサーを介してチミジン環のところにフルオレセイン部分を導入するフルオレセインｄＴホスホラミダイトを使用することにより、オリゴ内に導入されうる。フルオレセイン部分を末端位置に結合するために、ヨードアセトアミドフルオレセインがスルフィドリル基に結合されうる。テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）は、５’−テトラクロロ−フルオレセインホスホラミダイトを使用して自動合成時に導入されうる。他の反応性蛍光体誘導体およびそのそれぞれの付着部は、アミノ基に結合された５−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＨＤ）のスクシンイミジルエステル、スルフィドリル基に結合されたテトラメチルローダミンのヨードアセトアミド、アミノ基に結合されたテトラメチルローダミンのイソチオシアネート、またはスルフィドリル基に結合されたテキサス・レッドのスルホニルクロリドを含む。これらの標識された成分の合成時に、必要ならば、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡが、例えば、高圧液体クロマトグラフィまたは他の方法により精製できる。
【００９３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、２つの異なる蛍光色素で標識されている短い（例えば、２０〜２５塩基）オリゴデオキシヌクレオチドからなる。それぞれのプローブの５’末端には、レポーター色素が見つかり、それぞれのプローブの３’末端には、消光色素が見つかる。オリゴヌクレオチド・プローブ配列は、ＰＣＲ単位複製配列中に存在する内部標的配列に相補的なものとすることができる。プローブが無傷であれば、２つの蛍光体間にエネルギー移動が生じ、レポーターからの放射は、クエンチャーにより消光される（蛍光共鳴エネルギー移動またはＦＲＥＴ）。ＰＣＲの伸長フェーズでは、プローブは、反応で使用されるポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断され、これにより、オリゴヌクレオチド・クエンチャーからレポーターを放出し、レポーター放射強度の増大を生じる。
【００９４】
したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、標識とクエンチャーとを有するオリゴヌクレオチドであり、そこで標識は、増幅で使用されるポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ作用によりハイブリダイゼーションの後および増幅中に放出される。これは、合成時の増幅のリアルタイム尺度となる。さまざまなＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（本部はカリフォルニア州フォスター市に所在）だけでなく、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（例えば、ブラック・ホール・クエンチャー・プローブ）などのさまざまな専業メーカーからも市販されている。
【００９５】
量子ドットは、量子ドットの粒子サイズの選択により所望のエネルギーにチューニングされうる特徴的なスペクトル放射を有する蛍光半導体ナノ結晶である。量子ドットは、分光光度計で観測され測定されうる特徴的な放射スペクトルを放射する。量子ドットの発光スペクトルは、試料のサイズ不均質性に応じて２５〜３０ｎｍと狭い線幅を有し、線形状は、裾を引く領域のない対称的なガウス型またはほぼガウス型である。裾引き領域のないチューニング可能性、狭い線幅、および対称的発光スペクトルの組合せにより、システム内では増倍サイズの量子ドットの分解能が高められ、研究者たちは、量子ドットで標識されたさまざまな生物学的部分を同時に調べることができる。それに加えて、ナノ結晶量子ドットの励起波長の範囲は広く、すべての利用可能な量子ドットの放射波長に比べてエネルギーを高くすることができる。したがって、これにより、通常はスペクトルの紫外線または青色領域内の単一光源を備えるシステムにおいてすべての量子ドットの同時励起が可能になる。量子ドットは、さらに、従来の有機蛍光色素よりも強固であり、有機色素に比べて光退色に耐性がある。ヌクレオチドの蛍光標識としての量子ドットの使用は、Ｂｒｕｃｈｅｚら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８１：２０１３〜２０１６頁、１９９８年）、ＷａｒｒｅｎおよびＮｉｅ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８１：２０１６〜２０１８頁、１９９８年）、Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２７１：９３３〜９３７頁、１９９９年）、および米国特許第６，５４４，７３２号および第６，８５５，５５１号で説明されている。さまざまな量子ドット試薬が、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社（カリフォルニア州カールズバッド所在、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）またはＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ニューヨーク州トロイ所在、ｅｖｉｄｅｎｔｔｅｃｈ．ｃｏｍ）から市販されている。
