(57)【要約】  本発明は、Lが-(CH2)n-またはポリエチレングリコールのいずれかであり、Mが、-NH-、-O-、-S-および-COO-からなる群より選択され、Xが保護基または検出可能な単位のいずれかであることを特徴とする構造P=N-SO2-ベンゾール-L-M-Xを少なくとも１回含む修飾オリゴヌクレオチドを調製するための新規な標識試薬、ならびにその作製方法を提供する。Lは、好ましくは-(CH2)n-またはポリエチレングリコールのいずれかである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造
N3-SO2-ベンゾール-L-M-X
（Lは、好ましくは-NH-CO-ポリエチレングリコールまたはnが1〜18の自然数である-NH-CO-(CH2)nのいずれかであるリンカーであり、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択され、
Xは、保護基または検出可能な単位のいずれかであることを特徴とする）
を有する試薬。
【請求項２】
XがDMT、TFA、Fmoc、およびS-C1〜6-アルキルからなる群より選択される、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
Xが蛍光化合物である、請求項１記載の試薬。
【請求項４】
好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドである核酸を修飾するための、請求項１または２記載の化合物の使用。
【請求項５】
-3'ホスホルアミダイトと生成されるオリゴヌクレオチド鎖の5'OH末端を反応させる工程
-請求項1記載の試薬を反応させる工程
を含む、一本鎖オリゴヌクレオチドを修飾するための請求項４記載の使用。
【請求項６】
化学式
N3-SO2-ベンゾール-NH2
を有する化合物と、式
A-CO-L-M-X
（Lは、好ましくは-(CH2)n-またはポリエチレングリコールのいずれかであるリンカーであり、
Mは、-NH-、-O-、-S-からなる群より選択され、
Xは、保護基または検出可能ユニットのいずれかであり、
Aは、塩化物、無水物およびN-ヒドロキシスクシンイミドからなる群より選択されることを特徴とする）
を有する活性化カルボン酸を反応させる、
請求項１記載の試薬の調製方法。
【請求項７】
化学式
N3-SO2-ベンゾール-(CH2)n-COCl（nが0または1〜10の自然数である）を有する化合物と、式
NH2-(CH2)m-M-X
（mは、0または1〜10の自然数であり、
Mは、-NH-、-O-、-S-からなる群より選択され、
Xは、保護基または検出可能ユニットのいずれかであることを特徴とする）
を有する化合物を反応させる、
請求項１記載の試薬の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド化学の分野における新規な物質およびその作製方法に関する。これらの物質は、ヒドロキシル基が対応する模倣物で置換されたいわゆるリン酸塩模倣物である。
【０００２】
特に、本発明は、新規なクラスの修飾オリゴヌクレオチドの調製のための標識試薬に関する。
【０００３】
技術水準
修飾されたリン酸塩部分を有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成の分野において種々の方法が公知である。
【０００４】
合成(デオキシ)オリゴヌクレオチドは、通常、ホスホルアミダイト化学の補助により固相において調製される。通常、規定された大きさの細孔を有するガラスビーズが固相として使用される(以下において、CPG=制御細孔ガラスの略号で示す)。第１の単量体は、遊離オリゴヌクレオチドが固相合成終了後に切断された除去され得るように、切断可能な基によって支持体に連結される。また、第１の単量体は保護されたヒドロキシル基を含有し、この場合、通常、ジメトキシトリチル(DMT)が保護基として使用される。保護基は、酸処理によって除去され得る。次いで、5’末端で、DMT保護基がまた提供された (デオキシ)リボヌクレオシドの3’ホスホルアミダイト誘導体が、サイクル法におけるDMT保護基の各場合において放出される反応性基に連続的にカップリングされる。あるいは、3’ジメトキシトリチル保護された5’ホスホルアミダイトが逆オリゴヌクレオチド合成において使用される。また、特に、リン酸塩主鎖の修飾を導入するために、例えば、放射性標識ホスホロチオエートを調製するために、H-ホスホネートストラテジーが使用される。また、修飾または標識オリゴヌクレオチドを調製するための種々のストラテジーが既に公知である。3’末端が標識されたオリゴヌクレオチドを調製するために(to prepared)、従来技術に従って三官能性支持物質が使用される(US 5,290,925、US 5,401,837)。5’末端が標識されたオリゴヌクレオチドを調製するために、通常、C3〜12リンカーを介して標識基がホスホルアミダイトに結合された標識ホスホルアミダイトが使用される(US 4,997,928、US 5,231,191)。さらにまた、修飾は、個々の塩基のオリゴヌクレオチドに (US 5,241,060、US 5,260,433、US 5,668,266)、または内部非ヌクレオシドリンカーを導入することにより(US 5,656,744、US 6,130,323)導入され得る。
【０００５】
あるいは、ホスホロチオエートの合成後標識により(Hodges, R.R., et al. Biochemistry 28 (1989)261-7)または官能化されたホスホルアミダイトの後標識により(Agrawal, S., Methods in Mol. Biology 26 (1994), Protocols for Oligonucleotide Conjugates, 第3章、Humana Press, Totowa, NJ)により、ヌクレオシド間リン酸塩が標識され得る。しかしながら、これらの方法は、ホスホルアミダイトおよびリン酸チオエステルの不安定性のため、賛同が得られていない。
【０００６】
