(57)【要約】本発明は、虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、膜形質導入特性を有するペプチド配列及び細胞生存特性を有するペプチド配列を含んでなる融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする核酸の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
及び
＊  細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質、
又は
−  前記融合タンパク質若しくは前記相同タンパク質をコードする核酸
の虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用。
【請求項２】
前記膜形質導入特性を有するペプチド配列が、HIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)、例えば配列番号２で表されるHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
心筋虚血、例えば心筋梗塞に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための請求項１又は２の使用。
【請求項４】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン、BIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント
を含んでなるリストから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、以下：
−  配列番号４で表されるXIAP(ラット)、
−  配列番号６で表されるXIAP(ヒト)、
−  配列番号８で表されるBIR2ドメイン(ラット)、
−  配列番号44で表されるBIR2ドメイン(ヒト)、
−  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン(ラット)、
−  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン(ヒト)、
−  配列番号36で表されるBIR3とRINGドメインとの間のリンカードメイン(ラット)、
−  配列番号38で表されるBIR3とRINGドメインとの間のリンカードメイン(ヒト)、
−  配列番号14で表されるFLIP(FlipL)(マウス)、
−  配列番号16で表されるFLIP(FlipS)(マウス)、
−  配列番号18で表されるFLIP(Flip control)(マウス)
を含んでなるリストから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記融合タンパク質が以下：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP
を含んでなるリストから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、以下：
−  BIR2ドメイン、例えば配列番号８で表されるBIR2ドメイン、
又は
−  BIR3-RINGドメイン、例えば
＊  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン、
＊  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン、
又は
−  BIR3-RINGリンカードメイン、例えば
＊  配列番号36で表されるBIR3-RINGリンカードメイン、
＊  配列番号38で表されるBIR3-RINGリンカードメイン
である細胞生存を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記融合タンパク質が以下：
−  配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
脳虚血、例えば脳梗塞に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための請求項１又は２の使用。
【請求項１０】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、
−  細胞生存特性を有するヒトＸ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)の細胞生存特性を有するフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン若しくはBIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)の細胞生存特性を有するフラグメント
を含んでなるリストから選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、以下：
−  BIR2ドメイン、例えば配列番号８で表されるBIR2ドメイン、
又は
−  BIR3-RINGドメイン、例えば
＊  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン、
＊  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン、
−  BIR3-RINGリンカードメイン、例えば
＊  配列番号36で表されるBIR3-RINGリンカードメイン、
＊  配列番号38で表されるBIR3-RINGリンカードメイン
である細胞生存を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が以下：
−  配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)
である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
活性物質として、以下：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質
を医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで含んでなり、該融合タンパク質の約50mg〜約500mgの単位用量を個体に投与するに適切な医薬組成物。
【請求項１４】
前記膜形質導入特性を有するペプチド配列が、HIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)、例えば配列番号２で表されるHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン、BIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント
を含んでなるリストから選択される、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、以下：
−  配列番号４で表されるXIAP(ラット)、
−  配列番号６で表されるXIAP(ヒト)、
−  配列番号８で表されるBIR2ドメイン(ラット)、
−  配列番号44で表されるBIR2ドメイン(ヒト)、
−  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン(ラット)、
−  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン(ヒト)、
−  配列番号36で表されるBIR3とRINGドメインとの間のリンカードメイン(ラット)、
−  配列番号38で表されるBIR3とRINGドメインとの間のリンカードメイン(ヒト)、
−  配列番号14で表されるFLIP(FlipL)(マウス)、
−  配列番号16で表されるFLIP(FlipS)(マウス)、
−  配列番号18で表されるFLIP(Flip control)(マウス)
を含んでなるリストから選択される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が以下：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP
を含んでなるリストから選択される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
活性物質として、以下：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  以下を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列：
＊＊  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)の細胞生存特性を有するフラグメント、
又は
＊＊  Flice阻害タンパク質(FLIP)の細胞生存特性を有するフラグメント
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質
を医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで含んでなる医薬組成物。
【請求項１９】
前記細胞生存特性を有するペプチド配列が、以下：
−  BIR2ドメイン、例えば配列番号８で表されるBIR2ドメイン、
又は
−  BIR3-RINGドメイン、例えば
＊  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン、
＊  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン、
＊  配列番号36で表されるBIR3-RINGリンカードメイン(ラット)、
＊  配列番号38で表されるBIR3-RINGリンカードメイン(ヒト)
である細胞生存を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が以下：
−  配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)
である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
活性物質として、請求項１３〜２０のいずれか１項に規定の融合タンパク質をコードする核酸を、医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで含んでなる医薬組成物。
【請求項２２】
以下：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP
を含んでなるリストから選択される融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼが虚血誘導性脳傷害に能動的に寄与するという事実(Friedlander, 2003)の蓄積が前臨床研究における重要な進展を促している(Onteniente, 2004)。しかしながら、虚血発症後に投与された合成カスパーゼ阻害剤による神経学的不全という限界が、主に、軽度の虚血性発作の場合に得られており(Plesnila and Moskowitz, 2000)、該阻害剤の安定性、特異性、及び効力を向上させるために更なる開発が進行中である。加えて、虚血性細胞死メカニズムの複雑性を考慮すると、効率的な細胞保護はカスパーゼの阻害のみによっては得られそうもない。
【０００３】
内在性のカスパーゼ阻害剤の主なものはIAPファミリーのメンバーである。XIAPが最も強力なメンバーであり(Vaux and Silke, 2003)、その複雑な構造に非常に近似した合成ペプチドより高いカスパーゼ阻害能を有している(Deverauxら, 1999)。XIAPは３つのバキュロウイルスIAP反復(BIR)ドメイン(このうち２つ(BIR2及びBIR3)はカスパーゼと相互作用する)及びE3酵素活性(E3酵素は、ユビキチン/プロテアソーム経路における分解の標的(カスパーゼ-３及びXIAP自体も含まれる)をマークする(Huangら, 2000))が与えられたCOOH末端RING(really interesting new gene)ジンクフィンガーモチーフを持っている(Yangら, 2000)。カスパーゼ阻害の他に、XIAPはまた幾つかのシグナリング経路のモジュレーションに関与し(Lewisら, 2004)、転写因子NF-κBのDNA結合を活性化する(Holcikら, 2001)。この多様な形態の作用により、XIAPに独特な神経保護効力が与えられており、XIAPの過剰発現は、卒中や虚血性心疾患のような複雑な病因を持つ傷害に対抗するための有望な戦略のように思われる。
【０００４】
