(57)【要約】  本発明は、A3アデノシンレセプターの高レベルの発現に関連する病状態を治療するための医薬組成物の製造のための、抗A3アデノシンレセプター(A3AR)免疫グロブリンベースの分子の使用に関する。本発明はさらに、対象におけるA3アデノシンレセプターの高レベルの発現に関連する病状態を治療する方法を提供し、この方法は、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子のある量を前記対象に投与するステップを含み、この量は、病状態を治療または予防するのに有効なものである。最後に、本発明は、生理学的に許容可能な担体および抗A3AR免疫グロブリンベースの分子を含む、A3ARの高レベルの発現に関連する病状態を治療するための医薬組成物を提供する。
2009519236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
A3アデノシンレセプターの高レベルの発現に関連する病状態を治療するための医薬組成物の製造のための、抗A3アデノシンレセプター(A3AR)免疫グロブリンベースの分子の使用。
【請求項２】
前記抗A3AR免疫グロブリンベースの分子がポリクローナル抗体である、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記抗A3AR免疫グロブリンベースの分子がモノクローナル抗体(Mab)である、請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
前記抗A3AR免疫グロブリンベースの分子が、A3ARの3番目の細胞質ループに対して特異的である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記抗A3AR免疫グロブリンベースの分子が合成ペプチドに対して産生される、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
前記抗A3AR免疫グロブリンベースの分子がIgG抗体である、請求項1または2に記載の使用。
【請求項７】
前記抗A3AR免疫グロブリンベースの分子が、ab13161、H-80またはA3R31-Aから選択される抗A3AR抗体に類似した結合特性を有する、請求項1に記載の使用。
【請求項８】
前記病状態が、炎症状態、悪性腫瘍、神経変性障害、加速した骨吸収に関連した状態、良性過形成障害、乾癬およびドライアイから選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記炎症状態が、関節リウマチ、クローン病、変形性関節症、シェーグレン症候群から選択される、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
前記神経変性障害が多発性硬化症である、請求項8に記載の使用。
【請求項１１】
前記悪性腫瘍が、乳癌、結腸癌または黒色腫である、請求項8に記載の使用。
【請求項１２】
前記加速した骨吸収に関連した状態が骨粗鬆症である、請求項8に記載の使用。
【請求項１３】
対象におけるA3アデノシンレセプターの高レベルの発現に関連する病状態を治療する方法であって、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の量を前記対象に投与するステップを含み、前記量が、前記病状態を治療または予防するのに有効である、方法。
【請求項１４】
前記病状態が、炎症状態、悪性腫瘍、神経変性障害、加速した骨吸収に関連した状態、良性過形成障害、乾癬およびドライアイから選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症状態が、関節リウマチ、クローン病、変形性関節症、シェーグレン症候群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経変性障害が多発性硬化症である、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記悪性腫瘍が、乳癌、結腸癌および黒色腫から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記加速した骨吸収に関連した状態が骨粗鬆症である、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
生理学的に許容可能な担体および請求項1から7のいずれか一項に記載の抗A3AR免疫グロブリンベースの分子を含む、A3ARの高レベルの発現に関連する病状態を治療するための医薬組成物。
【請求項２０】
請求項8から12のいずれか一項に記載の状態を治療するための、請求項19に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療における抗A3アデノシンレセプター免疫グロブリンベースの分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の分野における技術水準を説明するのに適切と考えられる先行技術のリストを下記に示す。本明細書中では、下記リストの該当数字を括弧内に示すことによって、これらの参考文献を示すことがある。
【０００３】
Giタンパク質結合型の細胞表面レセプターであるA3アデノシンレセプター(A3AR)は、癌および炎症と闘うための標的として提起されている。このレセプターは種々の腫瘍細胞型で高度に発現されるが、隣接する正常組織では発現が低いことが示されている。特異的な合成アゴニストによるこのレセプターの活性化は、WntおよびNF-κBを含む下流のシグナル伝達経路の調節を誘導し、腫瘍成長の阻害を生じる(非特許文献1〜5)。
【０００４】
A3ARアゴニストは、関節リウマチおよびクローン病などの種々の実験的自己免疫モデルにおいて、炎症プロセスを緩和することによって抗炎症剤として作用することも示された(特許文献１、非特許文献6〜8)。
【０００５】
A3ARの発現レベルは、正常細胞と比較して癌細胞において上昇する(非特許文献9、10)。したがって、A3ARの発現レベルは、癌の診断のためのマーカーとして提起されてきた(特許文献2)。さらに、A3ARの発現レベルは、結腸直腸癌患者の末梢血細胞において上昇することも記載されている(非特許文献10)。
【特許文献１】米国特許出願第２００４０１６７０９４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４０１３７４７７号明細書
【特許文献１】WO2004/038419
【非特許文献１】Fishman P, Madi L, Bar-Yehuda S, Barer F, Del Valle L, Khalili K. Evidence for involvement of Wnt signaling pathway in IB-MECA mediated suppression of melanoma cells, Oncogene 21:4060-4064 (2002).
【非特許文献２】Fishman P., Bar-Yehuda S., Rath-Wolfson L., Ardon E., Barrer F., Ochaion A., Madi L. Targeting the A3 adenosine receptor for cancer therapy: inhibition of Prostate carcinoma cell growth by A3AR agonist. Anticancer Rex, 23:2077-2083 (2003).
【非特許文献３】Madi L., Bar-Yehuda S., Barer F., Ardon E., Ochaion A., Fishman P. A3 adenosine receptor activation in melanoma cells: association between receptor fate and tumor growth inhibition. J. Bio. Chem., 278:42121-42130 (2003).
【非特許文献４】Ohana, G., Bar-Yehuda S., Arich, A., Madi, L., Dreznick, Z., Silberman, D., Slosman, G., Volfsson-Rath L., Fishman, P. Inhibition of primary colon carcinoma growth and liver metastasis by the A3 adenosine receptor agonist IB-MECA. British J. Cancer., 89:1552-1558 (2003).
【非特許文献５】Fishman, P., Bar-Yehuda, S., Ohana G., Ochaion, A., Engelberg A., Barer F., Madi L. An agonist to the A3 adenosine receptor inhibits colon carcinoma growth in mice via modulation of GSK-3β and NF-κB. Oncogene, 23:2465-2471 (2004).
