(57)【要約】  本発明は、血小板ＧＰＩＩｂ／ｌｌｌａ分子に存在するヒト血小板抗原ＨＰＡ−Ｉａのエピトープを特に模倣し、且つＨＰＡ−Ｉａ特異抗体（抗ＨＰＡ−１ａ）の結合を中和可能なペプチドアプタマーに関する。このペプチドアプタマーは、ヒト血清中のＨＰＡ−Ｉａ特異抗体を検出及び同定する方法、抗体のスクリーニング及び同定のための診断キット、イムノアッセイ及び薬学的組成物に有利に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、
（ｉ）バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンから成る群から選択される４つの脂肪族アミノ酸、
（ｉｉ）アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される２つの酸性アミノ酸、
（ｉｉｉ）１つのプロリン、
（ｉｖ）アルギニン、リシン及びヒスチジンから成る群から選択される１つの塩基性アミノ酸、
（ｖ）アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される２つの酸性アミノ酸、
（ｖｉ）トレオニン及びセリンから成る群から選択される１つのアルコールアミノ酸、及び、
（ｖｉｉ）トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから成る群から選択される１つの芳香族アミノ酸、
の配列を有する、少なくとも1つのドデカペプチド、
（Ｂ）少なくとも1つのポリペプチド、及び必要に応じて、
（Ｃ）１つ又は複数の検出可能なマーカー、
を含む、ペプチドアプタマー。
【請求項２】
前記ドデカペプチドの配列が配列番号１に従う、請求項１に記載のペプチドアプタマー。
【請求項３】
前記ポリペプチドがチオレドキシン（Ｔｒｘ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、コイルドコイルポリペプチド、ジスルフィド架橋を形成可能なシステイン含有ポリペプチド、又は１つ又は複数のそれらの断片から成る群から選択される、請求項１又は２に記載のペプチドアプタマー。
【請求項４】
前記検出可能なマーカーが蛍光マーカー、放射性マーカー、Ｈｉｓタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｆｌａｇタグ、ビオチン、Ｈａタグ、Ｍｙｃタグ及びＸＰｒｅｓｓタグから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドアプタマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドアプタマーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６】
ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法であって、
（ｉ）ヒト血小板抗原特異抗体の検査を受けるヒト血清を準備する工程、
（ｉｉ）前記ヒト血清を請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドアプタマーと接触させる工程、及び、
（ｉｉｉ）前記ペプチドアプタマーのヒト血小板抗原特異抗体との直接又は間接相互作用を検出する工程、
を含む、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法。
【請求項７】
前記検出する工程（ｉｉｉ）がイムノブロット、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、プロテインアレイ技術、分光法、質量分析、クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、蛍光消光（fluorescence extinction）及び蛍光エネルギー移動から成る群から選択される１つ又は複数の検出方法を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検出又は同定される前記ヒト血小板抗原特異抗体が抗ＨＰＡ−１ａである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
免疫性血小板減少症の症状を患う患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び／又は同定する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫性血小板減少症が特発性（ideopathic）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、新生児／胎児同種免疫性血小板減少症（ＮＡＩＴ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）又は血小板不応状態から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドアプタマーを含む、ヒト血小板抗原特異抗体のスクリーニング及び／又は同定のための診断キット。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドアプタマーを含む、ヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出するイムノアッセイ。
【請求項１３】
治療に有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドアプタマー並びに必要に応じて、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、補助剤、希釈剤及び溶剤、又はそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される１つ又は複数の追加成分を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ分子に存在するヒト血小板抗原ＨＰＡ−１ａエピトープを特に模倣し、且つＨＰＡ−１ａ特異抗体（抗ＨＰＡ−１ａ）の結合を中和可能なペプチドアプタマーに関する。このペプチドアプタマーは、ヒト血清中のＨＰＡ−１ａ特異抗体を検出及び同定する方法、抗体のスクリーニング及び同定のための診断キット、イムノアッセイ及び薬学的組成物に有利に使用される。
【背景技術】
【０００２】
血小板はヒト血液の主成分の１つであり、血液凝固系の細胞成分である。血液は基本的に、血漿、赤血球（red blood cell／erythrocyte）、白血球（white blood cell／leukocyte）、及び血小板（platelet／thrombocyte）から構成されている。血小板は骨髄において巨核球により産生される。血小板は実際は真の細胞ではなく、顆粒を含む膜及び細胞質の断片であることが一般に認識されている。より詳細には、血小板は巨核球由来の外膜及び細胞質から成り、これらは顆粒、濃密体、暗調小管系、及びミトコンドリアを含む。
【０００３】
血小板糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＸ、ＧＰＩａ／ＩＩａ又はＧＰＩＶの他に、血小板はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより連結される少なくとも５つの糖タンパク質を含む。これらの一つに、ＣＤ１０９に分類される１７０ｋＤａの糖タンパク質がある。ＣＤ１０９は中でも、Ｇｏｖ同種抗原を保有することを特徴とする。
【０００４】
