(57)【要約】  本発明は、パーキンソン病の処置のために有用な作用物についてのアッセイを提供する。プロテアソーム機能に及ぼすＰａｒｋｉｎタンパク質の効果を調節する作用物についての細胞に基づくアッセイが含まれる。また本発明は、原核生物発現系、例えば、大腸菌細胞において生産される組み換え、酵素的に活性のある、Ｐａｒｋｉｎタンパク質を提供する。Ｐａｒｋｉｎタンパク質の精製方法もまた提供される。
2009519040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を試験作用物に対して曝露し；
（ｂ）その細胞におけるプロテアソーム機能と、試験化合物に曝露されなかったＰａｒｋｉｎを発現する対応する哺乳動物細胞のプロテアソーム機能特性とを比較すること；を含み、
ここで、試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能の増大されたレベルが、その作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを指示する、パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定するための細胞に基づくアッセイ。
【請求項２】
（ａ）Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を得て；
（ｂ）細胞を試験作用物に対して曝露し；
（ｃ）その細胞におけるプロテアソーム機能を、試験作用物に曝露されなかった細胞におけるプロテアソーム機能と比較すること；を含み、
ここで、試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能の増大されたレベルが、その作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを指示する、パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定するための細胞に基づくアッセイ。
【請求項３】
哺乳動物細胞がＧＦＰｕを発現し、そしてプロテアソーム機能がその細胞におけるＧＦＰｕの量を測定することによって測定される、請求項１の方法。
【請求項４】
細胞におけるＧＦＰｕの量がＧＦＰｕ蛍光を測定することによって決定される、請求項３の方法。
【請求項５】
（ａ）
（ｉ）変異Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を候補化合物に対して曝露し；
（ｉｉ）（ａ）（ｉ）における細胞におけるプロテアソーム機能を、候補化合物に曝露されなかった変異Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞のプロテアソーム機能特性と比較すること；を含む、プロテアソーム機能アッセイ、および／または
（ｂ）
（ｉ）Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎを発現する哺乳動物細胞を候補化合物に対して曝露し；
（ｉｉ）（ｂ）（ｉ）における細胞におけるプロテアソーム機能と、候補化合物に曝露されなかったＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎを発現する細胞のプロテアソーム機能特性とを比較すること；を含む、プロテアソーム機能アッセイ、および／または
（ｃ）
（ｉ）化合物の存在下で、精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション（ａｕｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）活性を測定し；そして
（ｉｉ）その化合物の存在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性を、その化合物の不在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性と比較すること；を含む、インビトロの活性アッセイ、および／または
（ｄ）
（ｉ）化合物を精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質と接触させ；
（ｉｉ）存在する場合には、その化合物とＰａｒｋｉｎタンパク質の結合を検出すること；を含む、インビトロの活性結合アッセイ、
をさらに含む、請求項１の細胞に基づくスクリーニング方法。
【請求項６】
（ｉ）変異Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を候補化合物に対して曝露し；（ｉｉ）その細胞におけるプロテアソーム機能と、変異Ｐａｒｋｉｎを発現し、かつ候補化合物に曝露されなかった細胞のプロテアソーム機能特性とを比較すること；を含むプロテアソーム機能アッセイを含み、ここで、変異ＰａｒｋｉｎがＲ４２Ｐ、Ｓ１６７Ｎ、Ｃ２１２Ｙ、Ｔ２４０Ｍ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２８９ＧまたはＰ４３７Ｌ  Ｐａｒｋｉｎである、請求項５の方法。
【請求項７】
方法が、
（ａ）封入体を破壊し、そしてヒスチジン・タグされたＰａｒｋｉｎを含有する可溶性画分を回収し；
（ｂ）（ａ）からのヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎのアフィニティークロマトグラフィーによってヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎを精製し、該クロマトグラフィーが、グアニジン−ＨＣｌを含む溶液により結合タンパク質を溶出して、ヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎとグアニジン−ＨＣｌを含んでなる組成物を生成することを含み；
（ｃ）ヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎとグアニジンを含んでなる組成物を、高濃度のアルギニンおよび還元剤を含有する緩衝水溶液に対して透析して、第１の透析物を生成し；そして
（ｄ）アルギニンを実質的に含まない緩衝水溶液に対して第１の透析物を透析すること；を含む、
Ｐａｒｋｉｎを発現する細菌細胞の封入体からヒスチジン・タグされたＰａｒｋｉｎを精製する方法。
【請求項８】
封入体が、グアニジンＨＣｌまたはイソチオシアン酸グアニジニウムの存在下で破壊される、請求項７の方法。
【請求項９】
封入体が２〜６Ｍ塩酸グアニジンの存在下で破壊される、請求項８の方法。
【請求項１０】
還元剤が、β−メルカプトエタノール、ＤＴＴまたはＴＣＥＰである、請求項７の方法。
【請求項１１】
高濃度のアルギニンを含有する緩衝水溶液中の高濃度のアルギニンが、約０．１Ｍ〜１Ｍアルギニンを含有する、請求項７の方法。
【請求項１２】
アルギニンを実質的に含まない緩衝水溶液が０．５ｍＭ未満のアルギニンを含有する、請求項７の方法。
【請求項１３】
アルギニンを実質的に含まない緩衝水溶液が０．１ｍＭ未満のアルギニンを含有する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
（ｂ）における溶出溶液が、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ，５００ｍＭイミダゾール、１０ｍＭβ−ＭＥ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡであり；（ｃ）における緩衝水溶液が、０．４Ｍアルギニン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴであり；そして（ｄ）における緩衝水溶液が、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＤＴＴである、請求項７の方法。
【請求項１５】
ヒスチジン・タグを含む酵素的に活性のある精製組み換えＰａｒｋｉｎを含んでなる、組成物。
【請求項１６】
Ｐａｒｋｉｎが細菌発現系から得られる、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
Ｐａｒｋｉｎが、少なくとも約１単位（Ｕ）／０．５μｇＰａｒｋｉｎタンパク質の比活性を有し、この場合、１単位が、ヒトＧＳＴ−Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチンおよびＭｇ−ＡＴＰの存在下で１５分間に５０ｎｇのユビキチンをＰａｒｋｉｎに転移する能力として定義される、細菌発現系から得られる酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎを含んでなる
組成物。
【請求項１８】
Ｐａｒｋｉｎがヒスチジン・タグを含む、請求項１７の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年１２月１２日提出の米国暫定出願第６０／７４９，９６４号の利益を請求するものであり、これの完全な内容は引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本発明は、パーキンソン病の処置のために有用な作用物についてのアッセイ、ならびにアッセイにおいて有用な組み換えＰａｒｋｉｎタンパク質に関する。本発明は、タンパク質精製、薬物発見および医薬の分野における応用を見出だす。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質のドーパミンニューロンの喪失として神経病理学的に特徴付けられる神経学的障害である。このニューロン喪失は、運動緩徐、硬直および／または振せんのような運動における変調として臨床的に現れる（非特許文献１）。ヒトの遺伝データの分析は、ＰＤの発生に結び付けられる遺伝子を特性決定するために使用されてきた。これらの遺伝子の１つは、１群の若年到来の患者を使用して染色体６に位置決定され、そしてＰａｒｋｉｎタンパク質として具体的に同定された（非特許文献２）。Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）において機能するＥ３リガーゼタンパク質であることが分かった（非特許文献３）。ＵＰＳは、分解のためのタンパク質の標的化除去に伴われる主要な細胞経路であり、そしてＥ３リガーゼは、細胞プロテアソーム（非特許文献４）またはリソソーム（非特許文献５）による分解のために基質を同定し、標識するために機能する。
【０００４】
パーキンソン病を処置するための新規方法に対する切迫したニーズが存在する。本発明は、ＰＤ療法のため、ならびに他の用途のための作用物を同定および／または評価するために有用である方法および材料を提供する。
【非特許文献１】Ｇｅｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６：３３−３９
【非特許文献２】Ｋｉｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：６０５−６０８
【非特許文献３】Ｓｈｉｍｕｒａ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：３０２−３０５
【非特許文献４】Ｈｅｒｅｓｈｋｏ  ａｎｄ  Ｃｉｅｎｃｈａｎｏｖｅｒ，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４２５−４７９
【非特許文献５】Ｈｉｃｋｅ，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１０７−１１２
【発明の開示】
【０００５】
１つの態様では、本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）の処置のために有用な化合物の同定、または化合物のスクリーニングのためのアッセイを提供する。１つの態様では、本発明は、（ａ）Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を試験作用物に対して曝露し；そして（ｂ）その細胞におけるプロテアソーム機能を、試験化合物に曝露されなかったＰａｒｋｉｎを発現する対応する哺乳動物細胞のプロテアソーム機能特性と比較すること；を含み、ここで、試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能の増大されたレベルが、その作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを指示する、パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定するための細胞に基づくアッセイを提供する。
【０００６】
関連態様では、本発明は、（ａ）Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を得て；（ｂ）細胞を試験作用物に対して曝露し；そして（ｃ）その細胞におけるプロテアソーム機能を、試験作用物に曝露されなかった細胞におけるプロテアソーム機能と比較すること；を含み、ここで、試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能の増大されたレベルが、その作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを指示する、パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定するための細胞に基づくアッセイを提供する。
【０００７】
種々の方法がプロテアソーム機能を測定または検査するために使用することができる。１つの実施態様では、哺乳動物細胞はＧＦＰｕを発現し、そしてプロテアソーム機能は細胞におけるＧＦＰｕの量を測定することによって測定される。１つの実施態様では、細胞におけるＧＦＰｕの量はＧＦＰｕ蛍光を測定することによって決定される。
【０００８】
