(57)【要約】  本発明は、慢性虚血性皮膚病変を患う糖尿病患者の下肢に非経口投与するための、上皮成長因子を充填したマイクロスフェアを含有する医薬組成物に関する。従来技術と対比して、本発明の組成物は、治療期間中の投与頻度を減少させ、溶液中に遊離している場合に上記因子を同量投与するのと比較してより迅速な病変の回復を可能にするという点で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病患者の下肢の皮膚慢性虚血性創傷において、非経口経路で投与し、前記身体部分の切断を防止するための上皮成長因子のマイクロスフェアを含有する医薬組成物。
【請求項２】
上皮成長因子が重合体マイクロスフェア又はナノスフェアの内部に封入されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
マイクロスフェアがグリコール酸又は乳酸のホモポリマー、及び両方に由来する共重合体である（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート−ポリヒドロキシバレレート共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリオルトエステル、及びポリ無水物から成る群から選択された重合体物質でできている、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記マイクロスフェアが１μｍから１００μｍの範囲の直径を有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上皮成長因子がマイクロスフェアの総質量の１．６〜２．４％を構成する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
第１日目の後における上皮成長因子の放出速度が５から１０μｇ／日である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
放出された上皮成長因子が、その物理化学的性質及び生物学的特性を１４日間保存する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
糖尿病患者の虚血性創傷の治療に使用される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
病変の縁部及び底部を含む組織での局所浸潤によって投与する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ型の温度感受性ヒドロゲル、又はキトサン若しくはデキストランの誘導体中に懸濁されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚慢性虚血性潰瘍創傷を有する糖尿病患者の下肢に、糖尿病の肢切断を防止するために非経口経路で投与する上皮成長因子（ＥＧＦ）を含有する重合体マイクロスフェアを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病は、下肢切断の主要な非外傷性危険因子である。足の潰瘍形成は、糖尿病の重大な合併症であり、年間発生率は２％よりわずかに高い（Ａｂｂｏｔｔ  Ｃ．Ａ．ら（２００２年）、「北西部糖尿病フットケア検査：地域ベース患者コホートにおける新規糖尿病足潰瘍形成の発生率及び危険因子（Ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈ−Ｗｅｓｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｏｏｔ  Ｃａｒｅ  Ｓｔｕｄｙ：ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ，ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ，ｎｅｗ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｈｏｒｔ）」、Ｄｉａｂｅｔ．Ｍｅｄ．１９（５）：３７７−８４）。少なくとも１５％の糖尿病患者が、彼らの寿命中に彼らの足部慢性潰瘍を発症し（Ｒｅｉｂｅｒ  Ｇ．Ｅ．（１９９６年）、「糖尿病性足疾患の疫学（Ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ）」、Ｄｉａｂｅｔ．Ｍｅｄ．１３  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ６−１１）、これらの患者の約１０％から３０％が下肢切断を必要とすると推算されている（Ｌｉｐｓｋｙ  Ｂ．Ａ．（２００４年）、「糖尿病性足感染の内科療法（Ｍｅｄｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３９  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０４−１４）。下肢の切断を受けた患者の術後５年間の死亡率は約５０〜６０％である（Ｒｅｉｂｅｒ  Ｇ．Ｅ．（１９９６年）、「糖尿病性足疾患の疫学（Ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ）」、Ｄｉａｂｅｔ．Ｍｅｄ．１３  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ６−１１）。
【０００３】
皮膚慢性虚血性潰瘍創傷を有する糖尿病患者の治療には、いくつかの方法が使用されてきた。それらには、厳格な代謝制御、調節可能な危険因子の予防、外科的壊死組織切除、包帯の使用、感染の抗菌剤治療、創傷領域における圧力の排除、皮膚移植の使用、成長因子、及び適用がある場合には血管再生法の使用が含まれる。
【０００４】
糖尿病性潰瘍の治癒には、代謝制御の次に、外科的壊死組織切除が最も重要な治療であり、いかなる他の局所的薬剤使用の前にも実行するべきである。外科的壊死組織切除は、周囲の硬皮のある組織と共に、創傷領域からすべての死組織及び感染組織（骨を含める）を除去することから成る。
【０００５】
