(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを有するヒト可変領域を含む、抗原結合部位を含むキメラ抗体ポリペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを有するヒト可変領域を含む抗原結合部位を含むキメラ抗体ポリペプチド。
【請求項２】
前記ヒト可変領域が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列、またはヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる前記アミノ酸配列と比べてアミノ酸が５つまで異なるものを含むアミノ酸配列を有するヒトフレームワーク領域を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項３】
前記ヒト可変領域が、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配、あるいは前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる前記アミノ酸配列と比べて合計でアミノ酸が１０個まで異なるものを含むアミノ酸配列を有する４つのヒトフレームワーク領域であるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む、請求項２に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項４】
前記フレームワーク領域が、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群より選択されるヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされる、請求項２または３に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項５】
前記新世界ザルのＣＤＲがＣＤＲ２である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項６】
前記新世界ザルのＣＤＲがＣＤＲ１またはＣＤＲ３である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項７】
前記新世界ザルのＣＤＲ配列が新世界ザルの生殖細胞系ＣＤＲ配列である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項８】
ｄＡｂ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合されたＦｖ、ＩｇＧ、およびダイアボディから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項９】
前記抗原がＴＮＦ−αである、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記新世界ザルがマーモセット科である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記新世界ザルがマーモセットである、請求項１０に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記ヒト可変領域のアミノ酸配列が、ＳａｎＤ  Ｉ制限酵素部位から距離をおいて配置されるＫｐｎ  Ｉ制限酵素部位を含み、前記ヒト可変領域の前記ＣＤＲがこれらの制限酵素部位の間にある、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記新世界ザルのＣＤＲ配列が、プライマー対であるＶＫ１ＢＬ（配列番号１１）／ＶＫ１ＢＬ３５ａ（配列番号１２）またはプライマー対であるＶＫ１ＢＬ（配列番号１１）／ＶＫ１ＢＬ３５ｂ（配列番号１３）を用いてＰＣＲによって、新世界ザルのＤＮＡから得ることが可能である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１４】
ヒトＴＮＦ−αに結合するヒトｄＡｂであって、前記ＣＤＲの少なくとも１つが新世界ザル由来の対応するＣＤＲで置換されている、ヒトＴＮＦ−αに結合するキメラドメイン抗体（ｄＡｂ）。
【請求項１５】
置換されるＣＤＲがＣＤＲ２である、請求項１に記載のキメラｄＡｂ。
【請求項１６】
前記新世界ザルがマーモセットである、請求項１または２に記載のキメラｄＡｂ。
【請求項１７】
（ｉ）    ヒト可変領域をコードするアクセプター配列を提供する工程、および
（ｉｉ）  前記可変領域のＣＤＲ配列を、新世界ザルのＣＤＲであるドナーＣＤＲ配列
で置換する工程、
を含む、請求項１から１４のいずれか一項で規定される抗体ポリペプチドを産生する方法。
【請求項１８】
工程（ｉｉ）において、前記ヒト可変領域の前記ＣＤＲを、制限酵素消化を利用し、前記ドナーＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを前記アクセプター配列にアニーリングして、前記ドナー新世界ザルのＣＤＲで置換する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉ）で産生される前記可変領域を（ｉｉｉ）親和性成熟させることを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変抗体ポリペプチドに関する。より特には、本発明は、少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを有するヒト可変領域を含む、抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドを提供する。特には、本発明はＴＮＦ−αを対象とする抗体ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
その名前が示唆するように、腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）は抗腫瘍特性を有する分子として元々記載されたが、この分子は、炎症や自己免疫疾患を介するのに顕著な役割を果たすのを含む、他のプロセスにおいて重要な役割を果たすことが次に発見された。ＴＮＦ‐αは、炎症状態における重要な炎症反応促進サイトカインであって、例えばリウマチ性関節炎（ＲＡ）、クローン病、潰瘍性大腸炎および他の腸疾患、乾癬、毒素ショック、移植片対宿主拒絶反応および多発性硬化症が含まれる。ＴＮＦ‐αの炎症反応促進作用により組織傷害が生じるが、例えばそれには、血管内皮細胞における凝血促進活性が含まれ（非特許文献１）、好中球やリンパ球の接着を増大させ（非特許文献２）、ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激する（非特許文献３）。ＴＮＦ‐αは、メタロプロテアーゼであるＴＮＦ‐α変換酵素によって切断される細胞内の尾（ｔａｉｌ）を有する２６ｋＤの膜貫通前駆タンパク質として合成された後、１７ｋＤの可溶性タンパク質として分泌される。この活性体は、２つの異なる細胞表面アクセプターであるｐ５５  ＴＮＦＲ１とｐ７５  ＴＮＦＲ２と相互作用する、１７ｋＤ単量体のホモ三量体から成る。ＴＮＦ‐αの細胞表面結合前駆体が、ＴＮＦ‐αのいくつかの生物学的効果を媒介することが可能であることもまた明らかである。ほとんどの細胞は、リガンドの異なる生物学的機能を媒介するｐ５５およびｐ７５レセプターの両方を発現する。ｐ７５レセプターはリンパ球の増殖を引き起こすことに関与しており、ｐ５５レセプターはＴＮＦを介した細胞傷害性、アポトーシス、抗ウイルス活性、繊維芽細胞の増殖およびＮＦ‐κβの活性化に関与する（非特許文献４を参照のこと）。ＴＮＦレセプターは、膜タンパク質のファミリーの一員であり、膜タンパク質にはＮＧＦレセプター、ＦＡＳ抗原、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０およびリンホトキシンα／βヘテロ二量体のレセプターが含まれる。ホモ三量体によるレセプターへの結合によりレセプターの凝集が誘導され、ｐ５５またはｐ７５のいずれかによる２つもしくは３つの分子の小さな集団が作られる。ＴＮＦ‐αは主に活性化されたマクロファージおよびＴリンパ球によって産生されるが、急性炎症反応の間に好中球、内皮細胞、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞によってもまた産生される。ＴＮＦ‐αは炎症反応促進サイトカインのカスケードの頂点にある（非特許文献５）。このサイトカインは、さらなる炎症反応促進サイトカイン、特にＩＬ−１やＩＬ−６（例えば、非特許文献６を参照のこと）の発現あるいは放出を誘導する。ＴＮＦ‐αの阻害は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦを含む炎症性サイトカインの産生を阻害する（非特許文献７）。炎症におけるその役割のために、ＴＮＦ‐αは、炎症性疾患の症状を減じさせるための重要な阻害標的として浮かびあがってきた。疾病の臨床治療のためのＴＮＦ‐αの阻害に対するさまざまな手法が追求されており、それには特に、可溶性のＴＮＦ‐αレセプターの使用およびＴＮＦ‐αに特異的な抗体が含まれる。臨床用途のために承認された市販製品には、例えば、抗体製品であるレミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ；ヒトＩｇＧ１定常領域およびマウス可変領域を有するキメラモノクローナルＩｇＧ抗体）、ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（登録商標）（ａｄａｌｉｍｕｍａｂつまりＤ２Ｅ７；アボットラボラトリーズ、特許文献１にて記載される）および可溶性レセプター製品であるエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、可溶性ｐ７５  ＴＦＮＲ２  Ｆｃ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ社）が含まれる。炎症性関節炎におけるＴＮＦ‐αの役割は、例えば、非特許文献８において論評される。ＲＡでは、ＴＮＦ‐αは炎症性滑膜の、特に軟骨‐パンヌス接合部で高発現する（非特許文献９−１１）。ＴＮＦ‐αが炎症性サイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦのレベルを上昇させる事実に加えて、ＴＮＦ‐αは単独で、関節の炎症および繊維芽細胞様滑膜細胞の増殖を引き起こすことも可能であり（非特許文献１２）、コラゲナーゼを誘導することが可能であり、それによって軟骨破壊が引き起こされ（非特許文献１３、１４）、関節軟骨細胞によってプロテオグリカン合成を阻害することが可能であり（非特許文献１５、１６）、ならびに破骨細胞形成および骨吸収を刺激することが可能である（非特許文献１７、１８）。