(57)【要約】【課題】細胞ベースの組成物、および、逆免疫反応（例えば、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、移植片対宿主病、もしくは、移植組織の拒絶反応）を抑制するために、それらを使用する方法を開示する。【解決手段】  組成物および方法は、分娩後由来細胞（例えば、胎盤もしくは臍に由来する細胞）を利用する。【選択図】図３
2009519978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法において、
細胞組成物を、前記逆免疫反応を抑制するために有効な量で、前記移植受容者に投与することを含み、
前記細胞組成物は、
製薬上許容できるキャリアと、
実質的に血液を含まないヒト分娩後組織に由来する分娩後由来細胞と、
を含み、
前記細胞は、培養中で自己再生し、増加することができ、
前記細胞は、成長のためにＬ−バリンを要求し、約５％から少なくとも約２０％までの酸素を含む空気中で成長することができ、
前記細胞は、以下の特徴、
（ａ）培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力があること、
（ｂ）コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであって、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備えること、
（ｃ）組織因子、ビメンチン、および、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｄ）CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2、HLA-A、HLA-B、および、HLA-Cのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｅ）フローサイトメトリーによって検出されたときに、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、HLA-DR、HLA-DP、および、HLA-DQのうちの少なくとも１つを産生していないこと、
（ｆ）interleukin 8、
reticulon 1、
chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 3、および、
tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｇ）C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activation-induced)、
Wilms tumor 1、
aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2、
renin、
oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1、
Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, partial cds、
protein kinase C, zeta、
hypothetical protein DKFZp564F013、
downregulated in ovarian cancer 1、および、
Homo sapiens mRNA; and cDNA DKFZp547K1113 (from clone DKFZp547K1113)
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｈ）線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、
short stature homeobox 2、
heat shock 27kDa protein 2、
chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、
elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、
mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、
sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、
crystallin, alpha B、
dishevelled associated activator of morphogenesis 2、
DKFZP586B2420 protein、
similar to neuralin 1、
tetranectin (plasminogen binding protein)、
src homology three (SH3) and cysteine rich domain、
B-cell translocation gene 1, anti-proliferative、
cholesterol 25-hydroxylase、
runt-related transcription factor 3、
hypothetical protein FLJ23191、
interleukin 11 receptor, alpha、
procollagen C-endopeptidase enhancer、
frizzled homolog 7 (Drosophila)、
hypothetical gene BC008967、
collagen, type VIII, alpha 1、
tenascin C (hexabrachion)、
iroquois homeobox protein 5、
hephaestin、
integrin, beta 8、
synaptic vesicle glycoprotein 2、
Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、
cytokine receptor-like factor 1、
potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、
integrin, alpha 7、
DKFZP586L151 protein、
transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、
sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、
KIAA1034 protein、
early growth response 3、
distal-less homeobox 5、
hypothetical protein FLJ20373、
aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、
biglycan、
fibronectin 1、
proenkephalin、
integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、
Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、
EphA3、
KIAA0367 protein、
natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、
hypothetical protein FLJ14054、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、
vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、
BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、
AE binding protein 1、
cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)、
neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、および、
insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa
のうちの少なくとも１つについて減少すること、
（ｉ）MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、および、TIMP1のうちの少なくとも１つを分泌すること、ならびに、
（ｊ）ELISAによって検出されたときに、TGF-beta 2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、および、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌していないこと、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項２】
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための製薬組成物において、
製薬上許容できるキャリアと、
前記移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における前記逆免疫反応を抑制するために有効な量の、請求項１の前記分娩後由来細胞と、
を含む、製薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、移植片対宿主病である、製薬組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、前記移植された組織の拒絶反応である、製薬組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の製薬組成物において、
前記分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせである、製薬組成物。
【請求項６】
請求項２に記載の製薬組成物において、
注射もしくは注入によって投与されるために処方される、製薬組成物。
【請求項７】
請求項２に記載の製薬組成物において、
前記移植受容者に埋め込まれる装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与されるために処方される、製薬組成物。
【請求項８】
請求項２に記載の製薬組成物において、
少なくとも約５０％の分娩後由来細胞を含む、製薬組成物。
【請求項９】
請求項２に記載の製薬組成物において、
実質的に同質な分娩後由来細胞の集団を含む、製薬組成物。
【請求項１０】
請求項２に記載の製薬組成物において、
少なくとも１つの他の細胞型を含む、製薬組成物。
【請求項１１】
請求項２に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの他の薬剤を含む、製薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の製薬組成物において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、もしくは、抗アポトーシス薬のうちの１つ以上である、製薬組成物。
【請求項１３】
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するためのキットにおいて、
製薬上許容できるキャリアと、
請求項１の前記分娩後由来細胞の集団と、
前記逆免疫反応を抑制するための方法で、前記キットを使用するための使用説明書と、
を含む、キット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキットにおいて、
前記分娩後由来細胞を培養するための、少なくとも１つの試薬および使用説明書を、更に含む、キット。
【請求項１５】
請求項１３に記載のキットにおいて、
少なくとも１つの他の細胞型の集団を、更に含む、キット。
【請求項１６】
請求項１３に記載のキットにおいて、
前記逆免疫反応を抑制するための、少なくとも１つの他の薬剤を、更に含む、キット。
【請求項１７】
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法において、
分娩後由来細胞によって生成された馴化培地、分娩後由来細胞から生成された細胞溶解物、分娩後由来細胞から生成された可溶性細胞区画、もしくは、分娩後由来細胞を含む細胞外マトリックスのうちの１つ以上を含む組成物を、患者に投与することを含み、
前記分娩後由来細胞は、実質的に血液を含まないヒト分娩後組織に由来し、培養中で自己再生し、増加することができ、
前記細胞は、成長のためにＬ−バリンを要求し、約５％から少なくとも約２０％までの酸素を含む空気中で成長することができ、
前記細胞は、以下の特徴、
（ａ）培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力があること、
（ｂ）コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであって、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備えること、
（ｃ）組織因子、ビメンチン、および、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｄ）CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2、HLA-A、HLA-B、および、HLA-Cのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｅ）フローサイトメトリーによって検出されたときに、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、HLA-DR、HLA-DP、および、HLA-DQのうちの少なくとも１つを産生していないこと、
（ｆ）interleukin 8、
reticulon 1、
chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 3、および、
tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｇ）C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activation-induced)、
Wilms tumor 1、
aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2、
renin、
oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1、
Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, partial cds、
protein kinase C, zeta、
hypothetical protein DKFZp564F013、
downregulated in ovarian cancer 1、および、
Homo sapiens mRNA; and cDNA DKFZp547K1113 (from clone DKFZp547K1113)
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｈ）線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、
short stature homeobox 2、
heat shock 27kDa protein 2、
chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、
elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、
mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、
sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、
crystallin, alpha B、
dishevelled associated activator of morphogenesis 2、
DKFZP586B2420 protein、
similar to neuralin 1、
tetranectin (plasminogen binding protein)、
src homology three (SH3) and cysteine rich domain、
B-cell translocation gene 1, anti-proliferative、
cholesterol 25-hydroxylase、
runt-related transcription factor 3、
hypothetical protein FLJ23191、
interleukin 11 receptor, alpha、
procollagen C-endopeptidase enhancer、
frizzled homolog 7 (Drosophila)、
hypothetical gene BC008967、
collagen, type VIII, alpha 1、
tenascin C (hexabrachion)、
iroquois homeobox protein 5、
hephaestin、integrin, beta 8、
synaptic vesicle glycoprotein 2、
Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、
cytokine receptor-like factor 1、
potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、
integrin, alpha 7、
DKFZP586L151 protein、
transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、
sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、
KIAA1034 protein、
early growth response 3、
distal-less homeobox 5、
hypothetical protein FLJ20373、
aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、
biglycan、
fibronectin 1、
proenkephalin、
integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、
Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、
EphA3、
KIAA0367 protein、
natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、
hypothetical protein FLJ14054、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、
vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、
BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、
AE binding protein 1、
cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)、
neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、および、
insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa
のうちの少なくとも１つについて減少すること、
（ｉ）MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、および、TIMP1のうちの少なくとも１つを分泌すること、ならびに、
（ｊ）ELISAによって検出されたときに、TGF-beta 2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、および、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌していないこと、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１８】
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための製薬組成物において、
製薬上許容できるキャリアと、
前記移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における前記逆免疫反応を抑制するために有効な量の、請求項１７の前記組成物と、
を含む、製薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、移植片対宿主病である、製薬組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、前記移植された組織の拒絶反応である、製薬組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の製薬組成物において、
前記分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせである、製薬組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の製薬組成物において、
注射もしくは注入によって投与されるために処方される、製薬組成物。
【請求項２３】
請求項１８に記載の製薬組成物において、
前記移植受容者に埋め込まれる装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与されるために処方される、製薬組成物。
【請求項２４】
請求項１８に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの他の薬剤を含む、製薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の製薬組成物において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、もしくは、抗アポトーシス薬のうちの１つ以上である、製薬組成物。
【請求項２６】
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するためのキットにおいて、
製薬上許容できるキャリアと、
請求項１７の前記組成物と、
前記逆免疫反応を抑制するための方法で、前記キットを使用するための使用説明書と、
を含む、キット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のキットにおいて、
前記逆免疫反応を抑制するための、少なくとも１つの他の薬剤を、更に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本願は、２００５年１２月１６日に出願された、米国特許仮出願第６０／７５１，３９５号に対する利益を主張するものであり、参照によりそれらの内容全体を本願に組み入れる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、移植免疫学の分野に関する。特に、本発明は組織適合性不適合の提供者と被移植者との間の組織移植において、逆免疫反応を抑制することのできる分娩後組織に由来する細胞、および、このような分娩後組織に由来する細胞を、移植受容者における拒絶反応を回避し、移植片対宿主病を防止するために用いるための方法に関する。
【０００３】
〔発明の背景〕
特許、公開特許公報、技術文献、および、学術文献を含む様々な刊行物は、明細書全体を通じて引用される。これらの引用された出版物のそれぞれは、参照によりその内容全体が本願に組み入れる。
【０００４】
組織移植は、様々な疾患、病状、および、外傷を治療するために指示される。毎年何千もの移植が実施されるが、米国では約９０，０００人の者が、組織・臓器の移植待機リスト上に自身の名前を見出すのみである。利用可能な移植組織の不足に貢献することは、移植提供者と移植受容者との間の適合性のために、包括的に必要である。
【０００５】
移植提供者と被移植者の適合性は、主に、主要組織適合性複合体(major histocompatibility complex)（MHC）に起因する。MHCは、細胞表面上で発現する糖タンパク質をコードする。これらの糖タンパク質は、ヒトでは、ヒト白血球抗原(human leukocyte antigen)（HLA）と呼ばれ、自己と非自己とを区別する免疫系の能力において、中心的な役割を果たす［Thorsby E et al. (2004) Transplant Proc. 36 (2Suppl): 16S-21S］。HLA分子の主な分類が３つ（HLA-A、HLA-B、HLA-DR）存在し、それらの組はハプロタイプと呼ばれる［Bradley B (1991) Immunol Lett 29: 55-59；および、Schreuder GM et al. (1999) Tissue Antigens, 54: 490-437］。ヒトでは、１つのハプロタイプがそれぞれの親から遺伝する。
【０００６】
HLA分子の各グループは、高度に多型的である［Turner D (2004) Vox Sang. 87 Suppll: 87-90］。このように、HLA発現の高い変異性は、親が同じ兄弟間にでさえ存在する［Jeras M (2002) Transpl. Immunol. 10: 205-14］。このHLA発現の高い変異性は、移植の目的に対して問題となる。なぜならば、移植提供者と被移植者との間のHLA不適合性はいずれも、移植組織の拒絶反応を促進するだろうからである［Petersdorf EW (2004) Curr. Op. Hematol. 11: 386-391］。
【０００７】
HLA不適合性に起因する他の問題は、移植片対宿主病(graft versus host disease)（GVHD）である。GVHDは一般的に、移植宿主の組織を攻撃できる免疫担当細胞を移植された組織が含むような例で起こる。骨髄移植(bone marrow transplantation)（BMT）、および、造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation)（HSCT）は、この点で特に問題である。なぜならば、これらの細胞は一般的に、免疫担当細胞で構成され、免疫担当細胞を生成することができるからである［Iwasaki T (2004) Clin. Med. Res. 2: 243-252］。
【０００８】
BMTおよびHSCTは、様々な血液病および免疫疾患に対して指示されるが、HSCTはますます好まれる方法である。しかしながら、HSCT患者の生存および全体的な健康に対する障害のうちの１つは、GVHDおよび関連する合併症である［Morishima Y et al. (2002) Blood. 99: 4200-4206］。移植の失敗もしくは生存、そして、移植受容者がGVHDを発症する危険があるかどうかにおいて、HLA適合性は、重要な役割を果たしている［Davies SM (2000) Blood 96: 4096-41002；および、Dickinson AM et al. (2005) Curr. Opin. Immunol. 17: 517-525］。
【０００９】
GVHDおよび移植組織の拒絶反応を回避するために、移植受容者は、生涯にわたる免疫抑制治療に耐えなければならない。多くの抗拒絶反応薬剤治療は、移植患者に重度の副作用をもたらし、その免疫抑制効果は、患者を日和見感染および特定のがんに対して脆弱にさせることがある。したがって、組織移植の飛躍的進歩は、GVHDおよび移植組織の拒絶反応のような、移植受容者における逆免疫反応(adverse immune response)を抑制するための手段を提供するだろう。その手段は、伝統的な方法の全身免疫抑制法よりも重度の副作用および合併症をあまり有することがなく、伝統的な方法の全身免疫抑制法を含まないものであるだろう。
【００１０】
〔発明の概要〕
本発明の１つの態様は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法を特色とする。その方法は、細胞組成物を逆免疫反応を抑制するために有効な量でその移植受容者に投与することを含み、その細胞組成物は、製薬上許容できるキャリアと、実質的に血液を含まないヒト分娩後組織に由来する分娩後由来細胞とを含み、その細胞は、培養中で自己再生し増加することができ、その細胞は、成長のためにＬ−バリンを要求し、約５％から少なくとも約２０％までの酸素を含む空気中で成長することができ、そして、その細胞は、以下の特徴、
（ａ）培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力があること、
（ｂ）コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであって、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備えること、
（ｃ）組織因子、ビメンチン、および、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｄ）CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2、HLA-A、HLA-B、および、HLA-Cのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｅ）フローサイトメトリーによって検出されたときに、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、HLA-DR、HLA-DP、および、HLA-DQのうちの少なくとも１つを産生していないこと、
