(57)【要約】  本発明は、少なくとも７０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。前記ポリペプチドは、ボツリヌス神経毒ＡのＨＣ−断片と結合する。ただし、ポリペプチドは、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃではない。
2009513118.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ボツリヌス神経毒ＡのＨｃ−断片と結合するポリペプチド（ただし、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃではない）。
【請求項２】
アミノ酸配列の少なくとも８０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列の少なくとも９０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列の少なくとも９５％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは、最高５個のアミノ酸、特に、最高１個のアミノ酸の付加、置換、欠失、挿入および／または反転によって、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と異なる、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列の少なくとも７０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一である、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列の少なくとも８０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一である、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列の少なくとも９０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一である、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列の少なくとも９５％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一である、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ボツリヌス神経毒ＡのＨｃ−断片と結合する、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）の単離ポリペプチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含有し、発現制御に適したプロモーターをさらに含有し、前記のポリペプチドをコードする核酸が前記のプロモーターによって制御される、ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸および／または請求項１２に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、適当な宿主細胞における請求項１１に記載のポリペプチドおよび／または請求項１２に記載のベクターをコードする核酸の組換え発現と、場合により、それ自体公知の方法で調製したポリペプチドを単離することとを含む方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１６】
少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列と結合する、抗体またはその断片。
【請求項１７】
シナプス小胞糖タンパク質２Ｃのボツリヌス神経毒との結合をブロックする、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドおよび／または請求項１６または１７に記載の少なくとも１種の抗体を含む薬剤組成物。
【請求項１９】
哺乳類においてＢｏＮＴ／Ａの神経毒性を低減する方法であって、哺乳類に、ＢｏＮＴ／Ａの、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列との結合を、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも５０％、特には、少なくとも８０％減少させる薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
哺乳類に、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ）の管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列を有し、ＢｏＮＴ／ＡのＳＶ２Ｃとの結合を減少させるポリペプチドを投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類に抗体を投与し、ＢｏＮＴ／Ａの、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ）の管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列との結合を減少させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳類に薬剤を投与し、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）の発現を減少させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
薬剤がアンチセンス分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＢｏＮＴ／Ａの治療的処置または化粧用途の際の過剰投与後の、ボツリヌス中毒、中毒においてＢｏＮＴ／Ａの神経毒性を低減するために、または予防目的で用いられる、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳類がヒトである、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＢｏＮＴ／Ａの、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）との結合を減少させる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）薬剤をＢｏＮＴ／ＡおよびＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ（４５４〜５７９）の溶液と接触させるステップと、
（ｂ）結合しているＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ（４５４〜５７９）の量を調べるステップと、
