(57)【要約】  本明細書において提供されているのは、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と基板のポリヌクレオチドとの組み合わされた使用に基づき試料内の標的を検出及び／又は選別するための方法及びシステムである。前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、所定の標的に特定的に結合する蛋白質、及び、基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するコード化ポリヌクレオチドから成り、前記基板のポリヌクレオチドは基板に結合される。
2009545747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の標的を検出する方法であって、
基板に結合された基板のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と組み合わせるステップであり、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質は前記標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは前記基板のポリヌクレオチドに特異的に結合する、ステップ；並びに
前記基板に結合された基板のポリヌクレオチドに結合されたポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を検出するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
基板に結合された基板のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と組み合わせるステップが、
基板に結合された基板のポリヌクレオチドを提供するステップ；
蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を提供するステップであって、前記蛋白質は前記標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは前記基板のポリヌクレオチドに特異的に結合する、ステップ；並びに、
ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と前記標的との結合、並びに、前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料及び前記基板に接触させるステップ；
により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料及び前記基板に接触させるステップが、
ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と前記標的との結合を可能にする間及び条件下で、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料に接触させるステップ；並びに、
前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を前記基板に接触させるステップ；
により行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料及び前記基板に接触させるステップが、
前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記基板に接触させるステップ；並びに、
ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の結合を可能にする間及び条件下で、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料に接触させるステップ；
により行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記基板上の前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を検出するステップが、
前記標的に特異的に結合する分子、及び、該分子に結合され、ラベル信号を与えるラベル化合物を含んだラベルされた分子を提供するステップ；
前記ラベルされた分子と前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体との結合を可能にする間及び条件下で、前記ラベルされた分子を前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に接触させるステップ；並びに、
前記基板上の前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に結合した前記ラベルされた分子から前記ラベル信号を検出するステップ；
によって行われる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ラベル化合物が金属ナノ粒子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質が抗体である、請求項1乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的は複数の標的であり、基板に結合された基板のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と組み合わせるステップが、
基板に結合された複数の基板のポリヌクレオチドを提供するステップであり、各基板のポリヌクレオチドが配列特異的であり、互いから位置的に区別できる、ステップ；
複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を提供するステップであり、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質は前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは、前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能である、ステップ；並びに
複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記蛋白質と前記標的分子との結合、並びに、前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料及び前記複数の基板のポリヌクレオチドに接触させるステップ；
により行われる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記基板上の前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を検出するステップが、
複数のラベルされた分子を提供するステップであり、各ラベルされた分子が、前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合する分子、及び、ラベル信号を与えるラベル化合物を含み、該ラベル化合物が１つのラベルされた分子に結合され、各ラベルされた分子が互いから検出可能な程度に区別可能である、ステップ；
前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体と前記複数のラベルされた分子との結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のラベルされた分子を前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に接触させるステップ；並びに、
前記基板上の前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に結合した前記複数のラベルされた分子から前記ラベル信号を検出するステップ；
により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラベル化合物が金属ナノ粒子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の蛋白質要素が抗体である、請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的は複数の標的であり、該標的は少なくとも１つの標的のポリヌクレオチドを含み、基板に結合された基板のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と組み合わせるステップが、
基板に結合された複数の基板のポリヌクレオチドを提供するステップであり、各基板のポリヌクレオチドが配列特異的であり、互いから位置的に区別できる、ステップ；
前記少なくとも１つの標的のポリヌクレオチドに特異的に結合する少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドを提供するステップであり、各ラベルされたポリヌクレオチドは互いから結合的に区別可能である、ステップ；
少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチドを提供するよう前記ラベルされたポリヌクレオチドと前記標的のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドを前記試料と接触させるステップであり、前記少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチドは、配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る、ステップ；
蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含んだ少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を提供するステップであり、前記蛋白質は前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは、配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能であり、各蛋白質は、各ラベルされたポリヌクレオチドから結合的に区別可能であり、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は各ラベルされた標的のポリヌクレオチドから結合的に区別可能である、ステップ；
少なくとも1つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記蛋白質と前記標的との結合を可能にする間及び条件下で、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を前記試料と接触させるステップ；並びに、
前記少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチドと対応する基板のポリヌクレオチドとの結合、並びに、前記少なくとも１つのコード化ポリヌクレオチドと対応する基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチド及び前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を前記複数の基板のポリヌクレオチドと接触させるステップ；
により行われる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記基板上の前記複数の空間的に置かれた基板のポリヌクレオチドに結合した前記ラベルされた標的のポリヌクレオチドを検出するステップをさらに含む方法。
【請求項１３】
前記基板上の前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を検出するステップが、
複数のラベルされた蛋白質を提供するステップであり、各ラベルされた分子が、前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合する分子要素、及び、ラベル信号を与えるラベル化合物を含み、該ラベル化合物が１つのラベルされた分子に結合される、ステップ；
前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体と前記複数のラベルされた分子との結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のラベルされた分子を前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に接触させるステップ；並びに、
前記基板上の前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に結合した前記複数のラベルされた蛋白質から前記ラベル信号を検出するステップ；
により行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ラベル化合物が、前記蛋白質に結合した金属ナノ粒子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の蛋白質要素が抗体である、請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
基板のポリヌクレオチドが結合された基板；及び
蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質であって、前記蛋白質は標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは前記基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質；
を含む、試料内の標的分子を検出するシステム。
【請求項１７】
前記標的に特異的に結合する分子、及び、前記蛋白質に結合され、ラベル信号を与えるラベル化合物を含んだラベルされた分子をさらに含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記標的が複数の標的である請求項１６に記載のシステムであって、
複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板であり、前記基板に結合された前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち各ポリヌクレオチドが配列特異的で互いから位置的に区別できる、複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板；及び、
複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質であり、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質は前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは、前記基板に結合された複数のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できるポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能である、複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質；
を含むシステム。
【請求項１９】
複数のラベルされた分子であって、各ラベルされた分子が、前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合する分子、及び、前記蛋白質要素に結合され、ラベル信号を与えるラベル化合物を含み、各ラベルされた分子が互いから検出可能な程度に区別可能である、複数のラベルされた分子をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記標的が、少なくとも１つの標的のポリヌクレオチドを含む複数の標的である請求項１６に記載のシステムであって、
複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板であり、各基板のポリヌクレオチドが配列特異的で互いから位置的に区別できる、複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板；
前記少なくとも１つの標的のポリヌクレオチドに特異的に結合する少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドであり、各ラベルされたポリヌクレオチドは互いから結合的に区別可能であり、各ラベルされたポリヌクレオチドは、前記複数の空間的に置かれた基板のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するラベルされた標的のポリヌクレオチドを生成するためにある、少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチド；
蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含んだ少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質であり、前記蛋白質は前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能である、少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質；を含み、
各蛋白質は各ラベルされたポリヌクレオチドから結合的に区別可能であり、
各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は各ラベルされた標的のポリヌクレオチドから結合的に区別可能である、システム。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの標的に特異的に結合する分子、及び、前記分子に結合され、ラベル信号を与えるラベル化合物を含む少なくとも１つのラベルされた分子をさらに含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
基板に結合された複数の基板のポリヌクレオチドを提供するステップであって、各基板のポリヌクレオチドが配列特異的であり、互いから位置的に区別できる、ステップ；
複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を提供するステップであって、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質は前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは、前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能である、ステップ；
前記抗体と前記標的との結合、従って、複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体の提供を可能にする間及び条件下で、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体を前記試料に接触させるステップ；並びに
前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板に結合された前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を前記複数の基板のポリヌクレオチドと接触させ、従って、前記基板に結合した複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記複数の標的を選別するステップ；
を含む、複数の標的から標的を選別する方法。
【請求項２３】
前記標的が細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板であって、前記基板に結合された前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち各ポリヌクレオチドが配列特異的で互いから位置的に区別できる、複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板；及び、
複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質であって、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質は前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは、前記基板に結合された複数のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できるポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質は互いから結合的に区別可能であり、各コード化ポリヌクレオチドは互いから結合的に区別可能である、複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質；
を含む、複数の標的を選別するシステム。
【請求項２５】
試料流体内の１又は複数の標的を検出するマイクロ流体アレイであって、
前記試料流体を保有するためのマイクロ流体特徴を有するマイクロ流体要素、及び
複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板要素であり、前記基板のポリヌクレオチドは配列特異的で位置的に区別でき、前記基板要素は、前記試料流体を分析するために前記マイクロ流体要素の前記マイクロ流体特徴と共同して操作可能である、基板要素を含み、
前記基板のポリヌクレオチドのそれぞれが、別の基板のポリヌクレオチドの配列に対して直交性の配列から成る、マイクロ流体アレイ。
【請求項２６】
請求項２５に記載のマイクロ流体アレイを用いて請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含む、試料流体内の１又は複数の標的を検出する方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載のマイクロ流体アレイを用いて請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含む、試料流体内の１又は複数の標的を検出する方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載のマイクロ流体アレイを用いて請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含む、試料流体内の１又は複数の標的を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的試料等の試料内の１又は複数の標的、特にバイオマーカーの検出に関する。より明確には、標的を検出及び／又は選別する方法並びにシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的、特にバイオマーカーの高感度な検出はこれまで、生物学的分子解析の分野において、特に複数の標的の検出に向けられた場合に挑戦であった。病理検査のためであろうと基本的な生物学の勉強のためであろうと、異なる種類の医用材料及び生体分子の検出にはいくつかの方法が一般的に使用される。
【０００３】
単一の生物学的標的の検出に対して最も一般的に研究室で使用される技術の一部には、ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロット、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、及び、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。これらの方法はこれまで、組織等の生物学的試料内の１又は複数のバイオマーカーを検出する能力を提供し、診断目的にも適している。
【０００４】
