(57)【要約】本発明は、粒子状固体多孔性材料および生分解性ペースト材料を含む、成形可能な生体材料に対するものである。ペースト材料および粒子状固体多孔性材料は、骨の置換または増大のために使用可能なマトリクスを形成する。種々の態様において、マトリクスは、移植後直ちにまたは間もなく不定形な無孔の塊に崩壊しない高い構造的完全性を有し、移植後にその孔隙率を維持し、移植後に二相性分解を示し、および／または、湿った開放されたインプラント部位に適用される際に洗い出されることに対して良好な抵抗性を有する。骨成長因子のような活性剤が、本発明の成形可能な生体材料に組み入れられ得る。キット、インプラント、製造方法、ならびに医薬用使用がまた、提供される。2009519065.tif 000004
2009519065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、成形可能な生体材料：
a）100〜4000μmの粒子サイズを有する粒子状固体多孔性材料、および
b）生分解性ペースト材料。
【請求項２】
a）粒子状固体多孔性材料が、100〜4000μmの平均粒子サイズを有し、リン酸三カルシウムで作られたセラミック顆粒を含み、ならびに
b）生分解性ペースト材料が、
i．水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤；
ii．可塑剤に可溶であり、かつ、生体適合性、生分解性、および／または生体吸収性（bioresorbable）である、水に不溶のポリマー；および
iii．可塑剤に不溶である、水に不溶の固体充填剤
を含むペーストである、
請求項1記載の成形可能な生体材料。
【請求項３】
成形可能な粘稠度を有し、かつ、
水性媒質または体液と接触すると固体インプラントを形成するようにインサイチューで硬化することが可能である、
請求項1または2のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項４】
成分a）およびb）が、凝集性産物を形成するための比で使用される、請求項1〜3のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項５】
成分b）のペーストが、カルボキシメチルセルロースである水溶性分解制御剤を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項６】
以下をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の成形可能な生体材料：
c）活性剤。
【請求項７】
活性剤が骨成長因子である、請求項1〜6のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項８】
活性剤が、BMP2、BMP7、およびGDF5の群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項９】
インサイチューで二相性分解を示す、請求項1〜8のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項１０】
インサイチューで硬化した後少なくとも2〜3日の期間、物理的完全性を維持し、かつ、
ポリマー成分の分解後に多孔性顆粒状構造を維持する、
請求項1〜9のいずれか一項記載の成形可能な生体材料。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項において記載される成形可能な生体材料の単離された成分a）およびb）、または、請求項6〜10のいずれか一項において記載される成形可能な生体材料の単離された成分a）、b）、およびc）を含む、キット。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項において記載される成形可能な生体材料の成分a）およびb）、または、請求項6〜10のいずれか一項において記載される成形可能な生体材料の成分a）、b）、およびc）を含む、インプラント。
【請求項１３】
混合物が成形可能な粘稠度を有するように、
i．水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤；
ii．可塑剤に可溶であり、かつ、生体適合性、生分解性、および／または生体吸収性である、水に不溶のポリマー；および
iii．可塑剤に不溶である、水に不溶の固体充填剤
を含むペーストをリン酸カルシウムまたは硫酸カルシウムと混合する段階を含み、
水性媒質または体液と接触すると固体多孔性インプラントを形成するようにインサイチューで硬化することが可能である、
成形可能な生体材料を製造する方法。
【請求項１４】
ペーストが水分乾燥され、ならびに／または、無水成分（i）、（ii）、および／もしくは（iii）を用いて製造される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
脊椎固定、長骨欠損、重大なサイズ欠損、偽関節、関節再配置、好ましくは膝または股関節部再配置、骨折修復、軟骨修復、顎顔面再構築、歯周部修復、変性椎間板疾患、脊椎すべり症、骨空隙充填のために使用される薬学的組成物または医療機器の製造のための、請求項1〜10のいずれか一項記載の成形可能な生体材料、請求項11記載のキット、または請求項12記載のインプラントの使用。
【請求項１６】
請求項13または14記載の方法によって製造された成形可能な生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子状固体多孔性材料および生分解性ペースト材料を含む、成形可能な生体材料に対するものである。
【０００２】
ペースト材料および粒子状固体多孔性材料は、骨の置換または増大のために使用可能なマトリクスを形成する。種々の態様において、マトリクスは、移植後直ちにまたは間もなく不定形な無孔の塊に崩壊しない高い構造的完全性を有し、移植後に孔隙率を維持し、移植後に二相性分解を示し、および／または、湿った開放されたインプラント部位に適用される際に洗い出されることに対して良好な抵抗性を有する。
【０００３】
骨成長因子のような活性剤が、本発明の成形可能な生体材料に組み入れられ得る。
【０００４】
キット、インプラント、製造方法、ならびに医薬用使用がまた、提供される。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
脊椎固定または脊椎関節固定（例えば、腰椎脊椎固定）は、脊椎の変性変化および不安定性によって引き起こされる慢性腰痛を有する患者において「最後の手段」として一般に行われる。椎間板のヘルニアまたは変性、椎間板の崩壊、および変性脊椎関節の関節異常によって引き起こされる腰痛を管理するための一つの提案される方法は、椎間板の除去、ならびに、骨の成長および隣接する椎骨の固定を可能にする多孔性機器による置換である。そのような固定技術は、椎間板の置換の代わりに固定機器がより後側方に配置される後側方固定に加えて、腰椎前方椎体間固定（anterior lumbar interbody fusion：ALIF）、腰椎後方椎体間固定（posterior lumbar interbody fusion：PLIF）、経椎間孔腰椎椎体間固定（transforaminal lumber interbody fusion：TLIF）を含む。
【０００６】
腸骨稜から採取される自己の骨グラフトが、脊椎固定手順において使用される究極の標準材料（gold standard material）である。しかしながら、自己骨のための採取部位として回腸を使用する欠点は、患者に追加的な問題を作ることである。これらは、通常の切開後疼痛、起こり得る神経腫形成による複合性局所疼痛障害、感染、術後の局所血腫、仙腸関節への創傷、骨盤靭帯の創傷、および骨盤軟部組織の問題を含む。さらに、自己の骨グラフトは、限定された入手可能性、および一貫しない骨の品質を有する。そのため、自家グラフトの使用は、BMP-2、BMP-7、およびGDF-5を含むTGF-β／BMPファミリーの因子のような増殖因子との組み合わせで骨代替品を使用することによって取って代えられると考えられる。
【０００７】
これらの因子は、コラーゲン、OP-1（Osigraft（登録商標）（OP-1 Implant）／OP-1 Putty）のようなコラーゲンおよびカルボキシメチルセルロース、Infuse（登録商標）（InductOs（登録商標））、コラーゲンヒドロキシアパタイト複合物、リン酸カルシウムセメント（Bone source（登録商標））、真性骨セラミックス、β-TCP、β-TCP／ヒドロキシアパタイト複合物（TCP/HA 15:85、TCP/HA 40:60）、PLA-DX-PEGコポリマーゲルを含むβ-TCPポリマー複合物材料、またはヒドロゲルとの組み合わせで使用される。
【０００８】
WO 94/15653（特許文献1）は、リン酸三カルシウム（tricalcium phosphate：TCP）、TGF-βおよびコラーゲンを含む製剤を開示する。TCPは、TGF-βのための送達媒体であるとして開示されている。
【０００９】
EP1 150 726（特許文献2）は、再吸収性スポンジ材料、骨形成因子、および粒子状鉱物を含む、新たな骨成長の誘導のために有用な骨形成スポンジを記載している。
【００１０】
PCT/EP2005/006204（特許文献3）において本発明者らは、可塑剤、水に不溶のポリマー、および水に不溶の固体充填剤、ならびに任意で孔形成剤を含み、水のような水性液体または体液との接触後に硬化する、インサイチュー硬化ペーストを提供する。
【００１１】
しかしながら、従来の固定機器または生体材料はいくつかの不利点を有する。例えば、それらは圧縮に耐性でなく、かつ、コラーゲンベース材料について記載されているように、結果的に望ましくない副作用のリスクを有する非生理学的な高濃度の骨成長促進物質を必要とする。他の組成物（例えば、セメント）は、移植後直ちにまたは間もなく不定形な無孔の塊に崩壊し、多孔性マトリクスの物理的完全性を維持しない。WO03/043673（特許文献4）に記載されているようなβ-リン酸カルシウム顆粒、またはHAナノ懸濁液のような生分解性インプラント材料は、多量に出血する環境のような湿った開放性野（wet opened field）に適用される際に、洗い出されたりまたは崩壊したりする傾向がある。ヒドロキシアパタイトのような生体材料は、非生分解性、または部分的に生分解性であり、長時間に渡って体内に残存する。
【００１２】
硬化する材料の別の限界は、硬化過程と適用との間の短い時間枠、ならびに孔隙率の欠如である（例えば、Biobon（登録商標）（α-BSM, US2005/0089579（特許文献5））、バイオセメント（Biocement） DおよびH、Biofill（登録商標）、Bonesource（登録商標）、Calcibon（登録商標）、Cementek（登録商標）、Mimics Biopex（登録商標）、およびNorian（登録商標）SRS（登録商標）のような古典的なリン酸カルシウムセメント（calcium phosphate cements：CPCs）を参照；全体として参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2005/006204（特許文献3）により多くが記載されている）。これらの入手可能なCPC製剤のほとんどは、混合された際に反応して硬化する二つの成分から構成されている。粉末成分が、いくつかは促進剤または助触媒（promoter）を含む水性溶液と、適用の直前に混合されて、注射可能なペーストを形成する。これらのペースト状組成物は、硬化することなく数時間より長く、最長で一週間または数週間までの間ペースト状の粘稠度で保存されるのは困難であり、自己設定反応が起きる温度に依存して、多くの場合は長くて20分から約60分まで、または約15分まででさえ困難である。US2005/0084542（特許文献6）に記載されているような鉱質除去骨マトリクス（demineralised bone matrix：DBM）を含むものを含むCPCは、インビボでの足場形成のため、生理学的水性液体の添加後にセメント反応を設定するために二つの無機成分を使用する。
【００１３】
予め混合されたペースト状製剤のさらなる不利点は、γ線滅菌のような一般の最終的な滅菌方法によって最終産物を滅菌することが可能でないため、無菌的な製造が必要であることである。そのため、一つの理由は、活性剤の損傷である。そのため、製造は精巧であり、かつ、非常に高価である。
【００１４】
要約すると、β-TCP、ヒドロキシアパタイト、または両方の混合物のようなセラミック材料、骨セメント、ポリマーベース材料を含む複合材料、またはコラーゲンのような、上記で説明されたような生体材料の存在にもかかわらず、脊椎固定、頭蓋顎顔面の（craniomaxillofacial）再構築、関節再構築、および骨折修復を含む適応症における改善された骨増大のための、生体材料および方法のさらなる改善の必要性が残存する。骨性構造によって生体材料を置換するために細胞の浸潤および遊走のための多孔性足場をインビボで提供し、一方、生物体に対する負担を軽減する、改善された生体適合性および生分解性組成物について必要性が存在する。好ましくは、組成物は、先行技術の従来の固定機器または生体材料の上記の不利点の一つまたは複数を克服する生体材料または機器であるべきである。
【００１５】
別の目的は、欠損部位に調整され得、かつ、細胞の浸潤および骨置換のための多孔性足場をインビボで提供する、改善された生体適合性および生分解性組成物の提供である。
【００１６】
本発明の別の目的は、欠損部中に配置された後にインビボで硬化するマクロ多孔性足場を形成することが可能である組成物による骨増大が必要な対象への移植に適した、インサイチュー硬化生体材料の提供である。
【００１７】
本発明の別の目的は、欠損部中に配置された後にインビボで硬化するマクロ多孔性足場を形成することが可能である組成物による骨増大が必要な対象への移植に適した、インサイチュー硬化生体材料の提供であって、成形可能な生体材料がカルシウムを含むセメントでない、提供である。
