(57)【要約】  本発明は核酸の配列決定方法を提供する。本方法は、標的核酸について核酸試料を濃縮するステップを含み、ここで核酸試料は少なくともハイブリダイゼーション選択および増幅の第１ラウンドおよびハイブリダイゼーション選択および増幅の第２ラウンドを通して濃縮される。濃縮された核酸は、固定化されたローリングサークルアンプリコンのショットガンシークエンシングバイハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）を用いる、カンタロープ配列決定技術による配列決定にとって便利な形態である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、核酸配列決定方法：
標的配列における核酸試料を濃縮するステップであって、前記核酸試料が少なくともハイブリダイゼーション選択および増幅の第１ラウンドおよびハイブリダイゼーション選択および増幅の第２ラウンドを通じて濃縮されるステップ；および
固定化されたローリングサークルアンプリコンのショットガンシークエンシングバイハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）によって前記標的配列を配列決定するステップ。
【請求項２】
前記ＤＮＡ試料がゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ試料が：ＤＮＡ断片の集団を生成するために前記ＤＮＡ試料を断片化するステップ；およびプライマー結合部位を含むＤＮＡアダプターを前記ＤＮＡ断片にライゲートするステップ；により、濃縮のために調製される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
約５００またはそれより少ない塩基対のＤＮＡ断片が、前記ＤＮＡ断片の集団から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
約２５０塩基対のＤＮＡ断片が、前記ＤＮＡ断片の集団から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記断片化するステップにより、平滑末端化されたＤＮＡ断片が生成される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡアダプターが、前記平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲートされ、各ＤＮＡアダプターが平滑末端を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１および第２ラウンドのハイブリダイゼーション選択が、前記ＤＮＡ試料を、タグを有する核酸プローブとハイブリダイズするステップ、および前記タグに対するリガンドを有するハイブリダイズされたＤＮＡを捕捉するステップ、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タグがビオチンであり前記リガンドがストレプトアビジンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ストレプトアビジンが磁気ビーズ上に固定化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１ラウンドのハイブリダイゼーション選択により選択されたＤＮＡが、次いで前記第１ラウンドの増幅において増幅される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１ラウンドの増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＣＲが前記ＤＮＡアダプターの前記プライマー結合部位に相補的なプライマーを用いて実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１ラウンドの増幅からの前記増幅されたＤＮＡが前記第２ラウンドのハイブリダイゼーション選択においてさらに濃縮される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２ラウンドのハイブリダイゼーション選択により選択された前記ＤＮＡが次いで前記第２ラウンドの増幅において増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２ラウンドの増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＣＲが前記ＤＮＡアダプターの前記プライマー結合部位に相補的なプライマーを用いて実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＲが、前記５’末端側がタグで修飾されたフォワードプライマーおよび前記５’末端側がリン酸化されたリバースプライマーを用いる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フォワードプライマーの５’末端上の前記タグがビオチンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２ラウンドの増幅の産物が変性され、一本鎖ＤＮＡを生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記タグを有する一本鎖ＤＮＡが捕捉されかつ除去される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タグがビオチンであり、前記ビオチンタグを有する一本鎖ＤＮＡがストレプトアビジンでコートされたビーズで捕捉されかつ除去される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リン酸化５’末端を有する前記一本鎖ＤＮＡを環状化するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記５’−リン酸化一本鎖ＤＮＡが：前記５’および３’末端をオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするステップであって、これにより前記５’および３’末端を近接状態で保持するステップ；および前記一本鎖ＤＮＡを環状化するために前記５’および３’末端をライゲートするステップ；により、環状化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドリンカーがタグを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドリンカーのタグがビオチンであり、前記一本鎖ＤＮＡの環状化後に、前記オリゴヌクレオチドリンカーがストレプトアビジンでコートされたビーズを用いて捕捉され除去される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記環状化されたＤＮＡが固体支持体上に固定化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記環状化されたＤＮＡが、固定化されたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより固定化され、前記固定化されたオリゴヌクレオチドはアミンを介して固定化される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固定化され、環状化されたＤＮＡがローリングサークル増幅により増幅される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ローリングサークル増幅産物がＳＢＨを用いて配列決定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的配列が疾患コホートにおける全ゲノム関連解析から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患コホートが、クローン病、乾癬、はげ、長寿、統合失調症、糖尿病、糖尿病性網膜症、ＡＤＨＤ、子宮内膜症、喘息、自己免疫関連疾患、炎症関連疾患、呼吸器関連疾患、胃腸関連疾患、生殖関連疾患、女性の健康に関連する疾患、皮膚関連疾患、および／または眼科関連疾患のうちの１または複数を有する患者に由来するＤＮＡ試料を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸プローブが細菌人工染色体（ＢＡＣ）から調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項３４】
反復配列が、競合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに先立ってブロックされる、請求項８に記載の方法。
【請求項３５】
固定化されたローリングサークルアンプリコンのＳＢＨによって配列決定するステップが、
複数の環状一本鎖ＤＮＡ鋳型分子を調製するステップであって、各鋳型分子がプライマーアニーリング配列および標的配列を含むステップ；
前記鋳型分子を、プライマーアニーリング配列にアニールする増幅プライマーと接触させるステップであって、これによりアニールプライマー／鋳型複合体を形成するステップ、および前記鋳型分子をローリングサークル増幅により増幅するステップであって、ここで前記ローリングサークル増幅産物が固体支持体上に固定化されるステップ、によって、固定化され増幅された環状ＤＮＡ鋳型分子のランダムアレイ形成するステップ；
前記ローリングサークル増幅産物を試験条件下でプローブパネルとプローブするステップ；
パネル中の各プローブについて前記プローブが前記ローリングサークル増幅産物の前記標的配列にハイブリダイズするか否かを前記試験条件下で判定するステップであって、これにより前記標的配列におけるハイブリダイゼーションスペクトルを得るステップ；
前記標的配列の前記配列を決定するために、各ハイブリダイゼーションスペクトルを、参照データベース内の参照配列における予想されるハイブリダイゼーションスペクトルと比較するステップ；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的配列と前記参照配列との間の配列の差異を判定するステップをさらに含み、ここで前記差異は、一塩基多型、挿入、欠失、選択的スプライシング、選択的転写開始部位、選択的ポリアデニル化、およびマイクロサテライトのうちの１または複数である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記プローブパネルが複数のプローブを含み、ここで：各プローブはレポーター部分を保有する安定化オリゴヌクレオチドであり、各プローブの有効な特異性が３〜１０ｂｐであり、
ここで、前記プローブパネルでは前記標的配列内のすべての位置の少なくとも１０％が前記パネル中の少なくとも１つのプローブと統計的にハイブリダイズする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
各プローブの前記有効な特異性が４〜６ｂｐである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブパネルでは、前記標的配列内のすべての位置の少なくとも２５％が前記パネル中の少なくとも１つのプローブと統計的にハイブリダイズする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記プローブパネルでは、前記標的配列内のすべての位置の少なくとも５０％が前記パネル中の少なくとも１つのプローブと統計的にハイブリダイズする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブパネルでは、前記標的配列内のすべての位置の少なくとも９０％が前記パネル中の少なくとも１つのプローブと統計的にハイブリダイズする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記プローブパネルでは、前記標的配列内のすべての位置の少なくとも１００％が前記パネル中の少なくとも１つのプローブと統計的にハイブリダイズする、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年３月１４日出願の米国仮特許出願第６０／７８１，７３１号明細書の優先権を主張するものであり、その開示内容全体はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、核酸配列決定(sequencing)、および特にＰＣＴ／ＥＰ２００５／００２８７０（国際公開第２００５／０９３０９４号パンフレットに対応）（その開示内容全体はその全体が参照により本明細書中に援用される）に開示された配列決定方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多数の異なる方法がゲノム研究において用いられているが、直接配列決定が群を抜いて最も有用なものである。事実、配列決定が効率的に行われうる場合、ゲノミクス分析の３つの主要なファセット（配列決定、遺伝子型決定および遺伝子発現分析）に対応することが可能となる。例えば、モデル種であれば配列決定可能であり、個体であれば全ゲノム配列決定により遺伝子型を特定可能であり、かつＲＮＡ集団であればｃＤＮＡへの変換後に徹底的に分析可能である。
【０００４】
配列決定技術における進歩により改善可能な他の分析には、エピゲノミクス（例えばメチル化シトシンであれば非メチル化シトシンからウリジンへのビスルファイト変換により同定可能である）、タンパク質−タンパク質相互作用の同定（例えば酵母ツーハイブリッド実験にて得られたヒットの配列決定による）、タンパク質−ＤＮＡ相互作用の同定（例えば染色体の免疫沈降後に得られるＤＮＡ断片の配列決定による）、ならびにその他多数が含まれる。
【０００５】
したがって、ＤＮＡ配列決定においては極めて効率的な方法が望ましい。具体的には、ハイスループット配列決定法が必要とされる。例えば、生体細胞は約３００，０００コピーのメッセンジャーＲＮＡ（各々、平均で約２，０００塩基長）を有する。単細胞内であってもＲＮＡに対する完全な配列決定を行うには、６億のヌクレオチドが分析されなければならない。何十種類もの異なる細胞種からなる複合組織内では細胞種に特異的な転写産物が希釈化されることから、課題はさらに一層困難なものになる。これらの要求を満たすには、ギガベースの１日のスループットが必要となる。以下の表は、様々な配列決定プロジェクトにおいて必要とされるスループットについてのいくつかの推定値を示す（数値は他に指示がない限りヒトの配列決定に対するものである）。
