(57)【要約】  本発明は、キメラリコンビナーゼタンパク質が、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼに関する。セリンリコンビナーゼは、いくつかの天然に存在するセリンリコンビナーゼのうちの１つであり得る。また、本発明には、キメラリコンビナーゼをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、該キメラリコンビナーゼを用いて組換えを行う方法、基質に連結されたタンパク質進化を用いて追加のキメラリコンビナーゼを作製する方法、該キメラリコンビナーゼを遺伝子治療に用いる方法、および医薬組成物が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに機能するように連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されるＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒し、前記セリンリコンビナーゼは、前記キメラタンパク質の構成において組換えを効率的に触媒するように選択され、または改良される、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２】
前記セリンリコンビナーゼドメインが、一般的な鎖交換機構を触媒する求核性の触媒セリン残基を含むリコンビナーゼドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３】
前記セリンリコンビナーゼが、（ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫＩ；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏｌＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ＿Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；連鎖球菌ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセスファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；結核菌プロファージφＲＶ１セリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ＿ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ１９５６；およびＣａｃ１９５４；ならびに
（ｂ）（ａ）のセリンリコンビナーゼの変異タンパク質
から成る群から選択される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項４】
前記セリンリコンビナーゼが、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ、Ｍｉｎ、Ｄｉｎ、およびＣｉｎならびにＧｉｎの変異タンパク質、Ｈｉｎの変異タンパク質、Ｓｉｎの変異タンパク質、Ｂｅｔａの変異タンパク質、Ｐｉｎの変異タンパク質、Ｍｉｎの変異タンパク質、Ｄｉｎの変異タンパク質、Ｃｉｎの変異タンパク質、Ｔｎ３の変異タンパク質から成る群から選択される、請求項３に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、ヘキサヌクレオチドと結合する２指向性のジンクフィンガー結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項６】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３ＧＡＧＧＡＧであり、かつ、６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーによって融合したＴｎ３由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項７】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＨｉｎＧＡＧＧＡＧであり、かつ、前記６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーを介して融合したＨｉｎ由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項８】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＧＡＧＧＡＧであり、かつ、前記６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーを介して融合したＧｉｎ由来のドメインを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項９】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３Ｃｈ１５Ｇであり、かつ、Ｔｎ３に由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１０】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１であり、かつ、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１１】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２であり、かつ、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１２】
（１）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＧ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、またはＥ１２４Ｑ；（２）Ｈｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＨ１０７Ｙ；（３）Ｇｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＭ７０Ｖ、Ｔ９６Ａ、またはＨ１０６Ｙ；あるいは（４）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＩ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｋ６５Ｒ、Ｍ７３Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ、Ｋ５３Ｅ、またはＫ１５１Ｍの変異のうち１つまたは複数の変異が、ＨｉｎおよびＧｉｎ中の対応する相同残基の変異とともに、前記セリンリコンビナーゼに導入される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１３】
前記セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｙ１０９Ｈ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１４８Ｍ、を全て含むＧｉｎドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼ。
【請求項１４】
前記セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１１４８Ｍを全て含むＧｉｎドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼ。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、９塩基対に結合する３指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１２塩基対に結合する４指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１５塩基対に結合する５指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、１８塩基対に結合する６指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１９】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＧＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号３）と結合する、請求項１５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２０】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４）と結合する、請求項１５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２１】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号５〜配列番号７４から成る群から選択される配列ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２２】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号４４〜配列番号５３から成る群から選択される前記配列ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２３】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号７５〜配列番号１３１から成る群から選択される配列ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２４】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号７５〜配列番号８４から成る群から選択される前記配列ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２３に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２５】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１３２〜配列番号１５６から成る群から選択される配列ＣＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１５７〜配列番号２６６から成る群から選択される前記配列ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号１５７〜配列番号１７２から成る群から選択される前記配列ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列が含まれる、請求項２６に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、配列番号２６７〜配列番号６２３および配列番号６５３〜配列番号７０５から成る群から選択される配列ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２９】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、配列番号２６７〜配列番号３１１から成る群から選択される前記配列ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項２８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３０】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、トリプレット結合ドメイン間に位置する少なくとも１つのオリゴペプチドリンカーを含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３１】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）、ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６２６）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号６２７）、ＧＧＲＧＲＧＲＧＲＱ（配列番号６２８）、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号６２９）、ＴＧＧＥＲＰ（配列番号６３０）、ＡＴＧＥＫＰ（配列番号６３１）、およびＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）から成る群から選択される、請求項３０に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３２】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）である、請求項３１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３３】
１から５の保存的アミノ酸置換による請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に由来するキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記保存的アミノ酸置換が各々、Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕから選択され、前記保存的アミノ酸置換に由来する前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記未変異のキメラリコンビナーゼと同じ組換えに対するＤＮＡ配列特異性を有し、その基質に対する結合親和性が、前記未変異のキメラリコンビナーゼの基質に対する結合親和性の約８０％以上であり、そのＶｍａｘが、前記未変異のキメラリコンビナーゼのＶｍａｘの約８０％以上である、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３４】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質が、少なくとも１つの追加のドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３５】
前記追加のドメインが、精製タグ、酵素ドメイン、リガンド結合ドメイン、および細胞透過性ドメインから成る群から選択される、請求項３４に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３６】
前記追加のドメインが酵素ドメインであり、前記酵素ドメインが、蛍光または生物発光を介して検出できる光の生成を触媒する、請求項３５に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３７】
請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項３８】
ＤＮＡである、請求項３７に記載の核酸配列。
【請求項３９】
請求項６に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４０】
ＤＮＡである、請求項３９に記載の核酸配列。
【請求項４１】
請求項７に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４２】
ＤＮＡである、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
請求項８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列。
【請求項４４】
ＤＮＡである、請求項４３に記載の核酸配列。
【請求項４５】
（ａ）（ｉ）前記キメラリコンビナーゼタンパク質が前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼ、
（ｉｉ）キメラリコンビナーゼＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ、
（ｉｉｉ）キメラリコンビナーゼＨｉｎＧＡＧＧＡＧ、および
（ｉｖ）キメラリコンビナーゼＧｉｎＧＡＧＧＡＧ
から成る群から選択されるキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離および精製された核酸配列と
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である、単離および精製された核酸配列であって、前記核酸配列が前記配列の活性を塩基の置換が行われるまで保持しており、かつ、前記核酸配列によりコードされるタンパク質の任意の活性および核酸レベルで発現される前記核酸配列の任意の活性を含む核酸配列と
から成る群から選択される、単離および精製された核酸配列。
【請求項４６】
ＤＮＡである、請求項４５に記載の核酸配列。
【請求項４７】
請求項３８に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４８】
発現ベクターである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項４０に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５０】
発現ベクターである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項４２に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５２】
発現ベクターである、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項４４に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５４】
発現ベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項４６に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項５６】
発現ベクターである、請求項５５に記載のベクター。
【請求項５７】
請求項３７に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５８】
請求項３９に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５９】
請求項４１に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６０】
請求項４３に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４５に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６２】
請求項４７に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６３】
請求項４９に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６４】
請求項５１に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６５】
請求項５３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６６】
請求項５５に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６７】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に結合している、少なくとも２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記部位がスペーサーによって分離されている工程と
（ｂ）前記ＤＮＡと前記キメラリコンビナーゼとを、少なくとも一つのキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断され、部位特異的組換えが起こる工程と
を含む、部位特異的組換えを行う方法。
【請求項６８】
部位特異的組換え事象が反転である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
部位特異的組換え事象が組込みである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
部位特異的組換え事象が分離である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の各々が少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と
（ｂ）前記第１の配列および第２の配列と、少なくとも一つの前記キメラリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件において反応させる工程であって、第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断され、第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換えが行われる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項７２】
前記第１の配列および前記第２の配列を伴って行われる組換え事象が、一部のＤＮＡが失われるかまたは付加され、かつ、産物の部位が少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとの反応に適合する基質ではない、非保存的組換え事象である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記組換え事象が、適合する組換え部位の１つの対または両方の対のいずれかが、一方向性の組換えに適しているカセット交換である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の一方が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有し、かつ、前記第１の配列および前記第２の配列のもう一方が、少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と
（ｂ）前記第１の配列および前記第２の配列と前記少なくとも一つのキメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記第１の配列と前記第２の配列の両方の鎖が切断され、前記第１の配列および前記第２の配列が関与する部位特異的組換え事象がおこる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項７５】
（ａ）組換えのための２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、各部位が、
（ｉ）キメラリコンビナーゼ半部位の最適な結合部位と比較して、実質的に低い親和性で前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと結合している、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのための変異結合部位、および
（ｉｉ）最適に結合している少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼ半部位のための結合部位を含み、これらの部位が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼと特異的に結合し、これらの部位がスペーサーによって分離されている、工程と
（ｂ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとを前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断されることにより部位特異的組換えが行われ、部位特異的組換え事象が組み込みであり、組み込みの結果が安定するようにキメラリコンビナーゼ半部位のための変異結合部位のホモ二量体が組換えに対して非機能的に形成される、工程と
を含む、ＤＮＡ分子において安定な組込みを行う方法。
【請求項７６】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第１の部位をその中に有する第１のＤＮＡ配列を提供する工程と
（ｂ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第２の部位をその中に有する第２のＤＮＡ配列を、前記第１の部位と前記第２の部位が機能的に直交するように提供する工程と
（ｃ）前記第１のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応させ、前記第２のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応させて組換えをもたらす工程と
を含む、ＤＮＡ分子において組換えを行う方法。
【請求項７７】
カセット交換を実行するために、前記組換えのための第１の部位かまたは前記組換えのための第２の部位のいずれかでの組込みに続いて、組込みに用いられていない前記第１および前記第２の部位の一方で切除が行われる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
組換えの結果が反転となる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
組換えの結果が分離となる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミド、および
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第２のプラスミドであって、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なり、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミド
を生成する工程と
（ｂ）第１の遺伝子のコード領域および第２の遺伝子のコード領域を、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位で隣接することにより２つのカセットを構築する工程と
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項８１】
組換えが、プラスミド内カセット交換である請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
組換えが、染色体遺伝子とプラスミドの間である請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
組換えが、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
組換えが、カセット交換により促進される切除である請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミドであって、前記第１のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第１の遺伝子の内在性隣接配列と結合する、第１のプラスミド、および
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第２のプラスミドであって、前記第２のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第２の遺伝子の内在性隣接配列と結合し、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、かつ前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミド
を生成する工程と
（ｂ）第１のカセットが第１の内在性隣接領域に隣接される第１の遺伝子を含み、第２のカセットが第２の内在性隣接領域に隣接される第２の遺伝子を含む２つのカセットを、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位をその中に含む前記２つの内在性隣接領域の各々により構築する工程と
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項８６】
前記組換えが、プラスミド内カセット交換である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記組換えが、染色体遺伝子とプラスミドの間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記組換えが、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記組換えが、カセット交換により促進される切除である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のジンクフィンガー結合部位を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーを適当な宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｃ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｄ）同時に維持された前記形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｅ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｆ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｇ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定する工程と
を含む、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定するための方法。
【請求項９１】
前記宿主が、細菌宿主、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主、および哺乳類細胞宿主から成る群から選択される請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記宿主が細菌宿主であり、前記細菌宿主が大腸菌である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
（ｈ）組換え産物によってのみ発現される別のレポーター遺伝子を含める工程と
（ｉ）前記レポーター遺伝子の活性についてスクリーニングする工程と
をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
請求項９０に記載の方法により見出される、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位。
【請求項９５】
（ａ）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のスペーサー配列を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｃ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｄ）前記同時に維持された前記形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｅ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｆ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｇ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化スペーサー配列を特定する工程と
を含む、シス不活性化スペーサー配列を特定するための方法。
【請求項９６】
（ａ）標的基質を生成する工程であって、前記標的基質が、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン認識配列、選択標的配列およびトランス活性化因子配列をその中に含む組換え部位をその中に含む、工程と
（ｂ）前記標的基質を、トランス活性化因子配列と完全に相補的である請求項１に記載の固定されたキメラリコンビナーゼの存在下、異なるＤＮＡ結合ドメインを含む請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのライブラリーとともにインキュベートして、単一の半部位ライブラリーを生成する工程と
（ｃ）工程（ｂ）で生成された前記単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程と
（ｄ）選択用の２種類の抗生物質を用いて前記形質転換体を同時に維持する工程と
（ｅ）前記同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程と
（ｆ）前記適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程と
（ｇ）前記再形質転換宿主を前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程と
（ｈ）前記２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定する工程と
を含む、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定するための方法。
【請求項９７】
（ａ）リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成して、変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程と
（ｂ）変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程と
（ｃ）前記変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーをプラスミドにクローニングする工程であって、前記プラスミドが、機能的選択のためのリコンビナーゼ基質を含む、工程と
（ｄ）前記リコンビナーゼの活性により修飾されるプラスミドを選択することにより、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質を選択する工程と
を含む、既存のキメラリコンビナーゼから新規なキメラリコンビナーゼを生成するための、基質に連結されたタンパク質進化を用いる方法。
【請求項９８】
前記リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成する工程が、ランダム変異誘発法を通して行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ランダム変異誘発法を通してリコンビナーゼ変異体のライブラリーを作成して変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程が、エラープローンＰＣＲによって行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記エラープローンＰＣＲが、１つ以上のｄＮＴＰ類似体の存在下で、前記リコンビナーゼドメインの増幅により行われる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ｄＮＴＰ類似体が、ｄＰＴＰおよび８−オキソ−ｄＧＴＰである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程が、オーバーラップＰＣＲを用いて行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
工程（ｄ）の選択法が、一方がＴｎ３を用いる使用に適し、もう一方がＧｉｎを用いる使用に適している２種類の異なるスペーサー配列間の組換えを用いて、ハイブリッドスペーサー配列を含む単一の組換え部位とし、その後に前記ハイブリッドスペーサー配列と相補的であるオリゴヌクレオチドを用いる増幅が続く、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ハイブリッドスペーサー配列が、ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号６３３）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記選択法が、相同組換えの可能性を排除する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記方法が、ＰＣＲシャフリングを用いる複数ラウンドの選択の後に前記活性変異体の組換えの工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＣＲシャフリングが、３ラウンドの選択の後に行われる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記方法が、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質の再クローニングの工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記方法が、選択により作製された１つ以上の融合タンパク質の配列決定の工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記基質がゲノムである請求項９７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸をその中に含む組成物を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程と
（ｂ）発現される前記部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程と
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれる遺伝子治療のための方法。
【請求項１１３】
前記有害遺伝子が、悪性腫瘍関連遺伝子；接合部型表皮水疱症に関連する欠陥遺伝子；デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子；鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症から成る群から選択される異常ヘモグロビン症に関連する欠陥遺伝子；重症複合免疫不全症に関連する欠陥遺伝子；ゴーシェ病に関連する欠陥遺伝子；嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子；血友病に関連する欠陥遺伝子；ならびに家族性高コレステロール血症に関連する欠陥遺伝子から成る群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子を前記ゲノムから特異的に取り除く工程と
（ｂ）前記発現される部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子を前記ゲノムから特異的に取り除かせる工程と
（ｃ）前記個体に、前記有害遺伝子のための機能性置換遺伝子をその中に含む核酸を投与する工程と
（ｄ）前記機能性置換遺伝子を前記部位特異的リコンビナーゼに触媒される組換え組込みにより前記ゲノムに挿入する工程と
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれ、その後に組換え組込みにより置き換えられる、遺伝子治療のための方法。
【請求項１１５】
前記有害遺伝子が、悪性腫瘍関連遺伝子；接合部型表皮水疱症に関連する欠陥遺伝子；デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子；鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症から成る群から選択される異常ヘモグロビン症に関連する欠陥遺伝子；重症複合免疫不全症に関連する欠陥遺伝子；ゴーシェ病に関連する欠陥遺伝子；嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子；血友病に関連する欠陥遺伝子；ならびに家族性高コレステロール血症に関連する欠陥遺伝子から成る群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ゲノムの中に有害遺伝子をもつ個体に、（１）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメント、および（２）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメントを有害遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込むように作用する、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼを投与する工程を含む、治療的組込みが有害遺伝子の構造または機能を崩壊し、改善された機能をもつ遺伝子を選択されたゲノム遺伝子座の中に送達するために行われる、遺伝子治療のための方法。
【請求項１１７】
前記方法が、天然の組換え部位で作用する少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼを投与する工程をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
（ａ）治療有効量の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質；および
（ｂ）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１１９】
（ａ）請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする治療有効量の核酸配列、および
（ｂ）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１２０】
前記核酸配列がＤＮＡである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２１】
前記核酸配列が遺伝子治療のための送達系に組み込まれている、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２２】
前記遺伝子治療のための送達系がウイルス系である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項１２３】
前記遺伝子治療のための送達系が非ウイルス系である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項１２４】
前記請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに触媒される組換えの作用によって作製されるトランスジェニック生物。
【請求項１２５】
前記トランスジェニック生物が真核生物である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２６】
前記真核生物が哺乳類である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２７】
前記トランスジェニック哺乳類が、前記トランスジェニック哺乳類の属する哺乳類の種により通常産生されない産物を産生する、請求項１２６に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項１２８】
前記真核生物が昆虫である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１２９】
前記トランスジェニック昆虫が、その昆虫の繁殖性または疾病または経済的な損害を引き起こすその昆虫の能力を低下させるように改変されている、請求項１２８に記載のトランスジェニック昆虫。
【請求項１３０】
前記真核生物が植物である、請求項１２５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３１】
前記トランスジェニック植物が、前記トランスジェニック植物の属する植物の種により通常産生されない産物を産生する、請求項１３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３２】
前記トランスジェニック植物が、改善された生育特性、低下した栄養要求量、または改善された栄養分を有するように改変されている、請求項１３０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３３】
前記トランスジェニック生物が酵母である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１３４】
前記トランスジェニック生物が細菌である、請求項１２４に記載のトランスジェニック生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、本参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００６年７月５日出願のＢａｒｂａｓ、ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許仮出願第６０／８１８，９０８号、標題「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｏｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、新規なＤＮＡ結合ドメインを組み込んでいるキメラリコンビナーゼ、好ましくは、限定されるものではないが、少なくとも１つのジンクフィンガードメイン、および、組換えを促進する触媒活性を有する少なくとも１つのドメイン、ならびに定方向進化によるこれらのリコンビナーゼの活性を最適化するための方法に関し、さらに、遺伝子治療、ならびに、例えば作物、動物および産業用生物に好ましい表現型を与えるための、その他の生物におけるＤＮＡの改変における、上記キメラリコンビナーゼおよび上記方法の適用に関する。
【０００３】
現在、内在性ヒトゲノムの標的化および部位特異的組換えを可能にする遺伝子治療のための戦略はない。そのような戦略があれば、有害遺伝子の迅速な除去および有益遺伝子の安全な組込みが可能となる。
【０００４】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系は、研究者がインビボで別個の細胞のゲノムを効率的に変化させることを可能にする。いったんゲノムのｌｏｘ部位が相同組換えにより導入されると、Ｃｒｅリコンビナーゼはそれらの遺伝子座で切除、反転、または組込みを触媒し得る。この革命的なツールは、誘発された遺伝子不活性化による胚死亡率の回避および胚形成の間の細胞分化系列の描写を含む、新規な適用を見出し続ける（１６）。Ｃｒｅの開発とともに、Ｆｌｐリコンビナーゼおよび部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）であるφＣ３１インテグラーゼは、現在、遺伝子操作のためのツールボックスを構成する。
【０００５】
その名の通り、ＳＳＲは、それらの天然基質に存在する約２８ｂｐの組換え部位に対して高度に特異的である。少数の変異組換え部位が機能的であると見出されているものの、この基本要件によりＳＳＲを内在性ゲノムに適用することが広く禁じられている。相同組換えの必要条件に制約されるため、ＳＳＲは多くの可能性のある適用を阻まれ、遺伝子治療がおそらく最も重要である。この制約が動機となって、いくつかのグループが、方向付けられたタンパク質の進化によってＳＳＲの基質特異性を修飾しようとした（１８、５３、５４）。Ｃａｌｏｓと共同研究者らは、φＣ３１が効率的な組込みを媒介する、内在性ヒトおよびマウスゲノム中の「偽」ａｔｔＰ部位を特徴付けした（６５）。彼らのこの酵素の接合部型表皮水疱症（４８）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（５０）、およびネズミ遺伝性チロシン血症Ｉ型（３１）の治療への適用により、内在性の部位特異的組換えの治療可能性が示唆される。
【０００６】