【００１８】
本発明の別の目的は、欠損部中に配置された後にインビボで硬化するマクロ多孔性足場を形成することが可能である組成物による骨増大が必要な対象への移植に適した、改善された孔隙率および／または機械的強度を有するインサイチュー硬化生体材料の提供である。
【００１９】
本発明の別の目的は、欠損部中に配置された後にインビボで硬化するマクロ多孔性足場を形成することが可能である組成物による骨増大が必要な対象への移植に適した、容易に製造され得、かつ改善された保存安定性を示す、インサイチュー硬化生体材料の提供である。
【００２０】
本発明の別の目的は、活性剤の徐放を伴う、改善された生体適合性および生分解性組成物の提供である。
【００２１】
本発明の基礎をなす別の目的は、従来の機器と比較して活性剤のより少ない用量を可能にする送達システムとして適する、改善された生体適合性および生分解性組成物の提供である。
【００２２】
本発明の基礎をなす別の目的は、長骨固定または脊椎椎体固定のような骨性固定のために設計された、改善された骨グラフト代替材料の提供である。
【００２３】
本発明の基礎をなす別の目的は、隣接する椎骨の間の骨性固定を促進するための骨形成成分を含む、脊椎インプラントの提供である。
【００２４】
本発明の別の目的は、顎顔面の骨増大および歯周部の再生を含む骨増大のための、改善された骨グラフト代替材料の提供である。
【００２５】
【特許文献１】WO 94/15653
【特許文献２】EP1 150 726
【特許文献３】PCT/EP2005/006204
【特許文献４】WO03/043673
【特許文献５】US2005/0089579
【特許文献６】US2005/0084542
【発明の開示】
【００２６】
発明の概要
驚くべきことに、本発明者らは、これらの目的を解決する成形可能な生体材料、および該生体材料の生産のための対応する方法を提供することが可能であった。
【００２７】
それに加えて、本発明者らは、100〜4000μmの平均粒子サイズを有する粒子状固体多孔性材料、および生分解性ペースト材料を含む成形可能な生体材料を提供する。
【００２８】
ペースト材料および粒子状固体多孔性材料は、骨の置換または増大のために特に有利なマトリクスを形成する。マトリクスは、移植後少なくとも約2〜3日の期間、構造的完全性を維持し、かつ、骨置換が起きている生理学的環境への移植後に多孔性構造を維持する。「構造的完全性」とは、移植されたマトリクスの形状およびサイズが実質的に維持されることを意味する。これは、粒子状固体多孔性材料が高い機械的強度の構造を形成し、かつ、ペースト材料が粒子状固体多孔性材料を共に保持する、二成分システムのためである。
【００２９】
本発明の成形可能な生体材料の構造的完全性は、インプラント後直ちにまたは間もなく構造が不定形な無孔の塊に崩壊する、セラミックまたはナノ結晶性ヒドロキシアパタイト懸濁液などの先行技術の組成物のような他のペーストと対照的である。本発明の成形可能な生体材料のマトリクスがまた、骨置換または増大の過程のために重要である移植後の孔隙率を維持することは、有利である。
【００３０】
本発明の成形可能な生体材料は、移植後インビボで二相性分解を示す二成分システムであり、すなわち、各成分、粒子状固体多孔性材料および生分解性ペースト材料は、異なる分解動態を引き起こす。二相性分解のために、本発明の成形可能な生体材料は、移植後の改善された骨形成のための多孔性構造を維持する。加えて、二相性分解は、骨成長誘導剤のような活性剤の改善された持続的な放出または送達を可能にする。
【００３１】
好ましくは、本発明の成形可能な生体材料は、移植後インビボで結局二成分システムの三相性分解プロファイルとなる、成分の一つの二相性分解プロファイルを有する。三相性分解プロファイルは、粒子状固体多孔性材料、生分解性ペースト材料のポリマー成分、および生分解性ペースト材料のセラミック成分それぞれの異なる分解動態によって引き起こされてもよい。
【００３２】
本発明の成形可能な生体材料の一つの利点は、適用の部位に容易に採用され得、かつ、適用の場所に残存する、成形可能な凝集性粘稠度を有することである。β-リン酸三カルシウム顆粒またはHAナノ懸濁液のような他の生分解性インプラント材料と対照的に、本発明のインプラントは、多量に出血する環境のような湿った開放されたインプラント部位に適用される際に洗い出されることに対して良好な抵抗性を有する。
【００３３】
本発明の別の利点は、インプラント材料に含まれる活性物質への有機溶媒の負の影響が、有機溶媒を含む生分解性ペースト材料と、活性物質を含むβ-リン酸三カルシウム顆粒のような粒子状固体多孔性材料とを分離することによって割愛され得ることである。
【００３４】
本発明のさらなる利点は、削減されたポリマー含量を有する従来のペースト状組成物と比較して、成形可能な生体材料の増加した孔隙率、およびそのために削減された生物体への負荷である。加えて、成形可能な生体材料の機械的安定性は、従来のペースト状組成物と比較して増加している。
【００３５】
本発明の成形可能な生体材料の二つの単離された成分を含むキットを提供することによって、二つの成分の使用直前の混合が可能である。活性物質を含むセラミック材料と有機溶媒を含む生分解性ペースト材料との、本発明の成形可能な生体材料を使用するすぐ前の混合によって、骨成長誘導タンパク質のような活性剤の保存期間は、既に保存条件下で有機溶媒および活性剤を含む製剤と比較してさらに増加され得る。
【００３６】
キットの別の利点は、二つの成分の分離のために、生分解性ペースト材料が、例えばγ線滅菌によって最終滅菌され得ることである。
【００３７】
PCT/EP2005/006204のペーストのようなポリマーペーストと比較して、インプラント材料のポリマー含量が減少されているにもかかわらず、インプラント材料が驚くべきことに多孔性セラミック材料の添加のないポリマーペーストの硬度よりも2.5倍高い硬度を2時間後に示すことが、本発明の局面である。
【００３８】
本発明の他の効果または利点は、以下に説明される。
【００３９】
本発明の態様は以下である。
【００４０】
（1）以下を含む成形可能な生体材料：
a）100〜4000μmの平均粒子サイズを有する粒子状固体多孔性材料、および
b）生分解性ペースト材料。
【００４１】
（1a）好ましくは、粒子状固体多孔性材料は、成形可能な生体材料の内部構造を形成し、かつ機械的強度を担い、一方、生分解性ペースト材料は、粒子状固体多孔性材料を共に保持する。さらに、生分解性ペースト材料は粒子状固体多孔性材料の機械的強度を改善する。本発明のおかげで、前者の粒子状固体多孔性材料は、粒子状固体多孔性材料（例えば、自由に流動するセラミック顆粒）および生分解性ペースト材料と比較して改善された機械的強度を有する単一の構造体に組み入れられる。
【００４２】
（1b）より好ましくは、成形可能な生体材料は骨置換材料である。
【００４３】
（1c）さらにより好ましくは、成形可能な生体材料は無水である。
【００４４】
（1d）最も好ましくは、生分解性ペースト材料は、非コラーゲンベースのポリマーを含む。
【００４５】
（1e）別の態様において、生分解性ペースト材料は、合成ポリマーを含む。
【００４６】
（1f）さらなる態様において、成形可能な生体材料のポリマー含量は、35 wt％未満、より好ましくは25 wt％未満、15 wt％未満、最も好ましくは約10〜15 wt％である。
【００４７】
（1g）さらなる態様において、成形可能な生体材料の粒子状固体多孔性材料および水に不溶の固体充填剤の含量は、50 wt％より多く、より好ましくは55 wt％より多く、最も好ましくは約58〜62 wt％である。
【００４８】
（1h）別の態様において、成形可能な生体材料内の固体材料の量は、少なくとも55 wt％、好ましくは55 wt％と80 wt％との間、55 wt％と70 wt％との間、55 wt％と65 wt％との間、58 wt％と62 wt％との間である。好ましくは、成形可能な生体材料内の固体材料および／または粒子状固体多孔性材料は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、およびウシ由来骨グラフト代替材料より選択される。
【００４９】
（2）生分解性ペースト材料が以下を含むペーストであって、ペーストが好ましくは注射可能である、態様1記載の成形可能な生体材料：
i．水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤；
ii．可塑剤に可溶であり、かつ、生体適合性、生分解性、および／または生体吸収性（bioresorbable）である、水に不溶のポリマー；および
iii．可塑剤に不溶である、水に不溶の固体充填剤。
【００５０】
（2a）以下であり、一つの局面におけるペーストが好ましくは注射可能である、態様1記載の成形可能な生体材料：
a）粒子状固体多孔性材料が、100〜4000μm、100〜3000μm、100〜2000μm、100〜1500μm、500〜4000μm、500〜3000μm、500〜2000μm、500〜1500μm、または500〜1000μmの平均粒子サイズを有する、顆粒、好ましくは、リン酸カルシウムまたは硫酸カルシウム、より好ましくはリン酸三カルシウム、最も好ましくはβ-リン酸三カルシウムで作られたセラミック顆粒を含み、ならびに
b）生分解性ペースト材料が、
i．水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤；
ii．可塑剤に可溶であり、かつ、生体適合性、生分解性、および／または生体吸収性である、水に不溶のポリマー；および
iii．可塑剤に不溶である、水に不溶の固体充填剤
を含むペーストである。
【００５１】
（2b）任意で、生分解性ペースト材料は、注射可能、かつパッケージ中で安定であり、かつ、水性媒質または体液と接触すると固体インプラントを形成するようにインサイチューで硬化することが可能である。
【００５２】
（2c）本発明の該粒子状固体多孔性材料は、生分解性、生体吸収性、および／または生体適合性であり、好ましくは、骨伝導性であり、かつ、骨成長促進物質のような活性剤またはその組み合わせの添加によってまた骨誘導性特性を有する、マクロ多孔性および／またはミクロ多孔性生体材料である。それは、成形可能な生体材料の機械的安定性を増加してもよく、かつ、ポリマー成分のようなb）の生分解性ペースト材料の分解後に細胞の浸潤およびその後の骨置換のためのマトリクスとして残存する。
【００５３】
好ましくは、固体多孔性材料は、相互に連結する孔を有する。
【００５４】
好ましくは、該粒子状固体多孔性材料は、無機カルシウム化合物またはバイオガラスのような二酸化ケイ素ベースの材料である。より好ましくは、該粒子状固体多孔性材料は、リン酸カルシウム、最も好ましくは、リン酸三カルシウム、β-リン酸三カルシウム、α-リン酸三カルシウム、アパタイト、リン酸カルシウムを含むセメント、テトラ‐リン酸カルシウム、二相性リン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト材料（TCP/HA）、または、それらの組み合わせもしくは混合物、最も好ましくは、β-リン酸三カルシウムである。
【００５５】
好ましくは、該粒子状固体多孔性材料は、顆粒状の外見、より好ましくは、自由に流動する顆粒としての外見を有する。好ましくは、該粒子状固体多孔性材料の平均粒子サイズおよびその好ましい態様は、100〜4000μm、100〜3000μm、100〜2000μm、100〜1500μm、500〜4000μm、500〜3000μm、500〜2000μm、500〜1500μm、または500〜1000μmである。
【００５６】
加えて、粒子状固体多孔性材料は、任意で、例えば下記の態様6において説明されるような活性剤のための担体である。好ましくは、活性剤は、粒子状固体多孔性材料上に、少なくとも部分的に一様にまたは均等に分配される。最も好ましくは、粒子状固体多孔性材料は、BMP-2、BMP-7、またはGDF-5を含むがそれらに限定されない形態発生タンパク質のような活性剤で、均質にまたは均一にコーティングされる。BMP-2、BMP-7、またはGDF-5を含む活性剤は、それらの成熟タンパク質、または、それらの生物学的活性断片もしくは変異体（例えば、N末端アラニン伸長を有する成熟ヒトBMP-2タンパク質）を含む、当技術分野において公知である活性形態において使用されてもよい。
【００５７】
（2d）一つの態様における該生分解性ペースト材料における該水に不溶の固体充填剤は、以下を含む：
a）無機化合物、および／または
b）有機化合物。
【００５８】
本態様における無機化合物は、好ましくは、カルシウム化合物、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、二酸化ケイ素、または、それらの組み合わせもしくは混合物、より好ましくは、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、またはリン酸カルシウム、最も好ましくは、リン酸三カルシウム、β-リン酸三カルシウム、α-リン酸三カルシウム、アパタイト、リン酸カルシウムを含むセメント、テトラ‐リン酸カルシウム、二相性リン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト（TCP/HA）、または、それらの組み合わせもしくは混合物である。
【００５９】
該有機化合物は、キトサン、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘導体、または、澱粉もしくはその誘導体を含む。
【００６０】
（2d）において言及された一つまたは複数の化合物の組み合わせもまた、包含される。
【００６１】