XIAPは、血液脳関門(BBB)を横切らない62kDaタンパク質である。その結果、卒中におけるXIAPの神経保護の可能性が、ウイルス媒介過剰発現(Xuら, 1999)又はトランスジェニックマウス(Trappら, 2003)を用いて分析されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の主な目的は、細胞生存特性を有するペプチド配列に膜形質導入特性を付与する医薬組成物を提供することであり、該医薬組成物は、虚血、より具体的には心筋性虚血又は脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療が意図される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
及び
＊  細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質、
又は
−  前記融合タンパク質若しくは前記相同タンパク質をコードする核酸
の虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【０００７】
上記の形質導入特性は、Dowdyら(Methods 24:247-256, 2001)に従い、フルオレセイン イソチオシアネート(FITC)で又は抗-HA抗体を用い続いて蛍光二次抗体を用いる免疫組織化学で融合タンパク質を直接標識し、蛍光活性化細胞選別法で該融合タンパク質を取り込んだ細胞を計数することによって評価することができる。
【０００８】
上記の細胞生存特性は、アポトーシス剤、低酸素又は酸素−グルコース欠乏により細胞死を誘導した後に細胞培養物に該タンパク質を加え、ホスファチジルセリンの外在化若しくは乳酸デヒドロゲナーゼ産生のようなアポトーシス特有のマーカーによるアポトーシス細胞の数を定量するか、又は生存細胞数を定量することによってインビトロで評価することができる。細胞生存特性は、虚血、アポトーシス誘起剤若しくは外傷性発作を含む種々の刺激により変性を誘起された後に組織中の生存細胞の数を定量するか、又は組織喪失の総量を定量することによってインビボで評価することができる。
【０００９】
細胞生存特性にはカスパーゼ阻害特性が含まれる。カスパーゼ阻害特性は、インビトロでカスパーゼに特異的な基質に該タンパク質を加えること、又は該タンパク質で処置した組織からの抽出物を特異的なカスパーゼ基質に反応させるによってインビトロで評価することができる(Benchouaら, J. Neurosci. 21:7127-7134, 2001)。
【００１０】
本発明は、より具体的には、上記融合タンパク質若しくは該融合タンパク質から誘導された相同タンパク質又は該融合タンパク質若しくは該相同タンパク質をコードする核酸配列の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００１１】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列がHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記融合タンパク質の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００１２】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列が配列番号２で表されるHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記融合タンパク質の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００１３】
本発明は、より具体的には、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン、BIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント。
【００１４】
XIAP若しくはFLIPタンパク質又はそれらのフラグメントは、好ましくは哺乳動物タンパク質、より好ましくはヒトタンパク質である。
【００１５】
XIAPタンパク質のBIR2ドメインは、BIR1とBIR2との間のリンカー配列に結合するXIAPの２番目のBIRドメインである。BIR2ドメインは、カスパーゼ阻害特性を有する。
【００１６】
XIAPタンパク質のBIR3−RINGドメインは、XIAPの３番目のBIRドメインとRING(Really Interesting New Gene)のジンクフィンガードメインの結合物であり、両ドメイン間のリンカー部分を含む。
【００１７】
BIR3−RINGリンカードメインは、XIAPのBIR3ドメインとRINGドメインを分離している領域である。
【００１８】
本発明は、より具体的には、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号４で表されるXIAP(ラット)、
−  配列番号６で表されるXIAP(ヒト)、
−  配列番号８で表されるBIR2ドメイン(ラット)、
−  配列番号44で表されるBIR2ドメイン(ヒト)、
−  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン(ラット)、
−  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン(ヒト)、
−  配列番号36で表されるBIR3とRINGドメインとの間のリンカードメイン(ラット)、
−  配列番号38で表されるBIR3とRINGドメインとの間のリンカードメイン(ヒト)、
−  配列番号14で表されるFLIP(FlipL)(マウス)、
−  配列番号16で表されるFLIP(FlipS)(マウス)、
−  配列番号18で表されるFLIP(Flip control)(マウス)。
【００１９】
本発明は、より具体的には、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP。
【００２０】
本発明は、より具体的には、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、次のものの使用に関する：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  以下を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列：
＊＊  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)の細胞生存特性を有するフラグメント、
又は
＊＊  Flice阻害タンパク質(FLIP)の細胞生存特性を有するフラグメント
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質
又は
−  該融合タンパク質若しくは該相同タンパク質をコードする核酸。
但し、該融合タンパク質又は該相同タンパク質はXIAPの全配列を含んでなるものではない。
【００２１】
本発明は、好ましくは、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる上記融合タンパク質の使用に関する：
−  BIR2ドメイン、
又は
−  BIR3−RINGドメイン、
又は
−  BIR3−RINGリンカードメイン。
【００２２】
本発明は、より好ましくは、細胞生存特性を有するペプチド配列が細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR1ドメインとBIR2ドメインとの間のリンカードメインを有するBIR2ドメインである上記融合タンパク質の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００２３】
これに関連して、本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が配列番号８で表されるか又は配列番号44で表される上記融合タンパク質の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００２４】
本発明は、より具体的には、配列番号24で表されるPTD−BIR2であるか又は配列番号46で表されるPTD−BIR2である上記融合タンパク質の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００２５】
本発明は、より好ましくは、細胞生存特性を有するペプチド配列が、細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR3−RINGドメイン又はBIR3−RINGリンカードメインである上記融合タンパク質の、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００２６】
これに関連して、本発明は、より具体的には、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号10で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号12で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン、
−  配列番号38で表されるBIR3−RINGリンカードメイン。
【００２７】
本発明は、より具体的には、心筋虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)。
【００２８】
本発明は、より具体的には、病理学的状態が心筋梗塞である上記の使用に関する。
【００２９】
本発明はまた、上記融合タンパク質若しくは該融合タンパク質から誘導される相同タンパク質又は該融合タンパク質若しくは該相同タンパク質をコードする核酸の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００３０】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列がHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記融合タンパク質の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００３１】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列が配列番号２で表されるHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記融合タンパク質の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００３２】
本発明は、より具体的には、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン、BIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント。
【００３３】
本発明は、より具体的には、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号４で表されるXIAP(ラット)、
−  配列番号６で表されるXIAP(ヒト)、
−  配列番号８で表されるBIR2ドメイン(ラット)、
−  配列番号44で表されるBIR2ドメイン(ヒト)、
−  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン(ラット)、
−  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン(ヒト)、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン(ラット)、
−  配列番号38で表されるBIR3ーRINGリンカードメイン(ヒト)、
−  配列番号14で表されるFLIP(FlipL)(マウス)、
−  配列番号16で表されるFLIP(FlipS)(マウス)、
−  配列番号18で表されるFLIP(Flip control)(マウス)。
【００３４】
本発明は、より具体的には、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP。
【００３５】
本発明は、より具体的には、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、次のものの使用に関する：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  以下を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列：
＊＊  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)の細胞生存特性を有するフラグメント、
又は
＊＊  Flice阻害タンパク質(FLIP)の細胞生存特性を有するフラグメント
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質
又は
−  該融合タンパク質若しくは該相同タンパク質をコードする核酸。
但し、該融合タンパク質又は該相同タンパク質はXIAPの全配列を含んでなるものではない。
【００３６】
