(57)【要約】本発明は、ａ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体、またはｂ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスの、あるいは、アデノ随伴ウイルスをコードし、それによりＦＲＮＫをコードする核酸を含む核酸の、インプラントの被覆（好ましくは、ステントの被覆および／またはカテーテルの被覆）のための使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体、または
ｂ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体をコードする核酸
を含むアデノ随伴ウイルスの、あるいは
アデノ随伴ウイルスをコードし、それによりＦＲＮＫをコードする核酸を含む核酸の、医薬品の製造のための使用。
【請求項２】
ａ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体、または
ｂ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体をコードする核酸
を含むアデノ随伴ウイルスの、あるいは
アデノ随伴ウイルスをコードし、それによりＦＲＮＫをコードする核酸を含む核酸の、インプラントの被覆、好ましくは、ステントの被覆および／またはカテーテルの被覆のための使用。
【請求項３】
ＦＲＮＫが配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１から２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
ＦＲＮＫが配列番号３または配列番号４の核酸によってコードされる、請求項１から２のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ＦＲＮＫが、配列番号３または配列番号４の核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる、請求項１から２のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ＦＲＮＫが、遺伝暗号の縮重性がない場合に配列番号３または配列番号４の核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる、請求項１から２のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
アデノ随伴ウイルス、ならびに／あるいは、アデノ随伴ウイルスおよび／またはアデノ随伴ウイルスコード核酸を含む医薬品がカテーテルまたはインプラントによって投与され、好ましくは、インプラントがステントである、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項１から７のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスをコードする核酸により被覆されたステント。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項１から７のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスをコードする核酸により被覆されたカテーテル。
【請求項１０】
医薬品または医療デバイスとしての、請求項８に記載のステントの使用。
【請求項１１】
医薬品または医療デバイスとしての、請求項９に記載のカテーテルの使用。
【請求項１２】
医薬品および／または医療デバイスが冠状動脈血管疾患および／または末梢血管疾患の治療および／または予防用である、請求項１から７および請求項１０から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
冠状動脈血管疾患および／または末梢血管疾患が、再狭窄、血管形成、狭心症、心臓発作、急性冠状動脈症候群、末梢動脈閉塞疾患、脈管炎、血栓症、頸動脈狭窄、発作、梗塞、壊疽、動脈潰瘍、静脈血栓症およびいずれかの四肢の切断を含む群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠状動脈疾患および／または末梢血管疾患の治療、ならびにそのための手段に関連する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患（例えば、狭心症または心臓発作など）は欧州連合および他の工業化国における死因の第１位である。この種の疾患を治療するための最適な方法は、動脈のバルーン治療および／またはステントの埋め込みによる冠状動脈での処置である。しかしながら、ステント埋め込み後に、全患者の約２０％〜６０％が、血管病変部およびリスクプロフィルに依存して、最初の治療の６ヶ月以内に再狭窄による血管の再閉塞を経験しており、したがって、血管再生術を受けなければならない。再狭窄の基礎となっている病態生理学的機構は現在では基本的には理解されている。典型的には、再狭窄は、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖および中膜から内膜内への遊走によって引き起こされ、これにより、血管内腔を減少させる新内膜の形成が生じている。
【０００３】
このことを考慮すると、再狭窄の危険性を減少させることが望ましい。先行技術の方法は、ステント設計に関する改善、超音波、非放射性物質または光化学物質の使用、ならびに、放射性物質によって覆われるステントの使用に基づいている。これらの物理的な手段のほかに、化学的な手段もまた、再狭窄を避けるために用いられており、それにより、特に好ましいものは、細胞増殖抑制剤ならびに抗炎症性物質、例えば、シロリムス、タクロリムス、アクチノマイシンＤ、タキソール、パクリタキセル、デキサメタゾン、マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害剤、スタチン類、インテグリンアンタゴニスト、血管拡張剤およびＮＯ供与体などである。
【０００４】
再狭窄を治療するためのさらなる方法は遺伝子治療に基づいている。先行技術では、数多くの候補遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ｅＮＯＳなど）がそのために標的化されていた。しかしながら、最適な標的を選ぶことのほかに、特有の問題が、これまでのところ、遊走中の血管平滑筋細胞の細胞質膜と、候補遺伝子に対処する投与されたベクターとの間での接触時間が短いことから生じていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
再狭窄を治療する目的のために投与される化学化合物は、典型的には、いわゆる薬物溶出ステントによって適用され、薬物溶出ステントから放出される。しかしながら、ステントを介して医薬的に活性な化合物を送達することは、物質が、好ましくはポリマー被覆によってステント上に被覆されることを必要とする。この種の被覆は、被覆されていないステントと比較して、ステントの増大した体積をもたらし、したがって、炎症および再狭窄の増大した危険性をもたらす。また、この種のステントは、製造することが困難である。再狭窄および再狭窄に関連する疾患、または再狭窄から生じる疾患を治療および／または予防するための別の手段がまだ求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様によれば、本発明の基礎となっている問題が、