しかし、現在の世界的な組織のゲノム分析及びプロテオミクス分析は、多くのヒト癌における分子レベルの理解に衝撃を与えている。遺伝子発現もプロテオミクスのデータもまとめる研究は特に有益である。そのようなマルチパラメータのデータセットは、癌の始まり及び進行を規定する乱された制御ネットワークを明らかにし始めている（Lin,  B.;  White,  J.  T.;  Lu,  W.;  Xie,  T.;  Utleg,  A.  G.;  Yan,  X.;  Yi,  E.  C.;  Shannon,  P.;  Khretbukova,  I;  Lange,  P.  H.;  Goodlett,  D.  R.;  Zhou,  D.;  Vasicek,  T.  J.;  Hood,  L.  Cancer  Res.  2005,  65,  3081-3091.  Kwong,  K.Y.;  Bloom,  G.  C.;  Yang,  I.;  Boulware,  D.;  Coppola,  D.;  Haseman,  L.;  Chen,  E.;  McGrath,  A.;  Makusky,  A.  J.;  Taylor,  J.;  Steiner,  S.;  Zhou,  J.;  Yeatman,  T.  J.;  Quackenbush,  J.  Genomics  2005,  86,  142-158.  Huber,  M.;  Bahr,  L;  Kratzchmar,  J.  R.;  Becker,  A.;  Muller,  E.-C;  Donner,  P.;  Pohlenz,  H.-D.;  Schneider,  M.  R.;  Sommer,  A.  Molec.  Cell.  Proteomics  2004,  3,  43-55.  Tian,  Q.;  Stepaniants,  S.  B.;  Mao,  M.;  Weng,  L.;  Feetham,  M.  C;  Doyle,  M.  J.;  Yi,  E.  C;  Dai,  H.;  Thorsson,  V.;  Eng,  J.;  Goodlett,  D.;  Berger,  J.  P.;  Gunter,  B.;  Linseley,  P.  S.;  Stoughton,  R.  B.;  Aebersold,  R.;  Collins,  S.  J.;  Hanlon,  W.  A.;  Hood,  L.  E.  Molec.  Cell.  Proteomics  2004,  3,  960-969.  Chen,  G;  Gharib,.  T.  G;  Huang,  C-C;  Taylor,  J.M.  G;  Misek,  D.  E.;  Kardia,  S.  L.  R.;  Giordano,  T.  J.;  Iannettoni,  M.  D.;  Orringer,  M.  B.;  Hanash,  S.  M.;  Beer,  D.  G  Molec.  Cell.  Proteomics  2002,  1,  304-313）。癌等の複雑な疾患におけるこの新たな状況、及び、新たな制癌剤の見込みの出現は（Prados,  M.;  Chang,  S.;  Burton,  E.;  Kapadia,  A.;  Rabbitt,  J.;  Page,  M.;  Federoff,  A.;  Kelly,  S.;  Fyfe,  G  Proc.  Am.  Soc.  Clin.  Oncology  2003,  22,  99.  Rich,  J.  N.;  Reardon,  D.  A.;  Peery,  T.;  Dowell,  J.  M.;  Quinn,  J.  A.;  Penne,  K.  L.;  Wikstrand,  C  J.;  van  Duyn,  L.  B.;  Dancey,  J.  E.;  McLendon,  R.  E.;  Kao,  J.  C;  Stenzel,  T.  T.;  Rasheed,  B.  K.  A.;  Tourt-Uhlig,  S.  E.;  Herndon,  J.  E.;  Vredenburgh,  J.  J.;  Sampson,  J.  H.;  Friedman,  A.  H.;  Bigner,  D.  D.;  Friedman,  H.  S.  J.  Clin.  Oncology  2004,  22,  133-142）、臨床病理学に対する新たな要求を提起している（Mellinghoff,  I.  K.;  Wang,  M.  Y.;  Vivanco,  I.;  Haas-Kogan,  D.  A.;  Zhu,  S.;  Dia,  E.  Q.;  Lu,  K.  V.;  Yoshimoto,  K.;  Huang,  J.  H.  Y.;  Chute,  D.  J.;  Riggs,  B.  L.;  Horvath,  S.;  Liau.,  L.  M.;  Cavenee,  W.  K.;  Rao,  P.  N.;  Beroukhim,  R.;  Peck,  T.  C;  Lee,  J.  C;  Sellers,  W.  R.;  Stokoe,  D.;  Prados,  M.;  Cloughesy,  T.  R;  Sawyers,  C.  L.;  Mischel,  P.  S.  N.  Engl.  J.  Med.  2006,  353,  2012-2024）。例えば、伝統的な病理学の実践（すなわち、組織の顕微鏡分析）は、新たな癌分子の治療に対する有望なレスポンダーをノンレスポンダーと区別しない（Betensky,  R.  A.;  Louis,  D.  N.;  Cairncross,  J.  G  J.  Clin.  Oncology  2002,  20,  2495-2499）。少なくとも２つの治療に対して有望なレスポンダーを識別するために少数パラメータ（ｐａｕｃｉｐａｒａｍｅｔｅｒ）の分子測定が利用されるといった最近の例が存在する（Hughes,  T.;  Branford,  S.,  2003.  Semin  Hematol.  2  Suppl  2,  62-68.  Lamb,  J.;  Crawford,  E.  D.;  Peck,  D.;  Modell,  J.  W.;  Blat,  I.  C;  Wrobel,  M.  J.;  Lerner,  J.;  Brunet,  J.  P.;  Subramanian,  A.;  Ross,  K.  N.;  Reich,  M.;  Hieronymus,  H.;  Wei,  G.;  Armstrong,  S.  A.;  Haggarty,  S.  J.;  Clemons,  P.  A.;  Wei,  R.;  Carr,  S.  A.;  Lander,  E.  S.;  Golub,  T.  R.,  Science  2006,  313,  (5795),  1929-1935.  Martin,  M.,  Clin.  Transl  Oncol.  8,  (1  ),  7-14.  Radich,  J.  P.;  Dai,  H.;  Mao,  M.;  Oehler,  V.;  Schelter,  J.;  Druker,  B.;  Sawyers,  C.  L.;  Shah,  [Nu].;  Stock,  W.;  Willman,  C.  L.;  Friend,  S.;  Linsley,  P.  S.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  2006,  103,  (8),  2794-2799）。しかし、シングルパラメータ測定が基準になることはありそうもない。その代わり、分子診断の分子治療とのカップリングは、患者を適切な治療又は治療の組合せに向けるために使用することができるマルチパラメータ（例えば、細胞、ｍＲＮＡ、及び蛋白質）のバイオマーカーパネルの測定を最終的に必要とするであろう。
【０００５】
現在、患部組織からのマルチパラメータのバイオマーカーパネルの測定には、顕微鏡分析、マイクロアレイデータ（Mischel,  P.  S.;  Cloughesy,  T.  F.;  Nelson,  S.  F.  Nature  Rev.  Neuroscience  2004,  5,  782-  794）、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット（Mellinghoff,  I.  K.;  Wang,  M.  Y.;  Vivanco,  I.;  Haas-Kogan,  D.  A.;  Zhu,  S.;  Dia,  E.  Q.;  Lu,  K.-  V.;  Yoshimoto,  K.;  Huang,  J.  H.  Y;  Chute,  D.  J.;  Riggs,  B.  L.;  Horvath,  S.;  Liau.,  L.  M.;  Cavenee,  W.  K.;  Rao,  P.  N.;  Beroukhim,  R.;  Peck,  T.  C;  Lee,  J.  C.;"  Sellers,  W.  R.;  Stokoe,  D.;  Prados,  M.;  Cloughesy,  T.  F.;  Sawyers,  C.  L.;  Mischel,  P.  S.  N.  Engl  J.  Med  2006,  353,  2012-  2024）、及び他の方法の組合せが要求される。収集されたデータは、診断を生じるために、癌の経路モデル等のある疾患に対するモデル内で共に統合される（Weinberg,  R.  A.,  Cancer  Biology.  Garland  Science:  2006）。現在、これらの種々の測定を行うには、外科的に切除された組織試料が必要である。そのような生検の異種性は、細胞、ｍＲＮＡ、及び蛋白質の種々の測定が組織の異なる領域からそれぞれ行われるため、重大なサンプリング誤差を引き起こす恐れがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書において提供されているのは、基板のポリヌクレオチドと組み合わせた、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の使用に基づく方法及びシステムである。本明細書において開示されているポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、標的に特異的に結合する蛋白質、及び、該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドから成る。該コード化ポリヌクレオチドは、基板のポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。本明細書において開示されている基板のポリヌクレオチドは、基板に結合され、さらに、前記コード化ポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。
【０００７】
それだけに限らないが、細胞、蛋白質、及び／若しくはポリヌクレオチド等の標的、特にバイオマーカーを検出並びに／又は分離するアッセイを含めたいくつかのアッセイを、本明細書に開示された方法及びシステムに従い行うことができる。特に、本明細書に開示された方法及びシステムを用いたアッセイにおいて、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質が、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体において標的に特異的に結合するために使用され、基板のポリヌクレオチドが、検出のために、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体を基板に結合させるために使用される。本開示を読んだ後に当業者には明らかになるように、本明細書において開示された方法及びシステムにより、特にマイクロ流体環境におけるいくつかのアッセイの有利な実行が可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によると、試料内の標的を検出する方法及びシステムが開示されており、当該方法及びシステムは、基板に結合された基板のポリヌクレオチドと、前記標的に特異的に結合する蛋白質及び前記基板に結合された基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するコード化ポリヌクレオチドから成るポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質との組み合わされた使用に基づいている。
【０００９】
当該方法において、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と前記標的との結合、並びに、前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にし、従って、前記基板のポリヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体の提供を可能にする間及び条件下で、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、前記試料及び前記基板のポリヌクレオチドに接触される。当該方法において、前記基板のポリヌクレオチドに結合した前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体は、次に、本開示を読んだ後に当業者により明らかになる検出技術により検出される。
【００１０】
当該システムでは、基板のポリヌクレオチドが結合された基板が、標的に特異的に結合する蛋白質及び前記基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するコード化ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と共に提供される。
【００１１】
第２の態様によると、試料内の複数の標的を検出する方法及びシステムが開示され、当該方法及びシステムは、基板に結合された複数の基板のポリヌクレオチドと複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体との組み合わされた使用に基づいている。
【００１２】
当該方法及びシステムにおいて、前記基板のポリヌクレオチドのそれぞれは、配列特異的であり、互いから位置的に区別できる。当該方法及びシステムでは、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質のそれぞれが、前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合する蛋白質、及び、前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するコード化ポリヌクレオチドから成る。さらに、当該方法及びシステムにおいて、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能（ｂｉｎｄｉｎｇｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ）である。
【００１３】
当該方法では、複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記抗体と前記標的との結合、並びに、前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体は、前記試料及び前記複数の基板のポリヌクレオチドに接触される。当該方法において、前記基板上の前記複数の基板のポリヌクレオチドに結合した前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体は、次に、本開示を読んだ後に当業者により明らかになる検出技術により検出される。
【００１４】
当該システムには、前記複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板が、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体と共に含まれている。
【００１５】
第３の態様によると、試料内の複数の標的を検出する方法及びシステムが開示され、前記標的は、少なくとも１つの標的のポリヌクレオチドを含んでいる。当該方法及びシステムは、基板に結合された複数の基板のポリヌクレオチドと少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された抗体と少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドとの組み合わされた使用に基づいている。
【００１６】
当該方法及びシステムにおいて、各基板のポリヌクレオチドは、配列特異的であり、互いから位置的に区別できる。当該方法及びシステムでは、前記少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドは前記少なくとも１つの標的のポリヌクレオチドに特異的に結合し、各ラベルされたポリヌクレオチドは互いから結合的に区別可能である。当該方法及びシステムにおいて、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合する蛋白質、及び、前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するコード化ポリヌクレオチドから成る。当該方法及びシステムにおいて、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは互いから結合的に区別可能であり、各蛋白質は、さらに、各ラベルされたポリヌクレオチドから結合的に区別可能であり、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は各ラベルされた標的のポリヌクレオチドから結合的に区別可能である。
【００１７】
当該方法において、少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチドを提供するよう前記ラベルされたポリヌクレオチドと前記標的のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドは前記試料と接触され、前記少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチドは、配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。さらに、当該方法では、少なくとも1つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記蛋白質と前記標的との結合を可能にする間及び条件下で、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は前記試料と接触される。さらに、当該方法において、前記少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチドと対応する基板のポリヌクレオチドとの結合、並びに、前記少なくとも１つのコード化ポリヌクレオチドと対応する基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記少なくとも１つのラベルされた標的のポリヌクレオチド及び前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体は、前記複数の基板のポリヌクレオチドと接触される。当該方法において、前記基板上の前記複数の空間的に置かれた基板のポリヌクレオチドに結合した前記ラベルされた標的のポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体は、次に、本開示を読んだ後に当業者により明らかになる検出技術の使用により検出される。
【００１８】
当該システムには、前記複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板が、前記少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチド及び前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と共に含まれている。当該システムにおいて、当該システムの前記少なくとも１つのラベルされたポリヌクレオチドは、配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するラベルされた標的のポリヌクレオチドを生成するためにある。
【００１９】
第４の態様によると、複数の標的から標的を選別する方法及びシステムが開示されており、当該方法及びシステムは、基板に結合された複数の基板のポリヌクレオチドと複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体との組み合わされた使用に基づいている。いくつかの実施形態において、前記標的は細胞であり、当該方法及びシステムは複数の細胞を選別するためのものである。
【００２０】
当該方法及びシステムにおいて、各基板のポリヌクレオチドは、配列特異的で互いから位置的に区別できる。当該方法及びシステムでは、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、蛋白質及び該蛋白質に結合されたコード化ポリヌクレオチドから成り、前記蛋白質は前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドは前記複数の基板のポリヌクレオチドのうち配列特異的で位置的に区別できる基板のポリヌクレオチドに特異的に結合する。当該方法及びシステムにおいて、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能である。
【００２１】
当該方法において、前記抗体と前記標的との結合、従って、複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体の提供を可能にする間及び条件下で、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体は前記試料に接触される。当該方法では、前記コード化ポリヌクレオチドと前記基板に結合された前記基板のポリヌクレオチドとの結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体は、次に、前記複数の基板のポリヌクレオチドと接触され、従って、前記基板に結合された複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体における前記複数の標的は選別される。
【００２２】
当該システムには、前記複数の基板のポリヌクレオチドが結合された基板が、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体と共に含まれている。
【００２３】
第５の態様によると、試料流体内の１又は複数の標的を検出するアレイが開示されており、当該アレイは基板を含み、複数の基板のポリヌクレオチドが前記基板の要素に結合され、前記基板のポリヌクレオチドは配列特異的で位置的に区別でき、前記基板のポリヌクレオチドのそれぞれは、別の基板のポリヌクレオチドの配列に対して直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）の配列から成る。
【００２４】
第６の態様によると、本明細書に開示された方法、システム、及びアレイそれぞれの前記基板は、流体を保有するためのマイクロ流体特徴を含んだマイクロ流体要素と共同して操作可能である。従って、当該方法において、前記コード化ポリヌクレオチド及び／又は前記ラベルされたポリヌクレオチド標的を前記基板のポリヌクレオチドと少なくとも接触させることは、前記マイクロ流体特徴により保有された流体において行うことができる。さらに、本明細書に開示された当該システムのそれぞれが、前記マイクロ流体特徴を含んだマイクロ流体要素をさらに含む。
【００２５】
本明細書に開示された方法及びシステムの第１の利点は、本明細書に開示された方法及びシステムそれぞれにおいて、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の前記標的への接触を前記蛋白質が前記基板に結合する前に行うことができるということである。結果として、細胞等の標的を用いて、前記蛋白質の結合部位への前記標的の接近を前記基板により減ずることはできず、前記蛋白質も前記標的分子も前記接触を行う際に完全な配向性の自由を有し、従って、開示された方法及びシステムで行われるいかなる関連するアッセイの感度も改善する。
【００２６】
