(57)【要約】  本発明は、広くは、改変された分泌特性を有する変異宿主菌株を利用することによって、シグナルペプチドを必要とせずに、原核生物から抗体または抗原結合性抗体断片の分泌させるための組成物および方法に係る。具体的には、本発明は、シグナルペプチドを必要とすることなく、細菌から抗体または抗原結合性抗体断片を分泌させるための宿主細胞および方法を提供し、前記方法によって得られた抗体配列の多様なライブラリを提供する。さらに、本発明は、多様なライブラリを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む抗体産生法：
（ａ）ｐｒｌ変異、および、該抗体の重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子と、該抗体の軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子とを含む少なくとも１つの発現ベクターを含む原核生物宿主細胞を、該抗体の重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該抗体の軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させる条件であって、それらのポリヌクレオチドの少なくとも１つがシグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードする条件下で培養する工程；
（ｂ）重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを、細胞膜を通して分泌させる工程；および
（ｃ）重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドから抗体を形成する工程。
【請求項２】
抗体が、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変ヒト抗体、およびエピトープ集中型抗体（ｅｐｉｔｏｐｅ−ｆｏｃｕｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、複数の異なったベクターに存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが両方とも同一のベクター上に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを欠く重鎖ポリペプチドをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを欠く軽鎖ポリペプチドをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを欠く重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞がグラム陰性細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
グラム陰性細菌が大腸菌である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
大腸菌細胞が、Ｓｅｃ経路に変異遺伝子を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
変異遺伝子がＳｅｃＹ遺伝子の変異体を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、実質的に野生型の機能を有するタンパク質をコードするＳｅｃＹ遺伝子、および実質的に野生型の機能を欠くタンパク質をコードするＳｅｃＹ遺伝子を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、ベクター上に担持された変異型ＳｅｃＹ遺伝子を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む抗体産生法：
（ａ）ｐｒｌ変異、および該抗体をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター
を含む原核生物宿主細胞を、該抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させる条件であって、ポリヌクレオチドがシグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードする条件下で培養する工程；および
（ｂ）該抗体を、細胞膜を通して分泌させる工程。
【請求項１５】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
大腸菌細胞がＳｅｃ経路に変異遺伝子を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
変異遺伝子がベクター上に担持される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
抗体が、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｄＡＢ、ＶＨＨ、ラクダ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む融合抗体産生法：
（ａ）ｐｒｌ変異と、該融合抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、少なくとも１個の発現ベクターとを含む原核生物宿主細胞を、発現ベクターが、融合抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させる条件であって、該ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、シグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードする条件下で培養する工程；（ｂ）ポリペプチドを、細胞膜を通して輸送する工程；および
（ｃ）融合抗体を形成することにより、前記融合抗体が抗原を結合させることができる工程。
【請求項２０】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
大腸菌細胞がＳｅｃ経路に変異遺伝子を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
融合抗体が、バクテリオファージの表面上に融合タンパク質として提示される、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程を含む、発現ライブラリを作製する方法：
（ａ）ｐｒｌ変異と、複数の発現ベクターの少なくとも１つとを含む複数の原核生物宿主細胞であって、各発現ベクターが複数の抗体の１つをコードする複数のポリヌクレオチドの１つをコードする宿主細胞を、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを複数の宿主細胞中で複数の発現ベクターから抗体をコードする複数のポリヌクレオチドを発現させる条件であって、各宿主細胞中で前記ポリヌクレオチドの１つ以上が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードする条件下で培養する工程；
（ｂ）複数の宿主細胞の中で細胞膜を通して複数のポリペプチドを輸送する工程；および（ｃ）少なくとも１つが抗原に結合することができる複数の抗体を形成する工程。
【請求項２４】
前記宿主細胞の少なくとも１つが大腸菌細胞である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、複数のエピトープ集中型ヒト抗体をコードする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを欠くすべての重鎖ポリペプチドまたはすべての軽鎖のポリペプチドをコードする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程を含む、多量体タンパク質を産生させる方法：
（ａ）ｐｒｌ変異と、多量体タンパク質の一員である複数のポリペプチドをコードする複
数のポリヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの発現ベクターとを含む原核生物宿主細胞を、それら複数のポリペプチドを発現させる条件であって、複数のポリヌクレオチドの少なくとも１つが、シグナルペプチドを欠く前記多量体タンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする条件下で培養する工程；
（ｂ）細胞膜を通して複数のポリペプチドを輸送する工程；および
（ｃ）多量体タンパク質を集合させる工程。
【請求項２８】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
以下の工程を含む抗体産生法：
（ａ）ｐｒｌ変異と、該抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの発現ベクターとを含む原核生物宿主細胞を、該抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養する工程；
（ｂ）シグナルに依存しないで、細胞膜を通して複数のポリペプチドを輸送する工程；および
（ｃ）抗原を結合させることができる抗体を形成する工程。
【請求項３０】
以下の工程を含む、発現ライブラリを作製する方法：
（ａ）ｐｒｌ変異と、複数の発現ベクターの少なくとも１つとを含む複数の原核生物宿主細胞であって、各発現ベクターが、複数の抗体の１つをコードする複数のポリヌクレオチドの１つをコードする宿主細胞を、複数の宿主細胞中で複数の発現ベクターから、抗体をコードする複数のポリヌクレオチドを発現させる条件であって、各宿主細胞中の前記ポリヌクレオチドの１つ以上が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードする条件下で培養する工程；
（ｂ）複数の宿主細胞においてシグナル配列に依存しないで、細胞膜を通して複数のポリペプチドを輸送する工程；および
（ｃ）複数の抗体の少なくとも１つが抗原を結合
させることができる複数の抗体を形成する工程。
【請求項３１】
発現ライブラリが、マウス、ラット、ヒツジ、またはウサギの発現ライブラリである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ｐｒｌ変異、および請求項３０によって作製された発現ライブラリの一員を含む原核生物宿主細胞。
【請求項３３】
複数の抗体をコードする複数のポリヌクレオチドを含む発現ライブラリであって、複数のポリヌクレオチドの１つ以上が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードし、かつ、ポリペプチドが分泌される発現ライブラリ。
【請求項３４】
細胞膜を通して少なくとも１つのポリペプチドを分泌するｐｒｌ変異を含むグラム陰性細菌原核生物宿主細胞であって、（複数の）ポリペプチドが、抗原を結合させることができる抗体を形成する宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が、実質的に野生型の機能を有するタンパク質をコードするｐｒｌ遺伝子を含み、かつ、実質的に野生型の機能を欠くタンパク質をコードする前記ｐｒｌ遺伝子を含む、請求項３４記載の宿主細胞。
【請求項３６】
宿主細胞が、ベクターに担持された変異型ｐｒｌ遺伝子を含む、請求項３４記載の宿主細胞。
【請求項３７】
以下の工程を含む、抗体の作製法：
（ａ）抗体または抗体の融合体を、ｐｒｌ変異を含む原核生物宿主細胞において、抗体または抗体の融合体をコードする少なくとも１つの発現ベクターから発現させる工程；
（ｂ）抗体または抗体の融合体を形成する工程；および
（ｃ）抗体または抗体の融合体を作製する宿主細胞を同定する工程。
【請求項３８】
抗体または抗体の融合体を単離する工程をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
原核生物宿主細胞の中で、抗体の重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、および抗体の軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の転写および翻訳を可能にする発現ベクターであって、これらのポリヌクレオチドの一方が、シグナルペプチドを欠く抗体ポリペプチドをコードし、他方のポリヌクレオチドが、シグナルペプチドを有する抗体ポリペプチドをコードする発現ベクター。
【請求項４０】
宿主細胞がｐｒｌ変異を含む、請求項３９記載の発現ベクター。
【請求項４１】
ポリヌクレオチドが、シグナル配列を欠く重鎖ポリヌクレオチドをコードする、請求項４０記載の発現ベクター。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドが、シグナル配列を欠く軽鎖ポリヌクレオチドをコードする、請求項４０記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への交互参照
本出願は、２００５年７月２２日付で出願された、「シグナルペプチドを用いない、細菌からの抗体分泌（ＳＥＣＲＥＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＷＩＴＨＯＵＴ  ＳＩＧＮＡＬ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＦＲＯＭ  ＢＡＣＴＥＲＩＡ）」という名称の米国特許仮出願第６０／７０１，９０２号からの米国特許法第１１９条による優先権の利益を主張するものであり、その開示内容は、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的には、シグナルペプチドを必要とせずに、原核生物から抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドを分泌させる方法に係る。具体的には、本発明は、シグナルペプチドを必要とすることなく、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドを細菌から分泌させるための宿主細胞および方法を提供し、このような方法によって得られた抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドの多様なライブラリを提供する。本発明は、また、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチド、および、本発明の方法によって作製されたそれらのライブラリを提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
腸内細菌などのグラム陰性細菌のペリプラズムまたは外膜に向かう大部分のタンパク質は、通常の分泌経路、すなわち、タンパク質の複合体であるＳｅｃ系によって細胞膜を通して輸送されるが、この経路は、搬出用ポリペプチドを識別して、それらを、細胞膜を通して移行させる。この系は、抗体断片などの哺乳動物タンパク質を腸内細菌である大腸菌から分泌させるために用いられてきた。天然の原核生物の分泌タンパク質、および哺乳動物タンパク質のような異種由来のタンパク質は、機能性シグナルペプチドを付加することにより分泌器官に向けられるが、シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端にある典型的には１３個から３０個のアミノ酸からなる配列で、疎水性コアと、新生ポリペプチド鎖を分泌器官に向かわせ、分泌後シグナルペプチドの正確な除去を可能にする付加的配列とを有する。少なくともいくつかの抗体断片を効率的に分泌させる、いくつかの原核生物のシグナルペプチドがすでに言及されており、エルビニア・カラトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒａｔｏｖｏｒａ）のペクチン酸リアーゼＢ（ＰｅｌＢ）タンパク質、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の耐熱性エンテロトキシン（ＳｔＩＩ）、および大腸菌のＯｍｐＡタンパク質などが含まれる。他の原核生物も同様の分泌系を有し、これら他の原核生物の多くについてのシグナルペプチドが言及されている。
【０００４】
しかしながら、分泌系は、どの抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドが分泌されるかによって、効率が非常に多様である。分泌の効率は、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列に依存している。例えば、マウスＶ領域を含むＦａｂ断片は、分泌されるとしても僅かである。さらに、ヒトＦａｂ断片は、Ｖ領域の配列、および／またはＶＨサブクラスによって、さまざまな効率で分泌される。このように多様な分泌効率は、作製された抗体ライブラリからスクリーニングすることができる抗体の配列に偏りを生じさせる。
【０００５】
場合によっては、分泌を促進させるためにＶ領域に変異を導入することができる。しかし、抗体のＶ領域のアミノ酸配列を変化させると、抗体機能を低下させる可能性があるため、これは一般的には望ましくない。
【０００６】
さらに、分泌されたポリペプチドからシグナルペプチドを切断することは、必ずしも効
率的ではない。例えば、大腸菌のＯｍｐＡまたはＰｈｏＡのシグナルペプチドは、ヒトインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）との融合タンパク質が大腸菌内で発現するとき、この融合タンパク質からは切断されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、シグナルペプチドを必要とせずに、細菌から抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドを分泌させ、それによって、可変領域配列によって生じる分泌の制約（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）を除去する組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、シグナルペプチドを必要とせずに原核生物に抗体、抗体断片、および／または抗体関連ポリペプチドを分泌させ、それにより、可変領域配列によりもたらされる制限を克服する方法に関する。１つの実施形態において、本発明の方法は、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、シグナル配列なしに原核生物宿主細胞内で発現させて、その後、宿主細胞の細胞膜を通過して、その抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドを分泌させることを含む。本発明の１つの実施形態において、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドは、細胞の分泌経路にあるタンパク質をコードする遺伝子に１つ以上の変異を含む原核生物宿主細胞を利用することによって、シグナル配列なしに分泌される。別の実施形態において、宿主細胞は大腸菌であり、分泌変異体はタンパク質局在（ｐｒｌ）変異体である。
【０００９】
また、本発明は、本発明の方法によって作製された抗体または関連ポリペプチドのライブラリに関する。１つの実施形態において、本発明のライブラリは、細胞膜を通過する輸送を指示するためにシグナル配列を利用した場合に、原核生物の中では分泌されないか、分泌されにくい抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドのクローンを含む。別の実施形態において、本発明の抗体、抗体断片、抗体関連ポリペプチド、またはその他のポリペプチドのライブラリは、シグナル配列によって発現されるライブラリよりも良好な発現量の多様なＶＨサブクラスおよびＶＬサブクラスを有する。本発明の抗体および関連ポリペプチドには、後述される、本来の免疫グロブリン、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ラクダ科動物抗体、抗原に結合する足場、抗体もしくは抗体関連ポリペプチドの融合タンパク質、およびその他のポリペプチドが含まれる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明の抗体関連ポリペプチドは、本発明の抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドによって認識される抗原を含む。本発明の１つの実施形態において、これらの抗原は自己抗原である。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、本発明の方法は、その１つ以上のサブユニットが機能的なシグナル配列を持たない多量体タンパク質の発現、分泌、および集合を可能にする。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の性質と目的をより理解しやすくするため、以下の詳細な説明は、添付の図面をともに参照されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、「抗原」は、適当な条件下で、特異的な抗体、抗体断片、または抗
体関連ポリペプチドと反応させることができる物質を意味する。抗原は、毒素または外来タンパク質など、可溶性物質であってもよいが、抗原決定基（エピトープ）として知られるタンパク質または抗原分子の一部だけが抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドと結合する。より広く定義すれば、「抗原」という用語は、本明細書においては、その物質が免疫原性であるか否かに関わらず、抗体が結合する物質、またはそれに対して抗体が存在することが望ましい物質を意味する。そのような抗原について、免疫反応とは無関係に、組換え法によって抗体を同定することができる。
【００１４】
本明細書において、「抗体」は、機能的には結合タンパク質として定義され、構造的には、免疫グロブリンの可変領域に由来していると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むと定義されるタンパク質を意味する。抗体は、免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子の断片、（さまざまな動物の遺伝情報を組み合わせて作製された）ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子、または合成免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている、１つ以上のポリペプチドからなっていてもよい。この認識された天然の免疫グロブリンには、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμという定常領域遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子ならびに多数のＤセグメントおよびＪセグメントが含まれる。軽鎖はκまたはλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類されるが、これらは転じて、免疫グロブリンの分類をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義している。
【００１５】
一般的な抗体の構造単位は４量体を含むことが知られている。４量体はそれぞれ、２つの同一対のポリペプチド鎖からなり、各対はそれぞれ、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する、約１００から１１０個、またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域（Ｖ）を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を意味する。
【００１６】
