(57)【要約】  神経変性および神経細胞の喪失を予防する効果を有する小分子化合物を含む組成物を投与することによって神経変性および神経細胞の喪失を予防するための方法が提供される。本発明の一側面において、方法および組成物はまた、神経変性の疾病を治療するために有用である。小分子化合物は、それらの安定性のため、製造および処方の両方の場合における使いやすさのため、投与の容易さのため、および患者の服薬遵守のために、重要な治療の選択肢を提供する。本発明の小分子化合物組成物は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤、カルシウムチャネル拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、葉酸合成阻害剤またはナトリウムチャネルブロッカー、および神経変性に効果があるそれらの機能的類似体を含んでよい。本発明の組成物は、臨床症状の発症の前に予防的に投与されてよく、また神経変性の疾病の臨床症状が発生した後に投与してもよい。【選択図】図１
2009516751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のミスフォールディングまたは凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防するための治療を必要とする哺乳類に対して、有効量の小分子化合物を含む組成物を投与することによって、タンパク質のミスフォールディングまたは凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防するための方法であって、ここにおいて、前記小分子化合物は、タンパク質のミスフォールディングまたは凝集に関連した神経変性および神経細胞の喪失を予防する効果を有し、および、
ここにおいて、前記小分子化合物は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤、カルシウムチャネル拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、葉酸合成阻害剤またはナトリウムチャネルブロッカーおよびそれらの機能的類似体を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、ロメフロキサシン、シノキサシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、オキソリニック酸、ナリジクス酸、スラミン、メルバロン、ゲニステイン、エピルビシンＨＣｌ、エリプチシン、ドキソルビシン、アウリントリカルボン酸またはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、オキソリニック酸またはナリジクス酸を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記オキソリニック酸が約１０ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記ナリジクス酸が約１グラム／日から約５グラム／日との間の用量で投与される方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤が、アンピシリン、クロキサシリン、ピペラシリン、アモキシシリン、セファドロキシル、ジクロキサシリン、カルベニシリン、ペニシリン、メタンピシリン、アモキシシリン、セフォキサチンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤がメタンピシリンを含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記メタンピシリンが約２５０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間の用量で８時間ごとに投与される方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記カルシウムチャネル拮抗剤が、ニモジピン、ジプロテベリン、ベラパミル、ニトレンジピン、ジルチアゼム、ミオフラジン、ロペラミド、フルナリジン、ベプリジル、リドフラジン、ＣＥＲＭ−１９６、Ｒ−５８７３５、Ｒ−５６８６５、ラノラジン、ニソルジピン、ニカルジピン、ＰＮ２００−１１０、フェロジピン、アムロジピン、Ｒ−（−）−２０２−７９１、またはＲ−（＋）Ｂａｙ  Ｋ−８６４４またはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記カルシウムチャネル拮抗剤がロペラミドを含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ロペラミドが、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記シクロオキシゲナーゼ阻害剤が、ナプロキセン、フルフェナム酸、トルフェナム酸、フェンブフェン、ケトプロフェン、フェナセチン、ジピロン、フルルビプロフェン、メクロフェナミド、ピロキシカム、インドメタシンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記シクロオキシゲナーゼ阻害剤がメクロフェナミドを含む方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記メクロフェナミドが、約２５ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記葉酸合成阻害剤が、スルホンアミド、ダプソン、トリメトプリム、ジアベリジン、ピリメタミン、メトトレキセート、またはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記葉酸合成阻害剤がマフェナイドである方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記マフェナイドが約２５０ｍｇ／ｋｇから約７５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で６時間ごとに投与される方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、前記ナトリウムチャネルブロッカーが、リドカイン、ディクロニンＨＣｌ、メキシリチン、フェニトイン、ケタミン、フレカイニド、アマンタジンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ナトリウムチャネルブロッカーがディクロニンＨＣｌである方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記ディクロニンＨＣｌが、約２ｍｇ／ｋｇから約３ｍｇ／ｋｇの間の用量で２時間ごとに投与される方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、前記小分子化合物が、吸入、経皮投与、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸管投与、または非経口投与にて投与される方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、前記小分子化合物が、タンパク質のミスフォールディングまたは凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失の発症の後に哺乳類に投与される方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記小分子化合物がトルシンタンパク質の活性を調整する方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記小分子化合物が野生型トルシンＡタンパク質の活性を調整する方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記小分子化合物が変異型トルシンＡタンパク質の活性を調整する方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、前記タンパク質のミスフォールディングまたは凝集が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、ポリグルタミン伸長病、脊髄小脳の運動失調、脊髄および延髄性の筋萎縮、海綿状脳症、タウオパチー、ハンティングトン舞踏病、またはジストニアを含む神経変性疾病と関連する方法。
【請求項２７】
活性酸素種に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防するための治療を必要とする哺乳類に対して、有効量の小分子化合物を含む組成物を投与することによって、活性酸素種に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防するための方法であって、ここにおいて、前記小分子化合物は、活性酸素種に関連した神経変性および神経細胞の喪失を予防する効果を有し、および、
ここにおいて、前記小分子化合物は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤、カルシウムチャネル拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、葉酸合成阻害剤またはナトリウムチャネルブロッカーおよびそれらの機能的類似体を含む方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記葉酸合成阻害剤が、マフェナイドＨＣｌ、スルファセタミドナトリウム水和物、スルファジアジン、スルファグアニディン、スルファチアゾール、スルファメトキサゾール、スルファベンザミドまたはそれらの機能的類似体を含む方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記葉酸合成酵素剤がマフェナイドを含む方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記マフェナイドが約２５０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法であって、前記ナトリウムチャネルブロッカーが、リドカイン、ディクロニンＨＣｌ、メキシリチン、フェニトイン、ケタミン、フレカイニド、アマンタジンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記ナトリウムチャネルブロッカーがリドカインを含む方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記リドカインが約１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法であって、前記シクロオキシゲナーゼ阻害剤が、フルルビプロフェン、メクロフェナミド、ピロキシカム、インドメタシンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記シクロオキシゲナーゼ阻害剤がメクロフェナミドを含む方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記メクロフェナミドが約２５ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される方法。
【請求項３７】
請求項２７に記載の方法であって、前記細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤が、アンピシリン、ペニシリン、セファドロキシル、アモキシシリン、ピペラシリン、クロキサシリン、カルベニシリン、メタンピシリン、ジクロキサシリン、アモキシシリン、セフォキサチンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤がメタンピシリンを含む方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記メタンピシリンが、約２５０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間の用量で８時間ごとに投与される方法。
【請求項４０】
請求項２７に記載の方法であって、前記小分子化合物が吸入、経皮投与、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸管投与、または非経口投与にて投与される方法。
【請求項４１】
請求項２７に記載の方法であって、前記活性酸素種が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、ポリグルタミン伸長病、脊髄小脳の運動失調、脊髄および延髄性の筋萎縮、海綿状脳症、タウオパチー、ハンティングトン舞踏病、またはジストニアを含む神経変性疾病と関連する方法。
【請求項４２】
請求項２７に記載の方法であって、前記小分子化合物が、更に、活性酸素種スカベンジャーまたは少なくとも１つの神経栄養性因子を含む方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記活性酸素種スカベンジャーが、補酵素Ｑ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ピルビン酸塩、メラトニン、ナイアシンアミド、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、またはニトロンを含む方法。
【請求項４４】
請求項２７に記載の方法であって、前記小分子化合物が、活性酸素種に関連する神経変性および神経細胞の喪失の発症の後に哺乳類に投与される方法。
【請求項４５】
請求項２７に記載の方法であって、前記小分子化合物が、トルシンタンパク質の神経保護活性を調整する方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記小分子化合物が、前記トルシンタンパク質の神経保護活性を間接的に調節する方法。
【請求項４７】
請求項２７に記載の方法であって、前記神経細胞がチロシン水酸化酵素を発現する方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記神経細胞がドーパミン作動性である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系の損傷または疾病を原因とする死または変性から神経細胞を保護するための方法およびそのような保護のための小分子化合物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連する出願への相互参照
本願は、２００５年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／７３８，７６１号、および２００５年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／７４９，９１０号の利益を主張し、両出願は、それら全体が本願に援用される。
【０００３】
中枢神経系（「ＣＮＳ」）の疾病および損傷は、毎年何百万もの個人の命を変化させる、破壊的で衰弱させる症状を起こす。一般に、これらの症状は、疾病または障害の中程度から重篤な臨床症状をもたらす、神経細胞の死および変性の後に発症する。外傷、虚血、および神経病理学的由来の多くのその他の発作による傷害は、例えば酸化ストレス、フリーラジカルによる損傷、または細胞タンパク質の機能不全といった機構により、直接的または間接的に神経細胞の損傷および死を起こすことが知られる。中枢神経系の傷害または疾病の例は、外傷性脳外傷（「ＴＢＩ」）；外傷後癲癇（「ＰＴＥ」）；脳卒中；脳虚血；神経変性疾病；イオン化または鉄プラズマ、神経ガス、シアン化物、または中毒性濃度の酸素の照射、曝露に誘導される発作に二次的な脳外傷；中枢神経系マラリアまたは抗マラリア薬剤による治療が原因の神経毒性；およびその他の中枢神経系外傷を含む。中枢神経系神経細胞傷害および神経変性疾病は何れも、しばしば、アポトーシス、酸化ストレスおよびミトコンドリアの機能障害による更なる神経細胞の減少を引き起こす。
【０００４】
神経変性の疾病は、進行性の神経細胞の喪失によって特徴づけられ、（１）酵素機能障害、（２）活性酸素種の形成、および／または（３）究極的に組織変性をもたらすタンパク質ミスフォールディングおよび凝集を伴う。神経変性の疾病は、とりわけ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、ポリグルタミン病、タウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）、ジストニア、脊髄小脳の運動失調、脊髄および延髄性の筋萎縮ならびにプリオン病を含む海綿状脳症を含む。
【０００５】
神経細胞の傷害および疾病は、酵素機能障害に結び付く可能性がある。多くの細胞の酵素は、神経細胞の機能にきわめて重大であり、および、タンパク質機能の変化は、細胞生存に破壊的と成り得る。正常な代謝酵素は、合成および分解の永続的なサイクルを構築するタンパク質を再利用する。正常な細胞機能の責任を負う細胞酵素は、レセプター、神経伝達物質輸送体、合成および分解酵素、分子シャペロンならびに転写制御因子を含む。これらの酵素における突然変異は、ミスフォールディングしたタンパク質の異常な蓄積および分解に結びつく。これらのミスフォールディングしたタンパク質は、神経細胞の損傷（例えば神経細胞の包含およびプラーク）に結びつくことが知られている。従って、細胞機序の理解、およびそのようなミスフォールディングしたタンパク質の減少、抑制および改良のための分子的ツールの同定は重大な意味を持つ。さらに、神経細胞の生存におけるタンパク質の凝集の効果を理解することは、これらの障害に対する合理的で効果的な治療プロトコールの開発を可能とする。
【０００６】
神経毒性の活性酸素種の形成は、細胞の/神経細胞の変性の経路を開始させ、壊死性の神経細胞死の仲介において、有意な役割を果たすようである。特異的な毒素は、活性酵素種の損傷および神経変性から神経細胞を保護する化合物のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるスクリーニングに使用することができる。例えば、過剰な活性酵素種の形成を引き起こし、動物モデルにおいてドーパミン作動性神経細胞の減少を誘導する毒素は、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（「ＭＰＴＰ」）、パラコート、ロテノン、および６−ヒドロキシドパミン（「６−ＯＨＤＡ」）（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，  １９７４，  ２０：  ３７５−３８４；  Ｌａｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８３，  ２１９：  ９７９−９８０；  Ｔａｎｎｅｒ，  Ｏｃｃｕｐ  Ｍｅｄ，  １９９２，  ７：  ５０３−５１３；  Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａ１．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ｌ９９７，  ４８：  １５８３−１５８８）を含む。
