(57)【要約】VEGFR-2モジュレーターを投与することを含む癌の治療方法に対して治療的に応答するであろう哺乳動物を同定およびモニターするための方法に有用なVEGFR-2バイオマーカーであって、該方法は(a)  該哺乳動物をVEGFR-2モジュレーターに曝露しおよび(b)  少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、その際、該VEGFR-2モジュレーターに曝露していない哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルと比較した(b)において測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルにおける差違が、該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを示し、および(c)  VEGFR-2モジュレーターに曝露した後の哺乳動物のバイオマーカーのレベルは該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答したことを示すことを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
VEGFR-2モジュレーターの投与を含む癌の治療法に対して、治療的に応答するであろう哺乳動物を同定する方法であって、：
(a)  表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し;
(b)  該哺乳動物を該VEGFR-2モジュレーターに曝露し;
(c)  工程(b)の曝露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、
その際、工程(a)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して、工程(c)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
インビトロ方法であり、該少なくとも一つのバイオマーカーを該哺乳動物からの少なくとも一つの哺乳動物の生物学的試料において測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
VEGFR-2モジュレーターの投与を含む癌の治療法に対して、治療的に応答するであろう哺乳動物を同定する方法であって、：
(a)  該哺乳動物を該VEGFR-2モジュレーターに曝露し;
(b)  工程(a)の曝露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、
その際、該VEGFR-2モジュレーターに曝露していない哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルと比較して、工程(b)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が該癌の治療法に対して、治療的に応答するであろうことを示すことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表:        
“Copy 1”のラベルを付したコンパクトディスクには、配列表が10661 PCT.ST25.txtとして含まれる。この配列表はサイズが828KBであり、2006年8月30日に記録された。このコンパクトディスクは2つのコンパクトディスクのうちの1である。このコンパクトディスクの複製は“Copy 2”のラベルを付してあり、2つのコンパクトディスクのうちの2である。コンパクトディスクおよび複製は同一の内容であり、参照のため本願に引用する。
【０００２】
本発明の分野:
本発明は一般にファーマコゲノミクスの分野に関し、さらに詳細には、疾患および障害を治療するうえで役立つ、個性化された遺伝子プロファイルの同定を可能にすべく、患者の応答をモニターしまたは感受性を決定するために使用される方法および手順に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景:
癌は組織臨床的な異質性の広い疾患である。従来の組織学的および臨床的な特徴が予後と関連付けられてきたが、同じみかけの予後タイプの腫瘍が治療に対する応答性および患者のその後の生存においては大きく異なっている。
【０００４】
各患者について治療の個性化を容易にする新たな予後および予測マーカーが、臨床において小分子や生物学的分子医薬などの治療に対する患者の応答を正確に予測するために必要である。この問題は、治療に対する患者の感受性をより良く予測できる新たなパラメーターの同定により解決することができる。患者試料の分類は癌の診断および治療の重要な側面である。分子および遺伝子マーカーでの治療に対する患者の応答の関連性は、非応答患者における治療の開発の新たな機会を開くことができ、あるいは有効性における一層高い信頼性のために他の治療選択の中から治療の適応症を識別することができる。さらに、医薬、薬物、または組合せ療法に良く応答する傾向のある患者を前もって選択することは、臨床試験において必要な患者の数を減らし、臨床開発プログラムを完成するのに必要な時間を短縮することができる(M. Cockett et al., Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000))。
【０００５】
患者において、抗血管新生治療(例えばVEGFR-2モジュレーター)に対して応答している患者を検出することができること、または薬物感受性を予測することができることは、特に興味深いことである。なぜなら、薬物応答性は標的細胞の内因性の特性のみならず、宿主の代謝特性をも反映するものだからである。遺伝情報を用いて薬物応答を予測またはモニターしようとする努力は、多剤耐性遺伝子mdr1およびmrp1などの広い作用を有する個々の遺伝子に主として向けられてきた（P. Sonneveld, J. Intern. Med., 247:521-534(2000)）。
【０００６】
遺伝子mRNA発現パターンの大スケールの特徴付けのためのマイクロアレイ法の開発は、分子マーカーを体系的に探索すること、および伝統的な組織病理学的方法では明らかでなかった異なるサブグループに癌を分類することを可能にした(J. Khan et al., Cancer Res., 58:5009-5013 (1998); A.A. Alizadeh et al., Nature, 403:503-511 (2000); M. Bittner et al., Nature, 406:536-540 (2000); J. Khan et al., Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001); および T.R. Golub et al., Science, 286:531-537 (1999); U. Alon et al., P. N. A. S. USA, 96:6745-6750 (1999))。そのような技術および分子ツールは、細胞集団内での多数の転写物の発現レベルをいつでもモニターすることを可能にした（たとえば、Schena et al., Science, 270:467-470 (1995); Lockhart et al., Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchard et al., Nature Biotechnology, 14:1649 (1996); 米国特許第5,569,588号 to Ashby et al.を参照）。
【０００７】
最近の研究は、ヒト腫瘍のマイクロアレイ分析によって生成した遺伝子発現情報が臨床結果を予測し得ることを示している(L.J. van't Veer et al., Nature, 415:530-536(2002); M. Shipp et al., Nature Medicine, 8(1):68-74(2002); G. Glinsky et al., The Journal of Clin. Invest., 113(6):913-923(2004))。これら知見は、治療に対する個々の腫瘍の応答をより良く予測することおよびモニターすることにより癌の治療が大きく改善されるであろうとの希望をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
患者の分子レベルでの応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要である個性化された診断法の開発を可能にすべく、患者の薬物感受性を決定、または応答をモニターする新たな別の方法および手順が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の概要:
本発明は、一つ以上の血管内皮成長因子受容体2(VEGFR-2)モジュレーターに対する患者の感受性を決定または分子レベルでの応答をモニターするための方法および手順を提供する。本発明はまた、癌などの疾患状態の治療を必要とする個体が、治療（該治療は一つ以上のVEGFR-2モジュレーターの投与を含むもの）を施与する前に該治療に対して応答するか否かを決定または予測する方法も提供する。該一つ以上のVEGFR-2モジュレーターは、例えば、一つ以上のVEGFR-2特異的リガンド、一つ以上の小分子VEGFR-2阻害剤、または一つ以上のVEGFR-2結合モノクローナル抗体から選択される化合物である。
【００１０】
一つの態様において、本発明はVEGFR-2モジュレーターの投与を含む癌の治療法に対して、治療的に応答する哺乳動物を同定する方法を提供し、該方法は： (a)  表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し; (b)  該哺乳動物からの生物学的試料を該VEGFR-2モジュレーターに曝露し; (c)  工程(b)の曝露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程(a)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して、工程(c)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを示す。
