(57)【要約】シュウ酸デカルボキシラーゼの架橋結晶などの安定化結晶を含むシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が開示される。また、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を使用して高シュウ酸濃度に関連する障害を治療する方法が開示される。さらに、タンパク質結晶を生成する方法が開示される。一実施形態では、結晶性シュウ酸デカルボキシラーゼは、哺乳動物に、例えば経口でもしくは胃に直接的に投与して、シュウ酸塩レベルを低減し、かつ／または哺乳動物のシュウ酸カルシウム沈着によって生じる損害を低減することができる。さらに、細胞抽出物からタンパク質結晶を生成する方法が開示される。シュウ酸デカルボキシラーゼ（「ＯＸＤＣ」）およびその架橋形態（「ＣＬＥＣ」）の結晶を含む組成物、例えば医薬組成物も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記結晶が、シュウ酸デカルボキシラーゼの可溶性形態よりも活性な、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記結晶の活性が、ｐＨ４における可溶性形態の活性より少なくとも約１００％高い、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が、架橋剤で架橋されており、シュウ酸デカルボキシラーゼの可溶性形態の活性の少なくとも約１００％を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が、架橋剤で架橋されており、シュウ酸デカルボキシラーゼの可溶性形態の活性の少なくとも約１５０％を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が、約０．０２％〜約１．５％（ｗ／ｖ）のグルタルアルデヒドで架橋されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記結晶が、約０．５％（ｗ／ｖ）のグルタルアルデヒドで架橋されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
哺乳動物中のシュウ酸塩を低減する方法であって、該シュウ酸塩を低減するのに十分な量で、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を含む組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が、架橋剤によって共有結合している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記結晶が、哺乳動物の胃腸管において活性かつ安定である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結晶が、約ｐＨ２〜約ｐＨ８で活性かつ安定である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が経口投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が体外装置内で使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物の投与によって、シュウ酸塩を少なくとも約１５％低減する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が経口投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
シュウ酸塩濃度をアッセイする方法であって、生体サンプルを調製するステップ、およびシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶または架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を使用してサンプル中のシュウ酸濃度を測定するステップを含む方法。
【請求項１８】
哺乳動物の高シュウ酸濃度に関連する障害を治療する方法であって、該障害に関連する１つまたは複数の症候を低減するのに十分な量で、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記障害が、腎臓または肝臓機能に関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記障害が、原発性高シュウ酸尿症、腸管性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール中毒、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、尿結石、腎結石、慢性腎疾患、血液透析、および胃腸バイパスからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）塩濃縮物中にタンパク質を可溶化し、またはタンパク質を濃縮するステップ、および
（ｂ）前記塩濃縮物を還元して結晶を形成するステップ
を含む、タンパク質の結晶化法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）の前記塩濃度が少なくとも約０．３Ｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）の前記塩濃度が約０．５Ｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質がシュウ酸デカルボキシラーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）細胞に塩を添加して、塩濃縮物としての細胞混合物を形成するステップ、および
（ｂ）前記塩濃縮物を還元して結晶を形成するステップ
を含む、細胞抽出物からタンパク質を結晶化する方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）の前記塩濃度が少なくとも約０．３Ｍである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）の前記塩濃度が約０．５Ｍである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞混合物がホモジナイズされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質がシュウ酸デカルボキシラーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２１に記載の方法によって生成される、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶。
【請求項３３】
請求項２２に記載の方法によって生成される、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
シュウ酸は、式ＨＯ２Ｃ−ＣＯ２Ｈのジカルボン酸である。シュウ酸は、主にシュウ酸の塩の形態であるシュウ酸塩として生物有機体中に存在する。シュウ酸塩は、ホウレンソウ、ダイオウ、イチゴ、クランベリー、ナッツ、ココア、チョコレート、ピーナツバター、モロコシ、および茶などの食物に見られる。シュウ酸塩は、ヒトおよび他の哺乳動物の最終的代謝産物でもある。シュウ酸塩は、腎臓によって尿に排出される。カルシウムと組み合わさると、シュウ酸は不溶性生成物であるシュウ酸カルシウムを生成するが、これは腎臓結石に最も一般に見られる化合物である。
【０００２】
哺乳動物は、シュウ酸塩を分解する酵素を合成しないため、個体中のシュウ酸塩レベルは、排出および食餌性シュウ酸塩の吸収を低減することによって正常に抑制される。シュウ酸塩の高濃度は、原発性高シュウ酸尿症、腸管性高シュウ酸尿症、および特発性高シュウ酸尿症などの様々な病理に関連している。Ｌｅｕｍａｎｎら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４巻：２５５６〜２５５８頁（１９９９年）およびＥａｒｎｅｓｔ、Ａｄｖ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２４巻：４０７〜４２７頁（１９７９年）。シュウ酸塩の増大は、食物からのシュウ酸塩の過消費、腸管からのシュウ酸塩の過剰吸収、およびシュウ酸塩生成異常によって引き起こされ得る。胆汁酸および脂肪吸収不全の疾患；回腸切除；ならびに、例えばセリアック病、膵外分泌機能不全、腸疾患、および肝疾患による脂肪便によって引き起こされる過剰吸収を含む、結腸および小腸のシュウ酸塩の過剰吸収が、腸疾患に関連し得る。
【０００３】
高シュウ酸尿症、または尿中シュウ酸塩排出の増大は、腎組織（腎石灰沈着症）または尿路（例えば、腎臓結石、尿結石、および腎結石）へのシュウ酸カルシウムの沈着に関係する幾つかの健康問題に関連している。シュウ酸カルシウムは、例えば、目、血管、関節、骨、筋肉、心臓、および他の主な器官に沈着し、それらに損害を与える恐れもある。例えば、非特許文献１および非特許文献２参照。シュウ酸塩レベルの増大作用は、様々な組織に現れ得る。例えば、小血管への沈着は、疼痛を伴う非治癒性の皮膚潰瘍を生じ、骨髄への沈着は貧血を生じ、骨組織への沈着は骨折を生じ、子どもの成長に影響を与え、心臓へのシュウ酸カルシウム沈着は、心拍異常または心機能低下を生じる。
【０００４】
高シュウ酸塩レベルを治療する既存の方法は、必ずしも効果的とは限らず、原発性高シュウ酸尿症の多くの患者に集中的な透析および臓器移植が必要とされ得る。様々な高シュウ酸尿症に対する既存療法には、高用量ピリドキシン、オルトリン酸塩、マグネシウム、鉄、アルミニウム、クエン酸カリウム、コレスチラミン、およびグリコサミノグリカン治療、ならびに食事および水分摂取の調節のため、透析のため、ならびに腎移植および肝移植などの外科的介入のためのレジメンが含まれる。これらの療法（例えば、低シュウ酸塩または低脂肪食、ピリドキシン、適切なカルシウム、および水分増大）は、部分的にのみ有効であり、オルトリン酸塩、マグネシウム、またはコレスチラミン補充の胃腸作用ならびに透析および手術のリスクなどの望ましくない副作用を有する恐れがある。したがって、身体から安全にシュウ酸塩を除去する方法が必要とされる。さらに、シュウ酸塩を分解して生体サンプル中のシュウ酸塩レベルを低減する方法は、例えば、シュウ酸塩の吸収またはクリアランス増大を阻害するだけの療法よりも有利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｅｕｍａｎｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１２巻：１９８６  １９９３頁（２００１年）
【非特許文献２】Ｍｏｎｉｃｏら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ６２巻：３９２  ４００頁（２００２年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、シュウ酸デカルボキシラーゼ（「ＯＸＤＣ」）およびその架橋形態（「ＣＬＥＣ」）の結晶、ならびにシュウ酸塩関連障害、例えば高シュウ酸尿症を治療するためのそれらの使用に関する。一実施形態では、結晶性シュウ酸デカルボキシラーゼは、哺乳動物に、例えば経口でもしくは胃に直接的に投与して、シュウ酸塩レベルを低減し、かつ／または哺乳動物のシュウ酸カルシウム沈着によって生じる損害を低減することができる。さらに、細胞抽出物からタンパク質結晶を生成する方法が開示される。シュウ酸デカルボキシラーゼ（「ＯＸＤＣ」）およびその架橋形態（「ＣＬＥＣ」）の結晶を含む組成物、例えば医薬組成物も開示される。
【０００７】
一態様では、本発明は、架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を提供する。架橋剤は、多官能性であってよく、幾つかの実施形態では、その薬剤は、グルタルアルデヒドなどの二官能性薬剤である。幾つかの実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は酵素活性を著しく変えない濃度、例えば少なくとも約０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のグルタルアルデヒドで架橋される。諸実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶の架橋レベルは、０．０２％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒドでの処理によってもたらされるレベルに等しい。架橋レベルは、当技術分野で知られている方法、または本明細書に開示の方法、例えば実施例１０〜１１に開示の、例えばタンパク質浸出レベルの決定によって決定することができる。
【０００８】
本発明はさらに、シュウ酸脱炭酸結晶、例えば可溶性シュウ酸脱炭酸物と比較して、例えば少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％高い活性を有するシュウ酸脱炭酸結晶を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、酸性条件下で、類似の酸性条件下（例えば約２〜３の酸性ｐＨ）の可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼが保持する活性および／または安定性の少なくとも２−、３−倍高い活性および／または安定性を保持する安定化した、例えば架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を提供する。諸実施形態では、安定化シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、酸性条件下で、可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼの少なくとも２００％、３００％、４００％より活性かつ／または安定である。
【００１０】
本発明はさらに、プロテアーゼの存在下で、類似の条件下の可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼが保持する活性および／または安定性の少なくとも２−、３−倍高い活性および／または安定性を保持する、安定化した、例えば架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を提供する。諸実施形態では、安定化シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、プロテアーゼの存在下で、可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼの少なくとも２００％、３００％、４００％、より活性かつ／または安定である。プロテアーゼは、例えば、ペプシン、キモトリプシン、またはパンクレアチンの１つまたは複数から選択することができる。諸実施形態では、安定化結晶もしくは可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼを、所定期間、例えば少なくとも１、２、３、４、または５時間（例えば、本明細書の実施例に記載のように）、酸性条件および／またはプロテアーゼに曝露した後、安定化または可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼの活性を測定する。
【００１１】
関連の一態様では、本発明は、可変ｐＨ条件下（例えば、約ｐＨ２．５または３〜７．５または８．５）、および／または例えば、ペプシン、キモトリプシン、もしくはパンクレアチンの１つまたは複数から選択することができる、例えばプロテアーゼの存在下で実質的に活性であり安定な架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を特徴とする。諸実施形態では、架橋した結晶は、本明細書に記載のように、酸性条件下（例えば約２〜３の酸性ｐＨ）およびプロテアーゼの存在下で、可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼが保持する活性の少なくとも２−、３−倍高い活性を保持する。他の実施形態では、安定化シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、本明細書に記載のように、酸性条件下（例えば約２〜３の酸性ｐＨ）およびプロテアーゼの存在下で、可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼよりも少なくとも２００％、３００％、４００％安定である。
【００１２】
本明細書に記載の結晶および／または架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を含む組成物、例えば医薬組成物も本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
幾つかの実施形態では、結晶は、特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エノキタケ（Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）またはエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シアノバクテリア属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、ストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、トラメテスヒルステ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｈｉｒｓｕｔｅ）、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、カワラタケ（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ポスティアプラセンタ（Ｐｏｓｔｉａ  ｐｌａｃｅｎｔａ）、ミロテシウムベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、ツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、メチロバクテリウムエクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、シュードモナスオキザラチカス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ）、ラルストニアユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、カプリアビダスオキザラチカス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ）、ウォルテシア属（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｓｐ．）、オキザリシバクテリウムフラバム（Ｏｘａｌｉｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、アンモニフィルスオキザラチカス（Ａｍｍｏｎｉｉｐｈｉｌｕｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ）、ビブリオオキザラチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ）、Ａ．オキサラチボランス（Ａ．ｏｘａｌａｔｉｖｏｒａｎｓ）、バリオボラックスパラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、キサントバクターオートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、およびムコール属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ．）からの植物、バクテリア、および菌などの天然源に見られるシュウ酸デカルボキシラーゼ配列と同じまたは実質的に同じ配列を有するシュウ酸デカルボキシラーゼを含む。他の実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼは、組み換えによって産生される。
【００１４】
一態様では、本発明は、本明細書に開示のシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶、例えば架橋したシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を含む組成物、例えば医薬組成物を投与することによって、対象のシュウ酸濃度を低減する方法を提供する。一実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、グルタルアルデヒドなどの架橋剤によって安定化する。組成物の投与によって、シュウ酸濃度を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％以上低減することができる。幾つかの実施形態では、組成物は、経口によって、または体外装置によって投与される。一実施形態では、体外装置は、カテーテル、例えばシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶でコーティングしたカテーテルである。他の実施形態では、組成物は、懸濁剤、乾燥粉剤、カプセル剤、または錠剤として投与される。一実施形態では、哺乳動物のシュウ酸濃度を低減する方法は、尿、血液、血漿、または血清サンプルなどの哺乳動物の生体サンプルのシュウ酸濃度をアッセイするステップを含む。
【００１５】
他の態様では、本発明は、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶および／または安定化した、例えば架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物の高シュウ酸濃度に関連する障害を治療し、予防し、かつ／またはその進行を遅延する方法を提供する。一実施形態では、高シュウ酸濃度に関連する該障害は、腎疾患、関節疾患、眼疾患、肝疾患、胃腸障害、または膵臓障害である。幾つかの実施形態では、障害は、原発性高シュウ酸尿症、腸管性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール中毒、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、尿結石、腎結石、慢性腎疾患、血液透析、および胃腸バイパスである。