【０００６】
【表１】
2009529876.tif 000002
【０００７】
多数の異なる配列決定技術が開発されている。
【０００８】
蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いるサンガー配列決定（Sanger et al., PNAS 74 no. 12: 5463-5467, 1977）が最も広く用いられる方法であり、９６本、さらには３８４本のキャピラリーシーケンサー内での自動化が成功している。しかし、サンガー法は鋳型の各塩基位置に対応する多数の断片の物理的分離に左右されることから、超ハイスループットの配列決定（最高の現行の機器は１日当たり〜２００万ヌクレオチドの配列を生成する）に対して容易に拡張可能なものではない。
【０００９】
シーケンシングバイハイブリダイゼーション（Sequencing-by-hybridization）（ＳＢＨ）では、特定の長さまでのあらゆる考えられ得る配列を表すプローブパネルが用いられる（例えばすべての１０−ｍｅｒｓのセットは１００万を超えるプローブを必要とする）。しかし、所与のすべての「ｋ−ｍｅｒｓ」のセットにおいては、ｋはマイクロアレイ表面上に適合可能なプローブの数に制限されることになる。さらに、ハイブリダイゼーションデータからの鋳型配列の再構築は複雑なものであり、ハイブリダイゼーションの動態の性質およびより大きい鋳型を配列決定するのに必要とされるプローブの数が組み合わせ的に莫大であることより一層困難なものになる。それ故、各鋳型に対して数百万のプローブを保有する１つのマイクロアレイが必要とされることからスループットは低い。
【００１０】
ＳＢＨに対する選択的アプローチは、鋳型を固体表面上に配置し、次いでプローブパネルを連続的にハイブリダイズすることである。このアプローチを用い、多数の鋳型を同時に配列決定可能であるが、プローブパネルのサイズがプロトコルの連続性により必然的に制限される。結果として、極めて短い鋳型に限って配列決定されうる。事実、ｋ−ｍｅｒのプローブで配列決定可能な、予想される長さは２ｋ、すなわち１６３８４のプローブを用いて１２８ヌクレオチドにすぎない（ｋ＝７）。現実のハイブリダイゼーション時間の場合、かかるプロトコルは実現できない。Drmanac et al．, Nature Biotech 16:54-8 (1998)では、数百の分離膜上に各鋳型を複製することにより（次いでこれを同時ハイブリダイズし得る）、この課題への対処が試みられている。しかし、この戦略はスループットを制限し、鋳型調製方法に対してさらなる要求を提示する。
【００１１】
ナノポア配列決定（例えば米国特許第６，３５５，４２０号明細書）では、ＤＮＡ分子が２つの反応チャンバを分離するナノポアを強制的に通過することで、チャンバ間の伝導性の変化により結合プローブの検出が可能になる。あらゆる考えられるｋ−ｍｅｒｓのサブセットでＤＮＡを修飾することにより、部分配列を推定することが可能である。これまで、ナノポアアプローチによって完全配列を取得するための実行可能な戦略は全く提案されておらず、たとえ実行可能であっても原理的にずれた（staggering）スループットが得られうる（３０分以内にほぼ１のヒトゲノムのオーダーで）。
【００１２】
合成による配列決定（ＳＢＳ）に対して様々なアプローチが設計されており、それらは取り込まれたヌクレオチドから放出される副産物を検出するかまたは永久的に付着した標識を検出することのいずれかを含む。ＳＢＳにおけるスループットを増大させるため、多数の鋳型上、例えばスライドグラス表面または類似の反応チャンバ上での各塩基の取り込みを同時に画像化することは望ましいであろう（例えば米国特許第４，８６３，８４９号明細書および米国特許第５，９０８，７５５号明細書を参照）。
【００１３】
例えば、パイロシーケンシング（例えば国際公開第９３２３５６４号パンフレット）では、取り込まれた各モノマーの副産物を無機二リン酸塩（ＰＰｉ）の形態で検出することにより鋳型の配列が決定される。全鋳型分子の反応の同調を保持するため、モノマーが１つずつ付加され、取り込まれなかったモノマーが次の付加前に分解される。しかし、複数の取り込みが阻止できないことから、ホモポリマーサブ配列（同一モノマーの進行）が問題を引き起こす。最終的に真のシグナルを無効にする鋳型の小画分での取り込みミス（misincorporation）に起因し、最終的に同調がくずれる。最良の使用可能な系でも、約２００，０００塩基／日の複合スループットで約２０〜３０塩基しか読み込むことができない。
【００１４】
米国特許第６，２７４，３２０号明細書では、光ファイバーに付着した縦列反復の線状一本鎖ＤＮＡ分子を生成するというローリングサークル増幅の使用について記載されており、ここで次いで同分子は、同時進行可能なパイロシーケンシング反応で分析される。かかる系のスループットは、原理的には表面積（鋳型分子の数）、反応速度およびイメージング機器（分解能）によってのみ制限を受ける。しかし、実際には、検出可能なシグナルへの変換前にＰＰｉが検出器から拡散することを防止する必要があることにより、反応部位の数が制限される。米国特許第６，２７４，３２０号明細書では、各反応が光ファイバーの先端に位置するミニチュアの反応容器内で生じるように制限されることから、配列の数が１つのファイバー当たり１つに制限される。
【００１５】
さらに一層の制限を受ける点はパイロシーケンシングによって得られる短いリード長である（５０ｂｐ未満）。かかる短い配列は、全ゲノム配列決定において常に有用とは限らず、一連の複雑なバランスをとるための反応が、リード長のさらなる大幅な延長を困難にする。極まれに、特異的鋳型についてリード長が最大で１００ｂｐを有することが報告されている。
【００１６】
放出された標識を検出するスキームが米国特許第６，２５５，０８３号明細書に記載され、ヌクレオチドの連続付加および標識の検出（これは次いでエキソヌクレアーゼを用いて除去される）の場合のスキームが国際公開第０１／２３６１０号パンフレットに記載されている。放出された標識または副産物を検出することの主な利点は、鋳型が次のステップで標識を含まない状態になるという点である。しかし、シグナルが鋳型から外部に拡散することから、かかる配列決定スキームをマイクロアレイなどの固体表面上で同時に実施することは困難でありうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
より効率的で改善された配列決定方法、例えばより高いスループットを有するものであれば、より効率的で改善されたゲノム分析が可能となる。
【００１８】
単一疾患、複合疾患のいずれにしても、ヒト疾患の根底にある遺伝子変異体および突然変異に対する探索には、多数の課題が存在する。複合疾患の場合、これらの探索の結果、一般に疾患リスクに関連した一塩基多型（ＳＮＰ）またはＳＮＰのセットが得られる。これまで、複合疾患、例えばクローン病、乾癬、喘息および統合失調症に関連したすべての遺伝子および遺伝形質の同定は可能ではなかった。主な理由は、ゲノム分析において利用可能な方法が時間消費的であることからプロセスにおけるボトルネックとなることにある。
【００１９】
全ゲノム関連解析（whole genome association studies）（ＷＧＡＳ）では多数の候補領域（ＣＲ）が同定されており、かかる領域を配列決定し、疾患に関連した遺伝子、遺伝子変異体および多型を同定する必要がある。しかし、ＣＲはかなり大規模でありうることから（１００ｋｂ超）、多数の個体での多数のＣＲの配列決定は膨大な配列決定上の負荷をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の概要
本発明は、核酸プローブのパネルが、配列情報が望まれる核酸にアニールされるという「高密度フィンガープリンティング」に関する。各プローブと標的核酸の間の配列相補性の存在または不在を判定することにより、配列情報が決定される。本発明は、部分的には鋳型に関連する参照配列の使用に基づくものであり、既存の配列決定技術に伴う様々な課題を克服し、標準の試薬および装置を用い、短時間での大量の配列の取得を可能にする。好ましい実施形態が更なる利点を提供する。
【００２１】
本発明は、配列分析のためのアルゴリズムおよび技術、ならびに配列決定のための装置およびシステムにも関する。本発明は、当該技術分野で容易に利用可能な標準の卓上機器のみを用いて、配列決定における膨大な取り組みの自動化を可能にする。
【００２２】
本発明は、連続ステップでの、プローブパネル（各プローブが１または複数のオリゴヌクレオチド分子を含む）のハイブリダイゼーション、ならびに各プローブについて鋳型にハイブリダイズしているか否かを判定するステップと、それによる標的の「ハイブリダイゼーションスペクトル」を形成するステップと、を含む。好ましくは、プローブパネルおよび鋳型鎖の長さが、任意の所与の鋳型鎖と「指示プローブ」（鋳型鎖上に１回で正確にハイブリダイズするプローブ）との広範な網羅性を確保するように調節される。本発明は、得られたハイブリダイゼーションスペクトルを鋳型鎖に類似の１または複数の配列を有することが予想される参照データベースと比較するステップと、１または複数の参照配列内での鋳型鎖の有望な位置を判定するステップと、をさらに含む。さらに本発明は、鋳型鎖のハイブリダイゼーションスペクトルを同位置での予想されるハイブリダイゼーションスペクトルと比較することにより、鋳型鎖の少なくとも部分的な配列情報を取得することを可能にする。
【００２３】
さらに本発明は、ゲノム分析およびＤＮＡ変異に関する試験を含むゲノミクスおよび遺伝学の分野に関する。特に、本発明は目的のＤＮＡセグメントについてのＤＮＡ試料の濃縮を検討する。目的のセグメントは、例えば疾患の全ゲノム関連解析から同定される候補領域（ＣＲ）を表す場合がある。ＣＲは、ゲノムＤＮＡ配列；遺伝子間ＤＮＡ配列；遺伝子要素に対応する配列、例えばプロモーター、エクソン、イントロン、ＵＴＲ、および保存された非コード配列；またはｃＤＮＡ配列でありうる。本発明は、特に、疾患に関連した、一塩基多型（ＳＮＰ）、多型の他のタイプ（挿入、欠失、マイクロサテライト）、ならびに特異的な対立遺伝子およびハプロタイプを同定するのに有用である。本発明の方法は、薬理ゲノム学、診断学、患者治療学の分野におけるＤＮＡの変異および多型の発見、ならびに疾患または複合遺伝形質に対する個人の感受性および／または特定の薬剤に対する個人の応答性を予測するための遺伝子ハプロタイプ情報の利用を提供し、それにより集団群の遺伝的差異に対して調整された薬剤が開発され、かつ／または適切な集団に投与されうる。
【００２４】
本発明は、高速で、正確でかつ費用効率が高いＣＲの選択および配列決定を行うための方法を提供する。詳細には、本発明はＤＮＡ断片の濃縮技術を「カンタロープ(Cantaloupe)」（国際公開第２００５／０９３０９４号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に詳細に記載）と称される配列決定技術とつなぐものである。Cantaloupe技術は、全ヒトゲノムの配列決定を約１０日で可能にする。濃縮技術について記載がなされているが（例えば、Lovett et al．, PNAS 88:9628- 9632, 2005；およびBashiardes et al．, Nat．Methods 2(1): 63-69, 2005（それら全体が参照により本明細書中に援用される）を参照）、本発明はCantaloupe配列決定プラットフォームに適合したＤＮＡ断片を生成する濃縮方法を提供する。
【００２５】
本発明の方法を用い、ゲノムＤＮＡ断片における目的の配列について濃縮がなされ、次いでそれがCantaloupe技術により簡便かつ容易に配列決定されることで、時間効率的で費用効率的な様式での大きいＤＮＡ断片のハイスループットな配列決定が可能になる場合がある。典型的な実施形態では、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡが断片化され、かつ所望のサイズの断片が選択される。本明細書中に、より十分に記載された、プライマー結合部位を有するＤＮＡアダプターが断片にライゲートされる。核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション選択および増幅を少なくとも２ラウンド行うことにより、濃縮試料が生成される。次いで、濃縮試料の一本鎖断片が生成され、環状化され、かつ固体支持体に固定化される。次いで、固定化ＤＮＡはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の機構により複製され、ローリングサークル（ＲＣ）増幅産物のランダムアレイが形成される。一連のプローブがＲＣ産物に連続的にハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーションスペクトルが生成される。全部で１，０２４の考えられる異なるプローブにおいては、プローブは（例えば）５つの可変塩基および２つの固定塩基を有する７−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドからなる。ハイブリダイゼーションスペクトルは各断片に対するバーコードに類似し、次いでそれは参照配列と比較されうる。次いで、「アセンブリ（assembling）」、および全断片バーコードを参照ゲノムと比較することにより、標的核酸の配列が再構築される。
【００２６】
したがって、本発明は、例えばゲノムＤＮＡの試料由来の目的の領域を選択し、かつ自動配列決定システム、例えばCantaloupe技術への準備が整った形態の遺伝子原料を生成する機能を有する。本発明の方法により、ＤＮＡ変異の迅速で、効率的かつ費用効率的な分析および同定がもたらされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
標的配列の濃縮
本発明は、その後に固定化ローリングサークルアンプリコンにおいてシーケンシングバイハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）を行うための、核酸試料における目的の標的配列を濃縮する方法を包含する。本発明の方法は、ハイブリダイゼーション選択および増幅の第１ラウンドならびにハイブリダイゼーション選択および増幅の第２ラウンドを含む。核酸試料のさらなる濃縮のため、選択および増幅の追加ラウンドが用いられる場合がある。
【００２８】