【００９６】
多色多重化アッセイは、量子ドット・バイオコンジュゲーションの具体的な強みである。量子ドット・ナノ結晶からの放射は、狭く、対称的であり、したがって、他の色との重なりは最小であり、隣接する検出流路内への滲み出しが少なく、クロストークも減衰され、さらに多くの色を同時に使用できる。それぞれのバイオコンジュゲーション色は、同じ基礎材料に基づくので（サイズのみ異なる）、１つの色に対するコンジュゲーションおよび使用法は、異なる色のすべてに容易に外挿され、アッセイ開発が簡素化され高速化される。さらに、すべての量子ドット・ナノ結晶は、単一の光源を使用して励起することができ、狭いレーザーと広いランプ励起は両方とも有用である。３色または４色検出は、もはや、複数のレーザーまたは根気のいる位置合わせおよび補正を必要としない。
【００９７】
一般に、プローブ、分子ビーコン、ＰＮＡ、ＬＮＡ（ロックト核酸）などを含む、オリゴヌクレオチドを作る合成法は、よく知られている。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（「Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ」１２：６１５９〜６１６８頁、１９８４年）で説明されているような、市販の自動合成装置を使用して、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ」２２：１８５９〜１８６２頁、１９８１年）で説明されている固相ホスホラミダイト・トリエステル法により化学的に合成されうる。修飾オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドは、さらに、当技術分野者に知られているさまざまな営利的供給元から入手することもできる。オリゴ合成サービスを行う営利事業者は多数有り、したがって、これは広くアクセス可能な技術といえる。核酸は、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．社（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州アラメダ所在）、および他の多くの会社などのさまざまな営利供給元から特注品として入手可能である。同様に、ＰＮＡは、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ社（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎｃ．社（ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ社（英国所在）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．社、および他の多くの会社などのさまざまな供給元から特注品として入手できる。
【００９８】
例えば、マイクロ流体デバイス内の増幅反応を伴う、ＰＣＲおよび他の増幅反応を実行する多くの高生産性アプローチが開発されたが、それとともに、それらのデバイス内またはデバイス上の増幅された核酸を検出し、分析する方法も開発された。これらの高生産性アプローチは、本発明とともに使用するように適合されうる。このような技術に関する詳細は、例えば、技術および特許文献、例えば、Ｋｏｐｐら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８０：１０４６〜１０４８頁、１９９８年）、Ｃｈｏｗら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８２：３９６〜３９９頁、１９９８年）、Ｚｈａｎｇら（「Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ」７１：１１３８〜１１４５頁、１９９９年）、米国特許第６，４４４，４６１号、第６，４０６，８９３号、第６，３９１，６２２号、第６，３０３，３４３号、第６，１７１，８５０号、第５，９３９，２９１号、第５，９５５，０２９号、第５，９６５，４１０号、および第７，０１５，０３０号、米国公開特許出願第２００４／０１８０３４６号および第２００５／００４２６３９号、他の多くの文献において説明されている。
【００９９】
