(57)【要約】  本発明は新規クラスの化合物、このような化合物を含む医薬組成物および異常なまたは無秩序なキナーゼ活性と関連する疾患または障害、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢキナーゼの異常な活性化が関与する疾患または障害を処置または予防するためにこのような化合物を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2009513632.tif 000013
〔式中：
ＹはＮおよびＣＨから選択され；
Ｒ１は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒ２は水素およびＣ１−６アルキルから選択されるか；またはＲ１およびＲ２はＲ１およびＲ２が結合しているフェニル環と一緒にＣ６−１０アリールもしくはＣ５−１０ヘテロアリールを形成し；
Ｒ３はＮＲ４Ｒ５およびＸ１Ｒ５から選択され；ここでＸ１は結合およびＣ１−４アルキレンから選択され；Ｒ４は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；Ｒ５は所望により独立してハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ５−１０ヘテロアリール−Ｃ０−４アルキルおよびＣ３−８ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択される１から３個のラジカルで置換されているＣ６−１０アリールから選択され；ここで、Ｒ５の該ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル置換基は所望によりＣ１−６アルキルで置換されている〕
で示される化合物ならびにその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物および異性体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２の両方が、水素であるか、またはＲ１およびＲ２がＲ１およびＲ２が結合しているフェニル環と一緒にキノリニルまたはナフタレニルを形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３がＮＨＲ５およびＸ１Ｒ５から選択され；ここで、Ｘ１が結合およびメチレンから選択され；Ｒ５が所望により独立してトリフルオロ−メチル、メトキシ、イミダゾリルおよびピペラジニル−メチルから選択される１から３個のラジカルで置換されているフェニルから選択され；ここで、Ｒ５の該イミダゾリルまたはピペラジニル置換基が所望によりメチルおよびエチルで置換されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
１−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア；１−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−３−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−（３，５−ジメトキシ−フェニル）−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア；１−［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−３−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［５−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−キノリン−８−イル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア；Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−２−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−アセトアミド；２−［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−Ｎ−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−アセトアミド；Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド；Ｎ−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；４−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；およびＮ−［５−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−キノリン−８−イル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミドから選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
治療有効量の請求項１に記載の化合物と薬学的に許容される賦形剤を一緒に含む医薬組成物。
【請求項６】
キナーゼ活性の阻害が疾患の病状および／または総体症状を予防、阻害または改善することができる動物の疾患を処置する方法であって、該動物に治療有効量の請求項１に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項７】
キナーゼがＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢのキナーゼ活性が疾患の病状および／または総体症状に関与する動物の疾患を処置するための薬剤の製造における請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）の下に２００５年１０月２８日出願の米国仮特許出願６０／７３１，１７９の優先権の利益を主張する。優先権主張の基礎の出願の記載は、引用により、それらの全体として、かつすべての目的に関して、本出願に包含される。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規クラスの化合物、このような化合物を含む医薬組成物および異常なまたは脱制御されたキナーゼ活性と関連する疾患または障害、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢキナーゼの異常な活性化が関与する疾患または障害の処置または予防におけるこのような化合物の使用法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
タンパク質キナーゼは、広範囲の細胞過程の制御ならびに細胞機能の制御の維持の中心的役割を有する、タンパク質の大きなファミリーを代表する。これらのキナーゼの部分的、非限定的リストは下記を含む：受容体チロシンキナーゼ、例えば、血小板由来増殖因子受容体キナーゼ（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経増殖因子受容体、ｔｒｋＢ、Ｍｅｔ、および繊維芽細胞増殖因子受容体、ＦＧＦＲ３；非受容体チロシンキナーゼ、例えば、Ａｂｌおよび融合キナーゼＢＣＲ−Ａｂｌ；ならびにセリン／スレオニンキナーゼ、例えばｂ−ＲＡＦ、ＳＧＫ、ＭＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｌｃｋ、Ｃｓｋ、Ｆｅｓ、Ｂｍｘおよびｃ−ｓｒｃ；ならびにセリン／スレオニンキナーゼ例えば、ｂ−ＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、ｓｇｋ、ＭＡＰキナーゼ（例えば、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、など）ならびにＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２βおよびＳＡＰＫ３。異常なキナーゼ活性は良性および悪性増殖性障害ならびに免疫系および神経系の不適切な活性化に由来する疾患を含む、多くの疾患状態で観察されている。
【０００４】
本発明の新規化合物は、１種またはそれ以上のタンパク質キナーゼを阻害し、故に、キナーゼ−関連疾患の処置に有用であると期待される。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
第１の局面において、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2009513632.tif 000002
〔式中：
ＹはＮおよびＣＨから選択され；
Ｒ１は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒ２は水素およびＣ１−６アルキルから選択されるか；またはＲ１およびＲ２はＲ１およびＲ２が結合しているフェニル環と一緒にＣ６−１０アリールもしくはＣ５−１０ヘテロアリールを形成し；
Ｒ３はＮＲ４Ｒ５およびＸ１Ｒ５から選択され；ここでＸ１は結合およびＣ１−４アルキレンから選択され；Ｒ４は水素およびＣ１−６アルキルから選択され；Ｒ５は所望により独立してハロ−置換−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ５−１０ヘテロアリール−Ｃ０−４アルキルおよびＣ３−８ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択される１から３個のラジカルで置換されているＣ６−１０アリールから選択され；ここで、Ｒ５の該ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル置換基は所望によりＣ１−６アルキルで置換されている〕
で示される化合物ならびにそれらのＮ−オキシド誘導体、プロドラッグ誘導体、保護された誘導体、個々の異性体および異性体の混合物；ならびにこのような化合物の薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）を提供する。
【０００６】
第２の局面において、本発明は、式Ｉの化合物またはそれらのＮ−オキシド誘導体、個々の異性体および異性体の混合物；またはそれらの薬学的に許容される塩を１種またはそれ以上の適当な賦形剤と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
第３の局面において、本発明は、キナーゼ活性、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２および／またはＴｒｋＢ活性の阻害が疾患の病状および／または総体症状を予防、阻止または改善できる動物の疾患の処置法であって、治療有効量の式Ｉの化合物またはそれらのＮ−オキシド誘導体、個々の異性体および異性体の混合物またはそれらの薬学的に許容される塩を動物に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
