(57)【要約】  本発明は、改善された生物学的活性を示す、ＧＤＦ−５由来の新規な生合成増殖因子変異体に関する。ヒトＧＤＦ−５の４５３位と４５６位の変異体を開示し、また、組織変性／破壊と関連した疾患の治療におけるこれらの変異体の使用を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−５関連タンパク質に由来する組換えタンパク質であって、
（ａ）ヒト野生型ＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５３（Ｍ４５３）に対応する位置にあるアミノ酸が、アラニン、バリン、もしくはイソロイシンであり、かつ／または
（ｂ）ヒト野生型ＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５６（Ｍ４５６）に対応する位置にあるアミノ酸が、アラニン、バリン、もしくはイソロイシンである、
ことを特徴とする上記タンパク質。
【請求項２】
以下のアミノ酸一般式：
（ａ）
2009519008.tif 000005
または
（ｂ）
2009519008.tif 000006
または
（ｃ）
2009519008.tif 000007
［式中、Ｘはどれも任意のアミノ酸を表し、Ｚ１はアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）を表し、Ｚ２はアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）を表す］
のうちの１つに一致する配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｘ１は、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ２は、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ４は、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ５は、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ６は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ７は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を表し、
Ｘ８は、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ９は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ１０は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニンン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ１１は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ１２は、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ１３は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ１４は、イソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ１５は、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ１６は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ１７は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１８は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ１９は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２０は、アラニン（Ａ）またはプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ２１は、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２２は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２３は、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ２４は、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２５は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ２６は、イソロイシン（Ｉ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２７は、アラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ２８は、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ２９は、アスパラギン（Ｎ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ３０は、グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、
Ｘ３１は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ３２は、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｚ１は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｚ２は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）を表す、
請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＧＤＦ−５関連タンパク質が、脊椎動物ＧＤＦ−５タンパク質またはその変異型もしくは対立遺伝子型である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＧＤＦ−５関連タンパク質が、ヒトＧＤＦ−５（配列番号１）またはその変異型である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
