(57)【要約】  本発明は、乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程；プロトン性有機溶媒と共に工程（ａ）のリポソーム形成脂質を含む前記混合物又はリポソーム形成脂質を溶解させて、前記脂質の溶液又は分散を形成する工程；及びイオン含有水溶液に対し工程（ｂ）の溶液又は分散を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程；を含む、単純化され費用効率的なリポソーム調製方法において、リポソームが、１．０超の作用物質対リポソーム形成脂質比で作用物質を封入することができる方法を提供している。本方法には、溶液又は分散を乾燥させて、乾燥脂質フィルムを形成する工程；及び／又は前記リポソーム懸濁液中でリポソームを小型化して小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）を形成する工程が関与していないことを特徴とする。このようにして形成されたリポソームは次に、両親媒性弱酸／塩基薬物などの活性作用物質をそれに装填するために使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程と；
（ｂ）  プロトン性有機溶媒と共に工程（ａ）のリポソーム形成脂質を含む前記混合物又はリポソーム形成脂質を溶解させて、前記脂質の溶液又は分散を形成する工程と；及び
（ｃ）  イオン含有水溶液に対し工程（ｂ）の溶液又は分散を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程；
を含むリポソーム調製方法であって、
リポソームが、１．０超の作用物質対リポソーム形成脂質比で、作用物質を封入することができる、方法。
【請求項２】
（ａ）  乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程と；
（ｂ）  プロトン性有機溶媒と共にリポソーム形成脂質を含む前記混合物又は前記リポソーム形成脂質を溶解させて、前記脂質の溶液又は分散を形成する工程と；及び
（ｃ）  イオン含有水溶液に対し前記溶液又は分散を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程と；
からなるリポソーム調製方法であって、
前記リポソームが、１．０超の前記作用物質対前記リポソーム形成脂質比で作用物質を封入することができる、方法。
【請求項３】
（ａ）  乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程と；
（ｂ）  プロトン性有機溶媒と共にリポソーム形成脂質を含む前記混合物又は前記リポソーム形成脂質を溶解させて、前記脂質の溶液又は分散を形成する工程と；及び
（ｃ）  イオン含有水溶液に対し前記溶液又は分散を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程と；
を含むリポソーム調製方法であり、前記リポソームが、１．０超の前記作用物質対前記リポソーム形成脂質比で作用物質を封入することができる方法であって、
前記溶液又は分散を乾燥させて、乾燥脂質フィルムを形成する工程；
前記リポソーム懸濁液中でリポソームを小型化して小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）を形成する工程；
のうちの１つ以上の工程が排除されていることを特徴とする方法。
【請求項４】
作用物質担持リポソームの調製方法であって、
（ｉ）  請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によりリポソーム懸濁液を提供する工程と；及び
（ｉｉ）  前記作用物質を含む溶液と前記リポソーム懸濁液をインキュベートして作用物質担持リポソームを形成する工程と；
を含み、
前記作用物質担持リポソームが、１．０超の前記作用物質対前記リポソーム形成脂質間モル／モル比を含む、方法。
【請求項５】
前記リポソーム懸濁液が多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リポソーム形成脂質がリン脂質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記乾燥混合物がコレステロールを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロトン性有機溶媒が水混和性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒がエタノール、メタノール又は第３級ブタノールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リポソーム形成脂質の前記溶液又は懸濁液が少なくとも２０ｍＭの脂質濃度を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質濃度が約３０ｍＭから約１００ｍＭの間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
大きい多重膜ベシクル（ＬＭＶＶ）を得るために、前記リポソーム懸濁液の少なくとも１回の凍結・解凍（Ｆ＆Ｔ）サイクルを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質対脂質比が１．８以上である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記リン脂質が水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記作用物質が弱両親媒性塩基又は弱両親媒性酸である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記弱両親媒性塩基でのインキュベーションが、低リポソーム間／高リポソーム内膜貫通ｐＨ又はイオン勾配を有するリポソームと共に行なわれる、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポソームが低リポソーム間／高リポソーム内膜貫通アンモニウム塩勾配を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記弱い両親媒性酸でのインキュベーションが、高リポソーム間／低リポソーム内膜貫通ｐＨ又はイオン勾配を有するリポソームと共に行なわれる、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記リポソームが高リポソーム間／低リポソーム内膜貫通酢酸塩勾配を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法により調製された生理学的に受容可能な担体及び作用物質担持リポソームを含む、薬学組成物。
【請求項２１】
請求項２〜２０のいずれか一項に記載の方法により調製された一定量の作用物質担持リポソームを対象に提供することを含む、前記対象の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム技術、および特にリポソーム調製方法に関する。
【０００２】
先行技術リスト
以下に記すのは、本発明の分野における最新技術を記載する上で関連性があるとみなされている先行技術のリストである：
１．  国際公開第００／０９０８９号パンフレット−硫酸アンモニウム勾配を用いて調製したリポソーム・ブピバカイン組成物（ボロチン（Ｂｏｌｏｔｉｎ）ＥＭら）；
２．  米国特許第４，５３２，０８９号明細書−巨大サイズのリポソームの調製方法（マクドナルド・ロバート（ＭＡＣＤＯＮＡＬＤ  ＲＯＢＥＲＴ）Ｃ）；
３．  米国特許第５，１９２，５４９号明細書−ｐＨ勾配によるリポソーム中の両親媒性薬物装填方法（バレンホルツ（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ）ら）；
４．  米国特許第５，８０７，５７２号明細書−塩酸塩の存在下で中に封入した生物活性物質を有する多小胞リポソーム（キム（Ｋｉｍ）Ｓ．ら）；
５．  キム  Ｓ．及びマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）Ｇ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第６４６号：１〜９頁（１９８１年）
６．  米国特許第５，７２３，１４７号明細書−塩酸塩の存在下で中に封入した生物活性物質を有する多小胞リポソーム（キム  Ｓ．ら）。
【背景技術】
【０００３】
リポソームは、現在入手可能である将来性の最も高い薬物担体の１つである。リポソームは、疎水性物質を封入し得る疎水性２重層と、その他の物質（例えば親水性又は両親媒性化合物）を封入し得る水性コアの両方を含む。
【０００４】
