(57)【要約】  真核ホスト細胞における異種ポリペプチドのリコンビナント産生のための方法が記載される。該ホスト細胞は発現プラスミドを含み、該発現プラスミドは、５’から３’方向に、ａ）プロモーター、ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、核酸、ｃ）異種ポリペプチドをコードする核酸、リンカーをコードする核酸および免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む、第２ポリペプチドをコードする核酸、ならびにｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域、を含む。更にプラスミドおよびキットが記載される。
2009509558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現プラスミドを含む真核ホスト細胞における異種ポリペプチドのリコンビナント産生のための方法であって、
ａ）該発現プラスミドが、５’から３’方向に、
ａａ）プロモーター、
ａｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、核酸、
ａｃ）ｉ）前記異種ポリペプチドをコードする核酸、
ｉｉ）リンカーをコードする核酸、
ｉｉｉ）免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸、
を含む第２ポリペプチドをコードする核酸、
ａｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域、
を含み、
ｂ）該発現プラスミドを真核ホスト細胞に導入し、
ｃ）該ホスト細胞を第２ポリペプチドの発現のために適当な条件下に培養し、
ｄ）第２ポリペプチドを培養培地から回収する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第２ポリペプチドが異種ポリペプチドの後にリンカーを含み、そしてリンカーの後に第２ポリペプチドのカルボキシ末端部分として免疫グロブリンフラグメントが続くことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドをコードする核酸に対して５’側の位置に、単一アミノ酸またはジペプチドまたはペプチドＱＩＷＮＮ（配列番号４７２）またはそのフラグメントをコードする追加の核酸を含有することを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
免疫グロブリンフラグメントがＩｇＧまたはＩｇＥから得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リンカーが、配列番号０６、０７、０８、０９、１０、１３９、１４０、５５４、５５５、５５６および５５７からなる群より選ばれるペプチドまたはポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
免疫グロブリンフラグメントが、
ａ）免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域または免疫グロブリン軽鎖のＣＬドメインのいずれか、
および、
ｂ）免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインのフラグメント、
を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリンフラグメントが定常ドメインのみを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
５’から３’方向に、
ａ）プロモーター、
ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、核酸；
ｃ）ｉ）異種ポリペプチドをコードする核酸、
ｉｉ）リンカーをコードする核酸、
ｉｉｉ）免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸、
を含む、第２ポリペプチドをコードする核酸；
ｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域；
を含むプラスミド。
【請求項１１】
５’から３’方向に、
ａ）プロモーター、
ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３６、３７、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８および３２９からなる群より選ばれる、核酸、
ｃ）ｉ）ペプチドＱＩＷＮＮ（配列番号４７２）またはそのＮ末端部分をコードする核酸、
ｉｉ）少なくとも１つの制限開裂部位を含むクローニング部位、
ｉｉｉ）配列番号０６、０７、０８、０９、１０、１３９、１４０、５５４、５５５、５５６および５５７からなる群より選ばれるリンカーをコードする核酸、
ｉｖ）免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸、
を含む第２ポリペプチドをコードする核酸；
ｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域、
を含むプラスミドを含む真核細胞において異種ポリペプチドを発現するためのプラスミドを調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞におけるポリペプチドのリコンビナント発現のための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
リコンビナントポリペプチドの産生のための発現システムは当該技術分野の状態で周知でありそして、例えばMarino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159により記載されている。医薬用途に使用するためのポリペプチドは、好ましくは、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞等において産生される。発現プラスミドの必須のエレメントは、複製起点および選択マーカーを含む例えばＥ．ｃｏｌｉのための原核生物プラスミド増殖単位、真核生物選択マーカー、ならびに各々プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む関心のある構造遺伝子（１つまたは複数）の発現用の１つ以上の発現カセットである。哺乳動物細胞における一過性発現のために、哺乳動物複製起点、例えば、ＳＶ４０  ＯｒｉまたはＯｒｉＰが含まれうる。プロモーターとして、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを選ぶことができる。最適化された転写のために、Ｋｏｚａｋ配列が、５’非翻訳領域に含まれうる。ｍＲＮＡプロセッシング、特にｍＲＮＡスプライシングおよび転写終結のために、構造遺伝子の構成（エキソン／イントロン構成）に依存して、ｍＲＮＡスプライシングシグナルならびにポリアデニル化シグナルが含まれうる。
【０００３】
遺伝子の発現は、一過性または恒久的発現として行われる。関心のあるポリペプチド（１つまたは複数）は、一般に分泌ポリペプチドであり、従って細胞を通して細胞外培地へのポリペプチドの輸送／分泌のために必要なＮ末端延長部（シグナル配列としても知られている）を含有する。
【０００４】
一般に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来することができる。異種シグナル配列が使用されるならば、それは、好ましくは、ホスト細胞により認識されそしてプロセッシングされる（即ち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）異種シグナル配列である。酵母における分泌のために、例えば、発現されるべき異種遺伝子のネイティブなシグナル配列は、分泌遺伝子に由来する相同酵母シグナル配列、例えば、酵母インベルターゼシグナル配列、α因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ  α因子リーダーを含む、２番目のものはＵＳ５，０１０，１８２に記載）、酸性ホスファターゼシグナル配列またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼシグナル配列（ＥＰ  ０３６２１７９）により置換されうる。哺乳動物細胞発現において、関心のあるタンパク質のネイティブなシグナル配列は満足すべきものであるが、例えば、ヒトまたはマウス起源の免疫グロブリンのための、同じまたは関連した種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ならびにウイルス分泌シグナル配列、例えば単純ヘルペス糖タンパク質Ｄシグナル配列のような他の哺乳動物シグナル配列が適当でありうる。このようなプレセグメントをコードするＤＮＡフラグメントは、関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントにインフレームでライゲーションされる。
【０００５】
ＷＯ９８／２８４２７において、ＯＢタンパク質のＮ末端部分に融合されたＦｃ免疫グロブリン領域、誘導体またはアナログを含む遺伝子的にまたは化学的に調製された融合タンパク質が報告されている。キメラ分子、即ち、カルボキシ末端タンパク質輸入配列およびアミノ末端カーゴ領域を含む抗体融合体または融合タンパク質が、ＷＯ  ０３／０３５８９２に提示されている。
【０００６】
ＵＳ２００３／００４９２２７において、アミノ末端免疫グロブリン部分およびカルボキシ末端サイトカイン部分を含む融合タンパク質であるイムノサイトカインを投与することにより哺乳動物において腫瘍に対する殺細胞性免疫応答を誘導するための方法が報告されている。
【０００７】
ＷＯ９１／１６４３７は、補体レセプター部位などのターゲット分子のための認識部位を含有しそして免疫グロブリン鎖のＮ末端に連結されているポリペプチドを含む哺乳動物循環系において安定な可溶性リコンビナント融合タンパク質を報告している。抗体および生物学的活性を有するペプチドから構成される融合タンパク質は、ＵＳ２００３／０１０３９８４に報告されている。
【０００８】
ＵＳ２００４／００３３５１１には、抗体−サイトカイン融合タンパク質が、そしてＵＳ２００４／０１８００３５には、抗体−サイトカインイムノコンジュゲートが報告されている。ゲロニン（Gelonin）および抗体を含むイムノトキシンがＷＯ９４／２６９１０に報告されている。
【０００９】
発明の要約
本発明は、発現プラスミドを含む真核ホスト細胞における異種ポリペプチドのリコンビナント産生のための方法であって、該発現プラスミドが、５’から３’方向に、ａ）プロモーター、ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、核酸、ｃ）前記異種ポリペプチドをコードする核酸、リンカーをコードする核酸、および免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む、第２ポリペプチドをコードする核酸、ならびにｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域、を含む上記の方法を含む。この方法は、更に、真核ホスト細胞に発現プラスミドを導入し、該真核ホスト細胞を第２ポリペプチドの発現のために適当な条件下に培養し、そして第２ポリペプチドを培養培地から回収することを含む。