糖尿病性足部潰瘍への包帯の使用は、十分に確立されており、数種類の包帯が研究されてきたが、各種類の包帯の、他のものに優る利点は知られていない。加えて、包帯の使用に関する研究はこれまでわずかであり、且つそれらは主として低度の潰瘍を対象にしたものであったので、それらの有効性を実証するには、臨床試験から、より多くの証拠が必要である。臨床試験で検査された新しい種類の包帯には、半透性重合体膜ベースのもの、ｐｒｏｍｏｇｒａｍ（登録商標）（コラーゲンマトリックス）、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロナン、及び亜大気圧を用いるものが含まれる（Ｅｌｄｏｒ  Ｒ．ら（２００４年）、「糖尿病性足部潰瘍治療への新規及び実験的アプローチ：新興治療戦略の包括的概説（Ｎｅｗ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒｓ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」、Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ．２１（１１）：１１６１−７３）。
【０００６】
潰瘍上に貼る皮膚代替物を生成するいくつかの方法が開発されている。例えば、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）は、生体吸収性物質の合成足場上に、ヒト真皮の線維芽細胞を播種することによって産生される。この装置は、より短い時間間隔に、より大きな割合の回復を伴い、低度の潰瘍に有効であることが示されている（Ｍａｒｓｔｏｎ  Ｗ．Ａ．ら（２００３年）、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ糖尿病性足部潰瘍検査グループ、「慢性糖尿病性足部潰瘍の治癒の改善における、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔの有効性及び安全性：前向きランダム化試験の結果（Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ  ｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２６：１７０１−５）。Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）は、ウシＩ型コラーゲンマトリックス中のヒト線維芽細胞で構成された真皮の層と、ヒト角質細胞によって形成された１層の表皮層とから成る。同様の方法で、皮膚のこの置換は、感染性潰瘍ではなく、ニューロパシーによる低度の潰瘍にそれが適用された場合、有意に、より大きく且つ迅速な創傷の治癒を生むことが示されている（Ｖｅｖｅｓ  Ａ．ら（２００１年）、「ヒト皮膚等価物であるＧｒａｆｔｓｋｉｎは、ニューロパシーによる非感染性糖尿病性足部潰瘍の管理に有効である：前向きランダム化多施設臨床試験（Ｇｒａｆｔｓｋｉｎ，ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒｓ：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２４：２９０−５）。
【０００７】
プラセボを対照とした第ＩＩＩ相ランダム化二重盲検臨床試験において、血液灌流が良好な、ニューロパシーによる潰瘍を有する糖尿病患者の治療に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のゲル製剤が有効且つ安全であることが示された（Ｗｉｅｍａｎ  Ｔ．Ｊ．ら（１９９８年）、「ベカプレルミン（ｒｈ  ＰＤＧＦ−ＢＢ）ゲルの臨床効果（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｂｅｃｌａｐｅｒｍｉｎ  （ｒｈ  ＰＤＧＦ−ＢＢ）  ｇｅｌ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２１（５）：８２２−７）。この研究に含まれていた患者の大部分（９５％）は、面積測定による評価によると、≦１０ｃｍ２の面積の潰瘍を有する。プラセボと比較して、ベカプレルミンゲル１００μｇ／ｇは、創傷の完全な治癒を有意に、４３％増大させ（５０対３５％、ｐ＝０．００７）、この効果を達成するのに必要な時間を３２％減少させた（８６対１２７日間、ｐ＝０．０１３）。ＰＤＧＦ又はベカプレルミン（Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標））を用いた満足のゆく結果は、糖尿病患者の下位の身体部分に位置し、皮下組織又はさらに深くまで及び、且つ適した血流を有する、ニューロパシーによる潰瘍の治療へのそれらの承認へと導いた（Ｂｒｅｍ  Ｈ．、Ｓｈｅｅｈａｎ  Ｐ．、Ｂｏｕｌｔｏｎ  Ａ．Ｊ．（２００４年）、「糖尿病性足部潰瘍治療のプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１８７（５Ａ）：１Ｓ−１０Ｓ）。
【０００８】
最近、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの治療薬を投与する方法が公開された。それは、何回かの注射による創傷へのＥＧＦ溶液の浸潤から成る（国際公開第０３／０５３４５８号）。しかし、それには明確な不都合がある。すなわち、創傷への注射の適用が極めて苦痛であるので、患者にとってそれは極めて衝撃の大きなものであるということである。各治療で何回かの注射を適用しなければならず、患者はその治療を１日おきに数週間受けなければならない。この方法の不都合な点を考慮すると、ＥＧＦの持続放出製剤の使用によって、薬物投与の頻度が減少しうる。これは、患者の利便性及び服薬遵守を大幅に向上させるであろう。
【０００９】
ある特許（米国特許第６０８６８６３号）では、ポリスチレン又は他の非分解性重合体のマイクロスフェアを含有する予防用又は治療用組成物中に、調節因子及び成長因子（すなわち上皮成長因子）を含めることができ、適切な媒体におけるこれらのマイクロスフェアの懸濁液の局所適用によって、糖尿病性足部潰瘍などの創傷の修復過程を改善する。いくつかの因子が薬物吸収を妨げうるので、薬物の局所適用には、作用部位に達する用量の制御が乏しいことに関する制限がある。それらの因子のうち、とりわけ、壊死組織及び局所滲出液の存在、血流障害、並びにＥＧＦを分解する酵素が言及できる。
