(57)【要約】  重合度に基づいて、個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し単離する方法が開示されている。モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、極性結合したクロマトグラフ固定相が充填された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラム中に導入する。２成分移動相溶出により、個々のモノマーおよび／またはオリゴマーを分離する。そのモノマーおよび／またはオリゴマーは、プロアントシアニジン、加水分解性タンニン、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコール、またはポリビニルアルコールであってよい。この２成分移動相は、極性非プロトン性溶媒から実質的になるＡ相および極性プロトン性溶媒から実質的になるＢ相を含む。  キサンチン、例えば、カフェインおよびテオブロミンを分離し単離する方法も開示されている。キサンチンおよびモノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、極性結合したクロマトグラフ固定相が充填されたＬＣカラム中に導入する。キサンチンは定組成移動相溶出により分離され、個々の分画が溶出される。  キサンチン並びに極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し単離する方法も開示されている。この方法において、上述した相が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロアントシアニジン、加水分解性タンニン、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し溶出する高速液体クロマトグラフィー方法であって、
ａ．  前記モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、およびニトロ相からなる群より選択される極性結合した固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、
ｂ．  極性非プロトン性溶媒から実質的になるＡ相および極性プロトン性溶媒から実質的になるＢ相を含む２成分移動相を前記カラムに通過させて、重合度に基づいて、前記個々のモノマーおよび／またはオリゴマーを分離し、
ｃ．  前記モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する１つ以上の個々の分画を溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記プロアントシアニジンが、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン、プロトリセチニジン、プロペラルゴニジン、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロギボルチニジン、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシニジンおよびプロメラカシニジンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記極性非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチルおよびニトロメタンからなる群より選択され、前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびイソブタノールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する前記液体試料が脱脂カカオ抽出物であり、前記モノマーがエピカテキンおよび／またはカテキンであり、前記オリゴマーがそのプロシアニジンオリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記固定相がジオール相またはグリセロール相であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記Ａ相および前記Ｂ相が水性相であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記Ａ相中の前記極性非プロトン性溶媒の比率が１００体積％までであり、前記Ｂ相中の前記極性プロトン性溶媒の比率が１００体積％までであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記Ａ相中の前記極性非プロトン性溶媒の比率が５０体積％より多く、前記Ｂ相中の前記極性プロトン性溶媒の比率が５０体積％より多いことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記Ａ相中の前記極性非プロトン性溶媒の比率が９０体積％より多く、前記Ｂ相中の前記極性プロトン性溶媒の比率が９０体積％より多いことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａ相中の前記極性非プロトン性溶媒が約９８体積％のアセトニトリルを含み、前記Ｂ相中の前記極性プロトン性溶媒が約９５体積％のメタノールを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記固定相が約３μｍから約１０μｍの粒径を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーからキサンチンを分離し単離する高速液体クロマトグラフィー方法であって、
ａ．  前記キサンチンおよび前記極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、およびニトロ相からなる群より選択される極性結合した固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、
ｂ．  極性非プロトン性溶媒から実質的になる定組成移動相を前記カラムに通過させて、前記モノマーおよび／またはオリゴマーから前記キサンチンを分離し、
ｃ．  前記キサンチンを含有する１つ以上の個々の分画を溶出する、
各工程を有してなる方法。
【請求項１３】
前記キサンチンがカフェインおよびテオブロミンであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記液体試料が脱脂カカオ抽出物であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記固定相がジオール相またはグリセロール相であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記定組成移動相が水性相であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記極性非プロトン性溶媒がアセトニトリルであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記定組成移動相中の前記極性非プロトン性溶媒の比率が少なくとも９０体積％であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記定組成移動相中の前記極性非プロトン性溶媒が約９９体積％のアセトニトリルから実質的になることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
キサンチンおよび個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し溶出する高速液体クロマトグラフィー方法であって、
ａ．  前記キサンチンおよび前記極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、およびニトロ相からなる群より選択される極性結合した固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、