増幅された核酸を検出するための利用可能な方法を本発明において使用することができる。共通のアプローチは、分子ビーコン、量子ドット、またはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いるリアルタイム増幅検出、挿入色素（上述のような）の検出、増幅された核酸それ自体に組み込まれている標識の検出などを含む。増幅された核酸（単位複製配列）は、均質な（実質的に分離されていない）反応混合物または溶液中で検出されうる。
【０１００】
増幅および検出機能は、本発明におけるマイクロ流体デバイスを備えるシステム内に一体化されるのがふつうである。核酸を検出するための検出機能を備える利用可能なマイクロ流体システムは、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州マウンテン・ビュー所在）の２５０  ＨＴＳシステムおよびＡＭＳ  ９０  ＳＥだけでなくＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ社、カリフォルニア州パロ・アルト所在）を含む。検出（および分離／検出）機能を備えるシステムに関する追加の詳細は、特許文献、例えば、本明細書で説明されている参考文献、およびＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ９８／００２３１号において明確に説明されている。
【０１０１】
一般に、本明細書のデバイスは、適宜、例えば蛍光、リン光、放射能、ｐＨ、電荷、吸光度、発光、温度、磁力などを検出する、シグナル検出器を備える。蛍光検出は、特に好ましく、一般的に増幅された核酸の検出、特にリアルタイムＰＣＲ増幅に使用される（しかし、下流の操作は、単位複製配列に対し実行することができ、これは、質量分析またはサイズ排除などの他の検出方法を伴う場合がある）。
【０１０２】
（複数の）検出器が、適宜、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応から届く１つまたは複数のシグナルを監視する。例えば、検出器は、「リアルタイム」増幅アッセイ結果に対応する光シグナルを監視することができる。検出器は、単一の種類のシグナルを監視するか、または、例えば、複数の異なるシグナルを同時に監視することができる。
【０１０３】
例示的な検出器は、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェ・フォトダイオード、フォトレジスタ、ボロメータ、マイクロチャネル・プレート検出器、ＣＣＤアレイ（強度増倍および電子増倍ＣＣＤアレイ）、ＣＭＯＳイメージセンサーおよび／または類似の要素を含む。波長識別は、多層誘電体干渉フィルタ、色吸収フィルタを使用して、または回折および／または屈折光学素子による分散により達成できる。検出可能なシグナルを放出する単位複製配列または他の成分は、検出器内を流れ去るか、またはそれとは別に、検出器は、増幅反応の部位に相対的に移動しうる（または、検出器は、例えば、ＣＣＤアレイのように、流路領域、またはマイクロタイター・ウェルに対応する多数の空間位置を同時に監視することができる）。本発明の検出器は、例えば、マイクロ流体デバイスの１つまたは複数の検出領域内に流れ込む本発明の核酸に関連付けられているプローブから来るシグナルを検出することができる。
【０１０４】
検出器は、例えば、検出器シグナル情報をアッセイ結果情報（例えば、注目している核酸の存在、注目している核酸の長さ、注目している長さの核酸の割合、および／または病状との相関）に変換するためのソフトウェアなどを有する、コンピュータ（または他の論理デバイス）を備えるか、または動作可能なようにリンクされうる。
【０１０５】
シグナルは、例えば、知られている発生源からのシグナルを監視することによりマイクロ流体システムを較正することで適宜較正される。例えば、シグナルは、基準光源、内部基準シグナルと突き合わせて較正されるか、または背景上の正のシグナルを検出するように正規化されうる。
【０１０６】
本発明によるマイクロ流体システムは、さらに、システム内のシグナルを監視するために複数の異なる検出システムを使用することができる。本発明の検出システムは、特定の流路領域（または他の反応検出領域）内の物質を検出し、監視するために使用される。検出された後、流路内の細胞または液滴の流量および流速は、センサーにより適宜測定され、上述のように制御されうる。
【０１０７】
