(57)【要約】本発明は、apoE4ドメイン相互作用を阻害する化合物、および該化合物を含む薬学的組成物を含む組成物を提供する。本発明はapoE4関連障害を治療する方法を提供する。この方法は通常、apoE4ドメイン相互作用阻害剤の治療的有効量をその必要がある個体に投与する段階を含む。2009510167.tif 000034
2009510167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式IのapoE4ドメイン相互作用阻害剤化合物:
2009510167.tif 000029
式中、
R1およびR2がそれぞれ独立して-H、-(CH2)n-SO3、および-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり; 但しR1およびR2の一方だけが-Hであり;
R3が-(CH2)m-SO3、-(CH2)m-O-SO3、-NH-(CH2)n-SO3、-NH-(CH2)n-O-SO3、(CH2)p-C6H4-SO3、-(CH2)p-C6H4-O-SO3、-NH-(CH2)p-C6H4-SO3、または-NH-(CH2)p-C6H4-O-SO3であり、ここでm=0、1、2、3、または4であり; ここでn=1、2、または3であり; およびここでp=0または1であり; ならびに
R4が低級アルキル(C1〜C4)または-(CH2)n-C6H5であり、ここでn=0または1である。
【請求項２】
下記式IIのapoE4ドメイン相互作用阻害剤化合物:
2009510167.tif 000030
式中、
R1およびR3がそれぞれ独立して-H、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり; 但しR1およびR2の少なくとも一方が-H以外であり;
R2およびR4がそれぞれ独立して-H、-OH、または-NH2であり;
R5が-OR、-NHR、またはNR2であり、ここでR=-CH3、または-CH2CH3であり; ならびに
Lが-N=N-; -CH=CH-、-N=CH-、-CH=N-、-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-CH2-NH-、-O-CH2-、または-CH2-O-である。
【請求項３】
下記式IIIのapoE4ドメイン相互作用阻害剤化合物:
2009510167.tif 000031
式中、
R1が-(CH2)m-(CR=CH)n-CR=であり、ここでmおよびnがそれぞれ独立して0または1であり、Rが-C6H5、-(CH2)-C6H5、-(NH)-C6H5、または-(O)-C6H5であり;
R2が-C6H5、-(CH2)-C6H5、-(NH)-C6H5、または-(O)-C6H5であり; ならびに
XおよびYがそれぞれ独立してOまたはNである。
【請求項４】
下記式IVのapoE4ドメイン相互作用阻害剤化合物:
2009510167.tif 000032
式中、
R1およびR2がそれぞれ独立して-Hまたは低級アルキル(例えば、C1〜C4)であり; 但しR1およびR2の少なくとも一方がアルキル化されており;
R3が-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=1〜4であり; ならびに
Lが-(CH2)m、=CH-(CH2)n-CH=、-CH=CH-(CH2)-、または-(CH2)-CH=CH-であり、ここでm=0、または1〜3の整数であり; およびここでn=0または1である。
【請求項５】
下記式VのapoE4ドメイン相互作用阻害剤化合物:
2009510167.tif 000033
式中、
R1およびR1'がそれぞれ独立して-Hまたは-O-SO3であり、但しR1およびR1'の少なくとも一方が-O-SO3であり;
R2およびR2'がそれぞれ独立して-H、-CH3、または-CH2CH3であり、但しR2およびR2'の少なくとも一方がアルキル化されており; ならびに
R3およびR3'がそれぞれ独立して-H、-Cl、または-Brであり、但しR3およびR3'の少なくとも一方がハロゲン化されている。
【請求項６】
式I〜Vのいずれか1つの化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
制御放出用に製剤化される、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
吸入による送達に適した流動性を有する製剤を含む、請求項6記載の組成物。
【請求項９】
化合物が液体担体および噴霧剤を用いて製剤化される、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
化合物が水溶液またはエタノール溶液に製剤化される、請求項8記載の組成物。
【請求項１１】
エアロゾルを生成するようエアロゾル化される、請求項8記載の組成物。
【請求項１２】
吸入による送達に適した流動性を有する製剤を内部に有する容器を含む、apoE4関連障害の治療に用いるパッケージであって、該製剤が薬学的に活性なapoE4ドメイン相互作用阻害剤を含む、パッケージ。
【請求項１３】
パッケージが定量吸入器であり、apoE4ドメイン相互作用阻害剤が噴霧剤を用いて製剤化される、請求項12記載のパッケージ。
【請求項１４】
製剤がエアロゾル化される際に、約0.5〜12マイクロメートルの直径を有する粒子が生成される、請求項13記載のパッケージ。
【請求項１５】
パッケージが乾燥粉末吸入器であり、apoE4ドメイン相互作用阻害剤が乾燥粉末製剤に製剤化される、請求項12記載のパッケージ。
【請求項１６】
パッケージが噴霧器であり、apoE4ドメイン相互作用阻害剤が水溶液またはエタノール溶液に製剤化される、請求項12記載のパッケージ。
【請求項１７】
apoE4関連障害を有する個体に式I〜Vのいずれか1つの化合物の有効量を投与する段階を含む、apoE4関連障害を治療する方法。
【請求項１８】
化合物が経口投与される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
化合物が鼻腔内に投与される、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
化合物が非経口投与される、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する化合物、およびapoE4に関連した障害を治療する方法に関する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は国立衛生研究所の計画プロジェクト助成番号HL41633からの資金を一部受けている。米国政府は本発明に対し一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
分子量34,000のタンパク質であるapoEは第19染色体上の単一遺伝子の産物であり、apoE2、apoE3およびapoE4と呼ばれる3種の主なアイソフォームで存在している。総説については、MahleyのMolecular and Genetic Bases of Neurological Disease 第2版; およびMahley (1988) Science 240:622-630を参照されたい。これらの異なるアイソフォームは、アミノ酸残基112位および158位でのアミノ酸置換から生じる。頻出のアイソフォームであるapoE3は、112位にシステイン残基および158位にアルギニン残基を有する。apoE4アイソフォームはapoE3と112位のみが異なり、この位置はアルギニン残基である。III型高リポタンパク血症と関連しているapoE2アイソフォーム(Mahley (1988))は、apoE3と158位のみが異なり、この位置はシステイン残基である。apoE3およびapoE4は通常、低密度リポタンパク質(LDL)受容体に結合するが、apoE2は結合しない。
【０００４】
apoEは2つの構造ドメイン: アミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインを含む。Weisgraber (1994) Adv. Protein Chem. 45:249-302。各ドメインは特異的機能に関連している。アミノ末端ドメインはリポタンパク質受容体結合領域を含み、カルボキシ末端ドメインは主要な脂質結合要素を含む。これら2つのドメインは、一方のドメインでのアミノ酸置換が他方のドメインの機能に影響を及ぼすように、アイソフォーム特異的な様式で互いと相互作用するように思われ、この現象はドメイン相互作用と称される。ドメイン相互作用は超低密度リポタンパク質(VLDL)に対するapoE4の選択性に寄与しており、高密度リポタンパク質(HDL)に対するapoE3の選択性とは対照的である。この相互作用に関与するapoE4内の特異的なアミノ酸残基は、アミノ末端ドメイン中のアルギニン-61およびカルボキシ末端ドメイン中のグルタミン酸-255と同定されている。Dong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365; およびDong and Weisgraber (1996) J. Biol. Chem. 271:19053-19057。
【０００５】
apoEは、さまざまな器官の細胞に脂質を再分配することにより、脂質代謝において非常に重要な役割を果たす。apoEはこの全体的な輸送機序をカイロミクロンおよびVLDLの代謝において発揮するが、組織内部の細胞間での脂質の局所輸送における働きもある。コレステロールおよび他の脂質を過剰に有する細胞はこれらの物質を、増殖または修復のため脂質を必要とする細胞に脂質を輸送できる、apoE-脂質複合体にまたはapoE含有性のHDLに放出することができる。これらのリポタンパク質粒子上のapoEは、それらの相互作用および取り込みを、LDL受容体またはLRPを介して媒介する。
【０００６】
apoEは神経生物学的な役割を果たす。apoEのmRNAは脳内に豊富に存在しており、そこで主に星状細胞によって合成および分泌される。Elshourbagy et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:203-207; Boyles et al. (1985) J. Clin. Invest. 76:1501-1513; およびPitas et al. (1987) Biochem. Biophys. Acta 917:148-161。apoE mRNAの発現レベルにおいて、脳は肝臓に次いで第二位である。apoE含有性のリポタンパク質は脳脊髄液中に認められ、中枢神経系(CNS)における脂質輸送で主要な役割を果たすように思われる。Pitas et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:14352-14360。実際に、脳脊髄液中の主要なリポタンパク質はapoE含有性HDLである。apoEに加え脂質の供給源は、培養物の後根神経節において神経突起の顕著な伸張を促す。Handelmann et al. (1992) J. Lipid Res. 33 : 1677-1688。末梢神経損傷の後、apoEのレベルは劇的に上昇する(約250倍)。Muller et al. (1985) Science 228:499-501; およびIgnatius et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1125-1129。apoEは軸索変性後に生じた脂質の除去にも、軸索再生のため出芽性神経突起へのおよびその後の新たな軸索の再ミエリン化のためシュワン細胞へのこれらの脂質の再分配にも関与するように思われる。Boyles et al. (1989) J. Clin. Invest. 83:1015-1031; およびIgnatius et al. (1987) Science 236:959-962。
【０００７】
ごく最近になって、apoEはアルツハイマー病および認知能力に関連付けられている。Saunders et al. (1993) Neurol. 43:1467-1472; Corder et al. (1993) Science 261:921-923 ; およびReed et al. (1994) Arch. Neurol. 51 : 1189-1192。apoE4は、アミロイドβ(Aβ)ペプチドの沈着を呈する細胞外の神経炎性斑、および微小管関連タンパク質である高リン酸化タウの線維を特徴とする細胞内の神経原線維変化というアルツハイマー病にみられる2種の特徴的な神経病理的病変と関連している。総説については、McKhann et al. (1984) Neurol. 34:939-944; Selkoe (1991) Neuron 6:487-498; Crowther (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:202-206; Roses (1994) Curr, Neurol. 14:111-141; Weisgraber et al. (1994) Curr. Opin. Lipidol. 5:110-116; およびWeisgraber et al. (1994) Curr. Opin. Struct. Biol. 4:507-515を参照されたい。
【０００８】
アルツハイマー病は、一般に以下の3つのカテゴリーに分類される: 早発型家族性疾患(60歳までに発症し、第21および第14染色体上の遺伝子に関係している)、遅発型家族性疾患、および散発性遅発型疾患。遅発型疾患の両タイプとも、最近になって、apoE遺伝子座で第19染色体に関連付けられている。その他の結果からも、apoE4が遅発型家系での疾患の重症度に直接的に関係していることが示唆されている。Roses (1994)。最近になって、コレステロール降下薬のスタチン類はapoE4のレベルを低下させることにより、アルツハイマー病の治療での用途が示唆されている。国際公開公報第95/06470号。
【０００９】
神経原線維変化は、高リン酸化されたタウからなる対らせん状の線維であり、神経細胞の細胞質中に蓄積する。タウは、微小管の構築および安定化に通常関与する微小管関連リンタンパク質であるが、高リン酸化を受けることによって微小管との相互作用能が損なわれる。apoEによるタウの結合性の増強がアルツハイマー病の治療として示唆されている。国際公開公報第95/06456号。
【００１０】
インビトロにおいて、タウはapoE3と相互作用するが、apoE4とは相互作用しない。Strittmatter et al. (1994) Exp. Neurol. 125:163-171。タウとのapoE3の相互作用はタウの高リン酸化を阻止し、その結果、微小管の構造および機能の安定化においてタウが正常に機能することができる。apoE4の存在下では、タウは高リン酸化され、その結果、不活性化されるようになり、これによって神経原線維変化の形成が促進されうる。
【００１１】
最近になって、apoE4は学習能力の低下および記憶障害と関連付けられている。Helkala et al. (1995) Neurosci. Letts. 191:141-144。apoE4は、記憶障害を有すると指摘された患者の転帰に関する強力な予測因子であることが判明している。apoE4は診断因子ではなく、危険因子として報告されていることに留意されたい。Peterson et al. (1995) JAMA 273:1274-1278; およびFeskens et al. (1994) BMJ 309:1202-1206。
【００１２】
apoEはLDL受容体およびLRPの両方と相互作用し、間違いなく神経細胞上の他のapoE結合受容体と相互作用する。LRPは、脳損傷または新生物へのグリア細胞の変化の後に増大することが分かっている。Lopes et al. (1994) FEBS Lett. 338:301-305。LRPはこれまでマクログロブリン受容体として同定されている。Strickland et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:13364-13369; およびBorth (1992) FASEB J. 6:3345-3353。apoEはLRPに直接的に結合しないが、細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)と初めに結び付く必要がある。Mahley et al. (1991) Curr. Opin. Lipidol. 2:170-176; およびJi et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:2764-2772。LRPは同様に、t-PA、I2-マクログロブリン-プロテアーゼ複合体、トロンボスポンジン-1、緑膿菌外毒素A、受容体関連タンパク質(RAP)およびラクトフェリンを含め、いくつかの他のリガンドを結合する。LRPリガンド結合部位は、少なくとも部分的に報告されている。Orth et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:21117-21122; Godyna et al. (1995) J. Cell. Biol. 129:1403-1410; Kounnas et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:12420-12423; Willnow et al. (1994) J. Cell Sci. 107:719-726; Meilinger et al. (1995) FEBS Lett. 360:70-74; Warshawsky et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22046-22054; およびWillnow et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:15827-15832。
【００１３】
β-VLDLとの培養液中での後根神経節神経細胞のインキュベーションにより、培地のみで増殖された細胞の神経突起成長に比べて、これらの細胞の神経突起成長が変化することがこれまでに明らかにされている。Handelmann et al. (1992)。脂質供給源(β-VLDLまたは遊離コレステロール)の存在下では、神経突起成長は、特に広範な枝分かれによって大いに増強される(神経突起伸張の増大はほとんどまたは全くない)。β-VLDLが外来性ウサギapoE (112位のシステイン残基の出現に関してヒトapoE3と同等)で富化された場合、神経突起伸張の増強が見られた。脂質供給源は膜の生合成を増強するように思われるが、脂質供給源による過剰なウサギapoEの添加では、長い神経突起伸張および枝分かれの縮小が起こる。神経突起成長に及ぼすapoE4の阻害作用は微小管重合に関連しているのに対し、apoE3は微小管形成を補助することも認められている。Nathan et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:19791-19799。
【００１４】
神経可塑性、新たなシナプス結合の形成または存在の維持は、記憶を含めて、正常な脳機能にとって重要である。この過程は年齢、アルツハイマー病での斑沈着および神経原線維変化ならびに酸素欠乏を含むが、これらに限定されない、さまざまな形のストレスによって損なわれうる。神経細胞の再形成の妨害は、脳機能の損傷または神経変性を引き起こすことがあり、このうち認知症およびアルツハイマー病が極端な例である。アルツハイマー病の場合だけで、米国ではおよそ400万人が罹患している。人口の高齢化とともに、この数は今後20年間に3倍になると予測されている。アルツハイマー病の現在の医療費は、米国だけでも1年あたり900億ドルと見積もられている。この疾患の平均発症が例え10年遅れるだけでも、社会の経済的負担ならびにこれらの患者家族の経済的および心理的負担は、劇的に低下するものと思われる。
【００１５】
ひとたび不可逆的な変性カスケードが始まれば、中枢および末梢神経系の機能の障害を停止(および、より重要には好転)させる有効な治療法は現在のところ存在していない。同様に、誘発ストレスが認知症に比べて壊滅的ではない影響または部分的に可逆的な影響を与える場合でも、正常な中枢および末梢神経系の機能を回復させる治療法は現在のところ存在していない。
【００１６】
当技術分野においてapoE4と関連する障害を治療するのに有効な治療法が必要である。本発明はこの必要性に取り組む。
【発明の開示】
【００１７】
発明の概要
本発明は、apoE4ドメイン相互作用を阻害する化合物; および該化合物を含んだ、薬学的組成物を含めて、組成物を提供する。本発明はapoE4関連障害を治療する方法を提供する。この方法は全体として、apoE4ドメイン相互作用阻害剤の治療的に有用な量をその必要がある個体に投与する段階を含む。
【００１８】
神経障害を治療するための組成物および治療法が開示されており、この組成物は、神経細胞リモデリングに影響を及ぼす試験化合物の能力を判定するアッセイによって同定される。具体的には、このアッセイは神経細胞リモデリング、および神経突起生長に対する作用をもたらす形で、apoE3および/またはapoE4のようなアポリポタンパク質の異なるアイソフォームの発現に影響を及ぼすよう操作されている細胞培養物を伴う。アポリポタンパク質E3を多く含むリポタンパク質は、生長および微小管安定性を刺激するのに対し、apoE4を多く含むリポタンパク質は、生長を阻害しかつ微小管を破壊する。神経細胞リモデリングおよび神経突起生長の阻害は、ある種の中枢神経系疾患に密接に関連しているので、そのアッセイは、このような疾患の治療における潜在的有効性がないか化合物をスクリーニングするのに有用である。神経生長および微小管安定性を刺激する化合物は、このような化合物で中枢神経系の疾患を治療する方法と同様に開示されている。apoE3およびapoE4の示差的蓄積は、細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)によって主に媒介される。(1) プロテオグリカンを発現していない細胞およびHSPGを特異的に発現していない細胞においてならびに(2) ヘパリナーゼで処理されたHSPG発現細胞において、apoE3およびapoE4の両方の保持が低減され、apoE3およびapoE4の示差的蓄積が解消される。
【００１９】
本明細書に示される結果から、アポリポタンパク質ならびにこれらのタンパク質の異なるアイソフォームの示差的な取り込みおよび/または発現が、神経細胞の成長に影響を及ぼし、従って神経疾患に重要な役割を果たすことが明示される。さらに、本明細書に示される結果から、広くはプロテオグリカンおよび具体的にはヘパリン硫酸プロテオグリカンが、apoE3およびapoE4の示差的蓄積をもたらすことが実証される。従って、それらの結果から、神経細胞成長の妨害または増強のいずれかを模倣するよう特異的に操作されている細胞系を含み、それによって化合物を、治療物質としてのその潜在性または神経細胞成長に及ぼすその潜在的有害作用についてアッセイすることを可能にするアッセイの創作が可能になる。
【００２０】
本発明のアッセイ系およびトランスフェクト細胞系は、神経障害を治療するための潜在的な治療化合物をスクリーニングするために使用できるだけでなく、どの化合物が神経細胞に悪影響をもたらすと予想され、従って回避されるべきであるかを判定するために使用することもできる。
【００２１】
本発明はさらに、apoE4に結合するおよびapoE3に影響を及ぼすことなくドメイン相互作用を低減する化合物を提供する。このような化合物(「apoE4ドメイン相互作用阻害剤」)は、apoE4をいっそう「apoE3様」とし、それ故に、神経障害、神経変性障害、および高脂血症により引き起こされる障害、例えば、心臓血管障害を含めて、apoE4と関連する障害を治療するのに有用である。本発明は、apoE4ドメイン相互作用阻害剤を含んだ、薬学的組成物を含めて、組成物を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、apoE4に関連した障害を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、この方法は、apoE4ドメイン相互作用を低減する化合物を投与する段階を含む。apoE4に関連した障害は、神経障害および心臓血管障害を含む。
【００２３】
本発明の目的は、神経疾患の治療などにおいて使用する化合物、組成物および方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、化合物を、神経突起生長をもたらすその能力がないか試験するためのアッセイを提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、apoE3およびapoE4の示差的な細胞蓄積に影響を及ぼす化合物および組成物に加えて、化合物のアッセイを提供することである。
【００２６】
別の目的は、細胞表面HSPGに影響を及ぼす化合物および組成物に加えて、化合物のアッセイを提供することである。
【００２７】
別の目的は、細胞におけるapoEの内部移行および蓄積に影響を及ぼす化合物および組成物に加えて、化合物のアッセイを提供することである。
【００２８】
具体的な目的は、細胞がapoEタンパク質のその発現に関して遺伝子操作されている細胞培養物を提供すること、および該細胞培養物をスクリーニングアッセイにおいて使用することである。
【００２９】
本発明の利点は、神経突起生長に及ぼす化合物の作用の明確な指標を細胞培養物が与えるということである。
【００３０】
本発明の別の利点は、どの化合物が神経突起生長のその阻害により潜在的に有害であるか、およびどの化合物が神経突起生長のその増強により潜在的に治療的であるかを判定するのに使用できるということである。
【００３１】
本発明の特徴は、apoEタンパク質の異なるアイソフォームを発現する遺伝子が個別に影響されうるということである。
【００３２】
本発明は同様に、apoE4ドメイン相互作用を妨害するうえで有効な化合物を同定する方法を含む。これらの方法は、ごく微量の125I-標識apoEを血漿に添加する段階、さまざまな血漿リポタンパク質画分をゲルろ過により分離する段階、およびリポタンパク質クラス間の125I-標識の分布を判定する段階を含む、血漿分布アッセイにより例証される。例えば、Dong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365を参照されたい。
【００３３】
本発明のこれらのおよびその他の目的、利点、および特徴は、添付の図面とともに本開示を読むことで、当業者には明らかになろう。
【００３４】
定義
以下の略語が本出願において使用される: apoE3、アポリポタンパク質3; apoE4、アポリポタンパク質4; CHO、チャイニーズハムスター卵巣; DiI、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン; DMEM、ダルベッコ改変イーグル培地; FBS、ウシ胎仔血清; FGF、線維芽細胞増殖因子; GPI、グリセロホスファチジルイノシトール; HSPG、ヘパリン硫酸プロテオグリカン; LDL、低密度リポタンパク質; LRP、LDL受容体関連タンパク質; PBS、リン酸緩衝生理食塩水; SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動; TCA、トリクロロ酢酸; およびVLDL、超低密度リポタンパク質。
【００３５】
本明細書において用いられる「apoE4関連障害」は、細胞中、血清中、間質液中、脳脊髄液中、または個体のその他任意の体液中のapoE4の存在によって引き起こされる任意の障害; apoE4ドメイン相互作用によって影響を受ける任意の生理学的過程または代謝事象; apoE4の存在によって特徴付けられる任意の障害; 細胞中または体液中のapoE4の存在によって引き起こされる障害の症状; apoE4の細胞中または体液中の存在によって引き起こされる障害に関連した現象; およびapoE4の存在によって引き起こされる任意の障害の後遺症である。apoE4関連障害は、apoE4関連神経障害および高血清脂質レベルに関連した障害を含む。apoE4関連神経障害は弧発性アルツハイマー病; 家族性アルツハイマー病; 卒中後の転帰不良；外傷性頭部損傷後の転帰不良；および脳虚血を含むが、これらに限定されることはない。apoE4関連神経障害に関連した現象は神経原線維変化; アミロイド沈着; 記憶喪失; および認知機能の低下を含むが、これらに限定されることはない。高血清脂質レベルに関連したapoE4関連障害は、アテローム性動脈硬化症、および冠動脈疾患を含むが、これらに限定されることはない。このようなapoE4関連障害に関連した現象は、高血清コレステロールレベルを含む。
【００３６】
本明細書において用いられる「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理的および/または生理的効果を得ることをいう。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、ならびに/または疾患および/もしくは疾患に寄与する悪影響の部分的なもしくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書において用いられる「治療」は哺乳類での、特にヒトでの疾患の任意の治療を網羅し、以下を含む: (a) 疾患の素因を有するが、疾患を有するとは未だ診断されていない被験体において疾患の発生を予防すること; (b) 疾患を阻害すること、すなわちその進行を阻止すること; および(c) 疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと。
【００３７】
本明細書において互換的に使用される「個体」、「被験体」および「患者」という用語は、マウス、サル、ヒト、哺乳類家畜動物、哺乳類運動動物、および哺乳類愛玩動物を含むが、これらに限定されない哺乳類をいう。
【００３８】
「単離された化合物」という用語は、それが天然においてともに存在するその他の化合物から実質的に分離されている、またはその他の化合物に対して濃縮されている化合物を意味する。単離された化合物は、典型的には、重量で少なくとも約80%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約98%純粋、少なくとも約99%純粋、または99%を超えて純粋である。活性化合物に関する本発明は、ジアステレオ異性体のほかにそのラセミ体および分割体、鏡像異性的に純粋な形態ならびに薬学的に許容されるその塩を包含すると意図される。
【００３９】
「治療的に有用な量」または「効果的な量」は、疾患を治療するため哺乳類またはその他の被験体に投与される場合、疾患に向けたそのような治療を達成するのに十分な化合物の量を意味する。「治療的に有用な量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに治療される被験体の年齢、体重などに応じて変化するであろう。
【００４０】
本明細書において用いられる「単位投与剤形」という用語は、ヒトおよび動物被験体に向けた単一の投与量として適した物理的に別個の単位であって、各々の単位が薬学的に許容される希釈剤、担体または媒体との関連で所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を含有するものをいう。本発明の活性作用物質の仕様は、利用される特定の化合物(例えば、式I〜Xのいずれか1つの化合物)および達成されるべき効果、ならびに宿主での各化合物に関わる薬力学に依存する。
【００４１】
「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」および「薬学的に許容される補助剤」は、一般的に安全、無毒性で生物学的にもその他の点でも望ましい薬学的組成物を調製するうえで有用な賦形剤、希釈剤、担体および補助剤を意味し、獣医学的用途ならびにヒトの薬学的用途に許容される賦形剤、希釈剤、担体および補助剤を含む。明細書および特許請求の範囲において使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体および補助剤」は、1つおよび2つ以上のこのような賦形剤、希釈剤、担体および補助剤を含む。
【００４２】
本明細書において用いられる「薬学的組成物」は、哺乳類、特にヒトなどの、被験体への投与に適した組成物を包含するよう意図される。概して、「薬学的組成物」は無菌であり、被験体内での望ましくない反応を誘発しうる混入物を一般に含まない(例えば、薬学的組成物中の化合物は薬学的等級である)。薬学的組成物は経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内などのような、いくつかの異なる投与経路を介しその必要がある被験体または患者への投与に向けてデザインすることができる。いくつかの態様では、組成物は経口投与経路による投与に適している。いくつかの態様では、組成物は吸入の投与経路による投与に適している。いくつかの態様では、組成物は、例えば浸透促進剤を用いた、経皮経路による投与に適している。他の態様では、薬学的組成物は経皮投与以外の経路による投与に適している。
【００４３】
本明細書において用いられる、本発明の化合物の「薬学的に許容される誘導体」は、その塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物またはプロドラッグを含む。当業者はこのような誘導体化のための公知の方法を用いて、このような誘導体を容易に調製することができる。生成された化合物は、実質的な毒作用なしに動物またはヒトに投与することができ、薬学的に活性であるか、またはプロドラッグであるかのいずれかである。
【００４４】
化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容されかつ親化合物の所望の薬理活性を保有する塩を意味する。このような塩は、(1) 塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸を用いて形成される; または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、グルコヘプトン酸、4,4'-メチレンビス-(3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸)、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などのような有機酸を用いて形成される、酸付加塩; あるいは(2) 親化合物中に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンに置き換えられるか、またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどのような有機塩基と配位結合しているかのいずれかの場合に形成される塩を含む。
【００４５】
本発明の化合物の「薬学的に許容されるエステル」は、薬学的に許容されかつ親化合物の所望の薬理活性を保有するエステルを意味し、カルボン酸、リン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸およびボロン酸を含むがこれらに限定されない、酸性基のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルエステルを含むが、これらに限定されることはない。
【００４６】
本発明の化合物の「薬学的に許容されるエノールエーテル」は、薬学的に許容されかつ親化合物の所望の薬理活性を保有するエノールエーテルを意味し、Rが水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクリルである式C=C(OR)の誘導体を含むが、これらに限定されることはない。
【００４７】
本発明の化合物の「薬学的に許容されるエノールエステル」は、薬学的に許容されかつ親化合物の所望の薬理活性を保有するエノールエステルを意味し、Rが水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクリルである式C=C(OC(O)R)の誘導体を含むが、これらに限定されることはない。
【００４８】
本発明の化合物の「薬学的に許容される溶媒和物または水和物」は、薬学的に許容されかつ親化合物の所望の薬理活性を保有する溶媒和錯体または水和錯体を意味し、1個もしくは複数個の溶媒もしくは水分子、または1個〜約100個、または1個〜約10個、または1個〜約2個、3個もしくは4個の溶媒もしくは水分子との本発明の化合物の錯体を含むが、これらに限定されることはない。
【００４９】
「プロドラッグ」は、哺乳類被験体に投与される場合、インビボにおいて式(I〜X)による活性な親薬物を放出する任意の化合物を意味する。式(I〜X)の化合物のプロドラッグは、式(I〜X)の化合物に存在する官能基を、インビボで切断されて親化合物を放出できるように修飾することにより調製される。プロドラッグは、化合物(I〜X)のいずれかのヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル基が、インビボで切断されて、それぞれ遊離ヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル基を再生できる任意の基に結合されている式(I〜X)の化合物を含む。プロドラッグの例としては式(I〜X)のいずれかの化合物中のヒドロキシ官能基のエステル(例えば、酢酸エステル、ギ酸エステルおよび安息香酸エステル誘導体)、カルバミン酸エステル(例えば、N,N-ジメチルアミノカルボニル)などを含むが、これらに限定されることはない。
【００５０】
本明細書において用いられる「有機基」および「有機ラジカル」という用語は、脂肪族基、環状基、芳香族基、それらの官能性誘導体および/またはそれらのさまざまな組合せに分類される炭化水素基を含めて、任意の炭素含有基を意味する。「脂肪族基」という用語は、飽和または不飽和直鎖または分枝炭化水素基を意味し、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を包含する。「アルキル基」という用語は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、イソプロピル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルなどを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8)を意味する。適当な置換基はカルボキシ、保護カルボキシ、アミノ、保護アミノ、ハロ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、一置換アミノ、保護一置換アミノ、二置換アミノ、C1〜C7アルコキシ、C1〜C7アシル、C1〜C7アシルオキシなどを含む。「置換アルキル」という用語は、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アミノ、保護アミノ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチル(trifloromethyl)、一置換アミノ、二置換アミノ、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、カルボキシ、保護カルボキシ、もしくはカルボキシ、アミノ、および/またはヒドロキシ塩により1〜3回置換されている上記に定義のアルキル基を意味する。ヘテロアリール環の置換基に関連して用いられる場合、「置換(シクロアルキル)アルキル」および「置換シクロアルキル」という用語は、「置換アルキル」基で列挙したのと同じ基で置換されている下記に定義のものである。「アルケニル基」という用語は、ビニル基などの、1つもしくは複数の炭素-炭素二重結合を有する不飽和の直鎖または分枝炭化水素基を意味する。「アルキニル基」という用語は、1つもしくは複数の炭素-炭素三重結合を有する不飽和の直鎖または分枝炭化水素基を意味する。「環状基」という用語は、脂環式基、芳香族基、または複素環基に分類される閉環炭化水素基を意味する。「脂環式基」という用語は、脂肪族基の特性に類似した特性を有する環状炭化水素基を意味する。「芳香族基」または「アリール基」という用語は、単環式または多環式芳香族炭化水素基を意味し、1つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよく、これは下記にさらに定義されている。「複素環基」という用語は、環中の原子の1つまたは複数が炭素以外の元素(例えば、窒素、酸素、硫黄など)である閉環炭化水素を意味し、下記にさらに定義されている。
【００５１】
「有機基」は官能化されてもよくあるいは別の方法で、保護されてもまたは保護されなくてもよい、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシルなどのような、有機基と関連するさらなる官能基を含んでもよい。例えば、「アルキル基」という語句は、メチル、エチル、プロピル、t-ブチルなどのような、純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなどのような、当技術分野において公知のさらなる置換基を持ったアルキル置換基も含むと意図される。このように、「アルキル基」はエーテル、エステル、ハロアルキル、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、スルホアルキルなどを含む。
【００５２】
「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード基をいう。1つまたは複数のハロゲンが存在してもよく、それらは同じであってもまたは異なっていてもよい。特に対象となるハロゲンは、クロロおよびブロモ基を含む。
【００５３】
「ハロアルキル」という用語は、1つまたは複数のハロゲン原子により置換されている上記に定義のアルキル基をいう。ハロゲン原子は同じであってもまたは異なっていてもよい。「ジハロアルキル」という用語は、2つのハロ基により置換されている上記のアルキル基をいい、ハロ基は同じであってもまたは異なっていてもよい。「トリハロアルキル」という用語は、3つのハロ基により置換されている上記のアルキル基をいい、ハロ基は同じであってもまたは異なっていてもよい。「ペルハロアルキル」という用語は、アルキル基中の各水素原子がハロゲン原子により置換されている上記に定義のハロアルキル基をいう。「ペルフルオロアルキル」という用語は、アルキル基中の各水素原子がフルオロ基により置換されている上記に定義のハロアルキル基をいう。
【００５４】
「シクロアルキル」という用語は、完全に飽和または部分的に不飽和の単環式、二環式または三環式飽和環を意味する。そのような基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、cis-またはtrans-デカリン、ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン、シクロヘキサ-1-エニル、シクロペンタ-1-エニル、1,4-シクロオクタジエニルなどが挙げられる。
【００５５】
