(57)【要約】  ハイスループットエレクトロポレーション用のエレクトロポレータは、各々のウェルが、ウェルリムから横方向に延びている水平のプラットホームとして又は薄い電極プレートの延長高さとして、接触領域を形成するためにウェルの開口部を越えて延びている内部電極を有するウェルプレートで構成される。エレクトロポレータは、回路と、ウェルプレートの露出した接触領域とかみ合う電気接点とを収容する蓋を有する。蓋の互換性により、異なるプロトコルに従ってウェルにショックを与えることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のサンプルのエレクトロポレーション用のエレクトロポレータにおいて、
上向きに方向付けられた開口部と、前記ウェルの内部に貼り付けられた複数の電極とを有する複数のウェルを備えているプレートであって、前記複数の電極が、接触領域を提供するために前記開口部を越えて延長部を有するプレートと、
蓋が前記プレートの上方で閉じられたとき、前記接触領域との電気接続部を形成するように配置された露出したリード線に終端する電気回路を有する蓋とを備えている、エレクトロポレータ。
【請求項２】
前記電気回路が、個々にかつ予め定めた順序で、複数の群のウェルの前記電極に電圧印加するように構成され、各々の群が前記複数のウェルの部分を構成する、請求項１に記載のエレクトロポレータ。
【請求項３】
前記電気回路が、複数の群のウェルの前記電極に電圧印加するように構成され、各々の群が前記複数のウェルの部分を構成し、前記のエレクトロポレータが、波形、電圧、容量及び抵抗から成る群から選択された少なくとも１つのパラメータだけ前記群の間で変化するプロトコルに従って、各々の群のウェルに個々に電圧印加するためのプログラミング手段をさらに備えている、請求項１に記載のエレクトロポレータ。
【請求項４】
電気回路なしのブランクの蓋をさらに備え、前記ブランクの蓋と、電気回路を有する前記蓋とが交換可能である、請求項１に記載のエレクトロポレータ。
【請求項５】
前記複数の電極が前記ウェルの各々の側に対向して列をなし、前記延長部が前記上縁に沿った水平の接触領域である、請求項１に記載のエレクトロポレータ。
【請求項６】
隣接するウェルの電極間のアーキングを防止するために、前記上縁に沿った前記電極の幅が前記ウェルの内部よりも狭い、請求項５に記載のエレクトロポレータ。
【請求項７】
前記蓋が、側壁及び端壁を有する下向きに開口するシェル内に形成される下面を有し、前記側壁が、前記接触領域積に相補的な縁部面を有し、前記縁部面が導電性材料である、請求項５に記載のエレクトロポレータ。
【請求項８】
前記端壁が前記側壁よりも短い、請求項７に記載のエレクトロポレータ。
【請求項９】
前記電極が、前記ウェルの各々の内部に延びている複数のバッフルから成り、連続するバッフルが奇数及び偶数の羽根として規定され、全ての奇数のバッフルが、前記ウェルの上縁から外側方向に延びている共通の第１の水平のプラットホームに接合され、全ての偶数のバッフルが、前記第１の水平のプラットホームと反対側の前記ウェルの上縁から外側方向に延びている共通の第２の水平のプラットホームに接合される、請求項１に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１０】
前記ウェルが床を有し、前記バッフルが前記床の上に終端する下縁を有する、請求項９に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１１】
前記プレートが上面を有し、前記ウェルが前記上面から上向きに延びている円筒である、請求項９に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１２】
前記電極が、前記ウェルの内部に装着された平行プレートであり、前記延長部が、前記開口部の上に垂直に延びている前記プレートの部分である、請求項１に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１３】
１つのウェル当たり前記電極の少なくとも３つを備えている、請求項１２に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１４】
１つのウェル当たり前記電極の４つを備えている、請求項１２に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１５】
前記露出したリード線が等しい数のレールであり、前記露出したリード線の長さが前記延長部に略等しい、請求項１２に記載のエレクトロポレータ。
【請求項１６】
