(57)【要約】  骨粗しょう症の表現型を予測し、または骨粗しょう症の定量的特性を推定する方法であって、選択されたSNP変数および臨床的変数に関する結果を判定するステップを含む方法。複数の骨粗しょう症関連遺伝子変異を遺伝子型判定するための製品および方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における骨粗しょう症の表現型を予測する方法であって、
(I)対象に関する1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を得るステップと、
(II)(I)で得られた結果を用いて前記表現型を予測するステップと
を含み、
(a)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における一般的なBSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(b)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における一般的なFSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(c)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における男性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(d)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における男性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(e)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における女性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(f)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における女性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(g)骨粗しょう症の表現型が、1つまたは複数の非外傷性椎骨骨折の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、表5における男性の椎骨骨折変数または女性の椎骨骨折変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA中のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法。
【請求項２】
対象における骨粗しょう症の定量的特性を推定する方法であって、
(I)対象に関する1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を得るステップと、
(II)(I)で得られた結果を用いて、前記特性を推定するステップと
を含み、
(a)前記定量的特性が、腰椎骨塩密度(LSBMD)であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のLSBMD変数を含み、かつ/または
(b)前記定量的特性が、大腿頚部骨塩密度(FNBMD)であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のFNBMD変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA内のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法。
【請求項３】
(a)から(g)のいずれかにおいて、ステップ(I)において結果の得られる変数が、モデルに関しては図9または表現型に関しては表5に掲げられたSNPおよび臨床的変数からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(II)において、ステップ(I)で得られた結果だけを用いて、前記表現型を予測し、または前記特性を推定する、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
SNP変数に関する結果を得るステップが、マイクロアレイ分析または配列決定を含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
SNP変数に関する結果を得るステップが、図2A、2Bまたは2Cに掲げられた1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブ対またはプローブ組の使用を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
SNP変数に関する結果を得るステップが、対象から得られた核酸の増幅を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
図3A、3Bまたは3Cに掲げられた1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー対の使用を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ステップ(II)が、
(i)ステップ(I)で判定された結果を、確率関数または定量的関数にインプットすることによって、確率関数値または定量的関数値を算出するステップと、
(ii)確率関数値が得られたら、前記確率関数値を、既知の表現型の個体に関して算出された確率関数値と比較するステップと
を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
対象における骨粗しょう症の表現型の予測で使用するための確率関数を誘導する方法であって、
(I)各個体が、骨粗しょう症の表現型に関して既知の臨床的に判定された表現型を有する個体の試験集団を提供するステップと、
(II)各個体に関して、1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を得ることによって、各個体に関する一連の結果を得るステップと、
(III)(II)で得られた結果および(I)で参照した既知の表現型に段階的多重ロジスティック回帰分析を適用するステップと、
(IV)それによって、前記集団における異なる表現型の個体間で、統計的に有意な区別をなす確率関数を誘導するステップと
を含み、
(a)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、図9における一般的なBSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(b)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、図9における一般的なFSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(c)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、図9における男性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(d)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、図9における男性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(e)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、図9における女性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(f)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、図9における女性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(g)骨粗しょう症の表現型が、1つまたは複数の非外傷性椎骨骨折の存在であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、表5における男性の椎骨骨折変数または女性の椎骨骨折変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA中のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法。
【請求項１１】
対象における骨粗しょう症の表現型の予測で使用するための確率関数を誘導する計算方法であって、
各個体が、骨粗しょう症の表現型に関して既知の臨床的に判定された表現型を有する個体の好適な試験集団から得られた結果のデータおよび表現型データに、段階的多重ロジスティック回帰分析を適用するステップと、それによって、前記集団における異なる表現型の個体間で、統計的に有意な区別をなす確率関数を誘導するステップとを含み、
(I)表現型データが、各個体の既知の臨床的に判定された表現型を含み、
(II)各個体に関する結果のデータが、1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を含み、
(a)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、図9における一般的なBSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(b)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、図9における一般的なFSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(c)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、図9における男性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(d)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、図9における男性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(e)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、図9における女性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(f)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、図9における女性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(g)骨粗しょう症の表現型が、1つまたは複数の非外傷性椎骨骨折の存在であり、(II)で結果を得て結果のデータをもたらす変数が、表5における男性の椎骨骨折変数または女性の椎骨骨折変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA中のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法。
【請求項１２】
対象における骨粗しょう症の定量的特性の予測で使用するための定量的関数を誘導する方法であって、
(I)各個体が、既知の臨床的に判定された骨粗しょう症の定量的特性を有する個体の試験集団を提供するステップと、
(II)各個体に関して、1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を得ることによって、各個体に関する一連の結果を得るステップと、
(III)(II)で得られた結果および(I)で参照した既知の特性に多重線形回帰分析を適用するステップと、
(IV)それによって、集団における個体の骨粗しょう症の定量的特性の統計的に有意な推定をなす定量的関数を誘導するステップと
を含み、
(a)骨粗しょう症の前記定量的特性が、腰椎骨塩密度(LSBMD)であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のLSBMD変数を含み、かつ/または
(b)骨粗しょう症の前記定量的特性が、大腿頚部骨塩密度(FNBMD)であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のFNBMD変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA内のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法。
【請求項１３】
対象における骨粗しょう症の定量的特性の予測で使用するための確率関数を誘導する計算方法であって、
各個体が、骨粗しょう症の既知の定量的特性を有する個体の集団から得られた結果のデータおよび骨粗しょう症の定量的特性データに、多重線形回帰分析を適用するステップと、それによって、集団における個体の定量的特性の統計的に有意な推定をなす定量的関数を誘導するステップとを含み、
(I)前記骨粗しょう症の定量的特性データが、各個体に関する既知の定量的特性値を含み、
(II)各個体に関する結果のデータが、1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を含み、
(a)前記骨粗しょう症の定量的特性が、腰椎骨塩密度(LSBMD)であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のLSBMD変数を含み、かつ/または
(b)前記骨粗しょう症の定量的特性が、大腿頚部骨塩密度(FNBMD)であり、ステップ(II)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のFNBMD変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA内のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法。
【請求項１４】
(a)から(g)のいずれかにおいて、結果の得られる変数が、モデルに関しては図9または表現型に関しては表5に掲げられたSNP変数および臨床的変数からなる、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１５】
表17A、17B、18A、18B、19Aまたは19Bのいずれかにおけるデータを用いて誘導された確率関数の使用を含む、請求項1または3から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
計算方法である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
対象における骨粗しょう症の治療に好適な処置を選択する方法であって:
(a)請求項1から9のいずれかに記載の方法に従って、対象における骨粗しょう症の表現型を予測し、または対象における骨粗しょう症の定量的特性を推定するステップと、
(b)判定された骨粗しょう症の表現型または特性に好適である処置を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
対象の骨粗しょう症を治療する方法であって、
(a)請求項1から9のいずれかに記載の方法により、対象における骨粗しょう症の表現型を予測するステップ、または対象における骨粗しょう症の定量的特性を推定するステップと、
(b)判定された骨粗しょう症の表現型または特性に好適である処置を対象に施すステップと
を含む方法。
【請求項１９】
個体における骨粗しょう症関連遺伝子変異を遺伝子型判定するin vitro方法であって、
(a)遺伝子型判定する遺伝子変異を含む核酸(標的DNA)を含有するサンプルを提供するステップと、
(b)遺伝子型判定する各遺伝子変異に関して、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのプローブ対を提供するステップであって、
(i)1つの対は、プローブ1および2からなり、他の対は、プローブ3および4からなり、
(ii)各対における1つのプローブは、遺伝子変異Aにハイブリダイズすることができ、各対における他のプローブは、遺伝子変異Bにハイブリダイズすることができ、
(iii)各プローブは、複製で提供され、
(iv)プローブの複製は、既知の一様分布に従って固体支持体上の位置に沈着させるステップと、
(c)ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下、前記標的DNAを前記プローブに接触させることによって、それぞれが検出可能に標識されている核酸-プローブハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
(d)各プローブの複製の位置で検出可能な標識の強度を測定することによって、生の強度値を得るステップと、
(e)場合によっては、バックグラウンドノイズを考慮に入れて生の強度値を修正することによって、各複製に関するクリーンな強度値を得るステップと、
(f)(d)または(e)からの強度データに好適なアルゴリズムを適用し、それによって各遺伝子変異に関する遺伝子型を決定するステップであって、前記アルゴリズムの適用が、各プローブの複製のそれぞれに関する強度値からの平均強度値の算出を含み、前記アルゴリズムが、遺伝子変異に関する3つの考えられる遺伝子型AA、ABまたはBBのそれぞれを特徴付ける3つの一次関数を使用するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記遺伝子変異が、一塩基多型(SNP)を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子変異が、表1Aまたは1Bの変異から選択される少なくとも5つの変異を含む、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子変異が、表1Aまたは1Bにおける変異を含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ(a)が:
(i)試験される遺伝子変異を含む核酸の領域を増幅させるステップと、場合によっては
(ii)前記増幅産物を断片化するステップと
をさらに含む、請求項19から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて実施される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
表3A、3Bまたは3Cのプライマーから選択される少なくとも1対のPCRプライマーの使用を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅産物または前記断片化産物が検出可能に標識されている、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
個体から得られた生物学的サンプルから核酸を抽出するステップをさらに含む、請求項19から26のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプルから抽出される核酸がDNAまたはRNAである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
抽出されたRNAからcDNAを作製するステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項19から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能な標識の強度がスキャナーを用いて判定される、請求項19から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記スキャナーが蛍光共焦点スキャナーである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブが、遺伝子変異により支持体上でグループ化されない、請求項19から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記支持体が、長さが19から27のヌクレオチドの少なくとも1対のプローブを含む、請求項19から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記支持体が、プローブの中央位置に試験される遺伝子変異を有する少なくとも1対のプローブを含む、請求項19から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記支持体が、表2A、2Bまたは2Cにおけるプローブ、プローブ対およびプローブ組から選択される少なくとも1つのプローブ、プローブ対またはプローブ組を含む、請求項19から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記支持体が、表2A、2Bまたは2Cにおけるプローブ対およびプローブ組から選択される少なくとも10、少なくとも20、少なくとも40、少なくとも60、または少なくとも80のプローブ対またはプローブ組を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記支持体が、表2Aまたは2Cにおけるプローブ組を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
プローブと核酸のハイブリダイゼーション後、ステップ(c)が、固体支持体上で増幅または結合反応を行うステップをさらに含む、請求項19から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅反応が、プライマー伸長反応またはオリゴヌクレオチド結合アッセイ(OLA)反応を含む請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
標識化が、ハイブリダイゼーション前またはハイブリダイゼーション後の増幅中に実施される、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
前記固体支持体がガラスである、請求項19から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
各プローブが、少なくとも6つ、8つまたは10の複製で提供される、請求項19から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記固体支持体が、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも40または少なくとも80の骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定のためのプローブを含む、請求項19から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記固体支持体が、表1Aまたは1Bに掲げた少なくとも10、少なくとも20、少なくとも40、少なくとも60または少なくとも80の骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定のためのプローブを含む、請求項19から44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記固体支持体が、表1Aまたは1Bに掲げた骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定のためのプローブを含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記固体支持体が、1つまたは複数の対照プローブをさらに含む、請求項19から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
各プローブに関する平均強度値の算出が、外れ強度値の除外を含む、請求項19から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記アルゴリズムが、各遺伝子変異に関する3つの考えられる遺伝子型のそれぞれを特徴付ける3つの一次関数(関数1、2および3)を使用する、請求項19から48のいずれか一項に記載の方法であって、
関数1は、遺伝子型AAを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数2は、遺伝子型ABを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数3は、遺伝子型BBを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
前記一次関数は、変数の比率1および2を伴う係数により形成され、
【数１】
2009542248.tif 000007
であり、
【数２】
2009542248.tif 000008
であり、
プローブ1および3が遺伝子変異Aを検出し、プローブ2および4が遺伝子変異Bを検出する
方法。
【請求項５０】
前記3つの一次関数における係数が、遺伝子型AA、ABおよびBBのそれぞれを有する「n」の対照個体に関する比率1および2を算出するステップと、識別化分析における3つの遺伝子型に好適な係数を得るステップとを含む訓練方法により決定される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
「n」が少なくとも3である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
3つの遺伝子型に関して3つの関数の識別能力が100%である、請求項49から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
比率1および2を算出するステップと、一次関数1、2および3における比率を置き換えるステップとを含み、最大の絶対値を有する関数が、試験する遺伝子変異に関して、前記個体が提示する遺伝子型を決定する、請求項49から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
フィードバック最適化ステップにおいて3つの一次関数に関する係数を再決定するために遺伝子型判定する個体に関して算出された比率1および2を用いるステップをさらに含む、請求項49から53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
遺伝子型判定する個体に関して決定された比率1および2が、3つの一次関数における係数を決定するために用いられる比率1および2の範囲内にある、請求項50から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
強度が共焦点蛍光スキャナーの使用により決定される場合、バックグラウンドノイズに関する4nの複製(「n」が各プローブに関する複製数である)の平均蛍光強度は5超であり、かつ/または
所与のプローブの複製に関する強度値間の変動係数は0.25未満である、
請求項49から55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
蛍光共焦点スキャナーが強度を決定するために用いられる場合、
バックグラウンドノイズの強度に対してチップ上の全てのプローブの複製に関する生の強度値の総計の比率が15超であり、かつ/または
所与のプローブの複製に関する強度値間の変動係数が0.25未満であり、かつ/または
陰性対照に関して得られた生のシグナル強度値が、バックグラウンドノイズの強度値の3倍以下である、
請求項49から56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
DNA-チップハイブリダイゼーション強度データから遺伝子型を得る計算方法であって、遺伝子変異に関して3つの考えられる遺伝子型AA、ABおよびBBのそれぞれを特徴付ける3つの一次関数のそれぞれにおいて比率1および2を用いるステップを含み、
関数1は、遺伝子型AAを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数2は、遺伝子型ABを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数3は、遺伝子型BBを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
前記一次関数は、変数の比率1および2を伴う係数により形成され、
【数３】
2009542248.tif 000009
であり、
【数４】
2009542248.tif 000010
であり、
プローブ1および3が遺伝子変異Aを検出し、プローブ2および4が遺伝子変異Bを検出し、
平均強度値は、請求項19から57のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、
計算方法。
【請求項５９】
各プローブに関して得られた平均強度値から比率1および2を算出するステップをさらに含む、請求項58に記載の計算方法。
【請求項６０】
各プローブの複製に関して得られた強度値を照合するステップと、各プローブに関して平均強度値を決定するステップとをさらに含む、請求項58または59に記載の計算方法。
【請求項６１】
バックグラウンドノイズを考慮に入れてプローブの複製に関して得られた生の強度値を修正することによって、複製に関するクリーンな強度値を得るステップをさらに含む、請求項58から60のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項６２】
前記3つの一次関数における係数が、遺伝子型AA、ABおよびBBのそれぞれを有する「n」の対照個体に関する比率1および2を算出するステップと、識別化分析における3つの遺伝子型に好適な係数を得るステップとを含む訓練方法により決定される、請求項58から61のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項６３】
「n」が少なくとも3である、請求項62に記載の計算方法。
【請求項６４】
3つの遺伝子型に関して3つの関数の識別能力が100%である、請求項58から63のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項６５】
フィードバック最適化ステップにおいて3つの一次関数に関する係数を再決定するために遺伝子型判定する個体に関して算出された比率1および2を用いるステップをさらに含む、請求項58から64のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項６６】
請求項19から65のいずれか一項に記載の方法で使用するための一次関数を誘導する方法であって、遺伝子変異に関して遺伝子型AAを有するn個体、遺伝子型ABを有するn個体、遺伝子型BBを有するn個体のそれぞれに関して:
(a)遺伝子変異を含む核酸(標的DNA)を含有するサンプルを提供するステップと、
(b)遺伝子変異に関して、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブ対(プローブ1+2、およびプローブ3+4)を提供するステップであって:
(i)1つの対はプローブ1および2からなり、他の対はプローブ3および4からなり、
(ii)各対における1つのプローブは、遺伝子変異Aにハイブリダイズすることができ、各対における他のプローブは、遺伝子変異Bにハイブリダイズすることができ、
(iii)各プローブは、複製で提供され、
(iv)前記プローブは、さらなる沈着プローブを含む固体支持体上の位置に沈着させ、前記プローブは、既知の一様分布に従って沈着させるステップと、
(c)ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下、前記核酸サンプルを前記プローブに接触させることによって、それぞれが検出可能に標識されている核酸-プローブハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
(d)各プローブの複製位置で検出可能な標識強度を測定することによって、生の強度値を得るステップと、
(e)場合によっては、バックグラウンドノイズを考慮に入れて生の強度値を修正することによって、各複製に関するクリーンな強度値を得るステップと、
(f)(d)または(e)からの強度データに好適なアルゴリズムを適用するステップであって、前記アルゴリズムの適用が、各プローブの複製のそれぞれに関する強度値からの平均強度値の算出を含み、前記アルゴリズムが、遺伝子変異に関する3つの考えられる遺伝子型AA、ABまたはBBのそれぞれを特徴付けることを意図した3つの一次関数を使用するステップと、
(g)識別分析において3つの遺伝子型群AA、ABおよびBB間の識別を最大化する一次関数を誘導するステップと
を含む方法。
【請求項６７】
前記プローブが、遺伝子変異により支持体上でグループ化されない、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
各プローブに関する平均強度値の算出が、外れ強度値の除外を含む、請求項66または67に記載の方法。
【請求項６９】
前記アルゴリズムが、各遺伝子変異に関する3つの考えられる遺伝型のそれぞれを特徴付ける3つの一次関数(関数1、2および3)を使用し、
関数1は、遺伝子型AAを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数2は、遺伝子型ABを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数3は、遺伝子型BBを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
前記一次関数は、変数の比率1および2を伴う係数により形成され、
【数５】
2009542248.tif 000011
であり、
【数６】
2009542248.tif 000012
であり、
プローブ1および3が遺伝子変異Aを検出し、プローブ2および4が遺伝子変異Bを検出する、
請求項66から68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
3つの遺伝子型に関して3つの関数の識別能力が100%である、請求項66から69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
強度が共焦点蛍光スキャナーの使用により決定される場合、バックグラウンドノイズに関する4nの複製  (「n」が各プローブに関する複製数である)の平均蛍光強度は5超であり、かつ/または
所与のプローブの複製に関する強度値間の変動係数は0.25未満である、
請求項66から70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
蛍光共焦点スキャナーが強度を決定するために用いられる場合、
バックグラウンドノイズの強度に対してチップ上の全てのプローブの複製に関する生の強度値の総計の比率が15超であり、かつ/または