本明細書に開示された方法及びシステムの第２の利点は、本明細書に開示された方法及びシステムそれぞれにおいて、前記ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を溶液内で構築することができ、その結果、結合後に基板を乾かすこと及び（例えば１００℃近くまで）上昇された温度を含む従来技術の方法に付随する蛋白質変性の影響を最小限にすることができるということである。それらの従来技術の方法のうちいくつかにおいて、微細なピンを介したガラスの基板上へのスポッティングによって蛋白質アレイは生じるので、製造者のステップは、前記蛋白質が乾燥し、従って変性しないことを確実にするために密接にモニターされる必要がある。それどころか、本明細書に開示された方法及びシステムにおいて、乾燥及び変性する蛋白質をゼロになるまで最小限にするよう前記蛋白質は溶液において前記基板上に構築することができる。
【００２７】
本明細書に開示された方法及びシステムの第３の利点は、本明細書に開示された方法及びシステムそれぞれにおいて、生物付着、すなわちコード化されていない蛋白質の前記基板への非特異的な結合が、従来技術の蛋白質ベースの方法及びシステムと比較した場合に非常に減少し、従って、より能率的な結合を可能し、さらに、検出が所望された場合に、試料内の標的分子における定量検出が、従来技術の抗体ベースの方法及びシステムと比較した場合により正確であるということである。
【００２８】
本明細書に開示された方法及びシステムの第４の利点は、従来技術の蛋白質ベースの方法及びシステムと比較して、より多くの標的の多重化された検出及び／又は分離を行うことができるということである。これは、いくつかの要因によるものである。第１の要因は、基板に結合した基板のポリヌクレオチドと組み合わせたポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の使用に付随する減少した生物付着により、基板に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体におけるより能率的な結合及び検出が可能になるということである。第２の要因は、本明細書に開示された方法及びシステムにおける基板のポリヌクレオチドのサイズが、従来技術の蛋白質ベースの方法及びシステムに使用される対応するアンカリング分子よりもはるかに小さいことである。結果として、従来の技術と比較してより高い密度の蛋白質（例えば、ＥＬＩＳＡのような技術の９６ウェルプレートに対して平方インチあたり約５０００個のスポット）を基板上に組み立てることができる。
【００２９】
本明細書に開示された方法及びシステムの第５の利点は、本明細書に開示された方法及びシステムそれぞれにおいて、異なる表面マーカーを有する、ポリヌクレオチド、蛋白質、及び細胞等のバイオマーカーを含めた化学的に異なる標的を単一の基板において検出及び分離することが可能であるということである。従って、本明細書に開示された方法及びシステムにより、同じ環境内の遺伝子、蛋白質、及び細胞の多重化された検出及び／又は分離が可能になる。
【００３０】
本明細書に開示された標的を選別する方法及びシステムのさらなる利点は、本明細書に開示された方法及びシステムにより、選別された細胞が選別後の分析に直ちに利用できるようになることであり、このことは、標的が、選別後の細胞における遺伝子及び蛋白質発現の分析に利用できるようになる細胞である実施形態において特に重要性がある。
【００３１】
診断アッセイを行うために使用される場合の本明細書に開示された方法及びシステムのさらなる利点は、組織の同じ領域由来の多数のバイオマーカーの多重化された検出を単一の基板上で行うことができるということである。診断アッセイを行うために使用される方法及びシステムのさらなる利点は、バイオマーカーが細胞、ｍＲＮＡ、及び蛋白質等の化学的に性質が異なるバイオマーカーであり得ること、並びに、検出が定量的な検出及び／又は性質的な検出であり得るということである。さらに、診断アッセイを行うために使用される場合の本明細書に開示された方法及びシステムのさらなる利点は、当該方法及びシステムによって複雑なゲノム及び／又はプロテオミクスの特性の検出が可能になり、その結果、所定の特性と比較した場合に、癌等の乱された制御ネットワークにより特徴づけられた疾患に対する診断上の指標を提供することである。診断アッセイを行うために使用される場合の本明細書に開示された方法及びシステムの別の利点は、マルチパラメータの様式で少量の生物学的試料を分析し、（ＤＮＡにより表される）遺伝子、蛋白質、及び細胞といった3種類の関連がある生物学的情報の領域の橋渡しをすることができる可能性である。
【００３２】
基板がマイクロ流体要素と共同して操作可能である場合の本明細書に開示された方法及びシステム全てのさらなる著しい利点は、従来技術の対応する方法及びシステムと比較した場合に、試料サイズが非常に減り、時間が短縮され、ステップ数が減少した多重化されたマルチパラメータアッセイの実行が可能になることである。特に、本明細書に開示された多重化されたマルチパラメータのマイクロ流体における方法及びシステムは、標的が組織由来のバイオマーカーである場合に、分析を行うのに必要とされる減少した量の試料を考慮すると、マウスを安楽死させる必要性を最小限に抑えるため特に有利である。さらに、本明細書に開示されたマイクロ流体環境で行われる方法及びシステムにより、少量の試料に含まれる標的の検出が可能になり、下は約１０フェムトモルに至るまでの濃度で試料に存在する分子の検出が可能になる。
【００３３】
さらに、診断アッセイを行うために使用され、基板がマイクロ流体要素と共同して操作可能である場合の本明細書に開示された方法及びシステムのさらなる利点は、ポリヌクレオチド、蛋白質、及び細胞等の化学的に性質が異なるバイオマーカーを含めたバイオマーカーの多重化された検出が可能になることである。本明細書に開示された診断方法及びシステムのさらなる追加の利点は、基板がマイクロ流体要素と共同して操作可能である実施形態において、異種起源の組織における同じ微細な領域由来の単一試料に対する多重化されたマルチパラメータアッセイの実行が可能になることである。結果として、本明細書に開示された方法及びシステムは、従来技術における複数の化学的に性質が異なるバイオマーカーの検出に対する診断方法及びシステムの種々の測定を行うのに必要とされる異種の生検に付随するサンプリング誤差も最小限にする。
【００３４】
本開示における１又は複数の実施形態の詳細は、付随する図面及び下記の説明において規定される。他の特徴、目的、及び利点は、前記説明及び図面から、並びに、特許請求の範囲から明らかになる。
【００３５】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付の図面は、本開示の１又は複数の実施形態を例証し、詳細な説明と共に、本開示の原理及び実行を説明するよう貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を調製するために利用される結合ストラテジーの概略図である。パネルａは、抗体を調製するための反応の概略図であり；パネルｂは、ポリヌクレオチドを調製するための反応の概略図であり；パネルｃは、パネルａに示されている抗体とパネルｂに示されているポリヌクレオチドのコンジュゲーションから生じるポリヌクレオチドによりコード化された抗体の図であり；パネルｄは、抗体に結合したポリヌクレオチド鎖Ａ’の数をパネルａに示されている抗体に対する結合分子の量を調整することにより調節することができると示したゲル移動度シフトアッセイを示している。ここで、レーンＩ〜ＩＶは、それぞれ３００：１、１００：１、５０：１、２５：１という結合分子対抗体の化学量論比に対応する。
【図２】本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質のコンジュゲーションの化学作用における概略図である。パネルａは、ポリヌクレオチドと蛋白質ストレプトアビジンとのコンジュゲーションの化学作用における概略図を示し；パネルｂは、ストレプトアビジンのリガンドであるビオチン含有蛋白質とのポリヌクレオチドによりコード化されたストレプトアビジンの構築を示しており；ＳＡはストレプトアビジン蛋白質を示し；ビオチン−蛋白質はリガンドビオチンを含有した蛋白質を示している。
【図３】本明細書に開示されている細胞表面マーカー認識のためのポリヌクレオチドによりコード化された抗体のポリヌクレオチド荷重の最適化を例示した図を示している。パネルａは、ポリヌクレオチドを抗体に結合させていないＦＩＴＣ  α−ＣＤ９０．２抗体とα−ＣＤ９０．２／ＦＩＴＣ−ポリヌクレオチドコンジュゲート（ＦＩＴＣ−ＤＮＡでラベルされたα−ＣＤ９０．２）を、抗体もポリヌクレオチドによりコード化された抗体も有していない（非標識の）負の対照と共に比較したＦＡＣＳプロットを示している。ＦＩＴＣチャネルに対応する蛍光強度がｘ軸上に与えられ、ｙ軸はヌル蛍光チャネルに対応しており；パネルｂは、抗体に結合した異なる数のＦＩＴＣ−ポリヌクレオチドに対する平均蛍光強度のヒストグラムを示し；ｘ軸上には抗体に結合したポリヌクレオチドの数が報告され、ｙ軸上には平均蛍光強度が報告されている。
【図４】本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体と基板のポリヌクレオチドとの組み合わされた使用における概略図である。
【図５】ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質がストレプトアビジンビオチンシステム、標的、及び細胞に基づいている方法及びシステムの実施形態を例示している。パネルａは、図２によるポリヌクレオチドによりコード化されたストレプトアビジンの構築を示しており、そこでビオチン含有蛋白質は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であり、関心のある細胞がガラス基板に曝露される前のポリヌクレオチドによりコード化されたストレプトアビジンの基板上への事前構築である。パネルｂは、溶液内での細胞に対するポリヌクレオチドによりコード化されたＭＨＣの結合に続くマイクロアレイの曝露を示している。
【図６】本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体及び基板のポリヌクレオチドを用いて複数の標的を検出する方法を例示している。パネルａは、基板のポリヌクレオチドと組み合わせた本明細書に開示されている複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体の組み合わされた使用における概略図を示している。パネルｂは、本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体及び基板のポリヌクレオチドを用いて行われる関連するイムノアッセイを示している。
【図７】コード化された本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体及び基板のポリヌクレオチドを用いた空間的にコード化された蛋白質アレイを示している。パネルａは、（Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４、又はＡｌｅｘａ６４７の染料でラベルされ）それぞれポリヌクレオチドＡ１’、Ｂ１’、及びＣ１’でタグを付けられた３つの同じヤギα−ヒトＩｇＧを用いて行われるイムノアッセイを示しており；白いバーにより示されたパネルａのアレイ部分由来のイムノアッセイの結果における概略図を示し；図に示されているスケールバーは１ｍｍに一致する。
【図８】本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体と基板のポリヌクレオチドとの組み合わされた使用から生じる非特異的蛋白質吸収の最小化を示したイムノアッセイの結果を示している。パネルａは、それぞれが特異的ポリヌクレオチドとコンジュゲートしたヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８／Ａ１’及びヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７／Ｃ１’、並びに、付属するＤＮＡを有さなかったヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ５９４に同時に曝露されたマイクロアレイを示しており、パネルｂは、白いバーにより示されたパネルａのアレイ部分由来のイムノアッセイの結果における概略図を示し；図に示されているスケールバーは１ｍｍに一致する。
【図９】基板のポリヌクレオチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの直交化の結果を例示しており、各基板のポリヌクレオチドは他のポリヌクレオチドに直交性であり、その対応する抗体の特異的なポリヌクレオチドに結合する。パネルａは、３種類の基板のポリヌクレオチドで印刷され、該３種類の基板のポリヌクレオチドのうち２つに相補的な２種類のポリヌクレオチドによりコード化された抗体に曝露されたガラススライドを示しており；パネルｂは、Ａ１のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのハイブリダイゼーション、抗体の特異的なポリヌクレオチドに相補的な２種類の基板のポリヌクレオチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのハイブリダイゼーションから形成された二次構造を示しており；パネルｃは、各鎖は互いに及びその対応する補体に直交性であるという制約を有した、さらなる基板のポリヌクレオチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの作製を示しており；パネルｄは、５’から３’末端に列挙された６種類の直交性の配列の組を示している。
【図１０】本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体及び基板のポリヌクレオチドを用いて多重化された細胞選別を行う方法を例示している。パネルａは、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体が細胞と組み合わされ、次にその混合物がスポットされたＤＮＡアレイのマイクロチップ上に導入されるホモジニアスアッセイを示しており；パネルｂは、スポットされたＤＮＡアレイ上に構築された後に細胞の導入が続くポリヌクレオチドによりコード化された抗体を示しており；パネルｃは、多重化された細胞選別実験の明視野顕微鏡画像及び蛍光顕微鏡画像を示しており、１：１のｍＲＦＰ発現Ｔ細胞（赤いチャネル）及びＥＧＦＰ発現Ｂ細胞（緑のチャネル）から成る混合物が、それぞれＡ１’及びＣ１’を有するα−ＣＤ９０．２抗体及びα−Ｂ２２０抗体のコード化に対応するスポットＡ１及びＣ１上へ空間的に層別化されており；パネルｄは、マウスから回収された初代細胞の多重化された選別の蛍光顕微鏡写真である。１：１のＥＧＦＰ遺伝子導入マウス由来のＣＤ４＋細胞、及び、ｄｓＲｅｄ遺伝子導入マウス由来のＣＤ８＋細胞から成る混合液が、ポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲートα−ＣＤ４−Ａ１’及びα−ＣＤ８−Ｃ１’をそれぞれ利用することによって、スポットＡ１及びＣ１に分離されている。
【図１１】細胞選別及び／又は化学的に異なる分子の同時の検出に対する、本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体と基板のポリヌクレオチドとの組み合わされた使用における概略図である。
【図１２】本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態に従い複数の標的を検出するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の能力を例示している。パネルａは、ポリヌクレオチドＣ１でコード化された、抗原ＩＬ４に特異的な抗体、及び、蛍光でラベルされたポリヌクレオチドＢ１に相補的なポリヌクレオチドに曝露されたマイクロアレイを示しており；パネルｂは、アッセイを行うために使用される本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態における概略図を示しており；パネルｃは、白いバーにより同定されたパネルＡの部分に例示されているアッセイの結果における概略図を示している。
【図１３】同時の、細胞捕獲並びに遺伝子及び蛋白質のマルチパラメータ検出を実証した顕微鏡法画像を示しており、図に示されているスケールバーは３００μｍに一致する。
【図１４】マイクロ流体において構築された、本明細書に開示されている標的を検出する方法の実施形態に使用される蛋白質アレイを示している。
【図１５】マイクロ流体チャネル内で実行したＤＮＡテンプレート蛋白質イムノアッセイの蛍光画像及び明視野画像を示しており、６００μｍ幅のチャネルが白い点線で描写されている。パネルａは、本明細書に開示されている基板のポリヌクレオチドと組み合わせてポリヌクレオチドによりコード化された抗体を用いて行われる２つのパラメータのイムノアッセイを示しており；パネルｂは、本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態における、蛍光ベースの技術を使用して行われた標的の濃度系列の検出を示しており；パネルｃは、本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態における、可視化及び増幅ストラテジーとしてＡｕ無電解メッキを使用して行われた標的の濃度系列の検出を示している。
【図１６】ポリヌクレオチドによりコード化された抗体と基板のポリヌクレオチドとの組み合わされた使用における概略図であり、前記ポリヌクレオチドによりコード化された抗体は、本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態に従い金属ナノ粒子でラベルされている。
【図１７】図１６の組み合わされた使用におけるさらなる概略図であり、本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態に従い、基板に結合され、金属ナノ粒子でラベルされたポリヌクレオチドによりコード化された抗体標的の複合体を示している。
【図１８】本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態に従い、金属ナノ粒子でラベルされたポリヌクレオチドによりコード化された抗体からの信号を検出する装置及び関連する方法の概略図である。
【図１９】本明細書に開示されている方法及びシステムを用いた、可視化及び増幅ストラテジーとしてＡｕ無電解メッキを使用して行われたプロテオミクスの検出を示している。パネルａは、約１００ｐＭの濃度での検出を示しており；パネルｂは、約１００フェムトＭの濃度での検出を示しており；パネルｃは、約１００ａｔｔｏＭの濃度での検出を示している。
【図２０】本明細書に開示されている方法及びシステムを用いた、可視化及び増幅ストラテジーとしてＡｕ無電解メッキを使用して行われたプロテオミクスの検出を示している。パネルａは、約１００ｐＭの濃度での検出を示しており；パネルｂは、約１ｐＭの濃度での検出を示しており；パネルｃは、約１０ｆＭの濃度での検出を示しており；パネルｄは、約１００ａＭの濃度での検出を示しており；パネルｅは、数えた蛋白質の数（ｙ軸）を溶液内のその濃度（ｘ軸）に相関させるヒストグラムを示している。
【図２１】本明細書に開示されている方法及びシステムを用いた、３種類の蛋白質（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）のプロテオミクスの、前記３種類の蛋白質が加えられた組織培地からの検出を示しており、該検出は、可視化及び増幅ストラテジーとしてＡｕ無電解メッキを使用して行われる。パネルａは、ＩＦＮ−γの検出を示しており；パネルｂは、ＴＮＦ−αの検出を示しており；パネルｃは、ＩＬ−２の検出を示している。
【図２２】本明細書に開示されている方法及びシステムを用いた、３種類の蛋白質（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）のプロテオミクスの、前記３種類の蛋白質が加えられた血清試料から（パネルａ）、及び、健康なヒトの血清から（パネルｂ）の検出を示しており、該検出は、可視化及び増幅ストラテジーとしてＡｕ無電解メッキを使用して行われる。
【図２３】本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態を用いた、蛋白質マーカーＰＴＥＮの較正及び定量化を例示した図である。パネルａは、パネルｂ及びｃに例示されたマイクロ流体実験から検出された信号の平均蛍光強度が例示されている図を示しており；パネルｂは、組み換えＰＴＥＮに対する較正レーンからの未加工データを示しており；パネルｃは、１つはＰＴＥＮの基礎レベルを発現するヌルＵ８７であり、もう１つは細胞試料を過剰発現するＵ−８７−ＰＴＥＮである２種類の細胞株由来の試料からの未加工の蛍光データを示している。
【図２４】本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態を用いた、タンデム型質量分析を介した血清バイオマーカー発見（パネルａ又は１）から大規模なＳＰＲ（パネルｂ又は２）を介した抗体の検証及び選択（パネルｃ又は３）、さらに臨床検証経路までの経路を例示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
試料内の標的を検出する方法及びシステムが開示されている。本明細書に開示された方法及びシステムにおいて、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を基板のポリヌクレオチドと組み合わせて使用し、試料内の１又は複数の標的を検出する。
【００３８】
「検出する」又は「検出」という用語は、本明細書において使用された場合、それだけに限らないが、試料、反応混合物、分子複合体、及び基板を含めた限られたスペース部分における標的又は信号の存在若しくは実態の決定を示している。標的又は信号の量の測定を参照する、前記測定に関する、又は、前記測定を含む場合に、検出は「定量的」であり（定量化とも呼ばれる）、それだけに限らないが、標的又は信号の量若しくは比率を決定するよう設計されたいかなる分析も含む。別の標的又は信号に対する相対存在量という点で、標的又は信号の質若しくは種類の同定を参照する、前記同定に関する、又は、前記同定を含む場合に、検出は「性質的」であって定量化されない。
【００３９】
「標的」という用語は、本明細書において使用された場合、関心のある分析物を示している。「分析物」という用語は、試料内に存在しているかどうか検出されなければならない物質、化合物、又は組成物を意味する。分析物には、それだけに限らないが生体分子、及び、特にバイオマーカーが含まれる。「生体分子」という用語は、本明細書において使用された場合、それだけに限らないが糖、アミノ酸、ペプチド蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生物細胞、生物細胞の一部、ビタミン、ホルモン等を含めた、生物学的環境に結合した物質、化合物、又は組成物を示している。「バイオマーカー」という用語は、それだけに限らないが、細胞周期の段階、健康及び疾患の状態を含めた生物学的環境の特定の状態と関連した生体分子を示している。バイオマーカーの有無、減少、増加は、特定の状態に関連しているか、又は、特定の状態を示している。
【００４０】
「試料」という用語は、本明細書において使用された場合、制限された量の何かを示し、それはより多くの量のその何かを示しており、それだけに限らないが、生物学的環境由来の流体、標本、培養物、組織、市販の組み換え蛋白質、合成化合物又はその一部を含む。
【００４１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用された場合、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はその類似体を含めた２つ以上のモノマーから成る有機ポリマーを示している。「ヌクレオチド」という用語は、プリン若しくはピリミジン塩基、及び、リン酸基に結合したリボース又はデオキシリボースの糖から成り、核酸の基本構造単位であるいくつかの化合物のうちどれも意味している。「ヌクレオシド」という用語は、デオキシリボース若しくはリボースと組み合わされたプリン又はピリミジン塩基から成り、特に核酸に存在する（グアノシン又はアデノシンとしての）化合物を意味している。「ヌクレオチド類似体」又は「ヌクレオシド類似体」という用語は、１若しくは複数の個々の原子が異なる原子又は異なる官能基と交換されたヌクレオチド又はヌクレオシドをそれぞれ意味している。従って、ポリヌクレオチドという用語は、いかなる長さのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似体の核酸並びにその断片も含んでいる。３つ以上のヌクレオチドから成るポリヌクレオチドは、ヌクレオチドオリゴマー又はオリゴヌクレオチドとも呼ばれている。