「(シクロアルキル)アルキル」という用語は、上記のシクロアルキル環の1つに対して置換されている上記に定義のアルキル基を意味する。そのような基の例としては、(シクロヘキシル)メチル、3-(シクロプロピル)-n-プロピル、5-(シクロペンチル)ヘキシル、6-(アダマンチル)ヘキシルなどが挙げられる。
【００５６】
「置換フェニル」という用語は、ハロゲン、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、C1〜C7アルキル、C1〜C7アルコキシ、C1〜C7アシル、C1〜C7アシルオキシ、カルボキシ、オキシカルボキシ、保護カルボキシ、カルボキシメチル、保護カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、保護ヒドロキシメチル、アミノ、保護アミノ、(一置換)アミノ、保護(一置換)アミノ、(二置換)アミノ、カルボキサミド、保護カルボキサミド、N-(C1〜C6アルキル)カルボキサミド、保護N-(C1〜C6アルキル)カルボキサミド、N,N-ジ(C1〜C6アルキル)カルボキサミド、トリフルオロメチル、N-((C1〜C6アルキル)スルホニル)アミノ、N-(フェニルスルホニル)アミノからなる群より選択される、1つもしくは複数の部分、および場合によっては1つ、2つもしくは3つの部分で置換されているフェニル基、または例えば、ビフェニル基もしくはナフチル基が生じるような、置換もしくは非置換のフェニルを指定する。
【００５７】
「置換フェニル」という用語の例としては、2-、3-もしくは4-クロロフェニル、2,6-ジクロロフェニル、2,5-ジクロロフェニル、3,4-ジクロロフェニル、2-、3-もしくは4-ブロモフェニル、3,4-ジブロモフェニル、3-クロロ-4-フルオロフェニル、2-、3-もしくは4-フルオロフェニルなどのようなモノもしくはジ(ハロ)フェニル基; 2-、3-、もしくは4-ヒドロキシフェニル、2,4-ジヒドロキシフェニル、それらの保護ヒドロキシ誘導体などのようなモノもしくはジ(ヒドロキシ)フェニル基; 2-、3-もしくは4-ニトロフェニルのようなニトロフェニル基; シアノフェニル基、例えば、2-、3-もしくは4-シアノフェニル; 2-、3-もしくは4-メチルフェニル、2,4-ジメチルフェニル、2-、3-もしくは4-(イソプロピル)フェニル、2-、3-もしくは4-エチルフェニル、2-、3-もしくは4-(n-プロピル)フェニルなどのようなモノもしくはジ(アルキル)フェニル基; モノもしくはジ(アルコキシ)フェニル基、例えば、2,6-ジメトキシフェニル、2-、3-もしくは4-(イソプロポキシ)フェニル、2-、3-もしくは4-(t-ブトキシ)フェニル、3-エトキシ-4-メトキシフェニルなど; 2-、3-もしくは4-トリフルオロメチルフェニル; 2-、3-もしくは4-カルボキシフェニルまたは2,4-ジ(保護カルボキシ)フェニルのようなモノもしくはジカルボキシフェニルまたは(保護カルボキシ)フェニル基; 2-、3-もしくは4-(保護ヒドロキシメチル)フェニルまたは3,4-ジ(ヒドロキシメチル)フェニルのようなモノもしくはジ(ヒドロキシメチル)フェニルまたは(保護ヒドロキシメチル)フェニル; 2-、3-もしくは4-(アミノメチル)フェニルまたは2,4-(保護アミノメチル)フェニルのようなモノもしくはジ(アミノメチル)フェニルまたは(保護アミノメチル)フェニル; あるいは2-、3-もしくは4-(N-(メチルスルホニルアミノ))フェニルのようなモノもしくはジ(N-(メチルスルホニルアミノ))フェニルが挙げられる。同様に、「置換フェニル」という用語は、置換基が異なる二置換フェニル基を表し、例えば、3-メチル-4-ヒドロキシフェニル、3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル、2-メトキシ-4-ブロモフェニル、4-エチル-2-ヒドロキシフェニル、3-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル、2-ヒドロキシ-4-クロロフェニルなどである。
【００５８】
「(置換フェニル)アルキル」という用語は、上記のアルキル基の1つに付着されている上記の置換フェニル基の1つを意味する。そのような基の例としては、2-フェニル-1-クロロエチル、2-(4'-メトキシフェニル)エチル、4-(2',6'-ジヒドロキシフェニル)n-ヘキシル、2-(5'-シアノ-3'-メトキシフェニル)n-ペンチル、3-(2',6'-ジメチルフェニル)n-プロピル、4-クロロ-3-アミノベンジル、6-(4'-メトキシフェニル)-3-カルボキシ(n-ヘキシル)、5-(4'-アミノメチルフェニル)-3-(アミノメチル)n-ペンチル、5-フェニル-3-オキソ-n-ペンタ-1-イル、(4-ヒドロキシナフタ-2-イル)メチルなどのような基が挙げられる。
【００５９】
上記のように「芳香族」または「アリール」という用語は6員の炭素環をいう。同じく上記のように「ヘテロアリール」という用語は、酸素、硫黄および/もしくは窒素原子、特に窒素原子のような、1〜4個のヘテロ原子を単独でまたは硫黄もしくは酸素環原子とともに有する置換されてもよい5員環または6員環を示す。
【００６０】
さらに、上記の置換されてもよい5員環または6員環は、芳香族5員または6員環系に任意で縮合されてもよい。例えば、これらの環はピリジンまたはトリアゾール系のような芳香族5員または6員環系に、例えば、ベンゼン環に任意で縮合されてもよい。
【００６１】
以下の環系は、「ヘテロアリール」という用語により示される複素環(置換または非置換を問わず)ラジカルの例である: チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、チアトリアゾリル、オキサトリアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、トリアジニル、チアジアジニルテトラゾロ、1,5-[b]ピリダジニルおよびプリニル、ならびにベンゾ縮合誘導体、例えば、ベンゾキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイミダゾリルおよびインドリル。
【００６２】
上記の置換されてもよいヘテロアリール環に対する置換基は、1〜3個のハロ、トリハロメチル、アミノ、保護アミノ、アミノ塩、一置換アミノ、二置換アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、カルボン酸塩、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ヒドロキシ基の塩、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、(シクロアルキル)アルキル、置換(シクロアルキル)アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、および(置換フェニル)アルキルである。ヘテロアリール基に対する置換基は、これまでに定義の通りであり、またはトリハロメチルの場合、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチルもしくはトリヨードメチルとすることができる。ヘテロアリール環に対する上記の置換基との関連で用いられる場合、「低級アルコキシ」はC1〜C4アルコキシ基を意味し、同様に「低級アルキルチオ」はC1〜C4アルキルチオ基を意味する。
【００６３】
「(一置換)アミノ」という用語は、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、C1〜C4アシル、C2〜C7アルケニル、C2〜C7置換アルケニル、C2〜C7アルキニル、C7〜C16アルキルアリール、C7〜C16置換アルキルアリールおよびヘテロアリール基からなる群より選択される1つの置換基を有するアミノ基をいう。(一置換)アミノは「保護(一置換)アミノ」という用語により包含されるように、アミノ保護基をさらに有することができる。「(二置換)アミノ」という用語は、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、C1〜C7アシル、C2〜C7アルケニル、C2〜C7アルキニル、C7〜C16アルキルアリール、C7〜C16置換アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される2つの置換基を有するアミノ基をいう。この2つの置換基は同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００６４】
「ヘテロアリール(アルキル)」という用語は、上記に定義のヘテロアリール基により任意の位置で置換されている、上記に定義のアルキル基を示す。
【００６５】
「任意の(optional)」または「任意に(optionally)」は、その後に記述されている事象、状況、特徴または要素が行われてもよいが、行われる必要はないこと、ならびにこの記述にはその事象または状況が行われる場合およびそれが行われない場合が含まれることを意味する。例えば、「アルキル基で任意に一置換または二置換されてもよいヘテロシクロ基」は、アルキルが存在してもよいが、存在する必要はないこと、ならびにこの記述にはヘテロシクロ基がアルキル基で一置換または二置換される状態、およびヘテロシクロ基がアルキル基で置換されない状態が含まれることを意味する。
【００６６】
同じ分子式を有するものの、それらの原子の結合の性質もしくは順序またはそれらの原子の空間配列が異なる化合物は「異性体」と呼ばれる。それらの原子の空間配列が異なる異性体は「立体異性体」と呼ばれる。互いの鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオ異性体」と呼ばれ、重ね合わせることができない互いの鏡像であるものは「鏡像異性体」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する、例えば、不斉中心が4つの異なる基に結合される場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体はその不斉中心の絶対配置により特徴付けることができ、CahnおよびPrelogのR-およびS-順序付け規則により記述され、または分子が偏光面を回転させる様式により特徴付けることができ、右旋性もしくは左旋性と(すなわち、それぞれ(+)もしくは(-)-異性体)と指定される。キラル化合物は、個々の鏡像異性体またはそれらの混合物のいずれかとして存在することができる。均等な割合の鏡像異性体を含有する混合物は「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００６７】
本発明の化合物は1つまたは複数の不斉中心を保有することができ、それ故、そのような化合物は個々の(R)-もしくは(S)-立体異性体としてまたはそれらの混合物として生成されてもよい。特に指定のない限り、明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の記述または命名は、個々の鏡像異性体もそれらの混合物、ラセミ混合物またはそうでないものもともに含むものと意図される。立体化学の決定および立体異性体の分離のための方法は、当技術分野において周知である(例えば「Advanced Organic Chemistry」, 第4版 J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992の第4章の考察を参照のこと)。
【００６８】
本発明についてさらに記述する前に、本発明は記述の特定の態様に限定されず、従って、もちろん、異なりうることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様について記述することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００６９】
ある範囲の値が示される場合、その範囲の上限と下限との間にある各値、およびその他任意の指定された値またはその指定された範囲内にある値は、文脈上明らかに他の指示がない限り、下限の単位の10分の1までが本発明の範囲内に包含されるものと理解されよう。これらのより小さい範囲の上限および下限は別個にその範囲に含まれてもよく、同様に本発明の範囲内に包含され、指定された範囲に特定の除外される限界がある場合はその対象となる。指定された範囲が一方または両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界のいずれか一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００７０】
他に規定のない限り、本明細書において用いられる技術および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記述されているものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実践または試験に使用することもできるが、これから、好ましい方法および材料について記述する。本明細書において言及した全ての刊行物は、それらの刊行物が引用された方法および/または材料との関連で方法および/材料を開示し記述するため、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形の「1つの(a)」、「および(and)」ならびに「その(the)」は、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。すなわち、例えば「apoE4ドメイン相互作用を低減する化合物(a compound that reduces apoE4 domain interaction)」に対する言及は、複数のこのような化合物を含み、「その類似体(the analog)」に対する言及は、1つまたは複数の類似体および当業者に公知のその等価物に対する言及を含む、など。特許請求の範囲は任意の要素を除外するように作成できることにさらに留意されたい。従って、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に(solely)」、「単に(only)」などのような排他的な専門用語の使用の、または「消極的な」限定の使用の根拠となるよう意図される。
【００７２】
本明細書において論じられている刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供されている。本発明が先行発明に基づいてそのような刊行物に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきものは、本明細書には何もない。さらに、提供されている刊行物の日付は実際の刊行日と異なる可能性があり、それらは個別に確認される必要があるかもしれない。
【００７３】
発明の詳細な説明
apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質
本発明は、apoE4ドメイン相互作用に影響を及ぼす作用物質、およびこのような作用物質を含む組成物を提供する。apoE4ドメイン相互作用を低減することにより、apoE4はいっそう「apoE3様」となり、apoE4の望ましくない作用が低減する。apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、apoE4関連神経障害の治療に有用である。apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は同様に、高血清脂質レベルに関係しているapoE4関連障害、例えば、心臓血管障害の治療に有用である。
【００７４】
apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、arg-61とglu-255との間の塩橋の形成を阻害する作用物質を含む。関心対象の作用物質は、作用物質の非存在下でのapoE4ドメイン相互作用と比べて、apoE4ドメイン相互作用を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%またはそれ以上、最大で100%低減するものである。
【００７５】
関心対象の作用物質は、apoE3構造に実質的に影響を及ぼすことなくapoE4ドメイン相互作用に影響を及ぼすものであり、すなわち、apoE4ドメイン相互作用に対する作用はapoE4に特異的である。作用物質がapoE4ドメイン相互作用を特異的に低減するかどうかは、実施例7に記述されている乳濁液結合アッセイのようなアッセイを用いて判定することができる。または、化合物がapoE4ドメイン相互作用を低減するかどうかは、実施例10に記述されているようにFRETに基づくアッセイを用いて容易に判定される。
【００７６】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、apoE4分子をいっそう「apoE3様」とし、例えば、apoE4分子はapoE3活性を有する。従って、いくつかの態様では、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質とapoE4分子を接触させる段階を含む、apoE4活性をapoE3活性に転換する方法を提供する。「apoE4活性」および「apoE3活性」の特徴は、特定のリポタンパク質クラスに対するアポリポタンパク質の結合選択性; インビトロでのおよび/またはインビボでのタウタンパク質との結合; ならびにAβタンパク質との結合を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、apoE4が、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質と接触される場合、作用物質の非存在下でのapoE4の特徴と比べて、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上apoE4の特徴を低減するようにapoE4活性をapoE3活性に転換する。
【００７７】
apoE4はVLDLに結合選択性を有するのに対し、apoE3はHDLに結合選択性を有する。典型的には、血漿リポタンパク質を標識済のapoE4およびapoE3に結合させ、結合したタンパク質を分画し、各画分中のapoE4およびapoE3の量を測定する場合、VLDL、IDL/LDL、およびHDL画分中のapoE4の量は、それぞれ約35%、約23%、約42%であるのに対し、これらの各画分中のapoE3の量は、それぞれ約20%、約20%、約60%である。従って、いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質はHDLに対する結合選択性をapoE4に持たせる。apoE4が、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質と接触される場合、VLDLに比べてHDLに結合選択性を有するかどうかは、任意の公知のアッセイを用いて判定することができる。1つの非限定的な例として、Dong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365に記述のアッセイがある。例えば、検出可能に標識(例えば、125Iで標識)されたapoE4およびapoE3を含むサンプルを約2時間約37℃で血漿と混合し、その時間後に、サンプルを種々のリポタンパク質クラスに分画し(例えば、クロマトグラフィーにより)、各画分中の標識の量を測定する。
【００７８】
apoE3はインビトロにおいてタウと相互作用するが、apoE4は相互作用しない。いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、apoE4にインビトロおよび/またはインビボにおいてタウを結合させる。タンパク質がインビトロにおいて、例えば、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の存在下において、タウを結合するかどうかは、タンパク質間の相互作用を測定または検出するための標準的なアッセイを用いて判定することができる。アッセイの非限定的な例は、Strittmatter et al. (1994) Exp. Neurol. 125:163-171に提供されている。
【００７９】
多くの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は有機小分子であり、一般に約50ダルトン〜約2500ダルトン、約100ダルトン〜約2000ダルトン、約200ダルトン〜約1500ダルトン、約300ダルトン〜約1250ダルトン、または約500ダルトン〜約1000ダルトンのサイズ範囲にある。
【００８０】
「作用物質」、「物質」および「化合物」という用語は、本明細書において互換的に使用される。候補作用物質は多くの化学的クラス、典型的には合成、半合成、または天然の無機または有機分子を包含する。候補作用物質は、約50ダルトンを超えかつ約2,500ダルトンに満たない分子量を有する有機小化合物とすることができる。候補作用物質は、例えばファンデルワールス相互作用、水素結合などの、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基を含むことができ、アミン、スルホアルキル、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含むことができ、前述の官能化学基の少なくとも2つを含むことができる。候補作用物質は、1つもしくは複数の前記の官能基で置換されている環式炭素もしくはヘテロ環式構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。候補作用物質は同様に、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む生体分子間に見出される。
【００８１】
候補作用物質は合成または天然化合物のライブラリーを含めて、多種多様な供給源から得られる。例えば、多くの手段が、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為的および指向的合成に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能でありまたは容易に作出される。あるいは、天然のまたは合成により作出されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を通じて容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作出するのに使用することができる。
【００８２】
薬理作用のある作用物質をアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような、指向的もしくは無作為的および/または指向的化学修飾に供して、構造類似体を作出することができる。このような構造類似体は、生物学的利用能を増大するもの、および/または細胞傷害性を低減するものを含む。当業者は多種多様な構造類似体を容易に構想し、生成し、生物学的利用能の増大および/もしくは細胞傷害性の低減ならびに/または血液脳関門を通過する能力のような所望の特性についてそれらの類似体を試験することができる。
【００８３】
多くの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、神経突起成長のapoE4媒介性阻害を低減する。化合物が神経突起成長のapoE4媒介性阻害を低減するかどうかは、本明細書において記述されている神経突起成長アッセイを用いて判定することができる。一般に、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、apoE4の存在下および作用物質の非存在下での神経突起成長の阻害と比較した場合、神経突起成長のapoE4媒介性阻害を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%またはそれ以上低減する。
【００８４】
apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質を同定するために多くの方法が利用可能である。1つの非限定的な例として、コンピュータモデリングを用いて、apoE4のN末端ドメインに結合する化合物を同定することができる。コンピュータモデリングプログラムは、当技術分野において公知であり、実施例7に記述されているように、DOCKプログラムを含むが、これらに限定されることはない。
【００８５】
コンピュータモデリングに基づきapoE4のN末端ドメインに結合する化合物は、例えば、機能アッセイによりさらに評価することができる。機能アッセイは、乳濁液結合アッセイ(実施例7に記述されている)、LDL受容体との結合を測定するアッセイ、LRPとの結合を測定するアッセイ、HSPGとの結合を測定するアッセイ、および神経突起成長アッセイを含むが、これらに限定されることはない。
【００８６】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する本作用物質は、個体での神経原線維変化の形成を低減する。これらの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減しかつ神経原線維変化の形成を低減する本作用物質は、作用物質の非存在下での神経原線維変化の形成と比較した場合、神経原線維変化の形成を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低減する。神経原線維変化の形成が低減されるかどうかは、例えば、アルツハイマー病の実験動物モデルを用いて判定することができ、この動物はヒトapoE4を合成し、その結果、神経原線維変化をもたらす。例えば、米国特許第6,046,381号を参照されたい。
【００８７】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する本作用物質は、細胞(例えば、神経細胞)によるAβペプチドの産生を低減する。例えば、いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する本作用物質は、作用物質の非存在下での細胞によるAβの産生と比較した場合、Aβの産生を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低減する。
【００８８】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する本作用物質は、神経毒性のapoE4タンパク質分解断片の産生を低減する。例えば、いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本作用物質は、作用物質の非存在下において産生される神経毒性のapoE4タンパク質分解断片のレベルと比較した場合、神経毒性のapoE4タンパク質分解断片の産生を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低減する。
【００８９】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する本作用物質は、Aβ誘発性のリソソーム漏出(lysosomal leakage)を低減する。例えば、いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本作用物質は、作用物質の非存在下でのAβ誘発性のリソソーム漏出のレベルと比較した場合、Aβ誘発性のリソソーム漏出を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%低減する。
【００９０】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は、約100 μM未満の、約75 μM未満の、約50 μM未満の、約25 μM未満の、約10 μM未満の、約1 μM未満の、約100 nM未満の、約80 nM未満の、約60 nM未満の、約50 nM未満の、約25 nM未満の、約10 nM未満の、もしくは約1 nM未満の、またはそれ以下のIC50を有するものである。
【００９１】
apoE4ドメイン相互作用を所望の程度まで低減する作用物質は同様に、例えば、標準的なアッセイを用いて、細胞の利用能、細胞傷害性、生体適合性、血液脳関門を通過する能力などについて評価することができる。
【００９２】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は式Iの化合物:
2009510167.tif 000003
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、ここでR1、R2、R3およびR4の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【００９３】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式Iの化合物であり、ここで、
R1およびR2がそれぞれ独立して-H、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり; 但しR1およびR2の一方だけが-Hであり;
R3が-(CH2)m-SO3、-(CH2)m-O-SO3、-NH-(CH2)n-SO3、-NH-(CH2)n-O-SO3、(CH2)p-C6H4-SO3、-(CH2)p-C6H4-O-SO3、-NH-(CH2)p-C6H4-SO3、または-NH-(CH2)p-C6H4-O-SO3であり; ここでm=0または1〜10の整数であり; ここでn=1、2、または3であり; およびここでp=0または1であり; かつ
R4が低級アルキル(C1〜C4)または-(CH2)n-C6H5であり、ここでn=0または1である; ならびに
そのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【００９４】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は、式Iaに描かれている構造(GIND-25とも称される)を有する。
2009510167.tif 000004
【００９５】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は式IIの化合物:
2009510167.tif 000005
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、式中R1、R2、R3、R4、R5およびLの各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【００９６】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式IIの化合物であり、ここで、
R1およびR3がそれぞれ独立して-H、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり; 但しR1およびR2の少なくとも一方が-H以外であり;
R2およびR4がそれぞれ独立して-H、-O、-OH、または-NH2であり;
R5が-OR、-NHR、またはNR2であり、ここでR=-CH3、または-CH2CH3であり; かつ
Lが-N=N-; -CH=CH-、-N=CH-、-CH=N-、-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-CH2-NH-、-O-CH2-、または-CH2-O-である、ならびに
そのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【００９７】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は、式IIaに描かれている構造(GIND-28とも称される)を有する。
2009510167.tif 000006
【００９８】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は式IIIの化合物:
2009510167.tif 000007
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、式中R1およびR2の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択され; 式中XおよびYがそれぞれ独立してC、O、またはNである。
【００９９】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式IIIの化合物であり、ここで
R1が-(CH2)m-(CR=CH)n-CR=であり、ここでmおよびnがそれぞれ独立して0または1であり、Rが-C6H5、-(CH2)-C6H5、-(NH)-C6H5、または-(O)-C6H5であり;
R2が-C6H5、-(CH2)-C6H5、-(NH)-C6H5、または-(O)-C6H5であり; かつ
XおよびYがそれぞれ独立してOまたはNである; ならびに
そのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１００】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は、式IIIaに描かれている構造(GIND-81とも称される)を有する。
2009510167.tif 000008
【０１０１】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は式IVの化合物:
2009510167.tif 000009
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、
式中R1、R2、R3、およびLの各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【０１０２】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式IVの化合物であり、ここで
R1およびR2がそれぞれ独立して-Hまたは低級アルキル(例えば、C1〜C4)であり; 但しR1およびR2の少なくとも一方がアルキル化されており;
R3が-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=1〜4であり; かつ
Lが-(CH2)m、=CH-(CH2)n-CH=、-CH=CH-(CH2)-、または-(CH2)-CH=CH-であり、ここでm=0、または1〜3の整数であり; およびここでn=0または1である; ならびに
そのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１０３】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は、式IVaに描かれている構造(GIND-105とも称される)を有する。
2009510167.tif 000010
【０１０４】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は式Vの化合物:
2009510167.tif 000011
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、式中R1、R2、R3の各々、ならびにR1'、R2'、およびR3'の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【０１０５】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式Vの化合物であり、ここで
R1およびR1'がそれぞれ独立して-Hまたは-O-SO3であり、但しR1およびR1'の少なくとも一方が-O-SO3であり;
R2およびR2'がそれぞれ独立して-H、-CH3、または-CH2CH3であり、但しR2およびR2'の少なくとも一方がアルキル化されており; かつ
R3およびR3'がそれぞれ独立して-H、-Cl、または-Brであり、但しR3およびR3'の少なくとも一方がハロゲン化されている; ならびに
そのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１０６】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は、式Vaに描かれている構造(GIND-111とも称される)を有する。
2009510167.tif 000012
【０１０７】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害剤は式VIに描かれている構造:
2009510167.tif 000013
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルを有し、
式中R1、R2、R3、およびR4の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【０１０８】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式VIの化合物であり、ここで
R1およびR2がそれぞれ独立して-H、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり; 但しR1およびR2の少なくとも一方が-H以外であり;
R3がO、H、OH、ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ)、あるいは置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8)であり; かつ
R4が-N=N-R5; -CH=CH-R5、-N=CH-R5、-CH=N-R5、-CH2-CH2-R5、-NH-CH2-R5、-CH2-NH-R5、-0-CH2-R5、-CH2-O-R5、置換または非置換フェニル基; 置換または非置換複素環式芳香族基、あるいは置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8)であり; ここでR5がH、置換または非置換フェニル基; 置換または非置換複素環式芳香族基、あるいは置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8)である; ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１０９】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式VIIの化合物:
2009510167.tif 000014
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、式中R1、R2、R3、R4、R5、およびR6の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【０１１０】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式VIIの化合物であり、ここで、
R1およびR2がそれぞれ独立して-Hもしくは-O-SO3、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり; 但しR1およびR2の少なくとも一方が-H以外であり;
XがC、S、またはNであり;
R3、R4、R5、およびR6の各々がH、ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8)、置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される; ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１１】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式VIIIの化合物:
2009510167.tif 000015
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルであり、
式中R1、R2、R3、R4、およびR5の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される。
【０１１２】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式VIIIの化合物であり、ここで、
R1が-O-SO3、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり;
式中R2、R3、R4、およびR5の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基; または-(CH2)m-SO3、-(CH2)m-O-SO3、-NH-(CH2)n-SO3、-NH-(CH2)n-O-SO3、(CH2)p-C6H4-SO3、-(CH2)p-C6H4-O-SO3、-NH-(CH2)p-C6H4-SO3、もしくは-NH-(CH2)p-C6H4-O-SO3から独立して選択され; ここでm=0または1〜10の整数であり; ここでn=1、2、または3であり; およびここでp=0または1である;
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１３】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式VIIIの化合物であり、ここで、
R1が-O-SO3、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3であり、ここでn=0、1、または2であり;
R2が-(CH2)m-SO3、-(CH2)m-O-SO3、-NH-(CH2)n-SO3、-NH-(CH2)n-O-SO3、(CH2)p-C6H4-SO3、-(CH2)p-C6H4-O-SO3、-NH-(CH2)p-C6H4-SO3、または-NH-(CH2)p-C6H4-O-SO3であり; ここでm=0または1〜10の整数であり; ここでn=1、2、または3であり; およびここでp=0または1であり; かつ
R3、R4、およびR5の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される;
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１４】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式IXの化合物:
2009510167.tif 000016
ここでW、X、Y、およびXがそれぞれ独立してC、N、S、またはOであり;
ここでR1およびR2の各々がH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から独立して選択される;
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１５】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式IXの化合物:
ここでW、X、Y、およびXがそれぞれ独立してC、N、S、またはOであり;