所与のプローブの複製に関する強度値間の変動係数が0.25未満であり、かつ/または
陰性対照に関して得られた生のシグナル強度値が、バックグラウンドノイズの強度値の3倍以下である、
請求項66から71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
遺伝子変異に関して遺伝子型AAを有するn個体、遺伝子型ABを有するn個体および遺伝子型BBを有するn個体のそれぞれに関して得られた比率1および2を用いる請求項19から65のいずれか一項に記載の方法で使用するための一次関数を誘導する計算方法であって、
(a)好適なアルゴリズムを適用するステップであって、前記アルゴリズムが、遺伝子変異に関する3つの可能な遺伝型AA、ABまたはBBのそれぞれを特徴付けることを意図した3つの一次関数(関数1、2および3)を使用し、
関数1は、遺伝子型AAを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数2は、遺伝子型ABを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
関数3は、遺伝子型BBを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および2の一次結合からなり、
前記一次関数は、変数の比率1および2を伴う係数により形成され、
【数７】
2009542248.tif 000013
であり、
【数８】
2009542248.tif 000014
であり、
プローブ1および3が、遺伝子変異Aを検出し、プローブ2および4が、遺伝子変異Bを検出するステップと、
(b)識別分析において3つの遺伝子型群AA、ABまたはBBの間で識別を最大化する一次関数を誘導することによって、3つの関数のそれぞれに関する係数を得るステップと
を含み、比率1および2が、請求項66から72のいずれか一項に記載の方法により得ることができる方法。
【請求項７４】
各プローブに関して得られた平均強度値から比率1および2を算出するステップをさらに含む、請求項73に記載の計算方法。
【請求項７５】
各プローブの複製に関して得られた強度値を照合するステップと、各プローブに関して平均強度値を決定するステップとをさらに含む、請求項73または74に記載の計算方法。
【請求項７６】
バックグラウンドノイズを考慮に入れてプローブの複製に関して得られた生の強度値を修正することによって、複製に関するクリーンな強度値を得るステップをさらに含む、請求項73から75のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項７７】
「n」が少なくとも3である、請求項73から76のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項７８】
3つの遺伝子型に関して3つの関数の識別能力が100%である、請求項73から77のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項７９】
フィードバック最適化ステップにおいて3つの一次関数に関する係数を再決定するためにさらなる試験個体に関して算出された比率1および2を用いるステップをさらに含む、請求項73から78のいずれか一項に記載の計算方法。
【請求項８０】
個体において骨粗しょう症または骨粗しょう症に対する感受性を診断する方法であって、請求項19から65のいずれか一項に記載の方法により1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体を遺伝子型判定するステップを含む方法。
【請求項８１】
骨粗しょう症を有する個体に対する治療を選択する方法であって、
(a)請求項19から65のいずれか一項に記載の方法により1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体を遺伝子型判定するステップと、
(b)(a)で決定された遺伝子型に基づいて好適な治療を選択するステップと
を含む方法。
【請求項８２】
骨粗しょう症を有する個体を治療する方法であって、
(a)請求項19から65のいずれか一項に記載の方法により1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体を遺伝子型判定するステップと、
(b)(a)で決定された遺伝子型に基づいて好適な治療を選択するステップと、
(c)前記個体に対して前記治療を施すステップと
を含む方法。
【請求項８３】
特定の骨粗しょう症の表現型を予測する遺伝子変異を同定する方法であって、
(a)請求項19から65のいずれか一項に記載の方法により1つまたは複数の遺伝子変異に関して複数の個体を遺伝子型判定するステップであって、前記個体の骨粗しょう症の遺伝子型が知られているステップと、
(b)前記個体の知られた表現型と1つまたは複数の遺伝子変異に関して試験された個体の遺伝子型とを比較するステップと、
(c)遺伝子変異と表現型との間で統計的に有意な関係がある任意の遺伝子変異を同定するステップと
を含む方法。
【請求項８４】
(d)そのように同定された遺伝子変異を使用して、疾患進行の可能性が高い過程を予測するステップ
をさらに含む、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
(e)(d)でなされた予測を使用して、前記個体に最も良く適合した治療的アプローチを示すステップ
をさらに含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
請求項83に記載の方法により特定の骨粗しょう症の表現型の発生を予測するものとして同定された1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体の遺伝子型を判定することにより、個体の骨粗しょう症の表現型を発症する可能性の高さを予測する方法。
【請求項８７】
請求項66から79のいずれか一項に記載の方法を実施するステップをさらに含む、請求項80から86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
請求項12、15、58から65または73から79のいずれか一項に記載の計算方法を実施するために、プロセッサおよびプロセッサを制御する手段を含むコンピュータシステム。
【請求項８９】
コンピュータまたはコンピュータネットワークを操作する場合に、コンピュータまたはコンピュータネットワークに請求項12、15、58から65または73から79のいずれか一項に記載の計算方法を実施させるコンピュータプログラムコードを含むコンピュータプログラム。
【請求項９０】
コンピュータ読取り可能な媒体に保存される、請求項89に記載のコンピュータプログラム。
【請求項９１】
固体支持体上に沈着させた複数のオリゴヌクレオチドプローブを含むDNAチップであって、請求項19から57のいずれか一項に記載の方法での使用に好適であるDNAチップ。
【請求項９２】
図9の一般的なBSTEPモデルのSNP;および/または図9の一般的なFSTEPモデルのSNP;および/または図9の男性BSTEPモデルのSNP;および/または図9の男性FSTEPモデルのSNP;および/または図9の女性BSTEPモデルのSNP;および/または図9の女性FSTEPモデルのSNP:から選択されるSNPにおけるサンプルの核酸中の対立遺伝子を決定するのに好適なオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ。
【請求項９３】
図9のSNPにおけるサンプルの核酸中の対立遺伝子を決定するのに好適なオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項92に記載のマイクロアレイ。
【請求項９４】
表1Aまたは1BのSNPにおけるサンプルの核酸中の対立遺伝子を決定するのに好適なオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項92または93に記載のマイクロアレイ。
【請求項９５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも50%を占める、請求項92から94のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項９６】
前記プローブが、表2A、2Bまたは2C(図2)のプローブから選択される、請求項92から95のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項９７】
前記プローブが、表2A、2Bまたは2C(図2)のオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項92から96のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項９８】
表2A、2Bまたは2C(図2)に掲げたオリゴヌクレオチドプローブ、プローブ対、または4-プローブ組。
【請求項９９】
表3A、3Bまたは3C(図3)に掲げたオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマー対。
【請求項１００】
請求項99に記載の少なくとも1対のプライマーを含むPCR増幅キット。
【請求項１０１】
請求項91から97のいずれかに記載のDNAチップまたはマイクロアレイを含む、骨粗しょう症関連遺伝子変異の検出のための診断キット。
【請求項１０２】
請求項1から65のいずれか一項に記載の方法で使用するための説明書をさらに含む、請求項101に記載のキット。
【請求項１０３】
請求項88に記載のコンピュータシステム、または請求項89もしくは90に記載のコンピュータプログラムをさらに含む、請求項101または102に記載のキット。
【請求項１０４】
請求項99に記載の1対または複数対のPCRプライマー、または請求項100に記載のPCR増幅キットをさらに含む請求項101から103のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０５】
請求項1から9または15のいずれか一項に記載の方法により、対象における骨粗しょう症の表現型を予測し、または対象における骨粗しょう症の定量的特性を推定するためのキットであって、
(i)選択された結果を判定する手段と、
(ii)前記結果から骨粗しょう症の表現型または骨粗しょう症の定量的特性を判定するための説明書と
を含むキット。
【請求項１０６】
前記手段が、請求項91から97のいずれかに記載のマイクロアレイを含む、請求項105に記載のキット。
【請求項１０７】
(a)表3A、3Bまたは3C(図3)に掲げた1つまたは複数のプライマー対、および/あるいは
(b)請求項88に記載のコンピュータシステムまたは請求項89もしくは90に記載のコンピュータプログラム
をさらに含む、請求項105または106に記載のキット。
【請求項１０８】
請求項1から87のいずれかに記載の方法における、請求項88に記載のコンピュータシステム、請求項89または90に記載のコンピュータプログラム、請求項91から97のいずれかに記載のDNAチップまたはマイクロアレイ、請求項98に記載のオリゴヌクレオチドプローブ、プローブ対、またはプローブ組、請求項99に記載のプライマーまたはプライマー対あるいは請求項100から107のいずれかに記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、それぞれの内容の全体が参照として本明細書に援用されている、2006年7月12日出願の英国特許出願第0613843.2号、および2006年11月24日出願の英国特許出願第0623502.2号に関連する。
【０００２】
本発明は、骨粗しょう症関連遺伝子変異のin vitro遺伝子型判定の方法および製品、特にマイクロアレイに関する。本発明はさらに、骨粗しょう症における低骨塩密度(BMD)および骨折を予測および治療する方法、ならびにそれらに使用する製品に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨粗しょう症、または多孔質骨は、低骨質量および骨組織の構造的劣化を特徴とし、骨の脆弱性および股関節、脊椎(椎骨)、および手首の骨折危険性の増大に至る疾患である。骨粗しょう症は「高齢女性の疾患」としばしば誤って考えられているが、閉経後の女性の3人に1人のみならず、50歳を超える男性の5人に1人も、より若い女性も、また小児も罹る。骨粗しょう症は骨折が生じるまでは無症状であることが多いため、「沈黙の病」として知られている。骨折が一旦生じると、その先1年以内の骨折の危険性は少なくとも2倍になる。
【０００４】
骨折した人は、激しい痛みと行為不能を被り、生活の質および独立性の損失がもたらされる。死亡の危険性もまた増大し、女性の24%および男性の33%が股関節骨折後、1年以内に死亡する。しかし骨粗しょう症は通常、結局診断されていないことは欧州での悲しむべき現実である。承認された診断および治療の選択肢が利用できるのに関わらず、多くは予防できたはずの骨折を被る人が跡を絶たない。しかし、正確な方法によって低骨塩密度および骨折を適切に予測できれば、この疾患は予防し治療することができると考えられる。
【０００５】
欧州の集団が高齢化し、より定着性になるにつれ、骨粗しょう症に罹る人の数は著しく増大するだろう。股関節骨折単独で、今後50年間に2倍になると予想されている。骨粗しょう症の予防および治療が政府および保健医療提供者にとって優先事項にならない限り、この骨粗しょう症数増加は、単に人々の生活の質の点だけでなく、保健医療、リハビリ医療および看護のための出費増加の点でも社会に重大な影響を与えることになろう。
【０００６】
股関節骨折は骨粗しょう症の重大な結果である。これらの骨折はほとんど決まって、慢性痛、運動性の低下、身体障害、および独立性の損失をもたらす。股関節骨折はまた、股関節骨折後1年以内に、20〜24%の死亡率をもたらす。生き残った人の中でも、機能および独立性の損失が著しく、およそ40%が独立歩行が不能であり、およそ60%が1年後に介助を必要とすることが、種々の研究により示されている。これらの損失のため、患者のおよそ三分の一が、股関節骨折後1年以内に全く依存的となるか、または養護ホームに入る。骨粗しょう症の負担を測定するために、股関節骨折の数および費用が通常用いられる。他の骨粗しょう症骨折とは異なり、股関節骨折の統計が病院記録を介して、通常入手できるからである。椎骨骨折および手首骨折は未記録になることが多く、椎骨骨折の場合は、未診断のままであることが多い。
【０００７】
骨粗しょう症の人々は、骨質量および骨質の低下を受け、簡単に言うと、彼らの骨は脆弱になり骨折の危険性が増加する。骨密度の損失は認識できる症状がない。骨質量の損失を判定するための最も信頼できる方法は、骨塩密度(BMD)試験を受けることである。DXA走査(二重エネルギーX線吸光光度法)は、BMD測定の最も正確で最も一般的に用いられている方法であり、脊椎および股関節の骨密度を測定するために通常用いられる。骨粗しょう症を適切に診断しモニターするために、DXA走査は重要である。しかし、欧州の多くの国では、骨塩密度測定の利用は最適状態に及ばない。その理由としては、デンシトメーターの入手が限定されていること、走査の実施を許可された人員が制限されていること、BNMD試験の有用性についての認識が低いこと、補償が限定されているか、または存在しないことが挙げられる。DXAスキャナーの多くが公共の保健医療システムで利用できないか、または地域によってばらつきがあり、国内のいくつかの地域がサービス不足であることを意味している。
【０００８】
したがって、骨折および/または低骨塩密度を予測する信頼できる手段が、当業界では依然として求められている。早期の診断および予後により、治療決定に影響を与えることができると考えられる。
【０００９】
総合的な骨粗しょう症治療計画には、適切な栄養、運動、および骨折をもたらす恐れのある転倒を予防するための安全性の問題に焦点を当てることが含まれる。さらに、骨損失を緩徐化または停止させ、骨密度を増加させ、骨折の危険性を低下させるための薬物治療がある。骨粗しょう症に対する現行の治療薬としては、アレンドロネート、ラロキシフェン、リセドロネート、およびイバンドロネートが挙げられ、それらは閉経後の骨粗しょう症の予防および治療のために、米国食品医薬品局(FDA)により承認されている。テリパラチドは、閉経後の女性および骨折の危険性の高い男性における疾患の治療のために承認されている。エストロゲン/ホルモン療法(ET/HT)は、閉経後骨粗しょう症の予防のために承認されており、カルシウムは治療のために承認されている。また、アレンドロネートは、男性における骨粗しょう症の治療のために承認されており、アレンドロネートとリセドロネートの双方が、糖質コルチコイドに誘導された骨粗しょう症に罹っている男性および女性による使用のために承認されている。
【００１０】
1つまたは複数の遺伝子変異が、骨粗しょう症を生じるより高い、またはより低い危険性、薬剤に対するより良好な、またはより不良な応答、さらに、該疾患および骨折をする危険性のより良好な、またはより不良な予後をもたらす多数の遺伝子が研究によって同定されている。
【００１１】
しかしながら、臨床目的で使用できるこのような遺伝子変異を確認する信頼できる手段が依然として求められている。
【００１２】
DNAチップは、遺伝子座における対立遺伝子の判定にしばしば用いられている。
【００１３】
2001年に、ヒトゲノムプロジェクトに関するコンソーシアムおよび民間のCelera社は、30,000の遺伝子を有するヒトゲノムの最初の完全な例を提示した。この瞬間から、完全なゲノムの試験、および大規模(ハイスループット)試験の可能性が開かれた。「マイクロアレイ」、「DNAアレイ」または「DNAバイオチップ」とも称されるいわゆる「DNAチップ」は、大規模試験用に機能的ゲノム解析が使用できる装置である。機能的ゲノム解析試験は、環境的因子および個体の遺伝子特性によって遺伝子発現が変化する。遺伝子配列には、SNP(一塩基多型)と称される1つのユニークなヌクレオチドにおける個体間の小さな変数が示され、低いパーセンテージでは、一定の病態を引き起こす遺伝子の発現および/または機能における変化に関与している。DNAチップを適用する試験の大多数は、遺伝子発現を試験するが、チップはSNPの検出にも用いられる。
【００１４】
最初のDNAチップは、固体支持体に結合した核酸分子を調べるために標識化DNA分子が用いられた「サザンブロット」であった。該支持体は一般に、ナイロン膜である。
【００１５】
2つのブレイクスルーがDNAチップの決定的な開始を特徴づけた。ガラスなどの非多孔性支持体の使用により、アレイの小型化が可能になり、それによって、多数の個々のプローブの特徴を、1cm2当たり>1,000プローブの密度で支持体の表面上に組み込むことが可能になった。半導体フォトリソグラフィー法の適用により、およそ20μm2の領域に400,000以上の異なるオリゴヌクレオチドを含有するDNAチップ、いわゆる高密度DNAチップの製造が可能になった。
【００１６】
一般に、DNAチップは、固定された位置で固体表面に結合した、DNA、cDNAまたは一定のオリゴヌクレオチドの形態で表された数百の異なる遺伝子の配列断片を含有する固体支持体を含む。該支持体は一般に、顕微鏡用のスライドガラス、ナイロン膜またはシリコン「チップ」である。各プローブの自動化された局在化により、発現を測定中の遺伝子が判定される際に、ヌクレオチド配列またはプローブが一定の位置で該支持体に結合していることが重要である。DNAチップは以下のように分類することができる:
高密度DNAチップ:支持体、例えばスライドガラスの表面上に見られるオリゴヌクレオチドは、フォトリソグラフィーと称される方法によって「in situ」で合成されている。
低密度DNAチップ:オリゴヌクレオチド、cDNAまたはPCR増幅断片は、支持体上の該DNA配列をプリントする自動装置により、支持体、例えばガラスの表面にナノ小滴の形態で置かれる。既存の低密度DNAチップの例はきわめて少ない:チロシナーゼ遺伝子における5つの変異を検出するDNAチップ;p53およびk-rasにおける変異を検出するDNAチップ;肥大性心筋症を引き起こす12の変異を検出するDNAチップ;大腸菌(Escherichia coil)株の遺伝子型判定用のDNAチップ;またはクリプトスポリジウムパルブム(Cryptosporidium parvum)またはロタウィルスなどの病原体を検出するDNAチップ。
【００１７】
遺伝子発現試験では、固体表面、例えばガラス上に沈着させたプローブを、所与のサンプルから抽出されたmRNAから合成されたcDNAにハイブリダイズする。一般にcDNAは、蛍光体によって標識化されている。DNAチップにおける相補的配列に結合するcDNA分子の数が多いほど、一般にレーザーにより測定される検出蛍光シグナルの強度はより大きくなる。したがって、この測定は、分析されたサンプル中のmRNA分子数の反映であり、その結果、DNAチップにおいて表された各遺伝子の発現レベルの反映である。
【００１８】
遺伝子発現DNAチップはまた、しばしば「ハウスキーピング遺伝子」と称される制御遺伝子の発現を検出するためのプローブも含有し、これにより、実験結果の標準化、および複数の実験を定量的様式で比較することが可能になる。DNAチップによって、1つの細胞内の数百または数千の遺伝子の発現レベルを、単一の実験で判定することができる。試験サンプルのcDNAと対照サンプルのcDNAを異なる2種の蛍光体によって標識することができるので、遺伝子発現の違いを試験するために同一のDNAチップを使用することができる。
【００１９】
遺伝子多型、DNA配列における変化または突然変異(一般に、遺伝子変異)を検出するためのDNAチップは、試験する遺伝子変異に相補的な、多数の遺伝子配列が置かれる(プローブ)固体表面、一般にガラスを含む。プローブをアレイに適用するための標準的な自動プリンターを用いて、高密度の個々のプローブ特性を得ることができ、例えば、1cm2当たり600以上の特性のプローブ密度を一般に達成することができる。アレイ上のプローブ配置は、プリントデバイス(自動装置、インクジェットプリンター、フォトリソグラフィーマスクなど)によって正確に制御され、プローブはグリッドに整列させる。プローブをアレイ上に構成することにより、引き続いての特異的なプローブ-標的相互作用の確認が促進される。さらに、必ずしも必要ではないが、引き続きサブアレイと称される、やはりグリッドの形状のより小さな区域にアレイ特性を分けることが一般的である。サブアレイは一般に、32の個別のプローブ特性を含むが、各サブアレイは、それより少ない(例えば16)かまたは多い(例えば64以上)特性を含み得る。
【００２０】
遺伝子変異を検出するために用いられる作戦の1つは、試験サンプルに由来するDNAの断片における正常および変異の対立遺伝子を特異的に認識する配列へのハイブリダイゼーションを含む。一般に、断片は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることによって増幅し、蛍光分子によって標識化されている。チップ上の結合標識断片を検出するためにレーザーを使用することができ、したがって、正常な対立遺伝子にホモ接合的な個体を、ヘテロ接合的な個体(常染色体優性状態の場合、これらの個体はキャリアと称される)または変異対立遺伝子に対してホモ接合的な個体から特異的に識別することができる。
【００２１】
遺伝子変異を検出するための別の戦略は、DNAチップそれ自体の上で、増幅反応または伸長反応を実施することを含む。
【００２２】
差次的ハイブリダイゼーションに基づく方法では、遺伝子型判定のためにハイブリダイゼーションデータを解析するには多数の方法がある:
ハイブリダイゼーションレベルの増加:正常および変異対立遺伝子に対する相補的プローブのハイブリダイゼーションレベルを比較する。
ハイブリダイゼーションレベルの低下:対照サンプルと試験サンプルとの間の配列の違いは、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと参照配列のハイブリダイゼーションレベルの低下により確認することができる。変異ホモ接合的個体では完全な損失が生じるが、ヘテロ接合的個体では50%の損失のみである。双方の鎖における「n」ヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)の長さの配列の全ての塩基を調べるDNAチップでは、全ての配列における該ヌクレオチド以外の先のオリゴヌクレオチドに重なる最少「2n」のオリゴヌクレオチドが必要である。一般に、オリゴヌクレオチドのサイズは約25ヌクレオチドである。再構成するために用いられるオリゴヌクレオチドの数が増加すると、ハイブリダイゼーションレベルの変動に由来する誤差が減少する。しかし、配列における正確な変化はこの方法では確認できず、変異を確認するためには、後に配列決定が必要である。
【００２３】
DNAチップそれ自体の上で増幅または伸長を実施する場合、例えば、3つの方法が提案されている:
ミニ配列決定法では、変異特異的プライマーがスライド上に固定され、蛍光ジデオキシヌクレオチドとの伸長反応の後、スキャナーによりDNAチップの画像を得る。
【００２４】
プライマー伸長法では、野生型配列および変異配列それぞれを検出するために、2種のオリゴヌクレオチドが設計される。1つのヌクレオチドを蛍光標識し、残りのヌクレオチドは未標識で、引き続き伸長反応を実施する。いずれの場合も出発物質は、RNAサンプルまたはPCRによって増幅されたDNA産物であり得る。
【００２５】
タグアレイ法では、伸長反応は、決定された5’配列または「タグ」を担持する特異的プライマーと共に溶液中で実施される。これらの配列または「タグ」に相補的なオリゴヌクレオチドを有するDNAチップを用いることによって、伸長によって生じた産物の捕捉が可能になる。この例としては、高密度DNAチップ「Flex-flex」(Affymetrix)が挙げられる。
【００２６】
遺伝子診断では、簡便性を考慮に入れる必要がある。差次的ハイブリダイゼーションに基づく方法に比較して、オンチップ伸長/増幅法は、増幅反応および精製反応が必要であるために不利である。
【００２７】
一般に、DNAチップ解析は、差次的ハイブリダイゼーション法を用いて実施される。しかしながら、差次的ハイブリダイゼーションは、スライドガラス上の増幅に関連させた方法ほどの特異性または感度を生じない。この理由から、ハイブリダイゼーション方法論の特異性および感度を高める数学的アルゴリズムの開発が必要である(Cutler DJ、Zwick ME、Carrasquillo MN、Yohn CT、Tobi KP、Kashuk C、Mathews DJ、Shah N、Eichler EE、Warrington JA、Chakravarti A、Geneome Research;11:1913-1925頁(2001)。
【００２８】
したがって、テクノロジーの進歩にも関わらず、高感度で特異的、再現可能な方法で多数の遺伝子変異の同時解析において、既存の方法には問題があり、臨床診断におけるルーチン使用を目的としたDNAチップの適用が妨げられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】英国特許出願第0613843.2号
【特許文献２】英国特許出願第0623502.2号
【特許文献３】PCT/IB2006/00796
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Cutler DJ、Zwick ME、Carrasquillo MN、Yohn CT、Tobi KP、Kashuk C、Mathews DJ、Shah N、Eichler EE、Warrington JA、Chakravarti A、Geneome Research;11:1913-1925頁(2001)
【非特許文献２】Hair J、Black B、Anderson R、Tatham R、Multivariate Data Analysis、6/E、Prentice Hall、2006年
【非特許文献３】「PCR protocols;A Guide to Methods and Applications」、Innisら編、1991年、Academic Press、ニューヨーク
【非特許文献４】Mullisら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.、51:263頁(1987)
【非特許文献５】Ehrlich(編)、PCR technology、Stockton Press、ニューヨーク州、1989年
【非特許文献６】Ehrlichら、Science、252:1643〜1650頁(1991)
【非特許文献７】Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第2版、Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献８】Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons、1992年
【非特許文献９】Tejedorら、2005年(Clinical Chemistry 51:1137〜1144頁)
【非特許文献１０】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp
【非特許文献１１】Eggerding FA、lovannisci DM、Brinson E.、Grossman P.、Winn-Deen E.S.、1995年、Human Mutation、5:153〜65頁
【非特許文献１２】Pastinen T、Raitio M、Lindroos K、Tainola P、Peltonen L、Syvanen AC、2000年、Genome Research 10:1031〜42頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明者は、情報的なSNP変数および臨床的変数の組み合わせに基づいた骨粗しょう症の表現型および骨粗しょう症の定量的特性を判定するための新規な手段を特定した。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
したがって、一態様において、本発明は、対象における骨粗しょう症の表現型を予測する方法であって、
(I)対象に関する1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を得るステップと、
(II)(I)で得られた結果を用いて、表現型を予測するステップと
を含み、
(a)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における一般的なBSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(b)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における一般的なFSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(c)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における男性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(d)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における男性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(e)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における女性BSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(f)骨粗しょう症の表現型が、手首、股関節または脊椎における1つまたは複数の非外傷性骨折(WSH骨折)の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、図9における女性FSTEPモデルの変数を含み、かつ/または
(g)骨粗しょう症の表現型が、1つまたは複数の非外傷性椎骨骨折の存在であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、表5における男性の椎骨骨折変数または女性の椎骨骨折変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA内のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法を提供する。
【００３３】
本発明はさらに、対象における骨粗しょう症の定量的特性を推定する方法であって、
(I)対象に関する1つまたは複数の一塩基多型変数および1つまたは複数の臨床的変数に関する結果を得るステップと、
(II)(I)で得られた結果を用いて、前記特性を推定するステップと
を含み、
(a)定量的特性が、腰椎骨塩密度(LSBMD)であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のLSBMD変数を含み、かつ/または
(b)定量的特性が、大腿頚部骨塩密度(FNBMD)であり、ステップ(I)で結果の得られる変数が、表5における男性または女性のFNBMD変数を含み、
(i)SNP変数に関する結果が、一塩基多型の位置における対象のゲノムDNA内のヌクレオチドの同一性であり、
(ii)臨床的変数の年齢(AGE)に関する結果が、対象の年齢であり、
(iii)臨床的変数の閉経年齢(MENOPAUSE AGE)に関する結果が、女性対象における閉経発現の年齢であり、
(iv)臨床的変数の初経年齢(MENARCHE AGE)に関する結果が、女性対象における初経発現の年齢であり、
(v)臨床的変数のBMIに関する結果が、対象の肥満度指数である
方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、本請求項に記載されるように、対象における骨粗しょう症の表現型の予測で使用するための確率関数を誘導する方法および対象における骨粗しょう症の表現型の予測で使用するための確率関数を誘導する計算方法に関する。
【００３５】
また、本請求項に記載されるように、対象における骨粗しょう症の定量的特性の予測で使用するための定量的関数を誘導する方法および対象における骨粗しょう症の定量的特性の予測で使用するための定量的関数を誘導する計算方法も提供される。
【００３６】
本発明はさらに、本請求項に記載されるように、対象における骨粗しょう症を治療するための好適な治療を選択する方法および対象における骨粗しょう症を治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明者はまた、マイクロアレイ技法を用いて、複数の遺伝子変異の正確な遺伝子型判定方法を開発した。したがって、本発明はまた、個体における骨粗しょう症関連遺伝子変異を遺伝子型判定するためのin vitroの方法を提供し、該方法は、
(a)遺伝子型判定する遺伝子変異を含む核酸(標的DNA)を含有するサンプルを提供するステップと、
(b)遺伝子型判定される各遺伝子変異に関して、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブ対を提供するステップであって、
(i)1つの対は、プローブ1および2からなり、他の対が、プローブ3および4からなり、
