(57)【要約】  本発明は、マイクロアレイに基づく技術を用いて、インプリンティング遺伝子のような後成的修飾を同定及びモニタリングするための新規な方法を提供する。詳細には、本発明は、重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられるインプリンティング遺伝子を検出する。本発明は、種々の医療状態を示唆するインプリンティングの消失をゲノムワイドスケールで検出する方法をも開示する。遺伝子インプリンティング及びその消失を同定するための診断アッセイ及びクロマチン構造マーカーをも開示する。【選択図】なし
2009519039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を同定する方法であって、以下の工程：
(a)対象から生体サンプルを単離する工程；
(b)前記対象のゲノムのクロマチン構造を解析して、前記対象のクロマチン構造の地図を作成する工程；及び
(c)前記地図上の、少なくとも1セットの重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる、少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を有するゲノム領域を同定する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記クロマチン構造のマーカーが、修飾されたヒストン又はRNAポリメラーゼIIを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記修飾されたヒストンが、アセチル化リジン9のヒストン3(AcK9H3)、トリメチルリジン9のヒストン3(3MeK9H3)、及びジメチルリジン9のヒストン3(2MeK9H3)から成る群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記解析工程をクロマチン免疫沈降マイクロアレイ、ChIP ChipTMで行う、請求項1記載の方法。
【請求項６】
真核生物ゲノム内のインプリンティング遺伝子を同定するために使用するクロマチン構造マーカー。
【請求項７】
真核生物ゲノム内のインプリンティング遺伝子を同定するために使用するクロマチン構造マーカーであって、該マーカーが修飾されたヒストン又はRNAポリメラーゼIIを含む、前記クロマチン構造マーカー。
【請求項８】
対象の遺伝子インプリンティングの消失を検出するための方法であって、以下の工程：
(a)前記対象から生体サンプルを得る工程（正常な生体サンプルは、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる正常な遺伝子インプリンティングを有する）；
(b)前記生体サンプルを少なくとも1つの遺伝子内のインプリンティングの消失についてスクリーニングする工程；及び
(c)少なくとも1つの遺伝子内の遺伝子インプリンティングの消失を検出する工程（ここで、前記インプリンティングの消失を示す遺伝子は、正常な遺伝子インプリンティングと比較して少なくとも1つの閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる）
を含んでなる方法。
【請求項９】
前記閉じたクロマチンマーカーが3MeK9H3である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
インプリンティングの消失と関連する疾患、例えば癌に対する素因を診断するための、請求項8記載の方法の使用。
【請求項１１】
ChIP ChipTM又は定量的PCRを用いて前記スクリーニング工程を行う、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
対象における疾患の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
(a)前記対象から生体サンプルを得る工程（正常な生体サンプルは、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる正常な遺伝子インプリンティングを有する）；
(b)前記生体サンプルを少なくとも1つの遺伝子内のインプリンティングの消失についてスクリーニングする工程（ここで、前記インプリンティングの消失を示す遺伝子は、正常な遺伝子インプリンティングと比較して少なくとも1つの閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる）；及び
(c)前記インプリンティングの消失が疾患の存在を示唆しているような、少なくとも1つの遺伝子内の前記インプリンティングの消失を検出する工程
を含んでなる方法。
【請求項１３】
ChIP ChipTM又は定量的PCRなどのアレイに基づく方法で前記スクリーニング工程を行う、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患が、癌、先天的欠損症、精神遅滞、肥満症、神経疾患、糖尿病、及び妊娠性糖尿病から成る群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、白血病/リンパ腫、肺癌、前立腺癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、内分泌性癌、泌尿器癌、膵臓癌、他の胃腸癌、卵巣癌、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌、及び腺腫から成る群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも1つの遺伝子が、IGF2、H19、p57/KIP2、KvLQT1、TSSC3、TSSC5、又はASCL2から成る群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
前記生体サンプルが、血液、唾液、頬、涙、精液、尿、汗、糞便、皮膚及び毛から成る群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１８】
対象が疾患にかかる危険性を評価するための方法であって、以下の工程：
(a)前記対象から生体サンプルを得る工程（正常な生体サンプルは、重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる正常な遺伝子インプリンティングを有する）；
(b)前記生体サンプルを少なくとも1つの遺伝子内のインプリンティングの消失についてスクリーニングする工程（ここで、前記インプリンティングの消失を示す遺伝子は、正常な遺伝子インプリンティングと比較して少なくとも1つの閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる）；及び
(c)少なくとも1つの遺伝子内の前記インプリンティングの消失を検出する工程（ここで、前記インプリンティングの消失は前記疾患にかかる危険性を示唆している）
を含んでなる方法。
【請求項１９】
前記インプリンティングの消失が、健康な個体のインプリンティング状態と比較して、重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの非存在によって特徴づけられる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
着床前胚がインプリンティングの消失に起因する疾患を発症する高い危険性を有するかを判定するための方法であって、以下の工程：
(a)少なくとも1つのコントロール胚内でインプリンティングされている少なくとも1つの遺伝子を、前記コントロール胚ゲノムのクロマチン構造の地図を作成することによって同定する工程（ここで、前記インプリンティングされている遺伝子は、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる）；