【００１６】
他の態様では、本発明は、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶、例えば架橋したシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（例えば、本明細書に開示の結晶および／または架橋した結晶）を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶、例えば架橋したシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（例えば、本明細書に開示の結晶および／または架橋した結晶）を含む、有効量の医薬組成物を投与することによって、哺乳動物を治療する方法を提供する。
【００１８】
他の態様では、本発明は、タンパク質結晶、例えば酵素結晶（例えば、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶）を生成する方法を提供し、該方法は、タンパク質を含有する細胞抽出物またはペレット／沈殿物／溶液の調製物を提供するステップ、およびその調製物からタンパク質を結晶化するステップを含む。諸実施形態では、該方法は、タンパク質を発現する原核生物の宿主細胞培養を培養するステップ、所望のタンパク質を含有するペレットもしくは抽出物の調製物を得るステップ、ペレットの調製物を可溶化するステップ、タンパク質結晶を形成するステップ、および／または架橋によって結晶をさらに安定化するステップの１つまたは複数を含む。一般に、タンパク質は組み換えによって発現する。諸実施形態では、ペレット調製物は封入体を含む。
【００１９】
諸実施形態では、可溶化ステップは、低い変性濃度（例えば約１Ｍ〜約３Ｍの濃度の、例えば尿素または塩酸グアニジン）を含む溶液；例えば約０．３〜約０．８Ｍの濃度の塩濃度の、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または他の塩の１つまたは複数から選択される高い塩濃度を含む溶液；塩基条件下、例えば約９〜約１２のｐＨで低い変性濃度を含む溶液；あるいは高い変性濃度、例えば約４Ｍ〜約８Ｍの尿素または塩酸グアニジンを含む溶液の１つまたは複数をペレットの調製物に添加するステップを含む。
【００２０】
諸実施形態では、精製ステップは、例えば１つもしくは複数のスピンもしくは遠心分離ステップによってペレットの可溶化調製物を例えば分離し、かつ／または上清を収集することによって、ペレットから残屑を除去するステップを含む。精製ステップは、任意選択で、ペレットの可溶化調製物をイオン交換クロマトグラフィーに通すステップ、および／または可溶化調製物を濾過するステップをさらに含むことができる。
【００２１】
諸実施形態では、結晶化ステップは、精製タンパク質を濃縮し、それによって結晶化タンパク質を形成するステップを含む。諸実施形態では、結晶化タンパク質は、分離ステップ後、例えば１つまたは複数のスピンまたは遠心分離ステップ後に収集された上清から得られる。結晶化ステップはさらに、結晶化タンパク質を架橋剤と、例えば本明細書に開示の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）と接触させるステップを含むことができる。使用される架橋剤の濃度は、０．０１％〜２０％ｗ／ｖ、典型的には０．０２％〜１０％ｗ／ｖの範囲、より典型的には０．０２％、０．５％、または１％ｗ／ｖであり得る。
【００２２】
諸実施形態では、ペレット調製物中のタンパク質の収率は、ペレット調製物が得られる細胞調製物に見られる特定のタンパク質の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％である。他の実施形態では、可溶化タンパク質の収率は、ペレット調製物に見られるものの少なくとも約９０％、９５％、またはそれ以上である。さらに別の実施形態では、結晶化タンパク質の収率は、ペレット調製物に見られるものの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％である。
【００２３】
本発明はさらに、タンパク質結晶、例えば本明細書に開示の方法によって生成される酵素結晶（例えば、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶）を提供する。
【００２４】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図および以下の説明に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼ（「可溶性」）、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「結晶」）、および架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＣＬＥＣ」）のｐＨ活性プロファイルを示すグラフである。
【図２】ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの尿中シュウ酸塩レベルを示す棒グラフである。各棒は、平均±ＳＥ（標準誤差）を表す。アスタリスクは、スチューデント両側ｔ検定を使用した時点のｐ＜０．０５における対照群と３つの処理群の間の有意な差異を示す。
【図３】エチレングリコール−チャレンジしたＡＧＴ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの尿中シュウ酸塩レベルの減少に対するＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの作用を示す棒グラフである。各棒は平均±ＳＥを表す。アスタリスクは、スチューデント両側ｔ検定を使用して算出した時点のｐ＜０．０５における対照群と３つの処理群の間の有意な差異を示す。
【図４】エチレングリコール−チャレンジしたＡＧＴ１ＫＯマウスのクレアチニンクリアランスに対するＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの作用を示す棒グラフである。各棒は平均±ＳＥを表す。アスタリスクは、スチューデント両側ｔ検定によるｐ＜０．０５における対照群と８０ｍｇ処理群の間の有意な差異を示す。
【図５】ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでの処理後の、腎実質へのシュウ酸カルシウム沈着の防止を示す画像である。図５Ａは、８０ｍｇのＯＸＤＣ−ＣＬＥＣで処理したＥＧチャレンジマウスからの腎実質片である。図５Ｂおよび５Ｃは、対照群からの腎実質片である。図５Ｂの片部は中程度の腎石灰沈着症を示し、図５Ｃの片部は重篤な腎石灰沈着症を示す。暗色の斑点はシュウ酸カルシウム沈着（白色矢印で示される例）であり、明色の斑点は間質性線維症（灰色矢印で示される例）の領域である。
【図６】３つの異なる用量のＯＸＤＣ−ＣＬＥＣまたはビヒクル対照で処理したＥＧ−チャレンジマウスの生存時間を比較する、カプラン−マイヤー生存プロットである。
【図７】低ｐＨにおける示された時間間隔での可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼ（「Ｓｏｌ」）、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＸＴＡＬ」）、および架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＣＬＥＣ」）の安定性を示すグラフである。
【図８】ペプシンの存在下、ｐＨ３．０における示された時間間隔での可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼ（「Ｓｏｌ」）、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＸＴＡＬ」）、および架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＣＬＥＣ」）の安定性を示すグラフである。
【図９】キモトリプシンの存在下、ｐＨ７．５における示された間隔での可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼ（「Ｓｏｌ」）、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＸＴＡＬ」）、および架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＣＬＥＣ」）の安定性を示すグラフである。
【図１０】刺激を与えた腸液とパンクレアチンの存在下、ｐＨ６．８における示された間隔での可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼ（「Ｓｏｌ」）、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＸＴＡＬ」）、および架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（「ＣＬＥＣ」）の安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、シュウ酸デカルボキシラーゼ（ＯＸＤＣ）の結晶の投与によって、哺乳動物の高シュウ酸尿症の症候を低減できるという発見に部分的に基づいている。ＯＸＤＣ結晶を投与して、様々なシュウ酸塩関連障害を治療する方法が、本明細書に記載される。さらに、ＯＸＤＣ結晶および架橋した結晶（ＣＬＥＣ）と、それらを含む組成物およびその使用が提供される。さらに、原核生物の宿主細胞の細胞抽出物から、多量のタンパク質結晶を生成する方法が開示される。
【００２７】
定義
本発明をより容易に理解できるように、幾つかの用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して示される。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「生体サンプル」は、例えば検体を検出するために、細胞、組織、器官、または有機体から収集される生物材料である。例示的生体サンプルには、体液、細胞、または組織サンプルが含まれる。生体液には、例えば血清、血液、血漿、唾液、尿、または汗が含まれる。細胞または組織サンプルには、生検、組織、細胞懸濁液、または臨床サンプルなどの他の標本およびサンプルが含まれる。
【００２９】
「結晶」は、三次元で周期的に反復するパターンに配列された原子を含む、物質の固体状態の１つの形態である（例えば、Ｂａｒｒｅｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｓ、第２版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９５２年）参照）。ポリペプチドの結晶形態は、例えば第２の形態−非晶質固体状態とは異なっている。結晶は、形状、格子構造、溶媒パーセント、および例えば屈折率などの光学特性を含む特徴的な特性を示す。
【００３０】
「体外装置」は、個体の治療において体液をＯＸＤＣ結晶と接触させるための、身体内部には無い構造である。体外装置は、好ましくは腎臓透析を含む透析に使用される装置、持続的動静脈血液濾過のための装置、膜型人工肺、または血流から老廃物を濾過するために使用される他の装置である。同様に、例えば管、多孔質材料、または膜を含む、老廃物を濾過するための装置の部品も該用語に包含される。特に、体外装置は透析装置であってよい。また体外装置は、透析装置の膜であってもよい。
【００３１】
ＯＸＤＣの「機能性フラグメント」は、シュウ酸塩の脱炭酸の触媒能などのＯＸＤＣの１つまたは複数の生物活性を保持するＯＸＤＣポリペプチドの一部分である。本明細書で使用されるように、機能性フラグメントは、別段の指定が無い限り１つまたは両方の末端からの末端切断部を含むことができる。例えば、機能性フラグメントは、ＯＸＤＣポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から切断された１、２、４、５、６、８、１０、１２、１５、または２０もしくはそれ以上の残基を有することができる。切断部は、好ましくは１つまたは両方の末端からの２０個以下のアミノ酸である。機能性フラグメントは、任意選択で１つまたは複数の異種配列に結合することができる。
【００３２】
「個体」または「対象」という用語は、それに限定されるものではないが、ヒト、ヒトではない霊長類、霊長類、ヒヒ、チンパンジー、サル、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、猫、犬、馬、牛、羊、山羊、豚等を含む、任意の分類動物を含む任意の哺乳動物を指す。
【００３３】
「単離された」という用語は、実質的にその元々の環境にはない分子を指す。例えば単離したタンパク質は、それが由来する細胞または組織源からの細胞材料または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離タンパク質が治療組成物として投与されるのに十分に純粋な、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは少なくとも８０％９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは９０〜９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋な調製物を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「約」は、その用語が修飾する値の最大±１０％を指す。例えば、約５０ｍＭは５０ｍＭ±５ｍＭを指し、約４％は４％±０．４％を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「シュウ酸塩関連障害」は、それに限定されるものではないが、高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症、腸管性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール（シュウ酸塩）中毒、特発性尿路結石症、腎不全（進行性、慢性、または末期腎不全を含む）、脂肪便、吸収不良、回腸疾患、外陰部疼痛（ｖｕｌｖｏｄｙｎｉａ）、心臓伝導障害、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、膵外分泌機能不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、腎石灰沈着症、尿結石、および腎結石を含むシュウ酸またはシュウ酸塩の病理レベルに関連する疾患または障害を指す。かかる状態および障害は、場合によっては急性または慢性であり得る。腎臓、骨、肝臓、胃腸管、および膵臓に関連するシュウ酸塩関連障害は、当技術分野で知られている。さらに、シュウ酸カルシウムは、それに限定されるものではないが、目、血管、関節、骨、筋肉、心臓、および他の主な器官を含む多様な組織に沈着して、幾つかのシュウ酸塩関連障害をもたらす恐れがあることが周知である。
【００３６】
「シュウ酸」は主に、尿および腸液のｐＨ（ｐＫａ１＝１．２３、ｐＫａ２＝４．１９）で、その塩の形態であるシュウ酸塩として（対応する共役塩基の塩として）存在する。Ｅａｒｎｅｓｔ、Ａｄｖ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２４巻：４０７  ４２７頁（１９７９年）。「シュウ酸」および「シュウ酸塩」という用語は、本開示を通して同義に使用される。リチウム、ナトリウム、カリウム、および鉄（ＩＩ）を含むシュウ酸塩は可溶性であるが、シュウ酸カルシウムは、一般に、非常に水に溶けにくい（例えば、１８℃で約０．５８ｍｇ／１００ｍｌしか溶解しない。Ｅａｒｎｅｓｔ、Ａｄｖ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２４巻：４０７  ４２７頁（１９７９年））。食物からのシュウ酸は、食餌性シュウ酸塩とも呼ばれる。代謝過程によって生成されるシュウ酸塩は、内因性シュウ酸塩と呼ばれる。循環シュウ酸塩は、血液などの循環体液中に存在するシュウ酸塩である。
【００３７】
「治療有効用量」または「治療有効量」という用語は、原発性高シュウ酸尿症または腸管性高シュウ酸尿症などの高シュウ酸尿症を含む、シュウ酸塩関連状態を防止し、その症候の発症を遅延し、またはその症候を緩和する化合物の量を指す。治療有効量は、例えば、高シュウ酸濃度に関連する障害の１つまたは複数の症候を治療し、防止し、その重篤度を低減し、発症を遅延し、かつ／またはその発症リスクを低減するのに十分な量となろう。有効量は、当技術分野で周知でありこの説明の後の部分で記載される方法によって決定することができる。
【００３８】
「治療」、「治療法」という用語、およびそれらの同語源語は、既存の障害の治療および／または予防／防止手段を指す。治療を必要とするものには、特定の医学的障害を既に有する個体、ならびにその障害の危険性がある、または有している個体、あるいは最終的にその障害に罹患する恐れがある個体が含まれ得る。治療の必要性は、例えば、障害の発症、障害の存在または進行に関連する１つまたは複数の危険因子の存在、あるいは障害を有する対象の治療に受容される可能性が高いことによって評価される。治療には、障害の進行の遅延または後退が含まれ得る。
【００３９】
シュウ酸デカルボキシラーゼ。本明細書で使用されるように、シュウ酸デカルボキシラーゼ（ＯＸＤＣ）（ＥＣ４．１．１．２）は、シュウ酸塩カルボキシ−リアーゼ酵素を指す。シュウ酸デカルボキシラーゼは、以下の反応に従って、二酸化炭素およびギ酸塩へのシュウ酸塩の酸素分子（Ｏ２）独立酸化を触媒できることが当技術分野で知られている酵素群である。
ＨＯ２Ｃ−ＣＯ２Ｈ→１ＣＯ２＋ＨＣＯＯＨ
シュウ酸デカルボキシラーゼのイソ型、およびそれらのイソ型の糖型が、この定義に含まれる。枯草菌、エノキタケまたはエノキタケ、コウジカビ、シュードモナス属、シアノバクテリア属、ストレプトコッカスミュータンス、トラメテスヒルステ、菌核病菌、カワラタケ、ポスティアプラセンタ、ミロテシウムベルカリア、ツクリタケ、メチロバクテリウムエクストルクエンス、シュードモナスオキザラチカス、ラルストニアユートロファ、カプリアビダスオキザラチカス、ウォルテシア属、オキザリシバクテリウムフラバム、アンモニフィルスオキザラチカス、ビブリオオキザラチカス、Ａ．オキサラチボランス、バリオボラックスパラドキサス、キサントバクターオートトロフィカス、アスペルギルス属、ペニシリウム属、およびムコール属などのバクテリアおよび菌からの真性シュウ酸デカルボキシラーゼを含む、植物、バクテリア、および菌からのＯＸＤＣが、その用語に包含される。任意選択で、ＯＸＤＣはさらに、腸管内有機体からのＯＸＤＣなどの補酵素Ａに依存することになろう。特定の状況では、ＯＸＤＣは可溶性の六量体タンパク質である。
【００４０】
シュウ酸デカルボキシラーゼは、より高等な植物、バクテリア、および菌によって生成され、シュウ酸塩カルボキシ−リアーゼ酵素活性を有する。シュウ酸デカルボキシラーゼには、枯草菌、エノキタケまたはエノキタケ、コウジカビ、シュードモナス属、シアノバクテリア属、ストレプトコッカスミュータンス、トラメテスヒルステ、菌核病菌、カワラタケ、ポスティアプラセンタ、ミロテシウムベルカリア、ツクリタケ、メチロバクテリウムエクストルクエンス、シュードモナスオキザラチカス、ラルストニアユートロファ、カプリアビダスオキザラチカス、ウォルテシア属、オキザリシバクテリウムフラバム、アンモニフィルスオキザラチカス、ビブリオオキザラチカス、Ａ．オキサラチボランス、バリオボラックスパラドキサス、キサントバクターオートトロフィカス、アスペルギルス属、ペニシリウム属、およびムコール属によって生成される、一般にｃｕｐｉｎ型ＯＸＤＣとして同定されるものが含まれる。ｃｕｐｉｎ−様タンパク質は、特定の構造特性を共有する、大きな種類のタンパク質である。モリノカバレタケ属（Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｓｐ．）からのＧ−ＯＸＤＣなどのＯＸＤＣは、例えば六量体糖タンパク質として活性である。
【００４１】
結晶を調製するために使用され、本明細書に記載の方法で使用されるシュウ酸デカルボキシラーゼは、例えば、天然源から単離することができ、または天然源由来のものであってよい。本明細書で使用されるように、「由来する」という用語は、供給源に天然に生じるアミノ酸または核酸配列を有することを意味する。例えば、枯草菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼは、枯草菌シュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質の一次配列を含み、またはシュウ酸デカルボキシラーゼもしくはその変性物をコードする枯草菌に見られる配列を含む核酸によってコードされよう。ある供給源由来のタンパク質または核酸は、供給源から単離され、組み換えによって産生され、かつ／または化学的に合成もしくは改変される分子を包含する。本明細書で提供される結晶は、シュウ酸塩分解活性を保持するＯＸＤＣのアミノ酸配列またはＯＸＤＣの機能性フラグメントを含むポリペプチドから形成することができる。好ましくは、ＯＸＤＣは、天然に生じるＯＸＤＣの少なくとも１つの機能特性を保持しており、例えば、シュウ酸塩分解の触媒能、多量体化能、および／またはマンガン必要量の１つまたは複数を保持している。
【００４２】
単離したシュウ酸デカルボキシラーゼ。シュウ酸デカルボキシラーゼは既に単離されており、したがって枯草菌、エノキタケまたはエノキタケ、コウジカビ、シュードモナス属、シアノバクテリア属、ストレプトコッカスミュータンス、トラメテスヒルステ、菌核病菌、カワラタケ、ポスティアプラセンタ、ミロテシウムベルカリア、ツクリタケ、メチロバクテリウムエクストルクエンス、シュードモナスオキザラチカス、ラルストニアユートロファ、カプリアビダスオキザラチカス、ウォルテシア属、オキザリシバクテリウムフラバム、アンモニフィルスオキザラチカス、ビブリオオキザラチカス、Ａ．オキサラチボランス、バリオボラックスパラドキサス、キサントバクターオートトロフィカス、アスペルギルス属、ペニシリウム属、およびムコール属を含む多くの供給源から利用可能である。ＯＸＤＣは、例えばＳｉｇｍａなどの市販の業者から購入することもできる。天然源からＯＸＤＣを単離する方法は、例えば以下の参照において既に説明されている。Ｔａｎｎｅｒら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４７巻：４３６２７〜４３６３４頁（２００１年）；Ｄａｓｈｅｋ、Ｗ．Ｖ．およびＭｉｃａｌｅｓ、Ｊ．Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．５巻：４９〜７１頁（１９９７年）；Ｍａｇｒｏら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．４９巻：４９〜５２頁（１９８８年）；Ａｎａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４１巻：７６５９〜７６６９頁（２００２年）；ならびにＴａｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｒｎｅｍａｎｎ、Ｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８２巻：５２７１〜５２７３頁（２０００年）。これらの単離されたシュウ酸デカルボキシラーゼを使用して、本明細書に記載の結晶および方法を形成することができる。