本発明は、好ましくは、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる上記融合タンパク質の使用に関する：
−  BIR2ドメイン、
又は
−  BIR3−RINGドメイン、
又は
−  BIR3−RINGリンカードメイン。
【００３７】
本発明は、より好ましくは、細胞生存特性を有するペプチド配列が細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR1ドメインとBIR2ドメインとの間のリンカードメインを有するBIR2ドメインである上記融合タンパク質の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００３８】
これに関連して、本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が配列番号８で表されるか又は配列番号44で表される上記融合タンパク質の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００３９】
本発明は、より具体的には、配列番号24で表されるPTD−BIR2であるか又は配列番号46で表されるPTD−BIR2である上記融合タンパク質の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００４０】
本発明は、より好ましくは、細胞生存特性を有するペプチド配列が、細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR3−RINGドメイン又はBIR3−RINGリンカードメインである上記融合タンパク質の、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための使用に関する。
【００４１】
これに関連して、本発明は、より具体的には、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号10で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号12で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン、
−  配列番号38で表されるBIR3−RINGリンカードメイン。
【００４２】
本発明は、より具体的には、脳虚血に起因する病理学的状態の予防又は治療を意図する医薬の製造のための、次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質の使用に関する：
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)。
【００４３】
本発明は、より具体的には、病理学的状態が脳梗塞である上記の使用に関する。
【００４４】
本発明は、活性物質として、以下：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質
を医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで含んでなる医薬組成物に関する。
【００４５】
本発明は、より具体的には、該融合タンパク質約50mg〜約500mgの単位用量を個体に投与するに適切な上記医薬組成物に関する。
【００４６】
本発明は、より具体的には、該融合タンパク質約１mg/kg〜約10mg/kgの用量を個体に投与するに適切な上記医薬組成物に関する。
【００４７】
本発明は、より具体的には、個体に静脈内経路により投与するに適切な上記医薬組成物に関する。
【００４８】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列が、HIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記医薬組成物に関する。
【００４９】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列が、配列番号２で表されるHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記医薬組成物に関する。
【００５０】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記医薬組成物に関する：
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン、BIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント。
【００５１】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記医薬組成物に関する：
−  配列番号４で表されるXIAP(ラット)、
−  配列番号６で表されるXIAP(ヒト)、
−  配列番号８で表されるBIR2ドメイン(ラット)、
−  配列番号44で表されるBIR2ドメイン(ヒト)、
−  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン(ラット)、
−  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン(ヒト)、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン(ラット)、
−  配列番号38で表されるBIR3−RINGリンカードメイン(ヒト)、
−  配列番号14で表されるFLIP(FlipL)(マウス)、
−  配列番号16で表されるFLIP(FlipS)(マウス)、
−  配列番号18で表されるFLIP(Flip control)(マウス)。
【００５２】
本発明は、より具体的には、融合タンパク質が次を含んでなるリストから選択される上記医薬組成物に関する：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP。
【００５３】
本発明は、より具体的には、医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで、活性物質として、次のものを含んでなる医薬組成物に関する：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  以下を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列：
＊＊  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)の細胞生存特性を有するフラグメント、
又は
＊＊  Flice阻害タンパク質(FLIP)の細胞生存特性を有するフラグメント
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質。
但し、該融合タンパク質又は該相同タンパク質はXIAPの全配列を含んでなるものではない。
【００５４】
本発明はまた、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が、次を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる上記医薬組成物に関する：
−  BIR2ドメイン、
又は
−  BIR3−RINGドメイン、
又は
−  BIR3−RINGリンカードメイン。
【００５５】
本発明はまた、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR1ドメインとBIR2ドメインとの間のリンカードメインを有するBIR2ドメインである上記医薬組成物に関する。
【００５６】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が配列番号８で表されるか又は配列番号44で表される上記医薬組成物に関する。
【００５７】
本発明はまた、より具体的には、融合タンパク質が配列番号24で表されるPTD−BIR2であるか又は配列番号46で表されるPTD−BIR2である上記医薬組成物に関する。
【００５８】
本発明はまた、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が、細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR3−RINGドメイン又はBIR3−RINGリンカードメインである上記医薬組成物に関する。
【００５９】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記医薬組成物に関する：
−  配列番号10で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号12で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン、
−  配列番号38で表されるBIR3−RINGリンカードメイン。
【００６０】
本発明は、また、より具体的には、融合タンパク質が次を含んでなるリストから選択される上記医薬組成物に関する：
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)。
【００６１】
本発明はまた、活性物質として、上記融合タンパク質をコードする核酸を医薬的に許容され得るキャリアとの組合せで含んでなる医薬組成物に関する。
【００６２】
本発明はまた、次のものから構成される融合タンパク質に関する：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
及び
＊  細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列
又は
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質。
【００６３】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列が、HIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記融合タンパク質に関する。
【００６４】
本発明は、より具体的には、膜形質導入特性を有するペプチド配列が、配列番号２で表されるHIV TATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(PTD)である上記融合タンパク質に関する。
【００６５】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質に関する：
−  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント、例えばXIAPのBIR2ドメイン、BIR3-RINGドメイン若しくはBIR3-RINGリンカードメイン、
又は
−  Flice阻害タンパク質(FLIP)又は細胞生存特性を有するそのフラグメント。
【００６６】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質に関する：
−  配列番号４で表されるXIAP(ラット)、
−  配列番号６で表されるXIAP(ヒト)、
−  配列番号８で表されるBIR2ドメイン(ラット)、
−  配列番号44で表されるBIR2ドメイン(ヒト)、
−  配列番号10で表されるBIR3-RINGドメイン(ラット)、
−  配列番号12で表されるBIR3-RINGドメイン(ヒト)、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン(ラット)、
−  配列番号38で表されるBIR3−RINGリンカードメイン(ヒト)、
−  配列番号14で表されるFLIP(FlipL)(マウス)、
−  配列番号16で表されるFLIP(FlipS)(マウス)、
−  配列番号18で表されるFLIP(Flip control)(マウス)。
【００６７】
本発明は、より具体的には、次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質に関する：
−  配列番号２及び配列番号４の融合物に相当する配列番号20で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号６の融合物に相当する配列番号22で表されるPTD-XIAP、
−  配列番号２及び配列番号８の融合物に相当する配列番号24で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号44の融合物に相当する配列番号46で表されるPTD-BIR2、
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号14の融合物に相当する配列番号30で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号16の融合物に相当する配列番号32で表されるPTD-FLIP、
