(57)【要約】本願は、フラビウイルス科由来のウイルスの感染を阻害するペプチド、ウイルス感染を阻害するためにこれらのペプチドを使用する方法、ならびに薬学的組成物および薬学的組合せ、ならびにこれらのペプチドを含む製品に関する。本発明の１つの実施形態により、長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の単離されたペプチドが提供され、該ペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造を有し、そして該ペプチドは、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有する。
2009510122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の単離されたペプチドであって、該ペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造を有し、そして該ペプチドは、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有する、単離されたペプチド。
【請求項２】
式Ｉ〜式Ｖ：
【化１】
2009510122.tif 000045
のうちのいずれか１つを含む配列を有し、
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６およびＸａａ１８は、個別に各々、極性アミノ酸であり、そして
Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、およびＸａａ１７は、個別に各々、非極性アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
式Ｉ〜式Ｖのうちのいずれか１つのペプチドのＮ末端にペプチド結合によって結合された１４アミノ酸のペプチド配列をさらに含み、該１４アミノ酸のペプチド配列は、構造：
【化２】
2009510122.tif 000046
を有し、各Ｒｘは、個別に、極性アミノ酸であり、そして各Ｒｙは、個別に、非極性アミノ酸である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
式Ｖのカルボキシ末端にペプチド結合によって結合された１２アミノ酸の配列をさらに含み、得られたペプチドは、構造：
【化３】
2009510122.tif 000047
を有し、そして
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６、Ｘａａ１８、Ｘａａ１９、Ｘａａ２２、Ｘａａ２３、Ｘａａ２６、Ｘａａ２９、およびＸａａ３０は、個別に各々、極性アミノ酸であり、
Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、Ｘａａ１７、Ｘａａ２０、Ｘａａ２１、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２７、およびＸａａ２８は、個別に各々、非極性アミノ酸である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
式ＶＩのペプチドのＮ末端にペプチド結合によって結合された１４アミノ酸のペプチド配列をさらに含み、該１４アミノ酸のペプチド配列は、構造：
【化４】
2009510122.tif 000048
を有し、各Ｒｘは、個別に、極性アミノ酸であり、そして各Ｒｙは、個別に、非極性アミノ酸である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項３、４または５に記載のペプチドの少なくとも１４個の隣接したアミノ酸を含む、ペプチド。
【請求項７】
前記非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
前記非極性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
前記極性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ホモシステイン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１０】
前記極性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびリジンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
アルギニン、システイン、グルタメート、セリン、バリン、２個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号９２または配列番号１０２のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、２個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号９３または配列番号１０１のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号９４または配列番号１００のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシン、３個のトリプトファンおよびフェニルアラニンの残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１８】
配列番号９５または配列番号９９のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシン、３個のトリプトファン、フェニルアラニンおよびリジンの残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２０】
配列番号４３および配列番号９６〜配列番号９８のアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
ＥＣ５０が、約５００ｎＭ以下である、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
ＥＣ５０が、約４００ｎＭ以下である、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２３】
ＥＣ５０が、約３００ｎＭである、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２４】
配列番号４３および配列番号９１〜配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２５】
長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の単離されたペプチドであって、該ペプチドは、配列番号４３および配列番号９１〜配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして該ペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造を有する、単離されたペプチド。
【請求項２６】
配列番号４〜配列番号８６のうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、単離されたペプチド。
【請求項２７】
配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３７、配列番号４４、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号４８、および配列番号５３のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記アミノ酸の各々は、Ｄ−アミノ酸である、請求項１〜２８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３０】
前記アミノ酸の各々は、Ｌ−アミノ酸である、請求項１〜２８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３１】
ダンシル部分をさらに含む、請求項１〜２８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３２】
前記ウイルスは、フラビウイルス属である、請求項１〜３１のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３３】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
前記組成物は、殺菌剤である、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記組成物は、膣用クリームである、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドと、抗ウイルス因子とを含む、薬学的組合せ。
【請求項３８】
前記抗ウイルス因子は、α−インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、プレコナリル、アシクロビル、ジドブジン、ラミブジン、またはその組合せである、請求項３７に記載の薬学的組合せ。
【請求項３９】
哺乳動物細胞においてウイルス感染を予防するための方法であって、該細胞と、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドとを接触させる工程、または該細胞と、請求項３４〜３８のいずれかに記載の薬学的組成物もしくは薬学的組合せとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルスは、フラビウイルス属である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスは、西ナイルウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳類においてウイルス感染を予防するための方法であって、該哺乳類に、有効量の請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドを投与する工程、または該哺乳類に、請求項３４〜３８のいずれかに記載の薬学的組成物もしくは薬学的組合せを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスは、フラビウイルス属である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
体液を回収するための容器と、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドとを備える、製品。
【請求項４９】
前記容器は、回収用バッグ、チューブ、キャピラリーチューブまたはシリンジである、請求項４８に記載の製品。
【請求項５０】
前記容器は、空にされている、請求項４８に記載の製品。
【請求項５１】
生物学的安定剤をさらに備える、請求項４８に記載の製品。
【請求項５２】
前記安定剤は、抗凝固剤、保存剤、プロテアーゼインヒビター、またはその任意の組合せである、請求項５１に記載の製品。
【請求項５３】
前記抗凝固剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、シュウ酸塩、フッ化物またはその任意の組合せである、請求項５２に記載の製品。
【請求項５４】
前記保存剤は、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムである、請求項５２に記載の製品。
【請求項５５】
前記プロテアーゼインヒビターは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである、請求項５２に記載の製品。
【請求項５６】
前記ペプチドおよび／または安定剤は、凍結乾燥される、請求項５１に記載の製品。
【請求項５７】
哺乳類の身体由来のサンプルと、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドとを含む、組成物。
【請求項５８】
生物学的安定剤をさらに含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記安定剤は、抗凝固剤、保存剤、プロテアーゼインヒビター、またはその任意の組合せである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記抗凝固剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、シュウ酸塩、フッ化物またはその任意の組合せである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記保存剤は、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
前記プロテアーゼインヒビターは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６３】
前記サンプルは、血液製剤である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６４】
前記血液製剤は、血漿、血小板、白血球または幹細胞である、請求項６３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府による財政支援）
本明細書中に記載された本発明は、認可番号ＣＡ１０８３０４の下でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって与えられた米国政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ウイルス疾患は、処置することが非常に困難であり得る。なぜならば、ウイルスは、哺乳動物細胞に進入し、ここで、ウイルスは、ウイルスタンパク質の転写および翻訳、ならびにウイルスゲノムの複製を含むその機能の多くを行うからである。したがって、ウイルスは、ウイルス感染が進行するに従い、宿主の免疫系からだけではなく、宿主に対して投与された薬剤からも防御される。
【０００３】
したがって、有効な抗ウイルス因子は、現在、わずかしかなく、そしてそれらのほとんどは、ウイルスの小さなサブセットに対してのみ有効である。例えば、研究者は、２０世紀末に最初の抗ウイルス薬を開発し、そしてその薬物（アシクロビル）は、単純ヘルペスウイルス感染を処置するために、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認された。現在まで、いくつかの他の抗ウイルス薬剤のみが、ウイルス感染を予防および／または処置するために利用可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ウイルス感染を処置および予防するための薬剤が、必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、フラビウイルス科のウイルスの感染を阻害するペプチドに関する。驚くべきことに、本発明のペプチドの多くは、溶液中に遊離しているウイルスに対して作用し得、そしてそのウイルスが哺乳動物細胞に感染する機会を有する前に、そのウイルスを阻害し得る。本発明の１つの局面は、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）ポリタンパク質に由来するペプチド（例えば、配列番号４〜６１に示される配列を有するペプチド）がフラビウイルス科の他のウイルスからの感染を阻害し得るという発見に関する。
【０００６】
１つの実施形態において、本発明は、長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の単離されたペプチドを提供し、そのペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造およびフラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有する。
【０００７】
１つの実施形態において、上記ペプチドは、式Ｉ〜式Ｖ：
【０００８】
【化５】
2009510122.tif 000003
のうちのいずれか１つを含む配列を有し、Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６およびＸａａ１８は、個別に各々、極性アミノ酸であり、そしてＸａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、およびＸａａ１７は、個別に各々、非極性アミノ酸である。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、１４アミノ酸のペプチド（Ｎ末端（ｔｅｒｍｉｎｙｌ）ペプチド）を式Ｉ〜式ＶのうちのいずれかのペプチドのＮ末端に結合することによって形成された、融合ペプチドを提供する。上記１４アミノ酸のＮ末端ペプチドは、構造：
【００１０】
【化６】
2009510122.tif 000004
を有し、各Ｒｘは、個別に、極性アミノ酸であり、そして各Ｒｙは、個別に、非極性アミノ酸である。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、１２アミノ酸のペプチド（Ｃ末端ペプチド）を式ＶのペプチドのＣ末端に結合することによって形成された、融合ペプチドを提供する。得られた融合ペプチドは、式ＶＩ：
【００１２】
【化７】
2009510122.tif 000005
の構造を有し、
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６、Ｘａａ１８、Ｘａａ１９、Ｘａａ２２、Ｘａａ２３、Ｘａａ２６、Ｘａａ２９、およびＸａａ３０は、個別に各々、極性アミノ酸であり、そして、
Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、Ｘａａ１７、Ｘａａ２０、Ｘａａ２１、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２７、およびＸａａ２８は、個別に各々、非極性アミノ酸である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、式ＶＩのペプチドのＮ末端にペプチド結合によって結合された配列番号１１７の１４アミノ酸のＮ末端ペプチドに対応する配列を有する融合ペプチドを提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、上に記載されたペプチドのうちのいずれかの少なくとも１４個の隣接したアミノ酸を含むペプチドである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、非極性アミノ酸は、（１）アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファン、または（２）バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、極性アミノ酸は、（１）アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ホモシステイン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、セリンおよびトレオニン；または（２）アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびリジンからなる群より選択される。
【００１６】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、アルギニン、システイン、グルタメート、セリン、バリン、２個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する。例えば、上記ペプチドは、配列番号９２または配列番号１０２のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、２個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する。例えば、上記ペプチドは、配列番号９３または配列番号１０１のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する。例えば、上記ペプチドは、配列番号９４または配列番号１００のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシン、３個のトリプトファンおよびフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｍｉｎｅ）の残基からなるアミノ酸組成を有する。例えば、上記ペプチドは、配列番号９５または配列番号９９のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシン、３個のトリプトファン、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｍｉｎｅ）およびリジンの残基からなるアミノ酸組成を有する。例えば、上記ペプチドは、配列番号４３および配列番号９６〜９８のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、配列番号４３および配列番号９１〜１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸であり、そのペプチドは、配列番号４３および配列番号９１〜１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そしてペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造を有する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、配列番号４〜８６のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。例えば、上記ペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３７、配列番号４４、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含む。他の実施形態において、本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、ダンシル部分を含む。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、約５００ｎＭ以下のＥＣ５０を有するか、または約４００ｎＭ以下のＥＣ５０を有するか、または約３００ｎＭのＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、Ｃ型肝炎ウイルスまたは西ナイルウイルスもしくはデング熱ウイルスなどのフラビウイルス属に対して活性である。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、上で考察された本発明のペプチドのうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記組成物は、殺菌剤または膣用クリームである。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、上で考察された本発明のペプチドのうちのいずれかと、抗ウイルス因子（例えば、α−インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、プレコナリル（ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ）、アシクロビル、ジドブジン、ラミブジン、またはその組合せ）とを含む薬学的組合せを提供する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞においてウイルス感染を予防するための方法を提供し、その方法は、その細胞と、上で考察された本発明のペプチド、ならびに、そのようなペプチドの１つ以上を含む薬学的組成物または薬学的組合せのいずれか１つ以上とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスまたは西ナイルウイルスもしくはデング熱ウイルスなどのフラビウイルス属である。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、哺乳類においてウイルス感染を予防するための方法を提供し、その方法は、その哺乳類に、有効量の上で考察されたペプチドおよび薬学的組成物または薬学的組合せのいずれかを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記哺乳類は、ヒトである。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、西ナイルウイルスもしくはデング熱ウイルスなどのフラビウイルス属またはＣ型肝炎ウイルスである。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、体液を回収するための容器と、上で考察される本発明のペプチドの任意の１種以上とを備える製品を提供する。いくつかの実施形態において、上記容器は、回収用バッグ（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｂａｇ）、チューブ、キャピラリーチューブ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ）またはシリンジである。いくつかの実施形態において、上記容器は、空にされている。いくつかの実施形態において、上記製品はまた、生物学的安定剤（例えば、抗凝固剤、保存剤、プロテアーゼインヒビター、またはその任意の組合せ）を含む。いくつかの実施形態において、上記抗凝固剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、シュウ酸塩、フッ化物またはその任意の組合せである。いくつかの実施形態において、上記保存剤は、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼインヒビターは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである。いくつかの実施形態において、上記ペプチドおよび／または安定剤は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、上記容器上に結合または吸着されて、そのペプチドは、その容器中におかれた材料が取り出された後にその容器中に保持される。上記容器上に結合または吸着される場合、上記ペプチドは、依然としてウイルス感染を阻害し得る。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、哺乳類の身体由来のサンプルと、上で考察されたペプチドのいずれか１つ以上とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記組成物は、生物学的安定剤をさらに含み、その生物学的安定剤は、いくつかの実施形態において、抗凝固剤、保存剤、プロテアーゼインヒビター、またはその任意の組合せである。いくつかの実施形態において、上記抗凝固剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、シュウ酸塩、フッ化物またはその任意の組合せである。いくつかの実施形態において、上記保存剤は、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼインヒビターは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、血液製剤（例えば、血漿、血小板、白血球または幹細胞であるが、これらに限定されない）である。
【００３０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ウイルス感染を阻害するペプチドに関する。本発明は、ＨＣＶポリタンパク質に由来する特定のペプチド（例えば、配列番号４〜６１に示される配列を有するペプチド）がフラビウイルス科のウイルスによる哺乳動物細胞の感染を阻害し得るという発見を含む。本発明はまた、ＨＣＶ感染を阻害することにおいて非常に有効であるＨＣＶポリタンパク質（配列番号１）由来の１３種のペプチドの発見を含む。さらに、本発明は、ＮＳ５Ａの膜アンカードメイン（ＮＳ５Ａ−１９７５）に由来する「ペプチド１」（配列番号４３）がＨＣＶならびにデング熱ウイルスおよび西ナイルウイルスなどのフラビウイルス属に対して特に強力であったという発見を含む。例えば、単一用量のペプチド１は、細胞傷害の形跡を伴わずに２８９ｎＭのＥＣ５０でＨＣＶ感染を完全にブロックした。さらに、２０μＭのペプチド１は、デング熱ウイルス感染を完全に阻害した。
【００３２】
したがって、本発明は、フラビウイルス科の１種以上のウイルスによる感染を阻害することにおいて有効であるペプチドを提供する。本発明のペプチドは、例えば、配列番号４〜６１に示される配列を有するペプチド、配列番号９１〜１０２に示される配列を有するペプチド、およびα−へリックス構造を形成でき、そして哺乳動物細胞においてウイルス感染を阻害し得る約８アミノ酸〜約５０アミノ酸のペプチドを含む。本発明は、抗ウイルスペプチドまたは抗ウイルスペプチドの組合せ、そのような抗ウイルスペプチドを含む種々の組成物および組合せ、ならびにそのようなペプチドを利用して哺乳動物細胞においてウイルス感染を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、そのような抗ウイルスペプチドを含む製品を提供する。
【００３３】
（Ｃ型肝炎ウイルス）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、急性肝炎および慢性肝炎および肝細胞癌を引き起こす非細胞障害性の＋鎖ＲＮＡウイルスである。Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ，Ｊ．Ｈ．（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６，Ｓ２１−２９。肝細胞は、一次標的細胞であるが、種々のリンパ系集団（特に、Ｂ細胞および樹状細胞）もまた、より低いレベルにて感染され得る。Ｋａｎｔｏら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，５５８４−５５９１；Ａｕｆｆｅｒｍａｎｎ−Ｇｒｅｔｚｉｎｇｅｒら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７，３１７１−３１７６；Ｈｉａｓａら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４９，９０−９５。ＨＣＶ感染の顕著な特徴は、急性感染の少なくとも７０％が持続性へと進行し、慢性化するその傾向である（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ，Ｊ．Ｈ．（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６，Ｓ２１−２９）。ＨＣＶの慢性化は、しばしば、重要な肝疾患（慢性活動性肝炎、肝硬変および肝細胞癌を含む）に関連する（Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．＆Ｓｅｅｆｆ，Ｌ．Ｂ．（２０００）Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０，１７−３５）。したがって、１億７０００万人を上回る現在の感染者を有するＨＣＶ（同著者）は、拡大する公衆衛生上の懸案事項を代表する。
【００３４】
一本鎖ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムは、約９５００ヌクレオチド長であり、そして大きいポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。上記ポリタンパク質は、約３０１０アミノ酸〜３０３３アミノ酸を有する（Ｑ．−Ｌ．Ｃｈｏｏ，らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２４５１−２４５５（１９９１）；Ｎ．Ｋａｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，９５２４−９５２８（１９９０）；Ａ．Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，１１０５−１１１３（１９９１））。
【００３５】
ＨＣＶの異なる単離株（ｉｓｏｌａｔｅ）についての核酸配列およびアミノ酸配列は、当該分野において、例えば、ＮＣＢＩデータベース中に見出され得る。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。ＨＣＶポリタンパク質配列の例は、ＮＣＢＩデータベース中にアクセッション番号ＮＰ  ６７１４９１（ｇｉ：２２１２９７９３）として見出され得る。ＮＰ  ６７１４９１（配列番号１）のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００３６】
【化８−１】
2009510122.tif 000006
【００３７】
【化８−２】
2009510122.tif 000007
ＮＣＢＩデータベースにおいて見出され得るＨＣＶポリタンパク質アミノ酸配列の別の例は、アクセッション番号ＢＡＢ３２８７２（ｇｉ：１３１２２２６２）である。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；ＫａｔｏらＪ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３３４−３３９（２００１）を参照のこと。このＨＣＶは、劇症肝炎患者から分離され、そしてそのアミノ酸配列（配列番号２）は、以下の通りである。
【００３８】
【化９−１】
2009510122.tif 000008
【００３９】
【化９−２】
2009510122.tif 000009
ＨＣＶポリタンパク質アミノ酸配列の別の例は、ＮＣＢＩデータベース中にアクセッション番号Ｑ９ＷＭＸ２（ｇｉ：６８５６５８４７）として見出され得る。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。この配列は、ＨＣＶのＣｏｎ１単離株から得られた。そのアミノ酸配列（配列番号３）は、以下のものである。
【００４０】
【化１０−１】
2009510122.tif 000010
【００４１】
【化１０−２】
2009510122.tif 000011
【００４２】
【化１０−３】
2009510122.tif 000012
