(57)【要約】  本発明は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）から単離されたデルタ−６不飽和化酵素遺伝子に関する。本発明は酵母中のシゾキトリウムに由来するデルタ−６不飽和化酵素のクローニングにさらに関する。デルタ−６不飽和化酵素の核酸配列、およびアミノ酸配列が開示される。異種制御配列と機能的に組み合わさった、デルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子を含むベクターである構築物もさらに開示される。新規のデルタ−６不飽和化酵素は、リノール酸をガンマ−リノレン酸に転換する代謝経路（オメガ−６経路）で使用できる。本発明は、上記のタンパク質をコードするこれらの新しい核酸の同定、シゾキトリウムからの単離を提供する。本発明は、具体的にはデルタ−６不飽和化酵素遺伝子を含むベクターを宿す組み換え酵母細胞と、生成される酵素によるガンマ−リノレン酸の生成を例証する。
2009510997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デルタ−６不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的な核酸配列またはその断片であって、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＳＣ１から単離される、単離核酸配列。
【請求項２】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１の核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的である、前記単離核酸配列またはその断片。
【請求項３】
デルタ−６不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする請求項１のヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的な単離核酸配列またはその断片であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の同一性を有する、単離核酸配列またはその断片。
【請求項４】
前記配列が、基質として多価不飽和脂肪酸を利用する、機能的に活性なデルタ−６不飽和化酵素をコードする、前記請求項のいずれか一つに記載の前記単離核酸配列。
【請求項５】
前記単離核酸の遺伝子産物の発現を可能にするプロモーターおよび終結シグナルとを作動的に結合する、請求項１〜４のいずれか一つに記載の単離核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項６】
前記プロモーターがＧａｌ１プロモーターである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
図４で表される、発現ベクター。
【請求項８】
請求項５、６または７に記載の発現ベクターで形質転換される酵母細胞。
【請求項９】
脂質結合脂肪酸の不飽和化活性を有するタンパク質をコードする単離核酸配列で形質転換された酵母細胞であって、前記核酸配列によってコードされるデルタ−６不飽和化酵素が多価不飽和脂肪酸を転換し、特にΔ−３脂肪酸を転換する、酵母細胞。
【請求項１０】
（ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを部分的デルタ−４不飽和化酵素遺伝子でスクリーニングして、前記部分的ｃＤＮＡクローンの同定に至るステップと、
（ｉｉ）陽性ＢＡＣクローン同定のために、シゾキトリウムＳＣ１のＢＡＣライブラリーを部分的ｃＤＮＡクローンでスクリーニングするステップと、
（ｉｉｉ）前記陽性ＢＡＣクローンを同定および配列決定し、全長配列内の前記デルタ−６不飽和化酵素ＯＲＦをさらに同定するステップと、
（ｉｖ）制御配列と作動的に結合する前記単離核酸配列を含むベクターを構築するステップと、
（ｖ）宿主細胞、具体的には酵母細胞を、より具体的には前記構築物で、前記不飽和化酵素の発現に十分な時間および条件下で形質転換するステップと、
を含む、多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法で生成される前記生成物多価不飽和脂肪酸よりなる群から選択される、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項１２】
調製粉乳、栄養補助食品、および食餌代用物よりなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物に投与される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
経腸的にまたは非経口的に投与される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載の組成物を予防または治療をもたらすのに十分な量で、前記患者に投与するステップを含む、多価不飽和脂肪酸の不十分な摂取によって引き起こされる病状を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）から単離されたデルタ−６不飽和化酵素遺伝子に向けたものである。これは、酵母中のシゾキトリウムに由来するデルタ−６不飽和化酵素のクローニングにさらに向けたものである。デルタ−６不飽和化酵素の核酸配列、およびアミノ酸配列が開示される。異種制御配列と機能的に組み合わさった、デルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子を含むベクターである構築物もさらに開示される。新しいデルタ−６不飽和化酵素は、リノール酸をガンマ−リノレン酸に転換する代謝経路（オメガ−６経路）で使用できる。本発明は、上述のタンパク質をコードするこれらの新しい核酸のシゾキトリウムからの同定、単離を提供する。本発明は、具体的にはデルタ−６不飽和化酵素遺伝子を含むベクターを宿す組み換え酵母細胞を例証し、生成した酵素によりガンマ−リノレン酸が生成できる。酵素の使用によって生成された多価不飽和脂肪酸は、医薬組成物、栄養組成物、動物飼料、ならびに化粧品などのその他の製品に添加してもよい。