−  配列番号２及び配列番号18の融合物に相当する配列番号34で表されるPTD-FLIP。
【００６８】
本発明はまた、次のものから構成される融合タンパク質に関する：
−  以下を含んでなるか又は以下から構成される融合タンパク質：
＊  膜形質導入特性を有する少なくとも１つのペプチド配列、
及び
＊  以下を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのペプチド配列：
＊＊  Ｘ染色体連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)の細胞生存特性を有するフラグメント、
又は
＊＊  Flice阻害タンパク質(FLIP)の細胞生存特性を有するフラグメント
−  少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換により前記融合タンパク質から誘導され、該融合タンパク質に関して少なくとも85％、好ましくは少なくとも89％の同一性割合を示しかつ膜形質導入特性及び細胞生存特性を示す相同タンパク質。
但し、該融合タンパク質又は該相同タンパク質はXIAPの全配列を含んでなるものではない。
【００６９】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなる上記融合タンパク質に関する：
−  BIR2ドメイン、
又は
−  BIR3−RINGドメイン、
又は
−  BIR3−RINGリンカードメイン。
【００７０】
本発明はまた、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR2ドメインであるか又はBIR1ドメインとBIR2ドメインとの間のリンカーである上記融合タンパク質に関する。
【００７１】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が配列番号８で表されるドメインか又は配列番号44で表されるドメインである上記融合タンパク質に関する。
【００７２】
本発明はまた、より具体的には、配列番号24で表されるPTD−BIR2であるか又は配列番号46で表されるPTD−BIR2である上記融合タンパク質に関する。
【００７３】
本発明はまた、より好ましくは、細胞生存特性を有するペプチド配列が、細胞生存特性を有する少なくとも１つのXIAPフラグメントを含んでなり、該フラグメントがBIR3−RINGドメイン又はBIR3−RINGリンカードメインである上記融合タンパク質に関する。
【００７４】
本発明は、より具体的には、細胞生存特性を有するペプチド配列が次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質に関する：
−  配列番号10で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号12で表されるBIR3−RINGドメイン、
−  配列番号36で表されるBIR3−RINGリンカードメイン、
−  配列番号38で表されるBIR3−RINGリンカードメイン。
【００７５】
本発明は、より具体的には、次を含んでなるリストから選択される上記融合タンパク質に関する：
−  配列番号２及び配列番号10の融合物に相当する配列番号26で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号12の融合物に相当する配列番号28で表されるPTD-BIR3-RING、
−  配列番号２及び配列番号36の融合物に相当する配列番号40で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)、
−  配列番号２及び配列番号38の融合物に相当する配列番号42で表されるPTD-(BIR3-RINGリンカー)。
【００７６】
本発明はまた、上記融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【００７７】
本発明は、より具体的には、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号45、配列番号39、又は配列番号41で表される上記核酸に関する。
【００７８】
本発明はまた、より具体的には、配列番号23、配列番号29、配列番号31、配列番号33、 配列番号45、配列番号39、又は配列番号41で表される上記核酸に関する。
【００７９】
本発明はまた、上記核酸をその発現に必要な遺伝要素との組合せで含んでなる真核細胞性又は原核細胞性の発現ベクターに関する。
【００８０】
本発明は、より具体的には、上記ベクターを含んでなる真核細胞又は原核細胞に関する。
【００８１】
本発明はまた、上記融合タンパク質を製造するための方法に関し、該方法は、以下：
−  上記ベクターを含んでなる形質転換真核又は原核細胞をインビトロ培養し、
−  該形質転換細胞において産生される融合タンパク質を回収し、必要により精製する
ことを含んでなる。
【００８２】
図面の説明
図1A、図1B及び図1C
PTD−XIAPの構造、純度、完全性及び組織形質導入
図1A：PTD融合タンパク質は、内在性タンパク質と区別するためにHAタグを含み、精製に利用する6-Hisを含む。
図1B：融合タンパク質の完全性を評価するための、２μgのPTD−XIAPの電気泳動後のクーマシーブルー染色アクリルアミドゲル。融合タンパク質の完全性は、抗-HA及び抗-XIAP抗体の両方による単一バンドとして認識される。
図1C：非手術マウス(コントロール)の皮質組織中の、並びに閉塞に対して同側及び対側の皮質組織中でpMCAOの１時間後及び６時間後のPTD−XIAPのウェスタンブロット(抗-HA抗体)。各レーンは異なる動物に対応する(１群あたりｎ＝３、局所投与)。最後のレーンにおける精製タンパク質(PTD−XIAP)は比較のために示されている。α−チューブリンは内部負荷コントロールとして用いた。
【００８３】
図2A、図2B、図2C、図2D、図2E、図2F、図2G、図2H、図2J、図2K、図2L、図2M、図2N、図2O、図2P、図2Q、図2R及び図2S
20μgの局所投与６時間後の虚血脳へのPTD−XIAPの形質導入
虚血マウスの対側皮質(図2A)にも動脈領域の周辺組織(図2B)にも、梗塞領域(図2C；矢印は虚血組織と非虚血組織の境界を示す)とは対照的にHAは観察されなかった。NeuNで標識されたほとんどのニューロンは、HAで標識された(図2D)。
図2E〜2G：二重免疫蛍光が、PTD−XIAP(HA染色)とグリアGFAP(図2F〜2G)及びニューロンNeuNマーカー(図2H〜2J)との共局在を示す。これは両細胞タイプへの形質導入を示している。(図2K〜2M)XIAP抗体とHA抗体により、内在性及び外来性のXIAPの細胞内分布が明らかにされる。棒線＝図2A〜2C：150；図2D：58μm；図2E〜2G：60μm；図2H〜2J：25μm；図2K〜2M：18μm。
【００８４】
図3A、図3B及び図3C
局所投与PTD−XIAPによる虚血損傷に対する保護
図3A〜3B(左パネル)：pMCAO後24時間(図3A)及び７日(図3B)における、生理的血清浸漬ゲル(コントロール)又はPTD−GFPの適用に対する完全長タンパク質による保護。図3A〜3B(右パネル)は、７箇所の傷害脳内レベルにおける梗塞サイズを示す。PTD−XIAPによる保護は、24時間(図3A)では前頭レベルでより有意であり、７日目にはゲルより低い位置で持続している。図3C：PTDBIR2及びPTD−BIR3/RINGによる24時間後の保護(左)並びに梗塞サイズの吻−尾分布(右)。
図3D：dMCAOの30分前又は30分後及び３時間後に実施されたPTD−BIR3/RINGの単回注射の効果。データは平均 Ｔ SEM；１群あたりｎ＝５〜８。コントロールに対して、*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001 (ANOVA及びスチューデントのｔ検定)。
図3E：24時間におけるpMCAOマウスのTTC染色冠状断面の２つの代表的写真。黒点線は梗塞境界を示す。
【００８５】
図4A、図4B及び図4C
Morris水迷路における成績(１群あたりｎ＝７)
プラットホームまでの距離(図4A)及び遊泳速度(図4B)。図4A中の挿入図は８ｍ未満でプラットホームを見つけた試行回数を示す。図4C：２回の探索試行の結果。Ｔ：標的四分円；Ｏ：反対側四分円、Ｌ：左側四分円、Ｒ：右側四分円。dMCAOに対して、*p＜0.05；**p＜0.001 (二元ANOVA；PLSD Fisherの事後検定)。
【００８６】
図5A及び図5B
pMCAO(ｎ＝６〜８)の１時間後、３時間後及び６時間後に評価したカスパーゼ-３(図5A)及びカスパーゼ-９(図5B)の活性(μmol遊離AFC/h.mgタンパク質で表される)。コントロール：非手術マウス。上側パネルは、非手術(コントロール)並びに虚血PTD−GFP処置マウス及びPTD−XIAP処置マウスの左側皮質における、pMCAOのそれぞれ３時間及び６時間後の活性なカスパーゼ-９及びカスパーゼ-３のウェスタンブロット分析の例を示す。各レーンは異なる動物(１群あたりｎ＝３)に対応する。データは、コントロールの百分率で表した平均±SEMである。コントロールに対して、*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001 (一元ANOVA；Fischerの事後検定)。
【００８７】
図6A、図6B、図6C、図6D、図6E及び図6F
pMCAOの１時間後及び６時間後の非手術マウス(Non-op.)、PTD−XIAP処置マウス及びPTD−GFP処置マウスにおけるNF-κB(図6A〜6C)及びAP1(図6D〜6F)のDNA結合活性を示すEMSA。各レーンは異なる動物(１群あたりｎ＝３)に対応する。
図6B：100倍過剰の非標識NF-κBプローブ(+comp.)及び非特異的競合剤TFIID (+non comp.)を用い、pMCAOの１時間後にPTD−XIAP処置マウスにおいて実施した競合アッセイ。PTD−XIAP処置マウスから得られた虚血の対側(Contra)及びサイトゾル細胞質タンパク質画分(Cytosol)におけるDNA結合。
図6C：抗NF-κB抗体と共に(+α-NF-κB)若しくは無しで又はタンパク質を欠くインキュベーション培地中(negative)でインキュベートされたPTD−XIAP処置抽出物におけるNF-κB活性。
図6D：pMCAOの１時間後及び６時間後のAP1 DNA結合活性(PTD−XIAP処置動物 対 PTD−GFB処置動物)。
図6E：100倍過剰の非標識AP1プローブ(+comp.)又は非特異的競合剤OCT1 (+non comp.)を用い、pMCAOの６時間後にPTD−XIAP処置マウスについて対側皮質(Contra)からの核タンパク質及びサイトゾル抽出物(Cytosol)において実施した競合試験。
図6F：pMCAOの６時間後のc-Fosに対する特異的抗体(２μg又は４μg)によるAP1結合のスーパーシフト(矢頭)。(Negative)：タンパク質を含まないインキュベーション培地。
【００８８】
図7A、図7B、図7C、図7D
虚血性心臓病のマウスモデルにおけるPTD−BIR3/RINGによる保護
閉塞糸を心筋中に挿入する(冠動脈に固く巻きつける)ことによりマウスに虚血を誘発する。冠動脈閉塞(CAO)を30分間実施する。再灌流(CAR、冠動脈再灌流)の30分後又は３時間後に、マウスの頸動脈に緩衝溶液(PBS)又はPTD−BIR3/RING(0.8mg/kg)の注射をする。動物を屠殺し、各動物について梗塞領域(IA)及びリスク領域(AR)の容積を測定する。
図7A：正常マウス(白)、PTD−BIR3/RING処置された虚血マウスの再灌流30分後(細い斜線)及び３時間後(太い斜線)のリスク領域の平均容積。
図7B：正常マウス(control)、再灌流の30分後及び３時間後(CAR３時間後のPTD−BIR3/RING)にPTD−BIR3/RING処置された虚血マウスでの梗塞の平均容積。
図7C：正常マウス(PBS(60μL) CAR30分間)、再灌流の30分後(Bir-3(0.8μg/g) CAR30分間)及び３時間後(Bir-3(0.8μg/g) CAR３時間)にPTD−BIR3/RING処置された虚血後マウスにおける左心室全容積に対するIA(梗塞領域)の割合。
図7D：CAO30分間に続く再灌流の１時間、３時間及び24時間(ｎ＝４〜６)後の心筋におけるPTD−BIR3/RINGによるカスパーゼ-３、カスパーゼ-８、カスパーゼ-９の阻害。タンパク質又はそのビヒクル溶液(PBS)を再灌流の30分後に頸静脈に注射した。
【００８９】
図8A、図8B、図8C、図8D
ラットにおける２時間のMCAOの24時間後の梗塞容積及び長期機能欠損に対するPTD−BIR3/RINGの単回静脈内注射の効果
図8A：閉塞30分前のPTD−BIR3/RING(0.12mg/kg)の投与は、梗塞組織及び浮腫の容積の顕著な保護をもたらす。このことは、血液脳関門が無傷であるときに上記タンパク質の浸透が有効であることを示している。
図8B：２時間のMCAO後の再灌流と同時の上記タンパク質(0.24mg/kg)の投与は、PTD−GFPの注射に比べて傷害容積の顕著な減少(**p＜0.001)をもたらす。