抗体は、完全な免疫グロブリンとして、さまざまなペプチダーゼにより消化されて生じた、いくつかの特徴のはっきりした断片として、または組換えＤＮＡ技術によって作製された多様な断片として存在する。すなわち、例えば、パパインは抗体を消化して、抗原結合Ｆａｂ断片および残存Ｆｃ断片にし；ペプシンは、ヒンジ領域にあるジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結されている軽鎖であるＦａｂの２量体であるＦ（ａｂ’）２を産生する。Ｆ（ａｂ’）２を、穏やかな条件下で還元すると、ヒンジ領域内にあるジスルフィド結合が切断され、それによって、Ｆ（ａｂ’）２２量体をＦａｂ’単量体に変えることができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、１９９３、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ参照）。本来の抗体の消化という面から、さまざまな抗体断片が定義されているが、当業者は、そのようなＦａｂ’断片、またはその他の断片を、化学的に、または組換えＤＮＡ技術を利用して、デノボ合成できることを理解しているはずである。さらに、組換えＤＮＡ方法論を用いて、酵素消化によっては作製することができない抗体を作製することができる。したがって、本明細書における抗体という用語は、全長抗体を改変して作製されるか、または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成される抗体断片も含む。抗体には、可変重鎖と可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーを介して）連結されて連続ポリペプチドを形成する単鎖抗体（単鎖のポリペプチドとして存在する抗体）などがあり、単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖかｓｃＦｖ）を含む。単鎖Ｆｖ抗体は、直接結合されているか、ペプチドをコードするリンカーによって結合されている、ＶＨコード配列およびＶＬコード配列を含む核酸から発現され得るＶＨ−ＶＬヘテロ２量体に共有結合している（Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３）。ＶＨおよびＶＬは、単鎖ポリペ
プチドとして互いに連結しているが、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは非共有結合的に会合している。繊維状ファージの表面に初めて発現された機能性抗体分子は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であったが、別の発現法も成功している。例えば、Ｆａｂ分子も、その一方の鎖（重鎖または軽鎖）がｇ３キャプシドタンパク質に融合され、その相補鎖が可溶性分子としてペリプラズムに搬出されれば、ファージ上に表示することができる。これら２つの鎖は、同一または異なったレプリコン上にコードされ得、重要な点は、各Ｆａｂ分子中の、これら２つの抗体鎖が翻訳後に集合して、２量体が、鎖の一方のｇ３ｐへの結合を介してファージ粒子に取り込まれることである（例えば、米国特許第５，７３３，７４３号参照。この文献は、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる）。ｓｃＦｖ抗体、および抗体のＶ領域に由来する、天然では凝集しているが化学的には分離されているポリペプチドの軽鎖および重鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似した３次元構造に折り畳まれる分子に変える、その他いくつかの構造体が当業者に知られている（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号および第４，９５６，７７８号参照）。特に好適な抗体は、ファージ上に表示されている抗体の全部（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂおよびジスルフィド結合型Ｆｖ（ライターら（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ），１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：１３２３−１３３１））を含む。抗体には、双抗体およびミニ抗体も含まれ得る。
【００１７】
抗体は複数の種に由来し得る。例えば、抗体には、齧歯動物（マウスおよびネズミなど）の抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、およびヒト抗体がある。また、抗体は、ある種に由来する可変領域を別の種に由来する定常領域に結合させているキメラ抗体であってもよい。同様に、抗体はヒト化することができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術によって構築して、ある種に由来するヒトフレームワーク領域が、別の種の免疫グロブリンに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合している免疫グロブリンを産生することができる（例えば、ＥＰＯ公報第０２３９４００号参照）。抗体の場合、モジュールは、「フレームワーク」モジュールおよび「ＣＤＲ」モジュールからなる。別のフレームワークモジュールおよびＣＤＲモジュールを作製することによって、さまざまな組み合わせで集合させることが可能になる。さらに、２個以上の人工遺伝子が、遺伝子の部分要素のそれぞれの境界域に同一対の切断部位を持っていれば、具体的な遺伝子配列に関する追加的な情報がなくても、これらの遺伝子に同時に、予め構築しておいた部分要素のライブラリを挿入することができる。この方法によって、例えば、抗体の親和性をすばやく最適化することできる。なぜなら、遺伝子の部分要素ライブラリをコードするＤＮＡカセットは、（ｉ）予め構築し、貯蔵し、再使用することができ、かつ（ｉｉ）実際の配列を知ることも、ライブラリの各メンバーの配列を決定することもなく、これらの配列のいずれにも正しい位置に挿入することができるからである。抗体の合成ライブラリをつくる方法の例は、例えば、米国特許第５，８８５，７９３号および第６，３００，０６４号に開示されており、その全文を参照して本明細書に組み込む。
【００１８】
抗体には、これらは、基準抗体（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）から、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３由来の少なくとも１つの最小必須結合特異性決定基を有するエピトープ集中型抗体も含み、そのようなエピトープ集中型抗体を作製する方法は米国特許出願第１１／０４０，１５９号に記載されており、この文献を、その全文を参照して本明細書に組み込む。
【００１９】
「細胞膜」という用語は、細胞の原形質を封入している膜であって、細菌においては、グラム陰性細菌のペリプラズムと外膜の内側にある膜を意味する。
【００２０】
本明細書において、「多様性」という用語は、異なる特異的な抗原結合抗体または関連ポリペプチドの数を意味する。
【００２１】
「発現ベクター」は、宿主細胞内で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸因子によって、組換え的または合成的に生成される核酸構造体である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であってもよい。一般的には、発現ベクターは、プロモーターと操作可能に結合した、転写されるべき核酸を含む。
【００２２】
本明細書において、「フレームワーク領域」という用語は、カバット（Ｋａｂａｔ）によって定義されたように、単一種の異なった免疫グロブリン間で比較的（すなわち、ＣＤＲ以外で）保存されている、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域の部分を意味する。本明細書において、「ヒトフレームワーク領域」とは、天然型ヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に（約８５％以上）同一であるフレームワーク領域である。
【００２３】
本明細書において、「融合抗体」という用語は、抗体が、抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において、非抗体ポリペプチドに融合している分子を意味する。１つの実施形態において、抗体断片は、検出および精製を容易にするために１つ以上のＣ末端ペプチドタグを含むことができる。別の実施形態において、抗体は、細胞、胞子、またはウイルスの表面上に提示されるように、ペプチドまたはポリペプチドに融合し得る。例えば、抗体断片の１本の鎖を、繊維状ファージなどのバクテリオファージの表面上に融合タンパク質として表示し得る。
【００２４】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターからポリペプチドを発現または分泌させる細胞機構を提供する細胞を意味する。
【００２５】
「ヒト化抗体」という用語は、ある種に由来するヒトフレームワーク領域が、別の種の免疫グロブリンに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合している免疫グロブリンを作製するために組換えＤＮＡ技術によって構築された抗体を意味する（例えば、ＥＰＯ公報第０２３９４００号参照）。
【００２６】
本明細書において、「免疫グロブリン」という用語は、４量体抗体、および抗体以外に、例えば、以下のような多様な形態を意味する：Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２、ならびに二機能性ハイブリッド抗体、融合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒューマニアド抗体（ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および単鎖抗体など。
【００２７】
「ライブラリ」とは、ヌクレオチド配列、例えば、クローン内で抗体および関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの収集物、または抗体または関連ポリペプチドの遺伝的に多様な収集物を意味する。
【００２８】
本明細書における「多量体タンパク質」は、インビトロまたはインビボで互いに結合して単一の球状タンパク質を形成している１つ以上の個別のポリペプチド鎖またはタンパク質鎖を含む球状タンパク質を意味する。多量体タンパク質は、同種の１つ以上のポリペプチドからなり、「ホモ多量体」を形成していてもよい。あるいは、多量体タンパク質は、異なった配列を有する１つ以上のポリペプチドからなり、「ヘテロ多量体」を形成していてもよい。このように、「ヘテロ多量体」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子であって、第２のポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸残基で第１のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる分子である。ヘテロ多量体は、第１および第２のポリペプチドによって形成された「ヘテロ２量体」を含んでもよく、または、２つ以上のポリペプチドが存在する高次立体構造を形成してもよい。ヘテロ多量体に対する構造の例には、ヘテロ２量体（例えば、Ｆｖ断片およびＦａｂ断片、二重特異性抗体、ＧＡＢＡＢレセプター１および２の複合体）、３量体Ｇタンパク質、４量体（例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片）、およびさらなるオリゴマー構造体がある。
【００２９】
「タンパク質局在化（ｐｒｌ）変異体」は、欠陥のあるシグナルペプチドを含むタンパク質、およびシグナルペプチドを有さないタンパク質の分泌欠損をレスキューするよう分泌装置において変更がなされている宿主細胞を意味する。
【００３０】
「分泌／分泌する／分泌性」という用語は、シグナル配列を必要とする輸送経路、およびシグナルを必要としない輸送経路など、細胞の原形質から細胞膜を通して輸送されることを意味する。
【００３１】
「シグナル配列」および「シグナルペプチド」という用語はいずれも、結合された新生ペプチドを宿主細胞外に分泌するのを助けることができるペプチド配列を意味する。
【００３２】
「ＶＨサブクラスおよびＶＬサブクラス」という用語は、ヒトにおいては、７つの認知されたＶＨサブクラス（ＶＨ１〜ＶＨ７）および１６のＶＬサブクラス（Ｖκ１〜Ｖκ６およびＶλ１〜Ｖλ１０）を意味する。
【００３３】
「ベクター」という用語は、クローニングに適した核酸、または本発明の宿主細胞において本発明の核酸を発現させるのに適した核酸を含む。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってもよい。ベクターは自己調節性であってもよく、あるいは宿主細胞の染色体または宿主細胞のその他の複製核酸の中に組み込むこともできる。また、ベクターは、例えば、一過的発現系におけるように、非複製性であるか、あまり複製しないものであってもよい。
【００３４】
本発明の発現系
本発明は、シグナルペプチドを必要とせずに原核生物宿主細胞から抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドを分泌させる方法を提供する。本発明の１つの態様において、抗体、または抗原結合断片を分泌させて、それを機能性抗原結合分子に集合させる新規の方法が提供される。この抗体は、１つの抗体のＶ領域のコード配列を含む１つ以上の核酸によってコードされる。本発明の抗体は、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる米国特許第６，２０４，０２３号に記載されているように、シグナル配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体または多量体タンパク質は、シグナル配列を欠くポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドから発現される。この抗体は、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドを発現することができる１つ以上のベクターによってコードされる。抗体が重鎖および軽鎖から形成されている場合、両鎖に対するコード配列は、同一ベクター上にあってもよく、またはこれらコード配列は、形質転換された宿主細胞内の異なったベクター上に存在していてもよい。好適な実施形態において、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかが、シグナル配列をコードしていないポリヌクレオチドから発現される。いくつかの好適な実施形態において、重鎖および軽鎖とも、シグナル配列をコードしていないポリヌクレオチドによってコードされている。ベクターの実施形態としては、プラスミド、ウイルスベクター、エピソーム、および染色体組み込み体が挙げられる。
【００３５】
一般に、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの複製開始点、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および出芽酵母ＴＲＰ１遺伝子など、宿主細胞における選択を可能にする表現型選択マーカー、下流にある構造配列の転写を指示する機能性プロモーター、ならびに機能可能なリーディングフレーム内にある適当な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルを含む。形質転換に適した原核生物宿主細胞は、大腸菌、またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、放射菌類属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に含まれるさまざまな種、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など他の
種などであり、また、その他の細菌宿主も、選択肢として用いることができる。
【００３６】
当業者によく知られている、本発明のポリペプチドを産生する発現系は数多くある。（例えば、ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＨｏｅｆｆｌｅｒ編、１９９９、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照）。数多くの適当なベクターが当業者に知られており、本発明の組換え構築物を作成するために市販されている。以下のベクターを代表的なものとして挙げるが、これらは非限定的な例である：細菌性ベクター：ｐＢｓ、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨｌ６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、λファージ由来ベクター、ｐ１５Ａに基づくベクター（Ｒｏｓｅ，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３５５および３５６）、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系。細菌に使用するための発現ベクターには、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝因子を含む市販プラスミドに由来する選択マーカーと細菌複製開始点を含むことができるものがある。そのような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ  １（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）などがある。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」部分を、適当なプロモーターおよび発現させようとする構造配列と組み合わせる。
【００３７】
一般的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、所望の宿主細胞の中で機能するプロモーターの調節下にある。多様なプロモーターが利用可能であり、本発明の発現ベクターの中で用いることができる。通常は、プロモーターの選択は、プロモーターが用いられる細胞型に依存する。そのようなプロモーターは、糖分解酵素、とりわけ、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来するかもしれない。具体的な名前を有する細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ｔａｃおよびｔｒｃなどである。一般的に用いられる原核生物プロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）；ならびにλ由来ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）などである。特定のプロモーター系が本発明にとって必須ではなく、原核生物において機能する任意の利用可能なプロモーターを用いることができる。適切なベクターおよびプロモーターを選択することは、当業者にとって適宜なし得ることである。
【００３８】
大腸菌以外の原核生物細胞の中でポリペプチドを発現させるためには、具体的な原核生物種の中で機能する、転写および翻訳の調節配列が必要である。そのようなプロモーターは、その生物種からクローニングされている遺伝子から得ることができ、または異種プロモーターを用いることもできる。例えば、ハイブリッド型ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、大腸菌に加えて桿状菌の中でも機能する。これらおよびその他適当な細菌由来プロモーターが、当技術分野において周知されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。本発明のタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌、桿状菌種、サルモネラ菌において利用可能である（Ｐａｌｖａら、１９８３，Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５：Ｍｏｓｂａｃｈら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３−５４５）。そのような発現系用のキットが市販されている。
【００３９】
本発明においては、構成的プロモーターまたは調節的プロモーターを使用することができる。大腸菌内での発現を調節する方法が当技術分野において周知であり、ＩＰＴＧによって誘導することができるｌａｃプロモーターまたはｔａｃプロモーターなどの誘導性プロモーター、およびアラビノース誘導性プロモーターを用いることを含む。宿主細胞における異種タンパク質の濃度を調節することができるため、調節プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の方が有利であるかもしれない。誘導性プロモーターとは、発現量が、例えば、温度、ｐＨ、嫌気条件または好気条件、光、転写因子および化学物質などの環境的または発生的な因子によって発現レベルを変えることができる遺伝子の発現を指示するプロモーターのことである。
【００４０】
大腸菌およびその他の細菌宿主細胞について、誘導性プロモーターは当業者に周知である。これらは、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、１９８３、Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８０：２１）、およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９８６、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ；Ｔａｂｏｒら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４−８）である。これらのプロモーターおよびそれらの使用法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲で考察されている。
【００４１】
他の生物の誘導性プロモーターも当業者によく知られている。これらは、例えば、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、およびその他多数のものがある。
【００４２】
その他の発現調節配列、例えば、リボソーム結合部位、転写終結部位、オペレーターも含まれ得る。これらの調節配列の１つ以上を含むＤＮＡ構築物は「発現カセット」と呼ばれる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸が、所望の宿主細胞の中で所望の量の発現を行うために組み込まれる。
【００４３】
翻訳開始コドンを、抗体または抗体断片のポリペプチドがＮ末端にメチオニル（またはＮ−ホルミルメチオニル）残基で発現されるように、成熟型の抗体または抗体断片をコードする配列の上流に直接導入することができる。例えば、抗体の精製または検出を容易にするか、または別の目的のために、付加的な配列を、抗体をコードする配列の中に含ませることができる。異種性の構造配列を、適当な翻訳リーディングフレームの中に、適当な翻訳開始配列および翻訳終了配列をもって集合させる。任意には、この異種配列は、例えば、発現された組換え産物の安定化、またはその精製を単純化、所望の特性を与えるＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
【００４４】
