(57)【要約】  式、Ｒ１−ＮＨ−Ｃ＊Ｈ（（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ３＋）−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ−Ｃ＊Ｈ（ＣＨ２Ｒ２）−Ｃ＝Ｏ−Ｒ３［式中、ｎは、１、２、３の値をとることができ、Ｒ１は、Ｈ、ベンジルオキシカルボニル−、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−、アセチル、３〜２４個の炭素原子を有する直鎖脂肪族アシル基、ビニルオキシカルボニル−（Ｖｏｃ）、アリルオキシカルボニル−（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルオキシカルボニル−（Ｉｐａｏｃ）、−Ｃ＝Ｏ−シクロヘキシル、シンナミルオキシカルボニル−（Ｃｏｃ）、Ｎ−（４，４−ジメチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−４−ペンテニル）、Ｎ−（４，６−ジメチル−１−オキソ−２，４−ドデカジエニル）、Ｎ−（１−オキソ−９，１２，１５−オクタデカトリエニル）、Ｎ−（４−メチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−１０−ウンデセニル）、Ｎ−（２−メチル−１−オキソプロピル）、９−フルオレニルメトキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）、（ホモ−ベンジルオキシカルボニル）−（ホモ−Ｚ）、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−（Ｍｏｚ）、９−アントリルメチル、Ｎ−フェニルエチルおよびトリフェニルメチル−（Ｔｒｔ）から選択される基を表し、Ｒ２は、ｐ−ヒドロキシフェニル−、４−ヒドロキシヘプタ−１，３，６−トリエン−５−オン−１−イル−、２，４−ジヒドロキシフェニル−、４［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル−、（５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−ピラン−２イル）−、（３−ヒドロキシ−４−オキソピリジン−１−（４Ｈ）−イル）−、（２−チオキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル）−、４−［（アミノカルボノチオイル）アミノ］フェニル）−、（２，２’ビピリジン４−イル）−、（５−ブチル−２，４−ジヒドロキシ−フェニル）−、２，４−ジヒドロキシ−５−（１−フェニルエチル）フェニル−、（４−ヒドロキシ−５−チオキソシクロヘプタ−１，３，６−トリエン−１−イル）−から選択される基を表し、Ｒ３は、−ＯＨ、ＮＨ２から選択される基である］の化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ｒ１−ＮＨ−Ｃ＊Ｈ（（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ３＋）−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ−Ｃ＊Ｈ（ＣＨ２Ｒ２）−Ｃ＝Ｏ−Ｒ３
［式中、ｎは、１、２、３の値をとることができ、
Ｒ１は、Ｈ、ベンジルオキシカルボニル−、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−、アセチル、３〜２４個の炭素原子を有する直鎖脂肪族アシル基、ビニルオキシカルボプニル−（Ｖｏｃ）、アリルオキシカルボニル−（Ａｌｌｏｃ）、１イソプロピルアリルオキシカルボニル−（Ｉｐａｏｃ）、−Ｃ＝Ｏ−シクロヘキシル、シンナミルオキシカルボニル−（Ｃｏｃ）、Ｎ−（４，４−ジメチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−４−ペンテニル）、Ｎ−（４，６−ジメチル−１−オキソ−２，４−ドデカジエニル）、Ｎ−（１−オキソ−９，１２，１５−オクタデカトリエニル）、Ｎ−（４−メチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−１０−ウンデセニル）、Ｎ−（２−メチル−１−オキソプロピル）、９−フルオレニルメトキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）、（ホモ−ベンジルオキシカルボニル）−（ホモ−Ｚ）、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−（Ｍｏｚ）、９−アントリルメチル、Ｎ−フェニルエチルおよびトリフェニルメチル−（Ｔｒｔ）から選択される基を表し、
Ｒ２は、ｐ−ヒドロキシフェニル−、４−ヒドロキシヘプタ−１，３，６−トリエン−５−オン−１−イル−、２，４−ジヒドロキシフェニル−、４［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル−、（５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−ピラン−２イル）−、（３−ヒドロキシ−４−オキソピリジン−１−（４Ｈ）−イル）−、（２−チオキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル）−、４−［（アミノカルボノチオイル）アミノ］フェニル）−、（２，２’ビピリジン４−イル）−、（５−ブチル−２，４−ジヒドロキシ−フェニル）−、２，４−ジヒドロキシ−５−（１−フェニルエチル）フェニル−、（４−ヒドロキシ−５−チオキソシクロヘプタ−１，３，６−トリエン−１−イル）−から選択される基を表し、
Ｒ３は、−ＯＨ、ＮＨ２から選択される基である］の化合物。
【請求項２】
ｎが１または２であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−またはベンジルオキシカルボニル−であることを特徴とする請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、Ｈまたはベンジルオキシカルボニルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、Ｃ末端が１，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノ酪酸、またはオルニチンとペプチド結合されているチロシンもしくはそのトロポロン−または２，４−ジヒドロキシ類似体−類似体からなるオリゴペプチドであり、前記Ｃ末端がカルボキシル官能またはアミド官能、好ましくは、アミド官能を表すことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物がジペプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
