(57)【要約】主としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造から成るＮ結合型グリコシル化パターンを有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む組成物および組成物を産生する方法が開示されている。このＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造は、ＦｃγＲｉπレセプターに対する結合を増加させ、ＦｃγＲＨレセプターに対する結合を減少させる効果がある。
2009507040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む組成物。
【請求項２】
前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセントより多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセントより多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセントより多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のＮ−グリカンが、前記複数のＮ−グリカンの次に最も主要なＮ−グリカン構造よりも約５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、ＦｃγＲＩＩレセプターに対する結合親和性の減少を示す請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＦｃγＲＩＩレセプターがＦｃγＲＩＩａレセプターである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、食作用（マクロファージによる免疫複合体のクリアランス）の減少を示す請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＦｃγＲＩＩレセプターが、ＦｃγＲＩＩｂレセプターである請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、Ｂ細胞を活性化する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、ＦｃγＲＩＩＩレセプターに対する結合親和性の増加を示す請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＦｃγＲＩＩＩレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩａである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＦｃγＲＩＩＩレセプターが、ＦｃγＲＩＩＩｂレセプターである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の増加を示す請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、フコースを本質的に含まない請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、フコースを欠いている請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、成長因子、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βから成る群から選択される抗原に結合する請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ２Ｆｃ領域、ＩｇＧ３Ｆｃ領域、およびＩｇＧ４Ｆｃ領域から成る群から選択されるＦｃ領域を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、フコースを本質的に含まない請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、フコースを欠いている請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、成長因子、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βから成る群から選択される抗原に結合する抗体を含む請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ２Ｆｃ領域、ＩｇＧ３Ｆｃ領域およびＩｇＧ４Ｆｃ領域から成る群から選択されるＦｃ領域を含む請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の組成物を含むキット。
【請求項２５】
免疫グロブリンまたはフラグメントをコードする外来性遺伝子を含み、請求項１に記載の免疫グロブリン組成物を発現するように遺伝子操作されているかまたは選択される真核生物宿主細胞。
【請求項２６】
下等真核生物宿主細胞である請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
複数の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含む組成物を生産する方法であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から本質的に成る複数のＮ−グリカンを含み、
（ａ）請求項２５に記載の真核生物宿主細胞を提供することと；
（ｂ）前記真核生物宿主細胞が前記免疫グロブリンまたはフラグメントを産生するために十分な時間、培地中で前記真核生物宿主細胞を増殖することと；
（ｃ）前記免疫グロブリンまたはフラグメントを単離して前記組成物を生産することとを含む方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、下等真核生物宿主細胞である請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ結合型グリコシル化パターンを有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む組成物および組成物を生産する方法に関する。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎグリカン構造は、免疫グロブリンの特異的エフェクター機能に及ぼす調節的な効果を有する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は、触媒作用、シグナル伝達、細胞間連絡、ならびに分子認識および分子集合を含むヒトおよび他の哺乳動物における多くの必須な機能を仲介する。糖タンパク質は、真核生物で大部分の非サイトゾルタンパク質の大部分を構成する（ＬｉｓとＳｈａｒｏｎ、１９９３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１〜２７）。多くの糖タンパク質は治療目的に利用され、この２０年間に天然の糖タンパク質の組換え型は、バイオテクノロジー産業の大きな部分となっている。治療薬として用いられる組換え型グリコシル化タンパク質の例には、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＨ）が含まれる（Ｃｕｍｍｉｎｇら、１９９１、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １．１１５〜１３０）。組換えにより産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変動は、臨床でアプローチする可能性のある予防薬および治療薬として生産される組換え型タンパク質として、科学界で最近非常に注目されたトピックスであった。
【０００３】
抗体または免疫グロブリンは、体液性免疫応答における中心的な役割を果たす糖タンパク質である。抗体は、体液性と細胞性の防御メカニズムを結び付けているアダプター分子と見なし得る。抗体による抗原特異的認識は、複数のエフェクターメカニズムを活性化する可能性のある免疫複合体の形成を生じ、この複合体の除去と破壊を生じる。免疫グロブリン（Ｉｇ）の一般的なクラスの中で、抗体の５つのクラス（アイソタイプ）であるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを、生化学的ならびに機能的に識別することができるが、可変部分領域に限定されたごくわずかな差異が、抗原結合の特異性の原因となる。免疫グロブリンのこれらの５つのクラスの中に、ラムダ（λ）とカッパー（κ）と呼ばれるＬ鎖の２つのタイプのみが存在する。λまたはκ鎖を有する抗体間に機能的な差異は見いだされてなく、Ｌ鎖の２つのタイプの割合は、生物種の間で異なる。５つのＨ鎖クラスまたはアイソタイプがあり、これらが抗体分子の機能的活性を決定する。それぞれの免疫グロブリンアイソタイプは、免疫応答において特定の機能を有し、これらの特有の機能的な特性は、Ｈ鎖のカルボキシ末端部分により付与され、この特性はＬ鎖とは関連していない。ＩｇＧは、血漿中で最も豊富な免疫グロブリンアイソタイプである（例えばＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊａｎｅｗａｙら、第６版、２００４、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０００４】
ＩｇＧ分子は、不変および可変領域を有するＦａｂ（抗原結合フラグメント）ドメインならびにＦｃ（結晶化するフラグメント）ドメインを含む。それぞれのＨ鎖のＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリカンを免疫グロブリン分子に結合するアスパラギン残基、通常アスパラギン残基２９７（Ａｓｎ−２９７）において、Ｎ結合型グリコシル化のための単一の部位を含んでいる（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２）。
【０００５】
Ｎ結合型オリゴ糖の構造的および機能的側面の分析は、３つの主な理由で生物学的興味がもたれている。すなわち、（１）ＣＨ２ドメインのグリコシル化は、進化の過程で保存され、オリゴ糖の重要な役割が示唆されている；（２）免疫グロブリン分子は、オリゴ糖の不均一性の分析のためのモデル系として役立つ（ＲａｄｅｍａｃｈｅｒとＤｗｅｋ、１９８４；Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、１９８２）；および（３）抗体は、２つのＨ鎖の二量体会合を含み、２オリゴ糖単位を互いに直接に接触させて配置して、その結果、免疫グロブリン分子は、特異的タンパク質と糖質の相互作用および糖質間の相互作用の両方を含む。
【０００６】
免疫グロブリンの異なるグリコシル化パターンは、異なる生物学的性質と関連していることが示されている（ＪｅｆｆｅｒｉｓとＬｕｎｄ、１９９７  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔとＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５：２６〜３２）。しかし、ほんの少数の特異的糖形態だけが、所望の生物学的機能を与えることが知られている。例えば、Ｎ結合型グリカンでフコシル化の減少した免疫グロブリン組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩへの結合が増強し、したがって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強することが報告されていることが示された（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：２６７３３〜２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６〜３４７３）。そして、ＣＨＯ細胞で作られたフコシル化されたＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）ＩｇＧの組成物は、報告によれば、異種起源抗体の組成物よりもはるかに大きく補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）活性を増加させる（Ｒａｊｕ、２００４、米国特許出願公開第２００４／０１３６９８６号）。また、腫瘍に対する最適な抗体は、優先的に結合してＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）を活性化し、阻害性ＦｃγＲＩＩｂレセプターには最小限に結合する抗体であることが示唆されている（Ｃｌｙｎｅｓら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、６：４４３〜４４６）。したがって、免疫グロブリン糖タンパク質の特異的糖形態を富化させる能力が強く望まれている。
【０００７】
一般に、糖タンパク質のグリコシル化構造（オリゴ糖）は、発現宿主および培養条件により異なる。非ヒト宿主細胞で産生される治療用のタンパク質は、ヒトで免疫原性応答を誘発し得る非ヒトグリコシル化、例えば、酵母菌におけるハイパーマンノシル化（Ｂａｌｌｏｕ、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０〜４７０）；植物における、α（１，３）−フコースおよびβ（１，２）−キシロース（Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕら、１９９９、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、９：３６５〜３７２）；チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｏｇｕｃｈｉら、１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７−５〜６２）およびマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、１９９３，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７〜４７９）を含む可能性がある。さらにまた、ガラクトシル化は細胞の培養条件での異なる可能性があり、このことは、いくらかの免疫グロブリン組成物をその組成物の特異的なガラクトースパターンによって免疫原性にさせる可能性のある（Ｐａｔｅｌら、１９９２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：８３９〜８４５）。非ヒト哺乳動物細胞により産生される糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のオリゴ糖構造により密接に関連する傾向がある。したがって、ほとんどの市販の免疫グロブリンは、哺乳動物細胞で産生されている。しかし、哺乳動物細胞は、タンパク質生産用の宿主細胞としていくつかの重大な欠点を有する。哺乳動物細胞でタンパク質を発現するプロセスは、コストのかさむことに加えて、糖形態の不均一な集団を生じ、低い容積測定による力価（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｔｅｒ）を有し、安定な細胞株を構築するために、継続的なウイルスの混入とかなりの時間との両方を必要とする。
【０００８】
異なる糖形態は、薬物動態、薬力学、レセプターの相互作用および組織特異的ターゲッティングが挙げられる治療用の糖タンパク質の特性に、著しい影響を与え得ることが理解されよう（Ｇｒａｄｄｉｓら、２００２、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５〜２９７）。特に、免疫グロブリンに対して、このオリゴ糖構造は、プロテアーゼ抵抗性、ＦｃＲｎレセプターにより媒介される抗体の血清中半減期、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘導する補体複合体Ｃ１への結合、および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）経路の調節に関与するＦｃγＲレセプターへの結合、食作用ならびに抗体フィードバックに関連する特性に影響を及ぼすことができる（ＮｏｓｅとＷｉｇｚｅｌｌ、１９８３；ＬｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗとＤｗｅｋ、１９８３、Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗら、１９８５；Ｗａｌｋｅｒら、１９８９、Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５〜４２８９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
