(57)【要約】  本発明は新規な神経栄養因子タンパク質であるＭＡＮＦ２およびそれをコードする遺伝子配列を開示する。この分子は、ＭＡＮＦ２依存性病態の治療、予防および／または診断に有用な広範にわたる療法の開発に有用である。本発明の分子は、更に一次ニューロンおよび中枢ニューロン、特に中枢神経系のドーパミン作動性ニューロン、のエフェクターおよび成長因子遺伝子としても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図７に示した配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する、単離精製した核酸。
【請求項２】
図７に示した配列番号１のヌクレオチド配列を含む、単離精製した核酸。
【請求項３】
図７に示した配列番号１のヌクレオチド配列、そのホモログ、またはそれらの断片を含む組み換えヌクレオチド配列を包含する、単離精製した核酸。
【請求項４】
発現制御配列に発現可能な状態に連結した請求項２の核酸を包含し、ＭＡＮＦ２ポリペプチドまたはその変異体をコードしうる発現構築物。
【請求項５】
請求項４の発現構築物で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項６】
ポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドはヒト ヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド鎖を含み、該ヒト ヌクレオチド配列は、図７に示した配列番号１の配列に相補的な非コード鎖を含むＤＮＡと以下のハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズすることを特徴とする宿主細胞。
（ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳと０．１ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で２０時間の条件下でフィルターを用いたハイブリダイゼーションを行い、そして
（ｂ）該フィルターの洗浄を、１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む洗浄液を用い、室温で３０分間を２回、そして６５℃で３０分間を２回行う。
【請求項７】
図７に示した配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離精製したＭＡＮＦ２ポリペプチド。
【請求項８】
発現可能な状態にプロモーター配列と関連付けられた、ＭＡＮＦ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する請求項５の宿主細胞を、該ポリペプチドをコードする核酸配列が発現されるように培養し、そして
該宿主細胞または該宿主細胞を培養した培地から該ポリペプチドを単離する
ことを包含する、請求項７のＭＡＮＦ２ポリペプチドを製造する方法。
【請求項９】
請求項７の単離精製したＭＡＮＦ２ポリペプチドまたはその抗原性断片で哺乳動物を免疫することを包含する、抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項７の単離精製したＭＡＮＦ２ポリペプチドまたはその抗原性断片を用いた抗原。
【請求項１１】
請求項９の方法で製造した抗体。
【請求項１２】
検出可能な標識で標識した、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
− 容器、および
− 該容器に入っている、ＭＡＮＦ２遺伝子またはそのアレル変異を検出しうる化合物、好ましくは標識されている化合物
を包含することを特徴とする、生物学的試料中のＭＡＮＦ２またはそのアレル変異の存在を検出するための、複数の試薬からなるキット。
【請求項１４】
該化合物がプライマーまたはプローブであることを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
該化合物が請求項１１の抗体であることを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
ＭＡＮＦ２の変異または機能不全が介在する病態について、疾病素質を評価するための、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１７】
該キットを用いるための説明書を更に包含する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ヒトまたはマウスのＭＡＮＦ２遺伝子をトランスジーンとして有する、トランスジェニックなヒト以外の動物。
【請求項１９】
ＭＡＮＦ２遺伝子またはそのホモログの発現を妨害するトランスジーンまたは挿入配列を有する、トランスジェニックなヒト以外の動物。
【請求項２０】
ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質、ＭＡＮＦ２ペプチド断片、ＭＡＮＦ２作用物質、ＭＡＮＦ２拮抗物質または抗ＭＡＮＦ２抗体を包含する、医薬化合物。
【請求項２１】
薬学的に有効な量の請求項２０の医薬化合物を、処置を必要とする患者に投与することを特徴とする、ＭＡＮＦ２依存性病態の処置方法。
【請求項２２】
該患者が、抹消神経障害を発症しているか、または発症する危険性のある患者であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該抹消神経障害が全身性疾患と関連するものであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該患者が、アルツハイマー病を発症しているか、または発症する危険性のある患者であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
該患者が、パーキンソン氏病を発症しているか、または発症する危険性のある患者であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程を包含する、ＭＡＮＦ２に結合する受容体をアフィニティー精製する方法。
（ａ）精製すべきＭＡＮＦ２受容体が、支持体に固定化したＭＡＮＦ２上に選択的に吸着される条件下で、ＭＡＮＦ２受容体の原料を、固定化したＭＡＮＦ２に接触させ、
（ｂ）固定化したＭＡＮＦ２とその支持体を洗浄して、吸着されていない物質を取り除き、そして
（ｃ）固定化したＭＡＮＦ２に吸着しているＭＡＮＦ２受容体分子を溶出バッファーで溶出して、ＭＡＮＦ２受容体分子を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して遺伝子工学の分野に関し、より詳細には、神経細胞、特にＣＮＳ（中枢神経系）のドーパミン作動性ニューロン、の成長因子および成長因子遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロンの運命を調節するメカニズムの研究は、ニューロンの決定、分化と維持を理解するために重要である。第２に、ニューロン表現型の決定に重要な細胞外および細胞内調節因子の同定は、多くの神経変性疾患の処置における治療的重要性が考えられるため、少なからぬ注目を集めてきた。脊椎動物神経系の多様性を決定する細胞外シグナルの役割は広範囲わたり研究されてきた。成熟途上の神経系および成熟した神経系の制御に関る分泌因子の中で最も詳しく特徴付けられているものは、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリーおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーの神経栄養因子である（Bibel and Barde, 2000, Genes Dev 14:2919-2937、Airaksinen et al. 1999, Mol. Cell Neurosci 13:313-325、およびAiraksinen and Saarma 2002, Nat Rev Neurosci 2002 3:383-394に報告がある）。これらの神経栄養因子は、脊椎動物における特定ニューロン群の生存、分化と維持を促進する。後にこれらの神経栄養因子には、活動依存性シナプス可塑性の調節、神経突起伸張の促進、および組織損傷の際のニューロンの保護と修復を含む他の重要な機能を有することが明らかになった。
【０００３】
発明の概要 
本発明は、新規な神経栄養因子タンパク質であるＭＡＮＦ２とそれをコードする遺伝子配列を開示する。この分子は、ＭＡＮＦ２依存性の病態の治療、予防および／または診断において有用な、多岐にわたる治療法や診断法の開発に有用となる。更に本発明の分子は、一次ニューロンおよび中枢ニューロンのエフェクターとしても有用である。
【０００４】
近年、新規なヒト神経栄養因子である、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor）（ＭＡＮＦ、本願ではＭＡＮＦ１と命名）が同定され、培養した胎胚性中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を支えることが明らかとなった（国際特許出願 WO 01/19851）。ＭＡＮＦ１は、他の公知のタンパク質ファミリーと有意な相同性を示さない２０ｋＤの分泌タンパク質である。ＭＡＮＦ１のin vitroにおける性質は、パーキンソン氏病の処置に使用できること、そして他の神経変性疾患の処置にも使用できる可能性があることを示唆している。しかし、ＭＡＮＦ１の広い発現パターン（Shridhar et al., 1996, Oncogene 12:1931-1939）は、ＭＡＮＦ１の神経系以外の場所における未だ発見されていない機能や、他の色々な種類の細胞に対する影響の可能性を示唆している。
【０００５】
従って、ＭＡＮＦ１は、ＭＡＮＦ１またはその活性に基づく治療用、予防用および診断用の薬剤の研究において潜在的に貴重な標的となる、重要な分子である。また、ＭＡＮＦ１の代替またはＭＡＮＦ１と共に使用するためのホモログまたは他の関連分子を同定する必要性もある。
【０００６】
本発明に至るまでの研究において、本発明者らは、ＭＡＮＦ１に関連した新しい成長因子である、ＭＡＮＦ２と命名した新規分子を発見した。
【０００７】
よって、本発明の好ましい１つの態様は、図７に示した配列番号２のアミノ酸配列、あるいはその変異（mutation）、変異体（variants）または断片を含む、単離したタンパク質分子を含むものである。
【０００８】
特に好ましい態様において本発明のＭＡＮＦ２分子は、図７に示した配列番号２のアミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列の一部、断片、誘導体または類似体である。特に好ましい％類似性としては、約１９〜２０％と２９〜３０％が挙げられる。％類似性は図７に示した配列番号２のアミノ酸配列の全てまたは一部に対して、好ましくは少なくとも約３０％、更に好ましくは少なくとも約４０％、更に好ましくは少なくとも約５０％、更に好ましくは少なくとも約６０〜７０％、更に好ましくは少なくとも約８０〜９５％である。
【０００９】
本発明の別の好ましい態様においては、組み換え型分子を提供する。
【００１０】
本発明は更に、図７に示した配列番号２のアミノ酸配列の一部に対応するペプチド断片あるいはその化学的同等物を企図する。本発明の単離分子または組み換え分子は天然にグリコシル化されているものでもよいし、また、本発明の単離分子または組み換え分子は、それが単離または合成された細胞に基づく改変グリコシル化パターンを有していてもよい。例えば、組み換え技術によって原核生物中で製造した場合、その分子はグリコシル化されていない。分子は、天然に見られる全長型、端部を除去した型、または他の誘導型でもよい。
【００１１】
更に、任意に処方したＭＡＮＦ２ポリペプチド医薬組成物を開示する。本発明のポリペプチド組成物は、更に親水性の（例えば、薬学的に許容される）担体のような、許容される担体を含有してもよい。このような組成物は、ＭＡＮＦ２依存性病態の処置に有用である。
【００１２】
本発明の１つの好ましい態様は、ＭＡＮＦ２に特異的に結合する抗体である。好ましい抗体は、ヒトに対して非免疫原性のモノクローナル抗体である。ＭＡＮＦ２と結合する親和性が少なくとも１０-6Ｍである抗体が好ましく、１０-7Ｍのものがより好ましい。
【００１３】
更に本発明は、診断薬として有用な、ＭＡＮＦ２分子に対する抗体またはＭＡＮＦ２分子をコードする遺伝子に対する核酸プローブを企図する。
【００１４】
更なる態様においては、ＭＡＮＦ２抗体とＭＡＮＦ２を含有すると考えられる試料とを接触させ、それらが結合したかどうかを検出することを包含する、in vitroまたはin vivoでＭＡＮＦ２を検出するための方法を提供する。
【００１５】
本発明には、哺乳動物のＭＡＮＦ２依存性障害を診断するためのキットや試薬も含まれる。このようなキットは、ＭＡＮＦ２をコードする核酸配列内の変異の存在や不存在、ＭＡＮＦ２ポリペプチドレベルおよび／またはＭＡＮＦ２抗体レベルの上昇や低下を検出するための試薬を包含する。変異の存在またはＭＡＮＦ２レベルの異常は、哺乳動物がＭＡＮＦ２依存性障害に罹患していることを意味する。キットは更にアプリケーターとその使用のための取扱説明書を包含する。
【００１６】
上記に加え、本発明は、本願に記載した組み換え技術によるＭＡＮＦ２の製造に使用することのできる、ＭＡＮＦ２をコードする、単離した核酸分子、発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。単離した核酸分子とベクターは、トランスジェニック動物の製造と、ＭＡＮＦ２障害を有する患者の処置を目的とした遺伝子療法的応用にも有用である。
【００１７】
本発明のＭＡＮＦ２分子は、それ単独で、あるいはＭＡＮＦ１等の他の分子と組み合わせて、広範にわたる治療的および／または診断的応用に有用となる。従って本発明は、ＭＡＮＦ２分子あるいはその一部、断片、誘導体、ホモログまたは類似体を、１種以上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤と共に包含する医薬組成物にまで及ぶ。更に本発明は、図７に示した配列番号１の核酸配列、またはそれに対して少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約４０％、更に好ましくは少なくとも約６０〜７９％、または更に好ましくは少なくとも約８０〜９５％の類似性を示す核酸配列を含有するベクター、およびそれを包含する宿主細胞にも及ぶ。
【００１８】
１つの好ましい態様において、単離したＭＡＮＦ２ポリヌクレオチドは、図７に示した配列番号１または配列番号３の配列あるいはその相補鎖と少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号２と少なくとも１５％のアミノ酸類似性を有するが、少なくとも５％の不同性も有するタンパク質様分子をコードする、ゲノムクローンまたは部分ゲノムクローンも企図する。
【００２０】
本発明はまた、家畜（例えば、ヒツジ、ブタ、ウマとウシ）、愛玩動物（例えば、イヌとネコ）、および実験用動物（例えば、マウス、ラット、ウサギとモルモット）などの他の哺乳動物のみならず、鳥類（例えば、家禽類）、魚類や爬虫類などの哺乳動物以外の動物から得られる相同分子とそのコード配列も企図する。最も好ましい態様においては、ＭＡＮＦ２分子はヒト由来である。従って本発明は、ＭＡＮＦ２分子をコードするヒトゲノム配列とその部分配列にも及ぶ。
【００２１】
本発明の更に別の態様は、後述するＭＡＮＦ２分子をコードする核酸分子に関する。具体的には、本発明は、図７に示した配列番号１と実質的に同じヌクレオチド配列を含む核酸分子、上記ヌクレオチド配列の全体または一部と少なくとも１５％の類似性を有する核酸分子、または図７に示した配列番号１のヌクレオチド配列の逆相補鎖と低いストリンジェンシーの条件でハイブリダイズ可能であるが、図７に示した配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の類似性を有し、且つ少なくとも５％の不同性を示す核酸分子を提供する。
【００２２】
ストリンジェンシーの程度を定義するために、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング − 実験マニュアル）（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）の９．４７〜９．５1頁を適宜参照することができるが、この記載をもって本願に組み込まれたものとする。この文献に開示されている洗浄工程は高いストリンジンシーであると考えられる。本願において低いストリンジェンシーとは、４〜６×ＳＳＣ／０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、３７〜４５℃で２〜３時間の条件である。ハイブリダイゼーションに関与する核酸の原料と濃度によるが、代わりとなる他のストリンジェンシーの条件も使用することができる。例えば、１〜４×ＳＳＣ／０．２５〜０．５％ｗ／ｖ ＳＤＳ中、４５℃で２〜３時間とする中度にストリンジェントな条件や、０．１〜１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳ中、６０℃で１〜３時間とする高度にストリンジェントな条件も使用することができる。
【００２３】
更に別の態様において本発明は、ＭＡＮＦ２遺伝子を破壊したトランスジェニックなヒト以外の動物、あるいは図７に示した配列番号２または配列番号４の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する外因性ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの相補鎖を発現するトランスジェニックなヒト以外の動物である。
【００２４】
別の態様においては、パーキンソン氏病やアルツハイマー病などの神経学的疾患を含む種々の病理の処置方法に本発明を使用することができる。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、ＭＡＮＦ２ヌクレオチド配列について組織試料のスクリーニングを行うための方法である。
【００２６】
本願に記載した方法や材料と類似したもの、または同等のものを、本発明を実施したり試験したりするために使用することができるが、以下に最適な方法と材料を記載する。下記の方法、材料および具体例は、説明のためにのみ記載したものであり、本発明を制限するものではない。
【００２７】
発明の詳細な説明 
国立医学図書館（National Library of Medicine）（ＮＬＭ）のwwwサーバー内の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）でBlastサーチ（Altschul et al. "Gapped BLAST(R) and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs（Gapped BLAST(R)とPSI-BLAST：新世代のタンパク質データベースサーチプログラム)", Nucleic Acids Res. 25 (1997): 3389-3402を参照）を行うことで、我々はＭＡＮＦ１と高い配列類似性を示す、いくつかのヒトとマウスのＥＳＴ（expressed sequence tag）ｃＤＮＡを同定した。しかし、明らかにＭＡＮＦ１ホモログである全長オープンリーディングフレームを含有するヒトＥＳＴはなく、その多くは挿入、欠失およびＭＡＮＦ１と全く相同性を示さない長さの異なる５’末端を有していた。
【００２８】
我々は、ＭＡＮＦ１と相同であるいくつかの部分ヒトＥＳＴ ｃＤＮＡクローンをまとめてコンティグとし、ＭＡＮＦ１ホモログとなりうるものの全長ｃＤＮＡをヒトおよびマウスからクローニングするためのプライマーを設計した（実施例１を参照）。驚くべきことに、ＲＴ−ＰＣＲ法によって脳から全長マウスｃＤＮＡと全長ヒトｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、マウスおよびヒトのＭＡＮＦ２と命名した（ヒトＭＡＮＦ２とマウスのＭＡＮＦ２の核酸配列およびアミノ酸配列については図７を参照）。
【００２９】
ヒトＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡとマウスＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡは共に１８７アミノ酸のタンパク質をコードしている（図１と図２）。ヒトＭＡＮＦ１とヒトＭＡＮＦ２の全長アミノ酸配列の同一性、およびマウスＭＡＮＦ１とマウスＭＡＮＦ２の全長アミノ酸配列の同一性は、いずれも約６５％である（表Ａ参照）。ＭＡＮＦ１タンパク質とＭＡＮＦ２タンパク質は共に８個の保存されたシステインからなるユニークなパターンを有する。バイオインフォマティックス解析によると、ヒトＭＡＮＦ２は、染色体１０に位置する、４つのエクソンからなる比較的小さな遺伝子によってコードされている。ヒトＭＡＮＦ２タンパク質とマウスＭＡＮＦ２タンパク質の二次構造は、ＭＡＮＦ１タンパク質と同様にαへリックス構造とランダムコイル構造がその大部分を占めている。更に、種々の生物のゲノムとＥＳＴ配列のバイオインフォマティックス解析の結果は、哺乳動物は２種のＭＡＮＦ遺伝子を有し、魚類、両生類と鳥類は少なくとも１種のＭＡＮＦ遺伝子を有し、線虫であるCaenorhabditis elegansとショウジョウバエであるDrosophila melanogasterは１種のＭＡＮＦ遺伝子を有することを示唆している（図３と図４）。
【００３０】
我々は、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡの発現も分析した。結果は、分析した全２６種のヒト組織および８種の異なるヒト脳領域においてＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡは広範にわたるが、比較的低レベルで発現していることを示した。発現レベルは種々の組織の間で多少異なっていた。脳においては、成体の脳と比べて胎児の脳におけるＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡレベルが低かった（図５）。同様の結果が、マウスＭＡＮＦ２発現についても得られた。
【００３１】
ＭＡＮＦ２タンパク質が分泌されているかどうかを検討するために、Ｖ５タグとＨｉｓタグを付したヒトＭＡＮＦ２融合タンパク質をコードする発現構築物を作製し、ＣＯＳ−７細胞による発現と分泌を解析した。結果は、ＭＡＮＦ２がグリコシル化および／または翻訳後プロセシング（開裂）の関与する可能性のある、２０ｋＤａ以下の分泌タンパク質であることを示した（図６）。
【００３２】
【表Ａ】
2009519028.tif 000002
【００３３】
特に断りがない限り、全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同じである。以下の定義は明確性を増すために記載した。
【００３４】
「単離した」ものが分子である場合、この「単離した」という用語は、ある分子が本来存在する自然環境中の成分から同定され、分離および／または回収されたものであり、したがって、「人の手によって」天然の状態から改変されたものであることを意味する。例えば、単離したポリヌクレオチドは、ベクターや物質組成物の一部であってもよいし、また、細胞に含まれるものでもよく、ベクター、物質組成物、または特定の細胞はポリヌクレオチドが本来存在した環境ではないため、そのような場合も「単離した」ということができる。「単離した」という用語は、本発明のポリヌクレオチド配列の特性を示さないことが技術的にわかっているゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、全細胞から得た全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ製品、ゲノムＤＮＡ製品（電気泳動で分離し、ブロットに転写したものも含まれる）、流れ負荷全細胞ゲノムＤＮＡ製品やその他の組成物を指すことはない。
【００３５】
本発明で使用する「ポリヌクレオチド」は、図７に示した配列番号１、その断片または変異体（variant）をコードする核酸配列、あるいは図７に示した配列番号３に含まれる核酸配列またはその相補鎖を有する分子を意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、全長ｃＤＮＡ配列の５’と３’の非翻訳領域およびコード領域を含むヌクレオチド配列のみならず、核酸配列の断片、エピトープ、ドメインおよび変異体を含有することができる。更に、本願における「ポリペプチド」は、本発明のポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列を有する分子と大まかに定義することができる。本願において「断片」という用語を核酸に用いた際には、通常は少なくとも約１０ヌクレオチドの長さであり、典型的には少なくとも約２０ヌクレオチドであり、より典型的なものは約２０〜約５０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約５０〜約１００ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約３００〜約４００ヌクレオチドであり、最も好ましい場合、核酸断片は約５００ヌクレオチドを超える長さである。
【００３６】
本願において「断片」という用語をポリペプチドに用いた際には、通常は少なくとも約７個の連続したアミノ酸であり、典型的には、少なくとも約１５個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約４０個の連続したアミノ酸であり、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸であり、より好ましくは少なくとも約６０個の連続したアミノ酸である。最も好ましいペプチド断片の長さは約７０個超の連続したアミノ酸である。
【００３７】
「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して作製したＤＮＡやＲＮＡの類似体、および誘導体、断片およびホモログが含まれる。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡを含むものが好ましい。
【００３８】
「単離した核酸分子」は、核酸の天然原料に存在する他の核酸分子から分離したものである。単離した核酸は、核酸を誘導した生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接している配列（即ち、核酸の５’末端と３’末端に位置する配列）を含んでいないことが好ましい。例えば、単離したＭＡＮＦ２ ＤＮＡ分子は、核酸を誘導した細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡにおいて天然では核酸に隣接しているヌクレオチド配列を含有してもよいが、その量は、種々の態様によって、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満である。更に、ｃＤＮＡ分子などの単離した核酸分子を組み換え技術で製造した場合には、他の細胞成分や培養液を実質的に含有しないことが可能であり、また化学合成した場合には、化学的前駆体や他の薬品を実質的に含有しないことも可能である。