０．０００１〜１５重量％、好ましくは、０．０１〜１重量％の使用濃度でヒトチロシナーゼの阻害および皮膚色素沈着の低減のための請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物の非治療的な使用。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物を含有する化粧用調製物。
【請求項９】
さらにジヒドロキシアセトン、メラニン誘導体、クルミ抽出物、またはエリトルロースが、前記調製物の総重量を基準にして、好ましくは、０．１重量％〜８重量％、特に好ましくは、０．４−２重量％の濃度で含有されていることを特徴とする請求項８に記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
局所色素沈着過度および強すぎる構成色素沈着は美容上の欠点として感じられる。皮膚の色素沈着は、皮膚独自の色素メラニンによって完全に内在的に決定される。これは上皮の特殊化細胞、メラニン細胞によって形成される。メラニン合成に際しては、チロシナーゼがペースメーカー酵素としてきわめて重要な役割を果たす。
【背景技術】
【０００２】
いわゆるフォトタイプにおいて反映される皮膚の均一の色素沈着に加えて、局所色素沈着の増強も生じうるが、これらはさまざまな原因を有しうる。これら局所色素沈着過度の例として挙げられるのは、そばかす、老人性色素斑、メラニン沈着、肝斑、炎症後色素沈着過度、黒子等々であろう。色素沈着のすべての形態は共通しており、（過度の）メラニンが発生する。
【０００３】
局所色素沈着過度およびそれ自体で皮膚型に完全に十分な色素沈着はしばしば美容上の欠点として認識される。したがって、皮膚の色素沈着を回避するさまざまな方法が開発された。ペースメーカー酵素チオシナーゼによって決定的に制御されるメラニン合成の阻害に加えて、メラニン細胞からメラニンの周囲のケラチン生成細胞へ輸送することを阻止する方法も周知である。例えば、この輸送を抑制する大豆からのセリンプロテアーゼ阻害剤が記載されている。ニアシンアミドは同様にして色素沈着を低減するという。皮膚のメラニン含有角質細胞の剥離増大を伴う皮膚の再生増強についても皮膚を明るくするために記載されている。この方法のためには特に乳酸、グリコール酸、さらにはビタミンＡ酸も使用される。また、ビタミンＣおよびその誘導体などの抗酸化剤が使用されるか、または、ペースメーカー酵素チロシナーゼの細胞内安定が（例えばリノール酸によって）減少される皮膚を明るくする治療法も周知である。
【０００４】
皮膚を明るくするための先に記載された方法に加えて、チロシナーゼの直接の阻害が多くの方法の前面に出ている。大部分の阻害剤はフェノール構造またはカテコール構造である。これにより、コウジ酸、アルブチン、およびヒドロキノンなど一般に周知のチロシナーゼ阻害剤が使用される。ヒドロキノンは文献においてしばしば「ゴールドスタンダード」として記載されている。ただし、インビボで効果のある濃度はしばしば明らかな副作用も示す。ほぼすべての皮膚を明るくする成分において生じうるこの毒性問題のため、毒性学的に問題のない効果のある色素沈着を低減する作用原理が依然として不足している。これまで入手可能なチロシナーゼ阻害剤はマッシュルームチロシナーゼのために最適化された。本発明の課題はさらに、ヒトチロシナーゼの阻害剤を開発し、ヒトチロシナーゼを高効率に阻害し、皮膚色素沈着を最小限にするための阻害剤を開発することであった。
【０００５】
トロポロンおよびその誘導体は、特許文献において、皮膚を明るくするためのチロシナーゼ阻害剤および物質としてすでに記載されている。例えば、特許文献１では皮膚のしみおよびそばかすの治療のためのトロポロンの使用が記載されている。特許文献２および特許文献３では、ツジャプリシンとも呼ばれる天然に存在するトロポロン誘導体であるイソプロピルトロポロンの皮膚を明るくする効果が記載されている。特許文献４では他の白化作用物質と組合せたトロポロンの使用が記載されている。
【０００６】
また、特許文献においてチロシナーゼ阻害のためのペプチド構造も記載されている（例えば、特許文献５、特許文献６）。これらの構造のいずれも本発明による化合物との一致を示していない。したがって、本発明の構成要素は、新種の酵素アッセイおよびそれを使用して識別される構造である。
【０００７】
【特許文献１】日本国特許第６３０３３３１３号公報
【特許文献２】日本国特許第１９７９−８２２１３号公報
【特許文献３】米国特許第４３６１５８１号明細書
【特許文献４】欧州特許第３０８９１９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００００６４９２６号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５１２６３２７号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
意外にも、式
Ｒ１−ＮＨ−Ｃ＊Ｈ（（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ３＋）−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ−Ｃ＊Ｈ（ＣＨ２Ｒ２）−Ｃ＝Ｏ−Ｒ３
［ｎは、１、２、３の値をとることができ、
Ｒ１は、Ｈ、ベンジルオキシカルボニル−、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−、アセチル、３〜２４個の炭素原子を有する直鎖脂肪族アシル基、Ｖｏｃ（ビニルオキシカルボプニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、Ｉｐａｏｃ（１−イソプロピルアリルオキシカルボニル）、−Ｃ＝Ｏ−シクロヘキシル、Ｃｏｃ（シンナミルオキシカルボニル）、Ｎ−（４，４−ジメチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−４−ペンテニル）、Ｎ−（４，６−ジメチル−１−オキソ−２，４−ドデカジエニル）、Ｎ−（１−オキソ−９，１２，１５−オクタデカトリエニル）、Ｎ−（４−メチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−１０−ウンデセニル）、Ｎ−（２−メチル−１−オキソプロピル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ホモ−Ｚ（ホモ−ベンジルオキシカルボニル）、Ｍｏｚ（Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）、９−アントリルメチル、Ｎ−フェニルエチルおよびＴｒｔ（トリフェニルメチル）から選択される基を表し、