また、従来技術から、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間リン酸塩部分に修飾が導入され得ることが既に公知である。最も顕著な場合では、これらは、ホスホチオエート(Burgers, P.M.およびEckstein, F., Biochemistry 18, (1979)592-6)、メチルホスホネート(Miller, P.S., et al., Biochemistry 18 (1979)5134-43)またはボラノリン酸塩(WO 91/08213)である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを調製するため、特別な単量体が合成される必要がある。対照的に、ホスホロチオエートおよびボラノリン酸塩を合成するには、従来のホスホルアミダイトまたはH-ホスホネートが使用され得、この場合、H-ホスホネートまたはホスホン酸トリエステルと反応する特別な試薬を使用することにより、オリゴヌクレオチド合成中または合成後でもボラノまたはチオ修飾が直接導入され得る。これらの方法はすべて、修飾オリゴヌクレオチドをもたらすが、これに使用される合成化学の要件は、このようにして検出され得る標識または官能基がオリゴヌクレオチド合成中にオリゴヌクレオチド鎖のリン酸塩主鎖に直接導入されること可能にしない。
【０００７】
Baschang, G.およびKvita, V., Angewandte Chemie 85(1)(1973)43-44は、メチルスルホニルアジドなどのアジドとのヌクレオチドリン酸トリエステルの反応により、トリアルキル(アリール)イミドリン酸塩を調製することを記載しているが、これは、不安定で分解する。
【０００８】
Nielsen, J.およびCaruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988)6275-6276は、アルキルアジドの存在下での、2-シアノ-1,1-ジメチルエチル保護基が提供されたデオキシヌクレオシドホスファイトの反応を記載する。さらに、著者らは、開示された方法の補助により調製されるどの型の修飾が特定の利点を有し得るかを解明することなく、この原理がリン酸塩部分が修飾されたヌクレオチドの調製に適することを示唆している。特に、著者らは、アルキル残基の導入を示唆している。
【０００９】
WO 89/091221は、N-アルキルホスホルアミダイトまたはむしろ適当なアルキルアミンの存在下でヌクレオシドホスファイト(保護基が提供された)を、ヨウ素で酸化することにより調製される、少なくとも１つのリン酸塩部分においてN-アルキルで置換されたオリゴヌクレオチドを開示する。
【００１０】
WO 03/02587は、H-リン酸塩がアミン化によってホスホルアミデートに変換された修飾オリゴヌクレオチドの調製を開示する。
【００１１】
したがって、これらの刊行物はすべて、リン酸塩部分の代わりにホスホルアミデートを含有する分子の調製を記載する。しかしながら、ホスホルアミデートを含有する分子は、酸性環境においてアミン基がプロトン化され、次いで、水によって置換されるため、加水分解されやすい。
【００１２】
また、WO 01/14401は、リン酸塩部分がN-ClO3、N-NO2またはN-SO2Rで置換されたヌクレオチド構成ブロックまたはオリゴヌクレオチドを提案する。WO 01/14401の教示によれば、かかる物質は、ピリジンの存在下でデオキシヌクレオシドの遊離ヒドロキシル基を塩化アミドホスホニルと反応させることにより調製され得る。しかしながら、この型の調製は複雑で、時間がかかり、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの常套的な合成に不適当である。
【００１３】
アシルアジドおよびスルホニルアジドなどのAccアジドの調製は簡単であり、以前から公知である(Review：Braese, S., et al., Angewandte Chemie 117 (2205)5320-5374, 3.4および3.5.2)。これらは、好ましくはアジ化ナトリウムを用いて塩化アシルまたは塩化スルホニルから、または亜硝酸を用いてヒドラジドから調製される。
【００１４】
例えば、色素スルホニルアジドもまた、染色方法において使用される(例えば、DE 19650252)。アジ化シアンは、アジ化ナトリウムを臭化シアンとアセトニトリル中で反応させることにより簡単に作製され得る(McMurry, J.E., et al., J. Organic Chemistry 38(16)(1973)2821-7)。ヘテロアリールアジドは、アジドとのハロゲンの求核性置換により、またはヘテロアリールヒドラジンから調製され得る。前提条件は、電子吸引性窒素がアジド基に対してパラまたはオルト位にあることであり、その場合のみ共鳴安定化されたリン酸塩模倣物のみが形成される。オルトおよびパラN-アルキルピリジニウムアジドは、これに関連して特に適している。また、いくつかのアシル、スルホニルおよびピリジルアジドは市販されている。
【００１５】
したがって、本発明の基礎を形成する技術課題は、改善された標識オリゴヌクレオチドを提供すること、およびその調製のための簡単な方法において使用され得る標識試薬を提供することであった。
【００１６】
発明の簡単な説明
したがって、本発明は、化学構造
N3-SO2-ベンゾール-L-M-X
を有する試薬であって、
Lは、好ましくは、-NH-CO-ポリエチレングリコール、または-NH-CO-(CH2)n（nは1〜18の自然数である）のいずれかであるリンカーである
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択される、ならびに
Xは、保護基または検出可能な単位のいずれかである
ことを特徴とする試薬に関する。
【００１７】
一態様において、Xは、DMT、TFA、FmocおよびS-アルキルからなる群より選択され、ここで、アルキルは、1〜6個の炭素原子の鎖である。あるいは、Xは、蛍光化合物などの標識化合物である。
【００１８】
第２の局面において、本発明は、好ましくは、単鎖オリゴヌクレオチドである核酸を修飾するための上記のような保護基としてXを有する化合物の使用に関する。
【００１９】
好ましい態様において、かかる修飾は、
-  3’ホスホルアミダイトを生成される(nascent)オリゴヌクレオチド鎖の5’OH末端と反応させる工程、および
-  中間体を上記で開示した試薬と反応させる工程
を含む。
【００２０】
第３の局面において、本発明は、化学式
N3-SO2-ベンゾール-NH2
を有する化合物を、式
A-CO-L-M-X
（式中
Lは、好ましくは、nが1〜18の自然数である-(CH2)n-またはポリエチレングリコールのいずれかであるリンカーである、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択される、
Xは、保護基または検出可能な単位のいずれかである、
ならびにAは、塩化物、無水物およびN-ヒドロキシ-スクシンイミドからなる群より選択される）
を有する活性化された炭酸と反応させることを特徴とする、上記で開示した試薬調製方法に関する。
【００２１】
あるいは、かかる試薬は、
化学式
N3-SO2-ベンゾール -(CH2)n-COCl （n= 0〜6）