【００４２】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において使用された場合、２つ以上のアミノ酸モノマー及び／又はその類似体から成る有機ポリマーを示している。「ポリペプチド」という用語は、完全長の蛋白質及びペプチド、並びにその類似体及び断片を含めたいかなる長さのアミノ酸ポリマーも含む。３つ以上のアミノ酸から成るポリペプチドは、蛋白質オリゴマー又はオリゴペプチドとも呼ばれている。本明細書において使用された場合、「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」、又は「アミノ酸残基」という用語は、不自然な側鎖を有する合成アミノ酸及びＤ型光学異性体もＬ型光学異性体も含めた２０個の天然アミノ酸のうちどれも意味している。「アミノ酸類似体」という用語は、１又は複数の個々の原子が異なる原子、同位体、又は異なる官能基と交換されたか、さもなければその天然のアミノ酸類似体と同一であるアミノ酸を意味している。
【００４３】
「蛋白質」という用語は、本明細書において使用された場合、それだけに限らないが、他の蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、代謝物、ホルモン、ケモカイン、及び小分子を含めた他の生体分子との相互作用に関与することができる特定の二次構造及び三次構造を有するポリペプチドを示している。
【００４４】
「抗体」という用語は、本明細書において使用された場合、抗原による刺激後の活性化されたＢ細胞によって産生され、その抗原に特異的に結合して生物学的システムにおける免疫反応を促進する、並びに、一般的に２つの重鎖及び２つの軽鎖を含めた４つのサブユニットから成る蛋白質を意味している。抗体という用語は、それだけに限らないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はその断片を含めた天然及び合成の抗体を含む。例証的な抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ等が含まれる。例証的な断片には、Ｆａｂ  Ｆｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２等が含まれる。モノクローナル抗体は、特定の空間及び極性の構成の、「エピトープ」と呼ばれる別の分子１つに特異的に結合し、その結果、前記別の分子に相補的であると定義される抗体である。ポリクローナル抗体は、各モノクローナル抗体が異なる抗原エピトープに結合する、モノクローナル抗体の混合物を意味している。抗体は、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の採取等当技術分野において周知の技術によって、又は、連続的なハイブリドーマ細胞株を調製する及び分泌された蛋白質（モノクローナル）を採取することによって調製することができる。
【００４５】
「特異的な」、「特異的に」、又は「特異性」という表現は、分子の別の分子への結合に関して本明細書において使用された場合、その分子と別の分子との間に生じる認識、接触、及び、安定した複合体の形成を意味し、その分子及び別の分子のそれぞれは、他の分子との間に認識、接触、及び安定した複合体の形成を実質的により生じない又は全く生じないことを意味している。例証的な特異的結合は、抗体−抗原の相互作用、細胞受容体−リガンドの相互作用、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、酵素基質の相互作用等である。「特異的な」という用語は、複合体の分子要素に関して本明細書において使用された場合、その要素が一部を成す特異的な複合体に対するその要素の独特な結合を意味している。「特異的な」という用語は、ポリヌクレオチドの配列に関して本明細書において使用された場合、その配列の相補的配列である単一のポリヌクレオチドへの独特な結合を意味している。
【００４６】
「ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質」という表現は、標的に特異的に結合し、その結果、前記標的に相補的であると定義される蛋白質要素、及び、該蛋白質要素に結合したコード化ポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチド−蛋白質の複合体を意味している。いくつかの実施形態において、蛋白質に結合したコード化ポリヌクレオチドは蛋白質特異的である。標的が既知であり、その標的の感度の良い検出が必要とされる時はいつでも、蛋白質特異的な相互作用を利用して、他の蛋白質、サイトカイン、ケモカイン、小分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質等を検出するアッセイを行うために、それらの実施形態を使用することができる。
【００４７】
「ポリヌクレオチドによりコード化された抗体」という用語は、本明細書において使用された場合、蛋白質要素が抗体であるポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を意味している。
【００４８】
「結合する」又は「結合した」という用語は、本明細書において使用された場合、２つ以上の要素を一緒にするための、接着、連結、力、又は結びによる接続又は合体を意味し、例えば第１の分子が第２の分子又は物質に直接結合する、及び、１若しくは複数の中間分子が第１の分子と第２の分子又は物質の間に配置される実施形態のように、直接的又は間接的な結合を含む。
【００４９】
「基板のポリヌクレオチド」という表現は、本明細書において使用された場合、その相補的なポリヌクレオチドに結合する能力を維持するように基板に結合したポリヌクレオチドを意味している。基板のポリヌクレオチドは、特に、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質のコード化ポリヌクレオチドに特異的に結合し、その結果、前記コード化ポリヌクレオチドと相補的であると定義される配列から成り得る。
【００５０】
「基板」という用語は、本明細書において使用された場合、基礎をなす支持体又は基層を示している。例証的な基板には、ガラス板、マイクロタイターウェルプレート、磁気ビーズ、シリコンウェハー、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定され得るさらなる基板等の固体の基板が含まれる。
【００５１】
本明細書で開示されているポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質において、各蛋白質は、所定の標的に特異的に結合し、その結果、前記標的に相補的であると定義され、各コード化ポリヌクレオチドは、所定の基板のポリヌクレオチドに特異的に結合し、その結果、前記基板のポリヌクレオチドに相補的であると定義される。
【００５２】
前記蛋白質が抗体である実施形態において、蛋白質−標的の相互作用は、抗体−抗原の相互作用である。前記蛋白質が抗体以外のものである実施形態において、相互作用は、受容体−リガンド、酵素−基質、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定され得るさらなる蛋白質−蛋白質の相互作用であり得る。例えば、前記蛋白質がストレプトアビジンである実施形態において、蛋白質−標的の相互作用は受容体−リガンドの相互作用であり、受容体及びリガンドはそれぞれストレプトアビジン及びビオチンであり、いかなる生体分子からも遊離であるか、又は、いかなる分子にも結合されている。
【００５３】
さらに、本明細書で開示されている方法及びシステムにおいて、各基板のポリヌクレオチド及びコード化ポリヌクレオチドは、互いから結合的に区別可能である。本明細書で開示されている方法及びシステムのいくつかの実施形態において、基板の各基板のポリヌクレオチドは、配列特異的であり、互いから位置的に区別可能である。
【００５４】
「結合的に区別可能である」という表現は、分子に関して本明細書において使用された場合、特異的な分子に特異的に結合するその能力に基づき区別可能であり、その結果、前記特異的な分子に相補的であると定義される分子を示している。従って、第１の分子が第３の分子に特異的に結合し、その結果、前記第３の分子に相補的であると定義され、第２の分子が第４の分子に特異的に結合し、その結果、前記第４の分子に相補的であると定義され、前記第４の分子が前記第３の分子とは異なる場合、前記第１の分子は前記第２の分子と結合的に区別できる。
【００５５】
「位置的に区別可能である」という表現は、分子に関して本明細書において使用された場合、前記分子により占有される点又は領域に基づき区別可能である分子を示している。従って、位置的に区別可能である基板のポリヌクレオチドは、前記基板上の異なる点又は領域を占有し、その結果、位置的に区別可能である基板のポリヌクレオチドである。
【００５６】
本明細書において開示されているポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、（通常リジン残基に存在する）結合されることになる蛋白質内の一級アミンの存在に依拠した技術を含む、化学架橋等の一般的なバイオコンジュゲーション法を用いて作製することができる。特に、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体（図１）及びポリヌクレオチドによりコード化されたストレプトアビジン（図２）に対して図１及び２に示された共有結合性のコンジュゲーションストラテジーにより作製することができる。
【００５７】
図１に例示された実施形態において、５’−アミノ化ポリヌクレオチドは、図１に概略的に例示され実施例１で例証されているように、ヒドラゾン連鎖を介して抗体に結合されている（Kozlov,  I.  A.;  Melnyk,  P.  C.;  Stromsborg,  K.  E.;  Chee,  M.  S.;  Barker,  D.  L.;  Zhao,  C.  Biopolymers  2004,  73,  621-630）。
【００５８】
実施例２で例証され図２において例示されているように、同じバイオコンジュゲーションの化学作用を、ポリヌクレオチドによりコード化されたストレプトアビジン等、いかなるポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の作製にも使用することができる。
【００５９】
特定のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と結合されることになるコード化ポリヌクレオチドの数はさまざまであり得る。特に、蛋白質要素に結合したポリヌクレオチドの数は、依然として結合特異性を維持しながら、サイズ、従って未決定部分の立体障害を最小限にするよう調整することができる。最適化は、実施例３において例証され図３において例示された手順により行うことができる。実施例３及び図３において、種々のバッチのポリヌクレオチドによりコード化された抗体を作製し、各抗体に結合したポリヌクレオチドの総数を変更した。図３及び実施例３のコード化ポリヌクレオチドは蛍光体を含んでいたため、ＦＡＣＳを用いて各変異体の細胞表面マーカーに対する結合効率を検査することができた。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）等の抗体の結合動態を直接測定する技術を含めた、ポリヌクレオチド荷重の関数として抗体の結合親和性を測定及び最適化するための他の類似した技術があることに注目されたい。
【００６０】
いくつかの実施形態において、各蛋白質に結合されることになるコード化ポリヌクレオチドの数は、１から６のうちどれでもあり得る。細胞選別等いくつかの実施形態において、１つの蛋白質あたり３つのコード化ポリヌクレオチドを結合させることにより、相補的な基板のポリヌクレオチドとの高い親和性のハイブリダイゼーションのために、ラベリングの立体効果を最小限にする、従って、複数のコード化ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質のラベリングを可能にするというさらなる利点がもたらされる。
【００６１】
未決定部分を形成するポリヌクレオチドの長さも、基板に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の結合を最適化するよう調節することができる。特に、コード化ポリヌクレオチドの長さを、実施例８及び図９において例証され、さらに以下で説明されているように、直交化の目的のために最適化することができる。
【００６２】
以下の詳細な説明において、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質がポリヌクレオチドによりコード化された抗体である実施形態が参照される場合が多くある。本開示を読んだ後、当業者は、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体に対して提供された教示を他のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質に適合させることができるようになる。
【００６３】
基板のポリヌクレオチドは、当技術分野において通常の技術により作製することができる。例えば、第一にポリヌクレオチドを化学的に合成することができる。そのポリヌクレオチドは、次に、スタンフォードのパットブラウン（Ｐａｔ  Ｂｒｏｗｎ）により概説されたパラダイム（Schena  M,  Shalon  D,  Davis  RW,  Brown  PO.  Science.  1995  Oct  20;  270  (5235):  467-70）によってピンスポットで照らすことができる。そのようにして作製された基板のポリヌクレオチドは、次に、本開示を読んだ後に当業者により同定可能な技術に従って基板に結合させることができる。特に、基板のポリヌクレオチドの作製に適したポリヌクレオチドは、ポリリジン基板上に少なくとも７５塩基長を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、コード化ポリヌクレオチド及び／又は基板のポリヌクレオチドは、コード化ポリヌクレオチドと基板のポリヌクレオチドとの非特異的結合を最小限にするよう直交させられている。従って、直交化されたポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド間の非特異的相互作用、及び、関連のある配列の無作為の発生に通常は関連したポリヌクレオチドにおける直線ではない二次相互作用を最小限にするために、不完全な塩基対合、不安的状態、及び／又は、他の二次構造を最小限にするよう配列が計算的に生じられるポリヌクレオチドが含まれる。
【００６５】
「直交化」という用語は、本明細書において使用された場合、ポリヌクレオチドがその相補鎖のみに結合し、他のポリヌクレオチドには結合しないように、一組のポリヌクレオチドが計算的に生じ、不完全な塩基対合、不安定な状態、及び他の二次構造が最小限にされる処理を意味している。本開示に使用される例証的な直交化技術には、ダークス（Ｄｉｒｋｓ）等により概説されたパラダイム（Dirks,  R.  M.;  Lin,  M.;  Winfree,  E.;  Pierce,  N.  A.  Nucleic  Acids  Research  2004,  32,  (4),  1392-1403）に従って行われる直交化が含まれる。
【００６６】
特に、いくつかの実施形態において、コード化ポリヌクレオチド及び対応する相補的な基板のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ番号：７からＳＥＱ  ＩＤ番号：１８までの配列を有する直交化されたポリヌクレオチドである（実施例８及び関連する表１を参照）。
【００６７】
追加の直交化されたポリヌクレオチドは、実施例８において例証され図９で例示されたポリヌクレオチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの直交化（すなわち、コンピュータでの直交化）、並びに、本開示を読んだ後当業者に明らかになる追加の手順等の方法及び手順によってさらに同定することができる。
【００６８】
本明細書に開示された方法及びシステムは、モノパラメータアッセイ及びマルチパラメータアッセイを含めた、標的の検出のためのアッセイを行うのに使用することができ、全て多重化されたアッセイとして行うことができる。
【００６９】
「モノパラメータアッセイ」という用語は、本明細書において使用された場合、１つの標的の有無又はその量を決定するために行われる分析を意味している。「マルチパラメータアッセイ」という用語は、複数の標的の有無又はその量を決定するために行われる分析を意味している。「多重化」又は「多重化された」アッセイという用語は、例えば複数の分析物の同時のアッセイ等、複数のアッセイ反応が一つの反応チャンバ内で実行される、並びに／又は、一つの分離及び検出フォーマットで分析されるアッセイを意味している。
【００７０】
いくつかの実施形態において、検出されることになる１又は複数の標的が所定の疾患に関連した所定のバイオマーカーである診断アッセイを行うために、本明細書に開示されている方法及びシステムを有利に使用することができる。それらの実施形態は、一般的に異種の組織試料の異なる領域、従って、量を計るのが難しい避けられないノイズ源を導入する領域から異なる種類の生体材料及び生体分子がそれぞれ測定される診断方法において特に有利である。
【００７１】
本明細書で開示されている方法及びシステムのいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質及び基板のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質がポリヌクレオチドによりコード化された抗体である図４において概略的に例示されているように組み合わせて使用される。
【００７２】
図４の実施形態において、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体（１０）は、基板（１００）と組み合わせて提供されている。ポリヌクレオチドによりコード化された抗体（１０）は、抗体（１１）及びコード化ポリヌクレオチド（１２）から成る。基板（１００）は、基板のポリヌクレオチド（１２０）を基板の表面に結合させている。コード化ポリヌクレオチド（１２）は基板のポリヌクレオチド（１２０）に相補的であるので、接触すると基板のポリヌクレオチド（１２０）及びコード化ポリヌクレオチド（１２）はハイブリッド形成する。
【００７３】
図４に示された実施形態において、本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された抗体は、試料と接触させて試料内の標的を検出することができる蛋白質アレイを形成する。図４の実施形態は、蛋白質−標的を検出及び／又は選別するのに特に有利である。
【００７４】
細胞の標的を検出及び／又は選別するのに特に適したさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体を相補的な基板のポリヌクレオチドと接触させる前に、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の一部又は全てが試料と接触される。それらのさらなる実施形態において、抗体及び１又は複数の対応する標的は、基板の非存在下で、例えば、どちらの分子も完全な配向の自由を有し、抗体の結合ポケットに対する標的のアクセスが基板により弱められない液相において結合することができる。さらに、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体は溶液内で蛋白質の三次元折り畳み構造を維持したままでいるため、表面誘発性の蛋白質変性は生じない。加えて、生物付着が最小限にされるので（以下の記述も参照）、従来技術の対応する方法及びシステムと比較した場合、行われるアッセイの感度及び特異性、並びに、基板に結合された抗体標的の複合体の検出性も改善される。上記の利点の一部を示した例証的な実施形態が、図５、７、８、１１、及び１３に例示されている。
【００７５】
本明細書に開示されている方法及びシステムでは、基板に結合された抗体−標的の複合体が最終的に基板から検出される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、検出されることになるポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質標的の複合体に特異的に結合することができるいかなる分子（例えば、抗体、アプタマー、ペプチド等）、及び、該分子に結合された、ラベル信号を生じるラベル化合物を含んだラベルされた分子を与えることによって、複合体の検出は行われる。本開示、特に実施例の項を読んだ後に当業者によって同定可能な手順に従い、そのラベルされた分子はポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に接触され、次に、基板上のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に結合したラベル化合物からのラベル信号を検出することができる。
【００７７】
１又は複数の標的が検出される、以下により詳しく記述される実施形態において、ラベルされた分子は、複数のラベルされた分子から形成することができる。各ラベルされた分子は、前記１又は複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合する分子、及び、該分子に結合したラベル化合物を含み、該ラベル化合物はラベル信号を生じ、各ラベルされた分子は互いから検出可能な程度に区別可能である。
【００７８】
「検出可能な程度に区別可能である」という表現は、ラベルされた分子に関して本明細書において使用された場合、分子に結合したラベル化合物により生じるラベル信号に基づき区別可能な分子を示している。検出可能な程度に区別可能であるラベルされた分子を提供するために使用することができる例証的なラベル化合物には、それだけに限らないが、放射性同位体、蛍光体、化学発光染料、発色団、酵素、酵素の基質、酵素の補助因子、酵素の阻害物、染料、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はハプテン等）、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定可能なさらなる化合物が含まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体の複数のラベルされた分子との結合を可能にする間及び条件下で、前記複数のラベルされた分子は、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に接触される。ラベル信号は、次に、基板上の前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体に結合した前記複数のラベルされた分子から検出される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、前記検出方法は、ラベルされた抗体が蛍光体でラベルされた蛍光ベースの読み取りを介して行うことができ、その蛍光体は、徹底的ではないが、小分子の染料、蛋白質発色団、量子ドット、及び金ナノ粒子を含む。特に、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及びシステムのうちどれにおいても、以下でさらに記述されるように一般的な現像液が金ナノ粒子を増幅することができる金ナノ粒子でラベルされた第２の検出システムで検出を行うことができる。さらに、金粒子を拡散させる暗視野から読み取りが生じる場合、単一分子のデジタルプロテオミクス（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）が可能になる。さらなる技術が本開示を読んだ後に当業者により同定可能であり、より詳細にはさらに記述されない。
【００８１】
