(57)【要約】  全固形分の少なくとも５０％を乳清タンパク質として有する乾燥変性乳清タンパク質濃縮物又は単離物を調製した。当該方法は、カルシウムの存在下で乳清タンパク質を加熱処理することを用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥改質乳清タンパク質濃縮物又は単離物の製造方法であって、以下の：
(ａ)  全固形分の最大３０％の水性乳清タンパク質濃縮物又は単離物を、(ｉ)二価金属水酸化物で処理して、ｐＨを約６.０〜約８.５に変化させるか；又は(ｉｉ)二価金属イオン塩で処理して、そしてｐＨを調節して、ｐＨを約６.０〜約８.５に変化させ、そして十分な二価金属イオン塩を加えて、乳清タンパク質濃縮物の二価金属イオン含量を最大３ｇ/ｋｇ乾燥固体に増加させるか、又はすでに３ｇ/ｋｇである場合少なくとも１.１倍に増加させ；そして
(ｂ)  得られた溶液を、７０℃超に加熱処理して、上記乳清タンパク質を変性させ；そして
(ｃ)  上記加熱処理された乳清タンパク質濃縮物を乾燥させる
を含み、ここで上記乳清タンパク質濃縮物又は単離物が、全固形分の少なくとも５０％(ｗ/ｗ)を乳清タンパク質として有する、前記方法。
【請求項２】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物が、１２〜３０％(ｗ/ｖ)の全固形分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物が、全固形分の少なくとも６５％を乳清タンパク質として有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳清タンパク質の比率が、前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物の由来元の乳清に比べて実質的に変化されていない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、乳清タンパク質残渣物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離開始物質が、ｐＨ約４.０〜６.４の生乳清を限外ろ過することにより調製される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、ｐＨ５.５〜６.２の生乳清を限外ろ過することにより調製される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、二価金属水酸化物で処理される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、水酸化カルシウムで処理される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、二価金属イオン塩と一緒にアルカリで処理される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
加熱される前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物中の二価金属イオンの濃度が、３０００〜２８０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質の範囲内である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
加熱される前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物中の二価金属イオンの濃度が、４０００〜１００００ｍｇ/ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記加熱処理が、少なくとも７０℃で行なわれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記加熱処理が、９０〜１２０℃で行なわれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
改質乳清タンパク質濃縮物又は単離物の製造方法であって、以下の：
(ａ)  約６.６〜約８.５のｐＨ、及び３０００〜２８０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質の二価金属イオン含量を有する溶液中に乳清タンパク質濃縮物又は単離物を提供し
、
(ｂ)  得られた溶液を７０℃超に加熱処理し；そして
(ｃ)  前記加熱処理された乳清タンパク質濃縮物を乾燥させる
を含み、ここで上記タンパク質濃縮物が、全固形分の少なくとも５０％(ｗ/ｗ)を乳清タンパク質として有する、前記方法。
【請求項１６】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物が、１２〜３０％(ｗ/ｖ)の全固形分を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物が、全固形分の少なくとも６５％を乳清タンパク質として有する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記乳清タンパク質の比率が、乳清タンパク質濃縮物又は単離物の由来元の乳清に比べて実質的に変化していない、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記開始乳清濃縮物又は単離物開始物質が、乳清タンパク質残渣物である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、約４.０〜６.４のｐＨの生乳清の限外ろ過により調製される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、ｐＨ５.５〜６.２の生乳清の限外ろ過により調製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、二価金属水酸化物で処理される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、水酸化カルシウムで処理される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記開始乳清タンパク質濃縮物又は単離物開始物質が、二価金属イオン塩と一緒にアルカリで処理される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