Ｒ２は、ｐ−ヒドロキシフェニル−、４−ヒドロキシヘプタ−１，３，６−トリエン−５−オン−１−イル−または２，４−ジヒドロキシフェニル−、４［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル−、（５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−ピラン−２イル）−、（３−ヒドロキシ−４−オキソピリジン−１−（４Ｈ）−イル）−、（２−チオキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル）−、４−［（アミノカルボノチオイル）アミノ］フェニル）−、（２，２’ビピリジン４−イル）−、（５−ブチル−２，４−ジヒドロキシ−フェニル）−、２，４−ジヒドロキシ−５−（１−フェニルエチル）フェニル−、（４−ヒドロキシ−５−チオキソシクロヘプタ−１，３，６−トリエン−１−イル）−から選択される基を表し、
Ｒ３は、−ＯＨ、ＮＨ２から選択される基である］の本発明による化合物が従来技術の欠点を取り除くことが示された。
【０００９】
これらは、ヒトチロシナーゼを阻害し、したがって皮膚色素沈着の低減をもたらすことに非常に適している。具体的には、これはそれぞれの皮膚型において自然に完全に適切に発生しうる（白化）および局所色素沈着過度のさまざまな形態（例えば、老人性色素斑、メラニン沈着、肝斑、そばかす、黒子、日焼け後、内生（ひげ）髪後、体毛の除去後、ひげそり後、および皮膚の炎症性病変（例えば、にきび）に際して等に発生する炎症後色素沈着過度のさまざまな形態などの色素沈着障害）におけるような望ましくない色素沈着の低減に関する。
【００１０】
さらに、本発明による化合物は、
・  自然の髪色を明るくし、
・  ＵＶ光線（日焼け）に対する皮膚の後続反応を減少させ、
・  ひげそり（かみそり負け）に対する皮膚の後続反応を減少させ、
・  皮膚に有用な保護および修復機序（例えば、機能不全の酵素、ＤＮＡ、脂質、タンパク質に対する）を上昇させ、
・  かつ、例えば、皺および傷跡の低減に役立ち、結果として生じる皮膚の刺激に抵抗するとともに損傷した皮膚における再生過程を促進させるレーザーの局所使用に際しての前
後処置および擦りむきの処置のために非常に適している。
【００１１】
さらに、本発明による化合物およびその製剤は次のさらなる利点、すなわち、予防的および治療のために
・  きわめて優れた皮膚忍容性
・  製剤における優れた配合性および高い安定性
・  それによって健康な肌の色がもたらされる皮膚の血行および再生および細胞再生の改善
・  皮膚の引締めおよびセルライトの減少
・  皮膚老化および皮膚障害の（ＵＶ誘発性）徴候の減少、すなわち、小皺および皺ならびに毛細血管拡張の減少
・  刺激作用および肌の張りの改善
・  肌の潤い改善
・  掻痒感の減少
を有する。
【００１２】
好ましくは、本発明による化合物において、ｎは１または２である。
【００１３】
さらに好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−またはベンジルオキシカルボニル−である。
【００１４】
特に好ましくは、Ｒ１は、Ｈまたはベンジルオキシカルボニルである。
【００１５】
非常に好ましくは、本発明による化合物は、Ｃ末端が、２，４−ジアミノ酪酸、またはオルニチンとペプチド結合されているチロシン、そのトロポロン類似体、または２，４−ジヒドロキシ類似体からなるオリゴペプチドである。
【００１６】
さらに好ましくは、本発明による化合物は、トリペプチド、好ましくは、ジペプチドである。本発明は、０．０００１〜１５重量％、好ましくは、０．０１〜１重量％の使用濃度でヒトチロシナーゼの阻害および皮膚色素沈着の低減のための本発明による化合物の使用をも包含する。本発明は、本発明による化合物を含有する化粧用調製物をも包含する。
【００１７】
本発明は、自然の髪色を明るくし、ＵＶ光線（日焼け）に対する皮膚の後続反応を減少させ、ひげそり（かみそり負け）に対する皮膚の後続反応を減少させ、皮膚に有用な保護および修復機序（例えば、機能不全の酵素、ＤＮＡ、脂質、タンパク質に対する）を上昇させるための、かつ、例えば、皺および傷跡の減少に役立ち、結果として生じる皮膚刺激性に抵抗するとともに損傷した皮膚における再生過程を促進させるレーザーの局所使用に際しての前後処置および擦りむきの処置を促進するための調製物における本発明による化合物の使用もしくは本発明による調製物の非治療的な使用をも包含する。
【００１８】
本発明による化合物は、オリゴペプチド、具体的には、Ｃ末端がチロシン残基もしくはその類似体であり、図２によれば、さまざまなＲ２基から由来し、オルニチン、または好ましくは、２，４−ジアミノ酪酸、または特に好ましくは、２，３−ジアミノプロパン酸とペプチド結合されているジペプチドでありうる。図１において、この化合物の一般構造が示されている。特殊な効果は、酵素の基本的な銅イオンのリガンドとしてチロシナーゼとの錯体において機能するＲ２基とのペプチド構造の組合せにある。好ましいＲ２基は、２／１、２／２、２／３、２／５  ２／９であり、このうち特に好ましくは、Ｒ６、Ｒ４が−ＨおよびＲ５が−ＯＨの２／１、および２／２である。
【００１９】
【化１】
2009529513.tif 000002
【表１】
2009529513.tif 000003
【００２０】
【化２】
2009529513.tif 000004
（Ｒ４、Ｒ５は−Ｈまたは−ＯＨ、Ｒ６はＨ、ＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３であり、ｎが０−１５、−ＣＨ（Ｍｅ）（Ｐｈ）、Ｐｈ、ＯＡｃ）：
２／１：フェノールおよびカテコール、
２／２：トロポロン、
２／３：サリチルヒドロキサム酸、
２／４：５−ヒドロキシ−４−ピロン、
２／５：３−ヒドロキシ−４−オキソピリジン、
２／６：チオオキサゾリドン、
２／７：フェニルチオ尿素
２／８：α，α’−ジピリジル
２／９：２−ヒドロキシチオトロポロン
【００２１】
図１および２に補足して次の特徴が確認される。すなわち、
・  Ｎ末端アミノ酸において側鎖における遊離アミノ基が必須であり、さらに、ｎ＝１はｎ＝２より有効であり、ｎ＝２はｎ＝３より有効である（図１を参照）
・  立体的に大きな疎水性置換基Ｒ１は阻害効果を改善しうる。
・  非保護Ｎ末端アミノ官能に加えて、これはさまざまな保護基によって保護されうる。Ｎ末端保護基は、疎水性の脂肪族直鎖、脂肪族分岐、もしくは環状、および特に好ましくは、芳香族基から選択されうる。
・  好ましい基は、−Ａｃ、−Ｃ＝Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ここでｎ＝１−２２であり、Ｖｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ｉｐａｏｃである。
・  Ｃ＝Ｏ−シクロヘキシル、Ｃｏｃ、Ｎ−（４，４−ジメチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−４−ペンテニル）、Ｎ−（４，６−ジメチル−１−オキソ−２，４−ドデカジエニル）、Ｎ−（１−オキソ−９，１２，１５−オクタデカトリエニル）、Ｎ−（４−メチル−１−オキソペンチル）、Ｎ−（１−オキソ−１０−ウンデセニル）、Ｎ−（２−メチル−１−オキソプロピル）、およびＦｍｏｃ、ホモ−Ｚ、Ｍｏｚ、９−アントリルメチル、Ｎ−フェニルエチル、Ｂｏｃ、およびＴｒｔである。
・  特に好ましくは、Ｃｂｓ（カルボベンゾキシ）である。