二量体形成に関与するシステインが別のアミノ酸で置換されているか、または欠失されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸または請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、および／または請求項７に記載の核酸、および／または請求項８に記載の発現ベクター、および／または請求項９に記載の宿主細胞を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１１】
製薬上許容される補助剤および／または担体物質をさらに含んでなる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質および／または核酸および／またはベクターおよび／または宿主細胞が、生体適合性マトリックス材料の中に、またはその上に存在する、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
組織変性および／または組織破壊に関連した疾患を予防または治療するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
骨、軟骨、結合組織、結合組織付着、腱、靭帯、脊椎／椎間板、半月板、歯組織、象牙質、歯周靭帯、血管、皮膚、毛髪もしくは神経組織の損傷に関連した障害または疾患を診断、予防および／または治療するための、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
軟骨および／または骨の成長および／または脊椎固定を促進するための；感覚器官の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺の組織、皮膚、粘膜、内皮、上皮からなる群より選択される損傷したまたは罹患した組織を診断、予防および／または治療するための；神経成長、組織再生、血管新生、潰瘍、熱傷、外傷および／または皮膚移植を含む創傷の治癒を引き出すための；前駆細胞および／または骨髄細胞の増殖を引き出すための；臓器もしくは組織移植用の組織または細胞を処理もしくは保存する目的で増殖状態または分化状態を維持するための；骨格要素への連結部に関する変性疾患を治療するための、かつ／または半月板および／または脊椎／椎間板を修復するための；神経変性疾患の予防および／または治療のための治療用および／または診断用組成物を製造するための、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
骨および軟骨の損傷に関連した疾患が骨粗鬆症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の生成方法であって、
（ａ）ヒト野生型ＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５３（Ｍ４５３）に対応する位置にあるアミノ酸をアラニン、バリン、もしくはイソロイシンで置き換える、および／または
（ｂ）ヒト野生型ＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５６（Ｍ４５６）に対応する位置にあるアミノ酸をアラニン、バリン、もしくはイソロイシンで置き換える、
ことにより、ＧＤＦ−５関連タンパク質に由来するタンパク質を遺伝子組換えにより調製することを含む、上記方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質に対して特異的な抗体。
【請求項２０】
骨および／または軟骨の損傷に関連した疾患を診断、予防および／または治療するための、あるいは骨および／または軟骨の疾患に作用するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２１】
軟骨および／または骨の形成および／または脊椎固定の促進のための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２２】
腱および／または靭帯を含む結合組織、歯科インプラントを含む歯周組織または歯組織、ＣＮＳ組織および神経病理学的状態を含む神経組織、感覚器官の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺の組織、皮膚、粘膜、内皮、上皮からなる群より選択される損傷したまたは罹患した組織を診断、予防および／または治療するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２３】
神経成長、組織再生、血管新生、潰瘍、熱傷、外傷および／または皮膚移植を含む創傷の治癒を引き出すための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２４】
前駆細胞および／または骨髄細胞の増殖を引き出すための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２５】
臓器もしくは組織移植用の組織または細胞を処理もしくは保存する目的で増殖状態または分化状態を維持するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２６】
胃腸管内壁の完全な状態のための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２７】
受胎能力、避妊および／または妊娠の障害を治療するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２８】
骨格要素への連結部に関する適応症のための、かつ／または半月板および／または脊椎／椎間板を修復するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２９】
パーキンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン病のような神経変性疾患を予防および／または治療するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項３０】