（ｆ）interleukin 8、reticulon 1、chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、chemokine (C-X-C motif) ligand 3、および、tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｇ）C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activation-induced)、Wilms tumor 1、aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2、renin、oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1、Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, partial cds、protein kinase C, zeta、hypothetical protein DKFZp564F013、downregulated in ovarian cancer 1、および、Homo sapiens mRNA; and cDNA DKFZp547K1113 (from clone DKFZp547K1113)のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｈ）線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、short stature homeobox 2、heat shock 27kDa protein 2、chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、crystallin, alpha B、dishevelled associated activator of morphogenesis 2、DKFZP586B2420 protein、similar to neuralin 1、tetranectin (plasminogen binding protein)、src homology three (SH3) and cysteine rich domain、B-cell translocation gene 1, anti-proliferative、cholesterol 25-hydroxylase、runt-related transcription factor 3、hypothetical protein FLJ23191、interleukin 11 receptor, alpha、procollagen C-endopeptidase enhancer、frizzled homolog 7 (Drosophila)、hypothetical gene BC008967、collagen, type VIII, alpha 1、tenascin C (hexabrachion)、iroquois homeobox protein 5、hephaestin、integrin, beta 8、synaptic vesicle glycoprotein 2、Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、cytokine receptor-like factor 1、potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、integrin, alpha 7、DKFZP586L151 protein、transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、KIAA1034 protein、early growth response 3、distal-less homeobox 5、hypothetical protein FLJ20373、aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、biglycan、fibronectin 1、proenkephalin、integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367 protein、natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、hypothetical protein FLJ14054、Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、AE binding protein 1、cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)、neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、および、insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDaのうちの少なくとも１つについて減少すること、
（ｉ）MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、および、TIMP1のうちの少なくとも１つを分泌すること、ならびに、
（ｊ）ELISAによって検出されたときに、TGF-beta 2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、および、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌していないこと、
のうちの少なくとも１つを含む。
【００１１】
いくつかの実施態様では、逆免疫反応は移植片対宿主病であるが、他の実施態様では、逆免疫反応は移植組織の拒絶反応である。分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせであってもよい。様々な実施態様では、細胞組成物は、注射もしくは注入によって投与され、または、移植受容者に埋め込まれる装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与されてもよい。
【００１２】
いくつかの実施態様では、細胞組成物は少なくとも約５０％の分娩後由来細胞を含む。他の実施態様では、細胞組成物は実質的に同質な分娩後由来細胞の集団を含む。ある実施態様では、細胞は少なくとも１つの他の細胞型とともに投与される。他の細胞型は、分娩後由来細胞と同時に、分娩後由来細胞の前に、もしくは、分娩後由来細胞の後に投与されてもよい。ある実施態様では、細胞は、逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの薬剤とともに投与される。他の薬剤は、分娩後由来細胞と同時に、分娩後由来細胞の前に、もしくは、分娩後由来細胞の後に投与されてもよい。他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調節薬、もしくは、抗アポトーシス薬を１つ以上含んでもよい。
【００１３】
本発明の他の態様は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための製薬組成物を特色とする。その製薬組成物は、製薬上許容できるキャリアと、上記の分娩後由来細胞の、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における逆免疫反応を抑制するために有効な量とを含む。
【００１４】
いくつかの実施態様では、逆免疫反応は移植片対宿主病であるが、他の実施態様では、逆免疫反応は移植組織の拒絶反応である。分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせであってもよい。様々な実施態様では、製薬組成物は、注射もしくは注入による投与のために処方され、または、移植受容者に埋め込まれる装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによる投与のために処方されてもよい。
【００１５】
いくつかの実施態様では、製薬組成物は少なくとも約５０％の分娩後由来細胞を含む。他の実施態様では、細胞組成物は実質的に同質な分娩後由来細胞の集団を含む。ある実施態様では、製薬組成物は、少なくとも１つの他の細胞型、もしくは、逆免疫反応を治療するための少なくとも１つの他の薬剤を含む。他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調節薬、もしくは、抗アポトーシス薬を１つ以上含んでもよい。
【００１６】
本発明の他の態様は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するためのキットを特色とする。そのキットは、製薬上許容できるキャリアと、上記の分娩後由来細胞の集団と、逆免疫反応を抑制するための方法でキットを使用するための使用説明書とを含む。キットはまた、分娩後由来細胞を培養するための、少なくとも１つの試薬および使用説明書、少なくとも他の１つの細胞型、または、逆免疫反応を抑制するための、少なくとも１つの他の薬剤のうち、１つ以上を含んでもよい。
【００１７】
本発明の他の態様は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法を特色とする。その方法は、上記の分娩後由来細胞によって生成された馴化培地、上記の分娩後由来細胞から生成された細胞溶解物、上記の分娩後由来細胞から生成された可溶性細胞区画、もしくは、上記の分娩後由来細胞を含む細胞外マトリックスのうちの１つ以上を含む組成物を、患者に投与することを含む。
【００１８】
本発明の更に他の態様は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための製薬組成物を特色とする。その製薬組成物は、製薬上許容できるキャリアと、上記の馴化培地、細胞溶解物、可溶性細胞区画、もしくは、細胞外マトリックスの、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するために有効な量とを含む。
【００１９】
本発明の更に他の態様は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するためのキットを特色とする。そのキットは、製薬上許容できるキャリアと、馴化培地、細胞溶解物、可溶性細胞区画、もしくは、細胞外マトリックスを含む上記の組成物と、逆免疫反応を抑制するための方法で、キットを使用するための使用説明書とを含む。
【００２０】
本発明の他の特色および利点は、以下の図面、詳細な説明、および、実施例から理解されるだろう。
【００２１】
〔例示的な実施形態の詳細な説明〕
本発明に係る方法および他の態様に関係する様々な用語が、明細書および特許請求の範囲全体に用いられる。このような用語は、他に指示しない限り、本分野における通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本願で提示された定義と一致する方法で解釈されるべきである。
【００２２】
以下の略号が、明細書および実施例で用いられてもよい。PPDC：分娩後由来細胞(postpartum-derived cells)、UDC：臍由来細胞(umbilicus-derived cells)、PDC：胎盤由来細胞(placental-derived cells)、MHC：主要組織適合性複合体(major histocompatibility complex)、HLA：ヒト白血球抗原(human leukocyte antigen)、BMT：骨髄移植(bone marrow transplantation)、HSCT：造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation)、GVHD：移植片対宿主病(graft versus host disease)。
【００２３】
「幹細胞」は、自己再生し、子孫細胞を産生するために分化する単一細胞の能力によって規定される未分化の細胞であり、その細胞は、自己再生性前駆細胞、非再生性前駆細胞、および、最終分化細胞を含む。幹細胞はまた、試験管内（in vitro）で多様な胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へと分化する能力によっても特徴付けられるし、移植後、多様な胚葉組織を生じ、胚盤胞注入後、すべてとは限らないが、実質的にほとんどの組織に対して貢献する能力によっても特徴付けられる。
【００２４】
幹細胞は、分化能に応じて、（１）「分化全能性(totipotent)」、（２）「分化万能性(pluripotent)」、（３）「分化多能性(multipotent)」、（４）「複分化性(oligopotent)」、（５）「単分化性(unipotent)」に分類される。「分化全能性」細胞は、すべての胚細胞型と胚外細胞型とを生じさせることができる。「分化万能性」細胞は、すべての胚細胞型を生じさせることができる。「分化多能性」細胞は、細胞系統の部分集団であるが、特定の組織、臓器、もしくは、生理系内にあるすべての細胞を生じさせることができるものを含む［例えば、造血幹細胞(hematopoietic stem cell)（HSC）は、（自己再生性の）HSC、血液細胞制限複分化性前駆体(blood cell-restricted oligopotent progenitors)、および、血液の正常成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫細胞を産生することができる］。「複分化性」である細胞は、分化多能性幹細胞よりも、更に限定された細胞系統の部分集団を生じさせることができ、「単分化性」である細胞は、単一細胞系統（例えば、精原幹細胞）を生じさせることができる。
【００２５】
幹細胞はまた、それらを入手することができる源に基づいて、類別される。「成熟幹細胞」は概して、多様に分化した細胞型を含む組織で見出される分化多能性の未分化細胞である。成熟幹細胞は、それ自体で再生することができる。通常環境下では、成熟幹細胞はまた、起源した組織の特殊化した細胞型、および、可能であれば他の組織型を生産するために分化することができる。「胚幹細胞」は、胚盤胞段階の胚の内細胞塊由来の分化万能性細胞である。「胎生」幹細胞は、胎生組織もしくは胎膜起源の細胞である。「分娩後幹細胞(postpartum stem cells)」は、出生後利用可能な胚外組織、すなわち、胎盤および臍帯から、実質的に起源した分化多能性細胞、もしくは、分化万能性細胞である。これらの細胞は、急速増殖および多くの細胞系統への分化能を含む、分化万能性幹細胞を特徴付ける特色を有すことが見出されてきた。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から入手される細胞）であってもよいし、もしくは、非血液由来（例えば、臍帯および胎盤の、非血液組織から入手される細胞）であってもよい。
【００２６】
「胚組織」は、一般的に、胚起源の組織として定義される（ヒトでは、受精から発生約６週までの時期をいう）。「胎生組織」は、胎児起源の組織をいい、ヒトでは、発生約６週から出産までの時期をいう。「胚外組織」は、胚もしくは胎児からは生じないが、それらに関連した組織である。胚外組織は、胚外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、尿膜）、臍帯、および、胎盤（絨毛膜および母体基底脱落膜から胎盤自身を形成する）を含む。
【００２７】
「分化」は、非特殊化された（「確定されていない」）細胞、もしくは、あまり特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞もしくは筋細胞のような、特殊化された細胞の特色を獲得する過程である。「分化」細胞は、細胞系統内で、より特殊化された（「確定された」）地位につく細胞である。用語「確定された」は、分化の過程に適用される場合、通常環境下で、特有の細胞型もしくは特有の細胞型の部分集団へと分化し続けるだろう時点まで、そして、通常環境下で、異なる細胞型へと分化することができず、もしくは、あまり分化していない細胞に戻ることができない時点まで、分化経路を継続してきた細胞をいう。「脱分化」は、細胞が、細胞系統内であまり特殊化されていない（すなわち、確定されていない）地位に戻る過程をいう。本願で用いられるように、細胞「系統」は、細胞の遺伝的性質、すなわち、細胞がどの細胞に由来したか、どんな細胞を生じさせることができるか、を規定する。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキーム内に、その細胞を配置する。
【００２８】
広義には、「前駆細胞」は、それ自身よりも更に分化した子孫を生み出す能力を有し、更に、前駆細胞の集合を補充する能力を保持する細胞である。その定義によると、幹細胞自身はまた、最終分化細胞のまさに直接の前駆体であるため、前駆細胞でもある。本発明に係る細胞についていえば、以下により詳細に説明するように、この広義の前駆細胞の定義が用いられることがある。より狭義には、前駆細胞はしばしば、分化経路における中間体として定義される。すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じ、成熟した細胞型もしくは細胞型の部分集団の産生における中間体である。この型の前駆細胞は概して、自己再生することができない。したがって、この型の細胞について本願で言及する場合、「非自己再生性前駆細胞」あるいは「中間前駆細胞」もしくは「中間前駆体細胞」と呼ばれるだろう。
【００２９】
用語「抑制」は、移植された提供組織に対する移植受容者の適応性免疫反応において観察されるのと同様に、移植受容者に対する移植提供組織の適応性免疫反応、すなわち、移植片対宿主病、において観察される逆免疫的な事象の低減についていう。
【００３０】
本発明の細胞は概して、「分娩後細胞」もしくは「分娩後由来細胞（PPDC）」と呼ばれる。それらはまた、時折、更に具体的に、「臍由来細胞（UDC）」もしくは「胎盤由来細胞（PDC）」と呼ばれてもよい。その上、その細胞は、幹細胞もしくは前駆細胞であるとして説明されてもよく、後者の用語は広義に用いられる。用語「由来した」は、細胞がその生物学的源から入手され、増殖され、もしくは別に試験管内（in vitro）で操作されてきた（例えば、成長培地において、集団を増加し、および／もしくは、細胞株を産生するために、培養されてきた）ことを示すために用いられる。本発明の、臍幹細胞の試験管内（in vitro）操作、および、臍由来細胞独特の特色は、以下に詳細に説明される。
【００３１】
様々な用語が培養中の細胞を説明するために用いられる。「細胞培養」は概して、生きている生物から採取された細胞、および、制御条件下（「培養中で」もしくは「培養された」）で成長した細胞をいう。「初代細胞培養」は、生物から直接採取された細胞、組織、もしくは、臓器を、最初の二次培養前に培養することである。細胞成長および／もしくは細胞分裂を促進する条件下の成長培地に置かれた場合、細胞は培養中で「増加」し、その結果、より大きな細胞集団が形成される。細胞が培養中で増加した場合、細胞増殖率は時折、細胞が数において倍加するために必要な時間の長さによって測定される。これを「倍加時間」と呼ぶ。
【００３２】
「細胞株」は、初代細胞培養の１回以上の二次培養によって形成された細胞集団である。二次培養の各期間は、「継代」と呼ばれる。細胞が二次培養される場合、その細胞は「継代された」と呼ばれる。特有の細胞集団、すなわち、細胞株は、時折、継代されてきた回数で呼ばれ、その回数によって特徴付けられる。例えば、１０回継代されてきた培養細胞集団は、「P10」培養と呼ばれる。初代培養、すなわち、組織から細胞単離後の最初の培養は、P0と表される。最初の二次培養後、細胞は２番目の培養（P1、すなわち、１代継代）と呼ばれる。２番目の二次培養後、細胞は３番目の培養（P2、すなわち、２代継代）になる、等。継代期間中、多くの集団倍加が存在するかもしれないことが、当業者には理解されるだろう。なぜならば、培養物の集団倍加数は、その継代数よりも多くなるからである。継代の間の期間中、細胞の増加（すなわち、集団倍加数）は、多くの要因に依存する。その要因は、限定されないが、接種密度、基質、培地、成長条件、および、継代の間の時間を含む。
【００３３】
「馴化培地」は、特有の細胞もしくは細胞集団が培養されきて、その後、除去される培地である。細胞が培地中で培養される場合、他の細胞に栄養的な補助を提供することのできる細胞因子を分泌するかもしれない。このような栄養因子は、限定されないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス(extracellular matrix)（ECM）、タンパク質、小胞、抗体、および、小粒を含む。細胞因子を含む培地が馴化培地である。
【００３４】
「成長培地」は概して、PPDCを培養するために十分な培地についていう。特に、本発明の細胞を培養するために、現在好ましい１つの培地は、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Media)（「DMEM」）を含む［ダルベッコ最小必須培地(Dulbecco's Minimal Essential Media)としても知られる］。特に好まれるのは、DMEM低グルコース(DMEM-low glucose)（本願では「DMEM-LG」とも表す）（Invitrogen, Carlsbad, CA）である。DMEM低グルコースは、好ましくは、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（例えば、規定ウシ胎仔血清；Hyclone, Logan, UT）、抗生物質および抗真菌薬（好ましくは、ペニシリン ５０〜１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン ５０〜１００μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ ０〜０．２５ｍｇ／ｍＬ；Invitrogen, Carlsbad, CA）、ならびに、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Sigma, St. Louis, MO）が補完される。
【００３５】
用語「標準成長条件」は、CO2 ５％を含む湿気た標準的な空気中、３７℃で、細胞を培養することをいう。このような条件は培養に有用であるが、細胞を培養するために本分野において利用できる選択肢を十分に理解できるだろう当業者によって、この条件は変更されうることが理解されるべきである。
【００３６】
概して、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖、および／もしくは、成熟を推進し、または、細胞の活性を高めるよう刺激する物質として定義される。
【００３７】
培養された脊椎動物細胞について言及する場合、用語「老化」（「複製老化」もしくは「細胞老化」）は、有限の細胞培養に起因する特性、すなわち、集団倍加の有限数を超えて成長することができないこと（時折、「ヘイフリック限界」と呼ばれる）についていう。細胞老化は、最初に線維芽様細胞を用いて説明されたが、培養中で首尾よく成長することができる正常なヒト細胞型のほとんどが、細胞老化を経験する。異なる細胞型の試験管内（in vitro）の寿命は変化するが、最大寿命は一般的に、１００回の集団倍加より少ない（これは、培養中で、老化し、それゆえ培養物が分裂できないようになったすべての細胞に対する倍加数のことである）。老化は経過時間に依存しないが、むしろ細胞分裂数、すなわち、培養物が経験してきた集団倍加数によって測定される。したがって、必須成長因子を除去することによって休眠した細胞は、成長因子を再導入する場合に、成長し分裂することが推測されるし、その後、継続的に成長した細胞と同等に、同数の倍加を実行する。同様に、様々な数の集団倍加後、細胞を液体窒素で凍結し、その後解凍し培養した場合、それらの細胞は、培養中で未凍結のまま維持された細胞と実質的に同数の倍加を経験する。老化細胞は死んでいる細胞でも、死につつある細胞でもない。それらの細胞は実はプログラム細胞死（アポトーシス）に耐えているし、３年間は分裂しない状態で維持されてきた。これらの細胞は、まさに生存しており、代謝的には活性であるが、分裂しない。老化細胞の非分裂状態は、いかなる生物学的因子、化学的因子、あるいは、ウイルス性因子によっても元に戻らないことが知られている。
【００３８】
用語「有効な量」は、本願において特定の生物学的結果を達成するために有効であることが説明される、化合物、材料、もしくは、組成物の、濃度もしくは量をいう。このような結果は、限定されないが、移植提供組織に対する移植受容者の適応性免疫反応を抑制すること、移植片対宿主病の抑制、および、移植拒絶反応の抑制と同様に、移植受容者に対する移植された提供組織の適応性免疫反応を抑制することを含む。このような有効な活性は、例えば、本発明の細胞、および／もしくは、組成物を、被移植者に投与することによって達成されるかもしれない。生体内（in vivo）で患者に投与されるようなPPDCに関して、有効な量は、数百個以下の範囲から、数百万個以上の範囲までであるかもしれない。具体的な実施態様では、有効な量は、１０３〜１０１１個の範囲であってよいし、更に具体的には、少なくとも約１０４個の細胞であってもよい。投与される細胞数は、治療されるべき疾患の特質に応じて変化するだろう。その特質は、限定されないが、治療されるべき領域の位置に対する投与部位の近さと同様に、治療されるべき大きさ、もしくは、全体量／表面積を含むことが、当業者に正しく理解されるだろう。
【００３９】
用語「有効な期間（もしくは、有効な時間）」および「有効な条件」は、意図された結果を達成するための薬剤もしくは製薬組成物に対して、必要とされ、好まれる、期間もしくは他の制御可能条件（例えば、試験管内（in vitro）法のための温度、湿度）についていう。
【００４０】
「適応免疫性」もしくは「適応性免疫反応」は、本願では、ほとんど同じ意味で、広義に用いられ、抗原投与に対する免疫反応についていう。その免疫反応は、免疫記憶の発達を含む。適応性免疫反応は、限定されないが、液性免疫および細胞免疫を含む。
【００４１】
「液性免疫」もしくは「液性免疫反応」は、本願では、ほとんど同じ意味で用いられ、抗原投与に対する反応における、免疫グロブリン分子の産生についていう。
【００４２】
「細胞免疫」、「細胞免疫反応」もしくは「細胞性免疫」は、本願では、ほとんど同じ意味で用いられ、抗原投与に対する反応における、細胞障害性Ｔリンパ球もしくはヘルパーＴリンパ球、単核球、および、サイトカインの、産生、活性化、ならびに／または、増殖についていう。その用語は、抗体に未感作な患者には転移することができない、適応性免疫すべてを包含する。
【００４３】
「先天性免疫」は、特定の抗原の追加投与によって高まらない、抗原投与に対して抵抗性を示す体の非特異的なメカニズムについていう。
【００４４】
用語「患者」もしくは「被験体」は、本願では、ほとんど同じ意味で用いられ、哺乳類、望ましくは、本願で説明される薬剤組成物で治療される、もしくは、本願で説明される方法にしたがって治療される、ヒトを含む動物についていう。
【００４５】
用語「提供者」もしくは「移植提供者」は、本願では、ほとんど同じ意味で用いられ、他の生物に移植される細胞源もしくは組織源である、任意の生物についていう。用語「被移植者」もしくは「移植受容者」は、本明細書では、ほとんど同じ意味で用いられ、提供者から移植される組織を受け取る、任意の生物についていう。
【００４６】
「組織適合性不適合」は、移植受容者の組織に対する移植細胞もしくは移植組織による免疫反応を引き出すことがあり、移植細胞もしくは移植組織に対する移植受容者による免疫反応を引き出すことがあり、ならびに／または、結果的に移植組織の拒絶反応もしくは移植片対宿主病を起こすことがある、移植提供者と移植受容者の間の組織適合性抗原における任意の相違についていう。
【００４７】
「拒絶反応」は、結果的に移植物の成長もしくは活力を低減させ、あるいは、移植物が生存することができないような、移植細胞もしくは移植組織に対する任意の免疫反応についていう。
【００４８】
「移植片対宿主病（GVHD）」は、本願では、広義に用いられ、反応の深刻度もしくは期間にかかわらず、そして、移植受容者が本分野において認識されるGVHDの臨床上の兆候のいずれかを発症しているかどうかにかかわらず、移植受容者の細胞もしくは組織に対する移植提供者由来の細胞もしくは組織による、任意の免疫反応についていう。
【００４９】
用語「製薬上許容できるキャリア（もしくは、培地）」は、本願では、「生物学上適合性のあるキャリアもしくは培地」とほとんど同じ意味で用いられ、治療上投与される細胞および他の薬剤と適合性があるだけではなく、合理的な損益率に見合った、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、もしくは、他の合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触させて用いるのに、健全な医学的判断の範囲内で適した試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／もしくは、剤形についていう。本願でより詳細に説明されるように、本発明で使用されるために適した製薬上許容できるキャリアは、液体材料、半固体材料（例えば、ゲル）、および、固体材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チューブシート、ならびに、本分野において知られ、本願においてより詳細に説明される他の材料）を含む。このような半固体材料および固体材料は、体内での分解に耐えるように設計されてもよいし（「非生分解性」）、体内で分解するように設計されてもよい（「生分解性」、「生侵食性(bioerodable)」）。生分解性材料は、更に「生吸収性(bioresorbable)」もしくは「生体吸収性(bioabsorbale)」であってもよい。すなわち、体液中に溶解され、吸収されてもよいし（水溶性インプラントは一例である）、他の材料への変換、もしくは、天然経路を通じた分解、排出のいずれかによって、最終的に体から排出されてもよい。
【００５０】
本願では、様々な用語が、細胞移植もしくは組織移植に関して用いられる。用語「自家移転(autologous transfer)」「自家移植」、「自家移植片」および同様の用語は、移植提供者が移植受容者でもある移植についていう。用語「同種移転(allogeneic transfer)」、「同種移植」、「同種移植片」および同様の用語は、移植提供者が、移植受容者と同じ種であるが、同じ個体ではない移植についていう。提供者の細胞が被移植者と組織適合性適合である細胞移植は、時折、「同系移転(syngeneic transfer)」と呼ばれる。用語「異種移転(xenogeneic transfer)」、「異種移植」、「異種移植片」および同様の用語は、移植提供者が移植受容者と異なる種である移植についていう。
【００５１】
本願で説明された方法にしたがって、哺乳類の胎盤および臍帯を、満期妊娠もしくは早産妊娠のいずれかの分娩中、または、分娩直後に（例えば、後産後に）回収する。フラスコ、ビーカー、培養皿、袋といった滅菌容器で、分娩後組織を、分娩室から研究所に輸送してもよい。容器は、溶液もしくは培地を有してもよく、限定されないが、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、ダルベッコ最小必須培地とも呼ばれる）、リン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline)（PBS）のような食塩水、もしくは、ウィスコンシン大学溶液、ペルフルオロ化合物溶液のような、移植用の臓器輸送に対して用いられるあらゆる溶液を含む。限定されないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、および、ナイスタチンのような、１つ以上の抗生物質、および／もしくは、抗真菌薬を、培地もしくはバッファーに加えてもよい。ヘパリン含有溶液のような抗凝血溶液で、分娩後組織をすすいでもよい。PPDC抽出に先立って、組織を約４〜１０℃に保つことが好ましい。PPDC抽出に先立って、組織を凍結しないことが、更により好ましい。
【００５２】
好ましくは、PPDC単離は無菌環境で行う。本分野において知られる手段によって、胎盤から臍帯を分離してもよい。または、臍帯および胎盤を分離することなく用いる。好ましくは、PPDC単離に先立って、血液および壊死組織片を分娩後組織から除去する。例えば、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水のようなバッファー溶液で、分娩後組織を洗浄してもよい。洗浄バッファーは、限定されないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンのような、１つ以上の抗真菌剤、および／もしくは、抗生物質を含んでもよい。
【００５３】
胎盤全体、または、その断片もしくは部分を含む分娩後組織を、機械的な力（刻む力、もしくは、せん断力）によって、ばらばらにしてもよい。現在好まれる実施態様では、単離手法は、酵素的消化過程をも利用する。本分野では、培養中で成長を促進するために、複合組織マトリックスから個々の細胞を単離するために有用な多くの酵素が知られている。弱い消化酵素［例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、中性プロテアーゼのディスパーゼ(dispase)］から強い消化酵素（例えば、パパイン、トリプシン）にまで及び、このような酵素は市販されている。本願に相性のよい酵素の限定的な一覧は、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、もしくは、エラスターゼ）、および、デオキシリボヌクレアーゼを含む。現在好まれるものは、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、粘液溶解活性から選択される酵素活性である。例えば、コラーゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離するために有用なことが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖DNAを消化することができ、単離中に、細胞凝集を最小にすることができる。好まれる方法は、例えば、コラーゲナーゼおよびディスパーゼ、もしくは、コラーゲナーゼ、ディスパーゼ、および、ヒアルロニダーゼによる酵素処理を伴い、ある好まれる実施態様において、このような方法が提供される。その実施態様では、解離ステップにおいて、コラーゲナーゼ、および、中性プロテアーゼのディスパーゼの混合液が用いられる。更に好まれるのは、少なくとも１つのヒストリチクム菌(Clostridium histolyticum)由来のコラーゲナーゼ、ならびに、プロテアーゼ活性、ディスパーゼ、および、サーモリシンのいずれかの存在下での消化を採用する方法である。更により好まれるのは、コラーゲナーゼとディスパーゼ酵素活性との両方による消化を採用する方法である。また、コラーゲナーゼとディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性による消化を含む方法も好まれる。当業者は、様々な組織源から細胞を単離するために、このような多くの酵素処理が、本分野において知られていることを十分に理解するだろう。例えば、LIBERASE Blendzyme（Roche）シリーズの酵素の組み合わせは、まさにこの方法において用いられるのに適している。他の酵素源も知られており、当業者は、それらの天然源から直接このような酵素を入手してもよい。当業者は、本発明の細胞を単離するにあたって有効な、新規の、もしくは、追加的な、酵素、もしくは、酵素の組み合わせを評価するための知識も十分に備えている。好まれる酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、もしくは、それ以上である。他の好まれる実施態様では、解離ステップの酵素処理の間、３７℃で組織をインキュベーションする。