第４の局面において、本発明は、キナーゼ活性、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２および／またはＴｒｋＢ活性が疾患の病状および／または総体症状に関与する動物の疾患を処置するための薬剤の製造における式Ｉの化合物の使用を提供する。
【０００９】
第５の局面において、本発明は、式Ｉの化合物ならびにそれらのＮ−オキシド誘導体、プロドラッグ誘導体、保護された誘導体、個々の異性体および異性体の混合物ならびにそれらの薬学的に許容される塩の製造法を提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
定義
基および他の基、例えばハロ置換アルキルおよびアルコキシの構造成分としての“アルキル”は、直鎖または分岐鎖であり得る。Ｃ１−４−アルコキシはメトキシ、エトキシなどを含む。ハロ置換アルキルはトリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどを含む。
【００１１】
“アリール”は６から１０個の環炭素原子を含む単環式または縮合二環式芳香環集合体を意味する。例えば、アリールはフェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルであり得る。“アリーレン”はアリール基から生じる二価のラジカルを意味する。
【００１２】
“ヘテロアリール”は１個またはそれ以上の環員がヘテロ原子であるときの上記アリールを定義するとおりのものである。例えば、ヘテロアリールはピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソール、イミダゾリル、ベンゾ−イミダゾリル、ピリミジニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、チエニルなどを含む。
【００１３】
“シクロアルキル”は示された環原子の数を含む飽和または部分的に不飽和、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合体を意味する。例えば、Ｃ３−１０シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む。
【００１４】
“ヘテロシクロアルキル”は本明細書に定義のとおりのシクロアルキルであるが、ただし、示された１個またはそれ以上の環炭素は−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−から選択される部分により置換されており、ここでＲは水素、Ｃ１−４アルキルまたは窒素を保護する基である。例えば、本発明の化合物を記載するために本明細書で使用されるＣ３−８ヘテロシクロアルキルはモルホリノ、ピロリジニル、ピロリジニル−２−オン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニロン（piperidinylone）、１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ−８−イルなどを含む。
【００１５】
“ハロゲン”（またはハロ）は好ましくはクロロまたはフルオロを示すが、またブロモまたはヨードであり得る。
【００１６】
“キナーゼパネル”はＡｂｌ（ヒト）、Ａｂｌ（Ｔ３１５Ｉ）、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＡＬＫ、ＪＮＫ１α１、ＡＬＫ４、ＫＤＲ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、ＭＡＰＫ１、Ｂｍｘ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＢＲＫ、ＭＥＫ１、ＣａＭＫＩＩ（ラット）、Ｍｅｔ、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＣＨＫ２、ＰＡＫ２、ＣＫ１、ＰＤＧＦＲα、ＣＫ２、ＰＤＫ１、ｃ−ｋｉｔ、Ｐｉｍ−２、ｃ−ＲＡＦ、ＰＫＡ（ｈ）、ＣＳＫ、ＰＫＢα、ｃＳｒｃ、ＰＫＣα、ＤＹＲＫ２、Ｐｌｋ３、ＥＧＦＲ、ＲＯＣＫ−Ｉ、Ｆｅｓ、Ｒｏｎ、ＦＧＦＲ３、Ｒｏｓ、Ｆｌｔ３、ＳＡＰＫ２α、Ｆｍｓ、ＳＧＫ、Ｆｙｎ、ＳＩＫ、ＧＳＫ３β、Ｓｙｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｔｉｅ−２、ＩＫＫβ、ＴｒＫＢ、ＩＲ、ＷＮＫ３、ＩＲＡＫ４、ＺＡＰ−７０、ＩＴＫ、ＡＭＰＫ（ラット）、ＬＩＭＫ１、Ｒｓｋ２、Ａｘｌ、ＬＫＢ１、ＳＡＰＫ２β、ＢｒＳＫ２、Ｌｙｎ（ｈ）、ＳＡＰＫ３、ＢＴＫ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３、ＳＡＰＫ４、ＣａＭＫＩＶ、ＭＡＲＫ１、Ｓｎｋ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＭＩＮＫ、ＳＲＰＫ１、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＭＫＫ４（ｍ）、ＴＡＫ１、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＭＫＫ６（ｈ）、ＴＢＫ１、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３、ＭＬＣＫ、ＴｒｋＡ、ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１、ＭＲＣＫβ、ＴＳＳＫ１、ＣＨＫ１、ＭＳＫ１、Ｙｅｓ、ＣＫ１ｄ、ＭＳＴ２、ＺＩＰＫ、ｃ−Ｋｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）、ＭｕＳＫ、ＤＡＰＫ２、ＮＥＫ２、ＤＤＲ２、ＮＥＫ６、ＤＭＰＫ、ＰＡＫ４、ＤＲＡＫ１、ＰＡＲ−１Ｂα、ＥｐｈＡ１、ＰＤＧＦＲβ、ＥｐｈＡ２、Ｐｉｍ−１、ＥｐｈＡ５、ＰＫＢβ、ＥｐｈＢ２、ＰＫＣβＩ、ＥｐｈＢ４、ＰＫＣδ、ＦＧＦＲ１、ＰＫＣη、ＦＧＦＲ２、ＰＫＣθ、ＦＧＦＲ４、ＰＫＤ２、Ｆｇｒ、ＰＫＧ１β、Ｆｌｔ１、ＰＲＫ２、Ｈｃｋ、ＰＹＫ２、ＨＩＰＫ２、Ｒｅｔ、ＩＫＫα、ＲＩＰＫ２、ＩＲＲ、ＲＯＣＫ−ＩＩ（ヒト）、ＪＮＫ２α２、Ｒｓｅ、ＪＮＫ３、Ｒｓｋ１（ｈ）、ＰＩ３Ｋγ、ＰＩ３ＫδおよびＰＩ３−Ｋβを含むキナーゼのリストである。本発明の化合物はキナーゼパネル（野生型および／またはその変異）に対してスクリーニングされ、該パネルメンバーの少なくとも１つの活性を阻害する。
【００１７】
“ＢＣＲ−Ａｂｌの変異型”は野生型配列からの１個または複数のアミノ酸変化を意味する。ＢＣＲ−ＡＢＬの変異型は、タンパク質と阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ、など）との重要な接点を乱すこと、しばしば、不活性から活性状態へ、すなわちＢＣＲ−ＡＢＬとＧｌｅｅｖｅｃが結合できない構造への変化を誘導することにより作用する。臨床サンプルの分析から、耐性表現型と関連して見られる変異形のレパートリーは、ゆっくりであるが時間と共に容赦なく増加し続ける。変異は４つの主な領域に集中するようである。変異の第１の群（Ｇ２５０Ｅ、Ｑ２５２Ｒ、Ｙ２５３Ｆ／Ｈ、Ｅ２５５Ｋ／Ｖ）はＡＴＰに対するリン酸結合ループ（Ｐループとしても既知）を形成するアミノ酸を含む。第２の群（Ｖ２８９Ａ、Ｆ３１１Ｌ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７Ｌ）はＧｌｅｅｖｅｃ結合部位において見いだすことができ、直接、水素結合またはファンデルワールス相互作用を介して阻害剤と相互作用できる。変異の第３の群（Ｍ３５１Ｔ、Ｅ３５５Ｇ）は触媒ドメインの近くに集中する。変異の第４の群（Ｈ３９６Ｒ／Ｐ）はキナーゼ活性化／非活性化を調節する分子スイッチである構造である活性ループに位置する。ＣＭＬおよびＡＬＬ患者で検出されるＧｌｅｅｖｅｃ耐性と関連のあるＢＣＲ−ＡＢＬ点変異は：Ｍ２２４Ｖ、Ｌ２４８Ｖ、Ｇ２５０Ｅ、Ｇ２５０Ｒ、Ｑ２５２Ｒ、Ｑ２５２Ｈ、Ｙ２５３Ｈ、Ｙ２５３Ｆ、Ｅ２５５Ｋ、Ｅ２５５Ｖ、Ｄ２７６Ｇ、Ｔ２７７Ａ、Ｖ２８９Ａ、Ｆ３１１Ｌ、Ｔ３１５Ｉ、Ｔ３１５Ｎ、Ｆ３１７Ｌ、Ｍ３４３Ｔ、Ｍ３１５Ｔ、Ｅ３５５Ｇ、Ｆ３５９Ｖ、Ｆ３５９Ａ、Ｖ３７９Ｉ、Ｆ３８２Ｌ、Ｌ３８７Ｍ、Ｌ３８７Ｆ、Ｈ３９６Ｐ、Ｈ３９６Ｒ、Ａ３９７Ｐ、Ｓ４１７Ｙ、Ｅ４５９Ｋ、およびＦ４８６Ｓ（一文字表記により示されるアミノ酸領域は、ＧｅｎＢａｎｋ配列、受入番号ＡＡＢ６０３９４に対するものであり、ＡＢＬ型１ａ；Martinelli et al., Haematologica/The Hematology Journal, 2005, April; 90-4に対応する）を含む。特に明記しない限り、Ｂｃｒ−Ａｂｌは本酵素の野生型および変異型を意味する。
【００１８】
“処置”、“処置し”および“処置する”は、疾患および／または附随する症状を軽減するまたは無くす方法を意味する。
【００１９】
好ましい態様の記載
本発明は、キナーゼ関連疾患、特にＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢキナーゼ関連疾患の処置のための化合物、組成物ならびに方法を提供する。例えば、白血病およびＢＣＲ−Ａｂｌに関連する他の増殖疾患は野生型およびＢｃｒ−Ａｂｌの変異型の阻害を介して処置され得る。
【００２０】
ある態様において、式Ｉの化合物に関して、Ｒ１およびＲ２の両方が水素である。
【００２１】
他の態様において、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２が結合しているフェニル環と一緒にキノリニルまたはナフタレニルを形成する。
【００２２】
他の態様において、Ｒ３は、ＮＨＲ５およびＸ１Ｒ５｛ここで、Ｘ１が結合およびメチレンから選択され；Ｒ５が所望により独立してトリフルオロ−メチル、メトキシ、イミダゾリルおよびピペラジニル−メチル（ここで、該Ｒ５のイミダゾリルまたはピペラジニル置換基は所望によりメチルおよびエチルで置換されている）から選択される１から３個のラジカルで置換されているフェニルから選択される｝から選択される。
【００２３】
