(57)【要約】  本発明は、非動物宿主生物において、アルギニン対リジンに対する基質特異性が増大した組換えトリプシンの変異体を産生することに関する。さらに本発明は、組換えトリプシンの変異体及びその産生に関する。また、インスリン前駆体を切断するために組換えブタ膵臓トリプシン変異体を使用すること、及びこのトリプシン変異体を含むキットが提供される。【選択図】  図１
2009507500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の調製方法におけるＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシン変異体の使用。
【請求項２】
インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の調製方法であって、
（ａ）プレプロインスリン、プレプロインスリンアナログ又はプレプロインスリン誘導体は、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンで切断されるものとし、
（ｂ）この得られる切断産物は、分離され、そして
（ａａ）この得られる切断産物のうちの１つが、インスリンアナログ若しくはインスリン誘導体である場合、このインスリンアナログ若しくはインスリン誘導体が得られることになり、又は
（ｃｃ）インスリン、インスリンアナログ若しくはインスリン誘導体の前駆体であるこれらの切断産物はさらにプロセシングされ、そしてこのようなさらなるプロセシングから得られるインスリン、インスリンアナログ若しくはインスリン誘導体が分離されそして得られることになる、
上記方法。
【請求項３】
インスリンがヒトインスリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
インスリンアナログが、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン、Ｂ２８位のプロリンが、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ若しくはＡｌａで置換されており、そしてここでＢ２９位のＬｙｓがＰｒｏで置換され得るヒトインスリン；ＡｌａＢ２６ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２７）ヒトインスリン及びｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンを含む群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
インスリンアナログがインスリングルリジンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インスリンアナログがインスリングラルギンである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
インスリン誘導体が、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイルヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイルヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−ミリストイルＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−パルミトイル−ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−ミリストイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−パルミトイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−パルミトイル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−リトコリル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン及びＢ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）ヒトインスリンを含む群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の前駆体であるこれらの切断産物のさらなるプロセシングが、カルボキシペプチダーゼＢでのこの産物の切断を含むものである、請求項２〜５及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンでの切断が、７.５〜９.５の範囲のｐＨ値；１℃と３０℃との間の温度で行われ、そして酵素反応が、サンプルを酸性化することにより停止されるものである、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
切断が、８.３のｐＨ値；８℃と１２℃との間の温度で行われ、そして酸性化が、１Ｎ又は２Ｎ  ＨＣｌ溶液の添加によって引き起こされるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号３の配列によって特徴付けられるＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシン。
【請求項１２】
Ｓｅｒ１７２ＡｌａブタトリプシンをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号４の配列によって特徴付けられる、請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
Ｓｅｒ１７２ＡｌａブタトリプシノーゲンをコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号６の配列によって特徴付けられる、請求項１４に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１２、１３、１４又は１５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１７】
Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンを産生する方法であって、以下の工程
（ａ）請求項１６に記載のベクターを提供すること、
（ｂ）このベクターで微生物宿主株を形質転換すること、
（ｃ）この形質転換された微生物宿主株を、栄養分を含む増殖培地で培養し、これによってこの微生物宿主株が、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシン又はＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシノーゲンを発現すること、
（ｄ）（ｃ）の発現産物が、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシノーゲンである場合、成熟Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンへ転換すること、並びに
（ｅ）微生物宿主株及び／又は増殖培地からＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンを精製すること、
を含むものである方法。
【請求項１８】
微生物宿主株が、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ種を含む群から選択されるメチロトローフ酵母株である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
微生物宿主株が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａを含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非動物宿主生物において、アルギニン対リジンに対する基質特異性が増大した組換えトリプシンの変異体を産生することに関する。さらに本発明は、組換えトリプシンの変異体及びその産生に関する。また、インスリン前駆体を切断するために組換えブタ膵臓トリプシン変異体を使用すること、及びこのトリプシン変異体を含むキットが提供される。
【背景技術】
【０００２】
トリプシンは、塩基性アミノ酸であるアルギニン及びリジンのカルボキシル基でペプチドの加水分解性切断を触媒するセリンプロテアーゼである（Ｋｅｉｌ  Ｂ．、（１９７１）Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ第ＩＩ巻  第３版、編者Ｂｏｙｅｒ、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ、２４９〜２７５頁）。組換えブタ膵臓トリプシンは、およそ２３,０００ダルトンの分子量を有し、そしてｐＨ８.０で最適な酵素活性を有する。
【０００３】
トリプシンは、インスリン及びインスリンアナログを産生する工業プロセスで使用されている。これらの生体分子の産生は、文献に記載されており、そしていくつかのアプローチが選択されている。経済的な観点から見れば、ヒトインスリン及びインスリンアナログの化学合成は、実行不可能である。従って、インスリン及びインスリンアナログの産生に関して主に２つの方法、すなわち出発物質としてブタインスリンを使用する半合成アプローチ、及び組換えインスリンを発現させるために、遺伝子操作された微生物を使用することが現在存在している。
【０００４】
インスリンは、５１アミノ酸のポリペプチドであり、これは、２つのアミノ酸鎖、すなわち２１アミノ酸を有するＡ鎖及び３０アミノ酸を有するＢ鎖に分けられる。これらの鎖は、２つのジスルフィド架橋によって互いに結合されている。インスリン調製物は、長年糖尿病治療に利用されている。この治療では、天然に存在するインスリンだけが使用されるわけではなく、最近ではまた、インスリンの誘導体及びアナログも利用されている。
【０００５】
インスリンアナログは、天然に存在するインスリン、すなわちヒトインスリン又は動物インスリンのアナログであり、これは、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されるか、そして／又は少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する（そうでなければ同一の）天然に存在するインスリンから付加／除去されることが異なる。この付加及び／又は置換されたアミノ酸残基はまた、天然に存在しないものであり得る。
【０００６】
インスリン誘導体は、天然に存在するインスリン又は化学修飾によって得られるインスリンアナログの誘導体である。この化学修飾は、例えば、１つ又はそれ以上の特定の化学基を１つ又はそれ以上のアミノ酸に付加することからなり得る。
【０００７】
インスリン誘導体の例は、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイルヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイルヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−ミリストイルＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−パルミトイル−ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−ミリストイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−パルミトイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−パルミトイル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−リトコリル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（ω
