(57)【要約】  本発明は、目的のタンパク質に機能的に結合した疎水性ターゲティングペプチドを含む融合タンパク質を用いて、目的のタンパク質を細菌細胞の細胞内疎水性封入体にターゲティングする方法；該封入体にターゲティングされる親油性化合物の生合成に関与する少なくとも１つの酵素を有する細胞内封入体を含む組換え細菌宿主を用いる、目的の親油性化合物の微生物産生法；ならびに、対応する融合タンパク質、コード配列、発現ベクター、及び組換え宿主、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質を細菌細胞の細胞内疎水性封入体にターゲティングする方法であって、目的のタンパク質に機能的に結合した疎水性ターゲティングペプチドを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、該疎水性封入体を有する細菌細胞中で発現することを含んでなる方法。
【請求項２】
該封入体が、TAG-、WE-、又はPHA-型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ターゲティングペプチドが原核生物又は真核生物ペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ターゲティング分子が、細菌、動物、又は植物起源のペプチドから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ターゲティング分子が、
a)天然状態で原核生物PHA封入体に結合したタンパク質に由来するか；又は
b)天然状態で真核生物TAGもしくはWE封入体に結合したタンパク質に由来する、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ターゲティング分子が、ポリヒドロキシアルカン酸体結合ファジン類、ペリリピン類、脂肪細胞分化関連タンパク質（ADRP）／アジポフィリン類、及びテイル相互作用性タンパク質（TIP）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ターゲティング分子が以下から選択される、請求項６に記載の方法。
a)PhaP1（配列番号19）
b)ペリリピンA（配列番号27）
c)ADRP（配列番号35）
d)TIP47（配列番号31）
又はこれらの機能的同等物
【請求項８】
目的のタンパク質が酵素である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、目的の疎水性（親油性）化合物の生合成に関与する酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酵素が以下の生合成に関与している、請求項９に記載の方法。
a)親油性ビタミン、その誘導体及び前駆体
b)脂肪酸及び脂肪アルコール
c)香味物質
【請求項１１】
細菌細胞が、PHA-、TAG-、又はWE-型の封入体を産生する能力を有する天然型細菌又は組換え細菌、特にTAGを産生するノカルジア状放線菌、ならびにタグを産生するストレプトミセス；n；WEを産生するアシネトバクター（Acinetobacter）属とアルカニボラックス（Alcanivorax）属、ならびにエシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、及びバシラス（Bacillus）属の組換え株から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細菌細胞が、ロードコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）PD630（DSM44193）及びマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）mc2155（ATCC 700084）から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細菌細胞が、融合タンパク質のコード配列を含む発現構築体を用いて、細菌宿主細胞中で機能するプロモーター配列の制御下で形質転換される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
目的の親油性化合物の微生物生産法であって、封入体に対してターゲティングされる該親油性化合物の生合成に関与する少なくとも１つの酵素を有する細胞内封入体を含む組換え細菌宿主を培養し、かつ親油性化合物の産生を支持する条件下で該宿主を培養することを含む上記方法。
【請求項１５】
目的の親油性化合物を有する封入体が単離され、目的の該親油性化合物が該封入体から回収される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該親油性化合物が以下から選択される、請求項１５に記載の方法。
a)親油性ビタミン、その誘導体及び前駆体、
b)脂肪酸及び脂肪アルコール、
c)香味物質
【請求項１７】
目的のタンパク質を細菌細胞の細胞内疎水性封入体にターゲティングするのに有用な融合タンパク質であって、目的のタンパク質に機能的に結合したターゲティングペプチドを含む、上記タンパク質。
【請求項１８】
目的のタンパク質をTAG-、WE-、又はPHA-型の封入体にターゲティングする、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
ターゲティングペプチドが原核生物又は真核生物ペプチドである、請求項１７または１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ターゲティング分子が、細菌、動物、又は植物起源のペプチドから選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
ターゲティング分子が、
a)天然状態で原核生物PHA封入体に結合したタンパク質に由来するか；又は
b)天然状態で真核生物TAGもしくはWE封入体に結合したタンパク質に由来する、
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ターゲティング分子が、ポリヒドロキシアルカン酸体結合ファジン類、ペリリピン類、脂肪細胞分化関連タンパク質（ADRP）／アジポフィリン類、及びテイル相互作用性タンパク質（TIP）から選択される、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
ターゲティング分子が以下から選択される、請求項２２に記載の融合タンパク質。
a)PhaP1（配列番号19）
b)ペリリピンA（配列番号27）
c)ADRP（配列番号35）
d)TIP47（配列番号31）
又はこれらの機能的同等物
【請求項２４】
目的のタンパク質が酵素である、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
酵素が疎水性化合物の生合成に関与する酵素である、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
酵素が以下の生合成に関与している、請求項２５に記載の方法。
a)親油性ビタミン、その誘導体及び前駆体
b)脂肪酸及び脂肪アルコール
c)香味物質
【請求項２７】
請求項１７〜２６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２８】
少なくとも１つの制御配列の制御下で、請求項２７に記載のコード配列を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む組換え細菌宿主細胞株。
【請求項３０】
請求項１１または１２で定義した微生物に由来する、請求項２９に記載の組換え細菌宿主細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的のタンパク質に機能的に結合した疎水性ターゲティングペプチドを含む融合タンパク質を用いて、目的のタンパク質を細菌細胞の細胞内疎水性封入体にターゲティングする方法；目的の親油性化合物の微生物産生法であって、該封入体にターゲティングされる該親油性化合物の生合成に関与する少なくとも１つの酵素を有する細胞内封入体を含む組換え細菌宿主を用いる方法；ならびに、対応する融合タンパク質、コード配列、発現ベクター、及び組換え宿主、に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物は、疎水性化合物、例えばトリアシルグリセロール（TAG）、蝋エステル（WE）、ステロールエステル、又はポリ（ヒドロキシルアルカノエート）（PHA）を蓄積することができる。これらの脂質及びポリマーは細胞内封入体として蓄積され、主にエネルギーとして、炭素保存場所として、及び膜脂質やステロイド生合成の前駆体として機能する。
【０００３】
真核生物の主要なエネルギー保存化合物はTAGであり、一方ほとんどの原核生物はPHAを合成する［18、24］。細菌では保存TAGとWEは主に、ノカルジア状の放線菌、ストレプトミセス（Streptomyces）、及び一部のグラム陰性株［3、31］に限定される。最も顕著な例として、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）H16は、ポリ（3-ヒドロキシ酪酸）（PHB）をその細胞乾燥重量の最大90％まで蓄積することができる（Steinbuchel、[24]）。
【０００４】
細菌の中性脂質封入体は、構造が真核生物のものに似ている。いずれもリン脂質の単層（これは細胞質から封入体を防御する）に囲まれた脂質コアからなり、従って疎水性相互作用による細胞質タンパク質の癒合又は変性を防止する。
【０００５】
細菌のTAG及びWE封入体の生物発生とタンパク質構成は、真核生物の脂質封入体とは大きく異なる。真核生物では脂質封入体は、小胞体（ER）の両方のリン脂質小葉間の脂質の蓄積と以後の脂質体出芽により発生すると考えられる。出芽粒子（これは外部ER小葉由来のリン脂質単層膜を有する）は最終的に細胞質中に放出される［5、18］。これに対して、細菌ではTAGとWEは、蝋エステルシンターゼ／アシルCoA：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（WS/DGAT）により、原形質膜の細胞質面で小さな酵素結合小滴として合成される。これらの小滴は凝集して大きな構造体になり、これがリン脂質により被覆された後、細胞質中に放出されると考えられる［11、30］。
【０００６】
動物や多くの植物では、脂質体単層は埋め込まれたタンパク質に結合しているが、細菌脂質封入体を取り囲むそのようなタンパク質は知られていない［12、30］。ペリリピン類は最もよく性状解析された哺乳動物脂質体タンパク質であり、細胞小器官の構造と形成、及びホルモン感受性リパーゼにより脂質溶解を制御することにより脂質バランスの制御に関与している［17］。3つのペリリピンアイソフォーム（A、B、及びC）は、単一の遺伝子から転写されたmRNAの選択的スプライシング型によりコードされる［9、16］。すべてのペリリピン類は共通のN末端を共有し、これはまたADRPとTIP47と非常によく似ており、これらは一緒にPATタンパク質ファミリーを構成する［15］。ペリリピンAは最も大きなアイソフォームであり、脂肪細胞脂質体に結合した最も豊富なタンパク質であり、一方ADRPとTIP47は広い組織分布を有する。ペリリピン類とADRPは脂質体表面に特異的に結合しており、一方、TIP47はまた細胞質中に豊富に存在する［4、17］。PATファミリータンパク質が遊離リボゾーム上で合成されるか又はERに沿った新生脂質体中に同時翻訳的に挿入されるかどうかについての報告は、植物のオレオシンと同様に、一致していない［5、8、15、20］。
【０００７】
オレオシン類［1、13］は、乾燥耐性植物の種子中の脂質体に結合する主要なタンパク質である。これらは、種子の脱水と出芽中にこれらが癒合することを防ぐため、脂質体の安定性の維持において主要な役割を果たすと考えられる［18］。オレオシン類はER上のポリリボゾームにより合成され、出芽プロセス中に脂質体中に同時翻訳的に取り込まれると考えられる。トウモロコシからのオレオシン類が組換え酵母（サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae））でもブラシカ・ナプス（Brassica napus）の種子脂質体にうまくターゲティングされているため、このER介在ターゲティングは真核生物に普遍的なようである［14、26］。
【０００８】
また一方で原核生物PHA封入体と他方で原核生物WE又はTAG封入体との間でタンパク質組成と生成について、大きな差が明らかになった。細菌TAG及びWE封入体に豊富に結合している特定のタンパク質は知られていないが、PHA封入体は、ユニークなクラスのタンパク質であるファジンによって被覆される（Potter & Steinbuchel [18c]; Waltermann & Steinbuchel [31]; Steinbuchel et al. [24b]）。PhaP1（これは、アール・ユートロファ（R. eutropha）H16のPHA封入体の表面上の主要なファジンである）は、その有無が細胞内の封入体の数とサイズ及びPHBの量に影響を与えるため、これらの封入体の生成と構造において重要な役割を果たす（Wieczorek et al. [31a], Potter et al., [18d], Pootter et al. [18e], York et al. [32]）。最も一般に認められたモデルによると、PHA封入体は、3HB-CoAの3-ヒドロキシ酪酸（3HB）をPHBに重合させて同時にCoAを切り離す可溶性PHAシンターゼから生成される。PHAシンターゼは、成長しているPHB鎖に共有結合しているため、親水性シンターゼと伸長するポリマー鎖からなる両親媒性複合体が生成される（Gerngross et al., [8a]）。これらの複合体は凝集してミセル様構造になり、これは、PHA鎖の伸長が進行するため、拡大してPHA顆粒になる。顆粒成長の間、ファジンとリン脂質はポリマーコアの露出した疎水性表面に移行し、従って疎水性コアと細胞質との間に界面を生成すると考えられる（Stubbe & Tian, [24c]）。しかしファジンタンパク質の３次元構造は報告されておらず、PHA顆粒へのターゲティングを仲介する及びそれに影響を与える因子やモチーフについてほとんどわかっていない（Pieper-Furst et al. [18b]）。
【０００９】
これに対してかつすでに上記したように、TAGとWEは蝋エステルシンターゼ／アシルCoA：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（WS/DGAT）により原形質膜の細胞質部位で生成される。後者は、細菌中のこれらの脂質の生合成の主要な酵素であり、脂質小滴に結合している。これらの小滴は癒合してより大きな構造体になり、これは次に細胞質中に放出され、最終的に大きな脂質封入体として出現する。
【００１０】
細菌細胞により生成される脂質体（例えばTAG）への機能性ポリペプチド（例えば機能性酵素）（これは該細胞内でその機能を利用するために充分な時間該脂質体に結合している）のターゲティングを可能にするシステムに対するニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要約
