(57)【要約】本発明は、糖ペプチド耐性腸球菌の中でも、VanA/VanB糖ペプチド耐性の群に属するE. フェカーリス（E. faecalis）種および/またはE. フェシウム（E. faecium）種、ならびに、VanC糖ペプチド耐性の群に属するE. ガリナルム（E. gallinarum）種/E. カセリフラブス（E. casseliflavus）種の群の検出および/または識別のための固体培養培地に関し、該培地は、腸球菌に対して選択的な培養培地中において、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、ならびに、メチル-α-グルコシドおよびグルコシル-α-グルコシドまたはそれらのポリマーより選択される、少なくとも1種類の呈色反応活性化剤（activator of a colored reaction）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸球菌の糖ペプチド耐性菌種である
- 糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属する、E. フェカーリス（E. faecalis）および/またはE. フェシウム（E. faecium）；ならびに
- 糖ペプチド耐性のVanC群に属する、E. ガリナルム（E. gallinarum）/E. カセリフラブス（E. casseliflavus）
の群の検出および/または識別のための固体培養培地であって、腸球菌に対して選択的な培養培地において、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、ならびに、メチル-α-グルコシドまたはそのポリマーおよびグルコシル-α-グルコシドまたはそのポリマーより選択される少なくとも1種類の呈色反応活性化剤（activator of a colored reaction）を含む、培地。
【請求項２】
糖ペプチド耐性のVanC群に属するE. ガリナルム種/E. カセリフラブス種の検出および/または識別のために、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質および少なくとも約10 g/lの濃度で使用されるメチル-α-グルコシドまたはそのポリマーを含むことを特徴とする、請求項1記載の培養培地。
【請求項３】
VanA/VanB糖ペプチド耐性の群に属するE. フェカーリス種の検出および/または識別のために、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質および少なくとも約0.1 g/lの濃度で使用されるグルコシル-α-グルコシドまたはそのポリマーを含むことを特徴とする、請求項1記載の培養培地。
【請求項４】
VanA/VanB糖ペプチド耐性の群に属するE. フェシウム種の検出および/または識別のために、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、少なくとも約10 g/lの濃度で使用されるメチル-α-グルコシドまたはそのポリマー、および少なくとも約0.1 g/lの濃度で使用されるグルコシル-α-グルコシドまたはそのポリマーを含むことを特徴とする、請求項1記載の培養培地。
【請求項５】
腸球菌に対して選択的な培養培地が、少なくとも1種類の糖ペプチド抗生物質を含む糖ペプチド耐性腸球菌に対して選択的な培地であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項６】
糖ペプチド抗生物質が、バンコマイシン、テイコプラニン、およびそれらの組合わせより選択されることを特徴とする、請求項5記載の培養培地。
【請求項７】
バンコマイシンが、約2 mg/l〜約15 mg/lの濃度で、好ましくは約3 mg/l〜約9 mg/lの濃度で、より好ましくは約4 mg/l〜約8 mg/lの濃度で使用され、特に好ましい値が約6 mg/lであることを特徴とする、請求項6記載の培養培地。
【請求項８】
テイコプラニンが、約0.5 mg/l〜約16 mg/lの濃度で、好ましくは約1 mg/l〜約10 mg/lの濃度で、より好ましくは約2 mg/l〜約8 mg/lの濃度で使用され、特に好ましい値が約5 mg/lであることを特徴とする、請求項6記載の培養培地。
【請求項９】