本発明に従い、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡなどの任意の核酸試料が用いられうる。
【００２９】
目的の標的核酸は、疾患コホートにおける全ゲノム関連解析から同定される核酸セグメントでありうる。かかる疾患コホートは、クローン病、乾癬、はげ、長寿、統合失調症、糖尿病、糖尿病性網膜症、ＡＤＨＤ、子宮内膜症、喘息、自己免疫関連疾患、炎症関連疾患、呼吸器関連疾患、胃腸関連疾患、生殖関連疾患、女性の健康に関連する疾患（women’s health related disease）、皮膚関連疾患、および眼科関連疾患などの、疾患または複合遺伝形質(complex genegtic traits)を有する患者に由来するＤＮＡ試料を含みうる。
【００３０】
核酸試料、例えばＤＮＡ試料は、濃縮のため、ＤＮＡ試料を断片化してＤＮＡ断片の集団を生成し、ＤＮＡアダプターをＤＮＡ断片にライゲートすることにより調製されうる。一実施形態では、ＤＮＡアダプターは、ハイブリダイゼーション選択後に増幅を促進するためのプライマー結合部位を有する。様々な断片化方法は当該技術分野で既知であるが、一実施形態ではＤＮＡ試料はDNaseIおよびマング・ビーン(Mung Bean)ヌクレアーゼを用いて分画されて平滑末端化されたＤＮＡ断片が生成され、これにより、やはり平滑末端を有するＤＮＡアダプターがＤＮＡ断片に平滑末端ライゲート（blunt-end ligated）されうる。
【００３１】
一実施形態では約５００またはそれより少ない塩基対のＤＮＡ断片がＤＮＡアダプターに対するライゲーション用に選択され、別の実施形態では約２００以下または約２５０以下の塩基対のＤＮＡ断片が選択される。
【００３２】
本発明の典型的な実施形態では、ハイブリダイゼーション選択の第１および第２のラウンドは、上記のように断片化されかつＤＮＡアダプターにライゲートされうるＤＮＡ試料を、タグを有する核酸プローブとハイブリダイズするステップを含む。一実施形態では、核酸プローブはビオチン化細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。次いで、ハイブリダイズされたＤＮＡは、例えばストレプトアビジンでコートされたビーズを用いて物理的に捕捉可能である。それ故に典型的な実施形態では、タグおよびリガンドはそれぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジンである。ストレプトアビジンが粒子またはビーズ、例えば磁気ビーズの上に含有されることで、捕捉されたハイブリダイズ複合体の分離が促進されうる。極めて多数の他の等価なタグが当該技術分野で既知であり、それは本発明と併せて用いられうる。
【００３３】
ハイブリダイゼーション選択の第１ラウンドにより選択された目的の核酸は、引き続き増幅の第１ラウンドにおいて増幅される。増幅の第１ラウンドは例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施可能であるが、当該技術分野で既知の任意の増幅方法を用いて実施可能である。増幅は、ＤＮＡアダプターに相補的なプライマーを用いると最も容易に実施可能であり、上記のようにＤＮＡ断片にライゲート可能である。
【００３４】
増幅の第１ラウンドから増幅された目的の核酸は、上で略説し、下記により詳述される技術を用い、ハイブリダイゼーション選択の第２ラウンドにおいてさらに濃縮される。次いで、ハイブリダイゼーション選択の第２ラウンドにより選択された目的の核酸が増幅の第２ラウンドで続けて増幅される。増幅の第２ラウンドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施可能であるだけでなく、当該技術分野で既知の任意の増幅方法を用いて実施可能である。第２の増幅はまた、ＤＮＡアダプターに相補的なプライマーを用いると最も容易に行われ、同プライマーは上記の典型的な実施形態において核酸断片にライゲートされる。
【００３５】
増幅の第２ラウンドあるいは場合により増幅の最終ラウンドでは、プライマーを修飾する(modify)ことでシーケンシングバイハイブリダイゼーションのための調製がさらに容易になる。例えば、第２ラウンドでの増幅プライマー、例えばフォワードプライマーにおける５’末端側がタグ、例えばビオチンタグで修飾され、かつ他のプライマー（例えばリバースプライマー）における５’末端側がリン酸化される場合がある。この実施形態によると、次いで、第２ラウンドの増幅産物が変性されて一本鎖核酸が生成され、その直後、タグ化された鎖が、タグに対するリガンド（例えばストレプトアビジン）を用いて捕捉されかつ除去されうる。次いで、一本鎖増幅産物のリン酸化鎖が環状化される。一実施形態では、リン酸化鎖は、５’および３’末端をオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズすることによって５’および３’末端を近接状態で保持し、５’および３’末端をライゲートして一本鎖ＤＮＡを環状化することにより環状化される。ライゲーションに先立ち、ギャップフィル重合ステップを用いて２つの末端の間の任意のギャップを埋めることが可能である。環状化の促進に用いられるオリゴヌクレオチドリンカーもまた、タグ化し（例えばビオチンで）、環状化後のその除去を促進可能である。
【００３６】
次いで、環状化された一本鎖分子は固体支持体上に固定化されうる。目的の核酸は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば本明細書中に記載のアミノ化されたオリゴヌクレオチドを用いて固定化されうる。次いで、固定化、環状化された目的の核酸は、国際公開第２００５／０９３０９４号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載のように、ローリングサークル増幅を用いて増幅され、ＳＢＨを用いて配列決定される。
【００３７】
疾患または複合遺伝形質（例えばクローン病および乾癬）における全ゲノム関連解析に基づくと、候補領域の平均サイズは約０．５メガベース（０．５Ｍｂ）である。本発明の一実施形態では、疾患に関連したすべての候補領域が選択される。別の実施形態では、一部の候補領域のみが選択される。さらに別の実施形態では、疾患に関連した単一の候補領域または候補領域の一部が分析のために選択される。
【００３８】
一旦配列決定のために領域が選択されると、核酸プローブの選択または設計が可能である。一般に、核酸プローブは染色体領域全体、例えばＷＧＡＳ試験から得られる候補領域を網羅する特異的なＤＮＡ分子である。プローブは候補領域の一部をも網羅しうる。適切なプローブはＹＡＣ、ＢＡＣ、コスミド、またはファージを含む。一実施形態では、核酸プローブは市販のＢＡＣ分子から選択され、目的の候補領域に特異的である。別の実施形態では、ＢＡＣ分子は非市販の供給源から選択されるかまたは特定の目的の個体から生成される。
【００３９】
核酸プローブは、当該技術分野で既知の一般の分子生物学技術を用いて調製可能である。例えばＢＡＣ−ＤＮＡは、周知の方法により、例えばQIAGEN（登録商標）Large-Construct Kitを（製造業者による説明のように）用いて、単離され、精製されうる。
【００４０】
ＤＮＡ試料は特定の疾患に罹患した個体（疾患試料）または非罹患個体（一実施形態では対照（対照試料）として用いられうる）から選択されうる。例えば１〜５０の試料が罹患個体（疾患試料）から選択されることができ、または別の実施形態では５０を超える試料が罹患個体から選択される。疾患試料は、目的の候補領域をすべて網羅する、リスク、中立、保護的およびまれなハプロタイプを含む、ハプロタイプの特定の組み合わせを表す。さらに別の実施形態では、健常個体由来の１〜５０の試料が対照として選択されるかまたは健常個体由来の５０を超える試料が対照として選択される。
【００４１】
ゲノムＤＮＡは、当該技術分野で任意の既知の方法を用いて単離され、調製されうる。ゲノムＤＮＡの品質はゲル電気泳動により評価可能であり、かつＤＮＡ濃度は標準的方法、例えばピコグリーン色素のＤＮＡ定量方法により判定可能である。
【００４２】
ゲノムＤＮＡの標準的な調製および精製を行った後、ゲノムＤＮＡ試料を２つの酵素ステップにより連続的に処理することで、平滑末端化されたＤＮＡ断片の生成が可能である。一実施形態では、ＤＮＡ断片は約２５０塩基対である。別の実施形態では、断片は２５０より短い塩基対、すなわち約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐなどである。別の実施形態では、断片は２５０より長い塩基対、すなわち約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ以上のものである。本発明の好ましい標的断片のサイズは約２００ｂｐ〜約４００ｂｐの範囲である。本発明の酵素反応は、任意の特定の酵素反応に限定されない。一実施形態では、酵素はDnaseIおよびマング・ビーン・ヌクレアーゼＩである。別の実施形態では、他の非酵素的な分画化方法、例えば超音波処理または剪断がさらに本明細書中に記載のように用いられうる。好ましくは、断片化方法により平滑末端化された断片がもたらされる。
【００４３】
次いで、得られた平滑末端化断片はＤＮＡアダプターにライゲートされる。一実施形態では、平滑末端化断片は以下のＤＮＡアダプターにライゲートされる。
アダプター−１
５’−ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴ−３’（配列番号１）
３’−ＣＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＧ−５’（配列番号２）
アダプター−２
５’−ＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧＣ−３’（配列番号３）
３’−ＴＣＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣ−５’（配列番号４）
【００４４】
ＤＮＡアダプターは、一末端およびゲノムＤＮＡ断片の平滑末端部分上でのライゲーションのみを許容するように設計される。ライゲーション反応は任意の方法により実施可能であり、多くは当該技術分野で既知である。一実施形態では、アダプターはゲノムＤＮＡ断片との関連で過剰に付加される。
【００４５】
次いで、アダプター（ゲノム−アダプターＤＮＡ）にライゲートされた断片は、任意の分離および精製方法によって分離、精製され、ここでそれら方法の多くは当該技術分野で既知であり、例えば１２％非変性ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％Metaphorアガロースゲル（Cambrex, Baltimore,MD）上での電気泳動によるものである。好ましくは、目的の断片は電気泳動により分離され、溶出され、ゲルから精製され（ＧＦＸカラム、（GE Healtcare））、任意のＤＮＡ定量方法、例えばピコグリーン色素ＤＮＡ定量により定量される。
【００４６】
別の実施形態では、ゲノム−アダプターＤＮＡは反復配列から精製される。この精製は、一般に競合ＤＮＡ、例えばビオチン化Ｃｏｔ１／２（Invitrogen）とのハイブリダイゼーション反応により実施される。さらに別の実施形態では、反復配列を除去するための任意の既知の精製方法が利用可能である。得られた精製ゲノム−アダプターＤＮＡは、本発明の第１の濃縮ステップにおける入力ゲノムＤＮＡなどで使用可能である。
【００４７】
ＢＡＣ  ＤＮＡが核酸プローブとして用いられる場合、ＢＡＣ  ＤＮＡは、ビオチン分子の断片化されたＢＡＣ−ＤＮＡへの付加によりタグ化または標識されることで、他の反応成分からの容易な分離のための手段が提供されうる。この実施形態では、ＢＡＣ−ＤＮＡは例えばストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズで捕捉可能である。ＢＡＣ  ＤＮＡのタグ化または標識する方法は、例えばビオチン−ニックトランスレーションミックス（Biotin-Nick Translation Mix）など、当該技術分野で既知である。ニックトランスレーション法では、Dnaseおよび大腸菌（E.coli）のＤＮＡポリメラーゼＩの組み合わせの使用によりＤＮＡの一方の鎖にニックが入れられ、次いでポリメラーゼがニック部位から再合成される際に標識ヌクレオチドが取り込まれる。ＢＡＣ  ＤＮＡ標識における等価な方法が当該技術分野で既知であり、それはこの実施形態と併せて用いられうる。
【００４８】
ゲノムＤＮＡの調製については、プローブ上のＢＡＣ−ＤＮＡリピートが、好ましくは競合ＤＮＡ、例えばＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Invitrogen）でブロックされる。別の実施形態では、ＢＡＣ−ＤＮＡプローブ上の反復配列のブロッキングについては任意の他の既知の方法が用いられうる。
【００４９】
本発明の方法は、濃縮の少なくとも１ラウンド、好ましくは少なくとも２ラウンドを含む。簡潔には、第１ラウンドでは全ゲノムＤＮＡから標的化ＤＮＡ断片が濃縮され、一方、第２ラウンドでは第１ラウンドからの標的化ＤＮＡ断片が混入断片(contaminating fragment)の量を低減することにより濃縮される。両方の濃縮ステップでは、好ましい最終産物は〜２５０ｂｐのＤＮＡ断片である。別の実施形態では、かかる断片は２５０ｂｐ未満、すなわち約２５ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約５０ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２５０ｂｐ、または約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐでありうる。別の実施形態では、断片は２５０ｂｐ超、すなわち約３００ｂｐ以上、約３５０ｂｐ以上、約４００ｂｐ以上、約４５０ｂｐ以上、約５００ｂｐ以上、約１０００ｂｐ以上などでありうる。
【００５０】
本発明における濃縮の好ましいレベルは少なくとも１０００倍である。しかし、少なくとも２００倍以上、少なくとも５００倍以上、少なくとも１５００倍以上、少なくとも２５００倍以上、少なくとも５０００倍以上などの濃縮レベルも意図される。本発明のＤＮＡ断片は、濃縮後、Cantaloupe配列決定技術にとって必要な特徴を有する。
【００５１】