（ｃ）ＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ（４５４〜５７９）と結合しているＢｏＮＴ／Ａの量を減少させる薬剤を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）が、細胞の原形質膜中に埋まっている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
薬剤の存在によって減少された、ＢｏＮＴ／Ａの、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃとの結合が、マウス半横隔膜試験におけるＢｏＮＴ／Ａの神経毒性の低減によって検出される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法によって得られる薬剤。
【請求項３０】
任意の所望のサンプルにおいてボツリヌス菌由来のＢｏＮＴ／Ａを検出する方法であって、
（ａ）ポリペプチドを固相上に固定化し、ポリペプチドが、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列を有し、ＢｏＮＴ／ＡのＳＶ２Ｃとの結合を減少させるステップと、
（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａのポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、固定化されたポリペプチドを、サンプルと接触させるステップと、
（ｃ）ＢｏＮＴ／Ａポリペプチド複合体を溶出するステップと、
（ｄ）複合体またはその成分を検出するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリヌス菌によって形成されるボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）と結合するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、その結果、このポリペプチドはボツリヌス神経毒ＡのＨｃ−断片と結合する（ただし、ポリペプチドはヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃではない）。本発明はさらに、ＢｏＮＴ／Ａと相互作用するＳＶ２Ｃタンパク質のペプチド部分に関する。特に、本発明は、ＢｏＮＴ／Ａの神経毒性を低減するためのアンタゴニストとしての、ＢｏＮＴ／Ａの神経細胞との結合を減少させる物質を同定するための、および種々のマトリックスにおいてＢｏＮＴ／Ａを検出するための手段としての、ポリペプチドおよびそのペプチド部分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、エキソサイトーシスによって伝達物質を放出する。細胞内小胞の膜の、原形質膜との融合が、エキソサイトーシスと呼ばれる。このプロセスの過程で、小胞内容物がシナプス間隙に同時に放出される。２種の膜の融合は、タンパク質シナプトタグミンと反応するカルシウムによって調節されている。シナプトタグミンは、その他の補助因子と一緒に、３種のいわゆる融合タンパク質、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン２およびシンタキシン１Ａの状態を制御する。シンタキシン１Ａおよびシナプトブレビン２が原形質膜および／または小胞膜中に組み込まれているのに対し、ＳＮＡＰ−２５は原形質膜と軽く結合しているだけである。細胞内カルシウム濃度が上昇する限り、３種のタンパク質は互いに結合し、両方の膜が互いに接近し、続いて一緒になって融合する。コリン作動性ニューロンの場合は、アセチルコリンが放出され、筋肉収縮、発汗およびその他のコリン作動によって誘発される反応を引き起こす。
【０００３】
上記の融合タンパク質は、細菌、ボツリヌス菌(C.botulinum)、酪酸菌(C.butyricum)、Ｃ．バラティ(C.baratii)および破傷風菌(C.tetani)によって形成されるクロストリジウム神経毒の軽鎖（ＬＣ）の標的分子（基質）である。
【０００４】
嫌気性グラム陽性細菌ボツリヌス菌は、７種の異なる血清型のクロストリジウム神経毒を産生する。後者はボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ〜ＢｏＮＴ／Ｇ）と呼ばれる。これらの中でも、特に、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂは、ボツリヌス中毒と呼ばれるヒトおよび動物において神経麻痺障害を引き起こす。ボツリヌス菌の胞子は、土壌中に見出すことができるが、不十分に滅菌され、密閉された自家製貯蔵食品中でも生育することがあり、ボツリヌス中毒の多くの場合がこれに起因する。
【０００５】
ＢｏＮＴ／Ａは、すべての既知生物学的物質のうちで最も活性である。わずか５〜６ｐｇの精製でＢｏＮＴ／ＡがＭＬＤ（最小致死量）に相当する。１ユニット（英語：Ｕｎｉｔ、Ｕ）のＢｏＮＴ／Ａは、腹膜内注射後に、各々体重１８〜２０ｇの雌のスイスウェブスターマウスの半数を死亡させるＭＬＤと定義される。７種の免疫学的に異なるＢｏＮＴが特性決定された。それらは、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと表され、血清型特異的抗体での中和によって区別され得る。異なる血清型のＢｏＮＴは、感染動物種において、引き起こされる麻痺の重篤度および期間に関して異なる。したがって、麻痺に関して、ＢｏＮＴ／Ａは、ラットでは、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂよりも５００倍より強力である。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、霊長類では、４８０Ｕ／体重１ｋｇという投与量では非毒性であるとわかっている。同量のＢｏＮＴ／Ａは、霊長類におけるこの物質の致死量の１２倍に相当する。他方、マウスにおけるＢｏＮＴ／Ａ注射後の麻痺期間は、ＢｏＮＴ／Ｅの注射後よりも１０倍長い。
【０００６】
ＢｏＮＴは、病的に過敏性の末梢神経によって引き起こされる骨格筋の運動亢進を特徴とする神経筋障害を治療するために使用されている。ＢｏＮＴ／Ａは、眼瞼痙攣、斜視、多汗症、しわおよび片側顔面痙攣を治療するために米国食品医薬品局によって承認されている。ＢｏＮＴ／Ａと比較して、残りのＢｏＮＴ血清型は明らかにあまり有効でなく、短期間の効力しか示さない。末梢−筋内投与されたＢｏＮＴ／Ａの臨床効果は、通常、１週間以内に気付かれる。ＢｏＮＴ／Ａの１回の単一筋内注射による症状抑制期間は、通常、約３〜６ヶ月である。
【０００７】
クロストリジウム神経毒は、融合器官の種々のタンパク質を特異的に加水分解する。ＢｏＮＴ／Ａ、Ｃ１およびＥはＳＮＡＰ−２５を破壊するのに対し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇならびに破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）は、小胞結合型膜タンパク質（ＶＡＭＰ）２（シナプトブレビン２とも呼ばれる）を攻撃し、ＢｏＮＴ／Ｃ１はさらに、シンタキシン１Ａを破壊する。
