(57)【要約】複数の標的核酸を含有する試料と、ヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させる段階であって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有する段階、および各標識されたプライマーの該検出可能なシグナルを計測して該標的核酸の同一性を決定する段階を含む、標的核酸を識別するための方法が開示される。2009545314.tif 000018
2009545314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階を含む、標的核酸を識別するための方法：
(a)複数の標的核酸を含有する試料と、ヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させる段階であって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有する段階、ならびに
(b)各標識されたプライマーの該検出可能なシグナルを計測して該標的核酸の同一性を決定する段階。
【請求項２】
試料が増幅された複数の標的核酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
複数の標的核酸が16SリボソームRNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階(b)の前に、標識されたプライマーを精製する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
精製段階が、クロマトグラフィー分離、酵素ベースの消化、スピンカラム精製、化学的析出または電気泳動分離からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つのシリーズそれぞれがヌクレオチドプライマーを3〜20個含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
シリーズ内のヌクレオチドプライマーの少なくとも一つが該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
シリーズ内のヌクレオチドプライマーそれぞれが該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
異なる長さがヌクレオチド2〜70個の差を含む、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
異なる長さが、異なる長さの核酸テールを使用して得られる、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
核酸テールが、ポリdAテールおよびポリdTテールからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
シリーズの個々のメンバー用の核酸テールがヌクレオチド2〜50個の範囲で変動する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
検出可能なシグナルで標識された単一ヌクレオチドを用いて該プライマーを伸長させる段階を、ヌクレオチドプライマーを標的核酸に結合させた後に含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
単一ヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオシド三リン酸ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
検出可能なシグナルが、蛍光シグナル、化学発光シグナル、発光シグナル、放射性シグナルまたはビオチン化シグナルからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
蛍光シグナルが、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン、蛍光ナノ粒子および蛍光量子色素からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
標識されたプライマーの検出可能なシグナルが、一つまたは複数の標的核酸の校正係数の適用によって定量される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
校正係数が、より低いレベルの特異性を有する結合したプライマーの検出可能なシグナルの強度に対する、より高いレベルの特異性を有する結合したプライマーの検出可能なシグナルの強度の比を決定することによって得られる、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
標識されたプライマーを分離して標的核酸の同一性の決定を可能にする段階を、段階(b)の前に含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
分離段階が、電気泳動、クロマトグラフィーおよび質量分析からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
プライマーを標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件が、該標的核酸への該プライマーのアニーリングおよび検出可能なシグナルで標識された少なくとも一つの単一ヌクレオチドによる該プライマーの伸長ならびにその多数のサイクルのための条件を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
段階(a)が、試料の第一のアリコートとヌクレオチドプライマーの第一のシリーズとを接触させること、かつそれとは別に、該試料の第二のアリコートとヌクレオチドプライマーの第二のシリーズとを接触させることを含み、該第一および第二のシリーズが少なくとも一つのヌクレオチドプライマーを共通に含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
不均一試料中の成分生物体を決定する方法である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
成分生物体が、原核生物および真核生物からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
原核生物が、バクテリアおよび古細菌からなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
真核生物が、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
ヌクレオチドプライマーのシリーズが、階層的レベルの特異性を有する複数のヌクレオチドプライマーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
シリーズが、より高い階層レベルの一つのプライマーおよびより低い階層レベルの複数のプライマーを含む、請求項1または27記載の方法。
【請求項２９】
ヌクレオチドプライマーのシリーズが、複数の種特異的プライマーおよび一つの非種特異的プライマーを含む、請求項1または27記載の方法。
【請求項３０】
シリーズが、一つのドメイン特異的プライマーと、門特異的プライマー、綱特異的プライマー、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
シリーズが、一つの門特異的プライマーと、綱特異的プライマー、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
シリーズが、一つの綱特異的プライマーと、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
シリーズが、一つの目特異的プライマーと、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
シリーズが、一つの科特異的プライマーと、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
シリーズが、一つの属特異的プライマーと複数の種特異的プライマーとを含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
シリーズの、より低いレベルの特異性を有する一つのメンバー以外の各メンバーが一つの標的核酸に対して特異的である、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
シリーズ内の少なくとも一つのヌクレオチドプライマーが多数の標的核酸に結合することができる、請求項1記載の方法。
【請求項３８】
下記を含む、標的核酸を識別するための方法で使用するためのキット：
(i)複数の標的核酸に結合することができるヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズであって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有するシリーズ、ならびに
(ii)複数の核酸を含有する試料と、該ヌクレオチドプライマーとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させることにより各標識されたプライマーの該検出可能なシグナルの計測を可能にして該標的核酸の同一性を決定するための、使用説明書。
【請求項３９】
ヌクレオチドプライマーに結合することができる検出可能なシグナルを有する標識のセットをさらに含む、請求項38記載のキット。
【請求項４０】
シリーズ内のヌクレオチドプライマーの少なくとも一つが該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有する、請求項38記載のキット。
【請求項４１】
シリーズ内のヌクレオチドプライマーそれぞれが該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有する、請求項38記載のキット。
【請求項４２】
対象からの試料中の標的核酸を識別することを含む、該対象における、腸管内菌叢の異常な分布に関連する腸障害を診断するための方法であって、識別することが、
(a)標的核酸を含有する試料と、ヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させる段階であって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有する段階、ならびに
(b)各標識されたプライマーの該検出可能なシグナルを計測して該標的核酸の同一性を決定する段階
を含み、該識別が腸管内菌叢分布の決定を提供する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、試料中の標的核酸を検出、識別および定量する方法に関する。特に、本発明は、複数の階層オリゴヌクレオチドプライマーを使用して試料、たとえば環境または生物学的試料中の標的核酸を検出、識別および定量する多重法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
多数の標的を含有する試料の分析のための数多くの分子的方法が開発されている。このような方法は、微生物群生分析、微生物モニタリングおよび微生物識別から、疾病関連バイオマーカーに基づく患者における疾病の識別に至る範囲の用途で使用されている。しかし、このような方法は、検出感度およびしきい値、定量能力、使いやすさならびにコストが様々である。たとえば、16S rRNA遺伝子ベースのクローンライブラリー手法は、所与の生態系における数値的に優占的な微生物集団を種または株レベルまで識別することができるが、時間とコストを要する方法である。同様に、群生フィンガプリンティング技術、たとえば変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)および末端制限断片長多型(T-RFLP)は、微生物群生構造において優占的な微生物集団を全PCR増幅産物の約0.1％まで高速プロファイリングし、異なる環境から、または同じ環境において異なる時期および場所で得られた様々な微生物群生構造の比較を可能にすることができるが、このようなフィンガプリンティング法は、存在する種の事前知識なしには所与の微生物群生中の個々の種を識別することができず、その結果は、多くの場合、DNA抽出およびPCR増幅に伴う不一致による影響を受ける。
【０００３】
また、微生物群生中の特定のタイプの微生物集団を識別するための他の方法、たとえば全細胞蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法(FISH)、膜ハイブリダイゼーション法およびリアルタイム定量PCR法(qPCR)および配列特異的酵素開裂法が開発されてきた。しかし、FISHは、長々とした固定およびハイブリダイゼーション手順を要し、細胞膜へのプローブの不十分な貫通、不活性細胞内部でのrRNAの低いコピーおよび生態系中に存在する雑多な非生物性物質による影響を受けるおそれがある。膜ハイブリダイゼーションおよびqPCRの場合、まず、参考株を使用して標準曲線を確立し、最適化しなければならず、そのため、労働集約的かつ時間浪費的であるだけでなく、ハイスループット用途には適用不可能である。
【０００４】
たとえば微生物の検出および微生物群生構造のモニタリングにおけるハイスループット用途の場合、現在、マイクロアレイ技術がもっとも正確な計測を提供する。しかし、現在、微生物優占度の大規模分析においてマイクロアレイ上で多重分析を実施することは困難である。
【０００５】
最近に開発されたもう一つの方法は、配列特異的酵素開裂を使用して対象の16S rRNA標的を定量する。16S rRNA標的の優占度は、電気泳動図中で、開裂した16S rRNAのピーク面積(強度)を全16S rRNAのピーク面積と比較することによって評価される。この技術は、外部標準曲線の事前準備または内部標準の使用を要しないが、実験ごとに一つの16S rRNA標的しか分析することができない。
【０００６】
上記欠点の一つまたは複数を解消または少なくとも軽減する、試料中の標的核酸の存在、同一性および／または量を決定するための、高速でハイスループットで高感度で高精度な、高い再現精度を有する方法を提供する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
概要
第一の局面によると、下記の段階を含む、標的核酸を識別する方法が提供される：
(a)複数の標的核酸を含有する試料と、ヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させる段階であって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有する段階；ならびに
(b)各標識されたプライマーの検出可能なシグナルを計測して該標的核酸の同一性を決定する段階。
【０００８】
一つの態様では、試料は増幅された標的核酸を含む。
【０００９】
一つの態様では、標的核酸は16SリボソームRNAを含む。
【００１０】
一つの態様では、第一の局面の方法は、段階(b)の前に、標識されたプライマーを精製する段階をさらに含む。精製段階は、クロマトグラフィー分離、酵素ベースの消化、スピンカラム精製、化学的析出または電気泳動分離を含むことができる。
【００１１】
一つの態様では、各シリーズはヌクレオチドプライマーを3〜20個含む。シリーズ内のヌクレオチドプライマーの少なくとも一つは、該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有することができる。または、シリーズ内の各ヌクレオチドが該シリーズの他のプライマーとは異なる長さを有することもできる。
【００１２】
異なる長さは、ヌクレオチド約2〜約70個の差を含むことができ、異なる長さの核酸テールを使用して得ることができる。例示的な核酸テールは、ポリdAテールおよびポリdTテールを含む。シリーズの個々のメンバーの核酸テールは、ヌクレオチド約2〜約50個の範囲で変動することができる。
【００１３】
