(57)【要約】  本発明は、ポリマー粒子およびその使用に関する。ポリマー粒子は、ポリ‐ベータ-アミノ酸、ポリラクテート、ポリチオエステルおよびポリエステルから選択されるポリマーを含み得る。特に本発明は、機能化ポリマー粒子、その産生方法および使用に関する。本発明の方法、ポリマー粒子および融合タンパク質は、診断、タンパク質産生、生体触媒固定化および薬剤送達において有用性を有する。
2009509530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む宿主を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
Ｃ）培養宿主細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法。
【請求項２】
ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列または付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列あるいはその組合せ（ここで、付加的融合ポリペプチドは以下のものを含む：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインまたはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質を含むポリペプチド、および少なくとも１つの融合相手、あるいは
（ｂ）少なくとも1つのポリペプチドならびに融合ポリペプチドまたは付加的融合ポリペプチドの融合相手を結合する結合ドメイン）
を含む宿主を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法。
【請求項３】
ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）ポリマー粒子結合ドメインを含む付加的融合ポリペプチド、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質；および少なくとも１つの融合相手をコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
（４）融合ポリペプチドの融合相手または付加的融合ポリペプチドを結合するポリペプチドおよび結合ドメインを含むさらなる融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む宿主細胞を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法。
【請求項４】
宿主細胞が付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む付加的発現構築物をさらに含む請求項１記載の方法であって、融合ポリペプチドが、以下の：
ａ．ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
ｂ．少なくとも1つの融合相手
を含む方法。
【請求項５】
宿主細胞がさらに粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む付加的発現構築物を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞がさらなる融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む付加的発現構築物をさらに含む請求項１記載の方法であって、融合ポリペプチドが融合ポリペプチドの融合相手を結合するポリペプチドおよび結合ドメインを含む方法。
【請求項７】
ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列（前記ポリマー合成酵素はポリマー粒子結合ドメインを含む）；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列（前記ポリマー合成酵素はポリマー粒子結合ドメインを含む）；ならびに
（３）任意に、ポリマー粒子結合ドメインを含む付加的融合ポリペプチド、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質；および少なくとも１つの融合相手をコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む細胞を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し（前記ポリマー合成酵素が前記粒子と会合したままである場合、それが生じ、そして任意の融合ポリペプチドが存在する場合はポリマー粒子を結合する）；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法。
【請求項８】
強力なプロモーターがウイルスプロモーターまたはファージプロモーターである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
プロモーターがファージプロモーターである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターがＴ７ファージプロモーターである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が異なる融合ポリペプチドを各々がコードする2またはそれより多くの異なる発現構築物を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が異なる融合ポリペプチドを各々がコードする3またはそれより多くの異なる発現構築物を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％が表面結合タンパク質により被覆される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマー粒子の表面積の少なくとも約10％が表面結合タンパク質により被覆される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマー粒子の表面積の少なくとも約50％が表面結合タンパク質により被覆される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
約200 nm未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
約150 nm未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
約110 nm未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞当たり少なくとも約20個の粒子を産生する請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞当たり少なくとも約40個の粒子を産生する請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞当たり少なくとも約60個の粒子を産生する請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
約110 nm未満の平均直径を有する少なくとも約20個／宿主細胞の粒子を産生する請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
以下の：
ａ．カップリング試薬を融合相手と結合すること、あるいは
ｂ．カップリング試薬を融合相手と結合し、そしてある物質をカップリング試薬と結合すること、あるいは
ｃ．ある物質を融合相手と結合すること、あるいは
ｄ．ポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質をカップリング試薬と接触することにより前記ポリマー合成酵素または前記タンパク質を化学的に修飾して、少なくとも1つの結合ドメインを生成すること、
ｅ．あるいはその組合せ
をさらに包含する請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
融合相手が結合ドメインを含む請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法であって、以下の：
ａ．カップリング試薬を結合ドメインと結合すること、あるいは
ｂ．カップリング試薬を結合ドメインと結合し、そしてある物質をカップリング試薬と結合すること、あるいは
ｃ．ある物質を結合ドメインと結合すること、あるいは
ｄ．あるいはその組合せ
をさらに包含する請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの物質がポリマー粒子と結合するかまたはそれに組入れられるよう、宿主細胞を培養しながら、少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの物質またはその組合せを付加することをさらに包含する請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリマー粒子を接触することを、ポリマー粒子と結合するかまたはそれに吸着される少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの物質またはその組合せを付加することとともにさらに包含する請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記物質がポリマー粒子中に組入れられるかまたは吸着される親油性物質である請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
前記物質が日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤またはその組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２９】
前記物質が以下の：
ａ）酵素、例えばセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼ、あるいは
ｂ）再汚染防止剤、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいは
ｃ）その組合せ
から選択される１つまたは複数の清浄剤である請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３０】
前記物質が着色または蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３１】
前記融合相手がタンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ‘）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチドおよびアフィニティー精製ペプチド、またはその組合せから選択される請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合相手が以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
を包含する請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合相手が抗体結合ドメインを包含する請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
約200 nm未満の平均直径を有する複数のポリマー粒子を含む組成物であって、ポリマー粒子が以下の：
Ａ）少なくとも1つのポリマー合成酵素、または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド、ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）少なくとも1つの付加的粒子形成タンパク質、または
（２）以下を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）少なくとも1つの融合相手、または
（３）少なくとも1つの（１）および少なくとも1つの（２）
を含む組成物。
【請求項３５】
約150 nm未満の平均直径を有する複数のポリマー粒子を含む組成物であって、ポリマー粒子が以下の：
Ａ）少なくとも1つのポリマー合成酵素、または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド、ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）少なくとも1つの付加的粒子形成タンパク質、または
（２）以下を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）少なくとも1つの融合相手、または
（３）少なくとも1つの（１）および少なくとも1つの（２）
を含む組成物。
【請求項３６】
約110 nm未満の平均直径を有する複数のポリマー粒子を含む組成物であって、ポリマー粒子が以下の：
Ａ）少なくとも1つのポリマー合成酵素、または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド、ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）少なくとも1つの付加的粒子形成タンパク質、または
（２）以下を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）少なくとも1つの融合相手、または
（３）少なくとも1つの（１）および少なくとも1つの（２）
を含む組成物。
【請求項３７】
ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％が表面結合タンパク質により被覆される請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ポリマー粒子の表面積の少なくとも約10％が表面結合タンパク質により被覆される請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ポリマー粒子の表面積の少なくとも約50％が表面結合タンパク質により被覆される請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ポリマー粒子またはその組合せに結合されるかまたは組入れられる少なくとも1つの物質をさらに含む請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記物質がリン油性物質である請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記物質が日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤またはその組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である請求項４０記載の組成物。
【請求項４３】
前記物質が以下の：
ａ）酵素、例えばセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼ、あるいは
ｂ）再汚染防止剤、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいは
ｃ）その組合せ
から選択される１つまたは複数の清浄剤である請求項４０記載の組成物。
【請求項４４】
前記物質が着色または蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである請求項４０記載の組成物。
【請求項４５】
前記融合相手がタンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチドおよびアフィニティー精製ペプチド、またはその組合せから選択される請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記融合相手が以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
である請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記融合相手が抗体結合ドメインを包含する請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
ａ．  カップリング試薬が融合相手と結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬が融合相手と結合され、そしてある物質がカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質が融合相手と結合され、あるいは
ｄ．  ポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質がカップリング試薬で化学的に修飾されて、少なくとも1つの結合ドメインを形成しているか、あるいは
ｅ．  その組合せである
請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
融合相手が結合ドメインを含み、そして
ａ．  カップリング試薬が結合ドメインと結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬が結合ドメインと結合され、そしてある物質がカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質が結合ドメインと結合され、
ｄ．  あるいはその組合せである
請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法に従って産生される請求項３４〜４９のいずれか一項に記載のポリマー粒子の組成物。
【請求項５１】
以下の：
Ａ）ポリマー合成酵素を含む少なくとも1つのポリペプチド；または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド；ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）粒子形成タンパク質を含む少なくとも1つのポリペプチド、または
（２）以下のものを含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）少なくとも1つの融合相手、または
（３）その組合せ
を含むポリマー粒子であって、前記ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％がポリペプチドにより被覆されるポリマー粒子。
【請求項５２】
以下の：
Ａ）ポリマー合成酵素を含む少なくとも1つのポリペプチド；または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド；ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）粒子形成タンパク質を含む少なくとも1つのポリペプチド、または
（２）以下のものを含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）少なくとも1つの融合相手、または
（３）その組合せ
を含むポリマー粒子であって、前記ポリマー粒子の表面積の少なくとも約10％がポリペプチドにより被覆されるポリマー粒子。
【請求項５３】
以下の：
Ａ）ポリマー合成酵素を含む少なくとも1つのポリペプチド；または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド；ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）粒子形成タンパク質を含む少なくとも1つのポリペプチド、または
（２）以下のものを含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）少なくとも1つの融合相手、または
（３）その組合せ
を含むポリマー粒子であって、前記ポリマー粒子の表面積の少なくとも約50％がポリペプチドにより被覆されるポリマー粒子。
【請求項５４】
ポリマー粒子またはその組合せと結合されるかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの物質をさらに含む請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項５５】
前記物質がタンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、免疫原またはその断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはその誘導体、阻害剤、補因子、基質、酵素、補因子、受容体、受容体サブユニットまたはその断片、リガンド、阻害剤、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞またはその断片、細胞抽出物、ウイルス、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、あるいはその組合せである請求項５４記載のポリマー粒子。
【請求項５６】
前記物質が日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤またはその組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である請求項５４記載のポリマー粒子。
【請求項５７】
前記物質が以下の：
ａ）酵素、例えばセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼ、あるいは
ｂ）再汚染防止剤、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいは
ｃ）その組合せ
から選択される１つまたは複数の清浄剤である請求項５４記載のポリマー粒子。
【請求項５８】
前記物質が着色または蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである請求項５４記載のポリマー粒子。
【請求項５９】
前記融合相手がタンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチドおよびアフィニティー精製ペプチド、またはその組合せから選択される請求項５１〜５８のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項６０】
前記融合相手が以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
である請求項５１〜５８のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項６１】
前記融合相手が抗体結合ドメインを包含する請求項５１〜５８のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項６２】
ａ．  カップリング試薬が融合相手と結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬が融合相手と結合され、そしてある物質がカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質が融合相手と結合され、あるいは
ｄ．  ポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質がカップリング試薬で化学的に修飾されて、少なくとも1つの結合ドメインを形成しているか、あるいは
ｅ．  その組合せである
請求項５１〜６１のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項６３】
融合相手が結合ドメインを含み、そして
ａ．  カップリング試薬が結合ドメインと結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬が結合ドメインと結合され、そしてある物質がカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質が結合ドメインと結合され、
ｄ．  あるいはその組合せである
請求項５１〜６１のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項６４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法に従って産生される請求項５１〜６３のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項６５】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法に従って産生される請求項５１〜６３のいずれか一項に記載のポリマー粒子を含む組成物。
【請求項６６】
請求項３４〜５０のいずれか一項に記載のポリマー粒子の組成物を含む、あるいは請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の１つまたは複数のポリマー粒子を含む診断試薬。
【請求項６７】
請求項３４〜５０のいずれか一項に記載のポリマー粒子の組成物を含む、あるいは請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の１つまたは複数のポリマー粒子を含む診断キット。
【請求項６８】
ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィー・マトリックス、あるいはその組合せの上にポリマー粒子が固定化される請求項６７記載の診断キット。
【請求項６９】
試料中の少なくとも1つの標的構成成分を検出し、そして任意に単離する方法であって、以下の：
（ａ）ポリマー粒子と共有的または非共有的に結合される少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む少なくとも1つのポリマー粒子であって、前記融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）標的構成成分を結合する少なくとも1つのドメイン
を含むポリマー粒子を提供すること、
（ｂ）結合ドメインが標的構成成分を結合して複合体を形成するよう、標的構成成分を含む試料とポリマー粒子を接触させること、
（ｃ）複合体を検出すること、そして
（ｄ）任意に試料から複合体を分離すること
を包含する方法。
【請求項７０】
複合体を検出することが、複合体と、少なくとも1つの融合ポリペプチドと、またはポリマー粒子と結合する標識化分子とポリマー粒子を接触させ、そして標識化分子を検出することを包含する請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
標識化分子が標識化抗体である請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
ポリマー粒子が以下の：
ａ）ポリマー粒子と結合されるかまたはその中に組入れられる標識、あるいは
ｂ）以下のものを含む少なくとも1つの付加的融合ポリマー：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）標識化分子を結合する結合ドメイン、あるいは
ｃ）レポータータンパク質を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド
を含む請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ポリマー粒子が2またはそれより多くの異なる融合ポリペプチドを含む請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ポリマー粒子がポリマー粒子表面上に2またはそれより多くの異なる融合ポリペプチドを含む請求項６８記載の方法または系。
【請求項７５】
ポリマー粒子がポリマー粒子表面上に3またはそれより多くの異なる融合ポリペプチドを含む請求項６８記載の方法または系。
【請求項７６】
ポリマー粒子がさらにポリマー粒子またはその組合せと結合されるかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの化合物を含む請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の方法または系。
【請求項７７】
前記化合物が着色蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである請求項７６記載の方法または系。
【請求項７８】
前記結合ドメインが、以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
である請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記結合ドメインがプロテインＡまたはＺＺドメインである請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記標的構成成分がタンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体または抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、阻害剤、補因子、基質、酵素、抗体酵素、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、受容体リガンド、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、シグナル伝達分子、シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質断片、成長因子、成長因子断片、転写因子、転写因子断片、阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、炎症媒介物質、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞、細胞表面タンパク質、細胞表面脂質、細胞表面炭水化物、細胞表面糖タンパク質、細胞抽出物、ウイルス、ウイルス外被タンパク質、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、カップリング試薬、ポリヒスチジン、薬学的活性物質、生物学的活性物質、標識、カップリング試薬、ライブラリーペプチド、発現構築物、核酸、あるいはその組合せから選択される請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
標的構成成分がインターロイキン-３（ＩＬ‐３）、インターロイキン-４（ＩＬ‐４）、インターロイキン-５（ＩＬ‐５）、インターロイキン１０-（ＩＬ‐１０）、インターロイキン-７（ＩＬ‐７）、インターロイキン-１β（ＩＬ‐１β）、インターロイキン-６（ＩＬ‐６）、インターロイキン-１２ｐ７０（ＩＬ‐１２ｐ７０）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、切断ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ-２および活性カスパーゼ-３タンパク質レベル、インターロイキン-８（ＩＬ‐８）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン-８（ＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、インターフェロン-γにより誘導されるモノカイン（ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ）、単球化学誘引物質タンパク質-１（ＣＣＬ２／ＭＣＰ-１）、またはインターフェロンガンマ誘導性タンパク質-１０（ＣＸＣＬ１０／ＩＰ-１０）、あるいはその混合物から選択される請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィーマトリックスを含む支持体上に少なくとも1つのポリマー粒子が固定化される請求項６９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも1つのポリマー粒子が、以下の：
ａ．  請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法に従って産生されるポリマー粒子、
ｂ．  請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の組成物、あるいは
ｃ．  請求項５１〜６４のいずれか一項に記載のポリマー粒子
を含む請求項６９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物を含む粒子産生宿主細胞を培養することを包含する組換えポリペプチドの産生方法であって、前記融合ポリペプチドが以下の：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）細胞発現系において発現される場合に封入体を形成するポリペプチド
を含む方法であって、培養条件が発現構築物からの融合ポリペプチドの発現のために、そしてポリマー粒子の形成のために適している方法。
【請求項８５】
組換えポリペプチドの産生方法であって、以下の：
（ａ）以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）細胞発現系において発現される場合に封入体を形成するポリペプチド
を含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを提供し、そして
（ｂ）融合ポリペプチドを粒子形成反応混合物と接触させて少なくとも1つのポリマー粒子を形成する
ことを包含する方法。
【請求項８６】
粒子形成タンパク質がポリマー合成酵素を含む請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
粒子形成反応混合物がポリマー合成酵素を含む請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
融合相手が細胞発現系中で発現される場合に封入体を形成するポリペプチドである請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
宿主細胞が各々異なる融合ポリペプチドをコードする2またはそれより多くの異なる発現構築物を含む請求項８４〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
以下の：
（ａ）細胞発現系で発現される場合に封入体を形成することが予め確定されているポリペプチドを同定するために文献検索を実行し；あるいは
（ｂ）ポリマー粒子を生成し得ない細胞中で候補ポリペプチドを発現し、そして細胞を顕微鏡的に検査して、発現ポリペプチドが封入体を形成したか否かを確定する
ことにより、細胞発現系で発現される場合に封入体を形成するポリペプチドを選択する初期ステップを包含する請求項８４〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
以下の：
（１）ポリマー粒子を細胞または反応混合物から分離して、ポリマー粒子を含む組成物を産生し、そして
（２）任意にポリマー粒子から融合ポリペプチドを分離し、そして
（２）任意に融合ポリペプチドからポリペプチドを分離する
ことをさらに包含する請求項８４〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
組換えポリペプチドがリフォールディングを必要としない請求項８４〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
受容体ポリペプチドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
ｄ）少なくとも1つの融合ポリペプチドを含み、前記融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つの受容体ポリペプチド
を含む少なくとも1つのポリマー粒子を提供し、そして
ｅ）少なくとも1つのポリマー粒子を少なくとも1つの標的分子と接触させ、そして
ｆ）受容体ポリペプチドを結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法。
【請求項９４】
受容体リガンドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
（ｂ）少なくとも1つの融合ポリペプチドを含み、前記融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つの受容体リガンド
を含む少なくとも1つのポリマー粒子を提供し、そして
（ｃ）少なくとも1つのポリマー粒子を少なくとも1つの標的分子と接触させ、そして
（ｄ）受容体リガンドを結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法。
【請求項９５】
ポリマー粒子の混合集団の産生方法であって、以下の：
ｄ）発現構築物の混合集団を含有し、各発現構築物が融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つの当該ポリペプチド
を含む混合集団を含有する粒子産生宿主細胞を提供し；
ｅ）ポリマー粒子を産生し、発現構築物を発現するよう宿主細胞を誘導して、ポリマー粒子を結合する融合ポリペプチドの混合集団を産生し；そして
ｆ）任意に、ポリマー粒子の混合集団を宿主細胞から分離する
ことを包含する方法。
【請求項９６】
ライブラリーポリペプチドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
ｄ）融合ポリペプチドの混合集団を含み、前記融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つのライブラリーポリペプチド
を含むポリマー粒子の混合集団を提供し；
ｅ）ポリマー粒子を少なくとも1つの標的分子と接触させ；
ｆ）ライブラリーポリペプチドを結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法。
【請求項９７】
少なくとも1つの当該ポリペプチド、少なくとも1つのライブラリーポリペプチド、または少なくとも1つの受容体リガンドがタンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ‘）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、阻害剤、結合ドメイン、またはその組合せから選択される請求項９３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
融合ポリペプチドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
（ｄ）融合相手が少なくとも1つの受容体ポリペプチド、少なくとも1つの受容体リガンド、少なくとも1つ当該ポリペプチド、少なくとも1つのライブラリーポリペプチド、またはその組合せを含む請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の組成物を提供し、
（ｅ）前記組成物を少なくとも1つの標的分子と接触させ、そして
（ｆ）融合相手を結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法。
【請求項９９】
標的分子を同定することがポリマー粒子を標的分子と、少なくとも1つの融合ポリペプチドと、またはポリマー粒子と結合する標識化分子と接触させること、そして標識化分子を検出することを包含する請求項９３〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィー・マトリックスを含む支持体上にポリマー粒子が固定化される請求項９３〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
請求項６９〜１００のいずれか一項で定義されたようなポリマー粒子を含む診断試薬。
【請求項１０２】
請求項６９〜１００のいずれか一項で定義されたようなポリマー粒子を包含する診断キット。
【請求項１０３】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法、または請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の組成物であって、
（ｇ）前記組成物中の粒子の80％が約10 nm〜約150 nmの直径を有し；
（ｈ）前記組成物中の粒子の60％が約10 nm〜約100 nmの直径を有し；
（ｉ）前記組成物中の粒子の45％が約10 nm〜約80 nmの直径を有し；
（ｊ）前記組成物中の粒子の40％が約10 nm〜約60 nmの直径を有し；
（ｋ）前記組成物中の粒子の25％が約10 nm〜約50 nmの直径を有し；あるいは
（ｌ）前記組成物中の粒子の5％が約10 nm〜約35 nmの直径を有する
方法または組成物。
【請求項１０４】
強力なプロモーターと操作可能的に連結される発現構築物であって、以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む発現構築物。
【請求項１０５】
強力なプロモーターと操作可能的に連結される発現構築物であって、以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列または付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列あるいはその組合せ（ここで、付加的融合ポリペプチドは以下のものを含む：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインまたはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質を含むポリペプチド、および少なくとも１つの融合相手、あるいは
（ｂ）少なくとも1つの融合相手）
を含む発現構築物。
【請求項１０６】
強力なプロモーターと操作可能的に連結される発現構築物であって、以下の：
（１）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）少なくとも1つのポリペプチドならびに融合ポリペプチドの融合相手を結合する結合ドメインを含む付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む発現構築物。
【請求項１０７】
請求項１０４、１０５または１０６の発現構築物を包含するベクター。
【請求項１０８】
請求項１０４、１０５または１０６の発現構築物を包含する高コピー数ベクター。
【請求項１０９】
請求項１０４〜１０８のいずれか一項に記載の発現構築物またはベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、ポリマー粒子およびその使用に関する。特に本発明は、機能化ポリマー粒子、その産生方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多数の細菌種が、余分量の栄養素を細胞内に貯蔵するための高分子を産生するが、これは他の栄養素の欠乏により成長が損傷されるかまたは制限され得る場合、炭素の貯蔵において一役を演じることが既知である。これらのポリマー粒子は、細胞中の細胞質内封入物として沈積される。これらのポリマー粒子のコアは、典型的には、ポリヒドロキシアルキルカルボキシレート、特にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）から成る。粒子は、おそらく、リン脂質膜により取り囲まれる。
【０００３】
ＰＨＡの特性は、医療、製薬および食品産業用途における薬剤およびその他の活性物質の輸送のためのマトリックスとしてのそれらの使用のほかに、バイオプラスチックとしてのそれらの用途に関して広範に研究されてきた。
【０００４】
多数のタンパク質も、これらのポリマー粒子を取り囲むリン脂質膜内に埋め込まれることが既知である。リン脂質層内に治療用タンパク質を固定化することが意図されている。このような機能化ポリマー粒子は、血管脳関門を通ることを含めて、治療薬を輸送するのに適しているとして、意図されてきた（WO 04/020623, Rehm）。
【０００５】
ポリマービーズ、例えばアガロース・ビーズは、混合物からの標的構成成分の分離のために一般的に用いられる。例えばアフィニティー分離技法は典型的には、親和性リガンド、例えばタンパク質または抗体が共有結合されるビーズから成る固体またはゲル固定相の上のまたは通り抜ける移動相の通過を包含する。分離は、移動相中の標的構成成分と特異的に結合し、一方、非結合構成成分は洗い落とされる親和性リガンドの能力に基づいている。標的構成成分は後に溶離され、そして親和性マトリックスがさらなる使用のために再生され得る。代替的には、移動相との接触後、細胞選別機、遠心分離または濾過を用いて、ビーズは分離され得る。