【背景技術】
【０００２】
デルタ−６不飽和化酵素は、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸合成に必要な重要な酵素である。ｎ−６経路の主要な代謝産物はアラキドン酸（２０：４ｎ−６）であり、一方ｎ−３経路の主要最終産物はエイコサペンタン酸（ＥＰＡ）（２０：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（２２：６ｎ−３）である。２０−および２２−炭素（ｎ−６）および（ｎ−３）ポリエン脂肪酸の入手可能性は、デルタ−６不飽和化酵素による１８：２（ｎ−６）および１８：３（ｎ−３）の不飽和化速度に大きく左右される。デルタ−６不飽和化酵素はミクロソーム酵素であり、ＮＡＤＨ−チトクロームｂ５還元酵素、チトクロームｂ５、およびデルタ−６不飽和化酵素を含む三酵素系の構成要素であると考えられる。デルタ−６不飽和化酵素はＰＵＦＡ合成の第１段階である律速段階を触媒する。デルタ−６不飽和化酵素は不飽和化および延長経路を通じた脂肪酸の流れの入り口として作用する。デルタ−６不飽和化酵素はあらゆる長鎖脂肪酸に作用できるが、基質結合親和力は、既存の二重結合数と共に大きく増大する。ヒトにおけるデルタ−６不飽和化酵素欠乏症の最近の同定は、この経路の重要性を強調する（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、２００３年）。
【０００３】
脊椎動物細胞は脂肪酸のデルタ−９位置に二重結合を導入できるが、脂肪酸のデルタ−９とメチル末端との間に追加的二重結合を導入できないので、リノール酸およびα−リノール酸などの不飽和脂肪酸は、本質的に脊椎動物が合成できない食餌性構成物である。したがって動物がデルタ−９位置を超えて不飽和化できず、故にオレイン酸をリノール酸に転換できないことは明らかであり、同様に哺乳類はガンマ−リノレン酸を合成できない。それらはその他の生成物の前駆物質であるので、リノールおよびα−リノール酸は、必須脂肪酸であり（身体で合成できないので食事の一部とすることが必要である）、通常、植物源から得られる。哺乳類はリノール酸をガンマ−リノレン酸に転換でき、次にこれは、ほとんどのプロスタグランジンの必須前駆物質である非常に重要な脂肪酸であるアラキドン酸（２０：４）に転換できる。さらにリノール、アルファ−リノレン酸およびオレイン酸からの高多価不飽和脂肪酸の動物生物変換は、主に食餌性およびホルモン刺激性機構を通じてデルタ−６およびデルタ−５不飽和化酵素によって調節される（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ６８（２）：１５１〜６２頁）。
【０００４】
前述の観点から、酵素産生の遺伝子組み換え方法を含む、デルタ−６不飽和化酵素と、この酵素をコードするそれぞれの遺伝子について明確な必要性が存在する。これらの必須脂肪酸の現在必要量は、前記のＰＵＦＡに富む植物源の食餌的摂取を通じて満たされてきた。しかしこれらの天然源は、常に供給が制御できない変動の影響を受けやすいという不都合が存在する。さらに、植物油は高度に不均一な組成を有し、目的の特定多価不飽和脂肪酸を分離するための大規模精製手順が必要である（米国特許出願公開第２００６００３５３５１号明細書）。しかし増大する世界人口の需要を満たすために、費用効率が高い代案を探索しなくてはならない。
【０００５】
本発明は、オメガ−３／オメガ−６脂肪酸生合成経路におけるそれぞれの基質の生物変換に起因する、ガンマ−リノレン酸、ステアリドン酸およびその他の脂肪酸などの脂肪酸を生成するための、海洋生物シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）から単離したデルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子の、酵母への導入に関する。酵母は、適切な培地中での脂肪酸発現の好ましいシステムとして、多数の利点を提供する。酵母は、微生物系の使用の容易さと処理系を共に提供できることから、長年にわたりタンパク質発現の宿主として認識および使用されている。酵母は、翻訳後修飾が必要とされる分泌タンパク質および細胞質ゾルタンパク質両方の生成に使用でき、またその生合成経路は多くの面でより高等な真核生物の細胞に似ていることから、宿主としていくつかの利点を誇る。さらにその他の真核生物系と比べて、酵母の遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と類似した操作の容易さから、かなり高度に理解されている。また発現レベルも培養１Ｌあたり数ミリグラムの範囲に及ぶ。
【０００６】
いくつかのデルタ−６不飽和化酵素が同定されている。薬草のボリジ（ルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ））などの植物中で、デルタ−６不飽和化酵素が同定されている（サヤノバ（Ｓａｙａｎｏｖａ）ら、１９９７年）。同一物質がヒト（ヘギョン（Ｈｙｅｋｙｕｎｇ）ら、１９９９年）、線虫シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）などの動物（マイケルソン（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ）ら、１９９８年；ナピア（Ｎａｐｉｅｒ）ら、１９９８年）、および真菌モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）などの真核微生物（フナグ（Ｈｕｎａｇ）ら、１９９９年；ナットゾン（Ｋｎｕｔｚｏｎ）ら、１９９８年）で同定されている。本発明の態様に従って、海洋生物シゾキトリウムから単離されるデルタ−６不飽和化酵素をコードするＤＮＡ配列を含む、単離核酸分子が提供される。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、不飽和化酵素活性を有するポリペプチド分子をコードする単離核酸配列またはその断片に関し、その核酸配列は配列番号１に記載され、そのアミノ酸配列は配列番号２に記載される。