免疫性血小板減少症は、血小板が抗体により破壊される臨床状態である。特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩａ／ＩＸ、ＧＰＩａ／ＩＩａ又はＧＰＩＶ血小板糖タンパク質を標的とする、ＩｇＧ抗血小板自己抗体により引き起こされる自己免疫性血小板破壊を特徴とする、ありふれた疾患である。新生児／胎児同種免疫性血小板減少症（ＮＡＩＴ）は、胎児血小板を破壊し、重症血小板減少症を誘発する、母系ヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）同種抗体（抗ＨＰＡ）により引き起こされる。ＮＡＩＴは妊娠例の１／１０００の推定発症率を有し、ｉｎ  ｕｔｅｒｏで脳出血又は脳室拡大をもたらす。同種抗体のスクリーニング及び同定は、この疾病の予防及び治療に必須の工程である。輸血後紫斑病（ＰＴＰ）は、抗ＨＰＡ同種抗体に起因する、血小板の別の免疫介在性破壊である。血小板不応状態は、レシピエントが産生した同種抗体により輸血血小板が破壊される臨床状態である。これらの抗体の特性決定は、効果的な血小板輸血の提供に必要とされる工程である。
【０００５】
イムノブロット法、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板免疫蛍光試験、又はモノクローナル抗体固定化血小板検定（ＭＡＩＰＡ）等の血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）において、これまでの血小板を対象とする自己抗体又は同種抗体の検出方法は全て、新鮮血小板を使用する。これらの測定法は全て、事前にＨＰＡ系で分類された血小板の採取を要する。さらに、当該技術分野で既知のこれらの測定法は、上述したように、新鮮血小板を使用する。しかしながら、４℃又は−２０℃での保存の間、血小板の糖タンパク質は脱離する過程をたどるため、血小板製剤は幾つかの血小板抗体の検出に不適切となる。一週間を超えるような長い期間にわたって正常なレベルの血小板糖タンパク質発現を保つ試みは全て成功（succesful）しなかった。これらの要因のために、毎週新たなバッチの血小板をドナーから採取する必要がある。したがって、血小板免疫学の分野において、正常なレベルの血小板糖タンパク質発現を、（例えば一ヶ月を超えるような）長期間保つ方法が常に必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の根底にある技術上の問題は、ヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体の検出及び／又は同定を可能にする新規のシステムを提供することにある。本発明は特に、（ｉ）血小板糖タンパク質に存在する血小板同種抗原のエピトープ発現、すなわち正常なレベル、また好ましくは正常なパターンでの発現を、保存下で安定に維持するアプタマー、（ｉｉ）かかる安定なアプタマーを産生するプロセス、及び（ｉｉｉ）かかる安定なアプタマーの分析的な、殊に免疫学的な用途を提供するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の技術上の問題に対する解決策は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施形態を提供することにより達成される。
【０００８】
特に、（Ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、
（ｉ）バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンから成る群から選択される４つの脂肪族アミノ酸、
（ｉｉ）アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される２つの酸性アミノ酸、
（ｉｉｉ）１つのプロリン、
（ｉｖ）アルギニン、リシン及びヒスチジンから成る群から選択される１つの塩基性アミノ酸、
（ｖ）アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される２つの酸性アミノ酸、
（ｖｉ）トレオニン及びセリンから成る群から選択される１つのアルコールアミノ酸、及び、
（ｖｉｉ）トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから成る群から選択される１つの芳香族アミノ酸、
の配列を有する、少なくとも1つのドデカペプチド、
（Ｂ）少なくとも1つのポリペプチド、及び必要に応じて、
（Ｃ）１つ又は複数の検出可能なマーカー、
を含む、ペプチドアプタマーが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
「ペプチドアプタマー」という用語は本明細書中で用いられる場合、ドデカペプチドがハプテンとして機能する、上記の任意の化合物も包含する。さらに、本発明によるペプチドアプタマーは、血小板糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに存在するＨＰＡ−１ａエピトープを模倣することができる。
【００１０】
本発明によると、「ドデカペプチド」という用語は、上記の又は図１ａ及び図１ｂに記載のアミノ酸配列を有する任意のドデカペプチドを包含する。特に、ドデカペプチドは任意の結合様式、例えば共有結合、水素架橋、ファンデルワールス結合又は静電結合を介して、１つ又は複数のポリペプチドに結合し得る。本発明の好適な実施形態では、ドデカペプチドはポリペプチドに共有結合する。
【００１１】
本発明の一実施形態では、上記のペプチドアプタマーはＶＶＡＧＤＤＰＲＥＤＴＷ（配列番号１）の配列を有するドデカペプチドを含む。
【００１２】
さらに、本明細書中で、「ポリペプチド」という用語は配列の長さ又は種類に関して限定されず、骨格タンパク質又は融合タンパク質の配列等の、任意の適切なアミノ酸配列を含む。本発明によると、当該ポリペプチド（複数可）は、本発明においてそれらの断片の形でも使用され得るし、検出に又は任意の精製工程で使用される標識等の、それらの調製に由来する任意の残基を含有し得る。本発明によるポリペプチド（複数可）は、グリコシル化（glycolysation）、核酸の付着又は任意の他の化学修飾等の、生物環境に接触することに由来する変化を有するポリペプチド（複数可）も包含する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、上記のペプチドアプタマーはチオレドキシン（Ｔｒｘ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、コイルドコイルポリペプチド及びジスルフィド架橋を形成可能なシステイン含有ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明によるポリペプチド（複数可）は、不活性担体、ドデカペプチドによる抗体への提示に有用な骨格タンパク質、ペプチドアプタマーの精製に有用な精製助剤又はペプチドアプタマーの検出において有用な検出手段として機能し得る。
【００１５】
本発明によると、上記のドデカペプチド（複数可）は、ポリペプチド（複数可）の任意の位置に結合し得る。例えば、ドデカペプチド（複数可）はポリペプチド（複数可）のＮ末端又はＣ末端に結合し得、又はポリペプチド内に組み込まれて、当該ドデカペプチドのＮ末端及びＣ末端に隣接する２つの断片を生じ得る。本発明によるペプチドアプタマーが２つ以上のドデカペプチドを含有することがさらに考えられるが、これらは当該ポリペプチド（複数可）の同じ位置若しくは異なる位置又はその断片に結合し得る。本発明のさらなる実施形態では、ペプチドアプタマーは、直接又はペプチドスペーサーを介して互いに結合する、２つ以上のドデカペプチドを含有する。