加水分解により発色基質が、インドキシル誘導体、ハロゲンインドキシル（ブロモ-インドキシル、クロロ-インドキシル、フルオロ-インドキシル、ヨード-インドキシル、ジクロロ-インドキシル、クロロ-ブロモ-インドキシル、トリ-クロロ-インドキシル）誘導体、メチル-インドキシル誘導体、またはヒドロキシ-キノリン誘導体、特に以下の誘導体：6-クロロ-インドキシル、5-ブロモ-インドキシル、3-ブロモ-インドキシル、6-フルオロ-インドキシル、5-ヨード-インドキシル、4,6-ジクロロ-インドキシル、6,7-ジクロロ-インドキシル、5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル、5-ブロモ-6-クロロ-インドキシル、4,6,7-トリクロロ-インドキシル、N-メチル-インドキシル、または8-ヒドロキシ-キノリンより選択される沈殿可能な発色団（precipitable chromophore）を放出することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１０】
α-グルコシダーゼに対する発色基質が5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル-α-グルコシドであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の培養培地。
【請求項１１】
腸球菌の糖ペプチド耐性菌種である
- 糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属する、E. フェカーリスおよび/またはE. フェシウム；ならびに
- 糖ペプチド耐性のVanC群に属する、E. ガリナルム/E. カセリフラブス
の群の検出および/または識別のための、請求項1〜10のいずれか一項記載の培養培地の使用。
【請求項１２】
少なくとも
(a) 該試料またはそれに由来する種菌による、請求項1〜10のいずれか一項記載の培養培地の接種；
(b) 該培養培地上での、腸球菌の糖ペプチド耐性菌種E. フェカーリス/E. フェシウムおよびE. ガリナルム/E. カセリフラブスの群の存在の検出；ならびに
(c) 任意で、該培養培地上に存在するその他の微生物からの、E. フェカーリス種および/またはE. フェシウム種および/またはE. ガリナルム種/E. カセリフラブス種の弁別
の工程を含むことを特徴とする、
試料中の腸球菌の糖ペプチド耐性菌種である
- 糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属する、E. フェカーリスおよび/またはE. フェシウム；ならびに
- 糖ペプチド耐性のVanC群に属する、E. ガリナルム/E. カセリフラブス
の群の検出および/または識別のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的および臨床的な微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、それらが1つまたは複数の抗生物質に対して耐性を有するために治療的処置の適合化を必要とする感染症の原因となる細菌種の、検出および/または識別のための手段に関する。
【０００２】
より明確には、本発明は、糖ペプチド耐性腸球菌の中でも、糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属するE. フェカーリス（E. faecalis）種および/またはE. フェシウム（E. faecium）種、ならびに、糖ペプチド耐性のVanC群に属するE. ガリナルム（E. gallinarum）種/E. カセリフラブス（E. casseliflavus）種の群の検出および/または識別のための固体培養培地に関し、ここで該培地は、腸球菌に対して選択的な培養培地中において、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、および、メチル-α-グルコシドおよびグルコシル-α-グルコシドまたはそれらのポリマーより選択される、少なくとも1種類の呈色反応活性化剤（activator of a colored reaction）を含む。
【背景技術】
【０００３】
バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の菌株、およびより大まかには糖ペプチド耐性腸球菌は、1980年代に初めて臨床的に単離された。それ以来、病院環境におけるVREの発生率は増加し続けている。これらの細菌は一般に、医療関係者にとって心配の種である院内感染の原因となる。さらに、多剤耐性VREの出現、すなわち、バンコマイシンに対してだけでなく1つまたは複数の非糖ペプチド（non-glycopeptide）抗生物質に対して耐性を有する腸球菌の出現は、臨床医にとっての真の治療上の問題点である。実際、腸球菌株のあいだでの耐性特性の多重度および伝播のために、標準的療法に対してある程度の不死性が生じている。
