(57)【要約】  本発明は、蛍光顕微鏡及びこれを用いて蛍光を測定する方法を提供する。その顕微鏡は、極めて平坦であり、蛍光を発しないシリコンウェーハフィルタ膜を備える。さらに、その顕微鏡は、非常に高い穴密度を有するので、効率的に測定するのに小さな表面積で十分である。さらに、位置感応検出器としてカメラを用いることによって、より良好な光学解像度を利用できるようになり、それは、より小さな開口数及びより低い倍率を有し、作動距離が長い光学系を利用できることを意味する。これらの全ての要因を合わせて、既存の蛍光顕微鏡よりもはるかに迅速に測定を実施することができる蛍光顕微鏡が提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡であって、励起光を放射するように設計される励起光源を有するハウジングと、励起光を蛍光物質によって生成される蛍光から分離するフィルタリング手段と、対物レンズと、基板ホルダと、位置感応光検出器と、該位置感応光検出器用の結像レンズとを備え、リソグラフィ処理技法に適している材料から形成されるウェーハベースフィルタ膜を含む基板も備え、前記フィルタ膜は、リソグラフィ処理によって導入される連続した穴のパターンを含む、蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記基板は実質的に、シリコン、シリコン化合物、サファイア、ケイ酸塩ガラス又はそれらの組み合わせから成る、請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記基板は実質的にシリコンを含む、請求項２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記基板は、窒化又は炭化した表面を有する、請求項３に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記基板は実質的に炭化ケイ素又は二酸化ケイ素を含む、請求項２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記基板の前記表面は、少なくとも片面において金属層でコーティングされる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項７】
３つの同一直線上にない点において前記基板の合焦距離を入力するように設計される鮮明合焦制御システムを備え、該鮮明合焦制御システムは、前記３つの点から、鮮明な合焦面を決定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項８】
合焦光を放射するように設計される合焦光源を有する合焦照明システムをさらに備え、前記合焦光の光路及び前記蛍光の光路は、前記対物レンズを介して、前記基板に向かって同軸上に延在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項９】
前記合焦光を部分的に透過し、前記基板から到来する光が前記光検出器に向けられるように前記合焦光の光路に配置されるミラーをさらに備える、請求項８に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
前記部分的に透過性のミラーと前記合焦光源との間に配置され、励起光の場合に、蛍光放射の場合よりも低い透過率を有するフィルタをさらに備える、請求項８又は９に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の蛍光カメラを利用して、基板上の試料の蛍光を検出する方法であって、
前記基板上の前記試料に励起光を照射すること、及び
前記試料からの蛍光を検出すること
を含む、方法。
【請求項１２】
前記合焦光源は実質的に、前記試料に焦点が合わせられたときにのみ合焦光を放射する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光は、前記基板上の前記試料の複数のサブエリアのそれぞれから検出され、その後、１つのサブエリアにおいて検出された蛍光から関連する画像情報が求められ、前記複数のサブエリアは前記試料からランダムに選択され、それまでに測定された全ての前記複数のサブエリアからの関連する画像情報の和が所定の信頼水準しきい値を超える場合には、前記蛍光の測定が中止される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡において用いる基板であって、リソグラフィ処理技法のために適している材料から形成されるウェーハベースフィルム膜を含み、前記フィルタ膜は、リソグラフィ処理によって導入される連続した穴のパターンを含み、前記基板の前記表面は、少なくとも片面において金属層でコーティングされる、基板。
【請求項１５】
請求項１４による基板を製造する方法であって、ウェーハベースフィルタ膜を設けるステップと、リソグラフィ技法によって、前記フィルタ膜に複数の穴を設けるステップと、