【００１６】
「検出可能なマーカー」という用語は、本明細書で用いられる場合、生化学的検出マーカー等の特別な種類の検出マーカーに限られず、検出に好適な当該技術分野で既知の任意の残基を包含する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、上記のペプチドアプタマーは、蛍光マーカー、放射性マーカー、Ｈｉｓタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｆｌａｇタグ、ビオチン、Ｈａタグ、Ｍｙｃタグ及びＸＰｒｅｓｓタグから成る群から選択される検出可能なマーカーを含む。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、「チオレドキシン−ヒト−血小板−抗原１ａ」（Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａ）は、本発明の好適な実施形態に関し、ここで上記のペプチドアプタマーは、検出マーカーとしてＨｉｓタグを有するポリペプチドチオレドキシン（Ｔｒｘ）の活性部位中に融合する、配列番号１に記載のドデカペプチドを含む（図３ａ及び図３ｂ）。当該Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａは、配列番号２に記載のタンパク質配列を有し（図３ｂ）、配列番号３の核酸配列によりコードされる（図３ａ）。
【００１９】
本発明のペプチドアプタマーは、組み換えＤＮＡ技術のような当該技術分野で既知の任意の方法により調製できる。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法であって、
（ｉ）ヒト血小板抗原特異抗体の検査を受けるヒト血清を準備する工程、
（ｉｉ）ヒト血清を上記のペプチドアプタマーと接触させる工程、及び、
（ｉｉｉ）ペプチドアプタマーのヒト血小板抗原特異抗体との直接又は間接相互作用を検出する工程、
を含む、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法に関する。
【００２１】
本明細書中で、「ヒト血小板抗原」という用語は、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ糖タンパク質に存在するＨＰＡ−１ａエピトープだけでなく、血清又は任意の体液中で可溶型のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに存在する可溶性ＨＰＡ−１ａエピトープも包含する。
【００２２】
本明細書中で、「ヒト血小板抗原特異抗体」という用語は、任意のＨＰＡ−１ａ特異抗体（抗ＨＰＡ−１ａ）を包含し、他のタンパク質又は糖タンパク質と交差反応性のある抗体も包含する。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「ヒト血清」という用語は、直接患者から又は保存血液から採取した任意のヒト血液の血清、血漿又は羊水を包含する。
【００２４】
本発明によると、「直接又は間接相互作用」という表現は、ペプチドアプタマーとヒト血小板抗原特異抗体との間の任意の相互作用を包含し、他の分子が関与する任意の相互作用をさらに包含する。このような他の分子は、例えばタンパク質、タンパク質複合体、核酸、糖及び／又は脂質であり得る。
【００２５】
上記の方法の検出する工程（ｉｉｉ）はイムノブロット、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、プロテインアレイ技術、分光法、質量分析、クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、蛍光消光及び／又は蛍光エネルギー移動から成る群から選択される１つ又は複数の検出方法を含む。
【００２６】
本発明の好適な実施形態では、上記の方法で検出又は同定される抗体は、抗ＨＰＡ−１ａである。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、免疫性血小板減少症を患う患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び／又は同定するために、上記の方法は用いられ得る。
【００２８】
本発明の好適な実施形態では、上記の方法は患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び／又は同定するために使用され、ここで患者は、特発性（ideopathic）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、新生児／胎児同種免疫性血小板減少症（ＮＡＩＴ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）又は血小板不応状態から成る群から選択される免疫性血小板減少症を患っている。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明によるペプチドアプタマーを含む、ヒト血小板抗原特異抗体のスクリーニング及び同定のための診断キットに関する。この診断キットは、スクリーニング又は同定手順を実施するために当該技術分野で既知の任意のさらなる成分／化合物を含み得る。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、本発明によるペプチドアプタマーを含む、ヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出するイムノアッセイに関する。このようなイムノアッセイの例としては、イムノブロット法、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び／又は放射免疫測定法が挙げられる。さらなるアッセイは、表面プラズモン共鳴、蛍光消光（fluorescence evanescence）及びフローサイトメトリーに関する。
【００３１】
本発明によるさらなる実施形態は、治療に有効な量の本発明によるペプチドアプタマー及び必要に応じて、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、補助剤、希釈剤及び溶剤、又はそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される１つ又は複数の追加成分を含む、薬学的組成物に関する。
【００３２】
さらに、薬学的組成物は、それを必要とする患者に対して５〜５０ｍｇの適切な用量で、非経口的、経口的、皮膚に若しくは舌下にといった任意の適切な手段を介して投与するか、又はリンパ器官に注射することができる。
【００３３】
本発明の薬学的組成物は、特発性（ideopathic）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、新生児／胎児同種免疫性血小板減少症（ＮＡＩＴ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）又は血小板不応状態等の免疫性血小板減少症疾患の治療及び／又は予防に使用することができる。このアプタマーを、母体の血漿中の抗ＨＰＡ−１ａ抗体を中和するために用いること、胎児又は羊水中に注射することが可能である。さらに、アフェレーシス手順（選択的血漿吸着法）において、血漿をインキュベートした場合に抗体を除去するためのビーズ又はポリマーのような支持体に、このアプタマーをグラフトすることが可能である。
【実施例】
【００３４】
実施例１
ＦｌｉＴｒｘ（商標）ペプチドライブラリ及びモノクローナル抗体