ＡＴＧコドンがコード配列の５’末端に存在するため、発現されたタンパク質はアミノ末端にＮ−ホルミル−メチオニン残基を有する。コード配列が発現されると、Ｎ末端アミノ酸は保持されるか、または宿主細胞のプロテアーゼによって除去することができる。本発明の本態様に従ったＤＮＡコード配列の発現によって生じた抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドは、抗原に結合する能力がある。抗体断片が重鎖および軽鎖から形成される場合、鎖の一方または両方を、ＡＴＧコドンを有するコード配列から発現させることができる。好ましくは、両鎖とも、シグナルペプチドプチをもたずに発現される。
【００４５】
翻訳結合（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を用いて発現を促進することができる。この方法は、その翻訳系本来の高発現型遺伝子に由来する、短い上流域オープン翻訳リーディングフレーム、または合成／非天然性の高発現型オープンリーディングフレームであって、プロモーターおよびリボソーム結合部位の下流、および終止コドンの上流に置かれたリーディングフレームを用いる。終止コドンの直前には第２のリボソーム結合部位があり、終止コドンに続いて、発現させようとするポリペプチドの翻訳開始コドンがある。この系は、翻訳が効率的に開始することを可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２参照。
【００４６】
分泌された抗体は、抗体発現に適した条件下で細菌を増殖させた後、培養培地中で検出するか、培養培地から単離することができる。培養培地の中の抗体を観察する方法には、ウエスタンブロット分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、および酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法がある。また、分泌された抗体は、細菌のペリプラズムの中で検出するか、ペリプラズムから単離することができる。ペリプラズムを破砕して、ペリプラズム画分から抗体を放出させる方法は当技術分野において周知されており、低ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）または浸透圧ショックを用いることを含む。
【００４７】
本発明のポリペプチドの精製を容易にするために、このポリペプチドをコードする核酸は、親和性結合試薬が利用可能なエピトープすなわち「タグ」のコード配列を含むこともできる。このようなエピトープタグには、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ−タグ、マルトース結合タンパク質、ＶＳＶ−Ｇタグ、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３）タグ、またはその他タグが含まれるが、それらの多くは当業者に周知されている。これらのエピトープを有する融合ポリペプチドを組換えによって製造するのに役立つ発現ベクターは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡのベクターであるｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは哺乳動物細胞での発現に適している）。本発明の融合タンパク質にタグを付着させるのに適した別の発現ベクター、およびそれに対応する検出系が当業者に知られており、いくつかのものは市販されている（例えば、「ＦＬＡＧ」（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））。適当なタグの別の例はポリヒスチジン配列であり、この配列は金属キレート親和性リガンドに結合することができる。一般には、６個の隣接したヒスチジンが用いられるが、６個より多いものも少ないものも使用することができる。ポリヒスチジンタグに対する結合部分として利用できる金属キレート親和性リガンドは、ニトリロ３酢酸（ＮＴＡ）などである（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．，１９９０，「金属キレート吸着体による組換えタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ）」、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編「遺伝子工学：原理と方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」より、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡより発売）。
【００４８】
当業者は、生物活性を低下させることなく、タンパク質のドメインに改変を加えることができることを認識している。改変には、クローニング、発現、またはポリペプチドへのドメインの組み込みを容易にするために行うことができるものがある。そのような改変は当業者によく知られており、例えば、結合ドメインをコードし、例えば、アミノ末端に付加されたメチオニンを提供し、開始部位をもたらしたり、またはいずれかの末端に配置された付加的アミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を提供し、都合良く位置付けられた制限部位もしくは終止コドンまたは精製配列を作製したりするポリヌクレオチドのいずれかの末端へのコドンの付加が含まれる。
【００４９】
ポリペプチド
抗体
１つの実施形態において、分泌されるポリペプチドは抗体である。基本的な抗体構造ユニットは、４量体からなることが知られている。４量体はそれぞれ、２組の同一対のポリペプチド鎖で構成されており、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクタ機能に関与する定常領域を規定する。各重／軽鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。このように、完全抗体は２つの結合部位を有する。各鎖は、定常領域（Ｃ）および可変領域（Ｖ）を有する。各鎖は一連のドメインへと組織化される。軽鎖には２つのドメインがあり、その１つはＣ領域に、他方はＶ領域に対応している。重鎖には４つのドメインがあり、その１つはＶ領域に対応し、３つ（１、２および３）はＣ領域に存在する。抗体には２本のアーム（各アームはＦａｂ領域である）があり、それぞれが互いに結合しているＶＬ領域およびＶＨ領域を有する。このＶ領域対（ＶＬおよびＶＨ）が、（アミノ酸配列変異により）抗体ごとに異なっているものであり、共に抗原認識および抗原結合部位の提供に関与している。さらに詳しく言えば、各Ｖ領域は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）で構成されている。ＣＤＲは、可変領域の中で最も可変性のある部分であり、重要な抗原結合機能を果たしている。ＣＤＲ領域は、組換え、突然変異、および選択を含む複合的な過程を介して、数多くの潜在的生殖系列配列から得られる。
【００５０】
軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義している。ヒトの重鎖サブクラスはＶＨ１〜ＶＨ７と名付けられている。軽鎖および重鎖の内部では、可変領域と定常領域が、約１２以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は約１０以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含んでいる（一般的には、１９９３，Ｐａｕｌ，Ｗ編、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ＳＨ．９（すべての目的に関して、その全体が参照されて組み込まれる））。
【００５１】
Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の可変領域はともに、ＦＲ、ＣＤＲ、ＦＲ、ＣＤＲ、ＦＲ、ＣＤＲおよびＦＲというように、フレームワークと相補性決定領域（ＣＤＲ）を交互に含む。各領域に対するアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ、１９８７および１９９１、前掲、および／またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義に従っている。
【００５２】
結合抗原の機能を全長抗体の断片が行い得ることが示されている。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；および（ｖｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結びつけられた２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片である。
【００５３】
本発明のさまざまな実施形態において、抗体または抗体断片は１本鎖抗体であってもよく、または、重鎖および軽鎖から形成されていてもよい。抗体の例には、本来の免疫グロブリン、１本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｄＡＢ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ラクダ科動物抗体、ナノ抗体、抗原に結合する足場、および抗体または抗体関連ポリペプチドの融合タンパク質などがある。抗体が重鎖または軽鎖を含む場合、１つ以上の鎖がシグナルペプチドなしで発現され、好ましくは、両鎖ともシグナルペプチドを有さずに発現される。
【００５４】
ラクダ科動物の免疫グロブリン（抗体分子）を構成するＩｇＧには２つの構造が存在することが知られており、一方は重鎖および軽鎖を有するヘテロ４量体であり、他方は重鎖２量体からなる。４量体構造は、ヒトおよびその他の動物に共通したＩｇＧの特徴である。一方、重鎖２量体構造を有する後者のＩｇＧはラクダ科動物の特徴であると考えられている。
【００５５】
ラクダ科動物における重鎖２量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水的相互作用を行う必要がないため、ラクダ科動物では、通常は軽鎖と接触する重鎖内領域が親水性のアミノ酸残基に変化している。正常なヘテロ４量体ＩｇＧのＶＨとの構造上の違いにより、重鎖２量体ＩｇＧのＶＨドメインは、重鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨＨ）と呼ばれる。
【００５６】
ＶＨＨは、親水性アミノ酸残基を有するため、非常に可溶性が高い。ＶＨＨの一次構造（アミノ酸配列）の全体にわたってアミノ酸置換が点在している。さらに、これらの親水性アミノ酸残基は、ＶＬドメインと相互作用する部位に対応したＶＨの立体構造のスペースでクラスターを形成する。本明細書において、立体構造の前記のスペースは、特に元ＶＬ領域側（ｆｏｒｍｅｒ  ＶＬ  ｓｉｄｅ）と呼ばれる。これらのアミノ酸置換は、例えば、Ｖ３７ＦまたはＶ３７Ｙ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５ＲまたはＬ４５Ｃであり、Ｗ４７も、大抵はＧｌｙと置換されている。このような置換は、ＶＨＨの元ＶＬ領域側の親水性を増大させる。
【００５７】
さらに、ラクダおよびラマに由来するＶＨＨは、マウスのへテロ４量体抗体と比較して温度安定性が非常に高い。これらの生物種に由来するＶＨＨを用いて、例えば、９０℃でも抗原結合能力を維持する分子を提供することができる（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４３１（１）：３７）。
【００５８】
ラクダ科動物の抗体レパートリの多様性は、ＶＨ領域またはＶＨＨ領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３によって決定される。３つのＣＤＲを持つことは他の動物種のＩｇＧと共通している。しかし、ラクダＶＨＨ領域のＣＤＲ３は、平均長がアミノ酸１６個と比較的長いことを特徴としている（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（９）：１１２９）。例えば、平均９アミノ酸のマウスＶＨのＣＤＲ３と較べて、ラクダＩｇＧのＣＤＲ３は非常に長い。
【００５９】
ラクダ科動物の可変領域のインビボにおける多様性を維持している、ラクダ由来抗体の可変領域のライブラリは、例えば、２００５年２月１７日公開の米国特許出願第２００５００３７４２１号に開示された方法によって作製することができ、この文献は、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、抗体関連ポリペプチドは、足場ポリペプチドである。足場ポリペプチドは、所定のリガンドに対して選択的結合活性を示す非免疫グロブリン結合ポリペプチドである。この非免疫グロブリン結合ポリペプチドは、親ポリペプチドの結合ドメインに移植することができる足場含有免疫グロブリン様ドメインに由来し、親ポリペプチドの結合親和性を足場含有免疫グロブリン様ドメインに付与する。本発明の非免疫グロブリン結合ポリペプチドには、足場ドメインの構造においても、広範な異種ポリペプチド結合ドメインを受容する能力においても、安定的かつモジュラー型であるという長所がある。さらに、足場を含む免疫グロブリン様ドメインは、ヒト由来源から容易に得ることができるため、ヒトの治療薬として用いられた場合に免疫原性は無視できる程度である。本発明の足場も、天然の多糖鎖を含んだり省いたり、または新規の鎖やその他の追加的足場部分もしくはポリペプチド構造を含むように容易に構築することができる。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明は、足場を含むＴｈｙｌ免疫グロブリン様ドメインに挿入された、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する非免疫グロブリン結合ポリペプチドを対象とする。ＣＤＲは、ＣＤＲをドナー抗体、すなわち親抗体の３次元構造におけると同様の立体構造に折り畳ませるＴｈｙｌポリペプチドのループ領域に挿入される。得られたハイブリッドすなわちキメラの抗体関連ポリペプチドは、親抗体と比較して同様の結合特性を示す。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は、いくつかまたは全部の位置におけるアミノ酸置換によって作られた改変型免疫グロブリン様ドメインループを有する抗体関連ポリペプチドを対象にする。ループドメイン中の改変アミノ酸配列は、抗体関連ポリペプチドが結合しているリガンド以外のリガンドに対する選択的結合活性を付与する。このアミノ酸改変は、当業者に周知のさまざまな方法を用いて、核酸またはポリペプチドのレベルで行うことができる。
【００６３】
さらに別の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを含む、ＴｈｙＯｘファミリーの免疫グロブリン様ドメインに由来する抗体関連ポリペプチドを対象とする。ＴｈｙＯｘポリペプチドを、足場含有免疫グロブリン様ドメインとして、または担体ポリペプチドとして用いて、本発明の抗体関連ポリペプチドを作製することができる。足場ポリペプチドおよびそのような足場ポリペプチドのライブラリは、例えば、２００４年１２月３０日公開の米国特許出願第２００４０２６６９９３号に開示された方法などにより作製することができる。本文献は、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００６４】
本明細書において、「免疫グロブリン様ドメイン」または「Ｉｇ様ドメイン」という用語は、足場に関して使用される場合、例えば、細胞外基質タンパク質、筋肉タンパク質、免疫タンパク質、細胞表面レセプター、および酵素など、多様な機能のタンパク質に見出される、当業者に周知のβ−サンドイッチ構造モチーフを意味するものとする。Ｉｇ様ドメインのメンバーは、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＩＩＩ型フィブロネクチンスーパーファミリー、およびカドヘリンスーパーファミリーなど、さまざまなスーパーファミリーに分けられている。Ｉｇ様ドメイン構造モチーフを含むその他のスーパーファミリーは、例えば、ＰＫＤドメイン、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼドメイン、トランスグルタミナーゼの２つのＣ末端ドメイン、アクチノキサンチン様、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ様、ＣＢＤ９様、ラミンＡ／Ｃの球状尾部ドメイン、クラスリンアダプタのアペンデージ（ａｐｐｅｎｄａｇｅ）ドメイン、インテグリンドメイン、ＰａｐＤ様、紫色酸性ホスファターゼのＮ末端ドメイン、スーパーオキシド還元酵素様、チオール：ジスルフィド交換タンパク質ＤｓｂＤのＮ末端ドメイン、およびインベイシン／インチミン細胞接着断片のスーパーファミリーのメンバーを含む。Ｉｇ様ドメインの構造的類似性が、有意な配列同一性とは関係なく、さまざまなスーパーファミリーのメンバー間で維持されている。この用語は、各スーパーファミリー内および全スーパーファミリーにおけるＩｇ様ドメインのメンバーを含むものとする。したがって、「免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含むスーパーファミリー」という用語は、前記のスーパーファミリーのいずれか、および当業者に周知のその他のもののメンバーであるポリペプチドを含むＩｇ様ドメインを意味するものである。さまざまなＩｇ様ドメインを含むスーパーファミリーについての説明は、例えば、Ｃｌａｒｋｅら、１９９９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．７：１１４５−５３およびＵＲＬ：ｐｄｂ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｃｏｐ／ｄａ−ｔａ／ｓｃｏｐ．ｂ．ｃ．ｂ．ｈｔｍｌなどの構造データベース内に記載されている。
【００６５】
本明細書において、「ＴｈｙＯｘ」または「ＴｈｙＯｘファミリーのポリペプチド」という用語は、本発明の抗体関連ポリペプチドに関して使用される場合、共通するβ−サンドイッチ構造モチーフによって関連づけられるポリペプチドを含み、かつ、抗体の可変領
域ドメインに類似した足場フレームワーク構造を含む免疫グロブリン様ドメインの免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に含まれるポリペプチドのサブクラスを意味するものである。ＴｈｙＯｘファミリーのポリペプチドに含まれる具体的なポリペプチドには、例えば、Ｔｈｙ−１、Ｏｘ２、ＧＰ４０、Ｏｘ２様タンパク質、およびＯｘ２ホモログなどがある。
【００６６】
本明細書において、「足場」という用語は、異種結合ドメイン、またはリガンドに結合特異性を付与する改変型アミノ酸配列を構成し、方向づけ、および収容するために用いられる支持ポリペプチドフレームワークを意味するものとする。足場は、結合特異性を付与するアミノ酸配列から構造的に分離可能であってもよい。足場の構造的に分離可能な部分は、例えば、β−サンドイッチ型、β−シート型、β−ヘリックス型、β−バレル型、コイルドコイル型、およびその他当技術分野においてよく知られているポリペプチドの２次元および３次元の構造など、さまざまな異なった構造モチーフを含むことができる。また、本発明の足場は、支持フレームワーク構造の安定性を実質的に低下させずに、アミノ酸配列の中で変化させることができる１つ以上の領域も含む。変化させることができる領域の例は、β−サンドイッチまたはβ−シートの２つの鎖を結合させるループ領域のセグメントなどである。足場の構造的に分離した部分に対応するアミノ酸残基を、本明細書においては、足場フレームワークと呼ぶ。本発明の足場を含む免疫グロブリン様ドメインは、ヒト免疫グロブリンの可変重鎖または軽鎖のフレームワークアミノ酸配列と約５０％よりも低いアミノ酸同一性を示す。通常、足場を含む免疫グロブリン様ドメインは、ヒト免疫グロブリンの可変重鎖または軽鎖のフレームワークアミノ酸配列に対し、例えば、約４５％、約４０％、約３０％、約２０％、約１５％、または約１０％よりも低いアミノ酸配列同一性を示すだろう。変化させることができる足場の残基は、ループ領域など、その構造的特性に関連して、あるいは、それが、改変された残基に適合できることに関連して、本明細書に記載されている。したがって、変化させることができる足場領域は、例えば、足場の可変領域、易変領域、交換領域、改変可能領域、または交換可能領域と呼ばれる。２次元および３次元の構造特性を付与する残基は、足場の全体構造が維持されるかぎり、保持、改変、または保存することができる。当業者は、どの残基がポリペプチド足場の構造的安定性に関して機能するか、および、そのような残基はどの程度まで改変することができるかを知っているか、決定することができる。
【００６７】
本発明の足場の具体例は、スーパーファミリーのメンバーを含む免疫グロブリン様ドメインなどである。これらのスーパーファミリーのメンバーは、本発明の足場として用いることができるβ−サンドイッチとしての特徴を有する免疫グロブリン様ドメインを含む。このβ−サンドイッチは、β−シートの平坦な疎水性面が互いに固まって対峙する、２層の逆平行β−シートを含む、約８０〜１５０アミノ酸残基からなっている。各β−シートは、足場ポリペプチドにユニークな結合特異性を付与するために、アミノ酸配列を変えることができるループ領域を含む。スーパーファミリーのメンバーを含むＩｇ様ドメインの例は、例えば、ＴｈｙＯｘファミリーのメンバーであるポリペプチド、および上記した免疫グロブリン様ドメインを含むスーパーファミリー内の多様な個別メンバーなどである。このような個別のメンバーは、例えば、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、サイトカインレセプター、ＧＣＳＦレセプター、ＧＭＣＳＦレセプター、ホルモンレセプター、成長ホルモンレセプター、エリスロポエチンレセプター、インターフェロンレセプター、インターフェロンγレセプター、プロラクチンレセプター、ＮＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、Ｎ−カデリン、Ｅ−カデリン、フィブロネクチン、テネイシン、およびＩ−セット含有ドメインポリペプチド、またはそれらの機能性断片などである。これらおよびその他のＩｇ様ドメイン含有スーパーファミリーメンバーの説明の例は、例えば、ＩｓａｃｋｅおよびＨｏｒｔｏｎ、２０００，接着分子ファクツブック（Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ），第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｆｉｔｚｇｅｒａ
ｌｄら、２００１，サイトカイン・ファクツブック（Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ），第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；およびＭａｒｓｈら、１９９９，ＨＬＡファクツブック（Ｔｈｅ  ＨＬＡ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ），第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載されている。
【００６８】
本発明の抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドは、さまざまな源に由来することができる。さまざまな実施形態において、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドは、さまざまな哺乳動物遺伝子に由来し、それらは、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ラット、ハムスターのキメラ型、ヒト化型、ハイブリッド型、またはエピトープ集中型であってもよい。本発明の抗体はモノクローナル型であってもよい。所定の抗原に対する特異性が高いために、モノクローナル抗体の出現（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５）は、科学的および商業的に重大な結果を伴う顕著な技術的ブレークスルーを意味した。