【００１０】
本発明の１つの態様では、第２ポリペプチドをコードする核酸は、異種ポリペプチドをコードする核酸に対して５’側の位置に、単一アミノ酸またはジペプチドまたはアミノ酸配列ＱＩＷＮＮ（配列番号４７２）のペプチドまたはそのフラグメントをコードする追加の核酸を含有する。
【００１１】
他の態様では、免疫グロブリンフラグメントは、ＩｇＧまたはＩｇＥから得られる。
【００１２】
更なる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞、特に、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ細胞である。
【００１３】
更に他の態様では、リンカーは、配列番号０６、０７、０８、０９、１０、１３９、１４０、５５４、５５５、５５６および５５７からなる群より選ばれるペプチドまたはポリペプチドである。
【００１４】
他の態様では、免疫グロブリンフラグメントは、天然に存在する免疫グロブリンまたは合成免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖のカルボキシ末端定常ドメイン、即ち、重鎖のＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたは軽鎖のＣＬドメインを含む。更に、免疫グロブリンフラグメントは可変ドメインフラグメントを含む。
【００１５】
他の態様では、可変ドメイナフラグメントは、可変ドメインの１〜６アミノ酸が欠失している免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変ドメインである。
【００１６】
更なる態様では、可変ドメインの１〜６領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が欠失している。
【００１７】
更なる態様では、可変ドメインが欠失している。
【００１８】
他の態様では、免疫グロブリンフラグメントは、天然に存在する免疫グロブリンまたはその変異体に由来する。
【００１９】
更なる態様では、免疫グロブリンフラグメントは、少なくとも部分的に合成の免疫グロブリンに由来する。
【００２０】
本発明の更に他の態様では、異種ポリペプチドのアミノ酸配列は、５〜５００アミノ酸残基、更に好ましくは１０〜３５０アミノ酸残基、最も好ましくは１５〜１５０アミノ酸残基である。
【００２１】
本発明は、更に、５’から３’方向に、ａ）プロモーター、ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、核酸、ｃ）異種ポリペプチドをコードする核酸、リンカーをコードする核酸および免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む、第２ポリペプチドをコードする核酸、ならびにｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域、を含むプラスミドを含む。
【００２２】
本発明は、なお更に、５’から３’方向に、ａ）プロモーター、ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３６、３７、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８および３２９からなる群より選ばれる、核酸、ｃ）ｉ）アミノ酸配列ＱＩＷＮＮ（配列番号４７２）のペプチドまたはそのＮ末端部分をコードする核酸、ｉｉ）異種ポリペプチドをコードする核酸の挿入のために適当な少なくとも１つの制限開裂部位を含むクローニング部位、ｉｉｉ）配列番号０６、０７、０８、０９、１０、１３９、１４０、５５４、５５５、５５６および５５７からなる群より選ばれるリンカーをコードする核酸、およびｉｖ）免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む、第２ポリペプチドをコードする核酸、ならびにｄ）ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域、を含むプラスミドを含む真核細胞において異種ポリペプチドを発現するためのプラスミドを調製するためのキットを含む。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、適当なプロモーター、転写ターミネーター、選択マーカー、ポリペプチドをコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含む真核ホスト細胞における関心のある異種ポリペプチドのリコンビナント発現のための方法であって、シグナル配列をコードする核酸配列が、続くポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、方法を含む。異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、シグナル配列をコードする核酸配列の末端の後の１５ヌクレオチド内で始まる。異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、免疫グロブリンのＦＲ１領域内に、免疫グロブリンのＶＬ領域内にまたは免疫グロブリンの第１定常ドメイン内に挿入されることができ、またはそれは免疫グロブリンのＦＲ１領域、免疫グロブリンのＶＬ領域または免疫グロブリンの第１定常ドメインのすべてもしくは一部を置換することができる。
【００２４】
本発明の範囲内で、使用される用語のいくつかは下記のとおり定義される。
【００２５】
本明細書で使用される「核酸分子」は、リコンビナントで産生されうるポリペプチドをコードする天然に存在するまたは部分的にもしくは完全に非天然の核酸を指す。核酸分子は、単離されたまたは化学的手段によって合成されたＤＮＡフラグメントから構成されうる。核酸分子は、例えば、発現プラスミドまたは真核ホスト細胞のゲノム／染色体において、他の核酸に組み込まれうる。プラスミドは、シャトルベクターおよび発現ベクターを含む。典型的には、プラスミドは、それぞれバクテリアにおけるベクターの複製および選択のための複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子）を含む原核生物増殖単位も含むであろう。
【００２６】
「発現カセット」は、細胞における少なくとも含有された構造遺伝子の発現および分泌のために必要なエレメントを含有する核酸配列を指す。
【００２７】
核酸分子は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によっておよび／または核酸分子によりコードされたアミノ酸配列によって同様に特徴付けられる。
【００２８】
「遺伝子」は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現のために必用な、例えば染色体上のまたはプラスミド上のセグメントを示す。コード領域のほかに、遺伝子は、プロモーター、イントロンおよびターミネーターを含む他の機能的エレメントを含む。
【００２９】
「構造遺伝子」は、シグナル配列なしの遺伝子のコード領域を示す。
【００３０】
この出願内で交換可能に使用される「耐性遺伝子」または「選択マーカー」は、対応する選択薬剤の存在下に、その遺伝子を有する細胞がそれについてまたはそれに対して特異的に選択されることを可能とする遺伝子である。有用なポジティブ選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーは、遺伝子で形質転換されたホスト細胞が対応する抗生物質の存在下にポジティブにそれについて選択されることを可能とし；形質転換されていないホスト細胞は、選択培養条件下に成長または生存することはできないであろう。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブまたは二機能性であることができる。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを有する細胞についての選択を可能とし、これに対してネガティブ選択マーカーは、マーカーを有する細胞が選択的に排除されることを可能とする。典型的には、選択マーカーは、薬剤に対する耐性を与えまたはホスト細胞における代謝または異化欠損を補うであろう。真核細胞に有用な耐性遺伝子は、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、ネオマイシンおよびＧ４１８  ＡＰＨ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシンおよびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子を含む。更なるマーカー遺伝子は、ＷＯ９２／０８７９６およびＷＯ９４／２８１４３に記載されている。
【００３１】
本明細書で使用される「調節エレメント」は、関心のあるポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子の転写および／または翻訳のために必要な、シスに存在するヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは通常、発現されるべき構造遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始部位および転写終結部位、およびポリアデニル化シグナル配列を含む。用語「転写開始部位」は、一次転写物、即ちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれた最初の核酸に対応する遺伝子中の核酸塩基を指し；転写開始部位は、プロモーター配列と重複することがある。用語「転写終結部位」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる、転写されるべき関心のある遺伝子の３’末端に通常は表されるヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化シグナル配列またはポリＡ付加シグナルは、真核生物ｍＲＮＡの３’末端における特異的部位での開裂のためのシグナル、および開裂された３’末端への約１００〜２００個のアデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）の配列の核における転写後の付加のためのシグナルを与える。ポリアデニル化シグナル配列は、開裂部位から約１０〜３０ヌクレオチド上流に位置したコンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡを含むことができる。
【００３２】
分泌ポリペプチドを産生するために、関心のある構造遺伝子は、シグナル配列／リーダーペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む。シグナル配列は、新たに合成されたポリペプチドをＥＲ膜へと向けそしてＥＲ膜を通させ、ＥＲ膜で、ポリペプチドは分泌のために経路決定されうる。シグナル配列は、タンパク質がＥＲ膜を横切る期間中にシグナルペプチダーゼにより開裂除去される。シグナル配列の機能に関して、ホスト細胞の分泌装置による認識は必須である。従って、使用されたシグナル配列は、ホスト細胞のタンパク質および分泌装置の酵素により認識されなければならない。
【００３３】