その後、前記フィルタ膜の少なくとも片面を金属層でコーティングするステップとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
詳細には、本発明は、励起光を放射するように設計される励起光源を有するハウジングと、蛍光物質によって生成される蛍光から励起光を分離するフィルタリング手段と、対物レンズと、基板ホルダと、位置感応光検出器と、位置感応光検出器のための結像レンズとを備える、蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００３】
このタイプの蛍光顕微鏡は、蛍光サンプル又は試料を調査する蛍光研究において広く用いられる。必要に応じて、それそのものは蛍光を発光しないサンプルに蛍光物質が与えられることもある。そのようなサンプル又は試料が適当な光、限定はしないが、通常は可視光又は紫外光を照射される場合には、サンプル内の蛍光物質は、励起光よりも長い波長を有する蛍光を発する。多くの場合に、蛍光の強度は低く、それは、概ね全ての場合に、励起光がフィルタの助けを借りて除去されることを意味する。それゆえ、原理的には、弱い蛍光が唯一の可視画像である。
【０００４】
実際には、蛍光研究は多くの場合に、微生物に対して実行される。これは通常、人間の目によって検査できるようにするために、好ましくは、対物レンズにおいて５０倍以上から１００倍まで、全体で１０００倍まで倍率を高めることを伴う。さらに、用いられる基板の典型的なサイズは、たとえば、直径２５ｍｍである。たとえば、そのようなサイズは、後に調査されるべき微生物学的粒子を、基板上で濃縮した状態で得るために、或る一定量のサンプル流体が基板の中を通り抜けなければならない微生物学的サンプルの場合に、しばしば必要とされる。その過程において、サンプル流体が、基板内の複数の細い穴の中を通り抜けて、それらの粒子が基板の表面に残される。
【０００５】
既知の蛍光顕微法の欠点は、測定時間が非常に長くなる可能性があることである。たとえば、１マイクロメートル未満の所望の解像力、及び２５ｍｍの直径を有する基板における微生物学的研究の場合に、画像当たり数秒の測定時間、全部で数時間から最大で１日に至る時間をかけることも珍しくない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、解像力を保持しながら、測定時間をはるかに短くできるようにする蛍光顕微法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、リソグラフィ処理技法に適している材料から形成される、ウェーハベースフィルタ膜を含む基板を備える、本発明による蛍光顕微鏡によって果たされ、そのフィルタ膜は、リソグラフィ処理によって導入される連続した穴のパターンを備える。
【０００８】
詳細には、そのフィルタ膜は、ウェーハの助けを借りて製造される。実際に、そのようなウェーハは特に平坦にすることができるので、ウェーハの表面形状を採用するフィルタ膜も同様に極めて平坦にすることができ、特に、１マイクロメートル以下、たとえば０．５μｍの解像力が与えられる蛍光顕微鏡を設定する場合に、基板表面全体を鮮明な焦点において結像できるほど十分に平坦にすることができる。これは、たとえば３ｍｍの直径よりも大きな基板が、０．５μｍ以内まで平坦でなければならないことを意味する。
【０００９】
リソグラフィは、一方では、そのような平坦な基板を提供する技法を提供し、他方では、はっきりと画定された非常に多くの穴を基板の中に導入できるようにする。たとえば、０．１μｍ〜１μｍの穴サイズの場合に、考えられる多孔率は５％〜２０％、さらには最大で４０％である。結果として、後にさらに詳細に説明されるように、その基板は、都合の良いことに、はるかに小さくすることができる。さらに、このタイプ（０．１９μｍ未満の穴サイズ）の基板を使用することによって生じる濾過液は無菌である。
【００１０】
シリコンから形成される、このタイプのフィルタ膜は、fluXXion社によって提供される。fluXXion社のシリコンフィルタ膜は、非常に薄く、穴の数が多く、その上、その穴が極めてはっきりと画定されているので、非常に高い透過率を有するというさらなる利点を有する。結果として、同じ全透過率を依然として有しながら、これまでに習慣的に用いられてきた基板よりも著しく小さな寸法を有する基板を設けることができる。たとえば、２５ｍｍの直径を有する従来技術の基板の代わりに、特に１０ｍｍ未満、たとえば３ｍｍの直径を有するシリコンフィルタ膜を用いることができる。これは、フィルタ膜の中を通り抜けたときに、サンプル流体内に位置する、調査される物質が、従来技術の基板の場合よりも、はるかに高い濃度で存在することを意味する。実際には、これは、はるかに小さなエリアしか調査しなくて済むことも意味する。たとえば、調査されるエリアが、２５平方ｍｍから３ｍｍの直径へと小さくなることは、約５０分の１まで時間が短縮されることを意味する。
【００１１】
