(57)【要約】  本発明は、対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の適当なリンパ球含有試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含んだ方法を含む。対象の免疫能力を判定する方法、及び抗原特異的なＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の適当なリンパ球含有試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ｉ）抗原の存在下で対象由来の適当なリンパ球含有試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びにＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原が、ツベルクリン、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）コア抗原、ＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）リンタンパク質６５（ｐｐ６５）、ＣＭＶ溶解物、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又は他の補助タンパク質由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対象の免疫能力を測定する方法であって、抗原及び／又はマイトジェンへの曝露に反応する、前記対象由来の適当なリンパ球含有試料中の細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法。
【請求項５】
以下のステップ：
（ｉ）抗原及び／又はマイトジェンの存在下で対象由来の適当なリンパ球含有試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びにＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培養するステップが、リンパ球含有試料を抗原の単独存在下で培養することからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原が、ツベルクリン、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）コア抗原、ＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）溶解物、ＣＭＶリンタンパク質６５（ｐｐ６５）、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又は他の補助タンパク質由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養するステップが、リンパ球含有試料をマイトジェンの単独存在下で培養することからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
マイトジェンが、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、ホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、ヤマゴボウマイトジェン、並びに場合によりＣＤ２８副刺激及び／又は抗ＣＤ２モノクローナル抗体と組み合わせることもある、抗ＣＤ３モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出するステップが、培養ステップの開始から約２４〜４８時間以内に実施される、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項１１】
検出するステップが、培養ステップの開始から約４０〜４４時間以内に実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リンパ球含有試料が全血試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
全血試料がヘパリン処理全血試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ２５、並びにＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を検出するステップが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ１３４を定量的又は定性的に検出することからなる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ２５、並びにＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を検出するステップが、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ１３７を定量的又は定性的に検出することからなる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
検出するステップが、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７の１種に特異的に結合するモノクローナル抗体の群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体の使用を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
検出するステップがフローサイトメトリーの使用を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ２５、並びにＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を発現する細胞を単離するステップを更に含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
単離するステップが、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７の１種に特異的に結合するモノクローナル抗体の群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体の使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
単離するステップがフローサイトメトリーの使用を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象がヒトである、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の検出法、又は対象の全般的免疫能力の測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球のＣＤ４＋亜集団（ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、病原性で細胞内の細菌（例えば、マイコバテリア）及び真菌（例えば、カンジダ）、ウィルス並びに原虫などの細胞内病原体に対する生体防御において、主要な役割を演じる。特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、このような細胞内病原体による感染症に対する細胞性免疫反応の調節を補助し、実際、抗原刺激に応じたサイトカインの放出を介して他細胞からの多様な免疫反応（例えば、Ｂリンパ球及び抗体反応の促進及び成熟化、マクロファージの活性化、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性強化）を促進することにより、しばしば「ヘルパー」Ｔ細胞と呼称される。このような抗原刺激は、適切なクラスII主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質を発現する任意の抗原提示細胞が提示する抗原が、「初回抗原刺激を受けた」ＣＤ４＋Ｔ細胞（即ち、「抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞」になるように、ある抗原に以前に曝されたことのあるＣＤ４＋Ｔ細胞）により認識されることによって実現される。前記の通り、刺激済みのＣＤ４＋Ｔ細胞が起こす免疫反応の１種又は「エフェクター機能」は、マクロファージの活性化である。活性化されたマクロファージは、食細胞活性の増加（即ち、活性化マクロファージは病原体食菌能の増加を示す）及び他の活性の増加を介した感染部位における病原体の殺滅に必須の役割を演じる。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞とマクロファージとの相互作用は、いわゆる遅延型過敏症反応（ＤＴＨ）の基礎となるが、この反応は、対象が以前に特定の抗原（例えば、病原体又はアレルゲンの抗原）に曝露又は「感作」されたことがあるか否かを判定するために、各種皮膚試験で利用されてきた。よく知られている１種のＤＴＨ皮膚試験は、対象における潜在的結核（結核菌で発症（Mycobacterium tuberculosis））を調べる、又は対象が、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）結核ワクチンの接種を以前に受けたことがあるか否かを判定する検査において、ツベルクリンを抗原として使用するツベルクリン反応（Mantoux試験）である。
【０００３】
ツベルクリン反応、及びBioMerieux Multitestなどの他の類似の遅延型過敏症皮膚試験は、恐らくはＣＤ４＋Ｔ細胞が媒介する抗原特異的反応を検出するために、臨床及び診断試験室並びに研究室において広く使用されてきた。しかし、こうした試験では、実施に（即ち、読取結果を得るために）相当量の時間が確かに必要であり、結果の読取りに患者が戻って来ることが必要であり、こうした試験の適用及び読取りにおいて担当者自身に相当な変動性がある。これらの問題が相俟ってその有効な使用が制限される。例えば、ツベルクリン反応では、ツベルクリン抗原の投与からおよそ２〜３日間何らかのＤＴＨ反応を観察しなければならず、そのため遠隔地に住んでいる人々の有効な検査には妥当でないか、望ましくないことになり得る。その上、皮膚試験結果の評価は、相対的に主観的なため、定量的な結果ではなく定性的な結果を生じる。
【０００４】
ＤＴＨ皮膚試験はさておき、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、他の方法によって検出し、実際に測定することができる。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、リンパ増殖アッセイ（ＬＰＡ）の名で知られる方法によって抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を測定することができる。しかし、インビトロでのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能を利用し、新たに合成されたＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取込みを培養の６〜７日後に検出するこの方法には、診断試験室にとってその魅力を失わせる制約がいくつかある。その制約は、即ち（ｉ）多量の放射性核種の使用、（ii）長い「応答」時間、（iii）ＰＢＭＣを調製するための血液試料の長々とした処理の必要性、（iv）バッチ間で変動性があることによる、慎重に選別したヒト血清に対する依存性、（ｖ）高度な訓練を要する培養技術の必要性、（vi）ＣＤ４＋Ｔ細胞を最初に精製した場合以外は、その反応の原因をＣＤ４＋Ｔ細胞とすることができないという事実、並びに（vii）試験室間の規格化に問題のある、アッセイ間及びアッセイ内の実質的変動性である。現在のところ、ＬＰＡは研究室以外ではめったに実施されない。
【０００５】
別の例は、カルボキシフルオレッセイン二酢酸スクシンイミジル（ＣＦＳＥ）標識ＰＢＭＣを用いるＬＰＡのフローサイトメトリー式変法である（Lyons, AB, and CR Parish. 1994. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J ImmunolMethods 171:131）。このアッセイは、研究室で広く使用されてきており、放射活性を使用せず、反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接同定も可能にするが、ＬＰＡの他の欠点をなお免れない。加えて、このアッセイには、当該細胞数が、しばしば多量の背景染色の中にあって微少になり得るために、フローサイトメトリー分析を非常に慎重に実施しなければならないという欠点がある。
【０００６】
更なる例は、いわゆる細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイである。このアッセイは、研究室においてかなり広く使用されようになっており、全血培養物中の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接検出を可能にする（Nomura, LE, JM Walker, and HT Maecker. 2000. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. Cytometry 40:60）。しかし、このアッセイは、非常に手が掛かり、全タンパク抗原を用いる６時間の培養（抗原の処理及び提示に２時間に加え、ブレフェルジンＡを用いて４時間）、又はペプチド及びブレフェルジンＡを用いる６時間の培養のいずれかを要する。更に、試料の取得がその日の遅くになると、夜遅く処理ステップが必要になり、そうでなければ翌日まで放置されるが、それは最適ではない。その上、次いで培養後に２時間の細胞内染色ステップが必要であり、その後にフローサイトメトリー分析が行われる。ＩＣＣアッセイの自動化は可能である（Suni, MA, HS Dunn, PL Orr, R de Laat, E Sinclair, SA Ghanekar, BM Bredt, JF Dunne, VC Maino, and HT Maecker. 2003. Performance of plate-based cytokine flow cytometry with automated data analysis. BMC Immunol 4:9）が、一般には利用できない。また、試験室間の規格化にも問題がある。
【０００７】
したがって、現在利用できる方法のうち、臨床及び診断試験室並びに研究室に直ぐに適用できる抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出法は存在しない。更に、診断試験室での使用に適した方法に関しては、それに伴う各種の問題及び困難のためにこれまで不評であった。しかし、診断試験室で不評となっている抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出アッセイが、唯一種の免疫反応アッセイではない。即ち、ポリクローナルマイトジェンであるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）に対する免疫系リンパ球の反応は、一般的なＴ細胞免疫能力の尺度として以前に広く使用されてきた（例えば、原発性免疫不全が疑われる場合に対して（Buckley, RH 2004. Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution. AnnuRev Immunol 22:625））。しかし、このアッセイは３Ｈ−チミジンＬＰＡに基づくので、細胞が３日目に採集されることは別として、ＬＰＡと本質的に同じ欠点を受ける。
【０００８】
抗凝固処理した全血試料の少量の一定分量を抗原又はＰＨＡと４時間（２４時間まで）インキュベートし、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の早期Ｔ細胞活性化マーカー抗原ＣＤ６９の上方調節による活性化をフローサイトメトリーで測定する、より簡潔な全血法が提案されてきた（Perfetto, SP, TE Hickey, PJ Blair, VC Maino, KF Wagner, S Zhou, DL Mayers, D St Louis, CH June, and JN Siegel. 1997. Measurement of CD69 induction in the assessment of immune function in asymptomatic HIV-infected individuals. Cytometry 30:1）。応答時間が短く、細胞表面の読取りが非常に簡単なこの全血アッセイは、魅力的な手法であった。しかし、本出願人によれば、このアッセイはポリクローナルＰＨＡ反応の測定には有用であるが、不適切なほど多数のＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原に応じてＣＤ６９を上方調節し、この読取りに特異性が欠如していることを示すので、このアッセイが抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に十分には特異的でないことが判明した。更に、エクスビボでのＣＤ４＋Ｔ細胞の小さいが無視できないサブセット上にＣＤ６９が存在するために、結果の分析が複雑になることが判明した。
【０００９】
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する全血アッセイの使用されている別の例は、Quantiferon（登録商標）全血刺激アッセイ（CSL Limited社製、Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）である。このアッセイでは、抗原刺激後に血漿を収集し、ＥＬＩＳＡによりそのＩＦＮ−γを分析する。しかし、多量のＩＦＮ−γが、特にウィルス抗原に反応するＣＤ８＋Ｔ細胞、並びに培養物中に存在するＮＫ細胞により産生されるため、標準的ＬＰＡ同様に、その反応がＣＤ４＋Ｔ細胞によることが確認されていない。現在のところ、このアッセイは結核菌に対する反応の検出だけに認可されている。しかし、このアッセイは、年少小児集団において多数の不確定な結果を示すことが認められてきた。結核菌により刺激されるＩＦＮ−γ反応の検出法であって、欧州で使用が認可されているT spot TBアッセイとして知られる第２のアッセイがある。このアッセイは、ELIspotプレート上に播種する前にＰＢＭＣの分離を要するELIspot基準法である。このアッセイは、特異性及び感度が類似しており、小児及び免疫低下者の患者において不確定結果の割合が減少するようである。
【００１０】
したがって、特に抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞、それだけでなく抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する、相対的に簡単で費用効果的な代替法に対する必要性が今なお存在している。
【００１１】
ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを用いて細胞表面マーカー抗原ＣＤ２５（インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のα鎖である膜貫通タンパク質）の上方調節と細胞分裂との動態を調べる間に、本出願人は、約４８時間以後に開始する細胞分裂に先立って、ＣＤ２５が、２４時間以後に抗原又はマイトジェンに反応するＣＤ４＋Ｔ細胞上に顕著に上方調節されることを見出した。同時に、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）などのある種の副刺激細胞表面タンパク質の発現動態を調べていると、これらのタンパク質の上方調節も２４時間以後に起こることが判明した。マウスモデルにおける遺伝子研究によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０と抗原提示細胞上のＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）との相互作用が、初回抗原刺激後の「記憶」ＣＤ４＋Ｔ細胞（即ち、即座の防御力、並びに抗原刺激に対してより迅速で有効な免疫反応を開始する能力を付与できる、いわゆる記憶細胞に成長した初回抗原刺激済みのＣＤ４＋Ｔ細胞）の生成、及びエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の生存促進にとって肝要であることが示された。ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１３４発現は、抗原又はマイトジェンによるＴ細胞受容体の刺激から２４〜４８時間後に最高潮となり、約１２０時間後に基準線に戻ることが以前に報告されていた（Croft, M 2003. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev Immunol 3:609）ので、本出願人は、抗原又はマイトジェンで刺激した全血培養物を用いて、ＣＤ２５及びＣＤ１３４が、４８時間の直前（即ち、最大のＣＤ１３４発現に相当するが、細胞分裂の開始前に相当した時点）に共発現するか否か、したがって抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出及び／又は測定する、相対的に簡単で費用効果的な方法の基礎として使用し得そうか否かを調査した。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞用のこうした細胞表面マーカーは、ヘパリンナトリウムで抗凝固処理した全血試料を用いて、抗原との４０〜４４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによって容易に測定できることが判明した。したがって、この方法は、準備の簡潔性（即ち、ＰＢＭＣの調製が不要）と、フローサイトメトリーの簡単な読取り（即ち、細胞の透過性化及びサイトカインの検出が不要）とを併用している。更に、この方法は、驚くほど低いバックグランド（ＣＤ４＋Ｔ細胞の＜０．０３％）を有することが判明済みであり、この方法の使用によって、マイコバクテリア抗原、破傷風トキソイド、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）溶解物、ワクシニア溶解物、及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）の調製物中に含まれる抗原に対して、特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞反応を容易に検出することがこれまでに可能となった。その上、この方法は、一般的な免疫能力の尺度として、ＰＨＡなどのマイトジェン及びブドウ球菌エンテロ抗原Ｂ（ＳＥＢ）に対するより広範な反応の評価にも使用できることが判明した。その上更に、この方法は、固定及び透過性化のステップを回避し得る、抗原特異的又はマイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞分取に適用を有する。
【非特許文献１】Lyons, AB, and CR Parish. 1994. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods 171:131