ここでR1がH、=O、ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ)、-O-SO3、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3から選択され、ここでn=0、1、または2であり; かつ
ここでR2がH、ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); n=0、1、もしくは2である-O-SO3、-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3; mおよびnはそれぞれ独立して0または1であり、かつRは-C6H5、-(CH2)-C6H5、-(NH)-C6H5、または-(O)-C6H5である-(CH2)m-(CR=CH)n-CR=; ならびに-C6H5、-(CH2)-C6H5、-(NH)-C6H5、または-(O)-C6H5から選択される;
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１６】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式Xの化合物:
2009510167.tif 000017
ここでXおよびYがそれぞれ独立してC、N、S、またはOであり;
ここでR1、R2、R3、R4、R5、およびR6がそれぞれ独立してH、ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基である;
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１７】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用の本阻害化合物は式Xの化合物:
ここでXおよびYがそれぞれ独立してC、N、S、またはOであり;
R2がH; ハロ; n=1〜4である-(CH2)n-SO3、または-(CH2)n-O-SO3; 置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基から選択され;
R1がH; ハロ; 置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); 置換または非置換フェニル基; 置換または非置換複素環式芳香族基; ならびにLは-(CH2)m、=CH-(CH2)n-CH=、-CH=CH-(CH2)-、または-(CH2)-CH=CH-であり、ここでm=0、または1〜3の整数であり、ここでn=0または1であり、かつR7は置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基であるL-R7から選択され;
ここでR3、R4、R5、およびR6がそれぞれ独立してH; ハロ(例えば、ブロモ、フルオロ、クロロ); 例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ヘプチル、n-オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、2-エチルヘキシルを含め、置換もしくは非置換の飽和直鎖もしくは分枝炭化水素基または鎖(例えば、C1〜C8); メトキシル基またはエトキシル基のようなエーテル基; 置換または非置換硫酸基; 置換または非置換フェニル基; および置換または非置換複素環式芳香族基である;
ならびにそのプロドラッグ、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容されるエステルである。
【０１１８】
いくつかの態様では、式Ia、IIa、IIIa、IVa、およびVaに描かれている化合物の1つまたは複数が特異的に除外される。
【０１１９】
組成物
本発明はさらに、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質を含んだ組成物を提供する。これらの組成物は、作用物質の所望の用途に応じて選択される緩衝剤を含んでもよく、意図した用途に適した他の物質を含んでもよい。当業者は、意図した用途に適した、多種多様のものが当技術分野において公知の適切な緩衝剤を容易に選択することができる。場合によっては、該組成物は薬学的に許容される賦形剤を含んでもよく、さまざまなものが当技術分野において公知であるので、本明細書において詳細に論じられる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro (1995) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 第19版, Lippincott, Williams, & Wilkinsを含め、さまざまな刊行物に十分に記述されている。
【０１２０】
製剤、投与量、および投与経路
本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質を含む、薬学的製剤を含め、製剤を提供する。一般に、製剤は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量を含む。「有効量」は望ましい結果、例えば、apoE4ドメイン相互作用の低減、神経突起成長の増大、血清脂質レベルの低下、心疾患のリスク低下などをもたらすのに十分な投与量を意味する。一般に、望ましい結果は、少なくとも対照と比較した場合のapoE4ドメイン相互作用の低減である。apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、以下にさらに詳述される通り、血液脳関門を回避するように送達することができる。apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、以下にさらに詳述される通り、作用物質が血液脳関門を通過できるように製剤化および/または修飾することができる。
【０１２１】
製剤
本方法において、作用物質は所望とされる、apoE4ドメイン相互作用の低減を生じうる任意の好都合な手段を用いて宿主に投与することができる。従って、作用物質は治療的投与のために種々の製剤に組み入れることができる。より詳細には、本発明の作用物質は、適切な、薬学的に許容される担体または希釈剤との組合せにより薬学的組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルのような、固体、半固体、液体または気体の形態の調製物に製剤化することができる。
【０１２２】
薬学的投与剤形において、作用物質は、その薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよく、あるいはそれらは単独でまたはその他の薬学的に活性な化合物に付随して、およびその化合物との組合せで使用されてもよい。以下の方法および賦形剤は、単なる例示にすぎず、決して限定するものではない。
【０１２３】
経口調製物の場合、作用物質を単独でまたは適切な添加剤との組合せで、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンのような従来の添加剤との組合せで、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤との組合せで、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤との組合せで、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤との組合せで、必要に応じ、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香料添加剤との組合せで使用して、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作出することができる。
【０１２４】
作用物質はそれらを、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステルまたはプロピレングリコールのような、水性または非水性溶媒に、必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤とともに溶解、懸濁または乳化することにより注射用調製物に製剤化することができる。
【０１２５】
作用物質は、吸入により投与されるエアロゾル製剤として利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、許容される噴霧剤に製剤化することができる。
【０１２６】
さらに、作用物質は、乳化基剤または水溶性基剤のような種々の基剤と混合することで坐剤にすることができる。本発明の化合物は、坐剤により直腸に投与することができる。坐剤としては、体温で融解するが、室温では固化しているココアバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのような媒体を挙げることができる。
【０１２７】
シロップ剤、エリキシル剤および懸濁液のような経口または直腸投与用の単位投与剤形は、各投与単位、例えば、小さじ1杯、大さじ1杯、錠剤または坐剤が、1つまたは複数の阻害剤を含んだ組成物の所定量を含有するように提供することができる。同様に、注射または静脈内投与用の単位投与剤形は、滅菌水溶液、通常の生理食塩水溶液または別の薬学的に許容される担体の溶液として、組成物の中に阻害剤を含むことができる。
【０１２８】
本明細書において用いられる「単位投与剤形」という用語は、ヒトおよび動物被験体に向けた単一の投与量として適した物理的に別個の単位であって、各々の単位が薬学的に許容される希釈剤、担体または媒体との関連で所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を含有するものをいう。本発明の新規の単位投与剤形の仕様は、利用される特定の化合物および達成されるべき効果、ならびに宿主での各化合物に関わる薬力学に依存する。
【０１２９】
その他の投与方法でも本発明での用途が見つかるであろう。例えば、本発明の作用物質は坐剤に、場合によっては、エアロゾルおよび鼻腔内投与組成物に製剤化することができる。坐剤の場合、媒体組成物は、従来の結合剤およびポリアルキレングリコール、またはトリグリセリドのような担体を含むであろう。このような坐剤は、約0.5%〜約10% (w/w)、例えば、約1%〜約2%の範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。
【０１３０】
鼻腔内投与製剤は、通常、鼻粘膜に対する刺激も引き起こさず、繊毛機能を著しく妨害もしない媒体を含むであろう。水、水性生理食塩水または他の公知の物質のような希釈剤を本発明で利用することができる。鼻腔投与製剤は同様に、以下に限定されないが、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムのような、ある種の保存剤を含んでもよい。界面活性剤を存在させて、鼻腔粘膜による対象タンパク質の吸収を増強してもよい。
【０１３１】
本発明の作用物質は注射可能物質として投与することができる。典型的には、注射可能な組成物を液体溶液または懸濁液として調製する。注射前の液体媒体溶液または液体媒体懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。この調製物は乳化されてもよく、または活性成分がリポソーム媒体に封入されてもよい。
【０１３２】
適当な賦形剤媒体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、必要に応じて、この媒体は湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤のような少量の補助物質を含有することができる。このような投与剤形を調製する実際の方法は当業者には公知であり、または明らかであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 第17版, 1985を参照されたい。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、治療される被験体において所望の状態を達成するのに十分な作用物質の量を含有するであろう。
【０１３３】
媒体、補助剤、担体または希釈剤のような、薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に利用可能である。さらに、pH調整剤および緩衝剤、等張調整剤、安定剤、湿潤剤などのような、薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に利用可能である。
【０１３４】
経口製剤
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質は、このような作用物質を必要としている個体への経口送達用に製剤化される。
【０１３５】
経口送達の場合、本活性作用物質を含む本製剤には、いくつかの態様では、腸溶性コーティング材が含まれるであろう。適当な腸溶性コーティング材には、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCAS)、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCP)、酢酸フタル酸セルロース(CAP)、フタル酸酢酸ポリビニル(PVPA)、Eudragit(商標)、およびシェラックが含まれる。
【０１３６】
適当な経口製剤の1つの非限定的な例として、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質を、米国特許第6,346,269号に記述されているように、1つまたは複数の薬学的賦形剤とともに製剤化し、腸溶コーティングで被覆する。例えば、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質および安定剤を含む溶液を、薬学的に許容される賦形剤を含む芯に被覆して活性作用物質-被覆芯を形成し、下掛層(sub-coating layer)を活性作用物質-被覆芯に塗布し、今度はこれを腸溶コーティング層で被覆する。この芯には一般に、ラクトース、デンプン、マンニトール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、色素、アルギン酸の塩、タルク、二酸化チタン、ステアリン酸、ステアリン酸塩、微結晶性セルロース、グリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、三酢酸プロパニル(propanyl triacetate)、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、硫酸カルシウム、シクロデキストリン、およびヒマシ油のような、薬学的に不活性な成分が含まれる。活性作用物質(apoE4ドメイン相互作用を阻害する本作用物質)に適した溶媒には、水性溶媒が含まれる。適当な安定剤にはアルカリ金属およびアルカリ土類金属、リン酸の塩基ならびに有機酸塩および有機アミンが含まれる。下掛層は粘着剤、軟化剤、および非粘着剤の1つまたは複数を含む。適当な非粘着剤にはタルク、ステアリン酸、ステアリン酸塩、ステアリルフマル酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、カオリンおよびエアロシルが含まれる。適当な粘着剤にはポリビニルピロリドン(PVP)、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、酢酸ビニル(VA)、ポリビニルアルコール(PVA)、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCP)、酢酸フタル酸セルロース(CAP)、キサンタンガム、アルギン酸、アルギン酸の塩、Eudragit(商標)、酢酸フタル酸ポリビニル(PVAP)を有するアクリル酸メチル/メタクリル酸メチル共重合体が含まれる。適当な軟化剤にはグリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、三酢酸プロパニルおよびヒマシ油が含まれる。適当な腸溶性コーティング材には、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCAS)、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCP)、酢酸フタル酸セルロース(CAP)、フタル酸酢酸ポリビニル(PVPA)、Eudragit(商標)およびシェラックが含まれる。
【０１３７】
適当な経口製剤は同様に、以下のいずれかとともに製剤化された、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質を含む: 微粒剤(例えば、米国特許第6,458,398号を参照のこと); 生分解性マクロマー(例えば、米国特許第6,703,037号を参照のこと); 生分解性ヒドロゲル(例えば、Graham and McNeill (1989) Biomaterials 5:27-36を参照のこと); 生分解性微粒子ベクター(例えば、米国特許第5,736,371号を参照のこと); 生分解性ラクトン重合体(例えば、米国特許第5,631,015号を参照のこと); 徐放性タンパク質重合体(例えば、米国特許第6,699,504号; Pelias Technologies, Inc.を参照のこと); ポリ(ラクチド-コ-グリコライド)/ポリエチレングリコールブロック共重合体(例えば、米国特許第6,630,155号; Atrix Laboratories, Inc.を参照のこと); 生体適合性重合体と該重合体内に分散された金属陽イオン安定化剤の粒子とを含む組成物(例えば、米国特許第6,379,701号; Alkermes Controlled Therapeutics, Inc.を参照のこと); およびミクロスフェア(例えば、米国特許第6,303,148号; Octoplus, B.V.を参照のこと)。
【０１３８】
適当な経口製剤は同様に、以下のいずれかとともに製剤化された、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質を含む: Emisphere(登録商標) (Emisphere Technologies, Inc.)のような担体; デキストロースの存在下、水中にて強力な結合剤ゲルを形成する、キサンタンガムとローカストビーンガムとを組み合わせた親水性重合体TIMERx (Penwest); Geminex(商標) (Penwest); Procise(商標) (GlaxoSmithKline); SAVIT(商標) (Mistral Pharma Inc.); RingCap(商標) (Alza Corp.); Smartrix(登録商標) (Smartrix Technologies, Inc.); SQZgel(商標) (MacroMed, Inc.); Geomatrix(商標) (Skye Pharma, Inc.); Oros(登録商標) Tri-layer (Alza Corporation)など。
【０１３９】
米国特許第6,296,842号(Alkermes Controlled Therapeutics, Inc.); 米国特許第6,187,330号(Scios, Inc.)などに記述されているもののような製剤も使用に適している。
【０１４０】
腸吸収促進剤を含む製剤も本明細書において使用に適している。適当な腸吸収促進剤は、カルシウムキレート剤(例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸); 界面活性剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、胆汁塩、パルミトイルカルニチン、および脂肪酸のナトリウム塩); 毒素(例えば、閉鎖帯毒素)などを含むが、これらに限定されることはない。
【０１４１】
制御放出製剤
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質は、制御放出製剤に製剤化される。
【０１４２】
本発明の範囲内の制御放出は、いくつかの拡張放出投与剤形の任意の1つを意味すると解釈することができる。以下の用語は本発明の目的のため、制御放出と実質的に等価であると見なすことができる: 連続的放出、制御放出、遅延放出、持効性製剤、段階的放出、長期放出、プログラム放出、持続放出、比例的放出、遅延性放出、持続性、遅滞性、徐放、間欠放出、徐放性放出、タイムコート(time coat)、時間調節放出、遅延作用、持続作用、階層的時間作用、長時間作用性、持続性作用、反復作用、緩徐作用性、持続作用性、持続作用性薬物、および拡張放出。これらの用語のさらなる論述は、Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.)の中で見出すことができる。
【０１４３】
種々の制御放出技術は非常に広範囲にわたる薬物投与剤形を対象としている。制御放出技術は物理的系および化学的系を含むが、これらに限定されることはない。
【０１４４】
物理的系はマイクロカプセル化、マクロカプセル化および膜系のような、速度制御膜を伴う貯蔵系; 中空繊維、超微孔質三酢酸セルロース、ならびに多孔質重合体基剤および発泡体のような、速度制御膜を伴わない貯蔵系; 非多孔質の重合性または弾性マトリックス(例えば、非侵食性、侵食性、環境因子の侵入性、および分解性)に物理的に溶解されている系、および非多孔質の重合性または弾性マトリックス(例えば、非侵食性、侵食性、環境因子の侵入性、および分解性)に物理的に分散されている材料を含む、単体系; 外部制御層と化学的に類似しているまたは類似していない貯蔵層を含む、積層構造; ならびに浸透圧ポンプ、またはイオン交換樹脂上への吸着のような、その他の物理的方法を含むが、これらに限定されることはない。
【０１４５】
化学的系は重合体マトリックスの化学侵食(例えば、不均質もしくは均質侵食)、または重合体マトリックスの生物学的侵食(例えば、不均質もしくは均質)を含むが、これらに限定されることはない。制御放出系の範疇に関するさらなる論述はAgis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods. Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.)の中で見出すことができる。
【０１４６】
経口投与向けに開発されたいくつかの制御放出薬物製剤がある。これらは浸透圧制御の胃腸管送達系; 動圧制御の胃腸管送達系; 微多孔膜透過制御の胃腸管送達装置を含め、膜透過制御の胃腸管送達系; 胃液抵抗性の腸を標的とした制御放出胃腸管送達装置; ゲル拡散制御の胃腸管送達系; ならびに陽イオン性および陰イオン性薬物を含め、イオン交換制御の胃腸管送達系を含むが、これらに限定されることはない。制御放出薬物送達系に関するさらなる情報は、Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.)の中で見出すことができる。これらの製剤のいくつかをこれからさらに詳述する。
【０１４７】
腸溶コーティングを錠剤に塗布し胃内での薬物の放出を阻止して、望ましくない副作用のリスクを低減するか、または胃の環境への曝露分解に別の形で供されうる薬物の安定性を維持する。この目的で使用される大部分の重合体はポリ酸であり、これは水性媒質中でのその溶解度がpH依存性であり、胃内で通常直面するよりも高いpHを伴う条件をそれらが必要にするという事実によって機能する。
【０１４８】
1つの例示的なタイプの経口制御放出構造は、固体または液体投与剤形の腸溶コーティングである。腸溶コーティングは、即時の吸収のため腸液中で崩壊するようにデザインされている。腸溶コーティングを有する製剤に組み入れられた活性作用物質の吸収の遅延は、胃腸管を通じた移送の速度に依存し、そのため胃排出速度は重要な要因である。研究者のなかには、顆粒剤のような、多ユニット型の投与剤形が単ユニット型よりも優れている可能性のあることを報告するものもいる。それ故に、1つの例示的な態様では、腸溶的にコーティングされた多ユニットの投与剤形の中に、apoE4ドメイン相互作用を阻害する本活性作用物質(「apoE4ドメイン相互作用阻害剤」)を含有させることができる。例示的な態様では、不活性芯材料にapoE4ドメイン相互作用阻害剤-腸溶コーティング剤の固体分散体の顆粒をスプレーコーティングすることにより、apoE4ドメイン相互作用阻害剤の投与剤形を調製する。これらの顆粒は、良好な生物学的利用能で薬物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０１４９】
典型的な腸溶コーティング剤はフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸-メタクリル酸エステル共重合体、酢酸-フタル酸ポリビニルおよび酢酸フタル酸セルロースを含むが、これらに限定されることはない。Akihiko Hasegawa, Application of solid dispersions of Nifedipine with enteric coating agent to prepare a sustained-release dosage form, Chem. Pharm. Bull. 33: 1615-1619 (1985)。種々の腸溶コーティング材料は、溶解時間、コーティング厚および直径破砕強度の最適な組合せを有するように最初からデザインされる腸溶コーティング投与剤形を達成するための試験に基づいて選択することができる。S. C. Porter et al., The Properties of Enteric Tablet Coatings Made From Polyvinyl Acetate-phthalate and Cellulose acetate Phthalate, J. Pharm. Pharmacol. 22:42p (1970)。
【０１５０】
別のタイプの有用な経口制御放出構造は固体分散体である。固体分散体は、溶融(融解)、溶媒、または溶融-溶媒法によって調製された固体状の、不活性担体またはマトリックス中の1つまたは複数の活性成分の分散体と定義することができる。Akihiko Hasegawa, Super Saturation Mechanism of Drugs from Solid Dispersions with Enteric Coating Agents, Chem. Pharm. Bull. 36: 4941-4950 (1998)。固体分散体は固相分散体とも呼ぶことができる。「共沈物」という用語は同様に、溶媒法によって得られる調製物をいうよう使用することができる。
【０１５１】
担体の選択は分散薬物(例えば、apoE4ドメイン相互作用阻害剤)の溶解特性に影響を及ぼしうる。これは、表面からの成分の溶解速度が多成分混合物中の他の成分の影響を受けうるからである。例えば、水溶性担体はマトリックスからの薬物の迅速な放出をもたらすことができ、または難溶性もしくは不溶性の担体はマトリックスからの薬物の緩徐な放出を導くことができる。apoE4ドメイン相互作用阻害剤の溶解度は、担体とのいくらかの相互作用によっても増大されうる。
【０１５２】
固体分散体において有用な担体の例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyraolidone)、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースのような水溶性重合体を含むが、これらに限定されることはない。別の担体はホスファチジルコリンを含む。ホスファチジルコリンは両性しかし不水溶性の脂質であり、さもなければ不溶性の非晶質状apoE4ドメイン相互作用阻害剤の、ホスファチジルコリン固体分散体中での溶解度を向上することができる。
【０１５３】
その他の担体はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を含む。水難溶性のapoE4ドメイン相互作用阻害剤は、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルエチルセルロースのような腸溶性重合体、ならびに非腸溶性重合体ヒドロキシプロピルメチルセルロースを有する固体分散系に含有させることができる。別の固体分散体の投与剤形は、いろいろな比率でのエチルセルロースおよびステアリン酸との対象とする薬物(例えば、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤)の混和を含む。
【０１５４】
固体分散体を調製するために一般に知られている種々の方法がある。これらは溶融法、溶媒法および溶融-溶媒法を含むが、これらに限定されることはない。
【０１５５】
別の制御放出投与剤形は、イオン交換樹脂と本apoE4ドメイン相互作用阻害剤との間の複合体である。酸性および塩基性薬物の徐放性放出製剤を製剤化するため、イオン交換樹脂-薬物の複合体が使用されている。1つの例示的な態様において、重合体フィルムコーティングをイオン交換樹脂-薬物複合体粒子に供与し、これらの粒子の拡散からの薬物放出を制御することができる。Y. Raghunathan et al., Sustained-released drug delivery system I: Coded ion-exchange resin systems for phenylpropanolamine and other drugs, J. Pharm. Sciences 70: 379-384 (1981)を参照されたい。
【０１５６】
注射可能なミクロスフェアは別の制御放出投与剤形である。注射可能なミクロスフェアは非水相分離技術、および噴霧乾燥技術によって調製することができる。ミクロスフェアは、ポリ乳酸またはコポリ(乳酸/グリコール酸), Shigeyuki Takada, Utilization of an Amorphous Form of a Water-Soluble GPIIb/IIIa Antagonist for Controlled Release From Biodegradable Micro spheres, Pharm. Res. 14:1146-1150 (1997)、およびエチルセルロース, Yoshiyuki Koida, Studies on Dissolution Mechanism of Drugs from Ethyl Cellulose Microcapsules, Chem. Pharm. Bull. 35:1538-1545 (1987)を用いて調製することができる。
【０１５７】
使用できる他の制御放出技術は、Elan Pharmaceutical Technologiesから入手可能なSODAS (Spheroidal Oral Drug Absorption System; 球状経口薬吸収系)、INDAS (Insoluble Drug Absorption System; 不溶性薬物吸収系)、IPDAS (Intestinal Protective Drug Absorption System; 腸保護性薬物吸収系)、MODAS (Multiporous Oral Drug Absorption System; 多孔性経口薬吸収系)、EFVAS (Effervescent Drug Absorption System; 発泡性薬物吸収系)、PRODAS (Programmable Oral Drug Absorption System; プログラム可能な経口薬吸収系)、およびDUREDAS (Dual Release Drug Absorption System; 二重放出性薬物吸収系)を含むが、これらに限定されることはない。SODASは、制御放出ビーズを利用した多重粒状投与剤形である。INDASは、難溶性薬物の溶解度を高めるようにデザインされた薬物送達技術の一群である。IPDASは、高密度制御放出ビーズおよび即時放出顆粒の組合せを利用した多重粒状錠剤構造である。MODASは制御放出単ユニット投与剤形である。各錠剤は、薬物放出速度を制御する複出半透性膜によって囲まれた内部芯からなる。EFVASは発泡性薬物吸収系である。PRODASは、即時放出および制御放出微小錠剤の組合せを利用した多重粒状製剤の一群である。DUREDASは、1つの投与剤形内に二元的な放出速度を与える二重層錠剤製剤である。これらの投与剤形は当業者に公知であるが、これらの特定の投与剤形をこれからさらに詳述する。
【０１５８】
INDASは、難水溶性薬物の溶解度および吸収特性を特に向上するように開発された。溶解度、特に胃腸管液内での溶解は、難水溶性薬物の全体的な経口生物学的利用能を判定するうえで重要な要因である。溶解度を高めることによって、薬物の全体的な生物学的利用能を増大し、結果的に投与量を減らすことができる。INDASは高エネルギーマトリックス錠剤の形態をとり、その作出は個別の2工程からなる: エネルギー、賦形剤および独自の処理手順の組合せを通じて、対象とするアデノシン類似体を非晶形に転換する。
【０１５９】
望ましい物理的形態に転換されたら、得られた高エネルギー複合体を、新規の重合体架橋技術を用いた吸収工程により安定化して、再結晶を阻止することができる。利用した賦形剤の可溶化特性に加え、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の物理的形態の変化の組合せにより、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の溶解度が高まる。得られた吸収済の非晶質薬物複合顆粒をゲル形成侵食性錠剤系とともに製剤化して、実質的に円滑かつ連続的な吸収を促進することができる。
【０１６０】
IPDASは、刺激性および潰瘍発生性の可能性のある薬物の胃腸管での認容性を増強できる多粒子錠剤技術である。腸での保護は、胃腸管全体に刺激性リポ酸塩の分散を促進するIPDAS製剤の多粒子性によって容易になる。個々のビーズの制御放出特性によって、高濃度の薬物が局所的に放出されることも全身的に吸収されることもともに回避することができる。両手法の組合せで、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の潜在的な有害性が最小限となり、結果的に患者に有益である。
【０１６１】
IPDASは多くの高密度制御放出ビーズから構成される。各ビーズは、包埋されたapoE4ドメイン相互作用阻害剤を有するミクロマトリックスの初期生産およびその後、インビボにおいて律速半透膜を形成する重合体溶液によるこのミクロマトリックスのコーティングを伴う2段階工程によって製造することができる。IPDAS錠剤が摂取されると、これは胃の中でビーズを崩壊し遊離しうる。これらのビーズはその後、例えば、制御されたかつ段階的な様式で、摂食状態とは無関係に、十二指腸へと胃腸管に沿って移行することができる。apoE4ドメイン相互作用阻害剤の放出はミクロマトリックスを通じた、およびその後、律速半透膜中の孔を通じた、拡散工程によって行われる。IPDAS錠剤からの放出速度は、臨床的有用性の最適化に関連する薬物特異的な吸収プロファイルを実現するようにカスタマイズすることができる。活性の速やかな発現が必要であるならば、錠剤の中に即時放出顆粒を含有させることができる。この錠剤は、個々の用量決定のために低用量が必要であるなら、薬物放出を実質的に損なうことなく、投与前に分割することができる。
【０１６２】
MODASは、水溶性作用物質の吸収を制御するために使用できる薬物送達系である。物理的にMODASは、インビボにおいて形成される半透膜での律速拡散の過程によって薬物放出を操作する、非崩壊性の錠剤製剤である。この拡散過程は胃腸液に対する薬物の提示速度を本質的に決定し、その結果、体内への取り込みが制御される。賦形剤の使用が最小であるため、MODASは小さな投与サイズの剤形に容易に収容することができる。各MODAS錠剤は始め、活性薬物に加えて賦形剤を含有する芯である。この芯は不溶性重合体および可溶性賦形剤の溶液で被覆される。この錠剤は摂取されると、胃腸管液が外部コーティング中の可溶性賦形剤を溶解し、実質的に不溶性重合体を残しうる。その結果、胃腸管から水溶性薬物の内部薬物芯に胃腸管液を連絡する小さくて狭いチャネルのネットワークが生じる。この胃腸管液がチャネルを通り、芯に移行して、結果的に薬物を溶解し、生じた薬物溶液は制御された様式で拡散することができる。これによって、制御された溶解も吸収もともに可能とすることができる。この系の利点は、錠剤の薬物放出孔が実質的に錠剤の表面全体に分布していることである。これは均一な薬物吸収を円滑にし、集中的な一方向の薬物送達を減らす。MODASは、内部芯も外部半透膜もともに薬物個々の送達要件に適するよう改変できるという点で非常に柔軟な投与剤形に当たる。特に、内部芯への賦形剤の添加は、いっそう予測可能な放出および吸収速度を円滑にする錠剤内微小環境の作出の手助けになりうる。即時放出性外部コーティングの付加により、併用製品の開発を可能にすることができる。
【０１６３】
さらに、PRODASを使用して、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤を送達することができる。PRODASは、直径が1.5〜4 mmのサイズ範囲の制御放出微小錠剤の作出に基づく多粒状薬物送達技術である。PRODAS技術は、多粒状法と親水性マトリックス錠剤法のハイブリッドであり、1つの投与剤形に、これらの両薬物送達系の利点を組み込むことができる。
【０１６４】
PRODASはその最も基本的な形状では、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤を含有する個々の微小錠剤を作出するために即時放出顆粒の直接圧縮を必要とする。これらの微小錠剤をその後、最終の投与剤形に当たる硬質ゲルおよびカプセルに組み入れる。この技術のさらに有益な使用は制御放出製剤の作出にある。この場合には、顆粒内でのさまざまな重合体の組合せの混和によって、個々の微小錠剤の各々からの薬物の放出速度を遅延することができる。これらの微小錠剤をその後、制御放出重合体溶液で被覆して、さらに放出遅延性をもたらすことができる。この付加的なコーティングは、高度に水溶性の薬物または恐らく胃刺激性の薬物の場合に必要になることがあり、後者の場合、製剤が胃腸管のいっそう末端領域に達するまで放出を遅延することができる。PRODAS技術の価値の1つは製剤に固有の柔軟性にあり、それによって、それぞれ異なる放出速度を有する微小錠剤の組合わせが1つの投与剤形に組み入れられる。このことは、特定の期間にわたる吸収の制御を潜在的に可能にすることに加えて、胃腸管全体の特定の吸収部位への薬物送達の標的化を可能にすることもできる。異なる活性成分とともに製剤化された微小錠剤を用い、併用製品を可能にすることもできる。
【０１６５】
DUREDASは、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤を製剤化するために使用できる二層打錠技術である。DUREDASは1つの投与剤形から薬物の、異なる二放出速度、または二元的放出をもたらすように開発された。二層という用語は、打錠工程の間に行われる2回の個別の直接的圧縮事象をいう。例示的な態様では、即時放出顆粒を最初に圧縮し、引き続き制御放出要素の添加を行い、今度はこれをこの最初の錠剤上に圧縮する。これにより、最終の投与剤形に見られる特徴的な二層をもたらすことができる。
【０１６６】
この制御放出特性は、親水性重合体の組合せによって与えることができる。ある場合には、治療作用の速やかな発現を円滑にするため、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の迅速な放出が望ましいかもしれない。それ故に、錠剤の第一層を即時放出顆粒として製剤化することができる。対照的に、錠剤の第二層は、例えば、親水性重合体の使用により、制御された様式で薬物を放出することができる。この制御放出は、親水性重合体マトリックスを通じた拡散および侵食の組合せから得ることができる。
【０１６７】
DUREDAS技術のさらなる拡張は、制御放出組合せ投与剤形の作出である。この場合、2つの異なる本apoE4ドメイン相互作用阻害化合物を二層錠剤の中に組み入れて、この組合せの治療作用を最大とするように各層からの薬物の放出を制御することができる。
【０１６８】
本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、前述の制御放出投与剤形のいずれか1つに、または他の従来の投与剤形に組み入れることができる。各用量に含まれる本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の量は、個々の患者、および適応の要求を満たすように調節することができる。当技術分野におけるおよび本開示を読んで理解する当業者であれば、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の送達およびその生物学的利用能を最適化するために、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤のレベルおよび制御放出製剤における放出速度を調節する方法を容易に理解するであろう。
【０１６９】
吸入製剤
本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、いくつかの態様では、吸入経路に向けた薬学的送達系により患者に投与することができる。本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、吸入による投与に適した形態で製剤化することができる。吸入による投与経路は、吸入薬が血液脳関門を迂回できるという利点をもたらす。薬学的送達系は、気管支の粘膜内層への本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の送達による呼吸療法に適した系である。本発明は、容器から本apoE4ドメイン相互作用阻害剤を押し出すのに圧縮ガスの力に依存した系を利用することができる。エアロゾルまたは加圧パッケージをこの目的に使用することができる。
【０１７０】
本明細書において用いられる「エアロゾル」という用語は、加圧下で噴霧剤により治療適用部位へ運搬される極めて微細な液体または固体の粒子を指すものとして、従来の意味で使用される。薬学的エアロゾルを本発明において利用する場合、エアロゾルは、液体担体と噴霧剤との混合物中に溶解、懸濁、または乳濁されてもよい治療的に活性な化合物(例えば、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤)を含有する。エアロゾルは溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、または半固体の調製物の形態でありうる。本発明において利用されるエアロゾルは、患者の気道を介した、微細な固体粒子として、または液体ミストとしての投与を目的とするものである。当業者に公知のさまざまなタイプの噴霧剤を用いることができる。適当な噴霧剤は、炭化水素またはその他の適当なガスを含むが、これらに限定されることはない。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達する値を定めることによって決定することができる。
【０１７１】
