(57)【要約】  本発明は、集合体の多様性が、ＨＣＤＲ３員の長に依存している、抗体重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）員の調製および使用に関している。ＨＣＤＲ３領域の集合体の多様性は、ヒトレパートリにおけるＨＣＤＲ３の自然のアミノ酸分布を実質的に表している。この自然のアミノ酸分布は、トリヌクレオチド変異（ＴＲＩＭ）技術を用いることにより、ＤＮＡ配列をコードするＨＣＤＲ３におけるアミノ酸の完全なランダム分布にバイアスをかけることにより表し得る。本発明の各々のＨＣＤＲ３員の集合体は、合成抗体または抗体フラグメントのライブラリーをつくるための抗体（または、その抗体のフラグメント）の可変領域内に含まれ得る。本発明の合成抗体ライブラリーは、本明細書の記載にしたがって調製したＨＣＤＲ３領域を含んだ１またはそれ以上のＣＤＲ領域に隣接しているユニークな制限酵素切断部位を含み得る、化学合成された「マスター遺伝子」フレームワーク領域のような、モジュール特性を含むようにデザインされ得る。本発明は、また、このような多様性集合体をコードする核酸分子および、それらの製造方法およびそれらの使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
集合体の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、そして第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものであって、該多様性要素が異なるものである、アミノ酸の範囲が変化する多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項２】
少なくとも前記Ｈ−ＣＤＲ３の一部分が、約４〜約２２アミノ酸長の範囲が変化する請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３の集合体。
【請求項３】
前記第一範囲のアミノ酸が約４〜約１３アミノ酸であり、前記第二の範囲のアミノ酸が約１４〜約２２である請求項２に記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項４】
集合体の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、および第三の多様性要素によって第三の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものであって、前記多様性要素が異なるものである請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項５】
前記第一の範囲のアミノ酸が約４〜約９アミノ酸であり、前記第二の範囲のアミノ酸が約１０〜約１６であり、前記第三の範囲のアミノ酸が約１７〜約２２アミノ酸である、請求項４記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項６】
集合体の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第三多様性要素によって第三範囲内のアミノ長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第四多様性要素によって第四範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第五多様性要素によって第五範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域および第六多様性要素によって第六範囲内のアミノ長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域によって生じるものであって、前記多様性要素が異なるものである請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項７】
前記第一範囲のアミノ酸が約４〜約６アミノ酸であり、前記第二範囲のアミノ酸が約７〜約９アミノ酸であり、前記第三範囲のアミノ酸が約１０〜約１２アミノ酸であり、前記第四範囲のアミノ酸が約１３〜約１５アミノ酸であり、前記第五範囲のアミノ酸が約１６〜約１８であり、前記第六範囲のアミノ酸が約１９〜約２２である、請求項６記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項８】
集合体の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第三多様性要素によって第三範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第四多様性要素によって第四範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第五多様性要素によって第五範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第六多様性要素によって第六範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第七多様性要素によって第七範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、第八多様性要素によって第八範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、および第九多様性要素によって第九範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３、により生じるものであって、前記多様性要素が異なるものである、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項９】
前記第一範囲のアミノ酸が約４〜約5アミノ酸であり、前記第二範囲のアミノ酸が約６〜約７アミノ酸であり、前記第三範囲のアミノ酸が約８〜約９であり、前記第四範囲のアミノ酸が約１０〜約１１であり、前記第五範囲のアミノ酸が約１２〜約１３であり、前記第六範囲のアミノ酸が約１４〜約１５であり、前記第七の範囲のアミノ酸が約１６〜約１７であり、前記第八範囲のアミノ酸が約１８〜約１９であり、そして前記第九範囲のアミノ酸が約２０〜約２２である、請求項８記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。  
【請求項１０】
前記第一範囲が約４〜約８アミノ酸であり、そして、前記第一多様性要素が、位置１においてアラニンが約８０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約６０％の頻度であり、位置３においてグリシンが約４０％の頻度であり、位置７においてアスパラギン酸が約５０％の頻度であり、位置８においてチロシンが約４０％の頻度であることを要する、請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１１】
前記第一範囲が約９〜約１５アミノ酸であり、該第一多様性要素が、位置１においてアラニンが約９０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約７０％の頻度であり、位置１０においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１１においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１２においてチロシンが約３０％の頻度であり、位置１３においてフェニルアラニンが約６０％の頻度であり、位置１４においてアスパラギン酸が約８０％の頻度であり、そして位置１５においてチロシンが約４０％の頻度であることを要する、請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。  
【請求項１２】
前記第一範囲が約１６〜約２２のアミノ酸であって、そして該第一多様性要素が、位置１においてアラニンが９０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約６０％の頻度であり、位置３においてアスパラギン酸が約３０％の頻度であり、位置４においてグリシンが約２０％の頻度であり、位置５においてアルギニンが約１０％の頻度であり、位置６においてアルギニンが約１０％の頻度であり、位置７においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１５においてチロシンが約４０％の頻度であり、位置１６においてチロシンが約５０％の頻度であり、位置１７においてチロシンが約５０％の頻度であり、位置１８においてチロシンが約６０％の頻度であり、位置１９においてチロシンが約４０％の頻度であり、位置２０においてメチオニンが約５０％の頻度であり、位置２１においてアスパラギン酸が約９５％の頻度であり、位置２２においてバリンが約６０％の頻度である、ことを要する請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体ＨＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１３】
前記第一の範囲が約９〜約１５アミノ酸であり、前記第一多様性要素が、前記第一の範囲内の少なくとも２アミノ酸の位置で高含量のグリシンとセリンを要する請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１４】
前記第一範囲が約１６〜約２２アミノ酸であり、前記第一多様性要素が、（i）前記第一範囲内の少なくとも１アミノ酸位置で高含量のセリンを、(ii)Ｈ−ＣＤＲ３領域の終端末部で高含量の塩基性アミノ酸を、（iii)Ｈ−ＣＤＲ３の前端部で高含量のアスパラギン酸を、および(iv)前記第一範囲内の少なくとも２アミノ酸部位で高含量の芳香性アミノ酸を、要する請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１５】
前記第一範囲が約５アミノ酸であり、そして、前記第一の多様性要素が位置１において、アラニンが約６０％の頻度であり、スレオニンが約２０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５８％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置２において、アルギニンが約３０％の頻度であり、リジンが約３０％の頻度であり、スレオニンが約３０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５５％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置３において、アスパラギン酸が約４０％の頻度であり、フェニルアラニンが約４０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５８％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置４において、アスパラギン酸が約３０％の頻度であり、グリシンが約３０％の頻度であり、メチオニンが約３０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．６３％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置５において、チロシンが約３０％の頻度であり、アスパラギン酸が約３０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５８％の頻度であることを要する、請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１６】
前記第一範囲が約１２アミノ酸であり、前記第一多様性要素が位置１において、アラニンが約８０％の頻度であり、スレオニンおよびバリンが併せて約１５％の頻度であることを要し；該第一多様性要素が位置２において、アルギニンが約７０％の頻度であり、セリン、スレオニン、グリシンおよびアラニンが併せて約３０％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置９において、アラニン、セリンおよびチロシンが併せて、約２０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．６３％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置１０において、フェニルアラニンが約６０％の頻度であり、メチオニンが約１０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５８％の頻度であることを要し； 前記第一多様性要素が位置１１において、アスパラギン酸が、約８０％の頻度であり、グリシンが約５％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５８％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置１２において、チロシンが約５０％の頻度であり、バリンおよびイソロイシンが併せて約１０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．６３％の頻度であることを要する、請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１７】