【非特許文献６】Szabo C., et al. Suppression of macrophage inflammatory protein (MIP)-1α production and collagen-induced arthritis by adenosine receptor agonists, British J. of Pharmacology, 125:379-387 (1998).
【非特許文献７】Mabley, J., et al. The adenosine A3 receptor agonist, N6-(3-iodobenzyl)-adenosine-5’-N-methyluronamide, is protective in two murine models of colitis. Europ. J. Pharmacology. 466:323-329 (2003).
【非特許文献８】Baharav E., et al. The effect of adenosine and the A3 adenosine receptor agonist IB-MECA on joint inflammation and autoimmune diseases models. Inter. J. Mol. Med. 10(supplement 1) page S104, abstract 499 (2002).
【非特許文献９】Madi L., Ochaion A., Rath-Wolfson L., Bar-Yehuda, S., Erlanger, A., Ohana G., Harish, A., Merimsik, O., Barer, F., Fishman, P. The A3 Adenosine Receptor is Highly Expressed in Tumor vs. Normal Cells: Potential Target for Tumor Growth Inhibition. Clinical Cancer Research, 10:4472-4479 (2004).
【非特許文献１０】Gessi, S. et al. Elevated expression of A3 adenosine receptors in human colorectal cancer is reflected in peripheral blood cells Clinical Cancer Research, 10:5895-5901 (2004).
【非特許文献１】Harlow et al. (1999)、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY
【非特許文献２】Harlow et al. (1989)、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York
【非特許文献３】Houston et al. (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883
【非特許文献４】Bird et al. (1988)、Science 242: 423-426
【非特許文献５】Orlandi, D. R. et al. (1989)、Proc Natl Acad Sci USA 86、3833-3837
【非特許文献６】Winter G. et al. (1991)、Nature 349、293-299
【非特許文献７】Kohler, G. et al. (1975)、Nature 256、495-497
【非特許文献８】Kozbor, D. et al. (1985)、J Immunol Methods 81、31-42
【非特許文献９】Cote, R. J. et al. (1983)、Proc Natl Acad Sci USA 80、2026-2030
【非特許文献１０】Cole, S. P. et al. (1984)、Mol Cell Biol 62、109-120
【非特許文献１１】Hanley, W. C. et al. (1995)、Review of Polyclonal Antibody Production Procedures in Mammals and Poultry、ILAR J 37(3)
【非特許文献１２】Harlow and Lane、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、New York (1988)
【非特許文献１３】Inbar et al. (1972)、Proc Natl Acad Sci USA 69、2659-62
【非特許文献１４】Whitlow and Filpula (1991)、Methods 2、97-105
【非特許文献１５】Pack et al. (1993)、Bio/Technology 11、1271-1277
【非特許文献１６】Larrick and Fry (1991)、Methods 2、106-110
【非特許文献１７】Antibody Fusion Proteins、Steven M.、Chamow (編者)、Avi Ashkenazi (編者) April 1999
【非特許文献１８】Jones et al. (1986)、Nature 321、522-525
【非特許文献１９】Riechmann et al. (1988)、Nature 332、323-329
【非特許文献２０】Presta (1992)、Curr Op Struct Biol 2、593-596
【非特許文献２１】Hoogenboom and Winter (1991)、J Mol Biol 227、381
【非特許文献２２】Marks et al. (1991)、J Mol Biol 222、581
【非特許文献２３】Cole et al. (1985)、「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」、Alan R. Liss編、77頁
【非特許文献２４】Boerner et al. (1991)、J Immunol 147、86-95
【非特許文献２５】Marks et al. (1992)、Bio/Technology 10、779-783
【非特許文献２６】Lonberg et al. (1994)、Nature 368、856-859
【非特許文献２７】Morrison (1994)、Nature 368、812-13
【非特許文献２８】Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnol 14、845-851
【非特許文献２９】Neuberger (1996)、Nature Biotechnol 14、826
【非特許文献３０】Lonberg and Huszar (1995)、Intern Rev Immunol 13、65-93
【非特許文献３１】DeVita, Jr. V.、Hellman S.、Rosenberg AS. CANCER Preinciple & Practice of Oncology. Vol1&2 Lippincott - Raven PUBLISHERS、Philadelphia、New York. 1997
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗A3AR抗体が腫瘍成長の阻害および腫瘍転移発生の予防に有効であることを示した、in vitroおよびin vivoの実験に基づく。
【０００７】
さらに、抗A3AR抗体は、WntおよびNF-κBのシグナル伝達経路に関与するタンパク質のレベルを調節することが現在示されており、これらのシグナル伝達経路は共に、癌または自己免疫性炎症疾患などの細胞の過剰増殖によって特徴付けられる疾患の病理に重要な役割を果たす。癌細胞および炎症細胞の特徴的な性質の中には、A3ARの過剰発現もある(非特許文献9〜10)。したがって、本発明によれば、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、癌、炎症およびこのレセプターの発現上昇に関連する他の様々な病状態を治療するために使用できる。
