(57)【要約】  本発明は、多能性間葉系幹細胞集合体を調製および特性評価するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、本発明の幹細胞集合体を使用するための方法を提供する。
2009525044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来幹細胞（「ＡＳＣ」）が組織化して三次元多細胞性構造を作るように該脂肪組織由来幹細胞を培養する方法であって、以下を含む方法：
ＡＳＣを得る；
該ＡＳＣを増殖培地中に懸濁する；
該ＡＳＣ含有増殖培地の１アリコートを、該ＡＳＣを集合させ三次元多細胞性構造を作らせるのに適した固相支持体に移す；および
該ＡＳＣを組織培養環境において維持し、それによって三次元多細胞性構造を形成する。
【請求項２】
前記三次元多細胞性構造が自己組織化間葉系芽体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相支持体を前記ＡＳＣ含有増殖培地のアリコートの添加後に反転し、前記固相支持体が反転している間に前記ＡＳＣを液滴状に集合させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アリコートが約１００マイクロリットル未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アリコートが約３０マイクロリットル未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記三次元多細胞性構造が増殖可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＳＣが、増殖培地中に懸濁される前に少なくとも１つの精製工程に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培地が約１％未満の血清を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が約０．５％未満の血清を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地が無血清である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＳＣが初期継代ＡＳＣである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＳＣがヒトＡＳＣである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相支持体が組織培養プレートカバーまたは細菌プレートである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＳＣが約４８〜７２時間以内に集合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＳＣが約２４時間以内に集合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己組織化間葉系芽体が、分化可能な少なくとも１種の細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞型へと分化可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己組織化間葉系芽体が、増殖可能な少なくとも１種の細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記自己組織化間葉系芽体が移動する能力を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己組織化間葉系芽体が、少なくとも１種の他の自己組織化間葉系芽体と融合する能力を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記固相支持体が、細胞付着に対する低付着性、超低付着性、または非付着性表面を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地が基本培地ＡＲ８またはＡＲ９を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
自己組織化間葉系芽体を増殖させる方法であって、ここで該自己組織化間葉系芽体は大きくなるか、または組織培養プレートに存在するものであり、少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体を得ること、該少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体を増殖培地を含む組織培養プレートに移し、それによって該自己組織化間葉系芽体を増殖させることを含む、方法。
【請求項２４】
前記自己組織化間葉系芽体が、少なくとも１種の他の自己組織化間葉系芽体と融合することによって大きくなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己組織化間葉系芽体が前記自己組織化間葉系芽体内での細胞増殖によって大きくなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記自己組織化間葉系芽体が、少なくとも１種の他の自己組織化間葉系芽体との融合および前記自己組織化間葉系芽体内での細胞増殖によって大きくなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記自己組織化間葉系芽体が細胞外マトリックスの生成によって大きくなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ＡＳＣを増殖させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記自己組織化間葉系芽体を少なくとも１ヶ月間増殖させ得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記自己組織化間葉系芽体を少なくとも３ヶ月間増殖させ得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記自己組織化間葉系芽体を少なくとも６ヶ月間増殖させ得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖自己組織化間葉系芽体が、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞からなる群から選択される少なくとも１種の細胞型へと分化する能力を有する細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記芽体がヒト細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
さらに前記自己組織化間葉系芽体がフィーダー細胞層とともに培養される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記自己組織化間葉系芽体が懸濁培養において維持される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体を、それを必要とする被験体に投与する方法であって、該被験体に医薬上許容される担体および少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体を含む医薬組成物を投与することを含み、該少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体が有効な数の細胞を含む、方法。
【請求項３７】
前記医薬組成物が少なくとも１つの薬物または化合物をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記医薬組成物が直接に、局所的に、または非経口的に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体を形成するために使用される細胞が、前記少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体が形成される前に細胞マーカーまたは細胞機能に基づく少なくとも１つの精製工程に供される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記マーカーが細胞表面マーカーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マーカーがＣＤ３４、ＮＧ２、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０５、ＡＬＤＨおよびＨＬＡ−１からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体が、前記少なくとも１種の自己組織化間葉系芽体の置換分ではない他の細胞の活性または機能を変調可能な少なくとも１つの因子を分泌する少なくとも１種の細胞を含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、合衆国法典第３５編第１１９条（ｅ）項に基づいて２００６年１月３０日出願の米国仮出願第６０／７６３，３３３号の優先権を主張し、この米国仮出願の開示内容は引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００２】
連邦支援調査または開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所(the National Institutes of Health)によって決定された認可番号ＨＬ７２１４１の下で合衆国政府支援を受けてなされたものである。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、真皮／皮膚などのような種々の組織から単離することができる幹細胞である。これらの細胞は、厳しい科学研究および調査の対象であり、将来の再生治療の潜在的に革命的なパラダイムの基礎であると考えられている。
【０００４】
間葉系幹細胞、一般には、脂肪幹細胞は、特に、体の自然治癒力を高める将来の臨床治療にかなり有望である。これらの潜在的な治療の使用に共通した１つの障害は、ヒトへの使用を目的とする細胞の培養培地においてウシ胎児血清または他の動物血清を使用する現在の慣習である。動物の血清の不明確性および可変性、ならびに生体異物の病原体を取り込み、一部の被験体において重篤なアレルギー応答を引き起こす関連するリスクは、現在当分野において未解決の技術的問題である。
【０００５】
最近では、主として骨髄から得られる間葉系幹細胞の同定が組織の再生および分化の進展をもたらした。かかる細胞は骨髄および骨膜に見られる多能性細胞であり、様々な間葉系組織または結合組織へと分化可能である。例えば、かかる骨髄由来幹細胞は、５−アザシチジンなどの薬剤への曝露によって誘導されて、筋細胞へと発展し得る(Wakitani et al., Muscle Nerve, 18 (12), 1417-26 (1995))。かかる細胞は軟骨、脂肪、および骨などの組織の修復に有用であるということ（例えば、米国特許第５，９０８，７８４号、同第５，９０６，９３４号、同第５，８２７，７４０号、同第５，８２７，７３５号参照）、そしてそれらの細胞はまた、遺伝子改変を使って応用もできるということ（例えば、米国特許第５，５９１，６２５号参照）が示唆されている。かかる細胞の同定は組織の再生および分化の進展をもたらしたが、かかる細胞の使用はいくつかの技術的な障害によって妨げられている。かかる細胞の使用の１つの欠点は、それらの細胞が希少であり（わずか１／２，０００，０００細胞に相当する）、それらの細胞を獲得し、単離するための任意のプロセスを困難かつ高コストにすることである。いうまでもなく、骨髄採取はドナーには一般に痛みを伴う。さらに、かかる細胞は、分化誘導しないで培養することは難しく、特にスクリーニングした血清ロットを使用しない場合、かかる幹細胞の使用にはさらにコストと労働が上乗せされる。
【０００６】
成体多能性「幹」細胞の存在は、数多くの組織（例えば骨髄、血液、肝臓、筋肉、神経系）および脂肪組織において立証されている。理論上、無限自己再生が可能である成体「幹」細胞は、優れた細胞可塑性、すなわちそれらの細胞が運命付けられていると考えられる組織以外の組織へと分化する能力を有する。胚幹細胞（ＥＳ）の特性と類似している前記細胞の特性は、特にそれら細胞の使用にはＥＳ細胞を用いて直面する適合性や倫理学の問題がないことから重要な治療的展望を開く。
【０００７】
脂肪組織は、ヒトおよび他の哺乳類種の正常な発達および生理学において重要な見過ごされた役割を果たす。多くの異なる種類の脂肪が存在する。最も一般的なタイプは、皮膚の下（皮下脂肪）、腹腔内（内臓脂肪）、および生殖器周囲（性腺脂肪）に位置する白色脂肪組織である。成体ヒトではあまり見られないのが褐色脂肪組織であるが、この褐色脂肪組織は新生児期の間の発熱において重要な役割を果たす；このタイプの脂肪は肩甲骨の間（肩甲骨間）、主要血管および心臓の周囲（大動脈周囲および心臓の周囲）、および腎臓の上（副腎）に位置する。
【０００８】
女性は成熟するにつれて、乳房脂肪組織の量が高まる。乳房脂肪体は、授乳期間中のエネルギー源となる。実際に、生殖能力および成熟は個体の脂肪組織蓄積と密接な関係がある。女性および男性の思春期は、脂肪組織由来ホルモンであるレプチンの産生および放出と、そして体脂肪組成と密接な相関関係がある。他の脂肪組織部位は体内で構造的役割を果たす。例えば、足の裏の機械的脂肪体は歩行の影響に対するクッションを提供する。この脂肪貯蔵の喪失は進行性筋骨格系損傷および移動性障害の原因となる。骨髄脂肪細胞は骨髄に存在して、エネルギーを提供し、骨髄内で血液細胞に発展させる。
【０００９】
骨髄脂肪細胞は脂肪組織に存在する脂肪細胞とは異なり、形態学、生理学、生化学ならびにインスリンなどの様々な刺激因子に対するそれらの応答において異なっている。骨髄間質に存在する脂肪細胞は：１）血行動態的に活性な骨髄の量を調節するように作用し得；２）骨髄細胞の増殖に必要な脂質の貯蔵器として働き、そして３）骨芽細胞などの他の細胞系統と発生的に関連し得る。白色脂肪組織（すなわち体脂肪）は、対照的に、脂質代謝およびエネルギー恒常性に関与している(Gimble, "The Function of Adipocytes in the Bone Marrow Stroma", The New Biologist 2(4), 1990, pp. 304-312)。
【００１０】
様々な幹細胞集団に関する調査の大半は、自然に混合されているか、またはクローンに由来する付着細胞培養物および／または単一細胞懸濁液としてのそれらの挙動および治療可能性に集中していた。しかしながら、幹細胞はin vivoでは支持的ニッチ、または微小環境の中で存在する可能性が最も高いという証拠を約束することによって裏付けられたコンセンサスは徐々に発展しつつある。
【００１１】
最近のいくつかの論文で概説されているように、新たに明らかになったデータは、「それが幹細胞の固有の特徴と、それらの特性を定め、それらの可能性を定義するそれらの微小環境との組合せである」ことを示唆している(Fuchs et al., Cell, 116:769-778, 2004)。本質的に、特殊細胞環境、またはニッチは、可溶性因子およびマトリックス因子の環境を作り出す／提供する（幹細胞構成要素に追加される、または幹細胞構成要素を含む）細胞の多様な異種コレクションからなる。これらの因子は、幹細胞貯蔵器のホメオスタシス（細胞増殖、分化、および再生を含む）を命令し、制御する手助けをする(Kindler, J. Leukocyte Biol., 78:836-844, 2005; Fuchs et al., Cell, 116:769-778, 2004)。そして、組織／ニッチが平衡状態にある場合には、幹細胞の大部分は細胞周期のＧ０期において休眠状態／静止状態であると現在は考えられているが、組織／ニッチの喪失、または損傷は幹細胞貯蔵器に強力な刺激を与えて、再生（増加）および／または分化によって平衡を再確立する（すなわち修復する；再生する）とも考えられている。この能力は恐らく非対称細胞分裂、さらに場合によってはある程度の脱分化を必要とし、これらの全てはニッチ微小環境によって支配されていると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記背景を考えると、ex vivo 幹細胞ニッチモデルの「作出」は、幹細胞生物学の研究だけでなく、可能性ある治療用途にも非常に有用かつ有益であろうことが明らかになる。研究者らは胚幹細胞（胚様体）および神経幹細胞（ニューロスフェア）のin vitro 「ニッチ」を記載し、特性評価した−それらの細胞は両方とも多細胞性集合体における前記細胞の懸濁（すなわち非付着性）培養を必要とする。しかしながら、間葉系幹／間質細胞、特に脂肪由来細胞ではそのような「システム」は記載されていない。かかる細胞は付着性単層として伝統的に培養されるが、これは、これらの細胞が細胞培養／付着に対して不利であると見られる表面に対してさえも極めて高い付着性を示すために、これらの細胞を懸濁状態で培養することが難しいことによると思われる。
【００１３】
当技術分野では長年にわたって、間葉系幹細胞、特に脂肪組織由来細胞の多細胞性集合体を調製、特性評価、および操作する方法、そして代替の、および／または強化された再生技術を提供する方法を必要としており、本発明はこの必要性を満たしている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、脂肪幹／間質細胞集団を増殖させ、分化させるための方法および組成物を提供する。本発明はさらに、かかる細胞のクラスターを操作し、巧みに処理するための方法および組成物を提供する。