【０００７】
ＡＬＳの発症は、一般に自然発生的であり、微量金属および活性酸素種の役割はまた、ＡＬＳおよびその他の神経変性の疾病（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、ポリグルタミン病、脊髄小脳の運動失調、脊髄及び延髄性の筋萎縮、海綿状脳症、タウオパチーおよびハンティングトン舞踏病）の散発的な症例に結びつけられる（Ｍａｎｆｒｅｄｉ  ａｎｄ  Ｘｕ，  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，  ２００５  Ａｐｒ，  ５（２）：  ７７−８７；  Ｚｅｅｖａｌｋ  ｅｔ  ａ１．，  Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ，  ２００５  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ，  ７（９−１０）：  １１１７−１１３９）。
【０００８】
トルシン（Ｔｏｒｓｉｎ）Ａは、熱ショックタンパク質（「Ｈｓｐ」）、プロテアーゼおよびダイニンを含むＡＴＰ分解酵素の機能的に多様なＡＡＡ＋タンパク質スーパーファミリーに属すタンパク質である（Ｎｅｕｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １９９９，  ９：  ２７−４３）。分子シャペロン活性を有するタンパク質のトルシンファミリーは、トルシンＡ、トルシンＢ、ＴＯＲ−１、ＴＯＲ−２およびＯＯＣ−５を含む。トルシンＡは、最近ドーパミン輸送体（「ＤＡＴ」）およびその他のポリトピック膜結合型タンパク質の細胞内レベルを調整することが示された（Ｔｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２００４，  ０１：  １５６５０−１５６５５）。トルシンＡは、ＤＡＴの調整により、活性酸素種への暴露の後、ドーパミン作動性神経細胞に対して神経保護的であると考えられている（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。トルシンタンパク質活性の低下または喪失もまた、タンパク質折りたたみを調整するその能力を抑制し、悪い環境条件に応答してタンパク質凝集および神経変性がもたらされる可能性がある。トルシンＡタンパク質の突然変異はまた、早発性の捻転ジストニア（ｔｏｒｓｉｏｎ  ｄｙｓｔｏｎｉａ）、ヒト運動障害に直接繋がった（Ｌ．  Ｊ．  Ｏｚｅｌｉｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９９７，  １７：  ４０）。
【０００９】
分子シャペロンタンパク質（例えばトルシンタンパク質）は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集を予防する正常な細胞性タンパク質の一つである。分子シャペロンタンパク質は、タンパク質ファミリー（例えばＨｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ４０）を含む（Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｗａｃｋｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００５，  ６：  １１−２２）。ヒトトルシンＡの突然変異は、抑えきれない筋痙攣によって特徴づけられる運動障害早発性の捻転ジストニアに結びつく。症状の重症度は、書痙から車椅子への束縛まで変動しうる。ジストニアは、北アメリカで３００，０００人を超える人々にて発症し、ハンティングトン舞踏病および筋ジストロフィーより一般的である。疾病が十分に理解されないので、治療は非常に制限され、選択肢は手術またはボツリヌス中毒症毒素を注入し筋収縮を制御することを含む。
【００１０】
早発性の捻転ジストニアの大多数の患者は、トルシンＡ遺伝子（「ＤＹＴ１」）の１コドンのユニークな欠失を有しており、その結果、トルシンＡのカルボキシ末端でのグルタミン酸（「ＧＡＧ」）残基の喪失がもたらされ、それによって機能不全のトルシンタンパク質が生産される（Ｌ．  Ｊ．  Ｏｚｅｌｉｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １９９９，  ６２：  ３７７；  Ｌ．  Ｊ．  Ｏｚｅｌｉｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９９７，  １７：  ４０）。最近の論文によると、カルボキシ末端での１８塩基対または６アミノ酸の付加的な欠失は、早発性の捻転ジストニアに結びつきうることが報告された（Ｌｅｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００１，  ３：  １３３−１４３）。
【００１１】
トルシンタンパク質はまた、神経変性の疾病（例えばハンティングトン舞踏病およびパーキンソン病）に関わるポリグルタミンの伸長およびα−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）ミスフォールディングの疾病におけるタンパク質ミスフォールディングおよび凝集の予防に関係付けられている（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００３，  １２：  ３０７−３１９；  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５：  ３８０１−３８１２）（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６，  ３１３：  ３２４−３２８も参照）。パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病およびポリグルタミン伸長疾病のような神経変性の障害は、異常なタンパク質ミスフォールディングおよび凝集の結果生じる。トルシンタンパク質は、これらの障害のｉｎ  ｖｉｖｏのモデルにおいて、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集を改善することが示された。トルシンタンパク質も、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関係する神経変性の疾病に結びつけられる、その他のタンパク質への作用を有すると考えられている。
【００１２】
神経変性の障害を取り巻く主要な障害は、患者が、神経細胞の変性に寄与する神経細胞の環境が発達していることに、臨床症状が現れる点まで気づかないことである。臨床症状が顕在化する頃には、相当な神経細胞の喪失が既に生じており、神経細胞の環境は神経細胞の生存に非常に好ましくない。遺伝学的スクリーニングは、個人が神経変性の疾病を発病し易いかどうかの情報を提供する。しかしながら、タンパク質凝集または神経細胞の喪失のための信頼できる早期発見方法の不足は、神経細胞の喪失がすでに起こったため治療の効果がない又は不要となる点まで、これらの変性疾患がモニターされずに進行することを許してしまう。さらに、たとえ信頼できる早期発見方法が利用できたとしても、現在の治療はこれらの神経変性の疾病の長期治療に効果がなく、新しい薬剤および治療方法が必要である。
【００１３】
異常なタンパク質凝集の分子機構および制御因子のより良い理解は、重大な神経細胞の破壊の前における結果として生じる障害の初期診断のための、およびドラッグデザインおよび開発を先導するための、改善された方法を開発するために必要である。タンパク質凝集に関係した特異的遺伝子および遺伝子産物を標的化する化合物は、モデルシステムを用いてスクリーニングし、開発することができる。加えて、それはまた、神経変性の機構を理解するために、およびタンパク質ミスフォールディングおよび凝集および神経細胞喪失の保証を予防または減弱させる神経保護の化合物を開発するために必要である。
【００１４】
ＣＮＳ傷害および疾病の罹患率は、神経変性の発生および進行の機構についての改善された理解の必要性を強調する。予防的にまたは傷害および疾病の出現後に、神経細胞の喪失を予防または減弱させる新規で改善された神経保護化合物の必要性が存在することが明らかである。従って、ＣＮＳ傷害または疾病を原因とする死および変性から神経細胞を保護するための新しい薬物療法学が必要である。
【００１５】
また、タンパク質ミスフォールディングおよびタンパク質凝集を含む神経細胞の損傷に起因する疾病を治療および予防するための新しい薬物療法学が必要とされる。理想的には、そのような薬物療法学は、予防的な使用並びに症状発現後の有用性である。現在利用できる治療的な選択肢は、ワクチンおよびタンパク質療法を含むが、ともに生成および管理が困難である。そのような薬物療法学が、何も存在しない治療選択肢を提供する一方で、製造および投与の困難性は、患者の服薬遵守の低下に結びつく可能性がある。従って、また、製造および投与が容易であり、高い患者の服薬遵守がもたらされる薬物療法が必要である。
【発明の概要】
【００１６】
神経細胞の死を予防する効果を有する小分子化合物を投与することによって、傷害、虚血または神経変性に起因する損傷および死から神経細胞を保護するための方法が提供される。本発明の一側面において、これらの方法は、機能不全の細胞性タンパク質と関連する神経細胞の損傷および神経変性の疾病を治療するために有用である。本発明の別の側面において、これらの方法はまた、活性酸素種に関連する神経細胞の損傷および神経変性の疾病を治療するために有用である。本発明の更なる側面において、これらの方法は、小分子化合物を投与することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質ミスフォールディングまたは凝集を予防および減少させるために有用である。本発明の別の側面は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関係する神経細胞の損傷および神経変性の疾病を治療するための方法を提供する。
【００１７】
本発明の小分子化合物は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤、カルシウムチャネル拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、葉酸合成阻害剤またはナトリウムチャネルブロッカー、および、神経保護の効果を有するそれらの機能的類似体を含む。神経保護の効果は、細胞性タンパク質（例えば神経伝達物質輸送体または分子シャペロンタンパク質）の調整に起因してよい。小分子化合物は、欠陥のある細胞性タンパク質に起因する神経細胞の損傷を減少させるトルシンタンパク質活性を調整することで作用してよい。小分子化合物はまた、神経細胞の表面で神経伝達物質輸送体分子を調整することによって活性酸素種に起因する神経細胞の損傷を減少させるトルシンタンパク質活性を調整することによって作用してよい。小分子化合物は、さらに、タンパク質の適当な折りたたみの先導を助けることにより、タンパク質ミスフォールディングまたは凝集に起因する神経細胞の損傷を減少させるトルシンタンパク質分子シャペロン活性を調整するよう作用しうる。小分子化合物は、それらの安定性、製造および処方の両場合における容易性、投与の容易性、および患者の服薬遵守のために、重要な治療選択肢を提供する。ＣＮＳ傷害または神経変性の疾病の臨床症状の発症が現れる前に予防的に投与してよく、またはその臨床症状が現れた後に投与してよい。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、ＣＮＳ傷害または神経変性の後において、神経細胞を傷害または死から保護するための方法および組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、欠陥のある細胞性タンパク質に関連した神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法および組成物において使用するための小分子化合物を同定することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、活性酸素種に関連した神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法および組成物において使用するための小分子化合物を同定することである。
【００２１】
本発明の更なる目的は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝縮に関連した神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法および組成物において使用するための小分子化合物を同定することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤、カルシウムチャネル拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、葉酸合成阻害剤またはナトリウムチャネルブロッカーおよびそれらの機能的類似体を含む小分子化合物を用いることによる、神経変性および神経細胞の喪失を予防する方法および組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、トルシンタンパク質の作用を調整することによる、神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法および組成物において使用するための小分子化合物を同定することである。
【００２４】
本発明の更なる目的は、トルシンタンパク質の活性を調整することによる、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関連した神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法および組成物において使用するための、トルシン依存的機構を通して作用する小分子化合物を同定することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関連した神経変性および神経細胞の喪失を治療または予防するための方法および組成物において使用するための、神経伝達物質輸送体分子活性を調整する小分子化合物を同定することである。
【００２７】
本発明のこれらおよびその他の目的、特徴、および利点は、開示される実施態様の以下の詳細な記載および添付される特許請求の範囲を精査した後明らかとなるだろう。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
本願に記載されるものと同一または等価の方法および材料は、本願発明の実施または試験において使用することができると理解される。本願で言及される全ての刊行物、特許出願、特許文献およびその他の引用文献は、その全てが本願に援用される。矛盾が生じる場合には、定義をも含めて本願発明によるものとする。加えて、物質、方法および実施例は、例証となるのみであり、本発明を限定するもとはならない。
【００２９】
「小分子化合物」、「候補化合物」および「薬剤化合物」とは、活性酸素種の形成、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集、神経細胞の傷害および神経変性に効果があるとしてスクリーニングされた、本発明の分子化合物を意味する。これらの化合物は、プレストウィックライブラリー（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  ｌｉｂｒａｒｙ）中の化合物、関連薬剤クラス（ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃｌａｓｓｅｓ）中の化合物またはその機能的類似体を含んでよい。
【００３０】
「タンパク質ミスフォールディング」とは、タンパク質が折りたたまれ二次または三次構造を達成する正常な様式とは異なる、タンパク質のフォールディングを意味する。タンパク質のフォールディングにおけるエラーは、突然変異によるタンパク質配列の変化または適当なタンパク質フォールディングを助ける分子シャペロンタンパク質の異常に起因し得る。ミスフォールディングは、適当なタンパク質機能を増大、減少、または妨げる可能性のある、タンパク質の生理的機能の変化を生じさせる可能性がある。
【００３１】
本発明の範囲内における「タンパク質凝集」とは、自己会合状態の集合体を形成するポリペプチドの異常な会合を意味し、それは可溶性または不溶性であってもよく、および必ずしも繊維状である必要はない。この用語はまた、互いに接触する少なくとも２つのポリペプチドが、その何れか１つが脱溶媒和の状態となっている現象を含む。これはまた、ポリペプチドの本来の機能的活性の喪失を含んでもよい。
【００３２】
本発明の範囲における「治療する」とは、減少させること、阻害すること、改善させること、または妨げることを指す。好ましくは、活性酸素種に起因する神経変性、活性酸素種による細胞性機能障害、神経変性の疾病、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質凝集、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に起因する細胞性機能障害、およびタンパク質凝集関連疾病が治療されてよい。
【００３３】
本発明の範囲内における「タンパク質凝集関連疾病」は、神経変性の障害を含むタンパク質凝集関連疾病に関係する、それが原因となる、またはそれに起因する、何れかの疾病、障害および／または苦痛を含む。
【００３４】
「神経変性の障害」は、感覚、運動、および認識挙動の進行性の低下により生じる病因学的因子による神経細胞の喪失に起因する障害を含む。そのような障害は、ＡＬＳ；アルツハイマー病；パーキンソン病；プリオン病；ポリグルタミン伸長疾病；脊髄小脳の運動失調；脊髄および延髄性の筋萎縮；海綿状脳症；タウオパチー；ハンティングトン舞踏病；前頭側頭型痴呆；運動ニューロン疾患（「ＭＮＤ」）などを含む。
【００３５】
「ＣＮＳ傷害」は、外傷性の脳損傷（「ＴＢＩ」）；外傷後癲癇（「ＰＴＥ」）；脳卒中；脳虚血；神経変性の疾病；イオン化もしくはイオンプラズマ（ｉｒｏｎ  ｐｌａｓｍａ）、神経ガス、シアン化物、または酸素の中毒性濃度の照射、曝露によって誘導される発作に対して従属的な脳損傷；ＣＮＳマラリアまたは抗マラリア薬剤による治療が原因の神経毒性等を含む。
【００３６】