【０００８】
クロストリジウム細菌は、神経毒を、各々１２５１〜１３１５個のアミノ酸を有する一本鎖ポリペプチドとして放出する。その後、内在性プロテアーゼがこれらのタンパク質の各々を規定の位置で、各々２つの鎖に開裂する（「ニッキング」）が、２つの鎖はジスルフィド架橋によってまだ連結されている。これらの二重鎖タンパク質がホロ毒素と呼ばれる（ショーン(Shone)ら、（１９８５）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１５１、７５〜８２頁を参照のこと）。この２つの鎖は異なる機能を有する。小さい断片、軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ＝ＬＣ）がＺｎ２＋依存性エンドプロテアーゼに相当し、大きいユニット（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ＝ＨＣ）が軽鎖の輸送手段に相当する。ＨＣをエンドペプチダーゼで処理することによって、２つの５０ｋＤａの断片が得られた（ヒメネス(Gimenez)ら、（１９９３）、ジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー(Journal of Protein Chemistry)１２、３５１〜３６３頁を参照のこと）。アミノ末端側の半分（ＨＮ−断片）は、低ｐＨ値で膜に組み込まれ、ＬＣが神経細胞のサイトゾルに移動する。カルボキシ末端側の半分（ＨＣ−断片）は、もっぱら、神経細胞膜に生じる複合体ポリシアロガングリオシドと、および今日まで部分的にしか同定されていないタンパク質受容体と結合する。後者により、クロストリジウム神経毒の高い神経選択性が説明される。結晶構造により、ＢｏＮＴ／Ａは３つのドメインを配置していることが確認され、これは３ステップの作用機序と一致し得る（レイシー(Lacy)ら（１９９８）ネイチャー・ストラクチュラル・バイオロジー(Nature Structural Biology)５、８９８〜９０２頁を参照のこと）。さらに、これらのデータは、ＨＣ−断片内に、各２５ｋＤａの２つの自律的サブユニット（サブドメイン）が存在するという結論につながる。２つの機能的サブドメインの存在についての第１の証拠は、組換え型で発現された、ＴｅＮＴのＨＣ−断片のアミノ末端側の半分（ＨＣＮ）およびカルボキシ末端側の半分（ＨＣＣ）によってもたらされ、これらは、ＨＣＣドメインはニューロンと結合するがＨＣＮドメインは結合しないということを示した（エレロス(Herreros)ら（２０００）、バイオケミカル・ジャーナル(Biochemical Journal)３４７、１９９〜２０４頁を参照のこと）。後者の段階では、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢのＨＣＣドメイン内の単一のガングリオシド結合部位の場所が特定され、特性決定された（ルンメル(Rummel)ら（２００４）、モレキュラー・ミクロバイオロジー(Molecular Microbiology)、５１、６３１〜６４３頁参照のこと）。ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのタンパク質受容体として同定されるシナプトタグミンＩおよびＩＩと結合する部位は、同様に、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのＨＣＣ−ドメインの領域内に制限され得る（ルンメル(Rummel)ら、（２００４）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７９、３０８６５〜７０頁を参照のこと）。ＰＣ１２細胞においても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質結合研究においても、ＢｏＮＴ／Ａがシナプトタグミンタンパク質ファミリーの現在の１３のメンバーのいずれかの種類と相互作用を示すとしていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ＢｏＮＴ／Ａの神経毒性に影響を及ぼす手段および方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供することによって、また、ポリペプチドがボツリヌス神経毒ＡのＨＣ−断片と結合する（ただし、このポリペプチドはヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃではない）という事実によって到達される。本発明はさらに、ＢｏＮＴ／Ａの神経毒性を低減するためのアンタゴニスとしての、ＢｏＮＴ／Ａの神経細胞との結合を減少させる物質を同定するための、および種々のマトリックスにおいてＢｏＮＴ／Ａを検出するための手段としての、ポリペプチドおよびその管腔ドメインの使用に関する。
【００１１】
ここで、本発明は、ＢｏＮＴ／Ａの受容体としてシナプス小胞タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ）を提案する。
【００１２】
本発明者は、研究において、シナプトフィジン、シナプトポリン(synaptoporin)、シナプトギリン(synaptogyrin)Ｉ＆ＩＩＩ、シナプス小胞糖タンパク質２Ａ（ＳＶ２Ａ）またはシナプス小胞糖タンパク質２Ｂ（ＳＶ２Ｂ）は、ＢｏＮＴ／Ａのタンパク質受容体として作用しないということを実証できた。しかし、ＢｏＮＴ／ＡのＳＶ２Ｃとの結合を実証することが可能であった。
【００１３】
リガンド−受容体研究では、タンパク質シナプトフィジン、シナプトポリン(synaptoporin)、シナプトギリン(synaptogryin)Ｉ＆ＩＩＩ、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢおよびＳＶ２Ｃ管腔ドメインをサブクローニングし、大腸菌(E.coli)において組換え型で発現させ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−（ＧＳＴ）−融合タンパク質として単離した。７種のＢｏＮＴの、およびＴｅＮＴのＨＣ−断片を、大腸菌において組換え型で双方とも発現させ、また３５Ｓ−メチオニンを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳した。ＨＣ−断片の、上記のＧＳＴ融合タンパク質の管腔ドメインに対する親和性を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−（ＧＳＴ）−プルダウン実験で調べた。ＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ誘導体の存在下で、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂの神経毒性の阻害を、クロストリジウム神経毒の生理学的標的に相当する、マウスの単離した神経−筋肉−調製物（半横隔膜アッセイ＝ＨＤＡ）で分析した。