「ラベル」及び「ラベルされた分子」という用語は、複合体又は分子の要素として本明細書において使用された場合、検出する能力を持つ分子を意味し、それだけに限らないが、放射性同位体、蛍光体、化学発光染料、発色団、酵素、酵素の基質、酵素の補助因子、酵素の阻害物、染料、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド等（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はハプテン等）を含む。「蛍光体」という用語は、検出可能な画像において蛍光を示すことができる物質又はその一部を意味している。結果として、「ラベル信号」という表現は、本明細書において使用された場合、ラベルから放出され、そのラベルの検出を可能にする信号を示し、それだけに限らないが、放射活性、蛍光発光、化学発光、酵素反応の結果における化合物の生成等を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、１つ特定の標的が検出される。それらの実施形態において、前記標的とのポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触は、基板との前記ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触前又は接触後に行うことができる。
【００８３】
標的とのポリヌクレオチド抗体の接触が基板との前記ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触前に行われる実施形態は、細胞を選別又は検出するのに特に適している。それらの実施形態において、抗体と標的との結合における効率及び特異性は、単一の標的の検出に対してさえも最大限にされる。拘束力はないが真でありうる説明は、本明細書に開示されている方法及びシステムにおいて、標的の捕獲は、抗体と細胞表面マーカーの相互作用により推進されないが、正しくは、協合的結合を介したマイクロアレイ上の対応する鎖に対する抗体の特異的なポリヌクレオチドの増加したアビディティーにより推進され、捕獲効率を非常に上げているということである。この利点は、効率的に捕獲することができる標的細胞に対して特に重要性があるので、この工程を用いて細胞のコンフルエントな層により全体的に占有されたＤＮＡスポットを見ることは一般的である（実施例５及び図５を参照）。
【００８４】
標的とのポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触が基板との前記ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触後に行われる実施形態は、高感度で蛋白質を選別又は検出するのに特に適している。標的とのポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触が基板との前記ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の接触後に行われる、本明細書に開示されている方法及びシステムの例証的な実施形態は、実施例１２及び１３に例証され、図１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４（ｃ）において例示されている。それらの実施形態において、標的に結合したポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と標的に結合していないポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質との間で生じる同じ特異的な基板のポリヌクレオチドに対する競合は除去することができ、従ってアッセイの感度を増加することができる。さらに、それらの実施形態において、より高濃度のポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質を基板に結合できるように、基板上のポリヌクレオチドの濃度を最適化することができ、次に、より高濃度の正しく構築された複合体を生じることになり、続いて、各結合を支配する平衡熱力学の法則によって全体の検出感度が上げられる。
【００８５】
図４及び５並びに実施例５に例証された方法及びシステムを用いて行うことができるモノパラメータアッセイには、それだけに限らないが、血清内の１種類のマーカーの検出、生物学的試料内の１種類の蛋白質の検出、１つの表面マーカーによる細胞選別に対するいかなるアッセイ、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定可能なさらなるアッセイも含まれる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、図６において概略的に例示されたストラテジーに従い複数の標的の検出が行われる。
【００８７】
複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体（１０、２０、及び３０）が作製され、各ポリヌクレオチドによりコード化された抗体は、所定の標的を抗体要素（１１、２１、及び３１）と特異的に結合させ、相補的な基板のポリヌクレオチドをコード化ポリヌクレオチド要素（１２、２２、及び３２）と結合させることができる。配列特異的で位置的に区別可能な基板のポリヌクレオチド（１１２、１２２、及び１３２）を有した基板が作製される。
【００８８】
ポリヌクレオチドによりコード化された抗体（１０、２０、及び３０）は、次に、基板のポリヌクレオチド（１１２、１２２、及び１３２）と接触され、抗体の特異的なポリヌクレオチドの対応する基板のポリヌクレオチドとの結合により、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の複合体自体が基板上に構築される。
【００８９】
図６に示された実施形態では、複数の結合的に区別可能及び位置的に区別可能な抗体から成る蛋白質アレイが作製される。それらの実施形態は、高感度で異なる蛋白質−標的を選別及び／又は検出するのに特に有利である。それらの実施形態の例証的な説明は、実施例９、１０、及び１２、並びに、図１０、１２、１３、及び１５ａに示されている。
【００９０】
さらなる実施形態において、前記複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体は、基板のポリヌクレオチドに接触する前に、関連する標的の検出のため試料に接触される。それらの実施形態では、本明細書で開示されている方法及びシステムを使用して多重化されたマルチパラメータアッセイを行うことができ、基板の非存在下における抗体と標的との結合と付随した改善された感度及び選択性のため、並びに、減少した生物付着及び蛋白質変性を考慮して、多数のバイオマーカーを量的な様式及び／又は質的な様式で効率的に検出することができる。それらの実施形態の例証的な説明が、実施例９、１０、及び１２、並びに、図１０、１２、１３、及び１５に示されている。
【００９１】
実施例９、１０、及び１２において例証され、図１０、１２、１３、及び１５で例示された方法及びシステムで行うことができるマルチパラメータアッセイには、それだけに限らないが、いかなるプロテオミクス分析、組織分析、血清診断、バイオマーカー、血清プロファイリング、マルチパラメータの細胞選別、単細胞研究、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定可能なさらなるアッセイも含まれる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、図６において概略的に図示された組み合わされた使用を、複数の標的が異なる種類の細胞、特に初代細胞から成る場合に特に有利である複数の標的を選別する方法に適用することができる。それらの実施形態において、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体は、実施例９で例証され図１０において例示された手順に従い、基板と接触する前に前記細胞を含んだ試料と接触されるのが好ましい。
【００９３】
前記複数の標的が異なる種類の細胞から成る方法及びシステムの実施形態は、基礎をなす基板上に印刷された表面マーカーに特異的な抗体と細胞が相互作用するパニング等（Cardoso,  A.  A.;  Watt,  S.  M.;  Batard,  P.;  Li,  M.  L.;  Hatzfeld,  A.;  Genevier,  H.;  Hatzfeld,  J.  Exp.  Hematol.  1995,  23,  407-412）、従来技術の対応する方法及びシステムと比較して特に有利である。特に、抗体を基板に結合させるためにポリヌクレオチドを使用するため（図５及び図１０を参照）、基板上での細胞捕獲の効率は、従来技術の方法及びシステムに対して改善される。さらに、それらの好ましい実施形態は、表面上で常に適切に方向づけられない抗体、及び／又は、乾燥し機能性をなくしてしまう抗体等、従来のスポットされた蛋白質のマイクロアレイと同じ制限を有していない。
【００９４】
本明細書において開示されている方法及びシステムにより選別された細胞は、直ちに選別後の遺伝子及び／又は蛋白質発現の分析に対して利用可能なため、細胞を選別するための実施形態のうちどれもが、ＦＡＣＳ等の当技術分野において既知である細胞を選別する方法及びシステムと比較していくつかの利点を有している。さらに、本明細書において開示されている方法及びシステムは、実施例９及び関連する図１０に例証されているように、多数の細胞の空間的に多重化された選別を行い、その選別は、多数の細胞表面マーカーにより細胞を選別することにおいて特に効果的であり、選別するために使用される前記細胞表面マーカーをラベルするために利用することができるスペクトルではっきりと識別する蛍光体の数により制限されない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、図１１において概略的に例示されている方法に従い複数の化学的に異なる標的を検出するために、図６に描かれている組み合わされた使用を適用することができる。特に、その方法は、ＤＮＡ、細胞、及び蛋白質等、複数の異なるバイオマーカーの分離のために例示されている。図１１に例示されている実施形態では、細胞、遺伝子、及び蛋白質の分析に対するマルチパラメータアッセイにおいて、細胞（１）を分離する（図１１、矢印Ａ１を参照）、及び、複数の基板のポリヌクレオチド（３）が結合した基板（２）を用いて、関連があるゲノム及びプロテオミクスのサインを分析する（図１１、矢印Ａ２を参照）ために、本明細書に開示されている方法及びシステムが行われている。
【００９６】
それらの実施形態のうち一部において、前記試料は複数のポリヌクレオチドによりコード化された抗体に接触され、複数のポリヌクレオチドによりコード化されたバイオマーカーの複合体の形成を可能にし、前記複合体は、次に、抗体の特異的なポリヌクレオチドが対応するＤＮＡ鎖に特異的に結合するＤＮＡアレイ等の基板に接触される。標的のポリヌクレオチドの検出が所望されるいくつかの実施形態では、基板上の所定のＤＮＡ鎖に特異的に結合するラベルされた標的のポリヌクレオチドを作製するため、標的のポリヌクレオチドに特異的に結合するラベルされたポリヌクレオチドを試料にさらに接触させることができる。ラベルされた標的のポリヌクレオチドは、最終的に基板のポリヌクレオチドと接触され検出される。この方法によると、細胞、蛋白質、及びＤＮＡのバイオマーカーが選別されて、次に単一の基板において検出され、従って、多重化されたマルチパラメータアッセイの有利な実行を可能にする。
【００９７】
それらの実施形態において、細胞、ｃＤＮＡ、及び蛋白質に対する共通の構築ストラテジーとしてポリヌクレオチドを使用することにより、スポットされた基板上への優れたＤＮＡ荷重に対する、及び、抗体への相補的なＤＮＡの荷重に対する基板の状態を最適化することが可能である。基板上での抗体におけるポリヌクレオチドベースの結合に付随するこの減少した生物付着により、蛋白質検出に対する非常に感度の良いサンドイッチアッセイ、並びに、（伝統的なパニングと比較して）高効率の細胞選別の実行が可能になる。化学的に異なるバイオマーカーの検出を行うための例証的な方法及びシステムが、実施例１０に記述され、図１３に例示されている。
【００９８】
実施例９、１０、１２、及び１３において例証され、図１３、１０ｃ、１０ｄ、１５ａ、２２、２３、２４で例示されている方法及びシステムを用いて実行できる、標的を選別するためのアッセイには、本開示を読んだ後に当業者により同定可能になる、混合物における（それだけに限らないが、細胞標的、蛋白質−標的、又は遺伝子標的を含めた）特定の標的の検出を必要とするいかなるアッセイも含まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、単一又は多数の標的における高感度の検出は、検出のために金属ナノ粒子でラベルされた抗体の使用に続いて無電解金属メッキにより行うことができる。
【０１００】
それらの実施形態では、本明細書に開示されている方法及びシステムのうちどれもが、基板に結合したコード化されたポリヌクレオチド蛋白質−標的の複合体を検出するためにラベル分子として金属ナノ粒子（特にＡｕナノ粒子）を使用することによって行うことができる。特に、金ナノ粒子等の金属ナノ粒子は、基板に結合したポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質−標的の複合体をラベルするために使用されるラベルされた分子（例えば第２の抗体）に結合される。Ａｕナノ粒子等の金属粒子は、光散乱を用いて可視光線の波長よりもはるかに小さい粒子を依然として容易にイメージすることができる独自の光学的性質を有している。このことは、光散乱式顕微鏡を用いてナノ粒子ラベル（従って蛋白質）を数えることにより読み取られることになるイムノアッセイを可能にする。この方法は、本明細書において、各ナノ粒子が１つの蛋白質に一致すると仮定して、数えられた粒子の数が特異的な抗体を介して捕獲された蛋白質の絶対数を表すデジタル法又はデジタルＤＥＡＬとしても規定される。
【０１０１】
図１６及び１７は、ラベル分子が金ナノ粒子等の金属ナノ粒子を含んでいる、本明細書において開示された方法及びシステムの例証的な実施形態を概略的に示している。特に、金ナノ粒子（２１０）は、リンカー分子（２１１）を介して第２の抗体（２１２）上に結合される。第１のＡＢ（２１３）上には、１又は複数のｓｓＤＮＡオリゴマー（２１４）が結合される。検出されることになる標的（２１７）は、溶液又は生物学的環境内に存在する。アッセイ自体は、ｓｓＤＮＡ’（２１５）で被覆された表面（２１６）上で測定される。例証的な実施形態が、さらに、図１８から２２で例示され、実施例１３において例証されている。
【０１０２】
金属ナノ粒子がラベリングに使用される際の本明細書において開示された方法及びシステムにおけるいくつかの実施形態の利点は、数えられた蛋白質の数が絶対測定を表しているため、蛋白質の測定が行われるたびにイムノアッセイを較正する必要がないことである。蛍光アッセイ又は吸収アッセイは、比較すると、背景蛍光（吸収）レベル、光増幅電子機器、（蛍光に対する）光退色効果等に依拠しているため、相対測定を表している。本明細書において開示されているナノ粒子ベースのデジタル方法及びシステムは：（１）高ａｔｔｏＭｏｌａｒレベルでの（従来のＥＬＩＳＡイムノアッセイと比較して１０３〜１０６倍の改善）、及び、広い濃度範囲にわたる超感度の蛋白質の検出；（２）同じチップ上でのいくつか異なる蛋白質の多重化された検出；並びに（３）ヒト患者の血清における細胞外で信号を出す分子、サイトカインの検出；に対して有利に使用することができる。
【０１０３】
ラベリング及び検出が金属ナノ粒子を使用することにより行われる、本明細書で開示された方法及びシステムにおけるいくつかの実施形態は、個々のプラズモンナノ粒子の間接的な可視化を可能にするＲａｌｅｉｇｈ散乱機構等の検出システムに基づいており、この場合、１つの蛋白質のカウントを実現するために４０ｎｍのＡｕナノ粒子が検出抗体に結合される。グラフィカルなソフトウェアインターフェースを利用して、粒子の絶対数をデジタル方式で数えることができ、従って、蛋白質の量を計ることができる。それらの実施形態は、増幅後の平均化された信号の読み取りを用いた従来の定量化方法ときわだって対照的である。ＤＮＡによりコード化された抗体のライブラリー技術と共に、金属ナノ粒子をラベル化合物として使用する本明細書に開示された方法及びシステムは、同じ生物学的試料から異なる種類の蛋白質を同時に数えることによって、検出を多重化することができる。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡ機構の異型に基づいた従来の非常に感度の良い蛋白質検出技術と比較した、金属ナノ粒子がラベル化合物として使用される本明細書に開示された方法及びシステムのさらなる利点は、信号の増幅、並びに、随伴のさらなるノイズ及び実行に必要とされる時間を除く可能性である。従来技術の方法は全て、ある種の増幅ステップを必要とし、各方法は、行われる全てのアッセイに対して実行しなければならないあるレベルの較正を必要とする。例えば、前記第２のＡＢがＤＮＡでラベルされ、そのＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いて増幅される方法が報告されてきた。検出され、次に、測定された蛋白質濃度に相関されるのは、この増幅されたＤＮＡである。別の異型において、前記第２のＡＢは金ナノ粒子でラベルされ、次に、銀金属がその金ナノ粒子上に（無電解メッキを介して）堆積され、増幅された吸収信号を生じる。どちらの場合も、その増幅ステップ自体がアッセイにノイズを導入してさらなる時間を必要としてしまい、かなりの時間を必要とする場合が多くある。
【０１０５】
上記の従来技術の方法と比較した、金属ナノ粒子を使用する本明細書に開示された方法及びシステムのさらなる利点は、従来技術の方法のうちどれもがデジタル化されたものではないということであり、それらの方法のうちどれもが蛋白質の数を実際に数えることはないが、代わりに蛍光又は吸光度等の相対的な信号を測定すると意味している。これは、前記信号が較正されなければならないことを意味している。それどころか、蛋白質のカウントは蛋白質濃度に相関することができる絶対数を生じるため、金属ナノ粒子をラベル化合物として使用する本明細書に開示された方法及びシステムを用いて行われるアッセイが特徴づけられると較正の必要はない。
【０１０６】
本願は、プロテオミクスの分野の検出（図２１及び２２）、及び／又は、例えば血液の液滴等小さい容積の試料内に非常に低濃度で存在するバイオマーカーの検出（図１９及び２０）に対して特に有利になるであろう。
【０１０７】
さらなる実施形態において、本明細書に開示されている方法及びシステムのうちどの方法及びシステムの基板も、マイクロ流体ベースのアッセイの実行を可能にするように、マイクロ流体要素と関連づけることができる。マイクロ流体ベースのアッセイは、減少した試料及び試薬の容積等の利点、並びに、短縮されたアッセイ時間を提供する（Breslauer,  D.  N.;  Lee,  P.  J.;  Lee,  L.  P.  Mol.  BioSyst.  2006,  2,  97-112）。例えば、特定の操作条件の下、表面結合アッセイの動態学は、拡散によってではなく、分析物（蛋白質）の濃度及び分析物／抗原結合親和性によって第一に決定される（Zimmermann,  M.;  Delamarche,  E.;  Wolf,  M.;  Hunziker,  P.  Biomedical  Microdevices  2005,  7,  (2),  99-110）。
【０１０８】
「マイクロ流体」という用語は、本明細書において使用された場合、例えばミクロン若しくはサブミクロンの規模で一般的に作製されるチャネル及び／又はチャンバ等マイクロ流体特徴を有する要素又はシステムを意味している。例えば、典型的なチャネル又はチャンバは、約０．１ミクロンから約１５００ミクロンという範囲、より一般的には約０．２ミクロンから約１０００ミクロンという範囲、さらにより一般的には約０．４ミクロンから約５００ミクロンという範囲の少なくとも１つの断面寸法を有している。個々のマイクロ流体特徴は、例えば約１０ナノリットルから約５ミリリットル、より一般的には約１００ナノリットルから約２ミリリットル、さらにより一般的には約２００ナノリットルから約５００ミクロリットル、又は、さらにより一般的には約５００ナノリットルから約２００ミクロリットルといった非常に小さい量の流体を一般的に保持している。
【０１０９】
マイクロ流体要素は、統合装置内に含まれ得る。本明細書において使用された場合、「統合装置」は、物理的に及び操作可能に共に結合された２つ（又はそれ以上）の要素を有する装置を意味している。前記要素は、互いから分けて（完全又は部分的に）作製し、その（完全又は部分的な）作製の後結合することができるか、又は、別個の要素を統合装置内に含んだ統合装置を作製することができる。統合されたマイクロ流体アレイ装置には、マイクロ流体要素に結合したアレイ要素が含まれ、前記マイクロ流体要素及び前記アレイ要素は、アレイ要素のアレイ基板がマイクロ流体要素のマイクロ流体特徴と流体内で連絡をとるように互いに操作可能に共同している。マイクロ流体要素は、マイクロ流体特徴を含み、アレイ要素と操作可能に共同するようされた要素である。アレイ要素は、基板を含み、マイクロ流体要素と操作可能に共同するようされた要素である。
【０１１０】
マイクロ流体システムは、モジュラー形式で提供することもできる。「モジュラー」は、多数の標準化された要素を共に使用するために有するシステム又は装置を表現しており、該システム又は装置の機能若しくは性能を変更するために、１つの種類の要素における多数の異なる例のうちの１つが、同じ種類の要素の別のものに代わることができる。そのようなシステム又は装置において、標準化された要素のそれぞれが「モジュール」である。
【０１１１】
マイクロ流体アッセイを行うための本明細書において開示された方法及びシステムの例証的な実施形態は、実施例１０及び１１に記述され、図１３及び１４に例示されている。
【０１１２】
本明細書で開示されている方法及びシステムのマイクロ流体の実施形態では、極めて小さな試料容積内の蛋白質バイオマーカーの大きなパネルにおける測定、及び、非常に減少したバックグラウンド／生物付着が可能である（図１４を参照）。
【０１１３】
本明細書で開示されている方法及びシステムのマイクロ流体の実施形態では、いかなる他の技術によっても検出可能なレベルより下であると以前は考えられた（例えばヒト血清内の蛋白質等の）バイオマーカーを含めた１０ｆＭほどに低い濃度の標的を検出するためにアッセイの感度も上げることができる。
【０１１４】
例証された実施形態において、そのような結果は、基板の荷重を上げ、さらに、検出のために金属ナノ粒子でラベルされた抗体を使用し、続く無電解金属メッキによって得られる（実施例１１及び図１４（ｃ）を参照）。
【０１１５】
さらに、例証された実施形態では、比色定量の多重化ではなく空間多重化が本明細書で開示された方法及びシステムにおいて利用されるため、蛍光ベースの読み取りを光学的なものに変換することができる。本明細書において開示されているマイクロ流体の方法及びシステムは、従って、従来技術の対応する方法及びシステムよりも１００〜１０００倍以上感度の良い光学的な読み取りのアッセイを可能にする（図１４を参照）。従って、本明細書において開示されているマイクロ流体の方法及びシステムのさらなる利点は、前記方法及びシステムをデジタル式の技術、すなわち、１つの分子のカウントを介した蛋白質の量的検出に対する技術として使用する可能性である。本願は、プロテオミクスの分野における検出（図１４）、及び／又は、小さい容積の試料（例えば血液の液滴）内に非常に低濃度で存在するバイオマーカーの検出に対して特に有利になるであろう。
【０１１６】
さらに、本明細書において開示されているマイクロ流体の方法及びシステムは、従来技術の対応するマイクロ流体の方法及びシステム、並びに、分子検出に対する他のマイクロ流体でない方法及びシステムと比較した際にサイズが減少した試料及びより高い感度で、（ｉ）（ポリヌクレオチドによりコード化された抗体、１又は複数の標的、及びラベルされた抗体が１つのステップで接触される）モノステップアッセイの実行も（ｉｉ）短縮された時間における（基板が、ポリヌクレオチドによりコード化された抗体、１又は複数の標的、次に、第２の抗体に順次曝露される）マルチステップアッセイの実行も可能にする（実施例１１及び１２を参照）。
【０１１７】
本明細書において開示されているマイクロ流体の方法及びシステムに付随するさらなる利点は、従来の技術を使用するとマイクロ流体のチップアセンブリに耐えられなかった基板により支持された抗体を含むいかなるアッセイもマイクロ流体の環境において行うという可能性を含んでいる。
【０１１８】
本明細書において開示されている方法及びシステムに付随するさらなる利点は：ガラス、及びプラスチック等低コストの試薬を使用して感度の良い測定を行う；並びに、試料の前処理及び精製のためのさらなる要素と組み合わせて基板を使用するという可能性である。
【０１１９】
本明細書において開示されている方法及びシステムにより、関心のあるバイオマーカーの多重化されたマルチパラメータ検出及び選別、並びに、関連した診断分析が可能になる。診断分析に対する本明細書に開示された方法及びシステムの適用における例証的な図示は、実施例１４で説明され、図２３及び２４に示されており、いかなる追加のアッセイも、本開示を読んだ後に当業者により同定可能である。
【０１２０】