(ii)各対における1つのプローブは、遺伝子変異Aにハイブリダイズすることができ、各対における他のプローブは、遺伝子変異Bにハイブリダイズすることができ、
(iii)各プローブは、複製で提供され、
(iv)プローブ複製は、既知の一様分布に従って固体支持体上の位置に沈着させるステップと、
(c)ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下、標的DNAをプローブに接触させることによって、それぞれが検出可能に標識されている核酸-プローブハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
(d)各プローブ複製の位置で検出可能な標識の強度を判定することによって、生の強度値を得るステップと、
(e)場合によっては、バックグラウンドノイズを考慮に入れて生の強度値を修正することによって、各複製に関するクリーンな強度値を得るステップと、
(f)(d)または(e)からの強度データに好適なアルゴリズムを適用し、それによって各遺伝子変異に関する遺伝子型を判定するステップであって、該アルゴリズムの適用が、各プローブの複製のそれぞれに関する強度値からの平均強度値の算出を含み、該アルゴリズムが、遺伝子変異に関する3つの考えられる遺伝子型AA、ABまたはBBのそれぞれを特徴付ける3つの一次関数を使用するステップと
を含む。
【００３８】
また、当該請求項に記載された、
-DNAチップのハイブリダイゼーション強度データから遺伝子型を得るための計算方法;
-当該遺伝子型判定法に用いられる一次関数を誘導する方法;
-当該遺伝子型判定法に用いられる一次関数を誘導する計算方法;
-1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体を遺伝子型判定するステップを含む、個体において骨粗しょう症または骨粗しょう症に対する感受性を診断する方法;
-骨粗しょう症を有する個体に対する治療を選択する方法;
-骨粗しょう症を有する個体を治療する方法;
-特定の骨粗しょう症表現型を予測する遺伝子変異を同定する方法;
-本発明の方法によって同定された1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体の遺伝子型を判定することにより、個体の骨粗しょう症の表現型を発症する可能性の高さを予測する方法;
-本発明の計算方法を実施するために、プロセッサおよびプロセッサを制御するための手段を含むコンピュータシステム;
-コンピュータまたはコンピュータネットワークを操作する場合に、コンピュータまたはコンピュータネットワークに本発明の方法を実施させるコンピュータプログラムコードを含むコンピュータプログラム;
-図9における一般的なBSTEPモデルSNP;および/または図9における一般的なFSTEPモデルSNP;および/または図9における男性BSTEPモデルSNP;および/または図9における男性FSTEPモデルSNP;および/または図9における女性BSTEPモデルSNP;および/または図9における女性FSTEPモデルSNP:から選択されるSNPにおけるサンプルの核酸中の対立遺伝子を決定するのに好適なオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ;
-表2A、2Bまたは2C(図2)に掲げたオリゴヌクレオチドプローブ、プローブ対、または4-プローブ組;
-表3A、3Bまたは3C(図3)に掲げたオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマー対;
-本発明によるプライマーの少なくとも1対を含むPCR増幅キット;
-骨粗しょう症関連遺伝子変異の検出のための診断キット;
-対象における骨粗しょう症の表現型を予測し、または対象における骨粗しょう症の定量的特性を推定するためのキット
もまた提供される。
【００３９】
配列の簡単な説明
配列番号:1〜220および674〜692は、表3A/B/Cに掲げられたように、表1A/1Bに掲げられた骨粗しょう症関連遺伝子変異を含む標的DNA領域の増幅に好適なPCRプライマーである。
【００４０】
配列番号:221〜668および693〜829は、表2A/B/Cに掲げられたように、表1A&1Bに掲げられた骨粗しょう症関連遺伝子変異の検出に好適なプローブである。
【００４１】
配列番号:669は、外部制御核酸である。
【００４２】
配列番号:670&571は、配列番号:669の外部対照核酸の検出に好適なプローブである。
【００４３】
配列番号:672は、正TAG配列である。
【００４４】
配列番号:673は、逆TAG配列である。
【００４５】
TAG 672は、実施例における各正プライマーに添加され、TAG 673は、各逆プライマーに添加される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】本明細書に記載された分析し得る骨粗しょう症に関連した複数の遺伝子変異(SNP)を掲げている表である。表1Aに記載された全ての遺伝子配列は知られており、以下のウェブサイト:GeneBank (NCBI)、GeneCard (Weizmann Institute of Sciences)およびSnpper. chip. org (Innate Immunity PGA)に公認されている。
【図１Ｂ】本明細書に記載された分析し得る骨粗しょう症に関連した複数の遺伝子変異(SNP)を掲げている表である。表1Aに記載された全ての遺伝子配列は知られており、以下のウェブサイト:GeneBank (NCBI)、GeneCard (Weizmann Institute of Sciences)およびSnpper. chip. org (Innate Immunity PGA)に公認されている。
【図１Ｃ】表1Aと同じSNPを示す表である。各SNPに関するRefSNPコード(rs#)は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)により提供されたSingle Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)から採用している(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp、2007年7月6日付け)。
【図１Ｄ】表1Aと同じSNPを示す表である。各SNPに関するRefSNPコード(rs#)は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)により提供されたSingle Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)から採用している(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp、2007年7月6日付け)。
【図１Ｅ】表1Aと同じSNPを示す表である。各SNPに関するRefSNPコード(rs#)は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)により提供されたSingle Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)から採用している(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp、2007年7月6日付け)。
【図１Ｆ】表1Aと同じSNPを示す表である。各SNPに関するRefSNPコード(rs#)は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)により提供されたSingle Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)から採用している(http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp、2007年7月6日付け)。
【図２Ａ】表1A/1Bに掲げたSNPにおける対立遺伝子間を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブを掲げている表である。この表には、各SNPに関して2つのプローブ対(4-プローブ組)を掲げている。
【図２Ｂ】表1A/1Bに掲げたいくつかのSNPにおける対立遺伝子間を識別するための最適化プローブを掲げている表である。
【図２Ｃ】表1A/1Bに掲げたSNPにおける対立遺伝子間を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブを掲げている。この表には、各SNPに関して2つのプローブ対(4-プローブ組)を掲げている。これらのプローブは、表2Aのプローブと同じであるが、関連するSNPに関して表2Bの最適化プローブを含む。
【図３Ａ】表1A/1Bに掲げたSNPを含有する核酸領域のPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを掲げている表である。
【図３Ｂ】表1A/1Bに掲げたいくつかのSNPを含有する核酸領域のPCR増幅のための最適化オリゴヌクレオチドプライマーを掲げている表である。
【図３Ｃ】表1A/1Bに掲げたSNPを含有する核酸領域のPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを掲げている表である。これらのプライマーは、表3Aのプライマーと同じであるが、関連するSNPに関して表3Bの最適化プライマーを含む。
【図４】当該試験(実施例2および3)に含まれる1029人の臨床的特性を掲げている表である。
【図５Ａ】実施例2で確立された確率関数および定量的関数に含まれた変数を掲げている表である。表5に示されたSNP番号(表5、第4欄)は、表1Bに示されたSNP番号と一致しない。SNP番号が本明細書に用いられる場合、これらは、表1B(図1B)のSNP番号に相当する。
【図５Ｂ】実施例2で確立された確率関数および定量的関数に含まれた変数を掲げている表である。表5に示されたSNP番号(表5、第4欄)は、表1Bに示されたSNP番号と一致しない。SNP番号が本明細書に用いられる場合、これらは、表1B(図1B)のSNP番号に相当する。
【図６．１】(男性における骨折の危険性を予測するための)男性における骨折確率関数を示す図である。確率関数は、実施例2の試験に含まれた骨折非罹患男性個体(0)と骨折罹患男性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図６．２】(男性における椎骨骨折の危険性を予測するための)男性における椎骨骨折確率関数を示す図である。確率関数は、実施例2の試験に含まれた椎骨骨折非罹患男性個体(0)と椎骨骨折罹患男性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図７．１】(女性における骨折の危険性を予測するための)女性における骨折確率関数を示す図である。確率関数は、実施例2の試験に含まれた骨折非罹患女性個体(0)と骨折罹患女性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図７．２】(女性における椎骨骨折の危険性を予測するための)女性における椎骨骨折確率関数を示す図である。確率関数は、実施例2の試験に含まれた椎骨骨折非罹患女性個体(0)と椎骨骨折罹患女性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表される。
【図８】男性と女性双方のLSBMDおよびFNBMDにおける定量的関数に関するR2値を示す表である(実施例2)。
【図９】実施例3で確立された予測モデル(確率関数)のそれぞれに含まれた変数を示す表である。
【図１０Ａ】識別力の推定を可能にする一般FSTEPモデルに関して得られたROC(受信者動作特性)曲線を示す図である。ROC曲線は、特異性を最大限にするために算出され、したがって同時に「偽」陽性率を減少させる。37.7%の感度を有する95.1%の特異性は、骨折表現型に関するこのモデルに対するカットオフである。このモデルは、7.7の尤度比(LR)値を示す。
【図１０Ｂ】一般FSTEPモデルにより実施例3の骨折表現型を予測するための確率関数を示す図である。確率関数は、実施例3の試験に定義された非骨折個体(0)と骨折個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図１１Ａ】識別力の推定を可能にする一般BSTEPモデルに関して得られたROC(受信者動作特性)曲線を示す図である。ROC曲線は、特異性を最大限にするために算出され、したがって同時に「偽」陽性率を減少させる。38.4%の感度を有する95.1%の特異性は、骨折表現型に関するこのモデルに対するカットオフである。このモデルは、7.8の尤度比(LR)値を示す。
【図１１Ｂ】一般BSTEPモデルにより実施例3の骨折表現型を予測するための確率関数を示す図である。確率関数は、実施例3の試験に定義された非骨折個体(0)と骨折個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図１２Ａ】識別力の推定を可能にする男性FSTEPモデルに関して得られたROC(受信者動作特性)曲線を示す図である。ROC曲線は、特異性を最大限にするために算出され、したがって同時に「偽」陽性率を減少させる。27.8%の感度を有する94.9%の特異性は、骨折表現型に関するこのモデルに対するカットオフである。このモデルは、5.5の尤度比(LR)値を示す。
【図１２Ｂ】男性FSTEPモデルにより実施例3の骨折表現型を予測するための確率関数を示す図である。確率関数は、実施例3の試験に定義された非骨折男性個体(0)と骨折男性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図１３Ａ】識別力の推定を可能にする男性BSTEPモデルに関して得られたROC(受信者動作特性)曲線を示す図である。ROC曲線は、特異性を最大限にするために算出され、したがって同時に「偽」陽性率を減少させる。44.4%の感度を有する94.9%の特異性は、骨折表現型に関するこのモデルに対するカットオフである。このモデルは、8.7の尤度比(LR)値を示す。
【図１３Ｂ】男性BSTEPモデルにより実施例3の骨折表現型を予測するための確率関数を示す図である。確率関数は、実施例3の試験に定義された非骨折男性個体(0)と骨折男性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図１４Ａ】識別力の推定を可能にする女性FSTEPモデルに関して得られたROC(受信者動作特性)曲線を示す図である。ROC曲線は、特異性を最大限にするために算出され、したがって同時に「偽」陽性率を減少させる。49.1%の感度を有する94.8%の特異性は、骨折表現型に関するこのモデルに対するカットオフである。このモデルは、9.4の尤度比(LR)値を示す。
【図１４Ｂ】女性FSTEPモデルにより実施例3の骨折表現型を予測するための確率関数を示す図である。確率関数は、実施例3の試験に定義された非骨折女性個体(0)と骨折女性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図１５Ａ】識別力の推定を可能にする女性BSTEPモデルに関して得られたROC(受信者動作特性)曲線を示す図である。ROC曲線は、特異性を最大限にするために算出され、したがって同時に「偽」陽性率を減少させる。50%の感度を有する95.2%の特異性は、骨折表現型に関するこのモデルに対するカットオフである。このモデルは、10.4の尤度比(LR)値を示す。
【図１５Ｂ】女性BSTEPモデルにより実施例3の骨折表現型を予測するための確率関数を示す図である。確率関数は、実施例3の試験に定義された非骨折女性個体(0)と骨折女性個体(1)におけるボックスウィスカープロットとして示されている。ボックスは四分値間範囲を表し、ウィスカーは、ボックスから最高値と最低値に伸展する線である。ボックスと交差する線は中央値を示す。外れ値および極値は、小円として表されている。
【図１６】図10から15において表されたモデルに関する感度、特異性、LR+値を示す表である。
【図１７Ａ】全般FSTEPおよび全般BSTEPモデルに関する変数を用いて確率関数を算出するためのデータを示す表である。回帰確率関数は、Statistical Package for the Social Sciences(SPSS社、本社、シカゴ、イリノイ州、米国)14.0版、SPSSv14を用いて作成される。Bは、確率関数における各遺伝子型に関する係数である。ETは、Bの算出における誤差である。Waldは、統計検定である。glは、自由度である。Sigは、Wald検定に関するBの値である。Exp(B)は、相対的危険性である。
【図１７Ｂ】全般FSTEPおよび全般BSTEPモデルに関する変数を用いて確率関数を算出するためのデータを示す表である。回帰確率関数は、Statistical Package for the Social Sciences(SPSS社、本社、シカゴ、イリノイ州、米国)14.0版、SPSSv14を用いて作成される。Bは、確率関数における各遺伝子型に関する係数である。ETは、Bの算出における誤差である。Waldは、統計検定である。glは、自由度である。Sigは、Wald検定に関するBの値である。Exp(B)は、相対的危険性である。
【図１８Ａ】男性FSTEPおよび男性BSTEPモデルに関する変数を用いて確率関数を算出するためのデータを示す表である。回帰確率関数は、Statistical Package for the Social Sciences(SPSS社、本社、シカゴ、イリノイ州、米国)14.0版、SPSSv14を用いて作成される。Bは、確率関数における各遺伝子型に関する係数である。ETは、Bの算出における誤差である。Waldは、統計検定である。glは、自由度である。Sigは、Wald検定に関するBの値である。Exp(B)は、相対的危険性である。
【図１８Ｂ】男性FSTEPおよび男性BSTEPモデルに関する変数を用いて確率関数を算出するためのデータを示す表である。回帰確率関数は、Statistical Package for the Social Sciences(SPSS社、本社、シカゴ、イリノイ州、米国)14.0版、SPSSv14を用いて作成される。Bは、確率関数における各遺伝子型に関する係数である。ETは、Bの算出における誤差である。Waldは、統計検定である。glは、自由度である。Sigは、Wald検定に関するBの値である。Exp(B)は、相対的危険性である。
【図１９Ａ】女性FSTEPおよび女性BSTEPモデルに関する変数を用いて確率関数を算出するためのデータを示す表である。回帰確率関数は、Statistical Package for the Social Sciences(SPSS社、本社、シカゴ、イリノイ州、米国)14.0版、SPSSv14を用いて作成される。Bは、確率関数における各遺伝子型に関する係数である。ETは、Bの算出における誤差である。Waldは、統計検定である。glは、自由度である。Sigは、Wald検定に関するBの値である。Exp(B)は、相対的危険性である。
【図１９Ｂ】女性FSTEPおよび女性BSTEPモデルに関する変数を用いて確率関数を算出するためのデータを示す表である。回帰確率関数は、Statistical Package for the Social Sciences(SPSS社、本社、シカゴ、イリノイ州、米国)14.0版、SPSSv14を用いて作成される。Bは、確率関数における各遺伝子型に関する係数である。ETは、Bの算出における誤差である。Waldは、統計検定である。glは、自由度である。Sigは、Wald検定に関するBの値である。Exp(B)は、相対的危険性である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
骨粗しょう症は、低骨質量(骨塩密度-BMDにより臨床的に判定される)および骨折、特に、股関節(大腿)、脊椎(椎骨)および手首の骨折に対する感受性の増加を特徴とする。一般に、この疾患は、BMDによって診断されるが、骨折が生じるまで診断されないことが多い。
【００４８】
本発明の骨チップマイクロアレイ、および臨床的検査を用い、本発明者は、低BMDおよび骨折の予測に使用できる多数のプロファイル(情報的SNPおよび臨床的変数に基づいた)を確認した。したがって、本発明者は、特に、骨粗しょう症患者における低BMD値および骨折(例えば、股関節、脊椎および手首の骨折)を正確に予測するための手段(特にモデル)を開発した。
【００４９】
したがって、一態様において本発明は、BMDおよび/または骨折を予測するための方法を提供する。したがって、本発明は、骨粗しょう症の早期の予測または診断のための方法を提供する。例えば、本発明は、以下の表現型を予測するための方法を提供する:
1.骨折(身体の任意の部分);
2.椎骨骨折;および
3.手首および/または股関節および/または脊椎の骨折。
【００５０】
該骨折は、一般に非外傷性である。
【００５１】
本発明はさらに、以下の定量的特性を予測するための方法を提供する:
3.腰椎骨塩密度(LSBMD);および
4.大腿頚部骨塩密度(FNBMD)。
【００５２】
このような正確な予測により、各患者に対する最も適切な療法の選択が促進され、(特に疾患の初期段階で使用した場合)疾患の経過を重篤な形態からより軽い形態へ変化させることを可能にし得る。いくつかの場合、これは、骨折の発現防止を意味し得る。
【００５３】
実施例2のとおり、当初の試験で、本発明者は、904人の閉経後のイタリア人の女性および高齢男性の集団ベースのコホート、ならびに非外傷性骨折のある125人の継続的イタリア人患者を選択した。
【００５４】
実施例2のとおり、各患者を評価して、骨折表現型の存在を判定し、また、LSBMDおよびFNBMDを判定した。また、各患者を種々の臨床的変数に関する結果を判定するために試験し、いくつかが骨粗しょう症の危険性および/または生理病理学に以前関連していた57の遺伝子の112の一塩基多型(SNP)のそれぞれにおいて遺伝子型判定を行った(実施例2および表4)。
【００５５】
本発明者は、遺伝子解析を用いて、さらなる試験のために特定のSNPを選択した(実施例2)。線形または対数回帰を用いて、遺伝子型-表現型の関連性および遺伝子型-定量的特性の関連性を解析した。男性と女性では該疾患の発生率が異なるため、遺伝子型-表現型の関連性および遺伝子型-定量的特性の関連性は、男性と女性とで別々に計算した。
【００５６】
この方法で、本発明者は、高い特異性、感度および正確性で、解析した各表現型(骨折または椎骨骨折の危険性)の択一的形態を有する患者間の信頼できる識別を可能にする確率関数を確立した(情報的SNPと臨床的変数の組み合わせに基づいて)。本発明者はまた、LSBMDおよびFNBMDの信頼できる予測を可能にする定量的関数も確立した(情報的SNPと臨床的変数の組み合わせに基づいて)。
【００５７】
各表現型または定量的特性に関するそれぞれの確率関数または定量的関数に含まれる情報的SNPと臨床的変数は表5に示されている(図5)。
【００５８】
骨折確率関数(男性または女性に関する)により、実施例2における骨折表現型(実施例2における骨折表現型は身体の任意の位置で非外傷性骨折を有している)を有する患者と有さない患者との間の識別が可能になる。椎骨骨折確率関数(男性または女性に関する)により、椎骨骨折表現型を有する患者と有さない患者との間の識別が可能になる。確率関数によって、表5における情報的変数の結果に基づいた個体の骨折発現の危険性または確率が計算される。図6.1、6.2、7.1、7.2におけるグラフは、臨床的検証における個体(臨床的に判定された既知の表現型を有する)の確率関数値を示している(実施例2)。
【００５９】
LSBMDおよびFNBMDの定量的関数により、LSBMDおよびFNBMDそれぞれの推定が可能になる。定量的関数により、表5における情報的変数の結果に基づいた個体のBMD値が推定される。図8は、臨床的検証における個体(臨床的に判定された既知の表現型を有する)に関するR2値を示している(実施例2)。
【００６０】
このように、表5における男性および女性に関する骨折変数は、骨折の予測に関して情報的な変数である。表5における椎骨変数は、椎骨骨折の予測に関して情報的な変数である。表5におけるLSBMD変数は、LSBMDの推定に関して情報的な変数である。表5におけるFNBMD変数は、FNBMDの推定に関して情報的な変数である。
【００６１】
次いで本発明者は、骨折のさらなる試験を実施した。実施例2と同一の試験集団からのサンプルを用い、本発明者は再度、表1A/1BにおけるSNPのそれぞれにおける集団の遺伝子型判定を行ったが、ただし、最適化したプローブおよびプライマーを用いた(実施例3ならびに表2Cおよび3C)。
【００６２】
本発明者は再度、遺伝子型-表現型関連性を試験したが、この試験では、骨折表現型は、脊椎(椎骨)、股関節(大腿)または手首における(非外傷性)骨折を有していると考えられた。本発明者は、男性集団、女性集団、および全集団(男性および女性)に関して試験を実施した。
【００６３】
それぞれの場合に、本発明者は、それぞれ情報的SNPおよび臨床的変数の組み合わせに基づき、それぞれが、高い特異性、感度および正確性で実施例3の骨折表現型(WSH骨折)の択一的形態を有する患者間での信頼できる識別を可能にする2つの確率関数(FSTEPおよびBSTEP)を確立した。
【００６４】
各関数に含まれる変数(SNPおよび臨床的変数)は、図9に示されている。
【００６５】
これらの新規な骨折確率関数(男性または女性または双方に関する)により、骨折表現型(実施例3に規定された)を有する患者と有さない患者との間の識別が可能になる。図9における情報的変数の結果に基づき、個体が手首、股関節または脊椎の骨折を発現させる危険性または確率を算出するために、該確率関数を用いることができる。図10A〜15Aは、本発明者により開発された各モデルに関するROC曲線を示している。各モデルに関する感度、特異性および正の確度比(LR+)は図16にある。図10B〜15Bにおけるグラフは、臨床的検証(実施例3)における個体(既知の臨床的に判定された表現型を有する)の確率関数値を示している。
【００６６】
特定の表現型または定量的特性に関する情報的変数の結果を判定することにより、新たな正確性および信頼性で、かつ多数の変数を解析する必要性なしに、対象における対応する表現型または対応する定量値を判定することが可能になることを、本発明者は認識した。
【００６７】
したがって、同定された臨床的変数およびSNP変数、ならびにそれらを用いて構築されたモデルにより、対象における対応する各表現型の発生および定量的特性を予測するための新規な手段が提供される。したがって本発明者は、本明細書に記載されるように、骨粗しょう症の予測、特に骨折の危険性の予測(例えば、椎骨骨折、または手首/脊椎/椎骨骨折のいずれか)およびLSBMDおよびFNBMDを推定するための方法を提供する。
【００６８】
骨粗しょう症は複雑な障害である。疾患の進行経過には変動が大きく、疾患挙動もきわめて様々である。骨粗しょう症の臨床的診断は、BMDに基づいたWHO基準(Tスコア+Zスコア)に基づいて行うことができる。
【００６９】
本明細書に記述されている骨粗しょう症の表現型は、実施例2で規定された骨折表現型または実施例2における椎骨骨折表現型を称し得る。骨折の存在は、臨床的データに基づいて判定することができる。
【００７０】
「実施例2における骨折表現型」とは、身体の任意の部分における1つまたは複数の非外傷性骨折の存在を称する。これ以降、これを骨折表現型と称する。患者は、彼または彼女が身体の任意の部分に1つまたは複数の非外傷性骨折を有していると臨床的に判定される場合に、骨折表現型を示していると一般に考えられる。
【００７１】
「実施例3における骨折表現型」とは、手首、脊椎(椎骨)または股関節(大腿)のいずれかにおける1つまたは複数の非外傷性骨折の存在を称する。これ以降、これをWSH骨折表現型と称する。患者は、彼または彼女が手首、股関節または脊椎のいずれかに1つまたは複数の非外傷性骨折を有していると臨床的に判定される場合に、WSH骨折表現型を示していると一般に考えられる。
【００７２】
骨折は、例えばX線によって、臨床的に診断することができる。
【００７３】
椎骨骨折とは、脊椎に生じる骨折を称する。このような骨折は、例えば、X線によって臨床的に診断することができる。患者は、彼または彼女が脊椎に1つまたは複数の非外傷性骨折を有していると臨床的に判定される場合に、椎骨骨折表現型を示していると一般に考えられる。
【００７４】
骨粗しょう症の定量的特性は、LSBMDおよび/またはFNBMDと称し得る。
【００７５】
腰椎骨塩密度(LSBMD)および大腿頚部骨塩密度(FNBMD)は、BMD試験を用いて、臨床的に判定することができる。例えば、二重エネルギーX線吸収(DXA)走査が使用できる。
【００７６】
当該方法は、対象における1つまたは複数の骨折表現型、WSH骨折表現型、または椎骨骨折表現型を予測するために、または、LSBMDおよびFNBMDを推定するために用いることができる。したがって、対象に、所与の表現型(例えば、骨折、WSH骨折、または椎骨骨折)または所与の定量的特性値(LSBMDおよびFNBMD)が既に存在するかどうかを(高信頼で)判定するために、および/または、所与の表現型(例えば、骨折、WSH骨折、または椎骨骨折)または所与の定量的特性値(LSBMDおよびFNBMD)値が発現し易いかどうかを判定するために、当該方法は有用であり得る。一般に該方法により、対象に存在しているか、または発現している所与の表現型の確率が得られる。一般に該方法により、対象に存在しているか、または発現している定量的特性値の推定が得られる。
【００７７】
一般に対象はヒトである。対象は例えば、中国人、日本人または白人であり得る。対象は、イタリア人の個体などの白人であることが好ましい。対象は男性でも女性でもよく、男性または女性の変数は本明細書に記載されたとおりに選択することができる。対象は例えば、閉経後の女性または高齢男性であり得る。対象は一般に、60歳を超える男性または女性であり得る。
【００７８】
一態様において、対象は、WHOの既存の方法および基準(ZスコアおよびTスコア)によって骨粗しょう症と既に診断されている。対象は既に骨粗しょう症と診断されていてもよい。他の態様において、対象はまだ診断されていなくてもよい。このような対象は骨粗しょう症に典型的な、または骨粗しょう症に関連した症状を示していてもよい。一態様において、対象は、骨折または椎骨骨折の表現型、またはWSH骨折表現型およびLSBMD値またはFNBMD値を仮に割り当てられていてもよい。したがって、予測および推定を確認するために、または新たな予測および推定を行うために、当該方法を用いることができる。
【００７９】
当該方法は、多数の変数または予測因子それぞれに関する結果の判定を含む。該変数は表5および図9に掲げられており、臨床的変数と共に112のSNPを含む。表1Bおよび5、および図9には、各SNPに関するRefSNPコード(rs#)が示されている。これらは、2006年11月24日(表5)および2007年7月6日(表1Bおよび図9)現在、バイオテクノロジー情報国立センター(NCBI)に管理されている一塩基多型データベース(dbSNP)から採用されている。
【００８０】
表5には、骨折表現型および椎骨骨折表現型(男性および女性における)の予測ならびにLSBMDおよびFNBMD(男性および女性における)の推定にとって情報的なSNP変数および臨床的変数が掲げられている。所与の表現型または特性に関して欄内のX印の付いた変数は、その表現型または特性の予測または推定にとって情報的な変数である。これらは、実施例2で確立された予測的モデル(または確率関数)に含まれた変数である。本明細書において、表5における表現型または特性の予測または推定にとって情報的であるとして掲げられている変数は、「表現型名変数」または「定量的特性名変数」と称される。したがって例えば、「女性骨折変数」とは、表5の女性骨折の欄内でX印が付いており、したがって、女性における骨折表現型の確度予測にとって情報的なSNPおよび臨床的変数を称する。
【００８１】
同様に図9には、WSH骨折表現型の予測にとって情報的なSNP変数および臨床的変数が掲げられている。実施例3において、WSH骨折表現型を予測するために、6つの異なるモデルが確立された。図9において、これらは6つの異なる欄に分けられている。男性対象または女性対象のいずれかにおけるWSH表現型の確度の予測または予後予測のために使用できる2つのモデル(FTEPおよびBSTEP)(一般的モデル)、男性対象におけるWSH表現型の確度の予測または予後予測のための2つのモデル(FTEPおよびBSTEP)(男性モデル)、および女性対象におけるWSH表現型の確度の予測または予後予測のための2つのモデル(FTEPおよびBSTEP)(女性モデル)がある。各モデルに関する欄には、その予測モデルに含まれるSNP変数および臨床的変数が掲げられている。したがって、例えば、男性FSTEPモデルは、SNP変数rs3736228および臨床的変数AGEを含む。本明細書において、図9におけるWSH骨折表現型を予測するためのモデルに含まれている変数は、「モデル名変数」と称される。したがって、例えば、男性FSTEPモデルに含まれているSNP変数rs3736228および臨床的変数AGEは、男性FSTEPモデル変数と称される。
【００８２】
所与のSNPに関する結果は、対象のゲノムDNA配列内のその位置におけるヌクレオチドまたはそのSNPに関する対象の遺伝子型の同一性である。したがって、所与のSNPに関する結果は、A、T、CまたはGであり得る。
【００８３】
当該方法はまた、対象に関する1つまたは複数の臨床的変数の結果の判定または使用を含む。これらの臨床的変数もまた、表5および図9に掲げられている。年齢は対象の年齢を言う。女性対象における閉経年齢とは、閉経の発現年齢を言う。女性対象における初経年齢とは、初経の発現年齢を言う。BMIは肥満度指数であり、公知の方法によって算出することができる。したがって、臨床的(非SNP)変数の結果は、示されているように、年齢、閉経年齢、初経年齢および肥満度指数(BMI)である。
【００８４】
したがって、一態様において本発明は、対象に関する表5または図9における表現型または特性の予測にとって情報的であるとして掲げられた1つまたは複数の変数(例えば、1つまたは複数のSNP変数および1つまたは複数の臨床的変数)の結果を判定するステップを含む、その対象における本明細書に記載された骨粗しょう症の表現型または定量的特性を予測するための方法を提供する。一態様において本発明は、対象に関する表5に掲げられた変数の結果を判定するステップを含む、その対象における骨折表現型または椎骨骨折表現型を予測するための方法を提供する。本発明はまた、対象に関する表5に掲げられた変数の結果を判定するステップを含む、その対象におけるLSBMDおよびFNBMDを推定する方法を提供する。
【００８５】