加熱される前記乳清タンパク質濃縮物又は単離物中の二価金属イオンの濃度が、３０００〜２８０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質の範囲内である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
加熱される乳清タンパク質濃縮物又は単離物中の前記二価金属イオンの濃度が、４０００〜１００００ｍｇ/ｋｇである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記加熱処理が、少なくとも７０℃で行なわれる、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記加熱処理が、９０〜１２０℃で行なわれる、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性乳清タンパク質を含む乳清タンパク質濃縮物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳清タンパク質は、チーズの製造又はカゼインの沈殿の副産物である。水に加え、乳清は、ラクトース、ミネラル、及び乳清タンパク質を含む。チーズ及び他の乳製品の製造の間に多量の乳清が製造される。乳清タンパク質製品、例えば乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)及び乳清タンパク質単離物(ＷＰＩ)は、他の成分の多くを取り除き、全固形分に対して乳清タンパク質を増加させ、そしてしばしば主成分とすることによって製造される。ＷＰＣは、通常、最大で８５％(ｗ／ｗ)のタンパク質含量を有する一方、ＷＰＩは、９０％以上(ｗ／ｗ)のタンパク質含量を有する。高タンパク質含量を達成することは、限外ろ過、透析、及びイオン交換などの従来技術を適用することによって可能となる。タンパク質は優れた栄養的価値を有するので、これらの製品は、食品成分として有用である。
【０００３】
これらは、多くの食品、例えば加工肉、パン、及び乳製品における機能成分として使用される(Kinsella, J.E. & Whitehead, D. M. Proteins in Whey: chemical, physical, and functional properties. Advances in Food Nutrition Research, 33, 343-438, 1989)。乳清タンパク質は、ゲル化剤として用いられる多糖と組合わされてもよい(例えば、ＵＳ６,４９７,９１５を参照のこと)。しかしながら、ＷＰＣの商業的使用は、組成及び処理に一貫性がないため生じるその機能性質における予測できない変化のため、限られていた(Xiong, Y.L., Influences of pH and ionic enviroment on the thermal aggregation of whey proteins Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 380-384, 1992)。多くの栄養的適用では、最終生成物の風合い又はレオロジーについての乳清タンパク質の効果は有用なものである。これらの適用は、ＷＰＣが熱誘導性のゲルを形成するという能力に依っていることが多い。他の適用では、これらのゲル化性質は所望されない。
【０００４】
低下されたゲル形成能を有する乳清タンパク質濃縮物の改善された製法、及び/又は生成物を提供し、及び/又は公衆に有用な選択肢を提供することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００５】
一の態様では、本発明は、乾燥改質乳清タンパク質濃縮物又は単離物の製造方法であって、以下の：
(ａ)  全固形分の最大３０％(ｗ/ｗ)、好ましくは８〜３０％、より好ましくは１２〜３０％の水性乳清タンパク質濃縮物又は単離物を、(ｉ)二価金属水酸化物、好ましくは水酸化カルシウムで処理して、ｐＨを約６.０〜約８.５、好ましくは約６.６〜約８.５、より好ましくは６.９〜７.５に変化させるか；又は(ｉｉ)二価金属イオン塩で処理して、そしてｐＨを約６.０〜約８.５、好ましくは約６.６〜約８.５、より好ましくは、６.９〜７.５に変化させ、ここで十分な二価金属イオン塩を加えて、乳清タンパク質濃縮物又は単離物の二価金属イオン含量を最大３ｇ/ｋｇ乾燥固体に、又はすでに３ｋｇ/ｋｇ以上である場合は少なくとも１.１倍に増加させ；そして
(ｂ)  得られた溶液を、７０℃超、好ましくは８５℃超に熱処理して、乳清タンパク質を変性させ；そして
(ｃ)  熱処理された乳清タンパク質濃縮物又は単離物を乾燥させる
を含み、ここで当該乳清タンパク質濃縮物又は単離物が、乳清タンパク質として全固形分の少なくとも５０％(ｗ/ｗ)を乳清タンパク質として有し、好ましくは５０％超、より好ましくは５０〜８５％タンパク質を有する、前記方法を提供する。
【０００６】
「乳清タンパク質濃縮物」は、少なくとも部分的にラクトースが取り除かれて、タンパク質含量が少なくとも２５％(ｗ/ｗ)に増大された乳清の分画である。本発明では、乳清タンパク質濃縮物は、全固形分の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは少なくとも７５％を乳清タンパク質として有する。好ましくは、乳清タンパク質の比率は、由来元の乳清に対して、実質的に変化されていない。好ましくは、乳清タンパク質濃縮物は、乳清タンパク質残渣物(retantate)である。本明細書の目的では、「乳清タンパク質濃縮物」は、脈絡が許容する場合、乳清タンパク質単離物を含む。
【０００７】
(ａ)の乳清タンパク質濃縮物開始物質は、約４.０〜６.４、好ましくは４.０〜６.２、より好ましくはｐＨ５.５〜６.２、最も好ましくは約ｐＨ６で生乳清を限外ろ過することにより製造することができる。限外ろ過を用いて、水、ラクトース、及びミネラルが取り除かれ、残渣物区分(retantate stream)が得られる。限外ろ過は、一般的に１０〜５０℃で行なわれる。ｐＨ６では、カルシウムの多くは、タンパク質区分に保持される。乳清タンパク質濃縮物のタンパク質濃度は、蒸発によりさらに増加させることができる。別法では、開始物質は、乾燥乳清タンパク質濃縮物から製造された再構成乳清タンパク質であってもよい。