本明細書において開示されているシステムは、アレイ又はパーツから成るキットの形状で提供することができる。「マイクロアレイ」と呼ばれる場合があるアレイには、いかなる１、２、又は３次元配置のアドレス可能な領域が含まれ、その領域に随伴の特定の分子を支えている。通常、特徴的な機能サイズはマイクロメートルである。図４、５、６、７、８、９、及び１０は、例証的なマイクロアレイを実現している。
【０１２１】
パーツから成るキットにおいて、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質及び基板は、キット内で個々に含まれている。ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は１又は複数の要素に含まれ、各ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は適した溶媒キャリア又は補助剤と共に１つの要素内に含まれている。
【０１２２】
当該システムにおいて提供されている基板は、基板のポリヌクレオチドをそこに結合させることができる。いくつかの実施形態において、基板のポリヌクレオチドを、前記キットの追加の要素としてさらに提供することができる。追加の要素は、ラベルされたポリヌクレオチド、ラベルされた抗体、ラベル、マイクロ流体チップ、照合標準器、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定可能な追加の要素を含むことができる。特に、本明細書において開示されている方法を実行するために、適した指示及び他の必要な試薬と共にキットの要素を提供することができる。キットは、通常、分離した容器に組成物を含むであろう。アッセイを実行するための、例えば紙又はテープ若しくはＣＤ−ＲＯＭ等の電子支援上の書かれた又は音声の指示等の指示が、通常、前記キット内に含まれるであろう。前記キットは、使用される特定の方法に応じて、他のパッケージされた試薬及び材料（すなわち洗浄用バッファー等）も含むことができる。
【０１２３】
組成物の適したキャリア剤又は補助剤の同定、並びに、キットの一般的な製造及びパッケージに関するさらなる詳細は、本開示を読んだ後に当業者によって同定することができる。
【実施例】
【０１２４】
本明細書に開示されている方法及びシステムは、図解により提供され、限定するよう意図されていない以下の実施例においてさらに例証されている。
〔実施例１：ポリヌクレオチドによりコード化された抗体の作製〕
ＤＮＡによりコード化された抗体を、図１に例示された２段階ストラテジーに従い作製した。特に、商業的に入手可能な試薬を用いて、アルデヒドの官能性を５’−アミノ化オリゴヌクレオチドにサクシニシドの化学作用を介して導入した（図１パネルａ）。同様に、ヒドラジド部分をそれぞれの抗体のリジン側鎖との反応を介して導入した（図１パネルａ）。次に、ＤＮＡ−抗体のコンジュゲート形成を、アルデヒドとヒドラジドの官能性間での化学式どおりのヒドラゾン結合形成を介して促進した。コンジュゲート形成及びＤＮＡ荷重における調整は、ＰＡＧＥ電気泳動法により検証した（図１パネルｂ）。
【０１２５】
それらの実験を行うために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８、５９４、及び６４７でラベルされたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。モノクローナルウサギ抗ヒトインターロイキン−４（クローン：８Ｄ４−８）、非蛍光性及びＡＰＣでラベルされたウサギ抗ヒト腫瘍壊死因子−α（クローン：それぞれＭＡｂ１及びＭＡｂ１１）、並びに、非蛍光性及びＰＥでラベルされたウサギ抗ヒトインターフェロン−γ（クローン：それぞれＮＩＢ４２及び４Ｓ．Ｂ３）を全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。非蛍光性及びビオチンでラベルされたマウス抗ヒトインターロイキン−２（クローン：それぞれ５３４４．１１１及びＢ３３−２）をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。５’−アミノ修飾を有した全てのＤＮＡ鎖をＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社から購入した。全６種類の２６−塩基長及びその指定に対する配列が、それぞれの名前／識別名と共に以下の表１に与えられており、その名称／識別名によって、その配列は添付の配列表に列挙されている。
【０１２６】
【表１】
2009545747.tif 000003
使用に先立ち、３０００ＭＷＣＯスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を用いて、全ての抗体を脱塩して、ｐＨ７．４ＰＢＳまでバッファー交換し、さらに、１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０１２７】
ヒドラジド基をモノクローナル抗体上へ同時に導入し、５’アルデヒドで修飾された一本鎖のＤＮＡを５’アミノ化オリゴマーから調製した（図１パネルａを参照）。
【０１２８】
特に、ＤＭＦ中サクシニミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（登録商標））を、ＳＡＮＨ対抗体における可変のモル過剰量（１０００：１から５：１）で抗体に添加した。この方法で、抗体に導入したヒドラジド基の数を変えた。別々に、ＤＭＦ中サクシニミジル４−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（登録商標））を、ＰＢＳ中５’アミノ化２６塩基長のオリゴマーに対して２０倍のモル過剰量で添加した。このＳＦＢ対ＤＮＡの比は、５’アルデヒドを生じるための５’アミン基の完全な反応を確実にした。室温にて４時間後、収量におけるさらなる改善は、抗体結合反応にもオリゴヌクレオチド結合反応にも観察されなかった。蛋白質脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標））を用いて、過剰なＳＡＮＨ及びＳＦＢを取り除き、試料をｐＨ６．０のクエン酸バッファーにバッファー交換した。
【０１２９】
次に、２０倍の過剰量の誘導体化されたＤＮＡを抗体と組み合わせ、室温にて一晩反応させて、図１のパネルｂに示されているＤＮＡによりコード化された抗体を形成させた。結合されていないＤＮＡをサイズ排除ゲル濾過スピンカラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−３０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標））で取り除くか、又は、０．５ｍｌ／ｍｉｎの均一濃度の流速のＰＢＳでＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラムを用いて精製した。ＤＮＡ−抗体コンジュゲートの合成を、５分間６０℃の緩和した変性状態で、非還元の７．５％トリス−ＨＣｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  ゲルスキャナー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で可視化した。蛍光抗体又は蛍光でラベルされたオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲーション反応を、同様に適切な励起及び放出フィルターを用いてイメージした。
【０１３０】
α−ヒトＩＬ−４に荷重している変化したオリゴマー（鎖Ａ１’）を、ゲル移動度シフトアッセイにより測定した（図１パネルｂを参照）。ＳＡＮＨ対抗体の化学量論比を変えることによって（レーンＩ〜ＩＶは、それぞれ３００：１、１００：１、５０：１、２５：１に対応する）、結合したオリゴヌクレオチドの平均数を調整することができる。
【０１３１】
著しく、コンジュゲートの合成に対する上記の方法は各抗体にＤＮＡ荷重を分布すると予期されるけれども、この効果はＰＡＧＥ分析を行う方法によって影響を受ける可能性がある。熱誘発性の変性進行ゲル電気泳動に対する正常な状態（１００℃で５分間）は、恐らくＤＮＡと蛋白質との間に生じるヒドラゾン結合を壊すことによって可視化されるＤＮＡ鎖の数を減少したことが特に観察された。変性状態を緩和することにより、５分間６０℃（優れたゲルに要求される最小限の条件）で加熱された試料は７つの分離したバンドを示し、５分間１００℃で加熱された同じ試料は付属のオリゴヌクレオチドを示さなかった。
〔実施例２：ポリヌクレオチドによりコード化されたストレプトアビジンの作製〕
ＤＮＡによりコード化されたストレプトアビジンの作製を、実施例１に例示されたＤＮＡによりコード化された抗体に対する方法と同じ方法に従い行った。唯一の相違点は、ＳＡＮＨ：ストレプトアビジンの比を１００：１で一定に保ったことであった。
〔実施例３：ポリヌクレオチドによりコード化された抗体のポリヌクレオチド荷重の最適化〕
オリゴヌクレオチドを用いて抗体にタグをつけることの有害な立体効果は、イムノアッセイ及び本明細書に記述された細胞選別／捕獲実験等種々のアッセイを行う場合に関心あるものである。この理由から、細胞表面マーカーの認識を保持するＤＮＡによりコード化された抗体の能力を、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により可視化しながら調査した。抗体ではなくＤＮＡ上に共有結合的にタグされた蛍光体を使用することにより、ＦＡＣＳを使用してポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲートに対するＤＮＡ荷重を最適化した。分析のため、種々のＳＡＮＨ対抗体の化学量論比（５：１、２５：１、５０：１、１００：１、３００：１）で、５’でアミノ化及び３’でＦＩＴＣによりラベルされたＤＮＡを、α−ＣＤ９０．２抗体上にタグした。これにより、ゲル移動度シフトアッセイにより測定された、平均で、１、２、３、４〜５、及び６〜７つの鎖のＦＩＴＣ−ＤＮＡコンジュゲ―トをそれぞれ作製した（図１パネルｄを参照）。これらのコンジュゲートのＴ細胞株ＶＬ３（ＣＤ９０．２発現）に結合する能力を、フローサイトメーターを用いてＦＩＴＣ蛍光をモニターすることによって検査した。Ｂ細胞株Ａ２０（ＣＤ９０．２陰性）を、負の対照として使用した（図３パネルａ及びｂを参照）。
【０１３２】
特に、ＶＬ３及びＡ−２０の細胞を、１００μＬのＰＢＳ−３％ＦＣＳ中０．５μｇのＦＩＴＣによりコンジュゲートされたネズミ抗マウスＣＤ９０．２（Ｔｈｙ１．２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン３０−Ｈ１２、カタログ＃５５３０１２）を用いて氷上で２０分間インキュベートした。種々のＦＩＴＣ−ＤＮＡ荷重により特徴づけられた、等モル濃度のα−ＣＤ９０．２／ＦＩＴＣ−ＤＮＡコンジュゲートを用いて、細胞を同様にインキュベートした。細胞を一度ＰＢＳ−３％ＦＣＳで洗浄し、次に、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを実行するＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）装置上のフローサイトメトリーにより分析した。
【０１３３】
α−ＣＤ９０．２／ＦＩＴＣ−ＤＮＡコンジュゲートを商業的に入手可能なＦＩＴＣα−ＣＤ９０．２抗体（ＤＮＡなし）と比較したＦＡＣＳプロット（パネルａ）及びヒストグラム（パネルｂ）が示された図３に、結果が示されている。
【０１３４】
図３に示されているように、コンジュゲートは、最小限のＡ２０との非特異的相互作用（１．３％）でＶＬ３細胞に（１００％）結合する。ＦＩＴＣα−ＣＤ９０．２と比較した場合、Ａ２０に対する非特異的結合はわずかに高く、全体の蛍光強度は１０分の１低い。パネルｂに例示された種々のＦＩＴＣ−ＤＮＡ荷重に対する平均蛍光強度のヒストグラムは、ＤＮＡ鎖の数が１から２、２から３に増加した場合に、蛍光の増加はおおよそ直線的であり、１、２、及び３つの発色団（１つの鎖あたり１つ）に対応することを示している。より高い荷重に対して、蛍光はプラトーに達し、次に減少する。
【０１３５】
特に、より高い荷重で、蛍光の増加は第一にプラトーに達し（４〜５オリゴマー）、次に、最荷重（６〜７オリゴマー）まで減少する。このように、過剰なＤＮＡラベル（４〜７オリゴマー）は、抗体の細胞表面マーカーを認識する能力を立体的に減少する。細胞表面マーカーの認識に対する最適な荷重は、１つの抗体あたり約３つのＤＮＡ鎖に対応する、５０：１のＳＡＮＨ：抗体比で合成した抗体を用いて得た。後の細胞選別実験はこの観察を考慮して行った。ＦＩＴＣα−ＣＤ９０．２対照と比較した場合、ＤＮＡ抗体コンジュゲートは、蛍光を１０分の１減少し、Ａ２０細胞に対する非特異的結合はわずかに高かった。あり得る要因は、ＤＮＡ抗体コンジュゲート対市販の抗体に対する蛍光体と抗体の化学量論比が異なることである。ＤＮＡ抗体コンジュゲートに対して、ＤＮＡの各鎖は、１つの蛍光体のみに結合する（すなわち、１つのＤＮＡ鎖を有するコンジュゲートは１：１の蛍光対抗体比を有する）が、市販の抗体は、一般的に、１つの抗体あたり１を超える蛍光体を有している（すなわち、蛍光抗体は１を超える蛍光対抗体比を有している）。
【０１３６】
従って、前述のオリゴマーの立体効果が相対的な蛍光強度におけるある種の減少の原因であることはあり得るけれども、１０分の１少ない蛍光は、ＤＮＡ抗体コンジュゲートの結合親和性における１０分の１の減少として厳密に解釈されるべきではない。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のような方法を用いた、対応する未修飾の抗体と比較したＤＮＡ抗体コンジュゲートの親和性の直接測定は、より決定的な情報を提供することができる。
【０１３７】
ポリヌクレオチドによりコード化された抗体のポリヌクレオチド荷重におけるさらなる最適化は、以下のように行った。２つの異なる長さの相補的ポリヌクレオチドを与えた。１つの組は１６塩基の重複を有し、もう一方の組は２０塩基の重複を有した。１６又は２０の組に対する直交のＤＮＡ配列は以下の実施例８で例証される手順に従い設計し、１６個の塩基が多数の直交配列を生じるのが可能な配列の総数にばらつきを有していなかったことを経験的に発見した。２０個の塩基に移ると、あり得る配列の最初のプールは劇的に増加し、直交配列を計算することははるかに簡単であるよう思われた。あり得る配列の総数は指数関数（４ｎ、ｎは相補的領域の長さ）であることに注目されたい。
〔実施例４：マイクロアレイ作製〕
Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｌｏｇｙの研究所（ＩＳＢ−Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）でマイクロアレイ設備により標準的な方法を介して、ＤＮＡマイクロアレイをアミンで被覆されたガラススライド上に印刷した。特に、ＳＥＱ  ＩＤ番号２、ＳＥＱ  ＩＤ番号４、ＳＥＱ  ＩＤ番号６、ＳＥＱ  ＩＤ番号８、ＳＥＱ  ＩＤ番号１０、ＳＥＱ  ＩＤ番号１２、ＳＥＱ  ＩＤ番号１４、ＳＥＱ  ＩＤ番号１６、及びＳＥＱ  ＩＤ番号１８といった配列を有するオリゴマーの種々の組合せを用いてＤＮＡマイクロアレイを印刷した。
【０１３８】
典型的なスポットサイズ及びスペーシングは、それぞれ１５０及び５００μｍであった。ポリリジンスライドを内々で作製した。空のガラススライドを、超音波処理バス内で各１０分間ＩＰＡ及び水で洗浄した。次に、１５０Ｗで６０秒間、酸素プラズマで処理し、続いて、ＤＩ水内に素早く浸漬して、シラノール末端の非常に親水性の高い表面を与えた。窒素銃で乾燥させた後、ポリ−Ｌ−リジン溶液（Ｓｉｇｍａ社  Ｐ８９２０、０．１％ｗ／ｖ、希釈なし）をプラズマ処理された表面に１５分間適用し、次に、ＤＩ水で数秒間洗い流した。最後に、これらの処理したスライドを６０℃で１時間ベーキングした。次に、これらのスライドをＩＳＢに送り、上記のように印刷した。
〔実施例５：モノパラメータなポリヌクレオチドによりコード化された抗体ベースのイムノアッセイ〕
図５は、ＤＮＡによりコード化されたストレプトアビジンを使用して細胞選別実験を行う１つの例である。ここでは、ＤＮＡによりコード化されたストレプトアビジンは第一に、４：１のビオチン−ＭＨＣ：ＤＮＡによりコード化されたストレプトアビジン比で、そのリガンドであるビオチンでラベルされた蛋白質に曝露される。ここで前記蛋白質は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）である。類似体のパニングも液相細胞捕獲実験も同時に行われる。特に、５μｌのストレプトアビジン−Ｃ３’は、２００μｌのＲＰＭＩ媒体中２０μｌのチロシナーゼＭＨＣと組み合わされ、氷上で２０分間構築させられる。その後、類似体のパニングのため、四量体は３０分間基板に結合させられ、後のアレイ上への２×１０６個の細胞の曝露の前にＰＢＳ内でリンスされる。パネルｂにおいて、ＤＮＡによりコード化されたＭＨＣは第一に、後の基礎をなすＤＮＡアレイへの曝露の前に、氷上で２０分間同じ数の細胞に結合させられる。２つのパネル間に細胞捕獲の効率が出現する。ｐＭＨＣ複合体に対する液相捕獲は、類似体のパニングよりもはるかに高い。留意すべきは、後者の一連の事象における高められた細胞捕獲の効率である。
〔実施例６：ポリヌクレオチドによりコード化された抗体を含む蛋白質アレイ〕
空間的に局在する抗体に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質法を、それぞれが異なる分子蛍光体を有し、それぞれが特有のＤＮＡ鎖でコード化された３つの同じヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて実証した。従って、３つ全ての抗体を含有する溶液を、相補的なオリゴヌクレオチドでスポットされたマイクロアレイ上に導入した。２時間のハイブリダイゼーション及び基板のリンス後、抗体はワトソン−クリック塩基対合に従い自己組織化した。
【０１３９】
特に、抗体マイクロアレイを、第一に３ｘＳＳＣ中０．１％ＢＳＡでＤＮＡスライドを３７℃で３０分間遮断することにより作製した。前記スライドをｄＨ２Ｏで洗浄し、ドライヤーで乾かした。ＤＮＡ−抗体コンジュゲートを含有した３０μｌ溶液（３ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．１％  ＢＳＡ、各コンジュゲート１５ｎｇ／μｌ）を顕微鏡スライドを用いてアレイにはさみ、３７℃で４時間インキュベートした。次に、アレイを、第一に３７℃で穏やかにかき混ぜながら１ｘ  ＳＳＣ、０．０５％  ＳＤＳで、続いて０．２ｘ  ＳＳＣで、続いて最後に０．０５ｘＳＳＣで洗浄した。そのスライドをドライヤーで乾かし、ＧｅｎｅＰｉｘ４２００２色アレイスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標））で走査した。
【０１４０】
イムノアッセイに対して、ＤＮＡによりコード化された第１の抗体（１５ｎｇ／μｌ）抗原（３ｎｇ／μｌ）、及び、蛍光でラベルされた第２の抗体（０．５ｎｇ／μｌ）を１つのチューブ内で混合した。３７℃で２時間後、形成した抗体−抗原−抗体の複合体を、実施例３で記述したようにマイクロアレイに導入した。後の洗浄ステップ及び可視化は同じであった。
【０１４１】
特に、（Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４、又はＡｌｅｘａ６４７の染料でラベルされた）３つの生化学的に同一のヤギα−ヒトＩｇＧを、オリゴＡ１’、Ｂ１’、及びＣ１’でそれぞれタグした。２時間のインキュベーション後、抗体／ＤＮＡコンジュゲートを、基礎をなすＤＮＡマイクロアレイにより指示された特異的部位に局在化させた。
【０１４２】
１ｍｍに一致するスケールバーで空間的にコード化された蛋白質アレイが示された図６及び７に、結果は示されている。図７から明らかなように、抗体は基板上でＤＮＡと集合し、従って、９００を超えるスポットの相補的なＤＮＡチップを多素子抗体アレイに変換している（図７を参照）。この観察は、かなり大きな抗体アレイを類似の様式で構築することができるということを意味した。
〔実施例７：生物付着の減少〕
最大サイズのいかなる蛋白質アレイも、蛋白質の非特異的結合からの干渉によっておそらく制限される。非特異的結合の寄与を可視化する試みにおいて、３つの抗体を同様にマイクロアレイ上に導入した。２つの抗体は相補的なＤＮＡラベルによりスポットされたオリゴヌクレオチドを有し、第３の抗体は未修飾抗体である。特に、マイクロアレイをヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８／Ａ１'、ヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７／Ｃ１’  ポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲート、及び、付属のＤＮＡを有さないヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ５９４に同時に曝露した。
【０１４３】
実証目的に対して、前記スライドはハイブリダイゼーションに引き続いて全くリンスせず、従って、コード化されていない蛍光でラベルされた抗体の非特異的吸着による高いバックグラウンド信号を観察した。
【０１４４】
非特異的な蛋白質の吸光に向けたポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の耐性方法の図解である図８に、結果は示されている。
【０１４５】
アレイを完全に遮断及び／又はリンスしなかった場合、非特異的結合をガラススライドの表面で観察したが、非相補的な印刷されたＤＮＡのスポットでは観察されなかった。すなわち、スポットＢ１は非相補的なＩｇＧコンジュゲートからの蛍光を有さなかったか、又は、ＤＮＡでコード化されていない蛋白質（ヤギα−ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ５９４）からの蛍光を示さなかった。
【０１４６】
抗体を化学的にコード化しなかったスポットされたヌクレオチド領域は、はるかに少ない非特異的に結合した蛋白質を示し、ＤＮＡは生物付着の有効領域を非常に減少することを意味した。そのような生物付着の阻止は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で機能化された基板を暗示している（Prime,  K.  L.;  Whitesides,  G.  M.  Science  1991,  252,  1164-1167.  Prime,  K.  L.;  Whitesides,  G.  M.  J.  Am.  Chem.  Soc.  1993,  115,  (23),  10714-10721）。ＰＥＧに付随する仮定上の機構との類似性によって（Jeon,  S.  I.;  Lee,  J.  H.;  Andrade,  J.  D.;  De  Gennes,  P.  G.  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science  1991,  142,  (1),  149-158.  Jeon,  S.  I.;  Andrade,  J.  D.  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science  1991,  142,  (1),  159-166.  Andrade,  J.  D.;  Hlady,  V.  Advanced  in  Polymer  Science  1986,  79,  (1-63)）、スポットされたオリゴヌクレオチドの親水性の性質が、非特異的吸着中に曝露されることが多い蛋白質の疎水性部分との相互作用を最小限にすることが仮定される。コンジュゲートハイブリダイゼーション実験は、算出した２倍の融解温度の５度内でも実行し、ワトソン−クリックのストリンジェンシーを利用し、従って非相補的なＤＮＡ相互作用を減少した。いかなる場合においても、１つの環境内で大きなパネルの蛋白質を適度に検出するためにポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質法をおそらく利用することができるこの方法によって、生物付着手段は減少した。
〔実施例８：Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのポリヌクレオチド直交化〕
別の重要な経験的観察は、非相補的なＤＮＡ鎖間でのクロストークのレベルである。その補体と共にＤＮＡ配列Ａ１、Ｂ１、Ｃ１を無作為に作製した。屈曲性のための５’Ａ１０セグメント及び１６塩基の認識配列の包含が唯一の制限であった。実験を実行するにあたり、低いが測定できる量のノイズが直線ではない二次相互作用による不適性配列から生じたことを発見した。ストリンジェンシー洗浄のみでノイズをかなり浄化することはできなかった。いかなる現実的なマルチパラメータのプラットフォームにおいても、このノイズは、調査におけるパラメータの数に比例して増大するおそれがある。従って、モデルプラットフォームは、互いに対して直交であり、ＤＮＡアレイ上に印刷された全ての曝露された相補鎖に対しても直交であるＤＮＡ配列を利用すべきである。
