(57)【要約】シナプス可塑性は学習および記憶貯蔵および認知障害に重要な役割を果たす。細胞骨格再構築は神経シナプス可塑性の基礎となるが、生体動物における細胞骨格速度論の調整について知られていない。安定な同位体標識は、ネズミ海馬における異なるニューロン区画を示す微小管サブ集団へのチューブリン取り込みの動態学を測定するために用いた。ニューロン微小管は大部分、静的であった。基底ターンオーバーはタウ関連にて最大で（軸索および成長円錐）、MAP2結合にてより低く（細胞体樹状突起）、冷却安定サブ集団にて最小であった（軸索軸）。脳室内グルタミン酸注射は軸索軸および細胞体樹状突起微小管への標識取り込みを刺激し、後者はcAMP-PKAに依存する。文脈恐怖条件付け後の海馬依存記憶形成はMAP2-および冷却安定-微小管の集合の増大と同時に起こった。微小管集合および記憶形成の両方は微小管脱ポリマー化薬物ノコダゾールにより阻害された。このアプローチは、学習および記憶の行動測定との相関、および学習および記憶における刺激活性のための候補薬剤のスクリーニングを可能とする。
2009510457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  試験系を少なくとも一つの候補薬剤に曝露し；
b)  同位体標識基質が微小管集団の形成中に少なくとも一つのチューブリンサブユニットに取り込まれるのに十分な時間にて該試験系に少なくとも一つの該同位体標識基質を投与し；
c)  第一時点にて第一微小管集団に取り込まれる少なくとも一つの同位体標識チューブリンサブユニットを含む第一サンプルおよび該第一時点にて少なくとも一つの同位体標識遊離チューブリンサブユニットを含む第二サンプルを該試験系から得；
d)  該第一微小管集団における該同位体標識チューブリンサブユニットの試験同位体取り込みおよび該同位体標識遊離チューブリンサブユニットの試験同位体取り込みを定量化し；
e)  第一時点からの微小管集団に取り込まれる少なくとも一つの同位体標識チューブリンサブユニットおよび第一時点からの少なくとも一つの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの対照同位体取り込みの定量化を提供し；
f)  試験および対照同位体取り込みを比較して上記薬剤の効果を測定する、
試験系におけるシナプス接続への候補薬剤の効果を評価する方法。
【請求項２】
定量化が、第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体取り込みの含有量および第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの同位体取り込みの含有量を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体取り込み速度および第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの同位体取り込み速度を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
定量化が、第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体取り込みパターンおよび第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの同位体取り込みパターンを測定することを含む、請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
定量化が、第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体取り込みの含有量における速度変化および第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの同位体取り込みの含有量における速度変化を測定することを含む、請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
定量化が、第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体取り込みパターンにおける速度変化および第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの同位体取り込みパターンにおける速度変化を測定することを含む、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
比較工程が、第一微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットにおける分子流動速度を同位体標識遊離チューブリンサブユニットにおける分子流動速度と比較することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
比較工程が、第一微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットにおける分子流動速度を遊離チューブリンサブユニットについての少なくとも一つの代謝前駆体プールにおける分子流動速度と比較することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前駆体プールが体内の水分である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前駆体プールが少なくとも一つのアミノ酸前駆体を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
同位体が安定な同位体である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
同位体標識基質が安定な同位体標識水である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
同位体標識基質がアミノ酸前駆体である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
同位体標識基質がアミノ酸である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
標識が安定な同位体である、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
標識が放射性同位体である、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸が2H標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、18O標識アミノ酸、3H標識アミノ酸、14C標識アミノ酸および35S標識アミノ酸からなる群から選択される、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
試験系が第二候補薬剤に曝露される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
試験系が特定線量の少なくとも一つの候補薬剤に曝露される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
試験系が第二線量の候補薬剤に曝露される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
得る工程がサンプルを微小管結合タンパク質結合剤と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
微小管結合タンパク質がタウ、微小管結合タンパク質2（MAP2）および安定な細管のみのポリペプチド（STOP）からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
結合剤が抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
シナプス接続への効果が治療効果である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
シナプス接続への治療効果が認知機能を増大する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
シナプス接続への治療効果が認知障害の少なくとも一つの臨床的兆候または症状の改善を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
a)  少なくとも一つの同位体標識基質、および
b)  キットの使用についての指示
を含む、請求項１記載の方法によるシナプス接続への効果のためのスクリーニング化合物についてのキット。
【請求項２８】
基質の投与のための道具をさらに含む、請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
サンプルを対象から集めるための器具をさらに含む、請求項２７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年９月３０日に出願された米国仮出願番号60/722,897に基づく優先権を主張し、これは本明細書にそのまま引用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、記憶、学習の基礎となりうる生化学的過程における変化、およびアルツハイマー病などの種々の疾患および障害を含む脳における他の神経生物学的変化を測定する方法に関する。より具体的には、本発明は、ニューロン内の微小管ポリマー、および神経組織を含む他の細胞タイプのターンオーバーを測定することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
学習の神経基盤は、シナプス結合の創製（すなわちシナプス形成）およびシナプス強度の変化（すなわち迅速タンパク質合成）を含む。シナプスにおける構造的柔軟性または形態変化は、長期増強（すなわちシナプス可塑性）に特に重要であり、学習および記憶過程の基礎である。樹状突起棘および軸索結合は、学習および記憶形成の基礎となる動的構造であるようだ。シナプス結合および再構築の生化学的基盤は微小管（チューブリンのポリマー）の形成である。これらの結合は樹状および軸索微小管の著しい安定性により維持される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、学習および記憶は、特異的な生化学的相関性、すなわち、樹状突起および軸索における新たな微小管の合成および安定性を有することができる。同様に、記憶痕跡の欠乏は、生化学的な意味において、チューブリンの予め形成されたポリマーの分解として示されうる。記憶痕跡が測定可能な生化学的相関性（チューブリンのポリマーのターンオーバー）を有するという概念は、この生化学的過程がインビボにて測定できたならば、神経生物学および神経疾患における多くの非常に有望な適用を示唆する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、微小管合成および分解の分子流動速度（微小管動態）を測定することにより、脳の細胞および組織における微小管ポリマー安定性を測定することに関する。チューブリンは同位体で標識され、チューブリンの二量体およびポリマーを単離し、質量分析または他の適当な技術、例えば同位体が放射性であるならば液体シンチレーションカウンティングを用いて同位体濃縮について測定する。
【０００６】
本発明は、ニューロン、中枢神経系（CNS）組織、または１以上の化合物（またはその組合せもしくは混合物）に曝露される有機体から測定される、微小管のポリマー化および脱ポリマー化の速度（すなわち微小管動態）と、非曝露ニューロン、CNS組織または有機体から測定される微小管のポリマー化および脱ポリマー化の速度との比較を可能とする。非曝露ニューロン、CNS組織または有機体はニューロン、CNS組織、または認知症もしくは学習障害などの疾患を有するが未だ１以上の化合物（またはその組合せもしくは混合物）に曝露されていない有機体であることができるか、あるいは非曝露ニューロン、CNS組織または有機体はニューロン、CNS組織、または認知症もしくは学習障害を有しない有機体であることができる。曝露および非曝露ニューロン、CNS組織または有機体からの微小管のポリマー化および脱ポリマー化の速度の差異を認識した後、この情報を用いて１以上の化合物（またはその組合せもしくは混合物）が曝露ニューロン、CNS組織または有機体における微小管動態の変化を導くか否かを決定する。１以上の化合物（またはその組合せもしくは混合物）を哺乳動物に投与し、微小管動態（速度）を計算し、同種の非曝露哺乳動物から計算された動態（速度）に対して評価することができる。ニューロンは培養するか、または有機体から単離することができる。CNS組織は生体外であるか、または有機体が１以上の化合物（またはその組合せもしくは混合物）に曝露された後、有機体から単離することができる。哺乳動物はヒトであることができる。
【０００７】
ある具体的態様にて、微小管動態は安定な同位体標識技術の使用により測定される。該技術は、問題の生物学的系への安定な同位体標識基質の投与または接触を含む。
【０００８】
安定な同位体標識としては、2H、13C、15N、18O、33S、34Sを挙げることができる。別の具体的態様にて、微小管動態（速度）を放射性同位体標識技術の使用により測定する。放射性同位体としては、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131Iを挙げることができる。
【０００９】
同位体標識基質としては、2H2O、H218O、15NH3、13CO2、H13CO3、2H標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、18O標識アミノ酸、34Sまたは33S標識アミノ酸、3H2O、3H標識アミノ酸および14C標識アミノ酸、2H-グルコース、13C標識グルコース、2H標識有機分子、13C標識有機分子および15N標識有機分子を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１０】
ある具体的態様にて、安定な同位体標識基質の１以上のチューブリン二量体（微小管ポリマーのサブユニット）への取り込みおよび微小管ポリマーへの取り込みは、当分野にて知られる方法により同時に測定される。このように、微小管の動態は、チューブリン二量体または微小管における特定期間にわたる同位体含有量および／もしくはパターンまたは同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度を、例えば質量分析または当分野にて知られている他の分析技術を用いることにより測定し比較することにより決定することができる。微小管における同位体含有量および／もしくはパターンまたは同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度と非集合チューブリン二量体サブユニットにおける同位体含有量および／もしくはパターンまたは同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度の関係は、特に有益であることができる。次いで微小管集合および分解（ポリマー化および脱ポリマー化）の動態を計算することができる。
【００１１】
あるいは、放射性標識基質は、放射性標識基質がチューブリン二量体に取り込まれた後、微小管ポリマーに取り込まれる、本発明における使用に包含される。このように、微小管の動態は、シンチレーション・カウンティングなどの当分野にて知られている技術を用いることによりチューブリン二量体および微小管ポリマーに存在する放射能を測定することにより決定することができる。次いで、微小管ポリマーの動態は、当分野にて知られている方法を用いて計算する。
【００１２】
別の具体的態様にて、微小管の動態は、１以上の化合物への曝露前および後に有機体における微小管の集合および分解（ポリマー化および脱ポリマー化）から測定され、毒性、例えば記憶障害または学習障害を評価する。ある変形にて、１以上の化合物は工業用または業務用化学物質であることができる。別の変形にて、１以上の化合物は化粧品であることができる。さらに別の変形にて、１以上の化合物は食品添加物であることができる。そしてさらに別の変形にて、１以上の化合物は環境汚染物質であることができる。
【００１３】
あるいは、１以上の化合物の曝露は一の有機体に対してすることができ、微小管の動態は同種の非曝露有機体からの微小管の動態と比較して毒性を評価する。
【００１４】
分化ニューロン（ここに、ニューロンは有糸分裂後であるので増殖速度を反映しない）における微小管動態の測定は、以下により完全に記載されるように、学習および記憶に影響しうる軸索機能障害などの重要な生物学的過程の測定を可能とする。
【００１５】
本発明の別の具体的態様にて、１以上の安定な同位体を含む同位体摂動分子を提供する。同位体摂動分子は本明細書に記載の標識方法の産物である。
【００１６】
本発明のさらに別の具体的態様にて、同位体摂動分子は１以上の放射性同位体で標識される。
【００１７】
本発明のさらに別の具体的態様にて、同位体標識前駆体およびその使用説明書を含む、１以上のキットを提供する。キットは安定な同位体標識前駆体または放射性標識同位体前駆体またはその両方を含むことができる。安定な同位体標識前駆体および放射性標識同位体前駆体は一のキットにて提供することができるか、または２以上のキットに分離して提供することができる。キットはさらに、同位体標識前駆体を投与するための１以上の道具を含むことができる。キットはまた、対象からのサンプルを集めるための１以上の道具を含むこともできる。
【００１８】
本発明のさらに別の具体的態様にて、本発明の方法から生成されるデータを含む、１以上の情報記憶装置を提供する。データは分析し、部分的に分析することができるか、または分析しなくてもよい。データは紙、プラスチック、磁気、光、または他の保存および表示媒体に記録することができる。
【００１９】
本発明のさらに別の具体的態様にて、本発明の方法により同定され、少なくとも部分的に特徴付けられる、１以上の薬物候補を包含する。
【００２０】
ある具体的態様にて、本発明は以下の工程を含む：(1)同位体標識をインビボにて動物に投与すること（ここに、標識は１以上のチューブリン二量体に取り込まれる）；(2)動物からの脳組織を集めること；(3)脳組織から１以上の同位体標識チューブリン二量体および／または１以上の同位体標識チューブリンポリマーを単離すること；(4)１以上のチューブリン二量体および／または１以上のチューブリンポリマーまたはそれらのアミノ酸成分の同位体濃縮を測定すること；(5)１以上のチューブリンポリマーに取り込まれる１以上の同位体標識チューブリン二量体の含有量、取り込み速度、および／または同位体標識の含有量および／もしくはパターンにおける変化のパターンもしくは速度を測定すること；(6)１以上の遊離チューブリン二量体の含有量、取り込み速度、および／または同位体標識の含有量および／もしくはパターンにおける変化のパターンもしくは速度を測定すること；(7)１以上のチューブリンポリマーに取り込まれる１以上のチューブリン二量体における同位体標識の含有量および／もしくはパターンまたは含有量および／もしくはパターンの変化の速度に基づく該１以上のチューブリンポリマーに取り込まれる１以上のチューブリンサブユニットの取り込みにおける分子流動速度を計算すること；および(8)該１以上のチューブリンポリマーに取り込まれるその１以上のチューブリン二量体間の分子流動速度を１以上の遊離チューブリン二量体間の分子流動速度と比較すること。同位体標識は水を標識することができる。ある具体的態様にて、標識された水は2H2Oである。別の具体的態様にて、標識された水はH218Oである。さらに別の具体的態様にて、標識された水は3H2Oである。別の具体的態様にて、同位体標識としては、2H、13C、15N、18O、33S、34Sなどの生体分子に存在する元素の特定の重同位体を挙げることができるか、または3H、14C、35S、125I、131Iなどの生体分子に存在する元素の他の同位体を含むことができる。同位体標識は2H2O、15NH3、13CO2およびH13CO3などの同位体標識タンパク質前駆体であることができるが、これらに限定されない。同位体標識は2H標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、18O標識アミノ酸、34Sまたは33S標識アミノ酸、3H2O 3H標識アミノ酸、および14C標識アミノ酸などの標識アミノ酸であることができるが、これらに限定されない。ある具体的態様にて、標識アミノ酸は2H3-ロイシンである。別の具体的態様にて、標識アミノ酸は15N-グリシンである。
【００２１】
2H標識は、非必須アミノ酸の生合成のための代謝経路を経由して、新たに合成された遊離チューブリンサブユニットに入れる。新たに合成された遊離チューブリン二量体への2Hの取り込みは、ポリマー化により微小管に取り込まれる前にチューブリン二量体プールに見られる（Fig. 2を参照のこと）。微小管が非常に動的である生物学的設定において、2H標識は、二つのプール間の急速な交換速度論（すなわち微小管の動態不安定性）を反映する同様の速度にて二量体およびポリマープールにて蓄積する。しかし、微小管がMAPにより安定化される（例えばニューロン内の微小管）設定にて、新たに合成されたチューブリン中の2H標識は、遊離チューブリンの生合成速度に比例する速度にて二量体プールに見られるが、微小管ポリマーへの取り込みはしばしば劇的により遅い。
【００２２】
次いで、微小管動態はガスクロマトグラフィー／質量分析（GC/MS）または当分野にて知られている他の分析技術により定量化され、以下により完全に記載されている。
【００２３】