本発明はまた、対象に関する図9に掲げられた変数の結果を判定するステップを含む、その対象におけるWSH骨折表現型を予測するための方法を提供する。例えば、方法は、一般的FSTEPモデル変数および/または一般的BSTEPモデル変数および/または女性FTSEPモデル変数および/または女性FTEPモデル変数の結果を判定すること、または得ることを含み得る。男性対象に関して、方法は、男性モデルおよび/または一般的モデルのそれぞれにおける変数の結果を判定すること、または得ることを含み得る。同様に女性対象に関して、方法は、女性モデルおよび/または一般的モデルのそれぞれにおける変数の結果を判定することを含み得る。したがって、男性におけるWSH骨折表現型は、図9における男性モデルおよび/または図9における一般的モデルのいずれかまたは双方を用いて予測することができる。同様に、女性におけるWSH骨折表現型は、図9における女性モデルおよび/または図9における一般的モデルのいずれかまたは双方を用いて予測することができる。一態様において、WSH骨折表現型を予測する方法は、図9における1つまたは複数のBSTEPモデルの使用を含む。モデルを使用することとは、モデル変数、例えば全てのモデル変数の結果を得ること、または判定すること、ならびにこれらの結果を用いて、本明細書に記載された表現型を予測することまたは判定することを言う。
【００８６】
したがって当該方法は、骨折表現型、椎骨骨折表現型および/またはWSH骨折表現型を予測するための、および/またはLSBMDおよびFNBMDを推定するためのものであり得る。該方法は、表5における(男性または女性)骨折変数および(男性または女性)椎骨骨折変数から選択された変数を用いて、骨折表現型および/または椎骨骨折表現型を予測するために使用できる。該方法は、表5における(男性または女性)LSBMDおよび(男性または女性)FNBMD変数から選択された変数を用いて、LSBMDおよびFNBMDを推定するために使用できる。該方法は、図9における各モデルに関して記載されたモデル変数から選択された変数を用いて、WSH骨折表現型を予測するために使用できる。
【００８７】
上記の方法は、表5における所与の表現型の予測または所与の特性の推定にとって情報的であるとして掲げられた男性または女性の骨折変数の全て、および/または男性または女性の椎骨骨折変数の全て、および/またはLSBMD変数の全て、および/またはFNBMD変数(またはSNP変数)の全てに関する結果の判定を含むことが好ましい。例えば、骨折表現型を予測するために、表5における男性または女性の骨折変数(またはSNP変数)の全てが試験されるか、または使用されることが好ましい。これによって、疾患の表現型または特性の最も正確な予測がなされると考えられる。
【００８８】
同様に、図9における予測モデルのいずれに関しても、そのモデルに関して記載されたモデル変数の全てを用いてWSH骨折表現型を予測することが好ましい。
【００８９】
しかしながら、該診断方法は、表5における所与の表現型または特性の予測にとって、または図9におけるモデルに含む上で情報的であるとして記載された変数(またはSNP変数)より少数を用いて実施できる(より低い正確度で)ことが考えられる。
【００９０】
したがって、例えばxが、表5において所与の表現型の予測または特性の推定にとって情報的であるとして掲げられた骨折、椎骨骨折、LSBMD変数またはFNBMD変数(またはSNP変数)の数である場合、該方法は、nが1から10(1、2、3、4、5、6、7、8、9または10)の任意の数である(少なくとも)(x-n)の骨折、椎骨骨折、LSBMD変数またはFNBMD変数(またはSNP変数)の結果を判定すること、およびこれらの変数の結果を用いて、所与の表現型を予測すること、または定量的特性を推定することを含み得る。使用される変数の最少数は、偶然与えられた識別力よりも有意に大きな識別力を可能にする数であることが好ましい(プレスのQ検定)(Hair J、Black B、Anderson R、Tatham R、Multivariate Data Analysis、6/E、Prentice Hall、2006年)。
【００９１】
例えば、表5には、女性の骨折表現型の予測にとって情報的である35のSNP変数を含む、女性に関する38の骨折変数が掲げられている。当該方法は、38全ての骨折変数または35の骨折SNP変数全ての結果を判定すること、およびこれらの結果に基づいて表現型を予測することを含むことが好ましい。しかしながら、いくつかの場合、該方法は、これらの変数またはSNP変数のわずか20、15または10に関する結果を判定することを含んでもよく、変数の最少数は、偶然与えられた識別力よりも有意に大きな識別力を可能にする数である(プレスのQ検定)(上記)。
【００９２】
同様に、xが、図9においてモデルに関するWSH骨折表現型の予測にとって情報的であるとして掲げられたモデル変数(またはSNP変数)の数である場合、該方法は、nが1から10(1、2、3、4、5、6、7、8、9または10)の任意の数である(少なくとも)(x-n)のモデル変数(またはSNP変数)の結果を判定すること、およびこれらの変数の結果を用いて、表現型を予測することを含み得る。使用される変数の最少数は、偶然与えられた識別力よりも有意に大きな識別力を可能にする数であることが好ましい(プレスのQ検定)(Hair J、Black B、Anderson R、Tatham R、Multivariate Data Analysis、6/E、Prentice Hall、2006年)。
【００９３】
例えば、図9には、一般的(男性および女性)集団におけるWSH骨折表現型の予測にとって情報的である9つのSNPを含む10の一般的BSTEPモデル変数が掲げられている。当該方法は、10のBSTEP骨折変数全てまたは9つのSNP変数全てに関する結果を判定すること、およびこれらの結果に基づいて表現型を予測することを含むことが好ましい。しかしながら、いくつかの場合、該方法は、これらの変数またはSNP変数のわずか8つ、7つ、6つ、または5つに関する結果を判定することを含んでもよく、変数の最少数は、偶然与えられた識別力よりも有意に大きな識別力を可能にする数である(プレスのQ検定)(上記)。
【００９４】
骨折、椎骨骨折、モデル、SNP変数などのLSBMD変数および/またはFNBMD変数の少なくとも1つが、当該方法において試験される。
【００９５】
表5における女性骨折変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37または38が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における女性骨折変数に基づいた)は、(イタリア人)女性における骨折表現型を予測し、55%超の感度および95%以上の特異性、11のLR値で表現型を割り当てるために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、女性における骨折表現型を予測するより正確で信頼できる手段を提供する。
【００９６】
表5における男性骨折変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27または28が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における男性骨折変数に基づいた)は、(イタリア人)男性における骨折表現型を予測し、57%超の感度および95%を超える特異性、11.4のLR値で表現型を割り当てるために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、男性における骨折表現型を予測するより正確で信頼できる手段を提供する。
【００９７】
表5における女性椎骨骨折変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32または33が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における女性椎骨骨折変数に基づいた)は、(イタリア人)女性における椎骨骨折表現型を予測し、72%超の感度および95%以上の特異性、14のLR値で表現型を割り当てるために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、女性における椎骨骨折表現型を予測するより正確で信頼できる手段を提供する。
【００９８】
表5における男性対骨骨折変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における男性椎骨骨折変数に基づいた)は、(イタリア人)男性における椎骨骨折表現型を予測し、71%超の感度および94%を超える特異性、11.8のLR値で表現型を割り当てるために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、男性における椎骨骨折表現型を予測するより正確で信頼できる手段を提供する。
【００９９】
表5における女性LSBMD変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における女性LSBMD変数に基づいた)は、0.3のR2を有する(イタリア人)女性におけるLSBMDを推定するために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、女性の年齢でLSBMDを推定するより正確で信頼できる手段を提供する。
【０１００】
表5における男性LSBMD変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における男性LSBMD変数に基づいた)は、0.38のR2を有する(イタリア人)男性におけるLSBMDを推定するために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、男性の年齢でLSBMDを推定するより正確で信頼できる手段を提供する。
【０１０１】
表5における女性FNBMD変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における女性FNBMD変数に基づいた)は、0.32のR2を有する(イタリア人)女性におけるFNBMDを推定するために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、女性の年齢でFNBMDを推定するより正確で信頼できる手段を提供する。
【０１０２】
表5における男性FNBMD変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。実施例2でのように、当該方法(表5における男性FNBMD変数に基づいた)は、0.35のR2を有する(イタリア人)男性におけるFNBMDを推定するために使用することができることを本発明者は見出した。したがって当該方法は、現行の慣例的方法よりも、男性の年齢でFNBMDを推定するより正確で信頼できる手段を提供する。
【０１０３】
図9における一般的FSTEPモデル変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3つ、4つ、5つまたは6つが結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。例えば、一方法は、対象に関して、図9に記載された一般的FSTEP変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。これらの変数を用いることによって、7.7のLR+を有するイタリア人集団におけるWSH骨折表現型の予測が可能になる(実施例3および図9を参照)。
【０１０４】
図9における一般的BSTEPモデル変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。例えば、一方法は、対象に関して、図9に掲げられた一般的BSTEP変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。これらの変数を用いることによって、7.8のLR+を有するイタリア人集団におけるWSH骨折表現型の予測が可能になる(実施例3および図16を参照)。
【０１０５】
図9における男性FSTEPモデル変数の場合、変数の少なくとも2つが結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。例えば、一方法は、対象に関して、図9に掲げられた男性FSTEP変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。これらの変数を用いることによって、5.5のLR+を有するイタリア人集団におけるWSH骨折表現型の予測が可能になる(実施例3および図16を参照)。
【０１０６】
図9における男性BSTEPモデル変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。例えば、一方法は、対象に関して、図9に掲げられた男性BSTEP変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。これらの変数を用いることによって、8.7のLR+を有するイタリア人集団におけるWSH骨折表現型の予測が可能になる(実施例3および図16を参照)。
【０１０７】
図9における女性FSTEP変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3つ、4つ、5つ、6つまたは7つが結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。例えば、一方法は、対象に関して、図9に掲げられた女性FSTEP変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。これらの変数を用いることによって、9.4のLR+を有するイタリア人集団におけるWSH骨折表現型の予測が可能になる(実施例3および図16を参照)。
【０１０８】
図9における女性BSTEP変数の場合、SNP変数などの変数の少なくとも2つ、例えば、少なくとも3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11または12が結果に関して試験され、予測に用いられることが好ましい。例えば、一方法は、対象に関して、図9に掲げられた女性BSTEP変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。これらの変数を用いることによって、10.4のLR+を有するイタリア人集団におけるWSH骨折表現型の予測が可能になる(実施例3および図16を参照)。
【０１０９】
一例において、該方法は、骨折表現型を予測することならびにLSBMDおよびFNBMDを推定することを含む。例えば、該方法は、対象、例えば男性または女性にとって適切な、上記のとおり選択された骨折変数、椎骨骨折、LSBMD変数および/またはFNBMD変数またはそれらの任意の組み合わせに関する結果を判定することを含み得る。該方法は、表5における変数、または表5における男性または女性の変数のそれぞれに関する結果を判定することを含み得る。したがって、例えば、骨粗しょう症に関して対象を試験すると同時に、骨折/椎骨骨折発現の確度を判定し、LSBMDおよびFNBMDを推定することが可能であり得る。
【０１１０】
例えば、一方法は、対象における骨折表現型の確度を判定すること、ならびに表5における骨折変数および表5におけるLSBMD変数および/またはFNBMD変数の結果を用いて、LSBMDおよび/またはFNBMDを推定することを含み得る。該変数は、男性または女性の対象に適切なものを、本明細書に記載されたように選択することができる。
【０１１１】
同様に、一方法は、本明細書に記載されたように、図9に掲げられた1つまたは複数のモデルを用いて、対象におけるWSH骨折表現型の確度を判定すること、ならびに表5におけるLSBMD変数および/またはFNBMD変数を用いて、LSBMDおよび/またはFNBMDを推定することを含み得る。
【０１１２】
一般に、該方法は、少なくとも1つのSNPの遺伝子型判定を含む。いくつかの例において、本発明で結果が判定される表5または図9の変数は、表5または図9に掲げられたSNPのみであり(臨床的変数ではなく)、したがって、結果は全ての遺伝子型である。
【０１１３】
いくつかの態様において、本発明は、対象に関する他の因子の判定を含む。例えば対象は、1つまたは複数の他の遺伝子変数(表5または図9に掲げられていない他のSNPなど)に関して遺伝子型判定され得る。これらは、骨粗しょう症または他の病態に関連した変数であり得る。他の疾患に関連した他のマーカー(SNP)を判定することもできる。当該方法は、本明細書に記載された骨粗しょう症に関する標準的な臨床的試験と併せて用いることもできる。例えば、該方法は、BMDに関する臨床的試験と併せて用いることができる。
【０１１４】
当該方法によって、比較的少数の情報的変数(特に、SNP)に基づいた骨折、椎骨骨折またはWSH骨折の表現型の正確な予測および/またはLSBMD/FNBMDの推定が可能になる。これは、大規模なSNPスクリーニングならびにより大規模な遺伝子型判定方法にとって必ずしも好適ではないと考えられる遺伝子型判定法の使用を可能にするという点で、有利であり得る。
【０１１５】
一般に、より多数のSNPまたは遺伝子変異または因子が当該方法において試験されるとしても、骨折/椎骨骨折の表現型の予測ならびにLSBMD/FNBMDの推定は、表5および/または図9に掲げられ、上記のとおり選択された情報的変数の結果のみに基づいて行うことができる。上記のとおり型および数が選択され、表5および/または図9に掲げられた変数は、予測にとって十分である。したがって一例において、当該方法により、上記のとおり数および型が選択された表5の変数またはSNP変数の結果に基づいた(最大限)、骨折/椎骨骨折の表現型の予測ならびにLSBMD/FNBMDの推定が可能になる。
【０１１６】
同様に、本明細書に記載されたように選択された、図9におけるモデル変数の結果に基づいて(最大限)、WSH骨折の表現型を予測することができる。例えば、男性対象に関する予測は、男性FSTEPモデル変数および/または男性BSTEPモデル変数および/または一般的FSTEPモデル変数および/または一般的BSTEPモデル変数の結果に基づいて(最大限)、行うことができる。
【０１１７】
しかしながら、いくつかの例では、予測または推定に、いくつかの追加の変数またはSNP変数または因子が用いられる場合もあり得る。当該方法において、上記のとおり選択された、表5および/または図9のSNP変数を含む(または、それらよりなる)SNPまたは骨粗しょう症関連SNPなどの、最大で130、120、110、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、26、24、20、10、5または4の変数の結果に基づいて、予測または診断が行われることが好ましい。
【０１１８】
一態様において該方法は、最大130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、26、24、20、10、5または4のSNPまたは骨粗しょう症関連SNPの遺伝子型判定を含み得る。該方法は、表5における最大112のSNPの遺伝子型判定を含み得る。いくつかの例において、該方法は、上記のとおり選択された、最大、骨折SNP変数、椎骨骨折SNP変数、図9モデルSNP変数、LSBMD SNP変数および/またはFNBMD SNP変数の遺伝子型判定を含む。
【０１１９】
いくつかの例において、上記のとおり表5および/または図9から数および型が選択されるSNPは、該方法において遺伝子型判定される骨粗しょう症関連SNPだけである。本発明による表現型または特性を予測するためのモデルを構築するために用いられるSNPなどの変数の数および組み合わせは、該モデルが、少なくとも6つ、7つ、8つ、9つまたは10などの少なくとも5つのLR+値で予測が行われるようなものであることが好ましい。LR+値の算出法は、本明細書に記載されている。
【０１２０】
所与の表現型の予測または定量的特性の推定のために、選択された変数(例えばSNP変数)のそれぞれに関して結果が判定されたら、次にこれらの結果を用いて、表現型を予測するか、または定量的特性を推定する。これらの結果は、好適な確率関数または定量的関数(その表現型を予測する、またはその定量的特性を推定するための)に使用または挿入され、確率関数値または定量的関数値が算出される。確率関数または定量的関数における使用ならびに確率関数値または定量的関数値の算出のために、結果をコード化することができる。確率関数の場合、次に確率関数値を、既知の(臨床的に判定された)表現型の個体の集団に関して得られた確率関数値と比較する。例えば、これは、図6.1、6.2、7.1および7.2におけるグラフなど、集団内の値の分布を示しているグラフと比較することによって行うことができる。したがって、試験確率関数値が属する表現型群に基づいて、試験個体が該表現型を発現する危険性が高いか低いかを判定することができる。
【０１２１】
所与の表現型または定量的特性に関する好適な確率関数または定量的関数は、当該実施例で示し、下記に記載されている方法によって誘導できる。一般に、個体の試験集団が与えられる。これらの個体は、確率関数または定量的関数が判定に用いられる表現型または特性に関して、公知の(臨床的に判定された)表現型および/または定量的特性を有する個体である。骨粗しょう症の臨床的診断および表現型判定は、ZスコアおよびTスコアに基づいた世界保健機構(WHO)の臨床的基準に従って行うことができる。本発明によって評価することのできる骨粗しょう症の表現型および特性のそれぞれは、本明細書に記載されたとおり臨床的に診断することができる。
【０１２２】
一例において、試験集団における個体は、実施例2の試験集団に関する選択基準の1つまたは複数または全てに合致し得る。
該集団は、例えば、中国人集団、日本人集団、またはイタリア人集団などの白人集団であり得る。該集団は男性であっても女性であってもよい。誘導する確率関数または定量的関数が表5における女性の変数または図9における女性モデルの変数に基づいている場合、該集団は女性個体であることが好ましい。誘導する確率関数または定量的関数が表5における男性の変数または図9における男性モデルの変数に基づいている場合、該集団は男性個体であることが好ましい。混合集団の場合は、男性と女性の分布は釣り合わせることが好ましい。該集団は、閉経女性および/または高齢男性を含み得る。男性および/または女性は60歳を超えていてよい。確率関数/定量的関数を誘導するために用いられる集団は、確率関数を適用する集団の代表的サンプルを含むことが好ましい。
【０１２３】
一般に、試験集団には少なくともn名の個体が含まれる。典型的には、nは300〜1200、例えば400、500または600である。択一的な表現型を有する、およそ等しい数の個体が存在することが好ましい。したがって、該集団は、およそ50%の表現型Aおよび50%の表現型Bであることが好ましい。しかしながら、その比率は、例えば60%/40%、70%/30%または任意の統計的に許容できる分布であり得る。
【０１２４】
次いで、試験集団内の個体を試験し、特定の表現型または定量的特性にとって情報的な変数(表5および/または図9に掲げられ、診断方法に関して上記のとおり数および型を選択された)のそれぞれに関する結果を各個体に関して判定する。試験、例えば遺伝子型判定は、本明細書に記載された方法のいずれかにより、例えば、本明細書に記載されたマイクロアレイ分析によって実施することができる。これにより、各個体に関する多数の結果が提供される。
【０１２５】
次いで、従属変数として臨床的に判定された疾患表現型を、独立変数として情報的変数の結果を用いて、多重ロジスティック回帰分析を実施する。それによって確率関数を誘導する。一般に確率関数は、例えば、t検定におけるp≦0.05で、統計的に有意な方法で試験集団における異なる表現型の個体間を識別することができる。
【０１２６】
次いで、従属変数として定量的特性を、独立変数として情報的変数の結果を用いて、多重線形回帰分析を実施する。それによって定量的関数を誘導する。一般に定量的関数は、例えば、t検定におけるp≦0.05で、統計的に有意な方法で試験集団における定量化特性を推定することができる。
【０１２７】
次いで、試験集団において既知の表現型を有する各個体に関して確立関数値を算出し、好適なグラフにプロットすることができる。例えば、好適なグラフは、図6.1、6.2、7.1および7.2、ならびに図10B〜15Bに示されている。
【０１２８】
したがって例えば、表5の変数を用いて女性における骨折表現型の予測に用いる確率関数の誘導において、骨折表現型を患っている個体および骨折表現型を患っていない個体の試験集団が提供される。次いで、表5における35の女性骨折SNP変数のそれぞれ(または38の変数のそれぞれ)に関する結果を判定するために、各女性個体を試験することができる。「結果」および「表現型」のデータに基づいて多重ロジスティック回帰を実施し、統計的に有意な方法で試験集団における2つの表現型群間を識別することのできる確率関数が誘導される。
【０１２９】
したがって例えば、LSBMD、例えば女性におけるLSBMDの推定に用いる定量的関数の誘導において、広範囲のLSBMDを有する個体の試験集団が提供される。次いで、表5における17の女性LSBMD SNP変数のそれぞれ(または表5における女性LSBMD SNP変数の全て)に関する結果を判定するために、各女性個体を試験することができる。「結果」および「表現型」のデータに基づいて多線形回帰を実施し、統計的に有意な方法で試験集団におけるLSBMDを推定することのできる定量的関数が誘導される。
【０１３０】
したがって一態様において、本発明は、
(i)それぞれが臨床的に判定された既知の表現型またはその表現型または特性に関する定量的特性を有する個体の集団を提供するステップ、
(ii)該集団における各個体に関する1組の変数の結果をex vivoで判定し、それによって各個体に関する1組の結果を得るステップ、および
(iii)
(a)(ii)で得られた結果および(i)で得られた既知の表現型に多重ロジスティック回帰分析を適用するステップ、および
(b)それによって、該集団における異なる表現型を有する個体の統計的に有意な区別をなす確率関数を誘導するステップ、
および/または
(iv)
(a)(ii)で得られた結果および(i)で得られた定量的特性に多重線形回帰分析を適用するステップ、および
(b)それによって、該集団における個体の定量的特性の統計的に有意な推定をなす定量的関数を誘導するステップ
を含み、
(a)表現型が、骨折または椎骨骨折の表現型であり、変数の組が、表5における骨折変数または椎骨骨折変数の組から選択され;および/または
(b)定量的特性がLSBMD/FNBMDであり、変数の組が表5におけるLSBMD変数またはFNBMD変数のセットから選択され、かつ/または
(c)表現型がWSH骨折表現型であり、変数の組が図9におけるいずれかのモデルに関するモデル変数から選択され、
特に、
(a)表現型が女性対象における骨折であり、変数の組が表5における女性骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(b)表現型が男性対象における骨折であり、変数の組が表5における男性骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(c)表現型が女性対象における椎骨骨折であり、変数の組が表5における女性椎骨骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(d)表現型が男性対象における椎骨骨折であり、変数の組が表5における男性椎骨骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(e)定量的特性が女性対象における腰椎骨塩密度(LSBMD)であり、変数の組が表5におけるLSBMD女性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(f)定量的特性が男性対象におけるLSBMDであり、変数の組が表5におけるLSBMD男性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(g)定量的特性が女性対象における大腿頚部骨塩密度(FNBMD)であり、変数の組が表5におけるFNBMD女性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(h)定量的特性が男性対象におけるFNBMDであり、変数の組が表5におけるFNBMD男性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(i)表現型が女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が図9における女性FSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(j)表現型が女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が図9における女性BSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(k)表現型が男性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が図9における男性FSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(l)表現型が男性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が図9における男性BSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(m)表現型が男性対象または女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が図9における一般的FSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、かつ/または
(n)表現型が男性対象または女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が図9における一般的BSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成される、
骨粗しょう症の表現型の予測、または骨粗しょう症の定量的特性の推定でそれぞれ使用するための確率関数または定量的関数を誘導する方法をさらに提供する。
【０１３１】
確率関数/定量的関数の誘導は、コンピュータにより実施できる。したがって一態様において、本発明はまた、骨粗しょう症の表現型の予測で使用するための確率関数または骨粗しょう症の定量的特性を推定する定量的関数を誘導する計算方法に関するものであり、該方法は、
(a)それぞれが既知の臨床的に判定された表現型を有する個体の集団から得られた結果のデータおよび表現型データに、多重ロジスティック回帰分析を適用し、それによって、該集団における異なる表現型を有する個体の統計的に有意な区別をなす確率関数を誘導するステップ、および/または
(b)それぞれが既知の定量的特性を有する個体の集団から得られた結果のデータおよび定量的特性データに多重線形回帰分析を適用し、それによって、該集団における個体の統計的に有意な推定をなす定量的関数を誘導するステップ
を含み、
(i)表現型データが、各個体の臨床的に判定された既知の表現型を含み、
(ii)定量的特性データが、各個体の既知の定量的特性値を含み、
(iii)結果のデータが、該集団における各個体に関する変数の組の結果を含み、
(a)表現型が、本明細書に記載された骨折表現型または椎骨骨折表現型を有し、変数の組が、表5における骨折変数または椎骨骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(b)定量的特性が、LSBMDまたはFNBMDであり、変数の組が、表5におけるLSBMD変数またはFNBMD変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(c)表現型が、WSH骨折表現型であり、変数の組が、図9におけるいずれかのモデルに関するモデル変数から選択されるか、またはそれから構成され、
特に、
(i)表現型データが、各個体の既知の臨床的に判定された表現型を含み、
(ii)定量的特性データが、各個体の既知の定量的特性値を含み、
(iii)結果のデータが、該集団における各個体に関する変数の組の結果を含み、
かつ、
(a)表現型が、女性対象における骨折であり、変数の組が、表5における女性骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(b)表現型が、男性対象における骨折であり、変数の組が、表5における男性骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(c)表現型が、女性対象における椎骨骨折であり、変数の組が、表5における女性椎骨骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(d)表現型が、男性対象における椎骨骨折であり、変数の組が、表5における男性椎骨骨折変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(e)定量的特性が、女性対象における腰椎骨塩密度(LSBMD)であり、変数の組が、表5におけるLSBMD女性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(f)定量的特性が、男性対象におけるLSBMDであり、変数の組が、表5におけるLSBMD男性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(g)定量的特性が、女性対象における大腿頚部骨塩密度(FNBMD)であり、変数の組が、表5におけるFNBMD女性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(h)定量的特性が、男性対象におけるFNBMDであり、変数の組が、表5におけるFNBMD男性変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(i)表現型が、女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が、図9における女性FSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(j)表現型が、女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が、図9における女性BSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(k)表現型が、男性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が、図9における男性FSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(l)表現型が、男性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が、図9における男性BSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(m)表現型が、男性対象または女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が、図9における一般的FSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成され、
(n)表現型が、男性対象または女性対象におけるWSH骨折であり、変数の組が、図9における一般的BSTEPモデル変数の組から選択されるか、またはそれから構成される。
【０１３２】