【０００８】
したがって、本発明は、A3ARの過剰発現に関連する病状態を治療または予防するための医薬組成物の製造における、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の使用を提供する。
【０００９】
本発明はまた、ある量の抗A3AR免疫グロブリンベースの分子を活性成分として含む医薬組成物を提供し、この量は、A3ARの過剰発現に関連する病状態を治療または予防するのに有効なものである。
【００１０】
なおさらに、本発明は、A3ARの過剰発現に関連する病状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、ある量の抗A3AR免疫グロブリンベースの分子を提供するステップを含み、この量は、上記状態を治療または予防するのに有効なものである。
【００１１】
本発明に従って治療可能な病状態としては、自己免疫障害(例えば、関節リウマチおよびクローン病、変形性関節症、シェーグレン症候群);乾癬;神経変性障害(例えば、アルツハイマー病および多発性硬化症);固形癌およびリンパ腫を含む癌、またはドライアイに関連する状態が含まれるがこれらに限定されず、これらは全て、その病状態に関連する病的細胞上のA3ARの発現の異常な増加(過剰発現)を示す。
【００１２】
抗A3AR免疫グロブリンベースの分子には、以下にさらに詳述する、抗A3AR抗体、その免疫学的フラグメント、ならびに、別の分子実体にコンジュゲートまたは融合した、前記抗体またはフラグメントを含む融合分子またはコンジュゲートが含まれる。
【００１３】
本発明を理解するためおよび本発明を如何に実施し得るかを理解するために、好ましい実施形態を、非限定的な例としてのみ、添付の図面を参照して本明細書に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、A3アデノシンレセプターの高レベルの発現に関連する病状態の治療のために使用される。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、用語「抗A3AR免疫グロブリンベースの分子」は時に、短縮した用語「A3AR抗体」と相互交換可能に本明細書中で使用され、A3AR抗原決定基と結合することが可能な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含む分子を意味する。抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、それらの免疫学的フラグメントであり得る。抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、免疫グロブリン産生B細胞を不死化し、産生されたモノクローナル抗体を回収することによって、免疫した動物から得てもよく、あるいは、合成手段または組換え手段によって得てもよい。抗A3AR免疫グロブリンベースの分子はまた、時に、免疫学的フラグメントとタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの融合パートナーとの間の融合タンパク質であり得る。本発明の抗体は、A3AR抗体の免疫学的フラグメントを含む、当技術分野で公知(非特許文献１１; 非特許文献１２; 非特許文献１３; 非特許文献１４)の二価抗体分子全体、一価Fabフラグメント、二価F(ab')2および化学的に形成されたキメラ抗体を含む多くの形態で存在し得る。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫学的フラグメント」とは、A3AR抗原決定基と結合することが可能な抗体の機能的フラグメントをいう。適切な免疫学的フラグメントは、例えば、免疫グロブリン軽鎖(「軽鎖」)の相補性決定領域(CDR)、免疫グロブリン重鎖(「重鎖」)のCDR、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Fdフラグメント、ならびに軽鎖および重鎖両方の可変領域の本質的に全体を含む免疫学的フラグメント(例えば、Fv、単鎖Fv、Fab、Fab'およびF(ab')2)であり得る。
【００１７】
用語「抗原決定基」は、この抗原決定基に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得るタンパク質上の領域(単数または複数)を示すために本明細書で使用される。抗原決定基は、インタクトな抗原(即ち、免疫応答を惹起するために使用される免疫原)と、抗体への結合について競合し得る。抗原決定基は典型的に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元的な構造的特徴ならびに特定の荷電特徴を有する。本発明の文脈において、用語「抗原決定基」とは具体的に、A3AR上の領域(単数または複数)(エピトープ)をいう。
【００１８】
抗体は、モノクローナル抗体(Mab)であってもポリクローナル抗体であってもよい。抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)を生成する方法は当技術分野で周知であり、抗体分子のin vivo産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング(非特許文献１５; 非特許文献１６)または培養物中の持続性の細胞株によるモノクローナル抗体分子の生成が含まれるがこれらに限定されない。後者には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタインバーウイルス(EBV)ハイブリドーマ技術が含まれるがこれらに限定されず、これらは当技術分野で周知である(非特許文献１７; 非特許文献１８; 非特許文献１９;および非特許文献２０)。
【００１９】
単一エピトープ特異性を提供するモノクローナル抗体は典型的に、研究対象である物質で免疫した動物から得た細胞株またはクローンによって産生される。所望のmAbを産生するために、細胞は2つの方法、適切に準備したマウスの腹腔内への注射またはプラスチックフラスコ中での細胞の組織培養のいずれかによって増殖させる必要がある。
【００２０】
ポリクローナル抗体は複数の特異性を提供し、それらの産生手順もまた当業者に公知である。一般に、ポリクローナル抗体は、免疫原上の異なるエピトープでの免疫に応答してin vivoで産生される。抗血清は、アジュバント(免疫応答の非特異的増強剤)と共に抗原を複数回注射することによって、広範な動物において惹起し得る。多くの小分子即ちハプテンについては、担体タンパク質(ヘルパーT細胞によって認識される決定基を提供する)が、種々の二官能性カップリング試薬を介したコンジュゲートに必要である。反復免疫すると、産生される抗体は主に、かなり高い親和性を有するIgGである。ポリクローナル抗体を産生するための手順の概説は、例えば、非特許文献２１中に見出される。
【００２１】
免疫学的フラグメントは、当技術分野で周知の方法を使用して得ることができる(例えば、非特許文献２２を参照のこと)。例えば、免疫学的フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解、またはこのフラグメントをコードするDNAのE.coliもしくは哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養物または他のタンパク質発現系)における発現によって調製できる。
【００２２】
あるいは、免疫学的フラグメントは、従来の方法により抗体全体をペプシンまたはパパインで消化することによって得ることができる。(Fab')2免疫学的フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され、5Sフラグメントを提供することができる。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断することができ、任意選択でスルフヒドリル基のための保護基がジスルフィド結合の切断から生じて、3.5SのFab'一価フラグメントを生成する。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断は、2つの一価Fab'フラグメントおよび1つのFcフラグメントを直接生成する。そのフラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原決定基に結合する限り、抗体を切断する他の方法(例えば、一価軽鎖-重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術)もまた使用し得る。