【００１１】
哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するか否かを示すのに充分であるバイオマーカーのレベルの差違は、公知技術を用いて当業者によって容易に決定されることができる。バイオマーカーのレベルの増加または減少は、その差違が治療的に応答する哺乳動物を同定するのに充分であるかを決定することに相関しうる。一つの態様において、該バイオマーカーのレベルの差違が充分であることにより、該哺乳動物が該治療に対して治療的に応答するかどうかを決定する前に、予定することができる。一つの態様において、該バイオマーカーのレベルの差違は、mRNAレベル（例えば、RT-PCTまたはマイクロアレイによって測定される）での差違であり、例えば、発現レベルにおける少なくとも２倍の差違、少なくとも３倍の差違、または少なくとも４倍の差違である。別の態様において、該バイオマーカーのレベルの差違は、IHCによって決定される。別の態様において、バイオマーカーのレベルの差違とは、分散分析（Anova）におけるp値＜0.05をいう。さらに別の態様において、該差違は、ELISA法で決定される。
【００１２】
本明細書において、治療的に応答するとは、癌の軽減または抑止をいう。このことは、癌を罹患した個体の平均余命が増すこと、または癌の一つ以上の症状が低減または改善されることを意味する。この用語は、癌性細胞の増殖または腫瘍体積の低減を包含する。哺乳動物が治療的に応答するか否かは、PET造影などの当該技術分野でよく知られた多くの方法によって測定することができる。
【００１３】
哺乳動物は、たとえば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、霊長類、またはサルでありうる。
【００１４】
本発明の方法は、たとえば、インビトロの方法であり、その際、哺乳動物において少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定する工程は、該哺乳動物から生物学的試料を採取し、ついで該生物学的試料中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。生物学的試料は、たとえば、血清、新鮮な全血、末梢血単核細胞、凍結した全血、新鮮な血漿、凍結した血漿、尿、唾液、皮膚、毛包、骨髄または腫瘍組織の少なくとも１つでありうる。
【００１５】
少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、たとえば、バイオマーカーのタンパク質および／またはmRNA転写物のレベルでありうる。
【００１６】
別の態様において、本発明はVEGFR-2モジュレーターの投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答する哺乳動物を同定する方法を提供し、該方法は: (a)  該哺乳動物からの生物学的試料を該VEGFR-2モジュレーターに曝露し; (b)  表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを前記生物学的試料において測定することを含み、その際、該VEGFR-2モジュレーターに曝露していない哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルと比較して、工程(b)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が前記癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを示す。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は哺乳動物がVEGFR-2モジュレーターの投与を含む癌の治療法に対して、治療的に応答するかどうかを試験または予想する方法を提供し、該方法は： (a)  表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し； (b)  該哺乳動物をVEGFR-2モジュレーターに曝露し; (c)  工程(b)の曝露後、少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、工程(a)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して、工程(c)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が該癌の治療法に対して、治療的に応答するであろうことを示す。
【００１８】
別の態様において、本発明は哺乳動物においてVEGFR-2活性を阻害する化合物を決定する方法を提供し、これは: 
(a)  該哺乳動物を該化合物に曝露し; (b)  工程(a)の曝露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、前記化合物に曝露していない哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルと比較して、工程(b)で測定した前記バイオマーカーのレベルが差違を有することが、該化合物が該哺乳動物においてVEGFR-2活性を阻害することを示す。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は哺乳動物がVEGFR-2活性を阻害する化合物に曝露したかどうかを決定する方法を提供し、これは、(a)  哺乳動物を該化合物に曝露し; および(b)  工程(a)の曝露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、前記化合物に曝露していない哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルと比較して、工程(b)で測定した前記バイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物がVEGFR-2活性を阻害する化合物に曝露したことを示す。
【００２０】
別の態様において、本発明は、哺乳動物がVEGFR-2活性を阻害する化合物に対して応答しているかどうかを決定する方法を提供し、これは、(a)該哺乳動物を該化合物に曝露し; (b)工程(a)の曝露後、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、前記化合物に曝露していない哺乳動物おける少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して、工程(b)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が該VEGFR-2活性を阻害する化合物に対して応答していることを示す。
【００２１】
本明細書において、“応答している”は、哺乳類において、生物学的および細胞性応答、ならびに臨床的応答（症状の改善、治療効果、または有害事象など）による応答を包含する。
【００２２】
本発明はまた、表１のバイオマーカーから選択される単離されたバイオマーカーも提供する。本発明のバイオマーカーは、表１および配列表にて提供されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から選択される配列、ならびにその断片および変異体を含む。
【００２３】
本発明はまた、表１のバイオマーカーから選択される２つ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーセットも提供する。
【００２４】
本発明はまた、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターを含む治療に対して患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するキットも提供する。該患者は、たとえば、結腸癌または腫瘍などの癌または腫瘍を罹患している。
【００２５】
一つの態様において、該キットは、本発明の一つ以上の特定のマイクロアレイ、患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに用いる一つ以上のVEGFR-2モジュレーター、および使用の指示書を入れた適当な容器含む。該キットはさらに、バイオマーカーセットの発現をmRNAレベルまたはタンパク質レベルでモニターするための試薬または材料を含みうる。
【００２６】
別の態様において、本発明は、表１のバイオマーカーから選択される２つ以上のバイオマーカーを含むキットを提供する。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための抗体および核酸の少なくとも一つを含むキットを提供する。別の態様において、該キットはさらに、VEGFR-2活性を阻害する化合物の投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを決定するための指示書を含む。別の態様において、該指示書は、(a)  表１のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、(b)  該哺乳動物を該化合物に曝露し、(c)  工程(b)の曝露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定する工程を含み、その際、工程(a)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して、工程(c)で測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが差違を有することが、該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを示す。