【非特許文献２】Nomura, LE, JM Walker, and HT Maecker. 2000. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. Cytometry 40:60
【非特許文献３】Suni, MA, HS Dunn, PL Orr, R de Laat, E Sinclair, SA Ghanekar, BM Bredt, JF Dunne, VC Maino, and HT Maecker. 2003. Performance of plate-based cytokine flow cytometrywith automated data analysis. BMC Immunol 4:9
【非特許文献４】Buckley, RH 2004. Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution. Annu Rev Immunol22:625
【非特許文献５】Perfetto, SP, TE Hickey, PJ Blair, VC Maino, KF Wagner, S Zhou, DL Mayers, D St Louis, CH June, and JN Siegel. 1997. Measurement of CD69 induction in the assessment of immune function in asymptomatic HIV-infected individuals. Cytometry30:1
【非特許文献６】Croft, M 2003. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev Immunol 3:609
【発明の開示】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の適当なリンパ球含有試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、第１の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原の存在下で対象由来の適当なリンパ球含有試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００１４】
好ましくは、該リンパ球含有試料は全血試料である。
【００１５】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、抗原の存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約４８時間以内に実施される。
【００１６】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなる。
【００１７】
好ましくは、この方法は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的又は定性的な検出に使用される。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、対象の免疫能力を測定する方法であって、抗原及び／又はマイトジェンへの曝露に反応する、前記対象由来の適当なリンパ球含有試料中の細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、第２の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原及び／又はマイトジェンの存在下で対象由来の適当なリンパ球含有試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００２０】
好ましくは、該リンパ球含有試料は全血試料である。
【００２１】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、抗原及び／又はマイトジェンの存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約４８時間以内に実施される。
【００２２】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなる。
【００２３】
好ましくは、この方法は、抗原特異的又はマイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的又は定性的な検出に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本出願人は、細胞表面マーカーＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現の検出が、対象由来のリンパ球含有培養試料、特に全血試料中の抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を検出及び／又は測定する有用な手段を提供することを見出した。
【００２５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に関して使用される用語「抗原特異的」とは、該Ｔ細胞が、対象とする特定抗原に特異的に結合及び反応することができることを意味すると理解されたい。加えて、「抗原特異的」と述べたＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ調節細胞（ＴＲＥＧ細胞）ではないことを理解されたい。
【００２６】
第１の態様では、本発明は、対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の適当なリンパ球含有試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、第１の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原の存在下で対象由来の適当なリンパ球含有試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００２８】
好ましくは、該リンパ球含有試料は全血試料である。このような全血試料は、当業者に周知の任意の方法によって（例えば、カニューレ及び血液試料バイアルの使用によって）対象から取得することができる。適当な抗凝血剤を全血試料に添加して凝固を防止してもよい。特に適当な抗凝血剤は、任意の市販のヘパリン処理血液試料バイアルを用いることにより、都合よく使用できるヘパリンナトリウムである。酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）をキレート化する抗凝血剤は、カルシウム流入の阻止によりリンパ球機能を妨害する恐れがあるので、避けることが好ましい（Lewis, RS. 2001. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Ann Rev Immunol 19:497-521）。したがって、第１の態様の方法に使用する全血試料は、ヘパリン処理血液試料バイアル中に収集することが好ましい。
【００２９】
リンパ球含有試料（例えば全血試料）を培養するステップは、当業者に周知の任意の方法に準じ得る。全血試料に対しては、試料を例えば適当な培地（例えば、Iscove改変ダルベッコ培地）及び抗原と混合し、３７℃でインキュベートし得る。その抗原は、検出しようと意図する抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞に従って選択することになろう。したがって、潜在的結核又はＢＣＧによる以前のワクチン接種を検査するためには、選択される該抗原は、ツベルクリン、又はＥＳＡＴ−６（early secretory antigenic target）、培養ろ液タンパク質−１０（ＣＦＰ−１０）などの結核特異抗原でもよい。同様にＣ型肝炎の検査には、選択される該抗原はＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のコア抗原又は非構造タンパク質３（ＮＳ３）とし得るが、ＣＭＶの検査にはリンタンパク質６５（ｐｐ６５）又はＣＭＶ溶解物を利用し得る。ＨＩＶ−１に対しては、選択される該抗原は、組換えｐ２４、又はＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ若しくは他のＨＩＶ−１補助遺伝子由来の重複ペプチドのプールでもよい。
【００３０】
ツベルクリン、ＨＩＶ−１  ｐ２４などの精製タンパク質（天然又は組換え）は別として、該抗原は、例えば、細菌若しくはウィルス溶解物、死滅全粒ウィルス、抗原性タンパク質断片（合成抗原性ペプチドを含む）、重複ペプチドプール（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238、Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）又は最適化抗原性ペプチド、細菌、真菌若しくは酵母の死滅若しくは固定全菌抗原性調製物、或いはウィルス感染細胞又は抗原パルス抗原提示細胞でもよい。該抗原は、適当な担体分子に結合してもよく、又はアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
好ましくは、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、培養物中に存在する実質数の細胞を分割する前に実施する。したがって、標準的な培養条件下で（例えば、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気の３７℃で、リンパ球の培養に適した標準培地を用いて）、該検出ステップは、好ましくは、抗原存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から６０時間以内、より好ましくは４８時間以内に実施される。その上、該検出ステップは、細胞表面マーカー（即ち、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７）の共発現を実質的に上方調節するのに十分な期間が経過した後、実施することが好ましい。したがって、標準的な培養条件下、該検出ステップは、抗原存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約２４〜４８時間以内に実施することがより好ましく、抗原存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約４０〜４４時間以内に実施することが最も好ましい。
【００３２】
この方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現の検出を含み得るが、この方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなることが好ましい。
【００３３】
これに関しては、抗原特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞以外のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のうち、エクスビボで細胞表面マーカーのこうした組合せを発現するものは、あるにしてもないに等しいことが判明しており、このためＣＤ２５及びＣＤ１３４の共発現又はＣＤ２５及びＣＤ１３７の共発現の非常に低い「バックグランド」に対して、該検出ステップを実施することが可能である。その結果、本発明の第１の態様の方法は、希少な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の０．１％未満の頻度で培養物中に存在する）の検出に特に使用し得る。
【００３４】
細胞表面マーカーを検出するステップは、当業者に周知の任意の方法に従って実施し得る。このような方法は、細胞表面マーカーＣＤ２５、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７の１種に特異的に結合する標識モノクローナル抗体の使用、並びに好ましくはフローサイトメトリーの使用を含み得る。これに関しては、適当な標識モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ１３４抗体）と結合した後、都合がよいときに（例えば、リンパ球含有試料の収集及び培養の場所からフローサイトメトリー試験室へ輸送した後）、試料を適当な固定剤（例えば、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中１％で使用し得るパラホルムアルデヒド）で固定することにより、その後の細胞表面マーカーの定量又は定性的決定を行い得ることは、当業者であれば理解されよう。したがって、該検出ステップを実施するための上記好ましい各時間に関しては、培養試料の「染色」（即ち、蛍光色素（複数も）で標識した適当なモノクローナル抗体による）及び「固定」は、所与の好ましい期間内に実施しさえすればよいと理解されたい。即ち、染色及び固定を、抗原存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から４４時間後に開始するが、細胞表面マーカーの実際の定量又は定性的決定は、後になる（例えば１２〜２４時間後）まで行わない場合、それでもなおその場合は、抗原存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約４０〜４４時間の最も好ましい期間内に該検出ステップを実施することになると理解されたい。
【００３５】
この第１の態様の方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を発現する細胞の単離を更に含み得る。該単離ステップは、当業者に周知の任意の方法に従い、例えば、多くのフローサイトメーターで利用できる細胞分取機能の利用によって実施し得る。
【００３６】
本発明の第１の態様の方法は、特に、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的又は定性的検出を可能にする（即ち、この方法はＣＤ４＋Ｔ細胞の想起反応のモニターを可能にする）。したがって、この方法は、細胞内病原性の細菌（例えば、マイコバクテリア、クロストリジウム及びヘリコバクター）、真菌（例えば、カンジダ、アスペルギルス及びクリプトコッカス）、ウィルス（例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、風疹ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ−２、ＪＣウィルス及びカポジ肉腫ヘルペスウィルス）並びに原虫（例えば、トキソプラズマ、ニューモシスティス、クリプトスポリジウム及びプラスモジウム）、細胞外の細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、連鎖球菌種、ナイセリア種、ヘモフィルス種、シュードモナス種）及びトキソイド（例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド）に対する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に有用となり得る。この方法は、自己抗原（例えば、インスリン、グリアジン、アセチルコリン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、ＤＮＡ及びクロマチン）並びにアレルゲン（例えば、イエダニタンパク質又は花粉タンパク質）に対する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出にも有用となり得る。好ましくは、該抗原は、ツベルクリン、ＨＣＶコア抗原、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＣＭＶ溶解物、ＨＳＶ−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ＪＣウィルス溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ＨＩＶ−１  ｐ２４、及びＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又は他のＨＩＶ−１補助遺伝子由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される。
【００３７】
対象は、人間又は獣医学上重要な別の動物（例えば、家畜動物、競走馬及び愛玩動物）でもよい。対象は、例えばヒト疾患のモデル又はワクチンの開発に使用するマウスやサルなどの実験動物の場合もあり、ワクチン開発では、免疫反応の様々な側面を分析することが特に興味深い。
【００３８】
第２の態様では、本発明は、対象の免疫能力を測定する方法であって、抗原及び／又はマイトジェンへの曝露に反応する、前記対象由来の適当なリンパ球含有試料中の細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００３９】
好ましくは、第２の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原及び／又はマイトジェンの存在下で対象由来の適当なリンパ球含有試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００４０】
好ましくは、該リンパ球含有試料は全血試料である。第１の態様の方法と同様に、全血試料は、当業者に周知の任意の方法により対象から取得できるが、カニューレ及びヘパリン処理血液試料バイアルの使用により都合よく取得し得る。カルシウムイオン（Ｃａ２＋）をキレート化する抗凝血剤は、リンパ球機能を妨害する恐れがあるので、避けることがやはり好ましい。
【００４１】
リンパ球含有試料（例えば全血試料）を培養するステップは、当業者に周知の任意の方法に準じ得る。したがって全血試料に対しては、試料を適当な培地並びに抗原及び／又はマイトジェンと混合し、３７℃でインキュベートし得る。
【００４２】
好ましくは、本発明の第２の態様の方法では、リンパ球含有試料を培養するステップは、マイトジェンの存在下で培養することを含む。該マイトジェンは、当業者に周知のマイトジェンから選択してもよく、例えば、該マイトジェンは、ＰＨＡ、ホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ＳＥＢ、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、ヤマゴボウマイトジェン、並びに場合によりＣＤ２８副刺激及び／又は抗ＣＤ２モノクローナル抗体と組み合わせることもある、抗ＣＤ３モノクローナル抗体からなる群から選択してもよい。
【００４３】
或いは、本発明の第２の態様の方法では、リンパ球含有試料を培養するステップは、抗原の存在下で培養することを含む。ツベルクリンなどの精製タンパク質（天然又は組換え）は別として、該抗原は、やはり例えば、細菌若しくはウィルス溶解物、抗原性タンパク質断片（合成抗原性ペプチドを含む）、又は重複ペプチドプールでもよい（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238、Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）。該抗原は、適当な担体分子に結合してもよく、又はアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
好ましくは、該抗原は、ツベルクリン、ＨＣＶコア抗原、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＣＭＶ溶解物、ＨＳＶ−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ、ＨＩＶ−１  ｐ２４、及びＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ又は他のＨＩＶ−１補助遺伝子由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される。
【００４５】
好ましくは、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、培養物中に存在する実質数の細胞を分割する前に実施する。したがって、該検出ステップは、好ましくは、抗原及び／又はマイトジェン存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から６０時間以内、より好ましくは４８時間以内に実施される。その上、該検出ステップは、細胞表面マーカー（即ち、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７）の発現を実質的に上方調節するのに十分な期間が経過した後、実施することが好ましい。したがって、該検出ステップは、抗原及び／又はマイトジェン存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約２４〜４８時間以内に実施することがより好ましく、抗原及び／又はマイトジェン存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約４０〜４４時間以内に実施することが最も好ましい。
【００４６】
この方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現の検出を含み得るが、この方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなることが好ましい。
【００４７】
細胞表面マーカーを検出するステップは、当業者に周知の任意の方法に従って実施し得る。好ましくは、該検出ステップはフローサイトメトリーの使用を含む。第１の態様の方法同様に、培養リンパ球含有試料を適当に固定すれば、フローサイトメトリーを遅らせてもよい（例えば１２〜２４時間）。したがって、該検出ステップが、例えば蛍光色素（複数も）で標識された適当なモノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ１３４抗体）の使用、並びにフローサイトメトリーの使用を含む場合、培養リンパ球含有試料は、抗原及び／又はマイトジェンとの試料の培養開始から４４時間後に染色及び固定するが、細胞表面マーカーの定量又は定性的決定（例えば、フローサイトメトリーによる）は、後で行ってもよい。したがって、該検出ステップは、それでもなお、抗原及び／又はマイトジェン存在下でのリンパ球含有試料の培養開始から約４０〜４４時間の最も好ましい期間内に実施されたと理解されよう。
【００４８】
この第２の態様の方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を発現する細胞の単離を更に含み得る。該単離ステップは、当業者に周知の任意の方法に従い、例えば、多くのフローサイトメーターで利用できる細胞分取機能の利用によって実施し得る。
【００４９】
対象は、人間又は獣医学若しくは実験上重要な別の動物でもよい。
【００５０】
本発明の特質をより明確に理解するために、以下の非限定的な実施例を参照しながらその好ましい形態を今から説明する。
［実施例］
【実施例１】
【００５１】
ヒト全血のＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
材料及び方法
対象