前記ウェルが床を有し、前記電極が、前記床の上に終端する下縁を有する、請求項１２に記載のエレクトロポレータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容の全体が参考として本出願に組み込まれている２００７年１月２５日に出願された米国仮特許出願第１１／６２７，２３５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、エレクトロポレーションの分野に関し、構造を懸濁することによって外来分子種を膜状構造に挿入するプロセスは、外来種の液体溶液であり、電界を懸濁液に印加することである。特に、本発明は、ハイスループットエレクトロポレーションのために使用される装置に関し、この用語は、同時に又は迅速に順次実行される多数の細胞懸濁液のエレクトロポレーションとして規定される。
【背景技術】
【０００３】
エレクトロポレーションは、生きている生物細胞、リポソーム、及び外来分子を有する小胞のような膜構造に含浸するための電界の使用を含む技術である。ハイスループットエレクトロポレーションにより、ユーザは、同時に又は順次自動的に多数のサンプルに電界を印加する、すなわち、「ショック」を与えることができる。ハイスループットエレクトロポレーションは、様々な手順で実施され、ｓｉＲＮＡを含む実験及びｃＤＮＡライブラリーの使用を含む研究が注目される。
【０００４】
外来種が溶解され、膜構造がエレクトロポレーション中に懸濁される媒体として高伝導度のバッファが使用され、比較的低い抵抗を電流に提供することに加えて、大部分の細胞の実効性に最も好ましい環境を提供するので、通常の生理的食塩水が一般に使用される。しかし、一般に、エレクトロポレータは、電気エネルギに対するそれらの抵抗によって制限される。したがって、標準的な９６ウェルのアレイを有するような多数ウェルのプレートが、１２の全てのバンクがショックを受けるまで、典型的に、８ウェルのバンクのようなセクションでショックを受ける。
【０００５】
一製造業者、ＢＴＸ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡは、８ｘ１２アレイの９６ウェルの内容物にショックを与えるように設計されたハイスループットエレクトロポレータを提供している。このエレクトロポレータは、特許協力条約の下で発行された国際公開公報第２００４／０５０８６６号に記載されており、その内容は参考として本出願に組み込まれている。国際公開公報第２００４／０５０８６６号に記載されたウェルプレートは、電極が各々のウェルの壁部にめっきされた長方形のウェルで作製される。８つのウェル（すなわち、コラム）のバンクの片側の電極の全ては、ワイヤ接続部を通して各バンクに沿ってめっきされたトレースに共通に接続され、同一のバンクのウェルの他方側の全ての電極は同様に共通に接続される。対応する電気接続部が１２のバンク全てに存在する。しかし、８つの平行ウェルの抵抗が低いため、利用可能な最大コンデンサが約３２００ｍｆｄの容量を有するという事実のため、８つのウェルの同時のショックにより、最大時定数は約２０ｍｓｅｃに、抵抗負荷は約６．２５オームに制限される。多くのプロトコルでは、全ての９６ウェルのショックには１０分が必要である。プレートへの電力供給は、ハンドラ内の電気リード線とプレート内の電極の各々との間で電気接触を行うプレートハンドラ内にプレートを下げることによって達成され、プレートハンドラは、１２のバンクの各々を順次外部電源に接続する内部のドライバ又はリレーを有する。次に、電気パルスが順次電極に供給される。同一のサイズ及び間隔の長方形のウェルが、９６ウェルのプレート及び２５ウェルのプレートの両方に使用され、全ての電気リード線及び接続部は、プレートの基部を形成する「中実の基板」に配置される。これにより、ウェルの使用が制限され、エレクトロポレータから汎用性が失われる。
【０００６】
本発明は、エレクトロポレーションプレートに関する。プレートそれ自体における又はプレートを支持する基板におけるよりもむしろ蓋の電気リード線との簡単な接触によって、電源との電気接続を形成するそれらの能力のため、従来技術に対する改良となる。電極は、ウェルの壁部のライニングとしてあるいはウェブの内部体積に浸漬されたプレート又はバッフルとしてウェルの内部にあるが、蓋内の電気リード線との接続は、ウェルの外側の領域への電極の延長部によって達成される。ある実施形態では、これらの延長部は、上方のリム又は縁部又は各々のウェルにおけるパッド、ショルダ、又はプラットホームのような横方向の接触領域であり、一方、他の実施形態では、これらの延長部はウェルの上方に垂直に突出する電極の上縁である。全ての場合に、延長部は、蓋内の電気接続を通して電源に接合される蓋の下側の対向するリード線との接触のために露出される。一群の実施形態では、ウェル内部の電極は、ウェルの対向壁部にめっきをされた領域であり、他の群の実施形態では、電極は、ウェル壁部からウェルの内部空間内に突出するバッフルである。３つ以上のバッフル、好ましくは４つ又は５つのバッフルが、好ましい実施形態で使用され、交互のバッフルが異なる極性に接続され、すなわち、奇数のバッフルは負電荷の極性のために接続され、偶数のバッフルは正電荷の極性のために接続される。