【００２８】
本発明はまた、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターによる治療に対して患者が感受性または耐性であるか否かを決定するためのスクリーニングアッセイも提供する。
【００２９】
本発明はまた、疾患を有する患者の治療をモニターする方法であって、前記疾患が一つ以上のVEGFR-2モジュレーターの投与を含む方法により治療されるものも提供する。
【００３０】
本発明はまた、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を治療するために必要な個性化された遺伝子プロファイルも提供する。
【００３１】
本発明はまた、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに対して感受性または耐性のいずれかと相関する発現プロファイルを有する一つ以上のバイオマーカーを含む、特別なマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNAマイクロアレイも提供する。
【００３２】
本発明はまた、本発明の一つ以上のバイオマーカーに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体も提供する。
【００３３】
本発明は、添付の図面と関連して考察しながら発明の詳細な説明を読むとより理解されるであろう。
【００３４】
発明の詳細な説明
有効性、薬物曝露、または臨床的応答をすばやくかつ利用しやすく読み出すバイオマーカーの同定は、薬物候補の臨床的開発において、ますます重要である。本発明の実施態様は、分泌タンパク質または血漿バイオマーカーのレベルにおける変化を測定することを含み、バイオマーカーの一つのカテゴリーに相当する。一つの態様において、血漿サンプルはすぐに利用できる材料源であり、バイオマーカー分析のための代用組織となる。
【００３５】
本発明は、特定のシグナル伝達経路の調節に対して応答し、VEGFR-2モジュレーター感受性または耐性と相関するバイオマーカーを提供する。これらのバイオマーカーは、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに対する応答を予測およびモニターするために用いることができる。一つの態様において、本発明のバイオマーカーは、表１および表２、ならびに配列表（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両配列を含む）にて示されるものである。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【００３６】
表１に示されるバイオマーカーは、腫瘍遺伝子発現プロファイルにおいてVEGFR-2と強力に同時発現される。該バイオマーカーは、VEGFR-2活性またはVEGFR-2シグナル伝達経路に作用するVEGFR-2モジュレーターに対する応答を予測およびモニターするために有用な分子ツールとなる。
【００３７】
表２に示されるバイオマーカーは、表１に示される該マーカーのサブセットであり、実施例で定義される“実施例VEGFR-2モジュレーター”による治療により有意に調節されることが確認された。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００３８】
VEGFR-2モジュレーター:
本明細書において、用語“VEGFR-2モジュレーター”とは、VEGFR-2活性またはVEGFR-2シグナル伝達経路を直接的にまたは間接的に調節する生体分子または小分子である化合物または薬物を意味することを意図する。従って、本明細書で使用される化合物または薬物とは、小分子および生体分子の両方を含むことを意図する。直接的または間接的な調節には、VEGFR-2活性またはVEGFR-2シグナル伝達経路の活性化または阻害が含まれる。一つの態様において、阻害とは、例えばVEGFのようなVEGFR-2リガンドへのVEGFR-2の結合の阻害をいう。別の態様において、阻害とは、VEGFR-2のキナーゼ活性の阻害をいう。
【００３９】
VEGFR-2モジュレーターには、例えばVEGFR-2特異的リガンド、小分子VEGFR-2阻害剤、およびVEGFR-2モノクローナル抗体が含まれる。一つの態様において、VEGFR-2モジュレーターはVEGFR-2活性を阻害しおよび／またはVEGFR-2シグナル伝達経路を阻害する。他の態様として、該VEGFR-2モジュレーターはVEGFR-2活性を阻害しおよび／またはVEGFR-2シグナル伝達経路を阻害するVEGFR-2モノクローナル抗体である。
【００４０】
VEGFR-2モジュレーターは、生体分子または小分子を含む。
【００４１】
生体分子は、450より大きい分子量を有するすべての脂質ならびに単糖、アミノ酸、およびヌクレオチドのポリマーを含む。従って、生体分子は、例えば、オリゴ糖および多糖類；オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドおよび蛋白質； ならびにオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、DNAおよびRNAを含む。
【００４２】
生体分子は、さらに上記分子のいずれの誘導体も含む。例えば、生体分子の誘導体は、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質の脂質およびグリコシル化誘導体を含む。
【００４３】
生体分子の誘導体はさらに、オリゴ糖および多糖類の脂質誘導体、例えばリポ多糖類を含む。最も典型的には、生体分子は抗体、または抗体の機能的な等価体である。抗体の機能的な等価体は、抗体と同程度の結合特性を有しVEGFR-2を発現する細胞の増殖を阻害する。該機能的な等価体は、例えばキメラ化、ヒト化、および単鎖抗体、ならびにそのフラグメントを含む。
【００４４】
抗体の機能的な等価体はまた、抗体の可変または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。一つ以上の置換、付加および／または欠失により他の配列と異なるが、該他の配列と実質的に同一であるアミノ酸配列は、等価な配列であると見なされる。配列におけるアミノ酸残基数の好ましくは50％未満、より好ましくは25％未満、さらに好ましくは10％未満が、該タンパク質を置換し、該タンパク質に付加され、該タンパク質から欠失する。
【００４５】
抗体の機能的な等価体は、好ましくはキメラ化またはヒト化抗体である。キメラ化抗体は、非ヒト抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を含む。ヒト化抗体は、非ヒト抗体の超可変領域（CDR）を含む。ヒト化抗体の、超可変領域以外の可変領域（例えば、フレームワーク可変領域）および定常領域は、ヒト抗体のそれらである。
【００４６】
適当な非ヒト抗体の可変および超可変領域は、モノクローナル抗体が作られたいずれかの非ヒト哺乳動物においてによって産生された抗体から得られうる。ヒト以外の哺乳動物の適当な例は、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、または霊長類が挙げられる。
【００４７】
機能的な等価体にはさらに、抗体全体と同一または同等の結合特性を有する抗体のフラグメントが含まれる。適当な抗体のフラグメントには、特異的にかつ十分な親和性でVEGFR-2チロシンキナーゼに結合して、該受容体を発現する細胞の増殖を阻害するのに十分な超可変(すなわち、相補性決定)領域の部分を含む、あらゆるフラグメントが挙げられる。
【００４８】
該フラグメントは、例えば、FabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメントの一つまたは両方を含んでいてもよい。該領域の全てよりも少なく（例えば３、４、または５個CDR）含有する機能的なフラグメントもまた含まれるが、好ましくは、該抗体フラグメントが抗体全体の相補性決定領域の６個全てを含む。
【００４９】
一つの態様において、該フラグメントは、単鎖抗体、またはFvフラグメントである。単鎖抗体は相互接続するリンカーを有するかまたは有さずに、該軽鎖の可変領域に連結する該抗体の重鎖の可変領域を少なくとも含むポリペプチドである。従って、Fvフラグメントは、抗体結合部位の全体を含む。これらの鎖は、細菌または真核細胞中で産生されうる。
【００５０】
該抗体および機能的な等価体は、免疫グロブリンのいずれかのクラス、例えばIgG、IgM、IgA、IgD、またはIgE、およびそのサブクラスに属しうる。
【００５１】
一つの態様において、該抗体は、IgG1サブクラスに属する。該機能的な等価体もまた、上記のクラスとサブクラスのいずれかの組み合わせと等価でありうる。
【００５２】
一つの態様において、該VEGFR-2抗体はCDP-791(UCB)である。別の態様において、該VEGFR-2抗体はIMC-1121b(ImClone Systems)である。さらに別の態様において、該VEGFR-2モジュレーターは、AVE-005(VEGF trap、Regeneron Pharmaceuticals)である。
【００５３】
上記の生体分子に加え、本発明において有用なVEGFR-2モジュレーターはまた、小分子でありうる。生体分子でない分子のいずれも、本明細書において、小分子であると見なされる。いくつかの小分子の例は、有機化合物、有機金属化合物、有機および有機金属化合物の塩、糖類、アミノ酸、およびヌクレオチドが挙げられる。小分子はさらに、それらの分子量が450以下であることを除いて、その他の点では生体分子とみなされる分子を含む。従って、小分子は450以下の分子量を有する脂質、オリゴ糖、オリゴペプチド、およびオリゴヌクレオチドならびにそれらの誘導体でありうる。