【００２３】
さらに、Fvは対になった重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン(非共有結合であり得る結合(例えば、非特許文献２３)からなるので、これらの可変ドメインは、分子間ジスルフィド結合によって連結されて単鎖Fvを生成し得るか、あるいは、このような鎖は、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋し得る。
【００２４】
単鎖Fvは、ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによって接続された重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによっても調製し得る。この構造遺伝子を発現ベクター中に挿入し、この発現ベクターは次いでE.coliなどの宿主細胞中に導入する。組換え宿主細胞は、2つの可変ドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。単鎖Fvを産生するための充分なガイダンスは当技術分野の文献(例えば、非特許文献２４; 非特許文献１４; 非特許文献２５)中に提供される。
【００２５】
単離されたCDRペプチドは、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のmRNAのRT-PCRによって調製し得る。このような方法を実施するための充分なガイダンスは、当技術分野の文献(例えば、非特許文献２６)中に提供される。
【００２６】
抗体融合タンパク質、即ちキメラ抗体もまた、例えばヒト化抗体を形成するために使用し得る（非特許文献２７）。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形態は、遺伝子操作されたキメラ抗体または非ヒト抗体由来の(好ましくは最小の)部分を有する免疫学的フラグメントであり得る。「ヒト化抗体」には、ヒト抗体(レシピエント抗体)のCDRが非ヒト種(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)(ドナー抗体)のCDR由来の残基で置換された、所望の官能性を有する抗体が含まれる。ある例では、ヒト抗体のFvフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基で置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインを含み、ここで、CDRの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のCDRに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが、適切なヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒト抗体由来の、Fc領域などの抗体定常領域の少なくとも一部もまた含む(例えば、非特許文献２８; 非特許文献２９;および非特許文献３０を参照のこと)。実際に、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり得、ここで、いくつかの相補性決定領域の残基およびおそらくいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体中の類似部位由来の残基で置換されている。
【００２７】
ヒト化抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の種々の技術を使用して産生し得る(非特許文献３１; 非特許文献３２; 非特許文献３３; 非特許文献３４)。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列を、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって作製し得る。抗原チャレンジの際、ヒト抗体産生がこのような動物中で観察され、これは全ての局面(遺伝子再編成、鎖のアセンブリおよび抗体レパートリーが含まれる)においてヒトで見られるものと非常に類似している。このようなアプローチを実施するための充分なガイダンスは、当技術分野の文献(例えば、非特許文献３５; 非特許文献３６; 非特許文献３７; 非特許文献３８; 非特許文献３９;ならびに非特許文献４０)中に提供される。
【００２８】
一実施形態によれば、抗体または抗体の免疫学的フラグメントは、免疫グロブリンG(IgG)抗体またはフラグメントである。
【００２９】
本発明のなお別の実施形態によれば、A3AR抗体は、好ましくは合成ペプチドに対して産生された、ポリクローナル抗体である。
【００３０】
本発明に従って利用される抗A3アデノシンレセプター(A3AR)免疫グロブリンベースの分子は、公知の(以下を参照のこと)抗A3AR抗体の結合特性に類似したA3ARに対する結合特性を有する分子である。用語「結合特性」とは、公知の抗A3AR抗体の結合特性と類似した、A3AR抗原決定基に対するA3AR免疫グロブリンベースの分子の結合特異性をいう。
【００３１】
A3AR抗原決定基に対するA3AR免疫グロブリンベースの分子の結合特性、即ちエピトープに対する特異性は、容易に利用可能で当業者に公知の種々の技術によって決定し得る。最も一般的な技術は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA、I125などの放射性同位体を使用する)または蛍光ベースのイムノアッセイからなる。他の技術には、ゲル免疫電気泳動(例えばウエスタンブロット)および凝集が含まれる。
【００３２】
一実施形態によれば、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、H-80抗体(sc-13938、Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルス)である、本発明で利用されるウサギポリクローナルIgG抗体の結合特性と類似した結合特性(特異性)を有する。
【００３３】
別の実施形態によれば、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、A3R31-A (Alpha Diagnostic International、米国テキサス州サンアントニオから購入した)の結合特性と類似した結合特性を有する。
【００３４】
抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、このレセプターの発現上昇に関連した病状態の治療または予防において有利な治療的効果を有する。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」とは、病理学的状態に対する所望の生化学的効果、好ましくは治療効果を達成するのに有効な様式でA3ARに結合する、本明細書中に規定される抗体またはその免疫学的フラグメントの治療有効量を投与することをいう。A3ARの過剰発現がそのような病理学的状態において示されているので、所望の効果には、癌細胞または炎症細胞(例えば、関節リウマチの場合)などの細胞増殖の阻害を含み得るがそれに限定されない。
【００３６】
したがって、例として、この病状態が癌である場合、治療とはとりわけ、腫瘍細胞の成長および増殖の阻害または減少をいい、原発性腫瘍の成長の停止、癌関連の死亡率の低下、癌関連の死亡の遅延(腫瘍サイズの減少または個体の身体からの腫瘍の完全な排除を生じ得る)、転移性腫瘍の発生率の低下、または個体において出現する転移性腫瘍の数の減少が含まれる。
【００３７】