【００３９】
本発明の核酸分子、例えば、ＭＡＮＦ２核酸分子や上述したこのヌクレオチド配列の相補鎖は、標準的な分子生物学の技術と本願に記載の配列情報を用いて単離することができる。目的のＭＡＮＦ２核酸配列の全部または一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いることで、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術によってＭＡＮＦ２分子を単離することができる（Ausubel et al., In Current protocols in Molecular Biology (分子生物学の最近のプロトコル), John Wiley and Sons, publishers, 1989、および前出のSambrook et al）。
【００４０】
「類似体」とは、その構造が未変性化合物と類似しているが同一ではなく、特定の成分または側鎖が未変性化合物と異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は合成したものでも、異なる進化学的起源に由来するものでもよく、野生型と比べて類似した代謝活性または反対の代謝活性を有するものである。
【００４１】
誘導体または類似体は、以下に説明するように、修飾核酸またはアミノ酸を含有する限り全長でも、全長以外のものでもかまわない。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体としては、本発明の核酸またはタンパク質と実質的に相同な領域を包含する分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。実質的に相同な領域とは、同じ大きさの核酸またはアミノ酸配列同士の比較、または当業界で知られるコンピューターホモロジープログラムを用いて行ったアラインメントでアラインした配列との比較において、種々の態様にもよるが、少なくとも約７０％、８０％または９５％の同一性（好ましくは８０〜９５％の同一性）を有するものか、あるいはそれをコードする核酸が、上述したタンパク質をコードする配列の相補鎖とストリンジェントな条件、中度にストリンジェントな条件、または低度にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものを意味する（前出のAusubel et al.）。
【００４２】
「コードする」とは、遺伝子、ｃＤＮＡやｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、生物学的機構によって他のポリマーやマクロ分子の合成の際にテンプレートとして働くという固有の性質であり、他のポリマーやマクロ分子とは、定義されたヌクレオチド配列を有するもの（即ち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡとｍＲＮＡ）、または定義されたアミノ酸配列及びそれに起因する生物学的特性を有するものである。従って、遺伝子は、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳によって細胞または他の生物系の中でタンパク質が製造される場合には、タンパク質をコードしている。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表で提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖は、共にタンパク質あるいはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードしていると言える。
【００４３】
特に記載しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、一群の縮重配列であって、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質とＲＮＡをコードするヌクレオチド配列にはイントロンが含まれてもよい。
【００４４】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基と遺伝子の非コード鎖のヌクレオチド残基とからなり、それぞれのヌクレオチド残基は、遺伝子の転写によって製造されるｍＲＮＡ分子のコード鎖と相同または相補的である。
【００４５】
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」も、ｍＲＮＡ分子内のヌクレオチド残基からなるものであり、ヌクレオチド残基は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の際にトランスファーＲＮＡ分子のアンチコドン領域と対合するもの、あるいは終止コドンをコードするものである。従って、コード領域は、ｍＲＮＡ分子のコードする成熟タンパク質には含まれないアミノ酸残基に対応するヌクレオチド残基（例えば、タンパク質排出シグナル配列のアミノ酸残基）を含んでいてもよい。
【００４６】
「制御配列」とは、特定の宿主生物において、発現可能な状態に結合したコード配列の発現を可能とするＤＮＡ配列である。原核生物の制御配列には、プロモーター、オペレーター配列とリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルとエンハンサーを使用する。
【００４７】
「発現可能な状態に結合した核酸」とは、核酸が、他の核酸配列と機能的な関係を築くように配置されている状態をいう。例えば、プロモーターやエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列はプロモーターやエンハンサーに発現可能な状態で結合している。また、リボゾーム結合部位が翻訳を促進する位置に存在する場合、コード配列はリボゾーム結合部位に発現可能な状態で結合している。一般的に、「発現可能な状態で結合した」とは、結合した複数のＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌用リーダー配列の場合は、連続し、読み取り相に含まれることを意味する。しかし、エンハンサーは連続していなくてもよい。結合は、適当な制限部位で連結することによって達成する。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを一般的な用法に従って使用する。
【００４８】
「ゲノムＤＮＡ」は、遺伝子と相同なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖である。例えば、染色体断片と哺乳動物ｍＲＮＡから逆転写によって誘導したｃＤＮＡとは、共にゲノムＤＮＡである。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」は一連の連結したヌクレオチド残基を含むものであり、このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応や他の応用法に使用するのに十分な数のヌクレオチド塩基を有している。短いオリゴヌクレオチド配列をゲノム配列やｃＤＮＡ配列に基づいて作製するか、そこから設計し、オリゴヌクレオチドと同一、類似または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを特定の細胞または組織について増幅、確認または存在を明らかにするために使用する。オリゴヌクレオチドは核酸の一部を含むものである。
【００５０】
「変異体（variant）」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を維持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。一般的に変異体は、全体的に非常に類似しており、多くの領域において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００５１】
「ストリンジェンシー」。ホモログ（即ち、ヒト以外の生物種から誘導したＭＡＮＦ２分子をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、当業界で周知の核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの方法を用いて、特定のヒト配列の全部又は一部をプローブとした、低度、中度または高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションで得ることができる。
【００５２】
一本鎖ＤＮＡが相補的断片にハイブリダイズする特異性は反応条件の「ストリンジェンシー」によって決まる。二本鎖ＤＮＡを形成する傾向が低下するほど、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは増加する。核酸ハイブリダイゼーション反応においては、特異的ハイブリダイゼーションが優先されるようにストリンジェンシー（高いストリンジェンシー）を選択することができ、例えば、ライブラリーから全長クローンを同定するために使用することができる。特異性の低いハイブリダイゼーション（低度のストリンジェンシー）は、関連するが同じではないＤＮＡ分子（相同であるが同一ではないもの）や区分を同定するために使用することができる。
【００５３】
二本鎖ＤＮＡは次の特性に基づいて安定化される：（1）相補的塩基対の数、（2）塩基対の種類、（3）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（4）反応温度、そして（5）二本鎖ＤＮＡの安定性を低下させるホルムアミドのような特定の有機溶媒の存在。一般的に、プローブが長いほど完全なアニーリングに必要な温度は高くなる。一般的な方法は、温度を変化させることであり、即ち、相対温度が高ければよりストリンジェントな反応条件となる。前出のAusubel et al.には、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関する優れた説明がある。
【００５４】
「ストリンジェントな条件下」でハイブリダイズするとは、少なくとも６０％相同のヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズした状態を維持するハイブリダイゼーションプロトコルを意味する。ストリンジェントな条件としては、一般的に一定のイオン強度における特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃以下の条件を選択する（WO 01/70174、およびPCT/USO1/0904330）。低いストリンジェンシーである「低度にストリンジェントな条件」は、中度のストリンジェンシー条件（前出のSambrook）よりもストリンジェンシーの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件を使用することで、ポリヌクレオチドが標的となるＭＡＮＦ２標的配列の全長、断片、誘導体または類似体にハイブリダイズするようにする。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の一例として、３５％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ フィコール、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび１０％（wt/vol）硫酸デキストランを含む溶液中、４０℃におけるハイブリダイゼーションと、それに続く、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡと０．１％ ＳＤＳを含む溶液を用いた、５０℃で１回以上の洗浄が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の低いストリンジェンシーの条件としては、前出のAusubel et al.、Kriegler MP (1990) "Gene transfer and expression, a laboratory manual (遺伝子伝播と発現、実験マニュアル)" 、やShilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981) に記載の、種間ハイブリダイゼーションの条件が挙げられる。
【００５５】
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをテンプレートとし、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅技術によってＭＡＮＦ２を増幅することができる。こうして得た核酸を適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。更にＭＡＮＦ２配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡ合成装置によって製造することもできる。
【００５６】
「プライマー」とは、指定したポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズすることができ、相補的なポリヌクレオチドの合成開始点を提供することのできるポリヌクレオチドである。このような合成は、合成を誘導する条件下、即ち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチドテンプレート、そしてＤＮＡポリメラーゼなどの合成用試薬の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれた時に生じる。典型的なプライマーは一本鎖であるが、二本鎖でもよい。
【００５７】
典型的なプライマーはデオキシリボ核酸であるが、種々の用途において、広範にわたる合成および天然のプライマーが有用である。テンプレートにハイブリダイズして合成開始点として機能するように設計されたプライマーはテンプレートと相補的であるが、テンプレートの配列を完全に反映する必要はない。このような場合、プライマーのテンプレートへの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば発色性、放射性または蛍光性の成分で標識し、検出可能な成分として使用することができる。
【００５８】
本願で使用する「ベクター」という用語は、外因性の核酸をコードする全てのプラスミドやウイルスを意味する。この用語には、ウイルス粒子や細胞への核酸の転送を助ける非プラスミド性や非ウイルス性の化合物、例えば、ポリリシン化合物なども含まれると理解されたい。ベクターは、所望のタンパク質またはその変異体（mutant）をコードする核酸を細胞に送達ための送達用ベヒクルとして適切なウイルスベクターでもよいし、同じ目的に適した非ウイルスベクターでもよい。ＤＮＡを細胞や組織に送達するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの具体例は当業界でよく知られており、例えば、Ma et al.（1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746に記載されている。ウイルスベクターの例としては、組み換えワクシニアウイルス、組み換えアデノウイルス、組み換えレトロウイルス、組み換えアデノ随伴ウイルス、組み換えトリポックスウイルスなど（Cranage et al., 1986, EMBO J. 5.3057-3063、1994年8月18日公開の国際特許出願公報 W094/17810、1994年10月27日公開の国際特許出願公報 W094/23744）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非ウイルスベクターの例としては、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列、好ましくはその特定の用途に応じて少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、またはそれ以上（例えば、６０００ｎｔ）のものである。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列を検出するためのものである。より長いプローブは、天然原料または組み換え原料から得ることができ、非常に特異的で、短いオリゴマープローブよりもハイブリダイズするのに時間がかかる。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよく、ＰＣＲ、膜によるハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を示すように設計することができる。プローブは、生物試料中の核酸分子にもハイブリダイズするので、染色体地図の作成、連鎖解析、組織の同定および／またはタイピング、ならびに種々の法医学的および診断的な本発明の方法に直ちに応用することができる。
【００６０】
プローブは、最適には少なくとも１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００ヌクレオチドの連続したセンス鎖ヌクレオチド配列、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列、あるいは目的のＭＡＮＦ２ ＤＮＡ配列の自然突然変異体にハイブリダイズする、実質的に純粋な状態に精製されたオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
未変性の（native）ＭＡＮＦ２ ＤＮＡ配列の全長または部分は、以下に例示する類似した（相同な）配列を「釣り上げる」ために使用することができる（前出のAusubel et al.およびSambrook）。（１）全ての生物種（例えば、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、細菌、ウイルス、レトロウイルス、酵母）のｃＤＮＡライブラリーから得られる、ＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡの全長または断片、（２）細胞や組織から得られる、ＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡの全長または断片、（３）生物種内に見られる変異体および（４）他の生物種のホモログや変異体。関連する遺伝子をコードする関連した配列を見つけるために、プローブは特徴的な配列または縮重を含んだ配列をコードするように設計することができる。配列は、未変性のＭＡＮＦ２配列に含まれるプロモーターエレメントやエンハンサーエレメントおよびイントロンを含むゲノム配列でもよい。
【００６２】
ハイブリダイゼーションを検出するために、例えば、32Ｐや35Ｓなどの放射性核種、またはアビジン−ビオチン系を介してプローブにカップリングするアルカリホスファターゼなどの酵素標識でプローブを標識する。標識したプローブは、所望の生物種のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーから、ＭＡＮＦ２に相補的な配列を有する核酸を検出するために使用する。このようなプローブは、対象から得た細胞試料中のＭＡＮＦ２レベルの測定（例えば、ＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡレベルの検出またはゲノムＭＡＮＦ２内の変異または欠失の検出）などを用いて、ＭＡＮＦ２の発現に誤りのある細胞または組織を同定するための診断キットの一部として使用することができる。
【００６３】
「アンチセンス」とは、特にタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、または非コード鎖と実質的に相同な配列を意味する。ここで定義したように、アンチセンス配列はタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、ＤＮＡ分子のコード鎖のコード領域にのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上に特定された、コード配列の発現を調節する制御配列に相補的でもよい。
【００６４】
「ホモログ」とは、他の生物種から誘導した特定遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００６５】
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」、あるいはこれらの変異体とは、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルの相同性によって特徴付けられた配列を意味する。相同ヌクレオチド配列は、ＭＡＮＦ２のアイソフォームをコードする配列である。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果、同じ生物の異なる組織で発現されていることもある。また、異なる遺伝子がアイソフォームをコードすることもある。本発明において相同ヌクレオチド配列には、ヒト以外の生物種（脊椎動物を含むが、これに限定されるものではなく、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマや他の生物も含む）のＭＡＮＦ２をコードするヌクレオチド配列も含まれる。相同ヌクレオチド配列には、更に本願で開示するヌクレオチド配列の天然に見られるアレル変異やその他の変異も含まれるが、これらに限定されるものではない。しかし、相同ヌクレオチド配列には、ヒトＭＡＮＦ２をコードするヌクレオチド配列そのものは含まれない。相同核酸配列には、目的のＭＡＮＦ２配列の保存性の高いアミノ酸置換をコードする核酸配列のみならず、ＭＡＮＦ２生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列も含まれる。
【００６６】
ＭＡＮＦ２の「パーセント（％）核酸配列同一性」とは、複数の配列のアライメントを行い、必要であれば、最大の配列同一性を達成するためのギャップを導入した後の候補配列に含まれる、特定ＭＡＮＦ２と同一であるヌクレオチドのパーセントである。
【００６７】
％核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業界で知られる様々な方法で達成することができる。例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR)またはClustalX ソフトウエアのような、一般に入手可能なコンピューターソフトウエアを使用することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、アラインメントの測定のための適切なパラメーターを決定することができる。
【００６８】
BLASTのタンパク質サーチは、以下に示すパラメーターを用いたXBLASTプログラム（ＮＣＢＩのウエブサイトでは“blastn”と称する）またはＮＣＢＩの“blastp”プログラムを用いて行うことができる： 予想値は１０．０、BLOSUM 62 スコアのマトリックスは本願明細書に記載したタンパク質分子に相同なアミノ酸配列が得られる値。
【００６９】
比較を目的としたギャップ有りのアラインメントを得るためには、Altschul et al.（1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）に記載のGapped BLASTを使用することができる。代わりに、分子間のかけ離れた関連性および共通するパターンを共有する分子間の関連性を検出する反復サーチを行うために、PSI-BlastまたはPHI-Blastを使用することもできる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastのプログラムを使用する際には、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTとNBLAST）の初期設定パラメーターを使用することができる。http ://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【００７０】
ＭＡＮＦ２遺伝子の「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）はＭＡＮＦ２をコードしている。ＯＲＦとは、通常は開始コドン（ＡＴＧ）を有し、３つの「終止」コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）のいずれか１つで終止するヌクレオチド配列である。しかし本発明においてＯＲＦは、開始コドンと終止コドンの有無にかかわらず、コード配列のいかなる部分でもかまわない。比類のない配列を得るためには、好ましくはＭＡＮＦ２−ＯＲＦは少なくとも５０個のアミノ酸をコードしている。
【００７１】
「組み換えポリヌクレオチド」とは、天然では連結していない配列を有するポリヌクレオチドを意味する。増幅または組み立てた組み換えポリヌクレオチドを、適切なベクターに導入し、このベクターを適切な宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【００７２】
組み換えポリヌクレオチドは、非コード機能部位（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位など）としても機能しうる。
【００７３】
「組み換えポリペプチド」は、組み換えポリヌクレオチドの発現によって製造されるものである。
【００７４】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基、関連した天然の構造変異体、およびその合成非天然類似体がペプチド結合で連結したポリマー、あるいは上記ポリマーに関連した天然の構造変異体、およびその合成非天然類似体である。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置で合成することができる。
【００７５】