【００１０】
したがって、糖尿病性足部潰瘍の治療における重大な問題は、虚血組織の再生を引き起こし、且つ糖尿病性の肢切断を防止する薬物の有効用量を決定することである。
【００１１】
他の多くの特許が、治癒速度を加速するように設計された他の方法に焦点を合わせている。それにもかかわらず、これらの方法はいずれも、広範に有効であるとは証明されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
概して、本発明は、皮膚慢性虚血性創傷を有する糖尿病患者の下肢に、これらの身体部分の切断を防止する目的で非経口経路で投与する、上皮成長因子を充填したマイクロスフェアを含有する医薬組成物に関する。本発明では、マイクロスフェアという用語には、マイクロスフェア及びナノスフェアが含まれる。
【００１３】
マイクロスフェア中にＥＧＦを封入することによって、（ｉ）薬物の遅延放出、及び（ｉｉ）作用部位に存在するプロテアーゼによるタンパク質消化などの分解過程からのＥＧＦの防御が可能となる。
【００１４】
本発明では、マイクロスフェアは、調節された様式で放出される薬物がそれらの全容積に均質的に分散されている重合体の球体として説明できる。
【００１５】
本発明との関連では、「調節放出」という用語には、連続的、非連続的、線形、又は非線形形態での薬物の放出が含まれる。これには、上記重合体マトリックスとは異なった組成物の使用、放出プロフィールを改変する賦形剤の包含、及び／若しくは重合体分解促進剤の添加、又は他の改変が伴い、これらの改変は、個別に、又は併せて加えられ、組成物の特性に期待された効果を生み出す。
【００１６】
上記マイクロスフェアは、Ｏｋａｄａら（米国特許第４６５２４４１号）によって記載された複エマルション溶媒留去法によって得た。
【００１７】
本発明の開発に好ましい重合体は、それらの特性によって生体適合性及び生物分解性となっているものである。最後の条件は、それが創傷における上記製剤の浸潤による上記製剤の非経口投与を可能にするので極めて重要である。とりわけ、グリコール酸又は乳酸のホモポリマー、及び両方に由来する共重合体であるポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡと略される）が好ましい。これらの重合体は、それらを縫合、固定整形外科装置、及び薬物送達系のための重合体マトリックスを製造するのに優れたバイオマテリアルにした特徴を有する（Ａｓｈａｍｍａｋｈｉ  Ｎ．ら（２００１年）、「頭蓋顎顔面外科の発展：自己強化生体吸収性骨固定装置の使用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｏｓｔｅｏｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）」、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｔｏｐｉｃ：１６７−８０；Ｅｐｐｌｅｙ  Ｂ．Ｌ．（２００５年）、「小児顔面骨骨折における吸収性プレート及びスクリューの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ  ｐｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｗｓ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｆａｃｉａｌ  ｆｒａｃｔｕｒｅｓ）」、Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．６３（３）：３８５−９１）。その特性に関しては、重合体マトリックスの組成、重合体の分子量、及び粒子への他の賦形剤の添加に基づいて、薬物の放出プロフィールを変える可能性を提供するのに加えて、それらは生体適合性及び生分解性である。
【００１８】
ＰＬＧＡに加えて、生体適合性及び生物分解性など類似の特性を有する他の重合体も使用できる。それらには、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート−ポリヒドロキシ吉草酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリオルトエステル、及びポリ無水物が含まれる。
【００１９】
好ましい実施形態では、上記医薬組成物のマイクロスフェアは、１から１００μｍの範囲の直径を有し、ＥＧＦはマイクロスフェアの総質量の１．６〜２．４％を構成する。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、マイクロスフェア内に封入されたＥＧＦが、その浸潤の第１日目の後に１日あたり５から１０μｇの量で放出され、そのＥＧＦは、その物理化学的及び生物学的特性を１４日間保存する。
【００２１】
本発明の別の態様は、創傷の縁部及び底部を含む局部組織における、上記医薬組成物の局所浸潤による投与を介した、糖尿病患者の虚血性創傷の治療に関する。
【００２２】
タンパク質薬物のマイクロカプセル封入は、マイクロカプセル封入処理後におけるこれらの生体分子の活性に関連して、特別な注意を必要とする。これは、タンパク質はその大部分が、封入工程でしばしば生じる高熱、及び重合体を溶解するのに用いられる有機溶剤に感受性であるという事実のためである。一方、各タンパク質は、マイクロカプセル封入工程で独自の挙動を示す。これらの側面を考慮すると、タンパク質を充填したマイクロスフェアを、それらの生物活性を変えずに調製する方法論を確立するには、適切な方法、重合体、溶媒、添加物などを選択するために徹底的な研究をする必要がある。
【００２３】
上記医薬組成物は、活性剤として、天然源から取得されたＥＧＦ、化学合成によるＥＧＦ、又は組換えＤＮＡ技術によるＥＧＦを含有しうる。
【００２４】