異なる糖形態は異なる生物学的特性と関連しているので、１つまたは複数の特異的糖形態を富化させる能力を、特異的糖形態と特異的生体機能との間の関連性を解明するために用いることができる。所望の生体機能を特異的糖形態パターンと結び付けた後、有利な糖形態構造を富化させた糖タンパク質組成物を生産できる。したがって、特定の糖形態を富化させた糖タンパク質組成物を生産する能力が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、複数の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む組成物であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンの種が、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む組成物を提供する。したがって、本発明は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物を提供する。
【００１１】
特定の実施形態においては、複数のＮ−グリカンの２０モルパーセントより多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る。さらに別の実施形態においては、複数のＮ−グリカンの５０モルパーセントより多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る。さらに別の実施形態においては、複数のＮ−グリカンの７５モルパーセントより多くが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から本質的に成る。さらに別の実施形態においては、複数のＮ−グリカンの９０パーセント以上が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から本質的に成る。他の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のＮ−グリカン構造は、前記複数のＮ−グリカンの次に最も主要なＮ−グリカン構造よりも約５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する。さらに、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する抗ＣＤ２０抗体を含む組成物が提供される。
【００１２】
本明細書の組成物を含む免疫グロブリンまたはフラグメントは、ＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合親和性の減少を示し、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する結合親和性の増加を示す。したがって、１つの態様においては、本発明は、複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成り、前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、ＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合親和性の減少を示す複数のＮ−グリカンを含む組成物を提供する。他の態様では、本発明は複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は複数のＮ−グリカンを含み、主要なＮ−グリカンは本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成り、前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する結合親和性の増加を示す組成物を提供する。
【００１３】
さらなる態様においては、本発明は、複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成り、前記免疫グロブリンまたはフラグメントが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加を示すことが期待される複数のＮ−グリカンを含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様においては、本発明の上記の組成物は、フコースを本質的に含まないかまたはフコースを欠く免疫グロブリンまたはフラグメントを含む。
【００１５】
また本発明の組成物は、医薬組成物および薬剤学的に許容し得る担体を含む。本発明の組成物はまた、精製され診断キットに組み込まれた免疫グロブリンまたはフラグメントの医薬組成物を含む。
【００１６】
本発明はさらに、複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む上述の組成物のいずれか１つを生産する方法であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から本質的に成る複数のＮ−グリカンを含む方法を提供する。１つの態様において、本方法は、この免疫グロブリンまたはフラグメントを発現するように遺伝子操作されているかまたは選択された宿主細胞、好ましくは真核生物宿主細胞を培養するステップを含む。特定の態様では、宿主細胞は、免疫グロブリンまたはフラグメントをコードする外来性遺伝子を含む。宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカンが富化される糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されているかまたは設計されていることが好ましい。したがって、特定の態様では、宿主細胞は、α−１，２−マンノシダーゼ、マンノシダーゼＩＩ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータ、およびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ１）から成る群から選択される１つまたは複数の外来性遺伝子を含む。また上記宿主細胞は、ＯＣＨ１およびホモログによってコードされるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損していることが好ましい。さらなる実施形態では、また上記の宿主細胞は、マンノシルリン酸化活性を欠損しており、さらに別の実施形態においては、また上記宿主細胞はβ−マンノシル化活性を欠損している。したがって、本発明は、複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物を産生する方法であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、前記主要なＮ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、（ａ）上記真核生物宿主細胞を提供することと；（ｂ）真核生物宿主細胞が免疫グロブリンまたはフラグメントを生産するのに十分な時間、培地中で真核生物宿主細胞を増殖させることと；（ｃ）免疫グロブリンまたはフラグメントを分離して組成物を生産することとを含む方法を提供する。
【００１７】
好ましい態様では、宿主細胞は、下等真核生物である。下等な真核細胞には、酵母菌、真菌、襟鞭毛虫類、微胞子虫類、アルベオラータ（ａｌｖｅｏｌａｔｅｓ）（例えば、渦べん毛虫）、ストラメノパイル（ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）（例えば、褐藻類、原生動物）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ）および他の原生生物が挙げられる。酵母菌および真菌には、限定されるものではないが、ピチア属種、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、サッカロミセス属種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ハンゼヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイヴェロマイセス属種、例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ；カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルスニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、フザリウム属種、例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。本発明の好ましい下等真核生物には、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、ピチア属種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、サッカロミセス属種、ハンゼヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイヴェロマイシス属種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、アスペルギルスニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｕｅ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌ���ｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、フザリウム属種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。
【００１８】
したがって、本発明はさらに、さらに複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む上述の組成物のいずれか１つを産生する方法であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより前記組成物は、下等真核生物宿主細胞において、主要なＮ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む方法を提供する。特定の態様では、下等真核生物宿主細胞は、免疫グロブリンまたはフラグメントをコードする外来性遺伝子を含み、宿主細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカンに関して富化されている糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されたかまたは設計されている。したがって、特定の態様では、下等真核生物宿主細胞は、α−１，２−マンノシダーゼ、マンノシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｎＴ１）、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータから成る群から選択される１つまたは複数の外来性遺伝子を含む。上記の下等真核生物宿主細胞は、上述した外来性遺伝子のそれぞれを含むことが好ましい。上記の下等真核生物宿主細胞はまた、遺伝子ＯＣＨ１ｐまたはそれらのホモログによってコードされるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損していることが好ましい。さらなる実施形態では、上記の下等真核生物宿主細胞はまた、マンノシルリン酸化活性を欠損しており（ＰＮＯ１およびＭＮＮ４ｂ遺伝子の欠失または破損）、さらに別の実施形態においては、上記の真核生物宿主細胞は、β−マンノシル化活性も欠損している（β−マンノシル化に関与する１つまたは複数の遺伝子の欠失または破損）。したがって、本発明は、複数の免疫グロブリンまたはフラグメントを含む組成物を生産する方法であって、それぞれの免疫グロブリンまたはフラグメントは、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより組成物は、主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から本質的に成る複数のＮ−グリカンを含み、（ａ）上記の下等真核生物宿主細胞を提供することと；（ｂ）下等真核生物宿主細胞が免疫グロブリンまたはフラグメントを生産するのに十分な時間、培地中で下等真核生物宿主細胞を増殖させることと；（ｃ）免疫グロブリンまたはフラグメントを分離して組成物を生産することとを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンである免疫グロブリンを発現するように設計するかまたは選択した上述の宿主細胞の１つで、ＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する免疫グロブリンまたはフラグメントの結合を増加させ、ＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する免疫グロブリンの結合を減少させる方法、または免疫グロブリンを生産することによりＡＤＣＣを増加させる方法を提供する。
【００２０】
特に定めのない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的な用語および語句は、当業者が通常理解する意味を有する。さらに文脈で必要とされるのでない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。一般に、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学とハイブリッド形成に関連して使用される命名法ならびに技術は、よく知られかつ当業界において一般的に使用されているものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
定義
特記しない限り、以下の用語は以下の意味を有することを理解されたい。
【００２２】
本明細書中で用いられる用語「抗体」、「免疫グロブリン」、「免疫グロブリン（複数）」および「免疫グロブリン分子」は、交換可能に使用される。それぞれの免疫グロブリン分子は、その免疫グロブリン分子がその特異抗原に結合することができるが、本明細書に記載されるように全ての免疫グロブリンは、同じ全体的構造を有するある特有の構造を有している。基本的な免疫グロブリンの構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、２つの同じ１組のポリペプチド鎖を有し、それぞれの１組は１つの「Ｌ」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を定める。Ｌ鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかに分類される。Ｈ鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤとＩｇＥと定める。
【００２３】
ＬおよびＨ鎖は、可変領域および定常領域に再分割される（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、１９８９），第７章を参照のこと）。それぞれのＬ／Ｈ鎖の１組の可変領域は、抗体が結合する部位を形成する。したがって、完全な抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同一である。この鎖は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）に、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域が結合している全て同じ一般的な構造を示す。この２つの鎖のＣＤＲのそれぞれ１組は、フレームワーク領域によって位置調整され、特異的エピトープに結合できる。この用語は、天然の形態ならびにフラグメントおよび誘導体を含む。この用語の範囲に含まれるものとして、免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤが存在する。またこの用語の範囲に含まれるものとして、ＩｇＧのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が存在する。この用語は、最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）ならびに複数のエピトープまたは抗原に結合する抗体組成物を含む。この用語は、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントが、ＣＨ２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位またはそれらの変異体を含むＨ鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの少なくとも一部を含んでいるかまたは修飾されて含んでいる限りは、抗体フラグメントを包含する。この用語に含まれるものには、Ｆｃ領域のみ、例えばイムノアドヘシン（米国特許出願公開第２００４０１３６９８６号）、Ｆｃ融合、および抗体様分子を含む分子がある。あるいは、これらの用語が、少なくともＮ結合型グリコシル化部位を含む少なくともＦａｂ領域の抗体フラグメントを意味する場合がある。