「タグ」ポリペプチドとは、目的のタンパク質にペプチド結合で連結することによって、目的タンパク質の位置決定、細胞抽出物からの精製、結合アッセイに使用するための固定、あるいは生物学的性質および／または機能の研究に使用することのできるタンパク質である。「タグ」エピトープを含有するキメラ（即ち、融合）タンパク質は、タグを結合する樹脂に固定化することができる。このようなタグエピトープと樹脂は、次に例示するように、当業界でよく知られている：  複数の連続したヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）を包含するタグエピトープは、このエピトープを含むキメラタンパク質のニッケル−ニトリロトリ酢酸−アガロースによる単離を可能にし、赤血球凝集素（ＨＡ）タグエピトープは、このエピトープを含むキメラタンパク質が抗ＨＡ−モノクローナル抗体アフィニティーマトリックスと結合することを可能にし、ｍｙｃタグエピトープは、このエピトープを含むキメラタンパク質が抗ｍｙｃモノクローナル抗体アフィニティーマトリックスと結合することを可能にし、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグエピトープはグルタチオン−セファロースカラムと、このエピトープを含むタンパク質との結合を誘導し、そしてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグエピトープはマルトース−セファロースカラムと、このエピトープを含むタンパク質との結合を誘導する。このようなタグエピトープを含むタンパク質の製造方法は当業界でよく知られており、標準的な学術文献、例えば、前出のSambrook et al.やAusubel et al.に記載されている。また、タグエピトープに対する抗体は、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイや細胞の免疫染色による融合タンパク質の検出と位置決定を可能にする。
【００７６】
「抗体」という用語は最も広義で使用しており、特にモノクローナル抗体、多価特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディおよび一本鎖分子のみならず、所望の生物活性を有する限り、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’) とＦｖ）もこの定義に含まれる。
【００７７】
本願で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、一群の実質的に相同な抗体から得られた抗体である、即ち、一群に含まれる個別の抗体は、微量しか存在しない天然で発生しうる変異を除けば、全て同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製品と比べて、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原に存在する単一の決定基に対するものである。その特異性に加えモノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンに汚染されていない培養ハイブリドーマで合成される点が有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の一群から得られたものという抗体の性質を表しており、特定の方法で抗体を製造することが必要であると理解してはいけない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体は、初めてKohler et al., Nature, 256: 495 (1975)に発表されたハイブリドーマ法、あるいは組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号（Cabilly et al.）を参照）で製造することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)とMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００７８】
本願におけるモノクローナル抗体には、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のみならず、所望の生物活性を有する限り、その断片も含まれる。キメラ抗体とは、その重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の生物種から誘導した抗体の対応する配列と同一または相同であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、鎖の残りは、別の生物種から誘導した抗体の対応する配列と同一または相同であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属するものである（前出のCabilly et al.、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。
【００７９】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンから誘導した最小配列を含むその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’) や、抗体の他の抗原結合性サブ配列）である。大部分のヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定部位（ＣＤＲ）内の残基を、所望の特異性、親和性と結合容量（capacity）を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト動物種の抗体（ドナー抗体）の残基と置換したものである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を、対応する非ヒト残基と置換する。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入したＣＤＲやフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでいてもよい。このような修飾は、抗体の性能を更に改良し、最適化するために行われる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つ存在する可変ドメインの実質的に全てを含んでおり、可変ドメインにおいては、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列である。最適なヒト化抗体は、更に免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリン、の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含んでいる。詳細については、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)、とPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照。ヒト化抗体には、霊長類化抗体も含まれ、このような抗体の抗原結合領域は、サルを目的の抗原で免疫して製造した抗体から誘導したものである。
【００８０】
「サイトカイン」という用語は、１つの細胞集団が分泌し、細胞間伝達因子として他の細胞に働くタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカインおよび古典的なポリペプチドホルモンが挙げられる。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；パラ甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトジェン；腫瘍壊死因子αとβ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−６、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、アルテミン、ニュールツリン、ペルセフィン、ＡＬ−Ｉおよび他のｅｐｈ受容体ファミリーのリガンドなどの神経栄養因子または神経成長因子；血小板誘導成長因子；ＴＧＦ−αとＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−ＩとII；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子；インターフェロン−α、−βと−γなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１とＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ならびにＬＩＦやキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本願で使用するように、サイトカインという用語には、天然の材料または培養組み換え細胞から得たタンパク質、および本来の配列からなるサイトカインの生物活性同等物が含まれる。更に、ＴｒｋＡ−ＩｇＧや他の可溶性キメラ受容体のような、サイトカイン活性を制御する遺伝子組み換え分子も含まれる。
【００８１】
処置の対象となる「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される全ての動物であり、ヒト、飼育用および家畜用の動物、ならびに動物園用、スポーツ用および愛玩用の動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００８２】
「生理学的に許容される」担体、賦形剤または安定化剤は、使用する容量および濃度において、それと接触する細胞または哺乳動物に対して毒性のないものである。多くの場合、生理学的に許容される担体は、水溶性のｐＨ緩衝化溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸や他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンやリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースやデキストリンなどの単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニックやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００８３】
「生物活性を有するポリペプチド」とは、容量依存的または非依存的な特定の生物学的アッセイで測定した活性が、成熟型を含む本発明のポリペプチドの活性と類似しているが、必ずしも同一ではないポリペプチドである。容量依存性が存在する場合には、活性が本発明のポリペプチドと同一である必要はないが、しかし、容量依存性は、測定した活性について本発明のポリペプチドが示すものと実質的に類似していなければならない（即ち、候補ポリペプチドの活性は、本発明のポリペプチドよりも高いか、または本発明のポリペプチドの活性に対する活性低下率が約２５分の１以下、好ましくは約１０分の１以下、最も好ましくは約３分の１以下である）。
【００８４】
「処置」とは、治療的処置と予防的または防御的処置の両方を意味する。処置の必要なものには、既に障害を有するもののみならず、障害の発生を防止すべきものが含まれる。
【００８５】
本発明は、特許願 WO 01/19851に記載のあるＭＡＮＦ１に相同なタンパク質であるＭＡＮＦ２の発見に基づくものである。本願に記載した実験は、ＭＡＮＦ２分子が１８７アミノ酸からなるタンパク質であり、分析した全ての組織で発現され、主に心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、前立腺、胸腺および脳のいくつかの異なる領域で発現されていることを示した。特にＭＡＮＦ２タンパク質は、ニューロンを含む種々の組織に存在が認められ、この結果は、ＭＡＮＦ２受容体含有細胞の増殖、成長、生存、分化、代謝または再生を刺激するために、ＭＡＮＦ２アゴニストが使用可能であることを示している。
【００８６】
１つの態様においては、本発明は、ＭＡＮＦ２ポリペプチド、その生物活性断片、または抗原性断片を包含する精製タンパク質、あるいは上記ポリペプチドまたは断片からなる精製タンパク質を提供する。
【００８７】
他の１つの態様においては、本発明は、ＭＡＮＦ２タンパク質との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を包含するタンパク質、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるタンパク質にも関する。
【００８８】
遺伝子コードには縮重が存在するために、図７に示した配列番号１のヌクレオチド配列に含まれるｃＤＮＡまたはその断片の核酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を有する核酸分子の多くが、「機能的な活性を有する」ポリペプチドをコードすることを当業者は直ちに認識する。実際に、いずれのヌクレオチド配列の縮重変異体も全て同じポリペプチドをコードするので、多くの場合、多数の核酸分子が「機能的な活性を有する」ポリペプチドをコードすることは当業者には明らかである。更に当業界においては、上述の核酸分子が縮重変異体ではない場合でも、かなりの数の核酸分子が機能的な活性を有するポリペプチドをコードすると認められる。その理由は、タンパク質の機能に著しい影響を与える可能性が低いかまたは与えないと考えられるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸が他の１つの脂肪族アミノ酸により置換される場合）について、当業者は熟知しているからである。これについては下記で詳細に説明する。
【００８９】
例えば、表現形質に影響することのないアミノ酸置換を行うための指針がBowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions (タンパク質配列のメッセージを解読する：アミノ酸置換の許容度)" Science 247:1306-1310 (1990) に開示されており、この論文の著者は、変更するアミノ酸配列の許容度を検討するための２つの主要な方法を示している。
【００９０】
第１の方法は、進化の過程における自然淘汰によるアミノ酸置換の許容度を活用する。色々な生物種の有するアミノ酸配列を比較することで、保存されているアミノ酸を同定することができる。このような保存されているアミノ酸はタンパク質の機能に重要であると考えられる。一方、自然淘汰によってある位置のアミノ酸置換が許容されたということは、この位置のアミノ酸はタンパク質の機能にとって決定的ではないことを意味する。従って、アミノ酸置換を許容する位置のアミノ酸は、タンパク質の生物活性を維持しながら修飾することができる。
【００９１】
ＭＡＮＦ２の天然のアレル変異の他にも、ＭＡＮＦ２ヌクレオチド配列のコードするＭＡＮＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列に置換が生じるように、突然変異によってＭＡＮＦ２ヌクレオチド配列に変更を導入することもできる。ヌクレオチドの置換によって、ＭＡＮＦ２ポリペプチドの配列中の「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物活性を変更することなくＭＡＮＦ２の野生型配列において変更することのできる残基であり、「必須」アミノ酸残基は、生物活性に必要なアミノ酸残基である。例えば、本発明のＭＡＮＦ２分子間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更の影響を受けにくい部分であると予測される。同類置換が可能なアミノ酸は当業者にはよく知られている。有用な同類置換を表Ｂの「好ましい置換」の欄に示した。あるクラスのアミノ酸を、同じクラスの他のアミノ酸で置換した同類置換体も、化合物の生物活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。
【００９２】
第２の方法では、遺伝子工学を用いてクローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化をもたらす変異を導入し、タンパク質の機能に重要な領域を同定する。例えば、部位特異的変異法やアラニンスキャニング変異法（分子内の全ての残基に対して単一アラニン変異を導入する方法）を用いることができる。Cunningham et al., Science 244:1081-1085 (1989) を参照。その結果として得られた変異分子について、次にその生物活性を試験する。同類アミノ酸置換（下記の表Ｂ参照）の他に、本発明の変異体には次の（i）〜（iv）の変異を有していてもよい：（i）１つまたはそれ以上の非同類アミノ酸残基であって、置換したアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされているかコードされていないもの、（ii）置換基を有するアミノ酸残基による、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、（iii）成熟ポリペプチドと、ポリペプチドの安定性および／または溶解性を向上する化合物（例えば、８９６Ｉポリエチレングリコール）などの他の化合物との融合、または（iv）ポリペプチドと、ＩｇＧ Ｆｃ融合ペプチド、血清アルブミン（好ましくはヒト血清アルブミン）またはその断片や変異体、リーダー配列または分泌性配列、精製を容易にする配列などの付加的なアミノ酸配列との融合。このような変異ポリペプチドは、本願の開示に基づいて当業者が作製可能である。
【００９３】
【表Ｂ】
2009519028.tif 000003
【００９４】
本発明の更なる態様は、アミノ酸置換を導入したアミノ酸配列を含むポリペプチドに関し、該ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、本願で開示するポリペプチド配列に１〜５０個のアミノ酸置換を導入したアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。上記アミノ酸置換は４０個以下が好ましく、３０個以下がより好ましく、２０個以下が更に好ましい。非常に好ましいポリペプチドは、そのアミノ酸配列が図７に示した配列番号２のＭＡＮＦ２ポリペプチド、その一部またはその補体（complement）のアミノ酸配列を包含し、１個以上であって、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個以下のアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換の数は少ないほど好ましい。
【００９５】
好ましい態様においては、アミノ酸置換は同類置換である。
【００９６】
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、図７に示した配列番号２の参照用アミノ酸配列の断片または変異体を含むか、あるいは断片または変異体からなるポリペプチドであって、上記断片または変異体は、参照用アミノ酸配列と比較して、１〜５個、５〜１０個、５〜２５個、５〜５０個、１０〜５０個または５０〜１５０個のアミノ酸残基の付加、置換および／または欠失を有する。
【００９７】
１つの態様においては、ＭＡＮＦ２ポリペプチドの製造に適した技術は当業界で広く知られており、そこにはポリペプチドの内因性原料からＭＡＮＦ２を単離する技術、（ペプチド合成装置を用いた）ペプチド合成法および組み換え技術（またはこれら技術の組み合わせ）が含まれる。
【００９８】
１つの態様においては、単離した核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、ＭＡＮＦ２のアミノ酸配列と少なくとも約４５％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、８０％または９０％、最も好ましくは約９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【００９９】
他の態様においては、ＭＡＮＦ２ポリペプチド変異体は、少なくとも以下の（１）〜（３）のいずれかを有する：（１）図７に示した配列番号２の全長未変性ＭＡＮＦ２ポリペプチド配列と約８０％の相同性を示すアミノ酸配列、（２）シグナルペプチドを欠いたＭＡＮＦ２ポリペプチド配列、または（３）全長ＭＡＮＦ２ポリペプチド配列の他の断片。例えば、ＭＡＮＦ２ポリペプチド変異体には、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を全長未変性アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付加したか、Ｎ末端またはＣ末端から欠失したＭＡＮＦ２ポリペプチドが含まれる。ＭＡＮＦ２ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、全長未変性ＭＡＮＦ２ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の同一性を有し、好ましくは少なくとも約８１％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の同一性を有し、少なくとも約９９％の同一性を有することが最も好ましい。ＭＡＮＦ２ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、全長ＭＡＮＦ２ポリペプチド配列のシグナルペプチドや他の断片を欠失していてもよい。通常、ＭＡＮＦ２変異体ポリペプチドの長さは少なくとも約１０アミノ酸であり、一般的には少なくとも約２０アミノ酸であり、より一般的には少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０アミノ酸、またはより長いものである。
【０１００】
本発明の１つの態様においては、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子、あるいは上記ポリヌクレオチドからなる単離した核酸分子を提供する。（ａ）図７に示した配列番号１のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１の一部であって、成熟ＭＡＮＦ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｃ）生物活性を有するＭＡＮＦ２ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）ＭＡＮＦ２ポリペプチドの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【０１０１】
更に本発明は、遺伝コードの縮重ゆえに本発明のヌクレオチド配列とは異なる核酸分子であって、配列番号２または４のアミノ酸配列で表されるＭＡＮＦ２タンパク質と同じものをコードする核酸分子も包含する。
【０１０２】
更に、核酸分子の集団の中には、ＭＡＮＦ２のアミノ酸配列を変化させる配列多型が存在してもよい。例えば、個体間の対立遺伝子変異はＭＡＮＦ２の遺伝的多型を示す。「遺伝子」と「組み換え遺伝子」という用語は、ＭＡＮＦ２、好ましくは脊椎動物のＭＡＮＦ２をコードする読み枠（ＯＲＦ）を含む核酸分子を意味する。このような天然の対立遺伝子変異は、典型的には１〜５％の変異をＭＡＮＦ２にもたらす。このようなヌクレオチド変異およびその結果であるＭＡＮＦ２アミノ酸配列の多型は天然の対立遺伝子変異の産物であり、ＭＡＮＦ２の機能的活性を変化させないものである。このような変異および多型のそれぞれとその全てが本発明の範囲に含まれる。
【０１０３】
更に、ヒトのＭＡＮＦ２配列とは異なるヌクレオチド配列からなる他の生物種のＭＡＮＦ２の存在も考えられる。天然のアレル変異や本発明のＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡのホモログに対応する核酸分子は、ＭＡＮＦ２との相同性に基づいて、ｃＤＮＡから誘導したプローブをストリンジェントな条件下で相同ＭＡＮＦ２配列にハイブリダイズさせることで単離することが可能である。
【０１０４】
「ＭＡＮＦ２変異体ポリヌクレオチド」または「ＭＡＮＦ２変異体核酸配列」とは、以下の（１）〜（３）のいずれかを有する活性ＭＡＮＦ２をコードする核酸分子を意味する：（１）全長未変性ＭＡＮＦ２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の相同性を有するもの、（２）シグナルペプチドを欠失した全長未変性ＭＡＮＦ２、または（３）全長ＭＡＮＦ２の他の断片。通常、ＭＡＮＦ２変異体ポリヌクレオチドは、全長未変性ＭＡＮＦ２をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有し、好ましくは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の同一性を有し、少なくとも約９９％の同一性を有することがより好ましい。ＭＡＮＦ２変異体ポリヌクレオチドがシグナルペプチドを欠失した全長未変性ＭＡＮＦ２をコードする時には、シグナル配列を有していても、有していなくてもよく、また、上記ポリヌクレオチドは他の断片を欠失した全長ＭＡＮＦ２をコードするものでもよい。変異体には、未変性ヌクレオチド配列は含まれない。
【０１０５】
通常、ＭＡＮＦ２変異体ポリヌクレオチドの長さは少なくとも約３０ヌクレオチドであり、一般的には少なくとも約６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００または４００ヌクレオチドであり、より一般的には少なくとも約５００ヌクレオチド、またはより長いものである。
【０１０６】
本願で開示するヒトおよびマウスの配列をコードする哺乳動物ＭＡＮＦ２のｃＤＮＡ配列の構造とヌクレオチド配列は、他の哺乳動物からＭＡＮＦ２をコードしている遺伝子配列をクローニングすることを可能にした。本発明において特に興味深い点は、本願に開示した配列を用いてヒトＭＡＮＦ２分子のクローニングが可能な点である。ＭＡＮＦ２をコードするＤＮＡは、本願実施例で行ったように、ＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡを有すると考えられ、検出可能なレベルで発現する組織から調製したいかなるｃＤＮＡライブラリーからも得ることができる。従って、ＭＡＮＦ２ ＤＮＡは、例えば哺乳動物胎児の肝臓、脳、筋肉、腸および末梢神経から調製したｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。ＭＡＮＦ２をコードする遺伝子は、ゲノムライブラリーまたはオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１０７】
目的遺伝子またはそれにコードされているタンパク質を同定するように設計したプローブ（ＭＡＮＦ２に対する抗体または約２０〜８０塩基からなるオリゴヌクレオチドなど）でライブラリーのスクリーニングを行う。選択したプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子クローニング：実験マニュアル) New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) の１０〜１２章に記載の標準的な方法、または上記Sambrook et al.のセクション１４に記載のＰＣＲ法で行うことができる。
【０１０８】