前記第一範囲が約２０アミノ酸であり、前記第一多様性要素が位置１において、アラニンが約１００％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置２において、アルギニンが約５０％の頻度であり、リジンが約５０％の頻度であることを要し；前記第一の多様性要素が、位置３においてグリシンが約３０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５５％の頻度であることを要し；前記第一の多様性要素が位置４において、アラニンが約２０％の頻度であり、グリシンが約２０％の頻度であり、ロイシンが約２０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．６３％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置１４において、セリンが約２０％の頻度であり、スレオニンが約２０％の頻度であり、システインが約２０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．６３％の頻度であることを要し；前記第一多様性要素が位置２１において、アスパラギン酸が約９５％の頻度であることを要し；そして、前記第一の多様性要素が位置２２において、バリンが約５０％の頻度であり、システインを除く他のすべてのアミノ酸が約０．５５％の頻度であることを要する、請求項２記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項１８】
請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を具える多様性ヒトまたはヒト化抗体可変重鎖の集合体。
【請求項１９】
請求項１８記載のヒトまたはヒト化抗体可変重鎖を具える、多様性ヒトまたはヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの集合体。
【請求項２０】
請求項１９記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体またはその機能的なフラグメントを具える合成ヒトまたはヒト化抗体ライブラリー。
【請求項２１】
複数のＤＮＡ分子がＤＮＡ分子を合成するステップを具え、各ＤＮＡ分子がＨ−ＣＤＲ３領域をコードし、前記Ｈ−ＣＤＲ３領域が範囲が変化するものであり、第一範囲のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３領域をコードするＤＮＡ分子が第一多様性要素によって合成され、第二範囲のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３領域をコードするＤＮＡ分子が第二多様性要素によって合成され、前記多様性要素が異なるものであることを特徴とする、多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域をコードする核酸分子の集合体を調製する方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法により調製された多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体をコードする核酸集合体。
【請求項２３】
集合体の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、および第二多様性要素によって第二範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、そして前記多様化要素が異なるものであることを特徴とする、範囲が変化するアミノ酸の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体をコードする核酸の集合体。
【請求項２４】
請求項２２または２３記載の核酸集合体を発現する工程を具える、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を得る方法。
【請求項２５】
前記集合体の員が４〜８アミノ酸長をもつ場合は、前記４〜８アミノ酸長をもつ前記員に適用する前記多様性要素は前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２または３定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項２６】
該集合体の員が９〜１０アミノ酸長をもつ場合は、前記９〜１０アミノ酸長をもつ前記員に適用される前記多様性要素は前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２または３定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項２７】
前記集合体の前記員が１１〜１３アミノ酸長をもつ場合は、前記１１〜１３アミノ酸長をもつ前記員に適用される前記多様性要素は前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２または３定常アミノ酸位置を定める、請求項１の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項２８】
前記集合体の員が１４アミノ酸長である場合は、前記１４アミノ酸長をもつ前記員に適用される前記多様性要素は前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で０、１、2、３、４または５定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項２９】
前記集合体の員が１５〜１６アミノ酸長をもつ場合は、前記アミノ酸長をもつ前記員に適用される前記多様性要素は前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２、３、４、５、６、７または８定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載のヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項３０】
前記集合体の員が１６〜１７アミノ酸長をもつ場合は、前記１６〜１７アミノ酸長をもつ前記員に適用する前記多様性要素は前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２、３、４、５、６、７または８定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載の多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項３１】
前記集合体の員が１８アミノ酸長をもつ場合は、前記１８アミノ酸長をもつ前記員に適用する前記多様性要素が前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で、０、１、２、３、４、５、６、７または８定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【請求項３２】
前記集合体の員が１９アミノ酸長またはそれより長いアミノ酸長をもつ場合は、前記１９アミノ酸またはそれより長いアミノ酸長をもつ前記員に適用する前記多様性要素が前記アミノ酸長をもつ前記員の前記Ｈ−ＣＤＲ３領域内で、０、１、２、３、４、５、６または７定常アミノ酸位置を定める、請求項１記載の多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
この出願は、全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００５年１２月２０日に出願された米国仮出願第６０／７５１，６３３に基づく優先権の利益を請求している。
【０００２】
免疫グロブリン重鎖（Ｈ−ＣＤＲ３）の第三相補性−決定領域は、古典的な抗原結合部位の中心を形成するものであり、そして、しばしば抗体の特異性および親和性を決定する支配的な役割を有している。免疫系が適応できる公知のすべての種においてＨ−ＣＤＲ３は、抗原結合部位の外側の境界を形成する他５種のＣＤＲ領域（Ｈ−ＣＲＤ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ３）のいずれよりも多様性である（トネガワ、１９８３；チョチア等、１９８９）。
【０００３】
その種に利用できる抗原結合構造の範囲と、従って抗体レパートリーの機能に大きく影響を与える(ジョンソンおよびユー、１９９８；コリス等、２００３)平均的なＨ−ＣＤＲ３長およびＨ−ＣＤＲ３の範囲は、マウスからヒトへ、家畜へと増大している（ユー等、１９９３）ことがわかっている。Ｈ−ＣＤＲ３の多様性は、ある種の中で調整することもできる。例えば、ヒトおよびマウスでは、Ｈ−ＣＤＲ３長の範囲およびＨ−ＣＤＲ３の多様性は個体発生中で増加している（フェネイ、１９９２、ゼムリン等、２００２）。
【０００４】
抗原結合における顕著な役割のために、Ｈ−ＣＤＲ３領域は合成抗体ライブラリーにおける超変異性導入用の媒体として用いられてきたものであり、その媒体は治療用の抗体の設計に用いることができる（ナピック等、２０００）。退化したプライマーによるこの領域のランダム化は、莫大な配列の多様性をもたらすが、これらの構造の多くは、ほとんどではないが、ひずみができ、機能性のないものである。したがって、所定の標的に対する良好な親和性を得るには、非常に大きな合成抗体ライブラリーが必要である。
【０００５】
ゼムリンは、ヒトにおけるＨ−ＣＤＲ３領域がネズミＨ−ＣＤＲ３領域に比較してより長い範囲を示していることに注目し、それに続いて、ネズミとヒトのユニークで機能上公知となったＨ−ＣＤＲ３領域についてゼムリンの分析がなされた。ゼムリンは、Ｈ−ＣＤＲ３の長さが増大するにつれて、ある種のアミノ酸の頻度が変化することに注目した。例えばゼムリンは、セリン頻度が８〜１４アミノ酸残基の長さで増加すること、しかし１４アミノ酸残基以上の長さでは混合パターンを示すことを報告した。
【０００６】
最近、ホエット等は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ２３：（３）Ｍａｒｃｈ  ２００５で、一部が合成されたものであるが、ヒト供与体から捕捉されたＨＣＤＲ３領域を含んでいる可変重鎖配列（ＶＨ）を含む抗体ライブラリーの構築を記載した。特に、ＨＣＤＲ３領域を含まない（ＦＲ１−Ｈ−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＦＲ３）ＶＨ鎖の部分は、合成的に造られＶＨ遺伝子に取り込まれた；そして、ＨＣＤＲ領域（ＨＣＤＲ３−ＦＲ４）を含むＶＨ鎖の一部分は、自然発生のヒト自己免疫疾患患者に由来した。
【０００７】
ホエットは、合成的に造られたＨＣＤＲ３領域をＶＨ鎖への取込みによっては、同程度の機能的ライブラリーの多様性が質的な理由で達成できなかったという根拠から、ヒト供与体から捕らえたＨＣＤＲ３の取込みを選んだ。他の者が、いわゆる絞り込んだＨＣＤＲ３ライブラリーを生じるアプローチをとっていることは、驚くべきことではない（例えば、公表された特許出願ＵＳ２００６／０２５７９３７Ａ１を参照）、そこでは、機能的でないバインダー濃度を減少させる努力により多様性が調整され（Ｖ、ＤおよびＪセグメントに対する限定的な分析による）、それは、従来の知識では、できるだけ多くの多様性を含めることを目的としたライブラリーに高い期待がされており、そこでは必要とされているものよりも負担の多いライブラリースクリーニングがされている（特許出願‘９３７Ａ１を参照）。事実、ホエットは、自然発生のヒト抗体において、ＨＣＤＲ３が４から３５残基を超えて変化し、非ランダム配列の多様性をもっていることのみならず、自然のＨ−ＣＤＲ３レパートリーにおいてみつかった配列と長さの両方の多様性をコードするＤＮＡを合成することは不可能であることに注目した。その目的のために、ホエットは、生殖系細胞Ｄセグメントが、ＨＣＤ３ライブラリー員の適切な折りたたみと結合を助けるために選ばれ、そして、ライブラリー中にＤセグメントを含むことが望ましいことに注目して、特許出願‘９３７Ａ１で教えたＨＣＤＲ３ライブラリーの使用を記載して表している。特許出願’９３７Ａ１に教示されている絞り込んだライブラリーの一つの実際的な結果は、限定して設けた１つのデータセットを視野に入れて構築されたものである、すなわち、公知のＶ、ＤおよびＪセグメントが、最適の多様性または多様化を全てのアミノ酸残基で達成することに失敗している。
【０００８】
ホエット及び特許出願‘９３７Ａ１の教示とは対照的に、本発明は、とりわけ、DNA配列をコードするＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列の完全ランダム配列をバイアスをかけることにより、自然アミノ酸配列を模倣して、自然Ｈ−ＣＤＲ３レパートリーで本質的にわかっている多様性をもつ合成ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。
