(57)【要約】  本発明は特定化学式を有するトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩、並びにそれを含む薬学組成物に関するものである。本発明の化合物または組成物は癌の治療に有用であり、特に乳癌治療に優れた効能を持つ。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で示されるトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩：
【化１】
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上記化学式１で、Ｒ１は炭素数１乃至８の直鎖状または分枝状アルキルであり、Ｒ２は炭素数１乃至８の直鎖状または分枝状アルキル、アリル、ピリジニルメチル、ピリジニルエチル及びピリジニルプロピルからなる群より選択されるいずれか一つであり、Ｒ３は置換されないベンゾイルまたは炭素数１乃至３のアルキルによって置換されたベンゾイルであり、ｎは１乃至３の定数である。
【請求項２】
上記化学式１でＲ１はブチルであり、Ｒ２はアリル、１-エチルプロピル及びピリジニルメチルからなる群より選択されるいずれか一つであり、Ｒ３は置換されないベンゾイルであり、ｎは２であることを特徴とする請求項１に記載のトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
上記化学式１のＲ２はアリルであることを特徴とする請求項２に記載のトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のトリアジン誘導体化合物またはそれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする癌治療用組成物。
【請求項５】
上記癌が、乳癌、大膓癌、腎臓癌、脳癌、卵巣癌、胃癌、子宮頸部癌、肺癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌及び子宮癌からなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項４に記載の癌治療用組成物。
【請求項６】
上記癌が、乳癌であることを特徴とする請求項５に記載の癌治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌、特に乳癌の治療に有用な新規化合物及びそれを含む組成物、並びにそれを用いる治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の韓国内報道資料によると、癌を含めて高血圧、脳血管疾患、糖尿病などのような慢性疾患の発病率が増加し続けており、このような疾病による経済的損失は約３７兆ウォンにのぼると分析している。特に、韓国における疾病による死亡率の１位は癌であり、癌による苦痛は経済的損失だけでなく精神的にもかなり悪影響を与える。また、癌治療法の進展により、癌による死亡者の数は持続的に減少しているが、癌患者の数の持続的な増加及び治療薬物の投与期間が長期化されている。
【０００３】
一方、乳癌は乳房にできる癌であって、乳房にある多種の細胞中、いずれのものでも癌になることができるので、乳癌の種類は非常に多いと言えるが、たいていの乳癌が乳管と乳腺葉にある細胞の中でも乳管細胞から始まるので、一般的に乳癌と言えば乳管と乳腺葉の上皮細胞から始まる癌を称する。乳癌は、癌の中で一番活発な研究が行われている癌であるにもかかわらず、未だに乳癌の発生機転として明らかになっているものはない。
【０００４】
韓国における乳癌の発病率は、全体の癌の中で、胃癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌に続いて５番目であり、２０００年には全体の癌発生の６.５％（５，４４４人）を占め、女性の悪性腫瘍の中で胃癌に続いて２番目に多くできる癌であったが、２００２年には全体の癌発生の７.４％（７，３５９人）を占め、胃癌を追い抜いて女性の悪性腫瘍の中で１位（１６.８％）を占めた（国立癌センター２００５年資料報告）。一方、乳癌は女性だけに発生するのではなく、男性も乳癌にかかることができるが、発生の割合は女性の１/１００未満である。
【０００５】
現在の抗癌療法中、化学療法を利用した抗癌剤が全体の約３０％を占めており、その一例として、前立腺癌にリュープロン（Lupron）、卵巣癌にタキソール（Taxol）、乳癌にゾラデックス（Zoladex）などを含めた４０〜５０余種が臨床で使われており、それ以外の多くの化学療法剤が開発中にある。抗癌剤の開発目的は、より選択的で根源的に癌を征服するとともに、毒性による副作用、耐性の誘発及び再発を克服することにある。特に、既存の治療方法でも乳癌患者の死亡率は非常に高いので、新しい乳癌治療剤の模索が切実に必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許登録番号第426452号