【０００６】
フローサイトメトリーは、多数の予備選択特性を保有する細胞または合成ビーズのような粒子を分離し、同時に特性化するために用いられ得る。測定可能な特性としては、サイズ、容積、光散乱特質、ＤＮＡまたはＲＮＡおよび表面抗原の含量が挙げられる。
【０００７】
異なる蛍光マーカーの使用は、単一小容積試料中で同時に実行され、測定されるべき単一粒子の多パラメーター分析を可能にする。このような粒子ベースのフローサイトメトリー・イムノアッセイの例としては、多数の分析物の同時測定を可能にするＢＤ細胞数測定用ビーズアレイ（BD Biosciencesから入手可能）が挙げられる（http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/products/display_product.php?keyID=9）。これらのビーズアレイは、別個の蛍光強度で各々標識され、そして種々の分析物に特異的な抗体を捕捉するために共有結合される異なるビーズ集団から成る。捕捉分析物は次に、蛍光抗体の付加により特定的に検出され得る。このようなビーズアレイは、疾患の診断において特に有益であり、異常細胞の免疫表現型分類、異なる細胞型の比率の確定、ならびに例えば移植患者における移植片拒絶およびウイルス感染間の区別を可能にする。
【０００８】
ビーズアレイは、リガンドスクリーニング方法にも用いられ得る。WO 2004/048922は、フローサイトメトリーに適合性のＧプロテイン結合受容体のビーズベースの検出を記載する。合成ビーズは、ヘキサヒスチジン‐タグ化Ｇプロテインを結合するためにニッケルで被覆され、あるいはビオチニル化抗ＦＬＡＧ抗体を、その後ＦＬＡＧ-タグ化Ｇプロテインを結合するためにストレプトアビジンで被覆された。複合体の親和性測定値を確定するために、蛍光リガンドを野生型受容体とともに用いて、あるいは蛍光受容体融合ポリペプチドを非標識化リガンドとともに用いて、三元複合体がビーズ上に集合された。
【０００９】
組合せペプチドライブラリーの生成およびスクリーニングは、生物学的系の研究のための、ならびに薬剤療法に関する候補分子の同定における強力なツールを提供する。このような方法の有用な再検討のためには、Ruiwu Liu et al(2003)およびAdda et al., (2002)を参照されたい。
【００１０】
ペプチドライブラリーを設計し、標的分子をスクリーニングし、そして当該化合物を単離するための方法は、当該技術分野で周知である（Diaz J et al., 2003；Wolkowicz and Nolan, 2003；Doi and Yanagawa 2001）。
【００１１】
ファージ表示技法は、それらの表面にペプチドを発現し、表示するバクテリオファージの能力を利用することにより、大型ライブラリーを表示し、スクリーニングするために広範に用いられてきた（Rhyner C et al., 2002）。ファージ表示の多数の用途は、表示されているペプチドの性質によって、3つの一般的部類に項目分けされ得る。これらは、（１）タンパク質またはタンパク質断片；（２）抗体断片；ならびに（３）ランダムペプチドの表示である。
【００１２】
タンパク質またはタンパク質断片のファージ表示は、他のタンパク質、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質または小化学化合物（有機または無機）、例えば当該タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストまたは基質である化合物を結合する触媒性および非触媒性タンパク質またはその断片を同定するために用いられ得る。この型のファージ表示は、特定の反応を触媒する酵素を同定するために、タンパク質ドメインおよびＤＮＡ間の相互作用を試験するために、そしてタンパク質-タンパク質相互作用、特に多機能性タンパク質、抗体、受容体およびシグナル伝達カスケードにおけるタンパク質との相互作用を探究するために用いられてきた。ランダムペプチドのファージ表示は、特に当該標的分子と結合する新規のペプチドを同定するために、同様に用いられ得る。
【００１３】
抗体または抗体断片（特に可変部断片、例えばＦａｂおよびｓｃＦｖ）のファージ表示は、当該エピトープと結合する抗体を同定するために用いられ得る。
しかしながら直接または間接的に合成ビーズにリガンドを固定化することは、多数の問題を提示する。例えばリガンドの生物学的活性は、固定化中に減損され得る。さらに結合されるリガンドの量およびその生物学的活性は、各ビーズ集団内で、異なるビーズ集団間で、一ビーズアレイバッチ間で別のものに変化して、標準化に伴う問題を提示し得る。
【００１４】
必要とされる広範な産生手順のため、ビーズベースの単離、検出またはスクリーニングキットは非常に高価になりがちである。
【００１５】
イオン交換クロマトグラフィー・マトリックスも、細胞発現系における封入体として発現される組換えタンパク質のリフォールディングに関して研究されてきた。
多数の微生物、植物および動物ゲノムシーケンシング・プロジェクトの完了は、多数の潜在的に有用なタンパク質の同定をもたらした。タンパク質発現系の進展は、種々の宿主細胞において考え得る組換えポリペプチドの産生を引き起こした。
【００１６】
特定のフォールディングまたは翻訳後修飾要件の非存在下では、大腸菌ベースの発酵系はしばしば、好ましい発現宿主である。このような発酵は、実験室規模での良好な収量を生じるが、しかしながら工業規模への規模拡大は問題がある。
【００１７】
組換えタンパク質産生性は、ｉ）細胞当たりの組換えタンパク質の量を増大すること；ならびにｉｉ）容積単位当たりの細胞質量を増大することにより立証され得る。しかしながら大腸菌における組換えタンパク質高レベル発現はしばしば、正しく折りたたまれたネイティブタンパク質というよりむしろ部分的に折りたたまれた中間体を含む封入体として統合される不活性タンパク質の形成を生じる。
【００１８】
封入体は主に当該タンパク質から成り、そして遠心分離により崩壊宿主細胞から単離され得る。したがって不活性であるにもかかわらず、封入体としての組換えタンパク質の産生はしばしば、精製の単一方法として利用される。付加的には、封入体はしばしば、非常に高レベルへの細胞質中の組換えタンパク質の蓄積を可能にし、そして可溶性形態と比較してタンパク質分解に対する防護増大を提供する。封入体はさらに生物学的活性を有さず、そうでなければ大腸菌宿主に対して毒性であり得るタンパク質の産生を可能にする。
【００１９】
封入体からの生物学的活性産物の回収は、典型的には、カオトロピック剤または酸によるアンフォールディングとその後の最適化リフォールディング緩衝液中への希釈または透析を包含する。しかしながらこのような回収は実験室規模で可能であるが、封入体からの生物学的活性タンパク質の回収は典型的には、大規模製造のためには経費が掛かりすぎる。さらに多数のオリゴマー的または構造的複合体ポリペプチドあるいはシステイン残基を含有するものは、in vitroリフォールディング中に積極的確証を容易に受け入れない。in vivoでの溶液および活性形態での組換えタンパク質の収量を最大にすることは、多くの研究の主眼点である。
【００２０】
改良されたポリマーペプチドおよびそれらの使用方法を提供すること、あるいは公衆に有用な選択を少なくとも提供することは、本発明の一目的である。
本発明のさらなる態様および利点は、例としてのみ示される後述の説明から明らかになる。
【発明の開示】
【００２１】
発明の要約
本発明の一態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む宿主を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
Ｃ）培養宿主細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列または付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列あるいはその組合せ（ここで、付加的融合ポリペプチドは以下のものを含む：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインまたはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質を含むポリペプチド、および少なくとも１つの融合相手、あるいは
（ｂ）少なくとも1つのポリペプチドならびに融合ポリペプチドまたは付加的融合ポリペプチドの融合相手を結合する結合ドメイン）
を含む宿主を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）ポリマー粒子結合ドメインを含む付加的融合ポリペプチド、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質；および少なくとも１つの融合相手をコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
（４）融合ポリペプチドの融合相手または付加的融合ポリペプチドを結合するポリペプチドおよび結合ドメインを含むさらなる融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む宿主細胞を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法に関する。
【００２４】
一実施形態では、宿主細胞は、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー結合ドメインを含むタンパク質または粒子形成タンパク質および少なくとも1つの融合相手を含む付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む付加的発現構築物をさらに含む。
【００２５】
一実施形態では、宿主細胞はさらに、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む付加的発現構築物を含む。
一実施形態では、宿主細胞はさらに、融合ポリペプチドの融合相手を結合するポリペプチドおよび結合ドメインを含むさらなる融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む付加的発現構築物をさらに含む。
【００２６】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターと操作可能的に連結される少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列（前記ポリマー合成酵素はポリマー粒子結合ドメインを含む）；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列（前記ポリマー合成酵素はポリマー粒子結合ドメインを含む）；ならびに
（３）任意に、ポリマー粒子結合ドメインを含む付加的融合ポリペプチド、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質；および少なくとも１つの融合相手をコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む細胞を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し（前記ポリマー合成酵素が前記粒子と会合したままである場合、それが生じ、そして任意の融合ポリペプチドが存在する場合はポリマー粒子を結合する）；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法に関する。
【００２７】
一実施形態では、発現構築物は、高コピー数ベクター中に存在する。高コピー数ベクターは、複製の関連起点を含む。
一実施形態では、強力なプロモーターは、ウイルスプロモーターまたはファージプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターはファージプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターはＴ７ファージプロモーターである。
一実施形態では、宿主細胞は、異なる融合ポリペプチドを各々がコードする2またはそれより多くの異なる発現構築物を含む。
【００２８】
一実施形態では、宿主細胞は、異なる融合ポリペプチドを各々がコードする3またはそれより多くの異なる発現構築物を含む。
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約10％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約50％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、当該方法は、約200 nm未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する。
一実施形態では、当該方法は、約150 nm未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する。
一実施形態では、当該方法は、約110 nm未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する。
一実施形態では、当該方法は、宿主細胞当たり少なくとも約20個の粒子を産生する。
一実施形態では、当該方法は、宿主細胞当たり少なくとも約40個の粒子を産生する。
【００２９】
一実施形態では、当該方法は、宿主細胞当たり少なくとも約60個の粒子を産生する。
一実施形態では、当該方法はさらに、少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの物質がポリマー粒子と結合するかまたはそれに組入れられるよう、宿主細胞を培養しながら、少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの物質またはその組合せを付加することをさらに包含する。
【００３０】
一実施形態では、当該方法は、ポリマー粒子を、ポリマー粒子と結合するかまたはそれに吸着される少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの物質またはその組合せと接触させることをさらに包含する。
一実施形態では、当該物質は、ポリマー粒子中に組入れられるかまたは吸着される親油性物質である。
【００３１】
一実施形態では、当該物質は、日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤またはその組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である。
一実施形態では、当該物質は、以下の：
ａ）酵素、例えばセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼ、あるいは
ｂ）再汚染防止剤、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいは
ｃ）その組合せ
から選択される１つまたは複数の清浄剤である。
【００３２】
一実施形態では、融合相手は、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ラセマーゼ、ヒドロラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ポリメラーゼ、ジオキシゲナーゼ、モノキシデナーゼ、リアーゼ、シンセターゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスフェラーゼ、トランスアクリラーゼおよび合成酵素からなる一覧から選択される酵素である。
一実施形態では、当該物質は、着色または蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである。
【００３３】
一実施形態では、融合相手は、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチドおよびアフィニティー精製ペプチド、またはその組合せから選択される。
【００３４】
一実施形態では、融合相手は、以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
を包含する。
【００３５】
一実施形態では、融合相手は、抗体結合ドメインを包含する。
一実施形態では、当該方法は、約110 nm未満の平均直径を有する少なくとも約20個／宿主細胞の粒子を産生する。
一実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
ａ．カップリング試薬を融合相手と結合すること、あるいは
ｂ．カップリング試薬を融合相手と結合し、そしてある物質をカップリング試薬と結合すること、あるいは
ｃ．ある物質を融合相手と結合すること、あるいは
ｄ．ポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質をカップリング試薬と接触することによりポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質を化学的に修飾して、少なくとも1つの結合ドメインを生成すること、
ｅ．あるいはその組合せ
をさらに包含する。
【００３６】
一実施形態では、融合相手は結合ドメインを含み、当該方法はさらに、以下の：
ａ．カップリング試薬を結合ドメインと結合すること、あるいは
ｂ．カップリング試薬を結合ドメインと結合し、そしてある物質をカップリング試薬と結合すること、あるいは
ｃ．ある物質を結合ドメインと結合すること、あるいは
ｄ．あるいはその組合せ
をさらに包含する。
【００３７】
本発明の別の態様は、約200 nm未満の平均直径を有する複数のポリマー粒子を含む組成物であって、上記ポリマー粒子が以下の：
Ａ）少なくとも1つのポリマー合成酵素、または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド、ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）少なくとも1つの付加的粒子形成タンパク質、または
（２）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド、あるいは
（３）少なくとも1つの（１）および少なくとも1つの（２）
を含む組成物に関する。
【００３８】
本発明の別の態様は、約150 nm未満の平均直径を有する複数のポリマー粒子を含む組成物であって、上記ポリマー粒子が以下の：
Ａ）少なくとも1つのポリマー合成酵素、または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド、ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）少なくとも1つの付加的粒子形成タンパク質、または
（２）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド、
（３）少なくとも1つの（１）および少なくとも1つの（２）
を含む組成物に関する。
【００３９】
本発明の別の態様は、約110 nm未満の平均直径を有する複数のポリマー粒子を含む組成物であって、上記ポリマー粒子が以下の：
Ａ）少なくとも1つのポリマー合成酵素、または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド、ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）少なくとも1つの付加的粒子形成タンパク質、または
（２）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド、または
（３）少なくとも1つの（１）および少なくとも1つの（２）
を含む組成物に関する。
【００４０】
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約10％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約50％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、組成物は、ポリマー粒子またはその組合せに結合されるかまたは組入れられる少なくとも1つの物質をさらに含む。
【００４１】
一実施形態では、当該物質はリン油性物質である。
一実施形態では、当該物質は、日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤またはその組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である。
【００４２】
一実施形態では、当該物質は、以下の：
ａ）酵素、例えばセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼ、あるいは
ｂ）再汚染防止剤、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいは
ｃ）その組合せ
から選択される１つまたは複数の清浄剤である。
【００４３】
一実施形態では、融合相手は、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ラセマーゼ、ヒドロラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ポリメラーゼ、ジオキシゲナーゼ、モノキシデナーゼ、リアーゼ、シンセターゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスフェラーゼ、トランスアクリラーゼおよび合成酵素からなる一覧から選択される酵素である。
【００４４】
一実施形態では、当該物質は、着色または蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである。
一実施形態では、融合相手は、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチドおよびアフィニティー精製ペプチド、またはその組合せから選択される。
【００４５】
一実施形態では、融合相手は、以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
である。
一実施形態では、融合相手は抗体結合ドメインを包含する。
一実施形態では、ａ．  カップリング試薬は融合相手と結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬は融合相手と結合され、そしてある物質はカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質は融合相手と結合され、あるいは
ｄ．  ポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質はカップリング試薬で化学的に修飾されて、少なくとも1つの結合ドメインを形成しているか、あるいは
ｅ．  その組合せである。
【００４６】
一実施形態では、融合相手は結合ドメインを含み、そして
ａ．  カップリング試薬は結合ドメインと結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬は結合ドメインと結合され、そしてある物質はカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質は結合ドメインと結合され、
ｄ．  あるいはその組合せである。
【００４７】
本発明の別の態様は、上記の方法に従って産生されるポリマー粒子の組成物に関する。
本発明の別の態様は、以下の：
Ａ）ポリマー合成酵素を含む少なくとも1つのポリペプチド；または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド；ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）粒子形成タンパク質を含む少なくとも1つのポリペプチド、または
（２）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド、または
（３）その組合せ
を含むポリマー粒子であって、上記ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％がポリペプチドにより被覆されるポリマー粒子に関する。
【００４８】
本発明の別の態様は、以下の：
Ａ）ポリマー合成酵素を含む少なくとも1つのポリペプチド；または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド；ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）粒子形成タンパク質を含む少なくとも1つのポリペプチド、または
（２）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド、または
（３）その組合せ
を含むポリマー粒子であって、上記ポリマー粒子の表面積の少なくとも約10％がポリペプチドにより被覆されるポリマー粒子に関する。
【００４９】
本発明の別の態様は、以下の：
Ａ）ポリマー合成酵素を含む少なくとも1つのポリペプチド；または
Ｂ）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチド；ならびに
Ｃ）任意に、以下の：
（１）粒子形成タンパク質を含む少なくとも1つのポリペプチド、または
（２）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに少なくとも1つの融合相手を包含する少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド、または
（３）その組合せ
を含むポリマー粒子であって、上記ポリマー粒子の表面積の少なくとも約50％がポリペプチドにより被覆されるポリマー粒子に関する。
【００５０】
一実施形態では、当該ポリマー粒子は、ポリマー粒子またはその組合せと結合されるかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの物質をさらに含む。
一実施形態では、当該物質は、タンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、免疫原またはその断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはその誘導体、阻害剤、補因子、基質、酵素、補因子、受容体、受容体サブユニットまたはその断片、リガンド、阻害剤、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞またはその断片、細胞抽出物、ウイルス、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、あるいはその組合せである。
【００５１】
一実施形態では、当該物質は、日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤またはその組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である。
【００５２】
一実施形態では、当該物質は、以下の：
ａ）酵素、例えばセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼ、あるいは
ｂ）再汚染防止剤、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいは
ｃ）その組合せ
から選択される１つまたは複数の清浄剤である。
【００５３】
一実施形態では、融合相手は、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ラセマーゼ、ヒドロラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ポリメラーゼ、ジオキシゲナーゼ、モノキシデナーゼ、リアーゼ、シンセターゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスフェラーゼ、トランスアクリラーゼおよび合成酵素からなる一覧から選択される酵素である。
一実施形態では、当該物質は、着色または蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである。
【００５４】
一実施形態では、融合相手は、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチドおよびアフィニティー精製ペプチド、またはその組合せから選択される。
【００５５】
一実施形態では、融合相手は、以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
である。
【００５６】
一実施形態では、融合相手は抗体結合ドメインを包含する。
一実施形態では、ａ．  カップリング試薬は融合相手と結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬は融合相手と結合され、そしてある物質はカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質は融合相手と結合され、あるいは
ｄ．  ポリマー合成酵素または粒子形成タンパク質はカップリング試薬で化学的に修飾されて、少なくとも1つの結合ドメインを形成しているか、あるいは
ｅ．  その組合せである。
【００５７】
一実施形態では、融合相手は結合ドメインを含み、そして
ａ．  カップリング試薬は結合ドメインと結合され、あるいは
ｂ．  カップリング試薬は結合ドメインと結合され、そしてある物質はカップリング試薬と結合され、あるいは
ｃ．  ある物質は結合ドメインと結合され、
ｄ．  あるいはその組合せである。
【００５８】
本発明の別の態様は、上記の方法に従って産生されるポリマー粒子に関する。
本発明の別の態様は、上記の方法に従って産生される上記のポリマー粒子を含む組成物に関する。
本発明の別の態様は、上記のポリマー粒子の組成物を含む、あるいは上記の１つまたは複数のポリマー粒子を含む診断試薬に関する。
本発明の別の態様は、上記のポリマー粒子の組成物を含む、あるいは上記の１つまたは複数のポリマー粒子を含む診断キットに関する。
一実施形態では、診断キット中のポリマー粒子は、ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィー・マトリックス、あるいはその組合せを含む支持体上に固定化される。
【００５９】
本発明の別の態様は、試料中の少なくとも1つの標的構成成分を検出し、そして任意に単離する方法であって、以下の：
（ａ）ポリマー粒子と共有的または非共有的に結合される少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む少なくとも1つのポリマー粒子であって、上記融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）標的構成成分を結合する少なくとも1つのドメイン
を含むポリマー粒子を提供すること、
（ｂ）結合ドメインが標的構成成分を結合して複合体を形成するよう、標的構成成分を含む試料とポリマー粒子を接触させること、
（ｃ）複合体を検出すること、そして
（ｄ）任意に試料から複合体を分離すること
を包含する方法に関する。
【００６０】
一実施形態では、複合体を検出することは、複合体と、少なくとも1つの融合ポリペプチドと、またはポリマー粒子と結合する標識化分子とポリマー粒子を接触させ、そして標識化分子を検出することを包含する。
一実施形態では、標識化分子は標識化抗体である。
一実施形態では、ポリマー粒子は、以下の：
ａ）ポリマー粒子と結合されるかまたはその中に組入れられる標識、あるいは
ｂ）以下のものを含む少なくとも1つの付加的融合ポリマー：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）標識化分子を結合する結合ドメイン、あるいは
ｃ）レポータータンパク質を含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド
を含む。
【００６１】
一実施形態では、ポリマー粒子は、2またはそれより多くの異なる融合ポリペプチドを含む。
一実施形態では、ポリマー粒子は、ポリマー粒子表面上に2またはそれより多くの異なる融合ポリペプチドを含む。
一実施形態では、ポリマー粒子は、ポリマー粒子表面上に3またはそれより多くの異なる融合ポリペプチドを含む。
一実施形態では、ポリマー粒子はさらに、ポリマー粒子またはその組合せと結合されるかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの物質を含む。
一実施形態では、当該物質は、着色蛍光分子、放射性同位体、１つまたは複数の金属イオン、あるいはその組合せである。
一実施形態では、結合ドメインは、以下の：
ａ）抗原、抗原決定基、エピトープまたは免疫原、あるいは
ｂ）抗体または抗体断片、あるいは
ｃ）抗体結合ドメイン
である。
【００６２】
一実施形態では、結合ドメインはプロテインＡまたはＺＺドメインである。
一実施形態では、標的構成成分は、タンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、阻害剤、補因子、基質、酵素、抗体酵素、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、受容体リガンド、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、シグナル伝達分子、シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質断片、成長因子、成長因子断片、転写因子、転写因子断片、阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、炎症媒介物質、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞、細胞表面タンパク質、細胞表面脂質、細胞表面炭水化物、細胞表面糖タンパク質、細胞抽出物、ウイルス、ウイルス外被タンパク質、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、カップリング試薬、ポリヒスチジン、薬学的活性物質、生物学的活性物質、標識、カップリング試薬、ライブラリーペプチド、発現構築物、核酸、あるいはその組合せから選択される。
【００６３】
一実施形態では、標的構成成分は、インターロイキン-３（ＩＬ‐３）、インターロイキン-４（ＩＬ‐４）、インターロイキン-５（ＩＬ‐５）、インターロイキン１０-（ＩＬ‐１０）、インターロイキン-７（ＩＬ‐７）、インターロイキン-１β（ＩＬ‐１β）、インターロイキン-６（ＩＬ‐６）、インターロイキン-１２ｐ７０（ＩＬ‐１２ｐ７０）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、切断ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ-２および活性カスパーゼ-３タンパク質レベル、インターロイキン-８（ＩＬ‐８）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン-８（ＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、インターフェロン-γにより誘導されるモノカイン（ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ）、単球化学誘引物質タンパク質-１（ＣＣＬ２／ＭＣＰ-１）、またはインターフェロンガンマ誘導性タンパク質-１０（ＣＸＣＬ１０／ＩＰ-１０）、あるいはその混合物から選択される。
【００６４】
一実施形態では、少なくとも1つのポリマー粒子は、ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィーマトリックスを含む支持体上に固定化される。
一実施形態では、少なくとも1つのポリマー粒子は、以下の：
ａ．  本発明の方法に従って産生されるポリマー粒子、
ｂ．  本発明の組成物、あるいは
ｃ．  本発明のポリマー粒子
を含む。
【００６５】
本発明の別の態様は、融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物を含む粒子産生宿主細胞を培養することを包含する組換えポリペプチドの産生方法であって、上記融合ポリペプチドが以下の：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｂ）細胞発現系において発現される場合に封入体を形成するポリペプチド
を含む方法であって、培養条件が発現構築物からの融合ポリペプチドの発現のために、そしてポリマー粒子の形成のために適している方法に関する。
【００６６】
本発明の別の態様は、組換えポリペプチドの産生方法であって、以下の：
（ａ）以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）細胞発現系において発現される場合に封入体を形成するポリペプチド
を含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを提供し、そして
（ｂ）融合ポリペプチドを粒子形成反応混合物と接触させて少なくとも1つのポリマー粒子を形成する
【００６７】
ことを包含する方法に関する。
一実施形態では、粒子形成タンパク質はポリマー合成酵素を含む。
一実施形態では、粒子形成反応混合物はポリマー合成酵素を含む。
一実施形態では、融合相手は、細胞発現系中で発現される場合に封入体を形成するポリペプチドである。
一実施形態では、宿主細胞は、各々異なる融合ポリペプチドをコードする2またはそれより多くの異なる発現構築物を含む。
一実施形態では、当該方法は、以下の：
（ａ）細胞発現系で発現される場合に封入体を形成することが予め確定されているポリペプチドを同定するために文献検索を実行し；あるいは
（ｂ）ポリマー粒子を生成し得ない細胞中で候補ポリペプチドを発現し、そして細胞を顕微鏡的に検査して、発現ポリペプチドが封入体を形成したか否かを確定する
ことにより、細胞発現系で発現される場合に封入体を形成するポリペプチドを選択する初期ステップを包含する。
【００６８】
一実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
（１）ポリマー粒子を細胞または反応混合物から分離して、ポリマー粒子を含む組成物を産生し、そして
（２）任意にポリマー粒子から融合ポリペプチドを分離し、そして
（２）任意に融合ポリペプチドからポリペプチドを分離する
ことをさらに包含する。
【００６９】
一実施形態では、組換えポリペプチドはリフォールディングを必要としない。
本発明の別の態様は、受容体ポリペプチドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
ａ）少なくとも1つの融合ポリペプチドを含み、当該融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つの受容体ポリペプチド
を含む少なくとも1つのポリマー粒子を提供し、そして
ｂ）少なくとも1つのポリマー粒子を少なくとも1つの標的分子と接触させ、
ｃ）受容体ポリペプチドを結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法に関する。
【００７０】
本発明の別の態様は、受容体リガンドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
（ａ）少なくとも1つの融合ポリペプチドを含み、当該融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つの受容体リガンド
を含む少なくとも1つのポリマー粒子を提供し、そして
（ａ）少なくとも1つのポリマー粒子を少なくとも1つの標的分子と接触させ、そして
（ｂ）受容体リガンドを結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法に関する。
【００７１】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の混合集団の産生方法であって、以下の：
ａ）発現構築物の混合集団を含有し、各発現構築物が融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、当該融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つの当該ポリペプチド
を含む混合集団を含有する粒子産生宿主細胞を提供し；
ｂ）ポリマー粒子を産生し、発現構築物を発現するよう宿主細胞を誘導して、ポリマー粒子を結合する融合ポリペプチドの混合集団を産生し；そして
ｃ）任意に、ポリマー粒子の混合集団を宿主細胞から分離する
ことを包含する方法に関する。
【００７２】
本発明の別の態様は、ライブラリーポリペプチドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
（ａ）融合ポリペプチドの混合集団を含み、当該融合ポリペプチドが以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド、またはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに
（ｉｉ）少なくとも1つのライブラリーポリペプチド
を含むポリマー粒子の混合集団を提供し；
（ｂ）ポリマー粒子を少なくとも1つの標的分子と接触させ；
（ｃ）ライブラリーポリペプチドを結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法に関する。
【００７３】
一実施形態では、標的分子を同定することは、ポリマー粒子を標的分子と、少なくとも1つの融合ポリペプチドと、またはポリマー粒子と結合する標識化分子と接触させること、そして標識化分子を検出することを包含する。
一実施形態では、ポリマー粒子は、ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィー・マトリックスを含む支持体上に固定化される。
【００７４】
一実施形態では、少なくとも1つの当該ポリペプチド、少なくとも1つのライブラリーポリペプチド、または少なくとも1つの受容体リガンドは、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、阻害剤、結合ドメイン、またはその組合せから選択される。
【００７５】
本発明の別の態様は、融合ポリペプチドを結合する標的分子の同定方法であって、以下の：
（ａ）融合相手が少なくとも1つの受容体ポリペプチド、少なくとも1つの受容体リガンド、少なくとも1つ当該ポリペプチド、少なくとも1つのライブラリーポリペプチド、またはその組合せを含む本発明の組成物を提供し、
（ｂ）上記組成物を少なくとも1つの標的分子と接触させ、そして
（ｃ）融合相手を結合する標的分子を同定する
ことを包含する方法に関する。
【００７６】
一実施形態では、標的分子を同定することは、ポリマー粒子を標的分子と、少なくとも1つの融合ポリペプチドと、またはポリマー粒子と結合する標識化分子と接触させること、そして標識化分子を検出することを包含する。
一実施形態では、ポリマー粒子は、ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィー・マトリックスを含む支持体上に固定化される。
【００７７】
本発明の別の態様は、上記のようなポリマー粒子を含む診断試薬に関する。
本発明の別の態様は、上記のようなポリマー粒子を包含する診断キットに関する。
本発明の別の態様は、上記の方法、または上記の組成物であって、
（ａ）前記組成物中の粒子の80％が約10 nm〜約150 nmの直径を有し；
（ｂ）前記組成物中の粒子の60％が約10 nm〜約100 nmの直径を有し；
（ｃ）前記組成物中の粒子の45％が約10 nm〜約80 nmの直径を有し；
（ｄ）前記組成物中の粒子の40％が約10 nm〜約60 nmの直径を有し；
（ｅ）前記組成物中の粒子の25％が約10 nm〜約50 nmの直径を有し；あるいは
（ｆ）前記組成物中の粒子の5％が約10 nm〜約35 nmの直径を有する
方法または組成物に関する。
【００７８】
本発明の別の態様は、強力なプロモーターと操作可能的に連結される発現構築物であって、以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む発現構築物に関する。
【００７９】