【００５４】
本発明のいくつかの実施態様では、分娩後組織を、組織の様々な態様、例えば、胎盤の、新生児の、新生児／母体の、および、母体の態様を含む切片に分離する。その後、本願で説明される方法にしたがって、機械的解離、および／もしくは、酵素的解離によって、分離された切片を解離する。本分野において知られる任意の手段、例えば、核型解析、もしくは、Ｙ染色体に対する本来の位置での（in situ）ハイブリダイゼーションによって、新生児系統、もしくは、母体系統の細胞を同定してもよい。
【００５５】
PPDCが生じる、単離細胞もしくは単離分娩後組織を、細胞培養を開始、すなわち、接種するために用いてもよい。コートされていない滅菌組織培養容器、または、細胞外マトリックスもしくはリガンド［例えば、ラミニン、コラーゲン（天然コラーゲン、変性コラーゲン、もしくは、架橋コラーゲン）、ゼラチン、フィブロネクチン、他の細胞外マトリックスタンパク質］でコートされている滅菌組織培養容器のいずれかに、単離細胞を移す。PPDCを、細胞の成長を持続することができる任意の細胞培地中で培養する。例えば、その細胞培地は、限定されないが、DMEM（高グルコース、低グルコース）、改良DMEM、DMEM/MCDB201、イーグル基本培地、ハムF10培地（F10）、ハムF12培地（F12）、ヘイフリック培地、イスコブ変法ダルベッコ培地(Iscove's modified Dulbecco's medium)、間充織幹細胞成長培地(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium)（MSCGM）、DMEM/F12、RPMI1640、CELL-GRO-FREEである。培養培地は１つ以上の成分を補ってもよい。例えば、その成分には、ウシ胎仔血清（FBS）好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）、ウマ血清(equine serum)（ES）、ヒト血清(human serum)（HS）、ウシ胎仔血清(fetal calf serum)、β−メルカプトエタノール（BME、2-ME）好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）、１つ以上の成長因子［例えば、血小板由来成長因子(platelet-derived growth factor)（PDGF）、上皮細胞成長因子(epidermal growth factor)（EGF）、線維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor)（FGF）、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor)（VEGF）、インスリン様成長因子１(insulin-like growth factor-1)（IGF-1）、白血球阻害因子(leukocyte inhibitory factor)（LIF）、および、エリスロポエチン］、Ｌ−バリンを含むアミノ酸、ならびに、微生物汚染を制御するための１つ以上の抗生物質（例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ナイスタチンの単独、もしくは、組み合わせのいずれか）を含む。培養培地は、好ましくは、実施例に規定されるような成長培地を含む。
【００５６】
細胞を培養容器中に細胞が成長できる密度で接種する。好まれる実施態様では、空気中に約０％〜約５％のＣＯ２量で、細胞を培養する。いくつかの実施態様では、空気中に約２〜２５％のO2で細胞を培養し、好ましくは、空気中約５〜２０％のＯ２である。好ましくは約２５〜約４０℃で細胞を培養し、より好ましくは３７℃で培養する。好ましくは、インキュベータ中で細胞を培養する。培養容器中の培地は、静止状態でありうるし、もしくは、例えばバイオリアクタを用いて、かき混ぜられうる。好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）、PPDCを成長させる。本願で用いられる「低酸化ストレス」は、培養細胞にフリーラジカルによる損傷を全く与えない、もしくは、損傷を最小限にする条件についていう。
【００５７】
最も適切な培養培地、培地準備、細胞培養技術を選択するための方法は、本分野において周知であり、様々な情報源で説明されている。その情報源は、Doyle et al., (eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester；および、Ho and Wang (cds.), 1991, ANIMAL CELL BlOREACTORS, Butterworth-Heinemarm, Bostonを含み、参照により本願に組み入れる。
【００５８】
単離細胞もしくは単離組織断片を十分な期間培養した後、PPDCは、分娩後組織からの細胞移動もしくは細胞分裂、あるいは、その両方の、いずれかの結果として生じるだろう。本発明のいくつかの実施態様では、PPDCを継代し、そして、最初に用いられ、細胞の集団が有糸分裂的に増加することができるような、同一の型、もしくは、異なる型の新鮮な培地を含む別々の培養容器へと除去する。本発明の細胞を、０代継代と老化との間の、任意の時点で用いてもよい。好ましくは、細胞を約３〜約２５回継代し、より好ましくは、約４〜約１２回継代する。細胞のクローン集団を単離したことを確認するために、クローニングおよび／もしくはサブクローニングを実施してもよい。
【００５９】
本発明のいくつかの態様では、分娩後組織中に存在する異なる細胞型を、PPDCを単離することのできる亜集団に分画する。このことは、細胞分離のための標準技術を用いることで達成される。その技術は、限定されないが、分娩後組織を構成細胞に解離するための酵素処理、ならびに、その後のクローニングおよび特有の細胞型の選択（例えば、限定されないが、形態マーカーおよび／もしくは生化学マーカーに基づく選択）；望まれる細胞の選択的な成長（陽性選択）、および、望ましくない細胞の破壊（陰性選択）；混合集団中の差異のある細胞凝集能に基づく分離（例えば、ダイズ凝集素による）；凍結解凍法；混合集団中での細胞の差異のある固着特性；ろ過；従来型ゾーン遠心分離；遠心分離による懸濁分離法［カウンターストリーミング遠心分離(counter-streaming centrifugation)；単位重力分離；逆流分配；電気泳動；蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)（FACS）を含む。クローン選択技術および細胞分離技術の概説については、Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 3rd Ed., Wiley-Liss, Inc., New Yorkを参照されたい。また、これは参照により本願に組み入れる。
【００６０】
必要に応じて、例えば、ピペットで、例えば、注意深く皿から培地を吸引し、新鮮な培地を補充することによって、培養培地を交換する。細胞の十分な数もしくは密度が皿中に蓄積するまで、インキュベーションを続ける。標準技術もしくは細胞スクレーパーを用いて、元々の外植組織切片を取り除いてもよいし、残りの細胞をトリプシン処理してもよい。トリプシン処理後、細胞を収集し、新鮮な培地へと除去し、上記のとおりインキュベーションする。いくつかの実施態様では、約２４時間の後トリプシン処理で少なくとも１回、任意の浮遊細胞を除去するために、培地を交換する。培養中に残っている細胞がPPDCであるとみなされる。
【００６１】
PPDCを低温保存してもよい。したがって、以下のとおり詳細に説明される好まれる実施態様では、（母か子かのいずれかについての）自家移転のためのPPDCは、子の誕生後の適切な分娩後組織に由来し、その後、移植のために後に必要とされる事象で利用可能なように、低温保存される。
【００６２】
PPDCは、例えば、成長特徴（例えば、継代から老化までの集団倍加能力、倍加時間）、核型分析（例えば、正常な核型、母体系統もしくは新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、FACS分析）、免疫組織化学および／もしくは免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出のため）、遺伝子発現プロファイリング［例えば、遺伝子チップアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写PCR、リアルタイムPCR、従来型PCR）］、タンパク質アレイ、タンパク質分泌［例えば、血漿凝固解析による、もしくは、例えば、酵素免疫測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)（ELISA）によるPDC馴化培地分析による］、混合リンパ球反応（例えば、PBMCの刺激を測定するような）、ならびに／または、本分野で知られている他の方法によって、特徴付けられてもよい。
【００６３】
胎盤組織に由来するPPDCの例は、American Type Culture Collection（ATCC；Manassas, VA）に寄託され、ATCC番号を以下のとおり割り当てられた。
（１）系統番号PLA 071003 (P8)、２００４年６月１５日寄託、ATCC番号PTA-6074
（２）系統番号PLA 071003 (P11)、２００４年６月１５日寄託、ATCC番号PTA-6075
（３）系統番号PLA 071003 (P16)、２００４年６月１６日寄託、ATCC番号PTA-6079
臍組織に由来するPPDCの例は、American Type Culture Collectionに２００４年６月１０日に寄託され、ATCC番号を以下のとおり割り当てられた。
（１）系統番号UMB 022803 (P7)、ATCC番号PTA-6067
（２）系統番号UMB 022803 (P17)、ATCC系統番号PTA-6068
【００６４】
様々な実施態様では、PPDCは以下の成長特色を１つ以上有する。
（１）培養中で、成長のためにＬ−バリンを要求すること、
（２）約５％から少なくとも約２０％の酸素を含む空気中で成長できること、
（３）老化に達する前に、培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力を有すること、
（４）コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであり、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備えること。
【００６５】
ある実施態様では、PPDCは、正常な核型を有し、細胞が継代されても維持される。核型分析は、特に、胎盤由来の母体細胞から新生児細胞を同定し区別するために有用である。核型分析の方法は、本分野の当業者には利用可能であり、知られている。
【００６６】
他の実施態様では、PPDCは、あるタンパク質の産生によって特徴付けられてもよい。それは、フローサイトメトリーで検出されるように、
（１）組織因子、ビメンチン、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生、
（２）CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2、HLA-A、HLA-B、HLA-Cという細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生、
を含む。他の実施態様では、PPDCは、フローサイトメトリーで検出されるように、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQという細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つが産生できないことによって、特徴付けられてもよい。特に好まれるのは、組織因子、ビメンチン、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも２つを産生する細胞である。より好まれるのは、組織因子、ビメンチン、α平滑筋アクチンの３つタンパク質すべてを産生する細胞である。
【００６７】
他の実施態様では、PPDCは、遺伝子発現によって特徴付けられてもよい。その遺伝子発現は、線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関係するものであり、interleukin 8、reticulon 1、chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、chemokine (C-X-C motif) ligand 3、tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3、C-type lectin, superfamily member 2、Wilms tumor 1、aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2、renin、oxidized low density lipoprotein receptor 1、Homo sapiens, clone IMAGE:4179671、protein kinase C, zeta、hypothetical protein DKFZp564F013、downregulated in ovarian cancer 1、Homo sapiens gene from clone DKFZp547K1113のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子について、発現が増加する。
【００６８】
更に他の実施態様では、PPDCは、遺伝子発現によって特徴付けられてもよい。その遺伝子発現は、線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関係するものであり、short stature homeobox 2、heat shock 27kDa protein 2、chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、crystallin, alpha B、dishevelled associated activator of morphogenesis 2、DKFZP586B2420 protein、similar to neuralin 1、tetranectin (plasminogen binding protein)、src homology three (SH3) and cysteine rich domain、cholesterol 25-hydroxylase、runt-related transcription factor 3、interleukin 11 receptor, alpha、procollagen C-endopeptidase enhancer、frizzled homolog 7 (Drosophila)、hypothetical gene BC008967、collagen, type VIII, alpha 1、tenascin C (hexabrachion)、iroquois homeobox protein 5、hephaestin、integrin, beta 8、synaptic vesicle glycoprotein 2、neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa、Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、cytokine receptor-like factor 1、potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、integrin, beta 7、transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、KIAA1034 protein、vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、early growth response 3、distal-less homeobox 5、hypothetical protein FLJ20373、aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、biglycan、transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、fibronectin 1、proenkephalin、integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367 protein、natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、hypothetical protein FLJ14054、Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、AE binding protein 1、cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子について、発現が減少する。
【００６９】
他の実施態様では、PPDCは、MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、TIMP1のうちの少なくとも１つの分泌によって特徴付けられてもよい。代替的な実施態様では、PPDCは、ELISAで検出されるように、TGF-beta2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌できないことによって、特徴付けられてもよい。
【００７０】
好まれる実施態様では、細胞は、上記の成長特徴、タンパク質／表面マーカー産生特徴、遺伝子発現特徴、もしくは、物質分泌特徴のうちの少なくとも２つ以上を含む。より好まれるものは、３つ、４つ、５つ、もしくは、それ以上の特徴を含む細胞である。更により好まれるものは、６つ、７つ、８つ、もしくは、それ以上の特徴を含むPPDCである。更に、現在より好まれるものは、上記の特徴のすべてを含む細胞である。
【００７１】
いくつかの好まれる実施態様では、PPDCは、実質的に血液を含まない臍帯組織に由来し、培養中で自己再生し、増加することができ、少なくとも神経系表現型細胞に分化する能力を有し、成長のためにＬ−バリンを要求し、少なくとも約５％の酸素中で成長でき、以下の特徴のうちの少なくとも１つを含む。その特徴とは、培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力があり；コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであり、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備え；ビメンチン、α平滑筋アクチンを産生し；CD10、CD13、CD44、CD73、CD90を産生し；線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関係する遺伝子の発現が、interleukin 8、reticulon 1をコードする遺伝子について、増加するものである。いくつかの実施態様では、このようなPPDCは、CD45、CD117を産生しない。本段落で説明されたPPDCを、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における逆免疫反応を抑制するために用いることができ、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における逆免疫反応を抑制するための製薬組成物（例えば、このような組成物は、これらの特徴を有する細胞と、製薬上許容できるキャリアとを含む）において用いることができ、そして、本願で説明され例示されるような方法や製薬組成物を製造し使用し実践するためのキットにおいて、用いることができる。その上、本段落で説明されたPPDCを、本願で説明され例示されるような方法や製薬組成物を製造し使用し実践するために用いられる馴化細胞培養培地を生成するために、用いることができる。
【００７２】
様々な態様で本発明とともに用いるのに現在好まれる細胞は、上記で説明された特性を有する分娩後細胞であり、より具体的には、正常な核型を有し、継代において正常な核型を維持し、更に、その細胞は、CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cのマーカーのそれぞれを発現し、その細胞は、列記したマーカーに対応する免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する。更により好ましいものは、前述のものに加えて、フローサイトメトリーによって検出されるような、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQのマーカーのいずれに対応するタンパク質を産生しない細胞である。
【００７３】
他の様々な態様では、本発明は、上記で説明された細胞を含む細胞集団を提供する。細胞集団は、単離細胞が提供できるよりもより多くの量の、製薬上の細胞組成物および細胞溶解物を製造することと関連して有用であるのと同様に、本発明の方法と関連して有用である。
【００７４】
好まれる集団は、約１％の分娩後由来細胞から約１０％の分娩後細胞を含む。より好まれる集団は、少なくとも約１０％の分娩後由来細胞を含む。より好まれる集団は、少なくとも約２５％の分娩後由来細胞を含む。また、いくつかの好まれる集団は、約５０％の分娩後由来細胞を含む。このような集団は、細胞が等しく密度が高く同じ割合で分裂し、もしくは、共存培養中もしくは別個の培養における培養物の増加後、集団を各培養物の約５０％に調整するような、共存培養もしくは他の培養に対して有用かもしれない。いくつかの適用について、より好ましくは、少なくとも約６５％の分娩後由来細胞を含む集団である。少なくとも約９０％の分娩後由来細胞を含む集団は、本発明のある態様で非常に好まれる。より好まれる集団は、実質的に分娩後由来細胞のみを含む。
【００７５】
集団は、分娩後由来細胞のクローン細胞株を含んでもよい。このような集団は、非常に望ましい機能性を有する細胞クローンが単離される場合に、特に有用である。本願では、新生児クローンおよび母体クローンの両方が有用であり、その両方が提供される。培養細胞からクローン細胞株を単離する方法は、本分野では知られている。
【００７６】
様々な実施態様では、本発明の方法は、分娩後細胞の集団から準備された細胞溶解物、可溶性細胞区画、膜豊富な細胞区画を利用してもよい。このような溶解物および区画は、多くの有用性がある。細胞溶解物、および、より特には可溶性細胞区画を生体内（in vivo）で用いることは、移植提供者に対して組織不適合性不適合な移植受容者に対して、リンパ球を刺激し、もしくは、他の逆免疫反応を生じさせることなく、移植組織の拒絶反応を促進することなく、そして、拒絶反応の誘因となることなく、用いられるような有利な細胞内環境を提供する。
【００７７】
細胞を溶解する方法は、本分野では周知であり、機械的破砕、酵素的破砕、化学的破砕、もしくは、その組み合わせのような様々な手段を含む。このような細胞溶解物は、成長培地、分泌された成長因子を含む培地、および同様のもの中で、直接、細胞から準備されてもよいし、または、例えば、PBSもしくは他の溶液中で培地を含まないように洗浄された細胞から準備されてもよい。成長培地中で直接、細胞から溶解物を製造するために、溶解物が用いられる生物種由来の血清中で、細胞を成長させる。いくつかの実施態様では、洗浄された細胞が好まれる。もし好ましいならば、洗浄された細胞を、元々の集団密度よりも高い濃度で再懸濁してもよい。
【００７８】
分娩後由来細胞集団から準備された細胞溶解物を用いてもよいし、更に、例えば、限外ろ過もしくは凍結乾燥によって濃縮され、あるいは、更に、乾燥され、濃縮され、部分的に精製され、本分野において知られている製薬上許容できるキャリアもしくは希釈剤と組み合わされ、または、例えば製薬上有用なタンパク質組成物といった生物学的製剤のような他の化合物と組み合わされてもよい。細胞溶解物は、試験管内（in vitro）もしくは生体内（in vivo）で用いられてもよいし、単独で、または、例えば、同系生細胞もしくは自家生細胞とともに用いられてもよい。溶解物を、もし生体内（in vivo）で導入するならば、治療部位に局所的に導入してもよいし、例えば、患者に必要とされる細胞成長因子を提供するために、離れた部位に導入してもよい。好ましくは、溶解物は免疫原性ではなく、より好ましくは、逆免疫的結果もしくは逆免疫的反応なしに、同系患者および同種患者の幅広い集団において、免疫耐性があるものである。本発明の細胞溶解物は、成長および増加のための条件下、例えば、成長培地上で成長した、任意の段階もしくは年齢の細胞由来で有用である。老化細胞でさえ、細胞溶解物の準備のために有用であり、生物学的に有用な特定の因子を提供することができる。成長不可能な細胞、あるいは、死んだ細胞、もしくは、殺された細胞でさえ、溶解物の準備および細胞区画の準備について有用性がある。
【００７９】
本発明の方法は、分娩後由来細胞、薬物化合物のような、他の治療薬、因子、もしくは、生物活性剤を含む製薬組成物をも利用することができる。このような生物活性薬は、限定されないが、抗血栓形成薬、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、免疫抑制薬もしくは免疫調整薬、および、抗酸化剤と同様に、IGF、LIF、PDGF、EGF、FGFを含む。このような組成物は、PPDCおよび生物活性成分に加えて、１つ以上の追加的な細胞型を更に含むことができる。
【００８０】
それゆえに、分娩後由来細胞と併せて、抗血栓形成薬、抗アポトーシス薬、抗炎症薬のような、他の生物学的に活性な分子は有用かもしれないし、それらを細胞とともに個々に、もしくは、２つ以上のこのような化合物もしくは薬剤と組み合わせて、順番に投与してもよいし、共に投与してもよい。例えば、抗アポトーシス薬は、プログラム細胞死を最小にするために有用かもしれない。このような薬剤は、限定されないが、EPO、EPO誘導体、EPO類似体、および、それらの塩、TPO、IGF-I、IGF-II、肝細胞成長因子(hepatocyte growth factor)（HGF）、ならびに、カスパーゼ阻害因子を含む。抗炎症薬は、限定されないが、P38 MAPキナーゼ阻害因子、スタチン、IL-6およびIL-1阻害因子、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムス、例えば、テポキサリン(Tepoxalin)、トルメチン、スプロフェンのような、非ステロイド系抗炎症化合物を含む。
【００８１】
分娩後由来細胞とともに共投与できる他の生物活性因子もしくは治療薬は、例えば、抗血栓形成因子、免疫抑制薬もしくは免疫調整薬、抗酸化剤を含む。分娩後由来細胞を、免疫抑制薬とともに共投与すること、すなわち、併用療法の１つの目的は、免疫抑制効果を補完することである。１つの実施態様では、分娩後由来細胞と免疫抑制薬の併用療法は、投与する免疫抑制薬の量を低減することができ、それによって、免疫抑制薬のみの施用に伴う望ましくない副作用を緩和することができ、一方で、同水準の生物学的効果を達成するかもしれない。他の実施態様では、分娩後由来細胞と免疫抑制薬の併用療法は、免疫抑制薬のみの治療を妨げるような、投与される免疫抑制薬量を増やすことなく、全体的な生物学的効果を増大することができるかもしれない。免疫抑制薬および免疫調整薬の例は、カルシニューリン阻害剤（例えば、スクロスポチン、タクロリムス）、mTOR阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、抗体（例えば、モノクローナル抗IL-2Rαレセプター抗体、Basiliximab、Daclizumab）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体［例えば、抗胸腺細胞グロブリン(anti-thymocyte globulin)（ATG）、抗リンパ球グロブリン(anti-lymphocyte globulin)（ALG）］、モノクローナル抗Ｔ細胞抗体OKT3を含む。本発明の細胞と併せて、治療上提供することができる抗血栓形成化合物は、例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、PPack（デキストロフェニルアラニン、プロリン、アルギニン、クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板レセプターアンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板レセプター抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、血小板阻害剤を含む。抗酸化剤は、当然本分野において周知であり、あらゆる製薬上許容できる抗酸化剤を、本発明の細胞と併せて投与してもよく、その抗酸化剤は、プロブコール、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、コエンザイムQ10、グルタチオン、Ｌシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、抗酸化剤誘導体、抗酸化剤類似体、それらの塩を含む。
【００８２】
上記に加えて、細胞に由来する構成物を、本発明の方法にしたがって用いてもよい。細胞溶解物、可溶性細胞区画、膜豊富な細胞区画が本願において、上記に詳細に説明したように提供される。例えば、基底膜を含む、細胞に由来する細胞外マトリックスも、有用であり、本願において提供される。細胞溶解物、可溶性細胞区画、膜豊富な細胞区画をすべて、適切に患者に投与することができるし、追加的な細胞もしくは細胞型とともに、もしくは、それらなしに、本願の細胞とともに共投与することができる。
【００８３】
本発明の方法はまた、本願で提供された馴化培養培地を用いることを含んでもよい。このような培地は、まず、本発明の細胞もしくは培養物を成長させるために用いられ、成長中に１つ以上の有用な産物を培地中に分泌する。これらの新規細胞由来の馴化培地は、多くの目的のために有用である。例えば、本発明の細胞および培養物によって培地中に分泌された成長因子もしくは栄養因子を必要とする他の哺乳類細胞の成長を補助すること、例えば、血管形成を促進することを含む。馴化培地を準備し保存する方法は、本分野では知られており、主に、例えば、遠心分離によって、細胞を除去することを伴う。
【００８４】
本発明は、移植において用いるための細胞組成物の他の態様を提供する。それは、製薬上許容できるキャリア、および、実質的に血液を含まない哺乳類分娩後組織に由来する分娩後由来細胞を含む。細胞は、培養中で自己再生し増加することができ、拒絶反応を抑制するために、移植された細胞もしくは組織による被移植者に対する、任意の免疫反応を抑制する能力を有し、かつ／または、被移植者による移植組織に対する任意の免疫反応を抑制する能力を有する。