【０００８】
本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれと相補的である、単離核酸配列またはその断片を包含する。
【０００９】
本発明はまた、不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする、単離核酸配列またはその断片を含み、前記ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
上述のヌクレオチド配列は、基質として一価不飽和または多価不飽和脂肪酸を利用する、機能的に活性なデルタ−６不飽和化酵素をコードする。ヌクレオチド配列はシゾキトリウムＳＣ１から単離されている。
【００１１】
さらに本発明は、
（１）ｃＤＮＡライブラリーを部分的デルタ−４不飽和化酵素遺伝子でスクリーニングして、部分的ｃＤＮＡクローンの同定をするステップと、
（２）陽性ＢＡＣクローン同定のために、シゾキトリウムＳＣ１  ＢＡＣライブラリースクリーニング用の部分的ｃＤＮＡクローンを使用するステップと、
（３）陽性ＢＡＣクローンを同定して配列決定し、全長配列内のデルタ−６不飽和化酵素ＯＲＦをさらに同定するステップと、
（４）配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むベクターを構築するステップと、
（５）不飽和化酵素の発現に十分な時間および条件下での形質転換を通じて構築ベクターを宿主細胞中に導入するステップと、
を含む、デルタ−６不飽和化酵素をコードする核酸配列およびアミノ酸配列の同定、単離、およびクローニング方法を含む。
【００１２】
宿主細胞は、例えば真核生物細胞または原核生物細胞であってもよい。原核生物細胞は、例えば大腸菌であってもよく、原核生物細胞は例えば真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類の細胞または植物細胞であってもよいが、好ましくはサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞である。その他の適切な宿主細胞としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種などを含む。
【００１３】
本発明の特定の実施態様は、デルタ−６不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその断片を含むベクターの構築について述べ、前記ポリペプチドは、配列番号２に記載の配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有し、デルタ−６不飽和化酵素発現のための最適条件下で、制御配列（例えばプロモーターおよびターミネーター）と作動的に結合するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
さらに本発明は、デルタ−６不飽和化酵素の発現がガンマ−リノレン酸の生成をもたらす、上記ベクターを含む酵母細胞を含む。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、リノール酸およびガンマ−リノレン酸の形成を示す、デルタ−１２およびデルタ−６不飽和化酵素を発現する酵母クローンの誘導に関する。オレイン酸からリノール酸への生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ）変換は、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃａｅ）デルタ−１２不飽和化酵素によって実施される。続くリノール酸からガンマ−リノレン酸への不飽和化は、クローン化ＳＣ１デルタ−６不飽和化酵素によって触媒される。前記発明の文脈で、実験は酵母中におけるＳＣ１デルタ−６不飽和化酵素の機能的発現を実証する。
【００１６】
配列番号１は、シゾキトリウムＳＣ１から単離されたデルタ−６不飽和化酵素の核酸配列であり、
配列番号２は、シゾキトリウムＳＣ１から単離されたデルタ−６−飽和酵素のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
リノール酸は、デルタ−６不飽和化酵素によってガンマ−リノレン酸に転換する。本発明は、デルタ−６不飽和化酵素をコードする単離核酸配列に関する。より具体的には、シゾキトリウムのＢＡＣライブラリーのスクリーニングを通じて得られた海洋生物シゾキトリウムに由来する、デルタ−６不飽和化酵素遺伝子からのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を指す。
【００１８】
本発明は、ｍＲＮＡの転写を指示する適切な制御配列と共に、機能的酵素をコードする本発明の核酸断片またはその一部を含むベクターの生細胞中への転移にさらに関する。生細胞はは本発明の文脈では酵母細胞であり、前記ベクターの酵母細胞中への転移によって、リノール酸からガンマ−リノレン酸への変換をもたらす、特定のデルタ−６不飽和化酵素の生成が得られる。  
【００１９】
本開示の文脈中で、いくつかの用語が使用される。本発明をより良く定義し、本発明の実施において当業者を指導するために以下の定義を提供する。特に断りのない限り、用語は当業者による従来の用法に従うものと理解される。
【００２０】
不飽和化酵素：不飽和化酵素は炭化水素分子中の炭素−炭素二重結合形成を促進する酵素である。
【００２１】