(b)前記着床前胚から生体サンプルを単離する工程；
(c)前記着床前胚のゲノムのクロマチン構造の地図を作成する工程；及び
(d)前記着床前胚が、前記コントロール胚のインプリンティング状態と比較した、前記着床前胚内のインプリンティング状態の消失に起因する疾患を発症する高い危険性を有することを同定する工程（ここで、前記インプリンティングの消失は少なくとも1つの閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる）
を含んでなる方法。
【請求項２１】
前記インプリンティングの消失が、前記胚のインプリンティング状態と比較して、重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの非存在によって特徴づけられる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
インプリンティング地図を作成する方法であって、以下の工程：
(a)対象からゲノムDNAサンプルを単離する工程；
(b)前記対象のゲノムを解析する工程；及び
(c)前記対象のクロマチン構造の地図を作成する工程；及び
(d)前記地図上の、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を有する染色体領域を同定して、インプリンティング地図を作成する工程
を含んでなる方法。
【請求項２３】
前記インプリンティング地図を異なる組織内で作成する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記インプリンティング地図を異なる発生段階で作成する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記インプリンティング地図を用いて疾患を検索する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
アレイに基づく技術、例えば、ChIP ChipTMを用いて前記解析工程を行う、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願に対するクロスレファレンス〕
この出願は、2005年12月13日提出の米国仮出願第60/749,924号（その全体が本明細書で援用される）の利益を主張する。
〔合衆国後援研究又は開発に関する供述〕
適用なし
【０００２】
〔発明の背景〕
メンデル遺伝学の伝統的法則に従い、人々はその遺伝子の2つのコピー−その母由来の1つとその父由来の1つ−を受け継ぐ。通常、各遺伝子の両コピーは細胞内で活性、つまり「オンになっている」。しかし、2つのコピーの1つだけが正常にオンになっている場合がある。どちらのコピーが活性かは起源の親によって決まる。いくつかの遺伝子は人の父から受け継いだときだけ活性であり、他の遺伝子は人の母から受け継いだときだけ活性である。この現象は「ゲノムインプリンティング(imprinting)」として知られる。ゲノムインプリンティングを受ける遺伝子では、卵細胞及び精細胞の形成中、該遺伝子上に起源の親が標識されることが多い(すなわち、メチル化プロセスを通じて)。この標識が、遺伝子のコピーが母から受け継いだか、父から受け継いだかを特定する。
ゲノムインプリンティングの証拠は全ゲノムの研究から始まり、次いで個人の染色体及び領域の研究に進行し、特異的なインプリンティング遺伝子の同定に帰着した。詳細には、インプリンティングの全ゲノムの証拠は、過剰ゲノムの親起源によって決まる顕著に異なる表現型を有するトリソミーマウス及びヒト胚に由来した。同様に、片親の二染色体又はUPD(一方の親コピーの重複と他方の親コピーの消失)を受けるマウス及びヒトの両染色体は、その子孫で特徴的な表現型の変化を示すことが多い。これらは、いくつかの染色体領域の父性UPDの場合の過成長、及び同じ染色体領域の母性UPDの場合の成長遅延を含み得る。インプリンティング遺伝子と出生前後の両成長との間に強い関連性がある。インプリンティングは、細胞成長に関連するいくつかの定量的な形質遺伝子座の基礎になるとも考えられる。インプリンティング自体、幹細胞移植に対する障壁の可能性がある。
【０００３】
インプリンティング遺伝子を内部に持つと思われる染色体として、少なくとも1、2、5、6、7、11、14、15、16、18、19、20、及びXが挙げられる。インプリンティング遺伝子に関与する特有のヒト疾患として以下のものが挙げられる：プラーダー-ヴィリ(Prader-Willi)症候群及びアンジェルマン(Angelman)症候群（低身長、精神遅滞、及び行動障害をもたらす）；ベックウィズ-ヴィーデマン症候群(Beckwith-Wiedemann Syndrome)(BWS)（ウィルムス(Wilms)腫瘍、肝芽腫及び神経芽細胞腫への出生前過成長及び素因を引き起こす）；及び偽性副甲状腺機能低下症IA型（骨形成異常症及び性腺機能不全をもたらす）。さらに、異数性自体は悪性腫瘍の有意な危険因子であり、癌素因における遺伝子量のかすかな変化の役割を示唆している。
さらに、多くの複合形質が特有の親からの優先遺伝を示す。この理由のため、いくつかの一般的疾患は寄与遺伝子の1つとしてインプリンティング遺伝子が関与すると考えられ、この疾患として、精神分裂病、双極性感情病、自閉症、糖尿病、及び癌が挙げられる。20年前、胞状奇胎及び卵巣奇形腫がそれぞれ雄核発生(46染色体、すべて父性起源)及び単為発生(すべて母性染色体)胚から起こるという観察によって、インプリンティングと癌の役割が間接的に示唆された。従って、たとえ正常数の染色体が存在しても、新生物が母性及び父性染色体間の不均衡を形成する。
さらに、父性ゲノムの過剰は母性ゲノムの過剰より進行性の腫瘍をもたらし、母性染色体と父性染色体は成長ホメオスタシスに対して異なる作用を有することを示唆している。或いは、インプリンティングの消失(loss of imprinting)(LOI)は、インプリンティング成長促進遺伝子、例えばIGFの正常なサイレントアレルの異常な活性化及び/又はインプリンティング腫瘍サプレッサー遺伝子、例えばp57/KIPの正常なサイレントアレルの異常なサイレンシングである。LOIはインプリンティング標識の完全な削除を要求しなくてもよい。また、我々及び他の研究者は、IGF2のLOIが癌における最も一般的な遺伝子変化の1つであることを見出した。これには小児期の胚芽腫(エパトブラストーマ(epatoblastoma)、横紋筋肉腫、及びユーイング肉腫)及び主に成人の悪性腫瘍(子宮、頚部、食道、前立腺、肺、及び生殖細胞腫瘍)が含まれる。
【０００４】
インプリンティング遺伝子を同定するために使用される一般的アプローチとして、母性又は父性二染色体マウス胚を用いるサブトラクションハイブリダイゼーション、及びマウス由来の二重消化したDNAの2-Dゲル電気泳動法が挙げられる。しかし、これらの方法は、比較的低い感受性と特異性を示している。インプリンティング遺伝子を同定することに対する主な限界は、マウスとヒトにおけるインプリンティングが同一でないことだった。さらに、マウス用に使用されている多くのアプローチは倫理的にヒトには適さない(例えば、胚実験を含む)。インプリンティング遺伝子は同じ染色体領域内で一緒にクラスター化する傾向があることが分かったので、別の緩徐なアプローチは、他のインプリンティング遺伝子近傍のインプリンティング遺伝子を検索することだった。しかし、このアプローチは既知のインプリンティング遺伝子（すべてのヒト遺伝子の小割合だけがゲノムインプリンティングを受けるので、かなり少ない）近傍の遺伝子に限定される。