毛髪の成長を促進するための治療用および／または診断用組成物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクターおよび／または請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された生物学的活性を示す、新規な組換え生合成増殖因子変異体に関する。改善されたタンパク質活性は、シグナル伝達分子のトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーの天然に存在するタンパク質である元の増殖因子タンパク質の特定のアミノ酸の置換によって達成される。本明細書で提供される組換えタンパク質は、様々な細胞、組織および器官の再生、増殖刺激ならびに分化を誘導するのに特に適している。本発明はまた、前記組換えタンパク質変異体をコードする核酸分子、その核酸分子を含む発現ベクターおよび宿主細胞、前記タンパク質変異体に対する抗体、医薬組成物ならびに増殖因子変異体を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのタンパク質は、ＴＧＦ−β、骨誘導タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビンおよび増殖／分化因子（ＧＤＦ）を含めて、３５以上のメンバーを包含する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質は、細胞の増殖および分化ならびに組織の形成を促進し、幅広い医療方法および医療用途に関係している。これらの二量体分子は、Ｉ型およびII型セリン／トレオニン受容体キナーゼを含む特異的な受容体との複合体を介して作用する。続いて受容体キナーゼはＳｍａｄタンパク質を活性化し、その後そのシグナルは核へ伝達されて標的遺伝子の発現を調節する。Ｓｍａｄ非依存性シグナル伝達経路もこれらの受容体によって開始され、ＭＡＰキナーゼ経路の誘導を引き起こす。Ｓｍａｄはシグナル伝達分子の特異なファミリーであって、細胞表面受容体から核に直接的にシグナルを伝達することができ、そこでそれらはＤＮＡ結合パートナーならびに転写コアクチベーターおよびコリプレッサーとの相互作用によって転写を調節する。
【０００３】
このタンパク質ファミリーのメンバーは、初めに大きな前駆体タンパク質として合成され、その後Ｃ末端から約１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターでタンパク質加水分解的切断を受け、Ｎ末端プロドメインからＣ末端成熟タンパク質部分を放出する。すべての成熟ポリペプチドは構造上関連していて保存された生物活性ドメインを有し、かかるドメインはこれらのタンパク質の特徴的な三次元「シスチンノット」（cystine-knot）モチーフに関与する６または７個のカノニカルなシステイン残基を含む。
【０００４】
様々なスーパーファミリーメンバーは、それらのシスチンノットモチーフの相同性／同一性の程度に基づき、明確に区別されるサブファミリーおよびサブグループにさらに分類できる。骨誘導タンパク質および増殖／分化因子（ＧＤＦ）の重複するファミリーは、骨格系および他の組織において多様な役割を果たすことが知られている（総説についてはDucyおよびKarsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214を参照されたい）。特に、ヒトＧＤＦ−５（そのタンパク質はＭＰ５２、ＣＤＭＰ−１として、または時にＢＭＰ−１４としても知られる）、ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ−１３）およびＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２）は、それらの類似した生物学的特性および非常に高度のアミノ酸配列同一性のために、数人の著者らにより同一のグループに分類されている（Mikic 2004, Annals of Biomedical Engineering 32, 466-476; Wolfmanら1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330などを参照されたい）。
【０００５】
骨および軟骨のｄｅ ｎｏｖｏ形成におけるＧＤＦ−５／ＧＤＦ−６／ＧＤＦ−７サブグループの顕著な機能（Chengら 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Settleら 2003, Developm. Biol. 254, 116-130）に加えて、このサブグループのメンバーはまた腱および靭帯（Wolfmanら 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330）、神経組織（Farkasら 1997, Neurosci Lett. 236,120-122; Watakabeら 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464）、歯周靭帯および歯（Senaら 2003, J. Dent. Res. 82, 166-171; Morotomeら 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85-90）、ならびに他の組織の重要な誘導因子および調節因子でもあることが繰り返し実証されている。
【０００６】
ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７をはじめとする様々な天然のＢＭＰ／ＧＤＦの遺伝子ならびにタンパク質の構造が既に解明されている。ＧＤＦ−５のいくつかの機能欠損変異体が同定され、それらは、例えば、手足の指の短縮（Ｃ型短指症）ならびに動物における短肢症（brachypodism）（Stormら 1994, Nature 368, 639-643）およびヒトにおける遠位肢・中間肢短縮症（acromesomelic displasias）（Thomasら 1996, Nature Gen. 12, 315-317）のような他の骨格異常を引き起こす。これらの変異体に関して、ヒトＧＤＦ−５の１７３位、２０４位、４００位、４３８位、４４１位および４９８位での特定のアミノ酸置換は、そのタンパク質機能を低下させるかまたは完全に失わせることが見出されている（Schwabeら 2004, Amer. J. Med Genet. 124A, 356-363）。これに対して、改善された生物学的活性を有するＧＤＦ変異体は今までにごくわずかしか知られていない。希少な例がＷＯ０１／１１０４１に開示されているが、これは、通常は二量体化に関与するシステイン残基を欠失した活性単量体ＧＤＦ−５に関する。
【０００７】
骨、軟骨、および他の組織を誘導する活性に関与する分子の探索は、増殖／分化因子と呼ばれる一連の分子の発見につながった。それらの特有の組織誘導活性によって、これらのタンパク質は、単独でまたは特定の担体および／またはマトリックス材料と組み合わせて、損傷した組織の自然治癒過程を促進し補助する治療法研究ならびに再生手術に応用されて成功を収めている。それでもなお、このような目的のために、これらのタンパク質の改善された、より効果的な形態を開発することが大いに求められている。
【発明の開示】
【０００８】
この目的は、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されるような、改善された生物学的活性を示すＧＤＦ−５関連タンパク質由来の新規な組換えタンパク質を提供することにより本発明に従って解決される。
【０００９】