【００１５】
本願は、懸濁培養においてヒト脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）を培養する複数の方法を開示し、これらの方法は、該ヒト脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）が：１）生じ、組織化して、血清、または他の異種のタンパク質を加えたまたは加えない（懸濁または付着性）培養下で長期間生存する三次元多細胞性集合体（スフェア、クラスター、芽体、ネットワークなどとも呼ばれる）を作り；２）集密状態まで増殖する付着細胞を繰り返し「発生させる」ことができ（すなわち高度自己再生能力）；３）多系統表現型へと分化することができ、そして４）異なる環境条件、例えば様々な培地または外傷に応じて変形する（増殖する、伸長する、分極する）ことができるような培養方法である。さらに、これらの三次元集合体は、２種以上の異なる細胞型、例えばＡＳＣとケラチノサイト、またはＡＳＣと造血幹細胞（ＨＳＣ）を用いることによって細胞キメラとして形成することができる。これらの三次元細胞集合体は、本明細書では芽体と呼ぶ。芽体は、損傷もしくは剥離構造／組織の再生を開始、促進、および／または命令する能力がある細胞のクラスターとして定義される。この文書を通じて、これらの芽体はさらに記載され、同義的に自己組織化間葉系芽体（ＳＯＭ−Ｂ）、脂肪幹／間質細胞芽体（ＡＳＣＢ）、キメラ芽体（ＣＢ）、および／またはＡＳＣ−間葉系芽体（ＡＳＣ−ＭＢ）と呼ばれる。
【００１６】
本発明は、懸濁（非付着性）状態のヒト脂肪由来幹／間質細胞が組織化して新規三次元多細胞性動的自立構造を作るように、それらを作製、培養、維持、および／または操作することを包含する。本願に開示する結果は、これらのex vivo構造はＡＳＣの／のための静止幹細胞ニッチ（微小環境）に匹敵し、それらの細胞を（それらがin vivoで存在するように）未分化および／または脱分化状態で維持することができることを示唆している。増殖因子への曝露および／または組織傷害などの適当なシグナルおよび／または状態により、それらのニッチにおける細胞は複製し、分化し、かつ／または移動、分極および／もしくは他の形態形成／発生挙動を受ける能力を有する。現在開示されているデータは、このニッチ環境で調製されたまたはこのニッチ環境から誘導されたＡＳＣは（標準的な技術を用いて付着性単層培養物として増殖させた細胞と比べて）発生可塑性の高まりを示し、結果として再生治療可能性の高まりを示すことをさらに示唆している。ＳＯＭ−Ｂは、移植細胞の移植および生存を促進するだけでなく、その宿主部位内でのそれらの組込み、移動および分化を促進する可能性を有する再生医療用途向けの新規送達系／戦略である。ＡＳＣは再生治療を病院へとつなげるための特に実用的で魅力的な細胞源であるため、この発見は調査、診断学、および治療学におけるＡＳＣの使用に重要な影響をもたらす。
【００１７】
本明細書に記載の本発明は、ＡＳＣが支持的ニッチ／微小環境において幹細胞集団のように作用する三次元多細胞性集合体を形成する方法での該ＡＳＣの培養に関する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、ＡＳＣが組織化して三次元多細胞性構造を作るように該ＡＳＣを培養する方法を提供する。一態様では、前記ＡＳＣは培養下でＳＯＭ−Ｂと呼ばれる集合体を形成する。一態様では、前記集合体は非付着性、すなわち懸濁状態である。一態様では、前記培養培地は無血清である。一態様では、前記培地は約０．５％血清を含む。一態様では、使用する前記培地はＡＲ８またはＡＲ９である。一態様では、前記ＳＯＭ−Ｂは培養下で増殖させることができる。一態様では、前記ＳＯＭ−Ｂは増殖可能な細胞を含む。一態様では、前記ＳＯＭ−Ｂは運動／移動可能である。一態様では、ＳＯＭ−Ｂは少なくとも１種の細胞型へと分化可能な細胞を含む。一態様では、ＳＯＭ−Ｂは、存在する環境条件または刺激に応じて、限定されるものではないが、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞を含む様々な細胞型へと分化可能な細胞を含む。一態様では、少なくとも１種のＳＯＭ−Ｂは少なくとも１種の他のＳＯＭ−Ｂと融合することができる。一態様では、前記ＡＳＣはヒトＡＳＣである。
【００１９】
一実施形態では、ＳＯＭ−Ｂ中の細胞は、該ＳＯＭ−Ｂに隣接するかまたは該ＳＯＭ−Ｂに近い細胞の活性および機能を変調可能な因子を分泌する。一態様では、前記因子は増殖因子である。もう１つの態様では、前記因子は分化因子である。さらにもう１つの態様では、前記因子は血管新生因子である。
【００２０】
一実施形態では、ＳＯＭ−Ｂ中の細胞は細胞外マトリックスタンパク質を分泌する。
【００２１】
一実施形態では、ＳＯＭ−Ｂは、キメラが形成されるようにＡＳＣ以外の細胞をさらに含んで形成され得る。
【００２２】
一実施形態では、ＳＯＭ−Ｂは培養下で増殖させる。一態様では、前記培養は懸濁培養である。
【００２３】
一実施形態では、ＳＯＭ−Ｂはそれを必要とする被験体に投与される。一態様では、前記ＳＯＭ−Ｂは薬物または他の薬剤もしくは化合物と同時投与され得る。かかる化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、リボザイム、核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、フィロマー（phylomer）、ポリマー、生分解性スキャフォールド、およびｓｉＲＮＡが含まれる。
【００２４】
一実施形態では、ＡＳＣは培養される前に少なくとも部分的に精製される。一態様では、細胞マーカーは前記細胞を精製するために使用される。一態様では、前記細胞マーカーはＣＤ３４、ＮＧ２、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０５、ＡＬＤＨおよびＨＬＡ−１からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の様々な態様および実施形態については以下でさらに詳細に記載する。
【００２６】
発明の詳細な説明
略語および頭字語
ＡＳＣ−脂肪組織由来幹細胞
ＡＳＣＢ−脂肪幹／間質細胞芽体
ＡＳＣ−ＭＢ−ＡＳＣ−間葉系芽体
ＣＢ−キメラ芽体
ＤＭＥＭ−ダルベッコ改変イーグル培地
ＥＳ−胚幹細胞
ＦＡＣＳ−蛍光活性化細胞選別
ＦＢＳ−ウシ胎児血清
ＨＳＣ−造血幹細胞
ＭＢ−メセンコイドボディ
ＳＯＭ−Ｂ−自己組織化間葉系芽体（本明細書においては「自己組織化メセンコイドボディ」とも呼ばれる）
ＵＬＡ−超低付着性組織培養プレート
【００２７】
定義
本発明を記載し、主張する場合において、次の用語は以下に示す定義に従って使用される。
【００２８】
冠詞「１つの(a)」および「１つの(an)」は、この冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。一例として、「１つの要素(an element)」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２９】
「約」とは、本明細書において、近似的に、〜の辺り、大体、または前後を意味する。この「約」が数値域とともに使用される場合には、それによって示された数値の上下限が広がることによってその範囲が変更される。例えば、一態様では、この「約」は、数値を表示値の上下に２０％の変動分変更するために本明細書において使用される。
【００３０】
「脂肪由来幹細胞」は、本明細書において「脂肪由来間質細胞」とも呼び、脂肪組織が起源である細胞を指す。「脂肪」とは任意の脂肪組織を意味する。この脂肪組織は、皮下、大網／内臓、乳房、性腺、または他の脂肪組織部位由来の褐色または白色脂肪組織であってよい。好ましくは、前記脂肪は皮下白色脂肪組織である。かかる細胞には初代細胞培養または不死化細胞株が含まれ得る。前記脂肪組織は脂肪組織を有する任意の生物由来であってよい。好ましくは、前記脂肪組織は哺乳類のものであり、より好ましくは、前記脂肪組織はヒトのものである。便宜な脂肪組織源は脂肪吸引術により得られるが、脂肪組織源または脂肪組織の分離方法は本発明にとっては極めて重要なものではない。
【００３１】
「成体」とは、本明細書において、任意の非胎児または非未成体被験体を指すことを意味する。例えば「成体脂肪組織幹細胞」とは、胎児または未成体被験体から得られるもの以外の脂肪幹細胞を指す。
【００３２】
疾患または障害は、該疾患、状態、もしくは障害の症状の重篤度、または被験体にかかる症状が見られる頻度、または両方が軽減されるならば「緩和される」。
【００３３】
本明細書において、化学化合物の「類似体」は、一例として、構造が別のものに似ている化合物であるが、必ずしも異性体とは限らない（例えば、５−フルオロウラシルはチミンの類似体である）。
【００３４】
本明細書において、アミノ酸は、次の表に示すとおり、その完全名称、それに対応する３文字表記、またはそれに対応する１文字表記によって表される：
【００３５】
【表１】
2009525044.tif 000003
【００３６】
表現「アミノ酸」とは、本明細書において、天然アミノ酸および合成アミノ酸の両方、ならびにＤ型アミノ酸およびＬ型アミノ酸の両方を含むことを意味する。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドにおいてよく見られる２０種の標準Ｌ−アミノ酸の任意のものを意味する。「非標準アミノ酸残基」とは、それが合成により調製されるか、または天然源から得られるかには関係なく、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書において、「合成アミノ酸」は、化学修飾アミノ酸も包含し、そのような化学修飾アミノ酸には、限定されるものではないが、塩、アミノ酸誘導体（例えばアミド）、および置換体が含まれる。本発明のペプチド内に含まれる、特にカルボキシ−またはアミノ−末端のアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化またはそれらのアミノ酸の活性に悪影響を及ぼさずにペプチドの循環半減期を変更することができる他の化学基との置換によって修飾することができる。加えて、ジスルフィド結合は本発明のペプチド中に存在していてよく、または不在であってもよい。
【００３７】
「アミノ酸」とは、「アミノ酸残基」と同義的に使用され、遊離アミノ酸も、さらにペプチドのアミノ酸残基も指し得る。この用語が遊離アミノ酸を指しているのか、またはペプチドの残基を指しているのかは、この用語が使用されている文脈から明らかであろう。
【００３８】
アミノ酸は次の一般構造を有する：
【化１】
2009525044.tif 000004
【００３９】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７つのグループに分類され得る：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基含有側鎖、（３）硫黄原子含有側鎖、（４）酸性またはアミド基含有側鎖、（５）塩基性基含有側鎖、（６）芳香環含有側鎖、および（７）プロリン、すなわちアミノ基と縮合されているイミノ酸。
【００４０】
本発明のペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、各アミノ酸残基の左にアミノ基を、右にカルボキシ基を示す従来の慣例に従う。本発明の選択した特定の実施形態を表す式において、前記アミノ−およびカルボキシ−末端基は、具体的には示していないが、特に断りのない限り、それらが生理学的ｐＨ値においてとるであろう形態であると考えられる。
【００４１】
「塩基性」または「正電荷」アミノ酸とは、本明細書において、Ｒ基がｐＨ７．０において正味の正電荷を有するアミノ酸を指し、そのようなアミノ酸には、限定されるものではないが、標準アミノ酸であるリジン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。
【００４２】
「抗体」とは、本明細書において、抗原の特定のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源または組換え体源から得られる無傷免疫グロブリンであり得、無傷免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、一般には、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は種々の形態で存在してよく、そのような形態には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体が含まれる。
【００４３】
本明細書において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」またはアンチセンス核酸とは、少なくとも一部が正常細胞または罹患細胞に存在する核酸と相補的である核酸高分子を意味する。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、またはその非コード鎖と実質的に相同である配列を指す。本明細書において定義されるとおり、アンチセンス配列はタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列と相補的である。このアンチセンス配列はＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分のみに相補的である必要はなく、アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上に定められた、そのコード配列の発現を制御する調節配列と相補的であってよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、限定されるものではないが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾体が含まれる。
【００４４】
「自己（の）」とは、本明細書において、ある特定の種類の組織中でまたは体の特定構造中で自然にかつ通常生じるものを指す。移植の場合、この用語は、同じ個体中にドナー領域とレシピエント領域がある移植片を指し、またはドナーが事前に提供し、その後、通常手術中に受ける血液を指す。
【００４５】
「基本培地」とは、本明細書において、他の成分を追加し得る、「ダルベッコ改変イーグル培地」、ＨａｍのＦ１２、イーグル培地、ＲＰＭＩ、ＡＲ８、などのような最小限必要なタイプの培地を指す。この用語は、調製されているまたは特殊用途に向けられたものであるが、修飾により他の細胞型などに使用することができる培地を排除しない。
【００４６】
「芽体」とは、本明細書において、とりわけ、器官、組織または部分が形成される原始細胞塊ならびに損傷もしくは剥離構造の再生を開始および／または促進する能力がある細胞のクラスターを包含する。
【００４７】
「生体適合性（の）」とは、本明細書において、宿主において実質的な有害応答を引き起こさない材料を指す。
【００４８】
「細胞」および「細胞系統」とは、本明細書において、同義的に使用され得る。これらの用語は全て、ありとあらゆる次の世代であるそれらの後代も含む。全ての後代は、意図的または非意図的な突然変異によって同一でない可能性があることは理解される。
【００４９】
「細胞培養」および「培養」とは、本明細書において、人工的なin vitro環境における細胞の維持を指す。しかしながら、この「細胞培養」とは、一般用語であり、個々の細胞だけでなく、組織、器官、器官系または生物全体の培養（このような培養に関して「組織培養」、「器官培養」、「器官系培養」または「器官培養」が「細胞培養」と同義的に使用される場合がある）を包含するように使用してよいことは理解すべきである
【００５０】
フレーズ「細胞培養培地」、「培養培地」（いずれの場合にも複合「培地」）および「培地処方物」は、細胞を培養するための栄養液を指し、同義的に使用され得る。
【００５１】
「化合物」とは、本明細書において、薬物、または薬物として使用するための候補、組合せ、および前記のものの混合物、ならびに本発明のポリペプチドおよび抗体と一般に考えられる任意の種類の物質または薬剤を指す。
【００５２】
「馴化培地」とは、培地中で細胞または組織の第１集団を培養し、その後、その培地を回収することによって調製されたものである。この馴化培地（細胞によって培地に分泌された任意のものとともに）は、その後、細胞の第２集団の増殖または分化を支援するために使用され得る。
【００５３】
「対照」細胞、組織、サンプル、または被験体とは、試験細胞、組織、サンプル、または被験体と同じ種類の細胞、組織、サンプル、または被験体である。この対照は、例えば、試験細胞、組織、サンプル、または被験体を調べるのと正確にまたはほぼ同時に調べてよい。対照はまた、例えば、試験細胞、組織、サンプル、または被験体を調べる時期から離れた時期に調べてもよく、対照の調査の結果は、記録された結果を試験細胞、組織、サンプル、または被験体の調査によって得られた結果と比較し得るように、記録され得る。この対照は、試験を実施する対象の疾患または障害の疑いがある被験体から試験サンプルが得られる試験群または被験体以外の別の源または同様の源からも得られ得る。
【００５４】
「試験」細胞、組織、サンプル、または被験体は、調べられるまたは処置されるもの（人）である。
【００５５】