さらに言うと、基板、すなわちフィルタ膜は、シリコンから形成される必要はなく、先に述べられたように、リソグラフィ技法に適している材料から形成することができる。詳細には、その基板は概ね、シリコン、シリコン化合物、サファイア、ケイ酸塩ガラス、又はそれらの組み合わせから成る。そのような材料は、これらの技法に適していることがわかっており、良好な機械的特性、良好な化学的耐性、及び低い固有蛍光を有する。考えられる材料の組み合わせは、たとえば、いわゆるＳｏＳ、すなわちシリコン・オン・サファイアを含む。
【００１２】
より詳細には、その基板は概ねシリコンを含む。この元素はリソグラフィ処理に極めて適しており、関連する技法が開発されているので最適である。
【００１３】
詳細には、１つ又は複数の特性、特に硬度又は化学的耐性を改善するために、その基板の表面に１つ又は複数の元素をドープすることができる。その基板は、窒化又は炭化した表面を有することが好都合である。シリコン基板を局所的に窒化又は炭化させることによって、それぞれ窒化ケイ素又は炭化ケイ素から成る非常に硬く、耐久性がある層が形成され、それにより、機械的特性がさらに改善される。
【００１４】
好都合な一実施の形態では、その基板は概ね、炭化ケイ素又は二酸化ケイ素を含む。表面だけを炭化させる代わりに、基板全体を概ね炭化ケイ素から形成することもでき、代替的には石英（二酸化ケイ素）から形成することもできる。
【００１５】
従来技術の蛍光顕微法において生じることがある別の問題は、基板が蛍光を発する可能性があることである。これは、蛍光測定値の中に、背景信号又は背景雑音が存在することを意味する。この背景信号は、本当の測定値、すなわち調査されるべき物質の測定を妨害することがある。それゆえ、蛍光を発しないか、又は低いレベルでしか発しない基板を提供することが望ましい。この目的は、概ね上記の材料を含む基板によって果たされる。
【００１６】
基板の表面は、少なくとも一方の側において金属層でコーティングされることが好都合である。そのような手段は、基板の固有蛍光をさらに小さくするのを確実にする。これは、まさに、リソグラフィ処理によって穴が形成される、本発明による基板において利点を提供する。その際に、化学薬品が用いられることも多く、その残留物が蛍光を引き起こすことがある。これらの残留物は、ここで、「本物の」基板と共に、薄い金属層によってマスクされる。そのような金属層の一例は、気相成長させたクロム層であるが、他の材料を用いることもできる。
【００１７】
さらに重要な点は、基板上での鮮明な合焦に関する。結局のところ、完全に平坦な基板が用いられる場合であっても、基板は顕微鏡の鮮明な合焦平面内に配置されるとは限らないので、基板の新たな部分が調査される度に、次々に鮮明に合焦することが必要になることもある。実際には、位置毎に、鮮明な合焦面に対する高さを求めることができる。しかしながら、完全に、又は少なくとも十分に平坦な基板の場合、鮮明な焦点の３点測定を実行することで十分であり、それにより、顕微鏡の鮮明な合焦面に対する基板の位置が求められる。その後、顕微鏡の鮮明な合焦面内に実際に配置されるように、基板を傾けることができる。その際、別のオプションは単に、所望の鮮明な合焦補正を位置毎に計算することであり、その際、必要に応じて、自動的に実行することができる。基板が動かされるのに応じて、鮮明な合焦を自動的に制御することができる。この実施の形態でも、平坦な基板は、合焦時間の多くの部分を短縮するであろう。
【００１８】
興味を引く実施の形態では、蛍光顕微鏡は、合焦光を放射するように設計される合焦光源を有する合焦照明システムを備え、合焦光の光路及び蛍光の光路は、対物レンズを介して、基板に向かって同軸上に延在する。それゆえ、これは、蛍光顕微鏡の使用中に、合焦動作において基板上に光が照射されることを伴う。合焦光の光路のうちの基板から検出器までの部分は、蛍光の光路と同じである。言い換えると、合焦光及び蛍光のいずれも基板の画像を生成することができる。これは、蛍光画像を、サンプル又は試料と共に、基板の通常の視像と関連付けるというオプションを提供する。これは、蛍光画像を解釈するために、そして、たとえば、それらの画像からアーティファクトを除去するために好都合であることがある。
【００１９】
そのような構成において、合焦光は、原理的には、通常の可視光を含むことができる。必要に応じて、合焦光は、可視スペクトルの一部だけを含む。合焦光は概ね、励起光の外側にある波長領域内の光を含み、その光は、結局、励起光を基板上に向けるミラー等によって別の方向に反射されることが好都合である。たとえば、合焦光は、蛍光の波長に近いか、又は等しい波長を有する光を含むか、又は場合によっては概ね蛍光そのものを含む。
【００２０】