ＭＡＮＦ２のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチドの変化をＭＡＮＦ２ ＤＮＡに導入するか、または目的ＭＡＮＦ２ポリペプチドを合成することで調製することができる。このような変異体は、図７の配列番号２または４に示したような、天然ＭＡＮＦ２のアミノ酸配列の内部または末端の一方か両方に挿入、置換および／または特定の欠失を有する。好ましくは、このような変異体は、成熟配列の内部または末端の一方か両方に挿入および／または置換を有するか、あるいはＭＡＮＦ２のシグナル配列の内部または末端の一方か両方に挿入、置換および／または特定の欠失を有する。成熟配列とシグナル配列の両方に変異を有していてもよい。本願で定義した目的の生物活性を有する最終的な構築物が得られる限り、挿入、置換および／または特定の欠失を色々な組み合わせで用いることができる。
【０１０９】
上述したような未変性配列の変異体は、米国特許第5,364,934号に記載の同類および非同類変異に関する技術とガイドラインを元に作製することができる。このような方法には、オリゴヌクレオチドを介した（部位特異的）変異法、アラニンスキャニング変異法およびＰＣＲ変異法が含まれる。
【０１１０】
ＭＡＮＦ２をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）を、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）や発現のために複製可能なベクターに挿入する。種々のベクターが入手可能である。一般的にベクター構成成分には、１つまたは複数の以下の成分が含まれるが、これらに限定されるものではない：シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーターおよび転写停止配列。
【０１１１】
本発明のＭＡＮＦ２類は、直接的に組換えによって製造する以外にも、異種ポリペプチド（好ましくはシグナル配列や特定の開裂部位を成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に有する他のポリペプチド）との融合ポリペプチドとして製造することもできる。融合タンパク質は組み換え法によって容易に調製することができる。読み枠を合わせてＭＡＮＦ２をコードする核酸とＭＡＮＦ２をコードしない核酸とを融合することができるが、ＭＡＮＦ２をコードしない核酸はＭＡＮＦ２のＮ末端、ＣＯＯＨ末端または内部に融合させる。融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置などの公知の方法で合成することもできる。ＭＡＮＦ２融合タンパク質は全長ＭＡＮＦ２のいかなる部分を含有していてもよく、生物活性部位をいくつも含有していてもよい。融合ポリペプチドは、発現の研究、細胞の位置決定、バイオアッセイおよびＭＡＮＦ２の精製に有用である。
【０１１２】
また、ＭＡＮＦ２融合タンパク質は、ＰＣＲ増幅法とアンカープライマーを用いて容易に製造することもできる。使用するアンカープライマーは、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを調製するものであり、次いで増幅産物のアニーリングを行い、それを再増幅することでキメラ遺伝子配列を製造することができる（Ausubel et al., supra）。
【０１１３】
シグナル配列はベクターの構成要素でもよいし、ベクターに挿入するＭＡＮＦ２ ＤＮＡの一部でもよい。選択した異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（例えば、シグナルぺプチダーゼによって開裂される）ものが好ましい。ＭＡＮＦ２の本来のシグナル配列を認識および処理することのない原核生物を宿主細胞とする場合には、例えば、アルカリホスファターゼのリーダー配列、ペニシリナーゼのリーダー配列および熱安定性II型エンテロトキシンのリーダー配列からなる群より選ばれる原核性シグナル配列で、ＭＡＮＦ２シグナル配列を置換する。酵母による分泌のためには、本来のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼのリーダー配列、α因子のリーダー配列（Saccharomyces属およびKluyveromyces属のα因子リーダー配列を含み、後者は1991年4月23日に発行された米国特許第5,010,182号に記載されている）、酸フォスファターゼのリーダー配列やCandida albicansグルコアミラーゼのリーダー配列（1990年4月4日に公開されたEP 362,179を参照）で置換することができる。哺乳動物細胞による発現においては、本来のシグナル配列（例えば、通常、ヒト細胞においてin vivoでＭＡＮＦ２の分泌を指示するＭＡＮＦ２プレ配列）で十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適当な場合もある。他の哺乳動物のシグナル配列としては、他の動物のＭＡＮＦ２のシグナル配列や、同一または関連する生物種の分泌ポリペプチド用のシグナル配列が挙げられ、他にはウイルス性分泌用リーダー配列、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＤシグナルも挙げられる。
【０１１４】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識されるプロモーターを含有し、発現可能な状態でＭＡＮＦ２核酸と連結している。ベクターの選択は、使用する生物または細胞と目的とするベクターの性質によって支配されている。ベクターは標的細胞中で１回複製するものでも、「自殺」ベクターでもよい。一般的に、ベクターはシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーターおよび転写停止配列を包含する。各因子の選択については、ベクターを使用する生物に依存し、容易に決定することができる。上記因子のいくつかは特定条件下でのみ機能するもの（例えば、適切な条件下でのみ機能する誘導性または条件付プロモーター）である。
【０１１５】
ベクターは２種に大別することができる。１つはクローニングベクターであって、適切な宿主細胞における増殖に必要のない領域も有する複製プラスミドまたはファージであり、外来ＤＮＡを挿入することができるものである。外来ＤＮＡはベクターの一成分であるかのように複製し、増幅する。もう一方の発現ベクター（プラスミド、酵母または動物ウイルスゲノム）は、外来遺伝物質を宿主細胞または組織に導入し、外来ＤＮＡの転写と翻訳を行うためのものである。発現ベクターに導入したＤＮＡは、宿主細胞に挿入遺伝子を転写するための指示を伝達するプロモーターなどの因子に発現可能な状態で連結している。いくつかのプロモーター、例えば、特定の因子に応答して遺伝子の転写を制御する誘導性プロモーター、は特に有用である。誘導性プロモーターに発現可能な状態で連結したＭＡＮＦ２またはそのアンチセンス構築物は、ＭＡＮＦ２またはその断片、あるいはアンチセンス構築物の発現を制御することができる。典型的な誘導性プロモーターの具体例としては、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、グルココルチコイドなどのステロイド類（Kaufman RJ, "Vectors Used for Expression in Mammalian Cells (哺乳動物細胞における発現に用いるベクター)", "Methods in Enzymology, Gene Expression Technology (酵素学の方法、遺伝子発現技術)", David V. Goeddel ed., 1990, 185:487-511）やテトラサイクリンに応答するプロモーターが挙げられる。他の好ましい誘導性プロモーターとしては、構築物を導入する細胞にとって内因性ではないが、誘導性物質を細胞の外部から与えた時に応答するものが挙げられる。
【０１１６】
プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’側）に位置する非翻訳配列（通常、約１００〜１,０００ｂｐ）であり、そこに発現可能な状態で連結した特定の核酸配列（例えばＭＡＮＦ２核酸配列）の転写と翻訳を制御するものである。このようなプロモーターは典型的には２つのクラス、誘導性と構成性、に大別することができる。誘導性のプロモーターは、培養条件の変化（例えば、栄養素の存在または不存在、または温度変化）に応じて、その制御下のＤＮＡの転写レベルの増加を制御するプロモーターである。今では、種々の宿主細胞候補によって認識されるプロモーターが多数知られている。このようなプロモーターを発現可能な状態でＭＡＮＦ２をコードするＤＮＡに連結する時には、プロモーターの原料となるＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを切り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入する。本来のＭＡＮＦ２プロモーター配列と種々の異種プロモーターは共に、ＭＡＮＦ２ ＤＮＡの直接的な増幅および／または発現に使用することができる。しかし、異種プロモーターは、通常、本来のＭＡＮＦ２プロモーターよりも高い転写率とＭＡＮＦ２の高収率を可能とするため、異種プロモーターが好ましい。原核細胞、真核細胞、酵母および哺乳動物の宿主細胞に用いるための種々のプロモーターが存在し、当業者に知られている。
【０１１７】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物から得た有核細胞）に用いる発現ベクターも、転写停止とｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの通常５’側、時には３’側の非翻訳領域から得られる。このような領域は、ＭＡＮＦ２をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１１８】
上で列挙した成分を１つまたは複数含有する適切なベクターの構築には、標準的な連結技術を用いる。必要なプラスミドが作製されるように、単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、仕立て直し、再連結する。
【０１１９】
本発明を実施する際に特に有用なのは、ＭＡＮＦ２をコードするＤＮＡの一過性発現を哺乳動物細胞中で可能とする発現ベクターである。一般的に、一過性発現には宿主細胞内で効果的に複製することのできる発現ベクターを用い、宿主細胞が発現ベクターの複数のコピーを蓄積し、その結果として発現ベクターによってコードされている目的ポリペプチドを高レベルで合成する（前出のSambrook et al., pp. 16.17-16.22を参照）。適切な発現ベクターと宿主細胞を包含する一過性発現系は、クローニングしたＤＮＡにコードされているポリペプチドの存在を簡単に同定するだけでなく、このようなポリペプチドを対象として目的とする生物学的特徴または生理的特徴についての迅速なスクリーニングを可能とする。従って、一過性発現系は、生物活性を有するＭＡＮＦ２類似体や変異体を同定するために、本発明において特に有用である。
【０１２０】
培地における脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は、日常的な操作である。例えば、"Tissue Culture (組織培養)", Academic Press, Kruse and Patterson ed. (1973）を参照。有用な哺乳動物宿主細胞株としては、サル腎臓細胞株ＣＶ１をSV40で形質転換したもの（COS-7、ATCC CRL 1651）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4216 (1980)）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）およびイヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）が挙げられる。
【０１２１】
上述のＭＡＮＦ２製造用の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または目的配列をコードする遺伝子の増幅に適当なように修飾した市販の栄養培地で培養する。
【０１２２】
トランスフェクションとは、コード配列が実際発現されるかどうかに関わりない、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。通常の知識を有する当業者には、トランスフェクションのための方法が多数知られており、例えば、エレクトロポレーション法が挙げられる。トランスフェクションの成功は、通常、宿主細胞においてこのベクターが機能したことを示す何らかの指標が生じたことによって確認する。
【０１２３】
形質転換とは、核外因子または染色体導入物として複製可能なようにＤＮＡを生体に導入することを意味する。使用する宿主細胞にもよるが、形質転換は各細胞に適した標準的な方法で行う。前出のSambrook et al.、セクション１．８２に記載の塩化カルシウムを用いたカルシウム処理またはエレクトロポレーション法が、実質的に細胞壁のバリアを有する原核細胞や他の細胞に一般的に用いられている。
【０１２４】
哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な特徴は、1983年8月16日発行の米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)およびHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979) の方法に準じて実施する。しかし、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば、核のマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、細菌のプロトプラストを無傷の細胞と融合する方法、またはポリカチオン法（例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどを用いる方法）を実施することもできる。哺乳動物細胞を形質転換する種々の方法については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988) を参照されたい。
【０１２５】
本発明のＭＡＮＦ２ポリペプチドの製造に用いる原核細胞は、前出のSambrook et al.などに包括的に記載されている培地の中の適切なもので培養する。一般的に、哺乳動物培養細胞の生産性を最大にするための原理、方法、実践的技術については、"Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (哺乳動物細胞生物工学：実践的手法)", M. Butler ed. (IRL Press, 1991) に記載されている。 
【０１２６】
遺伝子の増幅および／または発現は試料から直接測定することができ、例えば、本願で開示する配列に基づいた適切な標識プローブを用いた、公知のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を測定するためのノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ解析）またはin situハイブリダイゼーション法によって測定することができる。種々の標識、最も一般的にはラジオアイソトープ、特に32Ｐを使用する。しかし、その他の技術、例えば、ポリヌクレオチドに標識を導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドや、特定の二本鎖分子（二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖など）を認識する抗体も使用可能である。
【０１２７】
遺伝子の発現は、組織切片の免疫組織的染色、培養細胞や体液のイムノアッセイといった免疫学的手法によって、遺伝子産物の発現を直接定量することもできる。免疫組織的染色技術においては、細胞試料を（典型的な方法では脱水と固定によって）調製し、細胞にカップリングされている遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させる。この場合の標識は、通常目視で検出可能な酵素標識、蛍光標識、発光標識などである。本発明での使用に適した特に感度の高い染色方法が、Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980) に記載されている。
【０１２８】
組み換え体の作製 
ヒト由来ではない組み換え細胞によってＭＡＮＦ２を製造した場合、得られたＭＡＮＦ２はヒト由来のタンパク質やポリペプチドを全く含まない。しかし、ＭＡＮＦ２として実質的に均質な調製物を得るためには、製造したＭＡＮＦ２を組み換え細胞のタンパク質やポリペプチドから精製する必要がある。精製を行うには、まず、培地または細胞溶解物を遠心分離することで、そこから粒状の細胞片を取り除くことができる。次いで、適切な精製方法の例として以下に挙げる方法で、異物である可溶性のタンパク質やポリペプチドからＭＡＮＦ２を精製することができる。このような方法としては、イオン交換カラムによる分取、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ充填カラムを用いたクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング（chromatofocusing）、イムノアフィニティ法、エピトープタグ結合樹脂を用いる方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安沈殿法、Sephadex G-75などを用いたゲル濾過、およびＩｇＧなどの異物を取り除くためのプロテインＡセファロースカラムを用いる方法が挙げられる。
【０１２９】
アミノ酸残基が欠失、挿入または置換されたＭＡＮＦ２変異体は、変異によって生じた物性の実質的な変化にも考慮しながら、未変性ＭＡＮＦ２配列と同様の方法で回収する。モノクローナル抗ＭＡＮＦ２抗体結合樹脂（monoclonal anti-MANF2 resin）などのイムノアフィニティ樹脂をＭＡＮＦ２変異体中に残っている少なくとも１つのエピトープに結合させることにより、ＭＡＮＦ２変異体を樹脂に吸収させることができる。
【０１３０】
変異体のアッセイは以下のようにして行うことができる。ＭＡＮＦ２分子の免疫特性（例えば一定の抗体に対する親和性など）の変化は、競合的なイムノアッセイによって測定することができる。タンパク質やポリペプチドの物性（例えば酸化還元性、熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、担体との凝集傾向や多量体形成傾向など）の他の考えられる変化は、当業界で公知の方法でアッセイを行う。
【０１３１】
本発明は、異種ポリペプチドに融合したＭＡＮＦ２を含むキメラポリペプチドも包含する。キメラＭＡＮＦ２は、本発明で定義するＭＡＮＦ２変異体の１種である。１つの好ましい態様においては、キメラポリペプチドは、抗タグ抗体または抗タグ分子が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドと、ＭＡＮＦ２との融合物を包含する。このようなエピトープタグは、一般的にＭＡＮＦ２のアミノ末端またはカルボキシル末端に設けられる。エピトープタグを付したこのような形態のＭＡＮＦ２は、タグポリペプチドに対する標識抗体を用いてその存在を検出することが可能なので好ましい。また、エピトープタグを付与することで、抗タグ抗体を用いたアフィニティー精製でＭＡＮＦ２を容易に精製することが可能になる。抗体を用いたアフィニティー精製の方法および診断のためのアッセイに関しては後述する。
【０１３２】
タグポリペプチドとその抗体については、当業界においてよく知られている。例えば、インフルエンザＨＡタグポリペプチドとその抗体である１２ＣＡ５（Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)）、ｃ−ｍｙｃタグとその抗体である８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）、ならびに単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグとその抗体（Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)）などである。その他のタグポリペプチドも開示されており、例えば、Ｆｌａｇ ペプチド（Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）、ＫＴ３エピトープペプチド（Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)）、α−チューブリンエピトープペプチド（Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）、およびＴ７遺伝子誘導タンパク質に由来するペプチドタグ（Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が挙げられる。タグポリペプチドを選択すれば、それに対する抗体を、本願で説明する方法によって作製することができる。Ｃ末端ポリヒスチジン配列タグが好ましい。ポリヒスチジン配列は、例えば、Lindsay et al., Neuron 17:571-574 (1996) に記載のＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってタグを付したタンパク質の単離を可能にする。
【０１３３】
エピトープタグを付したＭＡＮＦ２の構築と製造に適した一般的な方法は、上記した様々な方法と同様のものである。
【０１３４】
エピトープタグを付したＭＡＮＦ２は、抗タグ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより簡便に精製することができる。アフィニティー抗体を結合させるマトリックスとしては大抵の場合アガロースが用いられるが、他のマトリックス（例えば、多孔性ガラスビーズ（controlled pore glass）やポリスチレンジビニルベンゼン）も使用可能である。エピトープタグを付したＭＡＮＦ２は、例えば緩衝液のｐＨやイオン強度を変化させたり、カオトロピックな物質を加えたりすることにより、アフィニティカラムから溶出させることができる。
【０１３５】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に結合したＭＡＮＦ２配列よって構築されるキメラ（イムノアドヘシン（immunoadhesins））は当業界でよく知られている：  文献に発表されたイムノアドヘシンとしては、以下のタンパク質との融合物が挙げられる。Ｔ細胞受容体（Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2936-2940 (1987)）、ＣＤ４*（Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989)、Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1989)、Zettmeissl et al., DNA Cell Biol USA, 9: 347-353 (1990) および Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1990)）、ＴＮＦ受容体（Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539 (1991)、Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 27: 2883-2886 (1991) および Peppel et al., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)）、およびＩｇＥレセプターα*（Ridgway et al., J. Cell. Biol., 1 15:abstr. 1448 (1991)）。文中のアスタリスク（*）は、受容体が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【０１３６】
最も単純で簡単なイムノアドヘシン設計においては、「アドヘシン」タンパク質の結合領域を、免疫グロブリンのＨ鎖のヒンジ部とＦｃ領域と組み合わせる。通常、本発明のＭＡＮＦ２−免疫グロブリンキメラを調製する場合は、ＭＡＮＦ２をコードする核酸を、ＭＡＮＦ２のＣ末端側に免疫グロブリンが結合するように、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端側に免疫グロブリンが結合するように核酸を融合することも可能である。
【０１３７】
概して、このような融合物では、コードされたキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン Ｈ鎖の定常領域のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを、機能的な活性を有する形態で保有する。定常ドメインのＦｃ部位のＣ末端から融合することもできるし、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端の直前やＬ鎖の対応領域から融合することもできる。
【０１３８】
融合させる正確な位置は重要ではなく、融合に適した特定の位置もよく知られている。融合位置は、ＭＡＮＦ２−免疫グロブリンキメラの生物活性、分泌特性または結合特性の最適化を目的として選択することができる。
【０１３９】
ＭＡＮＦ２イムノアドヘシンを発現させる宿主細胞株の選択は、主に発現ベクターに依存する。他に考慮する点は、必要なタンパク質の量である。例えば、リン酸カルシウム法またはＤＥＡＥ−デキストラン法（Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990) および Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)）を用いた一過性トランスフェクションでは、しばしばミリグラム単位のタンパク質を製造できる。より多量のタンパク質が望まれる場合には、宿主細胞株を安定なトランスフェクションに付した後でイムノアドヘシンを発現させればよく、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする更なるプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）に発現ベクターを導入する。
【０１４０】
抗体 
ＭＡＮＦ２核酸は、本発明で例示する組み換え技術によるＭＡＮＦ２ポリペプチドの調製に有用であり、このようにして得られるＭＡＮＦ２ポリペプチドは、後述する多様な用途を有する抗ＭＡＮＦ２抗体の製造に用いることができる。
【０１４１】
免疫組織染色および／または体液試料のアッセイに有用な抗体は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【０１４２】