「疾病指標」細胞、組織、またはサンプルは、存在する場合に、その細胞、組織、またはサンプルが存在している（またはその組織が得られる）動物が疾患または障害に罹患していることを示すものである。一例として、動物の肺組織に１つ以上の乳房細胞が存在することは、その動物が転移性乳癌に罹患していることを示している。
【００５６】
１つ以上の細胞が疾患または障害に罹患していない動物の組織に存在するならば、組織はその細胞を「通常含む」。
【００５７】
「送達ビヒクル」とは、in vivoで細胞を送達するのに使用することができ、または動物に投与される細胞を含む組成物に加えることができる任意の種類の装置または材料を指す。これには、限定されるものではないが、埋め込み可能な装置、細胞の集合体、マトリックス材料、ゲルなどが含まれる。
【００５８】
本明細書において、化合物の「誘導体」とは、類似構造の別の化合物から、アルキル、アシル、またはアミノ基によるＨの置換によるような１以上の工程によってもたらされ得る化学化合物を指す。
【００５９】
単語「検出する」およびその文法的変形の使用は、定量を伴わない種の測定を指すことを意味し、一方、単語「決定する」または「測定する」（それらの文法的変形を含む）の使用は、定量を伴う種の測定を指すことを意味する。「検出する」および「同定する」は本明細書において同義的に使用される。
【００６０】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、その疾患が改善されない場合にはその動物の健康は悪化し続ける動物の健康状態である。
【００６１】
これに対して、動物における「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することができるが、その動物の健康状態はその障害の不在下での状態よりもよくない健康状態である。処置しないまま放置しても、障害は必ずしも動物の健康状態をさらに低下させない。
【００６２】
本明細書において、「有効な量」とは、選択された効果をもたらすのに十分な量を意味する。
【００６３】
「フィーダー細胞」とは、本明細書において、第２の種類の細胞と同時培養されて、その第２の種類の細胞が維持され、恐らく増殖することができる環境を提供する、一種類の細胞を指す。このフィーダー細胞は、フィーダー細胞が支持している細胞とは異なる種由来のものであり得る。フィーダー細胞は、フィーダー細胞が増殖せず、フィーダー細胞が栄養供給している細胞と混ざらないことを確実にするために、同時培養される前に非致死的に照射または処理して、フィーダー細胞の増殖を防ぐことができる。「フィーダー細胞」、「フィーダー」、および「フィーダー層」は本明細書において同義的に使用される。
【００６４】
本明細書において、「機能性」分子とは、その分子が特徴付けられる特性または活性をその分子が示す形態にある分子である。
【００６５】
「断片」または「セグメント」は少なくとも１つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部、または少なくとも１つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部である。これらの「断片」および「セグメント」は本明細書において同義的に使用される。
【００６６】
「移植片」とは、移植に用いる任意の自由な（離れた）細胞、組織、または器官を指す。
【００６７】
「同種移植片」または「同種（の）」とは、同じ種の異なる動物から得られる移植細胞、組織、または器官を指す。
【００６８】
「異種移殖片」または「異種（の）」とは、異なる種の動物から得られる移植細胞、組織、または器官を指す
【００６９】
「相同（の）」とは、本明細書において、２高分子間、例えば、２核酸分子（例えば、２ＤＮＡ分子もしくは２ＲＮＡ分子）間、または２ポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。２分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合、例えば、２ＤＮＡ分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンによって占められているならば、それらはその位置において相同である。２配列間の相同性はマッチングまたは相同位置の数一次関数であり、例えば、２化合物配列における半分の位置（例えば、高分子１０サブユニット長において５つの位置）が相同であるならば、それらの２配列は５０％相同であり、９０％の位置、例えば、１０のうち９つの位置がマッチしているまたは相同であるならば、それらの２配列は９０％相同性を共有する。一例として、ＤＮＡ配列  ３’ΑＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％相同性を共有する。
【００７０】
本明細書において、「相同性」は「同一性」と同義的に使用される。
【００７１】
２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、２配列の比較に有用な数学アルゴリズムは、Karlin and Altschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)に記載のように改良されたKarlin and Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)のアルゴリズムである。このアルゴリズムはAltschul, et al.のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており(1990, J. Mol. Biol.215:403-410)、例えば国立バイオテクノロジー情報センター(the National Center for Biotechnology Information)（ＮＣＢＩ）ワールドワイドウェブサイトでアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と示される）を使用して、本明細書に記載の核酸と相同なヌクレオチド配列を得るための次のパラメーター：ギャップペナルティー＝５；ギャップ伸長ペナルティー＝２；ミスマッチペナルティー＝３；マッチスコア＝１；期待値  １０．０；およびワードサイズ＝１１を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と示される）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを使用して、本明細書に記載のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るための次のパラメーター：期待値  １０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２  スコア行列を用いて実行することができる。比較のためにギャップ付きアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載のとおりＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係（同文献）および共通したパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を実行することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合には、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
【００７２】
２配列間の同一性パーセントは、ギャップを伴うまたは伴わない、上記のものと同じような技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを算出する場合には、一般に、完全なマッチが計数される。
【００７３】
「成分」とは、細胞の増殖、生存、もしくは分化を維持または促進するために細胞培養培地に使用することができる、化学的起源のものであるかまたは生物学的起源のものであるかどうかにはかかわらない、任意の化合物を指す。「成分(component)」、「栄養物」、「補給物」および「成分(ingredient)」は同義的に使用され得、全てはかかる化合物を指すことを意味する。細胞培養培地に使用される非限定的な典型成分には、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが含まれる。ex vivoでの細胞の培養を促進または維持する他の成分は、特定のニーズに合わせて当業者によって選択され得る。
【００７４】
「阻害する」とは、本明細書において、活性もしくは機能が対照値と比べて低いように活性もしくは機能を抑制または遮断することを意味する。この阻害は直接または間接的機構によるものであってよい。一態様では、前記活性は、対照値と比べて少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２５％、さらに好ましくは、少なくとも５０％抑制または遮断される。
【００７５】
「阻害剤」とは、本明細書において、適用することによって、限定されるものではないが、分化および活性を含む目的のプロセスまたは機能の阻害をもたらす任意の化合物または薬剤を指す。目的の活性または機能の低下が起こるならば、阻害が推測され得る。
【００７６】
「傷害」とは、暴力、事故、外傷、または骨折などによって起こる身体への任意の物理的損害を指す。
【００７７】
本明細書において、「教示材料」には、本明細書に列挙する様々な疾患または障害の緩和をもたらすためのキット中の本発明のペプチドの有用性を伝達するために使用することができる刊行物、記録、図表、または任意の他の表現媒体が含まれる。所望により、または代替的に、教示材料には哺乳類の細胞または組織における疾患または障害を緩和する１以上の方法が記載されていることもある。本発明のキットの教示材料は、例えば、本発明の同定化合物が入っている容器へ添付され得るか、または同定化合物が入っている容器とともに出荷され得る。あるいは、この教示材料は、レシピエントによって教示材料と化合物が協力的に使用されるという意図で、容器とは別に出荷してもよい。
【００７８】
１）「単離する」と「選択する」；そして２）「検出する」と「同定する」は本明細書において同義的に使用される。
【００７９】
細胞に関して用いられる際の「単離（された）」とは、目的の単一細胞、または目的の細胞集団が起源の組織（例えば、脂肪組織）においてともに自然に生じる他の細胞型または他の細胞材料から少なくとも部分的に単離された目的の単一細胞、または目的の細胞集団を指す。幹細胞のサンプルは、目的の細胞以外の細胞が少なくとも６０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％、ある特定の場合では、少なくとも９９％存在しない場合に「実質的に純粋」である。純度は任意の適当な方法によって、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または細胞型を識別する他のアッセイによって測定することができる。
【００８０】
「単離核酸」とは、天然に存在する状態においてフランキングする配列から分離されている核酸セグメントまたは断片、例えば、通常はその断片に隣接している配列（例えば、それが自然に生じるゲノムにおいてその断片に隣接している配列）から取り出されたＤＮＡ断片を指す。この用語はまた、自然にその核酸に伴って起こる他の成分（例えば、細胞中で自然にそれに伴って起こるＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも当てはまる。そのため、この用語には、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか、あるいは他の配列とは無関係に独立した分子として（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡが含まれる。またこれには、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。
も含む。
【００８１】
特に断りのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重変形であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。
【００８２】
本明細書において、「検出マーカー」または「リポーター分子」は、マーカーを含まない類似化合物の存在下でマーカーを含む化合物の特異的検出を可能にする原子または分子である。検出マーカーまたはリポーター分子には、例えば、放射性同位元素、抗原決定基、酵素、ハイブリダイゼーションに利用できる核酸、発色団、フルオロフォア、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、および蛍光偏光の変化または光散乱の変化をもたらす分子が含まれる。
【００８３】
本明細書において、「リガンド」とは、標的化合物と特異的に結合する化合物である。異種化合物のサンプル中のある化合物の存在を決定する結合反応においてリガンド（例えば、抗体）が作用する場合に、そのリガンドはその化合物と「特異的に結合する」または「特異的に免疫反応する」。よって、設計されたアッセイ（例えば、イムノアッセイ）条件下では、リガンドは特定の化合物と選好的に結合し、サンプル中に存在する他の化合物とはわずかな程度にしか結合しない。例えば、抗体は、イムノアッセイ条件下では、抗体が作製されるエピトープを有する抗原と特異的に結合する。種々のイムノアッセイ形式を用いて、特定の抗原と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬｌＳＡイムノアッセイは、抗原と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の記載については、Harlow and Lane, 1988, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York参照。
【００８４】
本明細書において、「結合」とは、２群間の連結のを指す。この連結は共有結合性または非共有結合性のいずれかであり得、これには、限定されるものではないが、イオン結合、水素結合、および疎水性／親水性相互作用が含まれる。
【００８５】
本明細書において、「リンカー」とは、共有結合または非共有結合のいずれかによって、例えば、イオンもしくは水素結合またはファン・デル・ワールス相互作用によって他の２つの分子を連結させる分子を指す。
【００８６】
「細胞付着に対する低付着性、超低付着性、または非付着性表面」とは、細胞の付着を支援する表面の能力を指す。「細胞付着に対する非付着性表面」とは、細胞付着があるとしても表面がほとんど支援しないということを意味する。
【００８７】
「変調する」とは、本明細書において、活性、機能、またはプロセスのレベルを変化させることを指す。この「変調する」は、活性、機能、またはプロセスを阻害することと刺激することの両方を包含する。
【００８８】
「多細胞性集合体」、「多細胞性スフェア」、「芽体」、および「多細胞性構造」は本明細書において同義的に使用される。
【００８９】
本明細書において、「医薬上許容される担体」には、標準的な医薬担体の任意のもの、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（油／水または水／油エマルジョンなど）、および様々な種類の湿潤剤が含まれる。この用語はまた、ヒトをはじめとする動物に使用するためにＵＳ連邦政府の監督官庁によって認可されているまたはＵＳ薬局方に記載されている薬剤の任意のものも包含する。
【００９０】
「複数」とは、少なくとも２つを意味する。
【００９１】
幹細胞の「後代」とは、本明細書において、幹細胞から誘導された、親幹細胞の分化能力の全て、すなわち、多能性をまだ有し得る細胞、またはもはや多能性ではないかもしれないが、その時点でただ１種の細胞型へと分化可能な方向に傾倒しているもの、すなわち委任細胞型を指す。また、この用語は分化細胞も指すこともある。
【００９２】
「増殖させる」とは、繁殖させることまたは発生させることを意味する。
【００９３】
本明細書において、末端アミノ基に関して「保護基」とは、末端アミノ基が、ペプチド合成において伝統的に使用される様々なアミノ末端保護基の任意のものと結合されている、ペプチドの末端アミノ基を指す。かかる保護基には、例えば、アシル保護基（ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、およびメトキシスクシニルなど）；芳香族ウレタン保護基（ベンジルオキシカルボニルなど）；および脂肪族ウレタン保護基、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルが含まれる。好適な保護基については、Gross and Mienhofer, eds., The Peptides, vol. 3, pp. 3-88 (Academic Press, New York, 1981)参照。
【００９４】
本明細書において、末端カルボキシ基に関して「保護基」とは、末端カルボキシル基が様々なカルボキシル末端保護基の任意のものと結合されている、ペプチドの末端カルボキシル基を指す。かかる保護基には、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルまたはエステルまたはエーテル結合によって末端カルボキシル基と結合される他の許容される基が含まれる。
【００９５】