・  置換基Ｒ２としては優れた銅リガンドが特に効果がある。
・  Ｃ末端アミド化ペプチド（Ｒ３＝−ＮＨ２）は、遊離酸よりも効果がある。
【００２２】
表１は、特に効果のある阻害剤として証明された（＋＋＋）図１に示された一般構造（Ｒ２＝４−ヒドロキシベンゾイル−）の化合物を示す。この場合、構造の効果に対して決定的な影響を有する立体化学（両方のアミノ酸のＬ−もしくはＤ−配置）も考慮される。ほとんどの場合、Ｌ−配置が好ましいが、オルニチンの場合にはＤ−配置が好ましい。
【００２３】
特に有効に次の本発明による構造が製造された。
【００２４】
【化３】
2009529513.tif 000005
【００２５】
【化４】
2009529513.tif 000006
【００２６】
【化５】
2009529513.tif 000007
【００２７】
【化６】
2009529513.tif 000008
【００２８】
【化７】
2009529513.tif 000009
【００２９】
【化８】
2009529513.tif 000010
【００３０】
【化９】
2009529513.tif 000011
【００３１】
【化１０】
2009529513.tif 000012
【００３２】
【化１１】
2009529513.tif 000013
【００３３】
【化１２】
2009529513.tif 000014
【００３４】
【化１３】
2009529513.tif 000015
【００３５】
【化１４】
2009529513.tif 000016
【００３６】
【化１５】
2009529513.tif 000017
【００３７】
【化１６】
2009529513.tif 000018
【００３８】
【化１７】
2009529513.tif 000019
【００３９】
【化１８】
2009529513.tif 000020
【００４０】
上記の物質は部分的にバッヒェム（Ｂａｃｈｅｍ）社から購入されうるが、アミノ酸トロポロニルアラニンは、酵素チロシン＿フェノルリアーゼによって、トポロンもしくは２−ヒドロキシチオトロポンおよびアンモニアからなるドーパの製造と同様に製造されうる（フール（Ｆｏｏｒ）Ｆ、モリン（Ｍｏｒｉｎ）Ｎ、ボスティアン（Ｂｏｓｔｉａｎ）ＫＡ（１９９３年）エルビニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）からクローン化したチロシンフェノールリアーゼ遺伝子による大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるＬ−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｅｎｏｌ−ｌｙａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９、３０７０−３０７５頁、および「チロシン−フェノール−リアーゼによるトロポノリルアラニンの酵素的製造のための方法（Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ  ｚｕｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ  Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｔｒｏｐｏｎｏｌｙｌａｌａｎｉｎ  ｍｉｔ  Ｔｙｒｏｓｉｎ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｌｙａｓｅ）」：日本国特許第０８０７０８７８号公報）。次いで、ペプチドは、従来のペプチド合成法により特殊合成として製造される。
【００４１】
本発明による調製物は有利には本発明によるペプチドをさらに２個以上含有しうる。
【００４２】
本発明による調製物は、さらに有利に、例えば、ジヒドロキシアセトン、メラニン誘導体、およびエリトルロースなど自己褐変物質をも含有しうるが、この物質は調製物の総重量を基準にして０．１重量％〜８重量％、好ましくは、０．４−２重量％の濃度で使用される。本発明による製剤は、さらに有利には、ジヒドロキシアセトンに加えて、クルミ抽出物のほか、褐色性を保持または生成し、またはさらに増強する別の物質をも含有しうる。きわめて有利と証明されたのは、望ましくない色素沈着過度（黒皮症、老人性色素斑、そばかす等）を治療するための、自己褐変物質、具体的には、ジヒドロキシアセトンおよびエリトルロースと本発明による化合物の化粧用調製物における組合せである。
【００４３】
保湿剤と呼ばれるのは、皮膚表面への塗布後もしくは配置後に角質層の湿度放出（経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）とも呼ばれる）を低減し、かつ／または角質層の水和に好ましい影響を及ぼす特徴を化粧用または皮膚科用調製物に付与する物質または物質の混合物である。
【００４４】
本発明による保湿剤は、有利には、グリセリン、乳酸、および／または乳酸塩、具体的には乳酸ナトリウム、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ビオサッカリド  Ｇ
ｕｍ−１、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓｏｊａ）、エチルヘキシロキシグリセリン、ピロリドンカルボン酸、および尿素からなる群から選択される。さらに具体的に有利であるのは、水溶性、水中で膨張可能、または水によってゲル化可能な多糖類の群からなるポリマー保湿剤の使用である。具体的に有利なのは、ヒアルロン酸、キトサン、およびフコースが豊富な多糖類であり、これは登録番号１７８４６３−２３−５でケミカルアブストラクト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（ＣＡ））にファイリングされ、かつ例えば、フコゲル（Ｆｕｃｏｇｅｌ）（登録商標）１０００の名称でソラビア（ＳＯＬＡＢＩＡ）Ｓ．Ａ．社から得られるものである。保湿剤は、例えば、皮膚の老化に際して発生する美容上または皮膚科の皮膚の変化を予防および治療するための抗皺作用物質としても有利に使用されうる。本発明において特に有利であるのは、保湿剤としてのグリセリンを、好ましくは、調製物の総重量を基準にして０．０５〜３０重量％、特に好ましくは、１〜１０重量％の濃度で使用することである。
【００４５】