生分解性ペースト材料は、任意で、好ましくは、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、またはヒドロキシアパタイトの群より選択される、少なくとも一つのさらなるカルシウム含有の水に不溶の固体充填剤を含む。
【００６２】
（2e）一つの態様における生分解性ペースト材料における該水に不溶のポリマーは、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(無水物)、ポリ(アミノ酸)、ポリグリコリド酸（polyglycolid acid：PGA）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリ(D,L)-乳酸（PDLLA）、ポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（poly(lactic-co-glycolic acid)：PLGA）、ポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)ポリエチレングリコール（PLGA-PEG）コポリマー、ポリ(3-ヒドロキシブチル酸)（P(3-HB)）、ポリ(3-ヒドロキシ吉草酸)（P(3-HV)）、ポリ(p-ジオキサノン)（poly(p-dioxanone)：PDS）、ポリ(ε-カプロラクトン)（PCL）、ポリ無水物（PA）ポリオルトエステル、ポリグラクチン（polyglactine）、または、それらのコポリマー、ターポリマー、ブロックコポリマー、組み合わせ、混合物を含む。
【００６３】
好ましくは、水に不溶のポリマーはPLGA、好ましくは、75：25未満、好ましくは50：50の乳酸／グリコール酸の比を有する水に不溶のポリマーである。
【００６４】
また好ましくは、水に不溶のポリマーは末端キャップポリマーである。末端キャップポリマーは、非末端キャップポリマーと比較して極性の変化をもたらす、修飾されているが遊離でないカルボキシル末端基を含む。
【００６５】
好ましくは、水に不溶のポリマーは、非末端キャップポリマーまたは遊離カルボキシル末端基を有するポリマーである。そのようなポリマーは、極性の、好ましくは正電荷の活性剤と、末端キャップポリマーよりも良好に相互作用する可能性がある。そのためこれは、末端キャップポリマーと比較してさらなる徐放の利点をもたらす。
【００６６】
一つの局面において、生分解性ペースト材料の水に不溶のポリマーの含量は、40 wt％と等しいか、またはより少ない。
【００６７】
別の態様において、生分解性ペースト材料組成物の密度は、1,21 g/mlと等しいか、またはより大きく、好ましくは1,3 g/mlと1,5 g/mlとの間である。
【００６８】
（2f）一つの態様における該生分解性ペースト材料における該可塑剤は、ポリエチレングリコール（PEG）400、PEG 200、PEG 300、PEG 600、1,3-ブタンジオール（1,3-butandiole）、ひまし油、N-メチル-2-ピロリドン、2-ピロリドン、C2-C6アルカノール、プロピレングリコール、ソルケタール（solketal）、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、乳酸エチル、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、テトラヒドロフラン、デシルメチルスルホキシド、オレイン酸、プロピレンカーボネート、N,N-ジエチル-m-トルアミド；1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、またはそれらの混合物を含む。
【００６９】
好ましくは、該生分解性ペースト材料における可塑剤は、ポリエチレングリコール（PEG） 400を含む。
【００７０】
好ましくは、生分解性ペースト材料の可塑剤含量は40〜95 wt％、より好ましくは、40〜55 wt％である。
【００７１】
（2g）生分解性ペースト材料において、水に不溶の固体充填剤と水に不溶のポリマーとの比（すなわち、重量比）は、50 wt％未満、好ましくは30〜36 wt％の水に不溶の固体充填剤、および、40 wt％未満、好ましくは20〜25 wt％の水に不溶のポリマーを含む混合物におけるように、好ましくは1：1と5：1との間、より好ましくは1：1と3：1との間、さらにより好ましくは約1,5：1である。
【００７２】
（3）成形可能な粘稠度を有し、かつ、好ましくは、水性媒質または体液と接触すると固体インプラント、好ましくは固体多孔性インプラントを形成するようにインサイチューで硬化することが可能である、態様1または2のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００７３】
（3a）より好ましくは、固体インプラントが相互に連結する孔を有する、上記の態様のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００７４】
（4）成分a）およびb）が、凝集性産物を形成するための比、好ましくは1：0,3 wt％〜1：2 wt％、好ましくは1：1 wt％〜1：2 wt％、より好ましくは1：1,3 wt％〜1：1,7 wt％、最も好ましくは1：1,4 wt％〜1：1,6 wt％の比で使用される、態様1〜3のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００７５】
好ましい態様において、成形可能な生体材料の構造は、a）およびb）の二成分システムである。粒子状固体多孔性材料は、インビボで硬化した後のシステムの機械的強度を改善し、一方、生分解性ペースト材料は、適用の前および間に粒子状固体多孔性材料を共に保持する凝集性半固体構造を提供する。移植部位への適用の後、半固体凝集性材料は硬化し、かつ、インビボで粒子の間に少なくとも部分的に固体の架橋を形成することによって、固体多孔性粒子と共に結合する。こうして、二成分を組み合わせることによって、β-TCPのような顆粒材料とは対照的に局所的に固定された、または静止した生体材料である、凝集性の成形可能な材料が生成される。この凝集性の成形可能な材料は、水性溶液または体液内でインサイチューで硬化した後に、細胞の浸潤およびその後の骨形成のための凝集性の足場へと移されると考えられる。生体材料の成形可能な特徴は、骨空隙充填、重大なサイズ欠損、長骨欠損、および脊椎固定のような種々の適用における種々の機器の充填または骨形成を促進する。好ましくは、1：0,3 wt％〜1：2 wt％、好ましくは1：1 wt％〜1：2 wt％、より好ましくは1：1,3 wt％〜1：1,7 wt％、最も好ましくは1：1,4 wt％〜1：1,6 wt％のa）とb）との比が使用される。これらの比は、セラミック粒子の凝集性システムへの、および逆の理想的な結合が、脊椎固定のような適応症のために使用されるような最終的なインプラント材料の最大孔隙率を達成することを可能にする。最終的な成形可能な生体材料におけるセラミック粒子に対するペースト材料の比は、再生過程を促進するために、インサイチューで硬化した後の生体材料の全孔隙率を調節し、かつ、材料の崩壊を回避する。ポリマー成分の分解後でさえも、粒子状固体多孔性材料の多孔性足場は、適用の場所に残存し、その後、骨または軟骨のような新たに形成された組織によって置換されると考えられる。
【００７６】
（5）成分b）のペーストが、水溶性分解制御剤を含む、態様1〜4のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００７７】
（5a）成形可能な生体材料における該水溶性分解制御剤は、一つの態様において、一つまたは複数の以下を含む：
（a）膨張剤、好ましくはセルロース誘導体；
（b）表面活性剤、好ましくは、Pluronics（登録商標）もしくはTween（登録商標）80のような、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー；または
（c）トレハロース、マンニトール、スクロース、ソルビトール、生理学的アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アルギニン、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリビニルピロリドン（PVP）、PEG 4000、PEG 10000のような固体PEG、炭酸水素ナトリウム、硫酸カルシウム、もしくはキトサンのような孔生成剤（porogenic agent）；または
（d）ガス、または、炭酸カルシウムもしくは炭酸水素ナトリウムのようなガス生成剤。
【００７８】
（5b）生分解性ペースト材料における水溶性分解制御剤の含量は、成分b）のペーストの総重量に基づいて、10 wt％未満、好ましくは5 wt％未満、より好ましくは1〜4 wt％の間、最も好ましくは1,5〜3,5 wt％、最も好ましくは2〜3,5 wt％である。
【００７９】
（5c）生分解性ペースト材料における水溶性分解制御剤は、好ましくはカルボキシメチルセルロースであり、より好ましくは、成分b）の生分解性ペースト材料の総重量に基づいて、10 wt％未満、好ましくは5 wt％未満、より好ましくは1〜4 wt％の間、さらにより好ましくは1〜3,5 wt％、最も好ましくは2〜3,5 wt％のカルボキシメチルセルロースである。
【００８０】
（5d）生分解性ペースト材料における水溶性分解制御剤は、好ましくは、1000μm未満、好ましくは25〜1000μmの間、より好ましくは50〜500μm、最も好ましくは100〜300μmの平均粒子サイズを、好ましくは1500〜2500 mPa*sの粘度、好ましくは0,2と1,3との間、より好ましくは0,6と1との間、最も好ましくは約0,7の置換度とともに有する。
【００８１】
（6）さらに以下を含む、態様1〜5のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料：
c）活性剤、好ましくは治療的有効量の活性剤、最も好ましくは、活性剤は、組織再生剤、骨成長因子、骨誘導剤、または軟骨誘導剤である。
【００８２】
（6a）成形可能な生体材料における活性剤は、好ましくは、粒子状固体多孔性材料上にコーティングされるか、または、粒子状固体多孔性材料内に捕捉される。
【００８３】
（6b）別の局面において、活性剤は、水に不溶の固体充填剤上にコーティングされるか、または、可塑剤中に溶解されるか、もしくは懸濁され、好ましくは、生分解性ペースト材料の水に不溶の固体充填剤上に均質にコーティングされる。
【００８４】
（6c）好ましくは、活性剤を有さない、または好ましくは有する成形可能な生体材料は、インビボにおける骨誘導性および／または骨伝導性の軟骨または歯周靭帯再生特性を有する。
【００８５】
（7）活性剤が、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、好ましくは骨成長因子、抗生物質、および低分子からなる群より選択される、態様1〜6のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００８６】
（7a）一つの局面において、活性剤は、副甲状腺ホルモン（PTH）および／またはPTH 1-34ペプチドである。
【００８７】
（7b）別の局面において、活性剤は、骨誘導性または軟骨誘導性タンパク質である。
【００８８】
（7c）別の局面において、活性剤は、TGF-βファミリーのメンバー、または、好ましくは、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、もしくはBMP-16；GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、もしくはGDF-11より選択されるBMPもしくはGDFファミリーのメンバーである。これらの活性剤の二つまたはそれ以上の組み合わせもまた、適切な場合、本局面に包含される。
【００８９】
（7d）別の局面において、活性剤は、軟骨を再生する軟骨由来レチノイン酸感受性タンパク質（cartilage derived-retinoic acid-sensitive protein：CD-RAP）である。
【００９０】
（7e）好ましくは、該活性剤は、BMP-2、BMP-7、およびGDF-5より選択される。
【００９１】
（8）1mlの生体材料あたり5μg〜2 mgの活性剤、好ましくは1mlあたり250μg〜2 mg、最も好ましくは1mlあたり250μg〜1 mgを含む、態様1〜7のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００９２】
（9）インサイチューで二相性分解を示す、態様1〜8のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００９３】
本発明の利点は、ポリマーおよび固定された粒子状固体多孔性材料が、骨の置換または増大のために特に有利である複合マトリクスを形成することである。マトリクスの生理学的完全性が維持される約2〜3日の後に、ポリマー分解が増加し、数週間に渡って、新たに形成された骨による生体材料の置換が起きる環境内で、多孔性固体セラミックのマトリクス構造が維持される。
【００９４】
「二相性分解」という用語は、二段階の分解、すなわち、ポリマーの最初の分解、および第二の分解相を意味し、ここで、粒子状固体多孔性材料が、例えば破骨細胞のような細胞によって再吸収され、新たに形成された骨によって置換されると考えられる。第二の分解期間は、リモデリング過程の加速のための活性剤のさらなる放出を可能にする可能性がある。この分解プロファイルは、異なるまたは連続的な放出相に分割され得る放出パターンをもたらす。そのような放出相は、例えば、最初の放出、ポリマーの分解および／または外への拡散時のさらなる放出、ならびにポリマー成分の崩壊時の最終的な放出からなり得る。
【００９５】
（10）インサイチューで硬化した後少なくとも2〜3日の期間、物理的完全性を維持し、および／または、ポリマー成分の分解後に多孔性顆粒状構造を維持する、態様1〜9のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料。