ＣｒｅおよびφＣ３１を新しい基質に順化させることのできる程度は、それらのＤＮＡ結合相互作用の構造機構により制限されている。チロシンリコンビナーゼ、例えばＣｒｅなどは、同じタンパク質ドメインでＤＮＡ結合と触媒作用を媒介する。この配置は、全ての起こり得るＤＮＡ−タンパク質相互作用の幾何的配列を制約し、外因性ＤＮＡ結合ドメインでの置換を妨げる。特に、１つの変異Ｃｒｅ−基質相互作用の特徴付けにより、（架橋水分子により媒介される変更された塩基対との接触により）認識が間接的であることが明らかとなった（７）。十分特徴付けられたチロシンリコンビナーゼとは対照的に、φＣ３１インテグラーゼ、およびその他の大型のセリンリコンビナーゼの機能は大部分が不明瞭なままである。三次元タンパク質構造または既知のＤＮＡ結合ドメインの非存在下で、Ｃａｌｏｓと共同研究者らは、ランダム変異を含む全タンパク質配列をカバーすることによりφＣ３１を進化させた（５４）。大型のセリンリコンビナーゼの修飾は、重要なＤＮＡ結合領域の潜在的多重性によりさらに複雑である（２）。
【０００７】
したがって、特に遺伝子治療のための、内在性ゲノムの標的化および部位特異的組換えを触媒する、より一般化された方法、ならびにかかる標的化および部位特異的組換えを触媒することのできる酵素に対して必要性がある。これは遺伝子治療に特に有用であるが、遺伝子クローニングにおける適用を含む、多くの他の分子生物学分野への適用、ならびに産業用生物および農業用動植物の改変における使用を有する。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、キメラリコンビナーゼタンパク質が、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、かつ、セリンリコンビナーゼが、キメラタンパク質の状況において組換えを効率的に触媒するよう選択されるかまたは進化するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼタンパク質である。典型的に、セリンリコンビナーゼドメインは、一般的な鎖交換機構を触媒する触媒セリン求核剤を含むリコンビナーゼドメインである。特に好ましいキメラリコンビナーゼタンパク質としては、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧ、ＨｉｎＧＡＧＧＡＧ、およびＧｉｎＧＡＧＧＡＧが挙げられ、これらはジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインと融合したＴｎ３、Ｈｉｎ、またはＧｉｎに由来するドメインを有する。その他のキメラリコンビナーゼタンパク質は本発明の範囲内に含まれる。かかるキメラリコンビナーゼタンパク質としては、限定されるものではないが、そのキメラリコンビナーゼタンパク質がＴｎ３Ｃｈ１５Ｇであり、Ｔｎ３に由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、キメラリコンビナーゼタンパク質；そのキメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１であり、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、キメラリコンビナーゼタンパク質；そのキメラリコンビナーゼタンパク質がＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２であり、Ｇｉｎに由来する変異セリンリコンビナーゼを有する、キメラリコンビナーゼタンパク質；そのセリンリコンビナーゼに、次の変異、（１）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＧ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、またはＥ１２４Ｑ；（２）Ｈｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＨ１０７Ｙ；（３）Ｇｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＭ７０Ｖ、Ｔ９６Ａ、またはＨ１０６Ｙ；あるいは（４）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＩ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｋ６５Ｒ、Ｍ７３Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ、Ｋ５３Ｅ、およびＫ１５１Ｍの１つ以上が、ＨｉｎおよびＧｉｎ中の対応する相同残基の変異とともに導入されている、キメラリコンビナーゼタンパク質；そのセリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｙ１０９Ｈ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１４８Ｍを全て含むＧｉｎドメインであるキメラリコンビナーゼ；あるいは、そのセリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、およびＭ１１４Ｖを全て含むＧｉｎドメインであるキメラリコンビナーゼが挙げられる。
【０００９】
本発明の別の態様は、上記のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする単離および精製された核酸配列である。この核酸配列はＤＮＡ配列であってもよい。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、上記のＤＮＡ配列を含むベクターである。このベクターは、発現ベクターであってもよい。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、上記の核酸配列またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞である。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、
（１）本発明に係る少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼタンパク質を結合している少なくとも２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程（該部位はスペーサーにより分離されている）；および
（２）ＤＮＡ配列の両方の鎖が、キメラリコンビナーゼに特異的に結合している２つの部位の間で切断されて部位特異的組換え事象が行われる、部位特異的組換え事象を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが触媒する条件下で、ＤＮＡ配列とキメラリコンビナーゼを反応させる工程を含む、部位特異的組換え事象を行う方法である。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、
（１）第１の配列および第２の配列の各々が本発明に係る少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有する、第１の配列および第２の配列の、２つのＤＮＡ配列を提供する工程；および
（２）第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断されて第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換え事象が行われる、部位特異的組換え事象をキメラリコンビナーゼが触媒する条件下で、第１の配列および第２の配列を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと反応させる工程を含む、部位特異的組換え事象を行う方法である。
【００１４】
本発明のなお別の態様は、
（１）第１の配列および第２の配列の一方が、本発明に係る少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有し、かつ、第１の配列および第２の配列のもう一方が、少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼに結合している部位をその中に有する、第１の配列および第２の配列の、２つのＤＮＡ配列を提供する工程；および
（２）第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断されて第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換え事象が行われる、部位特異的組換え事象をキメラリコンビナーゼおよび天然に存在するセリンリコンビナーゼが触媒する条件下で、第１の配列および第２の配列を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼおよび天然に存在するセリンリコンビナーゼと反応させる工程を含む、部位特異的組換え事象を行う方法である。
【００１５】
本発明のなお別の態様は、
（１）各部位が、
（ａ）キメラリコンビナーゼ半部位の最適な結合部位と比較して、実質的に低い親和性で少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと結合している、少なくとも１種類の本発明に係るキメラリコンビナーゼのための変異結合部位；および
（ｂ）最適に結合している少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼ半部位のための結合部位を含み、これらの部位が、少なくとも１種類の本発明に係るキメラリコンビナーゼと特異的に結合し、これらの部位がスペーサーによって分離されている、組換えのための２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程；ならびに
（２）ＤＮＡ配列の両方の鎖が、キメラリコンビナーゼに特異的に結合している２つの部位の間で切断されて、部位特異的組換え事象が行われるような、部位特異的組換え事象を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが触媒する条件下で、ＤＮＡ配列を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと反応させ、該部位特異的組換え事象が組込みであり、組込みの結果が安定するように、組換えに対して機能的でない、キメラリコンビナーゼ半部位のための変異結合部位のホモ二量体が形成される工程を含む、ＤＮＡ分子において安定な組込みを行う方法である。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、
（１）本発明に係る少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第１の部位をその中に有する第１のＤＮＡ配列を提供する工程；
（２）本発明に係る少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第２の部位をその中に有する第２のＤＮＡ配列を、第１の部位と第２の部位が機能的に直交するように提供する工程；および
（３）第１のＤＮＡ配列を少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応させ、第２のＤＮＡ配列を少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応させて組換えをもたらす工程を含む、ＤＮＡ分子において組換えを行う方法である。
【００１７】
本発明の別の態様は、
（１）２つのプラスミド、
（ａ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第１のプラスミド；および
（ｂ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第２のプラスミド
を、第１の触媒ドメインと第２の触媒ドメインが異なり、かつ第１のジンクフィンガードメインと第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、第１および第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与するように生成する工程；
（２）第１の遺伝子のコード領域および第２の遺伝子のコード領域を、各々が、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼおよび本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼの１つと結合している、非反復ホモ二量体部位で隣接することにより２つのカセットを構築する工程；
（３）１つのカセットを各プラスミドに挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程；ならびに
（４）細菌宿主に、カセットを含む第１のプラスミドおよびカセットを含む第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程を含む、カセット交換を促進する方法である。
【００１８】
本発明の別の態様は、
（１）２つのプラスミド、
（ａ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第１のプラスミド（ここで、第１のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第１の遺伝子の内在性隣接配列と結合する）；および
（ｂ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第２のプラスミド（ここで、第２のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第２の遺伝子の内在性隣接配列と結合する）を、第１の触媒ドメインと第２の触媒ドメインが異なり、かつ第１のジンクフィンガードメインと第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、第１および第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与するように、生成する工程；
（２）第１のカセットが第１の内在性隣接領域に隣接される第１の遺伝子を含み、第２のカセットが第２の内在性隣接領域に隣接される第２の遺伝子を含む２つのカセットを、各々が、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼおよび本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼの１つと結合している、非反復ホモ二量体部位をその中に含む２つの内在性隣接領域の各々により構築する工程；
（３）１つのカセットを各プラスミドに挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程；ならびに
（４）細菌宿主に、カセットを含む第１のプラスミドおよびカセットを含む第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程を含む、カセット交換を促進する方法である。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、
（１）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のジンクフィンガー結合部位を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程；
（２）工程（１）で生成された単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程；
（３）選択用の２種類の抗生物質を用いて形質転換体を同時に維持する工程；
（４）同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程；
（５）適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程；
（６）再形質転換宿主を２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程；および
（７）２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定する工程を含む、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定するための方法である。
【００２０】
同じように、本発明の別の態様は、
（１）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のスペーサー配列を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程；
（２）工程（１）で生成された単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程；
（３）選択用の２種類の抗生物質を用いて形質転換体を同時に維持する工程；
（４）同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程；
（５）適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程；
（６）再形質転換宿主を２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程；および
（７）２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化スペーサー配列を特定する工程を含む、シス不活性化スペーサー配列を特定するための方法である。
【００２１】
さらに、同じように、本発明の別の態様は、
（１）２種類の異なるＤＮＡ結合ドメインの認識配列、選択標的配列およびトランス活性化因子配列をその中に含む組換え部位をその中に含む標的基質を生成する工程；
（２）標的基質を、トランス活性化因子配列と完全に相補的な本発明に係る固定されたキメラリコンビナーゼの存在下、ＤＮＡ結合ドメインを含む本発明に係るキメラリコンビナーゼのライブラリーとともにインキュベートして、単一の半部位ライブラリーを生成する工程；
（３）工程（２）で生成された単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程；
（４）選択用の２種類の抗生物質を用いて形質転換体を同時に維持する工程；
（５）同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程；
（６）適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程；
（７）再形質転換宿主を２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程；および
（８）２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定する工程を含む、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定するための方法である。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、
（１）リコンビナーゼ変異体のライブラリーを作成して、変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程；
（２）変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインと融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程；
（３）変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを、機能的選択のためのリコンビナーゼ基質を含むプラスミドにクローニングする工程；および
（４）リコンビナーゼの活性により修飾されるプラスミドを選択することにより、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質を選択する工程を含む、既存のキメラリコンビナーゼから新規なキメラリコンビナーゼを生成するための、基質に連結された（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｌｉｎｋｅｄ）タンパク質進化を用いる方法である。
【００２３】
本発明は、遺伝子治療のための方法をさらに包含する。これらの方法の一実施形態は、
（１）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、本発明に係る部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸をその中に含む組成物を投与し、該部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程；および
（２）発現される部位特異的リコンビナーゼに有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれる遺伝子治療のための方法である。
【００２４】
これらの方法の他の実施形態は、
（１）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、本発明に係る部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与し、該部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程；
（２）発現される部位特異的リコンビナーゼに有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程；
（３）個体に、有害遺伝子のための機能性置換遺伝子をその中に含む核酸を投与する工程；および
（４）機能性置換遺伝子を部位特異的リコンビナーゼに触媒される組換え組込みによりゲノムに挿入する工程を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれ、その後に組換え組込みにより置き換えられる、遺伝子治療のための方法である。
【００２５】
本発明の別の態様は、ゲノムの中に有害遺伝子をもつ個体に、（１）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメント；および（２）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメントを有害遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込むように作用する、少なくとも１種類の本発明に係るキメラリコンビナーゼを投与する工程を含む、治療的組込みが有害遺伝子の構造または機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）を崩壊し、改善された機能をもつ遺伝子を選択されたゲノム遺伝子座の中に送達するために行われる、遺伝子治療のための方法である。
【００２６】
本発明の別の態様は、医薬組成物である。本発明に係る一医薬組成物は、
（１）上記の治療有効量の本発明に係るキメラリコンビナーゼタンパク質；および
（２）医薬品として許容される担体
を含む。
【００２７】
その他の本発明に係る医薬組成物は、
（１）本発明に係るキメラリコンビナーゼタンパク質卯をコードする治療有効量の核酸配列；および
（２）医薬品として許容される担体
を含む。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、本発明に係るキメラリコンビナーゼに触媒される組換えの作用によって作製されるトランスジェニック生物である。
【００２９】
この技術は、作物および動物および微生物および多細胞生物、例えば昆虫などの遺伝子組み換えに広く用いることができる。作物および動物の遺伝子組み換えは、病気に対する抵抗性、改善された成長特性、低下した栄養所要量、またはその他の目的を含む、様々な目的のために取り組むことができる。
以下の発明は、本明細書、添付される特許請求の範囲および次の付属する図面を参照してよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】基質２０Ｔ−ＧＦＰ−２０Ｔのジンクフィンガー−リコンビナーゼ融合タンパク質Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧにより媒介される組換え事象の概略図である。（Ａ）４つの酵素モノマーが示されている；三角形はジンクフィンガードメインを表し、八角形はリコンビナーゼ触媒ドメインを表す。上記のシナプスはホモ四量体であるが、明確にするために４つの異なる色を用いた。ジンクフィンガードメインは、いずれの鎖上でもその同族配列、ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）に結合する（下線）。反転した結合部位に隣接されている、２つの同一の「スペーサー」領域は独自にボールドおよびイタリック文字で表されている。中心の塩基対ＡＴは、切断部位で（星印で示される）、分離かまたは反転のいずれかを起こさせる；反対の配向（図示）の部位をもつ対合は反転を可能にし、同じ配向（図示せず）は分離を可能にする。実線は介在プラスミドＤＮＡを表し；破線は隣接する塩基対間のつながりを表す。（Ｂ）対応するプラスミドの動画（Ｃａｒｔｏｏｎ）；四角形は組換え部位を表し、陰影部分は各リコンビナーゼモノマーの位置を示す。
【図２】ＲｅｃＺＦタンパク質構造および２０Ｔ組換え部位間のＲｅｃＺＦプラスミド分離を表す図である。（Ａ）ＤＮＡ結合γδリゾルバーゼ（６６）およびＺｉｆ２６８（２４）のアラインメントにより近似されるＲｅｃＺＦ構造。（Ｂ）２０Ｔ組換え部位、ＲｅｓＡおよびＲｅｓＢ間のＲｅｃＺＦプラスミド分離の図；基質およびＰＣＲ産物バンドの相対強度は、この反応の程度を示す。成功した分離の後のＰＣＲ産物サイズの変化に留意されたい。
【図３】自由対合によるＲｅｃＺＦ部位特異的組換えを示す図である。（Ａ）３つの組換えアッセイを動画で表す；産物の存在下、プライマー（矢印で示される）は特有のＰＣＲバンドを生成する。（Ｂ）Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧによる部位特異的組換え：分離（１０３９ｂｐ、１）、反転（１２６３ｂｐ、２）、および組込み（３７０ｂｐ、３）。３Ｂを除いて、「Ｂ」は常に基質を含まないＰＣＲ対照を表す；３Ｂは非特異組込みの対照である。
【図４】次善のジンクフィンガー結合部位を含む基質のＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ組換えを表す図である。（Ａ）一方向性の分離（１）および組込み（２）のためのＲＥ／ＬＥ戦略の動画。（Ｂ）各基質に存在する組換え部位；ボールドはジンクフィンガーと基質のミスマッチを表す。（Ｃ）Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧのヘテロ部位での分離ＰＣＲアッセイ（レーン１〜４）、およびＴｎ３ＧＡＧＧＡＧの弱い部位のホモ二量体での組込みアッセイ（レーン５〜８）；各ヘテロ部位の分離産物は、最適な組換え部位を有するその他のプラスミドとともに同時にインキュベートされた。
【図５】カセット交換戦略を表す図である。（Ａ）カセット交換戦略の動画である。組込みは、その後すぐにもう一方の部位での分離が続く場合２つの直交する部位のいずれでも起こり得る；２つの起こり得る機構の１つだけがここに示されている。図中、ｐ１およびｐ２は異なるプラスミド骨格であり、「ダッシュ記号」は目的のカセットの存在を表す。（Ｂ）ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１（１）およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２（２）による選択的反転。上列の数字は基質のＤＮＡ結合部位に対応し、下列は発現されたＲｅｃＺＦに対応する。（Ｃ）ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１（１）およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２（２）による選択的分離。
【図６】触媒ドメインスペーサー配列の偏りを調査するためのＰＣＲ戦略を表す図である。折れ曲がった黒色の矢印はプライマー結合部位を表す。スペーサー配列２０Ｔ’は、図１に表される反転の左右対称な産物（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）である。
【図７】哺乳類細胞においてＲｅｃＺＦに媒介される分離を証明するための系を表す図である。
【図８】内在性遺伝子ＣＣＲ５内でＲｅｃＺＦに媒介される切除を評価するための戦略を表す図である。（Ａ）ＣＣＲ５の４つのエキソンをコードするゲノム領域。（Ｂ）４番目のエキソンの翻訳領域中に存在するいくつかの可能性のあるＲｅｃＺＦ部位のマップ。「ｄ３２」の長方形は、自然のΔＣＣＲ５変異体を有する個体において欠失しているゲノム領域を占有する。このＨＩＶ共受容体を無効にすることにより、ΔＣＣＲ５変異は、この対立遺伝子の同形接合担体にＸ５ＨＩＶ感染からの一般的な免疫性を付与する（３８）。高くなった白色の円は、２０ｂｐスペーサー部位であり、一方低い灰色の円は２２ｂｐ部位である。２つの暗い円は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における特徴付けのために選択された候補を表す。（Ｃ）選択された部位でのＲｅｃＺＦ分離の評価；選択された４つの半部位の各々は、構築、および、異なるＲｅｃＺＦモノマーの同時発現を必要とする。
【図９】ランダム化されたＤＮＡ結合部位を用いてＴｎ３ＧＡＧＧＡＧのトランス活性化された（「弱い」）組換え部位を見出すための戦略を表す図である。大腸菌における基質の同時インキュベーションの後、一方向性の組込みを促進する部位が二重の抗生物質媒体で選択される。
【図１０】ジンクフィンガードメインのライブラリーから構築されたＲｅｃＺＦを用いて特定の６ｂｐＤＮＡ結合配列に関してトランス活性化された（「弱い」）ＲｅｃＺＦを見出すための戦略を表す図である。
【図１１】直交する部位での順次組換えによる安定な組込み反応ための２つの機構を表す図である。（Ａ）２つの適合性のプラスミド間のＧＦＰｕｖ（Ａ）およびｍＣＤ２（Ｂ）カセットの交換；この反応の産物は、選択培地で単離され、２つのＰＣＲプライマーの特有の組合せにより同定される。（Ｂ）一方向性プラスミドの融合；小型の２×カセット分離産物（破線）は複製起点を有さないために失われる。明確にするためにプラスミドが描かれるが、遺伝子は染色体（１または複数）または線状ＤＮＡ上にコードされ得る。
【図１２】ＲｅｃＺＦデザインおよび機能的アッセイを表す図である。（ａ）γδリゾルバーゼを用いて二量体化した３本指の（ｔｒｉｄａｃｔｙｌ）ＲｅｃＺＦキメラのモデル。（ｂ）．分離および反転アッセイ、および定方向進化に用いた、合した基質およびＲｅｃＺＦ発現プラスミド。（ｃ〜ｅ）Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇによる２０Ｔ組換え部位間の部位特異的な分離（ｃ）反転（ｄ）、および組込み（ｅ）のＰＣＲアッセイの図による描写。（ｆ）Ｔｎ２Ｃｈ１５Ｇによる２０Ｔ組換え部位間の組換えのＰＣＲアッセイ。レーン１は、２５０、５００、７５０、１０００、４５００  ２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、８０００、および１０，０００ｂｐでの分子量マーカーを含む（Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダー）。分離アッセイ（Ｒｅｓ）の結果は、レーン２および７に示される（Ｒｅｓ（Ｂ）、ＰＣＲ陰性対照）。成功した分離は、基質バンド（１．８ｋｂ）に対して産物バンド（１．０ｋｂ）の強度を増加させる。反転アッセイ（Ｉｎｖ）の結果は、レーン３および８に示される（Ｉｎｖ（Ｂ）、ＰＣＲ陰性対照）。成功した組込みは、産物バンドを生成する（０．４ｋｂ）。組込み反応は、第２のプラスミドの存在下で行い、第２のプラスミドはＧ２０Ｔ組換え部位を含むか（Ｉｎｔ（＋）、レーン４）、または欠いた（Ｉｎｔ（−）、レーン５）。レーン６は、１００、２００、３００、４００、５００、６００  ７００、８００、９００、１０００、１２００、および１５００ｂｐでの分子量マーカーを含む（Ｒｏｃｈｅ社１００ｂｐラダー）。全てのアッセイに関して、プラスミドは電気穿孔により大腸菌に導入され、培養物は３７℃にて一晩維持された。ＰＣＲは３０ｎｇプラスミドＤＮＡを用いて行い、１％アガロースゲルで分析した。ＰＣＲ陰性対照の反応はテンプレートを用いずに行った（レーン７、８、および９）。（ｇ）同様の方法で行った、２０Ｔスペーサー誘導体（表１）：Ｇ１８Ｔ−Ｇ−Ｇ１８Ｔ（レーン１、１８−１８）、Ｇ１８Ｔ−Ｇ２０Ｔ（レーン２、１８−２０）Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０−Ｔ（レーン３、２０−２０）、Ｇ２２Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン４、２２−２０）、Ｇ２２Ｔ−Ｇ−Ｇ２２Ｔ（レーン５、２２−２２）Ｇ２０ＴＣ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン７、ＴＣ）、Ｇ２０ＴＣ４−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン８、Ｃ４）、Ｇ２０ＴＣ５−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン９、Ｃ５）、Ｇ２０ＴＣ６−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン１０、Ｃ６）、Ｇ２０ＴＣ７−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン１１、Ｃ７）、Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン１２、ｇ）、を含有するカセットの分離アッセイ。レーン６にはＰｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。テンプレートを用いずに行った陰性対照のＰＣＲ反応を、ｆ、レーン７に示す。
【図１３】ＲｅｃＺＦＧ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔリゾルバーゼの定方向進化を表す図である。（ａ）産物特異的な選択プライマーを用いる基質に連結された定方向進化（ＳＬｉＰＥ）。レーン１には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。選択アッセイの結果はレーン２〜４に示される。成功した分離は産物バンドを生成する（０．８ｋｂ）。レーン２）大腸菌中、３７℃にて一晩のｐＢ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔのインキュベーションの後に単離された産物混合物（ＲｅｃＺＦ（＋））；レーン３）ＲｅｃＺＦ基質プラスミドｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（ＲｅｃＺＦ（−））；レーン４）テンプレートを用いずに行ったＰＣＲ陰性対照（ＲｅｃＺＦ（Ｂ））。（ｂ）高活性のクローン（＊；Ｔｎ３Ｌ８Ｃ１８Ｇ、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇ、ＨｉｎＬ６Ｃ４Ｇ）に対する、数回の双方向性選択による（２〜８）、出発クローン（ｓｃ；Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇ、ＧｉｎＧ、ＨｉｎＧ）およびナイーブライブラリー（１；Ｔｎ３Ｌ１Ｇ、ＧｉｎＬ１Ｇ、ＨｉｎＬ１Ｇ）からの機能的改善。レーン１には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。テンプレートを用いずに行った陰性対照のＰＣＲ反応を、ｆ、レーン７に示す。分離アッセイは、既に説明された方法で行った。（ｃ，ｄ）高活性のクローンの５０％以上で選択された変異は、一次配列アラインメント中に表され（ｃ）、ＤＮＡ結合γδリゾルバーゼ二量体（ｄｉｍｍｅｒ）の結晶構造の上にマッピングされた（ｄ）。青色、新規なＴｎ３触媒ドメイン変異；緑色、新規なＧｉｎ触媒ドメイン変異；橙色、新規なＨｉｎ、触媒ドメイン変異；ピンク色、元のクローン中に存在する過剰活性化（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）変異；赤色、触媒セリン、Ｓ１０。
【図１４】ＧｉｎＬ７Ｃ７触媒ドメインの特徴付けを表す図である。（ａ）既に説明された方法で行った、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１（Ｈ１）およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２（Ｐ２）の基質Ｈ１２０Ｇ−Ｇ−Ｈ１２０Ｔ（Ｈ１）およびＰ２２０Ｇ−Ｇ−Ｐ２２０Ｔ（Ｐ２）での分離および反転アッセイ。分離アッセイの結果はレーン１〜ｔに示される。成功した分離は、基質バンド（１．９）ｋｂに対して産物バンド（１．１ｋｂ）の強度を増加させる。レーン６には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。反転アッセイの結果はレーン７〜１１に示される。成功した反転は産物バンドを生成する（１．４ｋｂ）。ＰＣＲ陰性対照の反応（−，−）を、分離（レーン１）および反転（レーン１１）アッセイについてテンプレートを用いずに行った。（ｂ〜ｃ）ＲｅｃＺＦ基質ライブラリーを用いるスペーサー配列の偏りの分析。既に説明した方法で実施された反転アッセイで、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇを、５ｂｐ領域がランダム化されている基質の４つのプールと反応させた（ｂ）。反転関連ＰＣＲ産物をゲル精製し、配列決定した。機能性スペーサーの各凝集の配列決定クロマトグラム（ｃ、左）。完全なスペーサー領域（２０Ｔおよび２０Ｇ）は、その５ｂｐランダム化領域が単一のヌクレオチド（表１、６位）で重複する２つの基質ライブラリーからのクロマトグラムの合成で表される。
【図１５】ヒトゲノムの標的化された、部位特異的分離を示す図である。（ａ）ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１分離のためのリポーターカセットの単一コピーは、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを用いてＦｌｐ−Ｉｎ（商標）２９３ヒト胚腎臓細胞に導入された。（ｂ、ｃ、ｄ）リポーター細胞株に空のｐＢａｂｅ−ピューロマイシンベクター（ＲｅｃＺＦ（−））、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２、およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１を形質導入し、ピューロマイシン選択により濃縮した（２μｇ／ｍＬ）。形質導入後９日、各サンプルの蛍光をＦＡＣＳにより測定した（ｂ）。蛍光の低下した細胞の割合を、３回の独立した実験間で平均した。（ｃ）ＦＡＣＳサンプルをゲノムＤＮＡ精製のために溶解させた。単離ＤＮＡ（１００〜４００ｎｇ）は、ゲノム分離アッセイのＰＣＲのテンプレートとしての役割を果たし（（ａ）で表されるプライマーを使用）、結果を１％アガロースゲルで分析した（ｄ）。レーン１には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。分離アッセイの結果はレーン２〜６および８に示される（Ｒｅｓ（Ｂ）、ＰＣＲ陰性対照）。成功した分離は基質バンド（１．６ｋｂ  ｐｂ）に対して産物バンド（０．２ｋｂ）の強度を増加させる。レーン６にはＲｏｃｈｅ社１００ｂｐラダーが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００３２】
本明細書において、用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、または類似の用語とは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをさし、それには一本鎖または二本鎖型、およびコードもしくは非コード（例えば、「アンチセンス」）型が含まれる。この用語は天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。また、この用語は、修飾もしくは置換された塩基を含む核酸を、その修飾もしくは置換された塩基が相補ヌクレオチドのワトソン−クリック結合にも、特異的に結合するタンパク質、例えばジンクフィンガータンパク質などによる核酸配列の結合にも干渉しない限り、包含する。この用語はまた、合成骨格をもつ核酸様構造も包含する。本発明により提供されるＤＮＡ骨格類似体としては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダート、アルキルホスホトリエステル、スルファマート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６００，Ｅｄｓ．Ｂａｓｅｒｇａ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  （ＮＹＡＳ  １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ  （１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）参照。ＰＮＡには非イオン性骨格、例えばＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位などが含まれる。ホスホロチオエート結合は、例えば、米国特許第６，０３１，０９２号；同第６，００１，９８２号；同第５，６８４，１４８号に記載されている；また、ＷＯ９７／０３２１１号；ＷＯ９６／３９１５４号；Ｍａｔａ  （１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７も参照。この用語に包含されるその他の合成骨格としてはメチルホスホネート結合または代わりのメチルホスホネートおよびホスホジエステル結合（例えば、米国特許第５，９６２，６７４号；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ  （１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８参照）、およびベンジルホスホネート結合（例えば、米国特許第５，５３２，２２６号；Ｓａｍｓｔａｇ  （１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ６：１５３−１５６参照）が挙げられる。用語「核酸」、「核酸配列」などは、ワトソン−クリック型塩基対合則に従う定義された配列の補体を、その補体が除外される場合を除いてさらに包含する。核酸に含められる塩基としては、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の既知の塩基類似体が挙げられ、それらに限定されるものではないが、４−アセチルシトシン、８−���ドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュード−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、インビトロ重合ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの部分、ウイルスに由来する遺伝物質、直鎖ＤＮＡ、ベクター（人工染色体Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ１）、発現カセット、キメラ配列、組換えＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体の形態であってもよい。ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドＲＮＡ、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、インビトロ重合ＲＮＡ、組換えＲＮＡ、キメラ配列、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、リボザイム、またはこれらの群の誘導体の形態であってもよい。
【００３３】