【００８５】
分娩後由来細胞は、約５％から少なくとも約２０％の酸素を含む空気中で成長することができる。細胞はまた、成長のためにＬ−バリンを要求し；培養中で約４０回倍加する能力を有し：コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し増殖することであり、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、もしくは、フィブロネクチンでコートされ；組織因子、ビメンチン、α平滑筋アクチンを産生し；CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cのそれぞれを産生し；フローサイトメトリーで検出されるように、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQのいずれかを産生しない。好まれる実施態様では、細胞はヒト組織に由来する。
【００８６】
細胞組成物を、治療上、移植受容者に投与することができる。細胞組成物は、移植片対宿主病、ならびに／または、移植細胞もしくは移植組織の拒絶反応のような、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における逆免疫反応を抑制する、細胞もしくは細胞産物を含むことができる。
【００８７】
細胞組成物を、例えば、注射によって、移植受容者に投与することができる。ある実施態様では、移植位置に、もしくは、移植位置の近くに、細胞組成物を注射する。他の実施態様では、移植組織の表面上、近接した区域の中、もしくは、より離れた範囲にでさえ行ってもよい。好まれる実施態様では、細胞は移植の区域に存在することがある。特に好まれるのは、静脈内に注射され、適切に望まれる作用部位に配置することができる細胞である。
【００８８】
細胞組成物はまた、マトリックス・細胞複合体の形で提供されることができる。マトリックスは、生体適合性の足場、格子、自己集合構造および同様のもの、生体吸収性もしくはそうでないもの、液体、ゲル、あるいは、固体を含む。このようなマトリックスは、治療上の細胞治療、外科的修復、組織工学、創傷治癒の分野において知られている。好ましくは、マトリックスを細胞で前処理する。より好ましくは、マトリックスもしくはその空間と密接に関連する細胞とともに、マトリックスを投入する。いくつかの実施態様では、細胞はマトリックスに接着することができ、他の態様では、細胞は、マトリックス空間内に取り込まれ、含まれる。最も好まれるのは、細胞がマトリックスと密接に関連して成長しており、治療上用いられる場合、移植組織の成長および生存が刺激され補助され、適当な血管形成が同様に刺激され補助され、移植組織に対する移植受容者による、もしくは、被移植者に対する移植された組織によるあらゆる免疫反応が抑制される、マトリックス・細胞複合体である。マトリックス・細胞組成物は、本分野において知られている任意の方法で、患者の体に導入される。その方法は、限定されないが、埋め込み、注射、外科的付着、他の組織とともに移植、注射、および、同様のものを含む。いくつかの実施態様では、生体内（in vivo）の、もしくは、更により好ましくは、本来の位置で（in situ）のマトリックスの形態、例えば、本来の位置での（in situ）重合性ゲルを、本発明にしたがって用いることができる。このようなゲルの例は、本分野において知られている。
【００８９】
いくつかの実施態様では、分娩後由来細胞もしくはその共存培養物を、足場のような、このような三次元マトリックス上に接種してもよいし、生体内（in vivo）に埋め込んでもよい。接種された細胞は、骨格の上もしくはその中で増殖してもよいし、または、移植組織が定着する手助けをしてもよいし、そして、他の細胞とともに、もしくは、それらなしに、生体内（in vivo）で移植片対宿主反応を抑制してもよい。
【００９０】
好ましくは、三次元骨格上でのPPDCの成長もしくはその共存培養は、三次元組織の形成、すなわち、生体内（in vivo）で、例えば、被移植者に対する移植された細胞もしくは組織による任意の免疫反応を抑制するために、かつ／または、移植された細胞もしくは組織の拒絶反応を抑制するために利用されることがあるような組織の土台を、結果的に生ずる。１つの実施態様では、三次元足場は、例えば、血液脈管もしくは導管の移植に用いるための、チューブ状構造として準備されることがある。
【００９１】
本発明の１つの態様にしたがって、PPDCもしくはその共存培養物を、足場、泡、ヒドロゲルのような三次元骨格もしくはマトリックス上に、植え込み、もしくは、接種する。骨格を、概して平坦、概して円筒状、もしくは、チューブ状といった様々な形状に形成してもよいし、研究中の矯正構造として、要求され望まれるかもしれないような、完全に自由な形態であることができる。いくつかの実施態様では、PPDCは三次元構造上で成長し、一方、他の実施態様では、細胞は生存しているのみ、もしくは、死んでさえいるが、そのようにすることで、被移植者に対する移植された細胞もしくは組織による任意の免疫反応を抑制し、かつ／または、移植された細胞もしくは組織の拒絶反応を抑制する。いくつかの実施態様では、PPDCは、移植細胞もしくは移植組織の血管新生、成長、活力を促進する。
【００９２】
マトリックスを、マトリックス構造が、後の劣化なしに、PPDCもしくはその共存培養物を支持するよう設計することができ、または、マトリックスが劣化する時点で、移植物が血管新生し、それ自身で支持することができるよう設計することができる。マトリックス設計の概説は、Hutmacher, J. Biomat. Sci. Polymer Edn., 12(l): 107-124 (2001)によって提供される。
【００９３】
本願で使用するために考えられるマトリックス、足場、泡、自己集合システムを、本発明の細胞に加えて、任意の１つ以上の細胞、成長因子、薬物、もしくは、他の成分（例えば、治癒もしくは組織の成長を促進し、血管新生もしくはその神経支配を刺激し、さもなくば、治療結果もしくは本発明の実践を高め、もしくは、改良するような生物活性剤）と組み合わせて埋め込むことができる。
【００９４】
本発明の細胞は、培養中で自由に成長し、もしくは、培養から除去されて、三次元骨格上に植え込まれることができる。好ましくは、例えば、おおよそ１０６〜５×１０７細胞／ｍＬの細胞濃度での三次元骨格上への植え込みにより、結果的に、比較的短い期間での三次元的な支持が定着する。更に、いくつかの適用において、好ましくは、望まれる結果に応じて、より多い数の、もしくは、より少ない数の細胞が用いられてもよい。
【００９５】
いくつかの実施態様では、細胞が生体内（in vivo）への移植、もしくは、試験管内（in vitro）での使用に先立って成長する程度は、異なっていてもよいが、生体内（in vivo）で見られるような細胞微環境を、培養中に再現することは有用である。PPDCもしくはその共存培養物を、移植前もしくは移植後に、骨格上に植え込んでもよい。移植後の細胞の骨格上への植え込みのために、好ましくは、骨格を適切な成長培地中でインキュベーションする。インキュベーション期間中、インキュベーションされた細胞は成長し、骨格を包むだろうし、例えば、骨格の中の任意の格子空間を架橋してもよいし、部分的に架橋してもよい。
【００９６】
本発明の態様のために用いられてもよいマトリックス、例えば、足場の例は、マット（織られたもの、編まれたもの、より好ましくは、不織性のもの）、多孔性もしくは半多孔性の泡、自己集合性ペプチド、および、同様のものを含む。不織性マットは、例えば、天然ポリマー、もしくは、合成ポリマーから構成された繊維を用いて形成されてもよい。好まれる実施態様では、マットを形成するために、商用名VICRYL（Ethicon, Inc., Somerville, NJ）で販売されている、グリコール酸および乳酸吸収性コポリマー（PGA/PLA）が用いられる。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）コポリマー（PCL/PGA）から構成され、米国特許第６，３５５，６９９号に記載の、フリーズドライすなわち凍結乾燥といった工程によって形成される泡も、足場として役立ちうる。ゲルもまた、本願に用られるのに適したマトリックスである。例として、例えば、自己集合性ペプチドから構成される、本来の位置での（in situ）重合性ゲル、および、ヒドロゲルを含む。これらの材料は、組織を成長させるための支持体として頻繁に用いられる。本来の位置での形成分解性ネットワーク(in situ-forming degradable network)も、本発明において用いられるのに適している（例えば、Anseth, K.S. et al, 2002, J. Controlled Release 78: 199-209；Wang, D. et al, 2003, Biomaterials 24: 3969-3980；米国特許公開第２００２／００２２６７６号，He et al.を参照のこと）。これらの材料を、注射のために適した液体として処方し、その後、様々な手段（例えば、温度、ｐＨの変更、光照射）によって、本来の位置での（in situ）もしくは生体内（in vivo）の分解性ヒドロゲルネットワークを形成するように誘導してもよい。
【００９７】
１つの実施態様によると、骨格はフェルトであり、そのフェルトは、生体吸収性材料（例えば、PGA、PLA、PCLのコポリマー、その混合物、もしくは、ヒアルロン酸）から作られたマルチフィラメント糸から構成されうる。糸は、圧着、裁断、梳綿、穿刺から成る標準的な繊維加工技術を用いて、フェルトへと製造される。他の実施態様では、本発明の細胞を、複合構造であってもよい泡足場上へ植え込む。その上、三次元骨格を、移植を通じて、修復、置換、増補されるための、体内における特有の構造のような有用な形状に、成型してもよい。
【００９８】
本発明の細胞を植え込むに先立って、骨格を、細胞付着を高めるために処理してもよい。例えば、本発明の細胞とともに植え込むに先立って、ナイロンマトリックスを、そのナイロンをコートするために、０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、PBS、および／もしくは、コラーゲ中でインキュベーションすることができる。同様に、ポリスチレンを、硫酸を用いて処理することができる。
【００９９】
その上、三次元骨格の外側表面を、細胞の付着、もしくは、成長、組織の分化を改善するために、例えば、骨格をプラズマコーティングすることによって、もしくは、１つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ダルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、ならびに／または、他の材料（例えば、限定されないが、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、植物ゴム等）を追加することによって、修飾してもよい。
【０１００】
いくつかの実施態様では、足場を、血栓形成させない状態にするよう構成するか、血栓形成させない状態にする材料で処理する。これらの処理や材料はまた、内皮成長、細胞移動、細胞外マトリックス沈着を推進し、持続してもよい。これらの材料や処理は、限定されないが、基底膜タンパク質（例えば、ラミニン、IV型コラーゲン）のような天然材料、ePTFEやセグメント化ポリウレタンウレアシリコン［例えば、PURSPAN （The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, CA）］のような合成材料を含む。これらの材料を、足場を血栓形成させない状態にするために、更に処理することができる。このような処理は、ヘパリンのような抗血栓形成薬、プラズマコーティングのような材料の表面電荷を変化させる処理を含む。
【０１０１】
例えば、骨格上に沈着する、様々な型のコラーゲンの異なる割合は、組織特異的な細胞もしくは他の細胞の成長に影響を及ぼすことがある。それらは、後で骨格上に植え込まれてもよいし、生体内（in vivo）の構造上で成長してもよい。例えば、三次元皮膚培養システムのために、コラーゲンI型およびIII型を、好ましくは開始のマトリックス上に、沈着することができる。代わりに、望まれる適切なコラーゲン型を合成する細胞混合液を植え込むことができる。このように、培養される組織に応じて、骨格上に植え込まれる、もしくは、接種された細胞によって産生される、適切なコラーゲン型を選択してもよい。例えば、骨格上に存在する膠原線維、弾性線維の相対量を、開始の接種中の、エラスチン産生細胞に対するコラーゲン産生細胞の割合を制御することによって、調節することができる。例えば、動脈の内壁は、エラスチンが豊富なので、動脈の足場は、エラスチンを分泌する平滑筋細胞の共存培養物を含むべきである。
【０１０２】
接種される、もしくは、植え込まれた本願に係る三次元骨格を、様々な適用において用いることができる。これらは、限定されないが、マトリックスから入手された培養細胞、もしくは、生体内（in vivo）で培養されたマトリックスそれ自体のいずれかを移植し、もしくは、埋め込むことを含む。
【０１０３】
PPDCを平坦な足場上に植え込むことができる。好ましくは、埋め込みに先立って、培養培地中で、足場をインキュベーションする。多層骨格を生成するために、２つ以上の平坦な骨格を、他のものの上に横たえ、ともに縫合することができる。
【０１０４】
足場を、チューブ状臓器（例えば、肝管のような導管）の内周に概ね等しい幅の細長い切れ（例えば、長方形の形状）に、最終的にはそのチューブ状臓器の中に挿入されるように、切断することができる。細胞を足場上に植え込むことができ、液体培地に浮かべて、もしくは、懸濁して、インキュベーションすることができる。適切なコンフルエンス段階で、長い縁を接合することによって、足場をチューブ状に巻くことができる。適切な直径の適した材料の繊維を用いて、２つの縁を縫合することによって、継ぎ目を閉じることができる。
【０１０５】
本発明にしたがって、足場をチューブに形成し、PPDCを植え込み、インキュベーションチャンバー中で培地中に懸濁することができる。細胞が内腔を塞ぐことを防ぐために、チューブ状骨格の開口端の一方をノズルに固定することができる。チューブ状骨格の内部を通る流れを生み出すために、インキュベーションチャンバーと連結した供給源チャンバーからこのノズルを通じて、液体培地を流し込むことができる。もう一方の開口端を、供給源チャンバー経由で培地を再循環することができるような、収集チャンバーへと導く流出開口部に固定することができる。インキュベーションが完了した場合、チューブをノズルおよび流出開口部から取り外すことができる。この方法は、Ballermann, B.J., et alによる国際公開番号第９４／２５５８４号、および、米国特許公開第０８／４３０，７６８号に記載されており、参照により全体を本願に組み入れる。
【０１０６】
概して、本発明にしたがって、任意の以下の方法を用いることで、２つの三次元骨格をチューブへと組み合わせることができる。
【０１０７】
２つ以上の平坦な骨格を他のものの上に横たえ、ともに縫合することができる。その後、この２層シートを巻いて、上記で説明したように、ともに接合し、縫合することができる。
【０１０８】
内層として役立つような、１つのチューブ状足場にPPDCを植え込み、インキュベーションすることができる。２番目の足場は、チューブ状骨格の外周よりわずかに大きい幅の平坦な細長い切れにすることができる。適切な成長に到達した後、平坦な骨格を、チューブ状足場の外側に巻きつけることができ、その後、平坦な骨格の２つの縁の継ぎ目を閉じ、平坦な骨格を内側チューブに締め付ける。
【０１０９】
わずかに直径の異なる２つ以上のチューブ状メッシュを、別個に成長させることができる。より小さい直径を有する骨格を、より大きいものの内側に挿入し、締め付けることができる。
【０１１０】
これらの方法のそれぞれに対して、２層チューブに対する方法を再度適用することによって、より多くの層を加えることができる。足場をPPDCの任意の成長段階で組み合わせることができ、組み合わされた足場のインキュベーションを、望ましいときに続けることができる。
【０１１１】
チューブ状構築物の内腔の態様を、チューブ状足場の内腔表面を血栓形成されない状態にする材料で構成することができ、もしくは、その材料で処理することができる。これらの処理や材料はまた、内皮成長、細胞移動、細胞外マトリックス沈着を推進し、持続してもよい。これらの材料や処理は、限定されないが、基底膜タンパク質（例えば、ラミニン、IV型コラーゲン）のような天然材料、ePTFEやセグメント化ポリウレタンウレアシリコン［例えば、PURSPAN（The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, CA）］のような合成材料を含む。これらの材料を、足場を血栓形成させない状態にするために、更に処理することができる。このような処理は、ヘパリンのような抗血栓形成薬、プラズマコーティングのような材料の表面電荷を変化させる処理を含む。
【０１１２】
ある実施態様において、治療上の細胞組成物はまた、interleukin 8、reticulon 1、chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、chemokine (C-X-C motif) ligand 3、tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3のうちの少なくとも１つが発現するか、または、線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関連する発現が、short stature homeobox 2、heat shock 27kDa protein 2、chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、Homo sapiens mRNA, cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、crystallin, alpha B、dishevelled associated activator of morphogenesis 2、DKFZP586B2420 protein、similar to neuralin 1、tetranectin (plasminogen binding protein)、src homology three (SH3) and cysteine rich domain、B-cell translocation gene 1, anti-proliferative、cholesterol 25-hydroxylase、runt-related transcription factor 3、hypothetical protein FLJ23191、interleukin 11 receptor alpha、procollagen C-endopeptidase enhancer、frizzled homolog 7 (Drosophila)、hypothetical gene BC008967、collagen, type VIII, alpha 1、tenascin C (hexabrachion)、iroquois homeobox protein 5、hephaestin、integrin, beta 8、synaptic vesicle glycoprotein 2、Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、cytokine receptor-like factor 1、potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、integrin, alpha 7、DKFZP586L151 protein、transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、KIAA1034 protein、early growth response 3、distal-less homeobox 5、hypothetical protein FLJ20373、aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、biglycan、fibronectin 1、proenkephalin、integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367 protein、natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、hypothetical protein FLJ14054、Homo sapiens mRNA, cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、AE binding protein 1、cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)、neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDaのうちの少なくとも１つについて、発現が減少する細胞を含む。
【０１１３】
好まれる細胞組成物はまた、MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、TIMP1のうちの少なくとも１つを分泌し、ELISAによって検出されるように、TGF-beta2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌しない細胞を含む。
【０１１４】
更に他の態様では、本発明は、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における逆免疫反応を抑制するための方法を提供する。その方法は、分娩後由来細胞組成物を、逆免疫反応を抑制するために有効な量で、移植受容者に投与することを含む。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、逆免疫反応は、適応性免疫反応である。詳細な実施態様では、逆免疫反応は、移植受容者に対する移植された組織による免疫反応であり、結果的に移植片対宿主病を生じるかもしれない。他の詳細な実施態様では、逆免疫反応は、移植組織の拒絶反応である。いくつかの実施態様では、方法は、移植片対宿主病および移植組織の拒絶反応の両方を抑制するために有効である。このようなすべての実施態様では、分娩後由来細胞は、臍由来細胞、胎盤由来細胞、臍由来細胞および胎盤由来細胞の組み合わせである組成物を含む。
【０１１６】
分娩後由来細胞組成物は、移植組織の成長、刺激、活力のための補助を提供することができる。分娩後由来細胞を、細胞の一部、細胞溶解物、もしくは、他の同種細胞、同系細胞、自家細胞とともに共投与することができるが、うまく逆免疫反応を抑制するのは、他の細胞、細胞の一部、もしくは、細胞溶解物の不存在下で、PPDCを移植患者に投与することであろう。細胞は、移植組織と一体化する必要はないが、好まれるのは、患者において、PPDCを少なくとも部分的に一体化し、増殖し、生存することである。他の好まれる実施態様では、患者は、PPDCの投与から追加的利益を経験する。その利益とは、例えば、移植組織中もしくは移植組織の周囲に存在する、幹細胞もしくは前駆細胞を含む他の細胞の成長、移植組織の成長もしくは血管新生、および、ケモカイン、サイトカイン、および同様のもののような有用な細胞因子の産生を、PPDCが補助しうることである。いくつかの実施態様では、移植受容者は、PPDCによる治療処置により利益を受けるが、PPDCは患者体内に長期間生存しない。１つの実施態様では、細胞は、段階的に、数、活力、生化学活性の点で、減退し、他の実施態様では、細胞の減退は、例えば、成長、分裂生化学活性のような活性の期間によって進行するかもしれない。他の実施態様では、老化細胞、成長できない細胞、もしくは、死んでいる細胞でさえ、有益な効果を有することができる。
【０１１７】
本方法は、細胞組成物に加えて、１つ以上の薬剤を投与することを更に含んでもよい。このような薬剤を、細胞組成物が投与される前、その後、もしくは、同時に投与することができる。適した薬剤の非限定的な例は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調節薬、抗アポトーシス薬、もしくは、本分野に適した他の薬剤を含む。適切な薬剤の選択は、本分野の技術の範囲内にあり、移植受容者の身体特徴、全体的な健康状態に応じて異なるかもしれない。
【０１１８】
PPDCの投与は、好ましくは、生体内（in vivo）で、移植、埋め込み、注射、融合、カテーテルによる送達、移植受容者に埋め込まれた装置による送達、マトリックス・細胞複合体の提供、本分野において知られている細胞治療を提供するための任意の他の手段によって実行される。
【０１１９】
本発明の方法のいくつかの実施態様では、細胞組成物は、約５０％の分娩後由来細胞を含む。好まれる実施態様では、細胞組成物は、実質的に分娩後由来細胞のみを含む。より好まれる実施態様では、治療上の細胞組成物は、実質的に分娩後由来細胞の同質集団を含む。
【０１２０】
また、本発明に関連して特色とされるのは、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法であり、その方法は、患者に、分娩後由来細胞によって生成される馴化培地、分娩後由来細胞から生成される細胞溶解物、分娩後由来細胞から生成される可溶性細胞区画、分娩後由来細胞の細胞外マトリックスを含む組成物を投与することを含む。逆免疫反応は、移植片対宿主病もしくは移植組織の拒絶反応でありうる。これらの実施態様では、組成物を作るために用いられる分娩後由来細胞は、臍由来細胞、胎盤由来細胞、もしくは、両方の組み合わせでありうる。組成物に加えて、追加の細胞型、もしくは、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、抗アポトーシス薬のような追加の薬剤を、移植受容者に投与することができる。
【０１２１】
また、本願で提供されるのは、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法であり、その方法は、分娩後由来細胞組成物を、逆免疫反応を抑制するために有効な量で、患者に投与することを含み、分娩後由来細胞組成物は、マトリックス・細胞複合体として投与される。ある実施態様では、マトリックスは、好ましくは生体吸収性の足場であり、少なくとも、分娩後由来細胞を含む。
【０１２２】
本発明の方法を実践するためのキットも、提供される。移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するために用いられる場合、そのキットは、マトリックスとともに、もしくは、マトリックスなしの、そして、共存培養物が存在もしくは不存在の、PPDC組成物を含む。キットはまた選択的に、例えば、注射によって、細胞を投与するための手段、および、もし必要ならば、細胞のための製薬上許容できるキャリアを含む。キットは、細胞を用いるための使用説明書を含む。
【０１２３】
本発明はまた、本発明の組織、細胞、集団、細胞組成物を貯蔵することを提供する。上記で説明したように、PPDCは、容易に低温保存される。それゆえ、本発明は、細胞を貯蔵室に低温保存するための方法を提供し、そこで細胞は凍結され、細胞の免疫学的特性、生化学的特性、遺伝学的特性に基づいた細胞の完全な特徴付けと関連させて、保存される。ここで凍結された細胞を、手法の要求性および患者の必要性に応じて、自家移植、同系移植、同種移植のために、治療で用いることができる。好ましくは、低温保存サンプルの情報はいずれも、コンピュータ上で保存され、外科医の要求、細胞もしくは集団の特徴付けに基づいて作られた適した適合を有する手法および患者に基づいて、検索可能である。好ましくは、本発明の細胞を望まれる細胞量まで成長、増加させ、細胞組成物を、別個にもしくは共存培養として、マトリックスもしくは支持体の存在もしくは不存在下で、準備する。いくつかの適用に対して、新たに準備された細胞を用いることが好ましいが、残りのものを低温保存し、そして、細胞を凍結し、コンピュータ入力とサンプルとを関連付けるために情報をコンピュータに入力することによって、貯蔵することができる。免疫学上の目的のために、移植源もしくは提供者とこのような細胞の被移植者とが適合する必要はない場合でさえ、貯蔵システムは、例えば、貯蔵細胞の、望ましい生化学的もしくは遺伝的特性を治療上の必要性と適合することを容易にする。望まれる特性と貯蔵された微量サンプルと適合させた上で、サンプルは、治療上の使用のために、回収、準備される。本願で説明された細胞溶解物をまた、本発明にしたがって、低温保存し、貯蔵してもよい。
【０１２４】
本発明の他の態様では、PPDCを単離し、成長、維持し、用いるためのキットを提供する。細胞、細胞溶解物、可溶性細胞区画、膜区画、マトリックスを、キットの一部、例えば、培養もしくは埋め込みのためのキットのために、都合のよいように採用することができる。本発明は、分娩後由来細胞および追加成分を含むキットを提供する。その追加成分は、例えば、マトリックス（例えば、足場）材料、水和剤（例えば、生理学的適合性のある生理食塩水溶液、準備された細胞培養培地）、細胞培養基質（例えば、培養皿、培養プレート、培養バイアル、等）、細胞培養培地（液体か脱水された形態のいずれか）、抗生物質化合物、ホルモン、および同様のものとともに、単離、成長もしくは増殖、または、細胞もしくは細胞区画の使用のための使用説明書を含む。成長のためのキットは、例えば、本願で用いられる成長培地の、血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む成分すべてを含む。キットは、任意のこのような成分を含むことができるが、好ましくは、意図された使用のために必要なすべての原料を含む。もし望まれるなら、キットは、本願に説明されたような格子中に接種することができるような、（一般的に低温保存された）細胞をも含むことができる。単離のためのキットは、本願で提示された単離方法を実践するために要求されるあらゆるものを含むだろう。ただし、単離時点で組織貯蔵室から新鮮な状態、もしくは、凍結された状態で入手されるべき臍組織を除く。組織を解離するための外科的道具、好まれる酵素、もしくは、安定した形状の酵素の選択は、上記で説明された方法のために要求され好まれるように、バッファーおよび培地、細胞ろ過器および同様のものとして提供される。選択的なステップを伴う詳細な使用説明書、および、選択的もしくは代替的な材料の供給業者の一覧はまた、都合のよいように提供される。例えば、ATCCに寄託されたUDC培養物に単離される細胞の比較のために、対照細胞を含むことができる。
【０１２５】
PPDCを利用するためのキットは、好ましくは、細胞集団、もしくは、細胞、成分、産物、または、区画を含む組成物、あるいは、上記で説明された細胞由来の馴化培地を含む。いくつかの実施態様では、キットは、少なくともPDCおよび／もしくはUDCならびに製薬上許容できるキャリア（液体、半固体、もしくは、固体）を含む、１つ以上の細胞集団を含んでもよい。いくつかの実施態様における集団は、UDCもしくはPDCの同質もしくはクローン細胞株である。他の実施態様では、キットは、共存培養で使用するための他の細胞株を含む。好ましくは、キットは、追加の生物活性剤、例えば、抗血栓形成薬、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、および、免疫抑制化合物もしくは免疫調整化合物を含む。キットはまた、選択的に、例えば、注射によって、細胞を投与する手段を含んでもよい。キットは、細胞を用いるための使用説明書を更に含んでもよい。軍用の野戦病院用に準備されたキットは、急性損傷の回復と関連付けてその細胞を用いるような、組織足場、外科縫合、および、同様のものを含む完全な手順の供給物を含んでもよい。本願で説明された解析および試験管内（in vitro）法のためのキットは、（１）UDCもしくはUDCの区画、成分、産物、（２）試験管内（in vitro）法を実践するための試薬、（３）例えば、共存培養に適切な、他の細胞もしくは細胞集団、（４）試験管内（in vitro）法を実行するための使用説明書、のうちの１つ以上を含んでもよい。細胞由来成分の準備のためのキットは、細胞から望まれる区画を入手するための使用説明書に沿って、細胞の成長のために必要な成分と、目的の細胞区画を準備するために必要な成分の両方を含むことができる。馴化培地を産生し、収集するためのキットも本願で提供され、目的の分泌された分子を解析するための細胞、培地、収集容器、使用説明書、基準および同様のもの含む。