【００９６】
（10a）好ましい態様において以下を含む、成形可能な生体材料：
（a）β-リン酸三カルシウム
（b）i．PEG 400
ii．PLGA
iii．リン酸カルシウムを含むセメント、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸水素カルシウム、β-リン酸三カルシウム、およびα-リン酸三カルシウム、またはそれらの混合物の群より選択されるリン酸カルシウム；および
iv．任意で、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩。
【００９７】
（10b）さらに好ましい態様において以下を含む、成形可能な生体材料：
（a）500〜1000μmの平均粒子サイズを有し、好ましくは20〜70％の全孔隙率を有する、β-TCP顆粒；
（b）i．PEG 400：40〜50 wt％、好ましくは40〜45％；
ii．PLGA：20〜25 wt％、好ましくは22〜25％；
iii．リン酸カルシウムを含むセメント、およびβ-リン酸三カルシウムの群より選択されるリン酸カルシウム：25〜40 wt％、好ましくは30〜35％；および
iv．任意で、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩。
【００９８】
態様（10a）および（10b）における任意のカルボキシメチルセルロースナトリウム塩成分は、好ましくは、成分b）のペーストの総重量に基づいて、10 wt％未満、好ましくは5 wt％未満、より好ましくは1〜4 wt％の間、最も好ましくは2〜3,5 wt％の量で含まれてもよい。
【００９９】
本発明による全孔隙率とは、β-TCPのような合成生体材料の、マクロ‐および／またはミクロ孔隙率を意味する。孔隙率は、当業者に周知である水銀ポロシメトリー（porosimetry）およびマイクロCTのような方法によって測定され得る。
【０１００】
好ましくは、β-TCPは、生体材料の分解の間の望ましくない副作用を回避するために、相純粋の（phase pure）β-TCPである。相純度は、例えばTadic and Epple, (2004), Biomaterials 25: 987-994に記載されているような、高分解能X線回折法のような方法によって測定され得る。
【０１０１】
（11）態様1〜10のいずれか一つにおいて記載される成形可能な生体材料の単離された成分a）およびb）、または、態様6〜10のいずれか一つにおいて記載される成形可能な生体材料の単離された成分a）、b）、およびc）を含む、キット。
【０１０２】
本発明のおかげで、二つの成分a）およびb）の分離、a）、b）、およびc）の分離、または、b）およびc）の分離が、長期に渡る活性剤の安定性を増加させ、そのために、成形可能な生体材料の再生可能性を増加させる。これは、長期保存を改善し、そのために、最終製品の費用効果が高い提供を改善する。さらに、生分解性ペースト材料中への水の吸収または拡散を回避するために、薬学的調製物において一般に使用され、かつ当業者に周知である、ブリスター（blister）、ガラスバイアルのような一つまたは複数の一次パッケージング成分を使用することによって、ペースト材料の安定性がさらに延長されてもよい。使用する準備が整った製品（例えば、一成分製品）と比較して両成分の分離の別の利点は、成形可能な生体材料の工業生産が著しく単純化され（例えば、最終滅菌によって）、かつ、無菌製造工程のような他の工業生産工程と比較して高価でないことである。
【０１０３】
（11a）好ましい態様において、キットはまた、シリンジ、塗布具、注射銃、付着機器、機器、脊椎固定機器、最小侵襲性適用機器、へら、るつぼ、またはそれらの組み合わせのような適用のための器具を含んでもよい。
【０１０４】
（12）態様1〜10のいずれか一つにおいて記載される成形可能な生体材料の成分a）およびb）、または、態様6〜10のいずれか一つにおいて記載される成形可能な生体材料の成分a）、b）、およびc）を含むインプラント、好ましくは、水性溶液と接触すると得られる硬化したインプラント。
【０１０５】
（13）混合物が成形可能な粘稠度を有するように、
i．水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤；
ii．水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤；
iii．可塑剤に不溶である、水に不溶の固体充填剤
を含むペーストを、100〜4000μmの平均粒子サイズを有する粒子状多孔性材料、好ましくは上記の態様において説明されたような粒子状多孔性材料と混合する段階を含み、水性媒質または体液と接触すると固体多孔性インプラントを形成するようにインサイチューで硬化することが可能である、成形可能な生体材料を製造する方法。
【０１０６】
（14）生分解性ペースト材料が、水不純物を減少させるために乾燥され、ならびに／または、無水成分（i）、（ii）、および／もしくは（iii）を用いて製造される、態様13記載の方法。
【０１０７】
本製造段階の利点は、例えば、成形可能な生体材料の時期尚早な硬化、化学変化、またはポリマーの鎖切断を回避するための、ペースト材料および対応する成形可能な生体材料の安定性のさらなる増加である。
【０１０８】
（15）脊椎固定、長骨欠損、重大なサイズ欠損、偽関節、関節再配置、好ましくは膝または股関節部再配置、骨折修復、軟骨修復、全層または部分層欠損、顎顔面再構築、洞底（sinus floor）増大、歯周部修復、歯周炎、変性椎間板疾患、脊椎すべり症、骨空隙充填のような適応症のために使用される薬学的組成物または医療機器の製造のための、態様1〜10のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１０９】
（15a）好ましくは、薬学的組成物または医療機器は、隣接する椎骨を固定するために使用されるべきである。本態様において、薬学的組成物または医療機器は、好ましくは、隣接する椎骨の間に、任意で、脊椎固定ケージまたはスペーサーのような脊椎インプラント内に挿入されるべきである。
【０１１０】
脊椎手術のために使用される脊椎インプラントは、当業者に周知であり、円筒または円錐ケージ（ねじケージ（threaded cage））、箱型または長方形ケージ（非ねじケージ）、水平円柱（例えば、BAKケージ）、垂直リング（例えば、Harmsケージ）、開口箱（例えば、Brantiganケージ）から、固体長方形平行パイプスペーサー（solid rectangular parallel piped spacer）、例えば、LT-Cage Lumbar Tapered Fusion Device、INTER FIX（商標）およびINTER FIX（商標） Threaded Fusion Device、ならびに、茎ねじ（pedicle screw）および固定機器を有するまたは有さない、Telamon Peek（商標）およびTelamon Hydrosorb（商標）のような生体吸収性ケージまでの範囲の異なる形状で入手可能である（Advances in spinal fusion, Molecular Science, Biomechanics and Clinical Management, Marcel Dekker, Inc New York 2004）。異なる固定技術はさらに上記で説明されており、かつ、当業者に公知である。
【０１１１】
好ましくは、上記の態様記載の成形可能な生体材料は、骨形成の代わりの繊維組織形成を回避するために材料が空隙または中空構造を埋め合わせるように、脊椎インプラント中に充填される。任意で、充填されたインプラントは、細胞の遊走および組織再生に最適な多孔性足場をもたらす、体または組織中への適用のすぐ前に、水性液体、体液、または塩化ナトリウム溶液において、少し浸され、浸漬され、または湿らされ得る。
【０１１２】
または、薬学的組成物または医療機器はまた、内固定を有するまたは有さない一つまたは多数のレベルで後側方固定のために使用され得る。本態様において、薬学的組成物または医療機器は、好ましくは、任意で内固定を有してまたは有さずに、椎骨の後側方に挿入されるべきである。
【０１１３】
（15b）本態様は、態様1〜10のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントが、脊椎固定ケージまたはスペーサーのような脊椎インプラント内に、態様1〜10のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット成分、または態様12記載のインプラントを隣接する椎骨の間に挿入する段階を含んで、脊椎固定、長骨欠損の処置、重大なサイズ欠損の処置、骨折の処置、偽関節の処置、変性椎間板疾患の処置、脊椎すべり症の処置、骨空隙の処置の方法、または隣接する椎骨を固定する方法において使用されてもよいことを考慮に入れる。
【０１１４】
本態様はまた、態様1〜10のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントが、態様1〜10のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット成分、または態様12記載のインプラントを挿入する段階を含んで、骨および／または軟骨誘導の方法において使用されてもよいことを考慮に入れる。
【０１１５】
（16）態様13または14記載の方法によって製造される成形可能な生体材料。
【０１１６】
（17）態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントを含む、薬学的組成物。
【０１１７】
（18）骨増大のために使用される薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１１８】
（18a）好ましい態様において、該骨増大は、外傷性、悪性、または人為的欠損の後に続き、または、その後のインプラントの設定のための必要条件である。
【０１１９】
（19）骨欠損を処置するための薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２０】
（19a）好ましい態様において、該骨欠損は、長骨欠損、重大なサイズ欠損、偽関節、膝および股関節部再配置のような関節再配置後の欠損、顎顔面領域における欠損もしくは根尖切除後の骨欠損、嚢腫もしくは腫瘍の摘出、抜歯、頭蓋冠欠損、脳頭蓋もしくは顔面頭蓋の骨性欠損、骨粗鬆症、または保留された歯の手術的除去である。
【０１２１】
（20）変性、外傷性椎間板疾患、脊椎固定、椎体骨折、椎体形成、および椎骨形成を処置するための薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２２】
（21）骨の裂開を処置するための薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２３】
（22）萎縮した上顎または下顎隆線（ridge）の洞底隆起または増大のために使用される薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２４】
（23）窩洞の充填、歯周病学における再生、および／または歯周病学における支持体誘導組織再生のための薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２５】
（24）軟骨形成を促進するための薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２６】
（25）少なくとも一つの軟骨疾患の処置のために使用される薬学的組成物の調製のための、態様（1）〜（10）のいずれか一つ記載の成形可能な生体材料、態様11記載のキット、または態様12記載のインプラントの使用。
【０１２７】
好ましくは、該骨疾患は、軟骨形成性分化が関与する以下の疾患より選択される：変形性関節症、関節リウマチ、外傷による関節軟骨の損傷、骨軟骨欠損、全層もしくは部分層欠損、自己軟骨細胞移植における軟骨細胞表現型の維持、耳、気管、もしくは鼻における軟骨の再構築、離断性骨軟骨炎、椎間円板または半月板の再生、骨折、および／または軟骨からの骨形成。
【０１２８】
本発明の詳細な説明
本発明は次に、以下の定義および本発明の図面の説明を参照することによって、詳細に説明される。
【０１２９】
重要な技術用語の定義
本発明の原理の理解を促進する目的のために、その特定の態様、および、同じものを説明するために使用される具体的な術語について言及される。それにもかかわらず、それによって本発明の限定は意図されず、本明細書において例証されるような本発明の原理の変更、さらなる適用、および改変は、本発明が関する当業者に通常に起こるであろうように企図されることが、理解されると考えられる。
【０１３０】
A  成形可能な生体材料
「成形可能な生体材料」という用語は、欠損部位またはインプラントにおいて中空空隙または窩洞を充填するような、任意の形状および形態に容易に採用され得る生体材料を意味する。好ましくは、最小侵襲性適用または注射によって適用され得る懸濁液、分散液、または液体組成物を含む。また、延性のペースト様材料を含む。好ましくは、成形可能な生体材料は、湿った環境において、好ましくはヒトの体内で、またはヒト体液と接触して硬化することが可能であり、すなわち、インサイチューで硬化することが可能である。本発明の成形可能な生体材料は、生理食塩水または体液のような水性溶液の適用に先立って成形可能である点で、CPCのような他の従来の生体材料から区別する。セメント組成物または低結晶アパタイト（poorly crystalline apatitic：PCA）リン酸カルシウムインプラント材料のような従来の自己硬化または自己設定反応組成物と対照的に、本発明の成形可能な生体材料は、好ましくは、化学的セメント設定反応のための一つまたは複数の反応性成分の代わりに足場特性を有する粒子状固体多孔性材料を含む。好ましくは、成形可能な生体材料は、好ましくはリン酸カルシウムとの組み合わせで骨鉱質除去骨マトリクス（DBM）を含まない。