本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、ガス中に実質的に均一なサイズの極めて微細な液体粒子を生成させる装置である噴霧器による送達に向けて製剤化することもできる。例えば、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤を含有する液体は、飛沫として分散される。小飛沫は噴霧器の排出チューブから気流により運搬されることができる。生じたミストは患者の気道へと進入する。
【０１７２】
滑沢剤、担体、または噴霧剤を伴いまたは伴わずに、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤を含有する粉末組成物を、治療を必要としている哺乳動物に投与することができる。本発明のこの態様は、吸入により粉末の薬学的組成物を投与するための従来の装置を用いて行うことができる。例えば、化合物およびラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を、吸入器の補助によって粉末が投与されうる、例えばカプセルもしくはカートリッジ、例えばゼラチン、またはブリスターパックの中に単位投与剤形として与えることができる。
【０１７３】
本発明に関連して利用できるいくつかの異なるタイプの吸入法が存在する。本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は基本的に異なる3タイプの吸入用製剤に製剤化することができる。第一に、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、低沸点噴霧剤を用いて製剤化することができる。そのような製剤は一般に、従来の定量吸入器(MDI's)によって投与される。しかしながら、米国特許第5,404,871号および同第5,542,410号のなかで論じられている通り、患者の呼気量および流量を測定する技術を利用することで、反復可能な投薬をする能力を高めるように従来のMDI'sを改変することができる。
【０１７４】
あるいは、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、水溶液またはエタノール溶液に製剤化され、従来の噴霧器により送達されてもよい。いくつかの態様では、そのような溶液製剤は、米国特許第5,497,763号、同第5,544,646号、同第5,718,222号、および同第5,660,166号のなかで開示されているような装置および系を用いてエアロゾル化される。
【０１７５】
最後に、本apoE4ドメイン相互作用阻害剤は、乾燥粉末製剤の中に製剤化することができる。そのような製剤は、粉末のエアロゾル・ミストを作出した後、乾燥粉末製剤を単に吸入することで投与することができる。そのような方法を実施するための技術は、1998年7月7日付で発行された米国特許第5,775,320号および1998年4月21日付で発行された米国特許第5,740,794号のなかに記述されている。
【０１７６】
上記に引用された各特許に関し、本出願人らは、これらの特許が肺内薬物送達における他の刊行物を引用していること、および本apoE4ドメイン相互作用阻害剤の送達に関連して使用できる特定の方法、装置および製剤に対し、そのような刊行物を参照できることを指摘するものである。さらに、各特許は本apoE4ドメイン相互作用阻害製剤の製剤、装置、パッケージングおよび送達法を開示する目的で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
本発明はさらに、apoE4関連障害の治療に用いるパッケージを提供する。本パッケージは、吸入による送達に適した流動性を有する製剤であって、apoE4関連障害を治療するのに十分な量で薬学的に活性なapoE4ドメイン相互作用阻害剤を含んだ製剤を内部に有する容器を含む。いくつかの態様では、パッケージは定量吸入器であり、apoE4ドメイン相互作用阻害剤は噴霧剤を用いて製剤化される。パッケージがエアロゾル製剤を作出する場合、この製剤がエアロゾル化される際に約0.5〜12ミクロンの直径を有する粒子が生成される。いくつかの態様では、パッケージは乾燥粉末吸入器であり、apoE4ドメイン相互作用阻害剤は乾燥粉末製剤に製剤化される。他の態様では、パッケージは噴霧器であり、apoE4ドメイン相互作用阻害剤は水溶液またはエタノール溶液に製剤化される。
【０１７８】
投与量
用いられる投与量は到達しようとする臨床目的に応じて変化するが、適当な投与量の範囲は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質を約1 μg〜約1,000 μgまたは約10,000 μgまで提供するものであり、単回用量にして投与することができる。または、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の標的投与量は、作用物質を投与してから最初の24〜48時間内に採血した宿主の血液サンプル中にて約0.1〜1000 μM、約0.5〜500 μM、約1〜100 μM、または約5〜50 μMの範囲にあると考えることができる。
【０１７９】
用量レベルが特定の化合物、症状の重症度および副作用に対する被験体の感受性に応じて変化しうることを当業者は容易に理解するであろう。所与の化合物に好ましい投与量は、さまざまな手段によって当業者が容易に決定することができる。
【０１８０】
投与経路
apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質はインビボおよびエクスビボの方法、ならびに全身および局所投与経路を含め、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与される。
【０１８１】
薬学的に許容される従来の投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、経直腸、経鼻、経口ならびにその他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、必要に応じて、組み合わされてもよく、または作用物質および/もしくは所望の効果に応じて調節されてもよい。組成物は単回用量にしてまたは複数回用量にして投与することができる。いくつかの態様では、組成物は経口投与される。他の特定の態様では、組成物は吸入経路により投与される。いくつかの態様では、組成物は鼻腔内に投与される。
【０１８２】
作用物質は全身経路または局所経路を含め、従来薬の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路を用いて宿主に投与することができる。一般に、本発明により企図される投与経路は、経腸経路、非経口経路、または吸入経路を含むが、必ずしもこれらに限定されることはない。
【０１８３】
吸入投与以外の非経口投与経路は、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、関節内経路、脊髄内経路、胸骨内、および静脈経路、すなわち、消化管を経由する以外の任意の投与経路を含むが、必ずしもこれらに限定されることはない。非経口投与は、作用物質の全身または局所送達をもたらすよう行なうことができる。全身送達が望ましい場合、投与は典型的には、薬学的調製物の侵襲的投与または全身吸収性の局所もしくは粘膜投与を伴う。
【０１８４】
作用物質は同様に、経腸投与によって被験体に送達することができる。経腸的な投与経路は、経口および経直腸(例えば、坐剤を用いる)送達を含むが、これらに限定されることはない。
【０１８５】
皮膚または粘膜を経由する作用物質の投与方法は、適当な薬学的調製物の局所的塗布、経皮的透過、注射および表皮投与を含むが、必ずしもこれらに限定されることはない。経皮的透過の場合、吸収促進剤またはイオントフォレシスは適当な方法である。イオントフォレシス透過は、数日またはそれ以上の期間にわたり無傷の皮膚を通して電気パルスにより連続的に生成物を送達する市販の「パッチ」を用いて行なうことができる。
【０１８６】
治療とは、少なくとも宿主を苦しめる病態に関連した症状の改善を意味し、ここで改善は、apoE4関連神経障害およびそれに関連した疼痛のような、治療されるべき病態に関連したパラメータ、例えば症状の大きさを少なくとも縮小することをいうように広い意味で使用される。従って、治療は同様に、病態、または少なくともそれに関連した症状が、完全に阻害される、例えば発生が妨害されるか、または停止される、例えば終結され、その結果宿主は最早その病態に、または少なくともその病態を特徴付ける症状に罹患していないような状況を含む。
【０１８７】
さまざまな宿主(ここで「宿主」という用語は、本明細書において「被験体」および「患者」という用語と互換的に使用される)は、本方法によって治療可能である。一般にこのような宿主は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、ここでこれらの用語は、食肉目(例えば、イヌおよびネコ)、齧歯目(例えば、マウス、モルモット、およびラット)、ならびに霊長目(例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル)を含む、哺乳類綱内の生物を記述するために広く使用される。多くの態様では、宿主はヒトであろう。
【０１８８】
例えば、経口用量または注射用量にある、活性作用物質の単位用量を伴うキットが提供される。このようなキットには、単位用量を含有する容器に加えて、関心対象の病態の治療における薬物の用法および付随する恩恵について記述している情報を含んだ添付文書が含まれよう。好ましい化合物および単位用量は本明細書における上記のものである。
【０１８９】
apoE4関連神経障害を治療する方法
本発明はさらに、apoE4神経障害を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量をその必要がある個体に投与する段階を含む、apoE4を合成する宿主細胞においてapoE4ドメイン相互作用を低減する方法を提供する。他の態様では、本発明は細胞外、例えば血清、脳脊髄液中または間質液中に存在するapoE4においてapoE4ドメイン相互作用を低減する方法を提供する。いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、神経突起成長を増大するのに有効なものである。他の態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、卒中後の転帰の改善を生じるものである。いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、神経突起成長の増大に有効なものである。他の態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、外傷性頭部損傷後の転帰の改善を生じるものである。他の態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、アルツハイマー病を発症するリスクを低減するものである。他の態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、アルツハイマー病に関連した症状または現象を低減するものである。これらの態様のいくつかでは、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、神経原線維変化の形成を低減するものである。他の態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、個体に投与された場合に、個体の脳内のアミロイド沈着の減少を生じるものである。
【０１９０】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、神経原線維変化の形成またはAβ沈着のような、ADに関連した症状を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%またはそれ以上低減する。他の態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、記憶または認知機能のような、ADを有する個体において下降中のパラメータを少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%またはそれ以上改善し、その結果、これらのパラメータの1つでの下降が少なくとも減速される。
【０１９１】
神経細胞はapoE4それ自体を産生することができる。あるいは、またはそれに加え、神経細胞は、その環境からapoE4を、例えば、星状膠細胞およびグリア細胞のような支持細胞により産生されかつ間質液へと分泌されたapoE4を取り込むことができる。
【０１９２】
いくつかの態様では、本発明の方法は、apoE4を産生する神経細胞および/またはその環境からapoE4を取り込む神経細胞、すなわちapoE4の検出可能量が認められる神経細胞において、apoE4ドメイン相互作用を低減するのに有効である。本発明の方法を用いた治療に反応しやすい神経細胞は、48時間内に、総細胞タンパク質1 mgあたり約1 ng〜約1000 ng (またはそれ以上)、約5 ng〜約500 ng、約10 ng〜約100 ngのapoE4を産生または取り込むものである。
【０１９３】
他の態様では、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量を個体に投与する段階を含む、個体において神経原線維変化の形成を阻害する方法を提供する。神経原線維変化の形成が阻害されるかどうかは、例えば、アルツハイマー病(AD)の実験動物モデルにおいて判定することができる。ADの実験動物モデルは当技術分野において記述されており; いずれか公知のAD動物モデルを用いて、本発明の作用物質が神経原線維変化の形成を阻害するかどうかを判定することができる。例えば、米国特許第6,046,381号を参照されたい。このような動物モデルは同様に、アミロイド沈着、および認知能力のような他の現象が、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の影響を受けるかどうかを判定するのに使用することができる。apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質が、神経原線維変化の形成および/またはAβ沈着を低減するかどうかも、ヒトにおいて、脳生検標本の免疫組織化学染色を含むが、これに限定されない、任意の公知の方法を用い判定することができる。
【０１９４】
他の態様では、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量を個体に投与する段階を含む、ADを治療する方法を提供する。ADを発症するリスクのあることが分かっている個体は、本発明の方法を用いた治療に反応しやすい。従って、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、apoE4についてヘテロ接合性またはホモ接合性であるが、アルツハイマー病または他の神経変性障害の明白な症状を示していない患者において予防的に用いるのに適している。これらの方法は、ADの症状を既に呈している個体を治療するのにも有用であり、ここでこの方法は、該疾患の進行を低減することによってADを治療し、またはADに関連した症状の重症度を低減する。ADの進行が低減されるかまたはADに関連した症状の重症度が低減されるかどうかは、認知機能および記憶を含むが、これらに限定されない、ADに関連した任意の症状またはパラメータをアッセイすることによって判定することができる。このような判定は、当技術分野において公知の標準方法を用いて十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９５】
いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、卒中患者または外傷性頭部損傷を受けた個体のような、その必要がある個体に投与された場合に、個体に関する臨床転帰を改善するものである。apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質が、卒中または外傷性頭部損傷に罹患した個体に投与された場合に、卒中または外傷性頭部損傷の後の転帰の改善を生じるかどうかは、任意の利用可能な卒中および外傷性頭部損傷の動物モデルを用いて判定することができる。例えば脳虚血により引き起こされた神経損傷のような、神経損傷の齧歯類モデルは、外傷性事象により引き起こされた神経損傷の程度に及ぼすapoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の作用に加え、神経細胞リモデリング、修復およびそのような発作からの回復におけるそれらの役割を判定するために試験することができる。全虚血および限局性虚血の両方の脳虚血の齧歯類モデルは、脳虚血の出現を制御する機序および虚血性事象により引き起こされた損傷の治療に関する可能性のある治療的戦略の研究に有用である。通常一過性である全虚血の動物モデルは、広範に罹患した脳領域を有するが、典型的には選択的に脆弱な脳領域において神経の変質を有する。このようなモデルの例は、前脳虚血の2種の血管閉塞モデル、前脳虚血の4種の血管閉塞モデル、および上昇した脳脊髄液圧に関連した虚血モデルを含むが、これらに限定されることはない。例えば、Ginsberg and Busto, Stroke, 20:1627-1642 (1989)を参照されたい。
【０１９６】
高脂血症に関連したapoE4関連障害を治療する方法
本発明はさらに、上昇した血清脂質レベルに関連したapoE4関連障害を治療する方法を提供する。これらの方法は一般に、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量を個体に投与する段階を含む。
【０１９７】
いくつかの態様では、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質を投与する段階を含む、血清コレステロールレベルを低減する方法を提供する。これらの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、個体に投与された場合に、個体において血清コレステロールレベルを、該作用物質を投与しない個体の血清コレステロールに比べ、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、または少なくとも約50%低減する。一般に、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量は、少なくとも、血清コレステロールレベルを正常の範囲内にあるように低減するのに有効である。血清コレステロールの正常範囲は、個体の性別および年齢に加え、他の要因に応じて変わるであろう。成人の場合、血清コレステロールの正常範囲は、約200〜約240 mg/dLである。「上昇した血清コレステロールレベル」は、同様に個体の年齢および性別に応じて決まる。従って、例えば、血清コレステロールレベルが240 mg/dLを超える成人は、上昇した血清コレステロールレベルを有するとみなされる。いくつかの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量は、血清コレステロールレベルを240 mg/dL未満に低減するのに有効なものである。
【０１９８】
他の態様では、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質の有効量を個体に投与する段階を含む、個体が冠動脈疾患(CAD)またはアテローム動脈硬化症を発症するリスクを低減する方法を提供する。これらの態様では、apoE4ドメイン相互作用を低減する作用物質は、CADまたはアテローム動脈硬化症を発症するリスクを、該作用物質で治療されていない個体に関連するリスクと比べ、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、または少なくとも約50%またはそれ以上低減する。
【０１９９】
本発明の方法による治療に反応しやすい個体には、apoE4を発現しているため、CADを発症するリスクのあることが分かっている個体; apoE4を発現しかつ上昇した血清コレステロールレベルを有する個体; およびapoE4を発現しかつ1種または複数種の心臓事象を有した個体が含まれる。
【０２００】
神経細胞成長に影響を及ぼす化合物を検出するアッセイ
アポリポタンパク質Eの異なるアイソフォームの示差的発現は、神経細胞成長に影響を及ぼす。いくつかの態様では、本発明のアッセイは、神経細胞成長に影響を及ぼす化合物を判定するために、アポリポタンパク質Eの異なるアイソフォームの示差的発現を利用する。他の態様では、本明細書において記述されるアッセイは、apoE4ドメイン相互作用を低減する化合物を同定する。本発明のアッセイにより同定された化合物は、神経学的疾患、特にアポリポタンパク質のアイソフォームの異常な示差的発現が存在するような疾患の治療に有用な組成物に製剤化される。本発明の背後にある理論に加え本発明の具体例に関する詳細を、以下に提供する。しかし本発明は、このような理論または例に限定されるものではない。
【０２０１】
神経細胞において、細胞骨格は神経突起の伸張および退縮において機能する。それ故に、本明細書においておよび他者ら(Handelmann (1992); およびNathan et al. (1994) Science 264:850-852)によって記述されている研究は、神経突起の伸張および枝分かれに及ぼすapoE3およびapoE4のアイソフォーム特異的な作用に焦点を当てている。種々のapoEアイソフォームは、細胞内の細胞骨格装置を調節し、神経突起の伸張および枝分かれを変化させる。種々のapoEアイソフォームがいかにして細胞骨格を変化させるかを理解することで、(1) 神経原線維変化の形成のプロセス、および(2) 晩年のシナプス連結のapoE誘導性のリモデリングの制御に関する情報をもたらす。インビボにおいて神経突起の伸張を刺激する化合物は、中枢神経系でも末梢神経系でもともに神経細胞リモデリングの間の神経再生またはシナプス連結の形成を促進する可能性が高い。
【０２０２】
神経成長に及ぼす作用がないか化合物をスクリーニングするため、特異的なアッセイが開発されている。さらに、このアッセイは、細胞表面HSPGに影響を及ぼし、これによってapoE3およびapoE4の示差的な細胞蓄積をもたらす化合物をスクリーニングすることを可能にする。ヒトapoE3 対 ヒトapoE4の作用の比較から、神経突起成長に及ぼす著しく示差的なアイソフォーム特異的作用が示された。対照と比べて、ヒトapoE3に加えβ-VLDLでは神経突起伸張の増大が生じたが、apoE4に加えβ-VLDLでは神経突起の枝分かれおよび伸張の双方での顕著な減少が生じた。Nathanら(1995)により示された結果から、apoE4に加えβ-VLDLとともにインキュベートされた後根神経節神経細胞は、非常に短い、発育不良の神経突起を示したことが明らかにされている。これはapoE4の毒性作用ではなかった。apoE4含有培地を新鮮なapoE4欠損培地に交換すると、神経突起伸張をもたらす神経細胞の能力が回復したからである。さらに、apoE3およびapoE4特異的な作用は、(1) apoEの受容体結合ドメインに対する抗体、または(2) 重要なリジン残基の還元的メチル化により遮断されたことから、apoEのこの作用が受容体媒介性、またはHSPG媒介性であることが示唆された。
【０２０３】
中枢神経系由来のNeuro-2a細胞を用いて、上記の末梢神経系神経細胞に及ぼすapoEの作用を皮質神経細胞に及ぼす作用と比較した。両タイプの細胞はapoEに同様に反応する。脂質供給源を併用した場合、apoE3は神経突起伸張を刺激したのに対し、apoE4は神経突起伸張を阻害した。Nathan et al. (1994) Soc. Neurosci. 20 (Part 2): 1033 (要約); およびNathan et al. (1995)。β-VLDLを伴わない遊離apoE3またはapoE4の添加では、神経突起成長に影響がなかった。これらの結果から、神経細胞に及ぼすapoEの作用には、リポタンパク質受容体を介した、apoEまたはapoEおよび脂質の組合せの取り込みが必要になることが示唆される。脂質がないと、apoEはLDL受容体またはLRPのいずれにも結合しない。対照的に、別の研究において、Holtzmanらは、異なる神経細胞系を用いて、β-VLDLを伴うapoE3は、神経成長因子誘導性の神経突起成長を刺激したのに対し、apoE4では影響がないことを実証した。Holtzman et al. (1995) Soc. Neurosci. 21 (要約): 1009, 400.10。
【０２０４】
より低レベルの内因的に産生されたapoEがNeuro-2a細胞からの神経突起成長に影響を及ぼすかどうかを判定するため、以下に示した例のなかで、これらの神経細胞にapoE3またはapoE4をコードするヒトapoE cDNA構築体をトランスフェクトした。等量のapoE3またはapoE4 (apoE約50〜60 ng/mg細胞タンパク質/48時間)を分泌するトランスフェクト細胞のクローンを比較のために選択した。無血清対照培地中で増殖されたapoE3およびapoE4分泌細胞は、同程度の有限な神経突起伸張を示した。しかしながら、脂質供給源(β-VLDL)を培地に添加した場合、これらの細胞は顕著に異なる増殖パターンを示した。apoE3分泌細胞は、apoE4分泌細胞が示すよりも大きな神経突起伸張を示した。このように、非常に低レベルの内因的に産生されたapoEであっても脂質供給源を伴うことで、apoE3 対 apoE4の示差的作用が明らかになった。種々の組成物の脂質乳剤、および脳脊髄液リポタンパク質はβ-VLDLに代えて用いられてもよく、細胞のための脂質供給源としてまたはapoEを特異的な細胞内経路に輸送するための媒体として働くように思われる。本明細書において示される例から、神経突起成長に及ぼすapoEの作用がLRP、または類似のapoE4結合受容体を通じて媒介されること、およびこの相互作用を遮断することでまたは効果的に阻止することで、apoEによる神経突起成長阻害が阻害されることが明らかである。
【０２０５】
従って、本発明はapoE4およびapoE結合受容体、例えば、LRPの相互作用を阻害することにより、apoE4による神経細胞リモデリング阻害を低減する能力がないか化合物をアッセイすることに関する。このアッセイ法を介して見出された化合物は、神経細胞リモデリングでのapoE4の阻害を妨げるようにドメイン相互作用を変化させることで、apoE4の機能を改変する可能性がある。apoE4中のグルタミン酸-255とのアルギニン-61の相互作用を遮断する任意の作用物質を、このアッセイにおいてスクリーニングすることができよう。apoE4でのドメイン相互作用の遮断は、apoE4を「apoE3様」分子に転換し、これによって神経突起伸張に及ぼすapoE4の望ましくない作用を鈍らせる。これは同様に、apoE4の結合選択性をVLDLからHDLに切り換える作用も有することがある。
【０２０６】
アッセイでは、神経突起成長に及ぼす任意の作用を有する化合物をスクリーニングすることができるが、これらの化合物は、神経突起成長のapoE4阻害を少なくとも約10%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約90%低減するかどうかをスクリーニングすることができる。神経突起成長に及ぼす作用は、例えば、本明細書において記述されている方法により測定することができる。
【０２０７】
本発明のアッセイは、apoE4が神経細胞のLRPまたは他のapoE結合受容体と効果的に相互作用できないようにする化合物をスクリーニングするために使用することができる。この妨害はHSPGおよび/もしくはLRP相互作用で、またはよりapoE3様となるようにその機能を改変することで導くことが可能であり、直接的もしくは間接的に結合を遮断し、またはさもなければapoE4の結合によって誘導されたシグナル伝達を阻止しうる。従って、アッセイでは、これらの経路のいずれかにより神経突起成長の阻害を阻止する化合物をスクリーニングする。すなわち、本発明は、apoE4およびHSPGもしくはLRP、または他のapoE結合受容体の効果的な相互作用を阻止するタンパク質全体、その任意の機能的部分、類似体またはホモログを含む。スクリーニングされる化合物には、例えば、apoE4およびLRPの相互作用を効果的に遮断するその能力に実質的に影響しない、RAPもしくはラクトフェリンおよび他の公知のLRPリガンド、または他のapoE結合受容体のアミノ酸配列の変化がある。
【０２０８】
本発明は同様に、apoE4とLRPおよびLDL受容体ファミリーの他のメンバーとの相互作用を低減する治療的作用物質を検出する方法を包含する。これらの方法はインビトロでのリガンドブロッティング技術を含む。これは、例えば、非還元性ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による細胞膜タンパク質(これはLRPを含む)または膜タンパク質から部分的に精製されたLRPの分離およびニトロセルロース膜への転写によって行うことができる。LRPの部分的精製の方法は、例えば、Schneider et al. (1985) Methods Enzymol. 109:405-417により記述されている。この膜を次いで、apoEおよび例えばビオチン化により標識されているリポタンパク質(例えば、β-VLDL)とともにインキュベートする。apoE-β-VLDL複合体の膜との結合をその後、この標識を検出する試薬を用いて可視化する。相互作用を遮断する能力がないか試験される作用物質をapoEおよびβ-VLDLとともにニトロセルロースに添加して、相互作用が遮断されるかどうかを判定する。
【０２０９】
FRETに基づくアッセイ
本発明はさらに、細胞外および/または細胞内に存在するapoE4のドメイン相互作用を阻害する化合物を同定するインビトロでの細胞に基づくアッセイを提供する。本方法は単一サンプル中の細胞内でのおよび細胞外での(培地中での)apoE4ドメイン相互作用のかく乱の検出をもたらす。
【０２１０】
FRETは、励起状態にある供与体(donor)フルオロフォアからの近くの受容体(acceptor)フルオロフォアへのエネルギーの移動を伴う。この移動が起こるためには、供与体および受容体分子はすぐ近くに(例えば、10ナノメートル未満離れたところに、通常は10〜100オングストローム離れたところに)なければならず、供与体フルオロフォアの発光スペクトルは受容体フルオロフォアの励起スペクトルに重なっていなければならない。
【０２１１】
本アッセイでは、図30に図示的に示されるように、供与体フルオロフォアはapoE4のC末端ドメインの位置にまたは近くに付着され、受容体フルオロフォアはapoE4のN末端ドメインの位置にまたは近くに付着される。あるいは、供与体フルオロフォアはapoE4のN末端ドメインの位置にまたは近くに付着され、受容体フルオロフォアはapoE4のC末端ドメインの位置にまたは近くに付着される。apoE4ドメイン相互作用阻害剤の非存在下では、FRETが起こり、この際に供与体フルオロフォアの励起から生じる発光が受容体フルオロフォアを励起し、結果的に受容体フルオロフォアからの蛍光発光を引き起こす。関心対象の候補apoE4ドメイン相互作用阻害剤である試験化合物は、試験化合物の非存在下での受容体フルオロフォアからの発光レベルと比べて、受容体フルオロフォアからの発光を少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上低減する。関心対象の阻害剤は、試験細胞の生存能に顕著な影響を与えないものであり、例えば、関心対象の阻害剤は、試験細胞の生存能を約15%未満、約10%未満、約5%未満、約2%未満、または約1%未満低減する。
【０２１２】
本方法は全体として、インビトロの試験細胞を試験作用物質と接触させる段階; ならびにapoE4ポリペプチドが細胞内におよび/または細胞外に(培地中に)存在するapoE4のドメイン相互作用に及ぼす試験作用物質の、もしあれば、作用を判定する段階を含む。試験細胞は、apoE4ドメイン相互作用の阻害剤の非存在下においてFRETが起こるように、蛍光供与体および蛍光受容体がapoE4ポリペプチドに付着されている蛍光供与体および蛍光受容体を含んだapoE4ポリペプチドを産生するものである。多くの態様では、試験細胞は、蛍光供与体および蛍光受容体タグの付いたapoE4をコードするヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターで遺伝的に改変されているものである。例えば、多くの態様では、試験細胞は、N末端からC末端の順序で、蛍光受容体ポリペプチド、apoE4、および蛍光供与体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターで遺伝的に改変されているものである。または、試験細胞は、N末端からC末端の順序で、蛍光供与体ポリペプチド、apoE4、および蛍光受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターで遺伝的に改変されているものである。他の態様では、試験細胞は、蛍光的にタグ付けされたapoE4ポリペプチドが細胞の細胞質に存在するように、蛍光受容体および供与体色素タグの付いたapoE4ポリペプチドが導入されているものである。
【０２１３】
関心対象の阻害剤は、蛍光的にタグ付けされたapoE3ポリペプチドのFRETに顕著な影響を与えないものである。例えば、関心対象の阻害剤はFRETを、蛍光的にタグ付けされたapoE3ポリペプチドの約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約2%未満、またはそれ以下低減する。従って、例えば、蛍光供与体をN末端の位置にまたは近くにおよび蛍光受容体をC末端の位置にまたは近くに含むapoE3ポリペプチドは、apoE4に対する阻害剤の特異性の対照として役立つ。あるいは、蛍光的にタグ付けされたapoE3対照ポリペプチドは、蛍光供与体をC末端の位置にまたは近くにおよび蛍光受容体をN末端の位置にまたは近くに含む。対照細胞は従って、いくつかの態様では、蛍光的にタグ付けされたapoE3ポリペプチドを産生するであろう。対照細胞は、多くの態様では、試験細胞と同じ細胞型(例えば、同じ細胞系)であるが、蛍光的にタグ付けされたapoE3ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターで遺伝的に改変されているであろう。例えば、多くの態様では、対照細胞は、N末端からC末端の順序で、蛍光受容体ポリペプチド、apoE3、および蛍光供与体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターで遺伝的に改変されているものである。または、対照細胞は、N末端からC末端の順序で、蛍光供与体ポリペプチド、apoE3、および蛍光受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターで遺伝的に改変されているものである。他の態様では、対照細胞は、蛍光的にタグ付けされたapoE3ポリペプチドが細胞の細胞質に存在するように、蛍光受容体および供与体色素タグの付いたapoE3ポリペプチドが導入されているものである。
【０２１４】
適当な受容体および供与体としては、蛍光タンパク質または色素、例えばMatz et al., Nature Biotechnology (October 1999) 17:969-973に記述されている蛍光タンパク質、例えば、開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,066,476号、同第6,020,192号、同第5,985,577号、同第5,976,796号、同第5,968,750号、同第5,968,738号、同第5,958,713号、同第5,919,445号、同第5,874,304号に記述されているオワンクラゲ(Aequoria victoria)由来の緑色蛍光タンパク質またはその蛍光変異体; 黄色蛍光タンパク質; 開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,746号、同第5,700,673号、同第5,674,713号、同第5,618,722号、同第5,418,155号、同第5,330,906号、同第5,229,285号、同第5,221,623号、同第5,182,202号に記述されているものを含め、その他の蛍光色素、例えば、クマリンおよびその誘導体、例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、Bodipy FLのようなボディピー色素、カスケードブルー、フルオレセインおよびその誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン、ローダミン色素、例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオジンおよびエリスロシン、シアニン色素、例えばCy3およびCy5、ランタニドイオンの大環状キレート、例えばカンタム(quantum)色素など、化学発光色素、例えば、ルシフェラーゼが挙げられる。適切な蛍光供与体および蛍光受容体の選択は、十分に当業者の技術レベルの範囲内である。
【０２１５】
本アッセイは細胞に基づくアッセイである。多種多様な細胞のどれも本アッセイで用いるのに適している。これらの細胞は一般に、真核細胞、例えば、標準的な培養条件下でインビトロにおいて単細胞性実体として増殖する細胞である。適当な細胞の非限定的な例としては、Neuro-2a細胞、CHO細胞、COS細胞、酵母細胞(例えば、サッカロマイセスセレヴィシェ(Saccharomyces cerevisiae)、Picchia等)などが挙げられる。
【０２１６】
試験作用物質の存在下または非存在下での試験細胞を蛍光発光について分析する、例えば、FRETシグナルを検出する。FRETシグナルは、蛍光供与体の励起後の蛍光供与体蛍光強度に対する蛍光受容体の割当量として計算される。試験細胞の培地中でのFRETシグナル、および試験細胞中でのFRETシグナルを単一の細胞において測定することができる。MTTアッセイを試験細胞の同一サンプルにおいて行って、試験細胞の生存能に及ぼす試験化合物の、もしあれば、作用を判定することもできる。
【０２１７】
本発明のアッセイはハイスループット形式に適している。例えば、試験細胞を、適当な培地中、マルチウェルプレート(例えば、96ウェル、192ウェルプレート、384ウェルプレートなど)のウェルに入れる。
【０２１８】
「候補作用物質」、「試験作用物質」、「作用物質」、「物質」および「化合物」という用語は、本明細書において互換的に使用される。候補作用物質は数多くの化学的分類、典型的には合成、半合成、または天然の無機もしくは有機分子を包含する。候補作用物質には、合成または天然化合物の大規模ライブラリーに見出されるものが含まれる。例えば、合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、ComGenex (South San Francisco, CA)、およびMicroSource (New Milford, CT)から市販されている。稀有な化学物質ライブラリーはAldrich (Milwaukee, Wis.)から入手可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーはPan Labs (Bothell, WA)から入手可能であり、または容易に作製可能である。
【０２１９】
候補作用物質は、50ダルトンよりも高く約2,500ダルトンよりも低い分子量を有する低分子量の有機または無機化合物とすることができる。候補作用物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでよく、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を少なくとも1つ含んでよく、このような化学官能基のうち少なくとも2つを含んでもよい。候補作用物質が、上記の官能基のうち1つまたは複数によって置換された、環状炭素もしくは複素環式構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでもよい。候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む、生体分子からも見出される。
【０２２０】
本発明のアッセイは対照を含み、適当な対照には試験作用物質の非存在下でのサンプル(例えば、試験細胞を含むサンプル)が含まれる。一般に複数のアッセイ混合を種々の作用物質濃度と並行して行って、さまざまな濃度に対する種々の反応を得る。典型的には、これらの濃度のうち1つが陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満としての役割を果たす。
【０２２１】
神経障害
本明細書において記述されているアッセイにより見出された化合物は、広範な障害に罹患した患者に治療薬を提供するよう製剤化される。例えば、神経変性または低酸素症に罹患した患者を治療することができる。神経変性はアルツハイマー病、外傷、ウイルス感染症、遺伝的酵素欠損症、年齢に関連した認知力低下、およびプリオン病を含むが、これらに限定されない、いくつかの原因から生じうる。神経変性を引き起こしうるウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびエプスタインバーウイルスを含むが、これらに限定されることはない。神経変性を引き起こしうる遺伝的酵素欠損症は、テイ-サックス病を引き起こすβ-N-アセチルヘキソサミニナーゼの欠損を含むが、これらに限定されることはない。年齢に関連した認知力低下は、例えば、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth ed., Washington D. C. American Psychiatric Association (1994)に記述されている。プリオン病は、クールー病およびクロイツフェルトヤコブ病を含むが、これらに限定されることはない。低酸素症は一般に、卒中の結果であるか、または一過性であり、溺水、気道閉塞または一酸化炭素中毒の事例に関連している。
【０２２２】
神経細胞リモデリングは、それ以外は健常な患者においても重要である。それ故に、該アッセイにより同定された化合物は、apoE4についてヘテロ接合性またはホモ接合性であるが、アルツハイマー病または他の神経変性障害の明白な症状を示していない患者において予防的に用いるのに適しているかもしれない。
【０２２３】
本発明の神経突起成長アッセイはRAP、ヘパリナーゼおよびラクトフェリンのような、その全てがapoE4による神経突起成長阻害を低減するまたは消失させる、糖タンパク質を含めた潜在的な治療薬を同定するために使用された。本発明のアッセイでは、apoE4に特異的に結合しかつそのドメイン相互作用を妨害する化合物、例えば、小分子および抗体を同定することができる。ドメイン相互作用をかく乱する作用物質は、apoE4のアルギニン-61またはグルタミン酸-255に結合するようデザインされている小分子、糖タンパク質、ペプチドおよび抗体を含むが、これらに限定されない、多種多様な分子から選択することができる。このドメイン相互作用をかく乱する作用物質のスクリーニングのための特異的アッセイは、以下の実施例3および実施例7に記述されている。本発明のアッセイは、apoE4がapoE3活性を示すかどうかを判定するものを含む。
