(57)【要約】Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）および牛ウィルス性下痢症ウィルス（ＢＶＤＶ）感染症などのウィルス感染症は、小胞体（ＥＲ）膜中に直接、ｐＨ感受性リポソームを送達することにより処置することができる。例示的な２種のリポソーム製剤は、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（ＤＣリポソーム）およびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ＰＥＧ−ＰＥ（ＤＣＰＰリポソーム）である。ＤＣおよびＤＣＰＰリポソームは、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）の細胞内送達を最適化し、その結果、このイミノ糖のインビボ活性を数桁増大させることができ、しかもインターフェロンおよび／またはリバビリンなどの他の治療剤と併用することができた。直接ＥＲ中へのＮＢ−ＤＮＪの最適化放出は、ＮＢ−ＤＮＪが有効な抗ウィルス剤であることが知られている、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）などの他のウィルスの処置にも適用することができる。
2009545621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルス感染症を処置する方法であって、
（ａ）ＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳの脂質を含んだリポソームと、
（ｂ）リポソーム中に封入された１種または複数の化合物と
を含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、
ウィルス感染症が、ＥＲ膜出芽ウィルス感染症または原形質膜出芽ウィルス感染症であり、
１種または複数の化合物が、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）を含み、前記投与が、該感染症を起こすウィルスに感染している細胞の小胞体中に、１種または複数の化合物を送達し、細胞の小胞体膜中にリポソームの１種または複数の脂質を組み込む方法。
【請求項２】
前記感染症がＥＲ膜出芽ウィルス感染症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記感染症がＨＢＶ、ＨＣＶまたはＢＶＤＶ感染症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記感染症が原形質膜出芽ウィルス感染症である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記感染症がＨＩＶ感染症である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リポソームがＤＣリポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リポソームがＤＣＰＰリポソームである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リポソームがＰＩ脂質を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が５〜５０％である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が１０〜３０％である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１種または複数の前記化合物が、ヌクレオシド／ヌクレオチド抗ウィルス剤、免疫賦活／免疫調節剤、またはそれらの組合せを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオシド／ヌクレオチド抗ウィルス剤がリバビリンであり、免疫賦活／免疫調節剤がインターフェロンαである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種または複数の前記化合物が、少なくとも１種の抗ＨＩＶ化合物を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ウィルス感染症を処置する方法であって、
（ａ）ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＰＥＧ−ＰＥの脂質を含んだリポソームと、
（ｂ）リポソーム中に封入された１種または複数の化合物と
を含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、
１種または複数の化合物が、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）を含む方法。
【請求項１７】
前記ウィルスが肝炎ウィルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウィルスがＢ型肝炎ウィルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウィルスがＣ型肝炎ウィルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウィルスがＢＶＤＶウィルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウィルスがＢＶＤＶウィルスのｎｃｐ株である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウィルスがＢＶＤＶウィルスのｃｐ株である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
１種または複数の前記化合物が、ヌクレオシド／ヌクレオチド抗ウィルス剤、免疫賦活／免疫調節剤、またはそれらの組合せを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ヌクレオシド／ヌクレオチド抗ウィルス剤がリバビリンであり、免疫賦活／免疫調節剤がインターフェロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウィルスがＨＩＶウィルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＩＶウィルスが、９２ＵＧ０３７、９２ＲＷ０２１、ＪＲ−ＦＬ、９２ＨＴ５９９、８９．６、９３ＩＮ１０１、９７ＵＳＮＧ３０、９２ＵＧ０２１、９２ＵＧ０４６および９３ＢＲ０２０の初代ＨＩＶ−１分離株からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１種または複数の前記化合物が、１種または複数の抗ＨＩＶ剤を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）ｐＨ感受性リポソームと、（ｂ）リポソーム内部に封入された抗原とを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、前記投与が、抗原提示細胞の主要組織適合性分子クラス１による抗原提示を増加させる方法。
【請求項３０】
前記抗原が免疫増強ペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチドがＹＭＤＧＴＭＳＱＶペプチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ＨＩＶ感染症を処置する方法であって、
ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体標的指向部と結合したリポソームを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記標的指向部がｓＣＤ４分子を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的指向部がモノクローナル抗体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がＩｇＧ  ２Ｆ５またはＩｇＧ  ｂ１２抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＨＩＶ感染症が、９２ＵＧ０３７、９２ＲＷ０２１、ＪＲ−ＦＬ、９２ＨＴ５９９、８９．６、９３ＩＮ１０１、９７ＵＳＮＧ３０、９２ＵＧ０２１、９２ＵＧ０４６および９３ＢＲ０２０の初代ＨＩＶ−１分離株からなる群から選択される、ＨＩＶ−１初代分離株により起こされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記リポソームがＭＣＣ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記リポソームがＰＩ脂質を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、リポソーム内部に封入されたαグルコシダーゼ阻害剤を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記阻害剤がＮＢ−ＤＮＪを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＰＥＧ−ＰＥの脂質を含んだリポソームと、
リポソーム内部に封入されたＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）と
を含む組成物。
【請求項４８】
前記リポソームがＤＣＰＰリポソームである、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
ヌクレオシド／ヌクレオチド抗ウィルス剤、免疫賦活／免疫調節剤、またはそれらの組合せを更に含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
ヌクレオシド／ヌクレオチド抗ウィルス剤がリバビリンであり、免疫賦活／免疫調節剤がインターフェロンである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
１種または複数の抗ＨＩＶ剤を更に含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５２】
ｐＨ感受性リポソームと、リポソーム内部に封入された抗原とを含む組成物。
【請求項５３】
前記抗原が免疫増強ペプチドを含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記リポソームがＰＩ脂質を更に含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体標的指向部と結合したリポソームを含む組成物。
【請求項５８】
前記標的指向部がｓＣＤ４分子を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記標的指向部がモノクローナル抗体を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６０】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６１】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記リポソームがＭＣＣ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記リポソームがＰＩ脂質を更に含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が約１０〜約３０％である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
リポソーム内部に封入されたαグルコシダーゼ阻害剤を更に含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６６】
αグルコシダーゼ阻害剤がＮＢ−ＤＮＪを含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
ウィルス感染症を処置する方法であって、
（ａ）ＰＩ脂質を含んだリポソームと、
（ｂ）リポソーム中に封入された少なくとも１種の抗ウィルス化合物と
を含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、
ウィルス感染症が、ＥＲ膜ウィルス出芽感染症であり、
前記接触が、該感染症を起こすウィルスに感染している細胞の小胞体中に、少なくとも１種の化合物を送達し、細胞の小胞体膜中にリポソームの１種または複数の脂質を組み込む方法。
【請求項６８】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を更に含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が５〜５０％である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が１０〜３０％である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１種の前記抗ウィルス化合物がαグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
αグルコシダーゼ阻害剤がＮＢ−ＤＮＪを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記宿主がヒトである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
ＰＩ脂質を含んだリポソームと、
リポソーム中に封入された少なくとも１種の抗ウィルス化合物と
を含む組成物。
【請求項７５】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を更に含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が５〜５０％である、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７７】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が１０〜３０％である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
少なくとも１種の前記抗ウィルス化合物がαグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７９】
αグルコシダーゼ阻害剤がＮＢ−ＤＮＪを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
ウィルス感染症を処置する方法であって、
（ａ）ＰＩ脂質を含んだリポソームと、
（ｂ）リポソームの脂質層中に挿入された少なくとも１種の抗ウィルスタンパク質と
を含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、
前記接触が、該感染症を起こすウィルスに感染している細胞の小胞体膜中にリポソームの１種または複数の脂質を組み込む方法。
【請求項８１】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を更に含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が５〜５０％である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
ＰＩ脂質のモル濃度が１０〜３０％である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記組成物が、（ｃ）リポソーム中に封入された少なくとも１種の抗ウィルス化合物を更に含み、前記接触が、細胞の小胞体中に少なくとも１種の該化合物を送達する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも１種の前記抗ウィルス化合物がαグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
αグルコシダーゼ阻害剤がＮＢ−ＤＮＪを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
少なくとも１種の前記抗ウィルスタンパク質が、ウィルス受容体、変異型ウィルスエンベロープタンパク質、およびウィルスエンベロープの相互作用を妨害するタンパク質からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
前記ウィルス感染症がＥＲ膜出芽ウィルス感染症である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
ＥＲ膜出芽ウィルス感染症が、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＢＶＤＶ感染症である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記感染症が原形質膜出芽感染症である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
原形質膜出芽感染症がＨＩＶ感染症である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象がヒトである、請求項８０に記載の方法。
