(57)【要約】  優性の機能獲得型遺伝子によって引き起こされる疾患は、1つの突然変異体と1つのその遺伝子の野生型コピーを有するヘテロ接合体に生じる。野生型遺伝子がしばしば重要な機能を果たす一方、突然変異遺伝子は毒性を有するので、あらゆる治療方法は、野生型遺伝子の発現を維持しつつ、突然変異を選択的に阻害するものでなければならない。本発明は、ＲＮＡｉを用いて、共発現する野生型対立遺伝子の発現を保存しつつ、突然変異対立遺伝子の発現を特異的に阻害するための方法、優性の機能獲得型遺伝子突然変異に関連する疾患の治療方法を含む。本発明は、突然変異を選択的に抑制するが野生型に対してはしない、遺伝型筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を引き起こす銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子の発現を抑制する、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。本発明はさらに、有効性と特異性を高め、ＲＮＡｉを媒介する、非対称のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡをさらに提供する。
2009509548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｈＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する能力を高めるための方法であって、
（ｉ）少なくとも２１ヌクレオチド長のアンチセンスステム部分と、センスステム部分とを含む二本鎖ステムを含むｓｈＲＮＡを提供するステップと；
（ｉｉ）前記ｓｈＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を高めるように、前記ステムの非対称性高めるステップと；
を含む、方法。
【請求項２】
前記非対称性は、アンチセンス鎖部分の５’末端における塩基対と、センス鎖部分の３’末端の対応する塩基対と間の塩基対の力を弱めることによって高められる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンチセンス鎖部分の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間のＧ：Ｃ塩基対が、アンチセンス鎖部分の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間より少ないために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンチセンス鎖部分の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に、少なくとも１つのミスマッチの塩基対があるために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ミスマッチの塩基対は、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ミスマッチの塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、およびＵ：Ｕからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ミスマッチの塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、およびＵ：Ｔからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
アンチセンス鎖部分の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に、少なくとも１つのゆらぎ塩基対があるために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ゆらぎ塩基対は、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゆらぎ塩基対はＧ：Ｕである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゆらぎ塩基対はＧ：Ｔである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
希少ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対によって、前記塩基対の力は弱められる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記希少ヌクレオチドは、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記希少ヌクレオチドは、イノシン（Ｉ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ、およびＩ：Ｃからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
修飾されたヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対のために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾されたヌクレオチドは、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾されたヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ、および２，６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｓｈＲＮＡは、機能獲得型の突然変異対立遺伝子に標的化される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２１ヌクレオチド長のアンチセンスステム部分と、センスステム部分とを含む二本鎖ステムを含む非対称ｓｈＲＮＡであって、アンチセンス鎖部分の５’末端における塩基対が、センス鎖部分の３’末端の対応する塩基対と間の塩基対の力より弱い、非対称ｓｈＲＮＡ。
【請求項２１】
アンチセンス鎖部分の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間のＧ：Ｃ塩基対が、アンチセンス鎖部分の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間より少ないために、前記塩基対の力は弱められ、
前記非対称性は、アンチセンス鎖部分の５’末端における塩基対と、センス鎖部分の３’末端の対応する塩基対と間の塩基対の力を弱めることによって高められる、請求項２０に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２２】
アンチセンス鎖部分の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に、少なくとも１つのミスマッチの塩基対があるために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２３】
前記ミスマッチの塩基対は、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項２２に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２４】
前記ミスマッチの塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、およびＵ：Ｕからなる群から選択される、請求項２２に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２５】
前記ミスマッチの塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、およびＵ：Ｔからなる群から選択される、請求項２２に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２６】
アンチセンス鎖部分の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に、少なくとも１つのゆらぎ塩基対があるために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２７】
前記ゆらぎ塩基対は、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項２６に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２８】
前記ゆらぎ塩基対はＧ：Ｕである、請求項２６に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項２９】
前記ゆらぎ塩基対はＧ：Ｔである、請求項２６に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３０】
希少ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対によって、前記塩基対の力は弱められる、請求項２１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３１】
前記希少ヌクレオチドは、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項３０に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３２】
前記希少ヌクレオチドは、イノシン（Ｉ）である、請求項３０に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３３】
前記塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ、およびＩ：Ｃからなる群から選択される、請求項３０に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３４】
修飾されたヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対のために、前記塩基対の力は弱められる、請求項２１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３５】
前記修飾されたヌクレオチドは、アンチセンス鎖部分の５’末端から３位に導入されている、請求項３４に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３６】
前記修飾されたヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ、および２，６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される、請求項３４に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３７】
前記ｓｈＲＮＡは、機能獲得型の突然変異対立遺伝子に標的化される、請求項２１乃至３６のいずれかに記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３８】
前記対立遺伝子は、優性の機能獲得型突然変異に関連する障害と相関している、請求項３７に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項３９】
前記障害が、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項３８に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４０】
前記疾患が、筋萎縮性側策硬化症である、請求項３９に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４１】
前記対立遺伝子は、ＳＯＤ１である、請求項４０に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４２】
前記突然変異対立遺伝子は、点突然変異である、請求項４１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４３】
前記点突然変異は、グアニン：シトシン突然変異である、請求項４２に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４４】
前記突然変異はＧ２５６Ｃである、請求項４２に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４５】
前記突然変異はＧ２８１Ｃである、請求項４２に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４６】
前記ｓｈＲＮＡは、Ｓ１−２１、Ｓ２−２１、Ｓ３−２１、およびＳ４−２１からなる群から選択される、図１４に記載の配列を含む、ｓｈＲＮＡ。
【請求項４７】
前記ｓｈＲＮＡがＳ３−２１である、請求項４６に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項４８】
請求項２１乃至４７のいずれかに記載のｓｈＲＮＡを含む、ｓｈＲＮＡの細胞への移行を促進するために作られた、組成物。
【請求項４９】
請求項２１乃至４８のいずれかに記載のｓｈＲＮＡをコードする、作製物。
【請求項５０】
請求項２１乃至４８のいずれかに記載のｓｈＲＮＡを含む、薬学的組成物。
【請求項５１】
遺伝子の少なくとも２つの異なる対立遺伝子を含む標的対立遺伝子の細胞中での発現を阻害する方法であって、前記方法は、該細胞に請求項２１乃至４８のいずれかに記載のｓｈＲＮＡを導入するステップを含む、方法。
【請求項５２】
前記ｓｈＲＮＡは、前記細胞中で作製物から発現される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞を前記ｓｈＲＮＡに接触させることによって、前記ｓｈＲＮＡは前記細胞に導入する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
優性の機能獲得型突然変異の存在に相関した障害に罹患している被検体を治療する方法であって、前記方法は、前記被験体に対して、治療的有効量の、請求項３７に記載のｓｈＲＮＡ、または前記ｓｈＲＮＡをコードする作製物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５５】
前記障害が、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、筋萎縮性側策硬化症である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記対立遺伝子は、ＳＯＤ１である、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本願明細書は、２００２年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６０／４２３，５０７号「Allele-Specific RNA Interference（対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉）」および２００３年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／４８８，２８３号「Allele-Specific RNA Interference（対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉）」の部分継続出願である、２００３年１１月４日に出願された共係属中の米国実用新案出願第１０／７００，８１６号「Allele-Specific RNA Interference（対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉）」の部分継続出願である、２００５年９月３０日に出願された共係属中の米国実用新案出願第１１／２４１８７３号「Allele-Specific RNA Interference（対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉）」の継続出願である。参照された特許仮出願の内容全体は、引用をもって本願明細書に援用するものとする。
【０００２】
連邦政府の資金による研究に関する記載
米国政府は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された認可番号ＧＭ６２８６２およびＧＭ５３８７４、ならびに国立神経疾患・卒中研究所（ＮＩＮＤＳ）により授与された認可番号ＮＳ３５７５０およびＮＳ４１７３９−０１にしたがった本願発明の一定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
背景
優性の機能獲得型遺伝子によって引き起こされる疾患は、１つの突然変異体と、１つのその遺伝子の野生型コピーを有するヘテロ接合体に生じる。この種の疾患で最も知られるものの一部は、共通の神経変性疾患で、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ; 「ルー・ゲーリック病」）が含まれる（Taylor et al., 2002）。これらの疾患では、突然変異タンパク質が細胞変性を引き起こす正確な経路は明らかになってはいないが、突然変異タンパク質となる細胞毒性の起源は知られている。
【０００４】
ＳＯＤ１における突然変異は運動ニューロンの変性をきたし、ＡＬＳを引き起こす。それは、前記突然変異タンパク質がいくらかの毒性を獲得したためである（Cleveland et al., 2001）。この毒性の性質も、最終的に運動ニューロンの変性に至る下流経路も、解明されていない。マウスでは、突然変異体ＳＯＤ１の発現だけでなく、遺伝子ノックアウトによるＳＯＤ１の削除がＡＬＳを引き起こす。しかし、遺伝子ノックアウトマウスは、繁殖性の減少（Matzuk et al., 1990）、運動軸索障害（Shefner et al., 1999）、蝸牛有毛細胞の加齢に関連する喪失（McFadden et al., 2001）、および神経筋接合部シナプス（Flood et al.,1999）を含む様々な異常、ならびに、ＣＮＳおよびその他の系への、興奮毒性、虚血、神経毒、および放射線照射など各種の有害な攻撃への高い感受性を生じる（Matz et al., 2000; Kondo et al., 1997; Kawase et al., 1999; Behndig
et al., 2001）。突然変異種の毒性、および野生型タンパク質の機能的重要性を考えると、この疾患のための理想的な治療法は、前記突然変異タンパク質の発現を選択的に阻害する一方で野生型の発現を維持することである。
【０００５】
発明の概略
本発明は、優性の機能獲得型疾患を治療する新規の方法に関する。特に、本発明は、機能獲得型遺伝子から転写された突然変異ｍＲＮＡを選択的に破壊し、それにより、そのような遺伝子によってコードされる突然変異タンパク質の産生を抑制する方法を提供する。本発明は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の両方が、例えば、Ｇ８５Ｒ
ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ ＳＯＤ１などの突然変異対立遺伝子の発現を選択的に阻害する一方で、単一ヌクレオチド特異性で前記野生型タンパク質の発現を阻害するようにデザインすることができるという発見に、部分的に基づいている。
【０００６】
本願発明の方法は、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子にある点突然変位など、突然変異遺伝子における単一の対立遺伝子に生じる選択的な点変異に対して、ＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）を用いる。ＲＮＡｉは広範な真核生物の遺伝子発現を、標的遺伝子への配列類似性を有する短い二本鎖ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとよばれる）を導入することによって配列選択的抑制を媒介する（Caplen et al., 2001; Elbashir et al.2001c）。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いて、例えば、ＳＯＤ１突然変異タンパク質などの毒性突然変異遺伝子の発現を選択的にサイレンシングし、それにより野生型ＳＯＤ１対立遺伝子を継続的に機能させることができる。
【０００７】
本発明はまた、例えば、in vivoなどにおいて細胞で発現する場合、細胞自体のＲＮＡｉ経路を用いて標的遺伝子の突然変異対立遺伝子を選択的にサイレンシングする標的ｓｉＲＮＡを生じるように細胞によって処理された、新規の人為的操作ＲＮＡ前駆体の発見に基づく。これらの操作されたＲＮＡ前駆体をコードする核酸分子を、in vivoにおいて適切な調節配列（例えば、プラスミドなどのベクターにある導入遺伝子）を用いて細胞に導入することによって、操作されたＲＮＡ前駆体の発現は、時間的および空間的に、すなわち、特定の時間および／または特定の組織、器官、または細胞において選択的に制御することができる。
【０００８】
ある局面では、本発明は、遺伝子の少なくとも２つの異なる対立遺伝子を含む、細胞中の標的対立遺伝子の発現を、前記標的対立遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを前記細胞に投与することによって阻害する方法を特徴とする。ある実施態様では、前記標的対立遺伝子は、優性の機能獲得型突然変異に関連する障害と相関する。別の実施態様では、前記障害は筋萎縮性軸索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、またはパーキンソン病である。
【０００９】
別の局面では、本発明は、優性の機能獲得型突然変異対立遺伝子の存在と相関する疾患を有する被験体を治療するための方法であって、当該方法は、前記突然変異対立遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡの治療的有効量を、前記被験体に投与するステップを含む方法を特徴とする。ある実施態様では、前記ｓｉＲＮＡは機能獲得型突然変異を標的とする。別の実施態様では、前記障害は筋萎縮性軸索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、またはパーキンソン病である。
【００１０】
ある実施態様では、前記疾患は筋萎縮性軸索硬化症である。さらなる実施態様では、前記対立遺伝子はＳＯＤ１突然変異対立遺伝子である。
【００１１】
ある実施態様では、前記ｓｉＲＮＡは突然変異ＳＯＤ１対立遺伝子（配列番号：８）を標的とし、好ましくはＰ１０（配列番号：４）、次に好ましくはＰ９（配列番号：２）、次に好ましくはＰ１１（配列番号：６）を有する図１Ａに記載の突然変異ｓｉＲＮＡ配列を含む、またはそれから成る。
【００１２】
別の実施態様では、前記ｓｉＲＮＡ（例えば、制御ｓｉＲＮＡ）は野生型ＳＯＤ１対立遺伝子を標的とし、好ましくはＰ９（配列番号：１４）またはＰ１０（配列番号：１２）、次に好ましいのはＰ１１（配列番号：１０）を有する図１Ａに記載の野生型ｓｉＲＮＡ配列を含む、またはそれから成る。
【００１３】
別の局面では、本発明は、図１Ａに記載の配列を含むｓｉＲＮＡを提供する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、図１Ａに記載の配列（配列番号４）を含むｐ１０突然変異ｓｉＲＮＡを提供する。
【００１５】
別の局面では、本発明は、図１Ａに記載の配列（配列番号：２）を含むｐ９突然変異ｓｉＲＮＡを提供する。
【００１６】
別の局面では、本発明は、図３Ａに記載の配列（配列番号：１６）を含むＧ９３Ａ ＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡ、および本発明のｓｈＲＮＡを含む発現作製物を提供する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを含む治療用組成物、および薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００１８】
別の局面では、本発明は、高い特異性および有効性でＲＮＡｉ干渉（例えば、対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉）を媒介することが可能な非対称ＲＮＡｉ作用物質（例えば、非対称ｓｈＲＮＡ）を提供する。
【００１９】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子の突然変異は、筋萎縮性側策硬化症のサブセット、運動ニューロンの変性を来たす神経変性疾患、麻痺および死を引き起こす（Brown and Robberecht, 2001; Siddique and Lalani, 2002）。突然変異ＳＯＤ１が毒性を獲得することによって運動ニューロン変性を引き起こすことは、既知である（Cleveland and Rothstein, 2001）。しかし、この毒性の分子基礎も、運動ニューロンの死滅を来たす機序も、いずれも解明されていない。疾患の機序の理解が不十分なことから、合理的なデザインの治療法が着実で有効な転帰を生じたことがない。その一方で、運動ニューロンを死滅させる毒性が突然変異したタンパク質に起因することから（Cleveland and Rothstein, 2001）、突然変異タンパク質の減少によって、その疾患を緩和または予防できるはずである。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を用いてこの目的を達成することができる。
【００２１】
本発明は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが突然変異対立遺伝子の発現を選択的に阻害できるという発見であって、例えば、ＡＬＳと相関するＳＯＤ１の突然変異など、特定の突然変異についてのケースに見られるとおり、突然変異ｍＲＮＡと野生型との違いが１ヌクレオチドだけの場合であっても阻害できるという発見に基づく。これらの方法は、ＡＬＳに限定しないがそれを含む、優性で機能獲得型の遺伝子突然変異によって生じる疾患の治療に適用することができる。本発明のｓｉＲＮＡは、1ヌクレオチドの識別、およびその標的遺伝子の発現の選択的下方制御を可能にする。
【００２２】
本発明の方法は、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子の中ある点突然変位など、突然変異遺伝子における単一の対立遺伝子に生じる選択的な点変異に対して、ＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）を用いる。ＲＮＡｉは多様な真核生物の遺伝子発現を、標的遺伝子への配列相同性を有する短い二本鎖ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとよばれる）を導入することによって配列選択的に抑制するのを媒介する（Caplen et al., 2001; Elbashir et al.2001c）。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いて、例えばＳＯＤ１突然変異タンパク質などの毒性突然変異遺伝子の発現を選択的にサイレンシングし、それにより野生型ＳＯＤ１対立遺伝子を継続的に機能させることができる。
【００２３】
遺伝子発現の配列選択的、転写後不活性化は、ＲＮＡｉと呼ばれる現象である、標的遺伝子に相当する二本鎖ＲＮＡの導入によって、多様な原核生物に実現させることが可能である（Hutvagner and Zamore, 2002; Hannon, G. J., 2002; McManus and Sharp,
2002）。ＲＮＡｉの方法論は、培養哺乳動物細胞にも拡張されている（Caplen et al, 2001; Elbashir et al., 2001）。このアプローチは、ＲＮＡｉ経路の中間体であるｓｉＲＮＡが、当該ｓｉＲＮＡ配列に相当するｍＲＮＡの分解を引き起こすことがあるという発見を活用している。さらに、in vivoにおいて転写されたｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡステムの配列に相補的な標的ＲＮＡの分解を引き起こすことがある。それは、細胞内でｓｈＲＮＡがｓｉＲＮＡに加工されるためである（Paul et al., 2002; Lee et al., 2002; Paddison et al., 2002; Sui et
al., 2002; Yu et al., 2002; McManus et al., 2002; Zeng et al., 2002;
Brummelkamp et al., 2002; Miyagishi et al., 2002; Jacque et al., 2002）。本願出願人らは、ｓｉＲＮＡ 二本鎖またはｓｈＲＮＡを発現するウイルスを用いて、突然変異体率遺伝子の発現を選択的に阻害しながら、同時に発現する野生型対立遺伝子の発現を保護することができることを実証する。
【００２４】
ＡＬＳ関連ＳＯＤ１突然変異の大半は、1アミノ酸の変化を生じる1ヌクレオチド点変異である（ＡＬＳ遺伝子（ＳＯＤ１、ＡＬＳなど）突然変異のＡＬＳオンラインデータベース）。したがって、突然変異体の発現だけを選択的にサイレンシングを生じさせ、野生型にはサイレンシングを生じさせないために、1ヌクレオチド特異性が必要である。本願出願人らは、哺乳動物細胞において1ヌクレオチドの認識が実現可能であることを証明している。
【００２５】
本発明をより容易に理解するため、まず特定の用語を定義する。
【００２６】
「単離された核酸分子または配列」は、由来する生物の天然のゲノムにおいて、（片方は５’末端でもう片方が３’末端に）ただちに連続するコード配列の両側に、ただちに連続しない核酸分子または配列である。したがって、当該用語には、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、または他の配列からは独立した分離可能な分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。また、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含まれる。
【００２７】