ＨＣＶポリタンパク質配列のさらなる例が、入手可能である。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスの台湾単離株は、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号Ｐ２９８４６（ｇｉ：２６６８２１）にて入手可能である。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００４３】
感染された細胞において、上記ＨＣＶポリタンパク質は、細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼにより複数の部位において切断されて、構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質を産生する。成熟非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）の産生は、２つのウイルスプロテアーゼによって影響を受ける。依然としてあまり特徴付けられていない第１のウイルスプロテアーゼは、ＮＳ２−ＮＳ３連結にて切断する；第２のウイルスプロテアーゼは、ＮＳ３のＮ末端領域内に含まれるセリンプロテアーゼ（以下、ＮＳ３プロテアーゼと称される）であり、そしてその第２のウイルスプロテアーゼは、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ切断部位においてシスで、そして残りのＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ部位、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ部位、ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ部位についてトランスでの両方で、ＮＳ３の下流におけるその後の切断の全てを媒介する。ＮＳ４Ａタンパク質は、複数の機能（ＮＳ３プロテアーゼのための補因子として作用し、そしておそらくＮＳ３および他のウイルスレプリカーゼ成分の膜限局化を補助する）を果たすようである。ＮＳ３プロテアーゼとＮＳ４Ａとの複合体形成は、全ての部位においてタンパク質分解効率を向上させるプロセシング事象に必要であると考えられる。ＮＳ３タンパク質はまた、ヌクレオシドトリホスファターゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性を示す。ＮＳ５Ｂは、ＨＣＶの複製に関与するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００４４】
ＨＣＶ非構造（ＮＳ）タンパク質は、ウイルス複製に必須の触媒機構を提供すると推定される。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸（ウイルスポリタンパク質の１０２７位〜１２０７位）は、ＨＣＶポリタンパク質の４つ全ての下流部位をプロセシングするＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含むことが示されている（Ｃ．Ｌｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８１４７−８１５７（１９９４））。
【００４５】
ＨＣＶは、３個の構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア（ｃｏｒｅ）」と称される）および２個のエンベロープ糖タンパク質「Ｅ１」（Ｅとしても公知である）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知である））を有する。ＨＣＶタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：３８１−３８８を参照のこと。Ｅ１タンパク質は、３２〜３５ｋＤａの化学種（ｓｐｅｃｉｅｓ）として検出され、そして約１８Ｋｄａの単一のエンドＨ−感受性バンドに変換される。対照的に、Ｅ２は、免疫沈降の際に複数の化学種の産生と一致する複合体パターンを示す（Ｇｒａｋｏｕｉら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４０１７−４０２６）。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２は、共同免疫沈降し得る安定な複合体を形成する（Ｇｒａｋｏｕｉら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１３８５−１３９５；Ｌａｎｆｏｒｄら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９７：２２５−２３５；Ｒａｌｓｔｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６７５３−６７６１）。
【００４６】
（抗ウイルスペプチド）
１つの実施形態において、本発明は、抗ウイルスペプチドを提供する。抗ウイルスペプチドは、フラビウイルス科のウイルスの感染を予防し得るか、または減少させ得るペプチド（本明細書中で、本発明のペプチドインヒビターまたはペプチド）である。フラビウイルス科のウイルスの例としては、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱を引き起こすウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
フラビウイルス科は、球状のエンベロープウイルスであり、それらは、正の極性の直鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。フラビウイルス科は、フラビウイルス属、ヘパシウイルス属およびペスチウイルス属を含む。本発明は、フラビウイルス科感染（フラビウイルス属、ヘパシウイルス属およびペスチウイルス属のいずれかに由来する任意のウイルス、ならびにフラビウイルス科の割り当てられていない属のウイルスによって引き起こされる感染を含む）の処置を企図する。例えば、本発明のペプチドは、フラビウイルス属のうちの以下のウイルスによって引き起こされる感染を処置するために使用され得る：ダニ媒介脳炎ウイルス、中央ヨーロッパ型脳炎ウイルス、極東型脳炎（Ｆａｒ  Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、リオブラボー（Ｒｉｏ  Ｂｒａｖｏ）ウイルス、日本脳炎ウイルス、クンジン（Ｋｕｎｊｉｎ）ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、チュレンリー（Ｔｙｕｌｅｎｌｙ）ウイルス、タヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス、ウガンダＳ（Ｕｇａｎｄａ  Ｓ）ウイルス、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、モドック（Ｍｏｄｏｃ）ウイルス、および黄熱病ウイルス。さらに、本発明のペプチドは、ペスチウイルス属のうちの以下のウイルスによって引き起こされる感染を処置するために使用され得る：牛ウイルス性下痢ウイルス１型、牛ウイルス性下痢ウイルス２型、豚コレラ（Ｈｏｇ  ｃｈｏｌｅｒａ）（豚コレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルス）、およびボーダー病ウイルス。さらに、本発明のペプチドは、ヘパシウイルス属に分類されるＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染を処置するために使用され得る。その感染もまた本発明のペプチドによって処置され得るフラビウイルス科の割り当てられていない属のウイルスは、以下を含む：ＧＢウイルス−Ａ、ＧＢウイルス−ＢおよびＧＢウイルス−Ｃ。
【００４８】
ペプチドがフラビウイルス科の１種以上のメンバーに対して有する抗ウイルス活性のレベル、およびそのようなペプチドについての適切な投薬量を決定するために、当該分野において公知である方法（本明細書中に記載される方法が挙げられるが、これに限定されない）が、使用され得る。本発明のペプチドの存在下または非存在下におけるウイルス感染は、例えば、本明細書中に記載されるようなウイルスタンパク質に対する抗体を使用したイムノアッセイにより、細胞内のウイルスＲＮＡレベルまたはウイルス病巣の数を決定する事によって評価され得る。ペプチドの抗ウイルス活性はまた、本明細書中に例示されるようなリポソーム放出アッセイを使用して決定され得る。ペプチドは、任意の量（例えば、２倍または２倍よりも大きい）でウイルス感染を阻害し得るか、または減少させ得る場合、抗ウイルス活性を有する。例えば、本発明のペプチドは、２〜５倍、５〜１０倍、または１０倍よりも大きくＨＣＶ感染を阻害し得るか、または減少させ得る。本明細書中で以下に示される通り、表３に示されるペプチドの多く（例えば、配列番号６、８、１２、１３、１４、２４、２７、３０、３２、４３、４４、４７、４８および５３によるペプチドが挙げられる）は、１０倍よりも大きくＨＣＶ感染を阻害し得る。表３に示される他のペプチド（配列番号２１、２３、２８および３７によるペプチドが挙げられる）は、ＨＣＶ感染を５倍〜１０倍阻害し得る。上記ペプチドの残りは、ＨＣＶ感染を少なくとも２倍阻害し、そしてその残りのペプチドのうちのいくつかは、ＨＣＶ感染を最大で約５倍まで阻害する。これらのペプチドは、ナノモルレベルおよび低いマイクロモルレベルの濃度でウイルス感染のそのような阻害を示す。
【００４９】
本発明のペプチドは、α−アミノ基とα−カルボキシル基との間のアミド結合によって連結されたα−アミノ酸のポリマーである。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、α−アミノ酸をいう。本発明のペプチド中に含まれるアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸であり得る。さらに、本発明のペプチドにおいて使用されるアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸であり得る。したがって、本発明のペプチドは、遺伝的にコードされたアミノ酸、天然に存在する遺伝的にコードされていないアミノ酸、または合成アミノ酸から作製され得る。２０種の遺伝的にコードされたＬ−アミノ酸およびコードされていないアミノ酸のいくつかの例に対して本明細書中で使用されるアミノ酸表記は、表１に提供される。
【００５０】
【表１−１】
2009510122.tif 000013
【００５１】
【表１−２】
2009510122.tif 000014
本発明のペプチドは、少なくとも８アミノ酸残基〜約５０アミノ酸残基、通常は約１４アミノ酸〜４０アミノ酸、さらに通常は約３５よりも少ないアミノ酸長または約２５よりも少ないアミノ酸長を含む。本発明のペプチドは、より大きいペプチドの実質的に全ての活性を依然として維持しつつ、可能な限り小さい。したがって、本発明のペプチドは、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長または１３アミノ酸長であり得る。さらに、当業者によって選択されるペプチドの長さは、そのペプチドの安定性および／または配列に関連し得る。したがって、例えば、ペプチド１（配列番号４３）が、それが約１８アミノ酸である場合に最適な抗ウイルス活性を示す一方で、そのＣ末端からの切断は、５個程度のアミノ酸が削除されるまでペプチド１の抗ウイルス活性を排除しない。それにもかかわらず、配列番号４３と異なる配列を有するペプチドは、それらが１８アミノ酸よりも長いか、または１３アミノ酸よりも短い場合、至適な活性を示し得る。これは、上記ペプチドの二次構造を安定化または改変する配列の違いに起因し得る。さらに、上記ペプチドは、そのペプチドの安定性および活性を増強する因子によって誘導体化され得る。例えば、ペプチドは、そのペプチドの活性および／またはコンフォメーション安定性を改良するために、ダンシル部分の結合によって、または天然に存在しないアミノ酸の組み込みによって改変され得る。非天然アミノ酸およびダンシル部分の使用はまた、プロテアーゼによる切断に対する耐性を提供し得る。２つ以上のペプチドを連結して１つのペプチド構造にすることもまた、特定の場合において望まれ得る。
【００５２】
本発明はまた、本発明の抗ウイルスペプチドのペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）に関する。ペプチド模倣体は、ペプチド結合を有するペプチドと構造的に同様であるが、当該分野において公知である方法により結合（例えば、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−）によって必要に応じて置換された１つ以上のペプチド結合を有する。したがって、ペプチド模倣体は、鋳型ペプチドの特性と類似する特性を有するペプチドアナログ（例えば、製薬産業において非ペプチド薬物として一般に使用されるもの）である（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）およびＥｖａｎｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７））。天然ペプチドの実施形態を上回るペプチド模倣体の利点としては、より経済的な生産、より大きい安定性、変化した特異性および増強した薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力および効能）が挙げられ得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドのアミノ酸残基は、溶液中で両親媒性のα−へリックス構造を形成し得る。
【００５４】
用語「α−へリックス」とは、右回りコイルのコンフォメーションをいう。ポリペプチドにおいて、上記α−へリックス構造は、１個のアミノ酸の骨格Ｎ−Ｈ基と４残基前のアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基との間の水素結合から生じる。α−へリックスは、１回転あたり３．６アミノ酸残基を有する。特定のアミノ酸残基（例えば、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジンおよびリジン）は、ポリペプチド中のα−へリックス構造の形成に寄与する傾向にある。
【００５５】
しかし、α−へリックスの形成はまた、ペプチドが存在する溶液、ｐＨおよび温度に依存する。そうして、本発明に従って、本発明のペプチドは、水溶液中でα−へリックスである。上記水溶液は、例えば、生理学的ｐＨ、および／または生理学的な塩を有し得る。一般に、本発明のペプチドの両親媒性のα−へリックス構造は、中等度の温度（例えば、約４℃〜約５０℃またはほぼ室温〜ほぼ体温）にて検出される。したがって、例えば、ペプチドのα−へリックス構造は、生理学的温度および生理学的ｐＨ値の下で検出される。
【００５６】
α−へリックス構造は、当該分野において公知である方法（円偏光二色性分光学（ＣＤ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、結晶構造決定および旋光分散（ＯＲＤ）が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して検出され得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、語「両親媒性の」は、α−ぺリックスペプチドが親水性（または極性）面および疎水性（または非極性）面を有することを意味し、ここでそのような「面（ｆａｃｅ）」とは、そのペプチドの長手方向表面をいう。へリックス車輪図（ｈｅｌｉｃａｌ  ｗｈｅｅｌ）は、α−へリックスペプチドがその長手方向軸で見下ろされる場合に明らかであり（例えば、図１４Ａに示される）、この長手方向軸を囲むへリックス車輪図の１つの側は、親水性（または極性）残基からなり、そしてへリックス車輪図の他方の側は、疎水性（または非極性）残基からなる。したがって、本発明のペプチドが、親水性表面にある場合、そのペプチドの親水性面は、その親水性表面と接触する傾向にある。他方で、疎水性表面と向かい合っている場合、本発明のペプチドの疎水性面は、その疎水性表面と接触する傾向にある。
【００５８】
両親媒性のα−へリックスペプチドにおいて、そのα−へリックスの上記親水性面および上記疎水性面は、したがって、存在するアミノ酸の性質に基づいて同定され得る。α−へリックスの上記親水性面は、上記疎水性面上に存在する数よりも大きい数の親水性アミノ酸、荷電したアミノ酸および／または極性アミノ酸からなる。両親媒性のα−へリックスの上記疎水性面は、脂質二重層への挿入を容易にする疎水性アミノ酸および／または非極性アミノ酸からなる。上記疎水性面は、膜への挿入を可能にする十分な数の非極性アミノ酸が存在する限り、１個以上の親水性アミノ酸または極性アミノ酸を有し得る。一般に、上記α−へリックスの親水性面上のアミノ酸残基の大部分は、荷電したアミノ酸、またはそうでなければ極性アミノ酸であるが、そのα−へリックスの疎水性面上のアミノ酸残基の大部分は、非極性アミノ酸である。したがって、多くの実施形態において、上記α−へリックスの親水性面は、荷電したアミノ酸またはそうでなければ極性アミノ酸からなるが、そのα−へリックスの疎水性面は、非極性アミノ酸残基からなる。例えば、図１４Ａに示されるペプチド１（配列番号４３）のへリックス車輪図を参照のこと。
【００５９】
任意の所与のペプチド配列が膜への挿入を可能にするために十分な数の非極性アミノ酸を有するか否かは、当該分野において周知である方法（本明細書中で実施例に記載されるリポソーム色素放出を含む方法が挙げられるが、これに限定されない）を使用して決定され得る。さらに、ペプチドが両親媒性のα−へリックス構造を有するか否かは、ｈｔｔｐ：／／ｃｔｉ．ｉｔｃ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／〜ｃｍｇ／Ｄｅｍｏ／ｗｈｅｅｌ／ｗｈｅｅｌＡｐｐ．ｈｔｍｌ（最後に２００６年８月１５に訪れた）およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｉｂｓｏｎ／ＨｅｌｉｘＤｒａｗ／ｈｅｌｉｘｄｒａｗ．ｈｔｍｌ（最後に２００６年８月１５に訪れた）のようなインターネット上で利用可能なソフトウェアを使用して決定され得る。配列番号４３のペプチドの両親媒性のα−へリックス構造を例示する概略図は、図１４Ａに示される。
【００６０】
本発明のペプチドの例は、表３において見出され得る。表３に示されるペプチドと比較して、本発明の他のペプチドは、保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。本発明のペプチドはまた、表３に示されるペプチドに似たアミノ酸組成を有するペプチドを含む。これらは、表９に示される配列番号９６、配列番号９７および配列番号９８の配列を有するペプチドを含む。これらの配列は、配列番号４３のリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）改変体に対応するか、またはそれらの配列は、配列番号４３の「スクランブルされた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」改変体を構成する。ペプチド（例えば、配列番号４３）のレトロ（ｒｅｔｒｏ）改変体またはリバース改変体は、元のペプチド（配列番号４３）のアミノ酸組成に似たアミノ酸組成を有するが、その改変体のアミノ酸配列は、元のペプチドのアミノ酸配列と逆のものである。ペプチド（例えば、配列番号４３）のスクランブルされた改変体もまた、元のペプチド（配列番号４３）に似たアミノ酸組成を有するが、それらのアミノ酸の順序は、疎水性残基および親水性残基の相対的位置を変えることなくスクランブルまたは混合される。したがって、配列番号４３の「疎水性のスクランブルされた」改変体であるペプチドは、配列番号４３のアミノ酸組成と同じアミノ酸組成を有する。しかし、疎水性アミノ酸残基の順序は、その改変体ペプチドの両親媒性が元のペプチドの両親媒性に似るように、その配列内の疎水性残基および親水性残基の相対的位置を変えることなく変えられる。同様に、配列番号４３の「親水性スクランブルされた」改変体は、配列番号４３のアミノ酸組成と同じアミノ酸組成を有するが、親水性アミノ酸残基の順序は、その改変体ペプチドの両親媒性が元のペプチドの両親媒性に似るように、その配列内の疎水性残基および親水性残基の相対的位置を変えることなく変えられる。一般に、親水性（極性）アミノ酸に関して、用語「スクランブリング（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）」または「スクランブルされた」は、各々の親水性（極性）アミノ酸の位置が不変に保持される一方で、任意の他の親水性（極性）アミノ酸がその位置に配置され得ることを示すために使用される。同様に、疎水性（非極性）アミノ酸に関して、用語「スクランブリング」または「スクランブルされた」は、各々の疎水性（非極性）アミノ酸の位置が不変に保持される一方で、任意の疎水性（非極性）アミノ酸がその位置に配置され得ることを示すために使用される。
【００６１】
したがって、本発明のペプチドは、表３に示される配列と同一であるアミノ酸配列、およびそのような配列の改変体を有する。そのような改変体は、１個以上のアミノ酸の切断、保存的置換、親水性アミノ酸のみのスクランブリング、配列内の疎水性残基のみのスクランブリング、親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸の両方のスクランブリング、天然に存在しないアミノ酸による天然に存在するアミノ酸の置換または他の改変（例えば、ダンシル化）から生じ得る。そのような改変体ペプチドは、次の節においてさらに記載される。
【００６２】
（ペプチドホモログおよびペプチド改変体）
本発明は、多くのペプチドホモログおよびペプチド改変体を包含する。
【００６３】
ペプチドホモログは、配列番号１を有するＨ７７単離株以外のＨＣＶ単離株由来のペプチジル配列である。したがって、本発明のペプチドは、配列番号４〜６１のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドのホモログであり得る。したがって、例えば、本発明の１つのペプチドホモログは、配列番号６のペプチドのホモログである配列番号６２を有する。
【００６４】
【化１１】
2009510122.tif 000015
配列番号６２のペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００６５】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号８のペプチドのホモログである配列番号６３または配列番号６４を有する。
【００６６】
【化１２】
2009510122.tif 000016
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００６７】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号１２のペプチドのホモログである配列番号６５または配列番号６６を有する。
【００６８】
【化１３】
2009510122.tif 000017
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００６９】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号１３のペプチドのホモログである配列番号６７または配列番号６８を有する。
【００７０】
【化１４】
2009510122.tif 000018
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００７１】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号１４のペプチドのホモログである配列番号６９または配列番号７０を有する。
【００７２】
【化１５】
2009510122.tif 000019
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００７３】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号２４のペプチドのホモログである配列番号７１または配列番号７２を有する。
【００７４】
【化１６】
2009510122.tif 000020
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００７５】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号２７のペプチドのホモログである配列番号７３または配列番号７４を有する。
【００７６】
【化１７】
2009510122.tif 000021
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００７７】
本発明の別のペプチドインヒビターホモログは、配列番号３０のペプチドのホモログである配列番号７５または配列番号７６を有する。
【００７８】
【化１８】
2009510122.tif 000022
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００７９】
別の実施形態において、ペプチドインヒビターホモログは、配列番号３２のペプチドのホモログである配列番号７７または配列番号７８を有する。
【００８０】
【化１９】
2009510122.tif 000023
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００８１】
別の実施形態において、ペプチドインヒビターホモログは、配列番号４３のペプチドのホモログである配列番号７９または配列番号８０を有する。
【００８２】
【化２０】
2009510122.tif 000024
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００８３】
別の実施形態において、ペプチドインヒビターホモログは、配列番号４４のペプチドのホモログである配列番号８１または配列番号８２を有する。
【００８４】
【化２１】
2009510122.tif 000025
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００８５】
別の実施形態において、ペプチドインヒビターホモログは、配列番号４７のペプチドのホモログである配列番号８３または配列番号８４を有する。
【００８６】
【化２２】
2009510122.tif 000026
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００８７】
別の実施形態において、ペプチドインヒビターホモログは、配列番号５３のペプチドのホモログである配列番号８５または配列番号８６を有する。
【００８８】
【化２３】
2009510122.tif 000027
これらのペプチドインヒビターの配列は、配列番号２および配列番号３のＨＣＶポリタンパク質配列において見出される。
【００８９】
ペプチド改変体は、ＨＣＶ単離株のポリタンパク質配列中のセグメントと同一ではないアミノ酸配列を有する任意のペプチドである。したがって、本発明のペプチドは、保存的アミノ酸置換から生じる改変体配列を有し得る。互いに置換可能であるアミノ酸は、一般に、類似のクラス内またはサブクラス内に存在する。当業者に公知である通り、アミノ酸は、アミノ酸側鎖の化学的特定および物理的特性に主に依存する異なるクラスに分類され得る。例えば、いくつかのアミノ酸は、一般に、親水性アミノ酸または極性アミノ酸であると見なされ、そして他のアミノ酸は、疎水性アミノ酸または非極性アミノ酸であると見なされる。極性アミノ酸は、酸性側鎖、塩基性側鎖または親水性側鎖を有するアミノ酸を含み、そして非極性アミノ酸は、芳香族側鎖または疎水性側鎖を有するアミノ酸を含む。非極性アミノ酸は、さらに細分されて、とりわけ、脂肪族アミノ酸を含み得る。本明細書中で使用されるようなアミノ酸のクラスの定義は、以下の通りである。
【００９０】
「非極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて荷電されておらず、極性ではなく、かつ一般に、水溶液によって退けられる側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌが挙げられる。遺伝的にコードされていない非極性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡ、ＣｈａおよびＮｌｅが挙げられる。
【００９１】
「芳香族アミノ酸」とは、共役δ−電子系（芳香族基）を有する少なくとも１個の環を含む側鎖を有する非極性アミノ酸をいう。芳香族基は、置換基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルホニル基、ニトロ基およびアミノ基、ならびにその他の基）によってさらに置換され得る。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。一般的に存在する遺伝的にコードされていない芳香族アミノ酸としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、
【００９２】
【化２３−２】
2009510122.tif 000028
１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【００９３】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和直鎖状または不飽和直鎖状、分枝状または環状の炭化水素側鎖を有する非極性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられる。コードされていない脂肪族アミノ酸の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
【００９４】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて荷電されているかまたは荷電されておらず、かつ２個の原子によって共通して共有された電子対がそれらの原子のうちの一方とより近くに保持される結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。極性アミノ酸は、一般に、親水性であり、親水性は、それらが水溶液によって誘引される側鎖を有するアミノ酸を有することを意味する。遺伝的にコードされた極性アミノ酸の例としては、アスパラギン、システイン、グルタミン、リジンおよびセリンが挙げられる。遺伝的にコードされていない極性アミノ酸の例としては、シトルリン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが挙げられる。
【００９５】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、代表的に、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨにおいて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸（アスパルテート）およびグルタミン酸（グルタメート）が挙げられる。
【００９６】
「塩基性アミノ酸」とは、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、代表的に、ヒドロニウムイオンとの結合に起因して生理学的ｐＨにおいて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸の例としては、アミノ酸のオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
【００９７】
「イオン化可能なアミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて荷電され得るアミノ酸をいう。そのようなイオン化可能なアミノ酸としては、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸（例えば、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒドロキシリジン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒドロキシリジンまたはＬ−オルニチン）が挙げられる。
【００９８】
当業者によって認識される通り、上記の分類は、絶対的ではない。数種のアミノ酸は、１より多くの特徴的な特性を示し、したがって１より多くのカテゴリーに含まれ得る。例えば、チロシンは、非極性の芳香環および極性のヒドロキシル基の両方を有する。したがって、チロシンは、非極性、芳香族性および極性のように記載され得る数種の特徴を有する。しかし、その非極性の環が、優勢であるので、チロシンは、一般に、疎水性であると見なされる。同様に、ジスルフィド結合を形成し得ることに加えて、システインはまた、非極性の性質を有する。したがって、疎水性アミノ酸すなわち非極性アミノ酸として厳密に分類されていないが、多くの場合において、システインは、疎水性すなわち非極性をペプチドに与えるために使用され得る。
【００９９】
上に記載された遺伝的にコードされたアミノ酸および遺伝的にコードされていないアミノ酸の分類は、下で表２において要約される。表２は、例示のみを目的とし、そして本明細書中に記載されるペプチドおよびペプチドアナログを構成し得るアミノ酸残基の網羅的な一覧であることを意味しないことが、理解されるべきである。本明細書中に記載されるペプチドを作製するために有用である他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびその中に列挙された参考文献において見出され得る。アミノ酸残基の別の供給源は、ＲＳＰ  Ａｍｉｏｎ  Ａｃｉｄｓ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイト（ｗｗｗ．ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ．ｃｏｍ）によって提供される。本明細書中で具体的に言及されていないアミノ酸は、具体的に同定されたアミノ酸と比較して、公知の挙動ならびに／またはそれらの特徴的な化学的特性および／もしくは物理的特性に基づいて上に記載されたカテゴリーへと便宜的に分類され得る。
【０１００】
【表２−１】
2009510122.tif 000029
【０１０１】
【表２−２】
2009510122.tif 000030
いくつかの実施形態において、本発明によって企図される親水性アミノ酸または極性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ホモシステイン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、セリン、トレオニン、および構造的に関連したアミノ酸が挙げられる。１つの実施形態において、上記極性アミノ酸は、イオン化可能なアミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、リジン、またはオルニチン）である。
【０１０２】