この意味では、本発明は、今まで、構築することが不可能と考えられていた方法で構築された抗体ライブラリーを提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、集合体の多様性が第一多様性要素による第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、そして第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域によって生じ、その多様性要素が異なるものである、変化している範囲のアミノ酸の多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。
【００１０】
本発明の目的は、Ｈ−ＣＤＲ３領域の一部分が、約４から約２２アミノ酸長の範囲で変化する、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、また、第一範囲のアミノ酸が約４〜約１３アミノ酸であり、第二範囲のアミノ酸が約１４〜約２２アミノ酸である、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ3領域の集合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一つの態様においては、本発明はその集合体の多様性が、第一多様化要素により第一範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、第二多様性要素により第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化している性Ｈ−ＣＤＲ３領域により生じ、第三多様性要素により第三範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、それらの多様性要素が異なるものである、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。本発明のこのような集合体は、第一範囲のアミノ酸が約４〜約９であり、第二範囲のアミノ酸が約10〜約１６であり、第三範囲のアミノ酸が約１７から約２２である、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域を含んでいてもよい。
【００１３】
別の態様においては、本発明は、多様化の集合体が、第一多様性要素により第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、第二の多様性要素により第二の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第三の多様化要素により第三の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第四の多様化要素により第四の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第五の多様化要素により第五の範囲内のアミノ酸の長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、そして第六の多様化要素により第六の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものであって、その多様性要素が異なるものである、多様化ヒトまたはヒト化抗体ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。本発明のこのような集合体は、第一の範囲のアミノ酸が約４〜約６アミノ酸であり、第二の範囲のアミノ酸が約７〜約９アミノ酸であり、第三の範囲のアミノ酸が約１０〜約１２アミノ酸であり、第四の範囲のアミノ酸が約１３〜約１５アミノ酸であり、第五の範囲のアミノが約１６〜約１８であり、第六の範囲のアミノ酸が約１９〜約２２である、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域を含んでいてもよい。
【００１４】
さらに、別の形態においては、本発明は、集合体の多様性が、第一の多様性要素によって第一の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第一の多様性要素によって第一の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第二の多様性要素によって第二の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第三の多様性要素によって第三の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第四の多様性要素によって第四の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第五の多様性要素によって第五の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第六の多様性要素によって第六の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、第七の多様性要素によって第七の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、および第八の多様性要素によって第八の範囲のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものであって、そして多様性要素が異なるものである、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。本発明のこのような集合体は、第一の範囲のアミノ酸が約４〜約５アミノ酸であり、第二の範囲のアミノ酸が約６〜約７アミノ酸であり、第三の範囲のアミノ酸が約８〜約９アミノ酸であり、第四の範囲のアミノ酸が約１０〜約１１アミノ酸であり、第五の範囲のアミノ酸が約１２〜約１３アミノ酸であり、第六の範囲のアミノ酸が約１４〜約１５アミノ酸であり、第七の範囲のアミノ酸が約１６〜約１７アミノ酸であり、第八の範囲のアミノ酸が約１８〜約１９アミノ酸であり、そして第九の範囲のアミノ酸が約２０〜約２２アミノ酸である、多様化ヒトまたはヒト化抗体ＣＤＲ３領域を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明は、第一の範囲のアミノ酸が約４〜約８であり、第一の多様性要素が、位置１においてアラニンが約８０％の頻度であり、位置２においてアラニンが約６０％の頻度であり、位置３においてグリシンが約４０％の頻度であり、位置７においてアスパラギン酸が約５０％の頻度であり、そして位置８においてチロシンが約４０％の頻度である、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様では、第一の範囲のアミノ酸が約９〜約１５であり、第一の多様性要素が位置１においてアラニンが約９０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約７０％の頻度であり、位置１０においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１１においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１２においてチロシンが約３０％の頻度であり、位置１３においてフェニルアラニンが約６０％の頻度であり、位置１４においてアスパラギン酸が約８０％の頻度であり、そして位置１５においてチロシンが約４０％の頻度である、多様性ヒトまたはヒト化抗体ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。
【００１７】
本発明は、第一の範囲のアミノ酸が約１６〜約２２アミノ酸であり、第一の多様性要素が、位置１においてアラニンが約９０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約６０％の頻度であり、位置３においてアスパラギン酸が約３０％の頻度であり、位置４においてグリシンが約２０％の頻度であり、位置５においてアルギニンが約１０％の頻度であり、位置６においてアルギニンが約１０％の頻度であり、位置７においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１５においてチロシンが約４０％の頻度であり、位置１６においてチロシンが約５０％の頻度であり、位置１７においてチロシンが約６０％の頻度であり、位置１８においてチロシンが約５０％の頻度であり、位置１９においてチロシンが約４０％の頻度であり、位置２０においてメチオニンが約５０％の頻度であり、位置２１においてアスパラギン酸が約９５％の頻度であり、そして位置２２においてバリンが約６０％の頻度である、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域を提供する。
【００１８】
別の形態においては、本発明は、抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域アミノ酸長が約９〜約１５アミノ酸である場合は、多様性が、Ｈ−ＣＤＲ３領域内でグリシンおよびセリンの高含量により生じる、多様化ヒトまたはヒト化抗体ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。本発明に関連して、アミノ酸またはその基における「高容量」の用語は、アミノ酸またはその基の１０％以上の頻度として定める。
【００１９】
さらに、別の態様では、本発明は、抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域のアミノ酸長が約１６から約２２アミノ酸である場合は、その多様性は、そのＨ−ＣＤＲ３領域内で高含量のセリン、Ｈ−ＣＤＲ３領域の終末部で高含量の塩基性アミノ酸、Ｈ−ＣＤＲ３の前端部分でアスパラギン酸、全Ｈ−ＣＤＲ３領域にわたり高含量の芳香性アミノ酸により生じる、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。
【００２０】
本発明の目的は、また、抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域のアミノ酸長が５アミノ酸である場合は、そのアミノ酸組成は、位置１において６０％アラニン、２０％スレオニンおよび０．５８％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置２において３０％アルギニン、３０％リジン、３０％スレオニンおよび０．５５％のシステインを除く自然に生じているすべてのアミノ酸；位置３において４０％のアスパラギン酸、４０％のフェニルアラニンおよび０．５８％のシステインを除く本来生じているすべてのアミノ酸；位置４において３０％アスパラギン酸、３０％グリシン、３０％メチオニンおよび０．６３％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸；位置５において３０％チロシン、３０％アスパラギン酸および０．５８％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸である、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域のアミノ酸長が１２アミノ酸である場合は、そのアミノ酸組成は、位置１において８５％アラニンおよび１５％のスレオニンとバリンの混合であり；位置２において７０％アラニン、３０％のセリン、スレオニン、グリシンおよびアラニンの混合物であり；位置９において２０％のアラニン、セリンおよびチロシンの混合および０．６３％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置１０において６０％フェニルアラニン、１０％メチオニンおよび ０．５８％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置１１において８０％アスパラギン酸、５％グリシンおよび０．５８％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置１２において５０％チロシン、１０％のバリンとイソロイシンの混合および ０．６３％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸である、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。
【００２２】