【０００４】
大部分の抗生物質ファミリーに対する耐性を付与する機構とは異なり、糖ペプチド耐性は、単一遺伝子の産物に依存するのではなく、一連の密接に関連する遺伝子であるvan糖ペプチド耐性オペロンの調節されかつ双方向的な（interactive）発現を必要とする。
【０００５】
現在までに、腸球菌における複数の種類（または群）の糖ペプチド耐性が同定されており、そのうち、VanA（vanAオペロン）、VanB（vanBオペロン）、およびVanC（vanCオペロン）は、最も高頻度で見られる種類である（後述の表1を参照されたい）。これらの遺伝子群には、細菌株のあいだで伝播可能である（いわゆる獲得耐性）ものもあるが、内因的かつ伝播不可能なものもある（表1）。
【０００６】
最終的には、VREのなかでも最も高頻度な腸球菌の菌種は、所与の種類の糖ペプチド耐性により特異的に関連する菌種または菌種群に大まかに分類できる（表1）。
【０００７】
【表１】
2009542239.tif 000002
【０００８】
以下の表2に示すように、腸球菌における糖ペプチド耐性の種類は、原因となる遺伝子配列（vanオペロンの配列）、それらの担体（プラスミドまたはクロモソーム）、ならびに発現の機構およびそれに伴う発現の調節（誘導性のまたは構成的な耐性）によってだけでなく、随伴する糖ペプチド耐性レベルによっても区別されている。
【０００９】
【表２】
2009542239.tif 000003
MIC：最小阻止濃度（mg/l）
【００１０】
細菌を検出および/または識別するために、表現型または遺伝子型の特性の検出に基づく方法が、一般的に用いられている。さらに、検出の選択性および/または感度および/または特異性を向上させることにより解析の識別能を増大させるために、これらの方法のいくつかを好都合に組合わせることができる。
【００１１】
VRE検出の特定分野においては、既知の表現型法により、特異的発色によってVanC VRE培養物と非VanC VRE培養物（呈色していない）を識別することが可能になっている。この方法は液体培地（試験管またはウェル）中で実施されており、メチル-α-グルコシドの存在に関連した培地の酸性化を用いる。この試験においては、培地の酸性化を示すために用いられるpH指示薬の存在下で、濃度20 g/lの糖が使用される。
【００１２】
しかし、一方では偽陽性や偽陰性の結果が得られる可能性を無くすため、他方では（現在の試験では不可能な）菌種レベルでのVREの検出を可能にするために、選択性と特異性の両方の点でこの試験の識別能には未だ改善が必要である。
【００１３】
したがって現在、菌種レベルでのおよび随伴する種類の糖ペプチド耐性レベルでのVREの識別的検出を可能にするために、臨床環境において最も高頻度に遭遇するVREに対する、簡単で、迅速で、感度がよく、選択的で、特異的で、かつ信用性が高い検出試験が必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
この必要性に対し、本発明は、効果的かつ識別的なVRE検出のために（プレート上の）固体培地中で利用可能な表現型手段を提供することによって対応していることが明確である。
【００１５】
この点において、後述の実施例および表3において示されるように、先行技術の試験管技術をそのまま固体培地に適用した場合にはコロニーのごくわずかな発色しか得られず、したがってこれではVREを識別または弁別できないことが留意されねばならない。
【００１６】
さらに、固体培地中で使用される発色基質それ自体ではVREを満足に検出できないことが、本明細書において示されている（後述の表3を参照されたい）。
【００１７】
α-グルコシダーゼ酵素をコードする遺伝子の有無を単に実証するだけで検出が達成されるというありそうな仮説に基づき当業者が予想するであろうことに反して、本発明の枠組みの中で報告された結果は、試験管におけるメチル-α-グルコシドとpH指示薬との組合わせを、固体培地においてα-グルコシダーゼに対する発色基質へと単純に置き換えることが不可能であることを示している。
【００１８】