蛍光顕微鏡はミラーをさらに備えており、そのミラーは部分的に合焦光を透過し、合焦光の光路内で、基板から到来する光が光検出器に向けられるように配置される。これは、対物レンズを介して、合焦光を与えるというオプションを提供する。言い換えると、合焦光は、合焦画像を形成するために用いられる反射した合焦光を収集するために用いられるのと同じ光学系を介して、基板上に照射される。ここで、基板は、たとえば、シリコンウェーハフィルタ膜のように、完全に平坦であり、好ましくは鏡面反射性であることが重要である。これは、とりわけ、試料又はサンプルが視認されている間に、その時点で視認されている部分だけが合焦光を照射されるという利点を有する。これは、試料若しくはサンプルが多くの場合に光によって急速に脱色すること、又は同じように蛍光物質の分解が引き起こされることを考えると好都合である。別の利点は、合焦光が、蛍光を放射する側と同じ側に供給されることである。その際に、透過性の基板が別のオプションである。しかしながら、これは、実際には、連続した穴によって、非常に小さな開口数を有し、それゆえ非常に大きな焦点深度を有する光学素子を形成するので、ウェーハフィルタ膜ではあまり有効ではない。これは、言い換えると、合焦光に関して、下から鮮明に合焦させるのが難しくなることを意味する。ただし、「鮮明」は、結像光学系及びカメラに対する試料又はサンプルの合焦に関連する。結局、これらの光学系は、フィルタ膜内の連続した穴の実効的な開口数よりもはるかに小さな開口数を有する。
【００２１】
しかしながら、合焦光は、たとえば基板上に斜めに入射する他の光路を介して、たとえば、対物レンズの全面に合焦光を供給する合焦光源によっても供給できることに留意されたい。従来技術の場合よりも、選択された光学設定のための作動距離が一般的に大きく、液浸光学系顕微鏡よりも確実に大きいので、この実施の形態においても、本発明は利点を提供する。この点については、後にさらに詳細に説明される。
【００２２】
位置感応検出器としてピクセルを利用するカメラを用いるとき、そのカメラによって検出される視像からの多くの情報をできる限り保持するために、いわゆるピクセル解像度は、蛍光顕微鏡の光学解像度と同程度に良好であることが好ましい。ピクセル解像度は、単に、ピクセルサイズを倍率で割った値であり、１／３〜１×光学解像度であることが好ましく、すなわち、ピクセル解像度は、少なくとも光学解像度（情報保持）と同程度に良好であることが好ましいが、良くても高くて３×であり、すなわち１／３×光学解像度であることが好ましい。結局、ピクセル解像度がさらに「良好」であったとしても、与えられる視像内に実際には情報が存在しないので、実効的な解像度が高くなるのは見せかけにすぎないであろう。
【００２３】
その際、人間の目ではなく、特にカメラの特性に基づいて、それほど高くない光学解像度が選択される、すなわち、必要以上の光学解像度を選択しない場合には、より小さな倍率で十分であり得る。これは、必要とされるピクセル数を少なくしておくことができるか、又は少なくとも、測定される画像フィールドと、ピクセル数との間の関係が好都合であるという大きな利点をもたらす。そのピクセル数は、カメラの価格及び複雑さだけでなく、とりわけ、読出し速度を決定する。別法では、画像を記録するために存在するＣＣＤの限られた数のピクセルだけ、すなわち所望の解像度を達成するのに必要とされるピクセル以下のピクセルだけを用いることができる。いずれの場合でも、ピクセルの数が少ないことは、読出し速度が速いこと、それゆえ、測定が迅速であることを意味する。
【００２４】
一例を与えるために、所望の解像度は０．５μｍであり、５３０ｎｍの波長を有する緑色光が用いられる。その際、対応する開口数は少なくとも０．４０である。５μｍのピクセルサイズ、及び０．５×光学解像度、すなわち０．２５μｍの所望のピクセル解像度の場合に、この結果として、全体で２０×のカメラの場合に所望の倍率が得られる。実際には、実現可能なオプションは、たとえば、ｆ＝１０ｍｍの対物レンズと、ｆ＝２００ｍｍの結像レンズとを選択することである。これらの焦点距離は、約２ｃｍの作動距離を可能にしながら、顕微鏡をコンパクトに構成できるようにする焦点距離である。他の蛍光波長、ピクセルサイズ、ピクセル解像度と光学解像度との間の比（好ましくは１：１〜１：３）、並びに対物レンズ及び結像レンズの焦点距離が可能であるのと同様に、他の所望の解像度が可能であることは明らかである。当然、結像レンズはオプションでは、複合レンズ系である。
【００２５】
上記のように、所望の解像力を達成するために、小さなピクセルサイズと組み合わせて、対物レンズの強度又は倍率を確実に低くしておくことができるが、それでも全倍率が依然として十分であるようにすることも可能である。さらに別の利点は、対物レンズの開口数（ＮＡ）を、特に大きくしておく必要がないことであり、それは、大きな倍率における液浸が不要であることを意味する。
【００２６】
実際には、顕微鏡に必要とされるＮＡの推定値は、人間の目の代わりに、カメラが用いられるときの所望の解像度に基づいて求められ、その際、必要とされる倍率は、ピクセルサイズ及び所望のピクセル解像度に基づいて決定される。
【００２７】