上記問題は驚くべきことに、機能性ポリペプチド（例えば機能性酵素）に機能的に結合したターゲティングペプチドを含む融合タンパク質のコード配列で脂質体産生細菌細胞を形質転換することにより解決された。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】(A)SDS-PAGEを使用する、構築された発現プラスミドを有するエム・スメグマチス（M. smegmatis）中のPhaP1、eGFP、及びＣ末端PhaP1-eGFP融合体の合成に対するアセトアミド誘導の影響（左）、及びウェスタンブロット解析を使用する、各組換えタンパク質の免疫学的検出（右）。各タンパク質の検出に使用された抗体を図に示した。Std、分子量標準物質；レーン1、アセトアミドの非存在下のエム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::phaP1；エム・スメグマチス（M. smegmatis）レーン2、0.5%(w/v)アセトアミドで誘導したpJAM2::phaP1；レーン3、アセトアミドの非存在下のエム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::egfp；レーン4、0.5%(w/v)アセトアミドで誘導したエム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::egfp；レーン5；アセトアミドの非存在下のエム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::phaP1-egfp；レーン6、0.5%(w/v)アセトアミドで誘導したpJAM2::phaP1-egfp。(B)pJAM2::phaP1を有するエム・スメグマチス（M. smegmatis）中の組換えPhaP1合成と安定性の経時的分析。0.5％(w/v)アセトアミドを補足したアンモニウム低減MSM中の24時間（レーン1）、48時間（レーン2）、72時間（レーン3）、及び96時間（レーン4）増殖後の細胞粗抽出物の電気泳動図（左）と、SDS-PAGEに対応するウェスタンブロットで抗PhaP1 IgGを使用するPhaP1の免疫学的検出（右）。(A)と(B)に示したSDS-PAGEゲル中のタンパク質をクマシーブリリアントブルーR250により視覚化した。(C)TLCにより測定した、アンモニウム低減MSM中のエム・スメグマチス（M. smegmatis）の72時間増殖後の細胞内TAG蓄積に対する異なる濃度のアセトアミドの影響。Std、トリオレイン標準物質；レーン1、0.5％(w/v)；レーン2、0.3％(w/v)；レーン3、0.1％(w/v)；レーン4、0.05％(w/v)；レーン5、0.01％(w/v)；レーン6、0.005％(w/v)；レーン7、0.001％(w/v)。
【図２】アール・オパクス（R. opacus）野生型細胞とプラスミドpJAM2::phaP1、pJAM2::egfp、又はpJAM2::phaP1-egfpを有する各組換え株から得られた、細胞粗抽出物と細胞亜分画中のPhaP1、eGFP、及びPhaP1-eGFP融合体の免疫学的検出。左の画像は粗抽出物と細胞断片のSDS-PAGE電気泳動図を示し、中央と右の画像は、SDS-PAGEに対応するウェスタンブロットでそれぞれ抗PhaP1 IgGと抗eGFP IgGを使用した免疫学的アッセイを示す。ゲル中のタンパク質はクマシーブリリアントブルーR250で染色した。Std、分子量標準物質；レーン1、野生型細胞の粗抽出物；レーン2、野生型細胞の可溶性画分；レーン3、野生型細胞から単離されたTAG封入体；レーン4、pJAM2::phaP1を有する細胞の粗抽出物；レーン5、pJAM2::phaP1を有する細胞から得られた可溶性画分；レーン6、pJAM2::phaP1を有する細胞から単離されたTAG封入体；レーン7、pJAM2::egfpを有する細胞の粗抽出物；レーン8、pJAM2::egfpを有する細胞の可溶性画分；レーン9、pJAM2::egfpを有する細胞のTAG封入体；レーン10、pJAM2::phaP1-egfpを有する細胞の粗抽出物；レーン11、pJAM2::phaP1-egfpを有する細胞の可溶性画分；レーン12、pJAM2::phaP1-egfpを有する細胞から単離されたTAG封入体。細胞は、0.5％(w/v)アセトアミドを補足したアンモニウム低減MSMで72時間増殖させた。
【図３】(A)Std1培地と、アンモニウム低減MSMで24時間(B)、48時間(C)、又は72時間(D)増殖させたアール・オパクス（R. opacus）の組換え細胞中のナイルレッドとPhaP1-eGFP融合体の蛍光顕微鏡による局在化。各パネルの上の画像は、位相差顕微鏡（PH）、微分干渉位相差顕微鏡（DIC）、及びPH、ナイルレッド（NR）、及びeGFP蛍光画像から組合せた3チャネル蛍光顕微鏡の重層画像を示す。各パネルの下の画像は、1チャネルのeGFP及びNR画像、及びNRとeGFP蛍光から組合せた2チャネル蛍光顕微鏡の重層画像を示す。さらにパネルAは、細胞質膜で弱いPhaP1-eGFP蛍光（矢印）を示すStd1で増殖させたアール・オパクス（R. opacus）のデコンボリューション画像であり、パネルDの追加のデコンボリューション画像は、アンモニウム低減MSMで72時間増殖させた細胞中の細胞内TAG封入体の表面のPhaP1-eGFP蛍光を示す。(E)NRにより封入体の表面での融合タンパク質の分布とコアでの脂質の標識とを示す、保存条件下で72時間増殖させたphaP1-egfp発現アール・オパクス（R. opacus）細胞から単離されたTAG封入体のPHとデコンボリューション2チャネルeGFP/NR蛍光画像。(F)融合していないeGFP（上のパネル）の分散した細胞質の蛍光を示す保存条件下で48時間増殖させたpJAM2::egfpで形質転換したアール・オパクス（R. opacus）の細胞のPHと蛍光画像であり、細胞内TAG封入体は2チャネルeGFP/NR蛍光画像でNRにより明らかに標識された（下のパネル）。すべての画像は、0.5％(w/v)アセトアミドの存在下で培養した細胞から得られた。棒は特に明記しない場合は1μmを示す。
【図４】エム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の組換え細胞中のPhaP1-eGFP融合タンパク質の蛍光顕微鏡による局在化。左の画像は位相差顕微鏡画像を示し、右の画像は対応する蛍光画像を示す。pJAM2::egfpを有する対照株の細胞は、細胞質中で融合していないeGFPの拡散された蛍光を示す(A)。細胞の極の1つで単一の蛍光TAG封入体を示す、Std1培地中で増殖させたpJAM2::phaP1で形質転換したエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の細胞(B)。PhaP1-eGFP（矢印）で標識したTAG封入体の数の増加を示す、アンモニウム低減MSM中で24時間(C)と48時間(D)増殖させたpJAM2::phaP1-egfpを有する細胞。すべての画像は、アセトアミドの非存在下で培養した細胞から得られた。
【図５】PhaP1は、組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中で細胞内TAG封入体と原形質膜とに結合している。ウサギ抗PhaP1 IgGと次に18nm金結合ヤギ抗ウサギブタIgGを適用して、凍結切片で免疫細胞化学を行った（黒点）。細胞をpJAM2::phaP1で形質転換し、保存条件下で72時間増殖させた後、方法欄に記載したように切片の調製を行った。略語：CW、細胞壁；CY、細胞質；TAG、TAG封入体；スケールバー＝200nm。
【図６】組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630の細胞から単離されたTAG封入体のβ−ガラクトシダーゼ活性。(A)pJAM2::phaP1-lacZを有するアール・オパクス（R. opacus）PD630の細胞から単離されたTAG封入体のβ−ガラクトシダーゼ活性。(B)方法欄に記載したようにろ過してTAG封入体を除去した後のアッセイ(A)のβ−ガラクトシダーゼ活性。(C)対照としてpJAM2::phaP1を有するアール・オパクス（R. opacus）PD630の細胞から単離されたTAG封入体のβ−ガラクトシダーゼ活性。(D)TAG封入体の除去後のアッセイ(C)のβ−ガラクトシダーゼ活性。
【図７】エム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の組換え細胞の粗タンパク質抽出物中のトウモロコシオレオシンとマウスペリリピンA発現の免疫学的検出。(A)SDS-PAGE：Std、分子量標準物質；レーン1と3、エム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2；レーン2、エム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::oleomays；レーン4、エム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::perAmur。（BとC）SDS-PAGE(A)に対応するトウモロコシオレオシン(B)とマウスペリリピンA(C)の免疫学的検出。
【図８】組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中のペリリピンAのeGFP融合体の分布。左のパネルは位相差顕微鏡画像を示し、右側は対応する蛍光画像を示す。  (A)保存条件下で24時間増殖させたアール・オパクス（R. opacus）PD630のpJAM2::egfp形質転換細胞は、非融合eGFPの拡散した細胞質蛍光を示す。矢印は、細胞内のマークしていないTAG封入体による蛍光から除外された領域を示す。(B)eGFP融合マウスペリリピンAを発現する、保存条件下でそれぞれ0、24又は48時間増殖させたpJAM2::perAmur-egfpで形質転換した細胞。eGFP融合の蛍光は、細胞内TAG封入体と結合している（矢印）。(C)保存条件下で48時間増殖させたペリリピンA-eGFP発現アール・オパクス（R. opacus）PD630細胞から単離されたTAG封入体。TAG封入体の単離後、ナイルレッドを用いてコア脂質の対染色を行った。
【図９】組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中のTIP47のeGFP融合体の分布。位相差顕微鏡画像を左のパネルに示し、対応する蛍光画像を右のパネルに示す。(A)組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中の細胞内TAG封入体の生成と、これらの封入体とTIP47-eGFPタンパク質との結合を示す経時的実験。(B)結合したTIP47-eGFP融合体を運搬する、ナイルレッドで対比させた単離されたTAG封入体。TAG封入体は、脂質保存条件下で48時間増殖させた培養細胞から単離した。
【図１０】組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中のADRPのeGFP融合体の分布。位相差顕微鏡画像（左のパネル）と対応する蛍光画像（右のパネル）を示す。細胞をpJAM2::adrpnum-egfpで形質転換し、保存条件下で0、24、及び48時間増殖させた。
【図１１】凍結切片を形成し凍結破砕した組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630細胞の細胞質TAG封入体中のTIP47の免疫金標識。(A)モルモット抗ヒトIgGと次に18nm金結合ロバ抗モルモットIgGを適用する凍結切片上のTIP47の免疫金標識。細胞をpJAM2::tip47で形質転換し、保存条件下で24時間増殖させた。凹面に(B)及び凸面に(C)破砕した細胞中の細胞内TAG封入体のコア上のTIP47部分の融合タンパク質の免疫金（12nm金）標識。(D)交差破砕TAG封入体のコア中のeGFPタグによるTIP47-eGFPの免疫金（12nm金）標識。略語：Cw、細胞壁；Cy、細胞質；TAG、TAG封入体；スケールバー＝200nm。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
1. 好適な実施形態
第1の態様において本発明は、目的のタンパク質を組換え細菌細胞の細胞内疎水性封入体にターゲティングする方法であって、目的のタンパク質に機能的に結合した疎水性ターゲティングペプチドを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、該細菌細胞中で異種発現することを含んでなる方法に関する。
【００１４】
一般に該封入体は、TAG-、WE-、又はPHA-型である。好ましくはこれらはTAG封入体である。
【００１５】
本方法で使用されるターゲティングペプチドは原核生物又は真核生物ペプチドから選択され、特に細菌、動物、又は植物起源のペプチドから選択される。好適なものは細菌及び動物起源のターゲティング分子である。特にターゲティング分子は、天然状態で原核生物、特に細菌のPHA封入体に結合したタンパク質に由来する分子であるか、又は天然状態で真核生物、特に動物もしくは植物のTAGもしくはWE封入体に結合したタンパク質に由来する分子である。
【００１６】
具体的なクラスのターゲティング分子として、ポリヒドロキシアルカン酸体結合ファジン類、例えばPhaP1；PATファミリーのターゲティングタンパク質のメンバー、特にペリリピン類、例えばペリリピンA、B、もしくはC；脂肪細胞分化関連タンパク質（ADRP）（アジポフィリンとしても知られている）；及びテイル相互作用性タンパク質（TIP）、例えばTIP47を記載することができる。ターゲティング分子の非限定例は以下から選択される：
a)PhaP1（配列番号19）
b)ペリリピンA（配列番号27）
c)ADRP（配列番号35）
d)TIP47（配列番号31）
又はこれらの機能的同等物。
【００１７】
ターゲティング法の好適な実施形態において目的のタンパク質は酵素、例えば目的の疎水性化合物又は親油性化合物の生合成に関与する酵素である。例えば該酵素は
a)親油性ビタミン、その誘導体及び前駆体
b)飽和または不飽和脂肪酸及び脂肪アルコール、特に10〜30又は18〜25個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸又は対応する脂肪アルコール、例えばポリ不飽和脂肪酸（PUFA）、又は
c)香味物質
の生合成に関与しうる。
【００１８】
a)群の化合物の非限定例として、カロチノイド、例えばβ-カロチン、ルテイン、リコペン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン；ビタミン、例えばビタミンE及びQ10がある。
【００１９】
b)群の化合物の非限定例として、18〜22個の炭素原子及び3〜6個のC=C結合を有するPUFA、例えばオメガ-3脂肪酸：18:3ω3、18:4ω3、20:3ω3、20:4ω3、20:5ω3（すなわちエイコサペンタエン酸、EPA）、22:5ω3、22:6ω3（すなわちドコサヘキサエン酸、DHA）；又はオメガ-6脂肪酸：18:2ω6、18:3ω6、20:2ω6、20:3ω6（すなわち、ビスホモ−ガンマ−リノレン酸、DGLA）、20:4ω6（すなわちアラキドン酸、ARA）、22:3ω6、22:4ω6、又は22:5ω6がある。
【００２０】
c)群の化合物の非限定例として、イソペンテニル-PPから誘導しうる香味化合物、例えばメントールがある。
【００２１】
目的の酵素の非限定例として、カロチノイド生合成に関与する酵素、例えば遺伝子ispA（ファルネシル−ジホスフェートシンターゼ）、crtE（ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ）、crtB（フィトエンシンターゼ）、及びcrtl（フィトエンデサチュラーゼ）によりコードされるものがある。
【００２２】
親油性化合物、特に上記のような化合物の生合成に必要な酵素は当該分野で公知である（例えば：Gerhard Michal, Biochemical Pathways, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin (1999); D. Schomburg and D. Stephan, Enzyme Handbook 1-12, Springer Berlin Heidelberg (1996)、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００２３】
本発明で使用される細菌細胞は、PHA-、TAG-、又はWE-型、特にTAG産生ノカルジア状の放線菌、特にロードコッカス（Rhodococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ゴルドニア（Gordonia）、スケルマニア（Skermania）、及びツカムレラ（Tsukamurella）属；ならびにTAG産生放線菌；アシネトバクター（Acinetobacter）とアルカンイボラックス（Alcanivorax）属のWE-産生菌；ならびにエシェリヒア（Escherichia）属、特に（大腸菌（E. coli））、コリネバクテリウム（Corynebacterium）（特に、シー・グルタミクム（C. glutamicum）、及びバシラス（Bacillus）（特に枯草菌（B. subtilis））の組換え菌株の封入体を産生する能力を有する未変性のもしくは組換え細菌から選択される。例えば細菌細胞は、ロードコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）PD630（DSM44193）及びマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）mc2155（ATCC 700084）から選択される。
【００２４】