本発明の方法およびシステムで使用される検出システムの例には、光学センサー、温度センサー、圧力センサー、ｐＨセンサー、伝導度センサーなどを含めることができる。これらの種類のセンサーはそれぞれ、本明細書で説明されているマイクロ流体システム内に容易に組み込まれる。これらのシステムでは、そのような検出器は、マイクロ流体デバイスまたはそのデバイスの１つまたは複数の流路、チャンバまたは導管内に、またはそれに隣接して配置することができ、そのため、検出器は、デバイス、流路、またはチャンバとセンサーによる連絡範囲内にある。本明細書で使用されているような、特定の領域または要素の「センサーによる連絡範囲内にある」という語句は、一般に、検出器がマイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの一部、または検出器が意図されている、マイクロ流体デバイスの一部の内容物の特性を検出できるような位置に検出器を配置することを指す。例えば、マイクロスケール流路とのセンサーによる連絡範囲内に配置されているｐＨセンサーは、その流路内に配置された流体のｐＨを決定することができる。同様に、マイクロ流体デバイスの本体とのセンサーによる連絡範囲内に配置された温度センサーは、デバイスそれ自体の温度を決定することができる。
【０１０８】
本発明による好ましい検出システムは、本明細書で説明されているマイクロ流体システム内に組み込まれているマイクロ流体デバイスの流路および／またはチャンバ内の物質の光学的特性を検出するための光学的検出システムを含む。このような光学的検出システムは、典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロスケール流路に隣接して配置され、デバイスの流路またはチャンバに差し渡された光学的検出窓を介して流路とセンサーによる連絡範囲内にある。光学的検出システムは、流路内の物質から放射される光、物質の透過率または吸収度、さらには物質のスペクトル特性を測定することができるシステムを含む。好ましい態様では、検出器は、蛍光または化学発光物質などの、物質から放射される光の量を測定する。そのようなものとして、検出システムは、典型的には、検出窓を通して透過してきた光ベースのシグナルを収集し、その信号を適切な光検出器に伝達するための集光光学系を備える。変化する電力、視野直径、および焦点距離の顕微鏡対物は、この光学トレインの少なくとも一部として容易に使用される。光検出器は、適宜、分光光度計、フォトダイオード、アバランシェ・フォトダイオード、光電子増倍管、ダイオード・アレイ、または場合によっては、電荷結合素子ＣＣＤなどの結像系である。検出システムは、典型的には、アナログ−デジタル、またはデジタル−アナログ・コンバータを介して、コンピュータに結合され、検出された光データを分析、記憶領域への格納、およびデータ操作のためコンピュータに伝送する。
【０１０９】
標識された単位複製配列などの蛍光物質の場合、検出器は、典型的には、蛍光物質を活性化する適切な波長の光を発生する光源だけでなく、光源を検出窓を通して流路またはチャンバに入っている物質に向けるための光学系を備える。光源は、レーザーおよびＬＥＤを含む、適切な波長を発生する任意の数の光源であってよい。他の検出システムでは、他の光源が使用される。例えば、広帯域光源は、典型的には、光散乱／透過検出方式などで使用される。典型的には、光選択パラメータは、当技術分野者によく知られている。
【０１１０】
検出器は、独立のユニットとして存在することができるが、システムまたはマイクロ流体デバイスと一体化し、単一の計測器にできる。これらの機能を単一ユニットに一体化することで、少数のまたは（複数の）単一通信ポートを使用してコントローラ、検出器、およびコンピュータの間で情報をやり取りできるようにすることにより、これらの計測器をコンピュータと接続するのが容易になる。
【０１１１】
データを生成し、分析する方法、さらには他の関連する概念を理解する際に役立つ一般文献として、Ｗｅｉｓｓ（「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、第７版」Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ（マサチューセッツ州レディング所在）、２００４年）、Ｗｅｉｓｓ（「Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、第５版」Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ（マサチューセッツ州レディング所在）、２００１年）、Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ（「Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｏｎｌｉｎｅ：  Ｈｏｗ  ｔｏ  Ｌｏｃａｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｌｕｓｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  Ｙｏｕ  Ｎｅｅｄ」、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｏｄａｙ（ニュージャージー州メドフォード所在）、１９９８年）、Ｅｖｅｒｉｔｔ（「Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州所在）、１９９８年）、Ｋｏｔｚ（「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、ｖｏｌ．