ＴＮＦ‐αは、骨髄によるＣＤ１４＋単球の放出の増加を誘導する。このような単球は関節に浸潤してＲＡＮＫ（ＮＦ−κβのアクセプター活性化因子）−ＲＡＮＫＬシグナル経路を介した炎症性応答を増幅することが可能であり、関節炎症の間、破骨細胞の形成を生じさせる（非特許文献１９を概観のこと）。ＴＮＦ‐αは、ＩＬ−８のＴＮＦ‐αによる誘導を介して血管透過性を上昇させる急性期タンパク質であり、それにより、感染部位にマクロファージや好中球を呼び寄せる。いったん存在すれば、活性化されたマクロファージはＴＮＦ‐αを産生し続け、それによって炎症反応を維持し、増幅させる。可溶性アクセプターコンストラクトであるエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）によるＴＮＦ−αの滴定によって、ＲＡの治療に効果的であるが、クローン病の治療には効果的ではないことが証明されている。対照的に、抗体ＴＮＦ‐αのアンタゴニストであるｉｎｆｌｉｘｉｍａｂは、ＲＡとクローン病の両方を治療するのに効果的である。したがって、可溶性ＴＮＦ‐αの中和のみが、抗ＴＮＦベースの治療効果に関わる唯一のメカニズムというわけではない。むしろ、ＴＮＦ‐αによって誘導される他の炎症促進のシグナルもしくは分子の遮断（ｂｌｏｃｋａｄｅ）も重要な役割を果たす（非特許文献２０）。例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの投与により明らかに接着分子の発現が減少し、その結果、炎症部位への好中球の浸潤が減少する。また、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂによる治療により、クローン病でこれまで炎症を起こしていた腸粘膜から炎症性細胞が消える。固有層での活性化されたＴ細胞のこの消失は、膜結合ＴＮＦ‐αを有する細胞のアポトーシスによって介され、Ｆａｓ依存の態様で、カスパーゼ８、９、それから３の活性化による（非特許文献２１）。したがって、膜結合もしくはレセプター結合のＴＮＦ‐αは、抗ＴＮＦ‐α治療手法のた���の重要な標的である。他には、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂが、活性化された抹消血液細胞や固有層の細胞に結合し、カスパーゼ３の活性化を介してアポトーシスを誘導することが示されている（非特許文献２２を参照のこと）。細胞内では、レセプターに対して三量体ＴＮＦ‐αが結合することにより、シグナル伝達事象のカスケードが引き起こされ、それには例えばＳＯＤＤ（ｓｉｌｅｃｅｒ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎｓ）のような阻害分子の置換が含まれ、ならびにアダプター因子であるＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ｃ‐ＩＡＰ、ＲＡＩＤＤおよびＴＲＩＰに加えてキナーゼＲＩＰ１や特定のカスパーゼの結合がある（非特許文献２３、２４を概観のこと）。集合したシグナル複合体は、ＮＦ−κβの活性化およびそれに続く下流遺伝子の活性化を介した細胞の生存経路、あるいはカスパーゼの活性化を介したアポトーシス経路のいずれかを活性化することが可能である。同様な、細胞外の下流サイトカインのカスケードおよび細胞内のシグナル伝達経路が、他の疾患におけるＴＮＦ‐αによって誘導され得る。したがって、ＴＮＦ‐α分子が病変の原因となる他の疾病もしくは疾患に対して、ＴＮＦ‐αの阻害という治療へのアプローチが提示されている。血管新生は、炎症性滑膜組織の活発な増殖に関して重要な役割を果たす。高度に血管が発達しているＲＡの滑膜組織は、関節周囲の軟骨および骨組織に進入するので、関節破壊へと到る。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、知られている最も強力な血管新生サイトカインである。ＶＥＧＦは、最初の転写物の選択的スプライシングによって、いくつもの代替的な形態で存在する、分泌性でヘパリン結合性の、ホモ二量体の糖タンパク質である（非特許文献２５）。ＶＥＧＦは、炎症における重要なプロセスである、血管の漏出を誘導する能力のために、血管透過性因子（ＶＰＥ）としてもまた知られている。ＲＡ患者の滑膜組織におけるＶＥＧＦの同定により、ＲＡの病理におけるＶＥＧＦの潜在的な役割が明らかにされた(非特許文献２６、２７)。ＲＡの病理におけるＶＥＧＦの役割は、抗ＶＥＧＦ抗体がマウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて投与される、以下の研究により確かなものとされた。これらの研究において、関節におけるＶＥＧＦの発現により疾病の誘発が増大し、抗ＶＥＧＦの抗血清の投与により、関節炎疾患の発達が阻害されて確立した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）疾患が改善した（非特許文献２８、２９）。
【０００３】
抗体ポリペプチド
抗体はその結合する標的に対して非常に特異的であり、それ自身天然の防御機構由来であるにも関わらず、ヒトの患者における疾病の治療に適用される場合、抗体はいくつもの課題に直面する。通常の抗体は、少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む、大きなマルチサブユニットのタンパク分子である。例えば、ヒトＩｇＧは、機能的な抗体を形成するために、ジスルフィド結合された２つの重鎖と２つの軽鎖を有する。標準的なＩｇＧのサイズは約１５０ｋＤである。相対的に大きなサイズのため、完全抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）は、例えば組織透過性の問題のために治療的な有用性が制限される。抗原に結合する機能や可溶性を保有する、より小さい抗体フラグメントを同定し作製することに重点的に取り組むのに相当な努力がなされている。抗体の重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖は、抗原との相互作用に直接参加する可変（Ｖ）領域、ならびに構造的な支えを提供し、免疫エフェクターと非特異的な抗原相互作用に機能する定常（Ｃ）領域を含む。通常の抗体の抗原結合領域は、２つの別々の領域を含む：重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ：ＶκもしくはＶλのいずれかであることが可能）。抗原結合部位はそれ自身、６つのポリペプチドのループによって形成される：３つはＶＨ領域（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）より、３つはＶＬ領域（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）より。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＶ遺伝子の多様な初期レパートリーは、遺伝子断片の組合せの再配置（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）により作製される。Ｃ領域は、軽鎖Ｃ領域（ＣＬ領域と称される）および重鎖Ｃ領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域と称される）を含む。天然に存在する抗体における、たくさんの抗原に結合するより小さいフラグメントは、以下のプロテアーゼ消化によって同定されている。例えばこれらには、「Ｆａｂフラグメント」（ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１−ＶＨ）、「Ｆａｂ’フラグメント」（重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂ）および「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」（重鎖ヒンジ領域によって連結されるＦａｂ’フラグメントの二量体）が含まれる。組換え方法を用いることによってより小さい抗原結合フラグメントでさえ作製することができ、それらは「単鎖Ｆｖ」（可変フラグメント）つまり「ｓｃＦｖ」と称され、合成ペプチドリンカーによって連結されるＶＬおよびＶＨから成る。
【０００４】
単一ドメイン抗体
天然に存在する抗体における抗原が結合する部位（例えばヒトやほとんどの他の哺乳動物において）は、一般的に一対のＶ領域（ＶＬ／ＶＨ）を含むことが知られている一方で、ラクダ科の動物では、大部分は軽鎖配列を欠いた、完全に機能的で非常に特異的な抗体を発現する。ラクダ科の重鎖抗体は単一の重鎖のホモ二量体として発見されており、それらの定常領域を介して二量体化される。これらのラクダ科の重鎖抗体の可変領域は、ＶＨＨ領域と称され、ＶＨ鎖のフラグメントとして単離された場合、高い特異性で抗原に結合する能力を保持している（非特許文献３０、３１）。抗原に結合する単一のＶＨ領域もまた同定されており、例えばそれは、免疫したマウスの脾臓由来のゲノムＤＮＡより増幅され、大腸菌で発現しているマウスＶＨ遺伝子のライブラリー由来である（非特許文献３２）。Ｗａｒｄらは、単離した単一のＶＨ領域を、「ドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の代わりに「ｄＡｂｓ」と命名した。用語「ｄＡｂ」は、本明細書において、特異的に抗原に結合する単一のイムノグロブリン可変領域（ＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ）のポリペプチドを意味する。「ｄＡｂ」は他のＶ領域から独立して抗原に結合する；しかしながら、この用語が本明細書で使用される場合、「ｄＡｂ」は他のＶＨもしくはＶＬ領域を有するホモもしくはヘテロの多量体で存在することが可能であり、ここで他の領域はｄＡｂによる抗原結合には必要とされず、すなわち、ここでは、ｄＡｂは付加的なＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ領域から独立して抗原に結合する。単一のイムノグロブリン可変領域、例えば、ＶＨＨは周知の最も小さな抗原結合抗体ユニットである。治療において使用するために、ヒト抗体が好まれ、主には、患者に投与した場合に、免疫反応を引き起こす可能性がないようにするためである。単離されたラクダ科ではないＶＨ領域は、比較的不溶性の傾向があり、しばしばあまり発現されない。ラクダ科のＶＨＨとヒト抗体のＶＨ領域の比較により、ヒトＶＨ領域のＶＲ／ＶＬの接合部分に相当するラクダ科のＶＨＨ領域のフレームワーク領域において、いくつかの重要な違いが明らかにされている。発現量および溶解度を改善する試みで、ＶＨＨ配列により緊密な共通点を有するようにヒトＶＨ３のこれらの残基の変異（特にＧｌｙ４４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５ＡｒｇおよびＴｒｐ４７Ｇｌｙ）が行われ、「ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）」ヒトＶＨ領域が作製されている（非特許文献３３）。本明細書で用いられる可変領域のアミノ酸の番号の付け方は、カバットによる番号付け（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）の慣習と一致している（非特許文献３４）。