本発明は、シナプス可塑性またはシナプス形成への効果を評価するための方法を提供する。ある具体的態様にて、該方法としては、以下のものが挙げられる：a）生物系を１以上の候補薬剤に曝露すること；b）同位体標識基質がニューロンにおける１以上のチューブリンサブユニットに入り、それにより微小管分子の１以上の集団に入り、標識するのに十分な時間同位体標識基質を生物系に投与すること；c）１以上のサンプルを生物系から得ること（ここに、１以上のサンプルは微小管分子の１以上の集団に取り込まれる少なくとも一つの同位体標識サブユニットを含む）；d）１以上のサンプルを生物系から得ること（ここに、サンプルは少なくとも一つの同位体標識遊離チューブリンサブユニットを有する）；e）微小管分子の集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体標識の含有量、取り込み速度、および／または含有量および／もしくはパターンにおける変化のパターンもしくは速度を測定すること；f）同位体標識遊離チューブリンサブユニットの同位体標識の含有量、取り込み速度、および／または含有量および／もしくはパターンにおける変化のパターンもしくは速度を測定すること；g）微小管分子の集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットにおける同位体標識の含有量および／もしくはパターンまたは含有量および／もしくはパターンの変化の速度に基づく微小管分子の集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの取り込みにおける分子流動速度を計算すること；h）微小管分子の集団の同位体標識遊離チューブリンサブユニットにおける同位体標識の含有量および／もしくはパターンまたは含有量および／もしくはパターンの変化の速度に基づく微小管分子の集団の同位体標識遊離チューブリンサブユニットの取り込みにおける分子流動速度を計算すること；i）１以上の候補薬剤が投与されない少なくとも一つの生物系にて工程b）〜i）による分子集合における分子流動速度を測定すること；およびj）候補薬剤が投与される生物系における分子流動速度を候補薬剤が投与されない生物系における分子流動速度と比較すること。別の具体的態様にて、この方法を用いて、シナプス可塑性またはシナプス形成への内因性生物学的分子の効果を評価することができる。これを用いて、シナプス可塑性またはシナプス形成を測定することもでき、上記工程b）〜j）を含む。本発明の方法を用いて、シナプス可塑性またはシナプス形成へのポリヌクレオチドまたは遺伝子の効果を測定することもでき、上記工程b）〜j）を含み、ここに、比較工程j）はポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現レベル、構造、存在または非存在と相関する。
【００２４】
本発明の方法は、微小管分子の集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの分子流動速度と同位体標識遊離チューブリンサブユニットにおける分子流動速度との比較を含むことができる。あるいは、微小管分子の集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの分子流動速度は、体内の水分または遊離チューブリンサブユニットのための他の代謝前駆体プールにおける分子流動速度と比較することができる。
【００２５】
さらに、本発明の方法は、同位体標識基質を投与する工程の後および生物系を１以上の候補薬剤に曝露する工程の後の既知の時間または間隔にて生物系から１以上のサンプルを集める工程を含むことができる。本方法はまた、生物系を２以上の候補薬剤の組合せに曝露する工程を含むこともできる。
【００２６】
ある態様にて、本発明の方法は、微小管、および／または微小管結合タンパク質との会合に基づく微小管の集団の単離を含む。ある具体的態様にて、微小管結合タンパク質としては、タウ、微小管結合タンパク質2（MAP2）および安定な細管のみのポリペプチド（STOP）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
ある具体的態様にて、本発明により評価されるシナプス可塑性またはシナプス形成への効果は、生物系に治療的である。あるいは、該効果は毒性効果を生物系にもたらしうる。毒性効果は神経毒性効果であることができる。別の具体的態様にて、該効果は治療効果であることができる。治療効果は、認知機能の増大および／または認知障害の少なくとも一つの臨床的兆候もしくは症状の改善であることができる。別の具体的態様にて、該効果は特定線量またはある線量範囲の１以上の候補薬剤に対して測定することができる。
【００２８】
別の具体的態様にて、本方法に用いられる同位体は安定な同位体である。安定な同位体は2Hであることができる。あるいは、3Hなどの放射性同位体を挙げることができるが、これに限定されない。
【００２９】
他の具体的態様にて、同位体標識基質は安定な同位体標識水であることができ、2H2OおよびH218Oが挙げられるが、これらに限定されない。基質としてはまた、2H2O、3H2Oおよびアミノ酸またはその前駆体も挙げることができるが、これらに限定されない。同位体標識基質としてはまた、2H標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、18O標識アミノ酸、3H標識アミノ酸、14C標識アミノ酸および35S標識アミノ酸も挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３０】
ある具体的態様にて、本発明の方法の１以上の候補薬剤は、連邦食品医薬品局承認薬物などのすでに認可された薬物であるが、これに限定されない。あるいは、候補薬剤は新規な化学物質または生物学的因子であることができる。
【００３１】
本発明は、シナプス可塑性またはシナプス形成への効果を評価するための生物系を提供する。生物系としては、真核細胞、細胞系、細胞培養物、単離組織標本、ウサギ、イヌ、マウス、ラット、モルモット、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトを挙げることができるが、これらに限定されない。生物系はまた、ヒトであることもできる。
【００３２】
ある態様にて、本発明は、例えば上記工程a）〜j）を含む方法などの本明細書記載の方法により生成した同位体摂動微小管分子を提供する。
【００３３】
別の態様にて、本発明は、本明細書に記載の方法によるシナプス可塑性またはシナプス形成への効果について１以上の化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。ある具体的態様にて、キットは、１以上の同位体標識前駆体およびキットの使用説明書を含む。キットはまた、前駆体分子の投与のための道具および／または対象からのサンプルを集めるための器具も含むことができる。
【００３４】
別の態様にて、本発明の方法はまた、本明細書に記載の方法により少なくとも部分的に同定される１以上の候補薬剤を製造する工程も含む。あるいは、本方法は、本明細書に記載の方法により少なくとも部分的に同定される１以上の候補薬剤を開発する工程を含む。開発工程は、本明細書に記載の方法により得られるデータの使用を含むことができる。ある具体的態様にて、本発明は、本明細書に記載の方法によりシナプス可塑性またはシナプス形成への効果を測定し、生物系を１以上の候補薬剤に曝露する工程の結果を１以上の候補薬剤の存在下におけるシナプス可塑性またはシナプス形成への効果の測定結果と比較し、１以上の候補薬剤が該効果を変化するか否かを決定し、変化するならば薬剤を開発する工程を含む方法を提供する。薬剤は事実上治療的または診断的であることができる。本方法はさらに、取引にて薬剤を分配する工程を含むことができる。薬剤を販売する工程を含むこともできる。
【００３５】
別の態様にて、本発明はシナプス接続への候補薬剤の効果を評価する方法を提供し、これは以下の工程を含むことができる：a）試験系を少なくとも一つの候補薬剤に曝露すること；b）微小管集団の形成中に同位体標識基質が少なくとも一つのチューブリンサブユニットに取り込まれるのに十分な時間、少なくとも一つの同位体標識基質を試験系に投与すること；c）第一時点にて第一微小管集団に取り込まれる少なくとも一つの同位体標識チューブリンサブユニットを有する第一サンプル、および第一時点にて少なくとも一つの同位体標識遊離チューブリンサブユニットを有する第二サンプルを試験系から得ること；d）第一微小管集団における同位体標識チューブリンサブユニットの試験同位体取り込み、および同位体標識遊離チューブリンサブユニットの試験同位体取り込みを定量化すること；e）第一時点からの微小管集団に取り込まれる少なくとも一つの同位体標識チューブリンサブユニット、および第一時点からの少なくとも一つの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの対照同位体取り込みの定量化を提供すること；f）試験および対照同位体取り込みを比較し、候補薬剤の効果を決定すること。他の具体的態様にて、定量化工程d）は１以上の以下のものの測定を含むことができる：
【００３６】
1）第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットおよび第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの両方の同位体取り込みの含有量；
【００３７】
2）第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットおよび第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの両方の同位体取り込みの速度；
【００３８】
3）第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットおよび第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの両方の同位体取り込みのパターン；
【００３９】
4）第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットおよび第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの両方の同位体取り込みの含有量における変化の速度；および
【００４０】
5）第一時点からの微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットおよび第一時点からの同位体標識遊離チューブリンサブユニットの両方の同位体取り込みのパターンにおける変化の速度。
【００４１】
別の具体的態様にて、比較工程f）はまた、第一微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットにおける分子流動速度を同位体標識遊離チューブリンサブユニットにおける分子流動速度と比較することも含む。あるいは、比較工程f）は、第一微小管集団に取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットにおける分子流動速度を遊離チューブリンサブユニットのための少なくとも一つの代謝前駆体プールにおける分子流動速度と比較することを含む。前駆体プールは体内の水分であるか、または少なくとも一つのアミノ酸前駆体を含むことができる。
【００４２】
別の具体的態様にて、本発明の方法の同位体は安定な同位体である。該方法の同位体標識基質としては、安定な同位体標識水、アミノ酸前駆体およびアミノ酸を挙げることができるが、これらに限定されない。標識は、安定な同位体または放射性同位体であることができる。ある具体的態様にて、同位体標識基質は2H標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、18O標識アミノ酸、3H標識アミノ酸、14C標識アミノ酸および35S標識アミノ酸などのアミノ酸であるが、これらに限定されない。
【００４３】
いくつかの具体的態様にて、本発明の方法は、試験系を第二候補薬剤に曝露することを含む。さらに、該方法はまた、試験系を少なくとも一つの特定線量の候補薬剤に曝露することも含むことができる。該方法はまた、試験系を第二線量の候補薬剤に曝露することも含むことができる。別の候補薬剤のさらなる線量もまた可能である。
【００４４】
ある態様にて、得る工程c）は、サンプルを微小管結合タンパク質結合剤と接触させることを含む。適切な微小管結合タンパク質としては、タウ、微小管結合タンパク質2（MAP2）および安定な細管のみのポリペプチド（STOP）が挙げられるが、これらに限定されない。結合剤は、微小管結合タンパク質に対する抗体であることができる。
【００４５】
他の具体的態様にて、本明細書に記載の方法により評価されるシナプス接続への効果は、治療効果である。可能な治療効果は、認知機能の増大および認知障害の少なくとも一つの臨床的兆候または症状の改善が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
ある他の態様にて、本発明は、本明細書に記載の方法によるシナプス接続への効果について化合物をスクリーニングするキットを提供する。ある具体的態様にて、キットは少なくとも一つの同位体標識基質および該キットの使用説明書を含む。別のキット成分は、基質の投与のための道具およびサンプルを対象から集めるための器具を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
発明の詳細な記述
I.  序論
A.  発明の概説
成人脳は、著しい機能的可塑性により特徴付けられ、これは学習および従って行動適応ならびに学習したことの保持（記憶）を可能とする。神経解剖学的レベルにて、機能的可塑性はニューロン間の新規および／または強化された接続に反映される。ニューロン接続は主にシナプスにより起こる。それゆえ、シナプス可塑性は学習および記憶が脳に基づく物理的または生化学的基質を示す。
【００４８】
認知障害は典型的に、新規情報の追加（学習）または情報の保持（記憶）の障害により特徴付けられる。これらの障害は、情報の神経生物学的処理における変化を反映し、それゆえシナプス可塑性に関する事象により生化学的に媒介されると考えられる。学習および記憶の障害（認知障害）としては、アルツハイマー病および他の認知症、学習障害、外傷性脳損傷、脳血管障害、種々の精神病態（例えば統合失調症）および他の病態が挙げられる。認知障害は米国および世界中で、膨大な罹患率ならびに夭逝に関与する。
【００４９】
現在のところ、生体脳におけるシナプス可塑性の客観的な研究基準の測定基準は存在しない。生体動物におけるニューロン接続の現在のアッセイは、主に行動試験ならびに電気生理学的測定および他の広範な非生化学的技術からなる。行動測定は、特定の脳領域または分子標的への生物学的標的についての再現性、感度、正確性および潜在的可能性の観点にて基本的に限定されることが広く認識される。行動試験はまた典型的に、実験操作に応じて群間の有意な差異を観察するために多数の動物を必要とする。長期増強などのシナプス可塑性の特定の特徴（シナプス結合への強化された効果および刺激への繰り返し曝露により誘発される学習）は特に、有機体にて定量的に測定またはモニターする困難性を残す。
【００５０】
従って、生体脳内のシナプス形成およびシナプス可塑性などのシナプス接続の目的の生化学的マーカー（バイオマーカー）についての認知科学および脳可塑性の分野に長期間必要性が認識されている。成熟脳の期間中の新規ニューロン結合およびその維持または欠乏の「生化学的記録」の検出および定量化の能力は、この分野における基本的な進歩を示すだろう。シナプス可塑性、長期増強または適応、学習、記憶および一般的認知の他の生化学的態様における環境因子の影響（例えば富栄養環境、異なる学習パラダイム）、遺伝子（例えば系統差）、生理学的メディエーター（例えば神経伝達物質、ホルモン）および薬理学的物質（例えば学習または記憶を増強する薬物）を再現可能な方法で直接研究する能力は、主な進歩であろう。このタイプの測定基準は機能的（例えば認知、行動）な結果と関連付けることができ、最終的には後者と置き換えることができる。特に重要なことは、好ましくは認知機能を調節する薬物を発見し、不利に認知機能を変える候補薬物を廃棄する能力であろう。
【００５１】
ここに、出願人は、シナプス可塑性、それゆえ学習および記憶の基礎となる生化学的事象が生体動物の脳におけるハイ・スループット法を直接的および再現可能的に測定することを可能にする発明を開示する。出願人は、脳微小管の動態が安定な同位体質量分析標識アプローチによりインビボにて測定することができ、脳から生化学的に単離された特異的な微小管フラクションの動態がインビボにおけるシナプス可塑性およびニューロン接続の動態を明らかにすることを発見している。さらに、脳微小管の動態は神経化学的影響だけでなく、生体動物における人工許容行動測定とも相関する。
【００５２】
本発明の方法は、同位体標識遊離チューブリンサブユニットに重水（2H2O）を使用する（Figs. 1A、1Bを参照のこと）。当業者は、他の同位体を用いて、これを以下により完全に記載されているタンパク質生合成の標識アミノ酸または他の前駆体により投与することができることを認識するだろう（Fig. 1Cもまた参照のこと）。2H標識は、非必須アミノ酸の生合成のための代謝経路を経由して、新たに合成された遊離チューブリンサブユニットに入れる。2Hの新たに合成された遊離チューブリンサブユニットへの取り込みは、チューブリン二量体プールに見られた後、ポリマー化を通して微小管に取り込まれる（Fig. 2Aを参照のこと）。微小管が高動態的である生物学的設定にて、2H標識は、二つのプール間の急速交換速度論（すなわち微小管の動態不安定性）を反映する二量体およびポリマープールに同様の速度にて蓄積される。この動態状態にて、2H標識は、二量体に見られるのとほぼ同速度にてポリマーに蓄積される。しかし、微小管が低動態的であるかまたは微小管標的チューブリンポリマー化剤（MTPA）もしくは内因性微小管安定化因子により安定化される設定にて、新たに合成されるチューブリンにおける2H標識は遊離チューブリンの生合成速度に比例する速度にて二量体プールに見られるが、微小管ポリマーへの取り込みは劇的に遅く、減少することが多い（Fig. 2Bを参照のこと）。
【００５３】
それゆえ本明細書に開示されるこれらの発見および本発明により、研究者は生体脳におけるニューロン接続（シナプス可塑性）の客観的な生化学的記録を生成しモニターすることが可能となる。本明細書に開示される本発明の特に貴重な結果は、シナプス可塑性を調節し、それゆえ学習、記憶または認知機能の他の態様を改善（または悪化）しうる、薬物候補を選択し廃棄するためにスクリーニングする能力である。この学習および記憶の調節剤のための薬物スクリーニングおよびフィルターアプローチは、動物モデルのインビボにおけるハイ・スループットの可能性を明示する。
【００５４】
B.  神経系の生化学および細胞生物学
ニューロンは、細胞容積の99%より多くに及ぶ長い突起（神経突起）を含むという点で独特な細胞型である。これは、その特殊な形態を構築し維持するために洗練された分子機構の存在を必要とする。ニューロンの細胞の完全性に関与する主な分子機構は、微小管骨格である。神経突起（軸索および樹状突起）の形成を促進し安定性を与える微小管は、ニューロンにて非常に豊富である。軸索微小管の安定性および動態不安定性の状態（「微小管動態」）は、ニューロン内のシグナリング経路を示す。微小管の集合は主として、微小管結合タンパク質（MAP）により調整される。ニューロンMAPは特定の極性分布を有する。例えばタウは軸索区画にのみ局在し、神経変性障害に関与する。タウは微小管集合、神経突起伸長および神経突起安定性に影響する。これは、微小管の高動態的挙動を調整し、従ってそれらを安定化するタウの能力を通して達成される。それゆえ、微小管構造の完全性はニューロンにおける正常な恒常性のバイオセンサーとして供し、その完全性の調整における任意の崩壊は細胞ストレス反応の活性化をもたらしうる。
【００５５】
過去１０年にわたり、脳は、電気的および神経化学的回路による刺激への反応もまた特異的な生化学的および構造的変化に依存する動態系として認識されている。明らかに、微小管細胞骨格の再配列は、脳発達中の神経回路の構築および成熟ニューロンにおけるシナプス可塑性のために基本的に重要である。神経変性障害におけるシナプス接続の崩壊を理解し、薬理学的または再生的アプローチによるこれらの欠陥を修正することは、区画化された微小管の基本的な動態の正しい認識を必要とするだろう。本明細書に記載の反応速度測定法は、シナプス可塑性およびニューロン成熟の生化学的記録として有用であり、最終的に学習および記憶などの行動測定との相関性に重要であることを証明することができる。
【００５６】
II.  一般的技術
本発明の実践は、特に明記されなければ、分子生物学（組換え技術など）、神経生物学、基本的神経科学、臨床神経科学および神経学、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学および行動生物学（学習および記憶法など）の従来技術を用い、これらは当分野の技術の範囲内である。そのような技術は文献に完全に説明され、例えば文献（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；およびMass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations by Hellerstein and Neese (Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) El 146-E1162, 1999)）である。さらに、市販のアッセイキットおよび試薬を用いる手順は典型的に、特に明記されなければ、製造業者の定義したプロトコールにより使用されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
III.  定義