「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有結合したプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を意味する。例示的なヌクレオシドには、アデノシン、グアシン、シチジン、ウリジン、およびチミジンが含まれる。さらなる例示的なヌクレオシドには、イノシン、１−メチルイノシン、シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、および２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシン（「稀少」ヌクレオシドともよばれる）が含まれる。「ヌクレオチド」という用語は、糖部分にエステル結合したリン酸基を１つ以上有するヌクレオシドを意味する。例示的なヌクレオチドには、１リン酸ヌクレオシド、２リン酸ヌクレオシド、および３リン酸ヌクレオシドが含まれる。「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、本願明細書では交換可能に用いられ、５’および３’炭素原子の間のホスホジエステル結合によって結合したヌクレオシドのポリマーを意味する。
【００２８】
「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドのポリマーを意味する。「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。ＤＮＡおよびＲＮＡは自然に合成することができる（例えば、それぞれＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写によって）。ＲＮＡは転写後に修飾されることができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは化学的にも合成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは1本鎖であっても（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ）、または多重鎖（例えば二本鎖、すなわちそれぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であってもよい。「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する1本鎖ＲＮＡである。この情報は、リボソームがｍＲＮＡに結合する際にタンパク質合成中に翻訳される。
【００２９】
操作されたＲＮＡ前駆体、または操作された核酸分子の中などに使われる「操作された」という用語は、その前駆体または分子が天然には認められず、その前駆体または分子の核酸配列全体または一部分が人工的に作成された、または選択されたものであることを示す。一旦創製または選択されると、その配列は、細胞内のメカニズムによって複製、翻訳、転写やその他の処理を受けることができる。したがって、組換え核酸分子を含む導入遺伝子から細胞内で産生されたＲＮＡ前駆体は組換えＲＮＡ前駆体である。
【００３０】
本願明細書に記載の「小干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）という用語（当業で「短干渉ＲＮＡ」ともいう）は、ＲＮＡ干渉を方向付けるまたは媒介する能力のある約１０乃至５０ヌクレオチドを含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を意味する。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、約１５乃至３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、さらに好ましくは約１６乃至２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、よりさらに好ましくは約１８乃至２３ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）および、よりさらに好ましくは約１９乃至２２ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。「短分子」ｓｉＲＮＡとは、例えば１９、２０、２１、または２２ヌクレオチドなど、約２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む、ｓｉＲＮＡを意味する。「長分子」ｓｉＲＮＡとは、例えば２３、２４、２４、または２６ヌクレオチドなど、約２４乃至２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む、ｓｉＲＮＡを意味する。短いｓｉＲＮＡほどＲＮＡｉを媒介する能力を維持しているとすると、短分子ｓｉＲＮＡには、例えば１６、１７、または１８ヌクレオチドなど、１９ヌクレオチド未満が含まれてよい。同様に、長ｓｉＲＮＡは、短ｓｉＲＮＡに対して、例えば酵素的処理など、ＲＮＡｉが不在のさらなる処理を媒介する能力を維持しているとすると、ある場合には、長分子ｓｉＲＮＡには２６ヌクレオチド超が含まれてもよい。
【００３１】
「ヌクレオチド類似体」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、標準的ではないヌクレオチドを意味する。好ましいヌクレオチド類似体は、任意の位置を修飾し、ヌクレオチドの特定の化学的特性を変えつつ、核酸類似体の目的の機能を実行する能力を維持できるようにする。誘導可能なヌクレオチドの位置の例には、例えば，５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなどの５位、例えば、６−（２−アミノ）プロピルウリジンなどの６位、例えば、８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどのアデノシンおよび／またはグアノシンの８位が含まれる。ヌクレオチド類似体も、例えば７−デアザアデノシンなどのデアザヌクレオチド、Ｏ−およびＮ修飾（例えばアルカリ化、例えばＮ６−メチルアデノシン、またはその他の当業に知られる）ヌクレオチド、および例えばHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10（4）:297-310に記載されているなどのその他の複素環修飾ヌクレオチド類似体も含まれる。
【００３２】
ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの糖部分への修飾も含んでもよい。例えば、２’ＯＨ基はＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、またはＯＲであって、当該化学基においてＲは置換または非置換Ｃ１乃至Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどから選択される化学基と置換してもよい。その他の可能な修飾には、米国特許第５，８５８，９８８号および６，２９１，４３８号に記載されているものが含まれる。
【００３３】
ヌクレオチドのリン酸基は、例えば、リン酸基の1つ以上の酸素を硫黄で置換する（例えば、ホスホロチオ酸）ことにより、またはヌクレオチドが、例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10（2）:117-21、Rusckowski et
al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10（5）:333-45、 Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001
Oct. 11（5）: 317-25、 Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11（2）:77-85、 および米国特許第５，６８４，１４３号などに記載される目的の機能を実施できるようなその他の置換を行うことによって修飾してもよい。上に参照した修飾の一部は、好ましくは、例えば、in vivo またはin vitroにおいて前記類似体を含むポリヌクレオチドの加水分解速度を低減させる。
【００３４】
本願明細書に記載の、例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖など、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤の「アンチセンス鎖」という用語は、例えば、サイレンシングのターゲットである遺伝子のｍＲＮＡの約１５乃至３０、１６乃至２５、１８乃至２３または１９乃至２２ヌクレオチドなど、約１０乃至５０ヌクレオチドの部分に実質的に相補的な鎖を意味する。第１の鎖のアンチセンス鎖は、例えば、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによる望ましい標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な相補性など、標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を方向付ける望ましい標的ｍＲＮＡ配列に十分相補的な配列を有する。例えばｓｉＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖など、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤の「センス鎖」または「第２の鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第１の鎖に相補的な鎖を意味する。アンチセンスまたはセンス鎖は、第１鎖または第２鎖とも呼ばれ、標的配列に相補性を有する第１鎖または第２鎖、および前記第１鎖または第２鎖に相補性を有する第２鎖または第１鎖である。
【００３５】
本願明細書に記載の「ガイド鎖」という用語は、例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖など、ＲＮＡｉ剤の鎖であって、ＲＩＳＣ複合体に進入し、標的ｍＲＮＡの切断を方向付ける、鎖を意味する。
【００３６】
本明細書において用いられている「非対称」という語は、ＲＮＡi剤（例えば、ｓｈＲＮＡのステム）の二本鎖領域の非対称性におけるように、ＲＮＡi剤（例えば、第１の鎖もしくはステム部分上の末端ヌクレオチドと対抗する第２の鎖もしくはステム部分上の末端ヌクレオチドとの間）の末端間の結合力または塩基対の強度が等しくなく、二本鎖のうちの１つの鎖の５’末端は、相補鎖の５’末端と比べて、一時的に対になっていない、例えば、一本鎖中にある頻度がより高くなることを意味する。この構造的相違は、二本鎖中の１つの鎖が優先的にＲＩＳＣ複合体に組み込まれていることを示している。５’末端が相補鎖に対してしっかりと対をなしていない鎖が、ＲＩＳＣおよび媒介ＲＮＡｉに組み込まれることになるであろう。
【００３７】
本明細書において用いられている「結合力」または「塩基対の結合強度」は、オリゴヌクレオチド二本鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖）の対抗する鎖上の、主としてＨ結合、ファン・デル・ワールス相互作用などによるヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の相互作用の強度を意味する。
【００３８】
本願明細書に記載のアンチセンス鎖の５’末端としての「５’末端」は、例えばアンチセンス鎖の５’末端における１乃至約５ヌクレオチドなどの５’末端ヌクレオチドを意味する。本願明細書に記載のセンス鎖の３’末端としての「３’末端」は、例えば相補的アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドに相補的な１乃至約５ヌクレオチドの領域などの、領域を意味する。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体の短いポリマーを意味する。「ＲＮＡ類似体」という用語は、相当する未改変または未修飾ＲＮＡと比較して少なくとも1つの改変またな修飾ヌクレオチドを有するが、前記の相当する未改変または未修飾ＲＮＡと同一のまたは類似する性質または機能を保持する、ポリヌクレオチド（例えば、化学合成されたポリヌクレオチドなど）を意味する。上述の通り、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子と比較してＲＮＡ類似体の加水分解が低速度になる結合で結合していてよい。例えば、前記類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミド酸、ホスホロアミド酸、および／またはホスホロチオ酸結合を含んでよい。好ましいＲＮＡ類似体には、糖および／または骨格修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。そのような改変または修飾にはさらに、ＲＮＡ末端または内部などへの非ヌクレオチド物質の付加（ＲＮＡの1つ以上のヌクレオチド）が含まれる。ＲＮＡ類似体は、ＲＮＡ干渉を媒介する能力を有する天然のＲＮＡに十分類似しているだけでよい。
【００４０】
本願明細書ににおいて用いられている、「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）という用語は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を意味する。ＲＮＡｉ
は、細胞内で外来のＲＮＡ（例えば、ウイルス性ＲＮＡ）を除去するため自然に生じる。天然のＲＮＡｉは、分解メカニズムをその他の同様のＲＮＡ配列に方向付ける遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片によって進行する。別法として、ＲＮＡｉは、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングさせるなど、人工的に開始させることもできる。
【００４１】
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を方向付ける望ましい標的ｍＲＮＡ配列に十分相補的な配列」である鎖を有するＲＮＡｉ作用剤は、その鎖がＲＮＡｉ機構またはプロセスによる、標的ｍＲＮＡの破壊を惹起するのに十分な配列を有することを意味する。
【００４２】
本願明細書において用いられている「単離されたＲＮＡ」（例えば、「単離されたｓｉＲＮＡ」または「単離されたｓｉＲＮＡ前駆体」）という用語は、組換え技術によって生成した場合には、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合には、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない、ＲＮＡ分子を意味する。
【００４３】
「標的遺伝子」は、発現が選択的に阻害または「サイレンシング」されている遺伝子である。このサイレンシングは、細胞のＲＮＡｉシステムによって、操作されたＲＮＡから創製されたｓｉＲＮＡによる、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断によって実現する。ＲＮＡ前駆体の二本鎖ステムの一部分またはセグメントは、標的遺伝子のｍＲＮＡの約１８乃至約４０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの部分に、例えば完全に相補的など、相補的なアンチセンス鎖である。
【００４４】
本願明細書において用いられている「導入遺伝子」という用語は、細胞内に人為的に挿入した任意の核酸分子を意味する。そのような導入遺伝子には、トランスジェニック生物に部分的または完全に非相同的（すなわち外来性）である遺伝子を含むこともある。「導入遺伝子」という用語はまた、例えば、ＤＮＡなどの選択された1つ以上の核酸配列であって、その核酸配列は、例えば動物などのトランスジェニック生物に発現させるために１つ以上の操作されたＲＮＡ前駆体をコードする核酸配列であって、その生物は部分的または完全にトランスジェニック動物に非相同的または外来性であるか、またはトランスジェニック動物の内因性遺伝子に相同的であるが、天然遺伝子とは異なる部分にある前記動物のゲノムに挿入するようにデザインされたトランスジェニック生物である、核酸配列を意味する。導入遺伝子には、1つ以上のプロモーター、および特定の核酸配列の発現に必要なイントロンなどのその他の任意のＤＮＡであって、すべて特定の配列に機能的に連結されているプロモーターまたはその他の任意のＤＮＡが含まれ、およびエンハンサー配列が含まれてもよい。
【００４５】
疾患または障害に「関与する」遺伝子には、前記疾患または障害もしくは前記疾患または障害の少なくとも1つの症状に作用するまたはそれを生じる、正常なまたは異常な発現または機能の遺伝子が含まれる。
【００４６】
「発現の対立遺伝子特異的阻害」とは、例えば両方の対立遺伝子が同一の細胞に存在する場合など、1つの対立遺伝子の発現をもう1つの対立遺伝子の発現よりも著しく阻害する能力を意味する。例えば、その対立遺伝子は１、２、３またはそれ以上のヌクレオチドが異なっていてもよい。ある場合には、１つの対立遺伝子は、例えば、優性の機能獲得型突然変異に相関する疾患など、疾患の原因に関連する。
【００４７】
本願明細書において用いられている「機能獲得型突然変異」という用語は、遺伝子中の任意の突然変異であって、当該突然変異において、前記遺伝子によってコードされたタンパク質（つまり突然変異タンパク質）は、通常、タンパク質（つまり野生型タンパク質）に関連していない機能を獲得するか、または疾患もしくは障害を引き起こすまたはそれに寄与する機能を獲得する、突然変異を意味する。機能獲得型突然変異は、コードされたタンパク質の機能に変化を来たす、遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、もしくは置換、またはヌクレオチドであってよい。ある実施態様では、機能獲得型突然変異は、前記突然変異の機能を変更するか、またはその他のタンパク質と相互作用を引き起こす。別の実施態様では、機能獲得型突然変異は、例えば、改変した突然変異タンパク質と前記正常野生型タンパク質との相互作用によって、正常野生型タンパク質の減少、または除去を引き起こす。
【００４８】
「細胞または有機体における遺伝子機能の検証」という文言は、そこから生じる発現、活性、機能、または表現型の検証または研究を意味する。
【００４９】
本発明の様々な方法論には、本願明細書では「適切な対照」とも交換可能な意味である「好適な対照」と、価値、レベル、特色、特徴、性質などとの比較に関与するステップを含む。「好適な対照」または「適切な対照」は、比較の目的で有用な当業者が精通している任意の対照または標準である。ある実施態様では、「好適な対照」または「適切な対照」は、本願明細書に記載の通り、ＲＮＡｉ方法論を実行する前に決定する、価値、レベル、特色、特徴、性質などである。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または性質、ゲノタイプ、表現型などは、細胞または生物に本発明のＲＮＡｉを導入する前に決定することができる。別の実施態様では、「好適な対照」または「適切な対照」は、細胞、または例えば正常な形質を示す対象、または正常細胞もしくは生物などの生物において決定される価値、レベル、特色、特徴、性質などである。さらに別の実施態様では、「好適な対照」または「適切な対照」は、予め決定された価値、レベル、特色、特徴、性質などである。
【００５０】
発他に定義のない限り、本願明細書に用いられたすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。本願明細書に記載のものに類似するまたはそれに相当する方法および材料は、本発明の実施またはテストに用いることができ、好適な方法および材料を以下に説明する。
本願明細書に引用されるすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体を引用によりここに援用する。紛争の場合、定義を含む本願明細書が支配するだろう。さらに、当該材料、方法、および例は、実例のみで、制限を意図しない。
【００５１】
本発明のさまざまな局面は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
【００５２】
Ｉ．機能獲得型障害
機能獲得型障害は、機能獲得型突然変異によって特徴づけられる疾患または障害のクラスである。本明細書において用いられているところの用語「機能獲得型突然変異」は、前記遺伝子によってコードされたタンパク質（すなわち、突然変異タンパク質）が当該タンパク質（すなわち、野生型タンパク質）に正常に関連しない機能を獲得し、疾患もしくは障害を引き起こす、またはそれに寄与する、あらゆる突然変異を意味する。機能獲得型突然変異は、コードされたタンパク質の機能に変化を来たす、遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、もしくは置換、またはヌクレオチドであってよい。ある実施態様では、機能獲得型突然変異は、前記突然変異の機能を変更するか、またはその他のタンパク質と相互作用を引き起こす。別の実施態様では、機能獲得型突然変異は、例えば、改変した突然変異タンパク質と前記正常野生型タンパク質との相互作用によって、正常野生型タンパク質の減少、または除去を引き起こす。さらに別の実施態様においては、本発明の疾患または障害は、機能獲得型突然変異によって引き起こされる神経変性疾患を含む。例えば、筋萎縮性側策硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびパーキンソン病がＳＯＤ１、アミロイド前駆体タンパク質、すなわち、ＡＰＰ（Ikezu et al, EMBO J., （1996）, 15（10）:2468-75を参照されたい）、ハンチントン、すなわち、ｈｔｔ（Rubinsztein, Trends Genet., （2002）, 18（4）:202-9を参照されたい）、およびアルファシヌクレイン（例えば、Cuervo et al., Science, （2004）, 305（5688）: 1292-5を参照されたい）をそれぞれコードする遺伝子中の機能獲得型突然変異に関連する。別の実施態様では、本発明の疾患または障害は、癌遺伝子中の機能獲得型突然変異によって引き起こされる神経変性疾患、例えば、癌遺伝子（例えば、ret-1）中の突然変異によって引き起こされる癌、例えば、胃腸癌、内分泌腫瘍、延髄甲状腺腫瘍、副甲状腺ホルモン腫瘍、多発性内分泌腺腫瘍ＩＩ型、などが含まれる。特に好ましい実施態様においては、本発明の疾患または障害は、筋萎縮性側策硬化症である。  
【００５３】
Ａ．筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）
筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）は、ルー・ゲーリック病としても知られ、大脳皮質、脳幹、および脊髄の運動ニューロンが関与する、進行性、致死性の神経変性障害である（Hirano, A., 1996, Neurology 47 （Suppl. 2）, S63-S66）。この疾患は、例えばＳＯＤ１など、前記遺伝子の1つの突然変異種と1つの野生型コピーを有するヒトにおいて生じる、優性の機能獲得型遺伝子によって引き起こされる。ＳＯＤ１突然変異を引き起こすＡＬＳは、前記タンパク質中の1つのアミノ酸を変化させる1ヌクレオチド点突然変異である。この疾患はさらに、進行性の運動ニューロン変性によって特徴づけられ、麻痺、運動神経および呼吸機能の完全喪失、および最終的には最初の臨床徴候の出現から２乃至８年（発症後の平均期間は３年）に死に至るＡＬＳは、患者の１０％が遺伝子に由来しており、症例の９０％が特発性である。染色体２１
ｑ２２−１に位置する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子における点突然変異は、家族性の症例の２０％の病変に関与している（Rosen et al., 突然変異s in Cu/Zn
superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral
sclerosis, Nature, 362, 59-62, 1993, review in Rowland, Amyotrophic lateral
sclerosis: Human challenge for neuroscience, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,
1251-1253, 1995）。したがって、欠陥のあるＳＯＤ１は、運動ニューロン死に関連しており、家族性筋萎縮性側策硬化症の理解および可能な治療についての示唆を有する。
【００５４】
ｉ．ＳＯＤ１遺伝子
ＳＯＤ１は、銅原子1個、亜鉛原子1個を含む金属酵素で、ホモ二量体として細胞質の中に存在している。銅は酵素活性に必要であり、その一方で亜鉛はタンパク質の構造を安定化させる（Fridovich, 1986）。ＳＯＤ１はすべての真核細胞で発現し、マンガン依存性ミトコンドリアＳＯＤ（ＳＯＤ２）および銅／亜鉛細胞外（ＳＯＤ３）を含む、３種類のＳＯＤ酵素のファミリーの1種類である（I Fridovich, 1986,
"Superoxide dismutases," Advances in Enzymology 58: 61-97）。ＳＯＤ１の主な天然の機能は、スーパーオキシドジスムターゼで、スーパーオキシド（Ｏ２−）が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）および酸素に転換する。下流酵素のカタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２を水と酸素に転換する）とともに、ＳＯＤ１は細胞のフリーラジカルを解毒する。この機能の重要性は、生殖性の減退（Matzuk et al., 1998）、運動軸索障害（Shefner et al., 1999）、蝸牛有毛細胞の加齢に関連する喪失（McFadden et al., 2001）、および神経筋接合部シナプス（Flood et al., 1999）を含む、ＳＯＤ１遺伝子が欠損するマウスの様々な異常、ならびに、軸索損傷（Reaume et al., 1996）、虚血（Kondo et al., 1997; Kawase et al., 1999）、溶血血液の曝露（Matz et al., 2000）、および放射線照射（Behndig et al., 2001）など各種の有害な攻撃への高い感受性によって理解される。突然変異タンパク質の毒性、および野生型の機能的重要性を考えると、ＡＬＳの理想的な治療法は、前記突然変異ＳＯＤ１タンパク質の発現を選択的に阻害する一方で野生型ＳＯＤ１タンパク質の発現を維持することである。
【００５５】
本発明は、ＲＮＡｉを用いた突然変異ＳＯＤ１を標的とする。ＲＮＡｉに用いる方法は、突然変異ＳＯＤ１
ｍＲＮＡ内に点突然変異を含有する領域を補完する二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の1本鎖を含む。ｓｉＲＮＡをニューロンに導入後、ｓｉＲＮＡは部分的に巻き戻され、部位特異的にＳＯＤ１ ｍＲＮＡ内に点突然変異を含む領域に結合し、ｍＲＮＡヌクレアーゼを活性化する。このヌクレアーゼはＳＯＤ１ ｍＲＮＡを切断し、突然変異ＳＯＤ１の翻訳を中断させる。細胞は、部分的に切断されたｍＲＮＡを切り離し、その結果、翻訳を妨げるか、または細胞は部分的に翻訳されたタンパク質を切断する。ニューロンは野生型ＳＯＤ１（正常対立遺伝子の）上で生存するため、このアプローチは、突然変異ＳＯＤ１の産生物を除外することによって、突然変異ＳＯＤ１の破壊を防ぐ。
【００５６】
ヒト野生型ＳＯＤ１タンパク質のアミノ酸配列は、図１（配列番号：１８）に記載されている。ヒト野生型ＳＯＤ１遺伝子のコンセンサスヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）は、図２（配列番号：１７）に記載されている。
【００５７】
ｉｉ．ＳＯＤ−１突然変異体遺伝子
１００を超えるＳＯＤ１突然変異が同定されている。これらの突然変異の大半が、アミノ酸のスーパーオキシドジスムターゼの酵素鎖において1アミノ酸の置換を生じる。最も頻発する置換は、アミノ酸鎖の４位で生じるバリンによるアルギニンの置換（Ａｒｇ４Ｖａｌとも書く）であって、1型筋萎縮性側策硬化症を罹患するアメリカ人患者の５０％に生じる。
【００５８】
ＳＯＤ１突然変異は、１型筋萎縮性側策硬化症の症状が始まる年齢、および疾患の進行の速さに影響を与える。例えば、Ａｒｇ４Ｖａｌ突然変異は、生存期間が疾患の発症から２年間未満という、侵攻性の障害を生じる。３７位におけるグリシンのアルギニンへの置換（Ｇｌｙ３７Ａｒｇ）は、疾患の発症は早期だが生存期間は長い。さらに、その他の因子がＳＯＤ１突然変異と組み合わさると、１型筋萎縮性側策硬化症の経過が変化する。例えば、ＳＯＤ１遺伝子とＣＮＴＦとして知られる遺伝子の両方に生じる突然変異は、前記疾患の発症を早めるようである。ＣＮＴＦ突然変異だけでは病的影響はないが、ＳＯＤ１突然変異と組み合わさると、疾患の症状は他の影響を受けたファミリーメンバーと比較すると何十年も早まるようである。
【００５９】
ＳＯＤ１突然変異が、筋肉の運動を制御する働きに特化した脳および脊髄の神経細胞である運動ニューロンに、選択的死滅を引き起こす機序は明らかではない。スーパーオキシドジスムターゼ酵素が、ＳＯＤ１遺伝子において生じた変化が原因で、新しい（しかし、まだ同定されていない）毒性機能を獲得すると考えられている。機能が異常な酵素は、有害なスーパーオキシドラジカルの蓄積、他の種類の有毒ラジカルの異常産生、細胞死（アポトーシス）の促進、前記酵素とその他の細胞タンパク質との凝集、または消耗と死滅を引き起こすような運動ニューロンへの連続的な刺激によって運動ニューロンの死滅を引き起こすこともある（興奮毒性）。
【００６０】
【表１】
2009509548.tif 000003
2009509548.tif 000004
2009509548.tif 000005
【００６１】
ＩＶ.  ＲＮＡ干渉
本発明は、タンパク質（例えば、機能獲得型の突然変異タンパク質）の発現を抑制またはノックダウンする方法を特徴とする。本発明の方法は、ＲＮＡ干渉
（Hutvagner et al., 2002）などの配列特異的ＲＮＡサイレンシングメカニズムを用いた機能獲得型遺伝子（例えば、ＳＯＤ１）の突然変異対立遺伝子を選択的に標的化する新規なＲＮＡｉ剤を採用している。ＲＮＡi剤を細胞に導入した後、該作用物質を標的部位の配列に部位特異的やり方で（例えば、ＲＮＡｉによって）結合し、それによって、標的遺伝子の両方の形態の発現を停止する。
【００６２】
ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が動物および植物細胞において相同的なmＲＮＡの配列特異的分解を誘発する著しく有効なプロセスである（Hutvagner and Zamore （2002）, Curr. Opin.