ａ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体、または
ｂ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体をコードする核酸
を含むアデノ随伴ウイルスの使用によって解決される。
【０００７】
第２の態様において、本発明の基礎となっている問題が、アデノ随伴ウイルスをコードし、それによりＦＲＮＫをコードする核酸を含む核酸の、医薬品の製造のための使用によって解決される。
【０００８】
第３の態様において、本発明の基礎となっている問題が、
ａ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体、または
ｂ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体をコードする核酸
を含むアデノ随伴ウイルスの使用によって解決される。
【０００９】
第４の態様において、本発明の基礎となっている問題が、アデノ随伴ウイルスをコードし、それによりＦＲＮＫをコードする核酸を含む核酸の、インプラントの被覆のための使用によって解決される。
【００１０】
本発明の第３の態様および第４の態様の好ましい実施形態において、使用はステントの被覆および／またはカテーテルの被覆のためである。
【００１１】
本発明のこれらの態様のいずれかのさらなる実施形態において、ＦＲＮＫは配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明のこれらの態様のいずれかのさらにさらなる実施形態において、ＦＲＮＫは配列番号３または配列番号４の核酸によってコードされる。
【００１３】
本発明のこれらの態様のいずれかの別の実施形態において、ＦＲＮＫは、配列番号３または配列番号４の核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる。
【００１４】
本発明のこれらの態様のいずれかのさらなる実施形態において、ＦＲＮＫは、遺伝暗号の縮重性がない場合に、配列番号３または配列番号４の核酸配列に、好ましくはストリンジェント条件のもとで、ハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる。
【００１５】
これらの態様のいずれかのさらなる実施形態において、本発明のアデノ随伴ウイルス、ならびに／あるいは、本発明のアデノ随伴ウイルスおよび／または本発明のアデノ随伴ウイルスコード核酸を含む本発明の医薬品がカテーテルまたはインプラントによって投与される。
【００１６】
好ましい実施形態において、インプラントはステントである。
【００１７】
第５の態様において、本発明の基礎となっている問題が、本発明のこれらの態様のいずれかに関連して記載されるようなアデノ随伴ウイルスまたはそのようなアデノ随伴ウイルスをコードする核酸により被覆されたステントによって解決される。
【００１８】
第６の態様において、本発明の基礎となっている問題が、本発明のこれらの態様のいずれかに関連して記載されるようなアデノ随伴ウイルスまたはそのようなアデノ随伴ウイルスをコードする核酸により被覆されたカテーテルによって解決される。
【００１９】
第７の態様において、本発明の基礎となっている問題が、本発明の第５の態様に関連して記載されるようなステントの、医薬品または医療デバイスとしての使用によって解決される。
【００２０】
第８の態様において、本発明の基礎となっている問題が、本発明の第６の態様に関連して記載されるようなカテーテルの、医薬品または医療デバイスとしての使用によって解決される。
【００２１】
本発明のこれらの様々な態様による使用の好ましい実施形態において、医薬品および／または医療デバイスは、冠状動脈疾患および／または末梢血管疾患の治療および／または予防のためである。
【００２２】
本発明のこれらの様々な態様による使用のさらにより好ましい実施形態において、冠状動脈疾患および／または末梢血管疾患は、再狭窄、血管形成、狭心症、心臓発作、急性冠状動脈症候群、末梢動脈閉塞疾患、脈管炎、血栓症、頸動脈狭窄、発作、梗塞、壊疽、動脈潰瘍、静脈血栓症およびいずれかの四肢の切断を含む群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者らは驚くべきことに、再狭窄プロセスに関与する別個の標的を使用することと、別個のベクター系を使用することとの組合せが、効率的な遺伝子治療に基づく、再狭窄、および再狭窄に関連する疾患または状態の治療をもたらすことを発見している。より具体的には、標的はフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）であり、さらにより好ましい標的は、それに対する阻害剤である。特に好ましい標的はＦＲＮＫである。これに基づいて、本発明者らは、ＦＡＫの阻害剤を含有するか、またはＦＡＫの阻害剤をコードするアデノ随伴ウイルス、より具体的には、ＦＲＮＫをコードするアデノ随伴ウイルスを、別個のベクター系として使用することを明らかにしている。そのようなアデノ随伴ウイルスは、この事象に関与している血管平滑筋細胞にこのベクター系を使用して感染させるために、それを必要としている生物に、より具体的には、狭窄または再狭窄が生じつつあるか、または存在する部位に投与される。アデノ随伴ウイルスを血管平滑筋細胞に対する送達ビヒクルおよびトランスフェクション手段として使用することと、ＦＡＫに対する強力な阻害剤（例えば、ＦＲＮＫなど）をこのように導入することとのこの特定の組合せは、阻害剤の著しい過剰発現およびそれぞれの細胞（好ましくは、血管平滑筋）内への阻害剤コード核酸のほぼ定量的な遺伝子移入を提供する。これらの機構の組合せは、狭窄および再狭窄に関連づけられる病理学的機構、ならびにそれに関与する細胞（具体的には、血管平滑筋細胞）に対する非常に効率的かつ持続した効果をもたらす。
【００２４】
再狭窄に対する細胞的原因は、それぞれの血管（より好ましくは、動脈）の中膜からの内膜内への血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）の望ましくない遊走である。非病理学的な状態のもとでは、血管平滑筋細胞の遊走は、成体生物における創傷治癒プロセスに関与するプロセスである。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する細胞接着を調整することおよび細胞内のアクチン細胞骨格の収縮性の制御は、真核生物細胞の規定された運動のために不可欠である。様々なインテグリンが、特に、細胞外マトリックスのタンパク質に対する細胞受容体であり、フォーカルアドヒージョンまたはフォーカルアドヒージョン点と呼ばれる別個の部位に蓄積する。細胞外マトリックスおよび細胞内アクチン細胞骨格の相互作用を媒介することのほかに、これらのフォーカルアドヒージョンは、接着に依存した成長の制御、および細胞運動性の調節を含めて、細胞内へのシグナル伝達のために不可欠である。インテグリンは酵素活性を自身で有しないので、インテグリンにより媒介されるシグナル伝達はインテグリン会合酵素の活性に頼っている。
【００２５】