図8C：梗塞サイズの減少は、１ヶ月後のアポモルフィン誘発回転試験における虚血誘発機能欠損の完全回復と相関している。24時間後及び７日後にそれぞれ23％及び32％の減少が観察された。データは非虚血動物で得られた値の％である。
図8D：運動機能の回復は、粘着剤除去試験で評価した感覚運動機能の長期持続性障害減少と関連している。左肢上の粘着剤除去の潜時は、７日目に12％、１ヶ月後に58％減少している。
【００９０】
図９
PTD−BIR3/RINGの用量と永久MCAO後の脳保護の程度との関係
動脈閉塞の30分後にマウス尾静脈に注射された0.8μg/g及び1.6μg/gのPTD−BIR3/RINGによる、マウスにおいてdMCAOにより誘発された傷害容積の保護。
【００９１】
図１０
PTD−BIR3/RINGによる、ニューロスフェア(neurosphere)由来細胞のエトポシド誘発アポトーシスからの保護
ニューロスフェアは、Reynolds and Weiss (1992)に従ってマウスE14胚から調製し、100μMのエトポシドに24時間曝す。アネキシン-Ｖ標識を用いる蛍光活性化細胞計数法による細胞計数の前に、PTD−BIR3/RINGを25ng/μLにて４時間適用する。
【００９２】
図11A及び図11B
リンパ球集団の変化(modification)の欠如
マウスにおいてdMCAOの30分後にiv投与(0.8μg/g)されたPTD−BIR3/RINGの、蛍光活性化細胞選別によるリンパ球集団に対する効果。脳損傷を減少させるに効率的な濃度で使用されたPTD−BIR3/RINGは、リンパ球集団に対する有害効果を示さない。
図11A：脾臓における細胞分析により、４つの集団(大部分は集団R1)の存在が明らかにされる。
図11B：PTD−BIR3/RINGによる動物の処置後に、脾臓中に存在する４つの細胞集団に何の相違も観察されず、またリンパ節及び胸腺において免疫蛍光法によりCD4-陽性又はCD8-陽性と同定されたリンパ球にも相違は観察されなかった。
【００９３】
図12A及び図12B
心虚血におけるPTD−BIR3/RING投与後の心筋細胞のアポトーシスの減少
図12A：マウスにおける30分間のCAO後の心筋のTUNEL標識により、アポトーシス細胞が明らかにされる(１)。PTD−BIR3/RINGによる処置は、TUNEL陽性心筋細胞の数を有意に減少させる(２)。
図12B：図12Aの１及び２の状態に対応する組織学的切片。アポトーシス細胞は茶色に見える。
【００９４】
図13
PTD−BIR3/RINGの投与は、セリン−スレオニンキナーゼAkt及びBc12ファミリーのアポトーシス促進(pro-apoptotic)メンバーであるBad (Dattaら, 2002)の非リン酸化型に対するリン酸化型の比を増加させる。
図13A：PTD−BIR3/RINGは、非リン酸化型のAktの変化を誘発しない(上パネル)が、リン酸化型を著しく増加させる(下パネル)。
図13B：アポトーシス促進性の非リン酸化型Bad及び不活性なリン酸化型Badのウェスタンブロッティング。PTD−BIR3/RINGの投与は、リン酸化型を顕著に増加させる。
【００９５】
図14
PTD−BIR3/RINGの投与は、Bax (Korsmeyerら, 2000)及び切断型Bid(Reedら, 2006)を減少させる。
図14A：CARの30分後にPTD−BIR3/RINGを投与した後のマウス心臓組織中の含量減少を示す切断型Bid(Bidt)のウェスタンブロッティング。
図14B：CARの30分後にPTD−BIR3/RINGを投与した後のマウス心臓組織中の含量減少を示すBaxのウェスタンブロッティング。
【００９６】
図15
30分間のCAOに続く再灌流の30分後にPTD−BIR3/RINGを投与した後のAkt (Songら, 2005)、リン酸化Akt(P-Akt)、切断Bid(Bidt)及びBaxの変化の定量
PTD−BIR3/RING(100μl中0.8mg/kg)又はPBS(100μl)を静脈内に投与した。
【００９７】
図16
海馬大脳スライス中の低酸素誘発ニューロン死に対するPTD−BIR3/RINGの神経保護効果の分析
図17A及び図17B：PTD−BIR3/RING無し(Ａ)又は有り(Ｂ)で、通常の条件で培養したスライスは、低酸素誘発時にPI(ヨウ化プロピジウム)標識を示さない。
図17C：24時間後、PIの強力な取り込みがコントロールのスライスで観察される。このことは、大量の細胞死を示している。
図17D：PTD−BIR3/RINGの添加はPIの取り込みを劇的に減少させる。
図17E：低酸素誘発細胞死に対するPTD−BIR3/RINGの神経保護効果の定量。***p＜0.0001。
図17F：漸増濃度のPTD−BIR3/RINGによる用量応答曲線。有意な保護(p＜0.005)は、5ng/μL又はそれより多い用量で観察される。
【００９８】
図17
PTD−BIR3/RINGの細胞内シグナリング：小胞体に関連する死経路の阻害
図18A：３及び24時間における活性型のカスパーゼ-12のMCAO誘発変化を示す代表的ウェスタンブロット。Control：正常マウス；PTD−GFP：20μgのPTD−GFPタンパク質を静脈内処置されたMCAOマウス；PTD−BIR3/RING：20μgのPTD−BIR3/RINGを静脈内処置されたMCAOマウス。
図18B及び図18C：カスパーゼ-12のウェスタンブロットの結果の定量。カスパーゼ-12プロ型のチューブリン含量(図18B)及びカスパーゼ-12活性型(図18C)に対する比。Contralat：対側皮質；Ipsi PTD−GFP：PTD−GFP処置マウスの同側皮質；Ipsi PTD−BIR3/RING：PTD−BIR3/RING処置マウスの同側皮質。
【００９９】
図18
インビトロでの細胞増殖に対するPTD−BIR3/RINGの効果の不在
PTD−BIR3/RINGの漸増用量を２日間(左)又は３日間(右)にわたって投与した後のND7細胞株の増殖の分析。
２つの細胞密度を用いた：500細胞(図19A)及び5000細胞(図19B)。PTD−BIR3/RINGは増殖曲線に何の変化も誘発しなかった。
【０１００】
図19
PTD−BIR3/RINGシグナリング経路の要約
本発明者らの結果によれば、PTD−BIR3/RINGは、アポトーシス促進経路の阻害と相関する生存経路の活性化を通じて、その抗虚血効果を発揮する。生存経路には、Akt/PKBの活性化、転写因子(NFκB及びAP1)の活性化及びBad含量の減少が含まれる。アポトーシス促進経路の阻害には、カスパーゼ阻害、Badのリン酸化及び切断型のBidの減少が含まれる。重要なことは、カスパーゼ阻害は、カスパーゼ-３及び-９に対する周知の効果に限定されず、小胞体ストレス関連機序の弱化に至るカスパーゼ-12、及びアポトーシスの「死レセプター経路」の弱化に至るカスパーゼ-８も含まれる。
【実施例】
【０１０１】
材料及び方法
PTD−XIAPの作製、産生及び精製
ラットXIAPの全リーディングフレームをコードするcDNAを、プライマー5'-GGG CTC GAG ATG ACT TTT AAC AGT TTT GAA GG-3' (センス)及び5'-GGG GAA TTC TTA AAA CAT AAA AAT TTT TTT GCT TG-3' (アンチセンス)を用いるPCRで単離した。精製したフラグメントをpPTD−HAベクターのXhoI/EcoRI部位にクローニングした。BIR2ドメインとそれに連結するBIR1へのリンカー領域(PTD−BIR2)、又はBIR3/RINGドメイン(PTD−BIR3/RING)をコードする２つの更なる構築物をクローニングした(図1A)。構築物の完全性をDNA配列決定により確証した。プラスミドは、記載(Dietzら, 2002)されたように、E.coli株BL21(DE3)pLysS (Stratagene, La Jolla, CA, USA)中で発現させた。タンパク質の産生は、500μMのイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-ガラクトシドの添加により誘発した。タンパク質を８Ｍ尿素HEPES緩衝液に抽出し、Ni-NTA superflowアガロースカラム(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。塩をSephadex G-25M (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)でのゲル濾過により除去し、タンパク質をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含む溶液に集めた。pPTD−HA−緑色蛍光タンパク質(GFP)構築物をコントロールとして用いた(SF. Dowdyのご厚意による提供；Schwarzeら, 1999)。精製タンパク質の分子量を、クーマシーブルー染色及びウェスタンブロッティングにより検証した。最終的なcDNAは、６-ヒスチジン残基タグとPTD (YGRKKRRQRRR)とヘマグルチニン(HA)タグ(YPYDVPDVA)とXIAP、BIR2又はBIR3/RINGとを含んでなるタンパク質をコードしていた(図1A)。構築物の完全性をDNA配列決定により確証した。プラスミドは、記載(Dietzら, 2002)されたように、E.coli株BL21(DE3)pLysS (Stratagene, La Jolla, CA, USA)中に発現させた。タンパク質の産生は、500μMのイソプロピル１-チオ-β-Ｄ-ガラクトシドの添加により誘発した。タンパク質を８Ｍ尿素HEPES緩衝液に抽出し、Ni-NTA superflowアガロースカラム(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。塩をSephadex G-25M (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)でのゲル濾過により除去し、タンパク質をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含む溶液に集めた。pPTD−HA−緑色蛍光タンパク質(GFP)構築物をコントロールとして用いた(SF. Dowdyによる提供；Schwarzeら, 1999)。精製タンパク質の分子量を、クーマシーブルー染色及びウェスタンブロッティングにより検証した(図1B)。
【０１０２】
ラットBIR2ドメイン(PTD−BIR2)をコードする構築物は、次のプライマー、Forward：5’-AGA AAT CAT TTT GCT CTT GAC AGG-3’、Reward：5’-C AAG CAA AAA ATT TTT ATG TTT TAA-3'を用いる完全長XIAP配列のサブクローニングにより実現された。精製フラグメントをpPTD−HAベクターのXhoI/EcoRI部位にクローニングした。ラットBIR3/RINGドメイン(PTD−BIR3/RING)をコードする構築物は、次のプライマー、Forward：5’-ATG GCA GAA TAT GAC GCA CGG-3’、Reward：5’-C AAG CAA AAA ATT TTT ATG TTT TAA-3'を用いる完全長XIAP配列のサブクローニングにより実現された。精製フラグメントをpPTD−HAベクターのXhoI/EcoRI部位にクローニングした。ヒトBIR3/RINGドメイン(hPTD−BIR3/RING)をコードする構築物は、次のプライマー、Forward：5’-ATG GCA GAT TAT GAA GCA CGG-3’、Reward：5’-C AAG CAA AAA ATT TTT ATG TCT TAA-3'を用いる完全長XIAPのサブクローニングにより実現された。精製フラグメントをpPTD−HAベクターのXhoI/EcoRI部位にクローニングした。
【０１０３】
マウスにおける永久巣状虚血(focal ischemia)
マウスを用いた総ての実験は、欧州共同体の実験動物の管理及び使用のための勧告(86/609/EEC)に従って実施した。８週齢の雄性C57B1/6マウス(20〜22ｇ、Janvier, Le Genest-St-Isle, France)を、導入時には４％ハロタンで、外科的手続きの間は70％N2O及び30％O2中の２％ハロタンで麻酔した。PMCAO(永久中大脳動脈閉塞)を、Gottiら(1990)に従い、電気凝固(Aesculap(商標) GN 60, Tuttlingen, Germany)及び再灌流を避けるためのMCAの切断により実施した。直腸温を、恒温性の毛布(Harvard Apparatus)を用いて36.7〜37.5℃の間に維持した。動脈圧及び血液ガス組成を左大腿動脈からの血液サンプリングにより監視した。動脈血サンプルをpH、動脈酸素圧及び二酸化炭素分圧について分析した(Corning, CIBA-Corning Diagnostics)。
【０１０４】
ラットにおける一過性巣状虚血
雄性成熟(220〜250ｇ)Sprague-Dawleyラットを麻酔し、内頸動脈中に単繊維ナイロン糸をMCAの分岐点まで挿入することによりtMCAO(一過性中大脳動脈閉塞)に供した。局所脳血流をレーザドップラー(Optronix)により監視した。閉塞の２時間後に糸を除去した。直腸温を、恒温性の毛布(Harvard Apparatus)を用いて26.7〜37.5℃の間に維持した。