【０００８】
乳清タンパク質濃縮物の製造用の乳清は、好ましくは、酸性乳清又はチーズ乳清である。酸性乳清は、約４.６のｐＨを有し、一方チーズ乳清が約６〜６.４のｐＨを有する。本発明は、加熱したときに乳清が約ｐＨ７であるということを必要とする。その結果、酸性乳清は、そのｐＨを７に上昇させるために、チーズ乳清よりも多くのアルカリを加えなければならない。結果として、このｐＨでのミネラルバランスは、通常、個別に調節され、その結果、加熱の際に二価イオン-タンパク質の所望の相互作用を誘導するために、十分な二価イオン濃度を達成するということを保証する。
【０００９】
「二価金属水酸化物で処理する」という語句は、乳清タンパク質濃縮物のｐＨを上昇させ、そして二価金属イオンを乳清タンパク質濃縮物に加える任意の処理を含む。これには、二価金属水酸化物を直接添加すること、又は二価金属水酸化物と他の水酸化物の混合物を直接添加することが含まれる。好ましい二価金属水酸化物として、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、及び水酸化亜鉛が挙げられる。
【００１０】
さらに、この語句は、二価金属水酸化物、及び塩を含む他の成分を加えることを含む。当該語句は、アルカリを、二価金属イオン塩と一緒に加えることをさらに含む。例えば、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムなどの水酸化物は、塩化カルシウムなどの二価金属イオンと一緒に使用されてもよい。
【００１１】
ｐＨを増加させ、そして二価金属イオン濃度を増加させるために使用される物質の性質は、好ましくは、元の乳清の性質、乳清タンパク質濃縮物の製造方法、乳清タンパク質濃縮物のタンパク質含量、及び処理ステップの性質に依存して変化する。加熱される物質が、高い一価イオン濃度を有する場合、より多くの二価イオンを添加することは好ましい。例えば、比較的低いタンパク質含量を有する乳清タンパク質濃縮物、例えばＷＰＣ３５(全固形分の３５％を乳清タンパク質として有する)は、比較的高濃度の一価イオンを有する。さらに、タンパク質濃縮が、限外ろ過の代わりに蒸発を使用する場合、一価イオンの濃度は一般的により高くなる。理論に縛られることを臨まないが、高濃度の一価イオンが存在する場合、平衡を二価イオン-タンパク質相互作用側に傾かせるために、追加の二価イオンが必要とされるということを出願人は信じている。
【００１２】
好ましくは、使用される条件は、一価イオンを最小に維持して、追加の二価イオンを添加する必要性を避ける。その結果、二価金属イオン水酸化物の添加は、水酸化ナトリウムと二価金属塩の添加よりも好ましい。一般的に、加熱される乳清タンパク質濃縮物中の二価金属イオンの濃度は、３０００〜２８０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質、好ましくは４０００〜１００００ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは４０００〜８５００ｍｇ/ｋｇ、最も好ましくは４０００〜６０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質の範囲内である。本発明は、実施例１３に示される様に、より高いカルシウム濃度においても機能するが、適当な工業的濃度は、本明細書に与えられる範囲内である。
【００１３】
加熱ステップにおいて蒸気注入を使用することが好ましい。使用されうる他の加熱形態は、かきとり面形熱交換(scraped surface heat exchange)、オーム加熱、及びプレート又はチューブ熱交換を含む。加熱時間は、使用される温度に従って変化する。高温、例えば１２０℃では、数分の加熱しか必要とされない。７０℃では、長時間の加熱が必要とされる。
【００１４】
加熱ステップ後、任意的冷却ステップが存在する。このステップは、主に経済的理由のため熱を回収することを目的とする。
【００１５】
ホモジェナイズステップが使用されることもあるが、任意である。加熱条件が的確に合っている場合、加熱された溶液は濃いヨーグルトのように振舞う。この物質をポンプで送ることができ、そして高圧ポンプは、極微細の粒子へと当該系をバラバラにすることができる。この場合、ホモジェナイザーを使用する必要性はない。
【００１６】
次にタンパク質区分(stream)を濃縮してもよい。一般的に濃縮ステップは、限外ろ過又は蒸発のいずれかによって行なうことができる。
蒸発は任意である。ホモジェナイズされたタンパク質系を直接乾燥させることもできる。経済的理由から、乾燥する前に溶液蒸発させることがかなり推奨されている。
乾燥は、任意の乾燥形態でありうる。スプレー乾燥及び摩擦乾燥(attrition dry)が現在好まれている。
【００１７】
熱処理は、乳清タンパク質の大部分を変性させるために十分な時間であることを必要とする。好ましくは、加熱処理は、少なくとも７０℃、より好ましくは少なくとも８５℃で最大４０又は６０分である。より好ましくは、溶液は９０〜１２０℃で加熱される。
【００１８】
本発明の別の態様では、改質乳清タンパク質濃縮物を製造する方法であって、
(ａ)  約６.６〜約８.５、好ましくは約６.９〜７.５のｐＨを有する乳清タンパク質濃縮物、及び３０００〜２８０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質、好ましくは、４０００〜１００００ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは４０００〜８５００ｍｇ/ｋｇ、最も好ましくは４０００〜６０００ｍｇ/ｋｇ乾燥タンパク質の二価金属イオン含量を有する乳清タンパク質濃縮物を提供し、
(ｂ)  得られた溶液を７０℃超、好ましくは８５℃超に加熱して、タンパク質を変性させ；そして
(ｃ)  加熱処理された乳清タンパク質濃縮物を乾燥する
を含み、ここで、当該乳清タンパク質濃縮物が、全固形分の少なくとも５０％(ｗ/ｗ)、好ましくは５０％超を乳清タンパク質として有する方法が提供される。
【００１９】
好ましい乳清タンパク質濃縮物及び処理条件は、上に記載されるとおりである。好ましい二価金属イオンは、カルシウム、マグネシウム、及び亜鉛である。開始物質に加えられる二価金属イオンは、主にカルシウムイオンである。