治療用化合物のリポソーム封入が、制御型薬物送達における有意な展望を示してきた。例えば、一部の脂質ベースの処方物は、より長い生体内半減期、より優れた組織標的化、又は低い毒性を提供する。より有効な治療的処置を開発する目的で、リポソーム内にさまざまな治療用化合物を封入するための試みがなされてきた。例えば数多くの抗ガン又は抗腫瘍薬がリポソーム内に封入されてきた。これらには、アルキル化剤、ニトロソ尿素、シスプラチン、代謝拮抗物質、ビンカ・アルカロイド、カンプトセシン、タキサン及びアントラサイクリンが含まれる。アントラサイクリン抗生物質を含有するリポソームを用いた研究は明らかに心臓毒性の減少を示した。
【０００５】
薬物のリポソーム処方物は、リポソーム封入されていない遊離薬物対応物の薬物動態を修飾する。リポソーム薬物処方物については、薬物動態は主として、担体が血液から浄化される速度及び薬物が担体から放出される速度によって判定される。血液からの緩慢な浄化値を示すリポソーム担体組成物を同定するために多大な努力が払われてきており、長循環担体について数多くの科学的刊行物及び特許の中で記載されてきた。例えばさまざまな脂質構成要素又は放出制御のための膜電位を用いて、リポソーム担体からの薬物漏出又は放出を制御する努力も同じく払われてきた。
【０００６】
リポソームは数多くの方法によって調製されており、得られるベシクルは、二重層の数及び直径に関し著しく変動し得る。リポソームは、小さい又は大きい単層膜ベシクル（ＳＵＶ、ＬＵＶ）、多重膜ベシクルベシクル（ＭＬＶ）及び多小胞ベシクル（ＭＶＶ）又は、複数のベシクルひいては複数の分離した水相を含む大きい多小胞ベシクル（ＬＭＶＶ）として分類可能である〔クルカルニー（Ｋｕｌｋａｒｎｉ）Ｓ．Ｂ．、ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、第１２号：２２９〜２４６頁（１９９５年）〕。多小胞ベシクル（ＭＶＶ）の調製〔スゾカ（Ｓｚｏｋａ）、Ｆ．及びパパハジョポウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７５号：４１９４〜４１９８頁（１９７８年）〕、及びＭＬＶから構造的にＭＶＶに類似している〔Ｋｒａｍｅｒ、Ｊ．Ｍ．Ｈ．、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１７号：３９３２〜３９３５頁（１９９７年）〕凍結・解凍済みベシクル（ＦＴＭＬＶ）〔キム  Ｓ．及びマーチン、Ｇ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６４６：１−９（１９８１年）〕への転換中に、ベシクル内ベシクルが形成される。ＭＶＶ及びＦＴＭＬＶは、ＳＵＶ及びＭＬＶよりもはるかに多くの水相体積を封入するが、ＭＶＶとＦＴＭＬＶ（ＬＭＶＶ）の構造は大きく、直径が０．５〜１５μｍである。
【０００７】
リポソーム調製方法の大部分は、乾燥脂質の水和、又はこのように乾燥された脂質が水溶液中に添加されている有機溶媒の蒸発のいずれかに基づいている。乾燥脂質の水和に基づく方法は、一般的に多段階工程（脂質溶液からの有機溶媒の蒸発、脂質の乾燥、水和、検定そして場合によってはその他の段階）である。緩衝液中へのエタノール又はエーテル脂質溶液の注入に基づく方法は、主としてモデル膜としてのみ有用である小さいベシクルを結果としてもたらす〔バツィーリ（Ｂａｔｚｒｉ）、Ｓ．及びコーン（Ｋｏｒｎ）、Ｅ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ＿２９８：１０１５〜１０１９頁（１９７３年）；クラマー（Ｋｒａｍｅｒ）、Ｊ．Ｍ．Ｈ．、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１７号：３９３２〜３９３５頁（１９９７年）〕。有機、脂質可溶化溶媒中での水相ディスパーゲーション（ｄｉｓｐｅｒｇａｔｉｏｎ）及び直接ベシクル形成中の有機溶媒蒸発に基づく、いくつかの多段階方法が存在する。これらのうち、逆相蒸発方法は最も古いものである〔スゾカ、Ｆ．及びパパハジョポウロス、Ｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７５号：４１９４〜４１９８頁（１９７８年）〕。当初の手順によれば、水相が有機溶媒（エチルエーテル、ハロタン、クロロホルム、塩化メチレン又はその他）の中でディスパーゲートされて、これらの相の両方の混合物を音波処理することにより油中水型エマルジョンを形成する。次に、エマルジョンは回転蒸発器に移送され、溶媒は減圧下で除去される。この段階で、水相液滴の一部が組合さり、脂質膜中に包み込まれた緩衝液液滴が懸濁する環境を形成する。その後、凝集体を遠心分離させ、上清をろ過して、画定されたフィルタの孔径よりも小さいＬＵＶを得る。２重エマルジョン特性を用いたもう１つの方法は、振とう器での機械的攪拌によるリポソーム脂質のクロロホルム及びエチルエーテル溶液中の水性エマルジョン形成に基づいている。窒素の恒常なバブリングが、組合せ型エマルジョンを攪拌し、その結果単層又は多小胞ベシクルが形成される〔キムＳ．及びマーチン、Ｇ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ第６４６号：１〜９頁（１９８１年）、及び米国特許第５，７２３，１４７号明細書〕。
【０００８】
米国特許第５，７２３、１４７号明細書内で開示されているのは、生物学的に活性な物質を含有する多小胞リポソームであり、多小胞リポソームは、画定されたサイズ分布、調整可能な平均サイズ、調整可能な内部チャンバサイズ及び数、そして調節された生物活性物質の比率を有する。かかる多小胞リポソームを形成するのに用いられる工程には、揮発性有機溶媒中で脂質構成要素を溶解させる工程、封入されるべき少なくとも１つの生物活性物質を含有する非混和性水性構成要素を添加する工程及び、多小胞リポソームから有機溶媒及び脂質構成要素のいずれか又は両方への生物活性物質の放出速度を制御するのに有効な塩酸塩を添加する工程、２つの構成要素から油中水型エマルジョンを作る工程、第２の水性構成要素中にエマルジョンを浸す工程、エマルジョンを、さらに小さい水性チャンバを含む小さな溶媒小球へと分割する工程、そして次に溶媒を除去して、生物活性物質を封入する多小胞リポソームの水性懸濁液を得る工程、が含まれる。
【０００９】
ＬＭＶＶのさらなる調製方法が、国際公開第００／０９０８９号パンフレット中にも記載されている。この刊行物によれば、リポソーム・ブピバカイン組成物が、装填溶液からの薬物の沈殿を妨げるｐＨで、アンモニウム塩（例えば硫酸塩）勾配装填手順を用いて調製される。リポソームは、アンモニウム塩の水溶液で乾燥脂質フィルムをボルテックスし、結果として得られた懸濁液を均質化してＳＵＶの懸濁液を形成させ、液体窒素とそれに続く水中へのＳＵＶの懸濁液をくり返し（少なくとも５回）凍結解凍させることによって調製される、大きい多小胞リポソーム（ＧＭＶと呼ばれる）であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、リポソームを調製するための、単純化された、およびより費用効率の高い方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
その最初の態様に従うと、本発明により、
（ａ）  乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程と；
（ｂ）  プロトン性有機溶媒と共に工程（ａ）のリポソーム形成脂質を含む前記混合物又はリポソーム形成脂質を溶解させて、脂質又は脂質混合物の溶液又は分散を形成する工程と；及び
（ｃ）  イオン含有水溶液に対し溶液又は分散剤を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程と；
を含むリポソーム調製方法において、
このように形成されたリポソームが、１．０超の作用物質対リポソーム形成脂質間モル／モル比で作用物質を封入することができる方法、が提供されている。
【００１２】
本発明はまた、
（ａ）  乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程と；
（ｂ）  プロトン性有機溶媒と共にリポソーム形成脂質を含む前記混合物又はリポソーム形成脂質を溶解させて、脂質又はその混合物の溶液又は分散を形成する工程と；及び
（ｃ）  イオン含有水溶液に対し溶液又は分散を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程と；
からなるリポソーム調製方法において、
このように形成されたリポソームが、１．０超の作用物質対前記リポソーム形成脂質間モル／モル比で作用物質を封入することができる方法、も提供する。
【００１３】
さらに本発明は、
（ａ）  乾燥リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程と；
（ｂ）  プロトン性有機溶媒と共にリポソーム形成脂質を含む前記混合物又はリポソーム形成脂質を溶解させて、脂質又はその混合物の溶液又は分散を形成する工程と；及び
（ｃ）  イオン含有水溶液に対し溶液又は分散を添加してリポソーム懸濁液を形成する工程と；
を含むリポソーム調製方法であり、
このように形成されたリポソームが、１．０超の作用物質対リポソーム形成脂質比で作用物質を封入することができる方法であって、ここで
前記溶液又は分散を乾燥させて、乾燥脂質フィルムを形成する工程；