一つの態様では、方法は、検出可能なシグナルで標識された単一ヌクレオチドを用いてプライマーを伸長させる段階を、ヌクレオチドプライマーを標的核酸に結合させた後に含む。例示的な単一ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオシド三リン酸ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPを含む。検出可能なシグナルは、蛍光シグナル、化学発光シグナル、発光シグナル、放射性シグナルまたはビオチン化シグナルであることができる。例示的な蛍光シグナルは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン、蛍光ナノ粒子および蛍光量子色素を含む。
【００１４】
一つの態様では、標識されたプライマーの検出可能なシグナルは、一つまたは複数の標的核酸の校正係数の適用によって定量される。校正係数は、より低いレベルの特異性を有する結合したプライマーの検出可能なシグナルの強度に対する、より高いレベルの特異性を有する結合したプライマーの検出可能なシグナルの強度の比を決定することによって得ることができる。
【００１５】
一つの態様では、第一の局面の方法は、標識されたプライマーを分離して標的核酸の同一性の決定を可能にする段階を、段階(b)の前に含む。分離は、電気泳動、クロマトグラフィーまたは質量分析を使用して実施することができる。
【００１６】
一つの態様では、プライマーを少なくとも一つの標的核酸に結合させ、結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件は、標的核酸へのプライマーのアニーリングおよび検出可能なシグナルで標識された少なくとも一つの単一ヌクレオチドによるプライマーの伸長ならびにその多数のサイクルのための条件を含む。
【００１７】
一つの態様では、第一の局面の方法の段階(a)は、試料の第一のアリコートとヌクレオチドプライマーの第一のシリーズとを接触させること、かつそれとは別に、試料の第二のアリコートとヌクレオチドプライマーの第二のシリーズとを接触させることを含み、該第一および第二のシリーズは少なくとも一つのヌクレオチドプライマーを共通に含む。
【００１８】
一つの態様では、方法は、不均一試料中の成分生物体を決定する。成分生物体は、バクテリアおよび古細菌のような原核生物であることもできるし、真菌および酵母のような真核生物であることもできる。
【００１９】
一つの態様では、ヌクレオチドプライマーのシリーズは、階層的レベルの特異性を有する複数のヌクレオチドプライマーを含む。シリーズは、より高い階層レベルの一つのプライマーおよびより低い階層レベルの複数のプライマーを含むことができる。
【００２０】
一つの態様では、ヌクレオチドプライマーのシリーズは、複数の種特異的プライマーおよび一つの非種特異的プライマーを含む。シリーズは、一つのドメイン特異的プライマーと、門特異的プライマー、綱特異的プライマー、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの門特異的プライマーと、綱特異的プライマー、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの綱特異的プライマーと、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの目特異的プライマーと、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの科特異的プライマーと、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの属特異的プライマーと複数の種特異的プライマーとを含むこともできる。
【００２１】
一つの態様では、シリーズの、より低いレベルの特異性を有する一つのメンバー以外の各メンバーが一つの標的核酸に対して特異的である。
【００２２】
一つの態様では、シリーズ内の少なくとも一つのヌクレオチドプライマーが多数の標的核酸に結合することができる。
【００２３】
第二の局面によると、標的核酸を識別する方法で使用するための、下記を含むキットが提供される：
(i)複数の標的核酸に結合することができるヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズであって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有するシリーズ；ならびに
(ii)複数の核酸を含有する試料と、該ヌクレオチドプライマーとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させることにより各標識されたプライマーの検出可能なシグナルの計測を可能にして該標的核酸の同一性を決定するための、使用説明書。
【００２４】
一つの態様では、キットは、ヌクレオチドプライマーに結合することができる検出可能なシグナルを有する標識のセットをさらに含む。
【００２５】
一つの態様では、シリーズ内のヌクレオチドプライマーの少なくとも一つは、該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有する。
【００２６】
一つの態様では、シリーズ内のヌクレオチドプライマーそれぞれが、該シリーズの他のメンバーとは異なる長さを有する。
【００２７】
第三の局面によると、対象からの試料中の標的核酸を識別することを含む、該対象における、腸管内菌叢の異常な分布に関連する腸障害を診断するための方法であって、識別することが、
(a)標的核酸を含有する試料と、ヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズとを、該プライマーを該標的核酸の少なくとも一つに結合させることおよび結合したプライマーを検出可能なシグナルで標識することを可能にする条件下で接触させる段階であって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有する段階、ならびに
(b)各標識されたプライマーの検出可能なシグナルを計測して該標的核酸の同一性を決定する段階
を含み、該識別が腸管内菌叢分布の決定を提供する診断方法が提供される。
【００２８】
定義
本明細書で使用される以下の用語は指示どおりの意味を有するものとする。
【００２９】
「多重」という用語は、単一の反応容器の中で多数の反応が起こることをいう。
【００３０】
本明細書で使用する「複数」という用語は、少なくとも二つをいう。
【００３１】
「核酸」という用語および等価の語、たとえば「ポリヌクレオチド」とは、プリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、たとえばリボヌクレオチド(RNA)、デオキシリボヌクレオチド(DNA)またはペプチド核酸(PNA)をいう。核酸は二本鎖または一本鎖であることができる。ポリヌクレオチドの主鎖は、RNAまたはDNAで典型的に見られるような糖およびリン酸基または修飾もしくは置換された糖またはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、たとえばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドの各用語は一般に、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドの補体、断片および変異体またはそれらの類似物を含む。ポリヌクレオチドは、典型的にヌクレオチドを2〜約500個含む「オリゴヌクレオチド」を含む。
【００３２】
本明細書で使用する「プライマー」という用語は、標的核酸に結合することができる一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。典型的に、結合は選択的結合である。プライマーの正確な長さは特定の用途にしたがって異なるが、典型的に、ヌクレオチド約15〜約120個の範囲である。プライマーは、標的核酸鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型に結合するのに十分なだけ相補的でなければならない。「ヌクレオチドプライマー」という用語は「オリゴヌクレオチドプライマー」を含む。
【００３３】
「シリーズ」という用語は、多重反応の単一の反応容器で使用されるヌクレオチドプライマーのセットをいう。各シリーズ内で、ヌクレオチドプライマーは、同じまたは異なる長さであることができ、同じまたは異なる検出可能なシグナルを発する標識に結合することができ、異なるレベルの特異性を有することができ、一部のプライマーは多数の標的核酸に結合することができ、一部のプライマーは一つの特定の標的核酸にしか結合することができない。
【００３４】
「種特異的核酸」という用語は、特定種の生物体に由来する核酸をいう。いくつかの態様では、第一の生物体に由来する種特異的核酸が、第二の生物体に由来する種特異的核酸を含む混合試料中に存在することができる。「ドメイン特異的核酸」、「門特異的核酸」、「綱特異的核酸」、「目特異的核酸」、「科特異的核酸」および「属特異的核酸」という用語もまた、相応に解釈されるものとする。
【００３５】
「選択的に結合する」という用語は、ヌクレオチドプライマーが優先的に標的核酸に結合する能力をいう。この用語は、ヌクレオチドプライマーが「選択的に結合する」ことを指す場合、ストリンジェントな結合条件下、ヌクレオチドプライマーが、非標的核酸に対するよりも検出可能に大きな程度で標的核酸に結合するという指示を含む。
【００３６】
「検出可能な標識」という用語は、検出可能かつ計測可能なシグナルを発することができ、ヌクレオチドプライマーに共有結合的または非共有結合的に結合することができるレポータ分子または酵素をいう。
【００３７】
「標識された」という用語は、ヌクレオチドプライマーに関連して使用される場合、検出可能な物質(たとえば蛍光標識)をプライマーに共有結合的または非共有結合的に結合させる(たとえば物理的にリンクさせる)ことによるプライマーの直接標識および直接標識されている別の試薬との反応性によるプライマーの間接標識を包含するものと解釈される。直接標識は、蛍光標識のような検出可能なシグナルで標識されている単一ヌクレオチドによるヌクレオチドプライマーの伸長を含む単一ヌクレオチド鎖伸長によって達成することができる。間接標識の例は、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出することができるようなビオチンによるDNAプライマーの末端標識を含む。
【００３８】
「実質的に」という語は「完全に」を除外しない。たとえば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まないものでもよい。必要ならば、本発明の定義から「実質的に」を省略することもできる。
【００３９】
断りない限り、「含む」という用語および文法上のその変形は、言及された要素を含み、かつ、言及されていないさらなる要素の包含をも許す「非限定的」または「包括的」な言い方を表すものと解釈される。
【００４０】
成分の濃度に関して本明細書で使用される「約」という用語は、典型的に、述べられた値の±5％、より典型的には述べられた値の±4％、より典型的には述べられた値の±3％、より典型的には述べられた値の±2％、さらに典型的には述べられた値の±1％、さらに典型的には述べられた値の±0.5％を意味する。
【００４１】
本開示を通じて、特定の態様が範囲型式で開示されている。範囲型式における記載は単に簡便さおよび簡潔さのためであり、開示された範囲に対する不変的限定と解釈されるべきではないことが理解されよう。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される可能なすべての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を有するものとみなされるべきである。たとえば、1〜6のような範囲の記載は、具体的に開示される部分範囲、たとえば1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等およびその範囲内の個々の数値、たとえば1、2、3、4、5および6を有するものとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。
【００４２】
任意の態様の開示
以下、複数の標的核酸を検出、識別および／または定量する新規な方法の例示的な非限定的態様を開示する。
【００４３】
異なる核酸の混合物を含有する試料中の複数の異なる標的核酸の高速検出、識別および／または定量のための多重化法として階層オリゴヌクレオチドプライマー伸長(HOPE)が提供される。これに関して、複数とは少なくとも二つを意味する。
【００４４】
試料は、その成分の少なくともいくつかが決定される任意の試料であってもよい。たとえば、試料は、環境試料、生物学的試料または食品試料であることができる。
【００４５】
環境試料は、土壌、水、廃水、泥、植物抽出物、木材、生物学的材料、海洋または河口沈積物、工業流出物、ガス、鉱物抽出物、砂、天然排泄物、隕石等から得られた、またはそれらに由来する試料を含むが、それらに限定されない。試料は、様々な地域または条件、たとえば熱帯地域、砂漠、火山地域、森林、農地、工業地域、世帯等から採取することができる。
【００４６】
生物学的試料とは、生物体または生物体の成分(たとえば細胞)から得られる試料をいう。試料は、任意の生物学的組織または流体の試料であることができる。典型的に、生物学的試料は、患者に由来する「臨床試料」である。そのような試料は、糞便、糞便物、便、痰、髄液、血液、血液分画(たとえば血清、血漿)、血液細胞(たとえば白血球)、組織または細針生検試料、尿、腹膜液および胸膜液またはそれらの細胞ならびに細胞の切片、たとえば組織学的目的に採取される凍結切片を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
食品試料とは、動物、たとえば人が摂取することができる物質を指し、包装された食製品、乳製品、動物製品、植物製品、未加工食品、非殺菌または殺菌済み食品および水を含む。
【００４８】
試料は、未処理、処理済み、希釈または濃縮試料であることができる。試料は、そのままで分析することもできるし、開示された方法で使用する前に何らかの下処理に付すこともできる。そのような下処理は、分析前の、水もしくは適当な緩衝液への試料の懸濁／希釈またはたとえば遠心分離による壊死細胞片もしくは他の望ましくない成分の除去または試料の特定分画の選択を含むが、それらに限定されない。
【００４９】
標的核酸は、核酸の混合物を含有する試料中の他の核酸から分けられる任意の核酸であることができる。標的核酸は、RNA、DNA、cDNAまたはPNAであることができる。標的核酸は、同じ核酸分子の異なる領域であってもよい。たとえば、標的核酸は、特定の遺伝子クラスタ、たとえば16S rRNAまたは他の機能的遺伝子を含むことができる。
【００５０】
望むならば、標的核酸は、当技術分野で公知の技術、たとえば音波処理、洗浄剤による処理、酵素消化、塩析、アルコール析出およびフェノールクロロホルム抽出を使用して試料から抽出することができる。
【００５１】
標的核酸、たとえばゲノムDNAおよび未変性RNAは、開示された方法で直接使用することができる。いくつかの態様では、開示された方法で使用する前に標的核酸を増幅して、標的核酸の一部または全部のさらなるコピーを産生してもよい。たとえば、標的核酸は、PCR技術(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992を参照)または当技術分野で周知の他の核酸増幅技術、たとえばリガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace, Genomics 4:560 (1989)およびLandegren et al., Science 241:1077 (1988)を参照)、転写増幅(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)を参照)、自立性複製配列(Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990)を参照)および核酸ベースの配列増幅(NASBA)(J. Compton, Nucleic-Acid Based Sequence Amplification, Nature 350 (6313): 91, Mar. 7, 1991)を使用して増幅することができる。