タンパク質の投与は、動脈の電気凝固を行うために開頭した穴へ20μg/100μLのPTD−XIAP又はPTD−GFPを含むゲルフォームを0.5mm3片で適用するか、又は静脈内投与するかのいずれかで実施した。
【０１０５】
梗塞容積の測定
マウスをpMCAOの24時間後及び７日後に屠殺した。脳を８つの１mm冠状スライスに切断した(Mouse Brain Slicer Coronal matrix; Harvard Apparatus, Holliston, MA)。スライスを３％塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム(TTC)で染色し、KS400ソフトウェア(Zeiss, Oberkocken, Germany)を用いて対側皮質の同一領域から傷害皮質の健常領域を差し引くことにより、梗塞組織の容積を再構築した。
【０１０６】
ウェスタン  ブロット分析
タンパク質を、pMCAO(１群あたりｎ＝５)の１時間後及び６時間後に対側及び同側の皮質から、冷Tris緩衝液(50mM Tris pH7.4、150mM NaCl、１mM EDTA、１mM PMSF、及び５μ/mlプロテアーゼ阻害剤カクテル(P-8344, Sigma))に抽出した。タンパク質は、12〜15％SDS−ポリアクリルアミドゲル上で１レーンあたり30〜50μgのタンパク質を用いて分離した。免疫ブロットを、以前に記載(Benchouaら, 2001)されたように、マウスモノクローナル抗-HA (clone 12CA5, Roche Mol. Bioch, Indianapolis, IN, 1:500)又は抗-チューブリン(T5168, Sigma, France)抗体、及びウサギポリクローナル抗-XIAP (clone 2042, Cell Signaling Tech., Beverly, MA, 1:500)、抗-切断カスパーゼ-３ (R&D Systems, Minneapolis, MN, 1:200)、及び抗-切断カスパーゼ-９(AAP109, Stressgen Biotech., 1:200)抗体を用いて加工処理した。バンドを増強化学発光(ECL+ Detection System, Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)により可視化した。
【０１０７】
免疫組織化学的分析は、Benchouaら(2001)に従って、pMCAO(１群あたりｎ＝３)の１時間後、３時間後、６時間後及び24時間後に0.1Ｍリン酸緩衝液(PB、pH7.4)中の４％パラホルムアルデヒド(PFA)の心臓内灌流により脳を固定化した後に得られるクリオスタット切片について実施した。自由浮遊切片を４℃で一晩、マウスモノクローナル抗-HA (clone 12CA5, Roche Mol. Bioch, 1:200)、ウサギ抗-GFAP (Z0334, Dako, 1:1000)、抗-NeuN (Boehringer-Mannheim, 1/500)、又は抗-XIAP (#2042, Cell Signaling Technology, 1:200)抗体とともにインキュベートした。抗原は、蛍光体としてフルオレセイン又はシアニン-３を用いるTyramide Amplification System (NEN, Boston, MA)により顕在化させた。二重標識のために、切片をHA染色用に加工処理し、次いで酸性グリシン緩衝液(0.1Ｍ、pH3.34)中で10分間洗浄した(Nakane, 1968)。この手順は、増幅システムで得られた先の沈殿物を脱着させることなく、二重蛍光分析を可能とする。次いで、切片を、抗-GFAP抗体、抗-NeuN抗体又は抗-XIAP抗体で再度プローブする。Coolsnapデジタルカメラ(Photometrics)を装着したZeiss Axioplan II顕微鏡又はZeiss LSM共焦点顕微鏡(Zeiss)及びAxioVisionソフトウェア(Zeiss)を用いて切片を検査した。
【０１０８】
行動実験
空間学習を、Morris水迷路を用いて評価した。「初期」の訓練セッションを閉塞後の１〜２日目(D1〜D3)及びD6〜D9に実施し、続いて検索戦略を評価するための探索試行(D9)を行った。探索試行は、プールの４つの四分円(すなわち、プラットホームを含む四分円(Ｔ)並びに反対側(Ｏ)、左側(Ｌ)及び右側(Ｒ)の四分円)内で費した時間を定量する。２番目の訓練セッション(又は「後期」)は、D36〜D38及びD41〜D44に実施し、２番目の探索試行(D44)で終了する。遊泳成績は、View Point追跡システムを用いて追跡し分析した。潜時、不活動、遊泳速度及び経路長を場所訓練の間に測定した。本発明者らはまた、８ｍ未満でプラットホームに到達する成功試行数も測定した。８ｍのこの距離は、我々の実験パラダイムにおいて戦略習得を示す最大距離である。
アポモルフィン誘発回転：自発的な嗜好性の回転を手術前日に各ラットで監視する。
【０１０９】
カスパーゼ活性アッセイ
タンパク質を、pMCAO(１群あたりｎ＝５)の１時間後、３時間後、６時間後及び24時間後に対側及び同側の皮質から抽出した。組織を、25mM HEPES pH7.5、５mM MgCl2、２mM EDTA、0.1％ Triton x100、２mMジチオスレイトール(DTT)、１mM PMSF、５μl/mlプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む冷緩衝液中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃にて13000ｇで30分間遠心分離し、上清を集めた。タンパク質(50μg)をカスパーゼアッセイ緩衝液(50mM HEPES pH7.4、100mM NaCl、１mM EDTA、10mM DTT)中でインキュベートし、酵素反応を、0.2mM蛍光性基質(Ac-DEVD-AFC又はAc-LEHD-AFC、Biomol Res. Labs.)の添加により開始させた。蛍光の任意単位を、遊離AFC(A8401, Sigma)の標準曲線を用いてμモルのAFR/h.mgタンパク質に変換した。
【０１１０】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
核タンパク質を、pMCAO(１群あたりｎ＝３)の１時間後又は６時間後に屠殺した非手術、PTD−GFP処置及びPTD−XIAP処置のマウスから、NE-PER(商標)Nuclear and Cytopasmic Extraction reagents(Pierce, IL, USA)を製造者の指示に従って用いて抽出した。ゲル−シフトアッセイを、PromegaのDNA結合性タンパク質検出システム(E3050、E3300)を製造者の推奨するように用いて実施した。NF-κB (5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3')及びAP1 (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3')のコンセンサス結合性配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを、T4キナーゼ(Promega, France)により[γ-32P]デオキシATP (3000 Ci/mmol；Amersham Biosci., France)で放射性標識し、G-25スピンカラム(Amersham Pharmacia Biotech., France)により精製した。10μgの核タンパク質を、20％グリセロール、５mM MgCl2、2.5mM EDTA、2.5mM DTT、250mM NaCl、50mM Tris(pH7.5)及び0.25mg/mlポリ(dI-dC)を含む10μlの反応液中、室温(RT)にて10分間インキュベートした。結合反応は、70fmolの標識プローブを加えて開始させた。タンパク質−DNA複合体を、４℃にて45mM Trisホウ酸塩、１mM EDTAを含むランニング緩衝液(pH８)中で４％未修飾ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。ゲルを乾燥し、−80℃でBiomax MSフィルム(Kodak, NY)に曝した。放射性プローブを加える前に50〜100倍過剰の非標識競合剤を加えることにより、DNA結合の特異性を決定した。OCT-1 (5-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3')及びTFIID (5'-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3')のコンセンサス配列を、それぞれAP1アッセイ用及びNF-κBアッセイ用の非標識非特異的競合剤として用いた。サイトゾル抽出物を、細胞質タンパク質抽出物及び核タンパク質抽出物の精製の内部コントロールとして用いた。
【０１１１】
ゲルスーパーシフトアッセイのために、10μgの核抽出物を２〜４μgの抗-cFos抗体又は抗-NF-κB抗体(それぞれSC-52X及びSC-7178、Santa Cruz Biotech., CA)と共にインキュベートした後、EMSAの前に放射性標識プローブを加えた。SC-7178抗体を、NF-κBのDNA結合性ドメインに対して惹起させる。したがって、インキュベーション培地へのその添加は、NF-κBのDNA結合を損なわせる。このことは、ゲル上のプローブ/タンパク質複合体の移動度シフトよりむしろ特異バンドの減少をもたらす。
【０１１２】
統計分析
データは平均±S.E.M.である。図の凡例に示したように、一元ANOVAを使用してタンパク質濃度又はプロテアーゼ活性についての群間の差を比較し、続いて適当な事後検定を行った。差は0.05未満のｐ値について統計学的に有意であると見なした。
【０１１３】
結果
実施例１：脳虚血及び心虚血に対するXIAP融合タンパク質
XIAP融合タンパク質はインビボで脳細胞を効率的に形質導入する
構築物の完全性を、XIAP又はHAタグについてのウェスタンブロッティングによって確証した(図1B)。PTD−XIAPは、iv注射後の脳領域でも、局所投与後の処置マウスの対側でも検出されなかった(図1C)。対照的に、PTD−XIAPは、皮質上への投与の１時間後に傷害領域に存在し、閉塞後６時間で目立って増加していた(図1C)。免疫ブロットデータはHA-免疫組織化学で確証された。傷害の対側皮質(図2A)でもPTD−GFP浸漬ゲルを与えられたマウス(図示せず)でもHA-陽性細胞は検出されなかったが、PTD−XIAPは適用の１時間後に皮質細胞中に存在した(図2B)。PTD−XIAPとは対照的に、PTD−BIR2及びPTD−BIR3/RINGの両者は、iv投与後傷害領域で観察された。総てのタンパク質が、GFAP標識星状膠細胞(図2E〜2G)及びNeuN標識ニューロン(図2H〜2K)で観察された。これは定量されていないが、NeuN-陽性細胞の大部分はHAを含んでいた(図2K)。PTD−XIAP処置動物におけるHA-IRは点状であり(図2I、2M〜2O)、基部の神経突起を含むサイトゾル区域に限定されていた。抗-XIAP及び抗-HA抗体での同時標識により明らかにされたように、内在性及び外来性のXIAPが異なるサイトゾル区域に含まれていた(図2M〜2O)。BIR3/RINGでの処置は生理学的パラメータを変化させなかった(表１)。
【０１１４】
【表１】
2009510001.tif 000002
【０１１５】
XIAP融合タンパク質類はdMCAOに対して保護する。
MCA(中大脳動脈)の遠位閉塞(dMCAO)は、該動脈の皮質領域に限定された傷害を誘発する(Gueganら, 1998)。24時間での梗塞容積は、未処置動物(control、21.57±0.87mm3)又はPTD−GFP浸漬ゲル処置動物(21.49±2.71mm3)(図3A、左パネル)、及びXIAPをiv処置した動物において同等であった。対照的に、PTD−XIAP浸漬ゲルでの処置は、梗塞容積を51％減少させた(10.98±1.48mm3)。保護は、傷害のほとんど総ての吻−尾レベルに有効であり、前極(anterior pole)で最も強い効果があった(図3A、右パネル)。再灌流がなかったにもかかわらず、傷害容積の26%減少(14.95±1.48mm3 対 20.35±1.48mm3)が７日目でもまだ観察されたが、保護はゲルの下に位置するレベルに限定されていた(図3B)。図3CはTTC染色の例を示している。動脈閉塞の30分前に注射したとき、PTD−BIR2及びPTD−BIR3/RINGは、梗塞をそれぞれ29％(15.33±1.31mm3)及び45％(11.83±1.33mm3、図3C、左パネル)減少させた。最大保護は、両タンパク質について、再び、前方レベルで観察された(図3C、右パネル)。PTD−BIR3/RINGは、dMCAOの30分後(35％、14.04±1.75mm3)又は３時間後(17％、17.98±1.41mm3)に投与した場合でもまだ有効であった(図3D)。梗塞容積の測定に用いたTTC染色の例をPTD−XIAPについて図3Eに示した。