また、本発明の目的は、抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域のアミノ酸長が２０アミノ酸である場合は、アミノ酸組成は、位置１においては１００％アラニンであり；位置２において５０％アルギニンおよび５０％がリジンであり、位置３において３０％グリシンおよび０．５５％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置４において２０％アラニン、２０％グリシン、２０％ロイシンおよび０．６３％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置１４において、２０％セリン、２０％スレオニンおよび０．６３％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸であり；位置２１において９５％アスパラギン酸であり；位置２２において５０％バリンおよび０．５５％のシステインを除くすべての自然に生じているアミノ酸である、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。
【００２３】
本発明は、また、集合体の多様性が、第一の多様性要素によって第一の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じたものであり、第二の多様性要素によって第二の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じたものである、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を具える多様性ヒトまたはヒト化抗体可変重鎖に関する。
【００２４】
別の態様では、本発明によって範囲が変化するアミノ酸の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を具えるヒトまたはヒト化抗体可変重鎖の集合体を具える多様化ヒトまたはヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの集合体を提供する。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のヒトまたはヒト化抗体可変重鎖の集合体を具える多様性ヒトまたはヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの集合体を具える合成ヒトまたはヒト化抗体ライブラリーを提供する。
【００２６】
別の実施態様では、本発明は、ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域をコードする核酸分子の集合体を調製する方法であって、複数のＤＮＡ分子を合成する方法を具え、各々のＤＮＡ分子がＨ−ＣＤＲ３領域をコードするものであり、そのＨ−ＣＤＲ３領域は範囲が変化するものであり、第一範囲のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３領域をコードするＤＮＡ分子が第一多様性要素によって合成されたものであり、第二範囲のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３領域をコードするＤＮＡ分子が第二多様性要素によって合成されたものであって、その多様性要素が異なることとなる方法である。
【００２７】
本発明は、また、本発明の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体をコードする核酸の集合体に関する。
【００２８】
本発明は、また、集合体の多様性が第一の多様性要素によって第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、および、第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものであり、その多様性要素が異なるものである、範囲が変化するアミノ酸の多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体をコードする核酸集合体に関する。
【００２９】
本発明の目的は、また、核酸集合体の発現を具える変化する長の多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を得る方法を提供する。
【００３０】
本発明との関連では、他の多様性Ｈ−ＣＤＲ３領域における１またはそれ以上のアミノ酸位置は一定に保たれている。当業者はＨ−ＣＤＲ３領域内に多様性を導入するためのトリヌクレオチドの混合物を合成する効率および多様化したＨ−ＣＤＲ３領域をクローニングする効率にとって、Ｈ−ＣＤＲ３領域内に１またはそれ以上の定常位置を挿入することが望ましいと考えるであろう。
【００３１】
本発明の目的は、また、集合体の員が４から８アミノ酸長である場合は、４から８アミノ酸長をもつ前記員に適用する多様性要素は、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内で、０、１、２または３定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。本発明は、また、集合体の前記員が、９〜１０アミノ酸長である場合は、９〜１０のアミノ酸長をもつ 前記員に適用する前記多様性要素が、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２または３定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体に関する。
【００３２】
本発明は、また、その集合体の員が１１〜１３アミノ酸長である場合は、１１〜１３アミノ酸長をもつ前記員に適用する多様性要素が、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内に０、１、２または３定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。本発明の目的は、また、その集合体の員が１４アミノ酸長である場合は、１４アミノ酸長をもつ前記員に適用する前記多様性要素は、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内で ０、１、２、３、４または５定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。
【００３３】
本発明は、また、その集合体の員が１５〜１６アミノ酸である場合は、前記１５〜１６の長をもつ前記員に適用する前記多様性要素が、０、１、２、３、４、５、６、７または８定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。  
【００３４】
本発明の目的は、また、その集合体の員が１６〜１７アミノ酸長をもつ場合は、１６〜１７アミノ酸長をもつ前記員に適用される多様性要素が、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２、３、４、５、６、７または８定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することである。  
【００３５】
本発明は、また、その記集合体の員が１８アミノ酸長をもつ場合は、１８アミノ酸長をもつ前記集合体の前記員に適用する多様性要素が、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内で ０、１、２、３、４、５、６、７または８定常アミノ酸位置を定める多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することに関する。  
【００３６】
本発明は、また、前記集合体の員が１９アミノ酸長またはそれより長いアミノ酸長である場合は、１９アミノ酸長またはそれより長いアミノ酸長をもつ前記員の多様性が、前記長をもつ前記員のＨ−ＣＤＲ３領域内で０、１、２、３、４、５、６または７定常アミノ酸位置を定める、多様化ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体に関する。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
一つの態様は、本発明は、とりわけ、天然のアミノ酸分布を模倣したものであって、天然のＨ−ＣＤＲ３レパートリーとして本来知られている多様性を有する合成ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供することであって、これは、特定のＨ−ＣＤＲ領域の長さによってＤＮＡ配列をコードするＨ−ＣＤＲ３におけるアミノ酸のランダム分布にバイアスをかけることにより達成されたものである。
【００３８】
限定した一式のデータ、つまり公知のＶ、ＤおよびＪセグメントを用いる代わりに、従来から利用できるデータベース（例えば、Ｉｇ−ＢＬＡＳＴ）から入手可能なヒト抗体配列を分析し、Ｈ−ＣＤＲ３領域中のアミノ酸分布を決定するための根拠として用いることができる。
【００３９】
この意味では本発明は、今まで構築することが不可能と考えられていた方法により構築された抗体ライブラリーを提供する。
【００４０】
本発明は、また、範囲が変化するアミノ酸の多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供するものであり、当該集合体の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲内のアミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域を多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により、および第二多様性要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものである。
【００４１】
本発明の関連において、「多様性要素」の用語は、各々のＨ−ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸残基のいずれかの所定のアミノ酸の範囲に対して、前記Ｈ−ＣＤＲ３領域における１またはそれ以上の所与の位置においてアミノ酸が出現する頻度として定義される。本発明との関連では、所与の位置におけるアミノ酸の「頻度」は、本明細書での教示にしたがって頻度が０％〜１００％をとることができ、このような位置におけるアミノ酸出現の可能性として定義される。自然に生じているヒト抗体においては、Ｈ−ＣＤＲ３領域は約４〜３５アミノ酸長で変化する。したがって、本発明は、各Ｈ−ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸残基長が４から３５の間をとることができ、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸残基長であり、本明細書に十分に記載されているように、特定の多様性要素に適用されるアミノ酸の範囲は変化することができる。本発明の抗体または／および抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域は、ヒトまたはヒト化であることができるが、本明細書に十分に記載されているように、多くの関連について使用することができる。
【００４２】
一つの態様において、本発明は、２〜４の多様性要素によって変化するアミノ酸長の多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域を提供する。したがって、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体は、第一多様性要素によって第一範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域および第二多様化要素によって第二範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じる得る。本発明との関連では、第一および第二多様性要素は異なるものである。第一範囲のアミノ酸が約４〜１３アミノ酸であり、第二範囲のアミノ酸が約１４から２２アミノ酸である。多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じる：つまり、約４〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約１０〜約１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素および約１７〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素である。その代わりに、多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、例えば、以下の要素の適用により生じる：すなわち、約４〜約８のアミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性、約９〜１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約１４〜約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素および約１９〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素である。