【０１２６】
以下の実施例は、本発明の実施態様のいくつかの態様を、より詳細に説明したものである。これらの実施例は、本願に説明された発明の態様の、更なる例示を提供するが、限定されるものではない。
【０１２７】
〔実施例１〕
分娩後組織から細胞の派生
この実施例は、胎盤組織および臍帯組織から分娩後由来細胞を準備することについて、説明する。分娩後の臍帯および胎盤を、満期妊娠もしくは早産妊娠のいずれかの分娩から入手した。細胞を、５人の別個の提供者の臍組織および胎盤組織から採取した。細胞単離の異なる方法を、（１）幹細胞に共通する特徴である、異なる表現型を有する細胞へ分化する能力、または、（２）他の細胞や組織に有用な栄養因子を提供する能力、を有する細胞の生産力に関して、試験した。
【０１２８】
≪材料と方法≫
＜臍細胞単離＞
米国National Disease Research Interchange（NDRI；Philadelphia, PA）から臍帯を入手した。正常な出産にしたがって、組織を入手した。細胞単離プロトコルを、層流フード(laminar flow hood)中で無菌的に実施した。血液および壊死組織片を除去するために、臍帯を、抗真菌剤および抗生物質（ペニシリン １００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍＬ）存在下のリン酸緩衝生理食塩水（PBS；Invitrogen, Caelsbad, CA）で洗浄した。その後、培地（DMEM低グルコース、または、DMEM高グルコース）（Invitrogen）５０ｍＬ存在下の１５０ｃｍ２組織培養プレート中に、組織を、細かいパルプに細分化されるまで、機械的に分離した。細かくなった組織を、５０ｍＬコニカルチューブに（チューブ当たり、組織約５ｇになるように）移した。その後、上記の抗真菌剤および抗生物質を含む、DMEM低グルコース培地もしくはDMEM高グルコース培地のいずれかの中で、組織を消化した。いくつかの実験では、コラーゲナーゼとディスパーゼの酵素混合液［C:D；DMEM低グルコース培地中、コラーゲナーゼ（Sigma、St Louis, MO）５００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼ（Invitrogen）５０Ｕ／ｍＬ］を用いた。他の実験では、コラーゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ（C:D:H）の混合液［DMEM低グルコース培地中、コラーゲナーゼ ５００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼ ５０Ｕ／ｍＬ、ヒアルロニダーゼ（Sigma）５Ｕ／ｍＬ］を用いた。組織、培地、消化酵素が入ったコニカルチューブを、２２５回転／分のオービタルシェイカー(orbital shaker)（Environ, Brooklyn, NY）で２時間、３７℃で、インキュベーションした。
【０１２９】
消化後、組織を、１５０×ｇ、５分間、遠心分離し、上澄みを吸引した。成長培地［DMEM低グルコース(Invitrogen)、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（FBS；規定ウシ血清；Lot# AND18475；Hyclone, Logan, UT）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Sigma）、上記の抗生物質／抗真菌剤 １ｍＬ／１００ｍＬ］２０ｍＬ中に、ペレットを再懸濁した。細胞懸濁液を７０μｍナイロン細胞ろ過器(70-micrometer nylon cell strainer)（BD Biosciences）で、ろ過した。その後、ろ過器に、成長培地を含む追加のすすぎ液 ５ｍＬを通した。その後、細胞懸濁液を４０μｍナイロン細胞ろ過器(40-micrometer nylon cell strainer)（BD Biosciences）に通し、成長培地の追加のすすぎ液 ５ｍＬを通した。
【０１３０】
ろ過物を成長培地（全量５０ｍＬ）中に再懸濁し、１５０×ｇ、５分間、遠心分離した。上澄み液を吸引し、細胞を新しい成長培地 ５０ｍＬ中に再懸濁した。この過程を更に２回繰り返した。
【０１３１】
最後の遠心分離後、上澄みを吸引し、細胞ペレットを新しい成長培地 ５ｍＬ中に再懸濁した。トリパンブルー染色を用いて、生存細胞の数を決定した。その後、細胞を標準条件下で培養した。
【０１３２】
臍帯から単離された細胞を、上記で説明した抗生物質／抗真菌剤を含む成長培地の入ったゼラチンコートＴ−７５ｃｍ２フラスコ（Corning Inc., Corning, NY）上に、５，０００細胞／ｃｍ２で接種した。２日後（様々な実験では、細胞を２〜４日間インキュベーションしてから）、使用済み培地をフラスコから吸引した。壊死組織片と血液由来細胞を除去するために、細胞をPBSで３回洗浄した。その後、細胞に成長培地を補充し、コンフルエンスになるまで成長させた（０代継代から約１０日）。その後の継代（１代継代〜２代継代等）において、細胞は４〜５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％のコンフルエンス）に達した。これらのその後の継代に対して、５，０００細胞／ｃｍ２で、細胞を接種した。二酸化炭素 ５％、大気濃度の酸素とともに、３７℃、湿式インキュベータ中で、細胞を成長させた。
【０１３３】
＜胎盤細胞単離＞
NDRI（Philadelphia, PA）から、胎盤細胞を入手した。組織は分娩に由来し、正常な外科的出産時に入手した。臍細胞単離で説明したように、胎盤細胞を単離した。
【０１３４】
以下の実施例は、胎盤組織から母体由来細胞および新生児由来細胞の別個の集団を単離するために適用する。
【０１３５】
細胞単離プロトコルを、層流フード中で無菌的に実行した。血液および壊死組織片を除去するために、胎盤細胞を、抗真菌剤および抗生物質（上記で説明した）存在下のリン酸緩衝生理食塩水（PBS；Invitorogen, Carlsbad, CA）で洗浄した。その後、胎盤組織を、３つの区画：上層（新生児側または新生児面）、中層（新生児側および母体側の混合の細胞単離）、下層（母体側または母体面）で分析した。
【０１３６】
血液および壊死組織片を更に除去するために、分離した区画を個々に、抗生物質／抗真菌剤を含むPBSで数回洗浄した。その後、DMEM／低グルコース ５０ｍＬの入った１５０ｃｍ２組織培養プレート中に、細かいパルプになるまで、各区画を機械的に分離した。細かくなった組織を、５０ｍＬコニカルチューブに移した。各チューブには、約５ｇの組織が含まれた。抗真菌剤および抗生物質（ペニシリン １００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン １００μｇ／ｍＬ、アンフォテリシンＢ ０．２５μｇ／ｍＬ）、ならびに、消化酵素を含むDMEM低グルコース培地か、DMEM高グルコース培地かのいずれか中で、組織を消化した。いくつかの実験では、DMEM低グルコース培地中に、コラーゲナーゼ（Sigma, St Louis, MO）５００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼ（Invitrogen）５０Ｕ／ｍＬを含むコラーゲナーゼとディスパーゼとの混合液（C:D）を用いた。他の実験では、コラーゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ（C:D:H）の混合液を用いた［DMEM低グルコース中、コラーゲナーゼ ５００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼ ５０Ｕ／ｍＬ、ヒアルロニダーゼ（Sigma）５Ｕ／ｍＬ］。組織、培地、消化酵素が入ったコニカルチューブを、２２５回転／分のオービタルシェイカー（Environ, Brooklyn, NY）で２時間、３７℃で、インキュベーションした。
【０１３７】
消化後、１５０×ｇ、５分間で、組織を遠心分離し、結果的に生じた上澄みを吸引した。ペニシリン／ストレプトマイシン／アンテフォリシンＢを含む成長培地 ２０ｍＬ中に、ペレットを再懸濁した。７０μｍナイロン細胞ろ過器（BD Biosciences）で、全細胞懸濁液をろ過し、追加の成長培地 ５ｍＬですすいだ。
【０１３８】
ろ過物を成長培地（全量５０ｍＬ）中に再懸濁し、１５０×ｇ、５分間、遠心分離した。上澄み液を吸引し、細胞を新しい成長培地 ５０ｍＬ中に再懸濁した。この過程を更に２回繰り返した。最後の遠心分離後、上澄みを吸引し、細胞ペレットを新しい成長培地 ５ｍＬ中に再懸濁した。トリパンブルー染色を用いて、生存細胞の数を決定した。その後、細胞を標準条件下で培養した。
【０１３９】
＜LIBERASE細胞単離＞
LIBERASE（Bochringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN）（Blendzyme 3、２．５ｍｇ／ｍＬ；Roche Applied Sciences, Indiapolis, IN）、ヒアルロニダーゼ（５Ｕ／ｍＬ；Sigma）を含むDMEM低グルコース培地で、臍組織から細胞を単離した。組織消化、細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化について説明されたようにし、C:DもしくはC:D:H酵素混合液の代わりに、LIBERASE／ヒアルロニダーゼ混合液を用いた。LIBERASEによる組織消化により、結果的に、分娩後組織から細胞集団を単離し、それらを直ちに増加した。
【０１４０】
＜他の酵素の組み合わせを用いた細胞単離＞
臍帯からの細胞の単離について、異なる酵素の組み合わせを用いて、手法を比較した。消化力について比較された酵素は、（ｉ）コラーゲナーゼ、（ｉｉ）ディスパーゼ、（ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、（ｉｖ）コラーゲナーゼ：ディスパーゼ混合液（C:D）、（ｖ）コラーゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合液（C:H）、（ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合液（D:H）、（ｖｉｉ）コラーゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合液（C:D:H）を含んだ。これらの異なる酵素消化条件を利用した細胞単離のちがいが観察された（表１−１）。
【０１４１】
【表１】
2009519978.tif 000003
【０１４２】
＜臍帯の残留血からの細胞単離＞
異なるアプローチによって臍帯からの細胞集合を単離するために、他の試みがなされた。１つの例では、血餅、ゼラチン様物質を取り除くために、臍帯を薄く切り、成長培地で洗浄した。血液、ゼラチン様物質、成長培地の混合液を収集し、１５０×ｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁し、成長培地の入ったゼラチンコートフラスコ上に接種した。これらの実験から、細胞集団を単離し、直ちに増加した。
【０１４３】
＜臍帯血からの細胞単離＞
細胞を、NDRIから獲得された臍帯血サンプルからも単離してきた。ここで用いられる単離プロトコルは、Ho et al.による国際特許出願ＵＳ０２２９９７１号（Ho, T. W. et al., 国際公開第２００３０２５１４９号Ａ２）のものである。臍帯血（NDRI, Philadelphia PA）のサンプル（それぞれ、５０ｍＬ、１０．５ｍＬ）を、溶解バッファー［ろ過滅菌した塩化アンモニウム １５５ｍＭ、炭酸水素カリウム １０ｍｍｏｌ、ｐＨ７．２に緩衝EDTA ０．１ｍＭ（すべての成分はSigma製、St Louis, MO）］とともに混合した。臍帯血：溶解バッファーが１：２０の割合で、細胞を溶解した。結果的な細胞懸濁液を、５秒間かきまぜ、周辺温度で２分間、インキュベーションした。溶解物を遠心分離した（２００×ｇ、１０分間）。１０％ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan UT）、グルタミン（Mediatech Herndon, VA）４ｍｍｏｌ、ペニシリン １００Ｕ／１００ｍＬ、ストレプトマイシン（Gibco, Carlesbad, CA）１００μｇ／１００ｍＬを含む、完全最小必須培地（Gibco, Carlsbad CA）中に、細胞ペレットを再懸濁した。再懸濁細胞を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間）、上澄みを吸引し、細胞ペレットを完全培地で洗浄した。T75フラスコ（Corning, NY）、T75ラミニンコートフラスコ、もしくは、Ｔ１７５フィブロネクチンコートフラスコ（両方とも、Dickinson, Bedford, MA）のいずれか中に、直接、細胞を接種した。
【０１４４】
＜異なる酵素の組み合わせと成長条件を用いた細胞単離＞
細胞集団を異なる条件下で単離することができ、単離後即座に様々な条件下で増加できるかどうか決定するために、上記に示した手法にしたがって、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Sigma, St Louis. MO）を含む、もしくは、含まない成長培地中で、C:D:Hの酵素の組み合わせを用いて、細胞を消化した。そのように単離された胎盤由来細胞を、様々な条件下で接種した。すべての細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン存在下で成長させた（表１−２）。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
＜異なる酵素の組み合わせと成長条件を用いた細胞単離＞
すべての条件において、細胞は０代継代と１代継代の間に付着し、よく増加した（表１−２）。条件５〜８、１３〜１６の細胞は、低温保存し貯蔵した時点で接種後に、４代継代までよく増殖することが示された。
【０１４７】
≪結果≫
＜異なる酵素の組み合わせを用いた細胞単離＞
C:D:Hの組み合わせが、単離後の最良の細胞収量を提供し、他の条件よりも培養中でより多くの世代の間、増加する細胞を生成した（表１）。コラーゲナーゼもしくはヒアルロニダーゼ単独を用いては、増加可能な細胞集団は獲得されなかった。この結果は試験されたコラーゲン特異的かどうか決定する試みは、なされなかった。
【０１４８】
＜異なる酵素の組み合わせと成長条件を用いた細胞単離＞
酵素消化および成長のために試験されたすべての条件下で、細胞は、０代継代と１代継代の間に、付着し、よく増加した（表２）。実験条件５〜８、１３〜１６の細胞は、低温保存された時点で接種後に、４代継代までよく増殖した。すべての細胞を更なる調査のために貯蔵した。
【０１４９】
＜臍帯の残留血からの細胞単離＞
有核細胞は付着し、急速に成長した。これらの細胞をフローサイトメトリーによって分析したところ、酵素消化によって入手された細胞と同様であった。
【０１５０】
＜臍帯血からの細胞単離＞
準備物は赤血球および血小板を含んだ。最初の３週間の間、有核細胞は全く付着も、分裂もしなかった。接種後３週間で培地を交換したが、細胞が付着し、成長することが観察されなかった。
【０１５１】
＜概要＞
コラーゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）の酵素の組み合わせを用いて、臍帯、胎盤組織から、効果的に細胞集団を得ることができる。また、BlendzymeであるLIBERASEを用いてもよい。特に、コラーゲナーゼ（４Wunsch Ｕ／ｇ）およびサーモリシン（１７１４カゼインＵ／ｇ）であるBlendzyme 3もまた、細胞を単離するために、ヒアルロニダーゼとともに用いられた。これらの細胞は、ゼラチンコートプラスチック上の成長培地中で培養した場合、多くの継代で、直ちに増加した。
【０１５２】
細胞を、臍帯血ではなく、臍帯の残留血からも単離した。組織から洗浄された血餅における細胞の存在は、それらの細胞は用いられた条件下で接着し成長するものであるが、分解過程中に、放出される細胞に起因するかもしれない。
【０１５３】
〔実施例２〕
分娩後由来細胞の成長特徴
分娩後由来細胞（PPDC）の細胞増加能力を、単離された幹細胞の他の集団と比較した。老化に至る細胞増加の過程は、ヘイフリック限界と呼ばれる（Hayfiick L. 1974a, 1974b）。分娩後由来細胞は、治療上の使用のために非常に適している。なぜならば、それらの細胞は、直ちに十分な細胞数まで増加することができるからである。
【０１５４】
≪材料と方法≫
＜ゼラチンコートフラスコ＞
２％（ｖ／ｖ）ブタゼラチン（Type B: 225 Bloom；Sigma, St Louis, MO）２０ｍＬを、T75フラスコ（Corning, Corning, NY）に、室温、２０分間で、加えることにより、組織培養プラスチックフラスコをコーティングした。ゼラチン溶液を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Invitrogen, Carlsbad, CA）１０ｍＬを加え、その後、吸引した。
【０１５５】
＜PPDCと他の細胞集団との増加能力の比較＞
成長増加能力を比較するために、以下の細胞集団を利用した。（ｉ）間充織幹細胞(Mesenchymal Stem Cell)（MSC；Cambrex, Walkersville, MD）、（ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６，５５５，３７４号；米国特許出願第２００４／００５８４１２号）、（ｉｉｉ）正常な皮膚線維芽細胞（cc-2509 Lot# 9F0844；Cambrex, Walkersville, MD）、（ｉｖ）臍由来細胞、（ｖ）胎盤由来細胞。まず、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンフォテリシンＢを含む成長培地の入ったゼラチンコートT75フラスコ上に、細胞を５，０００細胞／ｃｍ２で接種した。その後の継代のために、細胞培養を以下のように処理した。トリプシン処理後、生存細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。細胞懸濁液（５０μＬ）をトリパンブルー（５０ｍＬ；Sigma, St. Louis MO）と組み合わせた。生存細胞の数を、血球計を用いて推定した。
【０１５６】
カウント後、新しい成長培地 ２５ｍＬの入ったゼラチンコートT75フラスコ上に、細胞を５，０００細胞／ｃｍ２で接種した。細胞を３７℃の標準条件下で成長させた。細胞が約８５％のコンフルエンスに達した場合、それらの細胞を継代し、この過程を、細胞が老化に達するまで、繰り返した。
【０１５７】
各継代において、細胞をトリプシン処理し、カウントした。生存細胞収量、集団倍加［ｌｎ（細胞最終数／細胞開始数）／ｌｎ２］、倍加時間［培養時間（時間）／集団倍加数］を計算した。最適細胞増加を決定するために、継代ごとの全細胞収量を、以前の継代に対する全収量を、各継代についての増加係数で割ることによって決定した（すなわち、増加係数＝細胞最終数／細胞開始数）。
【０１５８】
＜低密度で貯蔵した細胞増加能力＞
１０代継代で貯蔵した細胞の増加能力をも、異なる条件の組を用いて試験した。正常な皮膚線維芽細胞（cc-2509 lot # 9F0844；Cambrex, Walkersville, MD）、臍由来細胞、胎盤由来細胞を試験した。これらの細胞集団を、５，０００細胞／ｃｍ２で培養し、その時点の各継代においてコンフルエンスまで成長させて、これまでに１０代継代で貯蔵してきた。１０代継代で細胞解凍後の細胞集団上で、細胞密度の効果を決定した。細胞を標準条件下で解凍し、トリパンブルー染色を用いてカウントした。その後、解凍した細胞を、上記で説明した抗生物質／抗真菌剤を含むDMEM低グルコース成長培地中に、１，０００細胞／ｃｍ２で接種した。細胞を、３７℃、標準大気条件下で、成長させた。成長培地を週に２回交換し、細胞を８５％のコンフルエンスに到達するまで継代した。続いて、老化すなわち細胞がもはや成長できなくなるまで、細胞を継代した。細胞をトリプシン処理し、各継代でカウントした。細胞収量、集団倍加［ｌｎ（細胞最終数／細胞開始数）／ｌｎ２］、倍加時間［培養時間（時間）／集団倍加］を計算した。継代ごとの全細胞収量を、以前の継代に対する全収量を、各継代についての増加係数で割ることによって決定した（すなわち、増加係数＝細胞最終数／細胞開始数）。
【０１５９】
＜開始の細胞接種から低密度でのPPDCの増加＞
低細胞接種条件下で新たに単離されたPPDCの増加能力を試験した。PPDCを本願で説明したように準備した。細胞を１，０００細胞／ｃｍ２で接種し、老化まで上記で説明したように継代した。細胞を、３７℃、標準大気条件下で、成長させた。成長培地を週に２回交換した。細胞を８５％のコンフルエンスに到達するまで継代した。各継代において、細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー染色によってカウントした。細胞収量、集団倍加［ｌｎ（細胞最終数／細胞開始数）／ｌｎ２］、倍加時間［培養時間（時間）／集団倍加］を、各継代について計算した。以前の継代に対する全収量を、各継代についての増加係数で割ることによって、継代ごとの全細胞収量を決定した（すなわち、増加係数＝細胞最終数／細胞開始数）。細胞を、ゼラチンコートフラスコ、もしくは、非ゼラチンコートフラスコ上で成長させた。
【０１６０】
＜クローン新生児胎盤由来細胞の増加＞
胎盤組織から新生児細胞集団を増加させるために、クローニングを用いた。胎盤から３つの分化細胞集団を単離した後（本願で説明したように）、これらの細胞集団を標準成長条件下で増加させ、その後、単離細胞集団の同一性を明らかにするために核型決定した。細胞を、男児を出産した母体から単離したため、細胞分裂中期プレパラートを実施することによって、男性と女性の染色体を区別することは容易であった。これらの実験は、胎児側の細胞が新生児表現型について陽性の核型であり、中層細胞が新生児と母体の表現型両方について陽性の核型であり、母体側の細胞が母体細胞について陽性の核型であることを示した。
【０１６１】
＜低酸素培養条件における細胞増加＞
低酸素細胞培養条件は、ある環境における細胞増加を改良することがあることが、示されてきた（米国特許出願第２００４０００５７０４号）、PPDCの細胞増加が、細胞培養条件を変えることによって改良されるかどうか決定するために、臍由来細胞の培養物を、低酸素条件で成長させた。細胞を、ゼラチンコートフラスコ上の成長培地中に、５，０００細胞／ｃｍ２で接種した。まず、５代継代まで、標準大気条件下で、細胞を培養し、その後、低酸素条件（５％Ｏ２）に移行した。
【０１６２】
＜他の成長条件＞
他のプロトコルでは、細胞を非コートプレート、コラーゲンコートプレート、フィブロネクチンコートプレート、ラミニンコートプレート、細胞外マトリックスタンパク質コートプレート上で増加させた。培養物は、これらの異なるマトリックス上でも、よく増加することが示されてきた。
【０１６３】
≪結果≫
＜他の幹細胞および非幹細胞集団とPPDCの増加能力の比較＞
臍由来細胞、胎盤由来細胞の両方を、６０日間、１Ｅ１７個を超える細胞収量を生成する４０代継代より多くの間、増加させた。対して、MSC、線維芽細胞を、それぞれ２５日未満、６０日未満で老化させた。脂肪由来細胞を約６０日間増加させたが、全細胞収量は４．５Ｅ１２個であった。このように、利用した実験条件下で、５，０００細胞／ｃｍ２で接種した場合、胎盤由来細胞は同一条件下で、他の細胞型よりも非常によく増加した（表２−１）。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
＜低密度下での細胞貯蔵の増加能力＞
臍由来細胞、胎盤由来細胞、線維芽細胞を、６０日間、１Ｅ１１個を超える細胞収量を生成する１０代継代よりも多くの間、増加させた（表２−２）。これらの条件下で６０日後、線維芽細胞は老化状態になったにもかかわらず、臍由来細胞、胎盤由来細胞は、それぞれ５０回、４０回を超える集団倍加後に老化した。
【０１６６】
【表４】
2009519978.tif 000006
【０１６７】
＜開始の細胞接種から低密度でのPPDCの増加＞
PPDCを、ゼラチンコートプレートもしくはフラスコ、非ゼラチンコートプレートもしくはフラスコ上で、低密度（１，０００細胞／ｃｍ２）で増加させた。これらの細胞のこれらの条件下での成長能力は、良好であった。細胞は直ちに対数成長期で増加した。細胞増加速度は、胎盤由来細胞を、ゼラチンコートフラスコ上の成長培地中に、５，０００細胞／ｃｍ２で接種した場合に観察されたものと、同様であった。非コートフラスコもしくはゼラチンコートフラスコ上の、いずれの培養間における細胞増加能力に違いは見られなかった。しかしながら、ゼラチンコートフラスコ上では、細胞はかなり小さい表現型を示し、非コートフラスコ上では、より大きな細胞表現型が観察された。
【０１６８】
＜クローン新生児胎盤由来細胞もしくはクローン母体胎盤由来細胞の増加＞
クローン新生児細胞集団もしくはクローン母体細胞集団を、それぞれ胎盤の新生児側もしくは母体側から単離した胎盤由来細胞から、増加させた。細胞を段階希釈し、その後、９６穴ゼラチンコートプレート上で、１細胞／穴の増加のために、成長培地中のゼラチンコートプレート上に接種した。この開始クローニングから、増加するクローンを同定し、トリプシン処理し、成長培地の入った１２穴ゼラチンコートプレート中に再接種し、その後、成長培地の中に５，０００細胞／ｃｍ２で、T25ゼラチンコートフラスコに引き続き継代した。クローン細胞集団を確実に同定するために、サブクローニングを実施した。サブクローニング実験のために、細胞をトリプシン処理し、０．５細胞／穴で再接種した。よく成長したサブクローンを、５，０００細胞／ｃｍ２／フラスコで、ゼラチンコートT25フラスコ中で増加させた。細胞を、５，０００細胞／ｃｍ２／T75フラスコで、継代した。クローンの成長特徴を、細胞増加を示すために計画してもよい。核型分析により、クローンが新生児由来か、母体由来かを確認することができる。
【０１６９】
＜低酸素培養条件における細胞増加＞
細胞は低減酸素条件下でよく増加するが、低酸素条件下の培養は、用いられた条件下のPPDCの細胞増加に対して、有意な効果を示さなかった。
【０１７０】
＜概要＞
単離された分娩後由来細胞を、標準大気酸素条件下で、ゼラチンコートフラスコ、もしくは、非コートフラスコ上の成長培地中に、約５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、成長させることを含む細胞増加条件は、１１代継代で、数多くの細胞を生成するのに十分である。更に、データは、より低密度の培養条件（例えば、１，０００細胞／ｃｍ２）を用いても、直ちに細胞を増加させることができることを示唆している。低酸素条件における分娩後由来細胞の増加もまた細胞増加を促進するが、細胞増加能力についての漸進的な改良は、これらの成長条件を利用した場合に、今のところ観察されなかった。現在のところ、標準大気条件下で分娩後由来細胞を培養することが、細胞の大きな集合を生成するために、好まれる。しかしながら、培養条件を変える場合、分娩後由来細胞の増加も同様に変わることがありうる。この戦略は、これらの細胞集団の増殖能力、分化能力を高めるために用いられてもよい。利用された条件下で、MSC、脂肪由来細胞の増加能力は、限定されるが、分娩後由来細胞は直ちに多くの数まで増加する。
【０１７１】
≪実施例２に関する参照文献≫
（１）Hayflick L. 1974a. J Am Geriatr Soc. 22: 1-12.
（２）Hayflick L. 1974b. Gerontologist. 14: 37-45.
（３）米国特許出願第２００４００５８４１２号
（４）米国特許出願第２００４００４８３７２号
（５）米国特許出願第２００４０００５７０４号
【０１７２】
〔実施例３〕
胎盤由来細胞のための成長培地の評価
いくつかの細胞培養培地を、胎盤由来細胞の成長を補助する能力について評価した。通常の酸素（２０％）下、低酸素（５％）下の、胎盤由来細胞の成長を、MTS比色解析を用いて、３日後に検査した。
【０１７３】
≪方法と材料≫
８代継代（P8）の胎盤由来細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地の入った９６穴プレート中に１×１０３細胞／穴で、接種した。８時間後、以下に説明するように、培地を交換し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、通常酸素（大気濃度）もしくは低酸素（５％ｖ／ｖ）下で、４８時間、インキュベーションした。MTSを培養培地（CELLTITER 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay；Promega, Madison, WI）に３時間加え、４９０ｎｍ（Molecular Devices, Sunnyvale CA）で吸収を測定した。
【０１７４】
【表５】
2009519978.tif 000007
【０１７５】
≪結果≫
MTS解析のための標準曲線は、吸収における増加と細胞数の増加との線形相関によって確立した。得られた吸収値を推定された細胞数へと変換し、開始の接種に対する変化（％）を計算した。
【０１７６】
＜血清の効果＞
通常酸素条件で培地に血清を加えることは、結果的に、吸収において、そして、生存細胞数において用量依存的な増加を生じた。完全MSCGMへ血清を加えることは、吸収において用量依存的な減少を生じた。添加血清不含有の培地では、細胞は、CELLGRO-FREE培地、ハムF10培地、DMEM上でのみ、目に見えて成長した。
【０１７７】
＜酸素の効果＞
低減酸素は、成長培地、ハムF10培地、MSCGM培地上の細胞成長率を、明らかに増加させる。細胞を最も成長させる結果を生じる培地は、成長が減少する順で、成長培地＞MSCGM培地＞イスコブ培地＋１０％FBS＝DMEM-H＋１０％FBS＝ハムF12培地＋１０％FBS＝RPMI1640＋１０％FBSであった。
【０１７８】
＜概要＞
胎盤由来細胞は、通常酸素下、もしくは、低酸素下の、様々な培養培地中で成長してもよい。５％もしくは大気中の酸素下で、血清を０％、２％、１０％（ｖ／ｖ）で含む１２個の基本培地中で、胎盤由来細胞の短期間の成長を決定した。概して、胎盤由来細胞は、タンパク質をも含まないハムF10培地、CELLGRO-Freeを除く血清を含まない条件では、あまり成長しなかった。これらの血清を含まない培地における成長は、１５％血清を含む培地で観察される最大成長の約２５〜３３％であった。
【０１７９】
〔実施例４〕
Ｄ−バリンを含む培地中での分娩後由来細胞の成長
通常のＬ−バリンアイソフォームの代わりにＤ−バリンを含む培地が、培養中で、線維芽細胞様細胞の成長を選択的に抑制するために用いることができることが報告されてきた（Hongpaisan, 2000；Sordillo et al., 1988）。これまでに、分娩後由来細胞がＤ−バリンを含む培地中で成長できるかどうかは知られていなかった。
【０１８０】
≪方法と材料≫
胎盤由来細胞（P3）、線維芽細胞（P9）、臍由来細胞（P5）を、ゼラチンコートT75フラスコ（Corning, Corning, NY）中に、５×１０３細胞／ｃｍ２で接種した。２４時間後、培地を除去し、残りの培地を除去するために、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Gibco, Carlsbad, CA）で洗浄した。培地を、変法成長培地［Ｄ−バリン（Gibcoに特別注文）、１５％透析済ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan, UT）、０．００１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール（Sigma）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を含むDMEM］と置換した。
【０１８１】
≪結果≫
Ｄ−バリンを含む培地中に接種した胎盤由来細胞、臍由来細胞、線維芽細胞は、透析した血清を含む成長培地中に接種したにもかかわらず、増殖しなかった。線維芽細胞は形態的に変化し、寸法が増え、形状も変化した。４週間後、すべての細胞は死亡し、結果的にフラスコ表面から離れた。これらの結果は、Ｄ−バリンを含む培地は、胎盤後由来細胞を選択的に成長させるのに適していないことを示している。
【０１８２】
≪実施例４に関する参照文献≫
（１）Hongpaisan J. 2000. Cell Biol Int. 24: 1-7.