【００５４】
小分子が任意の分子量を有することができることを強調する。それらが典型的に450未満の分子量を有するので、それらを単に小分子と呼ぶ。小分子は、天然に見出される化合物および合成化合物を含む。一つの態様として、VEGFR-2モジュレーターは、VEGFR-2を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する小分子である。別の実施態様において、VEGFR-2モジュレーターは、VEGFR-2を発現する難治性の腫瘍細胞の増殖を阻害する小分子である。
【００５５】
多数の小分子が、VEGFR-2を阻害するのに有用であるとして記載されている。
【００５６】
一つの態様において、該VEGFR-2モジュレーターは、構造：
【化１】
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を有する、[(1R)、2S]-2-アミノプロピオン酸2-[4-(4-フルオロ-2-メチル-1H-インドール-5-イルオキシ)-5-メチルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-6-イルオキシ]-1-メチルエチルエステルである。
【００５７】
別の態様において、該VEGFR-2モジュレーターは、米国特許第6,869,952号（参照することにより本書に含まれる）に記載の化合物から選択される。さらに別の態様において、該VEGFR-2モジュレーターは、PCT公開第WO00/71129号または第WO2004/009601号（参照することにより本書に含まれる）に記載の化合物から選択される。
【００５８】
別の態様において、該VEGFR-2モジュレーターは、CHIR-258(Chiron)、AZD-2171(AstraZeneca)、GW786034(GlaxoSmithKline)、AMG 706(Amgen)、BIBF 1120(Boehringer Ingelheim)、AE788(Novartis)、ZD6474(AstraZeneca)、BAY 43-9006(Sorafenib、Bayer)、およびSU11248(Sutent、Pfizer)から選択される。
【００５９】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセット：
本発明は、VEGFR-2またはVEGFR-2経路を介するシグナル伝達が重要である疾患領域において、例えば、癌または腫瘍において、免疫的傷害、症状もしくは機能障害において、または細胞シグナル伝達および／または細胞増殖制御が正常ではないかもしくは異常である疾患状態において、診断および予後の両方で価値を有する個々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセットを含む。該バイオマーカーセットは、複数のバイオマーカー、たとえば、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに対する耐性または感受性と高度に相関関係を有する表１に示される複数のバイオマーカーを含む。
【００６０】
本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、種々の生物学的システムにおいてまたは細胞応答について、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターの起こりそうな効果を予測または合理的に予知することを可能にする。該バイオマーカーおよびバイオマーカーセットを試験細胞によるVEGFR-2モジュレーター応答のインビトロアッセイに使用することで、インビボでの結果を予測することができる。本発明によれば、本明細書に記載される種々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセット、または他のバイオマーカーもしくはマーカーとこれらのバイオマーカーセットの組合せを、例えば、癌患者が一つ以上のVEGFR-2モジュレーターによる治療的介入にどのように応答するかを予測およびモニターするために用いることができる。
【００６１】
一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに曝露された後の細胞の感受性または耐性と相関関係を有する細胞遺伝子発現パターンのバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、該VEGFR-2モジュレーターで治療する前に、一つ以上の腫瘍試料をスクリーニングするための有用なツールを提供する。該スクリーニングにより、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに曝露された腫瘍試料の細胞についてバイオマーカーおよびバイオマーカーセットの発現結果に基づき、該腫瘍が、それゆえ腫瘍を罹患した患者が該VEGFR-2モジュレーターによる治療に応答するか否の予測が可能になる。
【００６２】
バイオマーカーまたはバイオマーカーセットはまた、本明細書に記載するように、VEGFR-2モジュレーターが関与する疾患の治療を受けている患者において疾患の治療または療法の進行をモニターするために用いることができる。
【００６３】
該バイオマーカーはまた、疾患の治療のための療法の開発のための標的とすることができる。そのような標的は、癌、例えば、肝細胞癌、結腸直腸癌(CRC)、NSCLC、および転移性乳癌の治療に特に応用することができる。
【００６４】
実際、これらバイオマーカーは感受性細胞および耐性細胞において異なって発現するので、それらの発現パターンはVEGFR-2モジュレーターによる治療に対する細胞の相対的な内生の感受性と相関関係がある。従って、耐性の細胞において高度に発現したバイオマーカーは、VEGFR-2モジュレーター、特にVEGFR-2阻害剤に対して耐性の腫瘍の新たな療法の開発のための標的となり得る。バイオマーカータンパク質および／またはmRNAのレベルは、当業者によく知られた方法を用いて決定することができる。たとえば、タンパク質の定量は、ELISA、二次元SDS PAGE、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、またはフローサイトメトリーなどの方法を用いて行うことができる。mRNAの定量は、PCR、アレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、インシトゥハイブリダイゼーション、ドットブロット、タクマン法（Taqman）、またはRNAse保護アッセイなどの方法を用いて行うことができる。
【００６５】
マイクロアレイ:
本発明はまた、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに対する感受性または耐性のいずれかと相関関係のある発現プロファイルを示す一つ以上のバイオマーカーを含む、特定のマイクロアレイ、例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNAマイクロアレイを包含する。そのようなマイクロアレイは、腫瘍生検からの試験細胞においてバイオマーカーの発現レベルを評価し、これらの試験細胞がVEGFR-2モジュレーターに対して耐性または感受性でありそうか否かを決定するためのインビトロアッセイに使用することができる。例えば、特定のマイクロアレイは、本明細書に記載され、表１に示されるバイオマーカーの全てまたはそのサブセットを用いて調製することができる。組織または器官生検からの細胞を単離し、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターに曝露することができる。一つの態様において、未処置細胞および処置細胞の両方から単離した核酸を一つ以上の特定のマイクロアレイに適用した後、試験細胞の遺伝子発現パターンを決定し、マイクロアレイ上でバイオマーカーセットを作成するのに使用した細胞のコントロールパネルからのバイオマーカーパターンのものと比較することができる。試験に供した細胞からの遺伝子発現パターンの結果に基づき、該細胞が遺伝子発現の耐性プロファイルまたは感受性プロファイルを示すかを決定することができる。ついで、組織または器官生検からの試験細胞が一つ以上の該VEGFR-2モジュレーターに応答するか否か、および治療または療法の方針を、特定のマイクロアレイ分析の結果から収集した情報に基づいて決定または評価することができる。
【００６６】
抗体:
本発明はまた、一つ以上のポリペプチドバイオマーカーに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体も包含する。そのような抗体は様々な方法で用いることができ、例えばインビトロおよびインビボ両者での診断、検出、スクリーニング、および／または治療法を含めて、本発明のバイオマーカーを精製、検出、およびターゲティングするのに用いることができる。
【００６７】
キット:
本発明はまた、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターを含む治療に対して患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するためのキットも包含する。患者は、癌または腫瘍、例えば乳癌または乳腫瘍を罹患している。該キットは、患者の生検腫瘍もしくは癌試料を試験するのに使用するため、例えば患者の腫瘍または癌がVEGFR-2モジュレーターによる所定の治療または療法に対して、耐性であるかまたは感受性であるかを決定または予測するために、臨床場面において有用であろう。該キットは、: VEGFR-2モジュレーター、特にVEGFR-2阻害剤に対する耐性および感受性と相関するそれらのバイオマーカーを含む、一つ以上のマイクロアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNA マイクロアレイ）; 患者の組織標本または患者試料からの細胞を試験するのに使用するための一つ以上のVEGFR-2モジュレーター;および使用の指示書を入れた適当な容器を含む。さらに、本発明によって包含されるキットは、本明細書においてさらに記載するように、当該技術分野で実施されている他の技術およびシステム、例えば、RT-PCRアッセイ（本明細書に記載する一つ以上のバイオマーカーに基づいてデザインしたプライマーを使用する）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ELISA）などのイムノアッセイ、イムノブロッティング、例えば、ウエスタンブロッティング、またはインシトゥハイブリダイゼーションなどを用い、例えば、本発明のバイオマーカーの発現をmRNAまたはタンパク質のレベルでモニターするための試薬または材料をさらに含みうる。