本明細書において、「精製（された）」および同様の用語は、自然環境において分子または化合物と通常関係している他の成分に対してその分子または化合物を濃縮することに関連している。「精製（された）」は、処理中に特定分子の完全な純度が得られたことを必ずしも示さない。「高度に精製された」化合物とは、本明細書において、純度が９０％を超える化合物を指す。
【００９６】
「サンプル」とは、本明細書において、好ましくは、被験体からの生体サンプルを指し、これには、限定されるものではないが、正常組織サンプル、病変組織サンプル、生検材料、血液、唾液、糞便、精液、涙、および尿が含まれる。また、サンプルは、目的の細胞、組織、または体液を含む被験体から得られた任意の他の材料源でもあり得る。サンプルは、細胞または組織培養からも得ることができる。
【００９７】
本明細書において、「二次抗体」とは、別の抗体（一次抗体）の定常領域と結合する抗体を指す。
【００９８】
本明細書において、化合物と結合を形成する基体に関して用いられる際の「固相支持体」とは、様々な化合物と結合（好ましくは、共有結合）を形成することが可能である溶媒不溶性基体に関連している。この支持体は、生物学的な性質のもの（限定されるものではないが、細胞もしくはバクテリオファージ粒子など）、または合成品（限定されるものではないが、アクリルアミド誘導体、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカ、または磁化粒子など）のいすれかであり得る。
【００９９】
「組織培養環境において細胞を維持するのに適した固相支持体」とは、細胞を含む培地を加え、その支持体を、細胞を維持または増殖させるために組織培養インキュベーターなどの好適な環境に入れることができる、組織培養ディッシュまたはプレート、あるいはカバーなどの任意の表面を意味する。当然、これは滅菌済みかまたは滅菌可能である固相支持体でなければならない。この支持体は細胞付着に適したものである必要はない。
【０１００】
「固相支持体」とは、細胞培養用の低付着性、超低付着性、または非付着性支持体であり、表面に付着する哺乳類細胞の能力を高めるために処理または調製されていない細菌プレートまたは組織培養ディッシュもしくはプレートなどの手段を指す。これには、例えば、細胞が付着するのを防ぐために寒天層が加えられたディッシュも含まれることがある。細菌プレートは一般に寒天を用いて使用されることから、細菌プレートは哺乳類細胞の付着を高めるために処理されず、その細菌プレートでは、細菌が寒天中に懸濁され、その寒天中で増殖することは当業者に公知である。
【０１０１】
「発生させる」とは、本明細書において、とりわけ、集密状態まで増殖する能力を有する付着細胞（すなわち、後代）を生じる、本明細書に開示される細胞の多細胞性スフェア（ＳＯＭＢ）の能力を指す。
【０１０２】
「標準」とは、本明細書において、比較のために用いられるものを指す。例えば、標準は、対照サンプルに投与または添加され、試験サンプル中の化合物を測定する際に結果を比較するために用いられる既知標準薬剤または化合物であり得る。標準はまた、「内部標準」例えばサンプルに既知量で添加され、目的のマーカーが測定される前にサンプルを処理するまたは精製もしくは抽出法に供する際に精製または回収率のようなことを決定するのに有用である薬剤または化合物も指すことがある。
【０１０３】
「刺激する」とは、本明細書において、対照値と比べて高いように活性または機能レベルを誘導または増大させることを意味する。この刺激は直接または間接的機構によるものであってよい。一態様では、前記活性または分化は、対照値と比べて少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２５％、さらに好ましくは、少なくとも５０％刺激される。「刺激因子」とは、本明細書において、適用することによって、限定されるものではないが、ＡＳＣ細胞の産生、分化、および活性、ならびにＡＳＣ後代のものを含む目的のプロセスまたは機能の刺激をもたらす任意の化合物または薬剤を指す。
【０１０４】
解析、診断、または処置についての「被験体」は動物である。かかる動物には、哺乳類、好ましくは、ヒトが含まれる。
【０１０５】
「実質的に純粋な」は、自然に伴って起こる成分から分離されている化合物、例えば、タンパク質またはポリペプチドを説明する。一般に、化合物は、サンプル中の材料全体の（容量で、湿潤または乾燥重量で、またはモル百分率もしくはモル分率で）少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９９％が目的の化合物である場合に実質的に純粋である。純度は、任意の適当な方法によって、例えば、ポリペプチドの場合にはカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ解析によって測定することができる。化合物、例えば、タンパク質は、そのタンパク質が自然に関係している成分を本質的に含まない場合またはそのタンパク質がその自然状態においてそのタンパク質に伴って起こる自然混入物質から分離されている場合にも実質的に精製されている。
【０１０６】
フレーズ「少なくとも１種の自己組織化芽体の置換分ではない他の細胞」において使用される「置換分」とは、芽体の置換可能な細胞を指す。よって、自己組織化芽体の置換分ではない細胞は、芽体に隣接する細胞であり得、自己組織化芽体から誘導される細胞である必要はない。
【０１０７】
「治療的」処置は、病変の兆候を示す被験体に、それらの兆候を減少または除去する目的で施与される処置である。
【０１０８】
化合物の「治療上有効な量」とは、化合物が投与される被験体に有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。
【０１０９】
フレーズ「組織培養ディッシュまたはプレート」の使用は、増殖または分化のために細胞をプレーティングするのに使用することができる任意の種類の器を指す。
【０１１０】
本明細書において、「処置すること」には、特定の障害もしくは状態の予防、または特定の障害もしくは状態に伴う症状の緩和および／または前記症状の予防もしくは除去が含まれる。「予防的」処置は、疾患の兆候を示していないかまたはその疾患の初期兆候しか示していない被験体に、その疾患に関連する病変を発症する危険性を減少させる目的で施与される処置である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１１】
実施形態
本発明は、脂肪幹／間質細胞を増殖させ、本明細書に記載の細胞クラスターを形成するための方法および組成物を提供する。一実施形態では、無血清培養培地を提供する。一態様では、前記培地はＡＲ８である。もう１つの実施形態では、本発明は、脂肪組織細胞の増殖を促進または刺激するための培養培地および技術を提供する。一態様では、かかる細胞の濃縮方法は、前駆体細胞の分化を誘導する方法を含む。
【０１１２】
本発明は、脂肪幹／間質細胞およびそれらの誘導体の集団を同定および特性評価するための方法を提供する。一態様では、本発明は、本発明の細胞に向けられた抗体を提供する。
【０１１３】
成体ヒト皮下脂肪組織は、患者に対する危険性または不快感を最小限に抑えて日常的に採取することができる間質／幹細胞源である。証拠から脂肪由来間質細胞は複数の系統経路に沿って分化可能であることが示されている。脂肪組織は、多くの個体で容易に入手可能で、豊富にある。肥満症は米国において拡大している状態であり、成人の５０％を超える人が身長および体重に基づいた推奨ＢＭＩを上回っている。
【０１１４】
ＵＳ  ２００２／００７６４００およびＷＯ  ００／５３７９５では、ヒト脂肪組織からの多能性細胞集団の産生について記載されている。前記細胞集団は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および筋細胞へと分化させることができる。これらの公開では、in vitroで培養下、それらの多能性を損なわずに少なくとも１５回の細胞の移し替えの間維持することができる一部の細胞を示している。
【０１１５】
米国特許第６，８００，４８０号では、無フィーダー細胞培養系中で霊長類由来始原幹細胞を増殖させるための方法および材料について記載されている。
【０１１６】
脂肪細胞が補充可能な細胞集団であることは十分に裏付けられている。脂肪吸引術または他の手法による外科切除後でも、個体において経時的に脂肪細胞の再現が通常見られる。このことは、脂肪組織が自己再生可能である間質幹細胞を含むことを示唆している。
【０１１７】
脂肪組織には組織工学用途において多くの実用上の利点がある。第１に、脂肪組織は豊富にある。第２に、患者に対する危険性最小限に抑えた採取方法が利用可能である。第３に、脂肪組織は補充可能である。間質細胞は骨髄の有核細胞集団の０．０１％未満であるが、脂肪組織１ｇ当たり最大８．６ｘ１０４の間質細胞が存在する(Sen et al., 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319)。２〜４週間にわたるex vivoでの増殖により０．５ｋｇの脂肪組織から最大５億の間質細胞が得られる。これらの細胞はすぐに使用することができ、または今後の自己または同種適用のために低温保存することもできる。
【０１１８】
脂肪由来間質細胞はまた、数多くの付着および表面タンパク質も発現する。これらには、限定されるものではないが、細胞表面マーカー例えばＣＤ９；ＣＤ２９（インテグリンβ１）；ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）；ＣＤ４９ｄ，ｅ（インテグリンα４、５）；ＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）；ＣＤ５５（崩壊促進因子）；ＣＤ１０５（エンドグリン）；ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）；ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）およびＨＬＡ−ＡＢＣ（クラスＩ組織適合性抗原）；ならびにサイトカイン例えばインターロイキン６、７、８、１１；マクロファージ−コロニー刺激因子；ＧＭ−コロニー刺激因子；顆粒球−コロニー刺激因子；白血病抑制因子；幹細胞因子および骨形成タンパク質が含まれる。これらのタンパク質の多くは造血支持機能を果たす可能性を有し、それらの大部分は一般に骨髄間質細胞に共有される。
【０１１９】
本発明の方法において有用な脂肪組織由来幹／間質細胞は、the University of Pittsburgh et alのＷＯ  ００／５３７９５に記載されているような当業者に公知の種々の方法によって単離される。好ましい方法では、脂肪組織は哺乳類被験体、好ましくは、ヒト被験体から単離される。一態様では、脂肪組織源は大網脂肪である。もう１つの態様では、脂肪組織源は皮下脂肪である。ヒトでは、前記脂肪は一般に脂肪吸引術により単離される。本発明の細胞がヒト被験体に移植される場合には、前記脂肪組織は、自己移植物を提供するためにその同じ被験体から単離されることが好ましい。あるいは、前記移植細胞は同種である。
【０１２０】
単離、培養、分化誘導を助けるために、そして本発明の細胞を特徴付けるために使用することができる多くの技術が当業者に公知である(Gorio et al., 2004, Neuroscience, 125: 179-189; Yamashita et al,, 2005, J. Cell Sci., 118:665-672; Conley et al., 2004, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 36:555-567; Kindler, 2005, Journal of Leukocyte Biology, 78:836-844; Fuchs et al., 2004, Cell, 116:769-778; Campos, 2004, Journal of Neuroscience Research, 78:761-769; Dontu et al., 2005, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, 10:75-86)。
【０１２１】
一態様では、本発明は、様々な大きさのＳＯＭ−Ｂを形成するために必要な細胞の最適な数を決定するための方法を提供する。一態様では、前記ＳＯＭ−Ｂは「有効な」ＳＯＭ−Ｂと考えられ、この場合、有効なとは、増殖、分極、分化能力などの所望の特徴を表示する能力があることを意味する。本発明はまた、ＳＯＭ−Ｂにおいて細胞増殖が起こっている位置、産生されているマトリックスの種類、該マトリックスが産生されている位置、産生されているマトリックスの量を決定するための方法も提供する。前記特性を決定するための方法、ならびにかかる特徴を細胞増殖率などとして測定するための方法は当技術分野で公知である。
【０１２２】
ＳＯＭ−Ｂが付着細胞を発生させ得る頻度およびその発生した細胞の特徴、例えば増殖率、集密状態に達する能力、発生可塑性などを決定するために使用することができる方法もまた当技術分野で公知である。また、ＳＯＭ−Ｂ融合の頻度を決定するために、そして結果として得られた大きさ、形状、極性など測定するために使用することができる方法も入手可能である。また、ＳＯＭ−Ｂが多能性または可塑性であるかどうか、すなわち、ＳＯＭ−Ｂが２種以上の細胞型へと分化する能力を有するかどうかを検証する方法も当技術分野で公知である。かかる研究は、懸濁細胞、付着細胞、または発生細胞を使用して行うことができる。研究することができる細胞表現型としては、限定されるものではないが、脂肪細胞、骨、軟骨、骨格筋、心筋、神経系細胞例えばニューロン、膵島細胞、および内皮細胞が挙げられる。
【０１２３】
ＳＯＭＢを特性評価するための方法および試薬、例えば免疫特性評価を行うための方法および試薬も入手可能であり、それらには、限定されるものではないが、マーカーおよびタンパク質：Ｏｃｔ  ４、ＳＳＥＡ  ３、ＳＳＥＡ  ４、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１８４、ＮＧ２、ＡＢＣＧ２、ネスチン、ＭｙｏＤ、ＮＫｘ２．５、ラミニン、β１インテグリン、Ｃｂｆａｌ、コラーゲン型II、ＭＡＰＫ、ＨＬＡ−１対照、インスリン、Ｇａｔａ、Ｐａｘ、Ｗｈｔ、および他の転写因子およびタンパク質が含まれる。フローサイトメトリーマーカーとしては、ＣＤ３４、ＮＧ２、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０５、ＡＬＤＨおよびＨＬＡ−１が挙げられる。
【０１２４】
本発明はまた、in vivoでＳＯＭＢを使用するための方法も提供し、in vivoでＳＯＭＢを使用するための様々な技術は当業者に公知である。例えば、ＳＯＭＢは、様々な経路によって（局所的に、皮下に、筋肉内、および直接投与を含む）被験体に投与することができる。本発明のＳＯＭＢには種々の用途があり、そのような用途には、限定されるものではないが、血管リモデリング、骨増殖および再生、組織／細胞の代替使用（例えば膵臓／膵島、中枢神経系、皮膚修復および創傷治癒部分、末梢神経系、創傷、腱、靭帯、筋肉、器官例えば肝臓および腎臓、ならびにリンパ節）、ならびに移植手法が含まれる。
【０１２５】
ＳＯＭ−Ｂは、限定されるものではないが：
１）細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、形態形成／形状形成、アポトーシス／アノイキス、間葉−上皮、間葉−間質、および間葉−内胚葉相互作用／クロストーク、悪性形質転換、脱分化、分化形質転換、非対称細胞分裂の研究のための、基礎科学調査；
２）幹細胞アッセイ、薬物の純度および有効性、毒性学、医薬の効力の予測に用いる、診断学／アッセイ；
３）損傷、傷害、破壊または老化組織／器官に対する、細胞に基づく治療学および再生戦略、例えば単一細胞型（ＡＳＣなど）からなるＳＯＭ−Ｂの投与／使用、複数の細胞型／組合せからなるＳＯＭ−Ｂ、すなわち「ハイブリッドＳＯＭ−Ｂ」、例えば、ＡＳＣと膵島細胞、もしくはＡＳＣと骨芽細胞、ＡＳＣとＨＳＣ、もしくはケラチノサイトなどの外胚葉細胞を含むＡＳＣの投与／使用、ＳＯＭ−Ｂと他の細胞型、例えば単一細胞型、の解離細胞懸濁液の組合せ、または付着細胞から得られるおよび／もしくは懸濁状態のＳＯＭ−Ｂから得られる１種以上の細胞型もしくは解離細胞の組合せ、ならびに次の成分（限定されるものではないが、マトリックス因子、細胞外マトリックス分子、増殖因子、ホルモン、および生物活性因子を含む）の１種以上と組み合わせて使用される任意および／または全数の前記細胞順列の投与／使用；ならびに
４）ＳＯＭ−Ｂ／細胞懸濁液とは対照的に、極性、位置、表現型、遺伝子変化などに基づいて巧みに処理することができ、または生物活性因子を含むもしくは含まないマトリックス／高分子などのスキャフォールドを用いて／上に播種することができる、投与／移植前に「事前に作製された」前記のＳＯＭ−Ｂと細胞の組合せから巧みに処理された２Ｄまたは３Ｄ構築物（すなわち、細胞懸濁液、ＳＯＭ−Ｂおよび／またはスキャフォールドの構築物）を調製、研究および使用するための組織工学戦略
を含む様々な臨床および調査分野に新規影響および有用性をもたらす。「ハイブリッドＳＯＭ−Ｂ」および「キメラ−ＳＯＭ−Ｂ」は本明細書において同義的に使用される。
【０１２６】
また、ＳＯＭ−Ｂと本明細書に記載の組成物および方法は、細胞を含むもしくは含まない、処理および／または精製したＳＯＭ−Ｂ由来細胞外マトリックス利用する再生治療にも利用される。
【０１２７】
ＳＯＭ−Ｂ培養物から得られる馴化培地は診断目的に有用である。この馴化培地は再生治療にも有用である。
【０１２８】