前記リポソーム懸濁液中でリポソームを小型化して小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）を形成する工程；
のうちの１つ以上の工程を含んでいないことを条件としている方法、を提供している。
【００１４】
リポソームは薬物などの活性作用物質を担持するのに使用することができる。このようにして、さらなる一態様に従うと、本発明は、作用物質担持リポソームの調製方法において、
（ｉ）  本発明の方法によりリポソーム懸濁液を提供する工程、及び
（ｉｉ）  前記作用物質を含む溶液と前記リポソーム懸濁液をインキュベートして作用物質担持リポソームを形成する工程、
を含むか、又はこれらの工程からなり、
前記作用物質担持リポソームが、１．０超の前記作用物質対前記リポソーム形成脂質間モル／モル比を含む方法を提供している。
【００１５】
好ましい実施形態においては、作用物質担持リポソームを調製するための本発明の方法は、前記溶液又は分散を乾燥させて、乾燥脂質フィルムを形成する工程：及び／又は前記リポソーム懸濁液中でリポソームを小型化して小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）を形成する工程を排除している。
【００１６】
本発明は同様に、本発明の方法のいずれかにより調製される場合、常に生理学的に受容可能な担体及び作用物質担持リポソームを含む薬学組成物も提供している。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明の方法により調製される場合、常に一定量の作用物質担持リポソームを対象に投与する工程を含むことを必要としている、前記対象を治療するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、長時間送達、安全性及びその他の薬物学的及び薬物動態パラメータに関して利点を有し得ることが当業者に充分理解しうる、高い作用物質対脂質比（各々のモル量による）をもつリポソームを調製するための方法に関する。提案されている研究方法の簡潔性は、なかでも、これまで類似の特性及び装填能力をもつリポソームの調製における不可欠の構成要素と考えられてきたいくつかの工程の削除にある。
【００１９】
「リポソーム」及び「ベシクル」という用語は、当該技術分野においては周知であり、特定的に相反する記載があるか又は前後関係から必要となる場合を除き、本明細書中では互換的に使用されている。
【００２０】
本発明の方法は、乾燥リポソーム形成脂質又は１つ以上のリポソーム形成脂質を含む乾燥混合物を提供する工程；プロトン性有機溶媒と共に、脂質又は脂質を含む乾燥混合物を溶解させて、脂質の溶液又は分散を形成する工程；及びイオン含有水溶液に対しこのように形成された溶液又は分散剤を添加して、その結果としてリポソーム懸濁液を形成する工程を含む。かかるリポソームは高い作用物質対脂質モル／モル比で作用物質を装填する能力を有し、１．０超の高い比率であることが見いだされた。以下で詳述するように、活性作用物質は、作用物質の水溶液を伴うリポソーム懸濁液のインキュベーションなどの異なる方法によりリポソーム中に装填され得る。
【００２１】
本発明によれば、「高い作用物質対脂質比」は、作用物質対リポソーム形成脂質のモル／モル又は重量／重量比により判定される。以下の記載においては、相反する記載のない限り、「比」という用語」は、モル／モル比を表わす。本発明による高い作用物質対脂質（作用物質／脂質）比は、少なくとも１．０超、好ましくは１．５超、より好ましくは１．８超であり、あるあらゆる比として理解されるべきである。本発明の範囲内に入る適切な条件下で、この比は２．０超もあり得る、ということが見出されている。
【００２２】
比較的高い作用物質／脂質比（すなわち１．０超）で作用物質（例えば薬物）が装填されたリポソームを調製するための従来の方法は、類似の特性及び装填能力をもつリポソームの調製においてこれまで不可欠と考えられてきた以下の特徴、すなわち：
リポソーム形成脂質は乾燥後、リポソームを形成する前に再水和する必要があること；および／または、
リポソームは、作用物質を装填すべき最終的リポソームを得る前に（ＳＵＶの適切な操作の後）、例えばボルテックス、超音波処理、押出し加工及び／又は類似のプロセスにより小型化されて、小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）を形成する必要があること；および／又は、
ＳＵＶは、望ましいほどに高い作用物質対脂質比を示す能力をもつリポソームを得るため、少なくとも５回の凍結及び解凍（Ｆ＆Ｔ）サイクルを必要とすること；
凍結乾燥条件下（０℃以上の温度）で凍結しない特定の（このようにして制限的な）有機溶媒の選択。
を含んでいる、という点が指摘される
【００２３】
本明細書で示されているように、本発明の方法は、所望の高装填を達成するために上述の工程のいずれかを実施する必要なく高い作用物質／脂質比をもつ作用物質担持リポソームを提供する。換言すると、リポソーム形成に先立って脂質を乾燥させる必要性及び／又はリポソームを小型化する必要性及び／又は多数（２回以上）のＦ＆Ｔサイクルを実施する必要性を削除することにより、はるかに単純で費用効果の高い方法が提供される。かかる単純化された方法は、特に作用物質担持リポソームの大規模生産に関し、数多くの利点を有する。
【００２４】
本発明のリポソームは、リポソーム形成脂質から形成されている。「リポソーム形成脂質」（又は「ベシクル形成脂質」）は、０．７４から１．０以下のパッキングパラメータ又は０．７４から１以下の範囲内の相加的充填パラメータ（各構成要素のモル画分をリポソームの各構成要素の充填パラメータに乗じたものの合計）を有する脂質混合物により基本的に特徴づけられる両親媒性分子である。
【００２５】
さらに、本発明による「リポソーム形成脂質」は、頭部基にあるヒドロキシル基のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つが、アシル、アルキル又はアルケニル基のうちの１つ以上のものにより置換されているグリセロール主鎖、リン酸基、好ましくはアシル鎖（アシル又はジアシル誘導体を形成するためのもの）、以上のもののいずれかの組合せ、及び／又は以上のものの誘導体を有する脂質であり、頭部基に（アミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールなど）化学反応性基を含むことにより極性頭部基を提供してもよい。スフィンゴ脂質、特にスフィンゴミエリンはグリセロリン脂質の優れた代替物である。
【００２６】
標準的には、置換鎖例えばアシル、アルキル及び／又はアルケニル鎖は、長さが炭素原子約１４〜約２４個の間にあり、さまざまな飽和度を有し、このようにして完全水素化、部分水素化又は非水素化リポソーム形成脂質を結果としてもたらす。さらに、リポソーム形成脂質は天然供給源のものであっても、半合成又は完全合成脂質であってよく、中性、負又は正の電荷を有し得る。
【００２７】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）及び炭素原子１２〜２４個のアシル又はアルキル鎖をもつスフィンゴミエシン（ＳＭ）といったスフィンゴリン脂質などの（本発明による好ましい脂質である）リン脂質を含め、さまざまな合成リポソーム形成脂質及び天然発生リポソーム形成脂質が存在する。さまざまな飽和度を有する炭化水素鎖（例えばアシル／アルキル／アルケニル鎖）をもつ上述の脂質及びリン脂質は市販されているものを入手でき、そうでなければ公表された方法に従って調製することもできる。リポソーム中に内含され得るその他の適切な脂質は、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質およびステロール（例えばコレステロール又は植物ステロール）である。本発明に従って形成されたリポソームは、脂質の混合物を含む。従って本発明はで使用する上述の脂質リストは、網羅的であり制限的な意味をもたず、本明細書で開示するその他の脂質を本発明に従って使用することも可能である。
【００２８】
一実施形態によれば、リポソーム形成脂質は１６個以上の炭素原子を伴うアシル鎖を有するホスファチジルコリン（ＰＣ）及びその誘導体など（ただしこれらに制限されるわけではない）、４５℃超のＴｍ（ゲルから液体への結晶相転移温度）を有するものの中から選択される。ＰＣ誘導体の１つの好ましい例としては、５２℃のＴｍを有する水素添加大豆ＰＣ（ＨＳＰＣ）がある。リポソーム形成脂質はさらに又は代替的に、Ｎ−ステロイルスフィンゴミエリンなどのさまざまなＮアシル鎖のスフィンゴミエリンを含む。
【００２９】
カチオン脂質（モノ及びポリカチオン脂質）も同様に、本発明のリポソーム内での使用に適しており、ここでカチオン脂質は脂質組成物の少量構成要素としても、また主要構成要素もしくは単独構成要素としても含まれる。かかるカチオン脂質は標準的には、親油性部分、例えばステロール、アシル又はジアシル鎖を有し、脂質は標準的に全体的に正味の正電荷を有する。好ましくは、脂質の頭部基は、正電荷を担持する。モノカチオン脂質には例えば１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；及びジメチル−ジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）が含まれる。