【００５２】
いくつかの態様では、試料中の標的核酸の大部分または全部を増幅してもよい。いくつかの態様では、標的核酸の所望の亜集団を増幅してもよい。たとえば、バクテリア、マイコバクテリアおよび真菌を含むことが疑われる、または知られる廃水試料の場合、開示された方法で使用する前に、バクテリア性標的核酸を優先的に増幅することが望まれることもある。いくつかの態様では、標的核酸の選択された領域、たとえばrRNA、たとえば16S rRNAを増幅してもよい。
【００５３】
いくつかの態様では、試料中で、複数の異なる標的核酸を検出、識別および／または定量することができる。本明細書で使用する複数とは少なくとも二つを意味する。異なる生物体の混合物を含有することができる環境試料、たとえば土壌、水、廃水、泥、植物抽出物、木材、生物学的材料、海洋または河口沈積物、工業排出物、ガス、鉱物抽出物、砂、天然排泄物、隕石等に関連して、試料中で、複数の異なる標的核酸を検出、識別および／または定量することができ、たとえば、約2種、約3種、約4種、約5種、約10種、約15種または約20種の標的核酸を検出、識別および／または定量することができる。
【００５４】
標的核酸は、そのようなヌクレオチドプライマーの一つまたは複数のシリーズ中の多数のヌクレオチドプライマーを使用して、検出、識別および／または定量することができる。
【００５５】
開示された方法およびキットで使用するためのプライマーは典型的に、一般に長さ15〜120塩基のオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーは、たとえば直接化学合成またはクローニングおよび適切な配列の制限をはじめとする任意の適当な方法によって調製することができる。プライマー中のすべての塩基が、プライマーが結合する鋳型分子の配列を反映しなければならないわけではない。プライマーは、プライマーを標的核酸鋳型に結合させるのに十分な相補的塩基を含有するだけでよい。プライマーは、本明細書に記載されたプライマーのシリーズ内のプライマーの長さを変えるために、さらなる塩基をたとえばポリdAまたはポリdTテールの形態で5'末端に含むことができる。
【００５６】
プライマーを調製し、使用する方法は、たとえば、Sambrook, J.およびD. W. Russell(2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ea., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY)、Ausubel, F.M.ら(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 4d ea., John Wiley & Sons, New York NY)およびInnis, M.ら(1990; PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA)に記載されている。プライマーは、公知の配列から、たとえばその目的に使用されるコンピュータプログラム、たとえばPrimer(Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)を使用することによって導出することができる。
【００５７】
プライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のその目的用のソフトウェアを使用して選択することができる。たとえば、OLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences, Plymouth, MNより市販)が、それぞれヌクレオチド30〜100個までのプライマーの選択に有用であり、32キロベースまでの入力ポリヌクレオチド配列から5,000個までのヌクレオチドのより大きなポリヌクレオチドの分析にも有用である。同様なプライマー選択プログラムは、拡張された能力のためのいくつかの特徴を組み込んでいる。たとえば、PrimOUプライマー選択プログラム(Genome Center at University of Texas South West Medical Center, Dallas TXから一般に利用可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することができ、したがって、ゲノムワイドな範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム(Whitehead Institute/MIT Center for Genome 5 Research, Cambridge MAから一般に利用可能)は、ユーザが、プライマー結合部位として避けるべき配列がユーザ指定される「ミスプライミングライブラリー」を入力することを可能にする。Primer3は、特に、マイクロアレイ用のヌクレオチドの選択に有用である。(また、後者二つのプライマー選択プログラムのためのソースコードをそれぞれの供給元から得て、ユーザの具体的な必要性を満たすように改変することもできる。) PrimeGenプログラム(UK Human Genome Mapping Project Resource Centre, Cambridge UKから一般に利用可能)は、多数の配列アライメントに基づいてプライマーを設計し、それにより、アライメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかに結合またはハイブリダイズするプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、ユニークなヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片ならびに保存されたヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片の両方の識別に有用である。
【００５８】
複数のプライマーがプライマーのシリーズを形成することができる。プライマーの少なくとも一つのシリーズが開示された方法で使用される。プライマーの各シリーズは約3〜約20個のプライマーを含む。たとえば、シリーズは、約3〜約5、約5〜約10、約8〜約12、約10〜約15、約13〜約18または約15〜約20個のプライマーを含むことができる。たとえば、シリーズは、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のプライマーを含むことができる。
【００５９】
各プライマーは、シリーズ内で一つまたは複数のコピー数で存在することができる。
【００６０】
シリーズ内の異なるプライマーは、プライマー長さの違いまたは標識の違いまたは両方によって、分析または計測中に区別することができる。シリーズ内のプライマーがその長さに基づいて区別される場合、シリーズ内の少なくとも一つのプライマーは、該シリーズ内の他のメンバーとは異なる長さを有することができる。または、シリーズ内の各プライマーが、該シリーズ内の他の各メンバーとは異なる長さを有することもできる。シリーズ中のプライマーの長さの違いがプライマーどうしを区別する目的に使用される場合、その違いは、異なるプライマーそれぞれを区別することを可能にするのに十分でなければならない。当業者は、プライマーの分析方法が、プライマー間に求められる違いの程度に影響するということを認識するであろう。理由は、一部の分析方法は、塩基約1、2、3、4または5個の違いを区別することができ(たとえばキャピラリー電気泳動およびポリアミドゲル電気泳動)、他の方法は、塩基約5、6、7または8個よりも大きい違いを区別することができる(たとえばアガロースゲル電気泳動)。一般に、違いは、ヌクレオチド約2〜約70個の範囲であることができる。典型的には、違いは、ヌクレオチド約5〜約10、約11〜約15、約16〜約20、約21〜約30、約31〜約40、約41〜約50、約51〜約60または約61〜約70個であることができる。
【００６１】
いくつかの態様では、長さの違いは、異なる長さの核酸テールをシリーズ内のプライマーの一つまたは複数もしくはそれぞれに含めることによって得ることができる。使用することができる核酸テールは当技術分野で周知であり、ポリdAテールおよびポリdTテールを含むが、これらに限定されない。プライマーのシリーズの個々のメンバーの核酸テールの長さはヌクレオチド約2〜約50個の範囲で変動することができる。典型的には、核酸テールの長さは、ヌクレオチド約5〜約10、約11〜約15、約15〜約20、約21〜約25、約25〜約30、約31〜約35、約35〜約40、約41〜約45または約45〜約50個であることができる。いくつかの態様では、核酸テールの長さは、ヌクレオチド約4、約8、約12、約18、約24または約30個であることができる。
【００６２】
シリーズ内のプライマーの一つまたは複数がそれらの標識の違いに基づいて区別される場合、シリーズ内の少なくとも一つのプライマーは、該シリーズの他のメンバーとは異なる標識を有することができる。または、シリーズ内の各プライマーが、該シリーズ内の他の各メンバーとは異なる標識を有することもできる。各標識は、シリーズ内の異なるプライマーを区別する検出可能なシグナルを発することができる。開示された方法で使用することができる標識は、当技術分野で周知であり、蛍光シグナル、化学発光シグナル、発光シグナル、放射性シグナルまたはビオチン化シグナルを発するものを含むが、これらに限定されない。蛍光シグナルを発する標識の例は、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン、蛍光ナノ粒子および蛍光量子色素を含む。蛍光色素の具体例は、3-(ε-カルボキシペンチル)-3'-エチル-5,5'-ジメチルオキサ-カルボシアニン(CYA)、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5&6-カルボキシローダミン-110(R110)、6-カルボキシローダミン-6G(R6G)、N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、2',4',5',7',-テトラクロロ-4-7-ジクロロフルオレセイン(TET)および2',7'-ジメチル-4',5'-6カルボキシローダミン(JOE)を含む。化学発光シグナルを発する標識の例は、1,2-ジオキセタン、サイリューム、塩化オキサリル、テトラキス(ジメチルアミノ)エチレン、ピロガロール、ルシゲニンおよびルミノールを含み、放射性シグナルを発するものはヨウ素のγ放射性同位体を含む。
【００６３】
標識は、上記のように直接的または間接的にプライマーに結合させることができる。一つの態様では、標識は、プライマーをその標的核酸に結合したのち、検出可能なシグナルで標識された単一ヌクレオチドによる結合したプライマーの伸長を含む単鎖プライマー伸長反応により、プライマーに結合させることができる。この目的に使用することができる単一ヌクレオチドは当技術分野で周知であり、ジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPを含むが、これらに限定されない。典型的に、標的核酸にうまくアニーリングされると、蛍光標識されたジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)またはダイターミネーターがプライマーの3'末端に付加される。ホスホジエステル結合を形成するための付加されたddNTPにおける3'-OH基の欠如のせいで、連鎖伸長反応は終了する。したがって、ddNTP上の標識はヌクレオチドプライマーに結合する。
【００６４】
ヌクレオチドプライマーの各シリーズ内の一つのメンバーは、該シリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有する。一つの態様では、シリーズの、より低いレベルの特異性を有する一つのメンバー以外の各メンバーが異なる標的核酸に対して特異的である。他の態様では、シリーズ内の少なくとも一つのヌクレオチドプライマーが多数の標的核酸に結合することができる。他の態様では、シリーズの第一の複数のメンバーそれぞれが多数の核酸に結合することができ、該シリーズの第二の複数のメンバーそれぞれが異なる標的に特異的である。
【００６５】
一つの態様では、シリーズ内のヌクレオチドプライマーは階層的レベルの特異性を有する。たとえば、シリーズは、より高い階層レベルにある一つのプライマーおよびより低い階層レベルにある複数のプライマーを含むことができる。より高い階層レベルのプライマーは、そのプライマーが、より高いレベルの特異性を有するより低い階層レベルのプライマーよりも多くの標的核酸に結合することができるという点で、より低いレベルの特異性を有する。シリーズ内の最高ランクの階層レベルのプライマーは、たとえば、試料中の標的核酸のすべてに結合することができる。
【００６６】
一つの態様では、シリーズは、複数の種特異的プライマーおよび一つの非種特異的プライマーを含むことができる。たとえば、シリーズは、一つのドメイン特異的プライマーと、門特異的プライマー、綱特異的プライマー、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの門特異的プライマーと、綱特異的プライマー、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの綱特異的プライマーと、目特異的プライマー、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの目特異的プライマーと、科特異的プライマー、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの科特異的プライマーと、属特異的プライマーおよび種特異的プライマーからなる群より選択される複数のプライマーとを含むこともできるし、または一つの属特異的プライマーと複数の種特異的プライマーとを含むこともできる。ドメインレベル特異性を有するプライマーは、より低い階層特異性を有するプライマーよりも多くの標的核酸に結合することができると予想される。これに関して使用されるドメインとは、分類学的階層における生物体の最高ランクをいう。典型的に、分類学的階層は、ドメイン、次いで界、門、綱、目、科、属および種の順である。各階層ランクはさらに接頭辞を含むことができる。たとえば、接頭辞「亜」は一つ下のランクを示し、接頭辞「上」は一つ上のランクを示し、接頭辞「下」は「亜」より一つ下のランクを示す。たとえば上ドメインは、ドメインよりも高いランクであり、ドメインは亜ドメインよりも高いランクであり、亜ドメインは下ドメインよりも高いランクである。界、門、綱、目、科、属および種に関する接頭辞もまた、相応に解釈されるものとする。
【００６７】
上記のように、開示された方法ではヌクレオチドプライマーの多数のシリーズを使用することができる。たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のシリーズを使用して試料を分析することができる。一つより多い多重反応が実施される場合、ヌクレオチドプライマーのいくつかのシリーズを使用することができる。たとえば、シリーズ「A」を4重反応で使用し、シリーズ「B」を6重反応で使用し、シリーズ「C」を7重反応で使用することができる。また、別々の多重反応を様々な順列で組み合わせて多重反応の多重度をさらに高めることもできる。たとえば、6重反応におけるシリーズ「B」を7重反応のシリーズ「C」と組み合わせて多重度を10重反応まで高めることができる。
【００６８】
二つのシリーズを使用する場合、試料の第一のアリコートとヌクレオチドプライマーの第一のシリーズとを接触させ、かつそれとは別に、その試料の第二のアリコートとヌクレオチドプライマーの第二のシリーズとを接触させる。第一および第二のシリーズは少なくとも一つのプライマーを共通に有する。
【００６９】