【０００５】
特許文献２（Ｍｕｙｌｄｒｍａｎｓ）により、Ｔｒｐ１０３Ａｒｇの変異が、ラクダ科ではないＶＨ領域の溶解度を改善することが報告されている。ＤａｖｉｅｓとＲｉｅｃｈｍａｎｎ（非特許文献３５）もまた、ラクダ化されたヒトＶＨ領域のファージディスプレイのレパートリーの作製および１００−４００ｎＭの値域でハプテンに親和性を有して結合するクローンの選択を報告したが、タンパク質抗原に結合するように選択されたクローンは、弱い親和性を有していた。抗体の抗原結合領域は、２つの別々の領域を含む；重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ：ＶκもしくはＶλのいずれかであることが可能）。抗原結合部位はそれ自身、６つのポリペプチドのループによって形成される：３つはＶＨ領域（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）より、３つはＶＬ領域（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）より。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＶ遺伝子の多様な初期レパートリーは、遺伝子断片の組合せの再配置（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）により作製される。ＶＨ遺伝子は３つの遺伝子断片である、ＶＨ、ＤおよびＪＨの組み合わせによって産生される。ヒトでは、ハプロタイプに依存して、約５１の機能的なＶＨ断片（非特許文献３６）、２５の機能的なＤ断片（非特許文献３７）および６つの機能的なＪＨ断片（非特許文献３８）が存在する。ＶＨ断片が、ＶＨ領域（Ｈ１およびＨ２）の第１および第２の抗原が結合するループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードする一方で、ＶＨ、ＤおよびＪＨ断片が組み合わさってＶＨ領域（Ｈ３）の第３の抗原が結合するループを形成する。ＶＬ遺伝子は２つの遺伝子断片である、ＶＬおよびＪＬのみの組み合わせによって産生される。ヒトでは、ハプロタイプに依存して、約４０の機能的なＶκ断片（非特許文献３９）、３１の機能的なＶλ断片（非特許文献４０、４１）、５つの機能的なＪκ断片（非特許文献４２）および４つの機能的なＪλ断片（非特許文献４３）が存在する。ＶＬ断片が、ＶＬ領域（Ｌ１およびＬ２）の第１および第２の抗原が結合するループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードする一方で、ＶＬおよびＪＬ断片が組み合わさってＶＬ領域（Ｌ３）の第３の抗原が結合するループを形成する。
【０００６】
この初期レパートリーから選択される抗体は、少なくとも中程度の親和性を伴うほとんどすべての抗原に結合するために十分な多様性があると信じられている。高親和性の抗体は、再配列される遺伝子の「親和性成熟」によって産生され、親和性成熟では、点突然変異が産生され、結合を改善するのに基づいて免疫システムによって選択される。抗体の構造および配列の解析により、数に限りのある主鎖の立体配座または極限構造を有する、６つの抗原が結合するループ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の５つが示されている（非特許文献４４、４５）。主鎖の立体配座は、（ｉ）抗原が結合するループの長さ、および（ｉｉ）抗原が結合するループおよび抗体構造において特定の重要な位置における、特定の残基、もしくは残基の種類によって決定される。ループの長さおよび重要な残基の解析により、ヒト抗体配列の大部分によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖の立体配座を予測することが可能になっている（非特許文献４６−４８）。（Ｄ断片を利用するために、）Ｈ３領域は配列、長さおよび構造の観点からはるかに多様であるにも関わらず、ループおよび抗体構造において重要な位置での、長さおよび特定の残基、もしくは残基の種類に依存する短いループの長さに対して、数に限りのある主鎖の立体配座をも形成する（非特許文献４９、５０）。
【０００７】
相補的な対を成すＶＨおよびＶＬ領域を含む二重特異性抗体は当該技術分野で周知である。これらの二重特異性抗体は２組のＶＨおよびＶＬを含まなければならず、それぞれのＶＨ／ＶＬの対が単一の抗原もしくはエピトープに結合する。記載される方法には、ハイブリッドハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）（非特許文献５１）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（非特許文献５２）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）（非特許文献５３、特許文献３）、キレート組換抗体（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（非特許文献５４）、ｂｉｓｃＦＶ（ｓｃＦＶの二量体）（非特許文献５５）、「ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ」型の安定化された抗体（非特許文献５６）が関与する。それぞれの場合において、各抗体種は２つの抗原結合部位を含み、それぞれがＶＨおよびＶＬ領域の相補的な対によって構築される。したがって、各抗体は２つの異なる抗原もしくはエピトープに同時に結合することが可能であり、ＶＨおよびそれの相補的なＶＬ領域によって介される各抗原もしくは各エピトープに結合する。これらの技術のそれぞれが、特定の不利な面をもっている；例えばハイブリッドハイブリドーマの場合には、不活性のＶＨ／ＶＬの対により、二重特異性のＩｇＧの割合が著しく減少され得る。さらに、ほとんどの二重特異性の手法は、異なるＶＨ／ＶＬの対の結合もしくは異なる２つのＶＨ／ＶＬが結合する部位を再形成できるＶＨ鎖とＶＬ鎖の結合に依存する。したがって、集合分子における各抗原もしくは各エピトープに対する結合部位の比をコントロールすることは不可能であり、それゆえに、集合分子の多くが、一つの抗原もしくは一つのエピトープに結合するが、残りは結合しない。いくつかの場合において、サブユニットの接触面で重鎖もしくは軽鎖を設計することが可能であり（Ｃａｒｔｅｒら、１９９７年）、それにより、両方の抗原もしくは両方のエピトープに対する結合部位を有する分子数を向上させることが可能であるが、これにより全ての分子が両方の抗原もしくは両方のエピトープに結合を有することには決してならない。異なる２つの抗体が結合する特異性は、同じ結合部位に取り込まれる可能性はあるが、これらは通常、構造的に相関する抗原もしくはエピトープもしくは広く交差反応する抗体に対応して、２つ以上の特異性を表す。例えば、交差反応性抗体についてよく記載されており、通常は２つの抗原が配列や構造に関係している場合であって、例えばニワトリ卵白リゾチームや七面鳥のリゾチームなどであり（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、特許文献４）、またはフリーのハプテンや担体に共役したハプテンについてである（非特許文献５７）。さらなる例には、特許文献５（アボットラボラトリーズ）において、「二重特異性」を有する抗体分子が記載されている。参照された抗体分子は、複数の抗原に対して提示され選択される抗体であり、それらの特異性は１つより多い抗原に及ぶ。特許文献５の抗体におけるそれぞれの相補的なＶＨ／ＶＬの対は、２つ以上の構造的に相関する抗原に対する単一の結合特異性を明確にする；このような相補的な対におけるＶＨおよびＶＬ領域は、別々の特異性をそれぞれ有��てはいない。したがって、これらの抗体は、構造的に相関する２つの抗原を包含する、幅広い単一の特異性を有する。さらに、多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）である自然自己抗体について記載されており（非特許文献５８）、構造的に相関してはいない、少なくとも２つ（大抵はそれより多い）の異なる抗原もしくはエピトープと反応する。モノクローナル抗体に関するファージディスプレイ技術を用いてのランダムなペプチドのレパートリーの選択により、抗原に結合する部位に適合するペプチド配列の範囲が同定されることがまた示されている。配列の中には、コンセンサス配列に適合して高度に相関しているものがある一方で、非常に異なっていてミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）と呼ばれているものもある（非特許文献５９）。結合し相補的であるＶＨおよびＶＬ領域を含む天然の四鎖（ｆｏｕｒ−ｃｈａｉｎ）抗体が、多様な規模の周知の抗原由来の多くの異なる抗原に対して結合する潜在性を有することは、したがって明らかである。同一の抗体、特に必ずしも構造的に相関していない抗体において２つの任意の抗原に対してどのように結合部位が形成されるかはあまり明らかではない。提案されているプロテイン・エンジニアリング法はこれに関して身を結ぶ可能性がある。例えば、１つの可変領域を介して金属イオンへの、ならびに金属イオンおよび相補的な可変領域との接触を介してハプテン（基質）への結合活性を有する触媒抗体を作製し得ることが提議されている（非特許文献６０）。この場合にはしかしながら、基質（第一の抗原）の結合および触媒が、金属イオン（第二の抗原）の結合に必要であることが提案されている。したがって、ＶＨ／ＶＬの対に対する結合は、単一構成要素の抗原に関与しているが、複数の構成要素の抗原には関与していない。ラクダ科の抗体重鎖の単一領域由来の二重特異性抗体の作成に関する方法が記載されており、１つの抗原に対する結合接触は１つの可変領域で与えられ、２番目の抗原に対しては２番目の可変領域で与えられる。しかしながら、これらの可変領域は相補的ではない。したがって、１番目の重鎖可変領域は１番目の抗原に対して選択され、２番目の重鎖可変領域は２番目の可変領域に対して選択され、次いで両方の領域が同じ鎖に連結されて二重特異性の抗体フラグメントを生じさせる（非特許文献６１）。