翻訳調節エレメントは、翻訳開始コドン（ＡＵＧ）および停止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）を含む。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）はいくらかの構築物に含まれうる。
【００３４】
「プロモーター」は、それが作用可能に連結されている遺伝子／構造遺伝子または核酸配列の転写をコントロールするポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選ばれた配列の発現を意図するホスト細胞の細胞型において機能的であろう。種々の異なる供給源からの構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当該技術分野で周知であり（そしてＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて同定され）そしてクローニングされたポリヌクレオチドとしてまたはクローニングされたポリヌクレオチド内で入手可能である（例えばＡＴＣＣなどの寄託機関および他の商業的または個人的供給源から）。「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向させるヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接して、遺伝子の５’非コード領域または非翻訳領域に位置している。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によりしばしば特徴付けられる。これらのプロモーターエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント（ＤＳＥ；McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551）、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ；Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）および他の転写因子のための結合部位、例えば、ＣＲＥ／ＡＴＥ（O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938）、 ＡＰ２（Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728)、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253）およびオクタマー因子（一般に、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed.（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre, F.P. and Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14）を含む。プロモーターが誘導性プロモーターであるならば、転写の速度は誘導剤に応答して増加する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成的プロモーターであるならば、誘導剤により調節されない。抑制性プロモーターも知られている。例えば、ｃ−ｆｏｓプロモーターは、成長ホルモンが細胞表面のそのレセプターに結合すると、特異的に活性化される。テトラサイクリン（ｔｅｔ）調節された発現は、例えば、ＣＭＶプロモーター、その後に続く２つのＴｅｔオペレーター部位からなる人工的ハイブリッドプロモーターにより達成されうる。Ｔｅｔリプレッサーは、２つのＴｅｔオペレーター部位に結合しそして転写を阻止する。誘導物質テトラサイクリンを添加すると、ＴｅｔリプレッサーはＴｅｔオペレーター部位から遊離されそして転写は進行する（Gossen, M. and Bujard, H., PNAS 89(1992)5547-5551）。メタロチオネインおよび熱ショックプロモーターを含む他の誘導性プロモーターについては、例えばSambrook et al.（上記）およびGossen et al., Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520を参照されたい。高レベル発現のための強いプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子１α（ＣＨＥＦ−１、例えばＵＳ５，８８８，８０９参照）、ヒトＥＦ−１α、ユビキチンおよびヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ  ＩＥ）がある。
【００３５】
「プロモーター」は、構成的または誘導性であることができる。エンハンサー（即ち、プロモーターに作用して転写を増加させるシス作用性ＤＮＡエレメント）は、プロモーターと協同して機能してプロモーター単独で得られる発現レベルを増加させるのに必要であり得、そして転写調節エレメントとして含まれうる。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列も含むであろう（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０）。
【００３６】
本明細書で使用される「エンハンサー」は、それが作用可能に連結されている遺伝子またはコード配列の転写を高めるポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターと違って、エンハンサーは、相対的に方向及び位置非依存性であり、そして転写単位に対して５’または３’側に（Lusky, M., et al., Mol. Cell Bio. 3 (1983) 1108）、イントロン内に（Banerji, J., et al., Cell 33 (1983) 729）およびコード配列自体の内部に（Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4 (1984) 1293）見出された。従って、エンハンサーは、転写開始部位から上流もしくは下流にまたはプロモーターから相当な距離のところに位置することができるが、実際にはエンハンサーはプロモーターと物理的および機能的に重複していることがありうる。種々の異なる供給源からの多数のエンハンサーが当該技術分野で周知であり（そしてＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて同定され）そしてクローニングされたポリヌクレオチド配列としてまたはクローニングされたポリヌクレオチド配列内で入手可能である（例えばＡＴＣＣなどの寄託機関および他の商業的または個人的供給源から）。プロモーター配列を含む多数のポリヌクレオチド（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなどの）は、エンハンサー配列も含む。例えば、上記に列挙された強いプロモーターのすべては、強いエンハンサーも含有することができる（例えばBendig, M.M., Genetic Engineering 7 (1988) 91-127）。
【００３７】
「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの５’側の遺伝子から独立した翻訳開始を機能的に促進しそして動物細胞において単一転写物から２つのシストロン（オープンリーディグフレーム）が翻訳されることを可能とする配列を指す。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流（下流は本明細書では３’と相互に交換可能に使用される）のオープンリーディグフレームの翻訳のための独立したリボソーム進入部位を与える。ポリシストロン性でありうる、即ち、ｍＲＮＡから順次に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードするバクテリアｍＲＮＡとは異なり、動物細胞の大部分のｍＲＮＡはモノシストロン性でありそして１つのみのタンパク質の合成をコードする。真核細胞におけるポリシストロン性転写物では、翻訳は最も５’側の翻訳開始部位から開始され、最初の停止コドンで終結し、そして転写物はリボソームから放出され、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物における第２のまたはその次のオープンリーディグフレームに作用可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロン性転写物は、その下流のオープンリーディグフレームを順次に翻訳して、同じ転写物によりコードされた２つ以上のポリペプチドを産生することを可能とする。ベクター構築におけるＩＲＥＳエレメントの使用は、これまでに記載されており、例えば、Pelletier, J., et al., Nature 334 (1988) 320-325; Jang, S.K., et al., J.Virol. 63 (1989) 1651-1660; Davies, M.V., et al., J.Virol. 66 (1992) 1924-1932; Adam, M.A., et al., J.Virol. 65 (1991) 4985-4990; Morgan, R.A., et al., Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1293-1299; Sugimoto, Y., et al., Biotechnology 12 (1994) 694-698; Ramesh, N., et al., Nucl. Acid Res. 24 (1996) 2697-2700; およびMosser, D.D., et al., Biotechniques 22 (1997) 150-152）を参照されたい。
【００３８】
「作用可能に連結された」は、そのように記載されたコンポーネントがそれらの意図される方式でそれらを機能させる関係にある、２つ以上のコンポーネントの並置状態を指す。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、もしもそれがシスに作用して、連結された配列の転写をコントロールまたはモデュレーションするならば、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、しかし必ずしもそうではないが、「作用可能に連結されている」ＤＮＡ配列は、連続しており、そして分泌リーダー／シグナル配列およびポリペプチドなどの２つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続的でありかつリーディングフレーム内にある。しかしながら、作用可能に連結されたプロモーターは、一般にコード配列の上流に位置しているけれども、コード配列と必ずしも連続的ではない。
【００３９】
エンハンサーは、連続的である必要はない。エンハンサーは、もしエンハンサーがコード配列の転写を増加させるならば、コード配列に作用可能に連結されている。作用可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、コード配列内またはコード配列の下流にそしてプロモーターから相当の距離に位置することができる。ポリアデニル化部位は、もしも転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列に進行するようにコード配列の下流末端にそれが位置しているならば、コード配列に作用可能に連結されている。連結は、当該技術分野において知られているリコンビナント方法により、例えば、ＰＣＲ方法を使用しておよび／または都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。もしも好都合な制限部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用の実施に従って使用する。