一実施形態では、各濃縮ステップは、核酸プローブと核酸試料（例えばアダプターを有する断片化されたゲノムＤＮＡ）の間のハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション産物の固体媒体（ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズなど）への結合、選択された核酸の増幅、および核酸のクリーンアップステップを含む。
【００５２】
一実施形態では、核酸プローブとＤＮＡ試料（例えば上記のアダプター−ゲノムＤＮＡ）の間のハイブリダイゼーションは、精製アダプター−ゲノムＤＮＡと、ブロックされたＢＡＣ−ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション反応を含む。次いで、ハイブリダイゼーション混合物は、ハイブリダイゼーション混合物を認識可能および結合可能な任意の固体媒体にハイブリダイズされる。好ましくは、かかる固体媒体は、かかるハイブリダイゼーション複合体の単離を容易にするというさらなる特徴を含む。一実施形態では、かかる固体媒体はストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズである。ハイブリダイゼーション反応は当該技術分野で周知であり、本発明はハイブリダイゼーションにおける任意の特定の条件にそれ自体を限定することはない。典型的な条件が本明細書の実施例１に示される。固体媒体から回収されたＤＮＡは、その後のＰＣＲ増幅反応での使用のために精製され、濃縮される。他の既知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ、ＳＤＡなども用いられうる。
【００５３】
本発明における第１のＰＣＲ増幅ステップは２つのプライマー（一方がフォワードでかつもう一方がリバース）を用いて実施され、そのそれぞれはゲノムＤＮＡ断片にライゲートされたアダプター配列を有する。典型的な実施形態では、プライマー配列は次のとおりである。
フォワード：５’−ＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５）
リバース：５’−ＣＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号６）
【００５４】
ＰＣＲ増幅試薬については当該技術分野で十分に記載がなされており、ヌクレオチド、酵素および緩衝液を有する。サイクル用のパラメータは通常、初期変性ステップと、その後の２５〜３０サイクルを有し、各サイクルは変性、アニーリングおよび伸長ステップを有する。増幅産物は、任意のＤＮＡ精製の方法またはキット、例えばQIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を用いて精製され、第２の濃縮ステップにおける入力(input)ＤＮＡとして保持される。
【００５５】
本発明の第２の濃縮は、第１の濃縮からの増幅産物である入力ＤＮＡを用い、第１の濃縮ステップにおいて記載のように実施される。第２の増幅は、上記の第１の濃縮に記載の第１の増幅と同様である。しかし、第２のまたは最終の濃縮ステップでは、プライマーを修飾して、Cantaloupeによる配列決定のための一本鎖ＤＮＡの調製および環状化を容易にすることが可能である。例えば、プライマーは、先行する濃縮ステップで用いられるプライマーに対して塩基配列が同一でありうるが、一方のプライマーがその５’末端側にタグ、例えばビオチンタグを含み、かつ他方が５’リン酸塩を有する場合がある。例えば、
フォワード：５’−ビオチン−ＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号７）
リバース：５’−ＰＨＯ−ＣＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号８）
に示されるように、フォワードプライマーが５’ビオチンを有し、かつリバースプライマーが５’リン酸塩を有する場合がある。
【００５６】
プライマーにおけるこれらの修飾（ビオチン化およびリン酸化）は、得られるＤＮＡ断片が、一本鎖ＤＮＡの調製および環状化について準備が整い、Cantaloupe配列決定技術による簡便な配列決定を可能とすることを保証する。特に、ストレプトアビジンを含有する固体媒体を用いてビオチン化鎖を試料から捕捉し、除去することができ、それにより（５’末端側にリン酸基を有する）相補鎖が精製され、単離される。次いで、（５’末端側に存在するリン酸基とともに）生成された線状の一本鎖断片が、分子の５’および３’末端側にハイブリダイズ可能なリンカーとともにインキュベートされることで、２つの末端が近接状態になりうる。酵素反応、例えばＤＮＡリガーゼとのライゲーションにより、５’および３’末端が連結される。重合ギャップフィル反応は、ライゲーションに先立って２つの末端間の任意のギャップを埋めるために用いることも可能である。典型的な実施形態では、環状化に役立つリンカーは、
５’−ビオチン−ＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号９）
である。
【００５７】
上で示されるように、このリンカーは環状化分子の試料からのその除去を容易にするための標識またはタグも有しうる。
【００５８】
次いで、環状化された一本鎖ＤＮＡ分子はローリングサークル増幅のために固定化される。典型的な実施形態では、精製された環状分子の固定化においてはAsper BiotechのGenoramaＴＭ  SALの０．１５または１ｍｍのスライドが（処理および保存における製造業者の使用説明書に従い）用いられる。別の実施形態では、市販の任意のスライドを用い、環状分子を固定化してもよい。
【００５９】
一実施形態では、アミノ化オリゴヌクレオチド（下記図Ａを参照）を用い、環状化分子がスライドに固定される。例えば、以下の典型的なオリゴヌクレオチドが用いられうる。
５’ＸＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＧ３’  ＲＣＡ−Ｇ−ＲＩＮＧ（配列番号１０）
Ｘ＝ＮＨ２−（ＣＨ２）６−ＰＯ４−オリゴ
【化１】
2009529876.tif 000003
【００６０】
本発明では、特許出願、国際公開第２００５／０９３０９４号パンフレット中に完全に記載されかつ参照により本明細書中に援用される核酸配列決定技術が、本明細書中に記載の方法により濃縮される候補領域を配列決定するための方法として用いられる。
【００６１】
好ましい実施形態では、本明細書中に記載の濃縮方法により処理されかつスライドグラス上に固定化されるすべての候補領域が、Cantaloupe配列決定技術により処理される。
【００６２】
ＤＮＡ配列決定
上記のように、配列決定のために、環状一本鎖ＤＮＡ鋳型分子が調製される。これらの各鋳型分子はプライマーアニーリング配列および、配列情報が望まれる標的配列を含む。配列決定においては、固定化された環状ＤＮＡ鋳型分子のランダムアレイが形成された後、ローリングサークル増幅が、プライマーアニーリング配列にアニールする増幅プライマーを用いて行われる。次いで、ローリングサークル増幅産物が試験条件下でプローブパネルとハイブリダイズされることで、パネル中の各プローブにおいてプローブがローリングサークル増幅産物の標的配列にハイブリダイズするか否かが判定され、それにより標的配列におけるハイブリダイゼーションスペクトルが得られる。次いで、ハイブリダイゼーションスペクトルを参照データベース内の参照配列についての予想ハイブリダイゼーションスペクトルと比較し、標的核酸の配列を決定することが可能である。
【００６３】
ローリングサークル増幅により環状一本鎖鋳型分子を増幅するステップは、増幅プライマーの伸長および鎖置換を引き起こす条件下でポリメラーゼおよび三リン酸塩を添加して、標的配列の複数のコピーを含むタンデムリピート型増幅産物を形成するステップを含みうる。
【００６４】
用いられるプローブパネルは、下記にさらに説明されるように、完全なパネルまたは部分的なパネルでありうる。
【００６５】
参照配列は標的に対して類似した配列となる。参照配列と標的の間の類似性は多数の方法で測定可能である。例えば、同一のヌクレオチド位置の割合が一般に用いられる。例えばSmith-Watermanアラインメントなどのより高度な測定では、挿入および欠失への対応が可能であり、Durbin et al． "Biological Sequence Analysis" (Cambridge University Press 1998）にあるような、確率類似性スコアが提供される。
【００６６】
本発明の方法において必要とされる類似性の程度が、用いられるプローブの数および特異性、ハイブリダイゼーションデータの質、鋳型の長さおよび参照データベースのサイズを含むいくつかの要素により判定される。例えば、シミュレーションによると、マッチおよびミスマッチプローブの間の融点（℃）の差異があるという仮定の下（１℃の変動係数の下）で、２５６のプローブと１００ｂｐの鋳型を有する参照としてのヒトゲノムの使用、次いで最大５％の配列の差異が許容されうることが示される。これは例えば、参照としてヒトゲノムを用いたゴリラゲノムの配列決定に対応する。さらに、プローブの数の増加、鋳型の長さの減少またはマッチ／ミスマッチの識別の改善により、例えば５〜１０％、最大で１０％、５〜２０％、１０〜２０％または最大で２０％など、類似性がより低い配列の参照としての使用が可能になる。
【００６７】
本発明は、再配列決定、発現プロファイリング、遺伝的変動性の分析または評価、およびエピゲノミクスを含む様々な方法において適用可能である。．
【００６８】
様々な実施形態が以下のように実施されうる。
【００６９】
試料を断片化することで短い断片のショットガンライブラリーが生成される。特に配列の濃縮が望ましい場合、先の項目に記載の断片化方法が用いられうる。例えば、
酵素的：
○（Ｍｎ２＋の存在下で）DnaseIを用いる分解、次いでダングリング（dangling）ｓｓＤＮＡ末端の充填および／または酵素的短縮（enzymatic shortening）、
○中頻度カッター、例えばＭｂｏｌなどによる切断、
○高頻度カッター、例えばＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＪＩ＊などによる部分的切断、
○制限酵素の混合物による切断
機械的：
○フレンチプレス；
○超音波処理；
○剪断；
これら各々の次に酵素的短縮および末端修復が行われることがある。
ＰＣＲ
○六量体などのランダムプライミング配列（場合により入れ子ＰＣＲの配列によるテール付加）の使用；
○縮重プライマーまたは低ストリンジェンシー条件を用いるＰＣＲ
○遺伝子ファミリーに特異的なプライマー（など）を用いるＰＣＲ
を含む、断片を生成する他の酵素的および／または機械的方法が用いられうる。
【００７０】
ＰＣＲ技術の場合、このステップは、場合によりプライマー結合部位、例えばＲＣＡ（ローリングサークル増幅）プライマーアニーリング部位または濃縮用のアダプターを組み込む場合がある。
【００７１】
場合により、断片化ステップ後、ステップ「Ｘ」がさらに以下に記載のように実施されうる。
【００７２】
ＲＣＡプライマーアニーリング配列が断片に付加される。これは例えば、断片をベクター（例えば細菌ベクター、ファージなど）にクローニングし、次いでクローニング部位ならびにプライマーモチーフの外側に挿入された制限酵素を用いる切断で断片とすることによるもの；または一末端もしくは両末端での二本鎖アダプターのライゲーションによるもの；または各末端でのヘアピンアダプターのライゲーションによるもの（それはまた同時環状化をもたらす）、であり得る。組み込まれ得る、選択的、追加的かつ機能的特徴は、環状化の助けになる特徴および／または、ヘルパーオリゴが下流分析でのＦＲＥＴにおけるドナーまたはアクセプターとして機能しうる場合にはヘルパーオリゴ結合部位の特徴を含む。
【００７３】
場合により、ステップ「Ｘ」がさらに以下に記載のように実施されうる。
【００７４】
配列決定方法は、一本鎖環状ＤＮＡを生成するステップを含む。これは例えば、融解後のヘアピンアダプターのライゲーションおよびマラカス形状での末端から末端への自己アニーリングによるもの；ｄｓＤＮＡの自己ライゲーションとその後の融解によるもの；ヘルパー断片へのライゲーションによるｄｓＤＮＡサークルの形成とその後の融解によるもの；ヘアピンアダプターのｄｓＤＮＡの両末端へのダンベル形状でのライゲーションによるもの；または（ＲＣＡプライマーとしても機能しうる）ヘルパーリンカーを用いるｓｓＤＮＡの自己ライゲーションによるものでありうる。
【００７５】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は以下のプロトコルに従って実施可能である。
●ＲＣＡプライマーを環状ｓｓＤＮＡにアニールする。プライマーは、固定化において用いることが可能な反応部分を保有する必要がある。
●プライマー／鋳型複合体を、ＲＣＡプライマーの付着基を用い、活性化されたアレイの表面にランダムに固定化する。ＲＣＡ増幅後に重複（overlapping）産物を生成することなく表面上でのプライマー／鋳型複合体の数を最大にできるように、表面上でのプライマー／鋳型複合体の密度が最適化される必要がある（下記参照）。表面上のプライマー／鋳型複合体の密度は、例えばプライマー／鋳型複合体の濃度によって、表面上の付着部位の密度によって、および／または反応条件（時間、緩衝液、温度など）によって、制御可能である。
または
●ＲＣＡプライマーの付着基を用い、プライマーを活性化されたアレイの表面にランダムに固定化する。ＲＣＡ増幅後に重複産物を生成することなく表面上でのプライマー／鋳型複合体の数を最大にできるように、表面上のプライマーの密度が最適化される必要がある（下記参照）。表面上のプライマーの密度は、例えばプライマーの濃度によって、表面上の付着部位の密度によって、および／または反応条件（時間、緩衝液、温度など）によって、制御可能である。
●ＲＣＡプライマーを環状ｓｓＤＮＡにアニールする。プライマーは、固定化において用いることが可能な反応部分を保有する必要がある。
固定化およびアニーリング後に次のように行われる：
●ポリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰを付加し、ローリングサークル増幅を開始する。
●場合によりＦＲＥＴにおける蛍光ドナーまたはアクセプターとして機能しうる蛍光標識をＲＣＡに組み込む。
●複数の目的、すなわち
○タグに対する親和性を有する多価リンカー分子を用いる内部架橋によりＲＣＡ産物を縮重するためや、
○タグに対する親和性を有する分子と共有結合した蛍光標識を用いて増幅後の標識化を行うため
に用いられうるアフィニティータグを、場合によりＲＣＡに組み込む。