更に本発明には、ＭＡＮＦ２またはその断片に特異的に結合する抗体が含まれる。本発明の１つの好ましい態様には、ＭＡＮＦ２の生物活性を阻害する抗体も含まれる。上記の抗体は、ＭＡＮＦ２レベルが関与する疾患に罹患した哺乳動物のＭＡＮＦ２レベルを測定するための診断アッセイにおいて、ＭＡＮＦ２の同定に有用である。更に、ＭＡＮＦ２に特異的に結合する抗体は、ＭＡＮＦ２とその受容体との相互作用を遮断するのにも有用であるため、後述するように、ＭＡＮＦ２関連疾患を処置するための治療枠においても有用である。
【０１４３】
ＭＡＮＦ２タンパク質またはペプチドの全長配列またはペプチド断片に対するモノクローナル抗体は、公知のいかなるモノクローナル抗体調製法、例えば Harlow et al., （1988, "Antibodies, A Laboratory Manual (抗体、実験マニュアル)"、New York: Cold Spring Harbor）に記載の手法、を用いて調製してもよい。なお、抗ＭＡＮＦ２モノクローナル抗体は、少なくとも次の４つの工程を含んでなるハイブリドーマ法を用いて調製することができる。（１）宿主または宿主のリンパ球を免疫する工程、（２）モノクローナル抗体を分泌する（または分泌能を有する）リンパ球を回収する工程、（３）不死化した細胞と該リンパ球を融合する工程、そして（４）所望の（抗ＭＡＮＦ２）モノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する工程。モノクローナル抗体は、従来のＩｇ精製法、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿法またはアフィニティクロマトグラフィーなどを用いて、培地や腹水液から単離または精製することができる（Harlow et al., supra）。
【０１４４】
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはその他の適当な宿主を免疫して、免疫原に特異的に結合する抗体を製造するか、または製造能を有するリンパ球を誘導する。また、リンパ球はin vitroで免疫してもよい。
【０１４５】
ヒトの細胞が望ましい場合は、一般に、末梢血リンパ球を用いる。しかし、ヒト以外の哺乳動物由来の脾臓細胞またはリンパ球が好ましい。
【０１４６】
典型的な免疫原としては、ＭＡＮＦ２またはＭＡＮＦ２融合タンパク質が挙げられる。
【０１４７】
本発明は更に、ヒト化抗ＭＡＮＦ２抗体およびヒト抗ＭＡＮＦ２抗体も包含する。
【０１４８】
ヒト化した非ヒト動物抗体とは、非ヒト動物Ｉｇから誘導した最小配列を含有するキメラＩｇ、そのＩｇ鎖または断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)またはその他の抗原結合性配列）である。
【０１４９】
一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物原料から導入した１つ以上のアミノ酸残基を有する。このような非ヒトアミノ酸残基をしばしば「外来（import）」残基と称し、その残基は一般に「外来」可変ドメインから得たものである。ヒト化は、げっ歯類の相補性決定部位（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することで達成する（Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988) および Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, (1988)）。このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号, 1989年）、それは完全なヒト可変ドメインに実質的には満たない部分が、ヒト以外の動物種の対応配列で置換されたものである。実際には、ヒト化抗体は、一般的に、ヒト抗体のＣＤＲ内の残基の一部、更に可能であればＦＲ内の残基の一部が、げっ歯類抗体の相似性部位の残基によって置換されたものである。ヒト化抗体には、レシピエント抗体の相補性決定部位（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および結合容量を有するウス、ラット、ウサギなどの非ヒト動物種抗体（ドナー抗体）の残基と置換したヒトＩｇ（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒトＩｇ Ｆｖ断片のフレームワーク配列中の残基を、非ヒト動物種の対応する残基で置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、あるいは外来ＣＤＲ配列やフレームワーク配列中にも存在しない残基を包含してもよい。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つ存在する可変ドメインの実質的に全てを含んでおり、可変ドメインにおいては、ＣＤＲ領域の全てでなくとも大部分は非ヒト動物ＩｇのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全てでなくとも大部分はヒトＩｇのコンセンサス配列である。最適なヒト化抗体は、典型的にはヒトＩｇのＩｇ定常領域の少なくとも一部も含有する（Jones et al., supra および Presta LG, Curr Opin Biotechnol 3:394-398 (1992)）。
【０１５０】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー法（Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res 19:4133-4137 (1991) および Marks et al., Biotechnology (NY) 10:779-83 (1991)）やヒトモノクローナル抗体の調製法（Boerner et al., J. Immunol 147(1):86-95 (1991) および Reisfeld and Sell, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（モノクローナル抗体と抗癌治療）" New York: Alan R. Liss, Inc., 1985）などの様々な方法によっても製造することができる。同様に、内因性Ｉｇ遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物にヒトＩｇ遺伝子を導入する方法も、ヒト抗体の合成に活用することができる。トランスジェニック動物を攻撃すると、ヒト抗体の製造が観察され、例えば遺伝子の再配列、アセンブリおよび抗体のレパートリーなどの事象が、ヒトに見られるものと全ての点において酷似していた（米国特許第5,545,807号, 1996年、米国特許第5,545,806号, 1996年、米国特許第5,569,825号, 1996年、米国特許第5,633,425号, 1997年、米国特許第5,661,016号, 1997年、米国特許第5,625,126号, 1997年、Fishwild et al., Nat Biotechnol 14:845-51 (1996)、Lonberg and Huszar, Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)、Lonberg et al., Nature 368:856-9 (1994)およびMarks et al., Biotechnology (NY) 10:779-783 (1992)）。
【０１５１】
１つの好ましい態様において、本発明は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルな二重特異性抗体、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体を包含する。例えば、一方がＭＡＮＦ２に対する結合特異性で、他の一方は任意の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質、受容体または受容体サブユニット、に対する結合特異性である。
【０１５２】
従来の方法では、二重特異性抗体の組換えによる製造は、２組のＩｇのＨ鎖とＬ鎖の共発現に基づいているが、その場合、二本のＨ鎖は異なる特異性を有している（Milstein and Cuello, Nature 305:537-540 (1983)）。ＩｇのＨ鎖とＬ鎖を任意に組み合わせることによって得られるハイブリドーマ（クワドローマ（quadroma））は、異なる１０種の抗体分子の混合物を産生する可能性があるが、そのうち所望の二重特異性構造を有するのは１種だけである。所望の抗体はアフィニティクロマトグラフィーやその他の方法（WO 93/08829, (1993)およびTraunecker et al., Trends Biotechnol 9:109-113 (1991)）によって精製することができる。
【０１５３】
二重特異性抗体を製造する（Suresh et al., Methods Enzymol. 121:210-228 (1986)）には、所望の抗原抗体結合部位を有する可変ドメインをＩｇ定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、ヒンジ部、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含有するＩｇのＨ鎖定常ドメインに融合させる。Ｌ鎖との結合に必要な部位を含む第１Ｈ鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つに含まれていることが好ましい。Ｉｇ Ｈ鎖融合物（および所望によりＩｇ Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを、それぞれ別の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトする。
【０１５４】
Ｆａｂ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することもできる。例えば、完全にヒト化した二重特異性Ｆ(ａｂ’)抗体を作製することができる（Shalaby et al., J Exp Med. 175: 217-225 (1992)）。各Ｆａｂ断片を大腸菌に別々に分泌させ、in vitroで化学的に直接カップリングして、二重特異性抗体を形成する。
【０１５５】
また、二重特異性抗体の断片を培養組み換え細胞から直接調製したり、単離したりするための様々な方法も報告されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを活用することができる（Kostelny et al., Immunol. 148:1547-1553 (1992)）。Fosタンパク質とJunタンパク質から得たペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ部位に結合する。抗体のホモダイマーをヒンジ部で還元してモノマーに分離し、該モノマーを再び酸化して抗体のヘテロダイマーを形成する。この方法で抗体のホモダイマーを製造することもできる。
【０１５６】
「二重特異性抗体（diabody）」技術（Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90:6444-6448 (1993)）は、二重特異性抗体断片を製造するための別の方法を提供する。この断片は、同一鎖上で２つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを介して結合した、Ｈ鎖の可変ドメイン（ＶＨ）とＬ鎖の可変ドメイン（ＶＬ）を含有する。１つの断片のＶＨドメインとＶＬドメインを、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインに対合させ、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体断片を製造するための別の方法は、１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを用いる方法である（Gruber et al., Immunol. 152:5368-5374 (1994)）。また、２価を超える力価の抗体、例えば三重特異性抗体（Tutt et al., J lmmunol. 147:60-69 (1991)）も考えられる。
【０１５７】
ポリクローナル抗体は、例えば、１種以上の免疫原を、所望によりアジュバントと共に注射することで、哺乳動物を宿主として製造することができる。概して、免疫原および／またはアジュバントを哺乳動物に対して複数回の皮下注射または腹腔内注射によって投与する。免疫原としては、ＭＡＮＦ２またはＭＡＮＦ２融合タンパク質が挙げられる。
【０１５８】
アジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバントおよびモノホスホリル脂質Ａ合成トレハロースジコリノミコレート（monophosphoryl Lipid A synthetic-trehalose dicorynomycolate、ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。免疫応答を高めるには、ＭＡＮＦ２宿主において免疫原性を示すタンパク質、例えばスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシ チログロブリンおよび大豆トリプシン阻害因子、に免疫原を結合させてもよい。抗体の製造手順は、上記したHarlow et al.に記載されている。その他にも、ポリクローナル抗体は、ＩｇＹ分子を産生するニワトリで製造することもできる（Schade et al., "The production of avian (egg yolg) antibodies: IgY. The report and recommendations of ECVAM workshop (トリ（卵黄）抗体であるＩｇＹの製造 ECVAMワークショップによる報告と推奨方法)"、Alternatives to Laboratory Animals NAILA. 24:925-934 (1996)）。
【０１５９】
処置 
ＭＡＮＦ２またはＭＡＮＦ１の活性に関連する疾患や障害、またはＭＡＮＦ２／ＭＡＮＦ１の反応性に益を得る疾患や障害の治療において、ＭＡＮＦ２タンパク質およびＭＡＮＦ２遺伝子は、哺乳動物（特にヒト）に投与することを目的としたex vivoまたはin vivoにおける治療用途を有すると考えられる（WO 01/19851参照)。特にＭＡＮＦ２が適した疾患は、神経障害、好ましくは中枢神経系障害、パーキンソン氏病またはアルツハイマー病である。
【０１６０】
患者に対し、効果的な量の本発明のＭＡＮＦ２タンパク質、ペプチド断片または変異体を投与する。ＭＡＮＦ２、ＭＡＮＦ２作用物質、ＭＡＮＦ２拮抗物質または抗ＭＡＮＦ２抗体の投与を包含する治療方法も本発明の範囲内である。本発明はまた、適切な薬理学的担体に担持させた、ＭＡＮＦ２タンパク質、そのペプチド断片または誘導体を含有する医薬組成物を提供する。ＭＡＮＦ２タンパク質、そのペプチド断片または変異体の投与は、全身に行ってもよいし、局所的に行ってもよい。所望により、ＭＡＮＦ１投与前または後のＭＡＮＦ２タンパク質投与、好ましくＭＡＮＦ２タンパク質とＭＡＮＦ１の同時（また混合物としての）投与も、本願で開示する方法に適応することができる。
【０１６１】
疾患や医学的障害において、神経細胞および／または神経細胞の軸索突起の生存や機能に欠陥が生じた場合、それは神経障害とみなされる。そのような神経障害は、以下に挙げる病態の結果として起こるものである。（ａ）傷害部位近傍の軸索突起および／または神経細胞本体の変性を引き起こす身体的傷害、（ｂ）発作などの虚血症、（ｃ）癌の化学療法薬（例えば、シスプラチン）およびエイズの化学療法薬（例えば、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ））などの神経毒素との接触、（ｄ）糖尿病や腎臓機能障害などの慢性代謝障害、および（ｅ）パーキンソン氏病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの、特定の神経群の変性を伴う神経変性疾患。即ち、神経障害を起こす病態の中には、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、発作、糖尿病性多発神経炎、中毒性神経炎、および神経系への物理的損傷が含まれる。物理的損傷には、脳や脊髄の物理的傷害や、上肢、手や身体の他の部位における圧挫傷や切り傷などがあり、例えば、発作などで生じる神経系の一部における血流の一時的または永続的な停止も含まれる。
【０１６２】
神経障害、特に抹消神経障害の処置におけるＭＡＮＦ２の使用が考えられる。「抹消神経障害」とは、末梢神経系を冒す障害であり、最も多くの場合、運動神経障害、知覚神経障害、感覚運動神経障害または自律神経障害の１種または組み合わせである。抹消神経障害の示す多様な形態は、同等に多数の独自の原因にそれぞれ帰することができる。例えば、抹消神経障害には、遺伝に起因するもの、全身疾患によってもたらされるもの、および毒性のある薬剤によって誘導されるものがある。糖尿病性抹消神経障害、遠位感覚運動神経障害、および自律神経障害（消化管の運動性低下や膀胱の弛緩など）が例示できるが、これらに限定されるものではない。全身疾患に関連する神経障害の具体例としては、ポストポリオ症候群やＡＩＤＳ関連神経障害が挙げられ、遺伝性神経障害の具体例としては、シャルコー・マリー・トゥース病、レフサム病、無βリポタンパク血症、タンジール病、クラッペ病、異染性白質ジストロフィー、ファブリー病およびデジュリーヌ・ソッタス病が挙げられ、毒性のある薬剤によって誘導される神経障害の具体例としては、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、３’−アジド−３’−デオキシチミジンなどの化学療法薬による処置によって生じるものが挙げられる。これと同様に、ニューロトリミンの拮抗物質には、過剰な神経活動を特徴とする疾患における用途が期待される。
【０１６３】
アルツハイマー病は、前脳基底部に存在するコリン作動性ニューロンの損失の拡大を含む、脳に広がった神経変性によって特徴付けられる。前脳基底部のコリン作動性ニューロンの損失は、アルツハイマー病患者における認知記憶障害と空間記憶障害の一因である（Gilmor et al., 1999、およびLehericy et al. 1993）。アルツハイマー病患者におけるコリン作動性機能の回復と調節は、この疾患の処置方法の候補である（Sramek and Cutler, 1999、およびMufson et al., 1998）。他の種類の神経細胞がこの疾患に関与している可能性もある。
【０１６４】
パーキンソン氏病を患う患者には、運動機能障害や認知機能障害といった疾病兆候の最も初期の兆しが見られた時点で、神経変性の進行を止めるために処置を施すことができる。また、ＭＡＮＦ２培養細胞を後期疾患の患者に投与することによって、神経系の破壊を遅らせることも考えられる。
【０１６５】
更に、本発明においては、ＭＡＮＦ２製剤をパーキンソン氏病の処置に一般的に使用されている神経療法薬と組み合わせて投与することによって、２つの処置の相乗作用が発生し、単一の療法を受けている患者よりも、組み合わせ療法を受けている患者の方がより顕著な改善が見られると考えられる。
【０１６６】
プラミペクソール（ミラペックス）とレボドーパは、初期パーキンソン氏病（ＰＤ）の運動性症候の処置に効果的な薬剤である。In vitroの研究と動物による研究は、プラミペクソールはドーパミンニューロンを保護し、レボドーパはドーパミンニューロンを保護または破壊することを示唆している。ニューロイメージング手法は、ＰＤ患者におけるドーパミンニューロン変性の潜在的な他覚的バイオマーカーを提供する。パーキンソン氏病患者において発現が低レベルになっている神経伝達物質であるコエンザイムＱ１０も、ＰＤの処置に使用されている。レボドーパは、レボドーパ（L-dopa）の副作用を和らげるために、カルビドーパなどの他の薬剤と組み合わせることができる。単独あるいは組み合わせてパーキンソン氏病の処置に使用する他の薬剤としては、シネメットやセレギリン（エルデプリルの名称で販売）が挙げられ、これらは初期のパーキンソン氏病症状をいくらかは緩和する。アマンタジン（シンメトレル）は、抗パーキンソン氏病効果も提供する抗ウイルス薬であり、レボドーパをシネメットと組み合わせた際の「治療ウインドウ」を拡大するために頻繁に使用されている。
【０１６７】
上記神経療法の前、後、または同時にＭＡＮＦ２で処置することは、神経療法薬の効果を増強し、その結果、個体の必要とする薬剤の量を減少させ、複数または多量の神経療法薬によって生じる望ましくない副作用を低下させると考えられる。
【０１６８】
ＭＡＮＦ２遺伝子は筋肉細胞で発現されている。従って、本発明は、筋肉細胞障害の処置方法であって、このような処置を必要とする患者に本発明の化合物を投与することを包含する方法を提供する。このような処置の恩恵を受ける筋肉細胞障害としては、以下の種類の進行性筋肉ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されるものではない：デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、ランドゥジー−デジェリン型筋ジストロフィー、肩甲上腕筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、フォン・グレーフェ−フックスジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーおよび先天性筋ジストロフィー。更に、上述した分子は、先天性ミオパシー（中心コアミオパシー、ネマリンミオパシー、中心核病および先天性筋線維タイプ不均等症）および後天性ミオパシー（毒性ミオパシー、炎症性ミオパシー）の処置にも使用することができる。更に本発明は、筋肉細胞障害の処置方法であって、患者に有効量のＭＡＮＦ２タンパク質またはその活性領域を投与することを包含する方法を提供する。
【０１６９】
タンパク質の発現または活性の調節を達成するための遺伝子操作も特に本発明が企図する手法である。例えば、タンパク質の投与を検討している場合、目的タンパク質がin vivoで製造されるようにするための、遺伝子治療用ベクターの投与も考えられる。（例えば、抗体や小分子阻害剤による）タンパク質の阻害を検討している場合、ノックアウト技法やアンチセンス療法などの遺伝子技術によるin vivoにおけるタンパク質発現の阻害も考えられる。
【０１７０】
目的のトランスジーンを動物内に導入する時は、適切であればいかなるベクターを用いてもよい。公知文献に開示されたベクターの例としては、例えばレンチウイルスベクター（ただしこれに限定されない）などの非増殖性レトロウイルスベクター（Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46.）、アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第5,824,544号、米国特許第5,707,618号、米国特許第5,792,453号、米国特許第5,693,509号、米国特許第5,670,488号、米国特許第5,585,362号、Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992)、Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992)およびRosenfeld et al., Cell, 68: 143-155 (1992)を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第5,888,502号、米国特許第5,830,725号、米国特許第5,770,414号、米国特許第5,686,278号、米国特許第4,861,719号を参照)、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、米国特許第5,474,935号、米国特許第5,139,941号、米国特許第5,622,856号、米国特許第5,658,776号、米国特許第5,773,289号、米国特許第5,789,390号、米国特許第5,834,441号、米国特許第5,863,541号、米国特許第5,851,521号、米国特許第5,252,479号およびGnatenko et al., J. Investig. Med., 45: 87-98 (1997)を参照）、アデノウイルスとアデノ随伴ウイルスとのハイブリッドベクター（例えば、米国特許第5,856,152号を参照）またはワクシニアウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,879,934号、米国特許第5,849,571号、米国特許第5,830,727号、米国特許第5,661,033号 および 米国特許第5,328,688号を参照）、リポフェクチン仲介遺伝子導入系（ＢＲＬ製）、リポソームベクター（例えば、米国特許第5,631,237号 "Liposomes comprising Sendai virus proteins (センダイウイルスタンパク質を包含するリポソーム)"）、およびこれらの組み合わせである。なお上記文献の記載は全て本明細書に組み込まれているものとする。また、好ましい態様においては、非増殖性アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびレンチウイルスを用いる。
【０１７１】
ウイルスベクターを用いる態様において好ましいポリヌクレオチドは、目的の標的組織における発現を促進する適切なプロモーターとポリアデニル化配列を含んでいる。本発明の多様な用途において哺乳動物細胞による発現に適したプロモーター／エンハンサーとしては、例えば、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー（Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29:2494-2502 (1991) および Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)）；ラウス肉腫ウイルスのプロモーター（Davis et al., Hum. Gene Ther., 4:151 (1993)）；シミアンウイルス４０のプロモーター、レトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ケラチン１４のプロモーターおよびαミオシンＨ鎖プロモーターが挙げられる。
【０１７２】