さらに、例として、治療すべき病状態として炎症状態(例えば、炎症障害および自己免疫障害)をいう場合、治療とは、炎症状態に関連する所望されない症状の緩和、そのような症状が発生する前の症状の顕在化の予防、炎症状態の進行の減速、炎症状態に関連する症状の増悪の減速、炎症状態の慢性段階によって引き起こされる非可逆的損傷の減速、重症度の低減または炎症状態の治癒、生存率の改善あるいはこのような炎症状態からのより迅速な回復をいう。
【００３８】
本発明の文脈において、用語「治療」はまた、「予防的処置」、即ち、病状態の発生の予防または慢性的疾患である個体における病状態の急性期の再発の予防をいうことに留意すべきである。
【００３９】
癌および炎症状態(例えば、炎症障害または自己免疫障害)などの多数の病状態が、病的細胞上でのA3ARの高レベルの発現に関連する。
【００４０】
用語「病的細胞」とは、異常な挙動または表現型を示し、その病状態に関連した細胞(例えば、癌における癌細胞または炎症における炎症細胞)をいう。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、用語「高レベル」は、正常細胞における発現と比較して有意により高いレベルのレセプターの発現を意味すると理解すべきである。高レベルは、コントロールレベルと比較することによって決定でき、このコントロールレベル(参照標準)は、正常細胞(例えば健康な対象中の)におけるA3AR発現のレベルである。時に、1つまたは複数の参照標準(例えば、正常状態を示す1つの参照標準および病状態を示す別の参照標準)と平行して患者由来のアッセイサンプルを試験することによって、発現レベルを決定することが有用であり得る。次いで、正常レベル対上昇(即ち疾患)レベルの発現を示す尺度が作成され得、疾患組織または正常組織を決定する際の参照として使用される。
【００４２】
本発明に従って治療し得る病状態の非限定的な例は、炎症状態または疾患;神経変性障害;加速した骨吸収に関連する状態;悪性腫瘍;または良性の過形成状態である。
【００４３】
用語「炎症状態」とは、徴候の1つが炎症の提示である任意の状態をいう。炎症は、病状態の根本的な原因であり得るか、またはその状態の根本である別の生理学的プロセスの結果であり得る。この用語は、免疫により誘導される病理(例えば自己免疫障害)を含む、活性な炎症または無症候性の炎症の任意の状態をいう。炎症は炎症疾患に起因し得るか、あるいはいくつかの他の型の疾患または障害の副作用であり得る。A3ARを過剰発現する病的細胞は、関節炎症(関節リウマチ、変形性関節症)の場合における滑膜細胞および骨形成に関連する細胞、リンパ球、好中球、樹状細胞およびマクロファージなどの種々の免疫細胞であり得る。
【００４４】
以下は、本発明に従って治療し得る自己免疫疾患の非限定的な例である:以下は、本発明に従って治療し得る自己免疫疾患の非限定的なリストである:熱帯性痙性不全対麻痺症、急性壊死性出血性白質脳炎、傍腫瘍、橋本病、分娩後甲状腺炎、限局性甲状腺炎、若年性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、I型(インスリン依存性)糖尿病、アジソン病、下垂体炎、自己免疫性尿崩症、副甲状腺機能低下症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡/妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、後天性表皮水疱症、多形性紅斑、ヘルペスゲスタトニス(Herpes gestatonis)、白斑症、慢性蕁麻疹、円盤状エリテマトーデス、汎発性脱毛症/円形脱毛症、乾癬、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、慢性活動性肝炎/原発性胆汁性肝硬変合併、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少紫斑病、エバンス症候群、ヘパリン起因性血小板減少症、原発性自己免疫性好中球減少症、乳児期の自己免疫性(原発性)好中球減少症、骨髄移植後の自己免疫性好中球減少症、後天性自己免疫性血友病、自己免疫性胃炎および悪性貧血、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患(IBD)、唾液腺炎、自己免疫性早期卵巣機能不全、無精子症、性腺機能低下症、精子自己抗体に関連する男性不妊症、自己免疫性精巣炎、早期卵巣機能不全、自己免疫性卵巣炎、ブドウ膜炎、網膜炎、交感性眼炎、散弾網脈絡膜症、フォークト-小柳-原田肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体誘発性ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、先天性心ブロック(新生児ループス)、シャーガス病、アドリアマイシン心毒性、ドレスラー心筋炎症候群、気管支喘息、間質性線維化肺疾患、急速進行性糸球体腎炎、自己免疫性尿細管間質性腎炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、抗リン脂質症候群、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、フェルティ症候群、大顆粒性リンパ球増多症(LGL)、シェーグレン症候群、全身性硬化症(強皮症)、クレスト症候群、混合性結合組織疾患、多発性筋炎/皮膚筋炎、グッドパスチャー病、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグストラウス症候群、ヘノッホシェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、結節性動脈周囲炎、ベーチェット症候群、アテローム硬化症、側頭(巨)細胞性動脈炎、高安動脈炎、川崎病、強直性脊椎炎、ライター病、スネドン
症候群、自己免疫性多腺性内分泌不全症、カンジダ症-外胚葉ジストロフィー、本態性クリオグロブリン血管炎、皮膚白血球破壊性血管炎、ライム病、リウマチ熱およびリウマチ性心疾患、好酸球性筋膜炎、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、POEMS症候群(多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、Mスポットおよび皮膚変化)、再発性多発性軟骨炎、自己免疫性リンパ球増殖症候群、TINU症候群(急性尿細管間質性腎炎およびブドウ膜炎)、分類不能型免疫不全症、TAP(抗原提示に関連するトランスポーター)欠損症、オーメン症候群、高IgM症候群、BTK無ガンマグロブリン血症、ヒト免疫不全ウイルスおよび骨髄移植後。
【００４５】
好ましい実施形態によれば、本発明に従って治療される炎症状態は、関節リウマチ、クローン病および大腸炎(集合的にIBD-炎症性腸疾患と呼ぶ)および糖尿病から選択される自己免疫性炎症疾患である。
【００４６】
本発明に従う病状態はまた、神経変性障害であり得る。用語「神経変性障害」は、その系の機能不全を生じる神経系の異常な変性をいうために使用される。これには、神経機能における任意のパラメータ関連の減少によって示される、漸進的で一般に容赦のない、神経系の構造的要素の進行性の消耗、例えば、運動の低下、発声の低下、認知機能の低下(特に学習および記憶)異常な四肢-抱擁反射、網膜萎縮症、吊下がりテストに成功できないこと、MMP-2レベルの増大、神経原線維変化レベルの増大、タウのリン酸化の増大、タウフィラメント形成、異常な神経形態、リソソーム異常、ニューロン変性、神経膠症および脱髄が存在する一群の状態が含まれる。本発明の好ましい実施形態に従って治療される神経変性障害は、多発性硬化症(MS)である。
【００４７】
本発明に従う病状態はまた、「加速した骨吸収に関連する状態」であり得る。このような状態には、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼ周囲の骨喪失、変形性関節症または骨溶解、および悪性腫瘍の高カルシウム血症が含まれるがこれらに限定されない。これらの障害の最も一般的なものは骨粗鬆症であり、これは、その最も高頻度の出現で、産後の女性および異なる癌性疾患(例えば、乳癌および前立腺癌)で生じる。骨吸収および骨喪失に関連する障害は慢性状態なので、適切な治療は一般に長期の治療を必要とすると考えられる。