【０１４７】
結果として、３７℃で、配列と相補的な標的の間に生じるいかなる分子内相互作用も分子間相互作用も最小限にするという目的を持ってＤＮＡ配列を設計した。ダークス（Ｄｉｒｋｓ）等により概説されたパラダイム（Dirks,  R.  M.;  Lin,  M.;  Winfree,  E.;  Pierce,  N.  A.  Nucleic  Acids  Research  2004,  32,  (4),  1392-1403）を用いて計算的な設計を行った。特に、６種類の直交性の配列が設計され、経験的に検証されており、表２において報告されている。
【０１４８】
【表２】
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当業者は、本開示を読んだ後にさらなる直交化されたポリヌクレオチドを同定することができる。
〔実施例９：細胞の捕獲、分離、及び選別の方法〕
ＤＮＡによりラベルされた抗体を使用することによって、多重化された細胞選別に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の最適化及び使用を実証した。
【０１４９】
スタンダードなレトロウイルス形質導入プロトコールを使用して、２種類のマウスの細胞株、ＶＬ−３Ｔ細胞（胸腺リンパ腫細胞株（Groves,  T.;  Katis,  P.;  Madden,  Z.;  Manickam,  K.;  Ramsden,  D.;  Wu,  G.;  Guidos,  C.  J.  J.  Immunol.  1995,  154,  5011-5022））及びＡ２０Ｂ細胞（マウスＢ細胞リンパ腫（Kim,  K.  J.;  Langevin,  C.  K.;  Merwin,  R.  M.;  Sachs,  D.  H.;  Asfsky,  R.  J.  Immunol.  1979,  122,  549-554）、ＡＴＣＣから購入）を操作してそれぞれｍＲＦＰ及びＥＧＦＰを発現させた。これらの細胞株それぞれの表面マーカーに対する抗体、Ｖｌ−３にはα−ＣＤ９０．２及びＡ２０にはα−Ｂ２２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、上記のようにＤＮＡ鎖Ａ１’及びＢ１’でそれぞれコード化した。
【０１５０】
選別実験に対して、細胞を新鮮な培地〔１０％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ  非必須なアミノ酸、及び０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノールで補われたＲＰＭＩ  １６４０（ＡＴＣＣ）〕に１０６細胞／１００μｌ培地の濃度で継代培養し、ＤＮＡ−抗体コンジュゲート（０．５μｇ／１００μｌ）を用いて氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離後、過剰なコンジュゲートを上澄みから取り除き、その後で細胞を新たな培地中に再懸濁した。細胞のインキュベーションに先立ち、室温にて４時間、残留するアミン基をＰＨ＝７．４のＰＢＳ中１０ｍＭのメチル−ＰＥＯ１２−ＮＨＳエステル（Ｐｉｅｒｃｅ社）と反応させることによって、マイクロアレイのスライドを不動態化して非特異的細胞接着を減らした。細胞をマイクロアレイの表面に渡りむらなく広げ、氷上で１時間局在化させた。この時間の後、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ室温のトリス緩衝生理食塩水溶液で穏やかに洗浄しながら非接着細胞を取り除いた。全インキュベーションステップを、１：１のＴ及びＢ細胞（各１０６／１００μｌ）から成る混合物の存在下で行ったことを除いて細胞濃縮実験を同様に行った。
【０１５１】
初代のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、スタンダードな磁気ビーズによる負の選択プロトコール及びＢＤ  ＩＭａｇＴＭ細胞分離システムを使用して、（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た）ＥＧＦＰ及びｄｓＲｅｄ遺伝子導入マウスからそれぞれ精製した。ポリヌクレオチドによるコード化ベ―スの分画に先立ち、これらの集団の純度を、ＦＡＣＳにより分析し、８０％より大きいことを発見した。
【０１５２】
同時の細胞、遺伝子、及び蛋白質実験を、ペグ化したマイクロアレイ基板に対する上記の実験と同様に行った。
【０１５３】
手短に言えば、ＧＦＰ発現Ｂ細胞（１０６／１００μｌ）を、α−Ｂ２２０−Ｂ１’（  ０．５μｇ／１００μｌ）でラベルした後、Ｂ１スポット上に位置づけた。非接着細胞の除去に続いて、Ｃ１’によりコード化された第１の抗体及びＡＰＣでラベルされた第２の抗体とのＴＮＦ−α−ＥＬＩＳＡペアを、０．５ｎｇ／μｌのＦＩＴＣによりラベルされたＡ１’と共に導入し、室温にて３０分間ハイブリッド形成させた。次に、スライドをＴＢＳ＋ＭｇＣｌ２でリンスし、明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡を介して可視化した。
【０１５４】
ホモジニアスな細胞実験及びパニング細胞実験を並行して行った。ホモジニアスな細胞捕獲工程に対して、５ｘ１０６個のジャーカット（ＡＴＣＣ）を５μｇのα−ＣＤ３／Ｃ３’コンジュゲートと共に１ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。過剰なコンジュゲートを遠心分離により取り除き、ＤＮＡマイクロアレイに曝露する前にジャーカットを２００μｌの新鮮な培地中に再懸濁した。氷上での１時間のインキュベーションの後に、そのスライドをＴＢＳで穏やかにリンスした。細胞パニング実験を並行して行った。１ｍｌのＲＰＭＩ培地中５μｇのα−ＣＤ３／Ｃ３’コンジュゲートを、０．５ｘＰＢＳ、次に脱イオン水においてリンスする前に、氷上で１時間マイクロアレイの上でインキュベートした。そのスライドはドライヤーで乾かさずに、側面を優しくたたいて大部分の過剰な溶液を取り除き、アレイを水和させたままにした。直ちにジャーカット（５ｘ１０６／２００μＬ）を、氷上で１時間、アレイの上に配置した。後の洗浄及び可視化ステップは同じである。
【０１５５】
これらの実験の結果は図１０に例示されており、パネルａ及びｂは、本明細書に開示されている方法及びシステムの実施形態に従ったホモジニアスな細胞捕獲工程の効率を示した明視野画像を示している。
【０１５６】
特に、パネルａでは、ＤＮＡによりラベルされた抗体が細胞と組み合わされ、次に、その混合物がスポットされたＤＮＡアレイのマイクロチップ上に導入されるホモジニアスアッセイが描写されている。パネルｂでは、ＤＮＡによりラベルされた抗体が、スポットされたＤＮＡアレイ上に第一に集合され、細胞の導入が後に続く。このホモジニアスな工程は、表面に結合した抗体を使用して特異的細胞を捕獲する伝統的なパニング法に類似している。
【０１５７】
パネルａ及びｂに例示された結果を比較することにより、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質ベースの細胞選別を、ホモジニアスな細胞捕獲（液相の細胞捕獲）と細胞のヘテロジニアスな捕獲（表面に限られた細胞捕獲）を評価することによってパニングと比較した。ホモジニアスなＤＮＡによりコード化された蛋白質法は、より優れた細胞捕獲の効率を示した。
【０１５８】
捕獲効率の増加はいくつかの要因に起因し得る。ホモジニアスな細胞捕獲において、ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは、液内で適切に方向づけられ、細胞表面マーカーに結合させられる。細胞捕獲は、抗体対細胞表面マーカーの相互作用により駆動されないが、正しくは協合的結合を介したマイクロアレイ上の相補的なＤＮＡ鎖に対する多価のＤＮＡ−抗体コンジュゲートの増加した結合力により駆動され、捕獲効率を非常に上げている。類似の傾向がナノ粒子のＤＮＡハイブリダイゼーションスキームに対して報告されている（Taton,  T.  A.;  Mirkin,  C.  A.;  Letsinger,  R.  L.  Science  2000,  289,  1757-1760）。本明細書において開示されているヘテロジニアスなＤＮＡ−抗体により規定されたアレイに類似のパニング法を用いて、捕獲試薬は、表面のランダム配列を受け入れるよう限定される。単に細胞表面マーカーとの相互作用に対する不適当な配列のため抗体の活性は減少し、隣接する抗体との最大の結合力及び共同作用は減少する。
【０１５９】
パネルｃでは、多重化された細胞選別実験の明視野顕微鏡画像及び蛍光顕微鏡画像が示され、１：１のｍＲＦＰ発現Ｔ細胞（赤いチャネル）及びＥＧＦＰ発現Ｂ細胞（緑のチャネル）から成る混合物が、それぞれＡ１’及びＣ１’を有するα−ＣＤ９０．２抗体及びα−Ｂ２２０抗体のコード化に対応するスポットＡ１及びＣ１上へ空間的に層別化されている。特に、図１０ｃの実験において、Ｔ細胞マーカーＣＤ９０．２（Ｔｈｙ１．２）及びＢ細胞マーカーＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）に対してそれぞれ産生された抗体に２つの特有なＤＮＡ鎖をコンジュゲートした。多重化されたＤＮＡ−抗体ベースの細胞選別を、１：１の単量体の赤色蛍光蛋白質（Campbell,  R.  E.;  Tour,  O.;  Palmer,  A.  E.;  Steinbach,  P.  A.;  Baird,  G.  S.;  Zacharias,  D.  A.;  Tsien,  R.  Y.  Proc.  Natl.  Acaad.  Sci.  2002,  99,  7877-7882）（ｍＲＦＰ）発現Ｔ細胞（ＶＬ−３、マウス胸腺リンパ腫）及びＥＧＦＰ発現Ｂ細胞（マウスＢ細胞リンパ腫）の混合物を空間的に分離することによって実証した。Ｔ細胞マーカーに対してもＢ細胞マーカーに対しても独自にコード化されたＤＮＡ−抗体コンジュゲートでこの混合物をインキュベートし、適切にスポットされたマイクロアレイに導入した。結果は、明視野顕微鏡写真も擬似カラー蛍光顕微鏡写真も示しており、ｍＲＦＰ発現Ｔ細胞はスポットＡ１にて濃縮され、ＥＧＦＰ発現Ｂ細胞はＢ１に位置づけられており、それぞれの抗体のＤＮＡコード化と一貫したことを実証している。
【０１６０】
パネルｄには、マウスから回収された初代細胞の多重化された選別の蛍光顕微鏡写真が示されている。１：１のＥＧＦＰ遺伝子導入マウス由来のＣＤ４＋細胞、及び、ｄｓＲｅｄ遺伝子導入マウス由来のＣＤ８＋細胞から成る混合液が、ポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲートα−ＣＤ４−Ａ１’及びα−ＣＤ８−Ｃ１’をそれぞれ利用することによって、スポットＡ１及びＣ１に分離されている。初代細胞は確立された細胞株よりも通常脆弱である。これは、実現性を低下させてしまう工程である、（通常、酵素的消化により）周囲の組織から初代細胞が抽出されなければならないという事実のためである。さらに、培養工程は、非常に上げられた実現性並びに増殖能力により特徴づけられるクローンを選択する場合が多い。一般的な細胞選別技術は、従って、最小限の試料操作で初代細胞にも機能しなければならない。初代細胞の選別に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質法の実用性を実証するために、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の合成混合物を磁気によるネガティブ除去（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を介してＥＧＦＰ及びｄｓＲｅｄ遺伝子導入マウスからそれぞれ単離した。その混合物を、α−ＣＤ４及びα−ＣＤ８のＤＮＡ−抗体コンジュゲートを用いて層別化した。図１０ｄに示されているように、付属のＤＮＡコード化に従い、２種類の細胞型を異なる空間位置に分離した。
〔実施例１０：ＤＮＡによりコード化された抗体をＤＮＡが印刷されたアレイと組み合わせて使用したマルチパラメータ多重化分析〕
マルチパラメータ分析（細胞、ｍＲＮＡ、及び蛋白質）を、図１２において概略的に描写されたストラテジーに従い行った。
【０１６１】
図１１は、細胞選別並びに蛋白質及びｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の同時検出に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質法の図解である。（細胞選別のための）蛋白質、又は、（細胞表面マーカーを含んだ）他の蛋白質に対する抗体が、異なるＤＮＡオリゴマーでラベルされる。次に、これらのコンジュゲートは生物学的試料（細胞、組織等）と組み合わせることができ、その同起源の抗原に結合する。ＤＮＡマイクロアレイ上に導入された場合、同時の自己組織化が、ワトソン−クリック塩基対合に従い、特異的な空間位置に結合した種を局在化し、多重化されたマルチパラメータ分析を可能にしている。
【０１６２】
化学的に異なる標的を含んだ複数の標的を検出する本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の能力を例示するためにイムノアッセイを行った。特に、蛋白質標的ＩＬ４及びポリヌクレオチドＢ１の検出に対してアッセイを行った。この目的のために、蛋白質標的ＩＬ４に特異的な抗体をポリヌクレオチドＣ１でコード化し、ポリヌクレオチドＢ１に相補的なポリヌクレオチドを調製した。ポリヌクレオチドＢ１に相補的なポリヌクレオチドを、上記のように、Ｃ１’によりコード化された抗ＩＬ４と共にインキュベートした。図１２に例示されているように、特異的結合後、ＩＬ４に対する蛍光体第２の抗体を導入し、蛋白質標的ＩＬ４及びオリゴヌクレオチドＢ１の同時検出を行った。
【０１６３】
図１１において概略的に例示されたプラットフォームの普遍的な多様性を強調するために、ＧＦＰ発現Ｂ細胞をＢ１’ＤＮＡによりコード化された抗体のコンジュゲートでタグし、相補的なオリゴヌクレオチドでコード化されたスポット（Ｂ１）上に空間的に位置づけた。細胞局在化の後、ＦＩＴＣでラベルされたＡ１’ＤＮＡ及びＣ１’によりコード化されたＴＮＦ−αイムノサンドイッチを組合せ、同じマイクロアレイプラットフォームに導入した。図１３に示されている結果として生じる明視野顕微鏡画像及び蛍光顕微鏡画像は、異なるレベルの生物学的複雑さにわたって同時に及ぶための、本明細書に開示された方法及びシステムの実施形態によるプラットフォームの妥当性を実証している。
【０１６４】
特に、図１３は、同時の、スポットＢ１での細胞捕獲、並びに、遺伝子及び蛋白質のそれぞれスポットＡ１及びＣ１でのマルチパラメータ検出を実証した顕微鏡画像を示している。明視野画像は、スポットＢ１に位置づけられたＥＧＦＰ発現Ｂ細胞（緑色のチャネル）、ＦＩＴＣでラベルされた（緑色の）ｃＤＮＡをＡ１で、及び、Ｃ１にコード化されたＡＰＣでラベルされたＴＮＦ−αサンドイッチイムノアッセイ（青色）を示している。スケールバーは、３００μｍに一致する。
【０１６５】
本明細書において例証されたポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質の方法及びシステムにおける効率は、基板に抗体を固定するように特異的に結合するポリヌクレオチドの使用におそらく帰することができる。蛋白質検出に対する又は細胞パニングに対する従来の抗体アレイ（Wysocki,  L.  J.;  Sato,  V.  L.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  1978,  75,  (6),  2844-2848）には、アルデヒド、エポキシ、マレイミド、又は疎水性の固体支持体への抗体の固定化が必要とされる（Liu,  X.;  Wang,  H.;  Herron,  J.;  Prestwich,  G.,  Bioconjugate  Chem.  2000,  11,  (755-761).  Macbeath,  G.;  Schreiber,  S.  L.  Science  2000,  289,  1760-1763.  Pal,  M.;  Moffa,  A.;  Sreekumar,  A.;  Ethier,  S.;  Barder,  T.;  Chinnaiyan,  A.;  Lubman,  D.  Anal.  Chem.  2006,  78,  702-710.  Thirumalapura,  N.  R.;  Morton,  R.  J.;  Ramachandran,  A.;  Malayer,  J.  R.  Journal  of  Immuological  Methods  2005,  298,  73-81）。ｐＨ、イオン強度、温度、及び濃度を含めた多くの変動する要因に依拠する表面誘発性の変性のため、折り畳まれた（活性がある）抗体の高次構造を保つのは難しい場合が多い（Seigel,  R.  R.;  Harder,  P.;  Dahint,  R.;  Grunze,  M.;  Josse,  F.;  Mrksich,  M.;  Whitesides,  G.  M.  Anal.  Chem.  1997,  69,  3321-3328.  Ramsden,  J.  J.  Chem.  Soc.  Rev.  1995,  24,  73-78.  Fainerman,  V.  B.;  Lucassen-Reynders,  E.;  Miller,  R.  Colloids  Surf.  A  1998,  143,  141）。このことは、ヒドロゲル及びポリアクリルアミドのような３次元マトリックスを含んだ蛋白質特有の高次構造を保つ別の方法（Arenkov,  P.;  Kukhtin,  A.;  Gemmel,  A.;  Voloshchuk,  S.;  Chupeeva,  V.;  Mirzabekov,  A.  Anal.  Biochem.  2000,  278,  123-131.  Kiyonaka,  S.;  Sada,  K.;  Yoshimura,  I.;  Shinkai,  S.;  Kato,  N.;  Hamachi,  I.  Nature  Materials  2004,  3,  58-64）、クチナーゼにより方向をもった抗体のＳＡＭへの固体化（Kwon,  Y.;  Han,  Z.;  Karatan,  E.;  Marksich,  M.;  Kay,  B.  K.  Anal.  Chem.  2004,  76,  5713-5720）、並びに、ビオチン化した抗体のストレプトアビジンにより被覆された表面へのカップリング（Peluso,  P.;  Wilson,  D.;  Do,  D.;  Tran,  H.;  Venkatasubbaiah,  M.;  Quincy,  D.;  Heidecker,  B.;  Poindexter,  K.;  Tolani,  N.;  Phelan,  M.;  Witte,  K.;  Jung,  L.;  Wagner,  P.;  Nock,  S.;  Anal  Biochem.  2003,  312,  113-124.）の開発に拍車をかけた。さらに、アレイは、蛋白質変性を防ぐために、製造工程の間中水和を保つ必要がある（Macbeath,  G.;  Schreiber,  S.  L.  Science  2000,  289,  1760-1763）。一方、ＤＮＡマイクロアレイは、一般的に（スポット形成を介して）アミン表面上へと静電気的に吸収される。
【０１６６】
同じスライド上でＤＮＡも蛋白質も検出するための１つの選択肢は、システムの複雑さ及び操作をかなり増やしてしまうけれども、ＤＮＡを固定するために使用される官能基も蛋白質も同じ基板上にパターン形成することであろう。あるいは、両立できる表面は、アミン−ＤＮＡ及び蛋白質がどちらも共有結合的に結合することができる活性化されたエステルのガラススライドであり得る。しかし、本発明者等は、従来法で調製されたアミンスライド上に印刷されたＤＮＡと比較した場合に、ＤＮＡに対するこれらスライドの荷重能力は減少し、乏しい信号強度を生じることを発見した。さらに、未反応のエステルは、通常のハイブリダイゼーションバッファー（ｐＨ７）で負の電荷を持つカルボン酸まで加水分解で戻され、ＤＮＡ相互作用を静電気的に減少する。さらに、細胞及び蛋白質を調べるために、完全な抗体の機能性を維持しながら細胞の非特異的結合を減らす最良の表面は、ＤＮＡと両立しないアクリルアミドである（Soen,  Y.;  Chen,  D.  S.;  Kraft,  D.  L.;  Davis,  M.  M.;  Brown,  P.  O.  PLoS  Biology  2003,  1,  (3),  429-438.  Boozer,  C.;  Ladd,  J.;  Chen,  S.;  Yu,  Q.;  Homola.  J.;  Jiang,  S.  Anal.  Che,.  2004,  76,  6967-6972  ）。
【０１６７】
さらに、細胞、ｃＤＮＡ、及び蛋白質に対する一般的な構築ストラテジーとしてＤＮＡを使用することによって、スポットされた基板上への高いＤＮＡ荷重のため、及び、抗体への相補的なＤＮＡの荷重のために基板の状態を最適化することができる。これにより、（伝統的なパニングと比較して）非常に感度の高い蛋白質検出のためのサンドイッチアッセイ、並びに、高効率の細胞選別が生じる。
〔実施例１１：マイクロ流体デバイスの作製〕
マイクロ流体ベースのアッセイは、減少した試料及び試薬の容積並びに短縮されたアッセイ時間等の利点を提供する（Breslauer,  D.  N.;  Lee,  P.  J.;  Lee,  L.  P.  Mol.  BioSyst.  2006,  2,  97-112）。例えば、特定の操作条件の下、表面結合のアッセイ動態学は、拡散によってではなく、分析物（蛋白質）の濃度及び分析物／抗原の結合親和性によって第一に決定される（Zimmermann,  M.;  Delamarche,  E.;  Wolf,  M.;  Hunziker,  P.  Biomedical  Microdevices  2005,  7,  (2),  99-110）。マイクロ流体ベースのポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質法を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ベースのマイクロ流体チャネルをＤＮＡマイクロアレイの上面に結合させることにより評価した。
【０１６８】
特に、従来のソフトリソグラフィ技術を使用して、マイクロ流体チャネルをポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製した。目的は、表面アッセイを光学分析のために完了した後分解することができる強固なマイクロ流体チャネルを作製することであった。結果として生じる流体のネットワークが、それぞれ１０ｘ６００μｍの断面特性を有し、長さが２ｃｍである２０個の並列チャネルから成るように、種型を高解像度の透明マスクからフォトリソグラフィで作製した（ＣａｄＡｒｔ）。これは、１２０ｎｌのチャネル容積に一致する。シリコンエラストマー（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４（登録商標））を混合し、前記型の上面に注いだ。硬化後、ＰＤＭＳを型から取り除き、試料の注入口及び排出口に２０ゲージのスチールピン（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（登録商標））で穴をあけた。次に、マイクロ流体チャネルをマイクロアレイの上面に並べ、８０℃で一晩中基板に結合させた。
〔実施例１２：ＤＮＡによりコード化された抗体を使用したマイクロ流体ベースのアッセイ手順〕
０．５μｌ／ｍｉｎまでの含気性に調節された流速を可能にするために、マイクロ流体デバイスを２３ゲージのスチールピン及びＴｙｇｏｎ（登録商標）チューブとインターフェースで接続した。減少されたバックグラウンドノイズという点で１ｘＳＳＣ及びＰＢＳよりも良いと判ったトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）において、いくつかのアッセイを行った。流れ状態の下１０分間のＤＮＡ−抗体コンジュゲート又はイムノアッセイの組合せへの曝露に先立ち、各チャネルをＴＢＳ中１．０％ＢＳＡで遮断した。流れ状態の下、コンジュゲート又は抗原に１０分間曝露した後、チャネルをバッファーで２分間洗浄し、走査するためマイクロ流体をガラススライドから解体した。直ちに画像処理に先立ち、上記のように、スライド全体をＴＢＳにおいて簡単にリンスし、ドライヤーで乾燥して、アレイスキャナー上で画像処理した。
