(57)【要約】  本発明は、インヒビタープロテイン−１（Ｉ−１）の新規な突然変異型をコードする新規な核酸に関する。特に、突然変異型Ｉ−１はＰＫＣ−αの変性したリン酸化部位を包含するものである。さらに、本発明は、新規な核酸及びポリペプチドを採用する、心筋収縮性及び心機能を調節する方法、並びに心筋症及び心不全の治療のための方法に関する。さらに、新規な核酸を包含するベクター、新規なタンパク質に対する抗体、並びにこれらに関連する診断及びスクリーニング方法を提供するものである。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、当該核酸分子が７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードするものである、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片。
【請求項２】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含有してなる核酸分子及び配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する核酸分子からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、当該核酸分子が７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードするものである、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片。
【請求項４】
配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含有してなる核酸分子及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する核酸分子からなる群より選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号５で示されるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片。
【請求項６】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片。
【請求項７】
請求項１又は３に記載の単離された核酸分子の有効量を対象の心臓細胞に導入すること、それにより対象における心筋収縮性を低下させることを含有してなる、対象において心筋収縮性を低下させる方法。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の単離されたポリペプチドの有効量を投与すること、それにより対象における心筋収縮性を低下させることを含有してなる、対象において心筋収縮性を低下させる方法。
【請求項９】
野性型ホスファターゼインヒビター−１プロテインのＰＫＣ−αによるリン酸化部位に少なくとも１つの構成的に非リン酸化状態のアミノ酸を含有してなる、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型をコードする配列を含有してなる核酸分子を、ホスファターゼ活性を低下させる有効量で対象の心臓細胞に導入することを含有してなる、心不全を有する対象を治療する方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの構成的に非リン酸化状態のアミノ酸が、前記ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型の６７位でアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）若しくはシステイン（Ｃ）、又は７５位でアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）若しくはシステイン（Ｃ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸分子が、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５及び配列番号１７からなる群より選択される配列を含有してなる核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有している、及び核酸分子が６７位若しくは７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型が、配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２，配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有してなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子が、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０，配列番号１５及び配列番号１７からなる群より選択される配列を含有してなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
野性型ホスファターゼインヒビター−１プロテインのＰＫＡによるリン酸化部位に少なくとも１つの構成的にリン酸化状態のアミノ酸を含有してなる、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型をコードする配列を含有してなる核酸分子を、ホスファターゼ活性を低下させる有効量で導入することにより、心不全を有する対象を治療することをさらに含有してなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの構成的にリン酸化状態のアミノ酸が、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型の３５位においてアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子が、配列番号１９で示される配列を含有してなる核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有するものであり、３５位の構成的にリン酸化状態のアミノ酸をコードするものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型が、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含有してなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
核酸分子が、請求項１９に記載の配列を含有してなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型が、完全長タンパク質又は構成的に非リン酸化状態のその断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
ホスファターゼインヒビター−１プロテインが完全長タンパク質又は構成的に非リン酸化状態のその断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片を、ホスファターゼ活性を低下させる有効量で心不全を有する対象の心臓細胞に導入することによりその対象を治療することを含有してなる、心不全を有する対象を治療する方法。
【請求項２２】
核酸分子が、少なくとも配列番号２１で示される１〜６５位のアミノ酸を含有して配列番号２１のＰＫＣ−αによるリン酸化部位で切断されているポリペプチドをコードする配列を含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドが、配列番号２１で示される６７位又は７５位の辺りで切断されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
核酸分子が配列番号２２で示される配列を含有してなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、核酸分子が、コード配列に作動可能に連結したプロモーターを含有してなる、請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
プロモーターが構成的プロモーターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
プロモーターが複数の組織で発現するものであり、その組織の１つが心筋組織である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、心筋特異的なトロポニンＴ、ミオシン重鎖及びミオシン軽鎖からなる群のいずれか由来の調節配列を含有してなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
核酸分子が、ウイルス粒子を含有してなるウイルス送達システムを投与することにより導入されるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルス粒子が、レンチウイルス粒子又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含有してなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸分子が、心筋の短縮、弛緩の時定数の減少及びカルシウムシグナルの減衰の促進並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される状態をもたらすのに有効な量で導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項３２】
核酸分子が、収縮末期圧−径関係の改善に有効な量で導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項３３】
心不全を有する対象が、心不全の他に、虚血、不整脈、心筋梗塞、心収縮異常及びＣａ２＋代謝異常並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される疾患も有する、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
対象がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項３５】
対象の心臓の冠状血管を通る血流が制限されて、核酸分子が対象の冠状動脈の内腔に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項３６】
冠状静脈の血液流出が制限されている間も心臓がポンプとして機能する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
冠状血管を流れる血流が完全に制限される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
制限される冠状血管が、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）、左冠動脈回旋枝（ＬＣＸ）、大冠状静脈（ＧＣＶ）、中心静脈（ＭＣＶ）及び前室間静脈（ＡＩＶ）からなる群のいずれかを含有してなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
核酸分子が、冠状血管の虚血プレコンディショニングの後で導入される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
対象の心臓からの大動脈の血流が制限されている間に核酸分子を心臓に注入することにより核酸分子を心臓に流入させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
投与が、血流を冠動脈へリダイレクトするように心臓からの大動脈血流を制限する；
核酸分子を心臓の内腔、大動脈又は冠状動脈口に注入して核酸分子を冠状動脈へ供給する；心臓からの大動脈血流が制限されている間も心臓をポンプとして機能させる；及び
大動脈の血流を回復させる：段階を含有してなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
核酸分子がカテーテルで心臓に注入される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
核酸分子が心臓の筋肉に直接的に注入される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
さらに対象における心機能のパラメーターを評価することを含有してなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
心機能のパラメーターが、心拍数、心臓代謝、心収縮性、心室機能、Ｃａ２＋代謝及び筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ活性及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象から心臓のホスファターゼインヒビター−１プロテインのサンプルを採取すること；及び
少なくとも１つのリン酸化されたＰＫＣ−αのリン酸化部位の存在を検出すること、それにより対象の心不全を診断又は予知することを含有してなる、対象の心不全を診断又は予知する方法。
【請求項４７】
少なくとも１つのリン酸化されたＰＫＣ−αのリン酸化部位が、前記の心臓のホスファターゼインヒビター−１プロテインの７５位のスレオニン（Ｔ）残基又は６７位のセリン（Ｓ）残基である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１又は３に記載の単離された核酸分子を含有してなる組換えベクター。
【請求項４９】
請求項５又は６に記載の単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項５０】
請求項１又は３に記載の単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項５１】
単離された核酸分子が、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及び単純ヘルペスウイルス１からなる群より選択されるウイルスベクター中に存在する、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
請求項５又は６に記載の単離されたポリペプチドに対してもたらされる抗体。
【請求項５３】
請求項５２に記載の抗体を含有してなる診断用試薬。
【請求項５４】
さらに、核酸分子を入手することを含有してなる、請求項９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
配列番号５又は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び請求項９に記載の方法により心不全を有する対象を治療するための説明書を含有してなる心不全を有する対象を治療するためのキット。
【請求項５６】
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含有してなるホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型をコードする単離された核酸分子、及び請求項１４に記載の方法により心不全を有する対象を治療するための説明書をさらに含有してなる、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
配列番号２１で示されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子又はその断片、及び請求項２１に記載の方法により心不全を有する対象を治療するための説明書を含有してなる、心不全を有する対象を治療するためのキット。
【請求項５８】
配列番号１２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸であって、当該核酸分子が７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードする、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片。
【請求項５９】
配列番号１０で示されるヌクレオチド配列を含有してなる核酸分子及び配列番号１０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド分子からなる群より選択される、請求項５８に記載の単離された核酸分子。
【請求項６０】
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸であって、当該核酸分子が６７位及び７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードする、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片。  
【請求項６１】
配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を含有してなる核酸分子及び配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド分子からなる群より選択される、請求項６０に記載の単離された核酸分子。
【請求項６２】
配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸であって、当該核酸分子が６７位及び７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードする、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片。
【請求項６３】
配列番号１７で示されるヌクレオチド配列を含有してなる核酸分子及び配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド分子からなる群より選択される、請求項６２に記載の単離された核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願／特許及び参照による援用）
本出願は、２００６年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／７７２，３２７号に係る優先権を主張するものであり、この出願の内容を参照して本明細書に組み込む。
本明細書において引用する特許出願及び特許の各々、並びに特許出願及び特許の各々において引用される各々の資料又は参考文献（各々の発行済み特許の出願・審査期間のものを含む；「特許出願引用資料」）、及びこれらの特許出願及び特許のいずれかに対応する及び／又はその優先権を主張するＰＣＴ及び国外出願の各々、及び特許出願引用資料の各々において引用される又は参照される資料の各々は、参照により明白に本明細書中に組み込まれる。より一般的には、資料又は参考文献は、特許請求の範囲に先立つ「参考文献リスト」又は本明細書自体のいずれかにおいて、本明細書中で引用され、これらの資料又は参考文献の各々（「本明細書で引用される参考文献」）、並びに本明細書で引用される参考文献の各々の中で引用される各々の資料又は参考文献（製造者の仕様書、指示書等を含む）は、参照により明白に本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（政府の支援に関する記載）
以下の発明は、合衆国政府の一部助成によって作成された。従って、米国政府は、本発明における一定の権利を有する。助成金はアメリカ国立衛生研究所により、助成番号ＨＬ−６４０１８、ＨＬ−２６０５７及びＨＬ−７７１０１のもとに出資された。
【背景技術】
【０００３】
心不全の病態でプロテインキナーゼＣ−α（ＰＫＣ−α）活性が上昇することが既に認められており（米国特許出願公報第２００５００６６３８１号）、ホスファターゼインヒビタープロテイン−１（Ｉ−１）が心筋収縮性の鍵となるレギュレータであって、Ｉ−１がプロテインホスファターゼ１（ＰＰ−１）の活性を阻害することにより心筋収縮性を調節するということも知られている。さらに、Ｉ−１のＰＰ−１阻害活性がリン酸化によって調節されるということも知られている。Ｉ−１のスレオニン３５がプロテインキナーゼＡによってリン酸化されると、ＰＰ−１の活性が阻害され、心筋収縮性が改善される（Pathak, A., et al. 2005 Circ Res 15:756-66）。セリン６７（Ｓ６７）がＰＫＣαによるリン酸化部位であることは知られていて、構成的に非リン酸化の状態に似たＳ６７Ｉ−１突然変異体（例えば、Ｓ６７Ａ）では野性型Ｉ−１に比べてリン酸化が減少することも知られている。しかしながら、インビトロ試験の条件ではＰＰ−１活性の如何なる阻害も示さなかった。
【０００４】
心不全（うっ血性心不全とも呼ばれる）は、心筋の収縮性が低下する状態であり、心臓が効率よく血液を送り出す能力が低下する。アメリカ人だけで１，０００万人以上に発症していると推定される。心不全は、ほとんどの場合において慢性であり、長期にわたる疾患であり、医療行為及び人材のための費用が過度に費やされる。特に、心不全による他の体内臓器への影響は、患者の生産的な生活を全体的に低下させることに関しても、治療費の面でも深刻なものになり得る。この疾患は、心臓の右側、左側又は両側に現れる。心臓のポンプ作用が鈍ると、血液が体内の他の領域に鬱血するようになり、多くの臓器及び臓器系が酸素と栄養素の欠如による累積損傷を受けるようになる。
【０００５】
心不全は、多くの原因が根本にあり得るもので、加齢とともに起こりやすくなる。厄介なことに、心不全の患者には明らかに目立った症状を示さない患者もあり、深刻な臓器障害の予防又はその発生率を低下させるための早期診療の恩恵を受けることなく深刻な末梢的な疾患を発症させてしまうこともある。定期的なスクリーニング及び早期検出により、患者は病気の進行を遅らせる生活習慣及び食習慣へ変更することを選択できる。大規模なスクリーニングのための方法、並びに著しい臓器障害が起こる前の早期かつ正確な検出及び心不全の進行を予知する能力が明らかに必要とされている。さらに、特に高齢の患者については、製剤の摂取スケジュールのコンプライアンスに頼りきらない長期にわたる治療の選択肢も必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、ヒトを含む動物の心筋収縮性を調節する方法において採用されてもよい、ホスファターゼインヒビタープロテイン−１の新規な形態を包含するポリペプチドをコードする新規なヌクレオチド配列及びその機能的な断片を提供する。当該技術分野で公知の技術を用いて、ヌクレオチド配列が心臓細胞に挿入され、発現状態が誘発される。遺伝物質は、長期にわたる発現能力のために宿主の遺伝物質へ組み込むことを目的として又はより短期間で一時的な発現の必要性を目的として、挿入されてもよい。さらに、特により急性な発症の場合には、発現産物自体が、Ｉ−１の新規な形態を含む新規ポリペプチドの形態で、調節剤として、直接又は間接的に投与されてもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を包含する構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供するものである。本発明の一態様では、その単離された核酸が配列番号３で示される配列を包含する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性）を有するアミノ酸配列をコードするものであって、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供して、ここで核酸分子は構成的に非リン酸化状態の７５位のアミノ酸をコードするものである。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は、配列番号３で示される配列、又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド分子を包含する。
【０００９】