上記医薬組成物は、以下に示す群の追加薬物、すなわち、抗菌剤（ペニシリン、セファロスポリン、キノロン、メトロニダゾール、クリンダマイシン、バンコマイシン、マクロライド、テトラサイクリン、アズトレオナム、及びイミペネム）、麻酔薬、非ステロイド抗炎症剤の群に属する鎮痛剤、血管新生作用を有する薬物（血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子）、他の成長因子（顆粒球コロニー刺激因子）、又はエリスロポエチンをいくらか、媒体の一部として含有することができる。
【００２５】
糖尿病患者の下肢における皮膚慢性虚血性潰瘍創傷は、本発明の対象である医薬組成物で治療される症状である。創傷の状態と、治療するべき患者の特徴との両方に応じて、上記医薬組成物に含まれるマイクロスフェアは、別の分子の共同封入を必要としうるであろう。これらの追加治療薬は、抗菌剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬の群に属する鎮痛剤血管新生作用を有する薬物、及び他の成長因子の群に属する。
【００２６】
上記医薬組成物は、患者に投与する前に、適切な媒体に懸濁するべきである。適切な媒体は、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの増粘剤、並びにポリソルベートなどの界面活性剤を含有する食塩水か、或いはＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ型の温度感受性ヒドロゲル、又はキトサン若しくはデキストランの誘導体のいずれかでありうる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、治療期間中の投与頻度の減少を可能にし、治療の合計時間を減少させることによって、治療上の利益を予想外に増大させた。これは、創傷の治癒が、同等な量の非封入ＥＧＦで治療された創傷のものより速かったためである。実現された遅延放出プロフィールは低濃度のＥＧＦを生じるので、本発明者らの製剤における治療効果の改善は予想外であった。同じく予想外なことに、ＥＧＦ放出を加速させ、それにより、より高濃度の薬物を得るためになんらかの賦形剤を用いた別の製剤は、本発明の製剤の治療効果を有しなかった。
【実施例】
【００２８】
本発明の、より完全な説明を与えるために、以下の実施例を記載する。
【００２９】
（実施例１）
ＥＧＦを有するＰＬＧＡマイクロスフェアを含有する医薬組成物の調製
ＥＧＦ充填マイクロスフェアの調製
ジクロロメタン（ＤＣＭ）中に１ｇの重合体を溶解することによって、重合体溶液（ＰＬＧＡ  ５０：５０（Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在）、１０％（ｗ／ｖ））を調製した。ＰＬＧＡ溶液１ｍｌをガラス容器に入れ、２０ｍｇ／ｍｌのＥＧＦ水溶液２００μｌを添加した。この混合物を、超音波プローブ（ＩＫＡＳＯＮＩＣ  Ｕ  ２００  Ｓコントロール（ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社、独国所在）によって３０秒間超音波処理した。第１のエマルションを１％のポリビニルアルコール４０ｍｌに添加し、それらの相を、Ｔ８  Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社、独国所在）を用いて１４０００ｒｐｍで激しく撹拌することによって第２のエマルションを得た。この複エマルションを０．１％のポリビニルアルコール３００００〜７００００（Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）１４０ｍｌに添加し、ジクロロメタンを留去するために、ホモジナイザー（ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社、独国所在）中で１時間、３００ｒｐｍで撹拌した。最後に、マイクロスフェアを濾過によって収集し、蒸留水５０ｍｌで５回洗浄し、凍結乾燥機（Ｅｄｗａｒｄｓ社、英国所在）中で、凍結乾燥によって乾燥させた。乾燥したマイクロスフェアは、それらを使用するまで、４℃で保存した（図２）。
【００３０】
賦形剤を伴うＥＧＦのマイクロスフェアは同じ手順に従って得られたが、内部水相中へのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７（１０ｍｇ）及びＮａＣｌ（０．５ｍｇ）の添加を伴った。
【００３１】
ＥＧＦを含有するマイクロスフェアの特徴付け
マイクロカプセル封入工程及び粒子のタンパク質充填の効率は、粒子を１Ｎ  ＮａＯＨで消化し、測定の前に１Ｎ  ＨＣｌで中和した結果得られた溶液中における、ｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイによるＥＧＦ濃度の測定によって計算した。
【００３２】
上記のマイクロカプセル封入工程の結果、球形のマイクロ粒子を得た。それらは定型的な表面及び孔を示した（図３）。これらのマイクロスフェアは、約８５％の収率で得られた。上記封入工程での導入によって、総タンパク質量の４０〜６０％をマイクロスフェア内に組み入れることが可能であった。粒子は１．６〜２．４％のタンパク質充填を示した。マイクロスフェアのサイズは２５μｍ未満であった。
【表１】
2009525288.tif 000002
【００３３】
賦形剤の包含は、ＥＧＦを含有するマイクロスフェアの特徴を、有意の様式で変化させなかった。
【００３４】
封入されたＥＧＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出
ＥＧＦを充填したマイクロスフェア５０ｍｇを１ｍｌの受容液（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ）（ＰＢＳ  ｐＨ７．２中に０．００１％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．１％アジ化ナトリウム）中に懸濁した。この懸濁液を、穏やかな撹拌の下、３７℃でインキュベートした。指定された時間間隔で（０．２５（６ｈ）、０．５（１２ｈ）、１、３、７、及び１４日）、Ｈｅｔｔｉｃｈ社製卓上遠心分離機（独国ツットリンゲン（Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ）所在）中、５０００ｒｐｍで５分間、試料を遠心処理し、上清を収集し、等容積の新たな受容液を添加した。取り出された試料それぞれにおけるＥＧＦの濃度をｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイで評価した。