【００４３】
別の態様では、本発明は、５〜７の多様性要素によって変化する範囲のアミノ酸長の多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域を提供する。多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の要素の適用により生じる得る：約４〜約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約８〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約１２〜約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約１６〜約１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約２０〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域における多様性は、また、以下の要素の適用により生じ得る：約４〜約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約７〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約１０〜約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約１３〜約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１６〜約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１９〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素である。ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の要素の適用により生じる：約４〜約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約７〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約１０〜約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約１３〜約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１６〜約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１９〜約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素および約２１〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、８〜１０の多様性要素によりアミノ酸長が変化する多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域を提供する。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体部位における多様性は、以下の要素の適用により生じ得る：約４から約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約７〜約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約９〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約１２〜約１４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１５〜約１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１７〜約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１９〜約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員をもつ第七多様性要素および約２１〜２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素である。別の例としては、多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の要素の適用により生じ得る：約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６〜約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約８〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約１０〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１２〜約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１４〜約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１６〜約１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１８〜１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素および約２０〜２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の要素の適用により生じることができる：約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６〜約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約８〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約１０〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１２〜約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１４〜約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１６〜約１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１８〜１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約２０〜２１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素および約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素である。    
【００４５】
別の態様においては、本発明は、１１〜１４の多様性要素によって変化しているアミノ酸長の多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域を提供する。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じ得る：約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６〜約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約９〜約１０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１２〜約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１４〜約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１６〜１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１８〜１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素および約２１〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、また、以下の適用により生じることができる：約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約８〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１１〜約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１４〜１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１６〜１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１９〜２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素および約２１〜約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素である。多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じ得る： 約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約８〜約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約１０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１１〜約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１４〜１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１６〜１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１９〜２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一��様性要素、約２１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素および約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性が以下適用により生じ得る： 約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１０〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１３〜１４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１５〜１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１８〜１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素、約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素、約２１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素および約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十四多様性要素である。
【００４６】