ｂ．  極性非プロトン性溶媒から実質的になる定組成移動相を前記カラムに通過させて、前記モノマーおよび／またはオリゴマーから前記キサンチンを分離し、
ｃ．  前記キサンチンを含有する１つ以上の個々の分画を溶出し、
ｄ．  極性非プロトン性溶媒から実質的になるＡ相および極性プロトン性溶媒から実質的になるＢ相を含む２成分移動相を前記カラムに通過させて、重合度に基づいて、前記個々のモノマーおよび／またはオリゴマーを分離し、
ｅ．  前記モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する１つ以上の個々の分画を溶出する、
各工程を有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本ＰＣＴ出願は、現在係属中の、２００５年１０月３日に出願された米国特許出願第１１／２４２，２１０号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ジオール相液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いた、制限なく、フラバン−３−オールを含む個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを、重合度にしたがって、分離し、好ましくは回収する改良方法に関する。
【０００３】
個々のフラバン−３−オールが、異なる性質を示し、ヒトと動物に使用するための異なる用途を有することが知られている。重合度に基づく個々のフラバン−３−オールの改良された分離および回収により、より標的が定められたより有効なその使用が可能になる。
【背景技術】
【０００４】
フラバン−３−オールのオリゴマーおよびポリマーであるプロアントシアニジンは、リグニンに次いで、第２の最も豊富な天然植物フェノールである。フラバン−３−オールモノマーは、主にあるモノマーの４位から別のモノマーの８位への炭素−炭素結合（Ｃ４→Ｃ８）により連結し、より少ない程度でＣ４→Ｃ６結合により連結している。
【０００５】
プロアントシアニジンは、Ｂ型とＡ型のプロアントシアニジンを含む。Ｂ型プロアントシアニジンにおいて、モノマーは、インターフラバンＣ４→Ｃ６および／またはインターフラバンＣ４→Ｃ８結合により連結されている。全くＣ４→Ｃ８結合だけのオリゴマーは線状であり、一方で、Ｃ４→Ｃ６結合が少なくとも１つ存在すると、分岐オリゴマーとなる。対照的に、Ａ型プロアントシアニジンは、Ｃ２−Ｏ−Ｃ７並びにＣ４→Ｃ６またはＣ４→Ｃ８での結合を含む２つ連結したオリゴマーである。
【０００６】
プロアントシアニジンの分子量は一般に、重合度（ＤＰ）として表される。個々のオリゴマーは通常、二量体、三量体などと称される。
【０００７】
プロシアニジンは、プロアントシアニジンの最大の部類を表す。Gu等は、プロアントシアニジンを含有することが分かっている４１の食品の内、２７の食品がプロシアニジンを含有することを示した（非特許文献１）。プロシアニジンは、（−）−エピカテキン、（＋）−エピカテキン、（＋）−カテキンおよび／または（−）−カテキン単量体単位、並びに（−）−カテキンガレート、（＋）−カテキンガレート、（−）−エピカテキンガレートおよび／または（＋）−エピカテキンガレートなどの没食子酸モノマーを含むであろう。
【０００８】
植物性食品の色安定性、渋み、および苦味において、プロアントシアニジンが重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献２を参照のこと）。しかしながら、プロアントシアニジンの評判も、これらのフェノール化合物の潜在的な健康上の利益のために増してきた（非特許文献３から５を参照のこと）。
【０００９】
また、個々のプロシアニジンオリゴマーが、特殊な特徴およびヒトと動物への使用のための潜在的な利益を示すことも知られている。例えば、Tempestaは、２〜１１の重合度（ＤＰ）を持つプロシアニジンオリゴマーは、著しい抗ウイルス活性を有し、呼吸器多核体ウイルスなどのパラミクソウイルス科、インフルエンザＡ，ＢおよびＣなどのオルソミクソウイルス科、および単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルスに感染した、ヒトを含む温血動物の治療に有用であることを開示している（特許文献１）。Romanczyk Jr.等は、適切なキャリヤと共に３〜１１のＤＰを有するプロシアニジンオリゴマーを含む抗腫瘍性組成物を開示している（特許文献２）。Romanczyk Jr.等は、５〜１２のＤＰを有するプロシアニジンオリゴマーが酸化防止剤として有用であることも開示している（特許文献３）。Schmitz等は、抗血小板療法として、アセチルサリチル酸と共に２〜１８のＤＰを有するカカオプロシアニジンオリゴマーの使用を開示している（特許文献４）。
【００１０】
プロアントシアニジン分析の歴史は、それらの構造的複雑さおよび性質の多様性を考えると、豊富である（非特許文献６）。Leaは、プロシアニジン分析のための順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）の使用を記載し（非特許文献７）、定組成(isocratic)条件下で。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムを使用すると、大きいオリゴマーが小さいオリゴマーよりも長く保持される溶出順序となることも観察した（非特許文献８）。Wilson等は、アップルジュースのプロシアニジンに基づく部分分離を行うためのシアノカラム上でテトラヒドロフラン−酢酸／蟻酸−イソプロパノールに関する定組成移動相の使用を開示した（非特許文献９）。
【００１１】
プロシアニジンオリゴマーの分離および分解能における著しい改善が、シリカ固定相で達成された。非特許文献１０から１２を参照のこと。五量体（ＤＰ＝５）までのプロシアニジンオリゴマーの分解能が得られた。Hammerstone等は、未発酵の脱脂カカオ豆の分析において単量体から十量体までの分解能における改善をもたらすこのプロセスの改良を開示した。非特許文献１３を参照のこと。Gu等は、十量体（ＤＰ＝１０）の溶出、並びに全体のピーク形状と分解能における向上をもたらすさらに別の改善も開示した。非特許文献１４を参照のこと。
【００１２】
これらのＨＰＬＣプロセスでは、プロシアニジンオリゴマーの五量体への分離を行うための塩化メチレン−メタノール−酢酸／蟻酸−水からなる定組成移動相を、シリカカラム上でヘキサン−メタノール−酢酸エチルまたはヘキサン−アセトンを用いたアップル・プロシアニジンの分離のための代わりのプロセスと共に使用している（非特許文献１５）。
【００１３】
しかしながら、Gu等のものを含む現行のＨＰＬＣプロセスにはいくつかの欠点がある。第１に、塩化メチレン（ジクロロメタンとも称される）などの塩素化溶媒の使用には、安全性の懸念がある。このことは、大規模システムから単離された分画が、さらに別の生物学的研究の対象にされるときに、特に問題である。塩化メチレンへの曝露は、皮膚、目、中枢神経系（ＣＮＳ）、および循環系に影響を与え、短期の曝露でも、疲労、衰弱、眠気、軽い頭のふらつき、手足のしびれ、皮膚のひりひり感、吐き気、および皮膚や目の炎症を引き起こすことがある。塩化メチレンへの慢性的な曝露は、実験動物において、肺、肝臓、および膵臓の癌に関連している。塩化メチレンは、女性が妊娠中にそれに曝露されると、先天性欠損症を生じるかもしれない突然変異誘発物質でもある。
【００１４】
別の一般的なＨＰＬＣ溶媒であるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が、ヒト検体の目、並びに粘膜および胃腸管に刺激を与えることが知られている。ＴＨＦへの曝露過多により、咳き込み、息切れ、目眩、中枢神経系（ＣＮＳ）の抑制、中毒および虚脱が引き起こされるかもしれない。
【００１５】