を有する化合物を、式
NH2-(CH2)m-M-X
（mは、0または1〜10の自然数である、
Mは、-NH-、-O-、-S-からなる群より選択される、および
Xは、保護基または検出可能な単位のいずれかである
ことを特徴とする）
を有する化合物と反応させることによって本発明に従って合成され得る。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明の基本的概念
本発明の目的は、修飾されたリン酸塩部分を含み、したがって、好ましくは検出可能な標識もまた含み得るオリゴヌクレオチドを簡単な様式で作製するために使用され得る標識試薬を提供することである。
【００２３】
本発明の中心的な概念は、3価のリン原子を用いて開始し、これを試薬と、安定なリン酸塩模倣物が形成されるような様式で反応させることであった。本発明によれば、保護基が提供された少なくとも１つのヒドロキシル残基を含有するリン原子を、この目的のために、構造N = N = N - Acc（式中、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である）を有するアジドと反応させる。これは、N原子を介して強力な電子吸引性電子受容体基が共有結合される５価のリン原子の形成をもたらす。この基は、従来技術で公知のホスホルアミデート化合物とは対照的に、このようにして作製される化合物が、共鳴安定化され、加水分解を受けにくいことを確実にする。
【００２４】
本発明の下地となるこの概念は、3価のリンが中間体として形成されるすべての方法に適用され得る。
【００２５】
ホスホルアミダイトを用いた従来のオリゴヌクレオチド合成中、3価のリン原子を有するホスホン酸トリエステルが中間生成物として形成される。第１および第２のエステル結合は、ヌクレオシド間結合を表す。リン原子は、第３のエステル結合により例えば、β-シアノエチルオキシ基などの保護されたヒドロキシル基に連結される。ヨウ素での酸化の代わりに、次いで、生成されるオリゴヌクレオチドが、本発明に従って、該方法において、N-Accがリン原子に共有結合されると同時に窒素が切断されることによりその３価のリン原子が５価の原子に酸化される適切なアジドと反応され得る。
【００２６】
次いで、続いて、従来技術から公知のように、オリゴヌクレオチド合成が継続される。安定なオリゴヌクレオチドが、ほぼ任意の様式で１つ以上のヌクレオチド間リン酸塩部分が修飾された最終生成物として得られる。
【００２７】
定義
本発明の範囲において、使用されるいくつかの用語は、以下のとおりに規定される。
【００２８】
反応性基は、適当な条件下で、別の分子と反応すると同時に共有結合を形成し得る分子の基をいう。反応性基の例は、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール、ヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、ジエン、アルキンおよびカルボン酸基である。
【００２９】
保護基は、多工程合成反応の一部として、特定の１つだけの非保護反応性基が所望の反応パートナーと反応し得るように分子の１つ以上の反応性基と反応する分子を表す。ヒドロキシル基を保護するために頻繁に使用される保護基の例は、β-シアノ-エチル、β-シアノメチル、トリアルキルシリルおよびアリルである。アミノ基を保護するための保護基は、トリフルオロアセチルおよびFmocである。他の可能な保護基は、標準的な教科書(Greene, T.W., Protective groups in organic synthesis. Wiley Interscience Publications John Wiley&Sons (1981)New York, Chichester, Brisbane, Toronto；Souveaux, E., Methods in Mol. Biology, 第26巻(1994), Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press, Totowa, NJ, 第1章, S. Agrawal編)にまとめられている。
【００３０】
リンカーは、0〜40C原子の長さを有する炭素鎖と定義される。かかるリンカー鎖はまた、１つ以上の内部窒素、酸素、イオウおよび／またはリン原子をさらに有し得る。リンカーはまた、分枝鎖であり得、例えばまた樹状であり得る。リンカーは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの鎖を保護基によって任意に保護された検出可能な単位または反応性基のいずれかと相互連結する。
【００３１】
本発明の状況において、リンカーは、好ましくは少なくとも6個の原子を有する。また、好ましくは、該鎖はC原子で構成されるが、20個までのヘテロ原子を含有していてもよい。特定の態様において、かかるリンカーは、以下の構造：
-NR-(C=O)-、
-C(=O)-NR-、
-S(=O)2-NR-、
-NR-S(=O)2-
（RはHまたはC1〜C6アルキル）
またはO-CH2CH2-O
の１つ以上を含み得る(my comprise)。
【００３２】
検出可能な単位は、分析方法の補助により検出され得る物質を表すと理解されたい。該単位は、例えば、質量分析、免疫学的またはNMRの補助によって検出され得る単位であり得る。検出可能な単位はまた、特に、フルオレセイン、ローダミンおよび金粒子などの蛍光およびUV/VIS分光法などの光学的方法によって検出され得る物質である。該単位はまた、融解動作に対しても影響を及ぼし得、その蛍光がハイブリダイゼーションによって変化するインターカレーターおよび副溝結合剤を含む。
【００３３】
ホスホルアミダイトは、ヌクレオシドまたはヌクレオシド誘導体の5’末端にカップリングされ得る3価のリン原子を含有する分子を表す。したがって、ホスホルアミダイトは、オリゴヌクレオチド合成に使用され得る。鎖伸長に使用される(デオキシ)リボヌクレオチドホスホルアミダイトに加え、オリゴヌクレオチドを標識するためにオリゴヌクレオチド合成中または合成の最後に同様の方法で使用され得る標識で誘導体化されたホスホルアミダイトもまたある(Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993)33-61, S. Agrawal編；Wojczewski, C., et al., Synlett 10 (1999)1667-1678)。
【００３４】