【００１４】
特に、ＳＶ２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）は、ＢｏＮＴ／Ａとの相互作用のための断片に相当する。管腔ドメインの単離された１２５マーのペプチドは、ガングリオシドなしでＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片と相互作用できる。ＳＶ２Ｃペプチドの、ＢｏＮＴ／Ａとの相互作用の結果として、その受容体結合部位が占有され、膜中に埋まっているＳＶ２Ｃとの相互作用がブロックされる。より詳しくは、本発明は、ＳＶ２Ｃの管腔ドメインを含む１２５マーのペプチド、または少なくとも８０％がＳＶ２Ｃの管腔ドメインと同一であるか、翻訳後修飾されているアミノ酸配列からなるペプチドを含む。これらの薬剤は、ＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片との特異的結合のために使用できる。その結果として、ＢｏＮＴ／Ａの受容体結合部位が占有され、原形質膜中に存在するＳＶ２Ｃとのその生理学的相互作用が阻害される。したがって、ＢｏＮＴ／Ａでの急性中毒は防ぐことができる。さらに、これの薬剤は、同様にＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片中の受容体結合部位中に配置し、ひいては、アンタゴニストとして作用するその他の分子の検索における競合結合研究において使用できる。例えば、フルオロフォアを用いて薬剤に記しをつけることによって、または配列を具体的に同定することによって、またはこれらの薬剤とＢｏＮＴ／Ａとの結合の後に固体物質相上に固定化することによって、後者を直接かつ特異的に検出することができる。したがって、種々の環境およびマトリックスにおいて、ＢｏＮＴ／Ａを特異的に検出することが可能である。
【００１５】
ＳＶ２Ｃは、神経細胞および神経内分泌細胞由来の糖タンパク質である（要約論文：ヤンツ(Janz)，Ｒ．およびスドホフ(Sudhof)Ｔ．Ｃ．、ニューロサイエンス(Neuroscience)９４（１９９９）、１２７９〜１２９０頁）。８６ｋＤａという分子量を有する７２７個のアミノ酸からなり、１２回膜貫通ドメインによってシナプス小胞の膜中に埋まっている。約１６０アミノ酸の長さを有するアミノ末端および１１アミノ酸の長さを有するカルボキシル末端がサイトゾル中に位置しており、９０アミノ酸の長さを有する膜貫通ドメイン６と７の間の部分も同様である。膜貫通ドメイン７と８の間で、１２５アミノ酸（アミノ酸４５４〜５７９）の長さを有する部分のみが小胞内に位置し、小胞内すなわち管腔ドメイン（ＬＤ）は３つの推定Ｎグリコシル化部位および２つの推定ジスルフィド橋を含む。シナプス小胞におけるイオンまたは糖輸送体としてのＳＶ２Ｃの役割は確認されていないが、３種のＳＶ２アイソフォームの、シナプトタグミンのものとの（アミノ末端のリン酸化の機能のような）相互作用は、Ｃａ２＋を結合するための遊離シナプトタグミンの量およびその後のエキソサイトーシスの開始がＳＶ２によって影響を受けるということを示すものである。
【００１６】
シナプス小胞の膜は、エキソサイトーシスによってシナプス前原形質膜と合わさって１つになり、これによってシナプス小胞タンパク質もまたシナプス前膜中に短時間存在するようになる。その結果として、シナプス小胞タンパク質の小胞内ドメインが細胞外に露出される。ＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片の、神経細胞の表面に多数生じる複合体ポリシアロガングリオシドとの結合は、そのままでは神経毒を収容するのに十分ではない。しかし、神経細胞の表面にＢｏＮＴ／Ａ分子を蓄積することによって、これらは膜中に横方向に広がることができ、稀に露出されるタンパク質受容体との実りある遭遇の可能性が高まる。ＳＶ２Ｃの場合には、１２５個のアミノ酸を有する管腔ドメインが、小胞融合後に細胞外に露出され、このようにして、ＢｏＮＴ／Ａにとってタンパク質受容体として利用可能となる。神経毒は、ガングリオシド結合によって膜の上に相当に密接して存在するので、ＢｏＮＴ／Ｂ／Ｇ−シナプトタグミン相互作用と類似して、管腔ドメインのおよそ３０個の最初と最後のアミノ酸が、受容体として提供されることが好ましい。受容体神経毒複合体をエンドソーム中に収容した後、後者は酸性化され、エンドソームの膜中に移行ドメインが挿入され、一部折りたたまれたＬＣをサイトゾル中に移行し、そこで、後者は最終段階におけるその特異的基質に分割される。複合体形成および融合タンパク質の解離の周期が妨げられ、それによってアセチルコリンの放出が阻害される。その結果として、横紋筋が麻痺し、汗腺がその分泌を停止する。個々のＢｏＮＴ血清型の活性期間は、サイトゾル中の無傷のＬＣの存在に応じて異なる。
【００１７】
コリン作動性伝達がブロックされるということは、末梢ＨＣはニューロンに侵入するという事実によって説明できることが好ましい。中枢シナプスは、タンパク質によっては乗り越えることができない血管脳関門によって保護されている。
【００１８】
以下では、本願に関連して理解されるべきである用語を定義する。
【００１９】
とりわけ、天然のボツリヌス神経毒Ａと同一のアミノ酸配列を含む大腸菌から組換え型で調製されたボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）は、天然ＢｏＮＴ／Ａと薬理学的に同一の方法で作用し、組換えボツリヌス神経毒野生型と呼ばれる。組換え型で調製されたＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片は、対応する天然ＨＣ−断片と同一のアミノ酸配列および天然のＢｏＮＴ／Ａと同一の結合特性を有する。上記の神経細胞として、コリン作動性運動ニューロンがある。輸送タンパク質は、原形質膜と結合している分子、膜貫通タンパク質、シナプス小胞タンパク質、ＳＶ２ファミリーのタンパク質、好ましくは、ＳＶ２Ｃ、特に好ましくは、ＳＶ２Ｃの管腔ドメインと特異的に結合することが好ましい。結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されることが好ましい。測定は、実施例において詳細に述べられているＧＳＴ−プルダウン実験を用いて実施されることが特に好ましい。
【００２０】
ＳＶ２Ｃの配列は、誰でもデータベースから得ることができる。ヒト由来ＳＶ２Ｃの配列番号は、とりわけ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ０５５７９４であり、ラット由来ＳＶ２Ｃの配列番号は、とりわけ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ１１３７８１であり、マウス由来のＳＶ２Ｃの配列番号は、とりわけ、ＧｅｎＢａｎｋＸＰ＿１２７４９０である。
【００２１】