【０２２４】
ヘパリナーゼまたは他のHSPG修飾物質は、神経細胞リモデリングに及ぼすapoE4の作用を改善するうえでインビトロにおいて有効である。しかし、それらの多面的な作用は、これらをヒト治療に不適当なものにしている。本発明のアッセイを用いてHSPG類似体のような、apoE4に結合して、神経細胞とのapoE4の結合を妨害するが、実質的に多面的な作用を及ぼすことのない、潜在的に有効な治療的作用物質を同定することができる。
【０２２５】
このRAPは、ヒトでは見かけの分子量39 kDを有する糖タンパク質である。RAPは、ともにLDL受容体遺伝子ファミリーのメンバーであるgp330およびLRPと特異的に結び付く。種々のRAPおよびそのホモログが報告されており、それらの機能ドメインがマッピングされている。総説については、Orlando et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3161-3165; およびWarshawsky et al. (1995) Biochem. 34:3404-3415を参照されたい。RAP、およびその一部は、LRPのそのリガンドt-PAおよびI2-マクログロブリン-プロテアーゼ複合体との結合を遮断することが知られている。Warshawsky et al. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sci. pp. 514-517。
【０２２６】
ラクトフェリン
ラクトフェリンはLRP、gp330、およびHSPGに結合することが示されている。Willnow et al. (1994) J. Biol. Chem. 267:26172-26180;, Mahley et al. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 737:39-52; およびJi et al. (1994a) Arterioscler. Thromb. 14:2025-2032。ラクトフェリンは、LRPとの結合により血流から除去されるように思われる。Meilinger et al. (1995)。ラクトフェリンはLRPおよびHSPGの双方とのリガンドの結合を遮断し、HSPG-LRP経路を遮断する。これは明らかに、HSPG上の負に帯電した基およびLRPのリガンド結合ドメイン中の負に帯電したアミノ酸とのラクトフェリン上の正電荷の集中領域の相互作用を介して生じる。
【０２２７】
抗体
apoEに特異的な抗体はapoE4による神経細胞リモデリング阻害を遮断する。本発明のアッセイは、apoE4またはLRPのいずれかに対する抗体をスクリーニングして、治療的に可能な有用性を判定するために使用することができる。このアッセイはLRPとの結合を阻害することによるか、いっそうapoE3様となるようにapoE4の機能を改変することによるかを問わず、抗体をスクリーニングして、apoE4の神経細胞リモデリング阻害作用を阻害するものを見出すことができる。好ましい抗体はモノクローナル性であり、apoE4アイソフォームに特異的であって、apoE3またはapoE2には特異的でない。「抗体」という用語は同様に、その機能的部分および等価物を含む。例えば、抗体は、抗体全体が結合特異性を有するエピトープとの結合をもたらすのに十分な軽鎖可変領域の部分からなる任意の単一特異性化合物を含む。これらの断片は、少なくとも1本の重鎖または軽鎖免疫グロブリンペプチドの可変領域を含むことができ、これにはFab断片、Fab2断片、およびFv断片が含まれるが、これらに限定されることはない。さらに、抗体の単一特異性ドメインは組換え操作によって産生することができる。このような組換え分子は、細菌において産生された断片、およびマウス定常領域の大部分がヒト抗体定常領域と交換されているマウス抗体を含むが、これらに限定されることはない。
【０２２８】
治療的作用物質の送達
本発明のアッセイによって、化合物が潜在的な治療薬としてある種の特徴を有することが明らかにされた後に、該化合物がインビボでの治療的利用性を有するかどうかを判定することは当業者の技術の範囲内である。治療的作用物質の送達に適した投与剤形に製剤化することも、当業者の技術の範囲内である。送達部位が脳である場合、治療的作用物質は脳に送達されることが可能でなければならない。
【０２２９】
血液脳関門は多くの治療的作用物質の、全身循環からの脳および脊髄への取り込みを制限する。血液脳関門を通過する分子は2つの主な機構: 自由拡散; および促進輸送を使う。血液脳関門の存在のため、CNSにおける所与の治療的作用物質の有益な濃度を得るには、薬物送達戦略の使用が必要になることがある。治療的作用物質のCNSへの送達は、いくつかの方法により達成することができる。
【０２３０】
1つの方法は、神経外科技術に依る。事故の犠牲者のような危篤患者または種々の形態の認知症に罹患した患者の場合、外科的介入がその付帯リスクにもかかわらず正当化されている。例えば、治療的作用物質は、薬物の脳室内または髄腔内注射のような、CNSへの直接の物理的導入によって送達することができる。脳室内注射は、例えば、Ommaya貯留器のような貯留器に取り付けられている脳室内用カテーテルによって容易にすることができる。導入法は、再充填可能なまたは生分解可能な装置によりもたらすこともできる。別の手法は、血液脳関門の透過性を増大する物質による血液脳関門の破壊である。例としては、マンニトールのような拡散性に乏しい作用物質、エトポシドのような脳血管の透過性を増大する医薬品、またはロイコトリエンのような血管作用性物質の動脈内注入が挙げられる。Neuwelt and Rappoport (1984) Fed. Proc. 43:214-219; Baba et al. (1991) J. Cereb. Blood Flow Metab. 11 :638-643; およびGennuso et al. (1993) Cancer Invest. 11:638-643。
【０２３１】
さらに、治療が必要な領域へ局所的に薬学的作用物質を投与することが望ましいこともある; これは、例えば、手術中の局所注入により、注射により、カテーテルによって、またはインプラントによって達成することができ、該インプラントはシラスティック膜のような膜、もしくは繊維を含めて、多孔質、非孔質、またはゼラチン様物質のものである。
【０２３２】
治療的化合物は、化学的修飾または血液脳関門を通過しうる類似体のスクリーニングを含め、薬理学的手法を用いることにより送達することもできる。この化合物を修飾して、分子の疎水性を高めるか、分子の正味荷電もしくは分子量を減らすか、または血液脳関門を越えて通常輸送されるものに似るように分子を修飾するかしてもよい。Levin (1980) J. Med. Chem. 23:682-684; Pardridge (1991)中: Peptide Drug Delivery to the Brain: およびKostis et al. (1994) J. Clin. Pharmacol. 34:989-996。
【０２３３】
リポソームのような疎水性環境に薬物を封入することも、薬物をCNSに送達するうえで効果的である。例えば、国際公開公報第91/04014号では、血液脳関門を越えて通常輸送される分子が付加されたリポソームのなかに、薬物が封入されているリポソーム送達系について記述している。
【０２３４】
血液脳関門を通過するよう薬物を製剤化する別の方法は、薬物をシクロデキストリンに封入することである。J-シクロデキストリン、K-シクロデキストリンおよびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない、血液脳関門を通過する任意の適当なシクロデキストリンを利用することができる。全般的には、米国特許第5,017,566号、同第5,002,935号および同第4,983,586号を参照されたい。このような組成物は同様に、米国特許第5,153,179号により記述されているグリセロール誘導体を含むことができる。
【０２３５】
送達は、治療的作用物質の輸送可能な作用物質への結合によって、新規の輸送可能な治療的キメラ作用物質を得ることにより行うこともできる。例えば、血管作用性腸管ペプチド類似体(VIPa)はその血管作用性の効果を、特異的担体分子トランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体(Mab)への結合後にのみ発揮し、これにより血液脳関門を通じたVIPa-Mab複合体の取り込みが容易になった。Pardridge (1991); およびBickel et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:2618-2622。いくつかの他の特異的輸送系が同定されており、これらにはインスリン、またはインスリン様成長因子IおよびIIを輸送するためのものが含まれるが、これらに限定されることはない。その他の適当な非特異的担体には、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。ある種のプロドラッグは、それにより、中枢神経系への侵入時に、薬物が担体から切断されて活性な薬物を放出することが記述されている。米国特許第5,017,566号を参照されたい。
【０２３６】
実施例
以下の例は、本発明を行うおよび使う方法の完全な開示および記述を当業者に提供するために示されており、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものでも、以下の実験が、行われた全てのまたは唯一の実験であることを表すと意図するものでもない。使用した数字(例えば、量、温度など)に関して精度を保証するように努力したが、若干の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指定のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、および圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。標準的な略語、例えば、bp、塩基対; kb、キロベース; pl、ピコリットル; sまたはsec、秒; min、分; hまたはhr、時間; aa、アミノ酸; kb、キロベース; bp、塩基対; nt、ヌクレオチド; i.m.、筋肉内の(に); i.p.、腹腔内の(に); s.c.、皮下の(に)などが使用されていることがある。
【０２３７】
実施例1: LRPとのapoEの相互作用および神経突起成長に及ぼす作用
材料
ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、DME/F12 (ダルベッコの栄養素改変イーグル培地およびハム混合液F12の1:1混合液)、培地補完物(プロゲステロン、プトレスシン、セレナイトおよびトランスフェリン)、塩素酸ナトリウム、ヘパリナーゼ、ラクトフェリン、トリオレイン、および卵黄ホスファチジルコリン(XI-E型)はSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から購入し、ウシ胎仔血清(FBS)およびインスリンはGibco (Grand Island, NY)から、スラミンはMiles Inc. (FBA Pharmaceuticals, West Haven, CT)から、ならびにDiIはMolecular Probes Inc. (Eugene, OR)から購入した。Neuro-2aはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection) (Rockville, MD)から購入した。ウシCSFはPel-Freez, Inc. (Fayetteville, AR)から入手した。
【０２３８】
リポタンパク質およびリポソームの調製
ウサギβ-VLDL (d＜1.006 g/ml)はKowal (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5810-5814により記述されている方法に従って、高脂肪、高コレステロール飼料で4日間飼育したニュージーランド白ウサギの血漿から単離した。ウサギVLDL (d＜1.006 g/ml)を、通常のウサギ固形飼料で飼育したウサギから得た絶食血漿から超遠心により単離した。このVLDLは、超遠心分離により1回洗浄し、d=1.006 g/mlであった。ウシCSFリポタンパク質(d＜1.21 g/ml)をPitas et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:14352-14360により記述されている方法に従って、超遠心により単離した。これらをd=1.21 g/mlの溶液により再遠心分離することで1回洗浄した。イヌのapoE HDLC (d=1.006〜1.02 g/ml)はMahley et al. (1977) Am. J. Pathol. 87:205-226により記述されている方法に従って、水素化ココナッツ油およびコレステロールを含有する半合成飼料で飼育したフォックスハウンドの血漿から超遠心分離およびPevikon電気泳動により単離した。β-VLDLをBilheimer et al. (1972) Biochim. Biophys. Acta 260:212-221により記述されている方法に従ってヨウ素化し、遊離ヨウ素をPD10カラムクロマトグラフィーにより除去した。
【０２３９】
DMPC媒体は、本質的にInnerarity et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:4186-4190により記述されている方法に従って調製した。DMPC単独(90 mg)でまたはコレステロールを添加(10 mg)してベンゼンに溶解し、凍結乾燥により乾燥した。凍結乾燥した材料をその後、0.15 M NaCl、10 mM Tris-Cl、および1 mM EDTA (pH 7.6) 3 mlに再懸濁し、マイクロチップを装着したソニファイアー・セル・ディスラプター(Branson 450, Danbury, CT)を用いフル設定7 (50ワット)により、37℃で30分間超音波処理した。Innerarity (1979)、前記。この材料を2,000 rpm (37℃)で10分間遠心分離し、上清を細胞への添加に用いた。脂質乳剤AをPittman et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:2435-2442; およびSpooner et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:1444-1453により記述されている方法に従って調製した。手短に言えば、脂質を以下の比率: トリオレイン100 mgおよび卵黄ホスファチジルコリン25 mgで混合し、次に窒素流の下で乾燥した。次にこのペレットを10 mM Tris-Cl、0.1 M KCl、および1 mM EDTA (pH 8.0)緩衝液5 mlに再懸濁し、Spooner et al. (1988)により記述されている方法に従って超音波処理した。この材料をその後、2,000 rpmで10分間遠心分離した。最終的な乳剤の組成は、トリオレイン:ホスファチジルコリン2.7:1 (wt:wt)であった。この乳剤粒子のサイズおよび形態を電子顕微鏡ネガティブ染色法により判定した。
【０２４０】
発現ベクターの調製
発現ベクターはpBSSKプラスミド(Stratagene, La Jolla, CA)において組み立てた。この構築体はラットの神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター(Dr. J. G. Sutcliffe, Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CAによって親切にも提供していただいた)を含んでおり、これはトランスジェニックマウスにおいてヒトアミロイド前駆体タンパク質およびβ-ガラクトシダーゼの神経細胞特異的な発現を指令するため以前に使用されている。Quon et al. (1991) Nature 352:239-241; およびForss-Petter (1990) Neuron 5:187-197。さらに、この構築体にはapoE cDNAの前に、ヒトapoE遺伝子の第一エキソン(非コード)、第一イントロン、および第二エキソンの(開始メチオニンの前の)最初の6塩基が含まれた。
【０２４１】
apoE4構築体は、これが第三イントロンも含むこと以外には同一であった(図1)。第四エキソンの非コード領域はcDNAの下流であり、それにポリアデニル化シグナルを含むヒトapoE遺伝子の3'-フランキング配列112 bpが続いた。これらの発現ベクターに挿入するためのapoE構築体はJ. David Gladstone InstitutesのDr. S. LauerおよびDr. J. Taylorによって親切にも提供していただいた。cDNAの方向はApplied Biosystems社の自動配列決定装置を用いて、配列決定することにより確認した。最終構築体をNSE-E3 (apoE3 cDNAの場合)およびNSE-E4 (apoE4 cDNAの場合)と称した(図1)。プラスミドDNAはSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.により記述されている方法に従って、2ラウンドの塩化セシウム勾配超遠心分離により精製した。これらの構築体を試験するため、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎293細胞を(リポフェクチンを介して)一過性にトランスフェクトし、培地中のapoE濃度を、下記のように測定した。apoE3およびapoE4の同様の発現レベルが達成された。
【０２４２】
安定的にトランスフェクトされたNeuro-2a細胞系の産生
集密度20〜30%の細胞にpSV2neoおよびNSE-E3またはNSE-E4のいずれかを、本質的にはChen et al. (1988) BioTechniques 6:632-638により記述されているリン酸カルシウム沈降プロトコルを用いて共トランスフェクトした。同じプロトコルに従って、対照細胞にpSV2neoのみをトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトした細胞を10% FBSおよび400 μg/mlのG418 (Geneticin, Gibco)の入ったDME/F12培地中での増殖により選択した。個々のG418耐性コロニーを選択し、増殖した。トランスフェクト細胞によるヒトapoE3またはapoE4の分泌は、馴化培地のウエスタンブロッティングにより検証した。
【０２４３】
apoE定量
細胞内の、細胞表面結合型の、および分泌型のapoEはβ-VLDL (1 mlあたりコレステロール40 μg)を添加しまたは添加せずに、N2培地、血清不含および脂質不含培地(Bottenstein et al. (1980) Exp. Cell Res. 129:361-366に記述の増殖補完物を含有するDME/F12)の中で96時間維持した細胞において定量した。この培地は48時間で1回交換した。報告の分泌型apoEは、2回目の48時間のインキュベーション後の培地中に存在するものである。この培地を収集し、プロテアーゼ阻害剤の添加後、遠心分離して細胞浮遊液を除去した。細胞単層をPBSで洗浄し、25 mM Hepesおよび10 mMスラミン、つまり細胞表面に結合しているapoEを放出できる多価陰イオンを含有するDMEM/F12 2 mlとともに、4℃で1時間インキュベートした。Ji et al. (1994)。50 μg/mlの薫蒸シリカ(Sigma, St. Louis, MO)の添加および10分間13,000×gでの遠心分離により、apoEを培地およびスラミン抽出物から沈降させた。
【０２４４】
各ペレットを滅菌水で3回洗浄し、ゲル負荷用緩衝液に溶解した。表面結合型apoEのスラミン除去の後、STEN緩衝液(150 mM NaCl、2 mM EDTA、1% NP-40、20 mM PMSF、および5 μg/mlロイペプチンを含有する50 mM Tris-Cl、pH 7.6)を用いて、細胞のapoEを細胞から抽出した。Ji et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13429-13436により記述されている方法に従い、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する5〜20%のポリアクリルアミド勾配ゲルでサンプルを電気泳動した。これらのタンパク質をブロッティングによりニトロセルロース紙に転写し、ウサギにおいて産生された抗ヒトapoEポリクローナル抗血清(Dr. K. H. Weisgraber, Gladstone Institutesによって気前よく提供していただいた) (1,000分の1希釈)で処理した。ニトロセルロースイムノブロットをその後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されているロバ抗ウサギ二次抗体(5,000分の1希釈) (Amersham, Arlington Heights, IL)とともにインキュベートした。未結合の抗体を除去するため洗浄した後に、この免疫複合体を製造元の使用説明書に従って、ECLキット(Amersham)を用いて検出した。細胞によって結合された、内部移行された、および分泌されたapoEのレベルの定量は、デンシトメーターによるスキャニング(Ambis Scanner, San Diego, CA)により行い、精製ヒト血漿apoE3およびapoE4の標準曲線を基にした。
【０２４５】
細胞を10% FBSおよびG418 (400 μg/ml)含有のDME/F12中で増殖させた。実験を開始した日に、細胞を10% FBSの入ったDME/F12の中で35 mmプレートへ継代培養した。細胞を37℃で2時間プラスチックプレートに付着させた後、培地を、漸増濃度のリポタンパク質有りまたは無しのN2培地に交換した。37℃で48時間後、培地を同一の培地(リポタンパク質有りまたは無し)と交換し、インキュベーションをさらに48時間継続した。(CSFリポタンパク質は細胞への添加の前にN2培地に対し透析した)。細胞を次に0.2% BSAを含有するDME/F12で洗浄し、Nathan et al. (1994) Science 264:850-852により記述されている方法に従ってDMSOに添加されたDiIにより37℃で1時間非特異的に染色し、PBS中2.5%のグルタルアルデヒド(v/v)で固定した。共焦点レーザー走査システム(MRC-600, BioRad, Hercules, CA)により蛍光モードで神経細胞を撮像し、この画像をImage-1/AT画像解析システム(Universal Images, West Chester, PA)によりデジタル化した。神経細胞の画像を特徴付けの前にコード化し、以下の変量: 1) 各神経細胞上の神経突起(細胞直径の少なくとも半分の細胞表面突起と定義)の数; 2) 神経突起の枝分かれ(各神経突起の分枝点の数); および3) 神経突起伸張(細胞体から測定した、最長の神経突起の長さ)を測定した。典型的には、各実験において、プレート1枚につき20〜40個の神経細胞に神経突起が測定され、この結果を平均±S.E.M.として保存した。
【０２４６】
LRPとのリポタンパク質結合の阻害剤の作用に関する試験では、細胞を、表示濃度のラクトフェリン、塩素酸塩、もしくはヘパリナーゼ含有のまたは受容体関連タンパク質(RAP)入りのN2培地中で37℃にて1時間インキュベートした。その後β-VLDLを添加し、インキュベーションを計96時間継続した。これらの試薬は、β-VLDLを除き、24時間毎に再添加した。48時間後に、培地およびβ-VLDLを交換した。
【０２４７】
125I-β-VLDLの細胞結合および分解
細胞を35 mm培養皿中、N2培地のみで24時間増殖させた。その後125I-β-VLDL(培地1 mlあたりタンパク質3 μg)を添加し、インキュベーションを37℃で16時間継続した。この培地をGoldstein et al. (1983) Met. Enzymol. 98:241-260により記述されている方法に従い、TCA可溶性のリポタンパク質分解産物について分析した。細胞を氷上に置き、0.2% BSAを含有するPBSで洗浄し、0.1 N NaOHに溶解した。ガンマ計測器(Beckman Gamma 8000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)を用いておよびGoldstein et al. (1983)により記述されている方法に従って、細胞の放射能を測定することによりリポタンパク質の細胞結合を判定した。
【０２４８】
DiI標識β-VLDLの細胞結合
細胞を35 mm培養皿中、N2培地で24時間増殖させた。その後DiI標識β-VLDL (培地1 mlあたりタンパク質4 μg)を、Pitas et al. (1983) Arteriosclerosis 3:2-12; およびPitas et al. (1981) Arteriosclerosis 1:177-185により記述されている方法に従って調製し、添加し、インキュベーションを37℃で5時間継続した。次に細胞をPBSで洗浄し、PBS中4% (v/v)のパラホルムアルデヒドで固定した。DiI標識β-VLDLの取り込みを蛍光顕微鏡により視覚化した。インキュベーションの最後に細胞中のDiI標識リポタンパク質の量を定量するため、PBSの一定分量2×0.5 mlを用い、細胞を擦り取り、凍結乾燥した。DiIを乾燥細胞ペレットからメタノールで抽出し、蛍光光度計(励起520 nm、発光570 nm)により分析した。Pitas et al. (1983)。メタノール中のDiI標準物質を定量に用いた。
【０２４９】
脂質粒子とのapoEの結合
apoE3およびapoE4をInnerarity et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 12341-12347により記述されている方法に従ってBolton-Hunter試薬(DuPont NEN, Boston, MA)によりヨウ素化し、その後37℃で1時間脂質粒子とともにインキュベートした。このサンプルを次に、Superose 6カラム(10/50 HR, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)でのクロマトグラフィーにより分画し、一定の流速0.5 ml/分でPBS中1 mMのEDTAにより溶出した。画分0.5 mlを収集し、コレステロールおよびトリグリセリドについて分析し、125I-apoE含量をBeckman 8000計測器(Beckman Instruments)においておよびDong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365により記述されている方法に従って測定した。
【０２５０】
統計分析
データを対応のあるt-検定により分析した。
【０２５１】
結果
ヒトapoE3またはapoE4を発現する、安定的にトランスフェクトされたNeuro-2a細胞により培地中に分泌された、細胞表面に結合した、および細胞内に蓄積したapoEのレベルをウエスタンブロット分析により評価し、デンシトメトリーにより定量化した。得られた結果を表1に示す。
【０２５２】
（表１）分泌型の、スラミン放出性の、またはapoE3もしくはapoE4 cDNAにより安定的にトランスフェクトされた細胞内に存在するapoE3またはapoE4
2009510167.tif 000018
【０２５３】
表1に描かれている結果を得るため、トランスフェクト細胞をβ-VLDL (40 μgコレステロール/ml)有りまたは無しの培地中で96時間インキュベートした。培地は48時間で交換した。最後の48時間に分泌されたapoE、細胞内のapoE、およびスラミン放出性の(表面結合の)apoEをNathan et al. (1995)に記述されているように96時間のインキュベーション後に定量した。データは2つの個別の測定値の平均である。これらの二つ組は12%を超えて異なることはなかった。
【０２５４】
表1に描かれている結果は、これらの細胞が48時間で、細胞タンパク質1 mgにつきapoE3を44〜54 ngおよびapoE4を60〜89 ngを分泌したことを示唆する。このapoE3およびapoE4分泌細胞は、細胞表面に結合した(スラミン処理により放出性の)apoEの量がほぼ同じであり、細胞タンパク質1 mgにつきapoEが4.9〜8.0 ngの範囲であった。2つのapoE3発現細胞系におけるapoEの細胞内含量は、細胞タンパク質1 mgにつきapoEが140および259 ngであった。ほぼ同じ量の細胞内apoE (111〜215 ng/mg)がapoE4発現細胞系において認められた。これらの細胞にβ-VLDLを添加することでは、分泌されたapoE、表面に結合されたapoE、またはapoE3もしくはapoE4分泌細胞内に存在するapoEの量に有意な影響がなかった(表1)。
【０２５５】
初期の実験では、ほぼ同じ量のapoE3 (クローン1、54 ng/mg細胞タンパク質)およびapoE4 (クローン4、60 ng/mg細胞タンパク質)を分泌した2つのNeuro-2a細胞系(表1)を用いて、神経突起成長を調べた。これらの細胞をβ-VLDLを欠いたN2培地において増殖した場合、apoE3およびapoE4分泌細胞の間に神経突起成長の明らかな差異はなかった。しかし、β-VLDLを含有するN2培地における細胞のインキュベーションは、これらの細胞からの神経突起成長の顕著に異なるパターンを生じた。β-VLDLとともにインキュベートされたapoE3分泌細胞は、長い神経突起を発生したのに対し、apoE4分泌細胞では神経突起成長が抑制された。
【０２５６】
漸増濃度のβ-VLDLの存在下および非存在下での神経突起成長の差異は、1細胞あたりの神経突起の数、神経突起の枝分かれ、および神経突起伸張を測定することで定量した(それぞれ、図2A、B、およびC)。β-VLDLの非存在下にてN2培地中で96時間インキュベートされた非apoEトランスフェクト対照細胞の値を100%に設定した。トランスフェクトNeuro-2a細胞によるapoE3またはapoE4のいずれかの発現は、リポタンパク質非添加のN2培地において増殖した場合、神経突起の数、枝分かれ、または伸張には影響しなかった(図2A、BおよびC)。図2に描かれている結果を得るため、細胞(apoE3発現の場合クローン#1およびapoE4発現の場合クローン#4)を、N2培地単独中でまたは漸増濃度のβ-VLDLを含有する培地中で96時間インキュベートした。培地は48時間で交換した。これらの細胞をDiIで染色し、固定し、表示のパラメータを測定した。各々のデータの点は、4度の個別の実験における20〜50個の神経突起を発現している細胞の測定により得られた。このデータはN2培地単独による対照細胞で得た値の百分率として表わされている。データは平均±S.E.M.である。図2に描かれるように、N2培地単独によりインキュベートされた対照細胞で得られた平均値は、下記のようであった: A: 神経突起/細胞＝3; B: 分枝点/神経突起＝2; C: 平均神経突起長＝155 Tm。
【０２５７】
添加したβ-VLDLの作用の有意性のレベルの計算のため、β-VLDLの存在下での結果をβ-VLDLの非存在下での同じ細胞(すなわち、N2培地単独中にて増殖)で得たデータと比較する。＊p＜0.025; ＊＊p＜0.010; ＊＊＊p＜0.005。
【０２５８】
しかしながら、図2Aに示されるように、β-VLDLの添加は、対照細胞でのおよびapoE3を分泌している細胞での神経細胞数の増加をもたらした(N2培地中のapoE3分泌細胞と比較して40μgのβ-VLDLコレステロール/mlで有意に増加した)。その一方で、高濃度のβ-VLDLの存在下では、apoE4を分泌しているNeuro-2a細胞は、N2培地中のapoE4分泌細胞と比較して、1細胞あたりの神経突起数の有意な低下を示した。
【０２５９】
DRG細胞についてこれまでに記述されているように(Handelmann et al. (1992) J. Lipids Res. 33:1677-1688; およびNathan et al. (1994))、β-VLDL単独の添加で、神経突起の枝分かれの増大が生じた。図2Bに示されるように、非apoEトランスフェクト細胞にβ-VLDLを添加することで、神経突起の枝分かれの有意な増大が生じた。さらに、最高濃度のβ-VLDLコレステロールで、apoE3分泌細胞はN2培地単独中で増殖されたapoE3分泌細胞と比べれば、枝分かれの増強を示した。対照的に、β-VLDLとともにインキュベートした場合、apoE4分泌細胞は枝分かれの減少を示す傾向があった; しかしながら、この減少は、統計的有意性には達しなかった。
【０２６０】
神経突起伸張は、最高濃度のβ-VLDLとともにインキュベートした場合、apoE3を分泌しているNeuro-2a細胞において増大した。対照的に、apoE4分泌細胞において、神経突起伸張は、使用したβ-VLDLの最低濃度であってもかなり顕著に抑制された(図2C)。
【０２６１】
図2に記述されている結果は、神経突起の成長を有する細胞の比較を基にしているが、神経突起の伸張を伴わないNeuro-2a細胞は考慮しなかった。N2培地におけるNeuro-2a細胞のおよそ25〜30%が、神経突起伸張(細胞直径の少なくとも半分の細胞表面突起と定義)を有した。しかしながら、図3に示されるように、β-VLDLの存在下において、神経突起を発生しているapoE3分泌細胞の数は合計の60〜70%まで顕著に増大したことが明らかであった。その一方で、神経突起伸張を発生しているapoE4分泌細胞の数は、対照細胞またはapoE3分泌細胞と比較して、有意に低下した。従って、β-VLDLとともにインキュベートしたapoE3分泌細胞は、いっそう長い神経突起伸張を有しただけでなく、神経突起を伴う細胞数の増大も示した。β-VLDLの存在下で増殖されたapoE4分泌細胞は、より少ない神経突起を示し、かつ作出されたものは、はるかに短かった。
【０２６２】
apoE3およびapoE4分泌細胞での神経突起成長に及ぼすβ-VLDLの示差的作用が、クローンのバラツキによらないまたは各種細胞系でのapoEの分泌もしくは細胞内含量の差異によらないことを確認するため、apoE3またはapoE4を分泌している、その他の安定的にトランスフェクトされた細胞系により、追加の実験を行った。これらの細胞のβ-VLDLとのインキュベーションでも、神経突起成長に及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用が生じた。得られた結果を表2に示す。
【０２６３】
（表２）apoE3またはapoE4を安定的にトランスフェクトされた細胞の神経突起の数/細胞、枝分かれ、および神経突起伸張に及ぼすβ-VLDL (40μgコレステロール/ml培地)の作用
2009510167.tif 000019
【０２６４】
表2において、クローン#1、#3、#4、#5、および#6によるapoEの分泌レベルは、表1に記述されている通りである。クローン#2は36 ngのapoE3/mg細胞タンパク質/48時間を分泌した。表面に結合しかつ内部移行されたapoEは、クローン#2について定量しなかった。β-VLDLとのインキュベーションの条件は、図2に記述されている通りである。各々のデータ点は、細胞25〜40個の測定により得た。データは平均±S.E.M.である。
【０２６５】
表2に要約されているように、β-VLDLの存在下、リポタンパク質供給源を欠いたN2培地中で増殖された細胞と比べ、全てのapoE4分泌細胞は、発現された神経突起の数、枝分かれ、および神経突起伸張の有意な低下を示したのに対し、apoE3分泌細胞は、神経突起数の増大、枝分かれの増大、および伸張の増大を示した。
【０２６６】
apoE4がβ-VLDLの存在下で神経突起伸張を遮断するかどうかまたはこれが神経突起退縮を誘導するかどうかを判定するため、これらの細胞をN2培地単独中で48時間インキュベートして、神経突起伸張を刺激した。この培地を交換し、これらの細胞をβ-VLDL (コレステロール40 μg/ml)入りの培地中でさらに48または96時間インキュベートした。追加のβ-VLDLによっては、N2培地単独中でインキュベートされた細胞と比べ、apoE4発現細胞の神経突起の伸張が減少しなかった。従って、β-VLDLの存在下においてapoE4は、神経突起伸張を直接的に阻害し、既に伸張された神経突起の退縮を引き起こさない。
【０２６７】
その他のリポタンパク質を用いて、apoEを保持する任意の脂質媒体がβ-VLDLの代わりをするかどうかを判定した。トリグリセリド(Tg)に豊富なリポタンパク質であるウサギVLDLとのapoE3またはapoE4発現細胞のインキュベーションにより、β-VLDLで得られたような神経突起伸張に対する同様の作用が生じた。これらの結果を表3に示す。
【０２６８】
（表３）apoE3またはapoE4 cDNAを安定的にトランスフェクトされた細胞の神経突起伸張に及ぼすβ-VLDL、VLDL、または脂質乳剤の作用
2009510167.tif 000020
【０２６９】
表3に描かれている結果を得るため、細胞(apoE3発現の場合クローン#1およびapoE4発現の場合クローン#4)を、N2培地単独中でまたは表示濃度の下記粒子を含有する培地中で96時間インキュベートした: β-VLDL、40 μgコレステロール/ml培地(これは5μgトリグリセリド/ml培地に相当する); VLDL、5 μgトリグリセリド/ml培地; 乳剤A、5 μgトリグリセリド/ml培地。CHOL＝コレステロール; Tg＝トリグリセリド; PL＝リン脂質。各々のデータ点は3度の個別の実験において、神経突起を発現している細胞30〜40個の測定により得た。データは平均±S.E.M.である。ap＜0.010 対 対照＊＊＊。
【０２７０】
表3に示されるように、apoE3を分泌しているNeuro-2a細胞をVLDLとともにインキュベートした場合、これらは神経突起伸張の増大を示したのに対し、VLDLの存在下においてapoE4分泌細胞は、神経突起伸張の阻害を示した。その他の実験では、ヒトLDLおよびイヌapoE HDLc、つまりコレステロール摂食により誘導されるかつCSF中のapoE含有リポタンパク質に類似しているapoEを多く含む血漿高密度リポタンパク質(HDL) (Pitas et al. (1987))も使用した。apoE3およびapoE4を分泌しているNeuro-2a細胞は、LDL (コレステロール40 μg/ml)に反応しなかった(すなわち、N2培地単独中で増殖された対照細胞と比べて、神経突起伸張の差異は認められなかった)。その一方で、apoE4分泌細胞またはapoE3分泌細胞とのapoE HDLc (コレステロール40 μg/ml)のインキュベーションにより、それぞれ、神経突起伸張のほんのわずかな低下または増大が生じた(N2培地中の対照細胞、100%; apoE4分泌細胞に加えてHDLc、N2培地で得た値の85〜90%; apoE3分泌細胞に加えてHDLc、N2培地で得た値の110%)。
【０２７１】
リポソームおよび脂質乳剤も、apoEの送達に必要な脂質媒体の型を定義する試みにおいて使用した。DMPC乳剤単独またはコレステロールと複合体を形成したDMPCを最大45 μgリン脂質のリン脂質漸増濃度および5 μgコレステロール/ml培地(これ以上高い濃度は細胞にとって有毒である)で、apoE3およびapoE4分泌細胞とともに96時間インキュベートした。
【０２７２】
これらの試験において、apoEトランスフェクトNeuro-2a細胞のいずれかでの神経突起伸張に及ぼす作用は認められなかった。これまでに、apoEはDMPCと複合体を形成し、LDL受容体との高親和性結合を媒介することが明らかにされている。Pitas et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:5454-5460。その一方で、トリグリセリドおよびリン脂質を含有する球形粒子(およそ35.8 nm)である脂質乳剤粒子(表3中の乳剤A)は、apoE3分泌細胞における神経突起伸張の有意な増強を引き起こし、apoE4分泌細胞における伸張の阻害と関連していた。すなわち、脂質および/または独自の粒子サイズの特定の組合せは、apoEアイソフォームを誘発するのに、つまり神経突起成長に及ぼす特異的作用に必要でありうる。細胞へのコレステロールの送達には、示差的作用が必要とは思われないことに注目するのは興味深い。
【０２７３】
ウシCSF由来のリポタンパク質を用いた追加の試験から、CNS中の天然のリポタンパク質がapoE3およびapoE4のアイソフォーム特異的な作用を媒介できることが示唆される。図4に示されるように、CSFから単離されたリポタンパク質(d＜1.21 g/ml)をこれらの細胞に添加することで、apoE4発現細胞からの神経突起成長の阻害およびapoE3発現細胞からの成長の増大が引き起こされた。CSFリポタンパク質がコレステロール40 μg/mlの濃度で使用された場合、その作用はβ-VLDLを同じ濃度で使用して得られる作用と類似していた。
【０２７４】
CSFリポタンパク質(d＜1.21 g/ml)をタンパク質およびコレステロール含量ならびにアポリポタンパク質組成について分析した。タンパク質とのコレステロールの比はおよそ1:1であり、イヌCSFの場合に報告されているデータに類似していた。Pitas et al. (1987)。ウシCSFリポタンパク質(d＜1.21 g/ml)は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマシーブリリアントブルー染色で可視化した場合、apoEおよびapoA-Iのみを含有していた。これらの結果は、ヒトおよびイヌCSFリポタンパク質について既報のものに類似している。Pitas et al. (1987); およびRoheim et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4646-4649。
【０２７５】
β-VLDLを結合する、内部に取り入れる、および分解する神経芽腫細胞の能力を調べて、apoE3およびapoE4発現細胞における神経突起成長の差異が、細胞へのapoEおよび/またはリポタンパク質脂質の送達を刺激する分泌型apoE3およびapoE4の異なる能力に起因したものかどうかを判定した。これらの試験では、125I-β-VLDLを用いて、Neuro-2a細胞におけるリポタンパク質の結合、取り込み、および分解を定量した。これらの結果を表4に示す。
【０２７６】
（表４）安定的にトランスフェクトされた細胞および対照細胞による125I-β-VLDLの細胞結合および分解
2009510167.tif 000021
【０２７７】
表4に描かれている結果を得るため、細胞をN2培地単独中で24時間インキュベートした。その後125I-β-VLDL (3 μgタンパク質/ml培地)を添加し、37℃で16時間後、Neuro-2a細胞によるリポタンパク質の細胞結合(結合され、内部移行された)および分解を測定した。報告のデータは、二つ組で行われた2度の個別実験の平均である(±S.D.)。対照＝pSV2neo単独でトランスフェクトされた細胞。表4において、aは＜0.05 対 対照を表し、bは＜0.01 対 対照を表す。