本明細書において、用語「ジンクフィンガー」、「ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン」または類似の用語とは、天然に存在するジンクフィンガーおよび人工的に生成されたジンクフィンガーの両方をさす。かかるジンクフィンガーは、様々なフレームワーク構造、例えば、限定されるものではないが、Ｃ２Ｈ２、Ｃ４、Ｈ４、Ｈ３Ｃ、Ｃ３Ｘ、Ｈ３Ｘ、Ｃ２Ｘ２、およびＨ２Ｘ２（Ｘは、亜鉛とライゲートするアミノ酸である）を有し得る。これらのフレームワーク構造において、従来ジンクフィンガー構造を列挙される場合のように、「Ｃ」はシステイン残基を表し、「Ｈ」はヒスチジン残基を表す。フレームワークＣ２Ｈ２を有するジンクフィンガーとしては、限定されるものではないが、例えば、本参照によりその全てが本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｂａｓに対する米国特許第７，１０１，９７２号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，０６７，６１７号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，７９０，９４１号、Ｂａｒｂａｓに対する米国特許第６，６１０，５１２号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，２４２，５６８号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，１４０，４６６号、Ｂａｒｂａｓに対する米国特許第６，１４０，０８１号、Ｂａｒｂａｓによる米国特許出願公開第２００６０２２３７５７号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００６０２１１８４６号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００６００７８８８０号、Ｂａｒｂａｓによる米国特許出願公開第２００５０１４８０７５号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００５００８４８８５号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００４０２２４３８５号、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００３００５９７６７号、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００２０１６５３５６号に記載されるジンクフィンガーが挙げられ得る。その他のジンクフィンガーは、本参照によりその全てが本明細書に組み込まれる、Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，０６７，３１７号；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，０３０，２１５号；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，０２６，４６２号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，０１３，２１９号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，９７９，５３９号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，９３３，１１３号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，８２４，９７８号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，７９４，１３６号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，７８５，６１３号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，７７７，１８５号；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，７０６，４７０号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，６０７，８８２号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，５９９，６９２号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，５３４，２６１号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，５０３，７１７号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，４５３，２４２号；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００６／０２４６５８８号；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００６／０２４６５６７号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００６／０１６６２６３号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００６／００７８８７８号；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００５／０２５７０６２号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００５／０２１５５０２号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００５／０１３０３０４号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００４／０２０３０６４号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００３／０１６６１４１号；Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００３／０１３４３１８号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００３／０１０５５９３号；Ｃｏｘ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００３／００８７８１７号；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００３／００２１７７６号；およびＣａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００２／００８１６１４号に記載されている。例えば、これらの特許および特許広報に記載されている１つの代替形態は、いわゆる「Ｄ可能な部位」およびかかる部位と結合することのできるジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの使用を伴う。「Ｄ可能な」部位は、適切にデザインされたジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、標的鎖の３つの塩基ではなく４つの塩基に結合することを可能にする標的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、二本鎖ＤＮＡ標的セグメント（標的鎖）のうちの１本の鎖上の３つの塩基から成るトリプレットと、もう一本の相補的な鎖の第４の塩基と結合する。単一のジンクフィンガーと４塩基標的セグメントの結合は、標的鎖の配列およびジンクフィンガーのアミノ酸配列の両方に制約を課す。標的鎖中の標的部位には、「Ｄ可能な」部位モチーフ５’ＮＮＧＫ３’が含まれるべきであり、該ＮおよびＫは従来のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ多義性コード（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｃｏｄｅｓ）である。そのような部位に結合するためのジンクフィンガーは、−１位にアルギニン残基、および＋２位にアスパラギン酸、（またはあまり好ましくないが、グルタミン酸）を含むはずである。−１位のアルギニン残基は、Ｄ可能な部位のＧ残基と相互作用する。ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸（またはグルタミン酸）残基は、Ｄ可能な部位中のＫ塩基と相補的な逆の鎖と相互作用する。Ｄ−可能な部位という名称を与えるのは、アスパラギン酸（記号Ｄ）と逆の鎖の塩基（第４の塩基）の間の相互作用である。Ｄ−可能な部位の式から明らかなように、Ｄ−可能な部位には２つのサブタイプ：５’ＮＮＧＧ３’および５’ＮＮＧＴ３’がある。前者の部位について、ジンクフィ��ガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、Ｄ可能な部位と逆の鎖中のＣと相互作用する。後者の部位では、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸はＤ可能な部位と逆の鎖中のＡと相互作用する。典型的に、ＮＮＧＧはＮＮＧＴよりも好ましい。３本の指をもつＺＦＰのデザインでは、該タンパク質の少なくとも１本の指、および場合により、２本または３本全部の指がＤ可能な部位に結合する可能性を有する標的部位が選択されるべきである。そのようなことは、式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’を有するより大きな標的遺伝子の中から標的部位を選択することにより達成することができ、ここで、（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の組の各々が、（Ｎ、Ｎ）かまたは（Ｇ、Ｋ）のいずれかあり；（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の少なくとも１つが（Ｇ、Ｋ）であり、ＮおよびＫは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ多義性コードである。言い換えれば、３つの組（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）のうちの少なくとも１つが、組（Ｇ、Ｋ）、つまりこの組の第１の位置がＧであり、第２の位置がＧまたはＴである。この３つの組（存在する場合）のうち、（Ｇ、Ｋ）でないものは、（Ｎ、Ｎ）である、つまりこの組の第１の位置を任意のヌクレオチドが占有し、この組の第２の位置を任意のヌクレオチドが占有し得る。例として、（ｘ、ａ）の組は（Ｇ、Ｋ）であってもよく、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の組は両方とも（Ｎ、Ｎ）であってもよい。式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’において、ＮＮｘ  ａＮｙおよびＮｚｃのトリプレットは、ＺＦＰ中の３本の指により結合した標的鎖上の塩基のトリプレットを表す。もしｘ、ｙおよびｚのうち唯１つだけがＧである場合、このＧの後にはＫが続き、この標的部位には単一のＤ可能なサブ部位が含まれる。
【００３４】
本明細書において、用語「キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ」または「ＲｅｃＺＦ」には、配列特異的結合活性をもつ、人工もしくは天然に存在するジンクフィンガーまたはジンクフィンガー様タンパク質に由来するヌクレオチド結合ドメインを有する、限定されないリコンビナーゼが含まれる。これらの用語は、実際のジンクフィンガーに由来するヌクレオチド結合ドメインを有するリコンビナーゼに限定されない。
【００３５】
本明細書において、用語「転写調節ドメインもしくは因子」とは、遺伝子転写を調節する働きをする、本明細書において提供される融合ポリペプチドの部分をさす。例示的な、かつ好ましい転写抑制ドメインは、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、脱アセチル化酵素、ならびにそれらの誘導体、多量体および組合せ、例えば、ＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）２、（ＫＲＡＢ）３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）２、（ＳＩＤ）２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）である。本明細書において、用語「ヌクレオチド結合ドメインもしくは領域」とは、特異的な核酸結合能をもたらす、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物の部分をさす。ヌクレオチド結合領域は、特定の遺伝子に対して対象ポリペプチドを標的化する働きをする。本明細書において、用語「作動可能に連結された」とは、例えば、ポリペプチドというエレメントが、各々が意図されるように実行するかまたは機能するように連結されていることを意味する。例えば、リプレッサーは、その結合ドメインを介して標的ヌクレオチドに結合された場合、そのリプレッサーが転写を阻害するかまたは防ぐように働くような方法で、結合ドメインに結合している。２およびそれ以上のエレメント間の結合は直接的であっても、例えばリンカーを介するなど間接的であってもよい。これらのエレメントは必ずしも隣接するとは限らない。ゆえに、リプレッサードメインは、当技術分野で周知の任意の結合手順を用いてヌクレオチド結合ドメインと連結することができる。２つのドメインの間にリンカー部分を含めることが必要である。そのようなリンカー部分は、典型的に、ドメイン間に間隔をもたらすアミノ酸残基の短い配列である。リンカーが結合もしくはリプレッサードメインの何らかの機能を妨害しない限り、どのような配列を用いてもよい。
【００３６】
本明細書において、用語「調節する」は、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合モチーフが過活動である場合、それを含有するプロモーターからの発現の阻害または抑制、あるいは、その活動が低下している場合、そのようなプロモーターからの発現の増大または亢進を想定している。
【００３７】
本明細書において、本明細書に登場する様々なアミノ酸配列に生じるアミノ酸は、それらの周知の、３文字または１文字の略語に従って特定される。様々なＤＮＡ断片に生じるヌクレオチドは、当技術分野で常套的に用いられる標準的な単一文字の表示で名付けられる。
【００３８】
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般的に結果として得られる分子の生物活性を変更することなくなされ得る。当業者は、典型的に、ポリペプチドの不必要な領域における単一のアミノ酸置換が生物活性を実質的に変更しないことを理解する（例えば  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ｐ．２２４参照）。特に、そのような保存的変異体は、該変化（１または複数）が、タンパク質の（保存的変異体の）構造および／または活性、例えば、抗体活性、酵素活性、または受容体活性を実質的に変更しない、修飾されたアミノ酸配列を有する。これらには、アミノ酸配列の保存的に修飾された変形形態、すなわち、タンパク質活性に重要でないそれら残基のアミノ酸置換、付加または欠失、あるいは、重要なアミノ酸の置換でさえ構造および／または活性を実質的に変更しない、アミノ酸の類似特性（例えば、酸性、塩基性、正または負帯電、極性または非極性、その他）を有する残基での置換が含まれる。機能的に類似のアミノ酸を記載する保存的置換表は当技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択するための１つの例となる指針としては、（本来の残基の後に例となる置換が続く）：Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕが挙げられる。代わりの例となる指針は以下の６つの群を用い、各々は相互に保存的置換であるその他のアミノ酸を含む。（１）アラニン（ＡまたはＡｌａ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）；（２）アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）；（３）アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）；（４）アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）；（５）イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）；および（６）フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｃｈｕｌｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇも参照）。当業者であれば、上記に定義される置換が唯一可能な保存的置換でないことを理解する。例えば、ある目的のため、全ての荷電アミノ酸を、それらが正であっても負であっても、相互に保存的置換としてみなしてもよい。その上、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな比率のアミノ酸を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加も、三次元構造および送達される予定のタンパク質の機能がそのような変更形態により保存される場合、「保存的に修飾された変更形態」とみなすことができる。
【００３９】
本明細書において、用語「発現ベクター」とは、異種ＤＮＡ、例えば、本明細書の融合タンパク質をコードする核酸または本明細書において提供される発現カセットなどの挿入または組込みにより操作されている、プラスミド、ウイルス、ファージミド、または当技術分野で公知の他の媒体をさす。かかる発現ベクターは、典型的に、細胞に挿入された核酸の効率的な転写のためのプロモーター配列を含む。発現ベクターは、典型的に、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型の選択を許容する特異的遺伝子を含む。
【００４０】
本明細書において、用語「宿主細胞」とは、ベクターが増殖してそのＤＮＡが発現されることのできる細胞をさす。また、この用語には被験体宿主細胞の任意の後代が含まれる。複製の間に変異が起こる可能性があるため、全ての後代は親細胞と同一でない可能性があることは当然理解される。かかる後代は、用語「宿主細胞」が用いられる場合に含められる。外来ＤＮＡが宿主において継続的に維持される安定な移行の方法は当技術分野で公知である。
【００４１】
本明細書において、遺伝子治療は、かかる治療法が求められている疾病または状態の哺乳類、特にヒトの特定の細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を伴う。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現され、それによりコードされる治療用産物が産生されるような方法で、選択された標的細胞に導入される。あるいは、異種ＤＮＡは治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの方法で媒介することができるか、またはそれは、治療用産物の発現を何らかの方法で直接または間接に媒介する産物、例えばペプチドまたはＲＮＡなどをコードすることができる。遺伝子治療は、欠陥遺伝子を置換するか、あるいは哺乳類またはそれが導入されている細胞により産生される遺伝子産物を補う遺伝子産物をコードする核酸を送達するためにも用いることができる。導入された核酸は、哺乳類宿主中で通常産生されないか、あるいは治療上有効な量でまたは治療上有用な時に産生されない治療用化合物（例えばその増殖因子阻害剤など）または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤（例えばその受容体など）をコードすることができる。治療用産物をコードする異種ＤＮＡは、産物またはその発現を促進するか、そうでなければ変更するために、罹患宿主の細胞への導入の前に修飾されてもよい。遺伝子治療はまた、遺伝子発現の阻害剤またはリプレッサーまたはその他の調節因子の送達を伴い得る。
【００４２】
本明細書において、異種ＤＮＡは、通常インビボでそれが発現されている細胞により産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、転写、翻訳、またはその他の調節可能な生化学的プロセスに作用することにより内在性ＤＮＡの発現を変更するメディエーターを媒介するかコードするＤＮＡである。異種ＤＮＡはまた、外来ＤＮＡとも称される場合がある。当業者が、それが発現されている細胞に対して異種または外来と認識するかまたはみなすＤＮＡはいずれも本明細書において異種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、追跡可能なマーカータンパク質、例えば薬剤耐性を付与するタンパク質などをコードするＤＮＡ、治療上効果的な物質、例えば抗癌剤、酵素およびホルモンなどをコードするＤＮＡ、ならびにその他の種類のタンパク質、例えば抗体などをコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡにコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞の表面に分泌または発現され得る。
【００４３】
故に、本明細書において異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡには、ゲノム中に見出される対応ＤＮＡとして正確な配向および位置に存在しないＤＮＡ分子が含まれる。また、それは、その他の生物または種由来の（すなわち外因性の）ＤＮＡ分子をさす場合もある。
【００４４】
本明細書において、治療上効果的な産物は、異種核酸、一般にＤＮＡによりコードされる産物であり、該核酸を宿主へ導入すると、遺伝性または後天性の疾病の症状、症状を寛解させるかまたは消退させる、あるいは上記疾病を治癒する産物が発現される。典型的に、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡは、プラスミドベクターにクローニングされ、常套的な方法、例えばリン酸カルシウムにより媒介されるＤＮＡ取込みなど（（１９８１）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：６０３−６１６参照）または産生細胞、例えばパッケージング細胞などへのマイクロインジェクションにより導入される。産生細胞での増幅の後、異種ＤＮＡを含むベクターを選択された標的細胞に導入する。
【００４５】
本明細書において、発現または送達ベクターとは、適切な宿主細胞中で発現する（すなわち、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドが該宿主細胞の系の中で合成される）ために外来または異種ＤＮＡがその中に挿入された任意のプラスミドまたはウイルスをさす。１つ以上のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を指示することのできるベクターを本明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。また、逆転写酵素を用いて生成されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）のクローニングを可能にするベクターも含まれる。
【００４６】
本明細書において、遺伝子とは、その核酸配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸分子をさす。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。遺伝子には、コーディング領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれ得る。
【００４７】
本明細書において、核酸分子またはポリペプチドまたはその他の生体分子に関して用語「単離された」とは、その核酸またはポリペプチドが、該ポリペプチドまたは核酸が得られた生成環境から分離されている。また、それは生体分子が自然状態から変更されていることも意味し得る。例えば、この用語を本明細書で用いる際、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その自然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。よって、組換え宿主細胞内で産生される、かつ／または含まれているポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されたとみなされる。また、「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」とされるものは、組換え宿主細胞または天然供給源から部分的または実質的に精製されているポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、化合物の組換えによって精製されたバージョンは、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１４０に記載されている一工程法により実質的に精製することができる。単離および精製されたという用語は、置き換え可能に用いられる場合もある。
【００４８】
よって、「単離された」により、該核酸が、天然に存在するゲノムにおいて目的の核酸をコードする遺伝子に直ちに隣接する遺伝子のコード配列を含まないことが意味される。単離されたＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡ、または合成ＤＮＡであってもよい。それは天然のＤＮＡ配列と同一であってもよく、または１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換により、かかる配列と異なっていてもよい。
【００４９】
「単離された」または「精製された」とは、それらの用語が生体細胞または宿主から作成された調製物をさすために用いられる場合、目的のＤＮＡまたはタンパク質の粗抽出物を含む、示されるＤＮＡまたはタンパク質を含有する任意の細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合、精製された調製物は、個別の技法または一連の調製技法または生化学的技法に従って得ることができ、目的のＤＮＡまたはタンパク質は、様々な程度の純度でこれらの調製物中に存在し得る。特にタンパク質について、この手順には、例えば、限定されるものではないが、硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、等電点電気泳動法、クロマトフォーカシング、および電気泳動を挙げることができる。
【００５０】
「実質的に純粋な」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製物とは、調製物が、かかるＤＮＡまたはタンパク質と天然状態で通常関連している天然物質を含まないことを意味することが当然理解される。「本質的に純粋な」とは、目的のＤＮＡまたはタンパク質の少なくとも９５％を含む「高度に」精製された調製物を意味することが当然理解される。
【００５１】
目的のＤＮＡまたはタンパク質を含む細胞抽出物は、目的のタンパク質を発現するかＤＮＡを含む細胞から得たホモジネート調製物または無細胞調製物を意味することが当然理解される。用語「細胞抽出物」は、培地、特に細胞が取り除かれている使用済みの培地を含むことが意図される。
【００５２】
本明細書において、「調節する」とは、機能の抑制、亢進または誘導をさす。例えば、ジンクフィンガー−核酸結合ドメインおよびその変異体は、プロモーター内のモチーフと結合することによりプロモーター配列を調節することができ、それによってプロモーター細胞の核酸配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を促進または抑制する。あるいは、調節には、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド変異体が構造遺伝子に結合し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を読み通すことを阻止し、よって遺伝子の転写を阻害する、遺伝子の転写の阻害が含まれ得る。構造遺伝子は正常細胞遺伝子であっても、例えば癌遺伝子であってもよい。あるいは、調節には、転写物の翻訳の阻害が含まれてもよい。
【００５３】
本明細書において、用語「阻害する」とは、プロモーターに作動可能に連結された構造遺伝子の転写の活性化のレベルの抑制をさす。例えば、本明細書中の方法に関して、遺伝子には、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合モチーフが含まれる。
【００５４】
本明細書において、用語「転写調節領域」とは、標的細胞において遺伝子発現を推進する領域をさす。本明細書での使用に適した転写調節領域としては、限定されるものではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＰＧＫおよびＣＭＶエンハンサーと連結されたα−アクチンプロモーターが挙げられる。その他の転写調節領域も当技術分野で公知である。
【００５５】
本明細書において、遺伝子のプロモーター領域には、調節エレメントまたは典型的に構造遺伝子に対して５’に位置するエレメントが含まれる；複数の調節エレメントが、介在核酸配列により分離されて、存在し得る。遺伝子を活性化させる場合、転写因子として知られるタンパク質がその遺伝子のプロモーター領域に結合する。この構築は、酵素が第２の遺伝子セグメントをＤＮＡからＲＮＡに転写することを可能にすることによる「スイッチオンの状態（ｏｎ  ｓｗｉｔｃｈ）」に類似している。多くの場合、結果として得られるＲＮＡ分子は、特異的なタンパク質の合成のためのテンプレートとしての役割を果たす；時にはＲＮＡ自体が最終産物である場合もある。プロモーター領域は、正常な細胞プロモーターであってもよく、例えば、腫瘍プロモーターであってもよい。腫瘍プロモーターは、一般的にウイルス由来プロモーターである。ジンクフィンガー結合ポリペプチドを標的化することのできるウイルスプロモーターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）、およびレンチウイルスプロモーター、例えば、ヒトＴ細胞リンパ球好性ウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＴＬＶ）１型および２型ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型または２型由来のプロモーターなどが挙げられる。
【００５６】
本明細書において、用語「末端切断された」または類似の用語とは、天然のジンクフィンガー結合タンパク質中に見出されるジンクフィンガーの全数よりも少ない数を含むか、または、望ましくない配列が削除されているジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体をさす。例えば、天然に９本のジンクフィンガーを含むジンクフィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質ＴＦＩＩＩＡの末端切断によって、１〜３本のジンクフィンガーのみを含むポリペプチドがもたらされ得る。用語「拡大された」または類似の用語とは、追加のジンクフィンガーモジュールが付加されているジンクフィンガーポリペプチドをさす。例えば、ＴＦＩＩＩＡは、３つのジンクフィンガードメインを加えることにより１２本指まで拡大することができる。加えて、末端切断型ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドには１つ以上の野生型ポリペプチド由来のジンクフィンガーモジュールを含めることができ、よって「ハイブリッド」ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドが得られる。
【００５７】
本明細書において、用語「変異誘発された」とは、タンパク質をコードするＤＮＡのランダムもしくは部位特異的変異誘発を達成するための既知の方法のいずれかを行うことにより得られたジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドをさす。例として、ＴＦＩＩＩＡでは、変異誘発を行ってコンセンサス配列の１つ以上の反復中の非保存残基を置換することができる。末端切断または拡大されたジンクフィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質も変異誘発されてもよい。
【００５８】
本明細書において、ポリペプチド「変異体」または「誘導体」とは、ポリペプチドの変異誘発された形態、または組換えにより作製されたが、所望の活性、例えばリガンドまたは核酸分子と結合する能力または転写を調節する能力などをなおも保持する形態のポリペプチドをさす。
【００５９】
本明細書において、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチド「変異体」または「誘導体」とは、ジンクフィンガータンパク質の変異誘発形態または組換えによって作製された形態であるポリペプチドをさす。変異体は、例えば、第２のタンパク質のジンクフィンガードメイン（１または複数）と連結された１種類のタンパク質由来のジンクフィンガードメイン（１または複数）を含む、ハイブリッドであってもよい。ドメインは野生型であっても変異誘発されたものであってもよい。「変異体」または「誘導体」には、野生型タンパク質中の本来の指の数よりも少ない数を含む、末端切断形態の野生型ジンクフィンガータンパク質を含むことができる。誘導体または変異体を作製することのできるジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドの例としては、ＴＦＩＩＩＡおよびｚｉｆ２６８が挙げられる。類似の用語が、「変異体」または「誘導体」の核内ホルモン受容体および「変異体」または「誘導体」の転写エフェクタードメインをさすために用いられる。
【００６０】
本明細書において「ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合標的またはモチーフ」とは、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合誘導体ポリペプチドが特異的に結合するヌクレオチドセグメントの任意の２または３次元的特徴をさす。この定義の中に含まれるものは、一般的に５ヌクレオチド以下の核酸配列、ならびにＤＮＡ二重らせんの三次元の態様、例えば、限定されるものではないが、大小の溝およびヘリックスの面などである。モチーフは、典型的に、ジンクフィンガーポリペプチドが結合することのできる、適切な長さの任意の配列である。例えば、３本指のポリペプチドは、典型的に約９〜約１４塩基対を有する１つのモチーフに結合する。好ましくは、認識配列は、ゲノム内の特異性を確保するために少なくとも約１６塩基対である。したがって、どのような特異性をもつジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドも提供される。ジンクフィンガー結合モチーフは、経験的にデザインされた、またはジンクフィンガータンパク質がそれに結合する、任意の配列であってもよい。このモチーフは、調節配列、エキソン、イントロン、または任意の非コード配列を含む、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列中に見出され得る。
【００６１】
本明細書において、用語「医薬品として許容される」、「生理学的に容認できる」およびその文法的変形形態は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬に言及する際に、置き換え可能に用いられ、その物質が、組成物の投与を禁止し得る程度までの望ましくない生理的影響、例えば、悪心、浮動性めまい、胃部不快感等を生じることなく、ヒトに対して、またはヒトに投与可能であることを表す。
【００６２】
本明細書において、用語「ベクター」とは、それが作動可能に連結された別の核酸を異なる生成環境間で輸送することのできる核酸分子をさす。好ましいベクターは、自己複製、および、それらに作動可能に連結されたＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の発現の可能なベクターである。ベクターは、そのため、以前に記載されるレプリコンおよび選択マーカーを含むことが好ましい。ベクターとしては、必ずしも限定されるものではないが、発現ベクターが挙げられる。
【００６３】
本明細書において、ＤＮＡ断片を含む核酸分子に関して、語句「〜に作動可能に連結された」とは、好ましくは従来のリン酸ジエステル結合により、一本鎖形態であろうと二本鎖形態であろうと、作動可能に連結された部分が目的どおりに機能するようにＤＮＡの鎖に共有結合的に結合された配列またはセグメントを意味する。本明細書において提供される転写単位またはカセットに作動可能に連結されるベクターの選択は、直接に、当技術分野で周知のように、所望の機能特性、例えば、ベクター複製およびタンパク質発現、ならびに形質転換される宿主細胞によって決まり、これらは組換えＤＮＡ分子を構成する当技術分野に固有の制限である。
【００６４】
本明細書において、治療用組成物の投与は任意の手段によって達成することができ、それらに限定されるものではないが、経口、皮下、静脈内、筋肉内の、胸骨内、注入技法、腹膜内投与および非経口投与が挙げられる。
【００６５】
上述のＳＳＲの修飾を制限する因子を認識して、本発明者らは外因性ＤＮＡ結合ドメインのモジュラーライブラリーを用いて内在性部位への組換えを再標的化しようとした。高い親和性、高特異性で１０９を超える異なる１８塩基対配列と結合する、多指（ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ）ジンクフィンガータンパク質は、この適用に非常に適している。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフにより得られる、特有のＤＮＡ認識の方法から、本発明者らの研究室はトリヌクレオチド配列と結合するモジュラー構成要素を導き出した（２３）。大部分のＣＮＮおよびＴＮＮとともに、あらゆるＧＮＮおよびＡＮＮトリプレット（２２、２３、５５）に相当する非天然のジンクフィンガーを見出したため、本発明者らは今、６〜１８ｂｐＤＮＡ部位に選択的に結合する多指タンパク質を構成することができる。これらの新規なＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラタンパク質は、効果的に標的化された転写活性化および抑制（１３、１４、２３、２７、２８、４０、４２、５６）、ＤＮＡ切断（１０、１１  、１２、２０、３３、３９、４９、５７、５８）、および遺伝子組込み（６４）を有する。近年、Ｓｔａｒｋと共同研究者らは、天然のジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８に過剰活性Ｔｎ３リゾルバーゼ触媒ドメインを融合させ（６）、それによって第１の機能性ジンクフィンガー−リコンビナーゼを構成した（３）。
【００６６】
ジンクフィンガー−リコンビナーゼ（ＲｅｃＺＦ）とともに本発明者らの研究室で同時に構築された、ＳｔａｒｋのＺ−リゾルバーゼは（データは非公開）、Ｔｎ３リゾルバーゼのモジュラー構造が彼らを喚起した。セリンリコンビナーゼの「リゾルバーゼ／インベルターゼ」ファミリーメンバー（５９）、このタンパク質は、空間的に分離した触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインから成る（ＤＮＡに結合した高度に相同なγδリゾルバーゼの結晶構造に見られる通り（６６））。機構研究（１７、１９、２１、３０、３７、４４、４５、５２）、構造的特徴付け（４６）および機能性キメラ（３）から、全てのシナプス相互作用がリコンビナーゼ触媒ドメインに媒介される対合の「ＤＮＡの外部での（ＤＮＡ−ｏｕｔｓｉｄｅ）」モデルが確認された（図１）。高度に協調された切断事象および大規模な複合体の再配置に関する多くの詳細は未知のままであるが、ＤＮＡ結合ドメインがせいぜい小さな役割を果たすことは明らかであると思われる。
【００６７】
本発明者らは、配列特異的リコンビナーゼが新規な遺伝子治療戦略の重要な構成要素であり得ると予測する。本発明者らの予備研究は、ジンクフィンガー−リコンビナーゼ融合タンパク質が部位特異的な分離、反転、および組込みを効率的に触媒することを明らかにする（図１）。高等真核生物で観察されているセリンインベルターゼ活性とともに（４１）、ＲｅｃＺＦは、インビボで哺乳類細胞の内在性ゲノムを部位特異的に編集する能力をもたらし得る。小さなサイズのこれらのタンパク質（約７００ｂｐ）は、単一のベクターを用いるいくつかのリゾルバーゼの送達を考慮し、それによって２つの非対称の組換え部位間のＤＮＡ切除を指示することを実現可能とする。ＲｅｃＺＦはゲノムでの永続的な変化に作用するため、それらの存在は一時的である必要がある。したがって、このアプローチは、現在遺伝子療法の分野を悩ます安定な組込みに関連する危険を回避することができる。かかる治療的適用に加えて、ＲｅｃＺＦはまた、モデル生物の遺伝子操作を容易にすることができる。相同組換えの精巧な適用は現代生物学に革命をもたらしたが、この技法はしばしば非常に非効率的であり、多くの種および細胞型に不適切であった。これらの欠点は、ＲｅｃＺＦの潜在的重要性の範囲を示唆する。
【００６８】
機能性ジンクフィンガー−Ｔｎ３リゾルバーゼキメラの構成および評価。アクセサリー因子または直交結合部位をその機能にもはや必要としない、数種類のインベルターゼ／リゾルバーゼセリンリコンビナーゼの変異体が見出された（６、２９、３４）。これらの過剰活性変異体のための最小組換え部位は、ＤＮＡ結合ドメインのための逆反復認識配列しか含まない。いったんモノマーが各配列に固定されると、その後に続くあらゆる工程（二量体形成、鎖切断、交換、およびライゲーションを含む）は、もっぱら触媒ドメインにより媒介される。この作業の機能分割はこれらの２つのドメインタンパク質の構造的なモジュール性に反映される。本発明者らは、内在性ＤＮＡ結合ドメインが多指ジンクフィンガードメインで置き換えられる場合、部位特異的組換え部位はどのような遺伝子的状況にもデザインすることができると結論付けた。
【００６９】
ジンクフィンガー−リコンビナーゼ融合タンパク質（ＲｅｃＺＦ）の機能を評価するため、Ｔｎ３リゾルバーゼ（Ｄ１０２Ｙ、Ｅ１２４Ｑ）由来の過剰活性触媒ドメイン（６）を、配列ＧＡＧＧＡＧと選択的に結合する２本指の（ｂｉｄａｃｔｙｌ）ジンクフィンガータンパク質と融合させて、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧを作成した。リンカー部位（１４５Ｔ）、リンカーの長さ（６アミノ酸）、および組成物の選択は、コンピュータモデリング（図２Ａ、ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ）および関連のＤＮＡ／タンパク質相互作用の再検討により通知された６６、５１、３２。本発明者らのモデルのＺｉｆ２６８−γδリゾルバーゼキメラ（γδｚｉｆ２６８）は、反転した結合部位間の最適な距離を２０塩基対であると示唆した。したがって、第１のＲｅｃＺＦ組換え部位には、Ｔｎ３組換え部位「２０Ｔ」の中央の２０ｂｐで隔てられた逆反復のＧＡＧＧＡＧが含まれている（ＧＡＧＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧＣＴＣＣＴＣ（配列番号２）；ジンクフィンガー結合部位に下線が引かれている）。ＧＦＰｕｖ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）レポーター遺伝子に隣接する２つのかかる３２ｂｐ組換え部位を含む基質プラスミドを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（図２Ｂ）から大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）に構成した。Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧをこのプラスミド上のｌａｃプロモーターの後にライゲートし、形質転換された細胞を３７℃にて一晩増殖させた。
【００７０】
その過剰活性触媒ドメインは制御状況（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｔｅｘｔ）に関係なく機能するので、本発明者らはＴｎ３ＧＡＧＧＡＧが自由な対合を起こすのではないかと考えた。組換え部位に結合した時点で、各ＲｅｃＺＦ二量体は別の二量体と会合してプラスミド内またはプラスミド間のシナプスを形成する。この四量体のシナプスはランダムな会合により形成されるので、ＲｅｃＺＦは様々な組換え事象を触媒する可能性を有する（図１）。中央の塩基対（ＡＴ）はそれら自身の逆転した補体であるので、２０Ｔスペーサー配列は同じまたは逆の配向での部位間の組換えを可能にする。
【００７１】
Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧに触媒される組換え事象を検出するため、本発明者らは３通りのＰＣＲアッセイ：分離、反転、および組込みを開発した（図３Ａ）。いずれの場合にも、産物形成は、アガロースゲル上に視覚化される特有のバンドの出現と相関する。分離アッセイは、それらの相対的な存在量に関して基質および産物バンドを増幅する（それぞれ１８１４ｂｐおよび１０３９ｂｐ；図２Ｂ）。しかし、反転および組込みは、各々、単一のバンドの出現により証明される（それぞれ１２６３ｂｐおよび３７０ｂｐ）。これは、これらの２つの反応の唯一の産物が相補的なプライマー対を含むために起こる。したがって、これらの２つのアッセイは感度が高いが、反応の程度に関する情報はあまり得られない。分離および反転系がＧＦＰｕｖ領域の操作について報告するのに対し、ＲｅｃＺＦ触媒組込み反応の検出は第２の非相同プラスミドを必要とする。この目的のため、単一の組換え部位をｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にライゲートした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−分離産物を、修飾したｐＡＣＹＣ１８４と同時形質転換した。これらの２つの適合性プラスミドをカルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択下で同時に維持した。組込み産物は、いずれかのプラスミド上で単離されたプライマーが相互に補完できる時に検出される。図３のレーン３ｂに示される、この反応の対照は、修飾されていないｐＡＣＹＣ１８４（潜在的組換え部位を欠く）での同時形質転換体である。
【００７２】
３つ全てのアッセイでの陽性の結果は、本発明者らのＴｎ３ＧＡＧＧＡＧによる自由な対合という仮説を裏付けた（図３Ｂ）。予測した部位特異的な分離産物を単離し、その同一性をＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。組込みは安定な産物を生じないが、対応するＰＣＲバンドをアガロースゲルから精製することができた。そのバンドの塩基配列決定により、２つの基質プラスミドの、共有するＲｅｃＺＦ組換え部位により連結された部位特異的融合が明らかとなった。
【００７３】
本発明者らの最初の実験は、新規な３２塩基対配列部位への特異的組換えを目標とした。原則として、ほぼどの配列もＲｅｃＺＦ基質となることができた。公開された３２のＧＮＮおよびＡＮＮジンクフィンガードメインのみを考えると、ランダム化された１００ｂｐ領域は平均９の最小組換え部位（例えば、２０ｂｐ配列に隣接する反転したＧＡＧＧＡＧ（配列番号１））を含む。実際には、これらの酵素の適用は、必要なスペーサー−タンパク質相互作用により制限される可能性がある。γδリゾルバーゼ結晶構造は、アルギニン１４２と組換え部位の中心から４〜８ｂｐのＡ／Ｔの多い副溝との間に複数の相互作用を含む（６６）。変異研究から、これらのエレメントの両方がＴｎ３リゾルバーゼ（５１）およびＨｉｎインベルターゼ（３２）の適切な機能に必要とされることが示された。かかるＡ／Ｔの多い領域の重要性は、リコンビナーゼのこのファミリーに特徴付けられる部位の多くにそれらが存在することによりさらに証明される（５９）。
【００７４】
Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧ組換えが同様に制約される程度を測るため、本発明者らはスペーサーが長さかまたは配列のいずれかが変更された基質のパネルを構築した（図１２）。分離アッセイにより、スペーサー長への強い機能依存性が明らかとなった；組換えは１８ｂｐスペーサー領域を含む部位間でほとんど検出できず、２０ｂｐスペーサー領域で（および５’部位と３’部位が異なるミスマッチした２２／２０配置で）最も急速であり、２２ｂｐ部位では中間であった。追加の詳細は、下の実施例１に示される。
【００７５】
本発明者らの第１のスペーサー配列変異体は、それに反して、ＲｅｃＺＦが驚くべき程度の機能的乱雑さを有することを明らかにした。野生型Ｔｎ３とは対照的に、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧは、Ａ／Ｔの多い副溝を含む、スペーサー領域の全体にわたって点変異を許容した（図１２；下の実施例１に追加の詳細）。本発明者らは、二次的なＤＮＡ結合相互作用が、比較的密接に結合しているジンクフィンガードメインの存在下で不必要であると仮定した。この楽観的な観点は、２つのスペーサー領域のうちの１つがＧｉｎインベルターゼのそれに由来する（ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＧ（配列番号６３２）；図４Ｂ、レーン１１）、キメラ基質（２０Ｇ−ＧＦＰ−２０Ｔ）を用いた結果によって曇った。この状況において組換え不全は重大なスペーサー配列依存（可能性としてのＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ組換え部位の数（および、故に、頻度）の制限）を示唆する。
【００７６】
ＨｉｎおよびＧｉｎジンクフィンガー−リコンビナーゼの構成および進化。スペーサー配列依存の問題に直面し、本発明者らは、基質範囲がＴｎ３ＧＡＧＧＡＧのそれを補完する可能性のあるさらなるＲｅｃＺＦを生成しようとした。変異Ｔｎ３触媒ドメインについて選択するよりもむしろ、本発明者らは、セリンリコンビナーゼのリゾルバーゼ／インベルターゼファミリーの自然多様性を利用することを選んだ。様々なスペーサー配列の偏りを確保すること以上に、異なる触媒ドメインの使用は、ＲｅｃＺＦが直交する組換え事象を、平行して（例えば、異なる遺伝子の同時分離）または、より興味深いことに、順次に（例えば、カセット交換）のいずれかで行うことを可能にする。
【００７７】
補因子の非存在下、最小組換え部位で有用な過剰活性変異体は、Ｈｉｎ（２９）およびＧｉｎ（３４）のインベルターゼについて既に特徴付けされている。近縁種であるＨｉｎインベルターゼおよびＧｉｎインベルターゼは、一次構造においてＴｎ３リゾルバーゼとは有意に異なる。しかし、多くの保存されたエレメントが存在することにより、これらの３つのタンパク質の配列アラインメントが可能となり、ＨｉｎＧＡＧＧＡＧ（１４５Ｎ）およびＧｉｎＧＡＧＧＡＧ（１４４Ｔ）構成の類似するリンカー部位の決定が可能となった。この単純な融合により作製されたキメラは、検出可能なレベルの分離を触媒しなかった。しかし、ＰＣＲ反転アッセイにより、ＨｉｎＧＡＧＧＡＧおよびＧｉｎＧＡＧＧＡＧが両方とも一部のそれらの生来の触媒活性を保持したことが明らかとなった。Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧを含む、３つ全てのＲｅｃＺＦは、ジンクフィンガー組換え部位に隣接されるＧＦＰｕｖレポーター遺伝子を部位特異的に反転させることができる。この過剰活性触媒ドメインは制御状況に関係なく機能するので、キメラは自由な対合を起こす。組換え部位に結合した時点で、各ＲｅｃＺＦ二量体は別の二量体と会合してプラスミド内またはプラスミド間のシナプスを形成する場合がある。対合により可能となった鎖切断により、完全にタンパク質−タンパク質相互作用により結合される中間複合体が作製される。この中間体の内部の回転は制御されていないので、ＲｅｃＺＦ酵素はあらゆる可能性のある組換え事象（分離、反転、および組込みを含む）を触媒することができる。したがって、本発明者らのＨｉｎＧＡＧＧＡＧおよびＧｉｎＧＡＧＧＡＧ  機能性の調査は、反転ＰＣＲアッセイ（産物のみが増幅される）は分離アッセイ（産物および基質の両方が増幅される、図３Ａ、Ｂ）よりも有意に感度が高いというだけの理由で、反転活性のみが示され得る。