同様に、三つのシリーズを使用する場合、試料の第一のアリコートとヌクレオチドプライマーの第一のシリーズとを接触させ、それとは別に、該試料の第二のアリコートとヌクレオチドプライマーの第二のシリーズとを接触させ、かつそれとは別に、該試料の第三のアリコートをヌクレオチドプライマーの第三のシリーズと接触させる。第一および第二のシリーズは少なくとも一つのヌクレオチドプライマーを共通に有することができ、第二および第三のシリーズは少なくとも一つのヌクレオチドプライマーを共通に有することができ、第一および第三のシリーズは少なくとも一つのヌクレオチドプライマーを共通に有することができる。混乱を避けるため、第一、第二および第三のシリーズはすべて少なくとも一つのヌクレオチドプライマーを共通に有することができる。
【００７０】
一つの態様では、方法は、不均一試料中の成分生物体を決定する。成分生物体は、バクテリア(たとえばグラム陽性バクテリア、緑色糸状バクテリア、スピロヘータ、プロテオバクテリア、シアノバクテリア、プラクトミセス(planctomyces)、バクテロイデス・サイトファーガ属(bacteroides cytophaga)、サーモトガ(thermotoga)、超好熱菌(aquifex))および古細菌(たとえば好塩性生物、小荷物状菌(methanosarcina)、メタノバクテリウム(methanobacterium)、メタノコッカス(methanococcus)、サーモプロテウス(thermoproteus)、ピロディクティウム(pyrodicticum))のような原核生物であることもできるし、真菌(たとえば藻菌類、子嚢菌類および担子菌類)、酵母(たとえばサッカロミセス(saccharomyces)、クリベロマイセス(kluyveromyces))および植物(たとえば藻類、地衣類等)のような真核生物であることもできる。
【００７１】
プライマーを標的核酸に結合させる条件は、当技術分野で周知であるか、一般的な実験プロトコルを使用して容易に決定することができる。いずれの場合も、適当なプロトコルおよび試薬は個々の状況に大きく依存する。指針は、多様な情報源、たとえばSambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992から得ることができる。当業者は、所望の結果を達成する能力に影響することなく、これらの手法の様々なパラメータを変更することができることを容易に理解するであろう。たとえば、使用される標的核酸の量は、利用可能な材料もしくは試料、たとえばRNAもしくはDNAの量または効率的な結合に求められる標的核酸の最適量に依存して変えることができる。
【００７２】
典型的には、プライマーを標的核酸に結合させるのに適当な条件は、約1M未満、より普通には約500mM未満および約200mM未満の塩濃度を含む。適当な温度は5℃であることもできるが、典型的には22℃を超える、より典型的には約30℃を超える、好ましくは約37℃を超えることができる。標的核酸へのプライマーの結合は、好ましくは、ストリンジェントな条件の下で実施される。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況の下で異なる。より長いプライマーは、特異的結合のために高めの温度を要する可能性がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基ミスマッチの程度をはじめとする他の要因が結合のストリンジェンシーに影響するおそれがあるため、パラメータの組み合わせが、いずれか一つだけの絶対尺度よりも重要である。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の場合の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低い温度になるように選択される。Tmは、標的核酸に相補的なプライマーの50％が平衡状態で標的核酸に結合する温度(所定のイオン強度、pHおよび核酸組成の下)である。典型的に、ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3および少なくとも25℃の温度で、少なくとも0.01M〜1M以下のNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度を含む。
【００７３】
核酸標的へのプライマーの結合は、好ましくは、上記のような高いストリンジェンシー条件下で実施されるが、結合はまた、中程度のストリンジェンシーまたは低いストリンジェンシー条件下で実施することもできる。低ストリンジェンシー条件は、2×SSC中50℃で実施される結合に相当することができる。
【００７４】
そのような結合のストリンジェンシーを変化させるために用いることができる、当業者に周知の条件および要因が数多くある。たとえば、標的核酸に結合させるプライマーの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、塩および他の成分の濃度、たとえばホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコールの存在もしくは非存在ならびに結合および／または洗浄段階の温度を変えること。
【００７５】
本明細書で論じるように、結合したプライマーは、単一の標識されたヌクレオチドでプライマーを伸長させることによって標識することができる。単一ヌクレオチド鎖伸長は、典型的に、一本鎖DNA鋳型(すなわち標的核酸)、ヌクレオチドプライマー、酵素(すなわちDNAポリメラーゼ)、標識されたヌクレオチドおよびDNA鎖伸長を停止させる修飾されたヌクレオチド(たとえば、ジデオキシヌクレオチドまたはddNTP)を要する。これらのジデオキシヌクレオチドは、DNA鎖伸長中に2個のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の形成に必要な3'-0H基を欠く連鎖停止性ヌクレオチドである。したがって、新生中(伸長中)のDNA鎖へのジデオキシヌクレオチドの組み込みがDNA鎖伸長を停止させる。標識されたプライマーは、熱変性させ、以下さらに説明するように、サイズによって(ヌクレオチド1個単位の分解能で)分離することができる。
【００７６】
単一の標識されたヌクレオチドでプライマーを伸長させるのに適した条件は、PCRの伸長／延長段階で適用される条件と本質的に同じである。典型的には、使用されるDNAポリメラーゼに依存する適当な温度でDNAポリメラーゼ(たとえばTaqポリメラーゼ)がddNTPをプライマーに付加する。Taqポリメラーゼを使用する場合、たとえば、70〜74℃の最適温度を使用することができる。典型的には、約72℃の温度が使用される。当業者は、プライマーを伸長させるのに適した任意の酵素を使用することができることを認識するであろう。さらなる例は、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素、 DNAポリメラーゼIV(DinB)、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、T7 RNA ポリメラーゼおよび逆トランスプリプターゼを含む。
【００７７】
プライマーを標的核酸に結合し、検出可能なシグナルで標識された少なくとも一つの単一ヌクレオチドでプライマーを伸長させる条件の多数のサイクルを実施することもできる。たとえば、15〜50のサイクルを実施することができる。典型的には、約20、約25、約30または約35のサイクルが実施される。
【００７８】
産物(すなわち、伸長した標識されたプライマー)を分析の前に精製して、たとえば、反応混合物中に残る、組み込まれていない標識された単一ヌクレオチドを除去することもできる。精製プロトコルは、当業者には周知であり、種々の形態のクロマトグラフィー分離(たとえば高速液体クロマトグラフィー)、酵素ベースの消化(たとえばアルカリホスファターゼを使用)、スピンカラム精製または電気泳動分離を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
反応生成物は、プライマーに結合された標識によって発される検出可能なシグナルの検出および計測の前またはそれらと同時に、それらのサイズの違いおよび／または標識の違いにしたがって分離することができる。使用することができる分離技術は、電気泳動(たとえばゲルマイクロチャネルおよびキャピラリー電気泳動)、クロマトグラフィー(たとえば高速液体クロマトグラフィー)および質量分析(たとえばMALDI-TOF)を含む。
【００８０】
反応生成物は、検出器、たとえば蛍光、化学発光、発光または放射性検出器を備えたDNAオートシーケンサーを使用して分析することができる。
【００８１】
伸長したプライマーの長さおよび濃度は、内部標準、たとえば長さ13〜88bpおよび濃度100〜1000pMの範囲の異なる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドからなる内部標準にしたがって計算することができる。個々のプライマーの伸長効率を知ることにより、より低い特異性を有する標識されたプライマーに対する、より高い特異的を有する標識されたプライマーの相対強度を決定することができ、望むならば、それを使用して試料中の種々の標的核酸の相対量を計算することができる。
【００８２】
標識されたプライマーの検出可能なシグナルは、一つまたは複数の標的核酸の校正係数の適用によって定量することができる。校正係数は、より低いレベルの特異性を有する標識または伸長されたプライマーの検出可能なシグナルの強度に対する、より高いレベルの特異性を有する標識または伸長されたプライマーの検出可能なシグナルの強度の比を決定することによって得ることができる。標的核酸の相対優占度を決定するのには以下の式を使用することができる。
【００８３】
特定の伸長されたプライマーの濃度は、以下の式を使用して定量することができる：
2009545314.tif 000003
式中、Cpは、試料に関するHOPE反応で伸長された特定のプライマーのモル濃度を表し、Cstdは、対応する標準オリゴヌクレオチドのモル濃度を表す。
【００８４】
各プライマーの校正係数は、対応する標準オリゴヌクレオチドを鋳型として使用することによって得ることができ、以下の式を使用して決定することができる：
2009545314.tif 000004
式中、プライマーBは、プライマーAに比べて低いレベルの特異性を有する。
【００８５】
プライマーBの標的となる核酸に対する、プライマーAの標的となる核酸の相対優占度を以下のように計算することができる。
2009545314.tif 000005
【００８６】
本明細書に記載される方法の一つの態様が図1に示されている。開示された方法のこの態様の初期段階は、精製されたPCR増幅rRNA遺伝子の標的領域にうまくアニーリングされたとき、プライマーの3'末端の単一の蛍光標識されたジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddATP、ddTTP、ddGTPまたはddCTP)またはダイターミネーターを伸長させるための「ミニシーケンシング」に使用される鎖伸長反応を含む。この段階では、異なるレベルの特異性(すなわちドメイン、門等、種)で配列を標的とするように設計され、かつ異なる長さのポリdAテールで個々のプライマーの5'末端が修飾されている多数のオリゴヌクレオチドプライマーを加える。一回の塩基伸長の後、HOPE産物を精製し、4色検出器を備えたDNAオートシーケンサーを使用して分析する。長さおよび加えられるダイターミネーターのタイプ／色の違いにより、これらの伸長された階層プライマーを分離し、識別することができ、異なる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドからなる内部標準にしたがってそれらの長さおよび濃度を計算することができる。ドメインレベルの特異性を有するプライマーは、群特異的プライマーよりも多くのDNA鋳型にプライミングすることができるため、個々のプライマーの伸長効率を知ることにより、広い特定のプライマーに対する特定の標識されたプライマーの相対強度を得ることができ、この比が、PCR混合物中の標的指向化rRNA断片の相対優占度を表す。HOPE手法は、90分以内に完了させることができ、したがって、環境試料中の多数の微生物標的の速やかな識別を可能にする。
【００８７】
また、開示された方法で使用するためのキットが提供される。キットは、複数の標的核酸に結合することができるヌクレオチドプライマーの少なくとも一つのシリーズであって、各シリーズ内の一つのメンバーがそのシリーズの他のメンバーよりも低いレベルの特異性を有するシリーズ、および開示された方法にしたがって使用するための使用説明書を含むことができる。いくつかの態様では、キットは、プライマーの多数のシリーズ、たとえば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のシリーズを含むことができる。プライマーのシリーズは、本明細書に記載したように、ヌクレオチドプライマーを約3〜約20個含むことができる。
【００８８】
いくつかの態様では、キットは、ヌクレオチドプライマーに結合することができる検出可能なシグナルを有する標識のセットをさらに含むことができる。例示的な標識は、本明細書に記載したように、蛍光シグナル、化学発光シグナル、発光シグナル、放射性シグナルおよびビオチン化シグナルを発する標識を含む。
【００８９】
いくつかの態様では、キットは、ヌクレオチドを約2〜約70個含む核酸テールを含むことができる。キットに含めることができる例示的な核酸テールは、本明細書に記載したようなポリdAテールおよびポリdTテールである。
【００９０】
いくつかの態様では、キットは、さらなる試薬、たとえば試料下処理、試料増幅、プライマーの単一ヌクレオチド鎖伸長および反応生成物の精製のための試薬を含むことができる。試料下処理のための試薬は、試料の懸濁または希釈のための緩衝液ならびに核酸の抽出のためのアルコール(たとえばフェノール、クロロホルム、イソプロパノールおよびエタノール)および塩溶液(たとえば酢酸ナトリウムまたはアンモニウム)を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
試料増幅のための試薬は、プライマーを伸長させるのに適した酵素(たとえばTaqポリメラーゼまたは本明細書に記載する任意の他の酵素)、デオキシヌクレオチド三リン酸(たとえばdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP)、緩衝液(たとえば塩化カリウムおよびトリスHCl)および二価のカチオン(たとえば塩化マグネシウム)を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
プライマーの単一ヌクレオチド鎖伸長のための試薬は、プライマーを伸長させるのに適した酵素(たとえばTaqポリメラーゼまたは本明細書に記載した任意の他の酵素)、ジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)(たとえば本明細書に記載したddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTP)、適当な緩衝液(たとえば塩化カリウムおよびトリスHCl)および二価のカチオン(たとえば塩化マグネシウム)を含むが、これらに限定されない。ddNTPは、場合によっては、本明細書に記載したように、標識に結合させることもできる。
【００９３】
反応生成物の精製のための試薬は、クロマトグラフィー分離のための試薬(たとえば溶離緩衝液、たとえばTE緩衝液およびトリスHCl緩衝液)、酵素ベースの消化のための試薬(たとえばアルカリホスファターゼ)、スピンカラム精製のための試薬(たとえば溶離剤イミダゾール、塩化アンモニウム、ヒスチジン等)、化学的析出のための試薬(たとえばフェノール、イソプロパノール、酢酸ナトリウム、トリスEDTA等)および電気泳動分離のための試薬(たとえばアガロースゲル、ポリアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルリン酸ナトリウム等)を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
いくつかの態様では、キットは、標的核酸の定量を容易にするための内部標準、たとえば蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを含むこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