本発明のさらなる態様は、本発明の製造方法による生成物を提供する。
【００２０】
本発明は、加熱の際に主に非共有結合により形成される凝集体の形成を促進するイオン-タンパク質相互作用の操作を可能にする。この操作は、加熱時に十分な量の二価イオン-タンパク質相互作用を有することにより達成される。
【００２１】
一価イオン-タンパク質相互作用対二価イオン-タンパク質相互作用の比は動的であり、そして平衡は、存在する一価イオン及び二価イオンの濃度によりある程度決定される。
【００２２】
一価イオンに対して二価イオンが不十分な濃度である場合、ジスルフィド結合の形成が増加するであろう。
【００２３】
本発明の好ましい生成物を製造するために、二価イオンの濃度が不十分である場合、追加の二価イオンをこの系に添加することが必要とされる。
【００２４】
二価イオンの添加は、平衡を二価イオン-タンパク質相互作用が生じる可能性の高い系に傾かせる。
【００２５】
逆に、一価イオンが当該系に加えられる場合、平衡は、一価イオン-タンパク質相互作用を促進する方に傾く。
【００２６】
一価イオン-タンパク質相互作用の比率、及び二価イオン-タンパク質相互作用の比率が常に存在するということは当業者により認めらことである。
【００２７】
本発明のプロセスの生成物の利点は、凝集体において主に疎水性結合が存在することの結果として、乾燥前に粒子サイズの制御を簡単にすることである。
【００２８】
ジスルフィド結合で結合されたＷＰＣに比べて、非共有結合により変性されたＷＰＣ群は、加熱後及び乾燥前の機械的せん断により容易に破壊することができる。
【００２９】
その結果、本発明の非乾燥加熱処理ＷＰＣ区分(stream)は、ホモジェナイズ、高せん断ポンプなどのせん断を創出するユニット操作により、そしてスプレー乾燥条件(例えば、噴霧手段(ディスク対ノズル(disc verses nozzle))、ノズルタイプ、及び圧力)の操作により、カスタマイズすることができる。
【００３０】
再構成された変性ＷＰＣ製品の粒子サイズの中央値は、一般的に１０μｍ超であり、そして７０μｍ未満である。
【００３１】
粒子サイズの操作は、最終生成物の使用可能な適用を広げるのに重要である。従来技術では乾燥後の機械的製粉は、小さい粒子サイズが望ましい場合に一般的に使用される。
【００３２】
加熱誘導による凝集体の形成において、非共有結合を促進するために使用される二価イオンは、改質ＷＰＣ粒子中に閉じ込められるということが信じられている。
【００３３】
二価イオンの比率が、鉄イオンの形態である場合、乾燥生成物中のＦｅは、食品系中で他の化学種と相互作用できず、又は官能試験において検出できない様式で閉じ込められる。鉄強化は、多くの食品において共通の課題である。例えば、鉄は、イチゴのアントシアニンに結合して、赤から灰色へと色を変化させることが知られている。本発明により製造されたＷＰＣ中に閉じ込められた鉄で食品を強化することにより、食品系中の反応性化学種を、鉄から保護する。ＷＰＣの鉄強化は、加熱ステップ前にＷＰＣ混合物中に鉄イオンを含めることにより達成することができる。
【００３４】
本発明の生成物は広範囲の実用性を有している。当該生成物は、風味の主要な変化を生じさせることなく、タンパク質含量を増加させるために、適用において使用することができる。例えば、本発明のＷＰＣは、プロセスチーズ及び乳清チップスに使用するのに適している(WO06/19320)。本発明のＷＰＣは、製パンへの適用において有用である。製パン業者が、６％の乳清タンパク質を加えて、タンパク質に富むパンを製造することを決定した場合、このパンは岩みたいに堅くなってしまう。本発明の乳清タンパク質濃縮物は、このような所望されない堅さをもたらすことなくパンに乳清タンパク質を取り込むことを可能にする。
【００３５】
本発明において有用な二価金属イオンの含量は、ｍｍｏｌ/ｋｇ乾燥固体中で計測できる。これらのユニットでは、有用な範囲として、８０〜２２０ｍｍｏｌ/ｋｇ乾燥固体、好ましくは１００〜２２０ｍｍｏｌ/ｋｇ、より好ましくは１４０〜２１０ｍｍｏｌ/ｋｇ、最も好ましくは１６０〜２００ｍｍｏｌ/ｋｇが挙げられる。
【００３６】
本発明は、上に記載されており、そして以下の記載により与えられる例示の構成も予想される。
以下の実施例は、本発明の粒子をさらに例示する。
【実施例】
【００３７】
実施例１.改質ＷＰＣ８０の製造
改質ＷＰＣ粉末を図１に示されるプロセスに従って製造した。ＷＰＣ溶液(１７％、ｗ/ｗ)を、標準市販チーズＷＰＣ８０粉末(Ａ３９２、Fonterra Cooperative Group Limited, Clandeboye) から、適量のＭｉｌｌｉＱ水中に再構成することにより調製した。最終溶液は、６.８のｐＨを有した。溶液を２％Ｃａ(ＯＨ)2溶液を用いて中和した。最終ｐＨは７.４５であった。次に溶液を直接蒸気注入(ＤＳＩ)により９０℃で７分間加熱した。これは、加熱溶液を保持チューブ(holding tube)中を循環させることにより達成させた。次に、チューブ状の熱交換器を介して溶液を約６０℃に冷却し、ホモジェナイズし、そして次にスプレー乾燥した。次に粉末を特徴決定し、そしてプロセスチーズに適用された。
【００３８】
ＷＰＣ粉末の全タンパク質含量は、Association of Official Analytical Chemistsにより記載されたKjeldahl法を用いて決定した(Official Mehods of Analysis, 第１４版;Williams, S., Ed.; AOAC: Washington, DC, 1984, 窒素変換係数＝６.３８を用いた)。Russell, C.E.; Matthews, M. E.; Gray, I.K. "A comparison of methods for the extraction of the fat from soluble whey protein concentrate powders"、 New Zealand Journal of Dairy Science and Technology, 15, 239-244, 1980により記載されるＳｏｘｈｌｅｔ抽出を用いて脂肪含量を測定した。前もって秤量し、１０５℃で２４時間サンプルを二回オーブン乾燥し、デシケーターで２時間冷却し、そしてサンプルを再度秤量することにより、水分含量を測定した。Lee, J.; Sedcole, J.R.; Pritchard, M. W. Matrix interactions in an inductively couled argon plasma optimised for simultaneous multielement analysis by atomic emission spectrometry. Spectrochim. Acta 41B, 217-225, 1986.により記載される方法を用いて、誘導結合アルゴンプラズマを用いてミネラル分析を行なった。