プロシアニジンオリゴマーを分離するための現行のＨＰＬＣプロセスに関する他の問題として、固定相としてシリカを使用した場合、プロシアニジンの順相（ＮＰ）分離に関連する履歴問題、すなわち、カラム毎の変化性がある。しばしば、オリゴマーは、シリカ表面上に吸着されると考えられるので、ピーク強度が減少しているか、または全く検出されない。プロシアニジンのＮＰ分離におけるピーク形状に要求されるように、移動相に水を使用すると、カラム毎の再現性がさらに低下してしまう。また、実際的な観点から、プロシアニジンオリゴマーを含む、個々のフラバン−３−オールを分離するためのほとんどの現行のＨＰＬＣプロセスは、３成分または４成分移動相の使用を含み、それゆえ、最新式のＨＰＬＣクォータナリポンプを持たない分析研究所の能力を超えている。
【特許文献１】米国特許第５２１１９４４号明細書
【特許文献２】米国特許第５５５４６４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５８９１９０５号明細書
【特許文献４】米国特許第６５２４６３０号明細書
【非特許文献１】J. Agric. and Food Chem. (2003) 51:7513
【非特許文献２】Haslam, "Practical Polyphenols: From Molecular Recognition and Physiological Action" (Cambridge U. Press, 1998)
【非特許文献３】Bagchi et al., Toxicology (2000) 148:187
【非特許文献４】Foo et al., J. Natural Products (2000) 63: 1225
【非特許文献５】Steinberg et al., Am. J. Clin. Nutri. (2003) 77:1466
【非特許文献６】Santos-Buelga et al., "Processes in Polyphenol Analysis," Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003, p. 267
【非特許文献７】Lea et al., J. Sci. Food and Agriculture (1979) 30:833
【非特許文献８】Am. J. Enology and Viticulture (1979) 30:289
【非特許文献９】Sci. Food. Agric. (1981) 32:257
【非特許文献１０】Rigaud et al., Chromatogr. (1993) 654:179
【非特許文献１１】Cheynier et al., Processes in Enzymology (1999) 299
【非特許文献１２】Natsume et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:2581
【非特許文献１３】J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:490. Gu et al
【非特許文献１４】See J. Agric. and Food Chem. (2002) 50:4852
【非特許文献１５】Yanagida et al., J. Chromatogr. A (2000) 890:251
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
必要とされているのは、個々の極性プロトン性オリゴマーの改良された分離および回収を提供し、一般的なＨＰＬＣバイナリポンプしか備えていない分析研究所における使用に適しており、分取スケールの特定のオリゴマーの回収に適している、ＤＰに基づく個々の極性プロトン性オリゴマーを同定するための改良方法、並びに危険溶媒や環境に有害な溶媒を使用しない、ＤＰに基づく個々の極性プロトン性オリゴマーを分離し回収する方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し溶出する改良方法を提供する。この方法は、(i)モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、極性結合した固定相が充填された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラム中に導入し、(ii)極性非プロトン性溶媒から実質的になるＡ相および極性プロトン性溶媒から実質的になるＢ相を含む２成分移動相をカラムに通過させることによって、重合度に基づいて、個々のモノマーおよび／またはオリゴマーを分離し、(iii)モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する１つ以上の個々の分画を溶出する各工程を有してなる。ある好ましい実施の形態において、１種類以上の溶出した個々のモノマーおよび／またはオリゴマーは、乾燥手段または他の従来の手段により、食品、薬用食品、栄養補給製品、または薬剤製品に使用するために回収されるであろう。溶出した個々のモノマーおよび／またはオリゴマーは、他の分離において基準として使用するために回収してもよい。
【００１８】
極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーは、プロアントシアニジン、加水分解性タンニン、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコールまたはポリビニルアルコールであってよい。極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーがプロアントシアニジンである場合、それらは、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン、プロトリセチニジン(protricetinidin)、プロペラルゴニジン、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロギボルチニジン(proguibourtinidin)、プロフィセチニジン(profisetinidin)、プロロビネチニジン(prorobinetinidin)、プロテラカシニジン(proteracacinidin)および／またはプロメラカシニジン(promelacacinidin)であってよい。モノマーがエピカテキンおよび／またはカテキンであり、オリゴマーがそのプロシアニジンオリゴマーであることが好ましい。モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する試料が、極性の脱脂カカオ抽出物であることも好ましい。
【００１９】
ＬＣカラム中に導入される液体試料中に存在する抽出物の量は、１０ミリグラムより多いことが好ましい。抽出物の量は１００ミリグラムより多いことがより好ましい。抽出物の量は１グラムより多いことがさらにより好ましい。
【００２０】
極性結合した固定相は、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、またはニトロ相であってよい。固定相がジオール相またはグリセロール相であることが好ましい。
【００２１】
水性であることが好ましい、２成分移動相において、極性非プロトン性溶媒は、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチルおよびニトロメタンのいずれであってもよく、極性プロトン性溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびイソブタノールのいずれであってもよい。
【００２２】
Ａ相中の極性非プロトン性溶媒の比率は１００体積パーセントまでであってよく、Ｂ相中の極性プロトン性溶媒の比率は１００体積パーセントまでであってよい。Ａ相およびＢ相の残りは、任意の鉱酸または有機酸および／または水であってよい。Ａ相中の極性非プロトン性溶媒およびＢ相中の極性プロトン性溶媒の比率は、５０体積パーセントより多いことが好ましい。極性非プロトン性溶媒（Ａ相）および極性プロトン性溶媒（Ｂ相）の比率は、９０体積パーセントより多いことがさらにより好ましい。好ましい実施の形態において、Ａ相中の極性非プロトン性溶媒は約９８体積％のアセトニトリルであり、Ｂ相中の極性プロトン性溶媒は約９５体積％のメタノールである。