脂肪酸不飽和化酵素：ここで用語「脂肪酸不飽和化酵素」は、脂肪酸分子中の炭素−水素結合切断および炭素−炭素二重結合導入を触媒する酵素を指すために使用される。脂肪酸は遊離状態であっても、またはアシル−キャリアタンパク質、補酵素Ａ、グリセロ脂質のステロールおよびグリセロール部分を含む、これに限定されない別の分子にエステル化していてもよい。
【００２２】
「デルタ−６不飽和化酵素」とは、炭素位置番号１２と１３（メチル末端からの番号付け）の間の二重結合、すなわち炭素長１８の脂肪酸アシル鎖の炭素位置番号６と７（カルボニル炭素からの番号付け）に対応するものの形成を触媒する脂肪酸不飽和化酵素を指す。ここで述べるように、そして本発明の文脈では、デルタ−６不飽和化酵素はリノール酸のガンマ−リノレン酸への変換を触媒する。
【００２３】
「単離された核酸断片または配列」は、一本鎖または二本鎖であり、任意に合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有してもよいＲＮＡポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上の部分を含んでもよい。
【００２４】
「組み換え核酸」は、天然でない配列、または２つの他の分離した配列部分の人工的組み合わせにより作られる人工配列によって作られる配列を有する配列である。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、またはより一般には例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年、で述べられるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離部分の人工操作によって多くの場合達成される。
【００２５】
「遺伝子」とは、先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００２６】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。
【００２７】
「コード配列」とは、特定タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指し、非コード配列は除かれる。「コード配列」は「中断されていないコード配列」を構成し、すなわちイントロンを欠いていてもよく、または、適切なスプライス接合部によって結合する１つ以上のイントロンを含んでもよい。
【００２８】
「開始コドン」および「終止コドン」とは、それぞれタンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始および鎖連鎖停止を指定する、コード配列中の３つの隣接するヌクレオチド単位を指す。
【００２９】
「読み取り枠」（ＯＲＦ）とは、アミノ酸配列をコードする開始コドンと終止コドンの間がイントロンで中断されていないコード配列を指す。
【００３０】
「作動的に結合する」とは、片方の機能が他方によって制御されるような核酸断片の結びつきを指す。
【００３１】
「相同体」とは、共通の祖先配列を共有し、祖先配列を保有する種が２つの種に別れた際に分岐した、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。相同体は、かなりの程度の配列同一性を示すことが多い。
【００３２】
ここで「形質転換」とは、宿主生物ゲノムおよびその遺伝的に安定した遺伝的形質中への異質遺伝子の転移を指す。
【００３３】
ここで「発現」は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す。
【００３４】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多い、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。前記要素は、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞中に導入することができる独自の構成物に、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組み換えられている、あらゆる供給源に由来する自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列であってもよい。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の発現増強を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。  
【００３５】
本発明の態様に従って、シゾキトリウム（ＳＣ１）（以下「ＳＣ１」と称する）のｃＤＮＡライブラリーを部分的デルタ−４不飽和化酵素遺伝子でスクリーニングした。これは様々なその他の生物のデルタ−６不飽和化酵素遺伝子と相同的な長さ６１７塩基対のクローンの同定に至った。同定されたクローンは部分ｃＤＮＡクローンである。
【００３６】
本発明の別の態様に従って、同定された部分的クローンを使用してＳＣ１のＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。ＢＡＣライブラリーのスクリーニングは、デルタ−６不飽和化酵素遺伝子の全長配列を含む陽性クローンの同定をもたらす。クローンをさらに配列決定し、配列中のデルタ−６不飽和化酵素ＯＲＦ（読み取り枠）を同定した。
【００３７】
デルタ−６不飽和化酵素の核酸配列は、配列番号１に記載される。前記核酸配列は、アミノ酸４７２個のタンパク質に翻訳される。ＳＣ１からのデルタ−６不飽和化酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に記載される。本発明は、ＳＣ１などのその他の生物のその他の「入手可能」なデルタ−６不飽和化酵素を包含する。「入手可能」とは、生物学的に活性のタンパク質をコードする、ここで提供される配列と十分に類似した配列を有する、不飽和化酵素を示す。
