(57)【要約】本発明は、ＰＥＡ−１５タンパク質と相互作用することができる、規定された式の新規なシュードペプチド化合物、及び、スクリーニング方法におけるそれの使用、及び、ＰＥＡ−１５に関係しうる病理学的状態の診断の方法に関係する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）の化合物及びその誘導体、
【化１】
2009519305.tif 000036
ここで、
−  ｎが０又は１と等しく、
−  ｐが１〜６の整数、特に２〜４の整数を表し、
−  ｒが１〜１２の整数、特には２〜６の整数、及び特には４と等しい整数を表し、
−  Ｒ１が、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表し、
−  Ｒ２が、アミノ酸又はアミノ酸誘導体の側鎖を表し、
−  −ＣＯＲ３は、特に以下の式を有する基から選ばれる
【化２】
2009519305.tif 000037
塩基性実体Ｒ３と結合したアシル基を表し、
−  ここで、＊はアシル基との共有結合を表し、Ｙは、Ｎ又はＮ＋Ｒ７を表し、かつ、Ｒ６及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表す、
−  Ｒ４は、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ１０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表し、
−  Ａは、キサンテン残基、アクリジン残基又は４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザインダセン残基から誘導される基を表す。
【請求項２】
Ａが蛍光マーカーを表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、水素原子、任意的に１以上のハロゲン原子により置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基を表す、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ベンジル基、フェネチル基、又は、式ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基、ここでｎは１〜１０で変わりうる、を表す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、アラニン、グルタミン、ロイシン、グリシン、トリプトファン、β−アラニン、フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、イソニペコチン酸、４−アミノメチル安息香酸、３−テトラヒドロイソキノリン酸、及び、遊離の又はベンジル化されたヒスチジンから選ばれる、アミノ酸側鎖又はアミノ酸誘導体を表す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、以下の式（ＩＶ）である、
【化３】
2009519305.tif 000038
ここで、
−  ＊は、一般式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、そして、
−  Ｒ５は、任意的に１以上のハロゲン原子により置換されていてもよい、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状の、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、を表す、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５が、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ベンジル基、フェネチル基、式ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基、ここでｎは１〜１０で変わりうる、を表す、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
−ＣＯＲ３が、以下の式（ＶＩＩ）
【化４】
2009519305.tif 000039
の塩基性実体Ｒ３により置換されたアシル基であり、ここで、
−  ＊がアシル基との結合を表し、
−  ＹがＮ又はＮ＋Ｒ７を表し、及び、
−  Ｒ６及びＲ７が、互いに独立して、水素原子、任意的に１以上のハロゲン原子により置換された、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基を表す、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ６及びＲ７が、互いに独立して、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ベンジル基、フェネチル基、ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基、ここでｎは１〜１０で変わりうる、を表す、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ａが一般式（Ｖａ）の基であり、
【化５】
2009519305.tif 000040
ここで、
＊が、式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、
−  Ｚ＝Ｏ又はＮＨ
−  Ｒ８＝Ｒ９＝Ｎ（Ｒ’）２であり、Ｒ’はＣ１〜Ｃ６、特にはＣ２〜Ｃ４アルキル基を示し、又は、Ｒ８＝ＯＨかつＲ９＝Ｏであり、
−  Ｒ１０＝Ｒ１１＝Ｈ又はＸであり、Ｘ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、
または、一方でＲ８とＲ１０が、及び／又は他方でＲ９とＲ１１が、夫々、アクリジン残基又はキサンテン残基と縮合された５員複素環又は６員複素環を形成し、もし必要ならば１、２、３のメチル基により置換されていてもよく、そのヘテロ原子はアクリジン残基又はキサンテン残基のαに配置され、かつ、Ｎ又はＯから選ばれる、
−  Ｒ１２＝＊−ＮＨＳＯ２−又は＊−ＮＨＣＯ−であり、＊は式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、
−  Ｒ１３＝Ｈ、ＨＳＯ３−又はＣＯＯＨである、
又は、Ａが一般式（Ｖｂ）の基であり、
【化６】
2009519305.tif 000041
ここで
＊が、式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、
−  Ｒ１４はＣ２〜Ｃ４アシル残基を表し、
−  Ｒ１５はＣ５〜Ｃ７複素環基を表し、
−  Ｒ１６＝Ｒ１７＝Ｘであり、Ｘ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒである、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１２がオルト位にある、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
基Ａが、ボデピー（Ｂｏｄｉｐｙ）及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）及びその誘導体、フルオレセイン及びその誘導体、Ａｌｅｘａ（商標）及びその誘導体、並びに、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）及びその誘導体から選ばれる蛍光マーカーを表す、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
蛍光マーカーＡが、以下の式：
【化７】
2009519305.tif 000042
を有する蛍光マーカーから選ばれ、ここで＊が一般式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表す、
請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
ｎが０と等しい、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
以下の一般式（ＩＩ）
【化８】
2009519305.tif 000043
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ａ及びｐは請求項１〜１３のいずれか１項に従い定義された通りである、により表される、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
以下の一般式（ＩＩＩ）
【化９】
2009519305.tif 000044
ここでＡ、Ｒ５、Ｙ及びＲ６が、請求項１、２及び６〜１３のいずれか１項に従い定義された通りである、により表される、
請求項９に記載の化合物。
【請求項１７】
以下の式（ＩＶ）
【化１０】
2009519305.tif 000045
により表される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニング方法であって、
少なくとも
ａ）ＰＥＡ−１５タンパク質との相互作用に適当な条件下において、担体と結合された少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質を、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物の存在下に置くこと、
ｂ）段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
ｃ）該タンパク質との相互作用に適当な条件下において、段階ａ）において得られた集合体を、選抜されるべき剤の存在下に置くこと、
ｄ）段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
ｅ）該ＰＥＡ−１５タンパク質と該選抜されるべき剤とのあり得る相互作用に関する結論を引き出すために、Ｓ１とＳ２とを比較すること、
の段階を含む前記スクリーニング方法。
【請求項１９】
ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニング方法であって、
少なくとも
ａ）蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、少なくとも１の該タンパク質又はその類似体を、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１の化合物の存在下に置くこと、
ｂ）Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な、蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するものであること、
ｃ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする、或る波長での照射により、段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
ｄ）該タンパク質との相互作用に適当な条件下において、段階ａ）において得られた集合体を、選抜されるべき少なくとも１の剤を含有すると推測される媒体の存在下に置くこと、
ｅ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
ｆ）該選抜されるべき剤との該ＰＥＡ−１５タンパク質のあり得る相互作用に関する結論を引き出すために、第１及び第２のシグナル、Ｓ１とＳ２を比較すること、
の段階を含む前記方法。
【請求項２０】
蛍光マーカーＤが、蛍光タンパク質のようなタンパク質、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、Ａｌｅｘａ  ５３２（商標）誘導体、ボデピー（Ｂｏｄｉｐｙ）誘導体又はＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）誘導体から選ばれる蛍光マーカー、から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、又は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）若しくは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のようなその蛍光変形の１つ、又は、ＤＳ  Ｒｅｄ、又は、その変形の１つから選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質がＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内（in  cellulo）で実施されることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質を発現する細胞中で実施されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＥＡ−１５タンパク質を含有すると推測される少なくとも１の生物学的試料中のＰＥＡ−１５タンパク質の検出による、及び任意的に定量による、ＰＥＡ−１５と関係する傾向にある病理学的状態の診断及び／又は予後診断の方法であって、少なくとも