【００２３】
極性結合した固定相は、約３μｍから約１０μｍの粒径を有することが好ましい。ＬＣカラムは少なくとも１０ミリメートルの直径を有することが好ましい。
【００２４】
本発明は、重合度に基づいて、個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し溶出するシステムも提供する。このシステムは、極性結合したクロマトグラフ固定相が充填されたＬＣカラム、並びにモノマーおよび／またはオリゴマーを含有する１種類以上の個々の分画を溶出するための、極性非プロトン性溶媒から実質的になるＡ相および極性プロトン性溶媒から実質的になるＢ相を含む２成分移動相を含む。
【００２５】
極性結合した固定相は、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、およびニトロ相のいずれであってもよい。極性結合したクロマトグラフ固定相がジオール相またはグリセロール相であることが好ましい。極性結合したクロマトグラフ固定相が、約３μｍから約１０μｍの粒径を有することも好ましい。前記カラムが少なくとも１０ミリメートルの直径を有することが好ましい。
【００２６】
２成分相において、Ａ相中の極性非プロトン性溶媒は、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチルおよびニトロメタンのいずれであってもよい。Ｂ相中の極性プロトン性溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびイソブタノールのいずれであってもよい。
【００２７】
前記システムのための適切な極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーとしては、プロアントシアニジン、加水分解性タンニン、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコールおよびポリビニルアルコールが挙げられる。極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーがプロアントシアニジンである場合、それらは、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン、プロトリセチニジン、プロペラルゴニジン、プロデルフィニジン、プロギボルチニジン、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシニジンおよび／またはプロメラカシニジンであってよい。好ましい実施の形態において、モノマーがエピカテキンおよび／またはカテキンであり、オリゴマーがそのプロシアニジンオリゴマーである。
【００２８】
Ａ相中の極性非プロトン性溶媒の比率は１００体積パーセントまでであってよく、Ｂ相中の極性プロトン性溶媒の比率は１００体積パーセントまでであってよい。Ａ相およびＢ相の残りは、任意の鉱酸または有機酸および／または水であってよい。Ａ相中の極性非プロトン性溶媒およびＢ相中の極性プロトン性溶媒の比率は、５０体積パーセントより多いことが好ましい。極性非プロトン性溶媒（Ａ相）および極性プロトン性溶媒（Ｂ相）の比率は、９０体積パーセントより多いことがさらにより好ましい。好ましい実施の形態において、Ａ相中の極性非プロトン性溶媒は約９８体積％のアセトニトリルであり、Ｂ相中の極性プロトン性溶媒は約９５体積％のメタノールである。
【００２９】
本発明は、極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーからキサンチンを分離し単離する方法も提供する。この方法は、(i)キサンチンおよび極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、極性結合したクロマトグラフ固定相が充填された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラム中に導入し、(ii)極性非プロトン性溶媒から実質的になる定組成移動相をカラムに通過させることにより、キサンチンをモノマーおよび／またはオリゴマーから分離し、(iii)キサンチンを含有する１種類以上の個々の分画を溶出する各工程を有してなる。キサンチンがカフェインおよび／またはテオブロミンであることが好ましい。ある好ましい実施の形態において、液体試料は、極性の脱脂カカオ抽出物である。特定の好ましい実施の形態において、溶出された個々のキサンチンは、乾燥手段または他の従来の手段により、食品、薬用食品、栄養補給製品、または薬剤製品に使用するために回収されるであろう。溶出した個々のキサンチンは、他の分離において基準として使用するために回収されてもよい。
【００３０】
極性結合した固定相は、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、またはニトロ相であってよい。固定相がジオール相またはグリセロール相であることが好ましい。
【００３１】
水性であることが好ましい、定組成移動相において、極性非プロトン性溶媒はアセトニトリルであることが好ましい。
【００３２】
定組成移動相中の極性非プロトン性溶媒の比率は少なくとも９０体積パーセントである。移動相の残りは、任意の鉱酸または有機酸および／または水であってよい。好ましい実施の形態において、定組成移動相中の極性非プロトン性溶媒は約９９体積％のアセトニトリルである。
【００３３】
本発明は、極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーからキサンチンを分離し単離するためのシステムも提供する。このシステムは、極性結合したクロマトグラフ固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびキサンチンを含有する１種類以上の個々の分画を溶出するための、極性非プロトン性溶媒から実質的になる定組成移動相を含む。
【００３４】
極性結合した固定相は、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、およびニトロ相のいずれであってもよい。固定相がジオール相またはグリセロール相であることが好ましい。固定相が、約３μｍから約１０μｍの粒径を有することも好ましい。前記カラムが少なくとも１０ミリメートルの直径を有することが好ましい。
【００３５】
定組成移動相において、極性非プロトン性溶媒がアセトニトリルであることが好ましい。定組成移動相中の極性非プロトン性溶媒の比率は９０体積％より多いことが好ましい。残りは、任意の鉱酸または有機酸および／または水であってよい。好ましい実施の形態において、定組成移動相中の極性非プロトン性溶媒は約９９体積％のアセトニトリルである。
【００３６】
本発明は、キサンチンおよび個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し溶出する方法も提供する。この方法は、(i)キサンチンおよび極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する液体試料を、極性結合したクロマトグラフ固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、(ii)極性非プロトン性溶媒から実質的になる定組成移動相をカラムに通過させることによって、モノマーおよび／またはオリゴマーからキサンチンを分離し、キサンチンを含有する１種類以上の個々の分画を溶出させ、(iii)その後、極性非プロトン性溶媒から実質的になるＡ相および極性プロトン性溶媒から実質的になるＢ相を含む２成分移動相をカラムに通過させることによって、重合度に基づいて、個々のモノマーおよび／またはオリゴマーを分離し、(iv)モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する、１種類以上の個々の分画を溶出させる各工程を有してなる。ある好ましい実施の形態において、溶出したキサンチンおよび／または１種類以上の溶出した個々のモノマーおよび／またはオリゴマーは、乾燥手段または他の従来の手段により、食品、薬用食品、栄養補給製品、または薬剤製品に使用するために回収されるであろう。溶出した個々のキサンチンおよび／または溶出した個々のモノマーおよび／またはオリゴマーは、他の分離において基準として使用するために回収されてもよい。