【００２４】
用語「Ｆｃ」フラグメントは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む抗体の『結晶化したフラグメント』Ｃ末端領域を意味する（図１）。用語「Ｆａｂ」フラグメントは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含む抗体の『抗原結合フラグメント』領域を意味する（図１を参照）。
【００２５】
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能な天然に生じる変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が非常に高く、単一の抗原部位に対して向けられている。さらにまた、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を一般的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのｍＡｂは抗原の単一の決定基に向けられている。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリードーマ培養により合成でき、他の免疫グロブリンにより汚染されていないという点で有利である。用語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、により最初に記載されたハイブリードーマ法により作ることができるか、または組換え型ＤＮＡ方法により作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙらによる）を参照のこと）。
【００２６】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」の範囲内の用語「フラグメント」としては、フラグメントが標的分子に特異的に結合する能力を保持する限り、種々のプロテアーゼの消化により生成されたフラグメント、化学的な切断および／または化学的な分離により生成されたフラグメント、ならびに組換えにより生成されたフラグメントが挙げられる。このようなフラグメントには、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。以下において、用語「免疫グロブリン」は、また同様に用語「フラグメント」を含む。
【００２７】
免疫グロブリンとしてはさらに、配列が改変されたが標的分子に特異的に結合する能力を保持する免疫グロブリンまたはフラグメントが挙げられ、異種間のキメラ抗体およびヒト化抗体、抗体融合物、ヘテロメリック抗体複合体および抗体融合物、例えばダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（二重特異性抗体）、単鎖ダイアボディ、ならびにイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が挙げられる（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．、１９９８を参照のこと）。
【００２８】
本明細書中で用いられる用語「本質的に…から成る」とは、明示されたもの（integer）に実質的に影響を及ぼすかもしくは変更する改変または他のものを除外する一方で、明示されたものまたはそのものの集団を包含することを意味するように理解される。Ｎ−グリカンの種類に関して、「本質的に」明示されたＮ−グリカン「から成る」という用語は、糖タンパク質のアスパラギン残基に直接結合しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）においてそのＮ−グリカンがフコシル化されているかどうかに関係なく、Ｎ−グリカンを含むように理解される。
【００２９】
本明細書中で用いられる用語「主として」または「主要な」もしくは「主要である」などのバリエーションは、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、放出されたグリカンを質量分析法、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはＨＰＬＣにより分析した後の中性Ｎ−グリカン合計のうちの最高のモルパーセント（％）を有するグリカン種を意味することが理解されるであろう。換言すれば、語句「主に」とは、他のどんな個々の物質よりも大きなモルパーセントで存在する特定の糖形態のような個別の物質として定める。例えば、ある組成物が、４０モルパーセントで種類Ａから成り、３５モルパーセントの種類Ｂから成り、かつ２５モルパーセントの種類Ｃから成る場合は、この組成物は主に種類Ａを含み、種類Ｂは次に最も主要な種類である。一部の宿主細胞は、中性のＮ−グリカンおよびマンノシルホスフェートなどの荷電したＮ−グリカンを含む組成物を生成し得る。したがって、糖タンパク質の組成物は、複数の荷電および非荷電または中性のＮ−グリカンを含むことができる。本発明で、このことは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンである組成物中の複数の中性Ｎ−グリカン全ての文脈の範囲内である。したがって、本明細書中で用いられる「主要なＮ−グリカン」とは、組成物中の複数の中性Ｎ−グリカン全てのうちの主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であることを意味する。
【００３０】
本明細書中で用いられる、フコースまたはガラクトース等の特定の糖残基を「本質的に含まない」という用語は、この糖タンパク質組成物がこのような残基を含むＮ−グリカンを実質的に欠いていることを示すために用いられる。純度に関して表現される、本質的に含まないとは、上記の糖残基を含むＮ−グリカン構造の量が１０％を超えなく、好ましくは５％未満であり、より好ましくは１％未満であり、最も好ましくは０．５％未満であり、このパーセンテージは重量またはモルパーセントであることを意味する。したがって、本発明に従う糖タンパク質組成物中の実質的に全てのＮ−グリカン構造は、フコース、ガラクトース、またはこの両方を含まない。
【００３１】
本明細書において用いた場合、フコースまたはガラクトースなどの糖残基の検出可能な量が常にＮ−グリカン構造に存在しない場合は、糖タンパク質組成物は、このような特定の糖残基を「欠く」または「欠いている」。例えば、本発明の好ましい実施形態では、この糖タンパク質組成物は、上記で定義された酵母菌（例えば、ピチア属種、サッカロミセス属種、クルイヴェロマイシス属種、アスペルギルス属種）を含む下等真核生物により産生され、これらの生物の細胞はフコシル化されたＮ−グリカン構造の産生に必要な酵素を有していないので、「フコースを欠いている」。したがって、用語「フコースを本質的に含まない」は、用語「フコースを欠いている」を包含する。しかし組成物が一時期、フコシル化されたＮ−グリカン構造を含んでいたか、または上記のようなフコシル化されたＮ−グリカン構造の限られた量ではあはるが検出可能な量を含んでいるとしても、この組成物は「フコースを本質的に含まない」ことがあり得る。
【００３２】
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系細胞との相互作用、ならびに抗体依存性細胞媒介性傷害作用（ＡＤＣＣ）および種々の応答（補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、免疫複合体のクリアランス（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生とＩｇＧの血清中半減期が挙げられる）が以下でそれぞれ定められる：Ｄａｅｒｏｎら、１９９７  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４；ＷａｒｄとＧｈｅｔｉｅ、１９９５、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７〜９４；ＣｏｘとＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、２００１、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３３９〜３４５；Ｈｅｙｍａｎ、２００３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８８：１５７〜１６１，およびＲａｖｅｔｃｈ、１９９７  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９  １２１〜１２５。
【００３３】
本発明は、複数のＮ−グリカンを有する免疫グロブリンまたはフラグメントの集団を含み、主要なＮ−グリカンが本質的に構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成る組成物を提供する。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造は、詳細には［（ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３）（Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ］と表示することができる。
【００３４】
本明細書で本発明者らは、免疫グロブリン上のＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカンが特定の抗体エフェクター機能に影響を及ぼすことを示している。例えば、本明細書で示すように、免疫グロブリンを含み、主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であり、この免疫グロブリンは、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦレセプターおよびＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶレセプターに対する直接的な結合活性の増加を有し、ＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する直接的な結合活性の減少（または欠如）を有する組成物。上記の結合活性を考慮するならば、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンは、食細胞活動の減少を達成しながら、ＡＤＣＣ活性を増加させること、またはＢ細胞による抗体産生を増加させることのような他の抗体エフェクター機能を媒介することが期待される。したがって、組成物は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する複数の免疫グロブリンを含み、その中の免疫グロブリンは、ＦｃγＲＩＩＩレセプターに対する結合活性の増加とＦｃγＲＩＩレセプターに対する結合活性の減少とを有する。したがって、この組成物はＡＤＣＣ活性の増加、Ｂ細胞による抗体産生の増加、および食作用の減少をもたらすことが期待される。
【００３５】
本発明はさらに、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを含む組成物を生産する方法を提供する。主要な糖形態を有する免疫グロブリン組成物を生産する利点は、この生産により、望ましくない効果を誘導し得、かつ／またはさらに有効な免疫グロブリン糖形態の濃度を希薄にし得る、望ましくない糖形態を有する免疫グロブリンの生産および／または免疫グロブリンの不均一な混合物の生産を避けることである。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを含む医薬組成物は、より少ない用量で有効で、したがってより高い有効性または効能を有するかもしれないことが予想される。
【００３６】
１つの態様において、この組成物を含む免疫グロブリン分子は、Ｆｃ領域のＨ鎖ＣＨ２ドメインのアスパラギン残基番号２９７（Ａｓｎ−２９７）でＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造を有し、ここで末端ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン）のヒドロキシル基が２９７位のアスパラギンのアミド基に共有結合している。Ｆｃ領域は、免疫グロブリン分子において抗体エフェクター機能を媒介する。このＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、二量体化免疫グロブリンのそれぞれのＣＨ２領域のそれぞれのＡｓｎ−２９７残基上にあることが好ましい（図１を参照）。したがって、Ａｓｎ−２９７の主要な糖形態が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造である免疫グロブリンの組成物が提供される。あるいは免疫グロブリン分子に見出される１つまたは複数の他の炭水化物部分を、この分子から除去および／または分子に付加でき、したがって免疫グロブリンのグリコシル化部位の数を追加するかまたは削除できる。さらに、免疫グロブリン分子のＣＨ２領域内のＮ結合型グリコシル化部位の位置は、免疫グロブリン分子内の１つまたは複数の他の部位で、アスパラギンまたは他のＮ−グリコシル化部位を導入することにより変更できる。
【００３７】
Ａｓｎ−２９７は、マウスのおよびヒトＩｇＧ分子に通常見出されるＮ−グリコシル化部位であるが（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、１９９１）、Ａｓｎ−２９７部位は、グリコシル化できる免疫グロブリン分子の唯一の部位ではなく、機能のために維持されなければならない部位でもない。突然変異誘発のための既知の方法を用いて、免疫グロブリンをコードする核酸分子を、Ａｓｎ−２９７を含むＮ−グリコシル化部位をコードする核酸配列をＮ−グリコシル化に対して機能しないように欠失するかまたは変更するように改変でき、Ｎ−グリコシル化部位をコードする核酸配列を、免疫グロブリン分子をコードするこの核酸内の別の位置に導入して、天然ではない位置で主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを生産するように改変できる。Ｎ−グリコシル化部位をコードする新たな核酸配列を、上記の核酸（またはＡｓｎ−２９７Ｎ−グリコシル化部位をコードする核酸に）に導入して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が、分子内の２つ以上の部位における主要なＮ−グリカンであるＮ−グリカンを有する免疫グロブリン分子を作製することができる。しかし、Ｎ−グリコシル化部位は、免疫グロブリン分子のＣＨ２領域中に形成することが好ましい。しかし、免疫グロブリンのＦａｂ領域のグリコシル化が、血清抗体のうち３０％に記載されており、これは一般にＡｓｎ−７５に見出される（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．、５１．１３１〜１４８）。したがって、免疫グロブリン分子のＦａｂ領域のグリコシル化は、Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシル化に関連して組み合わせることができる追加の部位であるか、または単独のものである。
【００３８】
一般には、この組成物は、主要なＮ−グリカンが、組換え型免疫グロブリン組成物の次に主要なＮ−グリカン構造よりも少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在するＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である免疫グロブリンを含む。好ましい実施形態では、このＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造が、組換え型免疫グロブリン組成物の次に主要なＮ−グリカン構造よりも少なくとも約１０モルパーセントから約２５モルパーセント多いレベルで存在する。さらに好ましい実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造が、組換え型免疫グロブリン組成物の次に主要なＮ−グリカン構造よりも少なくとも約２５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する。さらに好ましい実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造が、組換え型免疫グロブリン組成物の次に主要なＮ−グリカン構造より多い約５０モルパーセントを超えるレベルで存在する。さらに好ましい実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造が、組換え型免疫グロブリン組成物の次に主要なＮ−グリカン構造より多い約７５モルパーセントを超えるレベルで存在する。最も好ましい実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造が、組換え型免疫グロブリン組成物の次に主要なグリカン構造より多い約９０モルパーセントを超えるレベルで存在する。