本発明においてさらに有利に使用される作用物質は、皮膚の状態に好ましく影響を及ぼすもの、具体的には、皺の発生または既存の皺を減少させる老年性皮膚に好ましい影響を及ぼす作用物質である。有利には、具体的には、バイオキノン、具体的には、ユビキノン（Ｑ１０）、ユビキノール、葉酸およびその誘導体（具体的には、テトラヒドロ葉酸およびジヒドロ葉酸）、ニアシンおよびその誘導体（具体的には、ニアシンアミド）、クレアチンおよびクレアチニン、カルニチン、ビオチン、イソフラボン、カルジオリピン、リポン酸、凍結抑制タンパク質、ホップおよびホップ−モルト抽出物である。結合組織の再構成を促進する、天然および合成イソフラボノイドおよびイソフラノイド含有植物抽出物、例えば、大豆およびクローバー抽出物などの薬剤も本発明による製剤においてきわめて優れて使用されうる。これらの製剤は、乾燥した皮膚における皮膚機能を補助するための作用物質（例えば、ビタミンＣ、ビオチン、カルニチン、プロピオン酸、緑茶−抽出物、ユーカリ油、尿素および金属塩（例えば、ＮａＣｌ、海底鉱物）およびオスモライト（例えば、イノシトール、ベタイン、第四級アンモニウム化合物）の使用に特殊な方法で適していることも示されている。同様にして、刺激性皮膚状態の軽減、もしくはこれに好ましい影響を及ぼすための作用物質の添加は、一般に敏感な皮膚の場合であれ、害毒物によって刺激された皮膚（ＵＶ光線、化学物質）の場合であれ、有利と証明された。ここで挙げられる作用物質は、例えば、セリコサイド、甘草のさまざまな抽出物、リコカルコン、具体的には、リコカルコンＡ、シリマリン、シリフォス（Ｓｉｌｙｐｈｏｓ）、デクスパンテノール、プロスタグランジン代謝、具体的には、シクロオキシゲナーゼ、ロイコトリエン代謝、具体的には、５−リポキシゲナーゼ、あるいはまた５−リポキシゲナーゼ阻害剤タンパク質、ＦＬＡＰの阻害剤である。前述した作用物質はさらに具体的には、（エネルギー）デポーを適用し、または更新し、かつさまざまな細胞構造、具体的には、ＤＮＡの修復（修理）を活性化するために適している。
【００４６】
また、色素沈着のその他の調節因子の添加も非常に特別に有利であると証明された。ここで作用物質として挙げられるのは、皮膚の色素沈着を減少させ、かつ皮膚に美容上望ましい明るさをもたらし、老人性色素斑の発生を低減し、または既存の老人性色素斑を明るくするものである。強調すべきは、チロシン硫酸、二酸（８−ヘキサデセン−１，１６−ジカルボン酸）のほか、リポン酸およびリポアミド、グラブリジン、甘草、桑、銅ブナ、マロニエ、マンサクのほか、バイカル・ヘルムクラウト（Ｂａｉｋａｌ−Ｈｅｌｍｋｒａｕｔ）のさまざまな抽出物、パンテテインスルホン酸、コウジ酸、ヒドロキノン、アルブチン、α−アルブチン、Ｄｅオキシアルブチン、果実酸、具体的にはα−ヒドロキシ酸（ＡＨＡ）、ベアベリー抽出物（ベアベリーまたはウワウルシ）、ウルソル酸、ルシノール、デオキシアルブチン、Ｂｉｏ３７７、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＯＨ、トロポロン、ツジャプリシンアスコルビン酸、緑茶−抽出物、アミノグアニジン、ピリドキサミン、ナイアシンアミドおよびその誘導体、プロテイナーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）の阻害剤である。非常に特に好ましくは、さらに、ＵＶ光線の影響の有無に関係なく、皮膚の
増強された、または迅速な褐変をもたらすその他の作用物質を含有する本発明による製剤である。これは、局所色素沈着過度（とりわけ老人性色素斑、そばかす、黒皮症）の低減に役立つような本発明による製剤に非常にきわめて該当する。かかる作用物質として、例えば、最終糖化生成物（ＡＧＥ）、リポフスチン、グリセルレチンおよびグリシルレチン酸、ヌクレイン酸オリゴヌクレオチド、プリンおよびピリミジン、ＮＯ−放出物質、チロシンおよびその誘導体（具体的にはＮ−アセチル−チロシン）、フェニルアラニンおよびその誘導体、具体的にはＮ−アセチル−フェニルアラニンのほか、プロテイナーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）の活性化剤が使用されうる。
【００４７】
特に有利な調製物はさらに、添加物質または作用物質として抗酸化剤が使用されると得られる。本発明によれば、調製物は有利には１つもしくはそれ以上の抗酸化剤を含有する。有利であるが、しかし随意に使用される抗酸化剤としては、化粧用および皮膚科用の使用に適し、または従来のすべての抗酸化剤が使用されうる。
【００４８】
本発明において非常に特に有利に、水溶性抗酸化剤、例えば、ビタミン、例えば、アスコルビン酸およびその誘導体、具体的には、パルミチン酸アスコルビル、ＮａおよびＭｇリン酸アスコルビル、および酢酸アスコルビルのほか、ルチン酸およびその誘導体、具体的には、αグルコシルルチン、クエルセチン、およびイソクエルセチンが使用されうる。
【００４９】
特に好ましい抗酸化剤はさらにビタミンＥおよびその誘導体（具体的には、酢酸ビタミンＥ）、ビタミンＡおよびその誘導体（具体的には、パルミチン酸ビタミンＡ）のほか、カルノシン、リポ酸およびその誘導体（具体的には、ジヒドロリポン酸およびリポンアミド）、ブチルヒドロキシトルオール、ブチルヒドロキシアニソール、β−アラニンのほか、カロチノイド（具体的には、β−カロチン）、およびフェトエンである。
【００５０】
調製物における抗酸化剤（１つもしくは複数の化合物）の量は、好ましくは、調製物の総重量を基準にして、０．００１〜３０重量％、特に好ましくは、０．０５〜２０重量％、具体的には、０．１〜１０重量％である。
【００５１】
ビタミンＥおよび／またはその誘導体が抗酸化剤を表す限り、そのそれぞれの濃度を製剤の総重量を基準にして、０．００１〜１０重量％の範囲から選択することが有利である。
【００５２】
ビタミンＡもしくはビタミンＡ誘導体、もしくはカロチンもしくはその誘導体が抗酸化剤を表す限り、そのそれぞれの濃度を製剤の総重量を基準にして、０．００１〜１０重量％の範囲から選択することが有利である。
【００５３】
具体的には、本発明による化粧用調製物が化粧用または皮膚科用作用物質を含有し、好ましくは、作用物質が、皮膚を酸化負荷から保護しうる抗酸化剤である場合に有利である。
【００５４】
本発明において有利には、本発明における調製物は、好ましくは、少なくとも１つの他のＵＶ−Ａ−、ＵＶ−Ｂ−および／または広帯域フィルター物質を含有する。製剤は、必ずしも必要ではないが、場合により、ＵＶフィルター物質として、水相および／または油相において存在しうる１つもしくは複数の有機および／または無機色素を含有しうる。
【００５５】
かかるＵＶ−フィルター物質は、フェニレン−１，４−ビス−（２−ベンゾイミダゾール）−３，３’−５，５’−テトラスルホン酸塩、２−フェニルベンゾイミダゾール５−スルホン酸塩、１，４−ジ（２−オキソ−１０−スルホ−３−ボルニリデンメチル）−ベンゾニルおよびその塩、４−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）ベンゾールスルホ