−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン及びＢ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）ヒトインスリンである。
【０００８】
インスリンアナログは、ＥＰ  ０  ２１４  ８２６、ＥＰ  ０  ３７５  ４３７及びＥＰ  ０  ６７８  ５２２に記載されている。ＥＰ  ０  ２１４  ８２６は、とりわけＢ２７及びＢ２８の置換に関連している。ＥＰ  ０  ６７８  ５２２は、Ｂ２９位に種々のアミノ酸（好ましくはプロリン）を有するがグルタミン酸は有さないインスリンアナログを記載している。
【０００９】
他のインスリンアナログは、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン、Ｂ２８位のプロリンが、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ若しくはＡｌａで置換されており、そしてここでＢ２９位のＬｙｓがＰｒｏで置換され得るヒトインスリン；ＡｌａＢ２６ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２７）ヒトインスリン又はｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンである。
【００１０】
ＥＰ  ０  ３７５  ４３７は、Ｂ２８にリジン又はアルギニンを有するインスリンアナログを含んでおり、これは、場合によりさらにＢ３及び／又はＡ２１で修飾され得るものである。
【００１１】
ＥＰ  ０  ４１９  ５０４において、化学修飾に対して保護されるインスリンアナログが開示されており、これにおいて、Ｂ３のアスパラギン及びＡ５、Ａ１５、Ａ１８又はＡ２１位の少なくとも１つのさらなるアミノ酸が修飾されている。ＷＯ  ９２／００３２１において、Ｂ１〜Ｂ６位の少なくとも１つのアミノ酸が、リジン又はアルギニンで置換されているインスリンアナログが記載されている。
【００１２】
本明細書でさらに議論される重要なインスリンアナログは、「インスリングラルギン」（Ｇｌｙ  Ａ（２１）、Ａｒｇ  Ｂ（３１）、Ａｒｇ  Ｂ（３２）ヒトインスリン）及び「インスリングルリジン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ）」（Ｌｙｓ  Ｂ（３）、Ｇｌｕ  Ｂ（２９）ヒトインスリン）である。
【００１３】
組換えＤＮＡ方法により、インスリン又はインスリンアナログの前駆体、特に、ヒトインスリンとは異なるアミノ酸配列及び／又はアミノ酸鎖長を有するヒトプロインスリン又はプロインスリンを、微生物中で調製することが可能である。遺伝子操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞から調製されたプロインスリンは、正確に結合したシスチン架橋をまったく有さない。Ｅ．ｃｏｌｉを用いてヒトインスリンを得る方法（ＥＰ  ０  ０５５  ９４５）は、以下の方法の工程に基づいている。
【００１４】
微生物の発酵、細胞分離、細胞破壊、インスリン又はインスリンアナログの前駆体の単離、プレプロインスリン（「ＰＰＩ」）を得るために、それぞれのジスルフィド結合を形成することによって所望の（ネイティブの）３次元構造にリフォールディングすること、それぞれのプレプロインスリンのトリプシン切断（おそらくカルボキシペプチダーゼＢの存在下）、基本的な精製、第一のクロマトグラフィー工程、ヒトインスリン又はそれぞれのインスリンアナログを得るための最終的な酵素切断、第二のクロマトグラフィー工程、すなわちＨＰＬＣによる最終精製、結晶化及び乾燥。
【００１５】
プレプロインスリンのトリプシン切断は、酵素反応かつ複合反応である。すなわち、それぞれの産物を得るために、プレ配列及びＣ−ペプチドがこの工程で切り離される。例えば、ヒトインスリン産物の場合、望ましい重要なものは、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−インスリン及びＡｒｇ（Ｂ３１）−インスリン（ＤＥ１９８２１８６６）である。
【００１６】
しかしトリプシン切断は、望ましくない副反応が生じる結果として、多くの副産物の形成を導く。トリプシンは、Ｃ末端でアルギニン（Ａｒｇ）又はリジン（Ｌｙｓ）残基のペプチド結合を切断するエンドプロテアーゼ（セリンタイプ）である。プレプロインスリン分子のトリプシン切断は、同時に異なる切断部位で生じ得る。特定のプレプロインスリン分子内には多くの切断部位があるので、多くの望ましくない副産物が、トリプシン切断反応の間に形成され得る。図１に見られ得るように、切断反応の間に生成される副産物の多くは、Ａｒｇ残基の代わりにＬｙｓのＣ末端側でペプチド結合を切断される結果なのである。
【００１７】
すべてのプレプロインスリンに関して、プレ配列とインスリンＢ鎖との間の切断部位は一塩基である。この接合部で、ただ１つの切断反応が生じ得る。
【００１８】
２つの他の接合部、Ｂ−鎖／Ｃ−ペプチド及びＣ−ペプチド／Ａ−鎖において、異なる切断部位が存在している。ヒトインスリン及びインスリングラルギンの場合、Ｂ−鎖／Ｃ−ペプチドとＣ−ペプチド／Ａ−鎖との間の切断部位は、両方とも二塩基である（それぞれ、Ａｒｇ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｒｇ）。さらに、Ｂ２９−Ｌｙｓの後の切断は、Ｂ３０−ｄｅｓ−Ｔｈｒ（「ｄｅｓ−Ｔｈｒ」）形成を導いている。
【００１９】
ヒトインスリンに関しては、残基Ｂ３１−Ａｒｇ及びＢ３２−Ａｒｇの後のトリプシン切断のみが、Ｂ−鎖／Ｃ−ペプチド接合部、すなわちＢ３１−Ａｒｇインスリン（「モノ−Ａｒｇ」）及びＢ３１−Ａｒｇ、Ｂ３２−Ａｒｇインスリン（「ジ−Ａｒｇ」）として重要な産物を生じる。これらの産物は、「Ａｒｇ−インスリン」として要約され得る。Ｂ３２−Ａｒｇの後の切断は、ジ−Ａｒｇ−インスリンのみが使用され得るので、インスリングラルギンの産生方法で重大である。ヒトインスリン及びインスリングラルギンに関しては、Ｂ２９−Ｌｙｓの後の切断は、ｄｅｓ−Ｔｈｒ形成をもたらす。インスリングルリジンに関しては、この切断部位は一塩基であり、そして可能な産物は、Ａｒｇ含有種である。
【００２０】
Ｃ−ペプチド／Ａ−鎖に関しては、Ａｒｇ残基の後であり、そしてＬｙｓ残基の後ではないトリプシン切断は、重要な産物を得るのに重大である。Ｌｙｓの後での誤った切断は、Ａ０−副産物の形成をもたらす。
【００２１】
当該分野の現状の不都合な点を克服するために、プレプロインスリンの切断プロセスにおいて、例えば図１に示されるように、異なる切断部位に対してＡｒｇ特異性が増大したトリプシン酵素を用いることが望ましい。トリプシン酵素のＡｒｇ特異性を増大させることによって、そしてその結果Ｌｙｓ特異性を減少させることによって、副産物、特にｄｅｓ−Ｔｈｒ及びＡ０−成分の形成が予想され得る。
【００２２】
Ｓｉｃｈｌｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００２）５３０：２２０〜２２４は、ヒトトリプシンにおいて、１９０位（Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．及びＢｏｄｅ，Ｗ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９７８）１１：１１４〜１２２に従ったキモトリプシノーゲンの番号付け）でのアミノ酸交換の影響を調べた。この位置での野生型セリンから突然変異体アラニンへの交換は、人工基質を用いたときに、アルギニンに対する切断部位選択性の増大、及びリジンに対するこの選択性の減少を引き起こすことが見出された。同時に、この突然変異体の酵素活性は、野生型と比較して、およそ２因子減少することが見出された。プレプロインスリンのプロセシングに関して、組換えヒト野生型トリプシン及びヒトトリプシン突然変異体（１９０位でのセリンからアラニンへのアミノ酸交換）を試験すると、両方の酵素に対して多量の副産物の形成が生じ、Ａｒｇ選択性の増大が、プレプロインスリン切断には対応付けされなかったことが明らかにされた（以下の実施例１を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
当該分野の現状を考慮して、解決すべき問題は、タンパク質分解活性を大部分損なわずに、アルギニンに対する切断部位選択性の増大を示すトリプシンの変異体を提供することである。解決すべき別の特定の問題は、例えば図１に示されるように、プレプロインスリンプロセシングの切断部位内のアルギニン残基に対して切断部位選択性が増大したトリプシンの変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
従って、１７２位でセリンからアラニンへとアミノ酸が交換したブタトリプシンの変異体を提供することによって問題は解決する。好ましい実施態様において、ブタトリプシンのＳｅｒ１７２Ａｌａ変異体は、組換え手段によって提供される。驚くべきことに、ブタトリプシンのＳｅｒ１７２Ａｌａ変異体の酵素活性は、野生型酵素と比較して、プレプロインスリンの切断反応がほぼ等しいことが見出された。
【００２５】
Ｓｉｃｈｌｅｒら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００２）５３０：２２０〜２２４）によってヒトトリプシンで試験された１９０位のアミノ酸セリンは、配列番号１で与えられるブタトリプシンの１７２位のセリンに対応している。両方の位置は、トリプシン様セリンプロテアーゼのいわゆるＳ１部位の一部である。
【００２６】
従って、本発明の一実施態様は、インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の調製方法において、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンを使用することである。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の調製方法であり、ここで、
（ａ）プレプロインスリン、プレプロインスリンアナログ又はプレプロインスリン誘導体は、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンで切断されるものとし、
（ｂ）この得られる切断産物は、分離され、そして
（ａａ）この得られる切断産物のうちの１つが、インスリンアナログ若しくはインスリン誘導体である場合、このインスリンアナログ若しくはインスリン誘導体が得られることになり、又は
（ｂｂ）インスリン、インスリンアナログ若しくはインスリン誘導体の前駆体であるこれらの切断産物はさらにプロセシングされ、そしてこのようなさらなるプロセシングから得られるインスリン、インスリンアナログ若しくはインスリン誘導体が分離されそして得られることになり；