本願において、「類似体」または「機能的類似体」とは、構造的に母物質と類似しているが、組成がわずかに異なる（例えば、１原子または官能基が異なる、付加される、または除かれる）化学物質を意味する。類似体は、元の化合物より異なる化学的特性または物理的特性を有しており、または有していなくてよく、並びに生物学的および／または化学的活性が改善されており、または改善されていなくてよい。例えば、類似体はより親水性でよく、または、母物質と比較して反応性が変化してもよい。類似体は、母物質の化学的および／または生物学的活性を模倣してもよく（すなわち、類似的または同一の活性を有してよい）、または、ある場合には、増大もしくは減少した活性を有していてよい。類似体は、元の化合物の天然または非天然で生じる（例えば組換え）変種であってもよい。類似体のその他のタイプは、異性体（鏡像異性体、ジアステレオマーなど）および化合物のキラルな変種のその他のタイプ並びに構造異性体を含む。類似体は、線形化合物の枝分かれしたまたは環状化した変種であってもよい。例えば、線形化合物は、特定の所要の性質（例えば、親水性または生物学的利用能の改善）を付与するために、枝分かれした、さもなければ置換された類似体を有してよい。
【００３７】
本願において「誘導体」とは、構造的に母物質と類似しており、および（実際にまたは理論的に）母物質から誘導される、化学物質の化学的または生物学的に改変された変種を意味する。母物質は、「誘導体」を作り出すための出発物質であってよく、一方、「類似体」または「機能的類似体」を作り出すための出発物質として母物質が必ずしも使用されなくてよいことから、「誘導体」は、「類似体」または「機能的類似体」と異なるものである。誘導体は、母物質と異なる化学的特性または物理的特性を有していてよく、または有していなくてよい。例えば、誘導体はより親水性でよく、または母物質と比較して反応性が変化していてよい。誘導体化（すなわち改変）は、分子内の、１以上の成分の置換（例えば官能基の変化）を含んでもよい。例えば、水素は、ハロゲン（例えばフッ素または塩素）で置換されてよく、またはヒドロキシル基（−ＯＨ）は、カルボン酸成分（−ＣＯＯＨ）で置き換えられてよい。「誘導体」という用語はまた、母物質のコンジュゲートおよびプロドラッグ（すなわち、生理的条件下で元の化合物に変化できる化学的に修飾された誘導体）を含む。例えば、プロドラッグは、活性薬剤の不活性型であってもよい。生理的条件下で、プロドラッグは活性型の化合物に変わってもよい。例えば、プロドラッグは、窒素原子における１または２水素原子が、アシル基（アシルプロドラッグ）またはカルバメート基（カルバメートプロドラッグ）によって置換されて作製されてよい。プロドラッグに関するより詳細な情報は、例えば、Ｆｌｅｉｓｈｅｒらによる文献（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９  （１９９６）  １１５；  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  （ｅｄ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  １９８５；  ａｎｄ  Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  １６  （１９９１）  ４４３）に記載されている。「誘導体」という用語はまた、全ての溶媒和化合物、例えば水和物または付加物（例えばアルコールによる付加物）、活性代謝物および母物質の塩を意味するよう使用される。作製してよい塩のタイプは、化合物内の成分の性質に依存する。例えば、カルボン酸基のような酸性基は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を形成することができる（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、および生理的に許容できる４原子アンモニウムイオンによる塩、ならびにアンモニアと生理的に許容できる有機アミン（例えばトリエチルアミン、エタノールアミンまたはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン）とによる酸付加塩）。塩基性基は、例えば、無機酸（例えば、塩酸（「ＨＣｌ」）、硫酸またはリン酸）との酸付加塩を形成することができ、または有機カルボン酸およびスルホン酸（例えば、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸）との酸付加塩を形成することができる。塩基性基および酸性基を同時に含む（例えば、塩基性窒素原子に加えてカルボキシル基）化合物は、双性イオンとして存在しうる。塩は、当業者に既知の慣習的な方法によって得ることができ、例えば、溶媒または希釈剤中で化合物と無機または有機酸または塩基とを組み合わせることで、または陽イオン交換もしくは陰イオン交換によってその他の塩から得ることができる。
【００３８】
タンパク質凝集関連疾病は、全て、顕著な共通の特徴：異常なタンパク質の凝集および堆積（表１）を共有しており、分子シャペロンタンパク質の役割もまた、そのような疾病に結び付けられてきた（Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｗａｃｋｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００５，  ６：１１−２２）。タンパク質凝集関連疾病は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン疾病、タウオパチー、ハンティングトン舞踏病、ジストニア、脊髄小脳運動失調、脊髄および延髄性の筋萎縮、海綿状脳症およびＡＬＳを含むが、これらに限定されない。遺伝子組換え動物モデル中の変異体タンパク質の発現は、これらの疾病の特徴を再現する（Ａ．  Ａｇｕｚｚｉ  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｒａｅｂｅｒ，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，  ８，  ６９５  （１９９８））。神経細胞は、特に、変異体またはミスフォールディングタンパク質の毒作用に脆弱である。本願に記載されるように、タンパク質凝集関連神経変性の障害に関連する一般的な特徴の理解、例えば、不必要で潜在的に有害なタンパク質を処分し、タンパク質の適当な折りたたみを促進するための、正常な細胞の機構の理解は、効率的で良好な治療計画および診断法の開発を可能とする。
【表１】
2009516751.tif 000003
【００３９】
正しい折りたたみは、起こりうるものの誤った高次構造の集まりから１つの特定の構造を決定することをタンパク質に要求する。ポリペプチドがそれらの適当な構造をとり損なうことは、細胞機能および生存率にとって大きな脅威である。従って、誤って折り畳まれたタンパク質の有害な効果から細胞を保護するため、精巧なシステムが進化した。誤って折り畳まれたタンパク質に対する防衛の第１線は分子シャペロンを含み、当該分子シャペロンは、新生ポリペプチドがリボソームから生じるとすぐに結合し、適切なフォールディングを促進し、有害な相互作用を妨げる（Ｊ．  Ｐ．  Ｔａｙｌｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００２，  ２９６：  １９９１）。タンパク質の不適当な折りたたみは、必ずしもタンパク質凝集または神経変性に帰着するわけではないが、疾病または障害の臨床症状は、細胞性機能障害のより巧妙な原因のために、なお顕在化する可能性がある。例えば、早発性の捻転ジストニアでは、欠陥のあるトルシンＡタンパク質は、適切にドーパミン輸送体の細胞レベルを調整せず、それによって、見かけ上の神経変性またはタンパク質凝集は起こらずジストニアの症状がもたらされる（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，  ２００２，  １０１：  １５６５０−１５６５５；  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。
【００４０】
本発明者らは、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集の妨げに作用する小分子化合物を同定するために、化学的に多様な小分子ライブラリーをスクリーニングした（表２）。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）小分子ライブラリーは、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ワシントンＤＣ）（以降「プレストウィックライブラリー」と呼ぶ）から得た。ライブラリーは、Ｃ．エレガンスにおいて耐性で選択した２４０の小分子の化学的に多様なコレクションである。ライブラリー中の全ての化合物は、ウォームの寿命にわたって毒性がないか調べられ、Ｃ．エレガンスに非有毒であることが示された。候補化合物は、組織学的研究のためのインキュベーション培地を着色することはなく、また不明瞭にさせることはない。ライブラリー中の化合物の９５％以上は、特許の切れた（ｏｆｆ−ｐａｔｅｎｔ）市販される薬剤であり、安全に人間に投与されている。これらの薬剤の約５％はアルカロイドである。このライブラリーは、十分な有効性で効果を示す薬剤のスクリーニングを可能とする。陽性結果が得られたが十分な有効性ではない場合、最適化された類似体を、コンピューターを利用したドラッグデザインを使用して合成し、同様に容易にスクリーニングに供してよい。このライブラリー中の化合物は、最初のリード化合物が、許容可能な半減期を有し、非有毒性で、経口的に生物利用可能であり、十分許容的であるため、更なる開発の機会を提供する。
【００４１】
成功の可能性を向上させるため、化合物はＣｈｅｍＸ／ＣｈｅｍＤｉｖｅｒｓｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）といったコンピュータプログラムを使用し、経験豊かな医薬化学者による決定的な工夫に基づいて選択してよい。多様性を増加させ、スクリーニング工程の成功率を増大させるため、異なる治療分野において有効であることが既知の化合物をこのライブラリーに集合させてよい。これらの化合物は、神経精神医学的薬剤、抗糖尿病薬、抗ウイルス剤、降圧薬、解熱薬、抗炎症剤、抗生物質、および抗感染剤を含んでもよい。
【００４２】
タンパク質凝集のためのＣ．エレガンスモデルにおいて小分子ライブラリーをスクリーニングすることによって、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集を予防する効果を有する幾つかのクラスの化合物が同定された（表２）。薬剤は基体上に固定（ｐｌａｔｅ）してよく、そこにおいて、遺伝子組換えウォームは生育されまたはその他の従来の様式で管理され、ウォームは候補薬剤に曝露される。増殖基体に導入される場合、小分子化合物は表皮を通した拡散および摂取の両方によって動物に浸透する。投与のこのモードは、動物に対する連続的な薬剤への曝露を可能とする。最初のスクリーニング濃度で薬剤が反応をもたらした場合、段階希釈を行い、観察できる効果を生じさせうる最高の用量が決定される。
【００４３】
遺伝子組換え動物モデルにおける変異体タンパク質の発現により、神経変性の疾病の特徴が再現される（Ａ．  Ａｇｕｚｚｉ  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｒａｅｂｅｒ，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，  １９９８，  ８：  ６９５）。神経細胞は、特に、変異タンパク質またはミスフォールディングタンパク質の毒性効果に対し脆弱である。これらの神経変性の障害の共通の特徴から、活性酸素種が原因の損傷を予防するための正常な細胞機構の理解に基づいて、類似した治療のアプローチが示唆される。
【００４４】
解剖学的および遺伝的に決定済みの透明なネマトーダ（ｎｅｍａｔｏｄｅ）は、正確に３０２の神経細胞を有し、その内８つがドーパミン作動性（「ＤＡ」）であるため、Ｃ．エレガンスはドーパミン作動性神経細胞の変性を研究するための理想的なモデルである。したがって、Ｃ．エレガンスモデルの使用は、動物齢（ａｎｉｍａｌ  ａｇｅｓ）の間、ドーパミン神経変性の迅速なスコアリングを促進する。ドーパミン作動性神経細胞は、特に、ドーパミン代謝の結果としての酸化ストレスに影響されやすく、並びに活性酸素種の形成に有利なその他の細胞内因子の存在に影響を受け易い。（Ｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。トルシンは、活性酸素種が関わる神経変性のためのモデルにおいて、ドーパミン機能障害と結びつけられる定義された細胞性ストレスからＣ．エレガンスのドーパミン作動性神経細胞を保護することができる。具体的には、トルシンは、６−ＯＨＤＡへの暴露によって誘導される活性酸素種に関係する神経変性を妨げることができる（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。
【００４５】
Ｃ．エレガンスで神経変性を記録するための別のモデルは、ｃａｔ−２を過剰発現する遺伝子組換えＣ．エレガンスであり、ｃａｔ−２とは、ヒトチロシン水酸化酵素（「ＴＨ」）のウォームの相同体であり、ドーパミン合成経路中の酵素である。ＣＡＴ−２の過剰発現は、ＤＡ神経細胞の広範囲にわたる喪失をもたらす（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。トルシンタンパク質は、ＤＡ神経細胞に対して一定の神経保護作用を有することが示された。このモデルは、アドレナリン作動性、ノルアドレナリン作動性およびＤＡ神経細胞といったＴＨを含む神経細胞において、作用のスクリーニングに使用できる。同様のアッセイは、異なる神経細胞のサブタイプ（例えば、セロトニン、グルタミン酸塩、ＧＡＢＡ、グリシン、アセチルコリン、ヒスタミンおよびペプチド神経伝達物質を含む神経細胞）の死および変性を研究するために使用することができる。
【００４６】
化学的に多様な小分子ライブラリーはまた、活性酸素種に関わる神経変性を予防する作用を有する小分子化合物を同定するためにスクリーニングされた。Ｃ．エレガンス小分子ライブラリーは、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ワシントン、ＤＣ）（以降「プレストウィックライブラリー」と呼ぶ）から得た。当該ライブラリーは、Ｃ．エレガンスにおいて耐性で選択された２４０の小分子の化学的に多様なコレクションである。ライブラリーの中の全ての化合物は、ウォームの生涯にわたって毒性がないか調べられ、Ｃ．エレガンスに非毒性であることが示された。候補化合物は、組織学的な研究のためのインキュベーション培地を着色することがなく、また濁らせなることがない。ライブラリー中の化合物の９５％以上は特許の切れた市販される薬剤であり、安全にヒトに投与された。これらの薬剤の約５％はアルカロイドである。このライブラリーは、十分な有効性で効果を示す薬剤のスクリーニングを可能とする。陽性結果が得られたが十分な有効性がない場合、最適化された類似体を、コンピューターを利用したドラッグデザインを使用して合成し、同様に容易にスクリーニングに供してよい。このライブラリー中の化合物は、最初のリード化合物が、許容可能な半減期を有し、非有毒性で、経口的に生物利用可能であり、十分許容的であるため、更なる開発の機会を提供する。
【００４７】
成功する可能性を向上させるため、化合物はＣｈｅｍＸ／ＣｈｅｍＤｉｖｅｒｓｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）といったコンピュータプログラムを使用し、経験豊かな医薬化学者による決定的な工夫に基づいて選択してよい。多様性を増加させ、スクリーニング工程の成功率を増大させるため、異なる治療分野において有効であることが既知の化合物をこのライブラリーに集合させてよい。これらの化合物は、神経精神医学的薬剤、抗糖尿病薬、抗ウイルス剤、降圧薬、解熱薬、抗炎症剤、抗生物質、および抗感染剤を含んでもよい。
【００４８】
神経保護のためのＣ．エレガンスモデルにて小分子ライブラリーをスクリーニングすることによって、活性酸素種に関わる神経変性を予防する効果を有する幾つかのクラスの化合物が同定された。薬剤は基体上に固定（ｐｌａｔｅ）してよく、そこにおいて、遺伝子組換えウォームは生育されまたはその他の従来の様式で管理され、ウォームは候補薬剤に曝される。増殖基体に導入される場合、小分子化合物は表皮を通した拡散および摂取の両方によって動物に浸透する。投与のこのモードは、動物に対する連続的な薬剤への曝露を可能とする。最初のスクリーニング濃度で薬剤が反応をもたらした場合、段階希釈を行い、観察できる効果を生じさせうる最高の用量が決定される。
【００４９】
以下のリストは限定することを意図せず、本願に記載される神経保護作用を有する特異的な小分子を提供する。
【００５０】
Ｉ．分子シャペロンの機能を補助する分子
以下のクラスの分子は、分子シャペロンの機能を調整することによって、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集に関連した神経変性および神経細胞の喪失を予防する。適切なタンパク質フォールディングの調節に主に関連する分子シャペロンは、４０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ４０；ＤｎａＪ）、６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０；ＧｒｏＥＬ）、７０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０；ＤｎａＫ）、およびトルシン（ＴＯＲ−１；ＴＯＲ−２；トルシンＡ；トルシンＢ；ＯＯＣ−５）ファミリーである。一実施態様において、これらのクラスの分子は、トルシンＡタンパク質の作用を調整することにより適切なタンパク質フォールディングを促進する。
【００５１】
ａ）トポイソメラーゼＩＩ阻害剤
一実施態様において、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集が関与する神経変性および神経細胞の喪失の予防に使用される。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、ロメフロキサシン、シノキサシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、オキソリニック酸（ｏｘｏｌｉｉｃ  ａｃｉｄ）、ナリジクス酸、スラミン、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、ゲニステイン、エピルビシンＨＣｌ、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）、ドキソルビシン、アウリントリカルボン酸（「ＡＴＡ」）またはそれらの医薬的に許容可能な塩から選択されるが、これらに限定されない。