【００３７】
キサンチンはカフェインおよび／またはテオブロミンであることが好ましい。モノマーおよび／またはオリゴマーは、プロアントシアニジン、加水分解性タンニン、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコールおよびポリビニルアルコールであってよい。極性結合した固定相は、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、またはニトロ相であってよい。
【００３８】
これらの他の目的および実施の形態は、以下の詳細な説明に開示されているか、またはそれから明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、個々の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する１種類以上の個々の分画を溶出するために、２成分移動相を持つジオール系ＬＣシステムを用いた、重合度に基づいて極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離し単離する改良方法、並びにそのためのシステムを開示する。
【００４０】
図１は、単量体フラバン−３−オール並びに炭素−炭素Ｃ４→Ｃ８およびＣ４→Ｃ６結合により連結したプロシアニジンオリゴマーの化学構造を示している。
【００４１】
本発明の改良された方法およびシステムでは、９８：２（ｖ／ｖ）の混合比のアセトニトリルおよび酢酸（ＣＨ3ＣＮ：ＨＯＡｃ）のＡ相および９５：３：２（ｖ／ｖ／ｖ）の混合比のメタノール、水および酢酸（ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＯＡｃ）のＢ相を含む２成分移動相およびジオール系固定相ＬＣカラムを使用する。それらは、個々のオリゴマー、特に高次オリゴマーを良好に分離するという課題を克服している。図４は、ジオール固定相（上側）およびシリカ固定相（下側）を用いて得られたクロマトグラムを比較している。図示されるように、ジオール固定相は、個々のオリゴマーをより顕著に分離した、特に、７以上のＤＰを持つオリゴマーをより顕著に分離した。改良方法はまた、幅広い範囲の溶媒（水を含む）に使用でき、ＬＣバイナリポンプのみしか備えていない研究所においても使用できるので、現行の方法よりも有用であるのが認識されよう。別の利点は、特に質量分析法と組み合わせて（ＬＣ−ＭＳ）、一回のＬＣの運転で、プロシアニジン意外に、他の化合物（すなわち、他のフラボノイド、カフェイン、およびテオブロミン）を分析する能力である。この改良方法を変更した、カフェインおよびテオブロミンを分離する方法も開示される。
【００４２】
前記方法およびシステムを以下により詳しく説明する。特別に開示した方法およびシステムはカカオプロシアニジンを含むが、開示された方法およびシステムは、制限を意図するものではなく、他のプロアントシアニジン（例えば、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン、プロトリセチニジン、プロペラルゴニジン、プロデルフィニジン、プロギボルチニジン、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシニジンおよびプロメラカシニジン）、加水分解性タンニン、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコールおよびポリビニルアルコールを含む任意の極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを分離するのに適しているのが当業者には理解されよう。極性プロトン性モノマーおよび／またはオリゴマーを含有する他の物質としては、ピーナツの外皮、シナモン、ブルーベリー、アップル、サトウモロコシ、サンザシ、クランベリー、およびグレープが挙げられる。さらに、開示された方法およびシステムは、マルト糖、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖、およびピリジルアミノ化糖鎖などの糖ポリマーを分離するのに適している。
【００４３】
全ての溶媒（塩化メチレン、アセトニトリル、メタノール、酢酸）は、クロマトグラフグレードのものであり、フィッシャー・サイエンティフィック社(Fisher Scientific)（ニュージャージー州、フェアローン所在）から購入した。エタノールは、シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)（ウィスコンシン州、ミルウォーキー所在）から購入したＵＳＰ食品グレードのものであった。水は、ミリポア社(Millipore)（マサチューセッツ州、ベッドフォード所在）からのＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｗａｔｅｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてイオンを除去した。
【００４４】
試料の調製：ＣＰ抽出物  カカオポリフェノール（ＣＰ）抽出物を、カカオプロシアニジンの分解を最小にすることを目的として、多段階プロセスにより調節した。カカオ豆を収穫し、洗浄して果肉を取り除き、乾燥させた。周囲条件下で、乾燥豆を圧搾機で圧搾して、カカオバターを除去した。次いで、圧搾機のケーキを粉にひき、エタノール：水（７０：３０ｖ／ｖ）で抽出した。固形物を遠心分離で除去した。減圧下で抽出物の液体を蒸発させて、エタノールを除去し、最後に噴霧乾燥させた。
【００４５】
試料の調製：カカオ種子からのＣＰ抽出物  新鮮な未発酵のカカオ種子（３０ｇ）を凍結乾燥した（１６．９ｇ）。凍結乾燥種子（１０．２ｇ）をヘキサンで脱脂し、脱脂豆のサブ試料（６．３ｇ）を粉に挽き、音波分解しながら（１０分間、５０℃）、４０ｍｌのアセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）で３回抽出した。減圧下で回転蒸発により、混合抽出物からアセトンを除去した。残りの液体を凍結乾燥して、赤紫の残留物（１．１３ｇ）を得た。
【００４６】
ＣＰ抽出物および精製オリゴマーの順相高速液体クロマトグラフィー質量分析法（ＮＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）による分析  以下に記載する分取システムから得たプロシアニジンオリゴマー分画およびカカオ抽出物中のプロシアニジンオリゴマーの分離および特徴付けを、ＮＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳにより行った。分離は、オートサンプラー、ＨＰＬＣクォータナリポンプ、カラムヒータ、ダイオードアレイ検出器、および蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムで行った。ＨＰＬＣは、ＡＰＩ−ＥＳイオン化チャンバを備えたＨＰシリーズ１１００質量選択検出器（モデルＧ１９４６Ａ）にインターフェースで接続されていた。使用したカラムは、フェノメネクス社(Phenomenex)（カリフォルニア州、トランス所在）から購入したＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（２５０×４．６ｍｍ内径、５μの粒径）であった。２成分移動相は、（Ａ）アセトニトリル：酢酸（９８：２、ｖ／ｖ）および（Ｂ）メタノール：水：酢酸（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）からなった。分離は、以下のように０．８ｍｌ／分の流量で３０℃での直線勾配（移動相の）により行った：０〜３５分、０〜４０％のＢ；３５〜４０分、４０％のＢの定組成；４０〜４５分、４０〜０％のＢ；それに続き５分間の再平衡時間。溶出液を蛍光検出器（ＦＬＤ）（励起波長＝２７６ｎｍ、発光波長＝３１６ｎｍ）によりモニタした。抽出物および精製分画を、その開示をここに引用するHammerstone et al., J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:490から適用したＭＳプロセスおよびパラメータにより特徴付けた。イオン化試薬を、質量分析器の直前にあるＬＣの溶出液流のＴ字管を介して加え、ＬＣポンプに供給した。陽イオンモードにおける分析条件としては、イオン化を支援するための０．０５ｍｌ／分の流量での０．０５ＭのＮａＣｌの導入、３．５ｋＶの毛管(capillary)電圧、１００Ｖのフラグメンタ(fragmentor)電圧、ゲージ圧で２５ｐｓｉ（約１７２ｋＰａ）の噴霧圧力、および３５０℃の乾燥ガス温度が挙げられた。陰イオンモードにおける分析条件としては、２９分間に亘り０．０９ｍｌ／分、次いで、０．０５ｍｌ／分の流量での緩衝剤としての１．５ＭのＮＨ4ＯＨが挙げられた。毛管電圧は３ｋＶであり、フラグメンタ電圧は７５Ｖであり、噴霧圧力はゲージ圧で２５ｐｓｉ（約１７２ｋＰａ）であり、乾燥ガス温度は３５０℃であった。