健常成人志願者を大学及び病院の人材から募集した。対象３名は、職業上の理由から地域の労働衛生安全指針に従ってワクシニアの接種を受け、他所（Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）に記載のように経時的試料を提供した。ＨＩＶ−１  ｐ２４（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）に対する検出容易なＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す、ＨＩＶ陽性長期非進行者ＬＴＮＰ−００１も検査を受けた。
【００５２】
試薬
マイトジェンのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ；Sigma社製、St Louis、ＭＯ、米国）を最終濃度５μｇ／ｍｌで全血培養物中で使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ；Sigma社製）を最終濃度１μｇ／ｍｌで使用した。
【００５３】
ＣＭＶ溶解物は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように調製し、最終濃度１／２５０で使用した。
【００５４】
インビトロアッセイ用のワクシニア抗原は、ＨｅＬａ細胞中でのＮＹＣＢＨ株の増殖後、他所（Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）に記載のように調製した。感染性細胞内成熟ウィルスの全粒ウィルス溶解物は、感染細胞を多数回凍結・融解した後、７００ｇ、１０分の遠心分離により細胞屑を除去することによって調製した。ウィルス抗原は、５６℃、３０分の熱不活性化で更に処理し、感染力価を１０６倍減少させた（データは示していない）。ワクシニア溶解物は、最終濃度１／２５０で使用した。未感染ＨｅＬａ細胞の対照溶解物も並行して調製し、同じ最終濃度で使用した。
【００５５】
結核菌（ＭＴＢ）由来のＰＰＤとして調製したマイコバクテリア抗原は、Staten Serum Institute社（デンマーク）から入手した。ＰＰＤは最終濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
【００５６】
破傷風トキソイド（ＴＴ）は、Commonwealth Serum Laboratories社（CSL Limited, Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）から入手した。ＴＴは、この製造業者の指示に従って最終濃度２Ｌｆ  Ｕ／ｍｌで使用した。
【００５７】
ＨＩＶ−１  ｐ２４（Protein Sciences社製、Meriden、ＣＴ、米国）は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
【００５８】
ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ１３４−ＰＥ及びＣＤ１３４−ＦＩＴＣの複合モノクローナル抗体は、Becton-Dickinson社（San Jose、ＣＡ、米国）から入手した。
【００５９】
リンパ増殖アッセイ（ＬＰＡ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のようにFicoll-Hypaque密度勾配遠心により分離した。ＰＢＭＣ１×１０５個を、１０％ヒト血清（Cambrex社製、East Rutherford、ＮＪ、米国）を含有するＲＰＭＩ１６４０（JRH社製、Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）中６日間、９６ウェル丸底プレート中の１ウェルにつきインキュベートした。添加物を含まない（対照）、又は異なる抗原若しくはマイトジェンを含む培養物を四重に用意した。３Ｈ−チミジン（Amersham社製、Buckinghamshire、英国）０．５μＣｉを１ウェルにつき添加し、更に１８時間インキュベートした後、細胞を採集し（Canberra Packard社）、TopCountシンチレーションカウンター（Packard Instrument社製、Meriden、ＣＴ、米国）上で計数した。各抗原又はマイトジェンに対する反復計数の平均値を対照培養物に対する平均値で割り、刺激指数（ＳＩ）を求めた。対照ウェルにおけるｃｐｍは、１２４〜４２８ｃｐｍの範囲にあった。
【００６０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイは、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように実施した。
【００６１】
細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイ
６色フローサイトメトリーを使用する、以前に公表済みの方法（Nomura, LE, JM Walker, and HT Maecker. 2000. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. Cytometry 40:60）に基づいた全血細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイを用いて、他所（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238、Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）に記載のようにワクシニア特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を測定した。手短に言うと、ヘパリンＮａ抗凝固処理全血を、無添加物（対照）、ＳＥＢ、又はワクシニア若しくは対照溶解物の存在下、共刺激性抗体ＣＤ２８及びＣＤ４９ｄと共に３７℃、２時間インキュベートした後、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Sigma-Aldrich社製）と共に更に４時間インキュベートした。このインキュベーション終了時に、ＥＤＴＡ（Sigma社製）を室温（ＲＴ）で１５分間、最終濃度２μＭで培養物に添加した。サイトカインの細胞内染色は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように実施した。手短に言うと、これらの培養物からの１００μｌを、次いでＦＡＣＳ溶解溶液１ｍｌとＲＴで１０分間インキュベートし、ＰＢＡ２ｍｌで１回洗浄した。次いで、ペレットをＦＡＣＳ透過作用溶液０．５ｍｌとＲＴで１０分間インキュベートし、ＰＢＡ２ｍｌで１回洗浄した。次いで、細胞をｍＡｂと暗所中、ＲＴで３０分間インキュベートした後、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＡ）２ｍｌで１回洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝塩水（ＰＦ／ＰＢＳ）中に再懸濁した。
【００６２】
解析のために、３０００００イベントを以前に記載（Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）のように収集した。Ｔリンパ球は、側方散乱光に対し先ずＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５にゲート設定し、次いでＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７陽性／ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７陰性細胞にゲート設定し、ＣＤ６９−ＡＰＣ＋ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ＋細胞を解析した。この方法は、ＨＩＶ陰性対照１６例の解析から、バックグランド結果と標準偏差の３倍との和に基づいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の陽性結果０．０８％の検証済みカットオフ値を有する（Munier等、未公表結果）。
【００６３】
全血のＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
ヘパリンＮａ抗凝固処理全血０．２５ｍｌを、滅菌した５ｍｌのポリスチレン製ネジ蓋瓶（Biolabs社製、Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）中でIscove改変ダルベッコ培地（IMDM; JRH社製）０．２５ｍｌと混合した。抗原及びマイトジェンを指定した濃度で添加し、蓋を緩く付けた状態で、培養物を空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃、４０時間インキュベートした。陰性対照培養物は、抗原の非存在下で全血及びＩＭＤＭの混合液だけを含んでいた。陽性対照培養物は、ＰＨＡ、ＳＥＢのいずれかを含有していた。こうした陽性及び陰性の対照培養物は、あらゆる実験に含められた。
【００６４】
フローサイトメトリー
全血培養物のフローサイトメトリーは、固定後にデュアルレーザーＬＳＲ  IIフローサイトメーター（Becton-Dickinson社製）上でＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。Ｔリンパ球は、側方散乱光ゲートに対し先ずＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を用いて同定し、次いでＣＤ３＋ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７＋Ｔ細胞にゲート設定した。また、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７染色を用いてＣＤ４＋ゲートからＣＤ８＋Ｔ細胞を除外した。次いで、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１３４−ＰＥで染色するために、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞を解析した。一部の実験では、示した通りＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１３４−ＦＩＴＣを使用した。モノクローナル抗体は、すべてBecton-Dickinson社から入手した。最低５００００イベントを解析した。補償は、個々の蛍光色素で染色したリンパ球を用いて調べ、次いでＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＣＤ１９−ＰＥ及びＣＤ１４−ＦＩＴＣ（Becton-Dickinson社製）で同時に染色した細胞で確認した。更なる対照には、ＡＰＣ、ＰＥ又はＦＩＴＣ抗体を含んでいない個々のチューブが含まれていた（データは示していない）。
【００６５】
結果
陰性対照並びにマイトジェン及び抗原に対する反応
対照培養物（＋０）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４のバックグランド共発現が、図１に示してある。３１回の個別実験で得られた結果から、バックグランド平均値は０．００６２％であり、標準偏差は０．００８２％であった。したがって、陽性結果のカットオフ値は、平均値＋３×標準偏差、即ち０．００６２％＋３×０．００８２％＝０．０３％と計算された。
【００６６】
ポリクローナルマイトジェンＳＥＢに対する反応を示す代表的ヒストグラムも図１に示されており、このマイトジェンに反応するＣＤ４＋Ｔ細胞の非常に高い比率を証明している。
【００６７】
健常成人対照において、ＣＭＶ溶解物、ＴＴ及びＰＰＤの各抗原を想起するための反応を示す代表的ヒストグラムも図１に示されている。
【００６８】
ＣＤ２５及びＣＤ１３４の共発現の動態
全血培養物におけるＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現の動態は、対象２名について図２に示されている。その結果から、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応は４４時間で最適に検出されることが示されている。この時点は、ＣＦＳＥ  ＬＰＡで検出した場合（データは示していない）、ＣＤ４＋Ｔ細胞がインビトロで増殖を開始し得る時間より前である。したがって、４４時間にＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋と測定されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、元の全血試料中に存在する個数を反映しているようである。
【００６９】
こうした実験におけるＳＥＢに対する反応は、２４時間の短時間でピークに達したが、大きさ類似の第２のピークが４４時間後に認められた（図２）。したがって、マイトジェンに対する抗原特異的反応、ポリクローナル反応の両方を４４時間の同一時点に測定することができる。
【００７０】
全血アッセイのＬＰＡ及びＣＦＳＥ標準増殖アッセイとの比較
ＣＭＶ、ＴＴ、ＰＰＤ及びＨＩＶ  ｐ２４を含む各種抗原に対する想起反応が異なる対象４名について、全血アッセイを２種の増殖アッセイと比較して調べた。フローサイトメトリーの代表的ヒストグラムを図３に示すが、これは、全血アッセイがＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のＣＦＳＥアッセイと合致することを実証している。対照の健常成人対象３名及びＨＩＶ＋長期非進行者（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）１名に対する結果が、表１に要約されている。全血アッセイの特異性は、対照の健常成人対象３名中２名が、全アッセイを通じてＣＭＶに対する反応で陰性ある一方、対照の第３の健常成人対象が全アッセイを通じて陽性であったという観察により、実証される。一般に、全血アッセイの結果が高いほど、増殖の結果も高かったが、２種の増殖アッセイ間ですら、アッセイ間に有意の変動性があるらしいことは確かであった。
【００７１】
ワクシニア接種後のワクチン反応の進展
全血アッセイで検出した、ワクチン未接種対象の接種後のワクシニアに対する反応の展開を示す代表的ヒストグラムが、図４Ａに示されている。異なるワクチン未接種対象３名に対するワクシニア特異的全血アッセイの経時的結果を図４Ｂに要約してあるが、この結果は、接種後の応答性の展開パターンがワクチン接種者全員とも類似していることを示す。図４Ｃは、すべての経時的全血試料にわたる、ＩＣＣアッセイ結果（他所（Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）で詳細に報告されている）に対するワクシニア特異的全血アッセイ結果の相関性を示す。この両アッセイ間には非常に強い相関性があり、回帰線の切片がゼロに非常に近い。しかし、全血アッセイは、８倍多くの抗原特異細胞を検出するようであった。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のより多いこの数は、細胞免疫表現型検査により特定された推定上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）にはるかに近似している。これは、ＨＩＶ−１一次感染及びＣＭＶ一次感染の間のＩＣＣ結果が、免疫表現型検査による推定上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のおよそ１０分の１であったという以前の知見（Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）と合致している。
【００７２】
【表１】
2009529894.tif 000002
【００７３】
考察
該結果は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイが極めて低いバックグランドを有し、これが、この２種の細胞表面マーカーに対する抗体によるこの２種の分子の独特な同時検出により実現されることを実証している。相当な比率の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞が比較的低レベルのＣＤ２５を発現しており、非常に低レベルのＣＤ１３４を発現する細胞もしばしば少数存在することは、よく知られている（データは示していない）。しかし、エクスビボで両抗原を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞は、実質上存在しない。したがって、この非常に低いバックグランドに対して、希少な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することが可能である。
【００７４】
該結果は、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が、このような培養物中に２４〜４０時間で容易に検出できることを示している。例示したアッセイは、以前の全血ＣＤ６９アッセイのいくつもの利点を有しており、即ち（ｉ）ヘパリンナトリウム抗凝血処理全血の小分量へ抗原又はマイトジェンを単に添加することが、準備に要するすべてである、（ii）細胞は、プールしたヒト血清の人工的状況ではなく、自家血漿中でインキュベートされる、（iii）固定及び透過性化を必要とせずに、細胞表面染色だけで済む、（iv）試料調製の時間及びフローサイトメトリー分析の複雑度は、最小限である。しかし、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋アッセイは、追加の利点、即ち（ｖ）抗体の組合せでＣＤ２５及びＣＤ１３４を同時に検出することにより、対照培養物中のバックグランド染色は常に極めて低いこと、並びに（vi）細胞表面上にＣＤ２５及びＣＤ１３４を同時に共発現する細胞だけを計数することにより、非常に高い特異性レベルが得られることを有している。
【００７５】
例示したアッセイを用いて、本出願人は、ウィルス抗原（即ち、ＣＭＶ及びＨＩＶ−１）、細菌抗原（即ち、ＰＰＤ及びＴＴ）並びにポリクローナルマイトジェン（即ち、ＰＨＡ及びＳＥＢ）を含め、多様な範囲の抗原に反応を示す対象間の識別をすることができた。すべての事例において、その反応は、現在の「基本標準」アッセイである、３Ｈ−チミジン、ＣＦＳＥのいずれかを用いるＬＰＡと高度な相関性を示した。別の一連の実験では、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイはＩＣＣアッセイとも高度な相関性を示した。
【００７６】
反対に、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイは、マイトジェンのＰＨＡ及びＳＥＢに対する非常に広い反応を容易に検出するため、Ｔリンパ球機能の簡潔な一般アッセイとして使用するのに適している。
【実施例２】
【００７７】
マカークの全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
材料及び方法
対象
この実施例ではマカーク３１匹を使用した。異なる３群、具体的には非ワクチン接種対照群（動物１１匹）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質を発現する構築体をワクチン接種した１群（動物１０匹）、並びにＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ及びＰｏｌ各タンパク質、更に他のＨＩＶ−１補助遺伝子を発現する構築体をワクチン接種した１群（動物１０匹）を調査した。
【００７８】
構築体
ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質、並びにＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ及びＰｏｌ各タンパク質、更に他のＨＩＶ−１補助遺伝子を発現する各構築体は、既に記載されている（De Rose R, Batten CJ, Smith MZ, Fernandez CS, PeutV, Thomson S, Ramshaw IA, CouparBE, Boyle DB, Venturi V, Davenport MP, Kent SJ.  2007.  Comparative efficacy of subtype AE simian-human immunodeficiency virus priming and boosting vaccines in pigtail macaques. J Virol. 81:292-300）。
【００７９】
試薬
ＨＩＶ−１  Ｇａｇ由来のペプチド１２２種の重複ペプチドプール（Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）を、各ペプチドの最終濃度２μｇ／ｍｌで全血培養物中で使用した。
【００８０】
ヒト分子に対して特異性を有し、サル分子と交差反応する以下のマウスモノクローナル抗体：抗ＣＤ３及び抗ＣＤ４（PharMingen社製、San Diego、ＣＡ、米国）、抗ＣＤ２５（BD Biosciences社製、San Jose、ＣＡ、米国）、並びに抗ＣＤ１３４（BD Biosciences社製、San Jose、ＣＡ、米国）を使用した。
【００８１】
細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイ
マカークでの使用に対して最適化した、実施例１に記載のアッセイ同様の全血ＩＣＣを使用して、該動物から得た新鮮末梢血試料中のＩＦＮ−γ反応を分析した。
【００８２】
全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
新鮮なヘパリンナトリウム抗凝血処理全血において、抗原としてＨＩＶ−１  Ｇａｇ由来の重複ペプチドのプールを用いて、実施例１に記載のようにＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイを実施した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１３４の発現について、培養済み試料を上記のモノクローナル抗体を用いて評価した。
【００８３】
結果及び考察
予定通りのワクチン接種を受けたマカークザル由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１  Ｇａｇに対する反応を、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイにより測定し、標準ＩＣＣアッセイにより測定したＩＦＮ−γ反応と比較した。図５に示した結果の比較から、明瞭な正の相関性が示され、したがって人間以外の対象、特に非ヒト霊長類に対する全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイの適正が実証された。
【実施例３】
【００８４】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するための全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイ
材料及び方法
対象