【００６９】
モノクローナル抗体は、伝統的に、特別な特異性を有する生体機能性抗体分子の一形態を分泌する単一の免疫グロブリン産生細胞に由来する不死哺乳動物細胞株を樹立することによって作製されている。抗体分泌性哺乳動物細胞株は不死であるため、その抗体の特徴をバッチからバッチへ再現することができる。モノクローナル抗体の基本性質は、特定の抗原に特異的であること、および再現性があるためにそれらを製造できることである。
【００７０】
モノクローナル抗体を作成する初期の方法は面倒で時間がかかるものであった。好んで選択された動物、例えば、マウスを所望の抗原で免疫し、抗体産生細胞を動物から（通常は脾臓摘出によって）回収し、適当な免疫化細胞、例えば、骨髄腫細胞に融合させて、抗体をクローン的に産生するハイブリドーマを作製した。そのようなハイブリドーマ技術は、例えば、米国特許第４，１７２，１２４号および第４，１９６，２６５号；Ｚｕｒａｗｓｋｉら、１９８０，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ３９：４９２２；ＦｒａｎｋｅｌおよびＧｅｒｈａｒｄ，１９１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６：１０１−１０６に開示されている。
【００７１】
完全なヒト抗体を産生するトランスジェニック動物の導入によって、これも完全なヒト抗体を産生するハイブリドーマの選択が可能になった。このようなトランスジェニック動物は、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および第６，３００，１２９号に開示されており、これらの文献は、その全文が参照されて本明細書に組み入れられる。
【００７２】
また、ディスプレイ技術によっても、完全にヒトもしくはその他の動物、キメラ、合成、および／または半合成のモノクローナル抗体を選択することが可能になっている。このようなディスプレイ技術の一例が、１つ以上の抗体鎖がファージタンパク質のＮ末端に融合されている融合抗体を発現させるベクターを構築するファージディスプレイ法である（実例が米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，８２１，０４７号；第５，８７１，９０７号；第５，８８５，７９３号；第５，９２２，５４５号；第５，４０３，４８４号；第５，８８５，７９３号；第６，１７２，１９７号；第６，２９１，１５８号；第６，２９１，６５０号；および第６，３８７，６２７号に開示されており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる）。このようなベクターを、抗体を発現させ、シグナルペプチドに依存せずにファージ−抗体を単離するために、本発明のｐｒｌ変異宿主株に導入することができる。本発明の宿主細胞内でファージ−抗体を発現させると、分泌されない抗体の発現が改善され、ライブラリに存在するさまざまなサブクラスの抗体が十分に表示されるようになる。融合タンパク質は、シグナル配列を欠く抗体融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現させることもできる。ファージ抗体をスクリーニング、精製、および解析する方法は、上記の特許文献に記載されている。このようなディスプレイ技術の別の例は酵母ディスプレイ法である（実例が米国特許第６，３
００，０６５号に開示されており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
ファージディスプレイ技術は、一般に、繊維状バクテリオファージＭ１３またはその近縁ファージであるｆｄを利用してきた。これらのファージは、円筒状のコートタンパク質によって囲まれた環状１本鎖ＤＮＡで構成されている。ウイルスのキャプシドの大部分は、主要タンパク質ｐＶＩＩＩからなり、そのコピーは、ファージあたり約２７００個ある。ファージ粒子の片端には、宿主細胞の結合および集合プロセスの終結に関与するｐＩＩＩおよびｐＶＩが、それぞれにつき５コピーずつある。もう一方の端には、それぞれ３３個および３２個のアミノ酸からなる疎水性ペプチドであって、集合の開始およびビリオンの安定性を維持するために必要とされるｐＶＩＩおよびｐＩＸがそれぞれ５コピーずつある。
【００７４】
本発明の実施形態はキメラ抗体および合成抗体を含む。上記した初期のモノクローナル技術によって非ヒト抗体が作製された。これらの抗体は、ヒトにおいて免疫原性である可能性があり、この免疫原性のために、治療用抗体の開発が大いに妨げられてきた。いわゆる「キメラ抗体」、例えば、ある種に由来する可変領域を別の種に由来する定常領域に連結させたものの製造にはいくらか成功しているが、多くの場合、免疫原性の問題は克服されていない。抗体をキメラ化する方法の例が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００７５】
組換えＤＮＡ技術を利用して、ある種に由来するヒトフレームワーク領域が、別の種の免疫グロブリンに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と結合している免疫グロブリンが製造されている（例えば、ＥＰＯ公報第０２３９４００号参照）。これらの新規のタンパク質は、「再形成型」または「ヒト化」免疫グロブリン（フレームワーク領域がヒトである場合）と呼ばれ、ドナーである免疫グロブリンを、そのＣＤＲをヒトフレームワークと結合させて、ヒト様免疫グロブリンに変える処理は「ヒト化」と呼ばれる。抗体をヒト化する方法の例は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号に開示され、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００７６】
人工抗体およびその断片を、相同的な抗体遺伝子のグループ全体の構造特性を反映する既知の抗体配列に基づいて構築することができる。そのため、構造レパートリを失わずに異なる遺伝子の数を減らすことが可能である。この方法によって、新規に合成することも可能な人工抗体の限定的なセットが得られ、その結果、切断部位を導入し、不要な切断部位を取り除くことができる。さらに、この方法によって、（ｉ）遺伝子のコドン使用を、任意の所望の宿主細胞で高度に発現される遺伝子のコドン使用に適合させること、（ｉｉ）抗体の軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）のあらゆる組み合わせを、相互作用選好性、抗原選好性、または組み換え体発現濃度について解析することが可能であるが、これは、ある生物の抗体遺伝子の完全なコレクションおよびそのすべての組み合わせを用いては実質的に不可能なことである。
【００７７】
完全に合成された遺伝子の限定的なセットを用いることにより、コードされた構造上の部分要素の境界に切断部位を創出することが可能である。したがって、各遺伝子は、タンパク質／（ポリ）ペプチドのレベルで構造上の部分要素を代表するモジュールから構成されている。抗体の場合、このモジュールは、「フレームワーク」モジュールおよび「ＣＤＲ」モジュールからなる。別々のフレームワークモジュールとＣＤＲモジュールを作ることによって、さまざまな組み合わせで集合する可能性を実施することができる。さらに、２つ以上の人工遺伝子が遺伝子の部分要素のそれぞれの境界に同じ組み合わせの切断部位を持つ場合には、予め構築された部分要素のライブラリを、特定の遺伝子配列に関する付加的情報なしに、これらの遺伝子に同時に挿入することができる。この方法によって、例えば、抗体の親和性を迅速に最適化することができる。というのは、遺伝子の部分要素の
ライブラリをコードするＤＮＡカセットは、（ｉ）予め構築しておき、保存、再利用すること、および（ｉｉ）実際の配列を知らなくても、または個々のライブラリメンバーの配列を決定する必要もなく、正しい位置でこれらの配列の任意のものに挿入することができるからである。抗体の合成ライブラリを作製する方法の例は、例えば、米国特許第５，８８５，７９３号および第６，３００，０６４号に開示されており、これらは、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００７８】
１つの実施形態において、抗体は、抗体を操作する方法によって創出されたエピトープ集中型ヒト抗体であるが、ただし、得られた抗体は、２００５年１月２０日に出願された米国特許出願第１１／０４０，１５９号に記載されているように、エピトープ結合特異性および親和性を保持すると同時に、ヒト配列で置換された非ヒト配列の大部分を持つ。なお、この文献は、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。これは、基準抗体のＢＳＤ対、例えば、ＣＤＲ３対（ＣＤＲ３２）のタンパク質を移行させることによって達成される。親和性成熟した抗体、例えば、基準抗体において、重鎖および軽鎖のＢＳＤは互い密着していて、結合した抗原結合立体構造が互いに安定化するように最適化されているため、それらは、ユニット、すなわち、ＢＳＤ対を形成する。抗原結合立体構造は当然、Ｖ領域の基礎となるフレームワークの支持体によって決まる。親和性成熟型ＢＳＤ、例えば、基準抗体のＢＳＤを、重鎖または軽鎖のＶセグメント対の完全ヒトレパートリの多様性および安定性と組み合わせると、ＢＳＤの最適な抗原結合立体構造を十分に支持する足場が、ファージディルプレイ法、細胞生死判別法、コロニーリフトバインディングアッセイ法（ＣＬＢＡ）、または、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法など、さまざまな免疫測定法などであるが、これらに限定されない選択系を用いて容易に同定される。
【００７９】
さらに、ＢＳＤ対を多様な生殖系列Ｖセグメントに移行させると、しばしば、５０ｎＭより高い親和性を有するＶ領域が選択される結果となる。これらの選択されたＶ領域も、任意の抗体の親和性成熟過程に組み込むことができる。Ｖ領域は、ＣＤＲ３レパートリを持たず、比較的小規模であるため、ヒトＶ領域の選択を、数多くの従来型選択系にとって検索可能な大きさのライブラリにおけるＢＳＤの一方または両方の限定的な変異誘発による多様化と組み合わせることもできる。
【００８０】
ライブラリを作成する際に、基準抗体の重鎖および／または軽鎖のＶセグメントを置換するために用いられるＶセグメントレパートリは、如何なる由来源によるものでもよい。ヒトレパートリは、例えば、末梢血または脾臓から得られたｃＤＮＡ由来の所望のセグメントに適したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法によって作製することができるが、その場合、このレパートリは、体細胞変異を有するクローンを含むと予想される。あるいは、生殖細胞系にコードされた配列を得るために、非免疫系細胞由来のゲノムＤＮＡを増幅することによって、レパートリとり得ることができる。
【００８１】
ヒト生殖系列のＶセグメントレパートリは、５１個の重鎖Ｖ領域、４０個のκ軽鎖Ｖセグメント、および３１個のλ軽鎖Ｖセグメントからなり、３，６２１個の生殖系列Ｖ領域対を作っている。また、これらのＶセグメントの多くについて安定した対立遺伝子変異体があるが、生殖系列レパートリの構造的多様性に対するこれらの変異体の寄与は限定的である。すべてのヒト生殖系列Ｖセグメント遺伝子の配列が知られており、英国ケンブリッジにあるＭＲＣタンパク質工学センター（ｔｈｅ  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）が提供しているＶ塩基データベースでアクセスすることができる（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：７７６−７９８；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９６，ＪＭｏ／Ｂｉｏｌ  ２６４：２２０−２３２参照）。親和性成熟過程での体細胞超変異によって作製されたＶセグメント変異体も、Ｖセグメントレパートリに重要な寄与をする
ことができる。なぜなら、これらの変異は非ランダム的だと考えられ、また、高親和性抗原特異性を促進する構造調整を行うことができるからである。ナイーブ抗体は、結合多様性を最大にするために、広範特異性および低親和性について最適化されているが、親和性成熟型抗体は、高親和性抗原特異的結合に必要とされるより厳格なＣＤＲに有利な構造的適応を含むことができる（例えば、ＤｉａｚおよびＫｌｉｎｍａｎ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２１：８９−１０２）。
【００８２】
ヒトＶ領域のレパートリは、生殖系列のものであっても、親和性成熟したものであっても、通常のｃＤＮＡクローニング法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を用いて、例えば、しばしば複数（例えば、少なくとも１０人）の健康な個人からプールされた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から回収することができる。生殖系列の度数分布が、発現された配列の中で均一でない限り、レパートリの最適な多様性を確保するために、３つのＶ領域アイソタイプ（ＶＨ、ＶＫ、およびＶλ）のそれぞれについて、少なくとも１０３個の独立したクローンを捕捉するのが賢明である。ＰＣＲ法を用いて、クローニング工程でＶ領域の配列を増幅することができる。しかし、指数関数的な増幅機構はランダムな偏りを起こしやすく、また、これは可変的なプライミング効率を有する縮重プライマーの使用と組み合わせることができる結果、多様性が失われる。そのため、増幅が望ましい場合には、可能ならば、インビトロ転写など、プライマー非依存的線形増幅法を用いることが望ましいだろう（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
【００８３】
基準抗体由来のＢＳＤを、上記したように作製されたＶセグメント配列のライブラリに移す。ＢＳＤは、Ｖセグメントの集団を発現ベクターの中にクローニングする前か後に、発現ベクターに組み込むことができる。移されるＢＳＤは、ＣＤＲ３−ＦＲ４、ＣＤＲ３、Ｄセグメント（ＢＳＤが重鎖に由来している場合）、ＭＥＢＳＤ、または基準抗体の他方の鎖に由来する相補ＢＳＤと一緒に結合特異性を有するＣＤＲ３−ＦＲ４の他の断片であってもよい。ＢＳＤを基準抗体から別のＶ領域に移す場合、重鎖または軽鎖のＶ領域の構造が、得られたＶ領域内で維持されることは当然である。したがって、基準抗体由来のＢＳＤがＣＤＲ３−ＦＲ４の部分領域であれば、完全なＣＤＲ３−ＦＲ４の構造長が維持される、すなわち、基準抗体に由来しないＣＤＲ３−ＦＲ４の残基の残余のものは、他の残基、一般的にはヒト生殖系列残基から構成されている。
【００８４】
上述したように、ＢＳＤは、例えば、基準抗体に由来する第４フレームワーク領域を含むことができるが、これらはＪセグメントの一部であるが、哺乳動物の間で高度に保存されていて、ＣＤＲ３構造にとって重要である。これらの配列は、例えば、第３フレームワークにインフレームでライゲーションするための制限酵素部位、および、例えば、Ｃ領域にライゲーションするために第４フレームワークのカルボキシル末端の下流にその他のユニークな制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅することができる。そして、各ＣＤＲ３−ＦＲ４を、Ｖ領域ライブラリ構築物の適当な部位に移行させる。あるいは、所望の配列、またはＣＤＲ３−ＦＲ４領域に対する配列を混合したものを、１つの連続したオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの混合物として合成し、第１鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型としてレパートリから合成されたインビトロ転写ｃＲＮＡを用いたプライマー伸長法によって、Ｖセグメントレパートリに連結させることができる。多様性を、ある領域、例えば、ＣＤＲ３および／またはＦＲ４に導入することもできる。
【００８５】
また、ＢＳＤは、完全なＣＤＲ３よりも短い配列、例えば、重鎖ＣＤＲ３またはＭＥＢＳＤのＤセグメントであってもよい。当業者に理解されているように、基準抗体のＢＳＤが完全なＣＤＲ３よりも短い場合、ＣＤＲ３の残余の残基が構築物に組み込まれるため、完全なＣＤＲ３が依然として抗体発現ライブラリとなる。例えば、適当なオリゴヌクレオチドを、ヒト配列、例えば、生殖系列のＪセグメントを取り込んで、ＭＥＢＳＤの一部でないＣＤＲ３残基を置換するように設計することができる。
【００８６】
ＭＥＢＳＤは、ＣＤＲ３配列または一対のＣＤＲ３の内部にある領域であって、ＣＤＲ３の残余の部分とＶ領域の残りとを再構成するヒト配列に結合されたときに、基準抗体の結合特異性を保持するために必要とされる領域である。ＭＥＢＳＤは、経験的に画定するか、または構造を考察して予想することができる。
【００８７】
抗体ライブラリは、抗体がＩｇＧ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ、１つ以上のドメインを欠失したＩｇＧ、またはＶ領域を含むその他の抗体断片であるライブラリであってもよい。
【００８８】
抗体は、ウイルス、細胞、胞子、またはウイルス様粒子の表面上に表示させることができる。このために、抗体断片の一方または両方の鎖を、一般的には融合タンパク質、例えば、繊維状ファージの表面に表示させるためにファージコートタンパク質との融合タンパク質として発現させる。あるいは、抗体ライブラリの抗体を宿主細胞から分泌させることも可能である。
【００８９】
以下に、抗体をＦａｂまたはＦａｂ’断片として発現させるための分泌系を用いて一例を説明する。しかし、この分泌系がいかなるライブラリ方式にも適合させ得ることは、当業者にとって明白である。この一般的な例として、完全なＶ領域のライブラリを、上記したように、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメントをコードするオリゴヌクレオチドをＶセグメントレパートリにライゲーションして作製する。完全なＶ領域をコードする増幅配列を適当な発現ベクターにクローニングして、Ｆａｂ分子またはＦａｂ’分子を発現させるために、この段階で、定常領域配列に融合させることができる。これらの抗体断片は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞などの原核生物細胞または真核生物細胞から分泌させることも可能である。
【００９０】
特定の抗原に特異的な分泌抗体を検出するためのフィルタースクリーニング法が既述されている。１つの方式では、分泌された抗体断片を、可溶性抗原でプローブされる膜上にトラップする（Ｓｋｅｒｒａら、１９９１，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：１５１−５）。この場合、Ｆａｂ断片を細菌のペリプラズムに分泌させるプラスミドベクターを内部に持つ細菌を膜またはフィルター上で増殖させる。分泌された断片を、この抗体断片に結合できる抗体（例えば、抗免疫グロブリン抗血清）でコーティングされた第２の「捕捉」膜に拡散させ、この捕捉フィルターを特異的抗原でプローブする。抗体−酵素結合体を用いて、捕捉膜上の抗原結合性抗体断片を有色スポットとして検出することができる。このコロニーを第１の膜上で再増殖させ、所望の抗体断片を発現するクローンを回収する。
【００９１】
抗体を直接的に抗原被覆膜上に拡散させるコロニーリフト結合アッセイ法も既述されている。Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉらは、単鎖抗体ライブラリをスクリーニングするプロトコルについて記載している（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉら、２００１  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．５  ｅ２７）。
【００９２】
分泌された抗体断片のライブラリは、複数のクローンのプールを用いるか、またはそれぞれがユニークな抗体配列を分泌する個別クローンをスクリーニングし、ＥＬＩＳＡ法に
よってスクリーニングすることができる。個々のクローンをスクリーニングする。このような方法の１つが、Ｗａｔｋｉｎｓら、１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：３７−４５に記載されている。このケースでは、マイクロタイター用ウェルを、ウェルに直接分泌される抗Ｆａｂ抗体を捕捉するために抗Ｆａｂ抗体でコーティングした。そして、Ｆａｂサンプルを可溶性ビオチン化抗体でプローブした後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体で検出した。
融合抗体
１つの実施形態において、ポリペプチドは融合抗体であってもよい。１つの実施形態において、抗体断片は、検出および精製を促進するために１つ以上のＣ末端ペプチドタグを含むことができる。別の実施形態において、抗体を、細胞、胞子、またはウイルスの表面上に表示するために、ペプチドまたはポリペプチドに融合させることができる。例えば、抗体断片の１本の鎖を、繊維状ファージなどのバクテリオファージの表面上に融合タンパク質として表示することができる。ファージ上で抗体を表示する方法は、当技術分野において周知されており、繊維状ファージのｐＩＩＩタンパク質およびｐＶＩＩＩタンパク質に融合させることを含む。１つの好適な実施形態において、抗体−ファージタンパク質の融合物を含むペプチドの少なくとも１つを、大腸菌のｐｒｌ株内でシグナルペプチドなしで発現させ、ファージ表面上に表示する。
【００９３】
分泌された鎖は、Ｎ末端メチオニン（またはＮ−ホルミルメチオニン）を保持することができる。あるいは、および場合によっては、抗体の配列に応じて、開始メチオニンを、宿主細胞によるタンパク分解処理によって取り除くことができる。
【００９４】
また、実施態様は、他の表示技術、例えば、酵母細胞ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、および哺乳動物細胞ディスプレイなどを含む。１つの実施形態において、ライブラリメンバーのプールをスクリーニングして、スクリーニングを実施する。
【００９５】
本発明において、断片およびサブユニットの相補系を用いて、所望の特性を有する抗体を選択／スクリーニングすることができる（「相補系」）。通常、断片相補系は、再会合して機能的レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）となる２つ（またはそれ以上）の部分に断片化または分離されているレスポンダーからなる。レスポンダーの断片／サブユニットを個別に結合アンサンブルのメンバーに融合させた後、２個の結合アンサンブルメンバーの直接的または間接的な相互作用によってレスポンダーの再会合体を行わせる。好適な実施形態において、結合アンサンブルは、抗体および抗原からなる。本発明において用いることができる断片／サブユニット相補系の例は以下に開示されている。米国特許第６，３４２，３４５号、第６，２７０，９６４号、第６，２９４，３３０号、第５，５０３，９７７号、第５，５８５，２４５号、これらは、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ特許出願公報第００／７１７０２号、およびにＦｉｅｌｄｓら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４７；Ｂａｉら、１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：３３１−３４７，Ｌｕｏら、１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：３５０−３５２、これらはその全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【００９６】