各表現型に関する誘導方法において、試験される変数は、その表現型または定量的特性または診断方法に関連した本明細書において既に記載されたモデルに関する、表5または図9における情報的変数から選択することができる。図9において表現型または定量的特性にとって情報的であるとして掲げられた、またはモデルに包含するために掲げられた全ての変数を試験することが好ましい。
【０１３３】
本発明はまた、このようにして誘導された確率関数/定量的関数、ならびに本明細書に記載された診断方法および予測方法におけるそれらの使用に関する。
【０１３４】
図9における各モデルによるWSH骨折表現型を予測するための確率関数の計算に関するデータは、図17〜19に提供されている。統計解析を、例えば社会科学のための統計パッケージ(SPSS本社、シカゴ、イリノイ州、米国)第14.0版を用いて実施することができる。これらを、本明細書における方法に使用する確率関数値の計算に使用することができる。表におけるデータを用いて、本発明に使用する確率関数を構築することができる。
【０１３５】
一態様において本発明は、図17〜19のいずれかにおけるデータを用いて、構築または誘導された確率関数、およびWSH骨折表現型を予測するための方法、例えば計算方法におけるそれらの使用に関する。本発明はさらに、本明細書に記載された関連するコンピュータプログラムおよびコンピュータシステムに関する。本発明はまた、当該方法によって誘導された確率関数および本明細書に記載された方法におけるそれらの使用に関する。
【０１３６】
試験結果のデータから確率関数値を算出し、試験個体における表現型発現の危険性を評価するために、前記値を既知の表現型の試験集団から得られた値と比較する過程もまた、適切なソフトウェアを用いて実施することができる。試験結果のデータから定量的関数値を算出する過程もまた、適切なソフトウェアを用いて実施することができる。
【０１３７】
したがって、一態様において本発明は、本明細書に記載された方法によって得られた、その表現型(骨折または椎骨骨折またはWSH骨折)にとって情報的な変数の結果(「結果のデータ」)を用いて、骨粗しょう症表現型(骨折または椎骨骨折またはWSH骨折)を予測するための計算方法に関する。該計算方法において、試験個体に関する確率関数値を得るために、特定の表現型にとって情報的な変数に関する試験結果のデータを好適な確率関数にインプットする。次いで、試験個体の表現型を診断または予測するために、試験確率関数値を、既知の表現型を有する個体の確率関数値と比較する。
【０１３８】
一態様において本発明は、本明細書に記載された方法によって得られた、その定量的特性(LSBMDまたはFNBMD)にとって情報的な変数の結果(「結果のデータ」)を用いて、骨粗しょう症の定量的特性(LSBMDまたはFNBMD)を推定するための計算方法に関する。該計算方法では、特定の定量的特性に関する情報的変数の試験結果のデータが好適な定量的関数にインプットされ、試験個体に関する定量的関数値が得られる。
【０１３９】
本発明はさらに、本明細書に記載された計算方法を実施するために、プロセッサおよび該プロセッサを制御するための手段を含むコンピュータシステム、ならびにコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で操作された場合、該コンピュータまたは該コンピュータネットワークに計算方法を実施させるコンピュータプログラムコードを含むコンピュータプログラムに関する。一態様において、該コンピュータプログラムはコンピュータ読取り可能媒体に貯蔵される。
【０１４０】
一般に当該方法は、個体から得られたサンプルを用いて、ex vivoまたはin vitroで実施される。一方法は、本明細書に記載された方法によって得られた臨床的変数の結果の使用を含み得る。
【０１４１】
当該方法において、所与の遺伝子変異(SNP変数など)に関して、対象の遺伝子型を、任意の好適な手段により判定することができる。例えば、遺伝子型は、マイクロアレイ分析、配列決定、プライマー伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの結合、プライマー伸長産物の質量決定、制限長多型分析、一本鎖コンホメーション多型分析、ピロ配列決定、dHPLCまたは変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)によって判定することができる。さらに、個体またはサンプルの配列決定した核酸を有すれば、該配列情報を保持し、元の核酸自体に頼らずに、引き続き探索することができる。したがって、コンピュータまたは他の電気的手段を用いて、配列情報のデータベースを走査することにより、配列の変化または変異を確認することができる。
【０１４２】
一般に、試験される遺伝子変異の少なくとも1つを含む核酸を含有するサンプル(対象から得られた)が提供される。該核酸は、特性化される遺伝子変異(SNP)を含む1つまたは複数の標的領域を含む。
【０１４３】
該核酸は、核酸を含有する任意の適切な生物学的サンプルから得ることができる。該サンプルは、人体由来の体液または組織、分泌物、細胞または細胞系から採取することができる。
【０１４４】
例えばサンプルは、人体由来の、血清を含む血液、リンパ球、リンパ芽球腫細胞、線維芽細胞、血小板、単核細胞または他の血液細胞から、唾液、肝臓、腎臓、膵臓または心臓、尿から、または他の任意の組織、体液、細胞または細胞系から採取することができる。例えば、好適なサンプルは、口腔からの細胞のサンプルであり得る。核酸は血液サンプルから得られることが好ましい。
【０１４５】
一般に核酸は、慣例的技法を用いて、生物学的サンプルから抽出される。生物学的サンプルから抽出される核酸は、DNA、またはRNA、一般に総RNAであり得る。試験される遺伝子変異が遺伝子のコード配列内に位置する場合、一般にRNAが抽出される。生物学的サンプルからRNAが抽出される場合、該方法は、RNAからcDNAを得るステップをさらに含み得る。これは、好適なプライマーを用いる逆転写などの慣例的方法を用いて実施することができる。次いで、抽出DNAまたは抽出RNAから得られたcDNAに対し、一般に引き続いて操作が行われる。本明細書に用いられる用語のDNAは、DNAとcDNAの双方を含み得る。
【０１４６】
一般に、試験される遺伝子変異は、例えば、配列に関して既知であり特性化されている。したがって、遺伝子変異を含む核酸領域は、当業界に公知の方法を用いて得ることができる。
【０１４７】
一般に、同定されるSNPを含有する核酸領域(標的領域)は、増幅反応に供される。増幅には任意の好適な技法または方法を用いることができる。一般に、複数のSNPが分析される場合、対応する標的領域(変異を含む)の全てを同時に増幅することが好ましい。
【０１４８】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、「PCR protocols;A Guide to Methods and Applications」、Innisら編、1991年、Academic Press、ニューヨーク、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.、51:263頁(1987)、Ehrlich(編)、PCR technology、Stockton Press、ニューヨーク州、1989年、およびEhrlichら、Science、252:1643〜1650頁(1991)に総説がある)を用いることができる。増幅反応においてテンプレートとして用いられる核酸は、ゲノムDNA、cDNAまたはRNAであり得る。
【０１４９】
他の特異的核酸増幅技法としては、鎖置換活性化、QB複製ーゼ系、修復連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅および結合活性化転写が挙げられる。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドPCRプライマーの適切な対を用いて、多重PCRを実施することができる。標的領域の特定の増幅を可能にする任意の好適なプライマー対を用いることができる。一態様において、該プライマーは、PCR反応の可能な最少数での増幅を可能にする。
【０１５１】
表1A/1B、表5および図9におけるSNPを含む標的DNA領域の増幅に好適なPCRプライマーは、表3A、B、およびCに掲げられている。当該方法は、これらのプライマーの1つまたは複数または掲げられたプライマー対の1つまたは複数の使用を含むことができる。一態様において、該方法は、図3Aまたは3Cに掲げられたプライマー全ての使用を含む。好適な反応条件は、当該実施例および当業界に知られた指針を用いて決定することができる。
【０１５２】
次いで、増幅された核酸を配列決定し、および/または他の任意の方法で試験して、特定の特性の存在または非存在を判定することができる。試験用の核酸は、制限酵素消化および電気泳動などの種々の他の技法を用いて、細胞から取り出した、またはライブラリーにおける核酸から調製することができる。
【０１５３】
例えば、少なくとも1つの多型の対立遺伝子(すなわち、一塩基多型の位置におけるヌクレオチドの同一性)を、ゲノムサンプルの増幅領域に対するオリゴヌクレオチドプローブの結合を判定することによって判定することができる。好適なオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも1つの多型の特定の対立遺伝子に特異的に結合し、少なくとも1つの多型の他の対立遺伝子には特異的に結合しないヌクレオチド配列を含む。このようなプローブは配列が、本明細書に記載されたSNPの1つまたは複数を含有するゲノム核酸のある領域、またはその相補体に対応し得る。好適なストリンジェントな条件下、試験核酸に対するこのようなプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、試験核酸における配列変化の存在を示す。効率的なスクリーニングを目的として、同一の試験サンプルに1つ超のプローブを用いることができる。
【０１５４】
当業者は、オリゴヌクレオチドの長さおよび塩基組成、温度などの因子を考慮に入れて、選択的ハイブリダイゼーションのために、所望のストリンジェンシーの好適な条件を採用する十分な能力がある。
【０１５５】
17から30の塩基を有するオリゴヌクレオチドに対する好適な選択的ハイブリダイゼーション条件としては、6×SSC中、42℃で一晩のハイブリダイゼーション、および6×SSC中、42℃から65℃に連続的に温度を増加させての洗浄が挙げられる。
【０１５６】
他の好適な条件およびプロトコルは、Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第2版、Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory PressおよびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons、1992年に記載されている。
【０１５７】
本発明のさらなる態様では、表1A/1B、表5および図9に示された一塩基多型からなる群から選択された多型の特定の対立遺伝子を含む核酸配列に特異的にハイブリダイズし、該SNPの他の対立遺伝子には特異的に結合しないオリゴヌクレオチドが提供される。ハイブリダイゼーションは、本明細書に記載された好適な選択的ハイブリダイゼーション条件下で判定することができる。
【０１５８】
核酸をスクリーニングする方法に、このようなオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【０１５９】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約10ヌクレオチド、より好ましくは、長さが少なくとも約15ヌクレオチド、より好ましくは、長さが少なくとも約20ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、長さが約100ヌクレオチドまで、より好ましくは、長さが約50ヌクレオチドまで、より好ましくは長さが約30ヌクレオチドまでであり得る。上記で用いられる境界値「約Xヌクレオチド」は、境界値「Xヌクレオチド」を含む。表1A/1B、表5および図9に掲げられたSNPの特定の対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、表2A、BおよびCに掲げられており、本明細書に記載されている。
【０１６０】
核酸が二本鎖DNAである場合、一般に、一本鎖DNAを生成させる変性がハイブリダイゼーションに先行する。ハイブリダイゼーションは、増幅、例えばPCR法の一部として、または増幅を含まないプロービング法の一部としてのものであり得る。方法の一例としては、PCRの組み合わせおよび低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションが考えられる。当業者に利用できる多くのものから選択されるスクリーニング法を用いて、成功したハイブリダイゼーションを同定し、ハイブリダイズした核酸を単離する。
【０１６１】
標的核酸(例えばDNA)に対するプローブの結合は、当業者が処理する多数の技法のいずれかを用いて測定することができる。例えばプローブは、放射性標識、蛍光標識または酵素標識することができる。プローブの標識化を含まない他の方法としては、制限断片長多型の試験、PCRを用いる増幅、RNアーゼ開裂および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングが挙げられる。プロービングには標準的なサザンブロット法を用いることができる。例えば、DNAを細胞から抽出し種々の制限酵素によって消化させることができる。次いで、制限断片をアガロースゲル上の電気泳動によって分離してから、変性し、ニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識化プローブを、該フィルター上でDNA断片にハイブリダイズさせ、結合を判定することができる。プロービング用のDNAは、細胞からのRNA調製物から調製することができる。
【０１６２】
プローブと試験核酸との間のハイブリダイゼーションおよび引き続いての誤対合の検出による方法を用いることができる。適切な条件(温度、pHなど)下、オリゴヌクレオチドプローブは、完全に相補的ではない配列にハイブリダイズする。これら2種の分子間の塩基対合の程度は、誤対合にも関わらずそれらがアニールする上で十分なものである。2種のアニールしている核酸分子間の誤対合の存在を検出するための種々の方法が当業界によく知られている。
【０１６３】
例えば、RNアーゼAは誤対合の部位で開裂する。関連プローブまたはプローブがアニールした試験核酸を電気泳動させ、完全長プローブ/試験ハイブリッドよりも小さな分子(すなわち、電気泳動移動性の高い分子)を探索することによって、開裂を検出することができる。
【０１６４】
ゲノムサンプルまたはその増幅領域であり得る試験サンプル中の核酸を配列決定して、多型対立遺伝子の同一性を同定または決定することができる。したがって、試験核酸中のSNPの対立遺伝子を、本明細書に記載されたSNPの感度対立遺伝子と比較して、試験核酸が疾患に関連した1つまたは複数の対立遺伝子を含有しているかどうかを判定することができる。
【０１６５】
配列決定においては一般に、標的配列に相補的なプライマーは、それらが該多型から好適な距離(例えば50〜400ヌクレオチド)にあるように設計される。次いで、慣例的な技法を用いて配列決定を実施する。例えば、好適なTm値を有し二次的構造を有さないか、または非標的配列にはハイブリダイズしない、適切なウィンドー内の配列を選択することを目指すソフトウェアを用いて、プライマーを設計することができる。
【０１６６】
増幅産物の配列決定は、イソプロパノールによる沈降、再懸濁化およびTaqFS+Dye停止剤配列決定キットを用いる配列決定を含み得る。伸長産物はABI 377 DNAシークエンサー上で電気泳動させ、Sequence Navigatorソフトウェアを用いてデータ解析することができる。
【０１６７】
遺伝子型分析はマイクロアレイ分析によって実施することができる。任意の好適なマイクロアレイ技法が使用できる。MG 1.0ソフトウェアを含む、Tejedorら、2005年(Clinical Chemistry 51:1137〜1144頁)に報告された方法論、および2006年1月12日出願の国際特許出願PCT/IB2006/00796号(その内容は、参照として本明細書に援用されている)における方法論を用いることができる。この技法では、SNPをスクリーンするために、低密度DNAアレイおよび対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションが用いられる。したがって、一態様において、骨チップマイクロアレイおよびマイクロアレイ法ならびに本明細書に記載された本発明の技法を用いて、本明細書に記載された情報的SNPの遺伝子型を判定することができる。
【０１６８】
一態様において本発明は、本明細書に記載された当該方法における使用に適合させたマイクロアレイに関する。
【０１６９】
本方法は、対象における骨折または椎骨骨折またはWSH骨折などの所与の骨粗しょう症表現型の確率を診断または予測するために、または対象における骨粗しょう症の定量的特性(LSBMDまたはFNBMD)を推定するために用いることができる。
【０１７０】
対象が、LSBMDおよび/またはFNBMDの低い推定値、または骨折および/または椎骨骨折および/またはWSH骨折発現の予測を得たら、その対象にとって最も適切な提案および/または治療を選択することができる。この方法で、本発明は、患者に対する療法のより良い標的化が可能になる。
【０１７１】
包括的な骨粗しょう症治療プログラムは、適切な栄養、運動、および骨折をもたらし得る転倒を防止するための安全性の問題を含む。さらに、骨の損失を緩徐化する、または停止させるための、骨密度を増加させるための、および骨折の危険性を減少させるための治療薬がある。現在、骨粗しょう症の治療薬としては、アレンドロネート、ラロキシフェン、リセドロネート、およびイバンドロネートが挙げられ、これらは閉経後の骨粗しょう症の予防用および治療用に、米国食品医薬品局(FDA)によって認可されている。テリパラチドは、閉経後の女性および骨折の危険性の高い男性における疾患の治療用に認可されている。エストロゲン/ホルモン療法(ET/HT)は閉経後の骨粗しょう症の予防用に認可されており、カルシトニンは、治療用に認可されている。なお、アレンドロネートは、男性における骨粗しょう症の治療用に認可されており、アレンドロネートとリセドロネートは双方とも、糖質コルチコイドに誘導された骨粗しょう症に罹っている男性および女性による使用に関して認可されている。
【０１７２】
したがってさらなる態様において、本発明は、対象において骨粗しょう症の好適な治療またはその予防を選択する方法を提供し、該方法は、
(a)本明細書に記載された方法によって、対象における骨粗しょう症の表現型(骨折または椎骨骨折またはWSH骨折)を予測するステップ、および/または対象における骨粗しょう症の定量的特性(LSBMDおよび/またはFNBMD)を推定するステップ、ならびに
(b)判定された表現型または特性にとって好適な治療を選択するステップ
を含む。
【０１７３】
次いで、選択された治療を該対象に施すことができる。したがって、本発明はまた、
(a)本明細書に記載された方法によって、対象における骨粗しょう症の表現型を予測するステップ(骨折または椎骨骨折またはWSH骨折、例えば骨折危険性を判定するステップ)、および/または対象における骨粗しょう症の定量的特性(LSBMDおよび/またはFNBMD)を推定するステップ、ならびに
(b)判定された表現型および/または特性にとって好適な治療によって対象を治療するステップ
を含む、対象において骨粗しょう症を治療する方法に関する。
【０１７４】
例えば、骨折および/または椎骨骨折および/またはWSH骨折の発現期を予測して、加齢によるLSBMDおよび/またはFNBMDの低値を推定するために、本発明を用いることができる。
【０１７５】
ある個体が、骨折、特にWSH骨折を発現させる有意な危険性および有意に低いBMDにあると予測される場合、その個体はより積極的な治療のために選択され得る。
【０１７６】
本方法を実施するための手段はキットの形態で提供できる。したがって、一態様において、本発明はさらに、本明細書に記載された方法における使用に好適な診断キットに関する。キットは一般に、
(i)選択された(SNP)変数の結果を判定するための手段;ならびに
(ii)骨折および/または椎骨骨折および/またはWSH骨折の危険性を判定し、LSBMDおよびFNBMDならびに該結果に基づいた可能な疾患過程を推定するための説明書
を含む。
【０１７７】
手段(i)は、判定される1つまたは複数のSNP変数の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブを含む。例えば手段(i)は、図2A、BまたはCに掲げられた1つまたは複数のプローブ対またはプローブ組を含み得る。一例において、該キットは、図2Aまたは2Cにおける全てのプローブ組を含み得る。
【０１７８】
手段(i)は、本明細書に記載された好適なマイクロアレイを含み得る。手段(i)は、判定する1つまたは複数のSNP変数の配列決定に好適な1つまたは複数の配列決定用プライマー対を含み得る。
【０１７９】
説明書(ii)は一般に、骨折および/または椎骨骨折および/またはWSH骨折の予測ならびにLSBMDおよび/またはFNBMDの推定のために、手段(i)を用いて判定された結果を用いるための説明書を含む。該説明書は、特定の疾患過程が生じる危険性を示すチャートを含み得る。
【０１８０】
いくつかの場合、キットは本明細書に記載されたコンピュータプログラムを含み得る。
【０１８１】
キットは、当該方法における使用に好適な他の成分を含み得る。例えばキットは、本明細書に記載されたような、判定されるSNPを含有する標的DNA領域の増幅に好適なプライマーを含み得る。キットはまた、好適な標識手段および検出手段、制御物質および/または緩衝剤などの他の試薬、ヌクレオチドまたはポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、トランスフェラーゼなどの酵素も含み得る。
【０１８２】
オリゴヌクレオチドプローブおよび/または増幅プライマー対などの、本発明による核酸を、キットの一部として提供することができる。該キットは、例えば、PCRおよび/または試験サンプル中の対象となっている核酸の存在を判定するための方法における核酸の使用のための説明書を含み得る。核酸がPCRに使用されることが意図されているキットは、ポリメラーゼ、ヌクレオシド、緩衝液など、該反応に必要な1つまたは複数の他の試薬を含み得る。核酸は標識され得る。
【０１８３】
対象となっている核酸の存在または非存在の判定に用いられるキットは、試験サンプル自体を提供するための手段、例えば口腔から細胞を取り出すためのスワブまたは血液サンプルを取り出すためのシリンジ(このような成分は一般に滅菌されている)などの該方法を実施するための1つまたは複数の製品および/または試薬を含み得る。
【０１８４】
さらなる態様において、本発明はまた、同時にかつ臨床的目的で、骨粗しょう症関連の遺伝子変異に関して、個体の信頼できる遺伝子型判定を可能にするDNAチップまたはマイクロアレイならびにそれらを使用する方法にも関する。
【０１８５】
したがって一態様において、本発明は、臨床的使用にとって十分に高感度で、特異的で再現性のある、個体における骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定の方法をさらに提供する。本発明者は、該方法に使用するための特別に設計されたプローブによる低密度DNAマイクロアレイ、ならびに該アレイによって生じたデータを解釈し処理するための計算方法およびアルゴリズムを開発した。
【０１８６】
一態様において、本発明は、個体における骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定のためのin vitro方法に関する。該方法により、対象の1つまたは複数の遺伝子に存在する複数のヒト遺伝子変異の同時的遺伝子型判定が可能になる。本発明の方法により、挿入、重複および欠失などの核酸変化ならびに所与の遺伝子変異に関する対象の遺伝子型の判定が可能になる。
【０１８７】
遺伝子変異または遺伝子変異体とは、変異、多型または対立遺伝子変異を言う。変異または遺伝子変異は、集団内の個体の中に、および種内の集団の中に見られる。
【０１８８】
骨粗しょう症関連遺伝子変異とは、統計的に有意な方法で骨粗しょう症に関連しており、個体における療法への応答性の診断、予後または予測における補助として使用できる遺伝子変異を称し得る。
【０１８９】
多型性とは、それぞれの可能な配列が集団の1%以上の比率で存在する、核酸のヌクレオチド配列における変異を言い、前記変異がただ1つのヌクレオチド(A、C、TまたはG)に生じる特定の場合、それは一塩基多型(SNP)と称される。
【０１９０】
遺伝子変異とは、それぞれの可能な配列が集団の1%未満に存在する、核酸内のヌクレオチド配列における変異を言う。
【０１９１】
対立遺伝子変異体または対立遺伝子とは、同一集団における同一の遺伝子座に現れる多型を言う。
【０１９２】
したがって、遺伝子変異は、1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含み得る。一態様において、当該方法により遺伝子型判定される遺伝子変異はSNPを含む。
【０１９３】
所与の遺伝子は、1つまたは複数の遺伝子変異を含み得る。したがって、当該方法は、1つまたは複数の遺伝子における1つまたは複数の遺伝子変異の遺伝子型判定に使用することができる。一般に個体はヒトである。
【０１９４】
一般に、所与の遺伝子変異に関し、3つの可能な遺伝子型がある:
AA  個体は遺伝子変異Aに対してホモ接合性である(例えば、野生型対立遺伝子に対してホモ接合性)
BB  個体は遺伝子変異Bに対してホモ接合性である(例えば、変異対立遺伝子に対してホモ接合性)
AB  個体は遺伝子変異AおよびBに対してヘテロ接合性である(例えば、1つは野生型で1つは変異対立遺伝子)
【０１９５】
当該方法によって分析されるSNPなどの遺伝子変異は、骨粗しょう症に関連している。当該方法によって評価できる、骨粗しょう症に関連した遺伝子変異の例としては、表1A/1B(図1)における変異が挙げられる。
【０１９６】
表1Aに掲げられた全ての遺伝子の配列は知られており、以下のウェブサイトで認識される:GeneBank(NCBI)、GeneCard (Weizmann Institute of Science) and Snpper.chip.org (Innate Immunity PGA)。表1Bにおける各SNPに関するRefSNPコード(rs#)は、バイオテクノロジー情報国立センター(NCBI)によって管理されている一塩基多型データベース(dbSNP)(2007年7月6日現在、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp)から採用されている。
【０１９７】
上記の遺伝子変異の1つまたは複数の臨床的遺伝子型判定を可能にすることにより、当該方法は、例えば対象における骨粗しょう症に対する感受性または骨粗しょう症の存在の診断に用いられる。当該遺伝子型判定法はまた、本明細書に記載された骨粗しょう症表現型の予測にも有用である。
【０１９８】
当該遺伝子型判定法において、少なくとも1つの骨粗しょう症関連遺伝子変異、例えばSNPが分析される。当該方法により、個体における複数の変異を同時に遺伝子型判定することが可能になり、典型的には、複数の変異、一般に少なくとも10、12、14、16、18または20の骨粗しょう症関連遺伝子変異が分析される。例えば、少なくとも25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105または110の変異、または250、350または450の変異など、150、200、300、400、500、または600までの変異を試験することができる。
【０１９９】
したがって、該遺伝子型判定法は、本明細書に記載された表1A/1Bにおける変異の全てまたは選択されたものに関して、個体の遺伝子型判定に用いることができる。例えば、表1A/1Bの少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110または全てを遺伝子型判定することができる。検出される変異はさらに、他の骨粗しょう症関連遺伝子変異を含み得る。
【０２００】
本発明はまた、骨粗しょう症関連遺伝子変異に加えて、他の遺伝子変異が評価される方法も包含する。
【０２０１】
当該方法により、試験される少なくとも1つの遺伝子変異を含む核酸(標的DNA)を含有するサンプルが提供される。好適なサンプルおよび該サンプルを得るための方法は、予測方法に関連して本明細書に記載されている。
【０２０２】
説明したように、同定される遺伝子変異を含有するDNA領域(標的DNA領域)は、同定される遺伝子変異を含有する増幅産物を得るために、増幅反応に供することができる。増幅には、任意の好適な技法または方法を用いることができる。一般に該技法により、同定される遺伝子変異を含有する全てのDNA配列の(同時の)増幅が可能になる。言い換えれば、複数の遺伝子変異が分析される場合、対応する標的DNA領域(該変異を含む)の全てを同時に増幅することが好ましい。単一ステップ(またはできるだけ少ないステップ)で増幅を実施することにより、該方法が簡便化される。
【０２０３】
例えば、同定される遺伝子変異を含有する標的領域を増幅することのできる適切なオリゴヌクレオチドPCRプライマー対を用いて、多重PCRを実施することができる。標的DNA領域の特異的増幅を可能にする任意の好適なプライマー対が使用できる。一態様において、該プライマーは、可能な最少のPCR反応数での増幅を可能にする。したがって、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対および適切な条件を用いることにより、最少の反応数での遺伝子型判定(例えばDNAチップ)分析のために、遺伝子変異の遺伝子型判定に必要な全ての標的DNA領域を増幅することができる。表1A/1Bにおける骨粗しょう症関連遺伝子変異を含む標的DNA領域の増幅に好適なPCRプライマーは、表3A、3Bおよび3Cに掲げられている。当該方法は、これらのプライマーの1つまたは複数、または掲げられたプライマー対の1つまたは複数を含み得る。例えば当該方法は、上記のとおり選択された表1A/1Bの変異の遺伝子型判定に用いることができる。したがって、表3A、3Bおよび3Cにおける対応するプライマーを使用のために選択することができる。
【０２０４】
一例において、該増幅産物は、増幅反応中に検出可能な標識により標識化することができる。その目的は、分析中の遺伝子変異を含有する標的DNAの断片と固体支持体上に固定されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを、後に検出できるようにすることである。プローブに対する標識化された標的DNAのハイブリダイゼーションの程度が大きいほど、そのプローブ位置における検出可能な標識の強度は大きい。
【０２０５】
該増幅産物は慣例的な方法によって標識化することができる。例えば、標識ヌクレオチドを増幅反応中に組み込むか、標識プライマーを増幅に使用することができる。
【０２０６】
標識化は、例えば、蛍光マーカーまたは放射性マーカーまたは当業者に知られた他の任意のマーカーを用いて、直接的であり得る。使用できる蛍光体の例としては、例えば、Cy3またはCy5が挙げられる。あるいは、サンプルの標識化のために、酵素、例えば、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを使用することができる。使用できる放射性同位体の例としては、例えば、33P、125I、または当業者に知られた他の任意のマーカーが挙げられる。一例において、増幅産物の標識化は、1つまたは複数の蛍光体によって直接または間接に標識化されたヌクレオチドを用いて実施される。他の例において、増幅産物の標識化は、1つまたは複数の蛍光体によって直接または間接に標識化されたプライマーを用いて実施される。
【０２０７】
標識化はまた、例えば、化学的または酵素的方法を用いて、間接的であり得る。例えば、増幅産物に、特異的結合対のメンバーの1つ、例えば蛍光マーカーに結合したアビジンまたはストレプトアビジンを組み込むことができ、それがハイブリダイズするプローブを、特異的結合対の他のメンバー、例えばビオチン(指示剤)に結合させることができ、プローブ/標的結合シグナルを蛍光定量法によって測定することが可能になる。別の例において、増幅産物に、特異的結合対のメンバーの1つ、例えば酵素(マーカー)に結合した抗ジオキシゲニン抗体を組み込むことができ、それがハイブリダイズするプローブを、特異的結合対の他のメンバー、例えば、ジオキシゲニン(指示剤)に結合させることができる。プローブへの増幅産物のハイブリダイゼーションの際、該酵素基質は発光産物または蛍光産物へと変換され、シグナルは、例えば、化学発光法または蛍光定量法によって読み取ることができる。
【０２０８】
試験される遺伝子変異を含む核酸、例えば(任意に標識化した)増幅産物は、さらに断片化反応を受けることができ、それによって、同定または分析される遺伝子変異を含む、または含有するいくつかの断片化産物を得ることができる。一般に、断片化により、ハイブリダイゼーション反応の効率が増加する。断片化は、当業界に知られた任意の好適な方法、例えば、該核酸、例えば該増幅産物を、DNアーゼなどの好適な酵素と接触させることにより、実施することができる。
【０２０９】
該核酸が、例えば、増幅反応中に、予め標識化されていない場合、(また、一般に、固体支持体上でハイブリダイゼーション後の増幅または結合が実施されない場合)、検出可能な標識による標識化は、断片化産物を標識化することにより、ハイブリダイゼーション前に実施することができる。好適な標識技法は当業界に知られており、本明細書に記載されているように、直接的または間接的であり得る。直接的標識化は、例えば、蛍光体、酵素または放射性同位体の使用を含み得る。間接的標識化は、例えば、蛍光体、酵素などを組み込んだ、例えば特異的結合対の使用を含み得る。例えば、増幅産物が増幅反応中に標識化されなかった場合、該断片化産物が、1種または種々のマーカー、例えば、1種または種々の蛍光体による直接的または間接的標識化を受けることができるが、当業者により他の公知のマーカーを用いることもできる。
【０２１０】
本方法により、核酸、例えば、検出される遺伝子変異を含む増幅産物または断片化産物(標的DNA)を、好適な条件下、ハイブリダイゼーションにより対応する遺伝子変異を検出することのできるオリゴヌクレオチドプローブに接触させる。
【０２１１】