添付の図面は、開示された態様を例示し、開示された態様の原理を説明するのに役立つ。しかし、図面は、例示のためだけに設計されたものであり、本発明の限定の定義として設計されたものではない。
【００９６】
【図１】多重識別および定量分析のための階層オリゴヌクレオチドプライマー伸長(HOPE)手法の概念を例示する略図である。
【図２】オリゴヌクレオチド分離および蛍光計測のためのDNAシーケンサーの感度を示す。(a)5'末端にCy5修飾を有する合成オリゴヌクレオチドの配列。(b)キャピラリー電気泳動によって分離された異なる濃度の4種のCy5標識オリゴヌクレオチドのサイズベースの電気泳動図。(c)Cy5標識オリゴヌクレオチドの濃度(94〜1857pM)の線形性およびピーク面積に換算した蛍光強度。(d)Cy5標識オリゴヌクレオチドの濃度(2.4〜46.4pM)の線形性およびピーク面積に換算した蛍光強度。
【図３】ダイターミネーターによるプライマー伸長の効率に対するポリdAテール長の効果を示す。(a)大腸菌(E.coli)16S rRNA遺伝子の選択された領域および様々な長さのポリdAテールで修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー(EUB338)の配列。ポリdAテールなしでEUB338プライマーで見いだされるヌクレオチドと同一のヌクレオチドがハイフンによって示されている。(b)EUB338プライマーの5'末端に付加されたポリdAテールの長さによって影響されるプライマー伸長効率の低下。％値として提示する伸長効率は、ポリdAテールなしのddCTP結合プライマーEUB338それぞれの濃度に対する、各ddCTP結合プライマーの濃度の比に基づいて計算した。データ点は、二つの反応および反復キャピラリー電気泳動分析から導出された平均値を表す。エラーバーは平均データ点の標準偏差を表す。
【図４】バクテロイデス属種 (Bacteroides spp.)の系統樹および多重HOPEで使用されるプライマーの特異性。デンドログラムは、ARBを使用する隣接連結法で構築し、大腸菌で発根させた。スケールバーは、ヌクレオチド位置100個あたり10個のヌクレオチド置換に対応する。4重(白丸)、6重(黒丸)および7重(黒四角)反応で使用されたプライマーが系統樹の右側に示されている。プライマー特異性はプライマーまたは括弧の位置によって指定されている。伸長されたヌクレオチドのタイプがプライマー名の後の括弧内に示されている。ARB中でtRFcutアドインプログラムを使用してBac32FおよびBac708Rならびに制限酵素AciIを用いてインシリコで分析されたバクテロイデス属種の末端制限断片(tRF)長さが種名の後の括弧内に示されている。
【図５】多重HOPEの効率に対するアニーリング温度の影響を示す。反応は、B.テタイオタオミクロン(B. thetaiotaomicron) 16S rRNA遺伝子アンプリコンならびに(a) EUB338Ia、(b) BAC303-5a、(c) BTH274-15aおよび(d) BTH584-16aを含有するプライマー混合物を使用して実施した。25サイクルの熱サイクリング(96℃で10秒間変性、評価した温度で30秒間アニーリング、72℃で15秒間伸長)を適用した。評価した温度ごとに、対応する効率を、そのプライマーに関して遭遇した最大値の割合として計算した。dAなしで、プライマーごとの融解温度(Tm)を、式：2(A＋T)＋4(G＋C)にしたがって計算した。
【図６】ダイターミネーターを用いる多重HOPEに対するサイクル数の影響を示す。反応は、熱サイクリング条件：96℃で30秒間変性、60℃で30秒間アニーリングおよび72℃で30秒間伸長を使用して実施した。実験は、B.テタイオタオミクロン 16S rRNA遺伝子アンプリコンならびにEUB338Ia、BAC303-5a、BTH274-15aおよびBTH584-16aを含有するプライマー混合物を使用して実施した。データ点は、二つの反応および反復したキャピラリー電気泳動分析から導出された平均値を表す。エラーバーは平均データ点の標準偏差を表す。
【図７】ユニバーサルプライマーEUB338Iaに対するプライマーBAC303-5a (●)、BTH274-15a (○)およびBTH584-16a (▼)の換算係数の分布を示す。プライマー対標的比(モルベース)は250〜16000の範囲であった。実験は、以下の実施例1で示すように、固定されたプライマー濃度および変化する標的濃度を使用して実施した。データ点は、三つの反応から導出された平均値を表す。エラーバーは平均データ点の標準偏差を表す。
【図８】多重HOPEの特異性を示す。プライマーEUB338、BAC303-5a、BTH274-15aおよびBTH584-16aが含まれる4重HOPE反応で個々のバクテロイデス属種鋳型を使用した。(a)プライマーおよび選択された参照標的の結合領域の配列。プライマーごとに第一のバクテリア種の相補配列が示されている。後続種で同一の配列組成に遭遇した場合、＝によって表している。プライマーEUB338に関して、下線を付けたヌクレオチドがプライマーEUB338Iaの配列を示す。(b)ダイターミネーターを用いた多重HOPEの特異性。各サイズベースの電気泳動図の右上に個々のバクテロイデス属種鋳型が示されている。点線および実線のピークは、それぞれD4-ddUTP結合プライマーおよびD2-ddCTP結合プライマーを表す。
【図９】ダイターミネーターを用いるHOPEの感度を示す。2種のプライマー(a) BTH274-15Aおよび(b) BTH584-16Aを、B.テタイオタオミクロンの16S rRNA遺伝子アプリコン1pg〜5000pgの連続濃度とともに使用した。反応は、B.テタイオタオミクロンアンプリコンのみを使用して全量20μl (白丸)、10μl (白四角)および5μl (白逆三角)で実施した。また、B.テタイオタオミクロンに加えてL.アシドフィルス(L. acidophilus)アプリコン100ngを用いる5μl (●)の反応を実施した。40サイクルの熱サイクリング条件(96℃で10秒間変性、60℃で30秒間アニーリング、72℃で15秒間伸長)を適用した。データ点は、一つの反応からキャピラリー電気泳動の反復分析によって導出された平均値を表す。エラーバーは平均データ点の標準偏差を表す。
【図１０】多重HOPE法で分析することができる、ゲノムDNA(a)および未変性RNA(b)を含む核酸の様々なフォーマットを示す。
【図１１】(a)バクテロイデス・テクタス(Bacteroides tectus)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)およびバクテロイデス・テタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)の混合16S rRNA遺伝子アンプリコンから生成された6重反応生成物の電気泳動図；(b)バクテロイデス・インテスチナリス(Bacteroides intestinalis)、B.フラジリス(B. fragilis)、バクテロイデス・アシジファシエンス(Bacteroides acidifaciens)、バクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)およびバクテロイデス ピオゲネス(Bacteroides pyogenes)の混合16S rRNA遺伝子アンプリコンから生成された7重反応生成物の電気泳動図；および(c)廃水流出物の16S rRNA遺伝子アンプリコンから生成された7重反応生成物の電気泳動図。点線、実線および実線のピークは、それぞれD4-ddUTP-、D3-ddGTPおよびD2-ddCTPで伸長されたプライマーを表す。検出されたプライマーおよび内部標準(GT40-D4およびGT46-D2)がパネル(c)中で対応するピークのそばに標識されている。
【図１２】HOPE反応のもう一つの態様を示す。PCRアンプリコン、フルオロフォア標識ddNTP、DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーを混合して、多重HOPE反応混合物を形成した。この混合物を20〜25サイクルの変性(96℃)、アニーリング(60〜64℃)および単一塩基伸長(72℃)に付した。そして、適量の生成混合物を合成オリゴヌクレオチド標準と混合し、キャピラリー電気泳動に付した。
【図１３】バクテロイデス属種の系統樹および多重HOPEで使用したプライマーの特異性を示す。多重HOPE反応1〜5は、種特異的プライマーおよびB.フラジリスクラスタ(Bfrg602_19dAまたはBth274[T]_15dA)に対して特異的なより高ランクのプライマーを含有する。多重HOPE反応6は、サブクラスタ(Bth274_15dA)、クラスタ(Bfrg602_19dA)、目(Bac303_5dA)およびドメイン(U1390_17dA)レベルを標的とするプライマーを含有する。
【図１４】多重HOPE反応1〜6のキャピラリー電気泳動図を示す。試料ごとに、PCRアンプリコン30ngおよびSNPプレミックス2.5μlを多重HOPE反応1〜6に加えた。キャピラリー電気泳動図に示すように、ヒト糞便H3に関してバクテロイデス属種がドメイン、目および種レベルで検出された。黒、赤および緑のピークは、dTAMRA-ddCTP、dROX-ddTTP、dR6G-ddATPで伸長したプライマーをそれぞれ表す。内部標準が対応するピークのそばに標識され、示されている。
【図１５】サイクルの最適数を決定するための、様々なサイクル数での微生物標的のPCR増幅を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
最良の形態
本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない具体的な実施例を参照することにより、本発明の非限定的な実施例をさらに詳細に説明する。
【００９８】
実施例1
環境試料中の微生物標的の分析
(a)材料および方法
地域廃水処理システムの流入試料および流出試料を採取し、微生物細胞を含む全懸濁固体を遠心分離によって濃縮した。
【００９９】
地域下水処理施設の個々の参照株および試料から全DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のPCR増幅のためのDNA鋳型として使用した。PCR(100ml)は、1×緩衝液(Promega)、2.0mMのMgCl2、20OnMの各プライマー[11F、GTT TGA TCC TGG CTC AGおよび1492R、GG(C/T) TAC CTT GTT ACG ACT T]、20OmMの各dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、0.5UのTaq DNAポリメラーゼ(Promega)および50〜100ngのゲノムDNAを含有するものであった。Bio-Rad iCycler (Hercules, CA)を使用して、以下の熱プログラムの下、PCR増幅を実施した：初期変性(95℃、3分)；95℃(30秒)、55℃(30秒)および72℃(30秒)の30サイクル；および最後の伸長(72℃、5分)。アガロースゲル電気泳動によって増幅を立証したのち、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して、製造者の使用説明書にしたがってPCR産物を精製した。DU 800分光光度計(Beckman Coulter, Fullerton, CA)を使用するUV吸光度計測により、精製したPCR産物の濃度を定量した。
【０１００】
精製されたPCR増幅産物をHOPE反応で使用した。5〜20μLの全量で実施されたHOPE反応は、5〜10ピコモル(pモル)の個々のオリゴヌクレオチドプライマー、精製された鋳型10〜20ngおよびCEQ(商標)SNP-Primer Extension Kit(Beckman Coulter, Fullerton, CA)の1×プレミックス溶液を含有するものであった。キット中に提供されていたDNAポリメラーゼ(9％、v/v)、反応緩衝液(18.2％、v/v)および蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド(ddUTP、ddGTP、ddATPおよびddCTP、18.2％ (v/v))を含有するプレミックスアリコート(2×)を製造者の推奨にしたがって調製した。ddNTPまたはダイターミネーターを四つの異なるWellRed蛍光色素(D1、D2、D3およびD4)(Beckman Coulter)で標識した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、HPLCを使用して精製した。Bio-Rad iCyclerを使用して、以下の熱サイクリングプログラムの下、プライマー伸長反応を実施した：96℃(10秒)、60℃(30秒)および72℃(15秒)の20サイクル。
【０１０１】
プライマー伸長反応の後、エビアルカリホスファターゼ(Roche Applied Science, Penzberg, Germany) 1Uを反応混合物に加えて、組み込まれなかったダイターミネーターの5'リン酸基を加水分解した。この混合物を37℃で60分間インキュベートし、85℃で10分間の熱変性によって反応を停止させた。または、反応時間を短縮するため、Microcon-YM3スピンカラム(Millipore)を使用してHOPE反応生成物を精製することもできる。表1bは、使用されたすべてのプライマーをリストする。
【０１０２】
4色検出能力を有するCEQ(商標)8000遺伝子分析システム(Beckman Coulter)を使用してHOPE反応生成物を分析した。キャピラリー電気泳動の前に、希釈したHOPE反応生成物1μLを、内部濃度およびサイズ標準1μL (以下参照、500〜100OpM)、GenomeLab(商標)DNAサイズ標準80キット(Beckman Coulter) 0.2μLならびに試料添加溶液(Beckman Coulter)39.8μLと混合した。この混合物を96穴プレートに移し、一滴の鉱油で覆った。そして、このプレートを、分離緩衝液で満たした緩衝液プレート(Beckman Coulter)とともにCEQ(商標) 8000システムに装填した。電気泳動プログラムは、変性段階(90℃、120秒)、2.1kVの電圧下で15秒間(または6kVで5秒間)の注入段階および6.0kVの電圧下での分離段階(58℃、16分間)を含むものであった。低濃度で存在する標識されたオリゴヌクレオチドを検出するために、注入試料量および注入時間をそれぞれ2μLおよび40秒に増大した。蛍光強度データを自動的に収集したのち、CEQ(商標)8000システムのために用意されたソフトウェアによって分析した。
【０１０３】
個々のオリゴヌクレオチドの電気泳動サイズを決定し、ソフトウェアに組み込まれたデフォルト線形モデルおよび色素校正パラメータ(SNP ver 1)を使用して内部サイズ標準で校正した。使用された内部濃度およびサイズ標準は、四つの異なる長さの四つの異なるCy5標識オリゴヌクレオチド(すなわち50-Cy5-[GT]x-30、x＝8、13、18および23)、一つのD2標識オリゴヌクレオチド(50-D2-[GT]23-30)および一つのD4標識オリゴヌクレオチド(すなわち50-D4-[GT]20-30)の混合物を含有するものであった(表1b)。これらを合成し、Operon Biotechnologies(Cologne, Germany)またはSigma-Proligo France SAS (Paris, France)によってHPLC精製した。これらのオリゴヌクレオチドの濃度および純度を、最大吸光度で計測されたオリゴヌクレオチドおよび色素の光学密度ならびに色素の吸光係数にしたがって計算した。GenomeLab(商標)DNAサイズ標準80キットは、長さ13および88bpのWellRed D1標識断片を含有するものであった。
【０１０４】
ダイターミネーター標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの濃度を、式(1)にしたがって定量した：
2009545314.tif 000006
式中、Cpは、特定のダイターミネーターとともに組み込まれるオリゴヌクレオチドプライマーのモル濃度を表し；Cdiは、標識されたオリゴヌクレオチドプライマーと同一の色素で標識された内部オリゴヌクレオチド標準のモル濃度を表し；Apは、オリゴヌクレオチドプライマーのピーク面積を表し；Adiは、内部オリゴヌクレオチド標準のピーク面積を表し；Vpは、試料添加溶液に添加されるHOPE反応生成物の量を表し；Vdiは、試料添加溶液に添加される内部標準の量を表す。