Genet. Dev., 12, 225-232; Sharp （2001）, Genes Dev.,
15, 485-490）。哺乳動物細胞では、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２１ヌクレオチド（ｎｔ）二本鎖
（Chiu et al. （2002）, Mol. Cell.,
10, 549-561; Elbashir et al. （2001）, Nature, 411,
494-498）、またはＤＮＡテンプレートを用いてＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターとともにin
vivoで発現するその他のdsＲＮＡ（Zeng et al. （2002）, Mol. Cell, 9,
1327-1333; Paddison et al. （2002）, Genes Dev., 16, 948-958; Lee et al. （2002）, Nature Biotechnol., 20, 500-505; Paul et al. （2002）, Nature Biotechnol., 20, 505-508; Tuschl, T. （2002）, Nature Biotechnol., 20, 440-448; Yu et al. （2002）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99（9）, 6047-6052; McManus et
al. （2002）, ＲＮＡ, 8, 842-850; Sui et al. （2002）, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 99（6）, 5515-5520.）によって引き起こすことができる。
【００６３】
ＲＮＡｉの分子メカニズムは、真核生物において著明に観察される。ＲＮＡｉ剤のｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡ構造が認識され、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーの酵素であるダイサーで処理され、２１−２５個のヌクレオチド小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となる。ｓｉＲＮＡは、細胞タンパク質ダイサーおよびＲ２Ｄ２と干渉し、複合体を形成し（ＲＩＳＣ−ローディング複合体またはＲＬＣ）、結果として、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体）と称されるｓｉＲＮＡ／マルチタンパク質複合体の形成を容易にする。その後、ＲＬＣは、添加された、Ａｇｏ２を含めた他のタンパク質と相互作用し、ガイド鎖と呼ばれる２つのｓｉＲＮＡ鎖のうちの１つを含有する活性ＲＩＳＣを形成する。活性ＲＩＳＣ複合体は、ガイド鎖を持つワトソン・クリック塩基対を介して、標的ＲＮＡを認識することができる。その後、ＲＩＳＣ複合体は、標的ＲＮＡを分割し、その後放出される。それによって、新たなサイクルの標的認識および分割に自由に触媒作用を及ぼすＲＩＳＣ複合体を再生する（Tomari & Zamore, 2005）。
【００６４】
ＲＮＡ干渉はまた、微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって引き起こすこともできる。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（BRACHT et al., 2004; CAI et al., 2004; Lee et al., 2004）によって合成されるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる長い転写物から生成される。Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であるＤｒｏｓｈａおよびそのパートナーＰａｓｈａによって処理され、〜７０ｎｔ長のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを形成し、ヘアピン構造に折りたたむ（Lee et al., 2003; Denli et al., 2004）。その後Ｅｘｐｏｒｔｉｎ５によって核から細胞質に移動され、そこで、ダイサーによってさらに処理され、一本鎖ｍｉＲＮＡを形成する（Grishok et al., 2001; Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001）。このプロセシングステップは、ｍｉＲＮＡのＲＩＳＣへの装填と密結合することができ、その後、標的ＲＮＡを、ＲＮＡｉによって分割することができる（該標的が配列中のｍＲＮＡを完全に捕捉する場合）。または、標的ＲＮＡの翻訳サイレンシングを媒介することができる（ｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡ中にミスマッチのマルチプル配列を有する場合）。このプロセスは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターまたはＰｏｌＩＩプロモーターのいずれかから合成されたｓｈＲＮＡｓによって模倣される（Xia et al., 2002; Shi, 2003; Zeng & Cullen, 2003; Zhou et al.,
2005）。
【００６５】
配列特異性ゆえに、ＲＮＡｉは、重要な治療法になってきた。しかしながら、いくつかの例においては、ＲＮＡi剤の有効性は、準最適かもしれない（（Khvorova
et al., 2003; Hsieh et al., 2004; Reynolds et al., 2004）。または、その特異性は、完全ではないかもしれない（Jackson et al., 2003）。これは、対立遺伝子特異的ＲＮＡサイレンシングが望ましい機能獲得型障害の治療にとっては、問題であるかもしれない。これを達成するには、突然変異部位を標的とするＲＮＡi剤を使用しなければならない（Ding et
al., 2003; Miller et al., 2003）。したがって、十分な配列相補性を持つＲＮＡi剤の数が限られているため、準最適な力価もしくは選択性を持つＲＮＡi剤を使わざるを得ないのである。
【００６６】
ＲＮＡｉ剤の有効性の減少について２つの原因が提案されている。１つは、標的領域への近づきにくさであり（近付きにくいこと, 到達しにくいこと）、他の１つは、ｓｉＲＮＡの好ましくない鎖の非対称性である（Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003）。鎖の非対称性は、以下のように定義される。生成されたそれぞれのｓｉＲＮＡについて、２つの鎖の１つだけ、すなわち、ガイド鎖がＲＩＳＣに入り、ＲＮＡｉを実行する。パッセンジャー鎖と呼ばれる他方の鎖は、破壊される。ｓｉＲＮＡの２つの末端の塩基対の熱力学的安定性は、鎖がガイド鎖またはパッセンジャー鎖となる可能性を予測する。その５’塩基対をもつ鎖は安定性に劣り、その３’塩基対のものはより、ＲＩＳＣに入る可能性が高く、逆も然りである。２つの末端の塩基対が類似した安定性を有している場合、２つの鎖は、同様の可能性を持って、ＲＩＳＣに入り、同様の力価でＲＮＡｉを媒介する。したがって、センス鎖（意図された標的に対して相補的なアンチセンス鎖の反対側）ＲＩＳＣに入ることを支持する末端塩基対の安定性をもつｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ有効性が悪い。したがって、好ましくない非対称性を持つことになる。
【００６７】
鎖の非対称性は、ＲＮＡｉ特異性にも影響を及ぼす。ＲＮＡｉは、意図していない標的に対しても、意図したものに比べたら程度は低いものの、サイレンス効果を及ぼす可能性がある。これはオフ標的効果と呼ばれる（Jackson et al., 2003）。ＲＩＳＣの標的ＲＮＡ残基に対する重要な結合エネルギーがガイド鎖の５’末端の半分に存在するため（Haley & Zamore, 2004）、このガイド鎖領域と意図しないＲＮＡの間の相同性は、オフ標的サイレンシングとなる（Jackson et al., 2003）。これは、ｓｉＲＮＡの双方の鎖がＲＩＳＣに入り、オフ標的サイレンシングの可能性が増加することを示唆するものである。したがって、いくつかの局面において、本発明は、前記作用物質から生成されるガイド鎖がＲＩＳＣに優先的に組み込まれるように修正されたＲＮＡｉ剤を提供する。本発明の修正ＲＮＡｉ剤は、したがって、ＲＮＡｉにおいて有効性と特異性が向上している。
【００６８】
Ｖ．ＲＮＡｉ剤
本発明は、ＲＮＡｉ剤（例えば、「ｓｉＲＮＡ」および「ｓｈＲＮＡ」）、前記ＲＮＡｉ剤を作製する方法、および前記ＲＮＡｉ剤を使用する方法（例えば、研究および／または治療方法）を特徴とする。本発明のＲＮＡｉ剤は、センス鎖および相補的なアンチセンス鎖（または、その部分）からなる二本鎖分子（または二本鎖様構造をもつ分子）であって、アンチセンス鎖はＲＮＡｉを媒介するのために十分な標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）への相補性を有している。いくつかの実施態様においては、該標的配列は、対立遺伝子多型、または突然変異対立遺伝子に特異的な点突然変異かもしれない。他の実施態様においては、標的配列は、突然変異体と野生型対立遺伝子の双方に共有されている。
【００６９】
ａ）ｓｉＲＮＡ分子
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖および相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖であって、アンチセンス鎖はＲＮＡｉを媒介するのために十分な標的ｍＲＮＡへの相補性を有している。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０乃至５０またはそれを超えるヌクレオチドの長さを有し、つまり、各鎖が１０乃至５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。含むより好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖に、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドなど約１６乃至３０の長さを有し、片方の鎖が標的領域に十分相補的である。好ましくは、前記鎖は、鎖がアニーリングされる時に二本鎖末端の片方または両方に１、２、または３残基のオーバーハングが生じるように、鎖末端に、アラインメントされない（つまり相補的な塩基が反対側の鎖に生じない）少なくとも１、２、または３塩基があるようにアラインメントされる。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡ分子は約１０乃至５０またはそれを超えるヌクレオチドの長さを有し、つまり、各鎖が１０乃至５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むより好ましくは、前記ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖に例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドなど約１６乃至３０の長さを有し、当該分子において片方の鎖が標的領域に実質的に例えば少なくとも８０％（またはそれを超える、例えば８５％、９０％、９５％、または１００％）相補的であって、例えば３、２、１または０のミスマッチヌクレオチドを有し、当該標的領域が野生型と突然変異の対立遺伝子の差が少なくとも１塩基対はある、例えば機能獲得型突然変異を含む標的領域などの標的領域であって、もう片方の鎖は第１の鎖と実質的に同一である。
【００７０】
一般的に、ｓｉＲＮＡは当業に知られる任意の方法、例えば以下のプロトコルを用いることによってデザインすることができる。
【００７１】
１．ＡＵＧ開始コドンから始めてＡＡジヌクレオチド配列を探す。各ＡＡおよび３’側に１６ヌクレオチド以上離れたところが、ｓｉＲＮＡ標的の候補である。ｓｉＲＮＡは機能獲得型突然変異を含む標的領域など、野生型と突然変異の対立遺伝子の差が少なくとも１塩基対の標的領域に特異的でなければならない。第１の鎖は、この配列に相補的でなければならず、その他の鎖は第１の鎖に同一であるか実質的に同一である。ある実施態様では、前記核酸分子は、例えばＳＯＤ１の配列など、開始コドンの少なくとも５０乃至１００ｎｔ下流から始まる標的対立遺伝子配列の領域から選択される。さらに、Ｇ／Ｃ含有量が少ないｓｉＲＮＡ（３５乃至５５％）は、Ｇ／Ｃ含有量が５５％を超えるものよりも活性であることもある。したがってある実施態様では、前記発明には３５乃至５５％のＧ／Ｃ含有量を有する核酸分子が含まれる。
【００７２】
２．ＲＮＡｉのセンス鎖は、選択された標的部位の配列に基づいて設計される。好ましくは、該センス鎖は、１９乃至２５のヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。より好ましくは、該センス鎖は、２１、２２、または２３ヌクレオチドを含む。しかしながら、当業者は、１９ヌクレオチド未満または２５ヌクレオチドより大きい長さを持つｓｉＲＮＡもＲＮＡｉを媒介する機能を持ちうることを理解するであろう。したがって、そのような長さのｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持していれば、本発明の範囲に含まれる。より長いＲＮＡｉ剤は、哺乳動物細胞のいくつかにおいて、インターフェロンまたはＰＫＲ反応を誘発することがわかっているが、それらが望ましくないかもしれない。好ましくは、本発明のＲＮＡｉ剤は、ＰＫＲ反応を誘発しない（すなわち、十分に長さが短い）。しかしながら、例えば、ＰＲＫ反応を生成することができない細胞タイプ、またはＰＲＫ反応が、別の手段でダウンレギュレーションされた、もしくは、減衰された状況においては、より長いＲＮＡｉ剤は有用かもしれない。
【００７３】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介することができるように、標的部位と十分な相補性を有している。したがって、好ましい実施態様においては、ＲＮＡｉのセンス鎖は、標的の一部と十分に同一性を有する配列を持つように設計される。例えば、ガイド鎖は、標的部位と１００％の同一性を有するかもしれない。しかしながら、１００％の同一性を有していなくてもよい。センス鎖と標的ＲＮＡ配列の間には８０％の同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはさらに１００％の同一性があることが好ましい。別の実施態様では、ＲＮＡｉのセンス鎖は、標的部位と完全な同一性を有している。別の実施態様では、センス鎖は、標的領域、例えば、野生型と突然変異対立遺伝子の間の少なくとも１つの塩基対が異なる標的領域、例えば、機能獲得型突然変異を含む標的領域に対して、４、３、２、１、または０のミスマッチヌクレオチドを有している。そしてもう一方の鎖は、第１の鎖と同一もしくはほぼ同一である。また、１もしくは２ヌクレオチドの小さな挿入もしくは欠失をもつｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｉを媒介するのに有効かもしれない。.
【００７４】
配列同一性は、当業で公知の配列比較やアライメントアルゴリズムによって決定してもよい。２つの核酸配列のパーセント同一性（または、アミノ酸配列）を決定するために、該配列を比較の目的で並べ（例えば、最適なアライメントのために第１または第２の配列にギャップを導入することができる。次いで、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸残基）部分におけるヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第１の配列のある部分は、第２の配列の対応する部分と同じ残基で占められており、その部分その分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、該配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の＃／位置の合計＃、ｘ１００）、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さゆえに、スコアを任意に不利にしてもよい。
【００７５】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。ある実施態様では、アライメントは、十分な同一性をもつ、配列のいくつかの部分において生成されるが、同一性（すなわち、局所的アライメント）の程度の低い部分では生成されない。配列の比較に用いられる、限定されないが好ましい局所的アライメントアルゴリズムとしては、Karlin and Altschul （1990） Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:2264-68, modified as in Karlin and Altschul （1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Altschul, et al. （1990） J. Mol. Biol. 215:403-10）。    
【００７６】
別の実施態様では、該アライメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、パーセント同一性は、アライメントされた配列の長さにわたって決定される（すなわち、ギャップ付きアライメント）。比較の目的で、ギャップ付きアライメントを得るためには、Altschul et al., （1997） Nucleic Acids Res. 25（17）:3389-3402に記載されているように、Gapped
BLASTを用いることができる。別の実施態様では、アライメントは、適切なギャップを導入することによって最適化され、パーセント同一性は、アライメントされた配列の長さ全体において決定される（すなわち、グローバルアライメント）。配列のグローバル比較に用いられる、限定されないが好ましい数学的アルゴリズムは、Myers and Miller, CABIOS （1989）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを用いた場合、ＰＡＭ１２０の重さの残基テーブル、ペナルティー１２のギャップ長、およびペナルティー４のギャップ長を用いることができる。
【００７７】
３．ｓｉＲＮＡのアンチセンスまたはガイド鎖は、センス鎖と常に同じ長さであり、相補ヌクレオチドを含む。ある実施態様では、ガイド鎖およびセンス鎖は完全に相補的である。すなわち、これらの鎖は、並べてアニーリングしたとき、末端が平滑化されている。別の実施態様では、ｓｉＲＮＡの鎖は、例えば２ヌクレオチドなど、１乃至４ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対を形成させることができる。オーバーハングは、標的遺伝子配列（またはその相補体）に対応するヌクレオチドを含む（または、それによって構成される）ことができる。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えば、ｄＴｓ、もしくはヌクレオチド類似体、もしくは他の好適な非ヌクレオチド物質を含む（または、それによって構成される）ことができる。したがって別の実施態様では、前記核酸分子はＴＴなどの２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有してもよい。前記のオーバーハングしているヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。上述のように、突然変異：野生型ミスマッチがプリン：プリンミスマッチである標的領域を選択することが望ましい。
【００７８】
４.当業に知られる任意の方法を用いて、標的候補と適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）を比較し、他のコード配列に顕著に相同性を有する任意の標的配列を考慮から除外する。そのような配列相同性の探索に使われる1つの方法はBLASTとして知られ、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手することができる。
【００７９】
５．評価基準に合う1つ以上の配列を選択する。
さらに、ｓｉＲＮＡのデザインおよび使用についての一般的な情報は、マックスプランク生物物理化学研究所のウェブサイトで入手できる「The ｓｉＲＮＡ User Guide（ｓｉＲＮＡユーザーガイド）」の中に見つけることもできる。
【００８０】
別法として、ｓｉＲＮＡは、標的配列を用いてハイブリダイズする（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃でハイブリダイゼーションを１２〜１６時間行い、その後洗浄を行う）ことが可能なヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義してもよい。さらに好ましいハイブリダイゼーション条件としては、１ｘＳＳＣ中で７０℃または１ｘＳＳＣ中で５０℃、５０％ホルムアミド、続いて１ｘＳＳＣ中で７０℃でのハイブリダイゼーション、または、４ｘＳＳＣ中で７０℃または４ｘＳＳＣ中で５０℃、５０％ホルムアミド、続いて１ｘＳＳＣ中で６７℃でのハイブリダイゼーションがあげられる。５０塩基対長未満であると予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−１０℃低い温度とすべきである。Ｔｍは、以下の式によって求められる。塩基対長が１８未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（°Ｃ）＝２（Ａの＃＋Ｔ塩基）＋４（Ｇの＃＋Ｃ塩基）。塩基対長が１８乃至４９のハイブリッドについては、Ｔｍ（°Ｃ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（但し、式中、Ｎは、ハイブリッドなかの塩基数、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェシー条件のさらなる例は、Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology,
1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and
6.3-6.4に記載されている。その内容を本明細書において引用によって援用する。
【００８１】
陰性対照ｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同一のヌクレオチド組成を有するべきだが、適切なゲノムに相補的な重要な配列は有さない。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルしてデザインしてもよく、相同性探索は、前記陰性対照が適切なゲノムにおける任意のその他の遺伝子に対する相同性を欠失していることを確認するために行うことができる。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡは、前記配列に1つ以上の塩基ミスマッチを導入することによってデザインすることができる。
【００８２】
１ヌクレオチド特異性を有するｓｉＲＮＡは、以下の通りデザインすることができる。
【００８３】
１．  標的ｍＲＮＡは、参照ｍＲＮＡ配列（例えば野生型対立遺伝子またはｍＲＮＡ配列）と比較したミスマッチ（例えば、点突然変異などの１ヌクレオチドミスマッチなど）を有するものが選択される（例えば、突然変異対立遺伝子またはｍＲＮＡ）。
【００８４】
２．  ｓｉＲＮＡは、１ヌクレオチドのところに、ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡ（例えば、突然変異ｍＲＮＡ）の間に完全な相補性が存在し、したがって、ｓｉＲＮＡ（例えば、アライニングされた）を参照配列（例えば、野生型対立遺伝子またはｍＲＮＡ配列）と比較する場合、ミスマッチが存在するようにデザインされる。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは、１ヌクレオチド（例えば、点突然変異）が意図される切断部位、またはその近傍に存在するようにデザインされる。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡが、標的とされる１ヌクレオチド（例えば、点突然変異）が完全にまたは正確にｓｉＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖）の中央に配置されるようにデザインされる。完全に中央に配置するという文言は、前記１ヌクレオチド（例えば点突然変異）の両側に並んでいるヌクレオチドの数が同一であるが（つまり８、９、１０、１１、または１２）、例えばｄＴｄＴ末端など任意のオーバーハングは含まないことを意味する。例えば、２ヌクレオチドの３’オーバーハング（例えばアンチセンス鎖の３’末端にあるオーバーハング）を有する２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡが選択される場合、前記１ヌクレオチド（例えば点突然変異）の両側には９ヌクレオチドが存在する。例えば、２ヌクレオチドの３’オーバーハング（例えばアンチセンス鎖の３’末端にあるオーバーハング）を有する２２ヌクレオチドｓｉＲＮＡの場合、前記１ヌクレオチド（例えば点突然変異）の両側には９および１０ヌクレオチドが存在する。２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡの場合、前記１ヌクレオチド（例えば、点突然変異）の両側に１０ヌクレオチドが存在する。２４ヌクレオチドｓｉＲＮＡの場合、前記１ヌクレオチド（例えば、点突然変異）の両側に１０および１１ヌクレオチドが存在する。例示した数は、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡの場合であるが、より長いまたは短いオーバーハングを有するか、またはオーバーハングを有さないｓｉＲＮＡにも容易に当てはめることができる。前記１ヌクレオチド（例えば、点突然変異）がｓｉＲＮＡの中央に位置しないようなｓｉＲＮＡをデザインする場合、ｓｉＲＮＡによる切断の有効性が減少する場合もある。
【００８５】
１ヌクレオチド特異性を有するｓｉＲＮＡは、好ましくは、相当する参照（例えば、野生型）配列における塩基対の形成が生じにくいようにデザインされる。例えば、ｓｉＲＮＡをプリン：プリン対形成が前記１ヌクレオチドの位置でｓｉＲＮＡと野生型ｍＲＮＡの間に存在するようにデザインすると、１ヌクレオチド特異性が促進される。プリン：プリン対形成は、例えば、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ｇ、Ｇ：ＡおよびＡ：Ａ対形成のグループから選択される。さらに、前記１ヌクレオチドの位置でのｓｉＲＮＡと突然変異ｍＲＮＡの間のプリン：ピリミジン対形成は、１ヌクレオチド特異性を促進する。プリン：ピリミジン対形成は、例えばＧ：Ｃ、Ｃ：Ｇ、Ａ：Ｕ、Ｕ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｕ：ＡおよびＡ：Ｕのグループから選択される。
【００８６】
いくつかの実施態様において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、上掲の表１に挙げた点突然変異のあらゆる点に相補的な配列を含んでもよい。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、突然変異体ｓｉＲＮＡ
Ｐ１１（配列番号：５、センス：配列番号：６、アンチセンスまたはガイド）、突然変異体ｓｉＲＮＡ １０（配列番号：３、センス：配列番号：４、アンチセンスまたはガイド）、突然変異体ｓｉＲＮＡ ９（配列番号：１、センス：配列番号：２、アンチセンスまたはガイド）、ＳＯＤ１野生型標的（配列番号：７）、ＳＯＤ１突然変異体標的（配列番号：８）、野生型ｓｉＲＮＡ
１１（配列番号：９、センス；配列番号：１０、アンチセンスまたはガイド）、野生型ｓｉＲＮＡ １０（配列番号：１１、センス；配列番号：１２、アンチセンスまたはガイド）、野生型ｓｉＲＮＡ Ｐ９（配列番号：１３、セス；配列番号：１４、アンチセンスまたはガイド）を含む図１Ａ、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡ（配列番号：１６）およびそれらの対立遺伝子変形を含む図３Ａに挙げた配列を含む、またはそれにより構成される。
【００８７】
ｂ）短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子
いくつかの特徴的な実施形態において、本発明は、機能獲得型の標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを媒介することが可能なｓｈＲＮＡを提供する。ｓｉＲＮＡとは対照的に、ｓｈＲＮＡは、天然のミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の前駆体に類似しており、遺伝子サイレンシング経路の先端に入る。この理由から、ｓｈＲＮＡは、天然の遺伝子サイレンシング経路を介して供給される遺伝子のサイレンシングをより効率的に媒介すると考えられている。
【００８８】
ｍｉＲＮＡは、植物および動物の成長中に転写後または転写レベルで遺伝子発現を制御することができる約２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡの領域である。ｍｉＲＮＡのある共通の性質は、おそらくダイサー、ＲＮＡｓｅ
ＩＩＩ型酵素、またはその相同体によって、約７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステム−ループからすべて切除されることである。天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、通常相補的である２つの部分を含む二本鎖ステム、およびステムの２つの部分を連結したループを形成する一本鎖を有する。典型的なｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓにおいては、該ステムは、１以上の隆起部分、例えば、ステムの１部分に単一のヌクレオチド「ループ」を創製する余分なヌクレオチド、および／または、ステムの１つの部分のハイブリダイゼーション中にギャップを創製する１以上の非対ヌクレオチドを含む。本発明の短ヘアピンＲＮＡ、または、操作されたＲＮＡ前駆体は、天然に存在するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓに基づいているが、所望のＲＮＡｉ剤（例えば、本発明のｓｉＲＮＡ）を得るために操作された、人工的な作製物である。標的ｍＲＮＡに相補的な配列を有するｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を置換することによって、ｓｈＲＮＡが形成される。該ｓｈＲＮＡは、細胞の遺伝子サイレンシング経路の全体によって処理され、それによって効率的にＲＮＡｉを媒介する。
【００８９】
ｓｈＲＮＡ分子の必須の要素には、アニーリングもしくはハイブリダイズして、二本鎖もしくは二重鎖ステム部分を形成するのに十分な相補性を有する第１の部分および第２の部分が含まれる。該２つの部分は、十分にもしくは完全に相補的である必要はない。第１および第２の「ステム」部分は、他の部分のｓｈＲＮＡにアニーリングもしくはハイブリダイズするには十分ではない配列相補性を持つ部分によって結合される。この後の部分は、ｓｈＲＮＡ分子の「ループ」部分と呼ばれる。ｓｈＲＮＡ分子は処理されてｓｉＲＮＡとなる。ｓｈＲＮＡｓはまた、１以上の隆起部分、すなわち、ステムの一部に小ヌクレオチド「ループ」を創製する余分なヌクレオチド、例えば、１、２、または３ヌクレオチドループをもつことができる。該ステム部分は、同じ長さを持つことができる。または、１つの部分は、例えば、ｌ−５ヌクレオチドのオーバーハングを持つことができる。オーバーハングを有するヌクレオチドは、例えば、ウラシル（Ｕｓ）、例えば、全てのＵｓである。そのようなＵｓは、転写の終了のシグナルであるｓｈＲＮＡコードＤＮＡにおいてチミジン（Ｔｓ）によって顕著にコードされる。
【００９０】
本発明のｓｈＲＮＡまたは操作された前駆体ＲＮＡにおいて、二本鎖ステムの一部は、標的ｍＲＮＡに対して相補的な（またはアンチセンス）核酸配列である。したがって、操作されたＲＮＡ前駆体は、２つの部分と２つのステム部分を結合するループを持つ二本鎖ステムを含む。該２つのステム部分は、約１８もしくは１９乃至約２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、３７、３８、３９、もしくは４０以上のヌクレオチド長である。好ましい実施態様においては、該ステム部分の長さは、２１ヌクレオチド以上とすべきである。哺乳動物細胞において用いられる場合、該ステム部分の長さは、約３０ヌクレオチド未満として、インターフェロン経路のような非特異的反応を回避すべきである。非哺乳動物細胞においては、該ステムは、３０ヌクレオチドより長い。実際、該ステムは、標的ｍＲＮＡに対して相補的なより大きな部分を含むことができる（最大、ｍＲＮＡ全体を含む）。
【００９１】
