(57)【要約】本発明は、糖鎖形成に関与する酵素を遺伝工学的に操作し、糖化が減少したヒト型糖タンパク質をハンセヌラポリモルファシステムを用いて生産する方法に関する。より具体的に、本発明は、ハンセヌラポリモルファのドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を同定し、前記同定された遺伝子を欠損させ、糖化が減少した糖タンパク質を生産するハンセヌラポリモルファ変異株を製造し、前記変異株の多様な操作によって、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質を製造する方法に関する。
2009513131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列、またはこれと９０％以上の相同性を有し、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ(dolichyl-phosphate-mannose dependentα-1,3-mannosyltransferase)
酵素活性を示すタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を持つ、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１で表される核酸を含む組み換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠損させ、糖化が減少した糖タンパク質を生産するハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項６】
さらに、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼおよびα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼの中から選ばれる少なくとも一つの遺伝子を欠損させた、請求項５に記載のハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項７】
α−１，２−マンノシダーゼ、マンノシダーゼＩＡ、 マンノシダーゼＩＢ、マンノシダーゼＩＣ、マンノシダーゼＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、ガラクトース転移酵素(galactosyltransferase)、シアリルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一つの糖鎖修飾酵素が過発現される、請求項５または６に記載のハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項８】
請求項５〜請求項７のいずれか１項による、Ｈｐａｌｇ３Δ（寄託番号第ＫＣＴＣ１０８６７ＢＰ号）、Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ（寄託番号第ＫＣＴＣ１０８６８ＢＰ号）またはＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ−ＭｓｄＳｐである変異株。
【請求項９】
請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の変異株を用いる段階を含む、ヒト型Ｎ糖鎖付き糖タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
Ｈｐａｌｇ３Δ変異株を用いて５個〜８個のマンノース残基を持つＭａｎ５−８ＧｌｎＮａｃ２の糖化骨格、Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ変異株を用いて４個〜６個のマンノース残基を持つＭａｎ４−６ＧｌｎＮａｃ２の糖化骨格、またはＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ−ＭｓｄＳｐ変異株を用いて３個のマンノース残基を持つＭａｎ３ＧｌｎＮａｃ２の糖化骨格を持つ糖タンパク質を製造する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって製造されたヒト型Ｎ糖鎖付き糖タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)における糖鎖形成に関与する酵素を遺伝工学的に操作することにより、多様なヒト型Ｎ糖鎖の最小核心骨格を有する糖タンパク質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬用タンパク質を過発現させる場合、宿主細胞または目的タンパク質の特徴によって、タンパク質の発現量、水溶性か否か、発現部位、修飾(modification)などが異なるので、効率的な生産システムを構築するためには、目的タンパク質に最も適した発現システムを選択しなければならない。現在、第２世代の糖タンパク質が組み換え医薬品市場の７０％近くを占有し、市場を主導している。糖タンパク質のアスパラギンアミノ酸の残基に付着するＮ糖鎖の成分および構造が効能および安定性の主要決定因子であるという事実が明らかになっており(Koury, M., Trends Botechnol. 21, 462-464 (2003))、ヒトの糖鎖と最も類似な糖鎖が付いている糖タンパク質を生産することが可能な動物細胞培養技術が市場を先導している。ところが、低い生産性、高価の培地費用、ヒトに有害なウイルスやプリオンなどの感染危険性、および安定な細胞株の製造に要求される長時間などは、糖物細胞培養を用いた組み換え糖タンパク質の生産に大きい制限として作用する。
【０００３】
動物細胞発現システムの代替宿主として、真核生物である、高等糖物細胞のＮ結合型糖鎖形成過程と初期段階が同じ糖鎖生合成経路を持つ酵母の発現システムを用いて、医薬用組み換え糖タンパク質を生産しようとした。酵母発現システムは、経済的であり、タンパク質を高濃度で迅速に生成し、調節し易い生産条件を利用することができ、遺伝子操作が容易であり、ヒトまたは動物病原体の感染がなく、タンパク質の回収が容易であるという利点がある。ところが、酵母で合成された糖鎖構造は、ヒトの糖タンパク質に付いている糖鎖構造とは相異し、ヒトへの注入時に免疫反応を誘発するおそれがある。特に、高濃度マンノースタイプの酵母特異的糖外鎖糖化による過糖化は、組み換えタンパク質産物の異質性をもたらしてタンパク質精製を困難且つ複雑にするうえ、糖鎖の増加によって酵素の特異的活性を減少させる(Bekkers et al., Biochem. Biophy. Acta. 1089, 345-351 (1991))。
【０００４】
かかる問題点を解決するために、酵母の糖化経路を再設計し、ヒト由来のものと同等な生物活性を持つ糖タンパク質を発現させるための糖鎖工学が台頭してきた。伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で発現される組み換え糖タンパク質は、コアオリゴ糖(core oligosaccharide)に５０個〜２００個のマンノースが連続的に付加される過糖化(hypermannosylation)の発生と、ヒトに抗原として認知できるα−１，３−結合型末端マンノース(α-1,3-linked terminal mannose)の存在が、糖タンパク質生産のための宿主としての大きい問題点として提起された。これに対し、メタノール資化性酵母(methylotrophic yeast)であるハンセヌラポリモルファ(Hansenula
polymorpha)とピチアパストリス(Pichia pastoris)で発現された組み換え糖タンパク質は、サッカロミセスセレビシエで発現された組み換え糖タンパク質よりは全体的なマンノース糖外鎖(mannose outer chain)の長さが相当短いと報告された(Kim et
al., Glycobiol. 14, 243-251 (2004))。特に、メタノール資化性酵母であるハンセヌラポリモルファとピチアパストリスで合成された糖鎖にはヒトに免疫原性として作用するα−１，３−結合型末端マンノースが存在しないという点で、ヒト医療用糖タンパク質生産宿主として、伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエより優れた発現システムと評価される。また、組み換え糖タンパク質を分泌する能力も、メタノール資化性酵母であるハンセヌラポリモルファとピチアパストリスが優れるので、産業的活用性が高くて注目を受けている。
【０００５】
ピチアパストリスは、これを生産宿主として発現した組み換えタンパク質の中でも、医薬品として公式的な承認を受けた製品のない、完全には検証されていない菌株であるが、ハンセヌラポリモルファは、ドイツのＲｈｅｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社がこれを用いて製造したＢ型感染ワクチン、ヒルジンおよびインスリンなどを、医薬品として許可を受けて既に販売しており、組み換え医薬品生産酵母宿主として脚光を浴びている(Kang and Gellissen, Production of Recombinant proteins. Ed. G.