【０２７８】
表4に示されている結果から、細胞結合された(結合され、内部移行された) 125I-β-VLDLの総量がapoE3およびapoE4分泌細胞においてほとんど同じであった(両方とも非apoEトランスフェクト対照細胞において認められたものよりもわずかに低かった)ことが示唆される。apoE3およびapoE4分泌細胞による125I-β-VLDLの分解は同様であった。非apoEトランスフェクトNeuro-2a対照細胞と比較した場合、apoE4分泌細胞による125I-β-VLDLの分解のわずかな(しかし統計学的に有意な)減少が認められた。
【０２７９】
平行実験では、これらの細胞をDiI標識β-VLDLとともにインキュベートして、蛍光顕微鏡によりapoE3およびapoE4分泌細胞でのリポタンパク質の内部移行
を可視化した。内部移行の後、DiIはリポソームに捕捉され、それ故に、これらの細胞の蛍光強度は、内部移行され、分解されたリポタンパク質の総量に比例する。Pitas et al. (1983)。これらの試験では、apoE3およびapoE4分泌細胞においてDiI標識β-VLDLの取り込みに差異は認められなかった。DiI標識β-VLDL (コレステロール40 μg/ml)とともに37℃で16時間インキュベートされた細胞からのDiIの抽出および定量から、DiI標識β-VLDLの取り込みがapoE3およびapoE4分泌細胞においてほぼ同じであったという視覚的印象が確認された。対照細胞は細胞タンパク質1 mgあたりDiI 8.9±0.4 ngを取り込んだのに対し、apoE3およびapoE4発現細胞はそれぞれ、細胞タンパク質1 mgあたりDiI 10.2±1.0 ngおよび10.8±0.3 ngを取り込んだ。
【０２８０】
apoEは、これらの細胞により分泌される濃度で存在する場合、脂質粒子に結合することを実証するため、放射標識apoE3またはapoE4をβ-VLDL、VLDL、または乳剤Aとともに(apoE 100 ngをβ-VLDLコレステロール40 μgとともに、またはapoE 100 ngをVLDLもしくは乳剤Aトリグリセリド5 μgのいずれかとともに) 37℃で1時間インキュベートし、FPLCにより分画した。apoEのおよそ70%がβ-VLDLと結合し、50%がVLDLおよび乳剤Aと結合した。脂質粒子に結合されたapoE3またはapoE4の量に差異は認められなかった。
【０２８１】
実施例2: apoE結合受容体(R)とのapoE結合の特異的阻害
どちらの受容体が神経突起成長に及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用の媒介に関与していたのかを判定するため、HSPG-LRP経路によるが、LDL受容体経路によらない、apoEを多く含むリポタンパク質の結合および内部移行を遮断する阻害剤を用いた。次に神経突起成長に及ぼす作用を判定した。β-VLDLの添加前に、これらの細胞を、ヘパリナーゼ(20ユニット/ml)および塩素酸塩(20 mM)とともに、RAP(5 Tg/ml)とともに、またはラクトフェリン(10 μg/ml)のいずれかとともに1時間プレインキュベートした。LRPとのapoEを多く含むリポタンパク質の結合には、細胞表面HSPGとのその初期の結合が必要になる。ヘパリナーゼおよび塩素酸塩は、それぞれ、細胞表面HSPGの硫酸化を切断および還元する。Ji et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:10160-10167; およびHumphries et al. (1989) Met. Enzymol. 179:428-434。ラクトフェリンはリポタンパク質のHSPGおよびLRPの両方との結合を遮断するのに対し、RAPは主に、apoEを多く含むリポタンパク質のLRPとの結合を遮断する。これらの試薬は全て、LRPによる、apoEを多く含むβ-VLDLの取り込みを阻害することがこれまでに明らかにされている。Mahley et al. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sci. 737:39-52; Ji et al. (1993); Ji et al. (1994a); およびWillnow et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:26172-26180。図2に示されているように、β-VLDLは単独で神経突起の成長を刺激した。β-VLDLによる神経突起成長の刺激は、apoE3発現細胞においてさらに増強され、apoE4分泌細胞において顕著に阻害された(表5)。
【０２８２】
（表５）apoE3またはapoE4 cDNAにより安定的にトランスフェクトされた細胞からの神経突起伸張に及ぼすβ-VLDLの存在下での塩素酸塩、ヘパリナーゼ、RAP、およびラクトフェリンの作用
2009510167.tif 000022
【０２８３】
表5に描かれている結果を得るため、細胞をN2培地単独中で、または表示濃度の塩素酸塩、ヘパリナーゼ、RAP、もしくはラクトフェリンを含有する培地中で1時間インキュベートした。その後β-VLDLを添加し、インキュベーションを計96時間継続した。試薬はβ-VLDLの除き、24時間毎に再添加した。培地およびβ-VLDLは48時間で交換した。各々のデータ点は2度の個別の実験において、神経突起を発現している神経細胞30〜40個を測定することにより得た。データは平均±S.E.M.である。ap＜0.05、bp＜0.01 対 対照細胞(β-VLDLとインキュベートされた非apoE発現細胞)で得られた値。cp＜0.05 対 β-VLDL単独によるapoE3発現細胞。d平行実験のセットにおいて、5 μg/mlのRAPでは、Neuro-2a細胞とのDiI標識LDLの結合が遮断されなかった。
【０２８４】
表5に描かれている結果は、塩素酸塩およびヘパリナーゼまたはRAPの添加によって、対照細胞(apoEを発現していないNeuro-2a細胞)での神経突起成長に及ぼすβ-VLDLの刺激作用が遮断されなかったことを示しており、β-VLDL単独の作用がLDL受容体により媒介されることを示唆している; しかしながら、これらの試薬は、apoEを分泌している細胞においてアイソフォーム特異的な作用を遮断した(表5)。細胞の塩素酸塩およびヘパリナーゼ処理またはRAPの添加は、β-VLDLとともにインキュベートされたapoE3発現細胞での神経突起伸張の刺激を妨害した(すなわち、β-VLDLを有意に減らし、apoE3を分泌しているNeuro-2a細胞での神経突起伸張を誘導した)。さらに、塩素酸塩およびヘパリナーゼまたはRAPは、apoE4発現細胞において認められた神経突起伸張の阻害を遮断した(すなわち、apoE4発現細胞はβ-VLDLの存在下において、神経突起伸張の阻害を示さなかったが、実際に、伸張の増大を示した)(表5)。ヘパリナーゼおよび塩素酸塩またはRAPの存在下、apoE分泌細胞において、神経突起成長は、apoEの非存在下においてβ-VLDLが対照細胞に添加された場合に認められたものに類似していた(表5)。従って、これらの試薬、LDL受容体の存在下において、β-VLDLの媒介作用は遮断されなかった。ラクトフェリンは同様に、神経突起成長に及ぼすapoE3およびapoE4の作用を遮断した; しかしながら、これは同様に、対照細胞での神経突起伸張に及ぼすβ-VLDLの作用をわずかに抑制した。これらのデータは、β-VLDLとHSPG-LRP経路の間の相互作用の阻害が、神経突起成長に及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用を妨害することを示している(表5)。
【０２８５】
後根神経節または神経芽腫細胞において、apoE3に加えた脂質供給源が神経突起伸張を補助および促進する。apoE3は細胞体および神経突起に広く蓄積し、細胞骨格を安定化し、神経突起伸長を補助し、微小管重合を直接的にまたは間接的に調節するように思われる。その一方で、apoE4は、神経細胞内に蓄積も、神経突起伸張を補助するようにも思われず、微小管装置を不安定化さえすることがある。apoE4の作用は、LRP経路により媒介されるように思われる。apoE4を伴う個体は、明らかに、若年期には正常な神経発達を有する。しかしながら、apoE4は、シナプス結合のリモデリングを可能にも補助もしないことにより、高齢期にその有害な作用を発揮することがある。この影響はアルツハイマー病の発病において重要であると考えられる。これは、apoE4が密度の高い、複雑で、潜在的に有毒なAβペプチド斑の形成を補助することによりアルツハイマー病に寄与すると考えられるからである。
【０２８６】
実施例3: apoE4ドメイン相互作用を妨害する作用物質の検出法
apoE4はInnerarity et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:4186-4190により既報のBolton-Hunter試薬(New England Nuclear Corp., Boston, MA)を、比活性範囲200〜1100 dpm/ngで用いてヨウ素化した。ヨウ素化apoE4 (0.1 M NH4HCO3 50〜10 ml中0.5〜2 mg)を試験試薬または化合物とともにインキュベートし、この混合物を健常被験体からの血漿250 mlに添加し37℃で2時間維持した。血漿をその後、Superose 6カラム(10/50 HR, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)でのクロマトグラフィーにより、0.15 M NaClを含有する20 mMリン酸ナトリウム(pH 7.4)で溶出して各種のリポタンパク質のクラスに分画した。カラム流速は0.5 ml/分で、画分0.5 mlを収集し、125I含量をBeckman 8000ガンマ計測器(Beckman Instruments, Fullerton, CA)において測定する。apoE4ドメイン相互作用を妨害する試薬は、「修飾された」apoE4の選択性をVLDLからHDLにシフトし、これはapoE3 (対照として平行して試行)のものに類似した分配を生じうる。
【０２８７】
apoE代謝
培養神経細胞(Neuro-2a細胞)によるapoEを多く含むβ-VLDLの代謝を3つの方法で: (1) 125I-β-VLDLの細胞結合(結合および内部移行)を測定することで; (2) apoEを多く含むDiI標識β-VLDLの代謝を試験することで(DiIはリポタンパク質粒子の脂質部分の蛍光マーカーとして働く); ならびに(3) apoEを多く含むβ-VLDLの細胞コレステロール含量を増大する能力を定量することで試験した。
【０２８８】
実施例4: apoEを多く含むβ-VLDL粒子の結合および内部移行
実施例4〜6の材料および方法
ヘパリナーゼIおよび特異的ホスホリパーゼCはSigma Chemical Company (St. Louis, MO)から購入した。スラミンはResearch Biochemicals International (Natick, MA)から入手した。精製ヒト血漿apoEおよびヒツジ抗ヒトapoE抗体はDr. Karl Weisgraber (Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, San Francisco, CA)からいただいた。ロバ抗ヒツジIgGはJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)から購入した。
【０２８９】
リポタンパク質の調製
ウサギβ-VLDL (d＜1.006 g/ml)は、高脂肪、高コレステロール飼料で4日間飼育したニュージーランド白ウサギの血漿から単離した。このβ-VLDL中のコレステロールのタンパク質に対する比は、およそ15〜20:1の範囲であった。ヒトapoEを多く含むβ-VLDLは、apoEをβ-VLDLとともに37℃で1時間インキュベートすることにより調製した。一部の実験の場合、apoEを多く含むβ-VLDLは、次のように高速液体クロマトグラフィーにより再単離した。125I-β-VLDLおよび非標識apoEまたは125I-apoEおよび非標識β-VLDLのいずれかを、β-VLDLタンパク質のapoEに対する比1:1.5で混合し、37℃で1時間インキュベートした。次にこの混合物(250 μl)をSuperose 6カラム(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden, 10/50 HR)でのクロマトグラフィーにより分画した。流速は0.5 ml/分で、画分0.5 mlを収集した。溶出プロファイルを125Iおよびコレステロールの定量によりモニターした。
【０２９０】
リポタンパク質およびapoEの標識
β-VLDLをBilheimer et al. (1972) Biochim. Biophys. Acta. 260:212-221の方法によりヨウ素化した。アポリポタンパク質E3およびE4をBolton-Hunter法(Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133:529-539)によりヨウ素化した。遊離ヨウ素をP10カラムクロマトグラフィーにより除去した。β-VLDLを既報(Pitas et al. (1981) Arteriosclerosis 1:177-185)のように、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン(DiI)で標識した。
【０２９１】
細胞抽出物中の完全なapoEの検出
マウス神経芽腫(Neuro-2a)細胞を10%ウシ胎仔血清(FBS)の入ったダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)/F12 (1:1)中でおよそ100%の集密度まで増殖し、N2培地で洗浄し、N2培地中にてβ-VLDL (コレステロール40 μg/ml)単独でまたは30 μg/mlのヨウ素化apoE3もしくはヨウ素化apoE4とともにインキュベートした。指定された時点で、表面に結合したapoEを4℃で30分間10 mMスラミンとのインキュベーションにより除去した。これらの細胞をその後、4℃にてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、ラバーポリスマンにより穏やかに擦り取った。これらの細胞をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプル緩衝液に溶解し、細胞タンパク質を3〜20%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離し、ニトロセルロース膜に転写し; apoEをオートラジオグラフィーにより検出した。
【０２９２】
細胞培養
Neuro-2a細胞は10% FBS含有のDMEM/F12 (1:1)中で維持し; この培地を使用のおよそ16時間前に無血清培地と交換した。ヒト皮膚線維芽細胞は10% FBS含有のDMEM中で増殖させた。LDL受容体陰性の線維芽細胞は、10% FBSを補完した最小必須培地中で増殖させた。ヒト肝細胞がん(HepG2)細胞は既報(Ji et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:2764-2772)のように、10% FBS、1%ヒト非必須アミノ酸、および1%ピルビン酸ナトリウム含有の最小必須培地中で維持した。どのグリコサミノグリカンも産生しないチャイニーズハムスター卵巣(CHO)変異細胞pgsA-745 (キシローストランスフェラーゼ欠損)、ならびにヘパリン硫酸を産生しないpgsD-677 (N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ欠損およびグルクロン酸トランスフェラーゼ欠損) (Esko (1991) Curr. Opin. Cell Biol. 3:805-816)は、Dr. J.D. Esko (University of Alabama, Birmingham)によって親切にも提供していただいた。CHO細胞は7.5% FBS含有のF12培地中で維持した。Dr. J. Herz (University of Texas Southwestern Medical School, Dallas, TX)によって提供していただいたマウスLRP陰性(LRP-/-)のおよびLRPヘテロ接合性(LRP+/-)の線維芽細胞は、10% FBS含有のDMEM中で維持した。β-VLDLまたは培養細胞のコレステロール含量をアッセイした。
【０２９３】
免疫細胞化学
組織培養皿の中で増殖されたNeuro-2a細胞または線維芽細胞を無血清培地で洗浄し、指定時間apoE3 (30 μg/ml)またはapoE4 (30 μg/ml)に加えβ-VLDL (コレステロール40 μg/ml)とともに37℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞をすぐに氷上に置き、リン酸緩衝液で洗浄した。細胞をその後、免疫蛍光細胞化学のため、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.4)中3%のパラホルムアルデヒドで固定した。apoEからの免疫蛍光を検出した。apoE免疫蛍光の強度は共焦点顕微鏡により定量した。
【０２９４】
apoEに加えβ-VLDLの細胞結合、内部移行、および分解
培養細胞をおよそ100%の集密度まで増殖し、新鮮な無血清培地で2回洗浄し、apoEを多く含むβ-VLDLとともに37℃でインキュベートした。細胞への添加の前に、β-VLDLおよびapoEを37℃で1時間一緒に(特に指定のない限り、それぞれ、タンパク質5および7.5 μg)インキュベートした。一部の細胞はapoEを多く含むβ-VLDLの添加の前に2時間37℃で、50 μMクロロキン、およびリソソームプロテアーゼ阻害剤とともにインキュベートした。指定された時点で、細胞を氷上に置き、この培地をタンパク質分解産物についてアッセイした。細胞結合試験の場合、Neuro-2a細胞を氷上で、0.2%ウシ血清アルブミン含有の0.1 M PBSにより5回および0.1 M PBSにより1回洗浄した。細胞に結合したリガンドは、結合した物質と内部移行された物質の両方に相当する。線維芽細胞を氷上でDMEM-Hepesにより3回洗浄し、30分間4℃で10 mMスラミンとともにインキュベートして、表面に結合したリガンドを除去した。細胞内に残留している放射能は、どちらが「内部移行された」かを表している。洗浄後、これらの細胞を放射能およびタンパク質濃度の測定のため、0.1 N NaOHに溶解した。
【０２９５】
線維芽細胞によるおよびNeuro-2a細胞による125I-apoEを多く含むβ-VLDLの内部移行も18℃で試験した。細胞をリポタンパク質の添加の前に20分間18℃のインキュベーターに入れて、それから18℃でさらに3時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を氷上に置き、DMEM-Hepesで3回洗浄し、30分間4℃で10 mMスラミンとともにインキュベートして、細胞表面に結合した125I-apoEを除去した。培地中の125I-β-VLDLまたは125I-apoEの分解産物をアッセイした。
【０２９６】
培養細胞によるDiI標識β-VLDLの取り込み
Neuro-2a細胞をDiI標識β-VLDL単独で、またはapoE3もしくはapoE4のいずれかと一緒に37℃にて2時間インキュベートした。細胞を次に0.1 N NaOHで洗浄および溶解し、代謝された(結合され、内部移行され、および分解された)リポタンパク質の総量に比例する、細胞に結合したDiIをアッセイした。
【０２９７】
細胞のヘパリナーゼおよび特異的ホスホリパーゼC処理
細胞を1時間ヘパリナーゼI (10ユニット/ml)によりまたは30分間特異的ホスホリパーゼC (5ユニット/ml)により37℃で前処理した。次いで細胞をこれらの酵素の存在下、apoE3またはapoE4のいずれかに合わせてβ-VLDLとともにインキュベートした。β-VLDL (タンパク質5 μg/ml)およびapoE (7.5 μg/ml)を混合し、細胞への添加の前に37℃で1時間一緒にインキュベートした。
【０２９８】
野生型およびHSPG欠損CHO細胞による125I-apoE＋β-VLDLのパルス追跡
培養細胞をおよそ100%の集密度まで増殖し、氷上に置き、冷DMEM-Hepesで2回洗浄した。細胞を次に、1時間4℃で125I-apoE＋β-VLDLとともにインキュベートして、細胞表面の結合(ゼロ時に結合したリガンド)を可能にした。細胞を冷F12培地で3回すすいで、未結合のリガンドを除去した。予め加温したF12培地を添加し、細胞を指定の時間37℃でインキュベートした。各時点で、細胞を再び氷上に置き、培地を収集した。培地0.5 mlに0.2%ウシ血清アルブミン(Sigma) 0.4 mlおよび50%トリクロロ酢酸(TCA) 0.4 mlを添加した。培地をその後、30分間4℃でインキュベートし、10分間3,000 rpmで遠心分離した。上清を125I-apoE分解アッセイのために収集し、ペレットをTCA沈殿性の完全な125I-apoEとして計測した。細胞を冷DMEM-Hepesで1回洗浄し、30分間低温室中にて氷上で10 mMスラミンとともにインキュベートし、その後0.1 N NaOHに溶解した。細胞の放射能（内部移行したapoE）をガンマ計測器で測定し、タンパク質濃度をLowry法により決定した。
【０２９９】
結果
Neuro-2a細胞による125I-β-VLDLまたはヒトapoE3もしくはapoE4のいずれかを多く含む125I-β-VLDLの細胞結合を37℃で試験した(図5)。これらの試験において、β-VLDL単独の最大の細胞結合はおよそ225 ng/mg細胞タンパク質であった。β-VLDLの細胞結合は、apoE3またはapoE4によりおよそ1.7倍に増強された。従って、125I-β-VLDLの結合および内部移行を促進するapoE3またはapoE4の能力において大きなアイソフォーム特異的差異は認められず、ほぼ同じ量のβ-VLDLが内部移行されたことを示唆している。さらに、DiI標識β-VLDLを用いて、Neuro-2a細胞によるβ-VLDL粒子の取り込みを試験した(図6)。リポタンパク質により内部移行されたDiIは、細胞により保持され、代謝された(結合され、内部移行され、および分解された)リポタンパク質の総量を定量するのに使用することができる。これらの試験において、2時間で、apoE3およびapoE4の両方が、apoEの非存在下で内部移行されたDiI標識β-VLDLの量と比べ、DiI標識β-VLDLの取り込みを刺激した(およそ1.8〜2倍)[apoE4はβ-VLDLの取り込みを、apoE3よりもわずかに大きい程度で刺激した(p＜0.002)]。
【０３００】
さらにapoE3およびapoE4が同様のβ-VLDL粒子の取り込みを刺激したことを確証するため、細胞を培地単独中で、β-VLDLを含有する培地中で、またはβ-VLDLおよびapoE3もしくはapoE4のいずれかを含有する培地中でインキュベートし、細胞のコレステロール含量を測定した(図7)。β-VLDL単独では、リポタンパク質の非存在下で維持された対照細胞と比べ、細胞のコレステロール含量がおよそ4.7倍増大した。apoE3またはapoE4のいずれかを多く含むβ-VLDLでは、β-VLDL単独でインキュベートされた細胞と比べ、細胞のコレステロール含量が増大した[それぞれ、およそ1.5倍およびおよそ1.7倍; apoE4によるコレステロール含量は有意に大きかった(p＜0.005)]。脂質を伴わずに添加された遊離のapoE3またはapoE4は、本質的に細胞のコレステロールレベルに影響を及ぼさなかった。まとめると、125I-β-VLDLまたはDiI標識β-VLDLの取り込みおよびβ-VLDL由来のコレステロールを蓄積する細胞の能力に及ぼすapoE3およびapoE4の作用を調べた結果は、apoE3およびapoE4がNeuro-2a細胞においてほぼ同程度にβ-VLDLの内部移行を刺激し、apoE4が若干活性の高いことを実証している。それ故に、リポタンパク質粒子の取り込みの差異は、apoEを多く含むβ-VLDLとともにインキュベートされたNeuro-2a細胞でのapoE3 対 apoE4の蓄積の差異(apoE3はapoE4よりも大きい)を説明することができなかった。
【０３０１】
実施例5: apoEアイソフォームの細胞内蓄積
apoE3およびapoE4の示差的蓄積の時間経過を、Neuro-2a細胞において分析した(図8)。これらの細胞を、apoEを多く含むβ-VLDLとともに2〜48時間インキュベートし、透過処理し、精製ヒトapoE3およびE4をウエスタンブロットにて等しく良好に検出するポリクローナル抗体により免疫細胞化学に向けて処理した。免疫反応性apoEを共焦点顕微鏡により検出および定量して、相対蛍光強度を測定した。最も早い時点(2時間目)で、これらの細胞はapoE4よりも約1.8倍多いapoE3を含んでいた。この免疫反応性apoEレベルの差異は、最大48時間(apoE4よりもおよそ1.6倍多いapoE3)まで維持された(図8)。
【０３０２】
蓄積された細胞内apoEは、主として完全なタンパク質であった。細胞を指定の時間、apoEを多く含むβ-VLDLとともにインキュベートし; これらの細胞タンパク質を抽出し、SDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、apoEをオートラジオグラフィーにより検出した。オートラジオグラフィーは、apoE4よりもより多くのapoE3の細胞蓄積および分解産物の明確でない蓄積を明らかにした。ウエスタンブロット分析は同様の結果をもたらし、完全なapoEの示差的細胞内蓄積を明らかにした。
【０３０３】
細胞によるapoE3およびapoE4の蓄積または保持の差異が細胞結合(結合および内部移行)の差異に起因するのか、または内部移行されたapoE3もしくはapoE4の分解の差異に起因するのかを判定するため、125I-apoE3または125I-apoE4を多く含むβ-VLDLを用いて試験を行った。これらの試験において、Neuro-2a細胞(図9)およびヒト皮膚線維芽細胞(図11)の両方におけるヨウ素化されたapoE3およびapoE4の示差的な細胞結合または内部移行も、最も早い時点(2時間目)で始まりかつ実験の最後(24時間目)まで継続することが明らかであった。これらの細胞のapoE3およびapoE4含量の差異は、インキュベーションの4〜8時間後に最大であった。Neuro-2a細胞において、これらの細胞に結合されたapoE3の量は、細胞に結合されたapoE4の量の2倍であった(図9)のに対し、線維芽細胞においては、apoE3は、それらの細胞中のapoE4よりも3倍豊富であった(図11)。同様に、125I-apoE2も、apoE4よりも大きい程度で細胞内に蓄積した(2時間目にapoE4よりもおよそ1.5倍大きい)。Neuro-2a細胞および線維芽細胞における、それぞれ、125I-apoE3および125I-apoE4の示差的な細胞結合または内部移行とは対照的に、これらの細胞によるヨウ素化されたapoE3またはapoE4の分解には有意差はなかった(図10および12)。
【０３０４】
apoEを多く含むβ-VLDLからのapoE3およびapoE4の示差的な細胞蓄積は、肝細胞においても認められた。表6に示されるように、125I-apoE3に加えてβ-VLDLとともにインキュベートされたHepG2細胞は、125I-apoE4に加えてβ-VLDLとともにインキュベートされた細胞と比べ、約2.5倍大きいapoEの細胞結合を示した。免疫学的試験およびオートラジオグラフィー試験からのデータに加え、結合および分解実験は、apoE3またはapoE4を多く含むβ-VLDLとともにインキュベートされたNeuro-2a細胞、線維芽細胞、および肝細胞におけるapoE3およびapoE4の示差的蓄積を示した。
【０３０５】
（表６）HepG2細胞による125I-apoE3または125I-apoE4を多く含むβ-VLDLの細胞結合
2009510167.tif 000023
平均±S.D.は、二つ組で行われた二つの独立した実験から得た。
【０３０６】
これまでに記述された実験において、apoE3およびapoE4を1時間37℃でβ-VLDLとともにインキュベートし、次いで混合物を細胞に添加した。高速液体クロマトグラフィーによる混合物の分離は、およそ50%のapoEがβ-VLDL粒子に結合されたことを明らかにした。この示差的蓄積に対し可能性がある理由の1つは、apoE4よりもapoE3のほうがβ-VLDLと結合すること、およびその結果apoE3の方がより細胞に送達されることである。この可能性は、高速液体クロマトグラフィーによるapoEを多く含むβ-VLDLの単離後、β-VLDLに結合した125I-apoE3または125I-apoE4の量を調べることによって除外された。実際、リポタンパク質粒子に結合したのはapoE3よりもapoE4がわずかに多かった(7.0 対 6.1 μg/mg β-VLDLコレステロール)。さらに、高速液体クロマトグラフィーにより精製された125I-apoEを多く含むβ-VLDLを用いて、本発明者らは、示差的なapoEの蓄積が、β-VLDL粒子上のapoEにより生じるが、脂質不含のまたは低脂質のapoEでは生じないことを示した。この細胞結合は、精製された125I-apoE3を多く含むβ-VLDLとともにインキュベートされたNeuro-2a細胞の方が、精製された125I-apoE4を多く含むβ-VLDLとともにインキュベートされたものよりも大きかった(2時間目で58 対 39 ng/mg細胞タンパク質; 4時間目で101 対 65 ng/mg細胞タンパク質)。
【０３０７】
実施例6: apoEアイソフォームの示差的蓄積に関与する機序
apoE3 対 apoE4の示差的プロセッシングにより、いかにして示差的蓄積を説明できるのかをさらに詳しく調べるため、本発明者らは、リポタンパク質の内部移行は起こるが分解は起こらない温度である18℃で、線維芽細胞およびNeuro-2a細胞によるヨウ素化されたapoEを多く含むβ-VLDLの内部移行を試験した(図13および14)。125I-apoEの分解産物の培地分析から、使用された条件下では分解が起こらなかったことが確認された。これらの試験では、線維芽細胞(図13)および神経細胞(図14)の両方においてapoE3はapoE4よりも多い程度まで蓄積し、示差的蓄積が内部移行apoEの少なくとも一部の示差的輸送に起因し、リソソーム分解の差異には起因しないことを実証している。この結論は、分解がクロロキンにより遮断された線維芽細胞での試験によって裏付けられた。リソソーム分解が存在しなくとも、apoE3またはapoE4を多く含むβ-VLDLとともに細胞をインキュベートした場合、apoE3およびapoE4の示差的蓄積が明らかであった。
【０３０８】
apoE3およびapoE4の示差的な細胞蓄積の機序を特定するため、本発明者らは、LDL受容体、LRP、または特異的な細胞表面プロテオグリカンの発現を欠いた線維芽細胞を利用した。apoEを多く含むβ-VLDLからのapoE3およびapoE4の示差的な細胞蓄積は、LDL受容体発現性の線維芽細胞でもLDL受容体陰性の線維芽細胞でもともに起きたことから、LDL受容体が示差的蓄積に関与していないことが実証された(図15)。その一方で、示差的蓄積はヘパリナーゼを用いた正常またはFH線維芽細胞の前処理によって完全に遮断され、全細胞結合が両アイソフォームで大幅に減少したことから、示差的作用がHSPG/LRP複合体またはHSPG単独のいずれかにより媒介されうることが示唆された(図15)。図16に示されるように、LRP発現についてヘテロ接合性(LRP+/-)か、またはLRP発現を欠いている(LRP-/-)かのいずれかの胚性マウス線維芽細胞は、apoE3およびapoE4の示差的蓄積を示した。従って、LRP発現はapoE3 対 apoE4の示差的蓄積に必要ではない。しかしながら、これらの細胞のヘパリナーゼ処理によってこの作用が遮断されたことから、この場合もやはり細胞表面HSPGの役割が示唆された(図16)。示されたように、ヘパリナーゼは、apoE3およびapoE4を多く含むβ-VLDLの両方の全体的な内部移行を著しく低減したことから、apoEを多く含むリポタンパク質の代謝の増強を媒介するうえでHSPG単独の重要性がさらに示唆された。
【０３０９】
apoE3およびapoE4の示差的蓄積におけるHSPGの役割を、対照CHO細胞において、HSPG発現を特異的に欠いている突然変異体CHO細胞において、および全てのプロテオグリカンの発現を欠いているCHO細胞においてさらに試験した(図17)。125I-apoE3 対 125I-apoE4の示差的な細胞蓄積または保持は、野生型CHO細胞において明らかであった; しかしながら、この示差的蓄積または保持はHSPG欠損およびプロテオグリカン欠損の両CHO細胞において完全に消失されたことから、この過程における細胞表面HSPGの重要性が結論的に実証された。同様に、CHO突然変異細胞によって内部移行されたapoE3およびapoE4のレベルは、かなり大幅に低下した。
【０３１０】
プロテオグリカンはグリセロホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーによるか、またはそれらのコアタンパク質の膜貫通によるかのいずれかにより、細胞膜と結合している。これらのクラスのプロテオグリカンは、異なる速度の細胞プロセッシングを受ける。GPIに固定されたプロテオグリカンは、迅速なエンドソームのリソソームへの輸送を示し、リソソーム分解を受け、細胞内半減期はおよそ30分であるのに対し、コアタンパク質に固定されたプロテオグリカンは、緩徐なエンドソームのリソソームへの輸送を示し(半減期およそ4時間)、遅延型のプロセッシングを受ける。これらの細胞によるapoEの保持は、エンドソームのリソソームへの輸送の緩徐な経路の使用で一貫しており、これらの細胞におけるapoE3およびapoE4の示差的蓄積は、GPIに固定されたプロテオグリカンによるapoEの内部移行に起因しないことを示唆している。これは、線維芽細胞とのヨウ素化されたapoEを多く含むβ-VLDLの細胞結合に及ぼす、GPIに固定されたHSPGを取除く、特異的ホスホリパーゼCの作用を調べることで実証された(図18)。使用条件の下で、ホスホリパーゼは、[35S]O4で24時間標識された細胞からおよび15%の35Sを取除いた。細胞の特異的ホスホリパーゼC処理では、細胞中のapoE3およびapoE4の示差的蓄積またはapoE3もしくはapoE4を多く含むβ-VLDLのいずれかの全体の結合および内部移行に影響が及ばなかったことから、GPIに固定されたHSPGが関与していないことが実証された(図18)。
【０３１１】
細胞内区画の中へ特異的にapoE3を押しやること(shunting)および/またはapoE4の逆エンドサイトーシスもしくは内部移行の遅延からapoE4アイソフォームが示差的に生じた可能性を検討した。これらの可能性を評価するため、本発明者らは改変されたパルス追跡(Apulse-chase)試験を行い、このなかでCHO細胞を、125I-apoEを多く含むβ-VLDLとともに4℃で1時間インキュベートし、洗浄して未結合のリポタンパク質を除去し、さまざまな時間37℃まで加温して内部移行、分解、および保持を追跡した(材料および方法を参照のこと)。特定の時点で、分解産物(分解apoE)およびTCA沈殿性のタンパク質(放出された完全なapoE)の両方の分析のために培地を取り除き、これらの細胞をスラミンで洗浄し(スラミン放出性のapoE)、次いで計測した(内部移行したapoE)。
【０３１２】
表7は、4℃ (ゼロ時)で結合したapoE3およびapoE4の量がほぼ同じであったことを示す; しかしながら、37℃で30、60、および120分後の細胞内の(内部移行された＝蓄積されたまたは保持された)apoE3の量は、apoE4の量よりも約2倍多かった。各時点で、本発明者らは、スラミン放出性であった少量の125I-apoE (すなわち、細胞表面に存在するapoE)を見出した。30〜120分の間に、分解された125I-apoE3およびapoE4の量は増大し、両アイソフォームに対しほぼ同等であった。従って、内部移行されたapoE3およびapoE4の類似の画分が分解された。関心があるのは、インキュベーション時間中に、とりわけ30分および60分の時点で、培地に出現したapoE4の量がいっそう多かったことである。このTCA沈殿性の完全なapoEは、逆エンドサイトーシスされるapoE、または細胞表面にもしくはその近くにあって、加温により速やかに放出されるapoEに相当することができよう。従って、経時的に、apoE4はapoE3よりも大きな程度で放出されるか、またはより少ない程度で内部移行されるか、あるいは、より多くのapoE3が区画中へ隔離されかつ放出されることができない。従って、より多くのapoE3が蓄積し、細胞により保持される。典型的には、4℃ゼロ時に細胞に結合した全apoEの80〜90%が、加温時間後の培地および細胞の各種画分において回収された(表7)。
【０３１３】
（表７）野生型CHO細胞による125I-apoE3および125I-apoE4を多く含むβ-VLDLの代謝
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【０３１４】
125I-apoE3-および125I-apoE4のほぼ同じ量(それぞれ、399 ng/mgおよび378 ng/mg細胞タンパク質)が4℃(すなわちゼロ時)に細胞に結合していた。37℃に加温した後に分析された画分中の125I-apoE (合計)の回収も、表に報告している。データは、四つ組で行われた1度の実験結果を表わしている。この実験は3度繰り返し、同様の結果を得た。
【０３１５】
このパルス追跡試験のデータは図19に図示されている。3度の個別の実験をこのデザインで行い、同等の結果を得た。野生型CHO細胞において、全ての時点で、apoE3が、apoE4よりもより多く蓄積され、かつ保持され、ほぼ同量のapoE3およびapoE4が分解され、30分および60分で、培地中にいっそう多くのapoE4が再出現した。対照的に、HSPG欠損CHO細胞は、野生型CHO細胞(399および378 ng/mg細胞タンパク質)よりもはるかに少ない125I-apoE3＋β-VLDLおよび125I-apoE4＋β-VLDLを結合し(77および75 ng/mg細胞タンパク質); HSPG欠損細胞は、全ての時点でapoE3およびapoE4のほぼ同じ量が内部移行されかつ分解された。ほぼ同じ量のスラミン放出性のおよびTCA沈殿性の125I-apoE3および125I-apoE4 (図10B)も見出された。従って、HSPG欠損細胞は、apoEの取り込みが顕著に低下しただけでなく、アイソフォーム特異的な示差的蓄積、分解または保持を示すこともない。
【０３１６】
apoEを多く含むβ-VLDLの代謝を調べて、apoE3およびapoE4が同じレベルのβ-VLDL粒子の取り込みを刺激するかどうかを判定した。さらに、細胞の取り込み(保持もしくは蓄積)またはapoEを多く含むβ-VLDLからのapoEは、免疫細胞化学によりおよびヨウ素化されたapoEの代謝を追跡することによりもっと直接的に調べられる。
【０３１７】
apoE3またはapoE4を多く含むβ-VLDLのいずれかとのNeuro-2a細胞のインキュベーションによって、β-VLDLの同様の細胞結合、および細胞コレステロールの同様の増加が起こった。このことから神経細胞において、線維芽細胞と同様に、apoE3およびapoE4がほぼ同じ数のリポタンパク質粒子の取り込みを刺激することが明らかである。その一方で、apoE3およびapoE4の特異的に細胞の蓄積を、免疫蛍光または抽出された細胞タンパク質の分析のいずれかによりNeuro-2a細胞において調べた場合、apoE3およびapoE4の示差的蓄積が認められた。これらの所見はNeuro-2a細胞において確認され、125I-apoE3または125I-apoE4を多く含むβ-VLDLの内部移行の細胞結合を調べることで線維芽細胞および肝細胞にまで広げられた。3つ全ての細胞型において、細胞内apoE3はapoE4よりも多い程度で蓄積された(およそ2倍)。同様に、apoE2もNeuro-2a細胞においてapoE4よりも多い程度で蓄積された(およそ1.5倍)。apoE3およびapoE4の示差的蓄積は、LDL受容体陰性のヒト線維芽細胞でもLRP陰性のマウス胚性線維芽細胞でもともに生じたことから、これらの受容体はあまり関係のないことが明らかである。しかしながら、この示差的蓄積または保持は、細胞をヘパリナーゼで処理することにより消失された。
【０３１８】
この過程におけるHSPGの役割は、HSPG合成を欠いた突然変異CHO細胞の使用によって確認された。これらの細胞において、apoE3およびapoE4の両方の蓄積は低下し、apoE3およびapoE4の示差的蓄積は消失された。リン脂質に固定されたHSPGを放出する特異的ホスホリパーゼCによるこれらの細胞の処理では、apoEを多く含むβ-VLDLからのapoE3およびapoE4の示差的蓄積に影響がなかった。apoE4の分解の増強は、これらの細胞によるapoE3およびapoE4の細胞蓄積の差異の理由ではなかった。この示差的蓄積は、エンドソーム-リソソーム融合が起こらない温度の18℃にて、およびリソソーム分解を阻害するクロロキノンの存在下において起こったからである。
【０３１９】
パルス追跡試験(表7、図19および20)は、apoEの示差的蓄積または保持に対して可能な機序を示唆している。ほぼ同じ量の125I-apoE3および125I-apoE4を多く含むβ-VLDLが4℃でCHO細胞に結合した後に、この細胞を37℃に加温することで、apoE4よりも多くのapoE3の内部移行が生じた。その一方で、より多くのapoE4が早い時点(30分および60分)で培地中に見出されたことから、示差的なapoEの蓄積および保持が、細胞からのapoE4の選択的放出から生じたことが示唆された。これらの同じ試験において、HSPG欠損CHO細胞はずっと少ないapoEを結合し、内部移行し、かつ分解し、apoE3とapoE4との間に相違はなかった。
【０３２０】
細胞表面HSPGは、いくつかの生物学的に重要な分子を結合する。さらに、HSPGは、特異的リガンドの結合および内部移行に直接的に関与する受容体として機能することができる。これはある種のウイルス、トロンボスポンジン、リポタンパク質および肝性リパーゼ、トロンビン、ならびに線維芽細胞増殖因子(FGF)について実証されている。さらに、HSPGは他の受容体とのリガンドの相互作用を促進し、または共受容体のように機能する橋として働く。例えば、HSPGはFGF受容体とのFGFの相互作用、apoEおよび肝性リパーゼ含有のリポタンパク質の結合および内部移行におけるHSPGおよびLRPに対する共受容体機能を促進することができる。本試験において実証されたように、apoE含有のリポタンパク質は、LDL受容体またはLRPの関与なしにHSPG依存的な過程において結合され、apoEは内部移行されることができる。ヘパリナーゼ処理単独で、apoEの示差的蓄積が消失された。培養細胞のヘパリナーゼ処理では、LDL受容体を介したLDL結合またはLRPを介したα2-マクログロブリン結合が妨害されることはない。
【０３２１】