該ターゲティング法のさらなる実施形態において細菌細胞は、該融合タンパク質のコード配列を含む発現構築体を用いて、該細菌宿主細胞中で機能するプロモーター配列の制御下で形質転換される。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、目的の親油性化合物の微生物生産法であって、封入体に対して上記方法でターゲティングされる該親油性化合物の生合成に関与する少なくとも１つの酵素を有する細胞内封入体を含む組換え細菌宿主を培養し、そして親油性化合物の産生を支持する条件下で該宿主を培養することを含んでなる。
【００２６】
好ましくは目的の親油性化合物を有する該封入体は単離され、目的の該親油性化合物は該封入体から回収される。該親油性化合物は好ましくは以下から選択される：
a)親油性ビタミン、その誘導体及び前駆体
b)上記で定義された脂肪酸及び脂肪アルコール、又は
c)香味物質。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、目的のタンパク質を細菌細胞の細胞内疎水性封入体にターゲティングするのに有用な融合タンパク質に関し、この融合タンパク質は該目的のタンパク質に機能的に結合したターゲティングペプチドを含む。該融合タンパク質は、目的のタンパク質を特にTAG-、WE-、又はPHA-型の封入体、好ましくはTAG封入体にターゲティングする。該ターゲティングペプチドは好ましくは上記で定義したものである。
【００２８】
好適な実施形態において融合タンパク質は：
a)PhaP1（配列番号19）
b)ペリリピンA（配列番号27）
c)ADRP（配列番号35）
d)TIP47（配列番号31）
又はこれらの機能的同等物
から選択されるターゲティング分子を含む。
【００２９】
該融合タンパク質において、該目的のタンパク質は好ましくは上記で定義した酵素である。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列；少なくとも１つの制御配列の制御下で、上記で定義した少なくとも１つの融合タンパク質のコード配列を含む発現ベクター；上記で定義した発現ベクターを含む組換え細菌宿主細胞株、に関する。好ましくは該組換え細菌宿主細胞株は、上記で定義した微生物に由来する。
【００３１】
2. 一般的用語の説明
本明細書において用語「油体」、「脂質体」、又は「封入体」は同義に使用され、上記したようにTAG-、WE-、及びPHA-型のものを含む広義で理解すべきである。該用語は細胞内構造体を包含し、これは親油性生成物の生合成に必要なエネルギー、炭素、又は化合物を保存するために生物により利用される。該用語は本明細書において、完全な構造体中に存在する任意の又はすべてのトリアシルグリセリド、リン脂質、蝋エステル、PHA、又はタンパク質成分を含む。
【００３２】
その組成と構造の結果として、該体は、これらがその中に懸濁されている異なる密度の液体から簡単かつ迅速に分離されうる。例えばその密度が油体より大きい水性媒体中では、これらは重力又は適用された遠心力の影響で浮上する。油体はまた、溶液又は懸濁液中に存在する液体及び他の固体から、サイズに基づいて、例えばその直径より小さい孔径を有する膜フィルターを使用して分画する方法により分離される。
【００３３】
用語「ターゲティングペプチド」は、上記の細胞内小器官又はその任意の機能的すなわちそのターゲティング断片の任意のものに結合した任意のタンパク質を包含する。
【００３４】
3. 発明の他の実施形態
3.1 本発明のタンパク質
本発明は、具体的に開示された「ターゲティングペプチド」又は「目的のタンパク質」又はその融合タンパク質に限定されるものではなく、その機能的同等物も包含する。
【００３５】
さらに、具体的に開示された酵素の「機能的同等物」又は類似体は、本発明の範囲内で、所望の生物学的機能又は活性、例えばターゲティング機能もしくは酵素活性を有するこれらの種々のポリペプチドである。
【００３６】
例えば「機能的同等物」は、酵素活性について使用される試験で、本明細書に記載の酵素の活性より少なくとも20％、好ましくは50％、特に好ましくは75％、特に好ましくは90％高いか又は低い活性を示す。
【００３７】
ターゲティングポリペプチドの「機能的同等物」は、本明細書に記載のターゲティングポリペプチドの特定の例と比較すると、より高いか又は低い封入体を標的とするものである。例えばターゲティング分子の効率は、本明細書に記載の免疫学的又は酵素的方法により分析することができ、実験の部に例示される。
【００３８】
本発明の「機能的同等物」はまた特に、上記アミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置に、具体的に記載したものとは異なるアミノ酸を有するが、上記生物学的活性の1つを有する変異体を意味する。従って「機能的同等物」は、1つ又はそれ以上のアミノ酸付加、置換、欠失、及び／又は逆位により得られる変異体を含み、ここで記載の変化は任意の配列位置で起きることができるが、但し、これらは本発明の性質プロフィールを有する変異体を与える。変異体と未変化ポリペプチドとの反応パターンが定性的に一致する場合、すなわち例えば同じ基質が異なる速度で変換される場合、機能的同等物が特に提供される。適切なアミノ酸置換の例を以下の表に示す：
【表１】
2009542240.tif 000002
【００３９】
上記意味の「機能的同等物」はまた、記載のポリペプチドの「前駆体」ならびにポリペプチドの「機能性誘導体」及び「塩」である。
【００４０】
「前駆体」はこの場合、所望の生物活性を有するか又は有さないポリペプチドの天然の又は合成前駆体である。
【００４１】
表現「塩」は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩ならびにアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は公知の方法で産生され、無機塩、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、及び亜鉛塩、及び有機塩基、例えばアミン（例えばトリエチルアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなど）との塩を含む。酸付加塩、例えば無機酸（例えば塩酸又は硫酸）との塩、及び有機酸（例えば酢酸及びシュウ酸）との塩も本発明により包含される。
【００４２】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、官能性アミノ酸側鎖基上で、又は公知の方法を使用してN末端又はC末端で産生されうる。かかる誘導体は、例えばアンモニウム又は1級もしくは2級アミンとの反応により得ることができるカルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応により産生される遊離アミノ基のNアシル誘導体；又はアシル基との反応により産生される遊離ヒドロキシ基のO-アシル誘導体を含む。
【００４３】
「機能的同等物」は当然また、他の生物から得られるポリペプチドならびに天然に存在する変種を含む。例えば相同配列領域の部分は配列比較により確立され得、同等の酵素は、本発明の具体的なパラメータに基づいて決定することができる。
【００４４】
「機能的同等物」はまた、例えば所望の生物学的機能を示す本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメイン又は配列モチーフを含む。
【００４５】
「機能的同等物」はさらに、上記のポリペプチド配列又はそれに由来する機能的同等物の1つと、機能性N末端又はC末端結合に少なくとも１つのさらに機能的に異なる異種配列とを有する融合タンパク質である（すなわち、融合タンパク質部分の実質的な互いの機能的傷害が無い）。これらの異種配列の非限定例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカー、又は酵素である。
【００４６】
本発明にさらに含まれる「機能的同等物」は、具体的に開示されたタンパク質の同族体である。これらは、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムに従って計算すると、具体的に開示されたアミノ酸配列と少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、特に少なくとも85％、例えば90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99％の相同性を有する。本発明の相同的ポリペプチドの相同性パーセントは特に、本明細書に具体的に開示されたアミノ酸配列の1つの全長と比較してアミノ酸残基の同一性パーセントを意味する。
【００４７】
可能なタンパク質グリコシル化の場合、本発明の「機能的同等物」は、脱グリコシル化型もしくはグリコシル化型の上記タイプのタンパク質、ならびにグリコシル化パターンを変化させることにより得られうる修飾型のタンパク質を含む。
【００４８】
本発明のタンパク質又はポリペプチドの同族体は、タンパク質の突然変異誘発、例えば点突然変異、伸長、又は短縮により産生することができる。
【００４９】
本発明のタンパク質の同族体は、変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることにより同定することができる。例えばタンパク質変種の多様なデータベースは、核酸レベルのコンビナトリアル突然変異誘発、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結により産生することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から同族体候補のデータベースを作成するのに使用できる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成機で行うことができ、次に合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することができる。縮重ゲノムの使用は、タンパク質配列候補の所望のセットをコードするすべての配列を混合物で供給することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は当業者に公知である（例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
【００５０】
先行技術では、点突然変異又は短縮により産生されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物のスクリーニング、及び選択された性質を有する遺伝子産物のcDNAライブラリーのスクリーニングについて、いくつかの方法が知られている。これらの方法は、本発明の同族体のコンビナトリアル突然変異誘発により産生された遺伝子バンクの迅速スクリーニング用に改変することができる。ハイスループット分析に基づく大きな遺伝子バンクをスクリーニングするのに最もしばしば使用される方法は、複製可能な発現ベクター中の遺伝子バンクのクローニングと、得られるベクターデータベースによる適当な細胞の形質転換と、所望の活性の検出がベクター（その生成物が検出される遺伝子をコードする）の単離を促進する条件での、コンビナトリアル遺伝子の発現とを含む。帰納的集合突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis、REM）（データベース中の機能性変異体の頻度を上昇させる方法）をスクリーニング試験と組合せて使用して同族体を同定することができる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００５１】
3.2 コード核酸配列
本発明はまた、本明細書で定義される融合タンパク質をコードする核酸配列に関する。
【００５２】
本発明はまた、本明細書に具体的に開示された配列とある特定の程度の「同一性」を有する核酸に関する。2つの核酸の間の「同一性」は、各場合に核酸の全長にわたってヌクレオチドの同一性を意味し、特に以下の設定を有するClustal Method（Higgins DG, Sharp PM. マイクロコンピューター上の迅速高感度な複数の配列の整列. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1）を使用して、company informax（USA）のVector NTI Suite 7.1プログラムにより計算される同一性を意味する：
複数のアライメントパラメータ：
ギャップオープニングペナルティ          10
ギャップエクステンションペナルティ      10
ギャップセパレーションペナルティレンジ  8
ギャップセパレーションペナルティ        off
アライメント遅延の％同一性              40
残基特異的ギャップ                      off
親水性残基ギャップ                      off
移行加重                                0
対になったアライメントパラメータ：
FASTアルゴリズム                        on
K-tupleサイズ                           1
ギャップペナルティ                      3
ウィンドウサイズ                        5
最適ダイアゴナルの数                    5
【００５３】
本明細書に記載のすべての核酸配列（一本鎖及び二本鎖DNA及びRNA配列、例えばcDNA及びmRNA）は、公知の方法でヌクレオチド構成単位の化学合成（例えば、2重らせんの個々の重複する相補的核酸構成単位の断片縮合）により産生することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば公知の方法で、ホスホアミダイト法により行われる（Voet, Voet, 第2版, Wiley Press, New York, pages 896-897）。DNAポリメラーゼのクレノウ断片と連結反応による合成オリゴヌクレオチドの蓄積とギャップの充填、ならびに一般的クローニング技術は、Sambrook et al. (1989)（後述）に記載されている。
【００５４】
本発明はまた、上記ポリペプチド及びその機能的同等物の1つをコードする核酸配列（一本鎖及び二本鎖DNA及びRNA配列、例えばcDNA及びmRNA）に関し、これは例えば人工的ヌクレオチド類似体を使用して得ることができる。
【００５５】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質又はこれらの生物活性セグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば、本発明のコード核酸を同定又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーとして使用できる核酸断片とに関する。
【００５６】
本発明の核酸分子はさらに、コーディング遺伝子領域の3'末端及び／又は5'末端からの非翻訳配列を含有することができる。
【００５７】
本発明はさらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列又はそのセグメントに相補的な核酸分子に関する。
【００５８】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞タイプや生物の相同配列の同定及び／又はクローニングに使用できるプローブとプライマーの産生を可能にする。かかるプローブ又はプライマーは一般に、本発明の核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、例えば約40、50、又は75の連続ヌクレオチド上の「ストリンジェント」条件（後述）下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００５９】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離され、さらに、組換え法により産生される場合は他の細胞物質又は培養培地を実質的に含まないか、又は化学的に合成される場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を含まない。