二本鎖ステムの２つの部分は、ハイブリダイゼーションして、二本鎖ステムを形成するのに十分相補的でなければならない。したがって、この２つの部分は、必ずしも必要ではないが、十分に、もしくは完全に相補的とすることができる。さらに、この２つのステム部分は、同じ長さとすることができるし、または、１つの部分が１、２、３、もしくは４ヌクレオチドのオーバーハングを含むこともできる。該オーバーハングしているヌクレオチドは、例えば、ウラシル（Ｕｓ）、例えば、全てのＵｓを含むことができる。ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体中のループは、ループ配列を修正して、対を形成したヌクレオチドを増加または減少させることによって、または、ループ配列の全ての部分をテトラループまたは他のループ配列と置換することによって、天然に存在するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列とは異なるものとしてもよい。したがって、ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体中のループは、２、３、４、５、６、７、８、９以上、例えば、１５または２０以上のヌクレオチド長とすることができる。
【００９２】
ｓｈＲＮＡのステム部分の１つの鎖はさらに、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列に対して十分に相補的（例えば、アンチセンス）で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して前記標的ＲＮＡの分解もしくは切断を媒介する。アンチセンス部分は、前記ステムの５’末端または３’末端である。ｓｈＲＮＡのステム部分は、好ましくは、約１５乃至約５０ヌクレオチド長である。好ましくは、該２つのステム部分は、１８もしくは１９乃至約２５、３０、３５、３７、３８、３９もしくは４０ヌクレオチド長以上である。哺乳動物細胞において用いられる場合、該ステム部分の長さは、約３０ヌクレオチド未満として、インターフェロン経路のような非特異的反応を回避すべきである。非哺乳動物細胞においては、該ステムは、３０ヌクレオチドより長い。実際、該ステムは、標的ｍＲＮＡに対して相補的なより大きな部分を含むことができる（最大、ｍＲＮＡ全体を含む）。二本鎖ステムの２つの部分は、ハイブリダイゼーションして、二本鎖ステムを形成するのに十分相補的でなければならない。したがって、この２つの部分は、必ずしも必要ではないが、十分に、もしくは完全に相補的とすることができる。
【００９３】
ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体中のループは、ループ配列を修正して、対を形成したヌクレオチドを増加または減少させることによって、または、ループ配列の全ての部分をテトラループまたは他のループ配列と置換することによって、天然に存在するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列とは異なるものとしてもよい。したがって、ｓｈＲＮＡまたは操作されたＲＮＡ前駆体中のループは、２、３、４、５、６、７、８、９以上、例えば、１５または２０以上のヌクレオチド長とすることができる。好ましいループは、「テトラループ」からなる、または、それを含む。テトラループ配列の例は、限定されないが、配列ＧＮＲＡが挙げられる（但し、Ｎは、あらゆるヌクレオチドを表し、Ｒは、プリンヌクレオチド、ＧＧＧＧ、およびＵＵＵＵを表す）。
【００９４】
いくつかの実施態様においては、本発明のｓｈＲＮＡは、上掲に記載された所望のｓｉＲＮＡ分子の配列を含む。別の実施態様において、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分の配列は、上記のように本質的に、または、通常１８、１９、２０、２１ヌクレオチド長以上の配列を、標的ＲＮＡ内の配列（例えば、ＳＯＤ１ｍＲＮＡ）から、例えば、翻訳開始領域の１００乃至２００もしくは３００ヌクレオチド上流もしくは下流から選択することによって設計することができる。通常、該配列は、前記部分が機能獲得型の突然変異部位から離れていれば、５’ＵＴＲ（非翻訳領域）、コード配列、または３’ＵＴＲを含む標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のあらゆる部分から選択することができる。該配列は、任意に２つの隣接ＡＡヌクレオチドを含有する標的遺伝子の直ぐ後の領域とすることができる。ヌクレオチド配列の最後の２つのヌクレオチドはＵＵとして選択することができる。この約２１ヌクレオチド配列を用いて、ｓｈＲＮＡ中の二本鎖ステムの一部を創製する。この配列は、野生型ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列のステム部分を、例えば、酵素的に、置換することができ、または、合成された完全な配列に含まれる。例えば、全体のステムループを操作されたＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチド、または、前駆体の二本鎖ステムに導入された部分をコードするもの、および制限酵素を用いて操作されたＲＮＡ前駆体作製物、例えば、野生型ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡからのもの、を合成することができる。  
【００９５】
いくつかの態様において、本発明のｓｈＲＮＡは、所望のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様二本鎖）の配列を含む。所望のＲＮＡサイレンシング二本鎖（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様二本鎖）、したがって、操作されたＲＮＡ前駆体中の２つのステム部分の双方は、当業で公知の方法によって選択することができる。これらは、限定されないが、通常１８、１９、２０、２１ヌクレオチド長以上の配列を、標的遺伝子ｍＲＮＡ配列から、３’側の翻訳開始領域の１００乃至２００もしくは３００ヌクレオチドの領域から選択することを含む。一般に、該配列は、５’ＵＴＲ（非翻訳領域）、コード配列、または３’ＵＴＲを含む、標的遺伝子からのｍＲＮＡのあらゆる部分から選択することができる。該配列は、任意に２つの隣接ＡＡヌクレオチドを含有する標的遺伝子の直ぐ後の領域とすることができる。この約２１ヌクレオチド配列の最後の２つのヌクレオチドはＵＵとして選択することができる（その結果、アンチＲＮＡｉのセンス鎖は、ＵＵで始まる）。この約２１ヌクレオチド配列を用いて、操作されたＲＮＡ前駆体内の二本鎖ステムの一部を創製する。この配列は、野生型ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列のステム部分を、例えば、酵素的に、置換することができ、または、合成された完全な配列に含まれる。例えば、全体のステムループを操作されたＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチド、または、前駆体の二本鎖ステムに導入された部分を単にコードするもの、および制限酵素を用いて操作されたＲＮＡ前駆体作製物、例えば、野生型ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡからのもの、を合成することができる。
【００９６】
操作されたＲＮＡ前駆体は、二本鎖中に、in
vivoで作製されることが好ましいｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様二本鎖の約２１乃至２２ヌクレオチド配列を含む。したがって該操作されたＲＮＡ前駆体の該ステム部分は、発現が抑制または阻害された遺伝子のエキソン部分の配列に対応する少なくとも１８または１９ヌクレオチド対を含む。このステムの領域に隣接する２つの３’ヌクレオチドは、操作されたＲＮＡ前駆体からのｓｉＲＮＡの産生を最大にし、得られたｓｉＲＮＡの、in vivo およびin vitroでのＲＮＡｉによる翻訳の抑圧または破壊のための対応するｍＲＮＡを標的化するときの有効性を最大にするよう選択されている。 
【００９７】
操作されたＲＮＡ前駆体は、二本鎖中に、in
vivoで作製されることが好ましいｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様二本鎖の約２１乃至２２ヌクレオチド配列を含む。したがって該操作されたＲＮＡ前駆体の該ステム部分は、発現が抑制または阻害された遺伝子のエキソン部分の配列に対応する少なくとも１８または１９ヌクレオチド対を含む。このステムの領域に隣接する２つの３’ヌクレオチドは、操作されたＲＮＡ前駆体からのｓｉＲＮＡの産生を最大にし、得られたｓｉＲＮＡの、in vivo およびin vitroでのＲＮＡｉによる翻訳の抑圧または破壊のための対応するｍＲＮＡを標的化するときの有効性を最大にするよう選択されている。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明のｓｈＲＮＡは、ＲＩＳＣへの移行を高めるために、ｍｉＲＮＡ配列、任意に末端修飾されたｍｉＲＮＡ配列を含む。ｍｉＲＮＡ配列は、あらゆる天然に存在するmiRNAのそれに類似もしくは同一とすることができる（例えば、The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004）。１０００以上の天然のｍｉＲＮＡがこれまでに確認されており、それらはあわせて、ゲノム中の予測されている全ての遺伝子の〜１％を含むと考えられている。多くの天然のｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン中に群生しており、相同性に基づいた検索を用いてin silicoで、同定することができる（Pasquinelli
et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros,
2001）。または、ｍｉＲＮＡ遺伝子候補がｐｒｉ−ｍＲＮＡのステムループ構造を作製する可能性を予測するコンピュータアルゴリズム（例えば、MiRScan, MiRSeeker）を用いて同定することができる（Grad et al., Mol. Cell., 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et
al., Science, 2003; Lai EC et al., Genome Bio., 2003）。全ての公開されているｍｉＲＮＡ配列の検索可能データベースがオンラインレジストリで提供される（The miRNA Registry at the Sanger Institute website; Griffiths-Jones
S, Nuc. Acids Res., 2004）。天然のｍｉＲＮＡの例としては、ｌｉｎ−４、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１０、ｍｉｒＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１６８、ｍｉＲ−１７５、ｍｉＲ−１９６およびそれらのホモログ、ならびに、ヒトおよび、キイロショウジョウバエ、エレガンス線虫、ゼブラフィッシュ、シロイヌナズナ、マウス、およびラットを含むいくつかのモデル生物からの他の天然のｍｉＲＮＡがある（ＰＣＴ国際公開第０３／０２９４５９号参照）。
【００９９】
天然に存在するｍｉＲＮＡは、内因性の遺伝子によって、in vivoで発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）から、ダイサーまたは他のＲＮＡｓｅｓによって処理される（Lagos-Quintana et al., Science, 2001; Lau et al., Science, 2001; Lee
and Ambros, Science, 2001; Lagos-Quintana et al.,Curr. Biol., 2002; Mourelatos
et al., Genes Dev., 2002; Reinhart et al., Science, 2002; Ambros et al., Curr.
Biol., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., RNA, 2003; Lim et
al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003）。ｍｉＲＮＡは、in vivoで二本の鎖をもつ二本鎖として一過的に存在することができるが、一本鎖のみを遺伝子のサイレンシングを導くＲＩＳＣ複合体によって獲得される。いくつかのｍｉＲＮＡ、例えば、植物ｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡに対して、完全またはほぼ完全な相補性を有する。したがって、標的ｍＲＮＡの分割を導く。他のｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡに対して、あまり完全ではない相補性を有する。したがって、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を導く。ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの間の相補性は、その行動メカニズムを決定すると考えられている。例えば、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの間の完全またはほぼ完全な相補性は、分割メカニズムを予測する
（Yekta et al., Science, 2004）。一方、あまり完全でない相補性は、翻訳抑制メカニズムを予測する。特別な実施態様において、ｍｉＲＮＡ配列は、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列のものであり、その異常な発現または活性は、ｍｉＲＮＡ障害と相関する。
【０１００】
操作されたＲＮＡ前駆体の、別の限定的な特徴は、それらの長さ、配列、および／または構造の結果として、配列非特異的反応、例えば、インターフェロン反応またはアポトーシスの誘導などを誘発しないことである。または、それらは、翻訳後遺伝子サイレンシングを誘発する（例えば、ＲＮＡｉ）のに用いられてきた長二重鎖ＲＮＡ（＞１５０ｂｐ）より低いレベルの配列非特異的反応を誘発することである。例えば、インターフェロン反応は、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡによって引き起こされる。
【０１０１】
ある実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、上掲表１に挙げた点突然変異の全てに十分な相補性を有する配列を含む。他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、突然変異ｓｉＲＮＡ
Ｐ１１（配列番号：５、センス；配列番号：６、アンチセンスまたはガイド）、突然変異 ｓｉＲＮＡ Ｐ１０（配列番号：３、センス；配列番号：４、アンチセンス、またはガイド）、突然変異
ｓｉＲＮＡ Ｐ９（配列番号：１、センス；配列番号：２、アンチセンス、またはガイド）、ＳＯＤ１野生型標的（配列番号：７）、ＳＯＤ１突然変異標的（配列番号：８）、野生型ｓｉＲＮＡ
Ｐ１１（配列番号：９、センス;配列番号：１０、アンチセンス、またはガイド）、野生型ｓｉＲＮＡ
Ｐ１０（配列番号：１１、センス; 配列番号：１２、アンチセンス、またはガイド）、野生型ｓｉＲＮＡ Ｐ９（配列番号：１３、センス;配列番号：１４、アンチセンス、またはガイド）が含まれる図1に記載の配列、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１
ｓｉＲＮＡ （配列番号：１６）が含まれる図３に記載の配列、およびその対立遺伝子変異種などを生成することが可能である。
【０１０２】
ｃ．修飾ＲＮＡｉ剤
本発明のいくつかの局面において、上記したように、本発明のＲＮＡi剤（または、その一部）は、作用薬のin vivo
活性を、作用薬のＲＮＡのサイレンシング活性を損なうことなく向上するように修飾してもよい。修飾は、一部では、作用薬の安定性を高めるため（例えば、分解を防止する）、細胞の取り込みを促進するため、
標的効率を高めるため、（例えば、標的に対する）結合の有効性を向上させるため、患者の作用物質に対する忍容性を向上させるため、および/または毒性を減少させる機能を果たすことができる。
【０１０３】
１）有効性および特異性を高めたＲＮＡｉ剤
いくつかの態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、非対称性デザインルールに基づいてＮＲＡｉを媒介する際の有効性および特異性の向上を促進するために改変されてきた（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／００１０４５号、米国特許出願第２００５−０１８１３８２Ａ１号参照）。そのような改変は、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖（例えば、本発明の方法を用いて設計されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから作製されたｓｉＲＮＡ）のＲＩＳＣへの移行を促進し、アンチセンス鎖が優先的に切断または標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を導き、その結果標的の切断およびサイレンシングを上昇または向上させるようにしてセンス鎖に有利なようにする。好ましくは、ＲＮＡｉ剤の対称性は、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖５’末端（ＡＳ５’）とセンス鎖３’末端（Ｓ３’）間の塩基対強度を、前記ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖３’末端（ＡＳ３’）およびセンス鎖５’末端（Ｓ５’）結合力または塩基対強度と比較して弱めることによって高められる。  
【０１０４】
ある実施態様では、本発明のＲＮＡｉ剤の非対称性を高めて、第１またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間のＧ：Ｃ塩基対が、第１またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間のＧ：Ｃ塩基対より少なくなるようにしてもよい。別の実施態様では、本発明のＲＮＡｉ剤の非対称性を高めて、第１またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在しうるようにしてもよい。ミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕからなる群から選択されることが好ましい。別の実施態様では、本発明のＲＮＡｉ剤の非対称性を高めて、第１またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのゆらぎ塩基対が存在しうるようにしてもよい。別の実施態様では、本発明のＲＮＡｉ剤の非対称性を高めて、希少ヌクレオチドを含む塩基対、例えば、イノシン（Ｉ）が少なくとも１つ存在するようにしてもよい。該塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択されることが好ましい。さらに別の実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤の非対称性を高めて、修飾されたヌクレオチドを含む塩基対が少なくとも１つ存在するようにしてもよい。好ましい実施態様においては、該修飾ヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ、および２，６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される。
【０１０５】
いくつかの特徴的な局面において、本発明は、修飾しない場合と比較して、ＲＮＡｉの有効性と特異性を高めることが可能な修飾された非対称ｓｈＲＮＡを提供する。修飾されたｓｈＲＮＡは、少なくとも２１ヌクレオチド長（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、３７、３８、３９、または４０以上のヌクレオチド長）であるアンチセンスステム部分を特徴とする（「２１ｎｔステムｓｈＲＮＡ」）。非対称ｓｈＲＮＡは、修飾されないｓｈＲＮＡと新たなｓｈＲＮＡからのサイレンシング二本鎖が、アンチセンス鎖または第１の鎖の５’末端とセンス鎖または第２の鎖の３’末端の間の塩基対の力がアンチセンス鎖または第１の鎖の３’末端とセンス鎖または第２の鎖の５’末端の間の塩基対の力より弱い点において異なる。
【０１０６】
ある好ましい実施態様では、本発明の修飾２１ｎｔステムｓｈＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端から３位で塩基対力を有する。したがって、ある実施態様では、修飾２１ｎｔステムｓｈＲＮＡは、第１またはアンチセンス鎖の５’末端から３位とセンス鎖部分の３’末端にミスマッチの塩基対を有する。ミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、およびＵ：Ｕからなる群から選択されることが好ましい。別の実施態様では、修飾２１ｎｔステムｓｈＲＮＡは、ゆらぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕを、第１またはアンチセンス鎖の５’末端から３位およびセンス鎖部分の３’末端に含む。別の実施態様では、修飾２１ｎｔステムｓｈＲＮＡは、希少ヌクレオチド、例えば、イノシン（Ｉ）を第１またはアンチセンス鎖の５’末端から３位およびセンス鎖部分の３’末端に含む。該塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択されることが好ましい。さらに別の実施態様において、修飾２１ｎｔステムｓｈＲＮＡは、第１またはアンチセンス鎖の５’末端から３位またはセンス鎖部分の３’末端に、修飾ヌクレオチドを持つ。好ましい実施態様においては、該修飾ヌクレオチドは、２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ、および２，６−ジアミノ−Ａからなる群から選択される。
【０１０７】
いくつかの例示的実施態様において、本発明の修飾ｓｈＲＮＡは、突然変異ｓｉＲＮＡ Ｐ１１（配列番号：５、センス；配列番号：６、アンチセンスまたはガイド）、突然変異 ｓｉＲＮＡ Ｐ１０（配列番号：３、センス；配列番号：４、アンチセンス、またはガイド）、突然変異
ｓｉＲＮＡ Ｐ９（配列番号：１、センス；配列番号：２、アンチセンス、またはガイド）、またはＧ９３Ａ
ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡを発現することができるｓｈＲＮＡの修飾された変形例である。前記修飾されたｓｈＲＮＡは、非対称である。なぜなら、前記修飾された変形例のアンチセンス鎖の５’末端の塩基力が、前記修飾された変形例のアンチセンス鎖の３’末端の塩基力より小さいからである。
【０１０８】
２）安定性が高められたＲＮＡｉ剤
本発明のＲＮＡｉ剤を修飾して、血清中または細胞培養用の成長培地中での安定性を高めることができる。安定性を高めるために、３’−残基を、分解に対して安定性を持つようにしてもよい。例えば、それらを、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドから成るように選択してもよい。別法として、ピリミジンヌクレオチドの修飾類似体での置換、例えば、ウリジンの２’−デオキシチミジンでの置換が許容でき、ＲＮＡ干渉の効率に影響を及ぼさない。    
【０１０９】
好ましい局面において、本発明は、第１および第２の鎖を含むＲＮＡｉ剤を特徴とする。そこで、第２の鎖および／または第１の鎖は、対応する非修飾ＲＮＡｉ剤と比較して in vivo 安定性が高められるように、内部ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドで置換することによって修飾されている。本明細書において定義されているように、「内部」ヌクレオチドとは、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外のあらゆる位置で発生するものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子中、または二本鎖の中の１つの鎖、または二本鎖分子であることができる。ある実施態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を、少なくとも１つの内部ヌクレオチドを置換することによって修飾する。別の実施態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の内部ヌクレオチドを置換することによって修飾する。別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を、内部ヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上を置換することによって修飾する。さらに別の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を、内部ヌクレオチドの全てを置換することによって修飾する。
【０１１０】
本発明の好ましい実施態様においては、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含有することができる。該ヌクレオチド類似体は、標的特異的サイレンシング活性、例えば、ＲＮＡｉ媒介活性、または翻訳抑制が実質的に影響を受けない位置、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端に位置づけることができる。特に、末端は、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことで安定化してもよい。
【０１１１】
好ましいヌクレオチド類似体は、糖修飾および／または骨格修飾されたリボヌクレオチド（すなわち、リン酸−糖骨格への修飾を含む）。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾して、少なくとも１つのニトロゲンまたは硫黄ヘテロ原子を含むようにしてもよい。好ましい骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接しているリボヌクレオチドに接続しているリン酸エステル基を、修飾された基、例えば、ホスホチオエートで置換してもよい。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、２’ＯＨ−基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＯＮから選択される基で置換される。但し、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩである。
【０１１２】
特別な実施形態において、修飾は、２’−フルオロ、２’−アミノおよび／または２’−チオ修飾である。特に好ましい修飾は、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、および／または５−アミノ−アルキル−ウリジンを含む。特別の実施形態において、該２’−フルオロリボヌクレオチドは、すべてのウリジンおよびシチジンである。修飾のさらなる例としては、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、および５−フルオロ−ウリジンが含まれる。２’−ｄｅｏｘｙ−ヌクレオチド、および２’−Ｏｍｅヌクレオチドは、本発明の修飾されたＲＮＡ−サイレンシング剤部分内で用いることもできる。さらなる修飾された残基には、デオキシアベーシック（原語：deoxy-abasic）、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチル−アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリンが含まれる。特に好ましい実施形態では、該２’部分は、メチル基であり、結合部分が２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドとなるようにしている。
【０１１３】
ある実施形態においては、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸（Locked Nucleic Acids）（ＬＮＡ）である。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に耐性のある糖修飾ヌクレオチド（非常に安定しいている）およびｍＲＮＡのために単一のヌクレオチド識別を有している（Elmen et al., Nucleic Acids Res., （2005）, 33（1）: 439-447; Braasch et al. （2003） Biochemistry
42:7967-7975, Petersen et al. （2003） Trends
Biotechnol 21:74-81）。これらの分子は、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸を、２’−デオキシ−２”−フルオロウリジンなどの可能な修飾とともに有している。さらにＬＮＡは、糖部分を３’−エンドコンホーメーションに強制的に入れることによって、オリゴヌクレオチドに対する特異性を上昇させている。それによって、塩基対に対するヌクレオチドを予め組織化し、ヌクレオチドの融解温度を一塩基につき１０℃も上昇させる。  
【０１１４】
別の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖−リン酸部分が、ヌクレアーゼ消化に対して高い耐性を示し、改良された結合特異性を分子に付与する、ポリアミド骨格を形成することが可能な中性の２−アミノエチルグリセリン部分で置換されている、修飾ヌクレオチドを含む（Nielsen, et al., Science, （2001）, 254:
1497-1500）。
【０１１５】
核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基ではなく、非天然に存在する核酸塩基を少なくとも１つ含有するリボヌクレオチドも好ましい。塩基を修飾してアデノシンデアミナーゼの活性をブロックしてもよい。修飾された核酸塩基の例としては、限定されないが、ウリジンおよび／または５位が修飾されたシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；アデノシンおよび／または８位が修飾されたグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンが好適である。上記修飾は組み合わせてもよい。
【０１１６】
別の実施態様において、架橋を採用して、ＲＮＡｉ剤のファーマコキネティクスを変更する、例えば、体内での半減期を長くすることができる。したがって、本発明は、２つの鎖が架橋している核酸の２つの相補鎖をもつＲＮＡｉ剤を含む。本発明はまた、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素）などに抱合または非抱合した（例えば、その３’末端にて）ＲＮＡｉ剤も含む。このようにｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することは、対応するｓｉＲＮＡと比較して、細胞の取り込みを向上させ、または、得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞標的活性を高めるかもしれず、細胞内のｓｉＲＮＡ誘導体を追跡するのに有用であり、または、対応するｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を高める。  
【０１１７】
抱合は、当業で公知の方法で、例えば、Lambert
et al., Drug Deliv. Rev.:47（1）, 99-112 （2001） （ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子に置かれた核酸について記載ている）；Fattal et al., J. Control Release 53（1-3）:137-43 （1998） （ナノ粒子に結合した核酸について記載ている）; Schwab et al., Ann.
Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 （1994） （挿入剤、疎水性基、ポリカチオンもしくはＰＡＣＡナノ粒子に結合した核酸について記載ている）; およびGodard et
al., Eur. J. Biochem. 232（2）:404-10 （1995） （ナノ粒子に結合した核酸について記載ている）に記載のの方法で達成することができる。
【０１１８】
本発明のＲＮＡｉ剤はさらに、当業で公知の方法を用いて標識化することができる。例えば、核酸組成物をフルオロフォア、例えば、Ｃｙ３、フルオレセイン、またはローダミンで標識化することができる。標識化は、キット、例えば、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ標識キット（Ambion）を用いて行うことができる。さらに、該物質は、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、また他の適切なアイソトープを用いて放射線標識を行うこともできる。
【０１１９】
ｄ．ＲＮＡｉ剤の作製
ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、酵素的に、または、部分的／全体的有機合成によって作製してもよい。
【０１２０】
ある実施態様では、ＲＮＡi剤は、化学的に調製される。RNA分子の合成方法は、当業で公知である。特にVerma and Eckstein （1998） Annul Rev.