【００７８】
最初のＨｉｎＧＡＧＧＡＧおよびＧｉｎＧＡＧＧＡＧキメラから本発明者らは、基質に連結されたタンパク質進化（ＳＬｉＰＥ）の戦略を用いて高活性のリゾルバーゼを生成した。このアプローチは、組換え部位を各リコンビナーゼ遺伝子に隣接させて配置する。したがって、好結果のリコンビナーゼをコードする遺伝子は、その酵素の作用により物理的にマークが付けられる。この識別マークにより、ＰＣＲ増幅による不成功の候補物質の大きなバックグラウンドから遺伝子を容易に取出すことができる。様々な基質でＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ活性を観察して、本発明者らの選択は２つの異なるスペーサー配列間の組換えに頼った（２０ＴおよびＧｉｎスペーサー誘導体、２０Ｇ、ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＧ（配列番号６３２））。介在するＧＦＰスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）の切除により、ハイブリッドスペーサー配列（２０Ｇ／Ｔ、ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号６３３）を含む単一の組換え部位とする。この新規な配列と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、部位特異的分離を触媒したＲｅｃＺＦを選択的に増幅させた（図１３；下の実施例１に追加の詳細）。ＣｒｅリコンビナーゼのためにＢｕｃｈｈｏｌｚおよびＳｔｅｗａｒｔにより開発された本来のＳＬＩＰＥ戦略（１８）と比較して、ここに採用されるアプローチは３つの主な利点を有する、それは、低下したバックグラウンドと改善された感度のための選択的な産物増幅、配列特異的選択性、および、最後に、相同組換えの可能性のない点である。
【００７９】
ＲｅｃＺＦ変異体のライブラリーを、Ｚａｃｃｏｌｏと共同研究者らの方法によるエラープローンＰＣＲにより作成した（６７）。ｄＮＴＰ類似体、ｄＰＴＰ（１２．５μＭ）および８−オキソ−ｄＧＴＰ（１２．５μＭ）の存在下、過剰活性ＨｉｎおよびＧｉｎ触媒ドメインの増幅によりランダムに配置されたヌクレオチド類似体を含むテンプレートが生成された。その後のオーバーラップＰＣＲにより各触媒ドメイン（平均３．２アミノ酸変化を含む）を融合してエラーを含まないジンクフィンガードメインとした。これらのＲｅｃＺＦライブラリーを、その後に第１ラウンドの機能選択用の基質プラスミドにクローニングした。３ラウンドの選択後、Ｓｔｅｍｍｅｒにより最初に記載されたＰＣＲシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法を用いて各プールに残っている変異体を組み換えた（６３）。いくつかの追加のラウンドのＰＣＲ選択により、各ＲｅｃＺＦプールの最も活性のあるキメラをコードする遺伝子を濃縮した（図１３Ｂ；下の実施例１に追加の詳細）。各ラウンドから６つのクローンを個別に検定し、最も速いリゾルバーゼを配列決定した。これらのクローンの分析は、ＨｉｎおよびＧｉｎ触媒ドメインの両方において同等の、単一の変異の選択を示す。２番目の位置で、進化したＧｉｎ触媒ドメインは、天然Ｈｉｎの同等残基に匹敵する変異を有した。この変異の機能的な重要性は不明なままであるが、今までのところ発見された２つの最良のクローン、ＨｉｎＬ＿６Ｃ４およびＧｉｎＬ７Ｃ７は、強力なリゾルバーゼである（図１３Ｂ；下の実施例１に追加の詳細）。予備的研究から、これらの２つの酵素が、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧについて観察したものに類似するスペーサー距離の偏りを有することが示唆される（活性が低下する順に、２０ｂｐ＞２２ｂｐ＞１８ｂｐ）。
【００８０】
ＲｅｃＺＦに媒介される安定な組込みのための戦略。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系は強力かつ用途の広い遺伝子操作のためのツールである。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ部位間の切除を選択的に触媒するが、変異ｌｏｘ部位を用いて組込み反応を促進することができる。この目的のため、２種類の組換え部位、「弱い」と直交、が開発された（４、５、９、１５、２５、２６、３５、６１）。類似の部位が、ｌｏｘＰ部位またはその変異体を用いることなく本発明に係るキメラリコンビナーゼのために開発された。
【００８１】
著しく低い親和性でＣｒｅに結合する半部位（ＬＥ変異体ｌｏｘ、ｌｏｘ７１、およびＲＥ変異体ｌｏｘ、ｌｏｘ６６）は、ｌｏｘＰ由来の天然の半部位で補完することができる（４）。同様のアプローチは、ｌｏｘＰ部位またはＣｒｅと結合する部位を使用することなく、本発明に係るキメラリコンビナーゼとともに用いることができる。ヘテロ部位は組換えのために機能的であるが、組込みにより作成された「弱い」部位のホモ二量体はそうではない（図４Ａ）。次善のジンクフィンガー−ＤＮＡ相互作用を含むＲｅｃＺＦ部位は、そのような右エレメント／左エレメント（ＬＥ／ＲＥ）戦略に必要とされる条件的組換えを可能にし得る。ＧＡＧに加えて、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧの反復ジンクフィンガーは、その他の３つのトリヌクレオチド配列に著しく低い親和性で結合する（親和性の低下する順に、ＧＧＧ＞ＧＴＧ＞ＧＣＧ）。ＧＦＰｕｖがＧＸＧＧＡＧヘテロ部位に隣接される、３つの基質を調製した（図４Ｂ、２〜４）。いずれの場合にも、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧに媒介される分離は急速に進行した（図４Ｃ、１〜４レーン）。この結果は、組換えのために機能性のままである次善の部位はかなりの数となることを示唆する（その断片はヘテロ部位の状況においてのみ機能し得る）。残念ながら、これらの特定の弱い部位のホモ二量体（図４Ｂ、６〜８）は、完全な機能性を証明し、第２のプラスミドに位置するＧＡＧＧＡＧホモ二量体に効率的に組み込まれる（図４Ｃ、５〜８レーン）。
【００８２】
安定な組込みのための第２の戦略は、ｌｏｘＰに不適合性の変異ｌｏｘ部位を含む（９、１５、２５、６１）。そのような完全な部位（例えば、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２およびｌｏｘ５１７１）（３６）は天然のＣｒｅ部位と機能的に直交するので、これら２つは順次組換え反応に一斉に用いることができる。さらに、直交する部位を用いる類似の戦略を、変異ｌｏｘ部位またはＣｒｅと結合する任意の部位を使用することなく、本発明に係るキメラリコンビナーゼとともに用いることができる。直交する部位は、異なって重複しない特異性をもつキメラリコンビナーゼとそれらの相互作用により直交する。１つの部位での組込みの後にその他の部位での切除が続く場合、結果（ｒｅｓｕｌｔ）はカセット交換である（図５Ａ）。安定な遺伝子組込みのためのこの戦略は、直交するスペーサー配列を直交する触媒ドメインで置き換えることによりＲｅｃＺＦに容易に順応させることができる。しかし、このアプローチが評価されることができる前に、ＲｅｃＺＦが様々なジンクフィンガー結合ドメインによって高い特異性で標的化されることができたかを本発明者らが確認することがまず必要であった。２つの３本指の（ｔｒｉ−ｄａｃｔｙｌ）ジンクフィンガータンパク質、Ｈ１（その同族の９ｂｐ配列はＧＧＡＧＧＣＧＴＧ（配列番号６３４）である）およびＰ２（ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号６３５））をこの作業に選択した。ＨｉｎおよびＧｉｎ進化に用いたものに類似の基質（２０Ｇ−ＧＦＰ−２０Ｔ）をＨ１およびＰ２ジンクフィンガー結合部位で構築した。Ｈ１およびＰ２のＧｉｎＬ７Ｃ７触媒ドメインへのＰＣＲ融合により、それぞれＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびＧｉｎＬ７Ｃ７ｐ２をコードする遺伝子を作成した。これらの新規なＲｅｃＺＦを、２組がマッチし、２組がミスマッチする、４組の対が生じるように、両方の基質にライゲートした。幸いにも、ＲｅｃＺＦは両方とも高活性であり、高度に選択的であった。反転（図５Ｂ）および分離（図５Ｃ）は、ジンクフィンガーが組換え部位にマッチした時にのみ観察された。必要とされる関係物を全て集めたので、局面は今やＲｅｃＺＦに媒介されるカセット交換の評価に設定される。
【００８３】
配列構成の多様性において機能性である高活性ジンクフィンガー−リコンビナーゼ（ＲｅｃＺＦ）の生成。ＲｅｃＺＦの治療的組換えを行う能力は、内在性ゲノムの中の可能性のある組換え部位の出現率に直接に依存する。この出現率は、高特異性ＤＮＡ結合ドメインの数の関数であり、さらに任意のスペーサー配列依存の関数である。本発明者らは、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびＧｉｎＬ７Ｌ７Ｐ２を用いてこれらの２つの制限のうち最初のものに取り組んだ（図５）。各ＲｅｃＺＦが高活性（それら自身の基質に特異的）であることは、触媒ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインのモジュール性を証明する。ＧＮＮ結合ドメインおよびＡＮＮ結合ドメインのみを用いると、２つの適当な間隔のあいた９ｂｐジンクフィンガー結合部位はランダム配列で６４ｂｐおきに現れる。残念ながら、この出現率はスペーサー配列依存により損なわれ得る。予備的データから、各触媒ドメインが別個の偏りを有していることが示唆される。Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧは、概して単一のＴｎ３由来の半部位内に点変異の影響を受けなかったが、ＧＦＰｕｖを切除するその能力はＧｉｎ由来のスペーサーにより著しく損なわれた（図１２；下の実施例１に追加の詳細）。同様に、ＧｉｎＬ７Ｃ７およびＨｉｎＬ６Ｃ４は、それらが選択された基質２０Ｇ−ＧＦＰ−２０Ｔへの偏りを示した。
【００８４】
本発明者らの観察した配列の偏りは、基質結合かまたは触媒作用のいずれかのレベルで生じ得る。低い親和性が速度を制限する場合、ジンクフィンガードメインをより多く有する（かつ密接に結合する）ＲｅｃＺＦは、より低いスペーサー配列依存を示す。本発明者らは早速対応し、この単純解を検討する。本発明者らのグループは、この作業に適した、十分特徴付けられた３本指（ｔｒｉ−ｄａｃｔｙｌ）および６本指（ｈｅｘａ−ｄａｃｔｙｌ）ジンクフィンガータンパク質を多く所有する。各ドメインの同族結合配列を用いて調製されるＲｅｃＺＦ基質を、リコンビナーゼ活性を直接比較するために生成する。この方法で偏りを克服することができなければ、スペーサーを、特定の触媒ドメインの既知の基質許容性にマッチさせる必要がある。
【００８５】
本発明者らは、まず３つ全ての既存のＲｅｃＺＦ触媒ドメインに固有の偏りを特徴付けることにより、機構的なスペーサー配列依存という課題に取り組む。この目的のため、ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて組換え部位のライブラリーを生成する。配列スペースの初期調査は、３つの変更されていない半部位の状況において完全にランダム化された１つの半部位を検定する（図６）。ＲｅｃＺＦとのインキュベーションの後、塩基配列決定のために反転産物を単離する。本発明者らの初期結果によりその後のライブラリーおよび試験基質のデザインの情報がもたらされることが予測される。これらの手段により、本発明者らは各触媒ドメインのスペーサー配列の偏りを効率的に特徴付けることができる。
【００８６】
現在の制限を知ることにより、新規なＲｅｃＺＦ触媒ドメインの本発明者らのデザインが方向付けられる。新規なスペーサー配列のための触媒ドメインは、３つの方法、さらなるセリンリコンビナーゼの順応、新規なＨｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３のＲｅｃＺＦ変異体の選択、および既存のＲｅｃＺＦの合理的修飾、のうちの１つで生成される。既に報告された５種類の過剰活性触媒ドメインとともに、本発明者らは、リゾルバーゼ／インベルターゼファミリーの３０種類を超えるセリンリコンビナーゼ（５９）の多くが（全部ではない）、ＲｅｃＺＦでの使用に適している可能性があると予測する。天然基質を調査することにより、広い範囲のスペーサー配列を網羅するために利用することのできる自然多様性が明らかとなる。構造的に相同の触媒ドメインを順応させることは、上記のＨｉｎおよびＧｉｎでの研究と直ちに類似する。
【００８７】
２つのインベルターゼでの本発明者らの経験はまた、リコンビナーゼが不自然な状況において機能するよう順化させることのできる能力を証明する。スペーサー配列依存をよりよく理解して、本発明者らは、特異性の変更された触媒ドメイン、または、好ましくは、広範囲の基質で高い活性をもつゼネラリストについて選択するためにＳＬＩＰＥ基質を構築する。この目標に向けて、本発明者らは、ＲｅｃＺＦライブラリーが６種類の異なる基質で分割される別の進化実験を開始する。各基質からの出力を標準化した後、次ラウンドの選択のために活性のあるリコンビナーゼをプールする。この進化的選択は、スペーサー領域配列とは無関係であるが、隣接するジンクフィンガータンパク質部位について選択的であるリコンビナーゼの選択を支持するはずである。
【００８８】
増加する数のＲｅｃＺＦの特徴付けは、スペーサー配列依存を付与する特定のタンパク質エレメントを浮き彫りにするはずである。この理解のレベルは、本発明者らが、触媒ドメインを合理的に修飾し、飽和変異誘発の遺伝子座を含む集中したライブラリーを生成できるようにする。
【００８９】
精製された酵素でのゲノム分離と、哺乳類細胞における一過性発現による証明。本発明者らは、ＲｅｃＺＦタンパク質をそれらのインビトロ動態学の特徴付けのために精製する。リコンビナーゼ−ジンクフィンガー−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質を、マルトースカラムでのアフィニティー精製のために生成する（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製ｐＭａｌタンパク質融合および精製系より順応させる）。大型のＣ末端ＭＢＰドメインが（大腸菌中の）リコンビナーゼ活性を阻害する場合、ファクターＸａプロテアーゼ部位が、各精製されたＲｅｃＺＦから嵩高い標識（ｂｕｌｋｙ  ｔａｇ）を切り離すために用いられ得る。あるいは、修飾されていないＲｅｃＺＦはＤＮＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。活性のあるＲｅｃＺＦの単離に成功した時点で、本発明者らは、それらの構造的な特徴付けのために、ここＳｃｒｉｐｐｓ社のＩａｎ  Ｗｉｌｓｏｎとともに結晶学的研究を深める。いったん効率的な精製戦略が開発されると、その能力は、ＲｅｃＺＦがマイクロインジェクションにより直接細胞の中に送達される将来的な研究を可能にする。ゲノムを仕立てるためのこの戦略は、発現ベクターが適していないかまたは入手可能でないかのいずれかの状況で用いられ得る。
【００９０】
ヒトゲノムからのＲｅｃＺＦ切除は、単純化された導入遺伝子切除の状況において最初に調査される。レポーター遺伝子ＲＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、隣接するＳＴＯＰカセット（全リーディングフレーム中の翻訳停止コドンと結合した４つのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリＡ配列のヘッドトゥテイルアレイ（４３、６０））とともに、ＲｅｃＺＦ組換え部位に隣接される。各半部位は、ＲＦＰ−ＳＴＯＰがＲｅｃＺＦホモ四量体により切除されることができるように、同じジンクフィンガー結合部位を含む。この領域の片側は構成的プロモーター（ＣＭＶ）であり、もう一方は、レポーター遺伝子ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。この配置は、分離前にはＲＦＰ発現のみ、その後はＥＧＦＰ発現のみを促進するはずである（図７）。この全ＲｅｃＺＦ応答領域は、レトロウイルスベクターｐＭＸを用いて２９３Ｔ細胞に安定に組み込まれる（４７）。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いてＲＦＰ発現に陽性の細胞を単離する。次に、このプールをＲｅｃＺＦ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトする。その後のＦＡＣＳ分析によりゲノム切除の程度に比例する、ＧＦＰのＲＦＰ発現に対する比を定量化する。
【００９１】
もし本発明者らが、ＲｅｃＺＦがゲノム組換えを媒介できることを証明できる場合、本発明者らは、内在性状況でのそれらの機能の検定を開始する。その時点で、スペーサー配列の同時制限（上に考察されるとおり）により、本発明者らが切除のためにどの遺伝子を選択するかが決定される。それらの制約に適う組換え部位は、ＧＣＧ  ＰＡＴＴＥＲＮＦＩＮＤＥＲプログラム（１）を用いて見出される。遺伝子切除の現在の候補には、ＩＣＡＭ−１およびＣＣＲ５が含まれる。本発明者らの研究室はこれらのタンパク質の両方の機能の調節経験があり、アプローチの成功を査定するアッセイがすぐに入手可能である（８、４２、６２）。遺伝子が選択されると直ちに、関連のゲノム領域を含む基質ベクターが、組換えのために大腸菌中で調製される（図８）。ヘテロ四量体対合に必要とされるＲｅｃＺＦモノマーの２つを各々発現する、さらに２つのプラスミドが生成される。相同組換えを排除するためにＲｅｃＺＦコドン使用頻度は変化される。３つ全てのプラスミドは大腸菌に形質転換され、抗生物質選択下で同時に維持される。成功した分離事象を、既に記載される方法でＰＣＲアッセイにより検出する。この試験が陽性の結果をもたらす場合、本発明者らは、適切な哺乳類細胞（構成的に標的タンパク質を発現）に４つのＲｅｃＺＦモノマーの各々をコードする発現ベクターを一時的にコトランスフェクトする。切除事象は、ＦＡＣＳ分析およびゲノムＰＣＲにより検出される。その成功を示す実験結果を含む、このアプローチの追加の詳細は、下の実施例１に示される。
【００９２】
ＲｅｃＺＦに触媒される安定な、部位特異的な組込みのための戦略の評価。本発明者らは、上記の安定な組込みのための２つの戦略、「弱い」部位のホモ二量体形成（図４Ａ）および直交組換えによるカセット交換（図４Ａ）を開発し続ける。一部の次善のジンクフィンガー結合部位は組換えに適格なままであることが証明されたので、弱い部位の探索は２つのトラックに沿って進めることができる。ＧＸＧＧＸＧ（配列番号６３６）配列の体系的評価に加えて、本発明者らは、シス活性化ジンクフィンガー結合部位を即座に見出すためのハイスループット戦略を提案する（図１１）。２つの適合性のプラスミドにおいて、単一の半部位ライブラリー（ＧＮＮＧＮＮ（配列番号６３７）部位ランダム化について６．６×１０４変異体、ＮＮＮＮＮＮ（配列番号６３８）について１．７×１０７）は、ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて生成される。これらの２つのプールは大腸菌に同時形質転換され、カルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択下で同時に維持される。この培養から精製したプラスミドを、低い濃度で再形質転換し、両方の抗生物質を含有するプレートで増殖する。この選択培地で増殖するコロニーを、一方向性の組込みについてＰＣＲによりスクリーニングする。もしさらなるストリンジェンシーが必要な場合、組込み産物によってのみ発現する別のレポーター遺伝子を加える。
【００９３】
ＲｅｃＺＦタンパク質のライブラリー（＞１０２４変異体）は、人工のジンクフィンガードメインの収集物から引き出したジンクフィンガードメインと一般的な触媒ドメインとの融合物から集めることができる（１３、４０、４２）。次に、本発明者らは、定義されたＤＮＡ結合配列を用いてこのＲｅｃＺＦライブラリーを検証することにより適切に弱い結合剤を見出すことができる。ＧＸＧＧＸＧ（配列番号６３６）の特徴付けは適切な弱い部位の存在を確立するために適切であると同時に、ＲｅｃＺＦライブラリーは、内在性ゲノムの中の特定の部位に取り組むためのより優れた戦略であり得る。この選択肢を調査するため、本発明者らは、同様の２つのプラスミド選択系を構築する。この場合、一方のプラスミドはリコンビナーゼのライブラリーを発現し、もう一方は単一のＲｅｃＺＦを発現する。これらの酵素が機能する部位は、ヘテロ二量体である（一方の結合部位は６ｂｐ標的に対応し、もう一方は一般的なＲｅｃＺＦの同族配列である（図１０））。選択および分析は、既に説明された方法で行われる。
【００９４】
弱い部位が見出されるとすぐ、本発明者らは、このジンクフィンガー−ＤＮＡ相互作用の親和性を決定する。この知識により、本発明者らが、弱い部位戦略の内在性適用のために配列とＲｅｃＺＦを迅速に組み合わせることが可能となり得る。
【００９５】
現在確定的に証明される選択的ジンクフィンガーターゲティングとともに（ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２、図５、ＢおよびＣ）、ＲｅｃＺＦに媒介されるカセット交換を評価することができる。この系は異なる触媒ドメインおよびジンクフィンガードメインから成る２つのＲｅｃＺＦの発現を必要とする。相同組換えの可能性を最小化するため、ベクター配列は最適化される。各プラスミドは、それらのカルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択下での同時維持を可能にするために特有の抗生物質抵抗性を付与する。２つのカセットは、ＧＦＰｕｖおよびｍＣＤ２コード領域を非反復ホモ二量体ＲｅｃＺＦ部位で隣接することにより構築される；この配置において、２つの直交するＲｅｃＺＦによるプラスミド内切除の可能性はないはずである。組換え部位の配置によって、本発明者らは、プラスミド内カセット交換（図１１Ａ）、または両方のカセットの喪失を伴うプラスミド融合（図１１Ｂ）のいずれかを促進することができるかもしれない。２つのプラスミド中間体を相互転換し得る反転反応は、その中央の塩基対（ＡＴとは違う）がそれ自体の逆転した補体でない、直接反復部位を用いることにより阻止される。最後に、組込み産物は抗生物質選択およびＰＣＲスクリーニングにより特定される。
【００９６】
以下の参照文献は、実施例１を除いて、本明細書に適用可能であり、参照により本明細書に組み込まれる；これらの参照文献はそれらに割り付けた参照番号で参照される。追加の参照文献もまた、本明細書中に列挙され、それらも参照により本明細書に組み込まれる。実施例１の参照文献は、その実施例に特有のその数字とともに下に示される。
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【００９７】
本発明は、そのため、限定されるものではないが、いかなる状況でも、分離または切除、反転、組込み、転座、二重鎖切断、共有結合、相同組換えの刺激、およびトランスポサーゼターゲティングを含む、どのような方法でも、任意の二本鎖ＤＮＡ基質の修飾のためのかかる触媒ドメインと構築した全てのキメラを対象とする。この状況は、どのような種類の細胞においても、またはどのような種類の生物においても、インビトロであってもよい。
【００９８】
より特に、本発明は、部位特異的組換え（すなわち、標的化または非標的化、および保存的または非保存的）の全ての適用に関する。それぞれの反応は、協調して働く１〜４種類の異なるキメラリコンビナーゼ（本明細書において「ＲｅｃＺＦ」とも称される）により行われる。特に注目すべきは、部位が、対応するＲｅｃＺＦを構成することのできる内在性ゲノム配列中に「見出された」内在性組換えの適用である。（これは、外因性部位（例えば、ｌｏｘ、ＦＲＴ）がゲノムに導入されて前から存在するリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ）に適合する現在のパラダイムの逆である）。そのため、キメラリコンビナーゼを用いることにより、組換えのための外因性部位をゲノムへ導入する必要なく、より高い柔軟性がもたらされる。これは、かかる外因性部位の導入が、有害、困難、または不都合であり得る場合に特に有利である。
【００９９】
したがって、本発明の一態様は、キメラリコンビナーゼタンパク質が、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、かつ、セリンリコンビナーゼが、キメラタンパク質の状況において組換えを効率的に触媒するよう選択されるかまたは進化するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼタンパク質である。典型的に、セリンリコンビナーゼドメインは、一般的な鎖交換機構を触媒する触媒セリン求核剤を含むリコンビナーゼドメインである。典型的に、セリンリコンビナーゼは、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ、Ｍｉｎ、Ｄｉｎ、およびＣｉｎならびにＧｉｎの変異タンパク質、Ｈｉｎの変異タンパク質、Ｓｉｎの変異タンパク質、Ｂｅｔａの変異タンパク質、Ｐｉｎの変異タンパク質、Ｍｉｎの変異タンパク質、Ｄｉｎの変異タンパク質、Ｃｉｎの変異タンパク質、Ｔｎ３の変異タンパク質から成る群から選択される。しかし、その他の適切なセリンリコンビナーゼが下に記載される。典型的に、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、ヘキサヌクレオチドに特異的に結合する２本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである。その他の代替形態では、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、９塩基対に結合する３本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン、１２塩基対に結合する４本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン、１５塩基対に結合する５本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン、または１８塩基対に結合する６本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである。結合する塩基対の数が大きいほど、リコンビナーゼの特異性は高く、作用する部位の数は少なくなる。しかし、上に定義されるように、用語「ジンクフィンガー」、「ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン」、等は、それにより特定されるアミノ酸配列が実際のジンクフィンガーから生じること、または必ずしも自然に存在するまたは構成されたジンクフィンガータンパク質と実質的な相同性を有することを必要としない。それらは関係するタンパク質ドメインの一般的な性質を説明するために用いられ、タンパク質構造中に必ずしも亜鉛イオンの関与を必要としない。
【０１００】
本発明に係るキメラリコンビナーゼに含められるジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、２つのサブドメインを含む。
【０１０１】
これらのサブドメインの１番目は、ＤＮＡ結合サブドメインである。下に説明されるように、一般にこのサブドメインは約７〜約１０アミノ酸、最も一般的には７または８アミノ酸を含み、下に記載される特異的なＤＮＡ結合能力を有する。ＤＮＡ結合サブドメインは、代わりにドメインと呼ぶこともでき、本明細書ではそのように呼ぶ。
【０１０２】
これらのサブドメインの２番目は、フレームワークサブドメインである。一代替形態では、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の構造に基づいて、フレームワークサブドメインは二分され、第１の半分は、ＤＮＡ結合サブドメインのアミノ末端がフレームワークサブドメインの第１の半分のカルボキシル末端に位置するように配置し、第２の半分は、ＤＮＡ結合サブドメインのカルボキシル末端がフレームワークサブドメインの第２の半分のアミノ末端に位置するように配置する。
【０１０３】
この代替形態では、野生型ジンクフィンガータンパク質によく見出されるように、フレームワークサブドメインには、２つのシステイン残基と２つのヒスチジン残基が含まれ得る。この配置を本明細書ではＣ２Ｈ２と命名する。Ｃ２Ｈ２配置の野生型ジンクフィンガータンパク質では、２つのシステイン残基はＤＮＡ結合サブドメインのアミノ末端側に位置し、２つのヒスチジン残基はＤＮＡ結合サブドメインのカルボキシル末端側に位置する。システインおよびヒスチジン残基はジンクフィンガータンパク質において亜鉛イオンに結合する。
【０１０４】
野生型ジンクフィンガータンパク質は、一般的に、だがそれに限らないが、Ｃ２Ｈ２配置を有し、フレームワークサブドメイン中のシステイン残基とヒスチジン残基を交換して、少数の天然に存在するジンクフィンガータンパク質に知られている、３つのシステイン残基と１つのヒスチジン残基（Ｃ３Ｈ）をもつ、４つのシステイン残基（Ｃ４）をもつフレームワークドメインを生成することが可能である。さらに、変異誘発を用いてこれらのフレームワークサブドメインのＨ４およびＣＨ３配置が作製された。ＣＨ３配置では、４つの関連する残基のいずれかがシステインであり得る；その他の３つは全てヒスチジンである。これらの変異ジンクフィンガータンパク質は、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ＣｙｓＨｉｓ３−Ｔｙｐｅ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２５：４２１−４２５（２００４）に開示されている。同様の変異ジンクフィンガータンパク質はまた、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｙ．Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｉｓ４−Ｔｙｐｅ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．４４：２９５−２９６（２０００）にも開示されている。
【０１０５】
さらに、Ｃ６（６つのシステイン残基）配置のジンクフィンガータンパク質が存在し、その配置は、本発明に係るキメラリコンビナーゼの中でジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインの一部をなすフレームワークサブドメインに組み込むことができる（Ｙ．Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｈｉｓ４−Ｔｙｐｅ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．４４：２９５−２９６（２０００））。
【０１０６】
追加のフレームワークサブドメインは、タンパク質トリ膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）に基づく。小型のタンパク質ａＰＰは、溶媒曝露αヘリックス面と溶媒曝露２型ポリプロリンへリックス面を有する。ａＰＰに基づくジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにおいて、上記のように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン由来のＤＮＡ結合サブドメインは、ａＰＰの溶媒曝露αヘリックス面か溶媒曝露２型ポリプロリンへリックス面のいずれかにグラフトされる。残基を変異させてより密接であるかより特異的なＤＮＡ結合をもたらすことができる。このアプローチは、両方とも本参照により本明細書に組み込まれる、Ｌ．Ｙａｎｇ  ＆  Ａ．Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：７４６９−７４７８（２００５），および  Ｎ．Ｊ．Ｚｏｎｄｌｏ  ＆  Ａ．Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：６９３８−６９３９（１９９９）に記載されている。典型的に、これらの残基はａＰＰの溶媒曝露αヘリックス面上にグラフトされる。このアプローチでは、ＤＮＡ結合サブドメインをαヘリックス残基で散在させることができる。
【０１０７】
本発明に係るキメラレコンビナーゼの構成に適したセリンリコンビナーゼとしては、必ずしもそれに限定されないが、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｎ．Ｄ．Ｆ，Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：５６７−６０５（２００６）に記載されている一般的な鎖交換機構において機能するものが挙げられる。
【０１０８】
本発明に係るキメラリコンビナーゼに組み込まれているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに結合した９塩基配列の例としては、限定されるものではないが、ＧＧＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号３）およびＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４）が挙げられる。
【０１０９】
本発明に係る具体的なキメラリコンビナーゼとしては、６ｂｐ配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選択的に結合する２本指のジンクフィンガータンパク質とリンカーによって融合したＴｎ３由来のドメインを有するＴｎ３ＧＡＧＧＡＧが挙げられる。キメラリコンビナーゼＴｎ３ＧＡＧＧＡＧは、２０ｂｐスペーサー部位（ＧＡＧＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧＣＴＣＣＴＣ）（配列番号２）（ジンクフィンガー結合部位に下線が引かれている）により隔てられたＤＮＡ配列での組換えを触媒する際に効果的である。
【０１１０】
本発明に係るその他のキメラリコンビナーゼとしては、ＨｉｎＧＡＧＧＡＧおよびＧｉｎＧＡＧＧＡＧが挙げられる。これらのキメラリコンビナーゼは、ヘキサヌクレオチドＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）に結合するジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに融合したリコンビナーゼＨｉｎおよびＧｉｎをそれぞれ有する。
【０１１１】
したがって、実施例１により詳細に説明される次のキメラリコンビナーゼ、Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇ、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１、およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２は、別のリコンビナーゼ触媒ドメインがＴｎ３またはＧｉｎセリンリコンビナーゼを置き換えるその変異体とともに、本発明の範囲内である。
【０１１２】
また、したがって、次の変異、（１）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＧ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、またはＥ１２４Ｑ；（２）Ｈｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＨ１０７Ｙ；（３）Ｇｉｎセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＭ７０Ｖ、Ｔ９６Ａ、またはＨ１０６Ｙ；あるいは（４）Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＩ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｋ６５Ｒ、Ｍ７３Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ、Ｋ５３Ｅ、およびＫ１５１Ｍの１つ以上が、ＨｉｎおよびＧｉｎ中の対応する相同残基の変異（番号付けはＴｎ３のもの（図１３参照））とともにセリンリコンビナーゼに導入されているキメラリコンビナーゼは、本発明の範囲内である。タンパク質中の変異は本明細書において、元の残基、残基数、および置換残基を用いる標準的な表記法により名付けられる、そのため「Ｉ１２Ｖ」は、１２位のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換されている変異である。この表記法は、一般的に当技術分野で公知である。
【０１１３】
同様に、セリンリコンビナーゼが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｙ１０９Ｈ、Ｍ１１４Ｖ、およびＫ１４８Ｍ（Ｙ１０９Ｈは野生型Ｇｉｎへの復帰変異であり、Ｋ１４８Ｍはリンカー変異である）を含むＧｉｎドメインであるキメラリコンビナーゼは、本発明の範囲内である。したがって、リコンビナーゼ触媒ドメインが、次の変異、Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、およびＭ１１４Ｖを含む（Ｙ１０９ＨとＫ１４８Ｍは除く）Ｇｉｎドメインであるキメラリコンビナーゼもまた本発明の範囲内である。
【０１１４】
本発明に係るさらにその他のキメラリコンビナーゼとしては、スペーサー配列依存を減らすよう構成されたキメラリコンビナーゼが挙げられる。観察された配列の偏りは、基質結合かまたは触媒作用のいずれかのレベルで生じる可能性がある。低い親和性が速度を制限する場合、ジンクフィンガードメインをより多く有する（かつ密接に結合している）ＲｅｃＺＦは、より低いスペーサー配列依存を示す。したがって、スペーサー配列依存または配列の偏りは、より多くの数のジンクフィンガードメインまたは、それらの標的核酸配列により密接に結合するジンクフィンガードメインを含むキメラリコンビナーゼを構成することにより減らすことができる。別の代替形態では、スペーサーのための触媒ドメインの親和性を決定すること、およびスペーサーを部位特異的変異誘発法で修飾してより大きな親和性を得ることにより、スペーサーを特定の触媒ドメインの既知の基質許容性にマッチさせることができる。核酸−タンパク質相互作用の親和性を決定するための方法は当技術分野で周知である。
【０１１５】
したがって、本発明に係るキメラリコンビナーゼを構成する際に有用なセリンリコンビナーゼとしては、限定されるものではないが、
（１）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫＩ；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏｌＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ＿Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；連鎖球菌ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス・セリカラー染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトミセスファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バチルス属菌プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；黄色ブドウ球菌ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；結核菌プロファージφＲＶ１セリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ＿ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ１９５６；およびＣａｃ１９５４；ならびに
（２）（ａ）のセリンリコンビナーゼの変異タンパク質
が挙げられる。
【０１１６】
これらの目的のため、既存の３つのＲｅｃＺＦ触媒ドメイン全てに固有の偏りは、本発明の別の実施形態である次の工程を含む方法により特徴付けられる。
（１）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを含む組換え部位の、複数のライブラリーを生成する工程；
（２）完全にランダム化された１つの半部位と変更されていない３つの半部位を含有する部位を検定して、これらの部位で少なくとも１つのＲｅｃＺＦにより行われる組換えの効率を判定する工程；および
（３）工程（２）からの反転産物を塩基配列決定のために単離して配列の偏りを特徴付けする工程。
【０１１７】
典型的に、この方法は、ＲｅｃＺＦ部位の各々について配列の偏りに関する構造−活性プロフィールを生成する。
【０１１８】
さらに、本発明に係るその他のキメラリコンビナーゼとしては、次のうちの１つ、（１）Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３以外のセリンリコンビナーゼの順応により生成される触媒ドメイン；（２）新規なＨｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３ＲｅｃＺＦ変異体の選択により生成される触媒ドメイン；あるいは（３）既存のＲｅｃＺＦの合理的修飾により生成される触媒ドメイン、である少なくとも１つの触媒ドメインが挙げられる。タンパク質構造の合理的修飾のための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄ  ＆  Ｃ．Ｓ．Ｃｒａｌｋ，ｅｄｓ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）に記載されている。具体的には、かかる方法としては、限定されるものではないが、分子モデリング、ＮＭＲ分光分析法、Ｘ線結晶学、またはその他の方法による触媒ドメイン中の機能的に重要な残基の特定；例えば、限定されるものではないが、ランダム変異誘発、欠失解析、またはリンカースキャニング変異誘発などの方法による構造情報から確認された残基の変異；機能性残基、例えば、高度に保存された残基、あるいは、生化学的方法、例えば化学架橋、親和性ラベリング、または化学修飾からの保護などにより確認される残基などを確認するためのタンパク質相同性（例えばリコンビナーゼの触媒ドメイン間などの）の使用；あるいはチャージド・トゥ・アラニンスキャニング変異誘発（ｃｈａｒｇｅｄ−ｔｏ−ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が挙げられる。また、合理的デザインには、残基ベースで結合親和性および／または特異性を最大化することを目的とする変異も含まれてもよく、それにはアミノ酸残基および核酸基質間の一時的な共有結合性相互作用、ならびに非共有結合性相互作用、例えば、水素結合、疎水性相互作用、塩結合（ｓａｌｔ  ｌｉｎｋｓ）、およびファンデルワールス相互作用などが考慮に入れられる。
【０１１９】
既に報告された５種類の過剰活性触媒ドメインとともに、リゾルバーゼ／インベルターゼファミリーの３０種類を超えるセリンリコンビナーゼの全てではないが、多くがＲｅｃＺＦでの使用に適していることが予測される。共有結合性セリン中間体の使用により作動するいずれのリコンビナーゼ、インベルターゼまたはインテグラーゼもこのアプローチに適している。これらは多様な起源のものであり、それには、細菌、真菌、およびバクテリオファージ由来のものが含まれる。これらは、参照により援用される、Ｍ．Ｃ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｈ．Ｍ．Ｔｈｏｒｐｅ，「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ」，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７（２００２）に記載されている。特異的なセリンリコンビナーゼ活性を有するこれらのセリンリコンビナーゼの変異タンパク質もまた、本発明に係るキメラリコンビナーゼに使用することができる。天然基質を調査することにより、広い範囲のスペーサー配列を網羅するために利用することのできる自然多様性が明らかとなる。構造的に相同の触媒ドメインを順応させることは、上記のＨｉｎおよびＧｉｎでの研究と直ちに類似する。
【０１２０】
本発明の範囲内である追加のキメラリコンビナーゼは、下に記載されるように、基質に連結されたタンパク質進化（ＳＬｉＰＥ）の使用により生成されるものである。ＳＬｉＰＥは特異性の変更された触媒ドメイン、または、好ましくは、広範囲の基質で高い活性をもつゼネラリストについて選択するために用いることができる。これらの触媒ドメインは、次に、本発明に係るキメラリコンビナーゼに組み込むことができる。
【０１２１】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、上記のように任意のヌクレオチド選択配列に結合することができる。一代替形態では、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、ヘキサヌクレオチド、例えばＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）などに結合する；これは一般に２本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである。別の代替形態では、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、９−ｂｐ配列、例えばＧＧＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号３）またはＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４）などに結合する；これは一般に３本指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである。その他の代替形態では、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、１２塩基対に結合する４指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン；１５塩基対に結合する５指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン；または１８塩基対に結合する６指のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインである。
【０１２２】
適切なジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、形態ＡＮＮ、ＣＮＮ、ＧＮＮ、またはＴＮＮのトリヌクレオチド配列に結合している個々のドメインから作り上げることができる。形態ＡＮＮのトリヌクレオチドに結合しているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、２００２年１１月７日公開の、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００２／０１６５３５６号、標題「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＮＮ」に開示され、本参照により本明細書に組み込まれる。形態ＣＮＮのトリヌクレオチドに結合しているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、２００４年１１月１１日公開の、Ｂａｒｂａｓによる米国特許出願公開第２００４／０２２４３８５号、標題「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ＣＮＮ」に開示され、本参照により本明細書に組み込まれる。形態ＧＮＮのトリヌクレオチドに結合しているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、２００３年８月２６日公開の、Ｂａｒｂａｓに対する米国特許第６，６１０，５１２号、標題「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ＧＮＮ」に開示され、本参照により本明細書に組み込まれる。形態ＴＮＮのトリヌクレオチドに結合しているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、２００６年１１月２８日出願の、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願第１１／５６４，１４１号、標題「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ＴＮＮ」に開示され、本参照により本明細書に組み込まれる。さらに、形態ＡＧＣのトリヌクレオチドに結合しているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、２００６年１２月１９日出願の、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願第１１／６１３，０７５号、標題「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＡＧＣ」に開示され、本参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