さらに、別の態様においては、本発明は、１５から１７の多様性要素によって変化しているアミノ酸長の多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域を提供する。多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じることができる：約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１０〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１４〜１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１７〜１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素、約１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素、約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素、約２１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十四多様性要素および約２２アミノ酸長をもつ第十五多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じ得る：約４〜約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約１０〜約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素、約１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素、約１８〜１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素、約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十四多様性要素、約２１アミノ酸長をもつ第十五多様性要素および約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十六多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下により適用することができる： 約４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約６〜約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に��する第五多様性要素、約１０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素、約１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素、約１７〜１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素、約１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十四多様性要素、約２０アミノ酸長をもつ第十五多様性要素、約２１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十六多様性要素および２２アミノ酸長をもつ第十七多様性要素である。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、１８〜１９の多様性要素によって変化するアミノ酸長の多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域を提供する。多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じることができる： 約４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素、約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素、約１６〜１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素、約１８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十四多様性要素、約１９アミノ酸長をもつ第十五多様性要素、約２０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十六多様性要素、約２１アミノ酸長をもつ第十七多様性要素および約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十八多様性要素である。多様性ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体における多様性は、以下の適用により生じることができる： 約４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第一多様性要素、約５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第二多様性要素、約６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第三多様性要素、約７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第四多様性要素、約８アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第五多様性要素、約９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第六多様性要素、約１０アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第七多様性要素、約１１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第八多様性要素、約１２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第九多様性要素、約１３アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十多様性要素、約１４アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十一多様性要素、約１５アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十二多様性要素、約１６アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十三多様性要素、約１７アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十四多様性要素、約１８アミノ酸長をもつ第十五多様性要素、約１９アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十六多様性要素、約２０アミノ酸長をもつ第十七多様性要素、約２１アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十八多様性要素および約２２アミノ酸長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員に対する第十九多様性要素である。
【００４８】
当業者は、多様性要素の数は、所定の長をもつＨ−ＣＤＲ３領域員におけるアミノ酸の位置の数にまで合わせることができると考えるであろう。好ましくは、１９までの多様性要素が用いられる、そして、本発明の多様化したＨ−ＣＤＲ３領域の集合体は、多様化したＨ−ＣＤＲ３領域の種々の集合体を形成するために、単独でまたは可変重鎖ドメインまたは全配列または実質的に免疫グロブリン鎖の完全長として併せることができる。
【実施例】
【００４９】
次のような限定されない実施例は、とりわけ、特定の範囲内のアミノ酸（aa）長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に適用することができる一定の多様性要素に対するパラメーターを特定することによって本発明の種々の実施態様を画定する。このような理論的デザインに、少なくとも一部は、基づいたある種のクローニング効率を満たす要望があるために、下記に述べる理論的なデザインから多様性（アミノ酸頻度）におけるいくらかの偏差が本発明の範囲から逸脱することなしに許容されることを当業者は理解するであろう。
【００５０】
Ｈ−ＣＤＲ３−設計作成のための配列の検索順序と編集：
分析用のデータ類は、ＮＣＢI−サーバー上のＩｇ−ＢＬＡＳＴから得た。Ｉｇ−ＢＬＡＳＴのデータレコードを含む次のファイル、ｆｔｐ：ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｉｇＳｅｑＰｒｏｔ．ｇｚ．、をダウンロードした。ヒトまたはマウスまたは、ＦＡＳＴＡフォーマット中にデータ収録さている名称−タグに認定がないもの、合計４０，８０８データレコ−ドをダウンロードした。ＭＳ−ワード中の名称タグで「ヒト」というキーワードでデータをフィルターをかけることにより、ヒト抗体として収録されている２２，５００を抽出した。ヒト抗体２２，５００収録の中で、１３，２３５が重鎖に、５，４９０が軽鎖に認定されていた。名称−タグにキーワードがみつからなかったので、残りの抗体は、hc-κ（カッパ）およびIc -λ（ラムダ）であるとさらに認定した。重鎖については、ＭＳ−Ｅｘｃｅｌで異なる長さには異なるワークシートを用いて長さにしたがってＨ−ＣＤＲ３集合体を処理した。Ｈ−ＣＤＲ３−分析のために、１３，２３５の配列中８，８８６が重鎖分析用に取りだされた。
【００５１】
長さ依存性Ｈ−ＣＤＲ３−デザイン：
一例として、３つの多様性要素によって次の３つのデザインが生じた。
４ａａ−７ａａ
８ａａ−１４ａａ
１５ａａ−２３ａａ
カバット位置（以下、位置という。）１０２でＹ−容量は、５０％から５％へ８ａａ−２３ａａ長を超える減少を示す、一方、この位置でＶ−容量は、１２％から６５％へ増加している。付け加えると、位置１０１におけるＤ−容量は、７５％から１００％に増大している。その長さを超えて異なるａａを見いだすためには、本発明の範囲を限定することにはならないが、ループベースのデザイン下では２つの異なる多様性要素を選ぶことを決めた：それは、一つは８−１４ａａであり、他は１５−２３ａａであり、一方、４−７ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に適用する多様性要素は、左のデザインによることができる。
【００５２】
アライメント−タイプ：
数種のａａ長の一つのデザインを要約するために、次のようなタイプのアライメントが、８−１４ａａおよび１５−２３ａａを含むライブラリー員をデザインするための代表的な選択（物）である（表１）：つまり、左側へのアライメント、右側へのアライメントおよび対称アライメントである。
【００５３】
【表１】
2009519727.tif 000002
【００５４】
「階段」の各ステップは、ある長さのコンセンサス−配列を表わす。最初の３つの位置は、近接するフレームワーク領域の部分を表している：カバット位置９２、９３、９４でのＣＡＲ領域およびカバット位置１０３でのＦＷ４（ＷＧＱＧ）の始めのＷである。
【００５５】
左アライメント（表１および図１）：
最初の３つの位置（カバット番号付け９６、９７および９８）はブロックとして整列された。これらの位置は、Ｖセグメントとセグメント間の境界にあって、Ｖ−コード（生殖細胞系）であるかもしれない。このようにこれらの位置は、残部のＨＣＤＲとは配置構成が異なっており、それらは、分離している。ここではＹ容量が減少しているので、位置９６と９７は他のＨＣＤＲの位置とは異なっており、一方、位置９６では、Ｄ容量が上昇している。優性なＦＤＹ−配列を含む最後の５つの位置（カバット位置ｌ、ｍ、ｎ、１０１および１０２）は、ブロックとして整列されている。１０１および１０２の位置は、しばしば、コードされたＪ−セグメントであり、そして、類似したアミノ酸分布を示す。先ず、最初の３つと最後の５つの位置をａａで満たした後、左側へのアライメントが、カバット位置９９で始まり、続いてカバット位置９９と「ｌ」間のギャップを満たしている。
【００５６】
右側アライメント（表１および図２）：
ここでは、左側アライメントについての記述と同様な考えにより、カバット位置９６、９７および９８が、カバット位置、ｌ、ｍ、ｎ、１０１および１０２は、ブロックとして整列されている。先ず、最初の３つを、そして最後の５つをａａで満たした後、右側へのアライメントはカバット位置「ｌ」で始まり、続いて  カバット位置「ｌ」と９９のギャップを満たした。
【００５７】
センターアライメント（表１および図３ａ、３ｂ、３ｃ）：
構造上の側面を考えると、左右対称アライメントが、アライメントの望ましいタイプであり、付け加えると、ループ中でａａとの相互作用を速い認識を可能にする。ここで、新アミノ酸が、ある位置に対称に加えられる。免疫グロブリン可変ドメインに対するさらに別の符番図：「分析手段の自動的なモデル化、Ａ．ホネガー、Ａ．プルックサン、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（２００１）３０９，６５７−６７０」に記載しているように、AHO−位置１２３に対して対称アライメントを実行した。
【００５８】
２つの対称アライメントが可能である：一つのアライメントは、１２３の位置でギャップをつくり、その配列をフレームワークの方へずらし、そして、別のアライメントは、対称軸としての位置１２３へ配列をずらし、同数のａａをもつ２つの部分に分割するものである。第一のアライメントは、隣接領域（図３ａ）の ａａ−分布を記載している、一方、同じ配列が取り出されて、別の方法で整列されているのであるが、第二のアライメントは、Ｈ−ＣＤＲ３領域のループ−チップを記載している（図３ｂ）。ループにとっては、新しいアミノ酸がループの基盤に対称に取り込まれている。混合センターアライメント（図３ｃ）においては、その配列は、ＡＨＯ−１２３位置に対して対称におかれたが、しかし、ループと側面領域の整列を組み合わせたものである。位置１２３を囲んでいる５個のａａのブロックは一定に維持されているが、一方では、他の配列が隣接領域に並んでいる。抗体可変領域に用いることができる符番システムの例を図４に示している。
【００５９】