【００６０】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準的方法と本発明で提供される配列情報とにより単離することができる。例えばcDNAは適当なcDNAライブラリーから、具体的に開示された完全配列の1つ又はそのセグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、そして標準的ハイブリダイゼーション方法（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている）により単離することができる。さらに、開示された完全な配列の1つ又はそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる。こうして増幅される核酸は適当なベクターにクローン化され、DNA配列決定により性状解析することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的合成方法により、例えば自動DNA合成機を使用して産生することができる。
【００６１】
本発明の核酸配列又はその誘導体、これらの配列の同族体又は部分は、例えば通常ハイブリダイゼーション法又はPCR法により、他の細菌から、例えばゲノムライブラリーもしくはcDNAライブラリーを介して単離することができる。これらのDNA配列は標準的条件で本発明の配列とハイブリダイズする。
【００６２】
「ハイブリダイズする」は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標準的条件でほとんど相補的配列に結合する能力を有するが、これらの条件で非相補的パートナー間の非特異結合は起きないことを意味する。このために、配列は90〜100％相補的であり得る。互いに特異的に結合できる相補的配列の性質は、例えばノーザンブロッティング又はサザンブロッティングで、又はPCRもしくはRT-PCRのプライマー結合で利用される。
【００６３】
保存領域の短いオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションのために有利に使用される。しかし本発明の核酸のより長い断片又は完全な配列を、ハイブリダイゼーションに使用することもできる。これらの標準的条件は、使用される核酸（オリゴヌクレオチド、長い断片、又は完全な配列）により、又はいずれのタイプの核酸（DNA又はRNA）がハイブリダイゼーションに使用されるかにより変化する。例えばDNA:DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA:RNAハイブリッドの融解温度より約10℃低い。
【００６４】
例えば、特定の核酸に依存して標準的条件は、0.1〜5×SSC（1×SSC＝0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2）の濃度の水性緩衝液中で42〜58℃、又はさらに50％ホルムアミドの存在下で、例えば5×SSC、50％ホルムアミドで42℃を意味する。有利にはDNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCで約20℃〜45℃、好ましくは約30℃〜45℃の温度である。DNA:RNAハイブリッドについてハイブリダイゼーション条件は有利には、0.1×SSCで約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃である。これらの記載したハイブリダイゼーション温度は、約100ヌクレオチドの長さでG+C含量が50％の核酸の、ホルムアミドの非存在下での計算された融解温度の例である。DNAハイブリダイゼーションの実験条件は関連する遺伝学の教科書、例えばSambrook et al., 1989に記載されており、当業者に公知の式を使用して、例えば核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、又はG+C含量に依存して計算することができる。当業者はさらに、以下の教科書からハイブリダイゼーションについての情報を得ることができる：Ausubel et al. (編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (編), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００６５】
「ハイブリダイゼーション」は特にストリンジェント条件下で実施することができる。かかるハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００６６】
「ストリンジェント」ハイブリダイゼーション条件は特に以下を意味する：50％ホルムアミド、5×SSC（750mM NaCl、75mMクエン酸3ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルツ溶液、10％デキストラン硫酸、及び20g/ml変性剪断サケ精子DNAからなる溶液中で42℃で一晩インキュベーション、次に0.1×SSCで65℃でフィルターを洗浄。
【００６７】
本発明はまた、具体的に開示されたか又は誘導可能な核酸配列の誘導体に関する。
【００６８】
すなわち本発明のさらなる核酸配列は、本明細書に具体的に開示された配列から得られ、個々の又はいくつかのヌクレオチドの付加、置換、挿入、又は欠失により、これとは異なり、さらに所望の性質プロフィールを有するポリペプチドをコードしうる。
【００６９】
本発明はまた、特殊な元々の生物又は宿主生物のコドン使用頻度に従って、具体的に記載された配列と比較して、いわゆるサイレント変異を含むか又は改変されている核酸配列、ならびに天然に存在する変種、例えばそのスプライス変種もしくは対立遺伝子変種を包含する。
【００７０】
これはまた、保存的ヌクレオチド置換（すなわち問題のアミノ酸を、同じ電荷、サイズ、極性、及び／又は可溶性のアミノ酸で置換）により得られうる配列に関する。
【００７１】
本発明はまた、具体的に開示された核酸から配列多型性により得られる分子に関する。これらの遺伝子多型は、自然の変動のために集団内の個体間で存在し得る。これらの自然の変動は通常、遺伝子のヌクレオチド配列中で1〜5％の分散を与える。
【００７２】
本発明の核酸配列の誘導体は、例えば得られるアミノ酸のレベルで、全配列範囲にわたって少なくとも60％の相同性、好ましくは少なくとも80％の相同性、特に好ましくは少なくとも90％の相同性を有する対立遺伝子変種を意味する（アミノ酸レベルの相同性については、上記ポリペプチドについての詳細を参照されたい）。有利には相同性は、配列の部分的領域にわたってより高くてもよい。
【００７３】
さらに誘導体は、本発明の核酸配列の同族体（例えば動物、植物、菌類、又は細菌同族体、短縮配列、コード及び非コードDNA配列の一本鎖DNAもしくはRNA）であると理解される。例えば同族体はDNAレベルで、本明細書に具体的に開示された配列中の全DNA領域にわたって、少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、特に好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも80％の相同性を有する。
【００７４】
さらに誘導体は、例えばプロモーターとの融合体であると理解される。記載のヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、プロモーターの機能又は効率を傷害することなく、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、逆位、及び／又は欠失により改変することができる。さらにプロモーターの効率はその配列を変化することにより上昇させることができるか、又は異なる属の生物のより有効なプロモーターと完全に交換することができる。
【００７５】
3.3 本発明の構築体
本発明は、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸配列を、制御核酸配列の遺伝子制御下で含有する発現構築体、ならびにこれらの発現構築体の少なくとも1つを含むベクターに関する。
【００７６】
本発明の「発現単位」は、本明細書で定義されるプロモーターを含み、発現される核酸又は遺伝子と機能的結合した後に、この核酸又はこの遺伝子の発現、すなわち転写と翻訳とを制御する発現活性を有する核酸を意味する。従ってこの関連でこれは「制御核酸配列」とも呼ばれる。プロモーター以外に、他の制御要素、例えばエンハンサーが存在してもよい。
【００７７】
本発明において「発現カセット」又は「発現構築体」は、発現される核酸又は発現される遺伝子と機能的に結合している発現単位を意味する。従って発現単位と比較して発現カセットは、転写と翻訳を制御する核酸配列のみではなく、転写と翻訳の結果としてタンパク質として発現される核酸配列も含む。
【００７８】
本発明に関連して用語「発現」又は「過剰発現」は、対応するDNAによりコードされる微生物中の1つ又はそれ以上の酵素の産生又は細胞内活性の上昇を記載する。このために例えば生物に遺伝子を挿入し、既存の遺伝子を別の遺伝子で置換し、遺伝子のコピー数を増加させ、強いプロモーターを使用し、又は高活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができ、そして場合によりこれらを組合せることができる。
【００７９】
好ましくは本発明のこのような構築体は、各コード配列から5'-上流にプロモーターを含み、3'-下流にターミネーター配列を含み、さらに随時通常の制御要素を含み、それぞれの場合にコード配列に機能的に結合している。
【００８０】
本発明において「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」又は「プロモーター配列」は、転写される核酸と機能的に結合しており、この核酸の転写を制御する核酸を意味する。
【００８１】
この関連で「機能的（functional）」又は「機能的（operative）」は、例えばプロモーター活性を有する核酸の1つと、転写すべき核酸配列と、随時さらなる制御要素（例えば、核酸の転写を可能にする核酸配列、及び例えばターミネーター）との、核酸配列の転写において各制御要素がその機能を果たすことができるような、連続的配置を意味する。これは必ずしも化学的意味で直接の結合を必要とはしない。遺伝子制御配列（例えばエンハンサー配列）はまた、より遠い位置から又は他のDNA分子から、標的配列にその機能を及ぼすことができる。2つの配列が互いに共有結合するように、転写される核酸配列はプロモーター配列の後（すなわち3'側）に位置する配置が好ましい。プロモーター配列と遺伝子導入的に発現される核酸配列との距離は、200bp（塩基対）未満、又は100bp未満、又は50bp未満でもよい。
【００８２】
プロモーターやターミネーターとは別に、言及される制御要素の例にはターゲティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製開始点などがある。適当な制御配列は例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００８３】
本発明の核酸構築体は特に、本明細書に具体的に記載されたもの、その誘導体及び同族体から選択される配列、ならびに遺伝子発現を制御、例えば上昇させるための1つ又はそれ以上の制御シグナルと機能的に有利に結合した本明細書に具体的に記載したアミノ酸配列から得られうる核酸配列を含む。
【００８４】
これらの制御配列以外に、自然の制御がスイッチオフされ、遺伝子の発現が増加するように、これらの配列の天然の制御は実際の構造遺伝子の前に存在してもよく、場合により遺伝的に改変されてもよい。核酸構築体は簡単な設計でもよく、すなわちコード配列の前に追加の制御シグナルは挿入されておらず、その制御で自然のプロモーターを除去していない。その代わりに、制御が起きずに遺伝子発現が上昇されるように、自然の制御配列はサイレンス化される。
【００８５】
好適な核酸構築体は有利には、プロモーターに機能的に結合した前記エンハンサー配列の1つまたはそれ以上を含有し、これは核酸配列の発現上昇を可能にする。さらなる有利な配列（例えば他の制御要素又はターミネーター）もまた、DNA配列の3'末端に挿入することができる。本発明の核酸の1つまたはそれ以上のコピーを構築体中に含有することができる。構築体はまた、他のマーカー、例えば抗生物質耐性もしくは栄養要求性相補遺伝子を、随時構築体で選択するために含有することができる。
【００８６】
適当な制御配列の例は、cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP (fhaPBAD)SP6-、ラムダ-PR-、又はラムダ-PL-プロモーターのようなプロモーター中に含有され、これらはグラム陰性菌で有利に使用される。他の有利な制御配列は、例えばグラム陽性プロモーターace、amy、及びSPO2中、酵母又は真菌のプロモーターADC1、MFアルファ、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に含有される。人工的プロモーターも制御のために使用することができる。
【００８７】
発現のために核酸構築体は宿主生物中に、有利には宿主中の遺伝子の最適発現を可能にするベクター、例えばプラスミド又はファージ中に挿入される。プラスミドやファージ以外にベクターはまた、当業者に公知のすべての他のベクター、例えばウイルス（例えばSV40、CMV、バキュロウイルス、及びアデノウイルス）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、及び線状又は環状DNAを意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物中で自律複製できるか、又は染色体により複製することができる。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を示す。
【００８８】
適当なプラスミドには、例えば大腸菌（E. coli）、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、又はpBdCI；ノカルジア状の放線菌pJAM2；ストレプトミセスpIJ101、pIJ364、pIJ702、又はpIJ361；バシラス（Bacillus）中のpUB110、pC194、又はpBD214；コリネバクテリウム中のpSA77又はpAJ667；真菌中のpALS1、pIL2、又はpBB116；酵母中の2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13、又はpEMBLYe23、又は植物中のpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、又はpDH51がある。前記プラスミドは可能なプラスミドからの小さい選択物である。他のプラスミドは当業者に周知であり、例えば教科書Cloning Vectors（編者Pouwels P.H. et al. Elsevier、Amsterdam-New York-Oxford、1985、ISBN 0 444 904018）に記載されている。
【００８９】
ベクターのさらなる実施形態において、本発明の核酸構築体又は本発明の核酸を含有するベクターは、微生物中に線状DNAの形で有利に挿入され、非相同又は相同的組換えにより宿主生物のゲノム中に組み込まれる。この線状DNAは、プラスミドのような線状化ベクター、又は本発明の核酸構築体もしくは核酸を含有してもよい。
【００９０】
生物中の異種遺伝子の最適発現のために、その生物で使用される特異的なコドン使用頻度に従って核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度は、問題の生物の他の公知の遺伝子のコンピューター評価に基づいて容易に決定することができる。
【００９１】
本発明の発現カセットの作製は、適当なプロモーターと適当なコードヌクレオチド配列及びターミネーターシグナルもしくはポリアデニル化シグナルとの融合に基づく。このために一般的組換え及びクローニング法が使用され、例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)およびT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されている。
【００９２】
組換え核酸構築体又は遺伝子構築体は有利には、適当な宿主生物中での発現のために宿主特異的ベクター中に挿入され、宿主での遺伝子の最適発現を可能にする。ベクターは当業者に周知であり、例えば”Cloning Vectors” (Pouwels P.H. et al., Publ. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に記載されている。
【００９３】
3.4 本発明で使用できる宿主
文脈により用語「微生物」は、出発微生物（野生型）又は本発明の遺伝子改変微生物、又はこれらの両方を意味する。
【００９４】
本発明において用語「野生型」は、対応する出発微生物を意味し、必ずしも天然に存在する生物に対応する必要は無い。