本発明において、再活性化に基づく分子間相互作用系（例えば、ＲＡＩＲ．ＴＭ）を用いて、所望の特性を有する抗体を選択／スクリーニングすることができる（「再活性化系」）。通常、再活性化に基づく分子間相互作用系は、レスポンダー、インヒビター、リアクチベーター、および２つ以上のメンバーからなる結合アンサンブルからなる。この系は２つの複合体からなるが、一方はレスポンダー、インヒビター、および結合アンサンブルの１メンバー（レスポンダー複合体）であり、他方は、リアクチベーターおよび結合アンサンブルの１メンバー（リアクチベーター複合体）である。レスポンダーは、その複合体内では抑制されているが、結合アンサンブルのメンバー同士が直接的または間接的に相互
作用して、リアクチベーター複合体がレスポンダー複合体にドッキングすると、リアクチベーターが、インヒビターを置換することによってレスポンダーを「再活性化」させる。一般的には、レスポンダー複合体は、レスポンダー分子、レスポンダーのインヒビター、および第１の結合アンサンブルメンバーを含む。レスポンダー複合体の成分は、共有結合または非共有結合によって、さまざまな配置に配列することができる。好適な実施形態において、結合アンサンブルは、抗体および抗原からなる。
【００９７】
好適な再活性化系において、分子間相互作用は、「自動阻害型レスポンダーの再活性化」、すなわち「ＲＡＩＲ」名付けられたプロセスによって検出することができる。ＲＡＩＲ系は以下の構成要素、すなわち、レスポンダー複合体および賦活剤複合体を含む。自動阻害型とは、インヒビターがレスポンダーに直接結合しているため、インヒビターが置換されて、レスポンダーがリアクチベーター複合体によって活性化されるまで、基本状態では自動的に阻害されていることを意味する。この結合が共有結合によるものである場合、共有結合はさらにリンカーを含むことができる。リアクチベーター複合体は、インヒビターおよび第２の結合アンサンブルメンバーを置換するためのリアクチベーター分子を含む。レスポンダー複合体の成分と同様、リアクチベーターおよび結合アンサンブルのメンバーも、共有結合的に結合していても非共有結合的に結合していてもよい。
【００９８】
第１のアンサンブルメンバーと第２のアンサンブルメンバーの間の分子間相互作用は、以下の機構によって検出することができる。レスポンダー複合体内のレスポンダーのシグナルまたは活性が複合体内にあるインヒビターによって捕捉されている、すなわち、レスポンダーは自動的に阻害されている。リアクチベーター複合体が導入されて、レスポンダー複合体内の第２のアンサンブルメンバーが十分な親和性をもって、レスポンダー複合体内の第１のアンサンブルメンバーに結合すると、リアクチベーターが、レスポンダー複合体内のインヒビターを置換して、いわゆる「自動的に阻害されているレスポンダーを再活性化する」することができるようになる。レスポンダーの活性またはシグナルが検出されることは、第１および第２のアンサンブルメンバーに相互作用があったことを示している。
【００９９】
ＲＡＩＲ系の変種を、相互作用のマッピングのため、第１の結合対メンバーの親和性を改善するため、および複数の結合分子を等方的に選択するために利用することができる。いくつかの変種において、第３のアンサンブルメンバーを用いることができる。
【０１００】
再活性化系の例が、米国特許出願第１０／２０８，７３０号に開示されており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
競合によって活性化される分子センサーを用いる系も、所望の特性を有する抗体を選択／スクリーニングするために本発明において用いることができる。これらの系はＣＯＭＰＡＣＴ．ＴＭと名付けられている。通常、競合的活性化系は、結合アンサンブル、レスポンダーおよびインヒビターからなる。レスポンダーは、１つの結合アンサンブルメンバーと複合体を形成し、インヒビターは別の結合アンサンブルメンバーと複合体を形成している。結合アンサンブルメンバーは互いに結合し合うと、レスポンダーとインヒビターを一緒にして、レスポンダーが阻害されるようにする。そして、結合アンサンブルを崩壊させるか、または結合アンサンブルの形成を阻害してレスポンダーを活性化させる本発明の抗体を選択することができる。好適な実施形態において、結合アンサンブルは抗体および抗原であり、「競合的アクチベーター」は抗体である。例えば、結合アンサンブルの抗体は、基準抗体であるかもしれず、競合的アクチベーターは、抗原への結合について、基準抗体と競合する抗体のライブラリを含むかもしれない。本発明において利用できる競合的活性化系の例が、米国特許出願第１０／０７６，８４５号に記載されており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
そのような系は、さらに「マスク」を用いて、系の感度を制御することができる。これらの系は、２００２年２月１４日に出願された、同時係属の米国特許出願第１０／０７６，８４５号に記載されている。「マスク」は、競合的活性化系との関連においては、レポーターまたはインヒビターに対して親和性が低いため、レポーターまたはインヒビターに共有結合的に繋ぎ止められない限り、常用の濃度では検知できるほどには結合しない。マスクはレポーター活性には影響せず、ただインヒビターの結合に影響するだけであり、またこの逆の場合もある。マスクを用いて系を調節すると、バックグラウンドでの阻害が増大するのを心配することなく高親和性ンヒビターを使うことが可能になる。なぜなら、このインヒビターの会合速度定数が、レポーター・インヒビター複合体の乖離速度定数に影響を及ぼすことなく、マスクによって非常に小さくなり、それによって、高親和性のレポーター・インヒビター複合体の安定性を保持しつつ、全体の親和性を低下させることになるからである。
ライブラリ
本発明の別の実施形態において、分泌されるポリペプチドは、ｐｒｌ変異を発現する大腸菌株など原核生物宿主細胞から発現される、さまざまな結合特性を有する抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドの多様なライブラリであって、１つ以上の抗体鎖が、シグナルペプチドなしで発現されているライブラリであろう。別の実施形態において、分泌されるポリペプチドを、シグナルに依存しないで発現される。本発明のこの態様に従ったライブラリは、ＶＨサブクラスおよびＶＬサブクラスをより広範に表示する。
【０１０３】
さまざまな抗体がさまざまなレベルでペリプラズムに分泌されること、および、抗体の一定のサブクラスは、可溶性の正しく折り畳まれた形態では、わずかしか発現されないことが当技術分野において知られている。多くの場合、抗体のＶ領域の配列が、抗体が大腸菌から分泌される能力に影響を及ぼす可能性がある。例えば、マウスのＶ領域は、ペリプラズム中では十分に折り畳まれず、凝集性で不活性の抗体の蓄積を生じさせるかもしれない（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９１，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．４：９７１；ＢｏｔｈｍａｎｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３７６；Ｈｅｌｌｅら、１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１９０７）。シャペロンタンパク質は、いくつかの抗体断片の折り畳みおよび発現を改善することができる（ＢｏｔｈｍａｎｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３７６；ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＢｏｔｈｍａｎｎ、２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００）。細菌由来の抗体のいくつかのサブクラスの分泌の偏りは、ライブラリからスクリーニングすることができる抗体の配列に偏りを生じさせる可能性がある。本発明の実施形態は、シグナル非依存的に抗体鎖を分泌させることにより、機能性で正しく折り畳まれた抗体および抗体断片を、細菌の分泌系からより多く回収することに取り組み、それを可能にする。
【０１０４】
本発明の実施形態は、ナイーブライブラリおよび免疫ライブラリを含む。ナイーブライブラリは、どの免疫原も投与されておらず、感染症または炎症の症状も呈していない適当な宿主のＢリンパ球から作製される。免疫ライブラリは、適当に「免疫された」宿主、すなわち、免疫原を投与された宿主から得られたＢ細胞およびプラズマ細胞の混合物から作製される。１つの実施形態において、これらの細胞から得たｍＲＮＡを、当技術分野において周知の方法（例えば、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡに翻訳する。代替的な実施形態において、宿主細胞由来の抗体をコードする核酸（ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ）を、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅する。そのような抗体遺伝子を増幅するためのプライマーは、当技術分野においてよく知られている（例えば、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９６，５５１号、およびＰＣＴ特許出願ＷＯ００／７００２３Ａ１にそのようなプライマーが開示されている）。混合的な実施形態において、宿主細胞由来のｍＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、次にこ
れらのｃＤＮＡを、抗体特異的プライマーを用いるＰＣＲ反応で増幅する（例えば、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１９，６９０号に、そのような混合法が開示されている）。あるいは、レパートリを、ＰＣＲ法を用いずに、従来のｃＤＮＡクローニング技術（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）によってクローニングすることができる。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態において、抗体配列が互いにアラインメントされている、ヒト由来の公開抗体配列データベースを構築する。このデータベースを用いて、配列、およびＣＤＲループの正準な折り畳み（抗体構造を解析して決定されたもの）において高度な類似性を示す抗体配列のサブグループを画定する。各サブグループについて、このサブグループのメンバーを表すコンセンサス配列を推定するため、その結果、コンセンサス配列の完全なコレクションが、ヒト抗体の完全な構造レパートリを表す。
【０１０６】
次に、これらの人工遺伝子を、例えば、全遺伝子合成によって、または合成遺伝子サブユニットを利用して構築する。これらの遺伝子サブユニットは、（ポリ）ペプチドレベルでの構造的部分要素に相当する。ＤＮＡレベルでは、これらの遺伝子サブユニットは、各部分要素の開始点と終止点にある切断部位によって画定されているが、それらは、ベクター系においてはユニークなものである。コンセンサス配列コレクションのメンバーであるすべての遺伝子は、対応する遺伝子部分配列の類似パターンを含むように構築されている。最も好ましくは、前記（ポリ）ペプチドは、以下のＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子であるか、またはこれらに由来するものである：Ｖｋ１、Ｖｋ２、Ｖｋ３、Ｖｋ４、Ｖｌ１、Ｖｌ２、Ｖｌ３、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、Ｃｋ、Ｃｌ、ＣＨ１、またはこれらＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子の任意の組み合わせ。
【０１０７】
次に、このＤＮＡ分子コレクションを用いて、抗体、好ましくは、新規の標的抗原に対する特異性の由来源として利用することができるＦｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ’断片の「合成ライブラリ」を創出することができる。米国特許第６，３００，０６４号は、１０８個以上の形質転換体を含む合成ライブラリを作製する方法を開示しており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
別の実施形態において、合成ヒト抗体が、現在、画定されたＶ領域エレメントから合成によって作製されている。Ｗｉｎｔｅｒ（欧州特許出願第０３６８  ６８４  Ｂｌ号）は、抗体の可変領域遺伝子を（ＰＣＲによって）増幅し、クローニングし、また発現させる方法を提供している。これらの遺伝子から始めて、彼は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３を無作為化することによって、機能性抗体断片のライブラリを創出することができた。この方法は、免疫系においてＢ細胞が発生する過程で生じる、ＶＪおよびＶＤＪの組換え天然プロセスと機能的には同一である。例えば、ヒト生殖系列のＶＨ遺伝子セグメントのレパートリを、５個のランダムなアミノ酸残基からなる合成「Ｄセグメント」とＪセグメントに結合させることによって、インビトロで再配列させて、８個の残基からなる、合成された第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を創出することができる。米国特許第５，８８５，７９３号は、そのような抗体ライブラリ、例えば、１０７個のファージクローンを含むライブラリを創出する方法などを作製する方法を開示しており、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
本発明の態様に従った抗体断片は、可溶性の分泌抗体断片であってもよく、または細胞、胞子、またはウイルスの上で融合タンパク質として表示されていてもよい。すなわち、
例えば、この抗体ライブラリは、抗体断片の１つ以上の鎖が、ファージタンパク質との融合タンパク質として発現され、融合タンパク質を含むペプチドの少なくとも１つがシグナルペプチドなしで発現されているファージディスプレイライブラリであってもよい。抗体断片が、重鎖および軽鎖からなる場合、両鎖ともシグナルペプチドなしで発現させることが好ましい。本発明のこの態様において、宿主株は、抗体ライブラリを発現させるのに適するように選択され、ｐｒｌＡ４などの変異株であってもよく、または、別の目的のために選ばれた株、例えば、形質転換率が高い菌株で、変異型ｐｒｌタンパク質がプラスミド発現ベクターから発現する菌株であってもよい。
【０１１０】
ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩを用いて、ペプチドおよび抗体のライブラリが表示されている。免疫されていない、すなわち「ナイーブ」な抗体−ファージライブラリをｐＩＩＩ上に表示することを利用して、さまざまな標的抗原に対するヒト抗体が単離されている。抗体は、ファージタンパク質のＮ末端にｓｃＦｖ鎖、またはＦａｂ鎖の一方が融合しているｓｃＦｖ方式またはＦａｂ方式で単離することができる。前記したすべての場合で、シグナルペプチドは、抗体−ファージ融合タンパク質の分泌を行わせるために、抗体鎖のＮ末端に融合している。ファージ外殻のその他タンパク質を用いても、抗体鎖が表示されている。ｐＶＩＩおよびｐＦＸが、それぞれ、抗体の可変重鎖領域（ＶＨ）および可変軽鎖領域（ＶＬ）を表示するために用いられている。ｐＩＸディスプレイ法も、分泌のためにＰｅｌＢシグナルペプチドを用いて、ｐＩＸのＮ末端にｓｃＦｖを融合させて、ナイーブなヒト抗体ライブラリを構築するために用いられている（Ｇａｏら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９９：１２６１２）。ファージ形質導入の効率が高いために、ファージディスプレイされた抗体のライブラリは、ライブラリ当り、抗体分子が１０９個を超え、または時には抗体分子が１０１０個、さらには１０１１個を超える多様性を有する、大規模なものとなり得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、２００５年１月２０日に出願された米国特許出願第１１／０４０，１５９号に記載されているようなエピトープ集中型ヒト抗体ライブラリであってもよい。なお、この文献は、その全文が参照されて本明細書に組み込まれる。例えば、そのようなライブラリは、重鎖Ｖセグメントであって、ＣＤＲ３に結合していない重鎖Ｖセグメントの多様な集団をコードする複数の核酸を含むことができる。また、本発明は、ＣＤＲ３に結合していない軽鎖Ｖセグメントの多様な集団をコードする核酸を含むライブラリも提供する。一方または両方のライブラリのＶセグメントが、例えば、ヒト生殖系列のものであってもよい。エピトープ集中型ヒト抗体のライブラリは、大きさがライブラリあたり１０３個から１０５個の抗体という範囲になるかもしれない。
【０１１２】
抗体ライブラリは、１つ以上のサブクラスのＶＨまたはＶＬの遺伝子セグメントのメンバーを主に含む集中型ライブラリであってもよい。したがって、例えば、ヒトでは、７つの既知のＶＨサブクラス（ＶＨ１〜ＶＨ７）と１６のＶＬサブクラス（Ｖκ１〜Ｖκ６およびＶλ１〜Ｖλ１０）があり、１つ以上のＶＨサブクラスのメンバーを、Ｖκ鎖またはＶλ軽鎖の多様性型ライブラリと組み合わせて含む集中型ライブラリを構築することができる。あるいは、１つ以上のＶＬサブクラスの集中型ライブラリを、重鎖の多様性型ライブラリと組み合わせることもできる。さらなる選択肢として、単一のＶＬサブクラスと単一のＶＨサブクラスのメンバー主に含む集中型ライブラリを構築することもできる。シグナル依存的に発現される場合、一般的にはＶＨ３サブクラスの抗体断片が大腸菌の中で効率的に発現される。他のＶＨサブクラスの抗体は、シグナルペプチドを用いて効率的には分泌されない。同様に、マウスのＶ領域を有する抗体断片も、シグナルペプチドを用いてはうまく分泌されない。本発明は、さまざまなサブクラスの分泌抗体の表現を向上させ、マウスＶ領域を含む抗体ライブラリの効率的な分泌を可能にする。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明は、１対のＶ領域が、ｉ）基準抗体からのヒトＶセグメ
ントおよび重鎖ＣＤＲ３を含む非選択的重鎖Ｖ領域、およびｉｉ）基準抗体からのヒトＶセグメントおよび軽鎖ＣＤＲ３を含む非選択的軽鎖Ｖ領域を含む、複数のヒト抗体Ｖ領域対を含むライブラリを提供する。
【０１１４】
別の実施形態において、このライブラリは、ＶＨおよびＶＬのＶセグメントがそれぞれ、対象とする基準抗体のＭＥＢＳＤに連結している、ヒト抗体のＶ領域対をコードする核酸を含むライブラリである。
【０１１５】
また、本発明のライブラリは、Ｖ領域がＤセグメントおよび／またはＪセグメントを有さない、１つのＶＨサブクラスまたはＶＬサブクラスのＶセグメントを含む、複数のＶＨ領域またはＶＬ領域をコードする核酸を含んでいてもよい。１つの実施形態において、ＶＨ領域のＶセグメントは生殖系列のものであり、および／または、ＶＬ領域のＶセグメントは生殖系列のものである。
【０１１６】
また、本発明は、複数のヒト抗体Ｖ領域対を含むライブラリであって、１対が、ｉ）多様なＶセグメントに結合している基準抗体からの重鎖ＣＤ３の結合特異的決定基であるＢＳＤを含む重鎖Ｖ領域、およびｉｉ）多様なＶセグメントに結合している基準抗体からの軽鎖ＣＤＲ３のＢＳＤを含む軽鎖Ｖ領域を含むが、ただし、少なくとも１つのＢＳＤが基準抗体のＣＤＲ３よりも少ないものを含むライブラリを提供する。
多量体タンパク質
多量体タンパク質のポリペプチドサブユニットを適正に集合させて、安定した複合体を形成することが、多量体タンパク質の生物学的機能を確保するためには必要である。本発明の実施形態によって、選択された単量体ポリペプチドが発現、分泌、および集合して、細胞質の外でヘテロ多量体の効率的な産生が可能になる。本発明の方法では、多量体タンパク質の単量体ポリペプチドの１つ以上を、シグナル配列なしで作製することができ、それ以外の単量体ポリペプチドを、シグナル配列の有無に関わらず発現させることができる。本発明によって作製できる集合した多量体タンパク質には、抗体、抗体断片、または抗体関連ポリペプチドなどがある。
核酸
本発明の方法において有用な核酸配列、すなわち、本発明の方法において分泌される各ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を少なくとも一部コードする核酸配列、または本発明のライブラリの中で発現される核酸配列もしくは本発明のライブラリを含む核酸配列は、天然のもの、合成されたもの、またはそれらが混合したものであってもよい。それらは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。好適な実施形態において、核酸は抗体をコードしている。
【０１１７】
組換えＤＮＡ論理法を用いて、酵素消化によっては作ることのできない抗体断片を創出することができる。したがって、本明細書において、抗体という用語は、全長抗体を改変することによって作製されるか、または、組換えＤＮＡ論理法を用いてデノボで合成される抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ）、もしくはファージディスプレイを用いて同定される抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４参照）も含む。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、組換え遺伝学の分野における日常的な技術を用いて得ることができる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編、２００１、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＡｕｓｕｂｅｌ編、１９９７、分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０１１８】
しばしば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、プローブを用いたハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライブラリからクローニングされるか、オリゴヌクレオチドプライマーによる増幅技術を用いて単離される。増幅技術を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡから配列を増幅および単離することができる（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、１９９５、ＰＣＲプライマー：実験マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）参照）。あるいは、重複したオリゴヌクレオチドを合成によって作製し、１つ以上のドメインを作製するために結合させることができる。構成要素ドメインをコードする核酸も、抗体をプローブとして使用して、発現ライブラリから単離することができる。
【０１１９】
ＰＣＲを用いて本発明のポリペプチドをコードする核酸を得るという例において、１個の制限酵素部位を含むセンス鎖プライマーと別の制限酵素部位を含むアンチセンス鎖プライマーとを用いて、核酸の配列または部分配列をＰＣＲ増幅する。これにより、所望のポリペプチドをコードし、末端に制限酵素部位を有する核酸が作製される。こうして、この核酸は、適当な対応する制限酵素部位を有するベクターに簡単にライゲーションすることができる。所望のポリペプチドが融合タンパク質である場合には、これらのドメインを直接結合させることもでき、リンカーやその他のタンパク質配列によって隔てることも可能である。適当なＰＣＲプライマーは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）その他の情報源で提供されている配列常法を用いて、当業者において決定できる。また、部位特異的変異誘発法を用いて、タンパク質またはタンパク質の部分配列をコードする核酸に適当な制限酵素部位を付加することもできる。本発明のポリペプチドをコードする配列を含むプラスミドを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、その後、標準的な方法によって増幅および／または発現させるために適当なベクターにライゲーションする。