【００３０】
ポリカチオン脂質の例には、ポリカチオン部分が付着されている、モノカチオン脂質について記載したものに類似する親油性部分が含まれる。典型的なポリカチオン分子としては、スペルミン又はスペルミジン（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＳＰＥＲにより例示されている通り）又はペプチド例えばポリリシン又はその他のポリアミン脂質が含まれる。例えば、中性脂質（ＤＯＰＥ）をポリリシンで誘導体化してカチオン脂質を形成することができる。ポリカチオン脂質としては、制限的な意味なく、Ｎ−［２−［［２，５−ビス［３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキソペンチル］アミノ］エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス［（１−オキソ−９−オクタデセニル）オキシ］−１−プロパンアンモニウム（ＤＯＳＰＡ）、及びセラミドカルバモイルスペルミン（ＣＣＳ）が含まれる。
【００３１】
さらにリポソームは、リポポリマーの用語で知られている新しい構成要素を形成するべく、親水性重合体で誘導体化された脂質を内含することもできる。リポポリマーは好ましくは、７５０Ｄａ以上の分子量を有する重合体でその頭部基に修飾されている脂質を含む。頭部基は極性又は無極性であり得る。しかしながら、リポポリマーは大きな（＞７５０Ｄａ）高度に水和された（１頭部基につき少なくとも６０の水分子）軟質重合体が付着されている極性頭部基である。脂質領域に対する親水性重合体頭部基の付着は、共有結合又は非共有結合付着であり得る。しかしながら好ましくは、脂質領域に対する親水性重合体頭部基の付着は共有結合の形成を介した（任意にはリンカーを介した）ものである。親水性重合体鎖の最も外側の表面被覆は、生体内で長い血液循環寿命をもつリポソームを提供する。リポポリマーは、（ａ）リポポリマーを脂質混合物に添加し、このようにしてリポソームを形成し、ここでリポポリマーがリポソーム２重層の内部及び外部葉状部において取込まれ曝露されること（アスター（Ｕｓｔｅｒ）Ｐ．Ｓ．ら、ＦＥＢＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３８６号：２４３頁（１９９６年））又は（ｂ）まず第１にリポソームを調製し、次に、リポポリマー及びリポソーム形成脂質のＴｍより高い温度でのインキュベーション又はマイクロ波照射に対する短時間曝露のいずれかにより、予め形成されたリポソームの外部葉状部内にリポポリマーを取込むことのいずれかによって、２つの異なる方法でリポソーム内に導入可能である。
【００３２】
（リポソーム形成脂質ではない）ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質及びリポソーム形成脂質からなるベシクルの調製及び、ほとんどの場合リポソーム形成脂質でない親水性重合体でのこのような脂質の誘導体化（このようにしてリポポリマーを形成）。例えばチロシュ（Ｔｉｒｏｓｈ）ら、（チロシュら．、Ｂｉｏｐｙｓ．Ｊ．、第７４号（３）：１３７１〜１３７９頁（１９９８年））によって、及び本明細書に参照により援用されている米国特許第５，０１３，５５６号明細書、同５，３９５，６１９号明細書；同５，８１７，８５６号明細書；同６，０４３，０９４号明細書及び同６，１６５、５０１号明細書内ならびに国際公開第９８／０７４０９号パンフレット内で、実施例が記載されてきた。リポポリマーは、非イオンリポポリマー（時として中性リポポリマー又は非荷電リポポリマーとして知られている）又は正味の負電荷、又は正味の正電荷を有するリポポリマーであり得る。
【００３３】
脂質に付着可能な重合体は数多く存在する。脂質修飾物質として標準的に使用される重合体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ポリ乳酸（ポリラクチド呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、アポリ乳酸−ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリアスパルタミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシエチルアクリラート及び例えばヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが含まれるが、これらに制限されない。重合体は、単独重合体としてか又はブロック又はランダム共重合体として利用可能である。
【００３４】
リポポリマーに誘導体化される脂質は、中性、装填電又は正荷電されたものである（すなわち特定の電荷（又は無電荷）に関する制約が全くない）が、最も一般的に用いられるリポポリマーへと誘導体された市販の脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、通常はジステアリールホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００３５】
本発明により利用され得るリポポリマーの特定のファミリーとしては、カルバマートリンケージを介して脂質にＰＥＧ重合体がリンクされることにより負に荷電したリポポリマーとなった、ＤＳＰＥに付着したモノメチル化ＰＥＧが含まれる（異なる長さのＰＥＧ鎖を伴い、本明細書中でＰＥＧという略号により言及されているメチル化ＰＥＧ）。その他のリポポリマーとしては、中性メチルポリエチレングリコールジステアロイルグリセロール（ｍＰＥＧ−ＤＳＧ）及び中性メチルポリエチレングリコールオキシカルボニル−３−アミノ−１，２−プロパンジオールジステアロイルエステル（ｍＰＥＧ−ＤＳ）がある（ガルブゼンコ（Ｇａｒｂｕｚｅｎｋｏ）Ｏ．ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．第２１号、２５６０〜２５６８頁（２００５年））。ＰＥＧ部分は好ましくは、約７５０Ｄａ〜約２０．０００Ｄａの分子量のＰＥＧ頭部基を有する。より好ましくは、頭部基の分子量は約７５０Ｄａ〜約１２０００Ｄａ、そして最も好ましくは約１０００Ｄａ〜約５０００Ｄａの間にある。本明細書で用いられる１つの特定的ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、本明細書中で２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ又は２ＫＰＥＧ−ＤＳＰＥと呼ばれている、２０００Ｄａの分子量をもつＰＥＧ部分である。
【００３６】
このような誘導体化された脂質を含むリポソームの調製も記載されており、ここでは標準的にかかる誘導体化脂質の１〜２０モルパーセントがリポソーム処方物中に含まれている。
【００３７】
（ＰＣ及びスフィンゴミエリンなど）リポソーム形成脂質に加えて、リポソーム処方物中にはコレステロール及びホスファチジルエタノールアミンを、（例えば膜の遊離体積ひいては透過性及びその中に封入された作用物質の漏出を減少させる目的で）リポソーム処方物を含ませることができる。１つの実施形態によれば、リポソームはコレステロールを含む。さらなる実施形態によれば、脂質／コレステロールのモル／モル比は約８０：２０〜約５０：５０の間の範囲内にある。より特定的なモル／モル比は約６０：４０である。
【００３８】
リポソームはその他の成分を含む。例えばベシクル−ベシクル融合を減少させかつ細胞とリポソームの相互作用を増大させるため、リポソーム二重層の中にホスファチジルグリセロールなどの電荷誘発脂質を取込むこともできる。リポソームの表面のｐＨを中性に近いものにするのに適したｐＨの緩衝液は、加水分解を減少させることができる。ビタミンＥといった酸化防止剤、又はデスフェラール（Ｄｅｓｆｅｒａｌ）又はＤＴＰＡなどのキレート化剤の添加を使用が可能である。
【００３９】
リポソーム形成脂質及びその他の脂質及び非脂質構成要素（使用される場合）は、プロトン性有機溶媒中に溶解される。本発明の状況下では、プロトン性有機溶媒は標準的にはアルコール、好ましくはＣ２からＣ４のアルコールである。溶媒は好ましくは水中で混和性をもつ。プロトン性有機溶媒の制限がない例としては、メタノール、エタノール、及び第３級ブタノール（ｔｅｒｔ−ブタノール）が含まれる。エタノールが好ましい溶媒である。
【００４０】
溶媒は、脂質又は脂質混合物を溶解させて、溶液又は分散を形成する。「溶解する」又は「溶液」という用語は、脂質が好ましくは溶媒内部で均質に混合されるというふうに理解されるべきである。それでも、本発明の状況下で、均質でない混合物を形成させ使用することも可能である（分散中）。
【００４１】
形成された溶液又は分散は、次にイオンを含む水溶液に添加される。「イオン含有水溶液」という用語は、本明細書では、塩例えば硫酸アンモニウム、酢酸カルシウムなどを溶解させた形で含む水溶液を表わすために使用される。異なるタイプのイオン及び塩が、ｐＨ又はイオン勾配形成に関して以下で詳述される。
【００４２】