別の態様では、本発明は配列番号６で示されるアミノ酸配列を包含する構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号４で示される配列を包含する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性）を有するアミノ酸配列をコードするものであって、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供して、ここで核酸分子は構成的に非リン酸化状態の７５位のアミノ酸をコードするものである。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は、配列番号４で示される配列、又は配列番号４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド分子を包含する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は配列番号５で示されるアミノ酸配列を包含する単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は配列番号６で示されるアミノ酸配列を包含する単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は配列番号１２で示されるアミノ酸配列を包含する構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又はその構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号１０で示される配列を包含する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性）を有するアミノ酸配列をコードして、構成的に非リン酸化状態の７５位のアミノ酸をコードする、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号１０で示される配列、又は配列番号１０で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド分子を包含する。
【００１５】
別の態様では、本発明は配列番号１６で示されるアミノ酸配列を包含する構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号１５で示される配列を包含する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性）を有するアミノ酸配列をコードして、構成的に非リン酸化状態の６７位及び７５位のアミノ酸をコードする、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号１５で示される配列、又は配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド分子を包含する。
【００１７】
別の態様では、本発明は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号１７で示される配列を包含する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性）を有するアミノ酸配列をコードするして、構成的に非リン酸化状態の６７位及び７５位のアミノ酸をコードする、構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を提供する。本発明の一実施態様では、単離された核酸分子は配列番号１７で示される配列、又は配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド分子を包含する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、配列番号５若しくは６で示されるアミノ酸配列を含有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片の有効量を対象の心臓細胞に導入すること、それにより対象の心筋収縮性を低下させることを含有してなる、対象の心筋収縮性を低下させる方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、配列番号５若しくは６で示されるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片の有効量を投与すること、それにより対象の心筋収縮性を低下させることを含有してなる、対象の心筋収縮性を低下させる方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、突然変異型が野性型ホスファターゼインヒビター−１プロテインのＰＫＣ−αによるリン酸化部位に構成的に非リン酸化状態のアミノ酸を少なくとも一つ包含する、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型をコードする配列を包含する核酸分子を、ホスファターゼ活性を低下させるのに有効な量で対象の心臓細胞に導入すること、それにより心不全を有する対象を治療することを含有してなる、心不全の対象を治療する方法を提供する。別の実施態様では、前記ホスファターゼインヒビター−１プロテインの前記突然変異型において、少なくとも一つの構成的に非リン酸化状態のアミノ酸は、６７位でＡ（アラニン）、Ｄ（アスパラギン酸）若しくはＣ（システイン）、又は７５位のＡ、Ｄ若しくはＣである。さらに別の実施態様では、核酸分子が、配列番号３、配列番号４，配列番号９、配列番号１０、配列番号１５及び配列番号１７からなる群より選択される配列を含有してなる核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有していて、ここでは核酸分子は６７位又は７５位の構成的に非リン酸化状態のアミノ酸をコードする。さらに別の態様ではホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型が、配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する。そのタンパク質の突然変異型をコードする核酸分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５及び配列番号１７からなる群より選択されるものであってもよい。ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型は、完全長タンパク質又は構成的に非リン酸化状態のその断片であってもよい。別の実施態様では、その方法はさらに核酸を得ることを包含する。
【００２２】
別の実施態様では、本発明の方法はさらに、突然変異型が野性型ホスファターゼインヒビター−１プロテインのＰＫＡによるリン酸化部位に構成的に非リン酸化状態のアミノ酸を少なくとも一つ包含する、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型をコードする配列を包含する核酸分子を、ホスファターゼ活性を低下させるのに有効な量で導入すること、それにより心不全を有する対象を治療することを包含する。さらに別の態様では、前記ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型において、その少なくとも１つの構成的にリン酸化状態のアミノ酸が、３５位でＤ（ＧＡＴも同様に考えられるが、アスパラギン酸、ＧＡＧ）又はＥ（ＧＡＡも同様に考えられるが、グルタミン酸、ＧＡＧ、）である。さらに別の実施態様では、その核酸分子が、配列番号１９で示される配列を含む核酸分子に少なくとも９０％の相同性を有するものであり、３５位の構成的にリン酸化状態のアミノ酸をコードするものである。さらに別の実施態様では、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型が配列番号２０で示されるアミノ酸を包含するものである。そのタンパク質の突然変異型をコードする核酸分子は配列番号１９で示される配列を包含していてもよい。ホスファターゼインヒビタープロテインの突然変異型は、完全長タンパク質又は構成的にリン酸化状態のその断片でもよい。
【００２３】
別の態様では、本発明は、配列番号２１で示されるアミノ酸を包含するポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片を、ホスファターゼ活性を低下させるのに有効な量で、対象の心臓に導入すること、それにより心不全を有する対象を治療することを包含する、心不全を有する対象を治療する方法を提供する。別の実施態様では、その核酸分子は、ポリペプチドが配列番号２１で示されるＰＫＣ−αによるリン酸化部位で切断されている、少なくとも配列番号２１で示される配列の１〜６５位のアミノ酸を包含するポリペプチドをコードする配列を包含する。ポリペプチドは、さらに別の実施態様において、配列番号２１の６７位又は７５位で切断されていてもよい。Ｉ−１のこれらの切断された形態は、ＰＰ−１の阻害に関する機能を保つものである。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、核酸分子はさらにコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを包含する。さらに別の実施態様では、そのプロモーターは構成的プロモーターである。さらに別の実施態様では、そのプロモーターは、複数の組織で発現されるものであり、その組織の一つが心筋組織である。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、心筋特異的なトロポニンＴ、ミオシン重鎖及びミオシン軽鎖からなる群のいずれかからの調節配列を包含していてもよい。
【００２５】
本発明の方法の別の実施態様では、核酸分子は、ウイルス粒子を含有してなるウイルス送達システムを投与することにより導入される。さらに別の実施態様では、そのウイルス粒子はレンチウイルス粒子又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を包含する。
【００２６】
本発明の方法の別の実施態様では、その核酸配列は、心筋の短縮、弛緩の時定数の減少及びカルシウムシグナルの減衰の促進並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される状態をもたらすのに有効な量で導入される。さらに別の実施態様では、核酸は、収縮末期圧−径関係の改善に有効な量で導入される。
【００２７】
本発明の方法の別の実施態様では、心不全を有する対象は、心不全の他に、虚血、不整脈、心筋梗塞、心収縮異常及びＣａ２＋代謝異常並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される疾患も有する。さらに別の実施態様では、対象がヒトである。
【００２８】
本発明の方法の別の実施態様では、対象の心臓の冠状血管を通る血流が制限されて、核酸分子が冠状動脈の内腔へ導入される。さらに別の実施態様では、冠状静脈からの流出量が制限されている間も心臓はポンプとして機能する。さらに別の実施態様では、冠状血管を流れる血流は完全に制限される。制限される冠状血管は、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）、左冠動脈回旋枝（ＬＣＸ）、大冠状静脈（ＧＣＶ）、中心静脈（ＭＣＶ）又は前室間静脈（ＡＩＶ）を包含していてもよいが、これらに限定されるものではない。さらに別の実施態様では、核酸分子は、冠状血管の虚血プレコンディショニングの後に導入される。さらに別の実施態様では、核酸分子は、心臓からの大動脈の血流が制限されている間に対象の心臓に注入され、それによって核酸分子が心臓に流入される。
【００２９】
本発明の方法の別の実施態様では、投与は、血流が冠状動脈へとリダイレクトするように心臓からの大動脈流を制限する；核酸分子を心臓の内腔、大動脈又は冠状動脈口に注入して核酸分子を冠状動脈へ供給する；心臓からの大動脈血流が制限されている間も心臓をポンプとして機能させる；及び大動脈血流を回復させる段階を包含する。さらに別の実施態様では、核酸分子はカテーテルで心臓に注入される。さらに別の実施態様では、核酸分子は、心臓の筋肉へ直接的に注入される。さらに別の実施態様では、その方法は、対象における心機能のパラメーターを評価することを包含する。心機能のパラメーターは、心拍数、心臓代謝、心収縮性、心室機能、Ｃａ２＋代謝及び筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ活性の１つ又はそれ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
別の態様では、本発明は、対象から心臓のホスファターゼインヒビター−１プロテインのサンプルを採取すること、及び少なくとも１つのリン酸化されたＰＫＣ−αのリン酸化部位の存在を検出すること、それにより対象の心不全を診断又は予知することを含有してなる、心不全の診断又は予知方法を提供する。別の実施態様では、その少なくとも１つのリン酸化されたＰＫＣ−αのリン酸化部位が心臓のホスファターゼインヒビター−１プロテインの７５位のＴ残基又は６７位のＳ残基である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片を含有してなる組換えベクターを提供する。さらに別の態様では、本発明は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片を含有してなる組換えベクターを提供するものである。
【００３２】
別の態様では、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは希釈剤を含有してなる医薬組成物を提供する。さらに別の態様では、本発明は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは希釈剤を含有してなる医薬組成物。さらに別の態様では、本発明は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは希釈剤を含有してなる医薬組成物を提供する。さらに、一実施態様では、核酸分子は、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１からなる群より選択されるウイルスベクター中に存在する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を包含する単離されたポリペプチド又は構成的に非リン酸化状態のその断片に対して作られた抗体を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号６で示されるアミノ酸を包含する単離されたポリペプチドまたは構成的に非リン酸化状態のその断片に対して作られた抗体を提供する。さらに別の態様では、本発明は、そのような抗体を包含する診断用試薬を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列を含有してなる構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビター−１プロテインをコードする単離された核酸分子又は構成的に非リン酸化状態のその断片、及び本発明の本方法による使用のための説明書を含有してなる、心不全を有する対象を治療するためのキットを提供する。さらに、そのキットは、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含有してなるホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型をコードする単離された核酸分子を包含する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドをコードする配列を包含する単離された核酸分子又はその断片、及び本発明の方法による心不全を有する対象を治療するための説明書を含有してなる、心不全を有する対象を治療するためのキットを提供する。
【００３７】
本発明の他の態様は、以下の開示において説明されるものであり、本発明の範囲に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書では、「核酸分子」又は「核酸配列」という用語は、ポリペプチドをコードする読み取り枠を含むポリヌクレオチドを意味するものであり、さらにイントロン及び望ましい調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等）のような非コード配列も含む。本発明の核酸配列は、選択された目的のために特定の遺伝子をコードできる。その遺伝子は、宿主細胞に対して内因性であるか又は宿主細胞に組換えによって導入されたもので、例えば、エピソームに保持されたプラスミド若しくはゲノム中に安定に組み込まれたプラスミド（若しくはその断片）のようなものであってもよい。
【００３９】
本明細書では、「単離された」という用語は、前述の物質が通常存在する環境から取り除かれたことを意味する。従って、単離された生物由来物質は、細胞成分すなわちその物質が存在する若しくは生成される細胞の成分を含んでいないものであり得る。核酸分子の場合、単離された核酸は、ＰＣＲ産物、ゲル上のｍＲＮＡのバンド、ｃＤＮＡ、又は制限断片を含む。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、及び人工染色体等に挿入された配列を含む。従って、組換え核酸は単離された核酸を構成するものであってもよい。単離されたタンパク質は、他のタンパク質、核酸又はその両方に付随するものであってよく、細胞中又はそれが膜結合タンパク質であれば細胞膜に付随するものであってよい。単離された物質は、精製されていてもよいがその必要はない。
【００４０】
本明細書では、核酸（ヌクレオチド）配列に対して「相補的」という用語は、塩基対を適合させることにより二本鎖構造を形成できる塩基の配列を意味する。例えば、Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃに対して相補的な配列は、Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇとなる。
【００４１】
本明細書では、「ホスファターゼインヒビター−１プロテイン」又は「Ｉ−１プロテイン」は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００６７４１により表されるタンパク質であって、プロテインホスファターゼ−１の活性を阻害することにより心筋収縮性を調節するタンパク質を意味する。
【００４２】
ホスファターゼインヒビター−１プロテイン又はＩ−１プロテインに関して、「野性型」という用語は、ホスファターゼインヒビタープロテイン−１（Ｉ−１）、サブユニット１Ａをコードする配列番号７で示されるヌクレオチド配列、及び配列番号８で示されるポリペプチド配列、並びに対立遺伝子多型のような（前述のポリペプチド配列と同様の機能特性及び結合親和性を有する）Ｉ−１プロテインをコードする他のいずれかの核酸配列を意味する。
【００４３】
野性型Ｉ−１には、タンパク質のいわゆる「機能的な誘導体」も含まれる。「機能的な誘導体」は、本発明のポリペプチド若しくは核酸の「化学的誘導体」、「断片」、「多型体」又は「変異体」も意味する。機能的な誘導体は、少なくとも本発明に従って実用可能なタンパク質の機能の部分を保持しているものである。当該技術分野では、遺伝コードの縮退により数多くの異なる核酸配列が同一のアミノ酸配列をコードできることが周知となっている。さらに、タンパク質又はポリペプチドが元の機能を保持するようにアミノ酸に保守的な変化を加えることも当該技術分野では周知である。両方の場合で、全ての置換が本開示に含まれる。
【００４４】
本発明の範囲には、本明細書において単離された核酸分子の機能的に同等な物質も含まれる。遺伝コードの縮退は、特定のコドンと同じアミノ酸を特定することで同じタンパク質を生成させる他のコドンとの置換を可能にする。メチオニンとトリプトファンを除き、公知のアミノ酸が１つ以上のコドンによりコードされることから、核酸配列は実質的に異なり得る。しかしながら、そのコードされたアミノ酸配列は保存される。
【００４５】
さらに、核酸配列は、そのヌクレオチド配列によりコードされる、本明細書に記載のアミノ酸配列を変えないものであれば、５’−末端及び／又は３’−末端への少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、又は置換によって生じたヌクレオチド配列を包含していてもよい。例えば、本発明の核酸分子は、その５’−末端及び／又は３’−末端に制限エンドヌクレアーゼの認識部位を付加されたものでもよい。
【００４６】
コドンを欠失させるか、又は１つ若しくはそれ以上のコドンを縮重コドン以外のコドンで置換して、非修飾の核酸分子により生成されたポリペプチドと実質的に同様の実用性若しくは活性を有する、構成的に修飾されたポリペプチドを生成することが可能である。当該技術分野で認識されているように、核酸分子間の差異が遺伝コードの縮退と関連がないとしても、２つのポリペプチドが産生されれば、その２つのポリペプチドは機能的に同等である。
【００４７】
Ｉ−１の「化学的誘導体」は、通常タンパク質の一部ではない化学的な部分をさらに含む。ペプチドの目標としたアミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子中にタンパク質若しくはペプチドの共有結合修飾を導入してもよい。
【００４８】
「断片」という用語は、Ｉ−１のアミノ酸配列から派生したポリペプチドであって、それが派生した完全長のポリペプチドよりも短いものを意味する。断片は、例えば、完全長タンパク質のタンパク質分解的切断により産出されたものであってもよい。また、断片は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を適切に修飾して、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸をそのＣ−末端、Ｎ−末端、及び／又は天然の配列の中の１つ若しくはそれ以上の部位において欠失させることによる、組換え的に得られるものであってもよい。断片は、天然のＩ−１の機能的な部分を保持する。
【００４９】
本発明の範囲に含まれる別の機能的な誘導体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、又は付加若しくは置換された天然のポリペプチドに関連するアミノ酸を含む「変異体」ポリペプチドである。さらなるアミノ酸が付加された及び／又は追加のアミノ酸で置換された変異体は、天然のＩ−１の機能的な部分を保持する。欠失、挿入及び／又は置換されたアミノ酸残基を有するタンパク質の機能的な誘導体は、当該技術分野で通常の技術を有する者に周知の標準的な技術（例えば、部位特異的突然変異誘発（Adelman et al., 1983, DNA 2:183）によって用意されるものであってよい。または、アミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換を有するタンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて、直接的な化学合成法により容易に用意されるものであってもよい。
【００５０】
本明細書では、「突然変異体」という用語は、野性型の配列に比べて変化したアミノ酸配列がもたらす及びＩ−１ポリペプチドの機能的な変化がもたらす、遺伝子の突然変異を含む遺伝子を翻訳したＩ−１のポリペプチドを意味する。
【００５１】
本明細書では、「ホスファターゼ活性」という用語は、一般的に使用されるモデルタンパク質の基質であるＭｙＢＰへのホスファターゼの活性を意味する。本明細書では、ミエリン塩基性タンパク質（ＭｙＢＰ）は、プロテインホスファターゼ活性の変化の測定において基質（結合パートナー）として採用される（３２Ｐで標識したもの）。
【００５２】
本明細書では、「構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビターＩ−１プロテイン」又は「構成的に非リン酸化状態のホスファターゼインヒビターＩ−１プロテインの断片」というような「構成的に非リン酸化状態の」という語句は、全ての生理条件下で少なくとも１つの特定のアミノ酸の位置が継続的にリン酸化していないような、ホスファターゼインヒビターＩ−１プロテイン、又はその断片を意味する。特定の実施態様では、断片は、６７位若しくは７５位又はその両方の少なくとも１つのアミノ酸の位置を保持するものであり、特定の残基のリン酸化可能な水酸基を除去又は置換するような変異も含む。「ホスファターゼインヒビター−１プロテインの構成的に非リン酸化状態のアミノ酸」とは、Ｉ−１プロテインのポリペプチド鎖又はその断片のアミノ酸で、全ての生理条件下で、すなわち特定の残基のリン酸化可能な水酸基を除去又は置換するアミノ酸残基の変異を介して、非リン酸化状態のアミノ酸を意味する。