ここでインスリンは、好ましくはヒトインスリンであり；そしてインスリンアナログは、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン、Ｂ２８位のプロリンが、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａで置換されており、そしてここでＢ２９位のＬｙｓが、Ｐｒｏで置換され得るヒトインスリン；ＡｌａＢ２６ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインスリン；  ｄｅｓ（Ｂ２７）ヒトインスリン及びｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンを含む群より選択され、そしてインスリン誘導体は、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイルヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイルヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−ミリストイルＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−パルミトイル−ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−ミリストイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−パルミトイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−パルミトイル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−リトコリル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン及びＢ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）ヒトインスリンを含む群より選択されるものとする。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様において、インスリンアナログは、インスリングルリジン又はインスリングラルギンである。
本発明のさらなる実施態様において、インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の前駆体であるこれらの切断産物の上記のさらなるプロセシングは、インスリングラルギンを除くカルボキシペプチダーゼＢでこの産物を切断することを含むものである。
【００２９】
本発明の別の実施態様において、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンでの切断は、７.５〜９.５の範囲のｐＨ値、好ましくは８.３のｐＨ値で、１℃と３０℃との間の温度、より好ましくは８℃と１５℃との間の温度、最も好ましくは８℃の温度で行われるものであり、そしてこの酵素反応は、サンプルを酸性化させることによって、好ましくは１Ｎ又は２Ｎ  ＨＣｌ溶液を添加することによって停止されるものである。
【００３０】
本発明の別の実施態様は、配列番号３の配列、すなわちＳｅｒ１７２ＡｌａブタトリプシンをコードするＤＮＡによって特徴付けられ、好ましくは配列番号４の配列によって特徴付けられるＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンである。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、配列番号６によって特徴付けられるＳｅｒ１７２ＡｌａプレトリプシノーゲンをコードするＤＮＡである。このプレトリプシノーゲンのシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−因子に由来している。
本発明の別の実施態様は、上記のＤＮＡを含むベクターである。
【００３２】
本発明の別の実施態様は、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンを産生する方法であって、次の工程
（ａ）請求項１６に記載のベクターを提供すること、
（ｂ）このベクターで微生物宿主株を形質転換すること、
（ｃ）この形質転換された微生物宿主株を、栄養分を含む増殖培地で培養し、これによってこの微生物宿主株が、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシン又はＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシノーゲンを発現すること、
（ｄ）（ｃ）の発現産物が、Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシノーゲンである場合、成熟Ｓｅｒ１７２Ａｌａブタ（ｐｒｏｃｉｎｅ）トリプシンへ転換すること、並びに
（ｅ）微生物宿主株及び／又は増殖培地からＳｅｒ１７２Ａｌａブタトリプシンを精製すること、
を含むものであり、特にここで、微生物宿主株は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ種を含む群より選択されるメチロトローフ酵母株であり；好ましくはここで、微生物宿主株は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａを含む群より選択されるものとする。
【００３３】
本明細書において、用語「ブタトリプシン変異体」及び「ブタトリプシンの変異体」は、配列番号１の１７２位でのアミノ酸置換によって生成する、変異体であるタンパク質、すなわち成熟ブタ膵臓トリプシンタンパク質アイソフォームＩの対立形質を表している。
【００３４】
本明細書で記載されるブタトリプシン変異体を簡単明瞭に命名することを目的として、数字は、配列番号１で与えられる成熟ブタ膵臓トリプシンのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基／位置を基準にしている点に注目しなければならない。アミノ酸識別は、アミノ酸の３文字略語、及び１文字アルファベット、すなわちＡｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸、Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン、Ｔｈｒ  Ｔ  スレオニン、Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン、Ｓｅｒ  Ｓ  セリン、Ｔｙｒ  Ｙ  チロシン、Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸、Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン、Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン、Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン、Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン、Ｌｙｓ  Ｋ  リジン、Ａｌａ  Ａ  アラニン、Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン、Ｃｙｓ  Ｃ  システイン、Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン、Ｖａｌ  Ｖ  バリン、Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン、Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン、Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギンを用いている。アミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸は、その３文字略語及び数字で与えられる。従って、Ｓｅｒ１７２は、配列番号１のアミノ酸１７２位のセリン残基を表している。異なるアミノ酸による置換は、位置を示す数字の後に付加される３文字略語として与えられる。例えば、「Ｓｅｒ１７２Ａｌａ」は、配列番号３の１７２位のＳｅｒがＡｌａで置換されることを表している。
【００３５】
用語トリプシン変異体の「切断部位選択性の増大」は、加水分解性切断に対する特異性が変化することであって、この変異体にとっては、この変化が、リジンよりもアルギニンのカルボキシル基で好ましく切断されることを導くものであることを表している。
トリプシン活性が定量化されると、本明細書では「単位」（Ｕ）を適用する。トリプシン及びその変異体のタンパク質分解活性は、基質としてＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＲＹ、Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＨ及びＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＰＬ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を使用した測光アッセイを用いて定量化される。与えられた調製物の「タンパク質分解比活性」又は「比活性」は、調製物中のタンパク質１ｍｇ当たりの単位数として定義され、実施例９に記載される方法によって測定される。
【００３６】
「メチロトローフ酵母」は、メタノールを炭素源として利用し得る酵母として定義される。この用語はまた、その実験株も含んでいる。メチロトローフ酵母株が栄養要求性であり、そしてこのため、例えば、メチロトローフ酵母株がこのアミノ酸を十分な量合成できない場合には、例えばヒスチジンのような補助的な（ａｕｘｉｌｌａｒｙ）炭素含有物質の補充が必要であり、この補助物質は栄養分とみなされ、炭素源とはみなされない。
「ベクター」は、本発明のＤＮＡフラグメントを含み得る、すなわち保有及び維持し得るＤＮＡとして定義され、例えばファージ及びプラスミドが挙げられる。これらの用語は、遺伝子工学分野の当業者に理解されている。用語「発現カセット」は、プロモーター及びターミネーターに作動可能に連結した、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を表している。発現カセットを含むベクターに関しては、用語「ベクター」及び「発現ベクター」は、同義語として使用される。
【００３７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、１００未満のヌクレオチド長の核酸分子、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）に対して使用される。
「形質転換」は、ＤＮＡを生物、すなわち宿主生物に導入して、その結果このＤＮＡが、染色体外エレメントとして、又は染色体への組込みのいずれかによって複製可能なことを意味している。
【００３８】
用語「発現」及び動詞「発現する」は、プレタンパク質をもたらす宿主生物中でのＤＮＡ配列の転写及び／又は転写されたｍＲＮＡの翻訳を表すものであり、すなわち翻訳後プロセスは含まれない。
核酸又はそのその相補体の少なくとも一部分が直接翻訳されて、ペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列をもたらし得るか、又はこの単離核酸が、単独若しくは発現ベクターの一部として使用されて、インビトロ、原核生物宿主細胞内若しくは真核生物宿主細胞内でこのペプチド若しくはタンパク質を発現し得るときに、ヌクレオチド配列は、ペプチド又はタンパク質を「コードしている」。