インプリンティング遺伝子の多大な公衆衛生の重要さ、及び多くの研究室で時間を費やしてきた大量の労力にかかわらず、インプリンティング遺伝子を同定するための新規な方法の開発はほとんど進行していない。従って、疾患発症の存在又は危険性を示唆しうる、インプリンティングの消失のスクリーニング及び検出を介してインプリンティング遺伝子を同定するための診断方法が要望されている。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、ゲノムワイドスケールで、インプリンティング遺伝子のような後成的修飾を迅速に同定及びモニタリングするための新規な方法として要約される。本方法は、インプリンティング遺伝子の一方のコピーは第1染色体上で活性であり、他方のコピーは第2染色体上で不活性であるという概念を基礎とする。活性遺伝子のプロモーターは第1染色体の開いたクロマチン領域に存すると仮定され、かつインプリンティング遺伝子の不活性コピーは第2染色体の閉じた(縮合した)クロマチン領域上にある。
出願人は、マイクロアレイに基づく方法、例えばクロマチン免疫沈降マイクロアレイ、ChIP ChipTM技術を用いて、インプリンティング遺伝子を同定するための少なくとも1セットの重なっている開いたクロマチン構造マーカーと閉じたクロマチン構造マーカーを有するゲノム領域の地図を作成することができた。或いは、他のアレイ又はPCRに基づく技術を用いて、重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーが一般的に観察されるゲノム領域内の開いたクロマチン構造マーカーだけの存在を観察することによって、インプリンティングの消失を同定することができる。従って、以下の実施例で述べるように、疾患と関連し得るインプリンティング遺伝子及び該インプリンティングの消失を同定することができる。
【０００６】
広い局面では、アレル特異性発現によって引き起こされるいずれの後成的修飾の同定及びアッセイをも包含する。この後成的修飾としてインプリンティング遺伝子が挙げられるが、これに限定するものではない。
別の局面では、本発明は、対象の少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を同定する方法であって、ChIP ChipTM技術によって前記対象のゲノムのクロマチン構造を解析することによって作成した地図上の、少なくとも1セットの重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を同定する方法を提供する。該法は、特定組織又は細胞内の活性及び不活性遺伝子を同定するためのゲノムの迅速スクリーニングを可能にする。
別の局面では、本発明は、ChIP ChipTM技術を用いて対象の遺伝子インプリンティングの消失を検出する方法（ここで、前記インプリンティングの消失は、疾患の指標である、閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる）方法を提供する。
この局面において、本発明は、疾患、例えば癌又は他の関連疾患に対する対象の素因の評価に有用なインプリンティングの消失を同定するための診断アッセイ又は試験を提供する。
関連局面では、本発明は、インプリンティングの消失の結果として対象が疾患にかかる危険性を評価するための方法を提供する。
関連局面では、本発明は、インプリンティングの消失の結果として対象における疾患の存在を検出するための方法を提供する。
関連局面では、本発明は、着床前胚がインプリンティングの消失に起因する疾患を発症する高い危険性を有するかを判定するための方法を提供する。
別の局面では、本発明は、疾患を検索するために使用するインプリンティング地図を作成する方法を提供する。
本発明の別の局面は、遺伝子インプリンティング及び該インプリンティングの消失を同定するためのクロマチン構造のマーカーを提供する。
この局面では、マーカーは、ヒストン修飾及びRNAポリメラーゼIIの存在を含む。ヒストン修飾として、例えば、1)ヒストン3のアセチル化リジン9(AcK9H3)；2)ヒストン3のトリメチルリジン9(3MeK9H3);及び3)ヒストン3のジメチルリジン(2MeK9H3)が挙げられる。
本発明の関連局面は、診断用のインプリンティング遺伝子の相対的に小さく高品質のセットを製造する能力である。
本発明の他の目的、利点及び特徴は、以下の説明から明らかになるだろう。
【０００７】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、広くは、後成的修飾、例えばインプリンティング遺伝子の迅速な同定及びモニタリング方法に関する。本発明は、インプリンティング遺伝子の一方のコピーは第1染色体上で活性であり、他方のコピーは第2染色体上で不活性であるという概念を基礎とする。活性遺伝子のプロモーターは第1染色体の開いたクロマチン領域に存すると仮定され、インプリンティング遺伝子の不活性コピーのプロモーターは第2染色体の縮合したクロマチン領域上にある。同じ領域内の開いたクロマチンと縮合したクロマチンを示唆しているクロマチン構造マーカーを検索することによって、アレイに基づく技術、例えば、ChIP ChipTMを用いて該ゲノム内のインプリンティング遺伝子の位置を迅速に同定することができる。或いは、他のアレイ又はPCRに基づく技術を用いて、重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーが一般的に観察されるゲノム領域内の開いたクロマチン構造マーカーだけの存在を観察することによって、インプリンティングの消失を同定することができる。従って、本明細書で述べるように、疾患と関連し得るインプリンティング遺伝子及び該インプリンティングの消失を同定することができる。
【０００８】
一般に、クロマチン免疫沈降法(Chromatin Immunoprecipitation)(ChIP)は、タンパク質-DNA相互作用をin vivo研究するために広く用いられている方法である(Solomon, et al. (1988) Cyclin in fission yeast. Cell 54: 738-739；及びOrlando, V. (2000) Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde crosslinked chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104参照；両文献はその全体が本明細書で援用される)。伝統的に、この技術は、転写因子(TF)が特定のDNA配列にin vivo結合するかを確認するために使用された。この技術を用いて、まず生細胞をホルムアルデヒドで処理してから破壊する。超音波処理で染色体を剪断し、架橋したクロマチンDNAフラグメントを、該TFに対して特異的な抗体を用いて免疫沈降させる。1対の遺伝子特異性プライマーを用いるPCRで該免疫沈降物内の特定配列の濃縮を試験し、ゲル電気泳動を用いて可視化する。非免疫沈降コントロールと比較したPCR産物の収率を分析して、問題のタンパク質が試験したDNA領域に結合しているかを決定する。しかし、DNAの各領域をPCRで個々に試験しなければらならい。従って、本発明と異なり、ChIP技術は一般的に、分析するために選択されるDNA領域が小セットに限定される。
研究者らは、免疫沈降物はTFのすべての標的配列を含むことを見出した。免疫沈降したDNAフラグメントを配列決定して因子標的遺伝子を同定することが試された(Weinmann et al., (2001) The use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol. Cell. Biol. 21: 6820-6832；及びWeinmann, et al., (2002) Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. Genes & Dev. 16: 235-244)。例えば、Weinmannらはヒト細胞からE2F4抗体で免疫沈降させたDNAをクローン化し、1ダースのクローンのE2Fタンパク質結合性を生化学的に検証し、それらを配列決定していくつかの新規なE2F標的遺伝子を同定した。しかし、同研究では既知のE2F標的遺伝子は見出されず、この方法の有効性に疑念を投げかけている。明らかに、不十分なクローニング工程及びしらみつぶしに擬陽性クローンを排除するための遅く骨の折れる生化学プロセスによって限定される。