Biochem. 67:99-134に記載の化学合成方法により公知である。
【０１２１】
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は酵素的に調製される。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、所望の標的ｍＲＮＡに対して十分な相補性をもつ長ｄｓＲＮＡの酵素処理によって調製することができる。長ｄｓＲＮＡの処理は、in vitroで、例えば、適切な細胞ライセート用いて達成することができ、続いてｓｉＲＮＡは、ゲル電気泳動またはゲル濾過によって精製することができる。ｓｉＲＮＡは、次に当該技術において認識されている方法によって変性することができる。ある実施形態において、ＲＮＡは、溶液または樹脂、沈澱、電気泳動、クロマトグラフィー、もしくはそれらの組み合わせを用いて抽出によって、混合物から、精製することができる。別法として、ＲＮＡは、サンプル処理による損失を回避するために、精製を行わないか、殆ど行わずに用いることもできる。別法として、ＲＮＡはまた、合成ＤＮＡ鋳型もしくはＤＮＡプラスミドからの酵素転写によって調製することもできる。典型的に、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３もしくはＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼが用いられる（Milligan and Uhlenbeck （1989） Methods Enzymol. 180:51-62）。ＲＮＡは、乾燥させて保存しても良いし、水溶液中に溶解させてもよい。該溶液は、緩衝液または塩を含有しており、アニーリングを阻害し、および/または、単一の鎖の安定化を促進する。 
【０１２２】
本発明のいくつかのＲＮＡi剤、特に、本発明のｓｉＲＮＡ分子はさらに、in vivo で、所望の標的ｍＲＮＡに対して十分な相補性をもつ長ｄｓＲＮＡ（＞３０ｂ．ｐ．）の酵素処理によって調製することができる。長ｄｓＲＮＡ分子のin vivo での処理は、ｄｓＲＮＡに対するインターフェロン媒介性の炎症が起こらない、非哺乳動物細胞または哺乳動物細胞において行う。ある実施態様では、ｄｓＲＮＡ酵素処理が可能な細胞は、生物内にあるかもしれない。ｄｓＲＮＡ処理をin vivoで誘発し、標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを生物内で引き起こす。別法として、ｄｓＲＮＡ処理のための内因性機構（例えば、ＤＩＣＥＲ）を含み、または異種遺伝子によって形質転換されｄｓＲＮＡ処理が可能とされた細胞（すなわち、ホスト細胞）を培養して、in vitroでｄｓＲＡＮを誘発してもよい。その後、サイレンシングすべき標的遺伝子を含有する生物に投与するために、ｄｓＲＮＡ処理に引き続いて、ＲＮＡサイレンシング剤をホスト細胞から精製することができる。
【０１２３】
別の実施態において、ＲＮＡｉは、in vivo、in situ、またはin vitroで直接合成される。細胞中の内因性のＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡi剤の転写をin vivoもしくはin situで媒介し、またはクローニングされたＲＮＡポリメラーゼは、 in vivo または in vitroで、転写のために使用することができる。in vivo導入遺伝子または発現作製物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナー、アクセプター、ポリアデニル化）を用いて、ＲＮＡi剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を転写してもよい。阻害を、臓器、組織、または細胞のタイプにおける特異的な転写、環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度、化学的誘導物質）、および/または開発段階もしくは年齢においける光学処理的転写によって、標的化してもよい。ＲＮＡi剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を発現する、該作製物を適切な生物に由来する接合体、胚性幹細胞、または他の多分化能細胞に導入することによって、トランスジェニック生物を組換え作製物から作製してもよい。
【０１２４】
ｅ．ＲＮＡｉ剤の検出
本発明のいくつかの局面において、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、標的ｍＲＮＡ、および／または前記標的ＲＮＡにコードされた遺伝子産物の生成または発現を検出することがこのましかもしれない。本明細書に記載の検出方法には、例えば、クローニングおよびシーケンシング、オリゴヌクレオチドのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応法の使用、およびそれらの変形（例えば、７−デアザＧＴＰを用いたＰＣＲ）、単一ヌクレオチドプライマー誘導伸長アッセイ、所与のストリンジェントな条件下で相補配列に優先的に結合し得ることがわかっている標的特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション技術、およびサンドウィッチハイブリダイゼーション法が含まれる。    
【０１２５】
シーケンシングは、標識されたプライマーもしくはターミネーターを用いた市販の自動シーケンサーを用いて行ってもよいし、またはシーケンシングゲルベース方法によって行ってもよい。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子上で互いに近接するとすぐアニーリングを行うオリゴヌクレオチド配列のライゲーションに基づく方法によって配列分析を行うこともできる（Wu and Wallace, Genomics 4: 560-569 （1989）; Landren et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8923-8927 （1990）; Barany, F.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 （1991））。オリゴヌクレオチドが正確に塩基対を成したときにのみ、リガーゼによって媒介される共有結合が生じる。遅発型の糖尿病突然変異の座位を調べるのに、標的の増幅に熱安定性Ｔａｑリガーゼを用いるリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）が特に有用である。本能温度を上げることで、高ストリンジェント条件下で行われるライゲーション反応が可能になる（Barany, F., PCR Methods and Applications 1: 5-16 （1991））。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション反応は、標的核酸をニトロセルロースまたはナイロン膜状で固定化し、オリゴヌクレオチドプローブで調べる、フィルターベースのフォーマットで行ってもよい。サザンブロット、スロットブロット、「逆」ドットブロット、溶液ハイブリダイゼーション、固体サポートベースのサンドウィッチハイブリダイゼーション、ビーズベース、シリコンチップベース、およびマイクロタイターウェルベースのハイブリダイゼーションフォーマットを含めた公知のハイブリダイゼーションフォーマットのいずれを使ってもよい。
【０１２７】
検出オリゴヌクレオチドプローブの範囲は、１０−１，０００塩基の大きさの範囲である。検出オリゴヌクレオチドプローブを用いて、必要な標的識別を取得するために、
通常、ハイブリダイゼーション反応は、２０℃乃至６０℃で行われる。最も好ましくは、３０℃乃至５０℃で行われる。当業で公知のように、完全な二本鎖およびミスマッチしている二本鎖の間の最適な識別は、ストリンジェントの洗浄中でのホルムアミドの温度および/または塩濃度を操作することによって行われる。
【０１２８】
タンパク質の検出は、特異的な抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、またはそのフラグメントを用いて行われる。
【０１２９】
好ましい検出試薬、例えば、蛍光剤によってクロモ-メチリカルに（coloro-metrically）または ラジオイソティピカルに（radio-iso-typically）標識され、視覚化および/または定量をが容易になる。
【０１３０】
ＩＶ．作製物およびホスト細胞
本発明の別の局面は、作製物、好ましくは、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）またはその部分をコードする発現作製物に関する。本発明の発現作製物には、適切な発現系に使用するのに好適な任意の作製物が含まれ、当業において公知のレトロウイルスベクター、直線状発現カセット、プラスミド、およびウイルスまたはウイルス由来ベクターがそれらに限定されずに含まれる。そのような発現作製物には、１つ以上の誘導プロモーター、Ｕ６
ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターシステム、または当業において公知のその他のプロモーターが含まれてよい。該作製物には、ＲＮＡｉ剤の１または両方の鎖を促進することを含むことができる。両方の鎖を発現する発現作製物には、両方の鎖を連結するループ構造が含まれてもよく、または各鎖は同一の作製物内の個別のプロモーターから別々に転写されてもよい。各鎖は個別の発現作製物から転写されてもよい（Tuschl （2002）,上掲）。
【０１３１】
ある実施態様では、該作製物は、導入遺伝子である。別の実施態において、該作製物はベクターである。本明細書において用いられているところの用語「ベクター」とは、連結された先の別の核酸を輸送できる核酸分子を言う。１つのタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションできる環状の二本鎖ＤＮＡループを言う「プラスミド」である。別のタイプのベクターはウイルスベクターである。このベクターでは、付加的なＤＮＡセグメントはウイルスゲノムにをライゲーションできる。いくつかのベクターは、それらが導入された宿主細胞（例えば、バクテリア性複製起点をもつバクテリアベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）において自律複製することができる。宿主細胞の導入時に、他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み込み、それによって宿主のゲノムとともに複製することができる。さらにいくつかのベクターは、それらが作用可能に結合した遺伝子の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技法に用いられる発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形体であるので、本明細書においては「プラスミド」および「ベクター」は、互換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、そのような形体の他の形体の発現ベクター、例えば、同様の機能を発揮するウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。
【０１３２】
本明細書に記載されているベクターは、当業で公知の種々の方法によって細胞や組織に導入することができる。そのような方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York （1992）に記載されている。その内容を本明細書に引用によって援用する。また、Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore,
Md.（1989）; Hitt et al, "Construction and propagation
of human adenovirus vectors," in Cell Biology: A Laboratory Handbook, Ed.
J. E. Celis., Academic Press. 2.sup.nd Edition, Volume 1, pp: 500-512, 1998;
Hitt et al, "Techniques for human adenovirus vector Construction and
characterization," in Methods in Molecular Genetics, Ed. K. W. Adolph,
Academic Press, Orlando, Fla., Volume 7B, pp:12-30, 1995; Hitt, et al.,
"Construction and propagation of human adenovirus vectors," in Cell
Biology: A Laboratory Handbook," Ed. J. E. Celis. Academic Press. pp:479-490,
1994,も参照されたい。これらも本明細書に引用を持って援用する。該方法は、例えば、安定な、もしくは一過性のトランスフェクション、リポフェクション（例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション）、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターの感染を含む。
【０１３３】
いくつかの態様において、本発明の発現作製物は、１以上の調節配列（例えば、プロモーター配列）に作用可能に連結する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）含む。「作用可能に連結する」というフレーズは、関心のあるヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする配列）を、ヌクレオチド配列（例えば、in vitro の転写／翻訳系の中、またはベクターを宿主細胞に導入した場合は宿主細胞中）が発現可能となるようなやり方で、調節配列に連結することを意味するものとされる。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および結合分子遺伝子鎖の転写または翻訳をコントロールする他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。そのような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, CA （1990）に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞でのヌクレオチド配列の直接的な構成発現および、特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の直接的発現（例えば、組織特異的調節配列）を含む。
【０１３４】
特定の発現ベクターの設計に含まれる他のエレメントは、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのファクターに依存することができる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる、ｍＲＮＡ、融合タンパク質もしくはペプチドを含むタンパク質もしくはペプチドを産生させることができる。
【０１３５】
作製物は、当業で公知の組換えＤＮＡ技術によって構築することができる。ＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列は、公知の技法を用いて調製することができる。例えば、２つの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成して、新規な全体的なＲＮＡｉ剤を創製することができる。クローニングのための「粘着性の末端」を残している、対を成すＤＮＡオリゴヌクレオチドを、プロモーター配列（例えば、Ｐｏｌ
ＩＩｍａｔａｈａ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）および適切なターミネーター配列３’を操作されたＲＮＡ前駆体配列（例えば、ＳＶ４０またはＰｏｌ
ＩＩＩターミネーター配列からの切断およびポリアデニル化シグナル）に含有するプラスミドの制限部位に挿入することができる。
【０１３６】
本明細書に記載の作製物は、当業で公知の種々の方法のいずれかによって細胞や組織に導入することができる。そのような方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York （1992） に記載されている。その内容を本明細書において引用によって援用する。また、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, Baltimore, Md.（1989）; Hitt et al, "Construction and
propagation of human adenovirus vectors," in Cell Biology: A Laboratory
Handbook, Ed. J. E. Celis., Academic Press. 2.sup.nd Edition, Volume 1, pp:
500-512, 1998; Hitt et al, "Techniques for human adenovirus vector
Construction and characterization," in Methods in Molecular Genetics, Ed.
K. W. Adolph, Academic Press, Orlando, Fla., Volume 7B, pp:12-30, 1995; Hitt,
et al., " Construction and propagation of human adenovirus vectors,"
in Cell Biology: A Laboratory Handbook," Ed. J. E. Celis. Academic Press.
pp:479-490, 1994も参照されたい。これらも本明細書に引用を持って援用する。該方法は、例えば、安定な、もしくは一過性のトランスフェクション、リポフェクション（例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション）、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターの感染を含む。
【０１３７】
ａ．ＲＮＡｉ剤発現作製物
いくつかの態様において、本発明は、本発明のＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）の発現を促進するＤＮＡ発現作製物を提供する。
【０１３８】
標的ｍＲＮＡの発現を抑制するのに十分なＲＮＡｉ剤の細胞内濃度を達成するためには、例えば、そのような発現作製物には、１つ以上の誘導プロモーター、Ｕ６
ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターシステム、または当業で公知のその他のプロモーターが含まれてよい。そのような作製物を、標的細胞をin vitro またはin vivo でトランスフェクトすることによって、切断（すなわち、ＲＮＡｉ）のための十分な量のＲＮＡi剤の転写が導かれる。例えば、ベクターは、細胞に取り込まれ、ＲＮＡｉ剤の転写を導くように、in
vivo で導入することができる。そのようなベクターは、エピソームを維持してもよいし、転写され、所望のｓｔＲＮＡ前駆体を産生する限り、染色体に導入されてもよい。
【０１３９】
いくつかの態様において、本発明の発現作製物は、ｓｉＲＮＡをコードする。該発現作製物は、好ましくは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖をコードする。両方の鎖を発現する発現作製物には、両方の鎖を連結するループ構造が含まれてもよい。別法として、各鎖は、同一の作製物内の別個のプロモーターから別々に転写されてもよい。各鎖は別個の発現作製物から転写されてもよい（Tuschl （2002）,上掲）。
【０１４０】
ある局面では、ＲＮＡｉ剤を本願明細書に記載の例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの干渉リボ核酸ではなく、前記ＲＮＡｉ剤は本願明細書に記載の例えばｓｈＲＮＡなどの干渉ヌクレアーゼをコードしてもよい。つまり、前記ＲＮＡｉ剤は、前記干渉リボ核酸の転写テンプレートであってもよい。したがって、本発明のＲＮＡｉ剤には、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびｓｈＲＮＡを発現するためにつくられた発現作製物が含まれてよい。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ
ＩＩＩ）プロモーターから開始し、４−５チミン転写終了部位の２位で終了すると考えられている。発現後、ｓｈＲＮＡは３’ＵＵオーバーハングを有するステム−ループ構造に折り畳まれると考えられ、その後、これらのｓｈＲＮＡの末端が処理されて、ｓｈＲＮＡが約２１乃至２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に転換される。 Brummelkamp et al., Science 296:550-553 （2002）; Lee et al, （2002）. 上掲; Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500 （2002）; Paddison et al. （2002）, 上掲; Paul （2002）, 上掲; Sui （2002） 上掲; Yu et al. （2002）, 上掲。そのようにして精製されたｓｈＲＮＡを適切な条件下で、ＲＮＡｉ機構によって処理して（例えば、適切な in vitro 反応または細胞中）（すなわち、ダイサーおよび/またはＲＩＳＣ複合体）、ｓｉＲＮＡを生成する。ｓｈＲＮＡは、外因的に合成することが可能であり、または、in vivo でRNAポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ ＩＩもしくはＰｏｌ ＩＩＩポリメラーゼ）から転写することもでき、所望の遺伝子サイレンシングが安定しており、また遺伝的である、連続的な細胞系列またはトランスジェニック動物を構築することを可能にする。
【０１４１】
単一の作製物は、ＲＮＡi剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）をコードする多数の配列、例えば、突然変異体ＳＯＤ１をコードし、同じ遺伝子または複数の遺伝子を標的化し、例えば、別個のＰｏｌ
ＩＩＩプロモーター部位によって駆動しうる遺伝子の多数の領域を含んでもよい。
【０１４２】
ウイルス媒介送達メカニズムを用いて、例えばＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター転写制御下におけるｓｉＲＮＡを有する組換えアデノウイルスの作製などによるｓｉＲＮＡの発現を通して、標的遺伝子の特異的サイレンシングを誘導することができる（Xia et al. （2002）, 上掲）。これらの組換えアデノウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染によって、内因性標的遺伝子発現を低減することができる。ｓｉＲＮＡの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに組換えアデノウイルスベクターを注射すると、in vivoにおいて標的遺伝子の発現が減少する。同文献。動物モデルにおいて、全胚電気穿孔は、合成ｓｉＲＮＡを効率的に移植後マウス胚合成ｓｉＲＮＡに送達させることができる（Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99（22）:14236-40 （2002））。成体マウスにおいて、核酸物質の効率的な送達は、「高圧」送達技術によって実現することができる。これは溶液を含有する大量の核酸物質を、尾部静脈を介して動物体内へ迅速に（５秒以内に）注入する技術である。（Liu （1999）, 上掲；McCaffrey （2002）, 上掲；Lewis, Nature Genetics 32:107-108 （2002））。
【０１４３】
ｂ.宿主細胞
本発明の別の局面は、本発明の宿主作製物が導入された宿主細胞、すなわち、「組換え宿主細胞」に関する。用語「組換え宿主細胞」は、特定の被検細胞のみならず、そのような細胞の子孫を意味することも意図されている。突然変異や環境の影響によって後の世代において特定の変形が生じるかも知れず、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲に含むものとする。
【０１４４】
宿主細胞は、真核細胞の方が好ましいものの、原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）が挙げられる。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１４５】
本発明の宿主細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック動物を作製することもできる。非ヒトトランスジェニック動物は、作用物質もしくは化合物、例えば、障害、例えば、突然変異もしくは異常な遺伝子発現、機能獲得型の突然変異に関連した疾患や障害、および神経学的疾患や障害などの有害な徴候を寛解させることが可能な薬物、医薬品などを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
【０１４６】
本発明はまた、限定されないが、本明細書において用いられる、細胞種や細胞系列の使用に関する。異なる組織、または異なる種（ヒト、マウス、など）からの細胞もまた本発明において有用である。
【０１４７】
Ｖ．ＲＮＡｉを誘導するための操作された前駆体の使用
本明細書において記載しているように、細胞または生物体全体に導入された操作されたＲＮＡ前駆体は、所望のｓｉＲＮＡ分子を導く。そのようなｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ経路の内因性のタンパク質成分と結合し、特異的なｍＲＮＡ配列を切断および破壊の標的とする。このようにして、操作されたＲＮＡ前駆体から生成されたｓｉＲＮＡによって標的とされたｍＲＮＡは、細胞または生物体から枯渇していき、細胞または生物体におけるｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の濃度は減少する。
【０１４８】
ＶＩ.核酸、ベクター、および宿主細胞を導入する方法
核酸を導入する物理的方法としては、核酸を含有する溶液の注入、核酸で被覆した粒子の照射、細胞もしくは生物体の核酸溶液への浸漬、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションがあげられる。ウイルス粒子にパッケージされたウイルス作製物は、発現作製物の細胞への効率的な導入および該発現作製物でコードされたＲＮＡの転写の双方を達成することができるであろう。核酸を細胞へ導入するための、当業で公知の他の方法を用いてもよい。例えば、液体媒介性担体輸送、リン酸カルシウムなどの化学物質により媒介される輸送などがある。核酸は、細胞によって核酸の取り込みを高める活性、標的遺伝子の阻害を高める活性のうちの１以上を達成する他の成分とともに導入してもよい。
【０１４９】
核酸は、細胞に直接（すなわち、細胞内に）導入してもよいし、または細胞外的に腔や間質性の空間に導入してもよいし、生物体の血液循環中に導入してもよい。また、経口的に導入してもよいし、細胞もしくは生物体を、核酸を含有する溶液に浸すことによって導入してもよい。血管もしくは血管外、血液もしくはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入する部位となる。
【０１５０】
該標的遺伝子を持つ細胞は、生殖細胞系列または体細胞、全能細胞または多分化能をもつ細胞、分裂型細胞または非分裂型細胞、実質細胞または上皮細胞、不死化された細胞または形質転換された細胞、などのいずれからのものでもよい。該細胞は幹細胞または分化細胞でよい。分化される細胞には、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、神経細胞、グリア細胞、血液細胞、巨大核細胞、リンパ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝実質細胞、および内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
【０１５１】