本明細書に記載のデータは、ＡＳＣ芽体はそれらの自然微小ニッチにおいて単層培養よりも現実的にＡＳＣを形に表すことを示唆し、ＡＳＣ芽体が単一細胞懸濁液よりよく組織修復を変調し得ることもさらに示唆している。より伝統的な単一細胞懸濁液と比較すると、３−Ｄニッチ（芽体）として事前に作製されたＡＳＣを投与することによっていくつかの実質的または潜在的利点がもたらされ得、それらの利点には以下が含まれる：
・本細胞は安定した細胞−細胞接触および細胞−マトリックス接触を受けるため、アノイキスの傾向が低い。アノイキスは細胞−マトリックス相互作用の喪失によって、または不適当な細胞−マトリックス相互作用によって誘導されるプログラム細胞死として定義される。(Valentijn et al., 2004; Michel, 2003)。アノイキスは様々な細胞送達方法に関する送達および移植の低効率に重要な役割を果たし得る。細胞間相互作用は幹細胞の様々な系統（心筋細胞など）への分化に重要であることが証明されている、例えば(Li et al., 2006)；
・本細胞はそれら自身の細胞外マトリックス環境と（推定上）関連した増殖因子を生み出した(Wang et al., 2004)；
・「数の上での強み」：本細胞は生存し、単層培養では単一細胞を死に至らしめる厳しいin vitro条件（無血清培養など）に耐えることができる；
・本細胞は（培養下で）拡散によって３−Ｄ構造として生存することができ、推定上、創傷／外傷環境への移植後にも同じことができると思われる；さらに
・本細胞は様々な外部刺激に応答して増殖、移動および／または変形する能力を保持し、それらの細胞が傷害組織環境内で動的に相互作用する可能性があることを示唆している。
【０１２９】
抗体は、当技術分野で周知である方法を使用して作製し得る。例えば、米国特許出願第０７／４８１，４９１号（これは引用することによりそのまま本明細書の一部とされる）では、特定タンパク質に対する抗体の作製方法を開示している。抗体の産生のために、様々な宿主動物（限定されるものではないが、ウサギ、マウス、およびラットを含む）を、特定ポリペプチドまたはそのペプチド断片を注射することによって免疫することができる。免疫応答を高めるために、宿主種に応じて様々なアジュバントを使用してよく、そのようなアジュバントには、限定されるものではないが、フロイントのもの（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチン、pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌(bacille Calmette-Guerin)）および(corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【０１３０】
モノクローナル抗体の調製のために、培養下での連続細胞系統による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いてよい。例えば、Kohler and Milsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技術(1975, Nature 256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)を使用して、ヒトモノクローナル抗体を産生させ得る。もう１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５（これは引用することによりそのまま本明細書の一部とされる）に記載されている技術を利用して無菌動物において産生される。
【０１３１】
本発明によれば、ヒト抗体を使用し、ヒトハイブリドーマを利用することによって(Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 80:2026-2030)またはin vitroでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することによって(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)得てよい。さらに、ＳＬＬＰポリペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生について開発された技術(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 :6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)も使用することができる；かかる抗体は本発明の範囲内である。一度、特異的モノクローナル抗体が開発されたら、従来の技術による突然変異体およびそれらの異型の調製も利用できる。
【０１３２】
一実施形態では、単鎖抗体の産生について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる）は、タンパク質特異的単鎖抗体を産生するように構成される。もう１つの実施形態では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載されている技術(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)は、特異的抗原、タンパク質、誘導体、または類似体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ簡易な同定を可能にするために利用される。
【０１３３】
イディオタイプの抗体分子を含む抗体フラグメントは、公知技術によって作製することができる。例えば、かかるフラグメントには、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によってもたらされ得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって生成され得るＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成され得るＦａｂフラグメント
；およびＦｖフラグメント：が含まれる。
【０１３４】
ポリクローナル抗体の作製は、所望の動物に抗原を接種し、そこからその抗原と特異的に結合する抗体を単離することにより行われる。
【０１３５】
タンパク質またはペプチドの全長ペプチドまたはペプチド断片に対して向けられたモノクローナル抗体は、任意の周知モノクローナル抗体調製手法（例えば、Harlow et al. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)およびTuszynski et al. (1988, Blood, 72:109-115)に記載のものなど）を用いて調製し得る。多量の所望のペプチドは化学合成技術を用いても合成し得る。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローニングし、多量のペプチドの作製に適した細胞において適当なプロモーター配列から発現させてもよい。ペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体は、本明細書において参照される標準的な手法を用いてペプチドで免疫したマウスから生成される。
【０１３６】
本明細書に記載の手法を用いて得られるモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野で入手可能である、例えば、Wright et al. (1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4): 125-168)およびそこで引用されている参照文献に記載されている技術を用いてクローニングし、配列決定し得る。さらに、本発明の抗体は、Wright et al.,（前掲）およびそこで引用されている参照文献、ならびにGu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759)に記載されている技術を用いて「ヒト化」し得る。
【０１３７】
ファージ抗体ライブラリーを作成するために、まず、ファージ表面で発現させる所望のタンパク質、例えば、所望の抗体を発現する細胞、例えば、ハイブリドーマから単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得る。前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーは逆転写酵素を用いて作出される。免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡはＰＣＲによって得られ、結果として得られたＤＮＡを、免疫グロブリン遺伝子を特定するＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリーを作成するのに適したバクテリオファージベクターにクローニングする。異種ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリーを作製するための手法は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)に記載されている。
【０１３８】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、そのタンパク質がその対応する結合タンパク質、例えば、その抗体が向けられる抗原との結合に利用できる方法でそのタンパク質がその表面に提示されるように巧みに処理し得る。このようにして、特異的抗体を発現するバクテリオファージを、その対応抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートする場合には、そのバクテリオファージは前記細胞と結合する。前記抗体を発現しないバクテリオファージは前記細胞と結合しない。かかるパニング技術は当技術分野で周知であり、Wright et al.,（前掲）に記載されている。
【０１３９】
前記のような方法は、Ｍ１３バクテリオファージディスプレイを用いたヒト抗体の産生に関して開発されている(Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191 -280)。本質的に、ｃＤＮＡライブラリーは、抗体産生細胞の集団から得られるｍＲＮＡから作成される。このｍＲＮＡは再配列された免疫グロブリン遺伝子をコードするため、そのｃＤＮＡもそれをコードする。増幅されたｃＤＮＡを、表面でヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリーを生み出すＭ１３発現ベクターにクローニングする。目的の抗体を提示するファージを抗原結合によって選択し、細菌で増殖させて、可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを作出する。このように、この手法は、従来のモノクローナル抗体合成とは異なり、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞よりもむしろヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０１４０】
ここで示した手法では、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの作製を記載している。しかしながら、本発明を、Ｆａｂ抗体をコードするファージの作製のみに限定するものと解釈してはならない。それどころか、単鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）も本発明に含まれる。Ｆａｂ分子は、完全Ｉｇ軽鎖を含む、すなわち、それらは軽鎖の可変領域および定常領域の両方を含む、が、重鎖については可変領域単独と第１定常領域ドメイン（ＣＨ１）を含む。単鎖抗体分子は、Ｉｇ  Ｆｖフラグメントを含むタンパク質の単鎖を含む。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域しか含まず、そこには定常領域は存在しない。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含むファージライブラリーは、Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597に記載されている手法に従って作製し得る。所望の抗体の単離のためにそのように作製されたファージのパニングは、Ｆａｂ  ＤＮＡを含むファージライブラリーについて記載されている方法と同様に実施される。
【０１４１】
本発明はまた、重鎖および軽鎖可変領域が考えられる特異性のほぼ全てを含むようにその重鎖および軽鎖可変領域を合成し得る合成ファージディスプレイライブラリーも含むものと解釈すべきである(Barbas, 1995, Nature Medicine 1 :837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol.248:97-105)。
【０１４２】
抗体の産生では、所望の抗体についてのスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって行うことができる。本発明に従って作製される抗体には、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ（すなわち、「ヒト化」）抗体、および単鎖（組換え）抗体、Ｆａｂフラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメントが含まれ得る。
【０１４３】
本発明のペプチドは、標準的な、十分に確立された技術、例えばStewart et al. によってSolid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinoisに記載されており；さらにBodanszky and BodanszkyによってThe Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New Yorkに記載されている固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって容易に調製し得る。最初に、適切に保護されたアミノ酸残基をそのカルボキシル基を通じて、誘導体化された不溶性高分子支持体、例えば架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂に結合する。「適切に保護された」とは、アミノ酸のα−アミノ基と、任意の側鎖官能基の両方に保護基が存在することを指す。側鎖保護基は、一般に、合成を通じて使用される溶媒、試薬および反応条件に対して安定しており、最終ペプチド産物に影響を及ぼさない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からＮ−保護基を除去し、それと所望のペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル末端をカップリングさせることによって行われる。このアミノ酸も適切に保護される。受入アミノ酸のカルボキシルは、反応性基を形成すること例えばカルボジイミド、対称酸無水物またはヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニルエステルなどの「活性エステル」基を形成することによって活性化して、支持体に結合したアミノ酸のＮ末端と反応させることができる。
【０１４４】
固相ペプチド合成方法の例としては、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを利用したＢＯＣ法、およびアミノ酸残基のα−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するＦＭＯＣ法が挙げられ、これらの両方法は当業者に周知である。
【０１４５】
Ｎ−および／またはＣ−封鎖基の組込みも固相ペプチド合成方法に慣用のプロトコールを用いて行うことができる。Ｃ末端封鎖基の組込みのために、例えば、所望のペプチドの合成は、一般に、固相として、支持樹脂から切断することによって所望のＣ末端封鎖基を有するペプチドが得られるように化学修飾された支持樹脂を使用して行われる。Ｃ末端に第１級アミノ封鎖基を有するペプチドを提供するためには、例えば、ペプチド合成が完了した際にフッ化水素酸で処理することによって所望のＣ末端アミド化ペプチドを放出するように、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用して合成は行われる。同様に、Ｃ末端でのＮ−メチルアミン封鎖基の組込みは、ＨＦ処理によってＮ−メチルアミド化Ｃ末端を有するペプチドを放出するＮ−メチルアミノエチル誘導体化ＤＶＢ樹脂を使用して行われる。エステル化によるＣ末端の封鎖も従来の手法を用いて行うことができる。これには、樹脂から側鎖ペプチドを放出させる樹脂／封鎖基組合せの使用を必要とシ、後に所望のアルコールと反応させて、エステル官能基を形成する。この目的には、ＦＭＯＣ保護基をメトキシアルコキシベンジルアルコールまたは等価リンカーで誘導体化したＤＶＢ樹脂と組み合わせて使用することができ、支持体からの切断はジクロロメタン中ＴＦＡによって行われる。次に、適切に活性化されたカルボキシル官能基の、例えばＤＣＣによるエステル化は、所望のアルコールを添加し、続いてエステル化されたペプチド産物の脱保護および単離を行うことによって進めることができる。
【０１４６】
Ｎ末端封鎖基の組込みは、合成されたペプチドが樹脂とまだ結合しているうちに、例えば、好適な無水物およびニトリルで処理することによって行うことができる。Ｎ末端にアセチル封鎖基を組み込むためには、例えば、樹脂結合ペプチドをアセトニトリル中２０％無水酢酸で処理することができる。次に、その樹脂からＮ封鎖ペプチド産物を切断し、脱保護し、続いて単離することができる。