本発明の別の態様は、強力なプロモーターと操作可能的に連結される発現構築物であって、以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（３）粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列または付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列あるいはその組合せ（ここで、付加的融合ポリペプチドは以下のものを含む：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインまたはポリマー粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質を含むポリペプチド、および少なくとも１つの融合相手、あるいは
（ｂ）少なくとも1つの融合相手）
を含む発現構築物に関する。
【００８０】
本発明の別の態様は、強力なプロモーターと操作可能的に連結される発現構築物であって、以下の：
（１）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列；ならびに
（２）少なくとも1つのポリペプチドならびに融合ポリペプチドの融合相手を結合する結合ドメインを含む付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む発現構築物に関する。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明の発現構築物を包含するベクターに関する。
一実施形態では、発現構築物は高コピー数ベクター上に存在する。
本発明の別の態様は、上記のような発現構築物またはベクターを含む宿主細胞に関する。
以下の実施形態は、上記の態様のいずれかに関連し得る。
【００８２】
一実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも1つのポリペプチド、ならびに融合ポリペプチドまたは付加的融合ポリペプチドの融合相手を結合する結合ドメインを含み得る。このような融合ポリペプチドは、宿主細胞からポリマー粒子を伴ってポリペプチドを分離させる。
【００８３】
一実施形態では、ポリマーコアは、ポリ-ベータ-アミノ酸、ポリラクテート、ポリチオエステルおよびポリエステルから選択されるポリマーを包含する。最も好ましくは、ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくはポリ（３-ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を包含する。
一実施形態では、ポリマー粒子は、リン脂質単層により封入されるポリマーコアを含む。
一実施形態では、粒子形成タンパク質は、ポリマーコアと、またはリン脂質単層と結合されるか、あるいは両方に結合される。
一実施形態では、粒子形成タンパク質は、それが形成するポリマー粒子と共有的にまたは非共有的に結合される。
【００８４】
一実施形態では、粒子形成タンパク質は、ポリマーデポリメラーゼ、ポリマー調節因子、ポリマー合成酵素および粒子サイズ決定タンパク質を含むタンパク質の群から選択される。これらのタンパク質は、好ましくは、ポリマー粒子を形成し得る微生物から、特にラルストニア属、アルカリゲネス属およびシュードモナス属からの微生物、さらに好ましくはフェノール資化細菌（Ralstonia eutropha）、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）、有機溶媒耐性細菌（Pseudomonas putida）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）および高度好塩菌（Halobiforma haloterrestris）から成る群から選択される微生物に由来する。
【００８５】
一実施形態では、ポリマー合成酵素は、フェノール資化細菌、シュードモナス・オレオボランス、有機溶媒耐性細菌、緑膿菌、アエロモナス・パンクタータ（Aeromonas punctata）、チオカプサ・フェンニギ（Thiocapsa pfennigii）または好塩菌（Haloarcula marismortui）からのＰＨＡポリマー合成酵素である。
【００８６】
一次構造、基質特異性およびサブユニット組成の点で異なる45の異なる細菌からの59のＰＨＡ合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列が得られている。本発明において用いるためのポリマー合成酵素はRehm B.H.A., Biochem J., (2003), 376(1): 15-33に詳細に記載されている（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。例えばポリマー合成酵素は、緑膿菌、紅色イオウ細菌（A. vinosum）、バシラス・メガテリウム（B. megaterium）、好塩菌、シュードモナス・オウレオファシエンス（P.aureofaciens ）または有機溶媒耐性細菌（それぞれ寄託番号AY836680、AE004091、AB205104、AF109909、YP137339、AB049413およびAF150670を有する）からのＰＨＡポリマー合成酵素を含み得る。
【００８７】
一実施形態では、粒子形成タンパク質はファジンである。最も好ましくは、ファジンは、フェノール資化細菌およびシュードモナス・オレオボランスからのファジン、好ましくはフェノール資化細菌からのファジンｐｈａＰおよびシュードモナス・オレオボランスからのファジンｐｈａＦから成る群から選択される。
一実施形態では、粒子形成タンパク質は、基質（Ｒ）-ヒドロキシアシル-ＣｏＡまたはその他のＣｏＡチオエステルまたはその誘導体を重合するかまたはその重合を促進することによるポリマー粒子のin vitro産生のために用いられ得る。
一実施形態では、基質または基質混合物は、少なくとも1つの任意置換アミノ酸、ラクテート、エステル、あるいは飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはアセチル-ＣｏＡを含む。
【００８８】
一実施形態では、融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の：
（１）ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列の５’または３’末端と隣接する融合相手をコードする核酸配列、あるいは
（２）所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列の５’または３’末端と間接的に融合される融合相手をコードする核酸配列、あるいは
（３）所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列中に挿入される融合相手をコードする核酸配列、あるいは
（４）融合相手をコードする核酸配列と、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列、あるいは
（５）融合相手をコードする核酸配列と、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置される自己スプライシング素子をコードする核酸配列；あるいは
（６）その2またはそれより多くの任意の組合せ
を包含する。
【００８９】
一実施形態では、少なくとも1つの融合ポリペプチドは、以下の：
（１）ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列のＮ-またはＣ-末端と隣接する融合相手をコードするアミノ酸配列、あるいは
（２）所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列のＮ-またはＣ-末端と間接的に融合される融合相手をコードするアミノ酸配列、あるいは
（３）所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列中に挿入される融合相手をコードするアミノ酸配列、あるいは
（４）融合相手をコードするアミノ酸配列と、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断部位をコードするアミノ酸配列、あるいは
（５）融合相手をコードするアミノ酸配列と、ポリマー合成酵素、ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列との間に間隔を置いて配置される自己スプライシング素子をコードするアミノ酸配列；あるいは
（６）その2またはそれより多くの任意の組合せ
を包含する。
【００９０】
一実施形態では、ポリマー粒子結合ドメインは、ポリマー合成酵素のポリマー粒子結合ドメインである。
一実施形態では、ポリマー合成酵素は、フェノール資化細菌、シュードモナス・オレオボランス、有機溶媒耐性細菌、緑膿菌、アエロモナス・パンクタータ（Aeromonas punctata）またはチオカプサ・フェンニギ（Thiocapsa pfennigii）からのＰＨＡポリマー合成酵素である。
一実施形態では、発現構築物は、構成または調節プロモーター系を包含する。
一実施形態では、調節プロモーター系は、誘導または抑制プロモーター系である。
一実施形態では、調節プロモーター系は、ＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージγおよびファージＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【００９１】
一実施形態では、プロモーターは、当業者に既知の任意の強力なプロモーターである。適切な強力なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター；または異種プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター；誘導プロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ-アクチンプロモーター；ヒト成長ホルモンプロモーター；ファージプロモーター、例えばＴ７、ＳＰ６およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびカリフラワーモザイク３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターを包含する。
【００９２】
一実施形態では、プロモーターはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターは配列番号２４で示されるような配列を有するプロモーターである。
一実施形態では、細胞は、各々が異なる融合ポリペプチドをコードする2またはそれより多くの異なる発現構築物を含む。
一実施形態では、基質は、ポリマー粒子のサイズの制御を保証するのに十分であるような量で、細胞培養またはin vitro溶液に付加される。
【００９３】
一実施形態では、融合相手は、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチド、アフィニティー精製ペプチド、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せを含む一覧から選択される。
一実施形態では、結合ドメインは、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）またはその断片をコードする。ＭＯＧをコードする結合ドメインは、例えば抗血清の試料中のＭＯＧに対して産生される抗体の検出を可能にする。
【００９４】
一実施形態では、標的構成成分は、抗ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）抗体またはその断片である。
一実施形態では、結合ドメインは、１型および２型免疫応答、アポトーシスおよび／または血管新生に関連した標的構成成分を結合する抗体またはその断片をコードする。
一実施形態では、結合ドメインは、オリゴペプチド、酵素、抗体酵素および非触媒性タンパク質からなる群から選択される。この群は、特に好ましくは、当該ペプチドが結合し得るＦＬＡＧエピトープまたは少なくとも1つのシステインを含む。
【００９５】
カップリング・ドメインは、カップリング試薬を用いて表面上に位置する少なくとも1つの結合ドメインを化学的に修飾することによりポリマー粒子の産生後に得られる。
一実施形態では、標識は、ポリマー粒子に結合されるか、その中に吸収されるかまたはその中に組入れられる検出可能標識、例えば着色染料、蛍光分子、例えば蛍光体または蛍光色素、放射性同位体；あるいは1つまたは複数の金属イオンである。
一実施形態では、組換えポリペプチドはディフィカルトフォルダー・ポリペプチドである。
【００９６】
一実施形態では、ディフィカルトフォルダー・ポリペプチドは、細胞発現系中で発現される場合、封入体を形成するポリペプチドである。
一実施形態では、ディフィカルトフォルダー・ポリペプチドは、文献検索を実行して、細胞発現系中で発現される場合に封入体を形成することが予め確定されているポリペプチドを同定することにより選択される。
一実施形態では、ディフィカルトフォルダー・ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成し得ない宿主細胞中で候補ポリペプチドを発現させ、そして発現ポリペプチドが封入体を形成するか否かを確定するために細胞を顕微鏡的に検査することにより、選択される。
好ましくは粒子形成タンパク質は、それが形成する粒子と会合したままで、ポリマー粒子の表面でのディフィカルトフォルダー・ポリペプチドの正確なフォールディングを手助けする。
【００９７】
一実施形態では、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％または100％は、表面結合タンパク質により被覆される。
一実施形態では、組成物中の粒子の90％は、約10 nm〜約200 nmの直径を有する。好ましくは：
（１）組成物中の粒子の80％が約10 nm〜約150 nmの直径を有し；
（２）組成物中の粒子の60％が約10 nm〜約100 nmの直径を有し；
（３）組成物中の粒子の45％が約10 nm〜約80 nmの直径を有し；
（４）組成物中の粒子の40％が約10 nm〜約60 nmの直径を有し；
（５）組成物中の粒子の25％が約10 nm〜約50 nmの直径を有し；あるいは
（６）組成物中の粒子の5％が約10 nm〜約35 nmの直径を有する。
【００９８】
一実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
Ａ）ポリマー粒子と結合するかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの物質を細胞培養または溶液に付加すること、あるいは
Ｂ）ポリマー粒子と結合するかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの物質を付加することに加えて、ポリマー粒子を接触させること、あるいは
Ｃ）その組合せ
を包含する。
【００９９】
一実施形態では、ポリマー粒子は、ポリマー粒子に結合されるかまたはその中に組入れられる少なくとも1つの物質を含む。
一実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
Ａ）カップリング試薬を融合相手結合ドメインと結合すること
を包含する。
【０１００】
一実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
Ａ）カップリング試薬を融合相手結合ドメインと結合すること、そして
Ｂ）少なくとも1つの物質をカップリング試薬と結合すること
を包含する。
一実施形態では、ポリマー粒子と結合するかまたはその中に組入れられる物質は、以下の：
（１）抗原、抗原決定基、エピトープまたはその断片の免疫原、あるいは
（２）抗体または抗体断片、あるいは
（３）抗体結合ドメイン
を包含する。
【０１０１】
本発明の別の態様は、本発明のポリマー粒子からなる診断試薬、ならびにこのような試薬を包含する診断キットに関する。
一実施形態では、ポリマー粒子は、ＥＬＩＳＡプレート、マイクロアレイ・スライドまたはクロマトグラフィー・マトリックスを包含する支持体上に固定化される。
一実施形態では、当該物質は、標識の平均強度により他の組のポリマーから当該粒子を区別させるための着色または蛍光分子、放射性同位体、あるいは１つまたは複数の金属イオンである。
【０１０２】
別の実施形態では、当該物質は、粒子を時期により分離させるか、あるいはＭＲＩまたはＸ線により他の組のポリマーから区別させる金属イオンを包含する。
一実施形態では、ポリマー粒子と結合するかまたはその中に組入れられる物質は、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、免疫原またはその断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはその誘導体、阻害剤、補因子、基質、酵素、補因子、受容体、受容体サブユニットまたはその断片、リガンド、阻害剤、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞またはその断片、細胞抽出物、ウイルス、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せを含む一覧から選択される。
【０１０３】
一実施形態では、ポリマー粒子と結合するかまたはその中に組入れられる物質は、日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せから選択される１つまたは複数のスキンケア剤である。
【０１０４】
一実施形態では、ポリマー粒子と結合するかまたはその中に組入れられる物質は、以下の：
（１）セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼおよびアラビノシダーゼからなる一覧から選択される酵素、あるいは
（２）メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマーからなる群から選択される再汚染防止剤、あるいは
（３）その2またはそれより多くのものの任意の組合せ
を包含する清浄剤である。
【０１０５】
一実施形態では、融合相手は、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ラセマーゼ、ヒドロラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ポリメラーゼ、ジオキシゲナーゼ、モノキシデナーゼ、リアーゼ、シンセターゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスフェラーゼ、トランスアクリラーゼおよび合成酵素からなる一覧から選択される酵素である。
本明細書中に開示される一連の数字（例えば1〜10）についての言及は、その範囲内のすべての有理数（例えば1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9および10）についての、そしてその範囲内の有理数の任意の範囲についての言及も組入れられ、したがって本明細書中で特に開示されるすべての範囲のすべての亜範囲がそれにより特に開示されることが意図される。これらは特に意図されるものの例に過ぎず、そして列挙される最低値および最高値間の数値のすべての考え得る組合せが、同様の方法で本出願に特に記述されるべきであるとみなされるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０６】
本発明の詳細な説明
本発明は、ポリマー粒子およびその使用に関する。特に本発明は、官能化ポリマー粒子、その産生方法および使用に関する。官能化ポリマー粒子は、１つまたは複数の表面結合融合ポリペプチド、ポリマー粒子コア中に組入れられるかまたは吸着される１つまたは複数の物質、表面結合融合ポリペプチドに結合される１つまたは複数の物質、あるいはその組合せを含み得る。
【０１０７】
１．定義
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「発現を変更すること」ならびに「変更された発現」という用語は、ポリヌクレオチドが就職され、したがってポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変更された発現をもたらす状況を包含するよう意図される。ポリヌクレオチドの修飾は、遺伝子形質転換または突然変異を誘導するための当該技術分野で既知のその他の方法によるものであり得る。「変更された発現」は、産生されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量の増大または低減に関連し得るし、ならびに産生されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列における変更のためのポリペプチドの活性変更も生じ得る。
【０１０８】
「コード領域」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）という用語は、適切な調節配列の制御下で転写産物および／またはポリペプチドを産生し得るゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンの存在により同定される。遺伝子構築物中に挿入される場合、「コード配列」は、それがプロモーターおよびターミネーター配列と操作可能的に連結されると、発現され得る。
【０１０９】
「複合体」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリマーコアならびに少なくとも1つの粒子結合ドメインをコードするアミノ酸配列および少なくとも1つの結合ドメインをコードするアミノ酸配列を含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを包含するポリマー粒子を指すが、この場合、上記結合ドメインは標的構成成分に結合される。
【０１１０】
「〜を含む」という用語は、この明細書中で用いられる場合、「少なくとも一部は〜からなる」ということを意味する。その用語を包含するこの明細書中の記述を解釈する場合、すべてが存在する必要があるが、しかし他の特徴も存在し得る。
【０１１１】
「カップリング試薬」という用語は、本明細書中で用いる場合、少なくとも1つの物質を結合するのに適している無機または有機化合物、あるいは一側面上にカップリング試薬を、そして他の側面上に少なくとも1つの物質を結合するのに適しているさらなるカップリング試薬を指す。
【０１１２】
本明細書中で用いる場合、「ディフィカルトフォルダー・ポリペプチド」という用語は、細胞発現系中で組換え発現される場合、正しくフォールディングされたネイティブタンパク質というよりむしろ、主に非フォールディング化または部分フォールディング化全長または部分長ポリペプチドの封入体として既知の不溶性集合体を形成するポリペプチドを指す。「不溶性集合体」および「封入体」という用語は、本明細書中では互換的に用いられる。
【０１１３】
「発現構築物」という用語は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写すること、そして任意に転写体をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な素子を含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は、典型的には５’から３’方向で、以下のものを包含する：
（１）構築物が形質転換される宿主中で機能的であるプロモーター、
（２）発現されるべきポリヌクレオチド、ならびに
（３）構築仏画形質転換される宿主細胞中で機能的であるターミネーター。
本発明の発現構築物は、クローニングのためにまたは発現のために複製可能なベクター中に挿入され得るし、あるいは宿主ゲノム中に組入れられ得る。
【０１１４】
「ポリマー粒子を形成する」および「ポリマー粒子の形成」という用語は、本明細書中で用いる場合、上記のような粒子形成タンパク質の活性を指す。
ポリペプチドの「断片」は、酵素または結合活性のために必要とされる機能を実施し、および／またはポリペプチドの三次元構造を提供するポリペプチドの亜配列である。
【０１１５】
「融合ポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、単一連続ポリペプチドを形成するためにペプチド結合によりそれぞれのアミノおよびカルボキシル残基を介して融合される2またはそれより多くのポリペプチドを含むポリペプチドを指す。2またはそれより多くのポリペプチドは、直接融合されるか、あるいはリンカーまたはスペーサーあるいは付加的ポリペプチドを介して、それらのそれぞれのアミノおよびカルボキシル末端により間接的に融合され得る、と理解されるべきである。
【０１１６】
本発明による融合ポリペプチドは、粒子結合ドメインをコードするアミノ酸配列、および少なくとも1つの融合相手をコードするアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列はンカーまたはスペーサーを介して間接的に融合され、例えば上記融合ポリペプチドのアミノ酸配列は粒子結合ドメイン・リンカー・融合相手の順序で整列される。他の実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、粒子結合ドメイン-付加的ポリペプチド-融合相手、または粒子結合ドメイン-リンカー-融合相手-付加的ポリペプチドの順序で配列される付加的ポリペプチドを介して間接的に融合され得るし、あるいはそれを包含し得る。
【０１１７】
本発明の融合ポリペプチドは、別のポリペプチドの配列内に挿入される１つまたは複数のポリペプチド配列も含み得る。例えばプロテアーゼ認識配列のようなポリペプチド配列は、粒子結合ドメインを含むタンパク質の可変部中に挿入され得る。
「融合相手」という用語は、本明細書中で用いる場合、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチド、アフィニティー精製ペプチド、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せといったようなポリペプチドを指す。
【０１１８】
上記の2またはそれより多くのポリペプチドは融合相手を形成し得る、と理解されるべきである。
「結合ドメイン」についての言及は、相補的結合対の片方を意味し、そして上記の一覧からの結合対を含み得る。例えば抗体-抗原、抗体-抗体結合ドメイン、ビオチン-ストレプトアビジン、受容体-リガンド、酵素-阻害剤対。標的結合ドメインは、試料中の標的分子を結合し、そして例えば抗体または抗体断片であり得る。ポリペプチド結合ドメインはポリペプチドを結合し、そして例えば抗体または抗体断片、あるいは受容体またはシグナル伝達タンパク質からの結合ドメインであり得る。
【０１１９】
結合ドメインにより結合され得る物質の例としては、タンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、阻害剤、補因子、基質、酵素、抗体酵素、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、受容体リガンド、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、シグナル伝達分子、シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質断片、成長因子、成長因子断片、転写因子、転写因子断片、阻害剤、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞、細胞表面タンパク質、細胞表面脂質、細胞表面炭水化物、細胞表面糖タンパク質、細胞抽出物、ウイルス、ウイルス外被タンパク質、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、カップリング試薬、ポリヒスチジン、薬学的活性物質、生物学的活性物質、標識、カップリング試薬、ライブラリーペプチド、発現構築物、核酸、あるいはその任意の2またはそれより多くの任意の組合せが挙げられる。
【０１２０】
ＤＮＡ結合ドメインの例としては、Ｔｒａｌおよびメチルトランスフェラーゼが挙げられる。
このような物質は、本発明の方法により分析される試料中の「標的構成成分」であり得る。
抗体または抗体断片についての本明細書中での任意の言及はまた、標識化抗体または抗体断片、例えば比色酵素標識抗体または抗体断片、染料標識抗体または抗体断片、蛍光標識抗体または抗体断片、あるいは量子ドット標識抗体または抗体断片を包含するよう意図される。
【０１２１】
「遺伝子構築物」という用語は、別のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）、例えばｃＤＮＡ分子（これらに限定されない）中に挿入されたポリヌクレオチド分子、通常は二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写すること、そして任意に転写体をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な素子を含有し得る。挿入ポリヌクレオチド分子は宿主細胞に由来するか、あるいは異なる細胞または生物体に由来し得るし、および／または組換えポリヌクレオチドであり得る。一旦宿主細胞内部に入ると、遺伝子構築物は宿主染色体ＤＮＡ中に組込まれるようになる。遺伝子構築物は、ベクターと連結され得る。
【０１２２】
「宿主細胞」という用語は、１）天然ＰＨＡ粒子産生宿主細胞、あるいは２）少なくともチオラーゼおよびレダクターゼ、任意にファジンをコードする核酸配列を含む発現構築物を保有する宿主細胞である細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞、例えば哺乳類宿主細胞を指す。宿主細胞がポリマー粒子形成のために欠いているものを増大することをどの遺伝子が必要とされているかは、宿主細胞の遺伝子構成に、そして培地中にどの基質が提供されるかによっている。
【０１２３】
「ＩｇＧ結合プロテインＡ断片」または「ＺＺドメイン」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＩｇＧを結合し得るプロテインＡ分子の一部、例えば配列番号１１のアミノ酸４８〜１７９で記述される配列を有する１３２アミノ酸ＺＺドメイン（リーダーペプチドを含むｐＢＨＲ８０-ＺＺドメイン）または配列番号１２のアミノ酸２〜１３３（リーダーペプチドを伴わないｐＢＨＲ８０-ＺＺドメイン）（これらに限定されない）を指す。
【０１２４】
「封入体」という用語は、本明細書中で用いる場合、正しくフォールディングされたネイティブタンパク質というよりむしろ、主に非フォールディング化または部分フォールディング化全長または部分長ポリペプチドからなる組換え発現ポリペプチドの不溶性集合体を指す。「不溶性集合体」および「封入体」という用語は、本明細書中では互換的に用いられる。
【０１２５】
「標識」という用語は、本明細書中で用いる場合、その存在により、ある粒子を標識を含有しない粒子と区別させる分子を指す。好ましくは標識は、所望の事象または状態の同定を可能にする任意の物質を包含する。例えば「所望の事象または状態」の同定は、それらが所望の事象または状態を表示するか否かに基づいて粒子を区別させる。好ましくは標識は、着色または蛍光分子、あるいは放射性同位体である。代替的には、標識は、１つまたは複数の金属イオンを包含して、磁気により当該粒子を分離させるか、あるいはＭＲＩまたはＸ線により他の組のポリマー粒子と区別させる。標識は融合相手であり得るし、あるいはポリマー粒子と結合されるか、それに吸着されるか、またはその中に組入れられ得る。
【０１２６】
染料組入れの一例は、WO 2004020623（Bernd Rehm）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に示されている。多数の蛍光標識も当該技術分野で既知であり、例としてはフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（約530 nmで蛍光を発する）、フィコエリトリン（ＰＥ）（575 nm）、テキサスレッド（620 nm）、フィコエリトリン-テキサスレッド（615 nm）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（660 nm）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（660 nm）、フィコエリトリン-シアニン染料（ＢＤ  Ｃｙ-クロム）（670 nm）、ペリジニン・クロロフィルタンパク質（ｐｅｒＣＰ）（675 nm）、ペリジニン・クロロフィルタンパク質-シアニン染料（ｐｅｒＣＰ-Ｃｙ５．５）（694 nm）、およびアロフィコシアニン-シアニン染料（ＡＰＣ-Ｃｙ７）（767 nm）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
「ライブラリーペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、ペプチドライブラリーの個々の成員を指す。ライブラリーペプチドは好ましくは、無傷タンパク質を含めた任意長の任意のポリペプチド（例えばｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片によりコードされるペプチド（枠内、枠外、センスまたはアンチセンス配向）、ランダムペプチド、あるいはランダムアミノ酸を含むバイアスペプチド）を含み得る。ペプチドライブラリーは、上記のような別個のポリペプチドのコレクション、またはこれらの存在物のうちの1つからの当該断片である。当該断片は、例えば機能性ドメインまたはエピトープを包含し得る。各ペプチドは、ペプチドライブラリーを表示する経過中に発現される核酸分子によりコードされる。ペプチドライブラリーをコードする核酸分子の混合物はしばしば、当業界では、発現ライブラリーと呼ばれる。「ペプチドライブラリー」および「発現ライブラリー」という用語は、状況によって、本明細書中では互換的に用いられ得る。本発明の方法により発現のためにペプチドライブラリーを調製するための技法を、下記で考察する。
【０１２８】
「リンカーまたはスペーサー」という用語は、本明細書中で用いる場合、2またはそれより多くのポリペプチドを、あるいは2またはそれより多くのポリペプチドをコードする2またはそれより多くの核酸配列を間接的に融合するアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する。好ましくはリンカーまたはスペーサーは、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または約100アミノ酸またはヌクレオチド長である。
【０１２９】
一実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、制限酵素認識部位を含み得る。別の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、プロテアーゼ切断認識配列、例えばエンテロキナーゼ、トロンビンまたは因子Ｘａ認識配列、または自己スプライシング素子、例えばインテインを含み得る。別の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを促進する。
【０１３０】
「混合集団」という用語は、本明細書中で用いる場合、存在物の集団を指し、集団内の各存在物は、集団内の別の存在物といくつかの点で異なる。例えば発現構築物の混合集団について言及するに際して用いられる場合、これは、各発現構築物がそれがコードする融合ポリペプチドの点で異なる発現構築物の集団を指す。代替的には、融合ポリペプチドの混合集団についての言及に用いられる場合、これは、各融合ポリペプチドがポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質または粒子形成タンパク質、あるいはそれが含有する少なくとも1つの融合相手の点で異なる融合ポリペプチドの集団を指す。さらにまた、ポリマー粒子の混合集団についての言及に用いられる場合、これは、各ポリマー粒子が融合ポリペプチドまたはそれが保有する融合ポリペプチドの点で異なるポリマー粒子の集団を指す。
【０１３１】
「核酸」という用語は、本明細書中で用いる場合、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基または天然ヌクレオチドの既知の類似体、あるいはその混合物の１本鎖または二本鎖ポリマーを指す。当該用語は、別記しない限り、特定配列についての、ならびにそれと相補的な配列についての言及を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中では互換的に用いられる。
【０１３２】
「操作可能的に連結される」とは、発現されるべき配列が、プロモーター、組織特異的調節素子、一時性調節素子、エンハンサー、レプレッサーおよびターミネーターを包含する調節素子の制御下に置かれる、ということを意味する。
【０１３３】
「過剰発現」という用語は一般に、正常または非形質転換宿主細胞中での産生のレベルを超える宿主細胞中での遺伝子産物の産生を指す。「過剰発現」という用語は、メッセンジャーＲＮＡのレベルに関連して用いられる場合、対照の宿主細胞または非形質転換細胞中で典型的に観察されるより少なくとも約3倍高い発現レベルを示す。さらに好ましくは、発現レベルは、対照宿主細胞または非形質転換細胞中で典型的に観察されるよりも少なくとも約5倍高い、約10倍高い、約15倍高い、約20倍高い、約25倍高い、約30倍高い、約35倍高い、約40倍高い、約45倍高い、約50倍高い、約55倍高い、約60倍高い、約65倍高い、約70倍高い、約75倍高い、約80倍高い、約85倍高い、約90倍高い、約95倍高い、または約100倍高いかまたはそれ以上である。
【０１３４】
ｍＲＮＡのレベルは、当業者に既知の多数の技法、例えばノーザンブロット分析（これに限定されない）のいずれかを用いて測定される。
「粒子結合ドメイン」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリマーコアと、またはポリマーコアを取り囲むリン脂質膜と、またはその両方と結合し得るドメインを形成するかまたは含むポリペプチド配列を指す。粒子結合ドメインは、例えば、ファジンまたはデポリメラーゼタンパク質の粒子結合Ｎ末端断片、あるいは合成酵素またはレプレッサータンパク質のＣ末端粒子結合断片から選択され得る。ポリマー粒子結合ドメインを含むポリペプチド配列の例としては、ポリマーデポリメラーゼ、ポリマー調節因子、ポリマー合成酵素および粒子サイズ決定タンパク質が挙げられる。
【０１３５】
フェノール資化細菌からの表面タンパク質ファジン（ＰｈａＰ）のＣ末端断片（＞Ａｌａ１４１からのアミノ酸残基）は親水性であり、そしてポリマー粒子の表面とのポリマー粒子結合ドメイン（即ちＮ末端断片）を介したファジンの結合を妨げることなく、融合相手に取って代わられ得る。この結合は疎水性相互作用に基づいており、そして可逆的である（Hanley, S.Z. et al, FEBS Letters 1999, Vol. 447, pp. 99-105）。同様に、有機溶媒耐性細菌からのＰｈａＦファジンのＮ末端断片（ＢｉｏＦ）は、融合相手を粒子表面に付着するためのポリマー粒子結合ドメインを提供する（Moldes C. et al, Appl Environ Microbiol. 2004 Jun; 70(6): 3205-12）。
【０１３６】
同様に、ＰＨＡ合成酵素タンパク質のＮ末端断片（アミノ酸１〜１００）は、高可変性であり、そして酵素を不活性化することなく、または粒子結合ドメイン（即ち、Ｃ末端断片）を介してポリマーコアへの合成酵素の共有結合を妨げることなく、欠失されるか、または融合相手に取って代わられ得る。合成酵素のポリマー粒子結合ドメインは、ポリマーコアの重合およびポリマー粒子の形成を媒介する合成酵素タンパク質の少なくとも触媒ドメインを含む。
【０１３７】
フェノール資化細菌（Ralstonia eutrophaの細胞内ポリマーデポリメラーゼのＣ末端（＞１８０からのアミノ酸残基）は、酵素をポリマー粒子のコアと結合する（Saegusa, H. et al., J. Bacteriol. 2001, Vol. 183(1), pp. 94-100）。
シュードモナス・オレオボランスからの遺伝子ｐｈａＩおよびｐｈａＦのポリマー中に埋め込まれるかまたは会合される発現産物のＮ末端（＜１４０からのアミノ酸残基）は、タンパク質をポリマー粒子のポリエステルコアと結合する（Prieto, M.A. et al., J. Bacteriol. 1999, Vol. 181(3), pp. 858-868）。
【０１３８】
「粒子形成タンパク質」という用語は、本明細書中で用いる場合、粒子の形成に関与するタンパク質を指す。それは、例えば、ポリマーデポリメラーゼ、ポリマー調節因子、ポリマー合成酵素および粒子サイズ決定タンパク質からなるタンパク質の群から選択され得る。好ましくは粒子形成タンパク質は、チオラーゼ、レダクターゼ、ポリマー合成酵素およびファジンからなる群から選択される。粒子形成タンパク質、例えば合成酵素は、基質または基質の誘導体を重合して、ポリマー粒子を形成することにより、ポリマー粒子の形成を触媒し得る。代替的には、粒子形成タンパク質、例えばチオラーゼ、レダクターゼまたはファジンは、重合を促進することにより、ポリマー粒子の形成を促し得る。例えばチオラーゼまたはレダクターゼは、ポリメラーゼのための適切な基質の産生を触媒し得る。ファジンは、形成されるポリマー粒子のサイズを制御し得る。好ましくは粒子形成タンパク質は、粒子結合ドメインおよび粒子形成ドメインを含む。
【０１３９】
本明細書中で用いる場合、「粒子形成反応混合物」という用語は、宿主細胞または発現構築物が合成酵素触媒ドメインを含む場合は、少なくともポリマー合成酵素を、あるいは宿主細胞または発現構築物が別の粒子形成タンパク質またはポリマー合成酵素触媒ドメインでない粒子結合ドメインを含む場合にはポリマー合成酵素およびその基質を指す。
【０１４０】
「粒子サイズ決定タンパク質」とは、ポリマー粒子のサイズを制御するタンパク質を指す。それは、例えば、好ましくはラルストニア属、アルカリゲネス属およびシュードモナス属からのものから選択されるファジン様タンパク質のファミリーから、さらに好ましくはフェノール資化細菌からのファジン遺伝子ｐｈａＰおよびシュードモナス・オレオボランスからのファジン遺伝子ｐｈａＦから得られる。ファジンは、ポリマー粒子の疎水性表面と密接に結合する14〜28 kDaの分子量を有する両親媒性タンパク質である。それは、粒子を結合し、粒子サイズに影響を及ぼす他の宿主細胞タンパク質も含み得る。
【０１４１】
「アフィニティー精製を可能にするためのペプチド」または「アフィニティー精製ペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、既知のリガンドと結合するペプチドを指す。このペプチドは、例えばそれらが産生された宿主細胞からの形成粒子の分離、ならびにスクリーニング後にクロマトグラフィーマトリックスから溶離される粒子の収集を促進する。例としては、アビジン、またはそのビオチン結合断片、ストレプトアビジンまたはそのビオチン結合断片、ビオチン、プロテインＡまたはそのＩｇＧ結合断片（例えばＺＺドメイン）、エピトープ、ポリヒスチジン、またはセルロース結合ドメインが挙げられる。
【０１４２】
「ポリマー調節因子」とは、本明細書中で用いる場合、ポリマー粒子の形成に関与する遺伝子ｐｈａＡ、ｐｈａＢおよびｐｈａＣの転写を調節するタンパク質を指す。それは、粒子表面に結合することにより、転写調節から撤退される。このような調節因子の一例は、フェノール資化細菌からのファジンレプレッサー（ｐｈａＲ）であって、これは、ファジン様遺伝子のプロモーターと結合し、この発現産物は形成されるポリマー粒子のサイズを調節し、そして遺伝子が読み取られるのを阻止する。ファジンレプレッサーは形成されたポリマー粒子の表面に結合されるため、プロモーター上のこの部位が放出され、そして下にある遺伝子の転写が開始し得る。
【０１４３】
「ポリマー合成酵素」とは、本明細書中で用いる場合、基質または基質の誘導体を重合して、ポリマー粒子を形成することにより、ポリマー粒子の形成を触媒し得るタンパク質を指す。45の異なる細菌からの59のＰＨＡ合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列が得られている（一次構造、基質特異性およびサブユニット組成が異なる）。ポリマー合成酵素は、ポリマーの重合ならびに粒子コアへの合成酵素タンパク質の結合を媒介する合成酵素タンパク質のＣ末端に少なくとも合成酵素触媒ドメインを含む。本発明に用いるためのポリマー合成酵素は、Rehm B.H.A., Biochem J., (2003), 376(1): 15-33（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳細に記載されている。例えばポリマー合成酵素は、クプリアビドス・ネカター、緑膿菌、紅色イオウ細菌、バシラス・メガテリウム、好塩菌、シュードモナス・オウレオファシエンスまたは有機溶媒耐性細菌（それぞれ寄託番号AY836680、AE004091、AB205104、AF109909、YP137339、AB049413およびAF150670を有する）からのＰＨＡポリマー合成酵素を含み得る。