【００３９】
タンパク質変性の程度の決定を、Havea, P., Singh, H., 及びCreamer, L.K, heat-induced aggregation of whey proteins: Comparison of cheese WPC with Acid WPC and relevance of mineral composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 4674-4681, 2002により記載されるサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)法を用いて、タンパク質変性度の決定を測定した。改質ＷＰＣ粉末から調製された１％ＷＰＣ溶液のＳＥＣ溶出プロファイルを、対照未加熱標準チーズＷＰＣ粉末(Ａ３９２)から調製された１％ＷＰＣ溶液の溶出プロファイルと比較した。これらのサンプルにおける各タンパク質のピーク領域間の差違を用いて、各粉末におけるタンパク質の変性レベルを計測した。対照ＷＰＣと改質ＷＰＣのＨＰＬＣプロファイルの例が図２に示される。
【００４０】
Ye, A. 及びSingh, H. Influence of calcium chloride addition on the properties of emulsions stabilized by whey protein concentrate. Food Hydrocolloids, 14, 337 -346, 2000により記載される方法を用いて、粉末及びＷＰＣ懸濁物の粒子サイズ分配を行なった。
【００４１】
比較のためＡ３９２粉末と並べて粉末を特徴決定した。以下の表１を参照のこと。
【表１】
2009529913.tif 000002
【００４２】
改質ＷＰＣを製造するためにＡ３９２を用いた。改質ＷＰＣは、Ａ３９２の組成とかなり似た組成を有した。改質ＷＰＣ粉末は、少し高いカルシウム含量と小さい粒子サイズを有した。カルシウム濃度が高いのは、ｐＨを調節する際にＣａ(ＯＨ)2を使用するためである。改質ＷＰＣ粉末は、明白色であり、指ざわりがよく、そして優れた官能性を有すると記載された。図１に示される方法を用いて、優れた性質を有する変性ＷＰＣを製造することができるということを示す。
【００４３】
実施例２.レトルト条件における改質ＷＰＣの適用
３種の異なるＷＰＣ粉末、Ａ３９２、Ｓｉｍｐｌｅｓｓｅ１００(つまり、市販の変性ＷＰＣ)、及び実施例１に開示される改質ＷＰＣを、各溶液においてタンパク質濃度が８％ｗ/ｗとなるように水に再構成することによりＷＰＣ溶液(ｐＨ７.５)を調製した。溶液をレトルト可能な硝子製容器にいれ、そして１２１℃で１０分間レトルトした。次に、ゲル及び沈殿物の存在について視覚的に溶液を評価した。
【００４４】
粒子が、レトルト飲料中で高いレベルで使用される場合、これらのタンパク質が、レトルト処理の間に懸濁のままであるということが望ましい。
【００４５】
溶液をレトルトした後に、Ａ３９２及びＳｉｍｐｌｅｓｓ１００ＷＰＣ溶液は、体量のタンパク質ゲルを形成した。改質ＷＰＣ溶液は、微粒子のタンパク質沈殿を有した。しかしながら、タンパク質含量は懸濁液中で大部分が残っていた。これにより、本発明の改質ＷＰＣがレトルト飲料に使用できるということが示された。特にこのレベルの未変性乳清タンパク質の加熱処理によりゲル形成がもたらされるということを当業者は理解している。本発明の改質ＷＰＣが、レトルト後に懸濁物が残っているという十分な変性程度を有する(つまり、熱誘導性ゲルを形成する能力を欠いている)ということがこの結果により示された。
【００４６】
実施例３.モデルプロセスチーズスライスシステムにおける改質ＷＰＣの適用
実施例１に開示された改質ＷＰＣをプロセスチーズ処方に使用した。ここで全タンパク質の１０％を用いた。対照の実行はレンネットカゼインのみを含んだ。他のサンプルセットは、改質ＷＰＣ又は標準チーズＷＰＣ(Ａ３９２)のいずれかにより置き換えられた全タンパク質の２０％を有した。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
2009529913.tif 000003
【００４８】
改質ＷＰＣは、レンネットカゼインのみ、又は標準ＷＰＣ(Ａ３９２)に比べて高い融点を与えるということに注意すべきである。
【００４９】
実施例４.モデルプロセスチーズスライスシステムにおける変性乳清タンパク質の影響
表３に示される処方を用いて、プロセスチーズスライスサンプルを製造した。使用されるタンパク質成分は、レンネットカゼイン(ＡＬＡＲＥＮ７９９、９０メッシュ)、Ａ３９２、及び改質ＷＰＣ(実施例１〜３に開示される)であった。
【００５０】
ハイブリッドチーズ-レンネットカゼイン処方を用いた。この処方は表３に示されている。
【００５１】
【表３】
2009529913.tif 000004
【００５２】
処方における乳清タンパク質含量(全タンパク質の２０％)は、改質ＷＰＣ(上の表におけるラベルされたＨＴ-ＷＰＣ)及びＡ３９２の混合物である。各々における様々なレベルを有することは、各サンプル中の改質ＷＰＣの様々なレベルをもたらす。以下の混合物を用いた(表４)。
【００５３】
【表４】
2009529913.tif 000005
【００５４】
チェダーチーズは、２００４年にFonterra-Whareroaで製造された高固体チーズであった。このチーズは、大部分の時間、凍結して貯蔵されていた。
【００５５】