【００３５】
ＰＬＧＡマイクロスフェア内に封入されたＥＧＦの放出プロフィールは、バースト放出と、別のステージとを示した。バースト放出は、第１日目の間に起こった。そして、別のステージでは、それ以後の１４日間、ＥＧＦ放出が連続的に起こる。第１のステージ全体を通して、両方の調製物において、封入された全タンパク質の約２０％が放出された。一方、評価期間の残りでは、放出プロフィールが相違していた。賦形剤を有するマイクロスフェアからのＥＧＦの放出は、ほとんど６５％（１日あたりの２８μｇの概算速度）にまで達し、賦形剤なしの粒子からは、最大３０％（１日あたり７μｇの概算速度）までが放出された（図４）。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで放出されたＥＧＦの特徴付け
この実験は、封入されたＥＧＦがそれらの物理化学的及び生物学的特性を保存することを実証するという目的を有する。インキュベーション期間（１４日間）中に放出されたＥＧＦの特性を評価した。
【００３７】
第１日目中、７日目まで、及び１４日目までに放出されたＥＧＦを、いくつかの分析技法、すなわち、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、スラブ型ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳働（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性バイオアッセイによって特徴付けた。結果を表２に示す。
【表２】
2009525288.tif 000003
ａ  ｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイによって定量化された質量に対する、免疫認識されたＥＧＦのパーセント。
ｂ  ６０００Ｄａに検出された主バンドに相当するパーセント。
ｃ  主要種に相当するパーセント。
ｄ  マイクロスフェアを得るのに使用されたＥＧＦ。
【００３８】
これらの結果は、マイクロスフェアを得るのに使用されたＥＧＦと同様な物理化学的及び生物学的特徴を、放出されたＥＧＦが有することの確認を可能にするものである。
【００３９】
プロテアーゼの作用に対するＥＧＦの安定性へのマイクロカプセル封入の影響
１ｍｇのＥＧＦを、３通りの異なった条件で独立的に調製した。（ｉ）４％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）１ｍｌに溶解した。（ｉｉ）ＰＬＧＡマイクロスフェア（２重量％）内に封入し、４％  ＮａＨＣＯ３  １ｍｌに懸濁した。（ｉｉｉ）空のＰＬＧＡマイクロスフェア５０ｍｇと混合し、４％  ＮａＨＣＯ３  １ｍｌに懸濁した。その後、２００μｇ／ｍｌトリプシンを含有する４％  ＮａＨＣＯ３  １００μｌを各調製物に添加し、穏やかに撹拌しながらそれらを３７℃で４時間インキュベートした。４％  ＮａＨＣＯ３  １．１ｍｌに溶解した１ｍｇのＥＧＦを対照として用いた。１０μｌのトリフルオロ酢酸を添加することによって反応を停止させた。マイクロスフェアを含有する試料を６０００ｇで１０分間遠心処理し、上清をペレットから分離した。マイクロカプセル封入されたか、又はマイクロスフェア上に吸着されたＥＧＦは、ジクロルメタン／酢酸での抽出によって重合体から分離した（Ｒｕｉｚ  Ｊ．Ｍ．ら（１９８９年）、「マイクロカプセル封入ペプチド：シリコーン油によるポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）共重合体５０／５０の相分離の研究（Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  （Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５０／５０  ｂｙ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｏｉｌ）」、Ｊ．Ｐｈａｍ．Ｓｃｉ．４９：６９−７７）。Ｈａｎら（Ｈａｎ  Ｋ．ら（１９９８年）、「ラット胃腸粘膜における組換型ヒト上皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）の部位特異的分解及び輸送（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ｒｈＥＧＦ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ）」、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１６８：１８９−１９７）によって記載された手順に従ったＲＰ−ＨＰＬＣによって、すべての試料を分析した。結果（図５）は、非封入ＥＧＦ及び空のマイクロスフェアと混合されたＥＧＦの両方が完全に分解されたことを示す。しかし、封入されたＥＧＦはタンパク質分解に対して保護されており、そのクロマトグラフィープロフィールは、対照のものと同様であった。
【００４０】
（実施例２）
遊離ＥＧＦと対比した封入ＥＧＦのｉｎ  ｖｉｖｏ効果（動物モデルでの効果）
制御された急性創傷の実験モデル
ここに記載された実験は、創傷縁部及び底部での注射による、浸潤用又は非経口的に使用するべき、ＥＧＦのマイクロスフェアを含有する新規製剤の、満足できる予後の急性創傷における治療効果を評価する目的で行った。
【００４１】
実験生体モデル：体重２２５〜２５０グラムの雄性ウィスター系ラット。動物は、ＣＩＧＢにおける動物施設の管理区域内において、１２×１２時間の一定照光スケジュール、換気サイクル、及び食物への自由な接近の下で飼育した。ラットは、個々にＴ３ボックス内で飼育し、床敷（ｂｅｄｄｉｎｇ）（事前に殺菌済）を４８時間ごとに交換した。
【００４２】