dMCAOの30分後に注射した漸増濃度のPTD−BIR3/RINGの効果の分析により、梗塞容積の保護との線形相関(ｐ＝0.013)が明らかとなった(図９)。
【０１１６】
PTD−XIAPはdMCAOにより誘発される機能欠損を減少させる
Morris水迷路試験において、初期には、PTD−XIAPによる処置の主効果も時間の主効果も検出されず、処置−時間相互作用も検出されなかった(図4A、左)。空間戦略の習得は、２つの探索試行によって示されるように、総ての群において同等であった(図4C、F(3,72)=40.61，p＜0.001)。対照的に、遊泳速度は、dMCAO動物では初期の期末で有意に増加し(図4B、p＜0.01)、PTD−XIAP処置により正常化した(F(2,144)=4.79、p＜0.01)。
後期では、経路長に対する時間(F(6,126)=5.07、p＜0.0001)及び処置(F(2,126)=5.19、p＜0.007)の主効果が認められ、経路長は該タンパク質によって正常化された(p＜0.03)。遊泳速度は、dMCAO動物において亢進状態を持続し、このパラメータに対する処置の効果は漸次喪失した(図4B)。PTD−XIAPによる処置はまた、８ｍ未満でプラットホームを見つけた成功試行の数も正常化した(図4A、挿入図、p＜0.01)。
【０１１７】
PTD−XIAPの効果はカスパーゼ阻害及び転写因子の活性化を含む
遠位MCAOは、カスパーゼ-３の二相性(１時間及び６時間でピークを有する)の活性化(図5A)を誘発し、最初の３時間の間にはカスパーゼ-９の進行性の活性化(図5B)を誘発する。総てのタンパク質は、両カスパーゼの活性化を有意に減少させた(図5A〜5B)。脳構造におけるPTD−XIAPの低レベルに一致して、カスパーゼ-３の活性は１時間で有意に減少しなかった。活性アッセイの結果は、カスパーゼ活性型に対する免疫ブロッティングによって確証した(図5A〜5B)。
【０１１８】
次に、本発明者らは、NF-κB及びAP1のDNA結合活性をEMSA(図６)により調べた。NF-κB DNA結合は、dMCAOの後で一過性に増加し(図6A〜6C)、PTD−XIAP処置により更に増加した。増加したNF-κB DNA結合はまた、PTD−XIAP処置マウスの対側皮質においても観察された。サイトゾル抽出物では結合活性は観察されなかった。100倍過剰の非標識NF-κB結合性オリゴヌクレオチドの添加により、DNA−タンパク質複合体がなくなり、無関係のオリゴヌクレオチド(TFIID)とのインキュベーション後には何の変化も観察されなかった。タンパク質の不在下では結合は観察されなかった。これは本発明者らの実験条件における結合の特異性を確証している。PTD−XIAP処置マウスからの核抽出物の抗NF-κB抗体とのプレインキュベーションは、NF-κB DNA結合を強く減少させた。
【０１１９】
コントロールマウスでもdMCAOの１時間後にPTD−XIAP処置したマウスでも、更にはPTD−GFP処置マウス及びPTD−XIAP処置マウスの対側でもサイトゾル画分でも、AP1 DNA結合活性は全く検出されなかったか又は低レベルで検出された(図6D−6E)。PTD−XIAP処置マウスにおいてpMCAOの６時間後に顕著なシフトを観察した(図6D)。競合実験において、非標識AP1結合性コンセンサス配列のみがAP1結合活性を減少させる一方、無関係のOCT-1結合性オリゴヌクレオチドは減少させなかった(図6E)。用量依存性の「スーパーシフト」バンドが、核抽出物へのc-Fos抗体(２又は４μg)の添加により観察された(図6F)。このことは、本アッセイの特異性を確証している。
【０１２０】
実施例２：一過性脳虚血に対するPTD−BIR3/RING融合タンパク質
再灌流を伴う脳虚血におけるPTD−BIR3/RINGの神経保護効果
PTD−BIR3/RING融合タンパク質の神経保護活性は、ラットにおける再灌流を伴うシルビウス梗塞モデルにて構造的方法及び機能的方法で評価した。MCAの閉塞は、内頸動脈中にMCA分岐点までナイロン単繊維を管腔内挿入することにより実行する(Hataら, 1998)。閉塞の２時間後に繊維を引き抜き、虚血領域において血流を再循環させる。閉塞はレーザドップラー流量測定により監視する。この技法は、マウスで用いた電気凝固による閉塞技法とは異なる。なぜなら、前記技法は、皮質傷害に加え、運動性を指令する線条体構造まで広がる傷害をもたらすからである。二形態の処置を分析した：閉塞前(予防的条件下及び血液脳関門(BBB)の破裂なしを意味する)の投与、及びヒトにおいて血栓溶解剤と組み合せて投与する状態を模倣するための、再灌流中の投与。両者の場合とも、該タンパク質は静脈内送達により注射した。運動能力は、アポモルフィン誘発回転試験(0.5mg/kgのアポモルフィン注射後の回転行動)により分析した。感覚運動能力は、粘着剤除去試験(ART)により評価した。動脈閉塞前に処置した動物は、閉塞の２時間後に誘発された傷害容積の有意な減少を示し、また浮腫からの保護も示した(図8A)。再灌流中に処置した動物は、虚血により誘発された行動欠損の有意な回復と関連する梗塞容積の同様な減少を示した(図8B〜8D)。
【０１２１】
ａ)動脈閉塞の30分前の投与
PTD−BIR3/RINGタンパク質の注射は、24時間後に分析した皮質傷害の容積を20％減少させ、線条体傷害の容積を18％減少させる。該タンパク質は、長期にリスクを抱える組織の容積を反映する全浮腫の24％を減少させる。このことは、MCA永久閉塞前のPTD−BIR3/RING注射によりマウスで得られた結果を確証し、また全身的方法で注射されたときに、該融合タンパク質がBBB及び細胞膜を効果的に横切ることができるという事実を確証している。
【０１２２】
ｂ)再灌流中の投与
再灌流中の内頸動脈への40(160)μgのPTD−BIR3/RINGの単回注射による保護は、25(31％)％である。後者は、0.5mg/kgのアポモルフィン注射により誘発される回転行動の100％に近い修正に相関する(図8C)。感覚運動機能の混乱も、また、PTD−BIR3/RINGにより保護される(図8D)。梗塞容積の減少は、皮質領域で大きく(72％)、線条体組織に対する効力はより小さい(28％)。機能欠損の減少は１ヶ月後に劇的であり、これはPTD−BIR3/RINGの長期持続性(おそらく永久)の効力を示している。
【０１２３】
海馬脳スライスにおける低酸素誘発ニューロン死に対するPTD−BIR3/RINGの神経保護効果の分析
低酸素誘発ニューロン死を制限するPTD−BIR3/RINGの可能性を分析するためにインビトロスライスモデルを用いた。器官型スライス培養物を、Norabergら(Norabergら, 2005)に従ってラットから製造した。３時間の低酸素に曝すことにより、24時間以内にCA1海馬領域の完全な変性が生じた。死亡細胞は、ヨウ化プロピジウム(PI)蛍光とのスライスのインキュベーションにより可視化した。生存細胞は、膜完全性に障害が起きた死亡細胞には浸透できるPIに対して透過性ではない。蛍光は、「Image 1.55」分析ソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて定量化した。コントロール切片においてもPTD−BIR3/RING処置切片(図16B)においても、低酸素誘発前にはPIの取り込みは観察されない(図16A)。劇的な細胞死は、低酸素後24時間で海馬切片で観察された(図16C)。PTD−BIR3/RINGでの処置により、PI標識細胞の有意な減少が生じた(図16D)。PTD−BIR3/RINGの保護効果の定量(図16E)及び用量−応答曲線(図16F)は、最大保護が５ng/μLの用量について観察されることを示している。
【０１２４】
PTD−BIR3/RINGの細胞内シグナリング：小胞体関連死経路の阻害
TNFRファミリーの死レセプターにリンクする死経路及びミトコンドリア経路に加え、小胞体(ER)ストレス経路が、虚血性細胞死に大きな役割を演じている(Qiら, 2004)。ERはカルシウムの重要な貯蔵部位である。虚血は細胞内カルシウムの大規模な増加を誘発し、幾つかのERストレス関連機序の活性化(これには、カスパーゼ-１２及びフォールディングされていないタンパク質の応答(UPR)の活性化が含まれる)に至る。UPRには、活性化転写因子(ATF)-６を含む多数のERストレスセンサーが含まれる。ATF-6は、グルコース調節タンパク質GRP78及びGRP94遺伝子の転写をアップレギュレートする(Yuら, 1999；De Graciaら, 2002)。
【０１２５】
MCAOの１時間後及び３時間後では、プロカスパーゼ-１２、GRP78及びGRP94のレベルに何の変化も観察されなかった。MCA閉塞の６時間後に、非手術マウスに比べてMCAOマウスにおいてプロカスパーゼ-１２のレベルが減少し、活性カスパーゼ-１２が検出された(図17A、17B及び17C)。24時間でもまだ高レベルが観察された。PTD−BIR3/RINGの投与は、虚血により誘発されるカスパーゼ-１２の活性型へのプロセシングを阻害した。活性GRP94タンパク質(80kDaフラグメント)は、PTD−GFP処置マウスで検知され、PTD−BIR3/RING処置マウスには存在しなかった。
【０１２６】
インビトロでの細胞増殖に対するPTD−BIR3/RINGの効果の欠如
アポトーシス阻害の有害効果には、腫瘍細胞の制御されない増殖が含まれる。望ましくない増殖を誘導する可能性を、高度に増殖性のND7細胞株で分析した。PTD−BIR3/RINGを、0.5×103細胞及び５×103細胞に24時間(0.5×103)及び36時間(５×103)適用した。図19A及び19Bは、PTD−BIR3/RINGでの処置が、低密度培養物又は高密度培養物に関してそれぞれ１日後及び２日後(図18A)又は１日後及び３日後(図18B)に増殖パターンに対して影響を有しなかったことを示す。
【０１２７】
ニューロスフェアに対するインビトロでのPTD−BIR3/RINGの保護効果
PTD−BIR3/RINGの神経保護効果を、エトポシド誘発細胞死に供したニューロスフェアに対してインビトロで評価した(図10)。アネキシンＶ (Annexin V-FITC kit, Beckman Coulter)標識による蛍光活性化細胞選別(FACS)で同定されたアポトーシス細胞に対して、明らかな神経保護効果が観察され、ヨウ化プロピジウムの取り込みがないことにより膜の破壊がないことも示される。
【０１２８】
リンパ球に対する有害効果の欠如
インビボでのPTD−BIR3/RING(0.8μg/gの単回注射)による処置の有害影響の発生を、dMCAOに供したマウスにおいて分析した。リンパ球の集団を、脾臓、胸腺及びリンパ節においてFACSにより分析した。細胞分布及びリンパ球成熟の変化は観察されなかった(図11)。動物死亡率の増加も処置群において観察されなかった。
【０１２９】
実施例３：PTD−BIR3/RINGの心保護効果
PTD−BIR3/RINGタンパク質を心筋梗塞マウスモデルで試験し、目覚ましい結果が得られた。PTD−BIR3/RINGは、このモデルで今まで記載されていない最大保護より高い保護能力を示す。これはプレコンディショニング(preconditioning)によって得られる。心虚血を、マウスで30分間の動脈閉塞により実施し、続いて24〜72時間の再灌流を行う。融合タンパク質を再灌流の30分後又は３時間後に静脈内投与した。
【０１３０】
PTD−BIR3/RINGタンパク質を次の条件で試験した：
−実験モデル
虚血は、麻酔下で、８週齢のC57BI/6雄性マウス(25〜30ｇ)において閉塞糸を心筋に挿入する(冠動脈に固く巻きつける)ことにより誘発した(CAO：冠動脈閉塞)。閉塞は、糸を30分間締め付けることにより誘発した。糸を緩めることにより心筋への再灌流が可能になる。エバンスブルーの心臓内灌流により３つの領域が現れる：血流が正常に循環している領域を示す青色領域(健全組織)、組織は未だ生存可能であるが低酸素症を被っているピンク色領域(リスク領域、AR)、及び組織が死んでいる白色領域(梗塞領域、IA)。リスク領域は、左心室の総容積に対する百分率(IA%LV)として定量化する。変性組織の容積は、リスク領域に対する百分率(AI%AR)として測定する。
【０１３１】
−処置
再灌流の30分後又は３時間後、マウスの頸動脈にPBS又はPTD−BIR3/RING(0.8mg/kg)の単回注射をする。動物を屠殺し、各動物についてIAとARを測定する。
【０１３２】
−結果
図7A：リスク領域の平均容積は３つの実験群で同じである；白：正常マウス；細い斜線：虚血後30分でPTD−BIR3/RING処置したマウス；太い斜線：虚血後３時間にPTD−BIR3/RING処置したマウス。
図7B：再灌流の開始３分後のPTD−BIR3/RING処置は、リスク領域の容積に比べて梗塞組織の容積を有意に減少させる(26mm3対43mm3)。該タンパク質を再灌流の３時間後に投与したときにもなお有力な保護が観察される。
図7C：PTD−BIR3/RINGでの処置は、比IA/左心室容積を有意に減少させる。
図7D：PTD−BIR3/RINGの投与は、虚血により誘発されるカスパーゼ-３、-８及び-９の活性化を阻害する。カスパーゼ-９は、XIAPのBIR3ドメインの公知の標的である。PTD−BIR3/RING投与後のカスパーゼ-９の阻害(図16)は、予測された知見であった。カスパーゼ-９活性の阻害は、該タンパク質が心組織への侵入後に生物学的活性を維持していることを示している。