さらに本発明は、α-グルコシダーゼに対する少なくとも2種類の基質（そのうち1つが発色性である）の多様な組合わせが、固体培地において、使用した基質およびその組合わせにより発色が逆転する場合に全く予想外の結果をもたらすことを示している。また、本発明者が、明確に後述されたもの以外のα-グルコシダーゼ基質を試験して失敗に終わったことも留意すべきである。例えば、後述のマルトースとは対照的に、トレハロースは、VREの菌種または菌種群の検出および弁別の点で満足いく結果をもたらさなかった（データは示さず）。
【００１９】
最後に、本発明の枠組みの中で得られた結果は驚くべきかつ予想外であるだけではなく、VanA/VanB VREに対するVanC VRE（逆も同様）の、あるいは他のVRE菌種に対するE. フェカーリス種またはE. フェシウム種の識別的検出が可能になるので、特に有益でもある。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
したがって、本発明の第一の局面は、腸球菌の糖ペプチド耐性菌種である
- 糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属する、E. フェカーリスおよび/またはE. フェシウム；ならびに
- 糖ペプチド耐性のVanC群に属する、E. ガリナルム/E. カセリフラブス
の群の検出および/または識別のための固体培養培地に関し、ここで該培地は、腸球菌に対して選択的な培養培地において、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、ならびに、メチル-α-グルコシドまたはそのポリマーおよびグルコシル-α-グルコシドまたはそのポリマーより選択される少なくとも1種類の呈色反応活性化剤を含む。
【００２１】
固体培地における、本明細書において初めて記載されたものなどの少なくとも1種類の呈色反応活性化剤を伴うα-グルコシダーゼに対する発色基質の使用は特に、追加の試験を行う必要なく、単離の際にVRE菌種または菌種群の弁別が可能である固体培地を開発できるという利点を有する。
【００２２】
本明細書において「メチル-α-グルコシドポリマー」とは、固体細菌培養培地中での使用に適合化され、かつ、（例えば酵素的分解によって）グリコシド結合を切断した後にメチル-α-グルコシドを放出する、オリゴ糖および多糖を指す。そのようなポリマーの典型例は、メチル-α-マルトシドである。
【００２３】
本明細書において「グルコシル-α-グルコシドポリマー」とは、固体細菌培養培地中での使用に適合化され、かつ、（例えば酵素的分解によって）グリコシド結合を切断した後にグルコシル-α-グルコシド（より一般的にはマルトースと呼ばれる）を放出する、オリゴ糖および多糖を指す。
【００２４】
「呈色反応活性化剤」とは、本発明の範囲内において、観察される反応の特質を向上させるための機能を有する化合物である。この化合物は、メチル-α-グルコシドまたはそのポリマーおよびグルコシル-α-グルコシドまたはそのポリマーより選択される。表3に提供する結果が示すように（後述の実施例を参照されたい）、本発明の固体培養培地中の少なくとも1種類の呈色反応活性化剤の存在は、VRE菌種または菌種群の識別的検出に必須である。
【００２５】
したがって本発明は、本発明の選択的固体培地上で発生する可能性のある数千の他のコロニーの存在下であってさえも、VREの呈色コロニーの菌種レベルまたは菌種群レベルでの検出および（有利なことに）同定を可能にする。実際、本発明の培地によって検出されるVREコロニーは特定の色を呈するが、残りの微生物は別の色を示すか無色である。
【００２６】
さらに本発明の枠組みの中で、VREコロニーの検出は、細菌培養後に現像液や特定の光源の使用などの行為または介入を必要としないという意味において、直接的である。
【００２７】
一態様によると、本発明の培養培地は、糖ペプチド耐性のVanC群に属するE. ガリナルム種/E. カセリフラブス種の発色による検出および/または識別のために、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、および、呈色反応活性化剤として少なくとも約10 g/lの濃度で使用されるメチル-α-グルコシドまたはそのポリマーを含む。これらの条件下で、E. ガリナルム/E. カセリフラブスのコロニーの非常に特殊かつ特異的な発色により、弁別が可能になる。発色基質により引き起こされるこの発色は、E. ガリナルム/E. カセリフラブスのコロニーにのみ関連するので、発色特異性の概念となる。
【００２８】
好ましくは、培地中のメチル-α-グルコシドの濃度は少なくとも約20 g/lである。より好ましくは、この濃度は約20 g/lである。
【００２９】