１〜９＋付録、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９８８年）、ＤｉｌｌｏｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（「Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９８４年）、ＴａｂａｃｈｎｉｃｋおよびＦｉｄｅｌｌ（「Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ニューヨーク州所在）、１９９６年）、Ｂｏｘら（「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｒｓ」、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９７８年）、Ｃｏｒｎｅｌｌ（「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ」、Ｗｉｌｅｙ（ニューヨーク州所在）、１９９０年）、Ｊｏｈｎ（「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ」、ＳＩＡＭ（フィラデルフィア所在）、１９９８年）、ＧｉｂａｓおよびＪａｍｂｅｃｋ（「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｋｉｌｌｓ」、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（カリフォルニア州セバストポル所在）、２００１年）、Ｐｅｖｚｎｅｒ（「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）、２０００年）、Ｄｕｒｂｉｎら（「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（英国ケンブリッジ所在）、１９９８年）、およびＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ（「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｂａｓｉｃｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（フロリダ州ボーカ・ラトーン所在）、２０００年）が挙げられる。
【０１１２】
増幅反応からのシグナルの非常に再現性の高いピーク・パラメータ、例えば、振幅、幅面積、および／または形状特徴は、反応に対する開始コピー数に相関し、かつ／または背景変動から注目する信号を区別するために使用されうる。この相関は、熱拡散率およびＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散を考慮して、理論的レベルで求められるか、または標準との比較（例えば、出発物質について知られているコピー数を有する増幅反応に対するピーク形状、例えば、高さ、幅、または一般的形状プロファイルとの比較）により求められうる。核酸の長さを測定する場合に２つ以上のプローブについて検出器シグナルを解釈する際に、同じ、または異なるピーク・パラメータを評価することができる。
【０１１３】
圧力駆動層流流路内で粒子を自由に拡散するために、修正拡散方程式を用いて、流路に沿った濃度プロフィルを近似することができる。Ｇ．Ｉ．Ｔａｙｌｏｒ（「Ｐｒｏｃ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ」Ａ  ２１９：１８６（１９５３年））およびＲ．Ａｒｉｓ（「Ｐｒｏｃ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ」Ａ  ２３５：６７（１９５６年））を参照のこと。Ｔａｙｌｏｒ分散係数（ＤＴ）は、マーカーの流れが通過するマイクロ流体キャビティの寸法および形状、平均流速（ｖ）、および分子拡散率（Ｄｍ）に依存する。ＤＴ＝Ｄｍ（１＋ｋｖ２ｗ２／Ｄｍ２）であるが、ただし、ｗは、特性流路幅であり、ｋは、流路断面の形状に依存する無次元係数である。好ましくは、流体パラメータおよび流路寸法は、許容可能なレベルまで分散を低減するように選択される。
【０１１４】
本発明のシステムは、マイクロ流体デバイス、反応混合物、検出器、試料貯蔵要素（マイクロタイター・プレート、コンポーネントの乾燥アレイなど）、フロー・コントローラ、増幅デバイス、またはマイクロ流体モジュール、コンピュータ、および／または同様のものを備えることができる。これらのシステムは、注目する核酸のアリコートを取り、増幅し、分析するために使用されうる。システムのマイクロ流体デバイス、増幅コンポーネント、検出器、および貯蔵要素は、すでに、上である程度詳しく説明されている。以下の説明では、適切なコントローラおよびコンピュータを取りあげるが、多くの構成が利用可能であり、当技術分野者であれば、その使用に長けていると予想され、また本発明にどのように応用できるかを理解するであろう。