【０１４７】
化学的合成技術または生物学的合成技術のいずれかから得られるペプチドが所望のペプチドであることを確実にするように、ペプチド組成の分析を行うべきである。かかるアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定する高分解能質量分析を用いて行ってよい。別法として、または加えて、酸性水溶液中でペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣ、またはアミノ酸分析計を使用して混合物の成分を分離し、同定し、定量することによって、ペプチドのアミノ酸含量を確認することができる。ペプチドを順次分解し、順にアミノ酸を同定するタンパク質シークエネーターを使用して、ペプチドの配列を正確に決定してもよい。
【０１４８】
ペプチドは、その使用前に精製して、混入物質を除去する。これに関して、ペプチドは、適切な監督官庁によって設定された基準に合うように精製されるということは分かるであろう。例えば、アルキル化シリカカラム例えばＣ４−、Ｃ８−またはＣ１８−シリカを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、数多くの従来の精製手法のうちの任意の１つの手法を用いて、必要な水準の純度を得てよい。一般には、漸増有機含有量の勾配移動相、例えば、少量のトリフルオロ酢酸を通常含む水性バッファー中アセトニトリルを使用して、精製を行う。また、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ペプチドを電荷に基づいて分離することもできる。
【０１４９】
当然、ペプチドまたは抗体、誘導体、もしくはそれらの断片は、活性に影響を及ぼすことなく修飾されるアミノ酸残基を組み込み得ることは分かるであろう。例えば、封鎖基、すなわち、「望ましくない分解」からＮ−およびＣ−末端を保護しかつ／または安定させるのに適した化学置換基を含むように末端を誘導体化し得、「望ましくない分解」は化合物の機能に影響を及ぼす可能性があるその末端での化合物の任意のタイプの酵素的、化学的または生化学的分解、すなわち、その末端での化合物の逐次分解を包含することを意味する。
【０１５０】
封鎖基には、ペプチドのin vivo活性に悪影響を及ぼさない、ペプチド化学の分野で通常使用される保護基が含まれる。例えば、好適なＮ末端封鎖基はＮ末端のアルキル化またはアシル化によって導入することができる。好適なＮ末端封鎖基の例としては、Ｃ１−Ｃ５分枝または非分枝アルキル基、ホルミル基およびアセチル基などのアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基などのそれらの置換形が挙げられる。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なＮ末端封鎖基であり、ペプチドのＮ末端とカップリングするか、またはＮ末端残基の代わりに使用することができる。Ｃ末端のカルボキシル基が組み込まれるまたは組み込まれない好適なＣ末端封鎖基としては、エステル、ケトンまたはアミドが挙げられる。Ｃ末端封鎖基の例は、エステルまたはケトン形成アルキル基、特に低級アルキル基例えばメチル、エチルおよびプロピル、ならびにアミド形成アミノ基例えば第一級アミン（−ＮＨ２）、およびモノ−およびジ−アルキルアミノ基例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどである。アグマチンなどのデスカルボキシル化アミノ酸類似体も有用なＣ末端封鎖基であり、ペプチドのＣ末端残基とカップリングするか、またはそれの代わりに使用することができる。さらに、ペプチドから末端の遊離アミノおよびカルボキシル基を完全に除去して、ペプチド活性に影響を及ぼさずにそれらのデスアミノおよびデスカルボキシル化形態を得ることができることは分かるであろう。
【０１５１】
他の修飾も活性に悪影響を及ぼさずに組み込むことができ、これらの修飾には、限定されるものではないが、１つ以上の天然Ｌ−異性体アミノ酸のＤ−異性体アミノ酸との置換が含まれる。よって、ペプチドは１つ以上のＤ−アミノ酸残基を含み得、または全てＤ型であるアミノ酸を含み得る。本発明に従うＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチド、例えば、全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸型と置換されている逆転ペプチドも考えられる。
【０１５２】
本発明の酸付加塩も機能的等価物として考えられる。よって、ペプチドの水溶性塩を提供するために、無機酸例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、または有機酸例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などで処理した本発明のペプチドは本発明での使用に適している。
【０１５３】
本発明はまた、タンパク質の類似体も提供する。類似体は、天然に存在するタンパク質またはペプチドと、保存的アミノ酸配列の違いによってまたは配列に影響を及ぼさない修飾によって、あるいはその両方によって異なり得る。
【０１５４】
例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列を変更するが、通常はその機能を変更しない保存的アミノ酸変化を加えてよい。これを受けて、１０以上の保存的アミノ酸変化は、一般に、ペプチドの機能には影響を及ぼさない。保存的アミノ酸置換には、一般に、以下の群内での置換が含まれる：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１５５】
修飾（通常は一次配列を変更しない）には、ポリペプチドのin vivo、またはin vitroでの化学誘導体化、例えば、アセチル化、またはカルボキシル化が含まれる。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセッシング中にまたはさらなるプロセッシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって；例えば、ポリペプチドをグリコシル化に作用する酵素、例えば、哺乳類グリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素に曝露することによって、もたらされるものも含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基を有する配列、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンも包含される。
【０１５６】
また、タンパク質分解に対するそれらの耐性を向上させるようにまたは溶解特性を最適化するようにまたは治療薬としてより適したものにするように、通常の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドまたは抗体フラグメントも含まれる。かかるポリペプチドの類似体には、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基を含むもの、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然には存在しない合成アミノ酸が含まれる。本発明のペプチドは、本明細書に記載のいかなる特定の模範的な方法の産物にも限定されない。
【０１５７】
本明細書に記載のとおりに得られる実質的に純粋なタンパク質はタンパク質精製についての公知手法に従うことによって精製し得、その際にはその手法の各段階において精製を監視するために、免疫アッセイ、酵素アッセイまたは他のアッセイを用いる。タンパク質精製方法は当技術分野で周知であり、例えばDeutscher et al. (ed., 1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego)に記載されている。
【０１５８】
本発明の方法に有用である医薬組成物は、投与に適した処方物で調製され、パッケージングされ、または販売され得る。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、大量に、一回分の単一単位用量として、または複数回分の単一単位用量として調製され、パッケージングされ、または販売され得る。本明細書において、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物（すなわち、細胞、ＳＯＭ−Ｂ、異なる大きさのＳＯＭ−Ｂなど）の独立した量である。本発明の医薬組成物中の有効成分、医薬上許容される担体、および任意の追加成分の相対量は、処置する被験体の特性、大きさ、および状態によって異なり、さらに組成物が投与される経路によっても異なる。本発明の医薬組成物は、有効成分の他に、１種以上の追加の医薬上活性な薬剤をさらに含み得る。
【０１６０】
本明細書において、医薬組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的突破を特徴とする任意の投与経路および組織の突破を通じた医薬組成物の投与を含む。よって、非経口投与には、限定されるものではないが、組成物の注射、外科的切開を通じた組成物の適用、組織に貫通する非外科的創傷を通じた組成物の適用などによる医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与は、限定されるものではないが、皮下、腹腔内、および筋肉内注入技術を含むと考えられる。
【０１６１】
非経口投与に適した医薬組成物の処方物は、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの医薬上許容される担体と組み合わせた有効成分を含む。かかる処方物は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製され、パッケージングされ、または販売され得る。注射処方物は、アンプルまたは防腐剤を含む複数投与用容器などの単位投与形で調製され、パッケージングされ、または販売され得る。非経口投与用処方物としては、限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、および埋め込み可能な持続放出性または生分解性処方物が挙げられる。かかる処方物は、限定されるものではないが、懸濁化剤、安定剤、または分散剤を含む１種以上の追加成分をさらに含み得る。非経口投与用処方物の一実施形態では、前記有効成分は、好適なビヒクル（例えば滅菌パイロジェンフリー水）で再構成される乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供され、再構成後に再構成された組成物が非経口投与される。
【０１６２】
本発明はまた、本発明の組成物とその組成物の投与または使用を記載する教示材料を含むキットも含む。もう１つの実施形態では、このキットは、本発明の組成物を投与する前にその組成物を溶解または懸濁するのに適した（好ましくは、滅菌）溶媒を含む。
【０１６３】
本明細書において、「教示材料」には、脂肪幹細胞の濃縮および増殖をもたらすためのキット中の本発明の有用性を伝達するために使用することができる刊行物、記録、図表、または任意の他の表現媒体が含まれる。所望により、または代替的に、教示材料には哺乳類の細胞または組織における疾患または障害を緩和する１以上の方法が記載されていることもある。本発明のキットの教示材料は、例えば、本発明の組成物が入っている容器へ添付され得るか、または抗体が入っている容器とともに出荷され得る。あるいは、この教示材料は、レシピエントによって教示材料と化合物が協力的に使用されるという意図で、容器とは別に出荷してもよい。
【実施例】
【０１６４】
一般的方法
本発明の方法において有用な脂肪組織由来幹／間質細胞は、当業者に公知の種々の方法によって単離することができる。好ましい脂肪組織源は皮下脂肪である。ヒトでは、前記脂肪は一般に脂肪吸引術により単離される。
【０１６５】
ヒト脂肪組織由来成体幹／間質細胞は、患者に対する危険性または不快感を最小限に抑えて日常的に採取することができる細胞源である。ヒト脂肪組織由来成体幹／間質細胞は、ex vivoで増殖させ、独自の系統経路に沿って分化させ、遺伝子操作し、自己移植または同種移植のいずれかとして個体に再導入することができる。
【０１６６】
ヒト脂肪組織由来細胞の単離、増殖、および分化のための方法は報告されている。例えば、Burris et al 1999, Mol Endocrinol 13:410-7; Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commun. Jan. 18, 2002; 290(2):763-9; Gronthos et al 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al 2001, Tissue Eng. 7(6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281 :907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517参照。脂肪組織由来間質細胞は、ヒト脂肪組織切片からコラゲナーゼ消化および分画遠心によって得られる(Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Hauner et al 1989, J Clin Invest 84:1663-1670; Rodbell et al 1966, J. Biol. Chem. 241: 130-139)。ヒト脂肪組織由来間質細胞を脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞系統経路に沿って分化させることができることを証明した人もいた(Erickson et al 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. Jan. 18, 2002; 290(2):763-9; Gronthos et al 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al, 2001, Tissue Eng. Dec. 7, 2001; (6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517; Zuk et al 2001, Tissue Eng. 7: 211-228)。他の有用な技術も利用可能である。
【０１６７】
上記に示した方法を用いて、脂肪組織および脂肪幹細胞を単離することができる。
【０１６８】
ＡＳＣは単層培養条件で独立した細胞「クラスター」または細胞の「結節」を形成することがあるという本発明者らによる観察に基づいて以下に記載する試験を開始した。
【０１６９】
培地の開発
２００５年９月８日、および２００５年９月１２日出願のそれぞれ、米国仮出願第６０／７１５，０２５号および同第６０／７１６，３３７号の優先権の利益を主張し、これらの米国仮出願の開示内容は引用することによりそのまま本明細書の一部とされるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／３４９１５（Katz and Parker；２００６年９月８日出願）に記載のとおり、原型基本培地に用いるためにＤＭＥＭ／Ｆ１２を選択した。ＡＳＣの増殖率を高めることが示された各成分の段階的な添加によって連続濃縮培地を作り出した。表１にこのプロセスと各反復でスクリーニングされた成分の一覧を要約する。
【０１７０】
【表２】
2009525044.tif 000005
【０１７１】
後の研究によって検証された最終的なレシピは、５種の増殖因子、４種のホルモン、数種の栄養補給物を補給し、０．５％ヒト血清を自由選択で補給した基本培地  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む（表２）。表２では、最初の基本レシピから開始し、その後、修飾を細胞増殖を高めるそれらの能力について個別にスクリーニングした研究を要約する。開始処方と比べて統計的に有意な増殖の増加を示す前記修飾を新たな基本レシピに加えた。これを段階的に繰り返して、リッチな基本培地の開発を導いた。
【０１７２】
本発明の基本培地成分を表２に示し、その表２にはＤＭＥＭ／Ｆ１２と表２に記載した成分を含めている。
【表３】
2009525044.tif 000006
【０１７３】
簡潔には、基本成分には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、抗生物質、栄養物（アミノ酸、脂肪酸、無機物）、増殖因子、および／もしくはホルモン、ならびにまたは接着因子：が含まれる。数種類のアルブミンを試験した。
【０１７４】