【特許文献２】韓国特許登録番号第367978号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Moon, H-S., et al., J Am Chem Soc., 124(39), 11608-11609 (2002)
【非特許文献２】J Am Chem Soc., 125, 11804-11805 (2003)
【非特許文献３】Byrne, J.A. et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995)
【非特許文献４】Bryne, J.A. et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、本発明が解決しようとする技術的課題は、癌の治療に有用な新規化合物及びそれを含む組成物、並びにそれを用いる癌治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記技術的課題を達成するために、本発明は下記化学式１で示されるトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩、それを含む癌治療用組成物及びそれを用いる癌治療方法を提供する。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
上記化学式 １で、Ｒ１は炭素数１乃至８の直鎖状（linear）または分枝状（branched）アルキルであり、Ｒ２は炭素数１乃至８の直鎖状または分枝状アルキル、アリル（allyl）、ピリジニルメチル（pyridinylmethyl）、ピリジニルエチル及びピリジニルプロピルからなる群より選択されたいずれか一つであり、Ｒ３は置換えないベンゾイル（benzyol）または炭素数１乃至３のアルキルに置換されたベンゾイルであり、ｎは１乃至３の定数である。
【００１２】
望ましくは、上記化学式１でＲ１はブチル（butyl）であり、Ｒ２はアリル、１-エチルプロピル及びピリジニルメチルからなる群より選択されたいずれか一つであり、Ｒ３は置換されないベンゾイルであり、ｎは２であり、さらに望ましくは、上記化学式１でＲ２はアリルである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、癌の治療に有用な上記化学式１で示されるトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩、それを含む組成物及びそれを用いる治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施例による化合物が、ＭＣＦ-７乳癌細胞の成長を抑制することを示す写真（２００倍拡大）である。
【図２】ＭＣＦ-７乳癌細胞を本発明の一実施例による化合物１００ｕＭで処理した後、成長抑制程度を示すグラフである。
【図３】陰性対照群の実験結果であって、ヌードマウスにＭＣＦ-７乳癌細胞を投与して発生させた乳癌腫塊を示す写真である。
【図４】ヌードマウスに乳癌細胞を投与して発生させた乳癌腫塊に、本発明の一実施例による化合物Ｄａｎ-ＢＣ１を投与した後、腫塊の大きさの変化を観察した写真である。
【図５】ヌードマウスに乳癌細胞を投与して発生させた乳癌腫塊に、本発明の一実施例による化合物Ｄａｎ-ＢＣ２を投与した後、腫塊の大きさの変化を観察した写真である。
【図６】ヌードマウスに乳癌細胞を投与して発生させた乳癌腫塊に、本発明の一実施例による化合物Ｄａｎ-ＢＣ３を投与した後、腫塊の大きさの変化を観察した写真である。
【図７】乳癌が誘導されたヌードマウスにおいて、本発明の一実施例によるトリアジン誘導体化合物Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の腫瘍抑制効果を比べたグラフである。
【図８】癌形成形質転換動物モデルで自然発生した乳癌腫塊に、本発明の一実施例による化合物Ｄａｎ-ＢＣ１を投与した後、腫塊の大きさの変化を観察した写真である。
【図９】癌形成形質転換動物モデルで自然発生した乳癌腫塊に、本発明の一実施例による化合物Ｄａｎ-ＢＣ２を投与した後、腫塊の大きさの変化を観察した写真である。
【図１０】癌形成形質転換動物モデルで自然発生した乳癌腫塊に、本発明の一実施例による化合物Ｄａｎ-ＢＣ３を投与した後、腫塊の大きさの変化を観察した写真である。
【図１１】癌形成形質転換動物モデルにおいて、本発明の一実施例によるトリアジン誘導体化合物Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の腫瘍抑制効果を比べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明による新しい癌治療剤及びそれを含む組成物、並びにそれを用いる癌治療方法についてより詳しく説明する。
【００１６】