特に定義されなければ、本明細書に用いられるすべての技術用語、表記および他の科学用語は、本発明が関係する分野における当業者により一般に理解される意味を有するものである。ある場合には、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするためにおよび／またはすぐに参照できるように本明細書に定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも当分野に一般的に理解される実質的な相違を示すために制限されるべきではない。本明細書に記載されるかまたは引用される技術および手順は、一般によく理解されており、当業者による従来の方法論を用いて一般に用いられ、例えば文献（Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations by Hellerstein and Neese (Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) E1146-E1162, 1999）である。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を必要とする手順を一般に、特に明記されなければ、製造業者に定義されるプロトコールおよび／またはパラメータに従って行う。
【００５８】
「分子流動速度」または「流動」は、細胞、組織または有機体内の分子の合成および／または分解の速度を意味する。「分子流動速度」はまた、分子のプールへの分子の流入またはそこからの除去を意味し、それゆえ分子のプールへのおよびそこからの流量と同義語である。
【００５９】
「代謝経路」は、分子の化学的、空間的または物理的形質転換であるものの最終結果である生物系における二以上の任意に連結した一連の生化学的過程（すなわち生化学的過程）を意味する。代謝経路は、該経路を含む生化学的過程を通した分子の方向および流量により定義される。代謝経路内の分子は、例えば脂質、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、核酸、ポリヌクレオチド、ポルフィリン、グリコサミノグリカン、糖脂質、中間代謝産物、無機鉱物、イオンなどの任意の生化学的クラスであることができるが、これらに限定されない。
【００６０】
「代謝経路を通した流動速度」は、定義される代謝経路を通した分子形質転換の速度を意味する。経路を通した流動速度の単位は、化学質量／時間（例えばモル／分、グラム／時間）である。経路を通した流動速度は最適に、明瞭に定義される生化学的出発点から明瞭に定義される生化学的終点まで（定義される興味の代謝経路中のすべての段階を含む）の形質転換速度を意味する。
【００６１】
「同位体」は、同数のプロトンを有し従って同一の元素であるが、異なる数の中性子を有する、原子を意味する（例えば1H対2HまたはD）。
【００６２】
「アイソトポログ（Isotopologue）」は、同一の元素および化学的組成を有するが同位体含有量の異なる、同位体相同物または分子種を意味する（例えばCH3NH2対上記実施例のCH3NHD）。アイソトポログはその同位体組成により定義され、従って各アイソトポログは独特の正確な質量を有するが独特の構造を有さなくてよい。アイソトポログは通常、同位体異性体（アイソトポマー）のファミリーを含み、これは分子における同位体の位置により異なる（例えばCH3NHDおよびCH2DNH2は同一のアイソトポログであるが、異なるアイソトポマーである）。
【００６３】
「同位体標識水」としては、水素または酸素のいずれかの１以上の特定の重同位体で標識された水が挙げられる。同位体標識水の特定の具体例としては、2H2O、3H2OおよびH218Oが挙げられる。
【００６４】
「化学物質」としては、有効な治療剤を発見するか（薬物または薬物候補またはリード薬物）または毒性効果を明らかにする（工業用化学薬品、農薬、除草剤、食品添加物、化粧品など）目標に向かう生物学的または生化学的活性についてスクリーニングする目的のために生物系に投与される、新規または既知の任意の分子、化学物質または化合物が挙げられる。
【００６５】
「リード薬物」または「薬物候補」は、本明細書において、有効な治療剤（薬物）として評価される化学物質または生体分子として定義される。「薬物」または「薬剤」または「化合物」は、本明細書において同義で用いられ、有効な治療剤として投与され、認可されもしくは試験されるかまたは既知の治療剤である、任意の物質の成分（例えば化学物質または生物学的要因）を記載する。
【００６６】
「既知の薬物」または「既知の薬剤」または「すでに認可された薬物」は、米国または他の管轄区域におけるヒトまたは動物における薬物としての治療的使用が認可されている物質（すなわち化学物質または生物学的要因）を意味する。本発明の文脈において、用語「すでに認可された薬物」は、本明細書に開示される方法の使用により試験されている示唆から明らかな適応のための認可を有する薬物を意味する。例として乾癬およびフルオキセチンを用いて、本発明の方法は、FDA（および他の管轄権）により鬱病の治療について認可されている薬物フルオキセチンを乾癬（例えば角化細胞の増殖またはケラチン合成）のバイオマーカーへの効果について試験することができ；乾癬をフルオキセチンで治療することは、FDAまたは他の管轄権により認可されていない適応である。このように、すでに認可された薬物（この例ではフルオキセチン）のための新規使用（この例では抗乾癬効果）を見出すことができる。
【００６７】
「生物学的要因」は、生物学的または生理学的活性（例えば予防的、治療的および／または毒性効果）を有する有機体により産生される化合物を意味する。生物学的要因の例としては、ワクチン、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、組換えタンパク質、単離されたタンパク質、可溶性レセプター、遺伝子治療産物などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において、用語「生物学的因子」は「生物学的要因」と同義である。
【００６８】
本発明の文脈において、「化合物」は、任意の新規な化学物質、化学物質、リード薬物、薬物候補、薬物、薬剤、物質、既知の薬物、既知の薬剤、すでに認可された薬物、生物学的因子または生物学的要因を意味する。用語は、すべての化学的および生物学的分子を包含することを意味する。
【００６９】
「食品添加物」としては、感覚刺激性物質（すなわち風味、質感、香りおよび色を与える物質）、ニトロソアミン、ニトロソアミド、N-ニトロソ物質などの保存剤、コンゲラント（congealant）、乳化剤、分散剤、燻蒸剤、保湿剤、酸化剤および還元剤、推進剤、金属イオン封鎖剤、溶剤、界面活性剤、表面処理剤（surface-finishing agent）、共力剤、農薬、塩素化有機化合物、食用動物により摂取されるかまたは食用植物により取り込まれる任意の化学物質、および包装材料から食物または飲料に浸出する（そうでなければそれらに進入する）任意の化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。該用語は、製造および包装工程におけるある段階にて食物または飲料物に加えられるか、あるいは食用動物による摂取もしくは食用植物による取り込みにより、または内毒素および外毒素（ボツリヌス毒素もしくはアフラトキシンなどの予め形成される毒素）などの微生物副生成物を通して、または調理工程を通して（ヘテロ環アミン、例えば2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]キノロンなど）、または製造、包装、貯蔵および取扱い活動中に包装材料からの浸出もしくは他の工程により食物に進入する、化学物質を包含するものである。
【００７０】
「工業用化学薬品」としては、揮発性有機化合物、半揮発性有機化合物、洗浄剤、溶媒、シンナー、ミキサー、金属化合物、金属、有機金属、半金属、置換および非置換脂肪族および非環式炭化水素（ヘキサンなど）、置換および非置換芳香族炭化水素（ベンゼンおよびスチレンなど）、ハロゲン化炭化水素（塩化ビニルなど）、アミノ誘導体およびニトロ誘導体（ニトロベンゼンなど）、グリコールおよび誘導体（プロピレングリコールなど）、ケトン（シクロヘキサノンなど）、アルデヒド（フルフラールなど）、アミドおよび無水物（アクリルアミドなど）、フェノール、シアニドおよびニトリル、イソシアネート、および農薬、除草剤、殺鼠剤、および殺菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
「環境汚染物質」としては、天然に見られない任意の化学物質、または天然に見られるが天然に見られるレベルを超えて人工的に濃縮された化学物質（少なくとも天然にて利用しやすい媒体中にて見られる）が挙げられる。そして、例えば、環境汚染物質は、公園、学校または遊び場などの非業務的または工業的環境にさえ見られる、業務用または工業用化学物質として認識される任意の非天然化学物質を含むことができる。あるいは、環境汚染物質は、鉛などの天然由来であるがバックグラウンドを超えるレベル（例えば自動車の加鉛ガソリンの燃焼からの排出により堆積する幹線道路に沿った土壌中に見られる鉛）である化学物質を含むことができる。環境汚染物質は、工場の煙突もしくは地表水もしくは地下水への工業廃水などの点源、または幹線道路に沿って移動する車からの排気、市街道路に沿って運行するバスからのディーゼル排気（およびそれに含まれるすべて）、もしくは農地に起因する浮遊粉塵からの土壌に堆積された農薬などの非点源に由来しうる。本明細書において、「環境汚染物」は「環境汚染物質」と同義である。
【００７２】
「生物系」としては、細胞、細胞系、疾患の動物モデル、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、他のペット動物、マウス、ラット、非ヒト霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。生物系は、動物、特に哺乳動物、特にヒトなどの脊椎動物が挙げられるがこれに限定されない、「試験系」を含む。学習および記憶障害などの種々の疾患状態を有する動物が含まれる。本発明によれば、少なくとも一つの候補薬剤は試験系に投与される。対照系は、候補薬剤を投与しない系または無病系であることができる。
【００７３】
「生物学的サンプル」、「サンプル」またはその文法上の均等物は、細胞、組織または有機体から得られる任意のサンプルを包含する。定義は血液および他の生体起源の液体サンプルを包含し、ここに、該サンプルは侵襲的手段（例えば手術、直視下生検、内視鏡生検、および無視できない危険性を伴う他の手順）または低侵襲的または非侵襲的アプローチ（例えば尿採取、採血、針吸引、および最小限のリスク、不快または努力を伴う他の手順）によるサンプリングを通して有機体から入手可能である。定義はまた、試薬による治療、可溶化またはタンパク質もしくは有機代謝物などのいくつかの成分の濃縮などによりそれらの調達後に何らかの方法で操作されるサンプルも含む。用語「生物学的サンプル」はまた、血清、血漿、他の生物学的流動体などの臨床サンプルまたは組織サンプルも包含し、培養物、細胞上清および細胞溶解物中の細胞も含む。
【００７４】
「生物学的流動体」は、尿、血液、間質液、浮腫液、唾液、涙液、炎症性滲出液、滑液、膿瘍、蓄膿症もしくは他の感染体液、脳脊髄液、汗、気道内分泌物（痰）、精液、糞、胆液、腸内分泌、または他の生物学的流動体を意味するが、これらに限定されない。
【００７５】
「正確な質量」は、分子式のすべての同位体の正確な質量を合計することにより計算される質量を意味する（例えばCH3NHDについて32.04847）。
【００７６】
「見掛けの質量」は、分子の正確な質量を四捨五入することにより得られる整数の質量を意味する。
【００７７】
「質量アイソトポマー」は、同位体組成物より見掛けの質量を基準にグループ分けされる同位体異性体のファミリーを意味する。質量アイソトポマーはアイソトポログと異なり、異なる同位体組成物の分子を含むことができる（例えばCH3NHD、13CH3NH2、CH315NH2は同じ質量アイソトポマーの一部であるが異なるアイソトポログである）。操作上の観点にて、質量アイソトポマーは質量分析計により分解しないアイソトポログのファミリーである。四重極質量分析計について、これは典型的に、質量アイソトポマーが見掛け上の質量を共有するアイソトポログのファミリーであることを意味する。従って、アイソトポログCH3NH2およびCH3NHDは見掛け上の質量が異なり、異なる質量アイソトポマーであると区別されるが、アイソトポログCH3NHD、CH2DNH2、13CH3NH2およびCH315NH2はすべて同じ見掛け上の質量であり、従って同じ質量アイソトポマーである。それゆえ質量アイソトポマーはそれぞれ、典型的に２以上のアイソトポログからなり、２以上の正確な質量を有する。質量分析データからの計算をアイソトポログより多数の質量アイソトポマーで行わなければならないように、すべての個別のアイソトポログが四重極質量分析計を用いて分解せず、より高い質量分解を産生する質量分析計を用いてさえ分解することができないので、アイソトポログおよび質量アイソトポマーの区別は実際に有用である。質量が最も小さい質量アイソトポマーはM0として示され；ほとんどの有機分子について、これは12C、1H、16O、14Nなどすべてを含む種である。他の質量アイソトポマーはM0（M1、M2など）からの質量差により区別される。与えられる質量アイソトポマーについて、分子内の同位体の配置または位置は特定されず、変化しうる（すなわち「位置アイソトポマー」は区別されない）。
【００７８】
「質量アイソトポマー・エンベロープ（isotopomer envelope）」は、各分子と関連するファミリーまたはモニターされるイオンフラグメントを含む、一連の質量アイソトポマーを意味する。
【００７９】
「質量アイソトポマー・パターン」は分子の質量アイソトポマーの存在度のヒストグラムを意味する。伝統的に、パターンは、すべての存在度が最大存在質量アイソトポマーのものに標準化される、百分率相対存在度として与えられ；最大存在アイソトポマーは100％であると言える。しかし、質量アイソトポマー分布分析（MIDA）などの確率分析法を含む適用のための好ましい形態は、各種が全存在度に寄与するフラクションが用いられる割合または部分存在度である。用語「同位体パターン」は用語「質量アイソトポマー・パターン」と同義で用いることができる。
【００８０】
「モノアイソトピック質量」は、1H、12C、14N、16O、32Sなどをすべて含む分子種の正確な質量を意味する。C、H、N、O、P、S、F、Cl、BrおよびIからなるアイソトポログについて、これらの元素の最大存在同位体もまた最小質量であるので、最小質量のアイソトポログの同位体組成は特異的であり、明白である。モノアイソトピック質量はm0として略され、他の質量アイソトポマーの質量はm0（m1、m2など）からのその質量差により同定される。
【００８１】
「同位体摂動」は、天然に通常見られる分布と異なる同位体分布を有する元素または分子の明白な取り込みを生じる元素または分子の状態を意味し、天然に少量で存在する同位体は過剰に（豊富）または欠乏して（消耗）存在する。
【００８２】
「興味の分子」は、生物系内の代謝経路内に存在するアミノ酸、炭水化物、脂肪酸、ペプチド、糖、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、グリコサミノグリカン、ポリペプチドまたはタンパク質などの任意の分子（ポリマーおよび／またはモノマー）を意味するが、これらに限定されない。本発明の文脈において、「興味の分子」は疾患の「バイオマーカー」であることができ、曝露されていないまたはそうでなければ健康な対象（すなわち対照対象）の流動速度に対するその流動速度は、興味の対象における将来の疾患または損傷の前兆となりうる興味の対象において臨床的に観察されないまたはわずかな病態生理学的な発生を示すことができる。このように、興味の対象における興味の１以上のバイオマーカーの流動速度と対照対象における興味の１以上のバイオマーカーの流動速度の比較により、興味の疾患についての興味の対象の診断における使用、または興味の疾患を患う危険性のある興味の対象の評価もしくは定量化における使用が見出されよう。さらに、そのような情報により、興味の疾患を有する興味の対象のための予後の構築、興味の対象における興味の疾患の進行のモニター、または興味の疾患を有する興味の対象における治療計画の治療的有効性の評価における使用が見出されよう。
【００８３】
「興味の対象」は、興味の疾患を有するかまたは興味の疾患を患うある程度の危険性を有する、ヒトまたは動物を意味する。
【００８４】
「対照対象」は、興味の疾患を有しないかまたは興味の疾患を患う危険性をある程度有しない、ヒトまたは動物を意味する。
【００８５】
「モノマー」は、ポリマー合成中に組み合わされポリマー中２以上存在する、化学的単位を意味する。
【００８６】
「ポリマー」は、２以上のモノマーの繰り返しから合成されこれを含む、分子を意味する。「バイオポリマー」は、生物系によりもしくはその中で合成されるかまたはそうでなければ生物系と結合する、ポリマーである。
【００８７】
「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書において、「タンパク質」は、長鎖アミノ酸ポリマーならびにペプチドなどの短鎖ポリマーを意味することができる。
【００８８】
「アミノ酸」は、アミノ基（すなわちNH2）を含む任意の両性有機酸を意味する。該用語は、２０の共通（common）（「標準」またはときどき「天然」として当分野にて称されることが多い）アミノ酸ならびに非共通（「非標準」として当分野にて称されることが多い）アミノ酸を包含する。２０の共通アミノ酸の例としては、アルファ-アミノ酸（またはα-アミノ酸）が挙げられ、これはアルファ位にアミノ基を有し、一般に式RCH-(NH2)-COOHを有する。α-アミノ酸はタンパク質のモノマー構成要素であり、加水分解を通してタンパク質から得ることができる。非標準アミノ酸の例としては、γ-アミノ酪酸、ドーパミン、ヒスタミン、チロキシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステインおよびS-アデノシルメチオニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
「同位体標識基質」は、生物系中の興味の分子に取り込むことができる任意の同位体標識前駆体分子を含む。同位体標識基質の例としては、2H2O、3H2O、2Hグルコース、2H標識アミノ酸、2H標識有機分子、13C標識有機分子、14C標識有機分子、13CO2、14CO2、15N標識有機分子および15NH3が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
「重水」は、１以上の2H同位体を取り込んだ水を意味する。
【００９１】
「投与」は、化学物質に曝露される生物系を含む。そのような曝露は、動物または他の高等有機体における局所適用、経口摂取、吸入、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射および動脈注射からであることができるが、これらに限定されない。
【００９２】
「毒性効果」は、生物系による候補薬剤に対する不利な反応を意味する。本発明の文脈における毒性効果は、学習障害もしくは記憶障害または完全な学習損失もしくは記憶喪失であることができる。
【００９３】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００９４】
「哺乳動物」は、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種などのヒトおよび非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類などの実験動物などの哺乳類クラスの任意のメンバーを意味するが、これらに限定されない。該用語は特定の年齢または性別を示さない。従って、雄または雌にかかわらず成人および新生児対象ならびに胎児を包含するものである。
【００９５】
創薬および開発の文脈にて「少なくとも部分的に認識される」は、薬剤（すなわち「化合物」）の少なくとも一つの臨床的に関連のある薬理学的特性が１以上の本発明の方法を用いて認識されることを意味する。この特性は、例えば疾患過程に寄与する代謝経路を通して分子流動速度を増大または減少し、疾患に関する代謝経路の活性を変えるシグナル伝達経路または細胞表面レセプターを変化させ、酵素などの活性化を阻害する、所望の特性であることができる。あるいは、薬剤の薬理学的特性は、所望でない特性、例えば１以上の毒性効果の産生であることができる。当業者によく知られている薬剤の多くの所望なおよび所望でない特性があり、それぞれは疾患を発症し標的化する特定の薬剤との関連で見られよう。もちろん、薬剤は、例えば薬物開発経路に沿って特定の画期的な決定点を支持するのに十分であるいくつかの特性（所望なまたは所望でないまたはその両方）が認識されるときに、少なくとも部分的より多く認識されうる。そのような画期的なものとしては、インビトロからインビボへの遷移についての前臨床決定、新薬臨床試験開始（IND）前申請決行／中止（go/no go）決定、I相からII相への遷移、II相からIII相への遷移、秘密保持契約（NDA）申請および市場取引のためのFDA認可が挙げられるが、これらに限定されない。それゆえ、「少なくとも部分的に」認識されているは、創薬／薬物開発過程における薬剤の評価に有用な１以上の薬理学的特性の認識を含む。薬理学者もしくは医師または他の研究者は薬剤の認識されている所望なおよび所望でない特性のすべてまたは一部を評価し、その治療指標を構築することができる。これは当分野によく知られている手順を用いて達成することができる。
【００９６】
本発明の文脈において「薬剤を製造する」は、薬剤製品を製造するために用いられる、当業者によく知られている任意の手段を含む。製造工程としては、医薬品合成（すなわち合成有機化学）、コンビナトリアル・ケミストリー、ハイブリドーマ・モノクローナル抗体産生などのバイオテクノロジー法、組換えDNA法および当業者によく知られている他の技術が挙げられるが、これらに限定されない。そのような製品は、併用製品の一部としてまたは単一製品としてのいずれであろうと、治療的使用のために市場取引される最終薬剤、治療的使用のために市場取引される併用製品の成分、または最終薬剤製品の開発に用いられる任意の中間製品であることができる。「薬剤を製造する」は「化合物を製造する」と同義である。