【００９５】
本発明のベクターにより、組換え微生物を産生することができ、これは例えば本発明の少なくとも１つのベクターで形質転換されており、本発明のポリペプチドの産生のために使用することができる。上記の本発明の組換え構築体は有利には、適当な宿主系に挿入され発現される。好ましくは、当業者に公知の一般的クローニングとトランスフェクション法（例えば共沈殿、プロトプラスト融合、電気穿孔法、レトロウイルストランスフェクションなど）を使用して、各発現系で記載の核酸の発現を確保することができる。適当な系は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,  F. Ausubel et al., Publ. Wiley Interscience, New York 1997,またはSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【００９６】
原理的にすべての原核生物は、本発明の核酸又は核酸構築体の宿主生物と見なされる。宿主生物として細菌が有利に使用される。好ましくはこれらは、PHA-、TAG-、又はWE-型、特にTAG産生ノカルジア状(nocardioform)の放線菌、特にロードコッカス（Rhodococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ゴルドニア（Gordonia）、スケルマニア（Skermania）、及びツカムレラ（Tsukamurella）属；ならびにTAG産生放線菌；WE産生アシネトバクター（Acinetobacter）とアルカンイボラックス（Alcanivorax）属；ならびにエシェリヒア（Escherichia）属（特に大腸菌（E. coli））、コリネバクテリウム（Corynebacterium）（特に、シー・グルタミクム（C. glutamicum）、及びバシラス（Bacillus）（特に枯草菌（B. subtilis））の組換え株の、封入体を産生する能力を有する天然型細菌もしくは組換え細菌から選択される。
【００９７】
従って本発明の宿主生物は好ましくは、上記定義の酵素活性をコードする本明細書に記載の少なくとも１つの核酸配列、核酸構築体、又はベクターを含有する。
【００９８】
本発明の方法で使用される生物は、宿主生物に依存して、当業者に公知の方法で増殖又は繁殖される。一般的に微生物は液体培地（これは一般的には糖の形の炭素源、一般的には有機窒素源、例えば酵母エキス又は硫酸アンモニウムのような塩の形の窒素源、微量元素、例えば鉄、マンガン、及びマグネシウム塩、及び随時ビタミンを含む）で、0℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃の温度で酸素を通気して培養される。液体栄養培地のpHは、一定値に維持（すなわち増殖中に制御するか又は制御しない）することができる。増殖は、バッチ的、半バッチ的、又は連続的に行われる。栄養物質は発酵の開始時に供給されるか、又は以後に、半連続的又は連続的に供給することができる。
【００９９】
3.5 親油性化合物の組換え産生
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現する融合タンパク質産生微生物を培養することによる本発明の親油性化合物の産生法であって、培養は該親油性化合物の酵素的産生を可能にし、培養物から所望の化合物を単離することを可能にする条件下で行われることを特徴とする方法に関する。化合物はまた、所望であればこの方法で工業的規模で産生することもできる。
【０１００】
該微生物は、所望の親油性化合物の合成のために必要な酵素活性を与える1つまたはそれ以上の融合タンパク質を発現しうる。酵素活性と脂質体が極めて近いため、産生された親油性産物は、脂質体に結合、すなわち取り込まれるか及び／又は吸着されると予測される。これは酵素反応の平衡をさらに所望の産物の方向にシフトさせるであろう。さらに脂質体に結合した生成物は、バイオマスバルクから容易に分離でき、従来の精製法（例えば抽出及びクロマトグラフィー）により精製することができる。
【０１０１】
所望の親油性産物の生合成を開始する前に、細菌細胞内に充分な脂質体担体が提供されていることに注意することが有利である。これは、例えば実施例中の具体的な株について例示されるように、細胞をいわゆる保存条件下で培養することにより便利に行われる。充分な酵素活性が脂質体にターゲティングされるように、次に又は同時に必要な融合タンパク質の組換え発現が誘導される。所望の親油性最終生成物の酵素的産生に必要な基質及び／又は共同基質を細菌細胞が産生できない（全くできないか又は充分な量ではできない）場合、必要な抽出物を培養培地に添加することができる。
【０１０２】
本発明で使用される微生物は、連続的に又は非連続的にバッチ法又は供給バッチ法又は繰り返し供給バッチ法で培養することができる。公知の培養法の総説は、教科書Chmiel (Bioprocesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))、又はStorhasによる教科書 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【０１０３】
使用される培養培地は、適切な方法で特定の株の要求を満足しなければならない。種々の微生物の培養培地の説明は、ハンドブック"Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)に記載されている。
【０１０４】
本発明で使用できるこれらの培地は、一般に1つまたはそれ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び／又は微量元素を含む。
【０１０５】
好適な炭素源は、糖、例えば単糖、二糖、又は多糖である。非常に良好な炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、乳糖、マルトース、ショ糖、ラフィノース、デンプン又はセルロースである。糖はまた、複合化合物（例えば、糖蜜、又は糖精製からの他の副産物）を介して培地に加えることもできる。
【０１０６】
また種々の炭素源の混合物を加えることも有利となり得る。他の可能な炭素源は油脂、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ピーナツ油、及びココナツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸、又はリノール酸、アルコール、例えばグリセロール、メタノール、又はエタノール、及び有機酸、例えば酢酸又は乳酸である。
【０１０７】
窒素源は、通常有機もしくは無機窒素化合物又はこれらの化合物を含有する物質である。窒素源の例には、アンモニアガス又はアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸、又は複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどがある。窒素源は別々に又は混合物として使用することができる。
【０１０８】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、及び鉄の塩酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩を含む。
【０１０９】
無機イオウ含有化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物、及び有機イオウ化合物、例えばメルカプタン及びチオールをイオウ源として使用することができる。
【０１１０】
リン酸、リン酸二水素カリウム、又はリン酸水素二カリウム、又は対応するナトリウム含有塩を、リン源として使用することができる。
【０１１１】
溶液中の金属イオンを維持するために、キレート剤を培地に加えることができる。特に適切なキレート剤は、ジヒドロキシフェノール、例えばカテコール又はプロトカテク酸塩、又は有機酸、例えばクエン酸を含む。
【０１１２】
本発明で使用される発酵培地はまた、他の増殖因子、例えばビタミン又は増殖促進剤（これは、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、及びピリドキシンを含む）を通常含有する。増殖因子と塩はしばしば、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの培地の複合成分から得られる。さらに適切な前駆体を培地に加えることができる。培地中の化合物の正確な組成は、具体的な実験に大きく依存し、個々の場合について個別に決定しなければならない。培地の最適化についての情報は教科書"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に記載されている。増殖培地はまた販売業者から得られ、例えばStandard 1 (Merck) 又は BHI (Brain heart infusion, DIFCO)などがある。
【０１１３】
培地のすべての成分は、加熱（1.5bar、121℃で20分）又は滅菌ろ過により滅菌される。成分は一緒に滅菌されるか、又は必要であれば別に滅菌される。培地のすべての成分が培養開示時に存在してもよいし又は、場合により、連続的にもしくはバッチ供給法で加えることができる。
【０１１４】
培養温度は通常15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃であり、実験中一定に維持しても変化させてもよい。培地のpHは5〜8.5の範囲、好ましくは約7.0である。培養のためのpH値は、塩基性化合物（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水）又は酸性化合物（例えばリン酸又は硫酸）を加えることにより培養中に制御することができる。消泡剤（例えば脂肪酸ポリグリコールエステル）を発泡の制御のために使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的作用を有する適当な物質（例えば抗生物質）を培地に加えることができる。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物（例えば周囲空気）が培養物に供給される。培養物の温度は通常20℃〜45℃である。培養は、所望の生成物が最大になるまで続けられる。これは通常10時間〜160時間以内に達成される。
【０１１５】
細胞は、高周波超音波、高圧（例えばフレンチプレスセル）、浸透圧破壊、界面活性剤作用、溶解性酵素、又は有機溶媒により、ホモジナイザーを使用して、又は記載の方法のいくつかを組合せることにより、随時破砕することができる。
【０１１６】
以下の例は本発明を単に例示するものである。当業者には明らかな多くの可能な変更態様も、本発明の範囲内に包含される。
【０１１７】
（実施例）
【実施例１】
【０１１８】
実験の部：
1. 材料と方法
a)株、プラスミド、及び培養条件
大腸菌（Escherichia coli）株XL1ブルー（Stratagene）とS17-1（Simon et al. [22a]）の細胞をLuria-Bertani（LB）培地（Sambrook et al. [21]）中で日常的手法で培養した。ロードコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）PD630（DSM 44193, Alvarez et al. [2])とマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）mc2155（ATCC 700084, Snapper et al. [23]）をStandard 1（Std1）培地（Merck）中で培養した。
【０１１９】
TAGの生合成と封入体の生成を促進するために細胞を、0.1g/l NH4Clを含有するミネラル塩培地（MSM）に移し、24、48、及び72時間培養した（Schlegel et al., [22]）。さらにエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155をSauton's培地（SM）（Darzins, 1958）でも培養した。SMでのTAG蓄積を促進するために、リン酸カリウム濃度を0.05g/lに低下させた。アール・オパクス（R. opacus）PD630又はエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155用にそれぞれグルコン酸ナトリウム又はグルコース（10g/l）としてMSM及びSMに炭素を供給した。プラスミドpJAM2と誘導体を維持するために、Sambrook et al. [21]に従ってカナマイシンを50μg/mlの最終濃度で使用した。pJAM2と誘導体のアセトアミダーゼ（ace）プロモーターの誘導を、各培養物に0.5％(w/v)アセトアミドを加えることにより行った（Triccas et al. [29]）。すべての液体培養は、邪魔板を取り付けた三角フラスコで、大腸菌（E. coli）は37℃で、アール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155は30℃で行った。18g/lの寒天を加えて固形培地を調製した。
【０１２０】
b)エレクトロコンピテント（electrocompetent）細胞の調製
プラスミドをモデル2550エレクトロポレーター（Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Germany）でアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155に移した。エレクトロコンピテント細胞の調製は、アール・オパクス（R. opacus）PD630についてはKalscheuer et al. [10]に記載されたように、エム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155についてはSnapper et al. [23]に記載されたように行った。
【０１２１】
c) 粗細胞抽出物、可溶性画分、及びTAG封入体の調製
上記したように低アンモニウム濃度のMSM中でアール・オパクス（R. opacus）とエム・スメグマチス（M. smegmatis）細胞を増殖させ、遠心分離（20分、6000×g、4℃）により採取し、2倍量の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に再懸濁した。フレンチプレスセル（1000MPa）に3回通した後、粗抽出物を得た。可溶性画分を得るために、Sorvall Discovery 90SE超遠心分離機で16000×g、4℃で30分、次に100000×g、4℃で90分遠心分離して、細胞破片を粗抽出物から除去した。膜断片を100000×gで超遠心分離してペレット化し、0.1mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で洗浄後、この緩衝液に再懸濁した。1〜2mlの粗抽出物を不連続グリセロール勾配上にのせて、TAG封入体を調製した。不連続グリセロール勾配は、22、44、及び88％(v/v)グリセロールの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）の各3mlからなる。勾配を170000×gで4℃で1時間遠心分離した。TAG封入体を取り出し、次に0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で2回洗浄し、さらなる分析のために使用した。
【０１２２】
d) 単離されたTAG封入体のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定
pJAM2::phaP1-lacZ又は対照としてpJAM2::phaP1を有するアール・オパクス（R. opacus）PD630細胞から単離したTAG封入体を、上記したように調製した。封入体（10mg湿重量）を100μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に懸濁し、次に17mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）、3mlのオルトニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）溶液（8％w/v）、1mM塩化マグネシウム、45mM β−メルカプトエタノール、及び4μl SDS溶液（20％w/v）からなる650μlの反応溶液を添加した。アッセイを37℃で30分インキュベートした。反応を停止するために、400μlの1M炭酸ナトリウムを加えた。次にろ過してTAG封入体をアッセイから除去し、ろ液の吸光度を405nmで測定して、切断したONPG量を分析した。酵素活性の計算のために、各生成物ONP（オルトニトロフェノール）についてε405nm＝4.6mM-1cm-1を使用した。封入体を除去した後アッセイのONPGのさらなる切断が起きなかったため、測定したβ−ガラクトシダーゼ活性は基本的にTAG封入体に関係していた。