本発明は、トリアジン誘導体化合物ライブラリ（library）の中で、上記化学式１で示されるトリアジン誘導体化合物が、癌、特に乳癌の治療に優れた効果を奏するという点に基いている。トリアジン誘導体化合物ライブラリは、本来マイオソベリン（myoseverin）-類似 抗-チューブリン（tubulin）薬物を開発するために、マイオソベリン誘導体から知られている構造-活性相関性（Structure Activity Relationship, SAR）データとコンピューター利用モデリング（computer aided modeling）とから考案されており（Moon, H-S., et al., J Am Chem Soc., 124(39),  11608-11609 (2002) 参照）、このようなトリアジン誘導体化合物ライブラリを利用して培養された乳癌細胞を含む一連の癌細胞を用いて発掘された抗癌化合物の効能を検証し、上記化学式 １で示されるトリアジン誘導体化合物及びそれの薬学的に許容可能な塩が、癌、特に乳癌に優れた効果を奏することを確認した。
【００１７】
また上記化学式１で示されるトリアジン誘導体化合物の中で、下記化学式２で示される化合物 Ｄａｎ-ＢＣ１（C31H42N8O4、分子量: 590.724）、下記化学式３で示される化合物Ｄａｎ-ＢＣ２（C34H43N9O4、分子量: 641.772）、及び、下記化学式４で示される化合物Ｄａｎ-ＢＣ３（C33H48N8O4、分子量: 620.793）は、腫瘍抑制効率など多くの側面で癌治療に更に効果的である。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
【化３】
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【００２０】
【化４】
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【００２１】
発見されたトリアジン誘導体化合物を利用して抗癌効能を把握しようと乳癌細胞、大膓癌細胞、腎臓癌細胞、脳癌細胞などで化学的且つ遺伝的スクリーニングを実施し、上述したトリアジン誘導体化合物ライブラリで上記化学式１で示される化合物、より望ましくは上記化合物 Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の３つの化合物が癌細胞抑制活性において更に有用であることを明かした。
【００２２】
より具体的に、本発明による化合物は、ＭＣＦ-７乳癌細胞株（ATCC  Number: HTB-22)で細胞成長抑制効果が一番高く、次はＭＤＡ-ＭＢ-４３５乳癌細胞株（ATCC Number: HTB-129）、ＭＤＡ-Ｎ乳癌細胞株（Wang, J.J., et al., Anticancer Drugs, 15(3), 277-286 (2004)）順で細胞成長抑制効果が高く、ＨＣＴ１５大膓癌細胞株（ATCC Number: CCL-225）、ＮＣＩ/ＡＤＲ-ＲＥＳ乳癌細胞株（Ehrlichova, M., et al., Anticancer Res., 25(6B), 4215-4224 (2005)）、ＣＡＫＩ-１腎臓癌細胞株（ATCC Number: HTB-46）、ＡＣＨＮ腎臓癌細胞株（ATCC Number: CRL-1611）、ＳＦ２９５脳癌細胞株（Rao, V.K., et al., Cancer Genet Cytogenet,160(2), 126-133 (2005)）及びＵＯ-３１腎臓癌細胞株（Jansen, A.P., et al., Mol. Cancer Ther., 3(2), 103-110 (2004); Chen, Y-L., et al., Eur J Med Chem., 40,928-934(2005)）でも癌細胞成長抑制効果を示した。
【００２３】
用いられた細胞株及び具体的化合物の種類によって変わることはあるが、本発明によるトリアジン誘導体化合物のＩＣ５０値は約１０ｕＭ程度であり、これらの活性濃度は約１乃至１０ｕＭであり、細胞毒性（Cytotoxicity）は約１００ｕＭまで観察されなかった。
【００２４】
本発明の「薬学的に許容可能な塩」とは、毒性がないか少ない酸または塩基で製造された塩を言う。本発明の化合物が相対的に酸性である場合、塩基（base）付加塩は十分な量の希望する塩基と適当な非活性（inert）溶媒で、そのような化合物の中性形態を接触して得ることができる。薬学的に許容可能な塩基付加塩はナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまたは有機アミノからなる塩を含むが、これに限られるのではない。本発明の化合物が相対的に塩基性である場合、酸（acid）付加塩は十分な量の酸と適当な非活性溶媒で、そのような化合物の中性形態を接触して得ることができる。薬学的に許容可能な酸付加塩はプロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、琥珀酸、スベリン（suberic）酸、フマル酸、マンデリック酸（mandelic acid）、フタル酸（phthalic acid）、ベンゼンスルホン酸、ｐ-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、塩酸、臭素酸（bromic acid）、硝酸、炭酸、 炭酸水素（monohydrogencarbonic）、リン酸、リン酸水素、リン酸二水素、硫酸、硫酸水素、ヨウ化水素、亜燐酸などから形成された塩を含むが、これに限られるのではない。また、アルギネート（arginate）などのアミノ酸の塩及びグルクロン酸（glucuronic acid）またはガラクツロン酸（galactunoric acid）などの有機酸の類似物を含むが、これに限られるのではない。