【００５３】
本明細書では、「ＰＫＣ−αによるリン酸化部位」という用語は、プロテインキナーゼＣ、アイソフォームα（ＰＫＣ−α）によりリン酸化される特定のアミノ酸を意味する。ＰＫＡのように、ＰＫＣはセリン／スレオニンに特異的なプロテインキナーゼであり、基質中のセリン又はスレオニン残基（特に、残基中のＯＨ基を）リン酸化する。
【００５４】
本明細書では、「ＰＫＡによるリン酸化部位」という用語は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ、ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼとしても知られる）によりリン酸化される特異的なアミノ酸を意味する。それぞれのＰＫＡは、２つの調節サブユニット及び２つの触媒サブユニットからなるホロ酵素である。低濃度のｃＡＭＰの下では、ホロ酵素は変化せず、触媒能を発揮しない。ｃＡＭＰ濃度が上昇すると（例えば、アデニル酸シクラーゼの特定のＧタンパク質共役受容体による活性化、ｃＡＭＰを分解するホスホジエステラーゼの阻害）、ｃＡＭＰは調節サブユニットの２つの結合部位に結合して、触媒サブユニットを解離する構造の変化を起こす。遊離した触媒サブユニットは、セリン又はスレオニン残基でのＡＴＰの末端リン酸塩のタンパク質基質への転移を触媒することができる。
【００５５】
本明細書では、「治療」という用語は、薬剤を、統計的に有意な程度まで若しくは当業者に検出可能な程度まで、疾患、症状若しくは病気に関連するパラメーターを改善する、又は病気の進行を阻止するのに有効な量、方法及び／又は様式で投与することを意味する。投与する有効な量、方法又は様式は、対象によって様々であり、対象に合わせて調整してもよい。例えば、投与の方法は、ウイルス又はウイルス様の粒子による送達を含む。病気の進行を阻止することにより、治療は、罹患した若しくは診断された対象又は病気を有している疑いのある対象における病気の悪化を防ぐことができるだけでなく、病気のリスクがある若しくは病気を有している疑いのある対象における病気の発症又は症状を予防することもできる。
【００５６】
本明細書では、「心不全」という用語は、心臓が身体の必要に応じて十分にポンプする能力に欠陥を有するいずれかの病気を意味する。多くの場合、心不全は、心臓細胞の興奮収縮連関の様々な段階における１つ又はそれ以上の細胞レベルの異常によって引き起こされ、多くの原因から生じる心筋収縮性の異常によって最も頻繁に発症する。最も一般的な原因には、心筋の虚血性障害、心臓からの血流への過度な機械的抵抗、弁膜機能の不全による心室への過負荷、心筋の感染若しくは炎症、又は先天性の心筋収縮不全などが挙げられる（Braunwald, E. 2001 Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th ed., pp1318-29)。
【００５７】
本明細書では、「心筋症」という用語は、心筋（すなわち、心臓の筋肉）の機能低下を意味する。心筋症は、外因性（例として、初期の病状が、例えば、虚血によって引き起こされるような、心筋そのものの外側にある）又は内因性（例えば、心筋の衰弱は特定できる外因によるものではない）であり得る。
【００５８】
本明細書では、心筋収縮性のような「収縮性」という用語は、心筋の能力を意味する。多くの場合で、心筋繊維が一定の繊維の長さで収縮する本質的な能力と定義される。
【００５９】
本明細書では、「収縮末期圧−径関係」（収縮末期圧容積関係としても知られる）という用語は、以下の一次関係を意味する（Grossman, W., et al. 1977 Circulation 56:845-52）：
ＰＥＳ＝ｍＶＥＳ＋ｂ
ＰＥＳ及びＶＥＳは、それぞれ収縮末期圧及び容積、ｍはこれらの関係を表す線の傾き、ｂはＶＥＳ＝０のときの圧を示す。また、式は：
ＰＥＳ＝ｍ（ＶＥＳ−Ｖ０）
と表すこともでき、ＰＥＳ＝０のとき、Ｖ０＝−ｂ／ｍである。収縮末期圧−径関係は一般的にヒトの心室収縮力の強力な指標であると考えられている。
【００６０】
本明細書では、「心臓細胞」という用語は、（ａ）対象に存在する心臓の一部、（ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏで維持される心臓の一部、（ｃ）心臓組織の一部、又は（ｄ）対象の心臓から単離された細胞を意味する。例えば、細胞は、心筋細胞又は平滑筋細胞のような心臓細胞であってよい。また、本発明の心臓細胞には、例えば、毛細血管、動脈又は他の血管のような心臓の内皮細胞も含まれる。
【００６１】
本明細書では、「心臓」という用語は、対象に存在する心器官又は対象の外のｅｘ  ｖｉｖｏで維持される心器官を意味する。
本明細書では、「心臓組織」という用語は、対象の心臓由来の組織を意味する。
【００６２】
本明細書では、「血流を制限する」という用語は、血管を通る血液の流れ、例えば、末梢大動脈及びその分枝への血流、を実質的に阻止することを意味する。例えば、心臓から出る血流の少なくとも約５０％が制限される、好ましくは、心臓から流れ出る血液の約７５％、そしてより好ましくは、約８０％、９０％又は１００％が制限される。血流は、大動脈及び肺動脈を、例えば、鉗子で、閉塞させることにより制限できる。
【００６３】
本明細書では、「入手する（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、核酸若しくはタンパク質を合成する、購入する又はその他獲得することを意味する。
本明細書では、「ウイルス送達システム」という用語は、例えば、非ウイルス配列を含む核酸配列を哺乳動物の細胞に導入することができるウイルス若しくはウイルス様粒子を意味する。ウイルス送達システムそのものは、ウイルス複製能力を有していてもいなくてもよい。
他の定義は本開示の文中において説明されるものである。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様
ホスファターゼインヒビター−１及びその突然変異体
微調整されたプロテインキナーゼ及びプロテインホスファターゼ活性の調節は、グリコーゲン代謝、タンパク質合成、細胞分裂、神経シグナル伝達及び筋収縮を調節するものであり、鍵となる様々なリンタンパク質の基質のリン酸化状態の制御に不可欠である。第二メッゼンジャーｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）と１型ホスファターゼ（ＰＰ１）の間のクロストークは、内因性リンタンパク質、インヒビター−１（Ｉ−１）のレベルで生じ、ｃＡＭＰシグナル伝達のカスケードを増幅させる。
【００６５】
Ｉ−１は、ウサギの骨格筋で最初に確認されたが、哺乳類の組織に広く発現し、生物種間で高度に保存されている。Ｔｈｒ３５でＰＫＡによりリン酸化された熱安定性タンパク質（Ｍｒ１８，７００）は、活性化してＰＫＡ媒介のタンパク質リン酸化を高めながらＰＰ１を強く阻害する。インヒビター−１のＴｈｒ３５はＣａ２＋／カルモジュリン依存タンパク質２Ｂ（ＰＰ−２Ｂ、カルシニューリン）及びプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ−２Ａ）によって脱リン酸化されるが、ＰＰ−２ＢはＣａ２＋の存在下で中心的な役割を果たす。ｃＡＭＰ及びカルシウムにより相互に調節されたインヒビター−１の可逆性のリン酸化は、２つの主要な第二メッセンジャーの作用に関連して、多数の細胞内プロセスの調節をもたらす。
【００６６】
心筋において、ＰＰ１のＩ−１による調節は、基礎的な収縮能及びβアドレナリン刺激への心臓の応答の両方において役割を果たすということが示されている。アドレナリン作動薬、イソプロテレノールの陽性変力作用は、心臓の収縮状態に関わる重要なタンパク質の脱リン酸化を阻止することによる、心筋収縮性を増強させるＰＰ１活性の阻害をもたらすものであるＩ−１のリン酸化を伴う。興味深いことに、Ｉ−１（Ｔ３５Ｄ；ＡＡ１−６５）の構成的活性型は、心臓を圧負荷により引き起こされる肥大化から保護しただけでなく、心不全を有する前の心機能を救った、これはＩ−１が心不全の治療における有望な候補であることを提示している。
【００６７】
Ｉ−１のＴｈｒ３５におけるリン酸化に加えて、Ｓｅｒ６７もまたｉｎ  ｖｉｖｏで実質的にリン酸化することがわかった。線条体脳組織におけるプロリン指向性キナーゼ、Ｃｄｋ５及びにニューロンｃｄｃ２様プロテインキナーゼ、ＮＣＬＫの両方がＩ−１のＳｅｒ６７をリン酸化することができる。Ｃｄｋ５によるリン酸化がＩ−１の活性に影響しない一方で、ＮＣＬＫは阻害活性を増強する。最近になって、マウス及びウサギの心臓で発現する主要なアイソザイムであるＰＫＣ−αもまたＳｅｒ６７をリン酸化することが発見された、そしてこれはＰＰ１活性を高めながら、ＰＰ１と相互に作用するＩ−１の活性を５０％まで低下させることができる。
【００６８】
ＰＫＣ−α及びＰＰ１の活性が共にヒト及び実験的心不全において増強されるとすると、本発明は、ヒトＩ−１がＰＫＣ−αによりさらなる部位（Ｔｈｒ７５）でリン酸化するという発見に、一部において基づくものである。本明細書で提示するデータは、このキナーゼがＳｅｒ６７をリン酸化するのと同程度にＴｈｒ７５をリン酸化するということを示している、さらに両方の残基は互いに独立してリン酸化される。広範な動態解析は、これらのＰＫＣ−α部位のどちらもがＰＰ１の触媒サブユニットの活性を阻害しないことを示す。さらに、これらのリン酸化したどちらの部位もＩ−１のＰＫＡ媒介の阻害作用を妨げない。この新規なリン酸化部位の発見は、心不全の治療のための新しい薬剤及び治療、特に、病態の下で上昇したＰＰ１、ＰＫＡ及びＰＫＣ−αの活性の間の相互作用に基づいた新しい治療の方法を提供するものである。
【００６９】
従って、心不全を有する対象を治療する方法は、ＰＫＣ−αのリン酸化活性を阻害することを包含すると考えられる。さらに、ＰＫＣ−αのリン酸化活性を阻害することに加えて、ＰＫＡのリン酸化活性を増強することも含まれると考えられる。
【００７０】
本発明の実施態様による治療方法は、対象の心臓細胞に、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型であって、野性型におけるＰＫＣ−αによるリン酸化部位の、構成的に非リン酸化状態の若しくは非リン酸化状態に似た少なくとも１つのアミノ酸を包含する突然変異型をコードする配列を含有してなる核酸を導入することを包含する。
【００７１】
より特異的な実施態様では、突然変異型は対象の残基（例えば、Ｓ６７及び／又はＴ７５）のリン酸化可能な水酸基を取り除く又は置換するような突然変異を包含するものである。より特異的な実施態様では、Ｔ７５及び／又はＳ６７残基は置換若しくは欠失していてもよい。
【００７２】
例えば、突然変異型は、構成的に非リン酸化状態のアミノ酸であって、野性型タンパク質のＰＫＣ−αによるリン酸化部位のアミノ酸を少なくとも１つ含んでいてもよい。特異的な実施態様では、少なくとも１つのアミノ酸が、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型の６５位のアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）若しくはシステイン（Ｃ）、又は７５位のアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）若しくはシステイン（Ｃ）である。アミノ酸の置換は、同様の電荷（電荷を持たない）に基づいて、同類置換を選択すること、及びサイズ（バルクの欠如）に基づいて選択されてもよい。
【００７３】
別の特異的な実施態様では、突然変異型は、野性型タンパク質のＰＫＡによるリン酸化部位の、構成的にリン酸化状態の少なくとも１つのアミノ酸を含有してなる。例えば、その少なくとも１つのアミノ酸は、ホスファターゼインヒビター−１プロテインの突然変異型の３５位のアスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）であってよい。また、アミノ酸の置換は同様の電荷（負）及びサイズ（バルクの欠如）に基づいて選択されてよい。
【００７４】
Ｔ３５突然変異体を使用するようなリン酸化状態に似ていることが残基に好ましい実施態様では、突然変異はグルタミン酸又はアスパラギン酸に関する残基の置換を包含すると考えられる。
【００７５】
核酸分子
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば、線状、環状、ｃＤＮＡ又は染色体）及びＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）及びヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含む。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよいが、有利には二本鎖ＤＮＡである。本発明の核酸分子は、その核酸が由来する生物の染色体ＤＮＡにおいてその核酸分子に天然的に隣接する配列（つまり、核酸分子の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない核酸分子を含む。さらに、ｃＤＮＡ分子のような単離された核酸分子は、組換え技術によって生成された場合は実質的に他の細胞物質を含まなくてもよい、又は化学的に合成された場合は実質的に化学的前駆体若しくは他の化学物質を含まなくてもよい。
【００７６】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５及び配列番号１７で示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、標準的な分子生物学の技術及び本明細書に開示する配列情報を用いて単離することができる。例えば、核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション法若しくはクローニング法を用いて単離できる（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)に記述のように）、又は例えば配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５及び配列番号１７で示される配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により単離することもできる。本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又その他にもゲノムＤＮＡを、標準的なＰＣＲ増幅技術法によるテンプレート及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて増幅することができる。別の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５及び配列番号１７で示されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子を包含する。
本発明は同様に、本明細書に記載される核酸分子を含む組換え核酸分子（例えば、組換えＤＮＡ分子）を特徴とする。
【００７７】
ポリペプチド
本発明の別の態様は、ポリペプチドを特徴とする。
当業者が、天然の遺伝子によりコードされるアミノ酸と同一のアミノ酸をコードする核酸を遺伝コードの縮退により突然変異（例えば、置換）させることができるということはよく理解されている。これは、特定の生物で発現するように核酸のコドンの使用法を改善するのに望ましいものであり得る。さらに、当業者が保存アミノ酸の置換をコードする核酸を突然変異（例えば、置換）させることができるということもよく理解されている。さらに、当業者が、天然の遺伝子産物と比較して実質的に機能に影響を与えることなく、ある程度まではアミノ酸を置換、付加又は欠失させることができるということもよく理解されている、いずれの場合も本発明の範囲内に含まれる。
一実施態様では、本発明のポリペプチドは配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する。
【００７８】
配列相同性
配列間の相同性若しくは配列同一性（本明細書においてこれらの用語はほぼ同じ意味で使われる）は以下のように計算される。２つのアミノ酸配列若しくは２つの核酸配列の相同率を決定するために、配列を最適な比較ができるように並べる（例えば、最適なアラインメントのためにアミノ酸若しくは核酸配列の第一若しくは第二の１つ若しくは両方にギャップを挿入することができ、非相同な配列は比較目的から無視されてよい）。好ましい実施態様では、比較目的で並べられた参照配列の長さは、少なくともその参照配列の３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％及び１００％である。そして、対応するアミノ酸の位置若しくはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置に、第二の配列の対応の位置と同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドがあれば、その分子はその位置において同一である（本明細書で使われるアミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」とほぼ同じ意味である）。これら２つの配列間の同一性の割合は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されたギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮して、その配列間で共有される同一な位置の数の関数で表される。
【００７９】
配列の比較及び２つの配列間の相同率の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成される。好ましい実施態様では、２つのアミノ酸配列の間の相同率は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４のギャップ加重及び１、２、３、４、５若しくは６の長さ加重を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comより入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているニードルマン・ヴンシュ（(1970)J. Mol. Biol. 48:44-453）のアルゴリズムを用いて決定される。さらに別の好ましい実施態様では、２つのヌクレオチド配列の相同率は、ＮＷＳギャップＤＮＡ．ＣＭＰマトリックス並びに４０、５０、６０、７０又は８０のギャップ加重及び１、２、３、４、５又は６の長さ加重を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comより入手可能）のＧＡＰプログラムを用いて決定される。特に好ましいパラメータの組み合わせ(及び他に特に規定がなければ用いるべき１つ)は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸張ペナルティ、５のフレームシフト・ギャップペナルティのＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスである。
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の相同率は、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているメイヤーとミラー（E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS, 4:11-17）のアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００８０】
遺伝子導入／送達
導入は、望ましい結果を達成するいずれかの既知若しくは未知の技術によってなされると考えられる。本明細書に記載される核酸は、遺伝子治療のプロトコルの一部として使用される遺伝子コンストラクトに組み込まれてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子導入の方法は、当該技術分野で公知である。手法には、組換えレトロウイルス、アデノウイルス（例えば、複製欠損した第一世代、又は欠如した(gutted)第二世代のアデノウイルス）アデノ随伴ウイルス（例えば、ウイルスカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０又はＡＡＶ１１カプシドのようなＡＡＶカプシドであってよい；当業者であれば、同様の若しくは類似の機能を果たす未確認の他の異性体が存在し得るということは公知であろう；又は２つ若しくはそれ以上のＡＡＶカプシドの成分を含んでいてもよい、米国特許第６，４９１，９０７に記載）、レンチウイルス及びおそらく単純ヘルペスウイルス１、又は組換え細菌性若しくは真核性プラスミドを含む。レンチウイルス粒子及び他のウイルス粒子を産生するために、目的の薬剤をコードする核酸はパッケージングシグナルに作動可能に連結される。核酸はウイルスの構造タンパク質を発現する細胞にパッケージされる。例えば、細胞はウイルスの構造タンパク質をコードするがパッケージングシグナルを欠く核酸を含んでいてもよい。
【００８１】
アデノ随伴ウイルスは、第１９染色体に部位特異的に組み込まれることができる非病原性ヒトパルボウイルスである（Fisher et al., Nature Medicine (1997)）。しかしながら、ウイルスの複製は、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスを必要とする（Fisher et al., Nature Medicine (1997)）。ＡＡＶコード領域は、非ウイルス遺伝子に置き換えることができて、修飾されたウイルスは分裂及び非分裂の細胞の両方に感染させるために利用できる（Xiaoet al., J. Virol. (1996); Kaplitt et al., Ann. Thorac. Surg. (1996)）。ＡＡＶの調製及び使用のための具体的な方法は、Fisher et al., Nature Medicine (1997) Xiao et al., J. Virol. (1996), Kaplitt et al., Ann. Thorac. Surg. (1996)に記載されている。
【００８２】
二重のパルボウイルスベクター（パルボウイルスのカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）を含有するパルボウイルス粒子）及び異種のヌクレオチド配列をコードする自己相補的なベクターゲノム（すなわち、ベクターゲノムは二量体の逆位反復性である）を含む、種々の組換えＡＡＶゲノムの構造は、国際公開第０１／０９２５５１号公報に記載されている。
【００８３】
ウイルスベクターは細胞に直接的に導入される；
プラスミドＤＮＡは、例えばカチオン性リポソーム（リポフェクチン）又は誘導体化物（例えば、抗体結合型）、ポリリシン複合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ又は他の細胞内のキャリアのようなものを用いて送達されてもよい、更にはｉｎ  ｖｉｖｏでは遺伝子コンストラクト又はＣａＰＯ４沈殿物が直接的に注入されてもよい。
【００８４】
心臓血管組織への遺伝子導入は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）若しくはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターによって駆動される、強力な、組織特異的でない遺伝子発現カセットを伴うアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを首尾よく用いている。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のような血管新生因子を送達するウイルスベクターでの心臓細胞の導入を含む臨床試験が継続されている。ウイルスの大動脈内若しくは冠動脈内の注入は、動物モデルのｉｎ  ｖｉｖｏで行われている。嚢胞性線維症の研究により知られているように、機能の改善のために１つの組織の全ての細胞の導入が必要とされているわけではない。
【００８５】