【００４３】
組み換え型シュウ酸デカルボキシラーゼ。あるいは、組み換え型ＯＸＤＣを使用して、本明細書に記載の結晶および方法を形成することができる。幾つかの場合、組み換え型ＯＸＤＣは、天然に生じるＯＸＤＣ配列からの配列を包含し、またはそれによってコードされる。さらに、天然に生じる配列と相同であるか、または実質的に同一のアミノ酸配列を含むＯＸＤＣを本明細書に記載する。また、天然に生じるＯＸＤＣをコードする核酸と相当であるか、または実質的に同一の核酸によってコードされるＯＸＤＣが提供され、本明細書に記載のように結晶化し、かつ／または投与することができる。
【００４４】
本明細書において「組み換え型」と呼ばれるポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使用するベクターへのクローニングなどの人工的組み換え法による手順によって作製されるものを含み、組み換え型ＤＮＡ法によって産生されたポリペプチドである。「組み換え型」ポリペプチドは、宿主細胞などの細胞中で組み換えによって改変された発現を伴う天然に生じるポリペプチドなどの、変化した発現を有するポリペプチドでもある。
【００４５】
一実施形態では、ＯＸＤＣは、枯草菌またはエノキタケＯＸＤＣ核酸配列と相同な核酸から組み換えによって産生され、例えば異種宿主における組み換え型の産生を増大または最適化するために改変されることがある。かかる改変された配列の一例は、配列番号１（核酸）で提供され、カンジダボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）での発現のためのエノキタケＯＸＤＣのオープンリーディングフレームの核酸配列を含む。そのＧＣ含量を低減するために改変されたＯＸＤＣ配列は、α接合因子分泌シグナル配列に結合しており、遺伝子組み換えされた制限エンドヌクレアーゼ切断部位が脇に配置されている。別の実施形態では、ＯＸＤＣは、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：Ｚ９９１２０で利用可能な、改変されていない枯草菌ＯＸＤＣ核酸配列から組み換えによって産生される。配列番号２によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号３として提供される。
【００４６】
ＯＸＤＣ結晶の形成に有用なＯＸＤＣポリペプチドは、ＯＸＤＣポリペプチドまたはその機能性フラグメントのコード配列を含む核酸構造を含む宿主細胞などの宿主細胞に発現することができる。ＯＸＤＣの発現に適した宿主細胞は、酵母、バクテリア、菌、昆虫、植物、もしくは哺乳動物細胞、または例えば、トランスジェニック植物、トランスジェニック動物、もしくは無細胞系であってよい。宿主細胞は、好ましくは必要に応じてＯＸＤＣポリペプチドに糖類付加することができ、ジスルフィド結合することができ、ＯＸＤＣを分泌することができ、かつ／またはＯＸＤＣポリペプチドの多量体化を支持することができる。好ましい宿主細胞には、それに限定されるものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂおよび大腸菌ＢＬ２１を含む）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、枯草菌、アスペルギルス、Ｓｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、２９３細胞（ヒト胎児腎臓）、および他のヒト細胞が含まれる。また、トランスジェニック植物、豚、牛、山羊、馬、鶏、およびウサギを含むトランスジェニック動物が、ＯＸＤＣ産生に適した宿主である。
【００４７】
ＯＸＤＣの組み換え型の産生のために、宿主または宿主細胞は、ＯＸＤＣまたはその機能性フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸を含む、プラスミド、ベクター、ファージミド、または転写もしくは発現カセットの形態の構造を含むべきである。単一コピーもしくは複数コピーに維持されるか、または宿主細胞染色体に組み入れられる構造を含む様々な構造が利用可能である。組み換え型発現のための多数の組み換え型発現系、成分、および試薬が、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カールスバッド）；Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（マサチューセッツ州スワンプスコット）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）；Ｎｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州マディソン）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ）；およびＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、（ドイツ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）から市販で入手可能である。
【００４８】
ＯＸＤＣの組み換え型発現は、構造性および／または誘導性プロモーターを含む異種プロモーターによって任意選択で制御される。例えば、Ｔ７、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーター、ジヒドロキシ−アセトン合成（ＤＡＳ）プロモーター、Ｇａｌ１，１０プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、銅メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、ＣＭＶおよびプロモーターポリヘドリンなどのプロモーターも適している。特定のプロモーターは、宿主または宿主細胞をベースに選択される。さらに、メタノール、硫酸銅、ガラクトースによって、低リン酸塩によって、アルコール、例えばエタノールによって例えば誘導されるプロモーターを使用することもでき、それらは当技術分野で周知である。
【００４９】
ＯＸＤＣをコードする核酸は、任意選択で異種配列を含むことができる。例えば幾つかの実施形態では、ＯＸＤＣポリペプチドのＮ−末端で分泌配列が含まれる。α接合因子、ＢＧＬ２、酵母酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ）、キシラナーゼ、αアミラーゼからのもの、他の酵母によって分泌されたタンパク質からのもの、および宿主細胞から直接分泌することができる他の種に由来する分泌シグナルペプチドなどのシグナル配列が有用となり得る。同様に、リンカー（例えば、切断部位または制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）ならびに１つまたは複数の発現制御因子、エンハンサー、終止剤、リーダー配列、および１つまたは複数の転写シグナルなどの他の異種配列が、本説明の範囲に含まれる。これらの配列は、任意選択で構造内に含まれ、かつ／またはＯＸＤＣをコードする核酸に結合することができる。別段の指定が無い限り、「結合」配列は、互いに直接または間接的に関連することができる。
【００５０】
同様に、ヒスチジン、ＨＡ（血球凝集素ペプチド）、マルトース結合タンパク質、ＡｖｉＴａｇ（登録商標）、ＦＬＡＧ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのエピトープまたはアフィニティー標識は、任意選択でＯＸＤＣポリペプチドに結合することができる。標識は、産生または精製された後にＯＸＤＣから任意選択で開裂することができる。当業者は、適切な異種配列、例えばマッチ（ｍａｔｃｈ）宿主細胞、構造、プロモーター、および／または分泌シグナル配列を容易に選択することができる。
【００５１】
ＯＸＤＣホモログまたは変異体は、１つまたは複数の残基によって、ＯＸＤＣ参照配列とは異なっている。構造的に類似のアミノ酸は、例えば特定のアミノ酸の幾つかを代替することができる。構造的に類似のアミノ酸には、（Ｉ、Ｌ、およびＶ）；（ＦおよびＹ）；（ＫおよびＲ）；（ＱおよびＮ）；（ＤおよびＥ）；ならびに（ＧおよびＡ）が含まれる。アミノ酸の欠失、付加、または置換は、本明細書に記載のＯＸＤＣホモログにも包含される。かかるホモログおよび変異体には、（ｉ）多形変異体および天然または人工変異体、（ｉｉ）１つまたは複数の残基が修飾されている修飾ポリペプチド、ならびに（ｉｉｉ）１つまたは複数の修飾残基を含む変異体が含まれる。
【００５２】
ＯＸＤＣポリペプチドまたは核酸は、参照配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同じである場合に、「相同」（または「ホモログ」）である。ホモログが参照配列と同じでない場合、それは「変異体」である。ホモログは、そのホモログのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、８、１０、２０、または５０個以下の残基だけ参照配列とは異なっており（例えば切断、欠失、置換、または付加によって）、シュウ酸塩分解の触媒能を保持する（またはそれを保持するポリペプチドをコードする）場合に、参照ＯＸＤＣ配列と「実質的に同一」である。変異体および／または実質的に同一の配列を含み、シュウ酸デカルボキシラーゼのフラグメントはホモログであり得る。例えばホモログは、ＯＸＤＣの様々な供給源由来のものであってよく、あるいは切断、欠失、置換、または付加変異体によって参照配列に由来するまたは関連することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の識別パーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３  ４１０頁（１９９０年）に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４４  ４５３頁（１９７０年）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．４巻：１１  １７頁（１９８８年）のアルゴリズムなどの標準の整列アルゴリズムによって決定することができる。かかるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、および「ＢＬＡＳＴ２配列」プログラム（ＭｃＧｉｎｎｉｓおよびＭａｄｄｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２巻：Ｗ２０〜Ｗ２５頁、２００４年に総説）に組み込まれる。かかるプログラムが使用される場合、デフォルトパラメータを使用することができる。例えばヌクレオチド配列に関して、「ＢＬＡＳＴ２配列」では以下の設定を使用することができる。プログラムＢＬＡＳＴＮ、マッチに対する報酬２、ミスマッチに対するペナルティ２、オープンギャップおよびエクステンションギャップペナルティがそれぞれ５および２、ギャップ×＿ドロップオフ５０、予測１０、文字サイズ１１、フィルタＯＮ。アミノ酸配列に関して、「ＢＬＡＳＴ２配列」では以下の設定を使用することができる。プログラムＢＬＡＳＴＰ、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップおよびエクステンションギャップペナルティがそれぞれ１１および１、ギャップ×＿ドロップオフ５０、予測１０、文字サイズ３、フィルタＯＮ。本明細書に記載の結晶を形成するのに適切なＯＸＤＣに対するアミノ酸および核酸配列は、相同な、変異体、または実質的に同一の配列を含むことができる。
【００５３】
シュウ酸デカルボキシラーゼの精製。シュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質またはポリペプチドは、結晶化の前に、天然または組み換え型供給源などの供給源から精製することができる。本明細書で「単離した」と呼ぶポリペプチドは、それらの発生源（例えば、細胞、組織（即ち植物組織）、または流体もしくは媒体（分泌ポリペプチドの場合））のタンパク質、脂質、および／または核酸などのその自然環境から実質的に自由になっているポリペプチドである。単離したポリペプチドには、本明細書に記載の方法または他の適切な方法によって得られるものが含まれ、実質的に純粋または本質的に純粋であるポリペプチド、ならびに化学合成によって、組み換え型産生によって、または生物学的および化学的方法の組合せによって産生されるポリペプチドが含まれる。単離したタンパク質を、任意選択で、その産生後に精製ステップなどのさらなる処理にかけた。
【００５４】
精製は、緩衝剤交換およびクロマトグラフのステップを含むことができる。任意選択で、例えば透析、クロマト分画クロマトグラフィーによる、および／または緩衝剤交換に関連する濃縮ステップを使用することができる。幾つかの場合、精製のために、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ＤＥ５２、スルホプロピルセファロースクロマトグラフィーもしくはＣＭ５２、または類似のカチオン交換カラムを含むカチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーが使用される。任意選択で緩衝剤交換がクロマトグラフ分離に優先し、ダイアフィルトレーションなどの接線流濾過によって実施することができる。幾つかの調製では、ＯＸＤＣは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、または９９．９％純粋である。
【００５５】
グラム規模実施の精製がＯＸＤＣの調製に適しており、手順は、効率的で安価な製造規模のＯＸＤＣ精製に合わせて最適化される。例えば、精製手順では、少なくとも０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、または１０００グラムもしくはそれ以上のＯＸＤＣの精製が提供される。例示的な一手順では、少なくとも１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、またはそれ以上の出発サンプルの接線流濾過が提供され、緩衝剤交換および汚染タンパク質の沈殿が可能となる。ＯＸＤＣの精製のために、単一のＱ−セファロースカラムが任意選択で使用される。
【００５６】
精製ＯＸＤＣの結晶化は汚染物質を除去し、例えばＯＸＤＣ調製物をさらに精製することもできる。例えば、実施例２〜６に記載のように結晶化したＯＸＤＣは、可溶性の精製ＯＸＤＣと比較して、低分子量の汚染物質レベルを低減した。幾つかの態様では、０〜１０ＫＤａ、１〜１０ＫＤａ、０．５〜５ＫＤａ、または２〜５ＫＤａの測定質量（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による）を有する汚染物質が、結晶形態から選択的に排除される。例えば、約２．５、３．０、３．７、３．８、４．０、４．２、または５．０ＫＤａの測定質量を有する汚染物質を、結晶化によって実質的に除去することができる。結晶化による精製は、例えば発酵媒体を含有する粗シュウ酸デカルボキシラーゼを使用して行うこともできる。
【００５７】
シュウ酸デカルボキシラーゼの結晶化。シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、上記のように（Ａｎａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１巻：７６５９〜７６６９頁（２００２年）参照）、六量体などのＯＸＤＣポリペプチドを使用して調製することができる。蒸気拡散（例えば、懸滴およびシッティングドロップ法など）、および例えば結晶化のバッチ法を使用することができる。シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、水溶液または有機溶媒を含む水溶液からタンパク質を制御結晶化することによって成長させることができる。制御される条件には、例えば溶媒の蒸発速度、適切な共溶質および緩衝剤の存在、ｐＨ、ならびに温度が含まれる。
【００５８】
シュウ酸塩レベルに関連する状態または障害を治療するためなどの治療投与に関して、様々なＯＸＤＣ結晶寸法が適している。幾つかの実施形態では、平均寸法約５００μｍ未満の結晶が投与される。長さが平均、最大、または最小寸法（例えば）約０．０１、０．１、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００μｍのシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶も提供される。微結晶シャワーも適している。
【００５９】
諸範囲が適しており、当業者には明らかとなろう。例えば、タンパク質結晶は、約０．０１μｍおよび約５００μｍの間、あるいは０．１μｍおよび約５０μｍの間の最長寸法を有することができる。特定の一実施形態では、最長寸法は、約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲である。結晶はまた、球、針、棒、六角形および四角形などの板、菱形、立方体、両錐、ならびに角柱から選択される形状を有することができる。例示的実施形態では、結晶は、５μｍ未満の最長寸法を有する立方体である。
【００６０】
一般に結晶は、結晶化するタンパク質と、塩または有機溶媒などの適切な水性溶媒または適切な結晶化剤を含有する水性溶媒とを組み合わせることによって生成される。溶媒をタンパク質と組み合わせ、任意選択で、結晶化の導入に適切でありタンパク質の活性および安定性の維持に許容可能な、実験によって決定される温度で撹拌する。溶媒は、一価または二価のカチオン、補因子またはカオトロープなどの共溶質、ならびにｐＨ制御のための緩衝剤種を任意選択で含むことができる。結晶化を容易にするために、共溶質の必要性およびそれらの濃度が実験によって決定される。工業規模のプロセスでは、結晶化をもたらす制御沈殿は、タンパク質、沈殿剤、共溶質と、任意選択で、例えばバッチプロセスの緩衝剤の組合せによって実施することができる。透析または蒸気拡散などの実験室での代替結晶化法および条件を採用することができる（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１４巻：１１２〜２０頁（１９８５年）およびＧｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ９０巻：５１〜５９頁（１９９８年））。場合によっては、架橋剤と結晶化媒体の間の不相溶性により、架橋前に緩衝剤（溶媒）を変える必要があり得る。
【００６１】
実施例に記載のように、シュウ酸デカルボキシラーゼは、広いｐＨ範囲（例えば、ｐＨ３．５〜８．０）を含む幾つかの条件下で結晶化する。記載の幾つかの実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００［実施例７および８参照］）などの沈殿剤または２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）などの有機共溶媒が含まれる。使用できる一般的な塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニア、酢酸亜鉛等が含まれる。
【００６２】
シュウ酸デカルボキシラーゼは、結晶化ブロス中、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｍｌ、もしくはそれ以上の濃度であってよい。結晶化反応の効率または収率は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上である。一実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼの結晶は、シュウ酸デカルボキシラーゼ溶液と適切な緩衝剤を混合することにより、バッチプロセスによって成長または生成される。幾つかの実施形態では、緩衝剤は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ８．０、および１００ｍＭのＮａＣｌと２ｍＭのシステイン−ＨＣｌである。
【００６３】
細胞または細胞抽出物からの結晶化。結晶は、細胞または粗細胞抽出物から直接調製することができる。一実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼを発現するバクテリア細胞が回収される。ＤＮａｓｅを用いてまたはそれなしに細胞を再懸濁し、ホモジナイズする。塩溶液を細胞溶解物に添加して、約０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、またはそれ以上の塩濃度を達成する。添加される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、または他の塩であってよい。タンパク質は、細胞残屑を除去することによって細胞混合物から任意選択で抽出することができる。一実施形態では、ホモジナイズした細胞混合物を遠心分離にかけ、上清溶液中にタンパク質を残す。結晶は、細胞混合物またはタンパク質溶液の塩濃度を低減することによって生成される。一実施形態では、塩は、タンパク質濃度を維持するための透析によって除去される。結晶収率を増大するために、溶液の塩濃度を低減する前に、タンパク質溶液を濃縮することができる。結晶は、ｐＨ約６、７、または８の溶液で生成することができる。
【００６４】
結晶は、タンパク質沈殿物またはペレットから調製することができる。一実施形態では、所望のタンパク質を発現する細胞を回収し、シュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質を沈殿物またはペレットとして収集する。シュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質を含有するペレットまたは沈殿物は、塩溶液に可溶化する。結晶は、タンパク質溶液中の塩濃度を低減することによって形成される。結晶収率を増大するための可溶化タンパク質溶液中の塩濃度は、結晶を生成するためにそれを低減する前では、少なくとも約０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、またはそれ以上である。