一般に、該ハイブリダイゼーション条件により、プローブと対応する標的核酸との間に特異的ハイブリダイゼーションが可能になり、特定のプローブ/標的ハイブリダイゼーション複合体が形成される一方、該DNAに対する1つまたは複数の誤対合を行うプローブ間のハイブリダイゼーションは最少化される。このような条件は、例えば、ハイブリダイゼーションの時間および/または温度、および/またはハイブリダイゼーション後に行われるアレイ洗浄ステップの回数およびストリンジェンシーを変えることによって経験的に決定することができ、また、非特異的なプローブ-DNA相互作用が排除されるように設計される。該方法において、固体の支持体または表面上に沈着させたプローブが提供される。該プローブは、予め決められたパターンに従って固体支持体上の位置に沈着させ、「DNAチップ」を形成する。該チップは、例えば、プローブの設計、検出される各遺伝子変異に対して提供されるプローブの数、および支持体上のプローブの分布に関して、本方法に使用されるために多数の要件に適合させる必要があることが分かった。これらは詳細に本明細書に記載されている。本発明者らは、当該方法に使用するための好適な遺伝子型判定用チップを開発したが、一態様により、本発明は、本明細書に記載された固体支持体上に沈着させた、または固定された複数のプローブを含むDNAチップまたは(マイクロ)アレイを提供する。
【０２１２】
一般に、該固体支持体または固体相は、当該方法において試験される各遺伝子変異の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブを含む。チップを用いて試験される遺伝子変異の数およびタイプは、本明細書に記載されたとおり選択することができる。
【０２１３】
一般に、選択されたハイブリダイゼーション条件下、遺伝子変異A(例えば、野生型または通常の対立遺伝子)に特異的にハイブリダイズすることのできる少なくとも1つのプローブ  (プローブ1)および遺伝子変異B(例えば、変異対立遺伝子)に特異的にハイブリダイズすることのできる1つのプローブ(プローブ2)が存在する。これらのプローブはプローブ対を形成する。プローブ1は遺伝子変異Aの検出用であり、プローブ2は、遺伝子変異Bの検出用である。一般に、該プローブは、AとB(例えば、野生型と変異対立遺伝子)との間の識別に用いることができる。
【０２１４】
該プローブは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを調べることができる。一般に、プローブ1およびプローブ2は、同一の核酸鎖を調べる(例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖)が、いくつかの場合は、該プローブは異なる鎖を調べることができる。一態様において、  プローブ1およびプローブ2は該遺伝子変異の部位以外は同一の配列を有する。
【０２１５】
一例において、プローブ対におけるプローブは、同一の長さを有する。遺伝子変異の分析に、2つ以上のプローブ対が提供されるいくつかの態様において、該プローブは全て同一の長さを有し得る。
【０２１６】
各遺伝子変異の検出のために、1つ超のプローブ対が提供されることが好ましい。したがって、遺伝子変異1つ当たり、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10またはそれ以上のプローブ対を提供することができる。一態様において、(少なくとも)2つのプローブ対が提供される。その目的は、当該方法における偽陽性および偽陰性の比率を低下させることである。
【０２１７】
例えば、所与の遺伝子変異に関して、
遺伝子変異A(例えば通常の対立遺伝子)にハイブリダイズすることのできるプローブ1
遺伝子変異B(例えば変異対立遺伝子)にハイブリダイズすることのできるプローブ2
遺伝子変異A(例えば通常の対立遺伝子)にハイブリダイズすることのできるプローブ3
遺伝子変異B(例えば変異対立遺伝子)にハイブリダイズすることのできるプローブ4
が存在し得る。
【０２１８】
該プローブは、同一の鎖または異なる鎖を調べることができる。したがって一実施形態において、プローブ3とプローブ4は、それぞれプローブ1とプローブ2に相補的であり、相補鎖を調べるために設計される。一態様において、各遺伝子変異の検出用に提供されるプローブは、双方の鎖を調べることが好ましい。
【０２１９】
上記のような遺伝子変異を分析するために、2つ超のプローブ対を提供することができる。例えば、遺伝子変異が同一鎖における4つの塩基のいずれか1つとして存在する場合(例えば、3つの変異可能性がある)、各可能性を検出するために、少なくとも1つのプローブ対が提供できる。各可能性に関して、少なくとも2つのプローブ対が提供されることが好ましい。
【０２２０】
したがって、例えば、SNP G2677T/A/Cに関して、G2677Tの検出用に少なくとも1つのプローブ対、G2677/Aの検出用に1対、およびG2677Cの検出用に1対を提供することができる。これらの置換物のそれぞれに関して、少なくとも2つのプローブ対が提供されることが好ましい。
【０２２１】
DNAチップの使用に好適なオリゴヌクレオチドプローブの設計に関して、多数の方法が当業界に知られている。
【０２２２】
「標準的タイリング」法を用いることができる。この方法では、一般に4つの可能なヌクレオチド、A、C、GおよびTを調べる中央位置以外は参照配列に完全に相補的な4つのオリゴヌクレオチドが設計される。この方法を示す一例は、HIV-1の遺伝子型判定のためのDNAチップ(Affymetrix)である。
【０２２３】
「代替タイリング」においては、第5のものが  該配列における可能な欠失を調べるように、5つのオリゴヌクレオチドが設計される。この方法の一例は、p53における変異を検出するDNAチップ(Affymetrix)である。
【０２２４】
「ブロックタイリング」では、4つのオリゴヌクレオチドが通常の配列に完全に相補的であり、他の4つが変異配列に完全に相補的であるように設計される。変化するヌクレオチドは中央位置に置かれるが、4つの塩基(A、C、TまたはG)の1つの誤対合は、識別が望まれるヌクレオチド位置の2ヌクレオチド前か後に置かれる。この方法の一例は、チトクロームp450における変異を検出するためのDNAチップ(RocheおよびAffymetrix)である。
【０２２５】
さらなる例は、「代替ブロックタイリング」であり、ここでは、ハイブリッドの特異性を増加させるために、1つの位置のみならず、-4、-1、0、+1および+4の位置における「誤対合」が用いられ、中央位置または0において生じた変化を同定する。一例は、1,500のSNPを検出するDNAチップ(Affymetrix)である。
【０２２６】
本発明に関するプローブを設計するために、これらの方法の1つまたは複数を用いることができる。標準的タイリング、特に、2対のプローブ、例えば、上記の2対の相補的プローブを用いることが好ましい。したがって、該オリゴヌクレオチド配列は、変異ヌクレオチドにフランキングしている領域における標的DNAまたは配列に相補的であることが好ましい。しかし、いくつかの場合、上記のとおり、1つまたは複数の誤対合が導入されてもよい。
【０２２７】
本発明に用いるオリゴヌクレオチドプローブは一般に、該オリゴヌクレオチドの中央に調べるべき塩基(遺伝子変異の部位)を提示する。これは特に、差次的ハイブリダイゼーション法が用いられる場合にそうである。一般にこれによって、対合プローブと誤対合プローブとの間の最も良好な識別が可能になるからである。これらの方法では一般に、ハイブリダイゼーション後のオンチップ増幅なしで、特異的に検出可能なハイブリダイゼーション複合体の形成がある。例えば、正確な(単一塩基)変異では、通常と変異の対立遺伝子間で異なる塩基が一般に、プローブの中央位置に置かれる。挿入、欠失および重複の場合は、通常と変異の配列間で異なる第1のヌクレオチドが中央位置に置かれる。プローブの中央に変異を置くことで、特異性が最大化されると考えられる。
【０２２８】
ハイブリダイゼーション後のオンチップ増幅(例えば、ライゲーションまたはプライマー伸長法)が用いられる場合、オリゴヌクレオチドプローブは一般に、該プローブの3’端に変異塩基を提示する。OLA方法論が用いられる場合、プローブ-標的複合体にハイブリダイズしてライゲーションを可能にするオリゴヌクレオチド(直接または間接に標識化)もまた設計される。
【０２２９】
一般に、本発明に用いられるプローブは、17から27のヌクレオチド、例えば、19、21、23、または25のヌクレオチド、または18、20、22、24または26のヌクレオチドを含むか、いくつかの実施形態においては、それらからなる。
【０２３０】
遺伝子変異の検出用に提供される個々のプローブは、選択されたハイブリダイゼーション条件下、通常対立遺伝子と変異対立遺伝子それぞれに特異的にハイブリダイズできることが好ましい。例えば、プローブ/標的複合体の融解温度は、75℃から85℃であり得、ハイブリダイゼーションは1時間の間であり得るが、それより高いおよび低い温度、またより長いまたは短いハイブリダイゼーションが十分な場合もあり得る。
【０２３１】
各遺伝子変異(上記)の(好適な)検出のために提供されるプローブは一般に、上記の所与のハイブリダイゼーション条件下、遺伝子変異AとB(例えば通常対立遺伝子と変異対立遺伝子)との間を識別することができる。該プローブの識別能力は実質的に100%であることが好ましい。識別能力が100%でない場合、該プローブを再設計することが好ましい。プローブ/標的複合体の融解温度は、75℃から85℃であることが好ましい。識別能力を試験する方法は、本明細書に記載されている。
【０２３２】
一実施例において、遺伝子変異の検出用に提供されるプローブは、双方の鎖を調べ、19〜27の範囲のヌクレオチドの長さを有する。該プローブは、100%の識別能力を有し、プローブ/標的複合体の融解温度は75〜85℃であることが好ましい。
【０２３３】
一般に、当該方法に用いるプローブを得るために、多数のプローブが設計され、例えば、ハイブリダイゼーション特異性および遺伝子変異(例えば、通常対立遺伝子と変異対立遺伝子)間を識別する能力に関して実験的に試験される。オリゴヌクレオチドプローブ配列候補は、上記のとおり設計することができる。これらは、例えば、長さ、鎖特異性、遺伝子変異の位置および標的DNAにおける遺伝子変異にフランキングしている配列に対する相補性の程度において変わり得る。プローブ対を設計したら、これらを、ハイブリダイゼーション特異性および識別能力に関して試験することができる。遺伝子変異AとB(例えば、通常対立遺伝子と変異対立遺伝子)との間を識別する特異的プローブの能力は、ハイブリダイゼーション条件、該変異にフランキングしている配列および該変異の領域における配列の二次構造に依存する。安定なハイブリダイゼーション条件を用いることによって、識別を最大化するための、鎖特異性および長さなどの適切なパラメーターを確立することができる。遺伝子変異は、試験したプローブの中央位置に保持されることが好ましい。
【０２３４】
プローブの識別能力を試験するための方法は、本明細書に記載されている。一般に、多数の候補プローブ対が提供され、下記の訓練方法に用いられる。一般に、該方法において、2対のプローブ(プローブ1と2、およびプローブ3と4)が試験される。例えば、双方の鎖(互いに相補的)を調べる2対のプローブを試験することができる。該プローブを用いて3つの遺伝子型判定群の間に100%の識別が得ることが可能でない場合、該プローブは一般に再設計される。訓練方法におけるハイブリダイゼーション条件は、一般に安定に維持される。一般に、プローブ/標的複合体の融解温度は75〜85℃である。例えば、双方の鎖(センスおよびアンチセンス)において、ある遺伝子変異(例えば通常対立遺伝子)および別の遺伝子変異(例えば変異対立遺伝子)を検出する25ヌクレオチドのプローブから出発し、一般に、平均8つのプローブを実験的に試験して、2つの確定対を同定することができる。
【０２３５】
好適なハイブリダイゼーション条件下、最高のハイブリダイゼーション特異性および遺伝子変異(例えば、通常対立遺伝子と変異対立遺伝子)間の識別能力を有するように、プローブが選択される。例えば、所与の遺伝子変異の検出用プローブ、例えば2対のプローブは一般に、実質的に100%の識別能力を有する。一般に、プローブ/標的複合体の融解温度は75〜85℃である。
【０２３６】
本明細書における方法を用いて、本発明者は、表1A/1Bにおける骨粗しょう症関連遺伝子変異の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブを開発した。これらのプローブは、表2A、2Bおよび2Cに示されている。該プローブは、検出される遺伝子変異によって、プローブ組で掲げられている。各組において、少なくとも2対のプローブが掲げられている。
【０２３７】
一態様において、本発明は、表2A、2Bおよび2Cに記載されている1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブ、プローブ対またはプローブ組のいずれか、ならびに遺伝子型判定、本発明の診断方法または治療方法におけるそれらの使用に関する。本発明はさらに、医療における、例えば、本明細書に記載された診断方法または治療方法における、表2A、2Bおよび2Cに記載されている1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブ、プローブ対またはプローブ組のいずれかに関する。本発明のチップは、本明細書に記載された1つまたは複数の掲げられたプローブ対またはプローブ組を含み得る。
【０２３８】
一般にプローブは、複製において支持体上に提供される。一般に、各プローブの少なくとも4、6、8、10、12、14、16、18または20の複製、特に、6、8または10の複製が提供される。したがって、例えば、各遺伝子変異を検出するために用いられる(少なくとも)4つのプローブに関して、該支持体(またはDNAチップ)は10の複製からなるか、またはそれらを含み得る(すなわち、40のプローブ)。あるいは、各遺伝子変異を検出するために用いられる(少なくとも)4つのプローブに関して、該支持体(またはDNAチップ)は8つの複製からなるか、またはそれらを含み得る(すなわち、32のプローブ)。またさらに、各遺伝子変異を検出するために用いられる(少なくとも)4つのプローブに関して、該支持体(またはDNAチップ)は6つの複製からなるか、またはそれらを含み得る(すなわち、24のプローブ)。プローブ複製を用いることにより、チップからのデータ解釈におけるひずみの最小化が助けられ、該方法の信頼性が改善される。
【０２３９】
一般に該支持体はまた、1つまたは複数の対照オリゴヌクレオチドプローブも含む。これらもまた、上記のとおり複製で提供される。したがって、該支持体(またはDNAチップ)は、ハイブリダイゼーション反応の陽性および/または陰性の対照として有用な、該支持体上に沈着させた1つまたは複数のオリゴヌクレオチドをさらに含む。ハイブリダイゼーション後の増幅またはライゲーション反応が該チップ上で行われる場合、これらの反応の1つまたは複数の陽性または陰性の対照もまた存在し得る。
【０２４０】
一般に、該チップまたはアレイは、陽性対照プローブ、例えば、標的ポリヌクレオチド分子内の配列に相補的であるか、またはハイブリダイズ可能なことが知られているプローブ、外部対照DNAにハイブリダイズすることが知られているプローブ、および陰性対照プローブ、例えば、標的ポリヌクレオチド分子内の配列に相補的でないか、またはハイブリダイズ可能でないことが知られているプローブを含む。該チップは、各標的に特異的な1つまたは複数の対照、例えば2つ、3つ、またはそれ以上の対照を有し得る。また、該アレイに関して、少なくとも1つの対照が存在し得る。
【０２４１】
陽性対照は、例えば、アレイの周囲に沿って、またはアレイにわたる斜め縞で合成することができる。各プローブに対する逆相補体は、該プローブの位置に隣接して合成することができ、陰性対照として役立つ。さらに他の例において、バックグラウンド(非特異的)ハイブリダイゼーションの測定を助けるために、他の生物種からの配列を陰性対照として用いることができる。
【０２４２】
上記のように、該支持体(またはDNAチップ)は、ハイブリダイゼーション反応の陽性対照および陰性対照として有用な、支持体上に沈着させたいくつかの(1つまたは複数の)オリゴヌクレオチドを含み得る。一般に、サブアレイのそれぞれは、典型的にはDNAチップを構成する、例えば16は、いくつかの外部ハイブリダイゼーション対照によりフランクされており、グリッド内の点をより容易に位置させることを可能にする参照点として役立つ。
【０２４３】
一例において、外部対照DNAのヌクレオチド配列は、以下(5’→3’):
CEH:GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGAGTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA(配列番号:669)
であり、その検出用オリゴヌクレオチドの配列は、以下:
ON1:CTTGACGACTCCTGAACGG(配列番号:670)
ON2:CTTGACGACACCTGAACGG(配列番号:671)
である。
【０２４４】
陽性対照プローブは一般に、全ての標的DNAサンプルに等しくハイブリダイズするように設計され、試験プローブへの標的DNA(サンプル)のハイブリダイゼーションを比較することのできる参照シグナル強度を提供する。陰性対照は、溶媒(DMSO)のみが支持体に適用された「ブランク」、または標的、例えば、ヒト、DNA(試験DNA)へのハイブリダイゼーションを示さないか、または最少のハイブリダイゼーションしか示さないように選択された対照オリゴヌクレオチドのいずれかを含む。ブランク、または陰性対照オリゴヌクレオチド特性のいずれかで検出されたいずれかのシグナルの強度は、サンプルDNAとアレイとの間の非特異的相互作用の指標であり、したがって、真のプローブ-サンプル相互作用からのシグナルを識別するバックグラウンドの目安である。
【０２４５】
該アレイ内の配列の数は、遺伝子変異の検出に好適な核酸の数がnである場合、陽性および陰性対照核酸の数が、典型的には0.01nから0.4nであるn’となるようにする。
【０２４６】
一般に、支持体またはチップは、骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定、特に、当該方法による遺伝子型判定に好適である。該チップは一般に、少なくとも1つ、しかし好ましくは、複数の骨粗しょう症関連遺伝子変異、典型的には、少なくとも10、12、14、16、18または20の変異の検出に好適なプローブを含む。例えば、少なくとも25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105または110の変異、または250、350、450までの変異など、150、200、300、400、500、または600までの変異を試験することができる。
【０２４７】
骨粗しょう症関連遺伝子変異は、表1A/1Bにおける変異のいずれか、または全てを含み得る。したがって、アレイまたはチップは、表1A/1Bにおける変異の全て、または本明細書に記載されたように表における変異の選択に関して、個体の遺伝子型判定に好適なプローブを含み得る。
【０２４８】
本発明によるDNAチップ(「骨チップ」)により、骨粗しょう症に関連した遺伝子変異の、同時的で、高感度で、特異的で再現性のある遺伝子型判定が可能になる。異なる変異の非限定例が、表1A/1Bに示されている。それでも、表に含まれる遺伝子変異の数は、他の遺伝子変異が引き続き骨粗しょう症に関連していると同定されるにつれて増加し得る。このように、該チップによって検出可能な遺伝子変異は、表1A/1Bまたは図5または図9に掲げられたもの、または当該診断方法および予測方法に関連して記載されたこれらの選択されたものを含み、または(本質的に)それからなり得る。該チップは、本明細書に記載されたこれらの遺伝子変異の検出に好適なプローブを含む。あるチップが表1A/1Bにおける遺伝子変異の検出用プローブを含む場合、そのチップは、その遺伝子変異の検出に好適な、表2A、BまたはCに掲げられた1つまたは複数のプローブ、例えば、その変異の検出用に表2A、BまたはCに掲げられたプローブ組を含む。一態様において、当該チップは、表2A、2Bまたは2Cにおけるプローブから選択された1つまたは複数のプローブを含む。
【０２４９】
該プローブは、検出される遺伝子変異によるプローブ組で掲げられている。各組において少なくとも2対のプローブが提供される。チップは、少なくとも1つのプローブ対、または少なくとも1つのプローブ組、または該プローブ組の選択されたもの、例えば、試験されている遺伝子変異によって、表2Aまたは2Cにおける少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110または112全ての組からの1つのプローブ対および1つのプローブ組を含み得る。チップは、表1A/1Bにおける変異、または具体的に掲げられたこれらの替わりに、またはこれらに加えて骨粗しょう症に関連した他の変異を検出するための他のプローブを含み得る。
【０２５０】
骨チップは、骨粗しょう症に関連しない遺伝子変異の検出用オリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得る。例えば、該チップは、骨関節炎または乾癬など、他の(関連)炎症性病態に関連したSNPなどの遺伝子変異の検出用プローブを含み得る。一般に骨粗しょう症において、骨粗しょう症に関連した遺伝子変異(例えば、表1A/1Bまたは図5または図9におけるもの)の検出に好適な核酸の数は、アレイ内の核酸の少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%またはそれ以上となる。
【０２５１】
一般に、該支持体またはチップは、300から40000、例えば、400から30000、または400から20000の核酸(プローブ)を有する。該チップは、1000から15000、または1000から10000、または1000から5000など、1000から20000のプローブを有し得る。好適なチップは、2000から20000、2000から10000、または2000から5000のプローブを有し得る。例えば、チップは、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、12000、14000、16000、18000または20000のプローブを有し得る。400、500、600、700、800、900または950のプローブなど、400から1000のプローブのより小さなチップもまた考えられる。
【０２５２】
一般に、本発明のアレイまたはチップは、結合(例えばハイブリダイゼーション)部位またはプローブの順序アレイを有する支持体または表面を含む。したがって、支持体上のプローブの配置は予め決められている。各プローブ(すなわち、各プローブの複製)は、各プローブの同一性(すなわち配列)が、アレイにおけるその位置から決定できるように、固体支持体上の既知の予め決められた位置にある。一般に該プローブは、予め決められたパターンに一様に分布している。
【０２５３】
支持体上に沈着させたプローブは、予め決められた配置を維持し、遺伝子変異によって分類されていないが、ランダムな分布を有することが好ましい。一般に、それらはまた、同一の遺伝子変異内に分類されていない。所望の場合、このランダムな分布は常に同じであり得る。したがって一般に、該プローブは、例えば、DNAチップを構成し得る2つの領域の間に一様に分布しているが、特性化される遺伝子変異によって分類されていないように、予め決められたパターンに従って(アレイ中で)固体支持体上に沈着させる。この方法においてプローブ複製をアレイにわたって分布させることにより、例えば、アレイにわたるバックグラウンドノイズの非一様分布から生じるシグナルおよびデータ解釈のひずみの減少または排除が助けられる。
【０２５４】
上記で説明したように、プローブをサブアレイにおける支持体上に配置することができる。
【０２５５】
複数のプローブが沈着させる支持体は、オリゴヌクレオチドが結合することのできる任意の固体支持体であり得る。実際、オリゴヌクレオチドを結合または固定させることができ、DNAチップの製造に使用し得る任意の支持体を本発明に用いることができる。例えば前記支持体は、非多孔性材料、例えば、ガラス、シリコーン、プラスチック、または膜またはフィルターなどの多孔性材料(例えば、ナイロン、ニトロセルロース)またはゲルの支持体であり得る。一実施形態において、前記支持体は、ガラススライドなどのガラス支持体である。
【０２５６】
マイクロアレイは一般に、所与のポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、次いで、このようなプローブを固体の支持体または表面に固定することによって調製される。プローブは、本明細書に記載されたとおり、設計され、試験され、選択され得る。一般にプローブはDNA配列を含み得る。いくつかの実施形態において、該プローブは、RNA配列、またはDNAおよびRNAのコポリマー配列を含み得る。該プローブのポリヌクレオチド配列はまた、DNA類縁体および/またはRNA類縁体、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列は、完全なゲノムDNAでもよく、またはその部分的な断片でもよい。プローブのポリヌクレオチド配列はまた、合成オリゴヌクレオチド配列などの合成ヌクレオチド配列であり得る。プローブ配列は、in vivoで酵素的に、in vitroで酵素的に(例えばPCRにより)、またはin vitroで非酵素的に合成することができる。
【０２５７】
マイクロアレイまたはチップは、多くの方法で作製することができる。どのように作製されても、マイクロアレイは一般に一定の特徴を共有する。該アレイは、再現性があり、所与のアレイの複数コピーの作製を可能にし、互いに容易に比較される。マイクロアレイは、結合(例えば、核酸ハイブリダイゼーション)下で安定な材料から作製することが好ましい。該マイクロアレイは、小型であること、例えば、0.5cm2から20cm2または0.5cm2から15cm2などの0.25cm2から25cm2または0.5cm2から20cm2の間、例えば、2、4、6または8cm2などの1cm2から15cm2または1cm2から10cm2であることが好ましい。
【０２５８】
プローブは、支持体の表面上にオリゴヌクレオチドを固定化するための慣例的な技法を用いて、当該支持体に結合させることができる。用いられる技法は、他の要因の中でも、使用される支持体の性質[多孔性(膜、マイクロ粒子など)または非多孔性(ガラス、プラスチック、シリコーンなど)]に依存する。一般に、非共有固定化法を用いることにより、または化学的過程による支持体へのプローブの共有結合に基づいた固定化法を用いることにより、該プローブを該支持体に固定化することができる。
【０２５９】
非多孔性支持体(例えば、ガラス、シリコーン、プラスチック)の調製は、一般に、反応性基(例えば、アミノ、アルデヒド)による予備処理、または特異的結合対(例えば、アビジン、ストレプトアビジン)のメンバーによる支持体表面の被覆を必要とする。同様に、一般に、該表面上へのプローブの特異的固定化を達成するために、チオール、アミノまたはビオチンなどの対応する基により、該プローブを予備活性化して固定させることが勧められる。
【０２６０】
支持体上へのプローブの固定化は、慣例的方法、例えば、支持体上でのプローブのin situ合成に基づいた技法(例えば、フォトリソグラフィー、直接的化学合成など)、または例えば、予備合成された対応プローブを配置するロボットアームに基づいた技法(例えば、接触なしのプリント、接触によるプリント)によって実施することができる。
【０２６１】
一実施形態において、支持体はガラススライドであり、この場合、該プローブは、確定された複製数(例えば、6、8または10)において、該オリゴヌクレオチドをグラススライド上に配置することにより、DNAチップの自動製造用装置(「マイクロアレイヤー」)を用いて、例えば、アミノシラン類によりコーティングされた予備処理済みガラススライド上にプリントされる。配置は、例えば、紫外線照射による架橋および加熱(80℃)により、適切な条件下、一般に40〜50%の間の相対湿度、および一般に20℃の温度で、配置過程の間、湿度を保持し、温度を制御しながら実施される。
【０２６２】
複製プローブは、領域または区域の中で一様に分布され(サブアレイ)、一般にこれがDNAチップを構成する。複製の数およびDNAチップにわたるそれらの一様な分布により、実験結果に影響を与え得る、プリント法から生じるばらつきが最小化される。同様に、陽性および陰性ハイブリダイゼーション対照(本明細書に記載されている)にプリントすることができる。各複製のハイブリダイゼーションシグナル、バックグラウンドノイズ、特異性、感度および再現性、ならびにプリント後の配置されたプローブ特徴の形態における変動によって生じる違いに関して、DNAチップの製造法の品質を制御するために、市販DNAを用いることができる。例えば、DNAチップのプリントの品質制御として、市販DNA(例えば、k562 DNA High Molecular Weight、Promega)によってハイブリダイゼーションを実施することができる。
【０２６３】
先ず第一に、プリントされた点の形態およびサイズが分析される。対照DNAによるハイブリダイゼーションにおいて、遺伝子型判定の信頼性を判定するための下記のパラメーターを、特に、シグナル強度とバックグラウンドノイズ、平均的特異性および感度との間の関連性、ならびに同一プローブの複製コピー間での再現性に付着させる。この方法により、判定される対照DNAの正確な遺伝子型が可能になる。上記のように、当該方法に従って、検出される遺伝子変異を含む核酸サンプル、例えば、増幅産物または断片化産物(標的DNA)を、標的DNAと対応するプローブとの間にハイブリダイゼーションを生じさせる条件下、本明細書に記載されたプローブアレイと接触させる。このように、標的核酸と対応するプローブとの間に、特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成される。
【０２６４】
例えば、断片化産物と、支持体上に配置された対応する遺伝子変異を検出することのできるプローブとのハイブリダイゼーションは、慣例的な方法およびデバイスを用いて実施することができる。一例において、ハイブリダイゼーションは、自動ハイブリダイゼーションステーションを用いて実施される。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、例えば断片化産物は、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下、プローブと接触させて置かれる。安定なハイブリダイゼーション条件を用いることにより、遺伝子変異AとBとの間、例えば、本明細書に記載された野生型配列と変異配列との間の識別を最大化するために、プローブの長さおよび配列を最適化することが可能になる。
【０２６５】
一例において、該方法は、差次的ハイブリダイゼーション、特にハイブリダイゼーションシグナルの増大に基づく。該方法は、標的DNAと対応プローブとの間の特異的ハイブリダイゼーション複合体の形成を含む。したがって、野生型配列を有する標的DNAは、野生型配列を検出するように設計されたプローブとハイブリダイズし、一方、変異配列を有する標的DNAは、変異配列を検出するように設計されたプローブとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション複合体は、本明細書に記載された手段により、検出可能に標識化される(例えば、標識がハイブリダイゼーションした時のみ検出可能であるように、標的DNAが直接標識されるか、または標的とプローブの双方が標識される)。予め決められたプローブ位置における検出可能な標識(存在する場合は)の強度を検出することにより、サンプル中の標的DNAの性質を判定することが可能である。この例において、該プローブ(対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、ASOとも称される)は、本明細書に記載されるように、中央位置に変異ヌクレオチドを有することが好ましい。
【０２６６】
別の例において、固体支持体(チップ)上のプローブに対する標的DNAのハイブリダイゼーションに引き続いて、例えば、プライマー伸長またはライゲーション、例えばオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ技法(OLA)(Eggerding FA、lovannisci DM、Brinson E.、Grossman P.、Winn-Deen E.S.、1995年、Human Mutation、5:153〜65頁)を用いて、オンチップ増幅が行われる。この場合、支持体上のプローブは、一般に、該プローブの3’端に変異ヌクレオチドを含む。
【０２６７】
標識化は、ハイブリダイゼーション後の増幅中実施することができる。標識化は、標識化増幅産物または断片化産物に関連して先に記述したものなどの慣例的方法を用い、例えば、蛍光体、酵素、放射性同位体などを用いた直接的標識化により、または、例えば、蛍光体、酵素などを組み込んだ特異的結合対を用いた間接的標識化によりなされる。
【０２６８】
ハイブリダイゼーション後の増幅は、例えば、「プライマー伸長」の方法論を用いて実施することができる。一般に、ハイブリダイゼーション後、支持体(例えば、ガラススライド)上でハイブリッドオリゴヌクレオチドの伸長反応を実施する。伸長は、直接的または間接的に標識化されたヌクレオチドによって実施でき、オリゴヌクレオチドの3’末端が該増幅産物と完全にハイブリダイズする時だけ生じる。
【０２６９】
プライマー伸長は、遺伝子型識別の公知の方法であり(Pastinen T、Raitio M、Lindroos K、Tainola P、Peltonen L、Syvanen AC、2000年、Genome Research 10:1031〜42頁)、多数の異なる仕方で実施することができる。一般に用いられるアプローチでは、標的配列にハイブリダイズするように、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの組が設計される。該プローブでは、各プローブに関して、所与の位置における可能な多型ヌクレオチドのうちの1つに相補的であるように設計されている該プローブの3’末端ヌクレオチドが互いに異なっている。
【０２７０】
該プローブの3’ヌクレオチドが試験下の配列に相補的であれば、塩基対の確認により、直接的または間接的に標識化されてあり得る追加ヌクレオチドの組込みにより、DNAポリメラーゼが該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることが可能になり、それによって、伸長したプローブと伸長しなかったプローブの引き続いての同定が可能になる。伸長に成功したプローブは、それらの3’端におけるSNPに相補的ヌクレオチドを運び、したがって、試験サンプルの遺伝子型の判定が可能になる。同様のアプローチ、例えば、増幅困難な変異系(ARMS)も開発されている。
【０２７１】
あるいは、例えばOLA方法論を用いて、ハイブリダイゼーション後のライゲーション反応を実施することができる。ハイブリダイゼーション後、標識オリゴヌクレオチドにより、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのライゲーション反応を固体支持体(例えばガラススライド)上で実施する。支持体上に配置されたプローブの3’末端が標的DNA(例えば増幅産物)と完全にハイブリダイズする時だけ、ライゲーションが生じる。