特定の標的細胞および送達されるＲＮＡｉ剤の投与量に依存して、このプロセスは、標的遺伝子の部分的または完全な機能の損失をもたらすかもしれない。遺伝子発現の減少もしくは損失は、例えば、標的とされる細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上である。遺伝子発現の阻害とは、標的遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡ生成物のレベルの欠如（もしくは観察可能な減少）を言う。いう。特異性とは、他の遺伝子の細胞に明らかな効果を及ぼすことなく標的遺伝子を阻害する能力を言う。阻害の結果は、細胞もしくは生物体（以下の例中に記載）の外向きの特性を調べることによって、または、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイを用いた遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、および蛍光標示式細胞分析（ＦＡＣＳ）によって、確認することができる。
【０１５２】
細胞系列または生物体全体におけるＲＮＡ媒介性の阻害は、そのタンパク質産物を容易に調べられるレポーター遺伝子または薬剤耐性遺伝子を用いて好都合に調べられる。そのようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコニダーゼ（原語；glucoronidase）（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体がある。多数の選択可能なマーカーが入手可能であり、それらはアンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対して耐性を示すものである。アッセイによって、遺伝子発現を定量化して、本発明によって処理されていない細胞と比較して、阻害の程度が１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％より大きいものを決定することができる。注入する物質の用量を下げ、ＲＮＡｉ剤投与からの時間を長くすることによって、少量の細胞での阻害を得てもよい（例えば、標的細胞の１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、または９５％）。細胞中での遺伝子発現の定量化によっても、標的ｍＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにおいて、類似の阻害量を示すかもしれない。例として、阻害効率は、細胞中の遺伝子産物の量を評価することによって決定すればよく、ｍＲＮＡは、阻害性二重鎖ＲＮＡに使用する領域の外部にヌクレオチド配列をもつハイブリダイゼーションによって阻害すればよい。または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対する抗体によって検出することができる。
【０１５３】
ＲＮＡｉ剤は、１細胞につき少なくとも１つのコピーを送達することができる量を導入すればよい。より高い容量（例えば、１細胞につき少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）の物質を用いれば、より高い阻害効率を得られるかもしれない。また、特異的適用のためには低用量が有用かもしれない。
【０１５４】
合成ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソームトランスフェクションおよびエレクトロポレーションをはじめとした、当業で公知の方法で細胞に送達することができる。しかしながら、外因性ｓｉＲＮＡは、一般的にサイレンシング効果の持続性が短い（培養細胞において４〜５日）。このことは、特定の実施態様においてのみ有益かもしれない。標的遺伝子（すなわち、突然変異体遺伝子）の抑制効果を長くし、特定の条件下で、送達を容易にするためには、１以上のｓｉＲＮＡを、組換えＤＮＡ作製物由来の細胞内で発現させることができる。組換えＤＮＡ作製物由来の細胞内でｓｉＲＮＡ二本鎖を発現させて、長時間の標的遺伝子抑制を可能にするそのような方法は、当業で公知であり、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡを発現することが可能な哺乳動物Ｐｏｌ
ＩＩＩプロモーター系（例えば、Ｈ１またはＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系（Tuschl （2002）、上掲）; （Bagella et al.,
J. Cell. Physiol. 177:206-213 （1998）; Lee et al. （2002）, 上掲; Miyagishi et
al. （2002）, 上掲; Paul et al. （2002）, 上掲; Yu et al. （2002）, 上掲; Sui et al. （2002）, 上掲）がなどがある。ＲＮＡ
Ｐｏｌ ＩＩＩによる転写終了は、ＤＮＡテンプレート内の４つの連続したＴ残基で起こり、ｓｉＲＮＡ転写を特異的な配列で停止するメカニズムを提供する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子内の配列に５’−３’および３’−５’方向において相補的である。そして、ｓｉＲＮＡの２つの鎖を同じ作製物または別個の作製物中で発現させることができる。Ｈ１またはＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターによって動くヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することができる（Bagella et al. （1998）, 上掲;  Lee et al. （2002）, 上掲; Miyagishi et
al. （2002）, 上掲; Paul et al. （2002）、上掲; Yu et al. （2002）, 上掲; Sui et al. （2002） 上掲）。T7 プロモーターの制御下で、ｓｉＲＮＡ配列を含有する作製物もまた、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを発現するベクターをもつ細胞中でコトランスフェクトされたとき、機能的ｓｉＲＮＡを作製する （Jacque （2002）, 上掲）。単一の作製物は、ｓｉＲＮＡをコードする多数の配列、例えば、突然変異体ＳＯＤ１をコードし、例えば、別個のＰｏｌＩＩＩプロモーター部位によって同じ遺伝子または多数の遺伝子を標的とする遺伝子の多数の領域を含んでもよい。
【０１５５】
動物細胞は、動物発育中の転写後または翻訳レベルでの遺伝子の発現を調節することができるミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称される約２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡの範囲を発現する。ｍｉＲＮＡの１つの共通の特徴は、約７０ヌクレオチド前駆体ＲＮＡステムループから、おそらくダイサー、ＲＮａｓｅ
ＩＩＩ型酵素、もしくはその類似体によって、切断されているということである。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を標的ｍＲＮＡに相補的な配列で置換することによって、操作された前駆体を発現するベクター作製物を用いて、ｓｉＲＮＡを作製し、哺乳動物細胞中で特異的なｍＲＮＡ標的に対するＲＮＡｉを開始することができる（Zeng （2002）, 上掲）。ポリメラーゼ ＩＩＩプロモーターを含有するＤＮＡベクターによって発現させたとき、 ヘアピン状態に設計されたミクロＲＮＡ
は、遺伝子発現をサイレンスにすることができる （McManus （2002）、上掲）。遺伝子多型を標的とするミクロＲＮＡも、ｓｉＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングの不存在下で突然変異タンパク質の翻訳をブロックする際に有用である。そのような適用は、例えばデザインされたｓｉＲＮＡが野生型タンパク質の標的外サイレンシングを生じるような状況で有用である場合がある。
【０１５６】
ウイルス媒介送達メカニズムを用いて、例えば、ＲＮＡ Pol IIプロモーター転写制御下におけるｓｉＲＮＡを有する組換えアデノウイルスの作製などによるｓｉＲＮＡの発現を通して、標的遺伝子の特異的サイレンシングを誘導することができる（Xia et al. （2002）、上掲）。 これらの組換えアデノウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染によって、内因性標的遺伝子発現を低減することができる。ｓｉＲＮＡの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに組換えアデノウイルスベクターを注射すると、in vivoにおいて標的遺伝子の発現が減少する。同文献。動物モデルにおいて、全胚電気穿孔は、合成ｓｉＲＮＡを効率的に移植後マウス胚合成ｓｉＲＮＡに送達させることができる（Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99（22）:14236-40 （2002））。成体マウスにおいて、ｓｉＲＮＡの効率的な送達は、「高圧」送達技術によって実現することができる。これは溶液を含有する大量のｓｉＲＮＡを、尾部静脈を介して動物体内へ迅速に（５秒以内に）注入する技術である（Liu （1999）、上掲; McCaffrey （2002）, 上掲; Lewis, Nature Genetics 32:107-108 （2002））。ナノ粒子およびリポソームを用いて、ｓｉＲＮＡを動物体内へ送達することもできる。
【０１５７】
本発明の核酸組成物には、非修飾ｓｉＲＮＡ、および架橋ｓｉＲＮＡ誘導体、または３’もしくは５’末端などに結合させた非ヌクレオチド部分を有する誘導体など、当業に知られる修飾ＲＮＡの両方が含まれる。このようなｓｉＲＮＡ誘導体の修飾は、細胞取り込みが改善するか、もしくは相当するｓｉＲＮＡと比較して、得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞の標的活性を促進するか、前記細胞のｓｉＲＮＡ誘導体を追跡するのに有用であるか、または相当するｓｉＲＮＡと比較したｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を向上することもある。
【０１５８】
本願明細書に記載の細胞または組織全体に導入された操作されたＲＮＡ前駆体によって、望ましいｓｉＲＮＡ分子の産生が引き起こされるだろう。そこで、そのようなｓｉＲＮＡ分子は、切断および破壊のための特異的なｍＲＮＡ配列に結合し標的とするＲＮＡｉ経路の内因性タンパク質要素に関連するだろう。このようにすれば、操作されたＲＮＡ前駆体から作製されたｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡは、前記細胞および生物体から大幅に減少し、前記細胞または組織中のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の濃度が減少するだろう。ＲＮＡ前駆体は、典型的にはｄｓＲＮＡの１本鎖を個別にコードするか、またはＲＮＡヘアピンループ構造のヌクレオチド配列全体をコードする核酸分子である。
【０１５９】
本発明の核酸組成物は、例えば吸収、有効性、バイオアベイラビリティ、および／または半減期などの薬物動態学的パラメタなどの前記組成物の性質を向上させるナノ粒子などの別の部分と結合させることもでき、または結合させないでもよい。その結合は、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.:47（1）, 99-112 （2001） （ポリアルキルシアノアクリル酸（PACA）ナノ粒子に装着された核酸について記載）、Fattal et al., J. Control
Release 53（1-3）:137-43 （1998） （ナノ粒子に結合させた核酸について記載）、 Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 （1994） （挿入剤、疎水基、ポリカチオンＰＡＣＡナノ粒子に結合させた核酸について記載）、およびGodard
et al., Eur. J. Biochem. 232（2）:404-10 （1995） （ナノ粒子に結合させた核酸について記載）の方法を用いるなど、当業に知られる方法によって実現することができる。
【０１６０】
本発明の核酸分子は、当業に知られる任意の方法を用いて標識することもでき、例えば、前記核酸分子組成物が例えばＣｙ３、フルオレセイン、ローダミンなどのフルオロフォアで標識することができる。その標識は、例えばＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡラベリングキット（アンビオン）など、キットを用いて行うことができる。さらに、前記ｓｉＲＮＡは、例えば３Ｈ、３２Ｐまたはその他の適切な同位体などを用いて放射標識することができる。
【０１６１】
さらに、ＲＮＡｉは、少なくとも１つの１本鎖ＲＮＡ中間体を経る過程であると考えられるため、当業者は、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ（例えばｄｓ−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖など、本願明細書に記載のとおりデザイン（例えば化学合成用に）、作製（例えば酵素的に作製）または発現（例えば、ベクターまたはプラスミドから）することもでき、本願特許請求の範囲に述べられた方法論にしたがって利用することができるということは理解されよう。さらに、無脊椎動物では、ＲＮＡｉは長いｄｓＲＮＡ（例えば長さが約１００乃至１０００ヌクレオチド、好ましくは約２００乃至５００であって、例えば、約２５０、３００、３５０、４００、または４５０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ）であって、ＲＮＡｉのエフェクタＴ細胞として作用するＲＮＡｉは長いｄｓＲＮＡによって効果的に引き起こすことができる。
【０１６２】
ＶＩＩ．薬学的組成物および投与方法
本発明のｓｉＲＮＡ分子は薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物には、典型的には、核酸分子および薬学的に許容な担体が含まれる。本願明細書に記載の「薬学的に許容な担体」という用語は、薬学的投与に適合する、食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、ならびに等張および吸収遅延剤などを意味する。補助的な活性化合物も、当該組成物に組み込むことができる。
【０１６３】
薬学的組成物は、意図する投与経路と適合するように調剤される。投与経路の例には、例えば、静脈内、皮内、皮下、口腔内（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与などの非経口投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下投与に使用する溶液または懸濁液には、以下の成分、注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などおキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などのバッファ、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力調整剤などが含まれていてよい。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの、酸や塩基で調整することができる。非経口製剤は、アンプル、ガラスまたはプラスチック製の使い捨て用シリンジ、または複数の投与用バイアルの中に封入されていてよい。
【０１６４】
注射に使用するために好適な薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性）、または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調整用滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に好適な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモホールＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パシッパニー）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、前記組成物は滅菌状態であって、注射容器への充填が容易な程度、流動的でなければならない。前記組成物は、製造および保存の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、および液体状ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。微生物の作用は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの各種抗細菌剤および抗真菌剤によって防ぐことができる。多くの場合、例えば、糖、マニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張剤を前記化合物に含めることが望ましいだろう。注射可能な組成物の吸収を持続させるために、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含ませてもよい。
【０１６５】
滅菌された注射可能な溶液は、適切な溶媒中に入れた必要量の前記活性化合物を、必要に応じて上述の成分1つまたはそれらの組み合わせに組み入れてからろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上述の物質のうちの必要なその他の成分を含む滅菌担体に前記活性化合物を組み入れて調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前記活性成分の粉末に加えて予め滅菌ろ過されたその溶液から得られた任意の追加の望ましい成分を得られる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１６６】
経口組成物には一般に、不活性な希釈剤または食用担体が含まれる。治療用の経口投与の場合、前記活性化合物を賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ、または例えばゼラチンカプセルなどのカプセルなどの形状で用いることができる。経口組成物はまた、洗口剤として用いられる液体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合な結合剤、および／またはアジュバント物質は、前記組成物の一部分として含めることもできる。前記錠剤、丸剤、カプセル、およびトローチなどは、以下の成分、もしくは同様の性質の化合物のいずれかを含むことができる。それは、微結晶性セルロース、ガムトラガカント、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（Sterote）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味料などの香味剤である。
【０１６７】
吸入による投与の場合、前記化合物は、例えば二酸化炭素などの好適な高圧ガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネビュライザーからのエアロゾルスプレーの形状で送達する。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されるものが含まれる。
【０１６８】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段でもよい。経粘膜または経皮投与の場合、透過させようとする関門に適切な浸透剤を、前記製剤に用いる。そのような浸透剤は一般に当業に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用によって実施することができる。経皮投与の場合、前記活性化合物は、一般に当業に知られる軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル、またはクリームに調製する。
【０１６９】
前記化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤ベース）または直腸送達用の停留浣腸の形状に調製してもよい。
【０１７０】
前記化合物はまた、McCaffrey et
al. （2002）, Nature, 418（6893）, 38-9 （流体力学トランスフェクション）; Xia et al. （2002）, Nature Biotechnol., 20（10）, 1006-10 （ウイルス媒介送達）; またはPutnam （1996）, Am. J. Health Syst. Pharm.53（2）, 151-160, 誤字 Am. J. Health
Syst. Pharm. 53（3）, 325 （1996）に記載の方法が限定されずに含まれる、当業に知られる方法を用いてトランスフェクションまたはインフェクションによって投与することができる。
【０１７１】
前記化合物はまた、ＤＮＡワクチンなど、核酸剤の投与に好適な任意の方法によって投与することもできる。前記方法には、遺伝子銃、バイオ注射器、および皮膚用添付剤、ならびに米国特許第６，１９４，３８９号に開示されている微粒子ＤＮＡワクチン技術などの無針法、米国特許第６，１６８，５８７号に開示されるパウダー状ワクチンを有する哺乳動物経皮無心ワクチン投与が含まれる。さらに、とりわけHamajima et al. （1998）, Clin. Immunol. Immunopathol., 88（2）, 205-10に記載されているものなど、経鼻送達も可能である。リポソーム（例えば米国特許第６，４７２，３７５号に記載されているなど）およびマイクロカプセル封入も使用することができる。生分解性標的化可能微粒子送達システムも使用することができる（例えば米国特許第６，４７１，９９６号に記載されているなど）。
【０１７２】
ある実施態様では、前記活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達システムを含む、制御放出製剤などの、体外への急速な排出から前記化合物を保護する担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製は、標準技術を用いて行うことができる。前記材料はアルザ社（Alza Corporation）およびノバファーマシューティカルズ社（Nova Pharmaceuticals, Inc）から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を狙ったリポソームを含む）を薬学的に許容な担体として用いることもできる。これらは、米国特許第４，５２２，８１１号などに記載の、当業に知られる方法に従って調製することができる。
【０１７３】
当該化合物の毒性および治療上の有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％に致死的な投与量）およびＥＤ５０（個体群の５０％に治療上有効な投与量）など、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的方法によって決定することができる。毒性作用および治療上有効な作用の投与量の比は治療指数であって、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を用いる場合、感染していない細胞に与える可能性のある損傷を最小にして副作用を減少するよう、そのような化合物を罹患組織の部位に狙わせる送達システムをデザインするように、注意が払われなければならない。
【０１７４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を決定する際に用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性が小さいかまたは皆無のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。前記用量は、用いられた投与剤形および使用された投与経路によって、この範囲内で変化させてもよい。本発明の方法に用いられるいずれの化合物の場合も、治療上有効な投与量は、最初は細胞培養アッセイで推定することができる。１回投与量は、動物モデルにおいて、細胞培養物で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大半減抑制を達成する前記テスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲になるように調製してもよい。このような知見は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために用いることができる。血漿濃度は、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定することもできる。
【０１７５】
本願明細書に記載の、核酸分子の治療上有効な量（すなわち有効投与量）は、選択された核酸による。例えば、ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを選択する場合、単回投与量は、約１:ｇ（原文）乃至１００ｍｇの範囲内で投与してもよく、ある実施態様では１０、３０、１００または１０００:ｇ（原文）を投与することがある。ある実施態様では、１乃至５ｇの前記組成物を投与することができる。前記組成物は、２日に１回など、１日１回乃至１回以上、または１週間に１回以上投与することができる。当業者は、特定の要因が、疾患またな障害の重篤度、治療歴、対象の全般的な健康状態、およびその他に罹患する疾患をそれらに限定せずに含む、前記対象を有効に治療するために必要な用量および時間に影響することもあるということを理解するであろう。さらに、被験体の治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体での治療は、単回の治療を含んでもよく、または好ましくは、一連の治療を含んでもよい。
【０１７６】
本発明の核酸分子は、例えば、上述のXia et
al., （2002）に記載の方法が限定されずに含まれる、当業に知られる方法を用いて、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターなどの発現作製物に挿入することができる。発現作製物は、例えば、吸入、経口、静脈内投与、局所投与（米国特許第５,３２８，４７０号参照）、または定位固定注射（例えばChen et al. （1994）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057参照）によって対照に送達することができる。前記輸送ベクターの薬学的調製には許容な希釈剤に入れたベクターが含まれてもよく、または輸送用賦形剤が埋め込まれた徐放性基質を含んでもよい。別法として、例えばレトロウイルスベクターなど、完全な輸送ベクターを組換え細胞から無傷で作製できる場合、前記薬学的調製物は遺伝子送達システムをつくる1つ以上の細胞を含むことができる。
【０１７７】
本発明の核酸分子には、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびｓｈＲＮＡを発現するためにつくられた発現作製物が含まれてよい。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼIII（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターから開始し、４−５チミン転写終了部位の２位で終了すると考えられている。発現後、ｓｈＲＮＡは３’ＵＵオーバーハングを有するステム−ループ構造に折り畳まれると考えられ、その後、これらのｓｈＲＮＡの末端が処理されて、ｓｈＲＮＡが約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に転換される。Brummelkamp et al. （2002）, Science, 296,
550-553; Lee et al, （2002）. supra; Miyagishi and Taira （2002）, Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. （2002）, supra; Paul （2002）, supra; Sui （2002） supra; Yu et
al. （2002）、上掲。
【０１７８】
前記発現作製物は、適切な発現システムに使用するのに好適な任意の作製物であってよく、当業に知られるレトロウイルスベクター、直線状発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターがそれらに限定されずに含まれる。そのような発現作製物には、１つ以上の誘導プロモーター、Ｕ６
ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターなどのＲＮＡ Ｐｏｌ IIIプロモーターシステム、または当業に知られるその他のプロモーターが含まれてよい。該生成物は、ｓｉＲＮＡの１つもしくは両方の鎖を含むことができる。両方の鎖を発現する発現作製物には、両方の鎖を連結するループ構造が含まれてもよく、または各鎖は同一の作製物内の個別のプロモーターから別々に転写されてもよい。各鎖は個別の発現作製物から転写されてもよい。上述のTuschl （2002）。
【０１７９】
薬学的組成物は、投与法の説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに包含されていてよい。
【０１８０】
ＶＩＩＩ．治療方法
本発明は、機能獲得型突然変異タンパク質によって、全体的にまたは部分的に引き起こされた疾患または障害のリスクがある（または感受性がある）を治療するための予防および治療方法の両方を提供する。ある実施態様では、前記疾患または障害は優性の機能獲得型疾患である。好ましい実施態様では、前記疾患または障害はＳＯＤ１遺伝子の改変、特にＳＯＤ１突然変異対立遺伝子における点突然変異に関連する疾患であって、臨床徴候にはＡＬＳ患者に認められるものが含まれるような、ＳＯＤ１遺伝子（構造または機能）またはＳＯＤ１タンパク質（構造または機能または発現）に異常を引き起こす疾患である。
【０１８１】
本願明細書に記載の「治療」または「治療する」は、疾患もしくは障害、疾患または障害の症状、または疾患もしくは障害の素因を有する患者への治療用の物質（例えばＲＮＡ剤またはベクターまたはそれをコードする導入遺伝子）の適用もしくは投与、または前記患者から単離された組織または細胞株への治療用物質の適用もしくは投与であって、当該適用もしくは投与の目的が疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患の素因の治療、治癒、緩和、軽減、改変、改善、改良、向上、または作用である、適用もしくは投与として定義される。
【０１８２】
ある局面では、本発明は、被験体において、該被験体に治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤またはベクターまたはそれをコードする導入遺伝子）を投与することによって、上述の疾患または障害を予防する方法を提供する。前記疾患のリスクがある被験体は、例えば本願明細書に記載の任意のまたは組み合わせた診断アッセイまたは予後アッセイによって同定することができる。予防剤は、前記疾患または障害を予防、または代替的にはその進行を遅らせるように、前記疾患または障害に特徴的な症状の徴候の前に投与することができる。
【０１８３】
本発明の別の局面は、被験体を治療的に処理する、つまり前記疾患または障害の症状の発症を改変させる方法に関連する。ある例示的な実施態様では、本発明の調節方法は、機能獲得型突然変異を発現する細胞と、前記遺伝子の配列特異的な干渉を実現するような、前記遺伝子内の突然変異に特異的な治療剤（例えばＲＮＡｉ剤またはベクターまたはそれをコードする導入遺伝子）と接触させるステップに関与する。これらの方法は、in vitro（例えば前記細胞を前記作用剤で培養するなど）または代替的にはin vivoにおいて（例えばその物質を被験体に「投与する」ステップによって）実行することができる。
【０１８４】
処置の予防的および治療的な方法の両方に関して、そのような処置は薬理ゲノム学分野から得られた知識を本に、特別にあつらえるか、または修正してもよい。本願明細書に記載の「薬理ゲノム学」は、臨床開発用および市販用薬物の遺伝子配列解析、統計学的遺伝子学、および遺伝子発現解析などのゲノミクス技術の適用を意味する。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対する応答（例えば患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」など）をどのように決定するかを研究することを意味する。したがって、本発明の別の局面は、本発明の標的遺伝子分子、または個人の薬物応答遺伝子型にしたがった標的遺伝子モジュレータのいずれかによる、個人の予防的または治療的処置をあつらえる方法を提供する。薬理ゲノム学は、臨床医または医師が、予防的または治療的処置から最も利益を得るであろう患者のみを前記処置の対象にし、有毒な薬物関連の副作用を経験するであろう患者の治療を避けることを可能にする。
【０１８５】
治療剤は適切な動物モデルにおいてテストすることができる。例えば、本願明細書に記載のＲＮＡｉ剤（または発現ベクターもしくはそれをコードする導入遺伝子）を動物モデルに用いて、前記薬剤での処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。別法として、治療剤を動物モデルに用い、そのような作用薬の作用機序を決定することができる。例えば、薬剤を動物モデルに用いて、前記薬剤での処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。別法として、薬剤を動物モデルに用い、そのような作用薬の作用機序を決定することができる。
【０１８６】
実施例
以下の材料、方法、および例は、具体例を示すのみで、制限を意図しない
【０１８７】
材料と方法
ＲＮＡおよびＤＮＡ作製物
１本鎖ＲＮＡ（例えば、図１参照）は、ダーマコン・リサーチ社（Dharmacon Research）から購入し、製造者の指示に従って脱保護し、記載の通りアニーリングした（Nykanen et al., 2001）。
【０１８８】
野生型および突然変異ＳＯＤ１−ＧＦＰ融合タンパク質を作製するために、ＳＯＤ１ ｗｔ（Genbank Accession No. ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０００４４５; 図７; 配列番号：１８）、ＳＯＤ１
Ｇ８５Ｒ、およびＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ（配列番号：１６）ｃＤＮＡを、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｍｉｔｏ／ＧＦＰ（インビトロゲン社（Invitrogen））のＰｍｌ I およびＰｓｔＩ部位の間でＰＣＲクローニングした。このクローニングステップによって、ミトコンドリア標的配列が削除された。
【０１８９】
ｍｙｃタグ付き野生型ＳＯＤ１を作製するために、ＳＯＤ１ｗｔ ｃＤＮＡ （配列番号：１７）をｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｍｉｔｏ／ＧＦＰのＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ部位の間でＰＣＲクローニングした。ミトコンドリア標的配列は、ＢｓｓＨＩＩおよびＰｍｌＩで切断し、平滑末端化ライゲーションすることによって削除した。
【０１９０】
ｓｈＲＮＡベクターを作製するために、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの２つの鎖をアニーリングし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｕ６）駆動ベクターに、制限部位ＰｍｅＩおよびＰｓｔＩを用いてサブクローニングした（Sui et al. 2002）。ＤＮＡ鎖は、９個のヌクレオチドループ（ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ）によって連結されている１９または２１ｎｔセンスおよびアンチセンス鎖（標的配列とマッチする）を含有していた。該センス鎖は、５個の連続するチミジン（ＴＴＴＴＴ）で終了する。
【０１９１】
すべての作製物を、シーケンシングによって確認した。ＤｓＲｅｄ（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１）は、クロンテック社（Clontech）（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。Ｕ６−Ｇ９３Ａ は上述の通り作製した（Sui et al., 2002）。３’ブロックｓｉＲＮＡは標準技術によって合成された。
【０１９２】
In-vitro ＲＮＡｉアッセイ
野生型または突然変異ＳＯＤ１のいずれかをコードする配列を有する５６０ヌクレオチドヒトＳＯＤ１標的ＲＮＡを、既報の通り調製する（Zamore et al., 2000）。標的切断は、濃度約〜５ｎＭのショウジョウバエ胚ライセートを含有する標準in vitro ＲＮＡｉ反応において２５乃至１００ｎＭ ｓｉＲＮＡを有する５’３２Ｐ−キャップ放射標識標的をインキュベートすることによって決定した。
【０１９３】
細胞培養およびトランスフェクション
Ｈｅｌａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌ−１ペニシリン、および１００ｕｇ／ｍｌ−１ストレプトマイシンをＤＭＥＭならびにＤＭＥＤおよびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（１：１）に入れたＮ２Ａ細胞の両方ともに添加し、その中で培養した。トランスフェクションの２４時間前、細胞（集密度７０乃至９０％）を倍散で脱離させ、６ウェルプレートに移して、抗生物質を含まない新鮮培地で培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（登録商標）（インビトロゲン社（Invitrogen））を、製造者の指示に従って用いて行った。トランスフェクションに用いた作製物の量は、突然変異または野生型ＳＯＤ１−ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄプラスミドそれぞれ４μｇ、ｓｉＲＮＡを４ｘ１０−１１または４ｘ１０−１２モル、ならびにＵ６−Ｇ９３Ａを２０または８μｇである。
【０１９４】
In vivoトランスフェクション
６乃至８週齢のマウス２４匹を３つのグループに分けた。第１のグループはｓｈＲＮＡベクターの投与を受けておらず、第２のグループは２０μｇの空ベクターの投与を受け、第３のグループはＳＯＤ１
Ｇ９３Ａ（配列番号：１６）に対するＵ６−ｈｐＲＮＡベクター２０μｇを投与された。すべてのグループは、ｍｙｃでタグしたヒト野生型ＳＯＤ１（配列番号：７）２０μｇ、およびＧＦＰでタグしたＳＯＤ１、２０μｇの両方が投与された。前記ベクターを合計体積がマウス１匹あたり２．５ｍｌになるように、リンガ液で希釈した。マウスをアバーチン（２４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、前記ベクターを、２６ゲージ針を用いて１０病未満で尾部静脈から注入する。注入から４８時間後、肝臓から血液を除去するために、動物を５ｍｌのＰＢＳで灌流した。肝臓を切り取り、素速くドライアイス上で冷凍させた。サンプルを、１％ＳＤＳ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、およびプロテアーゼ阻害物質カクテル（シグマ社１：１００希釈）を含有する２５ｍＭのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）中に入れ、携帯用ポリトロン（プロサイエンティフィック社（Pro-scientific））を用いてホモジナイズした。
【０１９５】
ウエスタンブロット分析法
タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアース社（Pierce）、イリノイ州ロックビル）を用いて決定した。Ｈｅｌａ細胞タンパク質２５μｇ、または１００μｇ肝タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ジーンスクリーン・プラス膜（Genescreen Plus membrane）（パーキンエルマー社）（Perkin Elmer）上に移動させた。ウサギ抗ＳＯＤ１（バイオデザイン社（Biodesign））またはヒツジ抗ＳＯＤ１は１次抗体、およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（アマシャム社（Amersham））またはロバ抗ヒツジＩｇＧは２次抗体だった。タンパク質のバンドの可視化には、スーパーシグナル・キット（ピアース社）（SuperSignal kit （Pierce））およびコダック・デジタルイメージステーション４４０ＣＦ（Kodak Digital
Image Station 440CF）を用いた。そのバンドの強度の定量化には、コダック１Ｄソフトウェアを用いた。
【０１９６】
実施例Ｘ−ＸＩ
１日目、９６−ウェルプレートにて、２ｎＭのｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。２日目、細胞をピペットによってゆっくりはがして、２４−ウェルプレートに移した。３日目、第２のトランスフェクションを行い、４日目、最終的に細胞を採集した。１％ＳＤＳ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害混液（Protease inhibitor cocktail）（シグマ社（Sigma））を含有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中でホモジナイゼーションすることによってタンパク質を抽出し、その濃度をＢＣＡアッセイ（ピアース社（Pierce））によって測定した。１５ｕｇのタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。ジーンスクリーン・プラス膜（Genescreen Plus membrane）（パーキンエルマー社）（Perkin Elmer）上に移動させた後、一次抗体としてウサギ抗ＳＯＤ１（バイオデザイン社（Biodesign））、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（アマシャム社（Amersham））を用いてＳＯＤ１を検出した。対照として、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を含有する緩衝液を用いて膜を除去し、ＧＡＰＤＨに対する抗体を用いて再び調べた。該タンパク質のバンドは、化学発光スーパーシグナル・キット（ピアース社）（Chemiluminescent SuperSignal kit （Pierce））を用いて可視化し、コダック・デジタルイメージステーション４４０ＣＦ（Kodak Digital Image Station 440CF）を用いて定量した。
【０１９７】
二重ルシフェラーゼアッセイ
修飾された二重ルシフェラーゼシステム（プロメガ社（Promega））を用いて細胞培養中のＲＮＡｉ効率を定量した。この研究のための特異的なルシフェラーゼレポート標的を作成するために、２つの制限部位（ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ）をホタルルシフェラーゼベクターの３’ＵＴＲ（ｐＧＬ２対照ベクター、プロメガ）に組み込んだ。ヒトＣｕ
Ｚｎ スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ１）遺伝子の３９ｎｔフラグメント（センス鎖５’−ＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡ−ＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡ−３’、アンチセンス鎖５’−ＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴ−ＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴ−３’）を合成し、アニーリングし、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩを用いてホタルルシフェラーゼベクターの３’ＵＴＲ領域にクローニングした。このホタルルシフェラーゼベクターをウミシイタケ・ルシフェラーゼベクター（ｐＲＬ−ＴＫ、プロメガ）と、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ合成ベクターをＨＥＫ２９３細胞に、９６ウェルプレート中でリポフェクタミン２０００（インビトロゲン社（Invitrogen））を用いて、コトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を２０ｕｌの受動溶解緩衝液（Passive Lysis Buffer）（Promega）を用いて溶解した。各ウェルから１０ｕｌのライセートをマイクロリットルストリップ（Thermo labsystems）のウェルに移し、ベリタスマイクロプレートルミノメーター（ターナー・バイオシステム（Turner Biosystem）を用いて測定した。ＲＮＡｉの測定には、発光強度比率（ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ）を用いた。
【０１９８】
ノーザンブロット
１ｕｇずつのｓｈＲＮＡを、６−ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を回収し、トリ試薬（Tri Reagent）（モレキュラーリサーチセンター（Molecular Research Center））を用いて、全てのＲＮＡを抽出した。合計１０ｕｇのＲＮＡを１５％ミニ変性ポリアクリルアミドゲル上に載せた。分離したＲＮＡをブライトスター・プラス・ナイロン膜（BrightStar-Plus nylon membrane）（アンビオン（Ambion））に移動させ、ＵＶと架橋結合させた。３２Ｐ標識センスまたはアンチセンス２１ｎｔ合成ＲＮＡを、相補的なＲＮＡ鎖を検出するためのプローブとして用いた。放射活性ＲＮＡバンドは、フジホスファーイメージングシステム（Fuji Phosphor Imaging system）ＦＬＡ−５０００ （フジメディカルシステム社（Fuji Medical Systems））を用いて読み取った。
【０１９９】
実施例１
例Ｉ乃至ＶＩＩＩは、ｓｉＲＮＡが、まずｓｉＲＮＡ活性を、ショウジョウバエ胚ライセートを含む無細胞ＲＮＡＩ反応でテストし、次に培養哺乳動物細胞中の活性１ヌクレオチド選択性ｓｉＲＮＡを分析することによって、１ヌクレオチド選択性を有するようにデザインされたことを明らかにする。結果は、２つのｍＲＮＡの差が１ヌクレオチドしかなく同一の細胞に存在するとしても、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの両方とも、選択的に突然変異ＳＯＤ１（配列番号：８）の発現を阻害するが、野生型ＳＯＤ１（配列番号：７）ではそのようなことがないようにデザインすることができることを示した。したがって、ＲＮＡｉはとりわけ、優性機能獲得型突然経によって生じる疾患の治療法として有用である。
【０２００】
実施例ＩＩ：ｓｉＲＮＡ二本鎖は突然変異ＳＯＤ１を区別することができる
それぞれ野生型または突然変異ｍＲＮＡのいずれかを狙う３つのｓｉＲＮＡの２セット（図１Ａ、配列番号：８）を、標的の切断部位またはその近傍のミスマッチが要求されるＡ型らせん形を乱しているかどうかをテストするように方向付けた。グアニン２５６（例えば、ジェンバンク受入番号Ｋ０００５６などの、翻訳開始に関連するＧ２５６）ＳＯＤ１の対立遺伝子がシトシンに突然変異し、グリシン−アルギニン突然変異（Ｇ８５Ｒ）を生じているＳＯＤ１の対立遺伝子を選択した。突然変異したヌクレオチドは、ＳＯＤ１
ｍＲＮＡ切断の予測された部位の近傍、すなわち、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に対して９位（Ｐ９）、１０位（Ｐ１０）、１１位（Ｐ１１）（図１Ａ）に位置した。ＳＯＤ１
ｍＲＮＡ切断のこの予測された部位は、前記ｓｉＲＮＡとＲＮＡｉエンドヌクレアーゼの活性部位の中または近傍の非同族標的ＲＮＡとの間にミスマッチを配置する。これらのｓｉＲＮＡのテストは、in vitroにおいてＲＮＡを再利用する、確立されたショウジョウバエ胚性ライセートで行った（Zamore et al., 2000; Tuschl et al., 1999）。予想通り、６つのｓｉＲＮＡのそれぞれが相当する標的ＲＮＡを切断したが、その有効性の差は劇的だった。例えば、Ｐ１１突然変異種および野生型ｓｉＲＮＡ（配列番号：６、１０）は、それぞれの標的ＲＮＡを効率的に切断できなかった。反対に、Ｐ１０突然変異種ｓｉＲＮＡ（配列番号：４）は前記突然変異種標的ＲＮＡを効率的に切断した。完全長突然変異種ＳＯＤ１標的ｍＲＮＡの切断は、対応する約２８８ヌクレオチドの５’切断産生物の蓄積によって行われ、結果は、前記標的ｍＲＮＡの非特異的分解ではなくＲＮＡｉを示唆している。ｓｉＲＮＡの欠如下、またはルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡの存在下において、前記突然変異標的ＲＮＡ（配列番号：８）はショウジョウバエ胚性ライセート中で安定だった（データは示していない）。標的ＲＮＡの切断および５’切断産生物の蓄積のデータは両方とも、１つの指数方程式に良くフィットし、この反応は擬１次動力学にしたがっていることを示している（図１Ｂ）。
【０２０１】
実施例ＩＩＩ．ｓｉＲＮＡ二本鎖は野生型ＳＯＤ１を区別することができる
６つのｓｉＲＮＡの特異性を決定するために、突然変異ＳＯＤ１配列（配列番号：８）に相当する各ｓｉＲＮＡを、野生型ＳＯＤ１
ＲＮＡ（配列番号：７）を切断する能力についてテストし、各野生型ｓｉＲＮＡについて突然変異ＲＮＡを切断する能力をテストした。すべてではないが一部のｓｉＲＮＡ二本鎖が、効率的に、完全にマッチする標的と１ヌクレオチドのミスマッチを有する標的を区別した。例えば、突然変異と野生型のｓｉＲＮＡ（配列番号：６、１０）の両方のＰ１１は、完全にマッチした標的ＲＮＡもミスマッチの標的ＲＮＡのいずれにも効率的な切断を惹起しなかった（図１Ａ）。したがって、これらのｓｉＲＮＡ配列は本質的にＲＮＡｉを惹起する能力が乏しい。反対に、Ｐ９（配列番号：１４）およびＰ１０野生型（配列番号：１２）ｓｉＲＮＡは、対応する野生型標的の迅速な切断を惹起しただけでなく、突然変異ＲＮＡの著しい切断も生じた（図１Ａ）。これらのｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを惹起する優れた能力があるが、乏しい選択性を示す。Ｐ１０突然変異種ｓｉＲＮＡ（配列番号：４）が、突然変異種および野生型ＳＯＤ１
ＲＮＡ（配列番号：７、８）を効率的および堅固に識別し、突然変異ＲＮＡを野生型よりもはるかに効率的に切断することが示された。最も重要なのは、Ｐ１０突然変異ｓｉＲＮＡ（配列番号：４）は、突然変異および野生型ＳＯＤ１
ｍＲＮＡ標的を実質的に完全に識別することが示された（図１Ａ）。このＰ１０突然変異ｓｉＲＮＡは、突然変異ＳＯＤ１標的の切断を効率的に媒介したが、野生型ＳＯＤ１
ｍＲＮＡの切断はほとんど媒介せず（図１Ｂ）、このｓｉＲＮＡは治療用途に理想的であることが示唆された。
【０２０２】
実施例ＩＶ：Ｈｅｌａ細胞における突然変異ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒ発現の選択的阻害
哺乳動物細胞において、無細胞反応が正確、効率的、および選択的にｓｉＲＮＡを予想できるかどうかをテストするために、カルボキシ末端を融合させたＧＦＰを有する野生型または突然変異種ＳＯＤ１
Ｇ８５Ｒを発現したプラスミド作製物を作製した。各作製物を、ｄｓＲｅｄ発現ベクターを用いてＨｅｌａ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション対照とした。突然変異または野生型のＳＯＤ１（配列番号：７、８）のいずれかの発現を、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）で緑色および赤色細胞を定量することによって監視した。Ｐ９、Ｐ１０およびＰ１１
ｓｉＲＮＡを相当する突然変異種または野生型標的でトランスフェクションしたところ、遺伝子発現を抑制したが、効率および選択性には差があった（図２）。反対に、ホタルルシフェラーゼに相補的なｓｉＲＮＡによるコトランスフェクションでは、突然変異または野生型ＳＯＤ１の発現のいずれも抑制しなかった（図２）。野生型に対するｓｉＲＮＡ
ｐ１０以外のすべてのｓｉＲＮＡは１ヌクレオチドミスマッチを有するｍＲＮＡを抑制しなかったが、野生型に対するｓｉＲＮＡ ｐ１０は野生型および突然変異ＳＯＤ１の発現の両方を効率的に抑制した（図２）。この結果は全般的にin vitroデータ（図1）と一致しており、すべてではないが一部のｓｉＲＮＡは１ヌクレオチドの差を有するｍＲＮＡ標的を効率的に区別することができることを示唆した。
【０２０３】
実施例Ｖ．  Ｈｅｌａ細胞におけるＵ６−Ｇ９３Ａベクターによる突然変異ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ発現の選択的阻害
最近、ｓｈＲＮＡがin vivoにおいてＲＮＡｉを惹起することができることが示された。突然変異種ＳＯＤ１に対するｓｈＲＮＡが、選択的に野生型ＳＯＤ１発現ではなく突然変異種ＳＯＤ１の発現を阻害することができるかどうかをテストするために、別の疾患の原因となる突然変異種ＳＯＤ１
Ｇ９３Ａに相同なｓｈＲＮＡ（ヌクレオチド２８１位のＧをＣに変え、ｓｈＲＮＡと野生型ＳＯＤ１ Ｇ：Ｇミスマッチを配置するヌクレオチド交換；配列番号：１６）を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｕ６）プロモーターの制御下において合成するプラスミドを作製した（Sui et al., 2002）。結果から、野生型または突然変異ＳＯＤ１−ＧＦＰプラスミドのいずれかとコトランスフェクトした場合、この作製物を用いて、培養細胞中の突然変異種ＳＯＤ１の１ヌクレオチド選択的ＲＮＡｉを惹起することができるということが示された（図３）。
【０２０４】
実施例ＶＩ：in vivoにおけるｓｉＲＮＡおよびＵ６−Ｇ９３Ａベクターによる突然変異ＳＯＤ１発現の選択的阻害
突然変異種の選択的阻害が神経細胞で実現するかどうかをテストするために、野生型および突然変異ＳＯＤ１−ＧＦＰ作製物を、ＳＯＤ１
Ｇ８５Ｒに対するｓｉＲＮＡ Ｐ１０、またはＳＯＤ Ｇ９３Ａ（配列番号：１６）に対するｓｈＲＮＡ合成ベクターのいずれかを用いて、神経芽細胞腫細胞株Ｎ２ａにコトランスフェクトした。Ｈｅｌａ細胞と同様に、合成ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ作製物が、Ｎ２ａ細胞における突然変異ＳＯＤ１発現の選択的阻害を方向付けた（図４Ａ、Ｂ）。
【０２０５】
実施例ＶＩＩ． in vivoにおける突然変異ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒの選択的阻害
同一の細胞に突然変異および野生型ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ１が両方とも存在する場合、ヌクレオチド選択的ｓｉＲＮＡがその突然変異および野生型ＳＯＤ１を識別できるかどうかを明らかにするために、Ｈｅｌａ細胞にＰ１０
ｓｉＲＮＡおよび突然変異ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒ−ＧＦＰでトランスフェクトした。抗ＳＯＤ１抗体で免疫ブロットすることによって、トランスフェクト融合ＳＯＤ１−ＧＦＰおよび内因性野生型ヒトＳＯＤ１の両方の検出が可能になった。内因性野生型ＳＯＤ１発現の約５０％阻害は、〜５０％のトランスフェクション効率を反映した。Ｐ１０野生型ｓｉＲＮＡに対して、突然変異種に対するＰ１０
ｓｉＲＮＡは２種類の異なる用量において突然変異種の発現を阻害したが、内因性野生型ＳＯＤ１の発現には効果がなかった（図５）。
【０２０６】
実施例ＶＩＩＩ．in vivoにおけるＵ６−Ｇ９３Ａベクターによる突然変異種ＳＯＤ１発現の選択的阻害
選択的阻害をin vivoで生じさせることができるかどうかをテストするために、ＳＯＤ１レポーターおよびｓｈＲＮＡプラスミドを、水力学的トランスフェクションプロトコルを用いてマウスにトランスフェクトした。突然変異ＳＯＤ１
Ｇ９３Ａ−ＧＦＰプラスミドおよびｍｙｃでタグした野生型ヒトＳＯＤ１（ゲル上においてトランスフェクトしたヒトＳＯＤ１を内因性マウスＳＯＤ１からよりよく分離することができる）をＵ６空ベクトルまたはＵ６−Ｇ９３Ａベクターでコトランスフェクトした。ＳＯＤ１
Ｇ９３Ａ−ＧＦＰおよびＳＯＤ１ｍｙｃの肝臓における発現を、ウエスタンブロットによって検証した。結果から、Ｕ６−Ｇ９３Ａで選択的にコトランスフェクトする場合のみ、Ｇ９３Ａ発現が減少することが示された（図６）。
【０２０７】
実施例ＩＸ：トランスジェニックマウスを用いたin
vivoにおける突然変異ＳＯＤ１のｓｈＲＮＡ抑制
突然変異ＳＯＤ１に対するｓｈＲＮＡがin
vivoにおいて突然変異ＳＯＤ１の発現を抑制することができるかどうかを明らかにするために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）プロモーターＵ６の制御下におけるＳＯＤ１Ｇ９３Ａに対するｓｈＲＮＡを発現するトランスジェニックマウス（Ｕ６−Ｇ９３Ａマウス）を、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＳＪＬのハイブリッド背景において作製した。