相対的に小さなＮＡ、好ましくは０．４５以下のＮＡを有するレンズの主な利点は、焦点深度が相対的に大きいことである。言い換えると、これは、基板を鮮明に合焦し直す必要がないか又は少なくとも必要とされる頻度が少なくなること、及び相対的に厚みのある基板の場合であっても、顕微鏡を調整することなく、そのまま測定することができることを意味する。
【００２８】
ここで、基板の完全な測定が、ただ一度の鮮明な合焦動作で可能であるので、これは、特に非常に平坦なウェーハフィルタ膜との組み合わせの場合に利点を提供する。実際のところ、ウェーハフィルタ膜は、２次元の基板を形成し、それにより、その表面にある膜内の穴において鮮明に合焦できるようになり、同時に試料又はサンプルが、その表面上に直に配置される。
【００２９】
たとえば、水又は油への液浸は常に、それぞれの液浸流体の蒸発を伴い、それは多くの場合に望ましくない。さらに、種々の試料との二次汚染の形で汚染が発生するおそれがあり、これはさらに大きな欠点である。これは単に、液浸流体が蒸発し、たとえば、微生物又は他の物質を同伴する結果として生じることがあるだけでなく、そのような物質が、液浸流体を介して、試料間で移動する結果として生じることがある。対物レンズの倍率が小さい場合に、本発明は、大きな作動距離を設定し、それゆえ汚染を防ぐ簡単な方法を提供する。
【００３０】
部分的に透過性のミラーは、１つのミラー又はいわゆるポルカドットビームスプリッタを含むことが好都合であり、合焦光のための反射係数と透過係数との間の比は少なくとも１０であり、有利には１００である。蛍光のための反射係数と透過係数との間の比は少なくとも１００であることが好ましい。合焦光を同軸上で注入する場合、最初に合焦光を部分的に透過し、その後、それを検出器に向かって部分的に反射するか、又は検出器及び合焦光源の位置が入れ替えられる場合には、その逆である光学素子が存在する。
【００３１】
本発明は、先行する請求項のいずれか一項に記載の蛍光カメラを利用して、基板上の試料に励起光を照射すること、及び試料からの蛍光を検出することを含む、基板上の試料の蛍光を検出する方法にさらに関する。本発明による蛍光顕微鏡、特に、シリコンウェーハ基板を用いることによって、蛍光測定の時間を大幅に短縮することができる。さらに、基板によって引き起こされる蛍光は全く存在しないか、又は概ね存在しない。
【００３２】
詳細には、蛍光光源は概ね、試料に焦点が合わせられたときにのみ、合焦光を放射する。結果として、基板上の試料又はサンプルの脱色が生じにくくなる。好ましくは励起放射と同軸である合焦光で照明することによって、必要に応じて、可視光画像を生成する合焦光画像と、蛍光画像とを交互に入れ替えることができ、これらの画像間で容易に相関をとることができる。基板が他の場所に動かされ、必要に応じて、鮮明に合焦し直すこと伴う場合には、合焦光源を、短時間（合焦時間）だけ、単にオンに切り替えることができる。
【００３３】
さらに、合焦光源は、非常に僅かの光を放射し、或いは、少なくとも非常にわずかな光が試料又はサンプルに達する。原理的には、合焦光は、鮮明な合焦を可能にするために必要とされるレベルに制限され、それにより、試料又はサンプル上での脱色又は他の不都合な作用が最小限に抑えられるようにする。当然、上記光レベルは、試料が結果として損傷を受けない場合には、さらに高くすることができ、それにより、さらに迅速且つ／又は正確に鮮明に合焦させることができるようになる。
【００３４】
特定の一実施の形態では、蛍光は、基板上にある試料の複数のサブエリアのそれぞれから検出され、その後、１つのサブエリアにおいて検出される蛍光から関連する画像情報が求められ、それらのサブエリアは試料からランダムに選択される。ただし、それまでに測定された全てのサブエリアからの関連する画像情報の和が所定の信頼水準しきい値を超える場合には、蛍光の測定が中止される。こうして、測定時間をさらに短縮することができる。その際、特定の試料又はサンプルがどの値で或る十分な信頼水準まで測定されているかを指示するしきい値が、予め選択されるべきである。簡単な一例は、特定の微生物が存在することが立証される必要があるという場合である。その場合、結局、その微生物のうちの１つ又は多数の個体を検出するだけで十分である。当然、しきい値として、或る（正当な）標準値を選択することもでき、標準値を超えているか否かを立証する等で十分である。このようにして、しきい値が超えられることの検出を組み入れることは、たとえば、自動式のパターン認識装置によって達成することができることが好ましい。
【００３５】
本発明は、リソグラフィ処理技法に適している材料から形成されるウェーハベースフィルタ膜を含む、本発明による蛍光顕微鏡において用いる基板も提供し、そのフィルタ膜は、リソグラフィ処理によって導入される連続した穴のパターンを含み、基板の表面は、少なくとも一方の側において金属層でコーティングされる。金属層があるため、基板の材料の残留固有蛍光を有効に抑えることができる。基板のベース材料及び金属層内の金属のタイプに関する限り、既に述べられている材料を使用することができる。
【００３６】