典型的に、形態ＡＮＮ、ＣＮＮ、ＧＮＮ、またはＴＮＮのトリヌクレオチドに結合している個々のジンクフィンガーヌクレオチド（本発明に係るキメラリコンビナーゼタンパク質に組み込まれているジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインはそれらから作り上げられる）は、５〜１０アミノ酸残基、好ましくは約７アミノ酸残基のヌクレオチド結合ドメインである。典型的に、ヌクレオチド結合ドメインは、７つのアミノ酸から成る配列であり、本明細書では「トリプレット結合ドメイン」と呼ばれ、その立体構造中では主にαヘリックスである。このトリプレット結合ドメインの構造は、より詳細に下に説明される。しかし、ヌクレオチド結合領域はそれぞれの側に５までのアミノ酸に隣接されることができ、用語「トリプレット結合ドメイン」には、本明細書において、これらの追加のアミノ酸が含まれる。
【０１２４】
ＡＮＮのための好ましい結合ドメインとしては、ＳＴＮＴＫＬＨＡ（配列番号５）、ＳＳＤＲＴＬＲＲ（配列番号６）、ＳＴＫＥＲＬＫＴ（配列番号７）、ＳＱＲＡＮＬＲＡ（配列番号８）、ＳＳＰＡＤＬＴＲ（配列番号９）、ＳＳＨＳＤＬＶＲ（配列番号１０）、ＳＮＧＧＥＬＩＲ（配列番号１１）、ＳＮＱＬＩＬＬＫ（配列番号１２）、ＳＳＲＭＤＬＫＲ（配列番号１３）、ＳＲＳＤＨＬＴＮ（配列番号１４）、ＳＱＬＡＨＬＲＡ（配列番号１５）、ＳＱＡＳＳＬＫＡ（配列番号１６）、ＳＱＫＳＳＬＩＡ（配列番号１７）、ＳＲＫＤＮＬＫＮ（配列番号１８）、ＳＤＳＧＮＬＲＶ（配列番号１９）、ＳＤＲＲＮＬＲＲ（配列番号２０）、ＳＤＫＫＤＬＳＲ（配列番号２１）、ＳＤＡＳＨＬＨＴ（配列番号２２）、ＳＴＮＳＧＬＫＮ（配列番号２３）、ＳＴＲＭＳＬＳＴ（配列番号２４）、ＳＮＨＤＡＬＲＡ（配列番号２５）、ＳＲＲＳＡＣＲＲ（配列番号２６）、ＳＲＲＳＳＣＲＫ（配列番号２７）、ＳＲＳＤＴＬＳＮ（配列番号２８）、ＳＲＭＧＮＬＩＲ（配列番号２９）、ＳＲＳＤＴＬＲＤ（配列番号３０）、ＳＲＡＨＤＬＶＲ（配列番号３１）、ＳＲＳＤＨＬＡＥ（配列番号３２）、ＳＲＲＤＡＬＮＶ（配列番号３３）、ＳＴＴＧＮＬＴＶ（配列番号３４）、ＳＴＳＧＮＬＬＶ（配列番号３５）、ＳＴＬＴＩＬＫＮ（配列番号３６）、ＳＲＭＳＴＬＲＨ（配列番号３７）、ＳＴＲＳＤＬＬＲ（配列番号３８）、ＳＴＫＴＤＬＫＲ（配列番号３９）、ＳＴＨＩＤＬＩＲ（配列番号４０）、ＳＨＲＳＴＬＬＮ（配列番号４１）、ＳＴＳＨＧＬＴＴ（配列番号４２）、ＳＨＫＮＡＬＱＮ（配列番号４３）、ＱＲＡＮＬＲＡ（配列番号４４）、ＤＳＧＮＬＲＶ（配列番号４５）、ＲＳＤＴＬＳＮ（配列番号４６）、ＴＴＧＮＬＴＶ（配列番号４７）、ＳＰＡＤＬＴＲ（配列番号４８）、ＤＫＫＤＬＴＲ（配列番号４９）、ＲＴＤＴＬＲＤ（配列番号５０）、ＴＨＬＤＬＩＲ（配列番号５１）、ＱＬＡＨＬＲＡ（配列番号５２）、ＲＳＤＨＬＡＥ（配列番号５３）、ＨＲＴＴＬＬＮ（配列番号５４）、ＱＫＳＳＬＩＡ（配列番号５５）、ＲＲＤＡＬＮＶ（配列番号５６）、ＨＫＮＡＬＱＮ（配列番号５７）、ＲＳＤＮＬＳＮ（配列番号５８）、ＲＫＤＮＬＫＮ（配列番号５９）、ＴＳＧＮＬＬＶ（配列番号６０）、ＲＳＤＨＬＴＮ（配列番号６１）、ＨＲＴＴＬＴＮ（配列番号６２）、ＳＨＳＤＬＶＲ（配列番号６３）、ＮＧＧＥＬＩＲ（配列番号６４）、ＳＴＫＤＬＫＲ（配列番号６５）、ＲＲＤＥＬＮＶ（配列番号６６）、ＱＡＳＳＬＫＡ（配列番号６７）、ＴＳＨＧＬＴＴ（配列番号６８）、ＱＳＳＨＬＶＲ（配列番号６９）、ＱＳＳＮＬＶＲ（配列番号７０）、ＤＰＧＡＬＲＶ（配列番号７１）、ＲＳＤＮＬＶＲ（配列番号７２）、ＱＳＧＤＬＲＲ（配列番号７３）およびＤＣＲＤＬＡＲ（配列番号７４）が挙げられる。
【０１２５】
ＡＮＮのための特に好ましい結合ドメインとしては、配列番号４４〜５３が挙げられる。
【０１２６】
ＡＧＣのための好ましい追加のドメインとしては、ＤＰＧＡＬＩＮ（配列番号７５）、ＥＲＳＨＬＲＥ（配列番号７６）、ＤＰＧＨＬＴＥ（配列番号７７）、ＥＰＧＡＬＩＮ（配列番号７８）、ＤＲＳＨＬＲＥ（配列番号７９）、ＥＰＧＨＬＴＥ（配列番号８０）、ＥＲＳＬＬＲＥ（配列番号８１）、ＤＲＳＫＬＲＥ（配列番号８２）、ＤＰＧＫＬＴＥ（配列番号８３）、ＥＰＧＫＬＴＥ（配列番号８４）、ＤＰＧＷＬＩＮ（配列番号８５）、ＤＰＧＴＬＩＮ（配列番号８６）、ＤＰＧＨＬＩＮ（配列番号８７）、ＥＲＳＷＬｌＮ（配列番号８８）、ＥＲＳＴＬＩＮ（配列番号８９）、ＤＰＧＷＬＴＥ（配列番号９０）、ＤＰＧＴＬＴＥ（配列番号９１）、ＥＰＧＷＬＩＮ（配列番号９２）、ＥＰＧＴＬＩＮ（配列番号９３）、ＥＰＧＨＬＩＮ（配列番号９４）、ＤＲＳＷＬＲＥ（配列番号９５）、ＤＲＳＴＬＲＥ（配列番号９６）、ＥＰＧＷＬＴＥ（配列番号９７）、ＥＰＧＴＬＴＥ（配列番号９８）、ＥＲＳＷＬＲＥ（配列番号９９）、ＥＲＳＴＬＲＥ（配列番号１００）、ＤＰＧＡＬＲＥ（配列番号１０１）、ＤＰＧＡＬＴＥ（配列番号１０２）、ＥＲＳＨＬＩＮ（配列番号１０３）、ＥＲＳＨＬＴＥ（配列番号１０４）、ＤＰＧＨＬＩＮ（配列番号１０５）、ＤＰＧＨＬＲＥ（配列番号１０６）、ＥＰＧＡＬＲＥ（配列番号１０７）、ＥＰＧＡＬＴＥ（配列番号１０８）、ＤＲＳＨＬＩＮ（配列番号１０９）、ＤＲＳＨＬＴＥ（配列番号１１０）、ＥＰＧＨＬＲＥ（配列番号１１１）、ＥＲＳＫＬＩＮ（配列番号１１２）、ＥＲＳＫＬＴＥ（配列番号１１３）、ＤＲＳＫＬＩＮ（配列番号１１４）、ＤＲＳＫＬＴＥ（配列番号１１５）、ＤＰＧＫＬＩＮ（配列番号１１６）、ＤＰＧＫＬＲＥ（配列番号１１７）、ＥＰＧＫＬＩＮ（配列番号１１８）、ＥＰＧＫＬＲＥ（配列番号１１９）、ＤＰＧＷＬＲＥ（配列番号１２０）、ＤＰＧＴＬＲＥ（配列番号１２１）、ＤＰＧＨＬＲＥ（配列番号１２２）、ＤＰＧＨＬＴＥ（配列番号１２３）、ＥＲＳＷＬＴＥ（配列番号１２４）、ＥＲＳＴＬＴＥ（配列番号１２５）、ＥＰＧＷＬＲＥ（配列番号１２６）、ＥＰＧＴＬＲＥ（配列番号１２７）、ＤＲＳＷＬＩＮ（配列番号１２８）、ＤＲＳＷＬＴＥ（配列番号１２９）、ＤＲＳＴＬＩＮ（配列番号１３０）およびＤＲＳＴＬＴＥ（配列番号１３１）が挙げられる。
【０１２７】
ＡＧＣのための特に好ましい結合ドメインとしては、配列番号７５〜８４が挙げられる。
【０１２８】
ＣＮＮのための好ましい結合ドメインとしては、ＱＲＨＮＬＴＥ（配列番号１３２）、ＱＳＧＮＬＴＥ（配列番号１３３）、ＮＬＱＨＬＧＥ（配列番号１３４）、ＲＡＤＮＬＴＥ（配列番号１３５）、ＲＡＤＮＬＡＩ（配列番号１３６）、ＮＴＴＨＬＥＨ（配列番号１３７）、ＳＫＫＨＬＡＥ（配列番号１３８）、ＲＮＤＴＬＴＥ（配列番号１３９）、ＲＮＤＴＬＱＡ（配列番号１４０）、ＱＳＧＨＬＴＥ（配列番号１４１）、ＱＬＡＨＬＫＥ（配列番号１４２）、ＱＲＡＨＬＴＥ（配列番号１４３）、ＨＴＧＨＬＬＥ（配列番号１４４）、ＲＳＤＨＬＴＥ（配列番号１４５）、ＲＳＤＫＬＴＥ（配列番号１４６）、ＲＳＤＨＬＴＤ（配列番号１４７）、ＲＳＤＨＬＴＮ（配列番号１４８）、ＳＲＲＴＣＲＡ（配列番号１４９）、ＱＬＲＨＬＲＥ（配列番号１５０）、ＱＲＨＳＬＴＥ（配列番号１５１）、ＱＬＡＨＬＫＲ（配列番号１５２）、ＮＬＱＨＬＧＥ（配列番号１５３）、ＲＮＤＡＬＴＥ（配列番号１５４）、ＴＫＱＴＬＴＥ（配列番号１５５）およびＱＳＧＤＬＴＥ（配列番号１５６）が挙げられる。
【０１２９】
ＧＮＮのための好ましい結合ドメインとしては、ＱＳＳＮＬＶＲ（配列番号１５７）、ＤＰＧＮＬＶＲ（配列番号１５８）、ＲＳＤＮＬＶＲ（配列番号１５９）、ＴＳＧＮＬＶＲ（配列番号１６０）、ＱＳＧＤＬＲＲ（配列番号１６１）、ＤＣＲＤＬＡＲ（配列番号１６２）、ＲＳＤＤＬＶＫ（配列番号１６３）、ＴＳＧＥＬＶＲ（配列番号１６４）、ＱＲＡＨＬＥＲ（配列番号１６５）、ＤＰＧＨＬＶＲ（配列番号１６６）、ＲＳＤＫＬＶＲ（配列番号１６７）、ＴＳＧＨＬＶＲ（配列番号１６８）、ＱＳＳＳＬＶＲ（配列番号１６９）、ＤＰＧＡＬＶＲ（配列番号１７０）、ＲＳＤＥＬＶＲ（配列番号１７１）、ＴＳＧＳＬＶＲ（配列番号１７２）、ＱＲＳＮＬＶＲ（配列番号１７３）、ＱＳＧＮＬＶＲ（配列番号１７４）、ＱＰＧＮＬＶＲ（配列番号１７５）、ＤＰＧＮＬＫＲ（配列番号１７６）、ＲＳＤＮＬＲＲ（配列番号１７７）、ＫＳＡＮＬＶＲ（配列番号１７８）、ＲＳＤＮＬＶＫ（配列番号１７９）、ＫＳＡＱＬＶＲ（配列番号１８０）、ＱＳＳＴＬＶＲ（配列番号１８１）、ＱＳＧＴＬＲＲ（配列番号１８２）、ＱＰＧＤＬＶＲ（配列番号１８３）、ＱＧＰＤＬＶＲ（配列番号１８４）、ＱＡＧＴＬＭＲ（配列番号１８５）、ＱＰＧＴＬＶＲ（配列番号１８６）、ＱＧＰＥＬＶＲ（配列番号１８７）、ＧＣＲＥＬＳＲ（配列番号１８８）、ＤＰＳＴＬＫＲ（配列番号１８９）、ＤＰＳＤＬＫＲ（配列番号１９０）、ＤＳＧＤＬＶＲ（配列番号１９１）、ＤＳＧＥＬＶＲ（配列番号１９２）、ＤＳＧＥＬＫＲ（配列番号１９３）、ＲＬＤＴＬＧＲ（配列番号１９４）、ＲＰＧＤＬＶＲ（配列番号１９５）、ＲＳＤＴＬＶＲ（配列番号１９６）、ＫＳＡＤＬＫＲ（配列番号１９７）、ＲＳＤＤＬＶＲ（配列番号１９８）、ＲＳＤＴＬＶＫ（配列番号１９９）、ＫＳＡＥＬＫＲ（配列番号２００）、ＫＳＡＥＬＶＲ（配列番号２０１）、ＲＧＰＥＬＶＲ（配列番号２０２）、ＫＰＧＥＬＶＲ（配列番号２０３）、ＳＳＱＴＬＴＲ（配列番号２０４）、ＴＰＧＥＬＶＲ（配列番号２０５）、ＴＳＧＤＬＶＲ（配列番号２０６）、ＳＳＱＴＬＶＲ（配列番号２０７）、ＴＳＱＴＬＴＲ（配列番号２０８）、ＴＳＧＥＬＫＲ（配列番号２０９）、ＱＳＳＤＬＶＲ（配列番号２１０）、ＳＳＧＴＬＶＲ（配列番号２１１）、ＴＰＧＴＬＶＲ（配列番号２１２）、ＴＳＱＤＬＫＲ（配列番号２１３）、ＴＳＧＴＬＶＲ（配列番号２１４）、ＱＳＳＨＬＶＲ（配列番号２１５）、ＱＳＧＨＬＶＲ（配列番号２１６）、ＱＰＧＨＬＶＲ（配列番号２１７）、ＥＲＳＫＬＡＲ（配列番号２１８）、ＤＰＧＨＬＡＲ（配列番号２１９）、ＱＲＡＫＬＥＲ（配列番号２２０）、ＱＳＳＫＬＶＲ（配列番号２２１）、ＤＲＳＫＬＡＲ（配列番号２２２）、ＤＰＧＫＬＡＲ（配列番号２２３）、ＲＳＫＤＬＴＲ（配列番号２２４）、ＲＳＤＨＬＴＲ（配列番号２２５）、ＫＳＡＫＬＥＲ（配列番号２２６）、ＴＡＤＨＬＳＲ（配列番号２２７）、ＴＡＤＫＬＳＲ（配列番号２２８）、ＴＰＧＨＬＶＲ（配列番号２２９）、ＴＳＳＨＬＶＲ（配列番号２３０）、ＴＳＧＫＬＶＲ（配列番号２３１）、ＱＰＧＥＬＶＲ（配列番号２３２）、ＱＳＧＥＬＶＲ（配列番号２３３）、ＱＳＧＥＬＲＲ（配列番号２３４）、ＤＰＧＳＬＶＲ（配列番号２３５）、ＲＫＤＳＬＶＲ（配列番号２３６）、ＲＳＤＶＬＶＲ（配列番号２３７）、ＲＨＤＳＬＬＲ（配列番号２３８）、ＲＳＤＡＬＶＲ（配列番号２３９）、ＲＳＳＳＬＶＲ（配列番号２４０）、ＲＳＳＳＨＶＲ（配列番号２４１）、ＲＳＤＥＬＶＫ（配列番号２４２）、ＲＳＤＡＬＶＫ（配列番号２４３）、ＲＳＤＶＬＶＫ（配列番号２４４）、ＲＳＳＡＬＶＲ（配列番号２４５）、ＲＫＤＳＬＶＫ（配列番号２４６）、ＲＳＡＳＬＶＲ（配列番号２４７）、ＲＳＤＳＬＶＲ（配列番号２４８）、ＲＩＨＳＬＶＲ（配列番号２４９）、ＲＰＧＳＬＶＲ（配列番号２５０）、ＲＧＰＳＬＶＲ（配列番号２５１）、ＲＰＧＡＬＶＲ（配列番号２５２）、ＫＳＡＳＫＶＲ（配列番号２５３）、ＫＳＡＡＬＶＲ（配列番号２５４）、ＫＳＡＶＬＶＲ（配列番号２５５）、ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号２５６）、ＴＳＱＳＬＶＲ（配列番号２５７）、ＴＳＳＳＬＶＲ（配列番号２５８）、ＴＰＧＳＬＶＲ（配列番号２５９）、ＴＳＧＡＬＶＲ（配列番号２６０）、ＴＰＧＡＬＶＲ（配列番号２６１）、ＴＧＧＳＬＶＲ（配列番号２６２）、ＴＳＧＥＬＶＲ（配列番号２６３）、ＴＳＧＥＬＴＲ（配列番号２６４）、ＴＳＳＡＬＶＫ（配列番号２６５）およびＴＳＳＡＬＶＲ（配列番号２６６）が挙げられる。
【０１３０】
ＧＮＮのための特に好ましい結合ドメインとしては、配列番号１５７〜１７２が挙げられる。
【０１３１】
ＴＮＮのための好ましい結合ドメインとしては、ＱＡＳＮＬＩＳ（配列番号２６７）、ＳＲＧＮＬＫＳ（配列番号２６８）、ＲＬＤＮＬＱＴ（配列番号２６９）、ＡＲＧＮＬＲＴ（配列番号２７０）、ＲＫＤＡＬＲＧ（配列番号２７１）、ＲＥＤＮＬＨＴ（配列番号２７２）、ＡＲＧＮＬＫＳ（配列番号２７３）、ＲＳＤＮＬＴＴ（配列番号２７４）、ＶＲＧＮＬＫＳ（配列番号２７５）、ＶＲＧＮＬＲＴ（配列番号２７６）、ＲＬＲＡＬＤＲ（配列番号２７７）、ＤＭＧＡＬＥＡ（配列番号２７８）、ＥＫＤＡＬＲＧ（配列番号２７９）、ＲＳＤＨＬＴＴ（配列番号２８０）、ＡＱＱＬＬＭＷ（配列番号２８１）、ＲＳＤＥＲＫＲ（配列番号２８２）、ＤＹＱＳＬＲＱ（配列番号２８３）、ＣＦＳＲＬＶＲ（配列番号２８４）、ＧＤＧＧＬＷＥ（配列番号２８５）、ＬＱＲＰＬＲＧ（配列番号２８６）、ＱＧＬＡＣＡＡ（配列番号２８７）、ＷＶＧＷＬＧＳ（配列番号２８８）、ＲＬＲＤＩＱＦ（配列番号２８９）、ＧＲＳＱＬＳＣ（配列番号２９０）、ＧＷＱＲＬＬＴ（配列番号２９１）、ＳＧＲＰＬＡＳ（配列番号２９２）、ＡＰＲＬＬＧＰ（配列番号２９３）、ＡＰＫＡＬＧＷ（配列番号２９４）、ＳＶＨＥＬＱＧ（配列番号２９５）、ＡＱＡＡＬＳＷ（配列番号２９６）、ＧＡＮＡＬＲＲ（配列番号２９７）、ＱＳＬＬＬＧＡ（配列番号２９８）、ＨＲＧＴＬＧＧ（配列番号２９９）、ＱＶＧＬＬＡＲ（配列番号３００）、ＧＡＲＧＬＲＧ（配列番号３０１）、ＤＫＨＭＬＤＴ（配列番号３０２）、ＤＬＧＧＬＲＱ（配列番号３０３）、ＱＣＹＲＬＥＲ（配列番号３０４）、ＡＥＡＥＬＱＲ（配列番号３０５）、ＱＧＧＶＬＡＡ（配列番号３０６）、ＱＧＲＣＬＶＴ（配列番号３０７）、ＨＰＥＡＬＤＮ（配列番号３０８）、ＧＲＧＡＬＱＡ（配列番号３０９）、ＬＡＳＲＬＱＱ（配列番号３１０）、ＲＥＤＮＬＩＳ（配列番号３１１）、ＤＡＳＮＬＩＳ（配列番号３１２）、ＥＡＳＮＬＩＳ（配列番号３１３）、ＲＡＳＮＬＩＳ（配列番号３１４）、ＴＡＳＮＬＩＳ（配列番号３１５）、ＳＡＳＮＬＩＳ（配列番号３１６）、ＱＡＳＴＬＩＳ（配列番号３１７）、ＱＡＳＤＬＩＳ（配列番号３１８）、ＱＡＳＥＬＩＳ（配列番号３１９）、ＱＡＳＨＬＩＳ（配列番号３２０）、ＱＡＳＫＬＩＳ（配列番号３２１）、ＱＡＳＳＬＩＳ（配列番号３２２）、ＱＡＳＡＬＩＳ（配列番号３２３）、ＤＡＳＴＬＩＳ（配列番号３２４）、ＤＡＳＤＬＩＳ（配列番号３２５）、ＤＡＳＥＬＩＳ（配列番号３２６）、ＤＡＳＨＬＩＳ（配列番号３２７）、ＤＡＳＫＬＩＳ（配列番号３２８）、ＤＡＳＳＬＩＳ（配列番号３２９）、ＤＡＳＡＬＩＳ（配列番号３３０）、ＥＡＳＴＬＩＳ（配列番号３３１）、ＥＡＳＤＬＩＳ（配列番号３３２）、ＥＡＳＥＬＩＳ（配列番号３３３）、ＥＡＳＨＬＩＳ（配列番号３３４）、ＥＡＳＫＬＩＳ（配列番号３３５）、ＥＡＳＳＬＩＳ（配列番号３３６）、ＥＡＳＡＬＩＳ（配列番号３３７）、ＲＡＳＴＬＩＳ（配列番号３３８）、ＲＡＳＤＬｌＳ（配列番号３３９）、ＲＡＳＥＬＩＳ（配列番号３４０）、ＲＡＳＨＬＩＳ（配列番号３４１）、ＲＡＳＫＬＩＳ（配列番号３４２）、ＲＡＳＳＬＩＳ（配列番号３４３）、ＲＡＳＡＬＩＳ（配列番号３４４）、ＴＡＳＴＬＩＳ（配列番号３４５）、ＴＡＳＤＬＩＳ（配列番号３４６）、ＴＡＳＥＬＩＳ（配列番号３４７）、ＴＡＳＨＬＩＳ（配列番号３４８）、ＴＡＳＫＬＩＳ（配列番号３４９）、ＴＡＳＳＬＩＳ（配列番号３５０）、ＴＡＳＡＬＩＳ（配列番号３５１）、ＳＡＳＴＬＩＳ（配列番号３５２）、ＳＡＳＤＬＩＳ（配列番号３５３）、ＳＡＳＥＬＩＳ（配列番号３５４）、ＳＡＳＨＬＩＳ（配列番号３５５）、ＳＡＳＫＬＩＳ（配列番号３５６）、ＳＡＳＳＬＩＳ（配列番号３５７）、ＳＡＳＡＬＩＳ（配列番号３５８）、ＱＬＤＮＬＱＴ（配列番号３５９）、ＤＬＤＮＬＱＴ（配列番号３６０）、ＥＬＤＮＬＱＴ（配列番号３６１）、ＴＬＤＮＬＱＴ（配列番号３６２）、ＳＬＤＮＬＱＴ（配列番号３６３）、ＲＬＤＴＬＱＴ（配列番号３６４）、ＲＬＤＤＬＱＴ（配列番号３６５）、ＲＬＤＥＬＱＴ（配列番号３６６）、ＲＬＤＨＬＱＴ（配列番号３６７）、ＲＬＤＫＬＱＴ（配列番号３６８）、ＲＬＤＳＬＱＴ（配列番号３６９）、ＲＬＤＡＬＱＴ（配列番号３７０）、ＱＬＤＴＬＱＴ（配列番号３７１）、ＱＬＤＤＬＱＴ（配列番号３７２）、ＱＬＤＥＬＱＴ（配列番号３７３）、ＱＬＤＨＬＱＴ（配列番号３７４）、ＱＬＤＫＬＱＴ（配列番号３７５）、ＱＬＤＳＬＱＴ（配列番号３７６）、ＱＬＤＡＬＱＴ（配列番号３７７）、ＤＬＤＴＬＱＴ（配列番号３７８）、ＤＬＤＤＬＱＴ（配列番号３７９）、ＤＬＤＥＬＱＴ（配列番号３８０）、ＤＬＤＨＬＱＴ（配列番号３８１）、ＤＬＤＫＬＱＴ（配列番号３８２）、ＤＬＤＳＬＱＴ（配列番号３８３）、ＤＬＤＡＬＱＴ（配列番号３８４）、ＥＬＤＴＬＱＴ（配列番号３８５）、ＥＬＤＤＬＱＴ（配列番号３８６）、ＥＬＤＥＬＱＴ（配列番号３８７）、ＥＬＤＨＬＱＴ（配列番号３８８）、ＥＬＤＫＬＱＴ（配列番号３８９）、ＥＬＤＳＬＱＴ（配列番号３９０）、ＥＬＤＡＬＱＴ（配列番号３９１）、ＴＬＤＴＬＱＴ（配列番号３９２）、ＴＬＤＤＬＱＴ（配列番号３９３）、ＴＬＤＥＬＱＴ（配列番号３９４）、ＴＬＤＨＬＱＴ（配列番号３９５）、ＴＬＤＫＬＱＴ（配列番号３９６）、ＴＬＤＳＬＱＴ（配列番号３９７）、ＴＬＤＡＬＱＴ（配列番号３９８）、ＳＬＤＴＬＱＴ（配列番号３９９）、ＳＬＤＤＬＱＴ（配列番号４００）、ＳＬＤＥＬＱＴ（配列番号４０１）、ＳＬＤＨＬＱＴ（配列番号４０２）、ＳＬＤＫＬＱＴ（配列番号４０３）、ＳＬＤＳＬＱＴ（配列番号４０４）、ＳＬＤＡＬＱＴ（配列番号４０５）、ＡＲＧＴＬＲＴ（配列番号４０６）、ＡＲＧＤＬＲＴ（配列番号４０７）、ＡＲＧＥＬＲＴ（配列番号４０８）、ＡＲＧＨＬＲＴ（配列番号４０９）、ＡＲＧＫＬＲＴ（配列番号４１０）、ＡＲＧＳＬＲＴ（配列番号４１１）、ＡＲＧＡＬＲＴ（配列番号４１２）、ＳＲＧＴＬＲＴ（配列番号４１３）、ＳＲＧＤＬＲＴ（配列番号４１４）、ＳＲＧＥＬＲＴ（配列番号４１５）、ＳＲＧＨＬＲＴ（配列番号４１６）、ＳＲＧＫＬＲＴ（配列番号４１７）、ＳＲＧＳＬＲＴ（配列番号４１８）、ＳＲＧＡＬＲＴ（配列番号４１９）、ＱＫＤＡＬＲＧ（配列番号４２０）、ＤＫＤＡＬＲＧ（配列番号４２１）、ＥＫＤＡＬＲＧ（配列番号４２２）、ＴＫＤＡＬＲＧ（配列番号４２３）、ＳＫＤＡＬＲＧ（配列番号４２４）、ＲＫＤＮＬＲＧ（配列番号４２５）、ＲＫＤＴＬＲＧ（配列番号４２６）、ＲＫＤＤＬＲＧ（配列番号４２７）、ＲＫＤＥＬＲＧ（配列番号４２８）、ＲＫＤＨＬＲＧ（配列番号４２９）、ＲＫＤＫＬＲＧ（配列番号４３０）、ＲＫＤＳＬＲＧ（配列番号４３１）、ＱＫＤＮＬＲＧ（配列番号４３２）、ＱＫＤＴＬＲＧ（配列番号４３３）、ＱＫＤＤＬＲＧ（配列番号４３４）、ＱＫＤＥＬＲＧ（配列番号４３５）、ＱＫＤＨＬＲＧ（配列番号４３６）、ＱＫＤＫＬＲＧ（配列番号４３７）、ＱＫＤＳＬＲＧ（配列番号４３８）、ＤＫＤＮＬＲＧ（配列番号４３９）、ＤＫＤＴＬＲＧ（配列番号４４０）、ＤＫＤＤＬＲＧ（配列番号４４１）、ＤＫＤＥＬＲＧ（配列番号４４２）、ＤＫＤＨＬＲＧ（配列番号４４３）、ＤＫＤＫＬＲＧ（配列番号４４４）、ＤＫＤＳＬＲＧ（配列番号４４５）、ＥＫＤＮＬＲＧ（配列番号４４６）、ＥＫＤＴＬＲＧ（配列番号４４７）、ＥＫＤＤＬＲＧ（配列番号４４８）、ＥＫＤＥＬＲＧ（配列番号４４９）、ＥＫＤＨＬＲＧ（配列番号４５０）、ＥＫＤＫＬＲＧ（配列番号４５１）、ＥＫＤＳＬＲＧ（配列番号４５２）、ＴＫＤＮＬＲＧ（配列番号４５３）、ＴＫＤＴＬＲＧ（配列番号４５４）、ＴＫＤＤＬＲＧ（配列番号４５５）、ＴＫＤＥＬＲＧ（配列番号４５６）、ＴＫＤＨＬＲＧ（配列番号４５７）、ＴＫＤＫＬＲＧ（配列番号４５８）、ＴＫＤＳＬＲＧ（配列番号４５９）、ＳＫＤＮＬＲＧ（配列番号４６０）、ＳＫＤＴＬＲＧ（配列番号４６１）、ＳＫＤＤＬＲＧ（配列番号４６２）、ＳＫＤＥＬＲＧ（配列番号４６３）、ＳＫＤＨＬＲＧ（配列番号４６４）、ＳＫＤＫＬＲＧ（配列番号４６５）、ＳＫＤＳＬＲＧ（配列番号４６６）、ＶＲＧＴＬＲＴ（配列番号４６７）、ＶＲＧＤＬＲＴ（配列番号４６８）、ＶＲＧＥＬＲＴ（配列番号４６９）、ＶＲＧＨＬＲＴ（配列番号４７０）、ＶＲＧＫＬＲＴ（配列番号４７１）、ＶＲＧＳＬＲＴ（配列番号４７２）、ＶＲＧＴＬＲＴ（配列番号４７３）、ＱＬＲＡＬＤＲ（配列番号４７４）、ＤＬＲＡＬＤＲ（配列番号４７５）、ＥＬＲＡＬＤＲ（配列番号４７６）、ＴＬＲＡＬＤＲ（配列番号４７７）、ＳＬＲＡＬＤＲ（配列番号４７８）、ＲＳＤＮＲＫＲ（配列番号４７９）、ＲＳＤＴＲＫＲ（配列番号４８０）、ＲＳＤＤＲＫＲ（配列番号４８１）、ＲＳＤＨＲＫＲ（配列番号４８２）、ＲＳＤＫＲＫＲ（配列番号４８３）、ＲＳＤＳＲＫＲ（配列番号４８４）、ＲＳＤＡＲＫＲ（配列番号４８５）、ＱＹＱＳＬＲＱ（配列番号４８６）、ＥＹＱＳＬＲＱ（配列番号４８７）、ＲＹＱＳＬＲＱ（配列番号４８８）、ＴＹＱＳＬＲＱ（配列番号４８９）、ＳＹＱＳＬＲＱ（配列番号４９０）、ＲＬＲＮＩＱＦ（配列番号４９１）、ＲＬＲＴＩＱＦ（配列番号４９２）、ＲＬＲＥＩＱＦ（配列番号４９３）、ＲＬＲＨＩＱＦ（配列番号４９４）、ＲＬＲＫＩＱＦ（配列番号４９５）、ＲＬＲＳＩＱＦ（配列番号４９６）、ＲＬＲＡＩＱＦ（配列番号４９７）、ＤＳＬＬＬＧＡ（配列番号４９８）、ＥＳＬＬＬＧＡ（配列番号４９９）、ＲＳＬＬＬＧＡ（配列番号５００）、ＴＳＬＬＬＧＡ（配列番号５０１）、ＳＳＬＬＬＧＡ（配列番号５０２）、ＨＲＧＮＬＧＧ（配列番号５０３）、ＨＲＧＤＬＧＧ（配列番号５０４）、ＨＲＧＥＬＧＧ（配列番号５０５）、ＨＲＧＨＬＧＧ（配列番号５０６）、ＨＲＧＫＬＧＧ（配列番号５０７）、ＨＲＧＳＬＧＧ（配列番号５０８）、ＨＲＧＡＬＧＧ（配列番号５０９）、ＱＫＨＭＬＤＴ（配列番号５１０）、ＥＫＨＭＬＤＴ（配列番号５１１）、ＲＫＨＭＬＤＴ（配列番号５１２）、ＴＫＨＭＬＤＴ（配列番号５１３）、ＳＫＨＭＬＤＴ（配列番号５１４）、ＱＬＧＧＬＲＱ（配列番号５１５）、ＥＬＧＧＬＲＱ（配列番号５１６）、ＲＬＧＧＬＲＱ（配列番号５１７）、ＴＬＧＧＬＲＱ（配列番号５１８）、ＳＬＧＧＬＲＱ（配列番号５１９）、ＡＥＡＮＬＱＲ（配列番号５２０）、ＡＥＡＴＬＱＲ（配列番号５２１）、ＡＥＡＤＬＱＲ（配列番号５２２）、ＡＥＡＨＬＱＲ（配列番号５２３）、ＡＥＡＫＬＱＲ（配列番号５２４）、ＡＥＡＳＬＱＲ（配列番号５２５）、ＡＥＡＡＬＱＲ（配列番号５２６）、ＤＧＲＣＬＶＴ（配列番号５２７）、ＥＧＲＣＬＶＴ（配列番号５２８）、ＲＧＲＣＬＶＴ（配列番号５２９）、ＴＧＲＣＬＶＴ（配列番号５３０）、ＳＧＲＣＬＶＴ（配列番号５３１）、ＱＥＤＮＬＨＴ（配列番号５３２）、ＤＥＤＮＬＨＴ（配列番号５３３）、ＥＥＤＮＬＨＴ（配列番号５３４）、ＳＥＤＮＬＨＴ（配列番号５３５）、ＲＥＤＴＬＨＴ（配列番号５３６）、ＲＥＤＤＬＨＴ（配列番号５３７）、ＲＥＤＥＬＨＴ（配列番号５３８）、ＲＥＤＨＬＨＴ（配列番号５３９）、ＲＥＤＫＬＨＴ（配列番号５４０）、ＲＥＤＳＬＨＴ（配列番号５４１）、ＲＥＤＡＬＨＴ（配列番号５４２）、ＱＥＤＴＬＨＴ（配列番号５４３）、ＱＥＤＤＬＨＴ（配列番号５４４）、ＱＥＤＥＬＨＴ（配列番号５４５）、ＱＥＤＨＬＨＴ（配列番号５４６）、ＱＥＤＫＬＨＴ（配列番号５４７）、ＱＥＤＳＬＨＴ（配列番号５４８）、ＱＥＤＡＬＨＴ（配列番号５４９）、ＤＥＤＴＬＨＴ（配列番号５５０）、ＤＥＤＤＬＨＴ（配列番号５５１）、ＤＥＤＥＬＨＴ（配列番号５５２）、ＤＥＤＨＬＨＴ（配列番号５５３）、ＤＥＤＫＬＨＴ（配列番号５５４）、ＤＥＤＳＬＨＴ（配列番号５５５）、ＤＥＤＡＬＨＴ（配列番号５５６）、ＥＥＤＴＬＨＴ（配列番号５５７）、ＥＥＤＤＬＨＴ（配列番号５５８）、ＥＥＤＥＬＨＴ（配列番号５５９）、ＥＥＤＨＬＨＴ（配列番号５６０）、ＥＥＤＫＬＨＴ（配列番号５６１）、ＥＥＤＳＬＨＴ（配列番号５６２）、ＥＥＤＡＬＨＴ（配列番号５６３）、ＴＥＤＴＬＨＴ（配列番号５６４）、ＴＥＤＤＬＨＴ（配列番号５６５）、ＴＥＤＥＬＨＴ（配列番号５６６
）、ＴＥＤＨＬＨＴ（配列番号５６７）、ＴＥＤＫＬＨＴ（配列番号５６８）、ＴＥＤＳＬＨＴ（配列番号５６９）、ＴＥＤＡＬＨＴ（配列番号５７０）、ＳＥＤＴＬＨＴ（配列番号５７１）、ＳＥＤＤＬＨＴ（配列番号５７２）、ＳＥＤＥＬＨＴ（配列番号５７３）、ＳＥＤＨＬＨＴ（配列番号５７４）、ＳＥＤＫＬＨＴ（配列番号５７５）、ＳＥＤＳＬＨＴ（配列番号５７６）、ＳＥＤＡＬＨＴ（配列番号５７７）、ＱＥＤＮＬＩＳ（配列番号５７８）、ＤＥＤＮＬＩＳ（配列番号５７９）、ＥＥＤＮＬＩＳ（配列番号５８０）、ＳＥＤＮＬＩＳ（配列番号５８１）、ＲＥＤＴＬＩＳ（配列番号５８２）、ＲＥＤＤＬＩＳ（配列番号５８３）、ＲＥＤＥＬＩＳ（配列番号５８４）、ＲＥＤＨＬＩＳ；（配列番号５８５）、ＲＥＤＫＬＩＳ（配列番号５８６）、ＲＥＤＳＬＩＳ（配列番号５８７）、ＲＥＤＡＬＩＳ（配列番号５８８）、ＱＥＤＴＬＩＳ（配列番号５８９）、ＱＥＤＤＬＩＳ（配列番号５９０）、ＱＥＤＥＬＩＳ（配列番号５９１）、ＱＥＤＨＬＩＳ（配列番号５９２）、ＱＥＤＫＬＩＳ（配列番号５９３）、ＱＥＤＳＬＩＳ（配列番号５９４）、ＱＥＤＡＬＩＳ（配列番号５９５）、ＤＥＤＴＬＩＳ（配列番号５９６）、ＤＥＤＤＬＩＳ（配列番号５９７）、ＤＥＤＥＬＩＳ（配列番号５９８）、ＤＥＤＨＬＩＳ（配列番号５９９）、ＤＥＤＫＬＩＳ（配列番号６００）、ＤＥＤＳＬＩＳ（配列番号６０１）、ＤＥＤＡＬＩＳ（配列番号６０２）、ＥＥＤＴＬＩＳ（配列番号６０３）、ＥＥＤＤＬＩＳ（配列番号６０４）、ＥＥＤＥＬＩＳ（配列番号６０５）、ＥＥＤＨＬＩＳ（配列番号６０６）、ＥＥＤＫＬＩＳ（配列番号６０７）、ＥＥＤＳＬＩＳ（配列番号６０８）、ＥＥＤＡＬＩＳ（配列番号６０９）、ＴＥＤＴＬＩＳ（配列番号６１０）、ＴＥＤＤＬＩＳ（配列番号６１１）、ＴＥＤＥＬＩＳ（配列番号６１２）、ＴＥＤＨＬＩＳ（配列番号６１３）、ＴＥＤＫＬＩＳ（配列番号６１４）、ＴＥＤＳＬＩＳ（配列番号６１５）、ＴＥＤＡＬＩＳ（配列番号６１６）、ＳＥＤＴＬＩＳ（配列番号６１７）、ＳＥＤＤＬＩＳ（配列番号６１８）、ＳＥＤＥＬＩＳ（配列番号６１９）、ＳＥＤＨＬＩＳ（配列番号６２０）、ＳＥＤＫＬＩＳ（配列番号６２１）、ＳＥＤＳＬＩＳ（配列番号６２２）、ＳＥＤＡＬＩＳ（配列番号６２３）、ＴＧＧＷＬＱＡ（配列番号６５３）、ＳＧＧＷＬＱＡ（配列番号６５４）、ＤＧＧＷＬＱＡ（配列番号６５５）、ＥＧＧＷＬＱＡ（配列番号６５６）、ＱＧＧＷＬＱＡ（配列番号６５７）、ＲＧＧＴＬＱＡ（配列番号６５８）、ＲＧＧＤＬＱＡ（配列番号６５９）、ＲＧＧＥＬＱＡ（配列番号６６０）、ＲＧＧＮＬＱＡ（配列番号６６１）、ＲＧＧＨＬＱＡ（配列番号６６２）、ＲＧＧＫＬＱＡ（配列番号６６３）、ＲＧＧＳＬＱＡ（配列番号６６４）、ＲＧＧＡＬＱＡ（配列番号６６５）、ＴＧＧＴＬＱＡ（配列番号６６６）、ＴＧＧＤＬＱＡ（配列番号６６７）、ＴＧＧＥＬＱＡ（配列番号６６８）、ＴＧＧＮＬＱＡ（配列番号６６９）、ＴＧＧＨＬＱＡ（配列番号６７０）、ＴＧＧＫＬＱＡ（配列番号６７１）、ＴＧＧＳＬＱＡ（配列番号６７２）、ＴＧＧＡＬＱＡ（配列番号６７３）、ＳＧＧＴＬＱＡ（配列番号６７４）、ＳＧＧＤＬＱＡ（配列番号６７５）、ＳＧＧＥＬＱＡ（配列番号６７６）、ＳＧＧＮＬＱＡ（配列番号６７７）、ＳＧＧＨＬＱＡ（配列番号６７８）、ＳＧＧＫＬＱＡ（配列番号６７９）、ＳＧＧＳＬＱＡ（配列番号６８０）、ＳＧＧＡＬＱＡ（配列番号６８１）、ＤＧＧＴＬＱＡ（配列番号６８２）、ＤＧＧＤＬＱＡ（配列番号６８３）、ＤＧＧＥＬＱＡ（配列番号６８４）、ＤＧＧＮＬＱＡ（配列番号６８５）、ＤＧＧＨＬＱＡ（配列番号６８６）、ＤＧＧＫＬＱＡ（配列番号６８７）、ＤＧＧＳＬＱＡ（配列番号６８８）、ＤＧＧＡＬＱＡ（配列番号６８９）、ＥＧＧＴＬＱＡ（配列番号６９０）、ＥＧＧＤＬＱＡ（配列番号６９１）、ＥＧＧＥＬＱＡ（配列番号６９２）、ＥＧＧＮＬＱＡ（配列番号６９３）、ＥＧＧＨＬＱＡ（配列番号６９４）、ＥＧＧＫＬＱＡ（配列番号６９５）、ＥＧＧＳＬＱＡ（配列番号６９６）、ＥＧＧＡＬＱＡ（配列番号６９７）、ＱＧＧＴＬＱＡ（配列番号６９８）、ＱＧＧＤＬＱＡ（配列番号６９９）、ＱＧＧＥＬＱＡ（配列番号７００）、ＱＧＧＮＬＱＡ（配列番号７０１）、ＱＧＧＨＬＱＡ（配列番号７０２）、ＱＧＧＫＬＱＡ（配列番号７０３）、ＱＧＧＳＬＱＡ（配列番号７０４）およびＱＧＧＡＬＱＡ（配列番号７０５）が挙げられる。
【０１３２】
ＴＮＮのための特に好ましい結合ドメインとしては、配列番号２６７〜３１１が挙げられる。ＴＮＮのためのより一層好ましい結合ドメインとしては、配列番号２６７〜２７２が挙げられる。
【０１３３】
キメラリコンビナーゼのジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン内で、トリプレット結合ドメインは、１または複数のオリゴペプチドリンカーがトリプレット結合ドメイン間に位置するように、少なくとも１つのオリゴペプチドリンカーと連結されることが好ましい。かかるリンカーは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質中に見いだされるリンカーに類似していることが好ましい。本発明における使用のために好ましいリンカーは、アミノ酸残基配列ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）である。このリンカーの修飾形態も用いてもよい。例えば、リンカーの３位にあるグルタミン酸（Ｅ）は、アスパラギン酸（Ｄ）と置換することができる。１位にあるトレオニン（Ｔ）は、セリン（Ｓ）と置換することができる。２位にあるグリシン（Ｇ）は、アラニン（Ａ）と置換することができる。４位にあるリジン（Ｋ）は、アルギニン（Ｒ）と置換することができる。本発明における使用のために好ましいその他のリンカーは、アミノ酸残基配列ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）である。このより長いリンカーの修飾形態も用いてもよい。例えば、４つのグリシン（Ｇ）残基にかかるポリグリシンは、各々それよりも長くても短くてもよい（すなわち各３または各５のグリシン残基）。ポリグリシン間のセリン残基（Ｓ）は、トレオニン（Ｔ）と置換することができる。リンカーＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）の一部をなすＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）部分は、上記のように、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）リンカーのみのために修飾され得る。その他のリンカー、例えばグリシンもしくはセリンリピートなどは、ペプチド（例えば、一本鎖抗体ドメイン）を連結するために当技術分野で周知であり、本発明の組成物中で使用され得る。リンカーは、全ての目的に対して用いる必要はなく、場合により、除外されてもよい。
【０１３４】
その他のリンカーは、当技術分野で公知であり、選択的に用いることができる。これらには、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６２６）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号６２７）、ＧＧＲＧＲＧＲＧＲＱ（配列番号６２８）、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号６２９）、ＴＧＧＥＲＰ（配列番号６３０）、ＡＴＧＥＫＰ（配列番号６３１）、およびＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）のリンカーが挙げられ、ならびに、上に記載されるようにＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）およびＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）のためにアミノ酸置換がなされるリンカーの誘導体が挙げられる。例えば、これらのリンカーの中で、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号６２９）またはＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）中のジグリシンまたはポリグリシン間のセリン（Ｓ）残基は、トレオニン（Ｔ）に置換されてもよい。ＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）では、９位のグルタミン酸（Ｅ）は、アスパラギン酸（Ｄ）に置換されてもよい。これらのリンカーおよびこれらのリンカーの誘導体を含むポリペプチド組成物は、本発明のポリペプチド組成物に含められる。
【０１３５】
典型的に、キメラリコンビナーゼのジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、ヘキサヌクレオチドに結合し、そのため２つのトリプレット結合ドメインを含む。しかし、キメラリコンビナーゼのジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインには、適切な特異性を得るために、より多くの数のトリプレット結合ドメイン（例えば、３または４など）が含まれてもよい。当然ながら、キメラリコンビナーゼのジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに組み込まれているトリプレット結合ドメインの数が大きいほど、ゲノム中の可能性のある部位への特異性は高い。したがって、トリプレット結合ドメインの数が増加すれば、組換えは特定のゲノム中のより少ない部位で起こり得る。
【０１３６】
トリプレット結合ドメインは、αヘリックスドメインの中に固有の七量体（７アミノ酸残基の隣接配列）を含み、その七量体配列が標的ヌクレオチドに対する結合特異性を決定する。七量体配列は、αヘリックスドメインの中のいずれに位置してもよいが、当技術分野の従来どおりに残基に番号付けした時に、七量体は−１位から６位にわたることが好ましい。本発明のポリペプチドは、適切な特異性を確保する必要に応じてジンクフィンガータンパク質の一部として機能することが当技術分野で公知の、いずれのβ−シートおよびフレームワーク配列を含んでもよい。
【０１３７】
本発明のキメラリコンビナーゼは、天然に存在しない変異体である。本明細書において、用語「天然に存在しない」とは、例えば、次のうちの１つ以上、（ａ）天然に存在しないアミノ酸配列で構成されたポリペプチド；（ｂ）自然界に存在する状態のそのポリペプチドと会合しない、天然に存在しない二次構造を有するポリペプチド；（ｃ）そのポリペプチドが天然に存在する生物種に通常会合しない１つ以上のアミノ酸を含むポリペプチド；（ｄ）そのポリペプチドを含むアミノ酸の１つ以上の立体異性体を含むポリペプチド（その立体異性体は自然界に存在するままの該ポリペプチドと会合しない）；（ｅ）天然アミノ酸のうちの１種類以外の、１つ以上の化学部分を含むポリペプチド；あるいは（ｆ）天然に存在するアミノ酸配列の単離された部分（例えば、末端切断配列）、を意味する。本発明のキメラリコンビナーゼは、単離された形態で存在し、混入物質を実質的に含まないように精製される。キメラリコンビナーゼは、天然の供給源から単離および精製されてもよい；あるいは、キメラリコンビナーゼは、当技術分野で周知の技法、例えば遺伝子工学または固相ペプチド合成などを用いて新規に作成することができる。キメラリコンビナーゼをそれから作製することのできるジンクフィンガータンパク質の例としては、ＳＰ１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡおよびＺｉｆ２６８、ならびにＣ７（Ｚｉｆ２６８の誘導体）および当技術分野で公知の他のジンクフィンガータンパク質が挙げられる。天然に存在するどのジンクフィンガードメインも、本発明で用いるために採用することができる。一部の適用では、転位のように、限定された特異性をもつジンクフィンガードメインが好ましい。
【０１３８】
本発明に係るキメラリコンビナーゼは、さらに、その他のタンパク質由来のドメインを、その追加のドメインがそのタンパク質のリコンビナーゼ活性に干渉しない限り、含むことができる。これらの追加のドメインは、スペーサーエレメントを組み込んでも組み込まなくてもよい。スペーサーエレメントの使用は当技術分野で周知である。これらの融合タンパク質は、当技術分野で公知のものなどの様々な追加のドメイン、例えば、精製タグ、酵素ドメイン、リガンド結合ドメイン、細胞透過性ドメイン、またはその他のドメインなどをキメラリコンビナーゼの特異的なリコンビナーゼ活性を著しく変更することなく含むことができる。酵素ドメインの例としては、蛍光またはバイオルミネセンスを介する検出可能な光の生成を触媒する酵素ドメインが挙げられる。蛍光タンパク質の例は、キメラリコンビナーゼを細胞に導入する一過性導入またはその他の手順の後にＦＡＣ分類の実行を可能にする、ＥＧＦＰである。リガンド結合ドメインには、ＲｅｃＺＦの核の存在を滴定する能力をもたらすエストロゲン受容体が含まれる。細胞浸透性ドメインの例は、ＲＧＤモチーフである。一例では、ポリペプチドを、β−ラクタマーゼのような分割された酵素の２つの半分に組み込み、細胞において、またはインビボで配列を感知させることができる。そのような分割された酵素の２つの半分の結合は、次に、分割された酵素の構築を可能にさせる（Ｊ．Ｍ．Ｓｐｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｔｉｍｅ−Ｌａｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１５１４２−１５１４７（２００２））。本発明に係るキメラリコンビナーゼを組み込み調製することのできる融合タンパク質の例は、リコンビナーゼ−ジンクフィンガー−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質である。典型的に、ＭＢＰはタンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に位置する。これらは、マルトースカラムでのアフィニティー精製に使用することができる。所望により、例えば大腸菌において大型のＣ末端ＭＢＰドメインがリコンビナーゼ活性を阻害すると思われる状況で、リコンビナーゼ活性を高めるためなどに、ファクターＸａプロテアーゼ部位を用いて精製されたＲｅｃＺＦから嵩高い標識（ｂｕｌｋｙ  ｔａｇ）を切り離すことができる。
【０１３９】
上に示したとおり、一般的に「保存的アミノ酸置換」と名付けられる、多数のアミノ酸配列変化を、タンパク質の二次構造、三次構造、四次構造（適宜）または機能を実質的に崩壊することなく、タンパク質において作成することができることはタンパク質化学において周知である。したがって、１〜５の保存的アミノ酸置換を含むキメラリコンビナーゼが、未変異のキメラリコンビナーゼと同じ、組換えのためのＤＮＡ配列特異性を有し、基質に対する結合親和性が未変異のキメラリコンビナーゼの基質に対する結合親和性の約８０％以上であり、かつ、Ｖｍａｘが未変異のキメラリコンビナーゼのＶｍａｘの約８０％以上である場合、１〜５の保存的アミノ酸置換を含む上記のそれに由来するキメラリコンビナーゼは、本発明の範囲内である。１〜５の保存的アミノ酸置換は、それぞれ次の置換から選択される。Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕ。２つ以下の保存的アミノ酸置換があることが好ましい。１つ以下のアミノ酸置換があることがより好ましい。
【０１４０】
上記と同じヌクレオチド結合特性をもつアミノ酸配列を有するジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインを含むさらにその他のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、キメラリコンビナーゼに用いることもでき、上記のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインの１つ以上を含むヌクレオチド標的との結合において競合するか、または、競合する方法で上記のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインの１つ以上の結合を置換する。競合的結合親和性を決定するための方法は当技術分野で公知である。
【０１４１】
さらに、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、当技術分野で公知のように、分子的にモデル化することができる。分子モデリングに適した１つのコンピュータプログラムはＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩである。分子モデリングを用いて、本明細書に記載されるジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインの変形形態に基づくその他のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインを作成することができ、それは本発明の範囲内である。かかる変形形態が、本発明の範囲内のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインのそれと実質的に同類であり、かつ、モデリングの基準として用いられている、水素結合のパターンを有することが確証される場合、かかる変形形態もまた本発明の範囲内である。本明細書において、水素結合パターンに関して、用語「実質的に同類の」とは、同じ数の水素結合が存在すること、各水素結合の結合角が約１０度以下で変化すること、および各水素結合の結合の長さが約０．２Å以下で変化することを意味する。
【０１４２】
典型的に、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインと適切な配列のＤＮＡとの間の結合は１μＭ〜１０μＭのＫＤで起こる。好ましくは、結合は、１０μＭ〜１μＭ、１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１００ｐＭ〜１０ｎＭのＫＤで、より好ましくは、１ｎＭ〜１０ｎＭのＫＤで起こる。別の代替形態では、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインと適切な配列のＤＮＡとの間の結合は、１０ｐＭまたはそれ未満のＫＤで起こる。
【０１４３】
本発明に係るポリペプチドに組み込むことのできるさらにその他のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインは、部位誘導変異誘発およびスクリーニングにより上記のドメイン、すなわち配列番号５〜配列番号６２３から誘導することができる。部位特異的変異誘発法としても公知の部位特異的変異誘発法は、当技術分野で周知であり、ここで詳細に説明する必要はない。かかる技法は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１），ｖ．２，ｃｈ．１３，ｐｐ．１３．１−１３．５６  に記載されている。
【０１４４】
本発明に係るキメラリコンビナーゼは、従来のタンパク質精製法により精製することができ、それらに限定されるものではないが、硫酸アンモニウムなどの塩を用いる沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動、クロマトフォーカシング、および当技術分野で周知であり、Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）に記載されているその他の技法などの技法が挙げられる。特に有用な１つのタンパク質精製手順は、キメラリコンビナーゼおよびＭＢＰを組み込んでいる融合タンパク質の精製のためのマルトースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーの使用である。別の有用なタンパク質精製手順は、ＤＮＡアフィニティークロマトグラフィーであり、これは修飾されていないＲｅｃＺＦを精製するために使用され得る。
【０１４５】
さらに、本発明の別の態様は、上記の本発明に係るキメラリコンビナーゼをコードする核酸配列である。上に定義されるように、核酸配列はＤＮＡとＲＮＡの両方を包含するが、その形態の核酸は安定性が増加するので、ＤＮＡとして調製され、扱われることのほうが一般的である。本発明のキメラリコンビナーゼをコードするＤＮＡ配列は、様々な方法により得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当技術分野で周知のハイブリダイゼーション手順を用いて単離され得る。これらには、限定されるものではないが、（１）共有核酸配列を検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション；（２）共有する構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成が挙げられる。本発明のＲＮＡ配列は、当分野で公知の方法により得ることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，１９８９参照）。
【０１４６】
本発明のキメラリコンビナーゼをコードする特異的なＤＮＡ配列の開発は、（１）二本鎖ＤＮＡ配列のゲノムＤＮＡからの単離；（２）目的のポリペプチドのために必要なコドンを得るためのＤＮＡ配列の化学的製造；および（３）真核生物のドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二重鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成、により得ることができる。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ補体が最終的に形成される。組換え手順で用いる特異的なＤＮＡ配列を開発するためのこれら３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡの単離は最もまれである。これは、イントロンの存在のために哺乳類ポリペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合に殊に当てはまる。本発明に係るキメラリコンビナーゼを得るため、ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が分かっている場合には、選択法である場合が多い。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が分かっていない場合、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、選択法はｃＤＮＡ配列の形成である。目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な手順の中には、高レベルの遺伝子発現を担持するドナー細胞に多いｍＲＮＡの逆転写から誘導される、プラスミドを有するｃＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合、たとえ珍しい発現産物であってもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が分かっている場合、標的ｃＤＮＡに存在していると想定される配列を複製する、標識された一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の生成を、一本鎖形態に変性されたｃＤＮＡのクローン化されたコピーで行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順に用いてもよい（Ｊａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：２３２５，１９８３）。
【０１４７】
本発明の範囲内である核酸配列に関して、記載される本発明の実施形態のポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、本発明の範囲内である核酸配列に含められる。これは、上に定義されるように保存的アミノ酸置換を組み込む、本発明に係るポリペプチドをコードする全ての核酸配列をさらに含む。これは、上記のように融合タンパク質を含む、キメラリコンビナーゼを組み込んでいる大きなタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。本発明に係るキメラリコンビナーゼは全て形式上融合タンパク質であり、用語「融合タンパク質」とは、本明細書において、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインおよびリコンビナーゼドメイン以外のドメインを組み込んでいるタンパク質分子をさすことに留意されたい。
【０１４８】
本発明の核酸配列は、該核酸配列が、該核酸配列によりコードされるタンパク質のいかなる活性および核酸レベル、例えば、転写に影響を及ぼすタンパク質のための結合部位などで発現される核酸配列のいかなる活性も含む、塩基の置換が行われる前の配列の活性を保持するという条件で、上記の配列と少なくとも９５％同一である核酸配列をさらに含む。好ましくは、核酸配列は少なくとも９７．５％同一である。より好ましくは、それらは少なくとも９９％同一である。これらの目的のため、「同定」は、ニードルマン−ヴンシュアルゴリズムに従って定義される（Ｓ．Ｂ．Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｃ．Ｄ．Ｗｕｎｓｃｈ，「Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））。