本発明の好ましい化合物は、１−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア；１−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−３−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−（３，５−ジメトキシ−フェニル）−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア；１−［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−３−トリフルオロメチル−フェニル］−３−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−ウレア；１−［５−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−キノリン−８−イル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア；Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−２−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−アセトアミド；２−［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−Ｎ−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−アセトアミド；Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−５−トリフルオロメチル−ベンズアミド；Ｎ−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；４−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；およびＮ−［５−（９Ｈ−プリン−６−イルオキシ）−キノリン−８−イル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミドから選択される。
【００２４】
本発明のさらなる好ましい化合物は下記実施例および表１において記載されている。
【００２５】
薬理学および有用性
本発明の化合物は、キナーゼの活性を調節し、それ自体、キナーゼがその疾患の病状および／または総体症状に関与する疾患または障害の処置に有用である。本明細書に記載の化合物および組成物ならびに本明細書に記載の方法で有用である薬剤により阻害されるキナーゼの例は、限定しないが、Ａｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（野生型および変異型）、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢを含む。
【００２６】
アベルソンチロシンキナーゼ（すなわちＡｂｌ、ｃ−Ａｂｌ）は、細胞サイクルの制御、遺伝毒性ストレスに対する細胞応答、およびインテグリンシグナル伝達を介した細胞環境についての情報伝達に関与する。全体として、Ａｂｌタンパク質は、様々な細胞外および細胞内供給源からのシグナルを統合し、細胞サイクルおよびアポトーシスに関する決定に影響を与える、細胞性モジュールとして複雑な役割を果たしているように見える。アベルソンチロシンキナーゼは、脱制御されたチロシンキナーゼ活性を伴うキメラ融合体（オンコプロテイン）ＢＣＲ−Ａｂｌまたはｖ−Ａｂｌのようなサブタイプ誘導体を含む。ＢＣＲ−Ａｂｌは、９５％の慢性骨髄性（myelogenous）白血病（ＣＭＬ）および１０％の急性リンパ性白血病の病因において重要である。ＳＴＩ５７１（Gleevec）は発癌性ＢＣＲ−Ａｂｌチロシンキナーゼの阻害剤であり、慢性骨髄性(myeloid)白血病（ＣＭＬ）の処置に使用されている。しかしながら、ＣＭＬの急性転化期にある患者の幾分かは、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼの変異により、ＳＴＩ−５７１に耐性である。２２を超える変異が今日までに報告されており、最も一般的なのはＧ２５０Ｅ、Ｅ２５５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７ＬおよびＭ３５１Ｔである。
【００２７】
本発明の化合物は、ａｂｌキナーゼ、とりわけｖ−ａｂｌキナーゼを阻害する。本発明の化合物はまた野生型ＢＣＲ−ＡｂｌキナーゼおよびＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼの変異を阻害し、故に、白血病（とりわけアポトーシス作用の機構が見られるとき、とりわけ慢性骨髄性（myeloid）白血病および急性リンパ芽球性白血病）のようなＢｃｒ−ａｂｌ−陽性癌および腫瘍疾患の処置に適当であり、また、白血病性幹細胞のサブグループにおける効果を示し、ならびにこれらの細胞を、該細胞を摘出した後（例えば、骨髄摘出）インビトロで精製し、それらが癌細胞から浄化された後細胞を再移植する(例えば、精製骨髄細胞の再移植)可能性がある。
【００２８】
マラリアはマラリア原虫属の寄生原虫類により引き起こされる。４種のマラリア原虫：熱帯熱マラリア原虫；三日熱マラリア原虫；卵形マラリア原虫；および四日熱マラリア原虫がその様々な形態で疾患を引き起こす。もっとも広がっておりそして危険である熱帯熱マラリア原虫は、治療せずに放置すると致命的な脳マラリアに至る。タンパク質チロシンキナーゼ活性は熱帯熱マラリア原虫寄生虫成熟の全ての段階に分布しており、本発明のキナーゼ阻害剤はマラリア原虫関連疾患を処置するために使用できる。本発明のチロシンキナーゼ阻害剤、特にｃ−ｋｉｔ阻害剤は、熱帯熱マラリア原虫の増殖の阻害を介してマラリア原虫関連疾患を処置するための手段であり得る。下記インビトロアッセイを、様々なマラリア寄生虫系統に対する本発明の化合物の活性を測定するための手段として使用する。
【００２９】
Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル経路は増殖シグナルに対する細胞応答を仲介する。Ｒａｓはヒト癌の〜１５％で癌形に変異される。Ｒａｆファミリーはセリン／スレオニンタンパク質キナーゼに属し、それは３個のメンバー、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆおよびｃ−Ｒａｆ（またはＲａｆ−１）を含む。薬剤標的はＲａｓの下流のエフェクターとしてＲａｆの関係に集中している。しかしながら、最近のデータはＢ−Ｒａｆは活性化Ｒａｓ対立遺伝子の関与が必要でないある腫瘍の形成において重要な役割を有し得ることを示唆した（Nature 417, 949 - 954 (01 Jul 2002）。特に、Ｂ−Ｒａｆ変異は悪性黒色腫の多くにおいて検出された。
【００３０】
黒色腫に対する医薬的処置はとりわけ後期黒色腫に対してそれらの有効性が制限される。本発明の化合物はまたｂ−Ｒａｆキナーゼと関連する細胞過程を阻害し、ヒト癌、とりわけ黒色腫の処置のための新規治療機会を提供する。
【００３１】
本発明の化合物はまたｃ−Ｒａｆキナーゼと関連する細胞過程を阻害する。ｃ−Ｒａｆはｒａｓ腫瘍遺伝子により活性化され、これは多くのヒト癌を変異させる。したがって、ｃ−Ｒａｆのキナーゼ活性の阻害はｒａｓ介在腫瘍増殖を予防するための方法を提供し得る[Campbell, S. L., Oncogene, 17, 1395 (1998)]。
【００３２】
ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）は非常に一般的に存在する増殖因子であり、発癌および血管の平滑筋細胞の疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および血栓症に見られるように、正常増殖およびまた病的細胞増殖の両方において重要な役割を果たす。本発明の化合物は、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）活性を阻害でき、したがって、神経膠腫、肉腫、前立腺腫瘍、および結腸、乳房および卵巣の腫瘍のような腫瘍疾患の処置に適当である。
【００３３】
本発明の化合物は、例えば小細胞肺癌における腫瘍阻害物質としてだけでなく、またアテローム性動脈硬化症、血栓症、乾癬、強皮症および線維症のような非悪性増殖性障害にも、ならびに幹細胞を、例えば、５−フルオロウラシルのような化学療法剤の血液毒性作用と戦うために保護するために、および喘息において使用できる。本発明の化合物は、とりわけＰＤＧＦ受容体キナーゼの阻害に応答する疾患の処置に有用である。
【００３４】
本発明の化合物は、移植、例えば、異種移植に起因する障害、とりわけ閉塞性細気管支炎（ＯＢ）、すなわち異種肺移植の慢性拒絶のような、とりわけ組織拒絶反応の処置に有効である。ＯＢのない患者と比較して、ＯＢを有する者は、しばしば気管支肺胞洗浄液中のＰＤＧＦ濃度の上昇を示す。
【００３５】
本発明の化合物はまた再狭窄およびアテローム性動脈硬化症のような、血管平滑筋細胞移動および増殖（ＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｒがしばしば役割を果たす場所である）が関連する疾患に有用である。血管平滑筋細胞インビトロおよびインビボにおけるこれらの効果および増殖または移動に対するそれらの結果は、本発明の化合物の投与により、またインビボでの血管内膜の機械的損傷後の肥厚に対する影響の試験により証明し得る。
【００３６】
ニューロトロフィン受容体のｔｒｋファミリー（ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ）は神経および非神経組織の生存、成長および分化を促進する。ＴｒｋＢタンパク質は小腸および大腸の神経内分泌型細胞、膵臓のα細胞、リンパ節および脾臓の単球およびマクロファージ、ならびに表皮の顆粒層において発現される（Shibayama and Koizumi, 1996）。ＴｒｋＢタンパク質の発現はＷｉｌｍｓ腫瘍および神経芽腫の好ましくない進行と関連している。さらにＴｋｒＢは癌前立腺細胞では発現されるが正常細胞では発現されない。ｔｒｋ受容体のシグナル経路下流はＳｈｃ、活性化Ｒａｓ、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２遺伝子、ならびにＰＬＣ−γ変換経路を介するＭＡＰＫの活性化のカスケード含む（Sugimoto et al., 2001）。
【００３７】
キナーゼ、ｃ−Ｓｒｃは多数の受容体の発癌シグナルを伝達する。例えば、腫瘍におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、悪性細胞に対して特徴的であるが正常細胞には存在しないｃ−ｓｒｃの構成的活性化をもたらす。他方、ｃ−ｓｒｃの不完全発現マウスは大理石骨病表現型を発現し、破骨細胞機能におけるｃ−ｓｒｃの重要な関与および関連疾患への関与している可能性を指示する。
【００３８】
Ｔｅｃファミリーキナーゼ、Ｂｍｘ、非受容体タンパク質−チロシンキナーゼは乳房上皮癌細胞の増殖を制御する。
【００３９】