【０１２０】
インビトロ増幅法によって当業者に教示するのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびに、参照してその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号；Ｉｎｎｉｓら編、１９９０、ＰＣＲプロトコル：方法および応用への手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、１９９０、Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：８１−９４；Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８９、Ｇｅｎｅ  Ａ：５６０；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０、Ｇｅｎｅ  ８９：１１７に記載されている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを改変することが望ましいかもしれない。当業者は、所定の核酸構築物に変化を生じさせる多くの方法を知っていよう。そのような周知の方法には、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅法、核酸を含む細胞を変異原または放射線に曝露する方法、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成法（例えば、高分子の核酸を生成させるためにライゲーションおよび／またはクローニングを伴う）、およびその他の周知技術が含まれる。例えば、ＧｉｌｉｍａｎおよびＳｍｉｔｈ、１９７９、Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４参照。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を改変して、選択された生物における核酸の翻訳を促進する好適なコドンが提供される（例えば、酵母
で発現させるため、コーディング核酸の中に酵母に好適なコドンを置換する）。
【０１２３】
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同等のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。本発明に係るポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、より一般的には、少なくとも約９０％、およびさらにより一般的には、少なくとも約９５％の配列同一性を、本発明のポリヌクレオチドに対して有する。本発明は、また、上記したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より一般的には、少なくとも約９０％、およびさらにより一般的には、少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体も提供する。このポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡでもよい。このようなポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは当技術分野において周知であり、例えば、所望の配列同一性を有するポリヌクレオチドを常法として単離することができるハイブリダイゼーション条件を決定する方法などが含まれ得る。
【０１２４】
本発明において有用な核酸は、自然に多様なものであるか、それら自然に多様なメンバーに合成による多様性を導入するか、または、その多様性がすべて合成されたものであってもよい。例えば、合成による多様性は、抗体遺伝子の１つ以上のＣＤＲに導入することも可能である。好ましくは、免疫グロブリンのＣＤＲ１およびＣＤＲ２の中に導入される。好ましくは、天然の多様性は、Ｂ細胞から本発明の免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ３領域に捕捉されている。もっとも好ましくは、本発明の核酸は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の少なくとも一方、より好ましくは、その両方に合成による多様性と、Ｂ細胞から捕捉したＣＤＲ３における多様性とを含む免疫グロブリン遺伝子の集団を含む。
【０１２５】
本発明に係るタンパク質アナログをコードする核酸（すなわち、１個以上のアミノ酸が野生型ポリペプチドとは異なるよう設計されているもの）を、部位特異的変位誘発法、またはプライマーが所望の点突然変異を有するＰＣＲ増幅を用いて作製することができる。適当な変異誘発技術についての詳細な説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．および／またはＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．参照。Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９によってＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．編、第２８巻７１６−７３４頁に記載された方法を用いた化学合成法を用いて、そのような核酸を調製することも可能である。
【０１２６】
「組換え変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失、および置換によって天然のポリペプチドとは異なっている、組換えＤＮＡ技術を用いて創出されたポリペプチドを意味する。酵素活性や結合活性などの目的とする活性を失うことなく、どのアミノ酸残基を置換、付加、または欠失することができるかを決定する上での手引きは、具体的なポリペプチドの配列を、相同ペプチドの配列と比較し、相同性が高い領域に起きるアミノ酸配列の変化を最少にすることで見つけることができる。
【０１２７】
好ましくは、アミノ酸の「置換」は、あるアミノ酸を、同じような構造特性および／または化学特性を有する別のアミノ酸に置き換えた結果、すなわち、保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトフ
ァン、およびメチオニンが含まれ、極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正荷電性（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、また負荷電性（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１２８】
「挿入」または「欠失」は、一般的には、約１個から５個のアミノ酸である。許容される変動は、組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチドにアミノ酸の挿入、欠失、または置換をシステマティックに作製し、得られた組換え変異体の活性を測定することによって実験的に決定することができる。
【０１２９】
あるいは、機能が変化することが望ましい場合には、挿入、欠失、または非保存的改変を操作して、改変ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを作製することができる。このような改変によって、例えば、本発明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特徴の１つ以上を改変することができる。例えば、このような改変によって、リガンド結合親和性、鎖間の親和性、または分解／代謝回転率などのポリペプチドの特徴を変えることができる。さらに、このような改変は、発現用に選択した宿主細胞における発現、スケールアップなどにより適したポリペプチドを作製するために選択することもできる。例えば、ジスルフィド架橋を除去するために、システイン残基を欠失させるか、別のアミノ酸残基で置換することができる。
【０１３０】
あるいは、遺伝子コードの「重複」を利用して、これら同一または類似したポリペプチドをコードする組換え変異体を合成または選択することができる。多様な制限酵素部位を生み出すサイレント変異など、さまざまなコドン置換を導入して、プラスミドベクターもしくはウイルスベクターへのクローニングを最適化するか、または特定の原核生物もしくは真核生物の系における発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列における変異は、そのポリペプチド、またはそのポリペプチドの任意の部分の性質を変更するために付加された別のペプチドのドメインに反映されて、リガンド結合親和性、鎖間の親和性、または分解／代謝回転率などの特徴を変化させる。
【０１３１】
本発明の核酸配列は、既述された核酸の変異体をコードする配列にも係る。これらのアミノ酸配列変異体は、当技術分野において既知の方法により、適当なヌクレオチド変異を天然型または変異型のポリヌクレオチドに導入することによって調製することができる。アミノ酸配列変異体の構築には、変異の位置および変異の性質という２つの変数がある。核酸のアミノ酸配列変異体は、好ましくは、ポリヌクレオチドを変異させて、自然には存在しないアミノ酸配列を生じさせることによって構築される。これらのアミノ酸改変は、核酸が別種とは異なる部位（可変位置）、または高度に保存された領域（定常領域）で作り出すことができる。そのような位置にある部位は、一般的に、例えば、まず、保存的な選択により（例えば、疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に）、次に、より関連性の薄い選択により（例えば、疎水性アミノ酸を荷電性アミノ酸に）置換することによって、連続して変更させることができ、さらに、標的部位に欠失または挿入を行うことができる。
【０１３２】
アミノ酸配列の欠失は、通常、約１〜３０残基の範囲であり、好ましくは、約１〜１０残基であり、一般的には連続している。アミノ酸の挿入には、１残基から１００残基以上の長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端における融合、および配列内への１個または複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。配列内挿入は、通常、約１個から１０個のアミノ酸残基、好ましくは１残基から５残基の範囲であろう。末端への挿入の例には、異なる宿主細胞において細胞内標的するのに必要な異種シグナル配列が含まれる。
【０１３３】
好適な方法において、新規の核酸をコードするポリヌクレオチドが、部位特異的変異誘発法によって変更される。この方法は、所望のアミノ酸変異体のポリヌクレオチド配列を
コードするオリゴヌクレオチド配列、および変更する部位の両側で安定した２重鎖を形成させるために、変更するアミノ酸の両側にある十分な隣接ヌクレオチドを用いる。一般的に、部位特異的変異誘発技術は当業者に周知されており、この技術は、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９８３，ＤＮＡ  ２：１８３などの刊行物に例示されている。ポリヌクレオチド配列に部位特異的変化を生じさせる多用途で効率的な方法が、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００に公表されている。
【０１３４】
また、ＰＣＲを用いて、新規核酸のアミノ酸配列変異体を創出することもできる。少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合には、鋳型ＤＮＡの対応領域の配列と僅かに異なるプライマーによって、所望のアミノ酸変異体を生じさせることができる。ＰＣＲ増幅によって、プライマーによって特定された位置で、コラーゲンをコードするポリヌクレオチド鋳型と異なる産物であるＤＮＡ断片の集団ができる。このＤＮＡ断片産物は、プラスミド中の対応領域を置換し、それによって、所望のアミノ酸変異体が得られる。
【０１３５】
アミノ酸変異体を生じさせる更なる技術は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５に記載されているカセット変異誘発技術、および、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、および分子生物学最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｕｓｕｂｅｌらの技術のように、当技術分野において周知されているその他の変異誘発技術である。
【０１３６】
遺伝子コードは元来縮重しているため、これら新規の核酸をクローニングおよび発現させるために本発明を実施する際には、実質的に同一または機能的に同等のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を使用することができる。このようなＤＮＡ配列には、適当な新規の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列が含まれる。また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重のせいで非常に異なった核酸配列を有する核酸も、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３７】
宿主細胞
本発明の別の態様では、シグナルペプチドを必要としないで、抗体または抗原結合抗体または多量体タンパク質の分泌を可能にする原核生物宿主細胞が提供される。本発明で用いるのに適した菌株は、一般的に高い透過性を有するものではなく、本発明の抗体および抗体断片など、分泌されるよう自然に方向づけられているタンパク質を選択的に分泌する。好適な実施形態において、原核生物は、好ましくはグラム陰性細菌であり、もっとも好ましくは大腸菌である。
【０１３８】
グラム陰性菌では、細胞質からペリプラズムへの、または内膜および外膜を通してのタンパク質の分泌については多数の経路が記載されており、伝統的には、４つの異なった系に分類される。ＩＩＩ型およびＩＶ型の系は、通常、細菌のタンパク質を隣接する真核生物宿主細胞に直接移行させるために用いられる。Ｉ型の系は、外膜と内膜を連結する「トンネル」を形成するため、この経路によって搬送されるタンパク質は、細胞外の培地に直接分泌される結果となる。ＩＩ型の分泌系は、一般分泌経路すなわちＳｅｃ経路としても知られており、大部分のタンパク質が内膜を通してペリプラズムに分泌されるのに関与している。特異的Ｎ末端シグナルペプチドを利用して、ペリプラズムを介するタンパク質の直接的分泌を行わせる、さらに別の分泌系がツインアルギニン移行（ＴＡＴ）経路である。緩やかに折り畳まれたタンパク質をペリプラズムに分泌し、そこでタンパク質の集合が起きるＳｅｃ系とは対照的に、ＴＡＴ経路は、既に折り畳まれた酵素を分泌させるために用いられる（Ｂｅｒｋｓら、２００５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ８：１７４−１８１に概説されている）。
【０１３９】
ＩＩ型の分泌系は、組換えタンパク質を大腸菌から分泌させるために広く用いられてきた。本発明の実施形態において、宿主細胞は、ＩＩ型経路すなわちＳｅｃ経路に変異遺伝子を含む。短いＮ末端シグナル配列を組換えタンパク質に付加すると、組換えタンパク質をこの経路に向けさせるのに役立ち、シグナルペプチドは分泌過程で除去される。この経路を用いて、ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢ、およびＰｈｏＡなど、この経路を用いて自然に分泌される細菌タンパク質のシグナル配列によって方向づけられる、Ｆａｂ断片などの抗体断片を発現させていた。抗体の重鎖および軽鎖は、ペリプラズムで集合して、抗原結合Ｆａｂ断片を形成することが示されている（例えば、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：９７１−９７９）。
【０１４０】
Ｓｅｃ経路の移行機構は、十分に研究された酵素複合体のトランスロカーゼであり、いくつかの内在性膜タンパク質と、移行のためのエネルギーを提供する結合ＡＴＰａｓｅとからなる（ＦｅｋｋｅｓおよびＤｒｉｅｓｓｅｎ、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３：１６１−１７３；ｖａｎ  ｄｅｒ  ＷｏＩｋら、１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：３６３１−３６３９に概説されている）。この酵素複合体の中心は、ＳｅｃＹタンパク質、ＳｅｃＥタンパク質、およびＳｅｃＧタンパク質（ＳｅｃＹＥＧ複合体）からなる、膜に埋め込まれたヘテロ３量体と、周辺にあるホモ２量体のＡＴＰａｓｅであるＳｅｃＡとからなる。ＳｅｃＤタンパク質、ＳｅｃＦタンパク質、およびＹａｊＣタンパク質は別のヘテロ３量体複合体を形成し、ＳｅｃＹＥＧ複合体と会合して完全なトランスロカーゼを形成する。
【０１４１】
新しく合成された前駆体タンパク質に、シャペロンであるＳｅｃＢが結合して、前駆タンパク質を、移行するのに適した緩やかに折り畳まれた立体構造に安定化させる。ＳｅｃＢおよびシグナル配列は、前駆タンパク質を膜に標的し、両者とも、高い親和性をもってＳｅｃＹＥＧ複合体のＳｅｃＹサブユニットに結合しているＳｅｃＡと会合する。ＳｅｃＢ−ＳｅｃＡ相互作用の結果、前駆タンパク質がＳｅｃＡに移行し、ＳｅｃＡが、そのシグナル配列とその成熟ドメインに結合する。ＳｅｃＢが膜から遊離するには、ＡＴＰが、ＳｅｃＡの２つのＡＴＰ結合部位の一方に結合する必要がある。この段階で、シグナル配列のループと、前駆タンパク質のＮ末端領域が、膜のペリプラズム表面に提示されて、シグナル配列がリーダーペプチダーゼによって切断できるようになる。
【０１４２】
前駆タンパク質のＮ末端シグナル配列は、ＳｅｃＡによる前駆タンパク質の認識という、初期の標的事象にとって重要であると考えられてきた。異常なシグナル配列は、トランスロカーゼによって効率的に認識されず、その結果、移行ができなくなる。
【０１４３】
Ｉ型分泌系も、大腸菌からの異種タンパク質の分泌を指示するために用いられてきた。本発明の実施形態において、宿主細胞は、Ｉ型分泌系に変異遺伝子を含む。Ｉ型経路の構成成分によって認識される分泌シグナルは、分泌タンパク質のカルボキシ末端に位置しており、ほとんどの場合、分泌シグナルは、分泌の間にもその後にも切り離されることがない。よく特徴が分かっている大腸菌タンパク質でＩ型分泌経路を介して分泌されるのはα−溶血素である。溶血素のＣ末端領域をｓｖＦｖコード配列のＣ末端に融合させることによって、このタンパク質のシグナル配列が、ｓｃＦｖ抗体断片など、いくつかの異種タンパク質の分泌を指示するために用いられてきた（ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＬｏｒｅｎｚｏ、２００１、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：３３２−３４６）。この場合、Ｃ末端にある溶血素のシグナルペプチドは、分泌産物にも保持されていた。
【０１４４】
正常に分泌される大腸菌タンパク質で、シグナル配列に欠損があるか、これを持たないものを効率的に分泌させることができる、Ｓｅｃ系構成成分におけるいくつかの変異が知られている。このようなタンパク質局在化（ｐｒｌ）変異が、例えば、ＳｅｃＹ（ｐｒｌ
Ａ）、ＳｅｃＥ（ｐｒｌＧ）、ＳｅｃＧ（ｐｒｌＨ）およびＳｅｃＡ（ｐｒｌＤ）など、Ｓｅｃ系の多数の構成成分で同定されている（ＢｏｓｔおよびＢｅｌｉｎ、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２：４０８７−９３、本文献は、その全文が参照されて本明細書に組み入れられる）。
【０１４５】
ｐｒｌ変異が、シグナルペプチドが完全に存在しないときに、いくつかの天然分泌型の大腸菌タンパク質の分泌をレスキューできることが分かっている。すなわち、シグナルペプチドを持たない大腸菌のマルトース結合タンパク質およびアルカリホスファターゼが、ｐｒｌＡ変異体から分泌されている（Ｄｅｒｍａｎら、１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８７９）。バクテリオファージのタンパク質であるＬａｍＢも、ｐｒｌＡ変異体ではシグナル配列なしで分泌され得る（Ｆｌｏｗｅｒら、１９９４，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６：１８）。しかし、真核生物のタンパク質のような異種タンパク質は、シグナル配列なしでｐｒｌ変異株ら分泌されることは、これまで明らかになっていない。Ｗｏｎｇら、１９８８，Ｇｅｎｅ  ６８：１９３は、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ遺伝子由来のシグナル配列を用いて、大腸菌からインスリン様成長因子１を分泌させることに成功し、ＬａｍＢ−ＩＧＦ−１およびＯｍｐＦ−ＩＧＦ−１の処理効率が、ｐｒｌＡ４変異を有する菌株では高まることを明らかにした。ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、またはＯｍｐＦのシグナルペプチドに融合したヒトＣＤ４も、ｐｒｌＡ変異体において効率的に発現されることが明らかになっている（Ｒｏｃｋｅｎｂａｃｈら、１９９１，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：３２−７）。プラスミドベクター上でのＳｅｃＹ変異体の過剰発現も、大腸菌からのヒトタンパク質の発現を促進させるために検討されてきた。このように、ｐｒｌＡ４変異体のＳｅｃＹタンパク質は、ｓｅｃＥとともに、ＯｍｐＡのシグナルペプチドに融合したヒトＩＬ−６の分泌を増加させた（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚら、１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１７８）。
【０１４６】
また、ｐｒｌＡ菌株は、ｐＩＩＩシグナルペプチドを用いて繊維状ファージｆｄの表面上に提示されるペプチドの多様性を増進させたり（Ｐｅｔｅｒｓら、１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４２９６）、ＰｈｏＡシグナルペプチドからファージ融合タンパク質としてウシ膵臓トリプシンインヒビターを発現させたりする（その全文が参照されて本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒら）ためにも利用されている。このように、ｐｒｌＡ変異タンパク質は、シグナルペプチド依存的に発現される一定の真核生物タンパク質の発現を促進することができると考えられる。
【０１４７】
細胞から正常に分泌されるタンパク質は、シグナル配列なしで大腸菌内で組換え発現させると、しばしば封入体を形成する。例えば、抗体の重鎖および軽鎖、または抗体断片をコードする遺伝子を、シグナル配列なしで大腸菌内で発現させたら、産生されるタンパク質は、一般的に、不溶性産物として細胞の内部にある封入体に蓄積する（Ｂｏｓｓら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：３７９１；Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３）。このようなタンパク質は、細胞膜を通過する輸送には利用できず、機能的なタンパク質を形成しない。封入体からの抗体断片を再び折り畳ませる方法が、米国特許第６，３３１，４１５号および第４，８１６，５６７号に記載されている。しかし、抗体を作製するためのこのような方法は効率が悪く、機能的な抗体の收率が低いため、ライブラリをスクリーニングする目的には用いることができない。
【０１４８】