【０１３１】
「無水」という用語は、成形可能な生体材料が、Karl Fisher法のような方法により測定される、5 wt％未満、より好ましくは3 wt％未満、さらにより好ましくは2 wt％未満、最も好ましくは1 wt％未満の水を含むことを意味する。好ましくは、無水という用語は、極微量の自由水（例えば、非結合水）のみが成形可能な生体材料中に存在することを意味する。自由水の量の減少は、例えばPLGAのようなポリマーの分解速度を低下させる可能性があり、従って、成形可能な生体材料の保存期間を増加させる可能性がある。
【０１３２】
極微量の水は、個々の成分を乾燥する、減圧下または高温下で乾燥するような当業者に公知の標準的な製造方法、原料の熱による前処理、真空乾燥、凍結乾燥を含む公知の方法、および適切な場合分子ふるいによって、ならびに、湿気感受性の薬学的調製物をパッケージングするための乾燥剤を有するパッケージングシステムを用いることによっても、さらに減少され得ない水の量を意味する。
【０１３３】
顆粒状材料のような「顆粒状」という用語は、少なくとも1μm、好ましくは少なくとも50μm、最も好ましくは少なくとも100μmのサイズ制限を有する、砂、粒状物、または粉末のような生体材料の分離した固体粒子を意味する。
【０１３４】
「凝集性」という用語は、互いに接着するまたは付着することを意味する。少なくともいくつか、例えば粒子状多孔性材料の粒子状粒子が、それらの粒子状隣接物の少なくともいくつかと粒子状固体多孔性材料を共に保持するように、生分解性ペースト材料を介して架橋を形成することも、また包含される。
【０１３５】
本発明において使用されるような「インサイチュー硬化」という用語は、エクスビボ、ならびに、ヒトまたは動物の体または組織のような生物体において、周囲への有機溶媒の消散または溶解後、水のような水性媒質、生理学的溶液、または体液との接触の後に、固体マトリクスを形成することを指す。成形可能な生体材料の適応症および使用に依存して、そのような固体マトリクスはまた、マトリクスが周囲の体液と接触した後に適用前のペーストよりも高い機械的強度を少なくとも有するマトリクス、好ましくはインプラントを包含すると考えられる。
【０１３６】
B  粒子状固体多孔性材料
「粒子状固体多孔性材料」という用語は、骨伝導性である、生分解性、生体吸収性、および／または生体適合性の、好ましくは、マクロ多孔性および／またはミクロ多孔性生体材料を意味する。また、リン酸カルシウムのような固体材料の微細の粒子を意味する。詳細な説明は、上記の態様にさらに包含されている。
【０１３７】
C  生分解性ペースト材料
上記で指示されたように、本発明は、一般に、以下の少なくとも三つの成分を含む生分解性ペースト材料であって、ペーストが、好ましくは、注射可能、かつパッケージ中で安定であり、かつ、欠損部へ配置された後に硬化する、生分解性ペースト材料を提供する：水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である、可塑剤、生体適合性、生分解性、および／または生体吸収性であり、かつ、可塑剤に可溶である、水に不溶のポリマー、および、可塑剤に不溶である、水に不溶の固体充填剤。
【０１３８】
好ましくは、予め混合された生分解性ペースト材料のパッケージにおける安定性は、少なくとも数週間、より好ましくは数ヶ月間、最も好ましくは少なくとも1年間である。安定性は、長期に渡って粘稠度に劇的な変化のない、それぞれの予混合物の粘稠度および成形可能性として理解され得る。パッケージは、薬学的適用において非経口適用のために一般に使用されるような、一般に使用される防水性パッケージを含む。
【０１３９】
本発明に従って使用されるような「ペースト」という用語は、本明細書において記載される少なくとも三つの成分、好ましくは少なくとも四つの成分を含む、好ましくはシリンジまたは最小侵襲性適用を用いて投与可能な（すなわち、16〜18ゲージのシリンジを通過することが可能な）、柔軟、平滑、濃厚な混合物もしくは材料、またはペースト状実体を指す。好ましくは、生分解性ペースト材料は、活性剤の望ましくない分解、および／または不活性化を回避するために、活性剤と適合性であるべきである。少なくともいくつかの態様において、ペーストは、懸濁液、分散液、または液体である。
【０１４０】
好ましい態様において、本発明の生分解性ペースト材料ならびに成形可能な生体材料は、毒性物質を含まない。生産過程の間の必要とされる除去段階、および、高感度の化学分析のための必要な高価な手段のために、それらの生産が追加的な支出を必要とするため、好ましくは、そのような毒性物質は生産過程において既に回避される。
【０１４１】
「毒性物質」という用語は、特に、当技術分野において記載されている方法により使用され、ICHによってクラス2溶媒として分類されている（ICH Topic Q 3 C Impurities: Residual Solvents）毒性有機溶媒および添加剤、例えば塩化メチレンを包含する。さらに、治療用タンパク質の開発についての国際ガイダンスは、製造過程において有害および毒性の物質は回避されるべきであることを要求している（詳細は、以下を参照：International Conference on Harmonization (ICH), Topic Q3C; www.emea.eu.int/）。しかしながら、本発明のペーストは、有利に、該クラス1分類毒性物質を含まない。さらに、本発明は、ICH Topic Q 3Cによってクラス3として分類された溶媒のみを含み、そのため、治療用に十分に許容され、かつ、規制当局の要求を満たす。
【０１４２】
さらに、さらに好ましい態様において、本発明の生分解性ペースト材料または成形可能な生体材料は、感染性材料を含まない。
【０１４３】
好ましくは、溶媒についてと共通に同じ要求が、生分解性ペーストの可塑剤、水に不溶の固体充填剤、および／または水溶性分解制御剤について、ならびに、本発明の生分解性ペースト自体および成形可能な生体材料について、有効である。
【０１４４】
本発明の生分解性ペーストならびに成形可能な生体材料の成分の濃度の変動は、ペーストまたは成形可能な生体材料の粘稠度、インサイチューでの硬化時間、孔隙率、および最終的なインプラントの機械的特性内の変化によって、特定の医療応用への適合をもたらす。追加的に、これらのパラメータの変動は、水に不溶のポリマーの変化した分解挙動によって活性剤の放出動態を適合させる有力な手段である。
【０１４５】
D  可塑剤
本発明による「可塑剤」という用語は、薬学的に許容される水溶性もしくは水混和性の有機液体もしくは溶媒、またはそれらの混合物を意味する。可塑剤の機能は、水に不溶の生分解性、生体適合性、および／または生体吸収性のポリマーを溶解すること、水に不溶の固体充填剤材料を懸濁すること；または、水に不溶の固体充填剤を追加的に懸濁して不溶性ポリマーを溶解することである。これらの機能は、活性剤の性質に依存してもよい。
【０１４６】
好ましくは、可塑剤の機能は、水に不溶の生分解性、生体適合性、および／または生体吸収性のポリマーのガラス転移温度を、生体材料が成形可能になる温度より下に低下させることであり、より好ましくは、水に不溶の生分解性、生体適合性、および／または生体吸収性のポリマーのガラス転移温度は、周囲の温度より低い。
【０１４７】
水性媒質または体液と接触した好ましいインサイチューでの硬化の間に、可塑剤はペーストの外に拡散し、孔を残し、かつ、安定な複合機器またはインサイチューインプラントの形態をもたらす。それによって、ポリマーのガラス転移温度が上昇して、ポリマーが凝固し、かつ、生体材料を機械的に安定なインプラントへと変化させる。好ましい態様において、可塑剤は、水溶性または水混和性の溶媒である。可塑剤は液体であり得；好ましくは水溶性ポリマーである。好ましくは、可塑剤は、インサイチューで硬化したインプラントにおいて水に不溶のポリマーのガラス転移温度に低い影響を有し、かつ、活性剤と適合性である。水に不溶のポリマーに依存して、下記でさらに定義される可塑剤の群より選択され、設定後のポリマーのガラス転移温度に最も低い影響を有する可塑剤が、使用されるべきである。
【０１４８】
「溶解する」という用語は、液体における物質の溶解または懸濁を意味し、液体内での物質の均質な分布をもたらす。
【０１４９】
好ましくは、該可塑剤は、生体適合性である。より好ましくは、該可塑剤は、ポリエチレングリコール（PEG）400、PEG 200、PEG 300、PEG 600、1,3ブタンジオール、ひまし油、C2-C6アルカノール、プロピレングリコール、ソルケタール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、乳酸エチル、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、テトラヒドロフラン、デシルメチルスルホキシド、オレイン酸、プロピレンカーボネート、N,N-ジエチル-m-トルアミド、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、またはそれらの混合物からなる群より選択される。
【０１５０】
好ましくは、本発明の生分解性ペーストは、60％未満、より好ましくは55％未満、さらにより好ましくは50％未満、最も好ましくは40％と45％との間の可塑剤を含む。
【０１５１】
「生体適合性」という用語は、特定の適用において適切な宿主応答とともに機能する材料の能力を意味する。さらに、「生体適合性」という用語は、材料が任意の毒性特性を示さず、かつ、適用後に任意の免疫反応または炎症性反応を誘導しないことを意味する。
【０１５２】
「生分解性」という用語は、インビボで分散を伴うマクロ分子分解のために分解するが、体からの排出については証拠が存在しない材料、例えばポリマーを明記する。体内の生分解性材料の量の減少は、宿主組織内の物理化学的条件（例えば、湿度、pH値）によって触媒される受動的過程の結果である。
【０１５３】
「生体吸収性」という用語は、インビボで分解、およびさらに吸収を受ける、ポリマー材料のような材料；すなわち、分解副産物の単純濾過のため、またはそれらの代謝後いずれかの天然の経路を通して排出されるポリマーを明記する。従って、生体吸収は、最初の外来材料の総排出を反映する概念である。好ましい態様において、該生体吸収性ポリマーは、水性環境においてマクロ分子分解のために鎖切断を受けるポリマーである。「吸収」という用語は、能動的過程を説明する。
【０１５４】
E  水に不溶のポリマー
「水に不溶のポリマー」という用語は、水に可溶でないポリマーを意味し、すなわち、水と混合された際に均質相を形成せず、可塑剤に可溶であり、かつ、水に不溶の固体充填剤が可塑剤の除去と同時に周囲の組織中に組み入れられる固体インプラントを形成するように水性媒質において凝固することが可能であるポリマーを意味する。好ましくは、該水に不溶のポリマーは、「生体適合性」、「生分解性」、および／または「生体吸収性」ポリマーである。より好ましくは、該水に不溶のポリマーは、好ましくは、純粋なポリマー物質の30℃を越えるガラス転移温度を有する脂肪族ポリマーである。本発明のポリマーの固有粘度（25℃、クロロホルムにおいて0.1％で測定された粘度）は、約0.1 dl/g〜5 dl/g、好ましくは約0,1 dl/g〜1 dl/gの範囲であると考えられる。
【０１５５】
別の態様において、ポリマーは合成ポリマーである。
【０１５６】
または、該水に不溶のポリマーは、ポリエチレン（PE）、ポリプロピレン（PP）、ポリエチレンレフタレート（polyethylenerephtalate：PET）、ポリグラクチン、ポリアミド（PA）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリヒドロキシメチルメタクリレート（PHEMA）、ポリビニルクロライド（PVC）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリスルホン（PSU）、ポリウレタン、ポリシロキサン、またはそれらの混合物からなる群より選択される。
【０１５７】
より好ましくは、該ポリマーは、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(無水物)、ポリ(アミノ酸)、ポリグリコリド（PGA）、ポリラクチド（PLLA）、ポリ(D,L-ラクチド)（PDLLA）、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)またはポリ(L-ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)ポリエチレングリコール（PLGA-PEG）コポリマー、ポリ(3-ヒドロキシブチル酸)（P(3-HB)）、ポリ(3-ヒドロキシ吉草酸)（P(3-HV)）、ポリ(p-ジオキサノン)（PDS）、ポリ(ε-カプロラクトン)（PCL）、ポリ無水物（PA）、それらのコポリマー、ターポリマー、ブロックコポリマー、組み合わせ、混合物からなる群より選択される。
【０１５８】
本発明の別の態様において、水に不溶のポリマーは末端キャップポリマーである。「末端キャップポリマー」という用語は、直鎖状ポリマー鎖の遊離のカルボキシル酸基がアルコールでエステル化されていることを意味する。
【０１５９】
本発明の別の態様において、水に不溶のポリマーは、PLGA-PEGコポリマー、好ましくはPLGA-PEGジブロック‐またはトリブロック‐コポリマーである。
【０１６０】
F  水に不溶の固体充填剤
「水に不溶の固体充填剤」という用語は、水ならびに可塑剤に不溶の化合物を意味し、すなわち、水または可塑剤と混合された際に均質相を形成しない。
【０１６１】