誤解や曖昧な表現を避けるために、本明細書において頻繁に用いられるいくつかの用語を以下のように定義して、例示する：
本明細書で用いる「シスチンノットドメイン」とは、ヒトＧＤＦ−５などのＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質の成熟部分に存在し、シスチンノットとして知られる三次元タンパク質構造を形成する、公知の保存されたシステインリッチのアミノ酸領域を意味する。このドメインにおいては、システイン残基同士のそれぞれの位置が重要であり、生物学的活性を失わないためにはわずかな変化しか許されない。シスチンノットドメインのコンセンサス配列は当技術分野において公知である。本明細書の定義によれば、タンパク質のシスチンノットドメインは、それぞれのタンパク質のシスチンノットに関与する最初のシステイン残基から始まり、それぞれのタンパク質のシスチンノットに関与する最後のシステイン残基に続く該残基で終わる。例えば、ヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質（配列番号１）のシスチンノットドメインはアミノ酸４００−５０１を含む（図１も参照されたい）。
【００１０】
本明細書で用いる「ＧＤＦ−５関連タンパク質」とは、ヒトＧＤＦ−５の１０２アミノ酸のシスチンノットドメイン（図１／配列番号１のアミノ酸４００−５０１）に対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するシスチンノットドメインを有し、ヒトＧＤＦ−５のメチオニン４５３（Ｍ４５３）に相当する位置にメチオニン残基を有し、かつヒトＧＤＦ−５のメチオニン４５６（Ｍ４５６）に相当する位置にメチオニンまたはロイシン残基を有する、天然に存在するまたは人工的に作製されたタンパク質を意味する。これらのタンパク質が上述の要件を満たすかぎり、脊椎動物または哺乳動物種に由来するＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７タンパク質のグループに属するタンパク質、ならびにそれらの組換え変異型が含まれる。
【００１１】
上記の定義に従うＧＤＦ−５関連タンパク質の非限定的な例は、ヒトＧＤＦ−５（ＷＯ９５／０４８１９に、およびHoettenら 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652にＭＰ５２として開示される）、組換えヒトＧＤＦ−５／ＭＰ５２（ＷＯ９６／３３２１５）、マウスＧＤＦ−５（ＵＳ ５，８０１，０１４）、ＣＤＭＰ−１（ＷＯ９６／１４３３５）、ＨＭＷヒトＭＰ５２ｓ（ＷＯ９７／０４０９５）、ウサギＧＤＦ−５（Sanyalら 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210）、ヒトＧＤＦ−６／ＢＭＰ−１３（ＵＳ ５，６５８，８８２）、ウシＧＤＦ−６（ＮＣＢＩ登録番号Ｐ５５１０６）、マウスＧＤＦ−６（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０３８５５４）、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−２（ＷＯ９６／１４３３５）、ヒトＧＤＦ−７／ＢＭＰ−１２（ＵＳ ５，６５８，８８２）、マウスＧＤＦ−７（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＰ９７７２１）、ＧＤＦ−７／ＣＤＭＰ−３（ＷＯ９６／１４３３３５）、ニワトリＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿９８９６６９）、アフリカツメガエルＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＴ９９３０３）、単量体ＧＤＦ−５、−６および−７（ＷＯ０１／１１０４１およびＷＯ９９／６１６１１）であり、図３および図４に示される。
【００１２】
本明細書で用いる「ＭＬ変異体」とは、本出願に記載されるヒトＧＤＦ−５とのアライメントの後で、ヒトＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５３（Ｍ４５３）に相当するアミノ酸がメチオニンではなく、かつ／またはヒトＧＤＦ−５のメチオニン４５６（Ｍ４５６）に相当するアミノ酸がメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）ではない、ＧＤＦ−５関連タンパク質に由来する組換えタンパク質を意味する。
【００１３】
本明細書で用いる「改善された生物学的活性」とは、それぞれの非変異体タンパク質の活性の少なくとも１２０％に達するＭＬ変異体の生物学的活性に関する。
【００１４】
「生物学的活性」とは、以下のアッセイの１つ以上により測定されるＧＤＦ−５関連タンパク質の活性を意味する：
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）、例えば、Takuwaら (1989), Am. J. Physiol. 257, E797-E803に記載される；
（ｂ）ドーパミン作動性ニューロンの生存率の上昇の測定、例えば、Krieglsteinら 1995 (J. Neuroscience Res. 42, 724-732) またはSullivanら 1997 (Neuroscience Letters 233, 73-76)に記載される；
（ｃ）胎生期網膜からの神経線維の成長、例えば、ＷＯ９７／０３１８８に記載される；
（ｄ）これらのタンパク質の血管新生能、ｉｎ ｖｉｖｏ角膜マイクロポケットモデルで確認され、例えば、Yamashitaら 1997 (Exp. Cell Research 235, 218-226)に記載される；
（ｅ）ＧＤＦ−５関連タンパク質が及ぼす筋芽細胞の最終分化への効果、例えばInadaら 1996 (Biochem Biophys Res Commun. 222, 317-322)に記載のように測定される；
（ｆ）腱および靭帯に関するタンパク質の誘導能を測定するｉｎ ｖｉｖｏ試験、例えば、Wolfmanら 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330に開示される；
（ｇ）ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したＳｍａｄ結合エレメントに基づくレポーター遺伝子アッセイを用いた、Ｓｍａｄの活性化によるシグナル伝達カスケードの測定、例えば、Noheら，2002. J Biol Chem. 277, 5330-5338に既に記載される。
【００１５】
本明細書で用いる「変異型」とは、下記のポリペプチドのいずれかを意味する：
（ａ）タンパク質の生物学的に活性な断片、