しかしながら、このラクダ科の重鎖の単一領域は、軽鎖を有さない天然のラクダ科由来であるという点で普通ではなく、実際にこの重鎖の単一領域は相補的なＶＨおよびＶＬの対を形成するためにラクダ科の軽鎖と結合することができない。単一の重鎖可変領域についてもまた記載されており、それらは軽鎖と通常連結する天然の抗体由来である（モノクローナル抗体由来もしくは領域のレパートリー由来；特許文献６を参照のこと）。これらの重鎖可変領域は、１つ以上の関連抗原と特異的に相互作用することが示されているが、他の重鎖もしくは軽鎖の可変領域と組合わさって２つ以上の異なる抗原に対する特異性を有するリガンドを形成することはできない。さらに、これらの単一領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏの半減期が非常に短いことが示されている。したがって、このような領域は治療的な価値が制限されている。（前記で記載したように）互いに異なる特異性を有する重鎖可変領域を連結させることによって、二重特異性抗体フラグメントを作成することが示唆されている。この手法の欠点は、単離される抗体可変領域が軽鎖と通常相互作用する疎水性の接触面を有するので、溶媒にさらされると、単一領域が疎水性の表面に結合することを可能にする「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）」になる可能性があるということである。さらに、パートナーの軽鎖の不存在下では、２つ以上の異なる重鎖可変領域の組み合わせおよびそれらの結合は、おそらくはそれらの疎水性の接触面を介して、単離時に結合することが可能であるリガンドの１つもしくは両方に結合することを阻害する可能性がある。さらにこの場合には、重鎖可変領域は相補的な軽鎖可変領域と結合しないであろうし、したがってより不安定で簡単に変性する可能性がある（非特許文献６２）。
【特許文献１】米国特許第６，０９０，３８２号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９４／１３８０４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０２７７３号パンフレット
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【特許文献７】欧州特許第０６０５４４２号明細書
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【非特許文献６４】Ehrlich et al.,1987,Hybridoma;6:151-60
【非特許文献６５】von Budingen et al,2001,Immunogenetics;53:557-563
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト／マウスキメラ抗体は、マウスゲノム由来の抗体可変領域の配列がヒトゲノム由来の抗体定常領域の配列と組合さって作成されている。キメラ抗体は、親マウス抗体の結合特異性を示し、そのエフェクター機能はヒト定常領域と関連する。この抗体は宿主細胞で発現されることによって産生され、例えばそれには、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＯＨＯ）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。
【０００９】
このようなキメラ抗体はヒト治療において用いられているが、これらのキメラ抗体に対する抗体はヒト受容者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）によって産生されている。キメラ抗体で治療を続けるのに、このような抗キメラ抗体は弊害をもたらす。
【００１０】
ヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト治療のためにマウスモノクローナル抗体よりも改良されることが期待される。旧世界ザル（アカゲザルやチンパンジー）由来の抗体を用いて行った研究より、これらのヒトでない霊長類の抗体は、ヒト抗体に構造的に類似しているので、ヒトにおいて許容されるであろうと主張されている（非特許文献６３）。さらに、ヒト抗体はアカゲザルにおいて免疫原性がないので（非特許文献６４）、その逆もまた当てはまり、ヒトにおいてアカゲザルの抗体は免疫原性がないことが見込まれる。これらのモノクローナル抗体は、リンパ球をヒト×マウスへテロ骨髄腫と融合させることによって作製されるハイブリドーマによって分泌される。
【００１１】
特許文献７は、ヒト抗原と結合するキメラ抗体を開示する。これらの抗体は、旧世界ザル由来の完全な可変領域およびヒトもしくはチンパンジーの抗体の定常領域を含む。これらのコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に対してこの参考文献で示唆される有利な点の一つは、マウスを宿主にして作製した抗体と比べて、ヒトでの免疫原性がより低いヒト抗原に対して、旧世界ザルで抗体を作製できる能力である。
【００１２】
新世界ザル（広鼻下目）は、２つの科である、マーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｃｉｄａｅ）とオマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ）に一般に分けられる少なくとも５３の属を含む。マーモセット科はマーモセットとタマリンから成る。オマキザル科は、リスザル、ティティザル（ｔｉｔｉ  ｍｏｎｋｅｙ）、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル（ｃａｐｕｃｈｉｎ）、ウアカリ（ｕａｋａｒｉｓ）、サキ（ｓａｋｉｓ）、ヨザル（ｎｉｇｈｔ  ｍｏｎｋｅｙもしくはｏｗｌ  ｍｏｎｋｅｙ）およびホエザルを含む。
【００１３】
新世界ザルのように進化的に遠い霊長類は、ヒト抗原に対して産生される抗体を許容するためにヒトと十分に異なっているのみならず、ヒト抗体に類似する抗体を有するためにヒトに十分に類似しているので、このような霊長類由来の抗体がヒト体内に導入される場合には、宿主（ｈｏｓｔ）は抗抗体免疫反応を起こさない。
【００１４】
以前の研究により、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ  ｍａｒｍｏｓｅｔ）の発現されたイムノグロブリンの重鎖レパートリーが特徴付けされた（非特許文献６５）。６つのＩＧＨＶサブグループが、ヒトのＩＧＨＶに相当するものに高い配列類似性を示すものとして同定された。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を比較した場合には、フレームワーク領域はより保存されていた。コモンマーモセットとヒトＩＧＨＶ配列の間の類似性の程度は、ヒトでない旧世界ザルとヒトの間のよりも低かった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを有するヒト可変領域を含む、抗原結合部位を含むキメラ抗体ポリペプチドを提供する。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様にしたがう抗体ポリペプチドを産生する、
（ｉ）    ヒト可変領域をコードするアクセプター配列（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）を提供する工程、および
（ｉｉ）  可変領域のＣＤＲ配列を、新世界ザルのＣＤＲ配列であるドナー配列（ｄｏ
ｎｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）で置換する工程、
を含む方法を提供する。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、ヒトＴＮＦ−αに結合し、イムノグロブリンの重鎖もしくは軽鎖の可変領域を含む、キメラドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供し、前記可変領域は少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを含む。
【００１８】
第４の態様において、本発明は、医薬として許容できる担体もしくは希釈剤とともに、本発明の第１の態様もしくは第３の態様にしたがって、有効量の抗体ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを有するヒト可変領域を含む、抗原結合部位を含むキメラ抗体ポリペプチドを提供する。
【００２０】
第３の態様において、本発明は、ヒトＴＮＦ−αに結合し、イムノグロブリンの重鎖もしくは軽鎖の可変領域を含む、キメラドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供し、前記可変領域は少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲを含む。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、医薬として許容できる担体もしくは希釈剤とともに、本発明の第１の態様もしくは第３の態様にしたがって、有効量の抗体ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明の実施態様において、ヒト可変領域は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列、またはヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列と比べてアミノ酸が５つまで異なるものを含むアミノ酸配列を有するヒトフレームワーク領域を少なくとも１つ含む。
【００２３】
ヒト可変領域は好ましくは、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列、または前記ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列と比べて合計でアミノ酸が１０個まで異なるものを含むアミノ酸配列を有する、４つのヒトフレームワーク領域である、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む。
【００２４】
好ましくは、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片は、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群より選択される。
【００２５】
新世界ザルのＣＤＲはいずれのＣＤＲであってもよいが、ＣＤＲ２であることが好ましい。
【００２６】
代わりに、新世界ザルのＣＤＲはＣＤＲ１またはＣＤＲ３である。
【００２７】
新世界ザルのＣＤＲ配列が新世界ザルの生殖細胞系ＣＤＲ配列であることもまた好ましい。