【００９７】
「バイオマーカー」は、１以上の疾患の開始、進行、重篤度、病変、攻撃性、悪性度、活性、障害、死亡率、罹患率、疾患サブクラス化または他の内在する病原性もしくは病理的特徴を測定するために有用なまたは潜在的に有用な有機体からの生化学的測定を意味する。バイオマーカーの概念はまた、１以上の疾患の開始、進行、重篤度、病変、攻撃性、悪性度、活性、障害、死亡率、罹患率、疾患サブクラス化または他の内在する病原性もしくは病理的特徴を測定するために有用な血圧などの身体の肉体的測定も含む。バイオマーカーの概念はまた、動物またはヒトにおける毒性事象を予想するために用いられる薬理学的または生理学的測定も含む。バイオマーカーは、治療的介入の効果をモニターするための標的（すなわち薬剤の標的）であることができる。
【００９８】
本発明の文脈において、「評価する」または「評価」または「評価した」は、化学物質の活性、毒性、相対的有効性、潜在的治療的数値および／もしくは有効性、有意性または価値、生物学的因子、化学物質の組合せ、または生物学的要因の組合せが、評価および検討を通して、通常、実験結果を構築された標準および／または条件と比較することにより決定される過程を意味する。該用語は、化学物質または生物学的要因（または化学物質の組合せもしくは生物学的要因の組合せ）の「決行／中止」決定をする決定メーカーのための十分な情報を提供し、さらに薬物開発過程に進行する概念を包含する。「決行／中止」決定は、臨床前開発内の任意の段階、臨床前から新薬臨床試験開始（IND）段階、I相からII相への段階、II相からII相内のより進んだ相（IIb相など）、II相からIII相への段階、III相から新薬申請（NDA）または生物製剤申請（BLA）段階、またはこれらを超えた段階（IV相またはNDA後もしくはBLA後段階など）などの薬物開発過程における任意の点または画期的な点にてなすことができる。該用語はまた、化合物（化学物質、生物製剤）のクラスにおける「種類における最適性」（または「種類の最適性」）を選択するのに十分な情報を提供する概念も包含する。
【００９９】
本発明の文脈において、「特徴付ける」、「特徴付けた」または「特徴付け」は、化学物質または化学物質の組合せの特徴または質を記載する取り組みを意味する。本明細書において、該用語は、薬物を「評価する」ことが薬物開発過程を通してその薬物または化学物質を進める「決行／中止」決定（治療的価値の評価に基づく）を行う能力を含む、「評価」のより洗練された態様を欠く「評価」とほぼ均等である。
【０１００】
「病態」または「医学的状態」は、全体またはその一部の身体の肉体的状態を意味する。該用語は通常、先の肉体的もしくは精神的状態、または疾患もしくは障害としての医学的権威により認識されない異常からの変化を示唆するために用いられる。「病態」または「医学的状態」の例は、肥満および妊娠を含む。
【０１０１】
「軸索」は、一つの細胞体から別の細胞への外向きシグナル（すなわち潜在活性）を通常伝達する、神経細胞の高特異的な比較的長い伸長（突起）を意味する。神経細胞はそれぞれ、一つの軸索を有し、脳内では比較的短いが身体の他の部分では数フィート長までであることができる。
【０１０２】
樹状突起は、ニューロンの細胞体から拡張する、細長く典型的に分枝の突起を意味する。ニューロンは、神経伝達物質により刺激される複数の樹状突起を含み、他のニューロンの神経線維（軸索）からの衝撃を受け、それらをその神経細胞体に運搬することができる。
【０１０３】
「神経分化」は、多能性細胞が次第により特異的になりニューロンに成熟する過程を意味する。
【０１０４】
「軸索発芽および軸索枝」は、軸索が発芽（軸索成長円錐にて起こる）または分枝（軸索軸にて起こる）して他の神経細胞と連結し、新たな神経経路を形成する過程を意味する。
【０１０５】
「シナプス」は、神経系の細胞が互いにおよび筋肉または腺などの非ニューロン細胞に信号を送る、特殊化した接合を意味する。
【０１０６】
「シナプス接続」は、シナプス形成および／またはシナプス可塑性を意味する。
【０１０７】
「シナプス形成」は、シナプス結合を創製する過程を意味する。
【０１０８】
「シナプス可塑性」は、環境的および化学的影響に対する生体脳におけるニューロン結合の調節および適合の一般的過程を意味する。シナプス可塑性は、記憶および学習の神経化学的基盤のヘッブ（Hebbian）理論の一部である。
【０１０９】
「神経伝達物質」は、シナプス前およびシナプス後ニューロン間の電気信号（潜在活性）を中継し、増幅し、調節するために用いられる化学物質を意味する。神経伝達物質は、ニューロンから放出され、細胞間の空間（シナプス間隙）の至る所に拡散し、レセプターに結合する。神経伝達物質は興奮性または抑制性シナプス後作用を引き起こしうる。
【０１１０】
「ニューロトロフィン」または「神経栄養因子」は、ニューロンにおけるアポトーシスを防ぐことにより神経組織の生存を促進する、化学物質または分子、成長因子の任意のファミリーを意味する。神経栄養因子はまた、インビトロにて神経分化およびシナプス形成も促進する。神経栄養因子の例は、脳由来神経栄養因子（BDNF）である。
【０１１１】
本明細書において、「グルタミン酸」は中枢神経系（CNS）の代表的な興奮性神経伝達物質である。
【０１１２】
「ニューロン微小管」は、生体細胞にて単一、対、三重または一団を発生するチューブリンのポリマーからなるタンパク質構造を意味する。ニューロン微小管は、ニューロンの異なる位置（体細胞、樹状突起および軸索）にて存在し、異なるタンパク質（例えばタウ、MAP2およびSTOP）と結合する。微小管は、神経分化および神経伝達物質の離れたシナプスへの軸索に沿った長距離輸送を構築し維持するのに必要である。
【０１１３】
「チューブリン」は、微小管の主要なタンパク質成分を意味する。チューブリンは二つの球形ポリペプチド、アルファ-チューブリンおよびベータ-チューブリンからなる二量体である。微小管はアルファ-およびベータ-チューブリン（α-およびβ-チューブリン）の二量体から組み立てられる。
【０１１４】
「MAP」または「微小管結合タンパク質」は、微小管への結合時にその機能および／または挙動を変化させるタンパク質である。
【０１１５】
本明細書において、「タウ」または「タウタンパク質」は、脳から単離される微小管結合タンパク質（MAP）の主なクラスである。神経細胞にて、タウは軸索成長円錐にて非常に豊富である。タウタンパク質は、いくつかの非ポリマー化チューブリン分子に同時に結合し、脳内のチューブリンポリマー化の核形成過程を加速する。タウは動態的軸索成長円錐微小管のターンオーバー／集合を調整する。化学的に修飾されたタウタンパク質はまた、アルツハイマー病に見られる神経原線維変化および神経網糸の形成および／または組成に関与するようだ。
【０１１６】
本明細書において、「MAP2」または「微小管結合タンパク質2」は、ニューロン樹状微小管に非常に豊富である高分子量の微小管結合タンパク質である。いくつかの条件下、MAP2は微小管へのチューブリン集合のために必要であり、集合微小管を安定化し、それらの動態を調整する。
【０１１７】
本明細書において、「STOP」または「安定な細管のみのポリペプチド」は、神経Ca2+-カルモジュリン調整微小管関連タンパク質である。STOPは、冷却温度にてミリモルカルシウムまたは薬物により誘発されるインビトロ分解に対して無制限に微小管を安定化する。
【０１１８】
「神経冷却安定微小管」は、薬物および冷却温度の両方により誘発される分解に安定である軸索微小管の十分なサブ集団を意味する。薬物および冷却温度による微小管分解への耐性は、STOP（安定な細管のみのポリペプチド）タンパク質と関連するポリマーに主として起因する。
【０１１９】
「動態」は、分子または分子の系の速度論的特徴を意味する。本明細書において、これは、時間の次元における化学的速度を意味し（例えば質量またはモル／時間単位、例えばモル／分、グラム／時）、合成速度、分解速度、ターンオーバー速度、形質転換速度、交換速度、集合および分解速度、ポリマー化および脱ポリマー化速度、および微小管の速度論的挙動の他の態様を含む。これらの速度のいくつかは関連しうることが示されるべきであり；例えば合成速度および分解速度を組み合わせてターンオーバー速度を得ることができるなどである。これはまた、場合により「代謝経路を通した流動速度」とも称される。ある場合には、特に不可逆的または非常に遅い脱ポリマー化について、「経路を通した流動速度」は、明確に定義された生化学的出発点から明確に定義された生化学的終点までの形質転換速度を意味することができる。
【０１２０】
「学習」は、技術または知識を取得する認知過程を意味する。
【０１２１】
「記憶」は、処理する能力または覚えるかもしくは思い出す作用、特に学習したかもしくは説明したことを再生する能力を意味する。この過程は、注意、貯蔵および検索を必要とする。記憶の期間は経験の繰り返し数の関数である。記憶の二つの形態、短期記憶および長期記憶がある。短期記憶は新規タンパク質の合成を必要としない。長期記憶は新規タンパク質の合成を必要とする。
【０１２２】
「LTP」または「長期増強」は、大半は衝撃の集中などのいくつかのプライミング事象に続くシナプス接続の接続強度の持続的な変化（増強）を意味する。LTPはインビトロにて分〜時間およびインビボにて時間〜日および月の延長された期間続く。LTPはシナプス強度をより永久的に増大する解剖学的変化（記憶強化）をゆっくりと作るための生理学的骨格を提供すると考えられる。
【０１２３】
「顕在記憶」は、人が近接にまたは大切に保持する記憶を意味する。これらの記憶は意識的な想起を必要とし、人、場所、目的および事象の記憶と関連する。
【０１２４】
「潜在記憶」は、過去のエピソードの意識的な想起を伴わないで行動を通して表現される知覚および運転技術の記憶を意味する。
【０１２５】
「感作」は、ヒトまたは実験動物が学習し他の中性刺激に強く関与する学問的懸念の形態を意味する。単一の刺激は数時間継続しうる記憶を発生させ；４〜５の刺激は数日間継続しうる。
【０１２６】
用語「習慣性」は、刺激の繰り返しを伴う行動反応の進行的減少がある非結合性学習事象である。この「学習」は、生物学的系の根本的または基本的過程であり、意識的な動機または認識を必要とせずに起こる。実に、習慣性とともに、ヒトまたは実験動物は、背景の変化しない情報から意味のある情報を区別することができる。
【０１２７】
「パブロフの条件付け」または「レスポンデント条件付け」とも称される用語「古典的条件付け」は、二つの刺激の結合（または対合）により引き起こされる、動物に見られる学習タイプを意味する。
【０１２８】
「認知機能」は、知識（学習）が取得され貯蔵される（記憶）精神的過程を意味する。これらは、知覚、推理、創作活動、課題解決および可能な直感を含む。
【０１２９】
「認知障害」は、先の機能性のレベルから著しい劣化を示す認知または記憶の有意な欠乏からなる一連の障害を意味する。これは記憶の欠落、集中困難、会話または筆記の際の単語混同、「奇妙性（spaciness）」および不器用さを含むことができる。
【０１３０】
本明細書において「候補薬剤」または「候補薬物」は、本明細書に概述される活性についてスクリーニングすることができる、例えば抗体および酵素などの生物学的治療剤などのタンパク質、既知の薬物および薬物候補などの小有機分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、核酸などのいずれの分子も記載する。候補薬剤は、微小管ポリマー化および脱ポリマー化速度に影響し、それゆえ学習および記憶に有効に影響する、有効な治療剤の発見などの種々の理由；薬剤（例えば工業用化学薬品、農薬、除草剤などの環境汚染物質など）、薬物および薬物候補、食品添加物、化粧品などの毒性効果の解明；創薬；ならびに基本的な生物医学的研究の促進（例えば学習および／または記憶の根本的な過程への研究）のために本発明にて評価される。
【０１３１】
候補薬剤は、多くの化学的クラスを包含する。ある具体的態様にて、候補薬剤は、有機分子、好ましくは100より大きく約2,500ダルトンより小さい分子量を有する小有機化合物である。特に好ましくは、100より大きく約2,000ダルトンより小さく、より好ましくは約1500ダルトンより小さく、より好ましくは約1000ダルトンより小さく、より好ましくは500ダルトンより小さい、分子量を有する小有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも二つの機能的化学基が挙げられる。候補薬剤は、１以上の上記官能基で置換された、環状炭素またはヘテロ環構造および／または芳香環または多環芳香環構造を含むことが多い。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはその組合せなどの生体分子の中でも見られる。
【０１３２】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーなどの広範な源から得られる。例えば、多くの手段が、無作為化オリゴヌクレオチドおよびペプチドの発現および／または合成などの広範な有機化合物および生体分子の無作為および指示合成に利用できる。あるいは、細菌性、真菌性、植物性および動物性抽出物の形態における天然化合物のライブラリーは、入手可能であるかまたは容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾される。既知の薬剤はアシル化、アルキル化、エステル化、アミディフィケーションなどの指定されたまたは無作為の化学修飾を受けて、構造的類似体を産生することができる。
【０１３３】
候補薬剤はタンパク質であることができる。本明細書において「タンパク質」は、少なくとも二つの共有結合したアミノ酸を意味し、該アミノ酸はタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、天然アミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造で構成されていてよい。従って、本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然および合成アミノ酸の両方を意味する。例えばホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含む。側鎖は、(R)または(S)立体配置であることができる。好ましい具体的態様にて、アミノ酸は(S)またはL-立体配置である。非天然側鎖が用いられるとき、非アミノ酸置換基は例えばインビボ分解を予防するかまたは妨害するために用いることができる。酵素のペプチド阻害剤は特定の用途を見出す。
【０１３４】
候補薬剤は天然タンパク質または天然タンパク質のフラグメントであることができる。従って、例えばタンパク質を含む細胞抽出物またはタンパク性細胞抽出物の無作為もしくは指定された消化物を用いることができる。このように、原核生物および真核生物タンパク質のライブラリーは、本明細書に記載の系におけるスクリーニングのために製造することができる。この具体的態様にて特に好ましくは、細菌性、真菌性、ウイルス性および哺乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０１３５】
候補薬剤は、抗体、タンパク質のクラスであることができる。用語「抗体」としては、Fab Fab2、単一鎖抗体（例えばFv）、キメラ抗体、ヒト化およびヒト抗体などの当分野にて知られているような抗体フラグメントの全体が挙げられ、それらのいずれかは全抗体または組換えDNA技術を用いて新たに合成されたものおよびその誘導体の改変により産生される。
【０１３６】
候補薬剤は核酸であってよい。「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または本明細書の文法的均等は一緒に共有結合した少なくとも二つのヌクレオチドを意味する。以下に概述されるいくつかの場合において、核酸類似体は、例えばホスホルアミド（Beaucage, et al., tetrahedron, 49(10):1925 (1993)およびその引用文献；Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970)；Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977)；Letsinger, et al., Nud. Acids Res., 14:3487 (1986)；Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988)；およびPauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986)）、ホスホロチオエート（Mag, et al., Nucleic acids Res., 19:1437 (1991)；および米国特許番号5,644,048）、ホスホロジチオエート（Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)）、O-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照のこと）、およびペプチド核酸骨格および結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992)；Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992)；Nielsen, Nature, 365:566 (1993)；Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996)、これらのすべての引用文献を参照のこと）を含む別の骨格を有することができるものを包含するが、本発明の核酸は一般に、ホスホジエステル結合を含むだろう。他の核酸類似体としては、陽性骨格（Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)）；非イオン性骨格（米国特許番号5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；および4,469,863；Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991)；Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988)；Letsinger, et al., Nucleoside＆Nucleotide, 13:1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580,「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker, et al., Bioorganic＆Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994)；Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994)；Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)）および米国特許番号5,235,033および5,034,506および文献（Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580,「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook）記載の非リボース骨格、およびペプチド核酸を有するものが挙げられる。１以上の環状炭素糖を含む核酸もまた、核酸の定義の範囲内に含まれる（Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176を参照のこと）。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C＆E News, June 2, 1997, page 35に記載される。これらの引用文献はすべて、本明細書に明確に引用される。リボース-リン酸骨格のこれらの改変は、標識などのさらなる部位の付加を促進するか、または生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増大するためになすことができる。さらに、天然核酸および類似体の混合物を製造することができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然核酸および類似体の混合物を製造することができる。核酸は、示される単一らせんもしくは二重らせんであることができるか、または限定骨格、ウイルス、プラスミド、染色体などの二重もしくは単一らせんの両方の部分を含むことができる。核酸はDNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNAまたはハイブリッドであることができ、ここに、該核酸はデオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドの任意の組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン（xathanine）ヒポキサタニン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン（pseudoisocytosine）、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル（pseudouracil）、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシンおよび2,6-ジアミノプリンなどの塩基の任意の組合せを含む。ヌクレオシド（リボースプラス塩基）およびヌクレオチド（リボース、塩基および少なくとも一つのリン酸）が本明細書において特に明記されなければ同義で用いられることは、本発明の文脈にて留意すべきことである。