本発明の方法は同様に、高い脂質濃度を利用できることを特徴としている。形成されたリポソーム中の脂質濃度が２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、５０ｍＭ超、９０ｍＭ超さらには最高９７ｍＭから１００ｍＭ以下である場合であっても、高い作用物質／脂質比（１．０超）が達成され得るということがわかっている。一実施形態によれば、脂質濃度は３０ｍＭから１００ｍＭ以下である。
【００４３】
これらのリポソーム成分間比の変動が、リポソームの薬理学的特性を決定づける。例えば、さまざまなタイプのベシクル利用分野についての主たる関心事であるリポソームの安定性は、特定のリポソーム成分を選択することによって決定づけられる。明らかに、リポソームの安定性は、従来の医薬品と同じ規格を満たすべきである。化学安定性には、リン脂質二重層内のエステル結合の加水分解の防止、および脂質鎖内の不飽和部位の酸化の防止の両方が関与している。化学的不安定性は、物理的不安定性又は二重層からの封入された薬物の漏洩及びベシクルの融合及び凝集を導く可能性がある。化学的不安定性は同様に、標的に対する効果的な接近及び標的との相互作用に影響を及ぼす、リポソームの短い血液循環時間ももたらす。
【００４４】
本発明の方法により、制限的な意味なく、多重膜ベシクル（ＭＬＶ）、小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）、大きな単層膜ベシクル（ＬＵＶ）、立体的に安定化したリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞ベシクル（ＭＶＶ）及び大きな多小胞ベシクル（ＬＭＶＶ）を含んだ、異なるタイプのリポソームを調製することができる。異なるタイプのリポソームは、上述の工程によって形成されたリポソームに対して１つ以上の付加的な処理工程を適用することによって得ることができる。例えば、リポソーム懸濁液について、１回および任意にはそれ以上の回数のＦ＆Ｔサイクルを実施することによって、ＬＭＶＶを得ることができる。ＳＵＶは、リポソームを小型化するための任意の既知の技術（例えばボルテックス処理、超音波処理、押出し加工など）により得ることができる。当業者であれば、本発明の方法によって形成されたリポソームをその他のリポソーム形態及び構造に転換するために適切な付加的処理工程をいかに選択すべきかがわかるであろう。
【００４５】
一実施形態によれば、本発明の方法は好ましくは、ＭＬＶを提供する。１回のＦ＆Ｔサイクルの後、ＭＬＶはＬＭＶＶに転換される。付加的なＦ＆Ｔサイクルを実施することもできる。
【００４６】
一実施形態によれば、少なくとも１つのＦ＆Ｔサイクルが実施される。もう１つの実施形態によれば５〜９回の間のＦ＆Ｔ工程が実施される。Ｆ＆Ｔサイクルは、ＭＬＶをＬＭＶＶに転換し、ＬＭＶＶは次に、その中に装填されるべき作用物質と共にインキュベートされる。
【００４７】
このようにして形成されたリポソーム懸濁液は、一定量のプロトン性有機溶媒を含む。この量は、溶媒及びこのようにして形成されるリポソームのタイプにより変動する。有機溶媒の量は、リポソームがミセルに転換されないような量となる。例えば、有機溶媒としてエタノールを用いる場合、リポソームからミセルへの変態が標準的に（体積で）３０％の溶媒で発生することになる。このようにして、リポソーム懸濁液中のエタノールレベルは、約２５体積％といった高いものであり得る。一実施形態によれば、エタノールレベルは約１０体積％である。
【００４８】
リポソーム内に装填されるべき活性作用物質は、あらゆる物質、例えば、治療法又は診断において有用である低又は高分子量化合物であり得る。一実施形態によれば、活性物質は、両親媒性の弱酸又は両親媒性弱塩基である。好ましい実施形態によれば、作用物質は両親媒性弱酸性薬物又は両親媒性弱塩基性薬物である。
【００４９】
両親媒性弱塩基性薬物としては、なかでも、以下の限定されないリストのものが含まれる：テンパミン（ＴＭＮ）ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、カルシノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン、Ｎ−アセチルダウノマイシン、全てのアントラシリン薬剤、ダウノリリン、トポテカン、イリノテカンプロパノロール、ペンタミジン、ジブカイン、ブピバカイン、テトラカイン、プロカイン、クロルプロマジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトマイシンＣ、ピロカルピン、フィソスチグミン、ネオスチグミン、クロロキン、アモジアキン、クロログアニド、プリマキン、メフロキン、キニーネ、プリジノール、プロジピン、ベンズトロピンメシラート、トリヘキシフェニジル塩酸塩、プロパノロール、チモロール、ピンドロール、キナクリン、ベナドリル、プロメタジン、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡセロトニン、エピネフリン、コデイン、メペリジン、メタドン、モルヒネ、アトロピン、デシクロミン、メチキセン、プロパンテリン、イミプラミン、アミトリプチリン、ドクセピン、デシプラミン、キニジン、プロパノロール、リドカイン、ブピバカイン、クロルプロマジン、プロメタジン、ペルフェナジン、アクリジンオレンジ、モルヒネやその他等のアへン剤。
【００５０】
一実施形態によれば、両親媒性弱塩基は、鎮痛剤である。一部の鎮痛剤は以上で列挙されており、リドカイン及びブピバカインを含む。これらの薬物も又以下で特定的に例示されている。
【００５１】
両親媒性弱酸性薬物には、これらに限定されないが、イブプロフェン、トルエチン、インドメタシン、フェニルブタゾン、メクロフェラム酸（ｍｅｃｌｏｆｅｒａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ピロキシカム、シトロフロキサシン、プロスタグランジン、フルオレスゲイン(ｆｌｕｏｒｅｓｇｅｉｎ）、カルボキシフルオレセイン、メチルペルドニソロン(ｍｅｔｈｙｌ ｐｅｒｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）へミコハク酸（ＭＰＳ）、パラセタモール（アセトアミノフェン）、アスピリン（アセチルサリチル酸）及びその他のＮＳＡＩＤ及びナリジスク酸が含まれる。
【００５２】
さらに、リポソーム中に装填される作用物質をグルココルチコステロイドとし、投与に先立ってこれらのリポソームを空のリポソームで処理することが有利である。グルココルチコイドの限定されないリストは、その全体が本明細書に参照により援用されているインターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ．ｃｏｍ／に見い出すことができる。限定されない例としては、へミコハク酸プレドニゾロン、へミコハク酸メチルプレドニゾロン、へミコハク酸デキサメタゾン、へミコハク酸アロプレグナノロン；２１−へミコハク酸ベクロメタゾン；２１−へミコハク酸ベータメタゾン；へミコハク酸ボルデノン；へミコハク酸プレドニゾロン；ナトリウム塩；２１−へミコハク酸プレドニゾロン；へミコハク酸ナンドロロン；へミコハク酸１９−ノルテストステロン；２１−へミコハク酸デオキシコルチコステロン；へミコハク酸デキサメタゾン；へミコハク酸デキサメタゾン；スペルミン；へミコハク酸コルチコステロン；ヘミコハク酸コルテキソロンが含まれる。
【００５３】
一般に、受動的取り込み及び能動的（遠隔）装填を含め、活性作用物質が取り込まれているリポソームを調製するために、さまざまな利用可能な装填方法が存在する。ここで用いられる「取り込み」という用語は、作用物質の少なくとも実質的部分がリポソームの内部水性コア内部に封入されるような形での、リポソーム上への、作用物質のあらゆる装填形態を意味している。内部コアの中で、作用物質は遊離していても、又脂質二重層の内部表面に会合させられていてもよい。このようにして、本発明の状況下では、「取り込み」という用語は、時として「封入」又は「担持」又は「装填」という用語と互換的に使用され得る。
【００５４】
受動的取り込み方法は、リポソーム膜内の親油性薬物の取り込み及び高い水溶性をもつ作用物質の取り込みに最も適している。
【００５５】
イオン化可能な親水性又は両親媒性作用物質の場合を膜貫通ｐＨ又はイオン勾配に対抗して作用物質をリポソーム内に装填することにより、さらに大きい作用物質装填効率を達成することができる（ニコラス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｊ．Ｗ．、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第４５５号：２６９〜２７１頁（１９７６年）；クラマー（Ｃｒａｍｅｒ）、Ｊ．、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、第７５号（２）：２９５〜３０１頁（１９７７年））。一般に遠隔装填と呼ばれるこの装填方法は、一般的にそれ自体両親媒性で、内側が高く外側が低いＨ＋及び／又はイオン勾配をもつリポソームの懸濁液に添加することで装填されるイオン性基を有する作用物質が関与する。