組織特異的なプロモーターは、心筋の遺伝子発現の特異性を高めるために使用されている（Rothmann, et al., Gene Ther. (1996)）。心臓へ導入される遺伝子の発現を制限する別の方法は、心筋へのウイルスベクターの直接的な注入を含む（Gutzman, et al., Cric. Res. (1993); French, et al., (1994), Circulation. (1994)）。別の試みは、プロテイナーゼ処理と組み合わせた心膜内へのウイルスベクターの注入を含むものであった（Fromes, et al., Gene Ther. (1999)）。これらの操作は、強いウィルスベクターの拡散の欠如による難点もあったが、局所的な遺伝子送達を達成した。
【００８６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによる心筋遺伝子送達の効果はｉｎ  ｖｉｔｒｏでラット新生仔の培養細胞を用いて確認され、浸漬されたラット乳頭筋を用いたｅｘ  ｖｉｖｏシステムでも確認された（Maeda, et al., J. Mol. Cell. Cardiol. (1998)）。ｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＡＶベクター導入に続く心臓の同系移植がマーカー遺伝子の発現が高い効率で達せられるということが報告されている（Svensson et al., Circulation. (1999)）。高レベルのｉｎ  ｖｉｖｏでの心筋指向性（ｃａｒｄｉｏｔｏｐｉｃ）遺伝子導入を高い一貫性で（心筋細胞の平均６０〜７０％）達成した方法は、例えば米国特許出願公報第２００２００３２１６７号に記載されている。ウイルスベクターの他の調製及び使用方法は、国際公開第９６／１３５９７号公報、同９６／３３２８１号公報、同９７／１５６７９号公報及びTrapnell, et al., Curr. Opin. Biotechnol. (1994); Ardehali, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1995); Dalesandro, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1996); Sawa, et al., Circ (1995); Lee, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1996); Yap, et al., Circ. (1996); 及びPellegrini, et al., Transpl. Int. (1998)に記載されている。
【００８７】
また、対象のポリヌクレオチドは、非ウイルス性送達媒体を用いて投与されてもよい。本明細書では、「非ウイルス性送達媒体」（本明細書においては「非ウイルス性ベクター」とも言われる）は、裸の若しくは凝縮したポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド及びカチオン化合物（例えば、硫酸デキストラン）の剤形）及びウイルス粒子のようなアジュバントと混合した裸の若しくは凝縮したポリヌクレオチド（すなわち、その目的のポリヌクレオチドはウイルス粒子には含まれないが、その形質転換体は裸のポリヌクレオチド及びウイルス粒子の両方からなる（例えば、アデノウイルス粒子）（例として、Curiel, et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1992)を参照されたい））を含有する化学的な剤形を含むことを意味する。従って、「非ウイルス性送達媒体」は、ポリヌクレオチドに加えて目的のポリヌクレオチドを含まないウイルス粒子からなるベクターを含んでいてもよい。
【００８８】
「非ウイルス性送達媒体」は、送達されるポリヌクレオチドがカプシドに包まれたものでない若しくはウイルス粒子の中に含まれるものでない、細菌プラスミド、ウイルスゲノム又はその一部、並びにウイルスゲノムの一部、及び細菌プラスミド及び／又はバクテリオファージの一部を包含するコンストラクトを含むものである。この用語はまた、天然の及び合成のポリマー及び共重合体も含み、さらに脂質ベースの媒体をも含む。脂質ベースの媒体には、Felgner, et al.（米国特許第５，２６４，６１８号、同第５，４５９，１２７号；PNAS 84:7413-7417 (1987)；Annals N.Y. Acad. Sci. (1995)）により開示されたようなカチオン性リポソームも含まれ；それらもまた中性若しくは負に帯電したリン脂質又はSchreier, et al.（米国特許第５，２５２，３４８号及び同第５，７６６，６２５号）により開示された人工のウイルスエンベロープを含むその混合物も含まれてもよい。
【００８９】
非ウイルス性送達媒体はポリマーベースの担体を含む。ポリマーベースの担体は、天然及び合成ポリマー並びに共重合体を含んでいてもよい。好ましくは、ポリマーは、生分解性であるか、又は対象から容易に除去できるものであってもよい。天然のポリマーは、ポリペプチド又は多糖を含む。合成ポリマーは、分子が縮合剤にもなり得るポリリシン及びポリエチレンイミン（PEI; Boussif, et al., PNAS 92:7297-7301 (1995)）を含むが、これらに限定されない。これらの担体は、水、エタノール、食塩水及びこれらの混合液のような分散液中に溶解、分散若しくは懸濁されてもよい。当該技術分野で公知の様々な合成ポリマーを使用することが可能である。
【００９０】
ウイルス送達システムのユニットを含む調製物は、当該技術分野で公知の種々の方法のいずれかにより対象の心臓細胞に（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで）送達できる。
臨床設定において、治療遺伝子の遺伝子送達システムは、それぞれが当該技術分野でよく知られている数ある方法のいずれかによって患者に導入され得る。例えば、遺伝子送達システムの医薬調製物は、例えば静脈注射により全身に導入され、そして標的細胞におけるタンパク質の特異的な形質導入が、主に、遺伝子送達媒体、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型若しくは組織型の発現又はその組み合わせにより与えられる形質転換の特異性によって生じる。他の実施態様では、組換え遺伝子の初期の送達は、極めて局所的になされる動物への導入により制限される。例えば、遺伝子送達媒体はカテーテル（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）又は定位的注入（例えば、Chen, et al. PNAS 91:3045-3057 (1994)）により導入され得る。
【００９１】
投与経路は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入又は経口摂取）、経皮（局所）、及び経粘膜的を含む。また、例えば、動脈内、筋肉内、心膜内、又は静脈内へのような注入も考えられる。
【００９２】
一実施例では、調製物は直接心臓組織へ注入される。米国出願第１０／９１４，８２９号で、直接的な注入のプロトコルについて記載されている。心筋へのウイルスベクターの直接的な注入又は適用は、心臓へ伝達された遺伝子の発現を制限できる（Gutzman et al., Cric. Res. (1993); French et al., Circulation (1994)）。また、調製物は細胞へｅｘ  ｖｉｖｏで提供されてもよい。次いで目的のタンパク質を含有する細胞（例えば、Ｉ−１の突然変異体）は、患者に投与される。
【００９３】
別の実施例では、調製物は１又はそれ以上の冠状動脈の内腔へ導入される。環状動脈からの血液の通過は制限されてもよい。調製物は順行性の送達をされて、動脈内に１〜５分間（例えば、１〜３分間）存在してもよい。
【００９４】
他の実施例では、国際公開第０１／０９１８０３号公報に記載されているように、調製物は支持マトリックス（例えば、縫合物、外科的に埋め込まれた物質、移植物等）に接着されて、局部組織及び／又は血管環境に制御された若しくは制御されない放出を提供する。
非ウイルス性媒体は類似の方法で送達されてもよい。
【００９５】
医薬組成物
本発明の単離された核酸分子又はポリペプチドは、例えば、ヒトのような対象への投与に適した医薬組成物に組み込まれる。このような組成物は通常ポリペプチド又は核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与に適合する、いずれかのそして全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことを意味する。そのような媒体及び薬剤が薬学的に活性な基質用に使用されることは知られている。いずれかの従来の媒体又は薬剤がその活性な化合物と適合できない場合を除いて、そのような媒体は本発明の組成物において使用され得る。また、その組成物には、補足的に活性な化合物を組み込むこともできる。
【００９６】
医薬組成物は、目的の投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶媒又は懸濁液は、以下の成分を含有する：注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩のような緩衝剤及び塩化ナトリウム若しくはデキストロースのような等張圧調整剤。ｐＨは、塩酸若しくは水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジ、又は複数回投与のバイアルに入れてもよい。
【００９７】
注射的使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び減菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈投与に関して、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ）（登録商標）（BASF, Parsippany, NJ）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合に、組成物は無菌で、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。製造及び保存条件下で安定で、また微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用に対して保護されているべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）を含む、溶媒又は分散媒質、及びそれらの適切な混合物であってよい。
【００９８】
適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆物の使用によって、分散物の場合は最適な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等のような、様々な抗菌及び抗真菌剤によって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによって、注射可能な組成物の持続的吸収を生じさせることができる。
【００９９】
注射可能な滅菌溶液は、活性な化合物（例えば、本明細書に記載の単離された拡散分子）を最適な量で上に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに適切な溶媒に組み込むことにより調製されて、次いでろ過滅菌されてよい。一般的に、分散物は、塩基性の分散媒及び上に列挙した他の成分を含有する滅菌媒体に治療用の薬剤を組み込むことにより調製される。注射可能な滅菌溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧下で乾燥させて凍結乾燥させる方法であり、前もってろ過滅菌された溶液からの付加的な所望の成分の何れかを加えた有効成分の粉末が得られる。
【０１００】
全身的な投与は、経粘膜的又は経皮的に行われる。経粘膜的又は経皮的投与に関して、浸透すべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤中に用いられる。そのような浸透剤は一般的に知られているものであり、例えば、経粘膜的投与のための洗浄剤、胆汁塩、フシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜的投与は、鼻腔用スプレー又は座薬を用いることによりなされる。経皮的投与に関して、活性化合物は、当該技術分野で公知の軟膏（ointments、salves）、ゲル 又はクリームに製剤化される。
【０１０１】
治療用薬剤は、植込錠及びマイクロカプセル化した送達システムを含む、放出制御製剤のような、体内からの迅速な排出を防ぐ担体（複数も）と共に調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかなものである。また、材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より商業的に入手可能である。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染させた細胞を標的にしたリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者にとって公知の方法によって調製することができる。
【０１０２】
医薬組成物は、容器、パック又はディスペンサーに投与に関する説明書と共に含まれていてよい。遺伝子治療構築物の医薬製剤は、遺伝子送達媒体が埋め込まれた徐放性マトリックスを包含するものであってもよい。組換えパルボウイルス、特に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、例えば、治療用のウイルスベクターが支持マトリックス上で乾燥される（すなわち、接着される）、脱水又は乾燥の工程（すなわち、不完全又は完全な乾燥、凍結乾燥）に続く遺伝子治療のための（上記の）核酸配列（すなわち、遺伝子及びＤＮＡ配列）の送達に使用できる。有用な支持マトリックスは、包装及び対象への輸送のための外科的に埋込み可能な物質（すなわち、縫合物、外科的な移植物質、埋込み型可能な装置等）を含み、それにより支持マトリックスに接着したｒＡＡＶによって遺伝子治療法の送達を可能にする。詳しくは国際公開第０１／０９１８０３号公報に記載されている。または、完全な遺伝子送達システムが、組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）から無傷で産生された場合、その医薬調製物は遺伝子送達システムを産生する１つ又はそれ以上の細胞を包含することができる。
【０１０３】
送達される核酸分子は、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−リポソーム錯体製剤としても製剤化できる。そのような錯体は、カチオン電荷（静電相互作用）の方法によって遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する脂質の混合物を包含する。本発明で使用されるカチオン性リポソームは、３．β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン）−カルバモイル］−コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ビス（オレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニオ−プロパン）（ＤＯＴＡＰ）（例えば、国際公開第９８／０７４０８号公報を参照されたい）、リシニルホスファチジルエタノール−アミン（Ｌ−ＰＥ）、リポスペルミンのようなリポポリアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロマイド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、Ｎ（１，２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＧＬ−６７、ＧＬ−８９、リポフェクチン及びリポフェクタミン（Thiery, et al., Gene Ther. (1997); Felgner, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. (1995); Eastman, et al., Hum. Gene Ther. (1997)）を含む。また、米国特許第５，８５８，７８４号に記載のポリヌクレオチド／脂質製剤も本明細書に記載の方法において使用され得る。多くのこれらの脂質は、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ及びＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（バーミンガム、アラバマ）より商業的に入手可能である。また、米国特許第５，２６４，６１８号、同５，２２３，２６３号及び同５，４５９，１２７号において開示されたカチオン性リン脂質も含まれる。使用され得る他の好適なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール等を含む。コレステロールが含まれてもよい。
【０１０４】
投与
上述の医薬組成物は、罹患血管（例えば、動脈）又は臓器（例えば、心臓）に注入され得る。治療の実施態様の一方法において、心臓の冠状動脈を通る血流が制限され、ウイルス送達システムが冠状動脈の内腔に導入される。特定の態様では、冠状静脈からの血流が制限されている間も心臓はポンプとして機能する。別の特定の実施態様では、心臓からの大動脈血流が制限されている間にウイルス送達システムが注入されて、それによりウイルス送達システムが流入し心臓に送達される。他の実施態様では、冠状血管の血流が完全に制限され、特にそのような態様で制限された冠状血管は、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）、左冠動脈回旋枝（ＬＣＸ）、大冠状静脈（ＧＣＶ）、中心静脈（ＭＣＶ）又は前室間静脈（ＡＩＶ）を包含する。ある特定の実施態様では、ウイルス送達システムは、冠状血管の虚血プレコンディショニングの後に導入される。
【０１０５】
別の実施態様では、ベクターを包含するウイルス送達システムは、血流が冠状動脈へリダイレクトするように心臓からの大動脈血流を制限する；ベクターが冠状動脈へ流入するようにベクターを心臓の内腔、大動脈又は冠状動脈口へ注入する；心臓からの大動脈血流が制限されている間も心臓をポンプとして機能させる；及び大動脈の血流を回復させる段階を包含する方法により心臓に注入される。より特異的な実施態様では、ベクターはカテーテルで心臓に注入され、さらに特異的な実施態様ではベクターは心臓の筋肉へ直接的に注入される。
【０１０６】
ＰＫＣ−αの活性が心不全の病態において上昇すると考えれば、ＰＫＣ−α阻害は、心不全の治療のための薬学的標的を構成するものである。従って、ＰＫＣ−αのアンタゴニスト又はＰＫＣ−αの活性を阻害する作用を有する薬剤を本発明の核酸又はポリペプチドと組み合わせて投与される。心筋収縮性の低下が望ましいような状況では、ＰＫＣ−αのアゴニストとして作用する薬剤の追加投与が指示される。
【０１０７】
治療の評価
本発明の治療方法は、心機能又は心筋細胞機能（例えば、心拍数、心臓代謝、心収縮性、心室機能、Ｃａ２＋代謝及び筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ活性などが挙げられるが、これらに限定されない）に関するパラメーターにおける治療による影響を評価して判断する。
【０１０８】
また、治療は、対象への影響によって（例えば、治療の分野において熟練した者が特定の治療に関連すると認識するパラメーターによって）も評価され得る。例えば、心不全の治療において典型的なパラメーターは心機能及び／又は肺機能に関するものであってよい。心臓のパラメーターは、脈拍、ＥＫＧシグナル、内腔の喪失、心拍数、心収縮性、心室機能、例えば、左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、左室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、Ｃａ２＋代謝、例えば、細胞内のＣａ２＋濃度若しくはピーク又は静止Ｃａ２＋濃度、力の発生、心臓の弛緩及び圧力、力−収縮頻度関係、心臓細胞の生存率若しくはアポトーシス又はイオンチャンネル活性、例えば、ナトリウムカルシウム交換、ナトリウムチャンネル活性、カルシウムチャンネル活性、カリウムナトリウムＡＴＰアーゼポンプ活性、ミオシン重鎖の活性、トロポニンＩ、トロポニンＣ、トロポニンＴ、トロポミオシン、アクチン、ミオシン軽鎖キナーゼ、ミオシン軽鎖１、ミオシン軽鎖２又はミオシン軽鎖３、ＩＧＦ−１受容体、ＰＩ３キナーゼ、ＡＫＴキナーゼ、ナトリウム−カルシウム交換体、カルシウムチャンネル（Ｌ及びＴ）、カルセクエストリン又はカルレティキュリンを含む。評価は、例えば、治療前、治療後若しくは治療中の、血管造影（例えば、量的な血管造影）及び／又は血管内エコー（ＩＶＵＳ）の実施を含んでいてもよい。
【０１０９】
心不全の診断／予知方法
さらに、本明細書においては、対象から心筋のホスファターゼインヒビター−１プロテインのサンプルを採取して、少なくとも１つのリン酸化されたＰＫＣ−αのリン酸化部位の存在を検出することによる、さらに具体的には、その少なくとも１つのリン酸化されたＰＫＣ−αのリン酸化部位はＴ７５又はＳ６７を包含している、対象の心不全を診断又は予知するものである。
【０１１０】
キット
本発明の単離された核酸分子又はポリペプチドは、キットにおいて提供される。キットは、（ａ）核酸分子又はポリペプチド（例えば、核酸分子又はポリペプチドを含む組成物）、及び（ｂ）情報的物質を含むが、これらに限定されない。情報的物質は、説明的、教示的、販売手段として又は本明細書に記載の方法及び／又は本明細書に記載の方法のための本発明の核酸分子又はポリペプチドの使用に関する他の物質を含んでもよい。例えば、情報的物質は心不全に関するものであってよい。
【０１１１】
一実施態様において、情報的物質は、例えば、好適な投与量、投与形態又は投与方法（例えば、本明細書に記載の投与量、投与形態又は投与方法）のような、本明細書に記載の方法を実施する好適な手段における本発明の核酸分子又はポリペプチドの投与の指示書を含んでいてもよい。別の実施態様では、情報的物質は、好適な対象（例えば、ヒト（例えば、心不全に罹患している又はリスクのあるヒト）に本発明の核酸分子又はポリペプチドを投与するための指示書を含んでいてもよい。例えば、その物質は、本発明の核酸分子又はポリペプチドを心筋症に罹患している又はリスクのある対象に投与するための指示書を含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明の単離された核酸分子又はポリペプチドに加えて、キットの組成物は、溶媒若しくは緩衝剤、安定剤、防腐剤、及び／又は心不全の治療のための第二の薬剤のような他の成分を含んでいてもよい。または、その他の成分は、キットに、しかし本発明の核酸分子又はポリペプチドとは異なる組成物又は容器に含まれてもよい。そのような実施態様では、キットは、本発明の核酸分子若しくはポリペプチドをその他の成分と混ぜるため、又は本発明の核酸分子又はポリペプチドを他の成分と共に使用するための指示書を含んでいてもよい。
【０１１３】
本発明の核酸分子又はポリペプチドは、例えば、液体、乾燥させた若しくは凍結乾燥させた形態のような形態の何れかで提供されてもよい。好ましくは、本発明の核酸分子又はポリペプチドは実質的に純粋及び／又は無菌である。本発明の核酸分子又はポリペプチドが溶液で提供される場合、その溶液は水溶液であり、滅菌溶液であることが好ましい。本発明の核酸分子又はポリペプチドが乾燥した形態で提供される場合、通常は適切な溶媒を加えることにより再構成される。その溶媒、例えば滅菌水若しくは緩衝液は、キットに含まれていてもよい。
【０１１４】
キットは、本発明の核酸分子又はポリペプチドを含有する組成物のための容器を１つ又はそれ以上含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、そのキットはその組成物のための個別の容器、仕切り又はコンパートメント及び情報的物質を含むものである。例えば、組成物は、瓶、バイアル又はシリンジに収容されてよく、情報的物質はプラスチックスリーブ又は包みに収容されてよい。他の実施態様では、キットの個別の要素は、単一の分割されていない容器に収容される。例えば、組成物は、ラベルの形でその情報的物質が添付された瓶、バイアル又はシリンジに収容される。いくつかの実施態様では、キットは、個々の容器を複数（例えば、１パック）含み、それぞれは薬剤の１つ又はそれ以上の剤形（例えば、本明細書に記載の剤形）の単位を含む。例えば、キットは複数のシリンジ、アンプル、ホイル包装又はブリスター包装を含み、それぞれが本発明の核酸分子又はポリペプチドの１単位用量を含有する。キットの容器は、気密及び／又は防水性でもよい。キットは、例えば、ステント、シリンジ又は有用な送達デバイスのような組成物の投与に適したデバイスを含んでもよい。