【００２５】
本発明の一部化合物は水化物の形態を含め、溶媒化された形態だけでなく、非-溶媒化された（unsolvated）形態で存在することもできる。本発明の一部化合物は、結晶形または無定形の形態で存在することができ、このようなすべての物理的形態は本発明の範囲に属する。また本発明の一部化合物は、光学中心である非対称炭素原子または二重結合を持つことができて、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体などが存在することができ、これらもまた本発明の範囲に属する。
【００２６】
また、本発明は、本発明によるトリアジン誘導体化合物またはそれの薬学的に許容可能な塩と、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む薬剤学的組成物を提供する。本発明のトリアジン誘導体化合物またはそれの薬学的に許容可能な塩は、単独あるいは便利な運搬体、賦形剤などと混合して投与することができ、そのような投与剤形は単回投与剤形または反復投与剤形であることができる。
【００２７】
本発明の組成物は固形製剤または液状製剤であることができ、固形製剤には散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限られるのではない、固形製剤には賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれるが、これに限られるのではない。液状製剤には水、プロピレングリコール溶液などの溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限られるのではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。
【００２８】
本発明の組成物は治療しなければならない疾患及び個体の状態によって経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入(infusion)、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、トレンスドマル剤、トピカル剤などで投与することができるが、これに限られるのではない。投与経路によって、通常的に使用され且つ非毒性である、薬剤学的に許容される運搬体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形に製剤化することができる。一定時間の間に薬物を持続的に放出することができるデポ（depot）剤形も本発明の範囲に属する。
【００２９】
本発明のトリアジン誘導体化合物またはそれの薬学的に許容可能な塩は、毎日約０.０４ｍｇ/ｋｇ乃至約２０ｍｇ/ｋｇを投与することができ、約０.４ｍｇ/ｋｇ乃至約２ｍｇ/ｋｇの１日投与用量が望ましい。しかし、上記投与量は患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性、使用された化合物などによって多様である。必要に応じて、便宜のために１日の総投与量を分け、一日中に数回に分けて投与することができる。
【００３０】
以下、本発明をより具体的に説明するために、下記実施例などをあげて説明する。しかし、本発明による実施例は多様な形態に変形することができ、本発明の範囲が下記に述べる実施例に限られるのではない。本発明の実施例は、本発明の具体的な理解のために例示的に提供されるのである。
【実施例１】
【００３１】
トリアジン誘導体化合物ライブラリの設計及び合成
トリアジン構造に基づいたトリアジン誘導体化合物ライブラリの設計及び合成は、Ｋｈｅｒｓｏｎｓｋｙ、Ｓ.Ｍ.などが開示した方法（J Am Chem Soc., 125, 11804-11805 (2003)）に基づいて遂行した。簡単に、トリアジン誘導体化合物ライブラリを製造するために固体相方法（solid-phase method）が使われ、３つのビルディングブロック（building block）が分離して製造され、これらは直交で（orthogonally）連結されて１，５３６個の純粋なトリアジン誘導体化合物を生成した。
【００３２】