【００３８】
本発明のさらに別の態様では、単離したデルタ−６不飽和化酵素の相同性の程度を異なる種のデルタ−６不飽和化酵素と比較する。単離したデルタ−６不飽和化酵素の核酸配列をその他の生物のデルタ−６不飽和化酵素をコードする「相同的な」または「関連した」ＤＮＡ配列と比較する。「相同的な」または「関連した」とは、ルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、エチウム・ゲンチアノイデス（Ｅｃｈｉｕｍ  ｇｅｎｔｉａｎｏｉｄｅｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、およびピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）などの例証される生物と比べて、同一のまたは保存的に置換された核酸配列を含む。２つの核酸または２つのアミノ酸配列間の類似性は、配列同一性百分率で表わされる。２つの配列間の配列同一性百分率が高いほど、２つの配列はより類似している。配列は整列化におけるギャップ許容度とともに整列させて、同一性領域はコンピューターアルゴリズムを使用して定量化する。コンピュータープログラムの初期値パラメーターを一般に使用して、ギャップ許容度およびその他の変数を設定する。
【００３９】
配列の整列化方法は、技術分野でよく知られている。様々なプログラムおよび整列化アルゴリズムについては、ピアゾン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７〜３３１頁、１９９４年、およびアルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：１１９〜１２９頁、１９９４年、で述べられている。アルシュールらは、配列比較法および相同性計算の詳細な考察を提示する。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁、１９９０年）は、メリーランド州ベセズダの国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの情報源、およびインターネットで利用でき、または配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘなどとの関連で使用する。
【００４０】
さらにポリペプチドの機能が改変されないまたは損なわれないような様式で、ポリペプチドが保存的に置換された特定アミノ酸を有してもよいことも当業者によって理解される。図１で表される実施された相同性比較から、ヒスチジンモチーフが比較対照の生物間で保存されていることが明らかである。
【００４１】
本発明の別の態様では、不飽和化酵素ドメインの存在確認のため、デルタ−６不飽和化酵素配列のモチーフ検索を行った。モチーフ検索の結果を図２に示す。遺伝子が、機能的不飽和化酵素に特徴的な完全な不飽和化酵素ドメインおよびチトクロームｂ５ドメインを有することが、このようにして確認された。
【００４２】
例えば配列番号１に記載の開示される核酸の全部または一部を含有する組み換え核酸は、例えばタンパク質を発現するように設計されたクローンの一部として、プロモーターなどの別の核酸要素と作動的に結合する。前記の目的のために、クローニングおよび発現システムが市販される。デルタ−６不飽和化酵素をコードするＤＮＡを含有するベクターもまた、本発明によって提供される。
【００４３】
タンパク質発現のために様々な宿主細胞が使用できる。例えばタンパク質の発現および精製のために、様々な酵母株および酵母由来ベクターが一般に使用される。本発明はクローン化遺伝子発現のための宿主として、サッカロミセス・セレヴィシエを使用する。しかしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現システムなどのその他の発現システムの使用もまた想定される。
【００４４】
適切な宿主細胞形質転換用の有用なベクターまたはＤＮＡカセットについては、技術分野でよく知られている。しかし一般的に、ベクターまたはカセットは、関連する遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカーを含有する。ｐＥＴシステムなどの発現ベクターを使用して、目的の遺伝子を発現できる。ベクターは、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージ、好ましくは本発明の目的のためにプラスミドであって、宿主細胞中で機能的かつヌクレオチド配列によってコードされる不飽和化酵素の発現を誘発できるヌクレオチド配列（例えばプロモーター）を含んでもよい（プロモーターはコード配列と「作動的に結合する」）。いくつかの適切なプロモーターとしては、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタラチオネインをコードする遺伝子、またはＧＡＬ１およびＧＡＬ１０などのガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターを含む。発現に使用されるプロモーターの種類は、所望の発現産物の種類と、宿主細胞の性質にも左右される。例えば本発明では、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターがデルタ−６不飽和化酵素遺伝子配列の発現を調節するために使用される。恒常的または誘導的転写が所望されるかどうか、目的のＯＲＦを発現するプロモーターの効率、構築の容易さなどによって、多くのの制御配列のうちいずれか１つが使用できる。翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周辺のヌクレオチド配列は、酵母細胞中での発現に影響することが分かっており、外来性遺伝子の特定のヌクレオチド配列は、所望の発現レベルに改変できる。酵母中での発現において、発現レベルは、非効率的に発現する遺伝子を内在性酵母遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子にインフレームで融合させる部位特異的変異誘発によって、実行できる。