対象は、実施例１に記載のように募集したが、或いは抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベル又はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫能力が注目される任意の対象を含め得る。例えば、注目し得る対象には、抗原に対してワクチン接種を受けたことがある、又は感染性病原体に曝露されたことのある対象、並びに免疫性又は疾患の進行が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルに関係している、疾患又は病状に罹っている対象が含まれる（例えば、病原体に感染した細胞又は屑の一掃にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を必要とする疾患であって、ＨＩＶ−１、Ｂ型及びＣ型肝炎、鳥インフルエンザを含むＡ型及びＢ型インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウィルス、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）Ｉ型及びII型、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、並びに一連の他のウィルス、更にマラリアなどの感染症を起こす非ウィルス病原体を含めた、ウィルス及び他の細胞内病原体が起こす感染症などの疾患；ＣＤ８＋Ｔ細胞が病原に重要な役割を演じているようである、抗レトロウィルス薬のアバカビルが誘発するような過敏性反応；更に、ウィルス病原体に対するワクチンへの反応、特に、ＤＮＡワクチン、又はＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘発することを意図した各種のプライムブースト系で、単独、組合せのいずれかで使用されるポックスウィルス系若しくはアデノウィルス系ワクチンが誘発する反応）。
【００８５】
試薬
使用し得る抗原及びマイトジェンは、実施例１に記載の通りである。しかし、当業者に周知の抗原又はマイトジェンの任意の個数を使用してもよい。例えば、抗原及びマイトジェンは、合成した最適化ペプチド又は重複ペプチドセット、ＥＢＶで形質転換及び不死化された感染自家Ｂ細胞系などのウィルス感染標的細胞、注目するＭＨＣ−１分子によるトランスフェクション、ペプチドセットのパルス、注目する抗原を発現するワクシニア構築体などのウィルスによる感染のいずれかを受けた細胞系を含み得る。この実験で使用した抗原及びマイトジェンは、ＰＨＡ、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、並びにＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザウィルス由来の最適化した抗原性ペプチドのプールであった。
【００８６】
モノクローナル抗体は、実施例１及び実施例２に記載のように使用した。しかし、抗ＣＤ１３４抗体の代わりに抗ＣＤ１３７−ＰＥ（BD Biosciences社製、San Jose、ＣＡ、米国）を使用した。
【００８７】
全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイ
全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイは、本質的に実施例１に記載のように実行した。培養済み試料は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５及びＣＤ１３７の発現についてモノクローナル抗体及びフローサイトメトリーを使用して評価した。
【００８８】
フローサイトメトリー
全血培養物のフローサイトメトリーは、実施例１同様に、デュアルレーザーＬＳＲ  IIフローサイトメーター（Becton-Dickinson社製）上でＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。Ｔリンパ球は、側方散乱光ゲートに対し先ずＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を用いて同定し、次いでＣＤ３＋ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７＋Ｔ細胞にゲート設定した。また、ＣＤ４−AlexaFluor700（Becton-Dickinson社製）による染色を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞ゲートからＣＤ４＋Ｔ細胞を除外した。次いで、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１３７−ＰＥを結合するために、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４−細胞を解析した。
【００８９】
結果及び考察
健常対象又はＨＩＶ感染対象のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＰＨＡ、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、並びにＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザウィルス由来の最適化した抗原性ペプチドのプールに対する反応を全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイで測定した。図６に示す結果では、健常成人対象Ｃ００２は、四量体、ＩＣＣ及びElispot分析（当業者に周知の技法を用いて実施、データは示していない）で示されたように、ＣＭＶに対する明確なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を有し、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイにおいて明瞭な陽性結果を生じた。反対に、ＨＩＶ感染対象Ｓ００９は、ＣＭＶ反応を示さなかった（ＣＭＶに対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応が該対象に欠如していたことと合致、データは示していない）が、ＨＩＶ  Ｇａｇペプチドには明瞭な陽性反応を有したため、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を試験し、検出するための全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイが適正であることを実証した。こうした結果は、マウスの遺伝学研究においてＣＤ８＋Ｔ記憶細胞の生成及び生存にＣＤ１３７が関与しているとの報告（Whitmire, JK and Ahmed, R. 2000. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Current Opinion in Immunology 12(4): 448-55）と合致している。
【００９０】
したがって、本発明の方法は、抗原への曝露に反応する全血試料中のＣＤ２５及びＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に測定することにより、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために使用することができる。したがって、この方法は、注目する抗原に対する特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞反応の検出に有用であり、そうした抗原は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、他の疱疹ウィルス、ＨＩＶ及び他のレトロウィルス（ヒトＴ細胞白血球ウィルス（ＨＴＬＶ）１型及び２型、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ−ＳＩＶ組換えウィルス（ＳＨＩＶ））、ワクシニアウィルス、天然若しくは組換えワクシニア、又は注目する抗原を発現する改変ワクシニアベクター、及び他の組換えポックスウィルス（例えば、鶏痘及びアビポックスウィルス）、インフルエンザウィルス、肝炎ウィルス特にＢ型及びＣ型、パルボウィルス、ＪＣウィルス、並びに一連のマウスウィルスなどのウィルス抗原に由来する、重複ペプチドセット又は最適化ペプチド中に含まれている抗原などである。
【００９１】
その上、この方法は、一般的な免疫能力の尺度として、ＰＨＡ（図６に示す通り）などのマイトジェン、ＳＥＢ並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８に対するより広範な反応の評価にも使用できる。
【実施例４】
【００９２】
マウス脾臓細胞のＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
材料及び方法
マウスの免疫
Ｃ５７ＢＬ／６マウス４匹の皮下に、フロイントの完全アジュバント（Sigma社製、St. Louis、ＭＯ、米国）中に乳化したメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ；Sigma社製、St. Louis、ＭＯ、米国）０．４ｍｇを接種した。７日後に、マウスの右足蹠にｍＢＳＡ２００μｇを注射し、対照として左足蹠にＰＢＳを注射した。２４〜４８時間後に、足蹠を調べ、最大腫脹を測定した。対照マウスにはｍＢＳＡを接種しなかった。８日目にマウスを犠牲にした。
【００９３】
細胞培養
これらのマウスの脾臓をミンチにして７０μｍ滅菌メッシュを通し、単個細胞浮遊液（１〜２×１０６細胞／ｍｌ）を１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中、５μｇ／ｍｌのメチルＢＳＡ存在下又は非存在下で４４時間培養した。追加の培養物中では、陽性対照としてマイトジェンのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ；Sigma社製、St. Louis、ＭＯ、米国）を最終濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
【００９４】
モノクローナル抗体及びフローサイトメトリー
マウス細胞表面抗原に対して特異性を有する以下のモノクローナル抗体：抗ＣＤ３−Pacific Blue、抗ＣＤ４ Alexa Fluor 700、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ及び抗ＣＤ１３４−ＰＥ（PharMingen社製、San Diego、ＣＡ、米国）を使用した。
【００９５】
細胞は染色し、実施例１に記載のようにＬＳＲ  IIフローサイトメーターで分析した。
【００９６】
結果及び考察
免疫されたマウスでは、メチルＢＳＡを皮内投与してから２４〜４８時間後の足蹠腫脹によって、マウスがインビボでメチルＢＳＡに反応したことが確認された（Jiang等、未公表；データは示していない）。１日後に、これらのマウスを犠牲にし、脾臓を取り出した。
【００９７】
ＰＨＡと共にインビトロで脾臓を４４時間培養した後、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞の平均比率は、全マウスに対して６６％であった。メチルＢＳＡと共に培養した免疫マウス由来の脾臓細胞については、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞の平均比率は１．８１％であった。非免疫対照マウス由来の脾臓細胞については、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞の平均比率は０．０４％であった。
【００９８】
こうした結果は、ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイが、マウスにおける抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出にも使用できることを実証している。
【００９９】
要約すると、例示したＣＤ２５／ＣＤ１３４及びＣＤ２５／ＣＤ１３７の全血アッセイは、培養準備の簡潔性（即ち、ＰＢＭＣの調製が不要）、分析用調製の簡潔性（細胞表面抗原だけ）、フローサイトメトリー分析の簡潔性（臨床試験室で現在使用している圧倒的多数のフローサイトメーターで操作できる４色分析）、非常に広範囲の反応に対する適用性（希少な抗原特異細胞からマイトジェンに対するポリクローナル反応まで）を含め、現行法に対していくつかの利点を有しており、特に小児集団において利点となる少ない血液量を利用し得る。更に、こうしたアッセイは、アッセイを現場から離れて準備できるように固定後の試料を輸送するが、専門施設で行うフローサイトメトリーにより検出することを可能にし得る。
【０１００】
ＣＤ２５／ＣＤ１３４及びＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイは、以下の事項を含む各種の用途に適している。
１．マイトジェン（例えばＰＨＡ）に対する反応の測定による一般的免疫不全の判定。
２．適切な抗原調製品が利用できる、細菌、真菌、ウィルス、原虫などの病原体（例えば、普通の微生物体及び環境微生物）に対する反応のモニタリング。
３．ＨＩＶ−１感染による進行免疫不全の対象における、このような病原体（例えばＣＭＶ）による感染に対する反応の喪失のモニタリング。
４．ワクチン反応（例えば、ワクシニア、ＴＴ、ＢＣＧ（ＭＴＢ）、ＨＩＶ−１、並びに麻疹、ムンプス及び風疹（ＭＭＲ））のモニタリング。
５．詳細な表現型検査をするための抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の同定（例えば、Ｔｈ１対Ｔｈ２などの分化マーカー、リンパ節ホーミング対腸又は皮膚ホーミングなどの転送マーカー、サイトカイン受容体、及びケモカイン受容体）。
６．４４時間培養した後の固定していない抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞分取（例えば、定量的な単一細胞の培養、抗原特異細胞の精製集団に関する機能アッセイ、遺伝子プロファイル作成を目的とした、各種の抗原提示細胞集団の活性化要件及び細胞活性化／増殖に対する差次的効果の評価、並びにＴ細胞受容体の分析を可能にする）。現在のところ、細胞分取をするための抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる同定には、細胞を固定し、透過性にするＩＣＣアッセイが普通は必要であるため、インビトロでの更なる増殖が妨げられる。対照的に、本発明に従って分取される細胞は、インビトロの操作に、又はマウス、マカーク、及び恐らくはヒトにおける再注入などのインビボの操作にでさえ使用できよう。この細胞は、遺伝子プロファイル作成を目的とした、ＲＮＡ種の単離にも使用できよう。
７．粗製混合物からの潜在的抗原の簡単な選別。
８．核抗原などの十分に特性決定済みの自己抗原、及びアレルゲン（例えば、イエダニタンパク質又は花粉タンパク質）に対する反応のモニタリング。
９．血液量が限られている小児科及び他の状況。
１０．獣医学的に重要な動物（例えば、家畜動物、競走馬及び愛玩動物）、或いは実験動物（例えば、ヒト疾患のモデルとして、又はワクチンの開発において、若しくは免疫反応の多様な側面を分析することが特に興味深い場合、刺激法、抑制法を問わない他種の免疫療法の開発において使用するマウス又はサル）における、抗原特異的又はマイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の検出。
【０１０１】
本明細書を通じて、単語「comprise」又は「comprises」や「comprising」などの変形は、明言した要素、整数若しくはステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップの包含を暗示するが、他の任意の要素、整数若しくはステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップの除外を暗示していないことは理解されよう。
【０１０２】
本明細書に記載したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に挙げた文書、法令、材料、装置、物品などに関するいずれの考察も、本発明に前後関係を提供するだけのためである。こうした事物のいずれか又はすべてが、従来技術の基礎の一部をなす、又は本願の各請求項の優先日以前にオーストラリア若しくは他国に存在していたような、本発明に関わる分野における一般常識であったことを認めたものと判断されてはならない。
【０１０３】
広義に言えば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、具体的な実施形態に示すように夥しい変形及び／又は改変を本発明になし得ることは、当業者であれば理解されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的なものではないと見なされたい。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】対照培養（＋０）中でのＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色と、ＳＥＢ、ＣＭＶ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、及び結核菌由来の精製タンパク分画（ＰＰＤ）に各々反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色との比較を示す、代表的な対照の健常成人対象１名から得たヒストグラムである。ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）が、各ヒストグラムに対して示されている。
【図２】対照の健常成人対象２名（Ｓ００１及びＳ００２）に対して、ＴＴ（Ｓ００１、左軸）、ＣＭＶ（Ｓ００２、左軸）、並びにＳＥＢ（Ｓ００１及びＳ００２、右軸）に各々反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を４〜５２時間の異なるインキュベーション時間で染色した結果を示す図である。
【図３】０、ＣＭＶ、ＴＴ及びＰＰＤに対する反応における、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色（４０時間のインキュベーション後）と、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞の７日目での染色（ＣＦＳＥ蛍光の減少を示すと定義される）との比較を示す、対照の健常成人対象１名（表１のＣ００３）から得たヒストグラムである。ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）が各ヒストグラムに対して示され（左図）、ＣＦＳＥ減少ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）も示されている（右図）。
【０１０５】
[図４]ワクシニア接種に反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の外観を示すデータである。
【図４Ａ】対象ＶＳ００１に対する、接種後の異なる日において対照（左図）、ワクシニア溶解物（右図）のいずれかに反応する全血培養物中でのＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色に関する代表的なヒストグラム。ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）が、各ヒストグラムに対して示されている。
【図４Ｂ】ワクシニア溶解物接種後の対象３名に対する、該溶解物に反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色結果。
【図４Ｃ】ワクシニア溶解物接種後の対象３名の該溶解物に対する反応における、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカインアッセイと比較した、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色の相関性。
【図５】ワクチン未接種、ＨＩＶ−１群特異抗原（Ｇａｇ）タンパク質を発現する構築体を用いたワクチン接種、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、外膜タンパク質（Ｅｎｖ）及びポリメラーゼポリプロテイン（Ｐｏｌ）タンパク質と他のＨＩＶ−１補助遺伝子とを発現する構築体によるワクチン接種のいずれかを施したマカークサルの全血のＨＩＶ−１  Ｇａｇ抗原ペプチドプールに対する反応における、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカインアッセイと比較した、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色の相関性を示す図である。
【図６】対照培養（＋０）中でのＣＤ２５＋ＣＤ１３７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の染色と、ＰＨＡ（＋ＰＨＡ）；ＨＩＶ−１  Ｇａｇ抗原由来の重複ペプチドのプール（＋ＨＩＶ  Ｇａｇ）；並びにＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザ由来の最適化抗原ペプチドのプール（＋ＣＥＦ）に各々反応する、ＣＤ２５＋ＣＤ１３７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の染色との比較を示す、代表的な対照の健常成人対象（Ｃ００２）及び代表的なＨＩＶ＋対象（Ｓ００９）から各々得たヒストグラムである。ＣＤ２５＋ＣＤ１３７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）が、各ヒストグラムに対して示されている。
【０１０６】
（参考文献）
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7. Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238.
8. Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660.
9. Lewis, RS. 2001. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Ann Rev Immunol19:497-521.
10. Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, RawlinsonW, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vacciniavirus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61.
11. Whitmire, JK and Ahmed, R. 2000. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Current Opinion in Immunology 12(4): 448-55.
12. De Rose R, Batten CJ, Smith MZ, Fernandez CS, Peut V, Thomson S, RamshawIA, Coupar BE, Boyle DB, VenturiV, Davenport MP, Kent SJ.  2007.  Comparative efficacy of subtype AE simian-human immunodeficiency virus priming and boosting vaccines in pigtail macaques. J Virol. 81:292-300.