【０１０５】
ユニバーサルプライマーによって定量される全標的に対する、特定のプライマーによって定量される特定の標的核酸配列の相対量は、以下の式(2)にしたがって計算することができる：
2009545314.tif 000007
式中、Cpは、HOPE反応で伸長された特定のプライマーのモル濃度を表し；C338Iaは、HOPE反応で伸長されたユニバーサルプライマーEUB338Iaのモル濃度を表し；CFp-338Iaは、参照株を使用して得られたEUB338Iaに対する特定のプライマーのプライマー伸長効率の校正係数である。
【０１０６】
(b)実験結果
図2は、オリゴヌクレオチド分離および蛍光計測のためのDNAシーケンサーの感度を示す。二つの異なる最終濃度範囲、2.4〜46.4pMおよび94〜1857pMで、四つの異なるCy5標識合成オリゴヌクレオチド(すなわち、cy5-GT16、cy5-GT26、cy5-GT36およびcy5-GT46)の混合物を評価した(図2a)。これら四つのCy5標識オリゴヌクレオチドの間で明瞭で正確な長さ分離が得られた(図2b)。観測された蛍光強度またはピーク面積は、これらのCy5標識オリゴヌクレオチドの濃度に対して高度に相関しており(R2＞0.9998)(図2cおよび2d)、ダイナミックレンジは少なくとも3オーダであった。
【０１０７】
図3は、単一塩基プライマー伸長効率に対するポリdA長さの影響を示す。0〜30ヌクレオチド(nt)の異なる長さのポリdAテールで修飾された7種のEUB338プライマーを、プライマー伸長反応で使用した(図3aおよび表1b)。これらをD2標識ddCTPで別々に伸長した。DNAオートシーケンサーを使用する分析の後、観測された蛍光強度にしたがって、式(1)を使用して、個々の伸長されたプライマーの濃度を定量した。EUB338の伸長効率を100％とみなすことにより、これらのポリdA結合EUBプライマーの相対プライマー伸長効率を計算した。図3bは、18ntまでのポリdAテールの長さの増大の場合、単一塩基プライマー伸長の効率が線形に低下した(1dAあたり3.6％)ことを示す(R2＝0.982)。ポリdAテールの長さが18ntを超えると、プライマー伸長効率は24〜34％前後で変動した。以後、18ntまでのポリdAテールの長さを使用した。
【０１０８】
まず、4種の異なる階層オリゴヌクレオチドプライマーをHOPE反応で使用した。これら4種のプライマー、すなわちEUB338Ia、BAC303-5a、BTH274-15aおよびBTH584-16aの5'末端を0、5、15および16dAによってそれぞれ修飾した。これらのプライマーの特異性が表1bおよび図4に示されている。
【０１０９】
これら4種のプライマーの予測される伸長されたヌクレオチドタイプを、ARBで提供されたMatch Probes関数により、28,289種のほぼ完全な16S rRNA配列(41450nt)を含むssu_jan04.arbデータベース(www.arb-home.de)を使用して、インシリコで分析した。伸長されたヌクレオチドの予測されるタイプは、EUB338Iaの場合には大部分がddTTP(91.6％)であり、BAC303-5aおよびBTH584-16aの場合にはddCTPであった。伸長されたヌクレオチドタイプは、それぞれ、BTH274-15aの場合にはddTTPであり、バクテロイデス・テタイオタオミクロンまたはバクテロイデス・フラジリス16S rRNA遺伝子の場合にはddCTPであった。他のHOPEプライマーおよびそれらの伸長されたヌクレオチドタイプの特異性が図4に示されている。
【０１１０】
図5は、プライマー伸長効率に対するアニーリング温度の影響を示す。アニーリング温度は、45℃から70℃まで5℃刻みで変化させた。鎖伸長反応の後、それらの標識されたプライマーを式(1)にしたがって定量した。個々のプライマーで観測された最高濃度に対して相対プライマー伸長効率を正規化した。BAC303-5A、BTH274-15AおよびBTH584-16Aの最高伸長効率は45℃のアニーリング温度で生じたが、EUB338Iaのそれは60℃であった。45〜60℃では、すべてのプライマーが80％〜100％の伸長効率を示した。65℃を超える温度では、EUB338Ia、BAC303-5AおよびBTH274-15Aのプライマー伸長効率は12.2％未満まで急低下した。BTH584-16Aの場合、アニーリング温度が70℃よりも高い場合、プライマー伸長効率は8.2％まで低下した。プライマー伸長のためのストリンジェントな条件を達成するために、本研究における後続の実験では60℃のアニーリング温度を使用した。
【０１１１】
プライマー伸長効率に対する、変性に使用した期間(10秒、30秒および60秒)、アニーリングに使用した期間(5秒、30秒および60秒)および伸長に使用した期間(15秒、30秒および60秒)の影響を調査した。得られた最適期間は、96℃での変性の場合には10秒、60℃でのアニーリングの場合には30秒、72℃での伸長の場合には15秒であった。
【０１１２】
図6は、プライマー伸長の一貫した結果を示す。これらの結果は、伸長されるプライマーの量が25までのサイクル数の増加とともに線形に増大し、30サイクル後は徐々に平坦域に達することを示した。プライマー伸長の効率は、25サイクルまでのサイクル数では一定のままであった。25サイクルまでは、D2-ddCTP標識されたBTH584-16AおよびBAC303-5Aの場合の増大率は、D4-ddUTP標識されたBTH274-15AおよびEUB338Iaの場合の増大率と同等およびそれ以上であった。BTH584-16A、BAC303-5A、BTH274-15AおよびEUB338Iaの場合のプライマー伸長の傾きは、それぞれ1サイクルあたり5.77、5.23、2.48および1.26フェムトモルであると計算された(R2＞0.99)。言い換えるならば、鋳型にアニーリングされ、うまく伸長されたBTH584-16A、BAC303-5AおよびBTH274-15Aの量は、伸長されたEUB338Iaの量の4.19、4.15および1.92倍の高さであった。
【０１１３】
図7はプライマー対鋳型比の影響を示す。この実験では、プライマーを、EUB338Iaの場合には5pmolに固定し、BAC303-5A、BTH584-16AおよびBTH274-15Aの場合には10pmolに固定した。鋳型量(すなわちB.テタイオタオミクロンPCRアンプリコン)を20fmolから0.3125fmolまで変えることにより、250〜16000の範囲のプライマー対鋳型比(EUB338Iaに基づく)を使用した。伸長されたEUB338Iaの量を1と仮定して、個々のプライマー対鋳型比でこれら4種のプライマーから伸長されたプライマーの量を正規化した。EUB338IaとD2-ddCTP伸長プライマー(BAC303-5AおよびBTH584-16A)との間の正規化比は、EUB338IaとD4-ddUTP伸長プライマー(BTH274-15A)との間の正規化比よりも一般に高かった。1000〜16000の範囲のプライマー対鋳型比では、正規化比は一般に、BTH274-15aおよびBAC303-5aの場合でそれぞれ1.73および4.0の一定値のままであった。BTH584-16aの場合、正規化比は3.49から2.69までわずかに低下した。これらの観測に基づき、鋳型濃度を超える(＞1000倍)オリゴヌクレオチドプライマーの初期濃度が存在する場合、正規化比を使用して、HOPE反応内でのこれらの伸長されたプライマーの濃度をさらに計算して、一貫したプライマー伸長効率を保証することができる。
【０１１４】
図8はHOPE法の特異性を示す。HOPEの特異性は、まず、四つの異なるバクテロイデス属種(すなわちB.テタイオタオミクロン、B.フラジリス、B.ブルガツス(B. vulgatus)およびB.ジスタソニス(B. distasonis))ならびに4種の異なるプライマーEUB338、BAC303-5A、BTH584-16AおよびBTH274-15Aを単一の反応で使用することによって立証した。図8aは、四つすべてのバクテロイデス属種が、D4-ddUTPまたはD2-ddCTPにより、それぞれEUB338またはBAC303-5Aを使用して正しく伸長されたことを示す。BTH274-15Aを使用した場合、B.テタイオタオミクロンおよびB.フラジリスはそれぞれD4-ddUTPおよびD2-ddCTPで伸長された。類似した電気泳動サイズを示すが、D4-ddUTP伸長プライマーとD2-ddCTP伸長プライマーとは、色素の色に基づくDNAシーケンサーによって容易に区別することができた。B.ブルガツスおよびB.ジスタソニスは、プライマーの3'末端にミスマッチヌクレオチド「T」および二つのミスマッチヌクレオチド「AG」をそれぞれ含有したため、プライマーBTH274-15Aに関して蛍光シグナルを発しなかった。B.テタイオタオミクロンのみが、BTH584-16Aを使用してD2-ddCTPによってうまく伸長された。他三つのバクテロイデス属種では、それらが少なくとも二つのヌクレオチドミスマッチをBTH584-16Aの配列に含んでいたため、シグナルは観測されなかった。これらの観測は、図8bに示すインシリコ予測に合致するものであった。全体の結果は、ミスマッチのある標的の場合の、HOPE技術の高い識別能力を示唆するものであった。
【０１１５】
糞便試料中に一般に見いだされる16の他の基準種を使用して4重HOPEの特異性をさらに確認した(表1a)。HOPE反応は、それらの参照株からの正しいタイプのヌクレオチドの伸長において100％の精度を示し、結果はインシリコ予測に合致するものであった。
【０１１６】
図9はHOPE法の感度を示す。HOPE反応は、三つの異なる反応量(すなわち、5μL、10μLおよび20μL)の下、異なる量(1〜5ng)のDNA鋳型(すなわちB.テタイオタオミクロン16S rRNA遺伝子)で実施した。二つの特異的プライマーBTH274-15AおよびBTH584-16Aを使用した。図9(a)は、D4-ddUTP伸長BTH274-15Aの量が鋳型濃度の低下とともに線形に減少したことを示す。20μL、10μLおよび5μLの反応量を使用すると、検出可能な最低鋳型量はそれぞれ250pg、31.3pgおよび7.8pgであることがわかった(それぞれR2＝0.999、0.993および0.988)。これら検出可能な量は、それぞれ227amol、28.4amolおよび7.1amolに対応する。プライマーBTH584-16aに関しても同様な結果が得られた(図9b)。また、検出された鋳型の最低量は、20μL、10μLおよび5μLの反応量の場合でそれぞれ250pg、31.3pgおよび7.8pgであった(R2＝0.999、0.991および0.994)。5μLの小さな反応量が検出感度を高め、試薬使用量を減らすことができることは明らかであった。
【０１１７】
標的鋳型(すなわちB.テタイオタオミクロン)を高濃度で存在する他の標的と混合することにより、HOPEの検出感度をさらに調査した。5μL反応量中、L.アシドフィルス16S rRNA遺伝子アンプリコン100ngを異なる量(1〜250pg)のB.テタイオタオミクロン16S rRNA遺伝子と混合した。最低検出量は、BTH274-15aの場合で15.6pgであり、BTH584-16aの場合で31.3pgであり(図9)、DNA鋳型中のL.アシドフィルスアンプリコンの非存在で得られた以前のデータに匹敵しうるものであった。最小検出可能標的DNAは、100ngの量で全DNA鋳型の約0.016〜0.031％であった。
【０１１８】
五つの異なるモデル群生を個別に調製し、表2に示すようにHOPE反応によって測定した。これらの群生は、三つの異なるバクテロイデス属種、L.アシドフィルス、E.フェシウム(E. faecium)およびP.プロダクツス(P. productus)、大腸菌ならびにM.バルケリ (M. barkeri)から増幅された様々な量の16S rRNA遺伝子を含むものであった。HOPE反応中、すべて4種のプライマー(BTH274-15A、BTH584-16A、BAC303-5AおよびEUB338Ia)によってB.テタイオタオミクロンを同時に検出することができた。B.ジスタソニスおよびB.ブルガツスは、BAC303-5aおよびEUB338Iaによってしか検出することができなかった。残り四つのバクテリア種はEUB338Iaによって検出することができ、M. バルケリはいずれのプライマーによっても検出することができなかった。特定の標的の優占度を式(2)にしたがって計算した。MC1、MC2およびMC3中、BAC303-5Aによるバクテロイデスの観測比は、全増幅DNAのそれぞれ77.0±3.9％、49.2±3.6％および14.8±1.0％であり(モルベース)、それぞれ調製比72.7％、46.2％および21.5％に非常に近かった(表2)。MC1およびMC2ではそれぞれ17.6〜18.5％であったBTH274-15AおよびBTH584-16Aによって検出されたB.テタイオタオミクロンの比もまた、調製比(21.5〜22.1％)に近かった。しかし、MC3では、より低い比(14.4〜14.9％)が観測された。MC4では、バクテロイデス属種の優占度は、全バクテリア16S rRNA遺伝子の9.7％であることが観測され、また、11.1％の理論値に非常に近かった。プライマーBTH2840-15AおよびBTH584-16Aによって検出されたB.テタイオタオミクロンの優占度は、全バクテリア16S rRNA遺伝子の2.8〜3.4％であり、また、理論比に非常に近かった。MC5では、大腸菌16S rRNA遺伝子をM. バルケリ 16S rRNA遺伝子で換えることにより、全バクテロイデス属種の観測比は、全バクテリア16S rRNA遺伝子の9.7％から53.1％に増大した。したがって、B.テタイオタオミクロンの優占度もまた、全バクテリア16S rRNA遺伝子の2.8〜3.4％から15.3〜17.4％に増大した。これらの結果は、HOPE反応が、プールされた16S rRNA遺伝子試料中の選択された標的の相対優占度を正確かつ再現可能にプロファイリングすることができることを示した。
【０１１９】
HOPE反応で分析することができる標的核酸のタイプが図10に示されている。PCR増幅産物に加えて、ゲノムDNAおよび未変性RNAを分析に使用することができる。ゲノムDNAが標的である場合、図10aに示すように、プライマー伸長効率を高めるために長めのプライマー(たとえば25〜50nt)を使用した。未変性RNA標的の場合、図10bに示すように、RNA依存性DNAポリメラーゼまたは逆トランスクリプターゼを使用した。HOPE反応を使用するRNA標的の分析は、試料中の標的の絶対的コピーの直接的な定量を提供することができることが示された。
【０１２０】
4重を超える多重反応能力を達成するために、6重反応および7重反応を設計し、試験した。図4は、ドメインバクテリア特異的プライマーおよび4種の群特異的プライマー(BTT1250、BAC303-5a、BTH274-15a、EUB338Ia-23aおよびBFRG602-19a)を含有する6重HOPE反応におけるプライマー組み合わせを示す。標的に依存して、BTH274-15aをddCTPまたはddTTPで伸長することができる。7重反応は、2種の群特異的プライマー(BFRG602-19aおよびBTH274-15a)および4種の種特異的プライマー(BUFM1018-18a、BADF1037-9a、BFG1024およびBITT141)を含むものであった。
【０１２１】
図11aおよび11bは、異なる参照株を用いた6重および7重反応の電気泳動図をそれぞれ示す。個々のプライマーは、長さおよび伸長したダイターミネータータイプに基づいて明確に分離され、識別されている。所与のプライマーと参照プライマーとの間で得られた校正係数は、図6および7から得られた校正係数に匹敵しうるものである。
【０１２２】