若干の場合には、また、細胞に基づくスクリーニング方法は、（ｉ）変異Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を候補化合物に対して曝露し；そして（ｉｉ）その細胞におけるプロテアソーム機能を、候補化合物に曝露されなかった変異Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞のプロテアソーム機能特性と比較すること；を含む、プロテアソーム機能アッセイを含む。
【０００９】
若干の場合には、また、細胞に基づくスクリーニング方法は、（ｉ）その他のタンパク質、例えばＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎを発現する哺乳動物細胞を候補化合物に対して曝露し；そして（ｉｉ）その細胞におけるプロテアソーム機能を、候補化合物に曝露されなかった他のタンパク質を発現する細胞のプロテアソーム機能特性と比較すること；を含む、プロテアソーム機能アッセイを含む。
【００１０】
若干の場合には、また、細胞に基づくスクリーニング方法は、（ｉ）化合物の存在下で、精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション（ａｕｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）活性を測定し；そして（ｉｉ）化合物の存在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性を、化合物の不在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性と比較すること；を含む、インビトロの活性アッセイを含む。
【００１１】
若干の場合には、また、細胞に基づくスクリーニング方法は、（ｉ）化合物を精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質と接触させ；そして（ｉｉ）存在する場合には、化合物とＰａｒｋｉｎタンパク質の結合を検出すること；を含む、インビトロの活性結合アッセイを含む。
【００１２】
その他の態様では、本発明は精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質およびそのようなタンパク質を得る方法を提供する。１つの態様では、本発明は、（ａ）グアニジンＨＣｌの存在下で封入体を破壊し、そしてヒスチジン・タグされたＰａｒｋｉｎを含有する可溶性画分を回収し；（ｂ）ヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎのアフィニティークロマトグラフィーによってヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎを精製し、ここで、クロマトグラフィーは、グアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ）を含む溶液により結合タンパク質を溶出して、ヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎとグアニジウムを含有する組成物を生成することを含み；（ｃ）ヒスチジン・タグＰａｒｋｉｎとグアニジウムを含有する組成物を、高濃度のアルギニンと還元剤を含有する緩衝水溶液に対して透析して、第１の透析物を生成し；そして（ｄ）アルギニンを実質的に含まない緩衝水溶液に対して第１の透析物を透析すること；によって、Ｐａｒｋｉｎを発現する細菌細胞の封入体からヒスチジン・タグされたＰａｒｋｉｎを精製する方法を提供する。本方法の１つの実施態様では、塩酸グアニジンは場合によっては２Ｍ〜６Ｍの濃度で使用される。本方法の１つの実施態様では、イソチオシアン酸グアニジニ
ウムが使用される。本方法の若干の実施態様では、還元剤はβ−メルカプトエタノール、ＤＴＴまたはＴＣＥＰである。本方法の若干の実施態様では、緩衝水溶液中の高濃度のアルギニンは約０．１Ｍ〜１Ｍアルギニンである。本方法の若干の実施態様では、アルギニンを実質的に含まない緩衝水溶液は０．５ｍＭ未満のアルギニン、例えば０．１ｍＭ未満のアルギニンを含有する。
【００１３】
１つの実施態様では、溶出溶液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  β−ＭＥ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡであり；（ｃ）における緩衝水溶液は、０．４Ｍアルギニン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴであり；そして（ｄ）における緩衝水溶液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴである。
【００１４】
ある態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌の発現系からの精製組み換えＰａｒｋｉｎを提供する。１つの態様では、本発明は、ヒスチジン・タグを含んでなる酵素的に活性のある精製組み換えＰａｒｋｉｎを提供する。１つの態様では、本発明は、細菌発現系から得られる酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎを提供する。Ｐａｒｋｉｎ活性は、Ｐａｒｋｉｎの酵素活性および／または生物学的機能を測定するすべてのアッセイを使用して例証することができる。細菌発現系から得られる酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎはヒスチジン・タグを含んでもよい。
【００１５】
ある態様では、本発明は、高い比活性、例えば、少なくとも約０．１単位（Ｕ）、少なくとも約０．２Ｕ、少なくとも約０．２５Ｕまたは少なくとも約１Ｕ／０．５μｇＰａｒｋｉｎタンパク質を有する細菌発現系から得られる酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎを提供する（ここで、１単位は、ヒトＧＳＴ−Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチンおよびＭｇ−ＡＴＰの存在下で１５分間に５０ｎｇのユビキチンをＰａｒｋｉｎに転移する能力として定義されるか、あるいは同等には、１／４単位は、３０分間に２５ｎｇのユビキチンをＰａｒｋｉｎに転移する能力である）。細菌発現系から得られる酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎはヒスチジン・タグを含んでもよい。
【００１６】
Ｉ．序論
遺伝データは、ヒトにおいて、Ｐａｒｋｉｎタンパク質の喪失が、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失と、最後にはパーキンソン病（「ＰＤ」）をもたらすことを確立した。ドーパミン作動性ニューロンにおける関連Ｐａｒｋｉｎ活性は、そのＥ３ユビキチンリガーゼ活性であると考えられる。本発明は、Ｐａｒｋｉｎが活性コンホメーションを達成または維持するのを助けることができる治療学的作用物、例えば低分子を使用してＰａｒｋｉｎリガーゼ活性を回復または増大するための治療学的アプローチを意図している。１つの態様では、本発明は、パーキンソン病を処置するために有用な作用物の同定方法に関する。これらの方法は細胞に基づくおよびタンパク質に基づくアッセイを含む。
【００１７】
その他の態様では、本発明は、組み換え細菌細胞において発現された酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎの精製方法を提供する。関連態様では、本発明はこれらの方法を使用して精製されるＰａｒｋｉｎを提供する。組み換えＰａｒｋｉｎは、本発明のスクリーニングアッセイにおいて、ならびに他の応用（例えば、Ｅｌｉｓａアッセイのためのスタンダードを確立するため、モノクローナル抗体を生成するための免疫原としての用途、および科学者および医学者にとっては明らかであろう他の用途のために）のために使用されてもよい。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の態様が、以下において、より詳細に議論される。
【００１９】
ＩＩ．定義
用語「Ｐａｒｋｉｎ」および「Ｐａｒｋｉｎタンパク質」は、互換性をもって使用され、そして野生型Ｐａｒｋｉｎまたは変異Ｐａｒｋｉｎを指す。
【００２０】
「野生型Ｐａｒｋｉｎ」は、配列番号：２の配列を有するヒトＰａｒｋｉｎまたは配列番号：４の配列を有するマウスＰａｒｋｉｎを指す。また野生型Ｐａｒｋｉｎは、Ｐａｒｋｉｎのリガーゼ活性に影響を与えず、かつ細胞において発現された場合異なる表現型を与えない突然変異を有するＰａｒｋｉｎ改変体（ｖａｒｉａｎｔ）を指してもよい。Ｐａｒｋｉｎおよび他のタンパク質をコードしている核酸およびタンパク質の配列は、読者の便宜のために提供され、そしてまた科学文献において見出だすことができる。しかしながら、本発明の実行は、特定の配列提供物に限定されるものではない。改変体がまた提供される配列の代わりに使用されてもよいことは評価できる。
【００２１】
「Ｐａｒｋｉｎ変異体」または「変異Ｐａｒｋｉｎ」は、１個以上の残基の置換、挿入または欠失によって配列番号：２から誘導され、そして野生型Ｐａｒｋｉｎによって与えられるものとは異なる活性を有するか、または異なる表現型を与える配列をもつＰａｒｋｉｎタンパク質を指す。Ｐａｒｋｉｎ変異体に関する場合、慣用の命名法が使用される。例えば、Ｒ２７５Ｗ変異体は位置２７５におけるアルギニン（Ｒ）の代わりにトリプトファン（Ｗ）の置換を有する。一般に、「Ｐａｒｋｉｎ変異体」は、例えば、Ｒ４２Ｐ、Ｓ１６７Ｎ、Ｃ２１２Ｙ、Ｔ２４０Ｍ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２８９ＧおよびＰ４３７Ｌを含む、天然に存在する変異タンパク質を指す。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「パーキンソン病を処置するために有用な作用物」または「パーキンソン病を処置するための候補化合物」に関しては、パーキンソン病を有する患者のために治療的または予防的利益を表す他の化合物よりも良好であろうとして同定された化合物、すなわち薬物候補を指す。薬物候補が患者に投与される前にさらなる試験（例えば、動物におけるインビボ試験）を受けてもよいことは、薬物発見の方法に親しい者によっては理解することができる。また、治療学的作用物が薬物候補の誘導体または化学的に改変された形態物であってもよいことは理解できる。
【００２３】
ＩＩＩ．パーキンソン病を処置するために有用な作用物の同定
細胞における野生型Ｐａｒｋｉｎの過発現がプロテアソーム活性を阻害し、そしてＰａｒｋｉｎタンパク質の大きい不溶性封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）の沈着をもらすことが発見された（参照、下記実施例）。脳組織の分析は、ＰＤ患者では、Ｐａｒｋｉｎレベルが健康な脳組織に較べて上昇され、そして不溶性画分において富有化されるように見えることを示した。参照、実施例５。特定のメカニズムに捕らわないことを意図すれば、実施例において記述された実験に一部基づいて、野生型Ｐａｒｋｉｎタンパク質はミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）を起こしがちであり、ミスフォールドされたＰａｒｋｉｎの蓄積は、（１）プロテアソーム活性の損傷、（２）Ｐａｒｋｉｎおよび他の細胞タンパク質を含有するａｇｇｒｅｓｏｍｅの生成、（３）細胞の罹病および（４）Ｐａｒｋｉｎ活性の喪失をもたらすことが信じられる。Ｐａｒｋｉｎ活性の喪失は、ＰＤをもたらす直接的メカニズムであり（Ｋｉｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：６０５−６０８）、そしてこの研究において記述された点突然変異がまた、疾病をもたらすＰａｒｋｉｎの機能の喪失に関係しているのであろう（Ｆｏｒｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６０：７９６−８０１）。
【００２４】
さらに、Ｐａｒｋｉｎを安定化する（すなわち、過発現された場合でも活性のある形態においてＰａｒｋｉｎを維持する）か、あるいはミスフォールドされたＰａｒｋｉｎの適当なフォールディングを誘導する作用物が、パーキンソン病の処置のための有用な治療学的作用物であることが発見された。本発明は、なかんずく、この発見に一部基づく薬物ス
クリーニングアッセイを提供する。
【００２５】
本発明は、そのような治療学的作用物のための、細胞に基づくおよびタンパク質に基づく両アッセイを提供する。
【００２６】
Ａ．細胞に基づくアッセイ
実施例１〜３に記述されるように、野生型Ｐａｒｋｉｎが過発現される細胞では、ａｇｇｒｅｓｏｍｅ（または「Ｐａｒｋｉｎ封入体」）が形成され、そしてプロテアソーム活性が減少される。培養におけるＨＥＫ２９３細胞では、Ｐａｒｋｉｎタンパク質が低レベルで内因的に発現される。この内因性の発現レベルにおいては、タンパク質はその正常なリガーゼ活性の遂行による外には、プロテアソーム経路には検出可能には影響を与えない。しかしながら、Ｐａｒｋｉｎタンパク質が、異種のプロモーターによって作動されるｃＤＮＡから組み換え技術によって発現される（すなわち、正常な内因性発現に比較して、細胞において高レベルに発現される）場合には、少なくとも若干のＰａｒｋｉｎタンパク質はミスフォールドされ、かつ／または不溶性になり、プロテアソーム機能を妨害する。また、Ｐａｒｋｉｎの発現レベルの高い発現のプロテアソーム抑制特性は、正常な発現条件下でははるかに低い、検出不可能なレベルで起きている可能性もある。脳細胞における不溶性画分としてのミスフォールドされたＰａｒｋｉｎタンパク質の徐々の蓄積が長期間（例えば、４０〜８０年）にわたって起きて病気をもたらすかも知れない。
【００２７】
この発見に一部基づいて、本発明は、パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定する細胞に基づくアッセイを提供する。本発明の１つのアッセイでは、Ｐａｒｋｉｎを安定化するか、または適当なフォールディングを誘導する作用物は、細胞におけるａｇｇｒｅｓｏｍｅ形成および／またはプロテアソーム機能に及ぼす作用物の効果によって同定することができる。