【００４０】
本明細書で使用される用語「発現」は、ホスト細胞内で起こる転写および／または翻訳を指す。ホスト細胞における所望の産物の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量に基いて決定されうる。例えば、選ばれた配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲによりまたはノーザンハイブリダイゼーションにより定量されうる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)参照）。選ばれた配列によりコードされたタンパク質は、種々の方法、例えばＥＬＩＳＡにより、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることによりまたはこのような活性に依存しないアッセイ、例えばタンパク質を認識しそしてタンパク質に結合する抗体を使用する、ウエスタンブロットもしくはラジオイムノアッセイを使用することにより定量されうる（Sambrook et al., 1989, 前記参照）。
【００４１】
「ホスト細胞」は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が導入される細胞を指す。ホスト細胞は、プラスミド／ベクターの増殖のために使用される原核細胞、および構造遺伝子の発現のための真核細胞の両方を含む。典型的には、真核細胞は哺乳動物細胞である。
【００４２】
「ポリペプチド」は、それが天然に産生されるか合成により産生されるかにかかわらず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約２０より少ないアミノ酸残基のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれうる。１つ以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドまたは１００アミノ酸以上の長さのアミノ酸鎖を含むポリペプチドは「タンパク質」と呼ばれうる。
【００４３】
「タンパク質」は、少なくとも１つの鎖が１００アミノ酸以上のアミノ酸長を有する、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、非ペプチド成分、例えば炭水化物基も含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によりタンパク質に付加され得、そして細胞のタイプによって変動し得る。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖構造として本明細書で定義され；炭水化物基などの付加は、一般に明記されないが、それにもかかわらず存在することができる。
【００４４】
「異種ＤＮＡ」または「異種ポリペプチド」は、所定のホスト細胞内に天然に存在しないＤＮＡ分子もしくはポリペプチド、またはＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団を指す。特定のホスト細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、そのホストＤＮＡが非ホストＤＮＡ（即ち、外来性ＤＮＡ）と組み合わされている限り、ホスト細胞種由来のＤＮＡ（即ち内在性ＤＮＡ）を含有することができる。例えば、プロモーターを含むホストＤＮＡセグメントに作用可能に連結されたポリペプチドをコードする非ホストＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。反対に、異種ＤＮＡ分子は外来性プロモーターと作用可能に連結された内在性構造遺伝子を含むことができる。
【００４５】
非ホストＤＮＡ分子によりコードされたペプチドまたはポリペプチドは「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００４６】
「クローニングベクター」は、ホスト細胞中で自律的に複製する能力を有する核酸分子、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミドまたはバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須の生物学的機能の損失なしに確定的な方式で核酸分子の挿入を可能とする１つもしくは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、およびクローニングベクターでトランスフォーメーションされた細胞の同定および選択において使用するために適当な耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列、を含有する。耐性遺伝子は、典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。
【００４７】
「発現プラスミド」は、ホスト細胞において発現されるべきタンパク質をコードする核酸分子である。典型的には、発現プラスミドは、複製起点を含む原核生物プラスミド増殖単位（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのための）、および選択マーカー、真核生物選択マーカー、ならびに関心のある構造遺伝子（１つまたは複数）の発現のための１つ以上の発現カセットであって、プロモーター、構造遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む発現カセットを含む。遺伝子発現は、通常プロモーターのコントロール下に置かれ、そしてこのような構造遺伝子は、プロモーターに「作用可能に連結されている」といわれる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、もしも調節エレメントがコアプロモーターの活性をモデュレーションするならば、作用可能に連結されている。
【００４８】
「ポリシストロン性転写単位」は、１つより多くの構造遺伝子が同じプロモーターのコントロール下にある転写単位である。
【００４９】
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質または天然においてポリペプチドと関連した他のタンパク質性不純物などの汚染性細胞成分を本質的に含まない。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態、即ち少なくとも約８０％純度、少なくとも約９０％純度、少なくとも約９５％純度、９５％より高い純度、または９９％より高い純度でポリペプチドを含有する。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含有することを示すための１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後の単一バンドの出現による。しかしながら、用語「単離された」は、別の物理的形態、例えば二量体あるいはグリコシル化されたまたは誘導体化された形態にある同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００５０】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされた１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常ドメイン（領域）遺伝子および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）を含む種々のフォーマットにおいて存在することができる（例えば、Huston, J.S., et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; 一般に、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); およびHunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16）。
【００５１】
免疫グロブリンは、一般に、少なくとも２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含む。重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖の各々は、抗原と相互作用することができる結合領域（ドメイン）を含有する可変ドメイン（領域）（一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有することができる。重ポリペプチド鎖及び軽ポリペプチド鎖の各々は、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）を有する細胞、例えば食細胞、またはｉｉ）Ｂｒａｍｂｅｌｌレセプターとしても知られている新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）を有する細胞に対する抗体の結合を媒介する。それは、古典的補体系の因子、例えば成分（Ｃ１ｑ）を含むいくらかの因子への結合も媒介する。
【００５２】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、即ち、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＣＤＲ）を含む。
【００５３】
「免疫グロブリンフラグメント」は、少なくとも免疫グロブリンの鎖の定常ドメイン、即ち、免疫グロブリンの重鎖のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３および場合によりＣＨ４または免疫グロブリンの軽鎖のＣＬを含むポリペプチドを示す。その誘導体および変異体も含まれる。更に、１つ以上のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在しうる。好ましい態様では、可変ドメインは、免疫グロブリンフラグメントにおいて欠失している。
【００５４】
この出願内に示された「転写ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼにｍＲＮＡ合成の終結のためのシグナルを与える、長さが５０〜７５０塩基対のＤＮＡ配列である。発現カセットの３’末端における非常に効率的な（強い）ターミネーターは、特に、強いプロモーターを使用するときＲＮＡポリメラーゼがリードスルーするのを防止するために推奨できる。非効率的な転写ターミネーターは、オペロン様ｍＲＮＡの形成をもたらすことがあり、これは、所望されない（例えば、プラスミドにコードされた）遺伝子の発現の理由でありうる。
【００５５】
この出願内で使用される用語「リンカー」は、天然起源または合成起源のペプチドリンカーを示す。それらは直鎖状アミノ酸鎖から構成される。鎖は、１〜５０アミノ酸、好ましくは３〜２５アミノ酸の長さを有する。リンカーは、天然に存在するポリペプチド、例えばヒンジ機能を有するポリペプチドの反復アミノ酸配列または一部を含有することができる。