【００６５】
結晶は、タンパク質溶液から調製することもできる。一実施形態では、シュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質溶液は塩溶液として濃縮され、その溶液の塩濃度を低減するときに結晶が形成する。結晶収率を増大するための塩濃度は、結晶を生成するためにそれを低減する前では、少なくとも約０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、またはそれ以上である。
【００６６】
安定化結晶。シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が適切な媒体中で成長すると、架橋などによって、任意選択でそれらを安定化することができる。架橋の結果、結晶の構成要素であるタンパク質分子間に共有結合が導入されることによって結晶格子が安定化する。これにより、結晶格子の存在またはそのままのタンパク質の存在と通常なら不相溶性であろう代替環境に、タンパク質を移すことが可能となる。シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、例えば、リシンアミン基、チオール（スルフヒドリル）基、および炭水化物部分を介して架橋することができる。架橋した結晶は、本明細書では「ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ」、「ＣＬＥＣ−ＯＸＤＣ」、または「ＣＬＥＣ」とも呼ばれる。
【００６７】
架橋した結晶は、酵素安定性（例えば、ｐＨ、温度、機械的および／または化学的安定性）、ＯＸＤＣ活性のｐＨプロファイル、可溶性、結晶寸法もしくは体積の均一性、結晶からの酵素の放出速度、および／または基礎をなす結晶格子における個々の酵素分子間の細孔径および形状を変えることができる。
【００６８】
有利には、本発明の架橋または安定化は、結晶が、可溶性ＯＸＤＣと比較して少なくとも６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ以上の活性を示すＯＸＤＣを含むように実施される。安定性は、可溶性ＯＸＤＣと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ以上増大することができる。安定性は、例えばｐＨ安定性、温度安定性、消化管プロテアーゼに対する安定性、溶解安定性、およびインビボ生物学的安定性などの保存条件下で測定することができる。
【００６９】
幾つかの実施形態では、架橋は、結晶中ＯＸＤＣポリペプチドの溶液への溶解を遅延させ、タンパク質分子を微結晶粒子に効果的に固定化する。保存以外の使用条件下などの架橋タンパク質結晶の周囲環境において、あるトリガーに曝露される際、タンパク質分子はゆっくり溶解し、活性なＯＸＤＣポリペプチドを放出し、かつ／またはＯＸＤＣ活性を増大する。溶解速度は、例えば以下の因子の１つまたは複数によって制御される。架橋度、架橋剤にタンパク質結晶を曝露する時間、タンパク質結晶に架橋剤を添加する速度、架橋剤の性質、架橋剤の鎖長、ｐＨ、温度、システイン、グルタチオンなどのスルフヒドリル試薬の存在、架橋タンパク質結晶の表面積、架橋タンパク質結晶の寸法、および架橋タンパク質結晶の形状。
【００７０】
架橋は、多官能性薬剤を含む多様な架橋剤の１つまたは組合せを、同時（並行）に、または順に使用して達成することができる。周囲環境において、または所与の時間にわたってあるトリガーに曝露される際、かかる多官能性架橋剤で架橋したタンパク質結晶間の架橋は減少または減衰し、タンパク質の溶解または活性の放出に至る。あるいは架橋が連結点で切断して、タンパク質の溶解または活性の放出に至ることもある。米国特許第５，９７６，５２９号および第６，１４０，４７５号参照。
【００７１】
幾つかの実施形態では、架橋剤は、少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上の活性部分を有する多官能性架橋剤である。様々な実施形態では、該薬剤は、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、グリオキサル、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、３，３’ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、ヘキサメチレンジアミン、ジアミノオクタン、エチレンジアミン、無水コハク酸、フェニルグルタル酸無水物、サリチルアルデヒド、アセトイミデート、ホルマリン、アクロレイン、コハク酸セミアルデヒド、ブチルアルデヒド、ドデシルアルデヒド、グリセルアルデヒド、およびトランス−オクト−２−エナールから選択することができる。
【００７２】
さらなる多官能性架橋剤には、ハロトリアジン、例えば塩化シアヌル；ハロ−ピリミジン、例えば２，４，６−トリクロロ／ブロモピリミジン；脂肪族または芳香族モノ−またはジ−カルボン酸の無水物またはハロゲン化物、例えば無水マレイン酸、塩化（メタ）アクリロイル、塩化クロロアセチル；Ｎ−メチロール化合物、例えばＮ−メチロールクロロ−アセトアミド；ジ−イソシアネートまたはジ−イソチオシアネート、例えばフェニレン−１，４−ジ−イソシアネート、およびアジリジンが含まれる。他の架橋剤には、例えばジ−エポキシド、トリ−エポキシド、およびテトラ−エポキシドなどのエポキシドが含まれる。一実施形態では、架橋剤は、グルタルアルデヒド、二官能性薬剤であり、グルタルアルデヒドは、単独で、またはエポキシドと順に使用される。他の架橋試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙの１９９６年カタログ参照）も、以下に記載のものなどの可逆性架橋剤と同時（並行）に、または順に使用することができる。
【００７３】
本発明の代替の一実施形態によれば、架橋は、可逆性架橋剤を並行にまたは順に使用して実施することができる。得られる架橋タンパク質結晶は、あるトリガーが別個の群として組み込まれる反応性多官能性リンカーを特徴とする。反応性官能基は、タンパク質中の反応性アミノ酸側鎖と一緒になって結合することに関与し、そのトリガーは、周囲環境の１つまたは複数の条件（例えば、ｐＨ、還元剤の存在、温度、または熱力学的水分活性）を変えることによって切断できる結合からなる。
【００７４】
架橋剤は、同種官能性または異種官能性であってよい。反応性官能基（または部分）は、例えば以下の官能基の１つから選択することができる（ただし、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、アルキル、アリール、または水素基であってよい）。
【００７５】
Ｉ．反応性アシル供与体、例えばカルボン酸エステルＲＣＯＯＲ’、アミドＲＣＯＮＨＲ’、アシルアジドＲＣＯＮ３、カルボジイミドＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’、Ｎヒドロキシイミドエステル、ＲＣＯ−Ｏ−ＮＲ’、イミドエステルＲ−Ｃ＝ＮＨ２＋（ＯＲ’）、無水物ＲＣＯ−Ｏ−ＣＯＲ’、炭酸塩ＲＯ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’、ウレタンＲＮＨＣＯＮＨＲ’、酸ハロゲン化物ＲＣＯＨａｌ（ただし、Ｈａｌ＝ハロゲン）、アシルヒドラジドＲＣＯＮＮＲ’Ｒ’’、およびＯアシルイソ尿素ＲＣＯ−Ｏ−Ｃ＝ＮＲ’（−ＮＲ’’Ｒ’’’）など。
【００７６】
ＩＩ．反応性カルボニル基、例えば、アルデヒドＲＣＨＯおよびケトンＲＣＯＲ’、アセタールＲＣＯ（Ｈ２）Ｒ’、およびケタールＲＲ’ＣＯ２Ｒ’Ｒ”（タンパク質固定化および架橋の技術者には知られている、官能基を含有する反応性カルボニルは文献に記載されている（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９９４年）；Ｓ．  Ｓ．  Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９９１年）））など。
【００７７】
ＩＩＩ．アルキルまたはアリール供与体、例えばアルキルまたはアリールハロゲン化物Ｒ−Ｈａｌ、アジドＲ−Ｎ３、硫酸エステルＲＳＯ３Ｒ’、リン酸エステルＲＰＯ（ＯＲ’３）、アルキルオキソニウム塩Ｒ３Ｏ＋、スルホニウムＲ３Ｓ＋、硝酸エステルＲＯＮＯ２、マイケル受容体ＲＣＲ’＝ＣＲ’’’ＣＯＲ’’、フッ化アリールＡｒＦ、イソニトリルＲＮ＋＝Ｃ−、ハロアミンＲ２Ｎ−Ｈａｌ、アルケン、およびアルキンなど。
【００７８】
ＩＶ．硫黄含有基、例えばジスルフィドＲＳＳＲ’、スルフヒドリルＲＳＨ、およびエポキシドＲ２Ｃ＿ＯＣＲ’２など。ならびに、
Ｖ．塩、例えばアルキルまたはアリールアンモニウム塩Ｒ４Ｎ＋、カルボン酸塩ＲＣＯＯ−、硫酸塩ＲＯＳＯ３−、リン酸塩ＲＯＰＯ３’’、およびアミンＲ３Ｎなど。
【００７９】
可逆性架橋剤は、例えばトリガーを含む。トリガーには、架橋するタンパク質と反応できる活性基をもつアルキル、アリール、または他の鎖が含まれる。これらの反応基は、とりわけハロゲン化物、アルデヒド、炭酸塩、ウレタン、キサンタン、およびエポキシドを含む、求核、フリーラジカル、または求電子置換を受けやすいものなどの任意の様々な基であってよい。例えば反応基は、酸、塩基、フッ化物、酵素、還元、酸化、チオール、金属、光分解、ラジカル、または熱に対して不安定であり得る。
【００８０】
可逆性架橋剤のさらなる例は、Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｅｄｓ．）（１９８１年）に記載されている。可逆性保護基に対して使用される任意の様々な戦略を、可逆的に制御可溶化することができる架橋タンパク質結晶の生成に適した架橋剤に組み込むことができる。様々な手法が、この目的のＷａｌｄｍａｎｎの概説、Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３５巻：２０５６頁（１９９６年）に列挙されている。
【００８１】
他の種類の可逆性架橋剤は、ジスルフィド結合含有架橋剤である。かかる架橋剤によって形成された架橋を破壊するトリガーは、架橋タンパク質結晶の環境への、システインなどの還元剤の添加である。例示的ジスルフィド架橋剤は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９４〜１９９５年）に記載されている。かかる架橋剤および方法の例は、米国特許第６，５４１，６０６号に開示されており、その関連部分は参照によって組み込まれる。
【００８２】
さらに、炭水化物部分間または炭水化物部分とアミノ酸との間を架橋する架橋剤を使用することもできる。
【００８３】
架橋剤の濃度は、溶液中、約０．０１％〜２０％、約０．０２％〜１０％、または約０．０５％〜５％ｗ／ｖであってよい。一般に、架橋剤は、約０．５％または約１％ｗ／ｖである。例えば、架橋剤の濃度は、溶液中、例えば約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、２％、３％、３．５％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、または２０％ｗ／ｖであってよい［実施例の表２参照］。架橋の前に緩衝剤を交換する必要があり得る。ＣＬＥＣを含む結晶は、任意選択で凍結乾燥し、そうでなければ配合することができる。
【００８４】
本明細書に記載の架橋した結晶を含む結晶は、本明細書に記載の治療法およびシュウ酸塩レベルを低減する方法に有用である。ＯＸＤＣ結晶は、工業プロセス（例えば、合成、処理、バイオレメディエーション、消毒、滅菌）に関連する方法、および例えばＳｖｅｄｒｕｚｉｃら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．４３３巻：１７６〜１９２頁（２００５年）に例えば概略のような、植物の真菌感染症などの植物の処理方法にも有用である。可溶性または非晶質ＯＸＤＣのかかる非治療適用は、例えば米国特許第５，８６６，７７８号、第６，２１８，１３４号、第６，２２９，０６５号、第６，２３５，５３０号、および第６，５０３，５０７号に記載されている。本明細書に記載の結晶は、シュウ酸デカルボキシラーゼ酵素の安定性の増大など、上記の安定化ＯＸＤＣ結晶の１つまたは複数の特性に基づいて、これらの使用に適用することができる。
【００８５】
シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶の乾燥。シュウ酸デカルボキシラーゼの結晶は、Ｎ２、空気、または不活性ガスでの乾燥を含む手段による水分、有機溶媒、または液体ポリマーの除去、真空オーブン乾燥、凍結乾燥、揮発性有機溶媒での洗浄後の溶媒の蒸発、換気フード中での蒸発、箱形乾燥、流動床乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、またはローラー乾燥によって乾燥される。一般に、結晶が自由流動性粉末になるときに乾燥が実現する。乾燥は、湿潤結晶上にガス流を通過させることによって実施することができる。ガスは、窒素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気、またはそれらの組合せからなる群から選択することができる。
【００８６】
主に乾燥結晶は、凍結乾燥によって調製することができる。しかしこの技術は、材料の急速な冷却を要し、凍結状態で安定な生成物にしか適用することができない。一実施形態では、まず、結晶性シュウ酸デカルボキシラーゼを含有する水溶液を−４０℃および−５０℃の間で凍結し、真空下で除去する。
【００８７】
シュウ酸デカルボキシラーゼの結晶生成物またはかかる結晶を含む配合物もしくは組成物。一態様では、シュウ酸デカルボキシラーゼの結晶、またはかかる結晶を含む配合物もしくは組成物が開示される。かかる組成物は、以下の方法に従って調製することができる。
【００８８】
まず、シュウ酸デカルボキシラーゼを結晶化する。次に、糖、糖アルコール、粘度増加剤、湿潤剤または可溶化剤、緩衝塩、乳化剤、抗菌剤、抗酸化剤、およびコーティング剤から選択される賦形剤または成分を、母液に直接添加する。あるいは、母液を除去した後、結晶を最小１時間〜最大２４時間の間、賦形剤溶液に懸濁する。賦形剤濃度は、一般に約０．０１％および約１０％（ｗ／ｗ）の間である。成分濃度は、約０．０１および約９０％（ｗ／ｗ）である。結晶濃度は、約０．０１および約９９％（ｗ／ｗ）の間である。
【００８９】
次いで、母液を濾過または遠心分離によって結晶スラリーから除去する。その後任意選択で、室温または約−２０℃〜約２５℃の間の温度で、約５０〜１００％（ｗ／ｗ）の、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、または酢酸エチルなどの１つまたは複数の有機溶媒の溶液で結晶を洗浄する。
【００９０】
次いで、窒素、空気、または不活性ガス流をそれらの上に通過させることによって、結晶を乾燥させる。あるいは、空気乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥によって結晶を乾燥させる。乾燥は、最終生成物の含水量が約１０重量％未満、最も好ましくは約５重量％未満になるまで、洗浄後最少約１時間〜最大約７２時間実施される。最後に、必要に応じて結晶の微粉化（寸法の縮小）を実施することができる。
【００９１】
本発明の一実施形態によれば、シュウ酸デカルボキシラーゼの結晶またはかかる結晶を含む配合物もしくは組成物を調製する場合、結晶化中に、界面活性剤などの増強剤は添加されない。結晶化後に、約１および約１０％（ｗ／ｗ）の間の濃度、あるいは約０．１および約２５％（ｗ／ｗ）の間の濃度、あるいは約０．１および約５０％（ｗ／ｗ）の濃度で賦形剤または成分を母液に添加する。賦形剤または成分を、約０．１〜約３時間、母液中で結晶と共にインキュベートし、あるいはインキュベーションを約０．１〜約１２時間実施し、あるいはインキュベーションを約０．１〜約２４時間実施する。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、成分または賦形剤を母液以外の溶液に溶解し、母液から結晶を除去し、賦形剤または成分の溶液に懸濁する。成分または賦形剤の濃度およびインキュベーション時間は、上記のものと同じである。
【００９３】
本発明の別の利点は、ミクロスフィアを含む組成物を形成するためにポリマー性担体内に封入されるシュウ酸デカルボキシラーゼの結晶またはその配合物を、凍結乾燥によって乾燥できるということである。凍結乾燥または冷凍−乾燥によって、組成物から水を分離することができる。まず、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶組成物を冷凍し、次いで高真空中に置く。真空下では、結晶性の水が昇華し、強固に結合した水のみを含有するシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶組成物が残る。かかる処理によって、組成物はさらに安定化し、典型的に遭遇する周囲温度での容易な保存および移動が可能になる。
【００９４】
噴霧乾燥によって、結晶調製物から水を分離することが可能になる。これは、溶液、乳液、およびポンプ移動可能な（ｐｕｍｐａｂｌｅ）懸濁液としての液体原料から、粉末、顆粒、または凝集形態としての乾燥固体を連続的に生成するのに非常に適している。噴霧乾燥は、液体原料を液滴の噴霧に噴霧化し、その液滴を乾燥チャンバー内で熱した空気に接触させることを含む。噴霧は、回転（輪）またはノズル噴霧器によって生成される。液滴からの水分の蒸発および乾燥粒子の形成は、制御された温度および気流条件下で進められる。噴霧乾燥操作には、相対的に高温が必要とされる。しかし、臨界乾燥期間中の蒸発冷却効果のため、およびその後の乾燥材料の高温への曝露時間を非常に短縮できるために、生成物への熱による損害は一般にごくわずかである。粉末は、乾燥チャンバーから継続的に排出される。操作条件および乾燥設計は、生成物および粉末仕様の乾燥特性によって選択される。噴霧乾燥は理想的なプロセスであるが、ここで最終生成物は、粒経分布、残留含水量、バルク密度、および粒形に関して正確な質標準に従わなければならない。
【００９５】
組成物。架橋した結晶を含むＯＸＤＣ結晶は、医薬組成物などの組成物として提供される（例えば、タンパク質結晶の配合物および組成物を記載している米国特許第６，５４１，６０６号参照）。ＯＸＤＣ結晶を含む医薬組成物は、ＯＸＤＣ結晶と、それに限定されるものではないが、糖および生体適合性ポリマーを含む１つまたは複数の成分または賦形剤を含む。賦形剤の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎによって共同出版されているＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに記載されており、さらなる例を以下に記載する。
【００９６】
ＯＸＤＣ酵素は、組成物中の結晶として、生理的に許容される様々な塩の形態のいずれかとして、かつ／または医薬組成物の部分として許容される医薬担体および／もしくは添加剤と共に投与することができる。生理的に許容される塩の形態および標準的な医薬配合技術および賦形剤は当業者に周知である（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００３年、第５７版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００２年；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、ｅｄｓ．  Ｇｅｎｎａｄｏら、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年参照）。本願の目的では、「配合物」には「結晶配合物」が含まれる。
【００９７】
本発明の方法に有用なシュウ酸デカルボキシラーゼは、賦形剤と組み合わせることができる。本発明によれば、「賦形剤」は、医薬組成物中に使用される充填剤または充填剤の組合せとして作用する。組成物に使用される例示的成分および賦形剤を以下に示す。
【００９８】
生体適合性ポリマー。生体適合性ポリマーは、非抗原性（助剤として使用されない場合）、非発癌性、非毒性のポリマーであり、他の形では生体と本質的には非適合性でないポリマーであり、それを本明細書に記載のＯＸＤＣ結晶組成物に使用することができる。それらの例には、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（乳酸）またはＰＬＡなどのポリ（エステル）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）またはＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、それらのブレンドおよびコポリマーが含まれる。
【００９９】
生分解性ポリマー、即ちＯＸＤＣ結晶組成物に含まれ得る、加水分解または可溶化によって分解するポリマー。分解は、異種（主に粒子の表面で生じる）であっても、同種（ポリマーマトリックス中で均一に分解する）であってもよい。
【０１００】
１つまたは複数の賦形剤もしくは医薬成分などの成分または賦形剤が、ＯＸＤＣ結晶組成物に含まれ得る。成分は、不活性または活性成分であってよい。
【０１０１】
ＯＸＤＣ結晶でのシュウ酸塩関連障害の治療法。本発明の方法は、シュウ酸デカルボキシラーゼ、例えばＯＸＤＣの結晶またはその架橋形態を哺乳動物対象に投与して、高シュウ酸塩レベルに関連する状態を治療、予防し、またはその発症の危険性を低減するステップを含む。シュウ酸塩の高レベルは、尿、血液、血清、または血漿を含む体液などの対象の生体サンプル中に検出され得る。幾つかの実施形態では、尿中シュウ酸塩レベルが検出される。結晶および／または結晶を含む組成物は、本明細書に記載の方法で投与することができる。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、原発性高シュウ酸尿症、腸管性高シュウ酸尿症、外科的介入によって生じる高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、シュウ酸症の個体の高シュウ酸尿症の治療法が提供される。他の場合には、腎臓、骨、肝臓胃腸管、および膵臓の高シュウ酸塩関連障害が、本明細書に開示の方法の治療対象となる。本明細書で提供される方法によって治療されるさらなる障害または疾患には、それに限定されるものではないが、エチレングリコール（シュウ酸塩）中毒、特発性尿路結石症、腎不全（進行性、慢性、または末期腎不全を含む）、脂肪便、吸収不良、回腸疾患、外陰部疼痛、心臓伝導障害、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、膵外分泌機能不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、腎石灰沈着症、骨粗鬆症、尿結石、および腎結石が含まれる。かかる状態および障害は、場合によっては急性または慢性であり得る。