【００３９】
免疫グロブリンサブクラスは、Ｆｃレセプターに対する異なる結合親和性を有することが示されている（Ｈｕｉｚｉｎｇａら、１９８９、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２：２３５９〜２３６４）。サブクラスのそれぞれは、本発明の異なる態様で特別な利点を提供する可能性がある。したがって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの混合物を含み、主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である組成物が提供される。さらなる実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンである免疫グロブリンが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧから成る群から選択される組成物が提供される。しかし、好ましい免疫グロブリンは、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から成る群から選択されるヒトＩｇＧまたはヒト化ＩｇＧである。より好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブタイプであることが好ましい。
【００４０】
好ましくは、この組成物は、宿主細胞に導入されたとき、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンである糖タンパク質を生産する核酸によりコードされるモノクローナル免疫グロブリン（抗体）を含んでいる。本明細書でモノクローナル抗体には、例えば「ヒト化抗体」が含まれる。ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植により得ることができる（Ｒ．ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎとＳ．Ｄｕｅｂｅｌ（２００１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５およびこの中の参考文献）。ＣＤＲ移植は、ヒト抗体の超可変ループをモノクローナル抗体（例えばマウス）の超可変ループで置換することから成る。他の方法は、「リサーフェーシング（ｒｅ−ｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」が挙げられる（ＤｕｅｂｅｌとＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００１）、Ｒｏｇｕｓｋａら、（１９９６）。ＣＤＲ移植および可変ドメインのリサーフェーシングによりヒト化した２つのマウスのモノクローナル抗体の比較（A comparison of two murine monoclonal anitbodies humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing）。Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ．９：８９５〜９０４）。抗体をヒト化するさらに別の方法は、Ｖ遺伝子をシャッフリングすることおよび抗原に対して選択することから成る。Ｖ遺伝子のシャッフリングは、これらに制限されるものではないが、ファージディスプレイを用いて実施できる（ＤｕｅｂｅｌとＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００１）、Ｊｅｓｐｅｒｓら、（１９９４）。ファージディスプレイレパートリーから単一のエピトープへヒト抗体の選択を誘導すること(Guiding the selection of human antibodies from pharge-display repertoires to a single epitope)。Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  １２：８９９〜９０３）。したがって、１つの起源のＬ鎖可変ドメインを異なる起源からのＨ鎖定常領域とともにスプライスすること、もしくはその逆もでき、あるいは起源の種または免疫グロブリンのクラスもしくはサブクラスの選定に関係なく、異種のタンパク質と可変または定常ドメインとの融合ができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙらによる）、ＭａｇｅとＬａｍｏｙｉ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．７９〜９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。
【００４１】
ヒト化抗体で最も一般的な形態は、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基により置換されたヒト免疫グロブリンである。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応する全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域および全てまたは実質的に全てのフレームワーク（ＦＲ）領域は、ヒト免疫グロブリン共通配列の領域である。ＦＲ領域は、ＣＤＲに隣接または側方に位置する抗体の可変領域の一部である。一般にこれらのＦＲ領域は、可変領域の立体構造に影響を及ぼす構造的機能をより主力に有し、抗体に対する抗原の特異的結合に直接にはあまり役割を果たさないが、それにもかかわらず、ＦＲ領域は相互作用に影響を及ぼし得る。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもインポートしたＣＤＲまたはＦＲ配列にも存在しない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体機能をさらに改良し、最大限に強化するために加えられる。詳細については、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２４；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７およびＰｒｅｓｔａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６を参照のこと。
【００４２】
本明細書でモノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）をさらに含み、ここでＨ鎖および／またはＬ鎖の一部は、第１の種に由来する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるかあるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しているが、他方この鎖（複数可）の残りの部分は、異なる種から由来した抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるかあるいはその異なる抗体のクラスまたはサブクラス、および少なくとも１つのＣＨ２を含むかもしくは含むように改変されているに限ったこのような抗体のフラグメントに属している。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト免疫グロブリンから由来する配列を含む特定の組換え免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列）である。抗体のＦｖフラグメントは、結合特性および分子全体の特異性を保持する抗体の最小単位である。Ｆｖフラグメントは、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインの非共有結合的に結合したヘテロダイマーである。Ｆ（ａｂ）’２フラグメントは、ジスルフィド架橋により結合したＦａｂフラグメントの両方の腕を含むフラグメントである。実施例１は、ヒトＩｇＧ１の定常領域に融合した抗原ＣＤ２０に対するマウスＩｇＧ１可変ドメインを含むキメラ抗体をコードする発現ベクターの構築を例示する。
【００４３】
ＦｃγＲＩＩＩレセプターに対する、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンの結合の増加
ＦｃγＲＩＩＩａレセプターおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する免疫グロブリン結合のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣの活性化は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域により媒介される。異なる機能が、この領域の異なるドメインにより媒介される。図６Ａおよび６Ｂは、主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する（実施例３に記載のように組換え型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現された）抗ＣＤ２０抗体を含む組成物が、抗ＣＤ２０抗体（例えばＲＩＴＵＸＩＭＡＢ）が、主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有していない組成物と比べて、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに対する結合が増加したことを示す。したがって、本発明は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域が主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリン分子および組成物を提供し、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を欠く免疫グロブリンと比較して、この免疫グロブリン分子は、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する結合が増加した。
【００４４】
興味深いことには、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子二型性（ｇｅｎｅ  ｄｉｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆの２つのアロタイプを生じる（Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：４６６４〜４６６９）。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖに対するホモ接合性遺伝子型は、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢに対するより高い臨床的な応答と関連している（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２、Ｂｌｏｏｄ、９９  ７５４〜７５８）。しかし集団のほとんどは、１つのＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ対立遺伝子を持つ。これらのヘテロ接合個体で、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を介するＡＤＣＣの誘導にあまり有効ではない。しかし、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ様の抗ＣＤ２０抗体が、フコシル基転移酵素活性を欠く宿主細胞で発現する場合、この抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖの両方を介するＡＤＣＣを増強するのに同程度に有効である（Ｎｉｗａら、２００４、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ．１０：６２４８〜６２５５）。本発明の特定の好ましい実施形態における抗体は、フコースをＮ−グリカンに付加しない宿主細胞（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、フコースを付加する能力を欠く酵母菌宿主）で発現する。図５Ａは、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有し、実施例３に記載の組換え型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現する抗ＣＤ２０抗体を含む組成物が、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有していないＲＩＴＵＸＩＭＡＢと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦレセプターに対する結合が約３倍〜４倍増加することを示し、図５Ｂは、この組成物がＲＩＴＵＸＩＭＡＢに比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶレセプターに約１０倍結合が増加することを示している。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する抗ＣＤ２０抗体およびさらにフコースを欠く抗ＣＤ２０抗体はＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆに対する結合を増強し、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢに臨床的な応答が低下した個体を治療するために特に有用であり得ることが考えられる。
【００４５】
ＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンの結合の減少
また免疫グロブリン分子のエフェクター機能は、ＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合を含む。食作用の減少をもたらすように思われるＦｃγＲＩＩｂに対する結合は、Ｂ細胞による抗体産生を減少し、ＡＤＣＣ活性を減少した。図４は、主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する抗ＣＤ２０抗体を含む免疫グロブリンの上記組成物は、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢに比較してＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合が減少したことを示す。したがって本発明は、この免疫グロブリン分子のＦｃ領域に主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有し、ＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合が減少した免疫グロブリン分子および組成物を提供する。
【００４６】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用の増加
主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンのＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の増加は、ＦｃγＲＩＩＩ媒介抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を増加させる可能性もある。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）レセプターが、ＡＤＣＣ活性に関与していることはよく知られている（Ｄａｅｒｏｎら、１９９７  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４）。主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリン分子または組成物のＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩｂへの結合の減少は、ＡＤＣＣ活性を増加させる可能性もある（Ｃｌｙｎｅｓら、２０００、前掲を参照のこと）。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリン分子またはこの免疫グロブリンを含む組成物は、ＡＤＣＣ活性が増加することが予期される。
【００４７】
食作用の減少（マクロファージによる免疫複合体のクリアランス）