ａ）蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、少なくとも１の該タンパク質又はその類似体を、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１の化合物の存在下に置くこと、
ｂ）Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な、蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するものであること、
ｃ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする、或る波長での照射により、段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
ｄ）段階ａ）において得られた集合体を、少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質を含有すると推測される生物学的試料の存在下に置くこと、これは本発明に従う該化合物と生物学的試料の該ＰＥＡ−１５タンパク質との相互作用に適当な条件下においてなされる、
ｅ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする、或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
ｆ）該生物学的試料中のＰＥＡ−１５タンパク質のあり得る存在に関する結論を引き出すために、及び任意的に該タンパク質の量に関する結論を引き出すために、Ｓ１とＳ２を比較すること、
の段階を含む前記方法。
【請求項２６】
蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質が、請求項２０〜２２のいずれか１項に従う、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質と、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の式の少なくとも１の化合物とを含む単離された複合体。
【請求項２８】
１のＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニングの為、又は、ＰＥＡ−１５と関係する傾向にある病理学的状態の診断及び／予後診断の為のキットであって、
−  蛍光マーカーＤ又は精製マーカーを運ぶ少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質、及び
−  請求項１〜１７のいずれか１項に従い定められる式の少なくとも１の化合物、
任意的に、Ａ及びＤは蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するものである、
を含有する前記キット。
【請求項２９】
医薬組成物中の活性剤としての使用のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項３１】
ＰＥＡ−１５に関係する病理学的状態の処置における使用のための医薬組成物の製造の為に、請求項１〜１７のいずれか１項に従い定められる化合物の使用をする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＡ−１５タンパク質（１５ｋＤａの分子量を有する、星状細胞に富むホスホプロテイン）と相互作用しうる化合物、それらの蛍光誘導体、及び、スクリーニング及び診断の方法におけるこれら化合物の利用、並びに、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＥＡ−１５は、脳で、特に星状細胞で豊富に発現され、そして、より少ない程度で、多くの他の組織で偏在的に発現される、１３０アミノ酸からなる小さな細胞質タンパク質である。
【０００３】
脊椎動物の間で非常に保存されている、このタンパク質の構造は、Ｎ末端に、８０アミノ酸のＤｅａｔｈ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｄｏｍａｉｎ（ＤＥＤ）、並びに、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のため及びＩＩ型カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼのためのリン酸化部位を含有する、低く組織化されたＣ末端を含有する。
【０００４】
ＰＥＡ−１５のゲノム配列は、４つのエキソンで構成され、そして、ゲノムＤＮＡの約１０．２ｋｂに広がる（Wolford et al., 2000, Gene, 241:143）。
【０００５】
ＰＥＡ−１５は、種々の形態（リン酸化されていない、モノリン酸化されている、及び  二リン酸化されている）でインビボで存在し、夫々が異なる生物学的活性を提示する。
【０００６】
ＰＥＡ−１５は、その様々な機能的ドメインにより、及び、そのリン酸化の程度に従い、多くの相手と相互作用しうる多機能タンパク質である（Renault et al., Biochem. Pharmacol, 2003, 66:1581）。今まで、ＰＥＡ−１５の７つの相手、すなわち、ＦＡＤＤ、ｃａｓｐａｓｅ  ８、Ｏｍｉ／ＨｔｒａＡ２、ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、Ｒｓｋ２及びホスホリパーゼＤ１が同定されており、このタンパク質により実行される複数の機能に介在する。これら複数の相互作用により、ＰＥＡ−１５は、多くの生理学的及び／又は病理学的な細胞のプロセスにおいて中心的な役割を果たすことが分かる。
【０００７】
このタンパク質は特に、アポトーシスを抑制する特性、細胞周期中の細胞の移行を抑制する特性、Ｈ−Ｒａｓガン遺伝子の発現により抑制されたインテグリンシグナル伝達の再確立に関与する特性、細胞増殖を抑制する特性並びにグルコースの輸送及びインスリンの分泌に関与する特性を有することが示されている（Renault et al., Biochem. Pharmacol., 2003, 66: 1581）。
【０００８】
例えば、星状細胞におけるＰＥＡ−１５の発現の抑制が、ＴＮＦ  αにより誘導されるアポトーシスに対する星状細胞の感受性の増加を結果すること（Kitsberg et al., J. Neurosci., 1999, 19: 8244）、及び、このタンパク質の発現の減少が、星状細胞、リンパ球及び肝細胞のような様々な細胞株の増殖の増加を引き起こすこと（Formstecher et al., Dev. Cell., 2001, 1: 239）が観察されている。該タンパク質の発現が細胞遊走も抑制することも観察されている。
【０００９】
加えて、このタンパク質は、脳の原始的な癌の発生及び／又は成長、並びに、転移プロセスにも関与しうる。
【００１０】
例えば、ＰＥＡ−１５の発現の増加は、グリア細胞腫、卵巣癌、腎臓癌、乳癌、肝細胞癌、リンパ腫又はメラノーマのような様々な癌において観察された（Hwang et al., Genomics, 1997, 42: 540; Bera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 9789）。
【００１１】
また、トランスジェニックマウスにおけるこのタンパク質の過剰発現は、化学的に誘導される皮膚がんへのそれらの感受性を増加する（Formisano et al., Oncogene, 2005, 24: 7012）。
【００１２】
他方、組織におけるＰＥＡ−１５の発現は、癌細胞の浸潤に対する、このfatterの寛容性の抑制を誘導する。
【００１３】
乳癌細胞は、ＰＥＡ−１５の発現の減少により、化学療法に敏感になりうることも示されている（Stassi et al., Cancer Res., 2005, 65: 6668）。
【００１４】
国際公開第２００４／１０８９６１号パンフレットは、乳頭腫に対する、マーカー及び治療上のターゲットとしてのＰＥＡ−１５の使用を提案する。
【００１５】
さらに、ＰＥＡ−１５の過剰発現が、ＩＩ型糖尿病に冒された患者の線維芽細胞、骨格筋及び脂肪組織において観察されており（Condorelli et al., EMBO. J., 1997, 17: 3858）、そして、このタンパク質の発現の抑制がグルコースに応答したインスリン分泌の回復を可能とした。
【００１６】
このタンパク質の過剰発現は、或る炎症プロセスにおいても観察される。
【００１７】
欧州特許出願公開第１，１８９，０６０号明細書は、神経変性病における、マーカー及び治療上のターゲットとしてのＰＥＡ−１５の使用を提案する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、ＰＥＡ−１５は多くの病理学的状態における治療のターゲットとして用いられうることが分かる。しかしながら、今まで、このタンパク質の活性を調節しうる、容易に利用可能な化合物はなかった。
【００１９】
加えて、そのような化合物の容易なスクリーニングを許しうる手段もない。
【００２０】
従って、ＰＥＡ−１５と相互作用し、かつ、その活性を調節しうる化合物を、容易に利用するニーズがある。
【００２１】
ＰＥＡ−１５の生物学的活性を調節しうる化合物のスクリーニング手段を有するニーズもある。
【００２２】
癌及びＩＩ型糖尿病のような病理学的状態の処置の為の新規化合物を有するニーズもある。
【００２３】
ＩＩ型糖尿病、癌、特にはグリア細胞腫、癌腫のような、ＰＥＡ−１５に関係する病理学的状態、特にはその発現及びその生物学的活性さえの変化の診断及び／若しくは予後診断、又は、例えばアポトーシス若しくは細胞増殖の過剰若しくは欠損に関係する病理学的状態の診断及び／若しくは予後診断の為の手段を有するニーズもある。
【００２４】
本発明の目的は、これらのニーズに満足を与えることである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
予期しない様式で、本発明者らは、以下の一般式（Ｉ）の化合物がＰＥＡ−１５と相互作用しかつその活性を調節しうることを観察した。ここで、ｎ、ｐ、ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡは本明細書中以下で定義される。
【化１】
2009519305.tif 000002
【００２６】
すなわち、例えば本明細書以下で詳述される蛍光化合物６Ｄ６−１のような本発明に従う化合物は、ＰＥＡ−１５タンパク質と特異的な様式で相互作用することができ、かつ、その生物学的活性を調節することができることを、本発明者らは観察した。
【００２７】
加えて、例えばＰＥＡ−１５と相互作用しうる剤のスクリーニング並びにＰＥＡ−１５に関係する病理学的状態の診断及び／予後診断を許す蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を実施する方法を発展する為の蛍光融合タンパク質ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５（緑色蛍光タンパク質）との組み合わせにおける、本発明の化合物、特に蛍光化合物を採用することが可能であったことも本発明者らは観察した。
【００２８】
競合により選抜する方法を実施する為の融合タンパク質ＧＳＴ−ＰＥＡ  １５との組み合わせにおける、そのような化合物、特に蛍光化合物を採用することも可能であり、ＰＥＡ−１５と相互作用しうる剤を同定することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
すなわち、その第１の局面の１に従い、本発明は、以下の式（Ｉ）の化合物及びその誘導体に関係し、
【化２】
2009519305.tif 000003
ここで、
−  ｎが０又は１と等しくてよく、
−  ｐが１〜６の整数、特に２〜４の整数を表してよく、
−  ｒが１〜１２の整数、特には２〜６の整数、及び特には４と等しい整数を表してよく、
−  Ｒ１が、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表してよく、
−  Ｒ２が、アミノ酸側鎖又はアミノ酸誘導体を表してよく、
−  −ＣＯＲ３は、特に以下の式を有する基から選ばれる、
【化３】
2009519305.tif 000004
塩基性実体Ｒ３と結合したアシル基を表してよく、
−  ここで、＊は、アシル基との共有結合を表し、ＹはＮ又はＮ＋Ｒ７を表してよく、かつＲ６及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和Ｃ３〜Ｃ１０環状アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表す、
−  Ｒ４は、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基若しくは１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表し、
−  Ａは、キサンテン残基、特には９−フェニルキサンテン残基、アクリジン残基、特には９−フェニルアクリジン残基又は４−ボラー３ａ，４ａ−ジアザインダセン残基から誘導される基を表しうる。
【００３０】
本発明に従い、或る分子に関して「残基」は、基の形態にある分子を意味することを意図する。