より具体的には、下記反応式１に示すように、３つのビルディングブロックは、（Ｉ）ＰＡＬ-レジン結合第一級アミン、（ＩＩ）２位置にアミン、アルコールまたはチオールを付加した４、６-ジクロロ-［１、３、５］トリアジン、及び（ＩＩＩ）一連の第一級または第二級アミンである。多様なベンジルアミンを含む第一級アミンが還元的アミノ化（reductive amination）反応を用いてＰＡＬアルデヒドレジンに付着してビルディングブロックＩが生成された。またトリアジン三塩化物（trichloride）に関する最初の置換反応の高反応性を用いて低 親核性（low nucleophilic）反応性を持つアルキル/アリルアルコール、バルキーな（bulky）アミンまたはアニリンを導入してビルディングブロックＩＩが製造された。多様な第一級及び第二級アミンがビルディングブロックＩＩＩとして予め用意された。
【００３３】
予め製造した又は商業的に利用可能な上記ビルディングブロックを用いたこのような簡単な合成プロセスを通じて、本発明のトリアジン誘導体化合物を製造し、製造された全ての化合物はＬＣ-ＭＳで確認され、その純度は全て９８％以上であった。
【００３４】
【化５】
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【００３５】
（ａ）Ｒ１ＮＨ２（５当量）、２％酢酸（acetic acid）のＴＨＦ、室温、１時間、その後、ＮａＢ（ＯＡｃ）３Ｈ（７当量）、室温、１２時間。
（ｂ）ＴＨＦ内Ｒ２Ｒ２'ＮＨ、Ｒ２ＯＨまたはＲ２ＳＨ（１当量）、０℃、１時間。
（ｃ）ＴＨＦ内ビルディングブロックＩＩ（４当量）、ＤＩＥＡ（４当量）、６０℃、３時間。
（ｄ）ＮＭＰ：ｎ-ＢｕＯＨの１：１混合溶媒内Ｒ３Ｒ３'ＮＨ（４当量）、ＤＩＥＡ（４当量）、１２０℃、３時間。
（ｅ）ＤＣＭ内５％ＴＦＡ、１０分。
【００３６】
［実施例２］
細胞培養
ＭＣＦ-７乳癌細胞株（ATCC Number: HTB-22）、ＭＤＡ-ＭＢ-４３５乳癌細胞株（ATCC Number: HTB-129）、ＭＤＡ-Ｎ乳癌細胞株（Wang, J.J., et al., Anticancer Drugs, 15(3), 277-286 (2004)、ＨＣＴ１５大膓癌細胞株（ATCC Number: CCL-225）、ＮＣＩ/ＡＤＲ-ＲＥＳ乳癌細胞株（Ehrlichova, M., et al., Anticancer Res., 25(6B), 4215-4224(2005)）、ＣＡＫＩ-１腎臓癌細胞株（ATCC Number: HTB-46）、ＡＣＨＮ腎臓癌細胞株（ATCC Number: CRL-1611）、ＳＦ２９５脳癌細胞株（Rao, V.K., et al., Cancer Genet Cytogenet, 160(2), 126-133 (2005)）及びＵＯ-３１腎臓癌細胞株（Jansen, A.P., et al., Mol. Cancer Ther., 3(2),103-110 (2004); Chen, Y-L., et al., Eur J Med Chem., 40, 928-934 (2005)）の癌細胞は、３７℃で５％のＣＯ２が含まれた細胞培養基で培養させた。培養及び継代時には１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地で成長させた。
【００３７】
［実施例３−１］
癌細胞を用いたトリアジン誘導体化合物のスクリーニング
凍結乾燥したライブラリ化合物をジメチルスルホキシド（DMSO）に再懸濁して最終濃度が１０ｍＭになるようにした。ライブラリ化合物を添加する一日前に、癌細胞を２４-ウェルプレートに１ｍｌの培養媒質でウェル当たり５×１０４細胞になるように位置させた。全ての化合物を、表示されている最終濃度になるように添加した。全ての実験において、ＤＭＳＯを陰性対照群として使用した。細胞は他の表示がない限り７２時間培養され、細胞生存率はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６水性‐非放射活性細胞増殖分析(aqueous non-radioactive cell proliferation assay）(Promega, Madison, WI, USA）を用いて測定した。
【００３８】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商標）水性‐非放射活性細胞増殖分析は細胞増殖、細胞毒性または化学過敏性（chemosensitivity）分析において生存細胞の数を測定するための均一で比色計的（colorimetric）方法である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６水性分析は、新しいテトラゾリウム化合物（３-(４，５-ジメチルチアゾル-２-イル)-５-(３-カルボキシルメトキシフェニル)-２(４-スルホフェニル)-２Ｈ-テトラゾリウム、内部塩（inner salt）、ＭＴＳ)と、電子カップルリング試薬（phenazine methosulfate, PMS）とで成っている。ＭＴＳは、組織培養媒質内に溶解されるホルマザン（formazan）プロダクトで、細胞によって生還元（bio-reduce）される。このホルマザンプロダクトの４９０ｎｍ吸光度が９６‐ウェル分析プレートから追加的な処理なしに直接測定されることができる。ＭＴＳの水溶性ホルマザンプロダクトへの転換は代謝的に活性な細胞で発見されるジヒドロゲナーゼ酵素によって遂行される。４９０ｎｍ 吸光度の量で測定されるホルマザンプロダクトの量は、培養液中に生きている細胞の数と直接的に比例する。