【００４５】
形質転換後に形質転換が成功した細胞選択のために、有用な選択可能マーカーを使用できる。選択用の選択可能マーカーは、ストレプトマイシン、アンピシリンなどに限定されない。
【００４６】
構築されたベクターは、形質移入、電気穿孔または形質転換などの当業者に知られている方法で、選択される宿主細胞中に導入されてもよい。このような技術は、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第１〜３巻、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、中でよく例証されている。ここで、ＤＮＡ配列を取り込ませるあらゆる方法によって操作された、発現カセットを取り込んだ宿主細胞を、「形質転換された」または「組み換え」と称する。
【００４７】
以下の実施例で、本発明をさらに例証する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証の目的でのみ提供されるものと理解される。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須の特徴を見極めて、その精神と範囲を逸脱することなく本発明を様々に変更および修正して、それを様々な使用法および条件に適合させることができる。
【実施例】
【００４８】
実施例１：部分的デルタ−４不飽和化酵素遺伝子によるＳＣ１のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＳＣ１  ｃＤＮＡライブラリーの配列決定から得られた部分的Δ−４不飽和化酵素遺伝子によるＳＣ１のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、いくつかのクローンを同定した。これらのクローンの１つである６１７塩基長のものは、いくつかの生物のデルタ−６不飽和化酵素と相同的であることが分かった。
【００４９】
配列は２７３塩基長まで続くＯＲＦを有した。３’ＵＴＲは４０１塩基長である。ポリアデニル化シグナル「ＡＡＴＡＡ」は、配列の３’末端側に見られた。
【００５０】
この配列をＮＣＢＩのタンパク質データベースに対して相同性検索すると、シャゼンムラサキ（Ｅｃｈｉｕｍ  ｐｌａｎｔａｇｉｎａ）、アルガニア・スピノサ（Ａｒａｇａｎｉａ  ｓｐｉｎｏｓａ）、およびエチウム・ピタルディ（Ｅｃｈｉｕｍ  ｐｉｔａｒｄｉｉ）種のデルタ−６不飽和化酵素との相同性を示した。
【００５１】
関連する実施手順は次のとおりであった。
（Ａ）ｃＤＮＡライブラリーの播種および膜への転移の実施手順
連続希釈
１μＬのｃＤＮＡライブラリークローン混合物および９μＬのＳＯＣをエッペンドルフ（希釈計数１０−１）に取り、管をＡと標識した。Ａ管から１μＬのクローン混合物を取り、９μＬのＳＯＣを添加して別の新しい管に入れ、Ｂと標識した（希釈計数１０−２）。Ｂ管から、１μＬのクローン混合物を取り、９μＬのＳＯＣを添加して別の新しい管に入れ、Ｃと標識した。Ａ、Ｂ、およびＣ管から１μＬを取り、９９μＬのＳＯＣを添加した。
【００５２】
播種
１．各管からの最終クローン混合物１００μＬを個別のＬＢａｍｐプレートに播種した。
２．プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
３．プレートあたり１０４個以上の細胞があるプレートを転移のために選んだ。
【００５３】
膜への転移
１．クローンの適切な位置確認のために、プレートを４箇所において墨汁で標識した。
２．ナイロン膜をプレート上で反転させ、１〜２分間浸漬した。
３．膜を無菌ピンセットにより片側から持ち上げて風乾し、さらにハイブリダイゼーションのために使用した。
【００５４】
（Ｂ）ランダムプライミングによる標識プローブ調製の実施手順
１．標識用のＤＮＡを滅菌水または１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡのどちらかに、１０μｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
２．（ＤＮＡ含有バイアルを沸騰水浴内に保持して）ＤＮＡを９５℃で２分間変性させ、即座に氷上で冷却した。
３．氷上に保持される小型エッペンドルフバイアル内に、試薬を以下の順序で添加して５０ｎｇのＤＮＡを標識した。
５μＬの変性ＤＮＡをバイアル内に入れ、これに５μＬのランダムプライマー緩衝液を添加して、次に５μＬのランダムプライマー溶液を添加し、さらにそれに１２μＬのｄＮＴＰ混合物、２μＬのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素（１Ｕ／μＬ）、１８μＬの滅菌水を添加した。
４．管に栓をして、底部をゆっくりタッピングするか、または遠心分離中の「タップスピン」のいずれかで、穏やかに混合した。
５．上の混合物をアクリル遮蔽物の後ろに置いて、３μＬ（３０μＣｉ）のＰ３２標識ヌクレオチドを添加した。
６．管をＰＣＲブロック内で３７℃の一定温度に静置した。
７．次に管をＰＣＲブロック内で９５℃に１５分間保ち、即座に氷上で冷却した。
８．ランダム標識された断片はプロービングの準備が整った。
【００５５】
（Ｃ）ハイブリダイゼーション実施手順
１．２５．０ｍＬのプレハイブリダイゼーション緩衝液をハイブリダイゼーションボトルに取り、膜をその中に浸した。
２．次にボトルを６５℃に設定したハイブリダイゼーションオーブンに２時間入れた。
３．プレハイブリダイゼーション緩衝液を廃棄して２５．０ｍＬの新鮮なプレハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。
４．アクリル遮蔽物の陰で５０μＬのランダム標識プローブをボトルに添加した。
５．ボトルを６５℃に設定したハイブリダイゼーションオーブンに一晩戻した。