【０００９】
さらに、出願人は、クロマチン免疫沈降法とマスクレスアレイ合成(Maskless Array Synthesis)(MAS)マイクロアレイ技術を結合してChIP ChipTM法（NimbleGen Systems (Madison, WI)を通じて入手可能）を開発した。MASマイクロアレイ技術は米国特許第6,375,903号及び米国特許第5,143,854号（それぞれその全体が本明細書で援用される）に記載されている。米国特許第6,375,903号の開示は、マスクレスアレイシンセサイザー(MAS)機器の構築を可能にする。この機器は光を用いてDNA配列の合成を方向づけ、光の方向づけはデジタルマイクロミラーデバイス(digital micromirror device)(DMD)を用いて行う。MAS機器を用いると、マイクロアレイで構築すべきDNA配列の選択はソフトウェアの制御下なので、個々に誂えてアレイを作って配列することができる。一般に、MASに基づくDNAマイクロアレイ合成技術は、標準的な顕微鏡のスライドグラス上の非常に小さい領域内で800,000を超える一意のオリゴヌクレオチドの並行合成を斟酌する。マイクロアレイは、通常、オリゴヌクレオチドがアレイ上の特有の位置で合成される光を用いて方向付けすることによって合成され、これらの位置が特徴と呼ばれる。
ChIP ChipTM技術を用いて、出願人及び他の研究者は、酵母菌細胞(Lee et al., Msx1 Cooperates with Histone H1b for Inhibition of Transcription and Myogene, Science (2004) 304: 1675-1678)及びヒト細胞(Kim et al., (2005) A high-resolution map of active promoters in the human genome.  Nature. 436:876-880)内のTF標的を同定することができた。免疫沈降したDNAを配列決定する代わりに、該DNAを増幅かつ蛍光標識してから、酵母菌又はヒトゲノムの遺伝子間領域に対するプローブを含有するDNAマイクロアレイにハイブリダイズする手順を開発した。コントロールとして、異なる蛍光染料を用いてゲノムDNAを標識して同じアレイにハイブリダイズする。IPに富んだDNAチャネル内で有意に強いシグナルを示すプローブは、対応する遺伝子間領域がTFによってin vivo結合していることを示し、該プローブのゲノム位置に沿ったIPに富んだDNA/ゲノムDNAコントロールの比としてプロットすることができる。
【００１０】
本発明により、ChIP ChipTM技術を用いてDNAクロマチン構造を研究することもできる。詳細には、ChIP ChipTMを用いて、DNAのパッケージングで用いられるヒストンタンパク質の酵素的修飾を基礎としてDNAを同定することができる。現在、ヒストンタンパク質に対する修飾は、DNAの詰め込み密度の決定に関与すると考えられている。適切なヒストン修飾として、限定するものではないが、ヒストンH3及びH4のアセチル化、ヒストンH3のメチル化、ヒストンH1のリン酸化が挙げられる。ヒストン3のリジン9上の3つのメチル基のような修飾(3MeK9H3)は、転写機構に利用できない縮合したクロマチンと関連すると考えられる。ヒストン3のリジン9上のアセチル基のような他の修飾(AcK9H3)は、転写機構に利用できる開いたクロマチンと関連すると考えられる。これらのヒストン修飾は多くの場合、遺伝子のプロモーター内で見られ、遺伝子転写を制御する手段であると考えられる。DNAはヒストンの周囲に密接に包まれ、これらの相互作用は架橋によって容易に捕獲される。ChIP ChipTMは、ヒストン修飾の地図作成に有効であることが分かった。
本明細書では、用語「ヒストン」は、真核生物の染色体のヌクレオソーム内でDNAがらせん状に巻かれる単位を形成するタンパク質を意味する。真核生物では、ゲノムDNAは、ヒストンタンパク質でクロマチンにパッケージングされ、DNAを数万倍圧縮している。DNA-ヒストン構造は、典型的に4つのコアヒストンH2A、H2B、H3及びH4の八量体と、該ヒストンの周囲に巻かれた146塩基対のDNAとで構成されるヌクレオソームである。各コアヒストンは、構造化ドメインと25〜40残基の非構造化アミノ末端部で構成される。この非構造化末端部がDNA渦巻を介して、ヌクレオソーム周囲の空間に伸長する。ヌクレオソームは遺伝子発現と適合しない。転写用のDNAにアクセスするための転写因子及びRNAポリメラーゼのためにヌクレオソームの再編成が必要である。
本明細書では、用語「ヒストン修飾」は、ヒストンの翻訳後修飾を意味する。ヒストンのアミノ末端の翻訳後修飾は、長い間クロマチンの構造と機能の制御で中心的役割を果たすと考えられていた。ヒストンの多数の共有結合修飾が考証されており、ヒストンのアミノ末端部ドメインで起こるアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、及びADPリボシル化が挙げられる。修飾の型のこのような多様性及びこれらの修飾を受ける残基の顕著な特異性は複雑な階層の順序と組合せ機能を示唆しており、未だに不明のままである。ヒストンのアミノ末端部の翻訳後共有結合修飾は、クロマチンの転写のオン又はオフ状態を制御し、染色体の凝縮と分離に影響を与える。3つの最も良く特徴づけられているヒストン修飾として、共有結合修飾：ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化及びシトシンメチル化が挙げられる。
本明細書では、用語「開いたクロマチン」は、エンドヌクレアーゼ、例えば、DNアーゼIの作用に対して、周囲領域より少なくとも10倍高い感受性である、クロマチンの領域を指す。クロマチンの開きは転写活性に必須なので、DNアーゼI感受性は、クロマチン領域の転写強化の手段を与え；通常、DNアーゼ感受性が高いほど、高い転写活性に相当する。DNアーゼ過敏性アッセイがWeintraub & Groudine, 1976, Science 193: 848-856（本明細書で援用される）で開示されている。「高度に転写された」又は「高度に発現された」領域又は遺伝子は、転写される開いたクロマチン構造の領域である。最近、研究者らは、遺伝子に富む領域は開いたクロマチン構造内である傾向があり、遺伝子が不十分な領域は緻密クロマチン内である傾向があることを見出した。しかし、開いたクロマチンが不活性遺伝子を含むことがあり、緻密クロマチンが活性遺伝子を含み得る(Bickmore, et al (2004) Chromatin Architecture of the Human Genome: Gene-Rich Domains Are Enriched in Open Chromatin Fibers, Cell, Vol 118, 555-566, 3参照)。
【００１１】
本発明は、後述する方法を通じて、後成的修飾、例えば遺伝子インプリンティング及び遺伝子インプリンティングの消失を同定及びモニタリングする方法に関係するする種々の関連実施形態を包含する。本明細書では、後成的修飾は、DNAメチル化及び/又はクロマチン構造内の遺伝的であるが潜在的に可逆性の変化によって制御される、遺伝子発現における修飾を意味する。DNAメチル化は、CpG配列内のシトシン残基がメチル化される複製後プロセスであり、遺伝子特異性のメチル化パターンを形成する。ハウスキーピング遺伝子は、すべての細胞型内でメチル化されないプロモーター領域にCpG-リッチ島を有するが、組織特異性遺伝子は、該遺伝子が発現される組織以外のすべての組織内でメチル化される。これらのメチル化パターンは明白に遺伝子発現と関係がある。さらに、ペアレント-オブ-オリジン(parent-of-origin)様式で単一対立遺伝子によって発現される、メンデルの遺伝法則に従わない遺伝子、例えばインプリンティング遺伝子は、後成的メカニズムによってインプリンティングされている。