これに関連して、用語「ポリペプチド」とは、少なくとも２つの単量体単位からなるアミノ酸重合体を表す。これに関連して、単量体は天然に存在するアミノ酸であってもよいし、天然に存在しないアミノ酸であってもよい。ポリペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸単量体を有することが好ましい。この場合、個々のアミノ酸は修飾されていてもよい。修飾は天然起源であってもよいし（例えば、翻訳後）、または例えば、グリコシル化、二量対形成およびオリゴマー形成によって、Ｃｙｓ残基の修飾によってなど、合成によって導入されてもよい。
【００２２】
本発明の「％同一性」とは、公知の手順、例えば、コンピュータを使った配列比較（ＢＬＡＳＴ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ｓ．Ｆ．アルトシュル(Altschul)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)215(1990)、４０３〜４１０頁によって確立されるタンパク質レベルでの％同一性を意味する。同一性を調べるのに好ましい方法は、まず、研究される配列との最大の可能性ある一致を作製する。配列対を互いに比較する場合には、プログラムＧＡＰ（デベロー(Devereux)，Ｊ．ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Reserch)１２８１２）＝：３８７（１９８７）およびＢｅｓｔＦｉｔを使用することも可能である。通常、標準パラメーターの使用が可能であり、以下が特に好ましい：
アルゴリズム：ニードルマン(Needleman)およびブンシュ(Wunsch)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)４：４４３〜４５３頁（１９７０）
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８９（１９９２）、１０９１５〜１０９１９頁からのＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
【００２３】
用語「抗体」とは、古典的な抗体、一本鎖抗体および抗体断片を含む。これに関連して、好ましい断片として、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ）がある。
【００２４】
混合物の他に、用語「組成物」もまた、融合タンパク質を含む。組成物中に含まれるポリペプチドは、コンジュゲートの形で存在し得る。これに関連して、色素、鉄粒子、ＦｌａｇまたはＨＡ−Ｔａｇなどのエピトープ、架橋剤、親和性ペプチドまたは放射性同位元素を含むコンジュゲートが好ましい。
【００２５】
好ましい実施形態によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも８０％が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一である。少なくとも９０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列が特に好ましい。少なくとも９５％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列が、特に好ましい。
【００２６】
さらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃのアミノ酸配列と、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは、最高５個のアミノ酸、特に、最高１個のアミノ酸の付加、置換、欠失、挿入および／または反転によって異なっている。これに関連して、付加、置換、欠失、挿入または反転は、それ自体公知の方法で実施できる。
【００２７】
さらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチドの少なくとも７０％のアミノ酸配列が、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一である。少なくとも８０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列が好ましい。また、少なくとも９０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列が好ましい。少なくとも９５％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列が特に好ましい。特に、ポリペプチドは、ボツリヌス神経毒ＡのＨＣ−断片と結合する、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）の単離ポリペプチドである。
【００２８】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。さらに、複製および場合により、適した宿主細胞における適当なプロモーターの制御下での発現のための本発明の核酸を含む本発明のベクターを提供する。本発明のさらなる態様によれば、適した宿主細胞におけるポリペプチドをコードする核酸の組換え発現と、場合によっては、それ自体公知の方法で調製されたポリペプチドを単離することとを含む、本発明のポリペプチドを調製する方法が提供される。
【００２９】
これに関連してコーディング核酸とは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの混合物を表し得る。核酸は、そのヌクレアーゼ耐性を考慮して、例えば、ホスホロチオエート(phosphorthioate)結合の挿入によってさらに修飾できる。核酸は親核酸から調製でき、この場合、この親核酸は、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡデータベースからクローニングすることによって利用可能である。さらに、核酸は、固相合成によって直接調製できる。適した方法は当業者には公知である。親核酸から開始する場合には、例えば、位置特異的突然変異誘発による選択的修飾を引き起こし、その結果、アミノ酸レベルでの少なくとも１つの付加、挿入、欠失および／または置換をもたらすことができる。次いで、核酸を適したプロモーターと機能しうる形で連結する。公知の発現系における発現に適したプロモーターは、当業者には公知である。この場合には、プロモーターの選択は、発現に用いる発現系に応じて変わる。一般に、構成的プロモーターが好ましいが、誘導性プロモーターも同様に使用できる。このようにして調製される構築物は、例えば、λ−誘導体、アデノウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ＳＶ−４０ウイルスおよびレトロウイルスから選択されるベクターの少なくとも１つの部分、特に、調節エレメントを含む。ベクターは、所与の宿主において核酸を発現できることが好ましい。
【００３０】
本発明は、ベクターを含み、ベクターを発現するのに適した宿主細胞をさらに提供する。最先端では、多数の原核生物の発現系および真核生物の発現系が知られており、宿主細胞は、例えば、大腸菌または巨大菌などの原核細胞から、Ｓ．セレビシエ(S.cerevisiae)およびＰ．パストリス(P.pastoris)などの真核細胞またはさらに高等な真核細胞、例えば、昆虫細胞もしくは哺乳類細胞から選択される。