【００２８】
１つの実施態様では、本アッセイは、（ａ）Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を得て；（ｂ）細胞を試験作用物に対して曝露し；そして（ｃ）試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能を、試験化合物に曝露されなかった類似の（対照）細胞におけるプロテアソーム機能と比較すること；によるパーキンソン病の処置のための候補化合物のスクリーニングを含む。対照細胞に較べて試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能の増大されたレベルは、その作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを指示する。代表的なアッセイは実施例６において記述される。
【００２９】
以下において、より詳細に記述されるように、このアッセイの種々の実施態様では、使用される細胞は野生型Ｐａｒｋｉｎまたは変異Ｐａｒｋｉｎを発現してもよい。好ましくは、発現のレベルは、アッセイにおいて使用される特定の細胞の正常なレベルよりも高い。組み換えＰａｒｋｉｎが安定にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞において発現される場合に、発現レベルは、正常な細胞よりも必然的に常に高いであろう。このことは、細胞におけるＰａｒｋｉｎの内因性レベルは低く、そしてＰａｒｋｉｎ発現が異種の（誘導性または構成性）プロモーターによって作動される組み換え発現は比較的に高いためである。トランスフェクトされたか、またはトランスフェクトされなかった細胞におけるＰａｒｋｉｎ発現のレベルは日常的な方法（例えば、免疫染色）を使用して測定することができる。
【００３０】
Ａ．１  プロテアソーム機能アッセイ
細胞におけるプロテアソーム機能に及ぼす作用物の効果は、プロテアソーム機能のすべてのアッセイを使用して検査することができる。主なプロテアソーム機能は細胞内タンパク質の分解である。このアッセイの１つの実施態様では、Ｐａｒｋｉｎは、レポーター−デグロン（ｄｅｇｒｏｎ）融合タンパク質をまた発現する細胞において発現され、そして
レポーターはプロテアソーム活性を測定するために使用される。融合タンパク質は、タンパク質のＣ末端（またはＮ末端）に付加された分解シグナル（「デグロン（ｄｅｇｒｏｎ）」）をもつ検出可能なポリペプチド配列を含む。具体的な説明のためには、そして限定されるものではないが、代表的なデグロン配列は、配列番号：９として提供される。分解シグナルは、ポリペプチドが分解されるプロテアソームに対してポリペプチドを標的化させるのに役立つ。プロテアソームの活性が損傷される場合、細胞におけるポリペプチドのレベルは、ポリペプチドが正常に機能するプロテアソームによって分解される細胞に較べて増大する。タンパク質レベルにおける増大は種々の方法において検出することができる。
【００３１】
１つの実施態様では、プロテアソーム機能はＧＦＰｕレポーター系を用いて細胞においてアッセイされる。ＧＦＰｕレポーター系では、タンパク質のＣ末端に付加された分解シグナルをもつ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞が使用される（参照、Ｂｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５５２−５５；Ｇｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：２７５９−６６；配列番号：６および９）。先に説明されたように、プロテアソームの活性が損傷される場合、細胞におけるＧＦＰのレベルが増大する。ＧＦＰレベルにおける増大は、生存細胞または細胞抽出物におけるＧＦＰ蛍光レベルを測定すること、および／またはＥＬＩＳＡ、イムノブロッティングなどによるＧＦＵタンパク質のレベルを測定することを含む、種々の方法において検出することができる。
【００３２】
他の類似するレポーター系が使用されてもよく、この系では、例えば、ＧＦＰ以外のレポータータンパク質が使用され、そして／または異なるデグロンが使用される。参照、例えば、Ｄａｎｔｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：５３８−５４３。赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質（例えば、Ｌｉｖｉｎｇ  ＣｏｌｏｒＴＭ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどのようなレポータータンパク質を含む、種々の他のタンパク質が使用されてもよい。あるいはまた、活性（例えば、測定できる酵素活性）、抗原性（例えば、免疫学的に検出可能な）、放射能、化学発光または蛍光標識、または類似するものによって検出可能なすべてのポリペプチド配列。デグロンは当該技術分野において既知である（参照、例えば、Ｇｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：２７５９−６６；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：６０６１−７１：Ｌｅｖｙｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９：２４４−５２；およびＳｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，１９９９，ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：６０１７−２６）。
【００３３】
１つのバージョン（「基本アッセイ」）では、本発明の細胞に基づくアッセイは、（ａ）野生型Ｐａｒｋｉｎをコードしている発現ベクターによりＧＦＰｕ発現細胞を一過性にトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトされた細胞の一部を試験作用物と接触させ、そして（ｃ）ＧＦＰｕタンパク質の分解速度が増大され、そしてＧＦＰｕレベルが試験作用物と接触されなかった対照細胞に較べて試験作用物と接触された細胞において低下されたか否かを決定することを伴う。ＧＦＰｕレベルを低下させる作用物は、さらなる分析および治療学的用途のための候補物である。ＧＦＰｕレベルを減少させる少なくともいくつかの作用物は、Ｐａｒｋｉｎ構造を安定化して、ミスフォールドされたＰａｒｋｉｎの量を低下させることによって、そのようにすることが期待される。
【００３４】
ＧＦＰｕレポーターを発現する細胞系はＡＴＣＣから入手できる（例えば、ＨＥＫ−ＧＦＰｕ  ＣＲＬ−２７９４）。あるいはまた、ＧＦＰｕレポーターまたは他のレポーター−デグロン融合タンパク質を発現する細胞は、この融合タンパク質をコードしているプラ
スミドにより細胞を形質転換することによってｄｅ  ｎｏｖｏで調製されてもよい。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ−２２６６）、ＣＯＳ細胞（ＣＲＬ−１６５１）；ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−６１）または他の哺乳動物細胞系を含む、種々の細胞のいずれが使用されてもよい。細胞は安定にまたは一過性にトランスフェクトすることができる。好ましくは、細胞は多数のアッセイをとおしての首尾一貫性のために安定なトタンスフェクタントである。
【００３５】
その他の実施態様では、本アッセイは、Ｐａｒｋｉｎを安定に発現し、そしてレポーター−デグロンタンパク質により一過性にトランスフェクトされた細胞を使用して、あるいはＰａｒｋｉｎおよびレポーターの両方により一過性にトランスフェクトされた細胞により実施できる。
【００３６】
本発明の実行のために適当な、発現ベクター、一過性トランスフェクションの方法および細胞培養の方法は、当該技術分野において周知であり、そして本明細書ではごく簡単に記述される。周知のように、発現ベクターは、典型的にはコーディング配列（例えば、Ｐａｒｋｉｎの）に操作可能に連結された真核生物の発現制御要素を含む組み換えポリヌクレオチド構築物である。発現制御要素は、プロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含んでもよい。発現ベクターは、典型的には、エピソームか、または宿主染色体ＤＮＡの組み込み部分のいずれかとして宿主生物において複製される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ｐＥＡＫ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびその他（参照、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２００５）を含む。通常は、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列により形質転換された細胞の検出を可能にするための選別マーカー、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションおよびエレクトロポレーションを含む、宿主細胞中に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入する種々の技術的に認知された技術を指す。また細胞培養技術も周知である。方法については、参照、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ；およびＡｕｓｕｂｅｌ，１９８９，前出。
【００３７】
Ａ．２  Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞
好適なプロテアソーム機能アッセイでは、レポーター−デグロン融合タンパク質を発現する細胞は、前記のように、Ｐａｒｋｉｎを発現する発現ベクターによりトランスフェクトされる。１つの実施態様では、発現ベクターは野生型Ｐａｒｋｉｎをコードしている。例えば、ヒトＰａｒｋｉｎ（ＮＭ００４５６２）のためのｃＤＮＡは、このアッセイにおいて使用するためにベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａｌ部位中に挿入することができる。
【００３８】
その他の実施態様では、Ｐａｒｋｉｎ変異体をコードしている発現ベクターが使用される。実施例４に示されるように、ある種のＰａｒｋｉｎ変異体の発現はプロテアソーム機能の抑制をもたらす。そのようなＰａｒｋｉｎ変異体を用いるプロテアソーム機能アッセイは、細胞がＰａｒｋｉｎ変異体をコードしている発現ベクターによりトランスフェクトされることを除いて、野生型Ｐａｒｋｉｎについて先に記述されたように実施できる。このプロテアソーム機能アッセイは、変異Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を試験化合
物に曝露し；試験化合物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能と試験化合物に曝露されなかった変異Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞のプロテアソーム機能特性とを比較することを伴う。代表的なＰａｒｋｉｎ変異体は、Ｓ１６７Ｎ、Ｃ２１２Ｙ、Ｔ２４０Ｍ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２８９Ｇ、Ｐ４３７Ｌを含む（参照、表１）。ある実施態様では、使用されるＰａｒｋｉｎ変異体は、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹまたはＣ２８９Ｇである。Ｐａｒｋｉｎ変異体を使用するアッセイは、野生型Ｐａｒｋｉｎを使用するアッセイの代替法として、またはそのアッセイと組み合わせて使用されてもよい。
【００３９】
【表１】
2009519040.tif 000003
【００４０】
Ａ．３  試験作用物に対する細胞の曝露
先に記述されたように、Ｐａｒｋｉｎ発現細胞が試験作用物に曝露されてプロテアソーム機能に及ぼす作用物の効果が決定される。もっともしばしば、レポーター融合タンパク質を発現する細胞（参照、例えば、実施例１）が増殖され、Ｐａｒｋｉｎをコードしている発現構築物によりトランスフェクトされる。細胞は１〜１０日間培養され、次いで試験作用物に曝露される。通常、細胞は、作用物への曝露（または曝露の開始）後２または３日試験作用物に曝露される。
【００４１】
広い種類の試験作用物が使用できる。例えば、化合物の多数の天然および合成ライブラリーが使用されてもよい（参照、ＮＣＩ  Ｏｐｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３に記述された化学的に合成されたライブラリー；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１２：７０９−７１０；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；およびＳａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２）。１つの実施態様では、作用物は、分子量１０００未満、しばしば５００未満をもつ分子のような低分子、例えば、「化学シャペロン」である。
【００４２】
曝露の期間は変えることができるが、普通には１〜２４時間、もっとも普通には４〜１６時間である。同様に、種々の濃度の作用物が試験されてもよい。濃度は作用物の性質に応じて変えることができるが、典型的には１ｎＭ〜５ｕＭの範囲内であると評価される。
典型的には、試験作用物のいくつかの異なる濃度が、ゼロ濃度の対照とともにアッセイされる（例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭ）。
【００４３】