遺伝子治療用途においては、例えば欠損遺伝子の代わりに、治療に有効な遺伝子産物のin vivo合成を行うために遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子治療」には、単一の治療によって永続効果が得られる従来の遺伝子治療と、治療に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡを１回または繰り返して投与することを含む遺伝子治療剤の投与との両方がある。アンチセンスＲＮＡとアンチセンスＤＮＡはin vivoにおいて特定の遺伝子の発現を阻害するための治療物質として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みが限定されるためその細胞内濃度が低いにも関らず、細胞内に導入されて阻害剤として働くことが明かになっている（Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:41434146 (1986)）。オリゴヌクレオチドは、例えば、負の電位を帯びたリン酸ジエステル基を、電位を帯びていない基で置換するといった修飾によって、取り込み量を高めることができる。
【０１７３】
生細胞に核酸を導入する際に利用可能な方法はいろいろある。使用する方法は、核酸をin vitroの培養細胞に導入するか、あるいは目的宿主内の細胞にex vivoまたはin vivoで導入するかによって異なる。In vitroでの哺乳動物細胞への核酸導入に適した方法としては、リポソームを利用する方法（Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982)、Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979)、Felgner, Sci. Am., 276(6):102-6 (1997) および Felgner, Hum. Gene Ther., 7(15):1791-3, (1996)）、エレクトロポレーション法（Tur-Kaspa, et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, (1986) および Potter, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, (1984)）、直接マイクロインジェクション法（Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099 (1985)）、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)）、リン酸カルシウム沈殿法（Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467 (1973)、Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, (1987) および Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695 (1990)）、細胞の超音波処理法（Fechheimer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467 (1987)）、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子ボンバードメント法（gene bombardment using high velocity microprojectiles）（Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9568-9572 (1990)）などが挙げられる。現在、in vivo遺伝子導入法として好ましい方法としては、ウイルス（概してレトロウイルス）ベクターによるトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質−リポソームを介したトランスフェクション（Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)）などが挙げられる。状況によっては、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、あるいは標的細胞に提示された受容体に対するリガンドなどの標的細胞をターゲティングする物質を、核酸材料と共に用いることが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質をターゲティングおよび／または取り込みの促進に用いてもよく、そのようなタンパク質としては、特定の細胞種に対して屈性を示すキャプシッドタンパク質やその断片、サイクリングの際に内在化するタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化をターゲットとして細胞内半減期を延ばすタンパク質などが挙げられる。なお、受容体を介したエンドサイトーシスに関する技術については、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987) および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990)に開示されている。現在までに公知の遺伝子標識および遺伝子治療のプロトコルに関する文献としては、Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)を参照されたい。
【０１７４】
本発明の具体的な態様においては、発現構築物（また、実際には上記のペプチド）は、リポソームに封入されていてもよい。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞状の構造体である。多重層リポソームは、水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。このようなリポソームは、リン脂質を過剰量の水溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、自己再配列を経て閉鎖構造を形成し、脂質二重層の間に水とそれに溶解した溶質を封入する（Ghosh and Bachhawat, "In Liver Diseases, Targeted Diagnosis And Therapy Using Specific Receptors And Ligands (肝臓病における、特異的な受容体とリガンドを用いる標的診断および治療法)", Wu, G., Wu, C., ed., New York: Marcel Dekker、pp. 87-104 (1991)）。陽イオンリポソームにＤＮＡを添加すると、位相変化（topological transition）が生じて、リポソームは光学的に複屈折性を示す液晶性凝縮小球となる（Radler, et al., Science, 275(5301):810-4, (1997)）。このようなＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療や遺伝子デリバリーに用いる非ウイルスベクターとなる可能性がある。
【０１７５】
また本発明においては、「リポフェクション」法を含む様々な市販のアプローチも考えられる。本発明のある態様においては、リポソームは赤血球凝集性のウイルス（ＨＶＪ、即ち、センダイウイルス）と複合体を形成していてもよい。これにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソームに封入されたＤＮＡが細胞へ入り込むのを促進することが報告されている（Kaneda, et al., Science, 243: 375-378 (1989)）。他の態様においては、リポソームは、細胞核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）（Kato, et al., J. Biol. Chem., 266:3361-3364 (1991)）との複合体として、またはＨＭＧ−１と共に使用してもよい。更に他の態様においては、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方との複合体を形成するか、または３種を共に使用してもよい。In vitroおよびin vivoにおいて核酸の導入と発現に有効に用いることができる発現構築物は、本発明に適用可能である。
【０１７６】
治療用遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するのに用いることができる他のベクター送達システムとしては、受容体仲介送達ベヒクルが挙げられる。このようなシステムは、ほぼ全ての真核細胞に見られる受容体仲介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的な取り込みを利用する。種々の受容体は細胞種特異的に分布するため、このようなシステムを用いた送達は高い特異性を示す（Wu and Wu (1993), supra）。
【０１７７】
本発明の他の１つの態様においては、発現構築物は、単に裸の組み換えＤＮＡまたはプラスミドからなるものでもよい。構築物の導入は、物理的または化学的に細胞膜を透過させる上記のいずれの方法によって行ってもよい。これはin vitroでの導入に特に適するが、in vivoでの使用に適用してもよい。Dubensky, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533 (1984)には、ポリオーマウイルスのＤＮＡをリン酸カルシウム沈殿物の形態で成体マウスおよび新生マウスの肝臓と脾臓に注射して、能動的なウイルス複製および急性感染に成功したことが報告されている。Benvenisty and Neshif, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555 (1986)にも、リン酸カルシウム沈殿したプラスミドの腹腔内直接投与がトランスフェクトした遺伝子の発現をもたらすことが報告されている。
【０１７８】
裸のＤＮＡ発現構造物を細胞に導入するための本発明の他の１つの態様では、粒子衝突法が使用できる。この方法は、ＤＮＡで被覆したマイクロプロジェクタイルが細胞膜を貫通し、細胞を殺すことなく細胞内に侵入するほどの高速に加速する技術によるものである（Klein, et al., Nature, 327:70-73 (1987)）。小さい粒子を加速するための装置がいくつか開発されている。そのような装置の１つは、高圧放電を用いて電流を発生させ、その結果として原動力を提供する技術に基づくものである（Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572 (1990)）。使用するマイクロプロジェクタイルは、タングステンや金のビーズのような、生物学的に不活性な物質からなる。
【０１７９】
当業者は、in vivoとex vivoの状況下で、どのように遺伝子送達を適用するかを認識している。ウイルスベクターに関しては、通常、ウイルスベクターの原液を調製する。ウイルスの種類と達成可能な力価により、１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11または１×１０12の感染性粒子を患者に送達する。リポソームまたはその他の非ウイルス性の処方物（formulation）についても、相対的な取り込み効率を比較することにより、同様の数値が外挿できる。薬学的に許容される組成物となる処方物については後述する。
【０１８０】
様々な細胞種に対する様々な投与方法が考えられる。実用的には、いかなる細胞、組織または器官の種類に関しても、全身送達（systemic delivery）が考えられる。他の態様においては、種々の直接的、局所的そして部分的なアプローチを用いることができる。例えば、細胞、組織または器官に発現ベクターまたはタンパク質を直接注射することができる。
【０１８１】
また、別の態様においては、ex vivoの遺伝子治療が考えられる。Ex vivoの態様においては、細胞を患者から取り出し、少なくともある程度の期間にわたり、体外で維持する。この期間中に、取り出した細胞に治療を施し、その後、細胞を患者の体内に再導入する。
【０１８２】
本発明はまた、ＭＡＮＦ２の活性化に対する拮抗物質（例えば、ＭＡＮＦ２アンチセンス核酸および中和抗体など）を提供する。内因性ＭＡＮＦ２活性のレベルが増加しているか、または過剰である哺乳動物にＭＡＮＦ２拮抗物質を投与することが考えられ、そのようなＭＡＮＦ２レベルの増加が病理学的な障害を引き起こす状況で投与することが好ましい。
【０１８３】
医薬用および治療用の組成物と処方物 
本発明のＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２ポリペプチドおよび抗ＭＡＮＦ２抗体（活性化合物）ならびにそれらの誘導体、断片、類似体およびホモログは、医薬組成物に組み込むことができる。
【０１８４】
そのようなＭＡＮＦ２組成物は、保存を目的として、望ましい純度を有するＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体を、所望により、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤（"Remington's Pharmaceutical Sciences (レミントンの薬理科学)", 第１６版, Osol, A.編集, (1980)）と混合し、凍結乾燥した固体または水溶液の形態に調製する。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用する用量および濃度においてレシピエントに非毒性である。その例としては、リン酸、クエン酸やその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンやリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースやデキストリンなどの単糖、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールおよびソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニックおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１８５】
ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体は、例えば、コアセルベーション法で調製したマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル）や界面重合法により調製したマイクロカプセル（例えば、ポリメチルメタクリレートマイクロカプセル）、コロイダルドラッグデリバリーシステム（colloidal drug delivery systems）（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに封入してもよい。このような手法は前出の「レミントンの薬理科学」に記載されている。
【０１８６】
ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体の投与は、公知の方法に従って行えばよく、例えば、個々の態様に関して上記した方法や、静脈、腹腔内、脳内、筋内、眼内、動脈内または病巣内への注射や点滴などの一般的な方法、あるいは以下に述べる徐放システムなどの公知の方法で行うことができる。ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体は、点滴により継続的に投与するか、または大量瞬時投与する。一般的には、疾患が許せば、ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体を部位特異的送達用に処方して投与すべきである。投与は継続的または断続的に行うことができる。また、投与は、流量が一定のまたは流量をプログラムできる埋め込み型のポンプ、あるいは断続的な注射により行うことができる。本発明の核酸分子は、ベクターに挿入し、遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば静脈注射や局所投与（Nabel and Nabel, 米国特許第5,328,470号, 1994年）、または定位注射（stereotactic injection）（Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 (1994)）により対象生物に送達することができる。遺伝子治療用ベクターの医薬用製剤は、許容される希釈剤を含んでいてもよいし、または遺伝子送達ベヒクルを包埋した徐放性マトリックスを包含していてもよい。
【０１８７】
また、完全な遺伝子送達ベクターを無傷の状態で組み換え細胞から製造することができる場合、例えば、レトロウイルスベクターを用いる場合には、医薬用製剤は遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を包含していてもよい。
【０１８８】
適当な徐放性製剤の例としては、タンパク質を含有する、固体の疎水性ポリマーからなる半透性マトリックスが挙げられ、このようなマトリックスは成形品（フィルムやマイクロカプセルなど）の形態をとっている。徐放性マトリックスの具体例としては、ポリエステル、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) および Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載のあるヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号およびEP 58,481）または非分解性エチレン酢酸ビニル（Langer et al., supra）が挙げられる。
【０１８９】
徐放性ＭＡＮＦ２組成物には、リポソームに封入されたＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体も含まれる。ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体を含有するリポソームは、それ自体公知である次の方法によって調製する：Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、米国特許第4,485,045号および第4,544,545号；ならびにEP 102,324。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストロームの）単膜型のものであり、脂質含量の約３０ｍｏｌ％超がコレステロールであり、その組成は、ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体を用いた治療の効果が最適となるように調整したものである。
【０１９０】
エチレン酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日にわたって分子を放出することを可能にする一方、特定のヒドロゲルはタンパク質をより短期間で放出する。封入されたタンパク質が体内に長期間残存すると、３７℃で湿気にさらされることによって変性したり凝集したりすることがあり、結果として生物活性が失われたり、免疫原性に変化が生じることがある。関連するメカニズムに基づいて、タンパク質を安定化させる合理的な方法を考案することが可能である。例えば、凝集のメカニズムがチオール−ジスルフィド相互交換（thio-disulfide interchange）による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると分かったら、タンパク質のスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用および特定のポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成することもできる。
【０１９１】
半透性の、移植可能な膜状装置は、特定の環境において薬物を送達するのに有用な手段である。例えば、可溶性ＭＡＮＦ２、キメラまたは抗体を分泌する細胞を上記の装置に封入し、患者、例えば、パーキンソン氏病を患う患者の脳に移植することができる。米国特許第4,892,538号（Aebischer et al.）、米国特許第5,011,472号（Aebischer et al.）、米国特許第5,106,627号（Aebischer et al.）、ＰＣＴ出願 WO 91／10425、ＰＣＴ出願 WO 91／10470、Winn et al., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991)、Aebischer et al., Exper Neurology, 111:269-275 (1991)、および Tresco et al., ASAIO, 38:17-23 (1992)を参照されたい。
【０１９２】
したがって、本発明は、神経の損傷またはその他のＭＡＮＦ２反応性細胞の損傷を予防または治療する方法であって、特定の病態に対して必要とされるＭＡＮＦ２、ＭＡＮＦ２作用物質またはＭＡＮＦ２拮抗物質を分泌する細胞を、治療を必要とする患者の体内へ移植することを包含する方法に関する。また、本発明は、本願に記載した神経の損傷または細胞の損傷を予防または治療するために移植する装置であって、半透膜とそこに封入されたＭＡＮＦ２（あるいは特定の病態に対して必要とされる作用物質または拮抗物質）を分泌する細胞とを包含し、該半透膜はＭＡＮＦ２（あるいはその作用物質または拮抗物質）に対して透過性であるが、細胞にとって有害な患者由来の因子に対しては不透性である装置に関する。ＭＡＮＦ２を製造するようにex vivoで形質転換した患者自身の細胞は、所望により、上記のようなカプセル封入を行うことなく、患者に直接移植することができる。生細胞の膜封入の方法は当業者にはよく知られたものであり、封入細胞の調製と封入細胞の患者への移植は過剰な（under）実験を行わずとも実施可能である。
【０１９３】
したがって、本発明には、神経の損傷を予防または治療する方法であって、ＭＡＮＦ２またはＭＡＮＦ２抗体を産生する能力を天然に有する細胞、または生物工学的に分泌するようにした細胞を、治療を必要とする患者の体内に移植することを包含する方法が含まれる。患者がヒトの場合、分泌されたＭＡＮＦ２またはＭＡＮＦ２抗体は、可溶性のヒト成熟ＭＡＮＦ２であることが好ましい。移植物は、非免疫原性であるか、免疫原性の移植細胞が免疫系により認識されるのを防ぐものであるか、またはこの両方であることが好ましい。ＣＮＳに送達するのに好ましい移植部位は、脊髄の脳脊髄液である。
【０１９４】
治療に用いるＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体の効果的な量は、例えば、治療目的、投与経路および患者の状態に依存する。従って、治療を行う専門家は投与量の力価を測定し、最適な治療効果が達成されるように投与経路を調整することが必要となる。典型的には、臨床医は、所望の効果を発揮する投与量に達するまでＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体を投与する。全身療法における典型的な１日の投与量は、上記の要因により異なるが、約１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ超である。もう１つの一般的な投与法としては、ＭＡＮＦ２核酸分子、ＭＡＮＦ２タンパク質またはＭＡＮＦ２抗体を処方し、組織中で効果的であるが過剰に毒性にならないＭＡＮＦ２レベルを達成する投与量を、標的部位または標的組織に送達する。可能であれば、連続的な点滴、徐放的な放出、局所的な投与、ＭＡＮＦ２発現細胞の移植または経験的に定めた頻度の注射によってこの組織内濃度を維持するべきである。この治療の経過は、公知のアッセイによって簡単にモニターすることができる。
【０１９５】
ウイルス送達または非ウイルス送達したＭＡＮＦ２ポリヌクレオチドの効果は、当業界で知られるパーキンソン氏病の数々の動物モデルによって試験することができる。例えば、最も広範に使用されているパーキンソン氏病の動物モデルは、ドーパミン作動性ニューロンの神経変性を、通常は毒素の投与によって複製したものである。マウスまたはラットの黒質への６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の一側性注射は、反対側大脳半球にわずかな変化しかもたらさずに、同側線条体と黒質緻密部における神経細胞消失を生じる。同様に、メタマンフェタミン誘導性神経毒性はドーパミン作動性ニューロンとセロトニン作動性ニューロンの神経変性をもたらし、ヒトの病態に非常に近い状態と当業者に考えられている。治療薬の効果は、アポモルヒネ誘導性回転行動を用いた行動結果によって評価することができる。
【０１９６】
別のパーキンソン氏病モデルは、神経毒であるＮ−メチルー４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を使用して構築したものである。ＭＰＴＰをマウス、ラット、サルなどの哺乳動物に投与する。サルへのＭＰＴＰの投与は、黒質緻密部および線条体におけるドーパミン作動性ニューロンおよびセロトニン作動性ニューロンの消失のみならず、無動症や硬直した姿勢などのヒトパーキンソン氏病患者に見られるものと類似した行動発現を発生させる。例えば、米国特許第6,362,319号を参照。この文献の記載は、本願に組み込まれたものとする。
【０１９７】
上述したパーキンソン氏病の動物モデルとは対照的に、生まれながらにドーパミン作動性細胞の数が徐々に減少するマウスの血統が多数入手可能である。例えば、相同組み換えによって作製したＤ２受容体欠失マウスの行動的特徴は、パーキンソン氏病に苦しむ患者のそれと似ている（Fitzgerald et al. (1993) Brain Res. 608:247-258）。第２の例は、中脳のドーパミン作動性ニューロン数が経時的に４０％まで徐々に減少するウイーバー変異マウスである（Verina et al. (1997) Exp. Brain Res. 113:5-12、Adelbrecht et al. (1996) Mol. Brain Res. 43:291-300、およびMitsumoto et al. (1994) Science 265:1107-1110）。
【０１９８】