利用され得る疎水性アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基の例としては、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなどが挙げられる。
【０１０３】
さらに、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド中の少なくとも１個のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への置換（Ｌ形態よりもむしろＤ形態を利用する置換が挙げられる）を含むペプチド改変体をもたらすために改変され得る。
【０１０４】
上記ペプチドの残基の１個以上は、上記ペプチドの生物学的活性を変化させるか、増強するか、または保存するために別のものに交換され得る。そのような改変体は、例えば、対応する非改変体ペプチドの生物学的活性の少なくとも約１０％を有し得る。保存的アミノ酸置換（すなわち、上に記載されるような類似の化学的特性および物理的特性を有するアミノ酸の置換）が、しばしば利用される。
【０１０５】
したがって、例えば、保存的アミノ酸置換は、アスパラギン酸をグルタミン酸と交換すること；リジンをアルギニンまたはヒスチジンと交換すること；非極性アミノ酸（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、バリン）を別の非極性アミノ酸と交換すること；および極性アミノ酸（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニンなど）を別の極性アミノ酸に交換することを含む。置換が導入される場合、上記改変体は、その生物学的活性のレベルを確認または決定するために試験され得る。
【０１０６】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、式Ｉ〜式Ｖ
【０１０７】
【化２４】
2009510122.tif 000031
のいずれか１つを含む配列を有し得、
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６およびＸａａ１８は、極性アミノ酸であり；そしてＸａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、およびＸａａ１７は、非極性アミノ酸である。
【０１０８】
他の実施形態において、本発明のペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかにさらなるペプチジル配列を有し得る。したがって、例えば、本発明は、１４アミノ酸のペプチド（Ｎ末端ペプチド）を式Ｉ〜式ＶのいずれかのペプチドのＮ末端に結合させることによって融合ペプチドを提供する。その１４アミノ酸のＮ末端ペプチドは、構造：
【０１０９】
【化２５】
2009510122.tif 000032
を有し、各Ｒｘは、個別に、極性アミノ酸であり、そして各Ｒｙは、個別に、非極性アミノ酸である。
【０１１０】
本発明はまた、１２アミノ酸のペプチド（Ｃ末端ペプチド）を式ＶのペプチドのＣ末端に結合させることによって形成された融合ペプチドを提供する。得られた融合ペプチドは、式ＶＩの構造：
【０１１１】
【化２６】
2009510122.tif 000033
を有し、
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６、Ｘａａ１８、Ｘａａ１９、Ｘａａ２２、Ｘａａ２３、Ｘａａ２６、Ｘａａ２９、およびＸａａ３０は、個別に各々、極性アミノ酸であり；そして
Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、Ｘａａ１７、Ｘａａ２０、Ｘａａ２１、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２７、およびＸａａ２８は、個別に各々、非極性アミノ酸である。
【０１１２】
本発明はまた、式ＶＩのペプチドのＮ末端にペプチド結合によって結合された配列番号１１７の１４アミノ酸のＮ末端ペプチドに対応する配列を有する融合ペプチドを提供する。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、上に記載されたペプチドのうちのいずれかの少なくとも１４個の隣接したアミノ酸を含むペプチドである。
【０１１４】
ペプチド改変体はまた、溶液中のそのペプチドの両親媒性のα−ヘリックス二次構造が維持される限り、配列内の親水性残基および／または疎水性残基の「スクランブリング」から生じ得る。
【０１１５】
（本発明のペプチドを作製する方法）
本発明の文脈（ｃｏｎｔｅｘｔ）において、「単離された」ペプチドは、そのネイティブな環境から分離して存在するペプチドであり、したがって天然の産物ではない。単離されたペプチドは、精製された形態で存在し得るか、あるいは、例えば、細胞または他の活性成分または不活性成分を含み得る溶媒などのネイティブではない環境中に存在し得る。１つの実施形態において、「単離された」ペプチドは、そのペプチドが本来由来するタンパク質中でそのペプチドに天然に隣接（ｆｌａｎｋ）する配列（すなわち、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に位置する配列）のうち少なくともいくつかを含まない。「精製された」ペプチドは、組換え技術によって産生される場合に他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成される場合に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。したがって、精製されたペプチド調製物は、ペプチドの少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％または少なくとも９０重量％である。純度は、当該分野において公知である方法（クロマトグラフィーを利用する方法またはポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用する方法が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して決定され得る。
【０１１６】
本発明のペプチドまたはその改変体は、例えば、固相ペプチド合成法または酵素触媒によるペプチド合成によってか、あるいは組換えＤＮＡ技術の補助によって、インビトロで合成され得る。固相ペプチド合成法は、以下のような参考文献に記載された、確立され、かつ広範に使用される方法である。：Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５  ２１４９（１９６３）；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，編；Ｃ．Ｈ．Ｌｉ，第２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３），ｐｐ．４８−２６７；ならびにＢａｖａａｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，編，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＦ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，第２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８０）ｐｐ．３−２８５。これらのペプチドは、免疫親和性カラムまたはイオン交換カラムにおける分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはアニオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）におけるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用したゲル濾過；リガンド親和性クロマトグラフィー；または非極性溶媒もしくは非極性／極性溶媒混合物からの結晶化もしくは沈殿によって、さらに精製され得る。結晶化または沈殿による精製が、好ましい。
【０１１７】
本発明のペプチドは、それらが抗ウイルス活性を保持する限り、環状ペプチドであり得る。そのような環状ペプチドは、代表的に、アミノ末端を末端カルボキシレートに共有結合することによって直鎖状ペプチドから産生される。末端のみが連結されることを確実にするために、アミノ側鎖およびカルボン酸側鎖が、市販の保護基によって保護され得る。いくつかの実施形態において、当業者は、アミノ末端またはカルボン酸末端のうちの一方、あるいは別のアミノ酸側鎖にペプチド側鎖を環化することを選択し得る。この場合において、保護基は再び、所望されるように環化反応を誘導するために使用され得る。
【０１１８】
ペプチドの環化は、利用可能な前駆体を使用して行われ得る。例えば、環化は、１〜５ｍＭのペプチド濃度にて、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）（粗ペプチドに対して５当量）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，Ｆｉｓｈｅｒ）（４０当量）との混合物を使用して、ジメチルホルムアミド中で行われ得る。ＤＩＥＡの量は、見かけのｐＨ９〜１０を達成するために調整される。その反応が実施された後、任意の便利な手段（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよび／またはＨＰＬＣ）が実施され得る。
【０１１９】
上記ペプチドまたはペプチド改変体のアミノ基のＮ−アシル誘導体は、Ｎ−アシル保護アミノ酸を最終的な縮合に利用することによってか、あるいは保護されたペプチドまたは保護されていないペプチドをアシル化することによって調製され得る。Ｏ−アシル誘導体は、例えば、遊離ヒドロキシペプチドまたはペプチド樹脂のアシル化によって調製され得る。どちらかのアシル化が、標準的なアシル化試薬（例えば、アシルハライド、無水物、アシルイミダゾールなど）を使用して実施され得る。所望される場合、Ｎ−アシル化およびＯ−アシル化の両方が、一緒に実施され得る。
【０１２０】
本発明のペプチドまたはペプチド改変体のカルボキシル基の塩は、上記ペプチドと、１当量以上の所望の塩基（例えば、金属水酸化物塩基（例えば、水酸化ナトリウム）；炭酸金属塩基または炭酸水素金属塩基（例えば、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム）；あるいはアミン塩基（例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなど））とを接触させることによって、通常の様式で調製され得る。
【０１２１】
上記ペプチドまたは改変体ペプチドの酸付加塩、あるいは上記ペプチドまたは改変体ペプチドのアミノ残基の酸付加塩は、そのペプチドまたはアミンと、１当量以上の所望の無機酸または有機酸（例えば、塩酸）とを接触させることによって調製され得る。上記ペプチドのカルボキシル基のエステルはまた、当該分野において公知である任意の通常の方法によって調製され得る。
【０１２２】
（使用方法）
本発明のペプチドは、フラビウイルス科のウイルスによる感染を予防するか、処置するか、またはそうでなければ改善するために使用され得、そのウイルスとしては、上に記載されるように、フラビウイルス属のウイルス、ペスチウイルス属のウイルス、およびヘパシウイルス属のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。フラビウイルス属のメンバーは、ダニ媒介脳炎、中央ヨーロッパ型脳炎、極東型脳炎、リオブラボー、日本脳炎、クンジン、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、チュレンリー、タヤ、ウガンダＳ、１型デング熱、２型デング熱、３型デング熱、４型デング熱、モドック、および黄熱病を引き起こすウイルスを含む。ペスチウイルス属のメンバーは、牛ウイルス性下痢ウイルス１型、牛ウイルス性下痢ウイルス２型、豚コレラ（Ｈｏｇ  ｃｈｏｌｅｒａ）（豚コレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルス）、およびボーダー病ウイルスを含む。ヘパシウイルス属は、Ｃ型肝炎ウイルスを含む。フラビウイルス科のさらなるメンバーは、割り当てられていないＧＢウイルス−Ａ、ＧＢウイルス−Ｂ、およびＧＢウイルス−Ｃを含む。フラビウイルス科のメンバーのウイルスは、種々の疾患を引き起こすことが公知であり、その疾患としては、例えば、デング熱、Ｃ型肝炎感染、日本脳炎、キャサヌール森林病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳炎、西ナイル脳炎および黄熱病が挙げられる。
【０１２３】
本発明のペプチドは、フラビウイルス科のメンバーのウイルスによる感染およびその関連する疾患状態を予防するか、処置するか、またはそうでなければ改善するために使用され得る。したがって、本発明の種々の適用の例としては、デング熱、デング出血熱、デングショック症候群、日本脳炎、キャサヌール森林病、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、ダニ媒介髄膜脳炎、慢性Ｃ型肝炎感染を有する患者に対する治療薬としての用途、肝臓移植の間の移植片感染を予防するための用途、性行為感染を予防するための用途、輸血において使用される血液および血液製剤の安全性を上昇させるための用途、ならびに臨床検査室サンプルの安全性の上昇についての用途が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）のウイルス感染を予防するか、またはそうでなければ改善するための方法、あるいは哺乳類（例えば、ヒト）のフラビウイルス科のウイルスによる急性感染または慢性感染を予防するか、処置するか、またはそうでなければ改善するための方法を提供する。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、フラビウイルス科のメンバーに曝され得るか、または曝された哺乳類（例えば、ヒト）に対する本発明のペプチドの投与を含むことを意図される。フラビウイルス科のウイルスに曝され得る哺乳類としては、これらのウイルスが優勢または一般的である地域（例えば、熱帯地方、東南アジアおよび極東アジア、南アジア、オーストラリアおよびパプアニューギニア、米国、ロシア、アフリカならびに中央アメリカおよび南アメリカ諸国）に存在する哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。フラビウイルス科のウイルスに曝され得る哺乳類としてはまた、シカダニまたは森林ダニ（ｆｏｒｅｓｔ  ｔｉｃｋ）あるいは蚊によって噛まれたもの；提供された身体組織または体液（例えば、レシピエントの血液または１種以上のその成分（例えば、血漿、血小板、または幹細胞））のレシピエント；ならびに身体組織または体液を取り扱う医療従事者、臨床従事者または歯科従事者が挙げられる。フラビウイルス科のウイルスに曝された哺乳類としては、ＨＣＶまたは任意の他のフラビウイルス科のウイルスに感染した者の身体組織または体液（例えば、血液）と接触した哺乳類、あるいはそうでなければそれらのウイルスと接触した哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
フラビウイルス科のウイルス感染の処置、またはそれを処置することは、ウイルス量の減少、またはその感染に代表的に関連する少なくとも１つの症状の緩和もしくは減少を含むことを意図される。上記処置はまた、１つより多くの症状の緩和もしくは減少を含む。理想的には、上記処置による治癒は、例えば、実質的に、ウイルス感染を阻害し、そして／またはその感染に関連する症状を排除する。
【０１２７】
ウイルスの曝露または感染の症状または症状発現は、特定の感染に特異的であり、そしてこれらは、当該分野において公知である。デング熱およびデング出血熱は、例えば、４種のフラビウイルス属血清型のうちの１つによって引き起こされる。これらの状態の症状としては、熱、激しい頭痛、関節痛および筋肉痛の突然の発症および発疹、ならびに高熱、血小板減少および血液濃縮が挙げられる。デング熱およびデング出血熱の臨床適応としてはまた、高熱、血小板減少および白血球減少を伴う点状出血性皮疹、ならびに出血傾向が挙げられる。日本脳炎の症状としては、熱、頭痛、頸部硬直（ｎｅｃｋ  ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、悪液質、不全片麻痺、痙攣および上昇した体温が挙げられる。日本脳炎は、血清および脳脊髄液における抗体の検出によって診断され得る。キャサヌール森林病の症状としては、高熱、頭痛、鼻腔および咽喉からの出血、および嘔吐が挙げられる。セントルイス脳炎の症状としては、熱、頭痛、頸部硬直（ｎｅｃｋ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、昏迷、失見当、昏睡、振せん、時折の痙攣および痙性麻痺が挙げられる。マリーバレー脳炎の症状としては、熱、発作、悪心および小児における下痢、ならびに頭痛、嗜眠および成人における錯乱が挙げられる。西ナイルウイルス感染の症状としては、インフルエンザ様症状、倦怠感、熱、食欲不振、悪心、嘔吐、眼の痛み、頭痛、筋痛、発疹およびリンパ節症、ならびに脳炎（脳の炎症）および髄膜炎（脳および脊髄の内膜（ｌｉｎｉｎｇ）の炎症）、髄膜症、一過性の失明、発作および昏睡が挙げられる。西ナイル感染は、血液または脳脊髄液において抗体を検出するために、ＥＬＩＳＡを使用して診断され得る。黄熱病の症状としては、熱、筋肉の痛み、頭痛、背痛、紅色舌、顔面紅潮、眼の充血、胃腸管からの出血、血性嘔吐物、黄疸、肝不全、タンパク尿を伴う腎不全、低血圧、脱水、せん妄、発作および昏睡が挙げられる。Ｃ型肝炎の症状としては、肝臓の炎症、食欲の減少、疲労、腹痛、黄疸、インフルエンザ様症状、掻痒、筋肉痛、関節痛、間欠的な軽度の発熱、睡眠障害、悪心、消化不良、認知変化、抑うつ性頭痛および気分変化が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶ感染はまた、ウイルスに対する抗体を検出すること、生検によって肝臓の炎症を検出すること、肝硬変、門脈圧亢進、甲状腺炎、クリオグロブリン血症および糸球体腎炎によって診断され得る。さらに、ＨＣＶ感染が、診断され得る。さらに、ＨＣＶへの曝露または感染の診断あるいはＨＣＶへの曝露の危険性があるものの同定は、慣用的な血液検査の間の病歴、異常な肝臓酵素または肝機能検査に基づき得る。一般に、フラビウイルス科のメンバーによる感染は、ウイルス抗原または抗ウイルス抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ、ウイルス抗原を検出するための免疫蛍光、ウイルスの核酸を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを使用して検出され得る。
【０１２８】
急性ウイルス感染または慢性ウイルス感染を予防するか、処置するか、またはそうでなければ改善する方法は、細胞と、有効量の本発明のペプチドとを接触させる工程または哺乳類（例えば、ヒト）に治療有効量の本発明のペプチドを投与する工程を包含する。
【０１２９】
本発明のペプチドは、種々の様式で投与され得る。投与経路としては、経口経路、非経口経路（皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路および腹腔内経路を含む）、直腸経路、膣経路、皮膚経路、経皮経路（局所）、経粘膜経路、胸内経路、肺内経路および鼻腔内（呼吸性）経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与の手段は、ポンプを使用した注射または任意の他の適切な機構によるものであり得る。
【０１３０】
本発明のペプチドは、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的であるのかもしくは予防的であるのか、および熟練した実施者に公知である他の因子に依存して、単一用量、複数用量、持続様式または間欠様式で投与され得る。本発明のペプチドの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に持続的であっても、一連の間隔を空けた用量であってもよい。局所投与および全身投与の両方が、企図される。
【０１３１】
哺乳類に対して投与される投薬量は、ウイルス感染を減少させるためもしくは予防するためか、またはそのウイルス感染に関連した少なくとも１つの症状を処置するために適切な任意の量であり得る。適切な投薬量を決定するいくつかの因子は、当業者に周知であり、そして慣用的な実験によって取り組まれ得る。例えば、物理化学的特性、毒物学的特性および薬物動態学的特性の決定は、標準的な化学的アッセイおよび生物学的アッセイを使用し、そして化学分野、薬理学分野および毒物学分野において公知である数学的モデリング技術の使用を介して行われ得る。治療的有効性および投薬レジメンは、そのような技術の結果ならびに適切な薬物動態学的モデルおよび／または薬力学的モデルの使用によって推定され得る。他の因子は、年齢、身体的状態、サイズ、体重、処置されるべき状態、状態の重篤度および任意の併用療法を含む個々の患者パラメータに依存する。上記投薬量はまた、選択されるペプチドおよび予防または処置が達成されるか否か、ならびにそのペプチドが化学的に改変されるか否かに依存する。そのような因子は、ウイルス感染モデル（例えば、本明細書中に記載されるＨＣＶ細胞培養／ＪＦＨ−１感染モデル、または当該分野において利用可能である他の動物モデルもしくは検査システム）を使用して臨床医によって容易に決定され得る。
【０１３２】
患者に対して投与される正確な量は、主治医の責務である。しかし、所望の効果を達成するために、本発明のペプチド、その改変体またはその組合せは、例えば、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．０１ｍｇから約５００〜７５０ｍｇまで、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．０１ｍｇから約３００〜５００ｍｇまで、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．１ｍｇから約１００〜３００ｍｇまで、または体重１ｋｇあたり少なくとも約１ｍｇから約５０〜１００ｍｇまでの単一投薬量または分割投薬量として投与され得るが、しかし、他の投薬量は、有益な結果を提供し得る。
【０１３３】
単位用量中に含まれる所与のペプチドの絶対的な重量は、広範に変動し得る。例えば、約０．０１〜約２ｇまたは約０．１〜約５００ｍｇの、特定の細胞型に特異的な本発明の少なくとも１種のペプチド、または複数種のペプチドが、投与され得る。あるいは、上記単位投薬量は、約０．０１ｇから約５０ｇまでか、約０．０１ｇから約３５ｇまでか、約０．１ｇから約２５ｇまでか、約０．５ｇから約１２ｇまでか、約０．５ｇから約８ｇまでか、約０．５ｇから約４ｇまでか、または約０．５ｇから約２ｇまで変動し得る。
【０１３４】
本発明のペプチドの日用量も、同様に、変動し得る。そのような日用量は、例えば、約０．１ｇ／日〜約５０ｇ／日、約０．１ｇ／日〜約２５ｇ／日、約０．１ｇ／日〜約１２ｇ／日、約０．５ｇ／日〜約８ｇ／日、約０．５ｇ／日〜約４ｇ／日、および約０．５ｇ／日〜約２ｇ／日の範囲であり得る。
【０１３５】
本発明のペプチドは、単独か、または第２の薬剤と組み合わせて使用され得る。上記第２の薬剤は、例えば、インターフェロンベースの治療剤または別の型の抗ウイルス性薬剤（例えば、リバビリン）などの公知の抗ウイルス因子であり得る。上記第２の薬剤は、抗癌因子、抗菌因子、または抗ウイルス因子であり得る。上記抗ウイルス因子は、最初の接着および進入から放出までのウイルスの生活環における任意の工程において作用し得る。したがって、上記添加された抗ウイルス因子は、接着、融合、進入、輸送、翻訳、ウイルスポリタンパク質のプロセシング、ウイルスゲノムの複製、ウイルス粒子の構築、放出または出芽を妨害し得る。つまり、上記抗ウイルス因子は、接着のインヒビター、進入のインヒビター、融合のインヒビター、輸送のインヒビター、複製のインヒビター、翻訳のインヒビター、タンパク質プロセシングのインヒビター、放出のインヒビター、本質的に、任意のウイルス機能のインヒビターであり得る。上記第２の薬剤の有効量は、その第２の薬剤の製造業者の推奨、担当医の判断に従い、そしてＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥに示されるような量および投薬についてのプロトコルおよび管理上の因子によって導かれる。
【０１３６】
処置の方法の有効性は、患者を上で考察されるようなウイルス感染の徴候または症状についてモニタリングすること、ならびに当該分野において公知である方法（ポリメラーゼ連鎖反応および転写媒介性の増幅が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して血液中にあるウイルスの存在および／または量（例えば、ウイルス量）を決定することによって評価され得る。
【０１３７】
（薬学的組成物）
１つの実施形態において、本発明は、本発明のペプチドを含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物を調製するために、本発明のペプチドは、合成されるか、または他の方法で得られ（必要な場合または所望される場合に精製され）、次いで凍結乾燥され、そして安定化される。その後、上記ペプチドは、適切な濃度に調整され得、次いで他の薬剤または薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得る。「薬学的に受容可能な」によって、処方物の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに有害ではないキャリア、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、意味される。
【０１３８】
本発明の治療用ペプチドを含む薬学的処方物は、周知であり、かつ容易に利用可能な成分を使用して当該分野において公知である手順によって調製され得る。例えば、上記ペプチドは、一般的な賦形剤、希釈剤、またはキャリアと一緒に処方され得、そして錠剤、カプセル剤、溶液、懸濁剤、散剤、エーロゾルなどへと成形され得る。そのような処方物に適した賦形剤、希釈剤、およびキャリアの例としては、緩衝剤、およびフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）および増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（例えば、デンプン、セルロース、糖類、マンニトール、およびケイ酸誘導体）が挙げられる。結合剤（例えば、カルボキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン、およびポリビニル−ピロリドン）もまた、含まれ得る。
【０１３９】
湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム）が、含まれ得る。溶解を遅延させるための薬剤（例えば、パラフィン）もまた、含まれ得る。吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）もまた、含まれ得る。表面活性剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）が、含まれ得る。吸着性キャリア（例えば、カオリンおよびベントナイト）が、添加され得る。滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに固体ポリエチルグリコール）もまた、含まれ得る。保存剤もまた、添加され得る。本発明の組成物はまた、増粘剤（例えば、セルロースおよび／またはセルロース誘導体）を含み得る。それらの組成物はまた、ゴム（例えば、キサンタンゴム、グアーガムまたはカルボガム（ｃａｒｂｏ  ｇｕｍ）あるいはアラビアゴム）、あるいはポリエチレングリコール、ベントン（ｂｅｎｔｏｎｅ）およびモンモリロナイトなどを含み得る。
【０１４０】
経口投与に関して、ペプチドは、粉末、顆粒処方物、溶液、懸濁物、エマルションとして存在し得るか、あるいはそのペプチドは、チューインガムからの活性成分の摂取のために、天然または合成のポリマーまたは樹脂中に存在し得る。上記活性ペプチドはまた、ボーラス、舐剤またはパスタとして提供され得る。上記処方物は、適切な場合、別個の単位投薬形態において便利に提供され得、そしてその処方物は、製薬分野で周知である任意の方法（治療因子と液体キャリア、固体マトリックス、半固体キャリア、微細に分割されたキャリアまたはそれらの組合せとを混合し、次いで、必要な場合に、その生成物を所望の送達系へと導入または成形する工程を包含する）によって調製され得る。そのような処方物中の全活性成分は、その処方物の０．１〜９９．９重量％を構成する。
【０１４１】
本発明のペプチドを含む錠剤またはカプレットは、緩衝剤（例えば、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウム）を含み得る。カプレットおよび錠剤はまた、不活性成分（例えば、セルロース、予めゼラチン様にされたデンプン、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、デンプン、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、トウモロコシデンプン、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛など）を含み得る。本発明の少なくとも１種のペプチドを含むハードゼラチンカプセルまたはソフトゼラチンカプセルは、不活性成分（例えば、ゼラチン、微結晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、タルク、および二酸化チタンなど）、および液体ビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物性油）を含み得る。さらに、本発明の１種以上のペプチドを含む腸溶性カプレットまたは腸溶性錠剤は、胃における崩壊に抵抗し、そして十二指腸のより中性〜アルカリ性の環境で溶解するように設計される。
【０１４２】
本発明の経口的に投与される治療用ペプチドはまた、徐放のために処方され得る。この場合において、本発明のペプチドは、コーティングされ得るか、マイクロカプセル化（ＷＯ  ９４／０７５２９、および米国特許第４，９６２，０９１号を参照のこと）され得るか、またはそうでなければ持続送達デバイス内におかれ得る。徐放性処方物は、例えば、腸管または気道の特定の部分において、おそらく、ある期間にわたって上記活性ペプチドを放出するように設計され得る。コーティング、外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、および保護マトリックスは、例えば、ポリマー物質（例えば、ポリラクチド−グリコレート）、リポソーム、マイクロエマルション、マイクロ粒子、ナノ粒子、またはワックスから作製され得る。これらのコーティング、外皮、および保護マトリックスは、留置デバイス（例えば、ステント、カテーテル、腹膜透析チュービング（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｔｕｂｉｎｇ）、排出デバイス（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）など）をコーティングするために有用である。
【０１４３】
本発明の治療用ペプチドはまた、便利な経口投与のためのエリキシル剤または溶液として処方され得るか、あるいは例えば、筋肉内経路、皮下経路、腹腔内経路または静脈内経路による非経口投与のための適切な溶液として処方され得る。本発明の治療用ペプチドの薬学的処方物はまた、水溶液もしくは無水溶液または分散物の形態、あるいはエマルションもしくは懸濁物または軟膏の形態をとり得る。
【０１４４】
したがって、治療用ペプチドは、非経口投与（例えば、注射（例えば、ボーラス注射または持続注入）のために処方され得、そしてその治療用ペプチドは、アンプル、予め充填されたシリンジ、小容量注入コンテナにおいて単位用量形態で提供されても、複数用量コンテナで提供されてもよい。上に記載される通り、保存剤は、上記投薬形態の貯蔵寿命の維持を補助するために添加され得る。上記活性ペプチドおよび他の成分は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中で懸濁物、溶液またはエマルションを形成し得、そして処方化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）（例えば、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤）を含み得る。あるいは、上記活性ペプチドおよび他の成分は、使用前の適切なビヒクル（例えば、無菌の、発熱物質を含まない水）による再構成のために、無菌固体の無菌性の単離によってか、または溶液からの凍結乾燥によって得られた粉末形態であり得る。
【０１４５】
これらの処方物は、当該分野において周知である薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルおよび佐剤を含み得る。例えば、水に加えて、溶媒（例えば、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、グリコールエステル（例えば、名称「Ｄｏｗａｎｏｌ」で販売されている製品、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール）、短鎖の酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、乳酸エチルまたは乳酸イソプロピル、脂肪酸トリグリセリド（例えば、名称「Ｍｉｇｌｙｏｌ」で市販されている製品、ミリスチン酸イソプロピル、動物性油、鉱油および植物性油）およびポリシロキサン）から選択され、生理学的観点から受容可能である１種以上の有機溶媒を使用して溶液を調製することが、可能である。
【０１４６】