【請求項９４】
（ａ）ＰＩ脂質を含んだリポソームと、
（ｂ）リポソームの脂質層中に挿入された少なくとも１種の抗ウィルスタンパク質と
を含む組成物。
【請求項９５】
前記リポソームがＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を更に含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記リポソームがＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度が５〜５０％である、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９８】
ＰＩ脂質のモル濃度が１０〜３０％である、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
（ｃ）リポソーム中に封入された少なくとも１種の抗ウィルス化合物を更に含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項１００】
少なくとも１種の前記抗ウィルス化合物がαグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
αグルコシダーゼ阻害剤がＮＢ−ＤＮＪを含む、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
少なくとも１種の前記抗ウィルスタンパク質が、ウィルス受容体、変異型ウィルスエンベロープタンパク質、およびウィルスエンベロープの相互作用を妨害するタンパク質からなる群から選択される、請求項９４に記載の組成物。
【請求項１０３】
ＰＩ脂質を含んだリポソームと、
リポソーム内部に封入された少なくとも１種の治療剤と
を含む組成物。
【請求項１０４】
生理的病状を処置または予防する方法であって、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入された少なくとも１種の治療剤とを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１０５】
ＰＩ脂質を含んだリポソームと、
リポソームの脂質二重層中に挿入された少なくとも１種のタンパク質と
を含む組成物。
【請求項１０６】
生理的病状を処置または予防する方法であって、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソームの脂質二重層中に挿入された少なくとも１種のタンパク質とを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、共にその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００６年８月２日出願のＤｗｅｋ他への米国仮出願第６０／８３４７９７号および２００６年９月２２日出願のＤｗｅｋ他への同第６０／８４６３４４号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本願は、一般に、ウィルス感染症を処置する方法および組成物、ならびにより具体的には、リポソームを利用してウィルス感染症を処置する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎ウィルス。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ、ＨｅｐＢ）は、肝線維症、肝硬変、炎症性肝疾患、および一部の患者に死をもたらす恐れのある肝臓癌を含めた急性および慢性肝疾患の病原体である。例えば、Joklik, Wolfgang K., Virology, Third Edition, Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1988 (ISBN 0-8385-9462-X)を参照されたい。有効なワクチンは入手できるが、全世界で２億８千万強の人々、即ち世界人口の５％が、このウィルスになお慢性的に感染している。例えば、Locarnini, S. A., et. al., Antiviral Chemistry & Chemotherapy (1996) 7(2):53-64を参照されたい。このようなワクチンは、このウィルスに既に感染している人々には治療価値がない。欧州および北米では、人口の０．１％〜１％が感染している。感染している個人の１５％〜２０％が、ＨＢＶ感染から肝硬変または原因の別の慢性障害を発症すると推定されている。肝硬変が一旦定着すると、罹患率および死亡率は多大であり、患者の存命期間は約５年である。例えば、Blume, H., E., et. al., Advanced Drug Delivery Reviews (1995) 17:321-331を参照されたい。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウィルス。全世界で約１億７千万の人々、即ち世界人口の３％（例えば、WHO, J. Viral. Hepat. 1999; 6: 35-47を参照されたい）、および米国内で約４百万の人々が、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ、ＨｅｐＣ）に感染している。ＨＣＶに急性感染している個人の約８０％は、慢性感染症になる。したがって、ＨＣＶは慢性肝炎の主因である。一旦慢性感染症になると、処置せずにこのウィルスが一掃されることは殆どない。稀な症例では、ＨＣＶ感染が、臨床的に急性の疾患および肝不全さえ起こす。慢性ＨＣＶ感染症は個人間の差が激しいことがあり、一部の人々は、臨床的にさほどのことがない、または僅かな肝疾患に罹り、合併症を発現することはなかろうが、他の人々は、臨床的に明白な慢性肝炎に罹ると見込まれ、肝硬変の発現に進行する恐れがある。肝硬変を発症することが確かなＨＣＶ保有者の約２０％は、末期の肝疾患を発症し、原発性肝臓癌発症の危険性が高まろう。
【０００５】
単独使用またはリバビリンとの併用のインターフェロンなどの抗ウィルス薬は、患者の８０％までに有効である（Di Bisceglie, A. M, and Hoofnagle, J. H. 2002, Hepatology 36, S121-S127）が、多くの患者はこの種の併用療法に耐えられない。
【０００６】
牛ウィルス性下痢症ウィルス。牛ウィルス性下痢症ウィルス（ＢＶＤＶ）は、世界的に分布しており、大部分の畜牛集団に蔓延している。ＢＶＤＶは、ＨＣＶの組織培養代用物としても汎用される。ＢＶＤＶには２つのウィルスバイオタイプ、非細胞変性型（ｎｃｐ）および細胞変性型（ｃｐ）が存在する。ウィルスバイオタイプの分類は、培養細胞における細胞変性作用に基づいており、病原性とは関係ない。ｎｃｐ  ＢＶＤＶは畜牛において一般的であるが、ｃｐバイオタイプは比較的稀であり、特定の変異事象がウィルスゲノム中に起こった後のｎｃｐ株から生じる。組織培養におけるｃｐ  ＢＶＤＶ株による細胞の感染は、細胞単層上でのアポトーシス細胞集合体（プラーク）の形成を特徴とし、それは顕微鏡で容易にモニターすることができる。
【０００７】
ヒト免疫不全ウィルス。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連障害の病原体である。ＨＩＶには少なくとも２種の異なるタイプ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が存在する。更に、こうしたタイプ各々の集団内に遺伝的異質性が多量に存在する。ＡＩＤＳ流行の開始以来、およそ２千万人が死んでおり、現在４千万人がＨＩＶ−１／ＡＩＤＳに罹って生活しており、世界全体で毎日１万４千人が感染すると推定されている。
【０００８】
少なくとも利用可能な人たちにとって、生活の質、量共に大いに改善してきた多数の抗ウィルス治療剤および診断有効剤が、開発されてきた。こうした薬物の大部分は、逆転写、プロテアーゼ活性などのウィルスのタンパク質または過程を妨害する。遺憾ながら、こうした処置剤が感染を消失させることはなく、多くの治療剤の副作用は重く、薬物耐性ＨＩＶ株が、現在使用されている抗ウィルス剤全種に対して存在する。
【０００９】
治療剤としてのＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）。別名Ｎ−ブチル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールのＮＢ−ＤＮＪは、ＥＲグルコシダーゼＩおよびＩＩによるプロセシングを阻害し、とりわけ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、およびＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスなどの肝炎ウィルス、牛ウィルス性下痢症ウィルスの糖タンパク質の異常折畳みおよび／またはＥＲ保持を起こすことにより、有効な抗ウィルス剤であることが示されている。ＮＢ−ＤＮＪおよび他のＮ置換デオキシノジリマイシン誘導体の合成法は、例えば、米国特許第５６２２９７２号、第４２４６３４５号、第４２６６０２５号、第４４０５７１４号および第４８０６６５０号に記載されている。ＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス作用は、例えば、肝炎ウィルスに対しては米国特許第６４６５４８７号、第６５４５０２１号、第６６８９７５９号、第６８０９０８３号に、ＨＩＶウィルスに対しては米国特許第４８４９４３０号に考察されている。
【００１０】
ＮＢ−ＤＮＪなどのグルコシダーゼ阻害剤は、細胞培養においても、ウッドチャック動物モデルを使用してもＨＢＶ感染の処置に有効であることが示されている。例えば、T. Block, X. Lu, A. S. Mehta, B. S. Blumberg, B. Tennant, M. Ebling, B. Korba, D. M. Lansky, G. S. Jacob & R. A. Dwek, Nat. Med. 1998 May;4(5):610-4を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪは、ＨＢＶ粒子の分泌を抑制し、ＨＢＶ  ＤＮＡの細胞内保持を起こす。
【００１１】
ＮＢ−ＤＮＪは、ＨＣＶの細胞培養モデルであるＢＶＤＶに対する強力な抗ウィルス剤であることが示されている。例えば、Branza-Nichita N, Durantel D, Carrouee-Durantel S, Dwek RA, Zitzmann N., J. Virol., 2001 April; 75(8):3527-36; Durantel, D., et al, J. Virol., 2001, 75, 8987-8998; N. Zitzmann, et al, PNAS, 1999, 96, 11878-11882を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪによる処置は、ウィルス子孫の感染性を低下させるが、分泌ウィルスの実数にはそれほどの効果がない。
【００１２】
ＮＢ−ＤＮＪは、ＨＩＶに対する抗ウィルス剤であることが示されており、処置によって、ＨＩＶ感染細胞から放出されるウィルス粒子の個数に相対的に小さな作用を起こすが、感染性ウィルスの量を著しく減少させる。例えば、P.B. Fischer, M. Collin, et al (1995), J. Virol. 69(9): 5791-7; P.B. Fischer, G.B. Karlsson, T. Butters, R. Dwek and F. Platt, J. Virol. 70(1996a), pp. 7143-7152, P.B. Fischer, G.B. Karlsson, R. Dwek and F. Platt, J. Virol. 70(1996b), pp. 7153-7160を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪに関する臨床試験がＨＩＶ−１感染患者において行われ、その結果、抗ウィルス活性に必要な濃度が高過ぎて、患者に重度の副作用を起こすことが示された。例えば、Fischl M.A., Resnick L., Coombs R., Kremer A.B., Pottage J.C.Jr, Fass R.J., Fife K.H., Powderly W.G., Collier A.C., Aspinall R.L., et. al., J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1994 Feb; 7(2):139-47を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪ処置に対して耐性な変異ＨＩＶ株は、現在のところ存在しない。
【００１３】
ＥＲタンパク質折畳みならびにグルコシダーゼＩおよびＩＩ。グルコシダーゼ阻害により示される抗ウィルス作用は、主にカルネキシン／カルレチキュリンサイクルへの進入を遮断することによる、ＥＲ内でのウィルス糖タンパク質の異常折畳みまたは保持の結果であると考えられている。成長ポリペプチド鎖中のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列へトリグルコシル化オリゴ糖（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が移行した後、成熟糖鎖単位への更なるプロセシングが起こり得る前に、α連結グルコース残基３個を放出することが必要である。その上、カルネキシン／カルレチキュリンサイクルへ進入できるように、外側２個のグルコース残基が、適切に折り畳めるように切り取られなければならない。例えば、Bergeron, J.J. et. al., Trends Biochem. Sci., 1994, 19, 124-128; Peterson, J. R. et. al., Mol. Biol. Cell, 1995, 6, 1173-1184を参照されたい。開始プロセシングは、内腔状配向の触媒ドメインを有し、α１−２連結グルコース残基を特異的に切断するＥＲ配置内在性膜酵素（グルコシダーゼＩ）に作用され、この後、α１−３連結グルコース成分の両者を放出するグルコシダーゼＩＩの作用を受ける。
【００１４】
リポソーム。リポソームは、分子障壁として作用する細胞膜を迂回することにより、細胞内へ直接水溶性化合物を送達することができる。ｐＨ感受性リポソーム製剤は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）またはその誘導体（例えば、ＤＯＰＥ）と、中性ｐＨで安定剤として作用できる酸性基含有化合物との組合せを含むことができる。コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）は、そのコレステロール基が、他の両親媒性安定剤と比較して、インビボでＰＥ含有小胞に高い安定性を付与するので、良好な安定化分子となり得る。リポソーム媒介送達のインビボ効果は、薬物動態および生体内分布に影響し得る血清成分（オプソニン）との相互作用に強く依存することができる。ｐＨ感受性リポソームは、血液循環系から急速に除去され、肝臓および脾臓中に蓄積できるが、共役結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有する脂質を包含すると、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム上の正味負電荷を安定化させることにより、細網内皮系（ＲＥＳ）による除去を克服し、長い循環時間に至ることができる。ＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳおよびＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳ−ＰＥＧ−ＰＥの各リポソームおよびそれらの調製法は、例えば、共にその全体が参照により本明細書に組み込まれるV.A. Slepushkin, S. Simoes, P. Dazin, M.S. Newman, L.S. Guo and M.C.P. de Lima, J. Biol. Chem. 272(1997) 2382-2388およびS. Simoes, V. Slepushkin, N. Duzgunes and M.C. Pedroso de Lima, Biomembranes 1515 (2001) 23-37に記載されている。
【００１５】
ＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳ（モル比６：４）中に封入されたＮＢ−ＤＮＪの送達は、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１２４１６０号に開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一実施形態は、ウィルス感染症を処置する方法であって、（ａ）ＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳの各脂質を含んだリポソームと、（ｂ）リポソーム中に封入された１種または複数の治療剤とを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、ウィルス感染症が、ＥＲ膜出芽ウィルス感染症または原形質膜出芽ウィルス感染症であり、１種または複数の治療剤がＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）を含み、前記投与が、該感染症を起こすウィルスに感染している細胞の小胞体中に、１種または複数の治療剤を送達し、細胞の小胞体膜中にリポソームの１種または複数の脂質を組み込む方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、ウィルス感染症を処置する方法であって、（ａ）ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＰＥＧ−ＰＥの各脂質を含んだリポソームと、（ｂ）リポソーム中に封入された１種または複数の治療剤とを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む方法を提供する。１種または複数の治療剤は、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）を含むことができる。
【００１８】
更に別の実施形態は、（ａ）ｐＨ感受性リポソームと、（ｂ）リポソーム内部に封入された抗原とを含む組成物を投与することを、それを必要とする宿主に含み、前記投与が、抗原提示細胞の主要組織適合性分子クラス１による抗原提示を増加させる方法を提供する。
【００１９】
更に別の実施形態は、ＨＩＶ感染症を処置する方法であって、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体標的指向部と結合したリポソームを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
また更に別の実施形態は、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＰＥＧ−ＰＥの各脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入されたＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）などの少なくとも１種の治療剤とを含む組成物である。
【００２１】
また更に別の実施形態は、ｐＨ感受性リポソームと、リポソーム内部に封入された抗原とを含む組成物である。
【００２２】
また更に別の実施形態は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体標的指向部と結合したリポソームを含む組成物である。
【００２３】
また更に、別の実施形態によれば、ウィルス感染症を処置または予防する方法は、（ａ）ＰＩ脂質を含んだリポソームと、（ｂ）リポソーム中に封入された少なくとも１種の抗ウィルス治療剤とを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与し、前記接触が、該感染症を起こすウィルスに感染している細胞のＥＲ内腔中に、少なくとも１種の該治療剤を送達し、細胞のＥＲ膜中にリポソームの１種または複数の脂質を組み込むことを含む。
【００２４】
また更に、別の実施形態によれば、ある組成物が、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入された少なくとも１種の抗ウィルス治療剤とを含む。
【００２５】
また更に別の実施形態は、ウィルス感染症を処置する方法であって、（ａ）ＰＩ脂質を含んだリポソームと、（ｂ）リポソームの脂質層中に挿入された少なくとも１種の抗ウィルスタンパク質とを含む組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含み、前記接触が、該感染症を起こすウィルスに感染している細胞の小胞体膜中に、リポソームの１種または複数の脂質を組み込む方法である。
【００２６】
また更に別の実施形態は、（ａ）ＰＩ脂質を含んだリポソームと、（ｂ）リポソームの脂質層中に挿入された少なくとも１種の抗ウィルスタンパク質とを含む組成物である。
【００２７】
また更に別の実施形態は、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入された少なくとも１種の治療剤とを含む組成物である。
【００２８】
また更に別の実施形態は、生理的病状を処置または予防する方法であって、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入された少なくとも１種の治療剤とを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
【００２９】
また更に別の実施形態は、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソームの脂質二重層中に挿入された少なくとも１種のタンパク質とを含む組成物である。
【００３０】
また更に別の実施形態は、生理的病状を処置または予防する方法であって、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソームの脂質二重層中に挿入された少なくとも１種のタンパク質とを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＤＣＰＰ−Ｒｈリポソームを介した送達後の脱消光カルセインおよび蛍光標識脂質（Ｒｈ−ＰＥ）の小胞体（ＥＲ）局在性を示す図である。
【図２】ＣＨＯおよびＭＤＢＫ細胞におけるＤＣＰＰリポソームの毒性を示す図である。ＰＢＳを封入したＤＣＰＰリポソームを、０〜５００μＭの範囲の最終脂質濃度にしてＣＨＯ細胞に添加し、０〜１５０μＭの範囲の濃度にしてＭＤＢＫ細胞に添加した。細胞およびリポソームを５日間インキュベートしておいた後、細胞生存率をトリパンブルー染色で測定した。その結果は、非処理対照と比較した生存細胞の比率（％）として提示している。
【図３】デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）およびＮ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）の各化合物を封入した場合の、ＣＨＯ細胞におけるＤＣＰＰ−Ｒｈリポソームの取込みおよび細胞内カルセインの脱消光を示すプロットである。ＤＣＰＰ−Ｒｈリポソームは、２段階の濃度で各化合物を封入して調製した。細胞膜中へのＲｈ−ＰＥの組込みで測定したリポソーム取込み、および細胞内放出の測定値であるカルセイン脱消光は、新鮮培地におけるリポソームの５分間パルスおよび３０分間追跡の後に決定した。
【図４】各種ＤＮＪ分子を含有するＤＣＰＰリポソームのｐＨ感受性を示す図である。
【図５】ＮＢ−ＤＮＪによる処理：遊離状態送達対ＤＣＰＰリポソーム媒介送達の後のＢＶＤＶ分泌を示すプロットである。培地中に遊離状態で、または最終脂質濃度５０μＭのリポソームを介して添加したＮＢ−ＤＮＪによる処理中における、感染ＭＤＢＫ細胞からのＢＶＤＶ粒子の分泌を、３日間のインキュベーション後にリアルタイムＰＣＲで決定した。その結果は、リアルタイムＰＣＲで検出し、非処理対照と比較したＲＮＡコピー数の比率（％）として提示してある。
【図６】ｎｃｐ  ＢＶＤＶ感染性に対するＮＢ−ＤＮＪの効果を遊離状態送達対ＤＣＰＰリポソーム媒介送達として示す図である。培地中に遊離状態で、または最終脂質濃度５０μＭのリポソームを介して添加したＮＢ−ＤＮＪの存在下、感染ＭＤＢＫ細胞が産生したｎｃｐ  ＢＶＤＶ粒子の感染性を、ナイーブＭＤＢＫ細胞との３日間のインキュベーションにより測定した。感染細胞は、対照としてＤＡＰＩ逆染色を用いて、ＭＤＢＫ細胞中に存在するＢＶＤＶ非構造タンパク質の免疫蛍光染色により検出した。ＢＶＤＶ分泌のデータ（図２）を用いて最終的感染率（％）の計算を規格化した。
【図７】ｃｐ  ＢＶＤＶに対するＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス作用を遊離状態送達対ＤＣリポソーム媒介送達として示す図である。遊離した、またはＤＣリポソームに封入したＮＢ−ＤＮＪの存在下、ｃｐ  ＢＶＤＶで感染したＭＤＢＫ細胞を３日間増殖させた。分泌ウィルスを含有する上清を用いてナイーブＭＤＢＫを感染させた。３日後、生成したプラークを顕微鏡下で計数した（収率アッセイ）。
【図８】ＮＢ−ＤＮＪ存在下における、発現したＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０に関するグリカンプロセシングの阻害を、遊離状態送達対ＤＣＰＰリポソーム媒介送達として示す図である。可溶型ｇｐ１２０を発現するＣＨＯ細胞を、培地中に遊離状態で、または最終脂質濃度１００μＭのリポソームを介して添加したＮＢ−ＤＮＪと共にインキュベートした。ＥＲグルコシダーゼによるグルコース切取りの阻害で決定したＮＢ−ＤＮＪ活性は、捕捉ＥＬＩＳＡにおけるＮＢ−ＤＮＪ処理ｇｐ１２０へのモノクローナル抗体２Ｇ１２およびｂ１２の結合により測定した。
【図９】（Ａ〜Ｃ）８種の異なるＨＩＶ−１初代分離株に対する遊離ＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス作用を示す図である。図９Ａは、様々な濃度のＮＢ−ＤＮＪで４週間に亘り処理した８種の分離株のｐ２４分泌平均値を示す。エラーバーは、各処理に対する分離株間の標準偏差を示す。図９Ｂは、０〜１ｍＭの濃度範囲の遊離ＮＢ−ＤＮＪで当初処理した後の各初代分離株の分泌を示す。図９Ｃは、３週間処理した後のＮＢ−ＤＮＪに対する個々の初代分離株の感受性を示す。全ての値は非処理対照に対する比率（％）として表示し、データは、独立した２回の実験の３重試料から得た平均値を表す。各処理に対する近似的なＩＣ５０およびＩＣ９０は、グラフを横切る灰色（点）直線で示す。
【図１０】（Ａ〜Ｈ）８種のＨＩＶ−１初代分離株に対して、リポソームがＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス活性を高める様子を示すデータを表す図である。各分離株で感染した（グラフＡ〜Ｈで表した）ＰＢＭＣを、様々な濃度でＮＢ−ＤＮＪを封入するリポソーム（Ｌ）で４週間に亘り処理した。培地中に遊離するＮＢ−ＤＮＪ５００μＭによる処理（Ｆ）を、抗ウィルス活性の基準として示す。説明書きは、各処理のＮＢ−ＤＮＪの最終濃度を示す。全ての値は非処理対照に対する比率（％）として表示し、データは、独立した２回の実験の３重試料から得た平均値を表す。
【図１１】広範囲のＨＩＶ−１分離株に感染した細胞による、ｓＣＤ４−リポソームおよび免疫リポソームの取込みを示す図である。ｓＣＤ４−リポソームおよびＭＡｂ−リポソーム各結合体（conjugate）を、異なる９種の初代分離株（括弧内はクレイド）に感染したＰＢＭＣと共にインキュベートする。取込みの増加は、インキュベーション後の細胞内蛍光脂質の増加により測定される。全ての値は、「非感染、リポソーム単独」対照に規格化したものであり、データは、１回の実験の３重試料から得た平均値±標準誤差を表す。相対的取込みデータは、一連の一元配置分散分析の後、事後テューキー検定を用いて各感染について個別に検定することにより、異なる標的指向分子間の有効性の差異を検定した。リポソーム結合体とリポソーム単独対照との取込み有意差（Ｐ＜０．０００１）は、星印で示す。
【図１２】（Ａ〜Ｈ）ＮＢ−ＤＮＪを封入したｓＣＤ４−リポソームの強力な相乗的抗ウィルス活性を示す図である。各分離株で感染した（グラフＡ〜Ｈで表した）ＰＢＭＣを、様々な濃度でＮＢ−ＤＮＪを封入するｓＣＤ４−リポソーム（ＣＤ４−Ｌ）で４週間に亘り処理した。培地中に遊離するＮＢ−ＤＮＪ５００μＭによる処理（Ｆ）を、抗ウィルス活性の基準として示す。説明書きは、各処理のＮＢ−ＤＮＪの最終濃度を示す。全ての値は非処理対照に対する比率（％）として表示し、データは、１回の実験の３重試料から得た平均値を表す。
【図１３−１】（Ａ〜Ｅ）様々なリポソーム調製物による１５分間パルス後のＭＤＢＫ細胞内部にあるローダミン標識ＰＥの代表的蛍光画像を示す図である。詳細には、図１３ＡはＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥ（６：４：０．１）、図１３ＢはＤＯＰＣ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥ（６：４：０．１）、図１３ＣはＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＩ：Ｒｈ−ＰＥ（６：４：１：０．１）、図１３ＤはＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＩ：Ｒｈ−ＰＥ（６：４：２：０．１）、および図１３ＥはＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＩ：Ｒｈ−ＰＥ（６：４：３：０．１）のデータを示す。Ｒｈ−ＰＥの細胞内局在性は、各リポソーム調製物について０、１、２、５、２４および４８時間の各時点で観察した。全細胞を可視化するために、ＤＡＰＩ逆染色を使用した。
【図１３−２】（図１３−１の続き）
【図１３−３】（図１３−２の続き）
【図１４】Ｒｈ標識ＰＥを含有する様々なリポソーム調製物でｃｐ−ＢＶＤＶ感染および非感染ＭＤＢＫ細胞を処理し、インキュベーション３日間後のＲｈ−ＰＥ脂質の分泌を測定した結果を示す図である。同じリポソーム組成物で処理した感染細胞と非感染細胞との間のＲｈ−ＰＥ分泌の増加は、ＥＲ膜から出芽した、Ｒｈ−ＰＥ脂質を含有するウィルス粒子の分泌に因るものであった。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
別途明記しない限り、「ａ」または「ａｎ」は「１つまたは複数」を意味する。
【００３３】
用語の定義：
本明細書で使用する場合、用語「ウィルス感染」とは、ウィルスが健常な細胞に侵入し、細胞の繁殖機構を用いて増殖または複製し、最終的に細胞を溶解する結果、細胞死、ウィルス粒子の放出、および新生される子孫ウィルスによる他細胞の感染を起こす病的状態を表示する。特定のウィルスによる潜伏感染も、ウィルス感染の考え得る結果である。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「ウィルス感染の処置または予防」とは、特定ウィルスの複製を阻害すること、ウィルス伝染を阻害することまたはウィルスが宿主中に定着するのを予防すること、およびウィルス感染が起こす疾患の症状を改善もしくは緩和することを意味する。ウィルス負荷の低下、致死率および／または罹患率の減少が起これば、その処置は治療的と見なされる。
【００３５】
用語「治療剤」とは、ウィルス感染またはそれが原因の疾患などの生理的病状の処置を補助することができる、分子または化合物などの任意の作用剤を指す。
【００３６】
本明細書で使用する場合の用語「相乗的」とは、２種以上の任意の個別治療剤の相加的作用より有効である組合せを指す。本明細書で使用する場合の相乗的作用とは、ウィルス感染またはそれが原因の疾患などの生理的病状を処置または予防するために、いずれの個別治療剤もより少ない量（用量）で使用する能力を指す。このより少ない用量によって、処置の効力を低下させずに毒性を低下させることができる。それに加え、相乗的作用は、効力の改善、例えば抗ウィルス活性の改善をもたらすことができる。最後に、ウィルス感染については、相乗作用は、個別治療剤または個別治療法に対するウィルス耐性の回避または低下を改善し得る。
【００３７】
リポソームは、球状二重層構成中に脂質を含む有機化合物と定義することができる。本明細書で考察するリポソームは、以下の略語で表現される１種または複数の脂質を含み得る。
ＣＨＥＭＳは、コレステリルヘミスクシネートの脂質を表す。
ＤＯＰＥは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの脂質を表す。
ＤＯＰＣは、ジオレオイルホスファチジルコリンの脂質を表す。
ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミンの脂質を表す。
ＰＥＧ−ＰＥは、ポリエチレングリコール（２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの脂質を表す。
Ｒｈ−ＰＥは、リサミンローダミンＢ−ホスファチジルエタノールアミンの脂質を表す。
ＭＣＣ−ＰＥは、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキサミド］の脂質を表す。
ＰＩは、ホスファチジルイノシトールの脂質を表す。
細胞内送達とは、リポソームから任意の細胞内区画への封入物質の送達を指す。
ＩＣ５０またはＩＣ９０（阻害濃度５０または９０）は、ウィルス感染のそれぞれ５０％または９０％低下を実現するために使用される治療剤の濃度である。
ＤＣリポソームは、ＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質を６：３のモル比で含むリポソームを指定する。
ＤＣＰＰリポソームは、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＰＥＧ−ＰＥ脂質を６：４：０．３のモル比で含むリポソームを指定する。
ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞を表す。