【０２０８】
マウスＵ６プロモーターの制御下におけるｓｈＲＮＡ相同的突然変異ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（ｓｈＧ９３Ａ）を合成するプラスミドは、公表されているプロトコルにしたがって作製した（Sui et al., 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520）。前記マウスを作製するために、Ｋｐｎ ＩおよびＳａｃ Ｉを用いた消化によって導入遺伝子を直線化し、精製して、マサチューセッツ大学医学部（University
of Massachusetts Medical School）（ＵＭＭＳ）トランスジェニック・コアでマウスの有精卵に注入した。
【０２０９】
Ｕ６−Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスをスクリーニングするために、前記導入遺伝子の配列を選択的に増幅するＰＣＲプライマーをデザインし、前記トランスジェニックマウスの同定に用いた。合計７匹の第０世代（Ｆ０）が同定された。これらの第０世代を、ＦＶＢ背景において、突然変異種ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ導入マウスと交雑させた。
【０２１０】
Ｆ１マウスを、既報のとおりのサザンブロット法を用いて導入遺伝子コピー数について解析した（Xu et al., 1993 Cell 73:23-33）。末端ＤＮＡをＢａｍ
Ｈ１で消化し、３８８ヌクレオチドの導入遺伝子断片を作製した。内因性マウスＵ６プロモーターにはＢａｍＨＩ部位が１つしかないため、ＢａｍＨＩ消化によって、内因性マウスＵ６遺伝子からより大きな断片を作製できた。前記Ｕ６プロモーター領域に相補的な３２Ｐ標識ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイゼーションに用いた。前記Ｕ６領域を標的として用いた。これは、前記内因性マウスＵ６バンドは同一ブロット上で前記導入遺伝子とともに検出でき、導入遺伝子のコピー数を定量化するための参照として前記内因性バンドを用いることができるためである。
【０２１１】
ノーザンブロット法を用いて測定したとおり、前記Ｕ６−Ｇ９３Ａ ｓｈＲＮＡ作製物を、２種類の遺伝子を導入したトランスジェニックマウスから採取した細胞に発現させた。ウエスタンブロット法を用いて測定した結果、前記Ｕ６−Ｇ９３Ａ
ｓｈＲＮＡ作製物は、２種類の遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおける突然変異種ＳＯＤ１Ｇ９３Ａの発現（Ｕ６−Ｇ９３Ａ ｓｈＲＮＡ作製物および突然変異種ＳＯＤ１Ｇ９３Ａを発現）をサイレンシングすることが明らかになった。
【０２１２】
実施例Ｉ乃至ＶＩＩＩの結果の考察
ＲＮＡｉを用いた優性突然変異種ＡＬＳ遺伝子を選択的にサイレンシングする可能性を調べた。野生型または突然変異種のＳＯＤ１のいずれかにマッチする複数のｓｉＲＮＡを用いた結果、in vitroにおいて、突然変異種ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒ に対するｓｉＲＮＡは前記突然変異種を切断するが、野生型ＳＯＤ１ ＲＮＡの切断は効率的ではないことが示された（図1）。さらに、同一の細胞に突然変異および野生型ＳＯＤ１タンパク質の両方が存在する場合でも（図4）、これらのｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞において突然変異ＳＯＤ１タンパク質発現を選択的に阻害するが野生型については阻害しなかった（図２）。in vivoにおいてｓｉＲＮＡに処理されたヘアピンを発現するベクターも、マウス肝において突然変異ＳＯＤ１の発現を選択的に阻害するが、野生型ＳＯＤ１の発現は阻害しなかった。これらの結果から、優性突然変異対立遺伝子の選択的阻害はＲＮＡｉを用いて実現することができ、in vitroまたはin vivoにおいて、前臨床スクリーニングによって最適化したｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ配列を同定することができることが明らかになった。
【０２１３】
哺乳動物細胞においてＳＯＤ１一ヌクレオチドの識別を実現することはできるが、この識別は確実なものではない。一部のｓｉＲＮＡは一ヌクレオチドの差を有する対立遺伝子間の識別が可能であるが、その他のｓｉＲＮＡでは識別することができない。結果は、突然変異病因対立遺伝子を標的とするようにデザインされたｓｉＲＮＡに２種類の異なる欠陥があることを示している。第１に、標的に完全にマッチするｓｉＲＮＡは、その標的を切断し、前記標的遺伝子からのタンパク質発現を阻害することができるが、すべてのｓｉＲＮＡが同一の効率でサイレンシングを生じるわけではない。例えば、前記野生型に対するｓｉＲＮＡの中で、in vitroにおいて、Ｐ９およびＰ１０はＰ１１よりも効率的に標的を切断した。Ｐ１０はまた、哺乳動物細胞において、標的遺伝子発現を最も効率的に阻害した（図２）。同様に、前記突然変異ＳＯＤ１
Ｇ８５Ｒに対するｓｉＲＮＡの中で、Ｐ９およびＰ１０はＰ１１よりも効率的に突然変異ＲＮＡを切断した。Ｐ１０はまた、哺乳動物細胞において、突然変異ＳＯＤ１発現の阻害について最も効率的だった（図２）。前記標的に対するｓｉＲＮＡ配列の１ヌクレオチドのシフトの結果、サイレンシングの効率においてこのような顕著な変化を生じる。第２に、完全にマッチした標的ＲＮＡと１ヌクレオチドのミスマッチを有するＲＮＡの間の選択性の差が、使用された６つのｓｉＲＮＡの中で認められた。例えば、野生型Ｐ１０
ｉＲＮＡは乏しい選択性を付与した。野生型Ｐ１０は、無細胞アッセイにおいて野生型および突然変異ＳＯＤ１ ＲＮＡの両方を切断し、哺乳動物動物の両方の対立遺伝子の発現を高い効率で阻害した（図１、２、４、５）。一方、突然変異ＳＯＤ１に対して方向付けられたＰ１０
ｓｉＲＮＡは最も高い選択性を付与した。それは突然変異ＳＯＤ１ ＲＮＡを切断し、無細胞アッセイにおいて突然変異ＳＯＤ１の発現を阻害し、哺乳動物細胞における突然変異ＳＯＤ１の発現は阻害したが野生型ＳＯＤ１は阻害しなかった（図１乃至６）。
【０２１４】
突然変異と野生型のＰ１０ ｓｉＲＮＡの選択性の差についての説明は、以下の通りである。突然変異種Ｐ１０
ｓｉＲＮＡと野生型ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの間のミスマッチがＧ：Ｇ衝突をつくり出したが、野生型Ｐ１０
ｓｉＲＮＡと突然変異種Ｇ８５Ｒ ｍＲＮＡの間のミスマッチはＣ：Ｃ衝突を生じた（図１Ａ参照）。したがって、特定の配列の１つの対立遺伝子に選択的に作用するｓｉＲＮＡをデザインする場合、以下が考慮された。理論によって制限したいとは考えないが、プリン:プリンミスマッチは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とそのｍＲＮＡ標的の間に要求されるＡ型らせんを妨げる（Chiu et al., 2002）。反対に、ピリミジン:ピリミジンミスマッチはＡ型らせんの中に容易に収容することができる。したがって、ｓｉＲＮＡと野生型標的ＲＮＡの間のＧ：Ｇ衝突は前記野生型標的を排除し、前記突然変異標的の選択性を高める。顕著なことに、突然変異種ＳＯＤ１
Ｇ９３Ａについて優れた選択性を示す、Ｇ９３Ａに対するｓｉＲＮＡヘアピンベクターも、野生型ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを有するＧ：Ｇ衝突をつくり出した。これらの結果は、プリン:プリンミスマッチはピリジン:ピリジンミスマッチよりも大きな選択性を付与することを示唆した。ピリジン:ピリジンミスマッチを含有する本発明の方法に用いたｓｉＲＮＡのデザインに加えて、前記ｓｉＲＮＡは当業に知られる方法を用いてデザインされる。
【０２１５】
実施例Ｘ：設計された非対称性は、鎖の嗜好性を切り換え、所望の鎖のＲＮＡｉの有効性を高める
天然のｓｉＲＮＡは、望ましくない鎖の非対称性を有しているかもしれない。例えば、実施例Ｉ乃至Ｘに記載の３つの抗ＳＯＤ１
ｓｉＲＮＡのうち、１つのｓｉＲＮＡ（Ｐ１０）は、その意図したｓｏｄ１ ｍＲＮＡ標的配列、ｓｏｄ１
ｍＲＮＡ配列（本明細書において「センス鎖標的」または「コード鎖標的」（ｓｓ標的）と称する）を、その逆の補体または「オフ標的」配列（本明細書において「アンチセンス鎖標的」または「非コード鎖標的」（ａｓ標的）と称する）よりも、よくサイレンシングしている。他の２つのｓｉＲＮＡ（Ｐ９、Ｐ１１）は、実際にａｓ標的をｓｓ標的よりもよくサイレンシングしている（図１０）。予測されたように、ａｓ標的を優先的にサイレンシングするｓｉＲＮＡは、ｓｓ標的に対するサイレンシングが相対的に非効率的であり、ｓｓ標的について、ＩＣ５０はＰ９で０．３９ｍＭ、Ｐ１１で０．７５ｍＭであり、ａｓ標的ついては、それぞれ０．０３ｎＭおよび０．０５ｎＭである。したがって、Ｐ９およびＰ１１は、天然のｓｉＲＮＡの候補として良好ではない。
【０２１６】
効率的でないｓｉＲＮＡを効率的なものに変換できるかどうかを決定するために、非効率的なｓｉＲＮＡ、Ｐ１１（図１１Ａ）をテストケースとして用いた。非対称性の規則に基づいて、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖（ａｓ−ｓｉＲＮＡ）の５’末端の塩基対を、Ａ：Ｕ対のミスマッチをその末端に配置することによって弱めた（図１１Ａ、Ｓ１乃至Ｓ３）。Ｐ１１は、自然にａｓ標的を好み（図１１Ｂ、Ｐ１１を参照）にもかかわらず、ａｓ−ｓｉＲＮＡの５’末端の塩基対が弱められたことにより、それはセンス標的を好むように変換された（図１１Ｂ、Ｓ１乃至Ｓ３）。対照的に、ＲＮＡｉのセンス鎖（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）の５’末端の塩基対が弱めると、非修飾Ｐ１１
ｓｉＲＮＡと比較して、ａｓ標的を優先的サイレンシングが加速された（図１１Ｂ、Ａ１乃至Ａ３）。さらに、一方または他方の末端のＧ：ＣをＩ：Ｃで置換することによって塩基対を弱めることによって、鎖の嗜好性は同様に変換された（図１１Ｂ、ＩＡ、ＩＳ）。両末端のＧ：ＣがＩ：Ｃに変えられた場合、鎖の嗜好性はＰ１１（図１１Ｂ、ＩＳ／ＩＡ）のパターンに戻った。これらの変化は、非対称性の規則から予測されたことに一致している。
【０２１７】
設計された非対称性の効果を定量的に特徴付けるために、異なる用量のｓｉＲＮＡをもつｓｓ標的およびａｓ標的をトランスフェクトした。もともとのＰ１１は、ａｓ標的を最高８１％サイレンシングした。ＩＣ５０は０．０５ｎＭであった。対照的にそれは、センス標的を最高６１％サイレンシングした。ＩＣ５０は０．７５ｎＭであった。ａｓ−ｓｉＲＮＡの５’末端の塩基対を弱めることによって、ｓｉＲＮＡは、ａｓ標的のサイレンシングは最高でわずか５６％であった。ｓｉＲＮＡが２ｎＭのとき、最高のサイレンシングに到達する非典型用量反応曲線を示し、より高い濃度では弱いサイレンシングが示された。対照的にｓｉＲＮＡは、センス標的を最高で７８％サイレンシングし、ＩＣ５０は０．０５ｎＭであった（図１２、Ｓ２）。もともとのＰ１１と比較して、有意に向上していた。したがって、もともとのＰ１１と比較して、ａｓ−ｓｉＲＮＡの５’末端の塩基対を弱めることによって、ａｓ標的に対するＲＮＡｉ効率を減少させ、ｓｓ標的に対するＲＮＡｉ効率を高めた。逆に、他の末端の塩基対を弱めることで、逆の効果が生じ、ａｓ標的の最高のサイレンシングを上昇させ、一方、センス配列を完全に阻害した（図１２、Ａ２）。ｓｉＲＮＡの両末端で塩基対を弱めると、標的のサイレンシングパターンは、もともとのＰ１１に対して逆になった（図１２、Ｓ２／Ａ２）。これらの結果は、非対称性の規則による予測を確認するものであり、非対称性の規則がｓｉＲＮＡ標的部位のレパートリーを増加させることに適用可能であることを示すものである。
【０２１８】
実施例ＸＩ：非対称性の規則のｓｈＲＮＡへの適用は、鎖の特異性およびその有効性を高める
非対称性の規則をｓｈＲＮＡの設計へ組み入れるための適切な方法を見つけるために、まず、１９ヌクレオチドステムをもち（「１９ｎｔステムｓｈＲＮＡ」）、さらに、ｓｈＲＮＡステムのそれぞれの末端の最初の４個のヌクレオチド内にミスマッチを含むｓｈＲＮＡをテストした（図１３Ａ）。ステムの２つの鎖をもつｓｈＲＮＡは、証明されている対照的なサイレンシング有効性と完全に一致した（図１３Ｂ、Ｐ１１−１９）。センス鎖の５’末端の１位および２位のミスマッチ（図１３Ａ、Ａ１−１９、Ａ２−１９）は、非対称性の規則により予測されたとおり、ｓｓ標的のサイレンシングを穏やかに弱めながら、ａｓ標的のサイレンシングを高めた（図１３Ｂ、Ａ１−１９、Ａ２−１９）。しかしながら、センス鎖の５’末端の３位および４位のミスマッチ（図１３Ａ、Ａ３−１９、Ａ４−１９）は、ｓｓ標的に対するサイレンシングの有効性を高めたが、ａｓ標的に対するサイレンシングの有効性には変化はなかった（図１３Ｂ、Ａ３−１９、Ａ４−１９）。このことは、１９ｎｔステムｓｈＲＮＡのこれらの２つの位置のミスマッチは、非対称性の規則に従わないことを示唆するものである。
【０２１９】
ａｓｓｈＲＮＡステムの５’末端から１つ目の位置のミスマッチ（図１３Ａ、Ｓ１−１９）も、非対称性の規則に従わない。それは、ａｓ標的のサイレンシングの有効性を変えないが、非対称性の規則から予測されることとは対照的に、実際には、ｓｓ標的のサイレンシングを傷つけた（図１３Ｂ、Ｓ１−１９）。ａｓｓｈＲＮＡステムの５’末端から２つ目および３つ目の位置のミスマッチ（図１３Ａ、Ｓ２−１９、Ｓ３−１９）は、ｓｓ標的に対するサイレンシング有効性を高めなかったが、ａｓ標的に対するサイレンシング有効性を減少させた（図１３Ｂ、Ｓ２−１９、Ｓ３−１９）。ａｓｓｈＲＮＡステムの５’末端から４つ目の位置のミスマッチ（図１３Ａ、Ｓ４−１９）は、ｓｓ標的、ａｓ標的のいずれに対してもサイレンシングの有効性に影響を及ぼさなかった（図１３Ｂ、Ｓ４−１９）。全体として、ステムの末端のいずれかに作製されたミスマッチの大半は、それらのサイレンシングの有効性に関して、非対称性の規則にあまり十分に従わない。
【０２２０】
ｓｈＲＮＡは、構造、プロセシング、および機能の点でｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに類似している。大半のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、２１ｎｔ長より長いステムを有している（Griffiths-Jones, 2004）。これらのステムから、非対称のものを含むｍｉＲＮＡ二本鎖が生成される（Kim, 2005）。したがって、２１ｎｔ以上のステムをもつｓｈＲＮＡは、非対称性の規則を組み込んだ後より、よく処理されるかもしれない。このことを調べるために、２１−ｎｔステムとステムの両末端の１〜４位に弱められた塩基対をもつｓｈＲＮＡを設計した（図１３Ａ）。ｓｈＲＮＡを合成するこれらのプラスミドのそれぞれと、センスまたはアンチセンス標的を合成するプラスミドとをコトランスフェクトし、それらのＲＮＡｉ有効性を決定した。
【０２２１】
Ｐ１１ ｓｈＲＮＡは、Ｐ１１ ｓｉＲＮＡと類似の鎖の嗜好性を有しており、ａｓ標的をｓｓ標的よりよくサイレンシングした（図１４Ｂ、Ｐ１１−２１）。ミスマッチを有する塩基対は、ｓｓ−ｓｈＲＮＡの５’末端に位置しているとき、ａｓ標的に対する鎖の嗜好性は、１位および２位において強調され（図１４Ｂ、Ａ１−２１、Ａ２−２１）たが、３位および４位においては減少した（図１４Ｂ、Ａ３−２１、Ａ４−２１）。逆に、ａｓ−ｓｈＲＮＡの５’末端の１−４位にミスマッチが位置する場合、鎖の嗜好性は、もともとのＰ１１−２１とは逆になった。すなわち、４位においては、鎖の嗜好性は減少していたものの、ｓｈＲＮＡは、ｓｓ標的をａｓ標的よりよくサイレンシングした（図１４Ｂ、Ｓ１−２１乃至Ｓ４−２１）。結論として、好ましい鎖の嗜好性を生成する最も弱い塩基対の位置は、センス鎖の２位（Ａ２を好むアンチセンス標的）およびアンチセンス鎖３位（Ｓ３を好むセンス標的）である。これらの位置のミスマッチは、最も大きな鎖の非対称性を生成するためである。
【０２２２】
ショウジョウバエ胚抽出物でのこれまでの研究から、ｓｉＲＮＡにおける２つの鎖の運命は、ＲＩＳＣを構築する間、異なっている。Ｒ２Ｄ２は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の非対称性のセンサとして作用し、熱力学的敵に安定な末端に結合する。次いで、ダイサーが、塩基対に関してあまり安定でない他の末端に結合する（Tomari et al., 2004）。この結果、好ましい鎖がＲＩＳＣに組み込まれ、ＲＮＡｉを媒介する。そして反対の鎖は破壊されることになる（Schwarz et al., 2003）。２つの鎖のＲＮＡｉ有効性がｓｈＲＮＡにおける鎖の非対称性に依存して切り換えられるということは、哺乳動物細胞においても同様であろうと示唆される（図１５Ａ）。このことを実験的にテストするために、ｓｈＲＮＡ発現ベクターによってトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡを用いてノーザンブロッティングを行った。３つ全ての作製物によってｓｈＲＮＡが作製されたことが検出された（図１５Ｂ）。ｓｈＲＮＡをプロセシングして、ｓｉＲＮＡとした。Ｐ１１作製物からのｓｉＲＮＡの両方の鎖が検出された。しかしながら、Ｓ２およびＡ３作製物からは、好ましい鎖のみが検出された（図１５Ｂ）。この結果は、ショウジョウバエ胚抽出物からのものと一致している（Tomari et al., 2004）。 ｓｈＲＮＡ対称性のセンサが何であるのかについては、いまだ明らかではないが、最近の実験によって、Drosophila, Loquacious （Ｌｏｑｓ）がｍｉＲＮＡに結合し、そしてこの結合は、ｍｉＲＮＡのダイサー１のプロセスを必要とするということが証明されている（Forstemann et al., 2005）。Ｌｏｑｓは、Ｒ２Ｄ２に類似するタンパク質と結合するｄｓＲＮＡであり、したがって、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの非対称性
センサとして作用することができるだろう。
【０２２３】
ｓｈＲＮＡのセンス鎖の２位またはアンチセンス鎖の３位にミスマッチを配置することによって他のｓｈＲＮＡにも好ましい鎖嗜好性を生じさせることができるだろうか？この質問に対する答えを出すために、さらに３種類のｓｈＲＮＡを作製し、Ａ２およびＡ３の位置にミスマッチを配置した（図１６Ａ）。もともとのｓｈＲＮＡは、アンチセンス鎖よりもセンス鎖をわずかによくサイレンシングした（図１６Ｂ、Ｏｒ）。Ａ２の位置にミスマッチを配置することによって、ａｓ標的に対するサイレンシングの有効性を上昇させ、３つのｓｈＲＮＡにおいて、ｓｓ標的に対するサイレンシングの有効性を減少させたが、ｓｈＲＮＡｓのうちの２つ、すなわち、ｓｈｓｏｄ１ａおよびｓｈｓｏｄ１ｃの対しては、この変化量は小さかった（図１６Ｂ、Ａ２）。一方、Ｓ３の位置にミスマッチを配置することによって、ｓｓ標的に対するサイレンシングの有効性を上昇させ、３つのｓｈＲＮＡにおいて、ａｓ標的に対するサイレンシングの有効性を減少させた（図１６Ｂ、Ｓ３）。この結果に基づいて、Ｓ３の位置に配置されたミスマッチは、鎖特異性およびＲＮＡｉ有効性を最も一貫して高めることがわかった。
【０２２４】
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【０２２５】
他の実施態様
本発明を、詳細な説明と組み合わせて説明してきたが、前述の説明は、例示の目的であって、添付の請求の範囲によって定義される、本発明の精神および範囲を限定することを意図するものではない。他の局面、利点、および変形が、続く請求の範囲に含まれるものとする。
【０２２６】
さらに、引用した全ての文献の内容の全体を引用によってここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】ｓｉＲＮＡ二本鎖は、in vitroにおいて突然変異および野生型のＳＯＤ１を区別することができる。（Ａ）突然変異ｓｉＲＮＡ Ｐ１１（配列番号：５、センス；配列番号:６、アンチセンスまたはガイド）、突然変異ｓｉＲＮＡ Ｐ１０（配列番号：３、センス；配列番号：４、アンチセンスまたはガイド）、突然変異ｓｉＲＮＡＰ９（配列番号：１、センス；配列番号：２アンチセンスまたはガイド）、ＳＯＤ１野生型標的（配列番号：７）、ＳＯＤ１突然変異標的（配列番号：８）、野生型ｓｉＲＮＡＰ１１（配列番号：９センス；配列番号：１０、アンチセンスまたはガイド）、野生型ｓｉＲＮＡ Ｐ１０（配列番号：１１、センス；配列番号：１２、アンチセンスまたはガイド）、野生型ｓｉＲＮＡ Ｐ９（配列番号：１３、センス；配列番号：１４、アンチセンスまたはガイド）（Ｂ）突然変異ｓｉＲＮＡ ｐ１０は、野生型ＳＯＤ１ ｍＲＮＡではなく突然変異ＳＯＤ１ ｍＲＮＡをＲＮＡｉ経路による破壊に方向付ける。
【図２】Ｈｅｌａ細胞におけるｓｉＲＮＡによる突然変異ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒ発現の選択的阻害。ＳＯＤ１ｗｔＧＦＰまたはＧ８５Ｒ−ＧＦＰを各種のｓｉＲＮＡとともにコトランスフェクトした。ｄｓＲｅｄをトランスフェクション対照としてコトランスフェクトした。緑色および赤色蛍光細胞を、ＦＡＣＳを用いて定量した。（Ａ）トランスフェクションにおける緑色（黒線）および赤色細胞（白線）の相対数（ｎ＝３）。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３】Ｈｅｌａ細胞におけるＵ６−Ｇ９３Ａベクターによる突然変異ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ発現の選択的阻害。（Ａ）Ｇ９３Ａ ｓｈＲＮＡのデザイン（配列番号：１６）、（Ｂ）ＳＯＤ１ｗｔＧＦＰまたはＳＯＤ１Ｇ９３Ａ−ＧＦＰをＵ６空またはＵ６−Ｇ９３Ａとともにコトランスフェクトした。ｄｓＲｅｄをトランスフェクション対照としてコトランスフェクトした。緑色および赤色傾向細胞を、ＦＡＣＳを用いて定量した。４回の実験の結果を平均した。エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】神経細胞芽腫Ｎ２ａ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびＵ６−Ｇ９３Ａベクターによる突然変異ＳＯＤ１発現の選択的阻害。（Ａ）Ｇ８５Ｒに対するｓｉＲＮＡ（ｎ＝４）、（Ｂ）Ｕ６−Ｇ９３Ａベクター（ｎ＝３）。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】同一の細胞におけるｓｉＲＮＡによる、野生型ＳＯＤ１ではなく、突然変異ＳＯＤ１Ｇ８５Ｒ発現の選択的阻害。（Ａ）突然変異ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒ−ＧＦＰを検出するトランスフェクトＨｅｌａ細胞のタンパク質ブロットから測定した、ＳＯＤ１の相対的レベル（４回のトランスフェクションの平均）。エラーバーは標準誤差を示す。
【図６】in vivoにおけるＵ６−Ｇ９３Ａベクターによる突然変異ＳＯＤ１発現の選択的阻害（Ａ）水力学的トランスフェクション法を用い、マウスにおいてＳＯＤ１Ｇ９３Ａ−ＧＦＰをＣ末端ｍｙｃタグ付き野生型ヒトＳＯＤ１とともにコトランスフェクトした。ＳＤＡ−ＰＡＧＥ上の相対バンド強度を定量した。野生型ＳＯＤ１ｍｙｃに対するＳＯＤ１Ｇ９３Ａ−ＧＦＰの割合を示す。各グループにおいて８匹の動物を用いた。Ｕ６−Ｇ９３Ａグループは、他の２つのグループとは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【図７】ヒトＳＯＤ−１タンパク質のジェンバンク登録。受入番号ＮＰ＿０００４４５。野生型ＳＯＤ−１（配列番号：１８）の推定アミノ酸配列を示す。
【図８】ヒトＳＯＤ−１ ｍＲＮＡのジェンバンク登録。受入番号ＮＭ＿０００４５４。野生型ＳＯＤ−１（配列番号：１７）のヌクレオチド配列を示す。
【図９】ＳＯＤ１ゲノム配列（配列番号:１９）である。
【図１０】図１０は、ｓｏｄ１ ｍＲＮＡの同じ領域を標的とすることが可能な、非対称ｓｉＲＮＡ（Ｐ９、Ｐ１０、およびＰ１１）を示す図である。Ｐ１１の配列を１１Ａに示す。Ｐ９およびＰ１０は、ｓｏｄ１ｍＲＮＡの５’末端へ２および１ヌクレオチド長、それぞれ移動したｓｏｄ１配列を標的とする。３つのｓｉＲＮＡは、互いに１ｎｔだけ離れた配列を標的としているにもかかわらず、それらの標準的な嗜好性は非常に異なっている。Ｐ９およびＰ１１は、アンチセンス鎖を標的とすることを好み、Ｐ１０は、センス鎖を標的とすることを好んでいる。
【図１１】図１１は、天然に存在する鎖を、ＲＩＳＣに入ることが好ましいｓｉＲＮＡ鎖の５’末端の位置にミスマッチを配置することによって、操作された非対称ｓｉＲＮＡを示す図である。図１１Ａは、ｓｉＲＮＡのいずれかの末端にミスマッチが置かれた状態で、センスおよびアンチセンス標的配列が、３’ＵＴＲ（上、左）、Ｐ１１ｓｉＲＮＡ、およびその変形に挿入された様子を示す図である。図１１Ｂは、種々のｓｉＲＮＡのサイレンス有効性を示す図である。ＲＮＡｉのセンス鎖およびその対応する標的配列（「アンチセンス標的」）を太字で示している。
【図１２】図１２は、所望の鎖のＲＮＡｉの有効性を向上させ、望ましくない鎖ＲＮＡｉの有効性を悪化させる非対称ｓｉＲＮＡの設計を示す図である。Ｐ１１、Ｓ２、およびＡ２のそれぞれのｓｉＲＮＡの配列を図１１Ａに示す。ｓｉＲＮＡＡ２／Ｓ２は、Ａ２ ｓｉＲＮＡのセンス鎖をＳ２ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖でアニーリングすることによって生成した（図１１Ａ参照）。
【図１３】図１３は、１９ｎｔステムをもつｓｈＲＮＡの鎖の嗜好性が非対称性の規則によって予測できないということを証明するデータを示す図である。図１３Ａは、１９ｎｔステムをもつｓｈＲＮＡの配列を示す図である。該ステムのいずれかの鎖の４位にミスマッチが配置されている。ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびその対応する標的配列（「アンチセンス標的」）を太字で示している。図１３Ｂは、センスまたはアンチセンス標的に対するｓｈＲＮＡの相対的サイレンシング有効性を調べるための二重ルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を含む全ての標的は、完全にｓｉＲＮＡ鎖を補完している。
【図１４】図１４は、２１ｎｔをもつｓｈＲＮＡの鎖の嗜好性が非対称性の規則によって予測されるということを証明するデータを示す図である。図１４Ａは、２１ｎｔステムをもつｓｈＲＮＡの配列を示す図である。該ステムのいずれかの鎖の４位にミスマッチが配置されている。ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびその対応する標的配列（「アンチセンス標的」）を太字で示している。図１４Ｂは、センスまたはアンチセンス標的に対するｓｈＲＮＡの相対的サイレンシング有効性を調べるための二重ルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を含む全ての標的は、完全にｓｉＲＮＡ鎖を補完している。
【図１５】図１５は、設計された非対称ｓｈＲＮＡが非対称性の規則によって予測されるように処理されることを証明するデータを示す図である。図１５Ａは、非対称性の規則によって予測されるようにｓｈＲＮＡの処理を行うことを模式的に示している。矢印の太さは、ｓｉＲＮＡ鎖をＲＩＳＣ複合体に組み込むための嗜好性の程度を示している。ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびその対応する標的配列（「アンチセンス標的」）を太字で示している。図１５Ｂは、ｓｈＲＮＡの存在と処理されたｓｉＲＮＡ鎖のを示すのザンブロットを示している。各レーンには、指示されたｓｈＲＮＡ作製物によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのＲＮＡの合計を載せている。センスまたはアンチセンスＲＮＡプローブのいずれかを用いてブロットを検出した。
【図１６】図１６は、ｓｈＲＮＡのループの遠位の鎖から３位のミスマッチが、好ましい鎖嗜好性をもつ最適化されたｓｈＲＮＡｓを導くことを証明するデータを示す図である。図１６Ａは、Ａ２またはＳ３位置にミスマッチを配置しない、あるいは配置した３セットのｓｈＲＮＡの配列を示す。ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびその対応する標的配列（「アンチセンス標的」）を太字で示している。図１６Ｂは、センスまたはアンチセンス標的に対するｓｈＲＮＡの相対的サイレンシング有効性を調べるための二重ルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を含む全ての標的は、完全にｓｉＲＮＡ鎖を補完している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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