Lu et al.（Lu Z, Murray KS, Van Cleave V, LaVallie ER, Stahl ML, McCoy JM.「フラジェリンとの機能融合としての大腸菌細胞表面上のチオレドキシンランダムペプチドライブラリの発現：タンパク質−タンパク質相互作用の探査のために設計されたシステム（Expression of thioredoxin random peptide libraries on the Escherichia coli cell surface as functional fusions to flagellin: a system designed for exploring protein-protein interactions）」Biotechnology (N Y). 1995 Apr; 13(4): 366-72）により記載されたシステムに基づく、ＦｌｉＴｒｘ（商標）ランダムペプチドライブラリは、Invitrogen（San Diego, CA）より入手した。表現型ＨＰＡ−１ａに特異的なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａタンパク質に対するｍＡｂ  Ｃａｍｔｒａｎは、Cambridge（Griffin H. M., Ouwehand W. H.,「Ｖ遺伝子ファージディスプレイライブラリ由来の血小板糖タンパク質ＩＩＩａのロイシン３３に特異的なヒトモノクローナル抗体（ＨＰＡ−１ａ）（A human monoclonal antibody specific for the Leucine 33 (HPA-1a) form of platelet glycoprotein IIIa from V gene phage display library）」Blood 1995, 86, 12: 4430-4436）より入手した。
【００３５】
増殖及びペプチドライブラリの誘導
細胞培養及び一般的なパンニング法を製造業者のプロトコルに記載の通り実施する。発現を駆動するＰＬバクテリオファージプロモータを含有するｐＦｌｉＴｒｘ（商標）を、ｃｌリプレッサの発現がｔｒｐプロモータの支配下にある大腸菌（ＧＩ８２６）中で伝播する。プラスミドを含む大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＩＭＣ培地（１×Ｍ９塩（４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ）、０．２％カザミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で２５℃で一晩、飽和状態になるまで増殖する。１００μｇ／ｍｌのトリプトファンにより、ペプチド挿入を含むチオレドキシン−フラジェリン融合タンパク質の発現を２５℃で６時間誘導する。次に、１０ｍｌの誘導大腸菌培養物に０．１ｇの脱脂粉乳、３００μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ及び５００μｌの２０％α−メチルマンノシドの混合物を添加する。得られた溶液は、以下のスクリーニングのためのペプチドライブラリとして使用される。
【００３６】
ランダムペプチドディスプレイライブラリのパンニング
６０ｍｍ組織培養プレート（Nunc）をペプチドライブラリスクリーニングに使用する。１ｍｌの滅菌水で希釈した抗体２０μｇを用いて、２０〜２５℃で１時間、プレートをプレコートする。液体を除去した後、１０ｍｌの滅菌水でプレートを洗浄し、次に１０ｍｌのブロッキング溶液（ＩＭＣ培地中、１％脱脂粉乳、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％α−メチルマンノシド及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）を補充し、１時間穏やかに攪拌する。６時間のペプチドライブラリ誘導の終了の直前に、ブロッキング溶液をデカントし、得られた溶液の１０ｍｌアリコートをプレートに添加する。プレートを水平振盪機で７５ｒｐｍで１分間穏やかに攪拌し、２０〜２５℃で１時間インキュベートする。細菌培養物をデカントし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％α−メチルマンノシドを含有するＩＭＣ培地１０ｍｌで、５分間穏やかに攪拌することでプレートを洗浄する。さらに４回洗浄した後、１ｍｌのＩＭＣで３０秒間ボルテックスすることで、結合細菌を分離する。残存する分離細菌をプレートから回収し、次回のバイオパンニングのために増殖する。続く４回のバイオパンニングで同様の手順を実施する。５回のバイオパンニング後、細菌のコロニーをＲＭＧ（１×Ｍ９塩、２％カザミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１．５％アガー）プレートから無作為に取り出し、３０℃で一晩増殖する。
【００３７】
ウエスタンブロット
基本的には製造業者のプロトコルに従って、ウエスタンブロットにより陽性クローンの同定を行う。簡潔に述べると、ＲＭＧプレートの４０のクローンを２ｍｌのＲＭ培地（１×Ｍ９塩、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に移し、３０℃で飽和状態になるまで振盪しながら増殖する。一晩培養物からの４０μｌの試料を、細胞密度がＯＤ６００、０．７５になるまで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１００μｇ／ｍｌのトリプトファンを含有するＩＭＣ２ｍｌ中に３７℃で接種した。誘導細胞培養物の１．５ｍｌアリコートを採取し、１００００ｇで１分間遠心分離した。ペレットをＳＤＳポリアクリルアミドゲルローディングバッファーに再懸濁し、５分間煮沸し、８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。分離したタンパク質を、液体電気泳動転写セル（Bio-Rad）のニトロセルロースメンブレン（ＰＲＯＴＲＡＮ（登録商標）ＢＡ７９、Schleicher & Schuell）にブロットする。次にメンブレンをＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）５％粉乳を用いて、４℃で一晩ブロッキングした後、ＴＢＳ１％粉乳、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１：１００に希釈したｃａｍｔｒａｎ抗体を用いて、２０〜２５℃で２時間インキュベートする。ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、１：９２０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Sigma、Ａ０１７０）を用いて、２０〜２５℃で４０分間、メンブレンをインキュベートする。ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でさらに３回洗浄した後、Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳウエスタンブロット基質（Roche）により結合複合体を検出する。次に、ＨＰＡ−１ｂ表現型に特異的なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａタンパク質に反応するヒト血清を用いて、ウエスタンブロットを行うことにより陽性クローンを再分析する。
【００３８】
ＤＮＡシークエンシング