ｓＣＤ４は、可溶性ＣＤ４分子を表す。「可溶性ＣＤ４」または「ｓＣＤ４」またはＤ１Ｄ２」とは、水溶液中にあり、当業者に理解されるように、ＨＩＶ  Ｅｎｖのコンホメーションを変えることにより、膜固定天然ＣＤ４の活性を模倣できるＣＤ４分子またはその断片を意味する。可溶性ＣＤ４の一例は、例えばSalzwedel et al. J. Virol. 74:326-333, 2000に記載される２ドメイン可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４またはＤ１Ｄ２）である。
ＭＡｂは、モノクローナル抗体を表す。
ＤＮＪは、デオキシノジリマイシンを示す。
ＮＢ−ＤＮＪは、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンを示す。
ＮＮ−ＤＮＪは、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシンを示す。
ＢＶＤＶは、牛ウィルス性下痢症ウィルスを表す。
ＨＢＶは、Ｂ型肝炎ウィルスを表す。
ＨＣＶは、Ｃ型肝炎ウィルスを表す。
ＨＩＶは、ヒト免疫不全ウィルスを表す。
ｎｃｐは、非細胞変性を表す。
ｃｐは、細胞変性を表す。
ＥＲは、小胞体を表す。
ＣＨＯは、チャイニーズハムスター卵巣細胞を表す。
ＭＤＢＫは、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞を表す。
ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応を表す。
ＦＯＳは、遊離オリゴ糖を表す。
ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィーを表す。
ＰＨＡは、フィトヘマグルチニンを表す。
ＦＢＳは、ウシ胎児血清を表す。
ＴＣＩＤ５０は、５０％組織培養感染用量を表す。
ＥＬＩＳＡは、酵素免疫吸着アッセイを表す。
ＩｇＧは、免疫グロブリンを表す。
ＤＡＰＩは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを表す。
ＰＢＳは、リン酸緩衝塩水を表す。
【００３８】
ウィルス感染症のリポソーム処置
本発明者等は、細胞と接触した際、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよび／またはＰＥＧ−ＰＥの各脂質を含む、ＤＣリポソームまたはＤＣＰＰリポソームなどのｐＨ感受性リポソームが、エンドサイトーシスに従う細胞のエンドソーム経路を迂回し、細胞の小胞体（ＥＲ）中に、即ちＥＲ内腔中に直接、リポソーム中に封入した物質を送達できることを発見した。リポソームの１種または複数の脂質は、細胞のＥＲ膜中に一体化することもできる。ウィルスに感染した細胞のＥＲ膜とのリポソーム脂質の合体は、出芽ウィルス粒子のエンベロープを変化させ、したがって感染性を低下させることができるので、この発見は、ＥＲ膜からのウィルスの出芽を要する、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＢＶＤＶ感染などのウィルス感染の処置に主要な意味合いをもつことができる。
【００３９】
本発明者等は、ＤＣＰＰリポソーム中にＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）を封入することにより、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）などの他のデオキシノジリマイシン化合物のＤＣＰＰ封入と比較して、細胞内送達を増加させることができることも発見した。ＮＢ−ＤＮＪの細胞内送達のこのような増加により、ＮＢ−ＤＮＪのインビボ活性を高めることができる。
【００４０】
更に本発明者等は、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよび／またはＰＥＧ−ＰＥの各脂質を含む、ＤＣＰＰリポソームなどのリポソームが、独自の、即ちリポソーム内部に封入された任意の治療剤と関係のない抗ウィルス活性を有することができること、ならびにＤＣＰＰリポソームおよびそのリポソーム内部に封入されているＮＢ−ＤＮＪなどの治療剤が、ウィルスに対して相乗的に作用することができることも発見した。
【００４１】
したがって、一実施形態は、ＥＲ膜ウィルス出芽感染、即ち、ウィルスの出芽がＥＲ膜で起きることができる、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＢＶＤＶ感染などのウィルス感染を処置する方法である。この方法は、感染症の原因であるウィルスに感染した細胞を、ＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳの各脂質を含むリポソーム中にＮＢ−ＤＮＪを封入した組成物と接触させることを含むことができる。このような接触によって、接触細胞のＥＲ膜へ１種または複数のリポソームの脂質を送達し、その膜を変化させ、その結果子孫ウィルスの感染性を低下させ、しかも封入ＮＢ−ＤＮＪを直接、細胞のＥＲ内腔中に放出することにより、感染性を低下させる相乗的治療をもたらすことができる。
【００４２】
別の実施形態は、感染症の原因であるウィルスに感染した細胞を、１）ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＰＥＧ−ＰＥの各脂質を含有するリポソームと、２）リポソーム内部に封入した治療剤とを含有する組成物と接触させることにより、ウィルス感染を処置する方法である。該ウィルス感染は、例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＢＶＤＶ、ＨＩＶ、モロニーマウス白血病ウィルス、マウス肝炎ウィルス、単純疱疹ウィルス１型および２型、サイトメガロウィルス、シンドビスウィルス、セムリキ森林熱ウィルス、水疱性口内炎ウィルス、Ａ型インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、デング熱ウィルス、または日本脳炎ウィルスの場合があり、そうしたウィルスは、R. A. Dwek, et al, Nat. Rev. Drug Discov. 2002 Jan; 1(1):65-75に記載されている。
【００４３】
幾つかの実施形態では、リポソーム内部に封入した治療剤は、α−グルコシダーゼ阻害剤でもよい。幾つかの実施形態では、α−グルコシダーゼ阻害剤はＥＲ  α−グルコシダーゼ阻害剤でもよい。一般に、ウィルスエンベロープ糖タンパク質の適正な折畳みのために、カルネキシンおよび／またはカルレチキュリンとの相互作用に依存するウィルスはいずれも、ＥＲ  α−グルコシダーゼ阻害剤の標的とすることができる。
【００４４】
該α−グルコシダーゼ阻害剤には、作用剤の非存在下での宿主α−グルコシダーゼの酵素活性と比較して、そのα−グルコシダーゼの酵素活性を少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれを超えて阻害する作用剤がなり得る。用語「α−グルコシダーゼ阻害剤」は、宿主α−グルコシダーゼ活性を阻害する天然、合成双方の作用剤を包含する。
【００４５】
適切なα−グルコシダーゼ阻害剤には、それだけに限らないが、デオキシノジリマイシン、ならびに式ＩＩの化合物および医薬として許容可能なその塩などのＮ−置換デオキシノジリマイシンが含まれ、
【化１】
2009545621.tif 000003
【００４６】
式中、Ｒ１は、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換シクロアルキル基、置換もしくは非置換アリール基、または置換もしくは非置換オキサアルキル基から選択され、それだけに限らないが、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、分枝または直鎖アルキル基、およびオキサアルキル基から選択され、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、各々独立に水素、アルカノイル基、アロイル基およびハロアルカノイル基から選択される。
【００４７】
このような実施形態の幾つかでは、Ｒ１が、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ヘキシル、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）６ＣＨ３、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ２ＣＨ３、および−（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３から選択される。他のこのような実施形態では、Ｒ１がブチルであり、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは全て水素である。
【００４８】
幾つかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、それだけに限らないが、Ｎ−（ｎ−ヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−ヘプチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−オクチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−オクチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−ノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−デシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−ウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−ノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−デシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−ウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−ドデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（２−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（４−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（５−メチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（３−プロピルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（１−ペンチルペンチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（１−ブチルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（７−メチルオクチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（８−メチルノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（９−メチルデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（１０−メチルウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（６−シクロヘキシルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（４−シクロヘキシルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（２−シクロヘキシルエチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（１−シクロヘキシルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（１−フェニルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（３−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（３−（４−メチル）フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、Ｎ−（ｎ−ノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−デシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−ウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（ｎ−ドデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（２−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（４−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（５−メチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（３−プロピルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（１−ペンチルペンチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（１−ブチルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（７−メチルオクチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（８−メチルノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（９−メチルデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（１０−メチルウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（６−シクロヘキシルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（４−シクロヘキシルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（２−シクロヘキシルエチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（１−シクロヘキシルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（１−フェニルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（３−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（３−（４−メチル）フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール四酪酸、医薬として許容可能なそれらの塩、およびそれらの任意の２種以上の混合物から選択される。
【００４９】
適切なα−グルコシダーゼ阻害剤には、米国特許第４６３９４３６号に記載のＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ＭｉｇｌｉｔｏｌまたはＧｌｙｓｅｔ（登録商標））などのＮ−オキサアルキル化デオキシノジリマイシンも含まれる。
【００５０】
適切なα−グルコシダーゼ阻害剤には、米国特許出願第２００６／０１９４８３５号に開示されている式（Ｉ）の化合物および医薬として許容可能なそれらの塩などの、６−Ｏ−ブタノイルカスタノスペルミン（セルゴシビル）を含めたカスタノスペルミンおよびカスタノスペルミン誘導体、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０１０５４６９２号に開示されている式ＩＩの化合物および医薬として許容可能なそれらの塩も含まれる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、該α−グルコシダーゼ阻害剤には、アカルボース（Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−［［（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］アミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）、またはＰｒｅｃｏｓｅ（登録商標）がなり得る。アカルボースは、米国特許第４９０４７６９号に開示されている。幾つかの実施形態では、該α−グルコシダーゼ阻害剤には、アカルボースの高純度型がなり得る（例えば、米国特許第４９０４７６９号を参照されたい）。
【００５２】