【００５６】
本発明の状況下で利用されるリポソームは好ましくは、遠隔装填原理によって装填される。遠隔装填は、作用物質の高いリポソーム内濃度及びリポソーム内部の作用物質対イオン塩の形成に起因するアンモニウム又はアンモニウム様（非有機、有機又は重合体アニオン、例えばアルキルアミンを伴う）勾配凝集などの、ｐＨ又はイオン勾配に起因して起こる。アンモニア（ＮＨ３）がリポソームから放出された時点で余剰の対イオンが発生する。アンモニウム塩を介した遠隔装填は、中性アンモニアガス分子（１．３×１０−１ｃｍ／ｓ）と荷電アニオン（＜１０−１０ｃｍ／ｓ）の透過性の大きな差異に基づいている。一般的には、アンモニア塩溶液を含むリポソーム内水相のｐＨは、アンモニウムとアンモニアの外部濃度を低下させることにより減少させることができる（ハラン（Ｈａｒａｎ）、Ｇ．、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ第１１５１号：２０１〜２１５頁（１９９３年））。リポソーム内ｐＨの減少は、リポソームプロトン（Ｈ＋）及び対イオン（例えばＨＳＯ４、ＳＯ４−２）内部から離脱するプロトン化されていないアンモニア化合物（ＮＨ３）がリポソームから放出された結果である。このようにして、ＮＨ４＋に比べて余剰の対アニオンがリポソーム内部で作られる。
【００５７】
ｐＨの低減はアンモニア形成を阻害し、このようにしてリポソームからのアンモニア放出を阻害する。リポソームの外部媒質に対し例えば両親媒性弱塩基といった作用物質を添加した場合、そのような作用物質はその未荷電形態で自由に脂質二重層と混合し、その荷電（低い透過性をもつ）形態で（遊離Ｈ＋によりプロトン化された後）内部水性区画内に蓄積する（シュルディナー（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ）、ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｃｈｅｍ第２５号：６４〜７０頁（１９７２年）；ニコラス及びディーマー（Ｄｅａｍｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第４５５号：２６９〜２７１頁（１９７６年））。明らかに、この蓄積は内部ｐＨを上昇させ、このようにしてアンモニアが再び形成されリポソームから放出され、作用物質の有効な装填が完了するまで、内部ｐＨなどを低減させる結果となる。従って、両親媒性弱塩基の装填のためには、リポソームが、低リポソーム間／高リポソーム内膜貫通勾配、例えばアンモニウム塩勾配（例えば硫酸アンモニウム）を有することが好ましい、という点が指摘される。
【００５８】
作用物質が弱両親媒性酸である場合には、リポソームが高リポソーム間／低リポソーム内膜貫通勾配を有することが好ましい。かかる勾配は、酢酸カルシウムなどの酢酸塩の水溶液を用いて達成可能である。この場合、酢酸塩イオン勾配は、駆動力であり、一方、リポソーム膜を通って非常に低い透過性をもつカルシウム（Ｃａ２＋）イオンは水相内部で弱両親媒性酸の対イオンとして作用し、よって装填を安定化し、装填された弱両親媒性酸の放出速度をより良く制御できるようにする（クラーク（Ｃｌｅｒｃ）、Ｓ．及びバレンホルツ、Ｙ．、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｍｐｈｉｐｈａｔｉｃ  ｗｅａｋ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１２４０号：２５７〜２６５頁（１９９５年））。
【００５９】
荷電（プロトン化）作用物質と未荷電作用物質の間の平衡は、透過係数に依存する速度で、リポソームからの未荷電弱塩基の緩慢な漏洩を可能にする。（リポソーム内部で装填された荷電作用物質と対イオンの間で形成された）凝集体の形成を介して平衡をシフトさせることは、リポソーム中の作用物質の保持をさらに改善し、ここで開示されている通り、リポソームからの作用物質の放出を制御するための手段として機能し得る。
【００６０】
本発明によれば、Ｈ＋及び／又はイオン勾配は、リポソーム形成脂質又はリポソーム形成脂質とその他の脂質（必ずしもリポソーム形成脂質ではなく、例えばコレステロール）を含む混合物をプロトン性有機溶媒で溶解させて前記脂質の溶液又は懸濁液を形成させ、次にイオン含有水溶液中に脂質溶液を添加してリポソーム懸濁液を形成させることにより、形成される。このとき、このリポソーム懸濁液は、リポソーム間区画とリポソーム内環境の間でそれぞれのＨ＋又はイオン勾配を達成するのに適したＨ＋又はイオン濃度、及び装填すべき作用物質を含む溶液を用いてインキュベートされる。両親媒性弱酸又は両親媒性弱塩基（活性作用物質／薬物として）の場合には、イオン性基が存在し、このようにして作用物質は、内側／外側ｐＨ勾配を有するように調製されたリポソームの懸濁液に添加することにより投与される。その結果、両親媒性弱酸及び両親媒性弱塩基の未荷電種は、リポソーム膜を通して拡散する。しかしながら、リポソーム間水相内のｐＨが、リポソーム内環境との関係においてより酸性（弱塩基について）又はよりアルカリ性（弱両親媒性酸について）であるというように異なっているため、作用物質はそれぞれにプロトン化又は脱プロトン化されて、荷電種となる。
【００６１】
一実施形態によれば、本発明の方法により形成されるリポソームは、例えば５．５〜７．５の適切なｐＨで、一般的には、０．１Ｍ〜０．３Ｍのアンモニア塩である、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどなどのアンモニウム塩を含有する水性緩衝液を用いることで調製可能である。勾配は、脂質溶液に添加された水溶液中に硫酸化重合体を内含させることによっても生成可能である。例えば、かかる硫酸化重合体は、デキストラン硫酸アンモニウム塩、ヘパリン硫酸アンモニウム塩又はスクラルファートを含む。リポソーム形成後、外部媒質を、アンモニウムイオンが欠如したものと交換することができる。この手法においては、装填中に両親媒性弱塩基はアンモニウムイオンと交換される。
【００６２】
Ｈ＋／イオン勾配は同じく、選択されたイオノフォアをリポソーム内含することによっても達成可能である。例えば、リポソーム二重層内にバリノマイシンを含ませるために調製されたリポソームがカリウム緩衝液中で調製され、その後、外部媒質がナトリウム緩衝液と交換され、カリウム内側／ナトリウム外側勾配を作り出す。内側から外側方向へのカリウムイオンの運動はそれ自体、恐らくはリポソーム膜を超えての正味の電気陰性電荷に応答したリポソーム内へのプロトンの移動に起因して、内側低／外側高のＨ＋又はイオン勾配を生み出す（ディーマー、Ｄ．Ｗ．、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第２７４号：３２３頁（１９７２年））。
【００６３】
類似の手法は、高い濃度の硫酸マグネシウムを有する水溶液に対し脂質を添加することにある。硫酸マグネシウム勾配は、スクロース中でのｐＨ７．４、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液による透析によって作り出される。その後、Ａ２３１８７イオノフォアが加えられ、その結果、各マグネシウムイオンについて２つのプロトンと交換でマグネシウムイオンが外向きに輸送され、その上高リポソーム内／低リポソーム外のプロトン勾配が確立される結果となる（センスク（Ｓｅｎｓｋｅ）ＤＢ、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１４１４号：１８８〜２０４頁（１９９８年））。
【００６４】
さらにもう１つの手法は、本明細書に参照により援用されている米国特許第５，９３９，０９６号明細書中で記載されている。簡単に言うと、その方法は、そのプロトン化形態がリポソーム膜を超えて転位してより高い内側が高く／外側が低いＨ＋又はイオン勾配を生成する、酢酸などの弱酸の塩が関与するプロトンシャトル機序を利用する。次に、両親媒性弱酸化合物が媒質に添加されて予備成形リポソームを生成する。この両親媒性弱酸はこの勾配に応答してリポソーム中に蓄積し、カチオン（すなわちカルシウムイオン）促進型沈殿又はリポソーム膜を超えた低い透過性によりリポソーム内に保持され得る：すなわち、両親媒性弱酸は酢酸と交換される。
【００６５】
弱塩基の場合、Ｈ＋／イオン勾配は、水酸化物；硫酸塩；リン酸塩；グルクロン酸塩；クエン酸塩；炭酸塩；重炭酸塩；硝酸塩；シアン酸塩；酢酸塩；安息香酸塩；臭化物；塩化物；その他の無機又は有機アニオン；アニオン重合体例えば硫酸デキストラン、リン酸デキストラン、ホウ酸デキストラン；カルボキシメチルデキストランなど；ならびにポリリン酸塩の中から選択された対イオンを有する塩を使用することにより形成可能であるが、これらに限定されない。弱酸の場合、対イオンは、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、アンモニウム、及びその他の無機及び有機カチオン又は例えばデキストランスペルミン、デキストランスペルミジン、アミノエチルデキストラン、トリメチルアンモニウムデキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、ポリエチレンイミンデキストランなどのカチオン重合体であり得る。対イオンは、遊離小イオンの形、又は重合体に付着された形、又は同時に両方の形で存在し得る。弱両親媒性酸を担持するリポソームについての特定の実施形態は、酢酸塩例えば酢酸カルシウム、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムなどの酢酸塩を使用することによりリポソーム外高／リポソーム内低の膜貫通勾配が形成されている実施形態である。酢酸カルシウム塩は、好ましい酢酸塩である。