【０１２３】
e) 免疫ブロット分析
同等のタンパク質濃度に基づいて細胞溶解物又は細胞亜分画の既知量をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲルに溶解し、Towbin et al. [28]の方法に従ってポリビニリデン（PVDF）膜に転写した。膜上のタンパク質をポンソーSで染色し、ポリクローナルニワトリ抗トウモロコシオレイシンIgG[19]、ポリクローナルウサギ抗マウスPAT IgG（C. Londosからの贈与）、ヒトTIP47（GP30；Progen Biotechnik）のN末端（アミノ酸1〜16）である合成ポリペプチドに対してモルモットで作製したポリクローナル抗体、ポリクローナルウサギ抗PhaP1 IgG（Wieczorek et al.,[31a]）、及びヒトADRP（AP125；Progen Biotechnik）のN末端（アミノ酸5〜27）である合成ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体、を使用して免疫学的に分析した。ヤギ抗ウサギ、抗マウス、又は抗ニワトリIgGアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用して、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート二カリウム／ニトロテトラゾリウムブルークロリドを不溶性の黒い生成物（Sigma）に変換することにより、IgGを視覚化した。
【０１２４】
f) 顕微鏡
0.5μg/mlナイルレッド（ストック溶液ジメチルスルホキシド中0.5mg/ml）を含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中で4℃で30分サンプルをインキュベートすることにより、ナイルレッド標識細胞と単離したTAG封入体を調製した。標識後、細胞と封入体を16000×gで4℃で遠心分離して沈殿させ、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に再懸濁した。
【０１２５】
細胞とTAG封入体を静電相互作用によりガラススライドに付着させ、これはポリ（α-L-リジン）（PL）ヒドロブロミドの吸着により陽性に荷電した。ガラス表面をPLヒドロブロミドで被覆するために、きれいなガラススライドを水道水で洗浄し、メタノールに浸漬し、脱イオン水で再度洗浄することにより完全に洗浄した。次に0.01％(w/v)のPLヒドロブロミド溶液を1滴加えた。空気乾燥後、スライドを脱イオン水で洗浄し、細胞懸濁液又はTAG封入体を1滴加えた。15分後、被覆スライドを脱イオン水で洗浄して、ゆるく結合した細菌又はTAG封入体を除去し、蛍光顕微鏡に移した。
【０１２６】
スライドを100x/1.4 NA 油浸Plan-Apochromat対物レンズと4xもしくは2.5x補助筒レンズを取り付けたZeiss Axio Imager M1アップライト広視野蛍光顕微鏡で、位相差（PH）又は微分干渉コントラスト（DIC）モードで観察した。ペルチェ冷却AxioCam MRm 16ビットデジタルモノクローム電荷結合素子カメラ（CCD）を使用して画像を採取した。2/3"サイズのCCDチップは、それぞれが6.45×6.45nmの大きさの1388(H)×1040(V)画素からなる。ナイルレッドとeGFP蛍光をZeiss HBO 103 W/2高圧水銀アークランプを使用して励起した。シングルチャネル及びマルチチャネル蛍光画像の記録は、発光帯域フィルターを使用して、eGFPについてEX/EM 470±40/525±50 nm、そしてナイルレッドについてEX/EM 550±25/605±70 nmで行った。全Z軸をカバーする光学部分の45〜96面からなる画像群を、0.275μmの増分で異なる焦点位置で高精度電動式xyzステージを使用して画像を集めることにより、作成した。サンプルと蛍光チャネルに依存して、デコンボリューションに適した充分な飽和した画像を得るために、露出時間は50〜1000msの間で変動させた。光退色を低下させるために、Zeiss高速シャッター装置により照射を制御した。記録が始まるまで、記録すべき視野が蛍光源に暴露することを避けるように注意し、最適画像を与えるようにカメラを調整してあった。画像は以後の画像データ処理のためにzviデータフォーマットで保存した。すべての画像はZeiss Axiovision 4.5ソフトウェアを使用して得た。記載した場合、Zeiss AxioVision 3Dデコンボリューションモジュールを使用して、採取した画像の制限付繰り返しデコンボリューションを行った。すべての画像処理は、Siemens 2.8 GHz Line Celsius R630ワークステーションで行った。
【０１２７】
g) 凍結破砕、凍結切片化、及び免疫金標識
凍結切片を形成するために、等量のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（pH7.4）中4％(w/v)パラホルムアルデヒドを加えて細胞懸濁物を5分間前固定した。同じ緩衝液で細胞を簡単に洗浄し、さらに4％(w/v)パラホルムアルデヒドで1時間固定し、次に凍結防止剤として50mM炭酸ナトリウム（pH7.0）で緩衝化した0.9Mショ糖と90％(w/v)ポリビニルピロリドン25を有する4％(w/v)パラホルムアルデヒドで１時間インキュベートした。細胞を遠心分離して濃縮し、少量の凍結防止剤中でピン上に置き、液体窒素中で凍結した。Tokuyasu[17]が記載したように超薄切片化を行った。凍結破砕のために細胞懸濁液（700ml）を6,000×g、4℃で30分遠心分離してペレット化し、30％(v/v)グリセロールに再懸濁し（＜30秒）、液体窒素で冷却したフレオン22で固定し、BA310凍結破砕ユニット（Balzer AG）で−100℃で凍結破砕した。38°と90°の角度で白金−炭素の電子線蒸発により2及び20nmの厚さに、新に破砕した細胞のレプリカを直ちに作製した。レプリカを5％(w/v)SDS中で一晩インキュベートして、レプリカに直接接着する分子以外の細胞物質を除去し、蒸留水で洗浄し、5％(w/v)ウシ血清アルブミン（BSA）で短時間インキュベートした後、免疫染色した。凍結破砕レプリカと凍結切片の免疫染色のために、上記したものと同じ一次抗体を使用し、次にそれぞれロバ抗モルモット18nm金コンジュゲート、ヤギ抗マウス12nm金コンジュゲート、又はヤギ抗ウサギ12nm金コンジュゲート（すべてJackson Immunoresearchから）を使用した。さらにそのeGFPタグによりeGFP融合体の細胞分布を明らかにするために、ウサギで作製したeGFPに対する一次抗体（BD Biosciences）を使用した。一次抗体無しで調製した対照試料は、基本的に金粒子を含まなかった。
【０１２８】
2. 合成例
合成例1：PhaP1コード構築体の調製
a)pJAM2のaceプロモーターの下流へのphaP1のクローニング
標準的分子生物学プロトコールを使用した（Sambrook et al., [21]）。すべてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物をまずTAベクター（pGEM-T Easy；Promega）にクローン化した。結合生成物をまずDNA配列決定により制御し、次に適切な制限酵素で消化して切り離し、次に発現ベクターpJAM2［これは、1.5kbpのaceプロモーター領域を含有する大腸菌（E. coli）−マイコバクテリウム（Mycobacterium）／ロードコッカス（Rhodococcus）シャトルベクターである（配列番号17）（Triccasら、[29]）］にクローン化した。サブクローニングのために、制限酵素認識部位（下線、後述）をオリゴヌクレオチドの配列に取り込んだ。PhaP1（配列番号18）のコード領域をオリゴヌクレオチド
phaP1-5' (5'-AAAGGATCCATCCTCACCCCGGAACAAGTT-3') (配列番号1) 及び 
phaP1-3' (5'-AAAGGATCCCGATATGCTTTGCCAACGGAC-3') (配列番号2)
を使用して、アール・ユートロファ（R. eutropha）H16ゲノムDNAからPCRにより、本来の開始コドン及び停止コドン（582bp）無しで増幅した。
【０１２９】
次にPCR産物をaceプロモーターに共線状的にpJAM2のBamHI部位にクローン化した。こうして、amiE遺伝子の最初の6つのコドンとの機能的フレーム内融合体が作製されpJAM2::phaP1が得られた。構築された融合体中のPhaP1遺伝子はそれ自身の停止コドンが欠如していたが、pJAM2のHis6-タグリンカー配列の後に停止コドンを含有した。従ってタンパク質のC末端領域にアミノ酸SRHHHHHHがあった。
【０１３０】
b)phaP1-egfpとphaP1-lacZ融合体を発現するプラスミドの構築
エコリア・ビクトリア（Aequoria victoria）の完全なeGFP遺伝子である720bp断片（配列番号20）を、本来の停止コドン（二重下線）を有するPCRプライマー
egfp-5' (5'-AAATCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3') (配列番号3) 及び 
egfp-3' (5'AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3') (配列番号4)
を使用してプラスミドpEGFP-N3（BD Bioscience Clontech）から開始コドン無しで増幅した。次にPCR産物をaceプロモーターに共線状的にphaP1の下流にpJAM2::phaP1のXbaI部位にクローン化して、pJAM2::phaP1-egfpが得られた。対照実験で非融合eGFPの発現と分布を調べるために、pJAM2::phaP1-egfpのphaP1部分をBamHI制限切断により発現プラスミドから切り離し、再連結してpJAM2::egfpを得た。
【０１３１】
pJAM2::phaP1-lacZの構築のためにlacZの3075bpのコード領域を、大腸菌（E. coli）S17-1のゲノムDNAから、その本来の開始コドン無しで、本来の停止コドン（二重下線）を有するPCRプライマー
lacZ-5' (5'-AAATCTAGAACCATGATTACGGATTCACTGG-3') (配列番号5) 及び 
lacZ-3' (5'-AAATCTAGATTATTTTTGACACCAGACCAACTG-3') (配列番号6)
を使用して増幅した。次にPCR産物をaceプロモーターにphaP1の下流に共線状的にpJAM2::phaP1のXbaI部位にクローン化した。
【０１３２】
合成例2：ペリリピンA、tip47、ADRP、オレオシン、又はオレオシンHDをコードする構築体の調製
a)pJAM2のaceプロモーターの下流への増強gfp（egfp）のクローニング
標準的分子生物学プロトコールを使用した[21]。すべてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物をまずTAベクター（pGEM-T Easy；Promega）にクローン化し、DNA配列決定により制御し、次に適切な制限酵素で消化して切り離し、次に発現ベクター（後述）にクローン化した。サブクローニングを促進するために、制限酵素認識部位（下線、後述）をオリゴヌクレオチドの配列に取り込んだ。egfp（配列番号20）の完全なコード配列を含有する720塩基対（bp）断片（配列番号20）を、プラスミドpEGFP-N3（BD Bioscience Clontech）から、開始コドン無しで、本来の停止コドン（二重下線）を有するPCRプライマー
egfp-5' (5'-AAATCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3') (配列番号: 3) 及び
egfp-3' (5'AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3') (配列番号: 4)
を使用して増幅した。次にPCR産物をaceプロモーターに共線状的にpJAM2［これは、1.5kbpのaceプロモーター領域[29]（配列番号17）を含有する大腸菌（E. coli）−マイコバクテリウム（Mycobacterium）／ロードコッカス（Rhodococcus）シャトルベクターである］のXbaI部位にクローン化して、amiC遺伝子の最初の6つのコドンとの機能的フレーム内融合体を作製して、pJAM2::egfpを得た。
【０１３３】
b)脂質体タンパク質-eGFP融合体発現プラスミドの構築
機能的融合構築体の生成を促進するために、本来の開始コドンと停止コドン無しで各タンパク質のコード領域を増幅した。マウスペリリピンAコード領域（1551bp）（配列番号26）をPCRにより、マウスペリリピンA cDNA［8］を有するレトロウイルス発現ベクターpSRαMSVtkneoから、オリゴヌクレオチド
perA-5' (5'-AAAAGTACTTCAATGAACAAGGGCCCAACC-3') (配列番号: 7) 及び 
perA-3' (5'-AAAAGTACTGCTCTTCTTGCGCAGCTGGC-3') (配列番号: 8) 
を使用して増幅した。
【０１３４】
ヒトTIP47 cDNA（1302bp）（配列番号30）をプラスミドpQE31［7］からオリゴヌクレオチド
tip47-5' (5'-AAAGGATCCTCTGCCGACGGGGCAGAGGC-3') (配列番号:9) 及び
tip47-3' (5'-AAAGGATCCTTTCTTCTCCTCCGGGGCTT-3') (配列番号: 10) 
を使用して増幅した。
【０１３５】
ヒトADRP cDNA（1311bp）（配列番号34）を、C. Londos (Laboratory of cellular and developmental biology, National Institutes of Health, Bethesda)から提供されたADRP cDNA断片から、オリゴヌクレオチド
adrp-5' (5'-AAAAGTACTAGTTTTATGCTCAGATCGCTGG-3') (配列番号: 11)、及び 
adrp-3' (5'-AAAAGTACTGCATCCGTTGCAGTTGATCCAC-3') (配列番号: 12) 
を使用して増幅した。
【０１３６】
PATファミリー遺伝子を含む各PCR産物をaceプロモーターに共線状的に、pJAM2::egfpのBamHI又はScaI部位にegfp領域の上流にクローン化して、それぞれpJAM2::perAmur-egfp、pJAM2::tip47hum-egfp、及びpJAM2::adrphum-egfpを作製した。
【０１３７】
18kDaのトウモロコシオレオシンのcDNAコード領域である567bp断片（配列番号38）をプラスミドpL2±［19］から、オリゴヌクレオチド
oleo-5' (5'-AAAGGATCCGCGGACCGCGACCGCAGCGG-3') (配列番号: 13)、及び 
oleo-3' (5'-AAAGGATCCCGAGGAAGCCCTGCCGCCG-3')  (配列番号: 14)
を使用して増幅し、次にpJAM2::egfpのBamHI部位にクローン化して、pJAM2::oleomays-egfpを作製した。同様にその中心の疎水性ドメイン（配列番号39のアミノ酸48〜113）である末端切断型トウモロコシオレオシンとのeGFP融合体を、PCRによりオリゴヌクレオチド
oleoHD-5'(5'-AAAGGATCCGCGCTGACGGTGGCGACGCTG-3') (配列番号: 15)、及び 
oleoHD-3'(5'-AAAGGATCCCGCCGTGTTGGCGAGGCACGT-3') (配列番号: 16)
を使用して構築した。このプラスミドをpJAM2::oleoHD-egfpと呼んだ。次に各融合体のegfp部分をXbaI制限切断により切り離し、構築された各発現プラスミドと再結合して、それぞれpJAM2::perAmur, pJAM2::tip47hum, pJAM2::adrphum, pJAM2::oleomays、及びpJAM2::oleoHDを得た。構築された各融合体中の脂質体タンパク質遺伝子はそれ自身の停止コドンが欠如していたが、pJAM2のHis6-タグリンカー配列の後に停止コドンを含有したため、各タンパク質のC末端領域にアミノ酸SRHHHHHHを付加した。