【００２８】
本発明の抗体ポリペプチドは、好ましくはｄＡｂ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合されたＦｖ、ＩｇＧ、およびダイアボディから選択される。
【００２９】
本発明の抗体ポリペプチドは、好ましくはＴＮＦ−αを対象とする。
【００３０】
別の好ましい実施態様において、ヒト可変領域のアミノ酸配列は、ＳａｎＤ  Ｉ制限酵素部位から距離をおいて配置されるＫｐｎ  Ｉ制限酵素部位を含み、ヒト可変領域の前記ＣＤＲはこれらの制限酵素部位の間に存在する。
【００３１】
新世界ザルの配列は、プライマー対であるＶＫ１ＢＬ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ）１１）／ＶＫ１ＢＬ３５ａ（配列番号１２）またはプライマー対であるＶＫ１ＢＬ（配列番号１１）／ＶＫ１ＢＬ３５ｂ（配列番号１３）を用いてＰＣＲによって、新世界ザルのＤＮＡから得ることが可能であるのがまた好ましい。
【００３２】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに結合するヒトｄＡｂであって、前記ＣＤＲの少なくとも１つが新世界ザル由来の対応するＣＤＲで置換されている、ヒトＴＮＦ−αに結合するキメラドメイン抗体（ｄＡｂ）を提供する。
【００３３】
本発明はまた、本発明の第１の態様にしたがう抗体ポリペプチドを産生する、
（ｉ）    ヒト可変領域をコードするアクセプター配列を提供する工程、および
（ｉｉ）  可変領域のＣＤＲ配列を、新世界ザルのＣＤＲ配列であるドナー配列で置換
する工程、
を含む方法を提供する。
【００３４】
工程（ｉｉ）において、前記ヒト可変領域の前記ＣＤＲを、制限酵素消化を利用し、ドナーＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドをアクセプター配列にアニーリングして前記ドナー新世界ザルのＣＤＲで置換することが好ましい。
【００３５】
この方法がさらに、工程（ｉｉ）で産生される可変領域を親和性成熟させることを含むことが好ましい。
【００３６】
本明細書で用いるとき、用語「新世界ザルのＣＤＲ」は、新世界ザルより得られるＣＤＲ配列を意味する。この用語は、抗原の結合特性の改善もしくは免疫原性の低下を成し遂げるために用いてよい配列内の１、２もしくは３アミノ酸の変異を網羅する。しかしながら、この用語は、ヒトＣＤＲ配列と同一である新世界ザルのＣＤＲ配列をもたらす変異を対象とするのには及ばない。
【００３７】
本明細書で用いるとき、用語「ヒトフレームワーク領域」は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列、またはヒト生殖細胞系遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列と比べてアミノ酸が５つまで異なるものを含むアミノ酸配列を有するヒトフレームワーク領域、あるいはヒトより得られるフレームワーク領域を意味する。この用語はまた、このフレームワーク領域のアミノ酸配列の修飾を網羅するので、抗原の結合特性の改善もしくは免疫原性の低下を得ることができ、例えばそれらは、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、米国特許第５，５８５，０８９号明細書および米国特許出願公開第２００３／００３９６４９号明細書で開示されており、それらの開示のすべてが参照として本明細書に取り入れられる。修飾を行う場合に、変更される残基の総数は、通常、フレームワーク領域に対して合計で１０以下である。
【００３８】
好ましい実施態様において、この可変領域は、少なくとも１つのフレームワーク領域がヒト生殖細胞系イムノグロブリン遺伝子によってコードされる対応するフレームワーク領域由来のアミノ酸配列を含む、４つのフレームワーク領域を含む。
【００３９】
さらなる好ましい実施態様において、これらの４つのフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系イムノグロブリン遺伝子によってコードされる対応するフレームワーク領域由来のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
よりさらなる好ましい実施態様において、このヒト生殖細胞系イムノグロブリン遺伝子は、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群より選択される。
【００４１】
用語「領域（ｄｏｍａｉｎ）」は、本明細書で用いられるとき、タンパク質の残りの部分から独立して三次元構造を保持する折りたたまれたタンパク質の構造を意味する。一般的に、領域（ドメイン）はタンパク質の個々の機能的な特性に関与しており、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能を失うことなく、ドメインを付加し、除去し、または他のタンパク質に移してよい。
【００４２】
イムノグロブリンもしくは抗体の「可変領域」という用語は、本明細書で用いられるとき、技術用語であって、イムノグロブリンもしくは抗体の重鎖もしくは軽鎖の可変領域の配列特異性を含む折りたたまれたポリペプチド領域を含み、抗原に特異的に結合する。
【００４３】
用語「イムノグロブリン」は、本明細書で用いられるとき、２つのβシートと、通常は保存されたジスルフィド結合を含む、抗体分子の特性を持つイムノグロブリンを有するぽるペプチドのファミリーを意味する。イムノグロブリンのスーパーファミリーのメンバーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞および非細胞の相互作用の多くの態様に関与しており、それには免疫システムにおける広範な役割（例えば、抗体、Ｔ細胞アクセプター分子など）、細胞接着における関与（例えばＩＣＡＭ分子）、および細胞内シグナル（例えば、ＰＤＧＦレセプターなどのようなレセプター分子）が含まれる。本発明は、結合ドメインを有するすべてのイムノグロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。好ましくは、本発明は抗体ポリペプチドに関する。
【００４４】
新世界ザル（広鼻下目）は、２つの科である、マーモセット科とオマキザル科に一般に分けられる少なくとも５３の属を含む。マーモセット科はマーモセットとタマリンから成る。オマキザル科は、リスザル、ティティザル（ｔｉｔｉ  ｍｏｎｋｅｙ）、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル（ｃａｐｕｃｈｉｎ）、ウアカリ（ｕａｋａｒｉｓ）、サキ（ｓａｋｉｓ）、ヨザル（ｎｉｇｈｔ  ｍｏｎｋｅｙもしくはｏｗｌ  ｍｏｎｋｅｙ）およびホエザルを含む。
【００４５】
新世界ザルのように進化的に遠い霊長類は、ヒト抗原に対して産生される抗体を許容するためにヒトと十分に異なっているのみならず、ヒト抗体に類似する抗体を有するためにヒトに十分に類似しているので、このような霊長類由来の抗体がヒト体内に導入される場合には、宿主（ｈｏｓｔ）は抗抗体免疫反応を起こさない。
【００４６】
以前の研究により、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ  ｍａｒｍｏｓｅｔ）の発現されたイムノグロブリンの重鎖レパートリーが特徴付けされた（非特許文献６５）。６つのＩＧＨＶサブグループが、ヒトのＩＧＨＶに相当するものに高い配列類似性を示すものとして同定された。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を比較した場合には、フレームワーク領域はより保存されていた。コモンマーモセットとヒトＩＧＨＶ配列の間の類似性の程度は、ヒトでない旧世界ザルとヒトの間のよりも低かった。
【００４７】
本発明の特定の実施態様において、新世界ザルのＣＤＲはマーモセット科由来である。
【００４８】
本発明のさらなる実施態様において、新世界ザルのＣＤＲは、マーモセット、タマリン、リスザル、ティティザル、クモザル、ウーリーモンキー、オマキザル、ウアカリ、サキ、ヨザル（ｎｉｇｈｔ  ｍｏｎｋｅｙもしくはｏｗｌ  ｍｏｎｋｅｙ）およびホエザルからなる群より選択される。より好ましくは、新世界ザルはマーモセットである。
【００４９】
本発明のさらなる実施態様において、少なくとも１つの新世界ザルのＣＤＲが、新世界ザルの生殖細胞系イムノグロブリン遺伝子によってコードされるＣＤＲに実質的に同一である。
【００５０】
「抗体」という用語は、本明細書で用いられるとき、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合によって相互に連結されている、４つのポリペプチド鎖からなるイムノグロブリン分子、あるいは２つの重鎖からなるイムノグロブリン分子を指すものとされる。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ、つまりＶＨ）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインである、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ、つまりＶＬ）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名づけられている、超可変性の領域にさらに分けられ、フレームワーク領域（ＦＲ）と名づけられている、より保存された領域が散在して組み入れられている。それぞれのＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される。
【００５１】