「プロモーター」は、転写を刺激する調節ヌクレオチド配列である。これらの用語は、遺伝子工学分野の当業者に理解されている。プロモーターと同様に、「プロモーターエレメント」は、転写を刺激するが、より長いプロモーター配列のサブフラグメントを構成される。
【００３９】
用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方によって影響を受けるように、１つのベクターに対して２つ又はそれ以上の核酸フラグメントが結合することをいう。例えば、プロモーターが、このコード配列、すなわちこのコード配列が、プロモーターの転写制御下にあるとき、に影響を及ぼし得るとき、コード配列に、すなわちタンパク質又はプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列プロモーターは、作動可能に連結されている。
【００４０】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって結合した９０を超えるアミノ酸モノマーから成るポリマーを表している。用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合した９０以下のアミノ酸モノマーから成るオリゴマーを表している。「ペプチド結合」は、一方のアミノ酸のα−アミノ基が他方のアミノ酸のα−カルボキシル基に結合した２つのアミノ酸間の共有結合である。
【００４１】
用語「プロタンパク質」、「プロタンパク質形態」、「チモーゲン」、「トリプシノーゲン」、「プレタンパク質」又は「プレプロタンパク質」は、成熟タンパク質の前駆体である一次翻訳産物を表しており、すなわちこの場合、タンパク質は、プレタンパク質の翻訳後プロセシングから得られる。
【００４２】
用語「翻訳後プロセシング」は、細胞区画又は細胞外区画に成熟タンパク質を生じさせるために、プレタンパク質又はプレプロタンパク質が受ける修飾工程を表している。
「シグナルペプチド」は、分泌タンパク質のプレタンパク質形態又はプレプロタンパク質形態で存在しているアミノ酸の切断可能なシグナル配列である。細胞膜を横切って輸送される、すなわち「分泌される」タンパク質は、代表的には、疎水性アミノ酸が豊富なＮ末端配列を有しており、代表的には、およそ１５〜３０アミノ酸長である。膜を通過するプロセスの間のある時に、このシグナル配列は、シグナルペプチダーゼによって切断される（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ.、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ.、Ｌｅｗｉｓ，Ｊ.、Ｒａｆｆ，Ｍ.、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ.、Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ.（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、２００２、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。シグナルペプチドの多くの供給源は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドのアミノ酸配列などが挙げられ得る。別の例は、配列番号５の１〜１６位のネイティブブタ膵臓トリプシノーゲンプレタンパク質のブタシグナルペプチドである。一般に、本質的にどのような分泌タンパク質のプレタンパク質のＮ末端でも、本発明の使用に好適なシグナルペプチドの可能性のある供給源なのである。シグナルペプチドはまた、二分性（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）であり得るものであり、プレタンパク質を第一の細胞区画及び第二の細胞区画に導く２つのシグナルペプチドを含んでいる。二分性のシグナルペプチドは、分泌経路の経過の間に、段階的に切り離される。従って特定の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子のプレプロペプチドである（Ｗａｔｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）６２０９〜１４）。
【００４３】
Ｎ末端シグナルペプチドを有するプレタンパク質は、「分泌経路」に入るように導かれている。この分泌経路は、翻訳後プロセシングのプロセスを含んでおり、そして最終的に、タンパク質の分泌をもたらす。グリコシル化及びジスルフィド結合の形成は、分泌される前の分泌経路の一部であるプロセスである。本明細書において、メチロトローフ酵母株によって分泌されるタンパク質は、この分泌経路を通ることを理解すべきである。
【００４４】
すべてのトリプシン様セリンプロテアーゼは、塩基性残基であるリジン又はアルギニンに対する基質優先性を共有している。ヒト膵臓トリプシンの１９０位に対応するセリンでのアミノ酸交換突然変異は、人工基質に関しては特異性を望ましく変化させるが、タンパク質分解活性は、結果として減少する。
【００４５】
さらに、ヒトトリプシン突然変異体の評価は、人工基質を用いたアルギニン残基に対する観察された特異性の変化が、プレプロインスリンプロセシングに対応付けられなかったことを明らかにした。実施例１は、ヒトセリン１９０アラニントリプシン突然変異体を用いたプレプロインスリンの転換を例示している。多量の副産物、主にＢ３０−ｄｅｓ−Ｔｈｒ−及びＡ０−成分が、反応の間に形成されている。
【００４６】
どの程度この効果がすべてのトリプシン様セリンプロテアーゼに等しく適用されるかは示されていない。この疑問を明らかにする一つの方法は、Ｓｅｒ−Ａｌａ交換突然変異を、他の哺乳動物トリプシン種のアミノ酸配列に、ヒト膵臓トリプシンアイソタイプＩの１９０位に対応するそれぞれのポリペプチド配列内の部位に導入することである。これを行うことにより、本発明者らは、驚くべきことに、ブタ膵臓トリプシンでのこのような交換突然変異が、プレプロインスリンプロセシングにおいてアルギニンに対する切断部位選択性を増大させ、そして同時に、より高いレベルのタンパク質分解活性を維持することを見出した。
【００４７】
当業者は、タンパク質中で１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を置換する方法を熟知している。実施例２は、アミノ酸交換突然変異体をコードＤＮＡ配列レベルで操作し得る方法を例示している。しかし、他の方法が可能である。本発明において、配列番号４で与えられるブタ膵臓トリプシンのＳｅｒ１７２Ａｌａ突然変異体をコードする合成ヌクレオチド配列を、微生物宿主生物中で発現させた。
【００４８】
このトリプシン変異体は、好ましくは、微生物宿主生物、例えば細菌及び真菌中で異種タンパク質として産生されるものである。当業者は、種々の原核生物宿主、例えばいくつか挙げると、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種として存在する細菌発現系を熟知している。なおより好ましい微生物宿主生物は真菌である。好ましい真菌属の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである。しかしなおより好ましくは、酵母種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種である。しかしなおより好ましくは、メチロトローフ酵母種の株である。
【００４９】
メチロトローフ酵母は、メタノール利用に必要な生化学的経路を有しており、そして細胞形態及び増殖特性に基づいて４つの属、すなわちＨａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓに分類されている。最も高度に発生したメチロトローフ宿主系は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）を利用する。
【００５０】
酵母での異種タンパク質の発現は、ＵＳ  ５,６１８,６７６、ＵＳ  ５,８５４,０１８、ＵＳ  ５,８５６,１２３及びＵＳ  ５,９１９,６５１に記載されている。
【００５１】
酵母生物は、細胞内で合成されるが、細胞外で機能を有する多くのタンパク質を産生する。これらの細胞外タンパク質は、分泌タンパク質といわれる。最初にこの分泌タンパク質は、発現された産物が小胞体の膜を横切って細胞の分泌経路に有効に向かうことを確実にするＮ末端シグナルペプチドを含む前駆体、プレタンパク質又はプレプロタンパク質の形態で細胞内で発現される。このシグナルペプチドは、一般に、トランスロケーションの間に所望の産物から切り離される。切断は、シグナルペプチダーゼによるタンパク質分解によって行われる。シグナルペプチドのアミノ酸の特定のサブ配列が認識され、そしてシグナルペプチダーゼによって切断される。このサブ配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位といわれる。一旦分泌経路に入ると、タンパク質は、ゴルジ装置に輸送される。ゴルジ装置から、タンパク質は、細胞膜、リソソーム及び分泌小胞に分配される。
【００５２】
分泌タンパク質は、細胞内タンパク質とは対照的に、異なる環境状態に直面する。分泌経路のプロセスの一部は、成熟した細胞外タンパク質を安定化することである。従って、酵母の分泌経路を通るプレタンパク質は、特定の翻訳後プロセシングを受ける。例えば、プロセシングは、分子内架橋を形成するジスルフィド結合の生成を含み得る。さらに、タンパク質の特定のアミノ酸は、グリコシル化され得る。
【００５３】
酵母とは異種のタンパク質を酵母中で発現及び分泌させるいくつかのアプローチが提案されている。ＥＰ  ０  １１６  ２０１は、酵母とは異種のタンパク質が、所望のタンパク質、シグナルペプチド及びシグナルペプチダーゼ切断部位として作用するペプチドをコードするＤＮＡを内部に有する発現ベクターによって形質転換されるプロセスを記載している。形質転換された生物の培養物が調製及び増殖され、そしてこのタンパク質が、培養基から回収される。酵母細胞での使用に好適なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドであることが見出されている（ＵＳ  ４,８７０,００８）。
【００５４】
酵母酵素ＫＥＸ−２は、分泌の間にプレタンパク質のリジン−アルギニン配列をその切断部位として認識するシグナルペプチダーゼである。ＫＥＸ−２は、接合部で所望のタンパク質の配列に切断する。結果として、この所望の遺伝子産物が放出され、リーダー部分、すなわちプレタンパク質のシグナルペプチドは含まれないのである。ＫＥＸ−２エンドプロテアーゼを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母で最初に特徴付けし、ここでこの酵素は、接合型α−因子及びキラー因子の前駆体を特異的にプロセシングしている（Ｊｕｌｉｕｓ，Ｄ.ら、Ｃｅｌｌ  ３７（１９８４）１０７５〜１０８９）。メチロトローフ酵母種、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＫＥＸ−２型プロテアーゼ（類似の役割及び機能）を共有している（Ｗｅｒｔｅｎ，Ｍ．Ｗ.ら、Ｙｅａｓｔ  １５（１９９９）１０８７〜１０９６）。
【００５５】