【０１３７】
一般にタンパク質について上記記載のように、核酸候補薬剤は天然核酸、ランダムおよび／または合成核酸であることができる。例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物はタンパク質について上記に概述されるように用いることができる。さらに、RNAは本明細書に含まれる。
【０１３８】
「リード薬物」または「薬物候補」は、本明細書において、有効な治療剤（薬物）として評価される化学物質または生体分子として定義される。「薬物」または「薬剤」または「化合物」は、本明細書にて同義で用いられ、有効な治療剤として投与され認可されもしくは試験されるか、または既知の治療剤である、因子（例えば化学物質または生物学的因子）の任意の組成物を記載する。
【０１３９】
「効果」は、生物系内のある目的の過程または構造における注目すべき変化、例えば生化学的、代謝的、遺伝的、細胞内、構造的、神経学的、生理学的、電気生理学的、認知的、社会的もしくは行動的測定基準もしくは結果における、または対象もしくは患者により報告される症状などの目的の過程における変化を含むが、これらに限定されないものを意味する。
【０１４０】
「治療的効果」は、任意の疾患または病態に有効な便益を有する任意の効果を意味する。
【０１４１】
「時点」およびその文法的な均等は、少なくとも一つの候補薬剤に曝露された後および少なくとも一つの同位体標識基質を投与された後の生物系、特に試験系における時間の段階を意味し、同位体標識基質が微小管集団の形成中の少なくとも一つのチューブリンサブユニットに取り込まれるのに十分な時間が経過する。与えられた時点にて、１以上のサンプルが試験系から得られる。本発明の方法は、２以上の「時点」を利用することができる。例えば、第一、第二、第三、第四などの時点は、さらなるサンプルを得るために選択することができる。
【０１４２】
「同位体取り込み」は、同位体標識基質が１以上のチューブリンサブユニットに取り込まれる程度を意味する。本発明の方法によれば、「同位体取り込み」は試験または対照系にて測定することができる。「試験同位体取り込み」は試験系から取り出されたサンプルにて測定される。「対照同位体取り込み」は対照系から取り出されたサンプルにて測定される。「同位体取り込み」の測定は、含有量、取り込み速度、および／または１以上のチューブリンサブユニットに取り込まれる同位体標識チューブリンサブユニットの同位体標識の含有量および／もしくはパターンにおける変化のパターンもしくは速度などの種々の量であることができるが、これらに限定されない。同位体取り込みは、微小管分子の集団および／または遊離チューブリンサブユニットにて測定することができる。
【０１４３】
IV.  発明の方法
A.  発明の方法の概説
本発明は、生物系の中枢神経系の細胞または組織における微小管の動態（例えばポリマー化および脱ポリマー化速度）を測定する方法を目的とする。まず、１以上の同位体標識基質（ときどき本明細書において「前駆体」と称される）は、多数の微小管のサブユニット（例えばチューブリン二量体および微小管ポリマー）に取り込まれるのに十分な時間の少なくとも第一期間で生物系に投与される。標識された微小管は種々の方法、例えば細胞分画にて生物系から得られ、標識の量は通常定量される。さらに、「取り込まれていない」標識された基質もまた、例えば本明細書に概述される質量分析を用いて定量することができる。
【０１４４】
このように上記に概述されるように、微小管の動態は、特定の時間間隔にわたる、標的されたサブユニットもしくは分子集団（例えばチューブリン二量体および微小管ポリマー）における同位体含有量および／もしくはパターンまたは同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度を、例えば質量分析または当分野にて知られる他の分析法を用いることにより測定し比較することにより測定することができる。微小管における同位体含有量および／もしくはパターンまたは同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度と、未集合サブユニットにおける同位体含有量および／もしくはパターンまたは同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度との関係は、特に有益であることができる。（しかし、必ずしも全ての系の分析が「取り込まれていない」または「遊離」基質の定量化または評価を必要としないことに留意すべきである。）次いで、微小管の動態集合および分解（ポリマー化および脱ポリマー化）を計算することができる。
【０１４５】
あるいは、放射性標識基質は、該放射性標識基質がチューブリン二量体に取り込まれ次いで微小管ポリマーに取り込まれる、本発明における使用について考慮される。このように、微小管の動態は、シンチレーション・カウンティングなどの当分野に知られる技術を用いることによりチューブリン二量体および微小管ポリマーに存在する放射能を測定することにより測定することができる。次いで、微小管ポリマーの動態は、当分野に知られている方法を用いて算出する。
【０１４６】
さらに別の具体的態様にて、安定かつ放射性の同位体は、１以上の同位体標識基質チューブリン二量体を標識するために用いられる。
【０１４７】
興味の標的された微小管分子は、細胞、組織または有機体からの生化学的単離手順（より詳細には以下に記載する）により得られ、質量分析または当分野にて知られている他の手段により同定される。興味のそれぞれ同定された微小管分子に対応する質量アイソトポマー膜内の相対的および絶対的多数のイオン（すなわち分子の同位体含有量および／もしくはパターンまたは分子の同位体含有量および／もしくはパターンの変化の速度）を定量する。ある具体的態様にて、興味のそれぞれ同定された微小管分子に対応する質量アイソトポマー膜内の相対的および絶対的多数のイオンは質量分析により定量する。次いで標的微小管経路を通した流動速度を当分野に知られている公式の使用により計算し、以下に記載する。標的微小管経路を通した流動速度は、１以上の候補薬剤もしくは候補薬剤の組合せへの曝露の存在下もしくは非存在下にて、または１以上の候補薬剤への異なるレベルの曝露に応じて、または候補薬剤の組合せへの異なるレベルの曝露に応じて、比較する。
【０１４８】
このように、学習および記憶および他の認知機能（またはアルツハイマー病などの認知機能障害）における変化に内在する標的された微小管ポリマー化および／または脱ポリマー化経路における変化を測定し、定量し、これは疾患診断；疾患の予後；投与された候補薬剤の治療的有効性；または候補薬剤の毒性効果に関する。
【０１４９】
別の具体的態様において、微小管の動態は、１以上の候補薬剤への曝露の前および後の有機体における微小管のポリマー化および脱ポリマー化から測定し、毒性、例えば候補薬剤が学習または記憶障害の原因となるかまたはこれに寄与するかを評価する。当業者により認識されるように、種々の適切なクラスの候補薬剤は、工業用化学薬品または業務用化学薬品、化粧品、食品添加物、環境汚染物質、薬物および薬物候補などの毒性について試験することができるであるが、これらに限定されない。
【０１５０】
あるいは、生物系の候補薬剤への曝露および微小管の動態は、同種の曝露されていない生物系からの微小管の動態と比較し、毒性（例えば学習または記憶障害などの毒性を評価するための複数の生物系の使用）を評価する。
【０１５１】
比較はまた、異なる時点または異なる時間、異なる用量の候補薬剤、候補薬剤の異なる組合せ、異なる「パルス・チェイス」実験またはその組合せにて行うこともできる。例えば、用量曲線もしくは用量時間曲線またはそのマトリックスを行うことができる。
【０１５２】
B.  同位体標識前駆体の投与
本発明の方法における第一工程として、同位体標識前駆体を投与する。
1.  同位体標識前駆体分子の投与
a.  標識前駆体分子
【０１５３】
(1)  同位体標識
分子流動速度の測定における第一工程は、同位体標識前駆体分子を生物系に投与することを含む。同位体標識前駆体分子は、安定な同位体または放射性同位体であることができる。用いうる同位体標識としては、2H、13C、15N、18O、3H、14C、35S、32P、125I、131Iまたは有機系に存在する元素の他の同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
ある具体的態様にて、同位体標識は2Hである。
【０１５５】
(2)  前駆体分子（同位体標識基質）
前駆体分子は、興味の「モノマー」もしくは「サブユニット」に取り込まれる同位体標識を有する任意の分子であることができるか、またはモノマー自体であることができる。同位体標識を用いて本明細書に開示されるすべての前駆体分子を改変し、同位体標識前駆体分子を形成させることができる。
【０１５６】
全前駆体分子は、１以上のチューブリン二量体サブユニットに取り込むことができる。あるいは、前駆体分子の一部はチューブリン二量体サブユニットに取り込むことができる。
【０１５７】
i.  タンパク質前駆体
タンパク質前駆体分子は、当分野にて知られている任意のタンパク質前駆体分子であることができる。これらの前駆体分子としては、CO2、NH3、グルコース、ラクテート、H2O、アセテートおよび脂肪酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
タンパク質の前駆体分子はまた、１以上のアミノ酸も含むことができる。前駆体は任意のアミノ酸であることができる。前駆体分子は単一または多数の重水素化アミノ酸であることができる。例えば、前駆体分子は、１以上の13C-リジン、15N-ヒスチジン、13C-セリン、13C-グリシン、2H-ロイシン、15N-グリシン、13C-ロイシン、2H5-ヒスチジンおよび任意の重水素化されたアミノ酸であることができる。標識アミノ酸は投与することができ、例えば非標識アミノ酸で未希釈または希釈することができる。すべての同位体標識前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs（Andover, MA）から市販されてよい。
【０１５９】
タンパク質前駆体分子はまた、翻訳後または翻訳前に改変されたアミノ酸についての任意の前駆体も包含することができる。これらの前駆体としては、グリシン、セリンまたはH2Oなどのメチル化の前駆体；H2OまたはO2などのヒドロキシル化の前駆体；ホスフェート、H2OまたはO2などのホスホリル化の前駆体；脂肪酸、アセテート、H2O、エタノール、ケトン体、グルコースまたはフルクトースなどのプレニル化の前駆体；CO2、O2、H2Oまたはグルコースなどのカルボキシル化の前駆体；アセテート、エタノール、グルコース、フルクトース、ラクテート、アラニン、H2O、CO2またはO2などのアセチル化の前駆体；グリコシル化の前駆体および当分野にて知られている翻訳後改変が挙げられが、これらに限定されない。
【０１６０】
遊離アミノ酸に存在する標識の程度は、実験的に測定することができるか、またはアミノ酸の標識部位の数に基づき推測することができる。例えば、水素同位体を標識として用いるとき、遊離アミノ酸またはより具体的にはtRNA-アミノ酸のC-H結合に存在する標識は体内の水分中の2H2Oへの曝露中に同定することができる。それぞれの非必須アミノ酸のC-H結合の総数は知られており、例えばアラニンにて4、グリシンにて2などである。
【０１６１】
タンパク質のための前駆体分子は水（例えば重水）であることができる。タンパク質のO-HおよびN-H結合は水溶液中にて不安定であるため、C-H結合上の水素原子は、2H2Oからのタンパク質合成の測定に有用であるアミノ酸上の水素原子である。そのようなものとして、2H2Oからの2H標識のO-HまたはN-H結合への交換は、上記の遊離アミノ酸からのタンパク質の合成なしで起こる。C-H結合は、特異的酵素触媒媒介代謝反応中の遊離アミノ酸へのH2Oからの取り込みを受ける。それゆえ、2H2O投与後のタンパク質結合アミノ酸のC-H結合中の2H標識の存在は、タンパク質が2H2O曝露の期間中の遊離形態である−例えばタンパク質が新たに合成される、アミノ酸から組み立てられたことを意味する。分析的に、用いられるアミノ酸誘導体は、すべてのC-H結合を含むが、すべての潜在的に含まれるN-HおよびO-H結合を除去しなければならない。
【０１６２】
体内の水分からの水素原子（例えば重水素または三重水素）は遊離アミノ酸に取り込むことができる。標識された水からの2Hまたは3Hは、中間代謝の反応を通して細胞中の遊離アミノ酸に入ることができるが、2Hまたは3Hはペプチド結合に存在するかまたはトランスファーRNAに結合するアミノ酸には入ることができない。遊離必須アミノ酸は、急速可逆性アミノ基転移反応を通してα-炭素C-H結合に体内の水分からの単一の水素原子を取り込むことができる。遊離非必須アミノ酸はもちろんより多数の代謝的に交換可能なC-H結合を含み、それゆえ新たに合成されたタンパク質の2H2Oからの分子あたりのより高い同位体濃縮値を示すことが期待される。
【０１６３】
当業者は、体内の水分からの標識された水素原子が他の生化学的経路により他のアミノ酸に取り込むことができることを認識するだろう。例えば、水からの水素原子がクエン酸回路における前駆体α-ケトグルタル酸の合成によりグルタミン酸に取り込むことができることは当分野に知られている。次いで、グルタミン酸はグルタミン、プロリンおよびアルギニンについての生化学的前駆体であることが知られている。別の例により、体内の水分からの水素原子は、翻訳後に修飾されるアミノ酸に取り込むことができ、例えば3-メチル-ヒスチジン中のメチル基、ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジン中のヒドロキシル基およびその他である。他のアミノ酸合成経路は、当業者に知られている。
【０１６４】
酸素原子（H218O）はまた、酵素触媒反応を通してアミノ酸に取り込むこともできる。例えば、アミノ酸のカルボン酸部分への酸素交換は、酵素触媒反応中に起こることがある。標識された酸素のアミノ酸への取り込みは、当業者に知られている。酸素原子はまた、酵素触媒反応を通して18O2からアミノ酸に取り込むこともできる（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンまたは他の翻訳後に修飾されたアミノ酸など）。
【０１６５】
標識された水からの水素および酸素標識はまた、翻訳後修飾を通してアミノ酸に取り込むこともできる。ある具体的態様において、翻訳後修飾はすでに、翻訳後修飾の前の生合成経路を通して標識された水素または酸素を含むことができる。別の具体的態様において、翻訳後修飾は、翻訳後修飾工程（例えばメチル化、ヒドロキシル化、ホスホリル化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化、グリコシル化または他の知られている翻訳後修飾）の前または後に、体内の水分からの遊離交換標識水素に関与する代謝誘導体からの標識された水素、酸素、炭素または窒素を取り込むことができる。
【０１６６】
対象への投与に適切なタンパク質前駆体としては、上記のタンパク質中に見られる標準アミノ酸に加えて、H2O、CO2、NH3およびHCO3が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
ii.  前駆体分子としての水
水は、タンパク質の前駆体および多くの有機代謝体である。そのようなものとして、標識された水は本明細書に示される方法にて前駆体として供することができる。
【０１６８】
H2O入手可能性はおそらく、細胞における生合成反応に決して限定されないが（H2Oが細胞の70%近い含有量または＞35モル濃度を示すため）、H2Oからの水素および酸素原子は生合成経路に含まれる多くの反応に化学量論量的に寄与する：例えば：R-CO-CH2-COOH＋NADPH＋H2O−＞R-CH2CH2COOH（脂肪酸合成）。
【０１６９】
結果として、H-またはO-同位体標識水の形態にて提供される同位体標識は、合成経路の一部として生物学的分子に取り込まれる。水素取り込みは、二つの経路にて起こりうる：分子の不安定な位置にて（すなわち急速に交換可能な必要とされない酵素触媒反応）または安定な位置にて（すなわち急速でなく交換可能な必要とされる酵素触媒）。酸素取り込みは安定な位置にて起こる。
【０１７０】
細胞内水から生物学的分子中のC-H結合へのいくつかの水素取り込み工程は、一連の生合成反応における特定の酵素触媒工程中にのみ起こり、一旦成熟した最終生成分子に存在すると不安定ではない（組織中の溶媒水と交換可能である）。例えば、グルコース上のC-H結合は、溶液中にて交換可能ではない。一方、以下のC-H位はそれぞれ、可逆的特異的酵素反応中にて体内の水分と交換する：クレブス回路および乳酸／ピルビン酸反応におけるオキサロ酢酸／コハク酸配列におけるC-1およびC-6；グルコース-6-リン酸／フルクトース-6-リン酸反応におけるC-2；グリセルアルデヒド-3-リン酸／ジヒドロキシアセトン-リン酸反応におけるC-3およびC-4；3-ホスホグリセリン酸／グリセルアルデヒド-3-リン酸およびグルコース-6-リン酸／フルクトース-6-リン酸反応におけるC-5。
【０１７１】
それにより、分子の特異的な不安定でない位置に共有的に取り込まれた水からの標識された水素または酸素原子は、分子の「生合成過程」を明らかにし−すなわち、標識取り込みは同位体標識水が細胞内水中に存在した期間中に分子が合成されたということを示す。
【０１７２】
これらの生物学的分子の不安定な水素（非共有的に結合するかまたは交換可能な共有結合に存在する）は分子の生合成過程を明らかにしない。不安定な水素原子は非標識水（H2O）でのインキュベーションにより容易に除去することができるが（すなわち2Hまたは3Hが第一位置に取り込まれたことを通した同じ非酵素交換反応の逆による）：
【化１】
2009510457.tif 000003
【０１７３】
結果として、生合成過程を反映しないが非合成交換反応により取り込まれる、潜在的に汚染された水素標識は、天然存在のH2Oでのインキュベーションにより実際には容易に除去することができる。
【０１７４】
分析方法は、標識された水素原子の生物学的分子への取り込みを定量的に測定するために利用できる（例えば3Hについての液体シンチレーション・カウンティング；2Hおよび18Oについての質量分析またはNMR分光学）。同位体標識水取り込みの理論のさらなる議論について、例えば文献（Jungas RL. Biochemistry. 1968 7:3708-17）を本明細書に引用する。
【０１７５】
標識された水は、商業的にたやすく得ることができる。例えば、2H2OはCambridge Isotope Labs（Andover, MA）から購入することができ、3H2Oは例えばNew England Nuclear, Inc.から購入することができる。一般に、2H2Oは非放射性であり、従って放射性3H2Oより毒性の問題がほとんど存在しない。2H2Oは、例えば体内の全水分の百分率、例えば体内の消費される全水分の1%として（例えば１日あたり消費される3リットルの水に対して30マイクロリットルの2H2Oが消費される）投与することができる。3H2Oが用いられる場合、当業者により容易に測定される無毒性量が投与される。
【０１７６】
2H2Oの比較的高い体内の水分濃縮（例えば体内の全水分の1〜10%が標識される）は本発明の技術を用いて比較的安価に達成することができる。この水濃縮は、これらのレベルが毒性の証拠を全く伴わないでヒトおよび実験動物にて数週間または数ヶ月間維持されるように、比較的一定であり安定である。この多数のヒト対象（＞100人）における結果は、高用量の2H2Oにて前庭毒性についての先の問題に反する。出願人は、体内の水分濃縮における急速な変化が妨げられる限り（例えば少量の分割された用量における初回投与による）、体内の水分の2H2Oの高濃縮が毒性を伴わないで維持することができることを発見した。例えば、市販の2H2Oの低価格により、比較的低価格にて1〜5%範囲で長期間濃縮の維持が可能である（例えば計算により、10%遊離ロイシン濃縮、従ってその期間のロイシン前駆体プールにおける7〜8%濃縮における2H-ロイシンの12時間標識よりも、2% 2H2O濃縮、従ってアラニン前駆体プールにおける7〜8%濃縮における2月間標識についてより低コストであることを明らかにする）。
【０１７７】
18O同位体は毒性でなく結果として有意な健康的危険性を与えないので、H218Oの投与について比較的高く比較的一定の体内の水分濃縮もまた達成することができる。
【０１７８】
iii.  前駆体および候補薬剤の投与
水などの同位体標識前駆体は、連続的同位体標識前駆体投与、不連続的同位体標識前駆体投与により、または同位体標識前駆体投与の単回もしくは複数回投与後に投与することができる。連続的同位体標識前駆体投与にて、同位体標識前駆体は、比較的一定の前駆体濃縮を個体にて長期にわたって維持するのに十分な期間中個体に投与される。連続的な方法について、標識された前駆体は、定常状態濃度を達成するのに十分な期間（例えばヒトにて3〜8週、齧歯目にて1〜2週）、最適に投与される。
【０１７９】
不連続的同位体標識前駆体投与にて、同位体標識前駆体の量を１以上の回数で測定した後、投与し、次いで同位体標識前駆体への曝露を中止し、体内の前駆体プールからの同位体標識前駆体の洗浄物が生じうる。次いで脱標識の経時変化をモニターすることができる。前駆体は、生物学的分子にて検出可能なレベルを達成するのに十分な期間、最適に投与する。
【０１８０】