【０１４４】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、任意の長さの、しかし好ましくは少なくとも5アミノ酸長のアミノ酸鎖、例えば全長タンパク質を包含し、この場合、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結される。本発明のポリペプチドは精製天然産物であり得るし、あるいは組換えまたは合成技法を用いて、部分的にまたは全体的に産生され得る。当該用語は、ポリペプチド、ポリペプチドの集合体、例えば二量体または他の多量体、融合ポリペプチド、ポリペプチド変異体またはその誘導体を指す。
【０１４５】
「プロモーター」という用語は、遺伝子転写を調節するコード領域の上流の非転写シス-調節素子を指す。プロモーターは、転写開始部位および保存ボックス、例えばＴＡＴＡボックスを特定するシス-イニシエーター素子、ならびに転写因子により結合されるモチーフを包含する。
【０１４６】
「ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質」という用語は、ポリマーコアまたはポリマー粒子のリン脂質層と結合する上記の粒子形成タンパク質以外の任意のタンパク質を含む。
【０１４７】
ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質の例としては、他の粒子会合タンパク質、例えば疎水性粒子および親水性細胞質間の界面を安定化して、粒子形態に影響を及ぼし、そして粒子と結合されるサイトゾルタンパク質の量を低減する大腸菌の熱ショックタンパク質Ａ／Ｂ（ＩｂｐＡ／Ｂ）（寄託番号P29209/P29210）が挙げられる。粒子会合タンパク質のその他の例としては、大腸菌のｔｕｆＢおよびｙｂｅＤ（寄託番号P02990およびP30977）、ならびに粒子会合されることが既知であるが、しかしその機能は未だ明らかでないシュードモナスのＰｈａＩ、ＰｈａＤおよびＰｈａＳ（Rehm, B. Biotechnol Lett. 2006 Feb; 28(4): 207-13）が挙げられる。それは、ポリマー粒子結合ドメインを含む任意の融合ポリペプチドでもあり得る。
【０１４８】
「プロテインＡポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、プロテインＡとして既知である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）細胞壁構成成分をコードするポリペプチドを指す。プロテインＡは、多数の種からのＩｇＧのサブクラスのＦｃ部分に対する高親和性を示す。このようなポリペプチドは、「抗体結合ドメイン」として既知である。
【０１４９】
「レポーターペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、それ自体検出可能であるか、あるいは検出可能産物の産生を触媒するペプチドを指す。本明細書中で有用なレポーターペプチドとしては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。
【０１５０】
「標的構成成分」という用語は、本明細書中で用いる場合、タンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、阻害剤、補因子、基質、酵素、抗体酵素、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、受容体リガンド、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、シグナル伝達分子、シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質断片、成長因子、成長因子断片、転写因子、転写因子断片、阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、炎症媒介物質、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞、細胞表面タンパク質、細胞表面脂質、細胞表面炭水化物、細胞表面糖タンパク質、細胞抽出物、ウイルス、ウイルス外被タンパク質、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、カップリング試薬、ポリヒスチジン、薬学的活性物質、生物学的活性物質、標識、カップリング試薬、ライブラリーペプチド、発現構築物、核酸、あるいはその組合せを指す。
【０１５１】
「ターミネーター」という用語は、翻訳配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端に見出される転写を終結する配列を指す。ターミネーターはｍＲＮＡ安定性の重要な決定因子であり、そしていくつかの場合、空間調節機能を有することが判明している。
「物質」という用語は、ポリマー粒子に結合されるかまたはその中に吸収されるかまたはその中に組入れられることに関連して言及される場合、融合相手により結合される物質、あるいはポリマー粒子に吸収されるかまたはその中に組入れられる物質を意味するよう意図される。
【０１５２】
融合相手結合ドメインにより結合され得る物質の例は、上記されている。ポリマー粒子中に吸収されるかまたはその中に組入れられ得る物質の例としては、染料および薬学的作用物質、好ましくは親油性染料および親油性薬学的作用物質が挙げられる。
【０１５３】
「変異体」という用語は、本明細書中で用いる場合、特定的に同定された配列とは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この場合、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失され、置換されまたは付加される。変異体は、天然対立遺伝子変異体または非天然変異体であり得る。変異体は、同一種からまたは他の種からであり得るし、相同体、パラ置換体およびオルト置換体を包含し得る。ある種の態様では、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドの変異体は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドのものと同一または類似である生物学的活性を保有する。ポリペプチドおよびポリペプチドに関する「変異体」という用語は、本明細書中で定義されるようなポリペプチドおよびポリペプチドのすべての形態を包含する。
【０１５４】
ポリヌクレオチド変異体
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、特定ポリヌクレオチド配列と少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも51％、少なくとも52％、少なくとも53％、少なくとも54％、少なくとも55％、少なくとも56％、少なくとも57％、少なくとも58％、少なくとも59％、少なくとも60％、少なくとも61％、少なくとも62％、少なくとも63％、少なくとも64％、少なくとも65％、少なくとも66％、少なくとも67％、少なくとも68％、少なくとも69％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を示す。同一性は、特定ポリヌクレオチド配列の少なくとも20ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド位置、少なくとも100ヌクレオチド位置の比較ウインドウに亘ってまたは全長に渡って見出される。
【０１５５】
ポリヌクレオチド配列同一性は、以下のようにして確定され得る。対象ポリヌクレオチド配列は、ｂｌ２ｓｅｑ（Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1900), ”Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250）（NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に利用可能）でＢＬＡＳＴＮ（BLASTプログラム組、バージョン2.2.10[Oct 2004]から）を用いて、候補ポリヌクレオチド配列と比較される。ｂ１２ｓｅｑのデフォルト・パラメーターが利用されるが、但し、低複雑性部分のフィルタリングは止められる必要がある。
ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のユニックス・コマンドライン・パラメーターを用いて検査され得る：
【０１５６】
Bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-FF-p blastn
パラメーター-ＦＦは低複雑性区分のフィルタリングを止める。パラメーター-ｐは、配列の対のための適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、ライン「同一性＝」における同一ヌクレオチドの数およびパーセンテージの両方として配列同一性を報告する。
【０１５７】
ポリヌクレオチド配列同一性はさらに、全体的配列アラインメント・プログラム（例えばNeedleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）を用いて、候補および対象ポリヌクレオチド配列間の重複の全長に亘って算定され得る。Needleman-Wunschグローバル・アラインメントアルゴリズムの完全履行は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277）におけるニードル・プログラムに見出され、これはhttp://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/から利用可能であり得る。European Bioinformatics Instituteサーバーも、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/でオンラインで2つの配列間のＥＭＢＯＳＳ-ニードル・グローバル・アラインメントを実施するための便宜を提供する。
【０１５８】
代替的には、末端ギャップに対するペナルティーなしに、2つの配列の最適グローバル・アラインメントをコンピューター計算するＧＡＰプログラムが用いられ得る。ＧＡＰは、以下の論文に記載されている：Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235。
本発明のポリヌクレオチド変異体は、それらの配列の機能的等価性を保存すると思われる特定的同定配列のうちの１つまたは複数との類似性を示すもの、そしてランダムチャンスにより起きたと読み取り可能的に予測され得ないものも包含する。ポリペプチドに関するこのような配列類似性は、NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのBLASTプログラム組（バージョン2.2.10[Oct 2004]）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて、確定され得る。
【０１５９】
ポリヌクレオチド配列の類似性は、以下のユニックス・コマンドライン・パラメーターを用いて検査され得る：
Bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-FF-p tblastx
【０１６０】
パラメーター-ＦＦは低複雑性区分のフィルタリングを止める。パラメーター-ｐは、配列の対のための適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の領域を見出し、そしてこのような領域の各々に関して、「Ｅ値」を報告するが、これは、ランダム配列を含有する固定参照サイズのデータベース中で偶然にこのような整合を見ることが予測され得る予測時間数である。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムでデフォルトにより設定される。1より非常に小さい小Ｅ値に関しては、Ｅ値はだいたいこのようなランダム整合の確率である。
【０１６１】
変異体ポリヌクレオチド配列は、特定的に同定された配列のいずれか1つと比較した場合、好ましくは1×10-10未満、さらに好ましくは1×10-20未満、1×10-30未満、1×10-40未満、1×10-50未満、1×10-60未満、1×10-70未満、1×10-80未満、1×10-90未満、1×10-100未満、1×10-110未満、1×10-120未満または1×10-123未満のＥ値を示す。
代替的には、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、緊縮条件下で特定ポリヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリダイズする。
【０１６２】
「緊縮条件下でハイブリダイズする」という用語ならびにその文法的等価用語は、温度および塩の独活の限定条件下で、標的ポリヌクレオチド分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡブロット、例えばサザンブロットまたはノーザンブロット上に固定化される標的ポリヌクレオチド分子）とハイブリダイズするポリヌクレオチド分子の能力を指す。緊縮条件下でハイブリダイズする能力は、最初に低緊縮条件下でハイブリダイズし、次に所望の緊縮度に緊縮性を増大することにより確定され得る。
【０１６３】
約100塩基長より大きいポリヌクレオチド分子に関しては、典型的緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ネイティブ二重鎖の融点（Ｔｍ）より25〜30℃以下（例えば10℃）低い（一般的はSambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press；Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing参照）。約100塩基より大きいポリヌクレオチド分子に関するＴｍは、式：Ｔｍ＝81.5＋0.41％（Ｇ＋Ｃ-log（Ｎａ+））により算定され得る（Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84: 1390）。100塩基長より大きいポリヌクレオチドに関する典型的緊縮条件は、6×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳの溶液中で予備洗浄し；65℃で、6×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳで一晩ハイブリダイズし；その後、各々1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で65℃で30分間、2回洗浄し、そして各々0.2×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で65℃で30分間、2回洗浄する。
【０１６４】
100塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関しては、例示的緊縮ハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより5〜10℃低い。平均で、100 bp未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、約（500／オリゴヌクレオチド長）℃低減される。
【０１６５】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6; 254 (5037): 1497-500）として既知のＤＮＡ模倣物に関しては、ＴＭ値は、ＤＮＡ-ＤＮＡまたはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドに関する値より高く、そしてGiesen et al., Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1; 26(21): 5004-6に記載された式を用いて算定され得る。100塩基未満の長さを有するＤＮＡ-ＰＮＡハイブリッドに関する例示的緊縮ハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより5〜10℃低い。
【０１６６】
本発明の変異体ポリヌクレオチドは、本発明の配列と異なるが、しかし遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない配列変更は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、同一アミノ酸に関する他のコドンは、例えば特定の宿主生物体におけるコドン発現を最適化するために、当業界で認知された技法により変えられ得る。
【０１６７】
その生物学的活性を有意に変更することなく、コード化ポリペプチド配列中の1つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換を生じるポリヌクレオチド配列変更も、本発明に包含される。表現型的サイレントアミノ酸置換の作成方法を、当業者は承知する（例えばBowie et al., 1990, Science 247, 1306参照）。
コード化ポリペプチド配列中のサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、上記のようなtblastxアルゴリズムによりNCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのBLASTプログラム組（バージョン2.2.10[Oct 2004]）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて、確定され得る。
【０１６８】
ポリペプチド変異体
ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、天然の、組換え的におよび合成的に産生されるポリペプチドを包含する。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列と少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも51％、少なくとも52％、少なくとも53％、少なくとも54％、少なくとも55％、少なくとも56％、少なくとも57％、少なくとも58％、少なくとも59％、少なくとも60％、少なくとも61％、少なくとも62％、少なくとも63％、少なくとも64％、少なくとも65％、少なくとも66％、少なくとも67％、少なくとも68％、少なくとも69％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を示す。同一性は、本発明のポリペプチドの少なくとも20アミノ酸位置、好ましくは少なくとも50アミノ酸位置、少なくとも100アミノ酸位置の比較ウインドウに亘ってまたは全長に渡って見出される。
【０１６９】
ポリポリペプチド配列同一性は、以下のようにして確定され得る。対象ポリヌクレオチド配列は、ｂｌ２ｓｅｑ（NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に利用可能）でＢＬＡＳＴＰ（BLASTプログラム組、バージョン2.2.10[Oct 2004]から）を用いて、候補ポリヌクレオチド配列と比較される。ｂ１２ｓｅｑのデフォルト・パラメーターが利用されるが、但し、低複雑性領域のフィルタリングは止められる必要がある。
【０１７０】
ポリペプチド配列同一性はさらに、全体的配列アラインメント・プログラムを用いて、候補および対象ポリヌクレオチド配列間の重複の全長に亘って算定され得る。上記のようなＥＭＢＯＳＳ-ニードル（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/で利用可能）およびＧＡＰ（Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235）も、ポリペプチド配列同一性を算定するための適切な全体的配列アラインメントプログラムである。
【０１７１】
本発明のポリペプチド変異体は、それらの配列の機能的等価性を保存すると思われる特定的同定配列のうちの１つまたは複数との類似性を示すもの、そしてランダムチャンスにより起きたと読み取り可能的に予測され得ないものも包含する。ポリペプチドに関するこのような配列類似性は、NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのBLASTプログラム組（バージョン2.2.10[Oct 2004]）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて、確定され得る。ポリヌクレオチド配列の類似性は、以下のユニックス・コマンドライン・パラメーターを用いて検査され得る：
【０１７２】
Bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-FF-p blastp
変異体ポリヌクレオチド配列は、特定的に同定された配列のいずれか1つと比較した場合、好ましくは1×10-10未満、さらに好ましくは1×10-20未満、1×10-30未満、1×10-40未満、1×10-50未満、1×10-60未満、1×10-70未満、1×10-80未満、1×10-90未満、1×10-100未満、1×10-110未満、1×10-120未満または1×10-123未満のＥ値を示す。
【０１７３】
パラメーター-ＦＦは、低複雑性区分のフィルタリングを止める。パラメーター-ｐは、配列の対のための適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の領域を見出し、そしてこのような領域の各々に関して、「Ｅ値」を報告するが、これは、ランダム配列を含有する固定参照サイズのデータベース中で偶然にこのような整合を見ることが予測され得る予測時間数である。1より非常に小さい小Ｅ値に関しては、これはだいたいこのようなランダム整合の確率である。
【０１７４】
その生物学的活性を有意に変更することなく、上記のポリペプチド配列の1つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換も、本発明に包含される。表現型的サイレントアミノ酸置換の作成方法を、当業者は承知する（例えばBowie et al., 1990, Science 247, 1306参照）。
【０１７５】
本発明のポリペプチド変異体は、ポリペプチドをコードする核酸から産生されるが、しかし野生型ポリペプチドとは異なるものを包含するが、この場合、それは、それが変更アミノ酸配列を有するよう、別の仕方で処理される。例えば変異体は、野生型ポリペプチドを産生するものの代替的スプライシングパターンの一次ＲＮＡ転写体により産生され得る。
【０１７６】
「ベクター」という用語は、宿主細胞中に遺伝子構築物を輸送するために用いられる、通常は二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子を指す。ベクターは、少なくとも1つの付加的宿主系、例えば大腸菌における複製を可能にし得る。
【０１７７】
２．発現構築物調製
微生物、植物細胞または動物細胞（細胞発現系）における、あるいは無細胞発現系、ならびに本発明で用いるためのポリマー粒子を形成するために有用な発現構築物を含む宿主細胞における融合ポリペプチドの発現のための発現構築物を産生し、使用するための方法は、当該技術分野で周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987参照）。
【０１７８】
本発明の方法に用いるための発現構築物は、クローニングのためにまたは発現のために複製可能ベクター中に挿入され得るし、あるいは宿主ゲノム中に組入れられ得る。種々のベクターが公的に利用可能である。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列は、種々の手法によりベクター中に挿入され得る。概して、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技法を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。ベクター構成成分としては一般的に、１つまたは複数のシグナル配列、複製の起点、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、エンハンサー素子、プロモーター、および転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。１つまたは複数のこれらの構成成分を含有する適切なベクターの構築は、当該技術分野で既知の標準結紮技法を用いる。
【０１７９】
発現およびクローニングベクターはともに、１つまたは複数の選択宿主細胞中でベクターを複製させる核酸配列を含有する。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関して周知である。
一実施形態では、発現構築物は、高コピー数ベクター上に存在する。
一実施形態では、高コピー数ベクターは、20〜3000コピー／宿主細胞で存在し得るものから選択される。
【０１８０】
一実施形態では、高コピー数ベクターは、高コピー数複製起点（ｏｒｉ）、例えばＣｏｌＥ１またはＣｏｌＥ１由来複製起点を含有する。例えばＣｏｌＥ-１由来複製起点は、ｐＵＣ１９複製起点を含み得る。
本発明のベクターで用いるのに適した多数の高コピー数複製起点は、当業者に既知である。これらの例としては、ｐＢＲ３２２およびその誘導体からのＣｏｌＥ１由来複製起点、ならびにその他の高コピー数複製起点、例えばＭ１３ＦＲｏｒｉまたはｐ１５Ａｏｒｉが挙げられる。2μプラスミド起点が酵母に関しては適しており、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳類細胞中でベクターをクローニングするために有用である。
【０１８１】
好ましくは、高コピー数複製起点は、ＣｏｌＥ１由来ｐＵＣ１９複製起点を含む。
制限部位への挿入物のクローニングが起点を不活性化して、それがベクターの複製に向くのを不可能にするよう、制限部位は複製起点に配置される。代替的には、制限部位中への挿入物のクローニングがベクターの低または単一コピー数複製のみを支持し得るようにさせるよう、少なくとも1つの制限部位は起点内に配置され得る。
発現およびクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有して、形質転換宿主細胞中のベクターの存在を検出する。典型的選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補足する、あるいは（ｃ）複合培地から利用可能でない重要栄養素を供給するタンパク質をコードする、例えば遺伝子は、桿菌に関するＤ-アラニンラセマーゼをコードする。
【０１８２】
植物形質転換に一般的に用いられる選択可能マーカーとしては、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴ  ＩＩ）（カナマイシン耐性を付与する）、ａａｄＡ遺伝子（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性を付与する）、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ遺伝子）（イグナイト（AgrEvo）およびバスタ（Hoechst）耐性に関する）、ならびにヒグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）（ヒグロマイシン耐性に関する）が挙げられる。
【０１８３】
哺乳類細胞のための適切な選択可能マーカーの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのような発現構築物を取り込むための細胞構成成分の同定を可能にするものである。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが用いられる場合、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)により記載されるように調製され、増殖されたＤＨＦＲ活性を欠くＣＨＯ細胞株である。酵母で用いるための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)；Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979)；Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンでの増殖能力を欠く酵母の突然変異体株、例えばＡＴＣＣ  No. 44076またはＰＥＰ４-１に関する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85: 12 (1977)］。
【０１８４】
ポリマー粒子を形成するために有用な発現構築物としては、好ましくは、ポリマー合成酵素、粒子形成タンパク質、または融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸の発現を制御するプロモーターが挙げられる。
種々の潜在的宿主細胞により認識されるプロモーターが周知である。原核生物宿主とともに用いるのに適したプロモーターとしては、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Chang et al., Nature, 275: 615 (1978)；Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)］、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980)；EP 36,776］、ならびにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)］が挙げられる。細菌系で用いるためのプロモーターも、ポリマー合成酵素、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドをコードする核酸と操作可能的に連結されるシャイン・ダルガーノ（S.D.）配列を含有する。
【０１８５】
酵母宿主とともに用いるための適切なプロモーティング配列の例としては、３-ホスホノグリセレートキナーゼ［Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)］またはその他の解糖酵素［Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-ホスフェートイソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
【０１８６】
その他の酵母プロモーター（増殖条件により制御される転写の付加的利点を有する誘導可能プロモーターである）は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に関するプロモーター領域である。
【０１８７】
植物宿主細胞、例えば単子葉または双子葉植物の組織または器官中で用いるための適切なプロモーターの例としては、細胞-、組織-および器官特異的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、一時性プロモーター、誘導可能プロモーター、ほとんどの植物組織中で活性である構成性プロモーター、ならびに組換えプロモーターが挙げられる。プロモーターの選択は、そのように所望されるクローン化ポリヌクレオチドの時間的および空間的発現によっている。プロモーターは、宿主細胞からのもの、あるいは他の植物、ウイルスおよび植物病原性細菌および真菌の遺伝子に由来するプロモーターであり得る。当業者は、過度の実験をすることなく、本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を用いて、発現構築物を修飾し、調整するに際して用いるのに適しているプロモーターを選択することができる。構成性植物プロモーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素・プロモーターおよびオクトピン合成酵素・プロモーター、ならびにトウモロコシからのＵｂｉ１プロモーターが挙げられる。特定組織中で活性である植物プロモーターは内部発達シグナルに応答し、あるいは外部非生物的または生物的ストレスは科学文献に記載されている。例示的プロモーターは、例えばWO 02/00894（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１８８】
哺乳類宿主細胞中で用いるための適切なプロモーターの例は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ・パピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ならびに熱ショックプロモーターから得られるものを含むが、但し、このようなプロモーターは宿主細胞系に適合性である。
【０１８９】
高等真核生物による発現構築物の転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大され得る。エンハンサーは、その転写を増大するためにプロモーターに作用する、通常は約10〜300 bpのＤＮＡのシス作用素子である。多数のエンハンサー配列が、目下、哺乳類遺伝子から既知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-胎児タンパク質およびインスリン）。しかしながら典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。例としては、複製の起点（bp100〜270）の後側におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製の起点の後側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ポリマー合成酵素、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドコード配列に対して位置５’または３’でベクターにスプライスされるが、しかし好ましくはプロモーターから部位５’に置かれる。
【０１９０】
真核生物宿主細胞中（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結のために、そしてｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有する。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、そして時として３‘非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ポリマー合成酵素、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１９１】
一実施形態では、発現構築物は、上流誘導可能プロモーター、例えばＢＡＤプロモーター（アラビノースにより誘導される）を含む。
一実施形態では、発現構築物は、構成または調節可能プロモーター系を含む。
一実施形態では、調節可能プロモーター系は、誘導可能または抑制可能プロモーター系である。
【０１９２】
組換えタンパク質の産生においては強力なプロモーターを用いるのが望ましいが、異種タンパク質の構成性過剰産生が増殖速度、プラスミド安定性および培養成育可能性の低減をもたらすため、これらのプロモーターの調節が不可欠である。
多数のプロモーターは、レプレッサータンパク質とオペレーター（プロモーターから下流の領域）との相互作用により調節される。最も周知のオペレーターは、ｌａｃオペロンから、およびバクテリオファージＡからのものである。大腸菌における調節プロモーターの大要は、”Parameters Influencing the Productivity of Recombinant E. coli Cultivations” Friends & Reardon. Advances in Biochemical Engineering Technology Vol 48 Springer Verlag (1991)の表に提示されている。
【０１９３】
標準細菌培養と組換え大腸菌を包含するものとの間の大きな差は、増殖および産生または誘導期の分離である。組換えタンパク質産生はしばしば、調節プロモーターを利用して、増殖期（プロモーターが「オフ」であり、そして宿主細胞に及ぼす代謝的負荷がわずかである場合）における高細胞密度を、次に誘導期（誘導後、プロモーターを「オン」に切り替える）における高率の異種タンパク質産生を達成する。
一実施形態では、調節可能プロモーター系は、ＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージγおよびファージＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【０１９４】
一実施形態では、プロモーター系は、ｌａｃまたはＰtacプロモーター、ならびにｌａｃレプレッサーまたはｔｒｐプロモーターおよびＴｒｐＲレプレッサーから選択される。
一実施形態では、ＬａｃＩレプレッサーは、活性レプレッサーと結合するイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクとピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加により不活性化されて、オペレーターからの解離を引き起こして、発現を可能にする。
一実施形態では、濃度が閾値レベルより低くなると、系が自己誘導性になるよう、ｔｒｐプロモーター系は、限定トリプトファン濃度を有する合成培地を用いる。一実施形態では、３-β-インドール-アクリル酸は、ＴｒｐＲレプレッサーを不活性化するために付加され得る。
【０１９５】
一実施形態では、プロモーター系は、バクテリオファージγレプレッサーｃＩを用い得る。このレプレッサーはγプロファージを用い、そしてＯLおよびＯRと呼ばれる2つのオペレーターとの相互作用により、溶解遺伝子のすべての発現を阻害する。これらのオペレーターは、それぞれ2つの強力なプロモーターＰLおよびＰRと重複する。ｃＩレプレッサーの存在下では、ＲＮＡポリメラーゼの結合は阻害される。ｃＩレプレッサーは、ＵＶ照射またはマイトマイシンＣによる細胞の処理により不活性化され得る。組換えポリペプチドの発現を可能にするさらに便利な方法は、温度感受性バージョンのｃＩレプレッサーｃＩ８５７の適用である。γベースの発現系を保有する宿主細胞は、低温で中-指数期に増殖し、次に高温に移されて、組換えポリペプチドの発現を誘導し得る。
【０１９６】
広範に用いられる発現系は、Ｔ７  ＤＮＡ上にのみ見出されるプロモーターだけを認識し、宿主染色体上に存在するプロモーターを認識しないファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。したがって発現構築物は、組換え遺伝子が融合されるＴ７プロモーター（普通は遺伝子１０の前に存在するプロモーター）のうちの1つを含有し得る。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、発現構築物上に、二次適合性発現構築物上に存在するか、または宿主細胞染色体中に組込まれる。3つの場合すべてにおいて、遺伝子は誘導可能プロモーターに融合されて、発現期中のその転写および翻訳を可能にする。
【０１９７】
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Invitrogen, CA）は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する宿主細胞の例である。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するその他の細胞株、例えばゲノム中に組込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する緑膿菌ＡＤＤ1976（Brunschwig & Darzins, 1992, Gene 111, 35-41）、ならびにｐｈａＰプロモーター制御下でゲノム中に組込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するクプリアビドス・ネカター（以前はラルストニア・ユートロファ）（Barnard et al. Protein Expr Purif. 2004 Dec; 38(2): 264-71）は、当該技術分野で既知である。
【０１９８】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細胞酵素を上回る3つの利点を提供する：第一に、それは1つのサブユニットのみで構成され、第二に、それはより高い進化性を発揮し、そして第三に、それはリファンピシンに対して非感受性である。後者の特質は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の誘導後、約10分にこの抗生物質を付加することにより、融合ポリペプチドの量を増強するために特に用いられ得る。その時間中、融合ポリペプチドの高レベルの発現を可能にするのに十分なポリメラーゼが合成され、そして宿主細胞酵素の阻害は、プラスミドおよび染色体の両方の上に存在する他の遺伝子すべてのさらなる発現を阻止する。細菌ＲＮＡポリメラーゼを阻害するが、しかしＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを阻害しない他の抗生物質、例えばストレプトリジギンおよびストレプトバリシンが当該技術分野で既知である。
【０１９９】
すべてのプロモーター系は漏出性であるため、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の低レベル発現は、組換えポリペプチドが毒性タンパク質をコードする場合、細胞に有害であり得る。増殖期中に存在するこれらのポリメラーゼ分子は、ライソザイムに関するＴ７コード遺伝子を発現することにより阻害され得る。この酵素は、宿主細胞の細胞壁中の結合を切断する二機能性タンパク質であり、それと結合することによりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを選択的に阻害する（Ｔ７感染中の転写の制御バーストを保証するフィードバック・メカニズム）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、Ｔ７ライソザイムを構成的に発現するプラスミドｐＬｙｓＳを保有する宿主細胞の一例である。
一実施形態では、プロモーター系は、温度シフトにより、例えば約30〜37℃から42℃に温度を上げて、誘導サイクルを開始することにより、誘導サイクルを開始するよる誘導されるかまたは「スイッチオンされ」得るＡＰＩまたはＡＰＲのようなプロモーターを使用する。
【０２００】
強力なプロモーターは、in vivo産生中に粒子の表面での融合ポリペプチド密度を増強し得る。
好ましい融合ポリペプチドは、以下のものを包含する：
（１）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質、あるいはその任意の2またはそれより多くのうちの任意の組合せ、ならびに
（２）以下のものを包含する融合相手：
（ｉ）少なくとも1つのポリペプチド、または
（ｉｉ）少なくとも1つの結合ドメイン、または
（ｉｉｉ）少なくとも1つのレポーターペプチド、または
（ｉｖ）少なくとも1つのアフィニティー精製ペプチド、または
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの任意の2またはそれより多くの任意の組合せ。
例えば一実施形態では、融合相手は、以下のものを包含し得る：
（ｉ）少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのレポーターペプチド、または
（ｉｉ）少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのアフィニティー精製ペプチド、または
（ｉｉｉ）少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのレポーターペプチドおよび少なくとも1つのアフィニティー精製ペプチド。
【０２０１】
例えば別の実施形態では、融合相手は以下のものを包含し得る：
（ｉ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの結合ドメイン、または
（ｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つのレポーターペプチド、または
（ｉｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つのアフィニティー精製ペプチド、または
（ｉｖ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのレポーターペプチド、または
（ｖ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのアフィニティー精製ペプチド、または
（ｖｉ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの結合ドメインおよび少なくとも1つのレポーターペプチドおよび少なくとも1つのアフィニティー精製ペプチド。
【０２０２】
本明細書中で用いるための融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、粒子結合ドメイン、粒子結合ドメインを含むタンパク質、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列、ならびに少なくとも1つの融合相手をコードする核酸配列を包含する。一旦発現されると、本明細書中で考察されるように、融合ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成するかまたは形成を促し得るし、あるいは単に、形成されたまたは形成中のポリマー粒子と結合し得る。
一実施形態では、少なくとも1つの融合相手をコードする核酸配列は、所望長のポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、粒子結合ドメイン、粒子結合ドメインを含む粒子、または粒子形成タンパク質をコードする核酸配列と間接的に融合される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列は、プロテアーゼ切断認識配列をコードする。
【０２０３】
一実施形態では、少なくとも1つの融合相手をコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ファシン、好ましくはｐｈａＰファジンまたはＮ末端ファジン断片をコードするアミノ酸配列のＣ末端と連続する。
一実施形態では、少なくとも1つの融合相手をコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを促す所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、ファジンまたはＣ末端ファジン断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と間接的に融合される。
【０２０４】
一実施形態では、少なくとも1つの融合相手をコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、合成酵素またはＣ末端合成酵素断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
一実施形態では、少なくとも1つの融合相手をコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを促すための所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して合成酵素またはＮ末端合成酵素断片をコードするアミノ酸配列のＣ末端と間接的に融合される。
【０２０５】
一実施形態では、少なくとも1つの融合相手をコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、デポリメラーゼまたはＣ末端デポリメラーゼ断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０２０６】
本発明による融合ポリペプチドの一利点は、ポリマー粒子の表面に結合するタンパク質の修飾がポリマー粒子の形成に関与するタンパク質の機能性に影響を及ぼさない、という点である。例えばポリマー合成酵素の機能性は、組換えポリペプチドがそのＮ末端と融合されて、粒子の表面上の組換えポリペプチドの産生を生じる場合、保持される。それにもかかわらず融合によりタンパク質の機能性が万一減損されると、この欠点は、同一機能を実施し、そして活性状態で存在する付加的粒子形成タンパク質の存在により相殺され得る。
【０２０７】
このようにして、粒子形成タンパク質を介してポリマー粒子に結合される組換えポリペプチドの安定結合を保証することが可能である。
一実施形態では、核酸は、以下のもののうちの任意の１つまたは複数のも包含し得る：
（１）粒子形成タンパク質、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列、または
（２）付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列であって、上記付加的融合ポリペプチドが、以下の：
（ａ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、粒子形成タンパク質、またはその組合せ、ならびに
（ｂ）少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは１つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｃ）少なくとも1つのポリペプチド、および少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは１つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｄ）少なくとも1つのレポーターペプチドまたはアフィニティー精製ペプチド
を包含する少なくとも1つの核酸配列、あるいは
（３）その2またはそれより多くのうちの任意の組合せ。
【０２０８】
一実施形態では、レポーターペプチドは、蛍光ペプチドまたはレポーター酵素である。
一実施形態では、レポーターペプチドは、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される。
融合ポリペプチド中のタンパク質の配置は、プラスミド中に含入される核酸中の遺伝子配列の順序によっている、と理解されるべきである。例えば、粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質がポリペプチドと間接的に融合される融合ポリペプチドを産生することが望ましい。「間接的に融合される」という用語は、少なくとも粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質を含む融合ポリペプチド、ならびに融合ポリペプチド中で発現されるよう所望される任意のタンパク質であり得る付加的タンパク質により分離されるポリペプチドを指す。
【０２０９】
一実施形態では、付加的タンパク質は、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチド、あるいは上記のような融合ポリペプチドの個々のフォールディングを促すためのリンカーまたはスペーサーから選択される。この実施形態では、融合ポリペプチドの所望の配置を反映するようプラスミド中に遺伝子の配列を指示することが必要である。
一実施形態では、粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質は、ポリペプチドに直接的に融合され得る。「直接的に融合される」という用語は、2またはそれより多くのペプチドがペプチド結合により連結される場合を示すために本明細書中で用いられる。
【０２１０】
粒子がポリマーコアに結合される少なくとも2つの別個の融合ポリペプチドを含む粒子を形成することも可能であり得る。例えばペプチドライブラリーに融合される粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質を包含する第一の融合ポリペプチドは、ポリマーコアと結合され得る。このほかに、少なくとも1つの付加的融合ポリペプチドが、上記の第一タンパク質と異なる部位でポリマーコアに結合され得る。付加的融合ポリペプチドは、上記のような粒子形成タンパク質、融合ポリペプチド、レポーターペプチド、またはアフィニティー精製ペプチドを包含し得る。
一実施形態では、発現構築物は、in vivoで発現される。好ましくは発現構築物は、微生物、好ましくは大腸菌中で発現されるプラスミドである。
【０２１１】
一実施形態では、発現構築物は、in vitroで発現される。好ましくは発現構築物は、無細胞発現系を用いてin vitroで発現される。
一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子が単一発現構築物中に挿入され得るし、あるいは１つまたは複数の遺伝子が宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。すべての場合、発現は、上記のようなプロモーターにより制御され得る。
【０２１２】
一実施形態では、発現構築物はさらに、上記のような粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、および少なくとも１つまたは複数の粒子形成タンパク質、融合ポリペプチド、レポーターペプチド、またはアフィニティー精製ペプチドを含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチドをコードする。
一実施形態では、本発明の方法はさらに、上記のような粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質および少なくとも１つまたは複数の粒子形成タンパク質、融合ポリペプチド、レポーターペプチド、またはアフィニティー精製ペプチドを含む少なくとも1つの付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの付加的発現構築物を提供することを包含する。
【０２１３】
一実施形態では、発現構築物は、発現構築物結合ペプチド結合ドメインを包含する。好ましくは発現構築物結合ペプチドおよび発現構築物結合ペプチド結合ドメインは、単一発現構築物または発現構築物の群に独特である。
好ましくは、アフィニティー精製を可能にするためのペプチドは、単一発現構築物または発現構築物の群に独特である。
本明細書中で有用なプラスミドは、図面に示されており、そして公開済みのＰＣＴ国際出願WO 2004020623（Bernd Rehm）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳細に記載されている。
【０２１４】
３．ペプチドライブラリー形成
本発明の一態様は、ペプチドおよびペプチドライブラリーを表示し、スクリーニングすることに関する。一実施形態では、本発明は、ポリマー粒子を用いてペプチドおよびペプチドライブラリーを表示し、そしてスクリーニングするためのポリマーの産生に関する。
ペプチドライブラリーの産生方法は、当該技術分野で周知である（例えばCrossley R, 2004；Mori T, 2004参照）。当該技術分野で既知であるペプチドの発現可能ライブラリー（発現ライブラリー）の生成のための任意の技法は、本発明による表示のためのペプチドライブラリーを生成するために用いられ得る。
【０２１５】
本明細書中で有用なペプチドライブラリーは、生物体の全遺伝子相補体またはその一部分から調製され得るし、あるいは当該タンパク質をコードする単一親配列から調製され得る。代替的には、ペプチドライブラリーは工学処理ライブラリーであり得る。ライブラリーにおける多様性は、既知の技法、例えば突然変異誘発、ＰＣＲを用いて導入されて、そしてオリゴヌクレオチドを合成するために用いられる反応混合物を変える。
【０２１６】
本明細書中で有用なペプチドライブラリーは別個のペプチドのコレクションを含み、この場合、各ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、阻害剤、カップリングドメイン、またはその組合せを包含する。細胞シグナル伝達に関与する受容体は、特に興味深い。
【０２１７】
このような受容体は、上記のようなＧプロテイン結合受容体、アセチルコリン受容体、トロンボポエチン受容体、核受容体、ケモカイン受容体、ステロイドホルモン受容体、上皮細胞増殖因子受容体、トル受容体、トル様受容体、マンノース受容体、７ＴＭ受容体、神経ペプチド受容体、ＮＭＤＡ受容体、Ｔ細胞受容体、ホルモン受容体、ＩｇＧ受容体またはサイトカイン受容体、ならびにその亜型を包含する。
【０２１８】
ゲノム／ｃＤＮＡライブラリー
染色体ＤＮＡは、例えば音波処理、ＤＮアーゼ処理またはゲージ針による剪断により、所望のサイズに断片化され得る。
音波処理は、試料が2〜3秒間音波処理され、断片サイズがゲル電気泳動により分析され、そして断片が長すぎるとみなされる場合、音波処理は容易に反復され得る、という利点を有する。したがって所望長の断片が容易に得られる。所望されるサイズは、ライブラリーの意図される用途によっている。主な目的が結合ドメインをマッピングすることである場合、小断片が用いられ得るが、一方、結合タンパク質をコードする遺伝子の同定のためには、大型断片が好ましい。
【０２１９】
ＤＮＡライブラリーは、プラスミドゲノムおよび細胞ＤＮＡの両方を同一制限ヌクレアーゼで消化することにより形成され得る。その結果生じるＤＮＡ断片は次に、切断プラスミドに付加され、そしてそれらの粘着末端を介してアニーリングされて、組換えＤＮＡを生成する。
【０２２０】
ｃＤＮＡライブラリーは、ｍＲＮＡを抽出し、そして逆転写酵素により触媒されるｃＤＮＡコピーを作製することにより、同一方法により形成され得る（Johnson et al., 1998）。次に１本鎖ＤＮＡ分子はＤＮＡポリメラーゼにより二本鎖ＤＮＡ分子に転化され、そして上記のように制限ヌクレアーゼで切断される。
単離され得るＤＮＡまたはＲＮＡの任意の選択は次に、断片に消化されて（例えば制限ヌクレアーゼを用いる）、ペプチドライブラリーをコードする発現ライブラリーを生じ得る（Cho G 2000；Wilson D et al., 2001）、ということが明らかになるはずである。
【０２２１】
ランダム化／突然変異誘発
分子の１つまたは複数のファミリーからの１つまたは複数のポリペプチドは、有益にランダム化されて、本発明の方法に用いるための候補分子の一ライブラリーを提供し得る。好ましくは特定機能のために重要であることが既知の分子の領域、例えば活性部位、タンパク質結合部位または核酸結合部位がランダム化され得る。しかしながら、分子の他の領域、例えば二次、三次または四次構造の形成に関与する領域をランダム化するのが望ましい。
【０２２２】
部位特異的またはランダム突然変異誘発といったような技法は、突然変異化ポリヌクレオチドを生成するために用いられ、これは次に、本発明の方法における発現のためにプラスミドに結紮され、あるいはプラスミドへの結紮前に断片化され得る。
【０２２３】
突然変異は、当業者に既知の任意の方法により実施され得る。しかしながら好ましいのは、当該タンパク質をコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発である。Ｍ１３のような１本鎖ファージを用いる方法からＰＣＲベースの技法まで、部位特異的突然変異誘発のための多数の方法が当該技術分野で既知である。これらは、以下の技法を包含する：
【０２２４】
エラー・プローンＰＣＲは、高率の点突然変異が全長のＰＣＲ産物とともに得られるよう、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施するための方法である（Leung, D.W., et al., Techique, 1:11-15 (1989)およびCadwell, R.C.& Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2: 28-33 (1992)）。
【０２２５】
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、当該クローン化ＤＮＡセグメントのいずれかにおける部位特異的突然変異の生成を可能にする一方法である（Reidhaar-Olson, J.F. & Sauer, R.T., et al., Science, 241: 53-57 (1988)）。
アセンブリーＰＣＲは、小ＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリーを包含する一方法である。多数の異なるＰＣＲ反応が同一バイアル中で平行して起こり、1つの反応産物が別の反応の産物の生成を促す。
【０２２６】
性的ＰＣＲ突然変異誘発（「ＤＮＡシャッフリング」としても既知である）とは、配列相同性に基づいたＤＮＡ分子のランダム断片化により引き起こされる、異なるがしかし高度に関連するＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間の強制的相同的組換えと、その後のＰＣＲ反応におけるプライマー伸長による乗換えの固定を指す（Stemmer, W.P., PNAS, USA, 91: 10747-10751 (1994)）。
【０２２７】
in vivo突然変異誘発は、1つまたは複数のＤＮＡ修復経路に突然変異を保有する大腸菌の一菌株におけるＤＮＡの増幅を包含する当該クローン化ＤＮＡのいずれかにおいてランダム突然変異を生成する一方法である。これらの「ミューテーター」株は、野生型親株のものよりも高いランダム突然変異率を有するこれらの菌株のうちの1つにおけるＤＮＡの増幅により、ＤＮＡ内のランダム突然変異が最終的に生成される。
カセット突然変異誘発は、二本鎖ＤＮＡ分子の小領域を、ネイティブ配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換するための一方法である。オリゴヌクレオチドはしばしば、完全におよび／または部分的にランダム化されたネイティブ配列を含有する。
【０２２８】
帰納的集合突然変異誘発とは、表現型関連突然変異体の多様な集団であって、その成員がアミノ酸配列において異なる当該集団を産生するために開発されたタンパク質工学処理（タンパク質突然変異誘発）のためのアルゴリズムを指す。この方法は、フィードバック・メカニズムを用いて、組合せカセット突然変異誘発の連続的サイクルを制御する（Arkin, A.P. and Youvan, D.C., PNAS, USA, 89: 7811-7815 (1992)）。
指数的集合突然変異誘発は、高パーセンテージの独特の且つ機能的な突然変異体を有する組合せライブラリーを生成するための一方法（この場合、残基の小さな基が平行してランダム化されて、各変更部分で、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する）（Delegrave, S. and Youvan, D.C., Biotechnology Research, 11: 1548-1552 (1993)）；ならびにランダムおよび部位特異的突然変異誘発（Amold, F.H., Current Opinion in Biotechnology, 4: 450-455 (1993)）である。
【０２２９】
抗体ライブラリー
全体的または部分的合成抗体組合せ部位または抗原結合部位の大型ライブラリーが構築されて、多様な且つ新規の免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大型ライブラリーを生じる（Feldhaus and Siegel 2004；Ttibbick G 2002）。抗体ライブラリーの産生は、Adda et al (2002)で再検討される。
【０２３０】
ライブラリーは、ＶLおよびＶRのような抗体断片をコードするランダム・オリゴヌクレオチドのライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをプラスミド中に挿入することにより、作製され得る。その結果、多様なペプチドを含有するペプチドライブラリーが構築され得る。
組合せ抗体ライブラリーの多様性は、重鎖および軽鎖遺伝子のシャッフリングにより、ライブラリーのクローン化重鎖遺伝子の相補的決定領域３（ＣＤＲ３）を変更することにより、そしてエラー・プローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりライブラリー中にランダム突然変異を導入することにより、増大され得る。
【０２３１】
突然変異誘発は、重鎖遺伝子と組合せて用いるための軽鎖遺伝子ライブラリー、ならびに多様なそして新規の免疫特異性の抗体ライブラリーを産生するための遺伝子ライブラリーを産生するために、免疫グロブリン軽鎖遺伝子のＣＤＲで誘導され得る。当該方法は、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により免疫グロブリン軽鎖遺伝子のＣＤＲ部分を増幅すること、そして次に増幅ＣＤＲを単離して、突然変異化免疫グロブリン軽鎖遺伝子のライブラリーを生成することを包含する。突然変異化軽鎖遺伝子のこの単離ライブラリーは、1つまたは複数の重鎖遺伝子と組合せて用いられて、発現重鎖および軽鎖遺伝子の組合せ抗体ライブラリーを形成し得る。
【０２３２】
１本鎖Ｆｖ断片から成る半合成抗体ライブラリーは、１本鎖Ｆｖ領域の重鎖ＣＤＲ３領域を、三つ組ヌクレオチドコドンを用いてアミノ酸のランダム配列により取り替えることにより構築され得る。
代替的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成する任意のＰＣＲ法が用いられ得る。さらに、ＤＮＡの音波処理も、ＤＮＡ断片を産生するために用いられ得る。
【０２３３】
合成ペプチド
ペプチドライブラリーは、既知の技法に従ってオリゴヌクレオチドの化学合成により調製され得る。用いられる反応混合物を変えることにより、あるいはエラー・プローン合成方法または酵素を用いることにより、多様性が導入され得る。
マイクロアレイ形成に用いられる適切な技法は、Seliger H, Hinz M, Happ E., “Arrays of immobilized oligonucleotides−contributions to nucleic acids technology”, Curr Pharm Biotechnol., 2003, 4(6): 379-95；およびGao X, Gulari E, Zhou X., “In situ synthesis of oligonucleotides microarrays”, Biopolymers, 2004, 73(5): 579-96により再検討される。
上記の方法のいずれかに関して、濃化方法、例えばＰＣＲを用いて、当該ライブラリー成員をコードする核酸をさらに単離しまたは増幅し得る。
【０２３４】
４．発現構築物発現および粒子産生
本発明のいくつかの態様では、宿主細胞中の発現構築物の過剰発現を達成することが望ましい。過剰発現は、ｉ）強力なプロモーター系、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター系の使用；ｉｉ）高コピー数プラスミド、例えばｃｏｌＥ１複製起点を含有するプラスミドの使用；あるいはｉｉｉ）例えば融合配列の使用によるメッセンジャーＲＮＡの安定化により達成され得る。過剰発現の利点は、所望の小粒子の産生ならびに多数のポリマー粒子の産生を可能にする。
【０２３５】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）粒子の、ならびにそれらの形成に関与するタンパク質の形成は、Madison, L.L. et al, “Metabolic Engineering of Poly(3-hydroxyalkanoates): From DNA to Plastic”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, (1999), 63(1): 21-53；公開済みＰＣＴ国際出願WO 2004020623（Bernd Rehm）；およびRehm B.H.A., “Polyester synthases: natural catalysts for plastics”, Biochem J., (2003), 376(1): 15-33；Brockelbank JA. Et al., Appl Environ Microbiol. 2006 Aug 25 [Epub ahead of print]；Peters V & Rehm BH., Appl Environ Microbiol. 2006 Mar; 72(3): 1777-83；B. Thomas Backstrom, Jane A Brockelbank and Bernd H.A. Rehm [in press]および Rehm  BHA ”Biopolyester particles produced by microbes of using polyester synthases: self assembly and potential applications” in Microbial Biotechnology: biological self-assembly systems and biopolymer-basednanostructures（Rehm BHA, Ed）Horizon Bioscience (2006)（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される）で報告されている。
【０２３６】
発現構築物は、粒子結合ドメインまたは粒子結合ドメインを含む粒子形成タンパク質、ならびに以下の：
（１）少なくとも1つの結合ドメインまたは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せ、あるいは
（２）少なくとも1つのポリペプチド、あるいは
（３）その組合せ
を包含する少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物で宿主細胞を形質転換することにより、発現され得る。
【０２３７】
形質転換後、形質転換宿主細胞は、発現構築物からの融合ポリペプチドの発現のために、そしてポリマー粒子の形成のために適している条件下で培養される。このような条件は、当該技術分野で既知であるような適切な生物体中のプラスミドのような、選択発現構築物の発現に適したものを包含する。培地中の適切な基質の提供は、融合ポリペプチドの粒子形成タンパク質構成成分にポリマー粒子を生成させる。
【０２３８】
発現構築物を含む宿主細胞は、本発明の方法に用いるためのポリマー粒子の組換え的産生のための当該技術分野で周知の方法（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987）において有用である。
【０２３９】
官能性側鎖基を有する少なくとも1つの脂肪酸は、好ましくは、ポリマー粒子の形成のための基質として培地中に導入され、少なくとも1つのヒドロキシ脂肪酸および／または少なくとも1つのメルカプト脂肪酸および／または少なくとも1つのβ-アミノ脂肪酸が特に好ましくは導入される。「官能性側鎖基を有する脂肪酸」は、飽和または不飽和脂肪酸を意味すると解釈されるべきである。これらは、メチル基、アルキル基、ヒドロキシル基、フェニル基、スルフヒドリル基、第一、第二および第三級アミノ基、アルデヒド基、ケト基、エーテル基、カルボキシル基、Ｏ-エステル基、チオエステル基、カルボン酸アミド基、ヘミアセタル基、アセタル基、ホスフェートモノエステル基およびホスフェートジエステル基からなる基から選択される官能性側鎖基を含有する脂肪酸も包含する。基質の使用は、ポリマーコアの所望の組成および所望の特性により確定される。
【０２４０】
それらを構成するポリマーの異なる組成を有するポリマー粒子は、異なる機械的特性を示し、そして生物学的活性物質、特に薬学的活性成分を、異なる速度で放出する。例えばＣ６-Ｃ１４  ３-ヒドロキシ脂肪酸から成るポリマー粒子は、当該ポリマーの低結晶化度のため、高率のポリマー分解を示す。ポリマー主鎖上に相対的に大きい側鎖を有するポリマー構成成分のモル比の増大は、通常は、結晶化度を低減して、より顕著なエラストマー特性を生じる。本発明に記載される方法に従ってポリマー組成を制御することにより、したがってポリマー粒子の生分解性に、したがって生物学的活性物質、特に薬学的活性成分またはスキンケア成分の放出速度にも、影響を及ぼし得る。
【０２４１】
生成されるポリマーコアのサイズのさらに的確な制御を達成するために、ポリマーコアのサイズの制御を保証するのに十分であるような量で、基質が培地中に付加され得る。これは、粒子サイズ全体のさらに有効な制御を発揮するための付加的可能性を生じる。
基質または基質混合物は、少なくとも1つの任意置換アミノ酸、ラクテート、エステル、あるいは飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはアセチル-ＣｏＡを含み得る。
【０２４２】
ポリマー粒子は、ポリ-ベータ-アミノ酸、ポリラクテート、ポリチオエステルおよびポリエステルから選択されるポリマーを含み得る。最も好ましくは、ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくはポリ（３-ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を含む。
【０２４３】
一実施形態では、標識または標識化基質は、標識がポリマー粒子形成中にポリマー粒子に組入れられるか、あるいはポリマー粒子中に拡散させられるよう、基質混合物中に提供される。好ましくは標識は、着色または蛍光分子、放射性同位体、あるいは1つまたは複数の金属イオンである。好ましくは標識化基質は、アミノ酸、ラクテート、エステル、あるいは飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはアセチル-ＣｏＡである。
【０２４４】
当該構成成分を同定するためのレポーター分子、例えばタグ、染料または標識の使用は、当該技術分野で周知である（Mitsopoulos G et al., 2004）。
一実施形態では、粒子形成タンパク質は、基質または基質の誘導体を重合することにより直接的にポリマー粒子の形成を触媒することにより、ポリマー粒子を形成し得る。このような粒子形成タンパク質の例としては、ポリマー合成酵素、特にＰＨＡポリマー合成酵素が挙げられる。代替的には、粒子形成タンパク質は、例えば重合を促すことによりポリマー粒子の形成を促進することにより、ポリマー粒子を形成し得る。重合を促し得る粒子形成タンパク質としては、ファジンが挙げられる。
【０２４５】
本明細書中で有用な粒子形成タンパク質を含む融合ポリペプチドの作用は、図１に示すようなポリマー粒子の形成を生じる。図１は、リン脂質単層により封入されるポリエステルコアを含むin vivo産生ポリマー粒子、ならびにコアにまたはリン脂質単層にまたはその両方に結合される粒子と会合されるタンパク質および脂質の模式的概観である。本発明に用いるために産生されるポリマー粒子は、図１で確認される1つまたは複数の特徴を有し得る。
【０２４６】
付加的粒子形成タンパク質は、代謝に影響を及ぼして、ポリマー粒子の形成をもたらし得る任意のタンパク質であり得る。図２は、フェノール資化細菌（近年、クプリアビドス・ネカターと改名）中でのポリマー粒子の合成の一例を示す。ポリヒドロキシアルカノエート・ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）は、基質アセチル-ＣｏＡから出発して、三段階工程で産生される。ＰＨＢ中のＣ４反復単位は、β-ヒドロキシ酪酸である。合成における最終ステップは、その表面に、好ましくはポリマーコアまたはリン脂質単層の外表面に、結合される粒子結合タンパク質を伴うポリマー粒子の形成を生じる。
粒子形成タンパク質をコードする核酸配列は、それがチオラーゼ、レダクターゼまたはポリマー合成酵素をコードするよう、選択され得る。ポリマー合成酵素は、ポリマーの形成のための最終ステップを触媒し得る任意のタンパク質であると解釈される。本発明に記載されるポリマー合成酵素とは別に、ポリマーの形成は、例えばリパーゼによっても行なわれ得る。
【０２４７】
一実施形態では、付加的粒子形成タンパク質は、ファジン様タンパク質のファミリーに由来し、そして好ましくは、フェノール資化細菌からのファジン遺伝子ｐｈａＰおよびシュードモナス・オレオボランスからのファジン遺伝子ｐｈａＦからなる群から選択される。ファジンは、ポリマー粒子の疎水性表面と密接に結合する14〜28 kDaの分子量を有する両親媒性タンパク質である。
【０２４８】
一実施形態では、粒子形成タンパク質は、ポリマー合成酵素から選択されるＰＨＡポリマー合成酵素であり、フェノール資化細菌、シュードモナス・オレオボランス、有機溶媒耐性細菌、緑膿菌、アエロモナス・パンクタータまたはチオカプサ・フェンニギからのポリマー合成酵素から成る群から選択される。
一実施形態では、粒子結合ドメインは、上記の粒子形成タンパク質の粒子結合ドメインから選択される粒子結合ドメインである。
発現構築物は、宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。
【０２４９】
好ましくは宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞、好ましくは単離または非ヒト宿主細胞である。
適切な原核生物宿主細胞は、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性細菌、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌を包含する。種々の大腸菌株、例えば大腸菌Ｋ１２菌株ＭＭ２９４（ATCC 31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC 27,325）およびＫ５  ７７２（ATCC 53,635）が公的に入手可能である。その他の適切な原核生物宿主としては、腸内細菌科細菌、例えばエシェリキア属、例えば大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア菌、および赤痢菌属、ならびにバシラス属、例えば枯草菌およびバシラス・リケミフォルミス、シュードモナス属、例えば緑膿菌、およびアクチノミセス属、例えばストレプトミセス、ロドコッカス、コリネバクテリウムおよびマイコバクテリウム属が挙げられる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ産物発酵のための共通宿主菌株である、ため、大腸菌株Ｗ３１１０が用いられ得る。好ましくは宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば菌株Ｗ３１１０は、宿主にとって内因性であるタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子突然変異を実行するよう修飾され、このような宿主の例としては、大腸菌Ｗ３１１０菌株１Ａ２（完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する）；大腸菌Ｗ３１１０菌株９Ｅ４（完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する）；大腸菌Ｗ３１１０菌株２７Ｃ７（ATCC 55,244）（完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（argF-lac）169 degP ompT kanrを有する）；大腸菌Ｗ３１１０菌株３７Ｄ６（完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（argF-lac）169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する）；大腸菌Ｗ３１１０菌株４０Ｂ４（非カナマイシン耐性degP欠失突然変異を有する菌株３７Ｄ６である）が挙げられる。
【０２５１】
原核生物のほかに、真核微生物、例えば糸状真菌または酵母が、本発明の方法に用いるための適切なクローニングまたは発現宿主である。ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）は、一般的に用いられる下等真核宿主微生物である。他の例としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Beach and Nurse, Nature, 290: 140[1981]；EP 139,383（1985年5月2日公開））；クリュイベロミセス属宿主（米国特許第4,943,529号；Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセス・ラクティス（ＭＷ９８-８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラジリス（ATCC 12,424）、クリュイベロミセス・ブルガリクス（ATCC 16,045）、クリュイベロミセス・ウィケラミ（ATCC 24,178）、クリュイベロミセス・ワルティ（ATCC 56,500）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム（ATCC 36,906；Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135(1990)）、クリュイベロミセス・サーモトレランスおよびクリュイベロミセス・マルキシアヌス；ヤロウィア（EP 402,226）；ピチカ・パストリス（EP 183,070；Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（EP 244,234）；ニューロスポラ・クラッサ（Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワンニオミセス、例えばシュワンニオミセス・オシデンタリス（EP 394,538（1990年10月31日公開））；ならびに糸状真菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（WO 91/00357（1991年1月10日公開））、ならびにアスペルギルス属宿主、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]；Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]；Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）およびアスペルギルス・ニガー（Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479[1985]）が挙げられる。メチロトロピック酵母が本明細書中では適しており、そしてハンセヌラ、カンジダ、クロエケラ、ピチカ、サッカロミセス、トルロプシスおよびロドトルラからなる属から選択されるメタノール上で増殖し得る酵母を含む。このクラスの酵母の例である特定の種の一覧は、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に見出され得る。
【０２５２】
無脊椎動物宿主細胞の例としては、昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９、ならびに植物細胞、例えばワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（蛾）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、黄色ショウジョウバエ（ミバエ）、およびカイコのような宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えばコナガ幼虫の核多角体病ウイルスＮＰＶのＬ-１変異体、およびカイコＮＰＶのＢｍ-５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、本発明にしたがって本明細書中でウイルスとして用いられ得る。
【０２５３】
有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ-７、ATCC CRL 1651）により形質転換されるサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養中での増殖のためにサブクローニングされる293または293細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)）、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)）；サル腎細胞（ＣＶ１  ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ-７６、ATCC CRL-1587）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、HB 8065）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ060562、ATCC CCL51）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
一実施形態では、宿主細胞は、酸化サイトゾルを有する細胞、例えば大腸菌Origami菌株（Novagen）である。
【０２５４】
別の実施形態では、宿主細胞は、還元サイトゾルを有する細胞、好ましくは大腸菌である。
宿主細胞は、好ましくはラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属および好塩菌属からなる属から選択される。好ましくは用いられる微生物は、フェノール資化細菌（Ralstonia eutropha）、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）、大腸菌、シュードモナス・フラジ、有機溶媒耐性細菌（Pseudomonas putida）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas/fluorescens）および高度好塩菌（Halobiforma haloterrestris）から成る群から選択される。この群は、生体適合性、生分解性粒子を天然に産生し得る微生物、ならびにそれらの遺伝的素質のためにそのようにすることができない例えば大腸菌のような微生物の両方を含む。後者の状態の微生物に粒子を産生させるために必要とされる遺伝子は、上記のように導入される。
【０２５５】
極端に好塩性の古細菌は、低レベルの非特異的タンパク質結合で出ポリマー粒子を産生して、細胞からの粒子のより容易な単離および生成を可能にする。
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つのさらなる核酸配列の意図を持った選択はさらに、ポリマー粒子のその後の組成に影響を及ぼさせる。ポリマー粒子の形成のための代謝経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、異なる反応産物とは異なる基質特異性を有し得るし、あるいはポリマー粒子の形成に関与する基質および分子に及ぼす意図を持った影響を発揮するために、代謝経路における分岐を遮断する。
【０２５６】
原則として、異なる退社のために宿主細胞がポリマー粒子を形成するために必要とされる基質を産生できない場合でさえ、任意の培養可能宿主細胞は、上記の方法によるポリマー粒子の産生のために用いられ得る。このような場合、必要な基質は培地に付加され、次に、細胞中に導入された遺伝子により発現されたタンパク質によりポリマーコアに転化される。
【０２５７】
後者の状態の宿主細胞にポリマー粒子を産生させるために必要とされる遺伝子は、チオラーゼ、レダクターゼまたはポリマー合成酵素、例えばフェノール資化細菌からのｐｈａＡチオラーゼ、ｐｈａＢケトアシルレダクターゼまたはｐｈａＣ合成酵素を包含する。図２は、フェノール資化細菌中でのポリマー粒子の合成の一例を、ならびにポリマー粒子形成のために必要な基質を生成するために必要とされる遺伝子を示す。宿主細胞がポリマー粒子形成を欠くことを増強するためにどの遺伝子が必要とされるかは、宿主細胞の遺伝的素質に、そしてどの基質が倍地中に提供されるかによっている。
最小量で、合成酵素単独が、基質としての（Ｒ）-ヒドロキシアシル-ＣｏＡまたは他のＣｏＡチオエステルまたはその誘導体とともに、任意の宿主細胞中に用いられ得る。
【０２５８】
ポリマー粒子は、in vitroでも形成され得る。好ましくは無細胞発現系が用いられる。in vitroでの粒子形成を可能にするための環境を作り出すためには、ポリマー粒子形成のために必要な基質が培地中に含まれるべきである。
【０２５９】
粒子形成タンパク質は、基質として（Ｒ）-ヒドロキシアシル-ＣｏＡまたは他のＣｏＡチオエステルを用いて、官能化ポリマー粒子のin vitro産生のために用いられ得る。