同定したクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標)Ｐｌｕｓ  ＳＶミニプレップＤＮＡ精製システム（Promega）を使用して単離する。ＦｌｉＴｒｘ（商標）フォワードシークエンシングプライマー（５’−ＡＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣ−３’）を使用して、ヌクレオチド配列をＭＷＧにより決定する。
【００３９】
タンパク質Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａのクローニング、発現及び精製
【００４０】
発現プラスミドのクローニング及び生成
事前に選択したｐＦｌｉｔｒｘプラスミドを用いて、チオレドキシンペプチドをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅する。ＰＣＲ条件は次の通りである：９５℃で１分、続いて９５℃で４５秒、３６℃で３０秒、７２℃で４５秒の１２サイクル、次に９５℃で４５秒、４５℃で３０秒、７２℃で４５秒の２０サイクル、そして反応を完全にするために７２℃で３分間。３’末端に、プライマー配列５’−ＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＴＡＧＣＧＴＣ−３’はＳａｌＩ部位を誘導し、５’末端に、プライマー配列５’−ＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡ−３’はＮｄｅＩ部位を誘導する。ＰＣＲで生成したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ（登録商標)−ＴイージーベクターシステムＩ（Promega）にサブクローニングする。次に、プラスミド構築物を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩにより増幅及び消化する。消化されたＤＮＡ断片を、ＳａｌｔＩ部位の下流の停止コドンの前の６つのＨｉｓコドンをコードする、アンピシリン耐性ベクターｐＴ７−７（Ｔ７ポリメラーゼ発現系に基づくベクター）のＮｄｅＩ部位及びＳａｌＩ部位にクローニングする。プラスミドを大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを単離する。耐性コロニーを増殖することでプラスミドの大規模な産生と精製が可能になる。プラスミドの適切な構築をＤＮＡシークエンシングにより確認する。
Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａ（ＪＴ−ＰＬＰ０１）の過剰発現及び精製
プラスミドを大腸菌株Ｃ４１（ＤＥ３）に形質転換する（Miroux B, Walker JE.「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生：幾つかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする突然変異宿主（Overproduction of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels）」J Mol Biol. 1996 Jul 19; 260(3): 289-98）。新たに形質転換したコロニーを２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４００ｍｌの２ＹＴ培地（１６％バクトトリプトン、１０％バクト酵母抽出物、８５．５ｍＭ  ＮａＣｌ）に接種し、０．７ｍＭ  イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドでの誘導前に、ＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで３７℃で増殖する。３７℃での一晩培養後、細胞を遠心分離により採取する。ペレットを再懸濁し、１０ｍＬの溶菌バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％グリセロール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１／２錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Roche）及び２５０単位／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Merck））中で、４℃で３０分間インキュベートする。画分（５ｍｌ）を３０秒間の超音波処理により破砕する。上清の４回の遠心分離（９０００ｇで３０分間）後、リゾチーム及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを含まない溶菌バッファー中で予め平衡化した７ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）にその可溶性画分をアプライする。混合物を４℃で１時間、浴中でインキュベートする。リゾチーム及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを含まない溶菌バッファー、次いで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％グリセロール、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び２０ｍＭイミダゾールを含む溶菌バッファーでカラムを洗浄し、１００ｍＭイミダゾールを含有する同じバッファーでＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａを溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａを含有すると判断された画分をプールする。試料のバッファーを交換し、５ｋＤａカットオフのＶｉｖａｓｐｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒメンブレン（Vivascience）及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、遠心分離により試料を濃縮する。１ｍＬ  Ｑ−セファロースカラム（Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５、Amersham Pharmacia Biotech）に試料をアプライする。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌでカラムを洗浄し、１０ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配でＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａを溶出する。Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａに富む画分をプールし、１〜１５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＰＢＳ又は滅菌水中、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒで平衡化し、使用するまで−２０℃で保管する。タンパク質濃度をブラッドフォード法（Kruger NJ.「タンパク質定量化のためのブラッドフォード法（The Bradford method for protein quantitation）」Methods Mol. Biol. 1994; 32: 9-15）により求める。
【００４１】