【００３１】
有利に、Ａは蛍光マーカーを表しうる。
【００３２】
その局面の他に従い、ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、少なくとも１の該タンパク質又はその類似体を、本発明に従う少なくとも１の化合物、特には本発明に従う少なくとも１の蛍光化合物の存在下に置くこと、
（ｂ）Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するものであること、
（ｃ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする、或る波長での照射により、段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
（ｄ）該タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、段階ａ）において得られた集合体を、選抜されるべき少なくとも１の剤を含有すると推測される媒体の存在下に置くこと、
（ｅ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
（ｆ）該選抜されるべき剤と該ＰＥＡ−１５タンパク質とのあり得る相互作用に関する結論を引き出すために、第１及び第２のシグナル、Ｓ１とＳ２を比較すること、
からなる段階を少なくとも含む前記スクリーニング方法に関係する。
【００３３】
本発明に従い、「ＰＥＡ−１５タンパク質類似体」は、ＰＥＡ−１５との配列の相同性及び同様の生物学的活性を提示するペプチド化合物、並びにUnderhillら（Mamm.  Genome,  2001,  12:  172）により記載されたもののような、このタンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生じうる変形、並びに本発明に従う式の化合物に結合する能力を有する、このタンパク質の断片又はこれらペプチド化合物タイプを意味することを意図する。「生物学的活性」は、ＰＥＡ−１５タンパク質の生物学的特性、とりわけ前に指摘された通りの生物学的特性を意味することを意図する。
【００３４】
「配列の相同性」は、ＰＥＡ−１５タンパク質との、特にはＰＥＡ−１５に特徴的な配列（Renault et al., Biochem. Pharmacol., 2003, 66: 1581）、すなわち、ＤＥＤドメイン及び特には保存されたＲｘＤＬＦ配列、ＮＥＳドメイン（核外輸送シグナル）、ＰＥＡ−１５タンパク質とその様々なタンパク質パートナー（例えばＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ＦＡＤＤ、ｃａｓｐａｓｅ  ８）との相互作用に関与するペプチド配列、及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）又はＩＩ型カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼにとってのホスホリル化部位、すなわち夫々ＬＴＲＩＰＳＡＫＫ（Ｓ１０４）及びＤＩＲＱＰＳＥＥＩＩＫ（Ｓ１１６）（Ｓ：ホスホリル化セリン）モチーフを含むペプチド配列の類似体の少なくとも８５％、特には少なくとも９０％及びより特には少なくとも９５％の配列同一性を意味することを意図する。
【００３５】
上記で定義される通りの類似体を得るためにタンパク質に導入されうる改変の性質及びそれらを実施する為の方法は、当技術分野における当業者の知識と通常の業務に依存する。
【００３６】
その局面の他に従い、ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）担体に結合された少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質を、該タンパク質との相互作用に適当な条件下において、本発明に従う化合物の存在下に置くこと、
（ｂ）段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
（ｃ）該タンパク質との相互作用に適当な条件下において、段階ａ）で得られた集合体を、選抜されるべき剤の存在下に置くこと、
（ｄ）段階ｃ）で得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
（ｅ）該ＰＥＡ−１５タンパク質と該選抜されるべき剤とのあり得る相互作用に関する結論を引き出すために、Ｓ１とＳ２を比較すること、
からなる段階を少なくとも含む前記スクリーニング方法に本発明は関する。
【００３７】
その局面の他に従い、個体から取られる生物学的試料中のＰＥＡ−１５の検出による及び任意的に定量化による、ＰＥＡ−１５と関係する傾向にある病理学的状態の診断及び／又は予後診断の方法であって、
（ａ）蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、少なくとも１の該タンパク質又はその類似体を、本発明に従う少なくとも１の化合物、特には蛍光化合物の存在下に置くこと、
（ｂ）Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するものであること、
（ｃ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする、或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
（ｄ）段階ａ）において得られた集合体を、少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質を含有すると推測される生物学的試料の存在下に置くこと、これは本発明に従う該化合物と生物学的試料の該ＰＥＡ−１５タンパク質との相互作用に適当な条件下においてなされる、
（ｅ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする、或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
（ｆ）該生物学的試料中のＰＥＡ−１５タンパク質のあり得る存在に関する結論を引き出すために、及び任意的に該タンパク質の量に関する結論を引き出すために、Ｓ１とＳ２を比較すること、
からなる段階を少なくとも含む前記方法に本発明は関係する。
【００３８】
その局面の他に従い、少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質と本発明に従う式の少なくとも１の化合物とを含む単離された複合体にも本発明は関係する。
【００３９】
その局面の他に従い、本発明は、ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニングの為のキットであって、
−  蛍光マーカーＤ又は精製マーカーを運ぶ少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質、及び、
−  本発明に従う少なくとも１の化合物、
任意的に、Ａ及びＤは蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するものである、
を含有する前記キットにも関係する。
【００４０】
化合物
【００４１】
本発明の化合物は、以下の一般式（Ｉ）及びその誘導体であって、
【化４】
2009519305.tif 000005
−  ｎが０又は１と等しくてよく、
−  ｐが１〜６の整数、特に２〜４の整数を表してよく、
−  ｒが１〜１２の整数、特に２〜６の整数、及び特には４と等しい整数を表してよく、
−  Ｒ１が、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表してよく、
−  Ｒ２が、アミノ酸側鎖又はアミノ酸誘導体を表してよく、
−  −ＣＯＲ３は、特に以下の式を有する基から選ばれる、
【化５】
2009519305.tif 000006
塩基性実体Ｒ３と結合したアシル基を表してよく、
−  ここで、＊はアシル基との共有結合を表し、ＹはＮ又はＮ＋Ｒ７を表してよく、かつ、Ｒ６及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表してよく、
−  Ｒ４は、水素原子、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ１０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子、１以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基又は１以上のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換された前記基を表してよく、
−  Ａは、キサンテン残基、特には９−フェニルキサンテン残基の基、アクリジン残基、特には９−フェニルアクリジン残基、又は４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザインダセン残基から誘導される基を表してよい。
【００４２】
１の実施態様に従い、Ａは蛍光マーカーを表すことができる。
【００４３】
本発明に従い、或る分子との関係における「残基」は、基の形態にある分子を意味することを意図する。
【００４４】
本発明に従い、「誘導体」は、互変異性体、立体異性体、多形体、医薬的に許容できる塩及び医薬的に許容できる溶媒和物を意味することを意図する。
【００４５】
本発明に従い、「互変異性体」は異性体の１つを意味することを意図し、その構造は、１の原子、一般的には水素原子の位置及び１以上の多重結合の位置で異なり、かつ、容易にかつ可逆的に１から他へと変換することができる。
【００４６】
本発明に従い、「立体異性体」は、同一の構造の分子の異性体であり、かつ空間におけるそれらの原子の異なる配置でだけ異なる異性体を意味することを意図する。
【００４７】
本発明に従い、「医薬的に許容できる塩」は、一般式（Ｉ）の化合物と塩基又は酸との反応により得られる化合物を意味することを意図する。
【００４８】
本発明に適当な塩基の例として、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、メタノール、ｔ−ブタノール、ジオキサン、イソプロパノール、エタノール、類似体及びそれらの混合物のような溶媒中の、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、水素化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、及び類似体、及びそれらの混合物を言及しうる。
【００４９】
リシン、アルギニン、ジエタノールアミン、コリン、トロメタミン、グアニジン及びそれらの誘導体のような有機塩基も用いられうる。
【００５０】
本発明に適当な酸添加的な塩の例として、酢酸エチル、エーテル、アルコール溶媒、アセトン、ＴＨＦ，ジオキサン、それらの類似体及びそれらの混合物のような溶媒中の、塩化水素酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、サリチル酸、ヒドロキシナフトエ酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、コハク酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、酒石酸、及びそれらの類似体、及びそれらの混合物のような酸と一般式（Ｉ）の化合物との反応により調製されるべき傾向にあるものを言及しうる。
【００５１】
「多形体」は、様々な溶媒の使用、例えば、典型的には結晶化の為に用いられる溶媒の使用のような種々の条件下における一般式（Ｉ）の化合物の結晶化により得られる化合物を意味することを意図する。種々の温度での結晶化は例えば、例えば、冷却の様々な様式、例えば緩やかな又は速い冷却により続かれる、化合物の加熱又は溶融段階を含む、非常に速い冷却から非常にゆっくりとした冷却を含む。多形体の存在は、ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法（赤外）、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）、Ｘ線回折又は他の類似の技術により測定されうる。
【００５２】
本発明に従い、「アルキル基」は、１〜２０の炭素原子、特には２〜１８の炭素原子、特には３〜１６の炭素原子、特には４〜１２の炭素原子、より特には６〜１０の炭素原子を有し、以下で定義される通りの基により置換される傾向にある、線状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素基を意味することを意図する。
【００５３】
例として、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルメチル、ｎ−プロピル、ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル又はデシルのような基が、この定義に含まれる。
【００５４】
本発明に従い、「環状アルキル基」は３〜１０の炭素原子、特にはＣ４〜Ｃ８及びより特にはＣ６を有する、任意的に分枝状であってもよい、飽和若しくは不飽和のアルキレン環、例えばシクロプロピル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチルなどを意味することを意図する。