【０１３８】
3. 発現実験
【実施例２】
【０１３９】
A. phaP1を用いる実験
実施例A1：エム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155とアール・オパクス（R. opacus）PD630の組換え株中のphaP1の発現と細胞亜分画中の翻訳産物の分布
組換え放線菌中のegfp、phaP1、及びphaP1-egfpの異種発現を測定するために、アンモニウム低減条件下で72時間増殖させた細胞の細胞粗抽出物と細胞画分を、方法欄に記載したようにSDS-PAGEとウェスタンブロットにより分析した。pJAM2::phaP1を有するエム・スメグマチス（M. smegmatis）細胞の電気泳動図は、0.5％(w/v)のアセトアミドで誘導した時、見かけの分子量が25kDaの追加のタンパク質を示した。この分子量（MW）は、His6タグ付きPhaP1について計算したものとよく一致した。His6タグ付きPhaP1は抗PhaP1 IgGを適用する対応するウェスタンブロットで容易に認識された。しかしHis6タグ付きPhaP1の合成は、52kDaのPhaP1-eGFP融合体と融合していない27kDaのeGFP（これも、抗PhaP1と抗eGFP IgGを使用してウェスタンブロットで証明された）を合成する株と比較して有意に低かった。すべてのIgGは、非誘導培養物の細胞粗抽出物中でタンパク質を認識せず、これはエム・スメグマチス（M. smegmatis）では組換えタンパク質の合成がアセトアミドの添加により厳密に制御されたことを示す。pJAM2::phaP1とpJAM2::egfpを有する細胞の電気泳動図とウェスタンブロットでは小さいMWの生成物は検出されないため、これらのタンパク質は細胞質中のタンパク質分解に対して安定であると思われた。しかしエム・スメグマチス（M. smegmatis）pJAM2::phaP1-egfpの細胞粗抽出物への抗PhaP1と抗eGFP IgGの適用は、融合タンパク質のわずかな切断が起きたことを示した。さらにエム・スメグマチス（M. smegmatis）細胞の粗抽出物のSDS-PAGE電気泳動図は、44kDaの追加のタンパク質を示し、これは、細胞を0.5％(w/v)アセトアミドで誘導した時、染色体にコードされたアセトアミダーゼである可能性が最も高いことを示した（図１Ａ）。組換えエム・スメグマチス（M. smegmatis）中のPhaP1の細胞内安定性もまた、発現時間を96時間に延長することにより証明された（図１Ｂ）。
【０１４０】
本発明者らは、エム・スメグマチス（M. smegmatis）の組換え細胞の細胞亜分画中のPhaP1分布の測定を試みた。残念ながらアセトアミドの濃度を0.05％に低下させても、アセトアミドによる細胞の誘導により、TAG封入体のTAG蓄積と数が大きく低下した（図１Ｃ）。これは、染色体にコードされたアセトアミダーゼによるインデューサーの切断のため、増殖のための充分なアンモニウムが細胞に提供されたためかも知れない。方法欄に記載のようにSM中のリン酸塩制限下のTAG封入体の充分な蓄積を達成する試みは、増殖が不充分なことと脂質蓄積がほとんど無いために失敗した（データは示していない）。
【０１４１】
この障害を避けるために、すべての構築したプラスミドを次にアール・オパクス（R. opacus）で誘導した。エム・スメグマチス（M. smegmatis）とは異なり、アール・オパクス（R. opacus）の対応する組換え株の粗抽出物のSDS-PAGE電気泳動図は、細胞を0.5％(w/v)アセトアミドで誘導した時でも、アンモニウム低減MSMで72時間増殖させた時に野生型から得られた粗抽出物と比較して、追加の目に見えるタンパク質バンドは証明されず、これはエム・スメグマチス（M. smegmatis）aceプロモーターにより制御された遺伝子発現がアール・オパクス（R. opacus）中では有意に低いことを示している。しかし組換えエム・スメグマチス（M. smegmatis）で得られた結果では、抗PhaP1 IgGは、pJAM2::phaP1を有する細胞の粗抽出物から得られたウェスタンブロット中の25kDaタンパク質を認識するが、ファジンの免疫学的認識は組換えエム・スメグマチス（M. smegmatis）中より有意に弱かった。エム・スメグマチス（M. smegmatis）と同様に、アール・オパクス（R. opacus）ではファジンの分解産物は検出されなかった。同様に、抗eGFP IgGを使用して証明されたように、pJAM2::egfpとpJAM2::phaP1-egfpを有する粗抽出物細胞のウェスタンブロットでそれぞれeGFPとPhaP1-eGFP融合体は容易に認識された（図２）。エム・スメグマチス（M. smegmatis）と異なり、培養物への0.5％(w/v)アセトアミドの添加は、アール・オパクス（R. opacus）中のTAG蓄積に影響を与えなかった（示していない）。アール・オパクス（R. opacus）中のPhaP1、eGFP、及びPhaP1-eGFP融合体の細胞分布を調べるために、誘導した細胞の粗抽出物を、可溶性画分、膜画分、及びTAG封入体を示す画分に分画した。アール・オパクス（R. opacus）pJAM2::phaP1の各画分のウェスタンブロットでは、TAG封入体を示す画分では抗PhaP1 IgGによりファジンが認識されたが、可溶性画分ではシグナルな存在しなかった。これは、PhaP1が組換えアール・オパクス（R. opacus）中でTAG封入体に結合していることを示した。アール・オパクス（R. opacus）の細胞画分中のPhaP1の分布について得られた結果はまた、pJAM2::phaP1-egfpを有する株のウェスタンブロットで抗eGFP IgGを使用することによりPhaP1-eGFP融合体の局在化により確認された。この組換え株では、融合タンパク質はまたTAG封入体である画分にのみ存在した。本発明者らは、組換え株の全膜画分の電気泳動図中でPhaP1とそのeGFP融合体の局在化を試みたが、うまくいかなかった（データは示していない）。予測されるように、融合しなかったeGFPは、pJAM2::egfpを有する対照株の可溶性画分にのみ局在化された（図２）。
【０１４２】
実施例A2：組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155中のPhaP1-eGFP融合タンパク質の分布
アール・オパクス（R. opacus）中のPhaP1-eGFPとTAG封入体との関連を証明するために、細胞質中で大きな細胞内TAG封入体の生成が起きた時TAG蓄積に許容性の条件下で、Std1培地で増殖させた細胞とアンモニウム低減MSM中で24、48、及び72時間増殖させた細胞中とで、蛍光顕微鏡により融合タンパク質の分布を調べた。その生成の全段階で、融合タンパク質の蛍光は主にTAG封入体と関連していた。Std1培地で増殖した細胞では、蛍光は原形質膜で発生期のTAG封入体と関連していたが、アンモニウム低減MSMで24、48、及び72時間増殖させた細胞の増殖後に、主に細胞質中の成熟TAG封入体に関連していた（図３Ａ〜Ｄ）。Std1増殖細胞から得られた画像の制限付繰り返しデコンボリューションにより証明されるように、細胞壁と原形質膜の領域でもある程度蛍光が存在した。しかしこれらの部位での蛍光は、細胞内TAG封入体の蛍光と比較するとはるかに弱かった（図３Ａのデコンボリューション画像を参照）。アンモニウム低減MSM中で72時間後に、細胞は明るい蛍光性のTAG封入体で充分に充填された。実際デコンボリューション後に、これらの細胞中の大きなTAG封入体はしばしば蛍光環を示し、封入体の表面での融合タンパク質の局在化を示していた（図３Ｄ）。TAG蓄積のすべての段階で融合タンパク質の蛍光はナイルレッド蛍光とは完全に区別可能であり、これはTAG封入体以外に、細胞エンベロープを明瞭に標識させた（図３Ａ〜Ｄ）。
【０１４３】
細胞破砕後、単離されたTAG封入体に関連してPhaP1-eGFPの蛍光が観察され、融合タンパク質が封入体と安定に結合していることを示した。全細胞で観察されたものと同様に、単離された封入体は、デコンボリューション画像中の周辺部で緑の蛍光環を示した（図３Ｅ）。これに対して、非融合eGFPを発現する細胞からのTAG封入体は、ナイルレッド標識無しで観察した時、蛍光を示さなかった（示していない）。陰性対照として機能する非融合egfpを発現する細胞は、細胞質中に拡散した緑の蛍光を示し、一方細胞内TAG封入体は、ナイルレッド蛍光により容易に検出可能であった（図３Ｆ）。
【０１４４】
非融合egfpを発現するエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の細胞は、アール・オパクス（R. opacus）PD630で観察されたものと同様に、細胞質中で分散された蛍光を示した（図４Ａ）。組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中の結果に対応して、アセトアミドで誘導しなかったpJAM2::phaP1-egfpを有するエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の細胞では、その生成のすべての段階でTAG封入体の位置に蛍光が観察され、これは、ファジンが封入体も標的としていることを示す。しかしエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155中のTAG封入体の数とサイズは決してアール・オパクス（R. opacus）PD630中のものには達しなかったため、TAG封入体は細胞質中の蛍光の分離した点としてのみ現れた（図４Ｂ〜Ｄ）。これに対してアセトアミドで誘導した細胞では、細胞中で非常に強い蛍光が現れ、これは亜細胞構造体に関連していなかった（データは示していない）。これはおそらく、細胞中の融合タンパク質が豊富にあるためであろう。
【０１４５】
実施例A３：凍結切片の免疫金標識
PhaP1-eGFPがアール・オパクス（R. opacus）PD630中のTAG封入体の表面にのみターゲティングされるか又は細胞の他の成分にもターゲティングされるかを調べるために、包埋後免疫金標識により凍結切片で融合タンパク質を局在化した。保存条件下で72時間増殖させた組換え細胞から超薄凍結切片を調製した。凍結切片の免疫金標識のために、ウサギ抗PhaP1 IgGをヤギ抗ウサギIgG金コンジュゲートとともに使用した。凍結切片化アール・オパクス（R. opacus）PD630細胞では、TAG封入体はほとんど球形の内部構造体のほとんど無い電子的に半透明の領域として現れた。封入体の表面にPhaP1-eGFPの強い標識が見られ、一方細胞質ではほとんど標識物は観察されなかった。標識物は原形質膜でも検出された。しかし細胞の周辺部でのPhaP1-eGFP標識物の濃度は、TAG封入体の表面と比較して低かった（図５）。
【０１４６】
実施例Ａ４：アール・オパクス（R. opacus）PD630中のTAG封入体への大腸菌（E. coli）lacZの固定化
TAG封入体への天然型PhaP1とPhaP1-eGFP融合体の結合が証明されたため、TAG封入体の表面への活性酵素の固定化用のアンカーとしてPhaP1が使用できるかどうかを調べた。このために、phaP1の3'末端領域へのレポーター遺伝子としての大腸菌（E. coli）lacZの融合体をプラスミドpJAM2で構築した。得られたプラスミドpJAM2::phaP1-lacZをアール・オパクス（R. opacus）PD630に移し、細胞を72時間培養した。次にTAG封入体を単離し、ONPGの酵素的変換のために使用した。対照実験のために、pJAM2::phaP1を有する細胞を同様に使用した。対照株のTAG封入体を含有するサンプルは、低いβ−ガラクトシダーゼ活性しか示さなかった。アール・オパクス（R. opacus）PD630はまた染色体でコードされるβ−ガラクトシダーゼを発現するため、低酵素活性は対照サンプルでも起きると予測された。さらに、種々のサイトゾルタンパク質が非特異的にTAG封入体に結合し、これは次に封入体と同時精製されることが証明された（Kalscheuer et al. [10a]; Waltermann & Steinbuchel [31]）。しかし、phaP1-lacZ発現株から単離されたTAG封入体を含有するサンプル中の酵素活性は有意に高かった。アッセイからTAG封入体を除去すると、すべての実験でONPGの変換が直ちに停止した。この結果は、遊離β−ガラクトシダーゼ分子（これは精製工程で除去されなかった）の参加を排除する（図６）。これらのデータは、アンカーとしてPhaP1に仲介される細菌TAG封入体へのlacZの安定な固定化を証明する。
【０１４７】
発現実験の考察−パートA
実験の部のこのセクションで、アール・ユートロファ（R. eutropha）H16 phaP1遺伝子で形質転換されたアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の組換え株の細胞が、ファジンPhaP1を合成することが証明された。これらの実験の主要な知見は、細胞中でファジンは安定に維持され、PhaP1とPhaP1融合タンパク質はTAG封入体にターゲティングされたということである。これは、TAG封入体へのファジンタンパク質の結合についての最初の報告である。アール・ユートロファ（R. eutropha）H16ではPhaP1はPHB顆粒画分に厳密に関連しており、転写リプレッサーPhaR（Potter et al. [18d]）による制御のために、その発現はPHB合成に高度に関連している。ファジンをアール・ユートロファ（R. eutropha）H16中のPHB顆粒にターゲティングするPhaP1のモチーフはまだ同定されていない。しかしPHB顆粒ならびにTAG封入体は、それぞれ、リン脂質の単層に囲まれていると考えられているポリエステル又は脂質の疎水性コアを有する（de Koning & Maxwell [6b]; Hocking & Marchessault [9a]; Mayer & Hoppert [16a]; Waltermann et al. [30]）。これらの実験で証明されるように、この共通の構造は、PHB顆粒また明らかにTAG封入体へのPhaP1のターゲティングを可能にする。従って本データは、アール・ユートロファ（R. eutropha）H16中のPHB顆粒へのPhaP1のターゲティングが、顆粒中のファジンとポリマーの直接相互認識により仲介されない可能性が高いことを示す。この結果は、PHA又は異なる疎水性化合物が封入体のコアに存在するかどうかに拘わらず、PhaP1が任意のタイプの疎水性封入体に結合する能力を明らかに有することを示す。さらにPHA代謝に関与する追加のまだ同定されていない成分が、本発明者らの試験で使用された株に存在するはずであるから、かかる成分が封入体へのPhaP1のターゲティングを仲介する可能性は小さい。おそらく封入体へのPhaP1の結合は、封入体と周りの細胞質との単層膜からなる両親媒性界面
、又はコアの疎水性表面、又はこの両方の組合せの存在にのみ仲介される。
【０１４８】
組合せ電子顕微鏡と包埋後免疫細胞化学により、PhaP1が主にTAG封入体の両親媒性表面に分布していることが証明された。しかし、アール・ユートロファ（R. eutropha）H16中のPHB顆粒の表面上にのみ分布していることに対して、一部のPhaP1はまたアール・オパクス（R. opacus）PD630の細胞中の原形質膜及び細胞壁領域にも存在することが証明された。この分布はまた、等量のTAGを合成することができるロードコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）中の14kDaのファジンとコポリマーであるポリ(3-ヒドロキシブチレート-co-3-ヒドロキシバレレート)の細胞分布を研究中に、Pieper-Furst et al. [18a]により報告された。アール・ルバー（R. ruber）TAG中のファジンとポリ(3HB-co-3HV)が封入体中で別々に存在するか又は同時に存在するかは不明であるが、この染色でファジンは細胞中の任意の封入体の表面上及び原形質膜の細胞質部位にも存在することが証明された。最近提唱されたモデルでは、原核生物のTAG封入体の起源は原形質膜の細胞質部位である（Waltermann et al. [31]）。すなわち合成部位での発生期のTAG封入体へのファジンの結合は、この分布の最も可能性のある説明である。
【０１４９】
アール・ユートロファ（R. eutropha）H16では、PHBの量と顆粒の数は、細胞中のファジン分子の量により直接影響される（Wieczorek et al. [31a]；Potter et al. [18d]）。ファジンの存在は、アール・オパクス（R. opacus）PD630中のTAGの量を変化させることはなく、またTAG封入体のサイズもしくは数に影響を与えることもなかった。本発現解析により証明されるように、このタンパク質の発現はプラスミドpJAM2のaceプロモーターにより制限されるため、細胞中のPhaP1の総量は非常に少なかった。多量のファジンの存在が細胞中のTAG代謝に影響を与えるかどうかは、まだ不明である。