【０１１５】
例えば、圧力ベースの制御または動電学的な制御により、本発明のデバイス内の流体および／または物質の輸送および方向を制御するために、さまざまな制御用計装機器が本明細書で説明されているマイクロ流体デバイスと適宜併用される。
【０１１６】
例えば、多くの場合において、流体輸送および方向は、流体流を駆動するために外部または内部圧力源を組み込んだ圧力ベースのフロー・システムを使用して、その全部または一部が制御される。内部供給源は、微細加工ポンプ、例えば、隔膜ポンプ、熱ポンプ、ラム波ポンプ、および当技術分野で説明されているものなどを備える。例えば、米国特許第５，２７１，７２４号、第５，２７７，５５６号、および第５，３７５，９７９号、およびＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ９４／０５４１４号およびＷＯ９７／０２３５７号を参照のこと。本明細書で説明されているシステムは、さらに、動電学的物質方向および輸送システムを使用することができる。
【０１１７】
好ましくは、外部圧力源が使用され、流路末端のポートに印加される。これらの印加される圧力、または真空は、流路の長さにわたって差圧を発生し、これにより流体流を通す。本明細書で説明されている相互接続された流路網では、体積に対する差流量は、異なる圧力または真空を複数のポートに印加することにより、または好ましくは、単一の真空を共通の廃液ポートに印加し、所望の流量が得られるように適切な抵抗を持つさまざまな流路を構成することにより適宜得られる。例示的なシステムは、米国公開特許出願第２００２／００１９０５９号で説明されている。
【０１１８】
典型的には、コントローラ・システムは、本明細書で説明されているようにマイクロ流体デバイスまたはシステム要素を受け入れるか、またはインターフェースするように適宜構成される。例えば、コントローラおよび／または検出器は、適宜、コントローラおよび／または検出器とデバイスとの間で適切なインターフェースを容易に取れるようにマイクロ流体デバイスが取り付けられているステージを備える。典型的には、ステージは、入れ子になっているウェル、位置合わせピンおよび／または孔、非対称エッジ構造（デバイスの適切な位置合わせがしやすいようにする）などの適切な取り付け／位置合わせ構造要素を備える。多くのこのような構成は、本明細書で引用されている参考文献において説明されている。
【０１１９】
上述の制御用計装は、さらに、上流の流量を制御するために注目する領域の下流にある物質の動電学的注入または取り出しを行えるようにするために適宜使用される。上述のと同じ計装および技術は、さらに、フロー制御要素として機能するように下流ポート内に流体を注入するために使用される。
【０１２０】
上記のように、コントローラ・システムおよび／または検出システムのいずれか、または両方が、事前プログラムされた、またはユーザー入力インストラクションに従ってこれらの計装の動作を指令し、それらの計装からデータおよび情報を受け取り、この情報を解釈し、操作し、ユーザーに報告する機能を持つ適切にプログラムされたプロセッサまたはコンピュータ（論理デバイス）に結合されうる。そのようなものとして、コンピュータは、典型的には、図１に例示されている主制御および処理コンピュータ１０５などの、それらの計装の一方または両方（例えば、必要に応じてアナログ−デジタルまたはデジタル−アナログ・コンバータを含む）に適宜結合される。
【０１２１】
コンピュータは、典型的には、例えばＧＵＩによる、設定パラメータ・フィールドへのユーザー入力の形態、または例えば、さまざまな異なる特定の操作について事前プログラムされた、事前プログラム・インストラクションの形態のユーザー・インストラクションを受け取るための適切なソフトウェアを備える。次いで、ソフトウェアは、これらのインストラクションを適切な言語に変換し、所望の操作を実行するように流体方向および輸送コントローラの操作を指令する。次いで、コンピュータは、システム内に含まれる１つまたは複数のセンサー／検出器からデータを受け取り、そのデータを解釈し、ユーザーの理解できるフォーマットで送るか、または、例えば、流量（連続流に対する流量を含む）、温度、印加電圧などの監視および制御などにおいて、そのデータを使用してプログラミングに従い他のコントローラ・インストラクションを開始する。
【０１２２】