水に不溶の固体充填剤は、一旦成形可能な生体材料が硬化すると、生分解性ペースト材料においてマトリクスとして貢献する。さらに、水に不溶の固体充填剤は、ポリマーの分解の間に局所的なpHを安定化させるために生体適合性（例えば、細胞の接着）をさらに増加させ得る。
【０１６２】
好ましくは、該水に不溶の固体充填剤は、無機または有機化合物である。
【０１６３】
「リン酸カルシウム」という用語は、カルシウムイオン（Ca2+）、リン酸イオン（PO33-）、任意で、水酸基イオン（OH-）、炭酸（CO32-）もしくはマグネシウム（Mg2+）のようなさらなるイオン、または本発明の水に不溶の固体充填剤に適する他のイオンを含む組成物を包含する。
【０１６４】
G  水溶性分解制御剤
「水溶性分解制御剤」という用語は、薬学的に許容され、かつ、水のような水性流体または体液において膨張可能または可溶であり、生分解性ペースト材料に添加された際にエクスビボまたは生物体において成形可能な生体材料の孔隙率を増加させる可能性がある化合物を意味する。形成される固体インプラントの孔隙率は、例えば、使用される水溶性分解制御剤の量に依存して増加され得る。好ましくは、水溶性分解制御剤は、インサイチューで硬化した材料中への生細胞の内部増殖に十分なサイズの孔、好ましくはマクロ孔の数を増加させる。より好ましくは、水溶性分解制御剤は、生分解性ペースト材料のポリマー成分の分解の調整を可能にする。
【０１６５】
分解制御剤の別の局面は、欠損部位で骨増大のような、しかしそれに限定されない再生過程をさらに促進する内因性増殖因子の固定化および／または濃縮であり得る。分解制御剤（例えば、膨張剤）はさらに、水と接触した際に成形可能な生体材料内に、天然の血餅の特性と類似しているヒドロゲルを形成し得る。
【０１６６】
本発明の水溶性分解制御剤は、例えば、アルギン酸ナトリウム、アミラーゼ、アミロペクチン、澱粉、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはメチルヒドロキシエチルセルロースおよびそれらの誘導体を含む。
【０１６７】
別の態様において、水溶性分解制御剤は、表面活性剤、好ましくは、Pluronics（登録商標）またはTween（登録商標）80のようなエチレンオキシド／ソルビタンおよびプロピレンオキシドのブロックポリマー（例えば、ポリソルベート80；Montanox（登録商標）80；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。
【０１６８】
より好ましくは、水溶性分解制御剤は、任意で、1000μm未満の粒子サイズを有する、より好ましくは25〜1000μmの粒子サイズを有するカルボキシメチルセルロース塩、最も好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム塩である。好ましくは、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩の重量パーセンテージは、生体材料ペースト成分の総重量に基づいて、10 wt％未満、好ましくは5 wt％未満、より好ましくは1〜4 wt％の間、最も好ましくは2〜3,5 wt％である。
【０１６９】
本発明による「粒子サイズ」という用語は、ふるい分析またはレーザー回折によって測定され得る、リン酸三カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースのような材料のミクロン（μm）におけるサイズ直径の平均分布を意味する。材料の特定の粒子サイズ範囲は、例えばふるいによって達成され得る。
【０１７０】
H  活性剤
「活性剤」という用語は、ポリペプチドまたは低分子薬物を含む。
【０１７１】
活性剤は、好ましくは、移植後の沈殿またはミクロ沈殿のために凝集されず、かつ、部分的にまたは完全に不活性化されない。これは、例えば、WO03/043673に記載されているように粒子状固体多孔性材料上に均質にコーティングすることによって達成される可能性がある。
【０１７２】
「均質にコーティングされる」または「均質に分配される」という用語は、活性剤が、粒子状固体多孔性材料の内部および／または外部表面上に均質に分配されることを意味する。
【０１７３】
均質分配は、移植の部位で周囲の組織への活性剤の有効な放出および活性にとって有利である。さらに、活性剤は、沈殿またはミクロ沈殿のために凝集されず、かつ、部分的にまたは完全に不活性化されず、むしろ生物学的に活性を有する非凝集性タンパク質の接着は均質コーティングによって達成されるべきであることが理解されるべきである。
【０１７４】
「骨伝導性」という用語は、血管進入細胞浸潤および接着、軟骨形成、および石灰化組織沈着のための有望な多孔性足場を提供する基質を指す。骨伝導性材料は、足場効果を介して骨の生成を支持してもよい。
【０１７５】
「骨誘導性」という用語は、骨芽細胞および軟骨細胞への間葉系幹細胞の転換の能力を指す。骨誘導についての先行条件は、成形可能な生体材料によって、前述の骨芽細胞前駆体が活性化されるようになる周囲の組織へ分配されるシグナルである。本明細書において使用されるような骨誘導は、骨前駆体細胞である骨芽細胞への間葉系細胞の分化を包含する。さらに、骨誘導はまた、骨の成熟細胞である骨細胞への該骨芽細胞の分化を含む。さらに、骨誘導によってまた包含されるのは、軟骨細胞への間葉系細胞の分化である。特に長骨において、骨の軟骨膜に存在する軟骨芽細胞および軟骨細胞はまた、骨細胞に分化し得る。従って、骨誘導は、骨を形成することが可能である骨細胞への未分化細胞または低分化（less-differentiated）細胞の分化を必要とする。従って、骨誘導についての先行条件は、成形可能な生体材料によって、前述の骨芽細胞前駆体が通常存在する周囲の組織へ分配されるシグナルである。
【０１７６】
「骨形成性」という用語は、骨芽細胞による新生骨の合成を説明する。本発明に従うと、移植の部位または成形可能な生体材料の周囲内に以前から存在していた骨細胞または前駆細胞は、硬化する過程の間に、細胞（例えば、骨細胞）が上に接着し得るマトリクスとして特に形成された、硬化した成形可能な生体材料の構造を用いて、硬化した成形可能な生体材料中へ増殖する。
【０１７７】
本発明の成形可能な生体材料中に包含されるタンパク質およびペプチドは、好ましくはインビボで骨誘導性特性を有する。例えば、トランスフォーミング増殖因子-β（Transforming Growth Factor-β：TGF-β）スーパーファミリーは、骨誘導性特性を有するメンバーを包含することが当技術分野において周知である。該TGF-βスーパーファミリーの個々のメンバーは下記に列挙される。結論として、担体から放出された後の本発明の成形可能な生体材料の骨誘導性タンパク質またはペプチドは、成形可能な生体材料の移植の部位の周囲の組織の骨前駆体細胞のための骨誘導性シグナルとして貢献する。
【０１７８】
「骨誘導性ポリペプチド」という用語は、骨誘導性特性を有する、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）スーパーファミリーのメンバーのようなポリペプチドを指す。
【０１７９】
本発明の成形可能な生体材料のさらに好ましい態様において、該骨誘導性タンパク質は、TGF-βファミリーのメンバーである。
【０１８０】
TGF-βファミリーの増殖および分化因子は、骨形成を含む多数の生物学的過程に関与することが示されている。該ファミリーのすべてのメンバーは、特徴的なドメイン構造を含む分泌ポリペプチドである。TGF-βファミリーメンバーは、まさにN末端にシグナルペプチドまたは分泌リーダーを含む。この配列のC末端に、プロドメインおよび成熟ポリペプチドの配列が続く。成熟ポリペプチドの配列は、7個の保存されたシステインを含み、そのうち6個は、一つが2個のポリペプチドの二量体化に必要とされる分子内ジスルフィド結合の形成に必要とされる。生物学的に活性を有するTGF-βファミリーメンバーは二量体であり、好ましくは2個の成熟ポリペプチドから構成される。TGF-βファミリーメンバーは、通常、成熟配列に加えてプロドメインを含むタンパク質として分泌される。プロドメインは、細胞外で切断され、シグナル分子の一部ではない。
【０１８１】
本発明の状況において、「TGF-βファミリーメンバー」という用語または下記で言及される該ファミリーのタンパク質は、該タンパク質またはメンバーのすべての生物学的に活性を有する変異体およびすべての変異体、ならびにそれらの不活性な前駆体を包含する。従って、単に成熟配列を含むタンパク質、ならびに、成熟タンパク質およびプロドメイン、または、成熟タンパク質、プロドメイン、およびリーダー配列を含むタンパク質、ならびに、それらの生物学的に活性を有する断片または変異体は、本発明の範囲内である。TGF-βメンバーの断片が生物活性を有するか否かは、先行技術において記載されている生物学的アッセイによって容易に測定され得る。
【０１８２】
より好ましくは、TGF-βスーパーファミリーの該メンバーは、BMPまたはGDFサブファミリーのメンバーである。
【０１８３】
本発明の骨誘導性ポリペプチドは、好ましくは、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、BMP-16、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、およびGDF-11からなる群より選択される。最も好ましくは、骨誘導性ポリペプチドは、BMP-2、BMP-7、およびGDF-5からなる群より選択される。
【０１８４】
骨誘導性ポリペプチドを開示する刊行物は、以下を含む。
2009519065.tif 000003
【０１８５】
好ましくは、BMPまたはGDFサブファミリーの活性剤、例えば、BMP-2、BMP-7、またはGDF-5は、それぞれ、プレプロフォーム（preproform）、プロフォーム（proform）、または成熟（例えば、BMP-2-、BMP-7-、またはGDF-5-）ペプチドを指す。さらに、実質的に同じ生物活性、好ましくは骨誘導性特性を有する該タンパク質の断片および変異体もまた包含される。
【０１８６】
実質的に同じ生物活性を有する該タンパク質の変異体、例えば、Ruppert et al. (1996), Eur. J. Biochem. 237: 295-302によって記載されているような、N末端にアラニン伸長のようなN末端伸長部を含む成熟BMP-2タンパク質配列を例えば含む、BMP-2変異体、および上記で言及されたポリペプチドの切断型もまた、本発明内に包含される。
【０１８７】
好ましくは、活性剤は、非グリコシル化タンパク質、より好ましくは大腸菌（E.coli）由来の組換えタンパク質である。非グリコシル化タンパク質の利点は、例えば、欠損部位での長期の固定化、および／またはrhBMP-2のような活性剤の必要量の減少である。
【０１８８】
該活性剤が、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、ならびに、ステロイド、プロスタグランジンなどのような他の天然および／または合成薬物物質である態様がまた、本発明によって包含される。
【０１８９】
好ましくは、該活性剤は、副甲状腺ホルモン（PTH）および／またはPTH 1-34ペプチドである。
【０１９０】
本発明の別の態様において、活性剤は、「軟骨誘導性」または「軟骨再生」タンパク質である。好ましい軟骨誘導性タンパク質は、MIA/CD-RAP（MIA、メラノーマ阻害活性、軟骨由来レチノイン酸感受性タンパク質、EP 0710248、EP 1146897）、OTOR（繊維細胞由来タンパク質、FDP、MIA様、MIAL）、およびTANGO 130（Bosserhoff et al. (2004), Gene Expr. Patterns. 4: 473-479; Bosserhoff and Buettner (2003), Biomaterials 24: 3229-3234; Bosserhoff et al. (1997), Dev. Dyn. 208: 516-525; WO00/12762）、より好ましくはヒトMIA/CD-RAPである。
【０１９１】
I  インプラント
「インプラント」という用語は、医療機器、整形外科機器、または生体材料を意味する。好ましくは、インプラントは、脊椎インプラント、骨折修復のためのインプラント、長骨欠損、重大なサイズ欠損、および偽関節のためのインプラント、軟骨修復のためのインプラント、顎顔面再構築、関節再構築、歯周部欠損のためのインプラント、骨空隙充填剤として使用されるインプラント、または、ケージ、プレート、ねじ、ピン、固定機器のような他の整形外科的使用のためのインプラントである。
【０１９２】
「脊椎インプラント」という用語は、上記でさらに説明されている。
【０１９３】
図の説明
本発明の詳細な局面は、図1〜5を参照することによって以下に説明される。
【０１９４】
図1は、水性環境におけるインサイチュー硬化後の、本発明の二成分の成形可能な生体材料の内部および外部孔隙率を示す。示されている画像において、組成物は以下のようであった：β-リン酸三カルシウム顆粒（40.0 wt％）、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（22.2 wt％）、ポリエチレングリコール400（44.4 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（33.3％）を含むポリマーペースト（60.0 wt％）。
【０１９５】
画像Aは、インサイチュー硬化後の二成分の成形可能な生体材料の外表面を示し、例外的にβ-リン酸三カルシウム顆粒の間の空隙に基づく孔を示す。
【０１９６】
画像Bは、材料の内部を示し、周囲の組織内でのインプラント材料の組込みのための基本的な必要条件である、100μmより大きい直径を有する孔を示す。
【０１９７】