（ｂ）タンパク質の元の配列に加えて付加的な配列を有するタンパク質構築物、
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の任意の組合せ。
【００１６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のＧＤＦ−５／−６／−７グループ（最もよく特徴付けられたメンバーとしてＧＤＦ−５を含む）は、脊椎動物／哺乳動物種の間で高度に保存されている（DucyおよびKarsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214）。今回驚いたことに、ヒトＧＤＦ−５のメチオニン４５３（Ｍ４５３）およびメチオニン４５６（Ｍ４５６）に対応するアミノ酸残基は、タンパク質機能に悪影響を及ぼすことなく、いくつかの特定のアミノ酸残基で置換され得ることが、突然変異研究や他の実験によって見出された。さらに、これらの置換はタンパク質の生物学的活性を顕著に増加させさえする。
【００１７】
本発明のこの実施形態はさらに、図１、２および３によって説明される。図１は、３８１アミノ酸のプロドメイン（シグナルペプチド（アミノ酸１−２７）を含むアミノ酸１−３８１、太字体）および１２０アミノ酸の成熟部分（アミノ酸３８２−５０１）からなるヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質（Hoettenら 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652）を示す。成熟部分または特にシスチンノットドメイン（アミノ酸４００−５０１、下線部）がこのタンパク質の生物学的機能にとって十分である。残基Ｍ４５３およびＭ４５６（灰色の囲み）はこのシスチンノットドメイン内に位置する。他のＧＤＦ−５関連タンパク質のシスチンノットドメイン内の対応する残基を図２および図３に示す（矢印で示す）。これらの図に示されていないタンパク質の対応する残基は、ヒトＧＤＦ−５との配列アライメントによって容易に決定することができる。
【００１８】
ＧＤＦ−５関連タンパク質において、ヒト野生型ＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５３（Ｍ４５３）に対応する位置のメチオニン残基がアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、またはイソロイシン（Ｉ）より選択されるアミノ酸と置換される場合、結果として生じる組換えタンパク質は増加した生物学的活性を有することが見出された。
【００１９】
好ましい実施形態では、Ｍ４５３の位置に対して選択されるアミノ酸はバリン（Ｖ）である。
【００２０】
また、独立して、またはＭ４５３の置換と組み合わせて、ヒト野生型ＧＤＦ−５（配列番号１）のメチオニン４５６（Ｍ４５６）に対応する位置のメチオニン残基がアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、またはイソロイシン（Ｉ）より選択されるアミノ酸と置換される場合、結果として生じる組換えタンパク質は増加した生物学的活性を有することも見出された。
【００２１】
好ましい実施形態では、Ｍ４５６の位置に対して選択されるアミノ酸はバリン（Ｖ）である。
【００２２】
Ｍ４５３および／またはＭ４５６同等物が上記に指定されたアミノ酸と置換された、ＧＤＦ−５関連タンパク質のこれらのＭＬ変異体は、それぞれの非変異体タンパク質の活性を大きく上回る生物学的活性を示す。
【００２３】
一例として、図５は、ｈＧＤＦ−５ ＭＬ変異体Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖの増強されたｉｎ ｖｉｔｒｏアルカリホスファターゼ誘導能を示す。この変異体タンパク質は、上記アッセイにおいて野生型タンパク質（ｒｈＧＤＦ−５）の活性の５８５．５％（１３３ｎｇ／ｍｌで）、３５６．３％（４００ｎｇ／ｍｌで）、および２３６．３％（１２００ｎｇ／ｍｌで）の生物学的活性を示す（複数回の実験の平均値）。したがって、平均活性は野生型タンパク質（ｒｈＧＤＦ−５）の活性の５８５．５＋３５６．３＋２３６．３：３＝３９２．７％である。単一のタンパク質濃度および単一の実験で該変異体について測定された最低の活性は、野生型タンパク質の活性の１５０％であった。
【００２４】
こうして、それぞれの非変異体タンパク質の活性の少なくとも１２０％に達する改善された生物学的活性を示すＭＬ変異体は、本発明に包含される。それぞれの非変異体タンパク質の生物学的活性の少なくとも１５０％、好ましくは少なくとも１６０％、より好ましくは少なくとも１７０％、より好ましくは少なくとも１８０％、そして最も好ましくは少なくとも２００％の改善された生物学的活性を有するＧＤＦ−５関連ＭＬ変異体が、特に好適である。
【００２５】
ＧＤＦ−５関連タンパク質およびそのＭＬ変異体の、例えば骨、軟骨および結合組織（歯周靭帯など）の誘導の分野における生物学的活性は、確立された試験系を用いて容易に測定することができる。最も有用で好ましいのは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ（Takuwaら 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803）として知られる一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験であり、これは実施例２／図５に示される。ＧＤＦ−５関連タンパク質は、例えば、ＷＯ９５／０４８１９に記載されるＲＯＢ−Ｃ２６骨前駆細胞（Yamaguchiら 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225）、胚性ＡＴＤＣ５細胞（Riken Gene Bank, ROB 0565）、マウス間質ＭＣＨＴ−１／２６細胞、およびNakamuraら 2003, J. Periodontal Res. 38,597-605に示される歯周靭帯（ＨＰＤＬ）細胞において、アルカリホスファターゼ活性を増加させることが実証されている。
【００２６】
本明細書で定義されるＧＤＦ−５関連タンパク質は、ヒトＧＤＦ−５の１０２アミノ酸のシスチンノットドメインに対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するシスチンノットドメインを含む。６０％の限定値が、ＧＤＦ−５／−６／−７グループのタンパク質メンバーならびにその変異型を、他のＧＤＦおよびＢＭＰなどの別のタンパク質から区別するのに十分である。ヒトＧＤＦ−５、ヒトＧＤＦ−６およびヒトＧＤＦ−７の１０２アミノ酸のシスチンノットドメインの比較（図２）は、これらのタンパク質間での高度のアミノ酸同一性を示す。ヒトＧＤＦ−６はヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインと８７個（８５％）の同一残基を共有し、ヒトＧＤＦ−７は８３個（８１％）の同一残基を共有する。これまでに同定されている他の脊椎動物および哺乳動物種由来のＧＤＦ−５／−６／−７分子のそれぞれのドメインもまた、ヒトＧＤＦ−５と比較したとき、少なくとも７５％（７９％〜９９％）という非常に高い同一性パーセントを示す（図４）。対照的に、ＧＤＦ−５／−６／−７サブグループに属さないＧＤＦおよびＢＭＰは、６０％よりはるかに低い同一性の値を示す。