【０１１５】
抗体
配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を包含する単離されたポリペプチドに選択的に結合する抗体も同様に意図される。抗体を調製する方法は免疫学における当業者に公知である。本明細書では、「抗体」という用語は、無傷の抗体分子のみならず免疫原−結合能を保持する抗体分子の断片も意味する。そのような断片もまた当該技術分野で公知であり、通常ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で採用される。従って、本明細書では「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、公知の活性フラグメントであるＦ（ａｂ’）２及びＦａｂも意味する。無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠くＦ（ａｂ’）２及びＦａｂフラグメントはより迅速に循環から除去され、無傷の抗体のより低い非特異的な組織結合性を有していてもよい（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)）。本発明の抗体は、完全に天然な抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域のフラグメント（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、及び特殊な抗体を包含する。
【０１１６】
一実施態様では、配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、又は構成的に非リン酸化状態のその断片を包含する単離されたポリペプチドに結合する抗体はモノクローナルである。あるいは、その抗体はポリクローナル抗体である。また、ポリクローナル抗体の調製及び使用は、当業者に公知である。さらに、本発明は、一組の重鎖及び軽鎖が第１
の抗体から得られるものであり、他方の組の重鎖及び軽鎖が異なる第２の抗体から得られる、ハイブリッド抗体も含む。ハイブリッドは、ヒト化重鎖及び軽鎖を用いて形成されてもよい。このような抗体は、度々「キメラ」抗体とも言われる。
【０１１７】
一般に、無傷の抗体は「Ｆｃ」及び「Ｆａｂ」領域を含むと考えられている。Ｆｃ領域は、補体活性化に関与するが、抗原結合には関与しない。Ｆｃ’領域が酵素的に切断された又はＦｃ’領域なしに産生される抗体、指定された「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントが、無傷の抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ’領域が酵素的に切断された又はＦｃ’領域なしに産生される抗体、指定された「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントが、無傷の抗体の１つの抗原結合部位を保持する。Ｆａｂ’フラグメントは、共有結合している抗体軽鎖と抗体重鎖の一部を含み、「Ｆｄ」と示される。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主な決定要因である（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させることなく１０までの異なる軽鎖と結びつく）。単離されたＦｄフラグメントは、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保つ。
【０１１８】
抗体は、当業者に公知の方法のいずれかにより、配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、若しくはその構成的に非リン酸化状態の断片、又はその免疫原性の断片を包含する単離されたポリペプチドを利用して、免疫原として産生される。抗体を入手する１つの方法は、好適な宿主動物に免疫原で免疫を与えて、ポリクローナル又はモノクローナル抗体産生のための標準的な手順に従うことである。免疫原は、細胞表面上の免疫原提示を容易にする。好適な宿主の免疫化は、数多くの方法で実施できる。配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、若しくはその構成的に非リン酸化状態の断片、又はその免疫原性の断片を包含する単離されたポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主の免疫細胞によって取り込まれる送達媒体により宿主に提供することができる。言い換えると、細胞は、細胞表面上に受容体を発現し、宿主において免疫反応を起こす。あるいは、配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、若しくはその構成的に非リン酸化状態の断片、又はその免疫原性の断片を包含する単離されたポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞に発現して、続いて受容体が単離されて、抗体が発生した好適な宿主へ受容体が投与されてもよい。
【０１１９】
また、配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、又はその構成的に非リン酸化状態の断片を包含する単離されたポリペプチドに対する抗体は、所望であれば、抗体ファージディスプレイライブラリから得てもよい。バクテリオファージは、細菌に感染して、その細菌中で増殖することができて、ヒト抗体遺伝子と組み合わせた場合にヒト抗体タンパクを提示するように改変されてもよい。ファージディスプレイ法は、ファージがその表面にヒト抗体タンパクを「ディスプレイ（提示）」するように作成される過程である。ヒト抗体遺伝子ライブラリー由来の遺伝子がファージの個体群に挿入される。それぞれのファージは、異なる抗体に対する遺伝子を運び、それにより異なる抗体をその表面に提示する。
【０１２０】
当該技術分野で公知の方法のいずれかにより作成された抗体は、次いで宿主から精製されてもよい。抗体の精製法は、塩析沈殿法（例えば、硫酸アンモニウムで）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン又は陰イオン交換カラムで、好ましくは中性のｐＨで処理し、イオン強度の増加の勾配を変えて溶出する）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲルろ過ＨＰＬＣを含む）、及びプロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイト及び抗免疫グロブリンのような親和性樹脂でのクロマトグラフィーを含んでいてもよい。
【０１２１】
抗体は、その抗体を発現するように設計されたハイブリドーマ細胞から産生される。ハイブリドーマの作成方法は当該技術分野で公知である。ハイブリドーマ細胞は適切な培地で培養され、使用済みの培地は抗体源として使用されてもよい。目的の抗体をコードするポリヌクレオチドは、その抗体を産生するハイブリドーマから入手することができ、次いでその抗体は合成的に又は組換え的にこれらのＤＮＡ配列から産生されてもよい。大量の抗体を産生するためには、腹水を入手することが一般的にはより便利である。腹水を生じさせる方法は、通常ハイブリドーマ細胞を免疫学的に未熟な組織適合性又は免疫耐性の哺乳動物、特にマウスへ注入することを含む。予め適切な組成物（例えば、プリスタン）を投与することにより哺乳動物は腹水の産生の準備ができる。
【０１２２】
本発明の方法により製造されるモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）は、当該技術分野で公知の方法により「ヒト化」される。「ヒト化」抗体とは、少なくとも部分的な配列が当初の形態からよりヒト免疫グロブリンに似た状態に改変された抗体である。抗体のヒト化の技術は、非ヒト動物の（例、マウスの）抗体を産生する場合に特に有用である。ネズミの抗体をヒト化するための方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同５，５３０，１０１号、同５，２２５，５３９号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号、及び同５，８５９，２０５号に記載されている。
【０１２３】
本発明は、続く補助実験及び実施例を参照することにより、より完全に理解されるものである。しかしながら、実施例は本発明の特定の態様を説明しようとするものであり、請求項によって示される本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０１２４】
(実施例)
本発明者らは精製したタンパク質を用いて、Ｉ−１のＰＫＣ−αによるリン酸化の実験を行った。ヒトＩ−１又はＳｅｒ６７をアラニンで置換したＩ−１突然変異体をコードするｃＤＮＡをクローンして発現した。得られた組換えタンパク質を精製してＧＳＴ標識を除去した。精製したタンパク質のＰＫＣ−αリン酸化では、３２Ｐの突然変異体への取り込みは減少するが、他にＰＫＣ−αリン酸化部位があることを示唆していて、Ｉ−１の野生型と比べて完全には阻止しないことを示した。この推定ＰＫＣ−α部位を同定するために、リン酸化状態のヒトＩ−１をエドマン分解と組み合わせてマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析に付した。これらの分析は、スレオニン７５がヒトＩ−１上の新規なＰＫＣ−α部位であると証明した。このデータを確認するために、Ｔｈｒ７５（Ｔ７５Ａ）及びＳｅｒ６７＋Ｔｈｒ７５（Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ）をアラニンで置換したＩ−１突然変異体を作製した。
【０１２５】
Ｉ−１及びその突然変異体のＰＫＣ−α処理は、Ｓ６７Ａ又はＴ７５Ａのどちらかへの３２Ｐ取り込みの減少及びＳ６７Ａ／Ｔ７５Ａへ取り込まないことを示した。二次元電気泳動による更なる分析は：１）Ｔｈｒ７５はＰＫＣ−α部位である；そして２）Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５はヒトＩ−１上のＰＫＣ−αによるたった１つのリン酸化状態の残基である：ことを証明した。Ｔｈｒ７５リン酸化の機能的意義を究明するために、プロテインホスファターゼ・アッセイを行った。ＰＫＡによるＩ−１又はＩ−１突然変異体のリン酸化は、ＰＰ１の阻害と関連していた。しかしながら、Ｉ−１のＰＫＣ−αのリン酸化はその活性に影響がなかった。更に、ＰＫＣ−αのリン酸化は、ＰＫＡによるＩ−１の阻害機能に影響がなかった。
【０１２６】
材料
ＰＫＣ−α、ＰＫＡ及びｃＡＭＰは Upstate BIotyechnology より購入した。ホスファチジルセリンは  Avanti Polar-Lipids  から入手した。ｐＧＥＸ ６Ｐ−３プラスミド、グルタチオンセファロース４Ｂ、PreScission Protease 及び Immobiline DryStrips、IPG Buffer pH４−７は、Amersham Biosciences から入手した。Quick-Change II 部位特異的突然変異生成キット及びBL21 CodonPlus(DE3)-RIPL Competent Cells はStratagene から入手した。ジアシルグリセロール、アンピシリン及びＩＰＴＧは Sigma Aldrich から入手した。SYPRO Ruby Protein Gel Stain は Cambrex から入手した。Ｔ４リガーゼ、EcoRI 及び Not I 制限酵素は New England Biolabs から購入した。タンパク質脱塩スピンカラム及び B-PER GST 溶解タンパク質精製キットは Pierce から購入した。〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰは Perkin Elmer から入手した。抗−ＡＣＩは、特注した（Affinity Bioreagents）マウスＩ−１のＮ−末端配列（１ＭＥＰＤＮＳＰＲＫＩＱＦＴＶＰ１５）（配列番号２４）に対する、アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体である。抗−ＧＳＴウサギポリクローナル抗体は Affinity Bioreagents から入手した。
【０１２７】
方法
インヒビター−１突然変異プロテインの生成
ヒトＩ−１ｃＤＮＡ（GenBank Accession#Ｕ４８７０７）をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子のＣ−末端側にフレームを一致させて、ｐＧＥＸ−６Ｐ−３ベクターでクローン化した（図１Ａ）。順方向クローニングプライマーは：５’−ＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）（EcoR I 制限酵素部位は下線付き；フレームをあわせた発現のためのスペーサーヌクレオチドは陰影付き；開始コドンはイタリック体）であり、そして逆方向クローニングプライマーは：５’−ＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＧＣＴＣＣＣＴー３’（配列番号２６）（Not I制限酵素部位は下線付き；終止コドンはイタリック体）であった。PreScission プロテアーゼ切断部位は、引き続くＧＳＴ標識の除去を促進するために、ＧＳＴとＩ−１遺伝子の間に位置していた。Ｉ−１ ｃＤＮＡの突然変異を、Quick-Chenge II 部位特異的突然変異生成キットを用いて、ｐＧＥＸ−６Ｐ３ベクター中で得た。
【０１２８】
Ｓｅｒ６７をＡｌａへ突然変異するために用いたプライマーは：５’−ＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２７）（アラニンコドンは下線付き）及びその相補体であった（図１Ｂ）。Ｔｈｒ７５をＡｌａに突然変異するためのプライマーは：５’−ＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号２８）（アラニンコドンは下線付き）及びその相補体であった。Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）をＴｈｒ７５をＡｌａに突然変異するためのテンプレートとして用い；Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）に関して上記した（図１Ｂ）プライマーの同じセットを用いて、Ｉ−１（Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ）を生成した。Ｓｅｒ６７をＡｓｐへ突然変異するために用いたプライマーは：５’−ＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２９）（アスパラテートコドンは下線付き）及びその相補体であった（図１Ｃ）。Ｔｈｒ７５をＡｓｐに突然変異するためのプライマーは：５’−ＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号３０）（アスパラテートコドンは下線付き）及びその相補体であった（図１Ｃ）。Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）を、上記（図１Ｃ）のように、段階方法で生成した。
【０１２９】
これらのそれぞれのプラスミドで、BL21CodonPlus(DE3)-RIPLコンピテント細胞をトランスフェクトして、アンピシリン含有（１５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天プレート上で生育した。個々のコロニーを、３−ｍｌのＬＢ−アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）出発培地に接種して、３７℃で１６時間生育した。これらの培地１ｍｌを１００ｍｌのＬＢ−アンピシリンに接種して２５℃で２時間生育した。この時点で、無菌のＩＰＴＧを最終濃度が０．１μＭになるように添加して、培地を２５℃で更に４時間生育した。次いで細胞をペレットとして、ＧＳＴ−Ｉ−１融合タンパク質をＢ−ＰＥＲ  ＧＳＴ融合タンパク質精製キットを用いて精製した。ＧＳＴ融合タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して広範に透析して、PreScission プロテアーゼと共に４℃で４時間培養した。タンパク質切断後に、予洗したグルタチオンセファロース４Ｂを４℃で４時間又は１晩用いて、PreScission 酵素及びＧＳＴタグを培地から除去した。精製後の切断範囲及びタンパク質の収率を評価するために、Laemmli（２４）の記載のようにして、１５％のポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分析した。タンパク質の濃度を Micro Bc アッセイ（Pierce）によって測定した。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのリン酸化分析
７μｇのＩ−１又はＩ−１突然変異タンパク質を含有する１５０μｌの緩衝液中、３５℃で反応を実施した。組み替え型Ｉ−１又はＩ−１（Ｓ６７Ａ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）、Ｉ−１（Ｓ６７Ａ／Ｔ５７Ａ）突然変異体をＰＫＣ−αでリン酸化した。ＰＫＣ−α（３μｇ／ｍｌ）でリン酸化するために、最終濃度は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＦ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．３ｍＭのホスファチジルセリンそして０．０２ｍＭの１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォ−Ｌ−セリンであった。リン酸化反応は０．０２５ｍＭの〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（０．４ｍＣｉ／ｎｍｏｌ）を添加して開始した。指定された時間に、各混合物から２０μｌを回収し、ＳＤＳサンプル緩衝液（５強度）を４μｌ加えて反応を停止した。二次元電気泳動を行うために、タンパク質２５μｇ（ある場合は３５μｇ）を１００μｌの緩衝液中で、３５℃にて４５分間（ある場合は１晩）、上記のようにして、ＰＫＣ−α（４ｕｇ／ｍｌ）によりリン酸化した。全ての場合に、Ｃａ２＋（１ｍＭのＥＧＴＡの存在中）、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール及びＰＫＣ−αは対照サンプル用の混合物に入れなかった。
【０１３１】
組み替え型Ｉ−１又はＩ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）突然変異体（７μｇ）をＰＫＡでリン酸化した。ＰＫＡ（０．１μｇ）リン酸化は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１μＭのｃＡＭＰ及び０．２５ｍＭの〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（０．４ｍＣｉ／ｎｍｏｌ）又は４００μＭのＡＴＰの存在下で実施した。１時間後に、ＳＤＳサンプル緩衝液を培地に加えて反応を停止しした。対照サンプル用には、ＰＫＡ及びｃＡＭＰを反応培地に入れなかった。Ｉ−１種中への〔３２Ｐ〕−リン酸の量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィー、又はトリクロロ酢酸（２０％、ｗ／ｖ）沈殿に次いで透析によって測定した。データの濃度測定はImageQuant ５．２ソフトウェアーを用いて行った。
【０１３２】
最初の実験では、ＰＫＣ−αでリン酸化されたＩ−１は、オートラジオグラフにおいてリンタンパク質のダブレットとして移動して観察された。更なる検討で、これはＰＫＡではなくＰＫＣ−αによるリン酸化で生じることが明らかになった（図２）。このダブレットは各２つのＰＫＣ−αリン酸化部位がＡｌａに突然変異されるときに、さらに観測された（図４及び６）。興味深いことに、リン酸化緩衝液中では、Ｉ−１ダブレットは、ＰＫＣ−α活性化因子である、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォ−Ｌ−セリン（ＤＡＧ）の存在と関連していた（データは示していない）。この事実はタンパク質の正味荷電の変化、及びそれによるＳＤＳの結合減少によるものであろう。
【０１３３】
インヒビター−１上の更なるリン酸化部位の同定
新規なＰＫＣ−αによるリン酸化部位を同定するために、１０ｕｇのＧＳＴ−Ｉ−１（精製したＩ−１）を上記のように５０μｇのＰＫＣ−αリン酸化緩衝液中で微量の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で３７℃で４時間培養した。反応混合物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、ゲルを室温で１晩ＳＹＰＯ  Ｒｕｂｙで染色した。３２Ｐ−標識ＧＳＴ−Ｉ−１バンドを同定し、ゲルから切り取って、トリプシン消化した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いてトリプシンペプチドを分離して、その画分を直ちにチェレンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）カウンティングによって３２Ｐについてアッセイした。放射性のピークをマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析及びエドマン分解に付した。実験したペプチドの質量をＩ−１ヒト配列由来の予測ペプチドに対して合致させるためにＧＰＭＡＷプログラムを用いた。
【０１３４】
免疫ブロット解析
Ｉ−１種を１２％のポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離した後、タンパク質をニトロセルロース膜（穴径０．１ｕｍ、Schleicher & Schuell Bioscience）に湿潤転写（１８０ｍＡで３時間）によって転写した。非特異的な結合部位を、０．１％のツイーン２０を含有するトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中の５％の粉乳を用いて、室温で１〜２時間ブロックした。膜を抗Ｉ−１の一次抗体（１：１０００）又は抗ＧＳＴ（１：１０００）で室温で３時間又は４℃で１晩プローブした。一次抗体を可視化するために、二次ペルオキシダーゼ標識抗体（Amersham Bioscience）を、拡張した化学発光による検出システム（Supersignal West Pico Chemiliminescent, Pierce）と組合わせて用いた。このバンドの光学密度をImageQuant 5.2 ソフトウェアーで解析した。
【０１３５】
二次元電気泳動
精製したＩ−１又はＰＫＣ−α又はＰＫＡによるリン酸化Ｉ−１及び突然変異体（Protein Desalting Spin Columns を用いて一度脱塩した）を７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、１％のＩＰＧ４−７緩衝液及び０．０１％のブロモフェノールブルーよりなる再水和緩衝液中で可溶化した。可溶化したタンパク質を１８ｃｍのImmobiline（登録商標）Drystrips（ｐＨ４〜７ＮＬ）に塗布して室温で１晩培養した。再水和等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を、Genomic Solutions Investigator 2-D Electrophoresis Sysstem上で、１枚に対して５０ｍＡで６０，０００ボルト時で実施した。第二次元は１２．５％のスラブゲル上、５００Ｖで１４時間実施した。ゲルを固定して、蛍光染色（SYPRO Ruby）で室温にて１晩染色した。SYPRO染色したゲルを、FLA-3000 Imager（Fuji Medical Systems, Stanford, CT）を用いて４７５ｎｍの蛍光光線及び黄色５２０ｎｍのフィルターでスキャンした。比較するために、２−Ｄゲルを同時に処理し次いで、スポットを座標軸の標準集合に局在化させるためにProImageソフトウェアを用いた。それにより、ゲルを互いに比較できて、実験操作によるタンパク質スポットの移動パターンを容易に検出できる。