【００７６】
あるいは、ＲＣＡは溶液中で実施可能であり、産物は増幅後に固定化可能である。例えば、同じプライマーを増幅のためおよび固定化のために使用することが可能である。別のオプションでは、固定化基を保有する修飾ｄＮＴＰが増幅の間に取り込み可能であり、次いで増幅産物が取り込まれた固定化基を用いて固定化可能である。例えば、ビオチン−ｄＵＴＰまたはアミノアリル−ｄＵＴＰ（Sigma）の使用が可能である。
【００７７】
次いで、配列決定が可能である。例えば、一実施形態では、アレイ上の様々な鋳型の完全または部分配列が、以下でさらに記載するように非固有プローブパネルの連続ハイブリダイゼーションを用いて決定される。次いで、各鋳型における配列情報を検討中の試料を表す配列のデータベースと比較し、試料中の各標的の相対的比率を判定すること、および／またはデータベースに対しての任意の遺伝的差異または他の構造的差異を判定することが可能である。
【００７８】
上記のステップＸは、断片のサイズ範囲を選択するステップである（理想的には極めて優れた分解能、１〜１０％のＣＶ）。用いられうる技術は、
●○ｄｓＤＮＡを用いるＰＡＧＥ
○ｓｓＤＮＡを用いるＰＡＧＥ
○アガロースゲル
を用いるゲル電気泳動および溶出によるもの、
●クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ）によるもの、
●アフィニティータグ、例えばｃＤＮＡ上の３’−ビオチンの使用
を含む。
【００７９】
これらのステップは、本発明の態様および実施形態に従う方法のステップを行う、好ましく選択的なステップおよび方法の開示を提供する。ステップについて開示される特徴のあらゆる組み合わせが、本発明の態様および実施形態として本明細書中であたかも逐語的に示されるように、本明細書中に提供される。
【００８０】
本発明による配列決定は、３つの基本的ステップを含みうる。第１に、局所的に増幅された鋳型分子のランダムアレイが複数の鋳型鎖を有する試料から（好ましくは単一のステップで）生成される。第２に、プローブパネルについての連続ハイブリダイゼーションがランダムアレイに施され、アレイ上の、各増幅された鋳型について、各プローブに相補的な配列の存在または不在の判定がなされる。第３に、このようにして得られたハイブリダイゼーションスペクトルを、起こり得る挿入、欠失、多型、スプライス変異体または他の目的の配列の特徴の判定を可能にする方法を用いて、参照配列データベースと比較する。比較ステップは、探索ステップとその後のアラインメントステップに、さらに分かれうる。
【００８１】
ランダムアレイ合成
増幅された鋳型を高密度で提供するアプローチが多数存在する。第１に、増幅された鋳型を機械的手段によりアレイ化し得るが、個々の各鋳型分子に別々の増幅反応が必要とされる（それ故、スループットが制限されかつコストが増大する）。第２に、（例えば、米国特許第６４８５９４４号明細書およびMitra RD, Church GM, "In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules", Nucleic Acids Research 1999: 27(24):e34に記載のように）インゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）ＰＣＲを用い、鋳型をin situで増幅し得るが、ゲルの使用を必要とする（それ故、その後のハイブリダイゼーション反応との干渉が大きい）。
【００８２】
本発明では、有利には、複数の鋳型分子を含有する試料から単一の反応でランダムアレイを合成するために、ローリングサークル増幅が用いられる。最大で１ｍｍ２当たり１０５〜１０７の密度が達成可能である。本発明の実施形態にて用いられるランダムアレイ合成プロトコルは、
ａ．活性化表面を有する表面（例えばスライドグラス）を提供する
ｂ．好ましくは共有結合を介してプライマーを付着させる、または、共有結合ではなく強力な非共有結合（ビオチン／ストレプトアビジンなど）が使用可能である
ｂ．環状一本鎖鋳型を好ましくは検出機器にとって適切な密度で付加する
ｃ．鋳型をプライマーにアニールする
ｄ．ローリングサークル増幅を用いて増幅し、各位置で表面に付着した長い一本鎖の縦列反復鋳型を生成する
を含みうる。
（例えば、Lizardi et al. describe "Mutation detection and single- molecule counting using isothermal rolling circle amplification": Nature Genetics vol 19, p. 225を参照）
【００８３】
この方法に対する改変は、固定化前に環状鋳型分子を活性化されたプライマーに予備アニーリングするステップ、および／またはプライマーへのアニーリング時に環状化され、ライゲーション反応を用いて閉じられる「オープンサークル（open-circle）」鋳型分子を提供するステップを含む。
【００８４】
「適切な密度」は、好ましくはスループットを最大化する密度、例えばできるだけ多数の検出器（または検出器内の画素）が単一の鋳型分子を検出することを保証する限界希釈である。完全な限界希釈により、任意の規則的なアレイ上のすべての位置の３７％が単一の鋳型を保持することになる一方（ポアソン分布の形式故に）、残りは全く保持しないかまたは２つ以上を保持することになるだろう。
【００８５】
例えば、７．５×２．２ｃｍの反応表面は、６μｍの画素サイズを有するTecan LS400上で、４５００万画素を保持する。限界希釈（ポアソン分布）の場合、それらの３７％が単一の鋳型を保持することになる（すなわち１７００万の鋳型）。各鋳型上での１５０ヌクレオチドの配列決定により、１５０サイクルで２．５Ｇｂの配列が得られる。５分のサイクル時間の場合、１日のスループットはヒトゲノムの２つの完全配列に相当する約５Ｇｂｐである。実際、特徴を確実に検出するのに２つ以上の画素が必要である場合があるが、検出器が単一の画素であるかまたは複数の画素であるかで同じ論理が適用できる。
【００８６】
固相ＲＣＡに適する鋳型は、下流での適用に適する配列を提供する一方、（鋳型配列のコピーの数の観点で）収量を最適化する必要がある。一般に、小さい鋳型が好ましい。特に、鋳型は２０〜２５ｂｐのプライマー結合配列および４０〜５００ｂｐの挿入（４０〜１５０ｂｐの挿入でありうる）からなる場合がある。しかし、最大５００ｂｐまたは最大１０００ｂｐまたは最大５０００ｂｐの鋳型も可能であるが、配列決定段階で、より少ないコピー数、それ故により低いシグナルが生成されることになる。プライマー結合配列を用いることで線状鋳型が最初に環状化され、環状化後にＲＣＡが開始されうるか、または鋳型は別々のＲＣＡプライマー結合部位を有しうる。
【００８７】
ローリングサークルで増幅された鋳型から生成されるシグナルを増大させるため、それらを濃縮することが必要でありうる。ＲＣＡ産物が本質的に１０００程度または１００００にまで至る、元の環状鋳型の縦列反復よりなる一本鎖ＤＮＡ分子であることから、分子は非常に長いことになる。例えば、ＲＣＡを用いて１０００倍に増幅された１００ｂｐの鋳型であれば約３０μｍになり、それ故にそのシグナルがいくつかの異なる画素を横切って広がることになる（５μｍの画素分解能を仮定）。薄いｓｓＤＮＡ産物が占有するのは３０μｍの画素領域の極くわずかな部分に限られ、それ故に検出できない可能性があることから、より低い分解能の器具を用いることは有用でない。したがって、シグナルをより小さい領域に濃縮可能であることが望ましい。
【００８８】
ＲＣＡ産物は、エピトープ標識されたヌクレオチドおよび多価抗体を架橋剤として用いて濃縮可能である。他のアプローチとして、ストレプトアビジンにより架橋されたビオチン化ヌクレオチドが挙げられる。
【００８９】
あるいは、濃縮はＣＴＡＢなどのＤＮＡ縮合剤を用いて行われうる（例えばBloomfeld ‘DNA condensation, by nultivalent cations’ in ‘Biopolymers: Nucleic Acid Sciences’を参照）。
【００９０】
ＲＣＡプライマーのオリゴヌクレオチドを表面に固定化するため、多数の異なるアプローチについての記載がなされている（例えば、Lindroos et al． "Minisequencing on oligonucleotide arrays: comparison of immobilisation chemistries", Nucleic Acids Research 2001: 29(13) e69を参照）。例えば、ビオチン化オリゴがストレプトアビジンでコートされたアレイに付着可能であり、ＮＨ２で修飾されたオリゴがエポキシシランで誘導体化されるかまたはイソチオシアネートでコートされたスライドグラスに共有結合可能であり、スクシニル化オリゴがアミノフェニルまたはアミノプロピルから誘導されたスライドグラスにペプチド結合により共役可能であり、ジスルフィドで修飾されたオリゴがチオール／ジスルフィド交換反応によりメルカプトシラン化された（mercaptosilanised）スライドグラス上に固定化可能である。文献にはさらに多数のアプローチについての記載がなされている。
【００９１】
短いプローブの連続ハイブリダイゼーションによる再配列決定
本発明の配列決定アプローチは、各々のプローブおよび標的についてのマッチ／ミスマッチの識別を伴う、プローブパネルのハイブリダイゼーションを含む。結果は各標的の「スペクトル」である。さらに、スペクトルが位置し整列する参照配列が提供され、参照に対する標的の配列の差異が高精度で判定されうる。
【００９２】
プローブパネルおよび標的の長さの最適化により、（１）参照配列内に各標的配列を正確に位置づけるため、および（２）標的と参照配列との間の任意の配列上の差異を正確に判定するための両方に、スペクトルを利用することができる。
【００９３】
第１の要求を満たすため、パネルは標的を正確に位置づけるための（情報理論的な意味で）十分な情報を有する。単一の長い特異的プローブが単一の特異的標的を位置づけるのに十分であるが、それには考えられる各標的に対して別々のプローブが必要となることから使用不可である。代わりに、短い非固有プローブが使用される。最適なパネルでは、各標的にハイブリダイズする統計的確率が５０％であるプローブが用いられ、１プローブ当たり１ビットの情報に対応する。５０のかかるプローブであれば１兆を超える標的を識別可能でありうる。かかるパネルは、エラーや遺伝子多型に対して回復力に富むというさらなる利点を有する。我々の実験では、１００の４−ｍｅｒのプローブパネルが、最大で１０ＳＮＰの存在下であっても、ヒトトランスクリプトーム内に１００ｂｐの標的を固有に配置可能であることが示されている。
【００９４】
第２の要求を満たすため、プローブパネルは標的を網羅しなければならず、また配列の差異がスペクトル上での一義的な変化をもたらすように設計されなければならない。例えば、全ての可能な４−ｍｅｒのプローブパネルであれば、４倍の冗長度で任意の所与の標的を完全に網羅することになる。任意の単一のヌクレオチド変化は、４つのプローブに対するハイブリダイゼーションのロスおよび４つの他の特徴的プローブの獲得をもたらす。
【００９５】
プローブパネルの感度は計算可能である。
【００９６】
プローブは１または複数のオリゴヌクレオチドの混合物である。各オリゴヌクレオチドの混合物および配列がプローブの特異性を規定する。プローブの希釈因子は、プローブが有するオリゴヌクレオチドの数である。プローブの有効な特異性は、標的に対する結合について同じ確率を有する非縮重オリゴヌクレオチドの長さによって与えられる。例えば、４つのオリゴヌクレオチドよりなる６−ｍｅｒのプローブであって、第１の位置が全４つのヌクレオチドの間で変化する（すなわち完全に縮重的である）場合、５つのヌクレオチドの有効な特異性を有する。
【００９７】
パネルとは、任意の所与のｋの長さの標的が、パネル中の１のみのプローブに１つハイブリダイズされるという特性を有する、ｋ−ｍｅｒのプローブのセットである。したがって、パネルとは完全でかつ非冗長なプローブのセットである。
【００９８】
プローブパネルの複雑性Ｃはパネル中のプローブの数である。
【００９９】
パネル中の位置の感度は、それがその位置で識別しうる異なる標的のセットである。例えば、プローブがある位置でＧＣ混合またはＡＴ混合である場合（ＧＣ／ＡＴと命名）、パネルは、Ｇ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｃ−ＴおよびＧ−Ｔの差異（すなわちトランジション）に対して感度があるが、トランスバージョン（ＧからＣなど）に対して感度がない。
【０１００】
完全なプローブパネルを用いてプローブする場合、標的内の各位置が、パネル中の各位置により、すなわちｋが変動する(staggered)重複プローブにより、確実にプローブされる。しかし、各位置の感度が場合により異なることから、標的内でのいくつかの差異がｋ未満のプローブによってのみ検出可能である。
【０１０１】
例えば、（ＧＣＡＴ）（ＧＣ／ＡＴ）（ＧＣ／ＡＴ）（Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ）（ＧＣ／ＡＴ）（ＧＣ／ＡＴ）（ＧＣＡＴ）で与えられるパネルは８つの位置を有する（すなわちｋ＝８）。１番目および最後の位置は完全に縮重的であることから、標的内のそれらの位置で検出される変化は全くない。各プローブにおいて、トランジション（ＧＣ<−>ＡＴ）が６つの位置で検出される一方、トランスバージョン（ＧＡ<−>ＣＴ）は２つの位置のみで検出される。有効な特異性は、各位置での有効な特異性を合計することにより計算可能である：０＋０．５＋０．５＋１＋１＋０．５＋０．５＋０＝４ｂｐ。
【０１０２】
重要な標的においては、プローブが標的において反復される場合が多い。かかるプローブは、依然として他のものにハイブリダイズすることから、任意の単一の位置での変化に対してその感度を失う。
【０１０３】
標的の長さＬを仮定すると、（標的内の各位置における）その位置での変化に対して感度があるプローブが少なくとも１つ存在するという確率を計算することができる。まずいくつのプローブが、反復のない標的内での目的の変化に対して感度があるかを判定する。これをｋｃと呼ぶ：ｋｃは先例において、トランジションでは６であり、トランスバージョンでは２である。
【０１０４】
任意の所与のプローブが標的内の１または複数の他の位置に存在する（すなわちそれが反復される）という確率ｐ（Ｒ）は次の通りである。
【数１】
2009529876.tif 000004
【０１０５】