【００２７】
関連アミノ酸配列における対応するアミノ酸位置の決定ならびにそれらの間の同一性パーセントの計算は、周知のアライメントアルゴリズムと、場合によりこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラムを用いて実行することができる。本特許出願におけるアミノ酸同一性は、初期設定パラメータを用いたフリーウェアのプログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン1.81）による配列のアライメント、およびその後の同一残基の手計算によって計算された。ペアワイズアライメント（遅い−正確）のための初期設定は、gap openingパラメータ：10.00；gap extensionパラメータ：0.10；Protein weightマトリックス：Gonnet 250である。ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムは、
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F.およびHiggins, D.G. (1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882
に詳細に記載されている。
【００２８】
ＣｌｕｓｔａｌＸはＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムに対するウィンドウズ（登録商標）インターフェースであり、すなわち、ftp-igbmc.u-strasbg.fr、ftp.embl-heidelberg.de、ftp.ebi.ac.ukからの匿名ｆｔｐから、または下記のウェブページ：http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/からのダウンロードなどによって、様々な供給源から入手可能である。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムおよびアルゴリズムはまた、
Thompson, J.D., Higgins, D.G.およびGibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680
に詳細に記載されている。
【００２９】
本発明に従ったＧＤＦ−５関連タンパク質由来のＭＬ変異体は通常、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７などのＧＤＦ−５関連タンパク質が有効であるあらゆる適応症に適用可能である。ＧＤＦ−５関連タンパク質は、骨および軟骨（Chengら 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Settleら 2003, Developm. Biol. 254, 116-130）、腱および靭帯などの結合組織（Wolfmanら 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330）、神経組織（Farkasら 1997, Neurosci Lett. 236,120-122; Watakabeら 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464）、幹細胞（Shimaokaら 2003, J. Biomed. Materials Res. Part A 68A, 168-176; Baiら 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 453-460）ならびに歯周靭帯および歯（Senaら 2003, J. Dent. Res. 82, 166-171; Morotomeら 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85-90）などの重要な誘導因子および調節因子／分化因子であることが実証されている。
【００３０】
好ましい実施形態では、ＭＬ変異体は、以下の一般アミノ酸配列：
（ａ）
2009519008.tif 000002
または
（ｂ）
2009519008.tif 000003
または
（ｃ）
2009519008.tif 000004
［式中、
すべてのＸは、任意のアミノ酸を表し、
Ｚ１は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｚ２は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）を表す］
のうちの１つに一致する配列を含む。
【００３１】
より好ましい実施形態では、ＭＬ変異体は、上記の一般アミノ酸配列：
［式中、
Ｘ１は、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ２は、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ４は、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ５は、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ６は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ７は、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を表し、