必要な場合、抗酸化剤、界面活性剤、他の保存剤、フィルム形成剤，角質溶解剤またはコメド溶解剤（ｃｏｍｅｄｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、香料、香味料および着色剤から選択される佐剤を添加することが、可能である。抗酸化剤（例えば、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールおよびその誘導体）が、添加され得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、局所的に投与されるか、または粘膜表面（例えば、膣、直腸、眼、鼻など）に投与される殺菌剤として処方される。局所投与に関して、治療剤は、標的領域に対する直接適用について当該分野において公知である通りに処方され得る。主に局所適用のために調整された形態は、例えば、クリーム、ミルク、ゲル、分散物またはマイクロエマルション、程度の差はあるが増粘されたローション、含浸パッド、軟膏またはスティック（ｓｔｉｃｋ）、エーロゾル処方物（例えば、スプレーまたはフォーム）、せっけん、洗浄剤、ローションまたはせっけんのケークの形態をとる。したがって、１つの実施形態において、本発明のペプチドは、局所的に適用される膣用クリームまたは殺菌剤として処方され得る。この目的のための他の従来の形態としては、創傷用包帯、コーティングされたバンデージまたは他のポリマー被覆剤、軟膏、クリーム、ローション、パスタ、ゼリー、スプレー、およびエーロゾルが挙げられる。したがって、本発明の治療用ペプチドは、皮膚投与のためのパッチまたはバンデージによって送達され得る。あるいは、上記ペプチドは、粘着性ポリマー（例えば、ポリアクリレートまたはアクリレート／酢酸ビニルコポリマー）の部分であるように処方され得る。長期適用について、微小孔性および／または通気性の裏地（ｂａｃｋｉｎｇ）積層体を使用する（したがって、皮膚の水和または浸軟が、最小化され得る）ことが、望まれ得る。裏地層は、所望の保護機能および支持機能を提供する任意の適切な厚さであり得る。適切な厚さは、一般に、約１０ミクロン〜約２００ミクロンである。
【０１４８】
軟膏およびクリームは、例えば、水性基剤または油性基剤を用い、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加することによって処方され得る。ローションは、水性基剤または油性基剤を用いて処方され得、そしてそのローションはまた、一般に、１種以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、または着色剤を含む。活性ペプチドはまた、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号；同第４，３８３，５２９号；または同第４，０５１，８４２号において公開される通り、イオン導入を介して導入され得る。局所処方物に存在する本発明の治療剤の重量％は、種々の因子に依存するが、一般に、その処方物の全重量の０．０１％〜９５％であり、そしてその重量％は、代表的に０．１〜８５重量％である。
【０１４９】
点滴剤（例えば、点眼薬または点鼻薬）は、１種以上の治療用ペプチドを用いて、１種以上の分散剤、可溶化剤または懸濁化剤をまた含む水性基剤または非水性基剤において処方され得る。液体スプレーは、加圧されたパックから便利に送達される。点滴剤は、単純な点眼キャップ付きの瓶または液体内容物を滴下で送達するために適合されたプラスチック瓶、特別に形成されたクロージャー（ｃｌｏｓｕｒｅ）を介して送達され得る。
【０１５０】
治療用ペプチドは、口腔または咽喉における局所投与のためにさらに処方され得る。例えば、上記活性成分は、風味付けした基剤（通常は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）をさらに含むロゼンジ；不活性な基剤（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア）中の組成物を含む香錠；および適切な液体キャリア中の本発明の組成物を含む含そう剤として処方され得る。
【０１５１】
本発明の薬学的処方物は、必要に応じた成分として、当該分野で利用可能である型の、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、可溶化剤または乳化剤、および塩を含み得る。そのような物質の例としては、通常の生理食塩溶液（例えば、生理学的に緩衝化された生理食塩溶液）および水が挙げられる。本発明の薬学的処方物において有用であるキャリアおよび／または希釈剤の特定の非限定的な例としては、水および生理学的に受容可能な緩衝化された生理食塩溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩溶液（ｐＨ７．０〜８．０）が挙げられる。
【０１５２】
本発明のペプチドはまた、気道に投与され得る。したがって、本発明はまた、エーロゾルの薬学的処方物および本発明の方法において使用するための投薬形態を提供する。一般に、このような投薬形態は、ウイルス感染の臨床症状を処置または予防するために有効な量の少なくとも１つの本発明の薬剤を含む。本発明の方法に従って処置された感染の１つ以上の症状の任意の統計的に有意な減衰は、本発明の範囲内のそのような感染の処置であると見なされる。
【０１５３】
あるいは、吸入またはガス注入による投与のために、上記組成物は、乾燥粉末（例えば、治療剤と適切な粉末基剤（例えば、乳糖またはデンプン）との粉末混合物）の形態をとり得る。上記粉末組成物は、例えば、粉末が吸入器、注入器、または定量吸入器（例えば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｓ．Ｐ．、Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ、Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．およびＤａｖｉａ，Ｄ．編、ｐｐ．１９７−２２４、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８４に開示される加圧式定量吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器を参照のこと）の補助によって投与され得る、カプセルまたはカートリッジ、すなわち、例えば、ゼラチンまたはブリスターパックにおいて、単位投薬形態で提供され得る。
【０１５４】
本発明の治療用ペプチドはまた、エーロゾルまたは吸入形態で投与される場合、水溶液で投与され得る。したがって、他のエーロゾル薬学的処方物は、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬとの間の、処置される適応または疾患に特異的な１種以上の本発明のペプチドを含む、生理学的に受容可能な緩衝化された生理食塩溶液を含み得る。液体に溶解または懸濁されていない微細に分割された固体ペプチドまたは核酸粒子の形態における乾燥エーロゾルもまた、本発明の実施において有用である。本発明のペプチドは、撒布剤（ｄｕｓｔｉｎｇ  ｐｏｗｄｅｒ）として処方され得、そしてそれは、約１μｍと５μｍとの間（あるいは、２μｍと３μｍとの間）の平均粒径を有する微細に分割された粒子を含み得る。微細に分割された粒子は、当該分野において周知である技術を使用して粉末化およびスクリーン濾過（ｓｃｒｅｅｎ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって調製され得る。上記粒子は、粉末の形態にあり得る所定の量の微細に分割された材料を吸入することによって投与され得る。必要有効量が複数の投薬単位の投与によって達成され得るので、各投薬形態の個々のエーロゾル用量に含まれる活性成分の単位含量が、それ自体、特定の感染、適用または疾患を処置するための有効量を構成する必要はないことが、認識される。さらに、上記有効量は、個別か、または一連の投与においてのいずれかで、上記投薬形態中の用量未満を使用して達成され得る。
【０１５５】
吸入による上気道（鼻）または下気道への投与に関して、本発明の治療用ペプチドは、噴霧器もしくは加圧されたパックまたはエーロゾルスプレーを送達する他の都合のよい手段から便利に送達される。加圧されたパックは、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）を含み得る。加圧されたエーロゾルの場合において、投薬単位は、定量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。噴霧器としては、米国特許第４，６２４，２５１号；同第３，７０３，１７３号；同第３，５６１，４４４号；および同第４，６３５，６２７号において記載される噴霧器が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される型のエーロゾル送達系は、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ  Ｃｏ．，（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を含む多数の商業的供給源から入手可能である。鼻腔内投与に関して、治療剤はまた、点鼻薬、液体スプレー（例えば、プラスチック瓶のアトマイザーまたは定量吸入器）によって投与され得る。代表的なアトマイザーは、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１５６】
本発明の治療用ペプチドはまた、記載された状態またはいくつかの他の状態のいずれかに対して、１種以上の公知の治療剤（例えば、鎮痛剤）；抗ウイルス因子（例えば、抗ＨＢＶ因子、抗ＨＣＶ因子（ＨＣＶインヒビター、ＨＣＶプロテアーゼインヒビター）または抗ヘルペス因子）；抗菌剤；抗癌剤；抗炎症剤；抗ヒスタミン剤；気管支拡張剤およびそれらの適切な組合せと組み合わせて使用され得る。
【０１５７】
（種々の組成物および製品）
１つの実施形態において、本発明は、微生物感染を制御するために本発明のペプチドを含む薬学的組成物を含む製品を提供する。そのような製品は、有用なデバイス（例えば、膣内リング、コンドーム、バンデージまたは同様のデバイス）であり得る。上記デバイスは、ウイルス感染を制御するために治療有効量の薬学的組成物を保持する。上記デバイスは、感染の制御のために上記薬学的組成物を使用するための説明書と一緒にキットに梱包され得る。上記薬学的組成物は、ウイルス感染が制御されるように、少なくとも１種の本発明のペプチドを治療有効量で含む。
【０１５８】
製品はまた、本発明のペプチドを含む生物学的サンプルの回収、処理または保存のために使用され得る容器または濾過ユニットであり得る。容器は、空にされてもよい。容器としては、キャピラリーチューブ、真空採血管（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）、血液または他の体液のための回収用バッグ、カニューレ、カテーテルが挙げられるが、これらに限定されない。濾過ユニットは、別のデバイス（例えば、生物学的流体の回収のためのカテーテル）の部分であり得る。さらに、本発明のペプチドはまた、上記製品（例えば、容器または濾過ユニット）に吸着されても、共有結合されてもよい。したがって、上記製品中の材料が、そこからデカントされるか、またはその製品を通過する場合、その材料は、上記ペプチドの実質的な量を保持しない。しかし、上記製品に対する上記ペプチドの吸着または共有結合は、ウイルスを殺すか、またはウイルスの伝播を予防し、それによってウイルス感染を制御することを補助する。したがって、例えば、本発明のペプチドは、回収された生物学的サンプル中に存在し得るウイルス粒子を除去または不活化するために、生物学的回収用のカテーテルおよびバイアルに組み込まれた濾過ユニット中にあり得るか、あるいは回収容器に添加され得、したがって上記疾患の伝播を予防する。
【０１５９】
本発明はまた、本発明のペプチドと１種以上の臨床的に有用な薬剤（例えば、生物学的安定剤）とを含む組成物を提供する。生物学的安定剤としては、抗凝固剤、保存剤およびプロテアーゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。抗凝固剤としては、シュウ酸塩、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸塩およびヘパリンが挙げられるが、これらに限定されない。保存剤としては、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼインヒビターとしては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのインヒビターが挙げられる。本発明のペプチドと生物学的安定剤とを含む組成物は、回収容器（例えば、キャピラリーチューブ、真空採血管、血液または他の体液のための回収用バッグ、カニューレ、カテーテルあるいは生物学的サンプルの回収、処理または保存のために使用される任意の他のコンテナまたは容器）中に含まれ得る。
【０１６０】
本発明はまた、本発明のペプチドと生物学的サンプル（例えば、血液、精液あるいは実験室において分析されるか、またはレシピエントの哺乳類に導入される他の体液）とを含む組成物を提供する。例えば、本発明のペプチドは、実験室処理および／または輸血の前に血液と混合され得る。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、生物学的組織（移植組織を含む）を保存および移植するために使用される生理学的媒体中に含まれ得る。したがって、例えば、肝臓、心臓、腎臓および他の組織は、移植片のレシピエントへのウイルス伝播を阻害するために、本発明のペプチドを含む媒体に浸漬され得る。
【０１６２】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに示される。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１：材料および方法）
ＨＣＶ構築物および転写。使用したＨＣＶコンセンサスクローンは、劇症肝炎を有する日本人患者に由来し、そしてＪＦＨ−１と表示された（Ｋａｔｏら（２００１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４，３３４−３３９）。このＨＣＶ  ｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターの後にクローニングして、プラスミドｐＪＦＨ−１、および複製欠損ＮＳ５Ｂネガティブコントロール構築物ｐＪＦＨ−１／ＧＮＤを作製した（Ｋａｔｏら（２００３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５，１８０８−１８１７）。ゲノムＪＦＨ−１およびＪＦＨ−１／ＧＮＤ  ＲＮＡを産生するために、ｐＪＦＨ−１プラスミドおよびｐＪＦＨ−１／ＧＮＤプラスミドを、ＸｂａＩ消化によってＨＣＶ  ｃＤＮＡの３’末端にて直線化した。次いで直線化したＤＮＡを、精製し、そしてインビトロ転写（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ；Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のための鋳型として使用した。ＪＦＨ−１鎖特異的ＲＮＡプローブを産生するために、本発明者らは、ＪＦＨ−１  ＮＳ５Ｂコード領域の１ｋｂフラグメントをｐＢＳＫＩＩ＋ベクター中にクローニングして、ＪＦＨ−１ネガティブ鎖プローブおよびＪＦＨ−１ポジティブ鎖プローブのＴ７駆動性およびＳＰ６駆動性の転写をそれぞれ可能にした。
【０１６４】
細胞培養。肝性のＨｕｈ−７細胞およびＨｕｈ−７．５．１細胞、ならびに非肝性のＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において５％  ＣＯ２にて維持した。これらの研究において使用した非肝性のＨＥＫ２９３細胞は、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４に記載される。使用したＨｅＬａ細胞は、Ｇｅｙら（１９５２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２，２６４−２６５に記載される。ヒト前骨髄芽球性のＨＬ−６０細胞および単芽球様Ｕ−９３７細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｓｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、そして推奨される通りに培養した。ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を、ＡＴＣＣから入手し、そしてＨｅｐＧ２は、Ｋｎｏｗｌｅｓら（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９，４９７−４９９に記載される。エプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞を、上に記載した同じ補充を伴うＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において維持した。
【０１６５】
Ｈｕｈ−７．５．１と表示した細胞は、Ｈｕｈ−７．５  ＧＦＰ−ＨＣＶレプリコン細胞株Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６（Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，７４００−７４０９）に由来した。Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６細胞由来のＨＣＶ−ＧＦＰレプリコンを取り除いてＨＣＶネガティブＨｕｈ−７．５．１細胞株を作製するために、Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６レプリコン細胞を、Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６レプリコンを根絶するために、１００ＩＵ／ｍｌのヒトインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の存在下で３週間にわたって培養した。ネオマイシン耐性遺伝子を有するＨＣＶレプリコンのクリアランスを、Ｇ４１８感受性およびＨＣＶ特異的逆転写の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＱＰＣＲ）分析によって確認した。
【０１６６】
ＨＣＶ  ＲＮＡトランスフェクション。２つの異なる方法を使用して、インビトロ転写されたＪＦＨ−１  ＲＮＡをＨｕｈ−７細胞およびＨｕｈ−７．５．１細胞にトランスフェクトした。１つの方法は、Ｋｒｉｅｇｅｒら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，４６１４−４６２４に記載されたエレクトロポレーションプロトコルの改変であった。簡単にいうと、トリプシン化細胞を、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって２回洗浄し、次いで１ｍｌあたり１×１０７個の細胞の細胞密度にて同じ媒体中に再懸濁した。１０マイクログラムのＪＦＨ−１  ＲＮＡを、４−ｍｍキュベットにおいて０．４ｍｌの上記細胞と混合し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒシステム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を、０．２７ｋＶ、１００ｏｈｍ、および９６０μＦにて単一のパルスを送達するために使用し、その細胞を、Ｔ１６２  Ｃｏｓｔａｒフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレートした。第２の方法は、リポソーム媒介性トランスフェクションを含み、そのリポソーム媒介性トランスフェクションを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、２０％  ＦＣＳの存在下で１０４個の細胞の懸濁物において５μｇのＪＦＨ−１  ＲＮＡを使用して１：２のＲＮＡ：リポフェクタミン比にて行った。次いで細胞を、２０％  ＦＣＳを含む完全ＤＭＥＭにプレートし、一晩にわたってインキュベーションした。両方の場合において、トランスフェクト細胞を、完全ＤＭＥＭに移し、そして示された期間にわたって培養した。細胞を、３〜５日毎に継代した。これらの細胞および対応する上清におけるＨＣＶの存在を、１μｇの全細胞ＲＮＡあたりのＨＣＶ  ＲＮＡコピーの数を定量すること、および選択した時点における上清のＨＣＶ感染価を決定することによって決定した。
【０１６７】
ＲＮＡ分析。全細胞ＲＮＡを、標準的なプロトコルを使用したグアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）法によって単離した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９。細胞上清由来のＲＮＡｓｅ耐性ＲＮＡを、改変したＧＴＣ抽出プロトコルによって単離した。５マイクログラムのＲＮＡを、ＨＣＶ  ＲＮＡを３２Ｐ−ＵＴＰ標識した鎖特異的プローブ（Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔ；Ａｍｂｉｏｎ）によって検出したことを除いて、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ（１９９５）によって先に記載された通りにノーザンブロット分析に供した。あるいは、１マイクログラムのＲＮＡを、ＤＮＡｓｅ処理（ＤＮＡ非含有試薬；Ａｍｂｉｏｎ）し、そして定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を、Ｋａｐａｄｉａら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，２５６１−２５６６；Ｋａｐａｄｉａら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，２０１４−２０１８に記載される通りに行った。ＤＮＡｓｅ処理したＲＮＡを、製造業者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＴａｑＭａｎ逆転写試薬を使用したｃＤＮＡ合成、その後のＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｌｅｒを使用したリアルタイム定量的ＰＣＲのために使用した。ＨＣＶ転写レベルおよびＧＡＰＤＨ転写レベルを、ＨＣＶ  ＪＦＨ−１  ｃＤＮＡまたはヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を含むプラスミドの系列希釈から構成された検量線に対して決定した。
【０１６８】
ヒトＧＡＰＤＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ｎＭＸ００２０４６）を検出するために使用したＰＣＲプライマー配列は、５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’（センス、配列番号８７）および５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（アンチセンス、配列番号８８）であった。ＪＦＨ−１を検出するために使用したＰＣＲプライマーは、５’−ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡ−３’（センス、配列番号８９）および５’−ＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣ−３’（アンチセンス、配列番号９０）であった。
【０１６９】
間接蛍光抗体法。細胞内染色を、Ｋａｐａｄｉａら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，２０１４−２０１８に記載される通りに行った。細胞を、１０分間にわたって室温（ｒｔ）にて４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．２）において固定し、そして１時間にわたって室温にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１０％  ＦＣＳを含むブロッキング緩衝液において透過させた。ポリクローナル抗ＮＳ５Ａウサギ抗体ＭＳ５を、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３％  ＢＳＡを含む緩衝液において１：１０００の希釈にて使用した。次いで細胞を、１：１０００希釈のＡｌｅｘａ５５５結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と一緒に１時間にわたって室温にてインキュベートした。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を使用して可視化した。
【０１７０】
感染性ＨＣＶ上清の力価。トランスフェクト細胞上清および／または感染細胞上清の感染性ウイルス力価を、エンドポイント限界希釈（ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ  ｌｉｍｉｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）分析によって決定した。簡単にいうと、細胞上清を、完全ＤＭＥＭにおいて連続的に１０倍に希釈し、そして９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において１ウェルあたり１０４個のナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞を感染させるために使用した。接種材料を、細胞と一緒に１時間にわたって３７℃にてインキュベートし、次いで新鮮な完全ＤＭＥＭを補充した。ＨＣＶ感染のレベルを、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａまたは糖タンパク質Ｅ２（赤色）に対する免疫蛍光染色によって、感染後３日目に決定した。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（青色）によって染色した。ウイルス力価を、最も高い希釈率において検出したＮＳ５Ａポジティブ病巣の平均数によって決定した、１ｍＬの上清あたりのフォーカス形成単位（ｆｏｃｕｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）（ｆｆｕ／ｍＬ）として示した。
【０１７１】
ＨＣＶウイルスストックの増幅。ウイルスストックを産生するために、感染性上清を、完全ＤＭＥＭにおいて希釈し、そしてナイーブな１０〜１５％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）なＨｕｈ−７．５．１細胞をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で０．０１のＭＯＩにて接種するために使用した。感染細胞を、トリプシン処理し、そして感染後（ｐ．ｉ．）４〜５日目においてコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）の前に再度プレートした。次いで、感染細胞由来の上清を、感染後８〜９日目に回収し、そしてアリコートを、−８０℃にて保存した。ウイルスストックの力価を、上に記載したように決定した。
【０１７２】
ＨＣＶの濃縮および精製。スクロース密度勾配超遠心分離分析を、Ｈｅｌｌｅｒら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，２５７９−２５８３に記載される通りに行った。２つの偽（ｍｏｃｋ）の感染Ｔ１６２ｃｍ２フラスコまたは２つのＨＣＶ感染Ｔ１６２ｃｍ２フラスコ由来のプールした上清を、細胞破片を除去するために４，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、次いで、Ｌ８−８０Ｍ超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）においてＳＷ２８ローターを使用して２８，０００ｒｐｍにて４時間にわたって、２０％スクロースのクッションによってペレットにした。そのペレットを、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む１ｍｌのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、２０％〜６０％のスクロース勾配（１２．５ｍＬの総容量）上にのせ、そしてＳＷ４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において１２０，０００×ｇで１６時間にわたって４℃にて遠心分離した。１．３ｍＬの画分を、その勾配の上部から回収した。その画分を、ＨＣＶ  ＲＮＡを検出するために定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。各画分の感染価を決定するために、各画分のアリコートを、ＤＭＥＭ媒体において、１：１０、１：１００、１：１０００および１：１００００に希釈し、そして上に記載されるようにＨｕｈ７．５．１細胞において力価決定した。全ての分析物について、偽の感染Ｈｕｈ−７．５．１細胞上清を、並行して分析した。
【０１７３】
ウェスタンブロット分析。ウェスタンブロット分析による細胞内ＨＣＶタンパク質の検出を、Ｋａｐａｄｉａ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｒｉｄｅａｕ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．＆Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．に記載される通りに行った。ＨＣＶコア（Ｃ７−５０）に対する抗体を、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）から得た。Ａｎｔｉ−ＮＳ３ウサギ抗体（ＭＳ１５）は、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）からの贈答品であった。
【０１７４】
ＣＤ８１特異的抗体およびＥ２特異的抗体による感染の遮断。組換えヒトモノクローナル抗Ｅ２抗体は、ファージディスプレイによって組換えＨＣＶ遺伝子型１ａ  Ｅ２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６２３２１）に対してスクリーニングしたｃＤＮＡ発現ライブラリー（ＨＣＶ患者の単核細胞から調製した）に由来した。その抗体を、連続的に希釈し、そして２５０マイクロリットルの容量で、１時間にわたって３７℃にて１５，０００ｆｆｕのＪＦＨ−１ウイルスと一緒にプレインキュベートした。そのウイルス抗体混合物を、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において３時間にわたって３７℃にて４５，０００個のＨｕｈ−７．５．１細胞に感染させるために使用した。
【０１７５】
１ｍｇ／ｍＬの濃度におけるマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ８１抗体５Ａ６（Ｌｅｖｙら（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，８９−１０９）を、連続的に希釈（１：２０００，１：２００，１：２０）し、そして５０μＬの容量で、９６ウェルプレートに接種（ｓｅｅｄ）した１０４個のＨｕｈ−７．５．１細胞と一緒に１時間にわたって３７℃にてプレインキュベートした。次いで、細胞に、０．３のｍｏｉにおいて３時間にわたって３７℃にて、感染性ＪＦＨ−１上清を接種（ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）した。抗体の存在下における感染の効率を、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫蛍光によって感染後３日間モニタリングした。
【０１７６】
インターフェロン処理。サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）なＨｕｈ−７．５．１細胞を、０．３のｍｏｉにおけるＪＦＨ−１ウイルスによる接種の前に、５ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬおよび５００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＦＮα−２ａまたはヒトＩＦＮγ（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって６時間処理した。その接種材料を、３７℃におけるインキュベーションの３時間後に除去し、そして示された用量のＩＦＮを補充した新鮮なＤＭＥＭを、その細胞に添加した。感染の効率を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって７２時間後にモニタリングした。
【０１７７】
（実施例２：ＨＣＶ  ＲＮＡによってトランスフェクトされた肝細胞癌培養細胞における感染性ＨＣＶ粒子の産生）
この実施例は、ＨＣＶネガティブＨｕｈ−７．５由来細胞株（本明細書中でＨｕｈ−７．５．１と称される）が、ＨＣＶ  ＲＮＡによってトランスフェクトされるか、またはＨＣＶ  ＲＮＡトランスフェクト細胞由来の上清と一緒に培養される場合に、感染性ＨＣＶ粒子が、効率的に産生されることを示す。
【０１７８】
上に記載したように、Ｈｕｈ−７．５．１細胞を、Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６細胞からＨＣＶ−ＧＦＰレプリコンを取り除くことによってＨｕｈ−７．５  ＧＦＰ−ＨＣＶレプリコン細胞株Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６（Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，７４００−７４０９）から得た。これを行うために、Ｉ／５Ａ−ＧＦＰ−６レプリコン細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の存在下で３週間培養した。これは、その細胞からＩ／５Ａ−ＧＦＰ−６レプリコンを根絶し、それによってＨｕｈ−７．５．１細胞を産生した。ＨＣＶレプリコンのクリアランスを、Ｇ４１８感受性（そのＨＣＶレプリコンは、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでいた）およびＨＣＶ特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した。
【０１７９】
ＨＣＶ  ＲＮＡによってトランスフェクトしたＨｕｈ−７．５．１肝細胞癌細胞による感染性ＨＣＶ粒子の産生。第１のセットの実験において、１０μｇのインビトロ転写されたゲノムＪＦＨ−１  ＲＮＡを、エレクトロポレーションによってＨｕｈ−７．５．１細胞に送達した。次いでトランスフェクト細胞を、実験全体を通してサブコンフルエントな培養物を維持するために、必要な場合（通常は、約３〜４日毎）に継代した。選択した間隔にて、全ＲＮＡを、トランスフェクトＨｕｈ−７．５．１細胞から単離し、そしてＨＣＶ  ＲＮＡのレベルを、ＨＣＶ特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＮＳ５Ａタンパク質発現をまた、免疫蛍光によってモニタリングし、そして感染性ウイルスの放出を、トランスフェクト細胞上清の力価決定によって決定した。
【０１８０】