すべての２ｋｃ感受性プローブが反復するわけではないという確率ｐ（Ｓ）は次の通りである。
【数２】
2009529876.tif 000005
任意の変化がｋｃプローブの不在およびｋｃの新しいプローブの存在をもたらすことから指数は２ｋｃである。
【０１０６】
感度は標的の長さが与えられると計算可能である。例えば、Ｃ＝２５６、ｋｃ＝２、Ｌ＝１２０からｐ＝９８％が得られ、すなわち２５６のプローブを有するパネルは全トランスバージョンの９８％（およびトランジションの１００％、ｋｃ＝６）に感度がある。パネル中のプローブの半分だけが用いられる場合、有効なｋｃ＝１であり、ｐはトランスバージョンでは８６％およびトランジションでは９９．７％である（ｋｃ＝３）。（６３％のトランジションを有する）ヒトのような種における平均感度全体は９５％となるであろう。
【０１０７】
理論は、ＳＮＰの数が標的の長さに対して少ない限り、すなわち複数のＳＮＰが１つのプローブ長の範囲内で生じることがない限り、極めて有効である。実際の実験ではこれはほぼ常に真であり、例えばヒトゲノムＤＮＡは１０００ヌクレオチド当たり約１個のＳＮＰを有することから、７塩基内にＳＮＰが２個である可能性は極めて低い。
【０１０８】
実際には、少なくとも２つの感受性プローブが、ＳＮＰのスコア化に必要でありうる（すなわち、ハイブリダイゼーションデータに誤りが生じやすいことが理由である）。その場合、確率Ｐ（Ｓ）は１−ｐ（Ｒ）２ｋｃ−１になり、計算値もまた正確である。
【０１０９】
（時間および試薬の節約のため）パネルのサブセットを用いて実施する場合、標的内の任意の位置が一方の鎖または他方の鎖に対してやはり確実にプローブされることが望ましい場合がある。言い換えると、プローブのサブセットが、プローブされていない任意のｋ−ｍｅｒが逆鎖に対して確実にプローブされるように決定される。かかるサブセットは、（Ｇ／Ａ）、（Ｃ／Ｔ）、（Ｇ／Ｔ）または（Ｃ／Ａ）を中間位置に挿入することにより取得されうる。例えば（Ｇ／Ａ）は標的内でＧおよびＡをプローブできないことになり、その場合、逆鎖は確実にＣまたはＴのいずれかであり、それらはプローブされる。他の変形についても考えられる。
【０１１０】
（ＧＣ／ＡＴ）縮重位置は２つの望ましい特徴を有する。第１に、それは各プローブ内の各オリゴが（それらは全ＧＣまたは全ＡＴのいずれかとなることから）類似の融点を有することを保証する。第２に、同位置はヒトにおける全ＳＮＰの６３％を表すトランジションに対して感度があることになる。
【０１１１】
短いオリゴマープローブのハイブリダイゼーション
本発明では、プローブパネルが標的に連続的にハイブリダイズされることが想定される。プローブパネルの複雑性を制限するため、プローブを短く保持し、好ましくは３〜６ｂｐだけの有効な特異性を有することが望ましい。
【０１１２】
プローブは有効にハイブリダイズするかまたは全てハイブリダイズするように安定化される。さらに、安定化により、標的内に存在しうる任意の内部二次構造とのプローブの競合が促進されうる。安定化は多数の異なる方法で得られうる。
●ハイブリダイゼーション反応内での安定化添加剤、例えば塩、ＣＴＡＢ、マグネシウム、安定化タンパク質による。
●プローブの複雑性を増大させることなくプローブの長さを延長する縮重位置の付加による。例えば、’Ｎ’位置で延長された６−ｍｅｒのプローブであれば実際には４つのオリゴヌクレオチド（各々が７塩基長）の混合物となる。（ＧＣ／ＡＴ）位置（ＧおよびＣの混合またはＡおよびＴの混合を示す）であれば、複雑性が（４倍ではなく）２倍になるだけで、プローブが１塩基分延長されることになる。
●例えばロック核酸(locked nucleic acid)（Exiqon,Denmark）、ペプチド核酸および／またはマイナーグルーブ結合剤（Epoch Biosciences,US）によるプローブ化学物質の修飾による。
●上記の組み合わせ、例えばＣＴＡＢ緩衝液中でのＬＮＡを有する縮重プローブのハイブリダイズ。
【０１１３】
これらの中で、第１の方法は標的も安定化する（それ故、ハイブリダイゼーションを阻止する安定な二次構造を潜在的に誘発する）。プローブを選択的に安定化させる方法が好ましい。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションの検出
ハイブリダイゼーションを検出するための多数のアプローチが既知である。
●直接蛍光。プローブは標識され、ハイブリダイゼーションは、標的にハイブリダイズされたプローブの局所濃度の増加により検出される。これには高倍率の共焦点光学系または全内部反射励起（ＴＩＲＦ）が必要でありうる。
●エネルギー伝達。プローブはクエンチャーまたはドナーで標識され、かつ標的は対応するドナーまたはクエンチャーで標識される。ハイブリダイゼーションはドナー蛍光における低下および／またはクエンチャー蛍光における増大により検出される。
●単一の塩基の延長。ハイブリダイズされたプローブは、蛍光色素を組み込む、単一の塩基の延長反応におけるプライマーとして機能する（あるいは放出されたＰＰｉがパイロシーケンシングなどにおけるように検出されうる）。
【０１１５】
一実施形態では、プローブはエピ蛍光顕微鏡またはレーザースキャナーで検出可能なフルオロフォア、例えばＣｙ３により標識される。多数の他の適切な色素が市販されている。ハイブリダイズされたアレイの状態で、すべての液体中に存在するバックグラウンドを超えて、濃度の局所的増加の検出を可能にするのに最適化された濃度で、プローブはアレイにハイブリダイズされる。例えば、４００ｎＭが用いられうるか、あるいはプローブは光学的設定に応じて１ｎＭ〜５００ｎＭでまたは５００ｎＭ〜５μＭであってもハイブリダイズされうる。この検出スキームの利点は洗浄ステップが省かれる点にあり、それにより平衡状態のハイブリダイゼーション条件での検出の進行が可能であり、マッチ／ミスマッチの識別が容易になる。
【０１１６】
エネルギー伝達アプローチが以下に記述される。
【０１１７】
標的は、蛍光ドナーを有する、恒久的にハイブリダイズされたヘルパーオリゴヌクレオチドを保有する。ヘルパーは、短いプローブを溶かし得る洗浄に耐えるように設計される。プローブはダーククエンチャーを保有する。例えば、ドナーはフルオレセインおよびクエンチャーのEclipse Dark Quencher（Epoch Biosciences）でありうる。多数の他のドナー／クエンチャー対が既知である（例えばHaugland, R．P．, ‘Handbook of fluorescent probes and research chemicals’, Molecular Probes Inc．, USAを参照）。一般に、長距離にわたり消光可能である、長いフォルスター（Forster）の半径を有するプローブを有することが望ましい。ハイブリダイゼーションは、プローブのハイブリダイゼーション時にドナーフルオロフォアの消光により検出される。
【０１１８】
スペクトルの探索およびアラインメント
標的のスペクトルが与えられると、配列の差異を考慮して、参照配列内の標的の位置が探索される。探索は、標的と同じサイズの窓を有する参照配列を単に走査し、各位置における予想スペクトルを計算し、予想スペクトルと同位置での観測スペクトルを比較することにより行われうる。最高スコアの位置が返される。本発明の方法が短時間に極めて多数のハイブリダイゼーションスペクトルを生成することから、探索ステップを最適化することが重要である。例えば、現行の実施においては、スペクトル探索がハイエンドワークステーション上で１秒当たり１２億マッチのペースで進行し、発明者は、単一の配列決定機器に匹敵するには１０台のワークステーションが必要になると推定している。プログラム可能なハードウェア、すなわちフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）を用いて探索を加速することは、本発明の別の態様である。探索アルゴリズムをMitrion-C（Mitrion AB, Sweden）に翻訳することにより、単一のワークステーションコンピュータ内にＦＰＧＡチップを２個だけ用いて、３０倍の加速が達成可能である。
【０１１９】
一旦１または複数の有望な位置が見出されると、参照配列に対する修飾が探索され、観測および予想スペクトルの間の任意の不一致が明らかにされることになる。この段階で、参照配列に関連の修飾、例えばＳＮＰ、短いindel、長いindel、マイクロサテライト、スプライス変異体などを導入することができる。各修飾または修飾の組み合わせについて、観測と予想スペクトルとの間の類似性についてのスコアをさらに計算する。最も有望な修飾された参照配列が返される。非常に大きいパラメータ空間を探索するための方法、例えばギブスサンプリング、マルコフ鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）およびメトロポリス・ヘイスティングス・アルゴリズムなどが、当該技術分野で既知である。
【０１２０】
スペクトルを比較する場合、単純な２進のオーバーラップスコアが用いられうるか（両スペクトルにおいてハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしないかのいずれかの各プローブに対しては１、それ以外では０のスコア）、あるいはより高度な統計的アプローチではスペクトルオーバーラップの逐次的または確率的測定が用いられうる。複数の標的が標的内の同じ位置に見出される場合、より高レベルの分析を行うことで任意の配列の差異における信頼性が評価されうる。
【０１２１】
自動ハイスループット配列決定のための装置
本発明による方法は、場合により熱制御を伴って、検出器上又は検出器内に設置の反応チャンバを通して多数の試薬溶液を循環させるだけで実施可能であることから、特に自動化に適する。
【０１２２】
一例では、検出器はＣＣＤイメージャであり、これは例えばフィルタキューブを通して誘導された白色光により作動して、各標的に結合したフルオロフォアに適する別々の励起および放射光路がもたらしうる。例えば、Kodak ＫＡＦ−１６８０１Ｅ  ＣＣＤの使用が可能であり、それは１６．７百万画素および約２秒のイメージング時間を有する。かかる機器の１日の配列決定のスループットは最大で１０Ｇｂｐとなる。
【０１２３】
反応チャンバは、
●光学系に対する容易な接近性
●閉じた反応チャンバ
●試薬を注入しかつ反応チャンバから除去するための注入口
●空気および試薬の、チャンバとの入出力を可能にする排出口
を提供する。
【０１２４】
反応チャンバは、イメージング機器内への挿入に適する、図３に示される標準マイクロアレイスライド形式で構築可能である。反応チャンバは機器に挿入され、全配列決定反応の間にその状態を保持する。ポンプおよび試薬フラスコが決められたプロトコルに従って試薬を供給し、コンピュータがポンプおよびスキャナーの双方を制御することで、反応と走査が交互に行われる。場合により、反応チャンバは温度制御可能である。また場合により、反応チャンバを位置決めステージに配置することでチャンバ上での複数の位置のイメージングが可能になる。
【０１２５】
ディスペンサーユニットが電動弁に接続されることで試薬の流れが誘導され、システム全体がコンピュータの制御下で稼働する。統合システムは、スキャナー、ディスペンサー、弁およびリザーバならびに制御コンピュータから構成される。
【０１２６】
本発明のさらなる態様によると、取り込まれた標識または放出された標識を検出可能なイメージング要素(component)、１または複数の付着された鋳型を、１サイクル当たり少なくとも１回イメージング要素にアクセス可能なように保持するための反応チャンバ、試薬を反応チャンバに提供するための試薬供給系を含む、本発明の方法を実施するための機器が提供される。
【０１２７】
反応チャンバは、付着された鋳型を、少なくとも１００／ｃｍ２、場合により少なくとも１０００／ｃｍ２、少なくとも１００００／ｃｍ２もしくは少なくとも１０００００／ｃｍ２、または少なくとも１００００００／ｃｍ２、少なくとも１０００００００／ｃｍ２もしくは少なくとも１００００００００／ｃｍ２の密度で提供する場合があり、かつイメージング要素は同鋳型を同密度で解像可能でありうる。
【０１２８】
イメージング要素は、例えば、光電子増倍管、フォトダイオード、電荷結合素子、ＣＭＯＳイメージングチップ、近接場走査型顕微鏡、遠視野共焦点顕微鏡、広視野落射照明（epi-illumination）顕微鏡および全内部反射顕微鏡よりなる群から選択されるシステムまたはデバイスを用いうる。
【０１２９】
イメージング要素は蛍光標識を検出しうる。
【０１３０】
イメージング要素はレーザー誘導蛍光を検出しうる。
【０１３１】
本発明の機器の一実施形態では、反応チャンバは透明な表面、蓋、および反応チャンバを試薬供給システムに接続するためのポートを含む閉構造であり、ここで透明な表面は鋳型分子をその内部表面上に保持し、かつイメージング要素は透明な表面を通して画像化可能である。
【０１３２】
本発明のさらなる態様は一本鎖ＤＮＡ分子のランダムアレイを提供し、ここで、各該分子は少なくとも２つの初期配列の縦列反復のコピーよりなり、各該分子はランダムな位置で表面上に、１ｃｍ２当たり１０３〜１０７、好ましくは１ｃｍ２当たり１０４〜１０５、または好ましくは１ｃｍ２当たり１０５〜１ｃｍ２当たり１０７の密度で固定化され、各該初期配列は、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ分子の混合物を含む初期標的ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーに由来するランダム断片を表し、すべての該ＤＮＡ分子の該初期配列はほぼ同じ長さを有する。
【０１３３】
一般に、同分子は、少なくとも１００、通常は少なくとも１０００、または少なくとも２０００、好ましくは最大２００００の初期配列の縦列反復のコピーを含むであろう。同分子は５０以上の初期配列の縦列反復のコピーを含む場合があり、これは標準の顕微鏡を用いて検出可能である。
【０１３４】
好ましくは、初期配列は、５０％以内のＣＶ、好ましくは５〜５０％のＣＶ、好ましくは１０％以内のＣＶ、好ましくは５％以内のＣＶで同じ長さを有する。すなわち、それにより変動係数（ＣＶ）が例えば５％であるように供給がなされる。ＣＶ＝標準偏差を平均で割ったものである。初期配列は同じ長さを有しうる。
【０１３５】
初期の標的ライブラリーは、例えば、ＲＮＡライブラリー、ｍＲＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、プラスミドＤＮＡライブラリーまたはＤＮＡ分子のライブラリーのうちの１もしくは複数であるかまたはそれらを含みうる。