本発明の二成分の成形可能な生体材料の利点は、適用の部位に容易に採用され得、かつ、適用の場所に残存する、成形可能な凝集性粘稠度を有することである。β-リン酸三カルシウム顆粒またはHAナノ懸濁液のような他の生分解性インプラント材料と対照的に、本発明のインプラントは、多量に出血する環境のような湿った開放性野、例えば手術野に適用される際に洗い出されることに対して良好な抵抗性を有する。加えて、インプラント材料は、材料の漏出および洗い出し効果なく、市場に存在する種々の脊椎固定ケージのようなインプラント中に充填されるために容易に使用され得る。さらに、材料は、周囲の組織の機械的ストレスに耐える、移植後の凝集性足場の特性を有する。他の注射可能な生体材料を超える別の利点は、体または組織内でのインサイチュー硬化後のインプラント材料の多孔性構造、および、コラーゲンベースのインプラントのような生体材料と比較される圧縮抵抗性である。
【０１９８】
多孔性マトリクスを形成するより大きなモノリシック生体材料は、剛性のために、脊椎固定ケージのような中空インプラントとの組み合わせで適用され得ないという不利点（障害）を有する。成形可能な粘稠度および便利な適用のために、本発明のインプラントは、ケージ内でのインプラント材料のインサイチュー硬化後にモノリシック構造を形成する、種々の形状の脊椎固定ケージのような脊椎インプラントの充填のための骨グラフト代替生体材料として有利に使用され得る。
【０１９９】
図2は、カルボキシメチルセルロースの添加によるペースト状成分内の膨張によって達成される、インサイチュー硬化後の本発明の二成分の成形可能な生体材料の追加的な外部孔隙率を示す。使用された組成物は、以下の組成を有した：β-リン酸三カルシウム顆粒（40.0 wt％）、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（21.6 wt％）、ポリエチレングリコール400（43.1 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（32.3％）、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（3.0 wt％）を含むポリマーペースト（60.0 wt％）。
【０２００】
画像Aは、本発明の二成分の成形可能な生体材料の外表面を示し、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩の膨張によって形成された、図1のインプラント材料と比較して追加的な孔を示す。これらの孔が100μmより大きい直径を有するため、細胞の内部増殖のための基本的な必要条件が満たされる。
【０２０１】
カルボキシメチルセルロースナトリウム塩のような膨張剤の添加の利点は、インプラント材料の外表面における孔隙率の増加であり、一方、内部孔隙率（イメージB）は膨張剤の添加時に必ずしも増加されていない可能性がある。内部孔隙率は、β-リン酸三カルシウムのような固体充填剤の顆粒状層形成、および生分解性ペースト材料の外への溶媒交換によって既に確立されている。
【０２０２】
図3は、インサイチュー硬化の2時間後の、本発明のポリマーペーストおよび二成分の成形可能な生体材料の機械的安定性の比較を示す。白色のカラムは、以下の組成で実施例2に従って製造されたポリマーペーストを示す：50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（RG502H）（21.6 wt％）、ポリエチレングリコール400（43.1 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（32.3％）、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（3.0 wt％）。黒色のカラムは、以下の組成で実施例3に従って製造されたインプラント材料を示す：実施例1に従って製造されたβ-リン酸三カルシウム顆粒（40.0 wt％）および白色のカラムについて説明されたポリマー（生分解性）ペースト（60.0 wt％）が、実施例3に従って混合された。
【０２０３】
インプラント材料のポリマー含量はポリマーペーストと比較して減少しているが、インプラント材料は驚くべきことに多孔性セラミック材料の添加のないポリマーペーストの硬度よりも2.5倍高い硬度を2時間後に示すことが、本発明の局面である。
【０２０４】
図4は、生分解性ペースト、すなわち本発明の成形可能な生体材料の成分b）の製造のために使用される有機溶媒に依存したタンパク質安定性を示す。図4において示されているペーストは、実施例6下で説明されるように調製された。Aは対照試料、Bはポリエチレングリコール400、CはN-メチルピロリドン、Dはジメチルスルホキシド、Eはテトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテルを表わす。
【０２０５】
図は、有機溶媒とタンパク質との接触がタンパク質の（部分）分解を誘発し得ることを強調する。図が示すように、分解の割合（白色のカラム）は、48時間後に、適用されたタンパク質の最初の量の75％までのレベルに達し得る。
【０２０６】
本発明の一つの利点は、インプラント材料に含まれる活性物質への有機溶媒の負の影響が、有機溶媒を含むポリマーペーストと活性物質を含むβ-リン酸三カルシウム顆粒のようなセラミック材料とを、保存の間分離することによって割愛され得ることである。活性物質を含むセラミック材料と有機溶媒を含むペーストとの、患者へのインプラント材料の適用のすぐ前の混合によって、骨成長誘導タンパク質のような活性物質の活性は、有機溶媒を含むマトリクスとのタンパク質の組み合わせと比較して保存され得る。
【０２０７】
図5は、本発明の成形可能な生体材料のペースト成分におけるポリマーの加水分解の程度の変動性を表わす。加水分解の程度は、成形可能な生体材料のペースト成分の1 gの酸性分解産物を中和するために必要とされる水酸化ナトリウム溶液の量によって測定された。図5において、PGLA-コポリマーが、生分解性ペースト材料のポリマー成分として使用された（実施例7参照）。
【０２０８】
灰色の三角は、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6 kDaの分子量（33.3 wt％）ならびにポリエチレングリコール400（66.6 wt％）から構成される成形可能な生体材料のペースト成分を表わし、白色の四角は、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6 kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（22.2 wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（33.3 wt％）から構成される本発明の成形可能な生体材料のペースト成分を表わし、黒色の四角は、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6 kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（21.6 wt％）、ポリエチレングリコール400（43.1 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（32.3 wt％）、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（3.0 wt％）から構成される本発明の成形可能な生体材料のペースト成分を表わす。
【０２０９】
水に不溶の無機充填剤（ここではβ-リン酸三カルシウム）の添加が驚くべきことにポリマー（ここではPLGA-コポリマー）の分解を加速することを、三試料の滴定曲線は示す。
【０２１０】
加えて、図5においてここで使用されているような約3％のカルボキシメチルセルロースのような、高濃度の水溶性分解制御剤は、インプラント材料内に包含されるポリマーの分解を加速し、従って活性原料の放出プロファイルを変化させる。
【０２１１】
本発明の一つの利点は、ペースト成分、すなわち生分解性ペースト材料、および、粒子状リン酸カルシウム鉱物のような粒子状固体多孔性材料が、骨の置換または増大のために特に有利である複合マトリクスを形成することである。マトリクスは、移植後少なくとも約2〜3日の期間、構造的（物理的）完全性を維持し、かつ、骨置換が起きている生物学的環境内で数週間リン酸カルシウム顆粒の多孔性構造を維持する。構造的（物理的）完全性とは、移植されたマトリクスの形状およびサイズが実質的に維持されることを意味する。これは、インプラント後直ちにまたは間もなく不定形な無孔の塊に崩壊する組成物と対照的である。マトリクスが、骨置換または増大過程に重要である孔隙率を維持することが有利である。
【０２１２】
二相性分解のために、本発明のインプラント材料は、改善された骨形成のための多孔性構造を維持する。加えて、二相性分解は、骨成長誘導剤のような活性物質の周囲の組織への制御放出または送達を可能にする。インサイチュー硬化後の本発明の成形可能な生体材料のペースト成分内でのポリマーの第一相分解による放出は、水に不溶の固体充填剤および／または水溶性分解制御剤を変化させることによって変化され得る。
【０２１３】
図6は、種々の生体材料に結合したrhBMP-2の回収を示す。図6が示すように、β-TCP顆粒のみを含む試料は、rhBMP-2（大腸菌）とほとんど相互作用を示さず、すなわち、上清からのrhBMP-2のほぼ100％の回収を示した（A）。rhBMP-2は正電荷を有するため、本発明の成形可能な生体材料における負電荷の基によって減少した回収が誘発される可能性がある。
【０２１４】
非末端キャップポリマーおよびCMCは、本発明の成形可能な生体材料へのrhBMP-2の活性剤吸着を誘発するため、および／または改善するための適当な手段であることが示される。活性剤の改善された吸着は、インビボでの使用時の本発明の成形可能な生体材料からの活性剤の徐放を延長することと相関している。
【０２１５】
β-TCP顆粒の絶対量は各試料についてと同等であり、かつ、β-TCP顆粒のみを含む試料はrhBMP-2（大腸菌）とほとんど相互作用を示さなかったため、他の担体へのタンパク質の観察された吸着は、それぞれ非末端キャップPLGA-コポリマーおよびCMCにより誘導されたアニオン性カルボキシル基によって誘発される必要がある。
【０２１６】
実際に、実験は、他の担体（B〜D）へのタンパク質の観察された吸着が、それぞれ非末端キャップPLGA-コポリマーおよびCMCにより誘導されたアニオン性カルボキシル基によって誘発されることを示す。この結論は、末端キャップPLGA-コポリマー（D）を含む調製物が、非末端キャップPLGA-コポリマー（BおよびC）を含む調製物と比較して増加した回収率を生じたという観察によって支持された。
【０２１７】
図7は、長期に渡る二つの異なる生体材料のポリマーの分解を示す。Aは、実施例2に従って製造され、以下からなる生分解性ペースト材料の分解を表わす：Resomer RG504（44.0 wt％）、PEG 400（22.0 wt％）、バイオセメントD（20.6 wt％）、乾燥した硫酸カルシウムニ水和物（20.6 wt％）、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（1.0 wt％）。Bは、実施例8の成形可能な生体材料の分解を示す。
【０２１８】
データは、生体材料内のポリマーの長期に渡る分解がBと比較してAについて延長されており、従って、材料Bのより早い再吸収を導くことを示す。データはまた、本発明の成形可能な生体材料の三相性分解動態を典型的に示す（図7Bを参照、0〜1日、2〜4日、および7〜10日での減少段階を参照）。
【０２１９】
実施例
実施例1：活性剤でコーティングされた粒子状固体多孔性材料の製造
本実施例は、固体多孔性材料としてβ-TCPコーティング顆粒、および活性剤としてrhGDF-5を使用する。代替物は類似して調製され得る。
【０２２０】
原材料は適切な方法で滅菌する必要がある。最初に、500 mgのβ-TCP（500〜1000μm顆粒サイズ）を乾燥形態で2R-ガラス中に配置した。rhGDF-5のストック溶液（10mM HCl中3.4 mg/ml）を、対応するコーティング緩衝液を用いて0.54μg/mlに希釈した。その方法で得られた475μlのrhGDF-5溶液をβ-TCP上にピペットで移して吸収させた。湿った顆粒を25℃で1時間インキュベーションし、その後凍結乾燥した。β-TCPをコーティングする他の実施例は、WO 03/043673およびPCT/EP2005/006204に記載されている。
【０２２１】
実施例2：生分解性ペースト材料の製造
最初に、ポリマー（RG502H；PLGA；ポリマー組成：48〜52モル％ D,L-ラクチドおよび48〜52モル％グリコリド；固有粘度：0,16〜0,24 dl/g、25℃、CHCl3中0,1％；Boehringer, Ingelheim）を磁器のるつぼ中で必須の量の有機溶媒（PEG 400）に添加した。これらの二つの成分を均質化し、ポリマーが完全に有機溶媒に溶解するまで約60℃の温度で加熱した。続いて、無機充填剤（β-リン酸三カルシウム粉末）および任意で他の賦形剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩のような分解制御剤）をポリマー溶液中に分散させた。
【０２２２】
実施例3：多孔性カルシウムセラミックを含む、インサイチューで硬化する成形可能な生体材料
実施例1のコーティングされたβ-リン酸三カルシウム顆粒および実施例2の生分解性ペースト材料を、凝集性かつ成形可能な材料を形成するように、例えば滅菌のへらを用いて穏やかに混合することによって、るつぼ中で均質化した。ポリマーペーストに対して様々な比（wt％／wt％）のβ-リン酸三カルシウム顆粒を有する異なるインプラント材料を調製した：a）β-TCP：ポリマーペーストの比が1：1.3、b）1：1.4、c）1：1.5、およびd）1：1.7。