【０１３６】
マウス心臓ホモジネート由来のトリクロロ酢酸沈殿タンパク質のサンプルDeSteak Solubilization緩衝液中で可溶化した後、等電点電気泳動を行うために１１ｃｍのＩＰＧストリップに塗布した。１２．５％のポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて二次元でタンパク質を分離した後、タンパク質をニトロセルロース膜（穴径、０．１ｕｍ）に、湿潤転写（１８０ｍＡで３時間）によって転写した。ここでＩ−Ｄゲルの免疫ブロット解析を行うために、前記と同じ操作を適用した。
【０１３７】
インヒビター−１の単離
Shenolikar et al(25) の記載に修正を加えた方法によって、マウス心筋からＩ−１を単離した。すなわち、液体窒素中で凍結した組織（１．５ｇ）を乳鉢で粉砕して、２ｍｌの氷冷したリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）中で、Polytron のホモジナイザーでホモジナイズした。直ちに、５ｍｌの１．５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加えて、ホモジネートを４℃で１時間撹拌した後、９，０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。上澄液をトリクロロ酢酸１５％（ｗ／ｖ）液に調節し、４℃で１晩撹拌して、１８，０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。ペレットを０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（原抽出量の１／２０）に再懸濁し、１０分沸騰して、上記のように遠心分離した。１ＭのＮａＯＨを用いて、上澄液のｐＨを〜７に調整して、サンプルを２−Ｄ電気泳動に付した。
【０１３８】
プロテインホスファターゼ活性アッセイ
プロテインホスファターゼ活性のアッセイを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のＢｒｉｊ３５、そして随意に０．５ｎｇのＰＰ１（New England BioLabs）を含有する５０μｌの反応混合物中で実施した。１０ｕｌの標準基質３２Ｐ−標識化Myelin Basic Protein (ＭｙＢＰ)（最終濃度は５０μＭ）を添加して反応を開始した。３２Ｐ−ＭｙＢＰ基質を生成するために、商業ベースに精製されているＭｙＢＰを、製造会社（New England BioLabs）の説明書に従って、１モル当たり化学量論的に２〜４モルのリン酸エステルになるようにＰＫＡで予めリン酸化して、４℃で貯蔵した。３０℃で１０分間反応した後、２００ｕｌの２０％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止し、氷上で冷却して、遠心分離した。上澄液からの２００ｕｌをシンチレーション測定して、アッセイ液中に放出された［３２Ｐ］の量を測定した。混合物からＰＰＩを抜いたブランク反応を同時に実施した。
【０１３９】
ＰＰＩにおけるＩ−１阻害活性を測定するために、Ｉ−１の野生型及びその突然変異体（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、上記のように４００μＭのＡＴＰの存在下３０℃で１時間又は１晩リン酸化して、アッセイ培地からＮａＦを抜いた後、ＰＫＣ−α又はＰＫＡによるＰＰＩ活性アッセイに加えた。２つのキナーゼ、ＰＫＡ及びＰＫＣ−αによる二重リン酸化を以下のように段階的に実施した。ＰＫＣ−α培養後に、混合物からアリコートを回収して、ＥＧＴＡ（ａｍＭ）、ｃＡＭＰ（１μＭ）、ＰＲＡ（０．１ｕｇ）及びＡＴＰ（４００μＭ）を培地に加えた。ＰＫＡリン酸化反応を３０℃で、ＰＫＣ−α処理で用いたのと同じ時間培養した。次いで、ＰＰＩによる［３２Ｐ］ＭｙＢＰの脱リン酸化は、脱リン酸化又はリン酸化Ｉ−１又は数種のＩ−１突然変異体の存在下で観察した。
【０１４０】
Ｉ−１アデノウイルスの生成
特定部位におけるＩ−１のリン酸化の機能的効果を評価するためのｅｘ  ｖｉｖｏ発現ベクターを生成するために、特定の突然変異（例えば、Ｔｈｒ７５のＡＳＰへの突然変異（Ｔ７５Ｄ））を生じるＩ−１ｃＤＮＡを最初にpShuttle-IRES-hrGFP-1ベクターでクローンした。このベクターをＡｄＥａｓｙ−１アデノウィルスのバックボーンベクターと相同的に組み替えした（図３）。そして、Ｉ−１野生型（Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ）、Ｉ−１突然変異体Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ｉ−１（Ｔ７４Ｄ）、Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）又は緑色蛍光タンパク質（Ａｄ．ＧＦＰ）をコードするアデノウイルスを生成するために、Ad-Easy XLシステムをい用いた。これは複製欠損性組み替えアデノウイルスをもたらし、Ｉ−１（例えば、Ｔ７５Ｄ突然変異体）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の両方を発現できる。このアデノウィルスを増幅し、精製（Adenovirus Mini Purification  kit(Virapur)を用いて）して、標準的な手法によって力価を測定（Adeno-X Rapid Titer kit(Clontech)を用いて）した。
【０１４１】
アデノウィルスによる遺伝子転写及び筋細胞収縮性
心臓収縮性における特定部位でのインヒビター−１のリン酸化の効果を特徴付けるために、成熟雄性ＳＤラット（〜３００グラム）由来の心室筋細胞を既に詳述されている（Fan et al.Circ. Res.(2004)）ようにコラゲナーゼ消化によって単離した。ラットは、Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Cincinnati で承認されているようにして扱われた。筋細胞を改良培養培地（Ｍ１９９、Gibco）中に再懸濁し、計数し、ラミニン被覆カバーグラス又はディッシュに載せて、加湿５％ＣＯ２培養器中３７℃で２時間、アデノウイルスで５００倍感染濃度で感染させた。基底レベルでの、及び随意に、Forskolin（１００ｎＭ、Sigma-Aldrich）治療下での筋細胞収縮を、感染２４時間後に、Grass S5刺激（０．５Ｈｚ、四角波）で実行した。左室内径短縮率（ＦＳ％）、９０％弛緩までの時間（ベースラインの％）及び収縮及び弛緩の最大比（ｄＬ／ｄＴｍａｘ）を、video edge motion detector(Crescent Electronics）を用いて計算した。イムノブロッティングするために、培養した心筋細胞を採取して、既に記載されている（Fan et al.Circ. Res.(2004)）ようにして溶解緩衝液中に４℃で３０分間溶解した。
【０１４２】
イムノブロッティングするために、培養した心筋細胞を採取して、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ｍＭのスクロース、０．３ｍＭのＰＭＳＦ、０．５ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びプロテアーゼインヒビターカクテル（組織２０グラム当たり１ｍｌ、Sigma）を含有する可溶化緩衝液中でPolytron を用いてホモジナイズした。プロテインホスファターゼ活性を測定するために、ＮａＦを緩衝液から抜いた。
【０１４３】
筋小胞体Ｃａ２＋の培養ラット心筋細胞への取り込み
ラット心筋細胞の感染２４時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、採取して、５０ｍＭのカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ｍＭのＰＭＳＦ及び０．５ｍＭのＤＴＴ中、４℃でホモジナイズした。ミリポアろ過技術及び４５ＣａＣｌ２を用い、既に記載されている（Kiss et al. Circ. Res. (1995))）ようにして、ホモジネート中の初期ＳＲＣａ２＋取り込み比を測定した。すなわち、１００〜２５０μｇのホモジネートを、４０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．０）、９５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＮａＮ３、５ｍＭのＭｇＣｌ３、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、及び５ｍＭのＭｇＣｌ３のＫ２Ｃ２Ｏ４を含有する反応緩衝液中、３７℃で培養した。初期取り込み比を、広いカルシウム値の範囲（ｐＣａ５〜８）にわたって測定した。心筋細胞へのカルシウムの取り込みを５ｍＭのＡＴＰを添加して開始して、反応終了０、３０、６０及び９０秒後にアリコートを０．４５μｍのミリポアフィルターでろ過した。特定４５Ｃａ２＋取り込み値（最大Ｃａ２＋取り込み比、Ｖｍａｘ、及び半減最大Ｃａ取り込み濃度、ＥＣ５０）をOriginLab ５．１プログラムを用いて分析した。
【０１４４】
オートラジオグラフィー及びデータ分析
上で簡単に述べたように、３２ＰのＩ−１種への取り込み量をオートラジオグラフィーで測定した。湿潤転写後に、ニトロセルロース膜をBlue Lite Auttorad Films（IscBioExpresｓ）に２４時間又は４８時間暴露して、Image Quant５．２ソフトウェアーを用いてデータの濃度分析を実施した。
【０１４５】
統計
ｎ検定について全ての値を平均±ＳＥＭで表した。対応のない値又は一方向ＡＮＯＶＡについては、必要に応じ、スチューデントｔ−検定で比較した。
※、ｐ＜０．０５；※※、ｐ＜０．０１；※※※、ｐ＜０．００１。
【実施例１】
【０１４６】
ＰＫＣ−αによるＩ−１及びＩ−１突然変異体のリン酸化
記述のように、先行の研究はＰＫＣ−αがインヒビター−１（Ｉ−１）をＳｅｒ６７でリン酸化することを示している。Ｉ−１上に更なるリン酸化部位が存在するか否かを試験するために、Ｓｅｒ６７がアラニンで置換されているＩ−１突然変異体を上記のようにインビトロでＰＫＣ−αでリン酸化した。図４は、Ｉ−１突然変異体（Ｓ６７Ａ）のＰＫＣ−αによるリン酸化は野生型Ｉ−１と比べると大幅に減少するが、完全にはなくならないということを示している。タンパク質当たりの３２Ｐ取り込みの濃度分析は、完全に取り込んだ時点で（２０〜４５分）、Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）が野生型に存在する放射活性レベル（１００％）の４０±８．６％を取り込んだことを明らかにした。いくつかの実験で、ＰＫＣ−αの自己リン酸化に対応する、７８Ｋｄａに単一の更なるバンドが生じた。その他の放射活性バンドはどの実験においても検出されなかった。特異抗体（ＡＣ１、１：１０００）はインヒビター−１のようにリン酸バンドを認識した（図４Ｂ）。従って、これらの結果は、Ｉ−１上に少なくとも１つのさらなるＰＫＣ−αリン酸化部位が存在することを示唆している。
【実施例２】
【０１４７】
リン酸化部位の決定
Ｉ−１上の更なるＰＫＣ−α部位（複数を含む）の位置を決定するために、組み替え型精製のＩ−１を精製して、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、インビトロでＰＫＣ−αによりリン酸化した。３２Ｐ標識化Ｉ−１をＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製して、トリプシンで消化した。逆相ＨＰＬＣでトリプシンペプチドを精製すると、Vydac カラムから６２％の放射活性を含有する２つのピーク、５０及び５１が溶出した。両方の分画をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に付した。分画５１から質量対応分析により、３つの可能性のあるリン酸化ペプチドが得られた。検出された質量（予測質量＋リン酸基）は、１２２６．４４、１４９４．４５及び１５７２．６８Ｄａであり、これらは次のＩ−１配列のそれぞれと対応していた：６２ＳＴＬＡＭＳＰＲＱＲ７１（配列番号３１）、７２ＫＫＭＴＲＩＴＰＴＭＫ８２（配列番号２３）、及び１３５ＫＴＡＥＣＩＰＫＴＨＥＲ１４６（配列番号３２）（データは示していない）。同時に、ピーク５０の分析で質量１３６６．４６Ｄａのペプチドを検出し、これは配列７３ＫＭＴＲＩＴＰＴＭＫ８２（配列番号３３）（ピーク５１で見いだした同じ配列−（マイナス）最初のリジン）（データは示していない）。
【０１４８】
リン酸基のアミノ酸の位置を同定する目的で、ピーク５０より多くの放射活性を含有しているので、画分５１にエドマン分解を行った。この分画にラジオシークエンスを１５サイクル行うと、主要な放射活性シグナルが４番目のアミノ酸と共に溶出されることが示された（バックグラウンドより約３７０ｃｐｍ上）（図５Ｃ）。ＭＡＬＤＩ質量対応に対するこの結果の更なる読み込みでは、たった１つのペプチド７２ＫＫＭＴＲＩＴＰＴＭＫ８２（配列番号２３）が４位にリン酸化可能なアミノ酸を有していることを示した（図５Ｂ及び５Ｃ；リン酸アミノが網掛けで強調されている）。３番目のアミノ酸と共に少量のアイソトープ（１２０ｃｐｍ）が溶出したが、これは恐らく、Ｉ−１（７３ＫＭＴＲＩＴＰＴＭＫ８２（配列番号３３））の７２と７３リジンの間での選択的なトリプシン切断によるものであろう。５位で検出されたアイソトープの量は、この技術の一般的な人工的産物（通常約５０％）であり、前回の部位の残りに起因していた。４サイクル後には、ほぼ同じパーセントだけサイクル毎にｃｐｍが減少した。配列７３ＫＭＴＲＩＴＰＴＭＫ８２（配列番号３３）に対応するペプチドは、その３番目のアミノ酸、Ｔｈｒ７５でリン酸化されることが分かった（図５Ｄ）。従って、スレオニン７５（Ｔｈｒ７５）を、ヒトＩ−１上の新規なリン酸化部位として同定した。
【０１４９】
ＰＫＣ−αに対するリン酸化部位としてＴｈｒ７５の同一性を更に確認し、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５がヒトＩ−１の唯一のＰＫＣ−αによるリン酸化部位であるか否かを究明するために、Ｔｈｒ７５［Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）］の及びＳｅｒ６７＋Ｔｈｒ７５の［（Ｉ−１（Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ）］アラニン置換突然変異体を上記のようにして作製した。図６（Ａ及びＣ）で示されているように、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）突然変異体は、Ｉ−１野生型と比較すると、ＰＫＣ−α培養によって有意に少ない３２Ｐを取り込んだ。ＡＣＩ抗体は、インヒビター−１のように、これら全てのリン酸バンドを認識した（図６Ｂ）。４５分でのタンパク質当たりの３２Ｐ取り込みの濃度分析は、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）が野生型のレベル（１００％）の３３．８±１２．７％を取り込んだことを明らかにした（図６Ｄ）。Ｉ−１野生型はＰＫＣ−αで４５分間リン酸化すると化学量論的に０．８８モルＰｉ／モルタンパク質となり、これに対してＩ−１（Ｓ６７Ａ）及びＩ−１（Ｔ７５Ａ）へのＰｉの取り込みは、それぞれ０．３５及び０．３０モルＰｉ／モルタンパク質に減少した。図６Ａ、６Ｃ、及び６Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ経時変化反応におけるＩ−１野生型及び突然変異体への３２Ｐの取り込みを、濃度単位として表して、示している。
【０１５０】
結果は、Ｔｈｒ７５が確かに、ヒトＩ−１上のＰＫＣ−α部位であることを示唆している。Ｔｈｒ７５のＡｌａへの突然変異は、Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）突然変異体と比較すると、３２Ｐ取り込みの大幅な減少と関連しているが、この相違は統計的に有意ではない（図６Ｄ）。従って、ＰＫＣ−αは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれがＳｅｒ６７をリン酸化するのと同程度にＴｈｒ７５でヒトＩ−１をリン酸化するものと考えられる。更に、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５の両方のＡｌａへの突然変異は、Ｉ−１への３２Ｐ取り込みをなくす（図６Ａ、６Ｃ、及び６Ｄ）。これらのデータは、本明細書に記載されている条件下で、これらが精製したヒトＩ−１プロテイン上の２つの主要なＰＫＣ−αのリン酸化部位であることを示唆している。
【実施例３】
【０１５１】
二次元電気泳動によるＩ−１のＰＫＣ−αリン酸化の分析
オートラジオグラフィーの結果を更に確証するために、２−Ｄゲル電気泳動分析を用いてＰＫＣ−αリン酸化に起因するＩ−１における可能な移動度変化を検出した。２Ｄ−ゲル電気泳動はその等電点（ｐＩ）及び分子量に基づいてタンパク質を分離する。リン酸化はタンパク質のｐＩ値がより酸性になるようにするが、その分子量に対しては殆ど影響を及ぼさない。非リン酸化状態のＩ−１ゲル画像の分析は、タンパク質が５．１のｐＩ及び３０ｋＤまでの分子量の単一スポットとして２−Ｄゲル中に移動することを示めした（図７Ａ）。ＰＫＣ−αのリン酸化サンプルでは、それぞれ非リン酸化、１回のリン酸化、２回のリン酸化に対応する、ｐＩが（右から左へ）；５．１、４．９及び４．７の３つのスポットが見られた（図７Ｂ）。２Ｄゲル電気泳動に付したリン酸化状態のＩ−１の高濃度（３５ｕｇ）は、更なるリン酸化によるシフトの何れも示さなかった。ＰＫＣ−α、ＡＴＰの濃度の増加又は培養時間の持続によるインヒビター−１のリン酸化程度を増強する試みは、更なるリンタンパク質のスポットを何ら明らかにしなかった。他のタンパク質スポットはサンプル中に検出されなかった。
【０１５２】
上の検討は、Ｔｈｒ７５がＰＫＣ−αに対する新規なリン酸化部位であることを示したので、精製したヒトＩ−１野生型、Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）及びＩ−１（Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ）プロテインをＰＫＣ−αと培養して、同時に２−Ｄゲル電気泳動に付した。Ｓｅｒ６７又はＴｈｒ７５の何れかをＡｌａに突然変異させる場合、ゲル中にｐＩ値が５．１と４．９の２つのスポットだけが検出された（図８Ｂ及び８Ｃ）。これらのデータは、２つのＰＫＣ−α部位の１つをブロックすると、タンパク質中へのリン酸の取り込みを阻害して、リン酸化状態のＩ−１野生型で観察される３−スポットと異なって、２−スポットパターンをもたらすことを立証した（図８Ａ）。更に、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５の同時突然変異は完全にＩ−１の左への移動シフトの何れもをもなくし（図８Ｄ）、更に１）Ｔｈｒ７５がヒトＩ−１のＰＫＣ−α部位であり；そして２）Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５は主なＰＫＣ−α部位であることを立証した。
【実施例４】
【０１５３】
Ｉ−１の機能に及ぼすＰＫＣ−αリン酸化の影響
過去の研究は、Ｉ−１インヒビターが、ＰＫＡによるリン酸化の上でのみＰＰＩを阻害すると報告している（６〜８）。ＰＫＣ−αがＩ−１を独立して２つの部位、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５で同程度にリン酸化するという本知見に基づいて、Ｉ−１の機能に及ぼすＰＫＣ−αリン酸化の影響を実験した。この検討において、未処理のＩ−１野生型又はＰＫＣ−α、ＰＫＡ又はＰＫＣ−α＋ＰＫＡでリン酸化したＩ−１野生型をプロテインホスファターゼアッセイで用いた（図９Ａ）。脱リン酸型Ｉ−１及びＰＫＣ−αリン酸化Ｉ−１の何れも、試験した濃度（０〜１５ｎＭ）の何れにおいてもＰＰＩ活性を阻害しなかった。しかしながら、ＰＫＡリン酸化Ｉ−１は、過去の報告（７〜９）と一致して、ＰＰＩをＩＣ５０値３．２±０．０８ｎＭで阻害した。
【０１５４】
ＰＫＣ−αのリン酸化がＰＫＡのリン酸化Ｉ−１の阻害機能に影響を及ぼすか否かを検討するために、Ｉ−１野生型を最初に上記のように、ＰＫＣ−α次いでＰＫＡでリン酸化した。図９Ａに示すように、ＰＫＣ−αによる前リン酸化はＩ−１のＰＫＡによる阻害機能（ＩＣ５０値４．９±０．７４ｎＭ）に影響を及ぼさなかった。更に、次の突然変異体：Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）又はＩ−１（Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ）の何れもＰＫＣ−αによるリン酸化によってＰＰＩ機能に対して阻害効果を有していなかった（図９Ｂ）。
【０１５５】
これらの結果を更に裏付けるために、Ｉ−１のリン酸化（９、１２）に似せた、アスパラギン酸置換の突然変異体を上記のようにして、Ｔｈｒ７５［Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）］及びＳｅｒ６７＋Ｔｈｒ７５［Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）］で作製した。これらの突然変異体の何れもＰＰＩ活性に対して阻害効果を有していなかった。従って、ＰＫＣ−αはＩ−１を２つの異なった部位でリン酸化できるが、これらのリン酸化はＰＰＩ活性を阻害しない。しかしながら、ＰＫＡリン酸化によって、これらＩ−１種の全てはＰＰＩ活性を充分に阻害することができた（図９Ｂ）。
【実施例５】
【０１５６】
マウス心臓組織由来インヒビター−１のリン酸化状況の分析
インヒビター−１はインビボで、２つの部位、Ｔｈｒ３５及びＳｅｒ６７だけでリン酸化されると過去に報告された。Ｔｈｒ７５もインビボでリン酸化されるかについて検討する目的で、Ｉ−１に豊富な画分をマウスの心筋（１．５ｇ）から、上記のようにして単離した。最終ペレット（最初のタンパク質の０．２５％まで）を２Ｄゲル電気泳動に付した。電気泳動の第２次泳動後に、タンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットして、Ｉ−１に対する抗体ＡＣＩ（１：１０００）と培養した。図１０に示すように、ｐＩ値が５．１、４．９、４．７及び４．５（右から左に）の４つのスポットを確認した。膜の右部分にある縞はタンパク質の不完全な電気泳動によるものであって、免疫ブロッティングの増加した感受性に起因して観察された。
【０１５７】
ProImageソフトウェアを用いるこの画像の分析は、ｐＩが５．１のスポットが脱リン酸化組み替え型Ｉ−１に対応していることを示した。これらの結果は、Ｉ−１が塩基性条件下のインビボで３回翻訳後修飾されることを明らかにした。Ｔｈｒ３５及びＳｅｒ６７がインビボでリン酸化されることが知られていて、Ｉ−１の等電点シフトが組み替えタンパク質を用いて観察されたものと同等であるとすると、この４つのスポットは脱リン酸化Ｉ−１及び１つ、２つ及び３つの部位（Ｔｈｒ３５、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５）でリン酸化されたＩ−１を表すと考えられる。
【実施例６】
【０１５８】
Ｉ−１の突然突然変異及び心臓収縮性
心臓収縮性に対するＩ−１の突然突然変異の効果を試験するために、成熟ラットの心筋細胞を、野生型Ｉ−１、又はＩ−１  Ｔ７５Ｄの何れかを発現する組み替えアデノウィルスに、ＣＭＶプロモーターの制御下で感染させた。空のベクターを対照として用いた。Grass S5 刺激（０．５Ｈｚ、四角波）で刺激した後に、筋細胞収縮と筋細胞延長の比を測定した。Ｉ−１ Ｔ７５Ｄの発現が、筋細胞収縮（＋ｄＬ／ｄｔｍａｘが２９％まで減少した）と筋細胞弛緩（−ｄＬ／ｄｔｍａｘが３３％まで減少した）の比を有意に減少させた（図１１）。更に、突然変異タンパク質を発現する筋細胞によって生じる総収縮力が３５％又はそれ以上減少した。このデータは、Ｔ７５におけるリン酸化が心臓における収縮機能を抑制することを示している。
【０１５９】