さらに別の実施形態では、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンのＦｃγＲＩＩａへの結合の減少は、免疫の複合体のＦｃγＲＩＩａ媒介クリアランス（食作用）を減少させる。ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）レセプターは、マクロファージによる免疫複合体のクリアランスに関与することが示されている（ＣｏｘとＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、２００１、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３３９〜３４５）。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンおよびこの免疫グロブリンを含む組成物は、食作用の減少を示し得ることが考えられる。
【００４８】
Ｂ細胞による抗体産生の増加
ＦｃγＲ調節経路を介する腫瘍に対する抗体の関与が示された（Ｃｌｙｎｅｓら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、６：４４３〜４４６）。具体的にはＦｃγＲＩＩｂが、免疫レセプターのチロシンベースの活性化モティーフ（ＩＴＡＭ）を含むレセプター、例えばＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩに共架橋している場合、これはＩＴＡＭにより媒介されるシグナルを阻害することが知られている。（ＶｉｖｉｅｒとＤａｅｒｏｎ、１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８：２８６〜２９１）。例えば、ＦｃγＲＩＩ−特異的抗体の添加により、ＦｃのＦｃγＲＩＩｂに対する結合が遮断され、Ｂ細胞増殖の増加をもたらす（Ｗａｇｌｅら、１９９９、Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２７３２〜２７４０）。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンおよびこの免疫グロブリンを含む組成物は、ＦｃγＲＩＩｂレセプター結合の減少を媒介し、Ｂ細胞の活性化をもたらし、次にプラズマ細胞による抗体産生を引き起こすと考えられる（Ｐａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｃ．１９９３、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１．３３１〜３６０）。
【００４９】
他の免疫学的活性
好中球上のエフェクター細胞分子の変更された表面発現は、細菌感染に対する感受性を増加させることが示された（Ｏｈｓａｋａら、１９９７  Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９８：１０８〜１１３）。ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞レセプターに対する結合は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現を調節することがさらに示された（Ｂｌｏｍら、２００４、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、４８：１００２〜１０１４））。さらにまた、ＦｃγＲに誘発されたＴＮＦ−αは、ＩｇＧで被覆した赤血球に結合して食菌する好中球の能力も増加させる（Ｃａｐｓｏｎｉら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１１５〜１２４）。したがって、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに対する結合の増加を示す、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンおよびこの免疫グロブリンを含む組成物は、ＴＮＦ−αの発現を増加させる可能性もあることが考えられる。
【００５０】
ＦｃγＲＩＩレセプターおよびＦｃγＲＩＩＩレセプター活性の増加により、リソソームβ−グルクロニダーゼならびに他のリソソーム酵素の分泌が増加することが示された（Ｋａｖａｉら、１９８２、Ａｄｖ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１４１．５７５〜５８２；ＷａｒｄとＧｈｅｔｉｅ、１９９５、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：７７〜９４）。さらにまた、これらのリガンドによる免疫受容体の嵌合後の重要なステップは、これらの内在化およびリソソームへの送達である（Ｂｏｎｎｅｒｏｔら、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７  ４９０６〜４９１６）。したがって、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターおよび／またはＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する結合の増加を示す、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンおよびこの免疫グロブリンを含む組成物は、リソソーム酵素の分泌を増加させる可能性もあることが考えられる。
【００５１】
ＦｃγＲＩＩａへの結合を介するさらに成熟した骨髄性細胞（例えば単核食細胞、顆粒球および好中球）の活性化は、スーパーオキサイド生成の増強をもたらす。さらにまた、好中球によるスーパーオキサイドラジカルの生成は、生体の防御システムの重要なファクターである（Ｈｕｉｚｉｎｇａら、１９８９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２：２３６５〜２３６９）。したがって、ＦｃγＲＩＩａレセプターに対する結合の減少を示す、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンおよびこの免疫グロブリンを含む組成物はまた、スーパーオキサイド生成の減少を与え得ることが考えられる。
【００５２】
もっぱら好中球上に存在するＦｃγＲＩＩＩｂは、免疫複合体の組立てにおいて主要な役割を果たし、この凝集は食作用、脱顆粒、およびオプソニン化された病原体の破壊を導く呼吸性のバーストを活性化する。好中球の活性化は、２つの細胞外ドメインに対応する、タンパク質分解で切断した可溶性形態のレセプターの分泌をもたらす。可溶性のＦｃγＲＩＩＩｂは、ＦｃγＲ依存エフェクター機能の競合阻害により、そして補体レセプターＣＲ３に対する結合を介して調節機能を発揮し、炎症性伝達物質の生成を導く（Ｓａｕｔｅｓ−Ｆｒｉｄｍａｎら、２００３、ＡＳＨＩ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ、１４８〜１５１）。したがって、ＦｃγＲＩＩＩｂレセプターに対する結合の増加を示す、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンおよびこの免疫グロブリンを含む組成物は、免疫複合体の組立てを促進する可能性もあることが考えられる。
【００５３】
主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリン分子を含む組成物の生産
この免疫グロブリンは、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質の組成物を生産するように遺伝子操作された宿主細胞で産生される。一般に、組換え型宿主細胞は、特定の標的抗原に対し特異的な免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする１つまたは複数の核酸を用いて形質転換され、好ましくは安定に形質転換される。１つの実施形態では、免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする核酸は、重なり合うオリゴヌクレオチドを用いてそれぞれ別々に合成し、宿主細胞での発現のために発現ベクター（実施例１を参照）にそれぞれ別々にクローニングする。特定の実施形態において、この核酸によりコードされる組換え型免疫グロブリンは、ヒト化免疫グロブリンである。組換え型宿主細胞は、組換え型細胞の培養に用いる培地中に免疫グロブリンを分泌することが好ましい。次いで組換え型宿主細胞を、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを生産するために適切な条件下で培養する。次いで免疫グロブリンを培地の他の成分から分離して、適切なビヒクルに再懸濁して組成物を作製する。多くの組換え型免疫グロブリンに関して、特定の実施形態のＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2は、Ａｓｎ−２９７のアミド基の窒素に結合されるが、Ｎ−グリカン結合のための部位は、免疫グロブリン分子中またはＦａｂ領域のＮ−グリコシル化部位と組み合わせた異なる部位におけるアスパラギン（Ａｓｎ−２９７以外のもの）であり得る。
【００５４】
組換え型宿主細胞は、真核生物または原核生物宿主細胞、例えば主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造を有する免疫グロブリン組成物を産生するように設計されたかもしくは選択された動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞その他であり得る。
【００５５】
好ましい実施形態では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンである免疫グロブリン組成物は、下等真核生物で生産される。下等真核生物宿主細胞は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を通常は産生しない。しかし下等真核生物を、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作できる。主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子改変された組換え型の下等な真核細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を本来産生するが低収率である哺乳動物細胞よりも好ましい。本明細書に記載されるような組換え型の下等な真核宿主細胞を用いる別の利点は、免疫グロブリンの組成物を、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を再現性良く提供できることである。なおさらなる利点は、下等真核生物細胞が、仔ウシ血清などの動物産物の使用を避ける規定の培地で増殖することができることである。
【００５６】
好ましくは、本発明の組換え型宿主細胞は、ＷＯ  ０２／００８７９、ＷＯ  ０４／０７４４９８、ＷＯ  ０４／０７４４９９、Ｃｈｏｉら、２００３、ＰＮＡＳ、１００：５０２２〜５０２７、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、３０１．１２４４〜１２４６およびＢｏｂｒｏｗｉｃｚら、２００４、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４：７５７〜７６６、およびＤａｖｉｄｓｏｎら、２００４  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４（５）：３９９〜４０７に記述されているような遺伝子操作されたかまたは修飾された下等真核生物宿主細胞である。下等な真核細胞には、酵母菌、真菌、襟鞭毛虫類、微胞子虫類、アルベオラータ（ａｌｖｅｏｌａｔｅｓ）（例えば、渦べん毛虫）、ストラメノパイル（ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）（例えば、褐藻類、原生動物）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ）および他の原生生物が含まれる。酵母菌および真菌には、限定されるものではないが、ピチア属種、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ；サッカロミセス属種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ハンゼヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイヴェロマイセス属種、例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ；カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルスニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、フザリウム属種、例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。本発明の好ましい下等真核生物には、限定されるものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、ピチア属種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、サッカロミセス属種、ハ���ゼヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイヴェロマイシス属種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、アスペルギルスニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｕｅ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、フザリウム属種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。特に好ましい種は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００５７】
主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを産生するある実施形態が、実施例２で示される。実施例２で、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域およびＬ鎖定常領域に結合されたＣＤ２０に特異的なマウスＩｇＧ１のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を含むキメラ免疫グロブリンをコードするベクターを、組換え型酵母菌Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ３７株に導入した（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１．１２４４〜１２４６）。ＹＳＨ３７組換え型酵母菌株は、内在性α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性（Ｏｃｈ１ｐ）を欠き、３つの異種遺伝子を含んでいる。すなわち、小胞体に局在するα−１，２−マンノシダーゼ（ＭｎｓＩＡ）をコードする遺伝子、および全てゴルジに局在するＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）トランスポータ、β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ１またはＧｎＴ１）、およびマンノシダーゼＩＩ（ＭｎｓＩＩ）をコードする遺伝子。一般にこれらの異種遺伝子は、菌類のＩＩ型膜タンパク質とＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の生物由来の触媒ドメイン間の合成的な融合を含む。組換え型酵母菌株で産生される糖タンパク質は、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造を有するので、組換え型酵母菌株で産生される実施例２の免疫グロブリンなどの免疫グロブリンは、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する。図３は、ＹＳＨ３７組換え型酵母菌株で産生される抗ＣＤ２０免疫グロブリンが、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有したことを示す。糖形態の約２０％はＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2から成り、複数の他の糖形態はより少量であった。
【００５８】