6重HOPE反応と7重HOPE反応とをさらにいっしょに使用して(全部で10重)、T-RFLPによる測定では25〜34種を超える検出可能なバクテリア群が観測された(データは示さず)国内廃水処理施設の流入物および流出物中の種々のバクテロイデス属種の相対優占度を同時に測定した。図11cは、7重HOPE反応を使用して流入試料に関して得られた電気泳動図を示す。これらの明瞭な検出可能なピークは、群特異的プライマー(BFRG602_19aおよびBTH274-15a)、二つの種特異的プライマー(BUFM1018-18aおよびBFG1024)ならびに二つのサイズおよび濃度標準に正しく対応する。表3は、バクテロイデス目 (Bacteroidales)群およびBFRG602関連群の相対優占度が流入物試料中の増幅16S rRNA遺伝子の10〜11.1％および3.6〜4.5％をそれぞれ占めるということを示す。これらの割合は、流出物試料中では1.1〜1.6％および50.1％に減少し、相対優占度の7〜45倍の減少である。BTH274関連群は、流入物試料中の全増幅バクテリア16S rRNA遺伝子の約0.3〜1.1％を占め、流出物中では検出不可能であった。BTH274関連群内には、B.フラジリスおよびバクテロイデス・ユニフォルミスが、BFRG602関連群の4.9〜5.1％および19.7〜21.6％またはEUB338Ia検出バクテリアの0.2％および0.8〜0.9％でそれぞれ存在し、使用された種特異的プライマーの標的とならなかった流入物中の他のバクテロイデス属種の存在を示唆した。
【０１２３】
実施例2
階層オリゴヌクレオチドプライマー伸長(HOPE)反応を使用する糞便および廃水中のヒト特異的バクテロイデス属種の定量分析
この実施例は、糞便および廃水中に存在する17種の異なるヒト特異的バクテロイデス属種に対して定量分析を実施するための新たな手法としてのHOPEの使用を実証する。長さが異なる、および／または、異なるddNTPで伸長する23種のプライマーを7本のHOPE反応管中に配設することにより、ハイスループットかつ高速の分析を90分以内に達成した。
【０１２４】
(a)材料および方法
バクテリア株および環境試料
Japan Collection of Microorganisms(Wako, Japan)またはBioresources Collection and Research Centre(Hsinchu, Taiwan)から得た19種の参照バクテリア株を使用した。それには、B.ジスタソニス (JCM5825)、B.ユニフォルミス(B. uniformis) (JCM5828)、B.ピオゲネス(B. pyogenes) (JCM6294)、B.ヘルコゲネス(B. helcogenes)(JCM6297)、B.ステルコリス(B. stercoris)(JCM9496)、B.メルダエ(B. merdae)(JCM9497)、B.カッカエ(B. caccae)(JCM9498)、B.テクタス (JCM10003)、B.アシジファシエンス(B. acidifaciens) (JCM10556)、B.フラジリス (BCRC10619)、B.テタイオタオミクロン (BCRC10624)、B.ブルガツス(BCRC12903)、B.コプロコラ(B. coprocola)(JCM12979)、B.マッシリエンシス (B. massiliensis)(JCM12892)、B.エガーシイ(B. eggerthii)(JCM12986)、B.ノルジイ (B. nordii)(JCM12987)、B.サリエルシア (B. salyersiae)(JCM12988)、B.インテスチナリス(B. intestinalis)(JCM13266)およびB.ゴールドステイニイ(B. goldsteinii)(JCM13446)が含まれていた。糞便試料は、(i)26〜32歳の3名の健康なドナー、(ii)3頭の健康なブタ、および(iii)3頭の健康なウシから採取した。環境試料は、シンガポールに位置する市の処理施設および台湾台南にあるブタの廃水処理施設の流入物から採取した。試料を採取し、DNA抽出まで-20℃で保存した。
【０１２５】
DNA抽出
純粋な培養物および流入物試料の全DNAを、先に記載したプロトコルに小さな変更を加えたものにしたがって抽出した(Schmidt, T. M., E. F. DeLong, and N. R. Pace. 1991. Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing. J Bacteriol 173:4371-8)。QIAamp DNA便ミニキット(Qiagen)を使用して糞便試料の全DNAを抽出した。理由は、この市販品キットが、糞便試料からのDNA抽出にもっとも適していると報告されていたからである。
【０１２６】
16S rRNA遺伝子のPCR増幅
各PCR反応物は、1×Takara Ex-Taq緩衝液中ゲノムDNA 50〜100ng、フォワードプライマー[11F、5'-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3']およびリバースプライマー[1492R、GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'] 200nM、dNTP 200mMおよびEx-Taq DNAポリメラーゼ(Takara)0.5Uを含有するものであった。
【０１２７】
熱プログラム(変性、95℃で30秒、アニーリング、55℃で45秒、伸長、72℃で60秒)のサイクル数を10から35まで5サイクル刻みで変えることにより、微生物群生の比例的増幅を得るために必要な熱サイクルの最適数を試験した。QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して、各サイクルで得られたアンプリコンを濃縮し、精製し、DU730分光光度計(Beckman Coulter)を使用するUV吸光度計測によって濃度を定量した。
【０１２８】
クローニングおよび配列決定
培養純度を保証するため、TAクローニングキット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)を使用してこれらの参照株の16S rRNA遺伝子をpCRIIベクターに別々にクローニングした。クローンライブラリーごとに、20個の群生を選択し、M13RおよびM13Fプライマーを用いる直接PCR増幅によってDNA挿入の存在を確認した。そして、ABI PRISM 3130遺伝子アナライザ(Applied Biosystems)およびBigdye Sequencingキット(Applied Biosystems)を使用して、挿入されたDNA断片を配列決定した。BLASTソフトウェアを使用して、これらの配列を16S rRNA遺伝子データベースに対して比較した。
【０１２９】
種特異的プライマー設計
ARBソフトウェアのプローブ設計機能を使用して、種々のヒト特異的バクテロイデス属種を特異的に標的とする全部で17種のプライマーを設計した。28,289種のほぼ完全な16S rRNA配列(長さ＞1450nt)を含む更新ssu_jan04. arbデータベース(www.arb-home.de)を、Ribosomal Database Project II(RDP)から得られた培養バクテロイデス属種の189種のアライメント配列および19種の参照バクテリア株のほぼ完全な16S rRNA配列とともに使用した。HOPEプライマーの特異性を高めるため、3'末端に位置する非標的のミスマッチ位置で各プライマーを設計した。設計したプライマーの特異性を、まず、RDPデータベースに対してインシリコで検証し、次いで、HOPE反応で検証して、非標的バクテリア株がDNA鋳型として使用された場合、プライマーが伸長しないことを確認した。
【０１３０】
内部標準オリゴヌクレオチド混合物
この混合物は、合成され、5'末端を4種の異なるフルオロフォア(すなわちdR110、dR6G、dTAMRAおよびdROX)(Applied Biosystems)で末端標識された異なる長さの4種のオリゴヌクレオチド[5'-(GT)x-3'、ここで、x＝18、20、22および24]を含有するものであった。個々のオリゴヌクレオチドの濃度を260nmで計測し、その後、5'-dR110-(GT)20-3'の場合には3nMに希釈し、5'-dTAMRA-(GT)22-3'の場合には15nMに希釈し、5'-dROX-(GT)24-3'の場合には18nMに希釈し、5'-dR6G-(GT)18-3'の場合には3nMに希釈した。
【０１３１】
HOPE反応
断りない限り、各HOPE反応物(全部で5μl)は、SNaPshotプレミックス2.5μl、DNA鋳型5〜30fmol、オリゴヌクレオチドプライマー(Sigma-Proligo, SingaporeおよびMission Biotech, Taiwan)10pmolおよび様々な量の脱イオン水を含有するものであった。SNaPshotプレミックスは、DNAポリメラーゼ、イオン緩衝液および蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド(dROXTM-ddTTP、dTAMRATM-ddCTP、dR110-ddGTPおよびdR6G-ddATP)からなるものであった。HOPE熱プログラムは、変性(96℃で10秒)、アニーリング(64℃で30秒)および伸長(72℃で15秒)の20サイクルからなるものであった。プライマー伸長反応の後、組み込まれなかったダイターミネーターを除去するためにエビアルカリホスファターゼ(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)1Uを加え、37℃で60分間インキュベートした。そして、酵素を75℃で10分間不活性化した。
【０１３２】
キャピラリー電気泳動
HOPE産物0.5〜1μlを、GeneScan Liz 120標準(Applied Biosystems)0.125μl、標準オリゴヌクレオチド混合物0.25μlおよびHi-Diホルムアミド(Applied Biosystems)12μlと混合した。電気泳動プログラムは、変性段階(60℃)、1.0〜2.1kVの印加電圧を12〜40秒間用いる注入段階および分離段階を含むものであった。その後、断片分析ソフトウェアGeneMapperによって蛍光データを分析し、伸長されたプライマーおよび内部標準オリゴヌクレオチドの断片サイズおよびピーク面積を記録した。
【０１３３】
HOPE産物の相対優占度の計算
伸長プライマーの濃度は以下のように定量した：
2009545314.tif 000008
式中、Cpは、試料に関するHOPE反応で伸長される特定のプライマーのモル濃度を表し、Cstdは、対応する標準オリゴヌクレオチドのモル濃度を表す。
【０１３４】
より高ランクのプライマーに対する各特定のプライマーの校正係数は、対応する参照株を鋳型として使用することによって得ることができ、以下のように計算することができる：
2009545314.tif 000009
式中、プライマーBは、プライマーAと比べてより高いレベルを標的としている。
【０１３５】
そして、プライマーBの標的となるアンプリコンに対する、プライマーAの標的となる16S rRNA遺伝子アンプリコンの相対優占度を、以下のように計算することができる。
2009545314.tif 000010
【０１３６】
(b)結果
PCR増幅
15〜20サイクルのPCRを実施したとき、微生物標的の比例的増幅が達成された。20サイクル後に指数関数的増幅が起こり、35サイクル後に平坦域に達した(図15)。したがって、糞便および廃水試料中の微生物標的のすべてのPCR増幅の場合、20サイクルPCRが、後続HOPE分析のためのDNA鋳型を生成するために選択された。これは、種の富度の定量分析を実施する際にPCRによって誘発される偏りを最小限にすることができる。
【０１３７】
階層プライマーの設計
表4は、種、群またはドメインレベルでバクテロイデスに関連する23種の異なるプライマーの配列および特異性をリストする。プライマーは、これらのバクテリア株の系統学的帰属に基づいて七つの異なる多重HOPE反応に割り当てられる(図13)。反応1〜6は、より高ランクの3種のプライマー(Bth274、Bdts_gp980またはBfrg602)を17種の種特異的プライマーとともに含有するものであった。したがって、より高ランクのプライマーの標的となる微生物標的に対する、各種特異的プライマーの標的となる個々の微生物標的の優占度を定量化することができる。反応7では、全バクテリア(U1390関連)に対するBth274、Bdts_gp980、Bfrg602およびBac303によって代表される微生物標的の相対優占度を計算することができる。同じHOPE反応で伸長されたプライマーを明確に区別するために、同じddNTPで伸長するプライマーの5'末端を5から24までの異なる長さのポリAテールで修飾した(表4)。
【０１３８】
プライマー伸長の特異性
プライマー伸長の特異性を参照株に対して立証した。結果は、すべての種特異的プライマーが、それらの標的とする種をDNA鋳型として反応で使用した場合、インシリコ予測の場合と同じヌクレオチドで正しく伸長することを示した。同様に、非標的が存在した場合、いずれの種特異的プライマーも伸長しなかった。群特異的プライマーBth274は、B.ユニフォルミスおよびB.フラジリスの存在ではヌクレオチド「C」で伸長し、B.テクタス、B.ピオゲネス、B.ノルジイ、B.サリエルシアおよびB.テタイオタオミクロンの存在ではヌクレオチド「T」で伸長した。Bfrg602は、B.フラジリスクラスタではバクテロイデス属種を標的とするように設計され、「C」で伸長させた。目およびドメインレベルですべての19種のバクテリア株を標的とするようにそれぞれ設計されたBac303およびU1390は、それぞれ「C」および「A」で伸長した(表4)。
【０１３９】
HOPE反応の電気泳動図の解釈
図14は、ヒト糞便中の種々のヒト特異的バクテロイデス属種を表す伸長されたプライマーの電気泳動図を示す。より高ランクのプライマーはプライミングすべきより多くの標的を有するため、それらのピーク高さおよび面積は、種特異的プライマーを表すピーク高さおよび面積よりも相当に大きかった。したがって、種特異的プライマーを用いるHOPE反応の好ましい態様では、より高ランクの関連するプライマーは、科レベルを超えて標的指向化することができない。これは、低いピーク高さの伸長した種特異的プライマーの検出を容易にするためである。加えて、伸長したプライマーは一貫した断片サイズで出現するため、伸長したプライマーと合致しない他すべてのピークをバックグラウンドノイズとして処理し、後続の分析から排除することができる。
【０１４０】
伸長したプライマーおよび内部標準オリゴヌクレオチドのピーク面積を記録し、相対優占度を計算するために使用した。
【０１４１】
糞便試料中のヒト特異的バクテロイデス属種の相対優占度
表5は、様々な分類学的レベルにおけるヒト特異的バクテロイデス属種の相対優占度を記す。すべてのヒト糞便試料で、Bfrg602関連群の中でB.ブルガツスが優占種(14.5〜51.2％)として観測されたが、多様なバクテロイデスにおける個体間差は明らかであった。B.フラジリス、B.エガーシイ、B.インテスチナリスおよびB.マッシリエンシスが、ボランティアH2およびH3中では0.6〜6.8％であると検出されたが、ボランティアH1では低すぎて検出されなかった。B.カッカエおよびB.ユニフォルミスもまた、異なる相対優占度(1.3〜9.1％)で存在していた。より高い分類学的レベルでは、Bth274[C]関連群(B.ユニフォルミスおよびB.フラジリスを含む)が、糞便叢中に存在するバクテリアの0.4〜0.8％を占めた。同様に、Bth274[T]関連群(B.テタイオタオミクロン、B.テクタス、B.カッカエ、B.ピオゲネス、B.ノルジイおよびB.サリエルシアを含む)がバクテリアの0.1〜0.6％を占め、この群ではB.テタイオタオミクロンが優占種であった(44.8〜96.4％)。Bfrg602関連のクラスタ(B.フラジリスクラスタ)は宿主によって変動し、バクテリアの3.0〜6.6％を占めた。さらに、Bac303プライマーの標的化となるバクテロイデス目群の相対優占度が3名のヒトボランティアの間で14.3〜21.8％の範囲であり、ヒト糞便叢が優占微生物の比較的安定なプロフィールを有することを示唆した。しかし、種の富度は、おそらくは生活習慣、年齢および食事の違いのせいで、個体間で顕著に異なった。比較上、ブタおよびウシ糞便叢では、ヒト特異的バクテロイデス属種の割合が顕著に低かった。HOPE反応7では、伸長したBth274_15dAおよびBfrg602_19dAを表す断片は検出されなかった。Bac303_5dAの標的となるバクテロイデス目は、ブタ糞便叢中の全バクテリアの2.4〜5.1％の範囲であり、ウシ糞便中の全バクテリアの1.8〜2.9％の範囲であった。バクテロイデス目のこの相対優占度は、ヒト糞便叢におけるそれの5倍の低さである。