幾つかの実施形態では、リポソーム内部に封入される治療剤には、イオンチャンネル阻害剤がなり得る。幾つかの実施形態では、イオンチャンネル阻害剤は、ＨＣＶ  ｐ７タンパク質の活性を阻害する作用剤でもよい。イオンチャンネル阻害剤およびそれらを同定する方法は、米国特許出願第２００４／０１１０７９５号に詳述されている。適切なイオンチャンネル阻害剤には、式（Ｉ）の化合物および医薬として許容可能なそれらの塩が含まれ、その中にはＮ−（７−オキサノニル）−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−７−オキサノニル６−ＭｅＤＧＪまたはＵＴ２３１Ｂ）およびＮ−１０−オキサウンデクル−６−ＭｅＤＧＪを含む。適切なイオンチャンネル阻害剤には、それだけに限らないが、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン、Ｎ−ノニルデオキシノガラクトノジリマイシン、およびＮ−オキサノニルデオキシノガラクトノジリマイシンも含まれる。
【００５３】
幾つかの実施形態では、リポソーム内部に封入される治療剤は、イミノ糖を含むことができる。適切なイミノ糖には、天然イミノ糖および合成イミノ糖の双方が含まれる。
【００５４】
幾つかの実施形態では、該イミノ糖には、デオキシノジリマイシンまたはＮ置換デオキシノジリマイシン誘導体がなり得る。適切なＮ置換デオキシノジリマイシン誘導体の例には、それだけに限らないが、本願の式ＩＩの化合物、米国特許第６５４５０２１号の式Ｉの化合物、および米国特許第４６３９４３６号に記載のＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ＭｉｇｌｉｔｏｌまたはＧｌｙｓｅｔ（登録商標））などのＮ−オキサアルキル化デオキシノジリマイシンが挙げられる。
【００５５】
幾つかの実施形態では、該イミノ糖は、カスタノスペルミンおよびカスタノスペルミン誘導体でもよい。適切なカスタノスペルミン誘導体には、それだけに限らないが、米国特許出願第２００６／０１９４８３５号に開示されている式（Ｉ）の化合物および医薬として許容可能なそれらの塩、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０１０５４６９２号に開示されている式ＩＩの化合物および医薬として許容可能なそれらの塩が含まれる。
【００５６】
幾つかの実施形態では、該イミノ糖は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２４４０１号および第ＷＯ０１／１０４２９号に開示されているようなデオキシノガラクトジリマイシンまたはそれらのＮ置換誘導体でもよい。適切なＮ置換デオキシノガラクトジリマイシン誘導体の例には、それだけに限らないが、Ｎ−ノニルデオキシノガラクトジリマイシンなどのＮ−アルキル化デオキシノガラクトジリマイシン（Ｎ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール）、およびＮ−７−オキサノニルデオキシノガラクトジリマイシンなどのＮ−オキサアルキル化デオキシノガラクトジリマイシン（Ｎ−オキサアルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール）が挙げられる。
【００５７】
幾つかの実施形態では、該イミノ糖は、それだけに限らないが、式Ｉの化合物を含めたＮ置換１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ置換ＭｅＤＧＪ）でもよい：
【化２】
2009545621.tif 000004
【００５８】
式中、Ｒは、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換シクロアルキル基、置換もしくは非置換ヘテロシクリル基、または置換もしくは非置換オキサアルキル基から選択される。幾つかの実施形態では、置換もしくは非置換アルキル基、および／または置換もしくは非置換オキサアルキル基は、１〜１６個の炭素原子、または４〜１２個の炭素原子、または８〜１０個の炭素原子を含む。幾つかの実施形態では、置換もしくは非置換アルキル基、および／または置換もしくは非置換オキサアルキル基は、１〜４個の酸素原子を含み、他の実施形態では、１〜２個の酸素原子を含む。他の実施形態では、置換もしくは非置換アルキル基、および／または置換もしくは非置換オキサアルキル基は、１〜１６個の炭素原子および１〜４個の酸素原子を含む。したがって幾つかの実施形態では、Ｒは、それだけに限らないが、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）６Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−（ＣＨ２）６Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）６ＣＨ３、および−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。Ｎ置換ＭｅＤＧＪは、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１０４２９号に開示されている。
幾つかの実施形態では、リポソーム内部に封入される治療剤は、式ＶＩＩＩを有する含窒素化合物または医薬として許容可能なその塩を含むことができ、
【化３】
2009545621.tif 000005
式中、Ｒ１２は、Ｃ１〜Ｃ２０、またはＣ１〜Ｃ６もしくはＣ７〜Ｃ１２もしくはＣ８〜Ｃ１６などのアルキル基であり、１〜５個または１〜３個または１〜２個の酸素も含有することができ、Ｒ１２は、オキサ置換アルキル誘導体でもよい。オキサ置換アルキル誘導体である場合の例には、３−オキサノニル、３−オキサデシル、７−オキサノニルおよび７−オキサデシルが挙げられる。
Ｒ２は水素であり、Ｒ３はカルボキシもしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシカルボニルであり、またはＲ２およびＲ３が一緒になって、
【化４】
2009545621.tif 000006
であり、式中、ｎは３もしくは４であり、各Ｘは、独立に水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシルオキシ、もしくはアロイルオキシであり、各Ｙは、独立に水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシルオキシ、もしくはアロイルオキシであり、または欠失しており（即ち、存在しない）、
Ｒ４は、水素または欠失しており（即ち、存在しない）、
Ｒ５は、水素、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキル、アリール、アラルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アシルオキシ、またはアロイルオキシであり、あるいはＲ３およびＲ５が一緒になってフェニルを形成し、Ｒ４が欠失している（即ち、存在しない）。
幾つかの実施形態では、該含窒素化合物は以下の式を有し、
【化５】
2009545621.tif 000007
式中、Ｒ６〜Ｒ１０は、各々独立に、水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ４アシルオキシ、およびアロイルオキシからなる群から選択され、Ｒ１１は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。該含窒素化合物は、Ｎ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−オキサアルキル化ピペリジン、Ｎ−アルキル化ピロリジン、Ｎ−オキサアルキル化ピロリジン、Ｎ−アルキル化フェニルアミン、Ｎ−オキサアルキル化フェニルアミン、Ｎ−アルキル化ピリジン、Ｎ−オキサアルキル化ピリジン、Ｎ−アルキル化ピロ−ル、Ｎ−オキサアルキル化ピロ−ル、Ｎ−アルキル化アミノ酸またはＮ−オキサアルキル化アミノ酸でもよい。ある種の実施形態では、Ｎ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−オキサアルキル化ピペリジン、Ｎ−アルキル化ピロリジンまたはＮ−オキサアルキル化ピロリジン化合物には、イミノ糖がなり得る。例えば、幾つかの実施形態では、該含窒素化合物は、以下の式：
【化６】
2009545621.tif 000008
を有するＮ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−アルキル−ＤＧＪ）もしくはＮ−オキサアルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−オキサアルキル−ＤＧＪ）、または以下の式：
【化７】
2009545621.tif 000009
を有するＮ−アルキル−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−アルキル−ＭｅＤＧＪ）もしくはＮ−オキサアルキル−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−オキサアルキル−ＭｅＤＧＪ）でもよい。
【００５９】
本明細書で使用する場合、当該の各基は、炭素原子数を別途明示しない限り以下の特性を有する。アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し、直鎖または分枝、置換または非置換である。アルコキシ基は、１〜１６個の炭素原子を有し、直鎖または分枝、置換または非置換である。アルコキシカルボニル基は、２〜１６個の炭素原子を有するエステル基である。アルケニルオキシ基は、２〜１６個の炭素原子、１〜６個の二重結合を有し、直鎖または分枝、置換または非置換である。アルキニルオキシ基は、２〜１６個の炭素原子、１〜３個の三重結合を有し、直鎖または分枝、置換または非置換である。アリール基は、６〜１４個の炭素原子を有し（例えば、フェニル基）、置換または非置換である。アラルキルオキシ基（例えば、ベンジルオキシ基）およびアロイルオキシ基（例えば、ベンゾイルオキシ基）は、７〜１５個の炭素原子を有し、置換または非置換である。アミノ基は、一級、二級、三級または四級アミノ基でもよい（即ち、置換アミノ基）。アミノカルボニル基は、１〜３２個の炭素原子を有するアミド基（例えば、置換アミド基）である。置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ１〜１０アシル、またはＣ１〜１０アルコキシからなる群から選択される置換基を含めることができる。
【００６０】
Ｎ−アルキル化アミノ酸には、Ｎ−アルキル化ａ−アミノ酸などのＮ−アルキル化天然アミノ酸がなり得る。天然アミノ酸は、一般的な２０種のα−アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＭｅｔおよびＰｒｏ）、ならびに天然産物であり、ノルロイシン、エチルグリシン、オルニチン、メチルブテニルメチルスレオニンおよびフェニルグリシンなどの他のアミノ酸のうち、１種である。アミノ酸側鎖（例えばＲ５）の例には、Ｈ（グリシン）、メチル（アラニン）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２−ＳＨ（システイン）および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３（スレオニン）が含まれる。
【００６１】
Ｎ−アルキル化化合物は、アミノ（またはイミノ）化合物の還元的アルキル化により調製することができる。例えば、アミノまたはイミノ化合物は、そのアミンをＮ−アルキル化するために、還元剤（例えば、水素化シアノホウ素ナトリウム）と共にアルデヒドに曝すことができる。同様に、Ｎ−オキサアルキル化化合物は、アミノ（またはイミノ）化合物の還元的アルキル化により調製することができる。例えば、アミノまたはイミノ化合物は、そのアミンをＮ−オキサアルキル化するために、還元剤（例えば、水素化シアノホウ素ナトリウム）と共にオキサアルデヒドに曝すことができる。
【００６２】
当含窒素化合物は、１個または複数の保護基を含むことができる。多種の保護基が知られている。一般に、保護基の化学種は、該化合物の他の位置における任意の後続反応（複数も）の条件に安定であり、かつその分子の残部に悪影響を及ぼさずに適当な時点で除くことができる限り、決定的に重要ではない。それに加え、実質的な合成的変換が完了した後、１種の保護基で別種を置き換えてもよい。明らかなことであるが、ある化合物が、本明細書に開示した化合物の１個または複数の保護基を異なる保護基で置き換えたという点だけで、その開示化合物と異なる場合、その化合物は本発明内に入る。更なる例および条件は、Greene, Protective Groups in Organic Chemistry, (1st Ed., 1981, Greene & Wuts, 2nd Ed., 1991) に見出される。
【００６３】
該含窒素化合物は、例えば、結晶化またはクロマトグラフィー法により精製することができる。この化合物は、出発物質として立体特異的なアミノまたはイミノ化合物を用いて立体特異的に調製することができる。
【００６４】
長鎖Ｎ−アルキル化化合物の調製に出発物質として使用されるアミノおよびイミノ化合物は、商業的に入手することができ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｃｈｅｓｈｉｒ、英国；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｒｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）、または既知の合成法で調製することができる。例えば、該化合物は、Ｎ−アルキル化イミノ糖化合物またはそれらのオキサ置換誘導体でもよい。そのイミノ糖は、例えば、デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）、１−メチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＭｅＤＧＪ）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、アルトロスタチン、２Ｒ，５Ｒ−ジヒドロキシメチル−３Ｒ，４Ｒ−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）、またはそれらの誘導体、鏡像異性体もしくは立体異性体でもよい。
【００６５】
多様なイミノ糖化合物の合成が、これまで記載されている。例えば、ＤＮＪ誘導体の合成法が知られており、例えば、米国特許第５６２２９７２号、第５４０１６４５号、第５２００５２３号、第５０４３２７３号、第４９９４５７２号、第４２４６３４５号、第４２６６０２５号、第４４０５７１４号および第４８０６６５０号に記載されている。他のイミノ糖誘導体の合成法が知られており、例えば、米国特許第４８６１８９２号、第４８９４３８８号、第４９１０３１０号、第４９９６３２９号、第５０１１９２９号、第５０１３８４２号、第５０１７７０４号、第５５８０８８４号、第５２８６８７７号および第５１００７９７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１０４２９号に記載されている。２Ｒ，５Ｒ−ジヒドロキシメチル−３Ｒ，４Ｒ−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）の鏡像異性特異的合成は、ＦｌｅｅｔおよびＳｍｉｔｈ（Tetrahedron Lett. 26: 1469-1472, 1985）により記載されている。
【００６６】
接触細胞には、人間などの哺乳動物の細胞がなり得る。幾つかの例では、感染細胞のリポソーム組成物との接触は、感染細胞を含んだ対象へその組成物を投与することにより、行うことができる。該対象には人間などの哺乳動物がなり得る。幾つかの実施形態では、リポソーム組成物は静脈注射で投与することができる。更に幾つかの実施形態では、リポソーム組成物は、腹腔内、皮下、皮内、表皮内、筋肉内または経皮経路などの、静脈注射以外の非経口経路を介して投与することができる。更に幾つかの実施形態では、リポソーム組成物は、粘膜表面、例えば、眼球、鼻腔内、肺、腸、直腸および尿管の表面を介して投与することができる。リポソーム組成物の投与経路は、例えば、A. S. Ulrich, Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles, Bioscience Reports, Volume 22, Issue 2, April 2002, 129-150 に開示されている。
【００６７】
リポソームを介したＥＲ内腔中へのＮＢ−ＤＮＪなどの治療剤の送達は、非リポソーム法と比較して、ＥＲグルコシダーゼの阻害に必要な治療剤の有効量を低下させることができる。例えばＮＢ−ＤＮＪについては、ＩＣ９０を、少なくとも１００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍、または少なくとも５０００倍、または少なくとも１００００倍、または少なくとも５００００倍、または少なくとも１０００００倍低下させることができる。ＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス有効量のこのような低下によって、投与ＮＢ−ＤＮＪの最終濃度を、哺乳動物、特に人間における毒性レベルより１桁または複数桁低くすることができる。
【００６８】