ン酸塩、２−メチル５−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）スルホン酸塩、２，２’−メチレン−ビス−（６−（２Ｈ−ベンゾトリアゾル−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール）、２−（２Ｈ−ベンゾトリアゾル−２−イル）−４−メチル−６−［２−メチル−３−［１，３，３，３−テトラメチル−１−［（トリメチルシリル）オキシ］ジシロキサンイル］プロピル］−フェノール、３−（４−メチルベンジリデン）カンファー、３−ベンゾイルデンカンファー、エチルヘキシルサリチル酸塩、テトラフタリデンジカンファースルホン酸、４−（ジメチルアミノ）−安息香酸（２−エチルヘキシル）エステル、４−（ジメチルアミノ）安息香酸−アミルエステル、４−メトキシベンザルマロン酸ジ（２−エチルヘキシル）エステル、４−メトキシシナモン酸（２−エチルヘキシル）エステル、４−メトキシシナモン酸イソアミルエステル、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−（４’−ジエチルアミノ−２’−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸ヘキシルエステル、４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン、ホモメチルサリチル酸塩、２−エチルヘキシル−２−ヒドロキシ安息香酸塩、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリル酸塩、ジメチコジエチルベンザルマロン酸塩、３−（４−（２，２−ビスエトキシカルボニルビニル）−フェノキシ）プロペニル）−メトキシシロキサン／ジメチルシロキサン−コポリマー、２，４−ビス−｛［４−（２−エチル−ヘキシロキシ）−２−ヒドロキシ］−フェニル｝−６−（４−メトキシフェニル）−１，３，５−トリアジン（ＩＮＣＩ：ビス−エチルヘキシロキシフェノールメトキシフェニルトリアジン）、ジオクチルアミドトリアゾン（ＩＮＣＩ：ジエチルヘキシル−ブタミドトリアゾン）、２，４−ビス−［５−１（ジメチルプロピル）ベンゾキサゾール−２−イル−（４−フェニル）−イミノ］−６−（２−エチルヘキシル）−イミノ−１，３，５−トリアジン（（ＣＡＳ番号２８８２５４−１６−０）を有する）、４，４’，４’’−（１，３，５−トリアジン−２，４，６−トリルトリイミノ）−トリス−安息香酸−トリス（２−エチルヘキシルエステル）（さらに：２，４，６−トリス−［アニリノ−（ｐ−カルボ−２’−エチル−１’−ヘキシロキシ）］−１，３，５−トリアジン（ＩＮＣＩ：エチルヘキシルトリアゾン）、２，４，６−トリビフェニル−４−イル−１，３，５−トリアジン、２−（４’−（ジエチルアミノ）−２’−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸ヘキシルエステルメロシアニン、チチアン二酸化物、調製物の総重量を基準にして０．０１〜４０重量％の濃度、および好ましくは、１〜２０重量％の濃度での亜鉛酸化物でありうる。
【００５６】
好ましい無機色素は、金属酸化物および／または水難溶性または不溶性金属化合物、具体的には、チタンの酸化物（ＴｉＯ２）、亜鉛の酸化物（ＺｎＯ）、鉄の酸化物（例えば、Ｆｅ２Ｏ３）、ジルコニウムの酸化物（ＺｒＯ２）、珪素の酸化物（ＳｉＯ２）、マンガンの酸化物（例えば、ＭｎＯ）、アルミニウムの酸化物（Ａｌ２Ｏ３）、セリウムの酸化物（例えば、Ｃｅ２Ｏ３）、かかる酸化物からの対応する金属および混合物の混合酸化物およびバリウムの硫酸塩（ＢａＳＯ４）である。
【００５７】
これらの色素は、本発明において有利に油性または水性の前分散液の形でも使用されうる。これらの前分散液には有利に分散助剤および／または溶解補助剤が添加されうる。
【００５８】
色素は本発明によれば有利に表面処理されうるが、例えば、親水性、両親媒性、または疎水性の特性が形成され、もしくは保持されるべきである。この表面処理は、それ自体周知の方法に従って薄い親水性および／または疎水性の無機層および／または有機層が色素に付与されることで行なわれうる。さまざまな表面コーティングは本発明において水も含有しうる。
【００５９】
本発明による無機表面コーティングは、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３、もしくは水酸化アルミニウム（別称：アルミナ、ＣＡＳ番号１
３３３−８４−２）、ヘキサメタリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ３）６、メタリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ３）ｎ、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）（別称：シリカ、ＣＡＳ番号７６３１−８６−９）、または酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）からなりうる。これらの無機表面コーティングは、単独で、組合せて、および／または有機コーティング材料と組合せて存在しうる。
【００６０】
本発明による有機表面コーティングは、植物性または動物性のステアリン酸アルミニウム、植物性または動物性のステアリン酸、ラウリン酸、ジメチルポリシロキサン（別称：ジメチコン）、メチルポリシロキサン（メチコン）、ジメチコン（平均鎖長２００〜３５０のジメチルシロキサン単位およびシリカゲルとのジメチルポリシロキサンの混合物）またはアルギン酸からなりうる。これらの有機表面コーティングは、単独で、組合せて、および／または無機コーティング材料と組合せて存在しうる。
【００６１】
本発明による適切な亜鉛酸化物粒子および亜鉛酸化物粒子の前分散液は、次の商品名で記載された会社において購入可能である。
【００６２】
【表２】
2009529513.tif 000021
【００６３】
適切なチタン二酸化物粒子およびチタン二酸化物粒子の前分散液は、次の商品名で記載された会社において購入可能である。
【００６４】
【表３】
2009529513.tif 000022
【００６５】
さらに有利な色素はラテックス粒子である。本発明により有利なラテックス粒子は、次の刊行物に記載されている。すなわち、米国特許第５，６６３，２１３号明細書および欧州特許第０７６１２０１号明細書である。特に有利なラテックス粒子は、水およびスチロール／アクリレートコポリマーで形成され、かつ例えば、ローム（Ｒｏｈｍ）アンド（＆）ハース（Ｈａａｓ）社において「Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＳｕｎＳｐｈｅｒｅ」の商品名で得られるものである。
【００６６】
無機色素、具体的には、完成した化粧用または皮膚科用調製物における疎水性の無機微小色素の総量は、有利には、調製物の総重量を基準にして、０．１−３０重量％、好ましくは、０．１−１０．０、具体的には、０．５−６．０重量％の範囲から選択される。
【００６７】
本発明によれば、化粧用および／または皮膚科用の光線防護製剤は従来どおりに組成され、かつ、皮膚および／または髪の治療、手入れ、および洗浄のために、かつ化粧品として装飾的な美容術において、化粧用および／または皮膚科用紫外線防護に役立ちうる。
【００６８】
使用のために、化粧用および皮膚科用調製物は、本発明によれば、化粧品に従来どおりの方法で皮膚および／または髪へ十分な量でもたらされる。
【００６９】
特に好ましくは、かかる化粧用および皮膚科用調製物は、日焼け防止剤の形で存在する。有利には、これらはさらに少なくとも１つの他のＵＶＡフィルターおよび／または少なくとも１つの他のＵＶＢフィルター、および／または少なくとも１つの無機色素、好ましくは、無機微小色素を含有しうる。