【０１６９】
第１の一連のアッセイにおいて、（Ａｌｅｘａ５９４及びＡｌｅｘａ６４７でラベルされた）２種類のヤギα−ヒトＩｇＧに、それぞれオリゴＡ１’及びＢ１’でタグをつけ、対応する相補鎖Ａ１及びＢ１を非相補鎖Ｃ１と共に有するＤＮＡマイクロアレイの上面に結合したマイクロ流体デバイス内に導入した。スポットＣ１にコード化されるポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲートは添加しなかった。０．５μｌ／ｍｉｎまでの流速で１０分間流した後、マイクロ流体ＰＤＭＳ平板を取り除き、ガラススライドを画像処理した。図１４に例示された結果は、抗体コンジュゲートが付属のオリゴヌクレオチドによりコード化された的確な空間位置で１０分より短い時間内で自己組織化したことを示しており（図１４を参照）、それはマイクロ流体におけるＤＮＡハイブリダイゼーションに対して報告された時間尺度（Erickson,  D.;  Li,  D.;  Krull,  U.  Anal.  Biochem.  2003,  317,  186-200.  Bunimovich,  Y.;  Shin,  Y.;  Yeo,  W.;  Amori,  M.;  Kwong,  G.;  Heath,  J.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2006  (ウェブによる公開１２  １  ２００６)  DOI:  10.1021/ja065923u.  Wei,  C.;  Cheng,  J.;  Huang,  C.;  Yen,  M.;  Young,  T.;  Nucleic  Acids  Research  2005,  33,  (8),  1-11）と一貫している。蛋白質検出に対するポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質ストラテジーを検証するために、スタンダードなイムノアッセイの異型においてコード化された抗体を利用して同起源の抗原を検出したさらなるアッセイを行った。
【０１７０】
スタンダードなイムノアッセイ（Engvall,  E.;  Perlmann,  P.  O.  J.  Immunol.  1972,  109,  129-135）において、第１の抗体が固体の支持体上に吸着され、抗原含有試料及び第２のラベルされた「読み取り」抗体の連続した導入並びにインキュベーションが、その間にリンス段階をはさみながら続く。この従来の５段階イムノアッセイを単純化するために、ＤＮＡによりコード化された抗体のコード化力を使用して、多重化された読み取りのためにサンドイッチ複合体全体を適切な位置に置き、アッセイを１段階まで減少した。
【０１７１】
特に、非蛍光性の、ＤＮＡによりコード化された第１の抗体を、抗原及び蛍光でラベルされた（ＤＮＡなしの）第２の抗体と組み合わせた。これらの条件の下、抗体−抗原−抗体のサンドイッチのホモジニアスな溶液における形成及びマイクロアレイ上への局在化が成功した場合のみ、蛍光信号は空間的にコード化される。
【０１７２】
特に、第１のさらなる一連のアッセイにおいて、２種類のサイトカイン、ヒトＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに対するＤＮＡによりコード化された抗体、同起源の抗原、並びに、蛍光でラベルされた第２の抗体の導入後、ＤＮＡによりコード化された抗体のサンドイッチアッセイは、図１５ａに示されているように、その抗体が検出された特異的な空間位置に自己組織化した。このマルチ蛋白質イムノアッセイも、完了するまで１０分かかった。
【０１７３】
マイクロ流体の、ＤＮＡによりコード化された抗体ベースのサンドイッチアッセイにおける感度制限を、第３のインターロイキンであるＩＬ−２を使用して、第２の一連のアッセイにおいて調査した。蛍光第２の抗体（パネルｂ）、並びに、可視化及び増幅ストラテジーとしてＡｕ無電解メッキ（パネルｃ）をそれぞれ使用して可視化を行った図１５ｂ及び図１５ｃに、結果は示されている。
【０１７４】
蛍光読み取りストラテジーを使用して、５μＭの飽和濃度で相補的なＤＮＡがスライド上に印刷されたアッセイは、約１ｎＭの感度制限で頂点に達した（データは図示せず）。ヒトＩＬ−２の濃度系列に対して、第１のＤＮＡ−抗体コンジュゲートを、抗原及び第２の抗体に曝露する前にまず表面上に置いた。これは、ＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションに対して、抗原が結合した第１の抗体に比べて抗原が非結合の第１の抗体は高い比を有することによって、より低い濃度の抗原で信号は減少するためである。アレイを第１のＤＮＡ−抗体コンジュゲートにまず曝露することによって、後に抗原及び第２の抗体に曝露する前に過剰量を洗い流して、信号を増加した。
【０１７５】
いくつかストラテジーを使用して感度を上げた。第一に、ＤＮＡに対するガラススライドの荷重能力を上げることにより、局在化されるポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲートの密度が増加し、従って、起こり得る捕獲事象の数が増加すると判断した。従来のＤＮＡマイクロアレイは、アミン−シランをガラスと反応させることにより生じる一級アミンの表面上に印刷される（Pirrung,  M.  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2002,  41,  1276-1289）。ＤＮＡ鎖は、中性ｐＨの条件でのプロトン化されたアミン由来の正電荷とＤＮＡのリン酸骨格上の負電荷との静電気的相互作用を介して固定化される。スライドの荷重能力を高めるために、ポリリジン表面を生じて、ＤＮＡとの相互作用の表面領域も電荷密度も増加した。これらの電荷を受けることにより、１００μＭの飽和濃度で相補的なＤＮＡをガラススライド上に印刷することが可能になる。対応して、蛍光ベースのアッセイの感度が１０ｐＭまで増加した（図１５ｂ）。
【０１７６】
異なる可視化方法では、信号をさらに増幅し、蛍光ベースの読み取りを光学のものに転換するために、Ａｕナノ粒子でラベルされた第２の抗体を使用した後、無電解金属メッキを続けた（Hainfeld,  J.  F.;  Powell,  R.  D.,  Silver-  and  Gold-Based  Autometallography  of  Nanogold.  In  Gold  and  Silver  Staining:  Techniques  in  Molecular  Morphology,  Hacker,  G.W.;  Gu,  J.,  Eds.  CRC  Press:  Washington,  DC,  2002;  pp  29-46）。これは、比色定量の多重化ではなく空間的な多重化が利用されるため可能である。
【０１７７】
特に、マイクロ流体ベースのＡｕ増幅実験を、ビオチン−第２の抗体を蛍光でラベルされた抗体の代わりに使用したことを特に除いて、上記のものと類似の様式で行った。後に、Ａｕ−ストレプトアビジン（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ社）を各チャネル（３ｎｇ／μｌ）内に１０分間導入し、その後チャネルをバッファーで徹底的にリンスした。ＰＤＭＳを取り除いた後、スライド全体を、次に、ゴ―ルドエンハンサーキット（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ社）を用いて製造業者のプロトコールに従い増幅した。
【０１７８】
これらの改善を受けることにより、ＩＬ−２インターロイキンの存在を、１０ｆＭ未満の濃度制限で容易に検出することができ（図１５ｃ）、蛍光ベースのマイクロ流体イムノアッセイよりも少なくとも１０００倍の感度の増加を表している。比較して、この方法は、従来のＥＬＩＳＡよりも１００〜１０００倍感度が良く（Crowther,  J.  R.;  ELISA;  Theory  and  Practice.  In  Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press  Inc.:  Totowa,  New  Jersey,  1995）、製造業者からの対応するヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡデータよりも１５０倍感度が良い（http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?prodId=6725）。
【０１７９】
これらの実験の結果は、１段階イムノアッセイと比較した場合の、特により低い濃度の抗原で試薬の連続した曝露を介して行われたアッセイにおける改善された感度を示している。これは、カーゴを用いた及びカーゴなしでの基礎と成るＤＮＡマイクロアレイ上へのハイブリダイゼーションに対するＤＮＡ抗体コンジュゲート間での競合的結合のため最も起こり得ることである。ポリヌクレオチドによりコード化されたコンジュゲート、抗原、続いて第２の抗体にアレイを順次に曝露することによって感度を上げた。利便性及び感度という点での所望の結果を考慮して、最も適した方法が選択されなければならない。しかし、それでも各段階に対して１０分以内のマイクロ流体流れ条件下で最大信号は達せられることを依然として強調されたい。このように、完全にオートメーション化された装置において、下は１０ｆＭに至るまでの感度で完全なマイクロ流体イムノアッセイを（Ａｕ増幅のための３０分の段階を含めて）１時間で得ることができる。
〔実施例１３：金属ナノ粒子でラベルされたＤＮＡによりコード化された抗体の使用における標的定量化〕
図１６及び１７に描写されたストラテジーに従い、ＤＮＡによりコード化された抗体をＤＮＡアレイと組み合わせて使用し、デジタルプロテオミクス（ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）を検出した。特に、特定のサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）を検出するためにアッセイを行ってきた。４０ｎｍＡｕ粒子が使用されること、及び、検出スキームが暗視野光散乱顕微鏡であることを特に除いて、上記の３段階イムノアッセイに類似の様式で全実験を行った。
【０１８０】
特に、デジタル方法において、暗視野光散乱顕微鏡法により容易に検出される４０ｎｍＡｕナノ粒子で前記第２の抗体をラベルした。より明確には、４０ナノメートルのＡｕナノ粒子−ストレプトアビジンコンジュゲートを、デジタルアッセイに対する検出プローブとして使用した。
【０１８１】
関連するデジタルイムノアッセイの検出を、図１８に例示された方法を用いて行った。図１８に例示された方法によると、散乱した光が暗視野顕微鏡対物レンズを用いて測定される。非常に小さなＡｕ粒子のプラズモン応答でさえも、容易に選び検出される。個々の粒子は、手動で、又は、粒子カウントのためのオートメーション化されたソフトウェアパッケージを用いて数えられる。粒子全ての散乱する色が、黄色から緑色に非常に類似していることに留意されたい。これは、Ａｕナノ粒子（１０）が（６０ナノメートル直径までの）かなり狭いサイズ範囲のものであるためである。光学フィルターを光散乱顕微鏡に利用して、他の散乱した光全てを除去し、従ってバックグラウンドを減少することができる。
【０１８２】
レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）光散乱を用いてコンジュゲートが可視化される図１９から２２に、実験の結果は示されている。
【０１８３】
本明細書において開示されている方法及びシステムの実施形態に従い行ったデジタルアッセイの感度は、ＴＮＦ−αの濃度系列が示されている図１９及び２０に実証されている。この蛋白質由来の信号は、１００ａｔｔｏＭｏｌａｒ程低い濃度で容易に同定することができる。図１９及び２０は、本明細書において開示されている方法及びシステムを用いて異なる濃度で行ったＴＮＦ−αデジタルイムノアッセイの典型的な暗視野画像を示している。ＮＩＨにより提供された科学的なグラフ処理ソフトウェアである、粒子数を自動的に数えるＩｍａｇｅＪ（登録商標）を使用した。金ナノ粒子の数対ＴＮＦ−α濃度が、図２０のヒストグラムにおいてプロットされている。
【０１８４】
血清測定におけるこの新たな技術の能力をさらに評価するために、前述の３種類のサイトカイン蛋白質（ＩＬ２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）を（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した）ヒト血清に加え、上記で行ったのと同じＡｕＮＰベースのアッセイを実行した。結果は図２１に示されている。特に、３種類の蛋白質：ＩＦＮ−γ；ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を加えた血清試料からパネルａの画像を回収した。パネルｂの画像は、本明細書に開示された方法及びシステムの実施形態に従い健康なヒトの血清から測定したデジタルイムノアッセイ由来である。これらの蛋白質のうち全３種類が、ヒト血清における検出可能な濃度未満で一般的に存在する。ＴＮＦ−αは検出可能限度よりも下であるが、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２は数フェムトモル（１０−１５Ｍ）の濃度レベルで存在する。この量の蛋白質は、従来の吸光若しくは蛍光ＥＬＩＳＡ、又は、さらに本明細書に開示された方法及びシステムの別の実施形態を用いて行ったイムノアッセイの検出限度よりもかなり下である。
【０１８５】
上記で例証された実施形態による方法は、高い感度及び非常に少ないバックグラウンドノイズで血清においてよく機能することが判った。生物学的に有益な分子であるが純粋な健康のヒト血清において微量に存在するサイトカインに対してデジタルイムノアッセイの実施形態は感度が良いということが重要である。図２１の右に示されているように、ＴＮＦ−αは検出しなかったけれども、ヒトＩＦＮ−γ及びＩＬ−２に対応する信号が存在する。この結果は、検出が金属ナノ粒子を用いて行われる、本明細書に開示された方法及びシステムの能力を示している。
【０１８６】
全て同じ濃度で調製した、前述の３種類のヒトサイトカイン蛋白質の検出を検査した（図２２）。特に、３種類のｓｓＤＮＡ’分子を基板上にスポットし、それぞれのｓｓＤＮＡ’は、第１のＡＢ：抗ＩＦＮ−γ；抗ＴＮＦ−α、及び抗ＩＬ−２上にラベルされたｓｓＤＮＡオリゴマーに相補的であった。基板を血清／蛋白質の混合物に曝露した後、６０ナノメートル直径のＡｕナノ粒子でラベルされた第２のＡＢを導入した。Ａｕナノ粒子は、暗視野光散乱顕微鏡を用いて可視化される。
【０１８７】
図２２に示されている結果は明白に可視化することができ、蛍光ベースのアッセイと一致して、ＴＮＦ−αは、第１の抗ＴＮＦ−αＡＢの高い親和性のため最大信号強度を示している。
【０１８８】
バックグラウンドはゼロに近いこと、及び、検出された蛋白質のダイナミックレンジは少なくとも１０６であることに注目されたい。これらの種類のアッセイは、特定のサイトカイン（ＩＬ２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）を健康なヒトの血清から検出するよう利用されてきた。このことは、それらの蛋白質が１〜５フェムトモルのみのレベルで存在する（本発明者等の測定による）ため以前から可能であった。抗体／蛋白質の親和性が特徴づけられると、これらの種類のアッセイは絶対的及び定量的であり、較正を必要としないことを意味するということに注目されたい。
【０１８９】
本明細書に開示されている方法及びシステムを用いた分子のデジタル検出は、マイクロ流体の環境に容易に適応される（図２１からの結果をマイクロ流体の環境において実行した）。この種のマイクロ流体イムノアッセイに付随して生じる試料サイズ及び時間尺度の利益に加えて、他の利点がある。例えば、読み取りに先立ち、アッセイ全体が溶液内で行われるため、（スポットされた抗体のマイクロアレイに対する懸念である）蛋白質変性により結合効率は減少しない。さらに、基板により支持された抗体を含むいかなるアッセイも、（８０℃での長期のベーキングを含んだ）マイクロ流体チップの構築に耐えられなかった。光学読み取り段階のために後に分解することができる強固なＰＤＭＳマイクロ流体チャネルを生じるその方法を設計した。
【０１９０】
液相アッセイを行う別の利益は、抗原によっても抗体によっても享受された配向性の自由により、固体の支持体が捕獲剤の結合ポケットへの分析物の接近を制限しないことが確実にされるということである。
〔実施例１４：診断方法及びシステム〕
バイオマーカーの分析に対する、本明細書に開示された方法及びシステムの一部の初期較正及び定量化を、多くの癌、特に神経膠芽腫において乱されるＰ１３Ｋ経路内で行った。特に、図２３では、神経膠芽腫（脳癌）において重要なマーカーであるバイオマーカーＰＴＥＮの検出に技術が適用された実施形態が例示されている。
【０１９１】
本明細書において開示されている方法及びシステムは、組み換えＰＴＥＮを基準として使用することによって第一に装置を較正する蛍光ベースのアッセイにおいて使用されてきた（図２３、パネルａ及びｂ）。蛋白質ＰＴＥＮの較正は、２５ｎＭから３７５ｐＭまでに及ぶ左の７値域で示されている。右の３値域は、ＰＴＥＮポジティブ及びＰＴＥＮゼロの試料を表している。較正値域と比較することにより、約１ｎＭにされるＰＴＥＮの濃度を既知の値から推定することができる。本発明者等は、従って、神経膠芽腫の細胞株Ｕ８７におけるＰＴＥＮ発現レベルを定量化するよう続けた（パネルａ及びｃ）。図２３に例示されたように、本明細書に開示された方法及びシステムを用いて、道理にかなったレベルのＰＴＥＮ（１ｎＭ）が検出可能であるということが明らかである。
【０１９２】
本明細書に開示された方法及びシステムを用いて、個々の健康状態に対する指標として、血清内のバイオマーカーの検出及び関連する分析を行うことも可能である。特に、本明細書に開示された方法及びシステムを用いて肝毒性の研究を行うことができる。肝臓はヒトの体内で２番目に大きい器官（１番目は皮膚）であり、血液と常に接触しているため、肝臓における結果は特に興味深い。従って、この器官での撹乱が血清に存在する肝臓特異的な蛋白質バイオマーカーの量に著しい変化をもたらすということは非常に起こり得ることである。
【０１９３】
血清バイオマーカー発見から臨床検証までの例証的な経路が図２４に例示されている。
【０１９４】
血清バイオマーカー発見における第一段階は、タンデム型質量分析における従来技術の現在の状況を介した、血液内の蛋白質のプロテオミクス分析を含む。従って、タンデム型質量分析を用いたマウスモデルに対する高レベルなアセトマニフェン（ａｃｅｔｏｍａｎｉｐｈｅｎ）の投与に引き続いて上方制御又は下方制御されることになる約２５種類の蛋白質の初期蛋白質リストを発見した（図２４、パネルａ（１））。特に、検出されるペプチドは、候補蛋白質バイオマーカーのリストを生じるよう位置づけかえされる。これらのバイオマーカー及びその随伴の捕獲剤（抗体）は、表面プラズモン共鳴における従来技術の状況を使用してスクリーニング及び検証される。特に、ＳＰＲを用いて、特に効果的な抗体ペアを検証した（図２４、パネルｂ（２））。最後に、非常に感度の良い、多重化されたモニタリングを可能にするために、これらの検証した蛋白質捕獲剤は、本明細書において開示された実施形態によるマイクロ流体システムに移され、血液内の血清バイオマーカーのモニタリングを可能にする。特に、４種類の肝臓特異的血清蛋白質及び３種類の免疫特異的蛋白質を血清全体から検出するためのチップを設計及び検査した（図２４、パネルｃ（３））。図２４に示されている結果により、障害なく全標的を血清から検出したことが示されている。
【０１９５】
上記の実証のうち全てを、マウス若しくはヒトの血清試料又はその両方で実行してきた。
【０１９６】
要約すると、本明細書において提供されているのは、ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質と基板のポリヌクレオチドとの組み合わされた使用に基づき試料内の標的を検出及び／又は選別する方法及びシステムである。ポリヌクレオチドによりコード化された蛋白質は、所定の標的に特異的に結合する蛋白質、及び、基板のポリヌクレオチドに特異的に結合するコード化ポリヌクレオチドから成り、基板のポリヌクレオチドは基板に結合される。
【０１９７】
上記の実施例は、本開示の装置、システム、及び方法の実施形態の作成方法及び使用方法における完全な開示及び説明を当業者に与えるよう提供されており、本発明者等がその開示としてみなすものの範囲を限定するよう意図されない。当業者には明らかである、本開示を実行するための上記の方法における修正は、以下の特許請求の範囲内であると意図される。本明細書において言及された全ての特許及び刊行物は、本開示が関連する当業者の技術のレベルを示している。本開示において引用された全ての参考文献は、各参考文献が個々にその全内容を参照により引用されたかのように、同じ程度まで参照により引用される。
【０１９８】
背景技術、発明の概要、並びに実施例における（特許、特許出願、学術誌の記事、要旨、実験マニュアル、本、又は、他の開示を含めた）引用された各文書の開示全体を、参照により本明細書に援用する。さらに、本明細書に添えて提出される配列表のハードコピー及び対応するコンピュータで読み取り可能な形態は、どちらもその全内容を参照により本明細書に援用する。
【０１９９】
本開示は、特定の組成物又は生物学的システムに限定されず、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は記述している特定の実施形態のみの目的のためであり、限定するとして意図されないことも理解されたい。本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用された場合、単数形の不定冠詞又は定冠詞は、その内容が何か他に明確に指示していない限り、その指示対象の複数形を含む。「複数の」という用語は、その内容が何か他に明確に指示していない限り、２つ以上の指示対象を含む。他に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示に関連する、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有している。本明細書に開示されているものと類似又は同等のいかなる方法及び材料も使用することができるけれども、適切な材料及び方法の特定の例をテストする実行が本明細書には記述されている。
【０２００】
本開示の多くの実施形態が記述されてきた。それにもかかわらず、本開示の真意及び範囲から逸脱することなく種々の修正を行うことができると理解されるであろう。従って、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【０２０１】
本国際出願は、２００６年８月２日に出願した米国仮出願番号第６０／８３４，８２３号、“Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｄｏｃｋｅｔ  ＮＯ．  ＣＩＴ−４７０７、及び、２００７年７月１６日に出願した米国仮出願番号第６０／９５９，６６５号、“Ｄｉｇｉｔａｌ  ＤＥＡＬ：  Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”Ｄｏｃｋｅｔ  ＮＯ．  ＣＩＴ−４９４４に基づく優先権を主張するものであり、第６０／８３４，８２３号及び第６０／９５９，６６５号の全内容を本国際出願に援用する。
政府による寄付金に関する記述
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ国立癌研究所により与えられた寄付金番号ＣＡ１１９３４７によって、並びに、ＡＲＯ−米国陸軍Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍｏｒｒｉｓ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒにより与えられた寄付金番号ＤＡＡＤ１９−０３−Ｄ−０００４／０００８及び寄付金番号５Ｕ５４ＣＡ１１９３４７によって、米国政府は本開示においてある種の権利を有している。
【０２０２】
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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