幾つかの例では、ＮＢ−ＤＮＪなどの治療剤を含むリポソーム組成物を、抗ウィルス剤などの１種または複数の追加の治療剤と併用して、感染細胞に接触させることができる。幾つかの例では、このような追加の治療剤は、リポソーム中にＮＢ−ＤＮＪと共に同時封入することができる。更に幾つかの例では、感染細胞のこのような追加の治療剤との接触は、その細胞を含む対象へ追加の該治療剤を投与した結果でもよい。追加の該治療剤の投与は、その組成物へ該治療剤を添加することにより実施することができる。更に幾つかの例では、追加の該治療剤の投与は、ＮＢ−ＤＮＪを含有するリポソーム組成物の投与とは別に、実施することができる。このような別の投与は、リポソーム組成物に使用する投与経路と同じでも、異なってもよい投与経路を介して実施することができる。
【００６９】
併用療法は、抗ウィルス活性に必要な作用剤の有効量を低下させ、それによりその毒性を低下させ得るだけでなく、多重の機構によりウィルスを攻撃する結果、絶対的な抗ウィルス作用も改善し得る。例えば、ＤＣＰＰリポソームの脂質およびＮＢ−ＤＮＪは、１）ＮＢ−ＤＮＪ含有リポソームによる処置が、外来脂質の付加でエンベロープ組成を変え得る場である、ウィルスのエンベロープに対して、および２）ウィルス糖タンパク質の異常折畳みを介して、作用することにより、感染性を低下させることができる。したがって、ＮＢ−ＤＮＪと異なる標的または作用機構を有する１種または複数の作用剤と併用される、ＮＢ−ＤＮＪを封入するリポソームは、相加的または相乗的効果をもたらすことができる。
【００７０】
それに加え、併用療法は、ウィルス耐性の発現を回避する、またはその発現確率を減少させる手段をもたらすことができる。
【００７１】
ＮＢ−ＤＮＪ含有リポソームと併用できる特定の追加治療剤（複数も）は、処置するウィルス感染症に依存することができる。例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＢＶＤＶ感染症などの肝炎感染症については、そのような治療剤（複数も）には、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド抗ウィルス剤、および／または免疫賦活／免疫調節剤がなり得る。肝炎処置のためにＮＢ−ＤＮＪと併用できる、多様なヌクレオシド剤、ヌクレオチド剤および免疫賦活／免疫調節剤が、２００４年２月１０日にＪａｃｏｂ他に交付された米国特許第６６８９７５９号に例示されている。例えば、Ｃ型肝炎感染症の処置については、ＮＢ−ＤＮＪを、ヌクレオチド剤としての１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（リバビリン）および免疫賦活／免疫調節剤としてのインターフェロンαなどのインターフェロンと組み合わせて、リポソーム中に封入することができる。リバビリンおよび／またはインターフェロンによる肝炎感染症の処置は、例えば、米国特許第６１７２０４６号、第６１７７０７４号、第６２９９８７２号、第６３８７３６５号、第６４７２３７３号、第６５２４５７０号および第６８２４７６８号で考察されている。
【００７２】
ＨＩＶ感染症の処置のために、ＮＢ−ＤＮＪ含有リポソームと併用できる治療剤は、抗ＨＩＶ剤でもよく、例えば、ヌクレオシド系逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤として（−）−２’−デオキシ−３’−チオシチジン−５’−三リン酸（３ＴＣ）、（−）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシメチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン（ＦＴＣ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）およびジデオキシイノシン（ｄｄＩ）など、非ヌクレオシドＲＴ阻害剤としてＮ１１−シクロプロピル−４−メチル−５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２’，３’−ｅ］−［１，４］ジアゼピン−６−オン（ネビパリン）など、プロテアーゼ阻害剤、またはそれらの組合せでもよい。抗ＨＩＶ治療剤は、ＡＺＴ、ＤＤＩおよびネビラピンの組合せなどの二重または三重の組合せで使用することができる。
【００７３】
ｇｐ１２０／ｇｐ４１標的指向部と結合したリポソーム
本発明は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１標的指向部と結合したリポソームを含む組成物、およびＨＩＶ感染症に感染した細胞をそのような組成物と接触させることにより、該感染症を処置する方法も提供する。ｇｐ１２０／ｇｐ４１標的指向部は、ｓＣＤ４分子、またはＩｇＧ  ２Ｆ５もしくはＩｇＧ  ｂ１２などのモノクローナル抗体を含むことができる。幾つかの実施形態では、リポソームはＤＯＰＥおよびＣＨＥＭＳの各脂質を含むことができる。幾つかの実施形態では、リポソームはＰＥＧ−ＰＥ脂質を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、リポソームはＭＣＣ−ＰＥ脂質を更に含むことができる。ＨＩＶ感染症の処置のために、該組成物は、リポソーム内部に封入されるＮＢ−ＤＮＪなどの追加治療剤を更に含むことができる。
【００７４】
ＰＩ脂質を含むリポソーム
本発明者等は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質を含むｐＨ感受性リポソームなどのリポソームが、ＰＩ脂質を含有しないリポソームより、細胞のＥＲ膜を効果的に標的とすることができることも発見した。更に、ＰＩ脂質を含むリポソームは、リポソームを介して送達される１種または複数の脂質の細胞における寿命を延ばすことができる。
したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入された、抗ウィルス治療剤などの少なくとも１種の治療剤とを含む組成物、および人間などの哺乳動物がなり得る対象に、そのような組成物を投与することを含む標的送達法を提供する。このような標的送達法は、ウィルス感染症などの生理的病状、またはその病状に侵された対象においてそれを原因とする疾患の処置または予防に使用することができる。
【００７５】
発明者等は更に、ＥＲ標的リポソーム中に少なくとも１種の抗ウィルスタンパク質を組み込むと、１）ウィルスエンベロープ中に組み込まれたときに、ウィルス感染性を低減できるリポソーム脂質のＥＲ膜中への直接送達、および２）出芽粒子のウィルスエンベロープ中に合体し、独自に感染性を低減できる少なくとも１種の抗ウィルスタンパク質のＥＲ膜中への直接送達により、ウィルス感染性が相乗的に低減し得ると考えている。抗ウィルス治療剤などの少なくとも１種の治療剤をリポソーム中に封入することによって、３）治療剤のＥＲ内腔などの細胞内区画中への直接送達により、付加的な相乗効果を得ることができる。
【００７６】
したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソームの脂質二重層中に挿入された、抗ウィルスタンパク質などの少なくとも１種のタンパク質とを含む組成物、および人間などの哺乳動物がなり得る対象に、そのような組成物を投与することを含む標的送達法を提供する。このような標的送達法は、ウィルス感染症などの生理的病状、またはその病状に侵された対象においてそれを原因とする疾患の処置または予防に使用することができる。
【００７７】
更に幾つかの実施形態では、本発明は、ＰＩ脂質を含んだリポソームと、リポソーム内部に封入された、抗ウィルス組成物などの少なくとも１種の治療剤と、リポソームの脂質二重層中に挿入された、抗ウィルスタンパク質などの少なくとも１種のタンパク質とを含む組成物、および人間などの哺乳動物がなり得る対象に、そのような組成物を投与することを含む標的送達法を提供する。
【００７８】
該ウィルス感染症は、例えば、ＥＲ膜出芽ウィルス感染症、即ちＥＲ膜でウィルスの出芽が起こるＨＢＶ、ＨＣＶもしくはＢＶＤＶ感染症などのウィルス感染症、または原形質膜出芽ウィルス感染症、即ち原形質膜でウィルスの出芽が起こるＨＩＶ感染症などのウィルス感染症でもよい。
【００７９】
ＰＩ脂質を含んだリポソームは、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよび／またはＰＥＧ−ＰＥ脂質などの１種または複数の脂質を更に含有することができる。リポソーム中のＰＩ脂質のモル濃度は、約３％〜約６０％まで、または約５％〜約５０％まで、または約１０％〜約３０％まで変化することができる。
【００８０】
幾つかの実施形態では、ＰＩ脂質を含んだリポソーム内部に封入される治療剤は、上記に考察したα−グルコシダーゼ阻害剤のいずれかなどのα−グルコシダーゼ阻害剤でもよい。
【００８１】
幾つかの実施形態では、ＰＩ脂質を含んだリポソーム内部に封入される治療剤は、上記に考察したイオンチャンネル活性阻害剤でもよい。
【００８２】
幾つかの実施形態では、ＰＩ脂質を含んだリポソーム内部に封入される治療剤は、上記に考察したイミノ糖のいずれかなどのイミノ糖でもよい。
【００８３】
幾つかの実施形態では、ＰＩ脂質を含んだリポソーム内部に封入される治療剤は、式ＶＩＩＩの含窒素化合物でもよい。
【００８４】
幾つかの実施形態では、ＰＩ脂質を含んだリポソーム中に挿入されるタンパク質は、抗ウィルスタンパク質でもよい。適切な抗ウィルスタンパク質には、それだけに限らないが、ウィルスエンベロープタンパク質に結合することが知られているウィルス受容体、および／または変異型ウィルスエンベロープタンパク質、および／またはウィルスエンベロープの相互作用を妨害することが知られているタンパク質が挙げられる。例えば、ＨＩＶ感染症については、抗ウィルスタンパク質にはＣＤ４タンパク質がなり得る。ＨＣＶ、ＢＶＤＶまたはＨＢＶ感染症については、抗ウィルスタンパク質には、ＨＣＶ／ＢＶＤＶのＥ１またはＥ２タンパク質などの各ウィルスエンベロープタンパク質の１種の変異型がなり得る。
【００８５】
以下の実施例に決して限定するわけではないが、それらによって本発明を更に例示する。
【００８６】
リポソームの調製
全ての実験に使用したリポソームは、以下の通り調製した。即ち、脂質のクロロホルム溶液をガラス管中に入れ、窒素気流下で溶媒を蒸発させた後、減圧下で真空遠心分離を行った。脂質膜（全脂質１０μｍｏｌ）を、ＰＢＳ緩衝液１ｍｌ、ｐＨ７．４（薬物入りもしくはなし、および／またはＰＢＳ中に８０ｍＭカルセイン含有）中、室温で１時間、渦流撹拌することにより水和した。生成した多重膜小胞を浴槽型超音波発生器中で１５分間、超音波処理した後、孔径８０ｎｍのポリカーボネートフィルターから２１回押し出した。
【００８７】
封入剤濃度の最適化
蛍光分子のカルセインを、その蛍光が自己消光される濃度の８０ｍＭでＤＣＰＰリポソーム内部に封入した。リポソームからのカルセインの漏出、および周囲媒体中へのその希釈によって、脱消光が起こり、測定／観察可能な蛍光が増大する。封入率（％）は、カルセインを含有する最終的リポソーム調製物をＭＥＳ緩衝塩水中で最終リン脂質濃度０．５μＭに希釈することにより、決定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を最終濃度０．１％まで添加する前後に、カルセインをλｅｘ＝４９０およびλｅｍ＝５２０ｎｍで測定した。界面活性剤添加後の蛍光差をリポソーム内封入率（％）とし、各実験におけるＤＮＪ化合物の最終濃度を決定するためのその化合物量の推算に使用する。
【００８８】
ＥＲ膜中への脂質封入
リポソームは、ＥＲ内腔中に直接、封入物質を送達すると同時に、脂質をＥＲ膜中に組み込むことができる。最初の証拠は、蛍光標識によるリポソームのタグ付けにより得られるが、そのタグ付けでは、脂質含量がＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥ：Ｒｈ−ＰＥ（ＤＣＰＰ−Ｒｈ）のモル比６：４：０．３：０．１となるように、ＰＥに結合したローダミン（Ｒｈ−ＰＥ）をＤＣＰＰリポソーム中に組み込んだ（モル含量１％）。ＭＤＢＫ細胞を、Ｒｈ−ＰＥで標識され、カルセインを含有するｐＨ感受性リポソームで３０分間パルス処理した。非吸着リポソームを除去し、その細胞を３時間更に追跡した。追跡期間の終りに、ＥＲマーカーであるＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒと３０分間細胞をインキュベートし、洗浄し、可視化した。図１に示したマージ図は、カルセイン、Ｒｈ標識脂質およびＥＲトラッカーが共局在していることを明示している。これに基づけば、リポソームは、ＥＲ膜内に合体する色素であるＥＲトラッカーとのリポソーム脂質の共局在で示される、ＥＲ膜との初期融合段階の後、ＥＲへその水性含有物を送達するとの結論を得ることができる。
【００８９】
リポソームの毒性
リポソームの毒性は、異なる２種の細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞において測定した。
【００９０】
集密度８０％を超えるまで６ウェルプレート中に細胞を播種し、ＰＢＳを封入したＤＣＰＰリポソームを、脂質最終濃度がＣＨＯ細胞に対しては０〜５００μＭ、ＭＤＢＫ細胞に対しては０〜１５０μＭの範囲となるように、培地に添加した。細胞およびリポソームを３７℃、５日間インキュベートしたままとした後、細胞を採集し、トリパンブルーで染色後、計数した。その結果は、非処理対照（ｘ軸上１００％）と比較した際に、処理試料中に存在する生存細胞の比率（％）として表し、３回の個別実験からの二重試料の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【００９１】
結果は図２に示してあり、ＣＨＯ細胞における細胞毒性が、脂質濃度１５０μＭの存在下でインキュベーション後に徐々に現れた。ＭＤＢＫ細胞の方が、ＤＣＰＰリポソームに対する感受性が高いようであり、７５μＭを超える脂質濃度で重度の細胞毒性を示した。
【００９２】
ＤＣＰＰリポソームからのイミノ糖放出
ＣＨＯおよびＭＤＢＫ細胞を用いた全ての実験において、脂質最終濃度が各々１００μＭおよび５０μＭとなるまでＤＣＰＰリポソームを添加した（両者の細胞生存率は＞９５％）。
【００９３】
次の実施例では、ＮＢ−ＤＮＪのブチル鎖が、封入物質のＤＣＰＰリポソームからの細胞内放出量増加を直接担っていることが示される。
【００９４】
ＤＣＰＰリポソーム内部に封入した際の異なるＤＮＪ化合物が、細胞取込みおよび細胞内放出に及ぼす効果を、既述のように化合物を８０ｍＭカルセイン中に希釈し、Ｒｈ−ＰＥをリポソーム膜中に組み込み、最終リポソーム組成をＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥ：Ｒｈ−ＰＥ（ＤＣＰＰ−Ｒｈ、６：４：０．３：０．１）とすることにより、決定した。カルセイン単独、１０μＭ  ＤＮＪ、１ｍＭ  ＤＮＪ、１０μＭ  ＮＢ−ＤＮＪ、１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪ、１０μＭ  ＮＮ−ＤＮＪまたは１ｍＭ  ＮＮ−ＤＮＪを封入したリポソームをＣＨＯ細胞と４５分間インキュベートした後、リポソームを除き、細胞を１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。次いで、細胞を蛍光光度計中で分析し、カルセインの脱消光（λｅｘ＝４９０およびλｅｍ＝５２０ｎｍ）ならびにローダミンの蛍光（λｅｘ＝５８４およびλｅｍ＝６１２ｎｍ）を測定した。データは、独立した４実験の三重試料から得た平均値±Ｓ．Ｄ．を表しており、ローダミン蛍光の平均値はリポソームの結合および取込みを反映し、カルセイン蛍光の平均はこの色素の細胞内脱消光を反映する（即ち、リポソームから細胞内区画中に放出された色素）。結果は、カルセイン／ＰＢＳ単独リポソーム対照（ｘ軸上１００％）と比較した、ＤＮＪ含有リポソームとのインキュベーション後に測定された蛍光率（％）として表示されている。
【００９５】
図３に示すように、ＤＮＪおよびＮＮ−ＤＮＪは共に、カルセインの脱消光量、したがって細胞内放出には全く効果がなかった。しかし、ＮＢ−ＤＮＪは、脱消光カルセインの濃度依存的増加を示し、１０μＭおよび１ｍＭの製剤が、各々約１．８倍および２．３倍の増加を起こす。
【００９６】
カルセイン対ローダミンの蛍光比計算値は、細胞結合リポソーム当たりの放出された水性マーカー量の尺度と見なされ、細胞内送達の効率を表す。各封入物質について計算した効率を表１に列挙してある。結果は、１０μＭおよび１ｍＭのＮＢ−ＤＮＪ含有リポソームが、ＤＣＰＰリポソームからの細胞内送達の効率を各々約２倍および３倍増加させたことを示す。
【００９７】
【表１】
2009545621.tif 000010
【００９８】
本発明はその作動理論に縛られることはないが、ＮＢ−ＤＮＪのブチル鎖が、ＤＣＰＰリポソームからの封入物質の細胞内送達増大を促進する機構は、脂質二重層内へのブチル鎖の挿入によるリポソームの不安定化を介する可能性が高い。ＮＮ−ＤＮＪの９炭素アルキル鎖も、リポソームの脂質二重層中に挿入されることができる。しかし、この長さでは、提示した結果が示唆するように、その分子は、実際には二重層の形成を安定化させ得る。ＮＮ−ＤＮＪリポソームは細胞取込みを増加させるが、カルセインの放出量は、対照と同等に留まり、細胞内でのリポソーム安定性の増加を示している。
【００９９】
ＤＣＰＰリポソームの安定性
次の実施例では、ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪ双方のアルキル鎖が、ｐＨを下げるとＤＣＰＰリポソームの安定性を高めることにより、その性質を変化させることが示されている。
【０１００】