なお別の群の実施形態では、電極は、ウェルの全幅に跨る薄いプレートである。３つ以上のこのようなプレートが好ましく、４つ以上のような偶数が最も好ましい。垂直の上向きの延長部を有する薄いプレートの場合、蓋は、各々のプレートにつき個々の接点を有することが好ましい。電極がバッフルであり、バッフルの長さがウェルの幅よりも短い場合、あるいはウェルの幅に跨る薄いプレートが使用される場合、隣接する電極は、プレートに対する総電圧を高めることなく、対向電極の間の狭いギャップ、したがって高圧の勾配のみを提供するように近接して離間される。同様にある実施形態では、電極は、それらが壁部ライニング、バッフル、又は薄いプレートとして構成されるかどうかに関わらず、各々のウェルの床の上方に短い距離で終端して、細胞と電極との間の直接接触なしに、細胞床に沿って粘着性の細胞を受け入れる。
【０００７】
電気リード線をプレートに配置し、電源を蓋に配置することによって、ウェル内の電極を電源からの電気リード線から分離することによって、いくつかの方法でエレクトロポレータに汎用性が付与される。予め定めたプレートのために、蓋の選択を行うことができ、各々の蓋は、ウェルにショックを与えるために異なるプロトコルを提供し、あるいは異なる蓋は、異なる数のウェル、異なる群のウェル、又はそれらの両方にショックを与える。蓋内の回路は、各々の群がプレート内の総数のウェルの部分を構成する群のウェルにショックを与えるように構成することができ、予め定めた順序でショックを行うことができる。エレクトロポレータは、波形、電圧、容量、抵抗、又はこれらのパラメータの組み合わせ、ならびにパルス持続時間、振幅、及び周波数のような他のパラメータにより群の間で変わるプロトコルに従って、各々の群のウェルに個々にショックを与えるためのコンピュータ又はアルゴリズムを含むことができる。予め定めた蓋のために、プレートの選択を行うことができ、各々のプレートは、異なるサイズ、異なる配置又は両方のウェル、及び異なる数及び配置の露出した接触領域を提供する。エレクトロポレータは、貯蔵、搬送、及び操作者の取扱いの目的で、回路又は電気接続部なしのブランクの蓋を含むことができる。
【０００８】
上記及び他の目的、特徴及び利点について、以下により詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
「ａ」又は「ａｎ」という用語は、「１つ以上」を意味するように意図される。「備えている”ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”」及び「備えている”ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”」のような”ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”という用語及びその変形例は、ステップ又は要素の記述の前に現れる場合、後続のステップ又は要素の追加が任意であり、かつ除外されないことを意味するように意図される。全ての特許、特許出願書、及び本明細書に引用した他の出版された参考資料は、それらの全体が参考として本出願に組み込まれている。本出願に引用した任意の参考資料と、本明細書の明示的な教示との間の任意の相違は、本明細書の教示を優先して解決されるように意図される。これには、当分野で理解される単語又は句の定義と、同一の単語又は句の本明細書で明示的に行われる定義との間の任意の相違が含まれる。
【００１０】
本発明を規定する特徴は様々な構造で実施できるが、本発明は全体として、特定の実施形態の詳細な検査によって最善に理解される。複数のこのような実施形態が図面に示されている。
【００１１】
図１は、本発明によるエレクトロポレータのエレクトロポレーションウェルプレート１０１及び蓋１０２を示している。プレート１０１は、標準１２ｘ８アレイの９６ウェル１０３を有し、蓋１０２は、プレートの上面の導電性接触領域と電気接触を行うためにその下面で露出される電気リード線１０４を有する。
【００１２】
図２と図３は、それぞれ、ウェルプレート１０１の上面２０１の部分の拡大図及び１つのウェルの電極対２０２、２０３の斜視図である。ウェル１０３の開口部は、図２に見ることができる。ウェルの形状は長方形であり、各々のウェルは、導電性の金属を壁面にめっきすることによってウェルの対向壁部に形成された１対の電極２０２、２０３を有する。めっきは、壁部の上縁を通過して延び、プレートの上面２０１の横方向接触領域２０４、２０５を形成する。図３は、接触領域２０４、２０５に加えて、各々の電極がノッチ、すなわち隅部カットアウトを有し、その上方の隅部の各々に、２つの電極が共に４つのノッチ３０１、３０２、３０３、３０４を有することを示している。これらのノッチにより、めっきをされた電極領域の幅は、ウェルの頂部においてウェル内部よりも狭い。頂部のこれらのより狭い幅により、隣接するウェルの接触領域２０４、２０５の間に比較的広い間隔が提供され、これによって、ウェルの間のアーキングが防止される。