【００４８】
本発明に従う病状態はまた、悪性腫瘍であり得る。用語「悪性腫瘍」は、A3ARを過剰発現する標的細胞が腫瘍細胞である疾患をいうために使用され、これには、固形腫瘍ならびにリンパ腫または白血病を含む血液腫瘍が含まれる。
【００４９】
用語「固形腫瘍」とは、癌腫、肉腫、腺腫およびニューロン起源の癌、事実上、造血細胞起源でない任意の型の癌をいい、特に以下に関する:癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋内皮肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、神経芽細胞腫、子宮内膜の癌、ならびに上記の全ての転移(以前の研究（非特許文献４１）において、A3ARの発現の増大が原発性腫瘍部位だけでなくその転移においても見出し得ることが示されているため(特許文献３))。
【００５０】
好ましい実施形態によれば、癌は乳癌または前立腺癌である。
【００５１】
本発明に従う病状態はまた、腺腫、良性前立腺過形成、およびA3ARの過剰発現にも関連し、したがってそれ自体本発明に従う治療に役立つ他の状態などの、「良性過形成状態」であり得る。
【００５２】
A3AR抗体は、生理学的に許容可能な担体または賦形剤と組み合わせて使用し得、医薬組成物を形成する。本発明の「医薬組成物」の目的は、活性成分としてのA3AR抗体またはその免疫学的フラグメントの、それを必要とする個体への投与を促進することである。
【００５３】
医薬品として使用する場合、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は通常、医薬組成物の形態で投与されて、それを必要とする個体への抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の投与を促進する。本発明はまた、1種または複数の医薬的に許容可能な担体または賦形剤と共に、活性成分として1種または複数の本明細書中に規定される抗A3AR免疫グロブリンベースの分子を含む医薬組成物を含む。使用される賦形剤は典型的に、ヒト対象または他の動物への投与に適したものである。本発明の組成物を作製する際、活性成分は通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤によって希釈されるか、またはカプセル、サシェ、紙もしくは他の容器の形態であり得る担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として作用する場合、これは、活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する、固体、半固体または液体の物質であり得る。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液、シロップ剤、エアロゾル(固体としてまたは液体媒体中で)、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液ならびに滅菌包装された粉末の形態であり得る。
【００５４】
適切な賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが含まれる。製剤はさらに以下を含み得る:タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などの滑沢剤;湿潤剤;乳化剤および懸濁剤;安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルなどの防腐剤;甘味剤;ならびに香味料。本発明の組成物は、当技術分野で公知の手順を使用することによって、患者への投与後に活性成分の迅速な放出、徐放または遅延放出を提供するように製剤化し得る。
【００５５】
医薬組成物およびその単位剤形中の抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の量は、特定の適用、導入の様式、特定の分子の効力、および所望の濃度に広く依存して変動または調節し得る。用語「単位剤形」とは、ヒト対象および他の哺乳動物のための単一の投薬量として適切な物理的に別個の単位をいい、各単位は、適切な医薬的賦形剤と共に、所望の治療効果を生じるように計算された活性物質の所定の量を含む。
【００５６】
抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、広い投薬量範囲にわたって有効であり、医薬的有効量で一般に投与される。しかし、実際に投与される分子の量は、関連する状況(治療すべき状態、選択された投与経路、投与される実際の分子、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含む)を考慮して、医師によって決定されることが理解されよう。
【００５７】
好ましくは、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、滅菌生理食塩水溶液などの適切な不活性な担体中に、非経口投与のために製剤化し得る。投与する用量は投与経路によって決定されよう。好ましい投与経路には、非経口投与または静脈内投与が含まれる。治療有効用量は、有意な治療応答(例えば、抗炎症、抗癌などの応答)を生じるのに有効な用量である。
【００５８】
静脈内製剤による抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の投与は、医薬産業で周知である。静脈内製剤は、単に治療的な抗A3AR免疫グロブリンベースの分子が可溶性である組成物であることとは別に、特定の品質を有するべきである。例えば、製剤は、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子ならびに存在する場合には他の活性成分(単数または複数)の全体の安定性を促進すべきであり、また、この製剤の製造はコスト効率がよくなければならない。これらの全ての因子が最終的に、静脈内製剤の全体的な成功および有用性を決定する。
【００５９】
抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の医薬製剤中に含まれ得る他の補助的添加剤は以下のとおりである:溶媒:エタノール、グリセロール、プロピレングリコール;安定剤:EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、クエン酸;抗菌防腐剤:ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン;緩衝剤:クエン酸/クエン酸ナトリウム、酒石酸水素カリウム、酒石酸水素ナトリウム、酢酸/酢酸ナトリウム、マレイン酸/マレイン酸ナトリウム、フタル酸水素ナトリウム、リン酸/リン酸二水素カリウム、リン酸/リン酸水素二ナトリウム;および張度調節剤:塩化ナトリウム、マンニトール、デキストロース。
【００６０】
緩衝剤の存在は、約4〜約8の範囲内、より好ましくは約4〜約6の範囲内の水溶液のpHを維持するために必要である。緩衝剤系は一般に、弱酸およびその可溶性の塩(例えば、クエン酸ナトリウム/クエン酸);または二塩基性酸のモノカチオン塩もしくはジカチオン塩(例えば、酒石酸水素カリウム;酒石酸水素ナトリウム、リン酸/リン酸二水素カリウム、およびリン酸/リン酸水素二ナトリウム)の混合物である。
【００６１】
使用される緩衝剤系の量は、(1)所望のpHおよび(2)薬物の量に依存する。一般に、使用する緩衝剤の量は、4〜8の範囲内のpHを維持するために、0.5:1〜50:1の製剤の緩衝剤:アレンドロネートのモル比(緩衝剤のモル数を、緩衝剤成分(例えば、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸)の合わせたモル数とした場合)であり、一般には、存在する薬物に対して緩衝剤(合わせたもの)の1:1〜10:1のモル比が使用される。
【００６２】