繊維芽細胞増殖因子受容体３は骨増殖の負の調節効果および軟骨細胞増殖の阻害に働くことを示した。繊維芽細胞増殖因子受容体３の様々な変異体、および１つの変異、ＴＤII  ＦＧＦＲ３によりもたらされる形成異常は、転写因子Ｓｔａｔｌを活性化する構成的チロシンキナーゼ活性を有し、細胞周期阻害剤の発現、増殖停止および異常な骨の発達をもたらす（Su et al., Nature, 1997, 386, 288-292）。ＦＧＦＲ３はまたしばしば多発性骨髄腫型癌において発現される。ＦＧＦＲ３活性の阻害剤は限定はしないが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、コラーゲンＩＩ関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、若年型糖尿病、シューグレン病、甲状腺疾患、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローンおよび潰瘍性大腸炎）、セリアック病および重症筋無力症を含むＴ細胞介在炎症性または自己免疫性疾患の処置において有用である。
【００４０】
血清およびグルココルチコイド調節キナーゼ（ＳＧＫ）の活性は摂動イオンチャネル活性、特にナトリウムおよび／またはカリウムチャネルの活性に相関性があり、本発明の化合物は高血圧を処理するために有用であり得る。
【００４１】
Lin et al (1997) J. Clin. Invest. 100, 8: 2072-2078およびP. Lin (1998) PNAS 95, 8829-8834は腫瘍増殖および血管形成の阻害またアデノウイルス感染または乳房腫瘍および黒色腫異種移植モデルにおけるＴｉｅ２（Ｔｅｋ）の細胞外ドメインの感染中の肺転移の減少を示した。Ｔｉｅ２阻害剤は新血管形成が不適当に起こる状況（すなわち、糖尿病網膜症、慢性炎症、乾癬、カポジ肉腫、黄斑変性症による慢性新血管形成、リウマチ性関節炎、小児血管腫および癌）において使用され得る。
【００４２】
ＬｃｋはＴ細胞シグナル伝達の役割を果たす。Ｌｃｋ遺伝子を欠いているマウスは胸腺細胞の発達に対して乏しい能力を有する。Ｔ細胞シグナル伝達の正の活性剤としてＬｃｋの機能はＬｃｋ阻害剤が自己免疫疾患、例えば、リウマチ性関節炎を処置するために有用であり得ることを示唆する。
【００４３】
他のＭＡＰＫと同様にＪＮＫは癌、トロンビン誘導血小板凝集、免疫不全疾患、自己免疫性疾患、細胞死、アレルギー、骨粗鬆症および心臓疾患に対する細胞応答を介在する役割を有することに関与している。ＪＮＫ経路の活性化と関連している治療対象は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リウマチ性関節炎、喘息、骨関節症、虚血、癌および神経変性疾患を含む。肝臓疾患または肝虚血の発症と関係があるＪＮＫ活性化に重要である結果として、本発明の化合物はまた様々な肝臓疾患の処置に有用であり得る。心臓血管疾患、例えば、心筋梗塞またはうっ血性心不全におけるＪＮＫの役割がまたＪＮＫが様々な型の心臓ストレスに対する肥大応答を介在することを示したとして報告されている。ＪＮＫカスケードはまたＩＬ−２プロモーターの活性化を含むＴ細胞活性化において役割を果たすことを立証されている。したがって、ＪＮＫの阻害剤は変化する異常な免疫応答において治療価値を有し得る。様々な癌のＪＮＫ活性化に対する役割がまた確立されており、癌におけるＪＮＫ阻害剤の利用可能性を示唆する。例えば、構造的に活性化ＪＮＫはＨＴＬＶ−１介在腫瘍形成と関連している［Oncogene 13:135-42 (1996)］。ＪＮＫはカポジ肉腫（ＫＳ）において役割を果たし得る。ＫＳ増殖に関与する他のサイトカイン、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ−６およびＴＮＦαの他の増殖効果はまたＪＮＫにより介在され得る。加えて、ｐ２１０  ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換細胞におけるｃ−ｊｕｎ遺伝子の調節はＪＮＫの活性に対応し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に対する処置におけるＪＮＫ阻害剤の役割を示唆する［Blood 92:2450-60 (1998)］。
【００４４】
ある異常増殖状態はｒａｆ発現と関連していると考えられ、したがってｒａｆ発現の阻害に反応することが考えられる。異常な高レベルのｒａｆタンパク質の発現はまた形質転換および異常細胞増殖と関連する。これらの異常増殖状態はまたｒａｆ発現の阻害に反応することが考えられる。６０％のすべての肺癌腫細胞系が通常高レベルのｃ−ｒａｆのｍＲＮＡおよびタンパク質を発現することが報告されているため、例えば、ｃ−ｒａｆタンパク質の発現は異常細胞増殖における役割を果たしていることが考えられる。異常増殖状態のさらなる例は過増殖性疾患、例えば、癌、腫瘍、過形成、肺線維症、血管形成、乾癬、アテローム性動脈硬化症および血管の平滑筋細胞増殖、例えば、狭窄または血管形成術後の再狭窄である。ｒａｆを一部に含む細胞性シグナル伝達経路はまたＴ細胞増殖（Ｔ細胞活性化および増殖）、例えば、組織移植拒絶反応、内毒素性ショック、および糸球体腎炎により特徴づけられる炎症疾患と関連していた。
【００４５】
ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）はｃ−ｊｕｎ転写因子の活性化およびｃ−ｊｕｎにより調節される遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路における最後から２番目の段階を表すタンパク質キナーゼのファミリーである。特に、ｃ−ｊｕｎは遺伝毒性障害により損傷を受けたＤＮＡの修復と関連するタンパク質をコードする遺伝子の転写と関連している。したがって、細胞におけるＳＡＰＫ活性を阻害する薬剤はＤＮＡ修復を防止し、ＤＮＡ損傷を誘導するかもしくはＤＮＡ合成を阻害し、細胞のアポトーシスを誘導する、または細胞増殖を阻害する薬剤に細胞を感受性にする。
【００４６】
マイトージェン−活性タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）は転写因子、翻訳因子および様々な細胞外シグナルに応答する他の標的分子を活性化する保存されたシグナル伝達経路のメンバーである。ＭＡＰＫはマイトージェン−活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）による配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒを有する二重リン酸化モチーフでのリン酸化により活性化される。高等真核生物において、ＭＡＰＫシグナル伝達の生理学的役割は細胞的事象、例えば、増殖、腫瘍形成、発生および分化と相関があった。したがって、これらの経路を介して（特にＭＫＫ４およびＭＫＫ６を介して）シグナル伝達を調節する能力はＭＡＰＫシグナル伝達と関連するヒトの疾患、例えば、炎症性疾患、自己免疫性疾患および癌に対する処置および予防治療の発達をもたらすことができた。
【００４７】
ヒトリボソームＳ６タンパク質キナーゼのファミリーは少なくとも８個のメンバー（ＲＳＫＩ、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＲＳＫ４、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋｂ）からなる。リボソームタンパク質Ｓ６タンパク質キナーゼは重要な多面的な機能を果たし、それらの中でタンパク質生合成中のｍＲＮＡ翻訳の調節の重要な役割である（Eur. J. Biochem 2000 November; 267(21): 6321-30, Exp Cell Res. Nov. 25, 1999; 253 (1):100-9, Mol Cell Endocrinol. May 25, 1999;151(1-2):65-77）。ｐ７０Ｓ６によるＳ６リボソームタンパク質のリン酸化はまた細胞運動（Immunol. Cell Biol. 2000 August;78(4):447-51）および細胞増殖（Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 2000;65:101-27）の調節と関連しており、故に腫瘍転移、免疫反応および組織修復ならびに他の疾患状態において重要であり得る。
【００４８】
ＳＡＰＫ（“ｊｕｎＮ末端キナーゼ”または“ＪＮＫ”とも呼ばれる）はｃ−ｊｕｎ転写因子の活性化およびｃ−ｊｕｎにより調節される遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路における最後から２番目の段階を示すタンパク質キナーゼのファミリーである。特に、ｃ−ｊｕｎは遺伝毒性障害により損傷を受けたＤＮＡの修復と関連するタンパク質をコードする遺伝子の転写と関連している。細胞におけるＳＡＰＫ活性を阻害する薬剤はＤＮＡ修復を防止し、ＤＮＡ損傷を誘導することにより機能するそれらの癌治療モダリティに対して細胞を感受性にする。
【００４９】
ＢＴＫは自己免疫性および／または炎症性疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ性関節炎、多発性脈管炎（multiple vasculitis）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、重症筋無力症および喘息において役割を果たす。Ｂ細胞活性化におけるＢＴＫの役割のため、ＢＴＫの阻害剤はＢ細胞介在病原性活性、例えば、自己抗体生産の阻害剤として有用であり、Ｂ細胞リンパ腫および白血病の処置のために有用である。
【００５０】
ＣＨＫ２はセリン／スレオニンタンパク質キナーゼのチェックポイントキナーゼファミリーのメンバーであり、ＤＮＡ損傷、例えば、環境変異原および内在性反応酸素種により引き起こされる損傷の監視のために使用されるメカニズムに関連している。結果として、それは腫瘍抑制遺伝子と関連し、癌治療の標的である。
【００５１】
ＣＳＫは癌細胞、特に大腸癌の転移能に影響する。
Ｆｅｓは様々なサイトカインシグナル伝達経路、ならびに骨髄細胞の分化に関連している非受容体タンパク質チロシンキナーゼである。Ｆｅｓはまた顆粒球分化機構の重要な要素である。
【００５２】
Ｆｌｔ３受容体チロシンキナーゼ活性は白血病および骨髄異形成症候群と関連している。約２５％のＡＭＬにおいて、白血病細胞は細胞表面に構造的に活性型の自己リン酸化（ｐ）ＦＬＴ３チロシンキナーゼを発現する。ｐ−ＦＬＴ３の活性は白血病細胞において増殖および生存に利点を与える。白血病細胞がｐ−ＦＬＴ３キナーゼ活性を表す急性白血病を有する患者は全体的に乏しい臨床結果を有する。ｐ−ＦＬＴ３キナーゼ活性の阻害は白血病細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する。
【００５３】
ＩＫＫαおよびＩＫＫβ（１＆２）の阻害剤はリウマチ性関節炎、移植拒絶反応、炎症性腸疾患、骨関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、多発性硬化症、卒中、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、くも膜下出血または脳および中枢神経系における炎症性メディエーターの過剰産生と関連する他の疾患または障害を含む疾患に対する治療剤