【００５６】
「合成リンカー」は、グリシン、グルタミンおよびセリン残基に富んでいるように指定される。これらの残基は、５個までのアミノ酸の小さいペプチド単位、例えばＧＧＧＧＳ、ＱＱＱＱＧまたはＳＳＳＳＧに配置される。小さなペプチド単位は、２〜５回反復されてマルチマー単位を形成する。マルチマー単位のアミノおよび／またはカルボキシ末端の各々において６個までの追加のアミノ酸が付加されうる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「生物学的に活性な分子」は、細胞系およびウイルスを使用するバイオアッセイなどの人工的生物学的システム内にまたは人工的生物学的システムに投与されるとき、またはヒトを含む、鳥類および哺乳動物を含むがそれに限定されない動物にｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的効果を引き起こす有機分子、例えば生物学的高分子、例えばペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドまたはタンパク質を指す。この生物学的効果は、酵素阻害もしくは活性化、結合部位または周辺におけるレセプターもしくはリガンドへの結合、シグナルトリガリングまたはシグナルモデュレーションでありうるが、それらに限定されない。
【００５８】
生物学的に活性な分子は、例えば、ホルモン、サイトカイン、成長因子、レセプターリガンド、アゴニストもしくはアンタゴニスト、細胞傷害剤、抗ウイルス剤、イメージング剤、酵素阻害剤、酵素活性化剤または酵素活性モデュレーター、例えばアロステリック物質であるが、それに限定されない。
【００５９】
この出願内で使用される用語「アミノ酸」は、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００６０】
本発明を実施するために有用な当業者に知られている方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００６１】
本発明は、真核ホスト細胞における異種ポリペプチドのリコンビナント産生のための方法を含む。ホスト細胞は、５’から３’方向に、ａ）プロモーター、ｂ）第１ポリペプチドをコードする核酸であって、該第１ポリペプチドのアミノ酸配列が第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸に依存して表１から選ばれる、核酸、ｃ）生物学的活性を有する異種ポリペプチドをコードする核酸、配列番号０６〜１０、１３９、１４０および５５４〜５５７からなる群より選ばれるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む、第２ポリペプチドをコードする核酸、ならびにｄ）３’非翻訳領域、を含む発現プラスミドを含む。この発現プラスミドは、第２ポリペプチドの発現のために適当な条件下に培養されるホスト細胞に導入される。分泌された第２ポリペプチドは培養培地から回収される。
【００６２】
第１ポリペプチドは、いわゆるシグナル配列である。シグナル配列は、結合された／後に続く／作用可能に連結されたポリペプチドの分泌を担う。有効であるためには、シグナル配列は、ポリペプチドを発現する細胞内でタンパク質および酵素により認識されそしてプロセッシングされなければならない。真核ホスト細胞の場合に、シグナル配列は、好ましくは真核生物シグナル配列である。本発明による第２ポリペプチドが正しく分泌されることを確実にするために、シグナル配列は、ヒトおよびマウス免疫グロブリンシグナル配列から選ばれる。シグナル配列の収集は表１に示される。
【００６３】
どのシグナル配列が選ばれるかは、後に続くアミノ酸に依存する。分泌プロセスの後にシグナル配列を開裂するシグナルペプチダーゼが分泌ポリペプチドのシグナル配列を認識しそしてそれを除去することが確実にされなければならない。シグナル配列から異種ポリペプチドへの「自然な」移行を与えるために、シグナル配列は、異種ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸が、天然において続く免疫グロブリンＦＲ１領域のアミノ酸配列の最初の２つのアミノ酸と同一であるように選ばれるべきである。
【００６４】
表１：シグナルペプチド（一文字コードで示された第１ポリペプチド）に割り当てられた第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸（一文字コードで示された）の組
【表１】
2009509558.tif 000003
2009509558.tif 000004
2009509558.tif 000005
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【００６５】
第２ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸のジペプチドが表１に明示的に列挙されておらず、そして表１の最後の列に記載されている配列を使用することが意図されないならば、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを直接一緒につながないことが有利である。このような場合に、５個までのアミノ酸の短い配列を挿入して天然において第１ポリペプチドに続くであろう／続くことができる免疫グロブリンＦＲ１領域配列の開始部に似させることが有利である。この配列は、天然において続く免疫グロブリンＦＲ１領域の最初の２つのアミノ酸に似させるために、単一アミノ酸またはジペプチド、ペプチドＱＩＷＮＮ（配列番号４７２）またはそのフラグメントであることができる。１つの態様では、この配列は、ペプチドＱＩＷＮＮ（配列番号４７２）、または少なくともジペプチドＱＩを含むそのＮ末端部分である。
【００６６】
第１ポリペプチドの後または場合により挿入された短い配列の後に、第２ポリペプチドは異種ポリペプチドを含む。この異種ポリペプチドは、５〜５００アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。本発明の好ましい態様では、アミノ酸配列は、１０〜３５０アミノ酸残基、更に好ましい態様では１５〜１５０アミノ酸残基である。免疫グロブリンにコンジュゲーションされた異種ポリペプチドは、生物学的に活性な分子を含む群から選ばれる。これらの分子は、例えばアッセイシステムにおける如き、人工的生物学的システムまたは生きている細胞に、または例えばヒトを含む鳥類もしくは哺乳動物などの生きている生物に投与されるときに生物学的効果を示す。これらの生物学的に活性な化合物は、レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、酵素の阻害剤および活性化剤等ならびに、細胞傷害性活性、抗ウイルス活性、抗菌活性または抗がん活性を示すペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびに抗原を含むが、それらに限定されない。生物学的効果は、酵素阻害、結合部位または周囲におけるレセプターへの結合、およびシグナルトリガリングであることができるが、それらに限定されない。これらの生物学的に活性な化合物は、例えば、医薬、治療または診断用途に有用である。
【００６７】
第２ポリペプチドは、異種ポリペプチドの後にリンカーを更に含む。本発明で好ましく使用されうるリンカーは表２に列挙される。
【００６８】
表２：可能なリンカー
【表２】
2009509558.tif 000018
【００６９】
リンカーの後に、免疫グロブリンフラグメントが、第２ポリペプチドのカルボキシ末端部分として続く。
【００７０】
第２ポリペプチドは、異種ポリペプチド、それに続くリンカーおよびその後のカルボキシ末端部分としての免疫グロブリンフラグメントを含む、即ち、第２ポリペプチドをコードする核酸は、５’から３’方向に、異種ポリペプチド、リンカーおよび免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む。
【００７１】
免疫グロブリン分子は、５つの異なるクラス：ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられる。これらの内、ＩｇＧおよびＩｇＥが、医薬および診断用途においてより頻繁に使用される。これらのクラス内で、免疫グロブリンは、それらの全体の構造は異なるが、構成要素は類似している。すべての免疫グロブリンは、２つの異なるポリペプチド鎖、軽鎖および重鎖から構築される。
【００７２】
免疫グロブリンフラグメントは、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のカルボキシ末端定常ドメイン（１つまたは複数）を含み、例えば、それは、免疫グロブリン重鎖の少なくともＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域および場合によりＣＨ４ドメイン、または免疫グロブリン軽鎖のＣＬドメインを含む。フラグメントが由来する免疫グロブリンは、天然に存在するまたは合成の免疫グロブリンであることができる。本発明の１つの態様では、免疫グロブリンフラグメントは、更に重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインまたはその変異体のフラグメントを含有する。可変ドメインフラグメントでは、アミノ酸（１つまたは複数）または領域（１つまたは複数）が欠失している。１つの態様では、可変ドメインの１〜６個のアミノ酸が欠失している。他の態様では、可変ドメインの１〜６つの領域が欠失している。更なる態様では、可変ドメインが欠失している。免疫グロブリンフラグメントにおける機能的、即ち、抗原認識性可変ドメインの存在は、本発明にとって必須ではない。本発明による機能的ではない免疫グロブリンは、抗原認識性可変ドメインを持たない免疫グロブリンである。１つの態様では、免疫グロブリンフラグメントは、機能的ではない免疫グロブリンである。１つの態様では、免疫グロブリンフラグメントに含まれる可変ドメインおよび定常ドメインは同じ抗体のものであるかまたは同じ抗体に由来する（即ち、同じ抗体に属する）。
【００７３】
異なる核酸配列は、発現プラスミド上で作用可能に連結されている。発現のために、プラスミドは、ホスト細胞に導入される。タンパク質は、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等において産生される。
【００７４】
下記の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために与えられ、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく示された手順において変更がなされうることは理解される。
【００７５】
実施例
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報が、Kabat,E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth ed.,NIH Publication No 91-3242に示されている。
【００７６】
抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付けに従って番号付けをする（Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242）。