【図１】
2009529894.tif 000003
【図２】
2009529894.tif 000004
【図３】
2009529894.tif 000005
【図４Ａ】
2009529894.tif 000006
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月17日(2008.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の全血試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに、細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ｉ）抗原の存在下で対象由来の全血試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原が、ツベルクリン、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）コア抗原、ＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）リンタンパク質６５（ｐｐ６５）、ＣＭＶ溶解物、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又は他の補助タンパク質由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対象の免疫能力を測定する方法であって、抗原及び／又はマイトジェンへの曝露に反応する、前記対象由来の全血試料中の細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法。
【請求項５】
以下のステップ：
（ｉ）抗原及び／又はマイトジェンの存在下で対象由来の全血試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培養するステップが、全血試料を抗原の単独存在下で培養することからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原が、ツベルクリン、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）コア抗原、ＨＣＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）溶解物、ＣＭＶリンタンパク質６５（ｐｐ６５）、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１  ｐ２４、及びＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又は他の補助タンパク質由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養するステップが、全血試料をマイトジェンの単独存在下で培養することからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
マイトジェンが、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、ホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、ヤマゴボウマイトジェン、並びに場合によりＣＤ２８副刺激及び／又は抗ＣＤ２モノクローナル抗体と組み合わせることもある、抗ＣＤ３モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出するステップが、培養ステップの開始から約２４〜４８時間以内に実施される、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項１１】
検出するステップが、培養ステップの開始から約４０〜４４時間以内に実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
全血試料がヘパリン処理全血試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を検出するステップが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ１３４を定量的又は定性的に検出することからなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を検出するステップが、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ１３７を定量的又は定性的に検出することからなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
検出するステップが、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７の１種に特異的に結合するモノクローナル抗体の群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体の使用を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
検出するステップがフローサイトメトリーの使用を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を発現する細胞を単離するステップを更に含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
単離するステップが、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７の１種に特異的に結合するモノクローナル抗体の群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体の使用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単離するステップがフローサイトメトリーの使用を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象がヒトである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の検出法、又は対象の全般的免疫能力の測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球のＣＤ４＋亜集団（ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、病原性で細胞内の細菌（例えば、マイコバテリア）及び真菌（例えば、カンジダ）、ウィルス並びに原虫などの細胞内病原体に対する生体防御において、主要な役割を演じる。特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、このような細胞内病原体による感染症に対する細胞性免疫反応の調節を補助し、実際、抗原刺激に応じたサイトカインの放出を介して他細胞からの多様な免疫反応（例えば、Ｂリンパ球及び抗体反応の促進及び成熟化、マクロファージの活性化、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性強化）を促進することにより、しばしば「ヘルパー」Ｔ細胞と呼称される。このような抗原刺激は、適切なクラスII主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質を発現する任意の抗原提示細胞が提示する抗原が、「初回抗原刺激を受けた」ＣＤ４＋Ｔ細胞（即ち、「抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞」になるように、ある抗原に以前に曝されたことのあるＣＤ４＋Ｔ細胞）により認識されることによって実現される。前記の通り、刺激済みのＣＤ４＋Ｔ細胞が起こす免疫反応の１種又は「エフェクター機能」は、マクロファージの活性化である。活性化されたマクロファージは、食細胞活性の増加（即ち、活性化マクロファージは病原体食菌能の増加を示す）及び他の活性の増加を介した感染部位における病原体の殺滅に必須の役割を演じる。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞とマクロファージとの相互作用は、いわゆる遅延型過敏症反応（ＤＴＨ）の基礎となるが、この反応は、対象が以前に特定の抗原（例えば、病原体又はアレルゲンの抗原）に曝露又は「感作」されたことがあるか否かを判定するために、各種皮膚試験で利用されてきた。よく知られている１種のＤＴＨ皮膚試験は、対象における潜在的結核（結核菌で発症（Mycobacterium tuberculosis））を調べる、又は対象が、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）結核ワクチンの接種を以前に受けたことがあるか否かを判定する検査において、ツベルクリンを抗原として使用するツベルクリン反応（Mantoux試験）である。
【０００３】
ツベルクリン反応、及びBioMerieux Multitestなどの他の類似の遅延型過敏症皮膚試験は、恐らくはＣＤ４＋Ｔ細胞が媒介する抗原特異的反応を検出するために、臨床及び診断試験室並びに研究室において広く使用されてきた。しかし、こうした試験では、実施に（即ち、読取結果を得るために）相当量の時間が確かに必要であり、結果の読取りに患者が戻って来ることが必要であり、こうした試験の適用及び読取りにおいて担当者自身に相当な変動性がある。これらの問題が相俟ってその有効な使用が制限される。例えば、ツベルクリン反応では、ツベルクリン抗原の投与からおよそ２〜３日間何らかのＤＴＨ反応を観察しなければならず、そのため遠隔地に住んでいる人々の有効な検査には妥当でないか、望ましくないことになり得る。その上、皮膚試験結果の評価は、相対的に主観的なため、定量的な結果ではなく定性的な結果を生じる。
【０００４】
ＤＴＨ皮膚試験はさておき、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、他の方法によって検出し、実際に測定することができる。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、リンパ増殖アッセイ（ＬＰＡ）の名で知られる方法によって抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を測定することができる。しかし、インビトロでのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能を利用し、新たに合成されたＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取込みを培養の６〜７日後に検出するこの方法には、診断試験室にとってその魅力を失わせる制約がいくつかある。その制約は、即ち（ｉ）多量の放射性核種の使用、（ii）長い「応答」時間、（iii）ＰＢＭＣを調製するための血液試料の長々とした処理の必要性、（iv）バッチ間で変動性があることによる、慎重に選別したヒト血清に対する依存性、（ｖ）高度な訓練を要する培養技術の必要性、（vi）ＣＤ４＋Ｔ細胞を最初に精製した場合以外は、その反応の原因をＣＤ４＋Ｔ細胞とすることができないという事実、並びに（vii）試験室間の規格化に問題のある、アッセイ間及びアッセイ内の実質的変動性である。現在のところ、ＬＰＡは研究室以外ではめったに実施されない。
【０００５】
別の例は、カルボキシフルオレッセイン二酢酸スクシンイミジル（ＣＦＳＥ）標識ＰＢＭＣを用いるＬＰＡのフローサイトメトリー式変法である（Lyons, AB, and CR Parish. 1994. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods 171:131）。このアッセイは、研究室で広く使用されてきており、放射活性を使用せず、反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接同定も可能にするが、ＬＰＡの他の欠点をなお免れない。加えて、このアッセイには、当該細胞数が、しばしば多量の背景染色の中にあって微少になり得るために、フローサイトメトリー分析を非常に慎重に実施しなければならないという欠点がある。
【０００６】
更なる例は、いわゆる細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイである。このアッセイは、研究室においてかなり広く使用されようになっており、全血培養物中の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接検出を可能にする（Nomura, LE, JM Walker, and HT Maecker. 2000. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. Cytometry 40:60）。しかし、このアッセイは、非常に手が掛かり、全タンパク抗原を用いる６時間の培養（抗原の処理及び提示に２時間に加え、ブレフェルジンＡを用いて４時間）、又はペプチド及びブレフェルジンＡを用いる６時間の培養のいずれかを要する。更に、試料の取得がその日の遅くになると、夜遅く処理ステップが必要になり、そうでなければ翌日まで放置されるが、それは最適ではない。その上、次いで培養後に２時間の細胞内染色ステップが必要であり、その後にフローサイトメトリー分析が行われる。ＩＣＣアッセイの自動化は可能である（Suni, MA, HS Dunn, PL Orr, R de Laat, E Sinclair, SA Ghanekar, BM Bredt, JF Dunne, VC Maino, and HT Maecker. 2003. Performance of plate-based cytokine flow cytometrywith automated data analysis. BMC Immunol 4:9）が、一般には利用できない。また、試験室間の規格化にも問題がある。
【０００７】
したがって、現在利用できる方法のうち、臨床及び診断試験室並びに研究室に直ぐに適用できる抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出法は存在しない。更に、診断試験室での使用に適した方法に関しては、それに伴う各種の問題及び困難のためにこれまで不評であった。しかし、診断試験室で不評となっている抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出アッセイが、唯一種の免疫反応アッセイではない。即ち、ポリクローナルマイトジェンであるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）に対する免疫系リンパ球の反応は、一般的なＴ細胞免疫能力の尺度として以前に広く使用されてきた（例えば、原発性免疫不全が疑われる場合に対して（Buckley, RH 2004. Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution. Annu Rev Immunol 22:625））。しかし、このアッセイは３Ｈ−チミジンＬＰＡに基づくので、細胞が３日目に採集されることは別として、ＬＰＡと本質的に同じ欠点を受ける。
【０００８】
抗凝固処理した全血試料の少量の一定分量を抗原又はＰＨＡと４時間（２４時間まで）インキュベートし、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の早期Ｔ細胞活性化マーカー抗原ＣＤ６９の上方調節による活性化をフローサイトメトリーで測定する、より簡潔な全血法が提案されてきた（Perfetto, SP, TE Hickey, PJ Blair, VC Maino, KF Wagner, S Zhou, DL Mayers, D St Louis, CH June, and JN Siegel. 1997. Measurement of CD69 induction in the assessment of immune function in asymptomatic HIV-infected individuals. Cytometry 30:1）。応答時間が短く、細胞表面の読取りが非常に簡単なこの全血アッセイは、魅力的な手法であった。しかし、本出願人によれば、このアッセイはポリクローナルＰＨＡ反応の測定には有用であるが、不適切なほど多数のＣＤ４＋Ｔ細胞が抗原に応じてＣＤ６９を上方調節し、この読取りに特異性が欠如していることを示すので、このアッセイが抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に十分には特異的でないことが判明した。更に、エクスビボでのＣＤ４＋Ｔ細胞の小さいが無視できないサブセット上にＣＤ６９が存在するために、結果の分析が複雑になることが判明した。
【０００９】
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する全血アッセイの使用されている別の例は、Quantiferon（登録商標）全血刺激アッセイ（CSL Limited社製、Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）である。このアッセイでは、抗原刺激後に血漿を収集し、ＥＬＩＳＡによりそのＩＦＮ−γを分析する。しかし、多量のＩＦＮ−γが、特にウィルス抗原に反応するＣＤ８＋Ｔ細胞、並びに培養物中に存在するＮＫ細胞により産生されるため、標準的ＬＰＡ同様に、その反応がＣＤ４＋Ｔ細胞によることが確認されていない。現在のところ、このアッセイは結核菌に対する反応の検出だけに認可されている。しかし、このアッセイは、年少小児集団において多数の不確定な結果を示すことが認められてきた。結核菌により刺激されるＩＦＮ−γ反応の検出法であって、欧州で使用が認可されているT spot TBアッセイとして知られる第２のアッセイがある。このアッセイは、ELIspotプレート上に播種する前にＰＢＭＣの分離を要するELIspot基準法である。このアッセイは、特異性及び感度が類似しており、小児及び免疫低下者の患者において不確定結果の割合が減少するようである。
【００１０】
したがって、特に抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞、それだけでなく抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する、相対的に簡単で費用効果的な代替法に対する必要性が今なお存在している。
【００１１】
ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを用いて細胞表面マーカー抗原ＣＤ２５（インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のα鎖である膜貫通タンパク質）の上方調節と細胞分裂との動態を調べる間に、本出願人は、約４８時間以後に開始する細胞分裂に先立って、ＣＤ２５が、２４時間以後に抗原又はマイトジェンに反応するＣＤ４＋Ｔ細胞上に顕著に上方調節されることを見出した。同時に、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）などのある種の副刺激細胞表面タンパク質の発現動態を調べていると、これらのタンパク質の上方調節も２４時間以後に起こることが判明した。マウスモデルにおける遺伝子研究によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０と抗原提示細胞上のＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）との相互作用が、初回抗原刺激後の「記憶」ＣＤ４＋Ｔ細胞（即ち、即座の防御力、並びに抗原刺激に対してより迅速で有効な免疫反応を開始する能力を付与できる、いわゆる記憶細胞に成長した初回抗原刺激済みのＣＤ４＋Ｔ細胞）の生成、及びエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の生存促進にとって肝要であることが示された。ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１３４発現は、抗原又はマイトジェンによるＴ細胞受容体の刺激から２４〜４８時間後に最高潮となり、約１２０時間後に基準線に戻ることが以前に報告されていた（Croft, M 2003. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev Immunol 3:609）ので、本出願人は、抗原又はマイトジェンで刺激した全血培養物を用いて、ＣＤ２５及びＣＤ１３４が、４８時間の直前（即ち、最大のＣＤ１３４発現に相当するが、細胞分裂の開始前に相当した時点）に共発現するか否か、したがって抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出及び／又は測定する、相対的に簡単で費用効果的な方法の基礎として使用し得そうか否かを調査した。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞用のこうした細胞表面マーカーは、ヘパリンナトリウムで抗凝固処理した全血試料を用いて、抗原との４０〜４４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによって容易に測定できることが判明した。したがって、この方法は、準備の簡潔性（即ち、ＰＢＭＣの調製が不要）と、フローサイトメトリーの簡単な読取り（即ち、細胞の透過性化及びサイトカインの検出が不要）とを併用している。更に、この方法は、驚くほど低いバックグランド（ＣＤ４＋Ｔ細胞の＜０．０３％）を有することが判明済みであり、この方法の使用によって、マイコバクテリア抗原、破傷風トキソイド、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）溶解物、ワクシニア溶解物、及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）の調製物中に含まれる抗原に対して、特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞反応を容易に検出することがこれまでに可能となった。その上、この方法は、一般的な免疫能力の尺度として、ＰＨＡなどのマイトジェン及びブドウ球菌エンテロ抗原Ｂ（ＳＥＢ）に対するより広範な反応の評価にも使用できることが判明した。その上更に、この方法は、固定及び透過性化のステップを回避し得る、抗原特異的又はマイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞分取に適用を有する。
【非特許文献１】Lyons, AB, and CR Parish. 1994. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods 171:131
【非特許文献２】Nomura, LE, JM Walker, and HT Maecker. 2000. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. Cytometry 40:60