【００５２】
ナリジクス酸（ＮＥＧＧＲＡＭ（登録商標），  Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，  ＮＪ；  ＣＡＳ  Ｎｏ．    ３  ８９−０８−２）は特に重要であり、一般に尿路の感染症を治療することが知られているキノロン系抗菌剤である。ナリジクス酸は、４−オキソ（窒素に対してパラの位置のカルボニル）を含むキノロンである４−キノロンの薬剤ファミリーに属す。これらは、ＤＮＡジャイレースのＡサブユニットを阻害し、抗生物質として使用される。第二世代の４−キノロンはまた、７位が１−ピペラジニル基で、６位がフッ素で置換されている。上記のように、本発明に含まれる小分子化合物は、ヒトにおける使用の認可を得ている。薬剤としてのナリジクス酸は尿路感染症の治療における使用の認可を受けており、推奨される用量は６時間ごとに約７５０ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇであり、より一般には６時間ごとに約１グラム／ｋｇで投与される。薬剤が１または２週を超えて摂取される場合、用量は６時間ごとに約５００ｍｇ／ｋｇまで減少させてよいが、この用量は必要に応じて適切に滴定することができる。活性薬剤のピーク血清レベルは、約９０分の半減期で、絶食状態の正常な個人への１グラム／ｋｇ用量の投与後の１から２時間において、平均して約２０〜４０ｊｉｇ／ｍＬ（９０％タンパク質が結合）となる。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関わる神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのナリジクス酸のこの用量は、その他の障害を治療するためにこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００５３】
特に重要なその他のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、尿路感染症の治療に使用される抗生物質である、オキソリニック酸（ｏｘｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＡＳ  ＮＯ：１４６９８−２９−４）である。上述のように、本発明を含む小分子化合物は、ヒトへの使用について認可されている。薬剤としてのオキソリニック酸は、尿路感染症の治療における使用の認可を得ており、推奨される用量は、約１０ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの間であり、より一般的には約２０ｍｇ／ｋｇである。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関する神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのオキソリニック酸のこの用量は、その他の障害の治療に対するこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定できる。
【００５４】
ｂ）細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤
代替となる実施態様において、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために使用される。細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤は、アンピシリン、クロキサシリン、ピペラシリン、アモキシシリン、セファドロキシル、ジクロキサシリン（ｄｉｃｌｏｘｙａｃｉｌｌｉｎ）、カルベニシリン、ペニシリン、メタンピシリン（ｍｅｔａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、アモキシシリン、セフォキサチン（ｃｅｆｏｘａｔｉｎ）またはそれらの医薬的に許容可能な塩から選択されるが、これらに限定されない。
【００５５】
特に重要なものは、ペニシリンの誘導体、メタンピシリンナトリウム塩である（ＣＡＳ  Ｎｏ．６４８９−９７−０；プレストウィックライブラリー化合物２３５）。メタンピシリンは、８時間ごとに、約２５０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間で一般に投与される。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関する神経変性および神経細胞の予防のためのメタンピシリンの用量は、その他の障害の治療に対するこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定できる。
【００５６】
本発明の一実施態様において、細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤は、活性酸素種に関係した神経変性および神経細胞の喪失の予防のために使用される。細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤は、アンピシリン、ペニシリン、ピバンピシリン、タランピシリン、メタンピシリン、アモキシシリンおよびセフォキサチンから選択されるが、これらに限定されない。一実施態様において、血液脳関門を通過する化合物が、活性酸素種に関する神経変性および神経細胞の喪失の予防に使われる。
【００５７】
ペニシリン誘導体であるメタンピシリンナトリウム塩はきわめて重要である（ＣＡＳ  Ｎｏ．  ６４８９−９７−０；プレストウィックライブラリー化合物２３５）。上述のように、本発明を含む小分子化合物は、ヒトへの使用について認可されている。薬剤メタンピシリンは細菌感染症の治療の使用において認可されており、推奨される用量は８時間ごとに約２５０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの間であるが、この用量は必要に応じて適切に滴定することができる。神経保護を提供するためのメタンピシリンのこの用量は、その他の障害を治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００５８】
ＩＩ．欠陥があるシャペロンの効果を逆転させて（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）、作用を発揮する分子
以下のクラスの分子は、欠陥がある分子シャペロンの作用を逆転させることにより、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防する。このグループには、欠陥のあるタンパク質分子シャペロン活性を有するトルシンタンパク質変異体の作用を逆転させる化合物が含まれる。
【００５９】
ａ）カルシウムチャネル拮抗薬
一実施態様において、カルシウムチャネル拮抗薬は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失の予防に使用される。カルシウムチャネル拮抗薬は、ニモジピン、ジプロテベリン（ｄｉｐｒｏｔｅｖｅｒｉｎｅ）、ベラパミル、ニトレンジピン、ジルチアゼム、ミオフラジン（ｍｉｏｆｌａｚｉｎｅ）、ロペラミド、フルナリジン、ベプリジル、リドフラジン、ＣＥＲＭ−１９６、Ｒ−５８７３５、Ｒ−５６８６５、ラノラジン（ｒａｎｏｌａｚｉｎｅ）、ニソルジピン、ニカルジピン、ＰＮ２００−１１０、フェロジピン、アムロジピン、Ｒ−（−）−２０２−７９１、またはＲ−（＋）Ｂａｙ  Ｋ−８６４４またはそれらの医薬的に許容可能な塩から選択してよいが、これらに限定されない。
【００６０】
特に重要なものとしては、ロペラミド塩酸塩（ＩＭＯＤＩＵＭ（登録商標），  ＭｃＮｅｉｌ−ＰＰＣ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｍｙｌａｎ，  ＣＡＳ  Ｎｏ．  ５３１７９−１１−６）であり、これはオピエート作動薬のグループに属し、特異的なデルタ、ミュー、およびカッパーオピエート受容体（それぞれ異なる脳の機能を調整する）の活性による、ＣＮＳおよび平滑筋における広範な効果を有している。上記の通り、本発明に含まれる小分子化合物は、ヒトへの使用について認可されている。薬剤ロペラミドＨＣｌは、下痢の治療における使用について認可されており、推奨される用量は、最初に約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇでその後約０．５ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇ、より一般的には最初に約４ｍｇ／ｋｇでその後約２ｍｇ／ｋｇであり、一日の用量が約１６ｍｇ／ｋｇを越えない。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に関わる神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのロペラミドＨＣｌのこの用量は、その他の障害の治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００６１】
ｂ）シクロオキシゲナーゼ阻害剤
一実施態様において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために用いられる。シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ナプロキセン、フルフェナム酸、トルフェナム酸、フェンブフェン、ケトプロフェン、フェナセチン、ジピロン、フルルビプロフェン、メクロフェナミド（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍｉｄｅ）、ピロキシカム、インドメタシンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩を含むが、これらに限定されない。消炎作用に加えて、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、鎮痛薬、解熱薬および血小板阻害作用を有する。それらは、主に、慢性的な関節炎症状および痛みおよび炎症に関係する特定の軟部組織異常の治療に使用される。シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、シクロオキシゲナーゼの阻害によるプロスタグランジンの合成を抑える作用を有する非ステロイド系抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）を含み、シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸を環状エンドペロキシド（プロスタグランジンの前駆体）に変換する。プロスタグランジン合成の阻害は、それらの鎮痛薬、解熱薬および血小板阻害作用の原因となり；その他の機構が、それらの抗炎症性効果に寄与する可能性がある。特定のＮＳＡＩＤもまた、リポキシゲナーゼ酵素またはホスホリパーゼＣを抑制する可能性があり、または、Ｔ細胞機能を調整する可能性がある（ＡＭＡ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  Ａｎｎｕａｌ，  ｌ９９４，  １８１４−１８１５）。
【００６２】
メクロフェナム酸ナトリウム塩は、きわめて重要である（Ｍｙｌａｎ，  ＣＡＳ  Ｎｏ．  ６４４−６２−２）。上記のように、本発明に含まれる小分子化合物は、ヒトへの使用について認可された。薬剤メクロフェナム酸ナトリウム塩は、痛みの治療における使用について認可されており、推奨される用量は、約２５ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇであり、より一般的には約５０ｍｇ／ｋｇで４回／日であるが、約４００ｍｇ／日まで増加してもよい。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのメクロフェナム酸ナトリウム塩のこの用量は、その他の障害の治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００６３】
本発明の一実施態様において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤が、活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために使われる。シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、フルルビプロフェン、メクロフェナミド、ピロキシカムおよびインドメタシンから選択されるが、これらに限定されない。消炎作用に加えて、それらは鎮痛薬、解熱薬および血小板阻害作用を有する。それらは、主に、慢性的関節炎症状ならびに痛みおよび炎症に関係する特定の軟部組織異常の治療に使用される。ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼを阻害することによってプロスタグランジンの合成を抑える作用を有する。シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸を環状エンドペロキシド（プロスタグランジンの前駆体）に変換する。プロスタグランジン合成の阻害は、それらの鎮痛薬、解熱薬および血小板阻害作用の原因となる；その他の機構は、それらの抗炎症性の効果に寄与する可能性がある。特定のＮＳＡＩＤもまた、リポキシゲナーゼ酵素またはホスホリパーゼＣを抑制する可能性があり、または、Ｔ細胞機能を調整する可能性がある（ＡＭＡ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  Ａｎｎｕａｌ，  ｌ９９４，  １８１４−１８１５）。
【００６４】
メクロフェナム酸ナトリウム塩は、きわめて重要である（Ｍｙｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  ＣＡＳ  Ｎｏ．  ６４４−６２−２；  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ２０６）。上記のように、本発明に含まれる小分子化合物は、ヒトへの使用について認可された。薬剤メクロフェナム酸は、痛みの治療における使用について認可されており、推奨される用量は、約２５ｍｇ／ｋｇから約７５ｍｇ／ｋｇであり、より一般的には約５０ｍｇ／ｋｇで４回／日であるが、約４００ｍｇ／日まで増加してもよい。活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのメクロフェナム酸ナトリウム塩のこの用量は、その他の障害の治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００６５】
ＩＩＩ．ポリグルタミン伸長に影響する分子
以下のクラスの分子は、凝集し易いタンパク質に影響して、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集に関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防する。これらのクラスには、ポリグルタミンリピートに関係するタンパク質に影響を与える分子が含まれる。
【００６６】
ａ）葉酸合成酵素阻害剤
一実施態様において、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集に関連する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために使用される。葉酸合成阻害剤は、スルホンアミド（スルファメトキサゾール、スルファジアジンおよびスルファドキシンを含む）；ダプソン；トリメトプリム；ジアベリジン（ｄｉａｖｅｒｉｄｉｎｅ）；ピリメタミン；メトトレキセート；またはそれらの医薬的に許容可能な塩から選択してよいが、それらに限定されない。
【００６７】
ＳＯ２ＮＨ２構造を含むスルホンアミドのメンバーであるマフェナイド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３８−３９−６；  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  １６６）は、きわめて重要である。この基のメンバーは「サルファ剤」としても知られ、スルファニルアミドの誘導体であり、微生物において葉酸合成阻害剤として作用し、静菌性である。上記のように、本発明に含まれる小分子化合物は、ヒトへの使用について認可された。薬剤マフェナイドは、抗菌剤としての使用が認可され、推奨される用量は、最初の用量として約５００ｍｇ／ｋｇであり、その後、必要に応じて最高７日目まで、６時間ごとに約２５０ｍｇ／ｋｇである。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのマフェナイドのこの用量は、その他の障害の治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００６８】
ｂ）局所麻酔（Ｎａ＋チャネルブロッカー）
一実施態様において、ナトリウムチャネルブロッカーは、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集に関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために使用される。ナトリウムチャネルブロッカーは、リドカイン、ディクロニンＨＣｌ、メキシリチン（ｍｅｘｉｌｉｔｉｎｅ）、フェニトイン、ケタミン、フレカイニド、アマンタジンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩から選択されるが、これらに限定されない。
【００６９】
ディクロニン塩酸塩（ＤＹＣＬＯＮＥ（登録商標），  ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，  ＤＥ，  ＣＡＳ  Ｎｏ．  ５８６−６０−７）はきわめて重要である。ディクロニンＨＣｌは、適切な濃度で神経組織に局所的に適用されるとき、神経伝導を遮断する局所麻酔薬剤である。ディクロニンは、神経系の何れかの部分およびあらゆる種類の神経線維に作用する。神経幹に接触した場合、これらの麻酔薬は、神経支配された領域において感覚性および運動麻痺を引き起こしうる。それらの作用は完全に可逆性である（Ｆｒｏｍ  Ｇｉｌｍａｎ  ＡＧ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  ｅｄ）。ほとんど全ての局所麻酔薬は、電位依存性ナトリウムチャネルの活性化する傾向を低下させることで作用する。上記のように、本発明を含む小分子化合物は、ヒトへの使用について認可された。薬剤ディクロニンＨＣｌは局所麻酔としての使用が認可され、推奨される用量は２時間おきに約２−３ｍｇ／ｋｇである。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのディクロニンＨＣｌのこの用量は、その他の障害の治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【００７０】