試験作用物と接触されたＰａｒｋｉｎ発現細胞のプロテアソーム機能は、Ｐａｒｋｉｎを発現するが候補化合物に曝露されなかった細胞のプロテアソーム機能特性と比較することができる。典型的には、これは、試験作用物（種々の濃度において）に曝露された細胞と試験化合物に曝露されなかった細胞とを使用する並行実験を実施することによって達成される。すなわち、細胞におけるプロテアソーム機能は化合物の存在または不在下で測定される。あるいはまた、試験細胞におけるプロテアソーム機能は、細胞におけるプロテアソーム機能について既に得られた標準値に比較されてもよい。その他の変法では、プロテアソーム機能は試験作用物の添加前と、次いで添加後の同じ細胞において測定される。
【００４４】
培養期間の最後に、プロテアソーム機能が測定されてもよい。例えば、ＧＦＰｕ発現細胞において、ＧＦＰｕ蛍光および／またはＧＦＰｕ量が測定されてもよい。測定値は、定量的、半定量的および／または比較的であってもよい。
【００４５】
基本アッセイの修飾ができることは読者には明らかであろう。例えば、種々の形式の培養プレート（例えば、６、２４、９６または３８４穴プレート）または他の高処理デバイスが、場合によっては、トランスフェクションにおけるプラスミド量の付随調節とともに、自動デバイスと組み合わせて使用されてもよい。
【００４６】
本発明の１つの実施態様では、ＨＥＫ２９３ＧＦＰｕ細胞は、６穴細胞培養プレートの培養ウェル（例えば、各ウェル直径約３０ｍｍ）において７５％密度まで増殖される。細胞は、１ウェル当たりプラスミド約２．５ｕｇを用いて前記Ｐａｒｋｉｎ発現ベクターをトランスフェクトされ、そして細胞は試験作用物による分析前に約３日間（例えば、２〜５日）培養される。
【００４７】
Ａ．４  作用物の効果がＰａｒｋｉｎに対して特異的であるか否かを決定するためのプロテアソーム機能アッセイ
Ｐａｒｋｉｎの特異性を確定するためのプロテアソーム機能アッセイは、細胞がミスフォールディングを起こしがちであると考えられる異なるタンパク質をコードしている発現ベクターによりトランスフェクトされる以外は、野生型Ｐａｒｋｉｎについての前記基本アッセイを使用することによって実施できる。例えば、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ（Ｈｔｔ）タンパク質（配列番号：１１）またはＣＦＴＲ（配列番号：１０；アクセッション番号ＮＭ０００４９２）タンパク質が使用されてもよい。このアッセイにおいて使用されてもよいミスフォールディングを起こしがちな他のタンパク質は、ＳＯＤ１、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｕｂ＋１およびｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎを含む。このプロテアソーム機能アッセイは、非Ｐａｒｋｉｎタンパク質（例えば、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）を発現する哺乳動物細胞を候補作用物に曝露し、そしてその細胞におけるプロテアソーム機能を候補作用物に曝露されなかったＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎを発現する細胞のプロテアソーム機能特性と比較することを伴う。Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞においてはプロテアソーム機能を安定化または増大するが、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎまたは他のタンパク質を発現する細胞では、そうではない作用物は、プロテアソームに及ぼすＰａｒｋｉｎの効果を多分特異的に調節しているであろう。Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎまたは他のタンパク質を発現する細胞、ならびにＰａｒｋｉｎを発現する細胞においてプロテアソーム機能を安定化または増大する作用物は、非特異的に作用しているのであろう。
【００４８】
Ａ．５  Ｐａｒｋｉｎ凝集アッセイ
１つの実施態様では、アッセイは、（ａ）野生型または変異Ｐａｒｋｉｎを発現する哺乳動物細胞を得て；（ｂ）細胞を試験作用物に対して曝露し；そして（ｃ）試験作用物に
曝露された細胞におけるＰａｒｋｉｎ凝集を、試験作用物に曝露されなかった対照細胞のＰａｒｋｉｎ凝集特性と比較すること；によるパーキンソン病の処置のための候補化合物のスクリーニングを含む。試験作用物の存在下のＰａｒｋｉｎ凝集の低下されたレベルは、その作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを指示する。１つの実施態様では、哺乳動物細胞は野生型Ｐａｒｋｉｎを発現する。１つの実施態様では、哺乳動物細胞は変異Ｐａｒｋｉｎを発現する。若干の例では、変異Ｐａｒｋｉｎは、Ｓ１６７Ｎ、Ｃ２１２Ｙ、Ｔ２４０Ｍ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２８９Ｇ、Ｐ４３７Ｌである。好ましくは、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹまたはＣ２８９Ｇが使用される。
【００４９】
Ｂ．Ｐａｒｋｉｎ結合アッセイ
多くの化学シャペロンの期待される特性は、それらがタンパク質標的に結合することである。したがって、パーキンソン病の処置のために有用な候補作用物は、Ｐａｒｋｉｎ結合アッセイを使用して同定することができる。結合アッセイは、通常、精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質を１種以上の試験化合物と接触させ、そしてタンパク質と試験化合物が結合複合体を形成するために十分な時間放置することを伴う。形成されたすべての結合複合体は、多数の確立された分析技術のいずれかを使用して検出することができる。タンパク質結合アッセイは、限定されるものではないが、共沈、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける共移動、およびウエスタンブロットにおける共移動を測定する方法を含む（参照、例えば、Ｂｅｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，１９８５，“Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ），ｐｐ．６１−８９）。そのようなアッセイにおいて利用されるＰａｒｋｉｎタンパク質は、哺乳動物細胞（組み換えまたは天然に存在する）に由来するものであっても、または組み換え細菌細胞からの精製Ｐａｒｋｉｎであってもよい。
【００５０】
Ｃ．Ｐａｒｋｉｎ活性アッセイ
Ｐａｒｋｉｎはユビキチンリガーゼである（Ｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：３０２）。ユビキチンリガーゼ活性は、特異的リガーゼ基質を認識し、そしてＥ２酵素と相互作用してユビキチン分子をＥ２から基質に転移するタンパク質の能力によって定義される。リガーゼ活性は、補助タンパク質によって調節されるが、またリガーゼ単独でも生じ得ることが示された（参照、Ｊｏａｚｅｉｒｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍｅｎ，２０００，Ｃｅｌｌ  １０２：５４９−５２）。
【００５１】
１つの実施態様では、候補作用物がパーキンソン病を処置するために有用であるか否かを決定するために使用されるインビトロアッセイは、Ｐａｒｋｉｎリガーゼ活性に及ぼす効果を測定することを含む。ある実施態様では、リガーゼ活性は、化合物の存在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性であり、そして化合物の存在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性を、化合物の不在下での精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質のオートユビキチネーション活性と比較することである。オートユビキチネーション活性を増大する作用物の能力は、パーキンソン病を処置するために有用な作用物およびさらなる試験のための候補物の指標である。さらに、オートユビキチネーション活性を刺激する作用物は基質へのリガーゼの親和力を増大しても、またはＰａｒｋｉｎタンパク質の細胞内代謝回転を妨害してもよく、したがって、それらの活性については同様に興味深い。
【００５２】
Ｐａｒｋｉｎのオートユビキチネーション活性は、下記および実施例において記述されるように、溶液アッセイまたは固定化アッセイにおいてアッセイすることができる。
【００５３】
Ｃ．１  固定化Ｐａｒｋｉｎを使用するアッセイ
固定化アッセイでは、組み換えまたは精製Ｐａｒｋｉｎが、表面（ミクロウェルプレート、セファロースビーズ、磁気ビーズなどのような）に固定化され、そしてユビキチンを含むリガーゼ反応混合液とともにインキュベートされる。アッセイ条件下のＰａｒｋｉｎのユビキチン化のレベルは、Ｐａｒｋｉｎオートユビキチネーション活性の測定値として決定される。
【００５４】
Ｐａｒｋｉｎ活性を妨害しないＰａｒｋｉｎのいかなる固定化方法も使用することができる。１つの実施態様では、Ｐａｒｋｉｎは９６穴または３８６穴ミクロウェルプレートのウェル中に固定化される。ミクロウェルプレートは、広く市販されている、例えば、Ｉｍｍｕｌｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびＭａｘｉｓｏｒｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から。Ｐａｒｋｉｎは、Ｐａｒｋｉｎを認識する抗体が表面上に固定化された抗体結合系を使用して固定化することができ、そしてＰａｒｋｉｎが添加され、抗体によって捕捉される。あるいはまた、抗体は、Ｐａｒｋｉｎタンパク質に融合されたエピトープ・タグ（例えば、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ、ＭＢＰ、など）を認識することができる。Ｐａｒｋｉｎの酵素活性を妨害しない抗体が選ばれる。抗体に基づく固定化の方法および他の免疫アッセイは周知である（参照、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。他のアプローチでは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有するＰａｒｋｉｎタンパク質がニッケル皮膜を施されたアッセイプレートを使用して固定化されてもよい。
【００５５】
ブロッキング段階の後、Ｅ１（ユビキチン活性化酵素、場合によっては、ＧＳＴまたはＨｉｓ６によりエピトープがタグされた）、Ｅ２（ユビキチン複合酵素）、ＡＴＰ−Ｍｇおよびユビキチン（通常、標識されたユビキチン）を含むリガーゼ反応混合液が固定化Ｐａｒｋｉｎ（ＰａｒｋｉｎＥ３リガーゼ）と合わせられる。精製ユビキチン経路酵素は市販品（例えば、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，８４０  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ０２１３９より）を得ても、また報告された（Ｗｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：４８９−４９８）ように調製されてもよい。プレートへのＥ１の非特異的結合を低下させるためのブロッキングは、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；ＳｙｎＢｌｏｃｋ（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）；ＳｅａＢｌｏｃｋ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；金属キレートブロック（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；１％カゼイン；グルタチオンおよび種々のこれらの組み合わせ物によってもよく、若干の実施態様では１％カゼインによるのが好適である。ブロッキング段階後、ウェルはＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ洗浄液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはＬｉｇａｓｅバッファー洗浄液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ）により洗浄されてもよい。１つの実施態様では、Ｉｍｍｕｌｏｎ９６または３８４穴プレートは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ中１％カゼインによりブロックされ、そして５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／４ｍＭ  ＤＴＴを用いて洗浄される。
【００５６】
代表的な反応混合液は、
１：１  ビオチン：ユビキチン            ５００ｎＭ
ＧＳＴ−Ｅ１                            ２〜６ｎＭ
Ｅ２（ＵｂｃＨ７）                      ３００ｎＭ
大腸菌Ｐａｒｋｉｎタンパク質            ２〜１０ｕｇ
ＭｇＡＴＰ                              １０ｍＭ
バッファー                              ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ／ｐＨ８．８
である。
【００５７】
大腸菌Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、以下のＩＶ節に記述されるように調製することができる。アッセイは３７℃で１時間実施され、そして５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌによりウェルを洗浄することによって停止される。ＡＴＰは、ネガティブ対照として、ある種のサンプルから除外されてもよい。１つの実施態様では、アッセイは９６または３８４穴プレート形式において実施される。プレートは一定期間（例えば、室温で６０分間または３７℃で４０〜６０分間）インキュベートされる。プレートは可溶性試薬を除去するために洗浄され、そしてユビキチンの存在または量（オートユビキチネーションを受けたＰａｒｋｉｎのユビキチン成分）が決定される。