【０１０３】
本発明の方法は、治療を受けない対象または対照となる対象のレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、対象のシュウ酸塩レベルを低減することができる。幾つかの実施形態では、低減量は、ＯＸＤＣ投与の前後で対象のシュウ酸塩レベルを比較することによって測定される。幾つかの実施形態では、本発明は、シュウ酸塩関連の状態または障害を治療または緩和して、その状態または障害の１つまたは複数の症候を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上改善することができる方法を提供する。幾つかの実施形態では、該方法は、内因性シュウ酸塩のレベルおよび／または食餌性シュウ酸塩の吸収を低減する。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、例えば、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ、グリオキシル酸還元酵素／ヒドロキシピルビン酸還元酵素、肝臓のグリコール酸オキシダーゼ、またはシュウ酸塩代謝に関与するもしくは高シュウ酸尿症に関連する別の酵素の活性を低減する変異体に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である個体など、高シュウ酸塩レベルに関連する遺伝子型を有する個体の治療法が提供される。他の実施形態では、オキサロバクターホルミゲネス（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ）腸内コロニー形成が減少または欠失している個体の治療法が提供される。
【０１０５】
開示の方法は、シュウ酸塩の高レベルに関連する状態の危険性がある、その状態を受けやすい、または罹患している哺乳動物対象に、治療有効量のシュウ酸デカルボキシラーゼを投与するステップを含む。本発明の方法によって治療される集団には、それに限定されるものではないが、例えば、原発性高シュウ酸尿症または腸管性高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩関連障害に罹患している、またはその発症の危険性がある対象が含まれる。
【０１０６】
本発明の方法に従って治療される対象には、それに限定されるものではないが、ヒト、ヒトではない霊長類、霊長類、ヒヒ、チンパンジー、サル、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、猫、犬、馬、牛、羊、山羊、豚等が含まれる。
【０１０７】
兆候、症候、および疾患指標。シュウ酸塩関連障害または高シュウ酸塩レベルに関連する状態の発症または進行を評価するために、多くの方法が利用可能である。かかる障害には、それに限定されるものではないが、先に定義の任意の状態、疾患、または障害が含まれる。シュウ酸関連障害の発症または進行は、例えば、尿中シュウ酸塩、血漿シュウ酸塩の測定、腎臓もしくは肝臓機能の測定、またはシュウ酸カルシウム沈着の検出によって評価することができる。
【０１０８】
状態、疾患、または障害は、例えば尿サンプルまたは他の生体サンプルもしくは体液中のシュウ酸濃度を検出または測定することによって同定できる。高シュウ酸尿症の初期症候は、一般に腎臓結石であり、これは重篤なもしくは急激な腹痛もしくは脇腹痛、血尿、頻尿、排尿の際の痛み、または発熱および悪寒に関連することがある。腎臓結石は、症候性または無症候性であり得、例えばｘ線、超音波、またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより腹部を画像化することによって視覚化できる。高シュウ酸尿症が制御されない場合、腎臓が損傷を受け、腎機能が損なわれる。腎臓が不全になる恐れもある。腎不全（および腎機能低下）は、排尿（糸球体濾過率）の減少または欠失、全体的な病感、倦怠感、および顕著な疲労感、吐き気、嘔吐、貧血、ならびに／あるいは若年の子どもの正常な成長および発育の不全によって同定することができる。他の組織および器官のシュウ酸カルシウム沈着は、直接可視化（例えば目視）、ｘ線、超音波、ＣＴ、心エコー図、または生検（例えば、骨、肝臓、または腎臓）を含む方法によって検出することもできる。
【０１０９】
腎臓および肝臓機能、ならびにシュウ酸濃度は、当技術分野で認識されている直接的および間接的アッセイを使用して評価することもできる。化学物質含量または尿、血液、もしくは他の生体サンプルは、周知の技術によって試験することもできる。例えば、シュウ酸塩、グリコール酸塩、およびグリセリン酸塩レベルを測定することができる。例えば、酵素欠損のための肝組織の分析およびシュウ酸塩沈着のための腎組織の分析などの、肝臓および腎臓機能のアッセイが周知である。原発性高シュウ酸尿症を生じることが知られているＤＮＡ変化について、サンプルを試験することもできる。
【０１１０】
治療のための他の兆候には、それに限定されるものではないが、先および以下の部分に論じるものを含む１つまたは複数の危険因子の存在が含まれる。状態、疾患、または障害を発症するまたは受けやすい危険性のある対象、あるいはシュウ酸デカルボキシラーゼでの治療に特に受容性があり得る対象は、１つまたは複数のかかる危険因子、診断上の指標、または予後指標の存在または非存在を究明することによって同定できる。同様に、シュウ酸塩関連障害を発症する危険性がある個体は、１つまたは複数の遺伝子マーカーまたは表現型マーカーの分析によって同定することができる。
【０１１１】
開示の方法は、２４時間またはそれ以上につき、シュウ酸塩が少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、または４００ｍｇの尿中シュウ酸塩レベルの対象において有用である。幾つかの実施形態では、シュウ酸塩レベルは、１つまたは複数の症候または病状に関連している。シュウ酸塩レベルは、血液、血清、血漿、または尿を含む体液などの生体サンプルで測定することができる。任意選択で、シュウ酸塩は、尿中クレアチニンなどの標準タンパク質または物質に標準化される。幾つかの実施形態では、特許請求する方法は、治療前１、３、５、７、９、１２、または１５日以内にシュウ酸デカルボキシラーゼを投与して、対象における循環シュウ酸塩レベルを検出不能なレベルに、または対象のシュウ酸塩レベルを１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％未満に低減するステップを含む。
【０１１２】
ヒトにおける高シュウ酸尿症は、１日当たり４０ｍｇ（約４４０μｍｏｌ）または３０ｍｇを超える尿中シュウ酸塩排出を特徴とし得る。例示的臨床カットオフレベルは、例えば男性については４３ｍｇ／日（約４７５μｍｏｌ）であり、女性については３２ｍｇ／日（約３５０μｍｏｌ）である。高シュウ酸尿症は、１日当たり尿中クレアチニン１グラムにつき３０ｍｇを超える尿中シュウ酸塩排出と定義することもできる。軽度高シュウ酸尿症のヒトは、１日当たりシュウ酸塩を少なくとも３０〜６０（３４２〜６８４μｍｏｌ）または４０〜６０（４５６〜６８４μｍｏｌ）ｍｇ排出することができる。腸管性高シュウ酸尿症のヒトは、１日当たり尿中シュウ酸塩を少なくとも８０ｍｇ（９１２μｍｏｌ）排出することがあり、原発性高シュウ酸尿症のヒトは、１日当たり少なくとも２００ｍｇ（２２８０μｍｏｌ）排出することができる。例えば、Ｂｏｒｏｗｓｋｉ  Ａ．Ｅ、Ｌａｎｇｍａｎ  ＣＢ．Ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ  ａｎｄ  Ｏｘａｌｏｓｉｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｅｘｐ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｐｈｒａｍａ（２００６年、近刊）。
【０１１３】
ＯＸＤＣ結晶およびその組成物の投与
本発明の方法によるシュウ酸デカルボキシラーゼの投与は、いかなる特定の送達系にも制限されず、上部消化管、例えば口（例えばカプセル剤、懸濁剤、錠剤で、または食物により）もしくは胃、または腸上部（例えばチューブまたは注入）を介して投与して、個体のシュウ酸塩レベルを低減することを含む。幾つかの場合、ＯＸＤＣは、内因性シュウ酸塩レベルおよび／または濃度を低減するために投与される。ＯＸＤＣは、透析装置、カテーテル、または個体からの生体サンプルに接触する構造もしくは装置などの体外装置によって提供することもできる。
【０１１４】
個体への投与は、単回用量または繰り返し投与で、様々な生理的に許容される形態のいずれかとして、ならびに／あるいは医薬組成物の部分として許容される医薬担体および／もしくは添加剤（上記）と共に投与することができる。開示の方法では、シュウ酸デカルボキシラーゼは単独で投与することができ、例えば、ピリドキシン（ビタミンＢ−６）、オルトリン酸塩、マグネシウム、グリコサミノグリカン、カルシウム、鉄、アルミニウム、マグネシウム、クエン酸カリウム、コレスチラミン、有機海産親水コロイド、例えばバナナの茎の汁もしくはビートの汁などの植物の汁、またはＬ−システインなどの１つまたは複数の追加の生物活性剤と、間隔を重複してまたは重複しないで同時にまたは連続して投与することができる。シュウ酸塩レベルを低減し、またはＯＸＤＣの活性もしくはアベイラビリティを増大する生物活性剤が提供される。逐次投与では、シュウ酸デカルボキシラーゼおよび追加の１つまたは複数の薬剤を、任意の順序で投与することができる。幾つかの実施形態では、重複間隔の長さは、２、４、６、１２、２４もしくは４８週超、またはそれ以上であってよい。
【０１１５】
シュウ酸デカルボキシラーゼは、単一の活性化合物として、または別の活性な化合物もしくは組成物と組み合わせて投与することができる。別段の指定が無い限り、シュウ酸デカルボキシラーゼは、症候の重篤度および疾患の進行度に応じて、約１０μｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ＯＸＤＣの適切な治療有効量は担当医によって選択され、約１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲となろう。さらに、実施例またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００３年、第５７版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００２年に示される特定投与量を使用することができる。
【０１１６】
本発明のシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、シュウ酸デカルボキシラーゼを患者に送達するなどのために、体外装置またはカテーテルを介して投与することができる。カテーテル、例えば導尿カテーテルは、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を含有する組成物でコーティングすることができる。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するものである。本発明の精神または範囲を変更することなく実施することができる数々の改変および変更を、当業者は認識されよう。かかる改変および変更は、本発明の範囲内に包含される。実施例は、いかなる方法でも本発明を制限するものではない。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）シュウ酸デカルボキシラーゼの発酵および精製
枯草菌からのシュウ酸デカルボキシラーゼ（ＯＸＤＣ）は、６個の同一のモノマーからなる２６１ｋＤａのホモ六量体タンパク質である。各モノマーは、算出分子量が約４３から４４ｋＤａであり、等電点が５．２の３８５アミノ酸を含有する。かつてｙｖｒＫとして知られていたＯＸＤＣ遺伝子は、枯草菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅したＰＣＲであった。
【０１１９】
増幅ＯＸＤＣ遺伝子を、まずｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア）にクローニングし、次いで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を使用して、ｐＥＴ−１１ａ発現ベクターからサブクローニングし発現させた。ｐＥＴ−１１ａベクターの遺伝子発現はＴ７プロモーターの制御下にあるので、ＯＸＤＣ発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）での誘導によって調整された。
【０１２０】
大腸菌中での組み換え型ＯＸＤＣの高発現レベルを達成するために、発酵を使用した。カゼイン加水分解物（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州クリーブランド）または大豆ペプトン、酵母抽出物（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＰＧ２０００アンチフォーム（ＰＰＧ）、ＫＯＨ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州フィリップスバーグ）、およびアンピリシン（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有する８００Ｌ（リットル）の発酵媒体で発現を実施した。ＯＸＤＣは、マンガン依存性酵素なので、５ｍＭのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ、Ｉｎｃ．）を発酵媒体に入れた。０．４ｍＭのＩＰＴＧ（Ｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することによって、ＯＸＤＣの発現を誘発した。ＯＸＤＣを発現する細胞を、振とうフラスコまたは発酵槽中で増殖させた。この方法によって、ＯＸＤＣは主にペレット調製物として発現した。
【０１２１】
発酵には、ｐＥＴ１１ａ−ＯＸＤＣで形質転換したＢＬ２１細胞のグリセロールストックを使用した。８００Ｌの発酵について、予め播種した培養物を、それぞれ５０ｍｌの媒体（ＬＢ＋アンピリシン１００μｇ／ｍｌ）を含有する２×２５０ｍｌのフラスコで調製した。２×０．５ｍｌの接種材料を使用した。培養物を、３５℃、２５０ｒｐｍで６時間インキュベートした。次いでこの培養物を、それぞれ１Ｌの媒体（ＬＢ＋アンピリシン１００μｇ／ｍｌ）を含有する６×２Ｌのフラスコに移した。各フラスコ中、出発培養物１０ｍｌを添加した。これらの培養物を、３５℃、２５０ｒｐｍで１２時間インキュベートした。この培養物６Ｌを、先に記載のように適切な媒体を含有する８００Ｌの発酵槽に移した。ＯＤ６００が約０．３に達するまで、培養物を１００ｒｐｍにて溶解酸素で約３０〜４０回振とうして、３７℃、ｐＨ７．０で増殖させた（このプロセスは約２〜３時間要した）。ＯＸＤＣの発現は、０．４ｍＭのＩＰＴＧ＋５ｍＭのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏで誘発した。３７℃、１００ｒｐｍで４時間、培養を誘発した。次いで細胞を回収し、後の使用のために凍結した。回収時のＯＤ６００は約５．５〜８．０であった。
【０１２２】
５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝剤４Ｌにつき細胞ペースト１ｋｇの比で、ＤＮａｓｅ１５〜２５Ｕ／ｍｌの存在下または非存在下で細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を、４℃で終夜ブレンドした（５０〜６０ｒｐｍ）。細胞懸濁液を、氷上で３回、予冷したホモジナイザに通過させた。細胞溶解の効率を顕微鏡で調査し、非崩壊細胞の懸濁液を対照として使用した。細胞を、１Ｌの瓶中、４℃において４，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離にかけた。上清およびペレットを保存して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けた。ＯＸＤＣの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。封入体を含むペレットおよび他の沈殿物にＯＸＤＣの大部分が見られた。ペレットを、４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離にかけることによって回収し、直に使用し、または後の使用のために−７０℃で凍結した。
【０１２３】
８００Ｌの発酵反応から、細胞５，０００ｇおよび５，５００ｇの間の細胞を得、２，８００ｇおよび３，０００ｇの間の湿潤重量のペレットを得た。
【０１２４】
（実施例２）弱変性濃度でのペレットの可溶化、その後のアニオン交換クロマトグラフィーによるシュウ酸デカルボキシラーゼの結晶化
ＯＸＤＣ結晶を調製するために、−２０℃で凍結保存したＯＸＤＣペレットを使用した。
【０１２５】
この手順では、変性濃縮およびｐＨの穏やかな条件下でペレットを可溶化した。次いで、アニオン交換マトリックスカラムを使用して、可溶化タンパク質をリフォールドした。
【０１２６】
２Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ１０．０、１０ｍＭのＤＴＴ、および１００ｍＭのＮａＣｌ（１：１０ｗ／ｖ）にペレット可溶化した。溶液を室温（ＲＴ）で２時間撹拌し、次いでその溶液を、４℃において１５Ｋで３０分間遠心分離にかけた。上清を注意深くデカントし保存した。ペレットを注意深く秤量し、個々に保存した。
【０１２７】
上清中の可溶化ペレットを、２Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する溶液１０体積に、絶えず穏やかに撹拌しながら流速１０ｍｌ／分で滴加した。上清を完全に添加した後、タンパク質溶液を室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、４℃における１５Ｋでの３０分間の遠心分離によるアニオン交換クロマトグラフィー用にタンパク質溶液を準備して、起こり得る任意の沈殿物を除去した。
【０１２８】
ガラスカラムにＱセファロースマトリックスを充填することによって、アニオン交換クロマトグラフィーカラムを調製した。カラムをＦＰＬＣに取り付け、０．５Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＭｎＣｌ２の溶液の１０カラム体積（ＣＶ）で洗浄することによって平衡化した。流速を６ｍｌ／分に維持した。可溶化ペレットをカラムに搭載した。タンパク質搭載量は、マトリックス１ｍｌ当たり８〜１０ｍｇであった。サンプルの搭載後、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＭｎＣｌ２少なくとも１０ＣＶを用いて、カラムを流速６ｍｌ／分で洗浄した。このステップによって、結合タンパク質サンプルから尿素を除去し、タンパク質をその天然構成にリフォールドした。
【０１２９】
１ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、および１ｍＭのＤＴＴを用いて、段階勾配または段階溶出によってタンパク質をカラムから溶出した。タンパク質溶離液を２８０ｎｍでモニタし、画分１０ｍｌを収集した。ピーク画分を一緒にプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性によって試験した。
【０１３０】
１０，０００ＭＷＣＯ膜を使用して細胞を撹拌し、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＤＴＴ１０体積に対して透析することによって、ＯＸＤＣを含有するピーク画分を１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。１時間間隔で２回の緩衝剤変更を行い、３回目の緩衝剤変更後、最大結晶回収のために終夜透析を継続した。サンプルを４℃において２Ｋで１５分間遠心分離にかけることによって、透析バッグ中で結晶化したタンパク質を回収した。透析後、リフォールドされたＯＸＤＣの約７０％が結晶化した。結晶は立方体の形状であり、均質な寸法であった。結晶は、約４４単位の活性を示した。
【０１３１】
（実施例３）高変性濃度を使用するペレットの可溶化、その後のアニオン交換クロマトグラフィーによるシュウ酸デカルボキシラーゼの結晶化
この方法では、５Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．６、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ（１：５ｗ／ｖ）にペレットを可溶化した。溶液を室温で２時間撹拌し、次いでその溶液を、４℃において１５Ｋで３０分間遠心分離にかけた。上清を注意深くデカントし保存した。ペレットを秤量し、個々に保存した。
【０１３２】
ガラスカラムにＱセファロースマトリックスを充填することによって、アニオン交換クロマトグラフィーカラムを調製した。カラムをＦＰＬＣに取り付け、４Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．６、および１０ｍＭのＤＴＴの３カラム体積（ＣＶ）で洗浄することによって平衡化した。１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ中、７ＣＶでカラムをさらに洗浄し、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｎＣｌ２の３ＣＶを用いて、単一ステップで溶出した。
【０１３３】
適切な画分を収集し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性アッセイによって同定した。可溶性タンパク質を、高塩（０．５ＭのＮａＣｌ）の存在下で濃縮した。０．５Ｍの塩で全体積４５０ｍｌを溶出し、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴへのｐｅｌｌｉｃｏｎ濾過で４５ｍｌに濃縮した。タンパク質濃縮後、塩濃度を０．５Ｍから０．１ＭのＮａＣｌに低減するために希釈した。この時点で、ＯＸＤＣ結晶が形成し始めた。この例では、体積を、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ当量中２１０ｍＬにした。形成した結晶をスピンし、１ｍＭのＤＴＴの存在下または非存在下で、１００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０中に回収した。