「抗体ポリペプチド」という用語は、本明細書で用いられるとき、抗原に結合することができる能力を示すイムノグロブリンの、１つ以上の成分を含むポリペプチドもしくは誘導体を指す。抗体の抗原に結合する機能は、完全長の抗体のフラグメントによって行われることが示されている。「抗体ポリペプチド」という用語によって網羅される結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域から成る１価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域から成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アーム（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｍ）のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｖ）単一のＶＨ領域、もしくはＶＬ領域（van den Beucken et al,2001,J.MoL Biol,310,591-601）から成るｄＡｂフラグメント（Ward et al,1989,Nature 341:544-546）；ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域である、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされ、組み換え方法によってそれらは連結されることが可能であり、合成リンカーによって１つのタンパク質鎖（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈａｉｎ）となることが可能であって、そこではＶＬおよびＶＨ領域が対となって、１価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）；（例えば、Bird et al, 1988, Science 242:423-426 and Huston et al.,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883を参照のこと）。このような単鎖Ｆｖは、抗体の「抗原結合部分」という用語を含んでいるものとされている。単鎖Ｆｖの他の形態およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）やトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）のような関連分子もまた含まれる。ダイアボディは２価の抗体であって、ＶＨおよびＶＬ領域が単一のポリペプチド鎖で発現されているが、あまりにも短くて同じ鎖の２つの領域間で対を作ることができないリンカーを用いることによって、この領域を別の鎖の相補的な領域と対を作るようにさせ、２つの抗原結合部位を作成させる（例えば、Holliger, et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USΛ,90:6444-6448;Poljak, et al.,1994,Structure,2:1121-1123を参照のこと）。
【００５２】
したがって本発明の特定の実施態様において、抗体ポリペプチドは、ｄＡｂ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合されたＦｖ、ＩｇＧ、およびダイアボディからなる群より選択される。
【００５３】
好ましくは、抗体ポリペプチドはさらに、ヒトまたはヒトでない霊長類の定常領域の配列を含む。ヒトでない霊長類の例には、それだけには限定されないが、チンパンジー、オラウータンおよびヒヒ（ｂａｂｏｏｎ）が含まれる。
【００５４】
定常領域の配列（Ｆｃ部分）は、ヒトまたはヒトでない霊長類のイムノグロブリン配列より得るのが好ましい。霊長類の配列は、新世界ザルまたは旧世界ザルの配列であってもよい。好適な旧世界ザルには、チンパンジー、または他のヒト科の類人猿（ｈｏｍｉｎｉｄ  ａｐｅ）であって例えばゴリラやチンパンジーが含まれ、それは、系統発生学的にヒトに近いからであり、ヒト定常領域配列と高いホモロジーを有する。ヒトまたは霊長類の定常領域をコードする配列はデータベースから入手可能であり、例えばそれには、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ、Ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔなどが含まれる。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様において、抗体ポリペプチドはドメイン抗体（ｄＡｂ）である。
【００５６】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体における小さな機能的な結合ユニットであって、抗体の重（ＶＨ）鎖もしくは軽（ＶＬ）鎖のいずれかの可変領域に相当する。ドメイン抗体は、約１３ｋＤａの分子量を有し、完全抗体の１０分の１未満のサイズである。
【００５７】
抗体の軽鎖は、κもしくはλの軽鎖のいずれかを指し、重鎖はγ、μ、δ、α、εのいずれかを指す。可変領域によって、抗体にその特異性が与えられる。それぞれの可変領域内が超可変性の領域であって、そうでなければ、フレームワーク領域を意味する、より保存された領域の側面に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）として知られる。それぞれの可変領域内には、３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク領域が存在する。
【００５８】
通常の抗体と対照的に、ドメイン抗体はバクテリア、酵母および哺乳類系でよく発現する。それらの小さなサイズにより、産物１グラムあたりに高いモル数量が可能となり、それによって、用量あたりの有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）の著しい上昇が提供される。さらに、ドメイン抗体は、ビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）として用いることが可能であるので、多重ターゲットのｄＡｂのような治療産物を作成することができ、これらのｄＡｂでは、コンストラクトが２つ以上の治療標的に結合する２つ以上の可変領域を含んでおり、あるいはｄＡｂは肺を標的としたり経口投与であったりする。
【００５９】
結合の増加は、抗体もしくはそれらの抗原結合部分に関するΚＤ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）の減少によって表わされる。有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）の増加は、生物学的検定法によって表される。例えば、抗体もしくはそれらの抗原結合部分の有効性を測定するために利用することができるアッセイには、ＴＮＦαにより誘導されるＬ９２９細胞傷害性中和アッセイ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ＩＬ‐１２により誘導される、ヒトＰＨＡで活性化される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖アッセイ、およびマウス脾細胞のＲＡＮＫＬを介した骨芽細胞の分化が含まれる（Stern, 1990,Pro.Natl.Acad.Sci.USA 87:6808-6812; Kong, et al.,1990,Nature 397:315-323; Matthews and Nealc in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach, 1987, MJ.Clemens, A.G. Morris and A.J.H. Gearing, cds., IRL Press, p.221）。
【００６０】
ＣＤＲ配列はいくつかの供給源から得てもよく、例えば、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ（www.ncbi.nlm.nih.gov.）、Ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（www.kabatdatabase.com）、またはｔｈｅ  ＩＭＧＴ  ｄａｔａｂａｓｅ（www.imgt.cines.fr.）のようなデータベースが挙げられる。代わりに、ＣＤＲ領域をＶＨおよびＶＬ領域のレパートリーから予測することが可能である（例として、Kabat and Wu, 1971, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-393 を参照のこと)。ＣＤＲ配列はゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡであってよい。
【００６１】
置換ＣＤＲを、可変領域の配列に接合させるたくさんの方法が存在し、このような方法は、当業者に精通している。本発明の好ましい方法は、プライマーに指向された突然変異生成（ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を介して、可変領域におけるＣＤＲ２の置換に関与する。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ合成の開始のためのプライマーを提供して、標的領域に対して望ましい変異をコードする合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすること、ＤＮＡポリメラーゼによってオリゴヌクレオチドを伸長させることによって望ましい突然変異を有する２本鎖ＤＮＡを生成させること、ならびに適切な発現ベクター中に配列をクローニングおよびライゲーションさせることから成る。
【００６２】
本発明のある実施態様において、ＣＤＲが接合される可変領域の配列は、「ｄＡｂアクセプター配列（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」であり、図１で提示される（指定化合物Ｊ２８；配列番号６）。
【００６３】
本明細書で用いられるときの「キメラの（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」という用語は、抗体ポリペプチドもしくはドメイン抗体が、１種（ｓｐｅｃｉｅｓ）以上の配列を含んでいることを意味する。
【００６４】
本発明にしたがう抗ヒトＴＮＦ−α  ｄＡｂは、例として例えば血清や血漿のような、生体サンプルについて、ヒトＴＮＦ−αを検出するのに使用することが可能であり、それには慣習的な免疫学的検定、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫分析（ＲＩＡ）または免疫組織化学法が用いられる。本発明にしたがう抗ヒトＴＮＦ−α  ｄＡｂは、検出可能な物質でラベリングされたヒト組み換えＴＮＦ−αスタンダードとラベリングされていない抗ヒトＴＮＦ−α抗体を用いる競合的な免疫学的検定（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって、生体液でアッセイが可能である。
【００６５】
本発明にしたがう抗ヒトＴＮＦ−α  ｄＡｂはまた、ヒト以外の種、例えばチンパンジー、マーモセット、アカゲザル、マウス、ブタ由来のＴＮＦ−αを検出するために用いてもよい。
【００６６】
本発明にしたがう抗ヒトＴＮＦ−α  ｄＡｂはまた、ＴＮＦ−α活性を阻害するのが望ましい細胞培養の用途に用いてもよい。
【００６７】
本発明はまた、ヒト患者において、ヒトＴＮＦ−α活性によって特徴づけされる疾患を治療する方法を提供し、患者に本発明の第２の態様にしたがう医薬組成物投与することを含む。
【００６８】