心臓収縮性に及ぼすＳ６７Ｄ突然変異の影響を試験するために、成熟ラットの心筋細胞を、野生型Ｉ−１、又はＩ−１  Ｓ６７Ｄの何れかを発現する組み替えアデノウィルスに、ＣＭＶプロモーターの制御下で感染させた。空ベクターを対照として用いた。Grass S5 刺激（０．５Ｈｚ、四角波）で刺激した後に、筋細胞収縮と筋細胞延長の比を測定した。Ｉ−１ Ｓ６７Ｄの発現が、筋細胞収縮（＋ｄＬ／ｄｔｍａｘが２４％まで減少した）と筋細胞弛緩（−ｄＬ／ｄｔｍａｘが２８％まで減少した）の比を有意に減少させた（図１２）。更に、この突然変異タンパク質を発現する筋細胞によって生じる総収縮力が３５％又はそれ以上減少した（３８％、図１２）。このデータはＳ６７におけるリン酸化が心臓における収縮機能にマイナスの影響を与えることを示している。
【０１６０】
次に、成熟ラットの心筋細胞をＩ−１野生型アデノウィルス（Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴ）、又はＴｈｒ７５で構成的にリン酸化したＩ−１（Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ））の何れかに感染させた。ＧＦＰ、Ａｄ．ＧＦＰのみを発現するアデノウィルスを対照として用いた。緑色蛍光で判定すると、２４時間後に感染効率がほぼ１００％に達した（図１３Ａ）。Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴ及びＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）は、期待されたＩ−１の過剰発現を示したが、Ａｄ．ＧＦＰで感染した細胞中には内因性のＩ−１は検出されなかった（図１３Ｂ）。
【０１６１】
Ｔｈｒ７５でのＩ−１の構成的なリン酸化は、Ｉ−１感染の野生型又はＧＦＰに感染の細胞の何れかと比較すると、筋細胞の収縮（ｄＬ／ｄｔｍａｘ；３１％）と弛緩（ｄＬ／ｄｔｍａｘ；３６％）の最大比、更に収縮率（３３％）の顕著な減弱を引き起こした（図１３Ｃ）。９０％弛緩するまでの時間は、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）の感染筋細胞において有意に増加（２２％まで）した。これらの知見は、Ｔｈｒ７５におけるＩ−１のリン酸化が筋細胞の収縮性を有意に低下させることを示している。
【０１６２】
次に、正常マウスの筋細胞を、Ａｄ．ＧＦＰ、Ａｄ．Ｉ−１、Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及びＡｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）に感染させた。２４時間後に、アデノウィルスによる形質転換の効率を緑色蛍光及びウェスタンブロット免疫検出で判定した。図１４に示すように、Ｉ−１の発現レベルは全群において同様であったが、過去の観察（Rodriguez et al. J.Biol.Chem.(2006)、El-Armouche et al. Cardiovasc. Res.(2001)）と同じように、内因性のＩ−１はＡｄ．ＧＦＰに感染した細胞では検出されなかった。細菌の知見（Rodriguez et al. J.Biol.Chem.(2006)）と一致して、培養筋細胞におけるＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）の発現は、Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴを発現する筋細胞と比較すると、収縮と弛緩（それぞれ、２９％及び３５．５％）の比、及び収縮率（２９％）をも有意に減少した（図１４Ｂ）。１２（Ａｄ，ＧＦＰ）、６（Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴ）５（Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ））、８（Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ））、及び５（Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ））：の群当たりの総心臓数を用いて、１５〜２０の筋細胞／心臓を分析した。
【０１６３】
Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）の発現は、筋細胞の収縮（２２．１％）及び弛緩（２７％）の比、更に収縮率（２５．３）においても、同様な減少を引き起こした（図１４Ｂ）。Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）を発現する筋細胞の機能的な性能はＡｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）を発現するものよりもより低下している傾向にあるが、その値に有意差があるとは言えない。興味深いことに、Ｓ６７Ｄ及びＴ７５Ｄにおける構成的な二重リン酸化Ｉ−１（Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ））の発現は、単一突然変異体のそれぞれによって示されるものと同様の結果をもたらした。Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）は、収縮及び弛緩の最大速度を、それぞれ３０％及び３４．５％まで減少した。収縮率は、Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴと比較すると、２６．１％まで減少した（図２Ｂ）。これらの結果は、Ｓｅｒ６７又はＴｈｒ７５の何れかのリン酸化が筋細胞の収縮性に対して同様な減少をもたらし、両方の部位が同時にリン酸化される場合に、収縮パラメータの更なる低下をもたらさないことを示している。
【０１６４】
ｃＡＭＰ依存性キナーゼ経路の刺激が構成的にリン酸化状態のＩ−１突然変異体を発現する筋細胞の低下した機能を逆転できるか否かを評価するために、アデノウィルスで感染した心筋細胞を１０ｎＭ〜１μＭの濃度範囲のホルスコリンで処理した。驚くべきことに、高濃度のホルスコリンが、構成的なリン酸化部位（Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５）を発現する筋細胞中だけに不整脈を誘発して、Ｉ−１ＷＴ又はＧＦＰには誘発しなかった。従って、０．１μＭを、不整脈を誘発せずに収縮性の刺激をもたらす最高濃度と定めた。Ａｄ，ＧＦＰを発現する筋細胞のホルスコリン処理は、基礎レベルと比較して、収縮（３８％）及び弛緩（５１％）の速度、更に収縮率（８．５％）についても劇的な増加をもたらした（図１５）。心臓の総数は以下の通りであった：１０（Ａｄ，ＧＦＰ）、５（Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴ）、５（Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ））、６（Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ））、及び６（Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ））、１５〜２０の筋細胞／心臓で。
【０１６５】
Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴを発現する細胞中の能力の増加は対照細胞と同様であった（収縮及び弛緩の速度、及び収縮率がそれぞれ、３６．５％、４９％及び１５．５％）。重要なことに、Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）又はＡｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）に感染した筋細胞の心臓機能も薬物処理によっても改善されるが、心臓パラメーターはＡｄ．Ｉ−１ ＷＴ又はＡｄ．ＧＦＰの何れかで観察された最大効果までは到達しなかった（図１５）特筆すべきは、構成的にリン酸化状態のＩ−１感染の筋細胞に対するホルスコリンによる収縮の速度における増加率が、Ａｄ．ＧＦＰ及びＡｄ．Ｉ−１ ＷＴの感染物に見い出された増加率と近似していることで、ＰＫＡ信号伝達経路で変化がないことを示している。従って、リン酸化状態のＩ−１突然変異体を発現する筋細胞の心臓収縮性は、ホルスコリン処理によりＩ−１ＷＴ及びＧＦＰ感染細胞と同様に増大して改善できるが、総括的な機能は対照細胞と比較すると低下したままである。
【実施例７】
【０１６６】
アデノウィルス感染心筋細胞における筋小胞体Ｃａ２＋の取り込み
Ｔｈｒ７５におけるＩ−１のリン酸化に関連している低下した収縮性が、筋小胞体のカルシウム移送機能における変化に対応しているか否かを究明するために、インビボでの弛緩と収縮の間に存在するものと類似している、広範囲の[Ｃａ２＋]においてＣａ２＋移送の初期速度を算定した。反応条件は以下の通りである：４０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ＝７．０）、９５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＮａＮ３、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、及び５ｍＭのＫ２Ｃ２Ｏ４中、３７℃で５ｍＭのＡＴＰを用いる。Ｃａ２＋に対する移送システムの見掛けの親和性は、Ａｄ．Ｉ−１ ＷＴ（ＥＣ５０値＝０．３３±０．０１μＭ；ｎ＝３）又はＡｄ．ＧＦＰ（０．２８±０．００６μＭ；ｎ＝３）に比較して、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）に感染した筋細胞において有意に低下した（ＥＣ５０値＝０．６７±０．０１μＭ；ｎ＝３；＊＊＊ｐ＜０．００１）（図１６Ａ）。しかしながら、Ｃａ２＋取り込みのＶｍａｘはこの３群全ての間で同様であった。更に、これらの群において、筋小胞体カルシウムポンプ（ＳＥＲＣＡ２ａ）及びホスホランバン（ＰＬＮ）タンパク質レベルでは３群に違いがなかった（図１６Ｂ）。これらのデータは、ＰＫＣ−αによるＩ−１のＴｈｒ７５におけるリン酸化がＳＥＲＣＡ２ａのＣａ２＋親和性の減少によって心臓収縮性の低下を誘発するであろうことを示している。
【０１６７】
ＳＲＣａ２＋取り込みの基礎ＳＲを、ＧＦＰ（対照として）、及びＩ−１種：Ｉ−１ＷＴ、Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）又はＩ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）を発現するアデノウィルスで感染した筋細胞由来のホモジネート中、ＳＲへのＣａ取り込みを制限する条件下で算定した。最近の研究[１０]と一致して、ＧＦＰ又は野生型Ｉ−１を発現するアデノウィルスでの感染は、同様なＳＥＲＣＡ ＥＣ５０値（それぞれ、０．２９４±０．００１μＭ及び０．３３６±０．０１３μＭ）を示した（図１７Ａ及び１７Ｃ）。しかしながら、カルシウムについての見掛けの親和性は、Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及びＩ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）突然変異体を発現する筋細胞において有意に低下した（それぞれ、０．４５７±０．０１２μＭ、０．６６４±０．０１４μＭ及び０．６１１±０．００５μＭ）（図１７Ａ及び１７Ｃ）。図１７に示したデータはそれぞれの群に対して計測したＶｍａｘに標準化して、OriginLab ５．１プログラムを用いてＳ字状曲線に適応させてある。
【０１６８】
従って、ヒトＩ−１アイソフォーム上のＳｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５のリン酸化は、心筋細胞におけるその後のＰＫＡ刺激の影響を和らげることが示された。一方又は両方の部位のリン酸化は、ＰＫＡ活性化に続くＰＰ１活性を充分に阻害するＩ−１の能力を同時に減弱し、全体的に減弱したＳＥＲＣＡ  ２ａの移送機能及び心臓収縮性をもたらす。
【０１６９】
予想通り、ホルスコリンによるＰＫＡ刺激はＧＦＰを発現する筋細胞におけるＣａ２＋についてのＳＲ ＣＡ２＋取り込みのＥＣ５０の有意な減少（ＥＣ５０＝０．１７±０．０２９μＭ）と関連していて、この減少は野生型Ｉ−１を発現する心筋細胞で観測されたもの（ＥＣ５０＝０．１４７±０．００５μＭ）と類似していた（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。しかしながら、構成的にリン酸化したＩ−１突然変異体を発現する心筋細胞のホルスコリン処理は、それぞれの基底値からＥＣ５０値を改善することができ、カルシウムの取り込み速度はＩ−１ＷＴ及びＧＦＰ感染細胞と比べて低下したままであった。ホルスコリン処理によるＩ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及びＩ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）を発現する心筋細胞のＥＣ５０値はそれぞれ：０．２３４±０．００５μＭ、０．３４２±０．０１６μＭ、及び０．３３４±０．０５３μＭであった（図１７Ａ及び１７Ｃ）。
【０１７０】
従って、Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５におけるＩ−１の構成的なリン酸化の結果は、低下したＳＲカルシウムの取り込み速度及び心筋細胞の機能と関連していた。低下したＳＲカルシウムの取り込み速度は基底及びホルスコリン刺激条件の両方における有意に高いＳＥＲＣＡ ＥＣ５０値を反映していた。ホルスコリンによるＰＫＡの活性化はリン酸化Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５のＩ−１を発現する筋細胞におけるＣＡ２＋−ＡＴＰアーゼの機能をＩ−１ＷＴ又はＧＦＰを発現する筋細胞と同じ程度には改善しないが、ＥＣ５０値の減少率は全ての群で同様に現れ、ＰＫＡ信号伝達経路が変化しなかったことを示した。
【０１７１】
カルシウムのＳＲへの取り込みが、心筋細胞の収縮性を調節する節点を示すので、リン酸化Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５Ｉ−１で感染した心筋細胞の力学的性能はＳＲのカルシウム取り込み量を反映していた。Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５の何れかにおけるＩ−１のリン酸化は、ＳＥＲＣＡ移送機能の有意な低下を誘発し、これらの値はホルスコリン処理の後でさえも低下したままであった。実際、感染した筋細胞のこれらの群におけるＰＫＡの刺激は、ＳＲ ＣＡ２＋の取り込み値をＩ−１ＷＴ群の基底レベルまで改善しただけである。これらの知見は、ＰＫＡの効果が、心筋細胞中でＳｅｒ６７又はＴｈｒ７５の何れかにおける構成的にリン酸化状態のＩ−１の突然変異体によって減弱することを示している。全てのサンプルで、Ｃａ２＋取り込みの最大速度（Ｖｍａｘ）について類似した値が測定された。
【実施例８】
【０１７２】
感染した心筋細胞におけるのプロテインホスファターゼ活性
心筋細胞の収縮性及びＣａ２＋についてのＳＲＣａ２＋移送システムの見掛けの親和性の低下が、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）、及びＡｄ．ＧＦＰで感染した成熟ラットの心筋細胞におけるプロテインホスファターゼ活性レベルの検討を促した。Ａｄ．ＧＦＰ、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ、又はＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）で感染した心筋細胞の溶解物（１μｇ）中で総ホスファターゼ活性をアッセイした。反応混合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のBrij３５、及び放射性標識化Myelin Basic Protein（５０μＭ）を含有していた。Ｉ−１野生型を発現する細胞又は対照の細胞と比較すると、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）を発現する筋細胞中でホスファターゼ活性が１６％まで増加した（図１８Ａ）。細胞性プロテインホスファターゼの２つの主要な種、ＰＰ１及びＰＰ２Ａの相対的寄与率を、ＰＰ２Ａをより強く阻害するオカダ酸（Neumann et al. J. Mol Cell. Cardiol(1997)）を１０ｎＭの濃度で存在させて、測定した。Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）で感染した心筋細胞は、タイプ１のホスファターゼ活性を、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ及びＡｄ．ＧＦＰと比較すると、２７％増加したが、タイプ２Ａのホスファターゼ活性では変化がなかった（図１８Ａ）。図１３Ｂで示したように、ＰＰＩのタンパク質レベルは全ての場合で同じであった。
【０１７３】
タイプ１のホスファターゼ活性におけるＴｈｒ７５でのＩ−１のリン酸化の効果を、組み替えＩ−１野生型、又は前もってＰＫＣ−αでリン酸化した構成的にリン酸化状態のＩ−１、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）又はＩ−１（Ｓ６７Ｄ）の何れかの存在下で、精製したＰＰ１触媒サブユニット（ＰＰ１ｃ）の活性を測定することによって確認した。両方の突然変異Ｉ−１プロテインが、Ｉ−１野生型と比較すると、それぞれ２３％及び２５％までＰＰ１ｃの活性を有意に増加した（図１８Ｂ）。これらをもとにすると、これらのデータは、ＰＫＣ−αによるＴｈｒ７５におけるＩ−１のリン酸化が、単離した筋細胞及びインビボ系の両方においてＰＰＩ活性を増加することを明らかにした。
【０１７４】
ホルスコリンによるＰＫＡ刺激の後は、総プロテインホスファターゼの阻害率が全ての群で類似していると思われるが（図１９）、ＰＰ２Ａインヒビターとして１０ｎＭのオカダ酸を用いて評価（Rodriguez et al. J. Biol. Chem.(2006)、Neumann et al. J. Mol Cell Cardio.(1997)）する、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴを発現する筋細胞による選択的ＰＰ１阻害性は、Ａｄ．ＧＦＰで感染した細胞と比較すると、ホルスコリン処理によって有意に高くなった。タイプ１と２Ａのホスファターゼ活性を差別化するために、オカダ酸（１０ｎＭ）を細胞溶解物に加えた。この結果は、内因性のＩ−１のレベルが、ＰＰ１活性を完全に阻害するために充分に高くはなかったことを示している。その一方、３つの構成的にリン酸化状態のＩ−１突然変異体、Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及びＩ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）は、対照又は野生型で感染した細胞と比較すると、ホルスコリンによるＰＰ１の有意に低い阻害性を示した。従って、Ｓｅｒ６７又はＴｈｒ７５の何れかの構成的なリン酸化は、心筋細胞においてＰＫＡ刺激に続く、ＰＰ１の阻害する範囲を減少させた。
【０１７５】
これら２つの部位はこの効果を誘発することにおいては同等であると思われ、両方の部位をリン酸化する時に更なる効果は観察されなかった。実際、これらの両方又は一方の部位のリン酸化は、ＰＫＡ刺激に続くＰＰＩ活性を２倍まで高くして保持することをもたらした。これらのデータは、心不全において、減弱したβ−アドレナリンの信号伝達及び増加したＰＫＣの信号伝達が、より高いＰＰ１活性に好都合な、二重の損傷をもたらすであろうことを示している。Ｉ−１の二重の突然変異体（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）を発現する筋細胞におけるＰＰ１阻害率は、Ｓ６７Ｄ又はＴ７５ＤのＩ−１突然変異体の何れかによって示されるものと類似していて、２つの部位の同時リン酸化は、ＰＫＡ刺激後のＰＰ１活性の阻害において更なる効果を呈しないことを示唆している。
【実施例９】
【０１７６】
ＰＫＡの基質になりうるその能力についてのＳｅｒ６７及びＴｈｒ７５でのＩ−１のリン酸化の効果
Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５の両方でのＩ−１のリン酸化が、Ｔｈｒ３５におけるＩ−１のＰＫＡによるリン酸化の能力を減少するか否かを検討するために、組み替えＩ−１野生型及びＩ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）プロテインを[γ−３２Ｐ]ＡＴＰの存在下でＰＫＡとインビトロで培養した。図２０に示したように、二重突然変異体は野生型に比べて２０％低い放射性活性を取り込んで、突然変異体中と同程度にＴｈｒ３５はリン酸化されないことを示唆した。従って、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５が前もってリン酸化されている場合、ＰＫＡによってリン酸化されるＩ−１の能力が変化したと考えられる。
【０１７７】
纏めると、本明細書に記載されているデータは、心臓において、ヒトＩ−１アイソフォームにおけるＳｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５のリン酸化が、β−アドレナリンの信号伝達をある程度低下させて、これによって、ＰＰ１活性の異常な増加を維持することによる収縮性促進作用を減少するように働くであろうことを示唆している。
【実施例１０】
【０１７８】
切断型Ｉ−１に最適化されたコドン
野生型Ｉ−１遺伝子は、高い出現頻度を有するレアコドンとして使用できること及び動物において発現を阻害できる、幾つかの逆シス作用性モチーフを含有することが見出された。従って、以下の配列番号１３でコードされる切断型突然変異ヒトＩ−１プロテイン（Ｔ３５Ｄ）を合成するために、（http://bip.weizmann.ac.il/index.html上で公開されて、例えば「Genetic Database」、M.J.Bishop ed.,Academic Press,(1999)に記載されている、以下のヒトコドン利用表に基づいて）標準的なコドン最適化を利用した。Ｉ−１ ｃＤＮＡの切断はタンパク質の最初の６５のアミノ酸をコードするようにする。
【０１７９】
コドンの利用は人類遺伝子のコドン偏重に適合させて、高いコドン適応指標（codon adaptation index;CAI）値（０．９９）をもたらした。コドンに最適化された（切断された）タンパク質は、より効率的なＡＡＶのパッケージングのために、増加したＧＣ含量（自然のヒト配列に比べて）を有している（データは示していない）。ある特定のシス作用性配列モチーフは除いた（例えば、スプライス部位、ポリＡシグナル）。翻訳開始を増加するために、コザック配列を導入した。効率的な終止を保証するために、２つのＳＴＯＰコドンを加えた。
【０１８０】
【表１】
2009525757.tif 000003
【０１８１】
表は、それぞれのコドンに対して、ヒトのコード領域におけるそれぞれのコドンの使用頻度（千分の一）（第一列）及び同義コドン間のそれぞれのコドンの相対頻度（第二列）を表す。
【０１８２】
2009525757.tif 000004
【０１８３】
配列番号１３によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１４として次のように表される：
【０１８４】
2009525757.tif 000005
【０１８５】
配列番号１３でコードされるアミノ酸配列は、配列番号１４として表される。
本明細書に記載のＩ−１突然変異体のコドンの最適化も同様に考えられる。
【０１８６】
配列情報
本発明を説明し、定義づけして請求するために、「配列番号」の参照は、その配列と少なくとも９０％の同一性を有するもので、特定の突然変異の何れかを維持する全ての配列を含むものと理解されたい。より具体的な実施態様では、配列と少なくとも９５％の同一性を有するもので、特定の突然変異の何れかを維持する配列を含むと理解されたい。さらに具体的な実施態様では、それは９９％及び１００％の間の同一性を有するもので、特定の突然変異の何れかを維持する配列を含む。
【０１８７】
ホモサピエンスプロテインホスファターゼＩ、インヒビターサブユニット１Ａ、（ＰＰ１Ｉ１Ａ）ｍＲＮＡの野性型配列を次に示す（配列番号７）。ｃＤＮＡに基づくナンバリングの手順に従った３６１位及び４００位の間に突然変異に対するヌクレオチドの変化が生じる。コード配列の最初のＡは、１として（１７２というよりも）示される。