【０１３３】
カスパーゼ-３の阻害は、XIAP分子のBIR2ドメインの役割であるが、過剰量のBIR3がインビトロでカスパーゼ-３の存在下でインキュベートされる場合に報告されていた。本発明者らは、PTD−BIR3/RINGで処置した虚血脳組織においてもカスパーゼ-３の阻害を観察した。PTD−BIR3/RINGによるカスパーゼ-３の阻害(図16)は重要な知見である。なぜなら、カスパーゼ-３は、アポトーシスプロセスにおける主要な執行体のカスパーゼであり、虚血性細胞死において鍵となる役割を演じているからである。
【０１３４】
カスパーゼ-８は、腫瘍壊死因子レセプター-１(TNF-R1)のファミリーに属する、いわゆる「死レセプター」により活性化される。TNF-R1の活性化はプロカスパーゼ-８の活性化を誘発する。活性カスパーゼ-８は、カスパーゼ-３、核PARP-1及び-2並びにBidを含む多数の標的を有する。XIAP又はそのいずれかのドメインによるカスパーゼ-８の阻害は新しい知見である(図16)。これは、PTD−BIR3/RINGがカスパーゼに対する幅広い作用を有し、外因性(死レセプター媒介)経路及び内因性(ミトコンドリア)経路の両方に干渉できることを示している。
【０１３５】
心虚血におけるPTD−BIR3/RING投与後の心筋細胞におけるアポトーシスの減少
マウスの冠動脈の30分間の閉塞後のTUNEL標識により、アポトーシス細胞が明らかになる(図12A及び12B、条件１)。アポトーシス細胞は褐色に見える。PTD−BIR3/RINGでの処置は、TUNEL陽性心筋細胞の数を顕著に減少させる(図12A及び12B、条件２)。
【０１３６】
PTD−BIR3/RINGの投与は、セリン−スレオニンキナーゼAkt及びアポトーシス促進性Badのリン酸化型 対 非リン酸化型の比を増加させる
PI3-キナーゼ活性化タンパク質キナーゼであるAkt/PKBは、細胞生存の主要なメディエータである。リン酸化Aktは、多数の標的のリン酸化による細胞保護において主要な役割を演じる。Aktはまた、例えばForkhead因子及びp53ファミリーの活性に対して影響することにより、アポトーシス性刺激に対する転写応答に影響する。加えて、Akt/PKBの代謝効果とその生存の制御との間の新規な関連付けが最近になされた(Songら, 2005)。
【０１３７】
リン酸化Akt標的には、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進メンバーであるBadがある。Badは、非リン酸化型で細胞質において不活性に保たれている。アポトーシスの間、Badはリン酸化されてアポトーシス性のミトコンドリア経路の活性化に参加する。活性(非リン酸化)Badは、抗アポトーシスBcl-2ファミリーメンバー(例えばBcl-XL)に結合してこれを阻害し、これにより他の２つのアポトーシス促進メンバーであるBakとBaxの凝集を許容することによって、アポトーシスを誘発する。これは、チトクロームＣの放出、カスパーゼの活性化、及びアポトーシスを誘発する。生存キナーゼによる内在性Badのリン酸化は、ミトコンドリアがアポトーシス刺激に応答してチトクロームＣを放出する閾値を上昇させるために必要である。このようにして、Badリン酸化は、生存シグナリングのセンサーとして役立ち、アポトーシスを受けるために細胞が曝されなければならないアポトーシス入力のレベルを決定する。
【０１３８】
Aktリン酸化の状態を心虚血の間に分析した(図13A、15)。30分間のCAOに続く再灌流の30分後のPTD−BIR3/RINGの投与は、リン酸化型のAktを顕著に増加させた。この増加はリン酸化型のBadの顕著な増加と相関している(図13B)。
【０１３９】
PTD−BIR3/RINGの投与はBax及び切断型のBidのを減少させる
BidとBaxはBcl2ファミリーのアポトーシス促進メンバーである。Bidは、カスパーゼ-８によるタンパク質分解性切断のために標的される。得られる切断型(又はBidt)は高度に活性であり、Baxのミトコンドリア外膜への転位に関与する。このことにより、孔形成及びチトクロームＣのようなアポトーシスアクチベータの漏れが導かれる(Korsmeyerら, 2000)。細胞質中のBidt及びBaxの濃度の減少は、ミトコンドリア経路の調節を通じたPTD−BIR3/RINGの保護効果を示している。図14A及び14Bは、CARの30分後にPTD−BIR3/RINGを投与した後での虚血心筋中のBidt及びBaxの減少を示しており、これはミトコンドリアのアポトーシス経路の阻害を示している。
【０１４０】
30分間のCAO後のAkt、リン酸化Akt(P-Akt)、切断型Bid(Bidt)及びBaxの変化の定量
PTD−BIR3/RING(100μl中0.8mg/kg)又はPBS(100μl)を再灌流の30分後に静脈内投与した。ウェスタンブロットデータの定量により、PTD−BIR3/RING処置心筋におけるBidt及びBaxの含量の減少並びにリン酸化Aktの増加が確証される。
Akt及びBadのリン酸化並びにカスパーゼ-８/Bid/Baxシグナリング経路に対するXIAPの効果は、本研究において初めて特定された。
【０１４１】
これらの実験は、PTD−BIR3/RINGタンパク質の細胞保護能力を確証する。細胞保護能力は心筋細胞及びニューロン細胞に対して顕著である。これらの結果は、本発明による融合タンパク質の、動脈閉塞後又は心不全後の心虚血の治療のための使用及び脳組織及び心臓組織の変性傷害全般に対する使用を確証している。命にかかわる重篤な有害効果はこれまで見つかっていない。
【０１４２】
本発明者らの結果によると、PTD−BIR3/RINGは、アポトーシス促進経路の阻害と相関する生存経路の活性化を通じて抗虚血効果を発揮する。生存経路には、Akt/PKBの活性化、転写因子(NFκB及びAP1)の活性化及びBad含量の減少が含まれる。アポトーシス促進経路の阻害には、カスパーゼ阻害、Badのリン酸化及びBidの切断型の減少が含まれる。重要なことに、カスパーゼ阻害はカスパーゼ-３及び-９に対する周知の効果に限定されず、小胞体ストレス関連機序の弱化に至るカスパーゼ-１２の阻害も含み、アポトーシスの「死レセプター経路」の弱化に至るカスパーゼ-８の阻害も含む。
【０１４３】
結論
本発明者らの結果は、PTD融合タンパク質戦略の可能性を確証している。傷害部位に濃縮されたPTD−XIAPは、１週間まで下の皮質領域を保護し、静脈内注射したより短い構築物は脳変性を有意に保護した。このことは、この戦略が再灌流のないときでさえも有効であることを示している。
２つの研究(Listonら, 2001；Wangら, 2004)で報告されている内在性XIAPの核への局在は、本研究では観察されず、内在性XIAPは核のまわりに蓄積していた。
【０１４４】
このモデルにおける閉塞は、MCAの皮質分岐に対して遠位で行われる。この手順は、線条体構造を傷つけず(spare)、個々の運動欠損又は感覚運動欠損を誘発しない(Iadecolaら, 1997)。「永久MCAO」と呼ばれるモデルには、一般に、皮質MCA分岐及び線条体MCA分岐の両方で血流阻止(明白な運動欠損に至る)を伴うより近位の閉塞が含まれることに言及しておかなければならない。本発明者らのモデルでは、２つの探索試行は、dMCAO動物が正確な空間学習をすることを確証することによって以前の知見と相関している。しかしながら、虚血動物の長期追跡調査(follow-up)によると、２つの試験パラメータの首尾一貫した変化が明らかになった：遊泳速度の増加及びプラットホームまでの経路長を８メートルの閾値を下回るまで減少させることができないこと。正確な空間戦略との組合せでの標的までの距離の増加は、注意欠陥に帰結させ得る正確性の欠如を明らかにした。このモデルにおける傷害位置によれば、注意欠陥はヒトの側頭頭頂領域の欠損と関連付けられる(Chambersら, 2004)。PTD−XIAPでの処置は、このスコアを顕著に改善し、プラットホームまでの距離を顕著に減少させる。このことは、dMCAOにより誘発された機能欠損の回復を示している。
【０１４５】
本モデルにおけるNF-κBの活性化は一過性である(このことが細胞生存を促進するための前提条件である)。長期持続性である場合、NF-κB活性は細胞死に関連付けられている(Clemens, 2000)。XIAPはNF-κB遺伝子標的に列する(Stehlikら, 1998；Zouら, 2004)ので、その活性化は、外来性PTD−XIAPの神経保護効力に加えて、内在性XIAPの産生増加をもたらす。
【０１４６】
本発明者らは、XIAPの投与が、神経保護に関連してインビボでAP1の活性化を誘発することを示している。AP1活性は、JNKによるc-Junトランス活性化ドメインのリン酸化により刺激され(Yangら, 1997)、JNKはXIAPにより選択的に活性化される(Sannaら, 1998)。虚血に関連して、XIAPは、JNK活性化を通じて、AP1 DNA結合の増加及び神経保護特性を有する遺伝子(これには、後期エフェクター遺伝子、例えば神経成長因子(Gueganら, 1998)、脳由来神経栄養因子(Dechant and Neumann, 2002)又は塩基性線維芽細胞成長因子(Lindvallら, 1992)がある)の転写を招き得る。
【０１４７】
PTD−XIAP融合タンパク質で得られた結果は、相乗的神経保護経路に作用する分子を用いるタンパク質療法が、複雑な病因を有する脳傷害(例えば、卒中)を制限することにおける単一モードのアプローチ(monomodal approach)に対する有望な代替手段であることを確証している。
【０１４８】
【表２−１】
2009510001.tif 000003
【表２−２】
2009510001.tif 000004
【表２−３】
2009510001.tif 000005
【表２−４】
2009510001.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】PTD−XIAPの構造、純度、完全性及び組織形質導入を示す。
【図２】20μgの局所投与６時間後の虚血脳へのPTD−XIAPの形質導入を示す。
【図３】局所投与PTD−XIAPによる虚血損傷に対する保護を示す。
【図４】Morris水迷路における成績を示す。
【図５】pMCAOの１時間後、３時間後及び６時間後に評価したカスパーゼ-３)及びカスパーゼ-９の活性を示す。
【図６】pMCAOの１時間後及び６時間後の非手術マウス、PTD−XIAP処置マウス及びPTD−GFP処置マウスにおけるNF-κB(図6A〜6C)及びAP1(図6D〜6F)のDNA結合活性を示すEMSAを示す。
【図７−１】虚血性心臓病のマウスモデルにおけるPTD−BIR3/RINGによる保護を示す。
【図７−２】虚血性心臓病のマウスモデルにおけるPTD−BIR3/RINGによる保護を示す。
【図８−１】ラットにおける２時間のMCAOの24時間後の梗塞容積及び長期機能欠損に対するPTD−BIR3/RINGの単回静脈内注射の効果を示す。
【図８−２】ラットにおける２時間のMCAOの24時間後の梗塞容積及び長期機能欠損に対するPTD−BIR3/RINGの単回静脈内注射の効果を示す。
【図９】PTD−BIR3/RINGの用量と永久MCAO後の脳保護の程度との関係を示す。
【図１０】PTD−BIR3/RINGによる、ニューロスフェア由来細胞のエトポシド誘発アポトーシスからの保護を示す。
【図１１】リンパ球集団の変化の欠如を示す。
【図１２】心虚血におけるPTD−BIR3/RING投与後の心筋細胞のアポトーシスの減少を示す。
【図１３】PTD−BIR3/RINGの投与は、セリン−スレオニンキナーゼAkt及びBc12ファミリーのアポトーシス促進メンバーであるBadの非リン酸化型に対するリン酸化型の比を増加させることを示す。
【図１４】PTD−BIR3/RINGの投与は、Bax及び切断型Bidを減少させることを示す。
【図１５】30分間のCAOに続く再灌流の30分後にPTD−BIR3/RINGを投与した後のAkt、リン酸化Akt(P-Akt)、切断Bid(Bidt)及びBaxの変化の定量を示す。
【図１６】海馬大脳スライス中の低酸素誘発ニューロン死に対するPTD−BIR3/RINGの神経保護効果の分析を示す。
【図１７】PTD−BIR3/RINGの細胞内シグナリング：小胞体に関連する死経路の阻害を示す。
【図１８】インビトロでの細胞増殖に対するPTD−BIR3/RINGの効果の不在を示す  PTD−BIR3/RINGの漸増用量を２日間(左)又は３日間(右)にわたって投与した後のND7細胞株の増殖の分析。  ２つの細胞密度を用いた：500細胞(図19A)及び5000細胞(図19B)。PTD−BIR3/RINGは増殖曲線に何の変化も誘発しなかった。
【図１９】PTD−BIR3/RINGシグナリング経路のまとめを示す。
【図２０】PTD−BIR3/RINGシグナリング経路のまとめを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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