ＲＶＡ４を用いてプロセスチーズを製造した(１０分の加熱、最大速度８００ｒｐｍ及び最大温度８５℃)。溶融したチーズを、〜２ｍｍのスライスにし、そしてプラスチックバッグ中で４℃で冷蔵して風合い試験及び溶融試験まで３日間貯蔵した。応力（stress)及びひずみ（strain）を、Ｖａｎｅ試験(Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ)を用いて応力とひずみを計測し、シリンダーテスト(ＴＡ-ＸＴ２)を用いて硬度を計測し、そしてKosikowaski, F. V. 及び Mistry, V.V. (1997) Cheese and Fermented Milk Foods, 第３版、P. 259. L.L.C. Connecticutの改良された溶融法(１７０℃で１０分)を用いて融点を測定した。
【００５６】
試験の残りを用いて、ｐＨと湿気をチェックした。硝子電極によりｐＨを測定し、そしてオーブン法(１０５℃で１６時間)を用いて、水分レベルを測定した(表５)。
【００５７】
【表５】
2009529913.tif 000006
【００５８】
風味及び融点の計測された性質を表６に示し、そして図３にプロットした。
【００５９】
【表６】
2009529913.tif 000007
【００６０】
応力及び硬度のデーターは、同様の傾向を示した：変性乳清タンパク質の比率が増加するにつれて、両者は徐々に増加する。溶融傾向は直線的ではない。融点は、以下の順番で減少した：４０％、６０％＞１００％＞２０％、０％。
【００６１】
実施例５.加熱ＷＰＣ溶液のゲル強度についてのカルシウム効果の証拠
ＷＰＣ溶液(１６％ＴＳ、〜１３％タンパク質、ｐＨ６.８)を、適切な量のチーズＷＰＣ８０(Ａ３９２)を水に溶解することにより調製した。溶液の異なるアリコートを準備し、そしてカルシウム(ＣａＣｌ2)を各々異なるレベルになるように加えた。２０℃〜８０℃へと２℃/分で加熱し、次に８０℃で３０分間乳清タンパク質を変性をさせる間、溶液のレオロジー性質の変化をモニターした。
【００６２】
低いひずみで、カップ及びボブの構成を用いて制御された応力レオメーターを用いて溶液の動的振動粘弾性をモニターした。約１９ｍｌのＷＰＣ溶液をサンプルセルに入れ、そして低粘度のミネラルオイルの薄層でカバーして蒸発を防いだ。レオロジー性を、線形粘弾性領域(０.５％ひずみ)及び低い振動数(１Ｈｚ)で測定した。
【００６３】
図４は、約１０００ｍｇ/ｋｇタンパク質のカルシウムの添加が、熱誘導性ゲル強度を５０％超だけ低下させたということを示す。低ゲル強度を有することは、ポンプ及びホモジェナイズなどの処理を比較的容易に行なうことを可能にする。
【００６４】
実施例６.加熱誘導性ＷＰＣのレオロジー性質における添加されたマグネシウム(ＭｇＣｌ2)の効果の証拠
実施例５と同じ濃度で同じ条件のＷＰＣ溶液をさらに調製した。様々なレベルのＭｇ2+(ＭｇＣｌ2)をＷＰＣ溶液の異なるアリコートに加えた。加熱の間におけるこれらの溶液のレオロジー性質の変化を、実施例５に記載したのと同じ方法を用いてモニターした。
【００６５】
２０００〜５０００ｍｇ/ｋｇタンパク質のレベルのマグネシウムの添加が、５０％未満にゲル強度を低下させたということを図５は示す。この例により、両方とも二価のカチオンであるカルシウムとマグネシウムが、加熱の間におけるＷＰＣ溶液のゲル強度について同様の効果を有することが示された。
【００６６】
これらのイオンの影響がある濃度で最適となる。添加レベルは、カルシウム又はマグネシウムが加えられるタンパク質溶液の開始イオン濃度に依存するであろう。開始ＷＰＣ溶液が、酸性ＷＰＣから製造される場合、例えばカルシウム含量は、標準のチーズＷＰＣ中に通常存在する含量の３分の１未満でありうる。この場合、添加されたカルシウムは、主に非共有結合性の凝集タンパク質を誘導するために十分なレベルであるべきである。
【００６７】
実施例７.原材料の異なるソースの証拠
実施例５に記載される条件と同じ条件で(チーズＷＰＣの代わりに)ＷＰＣ８０を用いてＷＰＣ溶液を調製した。溶液のアリコートを調製し、そして異なるレベルのカルシウム又はマグネシウムを加えた。加熱の間におけるこれらの溶液のレオロジー性質の変化を、実施例５に記載されるのと同じ方式でモニターした。
【００６８】
加熱の間におけるＷＰＣ溶液の貯蔵モジュールＧ'の変化を、図６に示す。十分なレベルでカルシウム(ＣａＣｌ2)、マグネシウム(ＭｇＣｌ2)、又は鉄(ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ)を添加することは、Ｇ'のレベルの有意な低下(＞５０％)をもたらした。酸とチーズＷＰＣとの間の主な差違のうちの一つは、酸性ＷＰＣよりもずっと多くの二価カチオンを含むという点である(Havea P, Singh H & Creamer LK Heat-induced aggregation of whey proteins: comparison of cheese WPC with acid WPC and relevance of mineral composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 4674-4681, 2002)。このように二価カチオンをＷＰＣ溶液に加えることは、変性タンパク質の性質に変化を与えるために十分でなければならない。
【００６９】
実施例８.酸性ＷＰＣ加熱誘導性ゲルの風合いに対するカルシウム添加の効果
酸性ＷＰＣ溶液(実施例７と同じ)を調製し、そして異なるレベルのカルシウムを加えた。次に、溶液を４００ｃｍ長、３０ｍｍ直径、中-壁ポリセルロースプラスチック製チューブ(medium-walled polycellulosic plastic tubes)に配置し、そしてゴムバンドを用いて末端を閉じて、堅い「ソーセージ」状のものを作った。これらのソーセージを次にサーモスタット制御の水浴中に６０分間配置した。各チューブの真ん中を７９.８℃に加熱するのに４０秒間かかった。加熱後に、チューブを水浴から取り出し、直ぐに氷浴(〜０℃)に３０分間配置し、４℃で一晩貯蔵した。次にワイヤーカッター及びテンプレートを用いて、ゲルを切って４個の円柱状のスライス(各々は３０ｍｍの長さである)を与えた。各スライスをプラスチック製フィルムで包み、水分が失われるのを防ぎ、密封容器内に配置して、サーモスタット制御された実験室(２０℃)に２時間置いて試験前に平衡に達しさせた。ＴＡ-ＨＤ風合い分析器(Stable Micro Systems, Haslemere, UK)の６０ｍｍ直径の上テフロン（登録商標）プレートと、９５ｍｍ×１０５ｍｍの下テフロン（登録商標）プレートとの間にサンプルを配置した。プレート表面を、パラフィンオイルで潤滑にして、摩擦を少なくした。次にサンプルを、５００Ｎのロードセルを用いて、０.