融合ポリペプチドは、in vitroポリマー粒子産生に用いる前に、細胞選別機、遠心分離、濾過またはアフィニティークロマトグラフィーを用いて、溶解細胞から精製され得る。
in vitroポリマー粒子形成は、融合ポリペプチド適用範囲のレベル、リン脂質組成等を含めて表面組成の最適制御を可能にする。
【０２６０】
一実施形態では、ポリマーコアの望ましい特質は、それが持続的であるという点である。「持続的な」という用語は、選択環境中での分解を阻止するポリマーコアの能力を指す。ポリマーコアの付加的な望ましい特質は、それが粒子形成タンパク質から形成され、そして粒子アセンブリー中に粒子形成タンパク質のＣまたはＮ末端に結合される、という点である。
【０２６１】
ポリマー粒子は、好ましくは、ポリマーコアを封入するリン脂質単層を包含する。好ましくは上記粒子形成タンパク質は、上記の脂質単層に及ぶ。
粒子形成タンパク質は、好ましくは、ポリマーコアと、あるいはリン脂質単層と結合されるか、あるいは両方と結合される。
粒子形成タンパク質は、好ましくは、それが形成するポリマー粒子と共有的にまたは非共有的に結合される。
【０２６２】
好ましくはポリマーコアの表面積の少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％または100％は、融合ポリペプチドにより被覆される。
天然系では、粒子形成タンパク質は、ポリマー粒子表面の1％未満を被覆するよう形成されている。本発明においては、粒子形成タンパク質のＮまたはＣ末端に結合される少なくとも組換えポリペプチドを有する融合ポリペプチドは、ポリマー粒子表面の少なくとも10％、好ましくは約25％またはそれ以上を被覆する。
ポリマー粒子は、約10 nm〜約3 μm、約10 nm〜約900 nmまたは約10 nm〜約110 nmの直径を有し得る。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、多数の小ポリマー粒子を産生するのが望ましい。
したがって本発明の一態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
Ａ）強力なプロモーターの制御下で少なくとも1つの発現構築物を含み、発現構築物が以下の：
（１）ポリマー合成酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列（前記ポリマー合成酵素はポリマー粒子結合ドメインを含む）；または
（２）ポリマー合成酵素および少なくとも1つの融合相手を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列（上記ポリマー合成酵素はポリマー粒子結合ドメインを含む）；ならびに
（３）任意に、以下の：
（ａ）粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列（上記タンパク質はポリマー粒子結合ドメインを含む）、または
（ｂ）付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列（ここで、上記付加的融合ポリペプチは以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、粒子形成タンパク質、またはその組合せ、および
（ｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｉｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｉｖ）少なくとも1つのレポーターペプチドまたはアフィニティー精製ペプチド
を含む）、あるいは
（ｃ）その2またはそれより多くの任意の組合せ
を含む細胞を提供し；
Ｂ）発現構築物の発現のためにならびにポリマー合成酵素によるポリマー粒子の生成のために適した条件下で宿主細胞を培養し（上記ポリマー合成酵素はそれが形成する粒子と会合したままである）；そして
Ｃ）培養細胞からポリマー粒子を分離してポリマー粒子を含む組成物を産生する
ことを包含する方法に関する。
【０２６４】
好ましい実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーターである。
いくつかの好ましい実施形態では、ポリマー粒子は、約300 nmより下の、約200 nmより下の、約150 nmより下の、または約105 nmより下の直径を有する。
本発明の産生方法は、野生型生物体により、または既知の粒子産生宿主細胞により産生されるより小さい粒子をより大きい割合で含む組成物の産生を可能にする。例えば本発明の方法は、組成物中の粒子の90％が約10 nm〜約200 nm、好ましくは以下の：
（ａ）上記組成物中の粒子の80％が約10 nm〜約150 nmの直径を有し；
（ｂ）上記組成物中の粒子の60％が約10 nm〜約100 nmの直径を有し；
（ｃ）上記組成物中の粒子の45％が約10 nm〜約80 nmの直径を有し；
（ｄ）上記組成物中の粒子の40％が約10 nm〜約60 nmの直径を有し；
（ｅ）上記組成物中の粒子の25％が約10 nm〜約50 nmの直径を有し；あるいは
（ｆ）上記組成物中の粒子の5％が約10 nm〜約35 nmの直径を有する
粒子の組成物の産生を可能にする。
【０２６５】
一実施形態では、宿主細胞は、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75または80個のポリマー粒子／細胞を含む。
一実施形態では、融合相手は、ポリペプチド、例えばタンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、レポーターペプチド、アフィニティー精製ペプチド、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せを含み得る。
【０２６６】
１本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）は、多数のバイオ分離適用におけるリガンドとして従来用いられてきた。それらの特異性および再現的に産生される能力のほかに、全抗体と比較した場合のこのような断片の小サイズは、夾雑物の非特異的結合を低減し得る。ＳｃＦｖは、ラセミ混合物中のエナンチオマーの分別ならびに食物および水試料からの微生物の除去、を含めて、多数の標的構成成分を分離するために用いられてきた。
【０２６７】
細胞の細胞質の還元環境は、１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）断片の正確なフォールディングおよび機能性に不可欠なドメイン内ジスルフィド結合の形成を減損する。したがって細胞質中で発現されるほとんどのＳｃＦｖ（細胞内発現抗体）は、大部分が不活性である。しかしながらサイトゾル中で機能的に産生され得るそして抗鶏卵ライソザイムのようなある種の結合親和性をグラフトするための足場として首尾よく用いられてきたいくつかの細胞内発現抗体（例えばｓｃＦｖ（Ｆ８））が単離されている（Donini et al., 2003, Journal of Molecular Biology, 330: 323-332）。さらに、無システイン細胞内発現抗体は、この困難を克服するよう工学処理されてきた（Woern and Plueckthun, 1998, FEBS Letters, 427: 357-361）。
【０２６８】
予備スクリーニング処理された細胞内発現抗体を安定化するための付加的アプローチは、融合ポリペプチドとしてそれらを発現することである。ジスルフィド結合含有ＳｃＦｖは、大腸菌の細胞質タンパク質であるマルトース結合タンパク質と融合された場合に細菌細胞質とともに可溶性および機能性形態で発現されることが示されている（Bach et al (2001)、 Shaki-Loewenstein et al., 2005、Journal of Immunological Methods, 2005, in press）。付加的には、酸化サイトゾルを有する宿主細胞株融合ポリペプチドを発現するために用いられ得る。
粒子形成タンパク質と融合され得る機能性ＶＨＨ細胞内発現抗体を工学処理する、ということも考えられる。
【０２６９】
ＬａｃＺ（ベータ-ガラクトシダーゼ）二量体との細胞内発現抗体の細胞内結合は、活性が容易に検出され得る活性四量体ＬａｃＺの形成を媒介した。これは、ランダム突然変異誘発後の機能性細胞内発現抗体のためのスクリーニング・ツールとして用いられた（Martineau et al., 1998, Journal of Molecular Biology 280: 117-127）。したがって類似のスクリーニング戦略が意図されて、最終的に粒子形成タンパク質と融合され得る任意の機能性細胞内発現抗体を生じて、当該粒子へのそれぞれの細胞内発現抗体の付着を可能にする。
【０２７０】
多数の細胞内発現抗体のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドは、本発明において用いられ得る。
一旦発現されると粒子表面に結合するタンパク質をコードする遺伝子の修飾中、細胞中に異なる修飾を有する構築物を導入することも可能である。その断片の異なるポリペプチドを伴うこれらの融合ポリペプチドが一旦発現され、そしてポリマー粒子が形成されると、このようなやり方で、異なる融合ポリペプチドを用いて粒子表面を多機能化することも可能である。この方法は、機能化ポリマー粒子の直接的且つ効率的質量産生を可能にする。
【０２７１】
一実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
（１）カップリング試薬を融合相手結合ドメインに結合すること
を包含する。
別の実施形態では、当該方法はさらに、以下の：
（１）カップリング試薬を融合相手結合ドメインに結合すること、そして
（２）少なくとも1つの物質をカップリング試薬に結合すること
を包含する。
カップリング試薬は、ポリマー粒子の表面に結合される融合ポリペプチドのその後の機能化のために用いられ、これあのカップリング試薬は、好ましくは、ビス（２-オキソ-３-オキサゾリジニル）ホスホン酸クロリド（ＢＯＰ-Ｃｌ）、ブロモトリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、ベンゾトリアゾール‐１-イル‐オキシ‐トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ｎ-ヒドロキシスクシンイミドビオチン、２-（１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ジクロロヘキシルカルボジイミド、ジスクシニミジルカルボネート、１‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐３‐エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ビス（２-オキソ-３-オキサゾリジニル）ホスフィン、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、２-（１Ｈ-ベンゾトリオキサゾリル）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２-（５-ノルボルネン-２，３-ジカルボキシイミド）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＮＴＵ）、パラ-ニトロフェニルクロロホルメートおよびＯ-（ｎ-スクシニミジル）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）から成る群から選択される。
【０２７２】
一旦形成されると、ポリマー粒子は、好ましくは、細胞の物理的崩壊と、その後の細胞選別機、遠心分離、濾過またはアフィニティークロマトグラフィーを用いた分離により、細胞を崩壊し、粒子を回収することにより、宿主細胞から分離され得る。
粒子の精製は、表面への分子の付加（化学的または融合技法による）を用いて、スクリーニング目的のためにも、アフィニティー精製および／または表面への吸着を可能にする。
【０２７３】
５．機能化ポリマー粒子
ポリヒドロキシアルキルポリマー粒子は、それらを産生した宿主細胞の外側で粒子として安定的に保持され得るということ、そしてこれらの粒子は多数の用途に適合するよう意図され得るということが発見されている。
【０２７４】
機能化ポリマー粒子は、1つまたは複数の表面結合融合ポリペプチド、ポリマー粒子コア中に組込まれるかまたは吸着される1つまたは複数の物質、表面結合融合ポリペプチドに結合される1つまたは複数の物質、あるいはその組合せを含み得る。
一実施形態では、物質は粒子形成中に粒子表面に固定化され、融合相手またはカップリング試薬に結合されるか、あるいは負荷、核酸または組入れにより粒子中に組入れられ得る。
【０２７５】
一実施形態では、物質は、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、免疫原またはその断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはその誘導体、阻害剤、補因子、基質、酵素、補因子、受容体、受容体サブユニットまたはその断片、リガンド、阻害剤、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞またはその断片、細胞抽出物、ウイルス、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せを含む一覧から選択される。
【０２７６】
一実施形態では、少なくとも1つの抗体抗原、抗原決定基、エピトープまたはその断片の免疫原がポリマー粒子の表面に固定化されるか、あるいはポリマー粒子中に組込まれ得る。
一実施形態では、融合相手は、金属イオンまたは金属イオン被覆分子を結合する金属イオン結合ドメインを含み、その結果生じる粒子は医療用画像診断試薬として用いられる。
一実施形態では、同定された感染作因からのＤＮＡは断片化され、そしてポリマー粒子結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする発現構築物中に挿入され得る。このようにして、抗原決定基を表示するポリマー粒子が産生され、そして感染患者からの血清および同定された抗原提示粒子を用いてスクリーニングされ、周知の且つ拡張性の細菌産生系を用いて単離され、再現され得る。
【０２７７】
一実施形態では、多数の抗原がポリマー粒子の表面に固定化され得る。
他の実施形態では、当該物質は、アルファ-ガラクトセラミド、ジデオキシイノシン、フロキシウリジン、６-メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、１-ダルビシン、シスプラチン、メトトレキセート、タキソール、抗生物質、抗凝固薬、殺菌剤、抗不整脈薬および活性成分前駆体またはその誘導体から成る一覧から選択される製剤、あるいはインスリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、上皮小体ホルモン、エリスロポイエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、非天然オピエート、スーパーオキシドジスムターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシンまたはペプシン、薬物送達における用途を有する粒子からなる一覧から選択されるタンパク質であり得る。
【０２７８】
他の実施形態では、ポリマー粒子を用いて、粒子表面で高密度に1つまたは複数の機能性酵素を発現することにより、あるいは当該粒子に物質を負荷することにより、清浄化用途に有用な物質を送達し得る。
一実施形態では、1つまたは複数の酵素は粒子に固定化されて、過酷なｐＨまたは温度の環境における、そして貯蔵における安定性を提供して、複合「汚染」環境中において機能的寿命を延長し、強靭性を増強し得る。
【０２７９】
一実施形態では、1つまたは複数の酵素を表示する粒子は、洗濯用潜在における可能性を有する。
一実施形態では、当該物質は、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ラセマーゼ、ヒドロラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ポリメラーゼ、ジオキシゲナーゼ、モノキシデナーゼ、リアーゼ、シンセターゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスフェラーゼ、トランスアクリラーゼおよび合成酵素からなる一覧から選択される酵素からなる一覧から選択される少なくとも1つの酵素であり得る。
一実施形態粒子では、多数の異なる酵素および界面活性剤が粒子表面に存在し得る。
融合ポリペプチドとして1つまたは複数の酵素を発現することは、複雑な抽出またはリフォールディングステップを必要とせずに、機能性固定化酵素のワンステップ産生を可能にする。
【０２８０】
このような実施形態は、洗剤の嵩も低減し得る。このような粒子は、例えば粒子表面の酵素および界面活性剤の近接性のため、酵素および界面活性剤の改良された提示および安定性のため、洗濯用洗剤の嵩を低減することにより、そして特定の種類の布にまたは特定の種類の染みまたは物質に粒子を向けるためのターゲッティング分子の含入により、洗濯用洗剤の性能改良を生じ得る。
一実施形態では、粒子表面に1つまたは複数の酵素を安定的に固定化する能力は、生体触媒およびバイオレメディエーションにも用途を有し得る。多数の酵素が単一粒子上に固定化されて、多重または多段階酵素変換を促進する。
【０２８１】
別の実施形態では、物質は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリレートポリマー、無水マレイン酸およびアクリル酸のコポリマー、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマー、無水マレイン酸およびメチルビニルエーテルのコポリマー、無水マレイン酸およびメタクリル酸のコポリマー、あるいはその任意の2またはそれより多くの任意の組合せからなる一覧から選択される再汚染防止剤であり得る。
他の実施形態では、ポリマー粒子は、スキンケア製品に有用な物質を送達するために用いられ得る。
【０２８２】
一実施形態では、粒子は一連の物質を保有して、処方物を簡素化し、製造コストを低減し得る。粒子はまた、ポリマー粒子組成を変更することにより特定速度で分解し、皮膚への活性分子の制御放出を提供するよう意図され得る。他の実施形態では、粒子サイズは、例えば皮膚表面への浸透を改良するか、または皮膚接触表面積を制御することにより、機能を増強し得る。
【０２８３】
一実施形態では、物質は、日焼け止め剤、粒状物質、コンディショニング剤、増粘剤、水溶性ビタミン、水分散性ビタミン、油分散性ビタミン、ジメチコン・コポリオール・クロスポリマーを含む乳化エラストマー、ジメチコン／ビニルジメチコン・クロスポリマーを含む非乳化エラストマー、油溶性テルペンアルコールを含む油溶性スキンケア活性剤、フィトステロール、抗アクネ活性剤、ベータヒドロキシ酸、ビタミンＢ3化合物、レチノイド、酸化防止剤／ラジカル・スカベンジャー、キレート化剤、フラボノイド、抗炎症剤、抗セルライト剤、局所麻酔剤、制汗剤および芳香剤、あるいはその任意の2またはそれより多くのものの任意の組合せから成る一覧から選択されるスキンケア活性剤であり得る。
【０２８４】
他の実施形態では、粒子は、香辛料、ビタミン、栄養素または生体活性剤のような物質を封入して、保存寿命、風味および栄養素利用可能性／含量を改良するために用いられ得る。
潜在的用途としては、以下のものが挙げられる：
１）クローン病または潰瘍性結腸炎を治療するための消化系の特定部分への栄養素または生体活性剤の、例えば腸の下方部への薬剤または生体活性剤の送達；
２）食品加工における、例えばチーズ製造および酵素安定化および／または再利用における生体触媒的使用；
３）腸または他の粘膜表面での免疫を刺激することによる食物または他のアレルギーの下向き調節；
４）保存寿命、風味または視覚的外観を改良するための食品パッケージまたはコーティング、例えば可食性コーティング；
４）長期保存のための食物成分の乳化；
５）振盪されるかまたは活性化されるまで食物成分を混合しないようにすること、例えば所望されるまで防止される酵素反応を妨げること；
６）薬剤または栄養素に関する能動的送達メカニズムを提供するための、食物の粘性活性修飾；ならびに
７）食料品の口当たりまたは受容可能性の改良、例えば後味を残すことなく食物へのオメガ-３脂肪酸の付加を可能にするための魚油の封入。
さらなる実施形態では、ポリマー粒子は、タンパク質産生および組合せスクリーニングにおいて、標的構成成分を検出し、そして任意に単離するために、さらなる診断用途に用いられ得る。
【０２８５】
６．標的構成成分の検出および任意の単離
一態様では、本発明は、試料中の少なくとも1つの標的構成成分の検出および任意の単離のための方法に関する。一実施形態では、当該方法は、以下の：
Ａ）ポリマー粒子結合ドメインおよび少なくとも1つの融合相手を含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを包含し、上記融合相手が以下の：
（１）1つまたは複数の標的構成成分あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを結合し得る少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは
（２）少なくとも1つのポリペプチド、あるいは
（３）任意に、以下の：
（ａ）少なくとも1つの粒子形成タンパク質（上記タンパク質はポリマー粒子結合ドメインを含む）、または
（ｂ）少なくとも1つの付加的融合ポリペプチド（ここで、上記付加的融合ポリペプチは以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、粒子形成タンパク質、またはその組合せ、および
（ｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの結合ドメイン（1つまたは複数の標的構成成分を結合し得る）、あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｉｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドおよび少なくとも1つの結合ドメイン（1つまたは複数の標的構成成分を結合し得る）、あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｉｖ）少なくとも1つのレポーターペプチドまたはアフィニティー精製ペプチド
を含む）、あるいは
（ｃ）その2またはそれより多くの任意の組合せ
を含む細胞を提供し；
（Ｂ）融合相手が標的構成成分を結合して複合体を形成するよう、ポリマー粒子を標的構成成分を含む試料と接触させ；
（Ｃ）標的構成成分の存在または非存在を検出し、そして
（Ｄ）任意に、結合標的構成成分を含有するポリマー粒子を試料から分離する
ことを包含する方法に関する。
【０２８６】
当該構成成分を同定するためのレポーター分子、例えばタグ、染料または標識の使用は、当該技術分野で周知である（Mitsopoulos G et al., 2004）。
検出可能標識の存在は、ポリマー粒子を標識を含有しないポリマー粒子から区別させる。標識は、ポリマー粒子コア中に組入れられ、複合体に直接または間接的に結合される分子とカップリングされ、あるいはレポーターペプチドとしてポリマー粒子に付着され得る。
【０２８７】
一実施形態では、標識は、複合体と結合する分子にカップリングされる。標識化分子は、複合体の任意の部分、例えばポリマーコア、リン脂質単層の一素子、融合ポリペプチドの一素子と、あるいは融合相手に結合される標的構成成分と結合され得る。
標識の存在を検出することは、好ましくは、標識の強度を測定して、試料中の標的構成成分のレベルの定量的測定値を算定させることを包含する。
【０２８８】
一実施形態では、2またはそれより多くの標識が用いられて、多数のパラメーターの同時的検出および定量を可能にする。
他の態様は、試料中の少なくとも1つの標的構成成分の検出および任意の単離のための系に関する。系は、ポリマー粒子および少なくとも1つの標識を包含し、この場合、上記ポリマー粒子は少なくとも1つの融合ポリペプチドを含み、そして上記融合ポリペプチドは、ポリマー粒子が標的構成成分と接触されると、結合ドメインが標的構成成分と結合して複合体を形成するよう、標的構成成分を結合する少なくとも1つの結合ドメインを含み、ここで、標識の存在または非存在は、標的構成成分の存在または非存在の検出を、そして任意に複合体の任意の分離を可能にする。
【０２８９】
一実施形態では、標的構成成分は、タンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、金属イオン、金属イオン被覆分子、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、阻害剤、補因子、基質、酵素、抗体酵素、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、受容体リガンド、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、シグナル伝達分子、シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質断片、成長因子、成長因子断片、転写因子、転写因子断片、阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、炎症媒介物質、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、細胞、細胞表面タンパク質、細胞表面脂質、細胞表面炭水化物、細胞表面糖タンパク質、細胞抽出物、ウイルス、ウイルス外被タンパク質、ホルモン、血清タンパク質、ミルクタンパク質、高分子、乱用薬物、カップリング試薬、ポリヒスチジン、薬学的活性物質、生物学的活性物質、標識、カップリング試薬、ライブラリーペプチド、発現構築物、核酸、あるいはその組合せを包含し得る。
【０２９０】
一実施形態では、融合相手は、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）またはその断片をコードし、標的構成成分は抗ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）抗体またはその断片である。
一実施形態では、融合相手は、１型および２型免疫応答、アポトーシスおよび／または血管新生に関連した標的構成成分を結合する抗体または抗体断片をコードし、そして標的構成成分は、インターロイキン-３（ＩＬ‐３）、インターロイキン-４（ＩＬ‐４）、インターロイキン-５（ＩＬ‐５）、インターロイキン１０-（ＩＬ‐１０）、インターロイキン-７（ＩＬ‐７）、インターロイキン-１β（ＩＬ‐１β）、インターロイキン-６（ＩＬ‐６）、インターロイキン-１２ｐ７０（ＩＬ‐１２ｐ７０）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、切断ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ-２および活性カスパーゼ-３タンパク質レベル、インターロイキン-８（ＩＬ‐８）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン-８（ＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、インターフェロン-γにより誘導されるモノカイン（ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ）、単球化学誘引物質タンパク質-１（ＣＣＬ２／ＭＣＰ-１）、およびインターフェロンガンマ誘導性タンパク質-１０（ＣＸＣＬ１０／ＩＰ-１０）から成る群から選択される。
【０２９１】
抗体結合ドメインは、抗体をポリマー粒子の表面に結合して、種々の免疫分離および免疫検出用途に用いられ得る機能化粒子を作製し得る。
一実施形態では、融合相手は、抗体ドメイン、好ましくはＩｇＧ結合ドメイン、例えば配列番号６のアミノ酸４８〜１７９または配列番号７のアミノ酸２〜１３３で記述される配列を有する132アミノ酸ＺＺドメインを含むプロテインＡである。
【０２９２】
一実施形態では、他のＩｇＧ結合タンパク質、例えばプロテインＧおよびプロテインＬも用いられ得る。プロテインＡおよびプロテインＧは、多数の種からのＩｇＧのサブクラスのＦｃ部分に対して高親和性を示す。プロテインＡおよびプロテインＧと異なり、プロテインＬは、カッパ軽鎖を介して免疫グロブリンと結合し、そして結果的に、ヒト、マウスおよびラットＩｇＧのすべてのサブクラスと結合するが、しかしウシＩｇＧとは結合しない。したがってプロテインＬは、ウシ血清を含有する培養上清からの、そしてトランスジェニック動物のミルクからの抗体のアフィニティー精製のために有用である。プロテインＬはまた、抗原と抗原結合部位との結合を妨げず、したがって免疫沈降および免疫検出のために適している。
一実施形態では、融合相手は、受容体タンパク質、受容体の亜型または受容体複合体のサブユニット、あるいはその断片をコードし、そして標的構成成分は受容体リガンドである。
【０２９３】
一実施形態では、標識は、粒子によるこのような標識の組入れまたは非組入れが確定されるよう、検出可能標識、例えば着色染料、蛍光分子、例えば蛍光体または蛍光色素、放射性同位体；あるいは1つまたは複数の金属イオンである。
一実施形態では、標識化分子は、当該技術分野で既知の蛍光分子と当該分子をカップリングすることにより標識され、例としては、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（約530 nmで蛍光を発する）、フィコエリトリン（ＰＥ）（575 nm）、テキサスレッド（620 nm）、フィコエリトリン-テキサスレッド（615 nm）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（660 nm）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（660 nm）、フィコエリトリン-シアニン染料（ＢＤ  Ｃｙ-クロム）（670 nm）、ペリジニン・クロロフィルタンパク質（ｐｅｒＣＰ）（675 nm）、ペリジニン・クロロフィルタンパク質-シアニン染料（ｐｅｒＣＰ-Ｃｙ５．５）（694 nm）、およびアロフィコシアニン-シアニン染料（ＡＰＣ-Ｃｙ７）（767 nm）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、標識は、複合体と直接的に結合されるモノクローナル抗体とカップリングされる。
【０２９４】
一実施形態では、複合体と、その後、一次抗体と結合する標識結合二次抗体と結合する一次抗体が用いられる。
一実施形態では、ポリマー粒子または標的構成成分と結合し、その後ビオチニル化二次抗体と結合する一次抗体が用いられる。二次抗体と結合するストレプトアビジン結合標識が次に用いられる。
【０２９５】
図２１は、ＰＨＡ顆粒を表示する抗原の微生物性産生、抗原特異的抗体を結合するに際してのそれらの使用と、その後の標識化二次抗体を用いた検出の模式図である。
一実施形態では、標識または標識化基質は、標識がポリマー粒子形成中にポリマー粒子中に組入れられるよう、培地中に提供されるか、あるいはポリマー粒子中に拡散させる。染料組入れの一例は、WO 2004020623（Bernd Rehm）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に示されている。
【０２９６】
一実施形態では、ポリマー粒子は、異なるレベルの蛍光染料で標識されて、フローサイトメトリー分析時のその平均蛍光強度（ＭＦＩ）により、それを他の組のポリマー粒子から区別させる。
【０２９７】
一実施形態では、ポリマー粒子は、固体支持体上に、好ましくはＥＬＩＳＡプレートまたはマイクロアレイのようなプレート上に、ポリスチレンビーズのようなビーズ上に、イムノチューブ中にまたは適切なクロマトグラフィー・マトリックス中に固定化され得る。
他の実施形態では、ポリマー粒子は溶液中の試料と接触され、そして結合標的構成成分はクロマトグラフィーを用いて検出される。例えば標識化複合体は診断試験ストリップの一部として用いられ、粒子複合体は、それらが試験領域と接触し、可視的シグナルを提供するまで、ストリップに沿って移動する。診断用イムノストリップは、当該技術分野で周知である。
【０２９８】
免疫吸着アッセイ検出
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、標識化粒子複合体の検出および定量のために用いられ得る。ＥＬＩＳＡは、溶液中の標的構成成分の測定のための当該技術分野で十分に確立されたプロトコールを有する。
標識化粒子複合体の検出および定量のために用いられるＥＬＩＳＡ技法としては、多数の周知の酵素結合イムノアッセイのいずれかが挙げられる。このような系の例は、当該技術分野で周知である。検定技術は、相補的結合対間の複合体の形成と、その後の、酵素接合標識および色素産生または蛍光発生性基質を包含する検出系による検出を基礎にしている。
【０２９９】
一実施形態では、ＥＬＩＳＡは「サンドイッチ」検定フォーマットである。このフォーマットでは、測定されるべき標的分析物は、2つの抗体間、即ち捕捉抗体および検出抗体間に結合される。結合ドメインは捕捉抗体を形成し得るし、あるいは捕捉抗体は結合ドメインに結合され得る。
【０３００】
別の実施形態では、ＥＬＩＳＡは競合的検定であって、この場合、標識化抗原が標識化抗体の代わりに用いられる。非標識化抗原および標識化抗原は捕捉抗体との結合に関して競合し、そして結合される標的構成成分の量は、検出される標識化抗原の割合により確定され得る。
【０３０１】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡ系における捕捉および検出抗体として用いられ得る。モノクローナル抗体は、抗原における小さな差の検出および定量を可能にする単一エピトープに対する固有の一特異性を有する。ポリクローナル抗体も、できるだけ多くの抗原と結合する捕捉抗体として用いられ、その後、モノクローナル抗体がサンドイッチ検定における検出抗体として用いられて、特異性改良を提供する。
このようなイムノアッセイ技法は抗体の使用に制限されず、任意の比色または蛍光定量検定に等しく適用可能である、と理解されるべきである。
【０３０２】
ＦＡＣＳ検出
一実施形態では、検出系は、細胞選別（例えばＦＡＣＳによる）を利用して、標識化ポリマー粒子複合体を、したがって結合標識構成成分を検出し、定量する。
フローサイトメトリーは、多数の予備選択特性のいずれかを基礎にしてポリマー粒子複合体を分離し、同時に特性化するために用いられ得る。測定可能特性としては、サイズ、容積、粘度、光散乱特質、ＤＮＡまたはＲＮＡの含量、ならびに表面抗原が挙げられる。本発明の方法において有用なポリマー粒子および形成される複合体は、これらの測定可能特性のいずれか1つまたは複数に基づいて分離可能である。フローサイトメトリー技法は、当該技術分野で周知である。
【０３０３】
一実施形態では、ポリマー粒子の混合集団および／または融合ポリペプチドの混合集団を表示するポリマー粒子を用いて、複数の異なる標的構成成分に関して試料をスクリーニングし得る。このようなポリマー粒子は、免疫および炎症性応答を媒介する細胞により同時発現される生物学的応答修飾因子（ＢＲＭ）のネットワークを分析するために、多重分析物中に用いられ得る。ＢＲＭ、例えば疾病または疾患に関連したサイトカイン、ケモカイン、炎症修飾因子、受容体および免疫グロブリンが標的化され得る。本発明のポリマー粒子を用いる多重分析物での蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、試料中の標的構成成分の抗原特異的および定量的レベルを検出し、そして任意に単離することを可能にする。
【０３０４】
レポーターペプチド検出
一実施形態では、レポーターペプチドをコードするアミノ酸配列は、結合ドメインのほかに、粒子形成タンパク質と融合される。代替的には、レポーターペプチドは、別個の融合ポリペプチドの一部として提供される。
【０３０５】
レポーターペプチドは、それ自体、検出可能であり、あるいは検出可能産物の産生を触媒する。本明細書中で有用なレポーターペプチドとしては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。
【０３０６】
レポーターペプチドは、レポーターペプチドを含有しないポリマー粒子からレポーターペプチドを含有するポリマー粒子を区別させるものである。多くの場合、レポーターペプチドにより変更される基質（例えばルシフェラーゼ、３-ガラクトシダーゼ等のようなレポーター酵素のための色素産生性（蛍光発生性を含む）基質）の付加により、あるいは例えば薬剤耐性表現型を付与することにより（例えばメトトレキセート選択でのＤＨＦＲを用いる）、検出可能変更の存在、例えば蛍光タンパク質の存在（本明細書中に略記されるように、検出可能遺伝子それ自体との融合の使用、あるいは活性化されるべきタンパク質の存在による検出可能遺伝子構築物の使用の両方を包含する）のために、細胞表現型は変更されるため、レポーター遺伝子発現は一般に容易にモニタリングされる。
【０３０７】
レポーターペプチドは一般に、検出遺伝子、間接的検出可能遺伝子、生存遺伝子等を含めたいくつかのクラスのうちの1つに属する。即ち、検出可能である遺伝子中にポリペプチドを挿入することにより（例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼ）、ペプチドの発現がモニタリングされ得る。同様に、抗生物質耐性遺伝子のような生存遺伝子への遺伝子の挿入は、細胞の生存によりペプチドの発現の検出を可能にする。
【０３０８】
レポーター遺伝子は、上記のようにいくつかのクラスに分類され、例としては、検出遺伝子、間接的検出可能遺伝子および生存遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、レポーターペプチドは、検出可能タンパク質である。「検出可能タンパク質」または「検出タンパク質」（検出可能または検出遺伝子によりコードされる）は、直接標識として用いられ得るタンパク質である；即ち、さらなる操作または構築物を伴わずに、タンパク質は検出可能である（そして好ましくは、検出可能タンパク質を含む粒子が検出可能である）。したがってこの実施形態では、レポーターペプチドそれ自体のタンパク質産物は、検出可能遺伝子を発現している粒子を区別するのに役立ち得る。この実施形態では、適切な検出可能遺伝子としては、自己蛍光タンパク質をコードするものが挙げられる。
【０３０９】
好ましい実施形態では、レポーターペプチドは、オワンクラゲ（Aequorea）グリーン蛍光タンパク質またはその変異体の1つである（Cody et al., (1993)；およびInouye and Tsuji (1994)参照）。
「グリーン蛍光タンパク質」または「ＧＦＰ」は、本明細書中では、一般に400〜700 nmで蛍光発光を示す自己蛍光タンパク質を意味する。野生型オワンクラゲＧＦＰは、238アミノ酸長であり、溶媒から蛍光体を保護する相対的に堅い３-缶構造の内側に埋蔵される修飾トリペプチド蛍光体を含有する（Cody et al. Biochemistry 1993; 32(5): 1212-8；Ormo et al., Science 1996; 273(5280) 1392-6；Prasher et al., Gene 1992; 111(2): 229-33）。
【０３１０】
他の適切な検出可能タンパク質としては、特に、ｌａｃＺ（Uppala and Koivunen 2000；Arndt et al., 2000）、ルシフェラーゼ（例えば蛍、Kennedy et al. (Journal of Biological Chemistry 1999; 274: 13281-91)；Renilla Mueller 米国特許第6,232,107号）、３-ガラクトシダーゼ（Nolan et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 1988; 85: 2603-7）、３-グルコウロニダーゼ（Jefferson et al. EMBO Journal 1987; 6(13): 3901-7）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびＳＥＡＰ（例えばヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの分泌形態；Cullen et al. (Methods in Enzymology 1992; 216: 362-8)）が挙げられる。
一実施形態では、上記レポーターペプチドは、粒子形成タンパク質および結合ドメインと一緒に融合ポリペプチドの一部を構成する。別の実施形態では、レポーターペプチドは、標識化分子と組合せて用いられ得る。
【０３１１】
したがって本発明は、試料中の少なくとも1つの標的構成成分の検出および任意の単離における少なくとも1つのポリマー粒子（上記ポリマー粒子は、標的構成成分を結合する少なくとも1つの結合ドメインを含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む）の使用にも関する。
【０３１２】
本発明の代替的実施形態は、特定の結合ドメインと相互作用するそれらの能力に関するスクリーニングと平行して複数の異なる標的構成成分をスクリーニングするための方法であって、以下の：各々が少なくとも1つの異なる標的構成成分を含有する異なる流体試料をポリマー粒子の混合集団と接触させるステップ（好ましくは特定標的構成成分は固定化される）；そして、標識または標識化基質を用いて、特定標的構成成分と結合ドメインとの相互作用を、直接または間接的に検出するステップを包含する方法を提供する。
【０３１３】
本発明は、試料中の少なくとも1つの標的構成成分の検出および任意の単離に用いるためのキットであって、本発明の方法および系の使用を促進するキットにも関する。
好ましくは本発明の方法を実行するためのキットは、当該方法を実行するために必要な試薬すべてを含有する。キットは好ましくは、例えば洗浄試薬および／または検出可能標識の存在または非存在を検出可能なその他の試薬を含入する1つまたは複数の容器を包含する。
【０３１４】
本発明の情況では、区画化キットは、試薬が別個の容器中に含入される、そして小ガラス容器、プラスチック容器あるいはプラスチックまたは紙のストリップを包含し得る任意のキットを包含する。このような容器は、試料および試薬の交差汚染を回避しながら、ある区画から別の区画への試薬の効率的移動を可能にし、そして定量的方式で、ある区画から別の区画への各容器の作用物質または溶液の付加を可能にする。このようなキットは、試験試料を受容する容器、検定に用いられるポリマーを含入する容器、ならびに洗浄試薬（例えば燐酸塩緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等）を含入する容器も包含する。
好ましくは本発明のキットは、適切な方法を実行するためにキット構成成分を使用するための使用説明書も包含する。
【０３１５】
一実施形態では、本発明は、標的構成成分を結合する少なくとも1つのポリマーをそうでないポリマー粒子から任意に単離することを包含する。単離されるポリマー粒子は、標的構成成分を結合する結合ドメインを包含する。
一実施形態では、少なくとも1つの標的構成成分と結合される少なくとも1つの結合ドメインを含むポリマー粒子は、当該技術分野で既知の多数の分離技法を用いて単離される。
一実施形態では、当該系は、少なくとも1つの所望の標的構成成分を混合物から単離するために用いられる。しかしながら代替的実施形態では、系は試料から少なくとも1つの望ましくない標的構成成分を除去するために用いられ得る。
【０３１６】
７．組換えポリペプチドの産生
上記のように、本発明は、細胞発現系で発現される場合に封入体を形成する組換えポリペプチドの産生方法に関する。
一実施形態では、本発明は、組換えポリペプチドの産生方法であって、以下の：
Ａ）以下の：
（１）融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列（上記融合ポリペプチドはポリマー粒子結合ドメインならびに細胞発現系中で発現される場合に封入体を形成する少なくとも1つのポリペプチドを含む）；
（２）任意に、以下の：
（ａ）粒子形成タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列（上記タンパク質はポリマー粒子結合ドメインを含む）、または
（ｂ）付加的融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列（上記付加的融合ポリペプチドは以下の：
（ｉ）ポリマー粒子結合ドメイン、ポリマー粒子結合ドメインを含むタンパク質、粒子形成タンパク質、またはその組合せ、および
（ｉｉ）少なくとも1つのポリペプチドまたは少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｉｉｉ）少なくとも1つのポリペプチド、および少なくとも1つの結合ドメイン、あるいは1つまたは複数のカップリング試薬、あるいはその組合せを含む融合相手、あるいは