【００５５】
本発明に従い、「アリール基」は、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる１以上のヘテロ原子を任意的に含有してもよい、かつもし必要ならば上記及び以下で定義された通りの基により置換された、６〜２０の炭素原子、特には１０〜１４の炭素原子の１〜３の、縮合してもよい芳香族環を意味することを意図する。
【００５６】
本発明に適当なアリール基の例として、フェニル基、ベンジル基、フェネチル基、ナフチル基、アントリル基、及び、例えばピリジン、チオフェン、ピロール、フラン、キノリン、アクリジン、キサンテン、４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザインダセンのような、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる１以上のヘテロ原子を含有する全ての芳香族環を言及することが可能である。
【００５７】
本発明に従い、「アルコキシ基」は、ＯＲ−基を意味することを意図し、ここで該アルキル基は、１〜２０の炭素原子、特には２〜１８の炭素原子、特には３〜１６の炭素原子、特には４〜１２の炭素原子及びより特には６〜１０の炭素原子を有する、線状、分枝状又は環状の、縮合された又は縮合されていない、飽和又は不飽和の炭化水素基である。
【００５８】
例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ、sec−ペントキシ、ｔ−ペントキシ、ヘキシルオキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ基及び類似体を言及しうる。
【００５９】
本発明に従い、「アシル基」は、Ｃ＝Ｏ部分を含有し、かつ、１〜１０の炭素原子、特には２〜８の炭素原子、及び好ましくは３〜６の炭素原子、及びより特には４の炭素原子を有する、線状、分枝状又は環状の、縮合された又は縮合されていない、飽和又は不飽和の炭化水素基、例えば、ホルミル基、アセチル基、スクシニル基、ベンゾイル基、１−ナフトイル又は２−ナフトイル基を意味することを意図する。
【００６０】
該基の炭化水素鎖は、もし必要ならば、例えば、アルキルエーテル基、アルキルエステル基又はヘテロ環のような、ヘテロアルキル基を形成するために、例えばＯ、Ｎ及びＳから選ばれる１以上のヘテロ原子により中断されうる。
【００６１】
本発明に従い、「ヘテロ環状基」は、例えば、かつ非限定的な意味で、フラニル基、チオフェニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、フラザニル基、ピラニル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、又はピラジニル基、フランニル基、キノレイニル基を意味することを意図する。
【００６２】
上記で定義された基は、もし必要ならば、１以上のハロゲン原子により置換されうる。
【００６３】
本発明に従い、「ハロゲン原子」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩの原子を意味することを意図する。本発明において有利に用いられるハロゲン原子は、フッ素及び塩素である。
【００６４】
特に、ハロゲン化アルキル基は、一般式ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基であってよく、ここでｎは１〜１０、特には２〜８、及びより特には３〜６でありうる。
【００６５】
１の実施態様に従い、Ｒ１は、特に、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１６アルキル基、例えばＣ６〜Ｃ１０アリール基、例えば任意的に１以上のハロゲン原子により置換された前記基を表しうる。
【００６６】
特に、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ベンジル基、フェネチル基、又は、ｎが１〜１０、特には２〜８及びより特には３〜６でありうる式ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基を特に表しうる。
【００６７】
特に、Ｒ１は、メチル基又はベンジル基を表しうる。
【００６８】
１の実施態様に従い、Ｒ２は、例えば、アラニン、グルタミン、ロイシン、グリシン、トリプトファン、β−アラニン、フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、イソニペコチン酸、４−アミノメチル安息香酸、３−テトラヒドロイソキノリン酸、及び遊離の又はベンジル化されたヒスチジンから選ばれるアミノ酸側鎖又はアミノ酸誘導体を表しうる。
【００６９】
該アミノ酸又はアミノ酸誘導体は、例えば、
【化６】
2009519305.tif 000007
から選ばれてよい。
【００７０】
１の実施態様に従い、Ｒ２は以下の式（ＶＩ）であってよく、
【化７】
2009519305.tif 000008
ここで
−  ＊は、一般式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、そして、
−  Ｒ５は、飽和若しくは不飽和の線状若しくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、飽和若しくは不飽和のＣ３〜Ｃ１０環状アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、又は任意的に１以上のハロゲン原子により置換された前記基を表してよい。
【００７１】
１の実施態様に従い、Ｒ５基を表す傾向にあるアルキル又はシクロアルキル基は、前に定義された通りの基により置換されてもよく、又は、それらの炭化水素鎖が、前に定義された通りの１以上のヘテロ原子により中断されてもよい。
【００７２】
特に、Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子により置換された前記基を表してよい。
【００７３】
特に、Ｒ５は、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ベンジル基、フェネチル基、ｎが１〜１０、特に２〜８及びより特には３〜６でありうる式ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基を表してよい。
【００７４】
特に、Ｒ５はメチル基又はベンジル基であってよい。
【００７５】
Ｒ２は特に、ヒスチジン、又はベンジル化ヒスチジンのようなヒスチジン誘導体であってよい。
【００７６】
１の実施態様に従い、−ＣＯＲ３は、前に定義された通りの塩基性実体Ｒ３により置換されたアシル基、特にはアセチル基であってよい。特に、この塩基性実体Ｒ３は、以下の式（ＶＩＩ）の基であってよく、
【化８】
2009519305.tif 000009
ここで
−  ＊は、アシル基との結合を表し、
−  Ｙは、Ｎ又はＮ＋Ｒ７を表してよく、かつ、
−  Ｒ６及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または任意的に１以上のハロゲン原子により置換された前記基であってよい。
【００７７】
特に、Ｒ６及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ベンジル基、フェネチル基、ｎが１〜１０、特には２〜８、及びより特には３〜６でありうる式ＣｎＦ２ｎ＋１のパーフルオロアルキル基を表しうる。
【００７８】
特に、Ｒ６及びＲ７は、互いに独立して、メチル基またはベンジル基を表しうる。
【００７９】
１の実施態様に従い、基Ａは、一般式（Ｖａ）の基を表してよく、
【化９】
2009519305.tif 000010
ここで
−  ＊は、式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、
−  Ｚ＝Ｏ又はＮＨであり、
−  Ｒ８＝Ｒ９＝Ｎ（Ｒ’）２であり、Ｒ’はＣ１〜Ｃ６、特にはＣ２〜Ｃ４アルキル基を示し、又はＲ８＝ＯＨかつＲ９＝Ｏであり、
−  Ｒ１０＝Ｒ１１＝Ｈ又はＸであり、Ｘ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、
−  または、一方で、Ｒ８とＲ１０が、及び／又は他方でＲ９とＲ１１が、夫々、アクリジン残基又はキサンテン残基と縮合された、５員複素環又は６員複素環を形成し、もし必要ならば１、２、３又はさらにより多いメチル基により置換されていてもよく、そのヘテロ原子はアクリジン残基又はキサンテン残基のαに配置され、かつ、Ｎ及びＯから選ばれる、
−  Ｒ１２＝＊−ＮＨＳＯ２−又は＊−ＮＨＣＯ−であり、＊は式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、
−  Ｒ１３＝Ｈ、ＨＳＯ３−又はＣＯＯＨである。
【００８０】
特に、式（Ｖａ）の基は、Ｒ８＝Ｒ９＝ＮＭｅ２又はＮＥｔ２のようなものでありうる。
【００８１】
特に、式（Ｖａ）の基Ａは、Ｒ１２がオルト位、メタ位又はパラ位にありうるようであってよい。
【００８２】
特に、Ｒ１２＝＊−ＮＨＳＣＯ２−であるとき、それは有利にオルト位にあってよい。
【００８３】
１の実施態様に従い、Ａは一般式（Ｖｂ）
【化１０】
2009519305.tif 000011
の基をあらわしてよく、ここで、
−  ＊は、式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表し、
−  Ｒ１４は、Ｃ２〜Ｃ４アシル残基を表してよく、
−  Ｒ１５は、Ｃ５〜Ｃ７へテロ環状基をあらわしてよく、かつ、
−  Ｒ１６＝Ｒ１７＝Ｘであり、Ｘ＝Ｆ、Ｃｌ又はＢｒ、及び特にはＸ＝Ｆである。
【００８４】
１の実施態様に従い、式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の基は、蛍光マーカーの基でありうる。
【００８５】
この発明の実施に適当な蛍光マーカーの例として、ローダミン及びその誘導体、例えばテトラメチルローダミン、Ｒｅｄ−Ｘ  ローダミン（リサミン）、ボデピー（Ｂｏｄｉｐｙ）及びその誘導体、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）及びその誘導体、フルオレセイン及びその誘導体、Ａｌｅｘａ（商標）及びその誘導体、並びに、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）及びその誘導体を言及することが可能である。
【００８６】
１の実施態様に従い、基Ａは、以下の式の蛍光マーカーから選ばれる蛍光マーカーを表してよく、
【化１１】
2009519305.tif 000012
ここで、
−  ＊は、本発明に従う式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表す。
【００８７】
１の実施態様に従い、蛍光マーカーＡは、例えばスルホニルローダミンＢ誘導体のような、ローダミンから誘導される蛍光マーカーから選ばれうる。
【００８８】
特に、一般式（Ｉ）の化合物の残基は、スルホニルローダミン（リサミン）誘導体に、オルト位で結合されうる。
【００８９】
とりわけ、リサミンから誘導される基は、以下の式の基により表されてよく、
【化１２】
2009519305.tif 000013
ここで、＊は、本発明に従う式（Ｉ）の化合物の残基との共有結合を表す。
【００９０】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は、ｎが０に等しくありうる一般式（Ｉ）のものであってよい。
【００９１】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は、例えば、以下の一般式（ＩＩ）により表されてよく、
【化１３】
2009519305.tif 000014
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ａ及びｐは、例えば前に定義された通りのものであってよい。
【００９２】
１の実施態様に従い、本発明の化合物は、一般式（Ｉ）のものであってよく、ｎは０と等しくてよく、ｐは４と等しくてよく、Ｒ１はメチル基であってよく、Ｒ２は以下の式の基でを表してよく、
【化１４】
2009519305.tif 000015
ここで、＊及びＲ５は、前に定義された通りのものであってよく、かつ、−ＣＯＲ３は、以下の式の塩基性実体Ｒ３により置換されたアシル基、特にはアセチルであってよく、
【化１５】
2009519305.tif 000016
ここで、＊は、アシル基との共有結合を表し、かつＹ及びＲ６は前に定義された通りのものであってよく、かつＲ４は水素原子であってよい。
【００９３】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は、以下の一般式（ＩＩＩ）のものであってよく、
【化１６】
2009519305.tif 000017
ここで、Ａ、Ｒ５、Ｙ及びＲ６は前に定義された通りのものであってよい。
【００９４】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は、前に定義された通りの一般式（ＩＩＩ）の化合物であってよく、ここで、蛍光マーカーＡは例えば、前に定義された通りのスルホニルローダミン基、とりわけ式（ＩＩＩ）の化合物の残基がスルホニルローダミン基のオルト位にあるようなものであってよく、Ｒ５はベンジル基であってよく、ＹはＮであってよく、かつ、Ｒ６はメチル基であってよい。