である。
【００５４】
Ｍｅｔは主要なヒト癌の大部分の型と関連し、発現はしばしば悪い予後と転移に相関がある。Ｍｅｔの阻害剤は癌、例えば、肺癌、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、腸癌、乳癌、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫または陰門の癌腫）、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌腺系の癌（例えば、甲状腺、副甲状腺または副腎の癌）、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、子供の固体腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌（例えば、腎臓細胞癌腫、腎盂の癌腫）、小児悪性腫瘍、中枢神経系の腫瘍（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹神経膠腫または下垂体腺腫）、血液の癌、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など、バレット食道炎（前癌症候群）、新生皮膚病、乾癬、菌状息肉腫および前立腺肥大症、糖尿病関連疾患、例えば、糖尿病網膜症、網膜虚血および網膜新血管形成、肝硬変症、心血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、免疫疾患、例えば、自己免疫疾患および腎臓疾患を含む疾患に対する治療となる。好ましくは、疾患は癌、例えば、急性骨髄性白血病および結腸直腸癌である。
【００５５】
Ｎｉｍａ関連キナーゼ２（Ｎｅｋ２）は中心体に限局される有糸分裂の開始で最大活性を有する細胞周期調節タンパク質キナーゼである。機能的研究は中心体分離および紡錘糸形成の調節にＮｅｋ２が関係するとした。Ｎｅｋ２タンパク質は頸部、卵巣、前立腺、および特に乳房の腫瘍を含むヒト腫瘍の範囲由来の細胞系では２から５倍高い。
【００５６】
ｐ７０Ｓ６Ｋ介在疾患または状態は限定すべきではないが増殖性疾患、例えば、癌および結節硬化症を含む。
【００５７】
前記によって、本発明は、さらに、処置を必要とする対象における、上記のいずれかの疾患または障害を処置する方法であり、該対象に治療的有効量（下記“投与および医薬組成物”参照）の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。上記の全ての使用に関して、必要な投与量は投与形態、処置すべき特定の状態および所望の効果に依存して変化する。
【００５８】
投与および医薬組成物：
一般に、本発明の化合物は単独でまたは１種もしくはそれ以上の治療剤との組合せのいずれかで当分野で既知の通常のおよび許容される形式のいずれかを介して、治療有効量を投与される。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康度、使用される化合物の有効性および他の要素に依存して広く変化し得る。一般に、満足な結果は体重あたり約０．０３から２．５ｍｇ／ｋｇの１日投与量で全身に得られることが示される。大型哺乳動物、例えばヒトにおいて指示される１日投与量は、例えば１日に４回までの分割用量でまたは遅延形で都合良く投与される約０．５ｍｇから約１００ｍｇの範囲である。経口投与のための適当な単位用量形は約１から５０ｍｇの活性成分を含む。
【００５９】
本発明の化合物は任意の慣用の経路、特に経腸的に、例えば経口的に、例えば錠剤形もしくはカプセル形で、または非経腸的に、例えば注射溶液形もしくは懸濁液形で、局所的に、例えばローション形、ゲル形、軟膏形もしくはクリーム形で、または経鼻形もしくは坐薬形で医薬組成物として投与できる。少なくとも１種の薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と一緒に遊離形または薬学的に許容される塩形の本発明の化合物を含む医薬組成物を、混合、造粒または被覆方法による慣用の方法で製造できる。例えば、経口組成物は、活性成分とａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；錠剤のためにまたｃ）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン；所望によりｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩または起沸性混合物；および／またはｅ）吸収剤、着色剤、香味剤および甘味剤を一緒に含む錠剤またはゼラチンカプセルであり得る。注射組成物は、等張水溶液または懸濁液であり得、そして座薬は脂肪エマルジョンまたは懸濁液から製造し得る。該組成物は滅菌し得そして／またはアジュバント、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／またはバッファーを含む。加えて、それらはまた、治療に有効な他の物質を含み得る。適当な経皮投与用製剤は有効量の本発明の化合物を担体と含む。担体は宿主の皮膚を介する輸送を助けるために、薬理学的に許容される吸収性溶媒を含み得る。例えば、経皮デバイスは裏当て部分、化合物と所望により担体を含む貯蔵部、所望により長時間にわたって制御されたおよびあらかじめ決められた速度で宿主の皮膚に化合物を送達するための速度制御バリア、および皮膚にデバイスを固定するための手段を含む、バンデージ形である。マトリックス経皮製剤もまた使用され得る。例えば、皮膚および眼への、適当な局所投与用製剤は、当分野で既知の好ましくは水溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。このような製剤は、可溶化剤、安定化剤、等張増加剤、バッファーおよび保存剤を含み得る。
【００６０】
本発明の化合物は、治療有効量の１種またはそれ以上の治療剤との組合せ（薬学的組合せ剤）で投与され得る。例えばシクロスポリン、ラパマイシン、もしくはアスコマイシン、またはそれらの免疫抑制剤類似体、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、シクロスポリンＧ、ＦＫ−５０６、ラパマイシン、もしくは同等な化合物、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ブレキナール、レフルノミド、ミゾルビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスパガリン、免疫抑制性抗体、とりわけ白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４５、ＣＤ５８もしくはそれらのリガンド、または他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４１ｇと一緒に使用されるとき、例えば、相乗効果が、他の免疫調節剤もしくは抗炎症剤と生じ得る。本発明の化合物が他の治療と一緒に投与されるとき、共投与される化合物の用量は、もちろん使用される共薬剤の型、使用される特定の薬剤、処置される状態などに依存して変化する。
【００６１】
本発明はまた、ａ）遊離形または薬学的に許容される塩形の本明細書に記載のとおりの本発明の化合物である第１の薬剤、およびｂ）少なくとも１つの共薬剤を含む薬学的組合せ剤、例えばキットを提供する。該キットはその投与のための指示書を含み得る。
【００６２】
本明細書で利用される“共投与”または“組合せ投与”などの用語は、個々の患者に選択された治療剤を投与することを含むことを意味し、そして必ずしも薬剤が同じ投与経路によりまたは同時に投与されない処置レジメンを含むことを意図する。
【００６３】
本明細書で使用される“薬学的組合せ剤”なる用語は、１種を超える活性成分の混合または組合せから生じる生産物を意味し、そして活性成分の固定された組合せ剤および固定されていない組合せ剤の両方を含む。“固定された組合せ剤”なる用語は、複数の活性成分、例えば式Ｉの化合物、および共薬剤両方が、単一の物または投与形で同時に患者に投与されることを意味する。“固定されていない組合せ剤”なる用語は、複数の活性成分、例えば式Ｉの化合物、および共薬剤両方が、同時に、共にまたは特定の時間制限なしに連続してのいずれかで、別々の物として投与することを意味し、このような投与は、治療有効量の２つの化合物を患者の体内に提供する。後者は、カクテル治療、例えば３つまたはそれ以上の活性成分の投与にも適用する。
【００６４】
本発明の化合物の製造方法
本発明はまた、本発明の化合物の製造方法を含む。記載されている反応において、反応性官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基を、これらが最終産物において望ましいとき、これらの望ましくない反応の参加を避けるために保護することが必要であり得る。慣用の保護基は、標準的技法にしたがって使用し得る、例えばT.W. Greene and P. G. M. Wuts in “Protective Groups in Organic Chemistry”, John Wiley and Sons, 1991参照。
【００６５】
式Ｉの化合物は下記反応スキームＩのとおりに行うことにより製造できる：
反応スキームＩ
【化２】
2009513632.tif 000003
式中、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は発明の概要で定義のとおりである。式Ｉの化合物は、適当な溶媒（例えば、ＤＭＦ、ジクロロメタン、トルエンなど）、適当な塩基（例えば、トリエチルアミン、ＤＩＰＥＡ、Ｎａ２ＣＯ３など）および適当なカップリング剤（例えば、ＤＣＣ、ＨＡＴＵなど）の存在下で、式２の化合物を式３の化合物と反応させることにより合成できる。該反応は約０℃から約５０℃の温度範囲で行い、約２４時間以内に完全に終了し得る。
【００６６】
式Ｉの化合物の合成の詳細な例は下記実施例で見いだすことができる。
【００６７】
本発明の化合物のさらなる製造方法
本発明の化合物を、遊離塩基形の化合物を薬学的に許容される無機酸または有機酸と反応させることにより薬学的に許容される酸付加塩として製造できる。あるいは、本発明の化合物の薬学的に許容される塩基付加塩を、遊離塩基形の化合物を薬学的に許容される無機塩基または有機塩基と反応させることにより製造できる。
【００６８】
あるいは、塩形の本発明の化合物を出発物質または中間体の塩を使用して製造できる。
【００６９】
遊離酸形または遊離塩基形の本発明の化合物を、対応する塩基付加塩形または酸付加塩形、各々から製造できる。例えば酸付加塩形の本発明の化合物は、適当な塩基（例えば、水酸化アンモニウム溶液、水酸化ナトリウムなど）と処理することにより対応する遊離塩基に変換できる。塩基付加塩形の本発明の化合物は、適当な酸（例えば、塩酸など）と処理することにより対応する遊離酸に変換できる。