本願の実施例では、SauerとOertelの部分ＰＤモデル（Sauer and Oertel, Neuroscience (1994) 59:401-415）を使用した。このモデルでは、ＤＡニューロンの進行性後退変性を６−ＯＨＤＡの線条体内注射によって誘導し、変性は損傷後１〜２週間で始まり、８〜１６週間にわたって継続する。このＤＡニューロンの進行性減損は、よりＰＤの疾病過程との類似性が高く、内側前脳束を破壊するためにより急激なＤＡニューロンの変性を起こす完全なモデルよりも治療研究用の動物モデルとして適切である。後に詳細に説明する実験においては、ベクターを注射する前のラットは一定した行動障害を示していた。アポモルヒネ誘導性回転の出現は、通常、線条体のドーパミン含量の９０％以下の減損を意味する（Hudson et al., Brain Res. (1993) 626:167-174）。しかし、ＰＤ患者と動物モデルの研究は、提唱されているドーパミンレベルよりも多くの生存ＤＡニューロンが存在する可能性を示している（Javoy-Agid et al., Neuroscience (1990) 38:245-253、Feamley and Lees, Brain (1991) 114:2283-2301、およびSchulzer et al.. Brain (1994) 117:509-516）。ここで使用しているモデルでは、損傷から４週間後には損傷を受けた側の黒質（ＳＮ）のＣＴＢ陽性ニューロン数は、反体側の値の２８．９％だった。この結果は、フルオロゴールド（ＦＧ）による逆行性標識を用いた過去の研究において、損傷を受けたＳＮ内のＦＧ陽性細胞数が２８．８％（損傷後３５日目）（Kozlowski et al., Exp. Neurol. (2000) 166:1 15）または３４％（損傷後４週間目）（Sauer and Oertel, Neuroscience (1994) 59:401-415）だった結果と一致した。更に、ＣＴＢ標識ニューロンの大部分はＴＨ陽性であり、これは黒質線条体の突起がＡＡＶベクター注入時には無傷で残存していたことを示唆している。特定の理論に拘束されるものではないが、このような無傷の黒質線条体突起の残存部とＤＡニューロンは、ＭＡＮＦ２遺伝子送達後の再生と機能回復のための基質として働く可能性がある。
【０１９９】
他の神経変性疾患の動物モデルについても報告があり、ＰＤ以外の神経変性障害の処置におけるウイルス送達性ＭＡＮＦ２ポリヌクレオチドの治療効果を評価する上で有用である。例えば、Martin et al. (1995) Brain Res. 683:172-178 にはてんかんの動物モデルが記載されており、Matheson et al. (1997) NeuroReport 8:1739-1742とOppenheim et al. (1995) Nature 373:344-346には、身体外傷による神経変性のモデルが記載されており、そしてSagot et al. (1996) J. Neurosci. 16:2335-2341には、動物における運動ニューロン変性のモデルが記載されている。
【０２００】
診断 
本発明はまた、生物学的試料中のＭＡＮＦ２またはそのアレル変異を検出するために用いる診断用のまたは予後判定用のキットに関する。このキットは、上述したＭＡＮＦ２依存性病態を診断するための手段、あるいはＭＡＮＦ２の変異または機能不全が介在する病態に関する個体の疾病素質を評価するための手段を提供する。このキットは、生物学的試料中のＭＡＮＦ２ポリペプチドまたはＭＡＮＦ２核酸（例えばｍＲＮＡ）を検出することができる標識化合物を含んでいてもよい。キットはまた、ＭＡＮＦ２遺伝子またはそのアレル変異の少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プライマーまたはプローブを含んでいてもよい。キットは適当な容器に入れることができ、該キットを使用するための説明書を含むことが好ましい。
【０２０１】
受容体の精製 
本発明の更に別の態様においては、ＭＡＮＦ２やＭＡＮＦ２類似体を、ＭＡＮＦ２に結合する受容体のアフィニティー精製に用いることができる。ＭＡＮＦ２は、精製のための好ましいリガンドである。簡単に言えば、この技術は以下の工程を包含する。（ａ）精製すべきＭＡＮＦ２受容体が、支持体に固定化したＭＡＮＦ２上に選択的に吸着される条件下で、該ＭＡＮＦ２受容体の原料を固定化したＭＡＮＦ２に接触させ、（ｂ）固定化したＭＡＮＦ２とその支持体を洗浄して、吸着されていない物質を取り除き、そして（ｃ）固定化したＭＡＮＦ２に吸着しているＭＡＮＦ２受容体分子を溶出バッファーで溶出して、ＭＡＮＦ２受容体分子を得る。アフィニティー精製の特に好ましい態様においては、ＭＡＮＦ２は不活性で多孔性のマトリックスまたは樹脂（例えば、臭化シアンと反応させたアガロース）に共有結合している。ここで特に好ましいのは、プロテインＡカラムに固定化したＭＡＮＦ２イムノアドヘシンである。次に、ＭＡＮＦ２受容体を含む溶液を、クロマトグラフィー材料に流す。ＭＡＮＦ２受容体はカラムに吸着し、溶出条件（例えば、ｐＨまたはイオン強度）を変えることによってＭＡＮＦ２受容体を溶出させる。
【０２０２】
ＭＡＮＦ２に結合する分子を同定するための好ましい手法は、固相（例えば、アッセイプレートのウェル）に付着したキメラＭＡＮＦ２（例えば、エピトープタグを付したＭＡＮＦ２やＭＡＮＦ２イムノアドヘシン）を用いる方法である。所望により標識した（例えば、放射線標識した）候補分子の、固定化したＭＡＮＦ２への結合を測定することができる。代わりに、125Ｉで標識し、結合に対するＭＡＮＦ１との競合を測定することもできる。
【０２０３】
トランスジェニック動物の作製 
ＭＡＮＦ２をコードする核酸、好ましくはヒト以外の生物種（例えばマウスやラット）のＭＡＮＦ２タンパク質をコードする核酸は、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物の作製に用いることができ、作製した動物は、治療に有用な試薬の開発やスクリーニングに役立てることができる。トランスジェニック動物（マウスなど）とは、トランスジーンを含有する細胞を有する動物であり、そのトランスジーンは、出生前段階、例えば胚の段階で該動物またはその祖先に導入したものである。トランスジーンは、トランスジェニック動物の発生の出発点となる細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。１つの態様においては、確立された技術を用いてＭＡＮＦ２をコードするヒトおよび／またはマウスのｃＤＮＡ、あるいはその適当な配列を、ＭＡＮＦ２をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに用い、得られたゲノム配列を、ＭＡＮＦ２をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物の作製に用いることができる。トランスジェニック動物（特にマウスなど）の作製法は当業界では既に一般的なものとなっており、例えば米国特許第4,736,866号および米国特許第4,870,009号に開示されている。典型的には、組織特異的エンハンサーを用いたＭＡＮＦ２トランスジーンの導入のために特定の細胞を標的とすることにより、所望の治療効果の実現につながると考えられる。胚発生期に生殖細胞系列にＭＡＮＦ２をコードするトランスジーンが導入されており、トランスジーンの複製物を内包するトランスジェニック動物は、ＭＡＮＦ２をコードするＤＮＡの発現増加の与える効果を調べるために用いることができる。このような動物は、例えばＭＡＮＦ２関連疾患からの保護を与えると考えられる試薬のための実験動物として使用することができる。本発明のこのような態様に基づけば、試薬で動物を処置することによって、疾患の発病率がトランスジーンを有する未処置の動物の発病率と比べて低下することは、疾患に対するの治療的介入の可能性を意味する。
【０２０４】
トランスジーンが５’側にイントロンを含有し、かつそのイントロンが天然のイントロンである場合、トランスジーンがより効率的に発現されることが今ではよく知られている（Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988) および Yokode et al., Science 250:1273-1275 (1990)）。
【０２０５】
生まれてきたトランスジェニックな動物（transgenic offspring）は、マイクロインジェクトしたトランスジーンの動物ゲノムへの組み込みを立証することで同定できるが、トランスジーンの組み込みは、テール部の短い部分からＤＮＡを調製し、トランスジーンの存在をサザンブロット法（即ち、「テールブロット（Tail Blots）法」）で分析することが好ましい。プローブとして好ましいのは、マウスゲノムには存在せず、トランスジーン特有の配列として存在するトランスジーン融合構築物（transgene fusion construct）の一部分である。また、トランスジーン内のコドンの天然配列を、同じペプチドをコードする異なる配列で置換することにより、ＤＮＡおよびＲＮＡの解析の際に同定可能な特有の領域が得られる。この方法で同定されたトランスジェニック「ファウンダー」マウスを正常なマウスと交配してヘテロ個体を得、得られたヘテロ個体を戻し交配することでトランスジェニックマウスの系統を創生する。そして、系統が確立されホモ個体が現れるまで、各世代のマウスのテールブロットを行う。産生に成功したファウンダーマウスおよびその系統は、系統間でマウスゲノムに挿入されたトランスジーンの位置やコピー数が異なるため、トランスジーンの発現レベルには幅広い多様性が見られる。確立された各系統から選択した動物を生後２ヶ月の時点で殺し、トランスジーンの発現を、肝臓、筋肉、脂肪、腎臓、脳、肺、心臓、脾臓、生殖腺、副腎および腸由来のＲＮＡのノーザンブロット法により分析する。
【０２０６】
「ノックアウト」動物の作製 
また、ＭＡＮＦ２の非ヒトホモログは、ＭＡＮＦ２「ノックアウト」動物（即ち、内因性ＭＡＮＦ２遺伝子と動物の胚細胞に導入した改変ゲノムＭＡＮＦ２ ＤＮＡとの相同組み換えの結果、ＭＡＮＦ２をコードする遺伝子が欠陥を有するかまたは改変されている動物）の作製に用いることもできる。例えば、マウスのＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡを用い、確立された手法でゲノムＭＡＮＦ２ ＤＮＡをクローニングすることが可能である。ゲノムＭＡＮＦ２ ＤＮＡの一部を欠損させたり、他の遺伝子（例えば組み込みをモニターするのに使うことのできる選択的マーカーをコードする遺伝子）などで置換したりすることが可能である。典型的には、ベクターには数キロベースの非改変隣接ＤＮＡ配列が（５’末端と３’末端の両方に）含まれている（相同組み換えベクターに関する記載については、Thomas and Capecchi, Cell 51:503 (1987)等を参照）。ベクターを胚性幹細胞系に（エレクトロポレーション法などで）導入し、導入したＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組み換えした細胞を選択する（例えば、Li et al., Cell 69:915 (1992)を参照）。続いて、選択した細胞を（マウスなどの）動物の胚盤胞に注入し、凝集キメラ（aggregation chimera）を形成する（Bradley, "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (奇形癌と胚性幹細胞：実践的アプローチ)", E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152等を参照）。その後、偽妊娠した適切な代理母動物にキメラ胚を移植し、「ノックアウト」動物が生まれるようにキメラ胚を出産日まで育てる。胚細胞に相同組み換えＤＮＡを有する子孫は標準的な手法で同定することができ、また、全細胞が相同組み換えＤＮＡを有する動物を交配するために用いることができる。ノックアウト動物は、ヒトの神経学的な障害や欠陥を模倣する能力によって特徴付けることができる。
【０２０７】
同等物 
本明細書中ではある特定の態様を詳細に開示しているが、これはあくまで説明を目的として実例を挙げたにすぎず、添付の請求項に定義する本発明の請求の範囲を限定するものではない。特に、本発明者らは、請求項で定義した本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な置き換え、変更および修飾をなし得ることを意図している。出発物質とする核酸、目的のクローン、ライブラリーの種類などの選択は、本明細書に開示する態様についての知識を有する当業者には慣例的な事項であると考える。本発明の他の態様、効果および改良に関しては、添付の請求の範囲内に含まれるものとする。
【０２０８】
本発明を概ね説明したが、以下の実施例に参照することで発明をより容易に理解することができる。しかし、以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、限定するものではない。
実施例
【実施例１】
【０２０９】
ＲＴ−ＰＣＲ法による、ＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡのクローニングとＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡの発現解析 
我々は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって、マウス脳細胞（プライマーとしてm-MANF2-ATGとm-MANF2-STOP-delを使用）およびヒト脳細胞（プライマーとしてh-MANF2-ATGとh-MANF2-STOP-delを使用）からマウスとヒトの全長ｃＤＮＡをクローニングすることができた。マウス全ＲＮＡはＲＮＡ抽出キット（Ambion製）を用いて単離し、ヒトＲＮＡはClontechから入手した。種々の組織から得た、オリゴ(ｄＴ)（Promega製）でプライミングした全ＲＮＡ（５μｇ）またはポリ(Ａ)＋ＲＮＡ（１μｇ）をテンプレートとして用い、逆転写酵素（SuperscriptII、Invitrogen製）で一本目のｃＤＮＡ鎖を合成した。
【０２１０】
マウスＭＡＮＦ２（ｍ−ＭＡＮＦ２）とヒトＭＡＮＦ２（Ｈ−ＭＡＮＦ２）のクローニングと発現解析に使用したプライマーは以下の通りである。
m-MANF2-ATG
ACC ATG CGG TGC ATC AGT CCA ACT GC (配列番号５) 
m-MANF2-int-as
CTC ATG GGA CGA GTG ACT TCT CC (配列番号６)
m-MANF2-STOP
GTC AGA GCT CCG TTT GGG GGT ATA TC (配列番号７)
m-MANF2-STOP-del
GAG CTC CGT TTG GGG GTA TAT C (配列番号８)
h-MANF2-ATG
ACC ATG TGG TGC GCG AGC CCA GTT GC (配列番号９)
h-MANF2-int-as
GCA CAC TCA TTG GGC GAG TGA CTT C (配列番号１０)
h-MANF2-stop
GAT CAG AGC TCT GTT TTG GGG TGT GTC (配列番号１１)
h-MANF2-stop-del
GAG CTC TGT TTT GGG GTG TGT C (配列番号１２)
【０２１１】
テンプレートとして１／１０のＲＴ反応混合物および０．２５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Dynazyme、Finnzymes Ltd製）を含む２５μｌ容量の反応系で、ExpandTM Long DistanceまたはGC-rich PCR System（いずれもRoche製）のいずれかのキットを取扱説明書に従って使用し、ＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡは以下の条件で増幅した：９４℃（２分）、そして９４℃（４０秒）、５５℃（４０秒）、７２℃（６０秒）を３５サイクル。全てのプライマーの組み合わせについて、アニーリング温度は５５℃とし、サイクル数は３０〜３５とした。増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで展開し、pCRIIベクターおよびpcDNA3-His-V5ベクター（Invitrogen製）にクローニングし、シークエンシングによって確認した。
【実施例２】
【０２１２】
細胞培養 
ＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Gibco製）を含有するダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。Fugene 6（Roche製）のトランスフェクションプロトコルを用いて、細胞にヒトまたはマウスのＭＡＮＦ２全長ｃＤＮＡを含有するpcDNA3.1（Invitrogen製）発現ベクターをトランスフェクトした。１２時間後に培地を除去し、無血清のＤＭＥＭで置換した。４８時間後に細胞を回収し、細胞からタンパク質抽出物を調製した。分泌タンパク質（培地）は濃縮した。タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲルで展開し、Ｖ５抗体（Invitrogen製）を用いたウエスタンブロットで分析した。
【実施例３】
【０２１３】
In situハイブリダイゼーション 
ＲＮＡプローブを合成する前に、pCRIIベクター内のマウスＭＡＮＦ２の全長ｃＤＮＡを線状化した。一本鎖ＲＮＡプローブを、５０μＣｉの［35Ｓ］−ＵＴＰとＴ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼを使用して、in vitroで転写した。ＤＮＡ分解酵素で消化した後、プローブを沈殿させ、５０％ ホルムアミドを含む１０ｍＭ ＤＴＴ溶液に再懸濁した。マウス脳の矢状断切片および冠状断切片をクリオスタットで切り出し、埋設用スライドに移した。切片を乾燥し、４％ パラホルムアルデヒドで固定し、５０％ ホルムアミド、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス、１０ｍＭ ＮａＰＯ4（ｐＨ６．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡおよび特異的なプローブを含むバッファー中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは５０℃で一晩行った。洗浄は、５０％ ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ中、３７℃で行い、続いて、ＲＮＡ分解酵素による消化を実施した。スライドをＸ線フィルムに暴露するか、またはKodak NTB-2エマルジョンに浸し、１４〜３０日後に現像した。
【実施例４】
【０２１４】
In situハイブリダイゼーションによるＭＡＮＦ２発現の解析  
プローブ 
pCRII-TOPO TAベクター（Invitrogen製）にクローニングした全長ＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡを用いて、アンチセンスｃＲＮＡプローブおよび対照センスｃＲＮＡプローブを作製した。適切な酵素でプラスミドを線状化し、35Ｓ標識ＵＴＰ（Amersham製）およびＳＰ６またはＴ７転写システム（Promega製）を用いたin vitroの転写法で、35Ｓ標識プローブを作製した。取り込まれなかったヌクレオチドをSephadex G-50（NICKカラム、Pharmacia Biotech製）を用いたゲル濾過で除去した。プローブをエタノール沈殿し、ハイブリダイゼーションバッファー（６０％ 脱イオンホルムアミド（ＦＡ）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ 硫酸デキストラン、１×デンハルト溶液、１００ｍＭ ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ 酵母ｔＲＮＡ）に終濃度が３２，０００〜３６，０００ｃｐｍ／μｌとなるように溶解した。
【０２１５】
組織試料 
出生後ＮＭＲＩマウスの脳（Ｐ１、Ｐ５、Ｐ１０と成体）をドライアイス上のTissue-Tekにマウントし、−７０℃で保存した。凍結組織から冠状断切片をクリオスタットで切り出した。マウス胚（Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１５）と成体マウス精巣を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、４℃で一晩固定し、エタノールの希釈系列で脱水し、トルエンで清浄化し、パラフィンに包埋した。矢状断切片を切り出した後、シリル化処理済のスライドガラスに接着した。
【０２１６】
In situハイブリダイゼーション 
凍結切片（融解し、風乾したもの）を、４％ ＰＦＡを使用して室温で１５分間固定し、ＰＢＳですすいだ。次に、プロテネーズＫ（１μｇ／ｍｌ、Sigma製）で処理し、すすいだ後、４％ ＰＦＡで再固定した。切片をＰＢＳですすいだ後、５０％ ＦＡを含む２×ＳＳＣで１０分間インキュベートし、水ですすぎ、アセチル化してから、５０％ ＦＡを含む２×ＳＳＣに１０分間浸漬した。５２℃、１．５〜２時間の条件下で切片とハイブリダイゼーションバッファーのプレハイブリダイゼーションを行い、５２℃でプローブ（１２０〜１５０μｌ）とのハイブリダイゼーションを一晩行った。
【０２１７】
パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、濃度の漸減するエタノール系列（純エタノール、９４％、７０％、５０％と３０％）で加水し、４％ ＰＦＡで固定した。スライドをＰＢＳですすぎ、プロテネーズＫ（２０μｇ／ｍｌ、Sigma製）で処理し、ＰＢＳですすいだ後、４％ ＰＦＡで再固定した。アセチル化のために、切片に０．１Ｍ トリエタノールアミン（ｐＨ８．０）と無水酢酸（２．５ｍｌ／Ｌ）を加えた。ｌ０分間インキュベートした後、スライドをＰＢＳですすぎ、濃度の漸増するエタノール系列で脱水し、風乾した。プローブ（１２０〜１５０μｌ）を各スライドにアプライし、加湿チャンバー内、５２℃でハイブリダイゼーションを一晩行った。
【０２１８】
ハイブリダイゼーションの後、切片を１０ｍＭ ＤＴＴを含む５×ＳＳＣを用いて５０℃で３０分間洗浄し、次に２×ＳＳＣ、３０ｍＭ ＤＴＴと５０％ ＦＡの溶液を用いて５５℃で３０分間洗浄し（低いストリンジェンシーの洗浄）、３７℃のＮＴＥバッファー（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０））で１０分間のすすぎを３回行い、リボヌクレアーゼＡ（２０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理した後、すすいだ。２回目の低いストリンジェンシーの洗浄を行い、切片を２×ＳＳＣと０．１×ＳＳＣでそれぞれ１５分間すすぎ、エタノール系列（０．３Ｍ 酢酸アンモニウムを含む、３０％、６０％、８０％と９５％のエタノールおよび純エタノール）で脱水し、風乾した後、Ｘ線フィルムに５〜６日間暴露した。スライドをＮＴＢ−２エマルジョン（Kodak製）に浸し、５〜６週間暴露した後に現像した。切片はヘマトキシリンで対比染色しPermountで包埋した。
【実施例５】
【０２１９】
Ｓｆ９昆虫細胞による組み換えＭＡＮＦ２タンパク質の製造 
推定シグナル配列なしのヒトＭＡＮＦ２ ｃＤＮＡを、Ｎ末端ミツバチメリチン分泌シグナルとＣ末端Ｖ５−６×Ｈｉｓタグの読み枠を合わせながら、pMIB/V5-His発現ベクター（InsectSelect system、Invitrogen製）にクローニングした。抗生物性の抗真菌薬（Gibco製）を含むＳＦ−９００ ＩＩ培地（Gibco製）で培養したＳｆ９細胞を６穴プレート（９×１０5細胞/ウエル）に植え付け、細胞が付着したら、６μｌのCellfectin試薬（Invitrogen製）を用いて２μｇのプラスミドをトランスフェクトした。２８℃で４８時間後には、細胞を１：５にわけ、一晩付着させた後、ブラストシチジンＳ（５０μｇ／ｍｌ、Invitrogen製）を添加した。ポリクローナルな細胞株（Ｓｆ９−ｈＭＡＮＦ２）を形成するために、耐性コロニーをコンフルエントになるまで培養した。安定な細胞を、ｌ０μｇ／ｍｌブラストシチジンで維持した。組み換えＭＡＮＦ２の培養液への分泌は、マウスモノクローナル抗Ｖ５抗体（１：５０００、Invitrogen製）によるウエスタンブロッティングで確認した。
【０２２０】
Ｓｆ９−ｈＭＡＮＦ２細胞の懸濁培養を対数増殖期の付着細胞で開始した。１×１０6細胞／ｍｌの細胞を、１０μｇ／ｍｌ ジェンタマイシンと１０μｇ／ｍｌ ブラストシチジンＳを含むＳＦ−９００ ＩＩ培地に植えつけた。２８℃、１２０ｒｐｍの条件で培養細胞を増殖させ、密度が約２×ｌ０6細胞／ｍｌに達したら、対数増殖を維持するために継代培養した。
【０２２１】
培地からのＭＡＮＦ２タンパク質の精製 
タンパク質の産生のために、Ｓｆ９−ｈＭＡＮＦ２懸濁培養細胞（２５０ｍｌ容）を対数増殖期終了まで４〜６日間培養した。細胞を１２００ｒｐｍでｌ０分の遠心分離で除去し、ＭＡＮＦ２を１Ｌの清浄化培地から４℃で精製した。
【０２２２】
工程１．  遠心分離によるニッケル−セファロース精製
Ｈｉｓタグを付したタンパク質の結合条件を調節するために、培地をＰＢＳで希釈（１：２）し、終濃度が５ｍＭとなるようにイミダゾール（Sigma製）を添加した。Chelating Sepharose Fast Flow（Pharmacia Biotech製）に０．１Ｍ ＮｉＣｌ2をチャージし、洗浄後、１ゲル等量のＰＢＳに再懸濁した。５０ｍｌの培地につき、１ｍｌのＮｉ−セファローススラリーを添加し、サンプルのエンド−オーバー−エンド回転を４℃で１時間継続した。ゲルを５００×ｇで２分の遠心分離で析出させ、０．５Ｍ ＫＣｌと５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳで４回洗浄した。ゲル容量と等量の０．５Ｍイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてタンパク質を溶出した。溶出液をまとめ、YM-10 Centriconフィルター装置（Millipore製）で終容量が５０〜１００μｌになるように濃縮した。一部を１５％ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥで流し、クーマシー染色で可視化した。
【０２２３】
工程２．  HiTrap Chelating HP カラム（５ｍｌ、Pharmacia Biotech製）をニッケルでチャージし、バインディングバッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４）で平衡化した。工程１で得たサンプルを５ｍｌのバインディングバッファーで希釈し、カラムにアプライした。２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の０．５Ｍ イミダゾールと０．５Ｍ ＮａＣｌによる溶出を、流速０．８ｍｌ／分の直線グラジエント（０〜１００％）で行った。画分（１ｍｌ）を回収し、抗Ｖ５抗体によるウエスタンブロッティングで解析した。ＭＡＮＦ２を含有する画分をＹＭ−１０フィルターで１００μｌまで濃縮した。ＰＢＳ（１ｍｌ）を添加し、更に終容量が５０μｌになるまで更に濃縮した。
【実施例６】
【０２２４】
組み換えヒトＭＡＮＦ２タンパク質のＮ末端シークエンシングと質量分析 
ＣＯＳ−７細胞を３枚の９ｃｍシャーレに植え付け、Fugene 6試薬（Roche製）を用いて１０μgのhMANF2-pcDNA3.1をトランスフェクトした。２４時間後に培地を無血清ＤＭＥＭで交換し、細胞を更に４８時間インキュベートした。培養液（２４ｍｌ）を回収し、組み換えＭＡＮＦ２を精製工程１と同様に精製した（上記参照）。
【０２２５】