本発明の好適な実施形態において、原核生物宿主細胞は、コードされたシグナルペプチドの不在下で抗体の分泌を可能にする分泌装置の１つ以上の構成成分にｐｒｌ変異を含む。ｐｒｌ変異体は、シグナルのない単量体タンパク質の分泌を可能にする変異であり、ＳｅｃＹ遺伝子、ＳｅｃＡ遺伝子、ＳｅｃＥ遺伝子、もしくはＳｅｃＧ遺伝子、またはその他の遺伝子の活性に影響を与える変異を含む可能性がある。また、ｐｒｌ変異体は、シグ
ナルペプチドとともにコードされているタンパク質のシグナル依存的な態様での分泌も可能にする。本発明の１つの実施形態は、ｐｒｌ変異を有する宿主株の中で、シグナル配列を有する抗体ポリペプチドを分泌させること、および、抗体を機能的な多量体タンパク質に集合させることを含む。これは予想外の結果である。なぜなら、分泌と鎖の集合は、密接に協調していると考えられているからである。別の実施態様は、ｐｒｌ変異を有する宿主株の中で、シグナル配列のないポリペプチドを分泌させることを含む。好ましくは、ｐｒｌ変異は、ＳｅｃＹ（ｐｒｌＡ）またはＳｅｃＥ（ｐｒｌＧ）に変異を含む。最も好ましくは、ｐｒｌ変異体は、ｐｒｌＡ４変異株（ＥｍｒおよびＢａｓｓｆｏｒｄ、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５７：５８５２−５８６０）のように、ＳｅｃＹに１つ以上の変異を含む。ｐｒｌＡ４アリルは、ｓｅｃＹ遺伝子に２つのミスセンス変異を含み、Ｆ２８６ＹおよびＩ４０８Ｎというアミノ酸置換を生じている。最も好ましくは、ｐｒｌＡ変異体が、ｓｅｃＹに少なくともＩ４０８Ｎ変異を含む。ｐｒｌＡ４変異体のＳｅｃＹタンパク質の配列を図１に示す。
【０１４９】
ｐｒｌ変異体は、大腸菌のｐｒｌＡ４変異株のように、宿主株の染色体にｐｒｌ変異を含むことができる。あるいは、ｐｒｌ変異体は、例えば、プラスミドによる発現ベクターにおける発現など、変異Ｓｅｃ遺伝子の追加的コピーの過剰発現によって誘導することも可能である。すなわち、例えば、ｐｒｌ変異体は、プラスミド上で発現する変異型のＳｅｃＹ遺伝子またはＳｅｃＥ遺伝子を含み得る。このようなプラスミドは、所望の時にだけシグナル配列のないポリペプチドの分泌を誘導できる構成的または誘導的なプロモーターを用いて構築することができる。大腸菌における発現を調節する方法は、当技術分野において周知であり、ＩＰＴＧによって誘導できるｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、またはｔａｃプロモーター、およびアラビノースによって誘導できるプロモーターなどの誘導型プロモーターを利用することを含む。変異型Ｓｅｃ遺伝子は、大腸菌由来の変異型Ｓｅｃ遺伝子でも、別のグラム陰性細菌に由来するものでもよい。したがって、例えば、シグナルペプチドなしで発現されたＦａｂ断片を分泌できるようにするため、ＳｅｃＹのｐｒｌＡ４変異型を、大腸菌宿主細胞中のプラスミドから発現させることができる。
【０１５０】
宿主細胞は、Ｗ３１１０など、野生型の大腸菌株であるか、または、別の大腸菌株であってもよい。適当な宿主菌株は、ＴＯＰ１０、ＤＨ５、ＤＨ５α、Ｏｒｉｇａｍｉ、およびＨＢ１０１などである。宿主細胞は、異種タンパク質の折り畳み、集合、および分泌に影響を与える別のシャペロンおよび遺伝子に変異を提供するものを選択することができる。細菌のＤｎａＫ系およびＧｒｏＥ系などの分子シャペロンを組み合わせると、シャペロニンと相互作用するが、なお適正に折り畳まれることができないタンパク質が再び折り畳まれるよう補強することが実証されている（Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｈ．，Ｈｅｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｔ．，Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ，Ｈ．Ｊ．，およびＢｕｋａｕ，Ｂ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６１，３２８−２３３，Ｐｅｔｉｔ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｄａｌｅ，Ｗ．，Ｏｓｉｐｉｕｋ，Ｊ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｍ．，Ｍｃｌｎｅｒｎｅｙ，Ｐ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｅｃｈｏｌｓ，Ｈ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３８２４−２３８２９）。また、ＤｎａＫは、新たに合成されたタンパク質の折り畳みを、トリガー因子と協調して行う。
【０１５１】
さまざまな機能アッセイ法における抗体断片のスクリーニングについて分泌を可能にするために、本発明のライブラリの実施形態を、ｐｒｌ変異型菌株の中で発現させることができる。同一のベクターを、抗体分子を再改造する必要なしに細胞内で発現させるための別の大腸菌株において発現させることができる。例えば、ジスルフィド結合の形成を可能にするために細胞質の酸化をもたらすためのｔｒｘＢ  ｇｏｒ変異体を用いて、抗体断片を効率的に産生させるために細胞内発現を用いることができる。正しく折り畳まれ、集合したＦａｂ断片の高量発現を、グルタチオン酸化還元酵素（ｇｏｒ）遺伝子およびチオレ
ドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ）遺伝子に変異を有する大腸菌の細胞質の中で行うことができる（Ｖｅｎｔｕｒｉら、２００２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１−８）。分子シャペロンの同時発現を用いて、正しく折り畳まれた抗体断片の発現および集合をさらに促進することができる（Ｌｅｖｙら、２００１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２３：３３８−４７；Ｊｕｒａｄｏら、２００２  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２８：３２０：１−１０）。
【０１５２】
本発明の別の実施形態は、第２の分泌経路である、ツインアルギニン移行すなわちＴＡＴ経路における変異体を含む。これは、すべてのｔａｔ依存性シグナルペプチドを本発明に包含しようとするものである。具体例は、ｐｈｏＤ配列およびｌｉｐＡ配列を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
本発明の別の実施形態は、第３の分泌経路である、ＩＩＩ型分泌系と呼ばれる経路を含む。ＩＩＩ型分泌装置は、人間、動物、および植物に対して病原性を有する数多くのグラム陰性細菌（シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、およびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）の種のメンバーなど）の中に存在する。例えば、Ｓｅｃ依存性ＩＩＩ型分泌経路は、エルシニア抗宿主タンパク質の分泌に関係する。サルモネラ種およびシゲラ種では、それは、上皮細胞の中に侵入する過程に関与する。また、それは、ＥＰＥＣシグナル伝達タンパク質、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）毒素、および多くの植物病原菌の病原因子、ならびに、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌の鞭毛の集合にも関与する。
【０１５４】
この分泌経路の特徴には、細菌が宿主細胞と接触することによって分泌が活性化されること（Ｍｅｎａｒｄら、１９９４，シゲラ  フレキシネリＩｐａインベイシンの分泌は、上皮細胞によって活性化され、ＩｐａＢとＩｐａＤによって調節される（Ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  Ｉｐａ  ｉｎｖａｓｉｎｓ  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ＩｐａＢ  ａｎｄ  ＩｐａＤ），ＥＭＢＯ  Ｊ，１３：５２９３−５３０２；Ｗａｔａｒａｉら、１９９５，シゲラ菌の宿主細胞との接触は、Ｉｐａインベイシンの放出を開始し、侵襲性の重要な機能である（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｏｆ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｗｉｔｈ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｉｐａ  ｉｎｖａｓｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）、ＥＭＢＯＪ．，１４：２４６１−２４７０；ＺｉｅｒｌｅｒおよびＧａｌａｎ、１９９５，培養上皮細胞との接触は、ネズミチフス菌の侵入タンパク質ＩｎｖＪの分泌を刺激する（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｉｎｖａｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＩｎｖＪ），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３：４０２４−４０２８）；分泌タンパク質の中には、宿主細胞の細胞質の中に送達されるものがあること（Ｒｏｓｑｖｉｓｔら、１９９４、標的細胞との接触は、エルシニアＹｏＰＥサイトトキシンの発現と哺乳動物細胞への極性移行を開始させる（Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ＹｏｐＥ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ），ＥＭＢＯＪ．，１３：９６４−９７２；ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｌｓ，１９９４，エルシニア・エンテロコリチカからＨｅＬａ細胞へのハイブリッド型ＹｏｐＥ−アデニル酸シクラーゼの移行（Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ＹｏｐＥ−ａｄｅｎｙｌａｔｅ−ｃｙｃｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｉｎｔｏ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ），Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４：５８３−５９４；Ｗｏｏｄら、１９９６，サルモネラ・ダブリンの分泌タンパク質であるＳｏｐＥは、ｓｉｐ依存性のメカニズムによって標的真核生物細胞に移行され、細菌の侵入を促進する（ＳｏｐＥ，ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ，ｉｓ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｖｉａ  ａ  ｓｉｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｒｙ），Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２２：３２７−３３８；ＣｏｌｌａｚｏおよびＧａｌａｎ、１９９７，ネズミチフス菌の侵入関連ＩＩＩ型系は、Ｓｉｐタンパク質の宿主細胞への移行を指示する（Ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｓｉｐ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ），Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２４：７４７−７５６）；および、分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写は、調節タンパク質の分泌によって調節されること（Ｈｕｇｈｅｓら、１９９３，負の調節因子を搬出することによって、細菌の鞭毛の集合における中間体を検知すること（Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ
ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２７７−１２８０；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、１９９６，病原菌と標的細胞との接触による病原因子発現の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｃｔ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１２３１−１２３３）などがある。
【０１５５】
本発明のこの態様の別の実施形態では、宿主株を、分泌に影響を与える別の変異について選択することができる。この目的で、分泌された選択マーカーをシグナルペプチドなしで宿主細胞において発現させ、マーカータンパク質を分泌できる変異株を選択する。宿主菌株は、変異の数を増加させる変異原で処理するか、または、トランスポゾンによる変異誘発など、変異を導入するその他の方法を用いることができる。適当なマーカータンパク質はβ−ラクタマーゼであり、これは、アンピシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性を付与する。β−ラクタマーゼはシグナルペプチドなしで発現させ、アンピシリン耐性変異体を選択する。ｐｒｌ変異を同定するために、シグナルペプチド不在下で、抗体断片など別のタンパク質を分泌できるかについて、これらの変異体をスクリーニングする。この方法によって、シグナル配列なしで分泌を可能にする変異を、野生型Ｗ３１１０菌株、または高い形質転換頻度を有する菌株、または別のシャペロンタンパク質に変異を有する菌株など、任意所望の大腸菌株に導入することができる。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施態様は、単一または複数のプロテアーゼ欠損変異型宿主を利用する。さまざまなタンパク質が、微生物によって正常に産生されるさまざまなプロテアーゼに対し、程度の差はあるが感受性である。ｏｍｐＴおよびｄｅｇＰ、プロテアーゼＩＩＩ、Ｌａプロテアーゼ、ＣｌｐＹＱ、ＣｌｐＸＰ、およびＣｌｐＡＰなどのプロテアーゼに欠損がある菌株を使用することができる。
【０１５７】
本発明は、以下の実験の詳細からよりよく理解できよう。ただし、検討されている具体的な方法および結果は、後述する請求の範囲により詳細に記載されている発明を例示したものにすぎないと、当業者は容易に理解できるはずである。
【実施例】
【０１５８】
実施例１．シグナルペプチドを有さないヒト抗ＰｃｒＶ  Ｆａｂ断片の発現および分泌
ヒト抗体１Ａ８のＦａｂ断片を、シグナルペプチドなしで、大腸菌変異株ｐｒｌＡ４か
ら発現および分泌させた。Ｆａｂ  １Ａ８は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰｃｒＶタンパク質上のエピトープに高い親和性をもって特異的に結合する、操作されたヒト抗体断片であり、同じエピトープに対して同定されたマウス抗体Ｍａｂ１６６と結合について競合する（Ｆｒａｎｋら、２００２、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１８６：６４−７３）。１Ａ８の軽鎖はＶｋ１−κ軽鎖からなり、Ｆｄ鎖は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインに融合したＶＨ３サブクラスＶ領域である。
【０１５９】
Ｆａｂ  １Ａ８を発現させるためのシグナルを有さない発現ベクターは、以下のようにしてｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から得られた。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１のアンピシリン耐性遺伝子をＡａｔＩＩおよびＡＩｗＮＩで消化して欠失させ、プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）からＰＣＲ増幅させて得たクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えてｐＧＥＸ−ＣＡＴを生じさせた。ＰＣＲ変異誘発法によって、２５６位のＴからＡへの点突然変異を生じさせて、ｐＧＥＸ−ＣＡＴのｐＴａｃプロモーターの下流にある翻訳開始コドンの直前にユニークなＢｓｔｌ１０７Ｉ制限酵素部位を導入した。
【０１６０】
ｐＧＥＸ−ＣＡＴのｐＴａｃプロモーターは、ＫＢ−Ｌベクターを生じさせるために以下のプライマーを用いたＰＣＲによってＢｓｔｌ１０７Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングされた軽鎖を発現させるために用いられた。Ｔ７ターミネーター配列が、プライマー２のＥｃｏＲＩ部位の前に組み込まれていた。
【０１６１】
プライマー１：ＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ（配列番号４）
プライマー２：ＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ（配列番号５）
このプライマー対は、１Ａ８の成熟型軽鎖のコード配列を増幅し、翻訳開始コドン、およびシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）リボソーム結合配列（ＡＧＧＡ（配列番号６））と開始コドンとの間に９ヌクレオチドという適当な距離を置くための上流配列を付加する。この軽鎖のＮ末端の予測されたアミノ酸配列は（１文字アミノ酸コードで）以下の通りである：
ＭＤＩＱＬＴＱ（配列番号７）
Ｆａｂ  １Ａ８の重鎖（Ｆｄ鎖）を、プライマー３および４を用いて同様にＰＣＲによってクローニングし、ｐＧＥＸ−ＣＡＴのＢｓｔｌ１０７Ｉ部位とＮｏｔＩ部位の間に導入して、ベクターＫＢ−Ｈを生じさせた。
【０１６２】
プライマー３：ＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号８）
プライマー４：ＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＣ（配列番号９）
このプライマー対は、成熟型Ｆｄ鎖のコード配列を増幅し、翻訳開始コドン、およびシャイン・ダルガノ−ＡＴＧ間の距離を９ヌクレオチドとする配列を付加する。この重鎖のＮ末端の予測されたアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＥＶＱＬＶＥ（配列番号１０）
次に、ＫＢ−ＨのｐＴａｃ発現カセットを、プライマー４および５を用いてＰＣＲによって増幅し、ＫＢ−ＬのＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位の間にクローニングしてＫＢ−ＬＨベクターを生じさせた。
【０１６３】
プライマー５：ＣＧＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧ（配列番号１１）
２つのｐＴａｃ発現カセットの間にスペーサを置くために、ＫＢ−ＬＨのＥｃｏＲＩ部位とＡｆｅＩ部位の間にｐＵＣ１９（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩ断片（１３８ヌクレオチド）をクローニングして、Ｆａｂ  １Ａ８を発現させるための最終的な無シグナル発現ベクターを構築した。プラスミドＫＢ５３４６のマップを図２に示す。
【０１６４】
ｐｒｌＡ４変異を含む大腸菌株ＳＥ６００４（Ｅｍｒら、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５７：５８５２；Ｗｏｎｇら、１９８８，Ｇｅｎｅ  ６８：１９３）は、オランダ国細菌培養細胞コレクション（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）から入手した（ＮＣＣＢカタログ番号２９７６）。
【０１６５】
プラスミドＫＢ５２４６を、エレクトロポレーションによってＳＥ６００４に導入した。エレクトロコンピテント細胞を、分子生物学ショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（第３版）Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ）に記載されているような標準的技術を用いて調製した。エレクトロポレーションは、バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ）の大腸菌用パルサー（Ｐｕｌｓｅｒ）エレクトロポレーション装置を用い、製造業者の指示通りに１．８ｋＶのパルスおよび５ｍｓ時定数を用いて実施した。エレクトロポレーション用キュベットはＢＴＸ社製であった。３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール上で選抜した形質転換体を２×ＹＴ培地で培養し、最大１ｍＭの濃度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてＦａｂ１Ａ８の重鎖および軽鎖の発現を誘導した。ペリプラズムにおけるＦａｂ発現を解析するために、誘導を３時間行うか、または、培地に放出されたＦａｂの解析を行うために１６時間培養を行った。
【０１６６】
細胞膜を通過してペリプラズムに分泌されるＦａｂを解析するために、細胞を以下のようにして分画した。１リットルの培養液からの細菌細胞のペレットを、１０ｍｌのＴＥＳバッファー（ｐＨ８．０の０．２Ｍトリス、１７．１２％スクロース、および０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ）に再懸濁して４℃で１５分間インキュベートした。１／４の割合のＴＥＳ／Ｈ２Ｏ、１２．５ｍｌを加えた後、細胞混合液を４℃で１５分間インキュベートした。この細胞を、ソーバル社（Ｓｏｒｖａｌｌ）のベンチトップ型遠心分離器中７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離によってペレット化し、上清を保存した。そして、このペレットを、１０ｍｌのＴＥＳに１５ｍＭのＭｇ２ＳＯ４を添加した液に再懸濁して４℃で１０分間インキュベートした後、７０００ｒｐｍで再ペレット化して上清を保存した。
【０１６７】
１０μｌのペリプラズム抽出物を、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に転移させて、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトκ鎖特異的抗体（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｓ）を用いてウエスタンブロットを行った。Ｆａｂの分泌を検出するために、ペルオキシダーゼの基質であるＥＣＬプラス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて発光シグナルを生じさせ、次いで、放射線写真フィルム上で検出を行った。図３に、ペリプラズムで検出された、集合した１Ａ８  Ｆａｂの分泌を示す代表的なウエスタンブロットの結果を示す。少量の低分子の免疫グロブリン関連タンパク質も検出できる。これらのバンドは、他のシグナル依存型分泌系において大腸菌からＦａｂ断片が分泌されるときに一般的に見られる軽鎖２量体および単量体軽鎖の分泌と一致している。
【０１６８】
ペリプラズムの中か、または培地の中に分泌されたＦａｂ  １Ａ８を、抗原結合活性について、特異的抗原による酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて解析した。このために、アミノ末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）精製用タグとインフレームになった融合タンパク質としてクローニングされた組換えＰｃｒＶ抗原を既述した（Ｆｒａｎｋら、２００２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８６：６４