本発明の別の実施態様において、ナトリウムチャネルブロッカーが、活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために使用される。ナトリウムチャネルブロッカーは、リドカイン、ディクロニンＨＣｌ、メキシリチン、フェニトイン、ケタミン、フレカイニド、およびアマンタジンか選択してよいが、これらに限定されず、ならびに一般に局所麻酔薬として使用される。神経幹と接触する場合、これらの麻酔薬は、神経支配された領域における感覚性および運動麻痺を引き起こしうる。それらの作用は完全に可逆性である（Ｆｒｏｍ  Ｇｉｌｍａｎ  ＡＧ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  ｅｄ）。
【００７１】
リドカインＨＣｌはきわめて重要である（Ａｌｐｈａｃａｉｎ  ＨＣｌ／ａｎｅｓｔａｃｏｎ／ｘｙｌｏｃａｉｎｅ，  Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ，  ＣＡＳ  Ｎｏ．  １３７−５８−６；  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５０）。リドカインは、適切な濃度で神経組織に局所的に適用されたときに神経伝導を遮断する局所麻酔薬剤である。リドカインは、神経系の何れかの部分およびあらゆる種類の神経線維に作用する。上記のように、本発明に含まれる小分子化合物は、ヒトへの使用について認可された。リドカインは、局所麻酔薬としての使用について認可され、推奨される用量は、約１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、より一般的には約５ｍｇ／ｋｇから約３５ｍｇ／ｋｇ、および最も一般的には約１０ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇである。活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するためのリドカインＨＣｌのこの用量は、その他の障害の治療するためのこれらの効果的および非毒性の用量に基づいて、必要に応じて適切に滴定することができる。
【表２】
2009516751.tif 000004
【００７２】
定量的構造活性相関（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（「ＱＳＡＲ」）法は、化合物の化学的構造とその生物活性との間の関係を定量するために使用してよい。それぞれの化合物のクラスは、化合物のクラスに関連がある１以上の構造に関連した１以上の活性を同定する構造活性相関（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（「ＳＡＲ」）および／またはＱＳＡＲ方法を用いて、広域スペクトルの有効性のために定量化または評価してよい。これらの化合物クラスのそれぞれは、合成可能性（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚａｂｉｌｉｔｙ）、柔軟性、特許性、活性、毒性および／または代謝といった因子に基づいて優先順位をつけられる。この場合、それぞれの特定の化合物のクラスの中の、全ての、または付加的なセットの化合物をアッセイおよび分析してよい。幾つかの化合物クラスは非常に大きい可能性があるため、そのクラスの化合物の部分集合をアッセイおよび分析してよく、クラスが予め決定したレベルを超える有効性を示し続ける場合、残りのメンバーがアッセイされるだろう。このアプローチはまた、本発明の使用のための、化合物の機能的類似体および化合物のクラスを同定するだろう。機能的類似体の活性は、Ｃ．エレガンスモデルを用いて、タンパク質の凝集をスクリーニングして確認してよい。
【００７３】
特別な重要性を有するとして上述した化合物に加えて、プレストウィックライブラリーに含まれるその他の関係する化学的化合物は、上記の化合物のクラス内で同定された。これらの化合物のクラスは表３に示される。
【表３】
2009516751.tif 000005
【００７４】
表３にリストされる化合物は、Ｃ．エレガンスによる第１次スクリーニングアッセイに供した。多くの化合物は、予備スクリーニング工程で有意な作用を有さないにも関わらず、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防することがわかった。このデータは例１に示される。その他のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイは、予備および第２のスクリーニングの結果を確認するために、これらの薬剤をスクリーニングする技術は公知である。予備スクリーニングにおけるネガティブな結果は、異なるアッセイを使用して有効となってもよい。タンパク質ミスフォールディングおよび凝集のその他のアッセイは、ダイナミック光散乱アッセイ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ２００４，  ｅＰｕｂ；  Ｋａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２００５，  ３５３：  ３５７−３７２）、沈降速度分析（ＭａｃＲａｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００４，  ２７７９：  ２１０３８−２１０４５）、および酵母凝集アッセイ（Ｏｕｔｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００３，  ３０２：  １７７２）を含むが、その他の分析が当該分野で公知であり、これらの目的のために使用してもよい。
【００７５】
同様に、特定された薬剤クラス内の関連する化学的化合物および機能的類似体またはＱＳＡＲを用いて同定されたこれらの化合物はまた、これらのタンパク質のミスフォールディング／凝集アッセイの何れかを用いてスクリーニングして、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集と関連した神経変性および神経細胞の喪失の予防における活性を決定してよい。ハイスループットスクリーニング技術は、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失の予防に効果のある一次Ｃ．エレガンススクリーニングで同定される薬剤の変種をスクリーニングするために使用してよい。コンピューターを利用したドラッグデザイン／コンピュータモデリング方法は、化学的変種を同定するために使用してよく、そのような化学的変種は、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集と関連した神経変性および神経細胞の喪失における作用についてスクリーニングされてよい。
【００７６】
コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造の可視化およびこの分子と相互作用するであろう新規の化合物の合理的な設計を可能とする。これらの方法は、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失において作用することがわかっている、小分子化合物の機能的類似体を見つける方法を提供する。標的タンパク質に結合する化合物の三次元構造の分析によって相互作用の部位が同定され、その後、同様の結合特性を有する同様の化合物および機能的類似体の同定に使用されるだろう。三次元構造物は、一般的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＩＶＩＲイメージングからデータに依存する。分子力学は、力場のデータを必要とする。コンピュータグラフィックシステムは、新規の化合物が分子を標的にどのように結びつけるかの予測を可能とし、結合特性を完全とするための化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能とする。小さな変化が生じた場合、分子−化合物相互作用はどのようなものかという予測は、分子機構ソフトウェアおよび演算力強化コンピューターの一方または両方によって行われ、それらは、通常、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーで、メニュー選択方式のインターフェースでつなげられる。
【００７７】
加えて、表３に挙げられる化合物の一部は、Ｃ．エレガンスにおける最初のスクリーニングに供した。多くの化合物は、予備スクリーニング工程で有意な作用を有さないにもかかわらず、活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防することがわかった。このデータは例２に示される。これらの薬剤をスクリーニングして予備および第２のスクリーニングの結果を確認するための、その他のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイは、当該分野において既知である。
【００７８】
同様に、特定された薬剤クラス内の関連する化学的化合物および機能的類似体またはＱＳＡＲを用いて同定されたこれらの化合物はまた、何れかの神経変性のアッセイを用いてスクリーニングして、活性酸素種と関連した神経変性および神経細胞の喪失の予防における活性を決定してよい。そのようなアッセイは当業者に既知であり、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを含み、細胞カルチャーアッセイおよび神経変性の遺伝子組換え動物モデルを含む。ハイスループットスクリーニング技術は、神経変性に効果のある一次Ｃ．エレガンススクリーニングで同定される薬剤の変種をスクリーニングするために使用してよい。コンピューターを利用したドラッグデザイン／コンピュータモデリング方法は、化学的変種を同定するために使用してよく、そのような化学的変種は、活性酸素種と関連した神経変性および神経細胞の喪失における作用でスクリーニングされてよい。
【００７９】
コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造の可視化およびこの分子と相互作用するであろう新規の化合物の合理的な設計を可能とする。これらの方法は、活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失において作用することがわかっている既知の小分子化合物の機能的類似体を見つける方法を提供する。標的タンパク質に結合する化合物の三次元構造の分析によって相互作用の部位が同定され、その後、同様の結合特性を有する同様の化合物および機能的類似体の同定に使用されるだろう。三次元構造物は、一般的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子力学は、力場のデータを必要とする。コンピュータグラフィックシステムは、新規の化合物が標的分子にどのように結びつくかの予測を可能とし、結合特性を完全とするための化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能とする。小さな変化が生じた場合、分子−化合物相互作用はどのようなものかという予測は、分子機構ソフトウェアおよび演算力強化コンピューターの一方または両方によって行われ、それらは、通常、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーで、メニュー選択方式のインターフェースでつなげられる。
【００８０】
分子モデルシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  Ｍａｓｓ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構成、グラフィックモデリングおよび分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互の分子の挙動の相互作用的な構成、改変、視覚化および分析を可能にする。
【００８１】
多くの論文は、特異的なタンパク質との薬剤相互作用のコンピュータモデリングを概説している（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｆｅｃｈｎｅｒ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，  ２００５  Ａｕｇ，  ４（８）：  ６４９−６６３；  Ｇｕｎｅｒ，  ＩＤｒｕｇｓ，  ２００５  Ｊｕｌ，  ８（７）：  ５６７−５７２；  ａｎｄ  Ｈａｎａｉ，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，  ２００５，  １２（５）：  ５０１−５２５）。化学薬品をスクリーニングし視覚的に示すその他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社（Ｐａｓａｄｅｎａ，  Ｃａｌｉｆ）およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）といった会社から利用できる。これらは主に、特定のタンパク質に特異的な薬剤への適用のために設計されるにもかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な薬剤の設計に、一旦その領域が同定されると、適用することができる。結合を変化させることができた化合物の設計および生成に関して上述したにも関わらず、天然物または合成化学薬品、およびタンパク質を含む生物活性物質を含む既知の化合物のライブラリーから、阻害剤または活性剤である化合物をスクリーニングすることができる。このアプローチを使用して同定される化合物の活性は、Ｃ．エレガンスモデルを使用してタンパク質凝集または神経保護のスクリーニングを行って確認してよい。
【００８２】
本発明の別の側面において、小分子化合物は、活性酸素種と関係する神経変性および神経細胞の喪失を予防するために、トルシン依存的な機構によって作用する。活性酸素種と関係する損傷から神経細胞を保護するためにトルシンタンパク質の作用を調整することに作用する小分子化合物は、本願にて記述される方法を用いて同定してよい。化合物は、直接的または間接的な相互作用を通してトルシンタンパク質の作用を調整してもよい。間接的な作用は、トルシンタンパク質に下流の作用（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｏｎｓ）を有する別の酵素または化学中間体を調整することを含んでもよい。一実施態様において、トルシンタンパク質の作用を調整する化合物は、メタンピシリンまたはその他の細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤を含む。
【００８３】
本発明のある実施態様において、組成物は少なくとも１つの活性酸素種スカベンジャーを更に含んでもよい。適切な活性酸素種スカベンジャーは、補酵素Ｑ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ピルビン酸塩、メラトニン、ナイアシンアミド、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン（「ＧＳＨ」）およびニトロンを含む。ある実施態様において、少なくとも１つの活性酸素種スカベンジャーは、小分子化合物の予防投与と共に、予防的に投与される。
【００８４】
本方法に有用な化合物、またはその医薬的に許容可能な塩は、投与の多種多様な経路または様式を用いて患者に送達できる。投与の適切な経路は、吸入、経皮投与、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸管投与、および非経口投与（筋肉内注射、皮下注射、および静脈内注射を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
「医薬的に許容可能な塩」という用語は、本方法で使用される化合物の生物学的効果および特性を保持する塩であって、生物学的にまたはその他の点で望ましくないわけではないそれらの塩を意味する。そのような塩は、無機および有機塩基から調製してよい。無機塩基に由来する塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩を含む。有機塩基に由来する塩は、１級、２級、および３級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、および環状アミンの塩を含むが、これらに限定されず、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジンおよびＮ−エチルピペリジンを含むが、これらに限定されない。カルボキサミド、低級アルキルカルボキサミド、ジ（低級アルキル）カルボキサミドなどを含むカルボン酸アミドといった、その他のカルボン酸誘導体は、この方法の実行において有用であると理解されるべきである。
【００８６】
化合物、またはその医薬的に許容可能な塩は、単独で、その他の化合物との組み合わせで、および／またはその他の治療薬との組み合わせのカクテルで投与してよい。当然、本方法の化合物と同時投与できる治療薬の選択は、部分的に、治療される条件に依存する。
【００８７】
活性化合物（またはその医薬的に許容可能な塩）は、それ自体で投与してよく、または、活性化合物が混合されている若しくは１以上の医薬的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と混合されている医薬的組成物の形態で投与してよい。本発明による使用のための医薬組成物は、医薬的に使用可能な製剤への活性化合物の加工を促進する１以上の生理的に許容可能な担体（賦形剤および添加剤を含む）を用いて、従来の様式で処方してよい。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【００８８】
注射のために、化合物は、水溶液、好ましくは生理的に適合性の緩衝液（例えばハンクス溶液、リンガー溶液または生理食塩水緩衝液）中で、処方してよい。経粘膜投与のために、浸透させる障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、通常、当該分野で既知である。
【００８９】