高レベルの組換えタンパク質発現のための宿主として例示的に記載される確立したメチロトローフ酵母種は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである（ＵＳ  ４,６８３,２９３、ＵＳ  ４,８０８,５３７、ＵＳ  ４,８１２,４０５、ＵＳ  ４,８１８,７００、ＵＳ  ４,８３７,１４８、ＵＳ  ４,８５５,２３１、ＵＳ  ４,８５７,４６７、ＵＳ  ４,８７９,２３１、ＵＳ  ４,８８２,２７９、ＵＳ  ４,８８５,２４２、ＵＳ  ４,８９５,８００、ＵＳ  ４,９２９,５５５、ＵＳ  ５,００２,８７６、ＵＳ  ５,００４,６８８、ＵＳ
５,０３２,５１６、ＵＳ  ５,１２２,４６５、ＵＳ  ５,１３５,８６８、ＵＳ  ５,１６６,３２９、ＷＯ  ００／５６９０３）。グルコースが存在しないとき、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、炭素源としてメタノールを用いており、これは同時に、メチロトローフ生物の特徴である。配列番号７で与えられるアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターは、アルコールオキシダーゼの発現を制御しており、これは、メタノール代謝の最初の工程を触媒している。代表的には、メタノール誘導性細胞の可溶性タンパク質全体の３０％が、アルコールオキシダーゼである。いくつかのＰｉｃｈｉａ発現ベクターは、ＡＯＸ１プロモーターを保有し、そしてメタノールを使用して、所望の異種タンパク質の高レベル発現を誘導している。発現構築物はまた、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに組み込まれて、形質転換され、そして遺伝的に安定な宿主を生成する。
【００５６】
シグナルペプチドすなわちシグナルペプチダーゼ切断部位を有するシグナルペプチド及び所望のタンパク質を含む異種プレタンパク質をコードする発現ベクターを用いて、メチロトローフ酵母株、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、増殖培地に所望の産物を分泌するように操作され得るものであり、この培地から分泌タンパク質が精製され得る。
【００５７】
実質的に異なるコドン使用頻度を有するプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を産生することが有利であり得る。コドンは、特定のコドンが宿主に利用される頻度に従って、プレタンパク質の発現が特定の酵母発現宿主内で生じる割合を増大させるように選択され得る。コードアミノ酸配列を改変せずに、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する他の理由としては、天然に存在する配列から産生される転写産物よりも望ましい性質、例えばより長い半減期を有するＲＮＡ転写産物を産生するためであることが挙げられる。
【００５８】
実施例３は、トリプシン変異体をコードする発現ベクターを得るためのクローニング工程を例示している。発現能力のある（例えばプロモーター又はプロモーターエレメント、及びターミネーター又はターミネーターエレメント、並びに効率的な翻訳に不可欠な配列に作動可能に連結した）プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを用いて、宿主生物はこのベクターで形質転換され、そして形質転換体が選択される。
【００５９】
一方発現収率は、シグナルペプチド、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチド又はネイティブブタ膵臓トリプシノーゲンのブタシグナルペプチドによって、所望の産物を例えば分泌経路に適切に向けることに左右される。実施例４は、形質転換された微生物宿主を与え、そして実施例５は、トリプシン変異体の発現を達成し得る方法を示している。従って、一次翻訳産物は、ポリペプチドを分泌経路に導くシグナルペプチドを含んでいる。実施例６は、形質転換されたメチロトローフ酵母の上清のトリプシン活性の測定を例示している。
【００６０】
一方発現収率は、所望の産物をコードする遺伝子の用量を増大させることによって増大され得る。従って、宿主生物中の発現構築物のコピー数、すなわち発現ベクター又は発現カセットが増幅されるのである。これを達成する一つの方法は、所望の産物をコードする発現ベクターを多重形質転換することによる。別の方法は、第一及び第二の発現ベクターを用いて、宿主生物に所望の産物をコードする遺伝子を導入することであり、ここで第二の発現ベクターは、第一の発現ベクターに使用される選択可能なマーカーとは異なる選択可能なマーカーに基づくものである。同じ所望の産物をコードする第二の発現ベクターは、宿主生物が第一の発現ベクターの複数のコピーをすでに保有しているときでさえも導入され得る（ＵＳ  ５,３２４,６３９；Ｔｈｉｌｌ，Ｇ．Ｐ.ら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ２（１９９０）４７７〜４９０頁；Ｖｅｄｖｉｃｋ，Ｔ.ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１９９１）１９７〜２０１；Ｗｅｒｔｅｎ，Ｍ．Ｗ.ら、Ｙｅａｓｔ  １５（１９９９）１０８７〜１０９６）。実施例７は、トリプシン変異体の発現収率が、工業規模での産生として酵母クローンを与えるために増大され得る方法を記載している。
【００６１】
形質転換体は、増殖培地に分泌される組換えタンパク質の収率を基準にして繰り返し分析される。酵素的に活性な組換えタンパク質を最も多量に分泌する形質転換体が選択される。
増殖培地へのブタトリプシン変異体の分泌は、増殖培地中に拡散する細胞質外空間に成熟組換えタンパク質を導くことである。液体培養液中で増殖した形質転換されたメチロトローフ酵母は、組換えブタ膵臓トリプシン変異体を液体増殖培地、すなわち液体培養基に分泌する。これにより、例えば濾過技術を用いて、酵母バイオマスと組換えタンパク質とを極めて効率的に分離し得る。結果として、この供給源から精製された組換えブタトリプシン変異体は、他の酵素活性、例えばリボヌクレアーゼ活性又は他の（非トリプシン）プロテアーゼ活性と極めて効率的に分けられる。
【００６２】
従って、本発明の第一に好ましい実施態様は、ブタ膵臓トリプシンアイソタイプＩのアミノ酸置換による変異体であり、ここで、配列番号１のブタ膵臓トリプシンアイソタイプＩのＮ末端から数えて１７２位のアミノ酸セリンは、アミノ酸残基アラニンで置換されて、トリプシン活性を有するブタ膵臓トリプシン変異体を形成する。
【００６３】
好ましくは、ブタ膵臓トリプシンの変異体は、アミノ酸リジンのカルボキシル基での加水分解性切断よりも、アミノ酸アルギニンのカルボキシル基での加水分解性切断に対する切断部位選択性が増大している。
【００６４】
より好ましくは、この単離された変異体は、インスリン前駆体ポリペプチド又はそのアナログが基質として使用されるときに、この選択性の増大を示すものである。
【００６５】
本発明のなお別の好ましい実施態様において、ブタトリプシン変異体の特異的なタンパク質分解活性は、野生型ブタ膵臓トリプシンと比較して１００％である。従って、等しい条件下で産生及び精製されるとき、この組換えブタ膵臓トリプシン変異体の特異的なトリプシン活性は、元のままのブタ膵臓トリプシン、すなわち野生型形態と比較して１００％である。
【００６６】
本発明の別の好ましい実施態様は、ブタ膵臓トリプシンの変異体を産生する方法であり、以下の工程（ａ）ブタ膵臓トリプシンの変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供すること、（ｂ）このベクターで微生物宿主株を形質転換すること、（ｃ）栄養分を含む増殖培地中で、形質転換された微生物宿主株を培養し、これによって、この微生物宿主株に、組換えブタ膵臓トリプシンの変異体を発現させること、並びに（ｄ）微生物宿主株及び／又は増殖培地から、この組換えブタ膵臓トリプシンの変異体を精製することを含むものである。
【００６７】
異種タンパク質の翻訳効率は、宿主生物の好ましいコドンに従って、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドンを適応させることによって改善され得る。従って、本発明の好ましい実施態様において、組換えブタ膵臓トリプシンの変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４である。
【００６８】
本発明のなおより好ましい実施態様において、（ａ）ベクターは、配列番号６で与えられるように、組換えブタ膵臓トリプシノーゲン及びシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、（ｂ）微生物宿主株は、メチロトローフ酵母株であり、（ｃ）増殖培地は、炭素源としてメタノールを含んでおり、（ｄ）メチロトローフ酵母株は、組換えブタ膵臓トリプシンの変異体を発現及び分泌するものであり、そして（ｅ）ブタ膵臓トリプシンの変異体は、増殖培地から精製されるものである。
【００６９】
特に言及されない限り、酵母由来の及び非酵母由来の真核生物シグナルペプチドは、同じ目的で使用され得る。シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによって切断可能ではないかもしれないが、シグナルペプチダーゼ切断ペプチドは、プレタンパク質のアミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドのアミノ酸配列と変異体の組換えブタ膵臓トリプシンポリペプチドのアミノ酸配列との間に挿入され得る。従って、本発明のなお別の極めてより好ましい実施態様において、シグナルペプチドは、組換えブタ膵臓トリプシノーゲンの最初（Ｎ末端）のアミノ酸に隣接して位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含んでいる。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施態様において、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーター又はプロモーターエレメントに作動可能に連結される。ベクターは、メチロトローフ酵母株内のエピソームとして複製され得るプラスミドであることが好ましい。メチロトローフ酵母株内で複製され得る人工染色体がベクターを含むことがさらに好ましい。しかし、メチロトローフ酵母株の染色体が、組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）としてベクターを含むことが最も好ましい。
【００７１】
従って、メチロトローフ酵母株及び特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を用いる好ましい方法において、ベクターは、分泌経路に入るブタ膵臓トリプシノーゲンプレタンパク質の変異体のアミノ酸配列をコードしている。
【００７２】
本発明のさらに好ましい実施態様において、メチロトローフ酵母株は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ又はＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ種である。メチロトローフ酵母株が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａからなる群より選択されることが極めて好ましい。メチロトローフ酵母株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号７６２７３のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株又はその誘導体であることがなおより好ましい。