【００７７】
リコンビナントＤＮＡ技術
標準方法を使用して、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A Laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているとおりにＤＮＡを操作した。分子生物学試薬は製造者の指示に従って使用した。
【００７８】
タンパク質決定
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０nmでの光学濃度（ＯＤ）を決定することにより決定した。
【００７９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)で行われた二本鎖配列決定により決定した。
【００８０】
ＤＮＡおよびタンパク質配列分析および配列データ管理
配列作成、マッピング、分析、アノテーションおよび図示のために、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）のソフトウエアパッケージバージョン１０．２およびＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅスイートバージョン８．０を使用した。
【００８１】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、化学的合成により作られたオリゴヌクレオチドからMedigenomix GmbH（Martinsried, Germany）により調製された。単一制限エンドヌクレアーゼ開裂部位により隣接されている１００〜６００ｂｐ長の遺伝子セグメントをＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより組立て、次いでｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp., USA）にＡオーバーハングを介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により確認した。
【００８２】
免疫グロブリンコンジュゲートのアフィニティー精製
発現されそして分泌された免疫グロブリンコンジュゲートを、公知の方法に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare  旧Amersham Bioscience, Sweden）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡単にいえば、遠心（１０，０００gで１０分間）および０．４５μmフィルターを通すろ過の後、免疫グロブリンコンジュゲートを含有する澄明化した培養上清をＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂカラムに適用した。結合しなかったタンパク質をＰＢＳ平衡化バッファーおよび０．１Mクエン酸バッファー、ｐＨ５．５で洗出した。免疫グロブリンコンジュゲートを０．１M クエン酸バッファー、ｐＨ３．０で溶出し、そして免疫グロブリンコンジュゲート含有画分を１M トリスベースで中和した。次いで免疫グロブリンコンジュゲートを４℃でＰＢＳバッファーに対して十分に透析し、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫ膜（Millipore Corp., USA）を備えたウルトラフリー遠心フィルターデバイスで濃縮しそして０℃の氷水浴中に保存した。
【００８３】
実施例１
発現プラスミドの作製
抗インスリン様増殖因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）抗体軽鎖可変ドメイン（領域）（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常ドメイン（領域）（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを、抗ＩＧＦ−１Ｒ重鎖可変ドメイン（領域）（ＶＨ）およびヒトγ１重鎖定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のための遺伝子セグメントと同様に連結した。
【００８４】
ａ）ベクター４８１８
ベクター４８１８は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（以下において抗ＩＧＦ−１Ｒとしても示される）重鎖の一過性発現のための発現プラスミド（ゲノム的に構成された発現カセット；エキソン−イントロン構成）である（配列についてはＵＳ２００５／０００８６４２参照）。それは、下記の機能的エレメントを含む：
抗ＩＧＦ−１Ｒγ１重鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子、を含有する。
【００８５】
抗ＩＧＦ−１Ｒγ１重遺伝子の転写単位は、下記のエレメント：
−ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−  合成５’非翻訳領域（ＵＴ）、
−シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−５’末端（Ｌ２シグナル配列）におけるユニークＢｓｍＩ制限部位および３’末端におけるスプライスドナー部位およびユニークＮｏｔＩ制限部位を配置されたクローニングされた抗ＩＧＦ−１Ｒ可変重鎖コードセグメント、
−マウス重鎖エンハンサーエレメント（部分ＪＨ３、ＪＨ４）を含むマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
−ゲノムヒトγ１重遺伝子定常領域、
−ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−それぞれ５’末端および３’末端におけるユニーク制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ、から構成される。
【００８６】
抗ＩＧＦ−１Ｒγ１重鎖発現ベクター４８１８のプラスミドマップを図２に示す。
【００８７】
ｂ）ベクター４８０２
ベクター４８０２は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖（ｃＤＮＡ）の一過性発現のための発現プラスミドである。それは、下記の機能的エレメントを含む。
【００８８】
抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子、
を含有する。
【００８９】
抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽鎖遺伝子の転写単位は、下記のエレメント：
−ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−以下を含むクローニングされた抗ＩＧＦ−１Ｒ可変軽鎖ｃＤＮＡ
−ネイティブ５’ＵＴおよび
−５’末端におけるユニークＢｇｌＩＩ制限部位を配置されたヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子のネイティブ軽鎖シグナル配列、
−ヒトκ軽鎖遺伝子定常領域、
−ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−それぞれ５’末端および３’末端におけるユニーク制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ、
から構成される。
【００９０】
抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽鎖発現ベクター４８０２のプラスミドマップを図３に示す。
【００９１】
ｃ）プラスミド４９６２
ベクター４９６２は、発現プラスミド４９６５、４９６６および４９６７の組立てのための基本構造として用いた。これらのプラスミドは、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における改変された抗体重鎖（可変ドメインなしのＮ末端コンジュゲーション、ｃＤＮＡ構成）の一過性発現を可能とした。プラスミド４９６２は、下記の機能的エレメントを含む。
【００９２】
γ１重鎖定常領域のための発現カセットのほかに、このベクターは、
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミド複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子、
を含有する。
【００９３】
γ１重鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の転写単位は、下記のエレメント：
−ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−５’末端における単一ＢｇｌＩＩ制限部位および３’末端における単一ＮｈｅＩ制限部位（ＣＨ１Ｎ末端内のＮｈｅＩ部位）を含む合成リンカー（配列番号０１）
【表３】
2009509558.tif 000019
−ヒトγ１重鎖遺伝子定常ドメイン（領域）（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ｃＤＮＡ構成）、
−ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
−それぞれ、５’末端および３’末端におけるユニーク制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ、から構成される。
【００９４】
γ１重鎖定常ドメイン／領域遺伝子ベクター４９６２のプラスミドマップを図４に示す。
【００９５】
ｄ）プラスミド４９６４
ベクター４９６４は、発現プラスミド４９７６および４９７７の組立てのための基本構造として用いた。これらのプラスミドは、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖（Ｎ末端コンジュゲーション）の一過性発現を可能とした。
【００９６】
プラスミド４９６４は、発現プラスミド４８０２の変異体である。
【００９７】
抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽遺伝子の転写単位を、下記のように改変した：
ネイティブ軽鎖シグナル配列を、ＶＬ−ＩＧＦ−１Ｒ可変ドメイン（領域）に直接連結された、５’末端におけるユニークＢｇｌＩＩ制限部位および３’末端におけるユニークＮｈｅｌ制限部位を配置された合成リンカーで置換する（配列番号０３）。
【００９８】
【表４】
2009509558.tif 000020
【００９９】
改変された抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽鎖発現ベクター４９６４のプラスミドマップを図５に示す。
【０１００】
ｅ）プラスミド４９６９
発現プラスミド４９６９は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖のための発現プラスミドであるプラスミド４８０２に由来する。プラスミドは、改変された抗体軽鎖フラグメント（可変ドメインなしのＮ末端コンジュゲーション；ポリペプチド−リンカー−κ鎖の定常領域）をコードする。
【０１０１】