（２）Sordillo LM, Oliver SP, Akers RM. 1988. Cell Biol Int Rep. 12: 355-64.
【０１８３】
〔実施例５〕
胎盤由来細胞のための低温保存培地
胎盤由来細胞の低温保存のための低温保存培地を評価した。
【０１８４】
≪方法と材料≫
ゼラチンコートT75フラスコの成長培地中で成長させた胎盤由来細胞を、PBSで洗浄し、トリプシン／EDTA（Gibco）１ｍＬを用いてトリプシン処理した。トリプシン処理を、成長培地 １０ｍＬを加えることによって停止した。細胞を１５０×ｇで遠心分離し、上澄みを除去し、細胞ペレットを成長培地 １ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液 ６０μＬを除去し、トリパンブルー（Sigma）６０μＬを加えた。生存細胞数を血球計を用いて推定した。細胞懸濁液を、各々８８×１０４細胞ずつ含む４つの等分量に分割した。細胞懸濁液を遠心分離し、以下のそれぞれの培地１ｍＬに再懸濁し、Cryovial（Nalgene）に移した。
【０１８５】
（１）成長培地＋１０％（ｖ／ｖ）DMSO（Hybrimax；Sigma, St. Louis, MO）
（２）DMSO、メチルセルロース含有、血清不含有の細胞凍結培地（C6295；Sigma, St. Louis, MO）
（３）血清不含有の細胞凍結培地（C2639；Sigma, St. Louis, MO）
（４）グリセロール含有細胞凍結培地（C6039；Sigma, St. Louis, MO）
【０１８６】
−８０℃の冷凍庫で、業者の使用説明書にしたがって（Nalgene, Rochester, NY）「Mr Frosty」凍結容器を用いて、約−１℃／分で一晩、細胞を冷蔵した。細胞のバイアルを、液体窒素中に２日間移し、解凍前に急速に３７℃の水浴に入れた。細胞数および活力を推定する前に、細胞を成長培地 １０ｍＬに加え、遠心分離した。細胞を５，０００細胞／ｃｍ２でゼラチンコートフラスコ上に接種し、細胞が付着し増殖するかどうか決定した。
【０１８７】
≪結果≫
低温保存した細胞の最初の生存力は、トリパンブルー染色によって検査したところ、１００％であった。低温保存した細胞の最初の生存力は、トリパンブルー染色によって検査したところ、１００％であった。
【０１８８】
細胞溶解のせいで、C6295について、生存力を有する細胞数の相応の減少があった。４つの溶液すべてにおいて、低温保存された生存細胞は、３日以内に、付着、分裂し、コンフルエンスな単層を産生した。推定された成長速度において、区別可能な違いはなかった。
【０１８９】
＜概要＞
細胞の低温保存は、細胞貯蔵もしくは細胞産物を準備するために利用可能な１つの手法である。ヒト胎盤由来細胞を凍結損傷から保護する能力について、４つの低温保存溶液を比較した。これらを比較して、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）および１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（DMSO）は、胎盤由来細胞の低温保存のために、好まれる培地である。
【０１９０】
〔実施例６〕
分娩後由来細胞の核型分析
細胞治療に用いられる細胞株は、好ましくは、同質であり、任意の細胞型に汚染されていないものである。細胞治療に用いられる細胞は、正常な染色体数（４６本）および正常な染色体構造を有するべきである。同質で、非分娩後組織起源の細胞が含まれない、胎盤由来細胞株および臍由来細胞株を同定するために、細胞サンプルの核型を解析した。
【０１９１】
≪材料と方法≫
新生男児の分娩後細胞由来のPPDCを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地中で培養した。新生男児由来の分娩後組織（Ｘ、Ｙ）を、新生児由来細胞および母体由来細胞（Ｘ、Ｘ）を区別できるように選択した。細胞を、T25フラスコ（Corning, Corning, NY）の成長培地中に、５，０００細胞／ｃｍ２で接種し、８０％のコンフルエンスまで増加させた。細胞を含むT25フラスコを、フラスコの首部分まで増殖培地で満たした。サンプルを、宅配便で治療細胞遺伝学の研究所へ送達した（研究室間の推定輸送時間は１時間である）。染色体が最もよく可視化される細胞分裂中期中に、細胞を分析した。カウントされた細胞分裂中期の２０個の細胞のうち、５つは正常な、同質な核型数（２）であると分析された。２つの核型が観察された場合、細胞サンプルは同質であると特徴付けられた。２つより多い核型が観察された場合、細胞サンプルは異質であると特徴付けられた。異質の核型数（４）が同定された場合、追加の細胞分裂中期細胞をカウントし、分析した。
【０１９２】
≪結果≫
染色体分析されたすべての細胞サンプルは、正常な外観を示していると解釈された。分析された１６個の細胞株のうちの３つが、異質な表現型（ＸＸおよびＸＹ）を示し、このことは、新生児起源および母体起源に由来する細胞の存在を示している（表６−１）。組織「胎盤−Ｎ」に由来する細胞を、胎盤の新生児面から単離した。０代継代において、この細胞株は、同質のＸＹを示した。しかしながら、９代継代において、細胞株は異質（ＸＸ／ＸＹ）であり、以前に検出されなかった母体起源の細胞の存在を示している。
【０１９３】
【表６】
2009519978.tif 000008
【０１９４】
＜概要＞
染色体分析は、治療細胞遺伝学の研究所で正常であると解釈された核型を示したような胎盤由来細胞および臍由来細胞を同定した。また、核型分析は、同質の核型によって決定されたような母体細胞を含まない細胞株を同定した。
【０１９５】
〔実施例７〕
フローサイトメトリーによるヒト分娩後由来細胞表面マーカーの評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質、すなわち、「マーカー」の特徴付けを、細胞株の同一性を決定するために用いることができる。発現の一貫性を、複数の提供者、および、異なる過程や培養条件にさらされた細胞において、決定することができる。胎盤および臍から単離された分娩後由来細胞（PPDC）株は、これらの細胞株の同定のためのプロファイルが提供される場合、（フローサイトメトリーによって）特徴付けられた。
【０１９６】
≪材料と方法≫
＜培地および培養容器＞
細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地（Gibco, Carlsbad, CA）中で培養した。細胞をプラズマ処理したT75、T150、T225組織培養フラスコ（Corning, Corning, NY）中で、コンフルエンスになるまで培養した。２％（ｖ／ｖ）ゼラチン（Sigma, St. Louis, MO）を、室温、２０分間でインキュベーションすることによって、フラスコの成長表面をゼラチンでコートした。
【０１９７】
＜抗体染色およびフローサイトメトリー分析＞
フラスコの接着細胞をPBSで洗浄し、トリプシン／EDTAで引き離した。細胞を採取し、遠心分離し、３％（ｖ／ｖ）FBSを含むPBSに、１ｍＬ当たり１×１０７個の細胞濃度になるように再懸濁した。業者の仕様書にしたがって、目的の細胞表面マーカー（以下参照のこと）に対する抗体を、細胞懸濁液 １００μＬに添加し、混合液を、暗所、４℃で、３０分間、インキュベーションした。インキュベーション後、非結合抗体を除去するために、PBSで洗浄し、遠心分離した。細胞をPBS ５００μＬ中に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリー分析を、FACScalibur機器（Becton Dickinson；San Jose, CA）上で実施した。
【０１９８】
以下の細胞表面マーカーに対する抗体を用いた。
【表７】
2009519978.tif 000009
【０１９９】
＜胎盤と臍の比較＞
胎盤由来細胞を、８代継代の臍由来細胞と比較した。
【０２００】
＜継代と継代の比較＞
胎盤由来細胞および臍由来細胞を、８代継代、１５代継代、２０代継代で分析した。
【０２０１】
＜提供者と提供者の比較＞
提供者間での違いを比較するために、異なる提供者由来の胎盤由来細胞を相互に比較し、異なる提供者由来の臍由来細胞を相互に比較した。
【０２０２】
＜表面コーティングの比較＞
ゼラチンコートフラスコ上で培養した胎盤由来細胞を、非コートフラスコ上で培養した胎盤由来細胞と比較した。ゼラチンコートフラスコ上で培養した臍由来細胞を、非コートフラスコ上で培養した臍由来細胞と比較した。
【０２０３】
＜消化酵素の比較＞
細胞の単離および準備のために用いた４つの処理を比較した。（１）コラーゲナーゼ、（２）コラーゲナーゼ／ディスパーゼ、（３）コラーゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、（４）コラーゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼの処理により胎盤から単離した細胞を比較した。
【０２０４】
＜胎盤層の比較＞
胎盤組織の母体面に由来する細胞を、胎盤組織の絨毛領域由来の細胞、胎盤の新生胎児面に由来する細胞と比較した。
【０２０５】
≪結果≫
＜胎盤と臍の比較＞
フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞、臍由来細胞は、CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cについて、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって示される、陽性発現を示した。これらの細胞は、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQについて、IgG対照と同程度の蛍光値によって示される、検出可能な発現が陰性であった。陽性曲線の蛍光値の変動が説明された。陽性曲線の平均値（すなわち、CD13）、および、値域（すなわち、CD90）が、いくつかの変動を示したが、その曲線は、正常な同質集団を確認できることを明らかにした。両曲線それぞれは、IgG対照よりも大きな値を示した。
【０２０６】
＜継代と継代の比較：胎盤由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された８代継代、１５代継代、２０代継代の胎盤由来細胞はすべて、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって反映されるように、CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cの発現について陽性であった。細胞は、IgG対照と一致する蛍光値を有するCD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２０７】
＜継代と継代の比較：臍由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された８代継代、１５代継代、２０代継代の臍由来細胞はすべて、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって反映されるように、CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを発現した。これらの細胞は、IgG対照と一致する蛍光値によって示される、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQについて陰性であった。
【０２０８】
＜提供者と提供者の比較：胎盤由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された別個の提供者から単離された胎盤由来細胞はそれぞれ、IgG対照と比較して増加した蛍光値を有するCD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを発現した。これらの細胞は、IgG対照と一致する蛍光値によって示されるような、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２０９】
＜提供者と提供者の比較：臍由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された別個の提供者から単離された臍由来細胞はそれぞれ、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって反映される、CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cの陽性発現を示した。これらの細胞はIgG対照と一致する蛍光値によって示される、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２１０】
＜胎盤由来細胞についてのゼラチン表面コーティングの効果＞
フローサイトメトリーによって分析された、ゼラチンコートフラスコ、もしくは、非コートフラスコのいずれか上で増加した胎盤由来細胞はすべて、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって反映されるCD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを発現した。これらの細胞は、IgG対照と一致する蛍光値を示されるCD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２１１】
＜臍由来細胞についてのゼラチン表面コーティングの効果＞
フローサイトメトリーによって分析された、ゼラチンフラスコ、および、非コートフラスコ上で増加した臍由来細胞はすべて、IgG対照と比較して増加した蛍光値を有するCD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cの発現について陽性であった。これらの細胞は、IgG対象と一致する蛍光値を有するCD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２１２】
＜細胞表面マーカープロファイルの細胞の準備のために用いられる酵素消化手法の効果＞
フローサイトメトリーによって分析された、様々な消化酵素を用いて単離された胎盤由来細胞はすべて、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって示されるCD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを発現した。これらの細胞は、IgG対照と一致する蛍光値によって示されるCD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２１３】
＜胎盤層の比較＞
フローサイトメトリーによってそれぞれ分析された胎盤の母体層、絨毛層、新生児層から単離した細胞は、IgG対照と比較して増加した蛍光値によって示されるCD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cの陽性発現を示した。これらの細胞は、IgG対照と一致する蛍光値によって示されるCD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現について陰性であった。
【０２１４】
＜概要＞
フローサイトメトリーによる胎盤由来細胞および臍由来細胞の分析は、これらの細胞株の同一性を確立してきた。胎盤由来細胞、臍由来細胞は、CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、HLA-A、HLA-B、HLA-Cについて陽性であり、CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQについて陰性である。この同一性は、提供者、継代、培養容器表面コーティング、消化酵素、胎盤層を含む変数における変動間で一致した。個々の蛍光値ヒストグラムの平均曲線および値域において、いくつかの変動が観察されたが、試験されたすべての条件下でのすべての陽性曲線は正常であり、IgG対照よりも大きく発現した蛍光値であった。このように、細胞は、マーカーの陽性発現を有する同質の集団を含むことを確認した。
【０２１５】
〔実施例８〕
分娩後組織表現型の免疫組織学的特徴付け
ヒト分娩後組織、すなわち、臍帯および胎盤中に見られる細胞の表現型を、免疫組織化学によって解析した。
【０２１６】
≪材料と方法≫
＜組織準備＞
ヒト臍帯組織および胎盤組織を採取し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に、４℃で一晩、浸し固定した。免疫組織化学を、以下のエピトープに対して指示された抗体を用いて実施した。ビメンチン（１：５００；Sigma, St. Louis, MO）、デスミン（１：１５０、対ウサギ；Sigma、もしくは、１：３００、対マウス；Chemicon, Temecula, CA）、α平滑筋アクチン（SMA；１：４００；Sigma）、サイトケラチン１８（CK18；１：４００；Sigma）、フォン・ヴィレブランド因子（vWF；１：２００；Sigma）、CD34（ヒトCD34クラスIII；１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）。加えて、以下のマーカーを試験した。抗ヒトGROalpha-PE（１：１００；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、抗ヒトGCP-2（１：１００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、抗ヒトoxidized LDL receptor 1（ox-LDL R1；１：１００；Santa Cruz Biotech）、抗ヒトNOGO-A（１：１００；Santa Cruz Biotech）。固定標本を外科用メスで整え、エタノールを含むドライアイス浴上のOCT包埋化合物（Tissue-Tek OCT；Sakura, Torrance, CA）内に配置した。その後、標準低温維持装置（Leica Microsystems）を用いて、凍結ブロックを切片形成し（１０μｍ厚）、染色のためにガラススライド上に乗せた。
【０２１７】
＜免疫組織化学法＞
免疫組織化学法を従来の研究（例えば、Messina, et al., 2003, Exper. Neurol. 184: 816-829）と同様に実施した。組織切片をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、PBS、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Chemicon, Temecula, CA）、０．３％（ｖ／ｖ）Triton（Triton X-100；Sigma）を含むタンパク質ブロッキング溶液に、細胞内抗原に接近するために、１時間さらした。目的のエピトープが細胞表面に位置するだろう例（CD34、ox-LDL R1）において、エピトープの損失を予防するために、手法のすべての段階において、Tritonを省略した。更に、一次抗体がヤギに対して産生された例（GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A）において、手法全体を通じて、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いた。一次抗体を、ブロッキング溶液に希釈し、その後、切片に対して、室温で３時間、適用した。一次抗体液を除去し、培養物をPBSで洗浄し、その後、二次抗体液を適用した（室温で１時間）。その二次抗体液は、ヤギ抗マウスIgG-Texas Red（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、および／もしくは、ヤギ抗ウサギIgG-Alexa488（１：２５０；Molecular Probes）、または、ロバ抗ヤギIgG-FITC（１：１５０；Santa Cruz Biotech）を含む。培養物を洗浄し、細胞核を可視化するために、１０分間、DAPI（Molecular Probes）１０μｍｏｌを適用した。
【０２１８】
免疫染色後、Olympus倒立落射蛍光顕微鏡（Olympus, Melville, NY）上で、適切な蛍光フィルタを用いて、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって示された。デジタルカラービデオカメラとImageProソフトウェア（Media Cybernetics, Carlsbad, CA）を用いて、代表的な像を撮影した。三重染色サンプルについて、各々の像を、一度に１つのみの発光フィルタを用いて撮影した。その後、Adobe Photoshopソフトウェア（Adobe, San Jose, CA）を用いて、層状モンタージュ写真を準備した。
【０２１９】
≪結果≫
＜臍帯特徴付け＞
ビメンチン、デスミン、SMA、CK18、vWF、CD34マーカーは、臍帯内に見られる細胞の部分集団において発現した。特に、vWF、CD34発現は、臍帯内に含まれる血管に限定されていた。CD34+細胞は、最内側層（内腔側）上にあった。ビメンチン発現は、臍帯のマトリックスおよび血管全体を通じて見られた。SMAは、動脈および静脈のマトリックスおよび外側壁に限定されたが、血管それ自身は含まれなかった。CK18、デスミンは、血管の内側のみに観察され、デスミンは中層および外層に限定的であった。
【０２２０】
＜胎盤特徴付け＞
ビメンチン、デスミン、SMA、CK18、vWF、CD34はすべて、胎盤内で観察され、領域特異的であった。
【０２２１】
＜GROalpha、GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-Aの組織発現＞
これらのマーカーはいずれも、臍帯組織もしくは胎盤組織内では観察されなかった。
【０２２２】
＜概要＞
ビメンチン、デスミン、α平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィレブランド因子、CD34は、ヒト臍帯およびヒト胎盤内の細胞において発現する。
【０２２３】
〔実施例９〕
オリゴヌクレオチドアレイを用いた分娩後組織由来細胞の解析
Affymetrix GENECHIPアレイを、臍由来細胞、および、胎盤由来細胞と、線維芽細胞、ヒト間充織肝細胞、および、その他のヒト骨髄由来の細胞株とを比較するために用いた。この分析は、分娩後由来細胞の特徴付けを提供し、これらの細胞に独特な分子マーカーを同定した。
【０２２４】
≪材料と方法≫
＜細胞の単離と培養＞
ヒト臍帯およびヒト胎盤を、National Disease Research Interchange（NDRI；Philadelphia, PA）から、正常な満期出産後、患者の同意を得て入手した。組織を受領し、実施例１に説明したように細胞を単離した。細胞を、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコ上の（DMEM-LGを用いた）6成長培地中で培養した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で、インキュベーションした。
【０２２５】
ヒト皮膚線維芽細胞を、Cambrec Incorporated（Walkersville, MD；ロット番号9F0844）、および、ATCC番号CRL-1501（CCD39SK）から購入した。両方の株を、１０％ウシ胎仔血清（Hyclone）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）を含むDMEM/F12培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で培養した。細胞を標準的な組織処理プラスチック上で成長させた。
【０２２６】
ヒト間充織幹細胞（hMSC）をCambrex Incorporated（Walkersville, MD；ロット番号2F1655、2F1656、2F1657）から購入し、MSCGM培地（Cambrex）中で、業者の仕様書にしたがって培養した。細胞を、標準的な組織培養プラスチック上で、３７℃、５％ＣＯ２で、成長させた。
【０２２７】
ヒト腸骨稜骨髄をNDRIから患者の同意を得て受領した。Ho, et al.（国際公開第０３／０２５１４９号）で概説された方法にしたがって、骨髄を加工した。骨髄を溶解バッファー（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ EDTA，ｐＨ７．２）と、１の骨髄に対して２０の溶解バッファーの割合で混ぜた。細胞懸濁液を撹拌し、周辺温度で２分間、インキュベーションし、５００×ｇで１０分間、遠心分離した。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、４ｍＭグルタミンを補完した最小必須培地α（Invitrogen）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、新しい培地中に、細胞ペレットを再懸濁した。生存単核球を、トリパンブルー排斥（Sigma, St. Louis, MO）を用いてカウントした。単核球を、組織培養プラスチックフラスコ中に、５×１０４細胞／ｃｍ２で接種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、標準大気Ｏ２もしくは５％Ｏ２のいずれかで、インキュベーションした。５日間培地を変えることなく、細胞を培養した。５日間の培養後、培地および非接着細胞を除去した。接着細胞を培養中に維持した。
【０２２８】
＜mRNA単離およびGENECHIP分析＞
活発に成長している細胞培養を、冷PBS中で細胞スクレーパーを用いて、フラスコから除去した。細胞を３００×ｇで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を新しいPBS中に再懸濁し、再び遠心分離した。上澄みを除去し、細胞ペレットを即座に凍結し、−８０℃で保存した。細胞mRNAを抽出し、cDNAに転写し、その後、cRNAに転写し、ビオチン標識した。ビオチン標識cRNAをHG-U133A GENECHIPオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix, Santa Clara CA）にハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションおよびテータ収集を、業者の仕様書にしたがって実施した。分析を「Significance Analysis of Microarrays」（SAM）version 1.21コンピュータソフトウェア（Stanford University, www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM；Tusher, V.G. et al, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116-5121）を用いて、実施した。
【０２２９】
≪結果≫
１４個の異なる細胞集団を解析した。継代情報、培養基質、培養培地とともに細胞を、表９−１に一覧にする。
【０２３０】
【表８】
2009519978.tif 000010
【０２３１】
主成分分析によってデータを評価し、細胞中で異なって発現している２９０個の遺伝子を分析した。この分析によって集団間の相同性についての相対的な比較が可能になる。表９−２は、細胞対を比較するために、計算したユークリッド距離について示す。ユークリッド距離は、細胞型間で異なって発現した２９０個の遺伝子に基づく細胞の比較に基づいた。ユークリッド距離は、２９０個の遺伝子の発現間の相同性に反比例する（すなわち、距離が大きくなれば、相同性が小さくなる）。
【０２３２】
【表９】
2009519978.tif 000011
【０２３３】
表９−３、９−４、９−５は、胎盤由来細胞において増加した遺伝子発現（表９−３）、臍由来細胞において増加した遺伝子発現（表９−４）、臍由来細胞、胎盤由来細胞において減少した遺伝子発現（表９−５）を示す。「プローブセットID」と命名された列は、チップ上の特定の部位に位置するいくつかのオリゴヌクレオチドプローブのセットに係る業者の同定コードについていう。これらは命名された遺伝子（列「遺伝子名」）にハイブリダイゼーションし、特異的なアクセッション番号（列「NCBIアクセッション番号」）でNCBI（GenBank）中に見出すことができる配列を含む。
【０２３４】
【表１０】
2009519978.tif 000012
【０２３５】
【表１１】
2009519978.tif 000013
【０２３６】
【表１２−１】
2009519978.tif 000014
【表１２−２】
2009519978.tif 000015
【０２３７】
表９−６、９−７、９−８は、ヒト線維芽細胞において増加した遺伝子発現（表９−６）、ICBM細胞において増加した遺伝子発現（表９−７）、MSCにおいて増加した遺伝子発現（表９−８）を示す。
【０２３８】
【表１３】
2009519978.tif 000016
【０２３９】
【表１４】
2009519978.tif 000017
【０２４０】
【表１５】
2009519978.tif 000018
【０２４１】
＜概要＞
本実験は、臍帯および胎盤由来の分娩後細胞の分子的特徴付けを提供するために実施された。この解析は、３つの異なる臍帯および３つの異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。実験は、２つの異なる皮膚線維芽細胞株、３つの間充織間細胞株、３つの腸骨稜骨髄細胞株をも含む。これらの細胞で発現したmRNAを、２２，０００個の遺伝子に対するプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを用いて分析した。結果は、２９０個の遺伝子は、これらの５つの異なる細胞型で、異なって発現していることを示した。これらの遺伝子は、胎盤由来細胞において特に増加した１０個の遺伝子、臍由来細胞において特に増加した７個の遺伝子を含む。５４個の遺伝子は、他の細胞型と比較して、胎盤と臍帯で特に低い発現を有することがわかった。選択された遺伝子発現は、PCRによって確認された（以下の実施例を参照のこと）。これらの結果は、分娩後由来細胞が、例えば、骨髄由来細胞、線維芽細胞と比べて、差異のある遺伝子発現プロファイルを有することを示している。
【０２４２】
〔実施例１０〕
分娩後由来細胞における１０個の細胞マーカー
つづく実施例において、ヒト胎盤およびヒト臍帯に由来する細胞における相同性および相違性を、それらの遺伝子発現プロファイルを他の源由来の細胞と（オリゴヌクレオチドアレイを用いて）比較することによって、検査した。６個の「特徴」遺伝子が同定された。oxidized LDL receptor 1、interleukin-8、rennin、reticulon、chemokine receptor ligand 3 (CXC ligand 3)、granulocyte chemotactic protein 2 (GCP-2)。これらの「特徴」遺伝子は、分娩後由来細胞において相対的に高いレベルで発現する。
【０２４３】
この実施例で説明される手法を、胎盤由来細胞、臍由来細胞に対する独特の識別子を検出するための信頼できる一連の解析を確立するために実施するのと同様に、マイクロアレイデータを検証するために、遺伝子発現とタンパク質発現の間の一致／不一致を見つけるために実施した。
【０２４４】
≪方法と材料≫
＜細胞＞
胎盤由来細胞（３つの単離物。核型解析によって同定された、主に新生児の１つの単離物を含む）、臍由来細胞（４つの単離物）、正常なヒト皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblast)（NHDF；新生児、成人）を、ゼラチンコートT75フラスコに入ったペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地中で成長させた。間充織幹細胞（MSC）を間充織幹細胞弾丸キット(Mesenchymal Stem cell Growth Medium Bullet kit)（MSCGM；Cambrex, Walkerville, MD）中で成長させた。
【０２４５】
IL-8プロトコルのために、細胞を液体窒素から解凍し、ゼラチンコートフラスコに、５，０００細胞／ｃｍ２でめっきし、成長培地中で４８時間、成長させ、その後、血清枯渇培地［DMEM低グルコース（Gibco, Carlsbad, CA）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Carlsbad, CA）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma, St. Louis, MO）］１０ｍＬ中でさらに８時間成長させた。この処理の後、RNAを抽出し、細胞壊死片を除去するために、１５０×ｇ、５分間、上澄みを遠心分離した。その後、ELISA解析のために、上澄みを−８０℃で凍結した。
【０２４６】
＜ELISA解析のための細胞培養＞
胎盤および臍由来の分娩後細胞を、ヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞と同様に、ゼラチンコートT75フラスコに入れた成長培地で培養した。細胞を１１代継代時に、液体窒素で凍結した。細胞を解凍し、１５ｍＬ遠心分離チューブへと移した。１５０×ｇ、５分間の遠心分離後、上澄みを廃棄した。細胞を培養培地４ｍＬに再懸濁し、細胞をカウントした。細胞を、成長培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２フラスコ中で、２４時間、フラスコ当たり３７５，０００細胞で、成長させた。培地を８時間で血清枯渇培地と交換した。血清枯渇培地をインキュベーションの最後に収集し、１４，０００×ｇ、５分間、遠心分離した（そして、−２０℃で保存した）。
【０２４７】