このようなインテグリン会合酵素の１つが、接着性細胞（例えば、上皮細胞、繊維芽細胞または平滑筋細胞など）に存在するタンパク質チロシンキナーゼであるフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）である。ＦＡＫは、細胞マトリックス接触、機械的ストレス、または種々の増殖因子の付加により活性化される。増大した酵素活性のために、ＦＡＫのチロシン残基Ｙ−３９７の自己リン酸化が生じる。ＦＡＫの機能にとって、インテグリンが多いフォーカルアドヒージョンへのＦＡＫの局在化を媒介するＣ末端に位置するフォーカルアドヒージョン標的化ドメイン（ＦＡＴ）は不可欠である。平滑筋細胞などのいくつかの細胞タイプでは、ＦＡＫのＣ末端領域が別個の転写物およびタンパク質としてそれぞれ発現される（これはまたＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）とも呼ばれる）。ＦＲＮＫはＦＡＴドメインを含むので、ＦＲＮＫもまた、フォーカルアドヒージョンに呼び寄せられ、結合部位についてフォーカルアドヒージョンにおいてＦＡＫと競合している。そのために、ＦＲＮＫは内因性ＦＡＫのドミナントネガティブ体であり、したがって、ＦＡＫに依存する細胞事象を阻止することができる。この機構に基づいて、ＦＲＮＫおよびその誘導体を、平滑筋細胞の運動性などのＦＡＫ媒介事象を阻害するために、かつ、したがって、再狭窄および狭窄をそれぞれ抑制するために使用することができる。
【００２６】
ＦＲＮＫおよびその誘導体が、ヒトＦＲＮＫである配列番号１のアミノ酸配列またはマウスＦＲＮＫである配列番号２のアミノ酸配列またはそのようなアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列（例えば、それぞれ、配列番号３および配列番号４など）によって、好ましい実施形態において定義される。加えて、本明細書中で使用されるＦＲＮＫは好ましくは、シグナル伝達においてＦＡＫの活性を発揮することなくフォーカルアドヒージョンにおいてＦＡＫ活性と競合することができる任意のＦＡＫ誘導体である。この種の活性はまた、本明細書中ではＦＲＮＫ活性と呼ばれる。この種のＦＲＮＫ活性を提供するような程度にＦＡＫを誘導体化することは当業者の技術の範囲内である。したがって、本発明は、好ましい実施形態において、ＦＲＮＫ活性を有する任意のタンパク質およびそのようなタンパク質をコードする任意の核酸を使用することができる。しかしながら、何らかの理論によって拘束されることを望まないが、任意のそのような誘導体はＦＡＫのＦＡＴドメインを含まなければならないようである。好ましくは、ＦＲＮＫは、データバンクアクセッション番号＃Ｑ０５３９７などに開示されるＦＡＫアミノ酸配列のアミノ酸残基６９３〜アミノ酸残基１０５０（すなわち、前記ＦＡＫのカルボキシ末端の３５９個のアミノ酸）を含む。さらなる実施形態において、ＦＲＮＫはまた、ＦＲＮＫの少なくとも１つの結合機能または生物学的機能（より具体的には、フォーカルアドヒージョンに対する結合）を保持し、かつ、パキシリンおよびタリンの結合部位を含む、ＦＡＫの前記３５９アミノ酸のカルボキシ末端のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは好ましくは、長さが１００アミノ酸、１５０アミノ酸または２００アミノ酸である。そのようなフラグメントは、ＦＲＮＫまたはＦＲＮＫ活性を有するタンパク質からアミノ末端セグメントを欠失することによって、そのカルボキシ末端セグメントを欠失することによって、その間のセグメントを欠失することによって、また、それらの組合せによって形成させることができる。１つまたは複数の小さい異種アミノ酸セグメント（例えば、長さが１アミノ酸〜１０アミノ酸）を、ＦＲＮＫの機能または活性を変化させることなく、アミノ末端において、カルボキシ末端において、間の位置において、またはそれらの組合せで、ＦＲＮＫまたはＦＲＮＫフラグメントに挿入することができることもまた理解される。ＦＡＫおよび／またはＦＲＮＫ、ならびにＦＡＫおよび／またはＦＲＮＫをコードするそれぞれの核酸は任意の生物種のものが可能であり、好ましくは、生物種は哺乳動物種であり、さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトであることが理解される。
【００２７】
ＦＲＮＫをコードする核酸は、本明細書中で使用される場合、好ましくは、配列番号３および／または配列番号４の核酸配列である。さらなる実施形態において、ＦＲＮＫをコードする核酸は、以前に記載されたようなＦＲＮＫタンパク質をコードする核酸であり、より好ましくは、配列番号１および／または配列番号２のＦＲＮＫタンパク質をコードする核酸である。アミノ酸配列から、特に遺伝暗号の縮重性を考えて、原理上、同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を推定することは当業者の技術の範囲内である。特に好ましい核酸配列は、真核生物細胞に対して、より具体的には平滑筋細胞に対して、さらにより好ましくは血管平滑筋細胞に対して適切であるようなそれぞれのコドン使用を使用する核酸配列である。また、ＦＲＮＫおよびその誘導体をコードする核酸は、以前に記載された核酸配列（より好ましくは、配列番号３および／または配列番号４の核酸配列）にハイブリダイゼーションする任意の核酸でありまたは遺伝暗号の縮重性がない場合にそのような核酸配列にハイブリダイゼーションする任意の核酸である。本発明の好ましい実施形態のために、本明細書中に記載の核酸配列はどれも、ＦＲＮＫまたはＦＲＮＫ活性を有するタンパク質およびその活性なフラグメントを含む上記で記載されたようなその誘導体をコードすることが不可欠である。発現したとき、ＦＲＮＫ、またはＦＲＮＫ活性を有するタンパク質を規定する他のＤＮＡが、本明細書中に記載されるようなＦＲＮＫをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションすることを可能にする条件を、知られている技術に従って決定することができる。例えば、そのような配列のハイブリダイゼーションを、低下したストリンジェンシーの条件のもとでまたは中程度のストリンジェンシーの条件のもとでまたはさらにストリンジェントな条件のもとで行うことができる（例えば、それぞれ、標準的なハイブリダイゼーションアッセイにおいて、本明細書中に開示される、ＦＲＮＫをコードするＤＮＡ、またはＦＲＮＫ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに対して、５倍のデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１ｘＳＳＰＥを伴う３７℃での３５％〜４０％のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件；５倍のデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１ｘＳＳＰＥを伴う４２℃での４０％〜４５％のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件；ならびに、５倍のデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１ｘＳＳＰＥを伴う４２℃での５０％のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件）（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）を参照のこと）。一般に、ＦＲＮＫをコードする核酸、またはＦＲＮＫ活性を有するタンパク質をコードする核酸は、本明細書中に開示されるＦＲＮＫをコードする配列に対して少なくとも７５％の相同性、８５％の相同性またはさらには９０％以上の相同性を有し、かつ、好ましくは、上記で示されたようなＦＲＮＫの生物学的活性を保持するタンパク質をコードする。本明細書中において、ＦＲＮＫ、ＦＲＮＫタンパク質およびＦＲＮＫ活性を有するタンパク質は、そうでないことが明示的に示されないならば、同義的様式で使用される。同じことが、タンパク質およびポリペプチドの用語の使用に対してもまた適用される。