精製Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａの分析
エレクトロスプレー装置ＡＰＩ １６５（Applied Biosystems）を使用して質量スペクトルを得る。ペプチドマスフィンガープリンティング及びＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ分析（ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＴＭ  ＰＲＯ、Applied Biosystems）により同定する。
【００４２】
ヒト血清からの全ＩｇＧの精製
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で予め平衡化した２５０μｌｍｌ  プロテインＡセファロースビーズカラム（Ｐ３３９１、Sigma-Aldrich）に、１０％の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で平衡化したヒト血清をアプライする。カラムを１０容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び１０容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄する。全ＩｇＧを１００ｍＭグリシン（ｐＨ３）で溶出する。溶出画分を１０％の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和する。ＩｇＧを含有する画分を濃縮し、５ｋＤａカットオフのＶｉｖａｓｐｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒメンブレン及びＰＢＳでバッファーを交換する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を分析し、ＩｇＧ濃度をブラッドフォード法（Kruger NJ.「タンパク質定量化のためのブラッドフォード法（The Bradford method for protein quantitation）」Methods Mol. Biol. 1994; 32: 9-15）により求める。
【００４３】
実施例２
免疫共沈降
１μｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質を、バッファーＡ（ＰＢＳ、０．５Ｍトレハロース）又は０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮＰ４０、若しくは０．０５％Ｔｒｉｔｏｎを含むバッファーＡ中、ヒト血清からのＩｇＧ抽出物３０μｇで２０〜２５℃で２時間インキュベートする。１０％の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを混合物に添加し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で予め平衡化した２５μｌのプロテインＡセファロースビーズを用いて４℃で４５分インキュベートする。次に、ビーズを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で４℃で１０分３回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。プロテインＡ−セファロース−ＩｇＧ−Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａ複合体の沈殿（fall）を作成するために、混合物を１００００ｇで２分間遠心分離する。ＳＤＳサンプルバッファー中で煮沸することによりタンパク質を溶出し、溶出物を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で溶解し、液体電気泳動転写セルのニトロセルロースメンブレン（ＰＲＯＴＲＡＮ（登録商標)ＢＡ７９、Schleicher & Schuell）上にブロットする。次に、ＴＢＳ５％粉乳でメンブレンを４℃で一晩ブロッキングした後、ＴＢＳ１％粉乳、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１：２００に希釈した抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓプローブ、Santa Cruz Biotechnology）を用いて、２０〜２５℃で１時間１０分インキュベートする。ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、１：３０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Dakocytomation）を用いて、メンブレンを２０〜２５℃で５０分間インキュベートする。ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でさらに３回洗浄した後、Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳウエスタンブロット基質により結合複合体を検出する。
【００４４】
実施例３
イムノキャプチャー
Rachel et al.により発表された技法（Med Lab Sci: 1985, 42; 194-199）によると、イムノキャプチャーは、血小板に対するＩｇＧ抗体を検出する古典的な技法である。
【００４５】
本明細書中で、Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａと血小板ＨＰＡ−１ａに対する抗体を含有するヒト血清との相互作用は、イムノキャプチャーにより試験される。血小板アッセイに対するＩｇＧ抗体を検出するための固相システム（Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｐ（登録商標)、Immucor）が使用される。血小板のプールをＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質と置き換える。炭酸バッファー（脱イオン水中、１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）中、１ウエル当たり５０ｎｇ又は１００ｎｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａで、円錐形のウエルを有するマイクロタイトレーションプレートを４℃で一晩コートする。ＰＢＳで洗浄した後、匿名のドナーの血清５０μｌをウエルに添加し、３７℃で４５分間インキュベートする。６回の洗浄後、５０μｌのＣａｐｔｕｒｅ−Ｐ指示赤血球（抗ヒトＩｇＧ抗体を保有する赤血球）。
【００４６】
実施例４
イムノアッセイ