潰瘍の誘導：ケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって動物に麻酔をかけた。肩甲骨後部から仙骨までの領域を含むラットの背中を機械的及び化学的に脱毛した。この領域を、ポビドンヨード及びイソプロピルアルコールの溶液で無菌化した。直径９ｍｍのバイオトーム（ＡｃｕＤｒｅｍ社、米国フロリダ州所在）の補助を用いて全幅の円形病変を形成させるため、潰瘍の誘導用に選択された皮膚の領域を墨でマークした。
【００４３】
図１に示す通り、各動物に、左右対称且つ等距離な６つの創傷を誘導した。創傷を無菌食塩水で洗浄し、時間ゼロの創傷面積を後で計算するために、それらの内側境界をパーマネントインクで線描した。いかなる処置の適用前にも、毎日、７０％エタノール及び無菌食塩水ですべての動物の病変を衛生処置した。
【００４４】
実験群：
入力順／群相互対応表を用いて、動物につくられた潰瘍を以下の実験治療群にランダムに割り当てた。
Ｉ群−無処置。これは自発的進展のための対照である。
ＩＩ群−プラセボ（マイクロスフェアを懸濁するのに用いた媒体：０．３％カルボキシメチルセルロース、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．９％塩化ナトリウム、これは局所的に浸潤させる）。
ＩＩＩ群−この製剤用に設計された媒体１ｍｌに懸濁された、６７５μｇのＥＧＦを含有するマイクロスフェア（賦形剤を含有しない）の浸潤。浸潤は創傷縁部及び底部で行った。
ＩＶ群−この製剤用に設計された媒体１ｍｌに懸濁された、６７５μｇのＥＧＦを含有するマイクロスフェア（賦形剤を含有する）の浸潤。浸潤は創傷縁部及び底部で行った。
Ｖ群−０．９％食塩水中の遊離ＥＧＦ（７５ｍｇ／ｍｌ）。
【００４５】
各群は１０頭のラットから成った。したがって、１群あたり６０の創傷が検査された。マイクロスフェアなしで上記製剤で処置された動物では、針（２７１／２）を創傷の縁部及び底部に挿入して、処置を毎日行った。各処置の前に、腹腔内経路によって、ジアゼパムで動物を沈静化させた。媒体、又はＥＧＦを充填したマイクロスフェアを含有する製剤で処置された動物には、１回のみ浸潤を行った。
【００４６】
創傷閉鎖レベルの測定。組織学的処理：
以下の時間にわたる、創傷収縮の動態を計算するために、創傷を透明なシート上に透写した。時間０−開口創傷領域１００％及び創傷収縮０％を表す。時間１−創傷誘導の７２時間後。時間２−創傷誘導の５日後。時間３−創傷誘導の７日後。時間４−創傷誘導の９日後。これらの病変の自発的治癒の動態に関する以前の経験に従って、第９日をこの検査の終わりに設定し、この日に動物を屠殺した。創傷境界の画像をデジタル化した。創傷面積及び収縮のパーセントは、画像分析ソフトウェアであるＤＩＧＩＰＡＴを用いて計算した。各パラメータの統計的分析は、ｐ＜０．０５の有意レベルを想定し、ＳＰＳＳパッケージでノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定法を用いることによって行った。
【００４７】
動物は、過剰量のペントバルビタールナトリウム（２５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによって屠殺した。創傷は、皮幹筋から乾燥させ、後のパラフィン封入用に１０％中性ホルマリン中で固定した。ヘマトキシリン／エオシン染色、ワンギーソン染色、及びマッソントリクローム染色を用いた。各群について、創傷の１００％上皮化、及び重層上皮、及び分化上皮を有する動物の数を決定した。
【００４８】
創傷収縮の動態の値を表３に示す（ｍｍ単位の収縮値を、時間０における創傷サイズと対比した創傷サイズのパーセント変化として表している）。
【表３】
2009525288.tif 000004
（＊）これは、他の群と比較したｐ＜０．０５の統計的相違を意味する。マン−ホイットニーＵ検定。
【００４９】
予想外なことに、より遅い放出プロフィールを有する、ＥＧＦのマイクロスフェアを含有する製剤（同時封入される賦形剤なしで）が、創傷縁部の収縮に最も強力な作用を示した。これは、換言すれば、それが全体的治癒の加速に最も好ましい効果を示すことを意味する。収縮は、創傷を組織修復期に近づけるいくつかの統合された事象の収束を表す。
【００５０】
各実験群における、潰瘍の成熟且つ組織化した肉芽組織が占める面積のパーセントを表４に示す。この計算は、各試料でワンギーソン及びマッソントリクローム反応を一致して有する陽性顕微鏡視野の数を、時間４に収集された試料で定量化して行った。２人の病理学者が独立的に、盲検の形態で評価を行った。
【表４】
2009525288.tif 000005
【００５１】
予想外なことに、より遅い放出プロフィールを有する、ＥＧＦのマイクロスフェアベースの製剤（同時封入の賦形剤を含有しない）が、肉芽組織の確立及び成熟過程に最も強力な効果を示した。これは創傷収縮の過程に関する上述の記載と一致する。
【００５２】
創傷の上皮化過程に関しても、上記処置の効果を検査した。潰瘍の再上皮化、重層上皮の存在、及び総ケラチン層の存在を考慮して、上皮の微視的状況を評価した。微視的検査には、創傷の中央縦方向二分割を行い、その結果生じた切片を同じパラフィンブロックに包埋した。各実験群につき合計１２０の組織学的切片を検査した。これらは６０の創傷に相当する。結果を表５に示す。
【表５】
2009525288.tif 000006
＊  これは、他の群と比較したｐ＜０．０５の統計的相違を意味する。マン−ホイットニーＵ検定
【００５３】
驚いたことに、遅い放出プロフィールを有する、ＥＧＦのマイクロスフェアベースの製剤（同時封入される賦形剤なしで）で処置されたＩＩＩ群が、全再上皮化及び上皮成熟によって支持された、上皮応答の最も良い指標を示した。
【００５４】
慢性皮膚潰瘍の実験モデル
以下の実験は、糖尿病患者の病変をシミュレートする予後不良の慢性病変における、浸潤用に使用されるべき、ＥＧＦを含有するマイクロスフェアをベースにした新規製剤の治癒効果の評価を目的とした。
【００５５】