表２の培地の調製は、５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibcoカタログ番号１１３２０−０３３；  Invitrogen Corp）、２５０μｌ  Ｌ−グルタミン（Gibcoカタログ番号２５０３０−０８１，Invitrogen Corp）、５ｍｌ抗生物質  抗真菌薬（Gibcoカタログ番号１５２４０−０６２，Invitrogen Corp）、２．５ｍｌ  ＩＴＳ＋３（Sigma  Ｉ−２７７１）、２５０μｌ脂肪酸補給物（Sigma  Ｆ−７０５０）、５ｍｌ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibcoカタログ番号１１１４０−０５０，Invitrogen Corp）、５０μＭ  ＡＳＡＰ（Sigma  Ａ−８９６０）、１ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（Research Diagnostics Inc.、ＲＤＩ−１１４ｂ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（R&D Systems  ２３６ＥＧ）、１ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＧＦ−β（Research Diagnostics Inc. ＲＤＩ−１０２２Ｂ）、１ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦα（Research Diagnostics Inc.，ＲＤＩ−３０１）、１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β（Research Diagnostics Inc.，ＲＤＩ−２０１Ｂ）、１ｘ１０−８Ｍ  β−エストラジオール（Sigma  Ｅ２７５８−１Ｇ）、１ｘ１０−８Ｍプロゲステロン（Sigma  Ｐ８７８３−５Ｇ）、１ｘ１０−８Ｍデキサメタゾン（Sigma  Ｄ−８８９３）、および５００ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Sigma  Ｈ０８８８−１Ｇ）：の使用を含む。ＡＲ９培地調製ではＡＲ８のＩＴＳ＋３を表２の右欄の成分と置き換える。
【０１７５】
間葉系幹細胞集合体の調製および特性評価
方法
自己組織化間葉系芽体（ＳＯＭ−Ｂ）の形成：
単層培養による低継代ＡＳＣを、製造業者の使用説明書に従ってＤｉＩまたはＤｉＯ(Molecular Probes)で前標識した（存在する場合には血清を除去するために細胞をすすぎ、  代表的な染料溶液を含む無血清培地（１：２００）中、３７℃で１５分間インキュベートし、続いて過剰の染料を除去するために再度すすいだ）。
【０１７６】
細胞をトリプシンで処理して、プラスチックから離した。遠心分離を経てペレットを得た。それらの細胞を、所望の希釈に適当な量の培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳまたは化学的に定義された低血清または無血清）で希釈した。所望の数の細胞（５００〜５０，０００）を含む培地の様々な量（１５〜３０μｌ）をピペットで培養プレートカバー上に移した。一部の試験では、培養プレートカバーを逆さにひっくり返して、「懸滴」を生じさせた。
【０１７７】
培地が乾燥しないようにプレートを高湿チャンバーに入れた。液滴を標準的な組織培養インキュベーター内で４８時間維持した。
【０１７８】
結果として生じたスフェア／ＳＯＭ−Ｂをピペットで超低付着性（ＵＬＡ）ウェル／プレート（Corning）に移した。一部のＳＯＭ−Ｂを１ウェル当たり１つのＳＯＭ−Ｂで９６ウェルプレートにプレーティングして、個々のＳＯＭ−Ｂの変化を経時的に記録した。一部のＳＯＭ−Ｂを１ウェル当たり複数のＳＯＭ−Ｂの群として１２ウェルＵＬＡプレートと２４ウェルＵＬＡプレートにプレーティングした。
【０１７９】
前記方法の変形は、ＵＬＡプレートの底でＡＳＣ含有液滴を形成することである。液滴中でＳＯＭ−Ｂが形成した後、プレートを、表面を上にひっくり返し、目的培地を充填して、ＳＯＭ−Ｂを懸濁状態に置く。この手法ではＳＯＭ−Ｂを手で取り扱わないようにする。
【０１８０】
前記方法のもう１つの変形は、ＵＬＡプレート内で培地中高密度で所定数のＡＳＣを懸濁し、続いて、結果として生じたＳＯＭ−Ｂをそれらの大きさに基づいて選別することによってＳＯＭ−Ｂを形成することである（図９参照）。
【０１８１】
形成後、異なる培地を入れたウェルにＳＯＭ−Ｂをプレーティングした：血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ、血清を含まないＡＲ培地バージョン６（ＡＲ６）；１％ヒト血清を含むＡＲ６；血清を含まないＡＲ培地バージョン８（ＡＲ８）；ＡＲ８＋０．５％ヒト血清；およびＡＲ８＋１％ヒト血清。全ての培地に１％抗生物質を含めた。培地は定期的に交換した。一定の間隔をおいてＳＯＭ−Ｂを写真撮影して、大きさと分極の変化を追跡した。これらの結果はＳＯＭ−Ｂはそれぞれの培地中で最大３ヶ月間またはそれ以上の間維持され得ることを示している。
【０１８２】
一部の試験では、以下のとおりに、ＳＯＭ−ＢをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染料で標識して、細胞の分布を明らかにした：ＳＯＭ−ＢをＰＢＳですすぎ、４μＭ染料溶液中で暗所において３７℃で１５分間インキュベートした。続いて、ＳＯＭ−ＢをＰＢＳですすぎ、適当な培地に入れた（図１４Ｃ参照）。一部の試験では細胞増殖の指標としてブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を使用して、細胞を標識した。
【０１８３】
凍結切片にするため、ＳＯＭ−Ｂを１０％ホルマリン中で３〜１２時間固定し、続いて、ＰＢＳ中３０％スクロース中で３〜１２  インキュベーションを行い、その後、冷却イソペンタン中で急速冷凍した。ＳＯＭ−Ｂを１０μｍの切片にし、Ｈ＆Ｅ染色（図１３）、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色、アリザリンレッド染色、および／または免疫組織化学のために処理した。ＳＯＭ−Ｂの自然形成について試験するために、ＡＳＣをＵＬＡ培養プレート内で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中または無血清ＡＲ８中、浮遊細胞の「超集密」層化を可能にする超高細胞密度で懸濁状態にしておいた。顕微鏡を使用してプレートを定期的に調べて、ＳＯＭ−Ｂの自然形成を監視し、記録した（図９）。
【０１８４】
結果
Ｉ．ＡＳＣはいくつかの異なるアプローチを用いて制御された様式により確実にかつ再現性のある方法で三次元多細胞性集合体に形成され得る。
【０１８５】
以下に開示する研究は、懸滴法を用いて複数のドナーから単離され、培養された初期継代ＡＳＣの様々な数（５００〜５０，０００）を使用して成功したＡＳＣスフェロイド（芽体）の形成を示している。芽体は、様々な培地量（１５〜３０マイクロリットル）でならびに種々の培地タイプ（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２、他の添加物を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２、無血清ＡＳＣ培地（ＡＲ８）、または低血清ＡＳＣ培地（ヒトまたは胎児ウシいずれかの０．５〜１％血清を含むＡＲ８）を含む）で生じた。スフェロイド形成に５００または１０００のＡＳＣを使用した際には、懸滴法により複数の小クラスター／スフェロイドが生じた。これに対し、多数の細胞（２，０００、５，０００およびそれ以上）を使用した際には、９５％以上の効率で一貫した大きさの大きな単一芽体が生じた。図１は、懸滴技術を用いて形成した直後の典型的なＳＯＭ−Ｂの初期クラスター化および外観を示している。懸滴方法を用いて、ＡＳＣは、一般に、２４−７２時間以内に組織化して独立したスフェロイドを作り（図２）、その後、確実に、形態を損傷または喪失することなく懸濁または付着性培養状態に移行させることができた。図２は、それらを懸濁培養へ移行させた直後の蛍光標識（ＤｉＩ）ＡＳＣからなる、均一な大きさの明確なＳＯＭ−Ｂ複数の顕微鏡写真を示している。対照的に、図９および図１５では、使用した細胞数と懸滴状態にした時間に応じて作製され得る芽体の大きさの可変範囲を示している。パネルＤはHamilton社製２０μｌマイクロシリンジのバレル内での「ミニ−ＳＯＭ−Ｂ」の外観を示しており、それによって、in vivo送達目標に向けてＳＯＭ−Ｂの大きさを制御／操作する能力を示していることに注目すべきである。懸滴技術において５，０００より少ない細胞を使用する際には、１つの大きな明確なスフェアではなくむしろ様々な大きさの「ミニ−ＳＯＭ−Ｂ」複数が生じる；予測可能かつ再現可能な大きさのＳＯＭ−Ｂを形成するには約５，０００以上の細胞が必要であると思われる。
【０１８６】
ＡＳＣ芽体は、超低付着性プレートを使用してＡＳＣを懸濁状態で超高密度で培養することによっても形成され得る。この方法を用いて、ＡＳＣの浮遊層は、前記と同様の種々の培養培地中で２４〜７２時間かけて自己集合する。懸滴技術とは異なり、この方法を用いて生じた芽体は大きさが均一ではなく、１集合体当たりのＡＳＣの数は限定されない。図９では、記載した「高密度浮遊細胞」技術を用いたＡＳＣ芽体の形成を示す２つのパネルを示している。
【０１８７】
芽体形成に対する細胞培養／細胞継代の影響および濃縮ＡＳＣ亜集団の効果を評価するために、さらなる研究を行った。ＳＯＭ−Ｂは、新たに単離された、プラスチックに触れたことのないＡＳＣで生じることができることが分かった。これらのＳＯＭ−Ｂは、付着性単層培養において１または２継代間増殖させた細胞から生じたスフェアと類似した形成特性、付着特性、および「発生」特性を示した。
【０１８８】
５ｘ１０２、１ｘ１０３、２ｘ１０３および５ｘ１０３のＦＡＣＳ選別ＡＳＣからのＳＯＭ−Ｂ形成について試験するために、さらなる研究を行った。以下のとおりに、細胞外抗原ＣＤ３４および細胞内ＡＬＤＨの有無により細胞を亜集団に選別した：ＡＬＤＨ＋単独、ＡＬＤＨ−単独、ＣＤ３４＋／ＡＬＤＨ＋、ＣＤ３４＋／ＡＬＤＨ−、ＣＤ３４−／ＡＬＤＨ＋、ＣＤ３４−／ＡＬＤＨ−。これら全ての群間ではＳＯＭ−Ｂ形成頻度に差は認められず、ＣＤ３４およびＡＬＤＨの有無では集合およびＳＯＭ−Ｂ形成能力の高いまたは低い細胞が事前選択されないことを示唆している（表３）。
【０１８９】
【表４】
2009525044.tif 000007
【０１９０】
II．ＡＳＣ芽体は、細胞と可変量の自然発生した細胞外マトリックスからなる。
ＳＯＭ−Ｂの細胞性と細胞形状を決定するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を用いて、核を標識した。これにより、ＳＯＭ−Ｂ全体にわたる広範囲に及ぶ外見上損傷のない細胞性が明らかになった（図１４Ｃ参照）。ＳＯＭ−Ｂの細胞性と構造をさらに評価するために、一部のＳＯＭ−Ｂを固定し、切片にし、染色した。この研究では、かなり均一な細胞性と豊富な細胞外マトリックスを有する構造が明らかになった。図１３、図１４および図１９に見られように、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−０％血清、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−１０％ＦＢＳ、またはＡＲ＋０％血清のいずれかで維持した代表的なＳＯＭ−ＢのＨ＆Ｅ染色により、ＳＯＭ−Ｂが大きくなるのは、強い細胞増殖および／または細胞外マトリックス産生によるものであることが示唆されている。さらに、ＳＯＭＢの細胞の最外層は上皮の、すなわち円柱状の外観を有するように見え、これらの細胞の上皮転換の問題を提起する。ＳＯＭ−Ｂ内での細胞増殖の差異は図１４Ｂで可視化された蛍光の差異（すなわち、偏光蛍光）に反映される。
【０１９１】
形成されたＳＯＭ−Ｂを最もよく解離する方法を決定するために、いくつかの研究を行った。ＳＯＭ−Ｂを、それらの細胞成分を単離する目的で種々の化合物および手法に供した。これらには、トリプシン、コラゲナーゼ、およびＳＯＭ−Ｂの機械的解離／攪拌が含まれた。ＳＯＭ−Ｂは、各段に強く持続的な耐性がある機械的解離戦略であることが分かった。酵素化合物（コラゲナーゼ、トリプシンなど）は最良の解離をもたらし、ＳＯＭ−Ｂ内の確立された細胞外マトリックス環境の存在をさらに示した。
【０１９２】
III．ＡＳＣ芽体は付着性培養において長期間維持することができ、付着性培養条件において高度自己再生能力を示す。
通常の組織培養プレート上にプレーティングすると、ＳＯＭ−Ｂは、そのＳＯＭ−Ｂから伸びる細胞突起によってプラスチックに「固定された」状態になった（図８参照）。ＳＯＭ−Ｂは、明らかに、固定している細胞突起の付着および解離の差異によって、プレートの表面上を複雑なパターンで移動し得る。付着直後、ＳＯＭ−Ｂは周辺部に後代細胞を「発生させる」（図１０Ｂ、図１１Ａ、および図１１Ｂ参照）。細胞はＳＯＭ−Ｂから増殖し、宿主プレート中に集密状態まで存在し続けた（図１０Ｃ参照）。さらに、付着ＳＯＭ−Ｂは、培養物から取り、新しい培養器に移し、または継代することができ、その培養器でそれらが容易に付着し、さらなる後代を発生させることが分かった。本発明者らは本書の執筆時点においてかかる付着ＳＯＭ−Ｂを３０回近く継代しており、２０代継代以降では後代細胞の発生は減少したが、それらは、集密状態まで増殖し、多系統発生可塑性を維持する単層ＡＳＣを生成し続ける（現在まで〜１５代継代細胞で試験した）。
【０１９３】
ＩＶ．ＡＳＣ芽体は懸濁培養において長期間維持することができ、様々な無血清懸濁培養条件で増殖させた際に強い生存能力を示す。
ＡＳＣ芽体はまた、ＵＬＡ培養製品を使用して懸濁（すなわち、浮遊）培養においてもうまく培養することができる。ＳＯＭ−Ｂは、顕微鏡像、Ｈ＆Ｅ組織学、および付着性培養に変えた際に新しい細胞を発生させるそれらの能力に基づいて、懸濁培養において少なくとも３ヶ月（試験した最長期間）生存することができる。ＤＭＥＭ−０％血清中で１ヶ月もの期間増殖させたＳＯＭ−Ｂでさえも、顕微鏡での評価、ならびにＤｉＩ蛍光に基づいて、それらのコンパクトな構造を維持した。さらに、かかるＳＯＭ−Ｂを通常の組織培養プレート上にプレーティングすると、それらはプラスチックに容易に付着し、細胞を発生させた。つまり、ＳＯＭ−Ｂが血清または他の添加物を含まない非添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持される際でも、細胞は生存することができるということを示す。また、これは、最もミニマリズムな培養条件の場合でも維持および再生可能なニッチ環境を示唆している。興味深いことに、ＳＯＭ−Ｂは低血清または無血清培地中で自然形成することも観察され（図２２参照）、ＡＳＣは、自己を組織化してネットワークを作ることによって、それら自身の生存に必要な因子／条件を生み出すことを示唆した。
【０１９４】
Ｖ．懸濁培養において増殖させたＡＳＣ芽体は様々な環境条件に応じて異なる動的増殖、形態形成、および／または自己組織化についての能力を示す。
細胞増殖、細胞移動およびＳＯＭ−Ｂの全体形状を可視化するために、一部の試験では、Ｄｉｌ標識ＡＳＣを用いてＳＯＭ−Ｂを形成させた。結果は、化学的に定義された増殖因子補給無血清のまたは低血清培地（ＡＲ８）中で懸濁状態で増殖させた際にＳＯＭ−Ｂは劇的に大きくなったことを示している。さらに、これらの無血清条件（ＡＲ８）下では、ＳＯＭ−Ｂは主として一方向に増殖し、結果として、細長い卵形状になるように見える。これらの結果は、略球形状の増殖パターンを示す、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でＳＯＭ−Ｂを増殖させる際に見られるものとは異なる（図３、図４、図５および図６参照）。
【０１９５】
ＡＳＣ芽体は、ＡＲ８培地中で増殖させた際のそれらの大きさの著しい増加に加えて、興味深い分極形状も示し、この分極形状は蛍光ＤｉＩ標識に容易に反映される。図３、図４、図５、図６および図７に見られるように、蛍光標識したＳＯＭ−ＢがＡＲ８培地中で増殖するにつれて、新しく生じた「極」は、「コア」、すなわち、強い蛍光の「極」と比べると蛍光が比較的弱くなる。この増殖差異は極めて顕著であり、さらに場合によってはＳＯＭ−Ｂ内での細胞の特定亜集団の非対称細胞分裂および／または能動的複製を反映する。いずれにしても、これらのデータは自己調節幹／間質細胞ニッチとしてのＳＯＭ−Ｂの概念を強く裏付けている。１０％ＦＢＳ中で増殖させたＳＯＭ−Ｂは、より少ない増殖を示すだけではなく、それらは蛍光勾配に反映される著しい増殖差異も示さない（図４および図５）。
【０１９６】
ＢｒｄＵパルシングを用いたさらなる試験では、ＡＲ８培地中で増殖させた芽体内でのＡＳＣの方向性増殖がさらに示された。図１９Ａの光学顕微鏡写真では、無血清ＡＲ８培地中で懸濁培養において増殖させたＳＯＭ−Ｂ（ＡＳＣ−ＭＢ）が分極および方向性増殖の兆候を示していることが分かる。同じＡＳＣ−ＭＢのＨ＆Ｅ組織学では、ＡＳＣ由来細胞外マトリックスの背景全体に明確な核を示している（１９Ｃ）  同じ切片（１９Ｂ）の蛍光顕微鏡写真では、（ＭＢの右側に向かって）増殖中の「頂端」部と比べてより強い細胞およびマトリックス高密度「コア」を示している。図１９Ｄは免疫組織化学的にＢｒｄＵ染色した同じＡＳＣ−ＭＢの切片（褐色の核）の光学顕微鏡写真である。このＡＳＣ−ＭＢは無血清培地中で８日間増殖させ、固定および染色の前にＢｒｄＵを加えて２４時間パルス処理した。観察された染色パターンは非蛍光極で観察される増殖活性と完全に一致している。大きさおよび組織化を自己調節するＡＳＣ芽体の能力は、融合研究によってされに例示される。いくつかの分極芽体を極めて接近して一緒に培養した際には、それらはすぐに互いに付着した。融合後、最初のうちは極めて大きいが、その新しいＳＯＭ−Ｂは、最終的にはそれら自身をＡＲ８培地中で増殖させた単一ＳＯＭ−Ｂに見られる大きさ（直径最大５００〜６００μｍ）にリモデリングし、その大きさは有効拡散距離によって定義されるアスペクト限界比の設定においてアポトーシスを反映していると思われる。さらに、融合したＳＯＭ−Ｂは動的再組織化を受け、この動的再組織化は蛍光の強いＤｉＩ＋「コア」の整列および統合から明らかである（図１２）。これらのデータは、ＡＳＣ芽体が様々な環境条件に応じて異なる動的増殖、複製、形態形成、および／または自己組織化についての能力を有するという結論を裏付けている。