【０１４９】
本発明により包含される核酸配列は、限定されるものではないが、発現ベクターを含むベクターに組み込むことができ、当技術分野で周知のように、適切な宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換するために用いることができる。本発明により包含される核酸配列を組み込んでいるベクターもまた、本発明の範囲内である。上記ベクターあるいは本発明のポリヌクレオチドまたは核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も本発明の範囲内である。宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい；真核生物である場合、宿主細胞は哺乳類細胞、昆虫細胞、または酵母細胞であってもよい。原核生物である場合、宿主細胞は典型的に細菌細胞である。
【０１５０】
宿主細胞の組換え型ＤＮＡでの形質転換は、当業者に周知の従来技法により行ってもよい。宿主が原核生物、例えば、大腸菌などである場合、ＤＮＡ取り込みのできるコンピテント細胞は、指数増殖期の後に回収し、その後、当技術分野で周知の手順によるＣａＣｌ２法で処理した細胞から調製することができる。代わりに、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを用いてもよい。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後、または電気穿孔によっても行うことができる。
【０１５１】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿などのＤＮＡのトランスフェクションの方法、従来の機械的手順、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソームの中に入れたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターなどを用いてもよい。
【０１５２】
様々な宿主−発現ベクター系を、ジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合コード配列を発現させるために利用することができる。これらには、限定されるものではないが、微生物、例えば、ジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌など；ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ジンクフィンガー由来ＤＮＡ結合コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させたか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；あるいは、ジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染させた動物細胞系、または、安定な発現のために操作された形質転換動物細胞系が挙げられる。グリコシル化が重要である場合、翻訳および翻訳後修飾を提供する発現系を用いてもよい；例えば、哺乳類、昆虫、酵母または植物発現系。
【０１５３】
利用する宿主／ベクター系に応じて、構成プロモーターおよび誘導プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれかを発現ベクターに用いてもよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４，１９８７参照）。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、誘導プロモーター、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等を用いてもよい。哺乳類細胞系におけるクローニングの場合、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスの末端反復配列；アデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を用いてもよい。組換えＤＮＡまたは合成技法により作成されたプロモーターは、挿入されたキメラリコンビナーゼコード配列の転写をもたらすために用いることもできる。
【０１５４】
細菌系において、発現されるキメラリコンビナーゼの意図される使用に応じて、多数の発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量に作製しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい場合がある。タンパク質を回収する際に役立つ切断部位を含むようにデザインされたものが好ましい。かかるベクターとしては、限定されるものではないが、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合タンパク質コード配列が、ｌａｃ  Ｚコード領域を含むフレーム中のベクターにライゲートされて、ハイブリッドジンクフィンガー−ｌａｃ  Ｚタンパク質を作製することのできる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１７９１，１９８３）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９，１９８５；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９，１９８９）；等が挙げられる。
【０１５５】
酵母では、構成プロモーターおよび誘導プロモーターを含有する多数のベクターを用いてもよい。該説については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，１９８８，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３；Ｇｒａｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，３１９８７，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐｐ．５１６−５４４；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８６，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；および  Ｂｉｔｔｅｒ，１９８７，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．６７３−６８４；および  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，１９８２，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＶｏＩｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ参照。構成酵母プロモーター、例えば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２など、あるいは誘導プロモーター、例えば、ＧＡＬなどを用いてもよい（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｃｈ．３，Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｉｎ：ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１１，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ，１９８６，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．）。あるいは、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組込みを促進するベクターを用いてもよい。
【０１５６】
植物発現ベクターを用いる場合、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかによって推進され得る。例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：５１１−５１４，１９８４）、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３０７−３１１，１９８７）などを用いてもよい；あるいは、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニットなど（Ｃｏｒｕｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，１９８４）；または熱ショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：５５９−５６５，１９８６）を用いてもよい。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接のＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔、その他を用いて植物細胞に導入することができる。かかる技法の概説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３，１９８８；および  Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９，１９８８参照。
【０１５７】
本発明のキメラリコンビナーゼを発現させるために用いることのできる代替的な発現系は昆虫系である。そのような１つの系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合ポリペプチドコード配列は、ウイルスの不必要な領域（スポドプテラ・フルギペルタでは、例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下においてもよい。キメラリコンビナーゼコード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子は失活して非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質性コートを欠くウイルス）が作製される。次に、これらの組換えウイルスを用いて細胞に感染させ、その細胞において挿入された遺伝子を発現させる（例えば、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．４６：５８４，１９８３；Ｓｍｉｔｈの米国特許第４，２１５，０５１号参照）。
【０１５８】
真核生物系、および好ましくは哺乳類発現系は、発現した哺乳類タンパク質の適切な翻訳後修飾を起こさせる。したがって、真核細胞、例えば、一次転写産物の適切なプロセッシング、グリコシル化、リン酸化、および、有利には遺伝子産物の分泌に関する細胞機構を有する哺乳類細胞などは、本発明に係るキメラリコンビナーゼの発現のために好ましい宿主細胞である。かかる宿主細胞系としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、およびＷＩ３８が挙げられ得る。
【０１５９】
発現を指示するために、組換えウイルスまたはウイルス要素を利用する哺乳類細胞系をデザインすることができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、キメラリコンビナーゼのコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列にライゲートすることができる。次に、このライゲートした複合体を、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの不必要な領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入により、生存可能であり、感染宿主でジンクフィンガーポリペプチドを発現することのできる組換えウイルスがもたらされる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９，１９８４参照）。あるいは、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４，１９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１，１９８２参照）。特に興味のあるものは、染色体外の要素として複製能力を有するウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターである（Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６，１９８１）。このＤＮＡをマウス細胞に導入した直後、このプラスミドは１細胞あたり約１００〜２００コピーまで複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は宿主の染色体中へのプラスミドの組み込みを必要としないので、高レベルの発現が得られる。これらのベクターは、プラスミド、例えばｎｅｏ遺伝子などに選択マーカーを含めることにより安定な発現のために用いることができる。あるいは、宿主細胞においてキメラリコンビナーゼ遺伝子の発現を導入し、指示することのできるベクターとして使用するためにレトロウイルスゲノムを修飾することができる（Ｃｏｎｅ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３，１９８４）。高レベルの発現は、限定されるものではないが、メタロチオネインＩＩＡプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含む誘導プロモーターを用いても達成することができる。
【０１６０】
組換え型タンパク質の長期間、高収率の製造のためには安定な発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他）により制御されるｃＤＮＡ、および選択マーカーで、宿主細胞を形質転換することができる。組換え型プラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体の中に安定に組み込み、成長して、順にクローン化して細胞株に拡張することのできるフォーカスを形成することを可能にする。例えば、外来ＤＮＡの導入の後、遺伝子操作された細胞を１〜２日間強化培地中で増殖させ、その後選択培地に切り換える。多数の選択系を使用してもよく、それらに限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３，１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６，１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＣｅＩｌ１  ２２：８１７，１９８０）遺伝子が含まれ、それらはそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性付与遺伝子を選択の基礎とすることができる；例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒのための遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７，１９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１  ；アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−  Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）；および、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）である。近年、追加の選択可能遺伝子、つまり、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）の代わりにヒスチジンを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４，１９８８）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ．，１９８７）が記載されている。
【０１６１】
本発明により提供される、微生物により発現されたタンパク質あるいはその断片の単離および精製は従来手段により行ってもよく、それには、分取クロマトグラフィーおよびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の関係する免疫学的分離が含まれる。本発明において提供される抗体は、本発明のキメラリコンビナーゼとの免疫応答性を有する。異なるエピトープ特異性をもつプールされたモノクローナル抗体から実質的になる抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物が得られる。モノクローナル抗体は、タンパク質の抗原含有断片から当技術分野で周知の方法により作成される（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ，，１９８９）。
【０１６２】
本発明の別の態様は、部位特異的組換え事象を実行するために本発明に係るキメラリコンビナーゼを用いる方法である。
【０１６３】
本発明に係る組換え反応において、最も重要な基質は、目的の内在性ゲノム、例えば、限定されるものではないが、ヒトゲノムまたは社会的もしくは経済的に重要な動物種、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコ、またはイヌ、ならびに魚、無脊椎動物、植物、または下にさらに説明される原核生物などのゲノムである。大部分の場合、そのような内在性ＲｅｃＺＦ部位は、ヘテロ二量体（共通の触媒ドメインを共有するが異なるジンクフィンガータンパク質である２つの異なるＲｅｃＺＦタンパク質）により結合される。ゲノムに加えて、ＲｅｃＺＦは二本鎖ＤＮＡから成る任意の遺伝物質を修飾でき得る（例えば、プラスミド、エピソーム、直線化された断片、ＰＣＲ断片、および、その他の技法、例えばＤＮＡ合成などにより生成された断片）。非ゲノム基質の良い例は、ＲｅｃＺＦ組換えにより宿主ゲノムに組み込まれたプラスミドである。この場合、２つの組換え部位（１つはプラスミド中で１つはゲノム中）は集められてＲｅｃＺＦタンパク質により修飾される。
【０１６４】
典型的に、本方法は、
（１）本発明に係る１種類のキメラリコンビナーゼまたは複数のキメラリコンビナーゼに特異的に結合している少なくとも２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程、（該部位はスペーサーにより分離されている）；および
（２）ＤＮＡ配列の両方の鎖が、キメラリコンビナーゼに特異的に結合している２つの部位の間で切断されて部位特異的組換え事象が行われる、部位特異的組換え事象を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが触媒する条件下で、ＤＮＡ配列と１種類のキメラリコンビナーゼまたは複数のキメラリコンビナーゼを反応させる工程
を含む。
【０１６５】
典型的に、この組換え反応において、２つの基質組換え部位は、同じＤＮＡ分子上（細胞内分離または反転）か、または異なるＤＮＡ分子上（細胞間組込みまたは転座）に位置することができる。この種類の組換えは、１〜４の異なるＲｅｃＺＦ（その違いはジンクフィンガー融合タンパク質にあり、それらは全て同じ触媒ドメインを共有する）により行われる。一部の例では、異なる触媒ドメイン（例えば、ＨｉｎおよびＧｉｎなど）は機能的に適合性となる可能性がある。この単純な反応は本質的に双方向性であり、動態学は組込みよりも切除を好む。
【０１６６】
一部の状況では、ＲｅｃＺＦ部位に結合したＲｅｃＺＦと天然の部位に結合した普通のセリンリコンビナーゼを反応させることが有利であり得る。この結合は、内在性補因子により作られた相互作用を保持することにより組換えを促進するはずであり、唯一の基質部位が内在性配列により決定付けられる組込みに特に有用であり得る。
【０１６７】
あるいは、本発明に係るキメラリコンビナーゼにより行われる組換え反応の別の態様は、低い親和性でＲｅｃＺＦに結合するＲｅｃＺＦ部位を伴う。混合部位（１つの強い半部位と１つの弱い半部位で構成される；ここで、「半部位」には、１つのジンクフィンガー結合部位とスペーサー領域の近位の半分が含まれる）は、２つの分離したＤＮＡ鎖で反応を開始する。組込みにより、これらの２つの鎖は新規な部位が生成されるように融合される（産物の組換え部位は常に基質組換え部位のキメラである）。この戦略は、２つの産物の部位のうちの１つが完全に弱い半部位で構成され（もう一方は２つの強い半部位を含む）、それがＲｅｃＺＦ二量体に結合できないことにより無能となる（次善の認識配列およびＤＮＡに対する次善のＤＮＡ結合タンパク質親和性（例えば、本質的に弱い１本指ジンクフィンガードメインが挙げられる）を含む、どのような理由であっても）ため、逆反応（切除）を防ぐ。次善のジンクフィンガー相互作用（結合親和性）の代わりに、触媒機能を協同的に低下させる次善のスペーサー配列を匹敵する半部位戦略に用いてもよい。そのような「弱い／強い半部位」反応の使用は、一方向性の組換えにとって一般的な戦略であり、結果的にいずれの組換え反応にも適用することができる。したがって、もし２つの部位が同じＤＮＡ鎖に存在する場合、この戦略を用いて一方向性の反転を促進することができる。この一適用は、いわゆる「自殺基質」の使用であり、自殺基質の組換え部位は、産物の部位が適合性でない基質であるように、非保存的組換えを促進する、すなわち、酵素の側の機構的エラーによって一部のＤＮＡが失われるかまたは付加される。このことは、それらが単に相互に反応することができないか、または一方または両方の部位がいずれのＲｅｃＺＦ部位とも反応することができないことを意味し得る。
【０１６８】
下に記載されるカセット交換戦略は、いずれの二本鎖ＤＮＡの分子にも適用することができるが、プラスミド断片のゲノムへの組込みへの適用が最も多く見出される。抗生物質抵抗性遺伝子およびマーカー遺伝子は、組込み産物を濃縮するために用いることができるが、それらはこの戦略に必須ではない。同じように、交換されたカセットは任意の遺伝物質を含むことができ得る。２つのカセット交換基質の各々は２つの直交する組換え部位から成る。これらの部位は、それらが異なる触媒ドメインのＲｅｃＺＦにより結合されているので直交する。結果として、各カセットは、２〜４の異なるＲｅｃＺＦにより結合され、８までのＲｅｃＺＦが反応に関与する。（直交性のスペーサー配列も使用することができ得る、その場合、直交性は、組換えのために基質部位を集めることができないことよりも、ＲｅｃＺＦが組換え産物を形成できないことに由来する。この場合、各カセットは１〜４の異なるＲｅｃＺＦにより結合され得る）。２つの基質上の一組の適合性部位（すなわち、同じ触媒ドメインを共有するＲｅｃＺＦらにより結合される部位）を組み換え、組込みにより２つの基質を融合する。第２工程では、その他の組の適合性部位を組み換え、１つの基質の骨格ともう一方のカセットから成る産物を切除する。このアプローチは、１つの断片が別の断片に置き換えられる配列の交換を達成する。その他の組の間の分離が続く場合、いずれの部位の組が組込みを実行するかは問題ではない。もし組込みおよびその後の分離が同じ部位間で起こる場合、最初の基質が再生される。
【０１６９】
上記の一方向性の戦略、すなわち「弱−強半部位」および「自殺基質」の使用をカセット交換戦略と組み合わせて、後者の組込み産物を捕捉することができる。この場合、適合性の組換え部位の１つの組かまたは両方の組のいずれかが一方向性の組換えに適している。
【０１７０】
部位の配向および切断されたＤＮＡ鎖の組み換えの配向に応じて、部位特異的組換え事象は、反転、組込み、または分離であり得る。反転では、ＤＮＡのセグメントは配向が反転している。組込みでは、ＤＮＡのセグメントは２つの部位の間に挿入されている。分離では、ＤＮＡのセグメントは除去されて、閉ざされたギャップが残る。逆の配向の部位を用いる対合は反転を可能にし、一方、同じ配向の部位を用いる対合は分離を可能にする（図３）。
【０１７１】
少なくとも分離に関する、組換え事象の効率は、スペーサーの長さによって決まる。Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧに関して、上に記載されるように、組換えは２０ｂｐのスペーサー領域または５’位と３’位が異なるミスマッチした２２／２０配置で最も急速であり、２２ｂｐのスペーサー領域でやや急速であり、１８ｂｐスペーサー領域でほとんど検出できない。
【０１７２】
一部の状況では、スペーサー配列依存が存在するが、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧに関して、点変異はスペーサー領域全体にわたって、たとえＡ／Ｔの多い溝を含んでいても許容される。特に、二次的なＤＮＡ相互作用は、比較的密接に結合しているジンクフィンガードメインの存在下では不用であり得る。しかし、２つのスペーサー領域のうちの１つがＧｉｎインベルターゼ（ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＧ（配列番号６３２）；図４Ｂ、レーン１１）のそれに由来する、キメラ基質、２０Ｇ−ＧＦＰ−２０Ｔについて、組換えは損なわれた。
【０１７３】
この方法の追加の例は、
（１）第１の配列および第２の配列の各々が本発明に係る少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有する、第１の配列および第２の配列の、２つのＤＮＡ配列を提供する工程と
（２）第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断されて第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換え事象が行われる、部位特異的組換え事象をキメラリコンビナーゼが触媒する条件下で、第１の配列および第２の配列と少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼを反応させる工程を含む。
【０１７４】
この方法の適用において、上記第１の配列および第２の配列を伴って行われる組換え事象は、一部のＤＮＡが失われるかまたは付加されるような、かつ、少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとの反応に適合性でない基質であるような、非保存的組換え事象である。この組換え事象は、適合性の組換え部位の１つの組かまたは両方の組のいずれかが一方向性の組換えに適しているカセット交換であってもよい。
【０１７５】
この方法の追加の例は、
（１）第１の配列および第２の配列の一方が、本発明に係る少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有し、かつ、第１の配列および第２の配列のもう一方が、少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼに結合している部位をその中に有する、第１の配列および第２の配列の、２つのＤＮＡ配列を提供する工程；
（２）第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断されて第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換え事象が行われる、部位特異的組換え事象をキメラリコンビナーゼおよび天然に存在するセリンリコンビナーゼが触媒する条件下で、第１の配列および第２の配列を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼおよび天然に存在するセリンリコンビナーゼと反応させる工程を含む。
【０１７６】
さらに、本発明に係る方法を用いて安定な組込みを達成することができる。安定な組込みを達成するために使用することのできる、本発明に係る一方法は、
（１）各部位が、
（ａ）キメラリコンビナーゼ半部位の最適な結合部位と比較して、実質的に低い親和性で少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと結合している、少なくとも１種類の本発明に係るキメラリコンビナーゼのための変異結合部位；および
（ｂ）最適に結合している少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼ半部位のための結合部位を含み、これらの部位が、少なくとも１種類の本発明に係るキメラリコンビナーゼと特異的に結合し、これらの部位がスペーサーによって分離されている、組換えのための２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程；および
（２）ＤＮＡ配列の両方の鎖が、キメラリコンビナーゼに特異的に結合している２つの部位の間で切断されて、部位特異的組換え事象が行われるような、部位特異的組換え事象を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが触媒する条件下で、ＤＮＡ配列を少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと反応させ、該部位特異的組換え事象が組込みであり、組込みの結果が安定するように、組換えに対して機能的でない、キメラリコンビナーゼ半部位のための変異結合部位のホモ二量体が形成される工程を含む。
【０１７７】
適切な半部位は、ＲｅｃＺＦの配列および、ＤＮＡ配列と特定の塩基に結合するアミノ酸との間の、既知の構造と親和性の関係に基づいて構築されてもよい。
【０１７８】
安定な組込みを達成する代替方法は、ＲｅｃＺＦの天然の結合部位と不適合性であるＲｅｃＺＦ部位の変異結合部位の使用を伴う。典型的に、この方法は、
（１）本発明に係る少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第１の部位をその中に有する第１のＤＮＡ配列を提供する工程；
（２）少なくとも１種類の請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第２の部位をその中に有する第２のＤＮＡ配列を、第１の部位と第２の部位が機能的に直交するように提供する工程；および
（３）第１のＤＮＡ配列を少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応させ、第２のＤＮＡ配列を少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応させて組換えをもたらす工程を含む。
【０１７９】
この方法の一代替形態では、組換えのための第１の部位かまたは組換えのための第２の部位のいずれかでの組込みに続いて、カセット交換を行うために、組込みに用いられていない第１および第２の部位の一方で切除が行われる。この組換えの結果、反転または分離がもたらされ得る。
【０１８０】
組換えを促進するための、本発明に係るキメラリコンビナーゼの別の使用は、
（１）２つのプラスミド、
（ａ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第１のプラスミド；および
（ｂ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している、第２のプラスミド
を、第１の触媒ドメインと第２の触媒ドメインが異なっていて、かつ第１のジンクフィンガードメインと第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、第１および第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与するように生成する工程；
（２）第１の遺伝子のコード領域および第２の遺伝子のコード領域を、各々が、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼおよび本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼの１つと結合している、非反復ホモ二量体部位で隣接することにより２つのカセットを構築する工程；
（３）１つのカセットを各プラスミドに挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程；および
（４）細菌宿主に、カセットを含む第１のプラスミドおよびカセットを含む第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程を含む、カセット交換を促進する方法である。
【０１８１】
この方法の一代替形態では、上記組換えは、プラスミド内カセット交換である。別の代替形態では、該組換えは染色体遺伝子とプラスミドの間である。さらに別の代替形態では、該組換えは導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間である。さらに別の代替形態では、該組換えはカセット交換により促進される切除である。
【０１８２】
本発明に係るカセット交換を促進するその他の方法は、
（１）２つのプラスミド、
（ａ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第１のプラスミド（ここで、第１のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第１の遺伝子の内在性隣接配列と結合する）；ならびに
（ｂ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第２のプラスミド（ここで、該第２のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第２の遺伝子の内在性隣接配列と結合する）を、第１の触媒ドメインと第２の触媒ドメインが異なっていて、かつ第１のジンクフィンガードメインと第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、第１および第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与するように、生成する工程；
（２）第１のカセットが第１の内在性隣接領域に隣接される第１の遺伝子を含み、第２のカセットが第２の内在性隣接領域に隣接される第２の遺伝子を含む２つのカセットを、各々が、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、本発明に係る第１のキメラリコンビナーゼおよび本発明に係る第２のキメラリコンビナーゼの１つと結合している、非反復ホモ二量体部位をその中に含む２つの内在性隣接領域の各々により構築する工程；
（３）１つのカセットを各プラスミドに挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程；および
（４）細菌宿主に、カセットを含む第１のプラスミドおよびカセットを含む第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程を含む。
【０１８３】
この方法では、一代替形態では、上記組換えは、プラスミド内カセット交換である。同様に、上記のように、該組換えは、染色体遺伝子とプラスミドの間、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間であってもよく、またはカセット交換により促進される切除であってもよい。
【０１８４】
本発明の別の態様は、
（１）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のジンクフィンガー結合部位を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程；
（２）工程（１）で生成された単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程；
（３）選択用の２種類の抗生物質を用いて形質転換体を同時に維持する工程；
（４）同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程；
（５）適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程；
（６）再形質転換宿主を２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程；および
（７）２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化スペーサー配列を特定する工程を含む、シス不活性化ジンクフィンガー結合部位を特定するための方法である。
【０１８５】
宿主は、細菌宿主、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主、および哺乳類細胞宿主から成る群から選択されてもよい。適切な細菌宿主は、大腸菌である。選択のために適した抗生物質は、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンであるが、各々の抗生物質に対する抵抗性がその組の他の抗生物質に対する抵抗性を付与できない限り、その他の組の抗生物質を用いてもよい。
【０１８６】
シス不活性化ＤＮＡ結合ドメイン認識部位の選択は、それらの結合部位が（ＤＮＡ合成の任意の方法により、一部または完全に）ランダム化されている、基質ライブラリーの生成から始める。これらの「単一の半部位」のライブラリーでは、２つの結合部位のうちの一方のみがランダム化されているが、他方は変化のないままである（ＲｅｃＺＦ融合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインと完全に相補的である）。この選択のため、アッセイは２つの同時に維持されたプラスミド上の２つのかかるハイブリッド部位の、一方向性の組込みを支持する能力を測定する。この方法は、前に説明した「弱い／強い半部位」の戦略に従う；単一の半部位ライブラリーのメンバーは、それらがトランス（すなわち、同じ組換え部位の反対側の、隣接する「強い」ジンクフィンガー結合部位により補完されている）では機能性であるが、シス（すなわち、別のかかる「弱い」結合部位に隣接する）では不活性であるように、ＲｅｃＺＦに低い親和性で結合する。全ての機能性組換え部位が一過性の組込みを支持するので、最終のＰＣＲスクリーニングは、逆の反応である、分離を支持しないジンクフィンガー結合部位を見出すことが必要とされる。この選択戦略を用いてシス不活性化スペーサー配列を見出し得る（スペーサー領域がＤＮＡ結合ドメイン認識配列の代わりにランダム化されている場合）。この戦略はまた、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインの選択にも用いることができる。この場合、標的基質は一定のままである（各組換え部位は、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン認識配列、選択標的（「弱い」）およびトランス活性化因子（「強い」）を含む）。これらの基質は、トランス活性化因子ＤＮＡ結合部位と完全に相補的であるＲｅｃＺＦの一定存在下、異なるＤＮＡ結合ドメインを含むＲｅｃＺＦのライブラリーとともにインキュベートされる。
【０１８７】
本方法は、さらに、
（８）組換え産物によってのみ発現される別のレポーター遺伝子を含める工程；および
（９）該レポーター遺伝子の活性についてスクリーニングする工程
を含む。
【０１８８】
本発明の別の態様は、上記の方法により見出されたシス不活性化ジンクフィンガー結合部位である。
【０１８９】
本発明の別の態様は、
（１）ランダム化されたヌクレオチドを含有するプライマーを用いて２つの適合するプラスミド中のスペーサー配列を含む単一の半部位ライブラリーを生成する工程；
（２）工程（１）で生成された単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程；
（３）選択用の２種類の抗生物質を用いて形質転換体を同時に維持する工程；
（４）同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程；
（５）適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程；
（６）再形質転換宿主を２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程；および
（７）２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化スペーサー配列を特定する工程、含む、シス不活性化スペーサー配列を特定するための同様の方法である。
【０１９０】
シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定するための同様の方法は、
（１）標的基質が、２種類の異なるＤＮＡ結合ドメインの認識配列、選択標的配列およびトランス活性化因子配列をその中に含む組換え部位をその中に含む、標的基質を生成する工程；
（２）標的基質を、トランス活性化因子配列と完全に相補的である本発明に係る固定されたキメラリコンビナーゼの存在下、ＤＮＡ結合ドメインを含む本発明に係るキメラリコンビナーゼのライブラリーとともにインキュベートして、単一の半部位ライブラリーを生成する工程；
（３）工程（２）で生成された単一の半部位ライブラリーに適した宿主を同時導入して形質転換体を生成する工程；
（４）選択用の２種類の抗生物質を用いて形質転換体を同時に維持する工程；
（５）同時に維持された形質転換体からプラスミドを精製する工程；
（６）適切な宿主を低い濃度で再形質転換する工程；
（７）再形質転換宿主を２種類の抗生物質を含有する培地で増殖させる工程；および
（８）２種類の抗生物質を含有する培地で増殖するコロニーをＰＣＲにより一方向性の組込みについてスクリーニングして、シス不活性化ＤＮＡ結合ドメインを特定する工程を含む。
【０１９１】
典型的に、この方法において、１つのプラスミドは、刺激のためにランダム化されたヌクレオチドを用いて、上記のリコンビナーゼのライブラリーを発現し、もう１つのプラスミドは単一のＲｅｃＺＦを発現する。２つの酵素がこの代替形態において機能する部位はヘテロ二量体、つまり１つの結合部位が６ｂｐの標的に対応し、もう１つの結合部位は共通のＲｅｃＺＦの同族配列である。
【０１９２】
本発明の別の態様は、基質に連結されたタンパク質進化（ＳＬｉＰＥ）を用いて既存のキメラリコンビナーゼから新規なキメラリコンビナーゼを生成する方法である。このアプローチは、組換え部位を各リコンビナーゼ遺伝子に隣接して配置する。したがって、成功したリコンビナーゼをコードする遺伝子はその酵素の遺伝子により物理的にマークが付けられる。この識別マークは、ＰＣＲ増幅による不成功の候補の大きなバックグラウンドから遺伝子が容易に回収されることを可能にする。
【０１９３】
この方法は、全てのＤＮＡ結合ドメイン、ライブラリー生成のどの方法、およびゲノム基質に適用可能である。これはヒトゲノムを修飾するそれらの能力に基づくＲｅｃＺＦの選択のために特に適切である。この選択は、２つの方法のうちの１つで行うことができ得る。（１）２つの組換え部位をゲノムへ導入し、それを受けてＲｅｃＺＦライブラリーを導入／発現して分離、反転、または転座を導く；または（２）１つの組換え部位をゲノムへ導入し、それを受けて第２の部位を（例えば、トランスフェクトされたプラスミドに）導入すると同時にＲｅｃＺＦライブラリーを導入／発現して組込みを導く。したがって、この方法の状況において選択プライマーの詳説は本明細書において、任意の非相同スペーサー領域を含み、かつ、かかるスペーサー間の組換えの任意の目的産物にアニールする任意のプライマーも含むとして定義される。選択プライマーの役割は、所望の組換え産物部位（ＲｅｃＺＦライブラリーの活性のあるメンバーの直近位（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｐｒｏｘｉｍａｌ））に結合することにより、所望のＲｅｃＺＦを特異的に増幅することである。
【０１９４】
既存のキメラリコンビナーゼから新規なキメラリコンビナーゼを生成するための、基質に連結されたタンパク質進化を用いる一方法は、
（１）リコンビナーゼ変異体のライブラリーを作成して、変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを生成する工程；
（２）変異を誘発されたリコンビナーゼドメインと、変異を誘発されていないＤＮＡ結合ドメインを融合させて、変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーを生成する工程；
（３）変異を誘発された融合タンパク質のライブラリーをプラスミドにクローニングする工程（上記プラスミドは、機能的選択のためのリコンビナーゼ基質を含む）；および
（４）リコンビナーゼの活性により修飾されるプラスミドを選択することにより、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質を選択する工程を含む。
【０１９５】
典型的に、リコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成する工程は、ランダム変異誘発法を通して行われる。基質はゲノムであってもよい。ＤＮＡ結合ドメインは、一般にジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインであるが、その他のＤＮＡ結合ドメインを用いてもよい。
【０１９６】
ランダム変異誘発法を通してリコンビナーゼ変異体のライブラリーを生成する好ましい一方法は、エラープローンＰＣＲによるものである。これは、１つ以上のｄＮＴＰ類似体の存在下でのリコンビナーゼドメインの増幅により行うことができる。特に好ましいｄＮＴＰ類似体は、下に示されるｄＰＴＰおよび８−オキソ−ｄＧＴＰである。ｄＰＴＰと８−オキソ−ｄＧＴＰの両方をエラープローンＰＣＲに用いることが好ましい。
【０１９７】
変異を誘発されたリコンビナーゼドメインを変異誘発されていないジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに融合する好ましい方法は、オーバーラップＰＣＲである。
【０１９８】
さらに、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインを変異させることができる。
【化１】
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【０１９９】
好ましい選択法は、一方がＴｎ３との使用に適し、もう一方がＧｉｎとの使用に適している２種類の異なるスペーサー配列間の組換えによりハイブリッドスペーサー配列を含む単一の組換え部位とし、続いてハイブリッドスペーサー配列と相補的なオリゴヌクレオチドを用いる増幅に基づく。これは、部位特異的認識を触媒したＲｅｃＺＦを選択的に増幅する。特に好ましい一代替形態では、ハイブリッドスペーサー配列は、２０Ｇ／Ｔと名付けられる、ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧ（配列番号６３３）である。好ましくは、この選択法は相同組換えの可能性を排除するためにデザインされる。
【０２００】
この方法は、ＰＣＲシャフリングを用いる複数ラウンドの選択の後に活性変異体の組換えをさらに含むことができる。ＰＣＲシャフリングは、典型的に３ラウンドの選択の後に行われるが、それよりも多いまたは少ないラウンドの選択の後に用いられてもよい。
【０２０１】
典型的に、この方法は、活性のある、変異を誘発された融合タンパク質の再クローニングをさらに含む。典型的に、この方法は、選択により作製された１つ以上の融合タンパク質の配列決定をさらに含み；配列決定された融合タンパク質は、組換えを触媒する際に最も活性のある融合タンパク質である。
【０２０２】
少なくとも１つの場合では、選択は、ＨｉｎおよびＧｉｎドメインにおいて同等である単一の変異に対する。別の場合では、選択は、天然Ｈｉｎ中の同等残基に匹敵する、Ｇｉｎドメインにおける変異に対する。典型的に、選択された、変異を誘発された融合タンパク質は、Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧキメラリコンビナーゼに実質的に等しいスペーサー配列長さに対する優先傾向または偏りを有する（活性が低下する順に、２０ｂｐ＞２２ｂｐ＞１８ｂｐ）。
【０２０３】
そのため、本発明の別の態様は、上記の方法により生成された、リコンビナーゼの変異タンパク質である。
【０２０４】