【００２８】
ＦＲＮＫタンパク質、またはＦＲＮＫをコードするＤＮＡは、哺乳動物を含めて、任意の好適な生物種（より好ましくは、ヒト）に由来する天然起源であり得るかまたは合成起源であり得る。
【００２９】
特に、上記ＦＲＮＫ、またはＦＲＮＫ活性を有するタンパク質と、それらをコードする核酸との組合せで、再狭窄、再狭窄関連疾患および／または狭窄関連疾患の非常に効率的な遺伝子治療を可能にするベクター系はアデノ随伴ウイルスである。
【００３０】
アデノ随伴ウイルスはパルボウイルス群のメンバーである。アデノ随伴ウイルスは、約５６００塩基の長さを有する環状の一本鎖ＤＮＡ分子を含む。アデノ随伴ウイルスは、典型的には、細胞がまたヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルスなど）によって感染したときにだけ、複製し、かつ増殖性の感染サイクルを開始することができる。ヘルパー細胞のほかに、トランス作用因子を提供するプラスミド（１つまたは複数）が、アデノ随伴ウイルスの複製を可能にするために提供され、使用され得る。増殖性複製はまた、細胞を細胞増殖抑制剤（例えば、ダヌボブラスチンなど）および／または放射線により治療されたときにも生じ得る。アデノ随伴ウイルスは、遺伝子発現の調節のために関連のある３つの異なるプロモーター（すなわち、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０）を含む。
【００３１】
本発明は特定のアデノ随伴ウイルスの使用に限定されない。しかしながら、特に好ましいのは２型アデノ随伴ウイルスの使用である（Ｒｏｈｒ  Ｕ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５（２００２）：２６５〜２７５）。本発明において使用することができる他のアデノ随伴ウイルスウイルスが当業者には知られている（例えば、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６（Ｇｒｉｍｍ  Ｄ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００３、第７巻（６）：８３９〜８５０））。
【００３２】
本発明者らは、驚くべきことに、先行技術において表された懸案事項、すなわち、アデノ随伴ウイルスベクターは脈管の血管における内皮細胞だけのトランスフェクションのために好適であるにすぎないということ（Ｌｙｎｃｈ，ＣＭ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８０：４９７〜５０５、１９９７）は正当化されないことを見出している。むしろ、それとは反対に、ＦＲＮＫを含むこの種のアデノ随伴ウイルスを使用する管腔内送達は、再狭窄を阻害することに対する予想外の非常に効率的かつ持続的な効果をもたらしている。
【００３３】
好ましくは、ＦＲＮＫおよびその誘導体をコードする核酸は、ＦＲＮＫの発現、好ましくは、前記ウイルスベクターによる感染を受けやすい細胞におけるＦＲＮＫの発現を導く少なくとも１つの調節配列に機能的に連結される。ＦＲＮＫの発現を導く調節配列（１つまたは複数）は、好ましくは、エンハンサー、オペレーター配列などのさらなる調節配列などをさらに含むことができるプロモーターである。プロモーターは、平滑筋細胞に対して特異的なプロモーターであることが最も好ましい。そのようなプロモーターは、好ましくは、「平滑筋２２α−アクチンプロモーター」（Ｓｏｌｗａｙ  Ｊ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５、２７０：１３４６０〜６９）を含む群から選択することができる。加えて、より万能的なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター（Ｒｏｈｒ  Ｕ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２００２、１０５：２６５〜２７５）などを用いることができる。
【００３４】
ウイルス粒子として存在するアデノ随伴ウイルスまたはそのようなアデノ随伴ウイルスをコードする核酸として存在するアデノ随伴ウイルスの両方が本発明の任意の態様において使用され得ることは本発明の範囲内である。組換えベクターが調製されると、組換えベクターは、好ましくは、ａ）ベクターの成長および複製を可能にする細胞を含む細胞培養物においてベクターを増殖させ、次いで、ｂ）組換えベクターを細胞培養物から集めることによって複製させることができる（すべてが、知られている技術に従って行われる）。培養物から集められたウイルスベクターは、知られている技術に従って培養培地から分離することができ、そして、本発明に従ってそれぞれ、対象への投与のための好適な医薬用キャリアと組み合わせることができまたは被覆ステントおよび被覆カテーテルの調製のために使用することができる。
【００３５】
本発明に従って設計されるようなアデノ随伴ウイルスは、様々な疾患の予防および／または治療のために使用することができ、したがって、それぞれの医薬品の製造に供するために好適である。このように設計されたウイルスまたはウイルスコード核酸が使用される疾患および医薬品はそれぞれ、基本的には再狭窄および狭窄、ならびに、再狭窄および狭窄に関連づけられる任意の疾患である。また、平滑筋細胞（より好ましくは、血管平滑筋細胞）の望ましくない成長から生じるそのような疾患も含まれる。好ましくは、そのような疾患は冠状動脈疾患および／または末梢血管疾患である。原理的には、本発明の様々な態様は動脈系および静脈系の両方に適用可能であり、しかし、本発明の基礎となっている分子的機構のために、血管系の動脈分岐に対する適用性がさらにより好都合である。
【００３６】
血管平滑筋細胞に導入されたＦＲＮＫ、およびＦＲＮＫ活性を有する任意のタンパク質、およびその誘導体の作用様式に関して、特に、下記の疾患を予防および／または治療することができる（それにより、原理的には、そのような治療は、それぞれの疾患の発症前または発症後のいずれかで、あるいは、バルーン治療などのその任意の治療が行われる前または行われた後のいずれかで行うことができる）：急性冠状動脈症候群、末梢動脈閉塞疾患、脈管炎、血栓症、頸動脈狭窄、発作、任意の梗塞（心筋梗塞、腸管梗塞、腎臓梗塞を含むが、これらに限定されない）、壊疽、動脈潰瘍、静脈血栓症およびいずれかの四肢の切断。
【００３７】