表２は、４−７ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（隣接領域）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等な分布であるという記載である。
【００６０】
【表２】
2009519727.tif 000003
【００６１】
表３は、４−７ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（ループ−領域）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等分布を記載する。
【００６２】
【表３】
2009519727.tif 000004
【００６３】
表４は、４−７ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対する左アライメントの結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等分布を記載している。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
表５は、４−７ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域の右アライメントを示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等分布を記載している。
【００６６】
【表５】
2009519727.tif 000006
【００６７】
表６は、８−１４ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（隣接−領域）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等分布を記載している。表７は、８−１４ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（ループ領域）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａ長の均等分布を記載している。表８は、８−１４ ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域のセンターアライメント（混合−センター）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等な分布を記載している。表９は、８−１４ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対する左アライメントの結果を示している。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等分布を記載している。表１０は、８−１４ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対する右アライメントの結果を示している。「All」は、システインを除く全ての１９ａａの均等分布を記載している。表１１は、１５−２３ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（隣接領域）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａ長の均等な分布を記載している。表１２は、１５−２３ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（ループ領域）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａ長の均等分布を記載している。表１３は、１５−２３ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対するセンターアライメント（混合−センター）の結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａ長の均等分布を記載している。表１４は、１５−２３ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対する左アライメントの結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａ長の均等分布を記載している。表１５は、１５−２３ａａ長をもつＨ−ＣＤＲ３領域に対する右アライメントの結果を示す。「All」は、システインを除く全ての１９ａａ長の均等分布を記載している。
【００６８】
【表６】
2009519727.tif 000007
【００６９】
【表７】
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【００７０】
【表８】
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【００７１】
【表９】
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【００７２】
【表１０】
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【００７３】
【表１１】
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【００７４】
【表１２】
2009519727.tif 000013
【００７５】
【表１３】
2009519727.tif 000014
【００７６】
【表１４】
2009519727.tif 000015
【００７７】
【表１５】
2009519727.tif 000016
【００７８】
別の限定されない実施例では、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ３領域の多様性が、第一の多様性要素による第一範囲内の約４〜約８アミノ酸の長をもつＨ−ＣＤＲ３領域により生じ得るものであり第一多様性要素が、位置１においてアラニンが約８０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約６０％の頻度であり、位置３においてグリシンが約４０％の頻度であり、位置７においてアスパラギン酸が約５０％の頻度であり、位置８においてチロシンが約４０％の頻度であることを要する変化する長の多様性Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する（表１６）。
【００７９】
【表１６】
2009519727.tif 000017
【００８０】
別の限定しない実施例においては、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ３領域の多様性が、第一多様性要素によって第一範囲内の約９〜約１５アミノ酸の長をもつＨ−ＣＤＲ３領域により生じ得るものであり、第一多様性要素が、位置１においてアラニンが約９０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約７０％の頻度であり、位置１０においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１１においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１２においてチロシンが約３０％の頻度であり、位置１３においてフェニルアラニンが約６０％の頻度であり、そして位置１４においてアスパラギン酸が約８０％の頻度であり、位置１５においてチロシンが約４０％の頻度であることを要する、変化する長のヒトまたはヒト化抗体ＣＤＲ３領域の集合体を提供する。好ましくは、約９〜約１５アミノ酸長をもつヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の多様性が、前記Ｈ−ＣＤＲ３領域の内側で高容量のグリシンおよびセリンにより生じるものである（表１７）。
【００８１】
【表１７】
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【００８２】
さらなる別の限定されない実施態様では、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ３領域の多様性要素が、第一多様性要素によって生じる約１６〜約２２アミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ得るものであり、第一多様性要素が、位置１においてアラニンが約９０％の頻度であり、位置２においてアルギニンが約６０％の頻度であり、位置３においてアルパラギン酸が約３０％の頻度であり、位置４においてグリシンが約２０％の頻度であり、位置５においてアルギニンが約１０％の頻度であり、位置６においてアルギニンが約１０％の頻度であり、位置７においてチロシンが約２０％の頻度であり、位置１５においてチロシンが約４０％の頻度であり、位置１６においてチロシンが約５０％の頻度であり、位置１８においてチロシンが約６０％の頻度であり、位置１９においてチロシンが約４０％の頻度であり、位置２０においてメチオニンが約５０％の頻度であり、位置２１においてアスパラギン酸が約９５％の頻度であり、そして位置２２においてバリンが約６０％の頻度であることを要する、長さが多様化している多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体を提供する（表１８）。
【００８３】
【表１８】
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【００８４】
さらに、約１６〜約２２アミノ酸のアミノ酸長をもつヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体の多様性が、Ｈ−ＣＤＲ３領域中の高容量のセリン、Ｈ−ＣＤＲ３領域の末端（Ｃ−末端）で高容量の塩基性アミノ酸、Ｈ−ＣＤＲ３領域中の前端部（Ｎ−末端）でのアスパラギン酸および全Ｈ−ＣＤＲ３領域にわたり高容量の芳香性アミノ酸により生じている。
【００８５】
本発明に関連して、Ｈ−ＣＤＲ３領域の所定のアミノ酸位置において、所与のアミノ酸位置における定められた頻度が特定されていないアミノ酸の出現は、実質的に互いに等しい比率であり、あるいは、あるアミノ酸はこのような位置においては、他のアミノ酸に比較して高い頻度であるかもしれない、ある場合では、ある種のアミノ酸は、一またはそれ以上の一定のアミノ酸位置において除外されているかもしれない（例えば、システイン）。
【００８６】
本発明に関連して、多様化Ｈ−ＣＤＲ３領域のデザインが、ＤＮＡ配列をコードするＨ−ＣＤＲ３領域におけるアミノ酸の完全なランダム分布にバイアスをかけることで公知の自然のアミノ酸分布を模倣することによりなされ得る。多様化Ｈ−ＣＤＲ３領域の生成は、トリヌクレオチド変異技術（ＴＲＩＭ）（ビルネケス等、１９９４）を用いて行うことができる、その技術は、どのような位置においても、いずれかのアミノ酸バイアスをいずれかの位置に導入することにより、各一つの位置において、意のままに希望するアミノ酸混合物を合成することができる。一般的には、ＴＲＩＭテクノロジーは、標準ＤＮＡ合成用に入力される予め調合したトリヌクレオチドの使用すること、その方法を用いて、フレームシフト、ストップコドン、望んでいないアミノ酸を回避し、莫大な量の配列の多様性を得ることについて信頼し得る。それ故、十分に広範囲な機能性配列スペースを生じさせるためには、大変大きな規模のライブラリーが必要となる。したがって、長さ依存アミノ酸組成物の知見をＴＲＩＭテクノロジーに併用すると、より高度な機能内容をもつＨ−ＣＤＲ３領域のより小さい集合体のデザインが可能になるはずである。
【００８７】
別の態様では、本発明は、各々のＨ−ＣＤＲ３領域の多様性が、第一の多様性要素による第一の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域および第二の多様性要素によって第二の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じ、そして各多様性要素が各Ｈ−ＣＤＲ３領域のアミノ酸長の機能である、多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域の集合体を具える、ヒトまたはヒト化抗体可変重鎖の集合体を提供する。さらに、本発明は、本発明のヒトまたはヒト化抗体可変重鎖をその各々に含む多様化ヒトまたはヒト化抗体または機能的なフラグメントの集合体を提供する。
本発明に関連して、多様化ヒトまたはヒト化抗体またはその機能性フラグメントの集合体の生成に対して、当業者は多様化Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体の理論的なデザインを改変するであろうと考えられる。当業者は、例えば、お互いに等モル濃度でこのような頻度以下で現れるアミノ酸を添加することにより、低い頻度（例えば、５％以下頻度、好ましくは、３％以下）で現れるアミノ酸に関してデザインを変更することは受け入れられるように思われ、従って、多様化ヒトまたはヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの集合体がこのような濃度でこのようなアミノ酸との混合物を含むことにより生じるかもしれない。