【００３１】
ペプチドまたはポリペプチドはまた、合成またはフラグメント縮合によって直接得ることができる。適当な方法は当業者には公知である。
【００３２】
ペプチドまたはポリペプチドはその後精製する。本明細書においては、当業者に公知の方法、例えば、クロマトグラフィー法または電気泳動などを用いる。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。この場合には、組成物は、混合物またはコンジュゲートとして存在し得る。例えば、ポリペプチドを色素分子または賦形剤とコンジュゲートさせることができる。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列と結合する抗体またはその断片を提供する。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法に従って、マウスなどの試験動物を免疫化することによって、続いて、ハイブリドーマを単離およびスクリーニングすることによって調製できる。
【００３５】
抗体は、シナプス小胞糖タンパク質２Ｃの、ボツリヌス神経毒との結合をブロックできることが好ましい。これは、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡなどの公知の競合アッセイによって検出できる。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１種の本発明のポリペプチドおよび／または少なくとも１種の本発明の抗体を含む薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、場合により、製薬上許容される賦形剤、希釈剤および／または添加物を含み得る。薬剤組成物は、経口、静脈内、皮下、筋肉内および局所投与に適している。
【００３７】
薬剤組成物は、ＢｏＮＴ／Ａの治療的処置または化粧用途の際の過剰投与後のボツリヌス中毒、中毒を治療するために、または予防目的で適応される。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、哺乳類に、ＢｏＮＴ／Ａの、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列との結合を、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも５０％、特に、少なくとも８０％減少させる薬剤を投与することを含む、哺乳類においてＢｏＮＴ／Ａの神経毒性を低減する方法を提供する。
【００３９】
この場合には、薬剤は、以下に記載されるスクリーニング法によって調べることができる。
【００４０】
少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ）の管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列を有し、ＢｏＮＴ／ＡのＳＶ２Ｃとの結合を減少させるポリペプチドを、哺乳類に投与することが好ましい。
【００４１】
さらに、ＢｏＮＴ／Ａの、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃ（ＳＶ２Ｃ）の管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列との結合を減少させる抗体を哺乳類に投与することが好ましい。
【００４２】
さらに、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）の発現を減少させる薬剤を哺乳類に投与することが好ましい。この場合には、薬剤は、アンチセンス分子であり得る。アンチセンス分子を調製する方法は、当業者に公知である。
【００４３】
この方法は、ＢｏＮＴ／Ａの治療的処置または化粧用途の際の過剰投与後のボツリヌス中毒、中毒において、ＢｏＮＴ／Ａの神経毒性を低減するために、または予防目的で使用できる。
【００４４】
哺乳類はヒトであることが好ましい。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、
（ａ）薬剤を、ＢｏＮＴ／ＡおよびＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ（４５４〜５７９）の溶液と接触させることと、
（ｂ）結合しているＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ（４５４〜５７９）の量を調べることと、
（ｃ）ＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ（４５４〜５７９）と結合しているＢｏＮＴ／Ａの量を減少させる薬剤を選択することと
を含む、ＢｏＮＴ／Ａの、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）との結合を減少させる薬剤を同定する方法を提供する。
【００４６】
これに関連して、スクリーニングは、例えば、化学ライブラリーによって実施できる。さらに、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子からなるデータベースも同様に考慮される。
【００４７】
ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）は、細胞の原形質膜中に埋まっていることが好ましい。これに関連して、適当な細胞として、神経内分泌細胞、例えば、ＰＣ１２、神経芽腫細胞、例えば、２Ａおよび胎児脳組織由来のハイブリドーマ細胞、例えば、ＮＴ２がある。
【００４８】
さらに、薬剤の存在によって減少した、ＢｏＮＴ／Ａの、ヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃとの結合は、マウス半横隔膜試験におけるＢｏＮＴ／Ａの神経毒性の低減によって検出されることが好ましい。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、上記の方法によって得ることができる薬剤を提供する。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、
（ａ）ポリペプチドを固相上に固定化し、ポリペプチドが、少なくとも７０％がヒトのシナプス小胞糖タンパク質２Ｃの管腔ドメイン（アミノ酸４５４〜５７９）と同一であるアミノ酸配列を有し、ＢｏＮＴ／ＡのＳＶ２Ｃとの結合を減少させることと、
（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａのポリペプチドとの結合を可能にする条件下で、固定化されたポリペプチドを、サンプルと接触させることと、
（ｃ）ＢｏＮＴ／Ａポリペプチド複合体を溶出することと、
（ｄ）複合体またはその成分を検出することと
を含む、任意の所望のサンプル中のボツリヌス菌由来ＢｏＮＴ／Ａを検出する方法を提供する。
【００５１】