同位体標識水は、当分野にて知られる種々の方法にて個体または組織に投与することができる。例えば、同位体標識水は、経口、非経口、皮下、経脈管的（例えば静脈内、動脈内）または腹腔内にて投与することができる。2H2OおよびH218Oのいくつかの市販源を利用でき、例えばIsotec, Inc.（Miamisburg OH, and Cambridge Isotopes, Inc. (Andover, MA）がある。投与される同位体標識水の同位体含有量は、約0.001%〜約20%の範囲であることができ、生物学的分子の同位体含有量を測定するために用いられる器具の分析感度に応ずる。ある具体的態様にて、飲料水中の4% 2H2Oは経口投与される。別の具体的態様にて、ヒトは2H2O 50 mLを経口投与される。
【０１８１】
標識された前駆体を投与される個体は哺乳類であることができる。ある変形にて、個体は実験動物であることができ、齧歯類、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌまたはブタなどが挙げられるが、これらに限定されない。薬物、薬物候補、リード薬物またはその組合せの投与を含む変形にて、個体は疾患の許容される動物モデルなどの実験動物またはヒトなどの哺乳類であることができる。食品添加物、工業用化学薬品もしくは業務用化学薬品、環境汚染物質または化粧品の投与を含む変形にて、個体は任意の実験動物であることができ、齧歯類、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌまたはブタが挙げられるが、これらに限定されない。候補薬剤は標識された前駆体の投与前、これと同時または後に投与することができる。候補薬剤はまた、十分な時間投与する。さらに、異なる用量の薬剤は、個体動物または同じ動物に投与することができる。
【０１８２】
さらに、２以上の候補薬剤を投与することができる。
【０１８３】
C.  興味の１以上の標的チューブリンまたは微小管ポリマー分子を得ること。
本発明の方法を行う際、ある態様にて、タンパク質は、当分野にて知られている方法により生物系から得られる。
【０１８４】
多量の微小管ポリマーおよび／または遊離チューブリン二量体サブユニットは、神経生物学の分野にてよく知られている技術を用いて生物系から得られる。１以上の生物学的サンプルは、１以上の脳脊髄液または神経組織などの体液または組織であることができる。タンパク質は、ニューロンなどの細胞の特異的な基、または他の成長もしくは非成長細胞から得ることができる。タンパク質はまた、当分野にて知られている標準的生化学的方法を用いて、生物学的サンプルから得ることもでき、適宜部分的に精製しまたは単離してもよい。
【０１８５】
生物学的サンプリングの頻度は、異なる因子に応じて変化しうる。そのような因子としては、サンプリングの容易性および安全性、タンパク質の合成および分解／除去速度、および細胞、動物またはヒトに投与される治療的候補薬剤の半減期が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
タンパク質は、アッセイ要件に応じて１以上の生物学的サンプルから部分的に精製しおよび／または単離することができる。一般に、微小管ポリマーおよび／またはチューブリン二量体サブユニットは、どのような他の成分がサンプルに存在しているかに応じて、当業者に知られている種々の方法にて単離しまたは精製することができる。標準的な精製方法としては、イオン交換、疎水性、親和性および逆相HPLCクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）、化学的抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーおよびクロマト分画などの電気泳動、分子的、免疫学的およびクロマトグラフィー法が挙げられる。例えば、いくつかのタンパク質は標準的抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質濃縮と併用する限外ろ過法およびダイアフィルトレーション法もまた、有用である。適切な精製技術における一般的なガイダンスについて、文献（Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)）を参照のこと。精製の必要性は、アッセイおよび系の成分に応じて変化するだろう。いくつかの場合には、精製は必要ないだろう。
【０１８７】
別の具体的態様にて、タンパク質は加水分解され、そうでなければ分解されて、より小さい分子を形成することができる。加水分解法としては、化学的加水分解（酸加水分解など）および生化学的加水分解（ペプチダーゼ分解）などの当分野にて知られている任意の方法が挙げられるが、これらに限定されない。加水分解または分解は、タンパク質の精製および／または単離の前または後に行うことができる。タンパク質はまた、HPLC、FPLC、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および／または当業者に知られている他の任意の化学的および／もしくは生化学的化合物の分離方法などの従来の精製方法により部分的に精製することができるか、または適宜単離してもよい。
【０１８８】
D.  分析
1.  質量分析
タンパク質中の同位体濃縮は、質量分析などの当分野にて知られている種々の方法により測定することができ、ガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）、同位体比質量分析、GC-同位体比-燃焼-MS、GC-同位体比-ピロール分解-MS、液体クロマトグラフィー-MS、エレクトロスプレーイオン化-MS、マトリックス支援レーザー脱離-飛行時間型MS、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴-MSおよびサイクロイドMSが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
質量分析計は、タンパク質などの分子を急速に移動する気体イオンに変換し、その質量−電荷比に基づき分離する。従って、イオンまたはイオン断片の同位体またはアイソトポログの分布を用いて、多数のタンパク質またはリン脂質またはコレステロール分子中の同位体濃縮を測定することができる。
【０１９０】
一般に、質量分析計はイオン化手段および質量分析器を含む。多くの異なるタイプの質量分析器が当分野にて知られている。これらとしては、磁場型分析器、エレクトロスプレーイオン化、四重極、イオントラップ、飛行時間型質量分析器およびフーリエ変換分析器が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
質量分析計はまた、多くの異なるイオン化法も含むことができる。これらとしては、電子衝撃、化学イオン化およびフィールドイオン化などのガス相イオン化源ならびに電界脱離、高速原子衝撃、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化および表面増強レーザー脱離／イオン化などの脱離源が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
さらに、２以上の質量分析器は連結して（MS/MS）、まず前駆体イオンを分離した後、ガス相断片イオンを分離して測定することができる。これらの器具は、タンパク質の一連の初期イオン断片を生成した後、初期イオンの第二断片を生成する。
【０１９３】
異なるイオン化法もまた、当分野にて知られている。一つの重要な躍進は、タンパク質などの大きな非揮発性巨大分子のイオン化のための技術の発展であった。このタイプの技術は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）およびマトリックス支援レーザー脱離（MALDI）を含んでいる。これらは、液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーゾーン電気泳動などの強力なサンプル分離導入技術との併用にてMSを適用することができる。
【０１９４】
さらに、質量分析計は、ガスクロマトグラフィー（GC）および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの分離手法と連結することができる。ガスクロマトグラフィー質量分析（GC/MS）にて、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムは質量分析計に直接連結し、適宜ジェットセパレーターを用いてもよい。そのような適用において、ガスクロマトグラフィー（GC）カラムはサンプル成分をサンプルガス混合物から分離し、分離された成分をイオン化し、質量分析計にて化学的に分析する。
【０１９５】
一般に、タンパク質についてのベースライン質量アイソトポマー頻度分布を決定するために、そのようなサンプルは同位体標識前駆体の注入前に採取する。そのような測定は、細胞、組織または有機体、タンパク質の質量アイソトポマーの天然頻度にて構築する手段の一つである。細胞、組織または有機体が同様の環境履歴を有する対象の集団の一部であるとき、集団アイソトポマー頻度分布はそのような背景測定のために用いることができる。さらに、そのようなベースラインアイソトポマー頻度分布は、平均的天然存在度の既知の同位体を用いて推定することができる。例えば、本来、有機炭素に存在する13Cの天然存在度は1.11%である。そのようなアイソトポマー頻度分布を測定する方法は、以下に記載する。典型的には、タンパク質のサンプルは同位体の投与の前および後に採取する。
【０１９６】
a.  相対的および絶対的質量アイソトポマー存在度の測定
測定された質量スペクトルのピーク高さ、あるいはピーク下領域は、親（ゼロ質量同位体）アイソトポマーに対する比として示すことができる。サンプル中のアイソトポマーの存在度についての相対的および絶対的値を提供する任意の計算手法が本発明の目的のためにそのようなデータを記載する際に用いられうることが認識される。
【０１９７】
2.  微小管ポリマーなどのタンパク質の標識：非標識の割合の計算
次いで、興味の標識および非標識分子の割合（例えばチューブリン二量体、微小管ポリマー）を計算する。実行者はまず、分子の単離されたアイソトポマー種についての測定された過剰モル比を決定する。次いで、実行者は、理論的パターンに対する過剰な比の測定された内部パターンを比較する。そのような理論的パターンは、米国特許番号5,338,686、5,910,403および6,010,846に記載の２項または多項分布関係を用いて計算することができ、これらは本明細書にそのまま引用される。計算は、質量アイソトポマー分布分析（MIDA）を含むことができる。質量アイソトポマー分布分析（MIDA）組合せアルゴリズムの変形は、当業者に知られている多くの異なる源に記載される。方法はさらに、文献（Hellerstein and Neese (1999)）ならびに文献（Chinkes, et al. (1996), and Kelleher and Masterson (1992)）および米国特許出願番号10/279,399に記載され、これらはすべて本明細書にそのまま引用される。
【０１９８】
上記参考文献に加えて、方法を実行する計算ソフトウェアは、カリフォルニア大学バークリーのMarc Hellerstein教授から公的に入手可能である。
【０１９９】
理論的パターンに対する過剰モル比の比較は、興味の分子について生成された表を用いて、または図式的に測定された関係を用いて行うことができる。これらの比較から、p値（ここに、p値は前駆体サブユニットプールにおけるサブユニットの質量同位体濃縮の確率を示す）などの値を測定する。次いで、この濃縮はAx*値（ここに、Ax値は各質量アイソトポマーのために新たに合成されたタンパク質の濃縮を示す）などの値を決定するために用いて、すべてのアイソトポマーが新たに合成されたならば存在することが期待されるアイソトポマー過剰比を明らかにする。
【０２００】
次いで、部分存在度を計算する。個別同位体（元素について）または質量アイソトポマー（分子について）の部分存在度は、その特定の同位体または質量アイソトポマーにより示される全存在度の部分である。これは相対的存在度から区別され、最も豊富な種は100の値を与え、他のすべての種は100に対して標準化され、百分率相対存在度として示される。質量アイソトポマーMxについて、
【０２０１】
【数１】
2009510457.tif 000004
（式中、0〜nは存在度が生じる最小質量（M0）質量アイソトポマーに対する見掛けの質量の範囲である）
【０２０２】
Δ部分存在度（濃縮または減少）＝
【０２０３】
【数２】
2009510457.tif 000005
【０２０４】
（ここに、下付き文字eは濃縮を意味し、bはベースラインまたは天然存在度を意味する）
【０２０５】
前駆体投与の期間中、実際に新たに合成されたポリマーのフラクションを測定するために、測定された過剰モル比（EMx）は、計算された濃縮値Ax*（各質量アイソトポマーについて新たに合成されたバイオポリマーの濃縮を示す）と比較して、すべてのアイソトポマーが新たに合成されたならば存在すると期待されるだろうアイソトポマー過剰比を明らかにする。
【０２０６】
3.  分子流動速度の計算
微小管のポリマー化および／または脱ポリマー化速度を測定する方法は、前駆体プールにおける微小管の質量同位体標識サブユニットの割合の計算、およびこの割合を用いた微小管の少なくとも一つの質量同位体標識サブユニットを含む微小管の期待頻度の計算を含む。次いで、この期待頻度は、実際の実験的に測定されたアイソトポマー頻度と比較する。これらの値から、選択される取り込み期間中に加えられた同位体標識前駆体から形成される微小管の割合を決定することができる。従って、そのような期間中の合成速度もまた、決定する。定常状態濃度における系にて、またはその系における濃度の任意の変化が測定可能であるかもしくはそうでなければ該期間中に知られるときに、それにより分解の速度は当分野にて知られている計算を用いて同様に知られる。次いで、前駆体-生成物関係を当てはめる。連続的標識法について、同位体濃縮は、漸近（例えば最大可能）濃縮と比較し、速度論的パラメータ（例えば合成速度）は前駆体-生成物公式から計算する。部分合成速度（ks）は、連続的に標識される前駆体-生成物式：
【０２０７】
ks = [-ln(1-f)]/t
【０２０８】
（式中、f＝部分合成＝生成物濃縮／漸近前駆体／濃縮
【０２０９】
およびt＝研究された系にて接触する標識投与の時間）
に当てはめることにより決定することができる。
【０２１０】
非連続的標識方法について、同位体濃縮における減少速度を計算し、サブユニットの速度論的パラメータを指数関数的減衰式から計算する。該方法を実行する際に、微小管は質量アイソトポマーに濃縮され、好ましくは微小管の複数の質量同位体標識サブユニットを含む。これらの微小管のより高質量のアイソトポマー（例えば3または4の質量同位体標識チューブリン二量体を含むタンパク質）は、比較的低存在度の天然質量同位体標識前駆体（例えば2H2O）により、外因性前駆体（例えば2H2O）の非存在下にてごくわずかな量にて形成されるが、前駆体取り込みの期間中（例えば2H2Oの細胞、組織、器官または有機体への投与の間）に有意な量にて形成される。微小管は、順次的な時点にて細胞、組織、器官または有機体から採取し、質量分析により分析し、高質量アイソトポマーの相対頻度を決定するかまたは微小管からのサブユニットの高質量アイソトポマーの相対頻度を決定する。高質量アイソトポマーが第一時点の前にほぼ排他的に合成されるので、二つの時点間の崩壊はサブユニットの崩壊速度の直接的な測定を提供する。複数の質量同位体標識サブユニットを含まない質量アイソトポマーの崩壊速度もまた、計算することができ、本明細書に記載の方法により用いることができる。
【０２１１】
好ましくは、第一時点は、投与形態に応じて、前駆体（例えば2H2O）の投与後、少なくとも2〜3時間にて停止し、質量同位体標識サブユニット（例えば微小管ポリマーについて標識チューブリン二量体）の割合が前駆体投与に続くその最高レベルから実質的に崩壊したことを確かめる。ある具体的態様にて、以下の時点は典型的に第一時点後1〜4時間であるが、このタイミングはバイオポリマープールの置換速度に依存するだろう。
【０２１２】
微小管の崩壊速度は、同位体標識サブユニットについての崩壊曲線から決定する。崩壊曲線がいくつかの時点により定義される場合に、崩壊速度論は曲線を指数関数的崩壊曲線に適合し、これから崩壊定数を決定することにより決定することができる。
【０２１３】
分解速度定数（kd）は指数関数的または他の速度論的崩壊曲線に基づき計算することができる：
【０２１４】
kd = [-ln f]/t
【０２１５】
E.  本発明の方法の使用
本明細書に開示される発明は、研究科学者または臨床医によりモニターすることができる生体脳におけるニューロン接続（シナプス可塑性）の客観的生化学的記録の生成を可能にする。本発明はまた、新しいシナプスの形成（シナプス形成）の研究も可能とする。本発明の特に有益な使用は、シナプス接続（例えばシナプス可塑性および／またはシナプス形成）を調節する薬物候補を選択し廃棄するためにスクリーニングし、それゆえ学習、記憶または認知機能の他の態様を改善する（かまたは悪化させる）ことができる能力である（Figs. 8および9を参照のこと）。この学習および記憶のモジュレータについての薬物スクリーニングおよびフィルタリングアプローチは、動物モデルにてインビボのハイ・スループットが可能であることを示す。
【０２１６】
嫌悪学習ボックス、遊泳または走行迷路、およびパブロフの条件付け試験モデルなどの標準的学習、行動および記憶動物モデルは、本発明の方法による使用のために意図されるが、これらに限定されない。当業者は、薬物スクリーニングプロジェクトまたは認知機能における基本的生物医学的研究または認知障害における臨床的研究にて、本発明の方法とともに他のよく知られている学習、行動および記憶の動物モデルを容易に用いることができる。
【０２１７】
Figure 8は、創薬および開発過程における本明細書記載の発明の使用を説明する。工程801にて、多数の候補薬剤は（集合的に「興味の分子」）例えば購入によりまたはライセンシングにより得られる。工程803にて、興味の分子は本明細書記載のようにインビトロおよびインビボ速度論的アッセイに適用する。工程805にて、シナプス可塑性および／またはシナプス形成は本明細書記載のように測定する。特定の表現型状態におけるシナプス可塑性および／またはシナプス形成を増大することが所望であるならば、シナプス可塑性および／またはシナプス形成を増大する化合物は一般により有用であり、反対にシナプス可塑性および／またはシナプス形成を減少する化合物は一般により所望でないと考えられよう。標的発見過程にて、シナプス可塑性および／またはシナプス形成を別の表現型に関して増大するかまたは減少する特定の表現型（例えば疾患対非疾患）は良い治療もしくは診断標的または良い治療もしくは診断標的の経路と考えることができる。工程807にて、興味の分子または診断剤を選択し、さらに使用し、開発する。工程809にて、化合物または診断剤を販売するかまたは分配する。Figure 8における過程における１以上の工程が最適な結果のためにほとんどの場合何度も繰り返されるだろうことはもちろん認識される。
【０２１８】
Figure 9は、創薬および開発における本発明の方法の値を示す。本発明の方法を用いることにより先の段落に記載の初期化合物（すなわち興味の分子）のスクリーニングにより、コストのかかる薬物開発過程におけるさらなる開発のための一連の化合物、「種類中の最高」または「クラス中の最高」から選択することができる。それゆえ、本発明により、当業者は薬物開発過程のますますより高価で厳格な段階における最大の成功の可能性を達成しそうな１以上の候補薬剤を進歩させることが可能となる。一連の化合物が有望な候補薬剤を与えない場合、本発明の方法はさらなる研究を終了させる決定（「決行／中止」決定点）を可能とする。薬物に再度目的を持たせまたは再配置する領域にて、本発明の方法は、広範に試験されているか、またはすでに市販のために正規な認可を受けている化合物のスクリーニングがシナプス可塑性および／またはシナプス形成の刺激における活性のためにスクリーニングされることを可能とする。化合物はシナプス可塑性活性もしくはシナプス形成活性のいずれかを刺激するか、またはその両者を刺激することができる。逆に、化合物はシナプス可塑性もしくはシナプス形成に阻害効果を有するか、またはその両者を阻害することができる。本発明の方法は、そのような活性を区別することを可能とする。
【０２１９】
さらに、本発明の方法は、学習または記憶に影響するいくつかの活性をすでに示しているがその作用機序が不十分に特徴付けられているかまたは全く特徴付けられていない候補薬剤のより徹底的な研究を可能とする。そのような場合に本発明の方法を用いることにより、当業者はさらなる開発とともに前進することを選択するか（高価な選択は臨床開発の後期に候補薬剤を失敗させるはずである）または本明細書記載の発明に従って１以上の候補薬剤をスクリーニングすることにより得られるデータに基づくさらなる開発を終了すること（また「決行／中止」決定点）を選択することができる。そのような情報は薬物開発時間を短くし、かなりの大金を節約するのに非常に有用である。
【０２２０】
F.  同位体摂動チューブリンまたは微小管分子
別の変形にて、該方法は同位体摂動チューブリンまたは微小管分子の産生を提供する。これらの同位体摂動分子は、上記および下記により詳細に記載される学習および記憶の基礎となる微小管集合／分解経路内のそれらの流動の決定に有用な情報を含む。有機体の細胞および／または組織から単離されるとすぐに、１以上の同位体摂動分子は分析されて、上記の情報を抽出される。
【０２２１】
G.  キット
本発明はまた、インビボにおける分子流動速度を測定し比較するためのキットも提供する。キットは、同位体標識前駆体分子を含み、さらにタンパク質を分離し精製しもしくは単離するための当分野にて知られている化合物、および／または組織サンプルを得るのに必要な化学薬品、コンビナトリアル分析のための自動計算ソフトウェア、およびキットの使用説明書を含むことができる。
【０２２２】
水の投与用ツール（例えば測定カップ、針、注射器、ピペット、IVチューブ）などの他のキット成分が適宜キットに供されていてもよい。同様に、細胞、組織または有機体からのサンプルを得るための器具（例えば標本カップ、針、注射器および組織サンプリング器具）もまた、適宜供されていてもよい。