さらなる実施形態では、上記の組換え型酵母菌株は、マンノシルリン酸化の排除を生じる、ＰＮＯ１遺伝子およびＭＮＮ４ｂ遺伝子の欠失または破壊を含んでいる（例えば、米国特許出願公開第２００６０１６０１７９号を参照のこと）。マンノシルリン酸化は、荷電したＮ−グリカンの産生をもたらす。このさらなる遺伝的改変は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンであり、免疫グロブリンがヒトで異常な免疫原活性を与える可能性があるマンノシルホスフェート（したがって正味の負電荷）を含まない免疫グロブリン組成物を生産できる組換え型酵母菌株を提供する。他の実施形態では、上記の組換え型酵母菌株は、β−マンノシル化に関与する１つまたは複数の遺伝子の欠失または破壊を含む（ＷＯ２００５１０６０１０および関連する米国特許出願第１１／１１８，００８号を参照）。これらのさらなる遺伝的修飾は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンであり、免疫グロブリンは、ヒトで異常な免疫原活性を与える可能性のあるβ−マンノシル化を含まない免疫グロブリン組成物を生産できる組換え型酵母菌株を提供する。さらに別の実施形態においては、上記の組換え型酵母菌株は、ＰＮＯ１遺伝子およびＭＮＮ４ｂ遺伝子ならびにβ−マンノシル化に関与する１つまたは複数の遺伝子の欠失および破壊を含む。これらのさらなる遺伝的改変は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が主要なＮ−グリカンであり、免疫グロブリンがマンノシルリン酸化およびβ−マンノシル化を含まない免疫グロブリン組成物を生産できる組換え型酵母菌株を提供する。
【００５９】
組換え型酵母菌細胞が、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを生産することが記載されているが、動物細部、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞等を含む他のタンパク質発現宿主系を、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを生産するために用いることができる。上記のタンパク質発現宿主系は、遺伝的に設計されるかまたは改変されるかまたは選択されて、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを発現し得るか、あるいは主要なＮ−グリカン構造としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を天然に生産し得る。設計されたタンパク質発現宿主系が主要な糖形態を有する糖タンパク質を産生する例には、遺伝子ノックアウト／変異（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、ＪＢＣ、２７７  ２６７３３〜２６７４０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞の遺伝子操作（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７  １７６〜１８０）またはこの両方の組合せが挙げられる。あるいは、特定の細胞、例えばニワトリ、ヒトおよびウシは、主要な糖形態を天然に発現する（Ｒａｊｕら、２０００、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０：４７７〜４８６）。これらの細胞は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを生産するように改変することができる。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンまたは組成物の発現を、多くの発現宿主系の少なくとも１つを選択することにより、当業者は実現することができる。発現宿主系としてはさらに、ＣＨＯ細胞：ＷＯ９９２２７６４Ａ１およびＷＯ０３０３５８３５Ａ１、ハイブリドーマ細胞：Ｔｒｅｂａｋら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３０：５９〜７０；昆虫細胞：Ｈｓｕら、１９９７  ＪＢＣ、２７２：９０６２〜９７０、および植物細胞：ＷＯ０４０７４４９９Ａ２が挙げられる。
【００６０】
免疫グロブリンの精製
免疫グロブリンの精製および分離のための方法が知られている（例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．５１〜６３、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８７）；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐｐ．５９〜１０４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１〜２５５、およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５〜２５８を参照のこと）。さらなる実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）に記載された技術を用いて生成された抗体ファージライブラリから、適切な抗体または抗体フラグメントを選択するために対象の抗原を用いて分離できる。
【００６１】
実施例３は、主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された酵母菌細胞で産生された主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリン分子を分離する方法を提供する。単離した免疫グロブリン分子上のグリカンの分析および分布は当業者に知られているいくつかの質量分析法により決定でき、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＬＣＭＳ、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが挙げられるがこれに限定されない。好ましい実施形態では、実施例５に開示されているように、グリカンの分布は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって測定される。
【００６２】
医薬組成物
主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリンを、免疫グロブリンが活性な治療薬である医薬組成物に組み込むことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８０を参照のこと）。好ましい組成物は、投与および治療意図される投与様式に依存する。組成物は同様に、望ましい製剤形態に応じて、動物またはヒトに投与するための医薬組成物を製剤化するのに一般に用いられるビヒクルとして定義づけられている薬学的に受容し得る非毒性の担体または希釈剤を含んでいてもよい。希釈剤は、この組合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。上記の希釈剤の例として、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液を挙げることができる。さらに、この医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性の非治療性の非免疫原性の安定剤等を含むこともできる。
【００６３】
非経口的投与のための医薬組成物は、無菌で、実質的に等張で、発熱性物質を含まず、無菌であり、米食品医薬品局または同様の機関のＧＭＰに従って調製される。この組成物は、無菌の液体、例えば水、オイル、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールであり得る製薬担体と共に生理学的に許容可能な希釈剤中の、この物質の溶液または懸濁液の注射可能な用量で投与することができる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等が組成物中存在することができる。医薬組成物の他の成分には、石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、および鉱物油の成分がある。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射可能な溶液のための好ましい液体担体である。組成物は、活性成分の持続的放出ができるように製剤化できる蓄積（デポー）注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。典型的には、組成物は、液体の溶液または懸濁液として注射可能なものとして調製される。注射の前に、液体ビヒクル中の溶液または懸濁液にするのに適切な固体形態に調製することもできる。上記のように、調製物を乳化するかまたはリポソームまたはミクロ粒子、例えばポリ乳酸、ポリグリコリド、もしくはアジュバント効果増強のためのコポリマーに封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８、９７〜１１９（１９９７）を参照のこと。
【００６４】
診断薬
主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する免疫グロブリン分子を、種々の診断キットおよびアレイなどの他の診断薬に組み込むこともできる。免疫グロブリンは、マイクロタイターディッシュのウェルなどの固相に、前もって結合して提供されることが多い。キットはまた、免疫グロブリン結合および標識化を検出するための試薬を含み、キットの使用法を提供することが多い。イムノメトリクまたはサンドイッチアッセイが、診断キットのための好ましい形式である（米国特許第４，３７６，１１０号、第４，４８６，５３０号、第５，９１４，２４１号、および第５，９６５，３７５号を参照のこと）。抗体アレイは、例えば、米国特許第５，９２２，６１５号、第５，４５８，８５２号、第６，０１９，９４４号、および第６，１４３，５７６号に記載されている。
【００６５】
主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する本発明の免疫グロブリン分子は、適応症、例えば癌、炎症性疾患、感染症、免疫疾患、自己免疫性疾患（特発性血小板減少性紫斑病、関節炎、全身性エリテマトーデスおよび自己免疫性溶血性貧血が挙げられる）に対する多くの治療薬適用を有する。対象の標的としては、成長因子レセプター（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＮＧＦＲおよびＶＥＧＦ）およびこれらのリガンドが含まれる。他の標的としては、Ｇタンパク質レセプターであり、サブスタンスＫレセプター、アンギオテンシンレセプター、α−およびβ−アドレナリンレセプター、セロトニンレセプター、ＰＡＦレセプターが挙げられる（例えば、Ｇｉｌｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６２５〜６４９（１９８７）を参照のこと。他の標的としては、イオンチャネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル）、ムスカリンレセプター、アセチルコリンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、グルタミン酸レセプター、およびドーパミンレセプターが挙げられる（Ｈａｒｐｏｌｄ、Ｕ．Ｓ．５，４０１，６２９およびＵ．Ｓ．５，４３６，１２８を参照のこと）。他の標的は、接着タンパク質（例えばインテグリン）、セレクチン、および免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーである（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：４２５〜４３３（１９９０）；Ｏｓｂｏｒｎ、Ｃｅｌｌ  ６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ  ６９：１１（１９９２）を参照のこと）。他の標的は、サイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）ならびに顆粒球単核細胞コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である。Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌら編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ  １９９１）を参照のこと。他の標的は、ホルモン、酵素、ならびに細胞内および細胞間メッセンジャー、例えば、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣである。対象の他の標的は、白血球抗原、例えばＣＤ２０およびＣＤ３３である。薬剤が、対象の標的でもあり得る。標的分子はヒト、哺乳類または細菌であり得る。他の標的は、抗原、例えばウイルスおよび細菌の両方の微生物病原体、および腫瘍由来のタンパク質、糖タンパク質および炭水化物である。さらに別の標的が、Ｕ．Ｓ．４，３６６，２４１に記載されている。
【００６６】
本発明の方法および技術は、当分野では周知であり、特記しない限り本明細書全体を通じて引用されて述べられる種々の一般およびさらに特定の参考文献に記載される通常の方法に従って一般に実施する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２年までの補遺）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ（１９９０）；ＴａｙｌｏｒとＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖｏｌ  Ｉ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖｏｌ  ＩＩ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊａｎｅｗａｙら、第６版、２００４、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００６７】
本明細書で述べられた全ての刊行物、特許および他の参考文献は、ここに全体を参考として本明細書に組み入れることとする。
【００６８】
以下の実施例はさらに本発明の理解を深めるためのものである。
【実施例１】
【００６９】
ヒトＬ鎖定常領域に融合したマウスＬ鎖可変領域を有するＬ（軽）鎖融合タンパク質およびヒトＨ鎖定常領域に融合したマウス可変Ｈ鎖領域から成るＨ（重）鎖融合タンパク質から成るキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をコードするベクターが、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された組換え型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を産生するために構築された。
【００７０】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現のためのキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＤＸ−ＩｇＧ１をコードする核酸のクローニングは、本質的には以下の通りであった。ＤＸ−ＩｇＧ１キメラ抗体のＬ鎖およびＨ鎖は、マウス可変領域およびヒト定常領域から成る。マウス／ヒトキメラＬ鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号１に示し、マウス／ヒトキメラＨ鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号２に示す。核酸をコードするＨ鎖およびＬ鎖を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より購入した重なり合うオリゴヌクレオチドを用いて合成する。
【００７１】
Ｌ鎖可変領域をコードする核酸を合成するために、１５個の重なり合うオリゴヌクレオチド（配列番号５〜１９）を購入し、ＰＣＲ反応でＥＸ  ＴＡＱ（Ｔａｋａｄａ）を用いてアニールして、５’ＭｌｙＩ部位を有するＬ鎖可変領域をコードする核酸を生成した。次いでこのＬ鎖可変をコードする核酸を、５’ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｌ／ｕｐ（配列番号２０）、３’可変／５’不変プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｕｐ（配列番号２１）、３’定常領域プライマーＬｆｕｓｉｏｎ  ＲＴＶＡＡＰＳ／ｌｐ（配列番号２２）および３’ＣＤ２０Ｌ／ｌｐ（配列番号２３）を用いるオーバーラップＰＣＲより、Ｌ鎖定常領域（配列番号３）（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）をコードする核酸とインフレームで結合した。次いで、キメラマウス−ヒトＬ鎖フラグメント（５’ＡＧ塩基対を含む）をコードする最終のＭｌｙＩ核酸を、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入し、ｐＤＸ３４３を得た（図２Ａ）。