Gellissen, pp. 111-136 (2005))。ところが、ヒト型糖鎖付き糖タンパク質の生産のための酵母の糖鎖経路再設計技術は、基盤研究が確保されたサッカロミセスセレビシエと、発現システムが商用化されているピチアパストリスを主対象としている（ＷＯ０１１４５２２、ＷＯ０２００８７９、ＷＯ０４００３１９４、ＵＳ２００５／０１７０４５２、Wildt and Gerngross, Nature Rev. Microbiol. 3, 119-128 (2005))。これに反し、ハンセヌラポリモルファを用いた研究は微々たる実情である。
【０００６】
ハンセヌラポリモルファを糖鎖工学に用いた研究としては、本発明者らがハンセヌラポリモルファの糖外鎖合成において重要な役割を果たすＨｐＯＣＨ１とＨｐＯＣＨ２遺伝子をクローニングし、この遺伝子が破砕された突然変異株を用いて、過糖化が起こっていない糖鎖構造を持つ組み換え糖タンパク質を生産する方法を開発したことがある（韓国特許出願第２００２−３７７１７号、韓国特許出願第２００４−６３５２号、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１８１９号）。ところが、ハイブリッドおよび複合ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質を発現させるためには、最小骨格である３つのマンノースが付いているトリマンノース核心糖鎖形態を作らなければならないが、ハンセヌラポリモルファではこれについての研究がなされていない実情である。
【０００７】
そこで、本発明者らは、メタノール資化性酵母であるハンセヌラポリモルファにおける、糖タンパク質に糖鎖が付着する前段階、すなわち脂質連結糖鎖形成過程の初期に関与する核心酵素であるドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼをコードする新規の遺伝子（ＨｐＡＬＧ３）を同定し、前記遺伝子単独、または糖化過程に関与する一つ以上の他の酵素を操作する場合、ハンセヌラポリモルファにおける糖化経路の多様な操作が可能であり、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質を製造することができるという事実を見出し、本発明を完成した。
【特許文献１】国際公開  ＷＯ０４／００３１９４
【特許文献２】国際特許出願  ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１８１９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を有し、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ(dolichyl-phosphate-mannose dependentα-1,3-mannosyltransferase)
酵素活性を示すタンパク質を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、配列番号１で表される前記タンパク質をコードする核酸を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、前記核酸を含む組み換えベクターを提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨｐＡＬＧ３）を欠損させ、糖化が減少した糖タンパク質を生産するハンセヌラポリモルファ変異株を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、（ａ）ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、および（ｂ）α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼとα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼの中から選ばれる少なくとも一つの遺伝子を欠損させたハンセヌラポリモルファ変異株を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、（ａ）ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子、および（ｂ）α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼとα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼの中から選ばれる少なくとも一つの遺伝子を欠損させ、（ｃ）少なくとも一つの糖鎖修飾酵素を過発現するハンセヌラポリモルファ変異株を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、前記変異株を用いる段階を含む、ヒト型糖タンパク質の製造方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記方法によって製造されたヒト型糖タンパク質を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、医薬用タンパク質の生産宿主として検証されたハンセヌラポリモルファにおいてヒト型糖鎖を持つように調節するためのシステム実現技術に関する。
【００１７】
タンパク質のプロセシングに関与する酵素を操作し、遺伝的に変形された糖化過程を保有する菌株を製作するためには、糖鎖形成の初期段階に作用する酵素を操作し、ハンセヌラポリモルファの糖鎖修飾経路を初期段階から再設計することが効率的である。全ての真核生物と同様に、小胞体で起るＮ糖鎖の初期生合成プロセスは２部分に大別される。まず、小胞体膜においてドリコールリン酸(Dolichyl phosphate)と呼ばれる脂質伝達体に連結された形態で順次酵素が糖を付け加えて最初糖鎖（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が合成される。そして、このように合成された最初糖鎖は、小胞体内に存在するタンパク質の適切なアスパラギン（Ａｓｎ）残基に伝達され、さらに糖切断過程が行われ、ゴルジ体に運搬される核心糖鎖（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）が作られる。
【００１８】