【００７０】
非酸化形の本発明の化合物を、適当な不活性有機溶媒（例えば、アセトニトリル、エタノール、ジオキサン溶液など）中で、０から８０℃で還元剤（例えば、硫黄、二酸化硫黄、トリフェニルホスフィン、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、三塩化リン、三臭化物など）と処理することにより本発明の化合物のＮ−オキシドから製造できる。
【００７１】
本発明の化合物のプロドラッグ誘導体を当業者に既知の方法で製造できる（例えばさらなる詳細のためにSaulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985参照のこと）。例えば、適当なプロドラッグを本発明の非誘導化化合物を適当なカルバミル化剤（例えば、１，１−アシルオキシアルキルカルバノクロリデート、パラ−ニトロフェニルカーボネートなど）と反応させることにより製造できる。
【００７２】
本発明の化合物の保護された誘導体を当業者に既知の方法で製造できる。保護基の創造およびその除去に適用できる技術の詳細な説明はT. W. Greene, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999において見ることができる。
【００７３】
本発明の化合物を、本発明の工程中に溶媒和物（例えば、水和物）として都合良く製造または形成できる。本発明の化合物の水和物を、有機溶媒、例えばジオキシン、テトラヒドロフランまたはメタノールを使用し、水性／有機溶媒混合物から再結晶することにより都合良く製造できる。
【００７４】
本発明の化合物を、化合物のラセミ混合物を光学的に活性な分割剤と反応させ、一組のジアステレオマー化合物を形成し、該ジアステレオマーを分離し、そして光学的に純粋なエナンチオマーを回収することにより、それらの個々の立体異性体として製造できる。エナンチオマーの分離は本発明の化合物の共有結合ジアステレオマー誘導体を使用して行い得るが、分離できる複合体が好ましい（例えば、結晶のジアステレオマー塩）。ジアステレオマーは異なる物理的性質（例えば、融点、沸点、溶解度、反応性など）を有し、そしてこれらの相違を利用して容易に分離できる。ジアステレオマーをクロマトグラフィー、または好ましくは溶解度の差異に基づく分割／分離技術により分割できる。次いで光学的に純粋なエナンチオマーを、ラセミ化をもたらさないであろう実用的手段により分割剤と一緒に回収する。ラセミ混合物から化合物の立体異性体の分離に適用できる技術のより詳細な説明はJean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolutions”, John Wiley And Sons, Inc., 1981において見ることができる。
【００７５】
手短に言えば、式Ｉの化合物を下記の工程を含む方法により製造できる：
（ａ）反応スキームＩの工程；ならびに
（ｂ）所望により本発明の化合物の薬学的に許容される塩への変換；
（ｃ）所望により塩形の本発明の化合物の非塩形への変換；
（ｄ）所望により非酸化形の本発明の化合物の薬学的に許容されるＮ−オキシドへの変換；
（ｅ）所望によりＮ−オキシド形の本発明の化合物の非酸化形への変換；
（ｆ）所望により異性体の混合物からの本発明の化合物の個々の異性体への分離；
（ｇ）所望により本発明の非誘導化合物の薬学的に許容されるプロドラッグ誘導体への変換；および
（ｈ）所望により本発明の化合物のプロドラッグ誘導体のその非誘導形への変換。
【００７６】
出発物質の製造において特に記載のない限り、化合物は既知であるか、または当分野で既知の方法に準じてもしくは下記の実施例に記載のとおりに製造できる。
【００７７】
当業者は、上記変換は本発明の化合物の製造法の代表例のみであり、そして他の既知の方法を同様に使用できることを理解できよう。
【実施例】
【００７８】
実施例
本発明は、本発明による式Ｉの化合物の製造を説明する下記実施例により限定されることなく、さらに例示される。
実施例１
１−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−３−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ウレア（４）の合成
【化３】
2009513632.tif 000004
【００７９】
４−（４−ニトロ−フェノキシ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン：
【化４】
2009513632.tif 000005
ＤＭＦ（６０ｍｌ）に溶解した４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（３．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に４−ニトロフェノール（４．９ｇ、３５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５．３ｇ、３８ｍｍｏｌ）を加える。得られる溶液を１１０℃に一晩加熱する。出発物質の消失により指示されるとおりの反応の完了後、反応混合物を環境温度に冷却し、氷水に注ぐ。得られる固体を濾過により回収し、水（３×１００ｍｌ）で洗浄する。粗生成物を溶離剤としてヘキサン：酢酸エチル（１／１  ｖ／ｖ）を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物を固体として得る：1H NMR 400 MHz (DMSO-d6) δ 12.34 (bs, 1H), 8.35 (m, 3H), 7.57 (m, 3H), 6.61 (m, 1H); ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）  Ｃ１２Ｈ９Ｎ４Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値２５７．０６６９、実測値２５７．０６７０。
【００８０】
４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニルアミン
【化５】
2009513632.tif 000006
この化合物を当分野で既知の方法を使用して対応するニトロ基の還元から得る：ＭＳ  ｍ／ｚ  ２２７．１（Ｍ＋１）。
【００８１】
１−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−３−（３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレア
【化６】
2009513632.tif 000007
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の３−（トリフルオロメチル）アニリン（０．０１３ｍｌ、１ｍｍｏｌ）の溶液にクロロギ酸４−ニトロフェニル（０．０２０ｍｌ、１ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．００８ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を５分撹拌し、この後、４（０．０１８ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１３４ｍｌ、０．７８ｍｍｏｌ）を加える。得られる反応物を１時間、環境温度で撹拌し、この時間後、ＬＣ−ＭＳ分析が３の消失を示す。溶媒を真空除去し、得られる残渣をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解する。得られる溶液を逆相ＬＣ−ＭＳにより精製し、表題化合物をトリフルオロ酢酸塩として得る：1H NMR 400 MHz (DMSO-d6) δ 12.19 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 9.1 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.28 (s, 1 H), 8.01 (s, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.51-7.50 (m, 1H), 7.43 (t, J = 2.8 Hz, 1H ), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.42 (m, 1H)；ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）  Ｃ２０Ｈ１５Ｆ３Ｎ５Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値４１４．１１７２、実測値４１４．１１６９。
【００８２】
実施例２
Ｎ−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ）−フェニル］−２−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−アセトアミドの合成
【化７】
2009513632.tif 000008
ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の３（０．０２０ｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）、（３−トリフルオロメチル−フェニル）−酢酸（０．０２０ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７．２μｌ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液にＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（０．０３６ｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を加える。１時間環境温度で撹拌後、粗反応混合物を酢酸エチルと水に分配する。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、粗生成物を得る。残渣をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解し、得られる溶液を逆相ＬＣ−ＭＳにより精製し、表題化合物をトリフルオロ酢酸塩として得る：1H NMR 400 MHz (DMSO-d6) δ 12.13 (bs, 1H), 10.38 (bs, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.6-7.66 (m, 5H), 7.43 (m, 1H), 7.19 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.41 (m, 1H) 3.82 (s, 2H)；ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ）  Ｃ２１Ｈ１６Ｆ３Ｎ４Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値４１３．１２２０、実測値４１３．１２２２。