リガンドの内部移行において機能するHSPG単独でのまたは共受容体との複合体での能力は、これらの分子の細胞内プロセッシングの方法が異なりうることを示唆している。FGFの細胞内の運命は、どちらの経路が使用されるかによって決まる。FGFがHSPG単独により内部移行される場合、これは分解される; しかし、FGFがHSPG/FGF受容体経路により内部移行される場合は、FGFの一部が細胞質に、かつ最終的には核に侵入する。明らかに、apoEを多く含むリポタンパク質は、次の3つの細胞機序: LDL受容体、HSPG/LRP経路、およびHSPG依存的/LRP非依存的経路により内部移行されうる。従って、apoEの細胞内の運命は、これらの各経路により細胞へ侵入するタンパク質の割合によって左右されることがある。具体的には、HSPG依存的/LRP非依存的経路は、apoE4よりも多いapoE3の蓄積に関与するapoE3 対 apoE4の示差的輸送の主な原因となる。一つには、HSPG経路を介したapoE3を多く含むリポタンパク質の取り込みは、apoE3を個別の(細胞内に隔離された)プールに向け、それが細胞内に蓄積することを可能にすると推測することができる。その一方で、HSPG経路を介して取り込まれたapoE4を多く含むリポタンパク質は、典型的なエンドソーム/リポソームカスケードを回避することができず、それ故に、apoE4が蓄積しない。あるいは、HSPGに対し複合体を形成したapoE4は、再利用されかつ細胞表面に放出されうる(逆エンドサイトーシス)。
【０３２２】
ここに提供されている結果から、apoE3またはapoE4のいずれかとともにβ-VLDLとの神経細胞、線維芽細胞、および肝細胞のインキュベーションによって、これらの細胞による完全なapoEの保持が起こり、apoE4よりも多いapoE3の細胞蓄積が起こることが明らかである。細胞表面HSPGは、保持およびapoEならびにapoE3 対 apoE4の示差的蓄積の両方において主要な役割を果たしているように思われる。LRPおよびLDL受容体は、主として関与していない。apoEの細胞内の運命はまだ究明されていない; しかしながら、これらの細胞によるapoEの保持は、HSPGの緩徐なエンドソームからのリソソームへの輸送との関連による可能性が最も高い。この経路においてapoEがリポソーム分解を回避し、細胞質区画に侵入し、そこでapoEが微小管結合タンパク質または神経突起生長および細胞骨格に及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用の主な原因となりうる他の細胞成分と相互作用しうるかどうかは、まだ究明されていない。
【０３２３】
実施例7: ドメイン相互作用を妨害する化合物の同定
apoE4においてドメイン相互作用を遮断しかつこのアイソフォームに関連したリスクの増強を覆す、小有機分子を同定した。これらの分子を同定するために使われた戦略は、物理試験のための選択肢を狭めるため利用可能な構造情報を使用することであった。最近になって決定された、ヒトapoE4のN-末端ドメイン構造により、構造に基づく薬物設計の絶好の機会が得られた。一般的手法は、N-末端ドメインの適切な領域に結合しかつC-末端ドメインとの相互作用を遮断する分子を見つけるという、「ネガティブイメージ」法であった。ヒトapoE4のN-末端ドメイン構造を用いて、Available Chemicals Directory (ACD; Molecular Design Limited, Inc., San Leandro, CA)を、コンピュータによりスクリーニングした。ACDは、化学製品供給業者から入手可能な200,000種を超える化合物のモデル-構築座標を含む。
【０３２４】
検索法-ネガティブイメージ法
ネガティブイメージ法において、プログラムDOCKは標的タンパク質との各候補分子の結合の模型を作る。Kuntz, ID. (1992) Science 257; 1078-82; およびEwing and Kuntz ( 1997) J Comput. Chem. 18:1175-1189。結合に利用可能な空間は、その部位を集合的に満たす一連の球体によって記述される。これらの球体の中心が次に、可能性のあるリガンド原子位置として処理され、各分子が数百から数千の位置中の部位に組み合わせ的に配置される。形の相補性を反映するものもあれば、Lennard-Jones型のファンデルワールス項およびクローン静電項からなるものもある単純な採点関数を用いて、位置を評価する。事前に計算されたグリッドにより、迅速な採点が可能になる。Meng et al. (1992) J. Comput. Chem. 13:505-524。各分子に対し、各採点関数による最良の位置が保存される。この過程の最後に、各関数による数百の最良得点の分子がグラフにより検証される。Kuntzおよび共同研究者らは、HIV1プロテアーゼおよびチミジル酸シンターゼを含めて、いくつかの標的にこのDOCK戦略を適用している。
【０３２５】
DOCK検索
DOCK 4.0版を用いて、apoE3およびapoE4の両方のN-末端ドメイン構造に対しACDを検索した。Kuntz (1997) J Comput. Chem. 18:1175-1189。関心対象の部位には、残基番号109、112、および61に加えて、周囲領域が含まれた。構造中の全てのタンパク質原子を採点の演算に使用した。検索は2つの異なるサンプリングレベルで行った(大ざっぱに言って、これはどのくらいの位置が各分子について試行されるかに対応している)。
【０３２６】
apoE4にドッキングされた場合に得点の良かった2000種を超える分子を、DOCKから出力した。ほとんどの場合、apoE3の対応リストにも出現した分子は、考察から省いた。グラフィックプログラムMIDASを用いて、標的部位との相補性および所望の薬物様特性の存在の評価により、化合物を視覚的にさらにスクリーニングした。Ferrin et al. (1988). J. Mol. Graph. 6:13-27; およびLipinski et al. (1997) Adv. Drug Delivery Rev. 23:3-25。例えば、あまりに大きく、疎水性、またはペプチド様の分子は、考察から省いた。多数の立体中心を有する天然産物は、誘導体の合成に適していないので、同様に切り捨てた。この過程によって115種の化合物のリストが得られ、65種(近似の類似体のセットにつき1種)が初めに推奨された。
【０３２７】
ドメイン相互作用のアッセイ
apoE4は、ドメイン相互作用によって媒介される、大きなトリグリセリドを多く含むリポタンパク質粒子に選択性を示すので、ドメイン相互作用を妨害する能力がないか候補化合物を試験するために乳剤結合アッセイを開発した。
【０３２８】
乳剤粒子の調製。トリオレイン(160 mg)およびL-α-ホスファチジルコリン(40 mg)を混ぜ合わせ、窒素下で乾燥する。緩衝液(10 mM Tris、100 mM KCl、1 mM EDTA、pH 8.0) 8 mlの添加後、この混合物を水浴中で超音波処理して、乳剤粒子の不均一な混合物を得る。この粒子を超遠心分離(TLA 100.2ローター、30分間30,000 rpm)により収集し、その結果生じた脂質ケーキを試験管のスライシングによって取り出し、20 mMリン酸緩衝液(PB) 100 μlに再懸濁する。トリオレインおよびリン脂質含量を測定し、全体の乳剤粒子濃度を決定する。
【０３２９】
放射性標識。新たに変性かつ再生されたアポリポタンパク質E3およびE4をBolton-Hunter試薬[125I](ICN)により放射標識する。比活性をLowry法およびGamma 8000計測器により測定する。
【０３３０】
結合親和性アッセイ。乳剤粒子に対するapoE3およびapoE4の結合親和性を以下のように測定した。ガラス試験管の中で、タンパク質(ヨウ素化された追跡子) 25 μgを1% β-メルカプトエタノールにより還元した。乳剤粒子250 μgおよび化合物(10 mMストック) 2.5 μlを添加し、最終混合物を20 mMリン酸緩衝液(PB)により250 μlとした。次に反応混合液を37℃の水浴中で2時間インキュベートし、その後1.5 mlの超遠心分離管に移した。最後に、60%スクロース50 μlをサンプルと混合し、20 mM PB 400 μlを慎重に最上層に積層した。TLA 100.2ローターを用いて、この管を30分間30,000 rpmで回転させた後に、切断して、管の底の遊離タンパク質から浮遊性の乳剤粒子層を分離した。その後、これらの画分を現管の各半分と合わせて、Gamma-8000により計測した。これらの結果から、全乳剤結合タンパク質を全遊離タンパク質と比較した。タンパク質のみのアッセイでは、タンパク質の94.5〜96.6%が管の底部に蓄積された。乳剤粒子のみのアッセイでは、乳剤粒子の94%が管の頂上部に蓄積された。
【０３３１】
対照の結合アッセイを化合物の添加なしで行って、回収率ならびにapoE3およびapoE4各々の乳剤粒子に対する親和性を測定した。表8はこの結果を示す。
【０３３２】
（表８）
2009510167.tif 000025
【０３３３】
apoE3およびE4の結合親和性が測定されたら、DOCK化合物を含めたアッセイを行った。apoE4対照を最初のアッセイに含め、apoE3およびapoE4対照を追跡アッセイに含めた。
【０３３４】
最初のスクリーニングにおいて、14種の化合物がドメイン相互作用を妨害し、6種が部分的に妨害した。追跡アッセイにおいて、14種のうち8種の化合物はドメイン相互作用を妨害するが、乳剤とのapoE3の結合に及ぼす作用はほとんどまたは全くないことが確認された。表9は、ドメイン相互作用を妨害する8種の化合物の結果を示している。値は、apoE4 (「E4」)またはapoE3 (「E3」)のいずれかの%結合/%遊離として示されている。
【０３３５】
（表９）
2009510167.tif 000026
【０３３６】
実施例8: Aβ産生に及ぼすapoE4の作用
Aβ産生アッセイ。野生型hAPP cDNA構築体をトランスフェクトした安定な神経芽細胞腫B103細胞系(B103-APP)は、それらを10%ウシ胎仔血清(FBS)および400 μg/ml G418含有のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖することにより選択した。マウス脳においてAPPを同様のレベル発現している細胞系をRNase保護アッセイ(RPA)により同定し、下記の試験に使用した。Aβ産生を判定するため、B103-APP細胞を37℃で24時間、apoEアイソフォーム有りまたは無しでN2補完物を含有する無血清の最小必須培地(MEM)によりインキュベートした。インキュベーション後、培地50 μlを収集し、ELISA法によりAβレベルをアッセイした。細胞を溶解し、細胞タンパク質をLowry法により測定した。Aβ産生を細胞タンパク質に対し規準化した。
【０３３７】
APPプロセッシングおよびAβ産生に及ぼす細胞コレステロールの作用。最近の研究によって、スタチンと呼ばれるコレステロール降下薬が動物モデルにおいてAβ産生を低減し、ヒト集団でのADのリスクを低下させることが示唆されている。インビボおよびインビトロの両試験によっても、細胞へのコレステロール送達がAβ産生を増大することが明らかにされている。この知識を利用し、APPプロセッシングおよびAβ産生に及ぼす、apoEアイソフォームのような、いくつかの反応物の作用を試験するための細胞ツールとして、ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)を安定的にトランスフェクトされたラット神経芽細胞腫B103細胞(B103-APP)を使用できるかどうかを判定した。B103-APP細胞中のコレステロールレベルが、コレステロールを多く含むリポタンパク質β-VLDLとのインキュベーションにより増大された場合、APPαの分泌は低減し、Aβの産生は増大した。対照的に、細胞コレステロールがHMG-CoAレダクターゼ阻害剤ロバスタチンにより低下された場合、APPαの分泌は増大し、Aβの産生は低減した。これらのデータは、細胞コレステロールレベルがAβ産生に重要であるという考え、およびいっそう高い細胞コレステロールがα-セクレターゼ活性を低減し、その結果、Aβ産生を増大するという考えと一致する。このように、B103-APP細胞系は、APPプロセッシングおよびAβ産生を試験するのに有用な細胞系であることが分かる。
【０３３８】
APPプロセッシングおよびAβ産生に及ぼすapoEアイソフォームの作用。多くの研究から、apoEがAβの沈着およびクリアランスに及ぼすアイソフォーム特異的な作用を有することが示唆されている。しかしながら、apoEがAPPプロセッシングおよびAβ産生にも影響を及ぼすかどうかに焦点を当てた研究はほとんどない。apoEの主要な役割は、コレステロールを細胞に輸送することである。従って、apoEは、細胞コレステロール含量を変化させることでAβ産生を調節することができる。Aβ産生に及ぼすapoE4またはapoE3有りまたは無しでのβ-VLDLの作用を調べた。これらの結果を図21A〜Dに示す。apoE3またはapoE4を多く含むウサギβ-VLDLとの培養B103-APP細胞のインキュベーションにより、リポタンパク質無しでまたはβ-VLDLのみでインキュベートされた細胞に比べてAβ産生が刺激された。しかしながら、apoEを多く含むβ-VLDLがFPLCにより2つの個別の画分(大きいβ-VLDL画分および小さい方の低脂質のapoE含有画分)に分画された場合 (図21A)、β-VLDLおよびapoE3またはapoE4のいずれかが豊富なβ-VLDLは、Aβ産生を同程度刺激したが(図21B)、それにもかかわらず試験した細胞のコレステロール含量の差異はなかった。これらの結果は、β-VLDLおよびapoE3またはapoE4を含有するβ-VLDLが、細胞コレステロール含量を増大し、これが今度はAβ産生を増大することを示唆している; しかし、apoE3またはapoE4によるβ-VLDLの濃厚化は、Aβ産生にさらには影響しない。
【０３３９】
その一方で、低脂質のapoE画分は、アイソフォーム特異的にAβ産生を増大し、apoE4はapoE3よりもより活性が高かった(図21C)。このアイソフォーム特異的な作用は、脂質不含のapoEで細胞を処理することによってさらに確認された。脂質不含のapoE3はAβ産生を30%増大し、脂質不含のapoE4はAβ産生をほぼ70%増大した(図21D)。細胞コレステロール含量は脂質不含のapoEによって変化がないので、これらのデータは、Aβ産生に及ぼすapoEのアイソフォーム特異的な作用が、コレステロールの細胞含量の変化により媒介されないことを示唆している。言い換えれば、apoEおよびコレステロールは、異なる機序でAβ産生を調節することができる。
【０３４０】
Aβ産生に及ぼすapoEのアイソフォーム特異的な作用に関与する可能性のある機序を調べるため、apoEアイソフォームがAβと相互作用しかつその分解を示差的に妨害し、これにより異なる量のAβを培地中に保持するかどうかを判定した。125I-標識Aβ (350 pg/ml)をneo-トランスフェクトB103細胞とともに、apoE3またはapoE4有りまたは無しでインキュベートした。Aβの細胞結合および分解は、24時間のインキュベーション後に変化がなかった。さらに、apoE3およびE4は、APPα分泌およびα-セクレターゼ活性に作用を及ぼさなかった。同様に、apoE3およびapoE4は、全細胞溶解液中のα-セクレターゼ活性に酵素的に影響を及ぼさなかった。
【０３４１】
APP再利用に及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用。成熟APPが細胞表面に戻って再利用される場合、分泌Aβの大部分はエンドソーム経路内で生成されるので、apoE3およびE4はAPP再利用に示差的に影響を及ぼすことによりAβ産生を刺激することが可能である。この仮説の裏付けとして、22℃での細胞の増殖によるエンドサイトーシスの阻害により、Aβ産生に及ぼすapoEのアイソフォーム特異的な作用が完全に消失した。APP再利用に及ぼすapoEの作用をさらに確認するため、内部移行アッセイを行った。細胞表面に結合され、次いで酢酸との30分間のインキュベーション後に放出された、APPアミノ末端抗体(1G7)に関連した放射能を測定することにより、細胞表面APPを検出した。細胞溶解液中の放射標識1G7を測定することにより細胞内APPを検出し、細胞表面に対する細胞内のAPPの比を算出した。apoEはアイソフォーム特異的にAPPの内部移行を増大し、apoE4はE3よりもいっそう効果的であった。APP内部移行の割合の増大により、α-セクレターゼに対しより多くのAPPが供与され、その結果、より多くのAβが作出されうる。
【０３４２】
LRPはapoE4によるAβ産生の増強を媒介しうる。apoEはLDL受容体、LDL受容体関連タンパク質(LRP)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)、VLDL受容体、およびapoE受容体-2を含めて、多くの細胞表面受容体のリガンドである。それ故に、Aβ産生に及ぼすapoE4の刺激作用の媒介に関与する受容体を調べた。受容体関連タンパク質(RAP)はLRPアンタゴニストである。B103-APP細胞を1時間37℃にて、RAP無しでまたはLRP経路を遮断する低濃度(25 nM)の、もしくはLRP経路もLDL受容体経路もともに遮断する高濃度(1 μM)のRAP有りでプレインキュベートし、その後、24時間apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)有りでさらにインキュベートした。LRP経路を少なくとも部分的に遮断する低濃度のRAP (25 nM)により、apoE4によるAβ産生の増強が消失したことから、LRP経路の関与の可能性が示唆された。興味深いことに、LRP経路もLDL受容体経路もともに遮断する高濃度のRAP (1 μM)は、低濃度のRAPと同様の作用を有していたことから、LDL受容体経路がapoEによるAβ産生の増強に関与しえないことが示唆された。
【０３４３】
apoE4ドメイン相互作用は、apoE4によるAβ産生の増強に関与しうる。カルボキシル末端ドメインとアミノ末端ドメインとの間の相互作用は、apoE4特有の生物物理学的特性である。apoEアイソフォームはそのリポタンパク質結合選択性が異なり: apoE2およびapoE3はHDLを選択するのに対し、apoE4はVLDLを選択する。それが、apoE4のVLDL選択性を決めているこのドメイン相互作用である。apoE4のArg-112は、これがapoE2およびapoE3において占拠している位置からArg-61の側鎖を再配向し、Glu-255と塩橋を形成できるようにする可能性が高い。apoE2およびapoE3において、Arg-61は異なる立体構造を有するので、ドメイン相互作用は起こらない。ヒトapoEのみがArg-61を有し; apoE遺伝子が配列決定されている他の17種は全てThr-61を有する。apoE4におけるArg-61のトレオニンへのまたはGlu-255のアラニンへの突然変異は、ドメイン相互作用を妨害し、apoE4をapoE3と同様に、HDLに選択的に結合するような形態に転換する。
【０３４４】
apoE4がAβ産生を刺激するのにドメイン相互作用は必要とされるかどうかを調べた。B103-APP細胞を24時間37℃で、細胞内ドメイン相互作用を欠いたapoE4 (Arg-61→Thr) (7.5 μg/ml)とともにインキュベートした。Aβ産生を測定し、apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)とともにインキュベートされたB103-APP細胞から得られたものと比較した。この試験から、Arg-61のトレオニンでの置換によってAβ産生の増強が消失したことが明らかであり、apoE4ドメイン相互作用はAβ産生の刺激に関与していることが示唆された。
【０３４５】
apoE4ドメイン相互作用をかく乱する小分子の同定。実施例7に論じられているように、DOCKプログラムを用いて、インビトロリポタンパク質分布アッセイで測定された、apoE4と相互作用しかつドメイン相互作用をかく乱する小分子(分子量およそ500〜600)を同定した。合理的な薬物設計のためにカリフォルニア大学サンフランシスコ校で開発されたコンピュータモデル化プログラムDOCKは、200,000種を超える化合物のモデル-構築座標を含む。apoE4ドメイン相互作用が起こると仮定される領域(残基番号61、109および112、ならびに周囲の残基)におけるapoE3およびapoE4の結晶構造をAvailable Chemical Directory中の200,000種の化合物と相補性がないか検索して、apoE4と特異的にドッキングする小分子を同定した。apoE4にドッキングされた場合、およそ2000種の分子は得点が良かった; 分子フィットの目視評価によってこの数は60種の分子にまで減少し、およそ12種をさらに広範囲な研究のために選択した。
【０３４６】
apoE4によるAβ産生の増強に及ぼすこれら8種の小分子(表9に示されている)の作用を調べた。8種のうち4種の化合物-それぞれGIND25、GIND29、GIND32およびGIND105とも称される、アゾカルミンG、グリシンクレゾールレッド、5-クロロ-2-(4-クロロ-2-(3,4-ジクロロフェニルウレイド)および3-ブチル-エチル-5-(2-(3-スルホブチル-ベンゾ(1,3)オキサゾは、apoE4によるAβ産生の増強を完全に消失したが、apoE3に対する作用はなかった(図22)。この4種の活性な小分子は、重要な塩基性残基と相互作用し、apoE4のヘリックス2と3との間の溝にフィットし、従ってドメイン相互作用をかく乱すると思われるスルホアルキル化合物である。
【０３４７】
まとめると、ドメイン相互作用の結果として、apoE4は細胞表面LRPと相互作用することでAPP再利用を増大し、Aβ産生の増大をもたらす。apoE4と相互作用しかつドメイン相互作用をかく乱する小分子、またはそれらの誘導体は、apoE4に関連したAβ過剰産生を低減するのに有用な反応物である。
【０３４８】
実施例9: apoE4ドメイン相互作用を阻害する化合物の特徴付け
材料および方法
精製された組換えヒトapoE3、apoE4、apoE4のThr-61変異体(apoE4-Thr-61)、および受容体関連タンパク質(RAP)は、記述のように産生された。Dong and Weisgraber ((1996) J. Biol. Chem. 271:19053-19057; Morrow et al. ((2002) J. Biol. Chem. 277:50380-50385; およびMorrow et al. ((1999) Protein Expr. Purif. 16:224-230。Aβの残基番号1〜17に対するモノクローナル抗体(mAb) 6E10 (sAPPαを検出する)およびAβの残基番号17〜24に対するmAb 4G8は、Signet (Dedham, MA)から購入した。Aβの1〜5および13〜28の残基を、それぞれ認識するmAb 266およびmAb 3D6は、Elan Pharmaceuticals (South San Francisco, CA)から購入した。APPの細胞外ドメイン(残基番号380〜665)を認識するmAb 1G7は、Dr. Edward H. Koo (University of California at San Diego, La Jolla, CA)によって親切にも提供していただいた。ロバスタチンはMerck Sharp and Dohme (Rahway, NJ)から購入した。GIND-25 (アゾカルミン-G)、メバロン酸塩、およびメチル-β-シクロデキストリンは、Sigma (St. Louis, MO)から購入した。GIND-105 (3-ブチル-1-エチル-5-[2-(3-スルホブチル-ベンゾ[1,3]オキサゾリジン-2-イリデン)-エチリデン]-2-チオキソ-イミダゾリジン-4-オンカリウム塩は、Synthon (Wolfen, Germany)から購入した。
【０３４９】
リポタンパク質の調製。ウサギβ-移動超低密度リポタンパク質(β-VLDL)は、記述のように高コレステロール飼料で飼育したウサギから調製した。Ji et al. ((1993) J. Biol. Chem. 268:10160-10167。ヒトapoEを多く含むβ-VLDLは、apoEアイソフォームを1時間37℃でβ-VLDLとインキュベートすることにより調製した。
【０３５０】
細胞培養。ヒト野生型APP (hAPP695wt)を安定的に発現するラット神経芽細胞腫B103細胞(Xu et al. ((1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:7547-7552; Esposito et al. (2004) J. Neurochem. 91 :1260-1274)は、Gladstone Institute of Neurological DiseaseのDr. Lennart Muckeの研究室において作出され、400 μg/ml G418、10%ウシ胎仔血清、および5%ウマ血清含有のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (GIBCO, Grand Island, NY)中において37℃で維持された。48ウェルプレートの中に蒔いて(1ウェルあたり細胞1×105個)から24時間後に、細胞を無血清DMEMで2回洗浄し、1% N-2補完物含有のDMEM (GIBCO)中でさらに24時間培養して、分化を誘導した。この細胞をさらに24時間1% N-2補完物含有の新鮮なDMEM中にて、β-VLDL (25 μg/mlコレステロール)、組換えヒトapoEアイソフォームを多く含むβ-VLDL (7.5 μg/ml apoEおよび25 μg/mlコレステロール)、または組換えヒトapoE (7.5 μg/ml apoE)のいずれかで処理した。一部の実験では、apoE処理の1時間前にRAP (25 nMまたは1 μM)を細胞に添加した。
【０３５１】
一部の実験では、記述のように、但し若干の変更を加え、細胞をロバスタチンで処理した。Fassbender et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5856-5861。手短に言えば、細胞を24時間、4 μMロバスタチンおよび0.25 mMメバロン酸塩含有の分化培地中で維持した。細胞膜コレステロールを枯渇させる5 mMメチル-β-シクロデキストリン(Bodovitz and Klein (1996) J. Biol. Chem. 271 :4436-4440; Kojro et al. (2001) Proc. Natl Acad. Sci. USA 98:5815-5820)での5分間の処理の後、細胞を24時間ロバスタチンおよびメバロン酸塩含有の新鮮な分化培地中でインキュベートした。この馴化培地を収集し、細胞コレステロールをクロロホルム/メタノールで抽出し(Huang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-1838)、Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)のキットで定量した。
【０３５２】
sAPPαの検出。24時間馴化された培地をタンパク質含量によって規準化し、SDS/PAGEに供した。次いでタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。sAPPαをmAb 6E10により検出し、増感化学発光系(Pierce, Rockford, IL)で視覚化した。
【０３５３】
Aβアッセイ。培地の中に分泌されたAβを記述のように、mAb 266を捕捉用抗体としておよび3D6を検出用抗体として用いて、サンドイッチ式の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で検出した。Johnson-Wood et al. ((1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550-1555)。Aβを標準曲線(Aβ42; Bachem, Torrance, CA)から定量し、全細胞タンパク質により規準化した。
【０３５４】
neo-トランスフェクトB103細胞による125I-Aβ40の細胞結合および分解。ネオマイシン耐性遺伝子を安定的にトランスフェクトされたB103細胞(B103-neo)をapoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)の存在下において37℃で125I-標識されたAβの40アミノ酸形態(125I-Aβ40) (225 pg/ml, 0.1 μCi/ml)とともにインキュベートした。培地を24時間後に回収し、培地中の125I-Aβ40の分解産物を記述のようにアッセイした。Goldstein et al al. ((1983) Methods Enzymol. 98:241-250)。細胞を氷上で、0.2%ウシ血清アルブミン含有のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により5回およびPBSにより1回洗浄し、0.1 N NaOHにより溶解した。細胞溶解物中の放射能を計測することにより、細胞に結合した125I-Aβ40を測定した。
【０３５５】
β-セクレターゼ活性のアッセイ。apoEアイソフォーム有りまたは無しで処理された細胞の溶解物中のβ-セクレターゼの活性は、蛍光発生基質(10 μM, MCA-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-DNP-NH2; SEQ ID NO:1) (Calbiochem, La Jolla, CA)を用いて、記述のように(Dong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365)アッセイした。蛍光を、それぞれ、325 nmおよび393 nmの励起波長および発光波長で10分間蛍光分光計にて記録した。β-セクレターゼ活性は、蛍光/分/mg細胞タンパク質の増大として計算した。
【０３５６】
APP内部移行アッセイ。細胞表面APPの内部移行は記述のように測定した(Koo and Squazzo (1994) J. Biol. Chem. 269:17386-17389; Perez et al (1999) J. Biol. Chem. 274:18851-18856)。手短に言えば、APPのアミノ末端ドメインを認識するmAb 1G7を製造元の使用説明書に従いIODO-GENで放射性ヨウ素化した。6ウェルプレート中で増殖されたB103-APP細胞またはB103-neo細胞(バックグラウンド対照)を24時間apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)で処理し、結合用緩衝液(0.2%ウシ血清アルブミンおよび20 mM HEPES含有のDMEM)で洗浄し、37℃で30分間同じ緩衝液中にてapoEの存在下で放射標識1G7抗体(2〜5 μCi/μg)とともにインキュベートした。氷冷PBSで5回洗浄することにより、未結合の抗体を除去した。細胞表面APPに結合した抗体を氷冷PBS (pH 2.0)での5分間の洗浄2回により脱離した。放射性の細胞表面結合APP抗体を低pH洗浄緩衝液の計測により定量し、これが細胞表面APPに相当した。次に細胞を0.2 N NaOHで溶解し、内部移行APPに相当する、細胞溶解物中の放射能を測定した。従って、細胞溶解物中の放射能の、低pH洗浄緩衝液中の放射能との比は、内部移行APP 対 細胞表面APPの指標に相当する。
【０３５７】
apoE4ドメイン相互作用をかく乱できる化合物の探索。ヒトapoE4およびapoE3のアミノ末端ドメインのx線構造を用いてコンピュータにより、200,000種を超える化合物のAvailable Chemicals Directory (Molecular Design Limited, Inc., San Leandro, CA)をスクリーニングした(Wilson et al. (1991) Science 252:1817-1822; およびDong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365)。プログラムDOCK, 4.0版を用いて、200,000種を超える化合物の座標を有するAvailable Chemicals Directoryをスクリーニングした(Kuntz (1992) Science 257:1078-1082; Ewing and Kuntz (1997) J. Comput. Chem. 18:1175-1189)。標的部位には残基番号109、112、および61に加えて、周囲領域が含まれた。DOCKにより、標的タンパク質との各候補分子の結合の模型を作った。結合に利用可能な空間を、その部位を集合的に満たす一連の球体によって記述した。これらの球体の中心を次に、可能性のあるリガンド原子位置として処理し、各分子を数百から数千の位置中の部位に組み合わせ的に配置した。形の相補性を反映するものもあれば、Lennard-Jones型のファンデルワールス項およびクローン静電項からなるものもある単純な採点関数を用いて、位置を評価した。事前に計算されたグリッドにより、迅速な採点が可能になった。Meng et al. (1992) J. Comput. Chem. 13:505-524。各分子に対し、各採点関数による最良の位置を保存した。この過程の最後に、各関数による数百の最良得点の分子をグラフにより検証した。
【０３５８】
apoE4にドッキングされた場合に得点の良かった2000種を超える分子を、DOCK検索から得た。ほとんどの場合、apoE3の対応リストにも出現した分子は、考察から省いた。標的部位との静電気および形の相補性のためグラフィックプログラムMIDAS (Ferrin et al. (1988) J. Mol. Graph. 6:13-27)を用い、化合物を視覚的にさらにスクリーニングした。Lipinski et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3-25。この過程によって115種の化合物のリストが得られ、65種(近似の類似体のセットにつき1種)が初めに推奨された。
【０３５９】
乳剤粒子の調製およびVLDL結合親和性アッセイ。VLDL様の乳剤粒子を記述のように、トリオレイン(160 mg)およびL-α-ホスファチジルコリン(40 mg)を用いて調製した。Dong and Weisgraber (1996) 前記; およびDong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22358-22365。乳剤粒子との125I-標識apoE3およびapoE4の結合親和性をさまざまな量の小分子化合物の存在下または非存在下において、記述のように(Dong and Weisgraber (1996) 前記; およびDong et al. (1994) 前記)、測定した。化合物無しでの乳剤粒子とのapoE3およびapoE4の結合を対照として使用した。
【０３６０】
siRNA調製およびトランスフェクション。ラットLRP遺伝子に特異的な二本鎖siRNAは、以下の配列に従ってDharmacon (Lafayette, CO)により化学的に合成された。
2009510167.tif 000027
24時間48ウェルプレート中で増殖されたB103-APP細胞(細胞1.0×105個/ウェル)に、製造元の使用説明書に従ってリポフェクトアミン(Invitrogen)を用い、両siRNA (各々に対し2 μg/ml)をトランスフェクトした。トランスフェクション複合体をOpti-MEM 250 μlの終容量に希釈し、3時間後、10% FBSおよび5%ウマ血清を補充したDMEMと交換した。トランスフェクションから72時間の後、細胞をapoE3またはapoE4で処理し、上記のように、Aβ産生を24時間後にアッセイした。
【０３６１】
統計分析。結果は平均±SDとして報告されている。差異はt検定または分散分析により評価した。
【０３６２】
結果
APPプロセッシングおよびAβ産生に及ぼす細胞コレステロールの作用
ヒトAPPを安定的にトランスフェクトされたラット神経芽細胞腫B103細胞であって、APPをマウス脳でのレベルに類似のレベルで発現する該細胞(Esposito et al. (2004) J. Neurochem. 91:1260-1274)をコレステロールに富むβ-VLDLとインキュベートした。細胞のコレステロール含量の増大(図23A)、sAPPαの分泌の減少(図23B)、およびAβの産生の増大(図23C)が認められた。対照的に、細胞コレステロールがロバスタチンで低下された場合(図23D)、sAPPα分泌が増大し(図23E)、Aβ産生が減少した(図23F)。これらのデータは、細胞コレステロール含量がAβ産生を調節しうるという考え、および細胞コレステロールレベルの増大がα-セクレターゼ活性を低減し、それ故に、Aβ産生を増大するという考えと一致する。
【０３６３】
図23A〜23F。sAPPαおよびAβの分泌に及ぼす細胞コレステロール含量およびapoEアイソフォームの作用。B103-APP細胞を記述のように、β-VLDL (25 μg/mlコレステロール)、ロバスタチン(4 μM)または培地単独(対照)で処理した。細胞コレステロール含量をβ-VLDL (A)での処理またはロバスタチン(D)処理の後に測定した。24時間の馴化培地中のsAPPαレベルは、β-VLDL (B)またはロバスタチン(E)での処理後にmAB 6E10 (1 μg/ml)を用いて測定した。(CおよびF) 24時間の馴化培地中のAβは、β-VLDL (C)またはロバスタチン(F)での処理後にELISAにより検出した。それぞれ4〜6回繰り返した2度の実験の平均±S.D。＊、p＜0.05 対 対照; ＊＊、p＜0.01 対 対照。
【０３６４】
APPプロセッシングおよびAβ産生に及ぼすヒトapoEアイソフォームの示差的作用
ヒトapoE3またはapoE4を多く含むウサギβ-VLDLとの培養B103-APP細胞のインキュベーションにより、リポタンパク質無しでまたはβ-VLDLのみでインキュベートされた細胞に比べてAβ産生が刺激された(図24A)。しかしながら、ヒトapoEを多く含むβ-VLDLが高速液体クロマトグラフィーにより2つの個別の画分(apoE含有β-VLDLの主要画分および小さい方の低脂質のapoE画分)に分画された場合(図24B)、この再単離された、apoE3またはapoE4のいずれかを多く含むβ-VLDLは、Aβ産生を同程度刺激した(図2C)。さらに、apoE含有β-VLDLは、ヒトapoEとともにインキュベートされなかった再単離β-VLDLのものと同じ結果をもたらした(図24C)。興味深いことに、いずれの処理細胞のコレステロール含量にも差異がなかった。これらの結果は、β-VLDLおよびapoE3またはapoE4を含有するβ-VLDLが、細胞コレステロール含量およびAβ産生を同程度まで増大したこと、ならびにこれらの条件の下ではapoE3またはapoE4の示差的作用がなかったことを示唆している。
【０３６５】
その一方で、低脂質のapoE画分(図24B)は、アイソフォーム特異的にAβ産生を増大し、apoE4はapoE3よりもより活性が高かった(図24D)。このアイソフォーム特異的な作用は、脂質不含のapoEで細胞を処理することによってさらに確認された。脂質不含のapoE3は培地単独と比べて、Aβ産生を約30%増大したのに対し、脂質不含のapoE4はAβ産生を約60%増大した(図24E)。細胞コレステロール含量は脂質不含のapoEによって変化がないので、これらのデータは、Aβ産生に及ぼすapoEのアイソフォーム特異的な作用が、コレステロールの細胞含量の変化により媒介されないことを示唆している。言い換えれば、apoEおよびコレステロールは、異なる機序でAβ産生を調節することができる。
【０３６６】
図24A〜D。低脂質のapoE画分または脂質不含のapoEは、Aβ産生をアイソフォーム特異的に増大する。(A) apoE3またはapoE4を多く含むβ-VLDLは、apoEアイソフォームを1時間37℃でβ-VLDLとインキュベートすることにより調製した。細胞をその後、培地単独(対照)、β-VLDL (25 μg/mlコレステロール)、またはapoEを多く含むβ-VLDL (7.5 μg/ml apoEおよび25 μg/mlコレステロール)のいずれかで処理した。馴化培地を24時間後に収集し、ELISAによりAβをアッセイした。値は2度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し4回繰り返した。a、p＜0.05 対 対照; b、p＜0.05 対 β-VLDL; c、p＜0.05 対 β-VLDL + apoE3。(B) apoEアイソフォームを1時間37℃でβ-VLDLとともにインキュベートした。apoE3またはapoE4を多く含むβ-VLDLおよびβ-VLDL単独を次いで、記述のように高速液体クロマトグラフィーにより分画した。コレステロールおよびタンパク質の定量によってモニターされた溶出プロファイルから、2つの異なる画分、つまり主要なβ-VLDL画分またはapoE含有β-VLDL画分および小さい方の、低脂質のapoE含有画分が示された。(CおよびD) 主要なβ-VLDL画分またはapoE含有β-VLDL画分由来のサンプル(C)をコレステロール含量によって規準化し、25 μg/mlコレステロールでB103-APP細胞とともにインキュベートした。小さい方の、低脂質のapoE含有画分由来のサンプル(D)をタンパク質含量によって規準化し、7.5 μg/mlのタンパク質で細胞とともにインキュベートした。24時間の馴化培地をELISAによりAβについてアッセイした。値は2度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し4〜6回繰り返した。＊、p＜0.05 対 対照(培地のみ); ＊＊、p＜0.05 対 apoE3またはapoE3不含の低脂質の画分。(E) 組換えヒトapoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)を24時間B103-APP細胞とともにインキュベートした。馴化培地をELISAによりAβについてアッセイした。値は3度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し4〜6回繰り返した。＊、p＜0.05 対 対照(培地のみ); ＊＊、p＜0.05 対 apoE3。
【０３６７】
Aβ産生に及ぼすapoEのアイソフォーム特異的な作用に関与する可能性のある機序を調べるため、apoEアイソフォームがAβと相互作用しかつその分解を示差的に妨害し、これにより異なる量のAβを培地中に保持するかどうかを判定した。125I-標識Aβ (350 pg/ml)をapoE3またはapoE4有りまたは無しでB103-neo細胞とともにインキュベートした。Aβの細胞結合および分解は、24時間のインキュベーション後に有意差がなかった(表10)。
【０３６８】
（表１０）125I-Aβ1-40の細胞結合および分解
2009510167.tif 000028
【０３６９】
125I-Aβ1-40 (350 pg/ml)をapoE3またはapoE4有りまたは無しでB103-neo細胞とともにインキュベートした。Aβの細胞結合および分解を上記の方法の項に記述されているように、24時間のインキュベーション後に測定した。
【０３７０】
さらに、apoE3およびE4は、sAPPα分泌またはα-セクレターゼ活性に有意な作用を及ぼさなかった。同様に、apoE3およびapoE4は、全細胞溶解液中のβ-セクレターゼ酵素活性に有意に影響を与えなかった。