本発明者らは、Ｈ．ポリモルファ菌株において、小胞体膜で起こる初期脂質連結糖鎖合成の核心酵素であるドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼに対するＨｐＡＬＧ３遺伝子を最初に究明した。また、本発明者らは、最初にＨ．ポリモルファのドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼとしての遺伝子産物の機能を解明した。その後、本発明者らは、前記遺伝子が破砕された変異株（Ｈｐａｌｇ３Δ）を製造し、前記変異株が成長表現型(growth
phenotype)へのいずれの変化なしでも糖タンパク質の糖化を効率よく減少させることを確認した。また、前記変異株を操作して多様なヒト型糖鎖の最小核心骨格となるトリマンノース核心糖鎖付き糖タンパク質を効果的に製造することができることを確認した。それだけでなく、ハンセヌラポリモルファのａｌｇ３Δ変異株がピチアパストリスのａｌｇ３Δ変異株(R Davidson et al., Glycobiol. 14, 399-407,(2004))より付着したマンノース糖の数が少なく、糖鎖プロファイリングの形態が単純且つ均一であって、ヒト型糖タンパク質の製造に一層さらに適するという事実も確認した。
【００１９】
本明細書において、用語「糖タンパク質(glycoprotein)」とは、少なくとも一つのアスパラギン残基または少なくとも一つのセリンまたはトレオニン残基上で糖化し、或いはアスパラギンおよびセリンまたはトレオニン残基上で糖化したタンパク質を意味する。本明細書において、用語「糖化が減少した(reduced glycosylation)」とは、メチル要求性酵母菌株内で糖タンパク質が発現されるとき、変形されていない野生型のメチル要求性酵母と比較して、糖タンパク質に結合する炭水化物の数が減少したこと、特により少ないマンノース残基を持つことを意味する。
【００２０】
一つの様態として、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を有し、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ(dolichyl-phosphate-mannose dependent α-1,3-mannosyltransferase)酵素活性を示すタンパク質に関する。
【００２１】
本発明者らは、ハンセヌラポリモルファのドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有することを究明した。野生型の配列を有するドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼだけでなく、酵素活性を持つ限りは、９０％以上の相同性を有するタンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明において、ハンセヌラポリモルファ起源のドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子に対して使用された用語「相同性」とは、野生型アミノ酸配列との類似な程度を示すためのものであって、本発明のドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼをコードするアミノ酸配列と好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一であり得るアミノ酸配列を含む。このような相同性の比較は、肉眼で、または購入し易い比較プログラムを用いて行うことができる。市販されるコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができる。相同性（％）は、隣接した配列に対して計算できる。
【００２３】
別の様態として、本発明は、前記タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００２４】
ハンセヌラポリモルファのドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、好ましくは配列番号１で表される核酸配列を有する。本発明者らは、配列番号１で表される核酸配列を有するハンセヌラポリモルファ由来のドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ（ＨｐＡＬＧ３）遺伝子をＧｅｎｅＢａｎｋに寄託番号ＤＱ１９３５３３で寄託し、また、このような遺伝子を含む組み換えベクターｐＧＥＭ−Ｔ
Ｅａｓｙ−ＨｐＡＬＧ３を製作した後、エシェリキアコライ(Escherichia cｏli)ＪＭ１０９菌株に形質転換によって導入し、２００５年８月１７日にＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ１０８３５ＢＰ号で寄託した。
【００２５】
別の様態として、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を有し、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターに関する。
【００２６】
このような組み換えベクターは、好ましくは配列番号２で表されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を有し、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００２７】
本発明において、用語「ベクター」は、宿主細胞にＤＮＡを導入しようとする通常の全ての手段を意味し、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどを含んだ通常の全てのベクターを含む。
【００２８】
適切なベクターは、プロモータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーなどの発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造できる。
【００２９】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、好ましくは寄託番号第ＫＣＴＣ１０８３５ＢＰ号で寄託された、形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３０】