【００８８】
別の態様においては、本発明は、多様性ヒトまたはヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの集合体を具える合成ヒトまたはヒト化抗体ライブラリーを提供する。合成コンセンサス配列は、ヒトゲノムにおいてコードされる抗体の構造上のレパートリーに及ぶことができる。合成ヒトまたはヒト化抗体ライブラリーは、抗体または抗体フラグメント、好ましくは、Ｆｖ，ジスルフィド結合をもつＦｖ，単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、またはＦａｂフラグメントに基づいている、そして、それらは新しい標的抗原に対する特異性の出所源として用いることができる。
【００８９】
本発明に関連して、合成ヒトまたはヒト化抗体ライブラリーは、インシリコでデザインされ、合成的に創られた核酸によりコードされるアミノ酸配列に基づくことができる。インシリコにおいて、例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、そこから得たデータを用いてポリペプチド配列を立案することにより抗体配列のデザインが達成されている。公知のヒト免疫グロブリン、可変ドメインの生殖系細胞のアミノ酸配列を分析することにより、抗体遺伝子が、配列のホモモロジーおよび標準構造に従い、サブファミリーに分類され得る（チョチア等１９９２，トムリンソン１９９５）。ある一つのサブファミリー内でのアミノ酸配列と標準構造の手法により高い相同性のために、７ＶＨとＶＬコンセンサス配列（マスター遺伝子）をデザインし、結合して４９の基本骨組（マスターフレームワーク）の組合わせを創った（クナップ等、２０００）。マスター遺伝子は、全ての機能的なモジュールを側面にもつユニークな制限サイトを導入することにより完全なモジュラー遺伝子構造をそこに生成するように化学合成され得る。         
【００９０】
デザインされ、イン  シリコで創られた配列を得る方法が記載されている、例えば、クナピック等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；クレブ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７；およびＵ．Ｓ．特許６，３００，０６４、クナップ等に記載されており、これらは、全内容が参照により本明細書に取り込まれている。
【００９１】
別の態様においては、本発明は、多様性ヒトまたはヒト化Ｈ−ＣＤＲ３領域をコードする核酸分子の集合体を調製する方法を提供する。このことは、例えば、各々がＨ−ＣＤＲ３領域をコードするものであり、そのＨ−ＣＤＲ３領域は範囲が変化するものである、複数のDNA分子を合成することによりなし得る。この目的のために、第一範囲のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３領域をコードするＤＮＡ分子が第一多様性要素によって合成され、そして、第二の範囲のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３領域をコードするＤＮＡ分子が、第二多様性要素によって合成され、その多様性要素が異なるものである。
【００９２】
一つの態様においては、本発明は、集合体の多様性が、第一の多様性要素によって第一の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域、および第二の多様性要素により第二の範囲内のアミノ酸長をもつ多様化しているＨ−ＣＤＲ３領域により生じるものであり、その多様性要素が異なるものである、変化している範囲のアミノ酸の多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体をコードする核酸の集合体を提供する。
【００９３】
多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＳＤＲ３領域の集合体を得る方法が、本発明の範囲内で提供されている。これは、本発明の多様化ヒトまたはヒト化抗体Ｈ−ＣＤＲ３領域の集合体をコードする核酸の集合体を発現させることにより達成し得る。
【００９４】
別の態様においては、所定の標的に結合する本発明の１またはそれ以上のＨ−ＣＤＲ３領域をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子を特定する方法を提供する。これは、例えば、Ｈ−ＣＤＲ３領域を発現させ、次に、所定の標的分子に結合する一つまたはそれ以上のＨ−ＣＤＲ３領域を単離するスクリーニングにより達成される。H-CDR3領域は、抗体可変重鎖範囲内に具えられる。スクリーニングは、ファージ提示法またはCysDisplay（例えば、ＵＳ特許６，７５３，１３６に記載）のような、その分野の熟練者により公知の方法の一つを用いて行うことができる。
【００９５】
本発明に関連して、ヒトまたはヒト化抗体ライブラリーはデザインされた合成ＤＮＡをヒト供与者からの遺伝子断片に併用することに基づくものであり得る。一例に、軽鎖可変領域またはある範囲の重鎖領域をコードするヒト供与体に由来する断片が、特定の部位に導入された多様性をもつヒト抗体配列をコードする合成ＤＮＡに組み合わせられている。
【００９６】
本発明は、本明細書に開示したような抗体またはそのフラグメントに由来する変異または最適化した抗体（またはそのフラグメント）を提供する。抗体は、２つのペプチド鎖により構成され、各々は、１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインおよび可変領域（ＶＬ，ＶＨ）を含み、後者は、各々が４つのＦＲ領域と３つの空隙をもつＣＤＲから造られている。 抗原結合部位は、１またはそれ以上のＣＤＲにより形成され、さらに、ＦＲ領域はＣＤＲの構造フレームワークを提供し、そして抗原結合に重要な役割を演ずる。ＣＤＲまたはＦＲ領域中の１またはそれ以上のアミノ酸残基を変えることにより、当業者は定型の仕事として、変異または多様化させた抗体配列を生成させることができ、それらは、抗原に対してスクリーニングでき、例えば、新規なまたは改良された性質をもつ抗原に対して選抜することができる。
【００９７】
また、本明細書で用いられているように、本明細書による「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ（またはそれらのサブクラス）に属するタンパクとして定義され、全ての従来の公知の抗体およびその機能的なフラグメントをも含まれる。抗体／免疫グロブリンの「機能的なフラグメント」は、本明細書では、抗原−結合領域を保持する抗体／免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧの可変領域）と定義する。抗体の「抗原−結合領域」は、１またはそれ以上の抗体の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、−２および／または−３領域にあることが知られているが、しかしながら、ＣＤＲにとっての足場の提供といった、可変フレームワーク領域もまた、抗原結合に重要な役割をもつ。好ましくは、「抗原結合−領域」は、少なくとも４〜１０３の可変軽鎖（ＶＬ）および５〜１０９の可変重鎖（ＶＨ）鎖を、より好ましくは、３〜１０７のＶＬおよび４〜１１１のＶＨであり、最も好ましくは、完全長のＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬの１〜１０９のアミノ酸位置、ＶＨでは１〜１１３のアミノ酸位置；ＷＯ９７／０８３２０に基づく数値）のアミノ酸残基を具えている。本発明において用いられる免疫グロブリンの好ましいクラスは、ＩｇＧである。本発明の「機能的なフラグメント」は、フラグメントＦ（ａｂ）２、フラグメントＦａｂおよびｓｃＦｖを含む。Ｆ（ａｂ）２およびＦａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメイン間で生じる分子間ジスルフィド結合の相互作用を最小化するために、または完全に取りはずすために設計される。
【００９８】
本明細書で用いる「超可変」の用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいては２４〜３４残基（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、重鎖可変ドメインにおいては３１〜３５（H１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（H３）；カバット等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１））、および／または「超可変ループ」からのそれらの残基（すなわち、軽鎖可変領域における、２６〜３２（Ｌ１），５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）であり、重鎖可変ドメインでは、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）である（チョチア、および  レスク、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））を具える。「フレームワーク」または「FR」残基は、本明細書で規定する以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【００９９】
「ヒト」抗体または機能性ヒト抗体フラグメントは、本明細書では、キメラ（例えば、
「ヒト化」ではない。）ではなく、そして、（全部または一部が）ヒト以外の種に由来するものはなない。ヒト抗体または機能性ヒト抗体フラグメントは、ヒトに由来するものであり得るか、または合成ヒト抗体でり得る。本明細書で「合成ヒト抗体」は、公知のヒト抗体配列の分析に基づいた、全部または一部がイン  シリコでの合成配列に由来する配列をもつ抗体として定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのイン  シリコでのデザインは、例えば、ヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを用いてポリペプチド配列を立案することにより、達成することができる。ヒト抗体または機能的なフラグメントの別の例は、ヒト起源のライブラリーまたは抗体配列から単離した核酸によりコードされるものである（すなわち、ヒト自然源から取り出された抗体に基づいたライブラリーのごときもの）。
【０１００】
「ヒト化抗体」または機能的なヒト化抗体フラグメントは、（i）少なくとも一部がヒトではない出所源に由来し（例えば、異種の免疫系をもつトランスジェニックマウス）、その抗体がヒト生殖細胞系列の配列に基づくもの、（ii)少なくとも可変領域の一部がヒト以外の起源に由来し、定常ドメインがヒト起源に由来するキメラ、(iii)可変ドメインのＣＤＲの少なくとも一部がヒト以外の起源に由来するものであり、一方、可変ドメインの１または１以上のフレームワークが、ヒト起源であって、定常領域がヒト起源である（もしあれば）、の中のいずれか一つとして本明細書では定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、左アライメントを示す図である。図１ｂにおいて描いた各「階段」における各ステップは、所定のＨＣＤＲ３長をもつ平均３８０配列のコンセンサス配列を表す。左アライメントでは、左から右にかけて長さが増加するにつれて対角線に沿って付加するアミノ酸残基を挿入することにより異なる長さのものが並んでいる。
【図２】図２は、右アライメントを示す図である。図２ｂにおいて描いた各「階段」における各ステップは、所定のＨＣＤＲ３長をもつ、平均３８０配列のコンセンサス配列を表す。右アライメントでは、右から左へ長さが増加増するにつれて対角線に沿って付加するアミノ酸残基を挿入することにより異なる長さのものが並んでいる。
【図３】図３ａは、センターアライメント（隣接領域）を示す図である。右図に描かれた図中の各層は、所定のＨＣＤＲ３長をもつ平均３８０配列のコンセンサス配列を表す。隣接領域のアライメントにおいては、外側の中程から内側へ（隣接領域からループ領域へ）長さが増加するにつれて、対角線に沿って付加アミノ酸残基の挿入により異なる長さのものが並んでいる。濃い灰色の部分は、新しく追加した残基を例示する。  図３ｂは、センターアライメント（ループ領域）を示す図である。右図に描かれた図中の各層は、所定のＨＣＤＲ３長をもつ平均３８０配列のコンセンサス配列を表す。濃い灰色の部分は、新しく追加した残基を例示する。  図３ｃは、センターアライメント（混合−センター）を示す図である。右図に描かれた図中の各層は、所定のＨＣＤＲ３長をもつ平均３８０配列のコンセンサス配列を表す。濃い灰色の部分は、新しく追加した残基を例示する。
【図４】図４は、抗体可変領域の符番模式図の例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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