好ましい実施形態において、これらの疾患はいずれも、本明細書中に記載されるようなアデノ随伴ウイルスまたはそのようなアデノ随伴ウイルスをコードする核酸で被覆されたステントまたはカテーテルの使用によって予防および／または治療される。すなわち、血管系の任意の部分にカテーテルまたはステントが到達することができるならば、そのような特定の疾患が好ましくは治療可能である。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載されるようなアデノ随伴ウイルスまたはそのようなアデノ随伴ウイルスをコードする核酸で被覆されたステント、より具体的には、ＦＲＮＫ、ＦＲＮＫ誘導体、および／または、ＦＲＮＫ活性を有する任意のタンパク質を発現および／またはコードするアデノ随伴ウイルスで被覆されたステントに関する。ステントは、それ自体はこの分野では知られており、典型的には、気管、食道および血管系などの中空臓器の内腔を橋渡しするか、または維持するために使用される内部人工器官である。典型的には、ステントは、前記中空臓器に設置されたときに自己膨張性である。設置は、好ましくは、この分野で知られているような内視鏡的手段によって行われる。ステントは多くの形態で存在し、本発明の適用性はステントの異なった実施形態または形態に限定されない。好ましくは、アデノ随伴ウイルスまたはアデノ随伴ウイルスをコードする核酸はステントに吸着させられる。そのような吸着は共有結合性の手段ならびに非共有結合性の手段を含むことができる。しかしながら、共有結合性の手段の場合には、ステントの表面へのアデノ随伴ウイルスの共有結合性の結合が、生理学的条件のもとで、すなわち、平滑筋細胞の遊走が阻害されるべきそれぞれの位置にステントが設置された後で切断されることが好ましい。ステントに対するアデノ随伴ウイルスの固定化は、治療されるべき状態に従って制御可能である特徴的な放出速度論をもたらし得ることが理解される。それぞれのアデノ随伴ウイルスが、特に多数の平滑筋細胞がトランスフェクションされることを確実にするようにバーストの形態で細胞に放出され得ることは本発明の範囲内である。ステントがより長い期間にわたって体内に留置され得るという事実を考えると、ステントからのアデノ随伴ウイルスの持続した放出もまた原理的には可能である。これは、さらなる世代の遊走している平滑筋細胞が、このような後に放出されたアデノ随伴ウイルス、またはアデノ随伴ウイルスをコードするそれぞれの核酸によって感染することを可能にする。
【００３９】
同じ事情、可能な使用および設計原理がまた、カテーテルに対して適用可能である。したがって、カテーテルを、本明細書中に記載されるようなアデノ随伴ウイルスまたはそのようなアデノ随伴ウイルスをコードする核酸によって被覆することができる。しかしながら、ステントと比較した場合、平滑筋細胞に対する本明細書中に記載されるようなアデノ随伴ウイルスの送達は、非常に限定された期間だけ、すなわち、カテーテルが、アデノ随伴ウイルスが送達されることになる中空臓器（より具体的には、それぞれの血管）の中に挿入されている期間にわたって行うことができる。カテーテルの適用は一般に、使用されるカテーテルの特定の形態に依存して、平滑筋細胞と、カテーテルから放出されるアデノ随伴ウイルスとの間でのかなり短い接触時間が実現されるように、中空臓器の内腔（例えば、血管の内腔など）のかなり短い遮断を得ようとすることである。しかしながら、カテーテルが挿入される中空臓器の内腔を通る体液の流れを遮断しないカテーテルもまた利用可能であることが理解される。これは、カテーテルと、平滑筋細胞の成長およびより具体的には、その遊走が、アデノ随伴ウイルスを介して導入されたＦＲＮＫおよびその誘導体によって阻害されることになる血管の部位との間でのより長く続く接触を可能にする。原理的には、ステントについて記載されたのと同じ被覆技術および吸着技術および固定化技術が、カテーテルを介する本明細書中に記載されるようなアデノ随伴ウイルスの投与に対して適用可能である。
【００４０】
アデノ随伴ウイルスをステントおよびカテーテルにそれぞれ吸着または固定化するための特に好都合なシステムがポリマーの使用である。アデノ随伴ウイルスがそれぞれのポリマーに埋め込まれる。典型的には、ポリマーは、アデノ随伴ウイルスを保持するケージとして作用する格子構造を示す。ポリマーは好ましくは、生理学的条件のもとで、より具体的には、アデノ随伴ウイルスが投与または送達されることになる部位において広く一般に存在する条件のもとで分解することができるポリマーである。あるいは、ポリマーは非分解性であり、被覆されたデバイスの表面に留まり、これにより、表面へのアデノ随伴ウイルスまたは様々な他の配合物の吸収を可能にする。好ましくは、被覆は、例えば、平滑筋細胞へのアデノ随伴ウイルスの即時的な放出を可能にするためのものなどである。より具体的には、被覆は、それぞれの中空臓器（より具体的には、それぞれの血管）を通過する体液によって直ちに接触される表面とは異なるステントまたはカテーテルのいずれかの表面においてである。さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載されるようなアデノ随伴ウイルスによって被覆されるステントおよび／またはカテーテルの製造に関する。
【００４１】
次に、本発明は、本発明のさらなる態様、実施形態、特徴および利点が理解され得る図および実施例によってさらに例示される。
【００４２】
図１はＦＡＫおよびＦＲＮＫの機能的ドメインの概略図を示す。ＦＲＮＫは数個のドメインを含む：すなわち、バンド４．１相同性ドメイン、それに続く、キナーゼドメイン、そして、ｐ１３０ＣａｓおよびＲｈｏ−ＧＡＰ  ＧＲＡＦなどのＳＨ３ドメイン含有タンパク質結合部位として役立ち得る２つのプロリンリッチ領域（Ｐｒｏ−１およびＰｒｏ−２）、そして、フォーカルアドヒージョン標的化ドメイン（これはまたＦＡＴドメインとも呼ばれる）。キナーゼドメインの近くにおいて、３９７位のチロシン残基が、実施例２においてさらに概略されるように、ＦＡＫによって媒介されるシグナル伝達のための必須条件であるＦＡＫの自己リン酸化のための標的である。
【００４３】
ＦＲＮＫはＦＡＫのキナーゼドメインの後のＣ末端領域を含む。図１に表されるようなＦＲＮＫの特定の実施形態において、ＦＲＮＫは、ＦＡＴドメインだけでなく、ｐｒｏ−１領域およびｐｒｏ−２領域の両方を含む。
【００４４】
バンド４．１相同性ドメインは、ＦＡＫをタンパク質チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦ受容体など）に連結するタンパク質−タンパク質相互作用に関与する。このキナーゼドメインは、以前に既に記載されていたように、ＦＡＫの自己リン酸化を含むリン酸化を介するシグナル伝達に関わっている。ＦＡＫのおそらくは最も重要なドメインは、インテグリンへのＦＡＫの局在化を媒介するフォーカルアドヒージョン標的化ドメインである。ＦＡＴドメインは、疎水性相互作用によって会合する４つのαらせんからなる束を含む。この領域（特に、そのＦＡＴドメイン）は、平滑筋細胞を含むいくつかの細胞タイプでは別個の転写物として発現される。この転写物はＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）と呼ばれる。ＦＲＮＫはＦＡＴドメインを含むので、それぞれの結合部位についてＦＡＫと競合することができる。ＦＡＫと比較した場合、ＦＲＮＫの何らかのキナーゼ活性がないことを考えると、ＦＲＮＫは内因性ＦＡＫのドミナントネガティブ体であり、したがって、ＦＡＫに依存する細胞事象に対する効率的な阻害剤である。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＦＲＮＫを発現するアデノ随伴ウイルスの構築
【００４６】