別の様態として、本発明は、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼを欠損させ、糖化が減少した糖タンパク質を生産するハンセヌラポリモルファ変異株に関する。
【００３１】
本発明者らは、酵母、より具体的にハンセヌラポリモルファから、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質を生産するためには、前述した核心糖鎖生合成に重要な役割を果たすドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨｐＡＬＧ３）を重合酵素連鎖反応によって確保した後、細胞内遺伝子組み換えメカニズムを用いてＨｐＡＬＧ３の破砕を行い、糖化が減少した糖タンパク質を生産するハンセヌラポリモルファ変異株を製造しようとした。
【００３２】
ゲノム上で目的とした遺伝子のみの特異的不活性化は当分野で確立された方法によって行うことができ、その方法は特に限定されない。本発明者らは、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼを特異的に欠損させるために、相同組み換え(homologous recombination)法を使用した。ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼのＮ末端とＣ末端との間に選別マーカーを含むベクターでハンセヌラポリモルファを形質転換させ、ゲノムとベクターとの間に組み換えを誘導した。使用される選別マーカー(selection marker)は、特に限定されず、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが使用でき、本発明ではＵＲＡ３を選別マーカーとして用いた。
【００３３】
前記方法でドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠損させたハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３Δ変異株（ハンセヌラポリモルファＤＬ−１  Ｈｐａｌｇ３Δ）で発現される糖タンパク質の糖鎖は、５個〜８個のマンノースが付いている糖鎖（Ｍａｎ５−８ＧｌｃＮＡｃ２）を持っている。これは、７個〜１２個のマンノースが付いている糖鎖を持つ野生型ハンセヌラポリモルファに比べて、付いているマンノース数が著しく減少した。また、本発明で製造したハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３Δ変異株で発現される糖タンパク質にα−１，２−マンノシダーゼとα−１，６−マンノシダーゼを順次処理すると、ヒト型糖鎖の最小核心骨格であるトリマンノース核心糖鎖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）構造に転換されるという事実を観察した。これは、競争酵母宿主であるピチアパストリスＰｐａｌｇ３Δ変異株で発現された糖タンパク質が、マンノースなどを含む６炭糖が６個〜１５個付いている糖鎖（Ｈｅｘ６−１５ＧｌｃＮＡｃ２）を持つだけでなく、この中にはマンノシダーゼによって除去されない６炭糖が存在するという事実と比較すると(Davidson et al., Glycobiol. 14, 399-407, (2004)) 、ハンセヌラポリモルファがヒトハイブリッド型および複合型糖タンパク質の生産のための糖鎖工学適用菌株としてピチアパストリスより適することを意味する。
【００３４】
本明細書において、用語「ヒト複合型」とは、トリマンノース核心糖鎖の末端にある２つのマンノースにそれぞれＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸などが順次付加されていく構造を総称し、２つ以上のアンテナ構造を持つ。本明細書において、用語「ヒトハイブリッド型」とは、トリマンノース核心糖鎖から延出したアンテナの少なくとも一つがマンノース残基のみで伸長または終了し、残りのアンテナはＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸などが順次付加されていく構造を意味する。
【００３５】
Ｈｐａｌｇ３Δ変異株は、さらに糖鎖修飾経路を再設計して多様な形態の糖鎖を持つように操作することができる。
【００３６】
このような試みの一環として、Ｈｐａｌｇ３Δ変異株を用いて、糖鎖形成に関与する遺伝子の追加的な操作が可能である。例えば、さらにα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、または両遺伝子ともを欠損させることができる。本発明の具体的な実施では、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＨｐＯＣＨ２と、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＨｐＡＬＧ３とが共に欠損したＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株を製造した。Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株は、マンノースが４個〜６個であって、Ｍａｎ４−６ＧｌｃＮＡｃ２マンノース数が著しく減少した糖鎖を持つことを確認することができた（図７Ｂ）。
【００３７】
また、前記変異株を、糖鎖修飾に関連した酵素活性を持つ少なくとも一つのタンパク質を発現させることが可能な発現ベクターで形質転換させることにより、ヒト型糖鎖を効果的に合成することができる。α−１，２−マンノシダーゼ、マンノシダーゼＩＡ、マンノシダーゼＩＢ、マンノシダーゼＩＣ、およびマンノシダーゼＩＩなどでトリマンノース核心糖鎖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を作ることができるが、必ずしもこれらに限定されるのではなく、マンノースを切断する活性を持つ遺伝子および遺伝子断片でも可能である。本発明の具体的な実施では、ハンセヌラポリモルファＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株でα−１，２−マンノシダーゼを発現させ、トリマンノース核心糖鎖が付いている組み換え糖タンパク質を生成した（図７Ｃ）。トリマンノース核心糖鎖は、ヒト型糖鎖の共通的な核心骨格であって、ここにＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコースおよびシアル酸などが付加されて多様なヒトハイブリッド型および複合型糖タンパク質が生産できる。