【００７２】
Ｈ鎖については、マウスＨ鎖可変領域をコードする核酸配列に対応する１７個の重なり合うオリゴヌクレオチド（配列番号２４〜４０）をＩＤＴから購入して、ＥＸ  ＴＡＱを用いてアニールした。次いで、マウスＨ鎖可変フラグメントをコードするこの核酸を、５’ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｈ／ｕｐ（配列番号４１）、５’可変／不変プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｕｐ（配列番号４２）、３’可変／不変プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｌｐ（配列番号４３）、および３’定常領域プライマーＨＦｃｋｐｎ１／ｌｐ（配列番号４４）を用いるオーバーラップＰＣＲにより、ヒトＨ鎖定常領域（配列番号４）（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ）をコードする核酸とインフレームで結合した。キメラマウス−ヒトＨ鎖フラグメント（５’ＡＧ塩基対を含む）をコードする最終のＭｌｙＩ核酸を、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターに挿入して、ｐＤＸ３６０を得た（図２Ｃ）。
【００７３】
完全長キメラＬ鎖および完全長キメラＨ鎖をコードする核酸を、Ｍｌｙ１−Ｎｏｔ１核酸フラグメントとしてそれぞれのＴＯＰＯベクターから分離した。次いで、これらのＬ鎖およびＨ鎖をコードする核酸フラグメントを、４個の重なり合うオリゴヌクレオチド−Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰｌ−ＥｃｏＲＩ、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＬＰ１、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ２およびＰ．ＢｉＰ／ＬＰ２（それぞれ配列番号４６〜４９）を用いて、それぞれＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列（配列番号４５）に連結し、次に、ｐＰＩＣＺＡのＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ１部位に連結して、Ｋａｒ２−Ｌ鎖およびＡＯＸ１転写終結配列（ＡＯＸ１ターミネーターまたはＴＴ）を持つｐＤＸ３４４（図２Ｂ）ならびにＫａｒ２−Ｈ鎖を持つｐＤＸ４６８（図２Ｅ）を得た。
【００７４】
次いで、ｐＤＸ３４４由来のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、染色体への組込みのためのＡＯＸ２プロモーター遺伝子を含むｐＢＫ８５にサブクローニングしてｐＤＸ４５８を得た（図２Ｄ）。
【００７５】
次いで、Ｈ鎖を持つｐＤＸ４６８由来のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＤＸ４５８にサブクローニングしてｐＤＸ４７８を得た（図２Ｆ）、そしてこれはＡＯＸ１プロモーターの制御下で、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の完全長のキメラＨ鎖およびＬ鎖の両方をコードする。ｐＤＸ４７８によりコードされるキメラ抗体を、ＤＸ−ＩｇＧ１と名付けた。次いで、ＡＯＸ２遺伝子座への組込みのために、ゼオシン耐性を用いて選択したトランスフォーマントで形質転換の前に、プラスミドｐＤＸ４７８をＳｐｅＩで線状にした（実施例２を参照）。
【００７６】
ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ／ＲＩＴＵＸＡＮは、Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡから購入した抗ＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧ１である。
【００７７】
ＰＣＲ増幅。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を、全てのＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡ、１２５μＭのｄＮＴＰ、それぞれ０．２μＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ＥＸ  ＴＡＱポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）、ＥＸ  ＴＡＱポリメラーゼまたはｐＦＵ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＦＵ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを含んでいた。ＤＮＡフラグメントを、最初の熱変性ステップ９７℃、２分間を伴い、９７℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で９０秒間のサイクルを３０回、そして７２℃で７分間の最終伸長ステップで増幅した。
【００７８】
ＰＣＲサンプルを、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡバンドを摘出して、Ｑｉａｇｅｎ製のＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。脱イオン化Ｈ2Ｏで溶出した最終のＰＣＲ（全て３つのフラグメントの重複部分）を除いて、全てのＤＮＡ精製は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で溶出した。
【実施例２】
【００７９】
この実施例は、組換え型酵母菌細胞で、ｐＤＸ４７８またはｐＪＣ１４０によりコードされた主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するキメラヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を生産する方法を示す。
【００８０】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＹＳＨ３７へのＩｇＧベクターの形質転換（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３）は、本質的には以下の通りだった。ｐＤＸ４７８のベクターＤＮＡを、酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍになるように添加して調製した。次いでＤＮＡサンプルに、氷冷１００パーセントエタノールを最終濃度７０％になるように添加した。ＤＮＡを遠心（１２０００ｇ×１０分）してペレット化し、７０％の氷冷エタノールで２回洗浄した。ＤＮＡを乾燥し、５０μＬのｌ０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に再懸濁した。
【００８１】
形質転換する酵母菌細胞は、ＢＭＧＹ（緩衝化最小グリセロール；１００ｍＭ  リン酸水素二カリウム、ｐＨ６．０；１．３４％  酵母窒素原基礎培地；４×１０-5％  ビオチン；１％  グリセロール）中での少量培養を、Ｏ．Ｄ．約２〜６に増殖させて調製した。次いで酵母菌細胞を、１Ｍソルビトールで３回洗浄し、約１〜２ｍＬの１Ｍソルビトールに再懸濁してエレクトロコンピテントにした。ベクターＤＮＡ（１〜２μｇ）を１００μＬのコンピテントな酵母菌と混合し、１０分間氷上でインキュベートした。次いで酵母菌細胞を、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００でパラメータ；１．５ｋＶ  １２９オーム、および２５μＦを用いて、エレクトロポレートした。１ミリリットルのＹＰＤＳ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍソルビトール）を、エレクトロポレートした細胞に添加した。その後、形質転換した酵母菌を、ゼオシンを含む選択性寒天平板に播種する。
【００８２】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでのＩｇＧ１産生の培養条件は、本質的に以下の通りであった。ｐＤＸ４７８で形質転換した上記ＹＳＨ３７株の単一のコロニーを、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ遠心チューブ中の１０ｍＬのＢＭＧＹ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％の酵母窒素原基礎培地、４×１０の５％ビオチン、および１％グリセロールから成る）に播種した。培養を、１７０〜１９０ｒｐｍで振盪しながら２４℃、４８時間、培養が定常期に至るまでインキュベートした。次いで、１００ｍＬのＢＭＧＹを５００ｍｌのバッフルフラスコに添加する。次いで種培養物を１００ｍＬのＢＭＧＹ培地を含むバッフルフラスコに移した。この培養を、１７０〜１９０ｒｐｍで振盪して２４℃で２４時間インキュベートした。フラスコの内容物を２本の５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ遠心チューブにデカントし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この細胞ペレットを、グリセロールを含まない２０ｍＬのＢＭＧＹで１回洗浄し、次いで２０ｍｌのＢＭＭＹ（１％グリセロールの代わりに１％ＭｅＯＨを有するＢＭＧＹ）を用いて穏やかに再懸濁した。懸濁した細胞を２５０ｍＬのバッフルフラスコに移した。培養物を、１７０〜１９０ｒｐｍの振盪により２４℃で２４時間インキュベートした。次いでフラスコの内容物を、２本の５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ遠心チューブにデカントし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。実施例６に記載のように、培養上清をＥＬＩＳＡで分析して、タンパク質を分離する前におおよその抗体力価を測定する。
【００８３】
培養上清の抗体の定量を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により実施した。高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、１０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中、２４μｇのヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｂｉｏｃａｒｔａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で被覆し、４℃で一夜インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後、漸増量の培養上清抗体（０．４、０．８、１．５、３．２、６．２５、１２．５、２５および５０μＬ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した。最後の洗浄後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液で添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄した。製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の説明書に従い、プレートをＴＭＢ基質キットを用いて分析した。
【００８４】
ｐＤＸ４７８を組換え型酵母菌株ＹＳＨ３７に形質転換する上記に示した方法に従って、酵母菌株ＤＸ５５４を生成した。
【実施例３】
【００８５】
実施例２で生成されたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の精製は、本質的に以下の通りであった。ｐＤＸ４７８で形質転換した酵母菌細胞により生成された抗体を、ＤＸ−ＩｇＧ１と名付けた。
【００８６】
抗体を、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて培養上清から捕捉した。抗体を、Ｔｒｉｓ−グリシンｐＨ３．５で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて中和した。さらに精製を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて実施した。ＨＩＣカラムの特定のタイプは抗体に依存する。ＤＸ−ＩｇＧ１に対しては、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（オクチルＳＥＰＨＡＲＯＳＥを用いることもできる）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（７．０）、１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4緩衝液で用い、１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4で始まり、０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4まで減少する直線濃度勾配の緩衝液で溶出した。フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラムからの抗体分画をプールし、カチオン交換（ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを介する最終的精製のために、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ５．２緩衝液と交換した。抗体を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いる直線濃度勾配で溶出した。ＤＸ−ＩｇＧ１抗体を、実施例２に従って増殖したＤＸ５５４培養物の培地から分離した。
【００８７】
クロマトグラフィー分画のタンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて測定し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６）７２、２４８〜２５４）、標準としてアルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いた。
【実施例４】
【００８８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製された抗体の検出は以下の通りであった。
【００８９】
精製したＤＸ−ＩｇＧ１抗体を、適量のサンプルローディング緩衝液と混合し、製造業者の説明書（ＮｕＰＡＧＥ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従い、プレキャストゲルを用いるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。ゲルタンパク質を、クーマシーブリリアントブルー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で染色した。
【実施例５】
【００９０】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を、実施例２で生成された主要な中性Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するＤＸ−ＩｇＧ１抗体のＡｓｎ結合オリゴ糖の分析に用いた。
【００９１】