本発明に関連して、用語「オリゴヌクレオチド」は、(デオキシ)オリゴリボヌクレオチドだけでなく、リン酸塩主鎖に修飾(例えば、メチルホスホネート、ホスホチオエートなど)、糖に修飾(2’-O-アルキル誘導体、3’および／または5’アミノリボース、LNA、HNA、TCA)または7-デアザプリンなどの修飾された塩基を有する１つ以上のヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドもまた包含する。これに関連して、本発明はまた、PNAまたは他の生体高分子、例えばペプチドなどの非ヌクレオシドアナログを含有するコンジュゲートおよびキメラを包含する。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、スペーサーなどの１つ以上の非ヌクレオシド単位を、各位置、例えば、ヘキサエチレングリコールまたはCn(n=3.6)スペーサーに含有し得る。
【００３５】
用語「電子受容体」は、自由電子対に結合する傾向を有する原子構造を包含する。これの測定の１つはハメット定数である。本発明は、特にハメット定数σPが特定の値0.30、好ましくは0.45、特に好ましくは0.60を超える態様に関する。
【００３６】
電子受容体は、さらに、オリゴヌクレオチド合成におけるすべての化学反応に適合性でなければならない、すなわち、
-  ヨウ素によって酸化されるべきではない
-  ジクロロ酢酸およびトリクロロ酢酸に対して不活性でなければならない、ならびに
-    塩基に対して、特にアンモニアに対して不活性でなければならない、ならびに
-  ３価のホスホルアミデートと反応すべきではない。
【００３７】
これらの条件を満たす電子受容体の例は、
-NO2、SO2-R、-CN、-CO-R、ピリニジニル、ピリジニル、ピリダジニル、ヘキサフルオロフェニル、ベンゾトリアゾリル(Hansch, C., et al., Chem. Reviews 91 (1991)165-195)である。また、これらの受容体は、ビニル系またはフェニル系の様式で窒素原子にも結合され得る。
【００３８】
用語「置換された」は、置換されたと称する構造が、任意の位置に別の残基を含有することを意味するが、この位置は、より詳細には規定されないものとする。用語「任意に置換された」は、このように称される構造が、さらなる残基を有する態様および有さない態様を含むことを表す。
【００３９】
用語「アミノ置換アルキル」は、少なくとも１つのアミノ基を含有するC1〜C30直鎖または分枝鎖 アルキルを包含し、ここで、このアミノ基は保護されているか、またはリンカーを介して検出可能な単位に結合されている。
【００４０】
用語「電子不足の六員環N+-複素環」は、複素環の全体としての電荷が正になるようにsp2 窒素がアルキル化されたN-複素環を包含する。この例は、ピリジニウム、ピリミジニウムおよびキノリニウムである。
【００４１】
用語「ヌクレオチド鎖」は、リン酸塩部分によって5’-3’相互連結された少なくとも２つのヌクレオシド残基を含有する分子または分子の一部と理解されたい。
【００４２】
本発明による化学標識試薬
本発明は、化学構造
N3-SO2-ベンゾールL-M-X
を有する試薬であって、Lは上記規定のリンカー構造であり、一態様において、Lは、好ましくは、-NH-CO-ポリエチレングリコールまたは-NH-CO-(CH2)n（nは1〜18の自然数である）のいずれかであり、別の特定の態様において、Lは、-CO-NH-ポリエチレングリコールまたは-NH-CO-(CH2)n（nは1〜18の自然数である）である、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択される、ならびに
Xは、保護基または検出可能な単位のいずれかである
ことを特徴とする試薬に関する。
【００４３】
ベンゾールに連結された部分は、メタ配置またはパラ配置のいずれかに位置する。好ましくは、該部分はパラ配置である。また、ベンゾールは、塩化物などのハロゲンのような非バルキー置換基で１つ以上の位置で置換され得る。
【００４４】
Lが-(CH2)n-である場合、nは、1〜18、好ましくは2〜12、最も好ましくは3〜6の自然数である。
【００４５】
Lがポリエチレングリコールである場合、鎖長は、好ましくは2(ジエチレングリコール(ethylenglycol))〜6(ヘキサエチレングリコール)の間で変わり得る。
【００４６】
好ましくは、Mは-NH-である。
【００４７】
Xが保護基である場合、これは、DMT(ジメトキシトリチル)、TFA (トリフルオロアセチル)、Fmoc((フルオレン-9-イル)メトキシ-カルボニル)および、-S-アルキルからなる群より選択される。ここで前記アルキル基は、1〜6個の炭素原子の鎖長を有する。Mの性質に応じて、異なる保護基が選択される。-NH-では、TFAおよびFmocが非常に好ましい。-O-および-S-では、DMTを使用することが賢明である。-S-では、-S-アルキルが使用され得る。
【００４８】
Xが検出可能な単位である場合、前記検出可能な単位は、蛍光標識などの着色標識色素であり得る。さらなる例は、すべて抗体によって検出可能である質量タグ、ジゴキシゲニンもしくはビオチンなどのハプテン、または小ペプチドである。好ましくは、Xは、例えば、フルオレセインなどの蛍光化合物または任意の他のリアルタイムPCRに使用される蛍光色素である。
【００４９】
X、MおよびLの定義および開示された特定の態様はまた、「本発明による化学標識試薬の合成」、「本発明によるオリゴヌクレオチドの作製」および「本発明による標識試薬を用いて作製されたオリゴヌクレオチド」を開示する以下の章
にも適用されることに注意されたい。
【００５０】
本発明による化学標識試薬の合成
本発明はまた、本発明による化合物を合成するための容易で直接的な方法を提供する。
【００５１】
化学式
N3-SO2-ベンゾール-NH2 
を有する化合物は、手ごろで安価な市販のN3-SO2-ベンゾール-NHアセチルから当該技術分野で公知の標準的(standart)な方法によって容易に入手可能である。
【００５２】
この化合物は、式
A-CO-L-M-X
（Aは、塩化物、無水物およびN-ヒドロキシ-スクシンイミド(NHSエステル)からなる群より選択され、好ましくは、AはN-ヒドロキシ-スクシンイミドである、
Lは、好ましくは、-(CH2)n-またはポリエチレングリコールのいずれかであるリンカーであり、Lが-(CH2)n-である場合、nは、1〜18、好ましくは2〜12、最も好ましくは3〜6の自然数であり、Lがポリエチレングリコールである場合、鎖長は、好ましくは、2(ジエチレングリコール)〜6(ヘキサエチレングリコール)で異なり得る、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択される、ならびに
Xは、上記の保護基または検出可能な単位のいずれかである