【００３８】
したがって、さらにＮ−アセチルグコサミントランスフェラーゼＩおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩなどでＮ−アセチルグルコサミンを付加することができ、ガラクトシルトランスフェーゼでガラクトースを付加し、シアリルトランスフェラーゼでシアル酸を付加し、フコーシルトランスフェラーゼでフコースを付加することができるが、必ずしもこれらに限定されるのではなく、糖鎖変形に役に立つ多様な遺伝子を使用することができる。また、これらの基質となるＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−シアル酸などを生合成する経路の遺伝子およびこれらのゴルジ体または小胞体に転移するトランスポーター遺伝子も含む。前記形質転換に使用される発現ベクターに含まれる糖鎖修飾酵素遺伝子およびその対象基質代謝関連遺伝子にはこのような酵素および転移タンパク質をコードする全体遺伝子配列だけでなく、これらの機能性部分をコードする断片配列も可能である。
【００３９】
別の様態として、本発明は、前記ハンセヌラポリモルファ変異株を用いる段階を含む、ヒト型糖タンパク質を製造する方法に関する。
【００４０】
ヒト型糖タンパク質の製造に使用できる変異株は、前述した全ての形態の変異株を含む。本発明のハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３Δ変異株、Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株またはＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ菌株に少なくとも一つの糖鎖修飾酵素およびその基質代謝関連遺伝子が発現される変異株を用いて、ヒトマンノース型またはハイブリッド型または複合型糖鎖が付いている組み換え糖タンパク質を製造することができる。
【００４１】
ヒトハイブリッド型および複合型などの複雑な糖鎖構造を保有するようにするためには、特定の糖形態が追加されるように操作することができる。例えば、ヒトの糖タンパク質から典型的に確認されるシアル酸、ガラクトース、フコースなどの糖は、一般に、酵母システムでは欠如している。前記ハンセヌラポリモルファ変異株と少なくとも一つの糖鎖修飾酵素およびその基質代謝関連遺伝子を用いて糖タンパク質にシアル酸、ガラクトース、フコースなどを添加し、ヒト細胞で形成された糖鎖と類似の構造を持つヒトハイブリッド型および複合型糖鎖が付いている多様なヒト型糖タンパク質を生産することができる。
【００４２】
生産された糖タンパク質は、通常の方法によって精製できる。精製される特定のタンパク質の特性に応じて精製プロトコルを決定する。このような決定は、当業者には通常の技術に属する。例えば、沈殿、免疫吸着、分画化または多様なクロマトグラフィーなどの典型的な分離技術によって精製することができる。
【００４３】
本発明によって生産できる糖タンパク質は、例えばサイトカイン（例えば、ＥＰＯ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦなど）、凝集因子（例えば、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ヒトタンパク質Ｃ）、治療用抗体類（例えば、免疫グロブリン、Ｆａｂ、二重特異抗体、単一体としての抗体、ｄｉａｂｏｄｙなど）およびＦｃ融合タンパク質、酵素治療剤（例えば、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−グルコシダーゼなど）、内皮成長因子、成長ホルモン放出因子、トリパノソーマクルーズトランスシアリダーゼ(trypanosoma cruzi trans-sialidase)、ＨＩＶ外皮タンパク質(HIV envelope protein)、インフルエンザウイルスＡヘマグルチニン(influenza
virus A haemagglutinin)、インフルエンザヌラミニダーゼ(influenza
neuraminidase)、牛のエンテロキナーゼ(enterokinase)活性因子、牛の疱疹ウイルスタイプ−１糖タンパク質Ｄ(Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D)、ヒトアンジオスタチン(human angiostatin)、ヒトＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ−７受容体ＣＴＬＡ−４、ヒト組織因子(human tissue factor)、成長因子（例えば、血素板由来成長因子）、ヒトα−アンチトリプシン(human alpha-antitrypsin)、組織プラズミノゲン活性化因子(tissue
plasminogen activator)、プラズミノゲン活性化因子抑制因子−１(plasminogen
activator inhibitor-1)、ウロキナーゼ(urokinase)、プラズミノゲン、トロムビンなどを含む。
【００４４】
別の様態としては、本発明のハンセヌラポリモルファ変異株を用いて製造された多様なヒト型糖タンパク質に関する。
【００４５】
本発明の方法で製造されたヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質は、ヒト内で免疫反応をより少し誘発するうえ、溶解度、タンパク質分解酵素に対する感受性、トラヒッキング、トランスポート、分泌、他のタンパク質または因子による認識などの反応が、ヒトで生成されたタンパク質と同一または類似なので、ヒトに適するように使用できる。
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲は下記実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：ハンセヌラポリモルファＨｐＡＬＧ３遺伝子の確保およびアミノ酸配列の分析
【００４８】