【００８３】
適当な出発物質を使用して上記実施例に記載の方法を繰り返すことにより、表１に記載の式Ｉの下記の化合物を得る。
【表１】
2009513632.tif 000009
【表２】
2009513632.tif 000010
【００８４】
【表３】
2009513632.tif 000011
【表４】
2009513632.tif 000012
【００８５】
アッセイ
本発明の化合物を、親３２Ｄ細胞と比較してＢｃｒ−Ａｂｌ（３２Ｄ−ｐ２１０）を発現する３２Ｄ細胞の細胞増殖を選択的に阻害する能力についてアッセイする。これらのＢＣＲ−Ａｂｌ形質転換細胞の増殖を選択的に阻害する化合物は野生型または変異形のＢｃｒ−ａｂｌのいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞における抗増殖性活性に対して試験する。加えて、化合物をＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢキナーゼを阻害する能力についてアッセイする。
【００８６】
細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ依存性増殖の阻害（ハイスループット法）
使用するマウス細胞系は、ＢＣＲ−Ａｂｌ  ｃＤＮＡで形質転換した３２Ｄ造血前駆細胞系（３２Ｄ−ｐ２１０）である。これらの細胞を、ペニシリン５０μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびＬ−グルタミン２００ｍＭを添加したＲＰＭＩ／１０％胎児ウシ血清（ＲＰＭＩ／ＦＣＳ）に維持する。形質転換されていない３２Ｄ細胞を、ＩＬ３の源として１５％のＷＥＨＩ馴化培地を添加して同様に維持する。
【００８７】
５０μｌの３２Ｄまたは３２Ｄ−ｐ２１０細胞懸濁液を５０００細胞／ウェルの密度でＧｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルマイクロプレート（black）に播種する。５０ｎｌの試験化合物（ＤＭＳＯ貯蔵溶液中で１ｍＭ）をそれぞれのウェルに加える（ＳＴＩ５７１を陽性対照として包含する）。細胞を７２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。１０μｌの６０％Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ溶液（Tek diagnostics）をそれぞれのウェルに加え、細胞をさらに２４時間インキュベートする。蛍光強度（５３０ｎｍで励起、５８０ｎｍで放射）でＡｃｑｕｅｓｔＴＭシステム（Molecular Devices）を使用して定量する。
【００８８】
細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ依存性増殖の阻害
３２Ｄ−ｐ２１０細胞を９６ウェルＴＣプレートに１５，０００細胞／ウェルの密度で播種する。５０μＬの試験化合物の２倍連続希釈（Ｃｍａｘは４０μＭ）をそれぞれのウェルに添加する（ＳＴＩ５７１を陽性対照として包含する）。細胞を４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベート後、１５μＬのＭＴＴ（Promega）をそれぞれのウェルに添加し、細胞をさらに５時間インキュベートする。５７０ｎｍの光学密度を分光測光により定量し、ＩＣ５０値、５０％阻害に必要な化合物の濃度を用量応答曲線から決定する。
【００８９】
細胞サイクル分布に対する効果
３２Ｄおよび３２Ｄ−ｐ２１０細胞を６ウェルＴＣプレートに、５ｍｌの培地中２．５×１０６細胞／ウェルで播種し、１または１０μＭの試験化合物を添加する（ＳＴＩ５７１を対照として包含する）。細胞を次いで２４時間または４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２ｍｌの細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、７０％ＥｔＯＨに１時間固定し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＲＮａｓｅ  Ａで３０分処置する。ヨウ化プロピジウム（Ｃｆ＝１０μｇ／ｍｌ）を添加し、蛍光強度をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒＴＭシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリーにより定量する。本発明の試験化合物は、３２Ｄ−ｐ２１０細胞に対してアポトーシス作用を証明するが、３２Ｄ親細胞ではアポトーシスを誘発しない。
【００９０】
細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ自己リン酸化に対する効果
ＢＣＲ−Ａｂｌ自己リン酸化を、ｃ−ａｂｌ特異的捕捉抗体および抗ホスホチロシン抗体を使用した、捕捉Ｅｌｉｓａで定量する。３２Ｄ−ｐ２１０細胞を９６ウェルＴＣプレートに、５０μＬの培地中２×１０５細胞／ウェルで播種する。５０μＬの試験化合物の２倍連続希釈（Ｃｍａｘは１０μＭ）をそれぞれのウェルに添加する（ＳＴＩ５７１を陽性対照として包含する）。細胞を、９０分、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。次いで、細胞を１時間、氷上でプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む１５０μＬの融解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡおよび１％ＮＰ−４０）で処理する。５０μＬの細胞融解物を、予め抗ａｂｌ特異的抗体でコーティングし、ブロックした９６ウェルｏｐｔｉｐｌａｔｅに添加する。プレートを、４時間、４℃でインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で洗浄後、５０μＬのアルカリホスファターゼ結合抗ホスホチロシン抗体を添加し、プレートをさらに一晩４℃でインキュベートする。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で洗浄後、９０μＬの発光基質を添加し、発光をＡｃｑｕｅｓｔＴＭシステム（Molecular Devices）を使用して定量する。ＢＣＲ−Ａｂｌ発現細胞の増殖を阻害する本発明の試験化合物は、細胞性ＢＣＲ−Ａｂｌ自己リン酸化を用量依存的方法で阻害する。
【００９１】
Ｂｃｒ−ａｂｌの変異型を発現する細胞の増殖に対する効果
本発明の化合物を、ＢＣＲ−Ａｂｌの野生型または、ＳＴＩ５７１に対する耐性を付与するか感受性を低下させる変異型（Ｇ２５０Ｅ、Ｅ２５５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７Ｌ、Ｍ３５１Ｔ）のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞に対するそれらの抗増殖効果を試験する。変異体ＢＣＲ−Ａｂｌ発現細胞および非形質転換細胞に対するこれらの化合物の抗増殖性効果を、上記のとおり（ＩＬ３欠如培地中で）１０、３．３、１．１および０．３７μＭで試験した。非形質転換細胞に対して毒性がない化合物のＩＣ５０値を、上記のとおりに得た用量応答曲線から決定した。
【００９２】
ＦＧＦＲ３（酵素アッセイ）
精製ＦＧＦＲ３（Upstate）でキナーゼ活性アッセイをキナーゼバッファー（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、４．５ｍＭのＭｎＣｌ２、１５μＭのＮａ３ＶＯ４および５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）中の０．２５μｇ／ｍＬの酵素、および基質（５μｇ／ｍＬのビオチン−ポリ−ＥＹ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）（CIS-US, Inc.）および３μＭのＡＴＰ）を含む最終容量１０μＬで行う。２つの溶液を作る：５μｌの第１の溶液はキナーゼバッファー中にＦＧＦＲ３酵素を含み、まず３８４フォーマットＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ（登録商標）（Perkin-Elmer）に分配し、次いでＤＭＳＯ中に溶解させた５０ｎＬの化合物を加え、次いで５μｌの第２の溶液はキナーゼバッファー中に基質（ポリ−ＥＹ）およびＡＴＰを含み、それぞれのウェルに加えた。室温で１時間インキュベートして反応させ、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５ＭのＫＦ、５０ｍＭのＥＴＤＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１５μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＸＬ６６５（CIS-US, Inc.）および１５０ｎｇ／ｍＬのクリプタート結合抗ホスホチロシン抗体（CIS-US, Inc.）を含む１０μＬのＨＴＲＦ検出混合物の添加により停止する。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用をするため室温で１時間インキュベーション後、時間分解蛍光シグナルはＡｎａｌｙｓｔ  ＧＴ（Molecular Devices Corp.）で読む。ＩＣ５０値は１２個の濃度（５０μＭから０．２８ｎＭの１：３希釈）でそれぞれの化合物の阻害％の線形回帰分析により計算する。このアッセイにおいて、本発明の化合物は１０ｎＭから２μＭの範囲のＩＣ５０を有する。
【００９３】
ＦＧＦＲ３（細胞アッセイ）