一適用において、本発明に係るキメラリコンビナーゼを用いて、適切なゲノムからの部位特異的な切除を触媒することができる。適切なゲノムはヒトゲノムであってもよい。本発明に係るキメラリコンビナーゼのを用いてヒトゲノムからの部位特異的な切除を触媒することのできる一状況は、上記の導入遺伝子切除である。あるいは、遺伝子、例えば、限定されるものではないが、ＩＣＡＭ−５およびＣＣＲ５などは、切除標的であり得る。切除事象は、ＦＡＣＳ分析およびゲノムＰＣＲにより検出することができる。また、適切な特異性をもつ、本発明に係る、精製されたキメラリコンビナーゼタンパク質の直接使用により部位特異的な切除も行ってもよい。
【０２０５】
組換えへのさらに別のアプローチでは、ＲｅｃＺＦライブラリーが使用されてもよい。ＲｅｃＺＦタンパク質のライブラリー（１０２４より多い変異体）は、人工のジンクフィンガードメイン、例えば上に記載されるものなどと共通の触媒ドメインとの融合から構築することができる。次に、適切に弱い結合剤を、このＲｅｃＺＦライブラリーを定義されたＤＮＡ結合配列で検証することにより見出すことができる。ＧＸＧＧＸＧ（配列番号６３６）の特徴付けは適切な弱い部位の存在を確立するために適切であり、一方、ＲｅｃＺＦライブラリーは、内在性ゲノムの中の特定の部位に対処するための優れた戦略であり得る。これは、上記のように、「弱い」部位での組換えを促進するために特に有用である。
【０２０６】
同様に、本発明に係るキメラリコンビナーゼを用いて、上記のようにカセット交換を促進することができる。これは、異なる触媒ドメインおよびジンクフィンガードメインを含む２つのＲｅｃＺＦの発現を必要とする。典型的に、ベクター配列は、相同組換えの可能性を最大限にするために最適化される。
【０２０７】
したがって、本発明に係る方法は、部位特異的切除およびカセット交換に使用することができる。
【０２０８】
さらに、組換えられる遺伝子自体に組換えを置くことなくゲノムを修飾することができるように、２つの遺伝子に隣接する内在性部位が標的化されるように、独特のリコンビナーゼを構築することができる。
【０２０９】
上記のように、本発明に係る組成物は、遺伝子治療に用いることができる。特に、本発明に係る組成物は、有害遺伝子を切除し、有益遺伝子を組み込む目的で、遺伝子治療に用いることができる。
【０２１０】
切除することのできる有害遺伝子の中には、悪性腫瘍関連遺伝子（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）ならびに接合部型表皮水疱症およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する欠陥遺伝子、ならびに、鎌形赤血球貧血、サラセミア、およびその他の異常ヘモグロビン症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ゴーシェ病、嚢胞性繊維症、血友病、家族性高コレステロール血症、およびその他の症状に関連する欠陥遺伝子がある。これらの例において、該疾病が、発現されて非機能性もしくは有害タンパク質を生成する遺伝子、例えば、鎌形赤血球貧血におけるものなどによるものであり、該遺伝子が同形接合体である場合、該遺伝子はその後の組込みにより野生型もしくはその他の機能性遺伝子で置き換えることができる。
【０２１１】
遺伝子治療が組換え切除による有害遺伝子の除去を伴う場合、典型的に、本発明に係る方法は、
（１）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、本発明に係る部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸をその中に含む組成物を投与し、該部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程；および
（２）発現される部位特異的リコンビナーゼに、有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程を含む。
【０２１２】
これらの方法は、あるいは、それらをコードする１または複数の遺伝子を導入せずに直接に精製されたキメラリコンビナーゼタンパク質を用いることによって実行することができる。
【０２１３】
この遺伝子治療が、組換え切除による有害遺伝子の除去およびその後の組換え組込みによる有害遺伝子の置換を含む場合、本発明に係る方法は、
（１）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与し、該部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く工程；
（２）発現される部位特異的リコンビナーゼに有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程；
（３）個体に、有害遺伝子のための機能性置換遺伝子をその中に含む核酸を投与する工程；および
（４）機能性置換遺伝子を部位特異的リコンビナーゼに触媒される組換え組込みによりゲノムに挿入する工程を含む。
【０２１４】
本発明に係る遺伝子治療のためのなお別の方法、かつ最も洗練された方法は、ゲノムの中に有害遺伝子をもつ個体に、（１）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメント；および（２）改善された機能をもつ遺伝子をその中に含むＤＮＡセグメントを有害遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込む働きをする少なくとも１種類の本発明に係るキメラリコンビナーゼを投与することを含む、有害遺伝子の構造または機能を崩壊し、改善された機能をもつ遺伝子を選択されたゲノム遺伝子座の中に送達するために、治療的組込みの行われる遺伝子治療のための方法である。この方法は、天然の組換え部位で作用する少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼを投与することをさらに含んでよい。
【０２１５】
別の適用として、損傷または欠陥対立遺伝子を機能性対立遺伝子または所望の機能を付与する対立遺伝子で直接に置き換えるための治療用カセット交換を用いることができる。
【０２１６】
遺伝子治療のための方法は当技術分野で周知であり、例えば、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋ  ＆  Ｊ．Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」（２ｎｄ  ｅｄ．，１９９８，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），ｃｈ．２１，ｐｐ．５５５−５８８に記載されている。手短に言えば、遺伝子治療に使用することのできるウイルス遺伝子送達系としては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター系、アデノウイルスベクター系、アデノ関連ウイルスベクター系、および単純ヘルペスウイルスベクター系が挙げられる。遺伝子治療に使用することのできる非ウイルス遺伝子送達系としては、限定されるものではないが、直接マイクロインジェクション、例えば、遺伝子銃を用いるものなど、リポソームトランスフェクション、特定の細胞受容体と共役したポリ−Ｌ−リジンとのＤＮＡ結合の使用、マイクロ染色体の使用、および当技術分野で周知の他の技法が挙げられる。
【０２１７】
本発明の別の態様は、医薬組成物である。
【０２１８】
一代替形態では、本発明は、
（１）治療有効量の上記の本発明に係るキメラリコンビナーゼ；および
（２）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物を提供する。
【０２１９】
別の代替形態では、本発明は、
（１）上記の本発明に係るキメラリコンビナーゼをコードする治療有効量の核酸配列；および
（２）医薬品として許容される担体
を含む医薬組成物を提供する。
【０２２０】
医薬組成物が治療有効量のヌクレオチド配列を含む場合、該ヌクレオチド配列は、ＤＮＡであることが好ましい。ヌクレオチド配列は、上記のように、例えば、ウイルスまたは非ウイルス系などの、遺伝子療法のための送達系に組み込むことができる。
【０２２１】
その中に溶解または分散させた有効成分を含む医薬組成物の調製は、当技術分野で周知である。一般にかかる組成物は、溶液または懸濁液、水性または非水性いずれかの無菌注射可能物質として調製されるが、しかし、使用前に液体中の溶液または懸濁液にとするのに適した固形形態も調製することができる。調製物は、乳化させてもよい。有効成分は、医薬品として許容され、有効成分と相溶性であり、本明細書に記載される治療方法で使用する適量の賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、等、およびそれらの組合せである。その他の賦形剤は当技術分野で公知であり、必ずしも限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類またはデンプンの種類、セルロース誘導体類、ゼラチン、植物油類、ポリエチレングリコール類、および生理学的適合性のある溶媒を挙げることができる。さらに、所望により、組成物は、少量の補助剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、ならびにｐＨ緩衝剤、および有効成分の有効性を高める同様のものなどを含んでよい。さらに、製薬の分野で慣用されているその他の成分、例えば、キレート薬、防腐剤、抗菌薬、抗酸化薬、着色剤、香味剤などは、組成物の特性および組成物に意図される投与経路に応じて用いることができる。
【０２２２】
本発明の医薬組成物には、その中の成分の医薬品として許容される塩を含んでよい。医薬品として許容される塩としては、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸および同種のものなどの有機酸とともに形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄の水酸化物などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどと同様の有機塩基に由来し得る。生理学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。液体担体の例には、有効成分と水に加えて何も物質を含まない、または、例えば、生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水、もしくはその両方、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などのバッファーを含む、無菌水溶液である。さらに、水性担体は、２つ以上の緩衝塩、ならびに塩類、例えば、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールならびに他の溶質などを含んでよい。液体組成物も、水に加えて、および水を除く、液相を含んでよい。かかる追加の液相の例は、グリセリン、植物油類、例えば綿実油など、有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなど、および水−油エマルジョンである。
【０２２３】
医薬組成物は、１つ以上の医薬品として許容される担体と併せて投与することができる。医薬品として許容される担体の例としては、限定されるものではないが、いずれかおよび／または全ての溶媒が挙げられ、それには、水性および非水性溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および／または抗真菌薬、等張剤および／または吸収遅延剤、および／または同様のものが含まれる。薬学的に活性な物質のための、かかる媒体および／または薬剤の使用は、当技術分野で周知である。通常の媒体、担体、または薬剤が１もしくは複数の有効成分と不適合である場合を除いて、本発明に係る組成物中でのその使用が企図される。本発明で用いられるいずれかの化合物の投与のためには、調製物は、米国食品医薬品局の生物製剤基準（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）または医薬品を規制する他の規制機関により定められた、無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の標準規格を満たさなくてはならない。
【０２２４】
本発明に係る医薬組成物は、経口、徐放性経口、口内、舌下、吸入、吹送、または非経口投与用に処方することができる。組成物が経口的に投与される場合、典型的に、従来の単位投与形、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、ウエハー、粉末剤、または液剤、例えば、溶液、懸濁液、チンキ、もしくはシロップ剤などで投与される。経口製剤には、典型的に、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤、およびその他の従来用いられる医薬品賦形剤が含まれる。特定の限定された実施形態では、経口医薬組成物は、不活性な希釈剤および／または吸収可能な可食性担体を含み、かつ／またはそれらは、殻の硬いまたは軟らかいゼラチンカプセル中に封入されてもよい。あるいは、それらは錠剤に圧縮されてもよい。別の代替形態として、特に獣医学診療のためには、それらを直接餌の中に組み入れることができる。経口治療用投与のためには、それらは賦形剤に組み入れるか、または摂取可能な錠剤、口内錠剤、糖衣錠、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、ウエハーの形態、もしくはその他の従来の投与形態に使用することができる。
【０２２５】
錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、ウエハー、またはその他の従来の投与形態は、以下に示すものも含んでよい。結合剤、例えば、トラガカントガム、アラビアガム、トウモロコシデンプン、ソルビトール、デンプン粘液、ポリビニルピロリドン、またはゼラチンなど；賦形剤または増量剤、例えば、第二リン酸カルシウム、ラクトース、微晶質セルロース、または糖など；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプン、クロスカルメロースナトリウム、もしくはグリコール酸ナトリウムデンプン、またはアルギン酸など；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、またはシリカなど；甘味剤、例えば、スクロース、ラクトース、またはサッカリンなど；湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど；または香味剤、例えば、ハッカ油、冬緑油、オレンジ香味剤、またはチェリー香味剤など。単位剤形がカプセル剤である場合、それには上記の種類の材料に加えて液体担体が含まれてもよい。様々なその他の物質が、コーティングとして、または、そうでなければ投与単位の物理的な形態および特性を変更するために存在してもよい。例として、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、セラック、糖類、またはその両方を用いてコーティングすることができる。本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、浮揚（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥工程により製造されてもよい。
【０２２６】
経口用の医薬調製物は、活性化合物と固形賦形剤を混合し、場合により、得られた混合物を粉砕し、所望により、錠剤または糖衣錠の核を得るために、適切な補助剤を加えた後に、顆粒の混合物を加工することにより得ることができる。適切な賦形剤は、特に、増量剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類など；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望により、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどを加えてもよい。
【０２２７】
糖衣錠の核には、適切なコーティングが施される。この目的のため、濃縮された糖溶液を用いてもよく、それは所望により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでよい。識別のため、または活性化合物の投与量の異なる組合せを特徴付けるために、染料または色素を、錠剤または糖衣錠のコーティングに加えてもよい。
【０２２８】
経口的に用いることのできる医薬調製物としては、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび例えば、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤の、軟封カプセル剤が挙げられる。プッシュフィットカプセル剤は、増量剤、例えばラクトースなど、結合剤、例えばデンプンなど、および／または滑沢剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなど、および場合により安定剤との混合物中に有効成分を含み得る。ソフトカプセル剤中では、活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの中に溶解または懸濁させてもよい。さらに、安定剤を加えてもよい。
【０２２９】
一代替形態では、徐放性製剤が用いられる。徐放性製剤は、当技術分野で周知である。例えば、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｉｃｈｗａｌに対する米国特許第６，０３９，９８０号に列挙されるように、徐放性製剤には、担体、例えば、ジメチルシロキサン、ケイ酸、マンナンおよびガラクタンの混合物、キサンタン、ならびに微粉末化された海藻などと併せた、多糖類、例えば、キサンタンガムおよびローカストビーンガムなどの使用が含まれてもよい。その他の徐放性製剤は、生分解性ポリマー、例えば、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，７４０，６３４号に列挙される、乳酸−グリコール酸ポリマーなどが組み入れられる。さらにその他の徐放性製剤には、本参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｉｔｈに対する米国特許第４，４２８，９２６号に列挙される、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコール系のポリマーを含む拡張可能な格子が組み入れられる。さらにその他の徐放性製剤は、Ｒｏｈｍ  ＆  ＨａａｓのＥｕｄｒａｇｉｔ（商標）ポリマーに基づくものであり、それには官能基として第四級アンモニウム基を含むアクリル酸塩およびメタクリル酸塩のコポリマー、ならびに中性エステル基を含むエチルアクリル酸塩とメチルメタクリル酸塩のコポリマーが含まれる。
【０２３０】
経口液体調製物は、例えば、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤、チンキ、もしくはエリキシル剤の形態で存在してもよく、または使用前に水もしくはその他の適切な媒体を用いて再構成するための乾燥製品として存在してもよい。かかる液体調製物は、従来の添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、または水素添加食用油脂など；乳化剤、例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアラビアガムなど；非水性媒体（食用油も含んでよい）、例えば、アーモンド油、ココナツ油、油性エステル、プロピレングリコール、またはエチルアルコール；または防腐剤、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、もしくはソルビン酸を含んでよい。この調製物は、緩衝塩、香味剤、着色剤、または甘味剤（例えば、マンニトール）も必要に応じて含んでよい。
【０２３１】
化合物が非経口投与用に処方される場合、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹膜内経路を介する注射用に処方される場合、多くの選択肢が可能であってもよい。有効量のキメラリコンビナーゼまたはヌクレオチド配列を含む水性組成物の調製は、当業者に公知である。典型的に、かかる組成物は、液体溶液および／または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として調製することができる。注射前に液体に加えることにより溶液および／または懸濁液を調製するための使用に適した固形形態も調製することができる。この調製物は、乳化されてもよい。
【０２３２】
注射液の使用に適した製剤形態としては、無菌水溶液および／または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル、トリグリセリド、および／または水性プロピレングリコールなどを含む製剤；および／または無菌注射液および／または分散液の即時調製用の無菌粉末剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含んでよい。場合により、懸濁液は、適切な安定剤、または高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大させる薬剤も含んでよい。すべての場合において、その形態は無菌でなくてはならず、かつ／または溶液が投与に適した直径のシリンジおよび針を容易に通過する程度の流動性を有していなくてはならない。それは、製造および保存／貯蔵条件下で安定でなくてはならず、微生物、例えば、細菌または真菌などの汚染作用から守られなくてはならない。
【０２３３】
遊離塩基、または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどと適切に混合された水中で調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および／またはその混合物中で、かつ／あるいは油中で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。適切な非感作性および非アレルゲン防腐剤は、当技術分野で周知である。
【０２３４】
また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および／または液体ポリエチレングリコール、および／または同様のもの）、その適切な混合物、および／または植物油を含む、溶媒および／または分散媒でもあってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンなどの使用により、分散液の場合には適切な粒径の維持により、および／または界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および／または抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、またはチメロサールを含めることによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。多くの場合、溶液を、生理学的に適合するバッファー、例えば、ハンクス溶液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液などの中で調製することが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中で吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンなどを使用することによりもたらすことができる。
【０２３５】
無菌注射液は、適切な溶媒中に所要量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙された様々なその他の成分と共に組み入れ、続いて滅菌されることにより調製される。滅菌は、典型的には、濾過により行われる。典型的に、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒および／またはその他の必要な成分を含む無菌媒体中へ組み入れることにより調製される。無菌注射液の調製物の無菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および／または凍結乾燥技法であり、有効成分に加えて任意のさらなる所望の成分の粉末が、従前に滅菌濾過したその溶液から得られる。直接注射のためのさらに濃縮された、または高濃度溶液の調製も企図され、ここで、必要に応じて狭い範囲に高濃度の活性薬剤を送達する、非常に速い浸透をもたらす、溶ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の媒としての使用が想定される。
【０２３６】
水溶液中の非経口投与のためには、例えば、その溶液は必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、かつ／または、その液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水、グルコース、またはその他の等張化剤を用いて等張な状態にされるべきである。これらの特定の水溶液は特に静脈内、筋肉内、皮下、または腹膜内投与に適している。これに関連して、本開示に照らして、用いられ得る無菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、１回投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入液体に加えるか、または注入の提案されている部位に注射する（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１５ｔｈ  ｅｄ．），ｐｐ．１０３５−１０３８，１５７０−１５８０を参照）。投与量のいくらかの変動は、治療をうける被験体の状態に応じて必然的に生じる。投与に関与する人は、いずれの場合であれ、個々の被験体に適切な用量を決定する。本発明に係る化合物および組成物は、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために処方することもでき、単位投与形、例としてアンプル、バイアル、小用量の輸液、もしくは予め充填されたシリンジに存在することもでき、または防腐剤を加えて、複数回投与容器中に存在することもできる。
【０２３７】
本発明に係る組成物の別の投与経路は経鼻的なものであり、投与形態、例えば、点鼻液、鼻腔用スプレー、エアロゾル、または吸入薬などを用いる。点鼻液は、通常、ドロップまたはスプレーで鼻腔に投与されるようにデザインされた水溶液である。点鼻液は典型的に、正常な繊毛活動が維持されるように、鼻汁に多くの点で類似するように調製されている。従って水性点鼻液は通常、ｐＨを約５．５から約６．５に維持するために等張化および／またはわずかに緩衝化されている。さらに、点眼薬で使用されているものに類似した抗菌性保存剤、および／または必要であれば適切な薬剤安定剤を製剤に含めることができる。様々な市販の点鼻薬が公知であり、それには、例えば、抗生物質または抗ヒスタミン薬が含まれ得る。スプレー組成物は、例えば、水溶液もしくは懸濁液として、または、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスなどを使用して、加圧パックから送達されるエアロゾルとして処方されてもよい。
【０２３８】
その他の投与手段に適した追加の製剤としては、膣坐剤および／またはペッサリーが挙げられる。直腸ペッサリーまたは坐剤も使用することができる。坐剤は、様々な重量または形状の固形投与形態であり、通常は薬用で、直腸、膣、または尿道中に挿入するためのものである。挿入後、坐剤は軟化し、融解し、かつ／または腔液に溶解する。典型的に、坐剤に関しては、従来の結合剤または担体にはポリアルキレングリコール、カカオバター、またはトリグリセリドが含まれ得る。
【０２３９】
その他の投与形態としては、限定されるものではないが、リポソーム製剤、軟膏、クリーム剤、ローション剤、粉末剤、またはクリーム剤などを代わりに用いることができる。軟膏およびクリーム剤は、例えば、水性または油性基剤に、適切なゲル化剤および／または溶媒を加えて処方してもよい。かかる基剤としては、従って、例えば、水および／または油、例えば、流動パラフィンまたは植物油、例えば、ラッカセイ（ピーナッツ）油もしくはヒマシ油など、または溶媒、例えば、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。使用してもよい増粘剤としては、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、微晶質ろう、および蜜ろうが挙げられる。ローション剤は水性または油性基剤を用いて処方され、一般的に乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、または増粘剤のうちのひとつも含む。
【０２４０】
外用の粉末剤は、任意の適切な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトース、またはデンプンを用いて作ることができる。
【０２４１】
的確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態に照らして個々の医師により選択されてもよい（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照）。注目すべきは、主治医は、毒性または臓器機能不全に起因する投与の終了、中断、調整の方法および時期がわかることである。逆に言えば、主治医は臨床反応が十分ではない場合、それより高いレベルに（毒性を防ぎながら）処置を調整する方法も分かっている。目的とする疾患の管理において、投与される投与量の程度は、処置される状態の重篤度および投与経路に応じて変化する。状態の重篤度は、例えば、ある程度、標準的な予後評価方法により評価してもよい。さらに、用量および考えられる投与回数は、年齢、体重、および個々の患者の反応によっても変化する。上に考察される内容と同様のプログラムは、獣医学で使用されてもよい。
【０２４２】
本発明に係るキメラリコンビナーゼ、およびそれらを含む医薬組成物またはそれらをコードしている核酸分子は、二本鎖ＤＮＡを有する、特に相同組換えに適さないすべての生物（すべての植物を含めて膨大な数）の遺伝子操作に用いることができる。これは、インビトロおよびインビボ両方で行うことができ得る。このキメラリコンビナーゼの適用は、農業（例えば、遺伝子組み換え生物の開発）、医薬品（例えば、トランスジェニック動物による治療薬）、医学（例えば、疾病モデル）、インビトロ受精（例えば、胚幹細胞における疾病遺伝子の修正）、および研究（例えば、フォワードジェネティクスおよびリバースジェネティクス）などを含む、工業バイオテクノロジーのほぼすべての態様にかかわる。
【０２４３】
本発明に係るキメラリコンビナーゼのフォワードジェネティクスに対する使用において、一適用は、最小限のＤＮＡ結合ドメインをもつＲｅｃＺＦ（例えば、２指のジンクフィンガータンパク質）のＲｅｃＺＦが所与ゲノム中に多くの可能性のある組換え部位を有するような使用である。かかる各々のタンパク質は、単一の部位修飾には不適切であり得るが、フォワードジェネティクス選択に有用な（例えば、近くの遺伝子を活性化または不活性化するプラスミドを組み込むことによる）組換え変異誘発の独特のパターンを発生させるために使用してもよい。２指のジンクフィンガータンパク質の実施例において、これは、各パターンがＲｅｃＺＦＤＮＡ特異性に関連している、約２０００の異なる変異誘発パターンを意味する。
【０２４４】
処置される被験体は、ヒト患者または社会的もしくは経済的に重要な動物であってもよく、それらに限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヤギ、またはブタが挙げられる。本発明に係る方法は、ヒトの処置に限定されるものではない。
【０２４５】
本発明の別の態様は、本発明に係るキメラリコンビナーゼにより触媒される組換えの作用によって作製されるトランスジェニック生物である。
【０２４６】
一代替形態では、トランスジェニック生物は真核生物である。真核生物は、哺乳類、例えば、トランスジェニック哺乳類が属する哺乳類種により通常産生されない産物を産生するトランスジェニック哺乳類などであってもよい。別の代替形態では、真核生物は昆虫、例えば、その昆虫の繁殖性またはその昆虫の疾病もしくは経済的な損害を引き起こす能力を低減するために改変された、トランスジェニック昆虫などであってもよい。例えば、この技法は、繁殖力のある害虫の交配を妨げ、結果としてその害虫が繁殖を通してまん延するのを防止する、不妊害虫を生成するための照射の変わりに用いることができる。この技法が適用されることのでき得る害虫の例は、チチュウカイミバエすなわち「ｍｅｄｆｌｙ」である。さらに別の代替形態では、トランスジェニック真核生物は、植物であってもよい。トランスジェニック植物は、そのトランスジェニック植物が属する植物種により通常産生されない産物を産生することができる。これらのトランスジェニック植物は、治療上重要なタンパク質、例えば、抗体などの産生のために使用することができ得る。あるいは、トランスジェニック植物は、改善された生育特性、低下した栄養要求性、または改善された栄養量を有するように改変することができる。これらの植物は、改善された食品の基礎として使用することができ得る。
【０２４７】
その他の代替形態では、トランスジェニック生物は、トランスジェニック酵母またはトランスジェニック細菌であり得る。かかるトランスジェニック酵母または細菌は、例えば、工業用発酵工程などの方法に用いることができる。
【０２４８】
本発明は、以下の実施例により説明される。この実施例は、例証目的のためのみに含められ、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【０２４９】
実施例１
キメラジンクフィンガーリコンビナーゼの構成、分析、および活性
【０２５０】
Ｃｒｅ−ｌｏｘ、Ｆｌｐ−ＦＲＴ、およびφＣ３１−ａｔｔを含む、部位特異的リコンビナーゼは、研究者らが染色体ＤＮＡをインビトロおよびインビボで高い忠実度で操作することを可能にする。いったん組換え部位が相同組換えにより内在性遺伝子座の中に導入されると、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）は、切除、反転、または組込みを触媒し得る。この内在性ゲノム修飾のための２工程方法論は、フォワードおよびリバースジェネティクスに革命をもたらした。ＳＳＲがインビボで選択的に活性化、結果として得られるコンディショナルノックアウトは、精巧な空間および時間的特異性をもつ遺伝子の機能を明らかにすることができる。
【０２５１】
慣用されるチロシンリコンビナーゼ（ＣｒｅおよびＦｌｐ）および大型のセリンインテグラーゼ（φＣ３１）とは対照的に、セリンリコンビナーゼのリゾルバーゼ／インベルターゼファミリーメンバーは、形態と機能の両方においてモジュール式である。いったん二量体が組換え部位で結合すると、その後のあらゆる工程（四量体化、鎖切断、交換、およびライゲーションを含む）は、触媒ドメインによってのみ媒介される。このモジュール性内在性ＤＮＡ結合ドメインを置換することにより再標的組換えを可能にする（１、２）。
【０２５２】
多指ジンクフィンガータンパク質は、高い親和性および特異性でＤＮＡに結合する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフから、本発明者らの研究室は、大部分がＡＮＮおよびＣＮＮであり、一部がＴＮＮである、あらゆるＧＮＮトリプレットに特異的に結合するモジュール式構成要素をデザインした。６〜１８ｂｐＤＮＡ部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインは、これらの構成要素を用いて容易に構成される（３〜６）。これらの新規なＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラタンパク質は、転写活性化および抑制（３、７〜１４）、ＤＮＡ切断（１５〜２４）、および遺伝子組込み（２５）を効率的に指示した。
【０２５３】
Ｓｔａｒｋと共同研究者ら（１）により同時に構築されたＺ−リゾルバーゼに類似する、本発明者らの第１のＲｅｃＺＦは、ハイブリッド組換え部位：２０ｂｐの中央のスペーサー領域に隣接している２つの反転したジンクフィンガー結合部位、を効率的に組み換えた。しかし、この単純な融合は、親リコンビナーゼにより認識される配列と密接に関連している部位にその活性を制限する固有の配列の偏りをもつキメラを作製した。この研究において、本発明者らは、所望の配列特異性をもつＲｅｃＺＦをデザインするための、基質に連結されたタンパク質進化（ＳＬｉＰＥ）（２６）の使用を証明する。本発明者らは、この合理的デザインと直接進化の組合せがどのような内在性の状況においても部位特異的組換えを可能にすると予測する。
【０２５４】
結果
ＲｅｃＺＦのデザイン
セリンリコンビナーゼは、それらの同族のクロスオーバー部位にヘッド・トゥ・ヘッドの二量体として結合する。本来、これらの二量体および隣接するＤＮＡ結合補因子タンパク質は集合して大型の多量体のシナプスを構築し、形態上の制約が選択的生成形成を裏付ける。何十年もの機構的研究（２７〜３４）、構造的特徴付け（３５〜３６）、および機能性キメラの分析（１、２）により、洗練された組換えの機構が明らかとなった。触媒四量体は２つのクロスオーバー部位間に生じ、セリン求核攻撃により全ての４本のＤＮＡ鎖の協調的切断を媒介し、各鎖を共有結合して別々のモノマーとする。その次の中間体は、四量体を分割する大きく平面的な疎水性表面を含み、鎖交換に必要な１８０度の回転を可能にする。この組換え反応は、４つの自由なＤＮＡ３’ヒドロキシル基がセリンエステルを攻撃するときに完了し、新規なリン酸ジエステル結合を生成する。
【０２５５】
いくつかのインベルターゼ／リゾルバーゼセリンリコンビナーゼの変異体は、それらの機能に対してアクセサリー因子または直交する結合部位を必要としないことが見出された（３７〜４０）。これらの変異体に関する最小の組換え部位は、ＤＮＡ結合ドメインにより認識されるたった２つの逆反復ＤＮＡ配列から成る。本発明者らは、過剰活性セリンリコンビナーゼの内在性ＤＮＡ結合ドメインが多指ジンクフィンガータンパク質に置き換えられた場合、部位特異的組換えを任意の所望の配列に対して標的化することができるのではないかと判断した。
【０２５６】
ＲｅｃＺＦを構成する前に、本発明者らは、ＩＮＳＩＧＨＴＩＩを用いてジンクフィンガータンパク質ＺＩＦ２６８（４１）およびγδリゾルバーゼ４２（図１２ａ）の結晶構造をかぶせることによりリコンビナーゼ／ジンクフィンガーキメラをモデル化した。この分析により、本発明者らは、ジンクフィンガータンパク質をＴｎ３、Ｈｉｎ、またはＧｉｎ触媒ドメインに融合するために用いたリンカーを合理的にデザインすることができた。本発明者らは、その可動性リンカーのＣ末端の近くで各リコンビナーゼを末端切断することを決め（Ｔｎ３の残基１４５、Ｈｉｎの１４３、Ｇｉｎの１４２）、基準のジンクフィンガーの開始前に追加の３残基（ＳＧＳ）を加えた。融合のために選択された第１のジンクフィンガータンパク質（以降「Ｇ」と称される２指タンパク質）は、ＤＮＡヌクレオチドＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）に結合すると予想された。Ｇジンクフィンガータンパク質と過剰活性Ｔｎ３リゾルバーゼ触媒ドメイン（Ｇ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、Ｅ１２４Ｑ変異を含む）（３８）の融合によりＲｅｃＺＦ  Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇが作製された。
【０２５７】
図１２において、ＲｅｃＺＦのデザインおよび機能性アッセイが示される。（ａ）γδリゾルバーゼを用いて二量体化した３本指のＲｅｃＺＦキメラのモデル。（ｂ）．分離および反転アッセイ、ならびに定方向進化において用いた、合した基質およびＲｅｃＺＦ発現プラスミド。（ｃ〜ｅ）Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇによる２０Ｔ組換え部位間の部位特異的な分離（ｃ）、反転（ｄ）、および組込み（ｅ）ＰＣＲアッセイの図による描写。（ｆ）Ｔｎ２Ｃｈ１５Ｇによる２０Ｔ組換え部位間の組換えのＰＣＦアッセイ。レーン１は、２５０、５００、７５０、１０００、４５００  ２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、８０００、および１０，０００ｂｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダー）での分子量マーカーを含む。分離アッセイ（Ｒｅｓ）の結果は、レーン２および７に示される（Ｒｅｓ（Ｂ）、ＰＣＲ陰性対照）。成功した分離は、基質バンド（１．８ｋｂ）に対して産物バンド（１．０ｋｂ）の強度を増加させる。反転アッセイ（Ｉｎｖ）の結果は、レーン３および８に示される（Ｉｎｖ（Ｂ）、ＰＣＲ陰性対照）。成功した組込みは産物バンドを生成する（０．４ｋｂ）。組込み反応は、第２のプラスミドの存在下で行い、第２のプラスミドはＧ２０Ｔ組換え部位を含むか（Ｉｎｔ（＋）、レーン４）、または欠いた（Ｉｎｔ（−）、レーン５）。レーン６は、１００、２００、３００、４００、５００、６００  ７００、８００、９００、１０００、１２００、および１５００ｂｐでの分子量マーカーを含む（Ｒｏｃｈｅ社１００ｂｐラダー）。全てのアッセイに関して、プラスミドは電気穿孔により大腸菌に導入され、培養物は３７℃にて一晩維持された。ＰＣＲは３０ｎｇプラスミドＤＮＡを用いて行い、１％アガロースゲルで分析した。ＰＣＲ陰性対照の反応はテンプレートを用いずに行った（レーン７、８、および９）。（ｇ）同様の方法で行った、２０Ｔスペーサー誘導体（表１）：Ｇ１８Ｔ−Ｇ−Ｇ１８Ｔ（レーン１、１８−１８）、Ｇ１８Ｔ−Ｇ２０Ｔ（レーン２、１８−２０）Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０−Ｔ（レーン３、２０−２０）、Ｇ２２Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン４、２２−２０）、Ｇ２２Ｔ−Ｇ−Ｇ２２Ｔ（レーン５、２２−２２）Ｇ２０ＴＣ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン７、ＴＣ）、Ｇ２０ＴＣ４−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン８、Ｃ４）、Ｇ２０ＴＣ５−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン９、Ｃ５）、Ｇ２０ＴＣ６−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン１０、Ｃ６）、Ｇ２０ＴＣ７−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン１１、Ｃ７）、Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（レーン１２、ｇ）、を含有するカセットの分離アッセイ。レーン６にはＰｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。テンプレートを用いずに行った陰性対照のＰＣＲ反応を、ｆ、レーン７に示す。
【０２５８】
ジンクフィンガー−リコンビナーゼ  融合タンパク質（ＲｅｃＺＦ）はハイブリッド組換え部位で結合および機能する。これらの部位は、中央のスペーサー領域（約２０ｂｐ）に隣接する（逆反復の）２つのジンクフィンガードメイン結合部位から成る（図１２ｂ）。例えば、Ｇ２０Ｔ部位は、ＧＡＧＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧＣＴＣＣＴＣ（配列番号２）であり、ここで、Ｇジンクフィンガータンパク質（ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１））に対するそれぞれの結合部位に下線が引かれている。介在するスペーサー領域、２０Ｔは、天然のＴｎ２トランスポゾンのｒｅｓ組換え部位の中の部位Ｉの中央の２０塩基対である（４３）。ジンクフィンガードメインＨ１（ＧＧＡＧＧＣＧＴＧ）（配列番号６３４）およびＰ２（ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ）（配列番号６３５）に対応する基質も構築した。追加のスペーサーには、ｇｉｘ組換え部位の中央の２０ｂｐから順応させた２０Ｔおよび２０Ｇの点変異体が含まれた（表１）。（４４）３つのプラスミドに基づくＰＣＲアッセイを開発してＲｅｃＺＦに触媒される分離、反転、および組込みを検出した（図１２ｃ〜ｅ）。Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇをコードする遺伝子を、Ｇ２０Ｔを有するプラスミドの大腸菌に電気穿孔し、有意なレベルの３つ全ての反応を観察した（図１２ｆ）。一方、過剰活性Ｈｉｎ（Ｈ１０７Ｙ）（４５）およびＧｉｎ（Ｈ１０６Ｙ）（３７）触媒ドメイン（ＨｉｎＧおよびＧｉｎＧ、それぞれＧ２０Ｔを用いる同じアッセイにおいて弱いインベルターゼ活性のみを示した（データは示さず））からキメラを構築した。
【０２５９】
ジンクフィンガー発見部位（ｆｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）（ＺＦＢＳ）間の最適な距離は、基質パネルのＴｎ３Ｃｈ１５Ｇ活性を評価することにより決定した。各ＲｅｃＺＦ部位は、１８ｂｐ、２０ｂｐ、または２２ｂｐスペーサーにより隔てられた２つの反転したジンクフィンガー結合部位から成った（表１、図１２ｂ）。最初にコンピュータモデルから推論したこの範囲のスペーサー距離は、サイズの異なる２つの組換え部位を有する一連の基質プラスミドでの分離アッセイを用いて検討した（図１２ｇ）。分離アッセイの最終工程は基質および産物断片を同時に増幅するＰＣＲ反応であったので（図１２ｃ）、アガロースゲル上の各バンドの相対強度はＲｅｃＺＦに触媒される分離速度に比例した。かかる定性的速度の比較から、Ｔｎ３ＣＨ１５Ｇは１８ｂｐおよび２２ｂｐスペーサー配置を許容したが、２０ｂｐがこの反応に最適であったことが示唆された。この結果は、別のジンクフィンガー−リコンビナーゼに関して前に報告した２２ｂｐの最適なスペーサーに類似する（１）。わずかな差異は、異なるリンカー長によるものである。本発明者らのＴｎ３Ｃｈ１５Ｇリゾルバーゼは５アミノ酸（ａａ）、最良のＺ−リゾルバーゼは１４ａａ。また注目すべきは、Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇがジンクフィンガー結合部位間の様々な距離を許容する能力であった。これらの酵素の最終の適用において、これは、内在性配列とともに存在するＲｅｃＺＦ部位の数および／または有用性を増大させ得る。
【表１】
2009542228.tif 000003
各ＲｅｃＺＦ組換え部位は、スペーサー領域に隣接する、逆反復の２つのジンクフィンガー結合部位から成る（例えば、Ｇ−２０Ｔ−Ｇは、ＧＡＧＧＡＧ
ＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧ  ＣＴＣＣＴＣ（配列番号６５２）であり、ここで、結合部位に下線が引かれている）
（ａ）ボールドは２０Ｔスペーサー配列の変異を表す。
（ｂ）スペーサー２０Ｔと２０Ｔの間の反転産物
（ｃ）スペーサー２０Ｇと２０Ｔの間の分離産物
（ｄ）スペーサー２０Ｇと２０Ｔの間の反転産物
【０２６０】
Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇのスペーサー配列許容性（ｓｐａｃｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）も、比較分離アッセイを用いて査定した（図１２ｇ）。この場合、２つの組換え部位のうちの１つが、天然のＴｎ３組換え部位配列である２０Ｔの中に変異を含んだ（表１）。過去の研究はこの領域における変異に対するセリンリコンビナーゼの許容性を評価し（４６−４７）、それによりクロスオーバー部位の中心から２、３、４、７、８、および９ｂｐ離れた場所（表１に表される位置）は許容性が良いが、１、５、６、および１０位での変更は天然のＨｉｎおよびγδリコンビナーゼの機能を劇的に阻害することが明らかとなっている。１位での変異は産物の部位の効率的なライゲーションを妨げる（４８）。５または６位でのシトシンおよびグアノシン置換は、副溝とリコンビナーゼリンカーの保存されたアルギニンとの間の重大な相互作用を中断させる（１４２、Ｔｎ３；１４０、Ｈｉｎ；１３９、Ｇｉｎ）。１０位での特異性は、内在性ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメインによってもたらされる。Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇは、１位（Ｇ２０Ｔ（ＴＣ））を除いて、調査したあらゆる位置（Ｇ２０Ｔ（Ｃ４）、Ｇ２０Ｔ（Ｃ５）、Ｃ２０Ｔ（Ｃ６）、およびＧ２０Ｔ（Ｃ７））に点変異を含む基質を許容した。しかし、複数の位置での同時変異は十分に許容されなかった。２０の位置のうち１２の位置で２０Ｔと異なる、天然のＧｉｎ部位に由来するスペーサー配列（２０Ｇ）を含む基質を用いる分離は非効率的であった（４４）。これらの実験から、本発明者らは、過剰活性触媒ドメインとジンクフィンガータンパク質の直接の（ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ）融合により、その親リコンビナーゼの制限的な配列の偏りを受け継いだキメラをもたらしたと結論付けた。