ハンセヌラポリモルファＤＬ−１菌株(Levine and Cooney, Appl. Microbiol.,26, 982-990, (1973))から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として一対のプライマー（ＡＬ３−ＮとＡＬ３−Ｃ、表１）を用いて重合酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ)によって、ＡＬＧ３の含まれた１．３６ｋｂサイズのＤＮＡ切片を確保し、アミノ酸配列を分析した。
【００４９】
ＨｐＡＬＧ３は、１，３６２ｂｐサイズを有し、４５４個のアミノ酸からなるタンパク質を暗号化する。前記ＨｐＡｌｇ３タンパク質は、アミノ酸配列上に４つの膜通過部位(transmembrane spanning region)と予測される部分があって膜タンパク質として思われる（図１）。図１において、膜通過部位はアミノ酸４２番目から５８番目まで、アミノ酸１７６番目から１９２番目まで、アミノ酸２２１番目から２３７番目まで、アミノ酸４２５番目から４４１番目まで下線で表示した。ＨｐＡｌｇ３タンパク質のアミノ酸配列は、ヒトであるホモサピエンスのＡｌｇ３タンパク質とは３０％の同一性と４４％の類似性を示し、酵母であるサッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベおよびピチアパストリス等とはそれぞれ３６％と５４％、２９％と４５％、４２％と６４％の同一性と類似性を示し、ピチアパストリスのＡｌｇ３タンパク質と最も近いことが分かった（図２）。
【００５０】
【表１】
2009513131.tif 000003
【００５１】
実施例２：ハンセヌラポリモルファＨｐＡＬＧ３遺伝子欠損菌株の製作および特性の分析
【００５２】
ハンセヌラポリモルファＡＬＧ３遺伝子が破砕された変異株を製作するために、表１に記述されたプライマー（ＨｐＡＬＧ３遺伝子クローニングと破砕のための重合酵素連鎖反応に使用されたプライマー）を用いて融合重合酵素連鎖反応(fusion PCR)と細胞内遺伝子組み換え(in vivo DNA
recombination)という２つの技術を導入し、遺伝子破砕を試みた(Oldenburg et al.,
Nuclei Acid Res,m 25, 451, 1997)。１次ＰＣＲで４対のプライマーを用いてそれぞれのＵＲＡ３遺伝子（Ｎ末端：ＵＮ−Ｓ、ＵＮ−Ａ、Ｃ−末端：ＵＣ−Ｓ、ＵＣ−Ａ）とＨｐＡＬＧ３遺伝子（Ｎ末端：ＡＬ３Ｎ−Ｓ、ＡＬ３Ｎ−Ａ、Ｃ−末端；ＡＬ３Ｃ−Ｓ、ＡＬ３Ｃ−Ａ）のＮ末端とＣ末端を増幅した後、二次融合重合酵素連鎖反応で２対のプライマーを用いてＨｐＡＧ３遺伝子のＮ末端とＵＲＡ３遺伝子のＮ末端を連結（ＡＬ３Ｎ−Ｓ、ＵＮ−Ａ）させ、ＵＲＡ３遺伝子のＣ末端とＨｐＡＬＧ３遺伝子のＣ末端を連結（ＵＣ−Ｓ、ＡＬ３Ｃ−Ａ）した。確保したそれぞれのＤＮＡ断片２つを酵母細胞内に導入した後、細胞内遺伝子組み換えによってＨｐＡＬＧ３遺伝子が破砕された形質転換体を選別した（図３）。１次的にＵＲＡ３選別標識によって、ウラシルが欠乏した最小培地で成長する形質転換体を選別した後、重合酵素連鎖反応によって、野生型菌株とは異なるように増幅されたＤＮＡ断片を確認し、ＨｐＡＬＧ３遺伝子が破砕されたハンセヌラポリモルファ変異株であるＨｐａｌｇ３（ｌｅｕ２；ａｌｇ３：：ＵＲＡ３）菌株を製作した。ＨｐＡＬＧ３遺伝子が欠損したハンセヌラポリモルファ変異株であるＨｐａｌｇ３Δを２００５年１０月２７日にＫＣＴＣ（Korean Collection
for Type Cultures、韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ１０８６７ＢＰ号で寄託した。確保したＨｐａｌｇ３Δ菌株の成長特性を考察すると、一般に、酵母の糖外鎖合成が欠損した突然変異株が現れる温度、またはハイグロマイシンＢ(Hygromycin B)などの抗生剤、カルコフルオロホワイト(Calcofluor
white)、デオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholate)に敏感性を示す成長阻害現象は現れておらず（図４および図５）、Ｈｐａｌｇ３Δ菌株の成長特性は野生型菌株と大きい差異がなかった。
【００５３】
実施例３：ハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３欠損変異株から合成された糖鎖の大きさおよび構造の分析
【００５４】
実施例２で開発されたハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３Δ変異株で合成される糖鎖の大きさと構造を分析するために、ハンセヌラポリモルファ由来の糖タンパク質であるｙａｐｓｉｎ１（Ｙｐｓ１ｐ）をハンセヌラポリモルファ野生型菌株とＨｐａｌｇ３Δ変異株から分泌発現させた。糖タンパク質であるＹｐｓ１ｐでは、Ｎ結合型糖化が起こり得る４つのアミノ酸配列が存在する。６個のヒスチジンが末端に付いているＹｐｓ１ｐを発現するベクターｐＤＬＭＯＸ−ＹＰＳ１（Ｈ）(YJ KIM, Biosynthesis and Maturation of Yapsins in the Methylotropic
Yeast Hansenula polymorpha, master’s thesis, National Chungnam University,
Korea(2005))で形質転換されたハンセヌラポリモルファ野生型菌株およびＨｐａｌｇ３Δ変異株をＹＰＭ（イースト抽出液１％、バクト−ペプトン２％、メタノール２％）液状複合培地で培養してＹｐｓ１ｐを分泌発現した。培養液として分泌されたＹｐｓ１ｐをニッケルカラムに通過させ、Ｃ末端部分に６個のヒスチジンが存在するＹｐｓ１ｐのみを選択的に分離し、Ｙｐｓ１ｐの糖鎖を分離回収するためにＰＮＧｇａｓｅ