８３ｍｍ/秒の速度で元の高さの８０％に圧縮した。破壊応力及び破壊ひずみを、国際酪農連盟(ＩＤＦ)により開発された試験及び分析プロトコルのドラフト基準に概説される分析方法に基づいたソフトウェアパッケージを用いて各サンプルについて計算した。Hamann, D.D. & MacDonald, G. A., (1992). Rheorogy and texture properties of surimi and surimi-based foods, In T. C. Lanier, & C. M. Lee (編), Surimi technology (PP. 429-500). New York: Marcel Dekker, Inc., and Truong, V.D. & Daubert, C. R. Textural Characterization of cheeses using vane rheometry and torsion analysis Food Engineering and Physical Properties, (2001) 6, 6 716-721, により記載されるように、ゲルの風合いの情報を提供するために、テクスチャマップ中に結果をプロットした。結果を図７に示す。
【００７０】
添加されたカルシウムが０〜８０００ｍｇ/ｋｇタンパク質に増加するにつれ、破壊応力(ゲル硬度)は、８０％超だけ低下し、そして破壊ひずみ(崩壊への抵抗性)は約７０％だけ低下した(エラーバーは、９５％信頼区間を表す)。これらの変化は、強固な粘弾性ゲルから「ドロドロ」のゲルへの変化を説明する。ドロドロのゲルは、柔らかく簡単に破壊されるタイプのゲルである。熱誘導性ＷＰＣゲルがこのように変化した場合、ポンプ、ホモジェナイズ、又は他の高せん断システムを用いてゲルを破壊することが簡単になる。
【００７１】
実施例９.酸性乳清からの熱改質ＷＰＣの製造
パイロット・プラント試行において、(乳酸乳清の限外ろ過及び透析から得られた)７５０ｌの乳清残渣物は、市販のＷＰＣプラントから供給された。この残渣物は、ｐＨ６.０で、２２％の乾燥物質、６５％タンパク質、２０％ラクトース、４％脂肪及び３％灰分(これら全ては乾燥物質に対する割合)を有した。次に残渣物を脱ミネラル水で１５００ｌに希釈した。次に、１０％Ｃａ(ＯＨ)2を用いて希釈された残渣物のｐＨを７に調節した。次に希釈された残渣物を７５０Ｌの二つのロットに分けた。各区分を二種の異なる試行として違う風に処理した。
【００７２】
試行１
オンライン直接蒸気注入(ＤＳＩ)システムを用いて６５℃に加熱し、次に第２のオンラインＤＳＩユニットを用いて希釈残渣物を１２０℃で３分間加熱した。加熱後に、タンパク質溶液を６０℃に急冷却した。加熱されたタンパク質溶液は、次に２５０ｂａｒでホモジェナイズされた。ホモジェナイズされたタンパク質溶液を次に蒸発させた。最終的な蒸発濃度は、３１％の乾燥物質を有した。次に濃縮されたタンパク質溶液をスプレー乾燥して、変性ＷＰＣ粉末を得た。
【００７３】
試行２
希釈された残渣物の第２のロットを、試行１と同じステップの後に処理して、１２０℃で８分間加熱した。さらに、蒸発ステップは、乳清タンパク質溶液を３０％乾燥物質へと濃縮した。
【００７４】
改質乳清タンパク質粉末の組成及び分析を表７に示す。
【００７５】
【表７】
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【００７６】
酸性乳清を原材料として用いて乾燥加熱改質ＷＰＣ生成物を製造することができるということをこの結果は示している。この結果はまた、乳清溶液(８％)の４分又は８分の加熱処理が、粉末の性質に大きな差違をもたらさないということを示す。所望のレベルのタンパク質変性(例えば８０％)を達成するために乳清の加熱処理は、穏和な条件に保持することを必要とするということが示唆される。この結果により、加熱済み乳清タンパク質溶液の高固体(〜３０％)への蒸発が達成可能であるということも示される。これは、かなりの経済的利点を有する。
【００７７】
実施例１０.高固体加熱の証拠
適切な量のチーズＷＰＣ８０粉末(Ａ３９２)を水に再構成することにより、ＷＰＣ溶液(４.５ｌ、２２.４％ＴＳ、〜１８％タンパク質)を調製した。８０００ｍｇのカルシウム/ｋｇタンパク質を添加した後に、ｐＨを６.７に調節した。次に、連続的設定で６５℃にサーモスタットにより維持された水浴中で予め加熱した。水浴上に浮かんでいる４ｍ長の(内直径６ｍｍ)のステンレスコイルへと蠕動ポンプを用いて溶液を送り込んだ。コイルに溶液を通過させた後に、ＷＰＣ溶液は６２±１℃の平均温度を有した。次に、同じセットを用いるが、サーモスタットにより８６℃の水浴で加熱することを用いて溶液をさらに加熱した。溶液をコイルに通してポンプで送った後に、溶液は７９±１℃の平均温度を有した。加熱された溶液をステンレス鋼ビーカーに回収し、そしてオーバーヘッドスターラー(４個の同じ大きさの刃、６ｃｍの直径、１８０ｒｐｍ)を用いて、連続して攪拌した。ステンレスビーカーは、熱水(７８±２℃)を含んだ別の水浴上に浮かべた。ＷＰＣ溶液を１０分間この温度に維持し、次にビーカーを水浴に浮かべて〜６２℃に冷却した。様々な段階で取ったサンプルの粘度を次に、Brookfield viscometerを用いて計測した。結果を表８に示す。
【００７８】
【表８】
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加熱溶液中での変性の度合いを、ＨＰＬＣを用いて評価して、＞９０％であった。
【００７９】
上の結果から、高いＴＳ(２２.３％)又は〜１８％の全タンパク質含量の後に、比較的低い粘度(＜１００ｃｐ)に加熱溶液を維持する一方、タンパク質の多くを熱変性することができるということが示された。この粘度では、加熱された溶液は、ポンプ又は蒸発のいずれかでさらに処理することができる。高せん断混合(ウルトラトラックス(ultraturrax)又はホモジェナイズ)の後に、粘性が有意に低下したことも示される。
【００８０】
実施例１１.再構成されたＷＰＣ５５粉末を用いた熱改質ＷＰＣ５５の製造