【００６８】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットの応用：
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットは種々の応用に用いることができる。バイオマーカーセットは、種々の生物学的系においていかなるVEGFR-2モジュレーターの起こりそうな効果についての予測をも可能とすべく、表１および表２に記載したバイオマーカーのいかなる組合せからも構築することができる。本明細書に記載する種々なバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、例えば、疾患管理における診断または予後の指標として、該VEGFR-2を調節する化合物による治療的介入に対して癌患者がどのように応答するかを予測するため、および全VEGFR-2制御経路を介するシグナル伝達を調節する治療的介入に対して患者がどのように応答するかを予測するために用いることができる。
【００６９】
本明細書に記載されるデータは、癌療法に潜在的な有用性を有する化合物をスクリーニングおよび同定するために通常使用される細胞系で作成されたが、該バイオマーカーは、VEGFR-2または該VEGFR-2経路を介するシグナル伝達が重要である疾患領域、例えば、免疫において、または細胞シグナル伝達および／または増殖制御がうまくいかない癌もしくは腫瘍において、診断および予後の両方において価値を有する。
【００７０】
本発明によれば、患者の組織試料からの細胞、例えば腫瘍または癌生検をアッセイして、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターで治療する前に、一つ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができる。治療の成功または失敗は、試験組織からの細胞（試験細胞）、例えば腫瘍または癌生検のバイオマーカーの発現パターンに基づき、一つ以上のバイオマーカーのコントロールセットの発現パターンと比べて同様であるか異なるかで決定することができる。それゆえ、もしも試験細胞が、該VEGFR-2モジュレーターに対して感受性の細胞のコントロールパネルでのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現プロファイルを示すなら、該個体の癌または腫瘍は該VEGFR-2モジュレーターによる治療に良好に応答するであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。対照的に、もしも試験細胞が、VEGFR-2モジュレーターに対して耐性の細胞のコントロールパネルのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現パターンを示すなら、該個体の癌または腫瘍は該VEGFR-2モジュレーターによる治療には応答しないであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。
【００７１】
本発明はまた、一つ以上のVEGFR-2モジュレーターによって治療できる疾患を有する患者の治療をモニターする方法も提供する。患者の組織試料、例えば、腫瘍生検または血液試料からの単離試験細胞を、VEGFR-2モジュレーター（好ましくは、該VEGFR-2モジュレーターはVEGFR-2阻害剤である）への曝露の前後に、一つ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定するためにアッセイすることができる。その結果得られた治療前および治療後の試験細胞のバイオマーカー発現プロファイルを、VEGFR-2モジュレーターに対して耐性または感受性のいずれかである細胞のコントロールパネルで高度に発現されるべき本明細書に記載し示した一つ以上のバイオマーカーのものと比較する。それゆえ、もしも患者の応答が一つ以上のバイオマーカーの発現プロファイルの相関関係に基づいてVEGFR-2モジュレーターによる治療に対して感受性であるなら、該患者の治療予後は良好であると認定され、治療を続行することができる。また、もしもVEGFR-2モジュレーターによる治療の後に試験細胞が該VEGFR-2モジュレーターに感受性の細胞のコントロールパネルに対応するバイオマーカー発現プロファイルに変化を示さないなら、このことは現在行っている治療を修正、変更、あるいは中止さえすべきであるとの指標となり得る。このモニタリングプロセスはVEGFR-2モジュレーターを用いた患者の治療の成功または失敗を指摘することができ、必要に応じてまたは所望により、そのようなモニタリングプロセスを繰り返すことができる。
【００７２】
本発明のバイオマーカーは、生物学的系について何らかの知見を得る前に結果を予測するのに用いることができる。本質的に、バイオマーカーは統計的なツールであると考えることができる。バイオマーカーは主として生物学的系を分類するのに用いる表現型を予測するうえで有用である。本発明の実施態様において、該予測のゴールは、活性VEGFR-2経路を有するかまたは不活性VEGFR-2経路を有するかに、癌細胞を分類することである。不活性VEGFR-2経路である癌細胞は、VEGFR-2モジュレーターによる治療に対して耐性であると見なすことができる。
【実施例】
【００７３】
実施例:
方法および試料:
下記の実施例において、化合物[(1R)、2S]-2-アミノプロピオン酸2-[4-(4-フルオロ-2-メチル-1H-インドール-5-イルオキシ)-5-メチルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-6-イルオキシ]-1-メチルエチルエステル:
【化２】
2009507226.tif 000027
を使用した。本明細書においてこの化合物を“実施例VEGFR-2阻害剤”と記載する。
【００７４】
ヒト癌腫瘍試料:
これらの試料の使用はLocal Ethics Committeeにより許可され、手術前に全ての患者からインフォームドコンセントを与えられた。試験集団は、1997年12月から2003年3月にロイヤルロンドン病院で手術をした、30の結腸直腸肝臓転移である患者26人および原発性結腸直腸腫瘍を有する患者118人(年齢範囲、27−91歳; 平均69±13.67歳)から構成された。患者92人が潜在的に治療を目的とした手術を受け、患者24人が非治療的または緩和的手術を受けた。原発性CRCを有する全患者について、下記のパラメーターを記録した:  年齢; 癌部位(右側または左側); 外科的切除のタイプ(治療的または非治療的); 腫瘍-結節-転移(TNM)分類およびDukes段階、組織学的分化度(高、中、または低); DNAマイクロサテライト安定性状態(安定または不安定を、先に報告された; Ref. 15のように、BAT26モノヌクレオチド反復の分析により評価した); 手術前後にうけた療法; 再発; および切除後の生存期間。
【００７５】
ヒト癌血液試料:
ELISA分析のための血液試料(血漿)を、臨床試験CA182-002（進行性または転移性固形腫瘍患者における実施例VEGFR-2阻害剤の安全性、薬物動態学、および薬力学を決定するための第I相用量漸増試験）を出資したBristol-Myers Squibb Co.から入手した。血液試料は、スクリーニング時、投与前、並びに投与後4時間、1日目、8日目、26日目、および治療の最後に患者から採取された。おおよそ60mlの血液をプロトコール特定サンプリングのために採取した。該標本の採取、加工、標識、操作、保存、および輸送に関する詳しい指示は、CA182-002 ラボラトリーマニュアルに示される。
【００７６】
マウス異種移植片腫瘍モデル:
L2987およびHCT-116癌細胞系を用いて、皮下(sc)移植したヌードマウス内で腫瘍を増殖させた。腫瘍継代は、おおよそ2〜4週間毎に生じた。ついで、腫瘍を既定のサイズウィンドウまで増殖させ(100〜200mm3、該範囲外の腫瘍は排除した)、動物を種々の処置群およびコントロール群に均一に分配した。動物を実施例VEGFR-2阻害剤で処置した(100mg/kg 1qd X 14日)。処置に関連する毒性／死亡率について、処置された動物を毎日チェックした。各群の動物の体重を、処置開始前(Wt1)および最後の処置投与後に再び(Wt2)測定した。体重の差違(Wt2-Wt1)が処置関連毒性の尺度となった。腫瘍が規定の標的サイズに達するまで該腫瘍をキャリパーで週２回測定することによって、腫瘍反応を測定した。該試験の間に、種々の処置群およびコントロール群に分配された動物を、最終的に屠殺して、ゲノム分析およびタンパク質分析のための腫瘍および血液試料を採取した。
【００７７】
マウス異種移植片血液試料:
約100〜200μlの全血を未処置および実施例VEGFR-2阻害剤処置異種移植片腫瘍モデルから採取した。採取した全血を5μlのプロテアーゼ阻害剤混合液を含む2mlバイアルに移し、数回反転させて混合した。該バイアルを卓上マクロ遠心分離機で10,000rpmにて10分間遠心分離した。遠心分離の後、２つの異なる血液の相、上相および下相が生じた。上相を該バイアルから注意深く取り除き、新しい2mlバイアルに入れ、その後-80℃で保存し、ELISA分析に使用した。下相は廃棄した。