マウスＦＲＮＫ（すなわち、図２Ｂにも示されるようなＦＡＫのアミノ酸６９３〜１０５０に対応するアミノ酸配列）のコード配列をＰＣＲによって増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの制限酵素に対する制限部位をプライマーの５’末端にそれぞれさらに導入した。得られたＰＣＲフラグメントを続いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の市販のアデノ随伴ウイルスシステムの一部であるベクターｐＡＡＶ−ＭＣＳに導入した。インサートは、ＦＲＮＫのアミノ酸配列を含むだけでなく、アデノ随伴ウイルスによって発現されたときにＦＲＮＫの特異的な検出を可能にするように導入されたＨＡタグを３’末端に含んだ。ｐＡＡＶシステムのベクターの配列は下記のインターネットサイトから入手可能である：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ／ａａｖ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍｌ。
【００４７】
ｐＡＡＶシステムのベクターを、１０％子ウシ血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｎｚ、オーストリア）を含有するＤＭＥＭ培地を使用してヒト２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で用いる提供されたプロトコルに従って感染性の複製欠陥アデノ随伴ウイルス粒子を作製するために使用した。典型的には、細胞を、１０ｍｌのこの培地を含有する直径１０ｃｍの組織培養ディッシュにおいて保った。細胞のコンフルエンシーを２０％〜９０％の間で維持した。同時に、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を含有するＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のベクターｐＡＡＶ−ＬａｃＺを、ＬａｃＺをコードする組換えＡＡＶ粒子を作製するために使用した。トランスフェクションされたヒト２９３Ｔ細胞の凍結−融解を繰り返し、ＦＲＮＫをコードするウイルス粒子（これはまたＡＡＶ−ＦＲＮＫと呼ばれる）、およびＬａｃＺをコードするウイルス粒子（ＡＡＶ−ＬａｃＺ）をそれぞれ放出させた後、感染性ウイルス粒子の力価を測定した。そのために、ヒト血管平滑筋細胞に、下記に示されるプロトコルに従って種々の希釈度のウイルス調製物を感染させ、５日後にｌａｃＺ陽性細胞の数を測定した。その数から、調製物の単位体積あたりの感染性粒子の数を決定することができる。とりわけ、この初代ヒト平滑筋細胞はＣｌｏｎｅｔｉｃｓから市販されている。
【００４８】
クローン化法（より具体的には、クローニングベクター）を再び図２Ａに示し、ＭＣＳにクローン化されたアミノ酸配列を図２Ｂに示す。
【００４９】
実施例２：インテグリン刺激時の平滑筋細胞におけるＦＡＫのチロシンリン酸化
【００５０】
本実験では、平滑筋細胞の遊走の阻害およびしたがって、再狭窄における標的としてのＦＡＫの重要性が確認された。ＦＡＫは、再狭窄に関連して平滑筋細胞の遊走のための活性化因子として同定された増殖因子または細胞外マトリックスのタンパク質（例えば、ビトロネクチンなど）により平滑筋細胞が刺激された後の、最も強くチロシンがリン酸化されているタンパク質の１つであることが判明した。
【００５１】
細胞外マトリックスへの付着によって刺激される細胞タンパク質を特徴づけるために、平滑筋細胞を、０．５％子ウシ血清を含有するＤＭＥＭにおいて１６時間の血清飢餓に供し、限定トリプシン消化によってプレートから剥離させ、０．２％ウシ血清アルブミンを含有するＤＭＥＭ（懸濁培地）において３７℃で懸濁状態に保った。懸濁状態で１時間の後、細胞をペレット化し、改変ＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロール、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、ならびに、各１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペファブロクおよびペプスタチン）に溶解し（懸濁サンプル）またはＰＢＳにおける１μｇ／ｍｌのビトロネクチンの５ｍｌにより４℃で１６時間被覆された１０ｃｍの細胞培養ディッシュに置床し、その後、ビトロネクチン付着細胞を改変ＲＩＰＡ緩衝液に溶解した（ＶＮ刺激）。清澄化された細胞溶解液の等しい量を等体積の還元性の２ｘＳＤＳサンプル緩衝液に加え、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦメンブランに移した。抗ホスホチロシン抗体および抗ＦＡＫ抗体をそれぞれ用いたウエスタンブロットを記載のように行った（Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ，Ｄ．Ｄ．およびＨｕｎｔｅｒ，Ｔ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９８、８（４）：１５１頁〜１５７頁）。
【００５２】
図３Ａに示されるように、ＦＡＫのチロシンリン酸化が、インテグリン刺激剤を何ら伴わない懸濁状態に置かれた細胞（ＳＵＳ）と比較して、ビトロネクチン（ＶＮ）に置床することによる細胞インテグリンの刺激のときに著しく増大している。図３Ａの上段パネルにおいて、リン酸化されたＦＡＫが、抗ホスホチロシン抗体（Ｐｔｙｒ）（すなわち、リン酸化されたチロシン残基を特異的に検出する抗体）を使用するウエスタンブロット分析で検出される。図３Ａの下段パネルは、モノクローナル抗ＦＡＫ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用する同じサンプルのウエスタンブロット分析を示す。これにより、観測された結果が、ＦＡＫタンパク質のレベルを変化させる転写効果または翻訳効果に基づくのではなく、ＦＡＫのリン酸化状態に依存することが確認される。懸濁された細胞、ならびに、ビトロネクチンに再置床された細胞の両方において、ＦＡＫが、類似したレベルで発現していた。
【００５３】
固定化ビトロネクチンに向かう初代ヒト平滑筋細胞の遊走応答を分析するために、細胞を改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバー走触性遊走アッセイにおいて分析した。このために、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌチャンバー（８μｍの細孔サイズ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、多孔性メンブランの下面側において、示された量のビトロネクチンにより室温で２時間被覆し、その後、４００μｌの懸濁培地を含有する２４ウエルプレートに置いた。３００μｌの懸濁培地における１ｘ１０５個の血清飢餓処理された平滑筋細胞をチャンバーの中に加え、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、遊走させた。その後、内側チャンバーに留まっている細胞を綿棒アプリケーターにより拭き取り、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの多孔性メンブランの下面側におけるビトロネクチン被覆表面に遊走していた細胞を固定処理し（Ｈ２Ｏにおける３７．５％エタノール、２５％酢酸）、クリスタルバイオレットにより染色した。チャンバーあたり４つの無作為な視野における染色された細胞を低倍率（４０ｘ）で倒立顕微鏡下で計数した。平均細胞数±標準偏差を図３Ｂに示す。結果から、ビトロネクチンは、ウシ血清アルブミンで被覆されたチャンバーと比較した場合、濃度依存的様式で平滑筋細胞の走触性を刺激していることが示される。この研究の重要なことは、この目的のために使用された細胞が、再狭窄の現象において非常に重要な役割を果たしていると考えられる冠状動脈由来の初代ヒト平滑筋細胞であるという事実に基づいている。