（ｉｖ）少なくとも1つのレポーターペプチドまたはアフィニティー精製ペプチド
を含む）、あるいは
（ｃ）その組合せ
を含む少なくとも1つの発現構築物を含む細胞を提供し；
Ｂ）融合ポリペプチドの発現のためにそして宿主細胞によるポリマー粒子の形成のために適した条件化で細胞を培養し；
Ｃ）任意に培養細胞から組換えポリペプチドを分離する
ことを包含する方法に関する。
【０３１７】
封入体の形成は、細胞発現系における高発現組換えタンパク質産生の高頻度結果であり、この場合、組換えタンパク質の定量的産生は、正しく折りたたまれたネイティブタンパク質というよりむしろ折りたたまれないかまたは部分的に折りたたまれた全長または部分長ポリペプチドの集合により強力に減損される。
多数の因子は、組換えポリペプチド産生中に封入体の形成を促すと考えられる。Wilkinson & Harrison (Nature Bio/Technology 9, 443-448 (1991))は、封入体を形成するならびにしない81のタンパク質の組成物の統計学的分析を用いて、37℃で増殖させた大腸菌における封入体形成の原因を研究した。6つの組成物由来パラメーターが調べられた。封入体形成とのそれらの相関の少ない順に、パラメーターは、電荷平均、折り返し構成残基分画、システイン分画、プロリン分画、親水性、ならびに残基総数を包含する。本発明の方法で産生される組換えポリペプチドは、1つまたは複数のこれらのパラメーターを含み得る。
【０３１８】
したがって多数の疎水性成員タンパク質、多ドメインタンパク質およびジスルフィド架橋を保有するタンパク質は、細胞発現系において封入体を形成すると思われる。過剰産生それ自体（新生ポリペプチド鎖の濃度の増大）も、封入体の形成を誘導するのに十分であり得る。
可溶化タグ（例えばＮｕｓＡ、ＭＢＰ等）、シャペロン（例えばＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ等）および／または補助シャペロン（例えばＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＣｌｐＢ等）の同時産生、および／またはジスルフィドイソメラーゼ、細胞の周辺または外側への分泌、産生温度の調整、遺伝子発現制御、in vitro遺伝子発現、ならびに酸化サイトゾルバックグラウンドを提供する大腸菌突然変異体（Origami）が、細胞発現系における封入体形成を克服するために用いられてきた。
【０３１９】
例えばベクタープラスミドは、それらのコピー数（コピー数は染色体当たりのプラスミドコピー数と定義される）に基づいて仮に4つのクラスに分けられる：極高コピー数ベクターは、染色体当たり100コピーより多く存在する（ｐＵＣベクター）；高コピー数ベクター（15〜60コピー；ｐＢＲ３２２）；中コピー数ベクター（約10コピー；ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＳＣ１０１）；ならびに低コピー数ベクター（1〜2コピー；ミニＦ）。いくつかの場合、中コピー数ベクターの使用は、それらの凝集を防止するのに十分に組換えタンパク質の量を低減し得る。代替的には、高コピー数ベクターは、弱プロモーター、例えば野生型ｌａｃプロモーターと組合せて用いられ得る。
【０３２０】
これらの条件および因子が機能性タンパク質の有意の産生を可能にしない場合、タンパク質は、リフォールディングを介して封入体から得られ、そして明らかに「ディフィカルトフォルダー」として分類され得る。リフォールディングが上手くいかない場合には、タンパク質は、古典的タンパク質精製プロトコールによりその本来の宿主から単離されなければならないが、これは通常は高収量をもたらさない。
【０３２１】
それに反して、本発明の方法は、組換えタンパク質産生を低レベルの発現または封入体からのタンパク質のリフォールディングに限定しない。
一実施形態では、ポリペプチドは、細胞発現系中で発現される場合に封入体を形成することが予め確定されているポリペプチドを同定するために文献検索を実行することにより、選択される。多数の文献データ、例えばNCBI Entrez PubMed データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）（これは、1950年代以降の生物医学文献に関するMEDLINEおよびその他のライフサイエンス季刊誌からの1500万を上回る引例を包含する）が公的にアクセス可能である。このようなデータベースは、キーワード、トピック、著者または季刊誌により検索されて、考え得るポリペプチドを同定し得るし、そして全原本記事およびその他の関連情報源へのリンクを包含する。
【０３２２】
一実施形態では、ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成しない宿主細胞中で候補遺伝子を発現し、そして細胞を顕微鏡的に検査して、発現ポリペプチドが封入体を形成するか否かを確定することにより、選択される。
候補ポリペプチドの発現は、構築物が形質転換される宿主細胞中で機能的なプロモーター、候補ポリペプチドの核酸配列、ならびに構築物が形質転換される宿主細胞中で機能的なターミネーターを含む発現構築物で宿主細胞を形質転換することにより、上記のように実行され得る。形質転換後、形質転換宿主細胞は、発現構築物からの候補ポリペプチドの発現に適した条件化で培養され、そして宿主細胞は顕微鏡的に検査されて、屈折封入体の存在または非存在を確定する。フローサイトメトリーも、他の方法から入手可能でない単一細胞レベルでの封入体蓄積に関する情報を提供するために用いられ得る。Wittrup et al（Nature Bio/Technology 6, 423-426 (1988)）は、組換え大腸菌における屈折体形成のプローブとしてのフローサイトメトリーからの単一細胞非仮散乱測定の使用を記載する。
【０３２３】
一実施形態では、Wilkinson and Harrison [Nature Bio/Technology 9, 443-448 (1991)]により記載されたような大腸菌中での発現に及ぼす溶解度の予測に関する統計学的モデルを用いて、組換えポリペプチドを選択し得る。このモデルは、発現結果が利用可能である81のタンパク質に関して用意された。判別解析を用いて、6つの組成物関連パラメーター、即ち：電荷平均、折り返し構成残基分画、システイン分画、プロリン分画、親水性、ならびにアミノ酸残基総数：に従ってこれらのタンパク質を比較した。折り返し構成残基（アスパラギン、グリシン、プロリンおよびセリン）の相対数、ならびに絶対電荷／残基（正および負荷電アミノ酸の分画）は、封入体形成と強く相関することが見出された。個々のアミノ酸の各々の関与によっている合成パラメーター（ＣＶ-正準変数）が得られたが、それを以下に示す：
【０３２４】
CV = 15.43｛(N+G+P+S)/n｝ - 29.56｛[(R+K)-(D+E)/n]-0.03｝
【０３２５】
（式中、Ｎ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅは、それぞれアスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基の絶対数であり、そしてｎは全配列中の残基の総数である）。閾値識別ＣＶ’＝1.71[Koschorreck M. et al., BMC Genomics. 2005; 6: 49-59]を導入して、可溶性タンパク質を不溶性タンパク質と区別した。ＣＶおよびＣＶ’間の差が負である場合、タンパク質は可溶性であると予測される。逆に、ゼロより大きいＣＶ-ＣＶ’差は、タンパク質が不溶性であることを予測する。さらに、溶解性の確率を以下の方程式から算定した：
【０３２６】
P = 0.4934+0.276(CV+CV’)-0.0392(CV+CV’) [Koschorreck M. et al., BMC Genomics. 2005; 6: 49-59]
【０３２７】
可溶性または不溶性としてタンパク質を分類するための確率パーセンテージを用いて、識別分析は、88％の全体的精度で、可溶性または不溶性であるとしてタンパク質を首尾よく分類する[Nature Bio/Technology 9, 443-448 (1991)]。
【０３２８】
ＰｆＥＭＰ１度メインデータセットに関しては、ＣＶ-ＣＶ’値、可溶性発現のための確率（％）、折り返し構成残基の相対数、電荷／残基、ならびにタンパク質配列の長さが比較された。付加的には、平均溶解性傾向は、各ドメイン群に関する低および上四分位数とともに比較された。この指数の算定のためのウエブサーバーは、http://www.biotech.ou.eduに見出される。
【０３２９】
組換えポリペプチドは、細胞発現系で発現される種々の異種タンパク質、例えばＨＴＬＶ-ＩＩＩ／ＬＡＶウイルス抗原、ＨＴＬＶ-ＩＩウイルス抗原、ＨＴＬＶ-Ｉウイルス抗原およびネコ白血病ウイルス抗原（これらは一般的に見出される培養条件下で封入体として出現する）を含み得る。他のこのような例としては、ヒトおよびブタ成長ホルモン、手足口病ウイルスキャプシドタンパク質、繊維芽細胞インターフェロン、ヒトインスリン、ソマトスタチン、アルファ、ベータおよびガンマ・インターフェロン、ならびにＢ型肝炎抗原が挙げられる。要するに、本発明の方法は、細胞発現系で発現される任意の異種タンパク質に適用可能であり、この場合、上記のタンパク質は、不溶性封入体として宿主細胞中に蓄積する。
【０３３０】
１本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）は、多数のバイオ分離適用におけるリガンドとして従来用いられてきた。それらの特異性および再現的に産生される能力のほかに、全抗体と比較した場合のこのような断片の小サイズは、夾雑物の非特異的結合を低減し得る。ＳｃＦｖは、ラセミ混合物中のエナンチオマーの分別ならびに食物および水試料からの微生物の除去、を含めて、多数の標的構成成分を分離するために用いられてきた。
細胞の細胞質の還元環境は、１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）断片の正確なフォールディングおよび機能性に不可欠なドメイン内ジスルフィド結合の形成を減損し、封入体の形成を促す。したがって細胞質中で発現されるほとんどのＳｃＦｖ（細胞内発現抗体）は、大部分が不活性である。ポリマー粒子と結合される融合ポリペプチドとしてのＳｃＦｖの産生は、意外にも、還元および酸化細胞環境の両方において、可溶性活性形態の産生を可能にする。
【０３３１】
粒子形成タンパク質と融合され得る機能性ＶＨＨ細胞内発現抗体を工学処理する、ということも考えられる。
ＬａｃＺ（ベータ-ガラクトシダーゼ）二量体との細胞内発現抗体の細胞内結合は、活性が容易に検出され得る活性四量体ＬａｃＺの形成を媒介した。これは、ランダム突然変異誘発後の機能性細胞内発現抗体のためのスクリーニング・ツールとして用いられた（Martineau et al., 1998, Journal of Molecular Biology 280: 117-127）。したがって類似のスクリーニング戦略が意図されて、最終的に粒子形成タンパク質と融合され得る任意の機能性細胞内発現抗体を生じて、当該粒子へのそれぞれの細胞内発現抗体の付着を可能にする。
【０３３２】
細胞の細胞質中で適正にフォールディングしない多数の細胞内発現抗体のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドは、本発明の方法により産生され得る。
一旦発現されると粒子表面に結合するタンパク質をコードする遺伝子の修飾中、細胞中に異なる修飾を有する構築物を導入することも可能である。その断片の異なるポリペプチドを伴うこれらの融合ポリペプチドが一旦発現され、そしてポリマー粒子が形成されると、このようなやり方で、異なる融合ポリペプチドを用いて粒子表面を多機能化することも可能である。この方法は、機能化ポリマー粒子の直接的且つ効率的質量産生および分離を可能にする。
【０３３３】
大腸菌中の組換えタンパク質の高レベル発現は、しばしば、封入体の形成を生じる。
直接または間接的にそれが形成するポリマー粒子と結合する融合ポリペプチドとしての組換えポリペプチドの発現は、可溶性活性形態での組換えポリペプチドの形成を可能にし、これはその後、ポリマー粒子から切断され、そして単離され得る、ということを本発明人等は見出した。
【０３３４】
可溶性および活性形態で組換えポリペプチドを発現することは、実質的に、組換えタンパク質発現の経費を削減する。さらに本発明の方法は、封入体を形成するそれらの傾向のために、今日まで組換え的に容易に発現され得ていない多数のタンパク質の産生を可能にする。
【０３３５】
一実施形態では、フォールディング・シャペロンまたはシャペロニンをコードする少なくとも1つの核酸配列は細胞中に存在し、そしてそれらのネイティブ機能性状態への組換えポリペプチドのフォールディングを手助けする。フォールディング・シャペロンの多数の異なるファミリーが当該技術分野で既知であり、各々、異なるやり方でタンパク質フォールディングを手助けするよう作用する。本発明における使用が見出され得るフォールディング・シャペロンは、それぞれ大腸菌中に、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体、ＤｎａＫ、ＨｔｐＧおよびＣｌｐＢファミリーとして既知であるＨｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ１００を包含する。群Ｉおよび群ＩＩシャペロンは、本発明における組換えポリペプチドフォールディングを手助けするために用いられ得るシャペロンのサブセットである。
【０３３６】
一実施形態では、組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、粒子結合ドメインと直接的に融合されるか、または所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して間接的に融合されて、好ましくは約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または約100アミノ酸長である融合ポリペプチドの個別のフォールディングを促し得る。
【０３３７】
一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、粒子結合タンパク質をコードする核酸配列と組換えポリペプチドをコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断認識配列をコードする。プロテアーゼ切断部位は、ポリマー粒子を単離し、精製して、次に粒子をプロテアーゼと接触させて、組換えポリペプチドを粒子から切断することにより、組換えポリペプチドを容易に単離させる。適切なプロテアーゼ切断認識配列は、エンテロキナーゼ認識配列（ＤＤＤＤＫ）、トロンビン認識配列（Ｆ／ＧＰＲ）および因子Ｘａ認識配列（ＩＥ／ＤＧＲ）を包含する。
【０３３８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、自己スプライシング素子、例えばインテインをコードする。インテインは、組換えタンパク質発現および精製スキームにおける使用のために適合される自己スプライシング宿主タンパク質である。インテイン切断は、ｐＨ変化またはチオールの付加により媒介され得る。インテインの包括的一覧は、http://tools.neb.com/inbase/index.php [Perler, F.B. (2002). Nucleic Acids Res. 30, 383-384]でInBaseインテイン・データベースおよび登録において見出され得る。
一旦形成されると、ポリマー粒子は、好ましくは、細胞の物理的崩壊と、その後の細胞選別機、遠心分離、濾過またはアフィニティークロマトグラフィーを用いた分離により、細胞を崩壊し、粒子を回収することにより、宿主細胞から分離され得る。このような分離プロトコールは、細胞質のタンパク質内容物からの、ポリマー粒子の、したがって組換えポリペプチドの迅速且つ容易な分離という利点を有する。
粒子の精製は、表面への分子の付加（化学的または融合技法による）を用いて、スクリーニング目的のためにも、アフィニティー精製および／または表面への吸着を可能にする。
【０３３９】
ポリマー粒子が単離されると、組換えポリペプチドはポリマー粒子から切断され、そして実質的に純粋な、可溶性および活性形態で単離される。このような方法は、封入体から可溶性および活性タンパク質を単離するために必要とされるアンフォールディングおよびリフォールディングステップを省く。
【０３４０】
８．スクリーニング
本発明の一態様は、ポリマー粒子の表面にペプチドおよびペプチドライブラリーを表示し、そしてスクリーニングすることに関する。
表示の多数の適用は、表示されるペプチドの性質によって、3つの一般的部類に分けられる。これらは、（１）タンパク質またはタンパク質断片；（２）抗体断片；ならびに（３）ランダム・ペプチドの表示である。
タンパク質またはタンパク質断片の表示は、他のタンパク質、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質または小化学化合物（有機または無機）、例えば当該タンパク質のアゴニスト、アンタゴニストまたは基質である化合物を結合する触媒性および非触媒性タンパク質またはその断片を同定するために用いられ得る。この型の表示は、特定の反応を触媒する酵素を同定するために、タンパク質ドメインおよびＤＮＡ間の相互作用を試験するために、そしてタンパク質-タンパク質相互作用、特に多機能性タンパク質、抗体、受容体およびシグナル伝達カスケードにおけるタンパク質との相互作用を探究するために用いられてきた。ランダムペプチドの表示は、特に当該標的分子と結合する新規のペプチドを同定するために、同様に用いられ得る。
【０３４１】
抗体または抗体断片（特に可変部断片、例えばＦａｂおよびｓｃＦｖ）の表示は、当該エピトープと結合する抗体を同定するために用いられ得る。
ポリペプチドに対する標的分子のスクリーニング方法は、当該技術分野で周知である（Campbell and Choy 2002；Golebiowski A et al., 2003；Jager et al., 2003；Pini A et al., 2002）。
一実施形態では、本発明の方法は、当該粒子を、標的分子の組合せライブラリーと接触させることを包含する。好ましくは標的分子の組合せライブラリーは、タンパク質ドメインまたはその断片、抗体または抗体断片、あるいは有機または無機化学化合物の組合せライブラリーを包含する。一実施形態では、組合せライブラリーはマイクロアレイにおいて表示される。
【０３４２】
好ましい実施形態では、受容体ポリペプチド（例えば受容体タンパク質、受容体複合体のサブユニット、またはその断片）を表示するポリマー粒子を用いて、組合せライブラリー（例えば化学的またはペプチド組合せライブラリー）をスクリーニングし、そして当該受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたは基質である候補リガンドとの結合相互作用を同定し得る。
【０３４３】
ライブラリーペプチドの混合集団を表示する粒子も、標的分子と接触されて、標的分子と相互作用するライブラリーペプチドを有する粒子を同定し得る。好ましくは相互作用は、標的分子と結合しているライブラリーペプチドにより限定される。
一実施形態では、標的分子は、受容体リガンド、タンパク質またはタンパク質断片、抗体または抗体断片、炭水化物、脂質、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、あるいは有機または無機化学化合物である。
【０３４４】
一実施形態では、受容体ポリペプチドは、Ｇプロテイン結合受容体、アセチルコリン受容体、トロンボポイエチン受容体、核受容体、ケモカイン受容体、ステロイドホルモン受容体、上皮細胞増殖因子受容体、トル受容体、トル様受容体、マンノース受容体、７ＴＭ受容体、神経ペプチド受容体、ＮＭＤＡ受容体、Ｔ細胞受容体、ホルモン受容体、ＩｇＧ受容体およびサイトカイン受容体から選択される。
【０３４５】
一実施形態では、受容体ポリペプチドは、アデノシン受容体の亜型Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂまたはＡ３；アドレナリン作動性受容体の亜型アルファ２Ａ、アルファ２Ｂ、アルファ２Ｃ、ベータ１、ベータ２またはベータ３；アドレノメデュリン受容体の亜型ＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ３；アンギオテンシン受容体の亜型ＡＴ１またはＡＴ２；アペリン受容体の亜型ＡＰＪ；ボンベシン受容体の亜型ＢＲＳ-３、ＢＢ１またはＢＢ２；ブラディキニン受容体の亜型Ｂ１またはＢ２；カンナビノイド受容体のＣＢ１またはＣＢ２；ＣＧＲＰ受容体の亜型ＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ１；ケモカイン受容体の亜型ＣＣＲ１、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９ａ、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１またはＸＣＲ；走化性フォルミルペプチド受容体の亜型ＦＰＲＬ１；走化性ペプチド受容体のＣ３ａまたはＣ５ａ；コレシトキニン受容体の亜型ＣＣＫ１またはＣＣＫ２；ドーパミン受容体の亜型Ｄ１、Ｄ３またはＤ４；エイコサノイド受容体の亜型ＨＭ７４様；エンドテリン受容体の亜型ＥＴＡまたはＥＴＢ；ＧＡＢＡ受容体の亜型ＧＡＢＡＢ；ガラニン受容体の亜型ＧａｌＲ１またはＧａｌＲ２；グレリン受容体の亜型ＧＨＳ-Ｒ；グルタメート受容体の亜型ｍＧｌｕＲ５；ヒスタミン受容体の亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３またはＨ４；ＬＣＦＡＲ受容体の亜型ＧＰＲ４０；ロイコトリエン受容体の亜型ＬＴＢ４Ｒ１、ＣｙｓＬＴ１またはＣｙｓＬＴ２；リゾリン脂質受容体の亜型ＥＤＧ８；ＭＣＨ受容体の亜型ＭＣＨ１およびＭＣＨ２；メラノコルチン受容体の亜型ＭＣ３、ＭＣ４およびＭＣ５；メラトニン受容体の亜型ＭＴ１およびＭＴ２；メタスタチン受容体の亜型ＧＰＲ５４；モチリン受容体の亜型ＧＰＲ３８；ムスカリン受容体の亜型Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５；ニューロキニン受容体の亜型ＮＫおよびＮＫ３；ニューロメジンＵ受容体の亜型ＦＭ３およびＦＭ４；ニューロペプチドＦＦ受容体の亜型ＮＰＦＦ２ｓ；ニューロテンシン受容体の亜型ＮＴＳ１；ニコチン受容体の亜型ＨＭ７ａ；ノシセプチン受容体のＯＲＬ１；オピオイド受容体のカッパ；オレキシン受容体の亜型ＯＸ１、ＯＸ２およびＯＸ２様；プロキネチシン受容体のＰＫＲ１およびＰＫＲ２；プロラクチンＲｅｌ．ペプチドの亜型ＧＰＲ１０；プロスタノイド受容体の亜型ＣＲＴＨ２、ＤＰ、ＥＰ２、ＥＰ４およびＦＰ；プリン作動性受容体の亜型Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ６およびＰ２Ｙ１１；セロトニン受容体の５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ２Ａ、５ＨＴ２Ｂ、５ＨＴ２Ｃｅ、５ＨＴ２Ｃｎｅ、５ＨＴ５Ａおよび５ＨＴ６；ソマトスタチン受容体のｓｓｔ１、ｓｓｔ２ａ、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４およびｓｓｔ５；ＴＲＨ受容体の亜型ＴＲＨＲ１；ウロテンシンＩＩ受容体のＧＰＲ１４；バソインテストペプチド受容体の亜型ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２およびＰＡＣ１ならびにバソプレッシン受容体のＶ１ａ、Ｖ１ｂおよびＶ２から成る受容体の亜型であり得る。
【０３４６】
一実施形態では、本発明の方法はさらに、ポリマー粒子またはポリマー粒子の混合集団を少なくとも1つの標的分子と接触させることを包含する。
一実施形態では、標的分子は、好ましくはＥＬＩＳＡプレートまたはマイクロアレイのようなプレート上に、ポリスチレンビーズのようなビーズ上に、イムノチューブ中にまたは適切なクロマトグラフィー・マトリックス、例えばアフィニティーマトリックス中に固定化され得る。
【０３４７】
一実施形態では、ペプチドライブラリーはプレート上でインキュベートされて、標的と相補的なライブラリーペプチドを表示する粒子を標的と結合させる。
本発明の一実施形態は、特定のポリペプチドと相互作用するそれらの能力に関するスクリーニングと平行して複数の異なる標的分子をスクリーニングするための方法であって、以下の：各々が少なくとも1つの異なる標的分子を含有する異なる流体試料を、本発明の方法により調製されるポリマー粒子の混合集団と接触させるステップ（好ましくは特定標的分子は固定化される）；そして、特定標的分子とポリペプチドとの相互作用を、直接または間接的に検出するステップを包含する方法を提供する。
【０３４８】
一実施形態では、標的分子を結合するポリペプチドを含むポリマー粒子は、細胞選別機、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離または濾過を用いて単離される。
一実施形態では、本発明の方法はさらに、標的分子を結合する少なくとも1つのポリマー粒子をそうでないものから単離することを包含する。結合するポリマー粒子は、標的分子を結合するライブラリーペプチドを含む。
【０３４９】
一実施形態では、本発明の方法はさらに、少なくとも1つの単離ポリマー粒子の融合ポリペプチドのアミノ酸配列を確定すること、あるいは融合ポリペプチドをコードする核酸配列の配列を確定することを包含する。連続サイクルを用いて、標的を特異的に結合する粒子のプールを濃化し得る。標的分子を結合するライブラリーペプチドを含む融合ポリペプチドのアミノ酸または核酸配列は、当該技術分野で既知の技法により確定され得る。
本発明の別の態様は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の核酸配列を含む発現構築物を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の発現構築物で形質転換される細胞を提供する。
本発明の別の態様は、ポリマーコアおよびポリマーコアと会合する融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を提供するが、この場合、融合ポリペプチドは上記のように粒子形成タンパク質および少なくとも1つのポリペプチドを含む。
【０３５０】
本発明の別の態様は、本発明のポリマー粒子を含む細胞を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の細胞を含む培養を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1つの粒子ならびに本発明の方法に用いるための使用説明書を包含するキットを提供する。
ここで、本発明の種々の態様を、以下の実施例への言及により非限定的に例証する。
【実施例】
【０３５１】
実施例
Ｉ  粒子産生
実施例１  -  ＭＯＧまたは-ＩＬ２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドによるポリマー粒子の調製
プラスミドの構築
融合ポリペプチド粒子形成を媒介するプラスミドの構築のために用いられるプラスミドを、図３および４に示す。
ｐＵ５７：Ａｍｐ（ＩＬ２およびＭＯＧをクローン化するために用いられる）；ｐＨＡＳ（Ｔ７）：Ａｍｐ（ｐＥＴ-１４ｂ誘導体（Yuan et al., 2001, Arch Biochem Biophys. 2001 Oct 1; 394(1): 87-98））およびｐＢＨＲ６８：Ａｍｐ（Spiekermann et al. 1999, Arch Microbiol. 1999 Jan; 171(2): 73-80）を用いて、ｐｈａＰファジンおよびＭＯＧまたはＩＬ‐２を含む融合ポリペプチドを有するＰＨＡ粒子を生成した。
【０３５２】
マウスからの全長成熟ＩＬ２タンパク質（アミノ酸６０〜１６９、寄託番号AAN38301）またはＭＯＧタンパク質の細胞外部分（アミノ酸１〜１１７、起爆番号Q61885）をコードするＤＮＡ断片は、GenScript Corp.(USA)により合成された。
大腸菌中での発現のために、コドン使用頻度を最適化した。ＩＬ２およびＭＯＧコードＤＮＡ断片に関する配列データを、それぞれ配列番号１および２で示す。各ＤＮＡ断片は、５’末端にＮｄｅＩ部位を、そして３’末端にＢａｍＨＩ部位を含有した。これらのＤＮＡ断片は、GenScript Corp.(USA)による合成直後にｐＵＣ５７のＳｍａＩ部位に挿入して、それぞれｐＵＣ５７-ＭＯＧまたはｐＵＣ５７-ＩＬ２を生じた。
【０３５３】
ｐｈａＰ１遺伝子のコード配列を、熱安定性ＰＣＲ酵素ＰｆｘおよびオリゴヌクレオチドｐｈａＰ-ＸｂａＩ-ＮｄｅＩおよびｐｈａＰ-ＮｄｅＩを用いて、フェノール資化細菌（近年、クプリアビドス・ネカターと改名）の染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅して、５’末端にＸｂａＩを、そして３’末端にエンテロキナーゼ部位を含むＮｄｅＩ部位を導入した。
ＰＣＲのために用いられるオリゴヌクレオチドは、以下のようであった：
（１）クローニングのためのＸｂａＩ部位を含有するｐｈａＰコード領域に関する５’プライマー（５’-ＸｂａＩ-トランス１-ＡＴＧ-ｐｈａＰ）：
【化１】
2009509530.tif 000003
（２）クローニングのためのＮｄｅＩ部位を含有するｐｈａＰコード領域、精製のための６×Ｈｉｓ-タグの発現のためのコード領域、ならびにＭＯＧおよびｐｈａｐキメラタンパク質の分離のためのエンテロキナーゼ認識配列ＤＤＤＤＫに関する３’プライマー（３’-ｐｈａＰ-（停止）-ＤＤＤＤＫ-６×Ｈｉｓ-ＮｄｅＩ）：
【化２】
2009509530.tif 000004
５’ＸｂａＩおよび３’エンテロキナーゼおよびＮｄｅＩ部位を含有するｐｈａＰ  ＰＣＲ産物を以下に示す：
【化３】
2009509530.tif 000005
【０３５４】
ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングプラスミドｐＣＲＩＩ中にサブクローニングした。大腸菌リボソーム結合部位およびｐｈａＰ-ＮｄｅＩを含めたオリゴヌクレオチドｐｈａＰ-ＸｂａＩを用いて、プラスミドｐＣＲ-ｐｈａＰから、ｐｈａＰコード配列を再び増幅した。その結果生じたＰＣＲ産物を、ｐＨＡＳのＸｂａＩおよびＮｄｅＩ部位中にサブクローニングした（ｐＥＴ-１４ｂ誘導体）。
【０３５５】
ｐＵＣ５７-ＭＯＧまたはｐＵＣ５７-ＩＬ２を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩとともに加水分解し、対応するＤＮＡ断片をｐＨＡＳ-ｐｈａＰ中にサブクローニングして、プラスミドｐＨＡＳ-ｐｈａＰ-ＭＯＧおよびｐＨＡＳ-ｐｈａＰ-ＩＬ２をそれぞれ生じた。次に、それぞれの融合タンパク質コード領域を、ｌａｃプロモーターの下流およびＰＨＢ生合成オペロンの上流のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いてｐＢＨＲ６８中にサブクローニングして、ｐＢＨＲ６８-ｐｈａＰ-ＩＬ２（図３）およびｐＢＨＲ６８-ｐｈａＰ-ＭＯＧ（図４）を得た。大腸菌中でＰＨＡ顆粒を表示する抗原の産生を媒介するプラスミド構築物の模式図を、図５に示す。
【０３５６】
ｐｈａＰ-ＩＬ２またはｐｈａＰ-ＭＯＧ挿入物を含有するクローンをシーケンシングし、正しい配列を含有する1つのクローンを選択した。
ｐＨＡＳ（ｐＥＴ-１４ｂ）、ｐＢＨＲ６８およびｐＵＣ５７プラスミドは、Ａｍｐ（75 ug/ml）選択を用いた。
【０３５７】
ＰＨＡ顆粒表面でのファジン融合タンパク質の産生
大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅの細胞を、それぞれプラスミドｐＢＨＲ６８-ＰｈａＰ-ＩＬ２およびｐＢＨＲ６８-ＰｈａＰ-ＭＯＧで形質転換した。形質転換体を、ＬＢ培地中で37℃で増殖させて、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを付加することにより誘導し、最終濃度を1 mMとした。48時間増殖後、細胞を遠心分離により収穫して、ＰＨＡ顆粒単離に付した。
【０３５８】
ＰＨＡ顆粒の単離
4℃で15分間、5,000 ×gでの遠心分離により、細胞を収穫した。沈殿物を洗浄し、3容積の50 mMリン酸塩緩衝液（ｐＨ7.5）中に懸濁した。細胞を、8000 psiで4回、フレンチプレスに通した。細胞溶解物（0.75 ml）を、グリセロール勾配（リン酸塩緩衝液中88％および44％（v/v）グリセロール）上に負荷した。10℃で2.5時間、100,000 ×gで超遠心分離後、88％グリセロール層上の白色層から顆粒を単離し得た。ＰＨＡ顆粒を10容積のリン酸塩緩衝液（50 mM, ｐＨ7.5）で洗浄し、4℃で30分間、10,000 ×gで遠心分離した。ＰＨＡ顆粒を含有する沈殿物をリン酸塩緩衝液中に懸濁し、4℃で保存した。
【０３５９】
実施例２  -  プロテインＡの抗体結合ＺＺドメインを含む融合ポリペプチドによるポリマー粒子の調製
プラスミドの構築
黄色ブドウ球菌からのプロテインＡのような抗体結合ドメインを用いて、抗体をポリマー粒子の表面に結合して、種々の免疫分離および免疫検出用途に用いられ得る機能化粒子を作製し得る。
プロテインＡのＺＺ-ドメインを、粒子表面に共有結合されるべき結合ドメインの一例として選択した。
融合タンパク質粒子形成を媒介するプラスミドの構築のために用いられるプラスミドを、図６〜８に示す。
【０３６０】
プラスミドｐＣＷＥ（Peters, V. and Rehm, B.H.A., 2005, FEMS Microbiol. Lett. 248, 93-100）、クプリアビドス・ネカターからのＰＨＡ合成酵素を含有するｐＢｌｕｅｓｒｃｒｉｐｔＳＫ誘導体（図６）、ポリヒドロキシアルカノエートコア（中鎖長３-ヒドロキシ脂肪酸を含む）の形成を媒介するｐＢＨＲ８０（Qi Q., Steinbuchel A., Rehm B.H.A. 2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 37-43）（図７）、およびGE Healthcareから供給されるｐＥＺＺ１８（ＺＺドメインおよびリーダーペプチドコード配列を提供する；Genbank寄託番号M74186（Loewenadler et al. (1987)））（図８）を用いて、ポリマーコアの表面にプロテインＡの免疫グロブリン結合部位を表示する組換えポリマー合成酵素を生成した。
【０３６１】
熱安定性ＰＣＲ酵素Ｐｆｘポリメラーゼを用いて、ｐＥＺＺ１８からＺＺドメインおよびリーダーペプチドを増幅し、そしてアンプリコンの各末端にＮｄｅＩ部位を導入した。ＰＣＲのために用いられるオリゴヌクレオチドは、以下のようであった：
（１）ＺＺドメインコード領域に関する３’プライマー：
【化４】
2009509530.tif 000006
（２）５’リーダーペプチド（＋）：
【化５】
2009509530.tif 000007
（３）５’リーダーペプチド（−）：
【化６】
2009509530.tif 000008
リーダードメインを欠くＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を、配列番号９で示す。
【化７】
2009509530.tif 000009
リーダードメインを含むＰＣＲ産物を、配列番号１０で示す。
【化８】
2009509530.tif 000010
【０３６２】
次に、ＰＣＲ産物を、それぞれプラスミドｐＣＷＥおよびｐＢＨＲ８０の各々のＮｄｅＩ部位中に挿入した。ｐＣＷＥ誘導体を、プラスミドｐＭＣＳ６９（Hoffmann, N., Amara, A.A., Br. Beermann, Qi, Q., B., Hinz, H.-J., Rehm, B.H.A. (2002) J. Biol. Chem, 277: 42926-42936）、大腸菌中でのポリヒドロキシブチレートの活性化前駆体の提示を媒介するｌａｃ-プロモーターと同一直線上にあるクプリアビドス・ネカターからの遺伝子ｐｈａＡおよびｐｈａＢを含有するｐＢＢＲ１ＭＣＳ誘導体を保有する大腸菌中で形質転換させた。
【０３６３】
プラスミドｐＣＷＥ-ＺＺ（＋）ｐｈａＣおよびｐＣＷＥ-ＺＺ（−）ｐｈａＣの各ハイブリッド遺伝子も、遺伝子ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢの上流のプラスミドｐＢＨＲ６９のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした。これは、プラスミドｐＢＨＲ６９-ＺＺ（＋）ｐｈａＣおよびｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣを生じた。
【０３６４】
ＰＨＡ顆粒表面でのそれぞれの融合ポリペプチドの過剰産生を達成するために、それぞれのハイブリッド遺伝子をさらにまた、強力なＴ７プロモーターの下流の過剰発現ベクターｐＥＴ１４ｂ中にサブクローニングした。ＺＺ-ＰｈａＣ＋または−シグナルペプチドをコードするその結果生じたプラスミドｐＥＴ１４ｂＺＺ（＋）ｐｈａＣおよびｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣを、ｐＭＣＳ６９（ｐｈｂＡ、ｐｈｂＢ）を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中で形質転換した。
【０３６５】
形質転換体を、ＬＢ培地中で37℃で0.6のＯＤ600に増殖させて、次に、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を付加することにより誘導し、最終濃度を0.1 mMとした。さらに5時間増殖後、細胞を遠心分離により収穫して、−80℃で保存した。必要な場合に、抗生物質を以下の濃度で用いた：アンピシリン75 μg/mlおよびクロラムフェニコール50 μg/ml。化学物質はすべて、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA)から購入した。
【０３６６】
それぞれの細菌細胞のＰＨＡ含量を分析することにより、ＰＨＡ合成酵素の機能性を調べた。蓄積ＰＨＡの量は、ＰＨＡ合成酵素の機能性に対応する。上記のような酸触媒加メタノール分解による３-ヒドロキシメチルエステルへのＰＨＡの転化後、ガスクロマトグラフィー／質量分光分析（ＧＣ-ＭＳ）により、ＰＨＡ含量を定性的および定量的に確定した（Peters, V. and Rehm, B.H.A., 2005, FEMS Microbiol. Lett. 248, 93-100）。対照としてのｐＣＷＥまたはｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細胞と比較した場合、ＰＨＡ蓄積における大きな差は検出されなかった（示されていない）。これらのデータは、ＺＺ-ＰＨＡ合成酵素融合タンパク質がＰＨＡ生合成およびＰＨＡ顆粒形成を媒介する、ということを示唆した。シグナルペプチドの存在および非存在は、ＰＨＡ合成酵素機能に影響を及ぼさなかった。
【０３６７】
4℃で15分間、5,000 ×gでの遠心分離により、細胞を収穫した。沈殿物を洗浄し、3容積の50 mMリン酸塩緩衝液（ｐＨ7.5）中に懸濁した。細胞を、8000 psiで4回、フレンチプレスに通した。細胞溶解物0.75 mlを、グリセロール勾配（リン酸塩緩衝液中88％および44％（v/v）グリセロール）上に負荷した。10℃で2.5時間、100,000 ×gで超遠心分離後、88％グリセロール層上の白色層から顆粒を単離し得た。ＰＨＡ顆粒を10容積のリン酸塩緩衝液（50 mM, ｐＨ7.5）で洗浄し、4℃で30分間、10,000 ×gで遠心分離した。ＰＨＡ顆粒を含有する沈殿物をリン酸塩緩衝液中に懸濁し、4℃で保存した。
【０３６８】
ＩＩ  診断法
特定タンパク質機能を表示する粒子（例えば抗原）は、一連の診断用途のために抗原または抗体捕捉分析を実行させる。
【０３６９】
実施例３  -  抗原を表示するポリマー粒子の調製
本発明の目的のために実行された調査は、特異的タンパク質抗原を発現するポリマー粒子を用いて、抗原特異的および定量的レベルの抗体をＦＡＣＳを用いて免疫感作マウスから検出し得る、ということを明示した。
この実施例に関しては、ｐｈａＰファジンおよび実施例１に従って調製されたマウス乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）抗原を含む融合ポリペプチドを表示するポリマー粒子を用いた。
400 μgの結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Difco, MI）中に乳化した指示50 μgの組換えＭＯＧタンパク質を用いて、左および右脇腹上で皮下的に、8〜12週Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを免疫感作した。上記のように、しかしＭＯＧの代わりに50 μgのオバルブミン（ＯＶＡ）を用いて、対照マウスを免疫感作した。
【０３７０】
4週間後、マウスを尾部採血し、次にＭＯＧ特異的ＩｇＧ抗体が検出され、定量されるか否かを調べた。4つの異なるＭＯＧまたはＯＶＡ免疫感作マウスからの抗血清をプールし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、1％ＦＣＳ、5 mMＥＤＴＡ、0.1％アジ化ナトリウム）中で希釈した。
【０３７１】
ＭＯＧ-ｐｈａＰ融合ポリペプチドを発現する5×106ポリマー粒子に、50 μlの希釈抗血清を96ウエルプレートの1つのウエル中で付加し、室温で15分間インキュベートした。次にウエルをＦＡＣＳ緩衝液で3回洗浄し、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotechnology, Ltd）の5000希釈液50 μlを次に付加し、15分間インキュベートした。さらに3回の洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液中の1:2000希釈ストレプトアビジン-ＰＥ（PharMingen）50 μlとともに15分間、ウエルをインキュベートして、次に、3回洗浄して、試験管中の200 μlのＦＡＣＳ緩衝液に移した。次に試料をＦＡＣＳソーターに通して、結果を、CellQuestソフトウエアを用いて分析した（図９Ａ）。
【０３７２】
結果は、ＭＯＧ免疫感作マウスからの抗原特異的ＩｇＧ抗体はＭＯＧ-ｐｈａＰ融合タンパク質ポリペプチドを発現する粒子と結合したが、一方、ＯＶＡ免疫感作マウスからの抗血清の結合は、全く認められないかまたは非常に少なかった、ということを示す。ＭＯＧ特異的ＩｇＧ抗体のレベルは、広範囲の希釈液（＞3の等級の大きさ）に亘って検出され得る、ということも結果は示している。抗血清特異性のさらなる検定を、実施例４に示す。
【０３７３】
これらの結果は、ポリマー粒子およびＦＡＣＳ技法が、抗原特異的抗体を検出するための迅速、正確且つ定量的方法である、ということを示す。慣用的ＥＬＩＳＡ技法はこの用途のためにしばしば用いられるが、しかしこのような方法はより多くの時間を要し、低感受性で、そして同一の動的範囲の検出を有さない。
【０３７４】
実施例４  -  酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用いた免疫感作マウスからの抗血清の抗原特異性の確定
実施例３は、ＭＯＧ免疫感作マウスからの抗血清は、ＰｈａＰ-ＭＯＧ融合タンパク質を認識する抗原特異的ＩｇＧ抗体を含有するが、しかしＯＶＡ感作マウスからの抗血清は含有しない、ということを示した。抗血清の特異性も、ＥＬＩＳＡを用いて試験した。
丸底96ウエルプレート（Becton, Dickinson and Company）を、4℃で一晩、ＰＢＳ中の3 μg/mlの組換えマウスＭＯＧ1-117またはＯＶＡタンパク質（Sigma-Aldrich）で被覆した（50 μl/ウエル）。上清を廃棄し、周囲温度で1時間、ＰＢＳ中の1％ＢＳＡを付加する（100 μl／ウエル）ことにより、ウエルを遮断した。次にプレートを10 mMトリス／ＨＣｌ、ｐＨ7.5、0.05％トゥイーン２０（ＥＬＩＳＡ緩衝液）で3回洗浄した。
【０３７５】
実施例３のＭＯＧ1-117またはＯＶＡ免疫感作マウスからの0.1％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の希釈血清（50 μl/ウエル）を付加し、そして2時間後、プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液で3回洗浄した。0.1％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で1:4,000に希釈したビオチン接合抗マウスＩｇＧ抗体（Southern Biotechnology, Ltd）を1時間付加し、次にウエルをＥＬＩＳＡ緩衝液で3回洗浄した。0.1％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で1:3,000に希釈したアムデックス・ストレプトアビジン-ＨＲＰ（Amersham Biosciences）（50 μl／ウエル）を各ウエルに付加し、30分間インキュベートした。次にプレートを3回洗浄し、３，３’，５，５’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を5〜30分間付加した。2 MＨ2ＳＯ4を用いて発色を停止させて、次にＥＬＩＳＡプレートを、Benchmarkマイクロプレート読取器（BioRad, Laboratories Inc. Hercules, CA, USA）で450 nmで読み取った。