【非特許文献３】Suni, MA, HS Dunn, PL Orr, R de Laat, E Sinclair, SA Ghanekar, BM Bredt, JF Dunne, VC Maino, and HT Maecker. 2003. Performance of plate-based cytokine flow cytometry with automated data analysis. BMC Immunol 4:9
【非特許文献４】Buckley, RH 2004. Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution. Annu Rev Immunol 22:625
【非特許文献５】Perfetto, SP, TE Hickey, PJ Blair, VC Maino, KF Wagner, S Zhou, DL Mayers, D St Louis, CH June, and JN Siegel. 1997. Measurement of CD69 induction in the assessment of immune function in asymptomatic HIV-infected individuals. Cytometry 30:1
【非特許文献６】Croft, M 2003. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev Immunol 3:609
【発明の開示】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の全血試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、第１の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原の存在下で対象由来の全血試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００１４】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、抗原の存在下での全血試料の培養開始から約４８時間以内に実施される。
【００１５】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなる。
【００１６】
好ましくは、この方法は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的又は定性的な検出に使用される。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、対象の免疫能力を測定する方法であって、抗原及び／又はマイトジェンへの曝露に反応する、前記対象由来の全血試料中の細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００１８】
好ましくは、第２の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原及び／又はマイトジェンの存在下で対象由来の全血試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００１９】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、抗原及び／又はマイトジェンの存在下での全血試料の培養開始から約４８時間以内に実施される。
【００２０】
好ましくは、ＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなる。
【００２１】
好ましくは、この方法は、抗原特異的又はマイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的又は定性的な検出に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本出願人は、細胞表面マーカーＣＤ２５並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現の検出が、対象由来の全血培養試料中の抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を検出及び／又は測定する有用な手段を提供することを見出した。
【００２３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に関して使用される用語「抗原特異的」とは、該Ｔ細胞が、対象とする特定抗原に特異的に結合及び反応することができることを意味すると理解されたい。加えて、「抗原特異的」と述べたＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ調節細胞（ＴＲＥＧ細胞）ではないことを理解されたい。
【００２４】
第１の態様では、本発明は、対象における抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を定量的又は定性的に検出する方法であって、抗原への曝露に反応する前記対象由来の全血試料において、細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００２５】
好ましくは、第１の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原の存在下で対象由来の全血試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００２６】
全血試料は、当業者に周知の任意の方法によって（例えば、カニューレ及び血液試料バイアルの使用によって）対象から取得することができる。適当な抗凝血剤を全血試料に添加して凝固を防止してもよい。特に適当な抗凝血剤は、任意の市販のヘパリン処理血液試料バイアルを用いることにより、都合よく使用できるヘパリンナトリウムである。酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）をキレート化する抗凝血剤は、カルシウム流入の阻止によりリンパ球機能を妨害する恐れがあるので、避けることが好ましい（Lewis, RS. 2001. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Ann Rev Immunol 19:497-521）。したがって、第１の態様の方法に使用する全血試料は、ヘパリン処理血液試料バイアル中に収集することが好ましい。
【００２７】
全血試料を培養するステップは、当業者に周知の任意の方法に準じ得る。全血試料は、例えば適当な培地（例えば、Iscove改変ダルベッコ培地）及び抗原と混合し、３７℃でインキュベートし得る。その抗原は、検出しようと意図する抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞に従って選択することになろう。したがって、潜在的結核又はＢＣＧによる以前のワクチン接種を検査するためには、選択される該抗原は、ツベルクリン、又はＥＳＡＴ−６（early secretory antigenic target）、培養ろ液タンパク質−１０（ＣＦＰ−１０）などの結核特異抗原でもよい。同様にＣ型肝炎の検査には、選択される該抗原はＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のコア抗原又は非構造タンパク質３（ＮＳ３）とし得るが、ＣＭＶの検査にはリンタンパク質６５（ｐｐ６５）又はＣＭＶ溶解物を利用し得る。ＨＩＶ−１に対しては、選択される該抗原は、組換えｐ２４、又はＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ若しくは他のＨＩＶ−１補助遺伝子由来の重複ペプチドのプールでもよい。
【００２８】
ツベルクリン、ＨＩＶ−１  ｐ２４などの精製タンパク質（天然又は組換え）は別として、該抗原は、例えば、細菌若しくはウィルス溶解物、死滅全粒ウィルス、抗原性タンパク質断片（合成抗原性ペプチドを含む）、重複ペプチドプール（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238、Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）又は最適化抗原性ペプチド、細菌、真菌若しくは酵母の死滅若しくは固定全菌抗原性調製物、或いはウィルス感染細胞又は抗原パルス抗原提示細胞でもよい。該抗原は、適当な担体分子に結合してもよく、又はアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
【００２９】
好ましくは、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、培養物中に存在する実質数の細胞を分割する前に実施する。したがって、標準的な培養条件下で（例えば、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気の３７℃で、リンパ球の培養に適した標準培地を用いて）、該検出ステップは、好ましくは、抗原存在下での全血試料の培養開始から６０時間以内、より好ましくは４８時間以内に実施される。その上、該検出ステップは、細胞表面マーカー（即ち、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７）の共発現を実質的に上方調節するのに十分な期間が経過した後、実施することが好ましい。したがって、標準的な培養条件下、該検出ステップは、抗原存在下での全血試料の培養開始から約２４〜４８時間以内に実施することがより好ましく、抗原存在下での全血試料の培養開始から約４０〜４４時間以内に実施することが最も好ましい。
【００３０】
この方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現の検出を含み得るが、この方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなることが好ましい。
【００３１】
これに関しては、抗原特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞以外のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のうち、エクスビボで細胞表面マーカーのこうした組合せを発現するものは、あるにしてもないに等しいことが判明しており、このためＣＤ２５及びＣＤ１３４の共発現又はＣＤ２５及びＣＤ１３７の共発現の非常に低い「バックグランド」に対して、該検出ステップを実施することが可能である。その結果、本発明の第１の態様の方法は、希少な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の０．１％未満の頻度で培養物中に存在する）の検出に特に使用し得る。
【００３２】
細胞表面マーカーを検出するステップは、当業者に周知の任意の方法に従って実施し得る。このような方法は、細胞表面マーカーＣＤ２５、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７の１種に特異的に結合する標識モノクローナル抗体の使用、並びに好ましくはフローサイトメトリーの使用を含み得る。これに関しては、適当な標識モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ１３４抗体）と結合した後、都合がよいときに（例えば、全血試料の収集及び培養の場所からフローサイトメトリー試験室へ輸送した後）、試料を適当な固定剤（例えば、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中１％で使用し得るパラホルムアルデヒド）で固定することにより、その後の細胞表面マーカーの定量又は定性的決定を行い得ることは、当業者であれば理解されよう。したがって、該検出ステップを実施するための上記好ましい各時間に関しては、培養試料の「染色」（即ち、蛍光色素（複数も）で標識した適当なモノクローナル抗体による）及び「固定」は、所与の好ましい期間内に実施しさえすればよいと理解されたい。即ち、染色及び固定を、抗原存在下での全血試料の培養開始から４４時間後に開始するが、細胞表面マーカーの実際の定量又は定性的決定は、後になる（例えば１２〜２４時間後）まで行わない場合、それでもなおその場合は、抗原存在下での全血試料の培養開始から約４０〜４４時間の最も好ましい期間内に該検出ステップを実施することになると理解されたい。
【００３３】
この第１の態様の方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を発現する細胞の単離を更に含み得る。該単離ステップは、当業者に周知の任意の方法に従い、例えば、多くのフローサイトメーターで利用できる細胞分取機能の利用によって実施し得る。
【００３４】
本発明の第１の態様の方法は、特に、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的又は定性的検出を可能にする（即ち、この方法はＣＤ４＋Ｔ細胞の想起反応のモニターを可能にする）。したがって、この方法は、細胞内病原性の細菌（例えば、マイコバクテリア、クロストリジウム及びヘリコバクター）、真菌（例えば、カンジダ、アスペルギルス及びクリプトコッカス）、ウィルス（例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、風疹ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ−２、ＪＣウィルス及びカポジ肉腫ヘルペスウィルス）並びに原虫（例えば、トキソプラズマ、ニューモシスティス、クリプトスポリジウム及びプラスモジウム）、細胞外の細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、連鎖球菌種、ナイセリア種、ヘモフィルス種、シュードモナス種）及びトキソイド（例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド）に対する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に有用となり得る。この方法は、自己抗原（例えば、インスリン、グリアジン、アセチルコリン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、ＤＮＡ及びクロマチン）並びにアレルゲン（例えば、イエダニタンパク質又は花粉タンパク質）に対する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出にも有用となり得る。好ましくは、該抗原は、ツベルクリン、ＨＣＶコア抗原、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＣＭＶ溶解物、ＨＳＶ−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ＪＣウィルス溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ＨＩＶ−１  ｐ２４、及びＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又は他のＨＩＶ−１補助遺伝子由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される。
【００３５】
対象は、人間又は獣医学上重要な別の動物（例えば、家畜動物、競走馬及び愛玩動物）でもよい。対象は、例えばヒト疾患のモデル又はワクチンの開発に使用するマウスやサルなどの実験動物の場合もあり、ワクチン開発では、免疫反応の様々な側面を分析することが特に興味深い。
【００３６】
第２の態様では、本発明は、対象の免疫能力を測定する方法であって、抗原及び／又はマイトジェンへの曝露に反応する、前記対象由来の適当な全血試料中の細胞表面マーカーＣＤ２５、並びに細胞表面マーカーＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に検出することを含む方法を提供する。
【００３７】
好ましくは、第２の態様の方法は、以下のステップ：
（ｉ）抗原及び／又はマイトジェンの存在下で対象由来の全血試料を培養するステップと、
（ii）培養試料中のＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現を定量的又は定性的に検出するステップと
を含む。
【００３８】
第１の態様の方法と同様に、全血試料は、当業者に周知の任意の方法により対象から取得できるが、カニューレ及びヘパリン処理血液試料バイアルの使用により都合よく取得し得る。カルシウムイオン（Ｃａ２＋）をキレート化する抗凝血剤は、リンパ球機能を妨害する恐れがあるので、避けることがやはり好ましい。
【００３９】
全血試料を培養するステップは、当業者に周知の任意の方法に準じ得る。したがって全血試料は、適当な培地並びに抗原及び／又はマイトジェンと混合し、３７℃でインキュベートし得る。
【００４０】
好ましくは、本発明の第２の態様の方法では、全血試料を培養するステップは、マイトジェンの存在下で培養することを含む。該マイトジェンは、当業者に周知のマイトジェンから選択してもよく、例えば、該マイトジェンは、ＰＨＡ、ホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ＳＥＢ、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、ヤマゴボウマイトジェン、並びに場合によりＣＤ２８副刺激及び／又は抗ＣＤ２モノクローナル抗体と組み合わせることもある、抗ＣＤ３モノクローナル抗体からなる群から選択してもよい。
【００４１】
或いは、本発明の第２の態様の方法では、全血試料を培養するステップは、抗原の存在下で培養することを含む。ツベルクリンなどの精製タンパク質（天然又は組換え）は別として、該抗原は、やはり例えば、細菌若しくはウィルス溶解物、抗原性タンパク質断片（合成抗原性ペプチドを含む）、又は重複ペプチドプールでもよい（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238、Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effectorcells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）。該抗原は、適当な担体分子に結合してもよく、又はアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
好ましくは、該抗原は、ツベルクリン、ＨＣＶコア抗原、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＣＭＶ溶解物、ＨＳＶ−１溶解物、ＨＳＶ−２溶解物、ワクシニア溶解物、破傷風トキソイド（ＴＴ）、結核菌由来の精製タンパク質誘導物質（ＰＰＤ）、連鎖球菌抗原ストレプトキナーゼ、ＨＩＶ−１  ｐ２４、及びＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ又は他のＨＩＶ−１補助遺伝子由来の重複ペプチドのプールからなる群から選択される。
【００４３】
好ましくは、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の発現を検出するステップは、培養物中に存在する実質数の細胞を分割する前に実施する。したがって、該検出ステップは、好ましくは、抗原及び／又はマイトジェン存在下での全血試料の培養開始から６０時間以内、より好ましくは４８時間以内に実施される。その上、該検出ステップは、細胞表面マーカー（即ち、ＣＤ２５、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７）の発現を実質的に上方調節するのに十分な期間が経過した後、実施することが好ましい。したがって、該検出ステップは、抗原及び／又はマイトジェン存在下での全血試料の培養開始から約２４〜４８時間以内に実施することがより好ましく、抗原及び／又はマイトジェン存在下での全血試料の培養開始から約４０〜４４時間以内に実施することが最も好ましい。
【００４４】
この方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７の共発現の検出を含み得るが、この方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４の定量的若しくは定性的な検出、又はＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３７の定量的若しくは定性的な検出からなることが好ましい。
【００４５】
細胞表面マーカーを検出するステップは、当業者に周知の任意の方法に従って実施し得る。好ましくは、該検出ステップはフローサイトメトリーの使用を含む。第１の態様の方法同様に、培養全血試料を適当に固定すれば、フローサイトメトリーを遅らせてもよい（例えば１２〜２４時間）。したがって、該検出ステップが、例えば蛍光色素（複数も）で標識された適当なモノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ１３４抗体）の使用、並びにフローサイトメトリーの使用を含む場合、培養全血試料は、抗原及び／又はマイトジェンとの試料の培養開始から４４時間後に染色及び固定するが、細胞表面マーカーの定量又は定性的決定（例えば、フローサイトメトリーによる）は、後で行ってもよい。したがって、該検出ステップは、それでもなお、抗原及び／又はマイトジェン存在下での全血試料の培養開始から約４０〜４４時間の最も好ましい期間内に実施されたと理解されよう。
【００４６】
この第２の態様の方法は、ＣＤ２５、並びに、ＣＤ１３４及び／又はＣＤ１３７を発現する細胞の単離を更に含み得る。該単離ステップは、当業者に周知の任意の方法に従い、例えば、多くのフローサイトメーターで利用できる細胞分取機能の利用によって実施し得る。
【００４７】
対象は、人間又は獣医学若しくは実験上重要な別の動物でもよい。
【００４８】
本発明の特質をより明確に理解するために、以下の非限定的な実施例を参照しながらその好ましい形態を今から説明する。
［実施例］
【実施例１】
【００４９】
ヒト全血のＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
材料及び方法
対象
健常成人志願者を大学及び病院の人材から募集した。対象３名は、職業上の理由から地域の労働衛生安全指針に従ってワクシニアの接種を受け、他所（Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）に記載のように経時的試料を提供した。ＨＩＶ−１  ｐ２４（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）に 対する検出容易なＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す、ＨＩＶ陽性長期非進行者ＬＴＮＰ−００１も検査を受けた。
【００５０】
試薬
マイトジェンのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ；Sigma社製、St Louis、ＭＯ、米国）を最終濃度５μｇ／ｍｌで全血培養物中で使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ；Sigma社製）を最終濃度１μｇ／ｍｌで使用した。
【００５１】