ヒトＴＮＦ−α活性によって特徴づけされる疾患には、疾患によって苦しんでいる患者のＴＮＦ−αの存在によって、疾患の病態生理学、または疾患を悪化させるのに寄与する因子のいずれかに原因があると疑われる、あるいはそういったことが示されている疾患およびその他の疾病が含まれることが意図される。好ましくは、ヒトＴＮＦ−α活性によって特徴づけされる疾患は、炎症、炎症性疾病、敗血性ショックを含む敗血症、内毒素性ショック、グラム陰性菌敗血症および毒素性ショック症候群；リウマチ性関節炎、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、通風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎およびネフローゼ症候群を含む、自己免疫疾患；感染による発熱、筋肉痛および感染による2次的な悪液質を含む、感染症；移植片対宿主拒絶反応；腫瘍成長または転移；成人呼吸窮迫症候群、ショック肺、慢性肺炎症、肺サルコイドーシス、肺繊維症、珪肺症を含む、肺疾患；クローン病および潰瘍性大腸炎を含む、炎症性腸疾患；心疾患；炎症性骨障害、肝炎、凝固障害、やけど、再かん流障害、ケロイド形成および瘢痕組織形成から成る群より選択される。
【００６９】
第４の態様では、本発明は、医薬として許容できる担体もしくは希釈剤とともに、本発明の第１の態様にしたがう有効量の抗体ポリペプチドまたは本発明の第３の態様にしたがうキメラドメイン抗体を含む、医薬組成物を提供する。
【００７０】
「医薬として許容できる担体」には、任意のあらゆる溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、および生理的に適合可能なものなどが含まれる。医薬として許容できる担体の例には、１つ以上の水、食塩水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、さらにはそれらの組み合わせなどが含まれる。多くの場合には、組成物中に等張剤が含まれるのが好ましく、それには例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムがある。医薬として許容できる物質には例えば浸潤剤もしくは少量の補助剤などがあり、少量の補助剤には例えば浸潤剤または乳化剤、防腐剤またはバッファーなどがある。
【００７１】
この組成物は多様な形態であってよく、液状、半固形および固形の剤型が含まれ、それは例えば溶液（例として、注射剤や注入剤（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ））、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソームおよび坐薬がある。好ましくは、この組成物は、免疫付与のために注射剤の形態である。投与は、静脈投与、皮下投与、腹腔投与、筋肉投与、経皮的な投与、くも膜下投与、および動脈内投与であってよい。
【００７２】
治療組成物は通常、製造および保存の条件下において、無菌でかつ安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度の薬剤に適している他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射剤は、活性のある化合物（例えば抗体ポリペプチド）を、ろ過滅菌した後に、前記に記載した成分を一つもしくは組み合わせて、適切な溶媒に必要量取り込ませることによって調整され得る。
【００７３】
この組成物はまた、無菌の注射剤の調製用に、無菌の粉末として製剤化してもよい。溶液の適当な流動性は、例えば、レシチンおよび／または界面活性剤のような被覆物を用いることによって、維持することが可能である。
【００７４】
特定の実施態様において、活性のある化合物は、急激な放出（ｒｅｌｅａｓｅ）から化合物を保護する担体とともに調製してもよく、例えばそれは、移植、経皮貼付（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｐａｔｃｈｅｓ）、およびマイクロカプセルに入れたデリバリーシステムを含む、放出制御製剤がある。
【００７５】
適合可能なポリマーを使用してもよく、それには例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸がある。
【００７６】
この組成物は、経口投与用に製剤化してもよい。この実施態様において、抗体ポリペプチドは、硬質もしくは軟質のゼラチンカプセルに入れてよく、固めて錠剤にしてもよく、または直接患者の食事の中に組み入れてもよい。
【００７７】
この組成物は、直腸投与用に製剤化してもよい。
【００７８】
補助的な活性のある化合物を、この組成物内に組み入れることもまた可能である。抗体ポリペプチドは、１つ以上の追加の治療剤とともに製剤化してもよく、および／または投与してもよく、追加の治療剤には例えば、抗炎症性化合物、可溶性のＴＮＦ−αレセプター、またはヒトＴＮＦ−αの産生を阻害する化学剤、またはサイトカインもしくは細胞表面分子のような他の標的に結合する抗体がある。代わりに、プロテインＡ、Ｃ、ＧもしくはＬのような可溶性の免疫化学試薬とともに投与してもよい。
【００７９】
有効量には、本発明の抗体ポリペプチドの、治療上の有効量または予防上の有効量が含まれてよい。治療上の有効量は、望ましい治療結果を得るために必要な期間および用量での効果的な量を意味する。予防上の有効量は、望ましい予防効果を得るために必要な期間および用量での効果的な量を意味する。
【００８０】
好ましい実施態様において、この組成物は哺乳類に投与され、ヒトおよび霊長類が好ましい。
【００８１】
本発明の本質がより明らかに理解されるよう、それらの好ましい形態を、以下の非限定例に、参照とともにこれより記載する。
【実施例１】
【００８２】
材料および方法
新世界ザルのＶＬ遺伝子の単離
【００８３】
マーモセット（マーモセット属、種は不明）およびヨザル（アオタス・トリビルガタス（ａｏｔｕｓ  ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ））のゲノムＤＮＡをＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）より入手し、それぞれのカタログ番号は８５０１１４１９および９０１１０５１０であった。マーモセットのＤＮＡは、細胞株Ｂ９５−８由来であり、ヨザルのＤＮＡは細胞株ＯＭＫ６３７−６９であった。
【００８４】
ヒトＶκリーダー配列に基づく縮重プライマーおよび組換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、ＷａｌｔｅｒおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎによる抗体エンジニアリング：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）による。生殖細胞系Ｖκ  ＤＮＡの適用のために用いたプライマーは以下のとおりであった。
【００８５】
プライマーＶＫ１ＢＬ
ＡＡＴＣＫＣＡＧＧＴＫＣＣＡＧＡＴＧ（配列番号１１）
【００８６】
プライマーＶＫ１ＢＬ３５ａ
ＧＴＴＹＲＧＧＴＫＫＧＴＡＡＣＡＣＴ（配列番号１２）
【００８７】
プライマーＶＫ１ＢＬ３５ｂ
ＡＴＧＭＣＴＴＧＴＷＡＣＡＣＴＧＴＧ（配列番号１３）
【００８８】
ゲノムＰＣＲ（３０サイクル数）を、プライマー対であるＶＫ１ＢＬ×ＶＫ１ＢＬ３５ａまたはＶＫ１ＢＬ×ＶＫ１ＢＬ３５ｂのいずれかとともに、Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った。クローニングされる配列および用いられる２つのプライマーセットの間には重複（ｏｖｅｒｌａｐ）があった。
【００８９】
ＰＣＲ産物を、インビトロジェン社のＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（カタログ番号Ｋ４５００−０１）中にクローニングして、Ｍ１３フォワードプライマーおよびｐＵＣリバースプライマーで配列を決定した。配列は、順方向および逆方向で確認した。ＰＣＲエラーになりにくい重要な配列をさらに確認するために、このＰＣＲおよびクローニングのプロセスを、マーモセットの配列について２回繰り返した。ヌクレオチド（配列番号１４〜２４および配列番号３６〜４１）ならびにアミノ酸（配列番号２５〜３５および配列番号４２〜４７）の配列を図２に示す。マーモセットの配列１、２および３を確認した。配列４、５、６、７および８は初期ＰＣＲ（ｉｎｉｔｉａｌ  ＰＣＲ）でのみ観察された。配列９、１０および１１は、反復（ｒｅｐｅａｔ）（すなわち２回目の）ＰＣＲおよびクローニングのみで観察された。
【００９０】
オリゴ合成およびアクセプター配列へのクローニング
【００９１】
４つのＣＤＲ配列、つまりヨザルの配列１（配列番号４２）由来のＹＡＡＴＫＬＱＳ（配列番号１）、ヨザルの配列２（配列番号４３）由来のＹＥＡＳＳＬＱＳ（配列番号２）、マーモセットの配列１（配列番号２５）由来のＹＥＡＳＫＬＱＳ（配列番号３）およびマーモセットの配列２（配列番号２６）由来のＹＳＡＳＮＬＥＴ（配列番号４）が、指し示したように、図２に示すアミノ酸配列から選択された。ヨザルの配列５  ＹＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号４８）が、Ａｏｔｕｓ  ｎａｎｃｙｍａａｅ（Ｍａ’ｓ  ｎｉｇｈｔ  ｍｏｎｋｅｙ）のｃＤＮＡ配列であるＧＩ６１７６２９５と同一であることが判明し、他のすべての配列は独特のものであった。
【００９２】
発現ベクター（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）におけるアクセプター配列の可変領域（抗ＴＮＦドメイン抗体）の配列を、制限酵素地図に指し示しているように、ＣＤＲ２のみならずＦＲ２の大部分を切除する、Ｋｐｎ  ＩおよびＳａｎＤ  Ｉによって連続的に消化した（２５μｇ）。次いで、このベクターをゲル精製して、切除した野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）のＦＲ２およびＣＤＲ配列を除去した。
【００９３】
オリゴのアニーリングを、９５℃で５分間に続いて６５℃で５分間、オリゴの対（それぞれの５００ｐｍｏｌが図４Ａおよび図４Ｂに示されている）をインキュベートすることによって行い、次いで、ホットブロック（ｈｏｔ  ｂｌｏｃｋ）上でゆっくりと室温に達するのを可能にさせた。重複部分は、ｄＮＴＰｓの存在下で、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）反応の間に満たされた。
【００９４】
親和性成熟
【００９５】
マーモセットのＣＤＲが接合したｄＡｂ化合物１４５（配列番号７）を、１４の別々のライブラリーを構築することによって親和性成熟させると、ライブラリーのそれぞれは配列番号７の配列を単一アミノ酸残基において多様化されていた。選択された残基を、以下に影をつけて示す。