【００７３】
本発明の別の好ましい実施態様は、配列番号７のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーター又はそのプロモーターエレメントと作動可能に連結した、組換えブタ膵臓トリプシンの変異体及びシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含んだ染色体を有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株である。
【００７４】
当業者は、増殖培地、例えば液体増殖培地から得られ得る分泌異種タンパク質、例えばブタ膵臓トリプシンの変異体の収率は、この異種タンパク質が発現及び分泌されるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコピー数が増大されると増大され得るという事実を認識している。従って、増殖培地から得られ得る分泌異種タンパク質の収率は、メチロトローフ酵母株のゲノム中のベクターのコピー数が増大されると増大され得るのである。例えば、ベクターのコピー数は、ベクターに含まれる選択マーカーが耐性を与える選択因子の濃度増大を用いて、ベクターを繰り返し形質転換し、そして繰り返し選択するというラウンドにメチロトローフ酵母株を供することによって増大され得る（ＵＳ  ５,３２４,６３９；Ｔｈｉｌｌ，Ｇ．Ｐ.ら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ２（１９９０）、４７７〜４９０頁；Ｖｅｄｖｉｃｋ，Ｔ.ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１９９１）１９７〜２０１）。
【００７５】
選択マーカーの例は、Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子、すなわちＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子である（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ，Ｄ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１９９０）４００９；Ｃａｒｍｅｌｓ，Ｔ.ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２０（１９９１）３０９〜３１４）。Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）に化学量論的かつ高い親和性で結合する。Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）の結合は、有毒な活性を阻害し、それによってＳｈ  ｂｌｅ遺伝子を含む形質転換体を選択するのである。培地中の選択因子としてＺｅｏｃｉｎ（登録商標）の濃度を増大させることにより、Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子を発現するベクターのコピー数の増大を選択することを当業者なら知っているはずである。従って、多コピーのベクターを含むメチロトローフ酵母株の多重形質転換体を繰り返し形質転換することによって生成される選択可能なマーカーとしてＳｈ  ｂｌｅ遺伝子を有するベクターを用いることが有利なのである。形質転換さ
れたメチロトローフ酵母株に対して、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）に対する耐性レベルのさらなる増大がこれ以上得られないか、又は選択培地中のＺｅｏｃｉｎ（登録商標）濃度のさらなる増大がこれ以上は不可能になるまで、形質転換を反復し、そしてなおより耐性の形質転換体の選択を反復することがさらに有利である。
【００７６】
当業者は、組換え発現され、そして分泌されたブタ膵臓トリプシンをクロマトグラフィーによって精製することに精通している（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ａ.ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）８８（１９８０）１１１３〜１１３８；Ｐａｕｄｅｌ，Ｈ．Ｋ.及びＬｉａｏ，Ｔ．Ｈ.、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６１（１９８６）１６００６〜１６０１１；Ｎｅｆｓｋｙ，Ｂ.及びＢｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ａ.、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９（１９８９）２１５〜２１９）。増殖培地中のブタ膵臓トリプシノーゲンの変異体が、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製されることが好ましい。精製産物に導く後処理プロセスの工程は、実施例８に記載されている。野生型ブタ膵臓トリプシンアイソフォームＩの産生を、野生型コード配列を発現ベクターを構築するために使用することを除いては同様に行った。
【００７７】
しかし、本発明の別の好ましい実施態様は、上記の方法のうちの１つによるブタ膵臓トリプシンアイソタイプＩの変異体である。本発明の別の実施態様は、プレプロインスリンプロセシングのためにブタ膵臓トリプシンの変異体を使用することである。異なるプレプロインスリンを酵素切断するために、ブタトリプシンのＳｅｒ１７２Ａｌａ変異体を使用する利点は、実施例１０〜１２に記載されている。以下の実施例、参考文献、配列表及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の正確な範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。この示された方法において、本発明の趣旨を逸脱することなく変更が行われ得ることが理解されるべきである。
【００７８】
一般に、以下の実施例において、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎマニュアル「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」バージョンＭ  ０１１１０２  ２５−００４３、「ｐＰＩＣＺＡ、Ｂ及びＣ」バージョンＤ  １１０８０１  ２５−０１４８、「ｐＰＩＣＺαＡ、Ｂ及びＣ」バージョンＥ  ０１０３０２  ２５−０１５０、及び「ｐＰＩＣ９Ｋ」バージョンＥ  ０３０４０２  ２５−０１０６に提案及び記載されている方法を適用した。このマニュアルで言及されるさらなるベクター、酵母株及び培地に対する参照もまた行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、２００１に記載されるような分子生物学の基本的方法を適用した。
【００７９】
ＨＰＬＣ方法：
固定相：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０−５  Ｃ１８、Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ、２５０×４ｍｍ；移動相Ａ：４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２.５）、３１５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；移動相Ｂ：４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２.５）、５５ｍＭ  ＮａＣｌ、６５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；勾配：３０分以内で６％相Ｂ〜１０％相Ｂの直線。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本発明を限定することなく本発明を例示することが意図される。
実施例１：組換えヒト野生型トリプシン及びセリン１９０アラニンヒトトリプシン変異体を用いた、プレプロインスリングラルギンの切断
これらの実験を、８℃及びｐＨ値８.３（緩衝化溶液）で行い、そして５０ｍＬスケールまでで行った。
ＰＰＩ溶液を、適切なサーモスタット反応容器に満たし、そして酵素調製物を添加することにより反応を開始させた。一定の時間間隔後にサンプルを採取した。１Ｎ又は２Ｎ  
ＨＣｌ溶液によってサンプル溶液を酸性化することにより、酵素反応を直ちに停止させた。それぞれの産物の濃度を、ＨＰＬＣによって測定した。
【００８１】
実施例２：ブタ膵臓トリプシノーゲンをコードする合成ヌクレオチド配列の突然変異誘発
一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、２００１に記載されるような分子生物学の標準的方法を適用した。以下に説明される方法は、「部位特異的突然変異誘発」としてまた公知の極めて一般的な方法の具体的な適用である。
突然変異を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて部位特異的様式で生成した。所望のコドン、すなわち塩基トリプレットを突然変異させるために、ブタ膵臓トリプシノーゲンをコードする合成ヌクレオチド配列の変異体部分を表す相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド対を設計及び合成した。この一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、突然変異されるトリプレット配列を除いては、配列番号２で与えられる配列と同一又は相補的であった。代表的には、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、およそ２０〜４５のヌクレオチド長を有し、突然変異されるトリプレット配列又はその相補体は、それを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの中央部分に位置し、そして両側がおよそ１０〜１２ヌクレオチド隣接していた。このＤＮＡオリゴヌクレオチドを、「野生型」組換えブタ膵臓トリプシノーゲンＤＮＡ（配列番号２）とのＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが、中央のミスマッチとのハイブリッドをもたらすが、このミスマッチの側面のインタクトな塩基対合（各ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端を含む）とはハイブリッドを生じないように設計した。
【００８２】
さらに、第一のプライマーは、配列番号２の５’末端の９ヌクレオチドを含む「５’トリプシン」（配列番号８）と命名され、そして第二のプライマーは、配列番号２の３’末端の１２ヌクレオチドに相補的な配列を含む「３’トリプシン」（配列番号９）と命名された２つの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを提供した。この２つのプライマーを、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むように設計した。従って、第一及び第二のプライマーを伸長し、そして配列番号２の合成ヌクレオチド配列の側面に位置した隣接配列を含めた。「５’トリプシン」は、ＥｃｏＲＩ及び３’Ｘｂａ  Ｉ部位を含んだ。