【００６６】
リポソームからの装填された作用物質の放出速度は、活性作用物質と１つの塩を形成する対イオン（これに関連して、全体が本明細書に参照により援用されている、国際公開第０３／０３２９４７号パンフレット「予め画定された放出プロファイルを有するリポソーム処方物の調製方法（Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」を参照のこと）、温度、媒質関連特性（媒質の組成、イオン強度、ｐＨ）、リポソーム関連特性（膜脂質組成、リポソームの型、薄層数、リポソームの大きさ、リン脂質膜の物理的状態、すなわち液体−無秩序（ＬＤ）、液体−秩序（ＬＯ）、固体−秩序（ＳＯ））及び装填分子関連特性（親油性、親水性、大きさ）を含めたさまざまな因子により左右されることが示された〔ハラン、Ｇ．、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１１５１号：２０１〜２１５頁（１９９３年）〕が、これらに限定されない。
【００６７】
本発明は同様に、生理学的に受容可能な担体及び本発明に従って調製された一定量の作用物質担持リポソームを含む薬学組成物も提供しており、前記量は、疾病又は障害を治療又は予防するために有効な量である。
【００６８】
この薬学組成物は単回用量として提供され得るが、好ましくは治療を必要とする対象に対して、（例えば累積的有効量を生成するため）長時間にわたって、数日間単回日用量でまたは一日に数回の用量で、等のように投与することができる。治療投薬計画及び投与すべき特定の処方物は、治療すべき病気の種類により依存することになり、医術当業者例えば医師にとって既知のさまざまな考慮事項により決定され得る。
【００６９】
「有効量」又は「〜に有効な量」という用語は、本明細書では、リポソームが投与された時点で所与の治療的投薬計画内で治療対象の疾病又は障害に関して、所望の治療効果を達成するのに充分である作用物質の量を表わすように用いられている。この量は、当該技術分野において既知の通りの考慮事項によって判定され、治療対象の身体条件の種類及び重症度及び治療投薬計画に依存する。有効量は、標準的には、適切に設計された臨床試験（用量範囲研究）の中で判定され、当業者であれば、有効量を判定する目的でかかる臨床試験をいかにして適切に行なうかがわかるだろう。一般に知られているように、有効量は、投与様式、両親媒性弱酸／塩基を担持する賦形剤の種類、活性作用物質（弱両親媒性酸又は塩基）の反応度、体内でのリポソームの分布プロファイル、例えばリポソームから放出された後の体内の半減期、存在する場合には望ましくない副作用、治療対象の年令及び性別などの因子などを含めた種々の因子を含んだ様々な薬理学的パラメータに依存する。
【００７０】
「投与する」（又は「投与」）という用語は、経口、非経口（皮下、筋内及び静脈内、動脈内、腹腔内など）及び鼻腔内投与、ならびに髄腔内及び注入技術を含んだ、患者体内の所望の場所へのあらゆる適切な送達経路による、患者へのリポソーム処方物の接触又は調剤、供給又は塗布を表わすために使用されている。
【００７１】
一実施形態によれば、本発明に従って使用される組成物は、注入に適した形態をしている。注入可能な処方物用の有効な薬学的賦形剤のための必要条件は、当業者にとって周知である（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、ペンシルベニア州フィラデルフィア、バンカー（Ｂａｎｋｅｒ）及びチャルマーズ（Ｃｈａｌｍｅｒｓ）編、２３８〜２５０頁（１９８２年）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ｔｏｉｓｓｅｌ、第４版、６２２〜６３０頁（１９８６年）を参照のこと）。
【００７２】
さらに本発明は、疾病又は障害について患者を治療する方法において、前記患者に対し本発明の方法により調製された一定量の作用物質担持リポソームを投与する工程を含む方法にも関する。
【００７３】
本明細書で使用する「治療」（又は「治療する」）という用語は、望ましくない病態の治癒又はある病気の進行の予防を表わす。治癒を目的とする場合、「治療」という用語は、その病気に付随する望ましくない症候の改善、病気の進行の減速、病気の進行期の発症の遅延、かかる症候の悪化の減速、病気の寛解期開始の増強、存在する場合には進行期の発症の遅延、生存率の改善又は病気からのより急速な回復、病気の重症度の削減又はその治癒などを含む。治療は疾病又は障害の予防も含む。「予防」という用語は、病気の発生の予防又は病気によりひき起こされる不可逆的損傷の予防、発生前の病気に付随する症候の発現の予防、病気の進行の阻害などの目的で一定量の組成物を投与することを含んでいるが、これらに限定されない。
【００７４】
明細書中に使用される通りの「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という形態には、前後関係から明らかに相反する指示がなされているのでないかぎり、単数ならびに複数の言及を含むことに留意されたい。例えば、「脂質（ａ  ｌｉｐｉｄ）」という用語は１つ以上の同じ又は異なる脂質を含む。同様にして、複数に対する言及は、前後関係から相反する指示がなされているのでないかぎり、単数も含む。
【００７５】
さらに、本明細書で使用される「〜を含む」という用語は、リポソームが列挙された成分を含むことを意味するように意図されているが、酸化防止剤、抗凍結剤などなどのリポソームの形成又は組成において任意であり得るその他のものを排除するわけではない。「本質的に〜からなる」という用語は、例えばリポソームといった、列挙された成分を含むものが、本物質のパラメータ（例えばリポソームの場合、安定性、リポソームからの作用物質の放出又は放出の欠如ならびにリポソームを特徴づけるその他のパラメータ）に対し必須の有意な効果をもち得るその他の成分を除く物質を定義するために用いられる。「〜からなる」というのは、このようにしてしたがって、このようなその他の成分の微量を上回る量を排除することを意味する。これらの転換語の各々により定義される実施形態が、本発明の範囲内に入る。
【００７６】
さらに、全ての数値は、例えば組成物又はリポソーム構成要素を構成する要素の量又は範囲に言及する場合、最高２０％、時として最高１０％だけ、記載された値が（＋）又は（−）に変動する近似である。つねに明示的に述べられていなくても、全ての数値的呼称の前に「約」という語が付いているものとして理解すべきである。
【００７７】
明確さを期して、別の実施形態に関して記載されている本発明の一部の特徴が、単一の実施形態において組合せた形でも提供され得る、ということがわかる。換言すると、簡明さを期して単一の実施形態に関連して記載された本発明のさまざまな特徴は、別々に又は任意の適切な一部組合せの形ででも提供可能である。
【００７８】
本発明は、その特定の実施形態と併せて記載されてきたが、当業者には数多くの代替方法、修正及び変動が明らかになるということは明白であり、本発明がこのような代替方法、修正及び変動を含むことは明示的に意図されている。
【００７９】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が、本明細書に参照により援用されている。
【実施例】
【００８０】
材料
水素添加大豆ホスファチジルコリン（以下、ＨＳＰＣという略語で表記する）を、リポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）（ルートビヒスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓａｈｆｅｎ）、ドイツ）から入手した。
【００８１】
コレステロールはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。
【００８２】
塩酸ブピバカイン（以下ＢＵＰという略語で表記する）をオルガモル（Ｏｒｇａｍｏｌ）（エヴィオナー（Ｅｖｉｏｎｎａｒ）、スイス）から入手した。
【００８３】
塩酸リドカイン（以下ＬＩＤという略号で表記する）をシグマから入手した。
【００８４】
ジミリストイルホスファチジルコリン（以下ＤＭＰＣという略語で表記する）を、リポイド（ルートビヒスハーフェン、ドイツ）から入手した。
【００８５】
ジパルミトイルホスファチジルコリン（以下ＤＰＰＣという略語で表記する）をリポイド（ルートビヒスハーフェン、ドイツ）から入手した。
【００８６】
リポソームの調製及び特徴づけ
多重膜ベシクル（ＭＬＶ）の調製