ＣＭＶ溶解物は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように調製し、最終濃度１／２５０で使用した。
【００５２】
インビトロアッセイ用のワクシニア抗原は、ＨｅＬａ細胞中でのＮＹＣＢＨ株の増殖後、他所（Zaunders JJ, Dyer WB, MunierML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effectorcells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）に記載のように調製した。感染性細胞内成熟ウィルスの全粒ウィルス溶解物は、感染細胞を多数回凍結・融解した後、７００ｇ、１０分の遠心分離により細胞屑を除去することによって調製した。ウィルス抗原は、５６℃、３０分の熱不活性化で更に処理し、感染力価を１０６倍減少させた（データは示していない）。ワクシニア溶解物は、最終濃度１／２５０で使用した。未感染ＨｅＬａ細胞の対照溶解物も並行して調製し、同じ最終濃度で使用した。
【００５３】
結核菌（ＭＴＢ）由来のＰＰＤとして調製したマイコバクテリア抗原は、Staten Serum Institute社（デンマーク）から入手した。ＰＰＤは最終濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
【００５４】
破傷風トキソイド（ＴＴ）は、Commonwealth Serum Laboratories社（CSL Limited, Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）から入手した。ＴＴは、この製造業者の指示に従って最終濃度２Ｌｆ  Ｕ／ｍｌで使用した。
【００５５】
ＨＩＶ−１  ｐ２４（Protein Sciences社製、Meriden、ＣＴ、米国）は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
【００５６】
ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ１３４−ＰＥ及びＣＤ１３４−ＦＩＴＣの複合モノクローナル抗体は、Becton-Dickinson社（San Jose、ＣＡ、米国）から入手した。
【００５７】
リンパ増殖アッセイ（ＬＰＡ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のようにFicoll-Hypaque密度勾配遠心により分離した。ＰＢＭＣ１×１０５個を、１０％ヒト血清（Cambrex社製、East Rutherford、ＮＪ、米国）を含有するＲＰＭＩ１６４０（JRH社製、Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）中６日間、９６ウェル丸底プレート中の１ウェルにつきインキュベートした。添加物を含まない（対照）、又は異なる抗原若しくはマイトジェンを含む培養物を四重に用意した。３Ｈ−チミジン（Amersham社製、Buckinghamshire、英国）０．５μＣｉを１ウェルにつき添加し、更に１８時間インキュベートした後、細胞を採集し（Canberra Packard社）、TopCountシンチレーションカウンター（Packard Instrument社製、Meriden、ＣＴ、米国）上で計数した。各抗原又はマイトジェンに対する反復計数の平均値を対照培養物に対する平均値で割り、刺激指数（ＳＩ）を求めた。対照ウェルにおけるｃｐｍは、１２４〜４２８ｃｐｍの範囲にあった。
【００５８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイは、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように実施した。
【００５９】
細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイ
６色フローサイトメトリーを使用する、以前に公表済みの方法（Nomura, LE, JM Walker, and HT Maecker. 2000. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. Cytometry 40:60）に基づいた全血細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイを用いて、他所（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238、Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, IpS, Liu J, Amyes E, RawlinsonW, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vacciniavirus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）に記載のようにワクシニア特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を測定した。手短に言うと、ヘパリンＮａ抗凝固処理全血を、無添加物（対照）、ＳＥＢ、又はワクシニア若しくは対照溶解物の存在下、共刺激性抗体ＣＤ２８及びＣＤ４９ｄと共に３７℃、２時間インキュベートした後、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Sigma-Aldrich社製）と共に更に４時間インキュベートした。このインキュベーション終了時に、ＥＤＴＡ（Sigma社製）を室温（ＲＴ）で１５分間、最終濃度２μＭで培養物に添加した。サイトカインの細胞内染色は、以前に記載（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）のように実施した。手短に言うと、これらの培養物からの１００μｌを、次いでＦＡＣＳ溶解溶液１ｍｌとＲＴで１０分間インキュベートし、ＰＢＡ２ｍｌで１回洗浄した。次いで、ペレットをＦＡＣＳ透過作用溶液０．５ｍｌとＲＴで１０分間インキュベートし、ＰＢＡ２ｍｌで１回洗浄した。次いで、細胞をｍＡｂと暗所中、ＲＴで３０分間インキュベートした後、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＡ）２ｍｌで１回洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝塩水（ＰＦ／ＰＢＳ）中に再懸濁した。
【００６０】
解析のために、３０００００イベントを以前に記載（Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）のように収集した。Ｔリンパ球は、側方散乱光に対し先ずＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５にゲート設定し、次いでＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７陽性／ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７陰性細胞にゲート設定し、ＣＤ６９−ＡＰＣ＋ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ＋細胞を解析した。この方法は、ＨＩＶ陰性対照１６例の解析から、バックグランド結果と標準偏差の３倍との和に基づいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の陽性結果０．０８％の検証済みカットオフ値を有する（Munier等、未公表結果）。
【００６１】
全血のＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
ヘパリンＮａ抗凝固処理全血０．２５ｍｌを、滅菌した５ｍｌのポリスチレン製ネジ蓋瓶（Biolabs社製、Melbourne、ＶＩＣ、オーストラリア）中でIscove改変ダルベッコ培地（IMDM; JRH社製）０．２５ｍｌと混合した。抗原及びマイトジェンを指定した濃度で添加し、蓋を緩く付けた状態で、培養物を空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃、４０時間インキュベートした。陰性対照培養物は、抗原の非存在下で全血及びＩＭＤＭの混合液だけを含んでいた。陽性対照培養物は、ＰＨＡ、ＳＥＢのいずれかを含有していた。こうした陽性及び陰性の対照培養物は、あらゆる実験に含められた。
【００６２】
フローサイトメトリー
全血培養物のフローサイトメトリーは、固定後にデュアルレーザーＬＳＲ  IIフローサイトメーター（Becton-Dickinson社製）上でＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。Ｔリンパ球は、側方散乱光ゲートに対し先ずＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を用いて同定し、次いでＣＤ３＋ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７＋Ｔ細胞にゲート設定した。また、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７染色を用いてＣＤ４＋ゲートからＣＤ８＋Ｔ細胞を除外した。次いで、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１３４−ＰＥで染色するために、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞を解析した。一部の実験では、示した通りＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１３４−ＦＩＴＣを使用した。モノクローナル抗体は、すべてBecton-Dickinson社から入手した。最低５００００イベントを解析した。補償は、個々の蛍光色素で染色したリンパ球を用いて調べ、次いでＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＣＤ１９−ＰＥ及びＣＤ１４−ＦＩＴＣ（Becton-Dickinson社製）で同時に染色した細胞で確認した。更なる対照には、ＡＰＣ、ＰＥ又はＦＩＴＣ抗体を含んでいない個々のチューブが含まれていた（データは示していない）。
【００６３】
結果
陰性対照並びにマイトジェン及び抗原に対する反応
対照培養物（＋０）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及びＣＤ１３４のバックグランド共発現が、図１に示してある。３１回の個別実験で得られた結果から、バックグランド平均値は０．００６２％であり、標準偏差は０．００８２％であった。したがって、陽性結果のカットオフ値は、平均値＋３×標準偏差、即ち０．００６２％＋３×０．００８２％＝０．０３％と計算された。
【００６４】
ポリクローナルマイトジェンＳＥＢに対する反応を示す代表的ヒストグラムも図１に示されており、このマイトジェンに反応するＣＤ４＋Ｔ細胞の非常に高い比率を証明している。
【００６５】
健常成人対照において、ＣＭＶ溶解物、ＴＴ及びＰＰＤの各抗原を想起するための反応を示す代表的ヒストグラムも図１に示されている。
【００６６】
ＣＤ２５及びＣＤ１３４の共発現の動態
全血培養物におけるＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現の動態は、対象２名について図２に示されている。その結果から、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応は４４時間で最適に検出されることが示されている。この時点は、ＣＦＳＥ  ＬＰＡで検出した場合（データは示していない）、ＣＤ４＋Ｔ細胞がインビトロで増殖を開始し得る時間より前である。したがって、４４時間にＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋と測定されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、元の全血試料中に存在する個数を反映しているようである。
【００６７】
こうした実験におけるＳＥＢに対する反応は、２４時間の短時間でピークに達したが、大きさ類似の第２のピークが４４時間後に認められた（図２）。したがって、マイトジェンに対する抗原特異的反応、ポリクローナル反応の両方を４４時間の同一時点に測定することができる。
【００６８】
全血アッセイのＬＰＡ及びＣＦＳＥ標準増殖アッセイとの比較
ＣＭＶ、ＴＴ、ＰＰＤ及びＨＩＶ  ｐ２４を含む各種抗原に対する想起反応が異なる対象４名について、全血アッセイを２種の増殖アッセイと比較して調べた。フローサイトメトリーの代表的ヒストグラムを図３に示すが、これは、全血アッセイがＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のＣＦＳＥアッセイと合致することを実証している。対照の健常成人対象３名及びＨＩＶ＋長期非進行者（Zaunders, JJ, WB Dyer, B Wang, ML Munier, M Miranda-Saksena, R Newton, J Moore, CR Mackay, DA Cooper, NK Saksena, and AD Kelleher. 2004. Identification of circulating antigen-specific CD4+ T lymphocytes with a CCR5+, cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term nonprogressor and in CMV infection. Blood 103:2238）１名に対する結果が、表１に要約されている。全血アッセイの特異性は、対照の健常成人対象３名中２名が、全アッセイを通じてＣＭＶに対する反応で陰性ある一方、対照の第３の健常成人対象が全アッセイを通じて陽性であったという観察により、実証される。一般に、全血アッセイの結果が高いほど、増殖の結果も高かったが、２種の増殖アッセイ間ですら、アッセイ間に有意の変動性があるらしいことは確かであった。
【００６９】
ワクシニア接種後のワクチン反応の進展
全血アッセイで検出した、ワクチン未接種対象の接種後のワクシニアに対する反応の展開を示す代表的ヒストグラムが、図４Ａに示されている。異なるワクチン未接種対象３名に対するワクシニア特異的全血アッセイの経時的結果を図４Ｂに要約してあるが、この結果は、接種後の応答性の展開パターンがワクチン接種者全員とも類似していることを示す。図４Ｃは、すべての経時的全血試料にわたる、ＩＣＣアッセイ結果（他所（Zaunders JJ, Dyer WB, MunierML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）で詳細に報告されている）に対するワクシニア特異的全血アッセイ結果の相関性を示す。この両アッセイ間には非常に強い相関性があり、回帰線の切片がゼロに非常に近い。しかし、全血アッセイは、８倍多くの抗原特異細胞を検出するようであった。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のより多いこの数は、細胞免疫表現型検査により特定された推定上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数（Zaunders JJ, Dyer WB, Munier ML, Ip S, Liu J, Amyes E, Rawlinson W, De Rose R, Kent SJ, Sullivan JS, Cooper DA, Kelleher AD. 2006. CD127+CCR5+CD38+++ CD4+ Th1 effector cells are an early component of the primary immune response to vaccinia virus and precede development of interleukin-2+ memory CD4+ T cells. J Virol. 80(20):10151-61）にはるかに近似している。これは、ＨＩＶ−１一次感染及びＣＭＶ一次感染の間のＩＣＣ結果が、免疫表現型検査による推定上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のおよそ１０分の１であったという以前の知見（Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）と合致している。
【００７０】
【表１】
2009529894.tif 000011
【００７１】
考察
該結果は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイが極めて低いバックグランドを有し、これが、この２種の細胞表面マーカーに対する抗体によるこの２種の分子の独特な同時検出により実現されることを実証している。相当な比率の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞が比較的低レベルのＣＤ２５を発現しており、非常に低レベルのＣＤ１３４を発現する細胞もしばしば少数存在することは、よく知られている（データは示していない）。しかし、エクスビボで両抗原を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞は、実質上存在しない。したがって、この非常に低いバックグランドに対して、希少な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することが可能である。
【００７２】
該結果は、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が、このような培養物中に２４〜４０時間で容易に検出できることを示している。例示したアッセイは、以前の全血ＣＤ６９アッセイのいくつもの利点を有しており、即ち（ｉ）ヘパリンナトリウム抗凝血処理全血の小分量へ抗原又はマイトジェンを単に添加することが、準備に要するすべてである、（ii）細胞は、プールしたヒト血清の人工的状況ではなく、自家血漿中でインキュベートされる、（iii）固定及び透過性化を必要とせずに、細胞表面染色だけで済む、（iv）試料調製の時間及びフローサイトメトリー分析の複雑度は、最小限である。しかし、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋アッセイは、追加の利点、即ち（ｖ）抗体の組合せでＣＤ２５及びＣＤ１３４を同時に検出することにより、対照培養物中のバックグランド染色は常に極めて低いこと、並びに（vi）細胞表面上にＣＤ２５及びＣＤ１３４を同時に共発現する細胞だけを計数することにより、非常に高い特異性レベルが得られることを有している。
【００７３】
例示したアッセイを用いて、本出願人は、ウィルス抗原（即ち、ＣＭＶ及びＨＩＶ−１）、細菌抗原（即ち、ＰＰＤ及びＴＴ）並びにポリクローナルマイトジェン（即ち、ＰＨＡ及びＳＥＢ）を含め、多様な範囲の抗原に反応を示す対象間の識別をすることができた。すべての事例において、その反応は、現在の「基本標準」アッセイである、３Ｈ−チミジン、ＣＦＳＥのいずれかを用いるＬＰＡと高度な相関性を示した。別の一連の実験では、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイはＩＣＣアッセイとも高度な相関性を示した。
【００７４】
反対に、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイは、マイトジェンのＰＨＡ及びＳＥＢに対する非常に広い反応を容易に検出するため、Ｔリンパ球機能の簡潔な一般アッセイとして使用するのに適している。
【実施例２】
【００７５】
マカークの全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
材料及び方法
対象
この実施例ではマカーク３１匹を使用した。異なる３群、具体的には非ワクチン接種対照群（動物１１匹）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質を発現する構築体をワクチン接種した１群（動物１０匹）、並びにＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ及びＰｏｌ各タンパク質、更に他のＨＩＶ−１補助遺伝子を発現する構築体をワクチン接種した１群（動物１０匹）を調査した。
【００７６】
構築体
ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質、並びにＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ及びＰｏｌ各タンパク質、更に他のＨＩＶ−１補助遺伝子を発現する各構築体は、既に記載されている（De Rose R, Batten CJ, Smith MZ, Fernandez CS, Peut V, Thomson S, Ramshaw IA, Coupar BE, Boyle DB, Venturi V, Davenport MP, Kent SJ.  2007.  Comparative efficacy of subtype AE simian-human immunodeficiency virus priming and boosting vaccines in pigtail macaques. J Virol. 81:292-300）。
【００７７】
試薬
ＨＩＶ−１  Ｇａｇ由来のペプチド１２２種の重複ペプチドプール（Zaunders, JJ, ML Munier, DE Kaufmann, S Ip, P Grey, D Smith, T Ramacciotti, D Quan, R Finlayson, J Kaldor, ES Rosenberg, BD Walker, DA Cooper, and AD Kelleher. 2005. Early proliferation of CCR5+ CD38+++ antigen-specific CD4+ Th1 effector cells during primary HIV-1 infection. Blood 106:1660）を、各ペプチドの最終濃度２μｇ／ｍｌで全血培養物中で使用した。
【００７８】
ヒト分子に対して特異性を有し、サル分子と交差反応する以下のマウスモノクローナル抗体：抗ＣＤ３及び抗ＣＤ４（PharMingen社製、San Diego、ＣＡ、米国）、抗ＣＤ２５（BD Biosciences社製、San Jose、ＣＡ、米国）、並びに抗ＣＤ１３４（BD Biosciences社製、San Jose、ＣＡ、米国）を使用した。
【００７９】
細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイ
マカークでの使用に対して最適化した、実施例１に記載のアッセイ同様の全血ＩＣＣを使用して、該動物から得た新鮮末梢血試料中のＩＦＮ−γ反応を分析した。
【００８０】
全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
新鮮なヘパリンナトリウム抗凝血処理全血において、抗原としてＨＩＶ−１  Ｇａｇ由来の重複ペプチドのプールを用いて、実施例１に記載のようにＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイを実施した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１３４の発現について、培養済み試料を上記のモノクローナル抗体を用いて評価した。