プラスミド４９６９の構築のために、ユニークＢｇｌＩＩ制限部位をＣＭＶプロモーターの３’末端に導入し、そしてユニークＢｂｓＩ制限部位を抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖の定常領域の内側に導入した（配列番号０４）。
【０１０２】
【表５】
2009509558.tif 000021
【０１０３】
ｆ）プラスミド４９６３
このプラスミドは、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体軽鎖の一過性発現を可能とした。
【０１０４】
プラスミド４９６３は、発現プラスミド４８０２の変異体である。
【０１０５】
抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽遺伝子の転写単位を、下記のように改変した：
−ヒトκ軽鎖定常遺伝子領域を、Ｃ−κ−Ｉｇ−κ−ｐＡ連結領域で僅かに改変した（ユニークＨｉｎｄＩＩＩおよびＫａｓＩ制限部位の挿入、配列番号５５８）。
【０１０６】
【表６】
2009509558.tif 000022
【０１０７】
改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ軽鎖発現ベクター４９６３のプラスミドマップを図６に示す。
【０１０８】
実施例２
最終発現プラスミドの作製
免疫グロブリン遺伝子セグメント、リンカー遺伝子セグメントおよびポリペプチド遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン融合遺伝子（重鎖および軽鎖）を、適合する遺伝子セグメント（核酸）の連結により公知のリコンビナント方法および技術により組立てた。
【０１０９】
ペプチドリンカーおよびポリペプチドをコードする核酸配列は、各々化学合成により合成し、次いでＥ．ｃｏｌｉプラスミドにライゲーションした。サブクローニングされた核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１１０】
使用した免疫グロブリンポリペプチド鎖、免疫グロブリンフラグメント、ポリペプチドコンジュゲーションの位置（Ｎ末端）、使用したリンカーおよび使用したポリペプチドを、表２（３０頁）、表３および表３ａに列挙する。
【０１１１】
表３：使用したタンパク質およびポリペプチド；アミノ酸配列および位置の番号付けは、ＢＨ８基準株（ローカスＨＩＶＨ３ＢＨ８；フランスからのＨＩＶ−１単離物ＬＡＩ／ＩＩＩＢクローンＢＨ８；Ratner, L., et al., Nature 313 (1985) 277-384）におけるとおりである。
【表７】
2009509558.tif 000023
【０１１２】
表３ａ：免疫グロブリンコンジュゲート遺伝子構築のために使用した化学的に調製した遺伝子セグメント
【表８】
2009509558.tif 000024
【０１１３】
改変された免疫グロブリンポリペプチド軽鎖および重鎖の一過性発現のための最終発現プラスミド（発現カセット）の構築のために使用したコンポーネントを、使用した基礎プラスミド、クローニング部位およびコンジュゲーションされた免疫グロブリンポリペプチドをコードする挿入された核酸配列に関して表４に列挙する。
【０１１４】
表４：使用した発現プラスミドの構築において使用したコンポーネント
【表９】
2009509558.tif 000025
【０１１５】
表５には、ＨＩＶ−１阻害特性を有する使用したポリペプチド（Ｔ６５１およびＨＩＶ−１ｇｐ４１外部ドメイン変異体）、免疫グロブリン軽鎖または重鎖をポリペプチドと連結するための使用したリンカーおよびコードされたアミノ酸配列から推定された改変された抗体鎖の推定された分子量を列挙する。
【０１１６】
表５：使用したポリペプチドおよび改変された免疫グロブリンポリペプチド鎖の推定された分子量の要約
【表１０】
2009509558.tif 000026
【０１１７】
実施例３
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
１０％超低ＩｇＧ  ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Gibco, Invitrogen Corp., USA）、２mM グルタミン（Gibco, Invitrogen Corp., USA）、１％容量／容量（v/v）非必須アミノ酸（Gibco, Invitrogen Corp., USA）および２５０μg/ml Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco,Invitrogen Corp., USA）中で培養された付着性の成長中のＨＥＫ−２９３ＥＢＮＡ細胞（エプスタインバールウイルス核抗原を発現するヒト胚腎臓細胞系２９３；アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションにより、リコンビナント免疫グロブリン変異体を生成させた。トランスフェクションのために、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）６トランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany）を、３：１〜６：１の範囲の試薬（μl）対ＤＮＡ（μg）の割合で使用した。免疫グロブリンポリペプチド軽鎖および重鎖を、１：２〜２：１の軽鎖コードプラスミド対重鎖コードプラスミドのモル比を使用して２つの異なるプラスミドから発現させた。免疫グロブリン変異体を含有する細胞培養上清をトランスフェクションの４〜１１日後に回収した。上清を精製まで氷水浴中に０℃で保存した。
【０１１８】
例えばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンのリコンビナント発現に関する一般的情報は、Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng.75(2001)197-203に与えられる。
【０１１９】
実施例４
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットトランスファーおよび免疫グロブリン特異的抗体コンジュゲートによる検出を使用する発現分析
発現されそして分泌されたポリペプチドを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により処理し、そして分離されたポリペプチドをゲルから膜に移し、次いで免疫学的方法により検出した。
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＤＳサンプルバッフアー、４倍濃縮物（４×）：４gグリセロール、０．６８２gトリスベース、０．６６６gトリス塩酸、０．８g ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６g ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酸）、Ｓｅｒｖａ  ＢｌｕｅＧ２５０の１重量％（w/v）水溶液０．７５ml、フェノールレッドの１重量％（w/v）溶液０．７５ml、水を加えて１０mlの全容積とする。
【０１２１】
分泌されたポリペプチドを含有する培養ブロスを遠心して細胞および細胞デブリを除去した。澄明化した上清のアリコートを４×ＬＤＳサンプルバッファー１／４容量（v/v）および０．５M １，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１／１０容量（v/v）と混合した。次いで、サンプルを７０℃で１０分間インキュベーションしそしてタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Invitrogen Corp., USA）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳランニングバッファーを使用した。
【０１２２】
ウエスタンブロット
トランスファーバッファー：３９mM グリシン、４８mM トリス塩酸、０．０４重量％（w/v）ＳＤＳおよび２０容量％メタノール（v/v）。
【０１２３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、分離した免疫グロブリンコンジュゲートポリペプチド鎖を、Burnetteの「半乾燥ブロット法」（Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）に従ってニトロセルロースフィルター膜（ポアーサイズ０．４５μm）に電気泳動によりトランスファーした。
【０１２４】
免疫学的検出
ＴＢＳバッファー：ｐＨ７．５に調節された、５０mM トリス塩酸、１５０mM ＮａＣｌ
ブロッキング溶液：ＴＢＳバッファー中の１％（w/v）ウエスタンブロッキング試薬（Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany）、
ＴＢＳＴバッファー：０．０５容量％（v/v）Ｔｗｅｅｎ−２０を有する１×ＴＢＳバッファー
【０１２５】
免疫学的検出のために、ウエスタンブロッティング膜をＴＢＳバッファー中で５分間２回そしてブロッキング溶液中で９０分間１回、室温で振とうさせながらインキュベーションした。
【０１２６】
免疫グロブリンコンジュゲートポリペプチド鎖の検出
重鎖：重鎖または重鎖フラグメント含有ポリペプチドの検出のために、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションされた精製ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した(コード番号Ｐ２０１４、DAKO, Denmark)。
【０１２７】
軽鎖：軽鎖または軽鎖フラグメントを含有するポリペプチドを、精製ペルオキシダーゼコンジュゲーション化ウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体（DAKO, Denmark，コード番号Ｐ０１２９）で検出した。
【０１２８】
抗体軽鎖および重鎖またはそのフラグメントの可視化のために、洗浄されそしてブロッキングされたウエスタンブロット膜を、重鎖の場合には、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションされた精製ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体と共に、または軽鎖の場合には、精製ペルオキシダーゼコンジュゲーション化ウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体と共に、一夜振とうしながら４℃で１０mlブロッキング溶液中で１：１０，０００希釈において最初にインキュベーションした。膜をＴＢＴＳバッファーで３回およびＴＢＳバッファーで１回１０分間室温で洗浄した後に、ウエスタンブロツト膜を化学発光を生じるルミノール／ペルオキシド溶液（Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany）で発色させた。従って、膜を１０mlルミノール／ペルオキシド溶液中で１０秒〜５分間インキュベーションしそして発せられた光をＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｆ１  Ａｎａｌｙｓａｔｏｒ（Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany）によりその後検出しそして／またはＸ線フイルムで記録した。