【０１３６】
本発明のさらなる態様は、プローブのセットまたはパネルを提供し、ここで、各プローブは１または複数のオリゴヌクレオチドからなり、各該オリゴヌクレオチドは安定化され、各該オリゴヌクレオチドはレポーター部分を保有し、各プローブの有効な特異性は３〜１０ｂｐであり、プローブセットは統計的に標的配列内のすべての位置の少なくとも１０％にハイブリダイズする。
【０１３７】
有効な特異性は４〜６ｂｐでありうる。有効な特異性は３、４、５、６、７、８、９または１０ｂｐでありうる。
【０１３８】
プローブセットは、統計的に標的配列内のすべての位置の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも９０％、または標的配列内のすべての位置の１００％にハイブリダイズしうる。
【０１３９】
プローブセットは、標的配列またはその逆相補（reverse complement）におけるすべての位置の１００％にハイブリダイズしうることで、標的または該位置における標的の逆相補における各位置で、セット内の少なくとも１つのプローブによりハイブリダイズする。
【０１４０】
標的配列は任意の標的配列でありうる。
【０１４１】
本発明のプローブセットは、縮重位置の導入、ロック核酸モノマーの導入、ペプチド核酸モノマーの導入およびマイナーグルーブ結合剤の導入のうちの１または複数により安定化されうる。
【０１４２】
レポーター部分は、例えば、フルオロフォア、クエンチャー、ダーククエンチャー、酸化還元ラベル、および酵素的または化学的手段により標識されうる化学反応基（例えば、標識ヌクレオチドを用いたプライマー延長のための遊離３’−ＯＨまたはハイブリダイゼーション後の化学標識用のアミン）よりなる群から選択されうる。
【実施例】
【０１４３】
本願の実施例
遺伝子発現プロファイリング
ｃＤＮＡ断片のランダムな配列決定を介して、対応するＲＮＡの発現レベルを、は各ＲＮＡ由来の断片の発生数を計数することによって定量可能である。構造的特徴（スプライス変異体、５’／３’ＵＴＲ変異体など）および遺伝子多型が同時に発見されうる。
【０１４４】
遺伝子プロファイリング
全ゲノムのショットガン配列決定を用い、参照ゲノムに対する配列の差異の発生を知ることにより、個体の遺伝子型を特定可能である。例えば、ＳＮＰおよびindel（挿入／欠失）は、このようにして容易に発見し、遺伝子型を特定することが可能である。ヘテロ接合部位を識別するため、両対立遺伝子を確実に配列決定するよう、断片の広範な網羅性(dense fragment coverage)が必要でありうる。
【０１４５】
本開示を考慮し、本発明のさらなる態様および実施形態が当業者にとって明白なものになるであろう。本明細書中のいずれかの箇所で引用されるあらゆる文書が参照により援用される。
【０１４６】
実施例１
CantaloupeにおけるＤＮＡ鋳型の調製
入力
二本鎖ＤＮＡ鋳型
【０１４７】
鋳型の分画化
５’−ＧＣ−３’を認識し、その間を平滑部に切断する制限酵素ＣｖｉＪ  Ｉ＊（EURx、Poland）を用いた。制限反応物を以下のように調製した。
【０１４８】
【表２】
2009529876.tif 000006
【０１４９】
切断したＤＮＡを、ＰＣＲクリーンアップキット（Qiagen）で製造業者のプロトコルに従って精製した。
【０１５０】
画分を２％アガロースゲル上で分析し、鋳型および酵素に特異的なバッチに最適な反応条件を同定した（図１、レーン４〜８を参照）。
【０１５１】
最適な切断反応を繰り返し、全部で５ｕｇのＤＮＡを得た（図１、レーン１）。
【０１５２】
鋳型サイズの選択
ＤＮＡを８％非変性ＰＡＧＥ（高さ４０ｃｍ、厚さ１ｍｍ）上で精製した。各ウェルに１μｇ以下のＤＮＡを負荷し、目的の領域を示す９５〜１０５のラダーを含めた。ラダーは９５、１００および１０５塩基対の３つのＰＣＲ断片からなるものであった。
【０１５３】
ゲルをＳＹＢＲゴールドで染色し、結果をスキャナー上で分析し、目的の領域（９５〜１０５ｂｐ）を切り取り、ElutaTubeTM（Fermentas）で製造業者のプロトコルに従って電気的溶出（electro-elute）した。
【０１５４】
アダプターライゲーション
ライゲーションにおいては１つのアダプターを用いた。
５’ＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＧ３’（配列番号１１）
３’ＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣ５’
【０１５５】
これは５’リン酸塩および内部ＮｏｔＩ部位を有した。
【０１５６】
以下のライゲーション混合物を調製した。
【０１５７】
【表３】
2009529876.tif 000007
【０１５８】
２５℃で１５分間インキュベートした。反応物をＰＣＲクリーンアップ（Qiagen）を用い製造業者のプロトコルに従って精製した。図２を参照。
【０１５９】
制限消化ＮｏｔＩ
以下の反応物を調製した。
【０１６０】
【表４】
2009529876.tif 000008
【０１６１】
３７℃で４時間または一晩インキュベートした。試料をＰＣＲクリーンアップ（Qiagen）を用い製造業者のプロトコルに従って精製した。
【０１６２】
精製をＰＣＲクリーンアップを用いて繰り返し、過剰なアダプターをできるだけ除去した。
【０１６３】
鋳型の環状化
一本鎖サークルを、オリゴヌクレオチドリンカーの存在下で試料を変性させることにより調製した。
５’−ＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号１２）
【０１６４】
具体的には反応物を以下のように調製した。
【０１６５】
【表５】
2009529876.tif 000009
【０１６６】
９３℃に３分間加熱し、冷たくなるまで氷上に置き、急速回転した。２×Ｑｕｉｃｋライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）５０ｕｌおよびQuickリガーゼ（ＮＥＢ）１ｕｌを添加し、短時間混合し、２５℃で１５分間インキュベートした。
【０１６７】
この段階ではサークルが形成され、試料をＲＣＡにおいて使用可能である。図３を参照。
【０１６８】
固定化
μＭのＲＣＡプライマー（追加の５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−Ｃ６−ＮＨ−３’テール（配列番号１３）（式中、Ｃ６は６炭素リンカーでありかつＮＨはアミン基である）を有する環状化リンカーと同一）を、１５％ＤＭＳＯを有するｐＨ９．０の１００ｍＭ炭酸塩緩衝液中のＳＡＬ−Ｉスライド（Asper Biotech, Estonia）上に固定化し、２３℃で１０時間インキュベートした。
【０１６９】
スライド表面上の残存する活性部位を、まず炭酸塩緩衝液（上記のものであるが４０ｍＭ）中の１５ｍＭのグルタミン酸に３０℃で４０分間のソーキング、次いでｐＨ８．０の２ｍｇ／ｍｌのポリアクリル酸に室温で１０分間のソーキングを行うことによりブロックした。
【０１７０】
環状鋳型を、緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中、３０℃で２時間アニールし、次いで緩衝液１中で２０分間洗浄し、次いで緩衝液２（２×ＳＳＣ、０．１％トゥイーン）中で３０分間洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ中ですすぎ、次いで１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中ですすいだ。
【０１７１】
増幅
ローリングサークル増幅を、Ｐｈｉ２９緩衝液、１ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．１６ｕ／μＬのＰｈｉ２９酵素（いずれもNEB（USA）から入手）の中、３０℃で２時間行った。
【０１７２】
環状化リンカーに相補的でありかつ６−ＦＡＭで標識されたレポーターオリゴヌクレオチドを上記のようにアニールした後、緩衝液３（５ｍＭトリス、ｐＨ８．０、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ（ＮＨ４Ｊ２ＳＯ４、０．０１ｍＭのＣＴＡＢ）中にソーキングした。図４は、各ＲＣＡ産物が明確に視認できるスライドのごく一部を示す。
【０１７３】
プローブパネルハイブリダイゼーション
各プローブを、以下のスキームに従って設計した。すなわち（ＧＣＡＴ）（ＧＣ／ＡＴ）（ＧＣ／ＡＴ）（Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ）（ＧＣ／ＡＴ）（Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ）（ＧＣ／ＡＴ）（各々は、位置２、４および６にロック核酸（Exiqon,Denmark）および３’末端にEclipseダーククエンチャー（Epoch Biosciences,USA）を有する）。
【０１７４】
プローブを１００ｎＭの緩衝液３中でハイブリダイズした。各プローブにおいて温度ランプを用い、マッチ／ミスマッチの識別に最適な温度を発見した。図５は、２つのマッチ／ミスマッチ対のハイブリダイゼーションの結果を示す。
【０１７５】
実施例２
Cantaloupe配列決定技術に用いられる候補領域の濃縮断片の調製
ステップ１：濃縮およびプローブ調製のための領域の選択
目的の候補領域における核酸試料を濃縮するため、Cantaloupe技術による配列決定に先立ち、以下の典型的なプロトコルが用いられうる。
【０１７６】
候補領域の平均サイズは、疾患または複合遺伝形質、例えばクローン病および乾癬における全ゲノム関連解析に基づくと、約０．５メガベース（０．５Ｍｂ）である。疾患に関連した全候補領域の選択が可能であるが、この実施例では、異なる染色体からの３つの異なる領域（領域Ｈ：４５３．５ｋｂ、領域Ｒ：２８５．５ｋｂおよび領域Ｅ：１９３．６ｋｂ）を選択した。これらは合計して全体で９３２．６ｋｂを網羅する。さらに、別の例では、領域Ｅ（１９３．６ｋｂ）のみを選択し、本発明の濃縮方法におけるサイズの効果（影響）を検証した。
【０１７７】
この方法におけるプローブセットは、染色体領域全体、すなわちGenizon GWS試験から得られた候補領域を網羅する特定のＤＮＡ分子を参照する。プローブの供給源は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、コスミドまたはファージのいずれかの単独または組み合わせでありうる。この実施例ではＢＡＣ分子を用いる。
【０１７８】
候補領域を、目的の領域に特異的な商用のＢＡＣクローンの利用可能性について精査し、プローブ調製のための供給源の材料として注文する。
【０１７９】
プローブ調製においては、以下のステップを実施する：
ａ）ＢＡＣをＬＢ−グリセロール中、−８０℃で保存する。滅菌したピペットチップまたは接種ループ（inoculating loop）を用い、バイアルの先端部をこそげ取る。
ｂ）次いで、接種材料をＬＢ寒天プレート（クロラムフェニコール１２．５μｇ／ｍＬ）上にストリークし、単一のコロニーを得る。
ｃ）次いで、プレートを３７℃で一晩、逆さまに置く。
ｄ）単一のコロニーを新たにストリークした選択プレートから選択し、これを用いてＬＢ（クロラムフェニコール１２．５μｇ／ｍＬ）５ｍｌのスターターカルチャーに接種する。
ｅ）培養物を激しい振とう下（３００ｒｐｍ）、３７℃で８時間インキュベートする。
ｆ）スターターカルチャー０．５〜１．０ｍｌを採取し、それを選択ＬＢ培地５００ｍｌに添加することにより希釈を行う（結果的に１／５００〜１／１０００希釈物が得られる）。
ｇ）次いで、希釈培養物を激しい振とう下（〜３００ｒｐｍ）、３７℃で１２〜１６時間インキュベートする。好ましくは培養物の容量の少なくとも４倍の容量を有するフラスコまたは容器を用いる。培養物は約３〜４×１０９細胞／ｍｌの細胞密度に達する必要がある。
ｈ）一晩培養物５００ｍｌから、ＢＡＣ−ＤＮＡを、QIAGEN（登録商標）  Large-Construct Kitを用い、製造業者による説明に従って単離する。典型的には最大で１５０μｇの細菌ゲノムＤＮＡを含まないＢＡＣ−ＤＮＡが得られる。
【０１８０】
ステップ２：ゲノムＤＮＡの調製
ＤＮＡ試料を特定の疾患に罹患した個体（疾患試料）から選択するかまたは対照として用いられる非罹患個体（対照試料）から選択する。疾患試料は、リスク、中立、保護的およびまれなハプロタイプを含むハプロタイプの特定の組み合わせを表し、目的の候補領域全てを網羅する。
【０１８１】
この実施例では、健常個体由来の３つの異なるヒトゲノムＤＮＡを用いた。ゲノムＤＮＡの標準の調製および精製の後、試料をウシ膵臓のDNaseIおよびマング・ビーン・ヌクレアーゼにより連続処理した。第１の酵素反応を用いてＭｇ２＋の存在下でＤＮＡにおける二本鎖の破壊を引き起こし、第２の酵素反応により平滑末端化されたＤＮＡ断片が生成した。平均の断片長（〜２００ｂｐ）およびゲノムＤＮＡの濃度を、ゲル電気泳動により評価した。得られた断片はアダプターのライゲーションのための準備を整えた。この実施例で用いられる２つの異なるアダプターは、下記に記載され、これらの配列は塩基修飾を有さない。
アダプター−１
５’−ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴ−３’（配列番号１）  オリゴ名：ＵＡ−ＡＤＰ１−５１２
５’−ＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号２）  オリゴ名：ＬＡ−ＡＤＰ１−５１２
アダプター−２
５’−ＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧＣ−３’（配列番号３）  オリゴ名：ＵＡ−ＡＤＰ２−５１２
５’−ＣＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣＣＡＣＴ−３’（配列番号４）
オリゴ名：ＬＡ−ＡＤＰ２−５１２
【０１８２】
アダプターを、ゲノムＤＮＡ断片の平滑末端でのみライゲートするように設計した。
【０１８３】
ａ）２つのアダプターを混合し、ライゲーション反応物に、鋳型のゲノムＤＮＡ断片に対して７５倍（各々３７．５倍）過剰に添加した。
【０１８４】
ｂ）ライゲーション反応後、２つの鎖を溶融し（７２℃）、Phusionポリメラーゼ（ＮＥＢ、校正ポリメラーゼ）を用いて平滑な二本鎖末端が生成された。
【０１８５】