トランスフェクション後２日目に、おそらく、投入（ｉｎｐｕｔ）ＲＮＡと細胞内のＨＣＶ複製によって産生されたＲＮＡとの組合せを反映する、１μｇの細胞ＲＮＡあたり１．３×１０７コピーのＨＣＶ  ＲＮＡを検出した（図１Ａ）。次いで、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルは、減少し、トランスフェクション後８日目に１μｇの細胞ＲＮＡあたり１．６×１０６コピーの最小レベルに到達した（図１Ａ）。しかし、重要なことに、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡレベルは、その後、増加し始め、トランスフェクション後１４日目に、１μｇの全ＲＮＡあたり１０７コピーより多い最大レベルに到達し、そしてこれらのレベルは、この実験を２６日目に終了するまで維持された（図１Ａ）。これらの結果は、ＨＣＶが、トランスフェクトＨｕｈ−７．５．１細胞中で活発に複製していることを示した。この仮説は、トランスフェクション後における複製能力のないＪＦＨ−１  ＲＮＡゲノムの迅速な消失によって支持される（図１Ｂ）。
【０１８１】
興味深いことに、ＮＳ５Ａに対する免疫蛍光染色は、トランスフェクト細胞培養物におけるＮＳ５Ａポジティブ細胞の％が、５日目における２％（図２Ａ）から２４日目におけるほぼ１００％（図２Ｂ）まで増加したことを示した。これらの結果は、ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅と一致し、そしてこれらの結果は、さらにＨＣＶトランスフェクト細胞が選択的増殖の利点を獲得したこと、またはＨＣＶがその培養物内のトランスフェクトされていない細胞に拡散したことのいずれかを支持した。
【０１８２】
ＪＦＨ−１トランスフェクトＨｕｈ−７．５．１細胞が感染性ウイルスを放出していたか否かを決定するために、ナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞に、上記トランスフェクション実験の間の異なる時点において回収した上清を接種した。接種後３日目の免疫蛍光染色は、培養物中のＮＳ５Ａポジティブ細胞（図２Ｃ）を示しただけでなく、その上清を連続的に希釈した場合に、その感染がＮＳ５Ａポジティブ細胞の分離した病巣をもたらした（図２Ｄ）ことも示した。したがって、トランスフェクション後の異なる時点で回収した上清における１ｍｌあたりのフォーカス形成単位（ｆｆｕ／ｍＬ）を、決定できた。この型の上清力価決定を、図１Ａに記載したトランスフェクション実験に対して行い、そしてその上清力価決定は、垂直のバーによって示される。感染性ウイルスは、トランスフェクション後３日目の培養培地において検出され（８０ｆｆｕ／ｍＬ）、次いでその感染性ウイルスは、細胞内ＪＦＨ−１  ＲＮＡの増幅を伴って増加し、トランスフェクション後２１日目に最大の４．６×１０４ｆｆｕ／ｍＬに到達した。
【０１８３】
まとめると、これらの結果は、ゲノムＪＦＨ−１  ＲＮＡによってトランスフェクトされたＨｕｈ−７．５．１細胞が、ＨＣＶ複製を支援し得るだけでなく、感染性ＨＣＶ粒子を産生し得ることを示す。特に、同様の結果を、ＪＦＨ−１  ＲＮＡを代替的なトランスフェクション方法（すなわち、リポソーム；図１Ｃ）によってＨｕｈ−７．５．１細胞に送達した場合に得た。
【０１８４】
トランスフェクションによるＨＣＶウイルスの増殖。さらなる実験を、ＪＦＨ−１トランスフェクト細胞上清に感染した細胞がナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞に連続的に継代され得る子孫ウイルスを産生するか否かを決定するために行った。ナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞を、２つの独立したトランスフェクション実験から回収した感染性上清によって低い感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１）にて感染させ、そして感染性ウイルス生成物を、選択した時点において感染細胞上清を力価決定することによってモニタリングした。接種後の第１日目において、感染性粒子を、いずれかのトランスフェクション細胞接種物（ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）に感染した細胞の上清において検出できなかった（図３Ａ）。しかし、感染性粒子は、その上清において指数関数的に蓄積し、その後、両方の感染後７日目に少なくとも１０４ｆｆｕ／ｍＬの最大力価に到達した（図３Ａ）。したがって、２つの別個の実験における感染後７日以内に、ＨＣＶは、ナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞において１００倍を超えて増幅された。同様の動態が、２つの別個のトランスフェクション実験において観察された。
【０１８５】
感染によって産生された子孫ウイルスがさらに継代され得るか否かを決定するために、ナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞に、リポフェクション実験のうちの１つから回収したウイルスを感染させた（このリポフェクション実験からのデータを、図３Ａに示す）。図３Ｂに示した通り、この二次感染は、一次感染について見られた動態（図３Ａ）と同様の動態で進行し、再び７日目に最大レベルに到達した。この二次感染の経過は、感染の時間経過にわたって漸増する数のＮＳ５Ａポジティブ細胞によって反映され、ほぼ全ての細胞が、７日目においてＮＳ５Ａについてポジティブであった（図３Ｃ）。これらの結果は、ＪＦＨ−１ウイルスがＪＦＨ−１  ＲＮＡのトランスフェクションによって産生され得、そして産生されたビリオンが感染性の検出可能な損失を伴わずにＨｕｈ−７．５．１細胞において継代され得ることを示す。さらに、ＪＦＨ−１ビリオンは、導入後の比較的短い期間において高い割合の細胞に感染する。
【０１８６】
さらなる実験をまた行い、ここでＨＣＶ  ＲＮＡおよびタンパク質の細胞内レベルをモニタリングした（図３Ｅ〜図３Ｆ）。この分析は、細胞培養上清における感染性ウイルスの出現が投入ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅およびその後の翻訳と直接相関することを確認した。同様の結果を、Ｈｕｈ−７細胞に関して得た（図３Ｇ）。
【０１８７】
要約すると、トランスフェクションによって細胞上清において産生されたウイルスは、ナイーブＨｕｈ−７細胞またはナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞へと連続的に継代され得る。感染性上清は、ナイーブＨｕｈ−７細胞またはナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞に、低い多重度（ＭＯＩ＝０．０１）で感染し得る。上記ウイルスは、上記ナイーブ細胞において伝播し得、そして一次感染と同様の動態で子孫ウイルスを産生し得る。さらに、感染によって産生された子孫ウイルスは、感染性の検出可能な損失を伴わずにナイーブ細胞へとさらに継代され得る。したがって、インビトロ感染系の重要な特性は、トランスフェクションによって上記細胞上清において産生されるウイルスは、ナイーブＨｕｈ−７細胞またはナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞へと連続的に継代され得る。
【０１８８】
ＨＣＶ感染は、抗Ｅ２抗体によって阻害される。ＨＣＶ表面糖タンパク質（Ｅ１／Ｅ２）シュードタイプウイルス（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）は、Ｂａｒｔｏｓｃｈら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７，６３３−６４２；Ｈｓｕら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，７２７１−７２７６に記載される。これらのＨＣＶ表面糖タンパク質（Ｅ１／Ｅ２）シュードタイプウイルスを使用した先の研究は、Ｅ１および／またはＥ２がウイルス吸着に必要とされる細胞レセプターとの相互作用を媒介することを示唆した。そのような相互作用がインビトロでのＨＣＶ感染に必要とされるか否かを検証するために、中和実験が、抗Ｅ２抗体を使用して行われ、この実験において、上記ＪＦＨ−１ウイルスを、感染前に３時間にわたって３７℃にて、ＨＣＶ  Ｅ２に特異的な組換えヒトモノクローナル抗体の系列希釈物またはアイソタイプのネガティブコントロール抗体の系列希釈物と一緒にプレインキュベートした。
【０１８９】
１００μｇ／ｍＬの抗Ｅ２抗体の存在下でＪＦＨ−１ウイルス（ｍｏｉ＝０．３）に感染したＨｕｈ−７．５．１細胞は、同量のアイソタイプのコントロール抗体の存在下で感染した細胞と比較して５倍低い細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを有することが見出された（図４Ａ）。抗Ｅ２抗体によるＨＣＶ感染の阻害は、免疫蛍光によって決定されるようなＮＳ５Ａポジティブ細胞における減少によってさらに反映された（データを示さない）。抗Ｅ２抗体の力価決定は、１０μｇ／ｍＬの抗体が感染後３日目における細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡの５０％の減少に必要とされたことを示した（図４Ａ）。これらの結果は、この系におけるインビトロＨＣＶ感染がウイルスエンベロープＥ２タンパク質によって部分的に媒介されるという結論と一致する。
【０１９０】
ＨＣＶ感染は、抗ＣＤ８１抗体によって阻害される。ＨＣＶ  Ｅ１／１Ｅ２を発現するシュードタイプウイルスを使用した先の研究はまた、ＨＣＶ  Ｅ２とＣＤ８１との間の相互作用がウイルスの進入に重要であることを示唆している（Ｚｈａｎｇら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，１４４８−１４５５）。ＣＤ８１がこのＨＣＶ感染系において必要とされるか否かを決定するために、抗ＣＤ８１抗体で前処理したナイーブＨｕｈ−７．５．１に、ＪＦＨ−１ウイルスを０．３のｍｏｉにて感染させ、そして感染後３日目に分析した。細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡレベルは、用量依存的様式で減少した。特に、コントロール抗体で処理した細胞と比較して、ＨＣＶ  ＲＮＡの５０倍の減少が、５０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ８１抗体を使用した場合に観察された（図４Ｂ）。
【０１９１】
感染性ＨＣＶ  ＪＦＨ−１粒子の生理学的特性。分泌性の感染性ＨＣＶビリオンの密度を試験するために、非感染Ｈｕｈ７．５．１細胞およびＨＣＶ感染Ｈｕｈ７．５．１細胞から回収した上清を、スクロース勾配遠心分離に供した。勾配画分を、遠心分離後に回収し、そしてＨＣＶ  ＲＮＡの存在および感染性について分析した（図５）。最大の感染価（１．２５×１０４ｆｆｕ／ｍＬ）は、画分５に存在し、そしてＨＣＶ  ＲＮＡのピークと一致した。ピーク感染性画分の約１．１０５ｇ／ｍＬの見かけの密度は、患者の血清から単離したＨＣＶビリオンについて先に報告されたこと（Ｈｉｊｉｋａｔａら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，１９５３−１９５８；Ｔｒｅｓｔａｒｄら（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３，２２４１−２２４５）と一致した。これらのデータは、組換えＪＦＨ−１ウイルスの密度がヒトから単離されたＨＣＶの密度と同様であることを示す。
【０１９２】
（ＪＦＨ−１  ＨＣＶのインビトロでの向性）
ＪＦＨ−１ウイルスによる感染がＨｕｈ−７．５．１細胞に限定されるか否かを決定するために、肝細胞株（Ｈｕｈ−７およびＨｅｐＧ２）のパネルおよび非肝細胞株（ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３形質転換Ｂ細胞、ＨＬ−６０形質転換Ｂ細胞、Ｕ−９３７形質転換Ｂ細胞およびＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞）のパネルに感染させる試行を、行った。感染後３日目におけるウイルスＮＳ５Ａタンパク質に対する免疫蛍光染色によって決定された通り、Ｈｕｈ−７．５．１細胞のほかに、Ｈｕｈ−７細胞のみが、ＨＣＶ感染に対して許容性であった（データを示さない）。
【０１９３】
Ｈｕｈ−７．５．１細胞とＨｕｈ−７細胞との間の感染効率において量的な差が存在したか否かを決定するために、両方の細胞株を、並行して感染させた。図６に示されるように、感染したＨｕｈ−７細胞の上清への感染粒子の放出は、Ｈｕｈ−７．５．１細胞による粒子産生と比較して遅延されたようであった。それにもかかわらず、Ｈｕｈ−７細胞は、８日目および１０日目に同様の量の感染性粒子を産生した。細胞内のＨＣＶ  ＲＮＡの増幅における同様の遅延した動態がまた、Ｈｕｈ−７細胞において観察された（図７）。これらの結果は、Ｈｕｈ−７細胞がＨｕｈ−７．５．１細胞と同様の量の子孫ウイルスを産生し得るが、遅延した動態を伴うことを示す。
【０１９４】
本明細書中に報告した結果は、ＪＦＨ−１トランスフェクトＨｕｈ−７．５．１細胞またはＪＦＨ−１感染Ｈｕｈ−７．５．１細胞が、ＪＦＨ−１コンセンサスｃＤＮＡクローンからの感染性ウイルスのレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）を可能にするＨＣＶ感染についての単純であるが頑強な細胞培養系を構成することを示す。したがって、本明細書中に示されるように、ＪＦＨ−１  ＲＮＡのＨｕｈ−７由来細胞へのトランスフェクションは、生存可能なＪＦＨウイルスの回復を可能にし、このＪＦＨウイルスは、次いで連続的に継代され得、そして感染ベースの実験のために使用され得る。印象的であることは、上記ウイルスの系列希釈物による感染は、産生されるＨＣＶを定量的に力価決定することを可能にする感染細胞病巣の形成をもたらしたことであった。
【０１９５】
したがって、感染後２４時間以内における上清からの投入ウイルスの消失は、ウイルス粒子がこの時間枠内に細胞に進入し得たことを示す。感染性ウイルス力価がこれらの検出されていないレベルから１０４ｆｆｕ／ｍＬ〜１０５ｆｆｕ／ｍＬまで上昇した場合、ＮＳ５Ａポジティブ細胞の数もまた、増加し、このことは、上記ウイルスが新規の細胞に拡散していたことを示す（図３Ｃ）。重要なことには、ナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞に継代される場合、トランスフェクト細胞および感染細胞の両方によって産生されたウイルスは、約２２時間のＨＣＶ倍加時間を有する同じ感染動態を示した。この倍加時間は、感染した患者（Ｂｕｈｋら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４４１６−２１）およびチンパンジー（Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１０３−１０７）において先に報告された６時間〜８時間よりも長いが、技術的要因および生物学的要因が、この矛盾の原因であり得る。例えば、より早期の推定値は、感染した個体の血清において検出されたＨＣＶゲノム等価物の数に基づいており、現在の研究において観察されるような感染価に基づいていなかった。
【０１９６】
ウイルス表面糖タンパク質Ｅ２に対する抗体がＪＦＨ−１ウイルスの感染性を減少させたという事実は、ウイルスの吸着および進入のプロセスがこの系において研究され得ることを示唆する。この主張と一致して、Ｈｕｈ−７由来細胞のＨＣＶ感染は、ＣＤ８１（広範に特徴付けられた推定上のＨＣＶレセプター）に対する抗体によって阻害された（図４）。
【０１９７】
したがって、ＪＦＨ−１ウイルスの向性は、ほぼＨｕｈ−７由来細胞株に限定されるようである。先の研究は、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３細胞がサブゲノムＪＦＨ−１レプリコンの支援を補助することを示している。Ｂｌｉｇｈｔら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，１９７２−１９７５；Ｋａｔｏら（２００１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４，３３４−３３９；Ｄａｔｅら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２２３７１−２２３７６を参照のこと。しかし、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、上に記載したようにＪＦＨ−１ビリオンに感染されなかった。対照的に、ＨＣＶに適合していないＨｕｈ−７細胞は、ＪＦＨ−１ウイルスに感染し易いことが見出された（図６）。Ｈｕｈ−７細胞におけるウイルス増幅は、若干ゆっくりであったが、Ｈｕｈ−７細胞は、最終的に、Ｈｕｈ−７．５．１細胞において達成されたウイルス力価に匹敵するウイルス力価をもたらした。
【０１９８】
Ｈｕｈ７．５細胞は、ＲＩＧ−Ｉにおける不活性化変異を含み（Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１０３−１０７）、ＲＩＧ−Ｉは、細胞の二本鎖ＲＮＡ感知機構の重要な成分である（Ｔａｎａｋａら（２００５）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４８，１２０−１２３）。ＨＣＶ感染はウイルスの複製および／または拡散を一過性に遅らせるＨｕｈ−７細胞における二本鎖ＲＮＡ抗ウイルス防御経路を誘導し得ることが、明らかである。ＨＣＶがＨｕｈ−７細胞に存在する制限を最終的に克服し、そしてＨｕｈ−７．５．１細胞によってもたらされるものと同様の力価に到達するという事実は、１つ以上のウイルスがコードする機能（例えば、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ）の発現が細胞内の抗ウイルス防御を遮断し得るか、または無効にし得ることをさらに示唆する。しかし、ＨＣＶ感染は、外因性に添加されたインターフェロンの効果に対して感受性のままであった；ＩＦＮαおよびＩＦＮγの両方は、Ｈｕｈ−７．５．１細胞のＪＦＨ−１ウイルス感染を予防した（図８）。興味深いことに、これらのインビトロでの観察は、臨床的に見られる観察（この観察において、インターフェロン療法は、上記ウイルスウイルスをＩＦＮ（そのウイルスが誘導する）の存在下において存続させるためにそのウイルスが進化した機構にかかわらず、幾人かの患者においてウイルス力価を減少させ得る）と似ているようである。
【０１９９】
したがって、ＨＣＶ感染の頑強な細胞培養モデルを、確立し、このモデルにおいて、感染性ＨＣＶが、産生され得、そしてナイーブ細胞に連続的に継代され得る。
【０２００】
（実施例３：ＨＣＶペプチドは、Ｃ型肝炎ウイルスを阻害する）
上で記載される通り、Ｈｕｈ−７細胞およびＨｕｈ−７．５．１細胞に、ＨＣＶ遺伝子型２ａ  ＪＦＨ−１クローンによって産生されたウイルスをインビトロで感染させ得る。この実施例は、配列番号６を有するＨＣＶペプチド、配列番号８を有するＨＣＶペプチド、配列番号１２を有するＨＣＶペプチド、配列番号１３を有するＨＣＶペプチド、配列番号１４を有するＨＣＶペプチド、配列番号２４を有するＨＣＶペプチド、配列番号２７を有するＨＣＶペプチド、配列番号３０を有するＨＣＶペプチド、配列番号３２を有するＨＣＶペプチド、配列番号４３を有するＨＣＶペプチド、配列番号４４を有するＨＣＶペプチド、配列番号４７を有するＨＣＶペプチド、配列番号４８を有するＨＣＶペプチドおよび配列番号５３を有するＨＣＶペプチドが、上に記載されたＨＣＶ感染のこの細胞培養モデルを使用して測定されるように、ＨＣＶ感染を強力に阻害することを示した。他のペプチドは、ＨＣＶ感染の良好な阻害を示した。有効なインヒビターであるこれらのＨＣＶ由来合成ペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質の構造領域および非構造領域の両方に由来する。
【０２０１】
遺伝子型１ａ（Ｈ７７）（配列番号１）の完全なＨＣＶポリタンパク質を網羅する４４１個の重複するペプチドのペプチドライブラリーを、試験した。上記ペプチドは、約１８アミノ酸長であり、１１個の重複するアミノ酸を有した。上記ペプチドライブラリーは、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（カタログ番号７６２０、ロット番号１）によって提供された。
【０２０２】
ＨＣＶ感染に対する抗ウイルス活性を示すペプチドを同定するために、上記ペプチドライブラリーを、ＨＣＶ病巣減少アッセイ（ｆｏｃｕｓ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によってスクリーニングした。上記ペプチドを、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬで１００％のＤＭＳＯにおいて再構成し、そして−２０℃で保存した。ペプチドストック溶液を、５０フォーカス形成単位（ｆｆｕ）のＨＣＶを含む完全ＤＭＥＭ増殖培地において約２０μＭの最終濃度まで１：２００で希釈した。上記ウイルス−ペプチド混合物を、９６ウェルプレート中の１ウェルあたり８０００個の細胞の密度にてＨｕｈ−７．５．１細胞に移した、３７℃にて４時間時間にわたる吸着の後、その接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にてインキュベートした。３日間の培養後、その細胞を、パラホルムアルデヒドによって固定し、そしてＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ５Ａに対する抗体によって免疫染色した。ＨＣＶ病巣の数を、蛍光顕微鏡検査において数え、そしてその結果を、ペプチド処理を伴わないが、溶媒である０．５％のＤＭＳＯを含む偽（ｍｏｃｋ）の百分率（％）として示す。
【０２０３】
これらのアッセイの結果を、図９および以下の表に示す。
【０２０４】
【表３−１】
2009510122.tif 000034
【０２０５】
【表３−２】
2009510122.tif 000035
４４１個のペプチドのうち、３８２個は、ＨＣＶ感染に対する効果を有さなかったか、またはＨＣＶ感染を２０％未満で遮断した（表３に示さない）。４１個のペプチドが、わずかにＨＣＶ感染を約２倍〜５倍阻害した。４個のペプチドが、ＨＣＶ感染を５倍〜１０倍阻害した。１４個のペプチドが、１０倍より大きくＨＣＶ感染を阻害した。特に、ＨＣＶ感染は、配列番号６、８、１２、１３、１４、２４、２７、３０、３２、４３、４４、４７、４８および５３のペプチドによって顕著に阻害された（９０〜１００％）。Ｈｕｈ−７．５．１細胞をこれらのペプチドと一緒にインキュベートした場合、毒性の形跡は検出されなかった。これらの結果は、ウイルスの生活環における１つ以上の工程を改変または阻害し得るペプチドインヒビターを同定する。さらに、本発明に従って、これらのペプチドは、抗ウイルス組成物およびＨＣＶ感染を阻害するための方法において使用され得る。感染を９０％よりも大きく阻害したペプチドを、さらなる分析のために選択した。
【０２０６】
ＨＣＶ感染に対する選択したペプチドの阻害効果を正確に定量するために、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡを、ペプチド処理を行った場合およびペプチド処理を行わなかった場合において、感染後にリアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定した。ペプチドストック溶液を、１：１００に希釈し、そして等量のウイルス上清と混合（トランスフェクション後１８日目のウイルス調製から伝播した）して、約２０μＭの最終濃度にした。次いで、ペプチドまたは０．５％のＤＭＳＯ溶媒コントロールを伴うウイルスを、Ｈｕｈ−７．５．１細胞に０．１の感染多重度（ＭＯＩ）にて感染させるために使用した。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にてインキュベートした。示された時点において、全細胞ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート法によって単離した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、プライマー５’−ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡ−３’（センス、配列番号８９）および５’−ＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣ−３’（アンチセンス、配列番号９０）を用いてリアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。結果を、以下の表に要約する。
【０２０７】
【表４−１】
2009510122.tif 000036
【０２０８】
【表４−２】
2009510122.tif 000037
感染性の階層に基づいて、ほとんどの活性ペプチドに、上の表に示される通り、感染性の階層におけるそれらの位置を反映するように数値表示（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｄｅｓｉｇｎａｔｏｒ）を再び割り当てた。
【０２０９】
（実施例４：Ｎ末端切断ペプチド１およびＣ末端切断ペプチド１の分析）
ペプチド＃１（配列番号４３）の抗ウイルス活性を規定するために、ペプチド１の一連のＮ末端切断物およびＣ末端切断物の抗ウイルス活性を、病巣減少アッセイを使用し、そして記載したように細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡの減少を測定することによって分析した。
【０２１０】
高度に精製したペプチド（９５％を超える純度）を、これらの研究のために使用した。全てのペプチドを、Ａ＆Ａ  Ｌａｂｓ，ＬＬＣ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって予め標識されたワング（ｗａｎｇ）樹脂においてフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用して合成した。上記ペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙマルチプルペプチド合成機（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）において合成した。次いで、粗ペプチドを、精製し、そして逆相Ｇｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステム（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）によって分析した。使用したカラムは、２０ｍｍのビーズ径および２５０ｍｍの長さを有するＣ１８カラム（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）であった。溶媒系は、３０分間にわたって５％〜７０％の直線勾配を有するＨ２Ｏおよびアセトニトリル溶媒系であった。質量スペクトル分析を、ＰＥ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−１００質量分析計によって行った。これは、合成されたペプチドの分子量を確認した。ペプチド濃度を、発色団残基（トリプトファンまたはチロシン）の消衰係数を使用して決定した（トリプトファン＝５５６０ＡＵ／ミリモル／ｍＬおよびチロシン１２００＝ＡＵ／ミリモル／ｍＬ）。計算を、式：１ｍＬあたりのペプチドのｍｇ＝（Ａ２８０×ＤＦ×ＭＷ）／ｅを使用して行い、ここでＡ２８０は、１−ｃｍセルでの２８０ｎＭにおける溶液の実際の吸光度であり、ＤＦは、希釈率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）であり、ＭＷは、ペプチドの分子量であり、そしてｅは、２８０ｎＭにおける各発色団のモル吸光係数であった。
【０２１１】
以下の表に要約した結果は、１〜４アミノ酸残基のＣ末端切断を有するペプチドが抗ウイルス活性を保持したことを示す。Ｎ末端からのわずか２アミノ酸の除去は、抗ウイルス活性を破壊した。
【０２１２】
【表５】
2009510122.tif 000038
（実施例５：ペプチド１の抗ＨＣＶ活性）
ペプチド＃１の抗ウイルス効果の持続期間を調べるために、Ｈｕｈ−７．５．１細胞に、１８μＭにおける単一用量のペプチド＃１と一緒に、ＨＣＶをＭＯＩ＝０．１にて感染させた。３７℃にて４時間後、そのウイルス−ペプチド接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にてインキュベートした。細胞を、コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達した時に、６の比で分割し、そして１１日間にわたって維持した。示された時点において、全細胞ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート法によって単離した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。その結果（図１０Ａ）は、ペプチド１がＨＣＶ感染を持続的に予防することを示す。
【０２１３】
ペプチド＃１が進行中の感染を廃絶し得るか否かを決定するために、Ｈｕｈ−７細胞に、最初にＨＣＶをＭＯＩ＝０．１にて感染させた。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、そのウイルス接種材料を、除去した。次いでその細胞を、増殖培地によって２回洗浄し、そしてその細胞に、１８μＭにおけるペプチド＃１またはコントロールとしての０．５％  ＤＭＳＯのいずれかを含む１２０μＬの新鮮な培地を積層し、そしてそのペプチドを、その後、培養培地中で維持した。その細胞を、３７℃にてコンフルエンシーまでインキュベートし、その時点でそれらを、１：４の比で分割した。分割の際、細胞懸濁物の一部分を、ＲＮＡ分析に供した。全細胞ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート法によって単離した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。並行して、細胞を、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する抗体によって免疫染色し、そしてＨＣＶ  Ｅ２ポジティブ細胞の数を、蛍光顕微鏡下で数えた。その結果（図１０Ｂ）は、感染の４時間後においてペプチド＃１を添加すること、および培養培地においてペプチド＃１を維持することが、ウイルス増幅の最初のラウンドに対して効果を有さなかったことを示す。なぜならば、ウイルス感染価および細胞内のウイルスＲＮＡは、上記細胞を４日目に分割するまで、全ての群において同じであったからである。しかし、上記細胞を分割した各時点において培養物に上記ペプチドを添加することによって、さらなるウイルス増幅（四角）を、上清の感染価（三角）を迅速かつ顕著に減少させることにより予防した。
【０２１４】
ペプチド＃１の半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ペプチドストック溶液（ＤＭＳＯ中の３．６ｍＭ）を、ＤＭＳＯにおいて連続的に２倍に希釈した。次いで、各希釈からのペプチドのアリコートを、完全増殖培地において１：１００に希釈し、そして等量のウイルス上清と混合した。次いで、そのウイルス−ペプチド混合物を、Ｈｕｈ−７．５．１細胞に感染（ＭＯＩ＝０．１）させるために使用した。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、そのウイルス−ペプチド接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にて３日間インキュベートした。細胞を、溶解し、そしてＲＮＡ分析に供した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。ＨＣＶ感染の阻害を、ペプチド処理と溶媒コントロールとの間で細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物を比較することによって計算した。その結果（図１０Ｃ〜図１０Ｄ）は、ペプチド＃１のＥＣ５０がこれらの条件下で約３００ｎＭであることを示す。
【０２１５】
（実施例６：ペプチド＃１の抗ウイルス活性の機構の決定）
ペプチド＃１の抗ウイルス活性の機構を規定するために、感染性接種材料の細胞における、ウイルスＲＮＡの細胞による結合／接着／取り込みを予防するペプチド＃１の能力を、調べた。Ｈｕｈ−７．５．１細胞を、９６ウェルプレート中の１ウェルあたり８０００個の細胞で接種した。１６時間後、その細胞を、１８μＭの濃度のペプチドの存在下または非存在下において、ＨＣＶと一緒にＭＯＩ＝０．１にてインキュベートした。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、そのウイルス−ペプチド接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、溶解し、そしてＲＮＡ分析に供した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＱＰＣＲ）アッセイによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。阻害活性を、ウイルス−ペプチド接種材料に曝された細胞  対  ウイルス−ＤＭＳＯコントロールに曝された細胞において、細胞が有するＨＣＶ  ＲＮＡの量を比較することによって定量した。その結果（図１１Ａ）は、ペプチド１（およびペプチド１と重複するペプチド２）が、ウイルスの結合／接着／取り込みを有意に遮断する一方で、他のペプチドが、このレベルにて活性ではなかったことを示す。
【０２１６】
作用の機構をさらに規定するために、ペプチド＃１を、接種材料の添加の時間に対して異なる時点において細胞に添加した。Ｈｕｈ−７．５．１細胞を、９６ウェルプレート中の１ウェルあたり８０００個の細胞で接種した。一晩の増殖後、その細胞単一層に、８０００ｆｆｕ／ウェルのＨＣＶを感染させた。ペプチド＃１を、以下の３つの異なる時間において１８μＭの最終濃度まで添加した：１）プレインキュベーション（すなわち、細胞との４時間のインキュベーション（次いで、ウイルス感染前の洗浄が行われる））；２）同時インキュベーション（すなわち、ウイルスおよびペプチドが洗浄によって除去された後に４時間にわたってウイルスと同時に起こる）；３）インキュベーション後（すなわち、ウイルスを４時間にわたって添加し、次いで細胞を、ウイルスを除去するために洗浄し、そしてペプチドを、添加し、そして実験の期間にわたって維持した）。感染の２４時間後および７２時間後において、細胞を、溶解し、そしてＲＮＡ分析に供した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。その結果（図１１Ｂ）は、上記ペプチドが、そのウイルスと一緒に添加した場合にもっとも有効であり、したがって最も可能性のある作用の機構としてウイルス中和を指向することを示す。