【００９６】
【表１】
2009519983.tif 000002
【００９７】
この選択は、成熟なヒトＩｇレパートリーにおいて多様化されることで知られているＣＤＲ１およびＣＤＲ３の残基、ならびに相関したｄＡｂでの突然変異生成後に機能的なタンパク質を産生することが観察されているフレームワーク残基に基づいている。選択された残基のそれぞれに関して、相補的なフォワードおよびリバースのＰＣＲプライマー対を、ＮＫＫ縮重を伴って設計し、ならびに２つの初期ＰＣＲ反応を、単一の変異プライマーおよび隣接するプライマー（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）でそれぞれ行った。精製後、２つのＰＣＲ産物をアニーリングして、次いで隣接するプライマーだけを用いて増幅した（ＰＣＲの重複延長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）によるスプライシング；Lowman H.L.& Clackson T. (eds), Phage Display: A practical approach, Oxford University Press , Oxford, UK）。クローンを最初に固相ＴＮＦを用いてＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、陽性クローンの配列を決定した。ｄＡｂタンパク質を最上のクローンから精製して、レセプター結合アッセイおよびＬ９２９細胞毒性アッセイにおける有効性を評価し、化合物１００（配列番号９）および１２３（配列番号８）が、親であるｄＡｂ、化合物１４５（配列番号７）と比較して、ＴＮＦの中和を改善させることを発見した。
【００９８】
化合物１００（配列番号９）および１２３（配列番号８）の親和性を増強させる置換の組み合わせによって、Ｌ９２９細胞毒性アッセイでの有効性をさらに改善させる抗−ＴＮＦ  ｄＡｂが得られた（化合物１９６（配列番号１０））。
【００９９】
結果
レセプター結合アッセイ（ＲＢＡ）および細胞毒性アッセイでの抗−ＴＮＦ  ｄＡｂクローンの有効性
【０１００】
ＴＮＦのそのレセプターへの結合を阻害し、Ｌ９２９細胞におけるＴＮＦによって介される細胞毒性を中和する抗−ＴＮＦ  ｄＡｂの能力の確認は、以下のように実施された。
【０１０１】
レセプター結合アッセイ
【０１０２】
１４の選択された位置で多様化されたｄＡｂは、組換えＴＮＦレセプター１（ｐ５５）に対するＴＮＦの結合を阻害する能力ついて試験された。手短に言えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、３０ｍｇ／ｍｌの抗−ヒトＦｃマウスモノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ、サンフランシスコ、ＵＳＡ）で一晩インキュベーションした。ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、１％ＢＳＡ入りＰＢＳでブロッキングしてから、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦレセプター１  Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）でインキュベーションした。それぞれのｄＡｂを、洗浄したウェルに最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるように加えたＴＮＦとともに混合した。ＴＮＦの結合を、０．２ｍｇ／ｍｌの、ビオチン化した抗−ＴＮＦ抗体（Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｕｂｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で検出してから、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合ストレプトアビジン（アマシャムバイオサイエンス社、ＵＫ）で１：５００になるように希釈し、次いでＴＭＢ基質（ＫＰＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）でインキュベーションした。この反応をＨＣＬを添加することによって止めてから、吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。抗−ＴＮＦ  ｄＡｂの活性は、ＴＮＦの結合の減少に通じるので、吸光度の減少を、ＴＮＦのみのコントロールと比較した（図５）。
【０１０３】
Ｌ９２９細胞毒性アッセイ
【０１０４】
化合物１００（配列番号９）および１２３（配列番号８）を含む、小さいライブラリーの多様化アプローチ（ｍｉｎｉｌｉｂｒａｒｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ）によって同定される抗−ＴＮＦ  ｄＡｂもまた、マウスＬ９２９繊維芽細胞に関するＴＮＦの細胞毒性活性を中和する能力のために試験した（Evans, T.,2000,Molecular Biotechnology 15,243-248）。手短に言えば、マイクロタイタープレートに播種したＬ９２９細胞を、抗−ＴＮＦ  ｄＡｂ、１００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦおよび１ｍｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤとともに一晩インキュベーションした（Ｓｉｇｍａ社、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）。細胞の生存能力を、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］でインキュベーションをした後に、４９０ｎｍでの吸光度を読むことによって測定した（プロメガ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）。抗−ＴＮＦ  ｄＡｂの活性は、ＴＮＦ細胞毒性の減少に通じるので、吸光度の減少を、ＴＮＦのみのコントロールと比較した。親であるｄＡｂ化合物１４５（配列番号７）と比較した場合の結果を、図６に示す。
【０１０５】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という別の態様の語は、記載した要素、整数もしくは段階（ｓｔｅｐ）、または要素、整数もしくは段階の群を含むものを意味すると理解されるが、他の任意の要素、整数もしくは段階、または要素、整数もしくは段階の群を除外しない。
【０１０６】
本明細書で言及されるすべての出願書類は、参考文献として本明細書に取り入れられる。本明細書に含まれる文書、法令、材料、装置、記事などに関するいずれの議論もが、もっぱら本明細書に関しての文脈を提供するための目的である。これらの任意のもしくはすべての事項が、本出願書類のそれぞれの特許請求の範囲の優先日より前に、オーストラリアもしくはそれ以外のいずれかに存在するものとして、先行技術の土台の部分を形成し、または本発明に関連する技術分野における通常の知識であるものとする解釈としては受け取らない。
【０１０７】
幅広く記載したように、本発明の精神もしくは範囲から外れることなしに特定の実施態様を示せるように、本発明に対してたくさんの変形および／または改良が、当業者によってなされるのが好ましい。したがって、本実施態様は、例示的なものとしてすべて捉えられるものであって、限定的なものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】アクセプターｄＡｂの、アミノ酸（配列番号６）およびヌクレオチド（配列番号５）の配列を示す図である。
【図２Ａ】１１のマーモセットおよび６つのヨザルのＶκ遺伝子断片のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す図である。
【図２Ｂ】１１のマーモセットおよび６つのヨザルのＶκ遺伝子断片のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す図である。
【図２Ｃ】１１のマーモセットおよび６つのヨザルのＶκ遺伝子断片のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す図である。
【図２Ｄ】１１のマーモセットおよび６つのヨザルのＶκ遺伝子断片のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す図である。
【図２Ｅ】１１のマーモセットおよび６つのヨザルのＶκ遺伝子断片のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す図である。
【図２Ｆ】１１のマーモセットおよび６つのヨザルのＶκ遺伝子断片のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す図である。
【図３】アクセプターｄＡｂのアミノ酸およびヌクレオチドの配列を示す図である（両鎖）。ＣＤＲ２を含む領域を切り取るＫｐｎ  ＩおよびＳａｎＤ  Ｉに対する制限酵素消化部位を図に示す。除去されるＣＤＲ２残基をアンダーラインで示す。
【図４Ａ】図２で示したヌクレオチド（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）の配列の、クローニングおよび最終的な配列確認の間に使用されたオリゴヌクレオチドを示す配列アラインメントを示す図である。
【図４Ｂ】図２で示したヌクレオチド（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）の配列の、クローニングおよび最終的な配列確認の間に使用されたオリゴヌクレオチドを示す配列アラインメントを示す図である。
【図５】組換ＴＮＦレセプターに対するＴＮＦの結合を阻害するための、ＣＤＲ２が接合されたｄＡｂの能力を表示する図である。試験されたｄＡｂは以下のとおりであった：ヨザル１（ＣＤＲ＝ＹＡＡＴＫＬＱＳ；配列番号１）、ヨザル２（ＣＤＲ＝ＹＥＡＳＳＬＱＳ；配列番号２）、マーモセット１（ＣＤＲ＝ＹＥＡＳＫＬＱＳ；配列番号３）、マーモセット２（ＣＤＲ＝ＹＳＡＳＮＬＥＴ；配列番号４）およびアクセプターｄＡｂ（ＣＤＲ＝ＹＳＡＳＥＬＱＳ；配列番号４９）。
【図６】マウスＬ９２９繊維芽細胞についてのＴＮＦの細胞毒性を中和する、化合物１４５に対する化合物１００および１２３の改良された能力を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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