【００７０】
非常に特に好ましい有機ＵＶフィルターは、エチルヘキシルメトキシシンナメート、エチルヘキシルサリチル酸ブチルメトキシジベンゾイルメタン、フェニルベンゾイミダゾールスルホン酸、フェニルジベンゾイミダゾールテトラスルホン酸、ベンゾフェノン−３（オキシベンゾン）および−４（２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸）、テトラフタルイリデンジカンファースルホン酸、エチルヘキシルトリアゾン、ビス−エチルヘキシロキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、３−（４−メチルベンジリデン）カンファー、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、ホモメチルサルチル酸である。
【００７１】
酸として挙げられたすべての物質は、アルカリ塩、アンモニウムまたはアルキルアンモニウム塩として溶解された形でも存在し、または使用されうる。
【００７２】
同じく非常に特に好ましい無機色素は、金属化合物および／または水難溶性または不溶性の他の金属化合物、具体的には、チタンの酸化物（ＴｉＯ２）、亜鉛の酸化物（ＺｎＯ）、鉄の酸化物（例えば、Ｆｅ２Ｏ３）、ジルコニウムの酸化物（ＺｒＯ２）、珪素の酸化物（ＳｉＯ２）、マンガンの酸化物（例えば、ＭｎＯ）、アルミニウムの酸化物（Ａｌ２Ｏ３）、セリウムの酸化物（例えば、Ｃｅ２Ｏ３）、かかる酸化物からの対応する金属および混合物の混合酸化物およびバリウムの硫酸塩（ＢａＳＯ４）である。
【００７３】
色素は、本発明によれば、有利に表面処理されうるが、例えば、親水性、両媒性、または疎水性の性質が形成され、もしくは保持されるべきでる。この表面処理は、それ自体周知の方法に従って薄い親水性および／または疎水性の無機層および／または有機層が色素に付与されることで行なわれうる。さまざまな表面コーティングは本発明において水も含有しうる。
【００７４】
本発明による無機表面コーティングは、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、水酸化アル
ミニウムＡｌ（ＯＨ）３、もしくは水酸化アルミニウム（別称：アルミナ、ＣＡＳ番号１３３３−８４−２）、ヘキサメタリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ３）６、メタリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ３）ｎ、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）（別称：シリカ、ＣＡＳ番号７６３１−８６−９）、または酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）からなりうる。これらの無機表面コーティングは、単独で、組合せて、および／または有機コーティング材料と組合せて存在しうる。
【００７５】
本発明による有機表面コーティングは、植物性または動物性のステアリン酸アルミニウム、植物性または動物性のステアリン酸、ラウリン酸、ジメチルポリシロキサン（別称：ジメチコン）、メチルポリシロキサン（メチコン）、ジメチコン（平均鎖長２００〜３５０のジメチルシロキサン単位およびシリカゲルとのジメチルポリシロキサンの混合物）またはアルギン酸からなりうる。これらの有機表面コーティングは、単独で、組合せて、および／または無機コーティング材料と組合せて存在しうる。イシレート、ホモサレート（＝３，３，５−トリメチルシクロヘキシル−２−ヒドロキシ安息香酸塩），
【００７６】
化粧用および皮膚科用調製物は、本発明によれば、化粧用助剤を含有しうるが、それらは通常、かかる調製物において使用されるものであり、例えば、保存剤、殺菌剤、香水、発泡を阻止するための物質、色素、着色効果を有する顔料、凝縮剤、湿潤および／または保湿物質、脂肪、油、ワックス、または化粧用もしくは皮膚科用製剤の通常の他の成分であるアルコール、ポリオール、ポリマー、発泡安定剤、電解質、有機溶剤、またはシリコーン誘導体などである。
【００７７】
Ｉ．ヒトチロシナーゼの阻害剤
表１に示されたＫｉ値は、ユーカリ発現系において予め組換えられたヒトチロシナーゼが得られる新種のチロシナーゼアッセイに基づく（付録１を参照）。その原理が発表されているこのアッセイにおいて、チロシナーゼのＬ−ＤＯＰＡ−オキシダーゼ活性が使用され、Ｌ−ＤＯＰＡがドーパキノンに変換される。形成されたドーパキノンは、ＭＢＴＨ（ベストロン（Ｂｅｓｔｈｏｒｎ）のヒドラゾン）で変換される。ピンク色の反応生成物は光度計で測定されうる。作用物質の開発用のこのアッセイの利点は、とりわけ、これにより作用物質の候補の阻害特性が初めてヒトチロシナーゼで検査されうる点にあるが、これによって、それがこれまで唯一利用可能のマッシュルームチロシナーゼと構造的に明らかに異なることが証明される。
【００７８】
表１に示されたＫｉ値は、例えば、本発明による物質ではＲ２＝２／１で示されている。
【００７９】
【表４】
2009529513.tif 000023
表１は、特に効果があると証明された（＋＋＋）一部の化合物を示す。表１に挙げられた構造において、さらに、構造の効果に決定的な影響を有する立体化学も考慮されている。
【００８０】
ＩＩ．チロシナーゼアッセイ
Ａ）ヒトチロシナーゼのクローニングおよび発現
チロシナーゼの発現のために、７０％の融合付着性Ｓｆ９細胞を１０−１５のＭＯＩ（感染の多重度、細胞当りの感染粒子の数）で使用した。高いドーパオキシダーゼ活性が感染後３日で確認可能であった。この時点で細胞の回収も行なわれた。細胞分離し、ＰＢＳ（４℃）で２回洗浄し、かつペレットをその後の使用まで−８０℃で保存した。細胞抽出物の調製のために、ペレットを氷上に浮かせ、溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００またはチャップス（Ｃｈａｐｓ））中に再懸濁し、かつ超音波によって溶解した。溶解物を残屑の除去のために１５分、１５，０００×ｇで遠心分離し、ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＫＰｉ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３−７．４、０．５％、トリトンＸ−１００）に対して透析し、またはセファデックス（Ｓｅｐａｄｅｘ）２５を介して緩衝した。透析溶解物は２週間まで４℃で保存され、活性測定のために使用されうる。酵素の観察された安定性に基づき、プロテアーゼ阻害剤の添加は行われなかった。組換え酵素はグリコシル化され、文献に記載された動態特性およびコウジ酸やミモシンなど代表的なチロシナーゼ阻害剤による抑制性を示した。
【００８１】
ヒトチロシナーゼの発現は、１０−１５のＭＯＩ（感染の多重度、細胞当りの感染粒子の数）で組換えウィルスで昆虫細胞（Ｓｆ９）の感染によって行なわれた。
【００８２】