【０２１７】
ペプチド＃１は、ＨＣＶビリオンに対して殺ウイルス性（ｖｉｒｏｃｉｄａｌ）であり得るか、またはウイルスと細胞との間の相互作用を遮断し得る。上記機構をさらに解明するために、ＨＣＶ殺ウイルスアッセイを、行った。簡単にいうと、ペプチド＃１を、２×１０５ｆｆｕ／ｍＬのＨＣＶを含む完全増殖培地において１８μＭの最終濃度まで希釈した。そのウイルス−ペプチド混合物を、３７℃にて４時間インキュベートした。そのサンプルを、以下の通り、３つの異なるアッセイによって分析した。
【０２１８】
ＨＣＶ感染性アッセイにおいて、上記サンプルを、増殖培地において、上記ペプチドがＨＣＶ感染に対する阻害効果を有さない濃度までさらに２５０倍に希釈した。残存する感染性を、その希釈したサンプルをＨｕｈ−７．５．１細胞上におくことによって決定し、そして細胞を、７２時間後にＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する抗体によって染色した。その結果（図１１Ｃ）は、ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションがウイルスの感染性を完全に廃絶することを示す。
【０２１９】
全ＨＣＶ  ＲＮＡアッセイにおいて、全ＲＮＡの１０μＬサンプルを、グアニジンチオシアネート法によって直接単離した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そしてＣＰＥの間にウイルス上清中に放出されたＧＡＰＤＨのレベルに対して正規化した。結果（図１１Ｄ）は、ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションが全ウイルスＲＮＡ成分を少なくとも３倍減少させることを示し、このことは、ウイルスの溶解を示唆する。
【０２２０】
スクロース密度勾配を、全ＨＣＶ  ＲＮＡおよびＨＣＶ感染性に対するペプチド１の抗ウイルス効果がＨＣＶ粒子のサブセットに限定されるか否かを調べるために使用した。この方法において、ペプチド処理サンプルおよびコントロールウイルスサンプル（２５０μＬ）を、スクロース密度勾配に対して分散（ｒｅｓｏｌｖｅ）させ、そして画分を、感染性およびウイルスＲＮＡ含量について分析した。勾配を、ＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中の２０％スクロース溶液、３０％スクロース溶液、４０％スクロース溶液、５０％スクロース溶液および６０％スクロース溶液の等容量（７００μＬ）段階によって形成した。平衡を、１２０，０００ｇで４℃にて１６時間にわたる超遠心分離（ＳＷ４１Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって達成した。２５０μＬの１５個の画分を、上部から回収し、そしてＨＣＶ  ＲＮＡおよびウイルス感染価の両方について分析した。各画分の密度を、各サンプルにおける１００μＬアリコートの質量を測定することによって決定した。その結果（図１１Ｅ）は、ウイルスとペプチドとのプレインキュベーションが全ての画分において感染性を完全に廃絶し、そして全ての画分のウイルスＲＮＡ含量を約４〜５倍減少させることを示し、このことは、ウイルスの溶解をさらに示唆する。
【０２２１】
（実施例７：ペプチド１のＬ形態とＤ形態との比較）
Ｌ−アミノ酸からなるペプチドは、タンパク質分解を受け易く、そのタンパク質分解は、ペプチドの半減期を短くし、したがってペプチドの生物学的活性を短くし得る。タンパク質分解の可能性を調べるため、そして特定のペプチド−ウイルスタンパク質相互作用が抗ウイルス活性を媒介するか否かを決定するために、ペプチド１を、全てＤ−アミノ酸を使用して合成し、９５％を超える均一性まで精製し、そしてその抗ウイルス活性および血清安定性を、ペプチド＃１のＬ型バージョンの同様に純粋な調製物と比較した。Ｌ型ペプチドおよびＤ型ペプチドの両方を、完全増殖培地（１０％のＦＢＳ）において１：１００に希釈し、そして等容量のウイルス上清と混合した。
【０２２２】
さらに、Ｌ型ペプチドおよびＤ型ペプチドの血清安定性を比較するために、上記希釈したペプチドを、ウイルス上清と混合する前に、３７℃にて、１時間、２時間および４時間インキュベートした。次いで、そのウイルス−ペプチド混合物を、Ｈｕｈ−７．５．１細胞に感染させる（ＭＯＩ＝０．１）ために使用した。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、そのウイルス−ペプチド接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にて３日間インキュベートした。細胞を、溶解し、そしてＲＮＡ分析に供した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。その結果（図１２Ａ）は、Ｌ−ペプチドの抗ウイルス活性の約９５％が３７℃における１０％のＦＢＳにおいて１時間以内に喪失したのに対して、Ｄ−ペプチドが同じ条件下で少なくとも４時間にわたって完全に安定であったことを示す。したがって、低い免疫原性および可能な経口バイオアベイラビリティーに加えて、Ｄ−アミノ酸からなるペプチドは、増強された血清安定性の潜在的な治療的利益を有する。
【０２２３】
ペプチド＃１のＬ形態およびＤ形態の半有効濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ペプチドストック溶液（ＤＭＳＯ中の３．６ｍＭ）を、ＤＭＳＯにおいて連続的に２倍に希釈した。次いで、各希釈物由来のペプチドのアリコートを、完全増殖培地において１：１００に希釈し、そして等容量のウイルス上清と混合した。次いで、そのウイルス−ペプチド混合物を、Ｈｕｈ−７．５．１細胞に感染させる（ＭＯＩ＝０．１）ために使用した。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、そのウイルス−ペプチド接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にて３日間インキュベートした。細胞を、溶解し、そしてＲＮＡ分析に供した。ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物レベルを、リアルタイムＲＴ−ＱＰＣＲによって測定し、そして細胞ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。ＨＣＶ感染の阻害を、ペプチド処理と溶媒コントロールとの間で細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物を比較することによって計算した。その結果（図１２Ｂ〜図１２Ｃ）は、ペプチド１のＬ形態およびＤ形態のＥＣ５０値が実質的に同一であることを示す。
【０２２４】
（実施例８：ペプチドの毒性）
ペプチドの細胞傷害性を、ＡＴＣＣ  ＭＴＴアッセイキット（カタログ番号３０−１０１０Ｋ）において提供されるプロトコルに基づくＭＴＴ細胞傷害アッセイによって測定した。簡単にいうと、９６ウェルプレート中の１ウェルあたり５０００個〜１０，０００個の細胞を、接種した。一晩の増殖後、２０μＬの連続的に２倍に希釈したペプチドを加えた１００μＬの新鮮な媒体を、添加した。ペプチドを含まない媒体を、未処理のコントロールとして少なくとも３個のウェルに添加した。次いで、その細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２にて７２時間インキュベートした。このインキュベーションの後、１／１０容量のＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬ）を、各ウェルに添加し、そしてその細胞を、インキュベーターに戻した。２時間後、その媒体を、除去し、１５０μＬのＤＭＳＯを、紫色の沈殿物であるホルマザンを溶解するために添加し、そしてそのプレートを、１５０ｒｐｍにて１０分間にわたって振盪した。６７０ｎＭにおけるバックグランドを減算した５７０ｎｍにおける吸光度は、細胞死の信頼できる基準である。個々のペプチドの細胞傷害性（ＬＤ５０）を、５０％の細胞死を引き起こしたペプチド濃度として定義した。その結果（図１３Ａ）は、ペプチド１のＬ形態およびＤ形態のＬＤ５０値が実質的に同一である（それぞれ、３．８μＭおよび３．７μＭ、ＦＢＳを伴わない；ならびに２６．７および３６．８μＭ、ＦＢＳを伴う）ことを示す。
【０２２５】
新鮮なヒト血液（ＥＤＴＡによって処理した）を、上清およびバフィーコートを除去するために１０００ｇにて１０分間遠心分離した。次いで、赤血球を、ＰＢＳにおいて２回洗浄し、そして１６％のＦＢＳを伴う場合および１６％のＦＢＳを伴わない場合において８％の最終濃度まで再懸濁した。ペプチドの２倍系列希釈物を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で６０μＬのＰＢＳにおいて調製し、そしてＦＢＳを伴う場合およびＦＢＳを伴わない場合において、６０μＬの懸濁したヒト赤血球を、添加した。そのプレートを、３７℃にて１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、１２０μＬのＰＢＳを、各ウェルに添加し、そしてそのプレートを、１０００ｇにて５分間遠心分離した。上清の１００μＬのアリコートを、新規の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。ヘモグロビンの放出を、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーを使用し、４１４ｎＭにおける吸光度を測定することによってモニタリングする。そのプレートにおいて、０％および１００％の溶血を、それぞれ、ＰＢＳおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において決定する。％溶血を、式：［（ペプチド溶液におけるＡ４１４ｎｍ−ＰＢＳにおけるＡ４１４ｎｍ）／（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００におけるＡ４１４ｎｍ−ＰＢＳにおけるＡ４１４ｎｍ）］×１００に従って決定する。
【０２２６】
その結果（図１３Ｂ）は、血清の存在下で試験した場合、ヒト赤血球に対するＬ−ペプチドおよびＤ−ペプチドのＬＣ５０値が、互いに同様であり、そしてインビトロでの肝細胞細胞株に対するそれらのＬＣ５０と同様であるであることを示す。重要なことに、両方の細胞型に対するＬＣ５０値は、一貫して各ペプチドについてのＥＣ５０値よりも５０〜１００倍高い。
【０２２７】
ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３のインビボ細胞傷害性の予備的な測定（表４を参照のこと）の通り、３匹のマウスの群（ＢＡＬＢ／ｃマウス、７週齢、約２３ｇ）に、２００μＬのＰＢＳ（注射前に３分間にわたって１４，０００ｒｐｍで回転させた）中の９２μｇのＬ型ペプチド１（約４ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ注射した。コントロール群において、３匹のマウスの各々に、５％のＤＭＳＯを含む２００μＬのＰＢＳを与えた。そのマウスを、注射後の最初の３時間の間の急性毒性についてモニタリングした。結果を、以下の表に要約する。
【０２２８】
【表６】
2009510122.tif 000039
外見、活動または行動における変化は、観察されなかった。次いで、そのマウスを、０日目、３日目、５日目、７日目および１０日目において秤量した。ペプチドを注射したマウスは、コントロールと同じ速度で体重が増加した。
【０２２９】
（実施例９：ペプチド１の物理的特性は、その抗ウイルス活性と相関する）
ペプチド１（配列番号４３）の二次構造を、ｃｔｉ．ｉｔｃ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／〜ｃｍｇ／Ｄｅｍｏ／ｗｈｅｅｌ／ｗｈｅｅｌＡｐｐ．ｈｔｍｌ（最後に２００６年８月１５日に訪れた）においてオンラインで利用可能であるへリックス車輪図アプレット（ｈｅｌｉｃａｌ  Ｗｈｅｅｌ  Ａｐｐｌｅｔ）のツールを使用して分析した。得られたへリックス車輪図（図１４Ａ）は、ペプチド１が疎水性面および親水性面の両方を有する両親媒性であることを示す。
【０２３０】
ペプチド１の二次構造をまた、Ａｖｉｖモデル６２ＤＳ  ＣＤ分光計（Ａｖｉｖ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．）を使用し、円偏光二色性（ＣＤ）分光学を使用して分析した。ペプチドのＣＤスペクトルを、２５℃にて１ｍｍ路程のセルを使用して測定した。１サンプルあたり３回の走査を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）において１９０〜２６０ｎＭの波長範囲にわたって行った。データを、６０ｎＭ／分の走査速度によって０．１ｎＭ間隔にて回収し、そして平均モル楕円率［ｑ］で得た。ペプチド濃度は、５０μＭであった。アンホトロピックなα−へリックスの非常に特徴的なスペクトルが、ペプチド１のＬ形態およびＤ形態について観察された（図１４Ｂ）。さらに、ダンシル化は、ペプチド１のアンホトロピックなα−へリックス構造を増強する（図１４Ｃ）。したがって、本発明のペプチドは、そこに共有結合されたダンシル部分を有し得る。
【０２３１】
ペプチド１の種々の切断誘導体（表７）の二次構造を、ＣＤ分光学を使用して分析した。結果は、ペプチド１のＣ末端からの２アミノ酸または４アミノ酸の削除がそのペプチドのα−へリックス構造を排除しなかったこと（図１４Ｄ）を示す。対照的に、ペプチド１のＮ末端からの２アミノ酸の削除は、そのペプチドのα−へリックス構造を排除した（図１４Ｅ）。
【０２３２】
ペプチド１のこれらの切断された改変体の抗ＨＣＶ活性をまた、決定した。結果（表７）は、ペプチド１（Ｌ形態）の抗ウイルス活性がそのα−へリックス構造と相関することを示す。
【０２３３】
【表７】
2009510122.tif 000040
（実施例１０：リポソーム−色素放出アッセイ）
リポソーム（Ｌａｒｇｅ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＬＵＶ）を、以下の通りに調製した。１０ＰＯＰＣ：１１ＤＰＰＣ：１ＰＯＰＳ：６Ｃｈｏｌｅｓｔｒｏｌ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）からなる比率における２８ｍｇの総脂質（１２ｍＭ）を含む脂質混合物を、１ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのエーテル、および２ｍＬのスルホローダミンＢ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ中の１００ｍＭ、ｐＨ７．２；ＳｕｌｆｏＢ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に溶解した。その混合物を、Ｂｒａｎｓｏｎ  ２２１０水浴超音波処理器を使用して１０分間にわたって４℃にて超音波処理した。有機溶媒を真空Ｂｕｃｈｉ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−１１４を使用して除去した後、その脂質を、２ｍＬのスルホローダミンＢに再懸濁した。その混合物を、発泡が止まるまでエバポレート（ｖａｐｏｒａｔｅ）した。その脂質小胞を、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）を使用して０．８μｍ、０．４μｍ、および０．２μｍのポリカーボネート濾過膜の積み重ねを通して８回繰り返し押し出すことによってサイジングした。スルホローダミンＢを搭載されたリポソームを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにおいて封入されていないスルホローダミンＢから分離した。
【０２３４】
色素放出アッセイを、Ａｍｉｎｃｏ−Ｂｏｗｍａｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において行った。１０マイクロリットルのリポソームを、滅菌したキュベット中で室温にて９７８μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液で１２０μＭの最終濃度まで希釈した。そのサンプルを、５３５ｎＭの波長で励起させ、そして発光を、５８５ｎＭにてモニタリングした。６０秒間の平衡後、１０μＬのペプチドを、上記キュベットに添加し、そして膜破裂の動態を、スルホローダミンＢ蛍光の増加によってモニタリングした。ペプチドの添加によって放出されたスルホローダミンＢの％を、以下の式：放出されたスルホローダミンＢの％＝１００×（Ｆ−Ｆｏ）／（Ｆ１００−Ｆｏ）を使用して計算し、ここでＦは、上記ペプチドによって達成された蛍光強度であり、Ｆｏは、ペプチドの添加の際に得られた基礎的な蛍光強度、そしてＦ１００は、２５μＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加によって得られた１００％のスルホローダミンＢ放出に対応する蛍光強度である（図１５Ａ）。
【０２３５】
表７中のペプチドを、このアッセイにおいて試験した。結果（図１５Ｂ）は、ペプチド１の種々の誘導体の抗ウイルス活性がリポソーム色素放出を引き起こす能力と相関することを示す。したがって、ペプチド１の抗ウイルス活性は、以下の表に要約される通り、α−へリックス構造およびリポソーム色素放出と相関する。
【０２３６】
【表８】
2009510122.tif 000041
（実施例１１：抗ウイルス活性および一次構造）
ペプチド１の抗ウイルス活性がその一次アミノ酸配列に依存するか否かを決定するために、ペプチド１由来の４種の誘導体ペプチドを、９５％を超える純度に合成した。アミノ酸の同じ組成を有する４種の誘導体は、（１）ペプチド１の配列を逆転したもの（レトロ−ペプチドとも称される）；（２）スクランブルされた疎水性アミノ酸；（３）スクランブルされた親水性アミノ酸；および（４）アスパラギン酸残基（Ｄ）がプロリン残基（Ｐ）によって置換された誘導体を含んだ。上記ペプチドの抗ウイルス活性を、上に記載したように以下の３つのペプチド濃度においてＨＣＶ病巣減少アッセイによって調べた：１８μＭ、６μＭおよび２μＭ。
【０２３７】
以下の表に要約される結果は、ペプチド１の抗ウイルス活性が、α−へリックス構造と相関するが、一次アミノ酸配列と相関しないことを示す。
【０２３８】
【表９】
2009510122.tif 000042
要約すると、合成ＨＣＶペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、効率的にＨＣＶ感染を阻害し得る１３個のペプチドが、同定された。例えば、ＮＳ５Ａ（ＮＳ５Ａ−１９７５）の膜アンカードメインに由来するペプチド１は、単一用量のこのペプチドが、細胞傷害の形跡を伴わずに２８９ｎＭのＥＣ５０によってＨＣＶ感染を完全に遮断したので、非常に強力である。抗ウイルス効果は、感染後少なくとも１１日目に関して明白であった。ペプチドは、ウイルスと一緒に細胞に添加される場合、最も活性であった。ペプチドとウイルスとのプレインキュベーションは、ウイルスの接着および感染性を有意に減少させ、このことは、ＮＳ５Ａ−１９７５の抗ウイルス活性が、そのウイルスと直接的に相互作用し、そしてそのウイルスを脱安定化することを示唆する。そのペプチドのＤ−アミノ酸形態は、完全に活性であり、そしてそのペプチドのＤ形態およびＬ形態は、溶液中の両親媒性のα−へリックス構造を示し、そして人工リポソームの透過を誘導する。重要なことに、一連のＮ末端切断ＮＳ５Ａ−１９７５ペプチドおよびＣ末端切断ＮＳ５Ａ−１９７５ペプチドの抗ウイルス活性は、それらの膜透過活性および両親媒性のα−へリックス構造と完全に相関する。対照的に、ＮＳ５Ａ−１９７５は、水疱性口内炎ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスおよびボルナ病ウイルスを含む数種の他のエンベロープＲＮＡウイルスに対する効果を有さなかった。したがって、ペプチド１は、ウイルスを細胞外で不活化することによってＨＣＶ感染を遮断する、強力なＨＣＶ由来の合成α−ヘリックスペプチドである。これらの結果は、ＮＳ５Ａ−１９７５がＨＣＶ感染に対する新規の治療ストラテジーを示し得ることを示唆する。
【０２３９】
（実施例１２：ＶＳＶ感染に対するペプチドの効果）
ペプチド＃１の抗ウイルス活性がＨＣＶに対して特異的であるか否かを決定するために、同様の実験を、他のエンベロープウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ））に対して行った。２つのアッセイを、ＶＳＶに対するペプチド＃１の抗ウイルス活性を試験するために使用した。
【０２４０】
感染の遮断。ペプチド１がＶＳＶ感染を遮断するか否かを調べるために、１８μＭの最終濃度におけるペプチド１および１ｐｆｕ／ｍＬ〜１０，０００ｐｆｕ／ｍＬのＶＳＶを、Ｈｕｈ−７細胞に対して同時に添加した。並行して、ペプチドおよびＨＣＶ（１０，０００ｆｆｕ／ｍＬ）を、コントロールとして細胞に添加した。３７℃にて４時間にわたる吸着の後、そのウイルス−ペプチド接種材料を、除去した。その細胞を、２回洗浄し、その細胞に、１２０μＬの新鮮な増殖培地を積層し、そしてそれを、３７℃にて３日間インキュベートした。ＶＳＶ感染およびＨＣＶ感染を、それぞれ、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）、およびＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する抗体による免疫染色によって評価した。
【０２４１】
殺ウイルス（ｖｉｒｏｃｉｄａｌ）活性。ペプチド１がＶＳＶに対する殺ウイルス（ｖｉｒｕｃｉｄａｌ）活性を有するか否かを決定するために、ペプチド１を、２×１０５ｐｆｕ（ｆｆｕ）／ｍＬのＶＳＶまたはＨＣＶを含む完全増殖培地において１８μＭの最終濃度まで希釈した。次いで、そのウイルス−ペプチド混合物を、３７℃にて４時間インキュベートした。次いで、ＶＳＶウイルス力価およびＨＣＶウイルス力価を、系列希釈によって決定し、そして、それぞれ、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）、およびＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する抗体による免疫染色によって評価した。
【０２４２】
その結果（図８）は、ペプチド１が、ＶＳＶ感染を遮断せず、そしてＶＳＶに対する殺ウイルス活性を有さないことを示す。
【０２４３】
（実施例１３：２型デング熱感染に対するペプチドの効果）
以下の実験を、ペプチドが２型デング熱感染を阻害することを決定するために行った。
【０２４４】
酵素結合イムノソルベント検定法。Ｖｅｒｏ細胞（８０，０００個の細胞／ウェル／ｍｌ）を、２４ウェルプレートにおいて感染の２４時間前に接種した。細胞を、漸増濃度のペプチド（またはコントロールとしてのＤＭＳＯ）の存在下において２型デング熱（Ｖｅｒｏ細胞に由来する）に曝した。ウイルスおよびペプチドを、インキュベーション全体を通して除去した（細胞を、洗浄しなかった）。感染を、感染したＶｅｒｏ細胞の上清中に放出された２型デング熱カプシドの量を測定するＥＬＩＳＡを使用して、５日後に分析した。
【０２４５】
蛍光病巣アッセイ：Ｖｅｒｏ細胞を、９６ウェルプレートにおいて感染前２４時間にわたって接種した。細胞を、漸増濃度のペプチド（またはコントロールとしてのＤＭＳＯ）の存在下において２型デング熱に曝した。ウイルスおよびペプチドを、感染の２時間後に洗い流した。上清を、感染後３日毎に回収し、そしてその上清を、蛍光病巣アッセイのために、新鮮なＶｅｒｏ細胞に添加した。新規に感染したＶｅｒｏ細胞を、３日後に４％ホルムアミドによって固定した。次いで、細胞を、デング熱Ｅｎｖ抗体によって染色し、次いでＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ色素に結合体化した二次抗体によって染色した。病巣を、蛍光顕微鏡を使用して数えた。
【０２４６】
結果を、以下の表および図１７に要約する。
【０２４７】
【表１０】
2009510122.tif 000043
表１０および図１７に示す通り、デング熱感染は、本発明のペプチドによって用量依存的様式で阻害された。本質的に、デング熱ウイルス感染の１００％の阻害は、２０μＭの濃度において観察された（図１７）。
【０２４８】
細胞内ＦＡＣＳアッセイ：Ｖｅｒｏ細胞を、６ウェルプレートにおいて感染前２４時間にわたって接種した。細胞を、漸増濃度のペプチド（またはコントロールとしてのＤＭＳＯ）の存在下において２型デング熱に曝した。ウイルスおよびペプチドを、感染の２時間後に洗い流した。細胞を、感染後３日目に細胞内染色のために採取した。細胞を、適切なアイソタイプコントロール抗体、デング熱Ｅｎｖ抗体、デング熱カプシド抗体またはチューブリン抗体によって染色した。細胞を、ＦＡＣＳによって分析した。
【０２４９】
２０μＭのペプチド濃度を使用した場合の結果を、表１１に示す。１．２５μＭ〜２０μＭについての結果を、図１８に示すグラフにおいて要約する。
【０２５０】
【表１１】
2009510122.tif 000044
表１１および図１８に示す通り、本発明のペプチドは、デング熱ウイルス感染を用量依存的様式で阻害する。本質的に、デング熱ウイルス感染の１００％の阻害は、２０μＭの濃度において観察された（図１８）。
【０２５１】
蛍光病巣アッセイ。Ｖｅｒｏ細胞を、９６ウェルプレートにおいて感染前２４時間にわたって接種した。細胞を、漸増濃度のペプチド（またはコントロールとしてのＤＭＳＯ）の存在下において２型デング熱に曝した。ウイルスおよびペプチドを、感染の２時間後に洗い流した。上清を、感染後３日毎に回収し、そして蛍光病巣アッセイのために、新鮮なＶｅｒｏ細胞に添加した。新規に感染したＶｅｒｏ細胞を、３日後に４％ホルムアミドによって固定した。次いで、細胞を、デング熱エンベロープタンパク質に対する抗体によって染色し、次いでＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ色素に結合体化した二次抗体によって染色した。病巣を、蛍光顕微鏡を使用して数えた。
【０２５２】
図１９に示される結果は、本発明のペプチドがデング熱ウイルス感染を強力に阻害することをさらに確認する。本質的に、デング熱ウイルス感染の１００％の阻害は、２０μＭの濃度において観察された（図１９）。
【０２５３】
（実施例１４−ペプチド１は、西ナイルウイルス感染に対して強力な抗ウイルス活性を有する）
この研究において、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）（フラビウイルス属）に対するペプチド１の活性を、調べた。Ａ５４９細胞に、１０２ＰＦＵ／ｍＬ〜１０５ＰＦＵ／ｍＬのＷＮＶ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ株）を、０．５％  ＤＭＳＯまたはペプチド１（０．５％  ＤＭＳＯ中の最終濃度１８μＭ）の存在下で感染させた。３７℃におけるインキュベーションの３日後、その細胞を、固定し、そしてＷＮＶタンパク質を検出するために免疫ペルオキシダーゼ染色に供した。結果（図２０）は、ＤＭＳＯによって処理した、１０５ＰＦＵ／ｍＬを伴う細胞単一層がほぼ完全に破壊され、そしてより低い力価のウェル中の細胞全てがＷＮＶタンパク質を発現したことを示す。対照的に、ペプチド処理細胞における単一層は、インタクトであり、そしてＷＮＶタンパク質は、ほとんど検出されないか、または全く検出されなかった。特に、ＷＮＶタンパク質の染色強度は、ウイルス接種材料の用量にかかわらず、感染していないネガティブコントロールウェルと同じであった。これらの結果は、ペプチド１（配列番号４３）がＷＮＶ感染に対する強力な抗ウイルス活性を有することを示す。
【０２５４】
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５．Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．＆Ｓｅｅｆｆ，Ｌ．Ｂ．（２０００）Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０，１７−３５。
６．Ｔｈｉｍｍｅ，Ｒ．，Ｏｌｄａｃｈ，Ｄ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｃ．，Ｒａｙ，Ｓ．Ｃ．＆Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４，１３９５−１４０６。
７．Ｔａｋａｋｉ，Ａ．，Ｗｉｅｓｅ，Ｍ．，Ｍａｅｒｔｅｎｓ，Ｇ．，Ｄｅｐｌａ，Ｅ．，Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｕ．，Ｌｉｅｂｅｔｒａｕ，Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｌ．，Ｍａｎｎｓ，Ｍ．Ｐ．＆Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，５７８−５８２。
８．Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｆ．，Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｋ．，Ｄｕｎｂａｒ，Ｐ．Ｒ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｒ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｔ．，Ｄｏｈｒｅｎｗｅｎｄ，Ｐ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｇ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．，Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｐ．＆Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，１４９９−１５１２。
９．Ｌｏｇｖｉｎｏｆｆ，Ｃ．，Ｍａｊｏｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｏｌｄａｃｈ，Ｄ．，Ｈｅｙｗａｒｄ，Ｓ．，Ｔａｌａｌ，Ａ．，Ｂａｌｆｅ，Ｐ．，Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．，Ａｌｔｅｒ，Ｈ．，Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．＆ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，Ｊ．Ａ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１０１４９−１０１５４。
１０．Ｓｈｏｕｋｒｙ，Ｎ．Ｈ．，Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．，Ｓｅｔｔｅ，Ａ．＆Ｗａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，４８３−４９２。
１１．Ｔｈｉｍｍｅ，Ｒ．，Ｂｕｋｈ，Ｊ．，Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｓ．，Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｇｅｒ，Ｃ．，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ．，Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．＆Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１５６６１−１５６６８。
１２．Ｂｕｋｈ，Ｊ．（２００４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９，１４６９−１４７５。
１３．Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ｙｉ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｋ．＆Ｌｅｍｏｎ，Ｓ．Ｍ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，２９９７−３００６。
１４．Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，Ｋｏｒｎｅｒ，Ｆ．，Ｋｏｃｈ，Ｊ．，Ｈｅｒｉａｎ，Ｕ．，Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ，Ｌ．＆Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，１１０−１１３。
１５．Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７，９７５−９７８。
１６．Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｈｅ，Ｙ．＆Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，６７５−６８７。
１７．Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｊ．＆Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，７７８−７８６。
１８．Ｙｅ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｓｕｍｐｔｅｒ，Ｒ．，Ｊｒ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．＆Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１５８６５−１５８７０。
１９．Ｋａｐａｄｉａ，Ｓ．Ｂ．＆Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，２５６１−２５６６。
２０．Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，Ｋｏｒｎｅｒ，Ｆ．，Ｄｏｂｉｅｒｚｅｗｓｋａ，Ａ．＆Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，１４３７−１４４９。
２１．Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．，Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ，Ａ．Ａ．＆Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，１９７２−１９７５。