【００３９】
［実施例３−２］
化合物Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３が乳癌細胞株の生存度（viability）に与える影響に対する評価
ＭＣＦ-７乳癌細胞株にそれぞれの化合物を濃度別に投与した後、乳癌細胞の活性を観察した。ＭＣＦ-７細胞２×１０５個を６ウェルプレートにそれぞれ株分けして成長させた。その後、化合物Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２またはＤａｎ-ＢＣ３を薬剤投与濃度である１０、５０及び１００ｕＭになるように希釈して癌細胞に濃度別に２日間処理した後、細胞生存度を薬剤を処置していない群と比較測定した。その結果を図１および図２に示した。
【００４０】
図１に、前記３つの化合物がＭＣＦ‐７乳癌細胞の成長を抑制することを見せる写真（200倍拡大）を示した。図１に示すように、Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３のすべてにおいて、１０ｕＭ濃度では細胞成長抑制効果が弱く、５０ｕＭ濃度では明らかな細胞成長抑制効果が確認できなかったが、１００ｕＭ濃度では細胞の死滅効果を肉眼で容易に確認することができた。従って、各トリアジン誘導体化合物の投与濃度を１００ｕＭに決めて後続実験を行った。
【００４１】
図２に、ＭＣＦ‐７乳癌細胞を上記３つの化合物１００ｕＭで処理した後、成長抑制程度を示した。乳癌細胞に対するＤａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の成長抑制効果をみると、Ｄａｎ-ＢＣ３は、１００ｕＭ投与後、薬剤を投与していない乳癌細胞株に比べて投与後１２時間目には約６０％が生存し、２４時間目には薬剤を投与していない乳癌細胞株に比べて約３７％だけが生存し、３６時間目には約７％、４８時間目にはすべての細胞が死滅になった。
【００４２】
Ｄａｎ-ＢＣ１は、１００ｕＭ投与後、薬剤を投与していない乳癌細胞株に比べて投与後１２時間目には約６８％が生存し、２４時間目には薬剤を投与していない乳癌細胞株に比べて約３７％だけが生存し、３６時間目には約２７％、４８時間目にはすべての細胞が死滅した。
【００４３】
Ｄａｎ-ＢＣ２は、１００ｕＭ投与後、薬剤を投与していない乳癌細胞株に比べて投与後１２時間目には約７５％が生存し、２４時間目には薬剤を投与していない乳癌細胞株に比べて約４９％だけが生存し、３６時間目には約３３％、４８時間目には２０％だけが生存した。
【００４４】
［実施例４−１］
ヌードマウスにおける乳癌腫瘤の形成及び試験化合物に対する評価
ヌードマウスでＭＣＦ-７腫瘍細胞の腫瘍形成能力を測定するために、生後４-５週齢の雌ヌードマウス（BALB/c係 athymic nu/nu）３０匹を対象にしてトリパンブルー（trypan blue）色素排除（dye exclusion）検査上細胞生存度が９５％以上である５×１０６個のＭＣＦ-７腫瘍細胞を２００ｕｌのＰＢＳに混ぜて皮下部位に接種し、２週齢から２ヶ月齢まで成長させた後に形成された腫瘍の直径が１０‐２５ｍｍ以上になったときに試験化合物の投与を始めた。
【００４５】
試験化合物は腫瘍の大きさの測定日から２日後に投与し始め、一週間間隔で投与した。この際、最初の投与濃度は各々５００ｕＭにした。試験化合物が投与されていない腫瘍が形成されたヌードマウスの写真を図３に示しており、腫瘍の大きさは長径２５ｍｍ、短径２０ｍｍ、高さ１５ｍｍ、体重２７ｇであった。
【００４６】
［実施例４−２］
各化合物の生体内の乳癌抑制効果に対する評価
実施例４−１と同様にヌードマウスに乳癌を形成させた後、本発明によるトリアジン誘導体化合物であるＤａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３を投与して、腫瘤の大きさの変化を観察した。化合物Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３を５００ｕＭずつ２回投与した後、同時間が経た上記実施例４−１の陰性対照群の乳癌腫瘤の大きさ（長径２５ｍｍ、短径２０ｍｍ、高さ１５ｍｍ）と比べた結果、化合物Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３投与後の腫瘤の大きさは、それぞれ下記表１、２及び３に記載のように減少していたので、ヌードマウスの生体内に形成された乳癌に対する本発明のトリアジン誘導体化合物の強力な抗癌効果を確認することができた。それぞれの写真を図４、５及び６に示した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
【表２】
2009542635.tif 000009
【００４９】
【表３】
2009542635.tif 000010
【００５０】