【０３７１】
APP再利用に及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用
成熟APPが細胞表面からエンドソームに戻って再利用される場合、分泌Aβの大部分はエンドソーム経路内で生成されるので、apoE3およびE4はAPP再利用に示差的に影響を及ぼすことによりAβ産生を刺激することが可能である。この仮説の裏付けとして、22℃での細胞の増殖によるエンドサイトーシスの阻害により、Aβ産生に及ぼすapoEのアイソフォーム特異的な作用が完全に消失した(図25A)。
【０３７２】
APP再利用に及ぼすapoEの作用をさらに評価するため、Kooおよびその同僚によって確立された内部移行アッセイを行った。Koo and Squazzo (1994) 前記; Perez et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18851-18856。apoEはアイソフォーム特異的にAPPの内部移行(または再利用)を増大し、apoE4はE3よりもいっそう効果的であった(図25B)。apoE4によるAPP内部移行(または再利用)の割合の増大により、β-セクレターゼ切断に対しより多くのAPPが送達され、その結果、より多くのAβが作出されうる。
【０３７３】
図25Aおよび25B。apoE3およびapoE4は細胞内のAPP再利用に及ぼすその示差的作用を通じて、Aβ産生に対しアイソフォーム特異的な作用を及ぼす。(A) 細胞を低温で培養することによるAPP再利用の遮断により、apoE4によるAβ産生の増強が消失した。組換えヒトapoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)を24時間22℃または37℃のいずれかでB103-APP細胞とともにインキュベートした。馴化培地をELISAによりAβについてアッセイした。値は2度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し4〜6回繰り返した。＊、p＜0.05。(B) apoE4はapoE3よりも高い程度まで、細胞表面APPの内部移行を増大した。apoE処理後の細胞表面APPの内部移行を、方法の項に記述されているように、放射性ヨウ素化1G7抗体の取り込みの測定によって判定した。これらの結果は、APPの内部移行プール 対 細胞表面プールに関連する放射能の比率として表されている。値は2度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し3回繰り返した。＊、p＜0.05。
【０３７４】
LRPはapoE4によるAβ産生の増強を媒介する
apoEはLDL受容体、LRP、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、VLDL受容体、およびapoE受容体-2を含めて、多くの細胞表面受容体のリガンドである。Aβ産生に及ぼすapoE4の刺激作用の媒介に関与する受容体を判定するため、B103-APP細胞を1時間37℃にて、RAP無しでまたはLRP経路を遮断する低濃度(25 nM)の、もしくはLRP経路もLDL受容体経路もともに遮断する高濃度(1 μM)のRAP有りでプレインキュベートし、その後、apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)を添加し、インキュベーションを24時間継続した。低濃度のRAP (25 nM)により、apoE4によるAβ産生の増強が消失したこと(図26A)から、LRP経路が関与していることが示唆された。興味深いことに、LRPもLDL受容体もともに遮断する高濃度のRAP (1 μM)、および低濃度のRAP (図26A)が同様の作用を有していたことから、LDL受容体経路がapoEによるAβ産生の増強に関与しえないことが示唆された。さらに、特異的siRNAによるLRP発現のノックダウン(70〜80%)によって、apoE4によるAβ産生の増強が消失したこと(図26B)から、この過程でのLRPの決定的な役割が確認された。興味深いことに、LRPのノックダウンによって同様に、対照細胞でのAβ産生が大幅に減少したことから、基礎的Aβ産生におけるLRPの関与が示唆された。
【０３７５】
図26Aおよび26B。LRPはapoE4によるAβ産生の増強を媒介する。(A) B103-APP細胞を1時間37℃にて、RAP無しでまたはLRP経路を遮断する低濃度(25 nM)の、もしくはLRP経路もLDL受容体経路もともに遮断する高濃度(1 μM)のRAP有りでプレインキュベートし、次いで24時間apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)とともにインキュベートした。馴化培地をELISAによりAβについてアッセイした。＊、p＜0.05 対 apoE3。(B) B103-APP細胞をラットLRP遺伝子に特異的なsiRNA (ヌクレオチド2 μg/ウェル)で3日間処理し、次いで24時間apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)とともにインキュベートした。馴化培地をapoE処理から24時間後に収集し、ELISAによりAβについてアッセイした。値はapoE処理無しの対照B103細胞の割合の平均±S.D.である(n = 4)。＊、p＜0.05 対 apoE3。
【０３７６】
apoE4ドメイン相互作用は、apoE4によるAβ産生の増強に関与する
カルボキシル末端ドメインとアミノ末端ドメインとの間の相互作用は、apoE4特有の生物物理学的特性であり、このなかにはArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成がある(図27A)。apoE4におけるArg-61のトレオニンへのまたはGlu-255のアラニンへの突然変異は、ドメイン相互作用を妨害し、apoE4をapoE3と構造的かつ機能的に似た形態に転換する(図27A)。それ故に、apoE4によるAβ産生の刺激におけるドメイン相互作用の役割を判定した。B103-APP細胞をapoE4-Thr-61 (7.5 μg/ml)とともに24時間37℃でインキュベートした。Aβ産生を測定し、apoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)とともにインキュベートされたB103-APP細胞から得られたものと比較した。残基番号61の、アルギニンのトレオニンとの置換によってAβ産生の増強が消失したことから、apoE4ドメイン相互作用はAβ産生の刺激に関与していることが示唆された(図27B)。
【０３７７】
図27Aおよび27B。apoE4ドメイン相互作用は、apoE4によるAβ産生の増強に関与する。(A) 薬物開発の標的としてのapoE4ドメイン相互作用のモデル。(B) B103-APP細胞を24時間37℃でapoE3、apoE4、またはapoE4-Thr-61 (7.5 μg/ml)とともにインキュベートした。馴化培地を収集し、ELISAによりAβについてアッセイした。値は3度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し4回繰り返した。＊、p＜0.05 対 apoE3またはapoE4-Thr-61。(C) GIND-25 (二硫酸塩)もGIND-105 (モノスルホアルキル)もともに、VLDL様の乳剤結合アッセイで測定される、apoE4ドメイン相互作用を遮断することができる。値は5〜8回のアッセイの平均±S.D.である。化合物 対 apoE4単独の双方でp＜0.01。(D) 化合物GIND-25およびGIND-105は、apoE4によるAβ産生の増強を消失する。組換えヒトapoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)を30分間37℃にてGIND-25またはGIND-105 (5 μM)有りまたは無しでプレインキュベートし、次いでB103-APP細胞とともに24時間さらにインキュベートした。馴化培地を収集し、ELISAによりAβについてアッセイした。値は3度の実験の平均±S.D.であり、それぞれを各条件に対し3〜5回繰り返した。
【０３７８】
ドメイン相互作用をかく乱可能な小分子化合物は、apoE4によるAβ産生の増強を消失する
VLDLとのapoE4の選択的結合は、ドメイン相互作用によって媒介される。DOCKスクリーニングから得られた65種の小分子化合物をインビトロVLDL結合アッセイにより、apoE4ドメイン相互作用を遮断するその能力についてアッセイした。65種のうち8種の化合物がVLDL様の乳剤粒子とのapoE4の結合を顕著に阻害することが分かり、それらが、apoE4ドメイン相互作用をかく乱することが示唆された。それらの化合物の大部分は、乳剤粒子とのapoE3の結合にほとんどまたは全く影響しなかった。apoE4結合を顕著に阻害した(図27C)が、apoE3結合に顕著な影響を及ぼさなかった2種の化合物(GIND-25、二硫酸塩およびGIND-105、モノスルホアルキル)を選択して、apoE4ドメイン相互作用から生じるAβ産生の増強をそれらが消失できたかどうかを判定した。どちらの化合物もともに水溶性であり、マイクロモルレベルでB103細胞に有意な毒性はなかった。図27Dで実証されている通り、どちらの化合物もともに、apoE4によって誘導されたAβ産生をapoE3によって誘導されたものに類似のレベルにまで低減した。これらの結果から、ドメイン相互作用をかく乱可能な小分子化合物は、apoE4によるAβ産生の増強を消失できることが示唆される。
【０３７９】
図28A〜Cに示されるように、apoE3もapoE4も細胞コレステロール含量、sAPPαレベル、またはβ-セクレターゼ活性を変えない。(28A) B103-APP細胞を24時間組換えヒトapoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)で処理した後に、細胞コレステロール含量を測定した。細胞コレステロールをクロロホルムにより抽出し、定量した。(28B) 組換えヒトapoE3もしくはapoE4 (7.5 μg/ml)またはβ-VLDL (25 μg/mlコレステロール)を24時間B103-APP細胞とともにインキュベートした。馴化培地をタンパク質含量により規準化し、12%ゲルでのSDS/PAGEに供した。sAPPαのレベルをmAb 6E10 (1 μg/ml)で検出した。(28C) B103-APP細胞を24時間組換えヒトapoE3またはapoE4 (7.5 μg/ml)で処理した後に、β-セクレターゼ活性を測定した。全細胞抽出物を方法の項で記述したように調製した。反応用緩衝液(40 mM Tris, pH 7.5, 1 mM CaCl2)中37℃で細胞抽出物50 μlを蛍光発生基質(10 μM MCA-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-DNP-NH2; SEQ ID NO:1)とともにインキュベートすることにより、β-セクレターゼ活性を測定した。
【０３８０】
実施例10: apoE4ドメイン相互作用の阻害のFRET分析
apoE4ドメイン相互作用をかく乱する小分子をスクリーニングするための細胞に基づく高速大量処理アッセイを確立するため、記述のように、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)アッセイを用いて、apoE3またはapoE4を発現している生きた神経細胞を分析した。Xu et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:25511-25516。FRET、つまり励起されたフルオロフォア(供与体)から別のフルオロフォア(受容体)への光子エネルギーの非放射性移動は、供与体および受容体がすぐ近く(＜100オングストローム)にあるときにだけ起こる。すなわち、ナノメートルスケールの距離を測定するために、この手法を用いることができる。
【０３８１】
生きた神経細胞においてapoE4ドメイン相互作用を測定するため、YFP-apoE3-CFPまたはYFP-apoE4-CFPを同様のレベルで発現している、安定的にトランスフェクトされたNeuro-2a細胞を使用した。Neuro-2a細胞に2つの構築体のうちの1つを安定的にトランスフェクトした: 1) YFP-apoE3-CFPは、pFLAG-CMV3ベクター(Sigma)の中にクローニングされた、5'から3'の順序で、黄色蛍光タンパク質(YFP)コード配列、ヒトapoE3コード配列、およびシアン蛍光タンパク質(CFP)コード配列を含む、構築体であり; ならびに2) YFP-apoE4-CFPは、pFLAG-CMV3ベクターの中にクローニングされた、5'から3'の順序で、黄色蛍光タンパク質(YFP)コード配列、ヒトapoE4コード配列、およびシアン蛍光タンパク質(CFP)コード配列を含む、構築体である。Xu et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:25511-25516。これらの構築体は図29に図式的に描かれている。
【０３８２】
CFPの発光スペクトル(460〜520 nm)はYFPの励起スペクトル(480〜520 nm)と重複するので、FLEXstation (Molecular Devices)を用いて、高速大量処理の様式でYFP-apoE3-CFPまたはYFP-apoE4-CFPを発現している生細胞でのFRETを測定することができる。ドメイン相互作用により、CFPおよびYFPはapoE4ではすぐ近くにあるが、apoE3ではそうでないので、CFP励起下で発光エネルギーの一部がCFPからYFPに移動され、それによりYFP発光を増して、CFP発光を減らす(図30に図式的に描かれている)。従って、YFP-apoE4-CFPを発現している細胞でのCFP発光に対するFRETの比率は、YFP-apoE3-CFPを発現している細胞でのものよりもずっと高い(図31)。さらに、apoE4ドメイン相互作用をかく乱する小分子による、YFP-apoE4-CFPを発現している細胞の処理により、CFP発光に対するFRETの比率が低減するはずであり、これを高速大量処理スクリーニングアッセイとして使用することができる。FLEXstationは、種々の小分子無しでまたは有りで処理した細胞でも培地でもともにFRETを読み取ることができるので、このアッセイにより、小分子がapoE4ドメイン相互作用に培地(「培地のFRET」)においてのみまたは細胞内(「細胞内のFRET」)においても影響を与えるかどうかを知ることが可能になる。さらに、細胞内のFRETの測定後、この細胞をMTTとともにさらにインキュベートして、化合物の細胞毒性を判定することができる。このように、細胞に基づくFRETアッセイは3つのデータセット、つまり細胞内のFRET、培地のFRET、および細胞毒性を同時に与えることができる。
【０３８３】
実験手順
YFPおよびCFPと融合されたapoE3またはapoE4をコードするcDNA構築体の調製−停止コドン無しで野生型ヒトapoE3またはapoE4をコードするPCR産物を、アミノ末端のFLAGタグおよびシグナルペプチド配列を含んだpFLAG-CMV3ベクター(Sigma)の中にサブクローニングした。停止コドン無しでYFPをコードするPCR産物をpEYFP-N1ベクター(Clontech, Palo Alto, CA)から増幅し、apoEのN末端でpFLAG-CMV3-apoE3およびpFLAG-CMV3-apoE4ベクターの中にサブクローニングした。最後に、停止コドン有りでCFPをコードするPCR産物をpECFP-C1ベクター(Clontech)から増幅し、apoEのC末端でpFLAG-CMV3-YFP-apoE3およびpFLAG-CMV3-YFP-apoE4ベクターの中にサブクローニングした。YFP-apoE3-CFPおよびYFP-apoE4-CFPをコードするcDNA構築体を作出した。DNA構築体は全て、配列解析により確認した。
【０３８４】
細胞培養およびトランスフェクション−マウス神経芽細胞腫Neuro-2a細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)を10%ウシ胎仔血清含有の最小必須培地中37℃で維持した。リポフェクトアミン2000試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、上記のapoE cDNA構築体をNeuro-2a細胞にトランスフェクトした。YFP-apoE3-CFPまたはYFP-apoE4-CFPを発現している安定な細胞系は、それらを10%ウシ胎仔血清および400 μg/mlのG418含有の最小必須培地中で継続的にインキュベートすることにより選択した。
【０３８５】
トランスフェクトNeuro-2a細胞でのFRETの定量−YFP-apoE3-CFPまたはYFP-apoE4-CFPを類似のレベルで発現している、安定的にトランスフェクトされたNeuro-2a細胞を蛍光活性化細胞選別装置(FACS)により選択した。トランスフェクト細胞のYFPおよびCFP像をMeta検出器で取得し、その蛍光強度を据付のコンピュータで分析した。FRETシグナルをCFP励起下でのCFPに対するYFPの蛍光強度の比率として計算した。各YFP-apoE-CFP構築体に対し、FRETシグナルを異なる視野の少なくとも12個の細胞において測定した。
【０３８６】
培地でのFRETの定量−YFP-apoE3-CFPまたはYFP-apoE4-CFPを安定的に発現しているNeuro-2a細胞および野生型細胞をT175フラスコ中で90%の集密度まで増殖させ、N2補完物を含有する無血清の最小必須培地とともに24時間インキュベートした。馴化培地(20 ml/フラスコ)をCentriplus-YM-10濃縮器(Amicon, Bedford, MA)で約20倍に濃縮し、PBSに対して透析し、CFP励起波長(430 nm)で照射し、発光スペクトルを走査した。FRETシグナルを475 nmでの発光(CFP)に対する525 nmでの発光(YFP)の比率として計算した。apoE3-CFPまたはapoE4-CFPを発現している細胞からの馴化培地を用いて、FRETがない場合のベースラインの蛍光を測定した。
【０３８７】
統計分析−結果は平均±SDとして報告されている。差異はt検定または分散分析により評価した。
【０３８８】
結果
細胞に基づくFRETアッセイを用いて、apoE4ドメイン相互作用をかく乱しうるDOCK化合物のいくつかをVLDL結合アッセイにおいて試験した。化合物GIND-25、GIND-28、GIND-81、GIND-105およびGIND-111は、5〜20 μMの用量で、YFP-apoE4-CFPを発現している細胞(図32)でもその培地(図22)でもともにCFPに対するFRETの発光の比率を大幅に低減したことから、これらの化合物がapoE4ドメイン相互作用をかく乱することが示唆された。重要なことには、これらの化合物のどれもYFP-apoE3-CFPを発現している細胞(図34)およびその培地(図35)において、CFPに対するFRETの発光の比率を有意に変えはしなかった。MTT ([3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド])アッセイから、これらの化合物は全て5〜10 μMの用量で有意な細胞毒性を引き起こさないことが実証された(図36)。
【０３８９】
実施例11: 神経細胞におけるAβ誘導性のリソソーム漏出(lysosomal leakage)およびアポトーシスに及ぼすapoE4ドメイン相互作用阻害剤の作用
材料および方法
細胞培養−Neuro-2a細胞を10%ウシ胎仔血清含有のNB培地(50%ダルベッコ改変イーグル培地および50% F12培地)中で維持した。Neuro-2a細胞にアポリポタンパク質(apo)E3またはapoE4ゲノムDNAをリポフェクトアミン(LipofectAMINE)法によりトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされた細胞を400 μg/ml G418含有の10% NB培地中で選択した。トランスフェクト細胞により培地中に分泌されたapoEの量をイムノブロットにより測定した。apoE 40または80 ng/ml培地/24時間を分泌する、apoE3およびapoE4トランスフェクト細胞を試験のために選択した; apoE 80 ng/ml培地/24時間を分泌する細胞を特に断りのない限り使用した。
【０３９０】
アミロイドβ1〜42 (Aβ1-42)またはAβ1-40 (1 mg)をジメチルスルホキシド100 μlに溶解し、水の中で1 mlに希釈した。Aβを72時間37℃でインキュベートして、使用前に凝集体を形成した。
【０３９１】
DNA断片化アッセイ−アポトーシス細胞のDNA断片化をCell Death Detection ELISAキット(Roche, Indianapolis, IN)で測定した。
【０３９２】
リソソーム膜安定性の測定−細胞を記述のAβ1-42またはapoEで処理し、リソソームの膜安定性および漏出をLucifer Yellow放出およびβ-ヘキソサミニダーゼ活性により細胞質ゾル中で測定した。細胞質ゾル画分は超遠心分離により得て、細胞質ゾルのβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。
【０３９３】
結果
apoE4はAβ誘導性のリソソーム漏出を促進する−apoEがAβ誘導性のリソソーム漏出にアイソフォーム特異的な作用を及ぼすかどうかを判定するため、neo-、apoE3-、およびapoE4-トランスフェクトNeuro-2a細胞を37℃で20時間20 μM Aβ1-42(またはAβ1-40)とともにインキュベートした。有意なリソソーム漏出は未処理のapoE3-またはapoE4-トランスフェクト細胞において認められなかった。しかしながら、Aβ1-42による処理の後、neo-またはapoE3-トランスフェクト細胞よりも多くのapoE4-トランスフェクトNeuro-2a細胞が、散在性の細胞内蛍光パターンを示すことが容易に見て取れ、細胞質ゾルへのリソソーム漏出が示唆された。
【０３９４】
Aβ1-42誘導性のリソソーム漏出に及ぼすapoE3およびapoE4の作用を、細胞質ゾル中のリソソーム酵素β-ヘキソサミニダーゼを測定することによりアッセイした(図37)。Aβ処理により、細胞質ゾルのβ-ヘキソサミニダーゼ活性がapoE4-トランスフェクト細胞においてneo-およびapoE3-トランスフェクト細胞におけるよりも顕著に高い程度に増大された(それぞれ、約85% 対 約40%および約30%; p＜0.001)。Aβで処理されたneo- 対 apoE3-トランスフェクト細胞に認められた差異は、統計的に有意ではなかった。
【０３９５】
図37。apoE3-およびapoE4-トランスフェクト細胞におけるAβ誘導性のリソソーム漏出。細胞質ゾル中のリソソーム酵素β-ヘキソサミニダーゼの活性の定量から、リソソーム漏出が示唆される。neo-、apoE3-、およびapoE4-トランスフェクト細胞を100-mm培養皿中およそ90%の集密度に増殖させ、24時間20 μMのAβ1-42とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、細胞質ゾル画分を材料および方法の項に記述したように単離した。β-ヘキソサミニダーゼの酵素活性を各サンプルに対し、細胞質ゾルタンパク質20 μgにてアッセイした。値は、二つ組で行われた2度の個別実験の平均±S.D.である。＊Aβ1-42で処理されたapoE4-トランスフェクト細胞 対 Aβ1-42で処理されたneo-およびapoE3-トランスフェクト細胞(p＜0.001)。
【０３９６】
apoE4はAβ1-42誘導性の細胞死およびアポトーシスを促進する−トランスフェクトNeuro-2a細胞を37℃で18時間20 μM Aβ1-42とともにインキュベートした。Aβ誘導性のアポトーシスに及ぼすapoE3およびapoE4の示差的作用を調べるため、本発明者らは20 μM Aβ1-42の添加から18時間後にneo-、apoE3-、およびapoE4-トランスフェクトNeuro-2a細胞においてDNA断片化を測定した。DNA断片化は、apoE4-トランスフェクト細胞においてneo-およびapoE3-トランスフェクト細胞におけるよりもはるかに高い程度に増大した(Z-VAD処理による対照細胞でのDNA断片化の、それぞれ、約250% 対 約140%および約110%) (図38)。apoE3が保護作用を示すという傾向だけが認められた; しかしながら、apoE4によるAβ1-42誘導性のアポトーシスの促進は極めて有意であった(p＜0.001)。Z-VADでの前処理により、3種全ての細胞系においてAβ誘導性のDNA断片化が大幅に減少し、apoE4-トランスフェクトNeuro-2a細胞において見られた促進のほぼ全てが消失した(図38)。
【０３９７】
図38。apoE4はAβ誘導性のアポトーシスDNA断片化を促進する。Neuro-2a細胞を最初、2時間Z-VAD (100 μg/ml)有りまたは無しでインキュベートし、その後、18時間Aβ1-42とともにインキュベートした。対照細胞はAβ1-42で処理しなかった。アポトーシス細胞死をDNA断片化アッセイにより測定した。値は3度の個別実験の平均±S.D.である。Z-VAD処理単独での影響を未処理の対照細胞で得られた結果と比較し、細胞系のいずれにおいても影響は示されなかった。
【０３９８】
apoE3-およびapoE4-分泌性のNeuro-2a細胞の馴化培地: apoE4はアポトーシスを促進する−トランスフェクト細胞の分泌経路のなかで作出されたapoEが、Aβ1-42処理後に見られた結果の原因でありうる可能性を検討した。apoE3-およびapoE4-分泌性のNeuro-2a細胞を24時間培養し、馴化培地をneo-トランスフェクト細胞に移し; 20 μMのAβ1-42を添加し、DNA断片化を18時間後に定量した。Aβ誘導性のDNA断片化はapoE4-馴化培地とともにインキュベートされた細胞において、neo-またはapoE3-馴化培地とともにインキュベートされた細胞におけるよりも有意に高かった(それぞれ、314% 対 232%および202%; p＜0.05)。neo-馴化培地中でインキュベートされた細胞におけるよりもapoE3-馴化培地中でインキュベートされた細胞においてDNA断片化が少ないという傾向が認められた(p = 0.067)。
【０３９９】
apoE4ドメイン相互作用を阻害することをDOCKにより特定された小分子は、apoE4による、Aβ誘導性のリソソーム漏出およびアポトーシスの増強を遮断する−図39Aおよび39Bに示されるように、GIND-25、-28、および-105は、apoE4に関連するリソソーム漏出およびアポトーシスを遮断するが、培地のみまたはapoE3に加えてAβ1-42含有の培地とともにインキュベートされた細胞に有意な作用を及ぼさない。
【０４００】
図39Aおよび39B。(39A) apoE4ドメイン相互作用を阻害する小分子(GIND-25、-28、および-105; 5 μM)は、apoE4による、Aβ誘導性のリソソーム漏出の増強を消失する。Neuro-2a細胞を、neo-、apoE3、またはapoE4でトランスフェクトされたC6星状細胞から集められた馴化培地とともにインキュベートした(24時間37℃)。場合によっては、Aβ1-42 (20 μM)を細胞に添加した。細胞質ゾルのβ-ヘキソサミニダーゼ活性をアッセイすることにより、リソソーム漏出を定量した。(39B) apoE4ドメイン相互作用を阻害する小分子(GIND-25、-28、および-105)は、apoE4による、Aβ誘導性のアポトーシスの増強を消失する。馴化培地を上記のように調製した。DNA断片化を測定することにより、アポトーシスを定量した。
【０４０１】
実施例12: ドメイン相互作用は、神経毒性断片を生ずるタンパク質分解に対するapoE4の感受性を促進する
apoEは、生物活性のapoEカルボキシル末端切断断片を生ずるキモトリプシン様のセリンプロテアーゼによる切断に供されることが実証されている[Huang Y. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:8838-8843]。年齢および性別を適合させた非認知症の対照におけるよりもAD患者の脳においてこれらのapoE断片の高いレベルが認められている。apoE4断片化はある脳領域に特異的であり、AD関連の神経変性に対し脆弱でない小脳におけるよりもAD関連の神経変性に対し脆弱である皮質および海馬において高い程度で起こる[Brecht W. et al., (2004) J. Neurosci, 24:2527-2534]。さらに、切断apoE4は培養神経細胞において発現されるかまたは培養物に外から加えられる場合、神経毒性であり、細胞死および一部の死細胞での細胞内のNFT様の封入体形成を引き起こす[Huang Y. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:8838-8843]。
【０４０２】
インビボでのapoE4断片の病原性を判定するため、カルボキシル末端の28アミノ酸を欠いたapoE4 [apoE4(Δ272-299)]を神経細胞においてさまざまなレベルで、合成および分泌するトランスジェニックマウスを作製した[Harris FM. et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:10966-10971]。この切断apoE4は、AD脳において作出される主な切断種の1つに相当する。高発現体マウスにおける海馬または皮質の神経細胞は、該切断apoE4含有の多数の細胞質内封入体を有し、これらはまだ2〜4ヶ月齢のマウスにおいて観察することができた。H&E染色により、これらの月齢での、該切断apoE4を発現している神経細胞の変性が明らかにされた。Gallyas銀染色により、新皮質の神経細胞におけるNFT様の封入が明らかにされた。行動試験により、低レベルの該切断apoE4を発現している6〜7ヶ月齢のトランスジェニックマウスにおいて学習および記憶の障害が実証された。しかしながら、脂質結合ドメイン(アミノ酸番号244〜272)を欠いたさらに短い切断型apoE4 [apoE4(Δ241-299)]は、トランスジェニックマウスにおいて神経病理を誘導しなかったことから、該切断apoE4断片内の脂質結合ドメインが神経毒性作用に関与しうることが示唆された[Harris FM. et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:10966-10971]。
【０４０３】
断片化がアイソフォーム特異的であるかどうかを判定するため、apoE断片の(29-kDaおよび14〜20-kDa一緒の)量を、apoE4有りまたは無しのAD患者(n=19)ならびに対応のapoE遺伝子型を有する、年齢および性別を適合させた対照(n=17)の脳溶解物での抗apoEによるウエスタンブロッティングにより測定した。完全長のapoEに対するapoE断片の比率はAD患者において、対応のapoE遺伝子型を有する対照におけるよりも高かった(図40A〜C、p＜0.01)。どちらの群でも、apoE4有りの被験体はapoE4無しのものよりも多くのapoE断片を持っていた(図40A〜C、p＜0.01)。これらの結果から、apoE断片化とADの発病との間の相関関係およびapoE4がapoE3よりもヒト脳でのタンパク質分解的切断に感受性の高いことが示唆される。
【０４０４】
同様に、神経細胞中にてヒトapoE4を発現しているトランスジェニックマウスの脳内で、年齢依存的に、切断されたapoE4断片が見出された。重要なことには、NSE-apoEマウスでのapoE断片化のパターンは、ヒトでのものと似ている(図41Aおよび41Cを比較のこと)。さらに、神経細胞のapoE3発現を有するトランスジェニックマウスでは、apoE4マウスよりもずっと少ないapoE断片が作出されたこと(図41C)から、ヒト脳と同様に、apoE4がapoE3よりもマウス脳でのタンパク質分解的切断に感受性の高いことが示唆された。
【０４０５】
ドメイン相互作用がタンパク質分解に対するapoE4の感受性に関与しているかどうかを判定するため、ともに分子内ドメイン相互作用のない、組換えapoE4-Thr-61またはapoE4-Ala-255 (1 μg)を、部分的に精製されたAECE (10 μl)とともに3時間37℃でインキュベートした。抗apoEによるウエスタンブロッティングにより、apoE4-Thr-61およびapoE4-Ala-255が野生型apoE4よりもタンパク質分解に対していっそう耐性であったこと(図42)から、ドメイン相互作用がタンパク質分解に対するapoE4の感受性に関与していることが示唆された。
【０４０６】
ドメイン相互作用がタンパク質分解に対するapoE4の感受性に関与していることをさらに証明するため、CNSの神経細胞においてapoE4-Thr-61またはapoE4-Ala-255を発現するトランスジェニックマウスを作製した。非常に著しくは、apoE断片化はapoE4-Thr-61またはapoE4-Ala-255マウス脳のいずれにおいても見られなかった(図43Bおよび43C)のに対し、かなりの量のapoE断片が同齢の野生型apoE4マウス脳において見られた(図43A)。ドメイン相互作用はapoE4-Thr-61でもapoE4-Ala-255でもともに解消されるので、これらの結果から、apoE4ドメイン相互作用が少なくともトランスジェニックマウスにおいてインビボでのタンパク質分解に対するapoE4の感受性に関与しているという結論が強く支持される。
【０４０７】
図40A〜C。ヒト脳におけるapoEのアイソフォーム特異的な断片化。AD患者19人(n = 9 apoE3/3、年齢75±7; n = 10 apoE4/3およびapoE4/4、年齢72±6)ならびに非認知症被験体17人(n = 10 apoE3/3、年齢72±6; n = 7 apoE4/3、年齢70±5)から脳組織を死後5〜14時間に収集し、ドライアイス上ですぐに凍結し、使用されるまで-80℃で貯蔵した。中前頭回(midfrontal gyrus)由来の組織(1〜2 g)を既報のようにPolytronホモジナイザーでホモジナイズした。この脳溶解物(総タンパク量150 μg)をSDS-PAGEに供し、完全長apoE(A)またはapoEのカルボキシル末端の28アミノ酸(B)に対する抗体により分析した。完全長apoEに対する切断apoE (29 kDaおよび14〜20 kDa)の比率を濃度測定により定量した(C)。w/o E4、apoE4無し(ここではapoE3/3のみ)の被験体; w/E4、少なくとも1つのapoE4対立遺伝子(apoE4/3またはapoE4/4)を有する被験体。
【０４０８】
図41A〜C。NSE-apoEまたはGFAP-apoEマウスおよびヒトの脳におけるapoE断片化。完全長apoEまたはカルボキシル末端apoEに対する抗体でのウエスタンブロッティングにより検出されたNSE-apoE (A)もしくはGFAP-apoE (B)マウスまたはヒト(C)の脳溶解物におけるapoE。apoE断片化はNSE-apoEマウス脳(A)において起こり、これはヒト脳(C)におけるそれと類似しているが、GFAP-apoEマウス脳(B)においてはそうでないことに留意されたい。
【０４０９】
図43A〜C。apoE4ドメイン相互作用は、トランスジェニックマウスにおいてタンパク質分解に対するapoE4の感受性に必要である。2ヶ月齢の3匹の野生型apoE4 (A)、3匹のapoE4-Thr-61 (B)、および2匹のapoE4-Ala-255 (C)トランスジェニックマウスの脳溶解物におけるapoEを、完全長apoEに対する抗体でのウエスタンブロッティングにより検出した。apoE断片化は野生型apoE4トランスジェニックマウスの脳において起こったが、apoE4-Thr-61またはapoE4-Ala-255トランスジェニックマウスの脳において起こらなかった。
【０４１０】
本発明をその具体的な態様に関して記述してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の変更がなされてもよく、等価物と置き換えられてもよいことを当業者は理解するはずである。さらに、本発明の目的、趣旨および範囲に適合するよう、特定の状況、材料、合成物、工程、工程段階に多くの変更がなされてもよい。そのような変更は全て、本明細書に添付されている特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０４１１】
【図１】Neuro-2a細胞をトランスフェクトするのに使用されたヒトapoE cDNA構築体の略図である。NSEプロモーター(N)、下部に「E」を有するapoEエキソン、下部に「P」を有するポリリンカー領域および下部に「A」を有するapoE cDNA。
【図２】対照Neuro-2a細胞からのおよびapoE3またはapoE4を発現するよう安定的にトランスフェクトされた細胞からの、1細胞あたりの神経突起の数(A)、神経突起の枝分かれ(B)、および神経突起伸張(C)に及ぼすβ-VLDLの作用を描いた一連の棒グラフである、2A、2Bおよび2Cを含む。いずれの場合にも、中実黒棒は対照を表し、斜線付き棒はapoE3発現細胞を表し、中実白棒はapoE4発現細胞を表す。いかなる場合でも、X軸はβ-VLDL (μgコレステロール/ml)を表す。
【図３】神経突起を発現している細胞の割合に及ぼすβ-VLDLの作用を描いたグラフである。各培養皿中の異なる4視野を選択し、神経突起を示している細胞の割合を測定した。データは、二つ組で行われた3度の異なる実験の平均(±S.E.M.)である。β-VLDLの非存在下において神経突起を発現している細胞の割合は: 対照細胞、35±11 (白四角); apoE3発現細胞、32±9 (黒円); apoE4発現細胞、25±13 (黒四角)であった。＊p＜0.025 対 対照; ＊＊p＜0.005 対 対照。
【図４】apoE3またはapoE4を発現するよう安定的にトランスフェクトされたNeuro-2a細胞からの神経突起伸張に及ぼす脳脊髄液(CSF)リポタンパク質の作用を描いた棒グラフである。細胞をβ-VLDLまたはウシCSFリポタンパク質(d＜1.21 g/ml)とともにインキュベートした。各データ点は神経細胞20〜40個の測定値を表す。データは平均±S.E.M.として報告されている。中実黒棒は対照を表す。斜線付き棒はapoE3発現細胞を表す。中実白棒はapoE4発現細胞を表す。＊p＜0.025、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.005。
【図５】本発明の特定の細胞に結合した125I-β-VLDLの量を、時間単位で経時的に示したグラフである。
【図６】標識された異なる3タイプの細胞に対する、細胞に結合したDiI-β-VLDLの相対蛍光強度の棒グラフである。
【図７】標識された異なる4タイプの細胞に対する、μg/mg細胞タンパク質でのコレステロール量の棒グラフである。
【図８】経時的なapoEの相対蛍光強度のグラフである。
【図９】異なる2タイプの細胞に対する、細胞結合125I-apoE量の経時的グラフである。
【図１０】異なる2タイプの細胞に対する、経時的に分解された125I-apoE量のグラフである。
【図１１】時間で測定された、異なる2タイプの細胞により内部移行された125I-apoE量の経時的グラフである。
【図１２】時間で測定された、異なる2タイプの細胞に対する分解された125I-apoE量の経時的グラフである。
【図１３】細胞培養物に添加された125I-apoE濃度に対する、異なる2タイプの細胞により内部移行された125I-apoE量のグラフである。
【図１４】試験した異なる2タイプの細胞により内部移行された125I-apoE総量のグラフである。
【図１５】LDL受容体を発現しているまたは欠いているヒト線維芽細胞により内部移行された125I-apoE量の棒グラフである。
【図１６】LRPを発現しているまたは欠いている異なる2タイプの細胞により内部移行された125I-apoE量の棒グラフである。
【図１７】標識された異なるタイプの細胞に対する、内部移行された125I-apoE量の棒グラフである。
【図１８】標識された異なるタイプの細胞と結合した125I-apoEの棒グラフである。
【図１９】標識された異なるタイプのCHO細胞に対する、ng/mg細胞タンパク質での125I-apoE量の棒グラフである。
【図２０】標識された異なるタイプのHSPG-欠損CHO細胞に対する、ng/mg細胞タンパク質での125I-apoE量の棒グラフである。
【図２１】A〜Dは、B103/APP細胞によるAβの産生に及ぼすβ-VLDL; apoE4またはapoE3と組み合わせたβ-VLDL; apoE3; およびapoE4の作用を示す。
【図２２】apoE4によるAβ産生の増強に及ぼす化合物の作用を示す。
【図２３】A〜Fは、sAPPαおよびAβの分泌に及ぼす細胞コレステロール含量およびapoEアイソフォームの作用を示す。
【図２４】A〜Eは、Aβ産生に及ぼす低脂質のapoE画分または脂質不含のapoEの作用を示す。
【図２５】AおよびBは、Aβ産生に及ぼすapoE3およびapoE4の作用を示す。
【図２６】AおよびBは、apoE4によるAβ産生のLRPを介した増強を示す。
【図２７】A〜Dは、apoE4によるAβ産生に及ぼすapoE4ドメイン相互作用の作用を示す。
【図２８】A〜Cは、細胞コレステロール含量、sAPPαレベル、およびβ-セクレターゼ活性に及ぼすapoE3およびapoE4の作用を示す。
【図２９】構築体YFP-apoE3-CFPおよびYFP-apoE4-CFPの略図である。
【図３０】Neuro-2a生細胞におけるapoE4ドメイン相互作用を映し出すためのFRETの使用の略図である。
【図３１】ドメイン相互作用の指標としてCFPに対するFRETの蛍光の比率を示す。
【図３２】YFP-apoE4-CFP細胞の細胞内FRETに及ぼす各種化合物の作用を示す。
【図３３】YFP-apoE4-CFP細胞の培地でのFRETに及ぼす各種化合物の作用を示す。
【図３４】YFP-apoE3-CFP細胞の細胞内FRETに及ぼす各種化合物の作用を示す。
【図３５】YFP-apoE3-CFP細胞の培地でのFRETに及ぼす各種化合物の作用を示す。
【図３６】YFP-apoE4-CFP細胞の生存に及ぼす各種化合物の作用を示す。
【図３７】apoE3-およびapoE4-トランスフェクト細胞におけるAβ誘導性のリソソーム漏出を示す。
【図３８】apoE3誘導性のアポトーシスDNA断片化に及ぼすapoE4の作用を示す。
【図３９】AおよびBは、apoE4によるAβ誘導性のアポトーシスの増強に及ぼすapoE4ドメイン相互作用の小分子阻害剤の作用を示す。
【図４０】A〜Cは、ヒト脳におけるapoEのアイソフォーム特異的な断片化を示す。
【図４１】A〜Cは、NSE-apoEまたはGFAP-apoEマウスの脳におけるおよびヒトの脳におけるapoE断片化を示す。
【図４２】タンパク質分解に対するapoE4、apoE3、apoE4-Thr-61、およびapoE4-Ala-255の感受性を示す。
【図４３】A〜Cは、野生型apoE4マウス、apoE4-Thr-61トランスジェニックマウス、およびapoE4-Ala-255トランスジェニックマウスの脳溶解物におけるapoEのタンパク質分解に対する感受性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009510167.tif 000078