２２．Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｄａｔｅ，Ｔ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｆｕｒｕｓａｋａ，Ａ．，Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅ，Ｋ．，Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．＆Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．（２００３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５，１８０８−１８１７。
２３．Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｓａｋａ，Ａ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｄａｔｅ，Ｔ．，Ｙａｓｕｉ，Ｋ．，Ｈｉｒａｍｏｔｏ，Ｊ．，Ｎａｇａｙａｍａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．＆Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．（２００１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６４，３３４−３３９。
２４．Ｄａｔｅ，Ｔ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｚｈａｏ，Ｚ．，Ｙａｓｕｉ，Ｋ．，Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．＆Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２２３７１−２２３７６。
２５．Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｄａｔｅ，Ｔ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｚｈａｏ，Ｚ．，Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．＆Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９，５９２−５９６。
２６．Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｄａｔｅ，Ｔ．＆Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．（２００４）１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ＆ｒｅｌａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ。
２７．Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．，Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｄａｔｅ，Ｔ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｚｈａｏ，Ｚ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｋ．，Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ａ．，Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．，Ｍｉｚｏｋａｍｉ，Ｍ．，Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．＆Ｌｉａｎｇ，Ｔ．Ｊ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ。
２８．Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｓｍｉｌｅｙ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｃ．＆Ｎａｉｒｎ，Ｒ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４。
２９．Ｇｅｙ，Ｇ．Ｏ．，Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｗ．Ｄ．＆Ｋｕｂｉｃｅｋ，Ｍ．Ｔ．（１９５２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２，２６４−２６５。
３０．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｂ．Ｂ．，Ｈｏｗｅ，Ｃ．Ｃ．＆Ａｄｅｎ，Ｄ．Ｐ．（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９，４９７−４９９。
３１．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ，Ｄ．，Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｏｓｅｒｔ，Ｒ．，Ｙｕａｎ，Ｚ．，Ｂｌｕｍ，Ｈ．Ｅ．，Ｇｏｆｆ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．＆Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，７４００−７４０９。
３２．Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｎ．，Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．＆Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，４６１４−４６２４。
３３．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．＆Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９。
３４．Ｋａｐａｄｉａ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｒｉｄｅａｕ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．＆Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，２０１４−２０１８。
３５．Ｈｅｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｓａｉｔｏ，Ｓ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｔ．，Ｍｏｒｅｅｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ，Ａ．，Ｃｒｕｚ，Ｂ．，Ｊｅｕｒｋａｒ，Ｎ．，Ｓａｐｐ，Ｒ．，Ｌｕｏ，Ｇ．＆Ｌｉａｎｇ，Ｔ．Ｊ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，２５７９−２５８３。
３６．Ｌｅｖｙ，Ｓ．，Ｔｏｄｄ，Ｓ．Ｃ．＆Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，８９−１０９。
３７．Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．，ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，Ｊ．Ａ．＆Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，１３００１−１３０１４。
３８．Ｂａｒｔｏｓｃｈ，Ｂ．，Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｊ．＆Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ．Ｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７，６３３−６４２。
３９．Ｈｓｕ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｆｌｉｎｔ，Ｍ．，Ｌｏｇｖｉｎｏｆｆ，Ｃ．，Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ，Ｃ．，Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．＆ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，Ｊ．Ａ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，７２７１−７２７６。
４０．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｒａｎｄａｌｌ，Ｇ．，Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｔｏｍ，Ａ．，Ｍｏｎｋ，Ｐ．，Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．＆ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，Ｊ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，１４４８−１４５５。
４１．Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．Ｋ．，Ｋａｔｏ，Ｈ．，Ｉｗａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｓｈｉｈ，Ｊ．Ｗ．，Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．，Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．＆Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ，Ｈ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，１９５３−１９５８。
４２．Ｔｒｅｓｔａｒｄ，Ａ．，Ｂａｃｑ，Ｙ．，Ｂｕｚｅｌａｙ，Ｌ．，Ｄｕｂｏｉｓ，Ｆ．，Ｂａｒｉｎ，Ｆ．，Ｇｏｕｄｅａｕ，Ａ．＆Ｒｏｉｎｇｅａｒｄ，Ｐ．（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４３，２２４１−２２４５。
４３．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｋａｕｌ，Ａ．＆Ｓｐａｒａｃｉｏ，Ｓ．（２００３）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．６０，９１−１０２。
４４．Ｂｕｋｈ，Ｊ．，Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．，Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｎ．，Ｆａｕｌｋ，Ｋ．，Ｅｎｇｌｅ，Ｒ．Ｅ．，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．，Ｓｔ  Ｃｌａｉｒｅ，Ｍ．＆Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１４４１６−１４４２１。
４５．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ａ．Ｕ．，Ｌａｍ，Ｎ．Ｐ．，Ｄａｈａｒｉ，Ｈ．，Ｇｒｅｔｃｈ，Ｄ．Ｒ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｔ．Ｅ．，Ｌａｙｄｅｎ，Ｔ．Ｊ．＆Ｐｅｒｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｓ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１０３−１０７。
４６．Ｔａｎａｋａ，Ｊ．，Ｋａｔａｙａｍａ，Ｋ．，Ｋｕｍａｇａｉ，Ｊ．，Ｋｏｍｉｙａ，Ｙ．，Ｙｕｇｉ，Ｈ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｍｉｚｕｉ，Ｍ．，Ｔｏｍｏｇｕｒｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｙ．＆Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｈ．（２００５）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４８，１２０−１２３。
４７．Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｅ．Ｇ．，Ｔｓａｍｉｓ，Ｆ．，Ｋａｊｕｍｏ，Ｆ．，Ｄｕｒｓｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｐ．＆Ｄｒａｇｉｃ，Ｔ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，７２７０−７２７４。
４８．Ｓｕｍｐｔｅｒ，Ｒ．，Ｊｒ．，Ｌｏｏ，Ｙ．Ｍ．，Ｆｏｙ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｋ．，Ｙｏｎｅｙａｍａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｌｅｍｏｎ，Ｓ．Ｍ．＆Ｇａｌｅ，Ｍ．，Ｊｒ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９，２６８９−２６９９。
４９．Ｙｏｎｅｙａｍａ，Ｍ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｎａｔｓｕｋａｗａ，Ｔ．，Ｓｈｉｎｏｂｕ，Ｎ．，Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｔａｉｒａ，Ｋ．，Ａｋｉｒａ，Ｓ．＆Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．（２００４）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，７３０−７３７。
５０．Ｍｂｏｗ，Ｍ．Ｌ．＆Ｓａｒｉｓｋｙ，Ｒ．Ｔ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，３９５−３９９。
【０２５５】
本明細書中で参照または言及された全ての特許および刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示し、そしてそれぞれのそのような参照された特許または刊行物は、あたかも、その全体が個別に参考として援用されているかまたはその全体が本明細書中に示されているかのように、本明細書によって参考として援用される。出願人は、任意のそのような列挙された特許または刊行物からの任意および全ての資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を保有する。
【０２５６】
本明細書中に記載される特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表し、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定として意図されない。他の対象、局面、および実施形態は、本明細書の検討の際に当業者が想起し、そして特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神の範囲内に包含される。種々の置換および改変が本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書中に開示された本発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかである。本明細書中に十分に例示として記載された本発明は、必須であるとして本明細書中に具体的に開示されない任意の要素または制限の非存在下において実施され得る。本明細書中に十分に記載された方法およびプロセスは、異なる順序の工程において実施され得、そしてその方法およびプロセスは、本明細書中に示される工程または特許請求の範囲における工程の順序に必ずしも制限されない。本明細書中添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうではないことを明確に示さない限り複数形を含む。したがって、例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、複数のそのような抗体（例えば、抗体の溶液または一連の抗体調製物）などを含む。いかなる場合においても、本明細書中に具体的に開示される特定の実施例または実施形態あるいは方法に限定されると解釈されることはない。いかなる場合においても、あらゆる審査官あるいは特許商標局の当局者または職員によって行われたあらゆる陳述が出願人による応答書面において具体的に、かつ明確に留保または限定を伴わずに採用されない限り、本特許は、そのような陳述によって限定されると解釈される可能性はない。
【０２５７】
使用された用語および表現は、説明の用語として使用され、かつ限定の用語として使用されず、示され、そして記載された特徴の任意の等価物またはその部分を除外する意図は、そのような用語および表現の使用において存在せず、種々の改変は特許請求されるような本発明の範囲内であり得ることが、認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書中に開示された概念の必要応じた特徴、改変およびバリエーションが、当業者によって用いられ得ること、ならびにそのような改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内であると見なされることが、理解されるべきである。
【０２５８】
本発明は、本明細書中に広範かつ一般的に記載されている。包括的な開示内に含まれるより狭義の種およびより包括的ではないグループ分けの各々はまた、本発明の部分を形成する。これは、削除される材料が本明細書中に具体的に記載されるか否かにかかわらず、類概念から任意の対象を除去する但し書きまたは消極的な限定を伴う本発明の一般的な説明を含む。
【０２５９】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴および局面が、マーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本発明もまた、それによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載されることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１Ａは、感染性Ｃ型肝炎ビリオンがゲノムＪＦＨ−１  ＲＮＡによるトランスフェクション後に産生されることを示す。細胞内ＲＮＡ増幅は、ＪＦＨ−１  ＲＮＡの産生を検出するために使用された。１０マイクログラムのインビトロで転写されたＪＦＨ−１  ＲＮＡは、４ｘ１０６個のＨｕｈ−７．５．１細胞中にエレクトロポレーションされた。トランスフェクト細胞および上清は、トランスフェクション後の示された日に回収された。全細胞ＲＮＡは、ＪＦＨ−１発現についてリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析され、そして１μｇの全ＲＮＡあたりのゲノム等価物（線）として示された。上清の感染価は、ナイーブＨｕｈ−７．５．１細胞において決定され、そして１ｍＬあたりのフォーカス形成単位（ｆｆｕ）（バー）として示された。図１Ｂは、ＪＦＨ−１  ウイルスゲノムがトランスフェクション後に活発に複製され、インビトロで転写された野生型（ｗｔ）ＪＦＨ−１およびポリメラーゼ変異体（ＧＮＤ）ＪＦＨ−１の完全長ゲノムＲＮＡがＨｕｈ−７．５．１細胞中にエレクトロポレーションされたことをさらに確認する。細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡは、その後の異なる時点にてモニタリングされた。示される通り、野生型ウイルスＲＮＡは、１日目〜２日目において僅かに増加し、次いで４日目に１０倍減少した。次いで細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡレベルは、１μｇの全細胞ＲＮＡあたり１０７コピーを上回って再度上昇し、そしてその実験の残りにわたって維持された。対照的に、ポリメラーゼ−欠損変異体ＪＦＨ／ＧＮＤ  ＲＮＡの細胞内レベルは、トランスフェクション後に迅速に数桁減少し、そして２０日目に検出不可能になった。これらの結果は、野生型ＪＦＨ−１  ＲＮＡがＨｕｈ−７．５．１細胞において活発に複製していたことを示す。図１Ｃは、ゲノムＪＦＨ−１  ＲＮＡのＨｕｈ−７．５．１細胞へのリポフェクタミントランスフェクション後における、ＨＣＶ複製および感染性ウイルスの産生の動態を示す。Ｈｕｈ−７．５．１細胞は、ＪＦＨクローンＲＮＡを用いて、リポフェクションによってトランスフェクトされ、そして細胞および上清は、それぞれ、その上清中の細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡおよび感染価を分析するために定期的に回収された。グラフは、ＨＣＶ  ＲＮＡの蓄積を、その上清中の１μｇの全ＲＮＡあたりのＧＥ（線）およびウイルス力価（ｆｆｕ／ｍＬ）（バー）として示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、ゲノムＪＦＨ−１  ＲＮＡによるトランスフェクション後の感染細胞の検出を示す。ＨＣＶ感染は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質の細胞免疫蛍光によって検出された。図２Ａは、トランスフェクション後５日目におけるＮＳ５Ａの発現を示す。図２Ｂは、トランスフェクション後２４日目におけるＮＳ５Ａの発現を示す。図２Ｃは、ＪＦＨ−１  ＲＮＡトランスフェクトＨｕｈ−７．５．１細胞から回収された希釈されていない上清への曝露後の、ナイーブ細胞におけるＮＳ５Ａの発現を示す。図２Ｄは、ＪＦＨ−１  ＲＮＡトランスフェクトＨｕｈ−７．５．１細胞から回収された上清の１：１０希釈物への曝露後の、ナイーブ細胞におけるＮＳ５Ａの発現を示す。ＮＳ５Ａ−ポジティブ細胞は、オリジナルにおいて赤色として検出された（オリジナルのいくつかのコピーにおいてより明るく光るスポットとして見られる）。細胞核は、Ｈｏｅｓｃｈｔ色素によって染色された（オリジナルにおいて青色、コピーにおいてより暗いスポット）。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｄは、組織培養細胞におけるＨＣＶ感染動態および継代を示す。ナイーブＨｕｈ  ７．５．１細胞は、培養上清を０．０１のＭＯＩにて接種された。接種された細胞由来の上清は、感染後の示された時点において回収され、そして感染性（ｆｆｕ／ｍＬ）について評価された。データは、２回以上の実験の平均をエラーバーを伴って示す。図３Ａは、ＪＦＨ−１ゲノムＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによるＨｕｈ−７．５．１細胞のトランスフェクションの１９日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（円の印）、またはリポフェクションの２４日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（菱形の印）を示す。ｘ軸は、上清の接種後の日数で時間を示す。図３Ｂは、図３Ａ中の菱形の印で示された感染から５日目に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価を示す。図３Ｃ〜図３Ｄは、そのデータが図３Ａに示される（菱形の印）感染から５日目に回収された上清を使用する場合、ＮＳ５Ａ免疫染色が感染後５日目（図３Ｃ）および感染後７日目（図３Ｄ）にＨｕｈ−７．５．１細胞において増加することを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｄは、組織培養細胞におけるＨＣＶ感染動態および継代を示す。ナイーブＨｕｈ  ７．５．１細胞は、培養上清を０．０１のＭＯＩにて接種された。接種された細胞由来の上清は、感染後の示された時点において回収され、そして感染性（ｆｆｕ／ｍＬ）について評価された。データは、２回以上の実験の平均をエラーバーを伴って示す。図３Ａは、ＪＦＨ−１ゲノムＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによるＨｕｈ−７．５．１細胞のトランスフェクションの１９日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（円の印）、またはリポフェクションの２４日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（菱形の印）を示す。ｘ軸は、上清の接種後の日数で時間を示す。図３Ｂは、図３Ａ中の菱形の印で示された感染から５日目に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価を示す。図３Ｃ〜図３Ｄは、そのデータが図３Ａに示される（菱形の印）感染から５日目に回収された上清を使用する場合、ＮＳ５Ａ免疫染色が感染後５日目（図３Ｃ）および感染後７日目（図３Ｄ）にＨｕｈ−７．５．１細胞において増加することを示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｄは、組織培養細胞におけるＨＣＶ感染動態および継代を示す。ナイーブＨｕｈ  ７．５．１細胞は、培養上清を０．０１のＭＯＩにて接種された。接種された細胞由来の上清は、感染後の示された時点において回収され、そして感染性（ｆｆｕ／ｍＬ）について評価された。データは、２回以上の実験の平均をエラーバーを伴って示す。図３Ａは、ＪＦＨ−１ゲノムＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによるＨｕｈ−７．５．１細胞のトランスフェクションの１９日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（円の印）、またはリポフェクションの２４日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（菱形の印）を示す。ｘ軸は、上清の接種後の日数で時間を示す。図３Ｂは、図３Ａ中の菱形の印で示された感染から５日目に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価を示す。図３Ｃ〜図３Ｄは、そのデータが図３Ａに示される（菱形の印）感染から５日目に回収された上清を使用する場合、ＮＳ５Ａ免疫染色が感染後５日目（図３Ｃ）および感染後７日目（図３Ｄ）にＨｕｈ−７．５．１細胞において増加することを示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｄは、組織培養細胞におけるＨＣＶ感染動態および継代を示す。ナイーブＨｕｈ  ７．５．１細胞は、培養上清を０．０１のＭＯＩにて接種された。接種された細胞由来の上清は、感染後の示された時点において回収され、そして感染性（ｆｆｕ／ｍＬ）について評価された。データは、２回以上の実験の平均をエラーバーを伴って示す。図３Ａは、ＪＦＨ−１ゲノムＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによるＨｕｈ−７．５．１細胞のトランスフェクションの１９日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（円の印）、またはリポフェクションの２４日後に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価（菱形の印）を示す。ｘ軸は、上清の接種後の日数で時間を示す。図３Ｂは、図３Ａ中の菱形の印で示された感染から５日目に回収された上清によって接種されたＨｕｈ−７．５．１細胞の感染価を示す。図３Ｃ〜図３Ｄは、そのデータが図３Ａに示される（菱形の印）感染から５日目に回収された上清を使用する場合、ＮＳ５Ａ免疫染色が感染後５日目（図３Ｃ）および感染後７日目（図３Ｄ）にＨｕｈ−７．５．１細胞において増加することを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅ〜図３Ｆは、ＨＣＶ感染の間におけるウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の産生をさらに示す。Ｈｕｈ−７．５．１細胞は、０．０１のＭＯＩにて感染され、そして細胞抽出物は、ＲＮＡ分析およびタンパク質分析のために、表示された時点において調製された。図３Ｅは、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡの量（線）および上清の感染価（バー）をグラフで示す。図３Ｆは、電気泳動で分離された細胞タンパク質のウェスタンブロットの画像である。示される通り、細胞内のＨＣＶコアおよびＮＳ３タンパク質は、感染が進行するにつれて蓄積した。
【図３Ｆ】図３Ｅ〜図３Ｆは、ＨＣＶ感染の間におけるウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の産生をさらに示す。Ｈｕｈ−７．５．１細胞は、０．０１のＭＯＩにて感染され、そして細胞抽出物は、ＲＮＡ分析およびタンパク質分析のために、表示された時点において調製された。図３Ｅは、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡの量（線）および上清の感染価（バー）をグラフで示す。図３Ｆは、電気泳動で分離された細胞タンパク質のウェスタンブロットの画像である。示される通り、細胞内のＨＣＶコアおよびＮＳ３タンパク質は、感染が進行するにつれて蓄積した。
【図３Ｇ】図３Ｇは、細胞上清において産生されたＨＣＶウイルスがナイーブＨｕｈ−７細胞によって連続的に継代され得ることを示すグラフである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、ＨＣＶ感染が抗Ｅ２抗体および抗ＣＤ８１抗体によって阻害されることを示す。図４Ａは、抗Ｅ２抗体の効果を示す。ＪＦＨ−１ウイルスは、Ｈｕｈ−７．５．１．細胞を接種するために使用される前に、示された濃度の抗Ｅ２抗体または関係のないヒトＩｇＧ１抗体と一緒に３７℃にて１時間プレインキュベートされた。全細胞ＲＮＡは、感染後３日目に定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析された。図４Ｂは、抗ＣＤ８１抗体の効果を示す。Ｈｕｈ−７．５．１細胞は、ＪＦＨ−１ウイルスによる０．３のＭＯＩにおける接種前に、示された濃度の抗ヒトＣＤ８１抗体またはコントロールマウスＩｇＧ１抗体と一緒に３７℃にて１時間プレインキュベートされた。全細胞ＲＮＡは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって感染後３日目に分析された。
【図５】図５は、感染性ＨＣＶのスクロース勾配沈降を示す。感染Ｈｕｈ−７．５．１細胞からの上清は、実施例１に記載されるように分画された。画分（１〜９）は、その勾配の上部から回収され、そしてＨＣＶ  ＲＮＡについて定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析された（線）。各画分の感染性は、力価決定によって決定された（バー）。画分の密度は、ｇ／ｍＬとして示される。
【図６】図６は、Ｈｕｈ−７．５．１細胞およびＨｕｈ−７細胞におけるＪＦＨ−１  ＨＣＶ感染の動態を示す。Ｈｕｈ−７．５．１において産生されたウイルスストックは、Ｈｕｈ−７．５．１細胞およびＨｕｈ−７細胞に０．０１のＭＯＩにて感染させるために希釈された。培養上清は、示された時間において回収され、そして力価決定された。Ｈｕｈ−７．５．１細胞（実線）およびＨｕｈ−７細胞（破線）における感染の力価は、ｆｆｕ／ｍＬとして示される。２つの独立した感染実験の平均値が、示される。
【図７】図７は、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡがＨｕｈ−７．５．１感染細胞およびＨｕｈ−７感染細胞において蓄積することを示す。全ＲＮＡは、図６に記載された感染Ｈｕｈ−７．５．１細胞および感染Ｈｕｈ−７細胞から単離された。感染Ｈｕｈ−７．５．１（実線）および感染Ｈｕｈ−７（破線）における細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡの蓄積は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された。その結果は、２つの独立した感染（ｎ＝２）の１μｇの全ＲＮＡあたりの平均ゲノム等価物（ＧＥ）として示される。
【図８】図８は、インターフェロンによるＨＣＶ感染の阻害をグラフで示す。４万５千個のＨｕｈ−７．５．１細胞は、プレートされ、そして５ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬおよび５００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＦＮα−２ａおよびヒトＩＦＮγによって６時間処理され、次いで同じ用量のＩＦＮの存在下において、組換えＪＦＨ−１ウイルスを０．３のＭＯＩにて接種された。そのウイルス接種材料は、４時間後に除去され、そしてその細胞は、インターフェロンと一緒に３日間わたってさらに培養された。その時点で、細胞が、回収され、ＲＮＡが、単離され、そして細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを決定するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析された。バーは、コントロール感染において得られたレベルの％として表される細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡレベルをを示す。その結果は、両方のインターフェロンがＨＣＶ感染を効率的に阻害することを示す。