さらに、望まれない副作用(例えば、悪心または下痢)およびおそらくは付随する血液障害を導く静脈内製剤の投与の際の赤血球の膨潤または収縮を回避するために、ヒト血液と同じ値に張度を調節するための薬剤(例えば、約1〜8mg/mlの量の塩化ナトリウム)の存在が必要とされることがある。一般に、製剤の張度は、282〜288mOsm/kgの範囲のヒト血液の張度と一致し、一般には285mOsm/kgであり、これは塩化ナトリウムの0.9%溶液に対応する浸透圧と等価である。
【００６３】
静脈内製剤は、直接的静脈内注射、腹腔内ボーラスによって投与し得るか、または0.9%塩化ナトリウム注射溶液もしくは他の適合性の注入溶液などの適切な注入溶液への添加によって、注入によって投与し得る。
【００６４】
抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、その分子の徐放を可能にするような様式で製剤化し得る徐放形態、例えば、デポー注射、インプラント製剤またはオスモティックポンプで投与し得る。徐放製剤のためのインプラントは当技術分野で周知である。インプラントには、生分解性または非生分解性のポリマーを用いてミクロスフェア、スラブとして製剤化し得るがこれらに限定されない。例えば、乳酸および/またはグリコール酸のポリマーは、宿主によって充分許容される腐食性のポリマーを形成する。インプラントは、分子の局所濃度が身体の残りの部分と比較してタンパク質沈着の部位(例えば、神経変性障害に関連するアミロイド沈着の形成の部位)で増大するように、その部位の近位に配置される。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスなどによって、製造し得る。適切な製剤はとりわけ、選択された投与経路に依存する。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、所望の場合、FDAに承認されたキットなどのパックまたはディスペンサー装置中に存在し得、これは示された状態の治療のためにラベル付けされてもよい。
【００６７】
抗A3AR免疫グロブリンベースの分子は、病状態を有するか病状態を発症する素質のある対象を治療するために使用する。この目的のために、対象に、ある量(有効量)のA3AR抗体またはその免疫学的フラグメントを投与し、この量は、病状態の発症を治療または予防するのに有効なものである。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、用語「対象」は哺乳動物をいい、より好ましくはヒトをいう。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、句「〜を有するか〜を発症する素質のある」とは、病状態を有するかもしくはその症状を示すことが決定された対象を記述するか、または、例えば遺伝的要因、有害物質への曝露などに起因して、病状態を発症する素質がある対象を記述する。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」は、治療される対象の病状態の症状を予防、緩和もしくは寛解するか、またはその生存を延長するのに有効な抗体もしくは免疫学的フラグメントの量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示を考慮すれば、充分に当業者の能力の範囲内である。一般に、投与すべき抗体または免疫学的フラグメントの量は、治療される対象、苦痛の重症度、投与様式、処方する医師の判断および他の因子に依存するであろう。有効量は典型的に、適切な用量設定臨床研究によって決定される。有効用量を決定する様式は、臨床開発の分野の当業者の技術水準の範囲内である。
【００７１】
治療すべき状態の重症度および応答性に依存して、投薬は、数日間から数週間まで続く治療過程での、または治癒がもたらされるか疾患状態の減少が達成されるまでの、単一または複数の投与であり得る。投薬スケジュールは典型的に、抗A3AR免疫グロブリンベースの分子の薬力学的(PK)特性に基づいて決定される。このようなPKを決定する様式もまた、臨床開発の当業者の技術範囲内である。時に、抗体が数週間にわたって体内に留まり得ることが知られている。したがって、投薬スケジュールは、とりわけ抗体の半減期(t1/2)に依存して、1日1回または数回の用量から、数日間に1回、1週間に1回、数週間に1回、さらに数カ月に1回までであり得る。
【００７２】
本明細書の明細書および特許請求の範囲を通じて、単数形「1つの(「a」、「an」および「the」)」は、文脈が明確にそれ以外を示さない限り複数形の言及を含む。したがって、例えば「1つの(「an」)抗体」に関する言及は、当業者に公知の1つまたは複数の抗体およびその等価物に対する言及である。本明細書の明細書および特許請求の範囲を通じて、複数形の語も同様に、文脈が明確にそれ以外を示さない限り単数形の言及を含む。したがって、例えば「抗体(複数)」に対する言及は、当業者に公知の1つの抗体またはその等価物に対する言及である。
【００７３】
なお、本明細書の明細書および特許請求の範囲を通じて、語「含む(comprise)」および「含む(contain)」ならびにこれらの語の変形、例えば、「含む(comprising)」および「含む(comprises)」は、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味し、他の部分、添加物、成分、整数またはステップを排除することを意図しない(および排除しない)。
【００７４】
本発明を、非限定的な実施例によってここに記載する。
【００７５】
いくつかの例示的実施形態の記載
【００７６】
（実施例１）
A3アデノシンレセプター(A3AR)抗体によるA3ARの活性化は抗腫瘍効果を誘導する
材料および方法
細胞培養:
B16-F10-マウス黒色腫細胞(10%ウシ胎仔血清(FBS)、200mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地中、37℃、5%CO2インキュベータで維持した);
BxPC3-ヒト膵癌細胞(4.5%グルコース、10%ウシ胎仔血清(FBS)、200mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン、1.5gm/L炭酸水素ナトリウム、10mM Hepes緩衝液、1.0mMピルビン酸ナトリウムを補充したRPMI 1640培地中、37℃、5%CO2インキュベータで維持した);
LnCap-ヒト前立腺癌細胞(10%ウシ胎仔血清(FBS)、200mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地中、37℃、5%CO2インキュベータで維持した)。
【００７７】
全ての細胞培養物は、1週間に2回新たに調製した培地に移した。
【００７８】
A3AR抗体-2種の抗体を以下の実施例において使用した:(1)H-80(SC-13938)(Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルスから購入)、ウサギポリクローナル抗ヒト抗体、LnCapおよびBXPC3ならびにヒトFLSでの実験に使用;(2)A3R31-A(ALPHA DIAGNOSTIC INTERNATIONAL、米国テキサス州サンアントニオから購入)、ポリクローナルウサギ抗ラット抗体、ラットFLSおよびB16-F10におけるin vitroおよびin vivoの研究において使用した。
【００７９】
チミジン取り込みアッセイ:
3[H]-チミジン取り込みアッセイを使用して、B16-F10、BxPC3またはLnCap細胞の増殖に対するA3AR抗体(H-80、サンタクルス)の影響を評価した。これらの細胞を、一晩血清枯渇させ、次いで5×104/mlの細胞を、種々の濃度のA3AR抗体の存在下、96ウェルのマイクロタイタープレート中で24時間、1%のFBSを補充した増殖培地中でインキュベートした。インキュベーションの最後の18時間にわたり、各ウェルを1μCiの3[H]-チミジンでパルスした。細胞を回収し、3[H]-チミジン取り込みをLKB液体シンチレーションカウンター(LKB、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)で決定した。