【００９５】
有利に、本発明に従う化合物は、前に定義された通りの一般式（Ｉ）の化合物でなく、ここで、蛍光マーカーＡは、式（Ｉ）の化合物の残基がスルホニルローダミン基のパラ位にあるようなスルホニルローダミン基（リサミン）である。
【００９６】
有利に、本発明に従う化合物は、前に定義された通りの一般式（ＩＩＩ）の化合物でなく、ここで蛍光マーカーＡは、式（ＩＩＩ）の化合物の残基がスルホニルローダミン基のパラ位にあり、かつ、Ｒ５がベンジル基であり、ＹがＮであり、かつＲ６がメチル基であるようなスルホニルローダミン基（リサミン）である。
【００９７】
代替的な実施態様に従い、本発明に従う化合物は、以下の式（ＩＶ）により表されうる。
【化１７】
2009519305.tif 000018
【００９８】
合成方法
【００９９】
本発明に従う化合物は、様々な式の化合物のライブラリーの形態において、又は、純粋な形で分離された若しくは立体異性体の混合物で分離された化合物の形態において得られうる。
【０１００】
合成方法は、マイケルアクセプターアクリル酸エステルにより官能化されたヒドロキシメチルポリスチレン樹脂からなる、ＲＥＭ型（REgenerated  Michael）のポリスチレン樹脂上で実施されうる。
【０１０１】
アミンを担体にグラフトさせる為に、アミンの最初のマイケル型付加を介するターシャリーアミノライブラリーの合成、及び引き続く、担体上での分子の合成、及び最後に、アミン四級化プロセスに従う担体からのそれの切断、続くホフマン（HOFFMANN）型の脱離のために、ＲＥＭ型樹脂は特に適当である。
【０１０２】
第２級アミンの固体担体上へのグラフト化の後に、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性化（１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いる、従来のペプチドカップリング方法により、他の残基が誘導されうる。
【０１０３】
例えば、スルホローダミンタイプ（例えばリサミン）の基Ａは、ウレタン結合により、例えばリシンの基ε−ＮＨ２のアミノ基に直接にグラフト化されてよく、又は、ジアミノ−ブタンスペーサーのような、リシンの基ε−ＮＨ２にグラフト化されたスペーサー上のアミノ基に直接にグラフト化されてもよい。
【０１０４】
化合物は、例えばヨウ化メチルのようなハロゲン化アルキル又は臭化ベンジルの存在下において、第２級アミンのアルキル化後に樹脂から放出されてよく、続いてAmberlite  IRA-95型のイオン交換塩基性樹脂の存在下で処理される。
【０１０５】
１の実施態様に従い、本発明に従うそのような合成方法は、プレート上で、例えばFLEXCHEM装置（Robbins  Scientific）を用いることによる９６ウェルプレート上で、並行して実施されうる。
【０１０６】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は、固体担体上での調製の方法であって、
ａ．式
【化１８】
2009519305.tif 000019
の固体担体上に、
式
【化１９】
2009519305.tif 000020
の化合物をカップリングして、以下の式（１）の化合物を得ること、
【化２０】
2009519305.tif 000021
ここでＲ４は上記で定義された通りものでありうる、
ａ．式（１）の化合物を脱保護し、次に、該脱保護された化合物を式
【化２１】
2009519305.tif 000022
の化合物とカップリングして、以下の式（２）の化合物を得ること、
【化２２】
2009519305.tif 000023
ここでＲ２は上記で定義された通りのものでありうる、
ｃ．式（２）の化合物を脱保護し、次に、該脱保護された化合物を以下の式
【化２３】
2009519305.tif 000024
の化合物とカップリングして、以下の式（３）の化合物を得ること、
【化２４】
2009519305.tif 000025
ここでｐは上で定義された通りのものでありうる、
ｄ．Ｆｍｏｃ基から式（３）の化合物を脱保護し、次に、Ｒ３ＣＯＯＨ化合物と該脱保護された化合物をカップリングして、以下の式（４）の化合物を得ること、
【化２５】
2009519305.tif 000026
ここでＣＯＲ３は上記で定義された通りのものでありうる、
ｅ．式（４）の化合物を脱保護して、以下の式（５）の化合物を得ること、
【化２６】
2009519305.tif 000027
ｆ．任意的に、式（５）の化合物を、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートと反応させ、次に式
【化２７】
2009519305.tif 000028
のジアミンと反応させて、以下の式（６）の化合物を得ること、
【化２８】
2009519305.tif 000029
ここでｒは上記で定義された通りのものでありうる、
ｇ．式（５）の化合物又は式（６）の化合物を、求電子性トレーサー、とりわけＡ−Ｃｌと反応させて、以下の式（７）の化合物を得ること、
【化２９】
2009519305.tif 000030
ここでＲ２、Ｒ３、Ａ、ｎ、ｐ及びｒは前に定義された通りのものである、
ｈ．式（７）の化合物を、式Ｒ１Ｘの化合物（Ｒ１は上記で定義された通りのものであり、かつ、Ｘはハロゲン原子、特にはＩ又はＢｒを表す）により開裂して、前に定義された通りの式（Ｉ）の化合物を得ること、
からなる段階を少なくとも含む上記方法に従い得られうる。
【０１０７】
スクリーニング及び診断方法
【０１０８】
ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、少なくとも１の該タンパク質又はその類似体を、本発明に従う少なくとも１の蛍光化合物の存在下に置くこと、Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するようなものであること、
（ｂ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする或る波長での照射により、段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
（ｃ）該タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、段階ａ）において得られた集合体を、選抜されるべき少なくとも１の剤を含有すると推測される媒体の存在下に置くこと、
（ｄ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
（ｅ）該選抜されるべき剤との該ＰＥＡ−１５タンパク質のあり得る相互作用に関する結論を引き出すために、第１及び第２のシグナル、Ｓ１とＳ２を比較すること、
からなる段階を少なくとも前記方法にも本発明は関係する。
【０１０９】
本発明に従い、「Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するようなものであること」は、その１の（蛍光エネルギー供与体の）放射スペクトルが、他の（蛍光エネルギー受容体の）励起スペクトルの全部又は一部をカバーする、蛍光マーカーの対を意味することを意図する。特に、供与体の励起スペクトルは、受容体の励起スペクトル又はその小部分をカバーせず、従って偽陽性の発生を回避し又は減少する。
【０１１０】
１の実施態様に従い、第１及び第２のシグナルは、エネルギー受容体及び／又は供与体の蛍光シグナルでありうる。
【０１１１】
蛍光エネルギー供与体を運ぶ化合物と相互作用する傾向にある、蛍光エネルギー受容体を運ぶ化合物の存在下において、蛍光エネルギー供与体の励起スペクトルの波長での集合体の照射は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす。
【０１１２】
本発明に従い、「蛍光エネルギーの移動」は、励起された発色団（蛍光エネルギー供与体）から他の発色団（蛍光エネルギー受容体）へと、双極子間相互作用により、非放射的な様式で、エネルギーが伝達される、距離に依存する、物理的なプロセスを意味すること意図する。
【０１１３】
そのような移動の実証は、例えば、蛍光供与体の蛍光シグナルの振幅の減少、及び／又は、受容体の蛍光シグナルの振幅の増加のような、供与体の蛍光シグナル及び／又は受容体の蛍光シグナルの変調により検出されうる。
【０１１４】
供与体の蛍光シグナルの振幅変動は、受容体の蛍光シグナルの振幅変動に付随しうる。代替的に、蛍光シグナルの１が、他の蛍光シグナルにおける変動が検出されること無く、変化してもよい。
【０１１５】
蛍光エネルギーの移動を実施するために調整する条件及びパラメーターは、例えばSekar及びPeriasamy（J.  Cell.  Biol.,  2003,  160  :629）を参照することが出来る当技術分野の当業者の実行に依存する。
【０１１６】
１の実施態様に従い、第１と第２のシグナルの比較は、蛍光シグナルの振幅変調を検出することを許しうる。
【０１１７】
本発明に従い、蛍光共鳴エネルギー移動の文脈における「蛍光シグナルの振幅変調」は、前に定義された、供与体蛍光シグナルの振幅、励起スペクトルの振幅又は供与体放射シグナルの振幅の何らかの変調を意味することを意図する。
【０１１８】
これらの蛍光シグナルの変調は、選抜されるべき剤と、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質とのあり得る相互作用を意味しうる。そのような相互作用は、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質／本発明に従う化合物、の複合体の解離を引き起こしうる。
【０１１９】
１の実施態様に従い、本発明に従うスクリーニング方法はさらに、少なくとも１の対照試料を調製することから成る段階を含んでよく、ここで前に定義された本発明に従う方法の段階ｃ）において加えられた該媒体は、選抜されるべき剤を含まない。
【０１２０】
対照試料は、ＰＥＡ−１５と相互作用する傾向にある剤のそのようなスクリーニング方法の実施と同時に又は独立に、本発明に従う方法に従い調製されうる。
【０１２１】
本発明に従う方法は、該選抜されるべき剤に関する情報を引き出すために、前に定義されたようなシグナルＳ１とＳ２と、対照試料から測定されたシグナルＳ３を比較することからなる段階を含みうる。
【０１２２】
このように比較されたシグナル間の違いは、試料中の選抜されるべき剤の、存在、量及び／又はＰＥＡ−１５との相互作用の情報を与えうる。
【０１２３】
１の実施態様に従い、ＰＥＡ−１５により運ばれる蛍光マーカーＤは、非限定的な様式で、タンパク質、例えば蛍光タンパク質など、蛍光マーカー、例えば、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、Ａｌｅｘａ  ５３２（商標）誘導体、ボデピー（Bodipy）誘導体又はＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）誘導体などから選ばれる蛍光マーカーから、ＤとＡが上記で規定された通りであることを条件として選ばれうる。
【０１２４】
１の実施態様に従い、蛍光タンパク質は、非限定的な様式で、緑色蛍光タンパク質、又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のようなその蛍光変形、又は、ＤＳ  Ｒｅｄ、又はその変形から選ばれてよい。
【０１２５】
１の実施態様に従い、蛍光マーカーを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質は特に、融合タンパク質、例えばＧＦＰ−ＰＥＡ−１５でありうる。そのようなタンパク質は、当技術分野の当業者に知られる任意の分子生物学技術、とりわけ「Molecular  cloning:  A  Laboratory  manual」、Cold  Spring  Harbor,  Laboratory  Cold  Spring  Harbor,  NY,  1989,  2d  Edに記載されたものにより得られてよい。
【０１２６】
例えばＧＦＰ−ＰＥＡ−１５のような融合タンパク質を含有する発現ベクターの構築及び取得は、当技術分野の当業者の知識と通常の業務に依存する。これらタンパク質のためのコーディング配列は、例えば、www.ncbi.nlm.nih.govウェブサイト又はca.expasy.orgウェブサイト上のデータバンクにおいて入手可能であり、及び、市販でも入手可能である。
【０１２７】
ＧＦＰ（又はその変形の１つ）又はＤＳ  Ｒｅｄをコードする核酸配列を含有する発現ベクターは、市販入手可能であり、とりわけ、Invitrogen又はClontechのような会社から市販入手可能である。
【０１２８】
任意の都合の良い宿主細胞中でそのようなベクターは発現されてよく、そして、融合タンパク質の回収、又はもし必要ならば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのような、そのようなタンパク質のためのコーディング核酸の回収は、当技術分野の当業者に既知の任意の適当な手段により実施されてよい。
【０１２９】