経口投与のために、化合物は、活性化合物と、当該分野で周知の医薬的に許容可能な担体とを組み合わせることによって、容易に処方できる。そのような担体は、治療される患者による経口摂取のために、本方法の化合物を、錠剤、ピル、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに処方することを可能とする。経口使用のための医薬製剤は、任意に、適切な添加剤を添加した後に、生成される混合物を挽き、顆粒の混合物を加工し、必要な場合錠剤または糖衣丸コアを得て、固体賦形剤として得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖のような充填材；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル〜セルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）を含むセルロース製剤である。必要に応じて、架橋結合ＰＶＰ、寒天、アルギン酸またはそれらの塩（例えばアルギン酸ナトリウム）のような、崩壊剤を添加してよい。
【００９０】
糖衣丸コアには、適切なコーティングを付与することができる。このために、濃縮糖溶液を使用してよく、それは任意にアラビアゴム、タルク、ＰＶＰ、カルボポールゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ  ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでよい。同定のため、または、活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣丸コーティングに染料または色素を添加してもよい。
【００９１】
経口投与のために、化合物は徐放性製剤として処方してよい。徐放性製剤を処方するための多数の技術は、以下の文献に記載されている：米国特許４，８９１，２２３；  ６，００４，５８２；  ５，３９７，５７４；  ５，４１９，９１７；  ５，４５８，００５；  ５，４５８，８８７；  ５，４５８，８８８；  ５，４７２，７０８；  ６，１０６，８６２；  ６，１０３，２６３；  ６，０９９，８６２；  ６，０９９，８５９；  ６，０９６，３４０；  ６，０７７，５４１；  ５，９１６，５９５；  ５，８３７，３７９；  ５，８３４，０２３；  ５，８８５，６１６；  ５，４５６，９２１；  ５，６０３，９５６；  ５，５１２，２９７；  ５，３９９，３６２；  ５，３９９，３５９；  ５，３９９，３５８；  ５，７２５，８８３；  ５，７７３，０２５；  ６，１１０，４９８；  ５，９５２，００４；  ５，９１２，０１３；  ５，８９７，８７６；  ５，８２４，６３８；  ５，４６４，６３３；  ５，４２２，１２３；および４，８３９，１７７；およびＷＯ  ９８／４７４９１。
【００９２】
経口的に使用可能な医薬製剤は、ゼラチンで出来ている押し込み型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、並びに、ゼラチンおよび可塑剤（例えばグリセリンまたはソルビトール）で出来ている、柔らかい、封着されたカプセル剤を含む。押し込み型カプセル剤は、ラクトースのような充填材、デンプンのような結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑油および任意に、安定剤との混合で、活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、適切な液体（例えば脂肪油、流動パラフィンまたは液体ＰＥＧ）に溶解または懸濁してよい。加えて、安定剤を添加してよい。経口投与のための全ての製剤は、そのような投与に適した用量でなければならない。
【００９３】
経頬投与のために、組成物は、従来の様式で処方される錠剤またはロゼンジの形態をしてもよい。
【００９４】
吸入による投与のために、活性化合物は、好都合に、適切な噴霧剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガス）を用いて、加圧パックまたはネブライザーからエアゾールスプレープレゼンテーションの形態で送達してよい。加圧エアゾールの場合、用量単位は、測定した量を送達するためのバルブを提供することで決定してよい。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または散布器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）の使用のためのゼラチンのような化合物のカプセル剤およびカートリッジは、化合物の散剤ミックスおよび適切な散剤ベース（例えばラクトースまたはデンプン）を含むように処方してよい。
【００９５】
化合物は、例えば、大量瞬時投与または持続注入法といった注射による非経口投与のために処方してよい。注射のための製剤は、防腐剤が添加されて、例えば、アンプルでまたはマルチ用量容器といった単位剤形で示されてもよい。組成物は、脂性または水性ベヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液といった形態をとってよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤といった処方用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含んでよい。
【００９６】
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な脂性の注射懸濁液として製造してよい。適切な親油性溶媒またはベヒクルは、脂肪油（例えば胡麻油）または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド）またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質（例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含んでもよい。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の製剤を可能とするために、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。
【００９７】
あるいは、活性化合物は、使用前に、適切な溶媒（例えば無菌パイロジェンフリー水）で構成するための散剤形態であってもよい。
【００９８】
化合物はまた、例えば、従来の座薬基剤（例えばカカオバターまたはその他のグリセリド）を含む化合物といった、坐剤または保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）といった直腸組成物に処方してよい。
【００９９】
前述の製剤に加えて、化合物はまた、デポ製剤として処方してよい。そのような長時間作用性の製剤は、移植または経皮的送達（例えば皮下にまたは筋肉内に）、筋肉内注射、または経皮パッチによって投与してよい。この為、例えば、化合物は、適切な重合体または疎水性物質（例えば、許容可能な油中の乳剤）またはイオン交換樹脂と共に、または、わずかに可溶性の塩といったわずかに可溶性の誘導体として処方してよい。
【０１００】
本発明の更なる実施態様はナノ粒子に関する。ここに記述される化合物はナノ粒子に取り込まれてもよい。本発明の範囲内のナノ粒子は、単一の分子レベルの粒子並びに顕微鏡的特性を示す粒子のそれらの集合体を含むよう意図される。前述のナノ粒子を使用および作製する方法は、当該分野において既知である（米国特許番号６，３９５，２５３；  ６，３８７，３２９；  ６，３８３，５００；  ６，３６１，９４４；  ６，３５０，５１５；  ６，３３３，０５１；  ６，３２３，９８９；  ６，３１６，０２９；  ６，３１２，７３１；  ６，３０６，６１０；  ６，２８８，０４０；  ６，２７２，２６２；  ６，２６８，２２２；  ６，２６５，５４６；  ６，２６２，１２９；  ６，２６２，０３２；  ６，２４８，７２４；  ６，２１７，９１２；  ６，２１７，９０１；  ６，２１７，８６４；  ６，２１４，５６０；  ６，１８７，５５９；  ６，１８０，４１５；  ６，１５９，４４５；  ６，１４９，８６８；  ６，１２１，００５；  ６，０８６，８８１；  ６，００７，８４５；  ６，００２，８１７；  ５，９８５，３５３；  ５，９８１，４６７；  ５，９６２，５６６；  ５，９２５，５６４；  ５，９０４，９３６；  ５，８５６，４３５；  ５，７９２，７５１；  ５，７８９，３７５；  ５，７７０，５８０；  ５，７５６，２６４；  ５，７０５，５８５；５，７０２，７２７；および５，６８６，１１３）。
【０１０１】
医薬組成物はまた、適切な固体またはゲル担体または賦形剤を含んでよい。そのような担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびＰＥＧといったポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
本方法に適した医薬組成物は、前述のように活性成分が治療的にまたは予防的に有効量で含まれ、例えば、治療的または予防的利益を達成するための有効量で含まれる組成物を含む。もちろん、特定の適用のための実際の有効量は、とりわけ、治療する症状および投与経路に依存する。有効量の測定は、特に本願の開示を考慮して、当業者の能力の範囲内で、適切に行われる。
【０１０３】
ヒトへの使用のための治療的有効量は、動物モデルから決定できる。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であることがわかった循環血中濃度を達成するよう処方できる。痛みの有用な動物モデルは当該分野において周知である。
【０１０４】
当業者は、過度の実験を行うことなく、投薬戦略−用量レベルおよび用量頻度の組合せ−を考案することができ、それは、各投薬期間において特定の期間望ましい濃度範囲での小分子化合物の血漿レベルの実質的に連続的な維持、それによる望ましい神経保護の最大化をもたらすだろう。連続的な曝露は、移植もしくは非経口的ポリマーまたは徐放性もしくはパルス放出性（ｐｕｌｓｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）経口製剤を含む徐放薬物送達システムの使用によって達成できる。血漿曝露を閾値レベルを越えるように維持することはまた、薬剤／製剤の組み合わせを用量レベルおよび投薬計画に対応させることによって達成することができることが当業者に周知である。これらの方法は、当該分野において、「ドージング・アップ（ｄｏｓｉｎｇ  ｕｐ）」または「ドージング・トゥ・ステディ・ステイト（ｄｏｓｉｎｇ  ｔｏ  ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ）」を含む様々な名称で知られる。例えば、血漿中の薬剤濃度の短い半減期をもたらす経口製剤は、血漿レベルを望ましい閾値より上に維持するために、より高いレベルで投与でき、またはより頻繁に投与できる−そのような投与および投与計画は、公表された式または計算または当業者に公知の商業的に入手可能なソフトウェアプログラムをもちいて、製剤の薬物動態学的プロファイルの数学的モデリングに基づいて選択される。その他の例として、高いレベルの延長した曝露をもたらす製剤は、より頻度の少ない計画にて投与することができ、そのような投与および投与計画は、公表された式または計算または当業者に公知の商業的に入手可能なソフトウェアプログラムをもちいて、製剤の薬物動態学的プロファイルの数学的モデリングに基づいて選択される。その他の例として、低いレベルで延長した曝露をもたらす製剤は、決定した範囲内に血漿レベルがあると示されるまで、またはその範囲内にあると予測されるまで、より頻繁な投与計画を使用して「ドージング・アップ」することができ、そのような投与および投与計画は、公表された式または計算または当業者に公知の商業的に入手可能なソフトウェアプログラムをもちいて、製剤の薬物動態学的プロファイルの数学的モデリングに基づいて選択される。
【０１０５】
本発明の組成物は、ＣＮＳ傷害または神経変性の疾病の発病の危険がある個人に、予防的に投与してよい。別の実施態様において、本発明の組成物は、個人がまだ無症候状態である場合には、神経変性の障害の遺伝的スクリーニングの陽性の試験結果の後、さもなければ神経変性の疾病の臨床症状が現れ始める場合には、疾病の発症のときに、個人に投与してよい。本方法の組成物は、個人がＣＮＳ傷害の危険がある、または神経変性の疾病を発病する危険がある期間の間、投与してよい。ここに記述される方法のいずれかにおいて、とりわけ記述される組成物は、神経変性を予防するための有効量で投与されてもよい。
【０１０６】
別の実施態様において、本発明の組成物は、傷害または虚血性の発作−例えば活性酸素種の形成−に二次的な因子が、第２の神経細胞の損傷をもたらす可能性のある、外傷性の脳損傷または虚血性の発作（例えば脳卒中）を患った直後に、個人に投与してよい。化合物は、傷害または虚血性の発作の後の少なくとも約３、９、１８、または２４時間、または傷害または虚血性の発作の後の少なくとも約３、５、７、１２、または１５日間投与してよい。少なくとも１ヵ月続く投与のより長い期間はまた、傷害の程度に従って使用してよい。
【０１０７】
本発明の方法のいずれかにおいて、ここに記述される組成物は、神経変性および神経細胞の喪失の治療または予防のために、有効量で投与してよい。化合物はまた、ＣＮＳ傷害または虚血性の発作による第２の損傷が原因の神経変性および神経細胞の喪失の治療または予防のために、有効量で投与してよい。化合物は、ＣＮＳ傷害または神経変性の疾病の症状の改善または軽減に十分な期間、投与してよい。様々な神経細胞のサブタイプは、ここに記述される小分子化合物によって保護されてよい。そのような神経細胞のサブタイプは、アドレナリン作動性の、ノルアドレナリン作動性の、セロトニン作動性の、ドーパミン作動性の、コリン作動性の、ＧＡＢＡ作動性の、グリシン作動性、グルタミン酸作動性の、および、ヒスタミン作動性の神経細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
別の実施態様において、ここに記述される化合物は、分子シャペロンタンパク質（例えば、タンパク質のトルシンファミリー内のタンパク質）の活性を調整するために投与されてもよい。これらの方法には、分子シャペロン活性が損なわれまたは悪化する障害に特に関係を有する。トルシンＡタンパク質の突然変異が、分子シャペロン活性を損ない、ジストニアが関係する神経細胞の機能障害の部分的原因となる、早発性のトルシンジストニアを治療するための化合物の投与は、きわめて重要である。
【０１０９】
化合物はまた、神経伝達物質輸送体の活性を調整するために投与されてもよい。そのような輸送体は、ドーパミン輸送体（「ＤＡＴ」）、セロトニン輸送体、ＧＡＢＡ輸送体、ノルアドレナリン輸送体、小胞アセチルコリン輸送体などを含んでよいが、これらに限定されない。トルシンタンパク質および神経伝達物質輸送体の調整は、損傷または死の危険にある神経細胞に神経保護を提供するために用いてよい。
【０１１０】
別の側面において、小分子化合物は、タンパク質ミスフォールディングまたは凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失の治療または予防のために、トルシン依存的機構を通して作用する。タンパク質ミスフォールディングまたは凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失の治療または予防のためにトルシンタンパク質の作用を調整して作用する小分子化合物は、ここに記述される方法を用いて同定してよい。化合物は、直接的または間接的な相互作用を通してトルシンタンパク質の作用を調整してよい。間接的作用は、トルシンタンパク質において下流の作用をするその他の酵素または化学的中間体の調整を含んでよい。一実施態様において、トルシンタンパク質の作用を調整する化合物は、メタンピシリンまたはその他の細菌性トランスペプチダーゼ阻害剤を含む。別の実施態様において、トルシンタンパク質の作用を調整する化合物は、ナリジクス酸またはオキソリン酸またはその他のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤を含む。さらに別の実施態様において、化合物は、タンパク質ミスフォールディングまたは凝集と関係する神経変性および神経細胞の喪失を治療するまたは予防するために、変異体トルシンタンパク質を調整する。この特定の実施態様において、化合物は、カルシウムチャネル拮抗剤（例えばロペラミドＨＣｌ）またはシクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばメクロフェナム酸ナトリウム塩一水和物）を含む。
【０１１１】
以下の例は、同時に如何なる限定をも構成することなく、本発明を更に例証するのに役立つだろう。手段は、その様々な実施態様、改変および等価物を有してよく、本願の説明を読んだ後に、発明の意図から逸脱することなく、それら自身を当業者に示唆してもよいことが明確に理解される。
【実施例】
【０１１２】
[例１]
タンパク質ミスフォールディングおよび凝集のＣ．エレガンスモデルを用いた小分子ライブラリーのスクリーニング
ブレンナーによって記述されるように、Ｃ．エレガンス  ネマトーダはＮＧＭプレート上にて２０℃で育てた（Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９７４，  ７７：  ７１−９４）。いくつかの遺伝子組換えＣ．エレガンス株を、プレストウィック小分子ライブラリーの一次スクリーニグのために使用した。遺伝子組換えウォーム株は、野生型（ｗｔ）（Ｐｕｎｃ−５４：：トルシンＡ）または変異体（Ｐｕｎｃ−５４：：トルシンＡ（ΔＥ））とともに、Ｐｕｎｃ−５４：：Ｑ８２−ＧＦＰを発現する。トルシンＡは、蛍光顕微鏡下で可視可能なタンパク質凝集を起こす表現型を発現する。遺伝子組換えウォームは薬剤プレート上にプレーティングし、子孫を可溶性タンパク質への復帰についての研究に供した。
【０１１３】
可溶化した薬剤とウォームを成育する寒天培地とを混合することによって、標準的方法を用いて薬剤をＣ．エレガンスに投与した（Ｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９５，  ４８：  １８７−２０４）。投与のこの様式は、薬剤に対するウォームの連続的な曝露を可能とする。
【０１１４】
各々の薬剤を、最初に適切な溶媒に溶解し、その後、予め考慮した薬剤溶液の量で、プレオートクレーブされた培地に薬剤溶液を添加した。全ての薬剤は０．５ｍｇ／ｍｌの初濃度で試験し、その内の少数がウォームに対して有毒であり、そのためそれらは０．１ｍｇ／ｍｌまたは０．０２５ｍｇ／ｍｌの濃度で試験を行った。各々のプレートに、１００μｌの濃縮したＥ．  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０細菌を播種した。
【０１１５】