４５０ｍｇの乾燥ＨＳＰＣ及び１５４ｍｇの乾燥コレステロール（モル比６０：４０）を秤量して、ＭＬＶリポソームを調製した。その後８０℃で１ｍｌのエタノール中に乾燥リン脂質／コレステロール混合物を溶解させ、溶解した混合物に（ＮＨ４）２ＳＯ４水溶液（２５０ｍＭ、２９７ｍｇの硫酸アンモニウムを９ｍｌの水に添加して調製したもの）を添加して、６０ｍＭの最終リン脂質濃度を有する調製物を得た。エタノール体積は、最終体積の１０％であった。このようにして得たＭＬＶを６５℃で４５分間加熱した。
【００８７】
大きな多小胞ベシクル（ＬＭＶＶ）の調製
上述のように調製したＭＬＶを１回以上（最高合計１０回の凍結−解凍サイクル）凍結−解凍させた。凍結は、液体窒素（−１９６℃）を用いて実施し、解凍は水浴（３７℃）を用いて実施した。凍結時間は、リポソーム調製物の体積に正比例し、このようにして調製物１ミリリットルあたり１分間の凍結が実行された（すなわち、１０ｍｌについて１０分間の凍結が行なわれた）。
【００８８】
膜貫通硫酸アンモニウム勾配を作り出すために、リポソーム調製物を生理食塩水中で逐次的に４回遠心分離した（４℃、１０００ｇ、５分）。これは、リポソーム調製物膜にわたる内側から外側のアンモニウムイオン勾配を作り出すのに有効である。アンモニウムイオン濃度勾配は、ブピバカイン（ＢＵＰ）などの両親媒性弱塩基の装填のための駆動力を提供する。膜貫通ｐＨ勾配の存在を、ハラン、Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１１５１号：２０１〜２１５頁（１９９３年）及びクラーク（Ｃｌｅｒｃ）Ｓ．、バレンホルツ、Ｙ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２５９号（ｌ）：１０４〜１１頁（１９９８年）中の記載通り、両親媒性弱塩基アクリジンオレンジ（ＡＯ）の分布を判定することによって確認した。
【００８９】
ＬＭＶＶリポソームに対する薬物の装填
４５分間６０℃で４．５％の適切な薬物溶液（薬物の５０ｍｇ／ｍｌ溶液）と共にリポソーム調製物をインキュベートすることによってリポソーム内に薬物、ＢＵＰ又はＬＩＤを遠隔装填した。
【００９０】
生理食塩水（４℃、１０００ｇ、５分）中での遠心分離によりＬＭＶＶ懸濁液から封入されていない薬物を除去した。最終媒質のｐＨは約５．５であった。このｐＨを保持して薬物の溶解度を確保し、沈殿を防止した。
【００９１】
一日の貯蔵後および貯蔵後少なくとも１ヵ月間、捕捉及び遊離した薬物の量を、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて測定し（グラント（Ｇｒａｎｔ）、Ｇ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、第１８号Ｎ３：３３６〜３４３頁（２００１年）及びグラント、Ｇ．ら、Ａｎａｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、第１０１号：１３３〜１３７頁（２００４年））、リポソーム処方物中のリン脂質の量をバートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）方法を用いて判定した（シュミーダ（Ｓｈｍｅｅｄａ）、Ｈ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第３６７号：２７２〜２９２頁（２００３年））。得られたパラメータから薬物対脂質比を計算した。
【００９２】
薬物装填されたリポソームの特性解析
薬物対脂質比
上述の通りに調製したリポソーム処方物中で得られた薬物対脂質比は、２超であった（薬物モル／脂質モル＞２）。
【００９３】
リポソームサイズ
レーザーフラウンホーファ回折（ＬＳ１３３２０レーザー回折粒子選別分析器、ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、英国）を用いてリポソームのサイズを判定した。計器のソフトウェアは、体積中位径として粒度を表現する。ＬＭＶＶの平均サイズは約８．５±６．５ミクロンであった。ＡＯ分布に従った膜貫通ｐＨ勾配のレベルは約８９％であり、低リポソーム間／高リポソーム内の膜貫通ｐＨ勾配が３超であることを確認した。
【００９４】
薬物装填されたリポソームの動態
リポソームからの薬物漏出の動態を、調製後１ヵ月（ＢＵＰについて）又は３ヵ月（ＬＩＤについて）間の貯蔵中に４℃で測定した。表１及び２は、異なる時点での漏出を表わすパラメータを提供している。
【００９５】
【表１】
2009513621.tif 000002
【００９６】
【表２】
2009513621.tif 000003
【００９７】
薬物／脂質比及び薬物放出レベルに対する凍結−解凍サイクル数の効果
ＬＭＶＶ特性に対する凍結・解凍サイクル数の効果を研究した。２回の独立した実験を実施した。２回目の実験においては、凍結−解凍されなかったリポソーム（ＭＬＶ）のバッチを検査した。膜貫通ｐＨ勾配及びＢＵＰ装填を上述の通りに準備した。ＡＯ分布測定値によると、膜貫通ｐＨ勾配は全ての調製物について同じ、すなわち約８５％〜９０％であった。
【００９８】
表３中に提示する結果は、調製後（一晩）及び一週間の貯蔵後に提供された合計ＢＵＰとの関係における組成物中の遊離非封入ＢＵＰの百分率を示す。
【００９９】
【表３】
2009513621.tif 000004
【０１００】
表３は、Ｆ＆Ｔの数が薬物−脂質比に対し有意な効果を全く有していなかったことを示している。さらに、リポソームのサイズ分布を、Ｆ＆Ｔ数の一関数として測定した。
【０１０１】
凍結−解凍サイクル数は、ベックマン・コールターの汎用液体モデルを用いてベシクルの体積に基づいて判定された、リポソームサイズ分布に対する有意な効果を全く有していなかった（１．２７μｍの精密サイズ標準直径を伴いフラウンホーファｒｆ７８０ｄの（サイズ分布計算用）光学モデルである０．０４０〜２０００μｍのサイズ範囲測定を可能にするＰＩＤＳ及び光回折の組合せ、ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）のＣａｔ  Ｎｏ．６４０３５を使用）（データ示さず）。特定的には、１回目の実験では１〜５回の凍結−解凍サイクルの場合および２回目の実験では１〜７回の凍結−解凍サイクルの場合でさえ、薬物／脂質比の間に有意な差異は全く存在しなかった。同時に、最高の薬物／脂質比は、両方の実験において９回の凍結−解凍サイクル後に得られた。第２の調製物はより高い薬物放出レベルを示した。
【０１０２】
薬物／脂質比及び薬物放出レベルに対する初期リン脂質濃度の効果
異なる初期脂質濃度の原液を調製し、凍結−解凍サイクル数（０、１及び９回のＦ＆Ｔサイクル）の効果を評価した。２つの独立した実験を実施した。１回目の実験では、薬物装填から２日後にリポソームからのＢＵＰ漏出を測定し、２回目の実験では、薬物装填後２週間のＢＵＰ漏出を判定した。結果は表４（１回目の実験）及び表５（２回目の実験）の中で提示されている。
【０１０３】
【表４】
2009513621.tif 000005
【０１０４】
【表５】
2009513621.tif 000006
2009513621.tif 000007
【０１０５】
表４及び５に提示されたデータによると、初期リン脂質濃度を増大させると（約９７ｍＭの高さまで）、ＭＬＶを伴う全ての調製物（Ｆ＆Ｔサイクル無し（０））中で薬物／脂質比に影響を及ぼしたことが明らかである。９回のＦ＆Ｔサイクルの後に得られたＬＭＶＶ中では、薬物／脂質比に対する異なる初期リン脂質濃度の有意な効果は全く存在しなかった。初期脂質濃度が高くなればなるほど薬物漏出（２週間後の）が低くなることが指摘される。しかしながら、最高１１８ｍＭまでのリン脂質初期濃度の付加的な増大が結果として薬物／脂質比の減少をもたらしたということもさらに指摘される。
【０１０６】
リポソーム中のＢＵＰの装填には、さまざまな利点があり、なかでも、遊離形態での薬物の毒性の低減という利点がある。高い効能をもつアミド総合型局部麻酔薬であるＢＵＰは、高濃度の薬物が循環に入った時点で心臓血管及び中枢神経系の毒性を結果としてもたらす、ということがわかっている。このようにして、標準的なＢＵＰ及びＬＭＶＶＢＵＰの全身的毒性を、腹腔内注射の後に５０％のマウスにおいて致死的である用量（ＬＤ５０）を判定することによって評価した。所要動物数を最小限におさえるために、ディクソン及びマッセイ（Ｄｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｓｓｅｙ）のアップアンドダウン法を使用した。全ての研究溶液について、動物の体重１０ｇあたり０．３ｍｌを注射し、マウスを注射後６時間にわたり毒性徴候について観察した。結果は、標準的ＢＵＰについてのＬＤ５０が７１ｍｇ／ｋｇであり、ＬＭＶＶＢＵＰについてのＬＤ５０が５６５ｍｇ／ｋｇであることを示した。ＬＭＶＶＢＵＰにおけるＬＤ５０のこの８倍増加は、リポソーム貯蔵からの薬物の低速放出と一貫性をもつものであった。これは同様に、ＬＭＶＶの使用によって現在許容されているよりもはるかに多い局所麻酔用量をより安全に投与することが可能になるということも示している。
【国際調査報告】
2009513621.tif 000008
2009513621.tif 000009
2009513621.tif 000010
2009513621.tif 000011