【０１２９】
スポットの強度をＬｕｍｉＡｎａｌｙｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．１）で定量した。
【０１３０】
イムノブロツトの多重染色
検出のために使用した二次ペルオキシダーゼ標識抗体コンジュゲートを、１００mM β−メルカプトエタノールおよび２０％（w/v）ＳＤＳを含有する１M トリス塩酸バッファー（ｐＨ６．７）において７０℃で１時間膜をインキュベーションすることにより染色されたブロットから除去することができる。この処理の後に、ブロットを異なる二次抗体で２回目の染色をすることができる。２回目の検出の前に、ブロットをＴＢＳバッファー中で振とうしながら室温で３回各々１０分間洗浄する。
【０１３１】
サンプル配置を表６に列挙する。
表６：ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル／ウエスタンブロットのサンプル配置
【表１１】
2009509558.tif 000027
【０１３２】
実施例５
組立てられた免疫グロブリンポリペプチドの検出
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂへのアフィニティー結合による免疫グロブリンポリペプチドの精製および濃縮
１つ以上のプラスミドを含有するＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、プラスミド（１つまたは複数）上に位置したポリペプチド遺伝子（１つまたは複数）の一過性発現のために適当な条件下に６〜１０日間培養した。１．８ml Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカップ中の澄明化した培養上清１mlに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare  旧Amersham Bioscience, Sweden）懸濁液（ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの１：１（v/v）懸濁液）０．１mlを加えた。この懸濁液を、振とうしながら室温で１〜６時間インキュベーションした。その後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを、遠心（３０秒、５０００rpm）により沈降させ、そして上清をすてた。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅペレットを、次いで各々１．６ml ＰＢＳバッファー、１．６ml ０．１M クエン酸バッファーｐＨ５．０および１．６ml蒸留水で洗浄した。プロテインＡが結合した免疫グロブリンをＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズから０．１ml １×ＬＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを用いて７０℃で５〜１０分間抽出した。実施例４に記載のとおりのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析を行った。
【０１３３】
結果
一過性発現後の重鎖および／または軽鎖フラグメント含有ポリペプチドの発現／分泌分析：
図７ａ−ｃ：アフィニティー精製されたポリペプチドのクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；表６に従うサンプル配置
【０１３４】
免疫グロブリン含有ポリペプチドの免疫検出
図８ａ−ｃ：ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清中の軽鎖フラグメント含有ポリペプチドの免疫検出。
【０１３５】
図９ａ−ｃ：ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清中の重鎖フラグメント含有ポリペプチドの免疫検出。
【０１３６】
図７ａ−ｃ、８ａ−ｃおよび９ａ−ｃから、ポリペプチドが一過性で発現されそして培養培地中に分泌されることが推定されうる。免疫グロブリン含有ポリペプチドが１つまたは複数のグリコシル化部位を有する場合、最終ポリペプチドは、正確に規定された分子量を有さず、グリコシル化の程度に依存する分子量分布を有する。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、そのすべてが１つのポリペプチドを表す種が均一には移動せず、従ってバンドはブロードになるということを引き起こす。
【０１３７】
実施例６
ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる発現された重鎖含有ポリペプチドの定量
細胞培養上清中の免疫グロブリン重鎖フラグメント含有ポリペプチド濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。このサンドイッチＥＬＩＳＡは、捕獲試薬としてビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを使用し、そして検出のためにペルオキシダーゼコンジュゲーション化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを使用した。
【０１３８】
ストレプトアビジンコーティングされた９６ウエルプレート（Pierce Reacti-Bind（商標）Streptavidin Coated Polystyrene Strip Plate、コード番号１５１２１，Pierce Chemical Company,USA）を、希釈剤バッファー（希釈剤バッファー：０．５重量／容量％（w/v）ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳバッファー）中の０．５μg/mlビオチン化ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント（（Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃγ＞Ｂｉ；Dianova, Germany, コード番号１０９−０６６−０９８）捕獲抗体（０．１ml／ウエル）で、振とうしながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションすることによりコーティングした。その後、プレートを０．３mlより多くの洗浄バッファー（洗浄バッファー：１重量／容量％（w/v）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ＩｇＧ免疫グロブリンコンジュゲート含有細胞培養上清（サンプル）を希釈剤バッファー中０．５〜２０ng/mlの濃度まで段階（２倍）希釈し、プレートに加えそして振とうしながらＲＴで１時間インキュベーションした。希釈剤バッファー中の精製抗ＩＧＦ−１Ｒ標準抗体（０．５〜２０ng/ml）を、ＩｇＧタンパク質標準曲線の作成のために使用した。プレートを０．３ml／ウエル洗浄バッファーで３回洗浄した後に、ヒトＦｃγに結合した複合体を、ペルオキシダーゼコンジュゲーションされたヤギポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメント［Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃγ＞ＰＯＤ；Dianova, コード番号１０９−０３６−０９８］で検出した。プレートを０．３ml／ウエル洗浄バッファーで３回洗浄した後に、プレートをＡＢＴＳ（登録商標）（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ペルオキシダーゼ基質溶液（Roche Molecular Biochemicals, コード番号１６８４３０２、Roche Diagnostics GmbH, Germany）で発色させた。１０〜３０分後、吸光度をＴｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒｐｌｕｓプレートリーダー（Tecan Deutschland GmbH, Germany）で試薬ブランク（インキュベーションバッファー＋ＡＢＴＳ（登録商標）溶液）に対して４０５nmおよび４９０nmで測定した。バックグラウンド補正のために、式Ｉに従って４９０nmにおける吸光度を４０５nmにおける吸光度から差し引いた。すべてのサンプルを少なくとも二連でアッセイし、そして二重または三重の吸光度測定値からの値を平均した。サンプルのＩｇＧ含量を標準曲線から計算した。
【数１】
2009509558.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＩｇＧクラスの免疫グロブリンの一般的構造。
【図２】抗ＩＧＦ−１Ｒγ１重鎖発現ベクター４８１８のプラスミドマップ。
【図３】抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽鎖発現ベクター４８０２のプラスミドマップ。
【図４】γ１重鎖定常領域遺伝子ベクター４９６２のプラスミドマップ。
【図５】改変抗ＩＧＦ−１Ｒκ軽鎖発現ベクター４９６４のプラスミドマップ。
【図６】改変抗ＩＧＦ−１Ｒ軽鎖発現ベクター４９６３のプラスミドマップ。
【図７ａ】アフィニティー精製された免疫グロブリンコンジュゲートのクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；表６に従うサンプル配置。
【図７ｂ】アフィニティー精製された免疫グロブリンコンジュゲートのクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；表６に従うサンプル配置。
【図７ｃ】アフィニティー精製された免疫グロブリンコンジュゲートのクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；表６に従うサンプル配置。
【図８ａ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清における軽鎖の免疫検出；表６に従うサンプル配置。
【図８ｂ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清における軽鎖の免疫検出；表６に従うサンプル配置。
【図８ｃ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清における軽鎖の免疫検出；表６に従うサンプル配置。
【図９ａ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清における重鎖の免疫検出；表６に従うサンプル配置。
【図９ｂ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清における重鎖の免疫検出；表６に従うサンプル配置。
【図９ｃ】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞における一過性発現の後の細胞培養上清における重鎖の免疫検出；表６に従うサンプル配置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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