【０２７２】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)は、SNP識別のための別の方法である(Eggerding FA、lovannisci DM、Brinson E.、Grossman P.、Winn-Deen E.S.、1995年、Human Mutation 5:153〜65頁)。OLAでは、変異塩基を含む標的DNAの隣接セグメントにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ対が用いられる。該多型ヌクレオチドの5’側にハイブリダイズするように設計されたプローブは、標的対立遺伝子の1つに対して対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)である。このASOの3’端における最後の塩基は、標的DNA多型の部位に配置され;該ASOは一般に、ビオチン分子もまたその5’端に有し、ビオチンがストレプトアビジンによって高特異的相互作用を受けるため、これはオリゴヌクレオチドの再生に引き続き使用できる「フック」として働く。
【０２７３】
該対の3’側または右側のオリゴマーは共通オリゴマーである(該配列は、試験が望まれている2つ以上の異なる対立遺伝子で同一である)。この共通オリゴマーは標的DNA多型に隣接した不変部位に位置し、その3’端が蛍光標識される。
【０２７４】
該ASOが標的配列に完全に相補的である場合、該ASOはアニールされると完全にハイブリダイズし、その標的に対してフラットな状態になり、DNAリガーゼが共通オリゴマーに該ASOを共有結合させることを可能にする。ライゲーション反応の後、ビオチンフックがASOの除去に用いられ、例えば蛍光標識された共通オリゴマーもまた除去され、検出可能な蛍光が得られる。
【０２７５】
該ASOが標的配列に完全には対合しない場合、ハイブリダイゼーションは不完全であり、該オリゴマーの3’塩基は、標的DNAと塩基対にならず、したがってライゲーションが妨げられる。これらの状況下では、ASOの除去にビオチンフックが用いられる場合、共通オリゴマーは除去されず、したがって、除去された分子内に検出可能な標識、例えば蛍光が存在しない。
【０２７６】
単一塩基が異なる2つの既知の対立遺伝子間を識別するためには、3つのオリゴヌクレオチドが必要である:2つは、単一3’末端塩基が互いに異なる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)であり;第1のものは、第1の対立遺伝子に相補的であり、第2のものは、第2の対立遺伝子に相補的である。第3のオリゴヌクレオチドは、変異塩基に隣接した不変配列に相補的である。
【０２７７】
ハイブリダイゼーション(および、任意にハイブリダイゼーション後の増幅)が行われたら、各プローブ(対照プローブを含む)位置における検出可能標識の強度を測定することができる。シグナルの強度(生の強度値)は各プローブにおけるハイブリダイゼーションの目安である。
【０２７８】
各プローブ位置(各プローブ複製)における検出可能標識の強度は、任意の好適な手段を用いて測定することができる。選択される手段は、該標識の性質に依存する。一般に、適切なデバイス、例えばスキャナーがハイブリダイズしたものの画像を回収し、DNAチップを展開する。画像が捕捉され定量化される。
【０２７９】
一例において、例えば蛍光標識が用いられる場合、ハイブリダイゼーション後、(任意に、ハイブリダイゼーション後の増幅またはライゲーションの後)、ハイブリダイゼーションが生じた箇所の標識の強度を定量化するために、ハイブリダイズされ展開されたDNAチップをスキャナー内に置く。実際には任意のスキャナーが使用できるが、一実施形態において、蛍光共焦点スキャナーが使用される。この場合、該DNAチップを前記装置内に置き、ハイブリダイゼーションが生じた箇所のシグナル強度を定量化するために、レーザーによる励起によって蛍光体から放出されたシグナルが走査される。本発明により使用できるスキャナー非限定例としては、以下の会社から市販されているスキャナーが挙げられる:Axon、Agilent、Perkin Elmerなど。
【０２８０】
一般に、各プローブ位置(すなわち、各プローブの複製)における検出可能な標識の強度の測定では、バックグラウンドノイズを考慮に入れてそれを除去する。バックグラウンドノイズは、プローブアレイに対する非特異的結合によって生じ、該アレイに含まれる対照によって測定することができる。バックグラウンドシグナルの強度を測定したら、クリーンな強度値を得るために、これを、各プローブに関する生の強度値から差し引くことができる。一般に、個々の特徴の近傍で検出されるシグナル強度に基づいた局所バックグラウンドを、生のシグナル強度値から差し引く。このバックグラウンドは、各特徴の周囲の予め決められた領域(例えば、該プローブの位置の中心におかれたXμm2、Yμm2またはZμm2)におけるシグナル強度から測定される。
【０２８１】
バックグラウンドシグナルは一般に、「ブランク」対照(溶媒のみ)の局所シグナルから測定される。多くの例において、該デバイス、例えばシグナリング強度を測定するために用いられるスキャナーは、バックグラウンドシグナルを測定するための手段を提供する。
【０２８２】
したがって、例えば、該標識が蛍光標識である場合、各プローブ複製に関して絶対的蛍光値(生の強度値)を集めることができ、また、各プローブ位置におけるシグナル強度に関する「クリーン」な値を得るために、各プローブ複製に関連したバックグラウンドノイズもまた評価することができる。
【０２８３】
標的DNAが該チップにハイブリダイズし、該チップ上のプローブ複製の位置において、検出可能標識の強度(生の強度値)が測定されたら、該チップからの強度データを個体の遺伝子型に関連づけることのできる方法(モデル)を提供することが必要である。
【０２８４】
これは、好適なアルゴリズムを該強度データに適用することによって実施できることを、本発明者は見出した。本発明者によって開発されたアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアにより、臨床設定において使用可能な、十分な感度および再現性での遺伝子変異の分析が可能になる。該アルゴリズムでは、所与の遺伝子変異に関して、3つの遺伝子型、AA、ABおよびBBのそれぞれを特徴付ける3つの一次関数が用いられる。該方法は一般に、各プローブに関する平均強度値を算出するために、各プローブの全ての複製に関する強度値の照合を含む。場合によっては、複製のそれぞれに関する強度値を照合する前に、(クリーンな強度値を得るために)バックグラウンドノイズを考慮して、各複製に関する生の強度値を修正することができる。
【０２８５】
一般に、所与の遺伝子変異に関して、チップの分析および解釈には、以下のステップが含まれる:
(a)遺伝子変異の検出用に提供された少なくとも4つのプローブ(プローブ1、2、3および4)のそれぞれに関する各複製における検出可能標識の強度(生の強度値)を提供するステップであって、
プローブ1は遺伝子変異A(例えば通常の対立遺伝子)を検出し(遺伝子変異Aに特異的にハイブリダイズすることができ)、プローブ2は遺伝子変異B(例えば変異対立遺伝子)を検出し(遺伝子変異Bに特異的にハイブリダイズすることができ)、
プローブ3は遺伝子変異A(例えば通常の対立遺伝子)を検出し(遺伝子変異Aに特異的にハイブリダイズすることができ)、プローブ4は遺伝子変異B(例えば変異対立遺伝子)を検出し(遺伝子変異Bに特異的にハイブリダイズすることができ)、
プローブ1とプローブ2は第1のプローブ対を形成し、プローブ3とプローブ4は第2のプローブ対を形成するステップ;
(b)場合によっては、バックグラウンドノイズを考慮に入れて各複製に関する生の強度値を修正して、クリーンな強度値を得るステップ;
(c)各プローブの複製それぞれに関する(場合によってはクリーンな)強度値を照合して、各プローブに関する平均強度値を決定するステップ;
(d)
【数１】
2009542248.tif 000002
であり、
【数２】
2009542248.tif 000003
である、比率1および比率2を算出するステップ
(e)3つの可能な遺伝子型、AA、ABおよびBBのそれぞれを特徴付ける3つの一次関数のそれぞれに、比率1および比率2をインプットするステップであって、
関数1は、遺伝子型AAを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および比率2の一次結合からなり、
関数2は、遺伝子型ABを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および比率2の一次結合からなり、
関数3は、遺伝子型BBを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および比率2の一次結合からなり、
該一次関数は、変数の比率1および比率2に伴う係数によって形成されているステップ;
(f)前記3つの関数のうちでどれが最高値を有するかを判定するステップ;および
(g)それによって、遺伝子変異に関して、個体の遺伝子型を判定するステップ。
【０２８６】
したがって、その個体の遺伝子型に対応する一次関数は、最高の絶対値を有する。
【０２８７】
複製および複製から算出された平均値の使用は、本発明の信頼できる作動にとって重要であることを、本発明者は見出した。該関数の使用により、分析がスピードアップし、より良好な識別が可能になる。
【０２８８】
上記3つの遺伝子型間の識別は、(およそ)100%であることが好ましい。識別が100%未満の場合、プローブを再設計することが好ましい。
【０２８９】
各プローブ複製に関する生の強度値は、上記の方法によって判定することができる。したがって、プローブ配列および複製は、本明細書に記載されたとおりに選択することができる。一例において、1つの遺伝子変異当たり、4つのプローブが用いられ、1つのプローブ当たり、6つ、8つまたは10の複製が用いられる。
【０２９０】
一般に、各プローブ複製に関してクリーンな強度値を得るための生の強度値の修正には、生の値からバックグラウンドノイズを差し引くことが含まれる。バックグラウンドノイズは一般に、本明細書に記載された適切な制御を用いて測定される。
【０２９１】
一般に、平均強度値の算出は、極値または外れ値の排除を含む。したがって、プローブ複製のそれぞれからの(場合によってはクリーンな)強度値が照合される場合、外れ値を確認し、さらなる考察から排除することができる。一実施形態において、外れ値は、得られた値の10%と50%との間、例えば、15%、20%、25%、30%、35%、40%または45%を構成する。一実施形態において、40%の値が排除される。一実施形態において、1つのプローブ当たり、6つ、8つまたは10の複製を有する4つのプローブが用いられ、極値または外れ値は、得られた値の10%と50%との間を構成する。
【０２９２】
多数の好適な一次関数が当業界に知られている。これらの関数を、本発明の目的のための線形識別分析に用いることができる。
【０２９３】
一態様において、本発明は、上記(ステップeおよびf)で定義した3つの一次関数において比率1および比率2を用い、所与の遺伝子変異に関して遺伝子型を判定するための計算方法または計算的モデル(アルゴリズム)に関する。したがって一実施形態において、当該方法により、比率1および比率2のインプットからの遺伝子型(AA、ABまたはBB)の結果が得られる。該方法はまた、比率1および比率2の1つまたは双方の算出も含み得る(ステップd)。いくつかの実施形態において、当該方法は、各プローブに関する平均強度値の算出(ステップc)および/または各プローブ複製に関するクリーンな強度値の算出(ステップb)をさらに含む。したがって、該モデルへのインプットは、平均強度値、クリーンな複製強度値または生の複製強度値の1つまたは複数を含み得る。該方法はこれに、各プローブ複製に関する生の強度値を決定するステップを含む(ステップa)。該方法は上記ステップの1つまたは複数を含み得る。
【０２９４】
上記の方法を実施するために、遺伝子変異に関する遺伝子型が既に知られている対照個体からのデータを用いて、訓練課程において、一次関数に関する係数を先ず決定する必要がある。訓練の方法は当業界に知られている。このような方法において、一般に、その結果(当該の場合は遺伝子型)が既に知られているインプットデータ(当該の場合は一般に、比率1および比率2)が用いられる。3つの一次方程式において、係数をランダムに置換し、結果を算出する。その結果に基づいて、1つまたは複数の係数を変化させ、インプットデータを再び入れて、別の結果を得る。所望の結果を最適化する係数が得られるまでこの処理を続ける。次いで、該方法がデータの試験に適用される際(結果はまだ未知である)、これらの最適化された係数を一次関数に用いる。
【０２９５】
当該モデルを訓練するために、遺伝子型AA(例えば、ホモ接合性野生型)を有するn名の対照個体、遺伝子型AB(例えば、ヘテロ接合性)を有するn名の対照個体および遺伝子型BB(例えば、ホモ接合性変異体)を有するn名の対照個体に関して、比率1および比率2を得る。これらの比率は上記の方法を用いて得ることができる。これらの比率を上記のとおりインプットし、AA群、AB群およびBB群の間の識別を最大化する3つの一次関数が得られるまで、識別分析において該係数を変化させる。次いで、モデルが未知の試験サンプル(遺伝子型が予め決められていない)に用いられる際、これらの係数を3つの関数において用いる。
【０２９６】
したがって、一態様において、本発明は、当該遺伝子型判定法に用いるための一次関数を誘導する方法を提供する。該方法は一般に、遺伝子変異に関し、遺伝子型AA(例えば、ホモ接合性野生型)を有するn名の対照個体、遺伝子型AB(ヘテロ接合性)を有するn名の対照個体および遺伝子型BB(例えば、ホモ接合性変異体)を有するn名の対照個体に関して、上記の遺伝子型判定方法のステップを実施することを含む。プローブ複製のそれぞれに関して得られた強度値を記述されたとおり集め、アルゴリズムを適用する。
【０２９７】
遺伝子型判定方法に関して記述されたとおり、アルゴリズムの適用には、各プローブに関する平均強度値の算出が含まれ、該アルゴリズムでは、所与の遺伝子変異に関して、3つの可能な遺伝子型、AA、ABおよびBBのそれぞれを特徴付けることが意図された3つの一次関数が用いられる。識別分析において遺伝子型間の識別を最大化する関数が誘導されるまで、関数内に反復的に係数を挿入する。これにより、該方法またはアルゴリズムが操作的に用いられる際(すなわち、試験個体の遺伝子型を判定するために)、一次関数に使用される係数が提供される。
【０２９８】
強度データを分析するために3つの一次関数を用いるアルゴリズムまたは方法は上記のものであり得る。
【０２９９】
いくつかの場合、訓練方法により、フィードバック最適化が可能になる。したがって、試験個体に関して強度値および比率が得られ、これらが遺伝子型判定されたら、強度データ、例えば比率、および遺伝子型をインプットし、一次関数に関する係数を再び算出する。
【０３００】
一態様において、本発明は、訓練用の計算方法に関する。ある遺伝子変異に関し、遺伝子型AAを有するn名の個体、遺伝子型ABを有するn名の個体および遺伝子型BBを有するn名の個体のそれぞれに関して得られた比率1および比率2を用いることにより、当該遺伝子型判定方法に用いる一次関数を誘導するために、該方法を用いることができる。該比率は上記の方法により得ることができる。該方法は、以下のように、遺伝子変異に関し、3つの可能な遺伝子型AA、ABおよびBBのそれぞれを特徴付けることが意図された3つの一次関数(関数1、2および3)を用いるアルゴリズムの適用を一般に含む:
関数1が、遺伝子型AAを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および比率2の一次結合からなり、
関数2が、遺伝子型ABを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および比率2の一次結合からなり、
関数3が、遺伝子型BBを有する個体を特徴付ける一次関数であり、比率1および比率2の一次結合からなり、
該一次関数は、変数の比率1および比率2に伴う係数によって形成され、
該アルゴリズムが試験方法に用いられる際(すなわち、遺伝子型判定のための操作的使用において)、一次関数に使用できる係数を得るために、識別分析においてAA、ABおよびBBの3つの遺伝子型群間の識別を最大化する一次関数を誘導する。
【０３０１】
強度データを分析するために3つの一次関数を用いるアルゴリズムまたは方法は、上記のとおりであり得る。
【０３０２】
該計算的訓練方法は、該プローブのそれぞれに関して提供された平均強度値から比率1および比率2を算出するステップ、および/またはプローブ複製からの強度値を照合して、各プローブに関する平均強度値を決定するステップ、および/またはバックグラウンドノイズを考慮してプローブ複製に関する生の強度値を修正し、それによって該複製に関するクリーンな強度値を得るステップをさらに含み得る。
【０３０３】
いくつかの態様において、該計算方法はまた、記載されたフィードバック最適化ステップを可能にする。
【０３０４】
一般に訓練において、nは≧3、例えば、3、4、5、6、7、8、9または10である。一態様において、nは≧5である。いくつかの場合、nは、10から50またはそれ以上、例えば、15から40、または20または30など、25から35であり得る。
【０３０５】
訓練方法のためのプローブおよびプローブ複製は、本明細書に記載されたとおり選択される。一実施形態において、各遺伝子変異に関して、各プローブの6、8または10の複製を有する4つのプローブが用いられる。選択されると、モデルが操作的に使用される際、訓練に用いられるプローブも用いられる(未知の遺伝子型を判定するために)。プローブを変える場合、新たなプローブによる識別を最適化するために、一般にモデルを再訓練する必要がある。
【０３０６】
3つの遺伝子型群間の識別(訓練および操作的使用の双方で)は実質的に100%であることが好ましい。識別が100%でない場合は、プローブを再設計することが好ましい。
【０３０７】
上記のとおり、モデルが操作的に使用されている場合、フィードバック最適化を受けることもできる。その場合、該モデルは先ず、個体の遺伝子型(AA、ABまたはBB)を判定するために用いられる。次いで、その個体に関する比率1および比率2を該モデルにインプットし、3つの遺伝子型群間の識別を最適化するために、必要ならば一次関数における係数を変える。このやり方で、モデルが使用される際に集められたさらなるデータを用いて、該一次関数の識別能力を最適化することができる。
【０３０８】
分析モデルまたは分析方法の性能および信頼性を最適化するために、決定され最適化され得る多数のパラメーターがある。
(i)一態様において、個体に関して決定された比率1および比率2は、モデルの訓練に(すなわち、3つの一次関数を最適化するために)用いられる比率1および比率2の範囲内に入る。したがって、所望の場合は、これにより、個体の遺伝子型に関する二重試験が提供される。
(ii)一態様において、バックグラウンドノイズに関して、4nの複製(「n」は各プローブに関する複製の数、例えば6、8または10である)、例えば40の複製の平均蛍光強度は5を超える。
(iii)一態様において、同一プローブの複製に関する強度値(生の強度値またはクリーンな強度値)間の変動は、最小である。例えば、所与のプローブの複製に関する強度値間の変動係数は、0.25未満であることが好ましい。
(iv)一態様において、蛍光スキャナーが用いられる場合、バックグラウンドノイズの強度に対するチップ上の全てのプローブ複製に関する生の強度値の総計の比率は15を超える。
(v)一態様において、陰性対照に関して得られた生のシグナル強度値は、バックグラウンドノイズの強度値の≦3倍である。例えば、陰性対照は、DMSO「ブランク」および上記の非ハイブリダイズオリゴヌクレオチドを含み得る。バックグラウンドノイズは、プローブが配置されなかったアレイの領域から誘導されたシグナルであり、上記のとおり測定することができる。
【０３０９】
強度が蛍光標識の蛍光強度である場合、特に、強度が共焦点蛍光スキャナーによって測定される場合、(i)から(v)の1つまたは複数が適用されることが好ましい。
【０３１０】
モデルが合うことが確認されたら、上記の1つまたは複数によって、信頼性および再現性の提供が助けられる。(i)から(v)のいずれか1つまたは複数が、該モデルに関して真であり得る。該モデルは上記(i)に合うことが好ましい。一例において、(i)、(ii)および(iii)が真である。別の例においては、(iii)、(iv)、(v)が真である。上記の全てが該モデルに関して真であることが好ましい。これは、訓練と操作的使用の双方に適用される。
【０３１１】
上記のとおり、試験サンプルに関して得られた、実験的に誘導された比率を、既知の遺伝子型を有する個体から得られた(n個の)対照サンプルに関して以前得られた比率と比較することができ、ここでnは、上記のように、通常>5、または>10、または>20である。対照サンプルの分析から誘導された参照比率により、遺伝子型を試験サンプルに帰属させることができる。したがって、これが二重試験であり得る。
【０３１２】
一例において、本発明の分析方法または分析アルゴリズムは、以下の一連のステップを含む:
複製(6、8または10の複製)における4つのプローブ(2対のプローブ)を用いて、複製の照合した強度から、各プローブの平均強度を算出するステップ;2対のプローブに関して、(遺伝子変異AおよびBを検出するために)上記のとおり比率1と比率2を算出するステップ;(遺伝子変異に関して)遺伝子型AAを有する「n」名の対照患者、遺伝子型ABを有する「n」名の対照患者、遺伝子型BBを有する「n」名の対照患者(一実験において、「n」は5)に関して算出された比率1と比率2を用いる識別分析において誘導された3つの一次方程式で得られた比率1と比率2を置き換えるステップ;どの一次関数が最大絶対値を有するかに基づいて、遺伝子変異に関して(DNAチップに含まれる各遺伝子変異に関して)、患者の遺伝子型を判定するステップ。各遺伝子型を判定するために、該試験比率はまた、「n」名の対照患者の比率と比較することができる。
【０３１３】
上記の分析および解釈は、1つの遺伝子変異に関して記述されている。しかし、当然のことながら、当該チップは、同時に分析できる複数の遺伝子変異の検出用プローブを一般に含む。したがって、当該方法は、本明細書に記載された複数の遺伝子変異の並行させた分析を含む。
【０３１４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の計算方法を実施するためのプロセッサおよび該プロセッサを制御するための手段を含むコンピュータシステムに関する。
【０３１５】
本発明はさらに、コンピュータまたはコンピュータネットワークを操作する場合、該コンピュータまたはコンピュータネットワークに本発明の計算方法を実施させるコンピュータプログラムコードを含むコンピュータプログラムに関する。該コンピュータプログラムは、コンピュータ読取り可能な媒体に保存することができる。
【０３１６】
本明細書に記載されたプローブおよびチップに加えて、本発明者はまた、例えば多重PCRによって、表1A/1Bにおける骨粗しょう症関連ヒト遺伝子変異を含有する標的DNA領域を増幅することのできるオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、評価した。これらのプライマーは当該遺伝子型判定、予測方法および治療方法に用いられる核酸の調製に有用である。
【０３１７】
表3A、3Bおよび3Cは、表1A/1Bにおける骨粗しょう症関連遺伝子変異を含有する標的DNA領域を増幅するプライマー対を、対応する遺伝子変異と共に掲げている。
【０３１８】
掲げられたオリゴヌクレオチドプライマーは、きわめて少ないPCR反応で、前記標的DNA領域の特異的増幅を可能にするという利点を有している。表3A、または3Cに掲げられたプライマーにより、最少数の多重PCR反応で、表1A/1Bにおける遺伝子変異を遺伝子型判定するのに必要な全ての断片の増幅が可能になり、これを骨チップ上で分析することができる。
【０３１９】
さらなる態様において、本発明は、表3A、BおよびCに掲げられたPCRプライマーのそれぞれ、特に、掲げられたPCRプライマー対のそれぞれならびに対応する遺伝子変異を含有する標的DNA領域のPCR増幅における、例えば多重PCR反応におけるそれらの使用に関する。本発明は一態様において、医療における使用のため、特に当該遺伝子型判定、診断/予後方法または治療方法における使用のために、これらのプライマーまたはプライマー対のいずれか1つを提供する。
【０３２０】
本発明はさらに、掲げられたPCRプライマーの少なくとも1対を含むPCR増幅キットに関する。該キットは、例えば、(熱安定性)ポリメラーゼ、dNTP、好適な緩衝液、追加プライマー、および/または、例えば対応する遺伝子変異を含有する標的DNA領域を増幅するための使用説明書をさらに含むことができる。該キットは、当該方法に使用する目的で、核酸サンプルからの標的DNA領域を増幅するために使用することができる。
【０３２１】
別の態様において、本発明は、骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定のため、および/または骨粗しょう症または骨粗しょう症に対する感受性を診断するための遺伝子型判定キットまたは診断(好ましくはin vitro)キットに関する。該キットは本発明によるDNAチップまたはアレイを含む。
【０３２２】
該キットは、本発明の遺伝子型判定方法における該チップの使用のための説明書、例えば、当該分析方法またはアルゴリズムにおける使用のための説明書をさらに含む。キットのさらなる成分は、以下を含み得る:
本発明によるコンピュータソフトウェア、コンピュータプログラムまたはコンピュータシステム;
本発明によるPCRプライマーまたはPCRプライマー対の1つまたは複数;および/または
本発明によるPCR増幅キット。
【０３２３】
チップ用のプローブまたはPCRプライマーは、検出される遺伝子変異または該キットの診断目的に応じて、上記のとおり選択することができる。
【０３２４】
該キットは、ハイブリダイゼーション反応の1つまたは複数の陽性対照および/または陰性対照を含有し得る。本発明はさらに、本発明の遺伝子型判定、予測方法または治療方法における該キットの使用に関する。
【０３２５】
本明細書に記載したとおり、当該遺伝子型判定方法は、対象における骨粗しょう症または骨粗しょう症に対する感受性の診断に有用である。該方法において得られた遺伝子型判定結果は、予後の決定に使用することができ、また、骨粗しょう症に対する適切な治療の決定に有用であり得る(例えば、療法に対する応答性を予測することにより)。
【０３２６】
骨粗しょう症は多数の表現型、特に、多くの異なる遺伝子における変異によって影響される複雑な多遺伝子的特性である骨格の脆弱性および骨折に対する感受性を示す。骨の質量、密度、サイズ、幾何学的形状、微細構造、脆弱性、および外傷危険性の決定に関与する遺伝子変異もまた、個体への骨粗しょう症性骨折の危険性判定において重要である。
【０３２７】
骨粗しょう症に関連した特定の遺伝子変異は、特定の表現型または特定の表現型の発現、したがって、疾患の進行に予測的であり得る。言い換えると、例えば、所与の遺伝子変異のうちの変異対立遺伝子Bと特定の表現型の発生/発現との間には統計的に有意な関連性があり得る。
【０３２８】
当該遺伝子型判定方法により、臨床設定における多くの遺伝子変異の信頼できる遺伝子型判定が可能になるため、これらを、既知の骨粗しょう症表現型を有する個体の遺伝子型判定のために、したがって、特定の骨粗しょう症表現型の予測的な遺伝子変異を同定するために用いることができる。
【０３２９】
したがって、一態様において、本発明は、上記で掲げられた表現型などの特定の骨粗しょう症表現型の予測的な遺伝子変異を同定する方法に関する。該方法は、本発明の方法を用いて、骨粗しょう症に関連した1つまたは複数の遺伝子変異に関して、複数の個体を遺伝子型判定することを含む。このような遡及的試験において、一般に、300人〜1000人の個体が遺伝子型判定され、例えば、400人、500人または600人の個体を遺伝子型判定することができる。骨粗しょう症疾患表現型は、遺伝子型判定される全ての個体に関する標準的臨床パラメーター(例えば、骨塩密度、骨折の履歴)に基づいて既に知られている。
【０３３０】
遺伝子型が得られたら、このデータを表現型データと比較して、特定の遺伝子型と特定の表現型との間の統計的に有意な関連性を確認する。統計的有意性を判定する方法は当業界に知られている。
【０３３１】
次いで、特定の表現型/疾患過程に予測的であるとして同定された遺伝子変異を用い、予測的遺伝子変異に関して個体の遺伝子型判定を行うことによって、試験個体におけるこれらの表現型/疾患経過を診断することができる。したがって、個体における疾患進行の可能性の高い経過を判定することが可能である。遺伝子型判定は、試験される変異の数によって、任意の適切な方法によって行うことができる。例えば、本発明の遺伝子型判定方法を用いることができる。あるいは、配列ベースの、または他のチップベースの方法が適切であり得る。
【０３３２】
したがって一態様において、本発明はさらに、本明細書に記載された方法により、予測的である(特定の骨粗しょう症表現型または疾患経過を)予測するものとして同定された1つまたは複数の遺伝子変異に関して個体の遺伝子型を判定することにより、個体における骨粗しょう症表現型を診断するか、または疾患進行の可能性の高い経過を予測する方法に関する。
【０３３３】
予測がなされたら、最も好適な治療アプローチを選択すること、例えば外科的介入の必要性を判定することが可能になる。
【０３３４】
したがって、当該アレイおよび方法は、臨床医が骨粗しょう症患者における疾患進行の可能性の高い経過を予測するための手段を提供し、また、最も好適な治療法の選択を助ける。したがって、それらは有用な予測用手段である。本発明によって得られた遺伝子型情報は、症状(疾患表現型)が不明瞭な場合の臨床的決定または診断において助けになり得る。骨チップまたは他の方法によって提供された遺伝子情報はまた、無症状の個体(例えば、骨粗しょう症罹患者の直接の家族)における疾患発現の可能性判定の補助となり得、例えば、提供すべきライフスタイルおよび食事についての指針、および疾患発生に対して考えられる感受性を示す遺伝子構成を有する個体の継続的モニタリングの必要性を指示することを可能にする。
【０３３５】
したがって、一態様において本発明は、個体における骨粗しょう症または骨粗しょう症に対する感受性を診断するか、または上記個体における疾患進行の可能性の高い経過を判定する方法に関する。該方法はin vitroであることが好ましい。該方法はさらに、骨粗しょう症に罹っている個体に対して、治療を選択する方法に関するものであり、いくつかの場合、該個体は本発明の方法によって、既に診断され試験されている。またさらに本発明は、いくつかの態様において、治療が選択された後に該治療を該個体に施す、骨粗しょう症に罹っている個体を治療する方法に関する。
【０３３６】
該診断方法、予測方法および治療方法は、本明細書に記載された本発明の遺伝子型判定方法を実施することを含み得る。該方法のいずれも、遺伝子型判定に用いられる一次関数を誘導するために、本明細書に記載された本発明の訓練方法を実施することを含み得る。さらに本発明は、本明細書に記載された本発明のチップ、コンピュータシステム、コンピュータプログラム、オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブの対もしくは組、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマー対、PCR増幅キットまたは診断キットの使用を含み得る。
【０３３７】
一態様において本発明は、本明細書に記載された当該方法における使用に適合させたマイクロアレイに関する。
【０３３８】
本発明はさらに、本明細書に記載された方法など、骨粗しょう症を予測するための方法における本発明の1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび/または1つまたは複数のプライマーまたはプライマー対の使用に関する。
【０３３９】
次に、本発明のさらなる態様を、例示であって限定ではない添付の図および実験的事例によって示す。さらなる態様および実施形態は、通常の当業者には明らかであろう。本明細書に記載された文書は全て、参照として本明細書に援用されている。
【０３４０】
(実施例)
一般に、本明細書に記載された技法は、当業界によく知られているが、特に、参考文献としてSambrookら、1989年、Molecular Cloning: a laboratory manualを挙げることができる。
【０３４１】
(実施例1)
本発明によるDNAチップ(骨チップ)を用いた骨粗しょう症関連ヒト遺伝子変異の検出
1.1骨粗しょう症関連遺伝子変異の遺伝子型判定用DNAチップの設計
同時の、高感度で、特異的かつ再現性のある検出を可能にする、骨粗しょう症に関連したヒト遺伝子変異を検出するためのDNAチップを設計し、製造した。前記遺伝子変異は、骨粗しょう症罹患の危険性がより高いかまたはより低いか、治療に対する応答がより良好かまたはより不良か、また疾患の予後がより良好かまたはより不良かに関連する。このDNAチップを用いて測定できる骨粗しょう症に関係する抗原関連のヒト遺伝子変異の例示的な例は、表1Aおよび1Bに示されている。
【０３４２】
設計および製造されたDNAチップは、前述の遺伝子変異の検出を可能にする表面上の複数のプローブを示す支持体(ガラススライド)からなる。これらのプローブは、骨粗しょう症関連遺伝子の増幅配列とハイブリダイズすることができる。使用されるプローブのそれぞれのDNA配列は、下記の表2A(図2)に示される。掲げたプローブの全ては、技術的に検証されている。
【０３４３】
1.2 DNAチップの製造
ガラススライドのプリントおよびプロセシング
先に同定された遺伝子変異を検出できるプローブを、溶媒としてDMSOを用いてアミノシランでコーティングされた支持体(ガラススライド)上にプリントする。このプリントは、温度および相対湿度を調節しながら、オリゴヌクレオチド(プローブ)のスポッターまたはプリンターを用いて実施する。
【０３４４】
支持体(ガラススライド)へのプローブの結合は、製造元(例えば、Corning Lifesciences http://www.corning.com)により提供された文書に記載されている紫外線照射および加熱による架橋手段により実施される。配置過程時の相対湿度は、40〜50%の間および温度は20℃周辺に維持する。
【０３４５】
1.3 DNAチップの臨床的有用性のバリデーション
1.3.1ハイブリダイズされるサンプルの調製
個体のDNAは、ろ過の標準的プロトコルにより血液サンプルから抽出する。(例えば、Macherey Nagel、Qiageneからの市販キットなど)。
【０３４６】
対象の遺伝子変異を含有する標的DNA領域は、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて多重PCRにより増幅される。検出される遺伝子変異が存在し得る遺伝子断片の特異的な増幅を可能にする、任意の好適なオリゴヌクレオチド対を使用することができる。有利なことに、できるだけ少ないPCR反応数で前記増幅が実施できるオリゴヌクレオチドプライマー対を使用する。
【０３４７】
表1Aおよび1Bの遺伝子変異を含有するPCR標的領域を(多重PCRにより)増幅させるために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、表3A(図3)にある。これらのプライマーは、本発明に追加される態様である。
【０３４８】