ことを特徴とする）
を有する活性化された炭酸と反応させる。
【００５３】
一般構造A-O-CO-L-M-Xによって変換されるいくつかの化合物はまた、オリゴヌクレオチドの合成(snthesis)後標識のために提供される試薬として市販されている。特に、蛍光色素は、LC Red 640およびLC Red 610 (Roche Applied Science カタログ番号：12 015 161 001, 03, 03 561 488 001)の場合のように、NHSエステルの形態で頻繁に提供される。しかしながら、本発明の状況において、かかる化合物は、まず、N3-SO2-ベンゾール-NH2と反応させ、かかる化合物は、次いで、アジドの形態で利用可能であるという結果を伴う。以下に記載するように、かかるアジドは、続いて、既にオリゴヌクレオチド合成中の標識の導入に使用され得る。
【００５４】
あるいは、標識試薬の合成は、Xが保護基であるN3-SO2-ベンゾールL-NH-Xを上記の方法に従って合成し、次いで、Xを脱保護することにより行なわれ得、ここで、Xは、アジド(azid)が妥当に安定な条件下で除去され得る保護基から選択されなければならない。適当な保護基はトリチル、Bocおよびフェニルアセチルである。得られたN3-SO2-ベンゾールL-NH2は、次いで、検出可能な基の活性化されたエステル、例えば、市販の色素のNHSエステルと反応され得る。
【００５５】
本発明の別の局面において、合成は、n=0〜1である化合物N3-SO2-ベンゾール(L)n-C(=O)Clから開始され得る。かかる化合物は、アリールに直接または連結部分を介して結合され得るカルボン酸で置換されたアリールスルホニルクロリド(choride)から容易に合成される。市販の化合物は、例えば、Cl-S(=O)2-Ph-COOHまたはCl-S(=O)2-Ph-(CH2)2COOHである。スルホニルクロリドは、アジ化ナトリウムと反応させることによりスルホニルアジドに変換され、次いで、カルボン酸は、標準的な方法によって酸塩化物に変換され得る(例えば、FR 1455154)。あるいは、N3-S(=O)2-Ph-NH2は、ジカルボン酸無水物と反応されてN3-S(=O)2-Ph-NHC(=O)(CH2)COOHとした後、標準的な方法によって該カルボン酸が酸塩化物に変換され得る。化合物N3-SO2-ベンゾール(L)n-C(=O)Clは、次いで、NH2-L-M-Xと反応され得る。NH2-L-M-Xは、市販されているか、または前記エステルを過剰のNH2-L-NH2と反応させることにより検出可能な基のNHSエステルから容易に合成され得る。
【００５６】
本発明によるオリゴヌクレオチドの作製
一般に、本発明は、化学構造
2009516715.tif 000002
（式中、PGは保護基を表す
Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5’末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表す、および
Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3’末端を表すか、またはリンカーを表す）
の３価のリン誘導体を、以下の構造
N3-SO2-ベンゾール-L-M-X
（Lは、好ましくは、-NH-CO-ポリエチレングリコールまたは-NH-CO-(CH2)n（nは1〜18の自然数である）のいずれかであるリンカーである、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択される、ならびに
Xは、保護基または検出可能な単位のいずれかである
ことを特徴とする）
のアジドと反応させることを特徴とする、修飾オリゴヌクレオチドを作製するための標識試薬に関する。
【００５７】
β-シアノエチル、メチル、アリルまたはシリルは、保護基(PG)として特に好ましい。あるいは、-O-PGがCH3に置換されたメチル-ホスホネートが本発明に従って作製され得る。
【００５８】
本発明による方法はまた、特に従来のオリゴヌクレオチド合成において常套的に使用され得る。したがって、本発明はまた、以下の工程
a)  生成されるオリゴヌクレオチド鎖の5’OH末端との3’ホスホルアミダイトの反応工程
b)  以下の構造
N3-SO2-ベンゾール-L-M-X
（式中、Lは好ましくは、-NH-CO-ポリエチレングリコールまたは-NH-CO-(CH2)nのいずれかであるリンカーであり、nは1〜18の自然数であり、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択され、ならびに
Xは、保護基または検出可能な単位であることを特徴とする）
のアジ化合物との反応
を含む方法に関する。
【００５９】
この場合、生成される（nascent）オリゴヌクレオチド鎖の5'OH末端は5'末端ヌクレオチドの5'末端またはCPGの遊離OH基のいずれかであり得る。
【００６０】
従来のオリゴヌクレオチド化学は、反応性固相支持体材料から着手している。固相支持体材料は、分子がさらに固定化され得る反応基を含む固相を形成する高分子物質と称される。オリゴヌクレオチド合成の場合において、支持体材料は通常、規定の孔径を有する多孔質ガラス、いわゆる孔制御ガラス粒子（CPG）である。あるいは、ポリスチレン残基および他の有機ポリマーならびにコポリマーを使用することも可能である（Ghosh, P.K., et al., J. Indian. Chem. Soc. 75 (1998) 206-218）。基質上に合成した後オリゴヌクレオチドが固定されたまま残り続ける場合、固相支持体材料としてガラスおよび半導体チップも使用することができる。かかる固相支持体材料は市販される。
【００６１】
該支持体は、切断可能な結合を含むいわゆるリンカー基により、DMT（ジメトキシトリチル）などの保護基に保護された末端反応性ヒドロキシル残基に結合され得る。切断可能な結合基を有するリンカー基は、三官能性スペーサーおよび固相支持体材料間に存在する基を示し、単純な化学反応により切断され得る。それらは、スクシニルもしくはオキサリルまたは切断可能なエステル結合を含む他のリンカー基であり得る。他のリンカー基は当業者に公知である（Ghosh, P.K., et al., J. Indian. Chem. Soc. 75 (1998) 206-218）。
【００６２】
かかるリンカー基は、オリゴヌクレオチドを合成するための支持体材料の使用に不可欠であり、合成の終了後水溶液中に存在するようになる。対照的に、核酸アレイの生成に関していえば、オリゴヌクレオチドは合成の終了後に支持体材料表面に残るべきであり（米国特許第5,624,711；Shchepinov, M.S., et al., Nucl. Acids. Res. 25 (1997) 1155-1161）、切断可能なリンカー基は不必要であるが、むしろ非切断リンカー基が好ましい。