ｃ）次いで、アダプターにライゲートされた断片を、３．５％のMetaphorアガロース（Cambrex,Baltimore,MD）上での電気泳動により分離した。目的の領域を切り取り（断片標的サイズの範囲は２００ｂｐ〜４００ｂｐ）、ＤＮＡをＧＦＸカラム（GE Healthcare）を用いて精製した。
【０１８６】
ｄ）得られたアダプターを有する精製ゲノムＤＮＡ断片（リンカー連結（linkered）５１２ゲノムＤＮＡ）をピコグリーン色素により定量し、２００ｎｇ／ｕｌの濃度に調節した。
【０１８７】
得られたリンカー連結５１２ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮し、ステップ４（濃縮ステップ）のために保持した。
【０１８８】
ステップ３：ＢＡＣ−ＤＮＡプローブの調製
ステップ１から得られたＢＡＣ−ＤＮＡをDnaseIにより断片化し、４０ｕＭのビオチン−１６−ｄＵＴＰを用い、ビオチン−ニックトランスレーション反応混合物（Roche）を用いてビオチン化した。同位体をトレーサーとしてニックトランスレーション反応物中に混入し、ビオチン化反応が効率的に進行したことを確認し、また、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズへのＢＡＣ−ＤＮＡの結合を確認した。
【０１８９】
ステップ２でゲノムＤＮＡについて記載したように、ＢＡＣ−ＤＮＡにおける反復配列をＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Invitrogen）を用いたブロッキングにより除去し、結果としてＣｏｔ−１ブロックＢＡＣ−ＤＮＡが得られ、これをステップ４（濃縮ステップ）のために保持した。
【０１９０】
ステップ４：濃縮ステップ
このステップは２ラウンドの濃縮を含む。簡潔には、第１ラウンドで標的ＤＮＡ断片を全ゲノムＤＮＡから濃縮し、第２ラウンドでは第１ラウンドから得られた標的ＤＮＡ断片に対して混入断片の量を低減することにより濃縮する。両方の濃縮ステップでの最終産物は〜２５０ｂｐのＤＮＡ断片であった。この濃縮を定量するため、得られた断片をプラスミドにクローニングし、細菌に形質転換した。得られた細菌を適切なＬＢプレート上でストリークした。独立のクローンをランダムに採取し、濃縮領域に特異的な配列についてプローブした。濃縮を計算するのに用いられる式は、
サイズＨＧ／サイズＣＲ×％特異的配列＝濃縮のレベル
サイズＨＧ：ヒトゲノムのサイズ（ｋｂ）
サイズＣＲ：目的の候補領域のサイズ（ｋｂ）
％ＳＳ：濃縮領域に特異的な配列の％
であった。
【０１９１】
以下の表は、この実施例にて行った濃縮の判定についてまとめる。
【０１９２】
【表６】
2009529876.tif 000010
【０１９３】
実験Ｂにおける結論は、３つのうちの１つのクローンが３つのうちの１つのＣＲに由来する標的配列およびCantaloupe技術で配列決定するのに必要な特徴（リンカー）を有することになる点である。
【０１９４】
第１の濃縮
（ステップ２から得られた）リンカー連結５１２ゲノムＤＮＡの、（ステップ３から得られた）Ｃｏｔ−２ブロックＢＡＣ−ＤＮＡとのハイブリダイゼーション。
【０１９５】
リンカー連結５１２ゲノムＤＮＡ（１ｕｇ）を２００ｕｌのＰＣＲチューブに移し、鉱油を重層した。
【０１９６】
試料を９５℃で５分間の加熱により変性させ、６５℃で１５分間インキュベートした。
【０１９７】
Ｃｏｔ−１ブロックＢＡＣ−ＤＮＡを添加し、ハイブリダイゼーション反応を６５℃で７０時間行った。
【０１９８】
ハイブリダイゼーション反応物のストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズへの結合
次いで、ハイブリダイゼーション混合物をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（１００ｕｌ）に１５〜２５℃で３０分間添加した。
【０１９９】
ビーズを磁気セパレータを用いて除去し、上清を廃棄した。
【０２００】
ビーズを、１ｍｌの１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間洗浄した。
【０２０１】
ビーズを３回、各回につき１ｍｌの０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間洗浄した。
【０２０２】
ハイブリダイズされた、リンカー連結５１２ゲノムＤＮＡ−Ｃｏｔ１ブロックＢＡＣ−ＤＮＡを、０．１Ｍ  ＮａＯＨ１００ｕｌの添加により磁気ビーズから溶出させ、室温で１０分間インキュベートした。
【０２０３】
ビーズを磁気セパレータを用いて除去した。ビーズはビオチン化され磁気ビーズ上に残ったＣｏｔ−１ブロックＢＡＣ−ＤＮＡを有した。上清を等容量のｐＨ８の１Ｍトリスで中性にし、次いでCentricon  YM-30カラム（Millipore）で脱塩した。
【０２０４】
下記の第１の濃縮および増幅ステップにおいては、得られたＤＮＡ（リンカー連結５１２ゲノムＤＮＡ）を鋳型として用いた。
【０２０５】
増幅の第１ラウンド
増幅反応物は上記より得られた鋳型ＤＮＡ（リンカー連結５１２ゲノムＤＮＡ）を有する。
【０２０６】
用いたプライマー（各々１０ｕＭ）は、
フォワード：５’−ＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５）
リバース：５’−ＣＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号６）
であった。
【０２０７】
用いた他の試薬：
各２５ｍＭのｄＮＴＰ
５×Phusion反応緩衝液
Phusionポリメラーゼ１Ｕ
最大で５０ｕｌの水
【０２０８】
増幅プログラムは、９８℃（３０秒）での変性サイクルを１回行った後に９８℃で１０秒間の変性、プライマー融解温度での１０秒間のアニーリングおよび７２℃で２０秒間の伸長からなるサイクルを３０回行うというものであった。
【０２０９】
増幅産物をQIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を用いて精製し、第２の濃縮ステップにおける入力ＤＮＡとして保持した。
【０２１０】
第２の濃縮
第２の濃縮を、第１の濃縮からの増幅産物を入力ＤＮＡとして用いて、第１の濃縮ステップについて記載したように行った。第２の増幅は、上記の第１の濃縮に記載の第１の増幅に類似し、用いたプライマーが異なった（プライマーは配列が同一であったが５’末端上に修飾を有した）。
フォワード：５’−ビオチン−ＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号７）
リバース：５’−ＰＨＯ−ＣＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号８）
【０２１１】
プライマーにこれらの修飾（ビオチン化およびリン酸化）を含めることで、得られたＤＮＡ断片が、配列決定技術「Cantaloupe」のための入力ＤＮＡの調製（環状化）の準備が整った。
【０２１２】
実施例３
Cantaloupeによる配列決定のためのＤＮＡ鋳型の調製
ステップ１：一本鎖の生成および環状化
このステップの目的は、実施例２に記載の第２の増幅ステップにおいて生成した入力二本鎖標的ＤＮＡのうちリン酸化された一本鎖のみを保持することである。
【０２１３】
Dynabeadsが、ビオチン化され、リン酸化された入力二本鎖断片を保持した。０．１ＭのＮａＯＨとのインキュベーションにより、環状化ステップにとって必要な５’−リン酸基を有するＤＮＡの一本鎖断片の放出および単離が促進された。ビオチン化鎖がDynabeads上で保持され、相補鎖が溶液中に放出され、これを環状化ステップにおける入力として用いた。
【０２１４】
一本鎖環状分子（Cantaloupe配列決定技術での使用に必要）を、以下のビオチン化オリゴヌクレオチドリンカー
５’−ビオチン−ＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号９）
の存在下で試料を変性することにより形成した。
【０２１５】
反応混合物は、ステップａで生成された一本鎖線状断片（０．３ｕＭ）、０．６ｕＭの上記のリンカー、および最大で５０ｕｌの水からなるものであった。反応混合物を６５℃に２分間加熱し、次いで室温まで冷却した（同ステップは〜１５分かかった）。次いで、氷冷したライゲーション混合物（ＤＮＡリガーゼ、１倍のライゲーション緩衝液中５Ｕ、Fermentas）を反応混合物に添加した。リガーゼの添加の目的は、一本鎖断片の３’および５’末端を連結し、環状分子の形成を可能にすることであった。清澄化の目的で、環状分子をビオチン化リンカーにハイブリダイズし、一本鎖断片の３’および５’末端の並置を可能にした。次いで、ビオチン化リンカーを除去し、精製された環状分子を取得し、同分子はCantaloupe配列決定技術において用いられる入力鋳型ＤＮＡであった。
【０２１６】
ステップ２：環状化分子の精製
次いで、（ステップ２からのビオチン化リンカーにアニールされた）環状化分子をDynabeadsに添加した。
【０２１７】
ビーズを洗浄し、（製造業者の使用説明書に記載のように）最終の洗浄後に乾燥させておいた。
【０２１８】
環状分子を、４０ｍＭのＮａＯＨを用いてビーズから溶出させた。
【０２１９】
分子をリアルタイムＰＣＲにより定量した。
【０２２０】
純粋な環状分子は、Cantaloupe配列決定技術におけるローリングサークル増幅ステップで用いられる鋳型である。
【０２２１】
ステップ３：Cantaloupeによる配列決定において用いられるスライドグラス上への環状化分子の固定化
Asper BiotechのGenoramaTM SAL、０．１５ｍｍまたは１ｍｍのスライドを、製造業者の使用説明書に従って処理および保存のために使用した。
【０２２２】
固定化
５ｕＭのＲＣＡプライマー（追加の５’−ＡＡＡＰＡＡＡＡＡＡ−Ｃ６−ＮＨ−３’テール（配列番号１３）（式中、Ｃ６は６炭素リンカー、ＮＨはアミン基である）を有する環状化リンカーと同一）を、１５％  ＤＭＳＯを有するｐＨ９．０の１００ｍＭ炭酸塩緩衝液中のＳＡＬ−Ｉスライド（Asper Biotech；図Ａで用いたオリゴ：５’ＸＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＧ３’（配列番号１０）のＲＣＡ−Ｇ−ＲＩＮＧＸ＝ＮＨ２−（ＣＨ２）６−ＰＯ４−オリゴを参照）上に固定化した。
【０２２３】
試料を３０℃で１時間インキュベートした。
【０２２４】
スライド表面上に残存する活性部位を、まず炭酸塩緩衝液（上記と同じであるが４０ｍＭ）中の１５ｍＭのグルタミン酸中、３０℃で４０分間ソーキングし、次いでｐＨ８．０の２ｍｇ／ｍｌのポリアクリル酸中、室温で１０分間ソーキングすることによりブロックした。
【０２２５】
環状鋳型を緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中、３０℃で２時間アニールし、次いで緩衝液１中で２０分間洗浄し、次いで緩衝液２（２×ＳＳＣ、０．１％トゥイーン）中で３０分間洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ中ですすぎ、次いで１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中ですすいだ。
【化２】
2009529876.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】持続時間を増加させ、ＣｖｉＪ＊を用いてｃＤＮＡ試料（レーン４）を切断した結果を示すゲル画像を示す。平均断片長における１００ｂｐに向けての漸減が観察される（１００ｂｐは標準サイズのうちの最短の断片である、レーン３）。レーン１では最適な切断反応がロードされ、約１００ｂｐの断片が精製される。
【図２】アダプターのライゲーションを示す。レーン１はサイズマーカー；レーン２はライゲートされていない断片；レーン３および４はライゲートされた断片である。大部分の断片が正確にライゲートされる。
【図３】環状化前（レーン１）および環状化後（レーン２）の断片の試料を示す。レーン３は精製後の結果を示す。レーン３におけるリンカーの不在に注意のこと。
【図４】４８８ｎｍのレーザーおよび６ＦＡＭのフィルターを用いる４μｍ分解能のTecanＴＭLS400を用いて走査されたランダムアレイのスライドから得られたおよそ０．８×２．４ｍｍの切片を示す。スポットが各環状鋳型分子から生成された増幅産物を表す。
【図５】融点分析により測定された短いオリゴヌクレオチドプローブの安定性を示す。図５ＡはｐＨ８．０の１００ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌの中でのＣＴＡＢの効果（影響）を示す。図５ＢはTaqExpress緩衝液（GENETIX, UK）中でのＬＮＡの効果を示す。図５ＣはTaqExpress緩衝液中でのＬＮＡの特異性を示す。図５Ｄは縮重を導入する位置の効果（影響）を示し、５つのＬＮＡを有する７−ｍｅｒ（左）、５つのＬＮＡおよび２の縮重位置を有する７−ｍｅｒ（中間）、３つのＬＮＡおよび２の縮重位置を有する７−ｍｅｒ（右）である。
【図６】ランダムアレイにハイブリダイズされかつ蛍光顕微鏡により画像化された、ＦＡＭ標識２０−ｍｅｒユニバーサルプローブ（左パネル）およびＴＡＭＲＡ標識７−ｍｅｒプローブ（中間）を示す。アレイは２つの鋳型を用いて合成され、それら双方はユニバーサルプローブに結合する必要があるが、それらの一方のみが配列ＣＧＡＡＣＣＴで７−ｍｅｒに結合する必要がある。画像は、Nikon TE2000倒立顕微鏡上で２０倍の倍率で、NikonのＤＳｌＱＭ  ＣＣＤカメラを用いて撮られた。右手パネルはカラー合成を示し、予想されたように、TAMRAで標識された特徴のすべてが、ＦＡＭ陽性でもあることを示す。
【図７】Cantaloupeによる配列決定のために、目的の標的配列におけるＤＮＡ試料を濃縮するためのステップを示す。
【図１】
2009529876.tif 000012
【図２】
2009529876.tif 000013
【図３】
2009529876.tif 000014
【図４】
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【図５】
2009529876.tif 000016
【図６】
2009529876.tif 000017
【図７】
2009529876.tif 000018
【配列表】
2009529876000001.app
【国際調査報告】
2009529876.tif 000019
2009529876.tif 000020