ヒト血清中のＨＰＡ−１ａ特異抗体を、炭酸バッファー中１ウエル当たり１００ｎｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａで、４℃で一晩コートしたマイクロタイトレーションプレート（Nunc）を使用して、ＥＬＩＳＡ試験により決定する。プレートを２５０μＬのＰＢＳで２回すすぐ。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａ７０３０、Sigma）を含有するＰＢＳ２５０μｌを用いて、非特異部位を２０〜２５℃で１時間３０分インキュベートすることによりブロッキングする。プレートを２５０μＬのＰＢＳで１回すすぎ、次に１００μｌのＰＢＳ１％ＢＳＡで希釈したヒト血清１０μｌを用いて、２０〜２５℃で４５分間、振盪培養器でインキュベートする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回、及びＰＢＳで１回の洗浄後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）（Jackson ImmunoResearch）を用いて、プレートを２０〜２５℃で４０分間、振盪培養器でインキュベートする。ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回、及びＰＢＳで２回の洗浄後、製造業者の使用説明書に従って、ペルオキシダーゼ基質ＯＰＤ（１，２−フェニレンジアミン二塩酸塩）（DakoCytomation）を添加することにより、抗ＨＰＡ−１ａ抗体の結合を検出する。２５〜３０分にわたって、４９２ｎｍでの吸収をＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定する。反応を停止するには、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４１００μｌをウエルに添加する。次に、ＯＰＤのインキュベート時間に従う、吸光度の進展（evolution）の曲線を分析する。
【００４７】
実施例５
この実験では、Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａのヒトＩｇＧＨＰＡ−１ａ特異的ポリクローナル同種抗体の結合を中和する能力を、ＭＡＩＰＡ技術により判定する。ＭＡＩＰＡ技術は、Kiefel et al.（Blood: 1987, 70; 1722-1727）により記載されているように使用される。ＭＡＩＰＡ技術は、血小板の同種抗体及び自己抗体を検出及び同定する、より特別な技法である。
【００４８】
特に、ポリクローナル抗ＨＰＡ−１ａを含む若しくは含まないヒト血清５０μｌ、又はポリクローナル抗ＨＰＡ−１ａを含まないヒト血清５０μＬ中の１５ｎｇのＣａｍｔｒａｎを、２０μＬのＰＢＳで希釈した０、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ又は１０００ｎｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａを用いて、２０〜２５℃で２５分間、振盪培養器でインキュベートする。混合物を３μｌのＮｉ−ＮＴＡアガーロースビーズで、５分間プレインキュベートし、複合体同種抗体／Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａを１３０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離により破壊する。５０μｌの上清を使用してＭＡＩＰＡを実施する。次に、従来のようにＭＡＩＰＡ技法を使用して血清の中和を判定する。
【００４９】
３０μＬのＰＢＳで希釈した、増加する濃度のＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａ（０、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ及び１０００ｎｇ）を、ポリクローナル抗ＨＰＡ−１ａを含む若しくは含まないヒト血清５０μＬ、又はポリクローナル抗ＨＰＡ−１ａを含まないヒト血清５０μＬで希釈した１５ｎｇのＣａｍｔｒａｎに添加する。２０〜２５℃で２５分間のインキュベート後、３μｌのＮｉ−ＮＴＡアガーロースビーズで混合物をプレインキュベートし、複合体同種抗体又はＣａｍｔｒａｎ／Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａを１３０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離により破壊する。次に、５０μＬの上清血清の中和を、従来のようにＭＡＩＰＡ技法を使用して判定する。結果は図８ａ、図８ｂ及び図８ｃに示す。
実施例６
ＭＡＩＰＡ及びＥＬＩＳＡを使用した抗ＨＰＡ−１ａ抗体の検出
血液試料（表１、左）は匿名のドナー又はＮＡＩＴ患者からのものである。粗血清（表１、「ＭＡＩＰＡ」）又はプロテインＡ精製免疫グロブリン（表１、「ＭＡＩＰＡ  ｐｕｒｅ」）についてＭＡＩＰＡを実施する。ドナーの大部分は、ＭＡＩＰＡ及びＥＬＩＳＡの双方を使用して、陰性であることが判明した。ＭＡＩＰＡが０．１を上回る光学密度（ＯＤ＞０．１）を示すことで、またＥＬＩＳＡ（終点測定）により、７つの試料は陰性であることが判明した。しかしながら、全てのドナー試料について、経時的分析は、光学密度は時間と共に直線的に増加し、一次導関数は一定であり（ｄＯＤ／ｄｔ＝一定）、二次導関数はゼロに等しい（ｄ２ＯＤ／ｄｔ２＝０）ことを示す。したがって、ＥＬＩＳＡを使用してｄ２ＯＤ／ｄｔ２＝０であった場合、所与の試料は陰性であることが割り出される。ＥＬＩＳＡ経時的分析の結果は、指定の欄に表示される（表１、「曲線」）：全てのドナー試料は陰性であると試験される（ｄ２ＯＤ／ｄｔ２＝０）、一方、ＮＡＩＴ患者（Pan, St Camb, Bru）からの３つの試験された試料は陽性であることが判明する（ｄ２ＯＤ／ｄｔ２＞０）。その結果、所与の試料は、本明細書中に記載のＥＬＩＳＡを用いて、以下の基準の１つを満たす場合、陰性である：０．１を下回る光学密度（終点）又はｄ２ＯＤ／ｄｔ２＝０（経時変化）。全ての試料は、終点プロトコルを用いて陰性であると判明したが、経時的プロトコルを用いても同様に陰性であると判明することが指摘されるべきである。また、ＮＡＩＴ患者（Ｐａｎ、Ｓｃｈ、Ａｃ  ｍＢ２）からの３つの試料の免疫除去は、精製ペプチドアプタマー（表１、「ｎｅｕｔｒ．」）を用いて首尾よく行われる。ＨＰＡ遺伝子座のジェノタイピングが示される（表１、「ｇｅｎｏ．」）。
【００５０】
表１は、ＭＡＩＰＡ及びＥＬＩＳＡを使用した抗ＨＰＡ−１ａ抗体検出実験の結果をまとめたものである。記号は次の通りである：（−）陰性；（＋）陽性；(−／＋)最初は陰性であったが後に陽性と試験された；（ＮＤ）判定せず。
【００５１】
【表１】
2009525725.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】（ａ）本発明によるペプチドアプタマーに含まれるドデカペプチドのアミノ酸の組み合わせ。全ての配列は順に、４つの脂肪族アミノ酸（Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ）、２つの酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、１つのプロリン、１つの塩基性アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、２つの酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、１つのアルコールアミノ酸（Ｔ、Ｓ）及び１つの芳香族アミノ酸（Ｗ、Ｙ、Ｆ）を含む。矢印はペプチドのＮ末端からＣ末端への方向を指す。（ｂ）本発明によるドデカペプチドの無作為な例。矢印はＮ末端からＣ末端への配列の方向を指す。例として得られたドデカペプチドは、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒのペプチド配列を有する。
【図２】Ｃａｍｔｒａｎモノクローナル抗体を使用して試験されたウエスタンブロット。選択された細菌クローンからの全タンパク質抽出物（１〜９）。ＨＰＡ−１ａ血小板からの試料は陽性対照として用いられた（左のレーン、「ｐｌａｔａ」）。陽性クローンは６３ｋＤのバンドを特徴とする（レーン２、３、５、８、９）。