特有の組織又は細胞型内のインプリンティング遺伝子の同定を効率的にできるようにするため、出願人は、ゲノムワイドクロマチン構造又はインプリンティング地図を作成する方法を開発した。一般に、用語「インプリンティング地図」は、インプリンティングを受けやすいゲノムの染色体領域を表す。インプリンティングを示しそうな染色体として、2、6、7、11、14、15、16、20及びXが挙げられる(Ledbetter D. H. and Engel E. (1995) Hum. Mol. Genet. 4: 1757; Morison I. M. and Reeve A. E. (1998) Hum. Mol. Genet. 7: 2599参照)。表現型に応じて染色体領域を標識することができる。
従って、一実施形態では、本発明は、重要な臨床と密接な関係があり得るヒト染色体インプリンティング地図を提供する。基本的方法は、対象からゲノムDNAサンプルを単離する工程を含む。次に、ChIP ChipTMと称する出願人のクロマチン免疫沈降マイクロアレイ技術を用いて対象のDNAサンプルを解析する。対象のクロマチン構造の地図を作成し、この地図上の、少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を有する染色体領域の同定を可能にする。本明細書で述べるように、インプリンティング遺伝子は、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる。
【００１２】
好ましい実施形態において、出願人は、以下の3つの特有の基準が存在するとき、本発明の方法が最も良く働くことを見出した：1)開いたクロマチンマーク；2)閉じたクロマチンマーク；及び3)これらのマークがCpG島上に存在すること。CpG島は、異常に高いCG含量の領域であり、通常ポジティブ選択下にある。詳細には、研究者らは、CpG島を50%のC+G含量及び約0.5又は約0.6過剰な観測CpG/予測CpG比を有する約200〜約500塩基対長さのDNAと定義した(Gardiner-Garden, M. and Frommer, M. (1987) J. Mol. Biol. 196, 261-282参照)。さらに、該CpGパターンに富む、ゲノム配列の領域はメチル化に抵抗性であり、かつ頻繁にスイッチがオンになる遺伝子と関連する傾向があることから、該領域の検出は重要である。該CpGパターンに富む領域はCpG島として知られている。
異なる組織のため及び異なる発生段階で本発明のインプリンティング地図を作成できると予想される。該インプリンティング地図を使用して、健康な対象のインプリンティング地図と比較して異常なインプリンティング又はインプリンティングの消失(遺伝子の第2アレルの活性化をもたらす、閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる)に起因する種々の疾患を検索できる。ヒトのみならず他の生物についてもインプリンティング地図を作製できることに注意されたい。他の生物として、限定するものではないが、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、トリ、ラット、ウマ、ブタ、又はサル等の猫脊椎動物及び哺乳動物が挙げられる。
関連実施形態では、本発明は、少なくとも1つのインプリンティング遺伝子の同定方法を提供する。本方法は、対象から生体サンプルを単離する工程及びChIP ChipTMで対象のゲノムのクロマチン構造を解析して該対象のクロマチン構造の地図を作成する工程を含む。引き続き、前記地図上の、少なくとも1セットの重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる、少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を有するゲノム領域を同定する。
【００１３】
本発明の実施において、出願人は、インプリンティング遺伝子の同定及びモニタリングの指標であるクロマチン構造の4つのマーカーを適宜同定した。これらの4つのマーカーは、以下のようなヒストン修飾を含む：1)ヒストン3のアセチル化リジン9(AcK9H3)（開いたクロマチンマーカー）；2)ヒストン3のトリメチルリジン9(3MeK9H3)（縮合したクロマチンマーカー）；3)ヒストン3のジメチルリジン9(2MeK9H3)（一時的に縮合したクロマチンマーカーと考えられる）；及び4)RNAポリメラーゼII(Pol II)（RNA転写に関与し、かつおそらく開いたクロマチンに結合した状態で見つかるタンパク質複合体）。詳細には、好ましい実施形態では、本発明は、ChIP ChipTMを用いてヒトのゲノムのクロマチン構造の地図を作成し、かつ少なくとも1つのインプリンティング遺伝子の存在を示唆する、重なっている開いたクロマチンマーカー(AcK9H3)と閉じたクロマチンマーカー(3MeK9H3)を有するゲノム領域を同定する。
従って、本発明の別の実施形態は、インプリンティング遺伝子及び該インプリンティング遺伝子の消失の同定で使うためのクロマチン構造のマーカーを提供する。遺伝子インプリンティングを同定するための好ましいマーカーとして、以下のようなヒストン修飾が挙げられる：1)ヒストン3のアセチル化リジン9(AcK9H3)；2)ヒストン3のトリメチルリジン9(3MeK9H3)；3)ヒストン3のジメチルリジン9(2MeK9H3)；及び4)RNAポリメラーゼII(Pol II)。或いは、インプリンティングの消失を同定するための好ましいマーカーには、AcK9H3及びPol II等の開いたクロマチンマーカーだけが含まれる。しかし、当業者は、インプリンティング遺伝子及びその消失を同定できる他の開いたクロマチンマーカー及び縮合したクロマチンマーカーも適用できることに容易に気づくだろう。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、対象内の遺伝子インプリンティングの消失(LOI)を同定するための新規な方法を提供する。一般的に、インプリンティングの消失を検出するための方法は、インプリンティング状態を解析するための定量的方法だった。例えば、定量的PCRアッセイを用いて、出願人はIGF2遺伝子の1つのアレル内でしばしば起こるインプリンティングの消失が結腸癌と関連すると判定した。従って、遺伝子又は遺伝子集団のインプリンティングの異常の同定は、疾患の診断を容易にし、又は疾患に対する素因を判定することができる(例えば、米国特許第6,235,474号参照)。
LOIを引き起こすか又はLOIの結果であるいずれかの条件、状態、又は現象を調査することによって、LOIの存在又は非存在を検出し得る。LOIの原因として、DNAメチル化の細胞機構の状態又は条件、インプリンティング制御領域の状態、インプリンティングのトランス作用性修飾因子の存在、ヒストンの脱アセチル化の程度又は存在が挙げられる。LOIについて査定している遺伝子と関連するゲノムDNAの状態として、DNAメチル化の程度が挙げられる。LOIの効果として以下のものが挙げられる：LOIについて査定している遺伝子の2つのアレルの相対転写；LOIについて査定している遺伝子の2つのアレルの差動発現と関連する転写後効果；LOIについて査定している遺伝子の2つのアレルの相対翻訳；及びLOIについて査定している遺伝子の2つのアレルの差動発現と関連する翻訳後効果。