【図９】図９は、ＨＣＶポリタンパク質遺伝子型１ａ（配列番号１を有するＨ７７単離株）に関するペプチドの位置および対応する抗ＨＣＶ活性を示す。試験された１３個のペプチドは、感染性を９０％以上阻害した。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、配列ＳＷＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ（配列番号４３）を有するペプチド１は、それがＨＣＶと一緒に細胞に添加された場合にＨＣＶ感染を持続的に予防し（図１０Ａ）、そして進行中のＨＣＶ感染を廃絶し（図１０Ｂ）、３００ｎＭのＥＣ５０を有すること（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）を、グラフで示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、配列ＳＷＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ（配列番号４３）を有するペプチド１は、それがＨＣＶと一緒に細胞に添加された場合にＨＣＶ感染を持続的に予防し（図１０Ａ）、そして進行中のＨＣＶ感染を廃絶し（図１０Ｂ）、３００ｎＭのＥＣ５０を有すること（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）を、グラフで示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、配列ＳＷＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ（配列番号４３）を有するペプチド１は、それがＨＣＶと一緒に細胞に添加された場合にＨＣＶ感染を持続的に予防し（図１０Ａ）、そして進行中のＨＣＶ感染を廃絶し（図１０Ｂ）、３００ｎＭのＥＣ５０を有すること（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）を、グラフで示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、配列ＳＷＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ（配列番号４３）を有するペプチド１は、それがＨＣＶと一緒に細胞に添加された場合にＨＣＶ感染を持続的に予防し（図１０Ａ）、そして進行中のＨＣＶ感染を廃絶し（図１０Ｂ）、３００ｎＭのＥＣ５０を有すること（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）を、グラフで示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、種々の合成ペプチド（図１１Ａ）によるＨｕｈ−７．５．１細胞へのＨＣＶ接着の阻害を示す結果であり；ペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞と一緒にプレインキュベートされる場合（「ＰＲＥ」）または細胞がウイルスに曝された後に添加される場合（「ＰＯＳＴ」）よりも、そのペプチドがウイルスと一緒に標的細胞に添加される場合（「ＣＯ」）に最も有効であり（図１１Ｂ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、ウイルスの感染性を完全に廃絶し（図１１Ｃ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、合計のウイルスＲＮＡ含量を少なくとも３倍減少させ（ウイルスの溶解を示す）（図１１Ｄ、ここで左のパネルは、ＨＣＶ  ＲＮＡを示し、そして右のパネルは、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを示す）；ウイルスとペプチドとのプレインキュベーションは、感染性を完全に廃絶し、そして全ての画分のウイルスＲＮＡ含量を約４〜５倍減少させる（Ｅ）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、種々の合成ペプチド（図１１Ａ）によるＨｕｈ−７．５．１細胞へのＨＣＶ接着の阻害を示す結果であり；ペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞と一緒にプレインキュベートされる場合（「ＰＲＥ」）または細胞がウイルスに曝された後に添加される場合（「ＰＯＳＴ」）よりも、そのペプチドがウイルスと一緒に標的細胞に添加される場合（「ＣＯ」）に最も有効であり（図１１Ｂ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、ウイルスの感染性を完全に廃絶し（図１１Ｃ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、合計のウイルスＲＮＡ含量を少なくとも３倍減少させ（ウイルスの溶解を示す）（図１１Ｄ、ここで左のパネルは、ＨＣＶ  ＲＮＡを示し、そして右のパネルは、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを示す）；ウイルスとペプチドとのプレインキュベーションは、感染性を完全に廃絶し、そして全ての画分のウイルスＲＮＡ含量を約４〜５倍減少させる（Ｅ）。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、種々の合成ペプチド（図１１Ａ）によるＨｕｈ−７．５．１細胞へのＨＣＶ接着の阻害を示す結果であり；ペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞と一緒にプレインキュベートされる場合（「ＰＲＥ」）または細胞がウイルスに曝された後に添加される場合（「ＰＯＳＴ」）よりも、そのペプチドがウイルスと一緒に標的細胞に添加される場合（「ＣＯ」）に最も有効であり（図１１Ｂ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、ウイルスの感染性を完全に廃絶し（図１１Ｃ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、合計のウイルスＲＮＡ含量を少なくとも３倍減少させ（ウイルスの溶解を示す）（図１１Ｄ、ここで左のパネルは、ＨＣＶ  ＲＮＡを示し、そして右のパネルは、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを示す）；ウイルスとペプチドとのプレインキュベーションは、感染性を完全に廃絶し、そして全ての画分のウイルスＲＮＡ含量を約４〜５倍減少させる（Ｅ）。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、種々の合成ペプチド（図１１Ａ）によるＨｕｈ−７．５．１細胞へのＨＣＶ接着の阻害を示す結果であり；ペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞と一緒にプレインキュベートされる場合（「ＰＲＥ」）または細胞がウイルスに曝された後に添加される場合（「ＰＯＳＴ」）よりも、そのペプチドがウイルスと一緒に標的細胞に添加される場合（「ＣＯ」）に最も有効であり（図１１Ｂ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、ウイルスの感染性を完全に廃絶し（図１１Ｃ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、合計のウイルスＲＮＡ含量を少なくとも３倍減少させ（ウイルスの溶解を示す）（図１１Ｄ、ここで左のパネルは、ＨＣＶ  ＲＮＡを示し、そして右のパネルは、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを示す）；ウイルスとペプチドとのプレインキュベーションは、感染性を完全に廃絶し、そして全ての画分のウイルスＲＮＡ含量を約４〜５倍減少させる（Ｅ）。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、種々の合成ペプチド（図１１Ａ）によるＨｕｈ−７．５．１細胞へのＨＣＶ接着の阻害を示す結果であり；ペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞と一緒にプレインキュベートされる場合（「ＰＲＥ」）または細胞がウイルスに曝された後に添加される場合（「ＰＯＳＴ」）よりも、そのペプチドがウイルスと一緒に標的細胞に添加される場合（「ＣＯ」）に最も有効であり（図１１Ｂ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、ウイルスの感染性を完全に廃絶し（図１１Ｃ）；ウイルスとペプチド１とのプレインキュベーションは、合計のウイルスＲＮＡ含量を少なくとも３倍減少させ（ウイルスの溶解を示す）（図１１Ｄ、ここで左のパネルは、ＨＣＶ  ＲＮＡを示し、そして右のパネルは、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを示す）；ウイルスとペプチドとのプレインキュベーションは、感染性を完全に廃絶し、そして全ての画分のウイルスＲＮＡ含量を約４〜５倍減少させる（Ｅ）。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ペプチド１のＤ形態が、完全に活性であり、そして増強した血清安定性を示すこと（Ａ）、ならびにペプチド１のＬ形態およびＤ形態のＥＣ５０が、非常に類似しており、両方とも１μＭの範囲にある（それぞれ、ＢおよびＣ）ことを示す結果である。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞、Ｈｕｈ−７．５．１細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞に対するペプチド１のＬ形態およびＤ形態の毒性（ＬＤ５０）（Ａ）；ならびにペプチド１のＬ形態およびＤ形態の溶血活性（Ｂ）を示す結果である。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞、Ｈｕｈ−７．５．１細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞に対するペプチド１のＬ形態およびＤ形態の毒性（ＬＤ５０）（Ａ）；ならびにペプチド１のＬ形態およびＤ形態の溶血活性（Ｂ）を示す結果である。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｅは、ペプチド１（配列番号４３）の両親媒性のα−ヘリックス性を示す。ペプチド１のヘリックス車輪図は、アミノ酸分布が親水性（すなわち極性）面および疎水性（すなわち非極性）面をもたらすことを示す（図１４Ａ）。円偏光二色性の結果は、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造（図１４Ｂ）を示し、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造に対するダンシル化の効果（図１４Ｃ）を示し、そしてＣ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｄ）およびＮ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｅ）のα−へリックス構造を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｅは、ペプチド１（配列番号４３）の両親媒性のα−ヘリックス性を示す。ペプチド１のヘリックス車輪図は、アミノ酸分布が親水性（極性）面および疎水性（または非極性）面をもたらすことを示す（図１４Ａ）。円偏光二色性の結果は、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造（図１４Ｂ）を示し、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造に対するダンシル化の効果（図１４Ｃ）を示し、そしてＣ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｄ）およびＮ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｅ）のα−へリックス構造を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜図１４Ｅは、ペプチド１（配列番号４３）の両親媒性のα−ヘリックス性を示す。ペプチド１のヘリックス車輪図は、アミノ酸分布が親水性（極性）面および疎水性（または非極性）面をもたらすことを示す（図１４Ａ）。円偏光二色性の結果は、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造（図１４Ｂ）を示し、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造に対するダンシル化の効果（図１４Ｃ）を示し、そしてＣ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｄ）およびＮ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｅ）のα−へリックス構造を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜図１４Ｅは、ペプチド１（配列番号４３）の両親媒性のα−ヘリックス性を示す。ペプチド１のヘリックス車輪図は、アミノ酸分布が親水性（極性）面および疎水性（または非極性）面をもたらすことを示す（図１４Ａ）。円偏光二色性の結果は、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造（図１４Ｂ）を示し、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造に対するダンシル化の効果（図１４Ｃ）を示し、そしてＣ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｄ）およびＮ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｅ）のα−へリックス構造を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜図１４Ｅは、ペプチド１（配列番号４３）の両親媒性のα−ヘリックス性を示す。ペプチド１のヘリックス車輪図は、アミノ酸分布が親水性（極性）面および疎水性（または非極性）面をもたらすことを示す（図１４Ａ）。円偏光二色性の結果は、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造（図１４Ｂ）を示し、ペプチド１のＬ−異性体およびＤ−異性体のα−へリックス構造に対するダンシル化の効果（図１４Ｃ）を示し、そしてＣ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｄ）およびＮ末端切断を有するペプチド１の改変体（図１４Ｅ）のα−へリックス構造を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｂは、一般的なリポソーム放出アッセイ（Ａ）およびペプチド１の種々の切断改変体について得られた結果（Ｂ）を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｂは、一般的なリポソーム放出アッセイ（Ａ）およびペプチド１の種々の切断改変体について得られた結果（Ｂ）を示す。これらの切断されたペプチドの配列は、表７に提供される。
【図１６】図１６は、ペプチド１が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）感染を遮断しないことを示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＥＬＩＳＡによって検出されるように、配列ＳＷＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ（配列番号４３）を有するペプチド２０２２（ペプチド１）および配列ＳＷＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬ（配列番号９２）を有するペプチド２０１３が、本質的に１００％のデング熱ウイルス感染を阻害することを示すグラフである。配列ＬＲＤＩＷＤＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ（配列番号１０７）を有するペプチド２０１７は、デング熱ウイルス感染を約８４％阻害する僅かに小さい活性を有した。
【図１８】図１８は、デング熱ウイルス抗原について細胞内で染色された細胞のＦＡＣＳ分析によって検出された、ペプチド２０２２（ペプチド１）、ペプチド２０１３、およびペプチド２０１７によるデング熱ウイルス感染の用量依存的阻害を示すグラフである。示される通り、ＦＡＣＳによって検出されたように、２０μＭの濃度において、ほぼ１００％のデング熱ウイルス感染が、ペプチド２０２２（ペプチド１）およびペプチド２０１３によって阻害された。２０μＭにおけるペプチド２０１７は、デング熱ウイルス感染を約８０％阻害する僅かに小さい活性を有した。
【図１９】図１９は、免疫蛍光アッセイによって検出されたように、ペプチド２０２２（ペプチド１）が本質的に１００％のデング熱ウイルス感染を阻害することを示すグラフである。ペプチド２０１７は、デング熱ウイルス感染を約９０％阻害する僅かに小さい活性を有した。
【図２０】図２０は、西ナイルウイルス感染を阻害することにおけるペプチド１の有効性を示すデータである。
【図１】
2009510122.tif 000049
【図２Ａ】
2009510122.tif 000050
【図２Ｂ】
2009510122.tif 000051
【図２Ｃ】
2009510122.tif 000052
【図２Ｄ】
2009510122.tif 000053
【図３Ａ】
2009510122.tif 000054
【図３Ｂ】
2009510122.tif 000055
【図３Ｃ】
2009510122.tif 000056
【図３Ｄ】
2009510122.tif 000057
【図３Ｅ】
2009510122.tif 000058
【図３Ｆ】
2009510122.tif 000059
【図３Ｇ】
2009510122.tif 000060
【図４Ａ】
2009510122.tif 000061
【図４Ｂ】
2009510122.tif 000062
【図５】
2009510122.tif 000063
【図６】
2009510122.tif 000064
【図７】
2009510122.tif 000065
【図８】
2009510122.tif 000066
【図９】
2009510122.tif 000067
【図１０Ａ】
2009510122.tif 000068
【図１０Ｂ】
2009510122.tif 000069
【図１０Ｃ】
2009510122.tif 000070
【図１０Ｄ】
2009510122.tif 000071
【図１１Ａ】
2009510122.tif 000072
【図１１Ｂ】
2009510122.tif 000073
【図１１Ｃ】
2009510122.tif 000074
【図１１Ｄ】
2009510122.tif 000075
【図１１Ｅ】
2009510122.tif 000076
【図１２】
2009510122.tif 000077
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2009510122.tif 000081
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2009510122.tif 000086
【図１６】
2009510122.tif 000087
【図１７】
2009510122.tif 000088
【図１８】
2009510122.tif 000089
【図１９】
2009510122.tif 000090
【図２０】
2009510122.tif 000091
【配列表】
2009510122000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月30日(2008.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の単離されたペプチドであって、該ペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造を有し、そして該ペプチドは、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有する、単離されたペプチド。
【請求項２】
式Ｉ〜式Ｖ：
【化１】
2009510122.tif 000092
のうちのいずれか１つを含む配列を有し、
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６およびＸａａ１８は、個別に各々、極性アミノ酸であり、そして
Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、およびＸａａ１７は、個別に各々、非極性アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
式Ｉ〜式Ｖのうちのいずれか１つのペプチドのＮ末端にペプチド結合によって結合された１４アミノ酸のペプチド配列をさらに含み、該１４アミノ酸のペプチド配列は、構造：
【化２】
2009510122.tif 000093
を有し、各Ｒｘは、個別に、極性アミノ酸であり、そして各Ｒｙは、個別に、非極性アミノ酸である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
式Ｖのカルボキシ末端にペプチド結合によって結合された１２アミノ酸の配列をさらに含み、得られたペプチドは、構造：
【化３】
2009510122.tif 000094
を有し、そして
Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１５、Ｘａａ１６、Ｘａａ１８、Ｘａａ１９、Ｘａａ２２、Ｘａａ２３、Ｘａａ２６、Ｘａａ２９、およびＸａａ３０は、個別に各々、極性アミノ酸であり、
Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ９、Ｘａａ１０、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、Ｘａａ１７、Ｘａａ２０、Ｘａａ２１、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２７、およびＸａａ２８は、個別に各々、非極性アミノ酸である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
式ＶＩのペプチドのＮ末端にペプチド結合によって結合された１４アミノ酸のペプチド配列をさらに含み、該１４アミノ酸のペプチド配列は、構造：
【化４】
2009510122.tif 000095
を有し、各Ｒｘは、個別に、極性アミノ酸であり、そして各Ｒｙは、個別に、非極性アミノ酸である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項３、４または５に記載のペプチドの少なくとも１４個の隣接したアミノ酸を含む、ペプチド。
【請求項７】
前記非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
前記非極性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
前記極性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ホモシステイン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１０】
前記極性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびリジンからなる群より選択される、請求項２〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
アルギニン、システイン、グルタメート、セリン、バリン、２個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号９２または配列番号１０２のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、２個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号９３または配列番号１０１のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシンおよび３個のトリプトファン残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号９４または配列番号１００のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシン、３個のトリプトファンおよびフェニルアラニンの残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１８】
配列番号９５または配列番号９９のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
アルギニン、システイン、グルタメート、２個のセリン、バリン、３個のアスパルテート、２個のロイシン、２個のイソロイシン、３個のトリプトファン、フェニルアラニンおよびリジンの残基からなるアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２０】
配列番号４３および配列番号９６〜配列番号９８のアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
ＥＣ５０が、約５００ｎＭ以下である、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
ＥＣ５０が、約４００ｎＭ以下である、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２３】
ＥＣ５０が、約３００ｎＭである、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２４】
配列番号４３および配列番号９１〜配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２５】
長さが１４個〜５０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の単離されたペプチドであって、該ペプチドは、配列番号４３および配列番号９１〜配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして該ペプチドは、両親媒性のα−へリックス構造を有する、単離されたペプチド。
【請求項２６】
配列番号４〜配列番号８６のうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、単離されたペプチド。
【請求項２７】
配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３７、配列番号４４、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号４８、および配列番号５３のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記アミノ酸の各々は、Ｄ−アミノ酸である、請求項１〜２８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３０】
前記アミノ酸の各々は、Ｌ−アミノ酸である、請求項１〜２８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３１】
ダンシル部分をさらに含む、請求項１〜２８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３２】
前記ウイルスは、フラビウイルス属である、請求項１〜３１のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３３】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
前記組成物は、殺菌剤である、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記組成物は、膣用クリームである、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドと、抗ウイルス因子とを含む、薬学的組合せ。
【請求項３８】
前記抗ウイルス因子は、α−インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、プレコナリル、アシクロビル、ジドブジン、ラミブジン、またはその組合せである、請求項３７に記載の薬学的組合せ。
【請求項３９】
哺乳動物細胞においてウイルス感染を予防するための組成物であって、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド、または請求項３４〜３８のいずれかに記載の薬学的組成物もしくは薬学的組合せを含み、ここで、該組成物は、該細胞と接触するために処方される、組成物。
【請求項４０】
前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ウイルスは、フラビウイルス属である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ウイルスは、西ナイルウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
哺乳類においてウイルス感染を予防するための組成物であって、有効量の請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド、または請求項３４〜３８のいずれかに記載の薬学的組成物もしくは薬学的組合せを含む、組成物。
【請求項４５】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ウイルスは、フラビウイルス属である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはデング熱ウイルスである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
体液を回収するための容器と、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドとを備える、製品。
【請求項４９】
前記容器は、回収用バッグ、チューブ、キャピラリーチューブまたはシリンジである、請求項４８に記載の製品。
【請求項５０】
前記容器は、空にされている、請求項４８に記載の製品。
【請求項５１】
生物学的安定剤をさらに備える、請求項４８に記載の製品。
【請求項５２】
前記安定剤は、抗凝固剤、保存剤、プロテアーゼインヒビター、またはその任意の組合せである、請求項５１に記載の製品。
【請求項５３】
前記抗凝固剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、シュウ酸塩、フッ化物またはその任意の組合せである、請求項５２に記載の製品。
【請求項５４】
前記保存剤は、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムである、請求項５２に記載の製品。
【請求項５５】
前記プロテアーゼインヒビターは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである、請求項５２に記載の製品。
【請求項５６】
前記ペプチドおよび／または安定剤は、凍結乾燥される、請求項５１に記載の製品。
【請求項５７】
哺乳類の身体由来のサンプルと、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチドとを含む、組成物。
【請求項５８】
生物学的安定剤をさらに含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記安定剤は、抗凝固剤、保存剤、プロテアーゼインヒビター、またはその任意の組合せである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記抗凝固剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、シュウ酸塩、フッ化物またはその任意の組合せである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記保存剤は、ホウ酸、ギ酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
前記プロテアーゼインヒビターは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６３】
前記サンプルは、血液製剤である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６４】
前記血液製剤は、血漿、血小板、白血球または幹細胞である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記抗ウイルス活性は、殺ウイルス活性である、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６６】
長さが１４個〜４０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６７】
長さが１４個〜３０個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６８】
長さが１４個〜２５個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６９】
長さが１４個〜１８個のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である、請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７０】
請求項３、４または５に記載のペプチドの１４個の隣接したアミノ酸である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項７１】
ＥＣ５０が、約１μＭ以下である、請求項１〜２０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７２】
哺乳類においてウイルス感染を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜３３のいずれかに記載のペプチド、または請求項３４〜３８のいずれかに記載の薬学的組成物もしくは薬学的組合せを含む、組成物。
【請求項７３】
前記ペプチドまたは前記薬学的組成物は、局所投与のために処方される、請求項３９、請求項４４または請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ウイルスは、フラビウイルス科のメンバーである、請求項３９、請求項４４または請求項７２に記載の組成物。
【国際調査報告】
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