−７３）とおりに使用した。このＰｃｒＶのコード配列を、発現ベクターｐＧＥＸ  ２ＴＫ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングして、ＧＳＴ−ＰｃｒＶ融合タンパク質を作製する。
【０１６９】
機能的な抗ＰｃｒＶ  Ｆａｂを検出するためのＥＬＩＳＡで使用するための抗原を産生させるために、ｐＧＥＸ  ２ＴＫ−ＰｃｒＶによって形質転換された大腸菌（ＢＬ２１）からＧＳＴ−ＰｃｒＶ融合タンパク質を発現させ、以下のようにして精製した。ＧＳＴ−ＰｃｒＶを発現する大腸菌の４リットルのバッチ培養液を２×ＹＴ培地の中で光学密度が６００ｎｍで０．６になるまで増殖させてから、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導し、さらに３時間増殖させた。この細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、１Ｕ／ｍｌのｒリゾチーム（ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）と製造業者の指示に従って希釈したプロテアーゼイン阻害剤の混合液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを添加したＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の溶液に溶解させた。この細胞溶解液を遠心分離と濾過によって清澄化した後、グルタチオン・セファロースカラム（ＧＳＴｒａｐ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上を通過させ、洗浄して、精製ＧＳＴ−ＰｃｒＶを１０ｍＭグルタチオンの中に溶出させた。抗原を脱塩してＰＢＳの中に戻した。
【０１７０】
抗ＰｃｒＶ  Ｆａｂをペリプラズム画分内または培地試料内で検出するための抗原結合ＥＬＩＳＡを以下のようにして実施した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＥＩＡ／ＲＩＡ）を、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ウェルのＧＳＴ−ＰｃｒＶ（上記参照）で、４℃にて１６時間インキュベートすることによって被覆し、ＰＢＳ  ０．１％  ＴＷｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）中５％の脱脂粉乳溶液で１時間ブロッキングした。ペリプラズム画分試料を２倍連続希釈して、３３℃で１時間ＥＬＩＳＡプレートに適用した。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴで１／１０００に希釈したヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ結合体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いて、抗原に結合した抗体断片を検出した。ペルオキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（１００μｌ／ウェル）を用いて抗体結合を明らかにし、１００μｌの２ＮのＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、標準的なプレート読み取り装置で読み取った。
【０１７１】
抗原結合ＥＬＩＳＡによって、機能的Ｆａｂ  １Ａ８がペリプラズムに存在し（図４参照）、プラスミドＫＢ５２４６を含むＳＥ６００４形質転換体の培地の中に放出されることが確認された。図４は、シグナル依存的にＦａｂ  １Ａ８を発現する細胞のペリプラズムにおけるＦａｂ断片の標準的な調製物（図４における調製物１１５０）と比較して、ＰｃｒＶに結合することができるＦａｂ断片が有意な量分泌されることを明らかにしている。
【０１７２】
このように、Ｆａｂ  １Ａ８の重鎖および軽鎖が、どちらの鎖にもシグナルペプチドを必要とせずに、ｐｒｌＡ４変異大腸菌から分泌される。この２つの鎖は集合して、ペリプラズム内で検出することができ、機能的抗原結合分子として培養培地に放出され得るＦａｂ断片を形成する。
【０１７３】
実施例２．コロニーリフト結合アッセイ法（ＣＬＢＡ）による抗原結合Ｆａｂの検出
プラスミドＫＢ５２４６にクローニングされてＳＥ６００４に形質転換された抗体Ｆａｂ断片のライブラリを、適当な抗生物質（３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）を含む２ＹＴアガー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｄｉｆｃｏ（商標）２ｘＹＴ酵母抽出物トリプトファン培地）上に植菌する。植菌効率を、生じた細菌コロニーが離れているが、プレートの面積を最大限に生かせる密度となるように調節する。スクリーニングすべきクローンのコロニー数に応じて、さまざまなサイズのプレートを使用する。すなわち、最大密度で、直径１０ｃｍのプレートは４０００個のコロニーを含み、直径１５ｃｍのプレートは１００００個のコロニーを含み、２５ｃｍ四方のプレートは５０，０００個の
コロニーを含む。
【０１７４】
直径８．２ｃｍ、１３．２ｃｍ、または２０ｃｍ四方のニトロセルロースフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢＡ８５）を、経験的に決定した濃度（通常０．５から２０μｇ／ｍｌの範囲）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入れた抗原で予めコーティングしておく。コーティング溶液の容量はフィルターのサイズによって決まる。上記のさまざまなフィルタサイズに対しては４ｍｌ、８ｍｌ、または２０ｍｌを用いることができる。抗原のプールの中にフィルターを表が下になるように置くと、毛細管作用によって抗体が均一に分布させられる。このフィルターを、ときどき振とうさせながら３３℃で２〜３時間コーティングする。そして、フィルターを、過剰量のＰＢＳで１回すすいでから、ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳溶液で、さらに２時間、２５℃で振とうさせながらブロックする。その後、フィルターを脱水してから、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を添加したＰＢＳで１回すすぎ、抗生物質選択（３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）および転写
誘導因子（ＩＰＴＧ）を添加した過剰量の２ＹＴ液体培地で２回すすぐ。ＩＰＴＧ濃度は、各ライブラリについて最適化することができるが、一般的には、０．０１〜０．１ｍＭの範囲内にある。フィルターを脱水させた後、それを、同じ濃度の抗体および誘導因子を添加した２ＹＴプレート（発現用プレート）上に置く。
【０１７５】
コーティングしていない乾いたニトロセルロース膜を、抗体断片ライブラリを含むコロニープレート上に表が下になるように置く。フィルターが目に見えて濡れたところで（ほぼ２０秒）、一息にフィルターを持ち上げて、コロニー側を上にして、発現用プレート上にすでに置いてある、コーティングしたフィルター上に置く。滅菌した針を用いて、フィルターに、位置合わせができるようなパターンになるよう穴を開ける。
【０１７６】
ニトロセルロースフィルタのサンドイッチを載せた発現用プレートを３３℃で１２〜１６時間静置する。この間、抗体断片が分泌されて、１枚目のニトロセルロース膜を通して２枚目の抗原でコーティングされた膜に拡散して行く。ある細菌コロニーからの抗体断片が抗原結合活性を持っていれば、それは抗原フィルターに保持され、後に検出される。
【０１７７】
１２〜１６時間の発現期間の後、発現用プレートからコロニーフィルタを取り出して、抗生物質選択は含むが転写誘導因子は含まない２ＹＴ−寒天プレート上に置いて４℃で保存する。
【０１７８】
抗原でコーティングされたフィルターを取り出し、過剰量のＰＢＳＴで３回（５分間洗浄）洗浄した後、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳溶液により、１．５時間、２５℃でブロックする。そして、抗原フィルター上に保持された抗体断片を、まず、以下の択一的な１次抗体の１つとインキュベートして検出する。ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ結合体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いて、結合したことを明らかにする。１０分間の洗浄を４回行った後、フィルターをペルオキシダーゼの基質溶液（ＥＣＬプラス、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の中でインキュベートして、感光性写真フィルムを感光させる。あるいは、蛍光標識に結合させた抗体を用いることができる。この場合、Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦＸ−Ｐｒｏ（Ｂｉｏｒａｄ）、またはＯｄｙｓｓｅｙ（Ｌｉｃｏｒ）などの平面励起スキャナーを用いて陽性スポットを可視化することができる。
【０１７９】
背面照射のためにライトボックスを用いて、写真フィルム上のスポットのパターン、またはデジタル画像を、コロニーフィルタ（このフィルターは、２ＹＴ寒天プレートから取り出して、この処理のためにプラスチック製透明板の上に置くことができる）と位置合わせする。同定された陽性コロニーを選び出し、それを用いて、２ＹＴ液体小規模培養液に植菌する。そして、１次スクリーンで得た細菌を、クローン集団が増大することを確認す
るために低い密度で再度蒔いて、その後の解析のために選び出す。
【０１８０】
実施例３．ｐｒｌＡ４細胞から分泌された、シグナルペプチドを有さないヒト抗ＰｃｒＶ  Ｆａｂ断片のＣＬＢＡを用いた検出
プラスミドＫＢ５２４６の中でシグナルペプチドなしに発現されるＦａｂ断片のために、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）および１０μＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ発現用プレート上に形質転換細胞を蒔いた。細胞を１６時間誘導して、抗原でコーティングしたフィルター上のＧＳＴ−ＰｃｒＶに結合する抗体断片を、ヤギ抗ヒトκ抗体−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＰＢＳＴで１／５０００に希釈したものを用いて、実施例２に記載されているようにして検出した。１５分間の洗浄を４回行い、ＥＣＬプラス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を適用した後、このフィルターを用いて、オートラジオグラフィー用フィルム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＨｙｐｅｒｆｉｌｍ）に感光させた。
【０１８１】
Ｆａｂ  １Ａ８を発現するプラスミドＫＢ５２４６を、（ｐｒｌＡ４変異を含む）変異型ＳｅｃＹ遺伝子を有するＳＥ６００４細胞、および野生型ＳｅｃＹ遺伝子を含むＴＯＰ１０細胞の中に形質転換した。ＰｃｒＶ抗原−ＣＬＢＡにおいて、ＳＥ６００４形質転換体だけからＦａｂ  １Ａ８を分泌する陽性コロニーが検出され、ＴＯＰ１０形質転換体は、検出可能量のＦａｂ  １Ａ８を分泌しなかった。この結果は、ｐｒｌＡ４変異菌株は、重鎖にも軽鎖にもシグナルペプチドを必要とせずにＦａｂ断片を分泌できることを示している。重鎖および軽鎖が集合して、ニトロセルロースフィルタ上にコーティングされた同種抗原に結合することができる完全に機能的なＦａｂ断片を形成することができる。
【０１８２】
実施例４．シグナルペプチドなしで分泌されたＦａｂの特異的抗原に対する結合剤のスクリーニング
Ｆａｂ  １Ａ８のＶ領域の代わりに適当なＶ領域配列をＫＢ５２４６の中にクローニングすることにより、ＳＥ６００４の中で、シグナルペプチドなしに、ヒトサイトカインに特異的な第２のヒトＦａｂ  ＦＢ４２−８を発現させた。２種類のＦａｂ（ＦＢ４２−８およびＦａｂ  １Ａ８）を発現する細胞を５０／５０で混合して、２×ＹＴ寒天上に蒔いた。ＰＣＲＶまたはＦＢ４２−８に特異的なサイトカイン抗原のいずれかであるコーティングされた抗原を用いて、実施例２に記載した通りにＣＬＢＡを行った。反復ＣＬＢＡ、検出、および位置合わせによって、各抗原に特異的なＦａｂが、２種類の形質転換体の混合物から選択できたことが示された。
【０１８３】
同じようにして、特定の抗原に対する結合剤について、多様なＦａｂのライブラリをスクリーニングすることができる。
【０１８４】
実施例５．シグナルペプチドなしでＦａｂを分泌させる効率
Ｆａｂを、細菌用の分泌リーダーペプチドを有する典型的な細菌発現用プラスミド（ＫＢ１１５０）か、またはＫＢ５２４６のＦａｂ  １Ａ８をコードする配列の位置にクローニングした。これら２つの構築物を、さまざまなＩＰＴＧ誘導条件での発現および分泌の効率について比較した。培養細胞を６００ｎｍでＯＤ０．６になるまで増殖させてから誘導した。増殖を１６時間続けさせた。培養培地中に分泌されたＦａｂを、実施例１におけるように、抗κ−ＨＲＰポリクローナル抗体によってウエスタンブロット上で検出した（図５参照）。
【０１８５】
マウスＶ領域を含むＦａｂを細菌中で発現させて高い收率を得ることは困難であることが知られている。本実験では、Ｆａｂが、シグナルペプチドなしでＳＥ６００４から、野生型ＴＯＰ１０菌株においてシグナルペプチドとともに発現させたときよりも高い効率で分泌された。実際、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞におけるシグナルペプチドによる分泌を利用して
、Ｆａｂ分泌は検出できなかったが、シグナルのないＦａｂを分泌させるためにＳＥ６００４菌株を利用したときには、培地中ですぐに検出することができた。このように、大腸菌内で発現されにくいＦａｂなどの抗体は、ｐｒｌＡ４変異型ＳＥ６００４のような適当な変異菌株から、シグナルペプチドなしで分泌させることによって都合よく産生させることが可能であろう。
【０１８６】
実施例６．ｐｒｌ４Ａ変異型ＳｅｃＹ遺伝子の発現ベクターの構築
強力な細菌プロモーターであるｔｒｃプロモーターの制御下で細菌細胞において遺伝子を発現させるために、発現ベクターｐ１５Ａを以下のようにして構築した。
【０１８７】
プラスミドｐＡＣＹ１７７（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をＢａｎＩで消化し、ＳｔｕＩで部分消化した。そして、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて、２３８６ｂｐのＤＮＡ断片を平滑末端化した。ｐＴｒｃプロモーターを、プラスミドｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、以下のプロモーターによってＰＣＲ増幅した。
【０１８８】
プライマー１：ＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡ（配列番号１２）
プライマー２：ＣＡＧＴＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＴＡＡＡＣＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＣＣ（配列番号１３）
そして、このＰＣＲ産物をＳｔｕＩで消化し、ｐＡＣＹ１７７の２３８６のＤＮＡ断片にライゲーションして、ｐ１５Ａベクターを得たが、このベクターは、ｐＴｒｃプロモーターの後ろにＮｃｏＩ部位とＫｐｎＩ部位を持っている。
【０１８９】
ｐｒｌＡ４変異型ＳｅｃＹ遺伝子を、以下のプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ＳＥ６００４細胞からクローニングした。
【０１９０】
プライマー３：ＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴＣ（配列番号１４）
プライマー４：ＣＡＧＴＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＧＧＣＣＧＴＡＧＣＣＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣ（配列番号１５）
そして、このＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化して、ｐ１５Ａベクターの同じ部位の間にクローニングして、ｔｒｃ細菌プロモーターの制御下で変異型ＳｅｃＹ遺伝子を発現するＫＢ５８２を得た（ｐＴｒｃ；図６参照）。大腸菌株のＫＢ５２８２による形質転換によって、宿主細胞にｐｒｌＡ表現型が付与され、また、シグナルペプチドをコードしないコード配列から、抗体などの異種タンパク質がペリプラズムを経由して分泌されるようになる。
【０１９１】
エレクトロコンピテントＤＨ５−α細胞を、エレクトロポレーションによってＫＢ５２８２で形質転換し、２×ＹＴ培地中３５μｇ／ｍｌのカナマイシンを用いて形質転換体を選択した。
【０１９２】
過剰発現された変異型ＳｅｃＹの存在下でＤＨ５α細胞におけるＦａｂ１Ａ８の発現を以下のようにして評価した。ＤＨ５α細胞を、エレクトロポレーションによって、ＫＢ５２４６プラスミド（シグナル配列なしにＦａｂを発現する）およびＫＢ５２８２（変異型ＳｅｃＹを発現する）で同時形質転換した。クロラムフェニコールとカナマイシンで選択した形質転換体を２×ＹＴ培地で培養し、濃度２０μＭまたは２００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、Ｆａｂ１Ａ８の重鎖および軽鎖の発現を誘導した。３３℃で振とうしながら、発現を１６時間続けさせた。変異型ＳｅｃＹで同時形質転換されたＤＨ５α細胞から発現および分泌された完全なＦａｂ断片の量を、実施例１に記載したように、同じ濃度のＩＰＴＧを用いて、ｐｒｌＡ４菌株ＳＥ６０
０４からのＦａｂの発現と比較した。ヒトκ鎖に特異的な検出用抗体を用いたウエスタンブロットを、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を泳動させた発現培地について行った（図７）。高量の分泌Ｆａｂが、変異型ＳｅｃＹを発現するＤＨ５α細胞の培地中で検出された。実際、これらの細胞は、２０μＭのＩＰＴＧを用いると、ＳＥ６００４細胞よりも高量のＦａｂを分泌した。これに対し、野生型ＳｅｃＹを発現する菌株であるＴＯＰ１０Ｆ’細胞にＫＢ５２４６を形質転換させても、検出可能なＦａｂの分泌は観察されなかった（図７）。
実施例７．ｐｒｌ変異型大腸菌株におけるシグナル配列を有する抗体断片の発現
シグナルペプチドを含む抗体ポリペプチドをコードする発現用ベクターは、以下のようにして、ｐｒｌ変異型大腸菌株の中で発現させることもできる。ｐｒｌ変異型菌株から集合して機能的なＦａｂ断片またはＦａｂ’断片を分泌させるために、シグナルペプチドを、重鎖をコードする配列、軽鎖をコードする配列、またはその両方のＮ末端に導入する。
【０１９３】
シグナルペプチドを含む抗体断片を発現させるために都合のよいｐｒｌ変異型菌株を作製するために、プラスミドＫＢ５２８２（実施例６）を用いて、ＤＨ５α細胞を形質転換する。カナマイシン耐性の形質転換体は、ｐｒｌＡ表現型をもち、実施例６に記載したようなシグナルペプチドを有さないＦａｂ断片を分泌することができる。この場合、軽鎖および重鎖の一方または両方の鎖がシグナルペプチドとともに発現される、抗体の重鎖および軽鎖を発現する発現ベクターで、エレクトロポレーションによって、ＫＢ５３８３  ＤＨ５α形質転換体を引き続き形質転換する。エレクトロコンピテントな細胞を、分子生物学ショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（第３版）Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ）に記載されているような標準的技術によって調製し、実施例１に記載されているようにエレクトロポレーションを行う。
【０１９４】
上記実施例１、２、および３に記載されているようにして、機能的なＦａｂ断片またはＦａｂ’断片を同定し、また、ペリプラズム画分または培養培地から単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】図１は、変異体Ｆ２８６Ｙおよび１４０８Ｎ（ｐｒｌＡ４）の大腸菌ＳｅｃＹタンパク質のアミノ酸配列であり、変異したアミノ酸を太字にし、下線を付けて示した（配列番号１）。
【図２】図２は、シグナルペプチドなしに大腸菌で抗体断片に対する重鎖および軽鎖の遺伝子を発現させるために使用したベクターのプラスミドマップを表したものである。このプラスミドは、クロラムフェニコール耐性を付与するためのクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、および遺伝子発現を調節するためのｌａｃリプレッサーを発現するｌａｃＩｑ遺伝子を有する。軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子は、それぞれｔａｃプロモーターの制御下にあり、ラクトースまたはＩＰＴＧによって発現が誘導される。
【図３】図３は、プラスミドＫＢ５２４６で形質転換されたＳＥ６００４のペリプラズム画分における集合体Ｆａｂ  １Ａ８の分泌を示すウエスタンブロット解析結果を示している。Ｆａｂの発現は、ＩＰＴＧ（配列番号２）を図に示した濃度（μＭ単位）で加えて誘導した。試料を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトκ特異的抗体を用いてプローブした。
【図４】図４は、ＳＥ６００４細胞のペリプラズム画分に存在するＦａｂ断片の抗原結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果を表したものである。プラスミドＫＢ５２４６で形質転換された細胞のペリプラズム抽出物の連続希釈液、またはその抽出物の１０倍希釈液（５２４６  １０％）の連続希釈液を、ＰｃｒＶ抗原に対する結合について、分泌を指示するためのシグナルペプチドを有する野生型大腸菌株で発現された抗ＰｃｒＶ  Ｆａｂを含む標準的ペリプラズム抽出物（１１５０）、またはその１０倍希釈液（１１５０  １０％）と比較して解析する。ＰｃｒＶ結合は、ＨＲＰ合成抗体によってＴＭＢ基質が着色生成物へと酵素作用で変化する結果、４５０ｎｍにおける吸光度の増加として明らかになる。
【図５】図５は、ペリプラズム抽出物で確認した、ＳＥ６００４細胞およびＴｏｐ１０Ｆ’細胞由来のＦａｂの分泌効率を比較したものである。Ｆａｂは、ＩＰＴＧ（配列番号２）誘導を用いて、シグナルペプチドを利用せずにＳＥ６００４細胞（ｐｒｌＡ）で示された濃度で発現させた。発現を、野生型菌株（ＴＯＰ１０Ｆ）に由来する同じＦａｂのシグナル依存型発現と比較する。ペリプラズム抽出物に存在するＦａｂを、抗ヒトκ検出試薬を用いてウエスタンブロット解析により検出する。
【図６】図６は、変異体ＳｅｃＹを過剰発現させるためのＫＢ５２８２プラスミドのマップである。ｐｒｌＡ４変異型ＳｅｃＹ遺伝子が、ｐＴｒｃプロモーターから発現される。ＮＰＴ２遺伝子がカナマイシン耐性を付与している。
【図７】図７は、ｐｒｌＡ４変異型菌株ＳＥ６００４、野生型ＳｅｃＹを発現するＴｏｐ１０Ｆ’細胞、およびｐｒｌＡ４変異型ＳｅｃＹ遺伝子で同時形質転換されたＤＨ５Ｄ細胞に由来するＦａｂ  １Ａ８の分泌効率を比較したウエスタンブロット解析結果である。非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥのブロットを、抗ヒトκ抗体を用いて調べた結果、培地中に分泌された抗体関連タンパク質が検出された。
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月27日(2008.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009510998000001.app