【００５８】
ユビキチンの検出方法は使用される標識またはタグに応じて異なるであろう。例えば、プレートアッセイでは、フルオレセイン・タグされたユビキチンは蛍光プレートリーダーを使用して直接検出でき、ビオチン・タグされたユビキチンは標識されたｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（例えば、ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰまたは１：５０００Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ［Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ］）を使用して検出でき、そしてエピトープ・タグされたユビキチンは抗タグ抗体を使用するイムノアッセイにおいて検出することができる。エピトープ・タグはユビキチンのＮ末端に融合されるか、あるいはユビキチン化を妨害しない他の方法で結合される。これらのアッセイおよび他の有用なアッセイは、当該技術分野において周知である。
【００５９】
Ｃ．２  溶液においてＰａｒｋｉｎを使用するアッセイ
別のアプローチでは、Ｐａｒｋｉｎのためのオートユビキチネーションアッセイは、溶液において実施され、次いで、溶液（または一定分量）が定量用の捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）プレートに移される。代表的な反応では、反応成分（下記）は５０μｌ容量に集められ、そしてアッセイが１０〜９０分間（例えば、６０分間）３７℃で行われる。
【００６０】
反応成分：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ８．８
５００ｎＭ  １：１  ビオチン：ユビキチン
２〜６ｎＭ  ＧＳＴ−Ｅ１
３００ｎＭ  Ｅ２（ＵｂｃＨ７）
２〜１０ｕｇ  大腸菌組み換えＰａｒｋｉｎタンパク質
１０ｍＭ  ＭｇＡＴＰ＊
＊最後に添加されて反応が開始できる。
【００６１】
反応終了後、反応混合液は、Ｐａｒｋｉｎを結合する固定化部分（例えば、抗Ｐａｒｋｉｎ抗体、Ｈｉｓ・タグＰａｒｋｉｎのためのニッケル、またはエピトープ・タグＰａｒｋｉｎのための抗エピトープ・タグ抗体、例えば抗ｆｌａｇＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、ＭＢＰなど）を含有する捕捉プレート（例えば、９６または３８４穴プレート）に移される。ニッケルプレートが使用されてＨｉｓ・タグＰａｒｋｉｎを固定化する場合は、反応は６ＭグアニジニウムＨＣｌの添加によって停止されてもよい。この捕捉プレートは１％カゼインによりブロックされてもよい。反応混合液は捕捉プレートにおいて６０分間インキュベートされる。この時間後、プレートは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／４ｍＭ  ＤＴＴにより３回洗浄される。検出は、ユビキチン部分に存在するタグに結合する試薬（例えば、ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ）を用いて実施され、そして標準操作を用いて処理される。
【００６２】
Ｄ．  アッセイの組み合わせ
前記の細胞に基づくおよびタンパク質に基づくアッセイは、独立にまたは種々の組み合わせにおいて使用されて、Ｐａｒｋｉｎタンパク質を発現する細胞におけるプロテアソーム損傷を低下させるパーキンソン病の処置のための候補化合物が同定されてもよい。１つの実施態様では、野生型Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞におけるプロテアソーム機能の抑制を改善する作用物の「基本アッセイ」は、さらなるアッセイ、例えば（１）Ｐａｒｋｉｎ変異体を使用するプロテアソーム機能アッセイ、（２）Ｐａｒｋｉｎ凝集アッセイ、（３）Ｐａｒｋｉｎ特異性を確立するプロテアソーム機能アッセイ、（４）Ｐａｒｋｉｎ結合アッセイ、（５）インビトロのタンパク質活性アッセイ：との組み合わせにおいて使用されてもよい。組み合わせて使用される場合、これらのアッセイはいかなる順序で実施されてもよい。例えば、最初の高処理スクリーニングがインビトロのタンパク質アッセイを用いて実施され、そして基本の細胞に基づくアッセイが第２の選別法として使用されてもよい。あるいはまた、例えば、細胞に基づくアッセイが最初に実施され、そしてインビトロのタンパク質結合および活性アッセイが第２の選別法として使用されてもよい。アッセイの他の配列および組み合わせも読者には明らかであろう。
【００６３】
１つの実施態様では、野生型Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞および変異Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞の両者のプロテアソーム機能を救済する作用物が、薬物候補を特に約束するものとして同定され、そしてさらなる試験にかけられる。１つの実施態様では、多数の細胞系、例えば、野生型Ｐａｒｋｉｎおよび変異Ｐａｒｋｉｎ（例えば、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹおよびＣ２８９Ｇ）から選ばれるタンパク質を発現する細胞において、プロテアソーム機能を救済する作用物が選択される。
【００６４】
本発明の１つの態様では、種々の細胞に基づくアッセイおよびタンパク質に基づくアッセイの組み合わせが使用されて、パーキンソン病の処置のために有用な作用物について選別される。例えば、野生型Ｐａｒｋｉｎを使用する基本の細胞に基づくアッセイは、前記アッセイのいずれか１つまたは組み合わせとともに使用されてもよい。単なる具体的な説明であって、限定されるものではないが、アッセイの代表的な組み合わせ（および代表的な、限定されるものではないが、有用であると考えられる作用物のプロフィル）が下記の表において示される。例えば、１つのスクリーニングアプローチ（Ｃ）は、２種のアッセイ：野生型Ｐａｒｋｉｎによる細胞に基づくアッセイおよびＰａｒｋｉｎ活性アッセイを含む。これらのアッセイはいかなる順序で実施されてもよい。
【００６５】
【表２】
2009519040.tif 000004
【００６６】
ＩＶ．酵素的に活性のある組み換えＰａｒｋｉｎの発現および精製
野生型および変異Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、組み換え哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞中に安定に組み込まれたｐｃＤＮＡ−Ｐａｒｋｉｎ発現ベクター）から発現され、そして精製することができる。あるいはまた、組み換えＰａｒｋｉｎはＢａｃｕｌｏウイルス発現または細菌発現を使用して得られてもよい。しかしながら、今日まで、細菌細胞（例えば、大腸菌）において発現された酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎの効率的精製をもたらす技術は報告されていない。
【００６７】
Ａ．組み換えＰａｒｋｉｎタンパク質の発現
Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、形質転換、選別および培養の日常的方法を使用して、大腸菌および他の原核生物宿主における発現によって生産することができる。使用されてもよい代表的な大腸菌菌株は、ＢＬ２１；ＢＬ２１−ｐＬｙｓＳ；ＢＬ２１−Ｓｔａｒ；ＢＬ２１−Ｃｏｄｏｎ＋；ＢＬ２１（ＤＥ３）；ＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｓｔａｒ；Ｌ２１（ＤＥ３）−Ｃｏｄｏｎ＋；およびＢＬ２１−Ａ１を含む。他の有用な細菌発現系は、バチルス属（例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ））、他の腸内細菌科（例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ），セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ），シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）または他の細菌宿主（例えば、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ロイコノストック・シトロボラム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍ）、ロイコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、およびイェルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ））を含む。
【００６８】
Ｐａｒｋｉｎは、精製を容易にするために親和力またはエピトープタグをもつ融合タンパク質として発現されてもよい。代表的なタグは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、６ｘヒスチジン［Ｈｉｓ］６、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）およびチオレドキシンを含む。好適なタグは、変性条件下で、例えば、６Ｍ塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）の存在下で親和性リガンドによって結合することができるものである。好適なタグは、ポリ−ヒスチジン（例えば、［Ｈｉｓ］６）である。実施例１は、ニッケル媒介アフィニティークロマトグラフィーを用いる精製のための全長のＨｉｓ−タグされたＰａｒｋｉｎの発現を記述している。
【００６９】
Ｂ．組み換えＰａｒｋｉｎタンパク質の精製およびリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）
本発明者らは、大腸菌において発現された場合、Ｐａｒｋｉｎが封入体に分配されることを見出だした。酵素的に活性のあるＰａｒｋｉｎ、特にＨｉｓ６−タグされたＰａｒｋｉｎは、
１）封入体の精製
２）封入体の破壊
３）クロマトグラフィー
４）リフォールディング：
を伴う４段階工程を使用して大腸菌および他の原核生物の封入体から回収することができる。これらの段階の各々が以下に記述される。
【００７０】
Ｂ．１  封入体の精製
種々の方法が、封入体の精製のために知られており、本発明の実行のために適当である。参照、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）Ｃｈ．６：“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ−ｂｏｄｙ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”
Ｂ．２  封入体の破壊
種々の方法が、また、封入体の破壊のために知られている。参照、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，前出およびＣｌａｒｋ，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
９：１５７−１６３。本発明の好適な実施態様では、封入体は塩酸グアニジン（例えば、２〜６Ｍ  ＧｕＨＣｌ）および還元剤（例えば、１〜１０ｍＭ  ＤＴＴ；４ｍＭ  ＴＣＥＰ［Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩］；４〜１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールなど）を用いて破壊される。例えば、封入体ペレットが５〜１０容量の懸濁バッファー［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．５，６Ｍ  ＧｕＨＣｌ，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール］と合わせられ、そしてｄｏｕｎｃｅホモジナーザー、音波処理または他の方法を使用して破壊できる。破壊後、何か残っている不溶性材料は遠心分離および／または濾過によって除去されてもよい。得られる可溶性画分はＰａｒｋｉｎを含有し、そして下記アフィニティークロマトグラフィーのために適当である。
【００７１】
その他の実施態様では、塩酸グアニジニウム以外の変性剤が封入体の破壊のために使用されてもよい。１つの他の実施態様では、イソチオシアン酸グアニジニウム（例えば、２〜６Ｍ）が使用されてもよい。他のあまり好適ではない実施態様では、尿素［２〜８Ｍ］；ｓａｒｋｏｓｙｌ（Ｎ−ラウロイルサルコシン）［１〜２％］；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋ｓａｒｋｏｓｙｌ［０．５〜２％＋１〜２％］；塩化Ｎ−セチルトリメチルアンモニウム［２〜５％］；Ｎ−オクチルグルコシド［０．５〜２％］；ドデシル硫酸ナトリウム［０．１〜０．５％］；アルカリ性ｐＨ〜ｐＨ＞９（例えば、ＮａＯＨの添加）；前記の組み合わせ物、および他の変性剤のような変性剤。参照、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｐ．７１（１９９９）。一般には、洗浄された封入体が変性剤中に１〜６０分間（特定の調製物、ならびに可溶化される封入体の量に応じて）再懸濁される。若干の場合には（例えば、８Ｍ尿素）、変性剤は通常、アフィニティークロマトグラフィーの前に少なくとも部分的に除去される。
【００７２】
Ｂ．３  アフィニティークロマトグラフィー