本発明の化合物をＦＧＦＲ３細胞キナーゼ活性に依存している形質転換Ｂａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＦＧＦＲ３細胞増殖を阻害する能力に対して試験する。Ｂａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＦＧＦＲ３を培養培地として１０％の胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０を含む懸濁液中に８００，０００細胞／ｍＬまで培養する。細胞を５０μＬの培養培地中に５０００細胞／ウェルで３８４ウェル形式のプレート中に分配する。本発明の化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、希釈する。一般的に１０ｍＭから０．０５μＭの範囲の濃度勾配を作るため、１：３連続希釈で１２点をＤＭＳＯ中に作る。細胞を５０ｎＬの希釈化合物と加え、４８時間、細胞培養インキュベーター中でインキュベーションする。増殖している細胞により作られる還元環境をモニタリングするために使用できるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（TREK Diagnostic Systems）を最終濃度１０％で細胞に加える。３７℃で細胞培養インキュベーター内でさらに４時間インキュベーション後、還元ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（５３０ｎｍで励起、５８０ｎｍで放射）からの蛍光シグナルをＡｎａｌｙｓｔ  ＧＴ（Molecular Devices Corp.）で定量化する。ＩＣ５０値は１２個の濃度でそれぞれの化合物の阻害％の線形回帰分析により計算する。
【００９４】
ＦＬＴ３およびＰＤＧＦＲβ（細胞アッセイ）
ＦＬＴ３およびＰＤＧＦＲβの細胞活性における本発明の化合物の効果を、Ｂａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＦＧＦＲ３を使用する代わりに、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＢａ／Ｆ３−Ｔｅｌ−ＰＤＧＦＲβを使用することを除いて上記ＦＧＦＲ３細胞活性と同一の方法を使用して実施する。
【００９５】
ｂ−Ｒａｆ−酵素アッセイ
本発明の化合物を、それらのｂ−Ｒａｆの活性を阻害する能力について試験する。アッセイを、黒色壁かつ透明底の３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（NUNC）で行う。基質、ＩκＢαをＤＰＢＳ（１：７５０）で希釈し、１５μｌをそれぞれのウェルに添加する。プレートを４℃で一晩インキュベートし、ＥＭＢＬＡプレート洗浄機を使用して、３回ＴＢＳＴ（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄する。プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（１５μｌ／ウェル）で３時間、室温でブロックし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて乾燥させる。２０μＭのＡＴＰ（１０μｌ）含有アッセイ緩衝液、続いて１００ｎｌまたは５００ｎｌの化合物をそれぞれのウェルに添加する。Ｂ−Ｒａｆをアッセイ緩衝液で希釈し（２５μｌ中に１μｌ）、１０μｌの希釈したｂ−Ｒａｆをそれぞれのウェルに添加する（０．４μｇ／ウェル）。プレートを室温で２．５時間インキュベートする。キナーゼ反応を、プレートを６回ＴＢＳＴで洗浄することにより停止させる。Ｐｈｏｓｐｈ−ＩκＢα（Ｓｅｒ３２／３６）抗体をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中で希釈し（１：１０，０００）、１５μｌをそれぞれのウェルに添加する。プレートを４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで６回洗浄する。ＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで希釈し（１：１，５００）、１５μｌをそれぞれのウェルに添加する。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで６回洗浄する。１５μｌの蛍光Ａｔｔｏｐｈｏｓ  ＡＰ基質（Promega）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温で１５分インキュベートする。プレートをＡｃｑｕｅｓｔまたはＡｎａｌｙｓｔ  ＧＴで、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ（励起４５５ｎｍ、放射５８０ｎｍ）を使用して読み取る。
【００９６】
ｂ−Ｒａｆ−細胞アッセイ
本発明の化合物をＡ３７５細胞でＭＥＫのリン酸化を阻害する能力に対して試験する。Ａ３７５細胞系（ＡＴＣＣ）はヒト黒色腫患者由来であり、Ｂ−Ｒａｆ遺伝子にＶ５９９Ｅ変異を有する。リン酸化ＭＥＫのレベルがＢ−Ｒａｆ変異のため上昇する。サブコンフルエントからコンフルエントＡ３７５細胞を化合物と２時間３７℃で無血清培地中でインキュベーションする。次いで細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む溶解バッファーで溶解する。遠心分離後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いでニトロセルロース膜に移す。次いで膜を抗−リン酸−ＭＥＫ抗体（ｓｅｒ２１７／２２１）（細胞シグナル）でウエスタンブロッティングに付す。リン酸化ＭＥＫの量はニトロセルロース膜のリン酸−ＭＥＫバンドの密度によりモニタリングする。
【００９７】
ＳＹＢＲグリーンＩを使用する抗マラリアアッセイ
本発明の化合物を、感染赤血球における寄生虫血症の増殖を阻害するそれらの能力を測定するためにアッセイできる。増殖を２本鎖ＤＮＡに対して高親和性を有するＳＹＢＲグリーンＩ（Invitrogen）（登録商標）色素の添加により定量化する。
【００９８】
薬剤スクリーニングのために、非ヒト血清を含む２０μｌのスクリーニング培地を、３個のアッセイプレートに分配する。抗マラリア対照（クロロキンおよびアーテミシニン）を含む、それぞれ５０ｎｌの本発明の化合物を次にアッセイプレートに移す。５０ｎｌのＤＭＳＯを基準およびバックグラウンド対照プレートに移す。次に、スクリーニング培地中の３０μｌの熱帯熱マラリア原虫感染ヒト赤血球の懸濁液を最終のヘマトクリットが２．５％であり、最終寄生虫血症の３％を有するようにアッセイプレートおよび基準対照プレートに分配する。非感染赤血球を最終ヘマトクリットが２．５％であるようにバックグラウンド対照プレートに分配する。該プレートを９３％のＮ２、４％のＣＯ２および３％のＯ２ガス混合物を有する、３７℃のインキュベーターに７２時間置く。１０μｌのＳＹＢＲグリーンＩ（登録商標）の１０×溶液を該プレートに分配する。該プレートを密閉し、−８０℃のフリーザーに一晩、赤血球の溶解のために置く。プレートを解凍し、最適染色のために室温で一晩放置する。蛍光強度をＡｃｑｕｅｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Molecular Devices）を使用して、測定する（励起４９７ｎｍ、放射５２０ｎｍ）。阻害％をそれぞれの化合物に対して計算する。
【００９９】
Ｕｐｓｔａｔｅ  ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ−放射酵素的フィルター結合アッセイ
本発明の化合物を、一連のキナーゼの個々のメンバーを阻害する能力についてアッセイする。化合物を、１０μＭの最終濃度でデュプリケートで、この一般的プロトコールに従い試験する。キナーゼ緩衝液組成物および基質は一連の“Ｕｐｓｔａｔｅ  ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ”を含んでいる異なるキナーゼに対して変化することを留意する。キナーゼ緩衝液（２．５μＬ、１０×−必要であればＭｎＣｌ２含有）、キナーゼ緩衝液中の活性キナーゼ（０．００１−０．０１単位；２．５μＬ）、特異的またはポリ（Ｇｌｕ４−Ｔｙｒ）ペプチド（５−５００μＭまたは．０１ｍｇ／ｍｌ）およびキナーゼ緩衝液（５０μＭ；５μＬ）を、氷上でエッペンドルフで混合する。Ｍｇ／ＡＴＰミックス（１０μＬ；６７．５（または３３．７５）ｍＭのＭｇＣｌ２、４５０（または２２５）μＭのＡＴＰおよび１μＣｉ／μｌ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を約３０℃で約１０分インキュベートする。反応混合物を２ｃｍ×２ｃｍのＰ８１（ホスホセルロース、正に荷電したペプチド基質のため）またはＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１（ポリ（Ｇｌｕ４−Ｔｙｒ）ペプチド基質のため）試験紙升目にスポット（２０μＬ）する。アッセイ升目を４回、それぞれ５分、０．７５％リン酸で、そして１回アセトンで５分洗浄する。アッセイ升目をシンチレーションバイアルに移し、５ｍｌシンチレーションカクテルを添加し、ペプチド基質への３２Ｐ取り込み（ｃｐｍ）をＢｅｃｋｍａｎシンチレーションカウンターで計数する。それぞれの反応について阻害パーセントを計算する。
【０１００】
遊離形または薬学的に許容される塩形の式Ｉの化合物は、例えば、本出願に記載のインビトロ試験法により示される通り、価値のある薬理学的特性を示す。例えば、式Ｉの化合物は、好ましくは野生型ＢＣＲ−ＡｂｌならびにＧ２５０Ｅ、Ｅ２５５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｆ３１７ＬおよびＭ３５１Ｔ  ＢＣＲ−Ａｂｌ変異体に対して１×１０−１０から１×１０−５Ｍの範囲、好ましくは５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭおよび５０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。１０μＭの濃度で式Ｉの化合物は、好ましくはＡｂｌ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｘｌ、ＢＭＸ、ＣＨＫ２、ｃ−ＲＡＦ、ｃＳＲＣ、Ｆｅｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｌｔ３、ＩＫＫα、ＩＲ、ＪＮＫ２α２、Ｌｃｋ、Ｍｅｔ、ＭＫＫ６、ＭＳＴ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＤＧＦＲα、ＰＫＡ、ＰＫＤ２、ＲＯＣＫ−ＩＩ、Ｒｏｓ、Ｒｓｋ１、ＳＡＰＫ２α、ＳＡＰＫ２β、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ２およびＴｒｋＢキナーゼに対して５０％以上、好ましくは約７０％以上の阻害％を示す。
【０１０１】
ここに記載の例および態様は、説明の目的のためのみであり、それに照らした様々な修飾または変化が当業者には示唆され、それらは本発明の精神および範囲の範囲内および添付の特許請求の範囲内に包含されることは理解されるべきである。本明細書で引用する全ての刊行物、特許および特許出願は全ての目的のために引用して本明細書に包含する。
【国際調査報告】
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