６．放射性標識物廃棄缶に、プローブ含有溶液を静かに注ぎ廃棄した。
７．膜を室温の２×ＳＳＣですすいで、非結合プローブを除去した。
８．膜をオーブン内の攪拌機上で、６５℃の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１５分間さらに洗浄した。
【００５６】
実施例２：ＳＣ１のデルタ−６不飽和化酵素部分ｃＤＮＡクローンのＢＡＣライブラリーの構築およびスクリーニング
部分クローンの１つによるＳＣ１のＢＡＣライブラリーのスクリーニングは、陽性ＢＡＣクローンの同定をもたらした。ＢＡＣクローンは配列決定され、配列中にΔ−６不飽和化酵素ＯＲＦが同定された。
【００５７】
ＢＡＣライブラリー構築のプロトコル
パルスフィールドゲル電気泳動法によって精製されたＤＮＡを１活性単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して、最大で７５〜２００Ｋｂの断片が得られた。サイズ選択されたＤＮＡを消化されたＢＡＣベクター（ｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ５３６）にライゲーションし（１００活性単位の高濃度Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μＬ；ＮＥＢバイオラブズ（ｂｉｏｌａｂｓ）、１：１０の挿入断片：ベクターモル比）、電気穿孔によって大腸菌エレクトロコンピテント細胞中に形質転換して、適切な培地上に播種した。組み換えクローンを拾って９６ウェルプレート中のＳＯＢに接種し、ライブラリーを−７０℃でグリセロール貯蔵物として保存した。
【００５８】
ＢＡＣライブラリースクリーニングの実験手順は、実施例１で述べられるものと同一である。
【００５９】
配列は異なる種のデルタ−６不飽和化酵素と高度な相同性を示す。
【００６０】
デルタ−６不飽和化酵素配列をモチーフ検索すると、機能的不飽和化酵素に特徴的な完全な不飽和化酵素ドメインとチトクロームｂ５ドメインを、遺伝子が有することが示された。
【００６１】
実施例３：遺伝子コピー数の判定
ＳＣ１から単離された１０μｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩで消化して、０．８％アガロースゲルに注入し、３０Ｖで一晩電気泳動してＤＮＡをナイロンＮ＋膜（ミリポア（ｍｉｌｉｐｏｒｅ））に転移した。ランダムプライミングによって３２ＰｄＣＴＰで標識されたＳＣ１デルタ−６不飽和化酵素遺伝子をブロットと６５℃で一晩ハイブリダイズした。次にブロットを中程度のストリンジェント条件（６５℃で２×ＳＳＣ１５分間、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ−１５分間、０．５×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ−１５分間）で洗浄し、Ｘ線フィルムに露光した。
【００６２】
ハイブリダイゼーションの結果を図３に示す。ハイブリダイゼーションの結果は、明らかなＳＣ１中のデルタ−６不飽和化酵素の単一コピーの存在を示した。相同的配列の交差ハイブリッド形成は、ＳＣ１ゲノム中では起きなかった。
【００６３】
実施例４：ベクターの構築
デルタ−６不飽和化酵素遺伝子をＧＡＬ１プロモーター下で、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ（ＰＥＴ−ＳＣ１−Ｄ６）のＢａｍ  ＨＩとＳａｌＩ部位の間のＭＣＳＩＩ部位中にクローンした。増幅のために使用したプライマーを下に示す。
【００６４】
【表１】
2009510997.tif 000003
表１：ＳＣ１からのデルタ−６不飽和化酵素の増幅と、ｐＥＳＣのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位の間のＭＣＳＩＩ中へのクローニング用に合成されるプライマー。プライマー中の制限部位を赤で示す。
【００６５】
２０μＬ反応用のＰＣＲ構成成分
ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水：２０Ｌまで
１０×反応緩衝液：２．０Ｌ
ｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）：０．２Ｌ
順方向プライマー（５．０ピコモル／μＬ）：１．０Ｌ
逆方向プライマー（５．０ピコモル／μＬ）：１．０Ｌ
ＳＣ１ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）：１．０Ｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（３Ｕ／μＬ）：０．１Ｌ（約０．３Ｕ）
【００６６】
サイクル条件は次のとおりである。
【００６７】
【表２】
2009510997.tif 000004
【００６８】
デルタ−６不飽和化酵素のＯＲＦを上記のプライマーで増幅し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで制限酵素消化して、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ中の対応する部位中に一方向性にクローンした。構築物をＰＥＴ−ＳＣ１−Ｄ６と命名し、図４に示す。
【００６９】
実施例５：酵母の形質転換
図４で表されるコンストラクトをサッカロミセス・セレヴィシエＹＰＨ５００株中に形質転換して、形質転換体をＰＣＲで確認した。ＰＣＲ結果を図５に示す。クローン（使用したキットはストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製の酵母エピトープ標識付けベクター）のＧａｌＩプライマーによる増幅は、デルタ−６不飽和化酵素遺伝子を示唆した。
【００７０】
酵母コンピテント細胞の調製プロトコル