【０１４２】
廃水中のヒト特異的バクテロイデス属種の相対優占度
HOPEをさらに適用して、ブタおよび市の廃水処理施設の流入物中のバクテロイデス属種の相対優占度を試験した(表5)。ヒト糞便中で以前に検出されたバクテロイデス属種が同じく市の廃水中にも存在しており、B.フラジリス、B.カッカエ、B.ユニフォルミス、B.ブルガツスおよびB.マッシリエンシスがそれぞれBfrg602関連群の11.8％、3.1％、21.5％、32.5％および6.1％を占めていた。Bth274[T]関連群ではB.テタイオタオミクロンが優占種としてとどまり、約93.6％を構成していた。市の廃水中に存在したBth274関連およびBfrg602関連群の相対優占度は、ヒト糞便叢中に見られるそれに近かったが、バクテロイデス目中の増幅16S rRNA遺伝子の相対優占度は2倍超低下したと思われた。これは、環境中のバクテロイデス属種の低い残存性を示唆する可能性がある。ブタの廃水処理施設の流入物中、種レベルでバクテロイデス属種を標的とするプライマーは何も検出されなかった。バクテロイデス目中の標的の相対優占度は市の廃水中の約3倍の低さであった。これは、ヒト特異的バクテロイデス属種は動物廃棄物中ではより低い優占度で存在するという以前の観測を再確認させた。
【０１４３】
(c)論考
腸内バクテロイデス属種の機能的重要性を研究するため、定量を実施する際の制限にもかかわらず、FISHのような分子ベースの方法および16S rRNAクローンライブラリーの構築を使用した。16S rRNAクローンライブラリーに基づき、バクテロイデス門が全バクテリアの27.7〜48％を占めることがわかった。それらのうち、B.フラジリスおよびB.ジスタソニス亜群が全バクテリアの13.3％までを占め、ヒト腸の十分な機能におけるそれらの優占度および重要性を示した。
【０１４４】
種レベルでは、B.テタイオタオミクロン、B.ブルガツス、B.ユニフォルミスおよびB.カッカエが、Suauらにより(Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Appl Environ Microbiol 65:4799-807v)、それぞれバクテリアの2.1％、1.4％、4.9％および1.1％を構成することが見いだされている。しかし、この報告された優占度は、B.ブルガツスおよびB.テタイオタオミクロンがそれぞれバクテリアの15％および6.2％を構成することを見いだしたEckburgら(2005; Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308:1635-8)によって報告されているそれの3倍超の低さである(表6)。
【０１４５】
これら二つの研究で報告されたバクテロイデス属種の優占度の差は、クローニングの前の増幅サイクルおよび分析に選択したクローンの総数の違いの結果であり得る。同様に、FISHもまた、亜群および目レベルでのバクテロイデスの同様な優占度を示した。しかし、バクテロイデス属中の各種を定量するための詳細な実験は実施されていない(表6)。これは、低い検出感度を生じさせる糞便中でのバクテロイデス 16S rRNA遺伝子の不活性に起因し得る。
【０１４６】
上述の方法に比べて、HOPEは、全PCR増幅微生物標的の0.05〜0.1％の検出感度を有し、したがって、種レベルで微生物標的を検出することができる。HOPEを使用すると、バクテロイデス目の相対優占度が全バクテリアの14.3〜21.8％を占めることが見いだされ、16S rRNAクローンライブラリーによって報告されたそれに類似していた。しかし、各バクテロイデス属種の優占度は3倍超の低さである(表6)。相対優占度におけるこのような変動は、二つの方法の不一致のせいである可能性が高い。全PCR増幅微生物群生を試験するHOPEとは違って、クローンライブラリーによる定量分析は、選択されるクローンの最終的な数に依存する。したがって、HOPE分析は、クローンライブラリーよりも正確に実際の種富度を表すことができる。加えて、全HOPE手法は、90分未満で完了させることができ、したがって、いかなる試料タイプででも定量分析のための高速で高感度な方法を提供する。
【０１４７】
HOPEは、糞便および汚染水のいずれででもバクテロイデス属種を速やかに定量することができるため、様々な環境微生物学的研究に使用することができる。Kreaderら(1995; Design and evaluation of Bacteroides DNA probes for the specific detection of human fecal pollution. Appl Environ Microbiol 61:1171-9)が、ヒト特異的バクテロイデス属種の優占度がヒト糞便を非ヒト糞便から区別することができることを見いだして以来、HOPEは、これらの微生物標的を定量するために使用することができ、したがって、糞便源追跡(FST)法として働くことができる。この研究は、高い割合でバクテロイデス属種を有する試料中のバクテロイデス属種の相対優占度を定量するためのHOPEの適用を示し、バクテロイデス16S rRNA遺伝子の量が全バクテリアに対して0.1％未満になり得る多量の水分の中でFSTを実行するその能力を正確に反映しないこともある。そのような場合、HOPEの検出感度を高めるために、バクテリアではなくバクテロイデス-プレボテラ(Bacteroides-Prevotella)を増幅させて、HOPE分析のためのDNA鋳型として働かせることができる。この代替HOPEベースのFST戦略で従来の糞便指示薬試験を補うことにより、糞便汚染のより良い理解を達成することができる。
【０１４８】
FSTのためのHOPEを使用する他に、この方法はまた、腸または糞便中に存在する疾病関連のバイオマーカーを識別するために応用することもできる。これは、まず、そのようなバイオマーカーの相対優占度を健康な被験者と罹患した被験者とで比較することによって達成することができる。したがって、これらのバイオマーカーによって演じられる機能的役割の理解と組み合わさって、微生物多様性の操作を含む代替処理戦略を計画することができる。今日まで、この分野では、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)のような培養ベースの従来の分子的方法しか適用されていない。HOPEは、定量分析を提供し、したがって、識別されたバイオマーカーとヒト疾病との間でより良好な統計的相関を達成するため、これらの従来方法に対して比較上の有利さを有する。
【０１４９】
要約すると、この研究は、微生物標的を様々な分類学的レベルで定量することができる高速でハイスループットの検出法としてのHOPEの使用を実証した。この手法の融通性はまた、ひとたび適切な階層プライマー設計が利用可能になるならば、この手法を、PCR増幅群生中の任意の微生物標的に拡張することができ、それにより、様々な生態環境における微生物多様性のさらなる理解を促進することを意味する。
【０１５０】
適用
有利には、開示された方法は、試料中の複数の標的核酸の高速でハイスループットで高感度で高精度な検出、識別および／または定量を1回の分析で可能にする。本方法は、環境および臨床用途における市販化またはカスタムメイドの診断キットの開発、たとえば飲用水中の指標微生物(たとえば病原体、糞便バクテリアおよび毒素生成性微生物)のモニタリング、水および廃水生物学的処理プロセス(バイオフィルム、糸状バクテリアおよび泡形成性バクテリア)、汚染土壌および地下水のバイオレメディエーション(指標バクテリア)ならびに特定の集団の優占度または多数の標的の検出および／または定量が重要であるか、求められるヒトおよび動物の腸(健康および疾病に関連するバクテリア)において用途を有する。
【０１５１】
前記開示を読んだのち、本発明の本質および範囲を逸することなく、本発明の様々な他の改変および適合が当業者には自明であることが明らかであり、そのような改変および適合がすべて請求の範囲に入るものと解釈される。
【０１５２】
（表１ａ）20種のバクテリア株の階層オリゴヌクレオチドプライマー伸長分析
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aバクテリア株は、American Type Culture Collection(ATCC)、Bioresource Collection and Research Center(BCRC)、Japan Collection of Microorganisms(JCM)、German National Resource Centre for Biological Material(DSMZ)およびNational Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria(NCIMB)から得たものである。
bミスマッチした塩基対合(MM)の数。
c形成されたプライマー・鋳型二重鎖に隣接する鋳型のヌクレオチドを指す。
d観測されたダイターミネーターを指す。
ND＝検出されず。
【０１５３】
（表１ｂ）実験に使用したオリゴヌクレオチドの配列および特異性
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a図4を参照。
【０１５４】
（表２）多重化HOPE法を使用する、規定の16S rRNA遺伝子アンプリコンで構成されたモデル群生の定量分析
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1フェムトモル／μl；括弧内の％値はバクテリアドメイン中の種優占度を示した。
【０１５５】
（表３）多重HOPE法を使用する、下水処理施設からの流入物および流出物中の特定の標的の相対優占度の定量
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a BTH274-15aのddCTPを用いたプライマー伸長によって検出された群。
b BTH274-15aのddTTPを用いたプライマー伸長によって検出された群。
6重、EUB338Ia-23a：BAC303-5a：BFRG602-19a：BTH274-15a(C)：BTH274-15a(T)：BTT1250に関して得られた校正係数＝1：6.1：11.2：14.4：3.1：2.4および7重、BFRG602-19a：BUFM1018-18a：BTH274-15a(C)：BTH274-15a(T)：BFG1024：BITT141に関して得られた校正係数＝1：0.8：1.2：0.4：1.7：0.1に関して得られた校正係数。
使用したバクテリア株は、B.テタイオタオミクロン、B.フラジリス、B.アシジファシエンス(JCM10556)、B.インテスチナリス(JCM13266)、B.ユニフォルミス(JCM5828)、バクテロイデス・テクタス(JCM10003)およびバクテロイデス・ピオゲネス(JCM6294)を含むものであった。
ND＝検出されず。
【０１５６】
（表４）様々な階層的レベル(種、属、目およびドメインレベル)でヒト特異的バクテロイデス属種を標的とするように設計した、本実験に含まれるプライマー
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(14) Harmsen, et al. 2002. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Appl Environ Microbiol 68:2982-90.
(26) Manz, et al. 1996. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. Microbiology 142(Pt 5):1097-106.
(32) Wang, et al. 1996. PCR detection and quantitation of predominant anaerobic bacteria in human and animal fecal samples. Appl Environ Microbiol 62:1242-7.
(38) Zheng, et al. 1996. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Appl Environ Microbiol 62:4504-13.
【０１５７】
（表５）多重HOPE法を使用して個々に定量した、ヒト、ブタおよびウシ糞便試料中の微生物標的の相対優占度ならびに市のWWTPおよびブタのWWTPの流入物中に存在するそれらの相対優占度
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1 プライマーBth274_15dAは、この群の微生物標的にアニーリングされると、ddCTPによって伸長する。
2 プライマーBth274_15dAは、この群の微生物標的にアニーリングされると、ddTTPによって伸長する。
3 NDは「検出されず」を示す。
多重管1〜4中のプライマー、Bfrg602_19dA：Bfrg1026_20dA：Bcc1066_15dA：Badf1009：Bitt141：Bufm1018_20dA：Begt999：Bhcg171_8dA：Bvg1016：Bms11000_19dA：Bcpc1015_24dAに関して得られた校正係数(CF)＝1：0.17：2.96：0.36：16.51：4.61：8.17：13.86：8.37：3.13：3.06。CFは、B.フラジリス(BCRC10619)、B.カッカエ(JCM9498)、B.アシジファシエンス(JCM10556)、B.ユニフォルミス(JCM5828)、B.エガーシイ(JCM12986)、B.ヘルコゲネス(JCM6297)、B.ブルガツス(BCRC12903)、B.マッシリエンシス(JCM12982)およびB.コプロコラ(JCM12979)を含むバクテリア株からのクローンを使用して得られた。
多重管5中のプライマー、Bth274[T]_15dA：Bnd136：Bsls1016_10dA：Pg_dtc732_20dA：Bth584_16dAに関して得られた校正係数(CF)＝1：2.05：0.39：0.36：0.19。CFは、B.ノルジイ(JCM12987)、B.サリエルシア(JCM12988)、B.ピオゲネス(JCM6294)およびB.テタイオタオミクロン(BCRC10624)を含むバクテリア株からのクローンを使用して得られた。
【０１５８】
（表６）様々な刊行文献から得られた様々な階層レベルのバクテロイデスの優占度の比較
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(12) Franks, et al. 1998. Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol 64:3336-45.
(14) Harmsen, et al. 2002. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Appl Environ Microbiol 68:2982-90.
(31) Suau, et al. 1999. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Appl Environ Microbiol 65:4799-807.
(7) Eckburg, et al. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308:1635-8.
(33) Wang, et al. 2003. Molecular characterization of the microbial species that colonize human ileal and colonic mucosa by using 16S rDNA sequence analysis. J Appl Microbiol 95:508-20.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月29日(2009.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009545314000001.app
【国際調査報告】
2009545314.tif 000034
2009545314.tif 000035