【０１３４】
（実施例４）高ｐＨおよび低変性濃度を使用するペレットの可溶化、その後の中空繊維での濃縮によるシュウ酸デカルボキシラーゼの結晶化
封入体および他の沈殿物を含有するペレット（３．９３ｋｇ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ１２、５００ｍＭのＮａＣｌ、２Ｍの尿素、１０ｍＭのＤＴＴ９．５Ｌに、室温で２時間可溶化した。最終体積は１２Ｌ、ｐＨ９．９であった。サンプルを７０００ｒｐｍで４５分間スピンし、上清を回収した。スピン後の全体積は１１．１Ｌ、ｐＨ９．９であった。サンプルを、１時間、中空繊維で濃縮して５Ｌにし、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２Ｍの尿素、１０ｍＭのＤＴＴでその体積をゆっくり２０Ｌにした。この過程を１時間で行った。この時点での尿素の最終濃度は、尿素約０．５Ｍと推定される。その体積を、中空繊維で２．５時間濃縮して６Ｌにした。サンプルを、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、２００ｍＭのＬ−アルギニンで３０分間希釈して２４Ｌにした。この時点で尿素の濃度は１２５ｍＭと推定された。もう一度濃縮を行い、最終体積を５Ｌにした。サンプルを、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｎＣｌ２で希釈して１８Ｌにし、再度濃縮して６．５Ｌにした。この時ｐＨは８．１であった。サンプルを７０００ｒｐｍで４５分間スピンし、最終ペレットを分析のために保存した。遠心分離後、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴでの希釈ステップを実施して、結晶を得た。希釈物を、蠕動ポンプを使用して室温で混合して３０Ｌにした。希釈物の流速は、５０ｍｌ／分と推定された。この希釈は、約９時間かかった。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８で３回洗浄し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。
【０１３５】
（実施例５）高塩を使用する細胞抽出物からのシュウ酸デカルボキシラーゼの結晶化
（１）高塩濃度を使用するタンパク質−含有ペレットの可溶化、その後の濃縮および希釈による結晶化
実施例１の凍結ペレット（４６５ｇ）を、室温で２時間、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＬ−システインＨＣＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、２．３Ｌに可溶化し、可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼを形成した。サンプルを７０００ｒｐｍで４５分間スピンし、上清を回収した。最終体積は２．１５Ｌであり、測定タンパク質濃度は２４．１４ｍｇ／ｍｌであった。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して５５０ｍｌにし、次いで流速７３ｍｌ／分で３０分かけて１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＬ−システインＨＣｌで希釈して２，７５０Ｌにし、室温で１時間撹拌した。冷却室内で終夜結晶を形成した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。大腸菌発現媒体から精製した組み換え型枯草菌ＯＸＤＣは、標準アッセイ条件下で約５０〜６０Ｕ／ｍｇの比活性を示す（実施例１５参照）。
【０１３６】
（２）高塩濃度を使用するペレットの可溶化、その後の濃縮および透析による結晶化
実施例１の凍結ペレット（５１０ｇ）を、室温で２時間、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＬ−システインＨＣＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３Ｌに可溶化した。サンプルを７０００ｒｐｍで３０分間スピンし、上清を回収した。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して５００ｍｌにし、次いで撹拌しながら１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０に対して透析した。冷却室内で終夜結晶を形成した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。結晶収率は６０％であった。
【０１３７】
（３）高塩濃度を使用するペレットの可溶化、その後の濃縮および透析による結晶化
実施例１の凍結ペレット（５１０ｇ）を、室温で２時間、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＬ−システインＨＣＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３Ｌに可溶化した。サンプルを７０００ｒｐｍで３０分間スピンし、上清を回収した。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して５００ｍｌにし、次いで撹拌しながら１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５に対して透析した。冷却室内で終夜結晶を形成した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。結晶収率は６７％であった。
【０１３８】
（４）高塩濃度を使用するペレットの可溶化、その後の濃縮および透析による結晶化
実施例１の凍結ペレット（５１０ｇ）を、室温で２時間、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＬ−システインＨＣＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３Ｌに可溶化した。サンプルを７０００ｒｐｍで３０分間スピンし、上清を回収した。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して５００ｍｌにし、次いで撹拌しながら１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．０に対して透析した。冷却室内で終夜結晶を形成した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．０に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。結晶収率は約８０％であった。
【０１３９】
（５）高塩濃度を使用するペレットの可溶化、その後の濃縮および透析による結晶化
実施例１の凍結ペレット（５１０ｇ）を、室温で２時間、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＬ−システインＨＣＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３Ｌに可溶化した。サンプルを７０００ｒｐｍで３０分間スピンし、上清を回収した。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して５００ｍｌにし、次いで撹拌しながら１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．５に対して透析した。冷却室内で終夜結晶を形成した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．５で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．５に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。結晶収率は約７０％であった。
【０１４０】
（６）高塩濃度を使用するペレットの可溶化、その後の濃縮および透析による結晶化
実施例１の凍結ペレット（５１０ｇ）を、室温で２時間、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＬ−システインＨＣＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、３Ｌに可溶化した。サンプルを７０００ｒｐｍで３０分間スピンし、上清を回収した。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して５００ｍｌにし、次いで撹拌しながら１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．０に対して透析した。冷却室内で終夜結晶を形成した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．０で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．０に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。結晶収率は約６０％であった。
【０１４１】
（７）均質化および可溶化後の細胞ペーストからのＯＸＤＣの結晶化
１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのシステイン、および１ｍＭの塩化マンガンを含有する緩衝剤３Ｌにつき細胞ペースト１ｋｇの比で、細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を、終夜４℃でブレンドした（５０〜６０ｒｐｍ）。細胞懸濁液を、氷上で２回、予冷したホモジナイザに通過させた。細胞溶解の効率を、顕微鏡で調査し、非崩壊細胞の懸濁液を対照として使用した。懸濁液を１０Ｌにし、室温で３時間、オーバーヘッド撹拌機で混合した。次いで粗抽出物を、４℃において７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけ、上清を回収した。上清およびペレットを保存して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けた。ＯＸＤＣの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。上清にＯＸＤＣの大部分が見られた。最終体積は１０Ｌであり、測定タンパク質濃度は３４ｍｇ／ｍｌであった。接線流濾過（１０ｋＤ  Ｐａｌｌ）によってサンプルを１時間濃縮して３．５Ｌにし、次いで室温で１時間、結晶化緩衝剤（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．５）を使用して、撹拌しながら希釈した。結晶を遠心分離によって回収し、上清を分析のために保存した。結晶を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．５で３回洗浄し、次いで１００ｍＭのＴｒｉｓおよび１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁した。結晶を４℃で保存した。
【０１４２】
（実施例６）可溶性タンパク質からのＯＸＤＣの結晶化
振とうフラスコ内の大腸菌でＯＸＤＣを発現させた。２５Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉを含有する２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌで、マイクロ流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）によって細胞を溶解した。細胞溶解物を室温で１時間インキュベートして、ＯＸＤＣ結晶を形成した。結晶をスピンして沈降させ、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８で再構成した。
【０１４３】
（実施例７）蒸気拡散によるＯＸＤＣの結晶化
市販で利用可能なスパースマトリックス結晶化キット：Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；カリフォルニア州アリソビエホ）、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ２（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｉ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ、ワシントン州アイランド）、Ｗｉｚａｒｄ  ＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｒｙｏ  Ｉ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＣｒｙｏ  ＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、懸滴結晶化試験を実施した。
【０１４４】
試薬６００μｌを各ウェルに入れた。試薬３μｌを、顕微鏡のガラスカバースリップ上に分注し、ＯＸＤＣ３μｌを、最小限の混合を伴って試薬ドロップに分注した。この６μｌの試薬およびＯＸＤＣドロップから、最大５つのさらなるドロップを作成した。これらのドロップを最小限に混合すると、その後の（小）ドロップのそれぞれは、タンパク質対試薬の異なる未知の比を有しており、したがって短期間で結晶を得る可能性が増大する。室温で終夜インキュベートした後、顕微鏡で結晶について懸滴を調査した。表１に示すように、多数の結晶化条件を得た。
【０１４５】
【表１】
2009545622.tif 000002
【０１４６】
ａＯＸＤＣ濃度は、ブラッドフォードアッセイによって決定して約１．７ｍｇ／ｍＬであった。
【０１４７】
（実施例８）マイクロバッチによるＯＸＤＣの結晶化
シュウ酸デカルボキシラーゼを、幾つかの結晶化条件からマイクロバッチ法によって結晶化することができた。
【０１４８】
（ｉ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ１０μｌを、１０μｌの１６％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。幾らかの沈殿物と共に、大型結晶を形成した。
【０１４９】
（ｉｉ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ１０μｌを、１０μｌの２０％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。沈殿物なしに大型結晶を形成した。
【０１５０】
（ｉｉｉ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ１０μｌを、１０μｌの２４％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。より小さい立方形結晶を形成した。
【０１５１】
（ｉｖ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ１０μｌを、１０μｌの２８％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。非常に小型の立方形結晶を形成した。沈殿物はなかった。
【０１５２】
（ｖ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ８μｌを、１２μｌの２４％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。非常に小型の立方形結晶を形成した。沈殿物はなかった。
【０１５３】
（ｖｉ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ９μｌを、１１μｌの２４％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。小型の立方形結晶を形成した。沈殿物はなかった。
【０１５４】
（ｖｉｉ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製シュウ酸デカルボキシラーゼ１０μｌを、１０μｌの２４％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。小型の立方形結晶を形成した。沈殿物はなかった。
【０１５５】
（ｖｉｉｉ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製シュウ酸デカルボキシラーゼ１１μｌを、９μｌの２４％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。立方形結晶を形成した。沈殿物はなかった。
【０１５６】
（ｉｘ）濃度２３．４６ｍｇ／ｍｌの精製ＯＸＤＣ１２μｌを、８μｌの２４％ＰＥＧ８０００と混合した。結晶化は、２〜５秒で即座に生じた。立方形結晶を形成した。沈殿物はなかった。
【０１５７】
（実施例９）可溶性ＯＸＤＣおよびＯＸＤＣ結晶の活性
ペレットを可溶化し、スピンし、上清を回収した後、実施例５に記載のように可溶性ＯＸＤＣを収集した。結晶を回収し洗浄した後、実施例５に記載のようにＯＸＤＣ結晶を収集した。可溶性ＯＸＤＣおよびＯＸＤＣ結晶の活性を、実施例１５に従って測定した。一実施形態では、可溶性ＯＸＤＣの活性は１２単位／ｍｇであり、ＯＸＤＣ結晶の活性は３５単位／ｍｇであった。
【０１５８】
可溶性ＯＸＤＣを実施例２〜５のいずれかに記載のように収集し、ＯＸＤＣ結晶を実施例２〜８のいずれかに記載のように回収する。可溶性ＯＸＤＣおよび結晶ＯＸＤＣの活性を、実施例１５に従って測定する。ＯＸＤＣ結晶の活性は、可溶性ＯＸＤＣの活性の少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％となり得る。
【０１５９】
（実施例１０）グルタルアルデヒドでのシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶の架橋
実施例２〜８のいずれかに従って調製したシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を、グルタルアルデヒドを使用して架橋した。結晶化後、ＯＸＤＣ結晶を濃縮して２０〜３０ｍｇ／ｍｌにした。２５％グルタルアルデヒド０．８ｍｌを、結晶２０ｍｌに添加して、１％グルタルアルデヒド溶液を生成し、結晶を室温で１８時間撹拌した。架橋した結晶を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．００で５回洗浄し、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．００に再懸濁した。
【０１６０】
結晶性ＯＸＤＣおよび架橋ＯＸＤＣ（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣと呼ぶ）の比活性を比較し（６つの試験）、架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶が、様々な調製物において結晶性タンパク質の元の活性の３０％超〜５０％超を保持していることを示した。
【０１６１】
酵素活性へのグルタルアルデヒド濃度変化の作用を試験するために、ＯＸＤＣ結晶（６０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌアリコートを、ｐＨ８．０において２５℃で１８時間、様々な濃度のグルタルアルデヒド（０．０５％〜２％、最終濃度）で架橋した。エッペンドルフチューブ中、２０００ｒｐｍでの遠心分離による架橋結晶の分離に次いで、１ｍｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．０への架橋結晶の再懸濁によって架橋を終了した。次いで、架橋ＯＸＤＣ（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ）を、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５で５回洗浄した後、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５で３回洗浄した（以下の表２の結果を参照）。
【０１６２】
（実施例１１）架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶のｐＨ制御された可溶性
様々な架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶の可溶性を、ｐＨ７．５から３．０へのｐＨ低減に従って調査した。架橋した結晶を、５０ｍＭグリシン  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）中、１ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。撹拌を伴う３７℃での５時間のインキュベーション後、アリコートを除去した。２０００ｒｐｍでの遠心分離による非溶解架橋結晶の分離および０．２２μｍフィルタを介する上清の濾過後、ＯＤ２８０ｎｍで可溶性タンパク質濃度を測定した。結果を以下の表２に記載する。
【０１６３】
【表２】
2009545622.tif 000003
【０１６４】
これらの結果は、実質的に安定なグルタルアルデヒドＯＸＤＣ架橋結晶が、少なくとも約０．０５％（最終濃度）グルタルアルデヒドの存在下で形成されることを示している。
【０１６５】
（実施例１２）可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣのｐＨ活性プロファイル