LOIの他の下流効果として、RNAレベル、スプライシングレベル、若しくはタンパク質レベルで測定される遺伝子発現の変化又は翻訳後レベル(すなわち、種々の巨大分子中へのインプリンティング遺伝子の出現の1つ以上のこれらの特性を測定する)；例えば、細胞周期、シグナル伝達、イオンチャネル、膜電位、細胞分割などを含み得る機能の変化(すなわち、正常に又は非正常にインプリンティングされている特有のインプリンティング遺伝子の生物学的結果(例えば、心臓のQT間隔)を測定する)が挙げられる。別群の巨大分子の変化として、LOIと関連するプロセス、例えばヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化、又はRNAスプライシングが挙げられる。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ChIP ChipTM技術を用いて、インプリンティングの消失の検出を容易にする。これは対象から生体サンプルを得る工程を含み、正常な生体サンプルは、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる正常な遺伝子インプリンティングを有する。次に生体サンプルを、正常な遺伝子インプリンティングを有することが分かっている領域内の少なくとも1つの閉じたクロマチンマーカー、例えば3MeK9H3の存在によって特徴づけられる少なくとも1つの遺伝子内でインプリンティングの消失についてスクリーニングする。インプリンティングの消失と関連する疾患、例えば癌に対する素因を判定するための診断試験又はアッセイとしてこの方法を使用し得る。
好ましくはゲノムDNAを含有するいずれの生体サンプルも(純粋な赤血球以外)実質的に使用できるであろう、インプリンティングの消失と関連する疾患に対する素因を判定するための診断アッセイが適切であると予想される。例えば、好都合な組織サンプルとして、白血球、唾液、頬、涙、精液、尿、汗、糞便、皮膚及び毛が挙げられる。従って、ここで述べる、ChIP ChipTM技術を用いたゲノムインプリンティングの診断アッセイは、このアッセイが腫瘍組織を必要としないことから、かなり実用的に重要である。ここで述べるアプローチは、一般集団内で癌の患者又は癌の危険性のある患者のかなりの割合を確認できる第一遺伝試験にも相当する。
【００１６】
関連実施形態では、本発明は、対象における疾患の存在を検出するための方法を提供する。本方法は、対象から生体サンプルを得る工程を含み、正常な生体サンプルは、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる正常な遺伝子インプリンティングを有する。生体サンプルは、血液又は組織由来の細胞を含んでよく、好ましくは遺伝情報を含む。次に、生体サンプルを少なくとも1つの遺伝子内のインプリンティングの消失についてスクリーニングする。このスクリーニングは、インプリンティングの消失(LOI)が該疾患の存在を示唆する、正常な遺伝子インプリンティングを有することが分かっている領域内で閉じたクロマチンマーカーの消失を検索することによって特徴づけられる。
一般に、正常にインプリンティングを示すことが分かっているいずれの遺伝子についてもLOIの存在又は非存在を判定し得る。現在、正常にインプリンティングされてることが分かっている約22の遺伝子がある(Feinberg in The Genetic Basis of Human Cancer, B Vogelstein & K Kinzler, Eds., McGraw Hill, 1997参照；本明細書で援用される)。該遺伝子の例として、限定するものではないが、IGF2、H19、p57/KIP2、KvLQT1、TSSC3、TSSCS、及びASCL2が挙げられる。しかし、正常にインプリンティングを示すさらなる遺伝子が発見され、該遺伝子のLOIが本発明の方法の標的となり得ることが予測され、従ってそれらは本実施形態に包含される。
該方法は、とりわけ癌、先天的欠損症、精神遅滞、肥満症、神経疾患、糖尿病、又は妊娠性糖尿病などの疾患の診断に有用であると予測される。詳細には、癌について、本方法は、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、白血病/リンパ腫、肺癌、前立腺癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、内分泌性癌、泌尿器癌、膵臓癌、他の胃腸癌、卵巣癌、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌、又は腺腫の検出に特に有用であると予測される。また、インプリンティング又はインプリンティングの消失についてモニタリングする遺伝子については、IGF2、H19、p57/KIP2、KvLQT1、TSSC3、TSSC5、又はASCL2が挙げられる。
【００１７】
関連実施形態では、本発明は、対象が疾患にかかる危険性を評価するための方法を提供する。本方法は、対象から生体サンプルを得る工程を含み、正常な生体サンプルは、重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる正常な遺伝子インプリンティングを有する。次に、生体サンプルを、少なくとも1つの遺伝子内の、正常な遺伝子インプリンティングを有することが分かっている領域内における閉じたクロマチンマーカーの消失（ここで、インプリンティングの消失は該疾患にかかる危険性を示唆する）によって特徴づけられるインプリンティングの消失についてスクリーニングする。他の実施形態として、一般集団のためのDNAに基づく血液試験が挙げられ、以下に述べる。
同様に、本発明は、一般集団内で高頻度に癌の危険性を同定する方法を提供する。好ましい実施形態では、ポジティブ血液試験は癌の危険増を示し、一般集団内で癌の監視を増やすための高リスク患者を同定するために使用できる可能性がある。本方法は、ネガティブ試験が、ポジティブ家族歴を有する患者を繰返しの侵襲性検査から排除するのに役立ち得るというさらなる利点を提供する。さらに、本試験は、血液などの生体サンプルについて行うことができる。
一実施形態では、RNAではなくDNAに基づく試験を用いて疾患に対する素因を評価することが好ましい。従って、ある実施形態では、本発明の方法は、一般集団のインプリンティング地図内で、重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーが存在する少なくとも1つの縮合したクロマチンマーカーの存在を通じて判定されるインプリンティングの消失についてゲノムDNAを解析する工程を含む。定量的PCRなどの診断ツールを用いて、診療所で該試験を施すことができると予測される。
【００１８】
日常的臨床ケアの際、例えば、明白又は疑わしい新生物、例えば癌のない対象に対する一般的な定期検査の一部として本発明の方法を実施できる。従って、ある実施形態の本発明は、一般集団のスクリーニング方法を提供する。現在の癌スクリーニングアッセイより若い年齢で本発明の方法を実施でき、例えば、65歳未満の対象について本発明を実施することができる。
例えば、通常、重なっている開いたマーカーと閉じたマーカーを含んでいたゲノム領域内の閉じたクロマチンマーカーの消失の結果として、対象の生体サンプルがLOIを示すことが見つかった場合、該対象は癌があるという高い確率を有すると同定されるだろう。該実施形態では、遺伝子の両アレルが正常に発現されるが、該ゲノム領域はもはやインプリンティングされていない。該実施形態では、1以上の診断試験を行って、該対象に癌が存在する可能性を精査することが好ましいだろう。さらに、たとえLOIを検出した時に癌が存在しなくても、将来、追加の診断試験を行う予定を指示することも好ましいだろう。限定するものではないが、胸のＸ線、癌胎児抗原(CEA)又は前立腺特異性抗原(PSA)レベルの定量、結腸直腸検査、内視鏡検査、MRI、CAT走査などの技術上周知のさらなる診断試験を行って、対象に存在する癌の可能性を精査することができる。
【００１９】