実験生体モデル：体重２２５〜２５０グラムの雄性ウィスター系ラット。動物は、ＣＩＧＢにおける動物施設の管理区域内において、１２×１２時間の一定照光スケジュール、換気サイクル、及び食物への自由な接近の下で飼育した。ラットは、個々にＴ３ボックス内で飼育し、床敷（事前に殺菌済）を４８時間ごとに交換した。長期進展の糖尿病患者に生じるものに類似した肉芽化環境を生成させるために、これらの動物を事前に０．０１％メチルグリオキサール溶液で２カ月間処置した。これは、他の有機障害（ｏｒｇａｎｉｃ  ｄａｍａｇｅ）のなかでもとりわけ、創傷の肉芽化及び組織修復の減速へと導くものである（Ｂｅｒｌａｎｇａ  Ｊ．、Ｃｉｂｒｉａｎ  Ｄ．ら（２００５年）、「メチルグリオキサール投与は、糖尿病様の微小血管変化を誘導し、皮膚創傷の治癒過程を妨げる（Ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉａｂｅｔｅｓ−ｌｉｋｅ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｒｂｓ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄｓ）」、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）、１０９（１）：８３−９５）。
【００５６】
潰瘍の誘導：ケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって動物に麻酔をかけた。肩甲骨後部から仙骨までの領域を含むラットの背中を機械的及び化学的に脱毛した。この領域を、ポビドンヨード及びイソプロピルアルコールの溶液で無菌化した。直径９ｍｍのバイオトーム（ＡｃｕＤｒｅｍ社、米国フロリダ州所在）の補助を用いて全幅の円形病変を誘導するため、潰瘍の誘導用に選択された皮膚の領域を墨でマークした。各動物に、左右対称且つ等距離な６つの創傷を誘導した。創傷を無菌食塩水で洗浄し、時間ゼロの創傷面積を後で計算するために、それらの内側境界をパーマネントインクで線描した。いかなる処置の適用前にも、毎日、７０％エタノール及び無菌食塩水ですべての動物の創傷を衛生処置した。
【００５７】
実験群：
入力順／群相互対応表を用いて、動物につくられた潰瘍を以下の実験治療群にランダムに割り当てた。
Ｉ群−無処置。これは自発的進展の対照である。
ＩＩ群−プラセボ（マイクロスフェアを懸濁するのに用いた媒体：０．３％カルボキシメチルセルロース、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，及び０．９％塩化ナトリウム、これは局所的に浸潤させる）。
ＩＩＩ群−この製剤用に設計された媒体１ｍｌに懸濁された、１ｍｇのＥＧＦを含有するマイクロスフェア（賦形剤を含有しない）の浸潤。浸潤は創傷縁部及び底部で行った。
ＩＶ群−この製剤用に設計された媒体１ｍｌに懸濁された、１ｍｇのＥＧＦを含有するマイクロスフェア（賦形剤を含有する）の浸潤。浸潤は創傷縁部及び底部で行った。
Ｖ群−０．９％食塩水中の遊離ＥＧＦ（７５ｍｇ／ｍｌ）。
【００５８】
各群は１０頭のラットから成った。したがって、１群あたり６０の創傷が検査された。マイクロスフェアなしで上記製剤で処置された動物では、毎日、処置を行った。各処置の前に、腹腔内経路によって、ジアゼパムで動物を沈静化させた。媒体、又はＥＧＦを充填したマイクロスフェアを含有する製剤で処置された動物には、１回のみ浸潤を行った。
【００５９】
創傷閉鎖レベルの測定。組織学処理。
以下の時間にわたる、創傷収縮の動態を計算するために、創傷を透明なシート上に透写した。時間０−開口創傷領域１００％及び創傷収縮０％を表す。時間１−創傷誘導の７２時間後。時間２−創傷誘導の５日後。時間３−創傷誘導の７日後。時間４−創傷誘導の９日後。時間５−創傷誘導の１４日後。これらの病変の自発的治癒の動態に関する以前の経験に従って、第１４日をこの検査の終わりに設定し、この日に動物を屠殺した。創傷境界の画像をデジタル化した。創傷面積及び収縮のパーセントは、画像分析ソフトウェアであるＤＩＧＩＰＡＴを用いて計算した。各パラメータの統計的分析は、ｐ＜０．０５の有意レベルを想定し、ＳＰＳＳパッケージでノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定法を用いることによって行った。
【００６０】
動物は、過剰量のペントバルビタールナトリウム（２５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによって屠殺した。創傷は、皮幹筋から乾燥させ、後のパラフィン封入用に１０％中性ホルマリン中で固定した。ヘマトキシリン／エオシン染色、ワンギーソン染色、及びマッソントリクローム染色を用いた。各群について、創傷の１００％上皮化、及び重層上皮、及び分化上皮を有する動物の数を決定した。
【００６１】
創傷収縮の動態の値を表６に示す。
【表６】
2009525288.tif 000007
（＊）これは、他の群と比較したｐ＜０．０５の統計的相違を意味する。（＊＊）これは、他の群と比較したｐ＜０．０１の統計的相違を意味する。マン−ホイットニーＵ検定。
【００６２】
ｍｍ単位の収縮値を、時間０における創傷サイズに対比した創傷サイズのパーセント変化として表している。
【００６３】
予想外なことに、より遅い放出プロフィールを有する、ＦＣＥのマイクロスフェアを含有する製剤（同時封入される賦形剤なしで）が、創傷縁部の収縮に最も強力な効果を示した。これは、換言すれば、それが全体的治癒の加速に最も好ましい効果を示すことを意味する。収縮は、創傷から組織修復期までのおおよそを表すいくつかの統合された事象の収束を表す。収縮機構が部分的又は全体的な形態で病理学的に撤廃されている、糖尿病性創傷の生化学的微環境を、これらの創傷がシミュレートしていることに注目するべきである。
【００６４】
各実験群における、慢性潰瘍の成熟且つ組織化した肉芽組織が占める面積のパーセントを表７に示す。この計算は、各試料でワンギーソン及びマッソントリクローム反応を一致して有する陽性顕微鏡視野の数を、時間５に収集された試料で定量化して行った。数人の病理学者及び１人のコンサルタントが独立的且つ盲検の形態で評価を行った。
【表７】
2009525288.tif 000008
（＊＊）これは、他の群と比較したｐ＜０．０１の統計的相違を意味する。マン−ホイットニーＵ検定
【００６５】
予想外なことに、より遅い放出プロフィールを有する、ＥＧＦのマイクロスフェアベースの製剤（同時封入される賦形剤なしで）が、肉芽組織の確立及び成熟過程に最も強力な効果を示した。これは創傷収縮の過程に関する上述の記載と一致する。