例えば、ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質は、KITSBERGら（J.  Neurosci.,  1999,  19:  8244）により記載されている。
【０１３０】
１の実施態様に従い、本発明に従うスクリーニング方法は、例えば、式（ＩＶ）の本発明に従う化合物を用いることにより実施されうる。
【０１３１】
１の実施態様に従い、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質は、ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質でありうる。
【０１３２】
１の実施態様に従い、本発明に従うスクリーニング方法は、エクスビボ又はインビトロで実施されうる。
【０１３３】
例えば、本発明に従う方法は、実験動物の細胞がＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質を組織特異的に又は組織非特異的に発現するように、遺伝学的に改変された実験動物から取られた組織からのエクスビボで実施されうる。
【０１３４】
インビトロで、特に完全な細胞からのin  celluloで（細胞内で）で、又はex  celluloで（細胞外で）、例えば細胞溶解物中において若しくはＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質のような、関心のある成分の分離後に、本発明に従う方法は実施されうる。
【０１３５】
細胞株の初代細胞のトランスフェクション後に、前に定義されたような発現ベクターにより、又は上記で定義された通りの構築物を発現するように遺伝学的に改変された実験動物から取られた細胞の培養物により、又は本発明に従う融合タンパク質若しくはこの融合タンパク質をコードする核酸配列の、例えばマイクロピペット又は当技術分野の当業者により知られる任意の他の手段による、初代細胞又は細胞株のかん流により、本発明に従うスクリーニング方法は、本発明に従う融合タンパク質を発現する細胞においてin  celluloで（細胞内で）実施されうる。
【０１３６】
その局面の他に従い、ＰＥＡ−１５タンパク質と相互作用する傾向にある剤又はその類似体のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＰＥＡ−１５タンパク質との相互作用に適当な条件下において、担体と結合された少なくとも１の該タンパク質を、本発明に従う化合物の存在下に置くこと、
（ｂ）段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
（ｃ）該タンパク質との相互作用に適当な条件下において、段階ａ）において得られた集合体を、選抜されるべき剤の存在下に置くこと、
（ｄ）段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
（ｅ）該選抜されるべき剤又はその類似体と該ＰＥＡ−１５タンパク質のあり得る相互作用に関する結論を引き出すためにＳ１とＳ２を比較すること、
からなる段階を少なくとも含む前記方法に本発明は関係する。
【０１３７】
１の実施態様に従い、ＰＥＡ−１５タンパク質は、「精製マーカー」との異名をとるマーカーにより、担体に結合されうる。
【０１３８】
本発明に従い、「精製マーカー」は、ＰＥＡ−１５タンパク質を担体と結合させる為に用いられるべき傾向にある任意の構造物を意味することを意図する。
【０１３９】
精製マーカーは、例えばかつ非限定的な様式で、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、又はＧＳＴタンパク質（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）でありうる。
【０１４０】
前に定義されたような精製マーカーに結合したＰＥＡ−１５タンパク質は、当技術分野の当業者に知られる分子生物学の任意の方法、特に上記で示されたような方法により得られる融合タンパク質でありうる。
【０１４１】
例えば、ＧＳＴ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質は、Kitsbergらにより記載されたプロトコル（J.  Neurosci,  1999,  19:  8244）に従い得られうる。
【０１４２】
考慮された精製マーカーに従い、本発明の実施に適当な担体は、例えばかつ非限定的な様式で、セファロースビーズの表面又はグルタチオンにより覆われた細胞培養プレート、例えばＳＩＧＭＡにより市販される９６−ウェルプレート（参照番号Ｐ３２３３）など、の表面、ニッケルカラム、Ｇタンパク質若しくはＡタンパク質カラムに又はセファロースビーズの表面若しくは細胞培養プレートのウェルの底に結合した抗ＦＬＡＧ抗体でありうる。
【０１４３】
加えて、本発明に従う方法の実施の為に、当技術分野の当業者に既知の手段に従い、表面プラズモン共鳴によるシグナル検出の方法における実施の為の、センサーチップの表面にＰＥＡ−１５タンパク質が結合されうる。
【０１４４】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は蛍光性であってよく、第１のシグナルＳ１及び第２のシグナルＳ２は蛍光シグナルであってよい。
【０１４５】
これらのシグナルの測定は、当技術分野の当業者に知られる、蛍光分光分析又は蛍光画像のいずれかの方法により得られうる。励起の条件及び蛍光放射の記録は、当技術分野の当業者により既知の様々な要素、例えばかつ限定的な様式で、蛍光マーカーＡのタイプ、ＰＥＡ−１５タンパク質が横たわる担体など、に従い適応されるべきである。
【０１４６】
予め結合された本発明に従う化合物の転置を引き起こす、選抜されるべき剤とＰＥＡ−１５タンパク質とのあり得る相互作用は、２つのシグナルＳ１とＳ２の間の蛍光強度における違いにより検出されうる。
【０１４７】
他の実施態様に従い、第１のシグナルＳ１と第２のシグナルＳ２は、例えば当技術分野の当業者に既知のプロトコルに従い、Biacore（商標）タイプの装置により、表面プラズモン共鳴により得られるシグナルでありうる。
【０１４８】
これらのシグナルは、本発明に従う化合物の蛍光タイプ又は非蛍光タイプから独立である。
【０１４９】
したがって、前に記載された方法のこの実施において、本発明に従う化合物は蛍光性でなくてよい。
【０１５０】
ＰＥＡ−１５タンパク質は、前に記載された通りのセンサーチップ上に固定化されうる。
【０１５１】
本発明に従う化合物は、センサーチップに固定化された該タンパク質との接触に付されうる。該化合物と該タンパク質の間の相互作用は、表面プラズモン共鳴により検出されうる。予め結合された本発明に従う化合物の転置を引き起こす、選抜されるべき剤とＰＥＡ−１５タンパク質とのあり得る相互作用は、表面プラズモン共鳴により検出されうる。
【０１５２】
他の実施態様に従い、ＰＥＡ−１５タンパク質を含有すると推測される少なくとも１の生物学的試料中のＰＥＡ−１５タンパク質の検出による、及び場合によっては定量による、ＰＥＡ−１５と関係する傾向にある病理学的状態の診断及び／又は予後診断の方法であって、
（ａ）蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体との相互作用に適当な条件下において、少なくとも１の該タンパク質又はその類似体を、本発明に従う少なくとも１の蛍光化合物の存在下に置くこと、
（ｂ）Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定するようなものであること、
（ｃ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする或る波長での照射により、段階ａ）において得られた集合体の特徴である第１のシグナルＳ１を測定すること、
（ｄ）段階ａ）において得られた集合体を、少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質を含有すると推測される生物学的試料の存在下に置くこと、これは本発明に従う該化合物と生物学的試料の該ＰＥＡ−１５タンパク質との相互作用に適当な条件下においてなされる、
（ｅ）蛍光エネルギー供与体が励起されることを可能とする或る波長での照射により、段階ｃ）において得られた集合体の特徴である、Ｓ１と同じタイプの第２のシグナルＳ２を測定すること、
（ｆ）該生物学的試料中のＰＥＡ−１５のあり得る存在に関する結論、及び場合によっては該タンパク質の量に関する結論を引き出すために、Ｓ１とＳ２を比較すること、
からなる段階を少なくとも含む前記方法に本発明は関する。
【０１５３】
第１と第２のシグナルの比較は、検出されるべき蛍光シグナルの振幅変調を可能とする。そのような変調は、試料中にもしかすると存在するＰＥＡ−１５タンパク質の存在及び場合によっては量の情報を提供しうる。
【０１５４】
場合によっては前の測定と同時に、場合によってはＰＥＡ−１５タンパク質の既知の量を含有する対照試料から又は健康な生物学的試料から得られる参照値と比較された、ＰＥＡ−１５タンパク質の存在及び場合によっては量の決定は、特にＰＥＡ−１５に関係する病理学的状態及び／又はそのような状態の評価の情報を提供しうる。
【０１５５】
本発明に従う方法により診断されうる及び／又は予測されうる病理学的状態の例として、癌、特にグリア細胞腫、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、メラノーマ、及びＩＩ型糖尿病も、言及しうる。
【０１５６】
生物学的試料は、生物学的組織又は体液から得られうる。
【０１５７】
本発明に従う方法は、生物学的試料中のＰＥＡ−１５の存在及び場合によっては量についての情報を引き出すために、前に定義された通りのシグナルＳ１及びＳ２と対照試料から測定されたシグナルＳ３とを比較することから成る段階を含みうる。
【０１５８】
１の実施態様に従い、第１と第２のシグナルは、１以上の対照試料から検出された１以上の蛍光シグナルと比較されうる。そのような対照試料は、本発明に従う方法を実施することにより、かつ、段階ｃ）において、該生物学的試料をＰＥＡ−１５タンパク質の既知の量を含有する１以上の試料によって置き換えることにより、得られうる。
【０１５９】
生物学的試料中のＰＥＡ−１５タンパク質の検出及び場合によっては定量の為に、本発明に従う方法の実施と同時に又は独立に、対照試料が本発明に従う方法に従い調製されうる。
【０１６０】
１の実施態様に従い、参照スケールを得るように、対照試料中のＰＥＡ−１５の既知の量、又は、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質の量及び／若しくは本発明に従う蛍光化合物の量を変更することが可能である。
【０１６１】
従って、前に定義された通りの変数量の１つと蛍光シグナルの相関関係は完成されうる。
【０１６２】
このように、ＰＥＡ−１５タンパク質の本発明に従う蛍光化合物のＦＲＥＴシグナルの相関関係は、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質の既知の量により作られる。
【０１６３】
１の実施態様に従い、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質は、特に、前に定義された通りであり得る。
【０１６４】
１の実施態様に従い、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質は、ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５タイプの融合タンパク質でありうる。
【０１６５】
１の実施態様に従い、本発明に従う化合物は、前に定義された通りであってよく、とくに、上記で特定された通りの式（ＩＶ）のものでありうる。
【０１６６】
本発明に従う診断の方法の多くの変形が考えられてよく、もし必要ならば本発明に従うスクリーニング方法の特徴と組み合わせられうる。
【０１６７】
すなわち、１の実施態様に従い、本発明は、スクリーニング方法のための上記で示された原理に従い実施される、例えば表面プラズモン共鳴による検出を実施する、ＰＥＡ−１５と関係しうる病理学的状態の診断及び／又は予後診断の方法に関係し、ここで該剤は、生物学的試料により置き換えられる。
【０１６８】
そのような試料中に場合によっては存在するＰＥＡ−１５は、本発明に従う化合物と結合することができるだろう、従って、記録されたシグナルを改変することができるだろう。
【０１６９】
スクリーニング又は診断のキット
【０１７０】
本発明は、ＰＥＡ−１５タンパク質又はその類似体と相互作用する傾向にある剤のスクリーニングの為のキット、又は、ＰＥＡ−１５と関係しうる病理学的状態の診断及び／又は予後診断の為のキットであって、
−  蛍光マーカーＤ又は精製マーカーを運ぶ少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質、及び、
−  本発明に従う少なくとも１の化合物、
任意的に、Ａ及びＤは蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定しうるものである、
を含有する前記キットにも関係する。
【０１７１】
１の実施態様に従い、蛍光マーカーＤ又は精製マーカーを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質は、前に定義されたとおりであり得る。
【０１７２】