化合物を同定するのに用いられるスクリーニング分析は、分子作用の特異性を決定するためにタンパク質凝集の情報（ｒｅａｄｏｕｔ）を使用する。スクリーニングは、ポリグルタミン伸長を使用して、動物モデルシステムＣ．エレガンスにおける細胞のアッセイを利用した。さらに、トルシンＡは３つの異なる方法で一部のアッセイに含めた：野生型トルシンＡの存在、変異体トルシンＡの存在または野生型および変異体トルシンＡの存在（全ての場合においてポリグルタミン伸長を伴う）。ウォームは、タンパク質凝集において統計学的に有意に減少するものをスクリーニングした。陽性結果を示した化合物は、再スクリーニングを行い、アッセイの結果に基づいて識別した。
【０１１６】
凝集分析アッセイの方法は、Ｃａｌｄｗｅｌｌらが記述している（Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００３，  １２（３）：  ３０７−３１９）。簡単に示すと、ウォームは、Ｅｎｄｏｗ  ＧＦＰ  ＨＹＱおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ＨＹＱフィルターキューブ（Ｃｈｒｏｍａ社）を備えたニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００エピフロレッセンス顕微鏡を使用して調べた。画像は、Ｓｐｏｔ  ＲＩ  ＣＣＤカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で取り込んだ。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）を、画像の仮着色（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ）、画像のオーバレイおよび凝集サイズの定量化のために使用した。分析した各々のウォーム株について、ｌ０００ｘの拡大率で、３０のＬ３段階動物（Ｑ８２：：ＧＦＰ集合体のため）の後方領域（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ）にて全ての凝集の画像を取り込むことによって、または３０の成体動物／日（Ｑ１９：：ＧＦＰ分析のために）の全ての凝集の画像を取り込むことによって、平均凝集サイズを決定した。ピクセル領域は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアシステムにてμｍに変換し、更なる分析のためにＥｘｃｅｌスプレッドシートに直接ダウンロードした。凝集サイズの統計分析は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ（ＳＰＰＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＡＮＯＶＡによって行った。
【０１１７】
タンパク質ミスフォールディングおよび凝集の抑制に対する候補化合物の効果を見るため、５つの産卵期の成体ウォームを、各々の薬剤プレート上に移し、約３日間２０℃で成育した。Ｌ３段階および若年成体段階の３０のＦｌウォームについて凝集数を数えた。
【０１１８】
タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に対する候補薬剤化合物の予防的効果を見るため、５つの産卵期の成体ウォームを、各々の薬剤プレート上に移し、約３日間２０℃で成育した。Ｌ２段階の３５−４０のＦｌウォームを選択し、薬剤プレートと比較して同じ濃度の対照溶媒を含む対照プレートに移した。３０のＬ３段階のウォームは、８時間後、凝集数を数えた。３０の若年成体は、３２時間後に分析した。
【０１１９】
タンパク質凝集における標準化された減少に基づくウォームに対する薬剤の特別な療法のスケール調整した有効性（ｓｃａｌｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）を算出するため、以下の式を使用した：
（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）ｘ１００％、ここにおいて
Ａ＝溶媒対照プレート上で生育するウォームの凝集数
Ｂ＝ウォームの全生涯の間の特定薬剤プレート上で生育するウォームの凝集数
Ｃ＝プレＬ２曝露を受け、その後溶媒対照プレートに移されたウォームの凝集数。
【０１２０】
療法に効果がない場合、値は０％に等しいと予想される。反対に、療法が、全生涯において薬剤上でウォームを生育させた場合と同様に有効であった場合、値は１００％に等しいと予想される。
【０１２１】
タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に対する候補薬剤化合物の補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ）効果を見るため、５つの産卵期の成体ウォームを、溶媒対照プレートに移し、約３日間２０℃で生育した。３５−４０のＬ２段階のＦｌウォームを選択し、薬剤プレートに移した。８時間後、３０のＬ３段階のウォームにて凝集数を数えた。３０の若年成体は、３２時間後に分析した。
【０１２２】
タンパク質凝集における標準化された減少に基づくウォームに対する薬剤の特別な療法のスケール調整した有効性を算出するため、以下の式を使用した：
（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）ｘ１００％、ここにおいて
Ａ＝溶媒対照プレート上で生育するウォームの凝集数
Ｂ＝ウォームの全生涯の間の特定薬剤プレート上で生育するウォームの凝集数
Ｃ＝Ｌ２段階から（成体期まで）曝露を受けたウォームの凝集数。
【０１２３】
療法に効果がない場合、値は０％に等しいと予想される。反対に、療法が、全生涯において薬剤上でウォームを生育させた場合と同様に有効であった場合、値は１００％に等しいと予想される。
【０１２４】
結果
ライブラリーの一次スクリーニングから、Ｐｕｎｃ−５４：：Ｑ８２：：ＧＦＰ＋Ｐｕｎｃ−５４：：トルシンＡ＋Ｐｕｎｃ５４：：トルシンＡ（ΔＥ）を含むウォームにおけるタンパク質凝集を再現的に減少させる７つの分子が同定された。
【０１２５】
小分子化合物が作用する機構を説明するために、一次スクリーニングで同定された全ての薬剤を、何れのトルシンＡも発現しない導入遺伝子Ｐｕｎｃ．５４：：Ｑ８２：：ＧＦＰを含む遺伝子組換えウォームを処理するために使用した。一次スクリーニングで同定された７つの化合物の内２つの薬剤、マフェナイドおよびディクロニン塩酸塩が、タンパク質凝集の存在を減少させた。このことは、これらの２つの薬剤が、おそらくポリグルタミンタンパク質に直接作用するトルシン依存的機構を介してタンパク質ミスフォールディングおよび凝集を予防することを意味する。
【０１２６】
単独で直接ポリグルタミンに作用しなかった残りの５つの一次候補薬剤は、ｗｔトルシンＡと共に導入遺伝Ｐｕｎｃ．５４：：Ｑ８２：：ＧＦＰ＋Ｐｕｎｃ５４：：トルシンＡを発現するウォームの存在下、プレーティングした。一次スクリーニングから同定された薬剤のうちの３つ、ナリジクス酸、オキソリン酸およびメタンピシリンナトリウム塩は、野生型トルシンＡを介してタンパク質凝集を減少させた。
【０１２７】
単独で直接ポリグルタミンに作用しなかった同じ５つの一次候補薬剤はまた、変異型トルシンＡとともに導入遺伝子Ｐｕｎｃ５４：：Ｑ８２：：ＧＦＰ＋Ｐｕｎｃ５４：：トルシンＡ（ΔＥ）のみを発現するウォームの存在下プレーティングした。２つの薬剤、塩酸ロペラミドおよびメクロフェナム酸ナトリウム塩は、変異体トルシンＡタンパク質に作用することによって、凝集を減少させた。これらのデータは、図１にまとめて示される。
【０１２８】
トルシン依存的機構によって作用する５つの分子と類似的な構造および作用機序を持つ分子を、タンパク質凝集の抑制ついて再分析した。これらの分子は、潜在的薬物療法学の初回の分析の第１回をパスしなかった。これらは、上記表２に示される。
【０１２９】
全ての分子は、プレストウィックライブラリー番号によって符号化される。Ｃ．エレガンス凝集モデルの関連薬剤のスクリーニングは、タンパク質凝集形成に対する可変性の作用をもたらした。これらのデータは図２に示される。試験した化合物の一部がこのモデルでタンパク質ミスフォールディングに有意な作用を示さないものの、その他のタンパク質ミスフォールディング/凝集アッセイで、タンパク質凝集の形成への作用が示される可能性がある。候補薬剤によって陽性反応を示す実験を複数回繰り返し、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集に対する効果を確認した。
【０１３０】
抑制アッセイの結果は、全ての５つのトルシン−特異的薬剤（ナリジクス酸、オキソリン酸、メタンピシリンナトリウム塩、ロペラミド（Ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）ＨＣＩ、メクロフェナム酸ナトリウム塩）が、ウォームが孵化からＬ２段階まで薬剤化合物に曝露された場合に、有用であることを示している。特に、ウォームの齢がより長くなるほど（暴露の不足にもかかわらず）、薬剤の効果は強くなった（グラフの中実バー）。これらの結果は図３に示す。
【０１３１】
補正アッセイの結果は、３つのトルシン−特異的薬剤（オキソリン酸、メタンピシリンナトリウム塩およびロペラミドＨＣｌ）は、薬剤化合物が発育後期まで供給されない場合に、有用であることを示している。これらの結果を図４に示す。
【０１３２】
これらの結果は、候補薬剤化合物のライブラリーは、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集の予防または補正に対する効果を、このＣ．エレガンスモデルでスクリーニングしてよいことを実証する。これらの薬剤のより幅広いクラスはまた、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集の予防または補正に効果があるその他の薬剤化合物を同定するために、このモデルを使用してスクリーニングしてもよい。
【０１３３】
[例２]
プレストウィック小分子ライブラリーから同定された化合物による、Ｃ．エレガンスのドーパミン作動性神経細胞の神経保護
以前の研究において、Ｃ．エレガンスの「ＣＥＰ」および「ＡＤＥ」機械感覚性神経細胞は、ドーパミン選択的神経毒６−ＯＨＤＡでの処理の後、容易に識別可能な神経細胞の変性を起こすことが確立された（Ｎａｓｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）。６−ＯＨＤＡの毒性は、非酵素的な自己酸化工程を経た過酸化水素および水酸化物遊離基の生成によって、活性酸素種の形成を通して仲介される（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｆｏｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｅｄｅｒｅｒ，  ２０００）。６−ＯＨＤＡへの曝露の後、Ｃ．エレガンスドーパミン神経細胞は、アポトーシス性細胞死の特徴的な用量依存パターンを示し、それは超微細構造分析によって確認された（Ｎａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。この変性は、生きた動物において、緑色蛍光タンパク質とともに共発現させ、３つの時間的および形態学的に異なる段階（神経突起小疱形成（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、突起喪失による細胞体球状化（ｃｅｌｌ  ｂｏｄｙ  ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｌｏｓｓ）、および細胞体喪失（ｃｅｌｌ  ｂｏｄｙ  ｌｏｓｓ）を含む）に分類することで、モニターできる。これらの特徴的な変化は２、３時間以内のオーダーで再現的に生じ、ＭＰＴＰ処理したサルおよび６−ＯＨＤＡ処理したラットの観察で再現され、線条体末端に対する損傷は逆行的な変化をもたらし、ＳＮｐｃ細胞体のそれに先行する（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｈｅｒｋｅｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。近年、６−ＯＨＤＡに媒介される神経変性におけるトルシンタンパク質の作用が示された（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２５（１）：  ３８０１−３８１２）。動物は様々な濃度の６−ＯＨＤＡで処理され、ウォームが成長および加齢するにつれて、神経変性は、時間とともに、これらの透明な動物におけるドーパミンＧＦＰマーカーの共発現を伴った。
【０１３４】
ブレンナーによって記述されるように、Ｃ．エレガンス  ネマトーダはＮＧＭプレート上にて２５℃で育てた（Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９７４，  ７７：  ７１−９４）。２つの遺伝子組換えＣ．エレガンス株を、プレストウィック小分子ライブラリーの一次スクリーニングに使用した。Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ（野生型（Ｐｄａｔ−ｌ：：トルシンＡ）または変異体（Ｐｄａｔ−１：：：トルシンＡ（ΔＡ））の両方とともに）を発現する遺伝子組換えウォーム株を使用した。トルシンＡは、６−ＯＨＤＡでの処理後、可視性の神経変性となる表現型を示す。遺伝子組換えウォームを薬剤プレートにプレーティングし、子孫において、Ｃ．エレガンスに存在する８つのドーパミン作動性神経細胞の形態学的な変化を研究した。
【０１３５】
薬剤は、可溶化した薬剤とウォームを生育する寒天培地とを混合することによって、標準的方法によりＣ．エレガンスに投与した（Ｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９５，  ４８：  １８７−２０４）  。投与のこの様式は、ウォームの薬剤への連続的な曝露を可能にする。
【０１３６】
各々の薬剤をまず適切な溶媒に溶解し、その後、予め薬剤溶液の量を考慮して、プレオートクレーブされた培地に薬剤を添加した。全ての薬剤は、０．５ｍｇ／ｍｌの初濃度で試験し、そのうちの少数がウォームに毒性を示したため、０．１ｍｇ／ｍｌまたは０．０２５ｍｇ／ｍｌの濃度で試験した。各々のプレートは、１００μｌの濃縮されたＥ．  ｃｏｌｉ  ＯＰ５０細菌を播種した。
【０１３７】
２％次亜塩素酸ナトリウムおよび０．５Ｍ  ＮａＯＨで産卵期の成体を処理して胚を単離することによって、年齢を同期化したウォームを得た（Ｌｅｗｉｓ  Ｆｌｅｍｉｎｇ，  １９９５）。これらの胚を２５℃で３０時間生育した。Ｌ３段階において、幼虫を、１０分おきに穏やかに撹拌して、１時間、１０ｍＭ（５０ｍＭ）６−ＯＨＤＡおよび２ｍＭ（または１０ｍＭ）アスコルビン酸でインキュベートした（Ｎａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。その後、ウォームを洗浄し、細菌（ＯＰ５０）を接種したＮＧＭプレート上に広げ、６−ＯＨＤＡ曝露後の２時間から７２時間までの時点でスコアをつけた。
【０１３８】
６−ＯＨＤＡ処理の直後、導入遺伝子を含むウォームを、ＧＦＰの存在に基づいて蛍光実体顕微鏡の下で選択し、ＯＰ５０を播種した新鮮なＮＧＭプレートに移した。それぞれの時点のために、３０−４０のウォームを２％アガロースパッドに適用し、３ｍＭレバミゾールで固定化した。ウォームは、Ｅｎｄｏｗ  ＧＦＰフィルターキューブ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ，  ＶＴ）を備えたニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００エピフロレッセンス顕微鏡の下で調べた。分析の簡略化のため、ウォーム頭部の４つのＣＥＰ  ＤＡ神経細胞だけスコア評価した。全ての４つのＣＥＰ神経細胞が存在し、それらの神経細胞の突起が完全な状態である場合、ウォームを「野生型」と評価した；以下に記載の通りに細胞体の４つの神経突起のうち少なくとも１つに欠損がある場合、ウォームを、「樹状突起小疱形成」、「細胞体球状化」または「細胞体喪失」と評価した。これらの実験は３回繰り返し、画像はＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）によって駆動されるＣｏｏｌ  Ｓｎａｐ  ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）で取り込んだ。
【０１３９】
結果
変異体および野生型トルシンの両方を発現しているウォームは、〜５０％の欠損ドーパミン神経細胞を有している。ライブラリーの１次スクリーニングは、６−ＯＨＤＡ曝露の後にＰｄａｔ−ｌ：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡ＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡ（ΔＥ）を含むウォームにおいてドーパミン作動性神経変性を再現的に減少させる３分子を同定した（図５ａ）。
【０１４０】
小分子化合物が行う機構を解明するために、一次スクリーニングで同定された全ての薬剤を、何れのトルシンＡも発現せず導入遺伝子Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰを含む遺伝子組換えウォームとともにプレーティングした。一次スクリーニングで同定された３つの化合物の内２つの薬剤、リドカインＨＣｌ（５０）およびメクロフェナム酸ナトリウム塩一水和物（２０６）が、６−ＯＨＤＡに仲介される神経変性を減少させた（図５ｂ）。これは、リドカインＨＣｌおよびメクロフェナム酸ナトリウム塩一水和物は、トルシン非依存的な機構によって神経変性を予防することを示唆している。
【０１４１】
メタンピシリンナトリウム塩（２３５）の作用機序を調べるため、Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡ（ｗｔトルシンＡをコード化する）またはＰｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡ（ΔＥ）（変異体トルシンＡをコード化する）を発現する２の遺伝子組換えウォーム菌株を、６−ＯＨＤＡの侵襲の前にメタンピシリンナトリウム塩で処理した。メタンピシリンナトリウム塩による神経保護は、ｗｔトルシンＡを発現するＰｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡウォームにて付与されるのみであった（図５ｃおよび５ｄ）。これらの結果は、メタンピシリンナトリウム塩は、ＤＡ神経細胞を保護する際にトルシンを通して作用することを示す。
【０１４２】
まとめると、これらのデータは、候補薬剤化合物のライブラリーは、活性酸素種と関係する神経変性の予防に対する効果について、このＣ．エレガンスモデルでスクリーニングしてもよいことを示している。また、これらの薬剤のより幅広いクラスをこのモデルを用いてスクリーニングされ、活性酸素種と関連する神経変性および神経細胞の喪失の予防に効果があるその他の薬剤化合物が同定される。
【０１４３】
[例３]