【図３】（ａ）Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質をコードする配列。このＯＲＦは、ｐＴ７−７発現ベクターのＮｄｅＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位との間にクローニングされる。Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質は、Ｃ末端に６−Ｈｉｓ尾部を持つ。（ｂ）Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質の配列。タンパク質はチオレドキシンの活性部位に１２アミノ酸長の配列、Ｃ末端にポリヒスチジン尾部を含有する。
【図４】（ａ）ＳＤＳＰａｇｅ（クマシーブルー）による組換えタンパク質の検出。陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製したタンパク質２０μｇを２０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した（レーン１）。分子量マーカーを右に示す。（ｂ）Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質のエレクトロスプレー質量スペクトル。期待した大きさ（１４６４０ｄａ）のメジャーピークが検出される。マイナーピーク（Ｄ）は、Ｎ末端に２つのメチオニン残基を欠くＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａに対応する。（ｃ）Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａのトリプシン消化後に得られた生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル。黒い星印（Ｈ）は期待した大きさでのピークに対応する。これらのピークでＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａ配列の８０％に相当する。
【図５】再懸濁し、抗Ｈｉｓ抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した免疫沈降物を示す。免疫沈降に使用したバッファーは、ＰＢＳ（レーン１、２、９、１０）、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）（レーン３、４）、ＰＢＳ−ＮＰ４０（０．１％）（レーン５、６）、ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ（０．５％）（レーン７、８）である。抗ＨＰＡ−１ａ抗体を含有する血清試料（１、３、５、７）又は含有しない血清試料（２、４、６、８）を免疫沈降に使用した。Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａを含まない陰性対照（９）又は免疫グロブリンを含まない陰性対照（１０）を示す。
【図６】典型的なイムノキャプチャー実験の結果を示す。以下の血清を使用した：抗ＨＰＡ−１ａ抗体を含有する２つの試料（１−２）、抗ＨＰＡ−１ｂ抗体を含有する１つの試料（３）、１つの陰性対照（４）。５０ｎｇ又は１００ｎｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａタンパク質でウエルをコートした。Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａとの相互作用は、抗ＨＰＡ−１ａ抗体を含有する血清（１、２）でのみ検出された。
【図７】ＥＬＩＳＡ実験を示す。ＯＤが４９２ｎｍの経時的分析。抗ＨＰＡ−１ａ抗体を含有する血清（Ｐ＋及びＳｔ  Ｃａｍｂ）又は含有しない血清（４２９８７６、３８３５４５、４８９９５６、３６１１７７）を使用した。ｄ２ＯＤ／ｄｔ２の値を示す（６ｃ）。ｄ２ＯＤ／ｄｔ２の算出により陽性試料と陰性試料を区別できる。ｄは、炭酸バッファー中１ウエルあたり１５０ｎｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａを用いて、４℃で一晩コートしたマイクロタイトレーションプレート（Ｎｕｎｃ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより測定した、ヒト血清中のＨＰＡ−１ａ特異抗体の検出を示す。プレートを２００μｌのＰＢＳで２回すすいだ。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａ７０３０、Sigma）を含有する２００μｌのＰＢＳを入れ、１００分間室温（ＲＴ）におくことで非特異的結合をブロッキングした。次に、プレートを２００μｌのＰＢＳで１回すすぎ、１００μｌのＰＢＳ＋１％ＢＳＡで（１：１００〜４：５に）希釈したヒト血清を用いて、ＲＴで４５分間振盪培養器で再度インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでの３回の洗浄及びＰＢＳでの１回の洗浄の後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）（Jackson ImmunoResearch）を用いて、ＲＴで４０分間、プレートを振盪培養器でインキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での３回の洗浄及びＰＢＳでの２回の洗浄の後、製造業者の使用説明書（DakoCytomation）に従って、ペルオキシダーゼ基質（ＯＰＤ：１，２−フェニレンジアミン二塩酸塩）を添加することにより、抗ＨＰＡ−１抗体の結合を検出した。２０分後、１００μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９２ｎｍで吸収を記録した。４９２ｎｍでのＯＤの進展は血清中の抗ＨＰＡ−１ａの力価に依存する。この進展は抗体−抗原相互作用に特徴的であり、Ｔｒｘ−ＨＰＡ−１ａアプタマーが抗ＨＰＡ−１ａを含む血清と含まない血清を区別できることを実証する。Ｓｃｈ及びＰａｎという試料は抗ＨＰＡ−１ａ抗体を含有し、試料Ｎｅｇは健康なドナーからの陰性対照である。高希釈（１／５０）で、ＮｅｇサンプルのＯＤは＜０．０５であり、一方、Ｓｃｈ及びＰａｎのＯＤは＞０．２３である。低希釈（１／２）で状況は同じであり、ＮｅｇのＯＤは＜０．１１、Ｓｃｈ及びＰａｎは＞０．６６であった。
【図８】（ａ）ＭＡＩＰＡアッセイにおける、ヒト血清の同種抗体抗ＨＰＡ−１ａの中和を示す。２つの異なる生成のデータを使用して時間内の安定性を比較した。（ｂ）ＭＡＩＰＡアッセイにおける、Ｃａｍｔｒａｎ抗体のＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａでの中和。１００ｎｇのＴｒｘ−ＨＰＡ−１ａは、ＭＡＩＰＡアッセイにおけるＣａｍｔｒａｎの阻害に十分であった。（ｃ）特異的ＨＰＡ−１ａ抗体（抗ＨＰＡ−１ａ）を含有する２種のヒト血清の中和。
【図１】
2009525725.tif 000003
【図２】
2009525725.tif 000004
【図３】
2009525725.tif 000005
【図４】
2009525725.tif 000006
【図５】
2009525725.tif 000007
【図６】
2009525725.tif 000008
【図７】
2009525725.tif 000009
【図８】
2009525725.tif 000010
【配列表】
2009525725000001.app
【国際調査報告】
2009525725.tif 000011
2009525725.tif 000012
2009525725.tif 000013