Ｆを処理した後、２−アミノピリジン（2-aminopyridine;ＰＡ）で蛍光標識してＨＰＬＣによって分析した。図６のＡとＤに示されているように、７個〜１２個のマンノースが付いている糖鎖（Ｍａｎ７−１２ＧｌｃＮＡｃ２）が均一に分布している野生型菌株に比べて、Ｈｐａｌｇ３Δ変異株から分泌発現されたＹｐｓ１ｐに付いている糖鎖は、５つのマンノースが付いているもの（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）が最も多く、６個〜８個が付いている糖鎖（Ｍａｎ６−８ＧｌｃＮＡｃ２）も一部存在した。Ｈｐａｌｇ３Δ変異株が、野生型菌株よりマンノースが２〜４個少なく付いている糖タンパク質を発現するという事実は、ＨｐＡＬＧ３遺伝子の欠損によってドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ活性が無くなってＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−Ｄｏｌ−ｐｐが生成されず、以後、これを基質とする脂質連結糖鎖の生合成過程が除去され、４個のマンノースが付加される機会を失ってしまい、Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の代わりにＧｌｃ３Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が糖タンパク質に転移され、以後、Ｎ糖鎖生合成過程が行われるものと判断される。
【００５５】
Ｙｐｓ１ｐから分離された糖鎖にα−１，２−マンノシダーゼとα−１，６−マンノシダーゼを順次処理した後、糖鎖プロファイルの変化を分析した結果、野生型菌株から確保された糖鎖は、マンノース５個と６個に該当する糖鎖（Ｍａｎ５−６ＧｌｃＮＡｃ２）に転換された後（図６Ｂ）、α−１，６−マンノシダーゼ処理によって全てマンノース５個の糖鎖（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）に転換された(図６Ｃ)。これに対し、Ｈｐａｌｇ３Δ変異株から得られた糖鎖は、α−１，２−マンノシダーゼを処理した場合、マンノース３個と４個に該当する糖鎖（Ｍａｎ３−４ＧｌｃＮＡｃ２）に転換され（図６Ｅ）、α−１，２−マンノシダーゼ処理によって全てマンノース３個を持つトリマンノース核心糖鎖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）に転換された（図６Ｆ）。このトリマンノース核心糖鎖は、ヒト型糖鎖の最小核心骨格であって、ここにＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸が順次付加されて典型的なヒト型糖鎖構造が完成される。まとめると、ＨｐＡＬＧ３遺伝子の産物はドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｈｐａｌｇ３Δ変異株は脂質連結糖鎖生合成の後半部が除去されるので、ヒト型糖鎖の核心骨格であるトリマンノース核心糖鎖の合成に有用に使用できる。
【００５６】
実施例４：ハンセヌラポリモルファＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株を用いた糖鎖工学
【００５７】
ハンセヌラポリモルファの糖化過程で、本発明者らは、既にα−１，６−マンノシールトランスフェラーゼをコードするＨｐＯＣＨ２遺伝子が欠損した変異株で糖外鎖結合を制限することに成功したことがある（韓国特許出願第２００４−６３５２号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１８１９）。これをさらに発展させ、本発明者らは、ＨｐＯＣＨ２遺伝子が欠損した変異株を母菌株として、実施例２で記述した融合重合酵素連鎖反応と細胞内遺伝子組み換え方法を用いて、ドリコールリン酸マンノース依存α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＨｐＡＬＧ３を欠損させてＨｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株を製造した。ＨｐＡＬＧ３遺伝子とＨｐＯＣＨ２遺伝子が二重欠損したハンセヌラポリモルファ変異株Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δを２００５年１０月２７日にＫＣＴＣ（Korean Collection
for Type Cultures、韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ１０８６８ＢＰ号で寄託した。その後、実施例３で記述した方法によってＹｐｓ１ｐ遺伝子を導入してＹｐｓｌｐタンパク質を分泌発現し、精製し、これから糖鎖を分離回収した後、蛍光標識してＨＰＬＣによって分析した。図７のＡにおいて、野生型株の糖鎖はマンノースが７個〜１２個結合している反面（図７Ａ）、Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株の糖鎖はマンノースが４個、５個および６個結合して（Ｍａｎ４−６ＧｌｃＮＡｃ２）マンノース数が著しく減少したことを確認することができた（図７Ｂ）。
【００５８】
また、本発明者らは、ヒト型複合糖鎖形成生合成のための最小骨格であるトリマノース核心糖鎖を合成するハンセヌラポリモルファ菌株を得るために、伝統酵母サッカロミセスセレビシエを対象として行われた先行研究(Chiba et al., J. Biol. Chem., 273, 26298-26304, (1998))で記述されたアスペルギルスサイトイ(Ａ．Saitoi)由来のα−１，２−マンノシダーゼを小胞体で発現させる方法を用いた。ハンセヌラポリモルファＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株に、前記α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子発現カセットを持つベクターｐＤＵＭＯＸ−ＭｓｄＳ（ＨＡ−ＨＤＥＬ）(Kim et al., J. Biol. Chem. 281, 626106272(2006))を導入し、糖鎖工学的に操作された組み換え菌株Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ−ＭｓｄＳｐを製作した。糖鎖工学的に操作されたハンセヌラポリモルファ菌株Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ−ＭｓｄＳｐがトリマンノース核心糖鎖Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を実際合成するかを調べるために、この菌株にＹＰＳ１遺伝子を導入させ、これから分泌発現されたＹｐｓ１ｐに付いている糖鎖構造を実施例３と同様の方法で観察した。糖鎖工学的に操作された組み換え菌株から生産された糖タンパク質の糖鎖のプロファイリング（図７Ｃ）は、マンノース３個が結合したトリマンノース核心糖鎖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）が主に生成された。前記糖鎖構造は、ヒト型糖タンパク質生産の最小骨格核心糖鎖であって、本菌株を活用して糖鎖工学的応用に利用すると、ヒト型糖鎖付着糖タンパク質の発現が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