【００７８】
RNA単離：
該癌患者から採取した結腸腫瘍試料を、切除20分内に液体窒素中で即座に凍結し（snap frozen）、その後-80℃で保存した。該マウス異種移植片腫瘍試料を２等分した。半分をバイアル中で10％ホルマリンと混合してIHCに用い、残りの半分を、1.0 mlのRNAlater登録商標 RNA 安定化薬(Ambion、Inc.、Austin、Texas)中で混合し、室温にて30分間置き、その後、-80℃で保存した。トータルRNAをRNeasy Kit登録商標(Qiagen、Valencia CA)を用いて腫瘍試料から抽出した。転写プロファイリングのために、分光測定(DU640 UV、Beckman Coulter、Fullerton、カリフォルニア)による260/280比が≧1.8である、少なくとも1μgのトータルRNAが必要であった。簡単に言うと、該腫瘍試料を、Qiagenより供された溶解-結合溶液中にホモジナイズした。等量のエタノールを各試料に混合し、該混合物を添付のフィルターカートリッジに通し、残りの抽出プロトコールを続けた(Ambion)。RNA収率および品質を標準1％アガロースゲルで評価した。28s/18s RNA比は1.5〜2.5の範囲であり、劣化のない高品質なRNAであることが示された。RNA試料を-80℃で保存した。
【００７９】
遺伝子発現プロファイリング:
該腫瘍試料から得られたRNAについて転写プロファイリングを行った。ヒトU133Aおよびマウス430Aアレイのハイブリダイゼーションおよびスキャニングに、アフィメトリクスGeneChipシステム(Affymtrix、サンタクララ、カリフォルニア)を使用した。MAS 5.0ソフトウェアを用いてデータを前処置した。cRNAの生成は標準的なT7増幅プロトコールに従った。トータルRNAをT7-(dT)24プライマーの存在下にSuperScript II(Gibco、Carlsbad、カリフォルニア)を用いて逆転写し、第一鎖cDNAを生成した。DNAポリメラーゼI、DNAリガーゼ、およびRNase H(Gibco)の存在下に、第二鎖cDNAの合成を行った。得られた二本鎖cDNAをT4 DNAポリメラーゼを用いてブラントエンドした。ついで、この二本鎖cDNAを、ビオチン-リボヌクレオチドの存在下、BioArray High Yield RNA 転写物標識キット(Enzo Life Sciences、Farmingdale、New York)を用いて、cRNAに転写した。増幅したビオチン-標識cRNAをQiagen RNeasy カラム(Qiagen Sciences)を用いて精製して、定量化し、断片化緩衝液(1X)の存在下94℃で35分間断片化した。断片化cRNAを、アフィメトリクス U113Aおよび430Aアレイに42℃で一晩、ハイブリッド形成させた。ついで該アレイをアフィメトリクスプロトコール推奨のように、染色および洗浄のためにfluidics stationに入れた。該チップをスキャンし、未補正の強度値をアレイ上の各プローブについて作成した。各試料の発現レベルを比較するため、各アレイのトリム平均強度を全体的なチップ強度における小さな差違を計算できるように1,500のスケールにした。
【００８０】
転写プロファイリングデータ分析:
ヒト癌でVEGFR-2と同時発現される遺伝子を同定するために、ピアソン相関測定基準を用い、ヒトU133A遺伝子チップ上の各プローブセットの遺伝子発現値を、選択したVEGFR-2プローブセット(プローブ ID＝203934_at)と比較した。H-U133A遺伝子チップデータに含まれる全てのプローブセットを、それらのVEGFR-2(203934_at)との相関についてのピアソン値の降順に並べた。VEGFR-2との相関が≧0.55(ピアソン相関結果)であるプローブセットを、VEGFR-2と強力に同時発現すると見なした。表１のマーカーを59の結腸腫瘍遺伝子発現プロファイルからVEGFR-2(プローブ ID＝203934_at)と強力に同時発現されると同定した。
U133Aアレイ上でプロファイルしたヒト癌から同定された94の同時発現VEGFR-2遺伝子を、マウス430Aアレイ上でプロファイルしたマウス異種移植片腫瘍から、それらに対応するマウスホモログを同定するために用いた。430Aアレイ上でプロファイルした未処置異種移植片腫瘍および実施例VEGFR-2阻害剤処置異種移植片腫瘍から作成した遺伝子発現プロファイルデータについて、T-検定分析を行った。試験した該94個の同時発現VEGFR-2遺伝子から、VEGFR-2モジュレーターを処置した後にmRNA量が有意に変化した総計18個のマーカー(プローブ)を同定した(p-値＜0.05; T-検定結果; 表２)。IHCおよびELISAベースのアッセイによるタンパク質レベルでの更なる分析のために、変化倍数およびT-検定スコアに基づいて該リストの18個から７個の候補マーカーを選んだ(C1QR1、COL4A1、CAV1、AGTRL1、TIE、CDH5、NID2)。
【００８１】
免疫組織化学的検査:
IHC用に採取した組織標本を、10％ホルマリンを用いて固定した。固定した後、該化学固定剤を捨て、該標本を70％エタノールに浸し、その後パラフィンブロックに組み込んだ。各ブロックから5ミクロン組織切片を切り、プラスに帯電した顕微鏡用スライドに設置した。該組織スライドをキシレンに浸してパラフィンを除去した。該スライドを100％エタノール、95％エタノール、および70％エタノール中で再水和した。再水和させた後、該スライドを脱イオン水で室温にて数回洗浄した。多重抗原回復条件(Citra、Citra Plus、およびAR10)をBioGenex EZ-レトリバーマイクロ波の使用により試験し、最適条件を決定した。各候補マーカー抗体についてそれぞれ自動BioGenex i6000 IHCシステムで染色最適化を行った。処置および未処置異種移植片の両方を同一の操作で染色し、スライド間のばらつきを最小限にした。コントロールとして、試験される候補マーカーの一次抗体の代わりにウサギまたはマウスIgGを用いた。ネガティブコントロールは全て異種移植片において染色を呈しなかった。
【００８２】
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA):
ヒト血漿のコラーゲンIV型およびVE-カドヘリン、または検出し測定すべきタンパク質の生物学的試料の検出および測定のためのELISA法について記載する。コラーゲンIV型ELISAについては、該キットが、Kamiya biomedical company(cat no. KT-035)により提供され、該アッセイの原理方法、固相一工程サンドイッチELISAは、次のとおりであった。試料中のコラーゲンIV型は、固相モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体-酵素複合体によって各々異なる抗原部位で同時に結合される。これにより、該コラーゲンIV型分子は、固相と酵素-標識抗体の間に挟まれる。非結合の酵素-標識抗体および試料を除去し、該プレートを該酵素基質3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)と共にインキュベートした。得られた発色は、試料中のコラーゲンIV量に直接的に比例した。該反応を酸を添加して終了し、450nmの吸光度を測定した。コラーゲンIV型の標準希釈液から標準曲線を作成し、コラーゲンIV型試料の濃度を決定した。VE-カドヘリンELISAについて、Bender Medsystemsにより提供されるキットを用い(cat no. BMS253)、該アッセイの原理法は、次のとおりであった。抗-VE-カドヘリン被覆抗体をマイクロウェル上に吸着させた。試料中に存在するVE-カドヘリンを該マイクロウェルに吸着させた抗体に結合させ; ビオチン結合抗-VE-カドヘリン抗体を加え、一次抗体に捕獲されたVE-カドヘリンに結合させた。インキュベーションの後、非結合のビオチン結合抗-VE-カドヘリンを洗浄工程の間に除去した。ストレプトアビジン-HRPを加え、ビオチン結合抗-VE-カドヘリンに結合させた。インキュベーションの後、洗浄工程の間に非結合のストレプトアビジン-HRPを除去し、HRPと反応する基質溶液を該ウェルに加えた。発色生成物が試料中に存在するVE-カドヘリン量に比例して生じた。該反応を酸を添加して終了し、450nmの吸光度を測定した。標準曲線をVE-カドヘリン標準希釈液から作成し、VE-カドヘリン試料濃度を決定した。
【００８３】
実施例１−バイオマーカーの同定および使用
所定の実験手順により得られたヒト癌およびマウス異種移植片腫瘍標本についてこれらの実験を行った。既知のヒトおよびマウス遺伝子の発現を、標準的なRNA抽出およびハイブリダイゼーション手順の後、アフィメトリクスU133Aおよび430A遺伝子チップ(アフィメトリクス、サンタクララ、カリフォルニア)を用いて試験した。血管内皮成長因子受容体2(VEGFR-2)と同時発現される遺伝子の発現を発見および検証するために、総計118個のヒト結腸癌遺伝子発現プロファイルを用いた。該試料を無作為化し、ついで各々59試料からなる２つのグループに分けた。59個のヒト結腸癌遺伝子発現プロファイルのうち、ピアソン相関測定基準によりVEGFR-2と同時発現される94個の遺伝子を同定し(表１)、次の59個のヒト結腸癌遺伝子発現プロファイルを、最初の発現パターンが再現可能かを確認する独立した検証セットとして使用した(FIG. 1)。該結果より、転写プロファイリングが、２つの患者サブグループを特徴づける、結腸癌におけるVEGFR-2遺伝子発現特性を同定する可能性を有すること示された(FIG. 2)。一方の患者サブグループは94個のVEGFR-2同時発現遺伝子を過発現し(すなわち、高発現mRNAレベルを示し、“＋”サインにより示される)、他方のサブグループは低mRNA発現レベルを示した(“−”サインにより示される)。VEGFR-2と同時発現されると同定された94個の遺伝子の多くは、内皮細胞、血管、およびストローマによって発現されることがこれまでに報告されている。