【００６３】
本発明による構造の組み込みのためのオリゴヌクレオチド合成の詳細は以下の通りである。
【００６４】
3'−5'方向への鎖の伸長が生じる反応性ヒドロキシル基は、酸処理によるDMT保護基の除去後に形成される。次いで、DMT保護基に提供される（デオキシ）リボヌクレオチドの3'ホスホルアミダイト誘導体は、テトラゾールの存在下、5'末端で、DMT保護基から解離したそれぞれの反応基と連続的にカップリングする。このプロセスにおいて三価のリン酸原子を含む中間体が、反応により共に結合するそれぞれのヌクレオシドとのエステル結合および使用されるホスホルアミダイト中に予め存在する保護ヒドロキシル基との第三のエステル結合を形成する中間体として形成される。例えば、β-シアノエチル、メチル、アリルまたはシリルであり得るこの保護基が、次いで、塩基性保護基およびCPGに対するリンカーも切断されるプロセスにおけるオリゴヌクレオチドの合成後にアンモニアにより切断される。
【００６５】
ヨウ素による酸化の代わりに、生成されるオリゴヌクレオチドが本発明に従って、リン酸模倣物がヌクレオチド鎖に導入される位置で、以下の構造
N3-SO2-ベンゾール-L-M-X、
（Lは好ましくは-NH-CO-ポリエチレングリコールまたは-NH-CO-(CH2)nのいずれかで、nは1〜18の自然数であるリンカーである、
Mは、-NH-、-O-、-S-からなる群より選択され、
Xは保護基または検出可能な単位のいずれかである、ことを特徴とする）
のアジドと反応する。
【００６６】
特にXが保護基である場合、Xはオリゴヌクレオチド合成後に除去され、反応性検出可能な単位でのオリゴヌクレオチド合成後標識が当該技術分野に公知の方法でなされ得る。
【００６７】
しかしながら、好ましくはXは検出可能な単位、例えば蛍光分子であり、従って、生成されるオリゴヌクレオチドの標識はホスホルアミダイトベースのオリゴヌクレオチド合成の際に既に生じている。
【００６８】
本発明の特定の態様は、好ましくは一標識が本発明の方法によりオリゴヌクレオチド内部に導入され、好ましくは別の標識が従来技術から公知の方法によりオリゴヌクレオチドの3'または5'末端に導入される、二重標識オリゴヌクレオチドプローブの調製に関する。
【００６９】
5'末端ヌクレオチドのリボースの5'位置での5'標識の場合、組み込みは、オリゴヌクレオチド合成の最後に色素標識ホスホルアミダイトを使用して実施される（Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, S. Agrawal Publishers）。
【００７０】
3'末端での標識は、トリチル化ヒドロキシル基に加えて検出可能な標識を予め含有する反応性固相支持体として市販のCPGを使用して実施される。DMT保護基の切断後、標準的オリゴヌクレオチド合成は、その際に遊離しているヒドロキシル基から開始される。
【００７１】
あるいは、後標識の従来技術分野から公知の方法が、さらなる5'または3'標識に使用できる（米国特許第5,002,885号；米国特許第5,401,837号）。
【００７２】
本発明はまた、標準的オリゴヌクレオチド合成の前に調製され得る、本発明による合成の中間体に関する。この場合、依然として固相に結合し、まだ脱保護されず、非塩基性スペーサー基を含み得る中間体が好ましい。3'リン酸化オリゴヌクレオチドはオリゴ合成後に合成されるので、当業者にリン酸CPGとして周知であるCPGは、該調製に好適に使用される。脱トリチル化後、かかるリン酸CPGは、アクチベーターの存在下でスペーサーホスホルアミダイトと反応する：形成される三価のリン中間体は、次いで、N3-SO2-ベンゾール-L-M-X（上述のように、式中、Xは検出可能な単位）と反応する。合成物のこれらの中間体は保管され得、三官能性CPGのように普遍的3'標識に使用され得る。
【００７３】
三官能性リン中間体はまた、本発明によりアジド（azid）と反応し得るメチルリン酸塩の合成の際に形成される。メチルリン酸塩も市販されている。
【００７４】
標準的オリゴヌクレオチドおよび特にアナログ、例えばN3'->P5'オリゴヌクレオチドの合成に使用される逆合成ストラテジー（欧州特許第1 155 027号）において、三官能性リンを含む中間体も形成され、本発明に従って本発明によるアジドと反応し得る。対応するホスホルアミダイトは市販されている。
【００７５】
本発明による標識試薬により生成されるオリゴヌクレオチド
本発明による合成ストラテジーによりリン酸主鎖上で修飾された多様な種類のオリゴヌクレオチドの調製が可能になる。修飾の程度、修飾の多様性および電荷は意図される使用により決定される。
【００７６】
本発明は、少なくとも一度以下の構造
2009516715.tif 000003
（式中、
Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5'末端またはOHを示す、
Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3'またはOHを表す、
およびAccは、-SO2-ベンゾール-L-M-X、
式中、Lは、好ましくは-NH-CO-ポリエチレングリコールまたは-NH-CO-(CH2)n（nは1〜18の自然数）のいずれかである
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択され、および
Xは、保護基または検出可能な単位である
ことを特徴とする）
を含む、任意の化合物を包含する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドの-OH基は通常脱プロトン化された状態で存在することは当業者に理解されよう。
【００７８】
さらに、本発明は、以下の構造
2009516715.tif 000004
のメチルリン酸塩も包含する。
【００７９】
オリゴヌクレオチドの意図される使用に依存して、上記の構造は、オリゴヌクレオチド中に1度、2度、多数回または全てのリン酸残基上に生じ得る。オリゴヌクレオチド中のリン酸残基は、内部ヌクレオシドリン酸塩
（Aは、第一のヌクレオシドの5'末端を表す
Bは、ヌクレオチド鎖中の第二のヌクレオシドの3'末端を表す）と呼ばれる。
【００８０】
さらに、本発明の構造はオリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端に位置し得る。それらがオリゴヌクレオチドの5'末端に存在する場合、