フラスコごとの細胞数を推定するために、トリプシン／EDTA（Gibco, Carlsbad, CA）２ｍＬを各フラスコに加えた。細胞をフラスコから引き離した後、トリプシン活性を成長培地 ８ｍＬで中和した。細胞を１５ｍＬ遠心分離チューブに移し、１５０×ｇ、５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、成長培地 １ｍＬを、細胞を再懸濁するために、各チューブに加えた。細胞数を血球計を用いて推定した。
【０２４８】
＜ELISA解析＞
細胞により血清枯渇培地中へ分泌されたIL-8の量を、ELISA解析（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて分析した。すべての解析を、業者から提供された使用説明書にしたがって試験した。
【０２４９】
＜全RNA単離＞
RNAをコンフルエンスな分娩後細胞、線維芽細胞から抽出し、もしくは、IL-8発現のために、上記で説明したように処理された細胞から抽出した。業者の使用説明書（RNeasy Mini Kit；Qiagen, Valencia, CA）にしたがって、β−メルカプトエタノール（Sigma, St. Louis, MO）を含むバッファーRLT ３５０μＬで、細胞を溶解した。RNAを業者の使用説明書（RNeasy Mini Kit；Qiagen, Valencia, CA）にしたがって抽出し、DNAse処理（２．７Ｕ／サンプル）（Sigma St. Louis, MO）した。RNAをDEPC処理水 ５０μＬに溶出し、−８０℃で保存した。
【０２５０】
＜逆転写＞
ヒト胎盤、ヒト臍からもRNAを抽出した。組織（３０ｍｇ）を２−メルカプトエタノールを含むバッファーRLT ７００μＬに懸濁した。サンプルを機械的に均質化し、RNA抽出を業者の仕様書にしたがって実行した。RNAをDEPC処理水 ５０μＬで抽出し、−８０℃で保存した。RNAを、TaqMan逆転写試薬（Applied Biosystems, Foster City, CA）とともにランダムヘキサマーを用いて、２５℃１０分間、３７℃６０分間、９５℃１０分間の条件で、逆転写した。サンプルを−２０℃で保存した。
【０２５１】
cDNAマイクロアレイによって、分娩後細胞において独自に制御されていると同定された遺伝子（特徴遺伝子。oxidized LDL receptor、interleukin-8、rennin、reticulonを含む。）を、更にリアルタイムPCR、従来型PCRを用いて調査した。
【０２５２】
＜リアルタイムPCR＞
PCRを、Assays-on-Demand（商標）遺伝子発現産物を用いて、cDNA上で実施した。oxidized LDL receptor (Hs00234028)、rennin (Hs00166915)、reticulon (Hs00382515)、CXC ligand 3 (Hs00171061)、GCP-2 (Hs00605742)、IL-8 (Hs00174103)、GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA)を、業者の使用説明書（Applied Biosystems, Foster City, CA）にしたがって、cDNAとTaqManユニバーサルPCRマスターミックスとを混ぜ、ABI Prism 7000 SDSソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA）ともに７０００配列検出システムを用いた。サーマルサイクル条件は、最初に、５０℃２分間、９５℃１０分間、その後、９５℃１５秒間および６０℃１分間を４０サイクルであった。PCRデータを、業者の仕様書（User Bulletin #2 from Applied Biosystems for ABI Prism 7700 Sequence Detection System）にしたがって、分析した。
【０２５３】
＜従来型PCR＞
従来型PCRを、ABI PRISM 7700（Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Massachusetts, USA）を用いて、リアルタイムPCRの結果を確認するために実施した。PCRを、cDNA溶液 ２μＬ、１×AmpliTaq GoldユニバーサルミックスPCR 反応バッファー（Applied Biosystems, Foster City, CA）、および、９４℃５分間の最初の変性条件を用いて実施した。増幅は各プライマーセットごとに最適化した。すなわち、IL-8、CXC ligand 3、reticulonのために、９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃３０秒を３０サイクル；renninのために、９４℃１５秒、５３℃１５秒、７２℃３０秒を３８サイクル；oxidized LDL receptor、GAPDHのために、９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃３０秒を３３サイクル。増幅のために用いたプライマーを表１に一覧にする。最終PCR反応におけるプライマー濃度は、GAPDHを除いて、１μｍｏｌであり、GAPDHについては０．５μｍｏｌであった。GAPDHプライマーは、リアルタイムPCRのものと同じものであったが、業者のTaqManプローブを最終PCR反応には加えなかった。サンプルを２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルに泳動し、エチジウムブロマイド（Sigma, St. Louis, MO）で染色した。像を、焦点長ポロライドカメラ（VWR International, South PLAinfield, NJ）を用いて、667ユニバーサルTwinpackフィルム（VWR International, South Plainfield, NJ）を用いて撮影した。
【０２５４】
【表１６】
2009519978.tif 000019
【０２５５】
＜免疫蛍光法＞
PPDCを冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアミド（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）とともに、１０分間、室温で、固定した。０代継代（P0）（単離後直接）臍由来細胞、胎盤由来細胞のそれぞれ１つの単離物、１１代継代（２つの胎盤由来細胞、２つの臍由来細胞の単離物）、線維芽細胞（P11）を用いた。免疫細胞化学法を、以下のエピトープに対して指示する抗体を用いて実施した。ビメンチン（１：５００；Sigma, St. Louis, MO）、デスミン（１：１５０、対ウサギ；Sigma、もしくは、１：３００、対マウス；Chemicon, Temecula, CA）、α平滑筋アクチン（SMA；１：４００；Sigma）、サイトケラチン１８（CK18；１：４００；Sigma）、フォン・ヴィレブランド因子（vWF；１：２００；Sigma）、CD34（ヒトCD34クラスIII；１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）。加えて、以下のマーカーを、１１代継代の分娩後細胞上で試験した。抗ヒトGROalpha-PE（１：１００；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、抗ヒトGCP-2（１：１００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、抗ヒトoxidized LDL receptor 1（ox-LDL R1；１：１００；Santa Cruz Biotech）、抗ヒトNOGO-A（１：１００；Santa Cruz Biotech）。
【０２５６】
培養物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、PBS、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Chemicon, Temecula, CA）、０．３％（ｖ／ｖ）Triton（Triton X-100；Sigma）を含むタンパク質ブロッキング溶液に、細胞内抗原に接近するために、３０分間さらした。目的のエピトープが細胞表面に位置するだろう場合（CD34、ox-LDL R1）において、エピトープの損失を予防するために、手法のすべての段階において、Tritonを省略した。更に、一次抗体がヤギに対して産生された例（GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A）において、全体を通じて、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いた。一次抗体を、ブロッキング溶液中に希釈し、その後、培養物に対して、室温で１時間、適用した。一次抗体液を除去し、培養物をPBSで洗浄し、その後、二次抗体液を適用した（室温で１時間）。その二次抗体液は、ヤギ抗マウスIgG-Texas Red（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、および／もしくは、ヤギ抗ウサギIgG-Alexa488（１：２５０；Molecular Probes）、または、ロバ抗ヤギIgG-FITC（１：１５０；Santa Cruz Biotech）を含む。その後、培養物を洗浄し、細胞核を可視化するために、１０分間、DAPI（Molecular Probes）１０μｍｏｌを適用した。
【０２５７】
免疫染色後、Olympus倒立落射蛍光顕微鏡（Olympus, Melville, NY）上で、適切な蛍光フィルタを用いて、蛍光を可視化した。すべての場合において、陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって示され、上記で概説された全体の手順は、一次抗体溶液の適用を除いて続けられた。デジタルカラービデオカメラとImageProソフトウェア（Media Cybernetics, Carlsbad, CA）を用いて、代表的な像を撮影した。三重染色サンプルについて、各々の像を、一度に１つのみの発光フィルタを用いて撮影した。その後、Adobe Photoshopソフトウェア（Adobe, San Jose, CA）を用いて、層状モンタージュ写真を準備した。
【０２５８】
＜FACS分析のための細胞の準備＞
フラスコ中の接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Gibco, Carlsbad, CA）によって洗浄し、トリプシン／EDTA（Gibco, Carlsbad, CA）によって引き離した。細胞を採取し、遠心分離し、３％（ｖ／ｖ）FBSの入ったPBSに、１ｍＬ当たり１×１０７の細胞濃度で再懸濁した。コニカルチューブに１００μＬ分量を分注した。細胞内抗原に対して染色された細胞を透過／洗浄バッファー（BD Pharmingen, San Diego, CA）で透過した。業者の仕様書どおりに、抗体を分液に加え、細胞を、暗所、４℃で、３０分間、インキュベーションした。インキュベーション後、余分な抗体を除去するために、細胞をPBSで洗浄し、遠心分離した。二次抗体が必要な細胞を、３％FBS １００μＬに再懸濁した。二次抗体を、業者の仕様書どおりに加え、細胞を暗所、４℃で、３０分間、インキュベーションした。インキュベーション後、余分な二次抗体を除去するために、細胞をPBSで洗浄し、遠心分離した。洗浄された細胞を、PBS ０．５ｍＬに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。その後の抗体は以下のものを用いた。oxidized LDL receptor 1（sc-5813；Santa Cruz, Biotech）、GROa（555042；BD Pharmingen, Bedford, MA）、マウスIgG1 kappa（P-4685；M-5284、Sigma）、ロバ抗ヤギIgG（sc-3743；Santa Cruz, Biotech）。フローサイトメトリー解析を、FACScalibur（Becton Dickinson San Jose, CA）を用いて実施した。
【０２５９】
≪結果≫
ヒト胎盤、成人および新生児の線維芽細胞、間充織幹細胞（MSC）由来の細胞のcDNA上で実施された、選択された「特徴」遺伝子についてのリアルタイムPCRの結果は、oxidized LDL receptor、rennin両方が、他の細胞と比較して、胎盤由来細胞においてより高いレベルで発現していることを示している。リアルタイムPCRで入手されたデータをΔΔCT法によって分析し、対数軸上で表現した。reticulon、oxidized LDL receptorのレベルは、他の細胞と比較して、臍由来細胞においてより高いものであった。CXC ligand 3、GCP-2の発現レベルについては、分娩後由来細胞と対照の間で、有意差は見られなかった。リアルタイムPCRの結果を、従来型PCRによって確認した。PCR産物の配列決定により、これらの結果は、更に確かめられた。上記に一覧にしたCXC ligand 3プライマーによる従来型PCR用いても、CXC ligand 3の発現レベルについて、分娩後由来細胞と対照との間に有意差は見られなかった。
【０２６０】
分娩後におけるサイトカイン、IL-8の産生を、成長培地で培養した分娩後由来細胞と、血清枯渇の分娩後由来細胞の両方で、評価した。すべてのリアルタイムPCRのデータは、従来型PCRとともに、そして、PCR産物の配列決定によって確かめられた。
【０２６１】
血清を含まない培地における細胞の上澄みがIL-8の存在下で試される場合、最も多い量が、臍由来細胞由来の培地、および、いくつかの胎盤細胞単離物由来の細胞で検出された（表１０−１）。ヒト線維芽細胞由来の培地では、IL-8は全く検出されなかった。
【０２６２】
【表１７】
2009519978.tif 000020
【０２６３】
胎盤由来細胞もまた、oxidized LDLreceptor、GCP-2、GROalphaの産生について、FACS分析によって調べられた。細胞はGCP-2について陽性であることを試験した。oxidized LDL receptor、GROはこの方法では検出されなかった。
【０２６４】
胎盤由来細胞はまた、免疫化学分析によって、選択されたタンパク質の産生について試験された。単離後即座に（０代継代）、ヒト胎盤由来細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、６つのタンパク質に対する抗体にさらした。フォン・ヴィルブランド因子、CD34、サイトケラチン１８、デスミン、α平滑筋アクチン、ビメンチン。細胞をα平滑筋アクチンとビメンチンの両方で陽性染色した。このパターンは、１１代継代を通じて保存された。０代継代のほんのわずかな細胞（５％未満）が、サイトケラチン１８について陽性染色された。
【０２６５】
０代継代のヒト胎盤由来細胞を、免疫細胞化学分析によって、選択されたタンパク質の産生について探索した。単離後即座に（０代継代）、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、６つのタンパク質に対する抗体にさらした。フォン・ヴィルブランド因子、CD34、サイトケラチン１８、デスミン、α平滑筋アクチン、ビメンチン。臍由来細胞は、α平滑筋アクチン、ビメンチンについて、陽性であり、１１代継代を通じて染色パターンは一致した。
【０２６６】
＜概要＞
マイクロアレイとPCR（リアルタイムと従来型の両方）によって測定された遺伝子発現レベル間の一致は、４つの遺伝子について確立された。oxidized LDL receptor 1、rennin、reticulon、IL-8。これらの遺伝子発現は、PPDCにおいてはmRNAレベルで異なって制御され、IL-8については、タンパク質レベルで異なって制御された。oxidized LDL receptorの存在は、胎盤由来細胞では、FACS分析によってタンパク質レベルで検出された。GCP-2、CXC ligand 3の異なる発現レベルは、mRNAレベルでは確認されなかったが、GCP-2はFACS分析によって、胎盤由来細胞において検出された。この結果は、マイクロアレイ実験から元々入手されるデータによっては反映されないが、これは方法の感度の違いのためかもしれない。
【０２６７】
単離後即座に（０代継代）、ヒト胎盤由来細胞は、α平滑筋アクチンとビメンチンの両方について陽性に染色された。このパターンは１１代継代の細胞においても観察された。これらの結果は、ビメンチン、α平滑筋アクチンの発現が、成長培地において、および、これらの手法で利用される条件下で、継代を通じて保存されるかもしれないということを示唆している。０代継代におけるヒト臍帯由来細胞を、α平滑筋アクチン、ビメンチンの発現について探索したところ、両方について陽性であった。染色パターンは、１１代継代を通じて保存された。
【０２６８】
〔実施例１１〕
分娩後由来細胞による栄養因子の分泌
胎盤由来細胞、臍帯由来細胞からの選択された栄養因子の分泌を測定した。検出のために選択された因子は以下のものを含む。
（１）血管形成活性を有することが知られる因子、例えば、肝細胞成長因子(hepatocyte growth factor)（HGF）［Rosen et al. (1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26］、単球走化性タンパク質(monocyte chemotactic protein 1)（MCP-1）［Salcedo et al. (2000) Blood 96;34-40］、インターロイキン８(interleukin-8)（IL-8）［Li et al. (2003) J. Immunol. 170:3369−76］、ケラチノサイト成長因子(keratinocyte growth factor)（KGF）、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor)（bFGF）、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor)（VEGF）［Hughes et al. (2004) Ann. Thorac. Surg. 77:812−8］、マトリックスメタロプロテアーゼ１(matrix metalloproteinase 1)（TIMP1）、アンジオポイエチン２(angiopoietin 2)（ANG2）、血小板由来成長因子(platelet derived growth factor)（PDGF-bb）、トロンボポイエチン(thrombopoietin)（TPO）、ヘパリン結合上皮成長因子(heparin-binding epidermal growth factor)（HB-EGF）、ストローマ細胞由来因子１α(stromal-derived factor 1 alpha)（SDF-1 alpha）、
（２）神経栄養活性／神経保護活性を有することが知られる因子、例えば、脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor)（BDNF）［Cheng et al. (2003) Dev. Biol. 258;319-33］、インターロイキン６(interleukin-6)（IL-6）、顆粒球走化性タンパク質(granulocyte chemotactic protein-2)（GCP-2）、形質転換成長因子β２(transforming growth factor beta 2)（TGFbeta2）、
（３）ケモカイン活性を有する因子、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１α(macrophage inflammatory protein 1 alpha)（MIP1a）、マクロファージ炎症性タンパク質１β(macrophage inflammatory protein 1 beta)（MIP1b）, 単球走化性タンパク質１(monocyte chemoattractant-1)（MCP-1）、Rantes (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)、I309、胸腺活性調整ケモカイン(thymus and activation-regulated chemokine)（TARC）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（MDC）、IL-8。
【０２６９】
≪方法と材料≫
＜細胞培養＞
ヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞と同様に胎盤および臍由来のPPDCを、ゼラチンコートT75フラスコに入ったペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地中で、培養した。細胞を１１代継代で低温保存し、液体窒素中で保存した。細胞を解凍後、細胞に成長培地を加え、その後、１５mＬ遠心分離チューブに移し、１５０×ｇ、５分間、遠心分離した。上澄みを廃棄した。細胞ペレットを成長培地 ４ｍＬに再懸濁し、細胞をカウントした。細胞を、成長培地 １５mＬを含む７５ｃｍ２フラスコ当たり３７５，０００細胞で接種し、２４時間培養した。培地を、血清を含まない培地［DMEM低グルコース（Gibco）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Sigma）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）］に、８時間で交換した。血清を含まない馴化培地を、インキュベーションの最後で収集し、１４，０００×ｇ、５分間、遠心分離し、−２０℃で保存した。各フラスコの細胞数を推定するために、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン／EDTA  ２mＬを用いて引き離した。トリプシン活性を成長培地 ８mＬを加えることで抑制した。細胞を、１５０×ｇ、５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を成長培地１mＬに再懸濁した。細胞数を、血球計を用いて推定した。
【０２７０】
＜ELISA解析＞
細胞を、３７℃、５％二酸化炭素、大気酸素条件で成長させた。胎盤由来細胞（101503群）を、５％酸素下、もしくは、β−メルカプトエタノール（BME）下で成長させた。各々の細胞サンプルによって産生されるMCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1 alpha、GCP-2、IL-8、TGF-beta 2の量を、ELISA解析（R&D Systems, Minneapolis, MN）によって測定した。すべての解析を、業者の使用説明書にしたがって実施した。
【０２７１】
＜SearchLight多重ELISA解析＞
ケモカイン（MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、I309、TARC、エオタキシン、MDC、IL8）、BDNF、血管形成因子（HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF）を、Searchlightプロテオームアレイ（Pierce Biotechnology Inc.）を用いて測定した。プロテオームアレイは、穴当たり２〜１６個のタンパク質を、量的に測定するための多重サンドイッチELISA(multiplexed sundwich ELISA)である。９６穴プレート中に、４〜１６個の異なる捕捉抗体を、２×２、３×３、もしくは、４×４のパターンでスポットすることによって、アレイを作った。サンドイッチELISA法後、全体のプレートを、プレートの各穴内の各スポットで生成された化学蛍光シグナルを撮影するために、造影した。各スポットで生成されたシグナル量は、元々の標準もしくはサンプルにおける標的タンパク質の量と比例する。
【０２７２】
≪結果≫
＜ELISA解析＞
MCP-1、IL-6は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、皮膚線維芽細胞によって分泌された（表１１−１）。SDF-1 alphaは、５％Ｏ２下で培養された胎盤由来細胞、線維芽細胞によって分泌された。GCP-2、IL-8は、BME存在下もしくは５％Ｏ２下で培養された臍由来細胞、胎盤由来細胞によって分泌された。GCP-2はまた、ヒト線維芽細胞によって分泌された。TGF-beta 2は、ELISA解析によって検出されなかった。
【０２７３】
【表１８】
2009519978.tif 000021
【０２７４】
＜SearchLight多重ELISA解析＞
TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC、IL-8が、臍由来細胞から分泌された（表１１−２、１１−３）。TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、エオタキシン、IL-8が、胎盤由来細胞から分泌された（表１２−２、１２−３）。Ang2、VEGF、PDGF-bbは全く検出されなかった。
【０２７５】
【表１９】
2009519978.tif 000022
【０２７６】
【表２０】
2009519978.tif 000023
＜概要＞
臍由来細胞、胎盤由来細胞は、数多くの細胞栄養因子を分泌した。これらの栄養因子（例えば、HGF、bFGF、MCP-1、IL-8）のいくつかは、血管形成において重要な役割を果たしている。他の栄養因子（例えば、BDNF、IL-6）は、神経再生において重要な役割を有している。
【０２７７】
〔実施例１２〕
分娩後由来細胞の試験管内（in vitro）での免疫学的評価
【０２７８】
分娩後由来細胞（PPDC）を、免疫反応を予測し、もしあるとすれば、これらの細胞を生体内（in vivo）での移植で誘出する目的で、その免疫学的特徴について試験管内（in vitro）で評価した。PPDCをHLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86、B7-H2の存在についてフローサイトメトリーで解析した。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（APC）によって発現され、非感作CD4+ T細胞の直接刺激を必要とする（Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171）。細胞株はまた、HLA-G（Abbas & Lichtman, 2003、上記参照）、CD178［Coumans, et al, (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196］、PD-L2［Abbas & Lichtman, 2003、上記参照；Brown, et. al. (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266］の発現について、フローサイトメトリーによって分析した。胎盤組織に存在する細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内における分娩組織の免疫免責状態を調節すると考えられている。胎盤由来細胞株、臍由来細胞株が生体内（in vivo）で免疫反応を誘出する程度を予測するために、細胞株を一方向混合リンパ球免疫反応(one-way mixed lymphocyte immune response)（MLR）で試験した。
【０２７９】
≪材料と方法≫
＜細胞培養＞
２％ゼラチン（Sigma, St. Louis, MO）でコートしたT75フラスコ（Corning, Corning, NY）に入ったペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地中で、細胞をコンフルエンスまで培養した。
【０２８０】
＜抗体染色＞
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Gibco, Carlsbad, CA）で洗浄し、トリプシン／EDTA（Gibco, Carlsbad, MO）で引き離した。細胞を採取し、遠心分離し、３％（ｖ／ｖ）FBSの入ったPBSで、mＬ当たり１×１０７細胞濃度で再懸濁した。抗体（表１２−１）を、業者の仕様書のとおりに細胞懸濁液１００μLに加え、暗所、４℃で、３０分間、インキュベーションした。インキュベーション後、非結合抗体を除去するために、細胞をPBSで洗浄し、遠心分離した。細胞をPBS ５００μLに再懸濁し、FACSCalibur機器（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２８１】
【表２１】
2009519978.tif 000024
【０２８２】
＜混合リンパ球反応＞
細胞株Ａとラベルした１０代継代の臍由来細胞の低温保存バイアル、および、細胞株Ｂとラベルした第１１代継代の胎盤由来細胞の低温保存バイアルを、CTBR SOP No. CAC-031を用いた混合リンパ球反応を実行するために、ドライアイス上のCTBR（Senneville, Quebec）へと移した。末梢血単核球（PBMC）を、複数の男女のボランティア提供者から収集した。刺激（提供者）同種PBMC、自家PBMC、分娩後細胞株をマイトマイシンＣで処理した。自家マイトマイシンＣ処理刺激細胞を、反応（被移植者）PBMCに加え、４日間培養した。インキュベーション後、各サンプルに［３Ｈ］チミジンを加え、１８時間培養した。細胞採集後、放射線標識されたDNAを抽出し、［３Ｈ］チミジン取込みを、シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０２８３】
同種提供者に対する刺激指数(stimulation index for the allogeic donor)（SIAD）を、受容者の基準増殖によって割った、受容者＋マイトマイシンＣ処理同種提供者の平均増殖として計算した。PPDCの刺激指数を、受容者＋マイトマイシンＣ処理分娩後細胞株の平均増殖として計算した。
【０２８４】
≪結果≫
＜混合リンパ球反応：胎盤由来細胞＞
７人のヒトボランティア血液提供者を、他の６人の血液提供者による混合リンパ球反応における堅調な増殖反応を示すであろう単独の同種提供者を同定するために、スクリーニングした。この提供者を、同種陽性対照提供者として選択した。残りの６人の血液提供者を、被移植者として選択した。同種陽性対照提供者、胎盤由来細胞株を、マイトマイシンＣで処理し、６人の個々の同種受容者とともに混合リンパ球反応において培養した。反応を、プレート当たり３つの受容者で、２つの細胞培養プレートを用いて３回実施した（表１２−２）。平均刺激指数は、１．３（プレート２）〜３（プレート１）の範囲であり、同種提供者陽性対照は、４６．２５（プレート２）〜２７９（プレート１）であった（表１２−３）。
【０２８５】
【表２２】
2009519978.tif 000025
【０２８６】
【表２３】
2009519978.tif 000026
【０２８７】
＜混合リンパ球反応：臍由来細胞＞
６人のヒトボランティア血液提供者を、他の５人の血液提供者による混合リンパ球反応における堅調な増殖反応を示すであろう胆道区の同種提供者を同定するために、スクリーニングした。この提供者を、同種陽性対照として選択した。残りの５人の血液提供者を、被移植者として選択した。同種陽性対照提供者、胎盤細胞株を、マイトマイシンＣで処理し、５人の個々の同種受容者とともに混合リンパ球反応において培養した。反応を、プレート当たり３つの受領体で、２つの細胞培養プレートを用いて３回実施した（表１２−４）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種提供者陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）であった（表１２−５）。
【０２８８】
【表２４】
2009519978.tif 000027
【０２８９】
【表２５】
2009519978.tif 000028
【０２９０】
＜抗原提示細胞マーカー：胎盤由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、IgG対照と一致する蛍光値で示されるように、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86、B7-H2の陰性発現を示している。このことは、胎盤由来細胞株はCD4+ T細胞を直接刺激するために要求される細胞表面分子が欠如していることを示している。
【０２９１】
＜免疫調節マーカー：胎盤由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、IgG対照と比較して増加した蛍光値で示されるように、PD-L2の陽性発現、および、IgG対照と一致する蛍光値で示されるように、CD178、HLA-Gの陰性発現を示している。
【０２９２】
＜抗原提示細胞マーカー：臍由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された臍由来細胞のヒストグラムは、IgG対照と一致する蛍光値で示されるように、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86、B7-H2の陰性発現を示している。このことは、臍由来細胞系統はCD4+ T細胞を直接刺激するために要求される細胞表面分子が欠如していることを示している。
【０２９３】
＜免疫調節マーカー：臍由来細胞＞
フローサイトメトリーによって分析された臍由来細胞のヒストグラムは、IgG対照と比較して増加した蛍光値で示されるように、PD-L2の陽性発現、および、IgG対照と一致する蛍光値で示されるように、CD178、HLA-Gの陰性発現を示している。
【０２９４】
＜概要＞