これらのシステムおよび／またはキットは、本明細書の方法工程を実施するためのシステム・インストラクション（例えば、コンピュータ内に、またはコンピュータ可読媒体内に、例えば、システム・ソフトウェアとして、具現化される）を備えることができる。例えば、システムは、適宜、検出器により検出された、注目する核酸の増幅されたコピーにより占有される形状、長さ、幅、体積、および／または面積と、アリコートの１つに存在する注目する核酸のコピーの数、または試料中に存在する注目する核酸のコピーの数、またはその両方との相関を求めるシステム・ソフトウェアを備える。同様に、システムは、適宜、試料を注目する核酸のコピーを含まない複数のゼロ・コピー・アリコートおよび注目する核酸の単一コピーを含む１つまたは複数の単一コピー・アリコートを含む、複数のアリコートに分けるように希釈モジュールに指令するシステム・インストラクションを含む。
【０１２３】
上記の統計関数を、システム・ソフトウェアに組み込むことも可能であり、例えば、コンピュータ、コンピュータ・メモリ、またはコンピュータ可読媒体に埋め込むことができる。例えば、コンピュータは、（温度サイクリングを介して）増幅を受けるアリコートの１つまたは複数から送られてくるシグナルに対し１つまたは複数の統計的または確率論的解析を実行する統計的または確率論的システム・ソフトウェアを備えることができる。統計的または確率論的解析ソフトウェアは、適宜、試料中の注目する核酸の濃度、割合、または個数を定量的に決定する。
【０１２４】
システムのコンピュータおよびソフトウェアは、１つまたは複素の解析結果からのシグナル・データを受け取って評価し、注目する核酸に対する計量および／または比例測定を行う。基本形態では、例えば、シグナルの振幅または積分面積は、例えばｎＬ当たりのコピー数、ｎｇ／μＬなどの所望の単位で出力に対する換算係数で調節されうる。それとは別に、知られている濃度の１つまたは複数の標準物質を分析して、回帰分析用にデータを生成し、濃度が変化する検出可能なシグナルの変化を式（標準曲線）として表し、１つまたは複数のシグナル・パラメータを式に挿入して、未知の濃度を決定することができる。特定の一実施形態では、注目する核酸の計量は、特定の強度の信号を得るために必要な増幅サイクル数に基づくことができる。
【０１２５】
本発明では、コンピュータは、典型的には、流路内の物質を監視するためのソフトウェアを備える。それに加えて、このソフトウェアは、適宜、物質の動電学的または圧力変調注入または引き出しを制御するために使用される。注入または引き出しは、上述のように流量を変調し、成分など混合するためなどに使用される。
【０１２６】
以下の実施例は、限定はしないが、請求されている発明を例示するために提示されている。本明細書で説明されている実施例および実施形態は、例示することのみを目的としており、このことを考慮してさまざまな修正形態または変更形態が、当技術分野者に示唆され、また本出願の精神および範囲ならびに付属の請求項の範囲の中に含まれるものであることは理解される。
【０１２７】
連続流条件の下でマイクロ流体デバイス内のＰＣＲ増幅のリアルタイム検出を実証するための実験が実施された。８流路マイクロ流体デバイスが、この実験に使用された。それぞれのマイクロチャネルの寸法は、おおよそ幅１８０μｍ、深さ１１μｍである。マイクロ流体デバイスの反応帯は、長さが約４０ｍｍであった。ｆｉｍＡ細菌ＤＮＡは、標準リアルタイムＰＣＲ技術を使用して増幅された。ｆｉｍＡ  ＤＮＡテンプレートおよびリアルタイムＰＣＲ試薬を含む試験液は、適宜フロー・マーカーを含む分散媒と交互に形成した。１サイクルにつき９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で２０秒を含む、６０秒のＰＣＲサイクル時間が使用された。流量は、実験時にマイクロチャネル内に連続流を通して毎分約１ｍｍとした。この実験で使用されたリアルタイムＰＣＲシステムは、４７０ｎｍのピークおよび６３０ｎｍのピークを有するＬＥＤ配列、励起フィルタ、および二重帯域通過干渉フィルタを備えていた。検出器の条件は、検出器：ＣＭＯＳ  １２．８Ｍピクセル、レンズ：５０ｍｍ  ｆ／１．４、倍率：約１：１、放射フィルタ：５１０〜５６５ｎｍおよび６６０〜７１０ｎｍの通過帯域を有する干渉フィルタ、ＩＳＯ感度：３２００、であった。同時多色画像取り込みが、７２℃の伸長フェーズで実行された。増幅産物を検出するために、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素が使用され、フロー・マーカーとして、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７赤色素が適宜使用された。
【０１２８】