【００４７】
ＭＳ分析から、水酸化アンモニウムの使用は除外した。試料は、アセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）または移動相中に溶解させ、注入前に０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルタに通して濾過した。
【００４８】
Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ固定相およびＤｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ固定相の両方に行ったＣＰ抽出物の比較ＮＰ−ＨＰＬＣ  ＣＰ分画の分離を、Adamson et al., J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:4184により記載されたクロマトグラフィー条件下で、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  ＳｉｌｉｃａおよびＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌの両方に行った。クロマトグラフィーシステムは、温度制御オートサンプラー、クォータナリポンプ、カラムヒータ、および蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムであった。使用したカラムは、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ（２５０×４．６ｍｍ、５μ、１００Åの細孔径）およびＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌであった。クロマトグラフィー移動相は、塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）、メタノール（ＣＨ3ＯＨ）、および酢酸：水（１：１）（ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ）からなった。出発移動相条件は、８２％のＣＨ2Ｃｌ2、１４％のＣＨ3ＯＨおよび４％の（ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ）であった。続いて、ＣＨ3ＯＨを、３０分後に２８．４％に、５０分後に４２．８％に、５１分後に８６．０％に増加させた。クロマトグラフィーの運転中ずっと、ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏの比は一定の４％に維持した。蛍光検出は、２７６ｎｍの励起波長および３１６ｎｍの発光波長により行った。全ての試料は、アセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５）中の溶解により調製し、次いで、その後のＨＰＬＣ注入のために０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルタに通して濾過した。
【００４９】
ＣＰ抽出物の分取ＮＰ−ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ分取ポンプをＨＰ  １０５０ＵＶ検出器およびＫｉｐｐ  ａｎｄ  Ｚｏｎｅｎレコーダに接続した。プロシアニジンの分取分離は、フェノメネクス社（カリフォルニア州、トランス所在）から購入したＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（３００×５０ｍｍ内径、１００μｍの粒径）カラムを使用して行った。移動相は、溶媒Ａ（ＣＨ3ＣＮ：ＨＯＡｃ、９９：１  ｖ／ｖ）およびＢ（ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＯＡｃ、９５：４：１  ｖ／ｖ／ｖ）からなり、３５分間に亘り０〜３０％のＢの直線勾配、その後、３０分間に亘り定組成期間を用い、最後に８０％のＢまで上昇させた。再平衡時間は１０分間であった。流量は５５ｍｌ／分に設定し、カラム温度は室温（２３±２℃）であった。検出器は２８０ｎｍに設定した。カラムの装填は、２ｍｌの注入ループを備えた手動式試料注入器Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  Ｖａｌｖｅモデル７７２５により行った。ＣＰ抽出物を移動相中に溶解させ、遠心分離し、注入の前に０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルタに通して濾過した。
【００５０】
プロシアニジンの半分取分離も、フェノメネクス社（カリフォルニア州、トランス所在）から購入したＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（２５０×２１．５ｍｍ内径、１００μｍの粒径）カラムを用いて行った。移動相は、上述したものと同じ組成からなった。直線勾配は、４５分間に亘り０〜３０％のＢであり、その後、２０分間の定組成期間が続き、最後に、８５％のＢに増加させて、カラムから任意の残留物を洗い流した。このカラムの流量は１５ｍｌ／分であった。
【００５１】
図２は、未発酵の脱脂カカオ種子抽出物のクロマトグラムを示している。表示の２〜１４は、ピークにおけるプロシアニジンの重合度を示している。化合物は、その重合度にしたがって溶出し、フラバン−３−オール単量体および十四量体（ＤＰ＝１４）までのオリゴマーとしてＬＣ−ＭＳにより特徴付けた。Gu等により開示されているように、未発酵カカオのフラバン−３−オールモノマー組成物およびオリゴマー組成物は、（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキンのみからなる。J. Agric. and Food Chem. (2003) 51:7513を参照のこと。ここに開示されたクロマトグラフ分離に従って、Gu等は、十量体ピーク後の、平均ＤＰが１４のプロシアニジンからなるプロシアニジンポリマーを単離した（同書）。図３は、改良されたジオール固定相および２成分移動相のプロセスを用いた、シナモマム・ロウレイリイ・アセトン緩衝液抽出物からのＤＰに基づくモノマーおよびオリゴマーの同様の分離を示している。
【００５２】