Aは、ヌクレオチド鎖の5'末端を表し、
Bは、ヒドロキシル基、または任意に検出可能な基もしくは別の反応基を含み得るリンカー基のいずれかであり、オリゴヌクレオチド上の検出可能な基の合成のために使用され得る。
【００８１】
電子受容体が検出可能な単位も示す置換基を含む場合、オリゴヌクレオチドは本発明により、5'末端で二重標識を伴って存在する。本発明による構造がヌクレオチド鎖の3'末端である場合、
Bは、前記オリゴヌクレオチドの3'末端を表し、
Aは、ヒドロキシル基または固相に結合したリンカーを示すが、ここで該固相は好適には、常套的なオリゴヌクレオチド合成の開始材料として使用されるものなどの制御孔ガラス粒子である。
【００８２】
本発明によるオリゴヌクレオチド中の個々のヌクレオシドは、任意の型のヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドまたはヌクレオシド誘導体を含み得る。糖単位は、通常DNAオリゴヌクレオチドにはデオキシリボース、またはRNAオリゴヌクレオチドにはリボースである。本発明によるオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオ塩基は、アデニン、グアニンチミジン、シチジン、ウリジン、それらの誘導体またはニトロインドールなどのいわゆるユニバーサル塩基等の天然に存在する塩基であり得る。
【００８３】
本発明による標識試薬で標識されたオリゴヌクレオチドは、リアルタイムPCRなどの分子生物学における種々の応用に有利に使用され得る。好ましくは、検出可能な標識は蛍光色素または蛍光クエンチャー分子である。オリゴヌクレオチドに対して検出可能な単位として作用する相当する色素および分子は、当業者に公知である。本発明の保護範囲を限定することはないが、これらの例は、フルオロセイン、ローダミン、シアニン、メロシアニン、カルボシアニンならびにアゾおよびポリアゾ化合物である。
【００８４】
本発明による標識試薬を用いて、少なくとも蛍光標識がアミド/電子受容体基によりオリゴヌクレオチド鎖のリン酸の原子に結合した上述の構造を有するリアルタイムPCRプローブを合成し得る。かかるプローブの例としては、FRETハイブリダイゼーションプローブ（国際公開公報97/46707）またはいわゆる単一標識プローブ（国際公開公報02/14555）がある。これに関連して、内部ヌクレオシド上に本発明による内部修飾があるこの結合オリゴヌクレオチドプローブにおいて、リン酸残基は特に特に好ましい。
【００８５】
これに関連して、本発明（present invention present）によるこの標識試薬は、2つの検出可能な単位を有する二重標識オリゴヌクレオチドの生成に特に有用である。かかるプローブの例は、TaqManプローブ（米国特許第5,804,375号）分子ビーコン（米国特許第5,118,801号）がある。これに関連して、本発明は第一の蛍光標識がアミド/電子受容体機によりオリゴヌクレオチド鎖の内部ヌクレオシドに結合し、第二の検出可能な単位がオリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端に存在する二重標識オリゴヌクレオチドに関する。かかる標識を有する分子およびそれらの調製方法は熟練者間で周知である。
【００８６】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に解明され、その範囲は特許請求の範囲に由来する。記載された方法は改変の後であったとしても、それまでに本発明の目的を記載している実施例として理解されよう。
【００８７】
以下の実施例は本発明の理解を補助するために提供され、その心の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神を逸脱することなく記載の手順に変更がなされ得ることが理解されよう。
【実施例】
【００８８】
実施例1：4-アミノベンゼンスルホニルアミド（DE 2919823に従う）
2.0g（8mmol)p-アセチルアミノベンゾイルスルホニルアジドを4.0g（3.4mL）の32％塩酸と共に攪拌して、95℃で20分加熱した。透明な溶液が形成された。室温まで冷却する際に、塩酸沈殿物を濾過により分離した。血漿を20mlの水に溶解し、飽和炭酸ナトリウム溶液を添加して、次いでジクロロメタンを用いて3回抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、得られた淡赤色の油分を真空下で塩化カルシウムを用いて一晩かけて乾燥させ、1.04g（66％）の組成生物が得られた。
【００８９】
プラスチックシート上TLCシリカ（トルエン:酢酸エチル:メタノール=4:1:1) Rf（生成物）=0.63
【００９０】
実施例2:(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)ヘキサノイルクロライド
735mg（3mmol）(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-ヘキサン酸を5mLの乾燥ジクロロメタンに溶解し、アルゴン流下で0℃で攪拌した。次いで、0.6mL（6.6mmol）のオキサリルクロライドを0℃で滴下して、数滴の乾燥ジメチルホルムアミドも滴下し、気体を発生させて以前は白色であった黄色の混合物を誘導した。混合物を室温で70分間攪拌した。次いで、混合物を繰り返しジクロロメタンで脱水した。組成生物を次の工程に直接使用した。
【００９１】
実施例3: 4-[6-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-ヘキサノイルアミノ]-ベンゼンスルホニルアジド
5mLジメチルホルムアミドに溶解した0.57g（3mmol）のパラ-アミノ-ベンゼンスルホニルアジドに0.9mL（6mmol）トリエチルアミンを添加し、次いで10mLジメチルホルムアミドに溶解した(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-ヘキサノイルクロライドを滴下した。混合物は茶色に変色し、それをアルゴン下で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ残りの油分を10mLジクロロメタンに溶解し室温に1時間放置した。沈殿物を濾過し、溶液を蒸発させて1.10gの粗油分を得た。得られた化合物をオリゴヌクレオチド合成に直接使用した。
【００９２】
実施例4:アミノ修飾オリゴヌクレオチドの合成
5' Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p