胎盤由来細胞株とともに実行された混合リンパ球反応において、平均刺激指数は１．３〜３の範囲であり、同種陽性対照の平均刺激標的は、４６．２５〜２７９であった。臍由来細胞株とともに実行された混合リンパ球反応において、平均刺激指数は、６．５〜９の範囲であり、同種陽性対照の平均刺激指数は、４２．７５〜７０であった。胎盤由来細胞株、臍由来細胞株は、フローサイトメトリーで測定されるように、刺激タンパク質HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86、B7-H2の発現について、陰性であった。胎盤由来細胞株、臍由来細胞株は、フローサイトメトリーで測定されるように、免疫調節タンパク質HLA-G、CD178の発現について陰性であり、PD-L2の発現について、陽性であった。同種提供者PBMCは、HLA-DR、DQ、CD8、CD86、B7-H2を発現した抗原提示細胞を含み、そのことによって、非感作CD4+ T細胞を刺激することができる。胎盤由来細胞、臍由来細胞上の、非感作CD4+ T細胞の直接刺激に要求される抗原提示細胞表面分子の不存在、および、免疫調節タンパク質PD-L2の存在は、MLRにおいて、これらの細胞によって示される、同種対象と比較して低い刺激指数を説明するかもしれない。
【０２９５】
〔実施例１３〕
免疫反応を抑圧するための第三者としてのヒト分娩後由来細胞の試験管内（in vitro）での評価
胎盤由来細胞、臍由来細胞（PDC、UDC）を、２つのハプロタイプで不適合な末梢血単核球（PBMC）集団間の免疫反応を抑制するための第三者としての能力について、試験管内（in vitro）で評価した。近年の報告は、移植片と提供者細胞集団の間の免疫反応を抑圧するために、様々な細胞型が有用であるかもしれないことを示唆してきた（１、２）。２つのハプロタイプで不適合な末梢血単核球（PBMC）集団間の免疫反応を抑圧するための第三者として行動することのできるPDCもしくはUDCの能力を調査するために、混合リンパ球反応を用いた（３）。
【０２９６】
≪材料と方法≫
＜PBMC単離と培養＞
PBMCを、同意を得た健康な提供者から入手した全血から、勾配遠心分離によって即座に単離し、１０％FBSの入ったRPMIに再懸濁した。
【０２９７】
＜PDCとUDC培養＞
胎盤由来細胞もしくは臍由来細胞を、５．０Ｅ＋０３細胞／ｃｍ２で接種し、成長培地（DMEM低グルコース、１５％FBS、BME、P/S）中で、約７０％のコンフルエンスまで増加させ、トリプシンとともに採取した。細胞を、増加中にIFN-γ ５００Ｕ／ｍＬで処理し、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQの発現を誘導した。
【０２９８】
＜ハプロタイプ不適合＞
刺激PBMC、反応PBMC、および、PDCもしくはUDCは、6つの主要な組織不適合性不適合のうちの６つであった。
【０２９９】
＜刺激細胞増殖抑制＞
PDCもしくはUDCおよび刺激PBMCを、細胞増殖を抑制するために、標準条件下、マイトマイシンＣ ２５μｇ／ｍＬととともに、３０分間、処理した。その後、細胞を新たなRPMI1640で洗浄した。
【０３００】
＜混合リンパ球反応＞
混合リンパ球反応を、丸底９６穴プレートで、１０％FBSを含むRPMI1640中で培養されたすべての細胞とともに、実行した。マイトマイシンＣ処理したPDCもしくはUDCを、穴当たり２．５Ｅ＋０４個もしくは１．２５Ｅ＋０４個で、指定された穴の中に配置した。マイトマイシンＣ処理した刺激PBMC、反応PBMCを、穴当たり１．０Ｅ＋０５細胞で、指定された穴の中に配置した。
【０３０１】
＜チミジン取込み＞
６日後、５０μＣｉ／ｍＬ ［３Ｈ］チミジン溶液の培養物２０μＬを、各穴に加えた。７日後の培養細胞を、［３Ｈ］チミジン取込みについて、TopCpint1シンチレーションカウンター機器で評価した。標識取込みを、カウント／分（cpm）で表現した。
【０３０２】
≪結果≫
胎盤由来細胞についての結果を、表１３−１、表１３−２、図１、図２に示す。
【０３０３】
【表２６】
2009519978.tif 000029
【０３０４】
【表２７】
2009519978.tif 000030
【０３０５】
臍由来細胞についての結果を、表１３−３、表１３−４、図３、図４に示す。
【０３０６】
【表２８】
2009519978.tif 000031
【０３０７】
【表２９】
2009519978.tif 000032
【０３０８】
図表に見られるように、一方向MLRにおいて、反応PBMCは、反応PBMCのみ、刺激PBMCのみと比較して、増加した［３Ｈ］チミジン取込みを示した。このことは、マイトマイシンＣ処理した刺激PBMCと共存培養した場合に、これらの細胞の増殖を示唆する。この反応PBMC増殖のレベルは、マイトマイシンＣ処理した刺激PBMCに対する、反応PBMCの免疫反応を示唆する。
【０３０９】
ハプロタイプ不適合のマイトマイシンＣ処理PDCのみで共存培養した反応PBMCによる［３Ｈ］チミジン取込みのレベルは、ハプロタイプ不適合のマイトマイシンＣ処理刺激PBMCと共存培養した反応PBMCによる［３Ｈ］チミジン取込みのレベルよりも小さかった。このことは、PDCが、この解析における、ハプロタイプ不適合の反応PBMCから、減少した免疫反応を誘出することを示唆する。
【０３１０】
マイトマイシンＣ処理したPDC（IFN−γ処理もしくは未処理）を、これらの培養物に加えることは、反応PBMCの［３Ｈ］標識チミジン取込みのレベルを減少させる。このことは、第三者PDCが、マイトマイシンＣ処理した刺激細胞に対して反応PBMCの免疫反応を抑圧することを示唆する。この抑圧は、細胞用量が直接的に反応PBMCの抑制に関連していたため、用量依存的であることが示される。
【０３１１】
実施例１３に関する参照文献
（１）Bruder SP等に付与された米国特許第６，３５５，２３９  Ｂ１号(2002年)
（２）「ブラッド（Blood.）」 2005年２月１５日; 105(4): 1815-22
（３）「クレイン、ジャン、イミュノロジー（Klein, Jan Immunology）」: The Science of Self-Nonself Discrimination John Wiley & Sons, ニューヨーク（New York），ページ４５３〜４５８（p.453-8）
【０３１２】
本発明は、記載され、上記に例示された実施態様に限定されず、添付した特許請求の範囲内で変更、改良が可能である。
【０３１３】
〔実施の態様〕
（１）移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法において、
細胞組成物を、前記逆免疫反応を抑制するために有効な量で、前記移植受容者に投与することを含み、
前記細胞組成物は、
製薬上許容できるキャリアと、
実質的に血液を含まないヒト分娩後組織に由来する分娩後由来細胞と、
を含み、
前記細胞は、培養中で自己再生し、増加することができ、
前記細胞は、成長のためにＬ−バリンを要求し、約５％から少なくとも約２０％までの酸素を含む空気中で成長することができ、
前記細胞は、以下の特徴、
（ａ）培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力があること、
（ｂ）コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであって、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備えること、
（ｃ）組織因子、ビメンチン、および、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｄ）CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2、HLA-A、HLA-B、および、HLA-Cのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｅ）フローサイトメトリーによって検出されたときに、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、HLA-DR、HLA-DP、および、HLA-DQのうちの少なくとも１つを産生していないこと、
（ｆ）interleukin 8、
reticulon 1、
chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 3、および、
tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｇ）C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activation-induced)、
Wilms tumor 1、
aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2、
renin、
oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1、
Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, partial cds、
protein kinase C, zeta、
hypothetical protein DKFZp564F013、
downregulated in ovarian cancer 1、および、
Homo sapiens mRNA; and cDNA DKFZp547K1113 (from clone DKFZp547K1113)
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｈ）線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、
short stature homeobox 2、
heat shock 27kDa protein 2、
chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、
elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、
mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、
sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、
crystallin, alpha B、
dishevelled associated activator of morphogenesis 2、
DKFZP586B2420 protein、
similar to neuralin 1、
tetranectin (plasminogen binding protein)、
src homology three (SH3) and cysteine rich domain、
B-cell translocation gene 1, anti-proliferative、
cholesterol 25-hydroxylase、
runt-related transcription factor 3、
hypothetical protein FLJ23191、
interleukin 11 receptor, alpha、
procollagen C-endopeptidase enhancer、
frizzled homolog 7 (Drosophila)、
hypothetical gene BC008967、
collagen, type VIII, alpha 1、
tenascin C (hexabrachion)、
iroquois homeobox protein 5、
hephaestin、
integrin, beta 8、
synaptic vesicle glycoprotein 2、
Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、
cytokine receptor-like factor 1、
potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、
integrin, alpha 7、
DKFZP586L151 protein、
transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、
sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、
KIAA1034 protein、
early growth response 3、
distal-less homeobox 5、
hypothetical protein FLJ20373、
aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、
biglycan、
fibronectin 1、
proenkephalin、
integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、
Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、
EphA3、
KIAA0367 protein、
natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、
hypothetical protein FLJ14054、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、
vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、
BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、
AE binding protein 1、
cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)、
neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、および、
insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa
のうちの少なくとも１つについて減少すること、
（ｉ）MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、および、TIMP1のうちの少なくとも１つを分泌すること、ならびに、
（ｊ）ELISAによって検出されたときに、TGF-beta 2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、および、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌していないこと、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
【０３１４】
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記逆免疫反応は、移植片対宿主病である、方法。
（３）実施態様１に記載の方法において、
前記逆免疫反応は、前記移植された組織の拒絶反応である、方法。
（４）実施態様１に記載の方法において、
前記分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせである、方法。
（５）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞組成物は、注射もしくは注入によって投与される、方法。
（６）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞組成物は、前記移植受容者に埋め込まれる、装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与される、方法。
【０３１５】
（７）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞組成物は、少なくとも約５０％の分娩後由来細胞を含む、方法。
（８）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞組成物は、実質的に同質な分娩後由来細胞の集団を含む、方法。
（９）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞型とともに投与される、方法。
（１０）実施態様９に記載の方法において、
前記少なくとも１つの他の細胞型は、前記分娩後由来細胞と同時に、前記分娩後由来細胞より前に、もしくは、前記分娩後由来細胞より後に投与される、方法。
（１１）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの他の薬剤とともに投与される、方法。
【０３１６】
（１２）実施態様１１に記載の方法において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、前記分娩後由来細胞と同時に、前記分娩後由来細胞より前に、もしくは、前記分娩後由来細胞より後に投与される、方法。
（１３）実施態様１１に記載の方法において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、もしくは、抗アポトーシス薬のうちの１つ以上である、方法。
（１４）移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための製薬組成物において、
製薬上許容できるキャリアと、
前記移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における前記逆免疫反応を抑制するために有効な量の、実施態様１の前記分娩後由来細胞と、
を含む、製薬組成物。
（１５）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、移植片対宿主病である、製薬組成物。
（１６）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、前記移植された組織の拒絶反応である、製薬組成物。
【０３１７】
（１７）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
前記分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせである、製薬組成物。
（１８）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
注射もしくは注入によって投与されるために処方される、製薬組成物。
（１９）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
前記移植受容者に埋め込まれる装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与されるために処方される、製薬組成物。
（２０）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
少なくとも約５０％の分娩後由来細胞を含む、製薬組成物。
（２１）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
実質的に同質な分娩後由来細胞の集団を含む、製薬組成物。
【０３１８】
（２２）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
少なくとも１つの他の細胞型を含む、製薬組成物。
（２３）実施態様１４に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの他の薬剤を含む、製薬組成物。
（２４）実施態様２３に記載の製薬組成物において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、もしくは、抗アポトーシス薬のうちの１つ以上である、製薬組成物。
（２５）移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するためのキットにおいて、
製薬上許容できるキャリアと、
実施態様１の前記分娩後由来細胞の集団と、
前記逆免疫反応を抑制するための方法で、前記キットを使用するための使用説明書と、
を含む、キット。
（２６）実施態様２５に記載のキットにおいて、
前記分娩後由来細胞を培養するための、少なくとも１つの試薬および使用説明書を、更に含む、キット。
【０３１９】
（２７）実施態様２５に記載のキットにおいて、
少なくとも１つの他の細胞型の集団を、更に含む、キット。
（２８）実施態様２５に記載のキットにおいて、
前記逆免疫反応を抑制するための、少なくとも１つの他の薬剤を、更に含む、キット。
【０３２０】
（２９）
移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための方法において、
分娩後由来細胞によって生成された馴化培地、分娩後由来細胞から生成された細胞溶解物、分娩後由来細胞から生成された可溶性細胞区画、もしくは、分娩後由来細胞を含む細胞外マトリックスのうちの１つ以上を含む組成物を、患者に投与することを含み、
前記分娩後由来細胞は、実質的に血液を含まないヒト分娩後組織に由来し、培養中で自己再生し、増加することができ、
前記細胞は、成長のためにＬ−バリンを要求し、約５％から少なくとも約２０％までの酸素を含む空気中で成長することができ、
前記細胞は、以下の特徴、
（ａ）培養中で、少なくとも約４０回倍加する能力があること、
（ｂ）コートされた組織培養容器、もしくは、コートされていない組織培養容器上に付着し、増加することであって、コートされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、もしくは、フィブロネクチンのコーティングを備えること、
（ｃ）組織因子、ビメンチン、および、α平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｄ）CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha、PD-L2、HLA-A、HLA-B、および、HLA-Cのうちの少なくとも１つを産生すること、
（ｅ）フローサイトメトリーによって検出されたときに、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、HLA-DR、HLA-DP、および、HLA-DQのうちの少なくとも１つを産生していないこと、
（ｆ）interleukin 8、
reticulon 1、
chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)、
chemokine (C-X-C motif) ligand 3、および、
tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｇ）C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activation-induced)、
Wilms tumor 1、
aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2、
renin、
oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1、
Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, partial cds、
protein kinase C, zeta、
hypothetical protein DKFZp564F013、
downregulated in ovarian cancer 1、および、
Homo sapiens mRNA; and cDNA DKFZp547K1113 (from clone DKFZp547K1113)
のうちの少なくとも１つを発現すること、
（ｈ）線維芽細胞、間充織幹細胞、もしくは、腸骨稜骨髄細胞といったヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、
short stature homeobox 2、
heat shock 27kDa protein 2、
chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1)、
elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022)、
mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox)、
sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila)、
crystallin, alpha B、
dishevelled associated activator of morphogenesis 2、
DKFZP586B2420 protein、
similar to neuralin 1、
tetranectin (plasminogen binding protein)、
src homology three (SH3) and cysteine rich domain、
B-cell translocation gene 1, anti-proliferative、
cholesterol 25-hydroxylase、
runt-related transcription factor 3、
hypothetical protein FLJ23191、
interleukin 11 receptor, alpha、
procollagen C-endopeptidase enhancer、
frizzled homolog 7 (Drosophila)、
hypothetical gene BC008967、
collagen, type VIII, alpha 1、
tenascin C (hexabrachion)、
iroquois homeobox protein 5、
hephaestin、integrin, beta 8、
synaptic vesicle glycoprotein 2、
Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744、
cytokine receptor-like factor 1、
potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4、
integrin, alpha 7、
DKFZP586L151 protein、
transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ)、
sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila)、
KIAA1034 protein、
early growth response 3、
distal-less homeobox 5、
hypothetical protein FLJ20373、
aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)、
biglycan、
fibronectin 1、
proenkephalin、
integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)、
Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422、
EphA3、
KIAA0367 protein、
natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C)、
hypothetical protein FLJ14054、
Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222)、
vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin)、
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1、
BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like、
AE binding protein 1、
cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)、
neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1、および、
insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa
のうちの少なくとも１つについて減少すること、
（ｉ）MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、および、TIMP1のうちの少なくとも１つを分泌すること、ならびに、
（ｊ）ELISAによって検出されたときに、TGF-beta 2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC、および、VEGFのうちの少なくとも１つを分泌していないこと、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
【０３２１】
（３０）実施態様２９に記載の方法において、
前記逆免疫反応は、移植片対宿主病である、方法。
（３１）実施態様２９に記載の方法において、
前記逆免疫反応は、前記移植された組織の拒絶反応である、方法。
（３２）実施態様２９に記載の方法において、
前記分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせである、方法。
（３３）実施態様２９に記載の方法において、
前記組成物は、注射もしくは注入によって、投与される、方法。
（３４）実施態様２９に記載の方法において、
前記組成物は、前記移植受容者における装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与される、方法。
【０３２２】
（３５）実施態様２９に記載の方法において、
前記組成物は、前記逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの他の薬剤とともに投与される、方法。
（３６）実施態様３５に記載の方法において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、前記組成物と同時に、前記組成物より前に、もしくは、前記組成物の後に投与される、方法。
（３７）実施態様３５に記載の方法において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、もしくは、抗アポトーシス薬のうちの１つ以上である、方法。
（３８）移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するための製薬組成物において、
製薬上許容できるキャリアと、
前記移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における前記逆免疫反応を抑制するために有効な量の、実施態様２９の前記組成物と、
を含む、製薬組成物。
（３９）実施態様３８に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、移植片対宿主病である、製薬組成物。
【０３２３】
（４０）実施態様３８に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応は、前記移植された組織の拒絶反応である、製薬組成物。
（４１）実施態様３８に記載の製薬組成物において、
前記分娩後由来細胞は、胎盤由来細胞、臍由来細胞、もしくは、胎盤由来細胞および臍由来細胞の組み合わせである、製薬組成物。
（４２）実施態様３８に記載の製薬組成物において、
注射もしくは注入によって投与されるために処方される、製薬組成物。
（４３）実施態様３８に記載の製薬組成物において、
前記移植受容者に埋め込まれる装置、足場、もしくは、マトリックスの埋め込みによって投与されるために処方される、製薬組成物。
（４４）実施態様３８に記載の製薬組成物において、
前記逆免疫反応を治療するための、少なくとも１つの他の薬剤を含む、製薬組成物。
【０３２４】
（４５）実施態様４４に記載の製薬組成物において、
前記少なくとも１つの他の薬剤は、抗血栓形成薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、免疫調整薬、もしくは、抗アポトーシス薬のうちの１つ以上である、製薬組成物。
（４６）移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応を抑制するためのキットにおいて、
製薬上許容できるキャリアと、
実施態様２９の前記組成物と、
前記逆免疫反応を抑制するための方法で、前記キットを使用するための使用説明書と、
を含む、キット。
（４７）実施態様４６に記載のキットにおいて、
前記逆免疫反応を抑制するための、少なくとも１つの他の薬剤を、更に含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】丸底プレートにおいて、第三者のIFNγ処理胎盤由来細胞による、二方向混合リンパ球反応（MLR）の結果を示す棒グラフである。
【図２】丸底プレートにおいて、非処理の胎盤由来細胞による、二方向の混合リンパ球反応（MLR）の結果を示す棒グラフである。
【図３】丸底プレートにおいて、第三者のIFNγ処理臍由来細胞による、二方向の混合リンパ球反応（MLR）の結果を示す棒グラフである。
【図４】丸底プレートにおいて、非処理の臍由来細胞による、二方向の混合リンパ球反応（MLR）の結果を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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