【０１８８】
2009525757.tif 000006
【０１８９】
配列番号７で示されるアミノ酸配列は、次に配列番号８として表す。
【０１９０】
2009525757.tif 000007
【０１９１】
３５位、６７位及び７５位のアミノ酸は太字及び下線で強調されている。
ヒト野性型ＰＰ−１は、既知又は未知の多形体として存在すると理解されている。例えば、アスパラギン又はリジンの残基のいずれかを包含していてよい８位のアミノ酸に基づく２つの多形体がある。前者は当該技術分野ではＱ異性体として知られ、一方後者はＫ異性体として知られる。先の「定義」の部分に記載したように、当該技術分野において通常の技術を有する者には、本発明を実施及び定義づけするために、どちらの異性体が適切であるか、及びこれらの異性体が本質的に互換可能であるということは明らかである。同じように他にもこれらのような多形体が存在し得ることも明らかであり、本発明の範囲内にあるということも等しく意味する。
【０１９２】
本明細書に記載の配列の説明のために、前記の配列番号７の１７２位のヌクレオチドは、１位に等しいと特記する。関連のコード配列は６８８位で終わる。前記の１７２位〜６８８位に定義されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの６７位のアミノ酸に相当するコドンの位置は、本発明では、３７１、３７２、３７３、（ＴＣＴ）、であり、７５位のアミノ酸に相当するコドンの位置は、同様に３９４、３９５、３９６（ＡＣＡ）である。
【０１９３】
突然変異体「Ｉ−１  Ｓ６７Ａ」は、ＧＣＡにより置き換えられたコドンＴＣＴを有するものであり、配列番号１で示される。突然変異体「Ｉ−１  Ｓ６７Ｄ」は、ＧＡＣにより置き換えられたコドンＴＣＴを有するものであり、配列番号２で示される。突然変異体「Ｉ−１  Ｔ７５Ｄ」は、ＧＡＣにより置き換えられたコドンＡＣＡを有するものであり、配列番号３で示される。突然変異体「Ｉ−１  Ｔ７５Ａ」は、ＧＣＡに置き換えられたコドンＡＣＡを有するものであり、配列番号４で示される。
【０１９４】
配列番号３によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号５で示される。配列番号４によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号６で示される。配列番号７によりコードされるアミノ酸は、配列番号８で示される。
【０１９５】
突然変異体「Ｉ−１  Ｓ６７Ｃ」は、コドンＴＧＴ又はＴＧＣにより置き換えられたコドンＴＣＴを有するものであり、配列番号９で示される。突然変異体「Ｉ−１  Ｔ７５Ｃ」は、コドンＴＧＴ又はＴＧＣにより置き換えられるコドンＡＣＡを有するものであり、配列番号１０で示される。配列番号９によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号１１で示される。配列番号１０にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１２で示される。
【０１９６】
単一の核酸分子が両方の位置での突然変異を包含することも考えられる。突然変異体「Ｉ−１  Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ」はＧＣＡにより置き換えられたコドン６７（ＴＣＴ）及びＧＣＡにより置き換えられたコドン７５（ＡＣＡ）を有するものであり、配列番号１５で示される。配列番号１５によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号１６で示される。突然変異体「Ｉ−１  Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ」はＧＡＣにより置き換えられたコドン６７（ＴＣＴ）及びＧＡＣにより置き換えられたコドン７５（ＡＣＡ）を有するものであり、配列番号１７で示される。配列番号１７によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号１８で示される。
【０１９７】
突然変異体「Ｉ−１  Ｔ３５Ｄ」はコドンＧＡＣにより置き換えられたコドンＡＣＣを有するものであり、配列番号１９で示される。
配列番号１９によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２０で示される。突然変異体「Ｉ−１  Ｓ６７Ａ／Ｔ３５Ｄ」はＧＣＡにより置き換えられたコドンＴＣＴ（３７１〜３７３）及びＧＡＣにより置き換えられたコドンＡＣＣ（２７７〜２７９）を有するものであり、配列番号２２で示される。配列番号２２によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号２１で示される。
【０１９８】
配列番号１：
2009525757.tif 000008
【０１９９】
配列番号２：
2009525757.tif 000009
【０２００】
配列番号３：
2009525757.tif 000010
【０２０１】
配列番号４：
2009525757.tif 000011
【０２０２】
配列番号５：
2009525757.tif 000012
【０２０３】
配列番号６：
2009525757.tif 000013
【０２０４】
配列番号９：
2009525757.tif 000014
【０２０５】
配列番号１０：
2009525757.tif 000015
【０２０６】
配列番号１１：
2009525757.tif 000016
【０２０７】
配列番号１２：
2009525757.tif 000017
【０２０８】
配列番号１５：
2009525757.tif 000018
【０２０９】
配列番号１６：
2009525757.tif 000019
【０２１０】
配列番号１７：
2009525757.tif 000020
【０２１１】
配列番号１８：
2009525757.tif 000021
【０２１２】
配列番号１９：
2009525757.tif 000022
【０２１３】
配列番号２０：
2009525757.tif 000023
【０２１４】
配列番号２１：
2009525757.tif 000024
【０２１５】
配列番号２２：
2009525757.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
記述される特定の態様により本発明が限定されることを意図しないが、実施例の態様で示される詳細な説明は、添付の図面と組み合わせて理解されてもよく、参照して本明細書に取り込まれるものである。本発明の多様な好ましい特徴及び態様は、限定するものではない実施例の態様で、及び以下の添付の図面を参照して記述されている。
【図１】図１は、組み換え型Ｉ−１プロテインの−（Ａ）Ｉ−１の組み換え型タンパク質の概略図。ヒトＩ−１ｃＤＮＡを、ＧＳＴ−融合タンパク質として発現するようにｐＧＥＸ−６Ｐ３ベクター中にクローンした。（Ｂ）各々、表示順に配列番号３４〜３８、及び（Ｃ）各々、表示順に配列番号３４、３９、３８及び４０。（Ｂ）及び（Ｃ）は、組み換え型突然変異体（Ｓ６７Ａ、Ｔ７５Ａ、Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ、Ｓ６７Ｄ、Ｔ７５Ｄ及びＳ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）と並べてＩ−１野生型を示しているシーケンスアラインメント。
【図２】図２は、ＰＫＣ−αによる又はＰＫＡによるＩ−１のリン酸化（即ち、放射性標識したリンタンパク質）を表現している、ＰＫＣ−α及びＰＫＡによる組み換えヒトインヒビター−１のリン酸化のオートラジオグラフ。ＰＫＣ−αアッセイに関し、対照サンプル（Ｃ）は、ＰＫＣ−α、Ｃａ２＋（ＥＧＴＡの存在）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォ−Ｌ−セリン及びホスファチジルセリンを欠いているが、他の全てのアッセイ化合物を含有する。ＰＫＡアッセイに関し、対照サンプル（Ｃ）は、ＰＫＡ及びｃＡＭＰを欠いているが、他の全てのアッセイ化合物を含有する。反応は、０．２５ｍＭ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（０．４ｍＣｉ／ｎｍｏｌ）の添加により開始した。
【図３】図３は、組み換えアデノウィルスベクター、Ｉ−１を発現する組み換えアデノウィルス種の概略図。ｃＤＮＡを、ｐＳＨＵＴＴＬＥ-ＩＲＥＳ-ｈｒＧＦＰ-1ベクター中にｐＧＥＸ−６Ｐ−３ベクターからサブクローニングして、そして相同的組み換え法によりＡｄＥａｓｙ−１ウィルスバックボーンに挿入した。
【図４】図４は、ＰＫＣ−αによるＩ−１及びＩ−１（Ｓ６７Ａ）のリン酸化の経時変化。ＰＫＣ−αは、Ｉ−１及びＩ−１（Ｓ６７Ａ）をｉｎ  ｖｉｒｏでリン酸化するために用いた。表示した時間において、各混合物から２０μｌを回収して、１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上に分離して、ニトロセルロース膜に転写した。Ａ）放射性標識したリンタンパク質を表したオートラジオグラフ。Ｂ）Ｉ−１及びＩ−１（Ｓ６７Ａ）の総タンパク質を検出するために、同じ膜をＡＣ１抗体（１：１０００）でプローブした。Ｃ）異なる時間におけるタンパク質（Ｂに存在する場合、両方のバンドにおける）に対する３２Ｐ−取り込みの比率（Ａの両方のバンドにおける）を示すプロットであり、濃度測定法により定量化して、バックグラウンドの補正を行った。データは、４回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。いくつかの場合、Ｓ．Ｄ．はシンボルの大きさより小さい。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
【図５−１】図５は、リン酸化部位の判定。−（Ａ）カラムから溶出する放射活性の大部分を含有するピーク５０及び５１を有する、ＨＰＬＣ画分によりナンバリングされたトリプシンペプチドの分離を示す逆相ＨＰＬＣ。（Ｂ）ヒトＩ−１配列（配列番号３３）のアミノ酸７３〜８２に対応する、質量１３６６．９０Ｄａのリン酸化ペプチドを示す、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。
【図５−２】（Ｃ）エドマン分解の各サイクルにおけるアミノ酸の位置に対して溶出する放射活性のプロットであり、大多数の同位体が４番目のアミノ酸とともに溶出することを示している。これは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦデータにおいて検出されたペプチド７２ＫＫＭＴＲＩＴＰＴＭＫ８２（配列番号３３）と一致する。直線グラフは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝計数された３ラウンドのｃｐｍ）。多くの場合、Ｓ．Ｄ．はシンボルの大きさよりも小さい。（Ｄ）確認された配列（配列番号３３）の３番目のアミノ酸における同位体のエドモン分解検出。
【図６】図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＫＣ−αのリン酸化は、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５が精製したヒトＩ−１上の主要なＰＫＣ−α部位であることを示した。−精製したヒトＩ−１、Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）及びＩ−１（Ｓ６７Ａ／Ｔ７５Ａ）プロテインは、外因性のＰＫＣ−αにより異なる時にリン酸化した。（Ａ）放射性標識したリンタンパク質を示すオートラジオグラフ。（Ｂ）同じ膜を、ＡＣＩ抗体（１：１０００）を用いることによるＩ−１及びＩ−１突然変異プロテインを検出するために用いた。（Ｃ）Ｉ−１及びＩ−１突然変異プロテインへの３２Ｐ−取り込み量を示すプロットであり、濃度測定法により定量化して、Ａに示される対応するリン酸化の時点でバックグラウンドの補正を行った。（Ｄ）４５分でのＩ−１及びその突然変異体に関連する放射活性を示す棒グラフ。濃度測定法により定量化して、Ｉ−１に対して標準化して示した。棒は、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、２次元電気泳動による精製したヒトインヒビター−１のリン酸化状態の分析。２次元ゲルは、ｐＩ値が４．９及び４．７（右から左へ）のタンパク質のスポットの左への移動シフト（Ｉ−１のＰＫＣ−αのリン酸化により誘発される）を表す。Ｉ−1の脱リン酸化に対するＰＩ値は５．１（ｎ＝３）である。Ｉ−１サンプルにおける２−Ｄゲル画像の対応する部分を示した。
【図８】図８は、２−Ｄゲル電気泳動が、Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５がヒトＩ−１における主要なＰＫＣ-αのリン酸化部位であることを裏付ける−Ｉ−１サンプルの２次元ゲルからの関連する領域の拡大が示さた。（Ａ）リン酸化したＩ−１の野生型は、ＰＩ値が５．１、４．９及び４．７（右から左へ）の独立した３つのタンパク質スポットとして表れる。（Ｂ）及び（Ｃ）ＰＩ値が５．１及び４．９の２つのスポットは、Ｉ−１のＳｅｒ６７又はＴｈｒ７５をアラニンで置換した場合に、観察された。（Ｄ）Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５の同時突然変異体は、タンパク質の移動シフトの何れもを失くした。ＰＩ値が５．１の単一のスポットが２−Ｄゲルに表れる。点で示す円は、野生型と比較して、各Ｉ−１突然変異体におけるリン酸化種の予測位置を示した。各２−Ｄゲルは、異なるリン酸化アッセイからの精製したタンパク質を用いて、３回実施した。
【図９】図９は、Ｉ−１又はＩ−１突然変異体のＰＫＣ−α及びＰＫＡのリン酸化のＰＰ１活性に及ぼす影響。−プロットは、（Ａ）脱リン−Ｉ−１（黒塗り四角）、ＰＫＣ−αリン−Ｉ−１（黒塗り三角）、ＰＫＡ−リン−Ｉ−１（白抜き四角）、及びＰＫＣ−α＋ＰＫＡ−リン−Ｉ−１（白抜き三角）；（Ｂ）ＰＫＣ−α−リン酸化：Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）（黒塗り四角）、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）（黒塗り三角）、及びＩ−１（Ｓ６7Ａ／Ｔ７５Ａ）（黒塗り丸）、並びにＰＫＡ−リン酸化：Ｉ−１（Ｓ６７Ａ）（白抜き四角）、Ｉ−１（Ｔ７５Ａ）（白抜き三角）、及びＩ−１（Ｓ６7Ａ／Ｔ７５Ａ）（白抜き丸）の存在下で観測された、ＰＰ１におけるＩ−１の阻害活性を示す。各Ｉ−１種に関連する活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｌ）は、Ｉ−１又はその突然変異体の非存在下での活性に対して標準化した。定量化した値は、２通りに実施した異なる７回の実験の平均を表す（平均±Ｓ．Ｄ．）。
【図１０】図１０は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩ−１の２次元のウェスタンブロット。ｐＩ（等電点）及び分子量に基づき分離したタンパク質を示す２次元のウェスタンブロットである。２−Ｄゲルの囲まれた領域を拡大したものを、図の下部に示す。
【図１１】図１１は、基底の心筋細胞の収縮性（Ｔ７５Ｄ突然変異体）。棒グラフは、I−１におけるＴ７５Ｄ突然変異体に応じた心臓収縮性の変化（経時的）を示す。筋細胞収縮率を＋ｄL／ｄｔｍａｘで表し、筋細胞弛緩率を−ｄL／ｄｔｍａｘで表し、生じた収縮力をＦＳで表す。
【図１２】図１２は、基底の心筋細胞の収縮性（Ｓ６７Ｄ突然変異体）。棒グラフは、I−１におけるＳ６７Ｄ突然変異体に応じた心臓収縮性の変化（経時的）を示す。筋細胞収縮率を＋ｄL／ｄｔｍａｘで表し、筋細胞弛緩率を−ｄL／ｄｔｍａｘで表し、生じた収縮力をＦＳで表す。
【図１３】Ｔｈｒ７５でのＩ−１のＰＫＣ−αのリン酸化は、心筋細胞の収縮性を低下させる。（Ａ）５００のＭＯＩで感染後２４時間のマウス心筋細胞の画像。右の画像は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を示す。（Ｂ）Ｉ−１抗体（ＡＣ１；１：１０００）−Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ及びＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）で感染した心筋細胞溶解物中にタンパク質の過剰発現を検出した。同じ膜をはがし取り、ＰＰＩ（ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１０００）に対してプローブした。同じゲルの上部のクマシー染色では、等しいタンパク質のローディング及びバンドパターンを明示する。（Ｃ）Ａｄ．ＧＦＰ（連続線）、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ（破線）及びＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）（薄色連続線）における心筋細胞の典型的なトレース。９０％弛緩までの時間、収縮率（ＦＳ％）、及び収縮と弛緩の最大比（ｄL／ｄｔｍａｘ）を棒グラフの形態で示す。６つの心臓からの総細胞数：１２１（Ａｄ．ＧＦＰ）、９０（Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ）及び９１（Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ））。値は平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１４】Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５でのＩ−１のリン酸化は、心筋細胞の機能を低下させる。（Ａ）５００のＭＯＩでのアデノウィルス感染後２４時間の成熟マウス心筋細胞の画像。Ｉ−１（ＡＣ１；１：１０００）に特異的な抗体は、1）ＧＦＰ；２）Ｉ−１ＷＴ；３）Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）；４）Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及び５）Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）で感染した筋細胞中のタンパク質の過剰発現を検出するために用いた。ゲルの上部はクマシー・ブルーで染色して、等しいタンパク質のローディングを明示する。（Ｂ）アデノウィルス感染の心筋細胞の収縮率（ＦＳ％）及び収縮と弛緩の最大比（ｄL／ｄｔｍａｘ、μｍ／秒）を棒グラフの形態で示す。
【図１５】図１５は、Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及びＡｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）で感染した筋細胞のＰＫＡ活性への影響。−０．１μＭのホルスコリンで処理した感染した心筋細胞の収縮率（ＦＳ％）及び収縮と弛緩の最大比（ｄL／ｄｔｍａｘ、μｍ／秒）を棒グラフの形態で示す。
【図１６】図１６は、Ｔｈｒ７５でのＩ−１のリン酸化のＳＲ  Ｃａ２＋−移送のＣａ２＋親和性への影響。（Ａ）プロットは、Ｉ−１野生型、Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及び培養した心筋細胞に発現したＧＦＰタンパク質に関して測定した、広範囲の［Ｃａ２＋］におけるＳＲ  Ｃａ２＋−移送の初期速度を示す。データは、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ、Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）及びＡｄ．ＧＦＰサンプルに対して算出したＶｍａｘを標準化した。曲線は、Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ  ５．１プログラムにより得られたＳ字状フィットを表す。符号は、２通りにアッセイした、Ａｄ．ＧＦＰ（黒塗り四角）、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ（白抜き丸）及びＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）（黒塗り丸）で感染した、３つの独立してホモジナイズされた心筋細胞の平均を示す。（Ｂ）免疫ブロットは、総ＳＥＲＣＡ２ａ（Affinity Bioreagents、１：１０００）、総ＰＬＮ及びカルセクエストリン（内因性のローディング対照として（Affinity Bioreagents、１：１０００））を示す。
【図１７−１】Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５におけるインヒビター−１のリン酸化のＳＲ  Ｃａ２＋−移送のＣａ２＋親和性への影響。プロットは、（Ａ）ＡＤ．ＧＦＰ；（Ｂ）Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ；（Ｃ）Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）で感染した心筋細胞におけるＳＥＲＣＡ  Ｃａ２＋−送達の初期速度の評価の結果を示す。符号は、２通りにアッセイした、基底又はホルスコリン処理下の独立した心臓由来の、３つのホモジナイズされた筋細胞の平均を示す。
【図１７−２】Ｓｅｒ６７及び／又はＴｈｒ７５におけるインヒビター−１のリン酸化のＳＲ  Ｃａ２＋−移送のＣａ２＋親和性への影響。プロットは、（Ｄ）Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）；（Ｅ）Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）で感染した心筋細胞におけるＳＥＲＣＡ  Ｃａ２＋−送達の初期速度の評価の結果を示す。符号は、２通りにアッセイした、基底又はホルスコリン処理下の独立した心臓由来の、３つのホモジナイズされた筋細胞の平均を示す。（Ｆ）グラフは、各群に対する基底及びホルスコリン処理下のＥＣ５０の平均値を示す。＊＊＊、Ｐ＜０．００１は、基底下の各群ｖｓ．ＧＦＰの比較を示す。＃、ｐ＜０．０５；＃＃、ｐ＜０．０１、は、ホルスコリン下の各群ｖｓ．ＧＦＰの比較を示す。
【図１８】図１８は、Ｔｈｒ７５でのＩ−１のＰＫＣ−αのリン酸化は、ＰＰ１活性を増強する。（Ａ）棒グラフは、ＡＤ．ＧＦＰ（黒塗り棒）、Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ（白抜き棒）又はＡｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）（灰色棒）で感染した心筋細胞溶解物（１μｇ）にてアッセイした全ホスファターゼ活性を示す。オカダ酸（１０ｎＭ）を細胞溶解物に添加して、タイプ１及び２Ａのホスファターゼ活性を差別化した。定量化した値は、２通りにアッセイした４つの独立した細胞溶解物の平均を表し、Ａｄ．ＧＦＰに対して標準化した（平均±ＳＥＭ）。（Ｂ）棒グラフは、精製した組換えＩ−１野生型（黒塗り棒）、ＰＫＣ−αでリン酸化したＩ−１（Ｓ６７Ａ）（白抜き棒）及びＩ−１（Ｔ７５Ｄ）（灰色棒）に関して測定したＰＰ１ｃ（０．５ｎｇ）の活性を示す。値は、Ｉ−１野生型に対して標準化した。エラーバーは、各々につき２通りの、独立した５回の実験に対するＳＥＭ値を示す。
【図１９】図１９は、ＰＫＡ刺激によるアデノウィルス感染筋細胞におけるプロテインホスファターゼ−１活性の阻害率を示す。棒グラフは、Ａｄ．ＧＦＰ（黒棒）；Ａｄ．Ｉ−１ＷＴ（白棒）；Ａｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ）（薄灰色棒）；Ａｄ．Ｉ−１（Ｔ７５Ｄ）（灰色棒）；及びＡｄ．Ｉ−１（Ｓ６７Ｄ／Ｔ７５Ｄ）（濃灰色棒）を過剰発現する、ホルスコリンで処理した筋細胞溶解物にてアッセイした総ホスファターゼ活性を示す。棒は、２通りにアッセイした独立した３つの筋細胞溶解物の平均を表す（平均±ＳＥＭ）。
【図２０】Ｓｅｒ６７及びＴｈｒ７５が前もってリン酸化されている場合、ＰＫＡによってリン酸化されるＩ−１の能力が変化する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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