８０ｍＭカルセイン緩衝液中の１ｍＭのＤＮＪ、ＮＢ−ＤＮＪまたはＮＮ−ＤＮＪを封入したＤＣＰＰリポソームを、空（カルセイン単独）のリポソームと比較することにより、ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＮ−ＤＮＪのアルキル鎖がｐＨ感受性に及ぼす効果を決定した。カルセイン担持ＤＣＰＰリポソーム（最終リン脂質濃度５μＭ）１０μｌを、５．０〜７．４の範囲の様々なｐＨ値でＭＥＳ緩衝塩水２ｍｌに添加し、３７℃、１５分間振とうしながらインキュベートするがままにした。インキュベーション後、Ｔｒｉｔｏｎを最終濃度０．１％まで添加する前後にカルセイン蛍光を測定した。ｐＨのカルセイン蛍光に対する若干の効果について、酸性ｐＨ値で得られた蛍光強度を補正した。各ｐＨでのカルセイン放出率（％）は次式を用いて計算したが、その式は、％漏出＝（（Ｉｎ−Ｉ０）／（Ｉ１００−Ｉ０））ｘ１００であり、式中Ｉ０は中性ｐＨでの蛍光、ＩｎはＴｒｉｔｏｎ添加前の酸性ｐＨでの補正強度、Ｉ１００は中性ｐＨでの脱消光全カルセインである。
【０１０１】
結果は図４に示してあり、カルセイン単独およびＤＮＪ封入型のリポソーム間の安定性に差異は認められなかった。しかし、ｐＨ感受性の有意な減少が、ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＮ−ＤＮＪリポソームで認められ、アルキル鎖の結果として低いｐＨで安定性の増加を示した。ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪの双方は、インビトロでより大きな安定性をＤＣＰＰリポソームに付与したが、インビボではＮＮ−ＤＮＪだけが、実際にはカルセイン送達を阻害しており（図４および表１）、細胞内積荷（cargo）放出の過程に影響する、またはそれを制御する、ｐＨ感受性以外の要因の存在を浮き彫りにした。
【０１０２】
図３、図４および表１からの知見に基づけば、ＤＮＪ分子上のアルキル鎖の存在だけでなく長さも、内部に封入した際、リポソームの性質に影響し得ると結論することができる。こうした観察は、アルキル鎖がリポソームの脂質二重層に挿入され、脂質組成を効果的に変化させた結果であることは、ほぼ間違いない。以上の研究では４炭素鎖（ＮＢ−ＤＮＪ）および９炭素鎖（ＮＮ−ＤＮＪ）だけが使用されたが、短鎖は、インビボでリポソームを不安定化させ、荷役分子の細胞内放出を増加させ得るのに対して、長鎖は、同じ脂質組成物を安定化させ、放出を阻害するかのように思われる。
【０１０３】
ＤＣＰＰリポソーム中に封入されたＮＢ−ＤＮＪによるＢＶＤＶ分泌の減少
次の実施例では、ＤＣＰＰリポソーム中に封入されたＮＢ−ＤＮＪが、ＭＤＢＫ細胞からのＢＶＤＶ粒子の分泌を減少させることが示される。
【０１０４】
ＤＣおよびＤＣＰＰリポソーム中に組み込まれたＮＢ−ＤＮＪの複合抗ウィルス作用が、ＢＶＤＶのｃｐ株、ｎｃｐ株のいずれかに感染したＭＤＢＫ細胞において示された。
【０１０５】
ＢＶＤＶのｎｃｐ株を用いた第１の研究では、ＮＢ−ＤＮＪを遊離状態で培地へ添加し、最終濃度を０〜７５０ｎＭの間の範囲にした。別のインキュベーションでは、ＮＢ−ＤＮＪ  ＤＣＰＰリポソームの添加により、最終脂質濃度を５０μＭとし、ＮＢ−ＤＮＪの最終濃度を０〜７５０ｎＭの間の範囲とした。実験は、６ウェルプレート中で二重に実施した。分泌ＢＶＤＶウィルス粒子の量は、３日間のインキュベーション後に測定した。ウィルス分泌の分析は、上清５００μｌから抽出したウィルスＲＮＡに関する定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）により行った。リアルタイムＰＣＲでは、ｎｃｐ  ＢＶＤＶ  ＲＮＡを対象としたプライマーを使用し、順方向プライマー配列はＴＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧであり、逆方向プライマー配列はＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＣＣＴＣＡであった。結果は、非処理対照（ｘ軸上１００％）と比較した際の処理試料中に存在するＲＮＡコピー数の比率（％）として表示される。
【０１０６】
図５は、ｎｃｐ  ＢＶＤＶの分泌に対する遊離状態、ＤＣＰＰ中双方のＮＢ−ＤＮＪの効果に関する結果を表す。ＮＢ−ＤＮＪの最終濃度７５０ｎＭを使用した場合、リポソーム媒介送達では分泌ウィルス粒子数が１／２に減少し、遊離送達では無効である。リポソーム、封入ＮＢ−ＤＮＪのいずれかの濃度を増加させることにより、アッセイを更に最適化させると、ウィルス分泌を更に一層減少させることができる。
【０１０７】
本発明はその作動理論に制限されることはないが、ＢＶＤＶ分泌を阻害することができた機構は、グルコシダーゼ阻害の結果、Ｅ１、Ｅ２などのウィルス糖タンパク質をＥＲ内に保持したことにより得る。
【０１０８】
ＢＶＤＶの感染性
次の実施例では、空およびＮＢ−ＤＮＪ封入双方のＤＣＰＰリポソームが、ＭＤＢＫ細胞から分泌されるＢＶＤＶ粒子の感染性を低減することが示される。ＤＣＰＰリポソームおよびＮＢ−ＤＮＪが、相乗的に作用することも示される。
【０１０９】
前の実験から採集したＢＶＤＶウィルス粒子（分泌ＢＶＤＶを含有する上清５００μｌ）を用いて、ＮＢ−ＤＮＪ処理分泌ＢＶＤＶの感染性を、ナイーブＭＤＢＫ細胞との３日間のインキュベーション後、免疫蛍光染色により感染細胞中のＢＶＤＶタンパク質を同定することによって、決定した。細胞は、抗ＢＶＤＶ  ＮＳ２−ＮＳ３モノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣ標識二次抗体を用いて感染後に染色した。実験は、６ウェルプレートを用いて二重に行った。ウィルス感染性（％）は、ＢＶＤＶ非構造タンパク質の存在で特定した感染細胞数を細胞核のＤＡＰＩ染色で決定した全細胞数で割ることにより、計算した。各試料中のウィルス価の増減を考慮するために、結果の規格化も行った（ＢＶＤＶ分泌実験の結果）。
【０１１０】
図６は、ｎｃｐ  ＢＶＤＶの感染性に対する遊離状態、ＤＣＰＰリポソーム中双方のＮＢ−ＤＮＪの効果に関する結果を表す。こうした結果は、非処理ＢＶＤＶ、ならびに最終濃度７５０ｎＭまでの遊離ＮＢ−ＤＮＪで処理したＢＶＤＶも、ナイーブＭＤＢＫ細胞の約２０％に感染できるウィルス子孫を産生したことを示している。しかし、ＤＣＰＰリポソームにより送達される７５０ｎＭのＮＢ−ＤＮＪとインキュベートした感染細胞は、ウィルス子孫の感染性を有意に低下させた（ナイーブ細胞の１％未満が感染した）。驚くべきことに、封入ＮＢ−ＤＮＪを有する、または有していない、いずれのＤＣＰＰリポソームで処理された全ての感染ＭＤＢＫ細胞も、ウィルス子孫に感染した細胞数を約７％へ低下させた。したがって、１×ＰＢＳだけを封入したＤＣＰＰリポソームは、非処理ウィルスと比較してＢＶＤＶ感染性をほぼ１／３に低下させたが、７５０ｎＭのＮＢ−ＤＮＪと併用すると、抗ウィルス作用は対照の２０倍強に増加した。同じ濃度の７５０ｎＭを培地に遊離状態で添加したＮＢ−ＤＮＪは、殆どないし全く効果を示さなかった。リポソーム、封入ＮＢ−ＤＮＪのいずれかの濃度を増加させることにより、アッセイを更に最適化させると、ウィルス感染性を完全に排除することができる。
【０１１１】
本発明はその作動理論に制限されることはないが、ＮＢ−ＤＮＪ封入ＤＣＰＰリポソームによる処理がウィルス感染性に作用する機構は、ＤＣＰＰ脂質のＥＲ膜中への合体と、更に、活性の向上およびウィルス糖タンパク質の異常折畳みを起こす、抗ウィルス剤ＮＢ−ＤＮＪの作用部位直接の標的送達との複合効果とし得る。その結果、こうしたリポソームで処理したウィルス子孫は、ＥＲ中でのグリカンプロセシングの欠如により欠損しているウィルス糖タンパク質に加え、ウィルスエンベロープ中に存在するＤＣＰＰ脂質を有し得る。
【０１１２】
リポソーム封入ＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス作用
ｃｐ  ＢＶＤＶに対するリポソーム封入ＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス作用も、感染細胞の単層上にプラークを形成できるｃｐ株を利用する方法である、収率低下アッセイを用いて試験した。
【０１１３】
図７は、感染性ｃｐ  ＢＶＤＶの分泌に対する、遊離状態対ＤＣリポソーム封入型のＮＢ−ＤＮＪの効果を表す。ｃｐ  ＢＶＤＶに感染したＭＤＢＫ細胞を、最終ＮＢ−ＤＮＪ濃度が０〜５００μＭの間の範囲にあり、全脂質濃度が１００μＭとなるように、遊離型またはＤＣリポソーム型のＮＢ−ＤＮＪで３日間処理した。次いで上清を取り出し、それを用いて６ウェルプレート中で新たなＭＤＢＫ単層を感染させた。３日後、プラークを顕微鏡下で計数し（プラークアッセイ）、その結果を薬物無添加上清による感染で生じたプラーク数（＝１００％）（ｘ軸）に対する比率（％）として表示した。ｙ軸は、プラークアッセイに使用した遊離状態またはＤＣリポソーム封入型のＮＢ−ＤＮＪ濃度を示す。ＩＣ５０は、グラフの下端部に示してある。その結果は、ＤＣリポソーム中へのＮＢ−ＤＮＪ封入型の方が、感染性ＢＶＤＶの分泌を８倍良好に阻害した（ＩＣ５０が、遊離薬物の１７５μＭに比較して２０μＭ）。ｃｐ  ＢＶＤＶに関するアッセイは、ＮＢ−ＤＮＪをＤＣＰＰリポソーム中に組み込むことにより最適化することができ、その場合に細胞培養培地中で安定性が高まり、そのため改善された抗ウィルス作用を有することができる。
【０１１４】
遊離オリゴ糖分析で測定したＤＣＰＰ封入ＮＢ−ＤＮＪの活性増加
遊離状態またはＤＣＰＰリポソーム封入型のＮＢ−ＤＮＪ存在下で産生される遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）の特性を決定し、細胞内送達による薬物活性の増強を測定するために、グルコシダーゼ阻害に対する細胞マーカーとして使用する。ＦＯＳは、ＥＲ膜にあるＳｅｃ６１含有チャンネルを通じて、プロテアソーム分解のためにＥＲから移出される異常折畳み糖タンパク質に対する、サイトゾルペプチドのＮ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）の作用を介して生成することが示されてきた。ＦＯＳ中に存在するグリカンの同定によって、タンパク質の折畳みがどの段階で妨害されたかが明らかとなる。この実験では、グルコシル化ＦＯＳの分布をＮＢ−ＤＮＪによるグルコシダーゼ阻害の尺度として使用するが、その場合、Ｇｌｃ１Ｍａｎｎ−ＦＯＳおよびＧｌｃ２Ｍａｎｎ−ＦＯＳはグルコシダーゼＩＩ阻害の結果であり、Ｇｌｃ３Ｍａｎｎ−ＦＯＳはグルコシダーゼＩ阻害の結果である。
【０１１５】
ＣＨＯ細胞を、抗ウィルス濃度０．５ｍＭの遊離ＮＢ−ＤＮＪの存在下で、または最終濃度範囲０〜７５ｎＭのＮＢ−ＤＮＪを封入したＤＣＰＰリポソーム１００μＭと共にインキュベートした。細胞を５日間インキュベートするがままにし、ＦＯＳの単離は、Mellor et al (2004). Biochem. J. 2004 August 1; 381(Pt 3): 861-866 が記載するように、全タンパク質を５００μｇに標準化した細胞ホモジェネートを用いて行った。ＦＯＳの検出は、オリゴ糖を２−アミノベンズアミドで標識した後、順相ＨＰＬＣにより行った。ＦＯＳの組成は、エンドグリコシダーゼＨ、タチナタマメα−マンノシダーゼ、ならびにα−グルコシダーゼＩおよびＩＩを含めたグリコシダーゼによる消化によって、更に特性決定し、判定した。非グルコシル化およびグルコシル化オリゴマンノースＦＯＳ（Ｍａｎｎ−ＦＯＳ、Ｇｌｃ１Ｍａｎｎ−ＦＯＳ、Ｇｌｃ２Ｍａｎｎ−ＦＯＳおよびＧｌｃ３Ｍａｎｎ−ＦＯＳで表される）の比率（％）を各試料について計算し、その結果を表２に表してある。結果は、別々の４実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【０１１６】
【表２】
2009545621.tif 000011
【０１１７】
抗ウィルス濃度０．５ｍＭの遊離ＮＢ−ＤＮＪの存在下でインキュベートしたＣＨＯ細胞は、主にＦＯＳのトリグルコシル化種を産生し、この濃度でグルコシダーゼＩの阻害を示した。これは、グルコシダーゼＩの阻害が、ＨＩＶについて以前に報告されたＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス作用を担っていると示唆することができる。増加させていくＮＢ−ＤＮＪ濃度でリポソーム処理した試料から単離したＦＯＳは、グルコシル化ＦＯＳの分布が、各々グルコシダーゼＩＩおよびＩの阻害による、主としてＧｌｃ１Ｍａｎ−ＦＯＳからＧｌｃ３Ｍａｎ−ＦＯＳへ徐々に移行することを明らかにした。ＤＣＰＰリポソームを介して送達した場合、ＮＢ−ＤＮＪ最終濃度７５０ｎＭで処理した試料は、０．５ｍＭの遊離状態インキュベーションについて見られたレベルと同等レベルのグルコシダーゼＩの阻害を示し、細胞内送達の結果、抗ウィルス活性が約６００〜７００倍増強したことを示唆した。
【０１１８】
本発明はその作動理論に縛られることはないが、ＮＢ−ＤＮＪ活性の増加を実現する機構は、この抗ウィルス剤の作用部位（即ち、ＥＲ内腔）への直接送達を介したものとし得る。ＥＲ直接送達は、ＮＢ−ＤＮＪを遊離状態で周囲培地へ添加した場合には障壁として恐らく作用できる原形質膜およびＥＲ膜双方を、抗ウィルス剤が迂回することを可能にし得る。ＮＢ−ＤＮＪを用いて封入した場合に認められる細胞内送達量の増加は、他の化合物に比較してＮＢ−ＤＮＪのＥＲ内腔内での高い濃度の結果、活性の増強にも寄与し得る。
【０１１９】
２Ｇ１２抗体結合で決定したＤＣＰＰ封入ＮＢ−ＤＮＪの活性増加
次の実施例では、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０上でのグリカンプロセシングの阻害で測定した場合のＮＢ−ＤＮＪの活性が、遊離またはＤＣＰＰリポソーム封入ＮＢ−ＤＮＪの存在下、ＣＨＯ細胞中での発現後に決定される。
【０１２０】
可溶型ＨＩＶ  ｇｐ１２０を発現するＣＨＯ細胞を、濃度範囲０〜５ｍＭの遊離ＮＢ−ＤＮＪの存在下で、または培地中の最終濃度範囲が０〜７５０ｎＭの間のＮＢ−ＤＮＪを封入したリポソームと共にインキュヘートした。細胞を５日間インキュヘートするがままにまかせた後、処理ｇｐ１２０を含有する細胞上清を採集した。ＮＢ−ＤＮＪの存在下（遊離状態、リポソーム中のいずれか）で、発現したｇｐ１２０上でのグリカンプロセシングの阻害を測定するために、ＭＡｂ  ２Ｇ１２の結合を捕捉ＥＬＩＳＡで決定した。２Ｇ１２は、ｇｐ１２０の糖鎖豊富な表面上にあるマンノース残基集合体を認識し、ＮＢ−ＤＮＪ存在下での結合の減失が、エピトープを形成するオリゴマンノースグリカン上でのグルコースの保持から生じる。しかし、結合親和性の減失は、該タンパク質の異常折畳みからも生じ得るので、こうした２通りの可能性を識別するために、中和用ＭＡｂ、ｂ１２に対する全試料の親和性も測定する。ｂ１２抗体は、ＣＤ４結合部位であるコンホメーション感受性エピトープを認識し、その部位は２Ｇ１２の結合部位と重複していない。細胞上清中にある可溶性ｇｐ１２０は、Ｄ７３２４抗体（ｇｐ１２０のＣ５領域に結合する）を用いてＥＬＩＳＡプレート中で捕捉し、２Ｇ１２、ｂ１２いずれかの１０μｇ／ｍｌで処理した。両抗体のＮＢ−ＤＮＪ処理試料への結合を非処理ｇｐ１２０に対する結合と関連付け、データは、結合率（％）として表示し、個別の４実験からの三重結果の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【０１２１】
図８は、培地中に遊離している０．５ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪで処理した後の２Ｇ１２に対するｇｐ１２０結合の減失（１．２±０．１％の結合）と、一方ｂ１２に対する１００％の結合維持とを示している。ＮＢ−ＤＮＪ最終濃度７．５ｎＭによるリポソーム媒介送達は、２Ｇ１２に対する９．８±４．８％の結合と、ｂ１２結合に対する効果が有意でない（９６．３±３．２％）結果とを生じ、細胞内送達の結果としてＩＣ９０が６００００〜７００００倍増強されたことを示している。
【０１２２】
免疫増強ペプチドのリポソーム送達
本発明者等は、抗原提示細胞を、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよび／またはＰＥＧ−ＰＥ脂質を含むリポソームなどのｐＨ感受性リポソームと、リポソーム中に封入された免疫増強ペプチドなどの抗原とを含有する組成物に接触させることによって、主要組織適合性分子クラスＩによる提示を増加させることができることも発見した。このような接触は、抗原提示細胞を含む対象に該組成物を投与した結果とし得る。対象に対する該組成物の投与は、対象のワクチン接種に使用することができる。
【０１２３】
免疫増強ペプチドは、チロシナーゼペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶにより例示することができ、そのペプチドは、全長チロシナーゼを発現する細胞上に主要組織適合性分子１のＨＬＡ−Ａ０２０１により提示されることが判明した。これは、チロシナーゼアミノ酸３６９〜３７７位に相当するチロシナーゼペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶから生じ、Ｎ連結糖鎖付加部位６を含む変換ペプチドである。本発明はその作動理論により制限されることはないが、該変換ペプチドは、酵素ペプチドであるＮ−グリカナーゼによるサイトゾル中での脱グリコシル化の結果、生じることができる。Ｎ−グリカナーゼペプチドは、抗原プロセシングに関連する輸送体（ＴＡＰ）に結合し、これがそのペプチドをＥＲ中に輸送する。ＹＭＤＧＴＭＳＱＶペプチドのＤＣＰＰリポソーム中への封入は、そのペプチドのＥＲ送達を１桁低下させる。
【０１２４】