【００５４】
ビトロネクチンの運動生成（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）能力が、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの下面メンブラン側における平滑筋細胞を６時間の遊走の後で固定処理し、クリスタルバイオレットを使用して染色した上記の走触性遊走実験からの２つの代表的な遊走チャンバーの下部メンブランの顕微鏡写真によってさらに明らかにされる。図３Ｃは、ＢＳＡにさらされた細胞は遊走せず、したがって、細胞をメンブランの下面側に認めることができず、これに対して、ビトロネクチン（ここでは、１０μｇ／ｍｌの濃度で）により被覆されたＭｉｌｌｉｃｅｌｌチャンバーに置かれた細胞は強い遊走応答を示し、したがって、クリスタルバイオレットにより染色された数多くの平滑筋細胞が多孔性メンブランの下面側に見出されたことを例示している（図３Ｃ）。
【００５５】
実施例３：ＦＲＮＫを発現するアデノ随伴ウイルスを感染させたときの平滑筋細胞のビトロネクチン刺激された走触性の阻害
【００５６】
本実験では、実施例１で作製されたアデノ随伴ウイルス型ベクター（ＡＡＶ−ＬａｃＺおよびＡＡＶ−ＦＲＮＫ）を使用した。トランスフェクションに対するウイルスの好適性を証明するために、ブタ平滑筋細胞ならびヒト平滑筋細胞にＡＡＶ−ＬａｃＺを感染させた。したがって、平滑筋細胞を、１０ｍｌの成長培地（増殖因子補充物ＳｍＧＭ−２（カタログ番号ＣＣ−４１４９；ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ、Ｓｔ．Ｋａｔｈａｒｉｎｅｎ、ドイツ）を有するＳｍＢＭ（カタログ番号ＣＣ−３１８１；ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ、Ｓｔ．Ｋａｔｈａｒｉｎｅｎ、ドイツ））を含有する１０ｃｍの細胞培養ディッシュにおいて、３７℃および５％ＣＯ２で１日間〜２日間、培養した。細胞集団が２０％のコンフルエンシーに達した後、培地を抜き取り、２％の熱不活化子ウシ血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｎｚ、オーストリア）を有する５ｍｌのＤＭＥＭによって置き換え、細胞を、細胞あたり５０の感染多重度（ＭＯＩ）の感染性ウイルス粒子と３７℃および５％ＣＯ２において２時間インキュベーションした。続いて５ｍｌの成長培地を培養物に加えた。５日後、形質導入された平滑筋細胞を固定処理し、ＬａｃＺ活性について染色しまたはタンパク質発現を測定するために溶解しまたは遊走実験において使用した。
【００５７】
ＬａｃＺ活性を分析するために、感染細胞を、β−ガラクトシダーゼをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＬａｃＺ）による感染後２日目に、ＰＢＳにおける１．８％ホルマリン、０．０５％グルタルアルデヒドにおいて室温で５分間、固定処理した。固定処理後、細胞をＬａｃＺ染色溶液（ＰＢＳにおける５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２）と３７℃で２時間インキュベーションした。このとき、ＬａｃＺ陽性細胞が青色の染色を表した。図４Ａにおいて認めることができるように、ブタ平滑筋細胞ならびにヒト平滑筋細胞の両方がβ−ガラクトシダーゼ活性の結果として青色の染色を示している。このことは、両者がアデノ随伴ウイルスベクターを使用して成功裏に形質導入されたことを明らかにしている。
【００５８】
初代平滑筋細胞を形質導入する、ＦＲＮＫをコードするアデノ随伴ウイルスの能力を評価するために、上記の実施例２で記載されたように、細胞を、ＡＡＶ−ＦＲＮＫによる感染後５日目に改変ＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、抗ＨＡタグ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いたウエスタンブロットによって分析した。
【００５９】
図４Ｂは、ＡＡＶ−ＦＲＮＫにより形質導入された平滑筋細胞（右側レーン）におけるＨＡ−ＦＲＮＫの発現を示し、これに対して、感染していないコントロール細胞（左側レーン）は、ＨＡ−ＦＲＮＫの予想される分子量を有する対応するタンパク質バンドを示していない。
【００６０】
ヒト血管平滑筋細胞におけるＦＲＮＫ発現の機能的結果を分析するために、ウイルス感染細胞を用いたＢｏｙｄｅｎチャンバー走触性遊走アッセイを実施例２で記載されたように行った。遊走刺激剤として、チャンバーを、多孔性メンブランの下面側において、陰性コントロールとしてのウシ血清アルブミン（ＤＭＥＭにおける０．２％ＢＳＡ）で、またはビトロネクチン（ＶＮ；ＤＭＥＭにおける１０μｇ／ｍｌ）でのいずれかで被覆した。走触性アッセイの５日前に、細胞に、実施例２で記載されたように、コントロールのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＬａｃＺ）またはＦＲＮＫをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＦＲＮＫ）を感染させた。図４Ｃにおいて認めることができるように、ＡＡＶ−ＬａｃＺを感染させた初代ヒト平滑筋細胞は、固定化されたビトロネクチンに対して応答し、下部のメンブラン表面に遊走している。しかしながら、ＡＡＶ−ＦＲＮＫによる細胞の感染および初代ヒト平滑筋細胞における得られるＨＡ−ＦＲＮＫ発現は、ＢＳＡ処理された遊走チャンバーにおけるコントロール細胞において認められる基底レベルの近くにまでビトロネクチン刺激された走触性遊走を効率的に低下させている。
【００６１】
実施例４：ＦＲＮＫの遺伝子移入による、ＰＴＣＡおよびステント埋め込みの後における再狭窄の治療
【００６２】
動物モデル
【００６３】
下記は、ＰＴＣＡおよびステント埋め込みの後における再狭窄を予防するために適用されるプロトコルであり、それにより、再狭窄が、より具体的には、二重バルーンカテーテルを使用するＦＲＮＫのアデノ随伴ウイルス−２（ＡＡＶ−２）媒介による遺伝子移入によって予防される。動物モデルはブタである。
【００６４】
右総頸動脈を完全麻酔および機械的通気のもとで調製する。７Ｆロックを導入した後、左冠状動脈の選択的血管造影を５Ｆガイドカテーテルによって行う。３．０／１０ｍｍのステントを左冠状動脈の心室間枝の近位側１／３および回旋枝の近位側１／３に埋め込む。十分な再狭窄を誘導するために、１．３：１のステント対動脈の比率が意図される。ステントを埋め込んだ後、２つのバルーンを有するバルーン灌流カテーテルを、ステントが位置する血管の断面に設置する。ステント＋両側２ミリメートルの全長を２つの閉塞バルーンの間で覆う。閉塞した断面の遠位側の冠状動脈の積極的な灌流を提供するために、頸動脈に挿入された７Ｆロックの側方ポートから取られる動脈血を使用する。灌流をローラーポンプによって行う。血液には、血液がローラーポンプに進入する前に連続注入としてヘパリンおよび硝酸塩の混合物を補充する。バルーンによる血管に対する損傷を避けるために、膨張を最小圧（０．５ａｔｍ）で行う。緑色蛍光タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＧＦＰ）およびＦＲＮＫと緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−ＦＲＮＫ−ＧＦＰ）を含む１０ｍｌのウイルス溶液（１ｍｌあたり１０８個〜１０１０個のウイルス粒子）をそれぞれ１０分かけて投与する。その後、積極的な灌流カテーテルを取り出し、頸動脈を結紮し、切開部を閉じる。