Ｘ８は、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ９は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ１０は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ１１は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ１２は、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ１３は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ１４は、イソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ１５は、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ１６は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ１７は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１８は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ１９は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２０は、アラニン（Ａ）またはプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ２１は、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２２は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２３は、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ２４は、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２５は、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ２６は、イソロイシン（Ｉ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ２７は、アラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ２８は、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ２９は、アスパラギン（Ｎ）またはリシン（Ｋ）を表し、
Ｘ３０は、グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、
Ｘ３１は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、
Ｘ３２は、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し、
Ｚ１は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）を表し、
Ｚ２は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）を表す］
のうちの１つに一致する配列を含む。
【００３２】
これらの一般配列は、図３の脊椎動物ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７配列のシスチンノットドメインの比較から作成された。アライメントされたタンパク質において保存されていない位置は、一般配列ではＸで示される。本発明に従って変異される位置は、Ｚで示される。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、本発明のＭＬ変異体タンパク質は、脊椎動物もしくは組換えＧＤＦ−５タンパク質またはその変異型のＭＬ変異体である。最も好ましいのは、哺乳動物ＧＤＦ−５タンパク質またはその変異型のＭＬ変異体である。脊椎動物および哺乳動物ＧＤＦ−５タンパク質の例としては、以下が挙げられる：ヒトＧＤＦ−５（ＷＯ９５／０４８１９にＭＰ５２として、Hoettenら 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652にヒトＧＤＦ−５として開示されている）、組換えヒトＧＤＦ−５／ＭＰ５２（ＷＯ９６／３３２１５）、ＨＭＷヒトＭＰ５２ｓ（ＷＯ９７／０４０９５）、ＣＤＭＰ−１（ＷＯ９６／１４３３５）、マウス（Mus musculus）ＧＤＦ−５（ＵＳ ５，８０１，０１４）、ウサギ（Oryctolagus cuniculus）ＧＤＦ−５（Sanyalら 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210）、ニワトリ（Gallus gallus）ＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿９８９６６９）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ＧＤＦ−５（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＴ９９３０３）。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態には、単量体ＧＤＦ−５関連タンパク質のＭＬ変異体タンパク質が含まれる。これらの単量体タンパク質では、二量体形成に関与するシステインが、別のアミノ酸で置換されているか、または欠失されているかのいずれかである。かかるタンパク質は例えばＷＯ０１／１１０４１およびＷＯ９９／６１６１１に記載されており、これらを参照として本明細書に組み入れる。特に好ましい単量体タンパク質は、そこに開示される組換え単量体ＧＤＦ−５である。
【００３５】
前述の遺伝子／タンパク質の対立遺伝子型のＭＬ変異体、ならびに、置換、付加および欠失などのさらなる変異を有する脊椎動物、哺乳動物および組換えタンパク質またはそれらの変異型のＭＬ変異体もまた、これらのさらなる変異がタンパク質活性に本質的な影響を与えない限り、これらの実施形態に含まれる。
【００３６】
一般的に、脊椎動物、哺乳動物もしくは組換えＧＤＦ−５タンパク質またはそれらの変異型のＭＬ変異体は、すでに記載されているすべてのＧＤＦ−５活性を示すことが予想され、上述の組換えおよび野生型ＧＤＦ−５がうまく利用されているあらゆる分野に適用され得る。例えば、ＧＤＦ−５は、骨および軟骨の形成ならびに結合組織の形成（例えば、ＷＯ９５／０４８１９、Hoettenら 1996, Growth Factors 13, 65-74; Stormら 1994, Nature 368, 639-643; Changら 1994, J. Biol. Chem. 269, 28227-28234を参照）、ならびに結合組織付着の形成（ＥＰ ０ ８３１ ８８４）に非常に有効な促進因子であると考えられる。これに関連して、ＧＤＦ−５は、骨格要素間の連結部に関する適用例に有用である（例えば、StormおよびKingsley 1996, Development 122, 3969-3979を参照）。結合組織の一例は腱と靭帯である（Wolfmanら 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330; AspenbergおよびForslund 1999, Acta Orthop Scand 70, 51-54; ＷＯ９５／１６０３５）。このタンパク質は、半月板修復および脊椎／椎間板修復（Walshら 2004, Spine 29, 156-63）ならびに脊椎固定への適用（Spiroら 2000, Biochem Soc Trans. 28, 362-368）に有用である。ＧＤＦ−５は、象牙質または歯周靭帯の再生などの歯（歯および歯周）への適用において有利に利用され得る（例えば、ＷＯ９５／０４８１９；ＷＯ９３／１６０９９；Morotomeら 1998, Biochem Biophys Res Comm 244, 85-90を参照されたい）。