【０２２３】
H.  情報保存機器
本発明はまた、本発明の方法から集められるデータを含む紙レポートまたはデータ保存機器などの情報保存機器も供する。情報保存機器としては、紙に記載されたレポートもしくは同様の有形の媒体、プラスチック透明シートもしくはマイクロフィッシュに記載されたレポートおよび光もしくは磁気媒体（例えばコンパクトディスク、デジタルビデオディスク、光ディスク、磁気ディスクなど）に保存されたデータ、または情報を一時的もしくは永久に保存するコンピュータが挙げられるが、これらに限定されない。データはコンピュータ内に少なくとも部分的に含まれていてよく、電子メールメッセージの形態であるかまたは別の電子ファイルとして電子メールメッセージに添付されていてよい。情報保存機器内のデータは、「生」（すなわち収集されているが分析されていない）であるか、部分的に分析されているか、または完全に分析されていてよい。データ分析はコンピュータもしくは他のいくつかの自動機器を通じて行うか、または手動で行うことができる。情報保存機器を用いてデータをさらなる分析もしくは表示またはその両者のために、別のデータ保存系（例えばコンピュータ、ノートパソコンなど）にダウンロードすることができる。あるいは、情報保存機器内のデータは紙、プラスチック透明シートまたはさらなる分析もしくは表示もしくはその両者のための他の同様の有形の媒体に印刷することができる。
【実施例】
【０２２４】
I.  実施例
以下の非限定的実施例はさらに、本明細書に開示される発明を説明する：
【０２２５】
実施例１：細胞培養
ヒト胚性癌細胞株NTERA-2クローンD1（NT2）をATCC（Manassas, VA）から得た。細胞を増殖させ、先に記載のように（Pleasure, S. J., Page, C., Lee, V. M. NTera 2細胞に由来する純粋な有糸分裂後偏光ヒトニューロンは末端分化ニューロン中の外因性タンパク質を発現するための系を提供する。J. Neurosci. 12, 1802-1815 (1992)）、以下の改変を伴って分化させた：NT2細胞を75-cm2組織培養フラスコ、完全なDMEM（10%ウシ胎仔血清、5%ウマ血清、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地）中、37℃、10% CO2の湿気環境にて増殖させ、3週間10μMレチノイン酸で分化させた。細胞を擦り取り、マトリゲルでコーティングされた15-cm2組織培養皿に置き換えた。2日後、神経細胞を10μMフルオロデオキシウリジン、10μMウリジンおよび1μMシトシンアラビノシドで5日間処理した。次いで、細胞を10 ng/ml脳由来神経栄養因子（BDNF）で全7週間処理した。標識研究について、培養培地ならびに加湿インキュベータは＞99% 2H2O（スペクトル安定同位体、Columbia, MD）の添加により5 mol %重水（2H2O）に調節し、24hまでの間この2H-濃縮にて維持した。示されたときに、L-グルタミン酸カリウム（Sigma）およびアデノシン-3',5'-モノホスホロチオエート、Rp-異性体（RpcAMP, Biolog）またはその両方を標識期間の始めに培養物に加えた。
【０２２６】
ラット脳海馬神経細胞はCambrex Bio Science（Walkersville, MD）から得た。ニューロンは、10% CO2の湿気環境中37℃にて14日間ポリ-D-リジンおよびラミニンでコーティングされた10 cm2組織培養皿上、2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリン／ストレプトマイシンおよび2% B27を添加したNeurobasal培地にて増殖させた。
【０２２７】
実施例２：チューブリン二量体およびポリマーの単離
チューブリンは先に記載のプロトコールの小改変を用いて精製した（Fanara, P., Oback, B., Ashman, K., Podtelejnikov, A., Brandt, R. MINUSの同定、微小管核形成抑制剤として機能する小ポリペプチド。EMBO J. 18, 565577 (1999)；Fanara, P. et al.重水による安定同位体標識を用いた微小管動態のインビボ測定。タキサンの効果。J. Biol. Chem. 279, 49940-49947 (2004)）。つまり、培養ニューロンは穏やかに培養プレートから擦り取り、リン酸緩衝食塩水（PBS）中で洗浄し、微小管安定化緩衝液中で均質化した。生体外における精製のために、マウスをイソフルランで麻酔し、頸椎脱臼で安楽死させた。脳を素早く取り出し、微小管安定化緩衝液（MSB）で洗浄し；海馬を解剖し、MSBにて穏やかに均質化した。細胞質チューブリン二量体を微小管ポリマーから分離するために、ポスト核（post-nuclear）上清を190,000 X g、20℃にて35分間遠心分離した。上清または非微小管フラクション（可溶性二量体チューブリンを含む）をペレットまたは微小管フラクション（ポリマー性チューブリンを含む）から分離し、素早く凍結させ、−20℃にて保存した。微小管ペレットはさらに、逐次免疫親和性クロマトグラフィー工程により分画した（Fig. 3）。タウ結合微小管を単離するために、TAU5抗体は、0.25 mg/mlの濃度にてエポキシ活性化セファロース・ビーズ（Amersham Pharmacia Biotech）に共有結合させた。約0.2 mgの微小管ペレットは0.5 ml MSB中、室温にて1時間TAU-5ビーズでインキュベーションした。未結合物質を除去し、ビーズをMSB 0.5 mlで３回洗浄し、結合物質を1M NaClを含む0.5 ml MSBに溶出した。いくつかの実験において、MAP2結合微小管は、同じプロトコールを用いてMAP2抗体に結合した（0.5 mg抗体／ビーズml）エポキシ活性化セファロース・ビーズ上における免疫親和性クロマトグラフィーによりTAU5-未結合物質から捕捉した。各製剤（チューブリン二量体およびTAU5結合、MAP2結合および未結合微小管フラクション）におけるチューブリンの相対的存在量をウエスタンブロットにより定量化し、これらのフラクションからのチューブリンをさらに、先に記載のように（Fanara, P. et al. 重水による安定同位体標識を用いた微小管動態のインビボ測定。タキサンの効果。J. Biol. Chem. 279, 49940-49947 (2004)）、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【０２２８】
実施例３：冷却安定微小管の単離
冷却安定微小管は先に記載のプロトコールの小改変を用いて単離した（Pirollet, F., Derancourt, J., Haiech, J., Job, D., Margolis, R. L.ウシ脳における微小管安定性のCa (2+)- カルモジュリン調整エフェクター。Biochemistry 31, 8849-8855 (1992)）。つまり、細胞または組織粗製ホモジネートを氷冷MSBにて調製した（Fanara, P., Oback, B., Ashman, K., Podtelejnikov, A., Brandt, R. MINUSの同定、微小管核形成抑制剤として機能する小ポリペプチド。1.5 mM CaCl2を含むEMBO J. 18, 565577 (1999)、緩衝剤の細胞質量または脳組織に対する割合は1.4:1（vol/wt）の比に設定した。氷上にて2分後、EGTAを3 mMの最終濃度まで加え、混合物をさらに1分間氷上にて均質化した。抽出物を150,000 x g、4℃にて30分間遠心分離し、上清を集めた。微小管集合は上清を30℃にてインキュベーションすることにより開始した。1時間後、抽出物を4℃にて20分間冷却し、微小管安定化緩衝液中50%（wt/vol）スクロース・クッションに通して200,000 x gにて30分間遠心分離した。微小管脱安定化緩衝液中4℃にて最終ペレット（冷却安定微小管）を懸濁した後、チューブリンを先に記載されるように精製した（Fanara, P. et al. 重水による安定同位体標識を用いた微小管動態のインビボ測定。タキサンの効果。J. Biol. Chem. 279, 49940-49947 (2004)）。
【０２２９】
実施例４：GC/MS分析のためのチューブリンの処理
チューブリンサンプルを16時間110℃にて6N HClによる処理により加水分解した。タンパク質由来アミノ酸をペンタフルオロベンジル誘導体に誘導体化し、アラニンへの2H取り込みを他に詳細に記載されているようにGC/MSにより測定した（Fanara, P. et al. 重水による安定同位体標識を用いた微小管動態のインビボ測定。タキサンの効果。J. Biol. Chem. 279, 49940-49947 (2004)）。天然存在度を超えて(M+1)質量アイソトポマーとして存在するアラニン誘導体の百分率が増大するにつれて、2H濃縮を計算した。
【０２３０】
実施例５：体内の水分における2H2O濃縮の測定
2H2O濃縮および培養培地の体内水分濃縮を上記のように測定した。つまり、血漿水からのプロトンを炭化カルシウムとの反応によりアセチレンに変換した。次いでアセチレンサンプルは、サイクロイド質量分析計シリーズ3000（Monitor instruments, Cheswick, PA）を用いて分析し、これを修飾してm/z 26および27（M0およびM1）にてイオンを記録し、99.9% 2H2Oを非標識水と混合することにより調製した標準曲線に対して測定した。体内水分2H濃縮は薬物処置により影響しなかった（データは示されていない）。
【０２３１】
実施例６：動物研究
雄C57BL/6JBomTacマウス（Taconic, Germantown, NY）10週齢は、制御された明暗周期、温度および湿度の設備にて保存した。すべての研究を機関認可の前に行った。脳室内にカニューレを挿入した（ICVC）マウスを個別に飼育した。n＝3 ICVCマウスの群に、ポリエチレンチューブによりマイクロシリンジに連結したカニューレを通して注入した。動物は80μM L-グルタミン酸カリウムまたは110 nM Rp-cAMPを含む80μM L-グルタミン酸カリウム6μlを6分にわたり受けた。対照動物を滅菌水で注射した。次いで2H2O標識について、マウスは4〜5%体内水分2H濃縮をもたらす0.9% w/v NaCl（Cambridge isotope laboratory, Andover MA）を含む30〜35 ml/kg 2H2O（99.9 mol % 2H2O）の腹腔内ボーラスを受け、犠牲前24時間、飲料水中8% 2H2Oにて維持した（代謝水により希釈標識を可能とした）。すべての動物はよく処置に耐え、異なる群における動物間に体重の差はなかった。
【０２３２】
実施例７：行動研究
恐怖条件付け実験を先の文献（Bourtchouladze, R. et al. 異なる訓練方法により、文脈記憶固定のための１または２の臨界期が採用され、これらはそれぞれタンパク質合成およびPKAを必要とする。Learn. Mem. 5, 365-374 (1998)）に記載されているように行った。訓練日に、C57BL/6JBomTacマウス（Taconic）10週齢に、訓練の4時間前にビヒクル（50%シクロデキストリン）またはノコダゾール（nocodazole、0.2 mg/kg）の腹腔内注射をした後、恐怖条件付けチャンバー（Med Associates）に条件付け刺激、音の開始前に2分間置き、これを2800 Hz、85 dBにて30秒間続けた。条件付け刺激の最後の2秒間は、条件付けされていない刺激0.5 mAショックと対にした。我々は1分の試行間隔で条件付けされていない刺激による条件付けの３つの対を採用した。チャンバー内でさらに30秒後、マウスをそのホームケージに戻した。後日に、文脈条件付けは、マウスが訓練される（CFC試験）チャンバー内にて連続して3分間評価した。条件付けは、4秒間隔で凍結挙動（文脈への凍結%）をスコアリングすることにより測定し、これは呼吸を除く移動の完全な欠乏として定義した。マウスは、CFC訓練および試験の１日前およびその間に8% 2H2Oで連続的に標識した。
【０２３３】
マウスは条件付けされた刺激（音）および条件付けされていない刺激（電気ショック）の三つの対にて訓練し、訓練の１日後にCFC応答について試験した（Fig. 10A）。チューブリン二量体における安定期標識を達成するために、マウスを8% 2H2Oで標識し、CFC訓練の１日前に開始し、標識は実験を通して続けた（Fig. 10A）。条件付けは、4秒間隔で凍結挙動（文脈への凍結%）を記録しスコアリングすることにより測定し、これは呼吸を除く移動の完全な欠乏として定義した。未投与動物は文脈まで曝露されたときに全く凍結挙動を示さなかったが（すなわちマウスが訓練されるチャンバー）、訓練された動物は約80%凍結を示した（Fig. 10B）。2H2Oで標識されたときに、未投与動物は、ベースライン条件下の前に見られるものと同様に、海馬遊離チューブリンおよび微小管サブ集団への2H取り込みのパターンを示した（Fig. 10C）。興味深いことに、同じ文脈に曝露されたときに、条件付けされた動物はより2H標識をMAP2結合に取り込み、冷却安定微小管は未投与マウスよりもそれらの海馬から単離された（Fig. 10D）。これらの微小管サブセットの全存在度は、ウエスタンブロッティングにより検出されるように、記憶形成中のこれらの微小管サブセットの新たな集合と一致して同様に増大した（データは示されていない）。チューブリン二量体およびタウ結合微小管の2H標識は訓練された動物にて変化しなかった。とりわけ、条件付けされた動物にて観察される異なる微小管サブ集団の転位は、CFC後のタウ結合区画における変化の欠乏を除き、グルタミン酸の中間用量を用いてLTPの薬理学的刺激の24時間後に見られるものに酷似した。同時にこれらの発見は、MAP2結合（細胞体樹状突起（somatodendritic））およびCS（軸索軸）微小管の再構築が長期記憶の形成とともに起こるシナプス有効性の変化と連結していることを明らかにする。
【０２３４】
海馬依存記憶における微小管／チューブリン交換の役割を試験するために、我々はCFC訓練の4時間前にノコダゾール（0.2 mg/kg）、微小管-脱ポリマー化剤で動物を処置した（Fig. 10A）。興味深いことに、同じ文脈に曝露されたときに、ノコダゾールで処置された条件付けされた動物は、ビヒクル処置対照と比べて凍結挙動にて有意な減少を示した（Fig. 10B）。訓練直後測定された文脈上の恐怖応答がビヒクルおよびノコダゾール処置動物で同様であるため、ノコダゾール誘発健忘は、学習の予防よりもむしろ記憶形成の阻害に起因し；さらに、ノコダゾール処置はCFC訓練の20分後に与えられたときに長期記憶の同様の障害をもたらした（データは示されていない）。これらの行動効果は、同じ動物における微小管動態と比較した。ノコダゾールで処置された条件付けされた動物はビヒクル処置対照と比較して（Fig. 10D）、チューブリン二量体合成の上方調整に反映されるように、遊離チューブリン二量体への2H取り込みの増大を示した（Fig. 10E、Baas et al., 1991; Jordan et al., 1992）。MAP2結合微小管への標識取り込みにおける条件付け誘発増大は、ノコダゾールにより逆転した。同様に、タウ結合微小管への標識取り込みは、未投与動物および条件付けされた動物の両方にて見られる基底レベルと比較して、ノコダゾールにより軽減された（Fig. 10E）。ウエスタンブロッティングにより検出されるように、微小管ポリマーの全存在度は、同様に減少した（データは示されていない）。CS微小管への標識取り込みの減少は統計的に有意ではなかった。これらの発見は、インビトロおよび細胞培養内のMT末端との結合を通して急速に分解した微小管へのノコダゾールの報告された能力と一致しており（Baas et al., 1991; Jordan et al., 1992）、最近集合し単離された微小管が選択的に分解されることを示唆する。このように、これらのデータは、微小管集合の実験的な分裂が文脈記憶についての健忘を誘発することを示唆する。
【０２３５】
実施例８：2H2O標識を用いたマウス脳における微小管動態のインビボ測定
最初の研究は、本明細書に開示される本発明を用いて行い、哺乳動物脳におけるインビボにて明確な神経区画内の微小管動態を特徴付け、2H2O（8%）を飲料水にて投与し、動物は標識の3、6、9、12および24時間後に犠牲にした。脳組織を取り出し、皮質および海馬に解剖し、細胞質抽出物をフラクション化し、遊離チューブリン二量体ならびにタウ結合（成長円錐）およびタウ非結合（細胞体樹状突起および軸索軸）微小管を単離した（Fig. 3, AおよびB）。タウ非結合フラクションは、主にMAP2およびSTOPと結合する細胞体樹状突起および軸索軸微小管からなると考えられる（Brandt, R. 神経細胞成長および発展におけるタウタンパク質。Front. Biosci. 1, 118-30 (1996); Gonzalez-Billault, C., Engelke, M., Jimenez-Mateos, E. M., Wandosell, F., Caceres, A., Avila, J. ニューロン極性の発展における構造的微小管結合タンパク質（MAP）の関与。J. Neurosci. Res. 67, 713-719 (2002); Slaughter, T., Black, M. M. STOP（安定な細管のみのポリペプチド）は軸索微小管の安定なドメインと選択的に結合する。J. Neurocytol. 32, 399-413 (2003)）。新規チューブリン生合成の速度を測定するために、チューブリン二量体を加水分解し、非必須アミノ酸、Alaへの2H標識取り込みはGC/MSにより定量化した（Fanara, P. et al. 重水による安定同位体標識を用いた微小管動態のインビボ測定。タキサンの効果。J. Biol. Chem. 279, 49940-49947 (2004)）。チューブリン二量体への標識取り込みは、皮質中約5〜6時間の半減期（t1/2）で単一指数関数的速度論に従った。標識取り込みは、海馬におけるものの約２倍速かった（t1/2＝3時間、Fig. 3C）。24時間後、安定期は、チューブリン二量体におけるAla分子の約20%が標識されるように達し（Fig. 3C）；標識はこのレベルにて2H2Oによる少なくとも1週間にわたる連続的標識を残存した（示されていない）。新規チューブリン二量体合成における低安定期（約20%新規）が非常に遅いターンオーバー（t1/2＞日）のチューブリンサブ集団の存在を示すようなので、脳組織における遊離Alaは2H2Oと＞80%平衡であった（示されていない）。タウ結合（軸索成長円錐）および非結合（細胞体樹状突起および軸索軸）微小管への標識取り込みの早い相の半減期は、同じ脳領域からのチューブリン二量体の全体的なターンオーバー速度と同様であった（皮質について5〜6時間および海馬について3時間）。しかし、軸索成長円錐微小管の安定期標識は約10%だけ達し、すなわち遊離チューブリン二量体について観察される標識の半分であり、他の微小管フラクションについてより小さい（約5%）。データは神経微小管の二つのサブ集団と一致し、チューブリン二量体合成の早い相と比較して急速な時間スケール（＜数時間）にて集合し分解するもの、および１日の時間スケールにてほぼ完全に安定であるものである。さらに、二量体との急速な動態学的交換における微小管の割合は、脳内の他の細胞内区画におけるよりも軸索成長円錐におけるものが約２倍高いようだ。これらの発見は、インビトロにおけるより不安定な成長円錐微小管に対して、細胞体樹状突起および軸索軸微小管の先に測定された安定性と一致する（Baas, P. W., Slaughter, T., Brown, A., Black, M. M. 軸索および樹状突起における微小管動態。J. Neurosci Res. 30, 134-153 (1991); Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. 成長円錐運動性および軸索成長における微小管動態の役割。J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995); Kwei, S. L., Clement, A., Faissner, A., Brandt, R. 培養における軸索形成中のMAP2、タウおよびMAP5の分化相互作用。Neuroreport 9, 1035-1040 (1998); Guillaud, L. et al. STOPタンパク質は神経細胞にて観察される高程度の微小管安定化に関与する。J. Cell Biol. 142, 167-179 (1998); Slaughter, T., Black, M. M. STOP（安定な細管のみのポリペプチド）は軸索微小管の安定なドメインと選択的に結合する。J. Neurocytol. 32, 399-413 (2003)）。
【０２３６】
実施例９：神経突起伸長およびシナプス形成中のチューブリンへの安定同位体取り込み
生体脳における微小管動態の最初の観察に続いて、より制御された（インビトロ）条件下にて本明細書に開示される発明を用いた研究を行った。遊離二量体プールとの微小管交換は、脳由来神経栄養因子（BDNF）を用いてインビトロにて区別される培養された有糸分裂後NT2-N神経細胞における神経分化およびシナプス形成中に追跡した。NT2-N神経細胞は、細胞が複数の神経過程を拡張するために視覚的に観察することができる時点である、BDNF処置後5日間培養培地にて5% 2H2Oで連続的に標識した（Fig. 4A）。この時点にて、本明細書記載の2H2O標識法を用いて、チューブリン二量体中のAla残基の40〜50%は、新たに合成されたものと見られ、期待されるように、成熟齧歯動物脳からの分化ニューロンにて見られたよりもニューロンのインビトロ分化中の新たに合成されるチューブリンのより大きな寄与を示した（Fig. 3C）。微小管は5日目における二量体（30〜35%）とほぼ完全に釣り合い（Fig. 4A）、タウ結合および非結合微小管がインビトロにおける神経分化中に非常に動的であることを示した。実に、後者は継続的な微小管集合の必要性と適合するために調整されると考えられるため、分化中の活性な微小管集合は、本モデルにおけるチューブリン生合成の上方調整を促進することができる（Cleveland, D.W. 動物細胞におけるチューブリン合成の自動調整された制御。Curr. Opin. Cell Biol. 1, 10-14 (1989); Fanara, P. et al. 重水による安定同位体標識を用いた微小管動態のインビボ測定。タキサンの効果。J. Biol. Chem. 279, 49940-49947 (2004)）。