また本発明は、ウェーハベースフィルタ膜を設けるステップと、リソグラフィ技法によってフィルタ膜に穴を設けるステップと、その後、フィルタ膜のうちの少なくとも一方の側を金属層でコーティングするステップとを含む、本発明による基板を形成する方法も提供する。上記のように、穴は、たとえば、０．１μｍ〜１μｍの直径を有することができるが、他の直径又は形状も除外されない。最初に金属層を気相成長させて、後に、穴を導入することもでき、それは、穴の内側に金属が付着しないという利点を有することに留意されたい。しかしながら、その場合に、金属がリソグラフィステップを妨害することがあり、さらに、残留リソグラフィ化学薬品が後に残ることになり、残留蛍光のリスクを伴う。
【００３７】
本発明による蛍光顕微鏡、方法及び基板によって、とりわけ、蛍光測定の速度が高められる。そのように速度を高められるのは、とりわけ、ウェーハフィルタ膜を使用することに起因しており、その結果として、既知の基板と比べて、はるかに小さな表面積上に同じように効率的なフィルタが設けられることが速度を高めることに繋がり、それゆえ、より短時間で試験することができる。さらに、それは平坦なフィルタであり、何度も鮮明な合焦を必要としない。３点測定で十分であり、必要とされる任意の後続の制御は、自動的に達成することができる。さらに、カメラを使用できるようになり、人間の目よりも優れた解像力が提供され、それにより、開口数が小さなレンズを使用できるようになる。これは、より安価なレンズを意味し、多くの場合に、もはや液浸は不要である。その上、少なくともカメラのピクセルが、所望の光学解像力に対してあまり大きくない場合には、小さな倍率で十分であり、したがって、用いられることになる焦点距離を長くできるようになり、結果として作動距離が長くなる。言い換えると、これは、液浸による汚染を防ぐ際に利点を有する。さらに、観測された統計量がその根拠を与える場合には、測定するのを止めることが好都合である。全体として、本発明による蛍光顕微鏡、方法及び基板は、非常に迅速に、高い信頼性で、且つ接触しないように、蛍光を測定するために用いることができる。
【００３８】
本発明は、図面を参照しながら以下に説明され、図面の１つの図が、本発明による蛍光顕微鏡の断面図を概略的に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
参照符号１によって蛍光顕微鏡が包括的に示されており、その蛍光顕微鏡は、カメラ１２を取り付けられているハウジング１０を備える。ハウジング１０の中には、第１のレンズ１６、励起フィルタ１８及びダイクロイックミラー２０と共に、励起光源１４が設けられる。
【００４０】
図１においてハウジング１０の底部に設けられるのは、対物レンズ２２であり、その対物レンズ２２を介して、基板２４を照明することができる。基板２４は、基板ホルダ２６の中に収容され、２８はｘ−ｙ−ｚ基板並進ステージを示す。
【００４１】
参照符号３０は、部分的に透過性のミラー又はビームスプリッタを示し、３２は放射フィルタを示し、３４は結像レンズを示す。
【００４２】
ハウジング１０の上には、合焦光源３６及び合焦レンズ３８が示される。
【００４３】
本発明による蛍光顕微鏡１のハウジング１０は概ね遮光性のハウジングである。ハウジング１０は原理的には、金属及び／又はプラスチックのような任意の材料から形成することができる。ハウジング１０の中には、多数の光学素子及び他の構成要素が配置される。
【００４４】
励起光源１４が、ハウジング１０の中に配置され、励起光を与える。励起光源は原理的には、１つ又は複数のＬＥＤ、（高圧）水銀ランプ、レーザ等の、この目的を果たすのに適している任意の光源を含むことができる。励起光源１４の励起光の波長は、調査される蛍光物質に応じて選択されるが、一般的には、比較的短い波長の光である。一般的に用いられる波長は、緑色から最も短くて近紫外線を含む領域までであるが、他の波長も除外されない。この場合、たとえば、励起光源１４は、青色ＬＥＤ光源である。
【００４５】
励起光源１４によって放射される光は、たとえば、十分に高い均質性の適切な励起光ビームを形成するように設計される、第１のレンズ１６の中を通り抜ける。また、その光ビームは励起フィルタ１８の中も通り抜け、そのフィルタ１８は、望ましくない光の部分をフィルタリングして除去するように設計される。詳細には、これは、蛍光に対応する励起光からの光部分に関連する。励起光内のそのような部分は、結局のところ、後の蛍光測定を妨害することがある。必要に応じて、励起フィルタ１８は、励起光又は蛍光以外の光の部分を種々の度合いで除去するように設定することもできる。こうして、蛍光に関連しない光に起因して起こり得る雑音をできる限り防ぐ。どのタイプの励起光及び／又は蛍光が用いられているかに応じて、当業者は、適切なフィルタを容易に選択することができる。必要に応じて、励起フィルタは、２つ以上のサブフィルタを含むことができる。
【００４６】
この場合には、励起光源はハウジング１０の中に示されるが、ハウジング１０の外部に励起光源を設置することもでき、必要に応じて、励起光源１４とハウジング１０との間に遮光性の結合が設けられる。後に説明される、カメラ１２との結合も参照されたい。