p*= p=N-SO2-Ph-NH-C(=O)-(CH2)5-NH2
オリゴヌクレオチド合成を、1μモルスケールでABI 394合成機を用いて行なった。市販のリン酸CPG（Glen Research）を支持体材料として使用した。標準的合成に使用した全ての化学物質はGlen Researchから購入した。Proligoのtert.ブチルフェノキシ-アセチル保護基を有するホスホルアミダイト（「tac」または「Expedite」単量体として公知）を使用した。
【００９３】
合成には標準的プロトコルを使用した。最後の合成サイクルでのみ、酸化体を無水アセトニトリル中の0.1M溶液の4-[6-(2,2,2-トリフルオロアセチルアミノ)-ヘキサノイルアミノ]-ベンゼンスルホニルアジドに替え、「酸化」時間を16分に延ばした。
【００９４】
55℃、15時間で、33％アンモニアを用いて生成物を支持体から切断させ、Poros Oligo R3 4.6 x 50mmカラムを用いて逆相クロマトグラフィーで精製した。クロマトグラフィー：バッファA：水中0.1M酢酸トリエチルアンモニウムpH 6.8、バッファB：水中0.1 M酢酸トリエチルアンモニウム/アセトニトリル1:1、勾配2分、0％B〜100％Bで45分。溶出物のUV吸光度を260nmで測定した。アミノ修飾オリゴヌクレオチドを含有する主画分を得た（wasc obtained）。真空遠心分離で溶媒を除去した。
【００９５】
MALDI：計算値：11436.7  測定値11435.6 
【００９６】
実施例5: LightCycler Red 640を用いた後標識
5' Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p
p*= p=N-SO2-Ph-NH-C(=O)-(CH2)5-NH LC Red 640
残渣を1mlの0.1M臭化ナトリウムバッファ（pH=8.5）に溶解した。1000μl DMF中の1mg LightCycler Red 640 NHSエステル（Roche Applied Science）の溶液を添加して、混合物を室温で一晩維持した。混合物を脱水して上述と同様の条件下で精製した。検出器として、ダイオードアレイを用いて260および625nmで検出を行なった。両方の吸光度を有する画分を回収して真空下で蒸発させた。残りを再蒸留（bidest.）水に溶解し、再度真空下で蒸発させた。次いで、残渣をbidest.水に溶解して凍結乾燥させた。
【００９７】
MALDI：計算値：12438.35  測定値：12435.5
【００９８】
実施例6:N-ダンシル3アミノプロパノイルクロライド
970mg（3mmol）ダンシルβアラニンを5mLの乾燥ジクロロメタンに溶解し、アルゴン流下、0℃で攪拌した。次いで、0.6mL（6.6mmol）オキサリルクロライドを0℃で滴下し、その後数滴の乾燥ジメチルホルムアミドを添加して、気体を発生させた。混合物を室温で100分間攪拌した。回転式エバポレータを使用して溶媒を除去し、次いでジクロロメタンを用いて残りを脱水した。粗生成物を次の工程に直接使用した。
【００９９】
実施例7:N-ダンシル(3アミノプロパノイル)ベンゼンスルホニルアジド
To 5mLのジメチルホルムアミド中の152mg（0.8mmol）のパラ-アミノ-ベンゼンスルホニルアジドに0.11mL（6mmol）トリエチルアミンを添加し、次いで、10mLのジメチルホルムアミドに溶解した0.5mmolのN-ダンシル3アミノプロパノイルクロライドを滴下した。混合物をアルゴン下で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残りの油分を、シリカを用いたクロマトグラフィー（溶離剤トルオール/酢酸エチルエステル1：1）で精製した。産物を含有する画分を回収して溶媒を蒸発させた。
【０１００】
1H NMR (Bruker DPX 300 MHz): d6 DMSO: 2.53 m [2H], 2.82 s[6H], 3.12 m [2H], 7.20 m [2H], 7.59 t [1H], 7.62 t [1H], 7.81 d[2H], 7.93 d[2H], 8.07 t [1H], 8.12 d [1H], 8.27 d[1H], 8.44[1H], 10.47 s [1H], (プロトン化形態) IR ( Nujol) 2122 cm-1
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月29日(2007.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造
N3-SO2-ベンゾール-L-M-X
（Lは、-NH-CO-ポリエチレングリコールまたはnが1〜18の自然数である-NH-CO-(CH2)nのいずれかであり、
Mは、-NH-、-O-および-S-からなる群より選択され、
Xは、DMT、TFA、Fmoc、およびS-C1〜6-アルキルからなる群より選択されるいずれかであるか、または
Xは、蛍光化合物であることを特徴とする）
を有する試薬。
【請求項２】
好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドである核酸を修飾するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項３】
- 3'ホスホルアミダイトと生成されるオリゴヌクレオチド鎖の5'OH末端を反応させる工程
-請求項1記載の試薬を反応させる工程
を含む、一本鎖オリゴヌクレオチドを修飾するための請求項２記載の使用。
【請求項４】
化学式
N3-SO2-ベンゾール-NH2
を有する化合物と、式
A-CO-L-M-X
（Lは、好ましくは-(CH2)n-またはポリエチレングリコールのいずれかであるリンカーであり、
Mは、-NH-、-O-、-S-からなる群より選択され、
Xは、保護基または検出可能ユニットのいずれかであり、
Aは、塩化物、無水物およびN-ヒドロキシスクシンイミドからなる群より選択されることを特徴とする）
を有する活性化カルボン酸が反応する、
請求項１記載の試薬の調製方法。
【請求項５】
化学式
N3-SO2-ベンゾール-(CH2)n-COCl（nが0または1〜10の自然数である）を有する化合物と、式
NH2-(CH2)m-M-X
（mは、0または1〜10の自然数であり、
Mは、-NH-、-O-、-S-からなる群より選択され、
Xは、保護基または検出可能ユニットのいずれかであることを特徴とする）
を有する化合物を反応させる、
請求項１記載の試薬の調製方法。
【国際調査報告】
2009516715.tif 000005
2009516715.tif 000006
2009516715.tif 000007