【０１９７】
ＶＩ．付着性培養によるＡＳＣ芽体は多系統分化能力を示す。
付着ＡＳＣ芽体を、付着後すぐにそれらを系統誘導条件に曝すことによって、多系統発生可塑性について試験した。図１６〜１８および図２３〜２６に見られるように、ＡＳＣ芽体は、繰り返し継代した後でさえも（図１７および図１８）、そして、種々の異なる培地中でのそれらの初期懸濁培養にもかかわらず（図２３〜２６）、脂肪生成および／または骨形成をすぐに受ける。
【０１９８】
ＶII．懸濁培養によるＡＳＣ芽体は多系統分化能力を示す。
ＡＳＣ芽体を、それらを系統誘導条件に様々な時間で曝すことによって、懸濁培養における多系統発生可塑性について試験した。図２７〜２９に見られるように、懸濁状態のＡＳＣ芽体は多系統分化能力を示唆する組織学的特徴を示している。
【０１９９】
本明細書において引用したいかなる特許、特許出願、および刊行物の開示内容も、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。見出しは、参照用に、そしてある特定の節を見つける助けをするように本明細書に含まれる。これらの見出しは、その中で下に記載されている概念の範囲を限定するものではなく、これらの概念は本明細書全体を通じて他の節にも適用可能であり得る。
【０２００】
使用しているが本明細書には記載していない他の方法は周知のものであり、臨床技術、化学技術、細胞技術、組織化学的技術、生化学的技術、分子生物学技術、微生物学技術および組換えＤＮＡ技術の分野の業者の能力の範囲内である。
【０２０１】
開示した実施形態の説明は、いかなる当業者でも本発明を作製または使用することができるように示している。これらの実施形態に対する様々な修飾については当業者ならば容易に理解し、本発明の精神または範囲を逸脱することなく、本明細書において定義した一般的な原理を他の実施形態に適用し得る。よって、本発明は、本明細書に示した実施形態に限定されるものではなく、本明細書に開示した原理および新規特徴と一致する最大範囲を許容するものである。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
図面の簡単な説明
写真原本の一部はカラー写真である。そのため、黒色、灰色、または白色以外の色について言及する場合には、それが本明細書に添えて提出された白黒写真の灰色として現れることに注意すべきである。
【０２０３】
【図１】左（１Ａ）および右（１Ｂ）パネルからなる、逆さにされた液滴中のＡＳＣからの自己組織化メセンコイドボディ(Self-Organizing Mesenchoid Bodies)（ＳＯＭ−Ｂ）の形成を示す顕微鏡写真画像である。
【０２０４】
【図２】均一な大きさの細胞スフェア／ＳＯＭＢの安定した形成を可能にする技術を示す顕微鏡写真画像である。
【０２０５】
【図３】図３Ａ〜Ｄからなる、ＳＯＭ−Ｂが化学的に定義された培地（ＡＲシリーズ）において多くは分極した形で劇的に増殖することを示す顕微鏡写真画像である。ＳＯＭＢ形成前にＤｉＩでＡＳＣを標識することによって（図３Ａおよび３Ｃ）増殖および分極の可視化を可能にしている（３Ｃの星印は最初の細胞集団を示している）。
【０２０６】
【図４】ＳＯＭＢが、最初の細胞の「コア」を維持しながら、合成無血清培地ＡＲ８中で３〜４週間後に増殖してそれらの最初の大きさの１０倍になることを示す顕微鏡写真画像であり、この「コア」はＳＯＭＢ形成前にＤｉＩでＡＳＣを前標識することによって明らかになる（赤色、ＡＲ８−０％中で増殖させた大型スフェア内のＤｉＩ＋「コア」）。小型スフェア（ＤｉＩにより赤色）はＤＭＥＭ／Ｆ１２−１０％ＦＢＳ中で維持されたＳＯＭＢである。
【０２０７】
【図５】図５Ａ〜Ｄからなり、顕微鏡写真画像を示し（５Ａ〜Ｃ）、１ヶ月後のＳＯＭＢインプリント領域をグラフにより示し、ＳＯＭ−Ｂが、細胞の最初の数（２Ｋ＝２，０００細胞）に関係なく増殖して最適な大きさになると思われることを示している。
【０２０８】
【図６】５つのパネルからなる、ＳＯＭ−Ｂ形成前にＤｉＩで細胞を前標識することによって極性増殖の蛍光に基づく測定を可能にすることを示す顕微鏡写真画像である（右下のパネル）。
【０２０９】
【図７】ＡＲタイプの培地中でのＳＯＭ−Ｂの極性増殖の進行を示す合成図の顕微鏡写真画像である
【０２１０】
【図８】４つのパネル（８Ａ〜８Ｄ）からなる、ゼロ血清または超低（０．５％）血清条件で数継代の間増殖させた際にＡＳＣがＳＯＭＢを自然形成することが観察された顕微鏡写真画像である。
【０２１１】
【図９】左および右パネルからなる、「液滴法」の代替法を示す顕微鏡写真画像であり：超低付着性プレートに超高密度にプレーティングした際にＡＳＣが誘導されてＳＯＭ−Ｂを形成した。
【０２１２】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄからなる、ＳＯＭ−Ｂ（１０Ａおよび１０Ｂ）が、ＳＯＭ−Ｂから伸びる細胞突起で「固定すること」によって組織培養用プラスチック製品に付着することを示す顕微鏡写真画像である。付着後、ＳＯＭ−Ｂは、最終的に培養場所に再集合する細胞を「発生させる」（Ｃ）。ＳＯＭ−Ｂはプレートから離すことができ（Ｄの星印）、新たな細胞の生成のために繰り返し再プレーティングすることができる。
【０２１３】
【図１１】左および右パネルからなる、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％またはＡＲタイプの培地＋０％血清で増殖させたＳＯＭ−Ｂによる細胞の付着、固定、および発生を示す顕微鏡写真画像である。
【０２１４】
【図１２】４つのパネル（１２Ａ〜１２Ｂ）からなる、ＳＯＭＢが接触するとそれらが細胞突起を互いに伸ばし合うことによって融合することができることを示す顕微鏡写真画像である。図１２Ａ（左上パネル）は接触したところの２つのより小さなＳＯＭＢを示す。図１２Ｂは融合の始まりを示す。融合後、ＳＯＭＢは、ＤｉＩ＋「コア」の形態変化および融合からも明らかなように、動的に再組織化し続ける（１２Ｃおよび１２Ｄ）。図１２Ｃおよび１２Ｄ（下のパネル）は複数のＳＯＭＢが融合する際に起こる自発的な自己組織化を示している。
【０２１５】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂからなり、図１３Ｂはさらに左および右パネルからなる、顕微鏡写真画像である。形成後１４日のＳＯＭ−ＢのＨ＆Ｅ染色は、スフェア全体にわたって、自然発生した細胞外マトリックスに組み込まれている明らかに生存能力のある細胞の均一分布を示し、スフェアの境界において細胞の分化が起こっている可能性を伴う。
【０２１６】
【図１４】図１４Ａ〜Ｃからなる、顕微鏡写真画像である。Ｈ＆Ｅ染色（Ａ）では細胞が増殖された最初のＤｉＩ陽性「コア」（Ｂ）とＳＯＭ−Ｂの残りの部分の間には細胞密度の差がないようであることが分かる。「生」ＳＯＭ−Ｂ（Ｃ）のＨｏｅｃｈｓｔ染色でもスフェア全体にわたって細胞のかなり均一な分布を示している。
【０２１７】
【図１５】４つのパネル（Ａ〜Ｄ）からなる、ＳＯＭ−Ｂの大きさは特定の用途、例えば傷へのin vivo送達のためなどに調整することができることを示す顕微鏡写真画像である。得られるＳＯＭＢは、１０μｌ  Hamilton社製マイクロシリンジ筒に適合するのに十分な小ささでありながら、細胞治療に最適な形状を与えることができる（１５Ｄ）。
【０２１８】
【図１６】脂肪生成培地中で１４日間培養したＳＯＭ−Ｂ由来マウスＡＳＣのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す顕微鏡写真画像である（星印は培養プレートへのＳＯＭ−Ｂの付着位置を示している）。
【０２１９】
【図１７】２回連続のＳＯＭ−Ｂ「移植」および再付着後に脂肪生成培地中で培養したＳＯＭ−Ｂ由来ヒトＡＳＣのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す顕微鏡写真画像である（星印は培養プレートへのＳＯＭ−Ｂの付着位置を示している）。
【０２２０】
【図１８】３回連続のＳＯＭ−Ｂ「移植」および再付着後に脂肪生成培地中で培養したＳＯＭ−Ｂ由来ヒトＡＳＣのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す顕微鏡写真画像である（星印は培養プレートへのＳＯＭ−Ｂの付着位置を示している）。
【０２２１】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄ（４つのパネル）からなる、懸濁培養におけるＳＯＭ−Ｂ（ＡＳＣ−ＭＢ）の方向性増殖を示す顕微鏡写真画像である。（１９Ａ）分極および方向性増殖の早期兆候を示す、無血清培地中での懸濁培養において増殖させたＡＳＣ−ＭＢの光学顕微鏡写真。（１９Ｂ）同じＡＳＣ−ＭＢのＨ＆Ｅ組織学では、ＡＳＣ由来細胞外マトリックスの背景全体に明確な核を示している。（１９Ｃ）（１９Ｂ）の同じ切片の蛍光顕微鏡写真では、（ＭＢの右側に向かって）増殖中の「頂端」部と比べてより強い細胞およびマトリックス高密度「コア」を示している。（１９Ｄ）では免疫組織化学的にＢｒｄＵ染色した同じＡＳＣ−ＭＢの切片（褐色の核）の光学顕微鏡写真を示している。このＡＳＣ−ＭＢは無血清培地中で８日間増殖させ、固定および染色の前にＢｒｄＵを加えて２４時間パルス処理した。観察された染色パターンは非蛍光極で観察される増殖活性と完全に一致している。
【０２２２】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃからなる、付着ＡＳＣの小クラスターを示す位相差画像であり、これらからやがて細胞の大きな後代がもたらされる（２０Ａ〜２０Ｃ）。
【０２２３】
【図２１】付着ＡＳＣ  ＳＯＭ−Ｂの顕微鏡写真画像であり、低血清（１％ヒト血清）培地、次に１０％ＦＢＳ培地中で最初に増殖させる場合、脂肪生成培地の不在下ではＳＯＭ−Ｂ内の細胞の脂肪細胞への強い分化が起こることを示している。
【０２２４】
【図２２】無血清培地に入れる場合、付着ＡＳＣは誘導されてＳＯＭ−Ｂを形成することができることを示す顕微鏡写真画像である。融合してＳＯＭ−Ｂにはならない細胞は最終的には分離し、死滅する。
【０２２５】
【図２３】４つのパネル（図２３Ａ−左上、１０ｘ倍率；右上、４ｘ倍率；図２３Ｂ−左下、１０ｘ；右下、４ｘ）からなる、無血清ＡＲ８培地中で懸濁培養において４週間増殖させたＡＳＣ芽体の顕微鏡写真画像である。次いで、それらを付着性培養に移した。付着性培養にて４日後、それらの芽体を脂肪生成培地または骨形成培地のいずれかにさらに１４日間さらした。その後、これらの培養物を固定し、染色した。上のパネル画像は骨形成培地中で増殖させた芽体における広範囲に及ぶアリザリンレッド染色を示している。下のパネル画像は脂肪生成培地中で増殖させた芽体における遊離脂質液滴と陽性Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示している。
【０２２６】
【図２４】４つのパネル（図２４Ａ−左上、１０ｘ；右上、４ｘ；図２４Ｂ−左下、１０ｘ；右下、４ｘ）からなる、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で懸濁培養において４週間増殖させたＡＳＣ芽体の顕微鏡写真画像である。次いで、それらを付着性培養に移した。付着性培養にて４日後、それらの芽体を脂肪生成培地または骨形成培地のいずれかにさらに１４日間さらした。その後、これらの培養物を固定し、染色した。上のパネル画像は骨形成培地中で増殖させた芽体における広範囲に及ぶアリザリンレッド染色を示している。下のパネル画像は脂肪生成培地中で増殖させた芽体における遊離脂質液滴と陽性Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示している。
【０２２７】
【図２５】４つのパネル（図２５Ａ−左上、１０ｘ；右上、４ｘ；左下、１０ｘ；図２５Ｂ−右下、４ｘ）からなる、無血清を含まない非添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で懸濁培養において４週間増殖させたＡＳＣ芽体の顕微鏡写真画像である。次いで、それらを付着性培養に移した。付着性培養にて４日後、それらの芽体をさらに、脂肪生成培地中または骨形成培地中のいずれかで１４日間培養した。その後、これらの培養物を固定し、染色した。上のパネル画像は骨形成培地中で増殖させた芽体における広範囲に及ぶアリザリンレッド染色を示している。下のパネル画像は脂肪生成培地中で増殖させた芽体における遊離脂質液滴と陽性Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示している。
【０２２８】
【図２６】４つのパネル（図２６Ａ−左上、１０ｘ；右上、４ｘ；図２６Ｂ−左下、１０ｘ；右下、４ｘ）からなる、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で懸濁培養において４週間増殖させたＡＳＣ芽体の顕微鏡写真画像である。次いで、それらを付着性培養に移した。付着性培養にて４日後、それらの芽体を、対照群となるＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中でさらに１４日間培養した。その後、これらの培養物を固定し、染色した。上のパネル画像は対照培地で増殖させた芽体におけるアリザリンレッド染色を示している。下のパネル画像は対照培地で増殖させた芽体におけるＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示している。
【０２２９】
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂからなる、懸濁培養におけるＡＳＣ芽体の分化を示す顕微鏡写真画像である。ＡＳＣ芽体を無血清ＡＲ８培地を用いて懸濁培養において２週間培養した。次いで、それらを対照培地（ＡＲ８または「対照」）、骨形成培地（ＯＭ）、または軟骨形成培地（ＣＭ）に３週間、および脂肪生成培地（ＡＭ）に２週間さらした。その後、これらの芽体を凍結し、凍結切片とし、Ｈ＆Ｅで染色した。４つの画像からなる上のパネル（図２７Ａ）は、光学顕微鏡を使用して懸濁培養（対照、ＡＭ、ＯＭ、ＣＭ）により芽体を示している。４つの画像からなる下のパネル（２７Ｂ）は、Ｈ＆Ｅ染色後の図２７Ａと同じ芽体を示している。
【０２３０】
【図２８】左（対照）および右（１０ｘ倍率でのＡＭ）パネルからなる、懸濁培養におけるヒトＡＳＣ芽体の脂肪生成分化を示す顕微鏡写真画像である。ヒトＡＳＣ芽体を懸濁培養においてＡＲ８無血清培地中で２週間、その後、脂肪生成培地（ＡＭ）中で６週間増殖させた。対照芽体をＡＲ８無血清培地中で８週間培養した。その後、両方の芽体を凍結切片とし、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを用いて脂質について染色した。左パネルは対照培地における芽体を示し、右パネルは広範囲に及ぶＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示したＡＭで誘導された芽体を示している。１０ｘ倍率。
【０２３１】
【図２９】懸濁培養におけるヒトＡＳＣ芽体の骨形成分化を示す顕微鏡写真画像である。ヒトＡＳＣ芽体を懸濁培養においてＡＲ８無血清培地中で２週間、その後、骨形成培地（ＡＭ）中で６週間増殖させた。対照芽体（矢印）をＡＲ８無血清培地中で８週間培養した。その後、両方の芽体を凍結切片とし、アリザリンレッド染料を用いて石灰化マトリックスについて染色した。ＯＭで増殖させた芽体は強い染色により容易に確認されるが、一方、対照芽体（矢印）では顕著な染色は認められない。
【図１】
2009525044.tif 000008
【図２】
2009525044.tif 000009
【図３】
2009525044.tif 000010
【図４】
2009525044.tif 000011
【図５】
2009525044.tif 000012
【図６】
2009525044.tif 000013
【図７】
2009525044.tif 000014
【図８】
2009525044.tif 000015
【図９】
2009525044.tif 000016
【図１０】
2009525044.tif 000017
【図１１】
2009525044.tif 000018
【図１２】
2009525044.tif 000019
【図１３】
2009525044.tif 000020
【図１４】
2009525044.tif 000021
【図１５】
2009525044.tif 000022
【図１６】
2009525044.tif 000023
【図１７】
2009525044.tif 000024
【図１８】
2009525044.tif 000025
【図１９】
2009525044.tif 000026
【図２０】
2009525044.tif 000027
【図２１】
2009525044.tif 000028
2009525044.tif 000029
【図２３】
2009525044.tif 000030
【図２４】
2009525044.tif 000031
【図２５】
2009525044.tif 000032
【図２６】
2009525044.tif 000033
【図２７】
2009525044.tif 000034
【図２８】
2009525044.tif 000035
【図２９】
2009525044.tif 000036
【国際調査報告】
2009525044.tif 000037
2009525044.tif 000038
2009525044.tif 000039