この実験の結果は、図８Ａ〜８Ｂおよび図９Ａ〜９Ｂに示されている。図８Ａは、連続流ＰＣＲ条件の下での流路の長さ３０ｍｍの部分を示している。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素ボーラスからなる赤色フロー・マーカーが、見える状態にある。右側の流路の下流端でしか目立たない緑色光は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素からのもので、増幅ＤＮＡの存在を示している。図８Ｂは、図８Ａからのマイクロチャネル２（上から２番目）に沿った赤色シグナルの強度のプロットを示している。拡散と分散により、これらの色素マーカー・ボーラスは、流路を下るにつれて広がり、その結果、下流のシグナル・ピークが幅広になり、短くなる。しかしながら、これらの効果は弱く、ボーラスは、流速を測定するために使用できる十分明確な区別を保持する。
【０１２９】
図９Ａは、連続流ＰＣＲ条件の下での流路の長さ３０ｍｍの部分を示している。緑色光は、伸長フェーズにおいて集光されたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素蛍光からのもので、増幅ＤＮＡの存在を示している。この場合、流路内に別のフロー・マーカーが注入されることはなかった。図９Ｂは、図９Ａからのマイクロチャネル２（上から２番目）に沿った緑色シグナルの強度のプロットを示している。流路の上流端に向かう形で、試料要素が少ないＰＣＲ温度サイクルを受ける場合、測定された強度は、背景散乱によって左右される。下流に進むにつれ、シグナルは急上昇し、次いで飽和する。シグナル対位置のこのシグモイド形状は、従来のリアルタイムＰＣＲシステムで見られるシグナル振幅対サイクル数の形状に似ている。これらの結果は、連続流条件の下でＰＣＲ増幅のリアルタイム検出を示している。
【０１３０】
本発明を説明する英語原文の文脈において「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示対象を使用している場合（特に、請求項の文脈において）、本明細書において特に断りのない限り、または文脈上明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を含むものと解釈されるべきである。「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「持つ、有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、備える（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む、含有する、収める（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という言葉は、断りのない限り、制約のない表現（つまり、「限定はしないが、．．．を含む」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書において断りのない限り、その範囲内に収まるそれぞれの個別の値を個々に参照する簡便法として使用されることを単に意図しており、それぞれの個別の値は、本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明されているすべての方法は、本明細書に断りのない限り、または文脈上明らかに矛盾していない限り、適当な順序で実行できる。本明細書に記載される任意のおよびすべての例、または例示的な言い回し（例えば、「．．．などの（ｓｕｃｈ  ａｓ）」の使用は、単に本発明をわかりやすくすることを意図しているだけであり、断りのない限り本発明の範囲に制限を課すことはしない。本明細書におけるどのような言い回しも、非請求要素を本発明の実施に本質的であるとして示すものとして解釈すべきではない。
【０１３１】
本発明の実施形態は、本明細書において説明されており、本発明を実施するために発明者に知られている最良の態様を含む。これらの実施形態の変更形態は、上記の説明を読んだ後、当技術分野者にとって明確になるものとしてよい。発明者は、当技術分野者がこのような変更形態を適宜採用することを期待し、発明者は、本明細書で特に説明されているのと違う形で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法により許されているとおりに付属の請求項に記載されている主題のすべての修正形態および同等の形態を含む。さらに、可能なすべての変更形態における上述の要素の任意の組合せは、本明細書に断りのない限り、または文脈上明らかに矛盾していない限り本発明により包含される。
【０１３２】
本出願中で引用されているすべての刊行物、特許出願、および／または他の文書は、それぞれの個別の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書が、すべての目的に関して参照により組み込まれることを個別に指示されていた場合と同じ程度にすべての目的に関して全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【国際調査報告】
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