実施例２〜８に記載のように調製したシュウ酸デカルボキシラーゼ結晶を、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって架橋した。ＯＸＤＣ結晶（３０〜４０ｍｇ／ｍｌ）のアリコート１ｍｌを、ｐＨ８．０において２５℃で１８時間、１％グルタルアルデヒド（最終濃度）で架橋した。エッペンドルフチューブ中、２０００ｒｐｍでの遠心分離による架橋結晶の分離に次いで、１ｍｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．０への架橋結晶の再懸濁によって架橋を終了した。次いでＯＸＤＣ−ＣＬＥＣを、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．０で５回洗浄した後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．０で３回洗浄した。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣのｐＨ活性プロファイルを、実施例１５に記載のように結晶の活性を測定することによって、ｐＨ２．０および３．０における５０ｍＭのグリシンＨＣｌ緩衝剤；ｐＨ４．０、５．０、および６．０における５０ｍＭのコハク酸塩緩衝剤；ならびにｐＨ７．０における５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝剤の、様々な緩衝剤およびｐＨを使用してアッセイした。各ｐＨにおける活性レベルを２回測定し、平均活性を算出した。図１に示す結果は、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣが、ｐＨ３．５および６．０の間でその可溶性対応物よりも活性であることを示している。非架橋結晶は、様々なｐＨにおいて、シュウ酸デカルボキシラーゼの可溶性形態よりも約５０％〜約２００％、３００％または４００％以上の範囲のかなり高い活性を示した。
【０１６６】
（実施例１３）腸管性高シュウ酸尿症の動物モデルにおけるシュウ酸デカルボキシラーゼ療法
腸管性高シュウ酸尿症のラットモデル、用量範囲試験：高シュウ酸塩の食餌を与えた雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、腸管性高シュウ酸尿症の試験に対して適切な動物系を構成する。この試験では、１．１％食餌性シュウ酸カリウムの投与の結果、尿中シュウ酸塩が５〜１０倍増加した。
【０１６７】
生後３５日未満で１００〜１２０グラムの体重のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット２０匹を、対照群と実験群に無作為に分割した（各群当たりラット５匹）。処理前に７日間、ラットを個々の代謝ケージ（ＬａｂＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．；デラウェア州シーフォード）に順応させた。この期間中、ラットには不断で補給酸性水を供給し、１．１％カリウムシュウ酸塩および低（０．５％）濃度カルシウムを有する合成食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  ＴＤ８９２２２ＰＷＤ；Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ；ウィスコンシン州マディソン）を与えた。治療期間中、ラットをこの食餌で維持した。
【０１６８】
順応期間後、１％グルタルアルデヒドで架橋した結晶（例えば実施例９参照）として配合された、３つの異なる用量の組み換え型シュウ酸デカルボキシラーゼを、４週間連続で試験ラットに投与した。結晶を、凍結／乾燥させた食餌の酵素混合物として経口投与した（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．０中、５ｍｇ、２５ｍｇ、および８０ｍｇのＯＸＤＣ−ＣＬＥＣスラリーを、それぞれ個別に１５ｇの食餌と混合し、凍結乾燥させる；各朝、食餌容器を約２０ｇの食餌／酵素混合物で再充填した）。処理前に、ラットをそれらの基礎尿中シュウ酸塩をベースにして対照群と実験群に無作為に分割した。
【０１６９】
尿サンプルの分析：尿中アスコルビン酸とシュウ酸塩との自発的破れを最小限に抑えるために、代謝ケージにおいて２４時間の尿サンプルを酸で収集した（６Ｎの塩酸２５０μｌを、２４時間の間に収集した尿サンプルと混合した）。さらなる分析まで、サンプルを−７０℃で保存した。シュウ酸塩およびクレアチニン測定のために、毎日の利尿および数回の２４時間の尿サンプルを収集した。シュウ酸塩およびクレアチニンのアッセイを、実施例１５に記載する。シュウ酸塩およびクレアチニンの尿排出を、２４時間の尿サンプルで検出されたシュウ酸塩およびクレアチニンのμｍｏｌとして表した。全データを、スチューデントｔ検定を使用して統計的に分析した。
【０１７０】
図２に示すように、慢性高シュウ酸尿症のＳＤラットへのＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの経口投与の結果、治療４日目から、尿中シュウ酸塩が持続的に低減した。２５〜４０％の間の最大連続減を、最高用量群として記録した（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ８０ｍｇ）。５ｍｇおよび２５ｍｇのより低い用量のＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでは、尿中シュウ酸塩の低減はより小さかった（それぞれ最大、２５ｍｇ群で３０％および５ｍｇ群で２０％）。２５ｍｇおよび８０ｍｇの用量では、全ての試験日の間で有意に低減したが（２５ｍｇ群の２１日目を除く）、最小用量５ｍｇでは最小の効果であり、有意ではなかった。この結果によって、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ療法の用量依存効果が明らかとなる。
【０１７１】
（実施例１４）原発性高シュウ酸尿症の動物モデルにおける経口によるシュウ酸デカルボキシラーゼ療法
Ｉ型原発性高シュウ酸尿症のマウスモデル：ＡＧＴ１ノックアウトマウスは、肝臓のペルオキシソーム酵素アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼを欠失しており、これは原発性高シュウ酸尿症Ｉ型を引き起こす欠陥である。キメラマウスを、Ｃ５７Ｂｌ６および１２９／ｓｖ背景系統でホモ接合性に育てた。全てのホモ接合性Ａｇｘｔマウスが、野生型（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）と比較して、正常値を超える５〜１０倍の尿中シュウ酸塩上昇となる軽度高シュウ酸尿症（１〜２ｍｍｏｌ／Ｌ）を示した。雄性の３０〜５０％および雌性の０％が、高齢期（月齢４〜７カ月）に軽度腎石灰沈着症および尿路のシュウ酸カルシウム結石を発症したことも見出された。興味深いことに、均質なＣ５７Ｂｌ６系統で変異体を分析すると、高シュウ酸尿症はいずれの性別においても尿路結石の発症には関連しておらず、これは、この疾患に典型的に観測される表現型の変動を強調するものである。
【０１７２】
合計４４匹の雄性マウス（Ｌａ  Ｌａｇｕｎａ  Ｔｅｎｅｒｉｆｅ、スペイン、Ｓａｌｉｄｏ博士によって育てられた系統ＡＧＴ１ＫＯ／１２９ｓｖ）をこれらの実験で使用した。マウスを、対照群と３つの実験群に無作為に分割した。マウスは２０〜２５グラムの体重で、月齢６カ月未満であった。
【０１７３】
ＡＧＴ１ＫＯ（１２９ｓｖ）マウスを、エチレングリコール（ＥＧ）でチャレンジして、重篤な高シュウ酸尿症および腎実質へのシュウ酸カルシウム沈着形成を引き起こした。ＥＧは、肝臓でシュウ酸塩に代謝される一般的アルコールである。通常、２〜６週のＥＧチャレンジ後、１２９／ｓｖ背景のＡＧＴ１ＫＯマウスは、（ｉ）尿中のシュウ酸塩の可変排出、（ｉｉ）クレアチニンクリアランスの減少、および（ｉｉｉ）最終的には腎不全および死に至る腎石灰沈着症によって決定される腎機能障害の徴候を示す。
【０１７４】
処理の前に７日間、マウスを個々の代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ、米国ペンシルベニア州エクストン）に順応させ、シュウ酸塩０．０２〜０．０８％未満およびカルシウム約０．５〜０．９％を含有する標準ブリーダー食（タンパク質１７％、脂肪１１％、炭水化物５３．５％）を与えた。順応期間後、マウスを４群に分割し、３つの処理群に食餌と混合したシュウ酸デカルボキシラーゼ−ＣＬＥＣを与え、マッチした対照群には、試験物質の添加なしに同じ食餌を与えた。処置の初日から試験の最後まで、全マウスに０．７％ＥＧを補充した飲料水を不断で与えた。チャレンジの数日後、マウスは１日当たり約３〜６ｍｍｏｌ／Ｌのシュウ酸塩を尿中に排出するが、それは野生型（チャレンジなし）マウスの約１０〜２０倍高い。
【０１７５】
ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ酵素の投与；用量範囲試験：系統ＡＧＴ１ＫＯ／１２９ｓｖからの合計４４匹の雄性マウスを、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの用量試験に使用した。マウスは体重が２０〜２５グラムであり、月齢６カ月未満であった。マウスをＥＧでチャレンジし、次いで対照群と実験群に無作為に分割した。架橋した結晶（１％グルタルアルデヒド；実施例９参照）として配合された３つの異なる用量の組み換え型シュウ酸デカルボキシラーゼの効率を、連続４週間かけてモニタした。この実施例で使用される用語「ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ」は、架橋した結晶（１％グルタルアルデヒド、実施例９に記載として配合された組み換え型シュウ酸デカルボキシラーゼを指す。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣを、凍結／乾燥させた食餌の酵素混合物として、見掛けの用量５、２５、および８０ｍｇ／日で経口投与した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．０）中の適量の酵素スラリーを食餌３．５ｇと混合し、凍結乾燥した。各朝、食餌容器を、食餌／酵素混合物約７ｇで再充填した。
【０１７６】
ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの効率の評価：酵素療法の効率を、尿中シュウ酸塩低減、腎実質におけるシュウ酸カルシウム沈着の防止、および生存によってモニタした。試験の終了時に生存マウスを屠殺し、クレアチニン測定のために血液サンプルを採取した。
【０１７７】
尿サンプルの分析：尿中アスコルビン酸とシュウ酸塩との自発的破れを最小限に抑えるために、代謝ケージにおいて２４時間の尿サンプルを酸で収集した（尿３〜４ｍｌ当たり６Ｎの塩酸５０μｌ）。さらなる分析まで、尿サンプルを−２０℃で保存した。シュウ酸塩およびクレアチニンレベルのために、毎日の利尿および数回の２４時間の尿サンプルを収集し分析した。シュウ酸塩およびクレアチニンのアッセイを、実施例１５に記載する。シュウ酸塩およびクレアチニンの尿排出を、２４時間の尿サンプル（ｍＬ）に排出されたシュウ酸塩またはクレアチニンのμｍｏｌとして表した。スチューデントｔ検定を使用してデータを統計的に分析した。
【０１７８】
血液サンプルの分析：試験の終了時にマウスを屠殺し、血清サンプルを収集した。、血清クレアチニン測定では、Ｊａｆｆｅ反応法をわずかに改変したもの（例えば、ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．；Ｓｌｏｔ、Ｓｃａｎｄ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１７巻：３８１頁、１９６５年；およびＨｅｉｎｅｇａｒｄ  Ｄ、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ４３巻：３０５頁、１９７３年参照）を使用した。非希釈血清サンプル８０μｌを、アルカリピクリン酸８００μｌとキュベット内で混合し、室温で３０分間インキュベートした。５１０ｎｍにおいて分光光度法で発色を測定し、次いで、６０％の酢酸３３．３μｌを添加して非特異性反応をクエンチした。サンプルを十分に混合し、５分後に、室温でのインキュベーションを５１０ｎｍにおいて再度読み取った。最終吸光度は、２つの読み取り値の差として存在する。標準曲線については１ｍＭクレアチニン溶液の連続希釈を使用した。
【０１７９】
クレアチニンクリアランスの測定によって、腎機能を間接的にモニタした。クレアチニンクリアランスを、クレアチニン（Ｕｃｒ×Ｖ）の排出率として表し、Ｕｃｒは、血漿クレアチニン（Ｐｃｒ）で除算した尿サンプルのクレアチニン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。これは、
Ｃｃｒ＝（Ｕｃｒ×Ｖ）／Ｐｃｒ＝ｍＬ／ｈ
として表される。
【０１８０】
試験中にモニタした安全性パラメータは、死亡、食餌および水分摂取、ならびに体重であった。試験中、死亡のチェックおよびケージ側部での臨床観察を１日１回実施した。食餌摂取を毎日測定し、水分摂取を週毎記録した。全動物の体重を、試験の最初および試験の最後に記録した。
【０１８１】
図３に示すように、ＥＧ−チャレンジＡＧＴ１ＫＯ（１２９ｓｖ）マウスへのＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの経口投与は、マッチした非処理対照マウスと比較して、処理の４日目から試験の最後まで、尿中シュウ酸塩レベルを有意に低減した。３つの全処理群において３０％および５０％の間の減少が観測され、最高用量群（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ８０ｍｇ）では最大減少が観測された。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ２５ｍｇおよび５ｍｇの低用量では、尿中シュウ酸塩を最大３５％低減した。
【０１８２】
不対のスチューデント両側ｔ検定によって結果を分析する。試験の最初に、各投与群はｎ＝１１のマウスを有していたが、エチレングリコールチャレンジによって試験過程中に数匹のマウスが死亡した。提示された結果は、尿のシュウ酸塩測定の特定日に生存していたマウスのみを含む。対照群における尿中シュウ酸塩排出の釣鐘型曲線は、尿中シュウ酸塩の最初の上昇が、腎石灰沈着症、腎臓濾過機能の低下、および経時的なシュウ酸塩排出率の結果的な低下、ならびに最悪の場合には最終的な死亡をもたらすという観測によって最も十分に説明が付く。
【０１８３】
クレアチニンクリアランス測定による腎機能の評価。試験の最後に、４週間のＥＧチャレンジを生き残った全動物を屠殺し、血液を収集して血漿クレアチニンおよびクレアチニンクリアランスを測定した。８０ｍｇ投与群の全１１匹のマウスが４週間のＥＧチャレンジを生き残り、２５ｍｇのＯＸＣＤ−ＣＬＥＣ投与群において１１匹のうち８匹のマウスが生き残り、５ｍｇのＯＸＣＤ−ＣＬＥＣ投与群において１１匹のうち８匹のマウスが生き残り、対照群において１１匹のうち７匹が生き残った。血清クレアチニン測定では、上記のわずかに改変したＪａｆｆｅ反応法を使用した（例えば、ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．；Ｓｌｏｔ、Ｓｃａｎｄ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１７巻：３８１頁、１９６５年；およびＨｅｉｎｅｇａｒｄ  Ｄ、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ４３巻：３０５頁、１９７３年参照）。
【０１８４】
経口投与したＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの腎機能に対する効率を、クレアチニンクリアランスを測定することによって評価した。全１カ月間の試験期間を生き残ったマウスのクレアチニンクリアランスを図４に示す。対照群と比較すると、クレアチニンクリアランスは、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ８０ｍｇを投与された生存マウス（ｐ＜０．０５）においてより有意に高かった。
【０１８５】
ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ８０ｍｇ処理群の全マウス（１１／１１）は、４週のＥＧチャレンジレジメンを生き残ったが、対照群ではわずか７匹のマウス（７／１１）がレジメンを生き残った。クレアチニンクリアランスによってアッセイした腎臓濾過率も、８０ｍｇ投与群のものより有意に低かった（図４）。
【０１８６】
腎臓組織病理分析：マウスの腎臓を、パラフィン包埋のために定期的に処理し、腎臓の完全な断面が得られるように位置した。各腎臓を、腎臓１個当たり４μｍの１２枚の連続切片に切断し、組織学的定期試験のためにヘモトキシリンおよびエオシンのいずれかで染色し、または腎組織のシュウ酸カルシウム結晶の存在を検出するための特定のＹａｓｕｅ金属置換組織化法によって染色した。２０×倍率を使用して顕微鏡でスライドを調査し、腎臓内の解剖学的領域（皮質、髄質、および乳頭）のそれぞれに対して同じ基準を適用して、４つの分類尺度の下で調査者が切片に点数付けした。点数は、（ｉ）なし（いかなる領域にもシュウ酸塩結晶がない）；（ｉｉ）最小（どの領域にも１〜５個の結晶）；（ｉｉｉ）中程度（どの領域にも６〜１０個の結晶）；および（ｉｖ）重篤（全ての領域が結晶の多数の収集を含む）とした。
【０１８７】
処理動物と対照動物の両方からの腎組織の代表的画像を、図５Ａ〜５Ｃに示す。Ｙａｓｕｅ−陽性のシュウ酸カルシウム結晶は、腎実質において２０×倍率で可視であった。８０ｍｇのＯＸＤＣ−ＣＬＥＣで処理した処理群の全マウスは、シュウ酸カルシウム沈着の痕跡のない、正常で健康な腎臓を有していた（図５Ａ）。対照群および低用量処理群の数匹のマウスに、中程度の腎石灰沈着症（図５Ｂ）および重篤な腎石灰沈着症（図５Ｃ）が観測された。白色矢印は、シュウ酸カルシウム沈着を示し、図５Ｃの灰色矢印は、間質性線維症を伴う大領域を示している。
【０１８８】
特定のＹａｓｕｅ金属置換法を使用する腎臓の組織学的試験によって、主に腎臓の皮質および髄質部分への沈着が示された。重篤な腎石灰沈着症（図５Ｃ）の場合、シュウ酸カルシウム沈着は、腎臓内に無作為に分布していた。線維症および炎症の徴候も可視であり、場合により糸球体内にシュウ酸カルシウム沈着が形成されることによって、糸球体の形態が変化していた。８０ｍｇ投与群の全マウス（１１／１１）は、剖検の際には正常な形態の腎臓を有しており、腎臓にも膀胱にもシュウ酸カルシウム沈着の痕跡はなかった。それとは逆に、未処理対照群のマウスの１００％（１１／１１）にシュウ酸カルシウム沈着があった。低処理群（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ２５ｍｇまたは５ｍｇ）では、マウスの６３％（７／１１）に腎臓へのシュウ酸カルシウム沈着があった。これらの結果は、ＥＧ−チャレンジＡＧＴ１ＫＯマウスにおけるＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでの経口療法の、高シュウ酸尿症の低減および腎臓へのシュウ酸カルシウム結晶沈着の防止に対する、用量依存性のプラス効果を示すものである。４群全てのマウスからの組織病理分析の概要を、表３に示す。
【０１８９】
【表３】
2009545622.tif 000004
【０１９０】
対照マウスおよび３つの異なる処理群のマウスにおける尿路結石形成頻度に対する経口ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ処理の効果も評価した。シュウ酸カルシウム一水和物結石およびシュウ酸カルシウム二水和物結石の、結石の主な２つのタイプがＥＧ  ＡＧＴ１ＫＯマウスの膀胱に見出された。光沢のある可視の膀胱結石が、対照群のマウスの３６％（４／１１）に存在し、２つの低処理群のマウスの１９％（２／１１）に存在した。８０ｍｇの高用量ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ群には、膀胱結石は観測されなかった。白っぽい粗い芽のような（ｂｕｄｄｉｎｇ）表面を伴う結石がシュウ酸カルシウム一水和物から主になり、鋭利な結晶角を伴う比較的大型の結石がシュウ酸カルシウム二水和物に相当することが、Ｘ線回折分析によって示された。
【０１９１】
カプラン−マイヤー推定量による生存率分析。エチレングリコールでチャレンジしたマウスの生存率へのＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ処理の効果を、カプラン−マイヤー法を使用して分析し、ここでは幾つかの時点で死亡した対象の生存率を、その時点でまだ試験下にあった対象の数で除算する。この方法は、試験における各群間の差異を如実に示すものである（図６）。算出にはＫａｌｅｉｄａグラフおよびＳＴＡＴＳなどの統計プログラムがしばしば使用される。
【０１９２】
ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでの経口治療によって、マッチした対照の生存率と比較して、ＥＧ−チャレンジＡＧＴ１ＫＯマウスの生存率が増大した。８０ｍｇＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ処理群の全マウス（１１／１１）が、疾患の徴候なしに３０日の試験期間を生き残り、対照群の１１匹のマウスのうち４匹が、尿路結石の発症と共に重篤な腎石灰沈着症を有していた。
【０１９３】
ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣは経口投与を対象としているため、胃腸（ＧＩ）組織への架橋結晶の副作用の潜在的可能性を評価した。処理したＥＧ−チャレンジＡＧＴ１ＫＯマウスの消化管を肉眼で調査し、胃（胃体および胃洞）および小腸（空腸および回腸）を含むＧＩ管の様々な部分でヘモトキシリン−エオシン染色での組織学的分析を実施した。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでの４週間の経口治療は良好な耐用性を示し、ＧＩ管に構造的または形態的変化を生じなかったことが、評価によって確認された。大腸についても類似の結果が観測された。
【０１９４】
シュウ酸デカルボキシラーゼ−ＣＬＥＣで経口治療したＥＧ−チャレンジＡＧＴ１ＫＯマウスにおける用量範囲試験の概要。原発性高シュウ酸尿症動物モデルにおけるＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでの経口治療は安全であり、効果的であった。概して、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣでの４週間の経口治療は、尿中シュウ酸塩を３０〜５０％だけ低減した。３つの用量の評価試験物質のぞれぞれで、有意な持続的低減が記録された。最高治療用量での４週間の経口治療で、腎実質のシュウ酸カルシウム沈着が防止された。４週間の経口治療によって、２つの低用量での生存率が増大し、研究された最高用量では動物の死亡が防止された。最終的に、４週間の治療レジメンではＧＩ管における巨視的または微視的変化はもたらされなかった。