【００６５】
手術後４週間の期間にわたって、動物には、１日あたり７５ｍｇのクロピドグレルおよび１００ｍｇのアセチルサリチル酸の組合せを経口投与する。４週間後、さらなる血管造影を行い、その後、各器官を取り出す。心臓をＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流においてホルムアルデヒド溶液により固定処理する。その後、ステントを含む冠状動脈切片を調製し、組織学および形態計測に関して分析する。
【００６６】
組織学および形態計測
【００６７】
ステントインプラントが４週間にわたって所定位置に置かれた上記試験に続いて、再狭窄の形態計測、組織学的切片におけるウイルス分布、バルーンの部位における新内膜の形成、ならびに、臓器損傷の毒学的分析、および各器官における全身的ウイルス放出を評価する。
【００６８】
形態計測のために、冠状動脈の灌流固定処理された断面部をメタクリラートに包埋し、切片をミクロトームによって調製する。平面形態計測を再狭窄の定量的測定のためのＨＥ染色の後に行う。
【００６９】
加えて、同じ切片に、ウイルスによって同時トランスフェクションされた、トランスフェクション効率の測定を可能にする緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を検出するために、蛍光光線（励起波長、５００ｎｍ）を使用して照射する。加えて、ウエスタンブロット分析を使用して、血管の３つの切片を、ＦＲＮＫ、ならびに、同時トランスフェクションされたマーカーのＦＬＡＧおよびＨＡについて分析する。サンプルの血管セグメントを臓器取り出し後直ちに単離する。血液およびステントを氷冷緩衝液中で取り除く。組織をタンパク質分析のためのさらなる処理の前に液体窒素において保存する。同様に、血管、心筋の隣接セグメントの組織サンプル、ならびに器官（例えば、肺、肝臓、腎臓および骨格筋など）の組織サンプルを、局所的分布および全身的分布を明らかにするために、ウイルスマーカーについて分析する。血液サンプルは試験の前および後で保存され、造血系に対する損傷について、また、肝臓、心臓、筋肉および腎臓のパラメーターについて分析される。
【００７０】
本明細書、特許請求の範囲、配列表および／または図面において開示される本発明の特徴は、別々に、また、その任意の組合せでの両方で、本発明をその様々な形態で実現するために必須であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＦＡＫおよびＦＲＮＫの機能的ドメインを示す概略図である。
【図２Ａ】３ｘＨＡタグを有するＦＲＮＫがクローン化されたマルチクローニング部位を有するアデノ随伴ウイルス型ベクターを示す略図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示されたアデノ随伴ウイルスにクローン化されるようなＦＲＮＫのアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】懸濁されたヒト冠状動脈平滑筋細胞およびビトロネクチンにより刺激されたときの接着性のヒト冠状動脈平滑筋細胞の全細胞溶解物におけるＦＡＫの発現およびそのリン酸化のウエスタンブロット分析を示す。
【図３Ｂ】平滑筋細胞の走触性（ｈａｐｔｏｔａｘｉｓ）に対するビトロネクチンの影響を示すグラフである。
【図３Ｃ】クリスタルバイオレットにより染色した後の、ウシ血清アルブミンおよびビトロネクチンで処理された平滑筋細胞を示す写真である。
【図４Ａ】β−ガラクトシダーゼをコードするアデノ随伴ウイルスを感染させた平滑筋細胞を示す写真である。
【図４Ｂ】ＦＲＮＫをコードするアデノ随伴ウイルスを感染させた後のヒト平滑筋細胞の細胞溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【図４Ｃ】ビトロネクチンによる刺激、およびＦＲＮＫを発現するアデノ随伴ウイルスによるトランスフェクションを行ったときのヒト平滑筋細胞の走触性−遊走を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
2009513556.tif 000003
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2009513556.tif 000006
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2009513556.tif 000009
【図４Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月16日(2005.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体、または
ｂ）ＦＲＮＫもしくはその誘導体をコードする核酸
を含むアデノ随伴ウイルスの、あるいは
アデノ随伴ウイルスをコードし、それによりＦＲＮＫをコードする核酸を含む核酸の、ステントの被覆および／またはカテーテルの被覆のための使用。
【請求項２】
ＦＲＮＫが配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＦＲＮＫが配列番号３または配列番号４の核酸によってコードされる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＦＲＮＫが、配列番号３または配列番号４の核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＦＲＮＫが、遺伝暗号の縮重性がない場合に配列番号３または配列番号４の核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項１から５のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスをコードする核酸により被覆されたステント。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項１から５のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスをコードする核酸により被覆されたカテーテル。
【請求項８】
医薬品または医療デバイスとしての、請求項６に記載のステントの使用。
【請求項９】
医薬品または医療デバイスとしての、請求項７に記載のカテーテルの使用。
【請求項１０】
医薬品および／または医療デバイスが冠状動脈血管疾患および／または末梢血管疾患の治療および／または予防用である、請求項８から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
冠状動脈血管疾患および／または末梢血管疾患が、再狭窄、血管形成、狭心症、心臓発作、急性冠状動脈症候群、末梢動脈閉塞疾患、脈管炎、血栓症、頸動脈狭窄、発作、梗塞、壊疽、動脈潰瘍、静脈血栓症およびいずれかの四肢の切断を含む群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【国際調査報告】
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