使用されるアフィニティークロマトグラフィーの性質は使用されるタグに応じて異なるであろう。注意すべきは、固相（アフィニティー樹脂）とＰａｒｋｉｎ融合タンパク質の間の親和性相互作用は、高濃度の塩酸グアニジニウム（例えば、２〜６Ｍ  ＧｕＨＣｌ）中で安定でなければならない。１つの実施態様では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）が使用される。ＩＭＡＣは、アミノ酸ヒスチジンがキレート化された遷移金属イオン、例えば、ニッケル（Ｎｉ２＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）、銅（Ｃｕ２＋）またはコバルト（Ｃｏ２＋）を結合する能力を利用する。通常、ニッケルまたはコバルトが使用される。クロマトグラフィーにおいて使用するための固定化されたニッケル生産物は、容易に入手できる（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））。クロマトグラフィーにおいて使用するための固定化されたコバルト生産物は、容易に入手できる（例えば、ＨＩＳ−ＳｅｌｅｃｔＴＭＣｏｂａｌｔ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）。
【００７３】
アフィニティーカラムへの可溶性画分の適用に続いて、カラムは洗浄されて未結合材料が除去され、そしてＰａｒｋｉｎ−Ｈｉｓ６融合タンパク質が溶出される。便利には、融合タンパク質はイミダゾール（例えば、１００〜５００ｍＭ）を用いて溶出することができる。１つの実施態様では、溶出バッファーは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ，５００ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  β−ＭＥ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡである。標的タンパク質を含有するフラクションが回収される。場合によっては、還元剤がまた、フラクションが回収されるにつれて添加されてもよい（例えば、還元剤の濃度の増大は、回収フラクションを増加することができる（例えば、１９ｍＭ  β−ＭＥまで））。
【００７４】
Ｂ．３  リフォールディング
２つの透析段階がＧｕＨＣｌ含有溶液から活性Ｐａｒｋｉｎを回収するために使用される。最初の透析段階では、溶出された材料は、アルギニンおよび還元剤を含有するバッファー溶液に対して透析される。アルギニンは範囲０．１〜１Ｍ、例えば範囲０．２〜０．８Ｍ、０．３〜０．６Ｍまたは０．３５〜０．５Ｍにおいて存在してもよい。代表的な還元剤は、ＤＴＴ（例えば、１〜１０ｍＭ、例えば１０ｍＭ）；Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、例えば４ｍＭ  ＴＣＥＰ）；β−メルカプトエタノール（例えば、４〜１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）および類似の還元力をもつ薬剤を含む。代表的なバッファーは、０．４Ｍアルギニン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴである。
【００７５】
第２の透析段階では、段階１からの透析物が実質的にアルギニンを含まないバッファーに対して透析される。タンパク質が安定である（すなわち、ほとんどのタンパク質がそれらの構造および活性を保持する）いかなるバッファーが使用されてもよいが、バッファーは多くとも最小量のアルギニン（すなわち、０．５ｍＭ未満、好ましくは０．１ｍＭ未満、もっとも好ましくは全くアルギニンを含有しない）しか含有しない。代表的なバッファーは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴである。場合によっては、この透析段階の前にグリセロールがサンプルに添加されてもよい。所望であれば、さらなる透析段階が実施されてもよい。
【００７６】
Ｐａｒｋｉｎを含有する透析物が回収され、そして何かの沈殿物が除去されてもよい。精製タンパク質の活性はオートユビキチネーションアッセイを用いて決定することができる。参照、Ｌｏｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，“ＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｅ２）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１３６４−９および実施例１０。好ましくは、精製Ｐａｒｋｉｎ材料（＞９５％Ｐａｒｋｉｎタンパク質）の比活性は、少なくとも約０．１単位（Ｕｎｉｔ）／０．５μｇＰａｒｋｉｎタンパク質である。例えば、比活性は、０．１単位／０．５μｇ〜５単位／０．５μｇであってもよい。ある実施態様では、比活性は、少なくとも約０．２Ｕ、少なくとも約０．２５Ｕまたは少なくとも約０．５Ｕ／０．５μｇＰａｒｋｉｎタンパク質である。比活性に関しては、１単位（「Ｕｎｉｔ」）は、１５分間に５０ｎｇユビキチンをＰａｒｋｉｎに転移するＰａｒｋｉｎ調製物の能力として定義される（例えば、反応液中０．５〜１０μｇ、通常、０．５μｇのＰａｒｋｉｎタンパク質が使用される、下記実施例１０において記述されるアッセイ条件下で）か、あるいは同等には、１／４単位は、３０分間に２５ｎｇユビキチンをＰａｒｋｉｎに転移する能力である。下記実施例にしたがって調製されたＨｉｓ−タグＰａｒｋｉｎは、約１／４単位／０．５μｇＰａｒｋｉｎの比活性を有する（すなわち、２５．２ｎｇユビキチンが３０分間に転移した）。あるいはまた、Ｐａｒｋｉｎ活性は、Ｐａｒｋｉｎの酵素的活性および／または生物学的機能を測定するいずれのアッセイを使用して例証されてもよい。
【００７７】
精製Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、スクリーニングアッセイ、免疫学的アッセイ、アッセイ標準およびその他を含む、種々の応用において使用することができる。Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、特定の応用のために必要なように修飾（例えば、他の化合物に複合され、そして／またはエピトープタグが除去される）または処理されてもよい。若干の実施態様では、Ｈｉｓエピトープタグが除去される。例えば、Ｈｉｓタグがトロンビンまたはエンテロキナーゼによる消化によって除去されてもよい、実施例７に記述されるプラスミドｐＥＴ３０ａベクター（参照、配列番号：５）。
【実施例】
【００７８】
Ｖ．実施例
例１：ＧＦＰｕ  ＨＥＫ２９３細胞
ＧＦＰｕ発現細胞系が次のように作成された：ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５７３）は、短いデグロンをコードしているオリゴヌクレオチド（Ｇｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：２７５９−６６）がＧＦＰのコーディング配列（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２５０１−５０４；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｐ４２２１２）に対してＣ末端に挿入された構築物を使用して形質転換された。細胞は２ｕｇｃＤＮＡによりトランスフェクトされた。細胞は４８時間培養され、形質転換株が１０００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を用いて選択された。さらなる７日後、細胞増殖培地（ＤＭＥＮ＋１０００ｕｇ／ｍｌＧ４１８）は古い培地を除去し、そして新鮮な培地を添加することによって交換された。細胞は２週間成長を続けられて、Ｇ４１８に耐性である細胞について選択された。次いで、これらの細胞は回収され、そしてＦＡＣＳ技術によって選別されて、単細胞を同定かつ単離した。これらの単細胞は、９６穴プレート中に個々に選別され、そして２週間にわたって成長かつ増殖された。次いで、細胞は２並列の９６穴プレート中に入れられた。１つのプレートはＦａｃＳｃａｎによって分析され、他方のプレートは、ＦａｃＳｃａｎ分析によってポジティブとして同定されたクローンを拡大するために使用された。
【００７９】
クローンは、プロテアソームインヒビター・ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎの存在下で、ＧＦＰの非常に低いバックグラウンドレベルおよび蛍光の２  ｌｏｇユニット以上の増大について選択された。２種のＧＦＰｕ発現細胞系、系６０および６１が、残りの実験において使用された。
【００８０】
２種の細胞系からの細胞は６穴プレートにおいて７５％密度まで増殖され、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｋｉｎ変異体、ＳｙｎｕｃｌｅｉｎまたはＳｙｎｕｃｌｅｉｎ変異体をコードしているｃＤＮＡ発現ベクターの２．５ｕｇ／ウェルによりトランスフェクトされた。細胞は２〜５日間培養され、そして蛍光検鏡法およびＦＡＣＳｃａｎを用いて検査されてＧＦＰ蛍光が測定された。若干の場合には、ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎは、ＧＦＰｕレベルのポジティブ対照としてＦＡＣＳｃａｎの５時間前に添加された。さらに、細胞抽出物がイムノブロッティングのために調製された。
【００８１】
例２：野生型Ｐａｒｋｉｎの発現はＰａｒｋｉｎ封入体をもたらし、そしてＧＦＰｕ発現細胞系においてプロテアソーム活性を減少させる
ＧＦＰｕ細胞系の両方（系６０および６１）において、Ｐａｒｋｉｎの過発現は、イムノブロッティングおよび検鏡法によって決定されるように、Ｐａｒｋｉｎ凝集体の形成をもらした。また、Ｐａｒｋｉｎトランスフェクションは、ＧＦＰｕレベルにおける衝撃的増大をもらし、このことは、Ｐａｒｋｉｎの発現または過発現がプロテアソーム活性を損傷させたことを示している。図１は細胞系６０からのイムノブロットを示す。ＧＦＰｕ／２９３細胞が、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（列１および２）またはｐｃＤＮＡ３．１−Ｐａｒｋｉｎ（列３および４）によりトランスフェクトされた。トランスフェクション４８
時間後、細胞は可溶性タンパク質および不溶性タンパク質について抽出され、そしてこれらの抽出物がＧＦＰｕ（下パネル）またはＰａｒｋｉｎ（上パネル）についてイムノブロッティングによって分析された。可溶性タンパク質抽出物（列１および３）；不溶性タンパク質抽出物（列２および４）。これらのデータは、Ｐａｒｋｉｎ発現後のＧＦＰｕタンパク質の明瞭な蓄積を例証し（列３＆４と列１＆２を比較する）、そしてまた、Ｐａｒｋｉｎ過発現後の不溶性タンパク質画分へのＧＦＰｕタンパク質の分配を例証する（列４と列３を比較する）。
【００８２】
例３：Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎではなく、Ｐａｒｋｉｎの過発現が、ａｇｇｒｅｓｏｍｅをもたらす
図２は、Ｐａｒｋｉｎタンパク質の発現が、ＧＦＰｕのような他のプロテアソーム基質の安定化および凝集をもたらすことを具体的に説明するエピ蛍光および免疫蛍光画像を示す。Ｐａｒｋｉｎ  ｃＤＮＡは、単独で（パネルＡおよびＢ）またはα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのｃＤＮＡおよびＰａｒｋｉｎｃＤＮＡにより（パネルＣ，ＤおよびＥ）実施例１に記述されたようにＧＦＰｕ  ２９３細胞中にトランスフェクトされた。細胞は４８時間後に固定され、そして免疫蛍光検鏡法のために処理された。Ｐａｒｋｉｎタンパク質は、ヒトＰａｒｋｉｎタンパク質の残基８５−９６に対する抗体ＨＰＡ１Ａにより染色することによって位置決定され、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎは、ｓｙｎ−１抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により染色することによって位置決定され、そしてＧＦＰｕはタンパク質の緑色蛍光に基づいて位置決定された。
【００８３】
Ｐａｒｋｉｎを発現する細胞では、Ｐａｒｋｉｎタンパク質（パネルＡ，矢印）は、細胞において凝集体として見出だされ、そしてＧＦＰｕの凝集体または蓄積物と共に局在している（パネルＢ，矢印）。Ｐａｒｋｉｎタンパク質を発現していない細胞（＊）では、ＧＦＰｕの蓄積はなかった。
【００８４】
Ｐａｒｋｉｎおよびα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの両方を発現する細胞では、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎは凝集せず、ＧＦＰｕにおけるＰａｒｋｉｎ媒介の増加のためには必要ではない。矢印は、両ｓｙｎｕｃｌｅｉｎおよびＰａｒｋｉｎを発現する細胞では、Ｐａｒｋｉｎ（パネルＣ）およびＧＦＰｕ（パネルＤ）の凝集体が見出だされるが、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（パネルＥ）の凝集体は見出だされないことを示している。矢印の頭は、Ｐａｒｋｉｎのみを発現する細胞を指示する。＃印はα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを発現するがＰａｒｋｉｎを発現しない細胞を同定する。この細胞はＧＦＰｕにおける増加を有せず、ｓｙｎｕｃｌｅｉｎがＧＦＰｕを増加させるのに十分ではないことを示している。ＧＦＰｕがＰａｒｋｉｎを発現する細胞において蓄積／凝集され、そしてα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎが要求されないことは、このことから明らかである。
【００８５】
例４：変異Ｐａｒｋｉｎ異型接合・「優性」Ｐａｒｋｉｎ変異の発現