別の態様によると、本発明の培養培地は、糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属するE. フェカーリス種の発色による検出および/または識別のために、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、および、呈色反応活性化剤として少なくとも約0.1 g/lの濃度で使用されるグルコシル-α-グルコシド（マルトース）またはそのポリマーを含む。ここで、E. フェカーリス種の菌株のコロニーのみが、プレート上で発色基質により引き起こされた色となる。
【００３０】
好ましくは、培地中のマルトースの濃度は少なくとも約0.2 g/lである。より好ましくは、この濃度は約0.2 g/lである。
【００３１】
さらに別の態様によると、本発明の培養培地は、糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属するE. フェシウム種の発色が無いことによる検出および/または識別のために、α-グルコシダーゼに対する少なくとも1種類の発色基質、ならびに、呈色反応活性化剤として、少なくとも約10 g/lの濃度で使用されるメチル-α-グルコシドまたはそのポリマーおよび少なくとも約0.1 g/lの濃度で使用されるグルコシル-α-グルコシドまたはそのポリマーを含む。この場合、E. フェカーリス種およびE. ガリナルム種/E. カセリフラブス種の菌株のコロニーは、プレート上で発色基質によって呈色する。E. フェシウムの菌株のコロニーのみがこの基質によって呈色せず、このことは、1種類または複数種類のその他の発色成分が培地に添加されている場合にはE. フェシウムのコロニーが別の色で現れるという条件下で、「発色欠失による」、すなわち、発色基質により引き起こされる発色が無いことによる、条件付き弁別を可能にする。
【００３２】
好ましくは、培地中のメチル-α-グルコシドおよびマルトースの濃度はそれぞれ、少なくとも約20 g/lおよび少なくとも約0.2 g/lである。より好ましくは、これらの濃度はそれぞれ、約20 g/lおよび約0.2 g/lである。
【００３３】
このように、実施される態様によると、本発明の培養培地は、固体培養培地上に存在するコロニーの単一発色、差次的発色、または発色欠失によってVRE菌種または菌種群を容易に識別することを可能にする。
【００３４】
「腸球菌に対する選択的培養培地」には、当業者に公知の、腸球菌に対する多様な選択因子が含まれる。例えばグラム陰性菌の阻害剤により、培養培地の特性を改善することおよびより容易に腸球菌（グラム陽性菌）を単離することが可能になる。
【００３５】
さらに、本発明の培養培地により提供される結果を最適化するために、VREに対して選択的であることが知られている因子を加えることが重要であり得；そのような因子は、VREに対して選択的な固体培養培地を得ることを可能にすると考えられる。好ましくは、VREに対するそのような選択的かつ特異的な培地には、少なくとも1種類の糖ペプチド抗生物質が含まれる。
【００３６】
一態様において、該糖ペプチド抗生物質は、バンコマイシン、テイコプラニン、およびそれらの組合わせより選択される。
【００３７】
好都合には、バンコマイシンは約2 mg/l〜約15 mg/lの濃度で、好ましくは約3 mg/l〜約9 mg/lの濃度で、より好ましくは約4 mg/l〜約8 mg/lの濃度で使用され、特に好ましい値は約6 mg/lである。
【００３８】
テイコプラニンは約0.5 mg/l〜約16 mg/lの濃度で、好ましくは約1 mg/l〜約10 mg/lの濃度で、より好ましくは約2 mg/l〜約8 mg/lの濃度で使用され、特に好ましい値は約5 mg/lである。
【００３９】
当然ながら、当業者は全ての場合において、（当業者の一般的知識に基づき、文献に基づき、かつ/または上述の表2に基づき）本発明の実施に適した糖ペプチドの濃度または濃度範囲を決定しかつ必要ならば試験することができる。
【００４０】
α-グルコシダーゼに対する発色基質は、沈殿可能な発色団（precipitable chromophore）を含むことが好ましく、これは、酵素による基質の加水分解によって放出される。したがって細菌コロニーは、放出された発色団に応じて呈色する。培養培地中に放出された発色団は固体であるので、これはしたがって、それが放出されたコロニーの近傍に残存する。
【００４１】