現行の方法論との比較  Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ相と比較してＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ相のクロマトグラフ性能を評価するために、各カラムを、Adamson等により記載されたクロマトグラフ条件下で評価した（J. Agric. and Food Chem. 47 (1999) 4184）。ジオール相に用いた新たなクロマトグラフ条件（すなわち、固定相にはジオール、２成分移動相においては、塩化メチレンの代わりにアセトニトリル）は、シリカにおいて試験したときに、プロシアニジンの分離に影響がなかった。Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ相およびＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ相の典型的なクロマトグラムが図４に示されている。これらのクロマトグラムは、同一のクロマトグラフ条件下での保持特徴における著しい差を示している。結合したジオール相は、プロシアニジンモノマー、すなわち、（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキンについてのみ同様の保持特徴を示した。結合したジオール相は、二量体から十量体まで、重合度と共に保持時間が長くなる、より強力な保持特徴を示した。十量体分画の保持時間は、同一条件下で、Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ相に観察された保持時間よりも約５０％長かった。ジオール相のより強い保持特徴と一致して、スペシエーション(speciation)の増加も観察された。このことは、全クロマトグラムに亘り明らかであり、１０分でのモノマー領域にさえ影響を与えた。ジオール相は、（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキンのほぼ基線分解能を生じたが、シリカ相は顕著な共溶出を示した。この向上したスペシエーションは、より保持力のある結合相については意外な結果ではなかった。しかしながら、ジオール固定相とシリカ固定相との間のピーク面積の比較により、ＤＰ＝２からＤＰ＝１０について全体のピーク面積が、シリカ層と比較して、ジオール相で増加したという予期せぬ結果が得られた。増加の大きさは、分子量が増加するにつれて大きくなった。図５のグラフに示されたこれらの観察はたぶん、吸着現象における保持の結果である。これらの観察は、保持時間が長くなると、一般により小さな面積のより広いピーク形状が生じることを考えると、特筆すべきことであった。
【００５３】
分取スケール  クロマトグラフィーのスケールを増大させることは、さらなる分析の進展のための基準を生成するためだけでなく、続いての生物学的調査のために「クリーンな」オリゴマー分画を生成することにより、これらのフェノール分子を利用することが意図された様々な生理機構を解明するために、興味深い。ＤＰに従ってプロシアニジンを分離するためのほとんどの現行の分析プロセスは、うまくいき、日常的に用いられてきたが（例えば、Rigaud et al., Chromatogr. (1993) 654:179; Hammerstone et al., J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:490; and Gu et al., J. Agric. and Food Chem. (2002) 50:4852を参照のこと）、移動相の組成（ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＯＨ、ＨＯＡｃ）により、このプロセスのスケールアップは厳しく制限されている。
【００５４】
ここに記載されたジオール移動相プロセスの主な利点の１つは、安全性の問題と廃棄費用の懸念が少なくプロセスをスケールアップする能力である。分析スケールに用いられる２成分移動相勾配の相対的な単純さおよび溶媒の選択の自由度のために、このプロセスは、半分取（２５０×２１．５ｍｍ）スケール、次いで、分取（３００×５０ｍｍ）スケールのＨＰＬＣシステムへと、勾配と流量のみを変更するだけで、移行できた。
【００５５】
プロシアニジンオリゴマーの分離は、アセトニトリル、メタノールおよび酢酸からなる移動相を用いた分取Ｄｉｏｌ−Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌカラム（３００×５０ｍｍ）により行った。溶出液の吸光度を２８０ｎｍでモニタした。７０分間の運転で９個のピークが観察された。図６は、レコーダから得たトレースを示している。そこで、ＴおよびＣは、それぞれ、テオブロミンおよびカフェインであるキサンチンを示す。ピークに付いた数字はＤＰを示す。溶媒は、沸点が低く、除去し易く、オリゴマーの単離を支援している。さらに、酸含有量は少ない。
【００５６】
この方法論は、カカオプロシアニジンオリゴマーの細分化が、塩化メチレン−メタノール−酢酸−水の勾配を用いてシリカカラム上で行われるAdamson等（J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:4184）のものとは際立って対照的である。５００×２０ｍｍのＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−Ｓｉカラムを用いた一回の運転（１８０分）で、Adamson等は、移動相の一部として塩化メチレンをほぼ４．５リットル使用した。さらに、参照材料として用いたオリゴマー分画を単離するために、Adamson等では、抽出運転を何回もする必要があった。
【００５７】
Ｓｅｐｈａｄｅｘとの比較  分取ジオールカラム上に充填できる材料の理論的上限は、６００×１００ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−５０カラム上に充填できるものよりも小さい（それぞれ、約４ｇ対２５ｇのＣＰ）が、溶媒の使用、時間（ジオールについて７０分間の運転に対して、Ｓｅｐｈａｄｅｘでは数日間）および分解能について著しい改善がある。さらに、分取ジオールシステムにより図７に示された「クリーンな」分画ができるので、回収中の検出およびモニタが可能である。現在、一回の注入（２ｍｌの注入ループ体積）の材料の量のサイズを制限するのは、移動相中のＣＰ抽出物の溶解度である。試料の調製では、移動相（Ａ：Ｂ、２５：７５  ｖ／ｖ）中にＣＰ抽出物が溶解される。これらの条件下で、白色の沈殿物（キサンチンの混合物と同定された）および樹脂材料が形成された。溶媒対固体の比を増加させても、これらの結果は変わらなかった。遠心分離後、上清を単離し、カラムに注入した。エタノールを加えると、樹脂材料が溶解した。分析スケールプロセスでこの溶解した材料を分析したら、１４までのＤＰを持つ分画が得られた。沈殿を誘発した移動相によるエタノール溶解性材料のカラムへの注入は、大規模分取作業にとって望ましくなかった。注入体積当たりの注入装填量を増加させ、それによって、効率を向上させるための試料調製のための様々な方法論（抽出による予備精製）を現在調査している。
【００５８】
単離ピークの分析（ＨＰＬＣ／ＦＬＤ）は、分画の純度を評価するのに役立つ。その分画の全てが９５％より高い純度を示した。図７は、オリゴマー分画ＤＰ＝１からＤＰ＝７に関するＣＰ抽出物の分取ＨＰＬＣ分離から回収した個々の分画のＦＬＤトレースを示している。陰イオンモードにおけるＭＳ−電気スプレイイオン化を、個々のオリゴマー分画の分子質量評価に用いた。これらのデータは、Hammerstone et al., J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:490の先の文献の報告と矛盾していない。図６の数字（すなわち、１〜７）はオリゴマー分画のＤＰに相当する。ＴおよびＣと表示された最初の２つのピークは、陽イオンモードにおけるＬＣ−ＭＳ  ＥＳＩを用いて、キサンチン、すなわち、テオブロミン（Ｔ）およびカフェイン（Ｃ）として同定された。
【００５９】
ジオール相のより強い保持特徴と矛盾せずに、スペシエーションの増加も観察された。これは、クロマトグラム全体に亘り明らかであり、１０分での単量体領域にさえ影響を与えた。ジオール相は（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキンのほぼ基線分解能を生じたが、シリカ相は顕著な共溶出を示した。
【００６０】