発現のために、付着性に成長するＳｆ９細胞およびＳｆ９懸濁培養も使用されうる。この感染は、７０％の融合で付着性に成長する細胞および２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁培養で成長する細胞で行なわれた。
【００８３】
高いドーパオキシダーゼ活性が感染後３日に確認可能であり、この時点で細胞の回収も行なわれた。細胞分離し、もしくは遠心分離によって回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、かつペレットをその後に使用するまで−８０℃で保存した。
【００８４】
細胞抽出物の調製のために細胞を２５ｍＭ  トリスｐＨ８．０に取り、かつ２７１／２ゲージのカニューレを通じて３回押圧することによって溶解した。細胞断片を１５分の遠心分離によって１８，０００ｒｐｍ（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、Ｊａ−２０ローター）で分離し、かつ溶解性タンパク質を含有する上清を廃棄した。
【００８５】
膜残留タンパク質の抽出のために２％チャップス（Ｃｈａｐｓ）ＰＢＳ中にペレットを取り、ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）均質化装置（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｏｒ）によって懸濁し、攪拌しながら１時間インキュベートした。次いで、細胞残屑は新たに１５分の遠心分離によってＪａ−２０ローターの１８，０００ｒｐｍで分離した。上清は緩衝（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ｇ−２５）後に０．１％チャップス（ＣＨＡＰＳ）ＰＢＳで直接、活性測定のために使用されるか、またはイオン交換クロマトグラフィーによって前洗浄にかけることができた。さらに、抽出物を２５ｍＭ  トリスｐＨ８．０、０．１％チャップス（ＣＨＡＰＳ）で緩衝し、同じ緩衝液で平衡化したＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に結合し、２５ｍＭ  トリスｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％チャップス（ＣＨＡＰＳ）で溶出した。溶出物は０．１％チャップス（ＣＨＡＰＳ）ＰＢＳでの緩衝（Ｇ−２５）後に活性測定のために使用することができた。陰イオン交換クロマトグラフィーのステップは、タンパク質抽出物におけるチロシナーゼの濃縮に役立つ。
【００８６】
Ｂ）チロシナーゼアッセイ
使用されたドーパオキシダーゼアッセイは、実質的にビンダー（Ｗｉｎｄｅｒ）とハリス（Ｈａｒｒｉｓ）によって記載されたプロトコル［ビンダー（Ｗｉｎｄｅｒ）ＡＪ、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）Ｈ（１９９１年）「チロシンヒドロキシラーゼおよびチロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性の新しいアッセイ（Ｎｅｗ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｄｏｐａ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８（２）、３１７−２６頁］に基づく。反応は、５０ｍＭカリウム−リン酸緩衝液ｐＨ７．０、［ビンダー（Ｗｉｎｄｅｒ）とハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ではｐＨ６．９］１２％  ＤＭＳＯ［２％ＤＭＦ］、６ｍＭ  ＭＢＴＨ（ベストロン（Ｂｅｓｔｈｏｒｎ）のヒドラゾン）および基質Ｌ−ドーパ（０−７．５ｍＭ）のさまざまな濃度で３７℃下、９６穴プレートにおいて行なわれた。各々の反応添加物の容量は２５０μｌであり、感染した昆虫細胞からのチロシナーゼ抽出物１０−３０μｌの各々の調製物の活性に応じて使用された。チロシナーゼはオキシダーゼをＬ−ドーパからＬ−ドーパキノンへ触媒するが、これは使用されたＭＢＴＨとのさらなる反応において、安定したピンクの色素に対して反応し、これは光度計により５０５ｎｍの波長（マイクロプレート光度計：４９０ｎｍフィルター）で測定されうる。反応添加物における１２％ＤＭＳＯの標準的な使用により、高い塩濃度でも使用されたＭＢＴＨの溶解性は保証され、かつアッセイで試験された多くの阻害剤の溶解性が明らかに改善される。唯一の基質としてＬ−ドーパの存在下のマッシュルームチロシナーゼの時間依存不活性化、およびＤＭＳＯによるドーパオキシダーゼ活性の不活性化［チェン（Ｃｈｅｎ）ＱＸ、リウ（Ｌｉｕ）ＸＤ、ファン（Ｈｕａｎｇ）  Ｍ（２００３年）「ジメチルスルホキシド溶液におけるマッシュルームチロシナーゼの不活性化速度（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」］は文献に記載されている。実施されたアッセイにおいて、高いＤＭＳＯ濃度（２０％以下）でもチロシナーゼの活性の低下は確認できなかった。組換えヒトチロシナーゼの時間依存不活性化はアッセイでは確認できなかったが、反応経過は１５分よりも長く線形であるのに対して、マッシュルームチロシナーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））は時間依存的に明らかな活性の喪失を示し、反応経過は５分未満の測定時間でのみ線形に経過した。
【実施例】
【００８７】
【表５】
2009529513.tif 000024
【００８８】
【表６】
2009529513.tif 000025
【００８９】
【表７】
2009529513.tif 000026
【００９０】
【表８】
2009529513.tif 000027
【００９１】
【表９】
2009529513.tif 000028
【００９２】
【表１０】
2009529513.tif 000029
【００９３】
【表１１】
2009529513.tif 000030
【００９４】
【表１２】
2009529513.tif 000031
【００９５】
【表１３】
2009529513.tif 000032
【００９６】
【表１４】
2009529513.tif 000033
【００９７】
【表１５】
2009529513.tif 000034
【００９８】
【表１６】
2009529513.tif 000035
【００９９】
【表１７】
2009529513.tif 000036
【０１００】
【表１８】
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【０１０１】
【表１９】
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【０１０２】
【表２０】
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【国際調査報告】
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