関連実施形態では、本発明は、疾患を検出するか、又は将来疾患を発症することについて対象の素因を測定するための新規な方法であって、対象から生体サンプルを得；かつ該生体サンプルを、閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる、異常なインプリンティング又はインプリンティングの消失(LOI)の存在についてスクリーニングすることによる方法を提供する。定量的PCRに基づく方法を用いて診療所で非常に効率的にLOIのスクリーニングを行うことができると予測される。
生体サンプルとしては、患者から都合よく取り出され、かつ信頼できる結果を得るのに十分な情報を含むいずれのサンプルも挙げられる。しかし、より小数の細胞を含むサンプルを得てから該細胞を濃縮することができる。さらに、ある高感受性アッセイ(例えば、問題の遺伝子(例えば、IGF)が豊富な場合のRT-PCR、及びIGF2が豊富でない場合でさえDNAメチル化のような他の方法)では、単細胞レベルに至るまでのサンプルサイズを得ることができる。また、サンプルは、該対象内のLOIの存在又は非存在を評価するために十分な生体物質(例えば、タンパク質；遺伝物質、例えばDNA又はRNA等)を含む限り、いずれの完全な細胞も含む必要がない。
本発明の別の実施形態では、着床前胚がインプリンティングの消失に起因する疾患を発症する高い危険性を有するかを判定するための方法が包含される。本方法は、少なくとも1つのコントロール胚内でインプリンティングされている少なくとも1つの遺伝子をChIP ChipTMを用いて該コントロール胚ゲノムのクロマチン構造の地図を作成することによって同定する工程を含む。ここで、前記インプリンティングされている遺伝子は、少なくとも1セットの重なっている閉じたクロマチンマーカーと開いたクロマチンマーカーの存在によって特徴づけられる。次に、生体サンプルを着床前胚から単離する。ChIP ChipTMを用いて、該着床前胚のゲノムのクロマチン構造の地図を作成する。結果は、着床前胚が、該コントロール胚のインプリンティング状態と比較したインプリンティング状態の消失に起因する疾患を発症する高い危険性を有することを示し得る。ここで、前記インプリンティングの消失は少なくとも1つの閉じたクロマチンマーカーの消失によって特徴づけられる。同様に、ChIP ChipTM技術を用いて、疾患状態、異なる組織と関連し、及び/又は異なる発生段階のインプリンティング遺伝子を同定できることも予測される。
アレイに基づく方法、例えばChIP ChipTMはインプリンティング遺伝子の同定に好ましいが、診療所又は前臨床診断環境内でLOIについてスクリーニングするための代替実施形態が本発明の範囲に包含される。これらの代替実施形態として、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法、例えばリアルタイム又は定量的PCR(Q-PCR)が挙げられる。この方法は、各増幅周期でPCR産物が蓄積するにつれて増す蛍光レポーター分子によって、DNA、cDNA、又はRNA鋳型の出発量を定量するための診断ツールである。このツールは、遺伝子発現解析及び遺伝子型解析アッセイといった、非常に増強された数分野の調査を有する。
このような技術上周知の診断ツールを用いて小数のゲノム領域を迅速に検定することができる。PCRに基づく方法の実用上の利点は、小数の診断試験を行うため安価なことである。さらに、Q-PCRを日常的に用いて、ChIP ChipTM実験のアレイ結果を検証する。
本発明の特定の実施形態のさらなる非限定例として以下の実施例を提供する。
【実施例】
【００２０】
実施例1：インプリンティング遺伝子の発見及びモニタリングのためのChIP ChipTM
ゲノムのどの領域がインプリンティング遺伝子を含むか決定するため、出願人は、ChIP ChipTM実験を行って、好ましくは修飾されたヒストンマーカー、例えばAcK9H3；3MeK9H3；2MeK9H3；及びRNAポリメラーゼIIとの関連によって、重なっている開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーを有する領域を同定した。
要するに、ChIP ChipTMを実施するため、細胞を化学的に処理してDNA結合タンパク質をその結合部位に架橋させた。これらの細胞からDNAを単離し、断片化し、かつ問題の修飾されたヒストンとRNAポリメラーゼに向けられた抗体による免疫沈降で濃縮した(一般的に、Ng et al., Genes Dev. 16, 806-819 (2002); Wyrick et al., Science 290, 2306-2309 (2002); Weinmann, et al., Genes Dev. 16, 235-244 (2002)参照)。
次に、この濃縮集団をLM-PCRで増幅した。図1に示されるように、本方法は、特異的プライマーでPCRを行うことによって個々のDNA領域を増幅することに限定されない。どちらかといえば、技術上周知のライゲーション媒介(Ligation-Mediated)PCR(LM-PCR)戦略を用いて全ゲノムを増幅する。この増幅されたDNAを、LM-PCRに蛍光標識したヌクレオチドを含めることによって蛍光標識してよい。増幅されたDNAをランダムプライム法で標識してよく、この方法は、該ランダムプライミング反応中に標識化プライマーを使用するか又は蛍光プローブを組み入れる。次に、標識されたLM-PCR増幅DNA集団を、抗体を省いたコントロールと並行してDNAマイクロアレイ(ChIP ChipTM)にハイブリダイズする。このDNAマイクロアレイは、該ゲノムのすべて又はサブセット(例えば、染色体)を表す特徴を含む。非免疫沈降コントロールと比較したマイクロアレイ上の各特徴の蛍光強度は、該特徴上にあるDNA領域に問題のタンパク質が結合しているかを示す。
出願人は、長い(50-60-mer)オリゴ、高密度アレイを合成するためのMASマイクロアレイ技術の能力が、バックグラウンドから真のポジティブを区別するのに十分な信号対雑音比を保証し、かつ問題のゲノムの大きい領域の地図を作成する能力を保証することに注目する。これらのアッセイのプローブ能力は、40MBまでの研究者指定配列が高分解能の開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーを調査するのを可能にする。従って、本明細書で述べる方法は、全ゲノムにまたがったタンパク質-DNA相互関係(重なっている開いたクロマチンと閉じたクロマチン)の検出が可能である。本明細書で述べるこのゲノムワイド位置解析方法は、全ゲノムにまたがってインプリンティング遺伝子をモニタリングすることができる。
図2A及び2Bで与えられる結果は、開いたクロマチンマーカー(AcK9H3)と閉じたクロマチンマーカー(3MeK9H3)の両方と重なっている領域を含むプロットを示す。修飾されたヒストンマーカーに対する抗体を利用するクロマチン免疫沈降法を用いて、ゲノム内のインプリンティング遺伝子を同定できることを示す。この実験及び他の関連実験の結果は、転写制御の我々の理解を大きく増進するChIP ChipTMマイクロアレイ解析の可能性を実証する。さらに詳細には、本発明は、疾患の存在及び/又は疾患発症の危険性を示唆し得るインプリンティングの消失の診断スクリーニングとして役立ち得るインプリンティング遺伝子のゲノムワイド同定を可能にする。
【００２１】
実施例2：新規なインプリンティング遺伝子を同定するための高処理能力方法としてのサイレンスクロマチンマークと活性クロマチンマークの共起性のマイクロアレイ解析
出願人は、CpG島、つまりGCに富む配列が存在する場合と存在しない場合、個々の細胞型内の当該CpG島のメチル化状態とは関係なく、一連のマイクロアレイ実験を行って、同時発生的な「活性」及び「サイレント」クロマチンマーカーについて効率的にスクリーニングし、或いは同定した。
〔クロマチン免疫沈降〕