ジオール固定相とシリカ固定相との間のピーク面積の比較により、予期せぬ結果が得られた：ＤＰ＝２からＤＰ＝１０に関する全体のピーク面積は、シリカ相と比較して、ジオール相のほうで増加していた。増加の大きさは、図５に示すように、分子量（すなわち、ＤＰ）が増加するにつれて、大きくなった。この観察は、保持時間が長いと、より小さな面積のより広いピーク形状が一般に生じることを考えると、特筆することであった。
【００６１】
上述した実施例では固定相としてジオールを使用しているが、他の極性結合したクロマトグラフ固定相を用いても、同じ結果が得られるであろうことが当業者には理解されよう。他の適切な固定相としては、以下に制限するものではなく、グリセロール相、アミノ相（好ましくは、プロピルアミン相）、シアノ相（好ましくは、シアノプロピル相）、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、またはニトロ相が挙げられる。また、開示されている粒径は５μｍであるが、特にジオール固定相に関して、分離のために、どのような市販の粒径を用いてもよいことが当業者には理解されよう。現在、市販のジオール粒径としては、３、５および１０μｍが挙げられる。
【００６２】
同様に、上述した実施例では、アセトニトリルとメタノールの２成分移動相を使用しているが、２成分移動相は、任意の極性非プロトン性溶媒（Ａ相）とそれに続く任意の極性プロトン性溶媒（Ｂ相）の組合せであってもよい。（Ａ）相の適切な極性非プロトン性溶媒としては、アセトニトリル以外に、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチルおよびニトロメタンが挙げられる。（Ｂ）相に適した極性プロトン性溶媒としては、メタノール以外に、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびイソブタノールが挙げられる。Ａ相中の極性非プロトン性溶媒およびＢ相中の極性プロトン性溶媒の比率は、０および１００体積％の間であってよく、５０体積％より大きいことが好ましく、９０体積％より大きいことがさらにより好ましいことが理解されよう。Ａ相およびＢ相の残りは、どのような鉱酸または有機酸（例えば、酢酸）および／または水であってもよい。
【００６３】
したがって、分析スケールで重合度に基づいて極性プロトン性オリゴマーを分離するため、並びに分取スケールでオリゴマーを分離し単離するための本発明の改良された方法およびシステムが、既存の手法より優れたいくつかの利点を提供する。極性結合したクロマトグラフ固定相は、シリカよりいっそう頑丈であり、幅広い溶媒を許容できる。シリカの長期の吸着特性は水の存在下で損なわれるのに対し、ジオールまたはグリセロール固定相などの極性結合したクロマトグラフ固定相について、このことは関係しない。シリカ相と直接比較すると、ジオール相は、表面吸着を減少させるかまたはなくし、それによって、特に少なくとも１０のＤＰを持つオリゴマーを含む個々のオリゴマーの増加したスペシエーションを提供することが示された。一般的な３成分相または４成分相よりむしろ２成分の移動相が用いられ、それによって、精巧なＨＰＬＣクォータナリポンプのない研究者にも、このプロセスを容易に適用できる。開示したプロセスに用いられる溶媒は、現在用いられているもの、すなわち、発癌物質／突然変異誘発物質である塩化メチレンおよびＣＮＳ抑制剤のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）よりも、危険が少なく、環境によりやさしい。最後に、このプロセスにより、ＤＰにしたがう分画の「クリーンな」物理的単離が可能になり、このことは、さらなる研究のためまたは個々のオリゴマーの精製のための基準を生成することに関して有利であり得る。
【００６４】
ＤＰに基づく極性プロトン性オリゴマーの分離に加え、プロシアニジンオリゴマーを分離する（ＤＰに従って）のに用いられる移動相勾配を変えると、脱カフェインおよび脱テオブロミンのカカオポリフェノール抽出物を生成できることが分かった。回収に関して、１ｇ（４０％のＣＰ、すなわち、４００ｍｇの材料）で出発して、１３４ｍｇのオリゴマー（ＤＰ＞２）を回収した。回収したモノマーの質量は３９ｍｇであった。
【００６５】
カカオポリフェノールからのキサンチン（カフェインおよびテオブロミン）の分離は、室温（すなわち、約２５℃）にてＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ３００×５０ｍｍ、１００μｍカラム（固定相）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムで行った。２成分移動相の組成は以下のとおりであった：（Ａ）相はアセトニトリル：酢酸  ９９：１（ｖ／ｖ）からなり、（Ｂ）相はメタノール：水：酢酸  ９５：４：１（ｖ／ｖ／ｖ）からなった。半分取作業の流量は３０ｍｌ／分に設定した。分離は、以下のような直線勾配により行った：０分で０％のＢ；１５分で０％のＢ；２０分で１００％のＢ；３０分で１００％のＢ。分析は、２８０ｎｍでのＵＶ検出、および蛍光によるものであった。
【００６６】
図８は、分取ＨＰＬＣシステムにより生成されたＬＣトレースを示している。ピーク１はテオブロミンであり、ピーク２はカフェインであり、ピーク３はモノマー（フラバノール）であり、ピーク４はＤＰ＞１のオリゴマーである。初期移動相条件を１５分間保持し（すなわち、０％のＢ相、１００％のＡ相）、テオブロミン、カフェインおよびモノマーを最初に溶出させた。移動相を高い極性に調節すると、ＣＰオリゴマー（ＤＰ＞１）を迅速に回収できた。
【００６７】
図９は、分画の分析を示している。トレース（ａ）は、ＣＰ抽出物の蛍光検出である。トレース（ｂ）は同じ材料のＵＶ検出である。キサンチンは実質的に蛍光を発せず、ＣＰはＵＶ検出下で強い信号を示さないことが知られている。それゆえ、両方の検出モードを使用して、より包括的な像が得られる。
【００６８】
トレース（ｃ）は、ＣＰ抽出物から回収したキサンチンのＵＶトレースを示している。テオブロミンおよびカフェインの個々の分画の分析は示されていないが、それらは、分離し物理的に単離できる。さらに、モノマーは、キサンチンから分離し単離できる。トレース（ｄ）を参照のこと。
【００６９】
トレース（ｅ）は、モノマーとキサンチンの除去後、ＣＰ抽出物のＵＶトレースを示している。その試料は、ＤＰ＞２のオリゴマーしか含有していないのが明らかである。
【００７０】
本発明を特定の実施の形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明から逸脱せずに、多くの改変および変更を行ってよいことが認識されよう。したがって、添付の特許請求の範囲により、本発明の精神および範囲に含まれるようにそのような改変および変更を全て包含することが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】単量体フラバン−３−オール並びに炭素−炭素Ｃ４→Ｃ８およびＣ４→Ｃ６結合により連結したプロシアニジンオリゴマーの化学構造
【図２】未発酵カカオ豆からのプロシアニジンのジオール相ＨＰＬＣ蛍光トレース
【図３】シナモマム・ロウレイリイアセトン緩衝液抽出物からの極性プロトン性モノマーおよびオリゴマーの分離のジオールカラムＨＰＬＣトレース
【図４】固定相としてＬｉｃｈｒｏｓｈｐｅｒｅ  Ｓｉｌｉｃａ（下側）およびＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（上側）を用いた、プロシアニジンのＨＰＬＣクロマトグラム
【図５】重合度による、プロシアニジンオリゴマーに関するＨＰＬＣにおけるジオール対シリカの固定相のピーク面積の増加百分率のグラフ
【図６】ＣＰ抽出物の分取相ＨＰＬＣプロファイル
【図７】ＤＰ＝１から７のオリゴマー分画に関するＣＰ抽出物のＨＰＬＣ分離から回収した個々の分画のＦＬＤトレース
【図８】ＣＰ抽出物からカフェインおよびテオブロミンを分離するための分取システムのＬＣトレースクロマトグラム
【図９】半分取ジオール分離からの単離分画のＨＰＬＣ分析クロマトグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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