パイロットプラント試行において、市販のチーズＷＰＣ５５粉末(Fonterra Cooperative Group Limited, Lichfield)を、最終溶液が１２％乾燥物質を有するように脱ミネラル水に再構成した。ＷＰＣ粉末は、５６.６％タンパク質、３.８％水分、４.０％脂肪、３.８％灰分、及び３１.８％ラクトースを含んだ。再構成溶液はｐＨ７.０を有した。１８００ｍｇカルシウム/ｋｇタンパク質の最終添加比率を達成するように、塩化カルシウムの溶液を加えた。次に実施例１に使用されるのと同じシステムを１２０で４分間用いて溶液を加熱した。加熱されたタンパク質溶液を次に２５０ｂａｒでホモジェナイズし、流下膜式蒸発器を用いて蒸発させた。濃縮された溶液は、３２％の乾燥物質を有した。次に濃縮物をスプレーして、改質ＷＰＣ粉末を得た。当該粉末を分析し、そして結果を表９に示す。粉末は、白色であると記載され、そして通常の官能性を有した。
【００８１】
【表９】
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【００８２】
実施例１２.塩化カルシウムを添加することなく再構成ＷＰＣ５５粉末を用いた熱改質ＷＰＣ５５の生産
別のパイロットプラント試行において、ＷＰＣ溶液(１２％乾燥物質)を、実施例１１に使用されるのと同じＷＰＣ５５を用いて調製した。カルシウムを加えない点を除いて上記実施例１１に使用されるのと同じ方法に従って溶液を処理した。溶液を加熱したときに、加熱溶液は直ぐに密集し、ＤＳＩシステムは、試行時間の１２分後に固まりとなり、試行を中止することとなった。加熱溶液の粘度は、Brookfield粘度計の限界を超えていた(＞１０5ｃｐ)。状況を改善すべく幾つかの試みを行なったが、改善が見られなかった。結果として、この試行からは粉末が生成されなかった。
【００８３】
この例により、カルシウム添加の重要性が示される。熱で再構成されたＷＰＣ溶液のタンパク質含量は、約７％であった。このレベルで、ＷＰＣ溶液は、厚いゲルを形成することができる。このようなゲルは、このようなゲルは、ジスルフィド結合と非共有結合の両方の組み合わせにより形成される(Havea P., Singh H., Creamer, L.K. & Campanella, O. H. Electrophoretic characterization of the protein products formed during heat treatment of whey protein concentrate solutions. Journal of Dairy Research, 65, 79-91, 1998)。塩が不十分なレベルである場合、このようなゲルは、この試行において高温熱処理下で形成される。カルシウムの添加は、タンパク質-タンパク質相互作用を主に非共有結合だけにする。
【００８４】
実施例１３.熱改変ＷＰＣ８０の生産
ＷＰＣ溶液を標準チーズＷＰＣ８０(５０ｌ、１６％乾燥物質、〜１２.８％タンパク質、ｐＨ６.８)により調製し、そしてカルシウムを２５０００ｍｇ/ｋｇタンパク質で加えた。次に再構成された溶液を、Spiroflo チューブ状熱交換器を用いて、間接的に８５℃で４分間加熱した。次に、加熱された溶液を、チューブ状流下膜式蒸発器を用いて蒸発させて、約２９％の乾燥物質含量にし、そしてスプレー乾燥してＷＰＣ粉末を得た。粉末を良好な官能性を有する白色として記載された。次に、この粉末を特徴決定し、そして組成及び性質を表１０に示す。
【００８５】
【表１０】
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【００８６】
この例は、本発明の生成物が、約１３％の開始タンパク質濃度を用いて製造することができるということを示す。２５０００ｍｇ/ｋｇタンパク質の高いカルシウムレベルにおいて、生成物を製造することができることも示している。また、ホモジェナイズをすることなく、比較的微粒子の粉末を製造することができるるということも示している。
【００８７】
本明細書において使用される「含む」という語句は、「少なくとも一部において、〜からなる」を意味し、つまり、当該語句を含む明細書の記載を解釈する際に、各記載中の語句により表される特徴が存在するが、他の特徴も存在してもよいということを意味する。
【００８８】
上野実施例は、本発明の実施を例示するものである。本発明が、多くの変更及びバリエーションを伴なって行なうことができるということを当業者により認められたい。例えば、開始物質として使用される物質を変えてもよいし、処理時間及び温度を変えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明のプロセスのフローチャートである。
【図２】図２は、未加熱対照標準チーズＷＰＣ(Ａ３９２)と改質ＷＰＣ粉末から製造された１％ＷＰＣ溶液のＳＥＣプロフィールを示す。
【図３】図３は、プロセスチーズ製品における、改質ＷＰＣのレベルに対する、応力(黒丸)、硬度(黒四角)、及び融点(黒三角)のグラフである。
【図４】図４は、チーズＷＰＣ熱誘導性ゲルにおけるカルシウムの効果を示す。カルシウムを加えられていない対照(黒丸、白丸)、１ｋｇのタンパク質あたり８４７ｍｇのＣａ+を有するサンプル(黒三角)、２０００ｍｇ/ｋｇタンパク質(白三角)、及び５０００ｍｇ/ｋｇタンパク質(黒四角)が示される。
【図５】図５は、チーズＷＰＣ加熱誘導性ゲルにおけるマグネシウムの効果を示す。Ｍｇ2+が加えられてないもの(黒丸)、２０００ｍｇ/ｋｇタンパク質のＭｇ2+が加えられたもの(白丸)、及び５０００ｍｇ/ｋｇタンパク質のＭｇ2+が加えられたもの(黒三角)が示される。
【図６】図６は、酸性ＷＰＣ加熱誘導性ゲルにおける異なる２価カチオンの効果を示す。対象は(黒丸)で示され、そしてＭｇ2+を加えられたサンプル(白丸８０００ｍｇ/ｋｇタンパク質)、Ｃａ2+を加えられたサンプル(黒三角１６０００ｍｇ/ｋｇタンパク質)、及びＦｅ2+(白三角１６０００ｍｇ/ｋｇタンパク質)を加えられたサンプルが図示される。
【図７】図７は、加熱誘導性の酸性ＷＰＣ加熱誘導性ゲルの風合いにおける添加されたＣａ2+の効果を示す(白丸はカルシウムが加えられておらず、白四角は１０００ｍｇＣａ/ｋｇタンパク質、白三角は２０００ｍｇＣａ/ｋｇタンパク質、白逆三角は３０００ｍｇＣａ/ｋｇタンパク質、白菱形は４０００ｍｇＣａ/ｋｇタンパク質、五角形は５０００ｍｇＣａ/ｋｇタンパク質、十字付きの五角形は８０００ｍｇＣａ/ｋｇタンパク質である)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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