【００８４】
ヒト癌においてVEGFR-2と同時発現されると同定された94個の遺伝子を、前臨床モデルを用いてさらに試験し、該遺伝子のいずれかが実施例VEGFR-2阻害剤を用いた処置により調節されるかを決定した。
【００８５】
遺伝子発現データのランクについての不等分散２-サンプルt-統計により、試験した94個の同時発現VEGFR-2遺伝子のリストから、未処置腫瘍および実施例VEGFR-2阻害剤処置腫瘍の間のmRNA発現レベルに有意な差違を有する18個の候補マーカーを同定した(表２)。表２に示されるバイオマーカーの上位５個についての遺伝子発現プロファイリングデータからボックスプロットを作成した。該ボックスプロットデータにより、実施例VEGFR-2阻害剤を用いた処置の前後におけるmRNA発現レベルの差違が図で示される(FIG. 3)。実施例VEGFR-2阻害剤により調節されると同定されたマーカーの50％より多くが、mRNA発現レベルを減少または低下した。この情報により、該VEGFR-2同時発現マーカーを過発現する患者は、実施例VEGFR-2阻害剤による治療により、レベルを減少しそうであることが示唆される。この情報は、実施例VEGFR-2阻害剤の療法から最も恩恵を受けそうな患者集団を選定するのに有用である。
【００８６】
変化倍数およびT-検定スコアに基づいて、該18個のリストから７個の候補マーカーを選択し、実施例VEGFR-2阻害剤により処置される前臨床および臨床試料において、タンパク質レベルでさらに検証した。
【００８７】
候補遺伝子のコラーゲンIV型(COL4A1)、補体成分 1,q サブコンポーネント、受容体 1(C1qR1)、およびアンジオテンシン受容体様１(AGTRL1)についての前臨床IHC結果により、実施例VEGFR-2阻害剤での処置の前には、腫瘍の血管の周囲は陽性染色を示した。実施例VEGFR-2阻害剤で処置した後は、該腫瘍試料は陰性を示し、または腫瘍の血管がより多い未処置腫瘍と比較して、染色の程度が低かった(FIG. 4)。これらの結果により、コラーゲンIV型、C1qR1、およびアンジオテンシン受容体様１は主に腫瘍の血管の周囲で発現され、該マーカーは実施例VEGFR-2阻害剤での処置によって該タンパク質レベルで調節されることが示唆される。これらのマーカーが実施例VEGFR-2阻害剤での処置により影響を受ける程度が、腫瘍の血管の喪失または崩壊量を反映しうる。
【００８８】
遺伝子発現プロファイリングにより実施例VEGFR-2阻害剤により調節されると同定された18個のマーカーの内の２つ(コラーゲンIV型およびVE-カドヘリン)用に、市販のELISA キットを２つ入手した。ELISA法を未処置および実施例VEGFR-2阻害剤処置腫瘍保有マウスから採取した血液試料で行った。コントロールとして腫瘍のない健康なマウスからも血液試料を採取した。該結果により、腫瘍保有マウスから採取した血液試料のコラーゲンIV型値およびVE-カドヘリン値は、腫瘍のない健康なマウスと比較して高いことが示された。健康なマウスおよび腫瘍保有マウスの両者は他の点では遺伝子的に同様であるため、このデータから、腫瘍保有マウスから採取した血液中で検出されたコラーゲンIV型およびVE-カドヘリンのレベルの上昇は、おそらく腫瘍を有する生物体では腫瘍の血管数が増加するためであることを示唆される。コラーゲンIV型およびVE-カドヘリン血中濃度が高い腫瘍保有マウスを、実施例VEGFR-2阻害剤で処置した(100mg/kg  1qd X 14日)。実施例VEGFR-2阻害剤で処置した後、血中にて検出したコラーゲンIV型およびVE-カドヘリンタンパク質の量は、腫瘍のない健康なマウスで検出された値まで減少した(FIG. 5)。
【００８９】
従って、該ELISAの結果により、腫瘍のない正常マウスと比較して腫瘍保有マウスのコラーゲンIV型およびVE-カドヘリンの血中濃度は高く、実施例VEGFR-2阻害剤で処置した後は、腫瘍保有マウスで検出された該血中濃度は正常マウスでみられたレベルにまで減少または低下したことが示される。このコラーゲンIV型およびVE-カドヘリンの血中濃度の減少は、腫瘍の血管形成が阻害または中断される程度を反映するものでありうる。
【００９０】
前臨床試験に基づいて、該コラーゲンIV型ELISAキットを潜在的な分子アッセイとして試験し、実施例VEGFR-2阻害剤を受けた癌患者から採取した標本について応答をモニターし、その発現を検証した。実施例VEGFR-2阻害剤で処置した12人の癌患者の生物学的試料を、プロトコールCA182002（単独薬剤の用量漸増試験、各３人の患者、180mg／日、320mg／日、600mg／日および800mg／日）において検討した。各患者についてコラーゲンIV型血中濃度を0日目(療法前)および26日目(処置後)にELISAベースのアッセイにより測定した。180mg／日コホートにおいて、コラーゲンIV型濃度は26日目で平均24％増加し; 320mg／日コホートにおいては、26日目で平均7％のみ増加した。600mg／日コホートにおいて、26日目で平均26％減少した。800mg／日コホートにおいて、26日目で29％（600mg／日コホートと比較してごく僅かに）減少した。こららのデータにより、実施例VEGFR-2阻害剤を増加することで、血液で検出したコラーゲンIV型濃度は用量依存的に減少することが示された(FIG. 6)。この情報は前臨床データを支持し、実施例VEGFR-2阻害剤がVEGFR-2モジュレーターで処置された実際の臨床対象から採取した血液中で検出されたコラーゲンIV型量を減少することができることを示す必須情報を提供する。この結果は、コラーゲンIV型血中濃度が実施例VEGFR-2阻害剤、および他のVEGFR-2モジュレーターのための有用な薬力学(PD)バイオマーカーとなることを示す。
【００９１】
コラーゲンIV型が実施例VEGFR-2阻害剤に対する臨床的応答のためのバイオマーカーとして有用であるかを確認するために、コラーゲンIV型ELISAアッセイを検討した。ファーター膨大部癌腫と診断され、600mg／日で処置された１人の患者(この患者はまた、１２人の試験患者のうちで最も高いコラーゲンIV型濃度を有すると検出された)の結果により、処置前のコラーゲンIV型血中濃度は0日目および26日目の間に有意に減少した(P=0.006; ＞50％)ことが示された(FIG. 7)。このコラーゲンIV型血中濃度減少は、抗-腫瘍活性の臨床的証拠と相関した。この患者は実施例VEGFR-2阻害剤に対して部分応答（全標的病変エリアの合計がベースラインの合計と比較して50％以上減少し、既存の非標的病変に明確な進行はなく、および新たな病変が出現していないと定義される）を有した。
追加のフォローアップデータにより、この患者は実施例VEGFR-2阻害剤療法を延長期間(総計126日)継続したことが示された。同一投与レベル(600mg／日)で処置した別の患者の結果では、0日目および26日目の間のコラーゲンIV型濃度に有意な減少は認められなかった(P=0.632)。この患者は実施例VEGFR-2阻害剤に対する臨床的応答を達成しなかった。追加のフォローアップデータにより、該患者は、より短い期間(総計32日)に実施例VEGFR-2阻害剤を継続したことを示し、さらにこの患者は実施例VEGFR-2阻害剤療法から最も恩恵を受けそうにないことを示した。概して、これらの評価可能な２人の患者の臨床結果は該前臨床データを裏付け、またコラーゲンIV型ELISAアッセイは、VEGFR-2モジュレーター、例えば実施例VEGFR-2阻害剤に対する応答をモニターする方法として臨床的に有用であることを示す。
【００９２】
ELISAベースアッセイにより、または腫瘍における遺伝子発現プロファイリングおよびIHCにより決定されるコラーゲンIV型血中濃度は、VEGFR-2モジュレーターの使用により、腫瘍の血管または癌増殖がどの程度阻害されているかを反映する代用バイオマーカーとして機能する。コラーゲンIV型がVEGFR-2モジュレーター(例えば、実施例VEGFR-2阻害剤)により減少される程度は、癌または他のVEGFR-2関連疾患と診断された患者にとっての有意な臨床的有益性および改善結果と通じうる。
【００９３】
癌の潜在的な予後マーカーとして、コラーゲンIV型(COL4A1)の更なるデータが提供された。該結果はCOL4A1の発現レベルが高い結腸癌患者はまた、COL4A1の発現レベルが低い患者と比較して無病生存率が低いことを示す(FIG. 8)。
【００９４】
従って、これらのデータは前臨床および臨床試験を加味して、高レベルでコラーゲンIV型を発現する患者が、コラーゲンIV型濃度を減少し腫瘍増殖を阻害することができる実施例VEGFR-2阻害剤で処置されることにより、それらの結果を改善することができることを示唆する。VEGFR-2モジュレーター療法から恩恵を受けそうな患者を選択するために、コラーゲンIV型を予後マーカーおよび予測マーカーとして使用することができる。
【００９５】
コラーゲンIV型は細胞の基底膜を構成する主な成分である。該基底膜はコラーゲンIV型の２つのサブユニットから成る。一つのサブユニットはコラーゲンIV型アルファ1(COL4A1)であり、他のサブユニットはコラーゲンIV型アルファ2(COL4A2)である。実施例VEGFR-2モジュレーターが有するコラーゲンIV型への影響を参照する場合、該２つのタンパク質はともに作用して基底膜を構成するため、それはおそらく両方のサブユニットに作用している。
【００９６】
実施例 2−異種移植片および実施例VEGFR-2阻害剤の効果
この実施例において、実施例VEGFR-2阻害剤で処置したマウス異種移植片腫瘍モデルを用いて、表２のバイオマーカーを同定した。これにより実施例VEGFR-2阻害剤に対して高応答性の(L2987)を使用したマウス異種移植片腫瘍モデルにおける実施例VEGFR-2阻害剤の有効性データが得られた(FIG. 9)。
【００９７】
インビボ抗腫瘍試験:
腫瘍を、ドナーマウスから採取した腫瘍フラグメントを用いて皮下(sc)移植としてヌードマウスで増殖させた。腫瘍継代は、およそ2〜4週間毎に起こった。ついで、腫瘍を既定のサイズウィンドウまで増殖させ(通常100〜200mgの間、該範囲外の腫瘍は排除した)、動物を種々の処置群およびコントロール群に均等に分配した。動物を実施例VEGFR-2阻害剤(100mg/kg  1qd X 26)で処置した。処置した動物を処置関連毒性/死亡率について毎日チェックした。各群の動物の、処置の開始前の重量（Wt1）、ついで再び、最後の処置投与後の重量（Wt2）を測定した。体重における差(Wt2-Wt1)は、処置関連毒性の尺度を提供した。腫瘍が１gmの所定の標的サイズに達するか、または壊死になるまで、腫瘍応答は、１週間に２回キャリパーで腫瘍の測定により決定した。腫瘍重量(mg)を、
式: 腫瘍重量＝(長さ×幅2)/2
から推定した。
【００９８】
原発性腫瘍増殖阻害に関して、抗腫瘍活性を測定した。これは２つの方法: (i)種々の時点での処置マウス(T)およびコントロールマウス(C)の相対平均腫瘍重量(MTW)を計算する(効果を％T/Cとして表した); および(ii)腫瘍増殖遅延(T-C値)（既定の標的サイズに達するのに要した時間(日)における、コントロールグループ(C)と比較した処置腫瘍(T)の差違と定義される）を計算することで決定された。データの統計的評価を、腫瘍が標的サイズに達する時間の比較について、ゲーハン(Gehan)の一般化ウィルコキソン（Wilcoxon）検定を用いて行った。統計的有意性を、p＜0.05で示した。抗腫瘍活性を、処置開始後の時間における少なくとも1つの腫瘍体積倍増時間(TVDT)についての連続的MTW ％T/C≦50％と定義した。ここで、TVDT(腫瘍体積倍増時間)＝コントロール腫瘍が標的サイズに達する平均時間(日)−コントロール腫瘍が標的サイズの半分に達する平均時間(日)である。加えて、活性と称されるために、処置グループは統計的に有意な腫瘍増殖遅延(T-C値)(p＜0.05)を伴わなければならなかった。
【００９９】
処置動物を処置関連毒性/死亡率について毎日チェックした。死亡が生じた場合、死亡日を記録した。それらの腫瘍が標的サイズに達する前に死亡した処置マウスは、薬物毒性によって死亡したとみなした。コントロールマウスは、標的サイズより小さい腫瘍を有して死亡することはなかった。薬物毒性が原因の１つ以上の死亡があった処置グループは、過剰に毒性ある処置をしていたとみなし、それらのデータは該化合物の抗腫瘍有効性の評価に含まなかった。
【０１００】
実施例３−バイオマーカーに対する抗体の製造
バイオマーカーに対する抗体は種々の方法により調製することができる。例えば、バイオマーカーポリペプチドを発現している細胞を動物に投与して、該発現されたポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。一つの態様において、当該技術分野で一般に行われている技術を用い、該バイオマーカータンパク質を調製および単離し、あるいは精製して天然の混入物を実質的に含まないようにする。ついで、発現され単離されたポリペプチドに対してより高い比活性を有するポリクローナル抗血清を製造するため、そのような調製物を動物に導入する。
【０１０１】
一つの態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合フラグメント）である。該バイオマーカーポリペプチドを発現する細胞はいずれかの適当な組織培養培地で培養することができるが、10％ウシ胎仔血清(約56℃で不活性化したもの)を含むように補充し、約10g/lの非必須アミノ酸、約1,00U/mlのペニシリン、および約100μg/mlストレプトマイシン含むように補充したEarle改良Eagle培地で細胞を培養することが好ましい
【０１０２】
免疫した（およびブースター投与した）マウスの脾細胞を抽出し、適当なミエローマ細胞株と融合することができる。いずれの適当なミエローマ細胞株を本発明に従って用いることができるが、ATCCから入手可能な親ミエローマ細胞株（SP2/0）を用いるのが好ましい。融合後、Wandsら（1981, Gastroenterology, 80:225-232）記載のように、得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地で選択的に維持し、ついで限界希釈によりクローニングする。ついで、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、該ポリペプチド免疫原またはその部分に結合することのできる抗体を分泌するそれらの細胞クローンを同定する。
【０１０３】
別法として、抗イディオタイプ抗体を用いる２工程法においてバイオマーカーポリペプチドに結合することのできるさらなる抗体を製造することができる。そのような方法は、抗体自身が抗原であること、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることができるとの事実を用いるものである。この方法によれば、タンパク質特異的抗体を用いて動物、好ましくはマウスを免疫することができる。ついで、そのような免疫した動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を製造し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングしてタンパク質特異的抗体に結合する能力が該ポリペプチドによって阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体はタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の生成を誘発するのに用いることができる。
【０１０４】
実施例４：免疫蛍光アッセイ：
以下の免疫蛍光プロトコールを、例えば、細胞上のVEGFR-2バイオマーカータンパク質発現を確認するため、あるいは、例えば、細胞の表面に発現したVEGFR-2バイオマーカーに結合する一つ以上の抗体の存在を確認するために、用いることができる。簡単に説明すると、Lab-Tek II チャンバースライドを、カルシウムおよびマグネシウム(DPBS++)を含むDPBS中の10μg/mlのウシコラーゲンII型で、4℃にて一晩コーティングする。ついで、該スライドを冷DPBS++で２回洗浄し、全容量125μlの8000 CHO-CCR5または CHO pC4トランスフェクト細胞を播種し、95％酸素/5％二酸化炭素の存在下、37℃でインキュベートする。
【０１０５】
該培地を吸引により穏やかに除去し、付着した細胞をDPBS++で周囲温度にて２回洗浄する。該スライドを0.2％BSA（ブロッキング剤）を含有するDPBS++で0〜4℃にて1時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を吸引により穏やかに除去し、125μlの抗体含有溶液（抗体含有溶液は、例えば、ハイブリドーマ培養上澄み（通常、希釈せずに用いる）、または血清／血漿（通常、希釈する、例えば約1/100の希釈）でありうる）を加える。該スライドを0〜4℃にて1時間インキュベートする。ついで、抗体溶液を吸引により穏やかに除去し、該細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で５回洗浄する。つぎに、ブロッキング溶液中のローダミン標識二次抗体（例えば、抗ヒトIgG）（125μl、1μg/ml）を該細胞に加える。再び、細胞を0〜4℃にて1時間インキュベートする。
【０１０６】
ついで、該二次抗体溶液を吸引により穏やかに除去し、該細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で３回、ついで冷DPBS++で５回、洗浄する。ついで、該細胞をDPBS++中の3.7％ホルムアルデヒド（125μl）で周囲温度にて15分間固定化する。その後、該細胞を400μlのDPBS++で周囲温度にて５回洗浄する。最後に、該細胞を50％水性グリセリンに入れ、ローダミンフィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】FIG. 1は、ヒト腫瘍遺伝子発現プロファイルにおけるVEGFR-2と同時発現された遺伝子の発見および検証のために用いた方法を示す。
【０１０８】
【図２】FIG. 2は、、ヒト結腸癌における94個の同時発現VEGFR-2遺伝子の階層的クラスター分析（hierarchal clustering）および２つの異なる患者サブグループの同定を示す。
【０１０９】
【図３】FIG. 3は遺伝子発現プロファイリングデータ(mRNAレベル)を示す。
【０１１０】
【図４】FIG. 4は、IHCによる遺伝子発現データの検証を示す。
【０１１１】
【図５】FIG. 5は、ELISAによる遺伝子発現データ検証を示す。
【０１１２】
【図６】FIG. 6は、コラーゲンIV型ELISA結果(コホートにつき3患者の0日目および26日目間の差違を測定した)を示す。
【０１１３】
【図７】FIG. 7は、個々の患者のコラーゲンIV型血中濃度のELISA結果を示す。
【０１１４】
【図８】FIG. 8は原発性結腸直腸腫瘍のコラーゲンIV型(COL4A1)mRNA発現レベルに基づく無病生存率比較結果を示す。
【０１１５】
【図９】FIG. 9はL2987腫瘍異種移植片モデルにおける実施例VEGFR-2阻害剤の有効性を示す。
【図１】
2009507226.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009507226.tif 000035
【図９】
2009507226.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月30日(2008.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009507226000001.app
【国際調査報告】
2009507226.tif 000037