遊離およびリポソーム封入ＮＢ−ＤＮＪによるＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣの処理
感染ヒト細胞由来のＨＩＶ−１初代分離株のＮＢ−ＤＮＪによる消失を、指標細胞としてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および評価項目としてｐ２４抗原産生の決定を使用して評価した。
【０１２５】
健常（感染していない）供与者４名からのＰＢＭＣを分離し、プールし、更に、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１ｍｌ当たり１００Ｕ、ストレプトマイシン１ｍｌ当たり１００μｇおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）で４８時間、続いてＰＨＡ＋インターロイキン−２（４０Ｕ／ｍｌ）で７２時間刺激した。全ての実験は、９６ウェルマイクロタイタープレート中で行った。細胞を感染させるために、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ１００μｌ（５×１０５／ｍｌ）を各ウェルに添加し、その後、初代分離株ストックの５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）１００倍分を含有する等容量を添加した。終夜のインキュベーション後、細胞を組織培養培地で３回洗浄し、最後に、リポソーム処理した、または遊離の適当なＮＢ−ＤＮＪを含有する培地中に再浮遊させた。７日目に、分泌されたＨＩＶ−１ビリオンを含有する培養容量の約１０〜３０％を用いて、２回目の感染および処理のためにナイーブＰＢＭＣを感染させた（移し取った容量は、その分離株の非処理対照がＴＣＩＤ５０＝１００でナイーブ細胞を感染させるのに必要な容量として計算した）。ナイーブ細胞の処理および感染の回数を４週間に亘って重ね、各時点で分泌ビリオンを含有する細胞上清を分離し、捕捉ＥＬＩＳＡに用いてｐ２４濃度（分泌の尺度）を決定した。それに加え、処理全体を通して各時点で分離した上清を用いて、ナイーブＰＢＭＣを２週間感染させた（ＴＣＩＤ５０＝１００）が、それ以上の処理を加えず、それによりウィルス活性のリバウンドの観察が可能となった。
【０１２６】
８種の初代分離株（表３に列挙）に感染したＰＢＭＣを、遊離ＮＢ−ＤＮＪ（濃度範囲０〜１ｍＭ）またはリポソーム封入ＮＢ−ＤＮＪ（０〜３．７５μＭ、最終脂質濃度５０μＭ）の存在下でインキュベートした。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
遊離ＮＢ−ＤＮＪで処理したＰＢＭＣの結果から、ＨＩＶ−１に対する抗ウィルス濃度は５００μＭであることが確認された。これは、全ての分離株において、４週間の処理をかけてウィルス活性を消失させる最低の濃度であった（図９ａ）。全ての分離株が、ウィルス活性の少なくとも９０％低下（ＩＣ９０）を示し、ＮＢ−ＤＮＪが、広範囲のＨＩＶ−１を効果的に標的とすることができることを示唆した。
【０１２９】
遊離ＮＢ−ＤＮＪのウィルス分泌に対する効果は、処理の第１週後に得たｐ２４測定値から決定することができる。培地中に遊離しているＮＢ−ＤＮＪの最高濃度１ｍＭでは、大部分の分離株がウィルス分泌の約３０〜４０％の低下で反応した（図９ｂ）。特に注目すべきは、３種のクレイドｂ分離株の８９．６、ＪＲ−ＦＬおよび９２ＨＴ５９９であり、その場合、分泌が５０％低下し、８９．６の場合には７５％低下した。クレイドｃ分離株の９３ＩＮ１０１も、分泌が５０％減少した。
【０１３０】
異なる初代分離株に対するＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス活性の程度（薬物感受性）は、処理３回後に得たｐ２４測定値から推算した。この時点では、ｐ２４分泌の完全な曲線が各分離株に対して観察され、したがってＩＣ５０およびＩＣ９０を共に計算することができた。試験した８種の分離株のデータを図９ｃに示してあり、６株はそれぞれ４００μＭおよび５００μＭ、２株はそれぞれ２５０μＭおよび３７５μＭのＩＣ５０およびＩＣ９０を有すると計算される。ＮＢ−ＤＮＪ処理に最も感受性が高いことが示された２株、８９．６および９３ＢＲ３０２０は、これらの実験に含められ、二重向性を示すことが知られている唯一の分離株でもあるのに対し、その他の６種の分離株は、Ｒ５、Ｘ４のいずれかに（単）向性である。
【０１３１】
ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥリポソーム内に封入した際のＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス活性を同じ８種の分離株で測定することにより、細胞内送達活性の増強を決定した。図１０は、ＮＢ−ＤＮＪの最終濃度範囲を０〜３．７５μＭとして、試験した８種の分離株（グラフＡ〜Ｈ）における４週間の処理をかけたｐ２４分泌量を示す。５００μＭ遊離ＮＢ−ＤＮＪを用いた結果とウィルス減少を比較すると、全ての分離株が、ＮＢ−ＤＮＪの濃度範囲３．７５〜３７．５ｎＭで、抗ウィルス活性の類似パターンを示し、増強は約１０４〜１０５倍である。薬物感受性の他に、リポソームの取込み速度および細胞内送達の効率などの新たな変数が存在するので、ＮＢ−ＤＮＪリポソームによる処理に対する異なる分離株の感受性には、やはり変動があった。
【０１３２】
ｓＣＤ４リポソームおよび免疫リポソームによるＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣのターゲッティング
ＨＩＶ−１感染細胞の表面上に発現したｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体をリポソームの標的とすることによる細胞取込みの増加を、異なる９種の初代分離株において、可溶性ＣＤ４分子（ｓＣＤ４）、およびこの複合体に結合することが知られている数種のモノクローナル抗体を用いて評価した。
【０１３３】
ｓＣＤ４リポソーム結合体は、最初にｓＣＤ４の一級アミンをＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネートと化学的に反応させて、保護スルフヒドリル基を創製し、次いでその基をヒドロキシルアミンＨＣｌで脱アセチル化することにより脱保護することによって、創製した。免疫リポソームは、最初に、ＩｇＧ分子を、２本の重鎖間にあるヒンジ領域のジスルフィド結合を特異的に還元する作用剤の２−メルカプトエタノールアミンで還元し、遊離スルフヒドリル基を各々含有する２本の半ＩｇＧ分子を創製することにより、調製した。リポソームは、既述のように調製したが、マレイミド基を含有するＰＥ脂質（ＭＣＣ−ＰＥ）を二重層中に組み込むことにより、最終的リポソーム組成をＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥ：ＭＣＣ−ＰＥ：Ｒｈ−ＰＥ（モル比６：４：０．３：０．３：０．１）とした。非保護ｓＣＤ４分子および還元ＩｇＧ分子は、室温で終夜、リポソームと共にインキュベートするがままにした。リポソームは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて遊離のｓＣＤ４またはＩｇＧから精製した。
【０１３４】
蛍光標識脂質（Ｒｈ−ＰＥ）をリポソーム二重層中に組み込み、エンドサイトーシスの増加を、インキュベーション後に細胞中に検出される蛍光の増加から計算した。ＰＢＭＣは、既述のように９６ウェルマイクロタイタープレート中で精製し、培養し、感染させた。ＰＢＭＣは、初代分離株（ＴＣＩＣ５０＝１００）と５日間インキュベートするがままにした後、細胞を組織培養培地で３回洗浄し、最後に適当なリポソーム処理剤を含有する培地中に再浮遊させた（最終脂質濃度５０μＭ）。２４時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを分離し、２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｅｍｐｉｇｅｎ入りＰＢＳ５０μｌ中に再浮遊させた。蛍光をλｅｘ＝５２０ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍで測定した。
【０１３５】
異なる６種のモノクローナル抗体ＩｇＧのｂ６、ｂ１２、２Ｇ１２、２Ｆ５、Ｘ５および４Ｅ１０を試験に含めたが、ｂ６および４Ｅ１０は、共に脂質の凝集を起こしたので、リポソームに結合することができなかった。
【０１３６】
図１１は、１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを封入した、ｓＣＤ４リポソーム、ならびにｂ１２、２Ｇ１２、２Ｆ５およびＸ５の各免疫リポソームを用いて得られ、対象に対するリポソーム取込み率（％）として表示した結果を表す。各感染について、標的指向分子とリポソーム単独対象との間には取込み量に有意差がある（Ｐ＜０．０００１）。ｓＣＤ４に連結したリポソームは、試験した分離株全９種を標的とすることができ、リポソーム単独対象に比して細胞取込み量の有意な増加を示した。２Ｆ５およびｂ１２免疫リポソームは、各々５種および６種の初代分離株に感染したＰＢＭＣにおけるリポソーム取込み量を増加させることができた。２Ｇ１２およびＸ５免疫リポソームは、試験した初代分離株のいずれをも標的とせず、該標的指向分子はいずれも、非特異的相互作用による有意なリポソーム取込みを起こさなかった。
【０１３７】
したがって、ｓＣＤ４リポソームが、ＨＩＶ感染細胞をリポソームの標的とするための最良分子になり得る。ｓＣＤ４は、広範囲のＨＩＶ−１初代分離株を首尾よく標的とするだけでなく、受容体媒介エンドサイトーシスを介した感染細胞におけるリポソーム取込みの増加も可能とする。
【０１３８】
ｓＣＤ４リポソーム封入ＮＢ−ＤＮＪによるＨＩＶ−１  ＰＢＭＣの処理
ｓＣＤ４リポソームが最も広範な標的指向能力を有することが示されたので、このリポソーム調製物をｐ２４分泌アッセイに用いて、ＮＢ−ＤＮＪの抗ウィルス活性を裸リポソームまたは遊離状態送達で認めたその活性と比較した。８種の初代分離株からなる同一群を含むアッセイを、ＮＢ−ＤＮＪの最終濃度範囲０〜３７５ｎＭを用いて行った。結果は図１２に提示してあり、ｓＣＤ４リポソームは追加の中和能をもたらすことにより、全てのｓＣＤ４リポソーム処理剤が、ＮＢ−ＤＮＪを全く含有しない処理剤でさえも、各初代分離株を完全に中和することが示された（グラフＡ〜Ｈ）。
【０１３９】
ＨＩＶ−１ウィルス活性のリバウンド
表４は、全てのＮＢ−ＤＮＪ処理剤を除去した後のウィルス活性のリバウンドを表すデータを要約している。全ての例において、ウィルス活性が一旦ゼロに（またはゼロ近くまで）低下すると、処理を２週間解除した直後にリバウンドがなかった。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
ホスファチジルイノシトールのＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム中への組込み
ウシ肝細胞から精製したホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を、最終モル濃度１０〜３０％でアッセイ済みのリポソーム組成物ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥ中に組み込んだ。陰性対照としてＤＯＰＣ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥリポソームを試験の中に含めた。リポソームは既述のように調製した。ＭＤＢＫ細胞を集密度５０％まで増殖させた後、培地を交換し、最終脂質濃度１００μＭのリポソームを含有する新鮮培地に取り替えた。１５分間のインキュベーション後、リポソームを除き、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を新鮮培地中で０、１、２、５、２４または４８時間インキュベートした後、細胞を２．５％パラホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡下で可視化した。細胞をＤＡＰＩで染色した後、目視分析を行った。
【０１４２】
図１３は、各リポソーム調製物のＭＤＢＫ細胞との１５分間パルス後、０、１、２、５、２４および４８時間の各時点で撮った代表的蛍光画像を示す。結果より、最終濃度１０〜３０％の間でＰＩ脂質を含有するリポソームは、細胞内の寿命が増加しており、それは、この方法で送達した脂質が、より効率的に細胞内に保持されている、あるいはより非効率的に分解されることを意味し得ることが示される。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥリポソームのＭＤＢＫ細胞とのインキュベーション後に撮った蛍光画像は、これらの脂質が、５時間と２４時間との間のある時間に主に分解し、４８時間までに完全に分解することを示している。４８時間後、ＰＩ含有リポソームは、処理細胞内になお非常に明瞭に認められており、Ｒｈ−ＰＥの拡散が進んだパターンが観察される。この結果は、この時点で大部分の脂質が、細胞膜中に合体してしまい、小胞にはもはや濃縮されていないことを示すことができる（点状蛍光パターン）。
【０１４３】
ＥＲ出芽ウィルス粒子のエンベロープ中へのＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソームの合体
リポソームが、ＥＲなどの細胞膜と融合できるか否かを調べるために、Ｒｈ−ＰＥを含有するリポソームを用いて、ＥＲ膜から出芽しているウィルス粒子中への取込みをモニターした。細胞変性ＢＶＤＶ（ＮＡＤＬ、ＭＯＩ＝０．０１）に持続的に感染させたＭＤＢＫ細胞、およびナイーブ（感染していない）ＭＤＢＫを、最終脂質濃度５０μＭのＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥ、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＩ：Ｒｈ−ＰＥまたはＤＯＰＣ：ＣＨＥＭＳ：Ｒｈ−ＰＥリポソームの存在下、２日間インキュベートする。インキュベーション後、リポソームを含有する培地を除き、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した後、新鮮培地を加え、細胞を更に３日間インキュベートした。３日後、処理細胞各組（感染済み、非感染の双方）からの上清試料を採り、λｅｘ＝５５０ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍに設定した分光蛍光計を用いた蛍光測定のために使用する。実験は三重に実施して、その結果は読取値３回の平均を表す。
【０１４４】
同じリポソーム調製物で処理した非感染細胞と比較した、感染細胞の上清における蛍光のいずれの増加も、エンベロープ中にＲｈ−ＰＥ脂質を含有するウィルス粒子の分泌に起因する。図１４は、異なる３種の脂質組成物を用いて得た結果を示し、これらのデータは、ＤＯＰＥ（ＰＥ）を含有するリポソームが、ＥＲ膜中に、続いて出芽ウィルスのエンベロープ中に合体することができることを示している。ＤＯＰＥリポソームで処理した感染細胞からの上清は全て、非感染試料と比較して蛍光の有意な増加を示した。陰性対照（ＥＲ標的指向性がない）として用いたＤＯＰＣ（ＰＣ）含有リポソームは、感染、非感染試料間に蛍光の差を示さなかった。驚くべきことに、図１３に提示したデータと一致して、脂質組成物の一部として１０〜３０％のＰＩを含有するリポソームは、ＰＩがないリポソームのほぼ５倍効率的にウィルスエンベロープ中に合体することができた。このことは、ＰＩが、ＥＲ膜中へのリポソームの取込み増加を担っていることを示す。この結果は、ＥＲから出芽するＢＶＤＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶなどのウィルスの処置に関わり合いを有し得る。
【０１４５】
ＥＲ標的リポソームを用いた抗ウィルス治療剤の開発における次の段階には、ＥＲ膜中へ送達することを目的とした、リポソームの脂質二重層内への抗ウィルスタンパク質の組込みがなり得る。抗ウィルスタンパク質には、それだけに限らないが、ウィルスエンベロープタンパク質に結合することが知られているウィルス受容体、および／またはウィルスエンベロープタンパク質の変異型、および／またはウィルスエンベロープの相互作用を妨害することが知られているタンパク質を含むことができる。
【０１４６】
抗ウィルス薬物を封入したＥＲ標的リポソーム調製物中に抗ウィルスタンパク質を組み込むことにより、相乗的に作用してウィルス感染性を低下させ得る３種の異なる戦略を併用することができる。即ち、そうした戦略は、１：ウィルスエンベロープ中に組み込んだ際に、ウィルス感染性を低下させると見込まれる、ＥＲ膜中への脂質の直接送達、２：出芽粒子のウィルスエンベロープ中に合体し、感染性を低下させると見込まれる、ＥＲ膜中へのタンパク質の直接送達、および３：細胞内区画中への抗ウィルス剤の直接送達である。
【０１４７】
以上では特定の好ましい実施形態に言及しているが、本発明がそのように制限されないことは理解されよう。開示した実施形態に多様な改変を加え得ること、およびそのような改変が本発明の範囲内に入ることを意図していることは、当業者には想いつかれよう。
【０１４８】
この明細書に引用した刊行物、特許出願および特許は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【国際調査報告】
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