【００４７】
こうしてコリメートされ、フィルタリングされた励起光は、ダイクロイックミラー２０を介して、さらに対物レンズ２２を介して、基板２４に向けて照射される。ダイクロイックミラー２０は、たとえば、励起光のできる限り多くの量を反射するように設計されるのに対して、基板２４から到来する蛍光は、高い透過率で通り抜ける。これは全て、誘電体層を適切に重ねることによって容易に果たすことができ、当業者には知られている。
【００４８】
対物レンズ２２として、たとえば、１０倍〜４５倍の倍率を有する、標準的な顕微鏡対物レンズを用いることができる。開口数は、たとえば、０．２〜０．５にすることができる。作動距離は、たとえば、数ミリメートルにすることができ、さらには、数センチメートルにすることもできる。この作動距離は、基板２４と接触することなく測定できるようにするほど十分な距離であることに留意されたい。
【００４９】
基板２４として、原理的には、たとえば、スライドガラス等の、この目的を果たすのに適している任意の基板を用いることができる。詳細には、微生物を測定するために、多くの場合に、多数の小さな穴を設けられた基板が用いられる。たとえば、測定する前に、調査される微生物等を含むサンプルが、基板の中を通り抜けるようになされ、その際、基板内の穴を通じて流体を排出することができ、調査される物質が後に残される。これらの試験のために用いられる典型的な基板は、たとえば、ポリマー基板を含む。しかしながら、基板２４は、たとえば、シリコン膜フィルタを含むことが好都合である。たとえば、fluXXion社によって市販される、このタイプのシリコン膜フィルタは、蛍光を発しないか、又は非常に低いレベルにおいてのみ蛍光を発し、結果として、いかなる蛍光測定も妨害する可能性がないシリコンから製造される。さらに、このタイプのシリコンフィルタ膜は、半導体技術において用いられるような、シリコンウェーハを基に作られる。それゆえ、そのシリコンフィルタ膜は極めて平坦でもあり、それは、倍率が高い場合であっても、蛍光顕微鏡の光学軸に対して垂直に配置して、調整することなく、全体として鮮明な画像を達成することができることを意味する。このタイプのシリコンフィルタ膜の別の利点は、さらに、非常に狭い範囲内に画定される数多くの穴があることによって、浸透性が非常に高いことである。これは、そのフィルタ膜が濾過中に高い選択性を有することができることを意味し、また、基板２４の寸法を非常に小さくしておくことができ、それでも、同じ量のサンプル流体を実際に慣例となっている時間内に濾過できるようになることを意味する。たとえば、３平方ミリメートルの断面を有するシリコンフィルタ膜であれば、この目的を果たすのに十分であり得るが、当然、他の寸法を用いることもできる。
【００５０】
基板２４は基板ホルダ２６内に収容され、基板ホルダ２６は、基板並進ステージ２８（輪郭だけが示される）を含む。基板並進ステージ２８は、ここでは、ｘ及びｙ方向とも呼ばれる、蛍光顕微鏡１の像平面内に位置する方向において基板２４を平行移動させるために用いられ、さらには、鮮明に合焦させる目的で、ここではｚ方向とも呼ばれる、像平面に対して垂直な方向において用いられる。さらに、基板並進ステージは、基板表面が蛍光顕微鏡１の鮮明な合焦面内に配置されるように、ｘ軸及び／又はｙ軸を中心にして、基板２４を傾斜させるようにも設計することができる。この後者の機構は、極めて平坦なフィルタ膜基板が、３点測定によって、鮮明な合焦面内でそのまま位置合わせされることができるので好都合である。さらに、基板は非常に平坦であり、本発明による蛍光顕微鏡の焦点深度も非常に大きいので、ｘ、ｙ平行移動全体にわたって、基板全体が焦点深度内にとどまる。その後、ｚ値は単に、ｘ及びｙの関数として、たとえば、ｘ及びｙの一次結合として設定することができる。
【００５１】
調査される物質を支持する基板２４に入射する励起光源１４の励起光は、基板２４上で、蛍光を引き起こすことができる。結果として生成される蛍光はさらに、対物レンズ２２を介してハウジング１０に入り、ハウジングの中で、ダイクロイックミラー２０の中を概ね通り抜ける。その後、蛍光は、部分的に透過性のミラー３０に入り、それにより、カメラ１２に向かって反射される。しかしながら、最初に、その蛍光は、蛍光のみを概ね透過するように設計される放射フィルタ３２の中を通り抜ける。より一般的に述べると、放射フィルタ３２の目的は、蛍光と、他の光、特に励起光との間の比を改善することである。原理的には、放射フィルタ３２は、概ね励起放射に合わせるだけで十分であるかもしれないが、放射フィルタ３２は、或る特定のタイプの蛍光を選択する役割も果たすことができる。結局、調査される物質以外の物質、特に基板も蛍光を発することがある。しかしながら、シリコンフィルタ膜が基板２４として用いられる場合には、このタイプの蛍光は通常、無視できるほどである。
【００５２】