【０２３７】
BDNFの存在下における培養の15日後に、軸索極性を明確に構築した（Fig. 4B）。この時点にて、新規チューブリン二量体のフラクションは、5日目以来実質的に増大せず、軸索および細胞体樹状突起極性が構築されるように新規チューブリン合成について後退した要求を示唆し、微小管が二量体と完全に釣り合った（Fig. 4B）。BDNFによる培養の7週後（Fig. 4C）、軸索が密になり、隣接神経細胞クラスターへの安定した連結を形成し（すなわちシナプス形成が促進された）、末端神経分化を示唆した。2H2O標識は、本明細書に開示される発明を用いてこれらの7週培養の最後の24時間にわたり行った。結果は、これらのニューロンにおける微小管動態がインビボにおける海馬および皮質ニューロンにて見られる動態と同様であり（Fig. 4C, cf. Fig. 3C）：約15〜20 %のチューブリン二量体が標識され、細胞体樹状突起および軸索軸微小管の標識が5 %未満であり、これらの微小管の後半の区画が主に安定であることを示し；軸索成長円錐微小管がいくらかより動的であったことを示す。従って、本明細書に開示される本発明の使用は、培養における神経分化の神経栄養誘発が新たに合成されるチューブリンの最初のバーストを伴い、神経突起伸長中の微小管集合の必要性に適合し；微小管の動態学的再構築が軸索分化を伴い、いくらかより動的である成長円錐を有する主として安定な細胞体樹状突起および軸索軸微小管の骨格により特徴付けられる継続的なシナプス形成を明らかにする末端分化状態となることを明らかにした。それゆえ細胞培養中のニューロンの末端分化状態は、本明細書に開示される本発明の使用により示され、成熟哺乳動物脳にて観察される微小管動態と同様であった。
【０２３８】
実施例１０：細胞体樹状突起対軸索微小管動態のインビトロおよびインビボ測定
神経接続の実験的操作中に、樹状微小管の種々の刺激に対する動態学的応答は、軸索軸または細胞体のものと異なるようである。本明細書に開示される本発明の使用によりそのような異なる応答を検出するために、我々はラット脳海馬からの初代神経細胞を培養し、培養培地中5 % 2H2Oを24時間添加することにより新たに合成されるチューブリン標識した。細胞質抽出物中のチューブリン二量体およびポリマーの分離後、我々は、タウおよびMAP2とそれぞれ反応性の高い免疫親和性カラムへの連続的な結合により軸索成長円錐および樹状微小管を捕捉し、体細胞および軸索軸微小管のみを未結合フラクションに放置した（Fig. 5A）。チューブリンは各フラクションからさらに精製され、Alaへの標識取り込みはGC/MSにより測定された（Fig. 5B）。約20〜25%のチューブリン二量体はこの培養系にて新たに合成され、インビボにおける全海馬にて観察されるかまたはNT2N培養細胞を分化する値に匹敵する値であった。培養培地中の遊離Alaは2H2Oと＞80%釣り合った（示されていない）。微小管フラクションのうち、タウ結合微小管（軸索成長円錐区画）は再び最も高く標識され、従って最も動的であり、次いでMAP2結合微小管（細胞体樹状突起区画、4〜5%標識）であった。タウおよびMAP2非結合物質が最小動態であった（3 %未満の標識）。我々は全マウス生体外海馬組織と同じ結果を得た（Fig. 5C）。
【０２３９】
軸索軸微小管の動態学を直接測定するために、我々は他の微小管集団と比較して、それらの特有の能力を生かし、冷却中の脱ポリマー化に抵抗し（Guillaud, L. et al. STOPタンパク質は神経細胞にて観察される高程度の微小管安定化に関与する。J. Cell Biol. 142, 167-179 (1998)）、これは「冷却安定性」と称し、STOPタンパク質とのそれらの結合に起因している（Slaughter, T., Black, M. M. STOP（安定な細管のみのポリペプチド）は軸索微小管の安定ドメインに選択的に結合する。J. Neurocytol. 32, 399-413 (2003)）。2H2O標識の24時間後に、培養された初代ラット海馬ニューロンからの（Fig. 5D）、またはインビボにて標識されたマウス海馬から製造された（Fig. 5E）、冷却安定微小管は、非常に低い程度まで（＜3 %新規Ala）再現性良く標識した。注目すべきことに、冷却安定微小管による2H取り込みの程度（Fig. 5Dおよび5E）はタウおよびMAP2非結合微小管のものと類似し（Fig. 5Bおよび5C）、軸索軸微小管が後半フラクションにて優位であるかまたは細胞体の微小管がまたチューブリン二量体と不十分に交換することを示唆した。我々は、本明細書に開示される本発明に基づき、微小管のSTOPとの結合が、他の微小管サブ集団と比較して、インビトロにおける冷却誘発分解を予防するだけでなく、培養およびインビボにおける軸索軸微小管の動態学的交換を減少することを結論づけた。
【０２４０】
これらの発見は、本明細書に開示される本発明が、軸索軸に存在する安定な微小管の形成および分解の速度をインビボにて測定することができ、それによりニューロン成熟およびシナプス形成と関連する最も安定な区画の動態学を検出することができることを示す。
【０２４１】
実施例１１：安定同位体取り込みはインビボにおけるシナプス可塑性中の微小管動態へのグルタミン酸の効果を明らかにする。
本明細書に開示される本発明の生体脳におけるシナプス可塑性を反映する能力を確かめるために、我々は、Wilsonの仕事に基づき（Wilson, M. T., Kisalita, W. S., Keith, C. H. 海馬樹状伸長のパターンにおけるグルタミン酸誘発変化：カルシウム依存経路および微小管細胞骨格についての役割。J. Neurobiol. 43, 159-172 (2000)）神経伝達物質アプローチを用い、インビボにてグルタミン酸が動態学的微小管再組織化およびシナプス可塑性を誘発することを示した。グルタミン酸誘発シナプス可塑性中のインビボにおける微小管動態学的再組織化のモデルは、グルタミン酸の先に報告された濃度（0.48 nmol）を用いたマウスにおける注入ICVCを含んだ（Wilson, M. T., Kisalita, W. S., Keith, C. H. 海馬樹状伸長のパターンにおけるグルタミン酸誘発変化：カルシウム依存経路および微小管細胞骨格についての役割。J. Neurobiol. 43, 159-172 (2000)）。新たに合成されるチューブリン二量体および交換可能な微小管は経口2H2O投与により8または24時間標識され、海馬組織抽出物はチューブリン二量体ならびにタウ結合、タウ非結合および冷却安定微小管への2H標識取り込みについて分析し（Fig. 6）、本明細書に開示される本発明の方法を用いた。
【０２４２】
予期されるように、チューブリン二量体のフラクション合成は8〜24時間増大し、グルタミン酸刺激動物にていくらか増強され、新たな微小管集合に関与するニューロンの必要性の増大を反映するようだ（Fig. 6Aおよび6B）。それぞれの微小管フラクションはグルタミン酸作動性刺激への独特のパターンの反応を示した。刺激された動物からの冷却安定（軸索軸）微小管の標識は8時間では対照から区別できないが、24時間にて増大し；後半の時間にて、それらは遊離チューブリンと約40%釣り合った（Fig 68）。従って、生体外のそれらの安定性にかかわらず、これらの微小管は、インビボにて実質的な量の新たに合成されるチューブリンを動態学的に取り込むことができ、場合により軸索枝の刺激を反映することができる（Dent, E. W., Kali, K. 軸索枝は動態学的微小管およびアクチン・フィラメント間の相互作用を必要とする。J. Neurosci. 21, 9757-9769 (2001)）。タウ非結合フラクションにおける微小管は、8および24時間の両方にて非常に動的であった（遊離チューブリンと約80%交換された）。冷却安定微小管は、8時間にて動的ではなく、そして、タウ非結合フラクションにおける標識の早い増大（樹状および軸索軸微小管を含む）が樹状微小管集合の急速な刺激に起因することができる。MAP2結合微小管の存在度は、ウエスタンブロッティングにより判断されるように、24時間にて増大した（示されていない）。逆に、タウ結合微小管（軸索軸区画）は、グルタミン酸による刺激の8時間後にチューブリン二量体と非常に交換したが、24時間にて対照よりも実際に低い動態学であった（Fig. 6B）。一つの説明は、グルタミン酸刺激Ca2+流動が成長円錐微小管を動かし、次いで安定な接続を再構築することである。8および24時間の間、新たに合成された微小管が成長円錐から選択的に流用され、樹状突起および軸索枝にて微小管集合を供給することができ、成長円錐にて取り込まれる標識されていないチューブリン集団を放置することもまた可能である。並行的な実験が初代ラットニューロンのグルタミン酸刺激培養にて行われ、同一の結果を示した（データは示されていない）。
【０２４３】
本明細書に開示される本発明を用いた別の実験にて、2H2O標識は、種々の量のグルタミン酸による動物の刺激の24時間前に開始し；2H2O標識は犠牲までの別の24時間続けた（Fig. 6C）。この実験にて、チューブリン二量体は24時間までに安定期に標識し（cf. Fig. 3C）、グルタミン酸はフラクションチューブリン合成にせいぜいわずかな効果を有した。刺激の24時間後における樹状および軸索軸微小管へのチューブリン取り込みの増大は、この時点におけるタウ結合微小管にて標識取り込みが減少するにつれて、グルタミン酸用量に依存することが示された（Fig. 6C）。同時に、本明細書に開示される本発明を用いたこれらの研究は、生体成熟脳におけるグルタミン酸誘発海馬シナプス可塑性が遊離チューブリンによる微小管の調整された動態学的交換を通した樹状突起、軸索軸および成長円錐における連続的な微小管再配列のプログラムを引き起こすことを示す。
【０２４４】
グルタミン酸誘発シナプス可塑性および海馬長期増強（LTP）のタンパク質合成の阻害剤への感受性は、先の調査員に新規タンパク質合成がグルタミン酸刺激後に上方調整されることを示唆している（Frey, U., Morris, R. G. シナプス標識および長期増強。Nature 385, 533-566 (1997); Kandel, E. R. 記憶貯蔵の分子生物学：遺伝子とシナプスの対話。Science 294, 1030-1038 (2001); Wiersma-Meems, R., Van Minnen, J., Syed, N. I. シナプス形成および可塑性：局所タンパク質合成の役割。Neuroscientist 11, 228-37 (2005)）。しかし、この仮説は先に生体脳にて試験されていなかった。この仮説を試験するために、我々は本明細書に開示される発明の方法を使用した。マウスに0.48 nmolグルタミン酸（注入剤中80μM）またはグルタミン酸プラス0.66 pmol Rp-cAMP（注入剤中110 nM）を含む水6μlを注入した。次いで、海馬チューブリン二量体および微小管ポリマーへの標識取り込みは、8時間または24時間の2H2Oの投与後に定量化した（Fig. 7Aおよび7B）。チューブリン二量体および微小管のフラクション合成は、グルタミン酸Rp-cAMP処置対模擬処置動物にて24時間にて有意に遮断され（Fig. 7C）、海馬微小管動態におけるグルタミン酸誘発変化がcAMP/pKAシグナリング経路に依存したことを示した（Fig. 7C）。これらの発見はさらに、海馬グルタミン酸NMDAレセプター依存学習（長期増強）およびタンパク質合成の間の先に報告された相関性を強化する（Kandel, E. R. 記憶貯蔵の分子生物学：遺伝子とシナプスの対話。Science 294, 1030-1038 (2001)）。同じ基準により、Fig. 6および7に示される海馬微小管動態における変化のグルタミン酸誘発プログラムはまた、インビボにおける海馬全タンパク質合成も変え（データは示されていない）、さらに、脳内の基本的神経解剖学的接続の生化学的記録を生成しそれによりインビボにおけるシナプス形成の動態学を明らかにする本明細書に開示される本発明の能力を支持する。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１−１】FIGURES 1Aおよび1Bは、同位体標識水から選択された遊離アミノ酸への標識された水素（2Hまたは3H）交換の経路を示す。二つのNEAA（アラニン、グリシン）およびEAA（ロイシン）は一例として示される。アラニンおよびグリシンは、Figure 1Aに与えられる。
【０２４６】
【図１−２】ロイシンはFigure 1Bに与えられる。略語：TA、アミノ基転移酵素；PEP-CK、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；TCAC、トリカルボン酸回路。
【０２４７】
【図１−３】FIGURE 1Cはタンパク質合成についてのH218Oによる遊離アミノ酸の18O標識を示す。
【０２４８】
【図２】FIGURE 2は微小管ポリマーへの2H標識チューブリン二量体の取り込みを示す。
【０２４９】
【図３】FIGURE 3はマウス脳における微小管（MT）へのチューブリン二量体のインビボ取り込みおよび交換を示す。(A)異なる区画からのニューロンMTを単離するための戦略の図式的表示。(B)抗タウカラムにより分離された細胞質抽出物の抗タウおよび抗MAP2ウエスタンブロット（レーン1）、タウ非結合（レーン2）およびタウ結合（レーン3）MTフラクション、タウ結合MTの定量的捕捉を示し；MAP2結合MTは未結合フラクションにおけるものである。(C)重水（2H2O）からチューブリン二量体および異なるMTフラクションへの2H取り込みの速度論。マウス（群あたりn=3）は体内の水分中5% 2H2Oで24時間までの種々の時間標識し、脳を解剖し、(A)にて単離されるMT集団を加水分解した。アラニンのC-H結合への2H取り込みはNCI-GC/MSにより測定され、フラクション合成として示される（標識期間中に新たに合成された百分率；平均値±標準偏差）。単一指数関数的曲線適合を示す。安定期値は24時間以内のインビボにおけるすべてのフラクションについて達し、約20%の新たに合成されるチューブリン二量体にて水平になり、タウ結合（成長円錐）およびMAP2/STOP結合（細胞体樹状突起および軸索軸）MTについてそれぞれこの値の半分または３分の１であった。しかし、微小管フラクションの半減期は遊離二量体のものと実質的に異なるものではなかった。
【０２５０】
【図４】FIGURE 4は、ニューロン成熟中の微小管（MT）動態学の測定を示す（AおよびB）。有糸分裂後NT2-N神経細胞を10ng/ml BDNFによる培養中に5% 2H2Oで連続的に標識した。チューブリンおよびMTフラクションはFig. 3のように分析した。5日目における神経突起の伸長（(A)における黒矢印）および15日目における軸索分化（(B)における白色矢印）は位相差顕微鏡法（上パネル；スケール・バー, 10  m）により見ることができた。2H標識チューブリン二量体間の異なる区画中のMTとの本質的に完全な平衡が観察された（下パネル）。(C) BDNFによる培養の7週後、NT2-N細胞は堅固なシナプス結合を構築し（上パネル）；培養の最後24時間の2H2O標識（下パネル）はチューブリンのMTへの低レベル取り込みを示し（タウ結合MTにてわずかに大きい）、成熟マウス脳におけるものと類似した（cf. Fig. 3C）。すべてのグラフは、病態あたり3培養皿について平均値±標準偏差を示す。
【０２５１】
【図５】FIGURE 5は、細胞培養およびインビボの両方における樹状および軸索微小管（MT）へのチューブリン取り込みを示す。特異的な微小管サブ集団を単離しそれらの動態学を測定する別法を（A、D）に示す。インビトロおよびインビボにおける2H2O標識の24時間後のチューブリン二量体および異なるMTサブ集団（平均値±標準偏差、n=3マウス）への2H取り込みのベースラインパターン（B、CおよびE、F）。培養初代ラット海馬ニューロン（BおよびE）およびインビボ標識マウス海馬組織（CおよびF）を分析した。STOP結合MTはタウおよびMAP2非結合フラクション（非結合MT、(A-C)）または冷却安定フラクション（CS、(D-F)）として単離した。すべての場合において、チューブリンのMTへの取り込みはタウ結合について最大で、MAP2結合について中間で、STOP結合MTについて最小であった（非結合またはCS；3%未満）。
【０２５２】
【図６】FIGURE 6はインビボにおけるグルタミン酸およびcAMPアンタゴニストのシナプス可塑性中のMT動態学への効果を示す。(A)および(B)において、マウスに水6μlのみまたは0.48 nmolグルタミン酸（注入剤中80μM）を含むかまたはグルタミン酸プラス0.66 pmol Rp-cAMP（注入剤中110 nM）のICVC注入をした。次いで動物を2H2Oで8時間(A)または24時間(B)、標識した。犠牲にて、海馬ポスト核上清をFig. 5Aに示されるようにフラクションに分け；別々のアリコートを冷却安定（CS）MTの単離のために用いた（Fig. 5D）。グルタミン酸注射は8および24時間における新規MAP2/STOP-MTおよび24時間におけるCS MTへの標識取り込みを刺激し；両者はRp-cAMPにより遮断された。チューブリン合成における混同する変化についての薬理学的介入のMT動態学への効果を修正するために、それぞれのバーを超える数は対応チューブリン二量体フラクションにおける2H標識の百分率としてMTへの2H標識取り込みを示す。(C)グルタミン酸の用量依存効果。2H2O標識はゼロ時間にて開始し、グルタミン酸の示された濃度での6μl ICVC注入を24時間にて行い、標識は48時間（グルタミン酸注入の24時間後）における犠牲まで続けた。海馬MTをタウ結合、MAP2結合および非結合（STOP結合）MTフラクションにFig. 5Aのようにフラクションに分けた。すべての実験において、バーは新規チューブリン%（平均値±標準偏差、n=3）を示す。
【０２５３】
【図７】FIGURE 7は、MTサブ集団の相対的量およびネズミ海馬における全タンパク質合成へのICVグルタミン酸の効果を示す。(A、B)チューブリン存在度は8時間(A)および24時間(B)におけるα-チューブリンについてのウエスタンブロット分析により測定する。サブ集団は全抽出物（total）、遊離チューブリン二量体、タウ結合MT、タウ非結合（MAP2/STOP）MTおよび冷却安定（CS）MTであった。模擬およびグルタミン酸注入ICVCマウスを示す（cf. Fig. 6AおよびB）。24時間にて、0.48 nmolグルタミン酸による処置はMAP2/STOP-MTおよびCS-MTの存在度を増大したが（p＜.001）、タウ-MTの存在度は変化しなかった。(C)全海馬タンパク質のフラクション合成。グルタミン酸は模擬処置動物に対するタンパク質合成を増大し（＊p＜0.01）；この効果は0.66 pmolのRp-cAMPでの共投与により遮断された（＊＊p＜0.02）。
【０２５４】
【図８】FIGURE 8は創薬過程における本明細書記載の発明の使用を説明する。
【０２５５】
【図９】FIGURE 9は努力を続けるかまたは止めることを決定するための手段としてシナプス可塑性およびシナプス形成への効果（すなわち本発明の方法により集められるデータ）を用いる創薬、開発および認可（DDDA）過程を示す図式的ダイアグラムである。
【０２５６】
【図１０−１】FIGURE 10は海馬依存文脈記憶中の微小管／チューブリン交換を示す。(A)文脈恐怖条件付け（CFC）中の微小管／チューブリン交換の測定のためのプロトコール。チューブリン二量体および微小管サブセットは連続2H2O標識を通して安定期まで標識し、CFC訓練の1日前に開始した。標識はCFC訓練（2日目）およびマウスに麻酔するまで（3日目）の文脈条件付け試験にわたり続けた。ビヒクルまたはノコダゾール処置マウスは、以下の実施例7に記載されるように、観察チャンバー内の三対の条件付けおよび条件付けされていない刺激からなるCFC訓練の4時間前に注射した。
【０２５７】
【図１０−２】(B) CFC実験はそれぞれ、未投与、ビヒクル（50%シクロデキストリン）およびノコダゾール処置（0.2 mg/kg）マウス（平均値±標準偏差、各群あたりn=8）の群に行った。ビヒクル処置マウスにおける文脈への凍結百分率として示される凍結応答は、未投与群にて有意に高かった（＊p＜0.001；一方向ANOVA）。これに対し、文脈への凍結百分率は、ビヒクル処置マウスと比較してノコダゾール処置マウスにて有意に低かった（＊＊p＜0.001；一方向ANOVA）。(C-E)海馬チューブリン二量体および微小管サブセットへの2H標識取り込みは示された実験群における犠牲にて比較した。微小管サブ集団は以下に記載されるようにフラクションに分け、新たに合成されるチューブリンの百分率をGC/MS（平均値±標準偏差、n=3）により定量化した。(C)および(D) ビヒクル-CFC訓練マウスにて、増大した凍結応答は、未投与対照動物と比較して、MAP2-およびCS-結合MTの2H標識における増大と一致した（§p＜0.01および§§p＜0.05；二方向ANOVA）。(E) ノコダゾール誘発健忘はビヒクル処置動物と比較して、MAP2-およびタウ-結合MTの有意な分解と一致した（＃p＜0.001；二方向ANOVA）。(C-E)にて、バーは新規チューブリン%（平均値±標準偏差、n=3）を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【国際調査報告】
2009510457.tif 000019
2009510457.tif 000020