次世代高付加価値組み換え医薬品である糖タンパク質がバイオ医薬品市場の主力として位置付けられており、これらを高品質、高効率で生産するための発現システムに対する市場の要求が急激に増加している。メタノール資化性酵母であるハンセヌラポリモルファは、組み換え肝炎ワクチンの大量生産システムとして既に国際的に認められている優れた組み換えタンパク質分泌発現宿主であって、本宿主で発現された組み換えタンパク質は、バイオ医薬品として開発される展望が非常に高いが、酵母特異的高濃度マンノースタイプの糖鎖構造によってヒト由来の医薬用糖タンパク質の発現システムとして広く用いられていない。前記実施例から分かるように、本発明で開発されたＨｐＡＬＧ３遺伝子が欠損したＨｐａｌｇ３Δ変異株とＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株は、マンノース付着が大きく減少した糖鎖を合成するうえ、α−１，２−マンノシダーゼの発現によって、容易にヒト型糖鎖の最小骨格であるトリマンノース核心糖鎖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）形態に転換できる。したがって、前記変異株またはさらに糖鎖修飾経路が再設計された変異株を用いると、野性型酵母菌株に比べてヒトハイブリッド型および複合型糖鎖構造とより近い形態で糖タンパク質を生産することができる。すなわち、本発明は、ヒト由来の医薬用糖タンパク質生産のための基盤宿主を開発し、医薬品糖タンパク質を高品質、高効率で大量生産することが可能な宿主システムを提供する。
【００６０】
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は、添付図面を参照する次の説明からさらに明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ハンセヌラポリモルファ(Hansenulapolymorpha: H. polymorpha)ＨｐＡＬＧ３遺伝子の塩基配列と予想のアミノ酸配列を示す。膜通過部位は４部分と推定され、下線で表示した。
【図２】ハンセヌラポリモルファと他の酵母菌株由来のＡｌｇ３タンパク質相同体のアミノ酸配列を比較したものである。Ｓ．ポンベ、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)Ａｌｇ３タンパク質；Ｈ．ポリモルファ(H. polymorpha)、ハンセヌラポリモルファＡｌｇ３タンパク質；Ｈ．サピエンス(H. sapiens)、ホモサピエンスＡｌｇ３タンパク質；Ｐ．パストリス(P.pastoris)、ピチアパストリスＡｌｇ３タンパク質、Ｓ．セレビシエ(S.cerevisiae)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Ａｌｇ３タンパク質。下端に示した表は、ハンセヌラポリモルファＡｌｇ３タンパク質と他の酵母およびヒトのＡｌｇ３タンパク質間のアミノ酸配列の同一性(identity)および類似性(similarity)を示すものである。
【図３】ハンセヌラポリモルファＨｐＡＬＧ３遺伝子の破砕を誘導するための細胞内遺伝子組み換えに関する模式図である。
【図４】ハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３Δ変異株とそれに対する野生型菌株の成長曲線を示す図式である。培養条件は３７℃でＹＰＤ（酵母抽出液１％、バクト−ペプトン２％、デキストロース２％）液状培地で振とう培養した。
【図５】ハンセヌラポリモルファＨｐａｌｇ３Δ変異株の成長特徴に関する図式である。指数期にあるハンセヌラポリモルファ野生型菌株とＨｐａｌｇ３欠損菌株の培養液（Ｏ．Ｄ．６００＝１）を１０倍ずつ連続的に希釈して３μＬずつスポットした後、２日間培養した。Ａ：３７℃におけるＹＰＤ培地、Ｂ：４５℃におけるＹＰＤ培地、Ｃ：０．４％デオキシコール酸ナトリウムが添加されたＹＰＤ培地、Ｄ：４０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢが添加されたＹＰＤ培地、Ｅ：７ｍｇ／ｍＬのカルコフルオロホワイト(Calcofluor white)が添加されたＹＰＤ培地。Ｂを除いた全てのプレートは３７℃で培養した。
【図６】ハンセヌラポリモルファ菌株で発現されたＹｐｓ１タンパク質に付いている糖鎖構造の変化をＨＰＬＣで分析した図式である。ＡとＤはハンセヌラポリモルファ野生型菌株とＨｐａｌｇ３欠損菌株から分泌発現されたＹｐｓ１タンパク質の糖鎖プロファイルであり、ＢとＥはα−１，２−マンノシダーゼを外部的に処理した後の糖鎖プロファイルであり、ＣとＦはα−１，６−マンノシダーゼを外部的に処理した後の糖鎖プロファイルである。
【図７】ハンセヌラポリモルファＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株および糖鎖工学適用菌株から生合成された糖タンパク質の糖鎖をＨＰＬＣで分析した図式である。Ａ：野生型菌株の糖鎖プロファイル、Ｂ：Ｈｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株に対する糖鎖プロファイル、Ｃ：ハンセヌラポリモルファＨｐｏｃｈ２Δａｌｇ３Δ二重欠損変異株にアスペルギルスサイトイ(Aspergillus saitoi)のα−１，２−マンノシダーゼ（ＭｓｄＳ）を発現させた組み換え変異株から生合成された糖鎖プロファイル。
【図１】
2009513131.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009513131.tif 000009
【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009513131.tif 000020
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