検出される遺伝子変異が存在し得る遺伝子断片の特異的増幅を可能にする、時間と温度が同じ条件下でPCR多重反応を同時に実施する。PCR多重反応が終了したら、アガロースゲル分析を用いて増幅反応が生じたことをチェックする。
【０３４９】
次に、ハイブリダイズされるサンプル(増幅産物)をDNアーゼによる断片化に供し、得られた断片化産物を間接的標識化に供する。ターミナルトランスフェラーゼにより、互いに特異的に結合する1対の分子のうちの1つのメンバー(例えば、後にストレプトアビジンへの特異的結合を可能にするビオチン)に共有結合されたヌクレオチドが、これらDNA小断片の末端に加えられる。
【０３５０】
DNAチップにサンプルを適用する前に、95℃で5分間加熱することによりサンプルを変性させてから、「ChipMap Kit Hybridization Buffer」(Ventana Medical Systems)を加える。
【０３５１】
1.3.2ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの使用に特に開発されたVentana Discovery (Ventana Medical Systems)などのハイブリダイゼーションステーションにおいて自動的にハイブリダイゼーションが実施される。あるいは、ハイブリダイゼーションは手動で実施することができる。
【０３５２】
スライドのプレハイブリダイゼーションおよびブロックを、BSAにより実施する。次に、ハイブリダイゼーション溶液(ChipMap Kit Hybridization Buffer、Ventana Medical Systems)を、Ventana 9.0 Europe (Ventana Medical Systems)のプロトコルに従ってDNAチップの表面に適用し、これを45℃で1時間維持する。最後にスライドを、種々の洗浄液(ChipMap hybridization Kit Buffer、Ventana Medical Systems)に供する。ハイブリダイゼーションの工程が終了したら、スライドの最終洗浄および乾燥を開始する。
【０３５３】
ハイブリダイゼーションが生じたら、ハイブリダイゼーションが生じたプローブ位置を標識するために、ターミナルトランスフェラーゼにより増幅産物に組み込まれた分子に特異的に結合できる蛍光標識化分子(例えば、ビオチン組込みの場合、ストレプトアビジン-Cy3などのストレプトアビジンに結合された蛍光体を使用することができる)とのインキュベーションにより、DNAチップを展開する。
【０３５４】
1.3.3スライドの走査
スライドを、蛍光共焦点スキャナー、例えば、Axon 4100a内に入れ、レーザーにより刺激された際に、蛍光により放射されたシグナルを走査する。
【０３５５】
1.3.4画像の定量化
スキャナー自体のソフトウェアは、ハイブリダイゼーションが生じた点におけるシグナルから得られた画像の定量化を可能にする。
【０３５６】
1.3.5結果の解釈
種々の遺伝子変異を検出するプローブにより得られたシグナルから、個体の遺伝子型が確立される。第一に、スキャナーのソフトウェアは、各プローブに関して得られた絶対シグナル強度値から局在性バックグラウンドノイズを差し引くために関数を作成する。次に、各遺伝子変異を特徴付けるために使用される4つのプローブのそれぞれに関する複製をグループ分けする。さらなる配慮により除外することができる異常値(外れ値)を同定するために、4つのプローブのそれぞれに関する平均強度値を、複製から照合された平均値を用いて算出する。各プローブに関する平均強度値を認識したら、2つの比率(比率1および比率2)を算出する。
【０３５７】
【数３】
2009542248.tif 000004
【数４】
2009542248.tif 000005
式中、プローブ1は、遺伝子変異A(例えば、通常の対立遺伝子)を検出し(特異的にハイブリダイズすることができ)、プローブ2は、遺伝子変異B(例えば、変異対立遺伝子)を検出し(特異的にハイブリダイズすることができ)、プローブ3は、遺伝子変異A(例えば、正常な対立遺伝子)を検出し(特異的にハイブリダイズすることができ)、プローブ4は、遺伝子変異B(例えば、変異対立遺伝子)を検出する(特異的にハイブリダイズすることができる)。
【０３５８】
これらの比率は、3つの可能な遺伝子型:
AA          関数1
AB          関数2
BB          関数3
のそれぞれを特徴付ける3つの一次関数に置き換えられる。
【０３５９】
最高の絶対値を表す関数が、患者の遺伝子型を判定する。
【０３６０】
この場合、一次関数は、遺伝子変異の3つの可能な遺伝子型(AA、AB、BB)のそれぞれに関して5人の対象を分析することにより得られる。その結果を用いて、比率1および2は、15人の対象に関して算出される。これらの比率は、設計された2対のプローブの識別能力を評価する一次関数を作成するための3つの群に関する分散変数である。この識別能力が100%でない場合、このプローブを再設計する。3つの遺伝子型のそれぞれに関して特性化された新たな対象は、一次関数を完全にするために、簡単に言うと、これら3つの関数に基づいたアルゴリズムの識別能力を改良するために、新たな比率1および2を構成する。
【０３６１】
共焦点蛍光スキャナーを使用する場合、信頼できる結果を得るために、比率1および2は、該群を構築するために用いられる比率の範囲内にあり、バックグラウンドノイズに対する4n(例えば、40)複製の平均蛍光強度は5超であり、全てのDNAチップ複製の変動係数は0.25以下であることが好ましい。
【０３６２】
やはり、共焦点蛍光スキャナーを実験に使用する場合、信頼できると考えられる完全なハイブリダイゼーションに関して、全てのDNAチッププローブのバックグラウンドノイズに対するプローブの蛍光強度の比率は、15超であることが好ましい。同様に、全ての比率の平均は、0.6超であることが好ましく、陰性対照は、3倍未満か、バックグラウンドノイズの3倍に等しいことが好ましい。
【０３６３】
要約すると、本実施例において、各変異の検出のためにスライド上に4つのプローブ(10回反復)が提示される。2つのプローブは、1つの遺伝子変異(A)を検出し、他の2つは、他の遺伝子変異(B)を検出する。調べられた塩基は、プローブの中央位置に配置されている。
【０３６４】
遺伝子変異Aに関してホモ接合性の対象は、遺伝子変異Bを示さない。その結果、ガラス支持体から得られた画像において、遺伝子変異Bを検出するプローブは、変異Aによって示されたものよりも有意に小さいハイブリダイゼーションシグナルを示し、逆もまた同様である。この場合、比率1および2は、1を示し、該対象は、ソフトウェア分析によりホモ接合性AAとして帰属される。
【０３６５】
他方、判定された遺伝子変異に関してヘテロ接合性の対象は、双方の遺伝子変異を示す。したがって、それらを検出するプローブは、等しいハイブリダイゼーションシグナルを示す。比率1および2は、0.5を示し、該対象は、ソフトウェア分析によりヘテロ接合性ABとして帰属される。
【０３６６】
(実施例2)
骨粗しょう症表現型患者を予測するモデルおよび方法の確立
2.1.患者の選択
904人の閉経後イタリア人女性および高齢者イタリア人男性、ならびに125人の非外傷性骨折継続性患者のコホートを選択した。BMD(脊椎-LS、股関節-FNおよび手)、ならびに骨の超音波特性、骨容量、骨のターンオーバー(骨アルカリホスファターゼおよび血清CTX)、PTHおよび性ホルモンレベルなどの骨粗しょう症の病因に関連する他の表現型を評価した。そのうえ、BMD(Tscore+Zscore)に基づくWHO評価基準に基づいて骨粗しょう症の診断を行った。股関節、椎骨、手首および他種の骨折は、既に登録されている。年齢、閉経年齢、初経年齢、性別、喫煙習慣、体重、身長、および身体運動もまた、共分散として考慮された。
【０３６７】
本試験に含まれたコホートおよび患者の臨床的特性は、図4(表4)に示されている。
【０３６８】
Policlinico Santa Maria alle Scotteの医学倫理委員会(そのオフイスはイタリア、Viale Bracci 1、53100 SIENAに所在)により、この試験は承認され、参加者からインフォームドコンセント書を得た。この試験は、世界医学協会のヘルシンキ宣言の倫理公布に従った。
【０３６９】
2.2.骨チップアレイによる遺伝子型判定
ゲノムDNAを得るために、静脈血サンプルを抗凝血剤を含有するチューブに採血した。DNAは、塩析法を用いて末梢血細胞から単離した(Millerら、1988年)。
【０３７０】
DNAアレイに基づく遺伝子型判定に関する方法論は、以前に報告されている(Tejedorら、2005年)。手短に言うと、SNP検出の精度を確保するために、各SNPの検出用に2対のオリゴヌクレオチドを設計した。各プローブ対は、A対立遺伝子に特異的なプローブおよびB対立遺伝子に特異的なプローブからなった。各オリゴヌクレオチドプローブのいくつかの複製を、Microgrid IIロボットスポッター(BioRobotics)を用いてアミノシランでコーティングされたガラススライド(UltraGAPs、Corning)上にスポットした。ハイブリダイゼーションの特異性を最大にするために、オリゴヌクレオチドの長さは、17から25ヌクレオチドの範囲であり、標的多型ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの中央位置に配置される(図2、表2A)。
【０３７１】
ハイブリダイゼーション用の標的DNAは、8つの独立した多重増幅反応において調製され、そのそれぞれは、それぞれ14、12、15、14、13、14、15および13の別々のプライマー対を含有した(図3、表3A)。多重増幅反応は同じ熱サイクリングプログラムを用いて同時に実施し、110のDNA断片の増幅を可能にした。各多重増幅反応は、テンプレートとしてゲノムDNA、および適切なプライマー対を用いて実施した。増幅反応は、95℃で15分間の最初の変性、次いで95℃で30秒間での45サイクルの変性、62℃で90秒間のプライマーアニーリング、および72℃で90秒間のプライマー伸長を用いて実施し、最終増幅サイクル後にプライマー伸長を、72℃で10分間に延長させた。増幅された断片(アンプリコン)のサイズは、100bpから400bpの範囲である。
【０３７２】
増幅後、生じた産物を、DNAアーゼIを用いた消化により断片化し、二本鎖DNA断片の3’-ヒドロキシル末端にビオチン化ヌクレオチド(Perkin Elmer)の付加を触媒するためにターミナルトランスフェラーゼ(Roche)を使用した。
【０３７３】
ChipMapのハイブリダイゼーション緩衝液およびMicroarray 9.0 Europeステーション(Ventana Medical Systems)に関するプロトコルを用い、Ventana Discoveryステーションにおいてハイブリダイゼーションを45℃で1時間自動的に実施した。標識化後、ビオチン化DNA断片を、自動ハイブリダイゼーションステーションにおいて該アレイにハイブリダイズさせ、Cy3-複合化ストレプトアビジン(Amersham Biosciences)により染色した。走査の前に、非特異的結合Cy3分子を除去するためにDNAアレイを洗浄した。
【０３７４】
緑色レーザー(Cy3励起用に543nm)で装備されたGenePix Pro 4100の共焦点蛍光スキャナー(Axon)の使用により、DNAアレイ画像を捕捉した。Gene Pix Pro Acuity 4.0ソフトウェア(Axon)の使用により、各オリゴヌクレオチドプローブからのCy3ハイブリダイゼーションシグナルの絶対値を得た。該アレイからのハイブリダイゼーションシグナルを走査し、定量化した後、スキャナーからのエクスポートファイルを、遺伝子型判定ソフトウェアMG v1.0(Tejedor Dら、2005年)により処理した。次に、AおよびB対立遺伝子のハイブリダイゼーションシグナル平均値の総計に対するA対立遺伝子のハイブリダイゼーションシグナル平均値の比率を、各SNPの遺伝子型を決定するために用いられた2対のオリゴヌクレオチドに関して定義した(比率1および2)。各遺伝子型に関して10の事例のうちの少なくとも1つにおけるヌクレオチド配列分析によって先に同定された各遺伝子型群に関する少なくとも10の対照DNAサンプルの使用により、DNAアレイの特異性および感度を評価した。3つのクラスター(AA、ABおよびBB)に相当する2つの比率値を決定するために、これらのDNA対照サンプルを用いた。本試験においてはMG 1.0ソフトウェアを用い、先に定義されたクラスターのどれに、1029のサンプルのそれぞれが帰属したかを判定した。
【０３７５】
2.3.統計解析
Statistical Package for the Social Sciences(SPSS)14.0版を用いて統計解析を実施した。解析下の遺伝子多型性の分布がHardy-Weinberg平衡であることを判定するためにX2検定を実施した。従属変数として臨床的に決定された疾患表現型および独立変数としてSNPを用いて多変数ロジスティック回帰の手段により遺伝子型-表現型の関連を分析した。分析された表現型の予測におけるDNAアレイに含まれたSNPの影響を評価するために、感度、特異性、および陽性尤度比(LR+=感度/(1-特異性))を、受信者動作特性曲線の手段により計算した。それぞれの比較された表現型間の平均確率関数値の比較は、t検定を用いて実施した。統計的有意性の閾値は、≦0.05のpレベルとして予め定義された。
【０３７６】
従属変数として定量的特性、独立変数としてSNPを用いる多変数線形回帰の手段により、遺伝子型-定量的特性の関連を分析した。BMDの推定において、SNPの影響および分析された臨床的変数を評価するために、R2値を計算した。
【０３７７】
結果
2.1.遺伝子型判定手段としての骨DNAアレイの特異性および感度
この遺伝子型判定DNAアレイ技法の特異性と感度は、以前に記載されたように(Tejedorら、2005年)、それぞれ99.7%および99.9%である。分析した各SNPについて3つの独立した遺伝子型判定クラスターが得られた。
【０３７８】
2.2.遺伝子型-表現型の関連
コホート患者の全ての遺伝子型分布は、Hardy-Weinberg平衡であった。
【０３７９】
従属変数として臨床的に決定された疾患表現型(2.2.1および2.2.2に記載された)および独立変数として表5(図5)に示された変数を含むロジスティック回帰の手段により、遺伝子型-表現型の関連を分析した。分析された各表現型に関して確率関数を得た。各確率関数に含まれた情報的SNPは、表5に示している。
【０３８０】
2.2.1.男性における骨折および椎骨骨折の危険性
男性における骨折または椎骨骨折の発生の予測因子を特定するために、従属変数として骨折または椎骨骨折の存在を用いてロジスティック回帰分析を実施した。
【０３８１】
男性における骨折による確率関数により、骨折の無い個体(0)に対して骨折に罹患している個体(1)が比較される。男性における骨折関数に含まれた変数は表5に示している。
【０３８２】
統計解析により、男性における骨折確率関数に含まれたSNP(表5)は、95%の特異性において57%の感度で骨折を予測できることを示した(LR+=11.4)。1および0の個体は、図6.1のボックスプロットでも表される。男性関数における平均骨折確率関数値を比較すると、両サブグループ:1対0間で統計的に有意差が見られた(p<0.05)。
【０３８３】
男性における椎骨骨折確率関数により、椎骨骨折の無い個体(0)に対して椎骨骨折に罹患している個体(1)が比較される。男性における骨折関数に含まれた変数は表5に示している。
【０３８４】
男性における椎骨骨折関数の感度値および特異性値は、それぞれ71%と94%であり、11.8の陽性尤度比(LR+)であった。1および0の個体は、図6.2のボックスプロットでも表される。男性関数における平均骨折確率関数値を比較すると、両サブグループ:1対0間で統計的に有意差が見られた(p<0.05)。
【０３８５】
2.2.2.女性における骨折および椎骨骨折の危険性
女性における骨折または椎骨骨折の発生の予測因子を特定するために、従属変数として骨折または椎骨骨折の存在を用いてロジスティック回帰分析を実施した。
【０３８６】
女性における骨折確率関数により、骨折の無い個体(0)に対して骨折に罹患している個体(1)が比較される。女性における骨折関数に含まれた変数は表5に示している。
【０３８７】
統計解析により、女性における骨折確率関数に含まれたSNP(表5)は、95%の特異性(LR+=11)において、55%の感度で骨折を予測できることを示した。1および0の個体は、図7.1のボックスプロットでも表される。女性関数における平均骨折確率関数値を比較すると、両サブグループ:1対0間で統計的に有意差が見られた(p<0.05)。
【０３８８】
女性における椎骨骨折確率関数により、椎骨骨折の無い個体(0)に対して椎骨骨折に罹患している個体(1)が比較される。女性における骨折関数に含まれた変数は表5に示している。
【０３８９】
女性における椎骨骨折関数の感度値および特異性値は、それぞれ72%と95%であり、14の陽性尤度比(LR+)であった。1および0の個体は、図7.2のボックスプロットでも表される。女性関数における平均骨折確率関数値を比較すると、両サブグループ:1対0間で統計的に有意差が見られた(p<0.05)。
【０３９０】
2.3.遺伝子型-定量的特性の関連
コホート患者の全ての遺伝子型分布は、Hardy-Weinberg平衡であった。
【０３９１】
従属変数として定量的特性(2.3.1および2.3.2に記載された)および独立変数として表5に示された変数を含む線形回帰の手段により、遺伝子型-定量的特性との関連を分析した。分析された各定量的特性に関して定量的関数が得られた。各確率関数に含まれた情報的SNPは、表5に示している。
【０３９２】
2.3.1.男性におけるLSBMDおよびFNBMD
男性におけるLSBMDおよびFNBMDを推定するための予測因子を特定するために、従属変数としてLSBMDおよびFNBMDの存在を用いて線形回帰分析を実施した。
【０３９３】
定量的関数により、SNP、年齢およびBMIに基づいたLSBMDおよびFNBMDを推定する。男性におけるLSBMDおよびFNBMD関数に含まれた変数は表5に示している。
【０３９４】
男性におけるLSBMDを推定するための定量的関数は、0.38のR2を示した(図3)。男性におけるFNBMDを推定するための定量的関数は、0.35のR2を示した(図8)。
【０３９５】
2.3.2.女性におけるLSBMDおよびFNBMD
女性におけるLSBMDおよびFNBMDを推定するための予測因子を特定するために、従属変数としてLSBMDおよびFNBMDの存在を用いて線形回帰分析を実施した。
【０３９６】
定量的関数により、SNP、年齢、閉経年齢、初経年齢およびBMIに基づいたLSBMDおよびFNBMDを推定する。女性におけるLSBMDおよびFNBMD関数に含まれた変数は表5に示している。
【０３９７】
女性におけるLSBMDを推定するための定量的関数は、0.3のR2を示した(図8)。女性におけるFNBMDを推定するための定量的関数は、0.32のR2を示した(図8)。
【０３９８】
2.4.性別によるLSBMD、FNBMD、骨折および椎骨骨折との一般的な関連
表5に基づいていくつかの結論を評価することができる:
ADRB1遺伝子のSNPは、双方の性別において骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０３９９】
ADRB2遺伝子のSNPは、双方の性別においてFNBMDおよび骨折との関連を示した。
【０４００】
ALOX12遺伝子のSNPは、双方の性別においてLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。女性における骨折および双方の性別における椎骨骨折との別の関連は、既に評価されている。
【０４０１】
ALOX15遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよび男性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４０２】
ALOX5遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。
【０４０３】
ALOX5P遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよび男性における骨折との関連を示した。
【０４０４】
AR(アンドロゲン受容体)遺伝子のSNPは、女性におけるFNBMD、男性における骨折および女性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４０５】
アロマターゼ遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。そのうえ、双方の性別における骨折との関連が評価された。
【０４０６】
BMP4遺伝子のSNPは、女性におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。双方の性別における骨折および椎骨骨折との関連もまた示した。
【０４０７】
BMP6遺伝子のSNPは、女性におけるFNBMDとの関連を示した。これらのSNPはまた、双方の性別における骨折および椎骨骨折と関連した。
【０４０８】
CaSR遺伝子のSNPは、男性における骨折および女性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４０９】
CICN7遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。これらのSNPはまた、女性における骨折および椎骨骨折と関連した。
【０４１０】
Col1A1遺伝子のSNPは、双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４１１】
Col1A2遺伝子のSNPは、女性におけるLSBMDおよびFNBMDおよび双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４１２】
COMT遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。これらのSNPはまた、女性における骨折および双方の性別における椎骨骨折と関連した。
【０４１３】
COX1遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMD、および女性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４１４】
CTR遺伝子のSNPは、男性および女性におけるLSBMD、および女性における骨折との関連を示した。
【０４１５】
CYP17遺伝子のSNPは、女性における骨折と関連した。
【０４１６】
CYP1A1遺伝子のSNPは、男性における骨折および脊椎骨折との関連を示した。
【０４１７】
CYP1B1遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMD、ならびに双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４１８】
ESRA遺伝子のSNPは、双方の性別における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４１９】
ESRB遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。
【０４２０】
FDPS遺伝子のSNPは、男性における骨折および双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４２１】
IGF-II遺伝子のSNPは、女性における骨折および双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４２２】
IL-10遺伝子のSNPは、男性における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４２３】
IL-1 RA遺伝子のSNPは、女性における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４２４】
IL-6遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよびFNBMD、ならびに女性における骨折との関連を示した。
【０４２５】
INTEGRINB3遺伝子のSNPは、双方の性別における骨折および女性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４２６】
KL遺伝子のSNPは、女性における骨折との関連を示した。
【０４２７】
LRP5遺伝子のSNPは、双方の性別におけるLSBMDおよびFNBMD、女性における骨折、ならびに双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４２８】
LRP6遺伝子のSNPは、女性における骨折との関連を示した。
【０４２９】
MTHFR遺伝子のSNPは、男性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４３０】
OPG遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。
【０４３１】
PPARGAMMA遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMD、双方の性別における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４３２】
PTH遺伝子のSNPは、男性における骨折および双方の性別における椎骨骨折との関連を示した。
【０４３３】
PTHR1遺伝子のSNPは、男性および女性におけるLSBMDおよびFNBMD、双方の性別における骨折および男性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４３４】
RANKL遺伝子のSNPは、女性におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。
【０４３５】
SOST遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMDとの関連を示した。
【０４３６】
SRD5A2遺伝子のSNPは、女性におけるFNBMD、双方の性別における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４３７】
TGF-B1遺伝子のSNPは、男性におけるLSBMDおよびFNBMD、男性における骨折および女性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４３８】
ALPL遺伝子のSNPは、女性におけるFNBMD、および男性における椎骨骨折との関連を示した。
【０４３９】
VITDR遺伝子のSNPは、女性におけるLSBMDおよびFNBMD、双方の性別における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４４０】
TNFアルファおよびTNFR2遺伝子のSNPは、男性における骨折および椎骨骨折との関連を示した。
【０４４１】
考察
現在、骨粗しょう症の診断は、BMD(LSBMDおよび/またはFNBMD)の測定に基づいている。この診断は、BMD測定機器が十分に利用できないため、実際には全般集団に適用することができない。そのうえ、この診断は、骨折が既に現れている場合のみ正常になされる。本法は、正確なBMD(LSBMDおよびFNBMD)の推定および骨折予測を提供し、したがって、骨粗しょう症および骨折の予防に役立つ。骨チップはまた、骨折の危険性の高い患者を選択する最初の手段を提供する。
【０４４２】
本試験に記載された骨チップは、このような多数のSNPをスクリーンできる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいた骨粗しょう症の診断および予測に関する最初の低密度DNAアレイである。
【０４４３】
したがって、骨チップおよび本法は、臨床疾患の管理のためにさらなる手段を提供し、それによって患者および医師双方に役立つこととなる。
【０４４４】
(実施例3)
手首、股関節または脊椎の骨折(WSH骨折表現型)を予測するためのさらなるモデルの提供
実施例2と同じ集団からの化学的データおよびゲノムDNAサンプルを用いて、本発明者は、骨折についてさらなる試験を実施した。
【０４４５】
本試験において、椎骨、大腿骨および手首の骨折を、共に単一の表現型としてグループ分けした。したがって、本試験において、陽性の骨折は、手首、脊椎および股関節の非外傷骨折として考慮された。この目的は、身体の別の場所に生じた骨折と対比させて、これら3箇所に生じる骨折を比較することであった。
【０４４６】
表2Cのプローブおよび表3Cのプライマーを用いたこと以外は(したがって、実施例2の試験と比較して、表2Bの最適化プローブおよび表3Bの最適化プライマーを組み込んで)、実施例2と同じ方法により、該集団の遺伝子型判定がなされた。
【０４４７】
統計解析は、下記に指示された場合を除いては、実施例2のとおり実施された。
【０４４８】
3つの異なるアプローチが実施された。第一のアプローチは、性別を考慮に入れないものである。これは、「一般的モデル」となる。他の2つのアプローチは、男性集団と女性集団とに分けて、それぞれ「男性モデル」および「女性モデル」を作成した。
【０４４９】
3つのアプローチのそれぞれに関して、2つの確率関数が生じ、1つには、フォワード変数選択(FSTEP)を用い、他の1つは、バックステップ(BSTEP)変数選択を用いる。これらは、同じ統計的アプローチ(多変数ロジスティック回帰)によりモデルを構築するための2つの方法論である。実施例2においては、BSTEPのみが考慮された。
【０４５０】
各モデルに含まれた変数を図9に掲げている。図10〜15は、特異性と感度との間の関係を示す6つのモデルのそれぞれに関するROC曲線を示している。これらの図はまた、分析で考慮された各群に関する確率分布を示す確率ボックスプロットを示している(1=椎骨、大腿骨および手首の骨折;0=椎骨、大腿骨または手首の骨折なし)。各モデルに関する感度値、特異性値、およびLR+値は図16に示している。
【０４５１】
各モデルに関する確率関数の算出用データは図17から図19に示している。
【０４５２】
バックステップモデルは、3つの試験全てにおいて、より良好な結果を与えるものと思われる。一般的モデルおよび女性モデルに関して、バックステップおよびフォワード双方の結果は、ある程度同様であった。しかしながら、男性集団に関して、バックステップは、はるかに良好な結果を与えることから、バックステップモデルは、過度適合性データであり得ることが示唆される。
【０４５３】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーに付加されたTAG配列は:
配列番号672          TTGAAGTTCG
CAGAATCGTA
配列番号673          AATACACGAA
GGAGTTAGCT
である。
(参考文献)
2009542248.tif 000006
【図１Ａ】
2009542248.tif 000015
【図１Ｂ】
2009542248.tif 000016
【図１Ｃ】
2009542248.tif 000017
【図１Ｄ】
2009542248.tif 000018
【図１Ｅ】
2009542248.tif 000019
【図１Ｆ】
2009542248.tif 000020
2009542248.tif 000021
2009542248.tif 000022
2009542248.tif 000023
2009542248.tif 000024
2009542248.tif 000025
2009542248.tif 000026
2009542248.tif 000027
2009542248.tif 000028
2009542248.tif 000029
2009542248.tif 000030
2009542248.tif 000031
2009542248.tif 000032
2009542248.tif 000033
2009542248.tif 000034
2009542248.tif 000035
2009542248.tif 000036
2009542248.tif 000037
2009542248.tif 000038
2009542248.tif 000039
2009542248.tif 000040
2009542248.tif 000041
2009542248.tif 000042
2009542248.tif 000043
2009542248.tif 000044
2009542248.tif 000045
2009542248.tif 000046
2009542248.tif 000047
2009542248.tif 000048
2009542248.tif 000049
2009542248.tif 000050
2009542248.tif 000051
2009542248.tif 000052
【図４】
2009542248.tif 000053
【図５Ａ】
2009542248.tif 000054
【図５Ｂ】
2009542248.tif 000055
【図６．１】
2009542248.tif 000056
【図８】
2009542248.tif 000057
【図９】
2009542248.tif 000058
【図１０Ａ】
2009542248.tif 000059
【図１１Ａ】
2009542248.tif 000060
【図１２Ａ】
2009542248.tif 000061
【図１３Ａ】
2009542248.tif 000062
【図１４Ａ】
2009542248.tif 000063
【図１５Ａ】
2009542248.tif 000064
【図１６】
2009542248.tif 000065
【図１７Ａ】
2009542248.tif 000066
【図１７Ｂ】
2009542248.tif 000067
【図１８Ａ】
2009542248.tif 000068
【図１８Ｂ】
2009542248.tif 000069
【図１９Ａ】
2009542248.tif 000070
【図１９Ｂ】
2009542248.tif 000071
【図６．２】
2009542248.tif 000072
【図７．１】
2009542248.tif 000073
【図７．２】
2009542248.tif 000074
【図１０Ｂ】
2009542248.tif 000075
【図１１Ｂ】
2009542248.tif 000076
【図１２Ｂ】
2009542248.tif 000077
【図１３Ｂ】
2009542248.tif 000078
【図１４Ｂ】
2009542248.tif 000079
【図１５Ｂ】
2009542248.tif 000080
【配列表】
2009542248000001.app
【国際調査報告】
2009542248.tif 000081
2009542248.tif 000082
2009542248.tif 000083
2009542248.tif 000084
2009542248.tif 000085
2009542248.tif 000086
2009542248.tif 000087