Ｎ結合型グリカンを、Ｐａｐａｃらの改良した手順を用いて抗体から遊離した（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８、４４５〜４５４（１９９８）。簡単に述べると、抗体サンプルを変性し、９６穴ＰＶＤＦメンブレンプレートにアプライした。次いでサンプルを、ジチオトレイトールで還元し、ヨード酢酸でカルボキシメチル化した。次いでウェルをポリビニルピリジンでブロックした。次いで抗体サンプルを、３７℃で１６時間、３０μＬの１０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８．３）中で１ｍＵのＮ−グリカナーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）とインキュベーションして脱グリコシルした。次いで遊離したグリカンを含む溶液を、遠心によりＰＶＤＦメンブレンから除去し、蒸発させて乾燥した。それぞれのウェルからの乾燥したグリカンを、１５μＬの水に溶解し、０．５μＬをステンレス鋼ＭＡＬＤＩサンプルプレート上へスポットし、０．５μＬのＳ−ＤＨＢマトリックス（９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸／１．１水／アセトニトリル中の１ｍｇ／ｍＬの５メトキシサリチル酸／０．１％トリフルオロ酢酸）と混合して乾燥させた。イオンを、４ナノ秒のパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）の照射により生成した。装置を１２５ナノ秒ディレイ（ｄｅｌａｙ）および２０ｋＶの加速電圧でディレイドエクストラクションモード（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）で作動した。グリッド電圧は、９３．００％であり、ガイドワイヤー電圧は、０．１％であり、内部の圧力は、５×１０7ｔｏｒｒ（１ｔｏｒｒ＝１３３Ｐａ）未満であり、低質量ゲート（ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｇａｔｅ）は８５０Ｄａであった。スペクトルは１００〜２００のレーザーパルスの合計から生成され、５００ＭＨｚのデジタイザで得た。Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2（Ｍｒ１２５７［Ｍ+Ｎａ］+）オリゴ糖を、外部分子量標準として用いた。全てのスペクトルは、ポジティブイオンモードでこの装置で生成された。
【００９２】
図３は、実施例２のプロトコルに従いＹＤＸ５５４細胞により生成されたＤＸ−ＩｇＧ１抗体を含む発酵番号Ｆ０６０７０８由来の組成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。図３は、この組成物の主要なＮ−グリカン構造が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であることを示す。しかし図３に示すように、組成物は他のＮ−グリカン構造も含む。これらのＮ−グリカンには、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ4ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ7ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ6ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ8ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2、およびＭａｎ10ＧｌｃＮＡｃ2が挙げられる。
【００９３】
種々の中性Ｎ−グリカン構造の相対的な量を測定するために、ＨＰＬＣを実施して、上記のＮ−グリカン構造のそれぞれに対応するピークの下の領域を、強度対保持時間を測定するＨＰＬＣスキャンから測定した。このＨＰＬＣは、ＰＲＥＶＡＩＬ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ＥＳ  ５μｍ  ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ（Ｃａｔ＃３５１０１、Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ａｖｏｎｄａｌｅ、ＰＡ）を用いる高速アミノ−シリカグリカン分離であった。サンプル量は、４５のμＬであり、溶媒はアセトニトリルおよびＬＳＳ（５０ｍＭのＮＨ4蟻酸塩  ｐＨ４．４）であった。流速は１．０ｍＬ／分で、カラム温度は３０℃であった。勾配は以下の通りであった：時間０、８０％アセトニトリル：２０％ＬＳＳ；時間５０、４０％アセトニトリル：６０％ＬＳＳ；時間５５、３０％アセトニトリル：７０％ＬＳＳ；時間６０、８０％アセトニトリル：２０％ＬＳＳ；および時間７０、８０％アセトニトリル：２０％ＬＳＳ。ＨＰＬＣの結果を表１に示す。ＨＰＬＣ分析は、主要なＮ−グリカン構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2が、全中性Ｎ−グリカン構造の約２０％を構成することが見いだされたことを示した。
【００９４】
【表１】
2009507040.tif 000003
【実施例６】
【００９５】
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂに対するＦｃレセプターの結合アッセイを、Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７６：６５９１〜６６０４に記載されたプロトコルに従って実施した。
【００９６】
ＦｃγＲＩＩｂ結合アッセイのために、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１μｇ／ｍＬでＦｃγＲＩＩｂ融合タンパク質を４℃で４８時間、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ，、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）上へ被覆した。プレートを、２５℃で１時間、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ＤＸ−ＩｇＧ１またはＲＩＴＵＸＩＭＡＢおよびＨＲＰ結合Ｆ（Ａｂ’）２抗Ｆ（Ａｂ’）２の２：１モル量を２５℃で１時間混合して、ＤＸ−ＩｇＧ１またはＲＩＴＵＸＩＭＡＢ二量体複合体を、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）中に調製した。次いで二量体複合体を、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：２に系列希釈し、２５℃で１時間プレート上へ被覆した。使用した基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（ＴＭＢ）であった。４５０ｎｍの吸光度を、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）の説明書に従い読み取った。
【００９７】
ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ結合アッセイ用に、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ融合タンパク質またはＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ融合タンパク質を、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４中、それぞれ０．８μｇ／ｍＬおよび０．４μｇ／ｍＬで、４℃で４８時間、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）上へ被覆した。プレートを、２５℃で１時間、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックした。ＤＸ−ＩｇＧ１またはＲＩＴＵＸＩＭＡＢおよびＨＲＰ結合Ｆ（Ａｂ’）２抗Ｆ（Ａｂ’）２の２：１モル量を２５℃で１時間混合して、ＤＸ−ＩｇＧ１またはＲＩＴＵＸＩＭＡＢ二量体複合体を１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中の）中に調製した。次いで二量体複合体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２に系列希釈し、２５℃で１時間プレート上へ被覆した。使用した基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｎｅｓ、Ｉｎｃ．）であった。製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）の指示に従って４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【００９８】
ＦｃγＲＩＩｂ、ならびにＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶと、ＹＤＸ５５４（ＤＸ−ＩｇＧ１を発現するＹＳＨ３７株）で産生された糖タンパク質に対する上記の方法に従って得られた結合の結果を、それぞれ図５および６Ａおよび６Ｂに示す。
【００９９】
図４は、主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する抗ＣＤ２０抗体を含む上記組成物は、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢに比べてＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合が減少したことを示す。
【０１００】
図５Ａは、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有し、実施例３に記載したように組換え型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現した抗ＣＤ２０抗体を含む組成物は、主要なＮ−グリカンとして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有していないＲＩＴＵＸＩＭＡＢと比べて、ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦレセプターに対して約３〜４倍結合が増加したことを示す。
【０１０１】
図５Ｂは、この組成物がは、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢに比べＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶレセプターに対して約１０倍結合が増加したことを示す。したがって、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有する糖タンパク質を生成するように遺伝子操作した細胞系から生成される抗体組成物は、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合が減少し、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合が増加した。
【０１０２】
配列の説明
配列番号１は、ＤＸ−ＩｇＧ１Ｌ鎖の核酸配列をコードする。
配列番号２は、ＤＸ−ＩｇＧ１Ｈ鎖の核酸配列をコードする。
配列番号３は、ＩｇＧ１Ｌ鎖のヒト定常領域の核酸配列をコードする。
配列番号４は、ＩｇＧ１Ｈ鎖のヒト定常領域の核酸配列をコードする。
配列番号５〜１９は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＸ−ＩｇＧ１のマウスＬ鎖可変領域の合成に用いた１５個の重なり合うオリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号２０〜２３は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウスのＬ鎖可領域をヒトＬ鎖定常領域に連結するために用いられた４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号２４〜４０は、ＰＣＲによるＤＸ−ＩｇＧ１のマウスＨ鎖可変領域を合成するために用いられた１７個の重なり合うオリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号４１〜４４は、ＤＸ−ＩｇＧ１のマウスＨ鎖可変領域をヒトＨ鎖定常領域に連結するために用いられた４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号４５は、Ｎ末端ＥｃｏＲＩ部位を有するＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列をコードする核酸配列をコードする。
配列番号４６〜４９は、Ｋａｒ２シグナル配列をＤＸ−ＩｇＧ１のＬおよびＨ鎖に連結するために用いられた４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
【０１０３】
本明細書に記載された本発明を例示された実施形態を参照して説明したが、本発明は、本明細書に限定されないことを理解されたい。当業者および本明細書の教示へのアクセスにより、これらの範囲内の追加的な修飾および実施形態は理解できるであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付された請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、それぞれのＣＨ２鎖のＡｓｎ２９７にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2  Ｎ−グリカン構造を有する免疫グロブリン分子の模式図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターでＤＸ−ＩｇＧ１  Ｌ鎖をコードするｐＤＸ３４３のプラスミド地図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｋａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列およびｐＤＸ３４３由来のＤＸ−ＩｇＧ１  Ｌ鎖をコードするｐＤＸ３４４のプラスミド地図を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターでＤＸ−ＩｇＧ１  Ｈ鎖コードするｐＤＸ３６０のプラスミド地図を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＡＯＸ２プロモーターをコードするｐＰＩＣＺＡベクター中にｐＤＸ３４４由来のＫａｒ２  ＳＳおよびＬ鎖をコードするｐＤＸ４５８のプラスミド地図を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、Ｋａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列およびｐＤＸ３６０からのＤＸ−ＩｇＧ１由来のＤＸ−ＩｇＧ１  Ｈ鎖をコードするｐＤＸ４６８のプラスミド地図を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ｐＤＸ４５８にサブクローニングしたＫａｒ２  ＳＳおよびｐＤＸ３６０由来のＤＸ−ＩｇＧ１  Ｈ鎖をコードするｐＤＸ４７８のプラスミド地図を示す（実施例１）。
【図３】図３は、ＹＤＸ５５４株から分離されたサンプルＦ０６０７０８のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（ＹＳＨ３７株で発現した主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するＤＸ−ＩｇＧ１）。
【図４】図４は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するＤＸ−ＩｇＧ１（Ｆ０６０７０８）ＦｃγＲＩＩｂに対する結合とＲＩＴＵＸＩＭＡＢのＦｃγＲＩＩｂに対する結合とを比較したＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するＤＸ−ＩｇＧ１（Ｆ０６０７０８）のＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦフェノタイプに対する結合とＲＩＴＵＸＩＭＡＢのＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦフェノタイプに対する結合とを比較したＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を有するＤＸ−ＩｇＧ１（Ｆ０６０７０８）ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶフェノタイプに対する結合とＲＩＴＵＸＩＭＡＢのＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶフェノタイプに対する結合とを比較したＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。
【図１】
2009507040.tif 000004
【図２Ａ】
2009507040.tif 000005
【図２Ｂ】
2009507040.tif 000006
【図２Ｃ】
2009507040.tif 000007
【図２Ｄ】
2009507040.tif 000008
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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