野生型成熟ブタ膵臓トリプシンタンパク質のアミノ酸置換による変異体をコードするヌクレオチド配列を、いくつかのＰＣＲに基づいた工程によって合成した。
【００８３】
第一及び第二のＰＣＲを、ベクター中の挿入物として存在した配列番号２のヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて行った。この挿入物に隣接するベクター配列は、従って、ＰＣＲの間に、アニーリングされると完全にマッチするプライマー「５’トリプシン」及び「３’トリプシン」であった。第一のＰＣＲを、「５’トリプシン」プライマー及び突然変異した、すなわち変異体トリプレット配列を含む第一の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いて行い、これによってこの２つのプライマーは、反対の鋳型ＤＮＡ鎖にアニーリングした。従って第二のＰＣＲを、「３’トリプシン」プライマー及び第一の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な第二の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて行った。結果として、第一及び第二のＰＣＲは、次の２つの中間産物を生成した：すなわち、組換えブタ膵臓トリプシンの変異体をコードするヌクレオチド配列の５’及び３’部分であって、これにより、５’部分は、その３’末端に突然変異した配列を保有し、そして逆に、３’部分は、その５’末端に突然変異した配列を保有した。
得られる２つの中間増幅産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、所望のフラグメントを切り出し、そして「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）を用いて、アガロースブロックからＤＮＡを単離した。
【００８４】
続いて第三のＰＣＲを、２つの部分を融合するために行った。この目的のために、２つの部分を１回のＰＣＲで結合させ、そしていかなる上流及び下流のプライマーをもさらに添加せずに５回のＰＣＲサイクルを行った。これらのサイクルの間、いくつかの全長産物が形成され、これによって、使用したアニーリング温度を、５’部分及び３’部分の重複配列について計算した。その後、プライマー「５’トリプシン」及び「３’トリプシン」を添加し、そして２５回以上のＰＣＲサイクルを行い、ここで使用したアニーリング温度は、添加されたプライマーに対応しており、より低い融点を有した。
続いて、突然変異した全長ＤＮＡフラグメントを、「ＰＣＲクローニングキット−平滑末端」（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ；カタログ番号１  ９３９  ６４５）を用いてクローニングベクターに挿入した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素分析及び配列決定によって確認した。次いで、確認したＤＮＡフラグメントを、Ｘｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉでの切断によって切り出し、そして同じ制限酵素で切断したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターに挿入した（実施例３及び実施例５を参照のこと）。
Ｓｅｒ１７２Ａｌａ：配列番号２の５２８〜５３１位に見出される塩基トリプレット「ＴＣＴ」を、「ＧＣＴ」で置換した。この目的のために、第一のＰＣＲにおいて、ＤＮＡオリゴヌクレオチド「５’−Ｔｒｙ−Ｓｅｒ１７２Ａｌａ」（配列番号１０）を、「３’−トリプシン」と組み合わせてプライマーとして使用し、そして第二のＰＣＲにおいて、「３’−Ｔｒｙ−Ｓｅｒ１７２Ａｌａ」（配列番号１１）を、「５’−トリプシン」と組み合わせてプライマーとして使用した。続いて、全長産物を生成するために、単離された中間フラグメントを第三のＰＣＲに使用した。
【００８５】
実施例３：ｐＰＩＣＺαＡ由来の発現ベクター中での変異体組換えブタ膵臓トリプシノーゲンをコードする人工ＤＮＡのクローニング
ＰＣＲフラグメントから生成された変異体組換えブタ膵臓トリプシノーゲンをコードするＤＮＡフラグメント（実施例２を参照のこと）を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で切り出した。このフラグメントを、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて、製造業者の指示書に従って単離した。
このフラグメントを、ｐＰＩＣＺαＡベクターに連結し、それによって、変異体組換えブタ膵臓トリプシノーゲンをコードするヌクレオチド配列を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に融合させた。連結反応の前に、ベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで同様に切断し、そして単離した。
このクローニング方法により、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の後に、直接及びインフレームで、変異体組換えブタ膵臓トリプシノーゲンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。
配列番号６で与えられる組換えプレプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいては、メタノールにより誘導性のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ−１プロモーター（配列番号７）の制御下に置いた。
【００８６】
製造業者の指示書に従って、線状化ベクターフラグメント２０ｎｇ（１μｌ容量）、切断ＰＣＲフラグメント１００ｎｇ（３μｌ）を総量１０μｌで結合し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）の存在下１６℃で一晩インキュベートすることにより、構築を達成した。その後、連結調製物５μｌを用いて、総量２０５μｌでコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を、４２℃で９０秒間熱ショックさせた。その後、細胞をＬＢ培地１ｍｌに移し、そして３７℃で１時間インキュベートして、選択マーカーを発現させた。その後、アリコートを、１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＬＢプレート上にプレーティングし、そして３７℃で１５時間インキュベートした。耐性クローンを選び、プラスミドを単離し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）そして制限分析及び配列分析によって試験した。エラー及びクローニングアーチファクトを含まないことが確認された構築クローンを選択した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドとともに変異体組換えブタ膵臓トリプシンを内部に有する発現ベクターを、ｐＴｒｙ−Ｓｅｒ１７２Ａｌａと命名した。
【００８７】
実施例４：ｐＰＩＣＺαＡ由来のｐＴｒｙ−Ｓｅｒ１７２Ａｌａ発現ベクターでのＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換
用いた宿主株は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＸ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ及びＳＭＤ１１６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。好ましい株は、Ｘ−３３及びＫＭ７１Ｈであった。宿主生物のゲノムに発現構築物を安定に組込むことが形質転換の目的であった。最初に、ＹＰＤ培地（ＹＰＤ＝酵母ペプトンデキストロース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５ｍｌを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓコロニーで接種し、そして３０℃で一晩、シェーカーで前培養した。形質転換コンピテントな細胞を調製するために、前培養物１００μｌを新鮮なＹＰＤ培地２００ｍｌに接種材料として添加し、そしてＯＤ600nmが１.３と１.５との間に達するまで増殖させた。細胞を、１,５００×ｇで５分間遠心分離し、そして氷冷（０℃）滅菌水２００ｍｌに再懸濁した。細胞を再び１,５００×ｇで５分間遠心分離し、そして氷冷滅菌水１００ｍｌに再懸濁した。細胞をもう一度１,５００×ｇで５分間遠心分離し、そして氷冷１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）１０ｍｌに再懸濁した。このように調製された細胞を氷上に置き、そして直ちに形質転換に使用した。
形質転換に使用されるｐＰＩＣＺαＡ由来のｐＴｒｙＳｅｒ１７２Ａｌａ発現ベクターを、ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて線状化し、沈殿させ、そして水に再懸濁した。「Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（登録商標）」（ＢｉｏＲａｄ）を用いたエレクトロポレーションによって形質転換を達成した。形質転換の設定のために、１Ｍソルビトール溶液中のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞８０μｌを、線状化発現ベクターＤＮＡ１μｇと穏やかに混合し、そして氷冷キュベットに移し、次いで氷上に５分間保持した。その後、キュベットをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒに移した。エレクトロポレーションパラメータは、１ｋＶ、１ｋΩ及び２５μＦであった。エレクトロポレーションの後、１Ｍソルビトール溶液１ｍｌを、細胞懸濁液に添加し、その後１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＹＰＤＳプレート（ＹＰＤＳ＝酵母ペプトンデキストロースソルビトール；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプレーティングし、細胞懸濁液１００〜１５０μｌを、１つのプレートに広げた。ＹＰＤＳプレートを、３０℃で２〜４日間インキュベートした。酵母クローンを、グリッド入りの最小デキストロースプレートに移した。これらのプレートからコロニーを選び、そして別々に滅菌水に再懸濁した。細胞を、３０℃で１時間、リチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）１７.５単位で消化し、そしてその後、−８０℃で１０分間凍結させた。ＰＣＲによって、それぞれのｐＰＩＣＺαＡ由来のｐＴｒｙＳｅｒ１７２Ａｌａ発現ベクターの発現カセットの存在を確認した。用語「発現カセット」は、ＡＯＸ１プロモーター及びＡＯＸ１ターミネーターに作動可能に連結した変異体組換えブタ膵臓トリプシンプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を表しており、ここでこの発現カセットは、形質転換に使用されるそれぞれのｐＰＩＣＺαＡ−ベクターに由来している。発現カセットを含むベクターに関しては、用語「ベクター」及び「発現ベクター」は、同義語である。