固定化は、例えば、ポリペプチドの、クロマトグラフィー目的のために知られている物質、例えば、セファロースとのＢｒＣｎ−カップリングによって実施できる。ＢｏＮＴ／Ａのポリペプチドとの結合が起こり得る条件下で、日常的試験によって実施できる。条件は、いずれの結合パートナーも変性させないよう選択されなければならない。溶出は、例えば、競合またはｐＨおよび／または塩条件の改変によって起こり得る。複合体およびその成分は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離できる。
【００５２】
以下の実施例は単に例示目的のために役目を果たすものであって、制限すると考えてはならない。
【００５３】
材料および方法
プラスミド構築および組換えタンパク質の調製
アフィニティー精製のためのカルボキシル末端ＳｔｒｅｐＴａｇまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のための３５Ｓ−メチオニンをそれぞれ含む、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢの全長型またはＢｏＮＴ／Ａ〜ＧおよびＴｅＮＴの組換えＨＣ−断片それぞれの大腸菌発現のためのプラスミドは、適当なプライマー、ＢｏＮＴ／Ａ〜ＧおよびＴｅＮＴをコードするｃＤＮＡおよび出発ベクターとして働く発現ベクターｐＱｅ３（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧまたはｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）をそれぞれ用いるＰＣＲ法によってもたらされた。
【００５４】
種々のシナプス小胞タンパク質の小胞内セグメントをコードするｃＤＮＡ部分を、適当なオリゴヌクレオチドおよび胎児マウスｃＤＮＡデータベース（ＧＳＴ−Ｓｙｏ−１５７−２１８、ＧＳＴ−Ｓｙｇ−Ｉ−４５−９８）またはＧＳＴ−Ｓｙｇ−Ｉ−１２７−１６９（ＲＺＰＤ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｎｚｅｎｔｒｕｍ  ｆｕｒ  Ｇｅｎｏｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ；  ｗｗｗ．ｒｚｐｄ．ｄｅ；ＩＤ  ＩＲＡＫｐ９６１Ｃ０７２Ｑ）、ＧＳＴ−ＳＶ２Ａ−４６８−６１８（ＲＺＰＤ−ＩＤ  ＩＲＡＫｐ９６１Ｏ２４１００Ｑ）、ＧＳＴ−Ｓｙｏ−２２−１０３（ラット；Ｔ．Ｃ．Ｓｕｄｈｏｆ，Ｄａｌｌａｓ）、ＧＳＴ−Ｓｙｇ−ＩＩＩ−４６−８８およびＧＳＴ−Ｓｙｇ−ＩＩＩ−１２８−１６８  （マウス；Ｔ．Ｃ．Ｓｕｄｈｏｆ，Ｄａｌｌａｓ）、ＧＳＴ−ＳＶ２Ｂ−４１３−５６０（ラット；Ｓ．Ｂａｊｊａｌｉｅｈ，Ｓｅａｔｔｌｅ）およびＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ−４５４−６０３（ラット；Ｒ．Ｊａｎｚ，Ｈｏｕｓｔｏｎ）を基礎とした適当なｃＤＮＡを含むプラスミドを用いて、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ３にクローニングした。ハイブリッドＧＳＴ−ＳＶ２−Ｃ／Ａをコードするプラスミドは、ＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５５３とＳＶ２Ａの５６８〜５９４を含み、ＰＣＲによって対応するオリゴヌクレオチドによって同様に作製した。すべてのプラスミドの核酸配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。組換えＨＣ−断片は、室温で１０時間の誘導の間に大腸菌株Ｍ１５［ｐＲｅｐ４］（Ｑｉａｇｅｎ）において調製し、製造業者の使用説明書に従ってＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−マトリックス（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）で精製した。大腸菌ＢＬ２１から得たＧＳＴ−融合タンパク質を、セファロースマイクロビーズ上に固定化されたグルタチオンを用いて単離した。所望のタンパク質を含有する画分を合わせ、それぞれ、トリス−Ｎａｃｌ−トライトンバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  トライトンＸ−１００、ｐＨ７．２）、ケルブス−リンガー(Kreb-Ringer)バッファー（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１１ｍＭ  グルコース））に対して透析した。
【００５５】
３５Ｓ標識したＨＣ−断片を、２μｌのバッチ中、網状赤血球溶解系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびＬ−３５Ｓ−メチオニン（８４０ｋＢｑ、＞３７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて神経毒のカルボキシル末端コドンの下流を線状化したｐＳＰ７２からｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。
【００５６】
ＧＳＴ−プルダウンアッセイ
１０μｌのＧＴ−セファロースマイクロビーズ上に固定化したＧＳＴ−融合タンパク質（各０．１５ｎｍｏｌ）を、１００μｌのトリス−ＮａＣｌ−トライトンバッファーという総容積中、ウシ脳ガングリオシド混合物（１８％ＧＭ１、５５％ＧＤ１ａ、１０％ＧＴ１ｂ、２％のその他のガングリオシド、カルビオケム(Calbiochem)各２０μｇ）の不在下または存在下で、ＨＣ−断片（０．１ｎｍｏｌ）とともに４℃で３時間インキュベートした。遠心分離によってマイクロビーズを集め、上清を回収し、各場合において分離したマイクロビーズを１６０μｌの同バッファーで３回すすいだ。すすいだペレット画分を、ＳＤＳ−サンプルバッファー中で沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色、オートラジオグラフィーまたはイムノブロッティングによって上清画分と一緒に調べた。
【００５７】
マウス半横隔膜アッセイ（ＨＤＡ）
マウス半横隔膜アッセイ（ＨＤＡ）を、ハーバーマン(Habermann)（ハーバーマン(Habermann)Ｅ、ドレイヤー(Dreer)Ｆ、ビガルケ(Bigalke)Ｈ（１９８０）テタナス・トキシン・ブロックス・ザ・ニューロマスキュラー・トランスミッション・イン・ビトロ・ライク・ボツリナムＡ・トキシン(Tetanus toxin blocks the neuromuscular transmission in vitro like botulinum A toxin)、ナウニン・シュミーデベルグス・アーカイブ・オブ・ファルマコロジー(Naunyn Schmiedeberg's Archives of Pharmacology)３１１（１９８０）、３３〜４０頁）に記載されるとおり実施した。横隔神経を１ヘルツで刺激し、効力メーター(potency meter)およびＶｉｔｒｏＤａｔオンラインソフトウェア（ＦＭＩ  ＧｍｂＨ，  Ｓｅｅｈｅｉｍ−Ｏｂｅｒ  Ｂｅｅｒｂａｃｈ）によって収縮幅を連続的に記録した。ＢｏＮＴを加えた後、収縮幅が出力値の５０％に低下する間の時間（麻痺半減時間）を測定した。全長ｓｃＢｏＮＴ／Ａ野生型を以下の最終濃度で少なくとも３倍測定した：２４．３ｐＭ、７２．８ｐＭ、２２３ｐＭおよび７２８ｐＭ。この濃度−効果−関係に、効力関数(potency function)を近似させた。