【０２６１】
最適化された基質特異性をもつＲｅｃＺＦの進化
内在性ゲノム組換えのための生成ツールを目的として、本発明者らは、ＲｅｃＺＦスペーサー配列の偏りを排除しようとした。ＲｅｃＺＦは、２つの非相同スペーサー配列、２０Ｔおよび２０Ｇを効率的に組み換える能力をもつタンパク質に対して、基質に連結されたタンパク質進化（ＳＬｉＰＥ）（２６）により濃縮された。このＳＬｉＰＥアプローチは、同じプラスミド上のリコンビナーゼ遺伝子と基質を、大腸菌に発現したそれぞれのリゾルバーゼにその親プラスミドを修飾する機会を与えるように結び付けた（図１３ａ）。このようにして、各分離産物は活性リコンビナーゼをコードし、基質プラスミドから物理的に区別できる。その後のＰＣＲ増幅は、それらの適応度に比例して濃縮された、変異体のプールを含む、特有の産物バンドを生成した。本発明者らの基質には非相同部位が含まれたので、本発明者らは、ハイブリッド組換え部位Ｇ２０（ＧＬ／ＴＲ）で分離産物に選択的にアニールするためのプライマー、Ｇ２０Ｓ３をデザインすることができた（表１）。隣接するプライマー（２６）を用いる選択ＰＣＲと比較して、Ｇ２０Ｓ３は２つの利点、産物増幅の劇的な増強および所望の部位特異的組換えの選択的濃縮を付与する。
【０２６２】
Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およびＴｎ３触媒ドメインをエラープローンＰＣＲにより増幅し、その後に（エラーを含まない）ジンクフィンガータンパク質Ｇに融合して変異体ＲｅｃＺＦの３つのライブラリー：ＨｉｎＬ１Ｇ、ＧｉｎＬ１Ｇ、およびＴｎ３Ｌ１Ｇを生成した。３ラウンドのＳＬｉＰＥの後、各選択されたプールの中のＲｅｃＺＦを、Ｓｔｅｍｍｅｒにより最初に記載されたＤＮＡシャフリング法（４９）を用いて組み換えた。さらに５ラウンドの選択は、機能性Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔリゾルバーゼを濃縮するために十分であった（図１３ｂ）。８つの高活性のクローンを、コロニーＰＣＲスクリーンおよび分離アッセイにより各プールから特定した。これらのクローンの５０％以上に存在する変異（図１３、ｃ、およびｄ）を４つの領域にグループ化した。触媒セリン残基を含む活性部位ループ（Ｉ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ；ここで、全ての数字はＴｎ３の同等の位置に相当する）、長いＥヘリックスとコアサブドメインの近位側（Ｋ６５Ｒ、Ｇ７０Ｓ、Ｍ７２Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｔ１０８Ａ）、溶媒曝露サブドメイン表面（Ｋ５３Ｅ）、および可動性リンカー（Ｋ１５１Ｍ）。Ｄ１３ＧがＨｉｎおよびＧｉｎ触媒ドメインにおいて観察される最も頻繁な変異であった。この置換は隣接するＡヘリックスを不安定化させやすく、それによりこの領域の柔軟性が増す。変異体酵素において進化した速度の上昇は、鎖切断のための触媒活性部位残基のより最適なポジショニングから生じる可能性がある。同じ効果は、Ｅヘリックス（残基１０３〜１３７）およいコアサブドメイン（１〜１０２）の相対位置を変化させる変異とともに達成され得る。Ｇｉｎ（Ｍ７０Ｖ、Ｔ９６Ａ）およびＴｎ３（１８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ）ドメインにおいて選択されたいくつかの変異は、この細胞内相互作用を媒介する残基で起こった。触媒セリンとヘリックスの界面の周囲の置換は、次善のスペーサーで四量体シナプス中間体を形成するために必要な柔軟性をもたらし得る。最も活性のある触媒ドメイン、ＧｉｎＬ７Ｃ７（Ｄ１２Ｇ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｋ５０Ｅ、Ｍ７０Ｖ、Ｉ９４Ｖ、Ｙ１０９Ｈ、Ｍ１１４Ｖ、Ｋ１４８Ｍ；ここで、Ｙ１０９Ｈは野生型Ｇｉｎへの復帰変異であり、Ｋ１４８はリンカー変異である）を、さらなる特徴付けのために選択した。
【０２６３】
図１３では、ＲｅｃＺＦＧ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔリゾルバーゼの定方向進化が示される。（ａ）産物特異的な選択プライマーを用いる、基質に連結された定方向進化（ＳＬｉＰＥ）。レーン１には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。選択アッセイの結果はレーン２〜４に示される。成功した分離は産物バンドを生成する（０．８ｋｂ）。２レーン）大腸菌中、３７℃にて一晩ｐＢ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔのインキュベーションの後に単離した産物混合物（ＲｅｃＺＦ（＋））；３レーン）ＲｅｃＺＦ基質プラスミドｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ（ＲｅｃＺＦ（−））；４レーン）テンプレートを用いずに行ったＰＣＲ陰性対照（ＲｅｃＺＦ（Ｂ））。（ｂ）高活性のクローン（＊；Ｔｎ３Ｌ８Ｃ１８Ｇ、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇ、ＨｉｎＬ６Ｃ４Ｇ）に対する、数回の双方向性選択による（２〜８）、出発クローン（ｓｃ；Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇ、ＧｉｎＧ、ＨｉｎＧ）およびナイーブライブラリー（１；Ｔｎ３Ｌ１Ｇ、ＧｉｎＬ１Ｇ、ＨｉｎＬ１Ｇ）からの機能的改善。レーン１には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。テンプレートを用いずに行った陰性対照のＰＣＲ反応を、ｆ、レーン７に示す。分離アッセイは、既に説明された方法で行った。（ｃ，ｄ）高活性のクローンの５０％以上で選択された変異は、一次配列アラインメント中に表され（ｃ）、ＤＮＡ結合γδリゾルバーゼ二量体（ｄｉｍｍｅｒ）の結晶構造の上にマッピングされた（ｄ）。青色、新規なＴｎ３触媒ドメイン変異；緑色、新規なＧｉｎ触媒ドメイン変異；橙色、新規なＨｉｎ、触媒ドメイン変異；ピンク色、元のクローン中に存在する過剰活性化変異；赤色、触媒セリン、Ｓ１０。
【０２６４】
ＲｅｃＺＦ特異性および基質許容性の特徴付け
特定のスペーサー配列（２０Ｔおよび２０Ｇ）での数ラウンドの選択は、新規な基質の偏りをもつＲｅｃＺＦを生じさせた可能性があり、おそらく隣接するジンクフィンガー結合部位の非存在下でそれらの配列を組み換える能力さえも育成した。後者の可能性を探るため、本発明者らは、２つの新規なジンクフィンガータンパク質を触媒ドメインＧｉｎＬ７Ｃ７に融合させた。結果として得られるＲｅｃＺＦ、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２は、配列５’−ＧＧＡＧＧＣＧＴＧ−３’（配列番号６３４）および５’−ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ−３’（配列番号６３５）にそれぞれ結合することが期待された。これらの配列が置換された基質５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１）（Ｈ１２０Ｇ−Ｇ−Ｈ１２０Ｔ、Ｐ２２０Ｇ−Ｇ−Ｐ２２０Ｔ）を調製した（表１）。ＲｅｃＺＦを基質の各々にクローニングし、分離および反転について検定した（図１４ａ）。組換えは、結合部位とジンクフィンガータンパク質がマッチしたサンプルのみに起こった。この結果は、ＲｅｃＺＦ機能が同族のジンクフィンガー結合部位に隣接される遺伝子座に制限されていることを示唆する。
【０２６５】
ＧｉｎＬ７Ｃ７触媒ドメインのスペーサー配列の偏りを迅速に特徴付けするために、５−塩基対スペーサー領域をランダム化した基質ライブラリーを調製した。ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇを、各ライブラリーにクローニングし、反転について検定した。反転ＰＣＲ産物を精製した後、本発明者らは、機能性組換え部位の凝集個体群を配列決定した（図１４ｂ）。結果として得られるクロマトグラムから、特にジンクフィンガー結合部位に隣接する５塩基対中に、予想外に広い基質許容性が示唆された（図１４ｃ）。この成果は、親の組換え部位とは無関係な配列にＲｅｃＺＦが首尾よく標的化されたことを示す。
【０２６６】
図１４では、ＧｉｎＬ７Ｃ７触媒ドメインの特徴付けが示される。（ａ）既に説明された方法で行った、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１（Ｈ１）およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２（Ｐ２）の基質Ｈ１２０Ｇ−Ｇ−Ｈ１２０Ｔ（Ｈ１）およびＰ２２０Ｇ−Ｇ−Ｐ２２０Ｔ（Ｐ２）での分離および反転アッセイ。分離アッセイの結果はレーン１〜ｔに示される。成功した分離は、基質バンド（１．９）ｋｂに対して産物バンド（１．１ｋｂ）の強度を増加させる。レーン６には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。反転アッセイの結果はレーン７〜１１に示される。成功した反転は産物バンドを生成する（１．４ｋｂ）。ＰＣＲ陰性対照の反応（−，−）を、分離（レーン１）および反転（レーン１１）アッセイについてテンプレートを用いずに行った。（ｂ〜ｃ）ＲｅｃＺＦ基質ライブラリーを用いるスペーサー配列の偏りの分析。既に説明した方法で実施された反転アッセイで、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｇを、５ｂｐ領域がランダム化されている基質の４つのプールと反応させた（ｂ）。反転関連ＰＣＲ産物をゲル精製し、配列決定した。機能性スペーサーの各凝集の配列決定クロマトグラム（ｃ、左）。完全なスペーサー領域（２０Ｔおよび２０Ｇ）は、その５ｂｐランダム化領域が単一のヌクレオチドで重複する２つの基質ライブラリーからのクロマトグラムの合成で表される（表１、６位）。
【０２６７】
ヒトゲノムにおけるＲｅｃＺＦ組換え
本発明者らの最終目標は、ヒトゲノム中の任意の所望の部位で標的化および部位特異的組換えを触媒するＲｅｃＺＦをデザインすることである。ヒト細胞における、本発明者らのＲｅｃＺＦによる組換えを評価するため、本発明者らは、ＣＭＶプロモーターにより推進され、組換え部位Ｈ１２０ＧおよびＨ１２０Ｔに隣接される高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするリポーターカセットを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを用いて２９３胚腎臓細胞に挿入した（図１５ａ）。カセットのただ１つのコピーが各細胞に存在するので（５０）、部位特異的な分離は、ＥＧＦＰノックアウトを生成し、リコンビナーゼ活性は、蛍光の低下した細胞の割合に正比例する。本発明者らは、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２をｐＢａｂｅ−ピューロマイシン発現ベクター（ｐＢＰ）にクローニングした（５１）。２つの構築物と空のベクターをレトロウイルス形質導入によりリポーター細胞株に導入し、ピューロマイシン選択により濃縮した。形質導入した細胞がコンフルエントに達した時、形質導入後９日に、それらをＦＡＣＳ分析（図１５ｂ、ｃ）およびゲノムＰＣＲ（図１５ｄ）に供した。両方のアッセイは一致した。ＲｅｃＺＦはゲノム組換えを効率的に、かつジンクフィンガーに媒介される特異性で触媒した。ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１は、予期されたＰＣＲバンドの産物（約２００ｂｐ）を生成し、形質導入細胞の１７．０％±０．８％でＥＧＦＰ蛍光を低下させた。それに対して、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２と空のベクター（ｐＢＰ）は、産物バンドも有意な数の非蛍光細胞（それぞれ、１．７％±０．２％および２．３％±０．４％）も生じなかった。本発明者らは、約２００ｂｐバンドを塩基配列決定することによるＰＣＲ結果を検証し、それが部位特異的分離の予期された産物であったことを確認した。より密接に遺伝子型および表現型を結び付けようと努力して、本発明者らは、ｐＢＰ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１で形質導入した、ＥＦＧＰおよびＥＧＦＰ＋細胞の個体群を単離した。その後のゲノムＰＣＲ分析が、ＦＡＣＳの部位特異的な切除の手段としての使用を立証した（図１５ｄ）。
【０２６８】
図１５では、標的化された、部位特異的なヒトゲノムの分離が示される。（ａ）ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１分離のためのリポーターカセットの単一コピーを、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを用いてＦｌｐ−Ｉｎ（商標）２９３ヒト胚腎臓細胞に導入した。（ｂ、ｃ、ｄ）リポーター細胞株に空のｐＢａｂｅ−ピューロマイシンベクター（ＲｅｃＺＦ（−））、ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２、およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１を形質導入し、ピューロマイシン選択により濃縮した（２μｇ／ｍＬ）。形質導入後９日、各サンプルの蛍光をＦＡＣＳにより測定した（ｂ）。蛍光の低下した細胞の割合を、３回の独立した実験間で平均した。（ｃ）ＦＡＣＳサンプルをゲノムＤＮＡ精製のために溶解させた。単離ＤＮＡ（１００〜４００ｎｇ）は、ゲノム分離アッセイのＰＣＲテンプレートとしての役割を果たし（（ａ）で表されるプライマーを使用）、結果を１％アガロースゲルで分析した（ｄ）。レーン１には、Ｐｒｏｍｅｇａ社１ｋｂラダーが含まれる。分離アッセイの結果はレーン２〜６および８に示される（Ｒｅｓ（Ｂ）、ＰＣＲ陰性対照）。成功した分離は基質バンド（１．６ｋｂ  ｐｂ）に対して産物バンド（０．２ｋｂ）の強度を増加させる。レーン６にはＲｏｃｈｅ社１００ｂｐラダーが含まれる。
【０２６９】
考察
標的化内在性ゲノム修飾に用いられた現在の技術は、主として相同組換え（ＨＲ）かまたは部位特異的組換えのいずれかに基づく。ＨＲは任意の遺伝子配列に容易に標的化することができるが、組換えの頻度はきわめて低い。ＨＲは内在性ＤＮＡの修復機構に頼っているため、組換えの頻度は細胞種に依存し、基質間の相同性の程度に比例する。それに対してＳＳＲは、どのような細胞環境においても、無関係の基質間での組換えを触媒する。しかし、部位特異的組換えの適用は、既知のリコンビナーゼの配列特異性により限局される。多大な努力がＨＲの効率の改善に注がれてきたが（二重鎖切断の導入（５２）、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（５３）、またはアデノ随伴ウイルス（５４）およびＳＳＲ基質選好性の変更（２６、５５、５６）による）、これらの制限はゲノム操作および遺伝子治療の多くの適用を妨げ続けている。
【０２７０】
多くの方法で、ＲｅｃＺＦはＨＲおよびＳＳＲの最良のエレメント、つまり、いずれの細胞種においても、無関係の基質を効率的に標的化組換えするエレメントと化合する。目的のゲノム遺伝子座に、またはゲノム遺伝子座間に分離、反転、または組込みしようとする試みは今では実現可能である。しかし、この機能性の増加は、同時に起こる制御不能により相殺されるものと考えることができる。ＨＲは所望の位置および配向で安定な産物を生成するが、Ｃ３１のようなセリンインテグラーゼは一方向性の組換えによって同じ目的を達成する。単純なＲｅｃＺＦ反応は、それらが基質配向およびトポロジーに非感受性の過剰活性触媒ドメインにより媒介されるため、そのような正確さを欠く。本発明者らは、ＲｅｃＺＦに媒介される組換えを制御する様々な戦略を想定している。セリン組換えの配向は、クロスオーバー部位の中心の２ｂｐのオーバーハングに導かれる（４８、５８）。それ自身の逆補体でないオーバーハング（ＡＴとは違って、スペーサー２０Ｇおよび２０Ｔ中）は、同じ方法でＲｅｃＺＦ反応を導くはずである；直接反復配列中の部位は分離を可能にするが、一方で逆反復は反転も可能にする。一方向性のＲｅｃＺＦ系は将来作成され得るが、次善の半部位（５９、６０）および組換えに媒介されるカセット交換（ＲＭＣＥ）（６２）を含む、ＣｒｅおよびＦｌｐのために以前に開発された戦略を順応させることにより、より直接の程度の制御が得られる。これらの技法に加えて、安定な組込みはＲｅｃＺＦ標的化転位（６２）を介して達成することもできる。
【０２７１】
ＲｅｃＺＦの新規な機能性は、現行のＳＳＲ方法論をどのような遺伝学的状況でも用いることを可能にするはずである。本発明者らは、インビトロおよびインビボで内在性ゲノムを素早く仕立てる自由が、基礎および応用の両研究において広い適用を有すると予測する。特定の遺伝子を計画的に崩壊させることは、ＲｅｃＺＦに対する明らかな用途であり、この役割においてそれらはＨＲが役に立たない様々な種においてリバースジェネティクスを促進でき得る。非特異的崩壊、または活性化は、２指のＲｅｃＺＦにより媒介される；トランスポサーゼと同程度の方法で、＞２００ＲｅｃＺＦ変異体の各々はゲノム変異誘発の特有のパターンを生成する。ＲｅｃＺＦはまた、モデル生物のゲノムを操作するために用いることもでき、それによりＨＲ（６３）およびＳＳＲ（６４〜６６）に類似の方法で有用な疾病モデルを生成する。
【０２７２】
ＲｅｃＺＦは、最終的に、遺伝子の欠陥を修復し、生命を増強する（ｌｉｆｅ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）遺伝子を送達する治療用「ゲノム手術」に用いることができる。小型のＲｅｃＺＦ遺伝子（約８００ｂｐ）であれば単一のベクター（６７）に内在性切除または組込みに必要とされる４つの異なるキメラを発現させることができる。同様の遺伝子治療は、健康上のリスクが治療上の利益を上回ったために失敗した。レトロウイルスインテグラーゼは高い効率で遺伝子を送達することができるが、非特異的組込みが癌遺伝子を活性化させ得る。ＨＲの特異性はそれを遺伝子修正の優れた候補とするが、関連するＤＮＡ損傷応答は、処置された細胞の生存力を減弱させる可能性がある（６８）。ＳＳＲはＤＮＡ損傷応答を誘発せず、治療用遺伝子の優れたベクターと思われる。実際、部位特異的なインテグラーゼφＣ３１は、マウスゲノムおよびヒトゲノムにおいて擬似部位を標的化し得（５５、６９、７０）、接合部型表皮水疱症（７１）デュシェンヌ型筋ジストロフィー（７２）、および遺伝性チロシン血症Ｉ型（７３）に対するネズミ疾病モデルの成功したインビボ治療を可能にする。残念ながら、φＣ３１はヒト細胞において有意なレベルの毒性と染色体間組換えを示す（７０、７４）。
【０２７３】
本発明者らは、ＲｅｃＺＦ系の中の毒性が特定のタンパク質に関して問題となる場合、それはジンクフィンガードメインを慎重に選ぶことにより軽減され得ると予期する。本研究において３本指のタンパク質は９ｂｐにしか結合しないが、１８ｂｐに結合する６本指の（ｈｅｘａｄａｃｔｙｌ）ジンクフィンガータンパク質はヒトゲノムにおいて単一の部位を標的化することができる。これらのタンパク質の特異性はインビトロで証明されている（７５）；６本指のＺＦは、ヒト細胞および全植物体において単一の遺伝子の調節を媒介する（７６、７７）。ＤＮＡ結合ドメイン修飾によって素早く活性を調整する能力は、これらのリコンビナーゼの独特の特徴である。中間体解離（７８）、擬似部位の存在、および半部位活性（７９）を含む、その他の問題点は、ＲｅｃＺＦが治療用途について評価される時に対処されねばならない。しかし、本研究において明示された顕著な機能的可塑性を考えると、ＲｅｃＺＦは、従来手を加えることができないゲノム修飾のレベルを促進するはずであり、遺伝子機能および遺伝子治療の両方の研究に力を与え得る、有望なツールである。
【０２７４】
方法
別に明示的に言及しない限り、ＰＣＲ断片および消化物（ｄｉｇｅｓｔｓ）は、ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製された。ベクターは、仔ウシ小腸由来ホスファターゼ（ＣＩＰ、１μＬ、３７℃にて１時間；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で処理されてライゲーションバックグラウンドが排除され、オーバーラップＰＣＲの前に中間ＰＣＲ産物はゲル精製された（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ；Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）。全てのプライマー配列は、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １オンラインで入手可能である。
【０２７５】
ＲｅｃＺＦ基質の構成
各基質プラスミドには、各々特定のＲｅｃＺＦ部位（例えば、Ｇ２０Ｔ−ＧＦＰ−５’およびＧＦＰ−Ｇ２０Ｔ−３’）をコードしたプライマーを含む、ＧＦＰｕｖ遺伝子に隣接する２つのＲｅｃＺＦ組換え部位から成る、組換えカセット（例えば、Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔ）が含まれたＰＣＲ産物を、１．２ｋｂ  ＳＳスタッファー（８０）がＳａｃｌとＸｂａｌの制限酵素部位間に挿入されている、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（ｐＢ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ）の変異体である、ｐＢＳＳにクローニングした（Ｘｂａｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ）。
【０２７６】
ＲｅｃＺＦ遺伝子の構成
Ｔｎ３リゾルバーゼ触媒ドメインを、２つの断片：Ｎ末端（プライマーＴｎ３Ｃａｔ６−ＰｒｉｍおよびＴｎ３−ｒｅｓｂａ１０２Ｙ１２４Ｑを含む）およびＣ末端（プライマーＴｎ３−ｒｅｓｆｏ１０２Ｙ１２４Ｑ−２およびＴｎ３Ｃａｔ６−Ｐｒｉｍ２）のプラスミドｐＷＬ６２５（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からＰＣＲ増幅した。これらの断片は、ジンクフィンガータンパク質Ｇ（プライマーＴｎ３Ｃａｔ８−２−Ｐｒｉｍ１およびＴｎ３Ｃａｔ８−２−Ｐｒｉｍ２を用いてｐＲＴＢＶ２−ＨＳ２＃１１から増幅）をコードする追加の断片とともに、オーバーラップＰＣＲにより一緒に融合された。完成したＴｎ３Ｇ遺伝子をＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化させ、同様に消化させたｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔにライゲートした。分離アッセイによりコロニーをスクリーニングした後、過剰活性単一クローン、Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇをさらに作業を行うために選択した。Ａｒｎｏｌｄと共同研究者らにより特徴付けられた過剰活性変異Ｄ１０２ＹおよびＥ１２４Ｑ（３８）に加えて、Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇも新規な変異Ｓ７０Ｇを含んでいた。
【０２７７】
Ｇｉｎインベルターゼ触媒ドメインを、２つの断片：Ｎ末端（プライマーＲｅｓＧｉｎ−Ｃａｔ−Ｆｏ１−Ｐｒｉｍ１およびＧｉｎｂａＨ１０６Ｙを含む）およびＣ末端（プライマーＧｉｎｆｏＨ１０６ＹおよびＲｅｓＧｉｎ−Ｃａｔ−Ｐｒｉｍ２を含む）のバクテリオファージＭｕ（ＡＴＣＣ）のゲノムからＰＣＲ増幅した。これらの断片は、ジンクフィンガータンパク質Ｇ（プライマーＴｎ３Ｃａｔ８−２−Ｐｒｉｍ１およびＴｎ３Ｃａｔ８−２−Ｐｒｉｍ２を用いてｐＲＴＢＶ２−ＨＳ２＃１１から増幅）をコードする追加の断片とともに、オーバーラップＰＣＲにより一緒に融合された。完成したＧｉｎＧ遺伝子をＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化させ、同様に消化させたｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔにライゲートした。反転アッセイによりコロニーをスクリーニングした後、過剰活性単一クローン、ＧｉｎＧをさらに作業を行うために選択した。ＧｉｎＧは、Ｋｌｉｐｐｅｌと共同研究者らにより特徴付けられた過剰活性変異Ｈ１０６Ｙ（３７）を含んでいた。
【０２７８】
Ｈｉｎインベルターゼ触媒ドメインを、３つの断片：Ｎ末端（プライマーＲｅｓＨｉｎ−Ｃａｔ−Ｆｏ１−Ｐｒｉｍ１およびＨｉｎＳａｃ１−Ｐｒｉｍ２を含む）、中間（プライマーＨｉｎＳａｃｌ−Ｐｒｉｍ１およびＨｉｎｂａＨ１０７Ｙを含む）、およびＣ末端（プライマーＨｉｎｆｏＨ１０７ＹおよびＲｅｓＨｉｎ−Ｃａｔ−Ｐｒｉｍ２）のサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）（ＡＴＣＣ）のゲノムからＰＣＲ増幅した。これらの断片は、ジンクフィンガータンパク質Ｇ（プライマーＴｎ３Ｃａｔ８−２−Ｐｒｉｍ１およびＴｎ３Ｃａｔ８−２−Ｐｒｉｍ２を用いてｐＲＴＶＶ２−ＨＳ２＃１１から増幅）をコードする追加の断片とともに、オーバーラップＰＣＲにより一緒に融合された。完成したＨｉｎＧ遺伝子をＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化させ、同様に消化させたｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔにライゲートした。反転アッセイによりコロニーをスクリーニングした後、過剰活性単一クローン、ＨｉｎＧをさらに作業を行うために選択した。ＧｉｎＧは、Ｍｅｒｉｃｋｅｌと共同研究者らにより特徴付けられた過剰活性変異Ｈ１０７Ｙ（４５）を含んでいた。
【０２７９】
進化の各ラウンドにおいて選択された触媒ドメインを、ＰＣＲ増幅し（プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２およびＲｅｓＣａｔ−Ｐｒｉｍ２により）、ｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１およびｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２の存在下、ＰＣＲによりジンクフィンガータンパク質Ｇ（プライマーＲｅｃＺＦ−Ｐｒｉｍ１およびｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１により増幅）のエラーを含まないコピーに融合した。これらのＲｅｃＺＦ遺伝子の新規なプールをＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化させ、次のラウンドの選択のために、同様に消化させたｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔにライゲートした。
【０２８０】
ＧｉｎＬ７Ｃ７触媒ドメインとＨ１ジンクフィンガータンパク質を融合することにより、３本指のＲｅｃＺＦ（ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１）を構築した。ＧｉｎＬ７Ｃ７触媒ドメインを、プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２およびＲｅｓＣａｔ−Ｐｒｉｍ２を用いて分離産物（ｐＢ−Ｇ２０（ＧＬ／ＴＲ）−ＧｉｎＬ７Ｃ７からＰＣＲ増幅した。３本指のジンクフィンガータンパク質Ｈ１は、プライマーＲｅｓＺＦ−Ｐｒｉｍ１およびＲｅｓ３ＺＦ−Ｐｒｉｍ２を用いてｐＭａｌ−ＨＬＴＲ３−ＨＳ１＃４からＰＣＲ増幅した。ＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化させ、同様に消化させた基質ベクターにライゲートしたｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２およびＲｅｓ３ＺＦＰｒｉｍ２の存在下、これらの２つの断片をＰＣＲにより融合した。Ｐ２ジンクフィンガータンパク質が、（プライマーＲｅｓ２ＺＦ−Ｐｒｉｍ１およびＲｅｓ３ＺＦ−Ｐｒｉｍ２を用いて）ｐＭａｌ−ＰＢＳ−（ｓ）ＨＳ２−Ｊ２からＰＣＲ増幅されると直ちに、ＧｉｎＬ７Ｃ７  Ｐ２の構築が同様に進んだ。形質導入および発現のためにＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２をヒト細胞へクローニングする時に、プライマーＨＢＳ−ＫＯＸ−ＧｉｎＬ７Ｃ７−Ｐｒｉｍ１およびＲｅｓ３ＺＦ−ＳＥＸ−Ｐｒｉｍ２を用いて融合ＰＣＲを行った。結果として得られる断片は、ＢＧ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、ｐＢａｂｅ−ピューロマイシン中で（５１）、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの間にライゲートしてｐＢＰ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびｐＢＰ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２を生成した。
【０２８１】
組換えアッセイ
基質プラスミドのｌａｃプロモーターの後にライゲートされたＲｅｃＺＦを、大腸菌細胞に電気穿孔した。固体培地と液体培地の両方で、これらの細胞を３７℃にて一晩増殖させた（ＩＰＴＧの非存在下）。翌日（単一のコロニーから、またはミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ）により）単離されたプラスミドを用いてＲｅｃＺＦ機能を特徴付けた。ＲｅｃＺＦに触媒される組換え事象を検出するため、本発明者らは、分離、反転、および組込みのためのＰＣＲアッセイを開発した（図１２ｃ〜１２ｆ）。いずれの場合にも、産物情報は、アガロースゲル上で視覚化される特有のバンドの出現との相関があった。分離アッセイ（図１２ｃ；プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１およびｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２）は、各々の相対存在量に比例して基質（１８１４ｂｐ）および産物（１０３９ｂｐ）の両方からプラスミド断片を増幅した。反転（図１２ｄ；プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２およびＩ−ＧＦＰ−Ｍｉｄ−Ｐｒｉｍ２）および組込み（図１２ｅ；プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１およびｐＡＣＹＣ１８４−Ｐｒｉｍ３）を、単一のバンド（それぞれ、１２６３ｂｐおよび３７０ｂｐ）の出現により証明した。いずれの場合にも、産物のプラスミドのみが相補的なプライマー結合部位（ＰＢＳ）を含んでいた。したがって、反転および組込みアッセイは高感度であったが、反応の程度についての情報はあまり得られなかった。一方で、分離および反転系は、ＧＦＰｕｖ領域の操作、第２の非相同プラスミドに必要なＲｅｃＺＦに触媒される組込み反応の検出について報告している。この目的のため、ｐＢ−Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０ＴおよびｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を両方ＺｂａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、組換えカセットＧ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０ＴをｐＡＣＹＣ１８４にライゲートしてｐＡ−Ｇ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｔを生成した。このコンストラクトを、分離産物、ｐＢ−２０Ｔ−Ｔｎ３Ｃｈ１５ｇで同時形質転換し、カルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択下で３７℃にて一晩同時に維持し、ミニプレップにより精製し、ＢｇＩＩＩで消化させ、ＣＩＰで処理し、大腸菌に再形質転換した。クロラムフェニコール選択培地で増殖したコロニーは全て新規な分離産物である、ｐＡ−２０Ｔを含んでいた。ｐＢ−２０Ｔ−Ｔｎ３Ｃｈ１５を、ｐＡ−２０Ｔと同時形質転換し、２つの適合性のプラスミドをカルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択下で同時に維持した。組込み産物は、各プラスミドにアニールするプライマー（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに対してｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１、およびｐＡＣＹＣ１８４に対してｐＡＣＹＣ１８４−Ｐｒｉｍ３）が相互に補完することができた時に検出される。図１４のレーン３ｂに示される、この反応の対照は、修飾されていないｐＡＣＹＣ１８４（可能性のある組換え部位を欠く）を用いる同時形質転換であった。全てのＰＣＲアッセイは、３０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ならびに、９４℃にて５分、１サイクル；９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて９０秒を３０サイクル；および７２℃にて７分の最終１サイクル、のプログラムを用いて行った。
【０２８２】
定方向進化
ＲｅｃＺＦ変異体のライブラリーは、Ｚａｃｃｏｌｏと共同研究者らの方法によるエラープローンＰＣＲにより作成した（８１）。ｄＮＴＰ類似体、ｄＰＴＰ（１２．５μＭ）および８−オキソ−ｄＧＴＰ（１２．５μＭ）の存在下、プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２およびＲｅｓＣａｔ−Ｐｒｉｍ２を用いて、過剰活性Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およびＴｎ３触媒ドメインの増幅を行い、ランダムに配置されたヌクレオチド類似体を含むテンプレートが生成された。その後のオーバーラップＰＣＲ（プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２およびＲｅｓ２ＺＦ−Ｐｒｉｍ２を用いる）により各触媒ドメイン（平均３．２アミノ酸変化を含む）を融合してジンクフィンガータンパク質Ｇのエラーを含まないコピーとした（既に記載したものと同じ方法）。これらのＲｅｃＺＦライブラリーは、その後、ＳａｃｌおよびＸｂａｌで消化させ、機能性選択の最初のラウンドのために、同様に消化させたｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔにライゲートした。プラスミドを大腸菌細胞（１ライゲーションあたり約１０８形質転換体）に電気穿孔し、液体培養で３７℃にて一晩増殖させ、ミニプレップで単離した。この反応凝集体を、１００〜４００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ならびに、９４℃にて５分、１サイクル；９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて９０秒を３０サイクル；および７２℃にて７分の最終１サイクル、のプログラムを用いて行った選択ＰＣＲ（プライマーＧ２０Ｓ３およびｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２を用いる）のためのテンプレートとして用いた。３ラウンドの選択後、各プールに残存する変異体を、Ｓｔｅｍｍｅｒにより記載されるＰＣＲシャフリング法（４９）を用いて組み換えた。さらに数ラウンドの選択の後、本発明者らは、各触媒ドメインから特に高活性のクローンを単離しようとした。平行して、５０〜２００のコロニーを分離活性についてスクリーニングした。１０〜２０の各プールで最も活性のあるＲｅｃＺＦをＰＣＲ増幅し（プライマーｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１およびｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ２を用いる）、ゲル精製し、分離アッセイのためにｐＢＳＳ−Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０Ｔにクローニングした。この方法で見出した８つの最も活性のあるＨｉｎ、Ｇｉｎ、およびＴｎ３変異体の配列を、全体として、図２ｃおよびｄに表す。
【０２８３】
基質許容性アッセイ
基質ライブラリー、Ｇ（１５Ｔ／５Ｎ）、Ｇ（１１Ｔ／５Ｎ／４Ｔ）、Ｇ（１５Ｇ／５Ｎ）、およびＧ（１１Ｇ／５Ｎ／４Ｇ）を、３’スペーサーの領域がランダム化されているプライマー（それぞれ、ＧＦＰ−Ｇ（１５Ｔ／５Ｎ）−３’、ＧＦＰ−Ｇ（１１Ｔ／５Ｎ／４Ｔ）−３’、ＧＦＰ−Ｇ（１５Ｇ／５Ｎ）−３’およびＧＦＰ−Ｇ（１１Ｇ／５Ｎ／４Ｇ）−３’）を用いて生成した。各ライブラリーは、基質Ｇ２０Ｇ−Ｇ−Ｇ２０ＴおよびＧ２０Ｔ−Ｇ−Ｇ２０Ｇの誘導体であった。Ｇ１５Ｔ／５Ｎの場合、プライマーＧ２０Ｇ−ＧＦＰ−５’およびＧＦＰ−Ｇ１５Ｔ／５Ｎ−３’を用いる増幅により、２０ＴのＺ末端の５塩基対がランダム化されている基質のプールを生成した。既に説明された方法で行ったクローニングにより、その平均分子数（約１０５）が可能性のある配列数を（１０２４）はるかに超えるライブラリーが得られた。配列のランダム化は、ｐＵＣ１８Ｐｒｉｍ１を用いて凝集体個体群を塩基配列決定することにより確認した。ＧｉｎＬ７Ｇ７Ｇを各基質ライブラリーにライゲートし、形質転換された大腸菌を３７℃にて一晩液体選択培地（５μＬカルベニシリン、２ｍＬ  ＳＯＣ培地、３ｍＬ  ＳＢ培地）中でインキュベートした。凝集体培養中の基質および産物のプラスミドをミニプレップにより単離した。精製されたプラスミドを用いる反転ＰＣＲを、ＧＦＰｕｖ遺伝子内の１つのプライマー（Ｉ−ＧＦＰ−Ｍｉｄ−Ｐｒｉｍ１）および３’組換え部位の外側の１つ（ｐＵＣ１８−Ｐｒｉｍ１）を用いて行い、基質ライブラリーの機能性メンバーのみを含む産物バンドを生成した。この混合物をその後配列決定し、凝集体クロマトグラムのピークをこの個体群におけるヌクレオチド発現量に比例すると想定した。反転コンピテントな（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）配列を選択するために用いたＰＣＲ戦略は、スペーサー配列のより拡張されたセクションがランダム化されているライブラリーの使用を除外した。中央の塩基対のランダム化が、凝集体クロマトグラムの使用に必要な部位特異的な精度を損なったことも注目に値する（データは示さず）。
【０２８４】
ＲｅｃＺＦ部位特異的ゲノム組換え
ＥＧＦＰ遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、ＲｅｃＺＦ部位を含有するプライマー（Ｂ−Ｈ１２０Ｇ−ＳＩＩ−ＥＧＦＰ−５’およびＥＧＦＰ−Ｚ−Ｈ１２０Ｔ−Ｈ−３’）でＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のｂｇＩＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にライゲートした。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＣＭＶプロモーターをプライマーＳａｃＩＩ−ＣＭＶ−５’およびＣＭＶ−ＳａｃＩＩ−３’で増幅し、ＳａｃＩＩで消化させ、ＥＧＦＰ基質プラスミドのＳａｃＩＩ部位にライゲートし、配向についてスクリーニングした。ＣＭＶ−ＥＧＦＰ基質プラスミドおよびＦｌｐ発現プラスミド（ｐＯＧ４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同時トランスフェクションにより、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に存在する単一のＦＬＰリコンビナーゼ標的（ＦＲＴ）部位への部位特異的な組込みが可能となった。この同質遺伝子のハイグロマイシン耐性個体群から単一のコロニーを単離し、ＦＡＣＳにより特徴付け、その後の全ての実験において基質細胞株（ＳｕｂＣ）として用いた。細胞を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ中で維持した。組織培地および試薬はＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。
【０２８５】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って用いて、ｐＢＰ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｈ１およびｐＢＰ−ＧｉｎＬ７Ｃ７Ｐ２を２９３パッケージング細胞（１２）にトランスフェクトした。産物のレトロウイルス粒子を用いて２×１０５ＳｕｂＣ細胞を感染させた。感染４８時間後、細胞を２ｎｇ／ｍＬのピューロマイシンに曝露した。この選択培地において、非感染細胞は４８時間以内に死滅し、形質導入された個体群は９日後にコンフルエントまで増殖する。ピューロマイシン耐性の個体群をフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒデュアルレーザーサイトメーターを使用）または選別（ＥＧＦＰ高および低個体群について、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＤｉＶａを使用）に供した。いずれの場合も、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡをその後に単離し、プライマーｐｃＤＮＡ−５’ＣＭＶ−Ｐｒｉｍ１およびＰｒｉｍＳｅｑ２を用いるＰＣＲ増幅による分離について検定した。アッセイは３つの別個の実験を３通り行った。凝集細胞個体群および選別されたサンプルのゲノムＰＣＦをそれぞれ、４００ｎｇおよび１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、ならびに、９４℃にて５分、１サイクル；９４℃にて３０秒、５５．７℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を３５サイクル；および７２℃にて７分の最終１サイクル、のプログラムを用いて行った。
【０２８６】
参照文献
以下の参照文献は、実施例１に具体的に適用可能であり、参照により本明細書に組み込まれる；これらの参照文献は実施例１においてそれらに割り当てられた参照番号により参照される。
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【産業上の利用可能性】
【０２８７】
本発明の利点
本発明は、部位特異的なゲノム組換えを実行するのに適した組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、有害遺伝子を除去し、それらを正常な機能をもたらす遺伝子と置換する遺伝子治療に用いることができる。これらの組成物および方法は、その働きにおいて多用途かつ極めて特異的であり、望ましくない組換え事象を最小限に抑える。
【０２８８】
本発明に係る組成物および方法は、ゲノム構造および機能の研究のための追加のツールを提供するのみでなく、一般に内在性ゲノムへのＳＳＲの適用を妨げる、それらの天然基質に存在する約２８塩基対の組換え部位に対して現在利用できるＳＳＲの限られた特異性を克服する手段をも提供する。
【０２８９】
数値の範囲に関して、その状況が明らかに別のものを指し示さない限り、本発明は範囲の上限値と下限値の間に、少なくとも下限値の単位の１０分の１までの、介在する各数値を包含する。さらに、本発明は、記載された範囲から明確に除外されない限り、範囲の上限値および下限値の一方あるいは両方を含む、その他の記載された介在する数値および範囲を包含する。
【０２９０】
別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語の意味は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるものである。また、当業者であれば、本明細書に記載されるものに類似または同等のいずれの方法および物質でも、本発明を実践または検証するために用いることができることを理解する。
【０２９１】
本明細書において論じられる刊行物および特許は、本願の出願日より前に、その開示のためのみに提供される。本明細書において、かかる刊行物が従前に発明されたという理由で、本発明がそれに先行する資格を持たないことを承認すると見なされるべきものはない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性がある。
【０２９２】
前述の全ての刊行物は参照によりその全文が本明細書に援用され、それには、全ての公開特許、特許出願、参照文献、ならびにそれらの公開された文書中に援用された刊行物が含まれる。しかし、参照により本明細書に組み込まれる任意の刊行物が公開される情報を参照する範囲で、出願者らは本願の出願日以降に発行されたそうしたいかなる情報も先行技術であるとは認めない。
【０２９３】
本明細書および添付される特許請求の範囲内において用いられる単数形は複数系を含む。例えば、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のものを指し示していない限り、複数の言及を含む。さらに、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連のあらゆる要素に言及していると理解される。本明細書において例示によって記載される発明は、本明細書において具体的に開示されてはいないが、任意の１または複数の要素の非存在下や、任意の１または複数の制限の非存在下でも、適切に実施され得る。よって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、展開的かつ無制限に読まれるものとする。さらに、本明細書で使われる用語および表現は、説明のための用語として用いられ、制限のための用語ではなく、かかる用語および表現の使用において、将来表示され記述されるいかなる相当語句またはそのいかなる部分をも排除する意図はなく、かつ、様々な変更が特許請求される本発明の範囲内で可能であると認識される。よって、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特性により具体的に開示されているが、本明細書において開示される発明の修正形態および変形形態は、当業者により再分類される可能性があること、ならびに、かかる修正形態および変形形態は、本明細書において開示される本発明の範囲内であると考えられることは当然理解される。本発明は、本明細書おいて広く一般的に説明されている。一般的な開示の範囲内に収まるそれより狭い種および亜属の分類の各々も、これらの発明の一部を形成する。これには、各発明の一般的記載が、削除された物質がその中に明確に属するか否かに関わらず、属から任意の対象を取り除く条件付きまたは消極的限定とともに含まれる。加えて、発明の特徴または態様がマルクーシュグループに関して記載されている場合、それによって、本発明がマルクーシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることは、当業者であれば理解されよう。また、上記の記述が説明的であるが限定的でないことを目的とすることも理解される。多くの実施形態は、上記の記述を検討すると当業者に明らかとなる。そのため、本発明の範囲は、上記の記述を参照して決定されるべきではなく、その代わりにかかる特許請求の範囲が資格を有する等価物の全範囲とともに、添付される特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。当業者は、記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を理解するし、または、常套的な実験程度を用いて確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを目的とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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