【０１５０】
PhaP1-lacZ融合体で標識したTAG封入体がin vitroでβ−ガラクトシダーゼ活性を示すことが証明された。表面又は規定した粒子上の酵素や他の種類のタンパク質の固定化は、興味深い応用を提供する。1つの例は、機能化されたナノ粒子、例えば分析目的のための抗体、またはホルモン及び他の治療薬を有するナノ粒子、の合成である。かかるナノ粒子は細胞粗抽出物から容易に精製することができる。Moldes et al. [17a]は、マトリックスとしてのPHA顆粒とリンカーとしてのシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）からのファジンPhaFのN末端を使用して、酵素の合成と精製のためのシステムを作製した。さらに組換え大腸菌（E. coli）中のPHB顆粒は、インテイン（intein）として知られているタンパク質スプライシング要素に基づく、ファジンと自己切断性親和性タグとの融合により、標的タンパク質の精製のためのマトリックスとして証明されている（Banki et al. [3a]）。またTAG封入体は、Moloneyにより酵素の精製のためのマトリックスとして使用された［17c；17d］。著者は、標的酵素をオレオシンを介して油体に結合させることにより植物細胞に基づくシステムを作製した。上記の両方の精製システムは特許化されており、市販されている（Prieto et al.：ES特許200102240 [18f]；Moloney：US特許5650554 [17b]、及び6924363 [17e]）。さらにPhaP1タグによるTAG封入体への酵素及び他のタンパク質のアンカリングは、細胞内TAG封入体の単層表面上の別の生体工学的経路への興味深い可能性を提供する。
【実施例３】
【０１５１】
B. 真核生物脂質体タンパク質を用いる実験
実施例B1：組換え放線菌中の真核生物脂質体タンパク質の発現
マウスペリリピンA（配列番号26）、ヒトADRP（配列番号34）、ヒトTIP47、及びトウモロコシオレオシン（配列番号38）遺伝子のコード領域を、大腸菌（E. coli）−ロードコッカス（Rhodococcus）／マイコバクテリウム（Mycobacterium）シャトルベクターpJAM2中へのHis6タグ付き融合体としてクローン化した。各形質転換したエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155及びアール・オパクス（R. opacus）PD630細胞の粗抽出物を、そのペリリピンA、ADRP、TIP47、及びオレオシン発現について、SDS-PAGEと免疫ブロッティングにより材料と方法欄に記載した抗体を使用して分析した。すべての抗体は非形質転換ロードコッカス（Rhodococcus）／マイコバクテリウム（Mycobacterium）細胞中のタンパク質を認識しなかった。ニワトリ抗トウモロコシオレオシンIgGは、pJAM2::oleomaysで形質転換したエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155細胞中の19kDaタンパク質を容易に認識した（図７）。しかしpJAM2::oleomaysを有するアール・オパクス（R. opacus）PD630の細胞では、アセトアミドで誘導しなかったエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155細胞と比較しても、発現は有意に低く、過剰露出した免疫ブロットでのみ観察された（示していない）。この19kDaタンパク質は、pJAM2::oleomays中のトウモロコシ遺伝子由来のHis6タグ付きオレオシンのはずである。アール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155中で、低Mrのタンパク質分解産物は検出されず、タンパク質が細胞内タンパク質分解に対して安定であることを示していた。プラスミドpJAM2::perAmurを有するエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155とアール・オパクス（R. opacus）PD630中のHis6タグ付きマウスペリリピンAの発現は、免疫ブロットで組換えオレオシン発現と同様の強度を有する58kDaの単一のシグナルを与え、これは、このタンパク質も安定性であり、細胞内タンパク質分解が起きなかったことを示していた（図７）。pJAM2::tip47hum又はpJAM2::adrphumを有するそれぞれエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155とアール・オパクス（R. opacus）PD630の粗抽出物では、観察可能な合成されたタンパク質は免疫ブロットで検出されなかった。ナイルレッドを色素として使用する薄層クロマトグラフィーと蛍光顕微鏡観察は、プラスミドの存在とタンパク質の発現が、アセトアミドの非存在下での野生型と比較して、細胞の脂質含量、脂質封入体の数、形、もしくはサイズを変化させないことを明らかにした。これに対して、エム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の細胞は、培養物の0.01％(w/v)を超えるアセトアミドを加えた時、有意に低下したTAGの量と脂質封入体の数を含有した（示していない）。
【０１５２】
実施例B2：組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155中のPATタンパク質融合体とオレオシン融合体の蛍光局在化
組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630の細胞亜分画中のペリリピンAとトウモロコシオレオシンを免疫ブロット分析により局在化するための実験を行ったが、合成されたタンパク質が少量であったことと免疫ブロットアッセイの感度が低かったことのためにうまく行かなかった。PATタンパク質とオレオシンの細胞内局在および細菌TAG封入体への結合特性を明らかにするために、脂質体タンパク質をeGFPとの融合体として組換え株中で視覚化した。各PATタンパク質−eGFP融合体発現プラスミドで形質転換したアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の細胞を、保存条件下で0、24、及び48時間培養し、その蛍光パターンを調べた。非融合eGFPを発現するプラスミドpJAM2::egfpを有する細胞を陰性対照とした。これらの条件下で及びこれらの期間中に、細胞はその脂質含量を増加させ細胞質中に多量の脂質封入体を蓄積し、これらは以前の観察では周辺脂質ドメインに由来した［6、30］。非融合eGFPはアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の細胞質全体に、広く拡散した蛍光を示した。しかしエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155から得られた画像は、その独特のコンフルエント増殖のためにアール・オパクス（R. opacus）PD630から得られたものと比較して弱かったが、アール・オパクス（R. opacus）PD630の組換え株で得られたすべての結果とよく対応した。脂質蓄積の後期に存在する大きな脂質封入体から、蛍光が排除された（図８Ａ）。これに対してpJAM2::perAmur-egfpを有する株は、脂質蓄積の早期に原形質膜に結合した小さい脂質封入体中でのみ蛍光を示した。TAG蓄積と細胞質脂質封入体の生成の進行中に、ペリリピンA−eGFP蛍光は、封入体の周りの周辺環としてしばしば観察された細胞質脂質封入体と関連しているようであった（図８Ｂ）。この蛍光パターンは脂質封入体からのペリリピンA−eGFP蛍光の単なる排除によるものではないことを明らかにするために、各組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630株から脂質封入体を単離し、蛍光顕微鏡で調べた。さらに、封入体のコア中の脂質をナイルレッドで染色した。ペリリピンA−eGFPを発現する細胞から単離された封入体は、その表面に明瞭な環状の蛍光を示し、取り込まれたナイルレッド色素により脂質コアの赤い蛍光が生じた（図８Ｃ）。これに対して非融合eGFPを発現する細胞の脂質封入体は、ナイルレッド標識無しで観察した時、蛍光を示さなかった。これらのデータは、ペリリピンA−eGFPが組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中の脂質封入体の表面に密接に結合し、また細胞破砕プロセス中に安定に結合していることを示す。
【０１５３】
pJAM2::adrphum-egfp又はpJAM2::tip47hum-egfpを有する組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630株中のそれぞれADRP-eGFPとTIP47-eGFPの細胞下局在を試験するタイムラップ実験も行った。両方の組換え株は、野生型とペリリピンA−eGFP発現株とで観察されたものと同様の脂質封入体を合成した。免疫ブロット分析に対して、pJAM2::tip47hum-egfpを有するアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155中で明瞭な蛍光が観察された。蛍光は、脂質蓄積の最初は細胞内の周辺脂質ドメインにのみ局在化していた。保存条件下で24及び48時間後、大きな細胞質脂質封入体が生じた。ペリリピンA−eGFPを合成するアール・オパクス（R. opacus）PD630で得られた結果と同様に、TIP47-eGFP蛍光はしばしば大きな脂質封入体を取り囲む環状の形で観察された（図９Ａ）。TIP47-eGFPでタグ付けした単離された封入体でも標識パターンが確認された（図９Ｂ）。pJAM2::adrphum-egfp蛍光を有する株では、脂質蓄積の早期の蛍光は非常に弱かったが、野生型アール・オパクス（R. opacus）PD630を用いて行った対照実験の自己蛍光から明瞭に区別可能であった。脂質蓄積の24及び48時間後に、脂質封入体中に明らかにADRP-eGFPが見えた。しかしバックグランド蛍光も観察され、これは画像記録中の長時間の露出によるかも知れない（図１０）。
【０１５４】
実施例B3：組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630の凍結切片と凍結破砕レプリカの免疫金標識
蛍光顕微鏡試験で証明されるようなアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155中の細胞内TAG封入体上のPATファミリータンパク質の排他的局在化を証明するために、凍結切片についての包埋後免疫金標識を、材料と方法欄に記載したPATファミリータンパク質とeGFPtagに対して作製した抗体を使用して行った。しかしペリリピンA又はADRPのeGFP融合体を発現するアール・オパクス（R. opacus）PD630とエム・スメグマチス（M. smegmatis）mc2155の組換え細胞の免疫金標識凍結切片は、各対照実験から区別できず、これは、ADRPの場合、合成されたタンパク質の量が少ないためかも知れない。モルモット抗ヒトTIP47抗体を使用した実験のみが信頼できる良好な結果を与え、本発明者らの観察結果に対応して、TIP47-eGFPは、pJAM2::tip47hum-egfpを有するアール・オパクス（R. opacus）PD630中のTAG封入体とのみ結合していた（図１１Ａ）。
【０１５５】
細菌中のTAG封入体の生成は、脂質コアへの脂質結合タンパク質の封入を引き起こし得るエマルジョン凝集によるプロセスであるため、組換え細胞中のTAG封入体の表面とコア上のPATファミリータンパク質の分布を明らかにするための凍結破砕実験を行った。一般に細菌細胞を凍結破砕すると、細胞膜の小葉の間に破砕面が走る。時に破砕面は細胞及び細胞内脂質封入体を貫通して走り、封入体のコア内に及ぶ破断面を視覚化可能にする。アール・オパクス（R. opacus）PD630の凍結破砕レプリカでは、真核生物及び原核生物TAG封入体の破断面で以前観察されたもの［20、30］と同様の、TAG封入体の破砕コア全体に、異なる深さの一連の堅く圧縮され交互に配置された脂質層が現れた。これらの層の最も外側は、周りのリン脂質層由来であると考えられる。凍結破砕レプリカ中のPATタンパク質の免疫金標識のために、アール・オパクス（R. opacus）PD630の組換え細胞を保存条件下で48時間増殖させた。凍結切片についての標識実験に対応して、アール・オパクス（R. opacus）PD630のADRP及びペリリピンA発現細胞の標識レプリカは信頼できる結果を与えず、各対照と区別できなかった。しかしpJAM2::tip47humを有する株から得られたレプリカの標識後に、脂質封入体内の種々の位置が標識された（図１１Ｂ＋Ｃ）。細胞の周り、細胞質、及び原形質膜の異なる面の有意な標識は得られなかった。組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中のTIP47の分布はまた、一次抗体としてウサギ抗eGFP IgGを使用して標識を行ったeGFPタグ付きTIP47を発現する各株のレプリカで確認された（図１１Ｃ）。
【０１５６】
発現実験の考察−パートＢ
この実験のセクションでは、TAG蓄積放線菌中の哺乳動物脂質体タンパク質ペリリピンA、ADRP、及びTIP47の合成と細胞内TAG封入体へのそのターゲティングが証明された。すでにペリリピン類とADRPは真核細胞中の脂質体にのみ結合していることがわかっていたが、これらが脂質体にターゲティングされる機構は不明であった［5］。この研究の局在化実験の最も興味深い結果の1つは、既存の脂質体のPATタンパク質による被覆がin vivoで細胞質を介して起きたことである。さらにこれらは原核生物系では存在しないため、他の特異的タンパク質に仲介される間接的固定は排除されるため、PATファミリータンパク質は脂質と直接相互作用するに違いない。いくつかの脂質小滴タンパク質のターゲティングのための配列は文献に報告されている。例えばペリリピン類のターゲティングと固定は、タンパク質の中央の25％の領域中の3つの疎水性配列により仲介されると考えられるが、正確なターゲティング機構は不明である［25］。凍結破砕免疫金標識は、TIP47が両親媒性表面のみでなく、組換えアール・オパクス（R. opacus）PD630中のTAG封入体の疎水性コアにも存在することを示した。この分布パターンは、細菌中で脂質封入体が生成される特殊な機構によるはずである。TAGは原形質膜で油性の乳剤質の層を生成する小さなWS/DGAT結合小滴として合成され、これは凝集／癒合して脂質プレ体となり、次に放出されて、進行する脂質合成中に細胞質に局在化された脂質封入体を生成する［30］。PATタンパク質と非被覆脂質との結合により、脂質の凝集／癒合プロセス中にPATタンパク質の封入が起き、PATタンパク質が封入体の疎水性コア中に捕捉される。従って本知見は、細菌中の中性脂質封入体の生成の現行のモデルを確認している。
【０１５７】
本実験は、細菌の脂質封入体の生成とこれらの脂質封入体への真核生物脂質体タンパク質のターゲティングとが、これらの背後にある機構を明らかにするための適切な手段であることを証明する。さらにPATファミリータンパク質のようなターゲティング分子は、バイオテクノロジー関連酵素を細菌脂質封入体の表面に固定するためのリンカーとして使用することができ、これは種々のバイオテクノロジー用途用に改変される。
【０１５８】
以後の表は、本説明と特許請求の範囲で言及される全アミノ酸配列と核酸配列とを列記する。
【表２】
2009542240.tif 000003
【０１５９】
本発明は上記の具体的な配列に限定されるものではない。本発明はまた、上記の配列から誘導される追加の配列を包含することを理解されたい。
【０１６０】
「誘導された」配列、例えば誘導されたアミノ酸配列又は核酸配列は、本発明において特に明記しない場合は、出発配列と少なくとも80％、又は少なくとも90％、特に91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、及び99％の同一性を有する配列を意味する。
【０１６１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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