異型接合性がＰＤの発生と相関される（１）野生型Ｐａｒｋｉｎまたは（２）変異Ｐａｒｋｉｎをコードしている発現プラスミドが、ＨＥＫ２９３／ＧＦＰｕ細胞中にトランスフェクトされて、プロテアソーム機能および凝集に及ぼす変異Ｐａｒｋｉｎタンパク質の影響が検査された（参照、表１）。
【００８６】
図３は、トランスフェクション２日後のＦＡＣｓｃａｎ分析の結果を示す。プロテアソーム活性の抑制は、野生型Ｐａｒｋｉｎよりも変異体Ｓ１６７Ｎ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹおよびＣ２８９Ｇによって有意に高かった。変異体Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹおよびＣ２８９Ｇは、試験されたすべての時間およびトランスフェクション濃度においてプロテアソーム活性を有意に低下させた。
【００８７】
図４は、ＨＥＫ２９３／ＧＦＰｕ細胞のトランスフェクション５日後の各サンプルのエ
ピ蛍光画像を示す。画像は各サンプルについて同じカメラ設定を使用して記録されて、蛍光強度のレベル、細胞におけるＧＦＰｕレベルの直接測定値を反映させた。図において見られるように、Ｐａｒｋｉｎ変異体の発現はＧＦＰｕをａｇｇｒｅｓｏｍｅ形成へと促進することができる。図４において示され、そしてＡｒｒａｙＳｃａｎ（Ｒ）高処理スクリーニング装置を使用する実験において確認されたように（データ未掲載）、変異体Ｓ１６７Ｎ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２１２ＹおよびＣ２８９Ｇの発現は、ＧＦＰレベルを増大した（すなわち、プロテアソーム活性を有意に低下させた）。
【００８８】
例５：ヒト脳組織におけるＰａｒｋｉｎ分布
散発性ＰＤ患者および健全な対照からのヒト脳組織におけるＰａｒｋｉｎタンパク質の局在場所および特性が、脳抽出物のイムノブロッティングによって決定された。
【００８９】
方法：  散発性ＰＤおよび正常な個人からの脳組織はＵＣＬＡ脳バンクから得られた。各サンプルは、４カ所の脳領域：前頭皮質、尾状核、被殻および黒質からの組織からなった。後者の３脳領域は黒質線状体経路の構成成分である。各脳領域からの凍結脳組織はｄｏｕｎｃｅによりホモジナイズされ、そして０．５ｍｇ組織／１ｍｌのＩＰＢ抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ７．５；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％デオキシコーレート；０．１％ＮＰ−４０；５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の比で抽出された。氷上で２０分後、ホモジネートは１０，０００ｘｇで１０分間回転された。この上澄液が除去され、そしてペレットは、同じ方法で再び抽出され、再び遠心分離された。この第２のＩＰＢ上澄液が除去され、そして最後に残っているペレットが、次に、室温で１０分間１％ＳＤＳ／１０ｍＭ  ｔｒｉｓ７．５中で可溶化され、続いて２０秒間音波処理された。
【００９０】
図５は、正常およびＰＤ脳におけるＰａｒｋｉｎタンパク質の分布を示す。脳タンパク質は電気泳動によって分離され、そしてイムノブロッティングが、ＨＰＡ１Ａ、ヒトＰａｒｋｉｎ残基８５−９５に対するポリクローナル抗体を用いて実施された。図５Ａにおいて、前記のように、（Ｉ）はＩＰＢ画分であり、（Ｓ）はＳＤＳ画分である。ＰＤサンプルでは、５２−ｋＤＰａｒｋｉｎタンパク質全体の量は増加され、そして不溶性Ｐａｒｋｉｎの量もまた増加されていることは注目に値する。
【００９１】
同じサンプルからの不溶性材料の直接比較は、図５Ｂにおいて提供される。図５Ａに較べて、より高い分子量の材料の蓄積が見られるが、これは、多分、図５Ａのゲルではなくて，図５Ｂのゲルに負荷する直前に音波処理されたからであろう。Ｐａｒｋｉｎは両サンプルの前頭皮質においては増加されるが、それは、ＰＤ患者では、脳の黒質線状体部分（被殻、尾状核および黒質）のみで増加されている。図５のデータは、散発性ＰＤ患者では、Ｐａｒｋｉｎレベルが、対照全体に較べて増加され、そして不溶性画分において富有化されることを示唆している。不溶性タンパク質は活性があるとはとても考えられない。
【００９２】
例６：細胞に基づくアッセイ
プロテアソームに標的化される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞が、野生型Ｐａｒｋｉｎを発現する発現ベクターまたはベクターのみの対照（ｐＥＡＫ；Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により一過性にトランスフェクトされた。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で１６〜２４時間維持された。続いて、細胞は３．７％ホルムアルデヒドで固定され、次いで、ＰＢＳにより２回洗浄された。次いで、細胞は１ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ染料により室温で１５分間染色され、次いでＰＢＳにより２回洗浄して、ウェルにＰＢＳの２００ｕｌを残した。細胞は、ＧＦＰに対して最適化されたＸＦ１００フィルターの設定を使用してＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩにおいて造影された。データは少なくとも２００細胞／ウェルから収集された。Ｔａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎプログラムが使用されて、細胞内蛍光（「平均（ｍｅａｎ）平均（ａｖｅｒａｇｅ）強度」）が分析さ
れたが、ここで、マスクモディファイヤー（ｍａｓｋ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）は２ピクセルに設定された。
【００９３】
図６Ａは、野生型Ｐａｒｋｉｎ（上方右）またはベクター対照（上方左）によりトランスフェクトされた細胞の画像を示している。対照のトランスフェクトされた細胞（ベクターのみ）では、非常に小さい蛍光強度であったが、Ｐａｒｋｉｎをトランスフェクトされた細胞では、ａｇｇｒｅｓｏｍｅ形成を示すＧＦＰ蛍光強度における顕著な増大が示された。
【００９４】
同様の結果が多数の異なる実験において観察された。シグナル対バックグラウンドの比は、一貫して３対５であり、ここで，シグナルはＰａｒｋｉｎトランスフェクト細胞からの平均蛍光強度として定義され、そしてバックグラウンドは対照処理細胞からの平均蛍光強度である（図６Ｂ）。
【００９５】
細胞はＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされたので、本発明者らは、ウェルからウェルへの測定された蛍光強度における変動は大きくなかったことを確認した。９６穴プレートの各ウェルにおける細胞が野生型Ｐａｒｋｉｎによりトランスフェクトされ、そして各ウェルからの平均平均蛍光強度が記録された。プレートをとおしての変動係数（ＣＶ）は全く低かったので、スクリーニングアッセイが信頼性のある一貫した結果を与えることが示された。
【００９６】
パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定するための特定の細胞に基づくアッセイは次のように実施することができる。プロテアソームに標的化される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現するＨｅｋ２９３細胞が得られ、そして野生型Ｐａｒｋｉｎを発現する発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされる（「試験細胞」）。ベクターのみの対照細胞もまた得られる。４個の等価のサブ培養物がベクターのみの細胞から調製され、そして１６個の試験サブ培養物が各親培養物から得られる。試験作用物（「ＴＡ＃１００」）が培養培地中に溶解された。試験細胞は、０、１、１０または１００μｇのＴＡ＃１００を含有する新鮮な培養培地を提供され、そしてＰａｒｋｉｎが発現される条件下で培養される。２日後、細胞は固定され、そして前記のように処理される。細胞は、ＧＦＰに対して最適化されたフィルターを使用してＡｒｒａｙＳｃａｎＶＴＩにおいて造影された。データは少なくとも２００細胞／ウェルから収集された。種々の量のＴＡ＃１００に曝露された細胞における蛍光強度および分布が決定されるが、ここで、蛍光強度は細胞におけるプロテアソーム機能の測定値である。ＴＡ＃１００の存在下の蛍光における減少は、試験作用物に曝露された細胞におけるプロテアソーム機能の増大されたレベルの証拠であり、そしてその作用物がパーキンソン病の処置のための候補化合物であることを示している。さらなるアッセイが実施されて、効果の用量−応答性が決定される。この実施例が具体的に説明するためのものであることは評価することができ、そしてこの明細書によって導かれる読者は、この特定のアッセイの多数の改変物が存在することを評価できる。
【００９７】
例７：組み換えヒトＰａｒｋｉｎの発現および精製
この実施例は、組み換えヒトＰａｒｋｉｎ−オリゴヒスチジン融合タンパク質（すなわち、Ｈｉｓ６−Ｐａｒｋｉｎ）の発現および精製を記述する。実施例８は変性タンパク質をリフォールドさせて酵素的に活性のある生成物を得ることを記述する。高濃度アルギニンおよび強力な還元剤の使用は、変性組み換えＰａｒｋｉｎをリフォードして、活性酵素を生成することにおいて有効であった。実施例９は、精製において使用されてもよい任意のさらなるクロマトグラフィー段階を記述する。
【００９８】
Ａ．Ｐａｒｋｉｎ含有封入体の精製
ヒスチジン・タグに融合された全長ヒトＰａｒｋｉｎをコードしている配列（参照、配列番号：５）が、細菌発現プラスミドｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１９）中にクローン化されて、ｐＥＴ３０ａ−Ｐａｒｋｉｎが生成された。Ｎ末端Ｈｉｓタグはｐｅｔ３０ａベクターによってコードされていて、そして５’および３’末端にそれぞれ付加されたＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をもつＰａｒｋｉｎ（ＮＭ００４５６２）のＰＣＲフラグメントが、またＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切断されたｐｅｔ３０ａベクター中に挿入される場合に、Ｐａｒｋｉｎに対してフレームＮ末端において融合される。大腸菌菌株Ｂ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳが形質転換され、そして形質転換株がカナマイシンを含むＬＢプレートにおいて抗生物質耐性に基づいて選択された。
【００９９】
ｐＥＴ３０ａ−ＰａｒｋｉｎとともにＢ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳの一夜培養物（１％グルコース、２５ｕｇ／ｍｌカナマイシンおよび３５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢにおいて増殖された）１０ｍｌが、ＬＢ＋抗生物質の各々１リットルを含有する４個のフラスコに植菌するために使用された。培養物は０．５５〜０．６のＯＤ６００まで増殖された。Ｐａｒｋｉｎ発現を誘導するために、ＩＰＴＧが０．４ｍＭまで添加され、そしてフラスコが振盪機に戻され、そして３７℃で４時間増殖された。培養物を遠心によって回収（総ペレット湿潤重量＝１５．６ｇ）し、次いで、−２０Ｃで一夜凍結された。
【０１００】
凍結ペレットは、溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）の１４０ｍｌ中に最懸濁され、そしてＤＮＡを破壊するために３分間ホモジナイズされた。得られる粘性溶液はネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）を４回通過された。得られる溶液を３０ｋＲＣＦ（ＳＳ３４ローター）において２０分間遠心して清澄にされ、そしてペレット（封入体を含有する）が回収された。
【０１０１】
封入体は、２００ｍｌの洗浄バッファー＃１［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  β−ＭＥ］中に懸濁され、２分間ホモジナーザーを使用して懸濁液が分散された。上澄液が分析のために回収され、封入体は３０ｋＲＣＦにおいて２０分間遠心することによって再ペレット化された。
【０１０２】
封入体は、２００ｍｌの洗浄バッファー＃２［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  β−ＭＥ］中に懸濁され、再びホモジナーザーを使用して固形物を分散した。上澄液がその後の分析のために回収され、封入体は３０ｋＲＣＦにおいて２０分間遠心することによって再ペレット化された。封入体サンプルの重量は２．４５ｇであった。
【０１０３】
封入体は、２０ｍｌの懸濁バッファー［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．５、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ  β−ＭＥ］中に再懸濁され、ｄｏｕｎｃｅホモジナーザーを使用して固形物塊がばらばらに壊された。濃い暗褐色であるサンプルは４℃で一夜放置された。翌朝、残っている不溶性材料が３０ｋＲＣＦにおいて２０分間遠心することによって除去され、そして上澄液は、使用前に０．２μＭＴｕｆｆｒｙｎフィルターで濾過された。上澄液２４．５ｍｌが回収されたが、これは１５．９ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有した。
【０１０４】
Ｂ．Ｐａｒｋｉｎ融合タンパク質のアフィニティー精製
上記サンプルが、硫酸ニッケルを予め負荷された４０ｍｌのＩＭＡＣカラム上に負荷された。クロマトグラフィーバッファーは、次のとおりであった：
バッファーＡ：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ  β−ＭＥ