【０３７６】
ＭＯＧ免疫感作抗血清は、組換えＭＯＧ被覆微量滴定ウエルを認識する抗原特異的ＩｇＧ抗体を含有したが、しかしＯＶＡ免疫感作の場合は含有しなかった。ＯＶＡ免疫感作マウスは、ＯＶＡで被覆された微量滴定ウエルと同様に、ＯＶＡ特異的ＩｇＧを産生したが、しかしＭＯＧで被覆した場合は産生せず、ＥＬＩＳＡを用いて容易に検出可能である結合ＩｇＧを示した（図９Ｂ）。
【０３７７】
実施例５  -  抗原特異的抗体を検出するためのポリマー粒子の使用
本発明の目的のために実行した検査は、ポリマー粒子の表面での融合ポリペプチドとしての特異的タンパク質抗原の発現を用いて、立体配座性エピトープに特異的なモノクローナル抗体を検出し得る、ということを明示した。
【０３７８】
実施例１に従って産生されたＭＯＧ-ｐｈａＰまたはＩＬ‐２-ｐｈａＰ融合ポリペプチドを発現するポリマー粒子（5×106）を抗ＭＯＧ（クローン８-１８Ｃ５）、非標識化または-ＩＬ２ＰＥ標識化ｍＡｂ（クローンＪＥＳ６-５Ｈ４）とともに、周囲温度で15分間インキュベートした。次に粒子を3回洗浄した。抗ＭＯＧ（クローン８-１８Ｃ５）とともにインキュベートした粒子を次に、ＡＰＣ標識化抗マウスＩｇＧとともに、またはビオチニル化抗マウスＩｇＧとともに15分間インキュベートし、次に3回洗浄した。ビオチニル化抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした粒子を、ストレプトアビジン-ＰＥとともに15分間さらにインキュベートし、次に3回洗浄した。
【０３７９】
全ポリマー粒子を、ＦＡＣＳソーターで分析した（図１０）。図１０は、（ｉ）直接標識化抗ＩＬ‐２-フィコエリトリンとともにインキュベートした粒子、（ｉｉ）抗ＭＯＧプラスビオチニル化抗マウスＩｇＧ＋ストレプトアビジン-フィコエリトリンとともにインキュベートした粒子、（ｉｉｉ）抗ＭＯＧ＋直接標識化抗マウスＩｇＧ-アロフィコシアニンとともにインキュベートした粒子とともにインキュベートしたポリマー粒子の表面のＭＯＧ（カラムＡ）またはＩＬ‐２（カラムＢ）融合ポリペプチドの蛍光を示す。
【０３８０】
中黒ヒストグラムは、陰性対照としてそれぞれ抗ＩＬ‐２または抗ＭＯＧｍＡｂとともにインキュベートしたＭＯＧ-またはＩＬ‐２ポリマー粒子の蛍光を示す。中白ヒストグラムは、それぞれ抗ＭＯＧｍＡｂまたは抗ＩＬ‐２とともにインキュベートしたＭＯＧ-またはＩＬ‐２ポリマー粒子の蛍光を示す。
結果は、抗原特異的抗体は各々、それらのそれぞれの融合ポリペプチドと結合したが、一方、非特異的抗体結合は全く認められないかまたは非常に少なかった、ということを示す。
【０３８１】
実施例６  -  ＺＺドメイン-ＰｈａＣ融合ポリペプチドの産生
黄色ブドウ球菌からのプロテインＡのような抗体結合ドメインを用いて、抗体をポリマー粒子の表面に結合し、種々の免疫分離および免疫検出用途に用いられ得る機能化粒子を作製し得る。
この実施例では、実施例２に従って産生されたプロテインＡのＺＺドメインを含む融合ポリペプチドを有する粒子を用いた。
粒子を、上記と同様にＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析に付した（Peters, V. and B.H.A. Rehm, 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72: 1777-83）。
【０３８２】
ＺＺ-ＰｈａＣ＋Ｎ末端シグナルペプチドは、83.981の理論分子量を有し、そして84 kDaの見かけの分子量を有するタンパク質が主要タンパク質として検出され得た。シグナルペプチド無しでは、融合タンパク質は79,338の理論分子量を有し、そして80 kDaの見かけの分子量を有するタンパク質が主要タンパク質として現れた。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳを用いて、ペプチド・フィンガープリンティングにより、これらのタンパク質の同一性を確証した。したがって両方のオープンリーディングフレームが、大腸菌中で効率的且つ完全に発現され得た。ＺＺ-ＰｈａＣ＋または−シグナルペプチドをコードするプラスミドｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（＋）ｐｈａＣおよびｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣは、ＰＨＡ顆粒表面でのＺＺ-ＰｈａＣの過剰産生を媒介した。
【０３８３】
実施例７  -  ＰＨＡ粒子表面でのＺＺドメインの表示
粒子表面にＺＺドメインを局在化するために、実施例２のプラスミドｐＣＷＥ-ＺＺ（＋）ｐｈａＣ、ｐＣＷＥ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ、ｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（＋）ｐｈａＣ、ｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣを保有する大腸菌の粒子、ならびに野生型ＰＨＡ合成酵素により産生される粒子（ｐＣＷＥまたはｐＨＡＳ）を単離し、ＥＬＩＳＡのために用いた。
ＥＬＩＳＡに関しては、微量滴定プレートのウエルを100 μlのＰＨＡ顆粒懸濁液で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。3％（w/v）ＢＳＡで1時間遮断した後、各ウエルを、プール化ヒト血清（Sigma-Aldrich, USA）とともに、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Abcam Inc, MA, USA）と接合されたポリクローナル抗ＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。各ステップの後、ウエルをリン酸塩緩衝生理食塩水で数回洗浄した。基質として、ｏ-フェニレンジアミン溶液（ＯＰＤ、Abbott Diagnostics, IL）100 μlを各ウエルに付加し、15分後、0.5容積の3 NＨ2ＳＯ4の付加により反応を停止させた。微量滴定プレート読取器を用いて490 nmの波長で、基質転化の量を測定した。
【０３８４】
ＺＺ-ＰＨＡ合成酵素融合タンパク質をコードする任意のプラスミドを保有する大腸菌から単離されたＰＨＡ顆粒とのＩｇＧの特異的結合は、野生型ＰＨＡ顆粒と比較した場合、490 nmの波長での吸光度の少なくとも2倍増により示唆された（図１０）。シグナルペプチドの存在および非存在は、ＩｇＧ結合能力に影響を及ぼさなかった。しかしながらＰＨＡ顆粒表面でのＺＺ-ＰｈａＣの過剰産生は、結合能力を有意に増大した（図１０）。
【０３８５】
実施例８  -  ＺＺ-ＰＨＡ粒子と市販プロテインＡ粒子との比較
実施例２のｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来のプロテインＡからのＩｇＧ結合ドメインＺＺを表示するＰＨＡ粒子を、ヒト血清からのＩｇＧ精製のために用いた。
比較分析のために、免疫感作組換えプロテインＡを有するプロテインＡ-セファロースビーズも用いて、ＩｇＧを精製した。プロテインＡセファロース４Ｂビーズ精製プロトコール（Sigma, USA）に従って、ＩｇＧ精製を実行した。溶離タンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、顆粒の表面にＰＨＡ合成酵素の一部としてＺＺドメインを表示するＺＺ-ＰＨＡ顆粒を用いて、免疫グロブリン（50 kDaの見掛けの分子量を有する重鎖を表わすタンパク質、ならびに25 kDaの見掛けの分子量を有する軽鎖を表わすタンパク質）が精製された、ということを示した。
【０３８６】
ｐＨ2.7でＰＨＡ顆粒から溶離された免疫グロブリンは、市販プロテインＡ-セファロースビーズに匹敵する高純度を示した（図１１）。野生型ＰＨＡ合成酵素により形成されるＰＨＡ顆粒はタンパク質の溶離を示さなかったが、このことは、血清タンパク質の非特異的結合がＩｇＧ精製を妨げないこと、そしてＺＺドメインがＩｇＧ精製を媒介することを示唆する（図１１）。
野生型ＰＨＡ合成酵素のみを含有する対照ＰＨＡ顆粒は、温度非依存性である低レベルの非特異的結合を示しただけであった。
【０３８７】
実施例９  -  ストレプトアビジンを含む融合ポリペプチドを有するポリマー粒子の調製
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）をベクター主鎖として用いて、これに、フェノール資化細菌のゲノムＤＮＡから増幅されたｐｈａＣ遺伝子を、出発コドンを伴わずに結紮した。
配列番号１５で記述されるストレプトアビジンのヌクレオチド配列（Sorensen HP, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK. Protein Exp Purif. 2003 Dec; 32(2): 252-259に発表されたｐＥＴ１５ｂ-ＮｕｓＡ-ＳＡ由来）を、ＳｐｅＩを用いて、ＰｈａＣのＮ末端にプラスミドを含有するｐｈａＣ中にサブクローニングした。
ストレプトアビジン配列の5’(GCACTAGTAT GACCACGGTC TCGATTAC)-および3’(TAACTAGTCT GCTGAACGGC GTC)プライマーは、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で記述される。
【０３８８】
ＰＣＲ反応（100 μl）：
ｄＮＴＰ：  200 μM
プライマー：  各々0.5 μM
鋳型：  10 ng  ｐＥＴ１５ｂ-ＮｕｓＡ-ＳＡ
ＭｇＣｌ2：  2 mM
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）：  2.5 U
反応緩衝液（Stratagene）：1×
反応条件：
１．  変性：  94℃で3分
２．  変性：  94℃で20分
３．  アニーリング：  融解温度50℃で20秒
４．  伸長：  72℃で60秒。
ステップ２〜４を30回。
【０３８９】
実施例５の場合と同一細菌株および培養条件。
このようなストレプトアビジンまたはその他のビオチン結合融合タンパク質を用いて、抗原、抗体および核酸を含むビオチン標識化基質を結合し得た。ビオチン-ストレプトアビジン相互作用の強度は、ｍＲＮＡ単離ならびに一次および二次抗体の補足を含めたその後の分離におけるリガンドとして捕捉基質を有用にさせる。
【０３９０】
ＩＩＩ  粒子産生
実施例１０  -  ＰＨＡ粒子上での融合ポリペプチドとしての組換えタンパク質の産生
ポリマー粒子上での融合ポリペプチドとしての組換えタンパク質の産生は、ｐｈａＰファジンおよびＭＯＧまたはＩＬ‐２を含む融合ポリペプチドを用いて、実施例１で実証された。さらに実施例５は、ＩＬ‐ｐｈａＰ融合ポリペプチドが立体配座的に正確なエピトープとして産生される、ということを実証した。立体配座的正確組換えポリペプチドを産生する能力は、組換えタンパク質産生のための有用な手段を提供する。
【０３９１】
組換えポリペプチドは、図５の模式図に示したように、融合ポリペプチドの組換えポリペプチドとｐｈａＰポリペプチドとの間に置かれる工学処理タンパク質設計配列を用いて、ポリマー粒子およびｐｈａＰポリペプチドから酵素的に切断され得る。この実施例では、配列ＤＤＤＤＫでの組換えポリペプチドの切断は、この部位がエンテロキナーゼにより認識され、そして利用可能であることを示す。
【０３９２】
上記の実施例１に記載した方法に従って、ＩＬ‐２-ｐｈａＰ融合ポリペプチドを発現するポリマー粒子（5×106）を産生し、次にウシエンテロキナーゼとともに（ｉ）0時間、（ｉｉ）1時間、および（ｉｉｉ）16時間、インキュベートした（図１３）。
インキュベーション後、粒子を洗浄し、次にフィコエリトリン標識ＩＬ‐２ｍＡｂ（クローンＪＥＳ６-５Ｈ４）または抗ＭＯＧ（クローン８-１８Ｃ５）非標識化ｍＡｂとともに、周囲温度で15分間インキュベートした。
【０３９３】
次に抗ＭＯＧ（クローン８-１８Ｃ５）とともにインキュベートされた粒子を、ビオチニル化抗マウスＩｇＧとともに15分間インキュベートし、次に3回洗浄した後、ストレプトアビジン結合フィコエリトリンとともに15分間さらにインキュベートした。
次に全粒子を3回洗浄し、ＦＡＣＳを用いて分析した。
図１３の中黒ヒストグラムは、陰性対照として抗ＭＯＧｍＡｂとともにインキュベートされたＩＬ‐２ポリマー粒子の蛍光を示す。検出される蛍光の欠如は、非特異的抗体結合が全く起こらなかったかまたは非常に少なかったことを示す。
中白ヒストグラムは、抗ＩＬ‐２ｍＡｂとともにインキュベートされたＩＬ‐２ポリマー粒子の蛍光を示す。エンテロキナーゼに0時間曝露後（ｉ）、中白ヒストグラムは陰性対照を上回る傾向の明らかなシフトを示すが、これは、ＩＬ‐２が検出され、そしてポリマー粒子に付着されたことを示す。
【０３９４】
エンテロキナーゼとともに1時間インキュベーション後（ｉｉ）、蛍光強度の小シフトは、ＩＬ‐２の一部が粒子から切断されたことを示す。
エンテロキナーゼとともに16時間インキュベーション後（ｉｉｉ）、ポリマー粒子の表面にＩＬ‐２は検出されないが、これは、ＩＬ‐２がポリマー粒子から切断されたことを示す。
【０３９５】
したがってＩＬ‐ｐｈａＰ融合ポリペプチドは、ウシエンテロキナーゼを伴う一晩のインキュベーションにより、ポリマー粒子から切断され得る。したがって組換えタンパク質発現中に封入体を典型的に形成するタンパク質が発現され、次に切り落とされ、そしてポリマー粒子から非常に容易に精製されて、高生物学的活性を有する非常に純粋なタンパク質を産生し得る。
【０３９６】
ＩＶ  スクリーニング
実施例１１  -  ヒトアセチルコリン受容体のアルファサブユニットを含有する組換えＰＨＡ粒子の調製
プラスミドｐＢＡＤＨｉｓＢ（Invitrogen）をベクター主鎖として用いて、これに、フェノール資化細菌のゲノムＤＮＡから増幅されたｐｈａＰ遺伝子を結紮する。
配列番号１６で記述されるようなヒトアセチルコリン受容体の可溶性ドメイン（”Reconstitution of conformationally dependent epitopes on the N-terminal extracellular domain of the human muscle acetylcholine receptor alpha subunit expressed in Escherichia coli: implications for myasthenia gravis therapeutic approaches”, 2000；International Immunology, Vol. 12, No. 9, pp. 1255-1265）を、Ｘｈｏを用いて、ＰｈａＰのＣ末端にプラスミドを含有するｐｈａＰ中にサブクローニングする。
図１４は、その結果生じたベクターｐＢＡＤ-Ｐ-ＡｃｈＲを示す。
このような融合ポリペプチドを有するポリマー粒子を用いて、ヒトアセチルコリン受容体の可溶性ドメインを結合する分子に関してスクリーニングし得る。
【０３９７】
実施例１２  -  ヒトトロンボポイエチン受容体Ｍｐ１のアルファサブユニットを含有する組換えＰＨＡ粒子の調製
この場合もまたプラスミドｐＢＡＤＨｉｓＢ（Invitrogen）をベクター主鎖として用いて、これに、フェノール資化細菌のゲノムＤＮＡから増幅されたｐｈａＰ遺伝子を結紮する。
配列番号１７で記述される日とトロンボポイエチン受容体Ｍｐ１のアルファサブユニット（”Expression of the Soluble Extracellular Domain of Human Thrombopoietin Receptor Using a Maltose-Biding Protein-Affinity Fusion System”, 2004；Biol. Pharm. Bull. 27(2): 219-221）を、ＰｈａＰのＣ末端にプラスミドを含有するｐｈａＰ中にサブクローニングする。
Ｍｐ１配列の5’(GGCTACTCGA GATGAATTCG AGCTCGAACA ACAACAACAA TAAC)および3’(CAGCTTCGAA TTAAGTTGGG TCCGACCACG AGCTCCAGGG)プライマーは、それぞれ配列番号１８および配列番号１９で記述される。
【０３９８】
図１５は、その結果生じたベクターｐＢＡＤ-Ｐ-Ｍｐ１を示す。
このような融合ポリペプチドを有するポリマー粒子を用いて、ヒトトロンボポイエチン受容体のアルファサブユニットを結合する分子に関してスクリーニングし得る。
【０３９９】
Ｖ  酵素固定化
実施例１３  -  ポリマー粒子の表面タンパク質およびポリマーコア間の結合の安定性
本発明の目的のために実行した検査は、ポリマー合成酵素が、変性試薬、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、塩酸グアニジンまたはジチオトレイトールによる処理によっても、あるいは酸性条件の使用によっても、生分解性ポリマー粒子のコアから剥離され得ない、ということを明示した。
これは、ポリマー粒子とポリマー合成酵素のポリマー粒子結合ドメインとの間の共有結合の存在を示す。結合の安定性増大は、ポリマー粒子と結合されるかまたはその中に組入れられる物質のそれらの標的部位への安定輸送を可能にする。
【０４００】
表面結合ポリマー合成酵素のＮ末端断片（保存α／β-ヒドロラーゼドメインの開始に対してのＮ末端）は非常に可変的であり、そして遺伝子工学処理方法を用いて機能性タンパク質により取って代わられ得る。このようにして、ポリマー合成酵素活性およびポリマー粒子の合成は保持される（Rehm, B.H.A. et al, Biochem. Biophys. Acta 2002, Vol. 1594, pp. 178-190）。その結果、安定性増大を示す表面機能化が得られる。
タンパク質分析は、意外にも、Ｎ末端融合を用いると、粒子表面のポリマー合成酵素のコピー数は、ほとんど免疫分析によって検出可能であるに過ぎない非融合ポリマー合成酵素と比較して、強力に増強される、ということを示している。
【０４０１】
実施例１４  -  プロテインＡ安定性
実施例２のＺＺ-ＰＨＡ顆粒を反復精製サイクルに付して、一貫した精製性能および強力な安定性を実証した。ＺＺ-ＰＨＡ顆粒に漸増温度を施して、次にＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ結合能力を査定することにより、温度安定性を試験した。顆粒を異なる温度で15分間加熱して、100 μlの懸濁液を微量滴定プレートに付加した。プレートを、4℃で一晩放置した。次にプレートをＰＢＳ中で3回洗浄して、ＰＢＳ中に溶解したヒト血清を付加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。ウエルをＰＢＳで3回洗浄し、抗ＩｇＧ-ＨＲＰを付加して、室温で30分間インキュベートした。次にウエルをＰＢＳで10回洗浄して、実施例７に記載したように展開した。
図１５は、60℃で、結合能力が60％に低下したことを示すが、これは、ＺＺドメインが部分的にアンフォールディングであったことを示唆する。
【０４０２】
実施例１５  -  β-ガラクトシダーゼ酵素固定化
本発明の目的のために実行した検査は、ポリマー粒子の表面での融合ポリペプチドとしての酵素の発現を用いて、一連の保存条件下で長期間、酵素を安定化し得る、ということを明示した。
この実施例では、ＰＨＡ合成酵素を用いて、ＰＨＡ顆粒表面でβ-ガラクトシダーゼを共有的に固定化した。
【０４０３】
プラスミドの構築
ＬａｃＺ-ＰｈａＣ１（β-ガラクトシダーゼ-ＰＨＡ合成酵素）融合を産生するために用いられるプラスミドを、以下のように構築した（制限認識部位には下線を付す）。オリゴヌクレオチドアダプタ5’-P-TATGGCTCTG CACTAGTCAC TGC-CA-3’（配列番号２０）およびアダプタ逆5’-P-TATGGCAGTG ACTAGTGCAG AG-CA-3’（配列番号２１）のハイブリダイゼーションにより、アダプタを含有し、リンカー領域をコードするＳｐｅＩ部位を生成した。アダプタを、ｐＢＨＲ８０のＮｄｅＩ部位に挿入した。ＳｐｅＩ部位を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子に関するフレーム内にｌａｃＺ遺伝子を挿入した。オリゴヌクレオチド5’-lacZ-SpeI5’-GGACTAGTAT GACCATGATT ACGGATTCAC TGG-3’（配列番号２２）および3’-lacZ-SpeI 5’-CAACTAGTTT TTTGACACCA GACCAACTGG TAATTG-3’（配列番号２３）を用いて（ＳｐｅＩ部位を提供）、大腸菌Ｓ１７-１のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲにより、ｌａｃＺ遺伝子コード領域を増幅した。天然宿主中のＬａｃＺ-ＰＨＡ合成酵素を調べるために、ｐＢＨＲ８０ＡｌａｃＺからのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片をｐＢＢＲ１ＪＯ-５それぞれの部位にサブクローニングすることにより（Peters, V. and Rehm, B.H.A., 2005, FEMS Microbiol. Lett. 248, 93-100）、広宿主範囲構築物を生成して、プラスミドｐＢＢＲ１ＪＯ５-ｌａｃＺｐｈａＣ１を生じた。ＬａｃＺ-ＰｈａＣ１およびＰｈａＣ１の過剰発現を達成するために、ｐＢＨＲ８０およびｐＢＨＲ８０ＡｌａｃＺからのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ１４ｂのそれぞれの部位にサブクローニングして、菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中で形質転換した。
【０４０４】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの細胞を、プラスミドｐＥＴ１４ｂ-ｐｈａＣ１およびｐＥＴ１４ｂ-ｌａｃＺｐｈａＣ１で形質転換した。形質転換体を、30℃で0.6のＯＤ600に増殖させた。次に、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を付加することにより誘導し、最終濃度を0.5 mMとした。さらに5時間増殖後、細胞を遠心分離により収穫して、−80℃で保存した。
【０４０５】
同質遺伝子マーカー無含有緑膿菌ΔｐｈａＣ１-Ｚ-Ｃ２突然変異体の相補性
ＰＨＡ陰性突然変異体の相補性に関して、プラスミドｐＢＨＲ８０ＡｌａｃＺのｌａｃＺ-ｐｈａＣ１遺伝子をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで加水分解して、広宿主範囲ベクターｐＢＢＲ１ＪＯ-５のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＢＢＲ１ＪＯ５-ｌａｃＺｐｈａＣ１を生じた。大腸菌Ｓ１７-１をドナーとして用いて、プラスミドｐＢＢＲ１ＪＯ５-ｌａｃＺｐｈａＣ１を緑膿菌ΔｐｈａＣ１-Ｚ-Ｃ２中に移して、150 μg/mlゲンタマイシンを含有するＭＳＭ上でトランスコンジュガントを選択した（６）。次に細胞をＰＨＡ蓄積条件下で増殖させて、ＧＣ／ＭＳ分析によりＰＨＡ含量を確定した。
【０４０６】
in vivoＰＨＡ合成酵素活性
それぞれの細菌細胞のＰＨＡ含量を分析することにより、in vivoＰＨＡ合成酵素活性を得た。蓄積ＰＨＡの量は、相対的in vivoＰＨＡ合成酵素活性に対応する。酸触媒加メタノール分解による３-ヒドロキシメチルエステルへのＰＨＡの転化後、ガスクロマトグラフィー／質量分光分析（ＧＣ-ＭＳ）により、ＰＨＡ含量を定性的および定量的に確定した。
【０４０７】
ＰＨＡ顆粒の単離
4℃で15分間、5,000 ×gでの遠心分離により、細胞を収穫した。沈殿物を洗浄し、3容積の50 mMリン酸塩緩衝液（ｐＨ7.5）中に懸濁した。細胞を、8000 psiで3回、フレンチプレスに通した。細胞溶解物0.8 mlを、グリセロール勾配（リン酸塩緩衝液中88％および44％（v/v）グリセロール）上に負荷した。4℃で2時間、100,000 ×gで超遠心分離後、88％グリセロール層上の白色層から顆粒を単離し得た。ＰＨＡ顆粒を10容積のリン酸塩緩衝液（50 mM, ｐＨ7.5）で洗浄し、4℃で30分間、10,000 ×gで遠心分離した。ＰＨＡ顆粒を含有する沈殿物をリン酸塩緩衝液中に懸濁し、4℃で保存した。
【０４０８】
ＰＨＡ顆粒表面にｌａｃＺを局在化するために、プラスミドｐＢＢＲ１ＪＯ５-ｌａｃＺｐｈａＣ１を保有する緑膿菌ΔｐｈａＣ１-Ｚ-Ｃ２のＰＨＡ顆粒、ならびに野生型緑膿菌ＰＡＯ１により産生されるＰＨＡ顆粒を単離し、ＥＬＩＳＡのために用いた。
【０４０９】
ＥＬＩＳＡに関しては、微量滴定プレートのウエルを200 μlのＰＨＡ顆粒懸濁液で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。3％（w/v）ＢＳＡで1時間遮断した後、各ウエルを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Abcam Inc, MA, USA）と接合されたポリクローナル抗β-ガラクトシダーゼ抗体とともにインキュベートした。各ステップの後、ウエルをリン酸塩緩衝生理食塩水で数回洗浄した。基質として、ｏ-フェニレンジアミン溶液（ＯＰＤ、Abbott Diagnostics, IL）200 μlを各ウエルに付加し、30分後、0.5容積の3 NＨ2ＳＯ4の付加により反応を停止させた。微量滴定プレート読取器を用いて405 nmの波長で、基質転化の量を測定した。
【０４１０】
ｐＢＢＲ１ＪＯ５-ｌａｃＺｐｈａＣ１を保有する緑膿菌ΔｐｈａＣ１-Ｚ-Ｃ２から単離されたＰＨＡ顆粒との抗ＬａｃＺ抗体の特異的結合は、野生型ＰＨＡ顆粒と比較した場合、405 nmの波長での吸光度の2倍増により示唆された（図１６）。
【０４１１】
β−ガラクトシダーゼ活性検定
ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に対してそのＣ末端と融合され、そしてＰＨＡ顆粒表面で固定化された場合に、ＬａｃＺが依然として活性であるか否かを確定するために、ＬａｃＺ活性を分析した。ＬａｃＺ活性が検出され、そして68,000 MUの平均活性を示された。
ＰＨＡ顆粒表面に固定化されたβ-ガラクトシダーゼの動的パラメーターの確定
酵素動力学を確定するために、単離ＰＨＡ顆粒のβ-ガラクトシダーゼ活性を10分間モニタリングした（データは示されていない）。オルト-ニトロフェニル-β-（Ｄ）-ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）濃度は、50 μM〜500 μMの範囲であった。Ｖ0と基質濃度との相関は、非線形回帰分析の助けを借りて、ミカエリス・メンテン動力学に適合され得た（Sigma Plot enzyme kinetics, systat software, Inc.）。630 μMのＫMおよび17.6 nmol/分のＶmaxを得た。
【０４１２】
酵素安定性
種々の保存条件下でＰＨＡ顆粒に固定化されたＬａｃＺの安定性を調べた。ＬａｃＺ活性を、12週間に亘ってモニタリングした。ＰＨＡ顆粒懸濁液を、付加プロテアーゼ阻害剤かくてク（）とともに、またはプロテアーゼ阻害剤カクテル＋20％（v/v）グリセロールとともに、4℃で保存した。20％（v/v）グリセロールの付加は、4週間後に最初の活性の91％という最良の保存安定性を生じた。20％（v/v）グリセロールを付加しない場合、4週間後に、ＬａｃＺ活性は最初に確定されたＬａｃＺ活性の84％に低減した（表１）。興味深いことに、12週間後、グリセロールを含有するＰＨＡ顆粒懸濁液中では初期活性の87％が未だ検出可能であったが、一方、グリセロールを含有しないＰＨＡ顆粒懸濁液のＬａｃＺ活性はすでに初期ＬａｃＺ活性の75％に低減されたことを示した（表１）。
【０４１３】
【表１】
2009509530.tif 000011
【０４１４】
実施例１６  -  ｌａｃおよびＴ７プロモーター間の比較
この実施例では、プロモーター強度の作用を調べた。
ｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の実施例２のプロテインＡからのＩｇＧ結合ドメインＺＺを表示するＰＨＡ粒子（Ｔ７プロモーターの制御下）を、ｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の粒子（ｌａｃプロモーターの制御下）と比較した。
図１７は、（ｉ）0；（ｉｉ）1または（ｉｉｉ）10 μg/mLの標識化マウスＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（プロテインＡと良好に結合し、ＰＥ（フィコエリトリン）で蛍光標識される（接合される））とともにインキュベートされたｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の粒子（Ａ）、ｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ（Ｂ）ならびにｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ（Ｃ）から新たに得られた粒子を示す。高濃度では、Ｔ７粒子は少なくとも10×より多くのＩｇＧ／粒子を結合する。低濃度、非飽和濃度（1 μg/ml）では、それはより多くのＩｇＧを結合する。
【０４１５】
実施例１７  -  ＺＺ粒子および市販BioMagビーズ間の比較
この実施例では、ＺＺドメイン表示粒子のＩｇＧ結合親和性を、市販のプロテインＡBioMagビーズ（Perspective Biosystems）と比較した。
プロテインＡからのＩｇＧ結合ドメインを表示する実施例２のｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来のＰＨＡ粒子（Ａ）（直径約150 nm）は、BioMagビーズ（Ｂ）と少なくとも同一の結合親和性を表示することが示された（図１９）。
【０４１６】
実施例１８  -  粒子サイズBioMag-ＢＮＰ比較例
この実施例では、粒子サイズの作用を調べた。
ｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の実施例２のプロテインＡからのＩｇＧ結合ドメインＺＺを表示するＰＨＡ粒子を、ｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の粒子と比較した。
【０４１７】
約100 nmの平均直径を有するｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来のＰＨＡ粒子（Ｃ）は、ｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の古くなった粒子（Ａ）、ならびにｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣから新たに得られた粒子（Ｂ）（ともに約150 nmの平均粒子直径を有した）と比較した場合、10倍増の結合親和性を有することが示された（図１９）。
【０４１８】
実施例１９  -  強力プロモーター由来のポリマー粒子のサイズ分布
この実施例では、粒子サイズに及ぼすプロモーター強度の作用を調べた。細胞を、50 mLの培養中で109〜1010/mLの細胞密度に増殖させた。16,000〜72,250倍の絶対倍率で、透過型電子顕微鏡により細胞画像を得て、解像度を約40 nmに下げさせた。粒子サイズの代表的画像を選択し、33細胞内のポリマー粒子をルーラーを用いて測定した。
ｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ由来の実施例２のプロテインＡからのＩｇＧ結合ドメインＺＺを表示するポリマー粒子のサイズ分布を、図２０に示す。
産生される粒子の90％が約200 nmまたはそれ以下の直径を有し、80％が約150 nmまたはそれ以下の直径を有し、60％が約100 nmまたはそれ以下の直径を有し、45％が約80 nmまたはそれ以下の直径を有し、40％が約60 nmまたはそれ以下の直径を有し、25％が約50 nmまたはそれ以下の直径を有し、そして5％が約35 nmまたはそれ以下の直径を有する。
【０４１９】
実施例２０  -  粒子融合ポリペプチド適用範囲の定量
ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて粒子結合タンパク質を分離することにより融合ポリペプチド適用範囲のレベルを概算し、融合ポリペプチドの分画を、実施例６に略記したような融合タンパク質帯域の強度に基づいて概算し得る。
【０４２０】
産業用途
本発明の方法、ポリマー粒子および融合タンパク質は、診断、タンパク質産生、生体触媒固定化および薬物送達において実用性を有する。
上記の説明は例証として提供されたに過ぎず、本発明を限定するものではない、と当業者は理解する。
【０４２１】
本発明のさらなる態様は、例として示されるだけの以下の説明から、そして添付の図面を参照すると明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０４２２】
【図１】図１は、in vivo産生ポリマー粒子、ならびに粒子と会合されるタンパク質および脂質の模式的概観である。
【図２】図２は、フェノール資化細菌（Ralstonia eutropha）中でのポリヒドロキシアルカノエートポリマーの合成の一例を示す。ポリヒドロキシアルカノエート・ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）は、基質アセチル-ＣｏＡから出発して、三段階工程で産生される。ＰＨＢ中のＣ４反復単位は、β-ヒドロキシ酪酸である。合成における最終ステップは、その表面に結合される粒子結合タンパク質を伴うポリマー粒子の形成を生じる。
【図３】図３は、ポリヒドロキシラクテートコア（３-ヒドロキシブチレート）ならびにファジンｐｈａＰおよびＩＬ‐２を含む融合ポリペプチドの産生のためのＰＨＡオペランをコードするプラスミドｐＢＨＲ６８-ｐｈａＰ-ＩＬ‐２を示す。
【図４】図４は、ポリヒドロキシラクテートコア（３-ヒドロキシブチレート）ならびにファジンｐｈａＰおよびＭＯＧを含む融合ポリペプチドの産生のためのＰＨＡオペランをコードするプラスミドｐＢＨＲ６８-ｐｈａＰ-ＭＯＧを示す。
【図５】図５は、図３および図４に示されるプラスミドの発現構築物の模式図を示す。三角形は、ｌａｃプロモーターを示し；ｐｈａＰはファジン遺伝子；ＩＬ２はインターロイキン２遺伝子；ＭＯＧはミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質コード遺伝子；ｐｈａＣはＰＨＡ合成酵素コード遺伝子；ｐｈａＡはβ-ケトホチオラーゼをコードする遺伝子；ｐｈａＢはアセトアセチル-ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を表わす。
【図６】図６は、クプリアビドス・ネカター（Cupriavidus necator）からのＰＨＡ合成酵素をコードするプラスミドｐＣＷＥ（Peters, V. and Rehm, B.H.A., 2005, FEMS Microbiol. Lett. 248, 93-100）を示す。
【図７】図７は、ポリヒドロキシアルカノエートコア（中鎖長３-ヒドロキシ脂肪酸）をコードするプラスミドｐＢＨＲ８０（Qi Q., Steinbuchel A., Rehm B.H.A. 2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 37-43）を示す。
【図８】図８は、抗原表示ＰＨＡ顆粒を用いた抗原特異的抗体の検出を示す。図８Ａでは、ＭＯＧ-ｐｈａＰ顆粒を、5つのＭＯＧ（ＭＯＧ）またはＯＶＡ（ＯＶＡ）免疫感作マウスからのプール血清の連続希釈液とともにインキュベートした。顆粒を広範に洗浄し、次にビオチニル化抗マウスＩｇＧとともに、その後、ＰＥ接合ストレプトアビジンとともにインキュベートし、ＦＡＣＳベースで検出した。データを、「正規化」方式で示した（最大の％）。少なくとも2つの実施実験のうちの代表的一実験を示す。図８Ｂでは、ＭＯＧ-ｐｈａＰに結合するＭＯＧまたはＯＶＡ免疫感作マウスからの抗血清の各希釈液に関する平均チャンネル蛍光を測定し、示した。図８Ｃでは、ＭＯＧ-およびＯＶＡ-免疫感作マウスからの抗血清に関して、ＥＬＩＳＡを実施した。抗血清の連続希釈液を、ＭＯＧ-またはＯＶＡ-被覆ウエルに付加し、30分間インキュベートした。次にビオチニル化抗マウスＩｇＧを洗浄ウエルに付加し、その後、ＨＲＰ接合ストレプトアビジンおよびＴＭＢ基質を付加した。光学濃度を450 nmで読み取って、少なくとも2つの実施実験のうちの代表的一実験からの結果を示す。図８Ｃでは、三重反復実験試料からの平均±ＳＥＭとしてデータを表示する。
【図９】図９は、ポリマー粒子の表面上のＭＯＧ-ｐｈａＰ（カラムＡ）およびＩＬ‐２ｐｈａＰ（カラムＢ）融合ポリペプチドが、立体配座的エピトープおよびＦＡＣＳに特異的なモノクローナル抗体を用いて検出され得る、ということを示す。（ｉ）直接標識抗ＩＬ‐２-フィコエリトリンとともに粒子をインキュベートした。（ｉｉ）抗ＭＯＧ＋ビオチニル化抗マウスＩｇＧ＋ストレプトアビジン‐フィコエリトリンとともに粒子をインキュベートし、（ｉｉｉ）抗ＭＯＧ＋直接標識抗マウスＩｇＧ-アロフィコシアニンとともに粒子をインキュベートした。黒塗りヒストグラムは、負の対照としてのそれぞれ抗ＩＬ‐２または抗ＭＯＧｍＡｂとともにインキュベートされたＭＯＧ-またはＩＬ‐２ポリマー粒子の蛍光を示す。中白ヒストグラムは、それぞれ抗ＭＯＧｍＡｂまたは抗ＩＬ‐２とともにインキュベートされたＭＯＧまたはＩＬ‐２ポリマー粒子の蛍光を示す。
【図１０】図１０は、ＰＨＡ顆粒に結合されたＩｇＧの検出のための種々のＰＨＡ顆粒および抗ＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡを示す。種々のプラスミドを保有する組換え大腸菌から、ＰＨＡ顆粒を単離した。プラスミドは、遺伝子発現のためのｌａｃプロモーターまたはＴ７ファージプロモーターを含有した。以下のバージョンのＰＨＡ合成酵素が、ＰＨＡ顆粒の産生を媒介した：ＷＴ、野生型ＰＨＡ合成酵素；Ａ（−）、シグナルペプチドを伴わないＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合；Ａ（＋）、ＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合＋シグナルペプチド。結合ヒトＩｇＧの検出のために、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体を用いた。2.6 μgのポリヒドロキシブチレートに対応する等量のＰＨＡ顆粒タンパク質（0.37 μg）を、各ウエルに付加した。四重反復実験で測定を実行した。平均値および標準偏差を示す。
【０４２３】
【図１１】図１１は、ＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合顆粒またはプロテインＡセファロースとin vitroに結合され、そして溶離後に放出されるタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す。Ｍ、分子量標準；１、ヒト血清；２、プロテインＡセファロースビーズから溶離されるタンパク質；３、野生型ＰＨＡ顆粒から溶離されるタンパク質；４、シグナル配列を伴わずにＺＺドメインを表示するＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合顆粒から溶離されるタンパク質。「Ａ」および「Ｂ」は、それぞれＩｇＧの重鎖および軽鎖を示す。
【図１２】図１２は、ポリマー粒子の表面上のＩＬ‐２-ｐｈａＰ融合ポリペプチド、ならびにエンテロキナーゼを用いたポリマー粒子からのＩＬ‐２の切断を示す。ヒストグラムは、フィコエリトリンに直接的にカップリングされ、そして（ｉ）0時間、（ｉｉ）1時間、および（ｉｉｉ）16時間後にエンテロキナーゼに曝露される抗ＩＬ‐２ｍＡｂで標識されるポリマー粒子を発現するＩＬ‐２-ｐｈａＰ発現ポリマー粒子を示す。
【図１３】図１３は、ベクターｐＢＡＤ-Ｐ-ＡＣｈＲを示す。この構造において、ヒトアセチルコリン-受容体の可溶性ドメイン（International Immunology (2000), Vol. 12, No. 9, pp. 1255-1265）を、Ｘｈｏｌを用いてＰｈａＰのＣ末端にサブクローニングして、ＰｈａＰ-ＡＣｈＲ融合ポリペプチドを作製した。
【図１４】図１４は、ベクターｐＢＡＤ-Ｐ-Ｍｐｌを示す。この構造において、ヒトトロンボポイエチン-受容体の可溶性ドメイン（Ｍｐｌ）（Biol. Pharm. Bull. (2004), 27(2): 219-221）を、ＰｈａＰのＣ末端にサブクローニングして、ＰｈａＰ-Ｍｐｌ融合ポリペプチドを作製した。
【図１５】図１５は、ＥＬＩＳＡにより査定されたＺＺ-ＰＨＡ顆粒の温度安定性を示す。黒三角、ＺＺドメインを表示するＺＺ-ＰＨＡ顆粒；黒四角、野生型ＰＨＡ顆粒。三重反復実験で測定を実行した。平均値および標準偏差を示す。
【図１６】図１６は、ＨＲＰおよびＰＨＡ顆粒に接合された抗β-ガラクトシダーゼ抗体を用いて抗体捕捉を適用するＥＬＩＳＡを示す。ＬａｃＺ-ＰｈａＣ融合ポリペプチドを表示するＰＨＡ顆粒（Ａ）を緑膿菌ΔｐｈａＣ１-Ｚ-Ｃ２（ｐＢＢＲ１ＪＯ５-ｌａｃＺｐｈａＣ１）から、ならびに野生型緑膿菌ＰＡＯ１（Ｂ）から単離した。抗β-ガラクトシダーゼ抗体接合体を微量滴定プレートに結合されたＰＨＡ顆粒と結合後、ｏ-フェニレンジアミン溶液を用い、405 nmの波長での吸光度を測定することにより、結合抗体を定量した。
【図１７】図１７は、ＦＡＣＳベースの検出によるシグナルペプチドを伴わないＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合ポリペプチドを表示するポリマー粒子のＩｇＧ結合成績を示す。ｐＣＷＥ-ＺＺ（−）ｐｈａＣおよびｐＭＣＳ６９（Ａ）、ｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ（Ｂ）ならびにｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ（Ｃ）を含有する細胞から、ＺＺドメイン-ＰｈａＣ融合ポリペプチドを表示するＰＨＡ顆粒を単離した。単離ポリマー粒子を、3つの異なる濃度：（ｉ）0μg/mLＩｇＧ-ＰＥ；（ｉｉ）1.0 μg/mLＩｇＧ-ＰＥ；および（ｉｉｉ）10 μg/mLでフィコエリトリンに接合された標識化マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体とともにインキュベートした。
【図１８】図１８は、フィコエリトリンに接合された標識化マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を用いて、市販プロテインＡBioMagビーズ（Ｂ）と比較した場合の、ＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合ポリペプチドを表示するポリマー粒子（Ａ）のＩｇＧ結合成績を示す。
【図１９】図１９は、ポリマーサイズの一関数としてのＺＺドメイン-ＰＨＡ合成酵素融合ポリペプチドを表示するポリマー粒子のＩｇＧ結合成績を示す。ｐＣＷＥ-ＺＺ（−）ｐｈａＣおよびｐＭＣＳ６９（Ａ）、ｐＢＨＲ６９-ＺＺ（−）ｐｈａＣ（Ｂ）ならびにｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣ（Ｃ）を含有する細胞から、ＺＺドメイン-ＰｈａＣ融合ポリペプチドを表示するＰＨＡ顆粒を単離した。（Ａ）および（Ｂ）における単離ポリマー粒子は約150 nmの平均サイズを有したが、一方、（Ｃ）におけるポリマー粒子は約100 nmの平均サイズを有した。10 μg/mLＩｇＧ-ＰＥの濃度でフィコエリトリンに接合された標識化マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体とともに、ポリマー粒子をインキュベートした。
【図２０】図２０は、ｐＥＴ１４ｂ-ＺＺ（−）ｐｈａＣに由来するプロテインＡからのＩｇＧ結合ドメインを表示するポリマー粒子のサイズ分布を示す。
【図２１】図２１は、ＰＨＡ顆粒を表示する抗原の微生物性産生、抗原特異的抗体を結合するに際してのそれらの使用と、その後の標識化二次抗体を用いた検出の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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