全てのステップは無菌条件下で実施する。単一コロニーをＹＰＤに接種して３０℃で一晩生育させる。５％の接種材料を使用して、光学濃度が１．０に達するまで５０ｍＬの培養を３０℃で生育させる。細胞を１０分間氷上に保持し、４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、培地を廃棄する。沈殿物を等容積の水（５０ｍＬ）に再懸濁し、４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠沈する。沈殿物を等容積の１Ｍソルビトールで２回洗浄して、４℃において５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。最後に沈殿物を１５０μＬの１Ｍソルビトールに再懸濁して、４℃で保存する。コンピテント細胞は１週間保存できる。
【００７１】
電気穿孔による酵母の形質転換
６０μＬのコンピテント細胞および約ｌμｇのＤＮＡをバイアルに取り、混合して氷上に保持した。これをさらに０．２ｃｍ電気穿孔キュベットに取り、ＳＣ２（１．７ｋＶおよび５．８ｍｓ）に設定したパルスを負荷した。即座に６００μＬの１Ｍソルビトールを添加して細胞を再懸濁し、バイアルに移して室温で５分間保持した。２００μＬの細胞を適切な選択培地上に広げ、３０℃で２日間インキュベートした。予期されたコロニー数は、２００μＬの培養散布あたり１００個であった。
【００７２】
シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製のトリプトファン添加ＳＤドロップアウト培地中で生育させて、形質転換酵母細胞を選択した。
【００７３】
実施例６：生体内機能証明
デルタ−６不飽和化酵素およびカラシナデルタ−１２不飽和化酵素を含有するｐＥＳＣ−Ｔｒｐコンストラクトで形質転換された酵母株ＹＰＨ４９９中において、生体内機能証明実験を実施した。この構築物を使用して、培地中の前駆脂肪酸添加の不在下における、生体内デルタ−６不飽和化酵素活性が観察できる。ｐＥＳＣ−ＴｒｐのＭＣＳＩのＥｃｏＲＩ部位とＳｐｅＩ部位の間でクローンされたΔ−６不飽和化酵素をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで制限酵素消化した。デルタ−１２不飽和化酵素を保有するＰＥＨ−Ｄ１２−ＢＪ−ＣＯクローンをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、放出されたデルタ−１２不飽和化酵素を単離した。後者を上記の構築物の対応するＭＣＳＩＩ部位中に一方向性にクローンした。このようにして得られた構築物はＭＣＳＩ中にデルタ−６を有し、ＭＣＳＩＩ中にデルタ−１２を有する。上記の構築物をＰＥＴ−Ｄ６ＳＣ１−Ｄ１２ＢＪ−ＣＯと称する（図６）。
【００７４】
いくつかの選択されるクローン中の両方の遺伝子の存在は、ＰＣＲ増幅および配列決定によって確認された（図７）。
【００７５】
組み換えクローンをトリプトファンなしのＳＤ培地（０．６７％酵母Ｎ２ベースＷ／Ｏアミノ酸；２％デキストロース；０．１３％トリプトファンなしのアミノ酸ドロップアウト粉末）中で一晩生育させた。細胞を、５，０００ｒｐｍで１０分間沈殿化し、滅菌水で一度洗浄し、トリプトファンなしのＳＧ培地（０．６７％酵母Ｎ２ベースＷ／Ｏアミノ酸；２％ガラクトース；０．１３％トリプトファンなしのアミノ酸ドロップアウト粉末）中に再懸濁した。培養を３０℃で１日インキュベートし、細胞を沈殿化して凍結乾燥した。脂肪酸プロファイリング用に、脂質抽出を実施して、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を調製し、ＧＣ−ＭＳを使用して分析した。一般的な組み換え酵母クローンの脂肪酸分析結果を下の表に示す。
【００７６】
【表３】
2009510997.tif 000005
【００７７】
デルタ−１２およびデルタ−６不飽和化酵素を発現する酵母クローンが、誘導時にリノール酸およびガンマ−リノレン酸の形成を示すことは、上記の表から明らかである。オレイン酸からリノール酸への生体内変換は、カラシナデルタ−１２不飽和化酵素によって実施される。続くリノール酸のガンマ−リノレン酸への不飽和化は、クローン化ＳＣ１デルタ−６不飽和化酵素によって触媒される。この実験は、酵母中におけるＳＣ１デルタ−６不飽和化酵素の機能的な発現を実証する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＳＣ１のデルタ−６不飽和化酵素と、その他既知のデルタ−６不飽和化酵素とのクラスター形成（全ての種における不飽和化酵素の機能に必須の、ヒスチジンモチーフの存在に留意されたい）。
【図２】ＳＣ１のデルタ−６不飽和化酵素中の脂肪酸不飽和化酵素モチーフおよびチトクロームＢ−５ドメインの存在。
【図３】ＥｃｏＲＩ（Ｅ）およびＰｓｔｌ（Ｐ）で消化されたＳＣ１のゲノムＤＮＡへのデルタ−６不飽和化酵素（全長）のサザンハイブリダイゼーション。Ｍは１ｋｂラダー。（ハイブリダイゼーションの結果は、ＳＣ１中のΔ−６不飽和化酵素の単一コピーの存在を明らかに示した。）
【図４】コンストラクトＰＥＴ−ＳＣ１−Ｄ６の構築図。
【図５】ＧａｌＩプライマーによるクローンの増幅（デルタ−６不飽和化酵素遺伝子の増幅（１．５Ｋｂ）に留意されたい）。
【図６】ＭＣＳＩ中でデルタ−６不飽和化酵素を含有し、ＭＣＳＩＩ中でデルタ−１２不飽和化酵素を含有する、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ構築物の設計図。コンストラクトはＰＥＴ−Ｄ６ＳＣ１−Ｄ１２ＢＪ−ＣＯと称される。
【図７】ＰＥＴ−Ｄ１２−Ｄ６構築物からのΔ−１２およびΔ−６不飽和化酵素の増幅（レーンＭは１ｋｂラダー、１はΔ−１２不飽和化酵素の増幅、２はΔ−６不飽和化酵素の増幅）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009510997.tif 000014
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