【０２２３】
硬化した形状において生分解性ペースト材料または成形可能な生体材料を必要とするすべての実験のために、材料を48ウェルプレートのウェル中に移した（250〜300 mg/ウェル）。その後、ウェルプレートをPBS緩衝液を含むバス中でインキュベーションし、それによって温度を37℃に固定した。バスは150 min-1の振動数を適用して絶えず振盪した。
【０２２４】
実施例4：機械的試験
実施例2において説明したように調製した生分解性ペースト材料、および、実施例3において説明したように調製したインサイチューで硬化する生分解性ペースト材料（インプラント材料）の硬化し、かつ湿った試料を、96ウェルプレートのウェル中に移した（ウェルあたり150〜200 mg、時点および試料あたり3ウェル）。続いて、生理学的条件をまねるために絶えず37℃のままであり、PBS緩衝液がインキュベーション媒質として貢献するインキュベーションバスに、試料を含むウェルプレートを移した。予め規定された時間に、機械的試験を実施するために、96ウェルプレートをインキュベーションバスから除去した。
【０２２５】
試料の硬度は、TH 2730（Fa Thuemler）を用いることによって試験した。実質的には、この機械は、試料上に圧縮力を印加することが可能である金属性打ち抜き道具（punching tool）、ならびに、印加された力を制御および測定し、かつ測定の間に踏破される距離を測定するのに貢献するLVDT-変換器からなる。異なる試料を試験するのに先立って、任意の試料を含まないウェルの高さ（h1）を規定する必要がある。そのため、その後の測定のための打ち抜き道具の開始点を固定した。試料の硬度の実際の測定は二段階を包含する。最初の測定において特定の試料の高さ（h2）を確かめる必要があり、打ち抜き道具のクロスヘッド速度は分あたり40 mmであり、印加力は0.2 Nに限定した。第二の測定は、30秒の間試料内で打ち抜き道具によって踏破される距離（d）を測定するために実施し、印加力は20 Nで一定に保った。試料の硬度は以下の様式において計算した：
硬度［％］＝（h2−d）／h2*100％
説明した方法は、ショア（Shore）（DIN 53505）による硬度の測定に基づいた。
【０２２６】
実施例5：SEM-解析のための調製
硬化し、かつ真空乾燥した試料を、当業者に公知である標準的な手順に従って金でスパッターした。SEM-マイクログラムは、20 kVの電圧を印加して行った。これらの解析のための標的構造は、インプラント材料の特定の試料の表面およびコア、ならびに特にこれらの構造によって示される孔隙率であった。
【０２２７】
実施例6：異なる有機溶媒におけるrhGDF-5の安定性
ポリエチレングリコール400、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、およびテトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテルのような溶媒を使用した。試料ならびに参照は、500μg/ g β-TCPの最終濃度を達成するように500 mgのβ-TCPをrhGDF-5でコーティングすることによって調製した。その後、666μlのそれぞれの溶媒を各試料に添加し、一方、参照は未処理のままにした。24時間、25℃の温度でのインキュベーションの後、試料および参照両方を、4℃で1時間、尿素（8M）、トリス（10 mM）およびEDTA（100 mM）からなり、pHレベルを塩酸で6.7に調整した3 mlの抽出緩衝液で抽出した。この抽出段階の後、すべての試料および参照を3分間、4500 rpmで遠心分離した。続いて、上清を1：1の比で溶媒A（水において0.15％トリフルオロ酢酸および20 ％アセトニトリル）で希釈した。溶媒Bは、水における0.15 ％トリフルオロ酢酸および84 ％アセトニトリルから構成された。タンパク質の特徴付けは、0.3 ml/分の流速でVydac C18、2.1×250 mmを用いて実施した。溶出プロファイルは220 nmでの吸光度を測定することによって記録した。rhGDF-5、rhBMP-2、およびそれらの分解産物の量は、220 nmでのピーク面積から計算した。
【０２２８】
実施例7：ポリマー分解の測定
実施例2において説明したように製造した生分解性ペースト材料を、6R-ベール（vail）において正確に計量し、約3.0 mlのPBS緩衝液を添加した。試料のpH値を指示するように、20μlのブロモチモールブルーを試料に加えると、深い青色が中性のpHを示した。ポリマー（ここでは：PLGA-コポリマー）の分解はpH値の低下を引き起こし、それは深い青色から黄色への色の変化によって指示される。規定された時点に、試料のpH値が指示薬の深い青色によって指示される中性レベルに達するまで、試料の上清を0.04 Mの水酸化ナトリウム溶液で滴定した。水酸化ナトリウムの総消費を各時点まで合計し、PLGA-コポリマーの適用された質量を考慮することによって標準化した。
【０２２９】
実施例8：インビトロポリマー分解の測定および長期に渡る成形可能な生体材料内のポリマー含量の定量化
10.0 gのβ-TCP顆粒および15.0 gの生分解性ペースト材料（Resomer RG502H（22.2 wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5 wt％）、β-TCP粉末（20.8 wt％）および乾燥した硫酸カルシウムニ水和物（12.5 wt％））を混合した。結果として生じた凝集性の塊の一部の1.0 gを円筒形状の試料を形成するように取り、続いて、50 mlの生理的リン酸緩衝液で満たした50 mlのポリプロピレン反応チューブ中に移した。
【０２３０】
指定された時点で（インキュベーションの1日、2日、4日、7日、10日、14日、21日後）、試料を除去して真空乾燥した。真空乾燥した複合材料の約75 mgを1.5 mlポリプロピレン反応チューブ中で正確に計量した。続いて、1.0 mlのテトラヒドロフランを添加した。試料を10分間、周囲温度で一定の水平攪拌（300 min-1）の下でインキュベーションした。不溶性無機成分を、13000 rpmで5分間の遠心分離によってポリマー溶液から分離した。その後、得られた上清を、実質的に、HPLC-機器、サイズ排除カラム（7.8 mm*30.0 cm）、および連続的に屈折率検出器と連結した多角光散乱（multi angle light scattering）検出器からなる連結サイズ排除クロマトグラフィー多角光散乱設備を介した解析に供した。
【０２３１】
それぞれの試料から抽出したポリマーの分子量を測定するために、200μlの上清をインジェクションした。それによって、ポリマーを、1.0 ml/分の一定流速を適用するテトラヒドロフランにより溶出した。カラム温度を40℃まで上昇させた。使用したソフトウェアが、解析したポリマーの絶対分子量および絶対インジェクション量を計算することを可能にするために、それぞれのポリマーの異なる屈折率（dn/dc）を、種々のポリマー濃度に対する屈折率シグナルの曲線下面積を記録することによって予め測定した。有機可塑剤と類似的に進行することによって、本方法は、長期に渡って成形可能な生体材料の相対組成の測定を可能にする。
【０２３２】
実施例9：種々の組成の成形可能な生体材料とのrhBMP-2（大腸菌）の相互作用
75 mgのβ-TCP顆粒を、成形可能な生体材料を得るために上記の試料に従って製剤された112.5 mgの生分解性ペースト材料と混合した。それによって、生体材料の以下の変形物を使用した：
A）β-TCP顆粒
B）β-TCP顆粒＋PEG 400（44.5 wt％）、β-TCP粉末（33.3 wt％）、およびResomer（登録商標）RG502H（非末端キャップ、22.2 wt％、Boehringer Ingelheimより購入）から構成される生分解性ペースト材料
C）β-TCP顆粒＋PEG 400（43.0 wt％）、β-TCP粉末（32.4 wt％）、Resomer（登録商標）RG502H（非末端キャップ、21.6 wt％、Boehringer Ingelheimより購入）、ならびに、0.7のDSおよび100〜200μmの粒子サイズを有するカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（CMC）（3.0 wt％）から構成される生分解性ペースト材料
D）β-TCP顆粒＋PEG 400（44.5 wt％）、β-TCP粉末（33.3 wt％）、およびResomer（登録商標）RG502（末端キャップ、22.2 wt％、Boehringer Ingelheimより購入）から構成される生分解性ペースト材料。
【０２３３】
β-TCP顆粒の分配から全般的なタンパク質の吸着までのrhBMP-2（大腸菌）との相互作用の程度への生分解性ペースト材料の特異的な影響を判断するために、75 mgのβ-TCPを参照担体として適用した（A）。
【０２３４】
各試料を、15 mlの水性緩衝液（20 mM モルホリノエタンスルホン酸一水和物（MES）における60 mM塩化カルシウム、0.01 wt％ポリソルベート80、0.02 wt％アジ化ナトリウム、pH 6.2）で満たした15 mlポリプロピレン反応チューブ中に移した。すべての試料を30μgのrhBMP-2（大腸菌）でスパイク（spike）した。指定された時点で（1日、2日、4日、7日、10日）、各試料の上清におけるrhBMP-2（大腸菌）濃度を、250 mm*4.6 mmのC4カラム（Vydac）を用いたRP-HPLCによって測定した。
【０２３５】
水における20 wt％アセトニトリルおよび0.15 wt％トリフルオロ酢酸、ならびに、水における84 wt％アセトニトリルおよび0.15 wt％トリフルオロ酢酸がそれぞれ溶出液として貢献した。流量を0.8 ml/分まで増加した。濃度を340 nm（励起280 nm）での蛍光検出によって測定した。上清におけるrhBMP-2の量は、「ゼロ」時点での上清におけるrhBMP-2の量（100％回収）と関連して測定した。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】水性環境におけるインサイチュー硬化後の、本発明の二成分の成形可能な生体材料の内部および外部孔隙率を示す。図1Aは、インサイチュー硬化後の二成分の成形可能な生体材料の外表面を示し、例外的にβ-リン酸三カルシウム顆粒の間の空隙に基づく孔を示す。図1Bは、材料の内部を示し、周囲の組織内でのインプラント材料の組込みのための基本的な必要条件である、100μmより大きい直径を有する孔を示す。
【図２】カルボキシメチルセルロースの添加によるペースト状成分内の膨張によって達成される、インサイチュー硬化後の本発明の二成分の成形可能な生体材料の追加的な外部孔隙率を示す。図2Aは、本発明の二成分の成形可能な生体材料の外表面を示し、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩の膨張によって形成された、図1のインプラント材料と比較して追加的な孔を示す。図2Bは、内部孔隙率を示す。
【図３】インサイチュー硬化の2時間後の、本発明のポリマーペースト（白色のカラム）および二成分の成形可能な生体材料（黒色のカラム）の機械的安定性の比較を示す。
【図４】生分解性ペースト、すなわち本発明の成形可能な生体材料の成分b）の製造のために使用される有機溶媒に依存したタンパク質安定性を示す。Aは対照試料、Bはポリエチレングリコール400、CはN-メチルピロリドン、Dはジメチルスルホキシド、Eはテトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテルを表わす。分解の割合（白色のカラム）は、48時間後に、適用されたタンパク質の最初の量の75％までのレベルに達し得る。
【図５】本発明の成形可能な生体材料のペースト成分におけるポリマーの加水分解の程度の変動性を表わす。灰色の三角は、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6 kDaの分子量（33.3 wt％）ならびにポリエチレングリコール400（66.6 wt％）から構成される成形可能な生体材料のペースト成分を表わし、白色の四角は、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6 kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（22.2 wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（33.3 wt％）から構成される本発明の成形可能な生体材料のペースト成分を表わし、黒色の四角は、50：50の乳酸／グリコール酸比および13.6 kDaの分子量を有するポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)（21.6 wt％）、ポリエチレングリコール400（43.1 wt％）、β-リン酸三カルシウム粉末（32.3 wt％）、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（3.0 wt％）から構成される本発明の成形可能な生体材料のペースト成分を表わす。
【図６】種々の生体材料に結合したrhBMP-2の回収を示す。Aはβ-TCP顆粒のみ、Bは非末端キャップPLGA-コポリマー、Cは非末端キャップPLGA-コポリマーおよびCMC、ならびにDは末端キャップPLGA-コポリマーを含む試料を示す。
【図７】長期に渡る二つの異なる生体材料のポリマーの分解を示す。図7Aは、実施例2に従って製造された生分解性ペースト材料の分解を表わす。図7Bは、実施例8の成形可能な生体材料の分解を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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