工程１で得た溶出液（総容量５００μｌ）の内の２５０μｌを逆相クロマトグラフィーに用いた。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に加えたサンプルをＣ１カラム（１ｍｍ×２０ｍｍ、Pharmacia Biotech製）にアプライし、０．１％ ＴＦＡ中の０〜１００％アセトニトリルグラジエントで溶出した。３μｇのＭＡＮＦ２を含有する分離ピークを回収し、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。ブロットを染色し、ＭＡＮＦ２を含有するバンドを切り出し、抽出してＮ末端のシークエンシングに付した。
【０２２６】
組み換えヒトＭＡＮＦ２の分子質量をＱ−ＴＯＦエレクトロスプレー解析で決定した。サンプルの一部をペプチド断片に消化し、断片の質量をＱ−ＴＯＦで決定した。
【０２２７】
ＣＯＳ−７細胞の産生した組み換えヒトＭＡＮＦ２のＮ末端のシークエンシングは、成熟タンパク質の予測配列（ＱＥＡＧＧ．．．）におけるＮ末端グルタミン（Ｑ）が環状ピログルタミン酸に修飾されていたために失敗したと考えられる。ＭＡＮＦ２ペプチド断片の質量分析は、２６位と２７位のアミノ酸の間でシグナル配列が開裂したことを立証した。タンパク質は３つまたは４つのシステイン架橋を有することもわかった。
【０２２８】
Ｓｆ９−ｈＭＡＮＦ２安定細胞株のＭＡＮＦ２も同様に解析した。Ｎ末端配列組み換えタンパク質が正しいことが確認できた。質量分析によると、成熟タンパク質において８個の保存されたシスチンは４つのシステイン架橋を形成する。
【実施例７】
【０２２９】
組み換えＭＡＮＦ２タンパク質の生物活性  
培養ドーパミンニューロン 
ドーパミンニューロンの調製には、Ｅ１４ラットまたはＥ１３マウスの中脳底板を解剖した。組織を０．５％ トリプシンを含むＨＢＳＳを用いて、３７℃で２０分間消化した。トリプシン活性は、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）の添加でブロックした。DnaseI（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、シリコン処理済のガラスピペットでサンプルを粉砕した。細胞を完全培地（１０％ ＨＣ−３、０．６％ グルコース（Sigma製）と１×Glutamax I（Gibco製）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２）で２回洗浄し、カバーガラス当たり１５０．０００細胞となるように、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニンでコートしたカバーガラスに細胞を植えつけた。次の日にはタンパク質因子を添加し、細胞を６日間培養した。４％ＰＦＡを含むＰＢＳを用いて培養細胞を室温で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、氷冷アセトンを用いて−２０℃で１５分の固定後処理を行い、洗浄した。固定した培養細胞を１０％ ＨＳを含むＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングし、ヒツジ抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体（１：２００、Chemicon International製）による処理を４℃で一晩行った。培養細胞をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体であるＣｙ３抗ヒツジ抗体（１：５００）による処理を室温で４５分間行った。培養細胞を洗浄し、マウント用メジウムでマウントした。
【０２３０】
培養後根ガングリオンニューロン 
ＤＲＧニューロンの調製には、１％ トリプシンを含むＨＢＳＳを用いて、Ｅ１６マウスの組織を３７℃で４５分消化した。組織を培養ドーパミンニューロンと同様に処理し、単離した細胞を完全培地（ＳＡＴＯ添加Ｈａｍ’ｓ Ｆ１４培地）に植えつけた。細胞はタンパク質因子有りまたは無しの条件で６日間培養し、細胞数を計測した。
【実施例８】
【０２３１】
実験計画 
全てのラットに定位マイクロインフュージョンを２回施した。具体的には、１回目には、ベヒクル（４μｌ）、ＭＡＮＦ２（１０μｇ）またはＧＤＮＦ（１０μｇ）のいずれかを注入し、６時間後にはそれぞれの動物に６−ＯＨＤＡ（８μｇ）を左尾状核の同じ部位に投与した。前頂と硬膜に対する左線条体における座標は、PaxinosとWatsonのアトラス（Paxinos and Watson, 1997, The rat brain in stereotaxic coordinates (ラット脳の定位座標), Academic press, San Diego）によるとＡ／Ｐ ＋１．０、Ｌ／Ｍ ＋２．７、Ｄ／Ｖ −４だった。この研究は、以下のグループからなるものである：  線条体 ＰＢＳ＋６−ＯＨＤＡ、線条体 ＧＤＮＦ＋６−ＯＨＤＡ、および線条体 ＭＡＮＦ２＋６−ＯＨＤＡ。
【０２３２】
回転行動  
損傷から２週間後と４週間後に行動試験を実施した。Ｄ−アンフェタミン（フィンランド国、ヘルシンキ、University Pharmacy製）投与（２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔注射）の３０分前には、ラットを試験チャンバーに慣らしておいた。完全な（３６０°の）同側性回転および反対側性回転の数を２時間にわたり記録した。損傷に対する累計同側性回転数は右回転の数から左回転の数を引くことで算出した。
【０２３３】
免疫組織化学  
損傷から４週間後には、過剰量のペントバルビトールナトリウム（９０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射）（フィンランド国、Orion Pharma製）でラットを麻酔し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて４％ パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）による心臓内還流を行った。脳を取り出し、４時間の固定後処理を行い、２０％ ショ糖含有リン酸ナトリウムバッファー中、４℃で保存した。４０μｍ厚の連続した環状断凍結切片をスライド式ミクロトームで切り出した。６セットの切片を凍結保護溶液（０．５Ｍ ＰＢ、３０％ グリセリンと３０％ エチレングリコール）に回収し、免疫組織学的処理を行うまで−２０℃で保存した。浮動性切片をＴＨ−免疫組織学のために処理した。ＰＢＳで３回すすいだ後、３％ Ｈ2Ｏ2／１０％ メタノール／ＰＢＳ中で内因性ペロキシダーゼ活性の抑制処理を５分間行った。ＰＢＳで３回すすいだ後、切片を正常ウマ血清（ＮＨＳ）／０．３％ Triton X-100 を含むＰＢＳとプレインキュベートすることで非特異的な染色をブロックした。その後、切片１：２０００に希釈したビオチン化マウス−抗ＴＨ抗体（カリフォルニア州、テメクラ、Chemicon製）と共に室温で一晩インキュベートした。続いて、１：２００に希釈したビオチン化ウマ抗マウス抗体（BA2001、Vector製）とのインキュベーション、およびElite ABC Vectastainキット（Vector Laboratories製）を用いたアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションを行った。ＤＡＢを発色団として使用し、反応を可視化した。
【０２３４】
形態解析 
ＳＮ細胞数
光学フラクショネーター（Optical fractionator）法を解像原理と公平な計測規則（West et al.,1991, Anat. Rec. 231, 482-497、Mouton et al. 2002, Brain Res. 956, 30-35）と組み合わせて使用する、公平なステレオロジーによる細胞計数法で、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のＴＨ陽性細胞数を計測した。ＳＮｐｃの全体を、Olympus BX51顕微鏡に装着したStereo Investigator（ドイツ国、MicroBrightField製）のプラットフォーム上で解析した。容量解析のために、それぞれの動物について、内側の尾状核（ＭＴＮ）が存在する（Ａ／Ｐ軸は−５．３）ＳＮｐｃの中央部から３つの切片を選択した。光学フラクショネーターによる推定は、個別の脳サンプルに関する計数誤差がｘ％未満となるように最適化した。それぞれの参照空間は低倍率（４×）で輪郭をとり、細胞は高倍率（６０×、油浸）の対物レンズを用いて計数した。
【０２３５】
結果 
オスのウイスターラットでは、線条体への１回のＭＡＮＦ２注射（１０μｇ）が黒質線条体路におけるドーパミン作動性神経の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ、８μｇ）誘導変性を防止した。麻酔下でラットに２回の定位マイクロインフュージョンを施した。具体的には、１回目には、ベヒクル（ＰＢＳ、４μｌ、対照群）またはＭＡＮＦ２（１０μｇ、処置群）を投与し、６時間後にはそれぞれの動物に６−ＯＨＤＡ（８μｇ）を左尾状核の同じ部位に投与した。前頂と硬膜に対する左線条体における座標は、PaxinosとWatsonのアトラス（Paxinos and Watson, 1997, The rat brain in stereotaxic coordinates (ラット脳の定位座標), Academic press, San Diego）によるとＡ／Ｐ ＋１．０、Ｌ／Ｍ ＋２．７、Ｄ／Ｖ −４だった。
【０２３６】
行動試験は全てのラットについて２回行った。損傷から２週間後と４週間後には、同側性（損傷した側への）回転行動を誘導するためにＤ−アンフェタミンを投与し（２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔注射）、行動を２時間にわたり記録した。損傷の２週間後には、対照群においてアンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔注射）は顕著な同側性回転行動誘導した。一方、処置群（６−ＯＨＤＡ処理の前にＭＡＮＦ２で処置）においては、同側性回転数の増加は見られなかった。損傷の４週間後には、ＭＡＮＦ２はアンフェタミン誘導性の同側性回転を著しく逆転させることができ、免疫組織学的研究も神経栄養因子によるＤＡ細胞の顕著な防御効果を示した。行動試験の結果を図１６に示した。 
【０２３７】
ＴＨ免疫組織化学  損傷の４週間後には、２回目の行動試験に続いて、過剰量のペントバルビトールナトリウム（９０ｍｇ／ｋｇ）でラットを麻酔し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて４％ パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）による心臓内還流を行った。浮動性切片をＴＨ−免疫組織学のために処理した。光学フラクショネーター法を解像原理と公平な計測規則（West et al.,1991, Anat. Rec. 231, 482-497、Mouton et al. 2002, Brain Res. 956, 30-35）と組み合わせて使用する、公平なステレオロジーによる細胞計数法で、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のＴＨ陽性細胞数を計測した。ＳＮｐｃの全体を、Olympus BX51顕微鏡に装着したStereo Investigator（ドイツ国、MicroBrightField製）のプラットフォーム上で解析した。対照群と処置群における、黒質緻密部のＴＨ陽性細胞数の減少はそれぞれ３０％と４％だった。結果の図表によるまとめを図１７に示した。
【０２３８】
尾状核から黒質へのＭＡＮＦ２の逆行性輸送がオスのウイスターラットで観察された。ヨウ素化ＭＡＮＦ２の尾状核への注射を定位注射で行った。その２４時間後には、過剰量のペントバルビトールナトリウム（９０ｍｇ／ｋｇ）でラットを麻酔し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて４％ パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）による心臓内還流を行った。脳を取り出し、１ｍｍ厚の環状断切片を切り出した。直径３ｍｍのサンプルを尾状核、前頭皮質、海馬状隆起および黒質から抜き出した。抜き出したサンプルの放射活性をガンマ線計測器（Perkin Elmer製）で測定した。脳のいくつかは４０ｍｍの冠状断に切り出し、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーに切片を付した。
【０２３９】
考察 
年齢と関連のある神経変性障害であるパーキンソン氏病では、黒質のドーパミン作動性ニューロンが徐々に失われてゆく。神経栄養因子は変性脳疾患の処置における顕著な治療可能性を有している。ニューロンの変性を遅らせるか逆行させる、あるいは神経の損傷を回復させる神経栄養因子は、創薬の潜在的な標的分子である。グリア細胞株誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、ドーパミン作動性ニューロンの、これまでに報告されている最も強力な標的誘導性栄養因子である（Lin et al., 1993, Science 260, 1130-2）。ヒトパーキンソン氏病患者の被殻へのＧＤＮＦの送達は、臨床上の改善をもたらした（Gill et al., 2003, Nat. Med. 9, 589-95）が、Amgenからのより最近のデータは、副作用の深刻な危険性を示している。この結果は、神経変性疾患の処置のための新規神経栄養因子の探索が有効であることを保証している。
【０２４０】
我々の発見は、ＭＡＮＦ２が進化的に保存されている初めての神経栄養因子である可能性を示している。ＭＡＮＦ２は、パーキンソン氏病のラット６−ＯＨＤＡモデルにおいて、ＧＤＮＦと同等に効率よく、そして場合によってはより選択的に脳ドーパミン作動性ニューロンをin vivoで救済することができる。ラット成体の尾状核への６−ＯＨＤＡ送達の６時間前にＭＡＮＦ２を１回注射することは、損傷から２週間後と４週間後のアンフェタミン誘導性同側性回転行動を顕著に減少させ（図１６を参照）、ほとんど完全に黒質のチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞を救済した（図１７）。
【０２４１】
ＭＡＮＦ２には、治療用タンパク質またはパーキンソン氏病治療用薬剤の開発の基盤としての大きな可能性がある。ＭＡＮＦ２は、いくつかの中枢ニューロンのエフェクターとしても有用であり、いくつかの神経変性障害ならびに神経学的および精神学的疾患のための薬剤として考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】Homo sapiensのＭＡＮＦ１とＭＡＮＦ２アミノ酸配列のアラインメント。アラインメントはClustalXプログラムで作製した。同一のアミノ酸残基をアスタリクスで示し、アミノ酸残基の物理化学的特徴に基づく高い類似性を二重のコロンで示し、類似性を点で示した。シグナル配列には下線を引いた。二次構造のαへリックスモチーフはＭＡＮＦ１とＭＡＮＦ２との間で保存されており、配列の上に記した。更に８個の保存されたシステインにも記し（囲い）を付した。
【図２】Homo sapiensとMus musculusのＭＡＮＦ２アミノ酸配列のアラインメント。図中の記号については図１を参照。
【図３】選択した生物のＭＡＮＦアミノ酸配列のアラインメント。配列は国立バイオテクノロジー情報センターのwwwサーバー（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）でBlastサーチを行うことで入手した。いくつかの場合、使用した配列はゲノム配列から組み立て、また、別の他の場合は、重複する発現配列タグから組み立てた。
【図４】選択した生物のＭＡＮＦファミリータンパク質の系統樹。
【図５】種々の組織におけるヒトＭＡＮＦ２発現のＲＴ−ＰＣＲ法による解析。全長ヒトＭＡＮＦ２遺伝子を増幅するプライマー（h-MANF2-atgとh-MANF2-stop-del）をDynazyme ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes製）およびDynazyme １０×バッファーと共にＰＣＲに使用した。ＰＣＲ反応の総容量は２５μｌだった。アニーリング温度を５５℃、伸張時間を３０秒として、合計３５サイクルのＰＣＲを行った。図５Ｃにおいては、プライマーとしてh-MANF2-atgとh-MANF2-int-asを使用した。  図５Ａのレーン： １ 副腎、２ 骨髄、３ 胎児脳、４ 成体脳、５ 小脳、６ 結腸、７ 心臓、8 腎臓、９ 胎児肝臓、１０ 成体肝臓、１１ 肺、１２ 乳腺、１３ 筋肉、１４ 膵臓。  図５Ｂのレーン： １ 胎盤、２ 前立腺、３ 唾液腺、４ 小腸、５ 脊髄、６ 脾臓、７ 胃、８ 睾丸、９ 胸腺、１０ 甲状腺、１１ 気管、１２ 子宮、１３ 水。  図５Ｃのレーン： １ 海馬状隆起、２ 視床、３ 小脳扁桃、４ 脳梁、５ 小脳、６ 尾状核、７ 大脳皮質、８ 黒質、９ 胎児脳、１０ 脳、１１ 水。
【図６】ＣＯＳ−７細胞の発現した、組み換えヒトＭＡＮＦ２タンパク質と組み換えマウスＭＡＮＦ２タンパク質の解析。Ｃ末端６−ヒスチジンタグとＶ５タグを有する全長ヒトまたはマウスＭＡＮＦ２遺伝子を含有する発現構築物は、終止コドンを含まない全長コード領域ｃＤＮＡをpcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen製）にクローニングすることで作製した。１０％ＦＣＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭで培養したＣＯＳ−７細胞を３５ｍｍプレートに植え付け、約７０％コンフルエントまで成長したら、４μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後には無血清培地で培地交換した。トランスフェクションの７２時間後に細胞と培養上清を回収した。１５％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからタンパク質をナイロンメンブランにブロッティングし、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）でブロッキングし、マウス抗Ｖ５抗体（希釈率は１：５０００）とＨＲＰ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン二次抗体（希釈率は１：２０００）を用いたＥＣＬ法で検出した。レーン１ ヒトＭＡＮＦ２遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトした細胞の細胞融解物、レーン２ ヒトＭＡＮＦ２遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトした細胞の培養上清、レーン３ マウスＭＡＮＦ２遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトした細胞の細胞融解物、レーン４ マウスＭＡＮＦ２遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトした細胞の培養上清。
【図７】Homo sapiensとMus musculusの、ＭＡＮＦ２アミノ酸配列と核酸配列。
【図８】In situハイブリダイゼーションによる、Ｐ１０マウス脳におけるＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡの発現。冠状断切片をセンスｃＲＮＡプローブ（Ａ，Ｃ）およびアンチセンスｃＲＮＡプローブ（Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）とハイブリダイズさせ、暗視野照明および明視野照明の下で撮影した。対照センス実験と比べて、ＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡは主として視床と海馬状隆起に発現が観察された。Ｆは、視床に局在する銀粒子である。出生後の脳および成体の脳におけるＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡの発現パターンは、ＭＡＮＦ１ ｍＲＮＡの発現と比べてより制限されており、ＭＡＮＦ１よりも発現レベルが低い。マウスの胚発生の際には、in situハイブリダイゼーション測定によって検出可能なレベルでのＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡ発現はなかった。ＣＴＸは大脳皮質、Ｔｈは視床、Ｈｃは海馬状隆起。スケールバーは１ｍｍ。
【図９】In situハイブリダイゼーションで検出された、成体マウス睾丸の精細管におけるＭＡＮＦ２ ｍＲＮＡ発現。切片をセンスｃＲＮＡプローブ（Ａ）およびアンチセンスｃＲＮＡプローブ（Ｂ，Ｃ，Ｄ）とハイブリダイズさせ、暗視野照明および明視野照明の下で撮影した。ＡとＢのスケールバーは５００μｍ、ＣとＤのスケールバーは１００μｍ。
【図１０】ＣＯＳ−７細胞由来の組み換えＭＡＮＦ２タンパク質は、in vitroにおいてＥ１６マウス後根ガングリオン（ＤＲＧ）ニューロンの生存を促進する。pcDNA3.1に入れたマウスＭＡＮＦ２、pcDNA3.1に入れたＭＡＮＦ１またはＧＦＰ（pGreenLantern、Gibco製）で一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の培養上清を回収し、濃縮した。ＭＡＮＦ２タンパク質およびＭＡＮＦ１タンパク質を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養神経細胞にアプライした。細胞は６日間培養し、生存ニューロン数を計測した。レーン： １ ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、２ 因子の添加なし、３ ＣＯＳ−７／ＧＦＰ、４ ＣＯＳ−７／マウスＭＡＮＦ１、５ ＣＯＳ−７／マウスＭＡＮＦ２。
【図１１】ＣＯＳ−７細胞の産生した組み換えＭＡＮＦ２タンパク質は、in vitroにおいてＥ１４ラットドーパミンニューロンの生存を促進する。pcDNA3.1に入れたマウスまたはヒトＭＡＮＦ２、pcDNA3.1に入れたマウスまたはヒトＭＡＮＦ１、あるいはＧＦＰ（pGreenLantern、Gibco製）で一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の培養上清を回収し、濃縮した。生存促進効果を試験するために、ＭＡＮＦタンパク質を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養ドーパミン細胞にアプライした。ＧＦＰでトランスフェクトした細胞の培養上清およびＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を負の対照と正の対照として使用した。細胞は６日間培養し、固定し、抗ＴＨ抗体で染色した。ヒトＭＡＮＦ１とマウス ＭＡＮＦ１と同様に、ヒトＭＡＮＦ２とマウスＭＡＮＦ２は共にドーパミン作動性ニューロンの生存を促進した。。パネルＡとＢにおけるレーン： １ 因子の添加なし、２ ＧＤＮＦ、３ ＣＯＳ−７／ＧＦＰ、４ ＣＯＳ−７／ヒトＭＡＮＦ１、５ ＣＯＳ−７／マウスＭＡＮＦ１、６ ＣＯＳ−７／ヒトＭＡＮＦ２、７ ＣＯＳ−７／マウスＭＡＮＦ２。
【図１２】Ｓｆ９細胞の産生した組み換えＭＡＮＦ２タンパク質は、in vitroにおいてＥ１３マウスドーパミンニューロンの生存を促進する。ヒト ＭＡＮＦ２を分泌する安定なＳｆ９細胞株を確立し、ＭＡＮＦ２タンパク質を条件培地から精製した。ドーパミンニューロンを因子の添加ありと添加なしの条件でそれぞれ６日間培養し、固定し、抗ＴＨ抗体で染色した。実験を繰り返しても同等の結果が得られた。レーン： １ ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、２ 因子の添加なし、３ ＭＡＮＦ２（ｌ０００ｎｇ／ｍｌ）、４ ＭＡＮＦ１（１００ｎｇ／ｍｌ）。
【図１３】Ｓｆ９−ｈＭＡＮＦ２安定細胞株からのＭＡＮＦ２タンパク質の精製。  Ａ．タンパク質の分泌を示す、抗Ｖ５抗体によるウエスタンブロット。  Ｂ．レーン１は精製工程１の後の試料、レーン２は精製工程２の後の試料。
【図１４】ＣＯＳ−７細胞培養上清からのＭＡＮＦ２タンパク質の精製。  Ａ．精製工程１の後の、Ｈｉｓタグを付したマウスＭＡＮＦ２（レーン１）とＨｉｓタグを付したヒトＭＡＮＦ２（レーン２）。pcDNA3.1に入れたマウスＭＡＮＦ２またはヒト ＭＡＮＦ２でＣＯＳ−７細胞を一過性にトランスフェクトし、培養液を回収し、Ｈｉｓタグを付したタンパク質をＮｉ−セファロースと共に沈殿させ、イミダゾールで溶出した。溶出液の一部（１０または２０μｌ）を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで流し、タンパク質をクーマシー染色で染めた。  Ｂ．逆相クロマトグラフィーで精製し、ＰＶＤＦ膜にブロットした組み換えＭＡＮＦ１タンパク質（レーン１）と組み換えＭＡＮＦ２タンパク質（レーン２）。
【図１５】ヒトＭＡＮＦ２タンパク質分泌シグナルの開裂部位。本来のシグナル配列を含む組み換えＭＡＮＦ２タンパク質をＣＯＳ−７細胞で製造した。精製タンパク質をトリプシンによる消化に付し、ペプチド断片をＱ−ＴＯＦ質量分析法で分析した。この分析によって、シグナル配列開裂部位は２６位と２７位のアミノ酸の間に存在することを確認した。
【図１６】ＭＡＮＦ２： 行動試験。６−ＯＨＤＡ送達の６時間前に行った、成体ラットの尾状核への単一のＭＡＮＦ２注射は、損傷から２週間後および４週間後のアンフェタミン誘導性の同側回転行動を著しく減少した。
【図１７】形態解析。６−ＯＨＤＡ送達の６時間前に行った、成体ラットの尾状核への単一のＭＡＮＦ２注射は、黒質のチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞をほぼ完全に救済した。
【配列表フリーテキスト】
【０２４３】
配列番号５：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１：  オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２：  オリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2009519028.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2009519028000001.app
【国際調査報告】
2009519028.tif 000021
2009519028.tif 000022
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2009519028.tif 000024
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