上記表１、２及び３の結果を総合して図７に示した。図７に示すように、ヌードマウスにおける、各化合物の、乳癌細胞に対する死滅効果は、化合物Ｄａｎ-ＢＣ１が一番高く、次は化合物Ｄａｎ-ＢＣ３、そして化合物Ｄａｎ-ＢＣ２の順で抗癌効果を示した。
【００５１】
［実施例５−１］
癌形成形質転換動物モデルを利用した Ｄａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の抗癌効果に対する評価
哺乳動物で過発現されて癌を誘発するヒト癌原遺伝子に形質転換されたマウスを利用して本発明による化合物であるＤａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の抗癌効果を評価した。
【００５２】
マウスを形質転換させるために用いられた細胞株は腫瘍形成能を持っているため、哺乳動物に移植される場合、触知性腫瘍（palpable tumor）のような癌腫を形成する。本実験に用いられた細胞株はヒト癌原遺伝子（以下、HCCR-1）を過発現して多量のＨＣＣＲ‐１タンパク質を生成し、このタンパク質が、癌と関連があると報告されているＤ５２タンパク質（GenBank 登録番号 NM003288）（Byrne, J.A. et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); 及び Bryne, J.A. et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998) 参照）と相互作用し、タンパク質キナーゼＣ及びテロメラーゼを活性化させ、細胞周期のチェックポイント調節機能を失うようにし、ｅｇｒ-１遺伝子の発現を下向き調節する過程を経て悪性腫瘍に転換する。特に、この過程で細胞周期調節に係わる腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現が増加されるが、生成されたｐ５３タンパク質のたいていが不活性化されることによって腫瘍抑制機能を果せず、悪性腫瘍に転換されたと思われる。
【００５３】
すなわち、ＨＣＣＲ-１は、上位段階（upstream level）で腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の機能を不活性化させると思われる（韓国特許登録番号第426452号「ヒト癌原遺伝子に形質転換された哺乳動物及びその遺伝子を用いた乳癌、腎臓癌、卵巣癌または胃癌の診断用キット」、及び、韓国特許登録番号第367978号「ヒト子宮頸部癌１癌原遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質」参照）。
【００５４】
従って、このような形質転換哺乳動物はヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ-１を過発現して癌を形成するため、抗癌性物質の探索などに有用に用いることができ、特に乳癌、腎臓癌、卵巣癌または胃癌に効果的な薬物のスクリーニングに有用である。
【００５５】
癌形成形質転換雌マウスで自然に形成された乳癌に、本発明による化合物であるＤａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３を各々１００ｕＭずつ一週間間隔で投与した後、腫瘍抑制効果を観察し、各々の結果を図８、９及び１０に示し、各々の結果を総合して図１１にグラフで示した。
【００５６】
図８に示すように、乳癌が自然発生した形質転換マウスに化合物Ｄａｎ-ＢＣ１を１００ｕＭずつ２回投与した。化合物Ｄａｎ-ＢＣ１の場合、１回投与だけでも乳癌の消失を誘導し、よって、化合物Ｄａｎ-ＢＣ１は乳癌形質転換マウスの生体内に形成された乳癌に対する強力な抗癌効果を示した。
【００５７】
図９に示すように、乳癌が自然発生した形質転換マウスに化合物Ｄａｎ‐ＢＣ２の１００ｕＭを１回投与した後、乳癌は消失された。Ｄａｎ-ＢＣ２の場合、１回投与だけでも乳癌の消失を誘導したが、２次注射時には再度腫瘍の形成が誘導された。化合物Ｄａｎ-ＢＣ２は乳癌形質転換マウスの生体内に形成された乳癌に対する抗癌効果を示した。
【００５８】
図１０に示すように、乳癌が自然発生した形質転換マウスに化合物Ｄａｎ-ＢＣ３の１００ｕＭを１回投与した後、乳癌は消失された。Ｄａｎ-ＢＣ３の場合、１回投与だけでも乳癌の消失を誘導したが、２次注射時には再度腫瘍の形成が誘導された。化合物Ｄａｎ-ＢＣ３は乳癌形質転換マウスの生体内に形成された乳癌に対する抗癌効果を示した。
【００５９】
以上の結果を総合して図１１に示した。図１１に示すように、癌形成形質転換動物モデルにおいて本発明によるトリアジン誘導体化合物であるＤａｎ-ＢＣ１、Ｄａｎ-ＢＣ２及びＤａｎ-ＢＣ３の中でＤａｎ-ＢＣ１の効果が一番優れており、次はＤａｎ-ＢＣ３、そしてＤａｎ-ＢＣ２の順で効果に差があった。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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