【００８０】
ウエスタンブロット分析:
脚抽出物のウエスタンブロット分析(WB)を以下のプロトコルに従って実施した。サンプルを氷冷PBSですすぎ、氷冷溶解緩衝液(TNN緩衝液、50mM Tris緩衝液(pH=7.5)、150mM NaCl、NP 40)に移した。細胞細片を7500×gで10分間の遠心分離によって除去した。タンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ色素試薬を使用して決定した。等量のサンプル(50μg)を、12%のポリアクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGEで分離した。次いで、分解されたタンパク質をニトロセルロースメンブレン(Schleicher & Schuell、米国ニューハンプシャー州キーン)上にエレクトロブロットした。メンブレンを1% BSAでブロッキングし、所望の一次抗体(希釈1:1000)と共に4℃で24時間インキュベートした。次いでブロットを洗浄し、二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。バンドをBCIP/NBT発色キット(Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)を使用して記録した。異なる図中に示したデータは、少なくとも4つの異なる実験の代表である。
【００８１】
マウス黒色腫肺転移モデル:
A3AR抗体の効果をin vivoで試験するために、マウス黒色腫肺転移モデルを利用した。B16-F10黒色腫細胞(250μlのPBS中、2.5×105細胞)を、オスC57BL/6Jマウスの尾静脈に静脈内注射した。A3AR抗体(1μg/kg)を、腫瘍接種の24時間後に腹腔内投与した。14日後、肺を取り出し、肺転移病巣を両眼下で計数した。
【００８２】
結果
A3AR抗体のin vitro効果:
チミジン取り込みに対するA3AR抗体のin vitro効果を、上記の3つの異なる細胞株で試験した。
【００８３】
図1A〜1Cは、B16-F10黒色腫細胞、BxPC3膵癌細胞またはLnCapヒト前立腺癌細胞の増殖培地へのA3AR抗体の添加が、これらの細胞の増殖を阻害したことを示す。
【００８４】
さらに、A3アデノシンレセプターのシグナル伝達経路におけるA3AR抗体の効果を決定した。この目的のために、0.005μg/mlのA3AR抗体で処理したLnCapヒト前立腺癌細胞由来のタンパク質抽出物を試験した。LnCapヒト前立腺癌細胞のタンパク質プロファイルが図2A〜2G中に示され、この図から、A3ARタンパク質発現レベルのダウンレギュレーションならびにWntおよびNF-κBのシグナル伝達経路に関与するタンパク質の発現レベルの調節が明らかである。PKB/AktおよびNF-κBのレベルがダウンレギュレートされ、これは、NF-κBシグナル伝達経路の阻害が発生したことを実証する。他方、Wntシグナル伝達経路の重要な要素であるGSK-3βの発現レベルの調節(リン酸化GSK-3βのアップレギュレーションおよび総GSK-3βのレベルのダウンレギュレーション)により、後者の阻害がA3AR抗体処理によって誘導されたことが実証された。上記事象の結果として、細胞増殖の阻害が誘導された。これは、細胞周期の進行において中心的な役割を果たしているタンパク質であるサイクリンD1およびc-Mycの発現レベルのダウンレギュレーションによって実証される。
【００８５】
A3AR抗体のin vivo効果:
A3AR抗体の効果をin vivoで試験するために、マウス黒色腫肺転移モデルを上記のように利用した。図3は、A3AR抗体の投与がin vivoで黒色腫肺転移の発生を阻害する能力を実証している。
【００８６】
（実施例２）
A3アデノシンレセプター(A3AR)抗体によるA3ARの活性化は線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)の増殖を阻害する
材料および方法
線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)-FLSは、穿刺を受けている変形性関節症患者またはアジュバントにより誘導された関節炎ラットから得た滑膜組織に由来した。具体的には、解剖した滑膜組織をコラゲナーゼ(4mg/ml)で37℃で1時間消化した。得られた滑膜細胞を、10%胎仔ウシ血清、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充した完全ダルベッコ最小必須培地中で、37℃で5% CO2インキュベータ中で維持した。培養したFLSを、1週間に2回新たに調製した培地に移した。
【００８７】
3[H]-チミジン取り込みアッセイ:3[H]-チミジン取り込みアッセイを使用して、FLS培養物に対するA3AR抗体の影響を評価した(ヒト起源のFLSについてH-80、およびラット起源のFLSについてC-31)。継代5〜8でのFLS(5×104/ml細胞)を、A3AR抗体(0.05μg/mlおよび0.75μg/ml)の存在下、96ウェルのマイクロタイタープレート中で72時間にわたり増殖培地中でインキュベートした。インキュベーションの最後の18時間にわたり、各ウェルを1μCiの3[H]-チミジンでパルスした。細胞を回収し、3[H]-チミジン取り込みをLKB液体シンチレーションカウンター(LKB、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)で決定した。
【００８８】
結果
ヒト起源(図4A)またはラット起源(図4B)のFLSの増殖培地へのA3AR抗体の添加は、これらの細胞の増殖を阻害した。この結果は、A3AR抗体の抗炎症活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】腫瘍細胞培養物(B16-F10、マウス黒色腫細胞)の増殖に対するA3AR抗体の影響を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】腫瘍細胞培養物(BxPC3、ヒト膵癌細胞)の増殖に対するA3AR抗体の影響を示す棒グラフである。
【図１Ｃ】腫瘍細胞培養物(LnCap、ヒト前立腺癌細胞)の増殖に対するA3AR抗体の影響を示す棒グラフである。
【図２Ａ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はA3ARである。
【図２Ｂ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はPKB-Aktである。
【図２Ｃ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はNF-κBである。
【図２Ｄ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はGSK-Pである。
【図２Ｅ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はGSK-3βである。
【図２Ｆ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はC-Mycである。
【図２Ｇ】A3AR抗体で処理していないコントロール細胞培養物と比較した、A3AR抗体の存在下でインキュベートしたLnCap、ヒト前立腺癌細胞培養物由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す図である;タンパク質抽出物はサイクリンD1である。
【図３】黒色腫細胞を接種したマウスの肺中のB16-F10黒色腫病巣の発生に対するA3AR抗体の影響を示す棒グラフである。
【図４Ａ】ヒト起源のFLSの増殖に対するA3AR抗体の阻害効果を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】ラット起源のFLSの増殖に対するA3AR抗体の阻害効果を示す棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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