【００６６】
創傷の上皮化過程に関しても、上記処置の効果を検査した。慢性潰瘍の再上皮化、重層上皮の存在、及び総ラチン層の存在を考慮して、上皮の微視的状況を評価した。微視的検査には、創傷の中央縦方向二分割を行い、その結果生じた切片を同じパラフィンブロックに包埋した。各実験群につき合計１２０の組織学的切片を検査した。これらは６０の創傷に相当する。細菌汚染によって除外された創傷はなかった。結果を表８に示す。
【表８】
2009525288.tif 000009
【００６７】
驚いたことに、遅いプロフィールを有する、ＥＧＦのマイクロスフェアベースの製剤（賦形剤なしで）で処置されたＩＩＩ群が、全再上皮化及び上皮成熟によって支持された、上皮応答の最も良い指標を示した。
【００６８】
（実施例３）
遊離ＥＧＦと対比した封入ＥＧＦの（皮膚慢性虚血性潰瘍創傷を有する患者における）ｉｎ  ｖｉｖｏ効果。
糖尿病性足部潰瘍及び大切断術の危険性を有する患者において、遅いプロフィール（賦形剤なしで）のＥＧＦマイクロスフェアベースの製剤を投与した。右足に面積３０．５ｃｍ２の慢性潰瘍を有し、罹患した身体部分の虚血の証拠がある５８歳の糖尿病女性患者を、本発明の製剤対象で処置した。創傷清拭の後に、より遅い放出プロフィールを有する、ＥＧＦのマイクロスフェアを含有する製剤を、創傷縁部及び底部の浸潤によって、１５日間あたり１回、１カ月間投与した。治療開始から第１週経過後、有用な肉芽組織の迅速な形成が観測され、第３週までに罹患した面積の１００％を被覆するに至った。患者は、創傷の完全な閉鎖と切断を適用する必要性の回避と伴った満足できる進展を示した。上記医薬組成物は十分に耐えられるものであり、有害作用も検出されなかった。
【００６９】
この製剤の病変周囲及び病変内投与は、肉芽組織の形成及び創傷閉鎖に好都合であった。それは予想外に、潰瘍治癒過程が、以前の治療に対比して、より短い時間間隔で起こるのを促進し、切断の必要性が回避された。この様式の治療は、注射がかなり減少することによって、より高い許容度を有することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】動物モデル体内に誘導された潰瘍の位置を表す模式図である。
【図２】複エマルション溶媒留去法による、ＥＧＦを充填したマイクロスフェアを得る工程の線図である。
【図３】ＥＧＦを充填したマイクロスフェアの走査電子顕微鏡像を示す図である。
【図４】ＰＬＧＡマイクロスフェアからのＥＧＦの放出プロフィールを示す図である。Ｘ軸は日を単位にした時間を示し、Ｙ軸は放出されたＥＧＦの量を表し、実験で用いられたマイクロスフェアに含有されていた総ＥＧＦのパーセントとして表されている。（◆）高速放出製剤及び（●）遅延放出製剤。
【図５】様々な条件下でトリプシン消化されたＥＧＦの逆相高速液体クロマトグラフィーを示す図である。Ａ：対照、Ｂ：遊離ＥＧＦ、Ｃ：ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入されたＥＧＦ、Ｄ：空のＰＬＧＡマイクロスフェアと混合されたＥＧＦ。
【図１】
2009525288.tif 000010
【図３】
2009525288.tif 000011
【図４】
2009525288.tif 000012
【図５】
2009525288.tif 000013
【図２】
2009525288.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月3日(2007.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病患者の下肢の皮膚慢性虚血性創傷を治療し、前記身体部分の切断を防止するための、非経口経路で投与される上皮成長因子のマイクロスフェアを含有する医薬組成物の使用。
【請求項２】
上皮成長因子が重合体マイクロスフェア又はナノスフェアの内部に封入されている、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３】
マイクロスフェアがグリコール酸又は乳酸のホモポリマー、及び両方に由来する共重合体である（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート−ポリヒドロキシバレレート共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリオルトエステル、及びポリ無水物から成る群から選択された重合体物質でできている、請求項２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４】
前記マイクロスフェアが１μｍから１００μｍの範囲の直径を有する、請求項２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５】
上皮成長因子がマイクロスフェアの総質量の１．６〜２．４％を構成する、請求項２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６】
第１日目の後における上皮成長因子の放出速度が５から１０μｇ／日である、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項７】
放出された上皮成長因子が、その物理化学的性質及び生物学的特性を１４日間保存する、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
病変の縁部及び底部を含む組織での局所浸潤によって前記組成物を投与する、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
マイクロスフェアがＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ型の温度感受性ヒドロゲル、又はキトサン若しくはデキストランの誘導体中に懸濁されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【国際調査報告】
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