Farnham研究室から2005年12月12日に電子的に公開され、かつホームページ(http://genomecenter.ucdavis.edu/farnham/farnham/protocols/chips.html)で公然と利用可能な周知のChIPプロトコルを、Ren et al. (2000) Science. 290, pg. 2306の方法を基礎とするライゲーション媒介PCR法(LMPCR)と併用して(両方ともその全体が本明細書で援用される)、クロマチン免疫沈降法(ChIP)を培養HeLA細胞及び293細胞について行った。
該ChIP解析を行うための材料は商業的に入手可能だった。ヒストンH3(トリメチルK9)抗体(cat.# ab8898)及びCTCF抗体(cat.# ab10571)をAbcam Inc.(Cambridge, MA)から得、ヒストンH3(抗-アセチルK9,cat.# 07-352)をUpstate Biotechnologyから得た。
〔マイクロアレイの設計〕
上述したようなNimbleGenマスクレスアレイ合成技術に基づいて50-merタイル張りマイクロアレイを設計した。このマイクロアレイは、本明細書で援用したインプリンティング遺伝子のカタログ(Morison IM, Paton CJ, Cleverley SD. The imprinted gene and parent-of-origin effect database. Nucleic Acids Research 2001; 29(1): 275-276 or Morison IM, Ramsay JP, Spencer HG. A census of mammalian imprinting. Trends in Genetics 2005参照、及びURL: www.otago.ac.nz/IGCで公然と利用可能)の既知インプリンティングの大多数(80%)を包含した。本マイクロアレイは、未知のインプリンティング遺伝子を内部に持つと考えられるいくつかの領域(染色体6、7、11、13、14、16、18及び22)をも包含した。
〔データ解析〕
NimbleGen Systems(Madison, WI)によって開発されたSignalMapTMプログラムを用いてデータを解析した。SignalMapTMは、NimbleGenアレイデータの可視化を可能にするソフトウェアツールである。
〔結果〕
該染色体領域のマイクロアレイ解析は、本方法が、サイレントクロマチンマークと活性クロマチンマークの共起性を通じて、インプリンティング遺伝子のような後成的修飾を同定及びモニタリングするために有効であるという確証を与えた。かなりの割合のインプリンティング遺伝子は、CpG島(三重サイン)のトップでサイレントクロマチンと活性クロマチンの共起性を示すことに注意されたい。例えば、図1はPLAGL1遺伝子が典型的な三重サイン「インプリンティングサイン」を有することを示しており、このサインは、PLAGL1プロモーターのCpG島の位置における同時の活性(アセチル化K9)と不活性(トリメチルK9)を示唆している。
検査した第1の細胞系(HeLa子宮頚癌)では、60Mbのゲノムをスクリーニングし(2%)、43のインプリンティング遺伝子のうち5つがこの三重サインを示した。これは、単一の閾値と単一の細胞系を用いると、25倍を超える濃縮である。この数は、選択的閾値と追加の細胞系を用いると、実質的に増えると予測されるだろう。この予測は、インプリンティング遺伝子の組織特異性を考慮すれば真実なので、単一の細胞型内ですべてのインプリンティング遺伝子を見つけようとはしないだろう。現在、ゲノムスケールのインプリンティング遺伝子発見のための実行可能な方法はない。従って、特許請求した方法は、後成的修飾の効率的な同定及びモニタリングに非常に有用であろう。
本方法は、疾患と関連する後成的マークを有する遺伝子をも、たとえ該遺伝子がインプリンティングされていなくても同定する。このような遺伝子を推測的に同定するためのこの方法の代替法はない。マウス胚実験は費用がかかり、かつ厄介であり、全く働かないだろうからである。該遺伝子の例はN-mycであり(図2)、目立つ三重サイン、すなわちインプリンティングサインをも示した。NMYCはNMYCプロモーターのCpG島の位置における同時の活性(アセチル化K9)及び不活性(トリメチルK9)を実証する。チップの数を増やすことによって、Signal MapTMスクリーニングを容易に全ゲノムに拡張できることに留意されたい。
出願人は、この三重サイン特徴をも示すが、インプリンティングされていることが未知である、この60Mb領域内の4つの他の遺伝子をも同定した(下表1参照)。同定された遺伝子の1つはBAT2である(HLA-B関連転写物2)。図3は、典型的な「インプリンティングサイン」を有するBAT2を示し、BAT2がBAT2プロモーターのCpG島の位置において同時に活性(アセチル化K9)及び不活性(トリメチルK9)であることを示唆している。
【００２２】
表1
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【００２３】
本発明を用いて、細胞型内の遺伝子を活性又は不活性として分類し得ることも予測される。詳細には、出願人は、活性シグナルとCpG島の共起性を有するすべての遺伝子(活性遺伝子)を列挙する補充表と、不活性シグナルとCpG島の共起性を有する遺伝子(不活性遺伝子)に関するデータを一つにまとめた。
要するに、出願人は、高処理能力マイクロアレイアプローチを通じた「活性」及び「サイレント」クロマチンの解析法を利用して新規なインプリンティング遺伝子を見つけられることを実証した。インプリンティングの組織特異性のため、多数の組織について使用できる高処理能力方法を有する必要がある。従って、この発明を用いて、いずれのゲノムを介してもタイルを張る(tile)ことができ、かつ少なくとも1つのインプリンティング遺伝子を同定して、個体が特定疾患に対する素因を有するかを判定することができるだろう。
本明細書で引用した各文献は、その全体が本明細書で援用される。
この開示で述べた本発明の特定の適応は、当業者にとって日常的な最適化にかかわる問題であり、本発明の精神、又は添付の特許請求の範囲を逸脱せずに実施できるものと解釈される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のChIP ChipTM実験の実施に関連する工程の概略フローチャートを示す。
【図２Ａ】開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーの重なり領域を示すChIP ChipTM実験のプロットであり、第1トラックがAcK9H3マーカー、開いたクロマチンマーカーを示し、第3トラックが3MeK9H3マーカー、閉じたクロマチンマーカーを示す。
【図２Ｂ】開いたクロマチンマーカーと閉じたクロマチンマーカーの重なり領域を示すChIP ChipTM実験のプロットであり、第2トラックが3MeK9H3マーカー、閉じたクロマチンマーカーを示し、第3トラックがAcK9H3マーカー、開いたクロマチンマーカーを示す。
【図３】PLAGL1遺伝子の典型的「インプリンティングサイン」を示し、PLAGL1はPLAGL1プロモーターのCpG島の位置における同時活性(アセチル化K9)及び不活性(トリメチルK9)を実証する。
【図４】N-myc遺伝子の典型的「インプリンティングサイン」を示し、NMYCはNMYCプロモーターのCpG島の位置における同時活性(アセチル化K9)及び不活性(トリメチルK9)を実証する。
【図５】BAT2遺伝子の典型的「インプリンティングサイン」を示し、BAT2はBAT2プロモーターのCpG島の位置における同時活性(アセチル化K9)及び不活性(トリメチルK9)を実証する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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