【００５８】
ｙ（Ａ）＝２２５．８７×−０．２５７３  （Ｒ２＝０．９６２７）。同様の方法で、以下の最終濃度を有する全長ｓｃＢｏＮＴ／Ｂ野生型について、濃度−効果−関係ｙ（Ｂ）＝４２３．５９×−０．２９７  （Ｒ２＝０．９８３）を定めた：１００ｐＭ、３００ｐＭ、１０００ｐＭおよび３０００ｐＭ。阻害研究のために、ｓｃＢｏＮＴ／Ａ（２２３ｐＭ）およびｓｃＢｏＮＴ／Ｂ（１０００ｐＭ）を、ＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ−４５４−５７９またはＧＳＴ−ＳＶ２−Ｃ／Ａ（最終濃度４、７または１１μＭ）のいずれかと混合し、２０℃で１５分間インキュベートし、ＨＤＡに加えた。効力関数に基づいて、部分的に延長した麻痺半減時間を低神経毒用量に相応に変換し、毒性％として表した。
【００５９】
結果
タンパク質、シナプトフィジン、シナプトポリン(synaptoporin)、シナプトギリン(synaptogyrin)Ｉ＆ＩＩＩ、シナプトタグミンＩＩ、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２およびＳＶ２Ｃの管腔ドメインおよびカルボキシル末端膜貫通ドメインを、サブクローニングし、大腸菌において組換え型で発現させ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質として単離した。７種のＢｏＮＴの、およびテタヌス神経毒（ＴｅＮＴ）のＨＣ−断片を、両方とも大腸菌で組換え型で発現させ、３５Ｓ−メチオニンを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳した。上記のＧＳＴ−融合タンパク質の管腔ドメインに対するＨＣ−断片の親和性を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−（ＧＳＴ）−プルダウン実験で調べた。この目的上、異なるＨＣ−断片を有するそれぞれのＧＳＴ融合タンパク質をインキュベートし、相分離を実施した。遊離ＨＣ−断片は分離された上清中のままであったが、結合しているＢｏＮＴ  ＨＣ−断片は、ＧＳＴ融合タンパク質と一緒に固相において検出できた。組換えＨＣ−断片の、３５Ｓ標識ＨＣ−断片による、ならびに全長ＢｏＮＴ／Ａによる置換は、ＨＣ−断片ＢｏＮＴ／Ａと比較してＧＳＴプルダウンアッセイにおいて同様の結果を示した。
【００６０】
【表１】
2009513118.tif 000003
【００６１】
これに関連して、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＴｅＮＴの８種のＨＣ−断片のいずれも、複合体ガングリオシドの存在にかかわらず、シナプトフィジン、シナプトポリン(synaptoporin)、シナプトギリン(synaptogyrin)Ｉ＆ＩＩ、ＳＶ２ＡおよびＳＶ２Ｂの管腔ドメインと結合しないことがわかった。すでに知られているように、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのＨＣ−断片は、シナプトタグミンＩＩの管腔ドメインと結合するが、ＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片は結合しない。組換えならびに３５Ｓ標識ＨＣ−断片ならびに全長ＢｏＮＴ／Ａのみが、複合体ガングリオシドの存在に関わらず、ＧＳＴと融合しているＳＶ２Ｃの管腔ドメインと特異的に結合する。すべてのその他のＨＣ−断片は、ＳＶ２Ｃと相互作用を示さない（図１）。
【００６２】
ＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片の、ＳＶ２Ｃの管腔ドメインとの結合は、膜貫通ドメイン８（ＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ  ４５４〜５７９）によって短縮した後に、より弱いことがさらに示された（図２）。２０アミノ酸のカルボキシル末端欠失（ＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ  ４５４〜５５３）およびさらなる短縮は、ＢｏＮＴ／Ａとの相互作用が停止に近づくことをもたらした。アミノ末端欠失は、ＢｏＮＴ／ＡのＧＳＴ−ＳＶ２Ｃ融合タンパク質との結合も同様に妨げた。
【００６３】
ＳＶ２Ｃと相同な、ＳＶ２ＡおよびＳＶ２ＢのＧＳＴ融合タンパク質は、カルボキシル末端膜貫通ドメインを含んでも含まなくとも、ＢｏＮＴ／Ａとの結合を示さなかった。ＧＳＴ、ＳＶ２Ｃのアミノ酸４５４〜５５４およびＳＶ２Ａのアミノ酸５６８〜５９４からなるハイブリッドの作製も同様に、もはやＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ−断片との相互作用を全く示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＢｏＮＴ／ＡのＨＣ−断片は、ＳＶ２Ｃと相互作用する。（Ａ）シナプス小胞糖タンパク質の略図。（Ｂ、Ｃ）ＧＴ−セファロースマイクロビーズ上に固定化されたＧＳＴ−融合タンパク質が、ガングリオシドの存在下で、組換え（Ｂ）または３５Ｓで記しを付けた（Ｃ）ＢｏＮＴ  ＨＣ−断片とともにインキュベートされている。固相と結合しているＨＣ−断片が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色またはオートラジオグラフィーによって検出されている。
【図２】ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ−断片は、ＳＶ２Ｃの膜貫通ドメイン８に隣接する小胞内領域と結合する。ＧＴ−セファロースマイクロビーズ上に固定化されたＧＳＴ−融合タンパク質が、ガングリオシドの存在下、組換えＢｏＮＴ  ＨＣ−断片とともにインキュベートされている。固相と結合しているＨＣ−断片が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、または免疫化学法によって検出されている。
【図１】
2009513118.tif 000004
【図２】
2009513118.tif 000005
【国際調査報告】
2009513118.tif 000006
2009513118.tif 000007
2009513118.tif 000008
2009513118.tif 000009
2009513118.tif 000010
2009513118.tif 000011
2009513118.tif 000012
2009513118.tif 000013
2009513118.tif 000014
2009513118.tif 000015