【０１９５】
（実施例１５）アッセイ
タンパク質濃度決定。シュウ酸デカルボキシラーゼの濃度を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。１．３６の光学密度（ＯＤ）の吸光度を１ｍｇ／ｍｌとみなした。
【０１９６】
ＯＸＤＣ活性アッセイ。改変したＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈプロトコル（シュウ酸デカルボキシラーゼの酵素アッセイ  ＥＣ４．１．１．２）を使用して、可溶性シュウ酸デカルボキシラーゼ、シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶、および架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ）の活性を測定した。これは、２つのステップによる活性のアッセイであり、第１の反応ではＯＸＤＣによって、基質のシュウ酸塩がギ酸塩および二酸化炭素に変換する。第２の反応では、ギ酸水素を化学量論的にＮＡＤに転移して、ギ酸デヒドロゲナーゼによってＮＡＤＨを形成する。ＮＡＤＨのその後の濃度を、分光光度によって３４０ｎｍにおいて定量化する。酵素活性の単位（ｕ）は、以下に従って定義される。１単位のシュウ酸デカルボキシラーゼは、ｐＨ５および３７℃において１分当たり、１．０μｍｏｌのシュウ酸塩をギ酸塩および二酸化炭素に形成する。
【０１９７】
５ｍＭのリン酸カリウム緩衝剤ｐＨ７．０と１ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）において、ＯＸＤＣ結晶およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣについてそれぞれ０．００７〜０．０２ｍｇ／ｍＬおよび０．００９〜０．０３ｍｇ／ｍＬの濃度で、アッセイサンプルを標準化した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度によって決定した。使用前に、４０Ｕ／ｍＬのギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を冷却したジ（ｄｉ）Ｈ２Ｏ中で調製した後、氷上で維持した。他の全ての試薬を室温で維持した。試薬を、以下の順で２ｍｌのマイクロチューブに撹拌しながら添加した。３００μＬの１００ｍＭリン酸カリウムおよび２００μＬのシュウ酸カリウムｐＨ４．０を混合し、３７℃の水浴中で５分間温め、次いで１００μＬの５ｍＭリン酸カリウムと１ｍＭのＤＴＴを、空のバイアルに入れ、１００μＬの希釈シュウ酸デカルボキシラーゼを、他の全てのバイアルに添加した。２分後、１５０ｍＭの二塩基性リン酸カリウムで反応を停止した。第２の反応では、２５μＬのＮＡＤ溶液を１００μＬのＦＤＨ溶液に添加し、さらに２０分間インキュベーションを続けた。次いで全サンプルを、１６，１００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけた。次いで、反応混合物を１．５ｍＬのＵＶキュベットに移し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＢｉｏＳｐｅｃ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリーランド州コロンビア）を使用して３４０ｎｍにおける吸光度を決定し記録した。
【０１９８】
酵素比活性を以下のようにして算出した。
ＯＸＤＣ複数単位／ｍＬ＝［Ａｂｓ×全体積（１．７２５ｍＬ）×希釈係数］／（吸光係数（Ｅｘｔ．）ＮＡＤＨ＝６．２２）（体積ＯＸＤＣ＝０．１ｍＬ）（アッセイ時間＝２／５分）
特定の実験では、シュウ酸デカルボキシラーゼの架橋結晶（ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ）（終夜撹拌することによって、１％グルタルアルデヒドで架橋したダイヤモンド型結晶、実施例９参照）を、ＯＸＤＣ結晶と比較した。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣは、対応する結晶性ＯＸＤＣ調製物の活性の５０％を保持していた。
【０１９９】
比色分析法によるシュウ酸塩決定。尿中シュウ酸塩の定量的決定のためのシュウ酸塩比色分析キットを、Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＳＡ（ミズーリ州セントルイス）またはＧｒｅｉｎｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＡＧ（スイス、Ｄｅｎｎｌｉｗｅｇ  ９）から購入した。尿サンプルを希釈し、製造者の指示に従って処理した。このアッセイは、２つの酵素反応を含む。（ａ）シュウ酸塩オキシダーゼによって、シュウ酸塩を二酸化炭素および過酸化水素に酸化すること、ならびに（ｂ）このようにして形成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）および３−（ジメチルアミノ）安息香酸（ＤＭＡＢ）と反応させて、５９０ｎｍにおける吸光度によって検出できるインダミン色素を得ること。生成された色の強度は、サンプル中のシュウ酸塩濃度と正比例する。尿中シュウ酸塩値を、標準曲線から算出する。
【０２００】
比色分析法によるクレアチニン決定。尿中クレアチニンの定量的決定のためのクレアチニン比色分析キットを、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州サンディエゴ；ＭＥＴＲＡクレアチニンアッセイキット）またはＲａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（英国アントリム州）から購入した。このアッセイは、クレアチニンがアルカリ性溶液中でピクリン酸と反応して、４９２ｎｍの吸光度を有する生成物を形成するという原理に基付いている。形成された錯体の量は、クレアチニン濃度に正比例する。単一代謝ケージから収集した２４時間のラットの尿サンプルを、再蒸留水で１５倍に希釈した。希釈した尿サンプル２０μｌを、２０μｌのピクリン酸／水酸化ナトリウム（１：１）と混合した。室温での２分間のインキュベーションでインキュベートした後に、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。標準曲線から尿中クレアチニン値を算出した。
【０２０１】
（実施例１６）ヒトのシュウ酸塩関連障害の治療のためのＯＸＤＣ療法
高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩関連障害の治療または防止の必要があるヒトを、架橋シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶の経口投与によって治療することができる。シュウ酸デカルボキシラーゼ結晶は、疾患の症候および進行の重篤度に応じて担当医によって決定されるように、約１０μｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。シュウ酸デカルボキシラーゼ架橋結晶は、１日に１、２、３、４、または５回投与されるか、または週１回もしくは２回など回数を減らして投与される。このＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの経口投与は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、またはそれ以上の尿中シュウ酸塩レベルの減少をもたらす。
【０２０２】
（実施例１７）シュウ酸デカルボキシラーゼの組み換え産物
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞において。ＯＸＤＣをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１または２）を、適切な発現ベクターにクローニングする。配列確認後、ベクターを線形化することができ、６ｃｍ直径皿中、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬を使用して、予め播種したＨＥＫ２９３細胞への線形化ベクターの形質転換を行うことができる。適切な媒体中で、トランスフェクション反応物を終夜培養し、次いで０．５ｇ／Ｌのネオマイシンを補充した媒体中で形質転換体を選択する。安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞クローンを、ネオマイシン含有媒体中で最大３週間増殖させた後に同定する。次いでクローンを単離し繁殖させ、ＯＸＤＣ発現に使用する。
【０２０３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において。ＯＸＤＣ遺伝子をコードするＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングする。次いで、培養したＣＨＯｌｅｃ３．２．８．１細胞をトリプシン消化によって分離し、遠心分離によって回収する。次いでその細胞をエレクトロポレーションリン酸緩衝生理食塩水緩衝剤（ＥＰＢＳ）に懸濁して最終濃度約１×１０７／ｍｌにし、エレクトロポレーションによって線形化ベクターで形質転換する。終夜の培養後、その媒体を、０．５ｇ／Ｌのネオマイシンを補充した媒体と交換する。媒体の連続的な変更を行って、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞クローンをスクリーニングする。安定にトランスフェクトした細胞クローンが確立し繁殖すると、その細胞をＯＸＤＣ発現に使用する。
【０２０４】
ピキアパストリスにおいて。ＯＸＤＣ遺伝子をコードするＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングする。配列確認後、ベクターを線形化し、次いでピキアパストリス宿主細胞に形質転換する（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．７巻：１３６〜１４５頁、２００２年参照）。形質転換体をＺｅｏｃｉｎで選択し、緩衝グリセロール錯体媒体（ＢＭＧＹ）中で増殖させ、メタノールで誘発した。次いでＯＸＤＣを培地から単離した。
【０２０５】
サッカロマイセスセレビシエにおいて。合成ＯＸＤＣ遺伝子は、例えば発現のためのＧａｌ１プロモーター（ｐＧａｌ）および終止配列を含有する適切な発現ベクターにクローニングすることができる。配列確認後、発現ベクターをエレクトロポレーションによってコンピテントなサッカロマイセスセレビシエＷ３０３−１Ａに形質転換する。形質転換体をスクリーニングし、ＯＸＤＣ発現への使用前に繁殖させる。
【０２０６】
昆虫細胞において。ＯＸＤＣをコードするＤＮＡを、例えばバキュロウィルス系などの適切な発現ベクターにクローニングすることができる。配列確認後、ベクターをコンピテントなＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞に形質転換することができ、組み換え型バクミドを含有する大腸菌細胞をスクリーニングし検証することができる。組み換え型バクミドＤＮＡを単離し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）などの試薬を使用して昆虫のＳｆ９細胞をトランスフェクトするために使用する。次いで、組み換え型バキュロウィルス粒子を単離し繁殖させ、滴定（ｔｉｔｅｒ）した後に使用してＯＸＤＣ発現のためにＳｆ９細胞を感染させた。
【０２０７】
大腸菌において。ＯＸＤＣをコードするＤＮＡを、適切な大腸菌発現ベクターにクローニングする。配列確認後、ベクターをコンピテントな大腸菌ＢＬ２１または必要に応じて大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）に形質転換し、それによってこの系統で発現する組み換え型タンパク質におけるジスルフィド結合の形成が可能となる。抗生物質を含有する栄養プレートで形質転換体を増殖することによって形質転換体をスクリーニングし、ＯＸＤＣ遺伝子特異的プライマーを使用してコロニーＰＣＲによって検証する。次いで、形質転換体を液体媒体中で培養し、ＯＸＤＣ発現のためにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発する。
【０２０８】
（実施例１８）配列
カンジダボイジニでの発現のためのエノキタケ配列（配列番号１）。２つのノットＩ配列にアンダーラインを引いている。太字のＡＴＡトリプレットはスペーサーコドンである。二重アンダーラインの配列は、Ｃ．ボイジニに合わせて最適化したα接合因子配列である。ＯＸＤＣをコードする配列を小文字で示す。
【０２０９】
【数１】
2009545622.tif 000005
【０２１０】
【数２】
2009545622.tif 000006
【０２１１】
枯草菌配列（配列番号２）：アンダーラインを引いた位置７０５の「Ｇ」は、Ａ→Ｇ塩基置換を示す。この塩基置換は、アミノ酸配列を変えるものではない。
【０２１２】
【数３】
2009545622.tif 000007
【０２１３】
枯草菌配列から翻訳されたシュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質を以下に示す（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｏ３４７１４）（配列番号３）。
【０２１４】
【数４】
2009545622.tif 000008
【０２１５】
（実施例１９）低ｐＨ３．０における可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性
可溶性ＯＸＤＣ、２．５ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、結晶性ＯＸＤＣ、５．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ、５．０ｍｇ／ｍＬ（実施例１０）を、それぞれエッペンドルフチューブ内でクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ３．０、１ｍＬに入れ、３７℃において５時間インキュベートした。酵素の安定性測定のために、０、２、および５時間目にサンプルを採取した。活性を実施例１５のように決定した。ｐＨ３．０における０、２、および５時間後のＯＸＤＣおよびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性を示す結果を図７に示す。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣは、ｐＨ３．０における５時間のインキュベーション後に約１００％の活性を保持していたが、可溶性ＯＸＤＣは、最初の２時間以内に約５１％の活性を喪失し、５時間後には元のものと比較してわずか約４０％の活性が残った。結晶性ＯＸＤＣは、１時間で約６８％の活性、２時間で約６７％の活性を保持していることから、可溶性ＯＸＤＣよりもより安定であった。
【０２１６】
（実施例２０）ペプシンの存在下での可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ結晶の安定性
可溶性ＯＸＤＣ、１．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、結晶性ＯＸＤＣ、１０．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ、１．０ｍｇ／ｍＬ（実施例１０）を、それぞれエッペンドルフチューブ内でクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ３．０、１ｍＬに入れ、ＯＸＤＣ対ペプシン５０：１の比でペプシンを用いて３７℃において５時間インキュベートした（ペプシンストックは、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤、ｐＨ７．５中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で生成した）。酵素の安定性測定のために、サンプルを０、２、および５時間目に採取した。活性を実施例１５のように決定した。ペプシンの存在下での０、２、および５時間後の可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性を示す結果を図８に示す。
【０２１７】
図８に示すように、可溶性ＯＸＤＣに対するＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ配合物の優位性は、共に低ｐＨでペプシンの存在下で明らかになった。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣサンプルは、３７℃における５時間のインキュベーション後に約６０％の活性を保持しており、可溶性ＯＸＤＣおよび非架橋結晶性ＯＸＤＣの大部分は、２時間後にはペプシンによって分解され、５時間後には約２０％の活性しか残っていなかった。
【０２１８】
（実施例２１）キモトリプシンの存在下での可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性
可溶性ＯＸＤＣ、１．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、結晶性ＯＸＤＣ、１０．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ、１．０ｍｇ／ｍＬ（実施例１０）を、それぞれエッペンドルフチューブ内で２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤ｐＨ７．５、１ｍＬに入れ、ＯＸＤＣ対キモトリプシン５０：１の比でキモトリプシンを用いて３７℃において５時間インキュベートした（キモトリプシンストックは、新しく調製した２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で生成した）。酵素の安定性測定のために、サンプルを０、２、および５時間目に採取した。活性を実施例１５のように決定した。キモトリプシンの存在下での０、２、および５時間目の可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性を示す結果を図９に示す。
【０２１９】
図９の結果によって、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣおよび非架橋結晶性ＯＸＤＣは、３７℃における５時間のインキュベーション後に安定であり、キモトリプシンによるタンパク質分解切断に対して耐性があったことが示される。分析によって、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣおよび非架橋結晶性ＯＸＤＣ酵素が、５時間でその最初の値と比較して約１００％の活性を保持していたことが示された。同時に、可溶性タンパク質は、キモトリプシンへの２時間の曝露後に約５０％の活性を喪失し、５時間後には全ての可溶性ＯＸＤＣが分解され、残った活性は０％であった。
【０２２０】
（実施例２２）パンクレアチンで刺激を与えた腸液における可溶性ＯＸＤＣ、結晶性ＯＸＤＣ、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性
可溶性ＯＸＤＣ、５．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、結晶性ＯＸＤＣ、１０．０ｍｇ／ｍＬ（実施例５）、およびＯＸＤＣ−ＣＬＥＣ、１０．０ｍｇ／ｍＬ（実施例１０）を、それぞれエッペンドルフチューブ内で、刺激を与えた腸液（刺激を与えた腸液を、ＵＳＢの推奨に従って生成した。一塩基性リン酸カリウム６．８ｇｍを、水２５０ｍｌに溶解し、０．２Ｎの水酸化ナトリウム７７ｍｌおよび脱イオン水５００ｍｌと混合し、次いでパンクレアチン１０ｇｍを添加し、ｐＨを０．２Ｎの塩酸または０．２Ｎの水酸化ナトリウムのいずれかで調節してｐＨ６．８にし、水を添加して１Ｌにした）１ｍＬに入れ、３７℃で２時間インキュベートした。酵素の安定性測定のために、サンプルを０、１、および２時間目に採取した。活性を実施例１５のように決定した。結果を図１０に示す。
【０２２１】
図１０に示された結果は、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣが、パンクレアチンで刺激を与えた腸液中で安定であり、約１００％の活性が保存されていたことを示す。それとは対照的に、可溶性ＯＸＤＣの大部分は、１時間以内にパンクレアチン（リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼのミックス）によって分解され、それぞれ１時間および２時間のインキュベーション後には約２６％〜２８％の間の活性しか残っていなかった。非架橋結晶性ＯＸＤＣは、パンクレチンの存在下ではその可溶性形態よりもかなり安定であり、非架橋結晶性ＯＸＤＣは、１時間および２時間のインキュベーション後にはそれぞれ約７６％および約４９％だけ活性を喪失した。
【０２２２】
さらにＯＸＤＣ−ＣＬＥＣは、ペプシンおよびキモトリプシンなどのプロテアーゼからの切断から酵素を保護する。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣの安定性は、同じ条件下では、可溶性ＯＸＤＣの安定性の少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％、またはそれ以上のものであり得る。ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣは、同じ条件下でその活性を維持している可溶性ＯＸＤＣよりも少なくとも約２、３、または４倍高い活性を維持している。したがって可溶性ＯＸＤＣと比較すると、ＯＸＤＣ−ＣＬＥＣは、約２．５または３の酸性ｐＨ〜約７．５または８．５のｐＨの範囲であり、様々なプロテアーゼを含有する腸の厳しい条件下で活性であり、かつ安定である。
【０２２３】
本発明の幾つかの実施形態を説明してきた。しかしなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な改変を行い得ることが理解されよう。したがって、他の実施形態も先の請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月27日(2009.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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