【００１３】
図４は、蓋１０２の下面４０１の拡大図である。蓋内の電気リード線は図４に示されていないが、蓋の下面は、下向きに開放する一列の逆長方形のシェル４０２を形成するように成形され、１つのシェルは、ウェルプレート１０１（図１）のウェルの各々に対応する。各々のシェルの機能面は、シェルの横壁４０５、４０６の下縁４０３、４０４である。これらの下縁４０３、４０４は、蓋（図示せず）内の接続リード線によって電力が供給される導電性の金属でめっきされ、ウェルプレート１０１（図２と図３）の電極の接触領域２０４、２０５と反対側にそれぞれ直接配置される。蓋１０２がウェルプレート１０１の上方に下げられると、各々のウェルの電極との電気接触が行われ、シェル４０２はウェルの頂部を覆う。ウェルプレートの接触領域との接触を改良するために、シェル４０２のめっきされた縁部４０３、４０４は、選択的に、輪郭がワッフル形状の波形又は網状線である表面を有することができる。各々のシェルの端壁４０７、４０８の垂直の長さは、各々のウェルの両端の上方リムに沿って小さな開口部を残すために、横壁４０５、４０６よりも小さい。これらの開口部は、エレクトロポレーション中に、ウェル内へのガス流入及びそこからのガス流出を可能にし、これによって、ウェル及びそれらの外側の間に生じるかもしれない全ての圧力差を等化する。
【００１４】
これらの図に示した実施形態では、蓋内の電気リード線は、下面と蓋の頂面との間に分布される。下面２０１の電気リード線の配置は図５に示され、一方、頂面の配置は図６に示されている。しかし、両方は、ウェルアレイ内の全てのウェルに電力がいかに分布されるかを理解しやすくするため、蓋の頂部を通して観測されるように示されている。
【００１５】
図５は、８つのウェルの各バンクについて、ウェルの片側の全ての電極が横方向トレース５０１を通して互いに、かつプレートの中心線に沿って共通のトレース５０２に接続されることを示している。中心線トレース５０２の２つの端部は、プレートの外側（それぞれ前部及び後部）の縁部のＣＯＭパッド５０３、５０４に接合される。各々の８ウェルバンクの４つのウェルについて、他方の側の電極は、同様に、横方向トレース５０５を通して互いに接続され、これらの各々は、プレートの一方の側縁に沿って接点５０６に個々に接続される。ＣＯＭパッド５０３、５０４により、各々の８ウェルバンクの個々の電圧印加が可能であり、一方、個々の接点５０６により、それらが接続される４ウェルのバンクの各々の個々の電圧印加が可能である。
【００１６】
プレートの頂面の回路を示している図６は、残りの電極、すなわち、各々の８ウェルのバンクの最も左側の４つのウェル内の対向電極用の配線を示している。ここで、プレートの下側の回路のように、予め定めたバンク内の残りの最も左側の４つのウェルの各々は、トレース６０１によって接続され、各々の群の４つは、プレートの前縁及び後縁の接点に個々に接続される。最後部の６つのバンクからのトレースは、後縁の接点６０２に終端し、一方、前部の６つのバンクからのトレースは、前縁の接点６０３に終端する。プレートと接触を行う蓋の接触領域は、全て蓋の下面にあるが、蓋の頂部のそれらの領域とトレースとの間の連通は、異なる群のトレースの間の干渉を低減するために、めっきスルーホール又はそれらの等価物によって行うことができる。図５と図６に示した構成により、外部制御器によってプログラミングできる順序で各々、個々の群の４つのウェルのショックが可能である。
【００１７】
本発明の実施に使用するためのエレクトロポレータウェルプレートの代替実施形態が、図７、図８と図９に示されている。図７のウェルプレート７０１は、２４のウェル７０２を有し、これらのウェルは、プレートの上面から上向きに突出する円筒として示されているが、代わりに、プレートの表面の下に延びているプレート内の窪部であることができる。ウェルは円形の円筒として示されているが、正方形又は長方形であるか、又は他の形状であることができる。図８は、１つのウェル７０２の頂面図であり、平行であるが、ウェル内に懸濁された細胞又は他の膜構造が羽根の間の空間を自由に通過することを可能にする程度に十分に離間している一連のバッフル８０１をウェルが有することを示している。バッフル８０１は電極として機能し、各々のバッフルは両側で導電性の金属でめっきされる。バッフルは、各々のウェルの上方リムから外側方向に横方向に延びている導電性のタブ８０２、８０３と電気的に接続され、各々のタブは、蓋内の電気接点用の接触領域として機能するための水平のプラットホームを形成する。バッフルは、タブ８０２、８０３に交互に接続され、すなわち、奇数のバッフルは一方のタブに接続され、偶数のバッフルは他方のバッフルに接続され、バッフルが１つのバッフルから次のバッフルに、交互極性の電荷で電圧印加されることを可能にする。