ポジティブクローン、すなわちゲノムに安定に組込まれた完全な発現カセットの存在に対してポジティブであると試験されたクローンを、変異体組換えブタ膵臓トリプシン発現のさらなる特徴付けに使用した。
さらに、コントロールの形質転換を、オリジナルのｐＰＩＣＺαＡベクターを用いてレシピエントのＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＫＭ７１Ｈ株で行った。ポジティブクローンを得て、同様の様式で確認した。
【００８８】
実施例５：変異体組換えブタ膵臓トリプシノーゲンの発現及び分泌
ｐＰＩＣＺαＡ−ｐＴｒｙＳｅｒ１７２Ａｌａ発現ベクターで形質転換された一連のポジティブクローン（２０〜３０）を、各々ＢＭＧＹ培地（ＢＭＧＹ＝緩衝化グリセロール複合培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３ｍｌ中で振盪培養として一晩増殖させた。その後、培養物のＯＤ600nm値を、各々ｐＨ３のＢＭＭＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍｌを含む振盪フラスコに継代する前に測定した。前培養を接種材料として使用して、各々ＯＤ600nmが１になった。この培養物を、シェーカー上３０℃に維持した。同時に、ポジティブコントロールクローンを、同じ条件下で培養した。
ＢＭＭＹ（ＢＭＭＹ＝緩衝液メタノール複合培地）培地は、変異体組換えブタ膵臓トリプシノーゲンをコードするヌクレオチド配列の転写を制御するＡＯＸ−１プロモーターの誘導物質であるメタノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｖ．）を含んだ。
サンプル５００μｌを、計７２時間にわたって２４時間間隔で振盪フラスコから採取した。サンプルアリコートを取り出すとき、この培養物にまた、０.５％メタノールを与えた。上清増殖培地のサンプルを、トリプシン酵素活性について試験した。
【００８９】
実施例６：変異体ブタ膵臓トリプシンの発現分析
実施例５に記載されるように得られたサンプルアリコートのＯＤ600nmを最初に測定した。その後、細胞を遠心分離によってペレット化し、そして上清は残しておいた。トリプシン活性を、上清を希釈せずに、そして１：１０希釈で測定した。
ｐＰＩＣＺαＡベクターで形質転換されたコントロールクローンは、培地中でいかなる測定可能なトリプシン活性も導かなかったが、ｐＰＩＣＺαＡ−ｐＴｒｙＳｅｒ１７２Ａｌａ発現ベクターで形質転換されたＰｉｃｈｉａ株は、増殖培地、すなわち培養基に分泌された組換えブタ膵臓トリプシンのそれぞれの変異体に起因したトリプシン活性を示した。従って、この場合、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドを含む組換えプレタンパク質の発現は、タンパク質分解活性を有する活性な酵素の分泌を可能にすると結論付けられ得る。
【００９０】
実施例７：多重形質転換及びＺｅｏｃｉｎ（登録商標）濃度の増大による発現収率の増大
上清培地中で最も高いトリプシン活性を生じることが見出されたｐＰＩＣＺαＡ−及びｐＰＩＣＺＡ−由来のｐＤＮＭ発現ベクターで形質転換された酵母クローンを、以前と同じ発現ベクターを用いて繰り返しエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション条件は、ＹＰＤＳプレートが、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）を高い濃度で、すなわち１,０００μｇ／ｍｌと２,０００μｇ／ｍｌとの間で含むこと以外は実施例４に記載される通りであった。それぞれの発現ベクターの多コピーがゲノムに組込まれた形質転換体を選択するために、抗生物質濃度を増大した。抗生物質に対する耐性が増大した酵母クローンを、グリッド入り最小デキストロースプレートに移した。すでに実施例５に記載される通り、前培養を個々の酵母クローンから行い、そして実施例６に記載される通りに、増殖培地に分泌されたトリプシン酵素活性を測定することによって発現を測定した。トリプシン活性量の増大を生じた個々のクローンを見出した。平均して、それぞれのｐＰＩＣＺαＡ−ｐＴｒｙ−Ｓｅｒ１７２Ａｌａ発現ベクターで繰り返し形質転換されたＰｉｃｈｉａ株の上清で測定されたトリプシン活性は、１回の形質転換しか受けなかったそれぞれの前駆体株と比較して、２倍〜３倍高かった。
【００９１】
実施例８：液体培養物の上清からのブタ膵臓トリプシノーゲンの変異体の精製及びトリプシン変異体を形成するための活性化
完全発酵ブロスを、５〜３０ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ３.５を含む酢酸アンモニウム緩衝液（５〜２０ｍＭ）で、およそ１：２〜１：４の比で希釈した。トリプシノーゲン変異体を、陽イオン交換体（例えば、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（登録商標）ＳＰ、ＸＬ）を用いた膨張層クロマトグラフィー（ＭｃＣｏｒｎｉｃｋ（１９９３）；ＥＰ  ０  ６９９  ６８７）により精製した。クロマトグラフィーを、酵母細胞を事前に分離せずに行った。さらなる精製を、充填層カラム（例えば、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ、ｆｆ）を用いて行った。自己触媒的活性化を、２０ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在下でｐＨを７〜８に再緩衝化することによって開始させた。ｐＨを２〜４の範囲に戻すことによって、活性化を終結させた。精製トリプシンを、自己タンパク質分解を避けるためにｐＨ１.５〜３で保管した。
【００９２】
実施例９：精製した変異体組換えブタ膵臓トリプシンのトリプシン比活性を測定するアッセイ
トリプシンの活性を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、２０ｍＭ  ＣａＣｌ2中２５℃で、Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＲＹ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて測定した。光度測定を、４０５ｎｍで行った。アルギニン対リジン間の基質特異性を区別するために、Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＨ（アルギニン／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨを含む）及びＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＰＬ（リジン／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨを含む）を使用した。
【００９３】
実施例１０：プレプロヒトインスリンの切断
すべての実験を、８℃及びｐＨ値８.３（緩衝化溶液又はＮａＯＨの投与で制御）で行い、そして２０ｍＬ〜３.５Ｌスケールで行った。いくつかの実験において、プレプロインスリンをまた、両方の酵素を直接比較するために、ネイティブの組換えブタトリプシンを用いて切断した。
ＰＰＩ溶液を、適切なサーモスタット反応溶液に満たし、そして酵素調製物を添加することによって反応を開始させた。一定の時間間隔後にサンプルを採取した。１Ｎ又は２Ｎ  ＨＣｌ溶液によってサンプル溶液を酸性化することにより、酵素反応を直ちに停止させた。それぞれの産物の濃度を、ＨＰＬＣによって測定した。
表１は、一実験の例示的な結果を示している。
【００９４】
【表１】
2009507500.tif 000003
【００９５】
表１に見られ得るように、Ｓ１７２Ａトリプシン変異体の使用により、望ましくない副産物、ｄｅｓ−Ｔｈｒ及びＡ０−化合物の形成が減少し、そして結果として、重要なＡｒｇ−インスリン（Ａｒｇ−Ｉｎｓ）量及びそれぞれの切断収率が増大した。
図５は、ネイティブの組換えブタトリプシンを用いたプレプロインスリンの転換を示しており、図６は、Ｓ１７２Ａ変異体トリプシンを用いたＰＰＩの転換を示している。
【００９６】
実施例１１：プレプロインスリングラルギンの切断
実施例１０の実験条件を用いた。プレプロインスリンをまた、両方の酵素を直接比較するためにネイティブの組換えブタトリプシンを用いて切断した。
ＨＰＬＣ方法：記載の通り。
表２は、行った実験の例示的な結果を示している。示される値は、最大産物形成点を表している。
【００９７】
【表２】
2009507500.tif 000004
【００９８】
表２に見られ得るように、Ｓ１７２Ａトリプシン変異体の使用により、望ましくない副産物、ｄｅｓ−Ｔｈｒ及びＡ０−化合物の形成が減少し、そして結果として、インスリングラルギン量が増大した。
【００９９】
実施例１２：プレプロインスリングルリジンの切断
実施例１０の実験条件を用いた。プレプロインスリンをまた、両方の酵素を直接比較するためにネイティブの組換えブタトリプシンを用いて切断した。表３は、実験の例示的な結果を示している。示される値は、最大産物形成点を表している。
【０１００】
【表３】
2009507500.tif 000005
【０１０１】
表３に見られ得るように、Ｓ１７２Ａトリプシン変異体の使用により、望ましくないＡ０−化合物の形成が減少し、そして結果として、インスリングルリジン量が増大した。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ヒトインスリン、インスリングラルギン及びインスリングルリジンのプレプロインスリンの主要なトリプシン切断部位の模式図である。黒三角は、産物を得る切断部位を表しており、白三角は、副産物を得る切断部位を表している。プレプロ（ｐｒｅ−ｐｒｅ）インスリンのジスルフィド結合は示していない。
【図２】組換え野生型ヒトトリプシンでのプレプロインスリングラルギンの切断である（実施例１）。
【図３】組換えセリン１９０アラニンヒトトリプシン変異体でのプレプロインスリングラルギンの切断である（実施例１）。
【図４】Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）に対する耐性を与える市販のプラスミドｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体であるプラスミドｐＴｒｙ−Ｓｅｒ１７２Ａｌａのマップである。ＴｒｙＳｅｒ１７２Ａｌａで表される挿入物は、Ｓｅｒ１７２Ａｌａアミノ酸置換を保有する組換えブタ分泌性トリプシノーゲンの変異体をコードする合成ＤＮＡ配列であり、そしてこれは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に融合されている。「ＡＯＸ１−Ｐｒｏｍ」は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１プロモーターを表しており、「Ｔｅｒｍ」は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１ターミネーターを表している。
【図５】ネイティブの組換えブタトリプシンでのプレプロインスリン（ヒトインスリン）切断を示している（実施例１０、表１）。
【図６】Ｓ１７２Ａ変異体ブタトリプシンでのプレプロインスリン（ヒトインスリン）切断を示している（実施例１０、表１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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