１の実施態様に従い、本発明に従うキットが、より特には病理学的状態の診断及び／又は予後診断の為に実施されるときは、それはさらにラベル化されていない少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質を含有しうる。
【０１７３】
１の実施態様に従い、蛍光タンパク質を有する１のＰＥＡ−１５タンパク質から構成される融合タンパク質、又は、ラベル化されていないＰＥＡ−１５タンパク質が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は発現ベクターのような、該タンパク質をコードする核酸配列の形態で、本発明に従うキット中に存在しうる。
【０１７４】
医薬組成物
【０１７５】
１の実施態様に従い、本発明は、医薬組成物中の活性剤としての使用の為の、本発明に従う化合物にも関係する。
【０１７６】
本発明に従い、「医薬組成物」は、ヒト又は動物の病気に関する治療的又は予防的特性を有するとして提供される組成物又は物質、並びに、病理学的状態若しくは非病理学的状態の診断及び／若しくは予後診断を確立する為又は個体の器官の機能を回復し、補正し、又は修正する為に用いられるべき物質又は組成物を意味する。
【０１７７】
本発明に従う医薬組成物を通じて実施される傾向にある診断及び／又は予後診断方法は、インビトロ又はエクスビボで実施されうる。
【０１７８】
本発明に従う医薬組成物は、薬学で通常用いられる基礎剤、希釈剤又は賦形剤との組み合わせにおける、一般式（Ｉ）の本発明に従う化合物、又は、互変異性体、立体異性体、多形体、医薬的に許容できる塩、又は医薬的に許容できる溶媒和物のようなその誘導体の１つを含有しうる。
【０１７９】
本発明に従う医薬組成物は、タブレット、カプセル、粉、シロップ、溶液、懸濁物のような、当技術分野で通常用いられるガレノス形態で提供されうる。
【０１８０】
本発明に従う医薬組成物は、口、鼻、舌下、局所的、眼、直腸経路のような、他の経路を介しての適用に適当な、ガレノス形態で提供されうる。
【０１８１】
本発明に従う化粧品組成物は、皮下的経路、経皮的経路、筋肉内経路、静脈内経路、動脈内経路、心臓内経路のような、非経口の適用に適当な、無菌の形態でも提供されうる。
【０１８２】
本発明に従う医薬組成物は、使用において、無菌の又は無菌でない水溶液と組み合わせられる、凍結乾燥された形態で提供されうる。
【０１８３】
特に、もし本発明に従う組成物が非経口の適用の為に用いられるべきならば、水溶液は無菌でありうる。
【０１８４】
医薬組成物中に存在する、本発明に従う化合物の量は、例えば、適用経路、処置されるべき個体のタイプ、及び処置されるべき病状のタイプに従い調節されるべきである。
【０１８５】
これらのパラメーターに従う量及び用量の調節は、当技術分野の当業者に知られている。
【０１８６】
本発明に従う組成物は、一般に、本発明に従う化合物の十分な量を含有する。
【０１８７】
「十分な量」は、要求される効果を得るために必要な量を意味することを意図する。本発明に従い、そのような効果は、個体、例えば場合によっては癌又はＩＩ型糖尿病のような病状を有する個体により提示される症状の減少又は処置でありうる。
【０１８８】
癌は、例えば、グリア細胞腫、腎臓癌、乳癌、又はメラノーマでありうる。
【０１８９】
その目的の他に従い、本発明は、ＰＥＡ−１５に関係する傾向にある病理学的状態の処置の為の医薬組成物の製造の為の、本発明に従う化合物の使用に関する。
【０１９０】
ＰＥＡ−１５タンパク質は、その発現の変化、すなわち例えば過剰発現又は発現の欠損により又はその生物学的活性の変化により、例えばその活性の増加又は減少を結果すること、及び場合によってはＰＥＡ−１５タンパク質の配列の変異（例えば置換、挿入又は欠失）若しくはＰＥＡ−１５タンパク質の生物学的活性及び／又は発現を調節する細胞シグナルの変化の結果となること、に関係しうる。
【０１９１】
ＰＥＡ−１５に関係しうる病理学的状態に関して、語「処置」は、例えば症状の減少又はこれら症状の予防のような、病気の重症度の減少を意味することを意図する。
【０１９２】
このように、そしてこの最近の例では、本発明に従う化合物は、病理学的状態の進行の前に適用されうる。
【０１９３】
本発明により考慮される病理学的状態は、癌、特にグリア細胞腫、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、及びＩＩ型糖尿病のような、前に説明されたそれらであり得る。
【０１９４】
本発明に従う「個体」は、ヒト、非ヒト霊長類、並びに、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット又はハムスター）のような実験動物、家畜、特には家禽、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及び魚、及び特には肉、卵及び乳のようなヒトの消費に適当な産物を産生するそれらのような経済的に関心のある動物を意味することを意図する。この語は、ネコ及びイヌのような家畜も表す。
【０１９５】
本発明は、前に定義された通りの医薬組成物にも関係する。
【０１９６】
１の実施態様に従い、本発明は、蛍光マーカーＤ又は精製マーカーを運ぶ少なくとも１のＰＥＡ−１５タンパク質と本発明に従う式の少なくとも１の化合物とを含有する、単離された複合体にも関係し、Ａ及びＤは、蛍光共鳴エネルギー移動の実施に適当な蛍光エネルギー受容体−供与体対を規定しうるものである。
【０１９７】
代わりの実施態様に従い、本発明に従う複合体は、蛍光マーカーＤを運ぶＰＥＡ−１５タンパク質としてＧＦＰ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質と、本発明に従う式の化合物として前に定義された通りの式（ＩＶ）の化合物とを含有しうる。
【０１９８】
上述されたとおりの、本発明の多くの修正が、本発明の範囲から離れることなく、当技術分野の当業者により考慮されうる。
【０１９９】
そのような修正は、本適用により含まれうる。
【０２００】
本発明は以下の実施例により説明され、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでない。
【０２０１】
図面の説明
【０２０２】
図１：５０μＭの６Ｄ６−１による処理の前及び後の、ＥＲＫ及びＰＥＡ−１５タンパク質の細胞内化合物の位置の共焦点像により得られた画像を表す。６Ｄ６−１化合物による細胞の処理は、核内のＥＲＫタンパク質の再配置を結果するが、ＰＥＡ−１５タンパク質は細胞質のままである。
スケールバーは４０μｍに対応する。
【０２０３】
図２：１及び５μＭの６Ｄ６−１の存在下においてインキュベートされた、ＧＳＴ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質を運ぶ、グルタチオンにより覆われたセファロースビーズ蛍光の平均強度を表す。
【０２０４】
実施例
【０２０５】
実施例１
【０２０６】
６Ｄ６−１化合物の合成
（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−カルバミン酸  tert−ブチルエステルの合成
【化３０】
2009519305.tif 000031
【０２０７】
反応器において、ＲＥＭ樹脂（REgenerated  Michael、ポリスチレン樹脂）（５ｇ、４ｍｍｏｌ、０．８ｍｍｏｌ・ｇ−１の理論的装填）が、最低の品質のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨張される。ＤＭＦ（５０ｍｌ）中のテルチオブチルオキシカルボニルアミノピペリジン（８ｇ、４０ｍｍｏｌ）の溶液が８０℃に加熱され、次に懸濁物中の該樹脂に添加される。該混合物は、８０℃で１６時間攪拌され、次に濾過され、そしてＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２  ＭｅＯＨの順に従い３回洗浄される。スペルコ（Supelco）シリンジ中で、該樹脂（２．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）は２０ｍｌのＤＭＦ中に展開され、そして、ヨウ化メチル（３．８１ｍｌ、６１ｍｍｏｌ）が添加される。該混合物は、２４時間回転により攪拌され、該樹脂は濾過され、ＤＭＦ／ＤＣＭの３連続により洗浄される。同じ条件下において、ヨウ化メチルによるアルキル化の第２段階が繰り返される。４０ｍｌのＤＣＭを有するバルーン中で、かつＩＲＡ−９５樹脂（３．１６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の存在下において、該樹脂上のピペリジンの開裂は達成される。磁石のバーによる２４時間の攪拌後、該樹脂はろ過され、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ洗浄される。ろ液は回収され、減圧下で乾燥される。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９／１）は、白色の粉末の形態にある（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−カルバミン酸  tert−ブチルエステルを結果する。
【０２０８】
収率＝１００％；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３、２００ＭＨｚ）：４．４３（ｍ、１Ｈ）、２．７７（ｍ、２Ｈ）、２．２６（ｓ、３Ｈ）、２．１３−１．８７（ｍ、４Ｈ）、１．５３−１．４６（ｍ、２Ｈ）、１．４２（ｓ、９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３、５０ＭＨｚ）１５５．６０、１１０．００、５４．８６、４６．４７、３２．９０、２８．８０。
【０２０９】
１−メチル−ピペリジン−４−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−ＮＨＢｏｃの合成
【化３１】
2009519305.tif 000032
【０２１０】
室温でかつ磁石の攪拌下で、（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−カルバミン酸  tert−ブチルエステル（０．０７ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）が、ＴＦＡ／ＤＣＭ（１ｍＬ／１ｍＬ）の溶液により９０分間処理される。該溶液は次に、減圧下で乾燥蒸発され、そして、得られた産物は１８時間真空乾燥される。保護されていないＮ−メチルピペリジンが、１ｍｌのＤＭＦ中に溶解され、そして、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−ＯＨ（０．１２ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリスピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート[ＰｙＢｏｐ]（０．１７ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン[ＤＩＥＡ]（０．２７ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）が、順次添加される。室温での３時間の磁石の攪拌後、反応物は乾燥蒸発され、次にＨＰＬＣにより精製され、そして凍結乾燥の後、半透明のオイルを結果する。
【０２１１】
収率＝１００％；ｔｒ＝１５．７４分；λ＝２２０ｎｍ；勾配  ｔ＝０分で０％溶媒Ｂ、ｔ＝５分で０％溶媒Ｂ、ｔ＝３５分で１００％溶媒Ｂ。ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）  [Ｃ２４Ｈ３５Ｎ５Ｏ３＋Ｈ]４４２について計算されたｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）は４４２と分かった。
【０２１２】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｏ−リサミン）−ＯＨの合成
【化３２】
2009519305.tif 000033
【０２１３】
室温でかつ磁石の攪拌下で、Ｆｍｏｃ−ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．５７ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）が、ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／５ｍｌ）の溶液により２時間処理される。該溶液は次に、減圧下で乾燥蒸発され、そして、得られた産物は１８時間真空乾燥される。Ｆｍｏｃ−ｌｙｓ−ＯＨは次に１７ｍｌのＤＣＭ中に溶解され、次にトリエチルアミン[ＴＥＡ]（１．３８ｍｌ、９．８４ｍｍｏｌ）が、ｐＨを約８〜９に調整するために添加され、すると、０℃で３０分間、ゲルの形成を観察し、該ゲルはリサミン（０．７８ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）が添加されると消失する。室温に戻し、反応物は磁石の攪拌下に５時間置かれる。反応混合物は次に、５０ｍｌのＤＣＭにより希釈され、１０％ＨＣｌ（１０ｍｌ）により２回洗浄され、次に有機層が硫酸ナトリウム上で乾燥され、次に乾燥蒸発される。精製及び２つの位置異性体の分離は、シリカゲル上で得られ（ジクロロメタン／メタノール／酢酸：９４／５／１）、そして、２つの紫色の粉を結果する。