チロシン水酸化酵素を過剰発現する遺伝子組換えＣ．エレガンスを用いた、神経変性のモデルにおける神経の保護
ｃａｔ−２（チロシン水酸化酵素のウォーム相同体）の過剰発現は、野生型と比較して７５％の遺伝子組換えウォームにおいて、神経細胞内のドーパミン生産の増大およびドーパミン作動性神経細胞の特徴的な喪失がもたらされる（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２５（１）：  ３８０１−３８１２）。ウォームまたはヒトトルシンタンパク質の共発現は、神経細胞の変性がなお現れるにも関わらず、ドーパミン作動性神経細胞の喪失をわずかな程度減少させる。これらの実験の目的は、神経変性の別の異なるＣ．エレガンスモデルにて、プレストウィックライブラリーで小分子化合物の効果を決定することであった。
【０１４４】
ウォームは、上述のものと同じ方法を用いて培養した。Ｐｄａｔ−ｌ：：ＣＡＴ−２を発現する遺伝子組換えウォーム株は、完全な株の全ての発育段階において可視性の神経変性を生じるという表現型を示し、７日齢動物のわずか約５５％が４つ全てのＣＥＰ神経細胞を維持している。神経保護のこのモデルを使用するスクリーニング実験は、２つの化合物が、特に、ｃａｔ−２を過剰発現するドーパミン作動性神経細胞に対して神経保護の作用を有することを示した。化合物１６６（マフェナイド）および２０６（メクロフェナム酸ナトリウム塩）は共に、遺伝子組換えウォームのドーパミン作動性神経変性の標準化された減少における低下を示した（図６）。これらの結果はまた、神経変性の１モデルにてほとんど神経保護を示さない化合物が、おそらく作用の異なる機構により作用して、神経変性のための異なるモデルにて、なお陽性結果をもたらす可能性があるということを示している。化合物１６６はそのような化合物の例である。
【０１４５】
[例４]
神経変性のためのＣ．エレガンスモデルにおける化合物２３５に関する分子のスクリーニング
一次スクリーニングで同定された化合物に類似した構造および作用機構を有する、プレストウィックライブラリー中の分子は、神経変性のための様々なモデルにおける神経保護作用のために再分析してよい。これらの分子は上記表３に挙げられる。
【０１４６】
全ての分子は、プレストウィックライブラリー番号によって符号化される。メタンピシリンナトリウム塩（化合物２３５）に関連した化合物はきわめて重要である。メタンピシリンは、トルシンＡタンパク質の作用を調整することにより、部分的に神経保護である（図５ａ−５ｄ）。神経細胞の喪失がジストニアで認められない一方で、トルシン依存機構が関係しており、それゆえ、トルシン活性を調整する化合物は、欠損のある変異体トルシンＡの発現が障害と関連する神経細胞の機能障害の原因となると考えられているジストニアの治療に関連する。化合物のスクリーニングは、可変性の神経保護の作用に帰着するＣ．エレガンス神経保護モデルにおけるメタンピシリンに関係した。これらのデータは図７に示される。試験した一部の化合物は、このモデルにおいて神経保護に有意な作用を示さないものの、その他の神経保護アッセイにより、神経細胞の死および変性の予防に作用することが実証される可能性がある。特に、セファドロキシルおよびカルベニシリン２ナトリウム塩（化合物４３４および７０３）は、化合物２３５と同程度の神経保護作用を示した。化合物クロキサシリンナトリウム塩およびアモキシシリン（化合物１８６および３５７）もまた、より小さな程度はあるが、このモデルにおいて神経保護作用を示した。候補薬剤によって陽性の反応を示した実験は、複数回繰り返し、神経保護作用を確認した。このモデルで陽性反応を示した化合物は、前述した（Ｐｄａｔ−１：：  ＧＦＰ  ＋  Ｐｄａｔ−１：：  トルシンＡ）  および（Ｐｄａｔ−１：：  ＧＦＰ  ＋  Ｐｄａｔ−１：：  トルシンＡ  （ΔＥ  ））モデルにて容易に再スクリーニングされ、トルシン依存的機構を介した作用かどうかが確認される。
【０１４７】
これらの結果は、候補薬剤化合物のライブラリーが、神経保護作用について、このＣ．エレガンスモデルにてスクリーニングしてよいことを実証する。表３に挙げられるその他のクラスといった、薬剤の幅広いクラスもまた、このモデルを用いてスクリーニングを行い、神経保護作用を有するその他の薬剤化合物を同定してよい。
【０１４８】
[例５]
α−シヌクレイン毒性アッセイにおけるトルシンＡ依存性の再確認
我々は以前に、トルシンＡは、Ｃ．エレガンスのＤＡ神経細胞におけるα−シヌクレインの過剰発現に起因するドーパミン（「ＤＡ」）神経細胞変性を予防できる一方で、トルシンＡ（「ΔＥ」）は神経保護が低下したことを示した（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。明確には、Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：α−シヌクレインを発現するウォームの２６．１±５．３％のみが、４齢成体としての４つ全ての野生型ＣＥＰ  ＤＡ神経細胞を維持する一方で、Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：α−シヌクレイン＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡおよびＰｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：α−シヌクレイン＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡ（ΔＥ）を発現しているウォームのパーセンテージは、それぞれ、５７．３±１．６％および４２．２±７．３％である（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）（図８）。
【０１４９】
全ての分子はプレストウィックライブラリー番号によって符号化される。凝集アッセイにより同定されるトルシンＡ依存性化合物は、トルシンＡ特異的な効果を有し、それゆえ、α−シヌクレイン毒性アッセイにおいて同様の様式で作用するようである。３つ全てのα−シヌクレイン遺伝子組換え株は、５つのトルシンＡ依存的な化合物に曝露され、トルシンＡ特異性が決定された（図９）。予想通り、これらの化合物は何れも、トルシンＡ発現がない場合にＰｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：α−シヌクレインで何の効果もなかった。対照的に、メタンピシリン（化合物２３５）、ナリジクス酸（化合物１８７）およびオキソリン酸（化合物１９３）、３つの野生型トルシンＡ依存化合物は、Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：α−シヌクレイン＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡにおいて、それぞれ３０．３±７％（ｐ＝０．０１３）、２８．９±４．９％（ｐ＝０．００５）および３１．４±３．７％（ｐ＝０．００２）で野生型ＤＡ神経細胞の生存性を増強させたが、一方で、塩酸ロペラミド（１４４）およびメクロフェナム酸（２０６）、２つのトルシンＡ（ΔＥ）依存化合物は、何れの有意な神経保護も示さなかった。反対に、Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ＋Ｐｄａｔ−１：：α−シヌクレイン＋Ｐｄａｔ−１：：トルシンＡ（ΔＥ）ウォームにおいて、メタンピシリン、ナリジクス酸およびオキソリン酸は、全く有意な神経保護を示さなかったが、塩酸ロペラミドおよびメクロフェナム酸は、ＤＡ神経細胞の生存性を、３９．５±１．４％（ｐ＝０．００１）および２５±１．２％（ｐ＝０．００２）増大させた。
【０１５０】
これらの結果は、Ｃ．エレガンスパーキンソンモデル（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２参照）を使用するα−シヌクレイン毒性アッセイが、パーキンソン病患者の脳で見られるようなα−シヌクレイン過剰発現の効果を模倣することを実証する。ヒトおよびネマトーダの両方において、ドーパミン神経細胞は、老化の進行の際、時間とともにα−シヌクレイン遺伝子の倍加に応じて死亡する。Ｃ．エレガンスパーキンソンモデルは、明確に、直接にヒト疾病状態に関連する治療的な能力を実証し、パーキンソン病の研究のための幾つかのモデルシステムをクロス確認し、および、さらに、複雑な神経変性の疾病の研究においてでさえ単純なモデルシステムが有用でありえることを証明する（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６，  ３１３：  ３２４−３２８参照）。
【０１５１】
[例６]
それぞれのトルシンＡ依存薬剤に機能的に類似する化合物の試験
表３に示されるものに加えて、機能的に類似した分子の活性は、Ｐｕｎｃ−５４：：Ｑ８２：：ＧＦＰ＋Ｐｕｎｃ−５４：：トルシンＡ＋Ｐｕｎｃ−５４：：トルシンＡ（ΔＥ）を含む神経保護のためのＣ．エレガンスモデルにおいてアッセイして、機能的に類似した化合物と関連する有意な活性があるかどうかを決定した（表４）。
【０１５２】
これらの結果は、表４に示されるように、付加的な機能的に類似した化合物が有意な神経保護活性を示すことを証明する。表３に挙げられるその他のクラスといった薬剤の広範なクラスもまた、このモデルを用いてスクリーニングされ、神経保護作用を有するその他の薬剤化合物を同定してよい。
【表４】
2009516751.tif 000006
【０１５３】
[例７]
異なる機構による、６−ＯＨＤＡに対するリドカインおよびメクロフェナム酸保護
メクロフェナム酸またはリドカインが、トルシンＡの機能に非依存的に、ＤＡＴ−１タンパク質レベルを下方制御することができるかどうか調べるために、我々は、以前に記述された遺伝子組換え株Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ：：ＤＡＴ−１を使用した（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。ｄａｔ−１  ｃＤＮＡは、ＤＡ神経細胞特異的プロモーターの制御下で、ｇｆｐにインフレームで融合しており、ＧＦＰおよびＤＡＴ−１との間の融合タンパク質を産生する。以前の遺伝子組換え集団内における蛍光強度および可視ＧＦＰ発現の出現率の試験にて示されたように、トルシンＡはＧＦＰ：：ＤＡＴ−１レベルを下方制御することが可能である（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。
【０１５４】
我々は、メクロフェナム酸またはリドカインでＰｄａｔ−１：：ＧＦＰ：：ＤＡＴ−１を処理し、メクロフェナム酸は、対照群の１９７０Ａ．Ｕ．から１７４０Ａ．Ｕ．（ｐ＝０．０２９）へと蛍光強度を減少させた一方、細胞体および神経細胞突起のＧＦＰを有するウォームのパーセンテージは、対照の７０％から４４．７％（ｐ＝０．０２９）まで減少させた（表５）。リドカインは、Ｐｄａｔ−１：：ＧＦＰ：：ＤＡＴ−１にて、対照の１９７０Ａ．Ｕ．から１６１２Ａ．Ｕ．（ｐ＝０．００２）まで蛍光強度を減少させた一方、細胞体および神経細胞突起のＧＦＰを有するウォームのパーセンテージは、対照の７０％から３０％（ｐ＝０．０００７）まで減少させた（表５）。これらのデータは、リドカインおよびメクロフェナム酸の両者が、直接ＤＡＴ−１タンパク質のレベルを下方制御することができることを実証している。
【０１５５】
これが非特異的な効果に起因しなかったことを確認するため、我々は、６−ヒドロキシドパミン（「６−ＯＨＤＡ」）に対して神経保護を示さないプレストウィックライブラリー由来の化合物（シクロピロックスエタノールアミン）を、ＧＦＰ：：ＤＡＴ−１レベルに対する効果について試験した。シクロピロックスエタノールアミンは、対照に対して有意な効果を全く示さなかった［蛍光強度は１９２３Ａ．Ｕ．（ｐ＝０．８２）およびウォームの６６．７％が細胞体および神経細胞突起のＧＦＰ（ｐ＝０．７１）を有した］（表５）。
【０１５６】
更にメクロフェナム酸およびリドカインの神経保護の効果を調べるため、我々は、我々が以前に記述した遺伝子組換え株（Ｐｄａｔ−１：：ＣＡＴ−２）を使用した（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。ｃａｔ−２（チロシン水酸化酵素（「ＴＨ」）遺伝子のＣ．エレガンス相同体）の過剰発現は、高いレベルのＤＡ産生を生じさせ、結果としてＤＡ神経細胞の変性が観察される（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，  ２００５，  ２５（１）：  ３８０１−３８ｌ２）。我々は、Ｐｄａｔ−１：：ＣＡＴ−２でリドカインを試験した；それは、ＣＡＴ−２誘導神経変性に対して有意な神経保護効果を示さなかった（−７．９％±５％，ｐ＝０．６）。このことは、確認された６−ＯＨＤＡに対する神経保護の効果は、もっぱらＤＡＴ−１レベルの下方制御に帰することを示唆している。我々はまた、メクロフェナム酸がＣＡＴ−２誘導型神経変性を抑制可能どうか試験した。特に、１９±１．１％（ｐ＝０．００２）の神経保護効果があった。従って、メクロフェナム酸は、ドーパミン前駆体（チロシン水酸化酵素）の過剰発現によって生じる変性からＤＡ神経細胞を保護することができる。
【０１５７】
これらの結果は、リドカインおよびメクロフェナム酸は、異なる機構によって神経毒６−ＯＨＤＡに対して、神経保護効果を及ぼすことを実証している。
【表５】
2009516751.tif 000007
【０１５８】
本明細書にて引用された全ての文献は本願に援用される。
【０１５９】
記述された本発明の実施態様に対する様々な修正および変更は、本発明の範囲および意図から逸脱することなく、当業者にとって明白であるだろう。本発明は、特異的で好ましい実施態様と関連して記述されるにも関わらず、請求される発明は、そのような特異的な実施態様に過度に制限されてはならないと理解される。実際、当業者にとって明らかな発明の実行の記述された様式の様々な改変は、本発明に包含されると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、プレストウィックライブラリーの一次スクリーニングで同定される候補薬剤の効果を示すグラフを提供する。図１ａは、ポリグルタミン凝集に起因する神経変性の疾病のＣ．エレガンスモデルにおけるタンパク質ミスフォールディングおよび凝集の発生率を減少させる７つの候補薬剤を示す。図１ｂは、７つの化合物のうちの２つがトルシン非依存的機構によって凝集したタンパク質に直接作用することを示す。図１ｃは、３つの化合物がトルシン依存的機構によって作用することを示す。図１ｄは、２つの薬剤が機能障害性トルシンＡに作用することによって機能することを示す。化合物は、プレストウィックライブラリーにおいてそれらの数によって同定される。
【図２】図２は、プレストウィックライブラリーの一次スクリーニングで同定される薬剤のそれぞれのクラスの範囲内における、機能的に関連のある化合物の効果を示すグラフを示す。化合物は、プレストウィックライブラリーでそれらの数によって同定される。
【図３】図３ａは、薬剤が孵化からＬ２段階まで投与される場合の、トルシン依存的機構によって作用する５つの候補化合物のための予防的アッセイの効果を示すグラフを提供する。ハッチングのかかったバーは、Ｌ３幼生段階でのタンパク質凝集における標準化された減少を表し、中実のバーは、若年成体段階でのタンパク質凝集における標準化された減少を表す。化合物は、プレストウィックライブラリーでそれらの数によって同定される。図３ｂは、薬剤曝露および中止並びに凝集体減少のためのアッセイの時間を含む、予防的アッセイフォーマットを示す。
【図４】図４ａは、薬剤曝露がＬ２段階からそれ以降に行われる場合の、トルシン依存的機構により作用する５つの候補化合物のための補正アッセイの効果を示すグラフである。ハッチングのかかったバーは、Ｌ３幼生段階でのタンパク質凝集における標準化された減少を表し、中実のバーは、若年成体段階でのタンパク質凝集における標準化された減少を表す。化合物は、プレストウィックライブラリーでそれらの数によって同定される。図４ｂは、薬剤曝露および中止並びに凝集体減少のためのアッセイの時間を含む、補正アッセイフォーマットを示す。
【図５】図５ａは、６−ＯＨＤＡ侵襲に起因するドーパミン作動性神経細胞損傷の予防における３つの候補化合物の効果を示すグラフを提供する。化合物は、プレストウィックライブラリーでそれらの数によって同定される（５０−リドカインＨＣｌ；  ２０６−メクロフェナム酸ナトリウム塩一水和物；  ２３  ５−メタンピシリンナトリウム塩）。図５ｂは、トルシン非依存的モデルにおける図５ａ由来の同一の化合物の効果を示すグラフを提供しており、３つの化合物のうちの２つが、ドーパミン作動性神経細胞をトルシン非依存的機構による損傷から保護することを示している。図５ｃおよび５ｄは、ドーパミン作動性の神経変性の予防におけるメタンピシリンナトリウム塩（プレストウィック化合物２３５）の作用がトルシン依存的機構によることを示すグラフを提供する。メタンピシリンは、野生型（「ｗｔ」）トルシンＡタンパク質を発現する遺伝子組換えウォームにおいて神経保護を提供する。変異体トルシンＡ（ΔＥ）を発現する遺伝子組換えウォームは、６−ＯＨＤＡ侵襲後、メタンピシリンによって保護されていない。
【図６】図６は、ドーパミンの過剰産生に起因する神経変性の発生の予防における、マフェナイド（プレストウィック化合物６６）およびメクロフェナム酸ナトリウム塩一水和物（プレストウィック化合物２０６）の効果を示すグラフを提供する。
【図７】図７は、神経変性のＣ．エレガンスモデルにおける６−ＯＨＤＡ侵襲に起因する神経変性の予防に対する、メタンピシリンナトリウム塩（プレストウィック化合物２３５）に関する一群の化合物の効果を示すグラフを提供する。
【図８】図８は、野生型（「ｗｔ」）トルシンＡが、Ｃ．エレガンスのドーパミン作動性神経細胞においてα−シヌクレインの過剰発現に起因するドーパミン神経細胞変性を予防できる一方で、変異体トルシンＡは神経保護が低下していることを示すグラフを提供する。
【図９】図９は、神経変性の疾病のＣ．エレガンスモデルにおける、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集の発生率を減少させる、プレストウィックライブラリー由来の５つのトルシンＡ依存的化合物のトルシンＡ特異性を示すグラフを提供する。図９は、５つのプレストウィック化合物のうちの３つは、トルシンＡ依存的機構によってドーパミン作動性神経細胞の生存性を改良するために、特に野生型（「ｗｔ」）トルシンＡタンパク質に作用することを示す。図９は、さらに、５つのプレストウィック化合物のうちの２つは、トルシンＡ依存的機構によってドーパミン作動性神経細胞の生存性を改良するために、特に変異体トルシンＡタンパク質に作用することを示す。
【図１】
2009516751.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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