好ましくは、該発色団は、インドキシル誘導体、ハロゲンインドキシル（ブロモ-インドキシル、クロロ-インドキシル、フルオロ-インドキシル、ヨード-インドキシル、ジクロロ-インドキシル、クロロ-ブロモ-インドキシル、トリ-クロロ-インドキシル）誘導体、メチル-インドキシル誘導体、またはヒドロキシ-キノリン誘導体より選択される。特に好ましい誘導体は、以下の誘導体より選択される：6-クロロ-インドキシル、5-ブロモ-インドキシル、3-ブロモ-インドキシル、6-フルオロ-インドキシル、5-ヨード-インドキシル、4,6-ジクロロ-インドキシル、6,7-ジクロロ-インドキシル、5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル、5-ブロモ-6-クロロ-インドキシル、4,6,7-トリクロロ-インドキシル、N-メチル-インドキシル、および8-ヒドロキシ-キノリン。
【００４２】
より優先的には、α-グルコシダーゼに対する発色基質は、5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル-α-グルコシドである。
【００４３】
発色基質は典型的に、約0.01 g/l〜約0.5 g/lの濃度で使用される。好ましい濃度は約0.1 g/lである。
【００４４】
本発明の培養培地中に存在する発色基質を少なくとも1種類の蛍光発生基質と置き換えるかまたは組み合わせることができることが、明記される。この基質は、α-グルコシダーゼに対する基質と4-メチルウンベリフェリルなどの蛍光体とをカップリングすることによって形成される。
【００４５】
本発明の第二の局面は、腸球菌の糖ペプチド耐性菌種である
- 糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属する、E. フェカーリスおよび/またはE. フェシウム；ならびに
- 糖ペプチド耐性のVanC群に属する、E. ガリナルム/E. カセリフラブス
の群の検出および/または識別のための、上記で定義された培養培地の使用に関する。
【００４６】
本発明の第三の局面は、少なくとも
(a) 該試料またはそれに由来する種菌による、上記で定義された培養培地の接種；
(b) 該培養培地上での、腸球菌の糖ペプチド耐性菌種E. フェカーリス/E. フェシウムおよびE. ガリナルム/E. カセリフラブスの群の存在の検出；ならびに
(c) 任意で、該培養培地上に存在するその他の微生物からの、E. フェカーリス種および/またはE. フェシウム種および/またはE. ガリナルム種/E. カセリフラブス種の弁別
の工程を含むことを特徴とする、
試料中の腸球菌の糖ペプチド耐性菌種である
- 糖ペプチド耐性のVanA/VanB群に属する、E. フェカーリスおよび/またはE. フェシウム；ならびに
- 糖ペプチド耐性のVanC群に属する、E. ガリナルム/E. カセリフラブス
の群の検出および/または識別のための方法に関する。
【００４７】
好都合なことに、本発明の培養培地の使用に先だって、当業者に既知の方法を用いた濃縮工程を実施することができる。特に、1 g/l NaCl（pH 8.6）または3 g/l NaClを含むアルカリペプトン水を使用することができる。
【００４８】
本発明の目的は、上述の記載に限定されない。本発明のその他の態様および利点は、本明細書において単なる例示として提供される以下の実施例より明らかになるであろう。本発明の目的および範囲のどちらも、本実施例により限定されないことは明らかである。
【００４９】
実施例
(a) 固体培養培地の基剤 (g/l):
- ペプトン 10
- 酵母エキス 5 
- 寒天 15
(b) 糖ペプチド:
複数の実験系を実施した：ある系は、腸球菌に対して選択的な培地（糖ペプチド非含有）上で実施し、その他は、6 mg/lのバンコマイシンを含む、VREに対して選択的な培地上で実施した。後述の表3に提供した結果は、全ての系に渡って得られた結果の平均を反映するものである。
(c) その他の成分 (g/l):
後述の表3を参照されたい。
X-α-グルコシド：α-グルコシダーゼに対する発色基質。
【００５０】
以下の表3に提供した結果は、示された培養培地上に細菌を接種し、その後全ての場合において約37℃で約24時間インキュベーションした後に得られたものである。
【００５１】
【表３】
2009542239.tif 000004
+：発色の強度
-：発色なし
【国際調査報告】
2009542239.tif 000005
2009542239.tif 000006
2009542239.tif 000007
2009542239.tif 000008
2009542239.tif 000009
2009542239.tif 000010