【００８１】
結果及び考察
予定通りのワクチン接種を受けたマカークザル由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１  Ｇａｇに対する反応を、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイにより測定し、標準ＩＣＣアッセイにより測定したＩＦＮ−γ反応と比較した。図５に示した結果の比較から、明瞭な正の相関性が示され、したがって人間以外の対象、特に非ヒト霊長類に対する全血ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイの適正が実証された。
【実施例３】
【００８２】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するための全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイ
材料及び方法
対象
対象は、実施例１に記載のように募集したが、或いは抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベル又はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫能力が注目される任意の対象を含め得る。例えば、注目し得る対象には、抗原に対してワクチン接種を受けたことがある、又は感染性病原体に曝露されたことのある対象、並びに免疫性又は疾患の進行が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルに関係している、疾患又は病状に罹っている対象が含まれる（例えば、病原体に感染した細胞又は屑の一掃にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を必要とする疾患であって、ＨＩＶ−１、Ｂ型及びＣ型肝炎、鳥インフルエンザを含むＡ型及びＢ型インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウィルス、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）Ｉ型及びII型、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、並びに一連の他のウィルス、更にマラリアなどの感染症を起こす非ウィルス病原体を含めた、ウィルス及び他の細胞内病原体が起こす感染症などの疾患；ＣＤ８＋Ｔ細胞が病原に重要な役割を演じているようである、抗レトロウィルス薬のアバカビルが誘発するような過敏性反応；更に、ウィルス病原体に対するワクチンへの反応、特に、ＤＮＡワクチン、又はＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘発することを意図した各種のプライムブースト系で、単独、組合せのいずれかで使用されるポックスウィルス系若しくはアデノウィルス系ワクチンが誘発する反応）。
【００８３】
試薬
使用し得る抗原及びマイトジェンは、実施例１に記載の通りである。しかし、当業者に周知の抗原又はマイトジェンの任意の個数を使用してもよい。例えば、抗原及びマイトジェンは、合成した最適化ペプチド又は重複ペプチドセット、ＥＢＶで形質転換及び不死化された感染自家Ｂ細胞系などのウィルス感染標的細胞、注目するＭＨＣ−１分子によるトランスフェクション、ペプチドセットのパルス、注目する抗原を発現するワクシニア構築体などのウィルスによる感染のいずれかを受けた細胞系を含み得る。この実験で使用した抗原及びマイトジェンは、ＰＨＡ、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、並びにＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザウィルス由来の最適化した抗原性ペプチドのプールであった。
【００８４】
モノクローナル抗体は、実施例１及び実施例２に記載のように使用した。しかし、抗ＣＤ１３４抗体の代わりに抗ＣＤ１３７−ＰＥ（BD Biosciences社製、San Jose、ＣＡ、米国）を使用した。
【００８５】
全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイ
全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイは、本質的に実施例１に記載のように実行した。培養済み試料は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５及びＣＤ１３７の発現についてモノクローナル抗体及びフローサイトメトリーを使用して評価した。
【００８６】
フローサイトメトリー
全血培養物のフローサイトメトリーは、実施例１同様に、デュアルレーザーＬＳＲ  IIフローサイトメーター（Becton-Dickinson社製）上でＦＡＣＳＤｉｖａ  ｖ４．１ソフトウェアを用いて実施した。Ｔリンパ球は、側方散乱光ゲートに対し先ずＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を用いて同定し、次いでＣＤ３＋ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７＋Ｔ細胞にゲート設定した。また、ＣＤ４−AlexaFluor700（Becton-Dickinson社製）による染色を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞ゲートからＣＤ４＋Ｔ細胞を除外した。次いで、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１３７−ＰＥを結合するために、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４−細胞を解析した。
【００８７】
結果及び考察
健常対象又はＨＩＶ感染対象のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＰＨＡ、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、並びにＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザウィルス由来の最適化した抗原性ペプチドのプールに対する反応を全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイで測定した。図６に示す結果では、健常成人対象Ｃ００２は、四量体、ＩＣＣ及びElispot分析（当業者に周知の技法を用いて実施、データは示していない）で示されたように、ＣＭＶに対する明確なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を有し、全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイにおいて明瞭な陽性結果を生じた。反対に、ＨＩＶ感染対象Ｓ００９は、ＣＭＶ反応を示さなかった（ＣＭＶに対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応が該対象に欠如していたことと合致、データは示していない）が、ＨＩＶ  Ｇａｇペプチドには明瞭な陽性反応を有したため、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を試験し、検出するための全血ＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイが適正であることを実証した。こうした結果は、マウスの遺伝学研究においてＣＤ８＋Ｔ記憶細胞の生成及び生存にＣＤ１３７が関与しているとの報告（Whitmire, JK and Ahmed, R. 2000. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Current Opinion in Immunology 12(4): 448-55）と合致している。
【００８８】
したがって、本発明の方法は、抗原への曝露に反応する全血試料中のＣＤ２５及びＣＤ１３７の発現を定量的又は定性的に測定することにより、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために使用することができる。したがって、この方法は、注目する抗原に対する特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞反応の検出に有用であり、そうした抗原は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、他の疱疹ウィルス、ＨＩＶ及び他のレトロウィルス（ヒトＴ細胞白血球ウィルス（ＨＴＬＶ）１型及び２型、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ−ＳＩＶ組換えウィルス（ＳＨＩＶ））、ワクシニアウィルス、天然若しくは組換えワクシニア、又は注目する抗原を発現する改変ワクシニアベクター、及び他の組換えポックスウィルス（例えば、鶏痘及びアビポックスウィルス）、インフルエンザウィルス、肝炎ウィルス特にＢ型及びＣ型、パルボウィルス、ＪＣウィルス、並びに一連のマウスウィルスなどのウィルス抗原に由来する、重複ペプチドセット又は最適化ペプチド中に含まれている抗原などである。
【００８９】
その上、この方法は、一般的な免疫能力の尺度として、ＰＨＡ（図６に示す通り）などのマイトジェン、ＳＥＢ並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８に対するより広範な反応の評価にも使用できる。
【実施例４】
【００９０】
マウス脾臓細胞のＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイ
材料及び方法
マウスの免疫
Ｃ５７ＢＬ／６マウス４匹の皮下に、フロイントの完全アジュバント（Sigma社製、St. Louis、ＭＯ、米国）中に乳化したメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ；Sigma社製、St. Louis、ＭＯ、米国）０．４ｍｇを接種した。７日後に、マウスの右足蹠にｍＢＳＡ２００μｇを注射し、対照として左足蹠にＰＢＳを注射した。２４〜４８時間後に、足蹠を調べ、最大腫脹を測定した。対照マウスにはｍＢＳＡを接種しなかった。８日目にマウスを犠牲にした。
【００９１】
細胞培養
これらのマウスの脾臓をミンチにして７０μｍ滅菌メッシュを通し、単個細胞浮遊液（１〜２×１０６細胞／ｍｌ）を１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中、５μｇ／ｍｌのメチルＢＳＡ存在下又は非存在下で４４時間培養した。追加の培養物中では、陽性対照としてマイトジェンのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ；Sigma社製、St. Louis、ＭＯ、米国）を最終濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
【００９２】
モノクローナル抗体及びフローサイトメトリー
マウス細胞表面抗原に対して特異性を有する以下のモノクローナル抗体：抗ＣＤ３−Pacific Blue、抗ＣＤ４ Alexa Fluor 700、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ及び抗ＣＤ１３４−ＰＥ（PharMingen社製、San Diego、ＣＡ、米国）を使用した。
【００９３】
細胞は染色し、実施例１に記載のようにＬＳＲ  IIフローサイトメーターで分析した。
【００９４】
結果及び考察
免疫されたマウスでは、メチルＢＳＡを皮内投与してから２４〜４８時間後の足蹠腫脹によって、マウスがインビボでメチルＢＳＡに反応したことが確認された（Jiang等、未公表；データは示していない）。１日後に、これらのマウスを犠牲にし、脾臓を取り出した。
【００９５】
ＰＨＡと共にインビトロで脾臓を４４時間培養した後、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞の平均比率は、全マウスに対して６６％であった。メチルＢＳＡと共に培養した免疫マウス由来の脾臓細胞については、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞の平均比率は１．８１％であった。非免疫対照マウス由来の脾臓細胞については、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞の平均比率は０．０４％であった。
【００９６】
こうした結果は、ＣＤ２５／ＣＤ１３４アッセイが、マウスにおける抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出にも使用できることを実証している。
【００９７】
要約すると、例示したＣＤ２５／ＣＤ１３４及びＣＤ２５／ＣＤ１３７の全血アッセイは、培養準備の簡潔性（即ち、ＰＢＭＣの調製が不要）、分析用調製の簡潔性（細胞表面抗原だけ）、フローサイトメトリー分析の簡潔性（臨床試験室で現在使用している圧倒的多数のフローサイトメーターで操作できる４色分析）、非常に広範囲の反応に対する適用性（希少な抗原特異細胞からマイトジェンに対するポリクローナル反応まで）を含め、現行法に対していくつかの利点を有しており、特に小児集団において利点となる少ない血液量を利用し得る。更に、こうしたアッセイは、アッセイを現場から離れて準備できるように固定後の試料を輸送するが、専門施設で行うフローサイトメトリーにより検出することを可能にし得る。
【００９８】
ＣＤ２５／ＣＤ１３４及びＣＤ２５／ＣＤ１３７アッセイは、以下の事項を含む各種の用途に適している。
１．マイトジェン（例えばＰＨＡ）に対する反応の測定による一般的免疫不全の判定。
２．適切な抗原調製品が利用できる、細菌、真菌、ウィルス、原虫などの病原体（例えば、普通の微生物体及び環境微生物）に対する反応のモニタリング。
３．ＨＩＶ−１感染による進行免疫不全の対象における、このような病原体（例えばＣＭＶ）による感染に対する反応の喪失のモニタリング。
４．ワクチン反応（例えば、ワクシニア、ＴＴ、ＢＣＧ（ＭＴＢ）、ＨＩＶ−１、並びに麻疹、ムンプス及び風疹（ＭＭＲ））のモニタリング。
５．詳細な表現型検査をするための抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の同定（例えば、Ｔｈ１対Ｔｈ２などの分化マーカー、リンパ節ホーミング対腸又は皮膚ホーミングなどの転送マーカー、サイトカイン受容体、及びケモカイン受容体）。
６．４４時間培養した後の固定していない抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞分取（例えば、定量的な単一細胞の培養、抗原特異細胞の精製集団に関する機能アッセイ、遺伝子プロファイル作成を目的とした、各種の抗原提示細胞集団の活性化要件及び細胞活性化／増殖に対する差次的効果の評価、並びにＴ細胞受容体の分析を可能にする）。現在のところ、細胞分取をするための抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる同定には、細胞を固定し、透過性にするＩＣＣアッセイが普通は必要であるため、インビトロでの更なる増殖が妨げられる。対照的に、本発明に従って分取される細胞は、インビトロの操作に、又はマウス、マカーク、及び恐らくはヒトにおける再注入などのインビボの操作にでさえ使用できよう。この細胞は、遺伝子プロファイル作成を目的とした、ＲＮＡ種の単離にも使用できよう。
７．粗製混合物からの潜在的抗原の簡単な選別。
８．核抗原などの十分に特性決定済みの自己抗原、及びアレルゲン（例えば、イエダニタンパク質又は花粉タンパク質）に対する反応のモニタリング。
９．血液量が限られている小児科及び他の状況。
１０．獣医学的に重要な動物（例えば、家畜動物、競走馬及び愛玩動物）、或いは実験動物（例えば、ヒト疾患のモデルとして、又はワクチンの開発において、若しくは免疫反応の多様な側面を分析することが特に興味深い場合、刺激法、抑制法を問わない他種の免疫療法の開発において使用するマウス又はサル）における、抗原特異的又はマイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の検出。
【００９９】
本明細書を通じて、単語「comprise」又は「comprises」や「comprising」などの変形は、明言した要素、整数若しくはステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップの包含を暗示するが、他の任意の要素、整数若しくはステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップの除外を暗示していないことは理解されよう。
【０１００】
本明細書に記載したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に挙げた文書、法令、材料、装置、物品などに関するいずれの考察も、本発明に前後関係を提供するだけのためである。こうした事物のいずれか又はすべてが、従来技術の基礎の一部をなす、又は本願の各請求項の優先日以前にオーストラリア若しくは他国に存在していたような、本発明に関わる分野における一般常識であったことを認めたものと判断されてはならない。
【０１０１】
広義に言えば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、具体的な実施形態に示すように夥しい変形及び／又は改変を本発明になし得ることは、当業者であれば理解されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的なものではないと見なされたい。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】対照培養（＋０）中でのＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色と、ＳＥＢ、ＣＭＶ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、及び結核菌由来の精製タンパク分画（ＰＰＤ）に各々反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色との比較を示す、代表的な対照の健常成人対象１名から得たヒストグラムである。ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）が、各ヒストグラムに対して示されている。
【図２】対照の健常成人対象２名（Ｓ００１及びＳ００２）に対して、ＴＴ（Ｓ００１、左軸）、ＣＭＶ（Ｓ００２、左軸）、並びにＳＥＢ（Ｓ００１及びＳ００２、右軸）に各々反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を４〜５２時間の異なるインキュベーション時間で染色した結果を示す図である。
【図３】０、ＣＭＶ、ＴＴ及びＰＰＤに対する反応における、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色（４０時間のインキュベーション後）と、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞の７日目での染色（ＣＦＳＥ蛍光の減少を示すと定義される）との比較を示す、対照の健常成人対象１名（表１のＣ００３）から得たヒストグラムである。ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）が各ヒストグラムに対して示され（左図）、ＣＦＳＥ減少ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）も示されている（右図）。
【０１０３】
[図４]ワクシニア接種に反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の外観を示すデータである。
【図４Ａ】対象ＶＳ００１に対する、接種後の異なる日において対照（左図）、ワクシニア溶解物（右図）のいずれかに反応する全血培養物中でのＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色に関する代表的なヒストグラム。ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率（％）が、各ヒストグラムに対して示されている。
【図４Ｂ】ワクシニア溶解物接種後の対象３名に対する、該溶解物に反応するＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色結果。
【図４Ｃ】ワクシニア溶解物接種後の対象３名の該溶解物に対する反応における、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカインアッセイと比較した、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色の相関性。
【図５】ワクチン未接種、ＨＩＶ−１群特異抗原（Ｇａｇ）タンパク質を発現する構築体を用いたワクチン接種、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、外膜タンパク質（Ｅｎｖ）及びポリメラーゼポリプロテイン（Ｐｏｌ）タンパク質と他のＨＩＶ−１補助遺伝子とを発現する構築体によるワクチン接種のいずれかを施したマカークサルの全血のＨＩＶ−１  Ｇａｇ抗原ペプチドプールに対する反応における、ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカインアッセイと比較した、ＣＤ２５＋ＣＤ１３４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の染色の相関性を示す図である。
【図６】対照培養（＋０）中でのＣＤ２５＋ＣＤ１３７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の染色と、ＰＨＡ（＋ＰＨＡ）；ＨＩＶ−１  Ｇａｇ抗原由来の重複ペプチドのプール（＋ＨＩＶ  Ｇａｇ）；並びにＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザ由来の最適化抗原ペプチドのプール（＋ＣＥＦ）に各々反応する、ＣＤ２５＋ＣＤ１３７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の染色との比較を示す、代表的な対照の健常成人対象（Ｃ００２）及び代表的なＨＩＶ＋対象（Ｓ００９）から各々得たヒストグラムである。ＣＤ２５＋ＣＤ１３７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）が、各ヒストグラムに対して示されている。
【０１０４】
（参考文献）
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【国際調査報告】
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