その際、蛍光は、結像レンズ３４の中を通り抜け、たとえば、５３０ｎｍの波長を有する。カメラ１２として、１０マイクロメートル以下のピクセルサイズを有する、ＣＣＤカメラ等を用いることができる。具体的な例では、ピクセルサイズは、たとえば、４．６５μｍであり、ピクセル解像度と光学解像度との望ましい比は、少なくとも２倍である。たとえば、約０．５μｍの光学解像力が要求される場合、ピクセル解像度は、たとえば０．２３μｍであり、必要な倍率は約２０である。たとえば、対物レンズ２２は１０ｍｍの焦点距離及び０．４２のＮＡを有し、結像レンズ３４は２００ｍｍの焦点距離を有する。そのような組み合わせを考える場合、対物レンズ２２において、好都合な、すなわち十分に大きな作動距離も達成される。
【００５３】
ＣＣＤカメラ１２に対する代替形態として、たとえば、ＣＭＯＳカメラ、又はたとえば、写真乾板を用いることもできる。ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラは、画像を電子的に処理することができるという利点を有し、既に述べられているように、それらのカメラは、人間の目よりも良好な有効光学解像度を有する。この目的を果たすために、カメラ１２は、たとえば、画像処理装置及び／又は画像認識装置及び／又はソフトウエア（図示せず）を備えるコンピュータに接続することができる。
【００５４】
図１に示される光線経路、すなわち部分的に透過性のミラー３０を介してカメラ１２に向かう、蛍光放射の光線経路は、合焦光源３６との関連で選択されたことに留意されたい。合焦光源３６が存在しない場合、カメラは、上記合焦光源３６の場所に配置することができ、結果として、部分的に透過性のミラー３０は実質的に不要になっていたであろう。しかしながら、図１に示される蛍光顕微鏡１は、合焦光源３６を組み込む。その目的は、基板２４を、蛍光顕微鏡１の鮮明な合焦面内に簡単に位置決めすることができるだけの十分な量の光を利用することである。これを果たすために、たとえば、合焦光源３６は、白色光又は緑色光、詳細には、放射フィルタ３２、そして当然、ダイクロイックミラー３０によって透過される光を放射する。それゆえ、合焦光源３６によって放射される光の色は、励起光源１４からの光の色に、且つ蛍光の色によって決まる。これらの全ての態様は、当業者によって容易に選択することができる。合焦光源３６として、たとえば、ＬＥＤ光源を用いることができるか、別法では、（ハロゲン）白熱電球又は（高圧）水銀灯を用いることができる。他の光源も同様に用いることができる。ＬＥＤ光源が用いられることが好都合であり、その利点は、迅速に切り替えられるというオプションを含み、それにより、機械式シャッタ、回転ミラー等が不要になるだけでなく、本来効率が高いこと、及び相対的に帯域幅が狭いことに起因して、寿命が長く、且つ照明が効率的であり、それは、フィルタ及び基板が取り扱う電力が相対的に低くて済むことを意味する。ちなみに、これらの利点は、励起光源がＬＥＤ光源を含む場合にも同じく当てはまる。
【００５５】
合焦レンズ３８の目的は、十分に均質性の光ビームを得ることであり、それは鮮明な合焦を促進する。別の利点は、基板２４の、位置合わせとも呼ばれる合焦の過程において、おそらく存在する調査される物質、特に標識された細菌が漂白されないことである。漂白されれば、後に実行される蛍光測定に悪影響を及ぼすであろう。漂白を防ぐために、合焦光源３６は、合焦中にだけ用いられる。また、励起光の光強度と、合焦光源３６からの光が基板２４に達するときの光強度との高い比を選択することも好都合である。励起光源１４及び合焦光源３６として、たとえば、上記のＬＥＤ光源を用いるとき、２０００：１の励起光と位置合わせ光との比を容易に達成することができる。オプションでは、部分的に透過性のミラー３０と合焦レンズ３８との間に、放射フィルタ３２に概ね対応することができる第２の放射フィルタを配置することができる。そのような場合には、１００００：１の比を容易に達成することができる。そのような比を仮定すると、合焦光による、調査される物質のあらゆる漂白を確実に避けることができる。平坦で、小さな基板を使用することによって、鮮明な合焦を実行する回数が少なくて済むという、さらに別の利点がもたらされる。
【００５６】
用語「レンズ」の使用に関して全体を通じて解説すると、全ての事例において、このレンズとして複合レンズ、すなわち複数の光学素子を含むレンズを用いることができる。さらに、原理的には、関連するレンズ、すなわち結像レンズ３４及び照明レンズ１６に対する放射フィルタ３２及び励起フィルタ１８の位置は入れ替えることができる。
【００５７】
上述の実施形態は、限定しない例と見なされるべきである。本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明による蛍光顕微鏡の断面図である。
【図１】
2009510539.tif 000003
【国際調査報告】
2009510539.tif 000004
2009510539.tif 000005
2009510539.tif 000006