バッファーＢ：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  β−ＭＥ
全てが添加された後（使用直前に新たに添加されるβ−ＭＥを除いて）ｐＨが再チェックされた。サンプルは、サンプルを負荷するために使用される２カラム容量の総量をもつ１％バッファーＢを用いて２ｍｌ／ｍｉｎにおいて負荷された。カラム容量対して２．５カラム容量の５％Ｂを用いる４ｍｌ／ｍｉｎにおけるさらなる洗浄。１０ｍｌフラクションが回収された。
【０１０５】
サンプルは、１００％バッファーＢの２カラム容量を用いて４ｍｌ／ｍｉｎで溶出された。１０ｍｌフラクションが回収された。各カラムが回収された後、さらなるβ−ＭＥが２０ｍＭの最終濃度まで添加され、そして０．５Ｍ  ＥＤＴＡが０．５ｍＭの最終濃度まで添加された。タンパク質濃度は洗浄および溶出中にモニターされ、そして溶出段階中に回収された４個の１０−ｍｌフラクションが蓄えられた（「プール３」）。プール３（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、５．５Ｍ  ＧｕＨＣＬ、５００ｍＭイミダゾール、１０ｍ  Ｍβ−ＭＥ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）のタンパク質濃度は２．２２ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
例８：活性酵素を生成するための変性組み換えＰａｒｋｉｎのリフォールディング
実施例７からのプール３が、（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴ）により約１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈され、そして２Ｘ１ｍｌのサンプルが、１０ｋＭＷＣＯ透析チューブを使用して５００ｍｌ（１．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴ）に対して４Ｃで一夜透析された。翌朝、肉眼的に明らかな沈殿はなかった。サンプルの１つは、（０．４Ｍアルギニン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴ）に対して４Ｃで一夜透析された。明らかな沈殿はなかった。透析物が回収され、そして濾過によって清澄化された。
【０１０７】
アルギニンは、４Ｃで一夜のサンプルのさらなる透析によって除去された。サンプル８Ｂ（５００ｕｌ、１１１０ｕｇ／ｍｌにおいて）は、〜１０％グリセロールに作成され、次いで、１０００容量の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１０ｍＭ  ＤＴＴに対して透析された。翌朝、いずれのサンプルにおいても肉眼的に沈殿は見られなかった。サンプルは、ｍｉｃｒｏｆｕｇｅにおいて最高スピードで５分間遠心され、次いでタンパク質濃度についてアッセイされた。サンプル８Ｂの収量は７８％であった。
【０１０８】
例９：任意のＳＥＣ精製
Ｈｉｓ６−タグされたＰａｒｋｉｎは、実施例６、節Ａに記述されたように、封入体から単離された。ＧｕＨＣｌ−可溶化画分は−８０℃で保存され、迅速解凍され、合わされた。新鮮ＤＴＴが１０ｍＭまで添加された。３２０ｍｌのＳ２００クロマトグラフィーカラムに負荷する前に、タンパク質サンプルは、１０ｋ  ＭＷＣＯを用いＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５を使用して濃縮された。最終濃度はＳＥＣバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０、３Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ（実施直前に新しく添加される））を用いて１０ｍｇ／ｍｌに調節された。
【０１０９】
カラムは、１ｍｌ／ｍｉｎ（２１℃）におけるＳＥＣバッファーの６４０ｍｌ（２ＣＶ）により平衡化された。変性Ｈｉｓ６−Ｐａｒｋｉｎ（５ｍｌ＠１０ｍｇ／ｍｌ）出発材料の５０ｍｇが、０．７５ｍｌ／ｍｉｎにおいてカラムに負荷された。流速は、１．５ｍｌ／ｍｉｎ  １７４ｍｌｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｒｕｎに増加された。５ｍｌのフラクションが回収され、そしてさらなるＤＴＴが１０ｍＭの最終まで添加された。フラクションは分析されるまで４℃で保存された。実施例７におけるようにリフォールドされた場合、得られるフラクション（「＃８ＢＳＥＣ」）は、ほぼ同じ「＃８Ｂ」材料の活性を有した。
【０１１０】
例１０：精製Ｐａｒｋｉｎの活性の例証
実施例６および７において記述されたように調製されたＨｉｓ６−Ｐａｒｋｉｎを含有するアッセイ混合液が調製された。５０ｕｌ容量アッセイは、次のものを含有した：
５μＭ  Ｈｉｓ６−Ｐａｒｋｉｎ
１００ｎＭヒトＧＳＴ−Ｅ１（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｌｏｔ＃０２７１４８５，７．３５μＭ）
５μＭ  ＵｂｃＨ７（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｌｏｔ＃１０７０２２４）
１００μＭ  ユビキチン＊
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ（対照からは除外される）
＊１ｍＭメチル化ユビキチン（Ｕ−５０２，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｌｏｔ＃２８８０５７４，ｄＨ２Ｏ中１ｍＭに溶解された）の２９．２μｌが、ビオチン−ユビキチン（ＵＢ−５６０，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｌｏｔ＃２０１１５８４）の５０μｇを再懸濁するために使用された。これは、１７％ビオチン化された１．１７ｍＭユビキチンの３０μｌをもたらす。
【０１１１】
反応液は３７℃で０、１５、３０、６０または９０分間インキュベートされ、そして反応は６μｌの５Ｘサンプルバッファー（２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）＋４μｌの１Ｍ  ＤＴＴを添加することによって終了された。
【０１１２】
アッセイ混合液の１５μｌ分量が、１２％ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動され、そして一夜、ウエスタンブロットのためにフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブランに転移された（１０ｍＭ  ＣＡＰＳ，ｐＨ１１，１０％ＭｅＯＨ中２５Ｖ，４℃）。メンブランはＴＢＳＴ＋５％ＢＳＡ中で２時間ブロックされ、そしてＴＢＳＴ＋３％ＢＳＡ中でＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（希釈：１：７，５００）とともに室温で１時間インキュベートされた（室温で１時間）。メンブランは室温ＴＢＳＴにより８Ｘ１５分洗浄された。ゲルからメンブランへの均一な転移はＰｏｎｃｅａｕＳ染色によって確認された。
【０１１３】
結果は図７において示される。Ｈｉｓ６−Ｐａｒｋｉｎは５７ｋＤａにおいて、ＵｂｃＨ７は１８ｋＤａにおいて、Ｕｂは８．６ｋＤａにおいて、そしてＨｉｓ６−Ｐａｒｋｉｎ−Ｕｂ複合体は６５ｋＤａ超において移動することに注目。明瞭なバンド形成パターンは、ＡＴＰを含有する反応液において１５分に始まる６６ｋＤａ領域において見られた。リガーゼ依存性活性は、９０分までのＡＴＰ不在下では観察されなかった。若干のシグナルが、Ｐａｒｋｉｎ、Ｅ１、ユビキチンおよびＡＴＰが９０分間インキュベートされた場合に、６６ｋＤａ領域に観察された（列４）。
【０１１４】
図７において示される結果は、１５分の反応時間に始まる、大腸菌産生Ｐａｒｋｉｎのリガーゼ活性を例証する他の実験と一致する。活性は６０分で横ばいになるようである−生産物におけるさらなる増加は９０分では見られなかった。６０ｋＤａ領域における明瞭な二重の生産物（ならびに高分子量の染色（ｓｍｅａｒ））の生成はＡＴＰを必要とし；これは、ユビキチンが非特異的方式でＰａｒｋｉｎと単純に共凝集している可能性を排除する。しかしながら、若干の反応生産物は、ＰａｒｋｉｎがＥ１およびユビキチンと９０分間インキュベートされた場合、ＵｂｃＨ７の不在下で見られた。ＵｂｃＨ７不在下のＰａｒｋｉｎのこの明らかなユビキチン化は、ＰａｒｋｉｎとＥ１の間の非特異的相互作用であるともっとも考えられる。この反応において９０分に生成された生産物量は、１５分にＵｂｃＨ７存在下で生成された生産物量よりもずっと少なかった（列４および１２を比較せよ）。
【０１１５】
本明細書において引用された全公表物および特許文書（特許、公開された特許明細書および未公開特許明細書）は、各々のそのような公表物または文書が、具体的および個別に、引用によって本明細書に組み入れられているように、引用によって本明細書に組み入れられている。公表物および特許文書の引用は、いずれかのそのような文書が先行技術に関していることの是認を意図してなく、またそれが、同文書の内容または期日に関するいかなる是認をも構成しない。本発明は、記述された説明および実施例によって述べられた新規性を有し、当業者は、本発明が種々の実施態様において実行でき、そして前述の説明および実施例が具体的に説明することを目的とし、次に示す請求項を限定するものではないことを認識できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】Ｐａｒｋｉｎの過発現がプロテアソーム活性の損傷をもたらすことを例証するイムノブロットを示す。
【図２Ａ−Ｅ】Ｐａｒｋｉｎタンパク質の発現がＧＦＰｕのような他のプロテアソーム基質の安定化および凝集をもたらすことを具体的に示すエピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）および免疫蛍光画像を示す。
【図３】ＧＦＰｕを発現し、そしてベクター発現ＰａｒｋｉｎまたはＰａｒｋｉｎ変異体（２ｕｇＤＮＡ）によりトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰｕレベルのＦＡＣｓｃａｎ分析を示す。棒グラフはトランスフェクション２日後のＧＦＰｕレベルを示す。変異体１６７、２１２、２７５および２８９は野生型Ｐａｒｋｉｎ（ＰＫＮ）以上にプロテアソーム活性を減少させた。
【図４】ＨＥＫ２９３／ＧＦＰｕ細胞における種々のＰａｒｋｉｎ変異体ｃＤＮＡの発現後のＧＦＰｕ・ａｇｇｒｅｓｏｍｅの形成を示す。細胞は２ｕｇのｃＤＮＡによりトランスフェクトされ、そして５日後、各サンプルのエピ蛍光画像が、蛍光強度のレベルを反映するように各サンプルについて同じカメラ設定を用いて記録された。蛍光強度は細胞におけるＧＦＰｕレベルの直接測定値である。
【図５Ａ−Ｂ】正常およびＰＤ脳におけるＰａｒｋｉｎタンパク質の分布を示す。
【図６】ベクター対照（図６Ａ、左）または野生型Ｐａｒｋｉｎ（図６Ａ、右）によりトランスフェクトされた細胞の蛍光画像、および細胞からの平均蛍光強度を示す。
【図７】組み換え大腸菌からの精製ヒトＰａｒｋｉｎについての活性アッセイの結果を示す。イムノブロットにおける列は、（１）ＭＷマーカー；（２）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、時間＝９０分；（３）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、ＡＴＰ、時間＝９０分；（４）Ｅ１、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝９０分；（５）ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝９０分；（６）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、時間＝０分；（７）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、時間＝１５分；（８）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、時間＝３０分；（９）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、時間＝６０分；（１０）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、時間＝９０分；（１１）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝０分；（１２）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝１５分；（１３）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝３０分；（１４）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝６０分；（１５）Ｅ１、ＵｂｃＨ７、ユビキチン、Ｐａｒｋｉｎ、ＡＴＰ、時間＝９０分に対する対応物を示す。
【図１】
2009519040.tif 000005
【図２Ａ−２Ｅ】
2009519040.tif 000006
【図３】
2009519040.tif 000007
【図４】
2009519040.tif 000008
【図５Ａ】
2009519040.tif 000009
【図５Ｂ】
2009519040.tif 000010
【図６Ａ】
2009519040.tif 000011
【図６Ｂ】
2009519040.tif 000012
【図７】
2009519040.tif 000013
【配列表】
2009519040000001.xml
【国際調査報告】
2009519040.tif 000041
2009519040.tif 000042
2009519040.tif 000043
2009519040.tif 000044
2009519040.tif 000045