【０２１４】
収率：４０％  パラ異性体  及び  ５％  オルト異性体。ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）  [Ｃ４８Ｈ５２Ｎ４Ｏ１０Ｓ２＋Ｈ]９０９について計算されたｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）９０９は、９０９と分かった。
【０２１５】
１−メチル−ピペリジン−４  Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（ｏ−リサミン）−ＮＨＦｍｏｃの合成
【化３３】
2009519305.tif 000034
【０２１６】
室温でかつ磁石の攪拌下で、１−メチル−ピペリジン−４−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−ＮＨＢｏｃ（０．０３ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）がＴＦＡ／ＤＣＭ（１ｍｌ／１ｍｌ）の溶液により９０分間処理される。該溶液は次に減圧下で乾燥蒸発され、そして産物は１８時間真空乾燥される。このように得られたアミンは０．５ｍｌのＤＭＦに溶解され、そして、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｏ−リサミン）−ＯＨ（０．０６ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢｏｐ（０．０３ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．０１ｍｌ、０．０７ｍｍｏｌ）が順次に添加される。室温での４時間の磁石の攪拌後、反応物は乾燥蒸発され、次にＨＰＬＣにより精製され、そして凍結−乾燥後、紫色の粉を結果する。
【０２１７】
収率＝１５％；ｔｒ＝１８．９７分；λ＝２２０ｎｍ；勾配  ｔ＝０分で５％溶媒Ｂ、ｔ＝３０分で１００％溶媒Ｂ。ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）  [Ｃ６７Ｈ７７Ｎ９Ｏ１０Ｓ２＋Ｈ]１２３２について計算されたｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）は、１２３２と分かった。
【０２１８】
１−メチル−ピペリジン−４−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（ｏ−リサミン）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−アセトアミドの合成
【化３４】
2009519305.tif 000035
【０２１９】
第１段階において、１−メチル−ピペリジン−４−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（ｏ−リサミン）−ＮＨＦｍｏｃ（０．０１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）が、０．５ｍｌのＤＭＦ中の０．１２ｍｌのピペリジンにより、室温で１時間処理される。該溶液は次に、分取用ＨＰＬＣに直接に注入され、そして、保護されていない産物を、４０％の収率で最終アミンについて結果する。このように得られたアミン（０．００４ｇ、０．００４ｍｍｏｌ）は、０．３ｍｌのＤＭＳＯ中のＰｙＢｏｐ（０．００３ｇ、０．００７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．００５ｍｌ、０．０３３ｍｍｏｌ）の存在下で１−メチル−４−イミダゾール酢酸塩酸塩（０．００１ｇ、０．００７ｍｍｏｌ）とのカップリングの最終段階を受ける。室温での９０分間の攪拌の後、該溶液は、分取用ＨＰＬＣに直接に注入され、そして凍結乾燥後、紫色の粉を結果する。
【０２２０】
収率  ３０％、ｔｒ＝１７．７０分；λ＝２２０Ｎｍ；勾配  ｔ＝０分で５％溶媒Ｂ、ｔ＝３５分で１００％溶媒Ｂ。ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）  [Ｃ５８Ｈ７３Ｎ１１Ｏ９Ｓ＋Ｈ]１１３２について計算されたｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）は１１３２と分かった。
【０２２１】
実施例２
【０２２２】
ＦＲＥＴによる、６Ｄ６−１化合物とＰＥＡ−１５ＧＦＰとの相互作用の検出
【０２２３】
KITSBERGら（J.  Neurosci.,  1999,  19:  8244）により記載された通りに得られたＥＧＦＰ−ＰＥＡ−１５プラスミドによる、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションにより、FORMSTECHERら（Dev.  Cell.,  2001,  1;239）により記載された通りに、ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５を発現する細胞株３Ｔ３（３Ｔ３−ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５細胞）が得られた。
【０２２４】
１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（５ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５ｇ／ｍｌ）により補われたＤＭＥＭ（Ｒｏｃｈｅ）培地中で、ネオマイシン（Ｇ４１８）に耐性のクローンが、選択されそして培養された。
【０２２５】
生きている細胞の蛍光の測定により、及び、抗ＧＦＰ抗体（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１，８１４，４６０  マウスから得られる２のモノクローナル抗体（クローン７．１及びクローン１３．１）の混合物）及び抗ＰＥＡ−１５（ウサギポリクローナル抗体、Sharifら、neuroscience,  126:  263,  2004）によるウェスタントランスファー分析により、ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５タンパク質発現が確かめられた。
【０２２６】
次に、３Ｔ３−ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５細胞は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の経験の前に、ペニシリン（１０  ０００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１０  ０００μｇ／ｍｌ）、７％のウシ胎仔血清（BIOWHITTAKER）を含有するＨＡＭ−Ｆ１２培地中でコンフルエンス（confluence）へと培養される。
【０２２７】
約２０ｍｍの濃度でＤＭＳＯ中に溶解された、６Ｄ６−１化合物の原液が、使用の前に、最終濃度の１０倍の濃度で、ＰＢＳ中に希釈される。
【０２２８】
６Ｄ６−１化合物は、１０−４Ｍ及び１０−５Ｍで試験される。
【０２２９】
６Ｄ６−１化合物の添加後、化合物が拡散すること及び細胞中へ入ることを可能とする為に、蛍光の読み取りの前に、細胞は６０分間穏やかに攪拌される（１００ｒｐｍ）。
【０２３０】
細胞は、４６５ｎｍの励起波長で照射される。
【０２３１】
４６５ｎｍで励起されたＧＦＰタンパク質は、５３５ｎｍの蛍光シグナルを放射する。
【０２３２】
ＧＦＰ−ＰＥＡ−１５タンパク質への、６Ｄ６−１化合物の結合は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能とし、５９０ｎｍでの蛍光シグナルの放射を結果する。
【０２３３】
実施例３
【０２３４】
ＥＲＫ位置についての６Ｄ６−１化合物の効果
【０２３５】
初代星状細胞培養物が、ARAUJOら（J.  Biol.  Chem.,  1993,  268:  5911）により記載された通りに、マウス胚（１６日）の皮質及び線条体から調製された。
【０２３６】
ＥＲＫの主に細胞質内の位置を誘導すると知られる条件である、血清不在のもとで初代星状細胞培養物は２４時間維持された。
【０２３７】
次に、細胞は５０μＭの６Ｄ６−１化合物により、２時間１５分の間、処理され又は処理されなかった。
【０２３８】
ＥＲＫとＰＥＡ−１５の細胞内の位置が、蛍光抗体により細胞をラベル化した後に、共焦点顕微鏡により観察された。
【０２３９】
細胞は、室温で、ＰＢＳ（Dulbecco  リン酸塩生理食塩水緩衝液、CaCl2もMgCl2も無い、Sigma）により２回洗浄され、そして、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の４％パラホルムアルデヒドにより１５分間固定され、次に０．１Ｍのグリシンを含有するＰＢＳにより２回洗浄された。
【０２４０】
次に、細胞は、０．２％のトライトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中で、５分間インキュベートされた。
【０２４１】
非特異的部位が、室温で、１時間、１０％の標準ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有するＰＢＳによりブロックされた。
【０２４２】
次に、細胞は、１．５％のＮＧＳを含有するＰＢＳ中に希釈された、ＰＥＡ−１５特異的抗体（ウサギポリクローナル抗体、Sharifら、Neuroscience,  2004）又はＥＲＫ特異的抗体（ウサギポリクローナル抗体、Santa  Cruz  K-23（参照番号Ｓｃ−９４））と共に、４℃で一晩インキュベートされた。
【０２４３】
ＰＢＳ中での３回の洗浄後、細胞はＡｌｅｘａ−４８８（分子プローブ）によりラベル化された抗ウサギ抗体により、室温で１時間インキュベートされる。
【０２４４】
細胞核が、ＴＯＰＲＯ２ヨウ化物により、製造者（HOECHST）の仕様書に従い、ラベル化された。
【０２４５】
ラメラが、フルオロマウント（FLUOROMOUNT）媒体（Southern  Biotechnology）中の、スライドガラス上に載せられ、そして、適当なフィルターを有する共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２、ＬＥＩＣＡ）により観察された。
【０２４６】
共焦点分析について、励起波長は、Ａｌｅｘａ４８８については４８８ｎｍ、ＴＯＰＲＯについては６３３ｎｍであり、そして、放射波長は、ＡＬＥＸＡ−４８８については５１０〜５２５ｎｍ、ＴＯＰＲＯについては６４７ｎｍであった。
【０２４７】
５０μＭの６Ｄ６−１化合物による星状細胞の処理は、核内のＥＲＫの再配置を結果するが、一方、ＰＥＡ＝１５は細胞質内のままである（図１）。
【０２４８】
実施例４
【０２４９】
６Ｄ６−１／ＰＥＡ−１５タンパク質相互作用
【０２５０】
ＧＳＴ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質が、Kitsberら（J.  Neurosci,  1999,  19:  8244）により記載されたプロトコルに従い得られた。
【０２５１】
ＧＳＴ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質は、バクテリアの溶解（リーシス）後に回収され、そして、グルタチオンにより覆われたセファロースビーズと一緒にインキュベートされた。
【０２５２】
このようにして得られたビーズは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液中の、１又は５μＭの６Ｄ６−１の存在下においてインキュベートされる。
【０２５３】
１連の３回の洗浄後、ビーズはセルロース膜上で乾燥され、そして、蛍光は、５４３ｎｍでの励起によるリサミンの蛍光を測定すること及び５９０ｎｍでの放射の測定により、ホスホイメージャー（phosphoImager）（Biorad）により定量される。
【０２５４】
結果は、３つの独立した試験の平均である。
【０２５５】
結果は、蛍光の平均強度は化合物の濃度に依存すること、及び従って、６Ｄ６−１化合物とＰＥＡ−１５タンパク質との間の特異的な相互作用を示唆することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】６Ｄ６−１の５０μＭによる処理の前及び後の、ＥＲＫ及びＰＥＡ−１５タンパク質の細胞内化合物の位置の共焦点像により得られた画像である。
【図２】６Ｄ６−１の１及び５μＭの存在下においてインキュベートされた、ＧＳＴ−ＰＥＡ−１５融合タンパク質を運ぶ、グルタチオンにより覆われたセファロースビーズ蛍光の平均強度を表すグラフである。
【図１】
2009519305.tif 000046
【図２】
2009519305.tif 000047
【国際調査報告】
2009519305.tif 000048
2009519305.tif 000049
2009519305.tif 000050
2009519305.tif 000051
2009519305.tif 000052
2009519305.tif 000053
2009519305.tif 000054
2009519305.tif 000055