これらの図に示した実施形態は、１つのウェル当たり５つのバッフルを有するが、バッフルの数は、ウェルが受け入れることができる数に応じて変更することができる。好ましい構造では、ピペット先端の挿入を可能にする空間が縁部に設けられる。代わりに、中央バッフルは、ピペット先端を挿入するための中空の垂直リブを有するように設計することができる。図９の断面図は、この特定の実施形態のバッフル８０１が、ウェルの床９０２の上方に短い距離９０１でバッフルの下方の末端に終端することを示している。この距離は、細胞をバッフルと接触させずに、ウェルの底部の粘着性の細胞を含む細胞（又は一般的に膜構造）用の隙間を提供する。考えられる典型的な距離９０１は、１〜２ｍｍであるが、より大きいことができ、最適な距離は実験によって決定することができる。
【００１８】
図７、図８と図９によって示したウェルプレート用の蓋は図示されていないが、図１と図４の蓋１０２と同様の蓋を設計することができ、対応する接触領域は、ウェルプレートの接触領域８０２、８０３に整合する。
【００１９】
ウェルプレート及び蓋の両方の別の要素が、図１０、図１１と図１２に示されている。その頂面図が図１０に示されているウェルプレートは１２のウェル１００２を有するが、２４、９６、又は任意の他の数の同一の種類のウェルを有する対応するプレートを使用することができる。このプレートのウェルは円形であるが、上述の実施形態のように、正方形、長方形、又は同様に他の形状であることができ、プレート面から上向きに延びている円筒又はプレートの本体の窪部であることができる。これらのウェル内の電極は、図１１に示したように、各々のウェルの外周の上方に短い距離だけ延びている一連の薄い金属プレート１００３である。プレートとの電気接触は、ウェルのリムに隣接する横方向に延びている接触領域におけるよりもむしろ、プレートの突出する上縁に沿って達成される。プレートの上向きの突出部は、この接触を促進する。図７、図８と図９の実施形態のように、プレートは、ウェルの床１００４に延びず、代わりに、床の上方に短い距離で終端して、ウェルの底部の細胞に隙間を提供する。図１２は蓋１２０１を示し、電極プレートの上向きに突出する縁部と接触するレールの形態のトレース１２０２を示している。蓋１２０１は、当分野で公知の従来のめっき方法の任意の方法によって、トレースがめっきされるプリント回路基板として構成することができる。蓋の縁部においてレールを接続部１２０４に接合する蓋の様々な電気リード線１２０３も示されている。
【００２０】
上に示した実施形態の全てにおいて、蓋とプレートとの間の接点の適切な整列を維持し、かつ蓋の摺動を防止する方法で、ウェルプレートに確実に嵌合するように蓋を構成することができる。このことは、例えば、蓋周辺の周りにスカート、又はプレートの隆起した周辺リッジと噛合する溝、又は任意の同様の構造を組み込むことによって、達成することができる。他の構造が、当業者には容易に明らかであろう。蓋内のトレースは、蓋に挿入するためにモジュール式フォーマットで行うことができる。
【００２１】
図１１に示した構造の変形例として、薄い金属プレート１００３の突出する上縁を、台形の延長部のような先細りの延長部又は点に終端する部分で置き換えることができ、図１２のレール１２０２をチューリップ接点又は同様の弾性の把持接点で置き換えることができる。次に、蓋１２０１をウェルプレート１００１に押圧することによって、電気接続部が形成される。
【００２２】
前述の説明は図に示した構成要素に対する様々な代替構成要素について述べているが、なお別の代替例が当業者には明白であり、本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明によるエレクトロポレータの斜視図である。
【図２】図１のエレクトロポレータのウェルプレートの部分の頂面図である。
【図３】図２のウェルプレートの１つのウェルの電極の斜視図である。
【図４】蓋の隅部を示した図１のエレクトロポレータの蓋の下側の斜視図である。
【図５】頂部から蓋を通して観測されるような図１のエレクトロポレータの蓋の下側の回路の平面図である。
【図６】頂部から観測されるような図１のエレクトロポレータの蓋の頂面の回路の平面図である。
【図７】本発明の代わりのエレクトロポレータ用のウェルプレートの斜視図である。
【図８】図７のウェルプレートの１つのウェルの電極の頂面図である。
【図９】線９−９に沿った図８のウェルの断面図である。
【図１０】本発明の第３のエレクトロポレータのウェルプレートの頂面図である。
【図１１】図１０のウェルプレートの１つのウェルの斜視図である。
【図１２】図１０のウェルプレートを有するエレクトロポレータの蓋の回路図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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