【００３７】
ＧＤＦ−５はまた、あらゆる種類の創傷修復においても有用である。それは、ニューロン系における組織増殖を促進したり、また、例えばドーパミン作動性ニューロンの生存を促進したりするためにも有用である。これに関連して、ＧＤＦ−５は、例えばパーキンソン病、おそらくはまたアルツハイマー病やハンチントン舞踏病の組織のような神経変性疾患の治療のために使用される（例えば、ＷＯ９７／０３１８８；Krieglsteinら (1995) J. Neurosci Res. 42, 724-732; Sullivanら (1997) Neurosci Lett 233, 73-76; Sullivanら (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681-3688を参照されたい）。ＧＤＦ−５は、神経機能を維持すること、または既に損傷を受けた組織において神経機能を保持することを可能にする。従って、ＧＤＦ−５は広く適用可能な神経栄養因子であると考えられる。
【００３８】
それはまた、目、特に網膜、角膜および視神経の疾患（例えば、ＷＯ９７／０３１８８；Youら (1999), Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296-311を参照）、毛髪成長および皮膚関連疾患の治療および診断（ＷＯ０２／０７６４９４；Battagliaら 2002, Trans. Orthop. Res. Soc. 27, 584）、ならびに血管新生の誘導（Yamashitaら 1997, Exp. Cell Res. 235, 218-26）のためにも有用である。
【００３９】
一方には、骨および／または軟骨の損傷に関連した疾患、あるいは骨および／または軟骨を侵す疾患の予防あるいは治療があり、また一般的には、軟骨および／または骨形成が望まれる状況あるいは脊椎固定の状況がある。他方には、神経成長、組織再生、血管新生、潰瘍、熱傷、傷害もしくは皮膚移植をはじめとする創傷治癒の促進または誘導のための、前駆細胞または骨髄細胞の増殖の誘導のための、臓器もしくは組織移植用の組織または細胞の処理もしくは保存の目的での増殖状態または分化状態の維持のための、胃腸管内壁の完全な状態のための、受胎能力、避妊もしくは妊娠における障害の治療のための、腱および／もしくは靭帯を含む結合組織、歯科インプラントを含む歯周組織または歯組織、ＣＮＳ組織および神経病理学的状態を含む神経組織、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚、粘膜、内皮、上皮に関連した組織の損傷したまたは罹患した組織の予防あるいは治療がある。
【００４０】
目のような感覚器官に関する疾患もまた、本発明の医薬組成物の好ましい適用例に含まれる。神経疾患としては、パーキンソン病およびアルツハイマー病も例として挙げられる。
【００４１】
実施例３および図６は、組換えヒトＧＤＦ−５（ＷＯ９６／３３２１５）および組換えヒトＧＤＦ−５（ｒｈＧＤＦ−５）のＭＬ変異体Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖを用いたアルカリホスファターゼアッセイの結果を記載する。組換えヒトＧＤＦ−５は、１００％の生物学的活性を有する標準／対照として使用した。変異体タンパク質は、このアッセイにおいて野生型タンパク質（ｒｈＧＤＦ−５）の活性の５８５．５％（１３３ｎｇ／ｍｌで）、３５６．３％（４００ｎｇ／ｍｌで）、および２３６．３％（１２００ｎｇ／ｍｌで）の生物学的活性を示す（複数回の実験の平均値）。したがって、平均活性は、野生型タンパク質（ｒｈＧＤＦ−５）の活性の５８５．５＋３５６．３＋２３６．３：３＝３９２．７％である。１種類のタンパク質濃度および１回の実験で変異体について測定された最低の活性は、野生型タンパク質の活性の１５０％であった。
【００４２】
本発明のＭＬ変異体は、さまざまな原核生物および真核生物の発現系において、特に原核生物での発現とそれに続く公知の方法に従った再生／リフォールディングによって、容易に生成することができる（例えばＷＯ９６／３３２１５を参照されたい）。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のＭＬ変異体をコードする核酸である。この核酸は、ヒトＧＤＦ−５のＭ４５３およびＭ４５６に相当する一方または両方の残基が、本出願において特定したアミノ酸の１つで置換されている配列を有する。これらのアミノ酸をコードする塩基トリプレットおよび遺伝子コードの縮重は一般的に知られている。本発明のタンパク質が適切な系での発現によってこの核酸から得られるかぎり、この核酸はＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列であり得る。
【００４４】
発現ベクターは本発明のさらなる実施形態であり、そこでは核酸が適切なベクター系に挿入され、そのベクター系はタンパク質の望ましい発現に応じて選択される。ベクター系は真核生物ベクター系であり得るが、原核生物ベクター系が好ましく、それを用いるとタンパク質を特に容易かつ純粋な方法で産生することができる。適切な発現ベクターは、ＷＯ９６／３３２１５などに示されている。発現ベクターはまた、遺伝子治療法などに使用できるウイルスベクターとすることもできる。
【００４５】
宿主細胞もまた本発明の実施形態である。宿主細胞は、それが本発明の核酸または発現ベクターを含むという点で、また、それが本発明のＭＬ変異体の発現のために核酸および発現ベクター中にそれぞれ存在する情報を使用できるという点で特徴づけられる。適切な宿主細胞は、好ましくは原核細胞、特に大腸菌株である。特に有用な宿主菌株は、例えばＷＯ９６／３３２１５に示されるような、大腸菌Ｗ３１１０の子孫である。好ましい実施形態では、宿主細胞（好ましくはヒト由来）はまた、それを必要とする患者への移植に有用なものでありうる。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、ＭＬ変異体に対する抗体である。本発明のこれらの抗体は、特許請求された組換えＭＬ変異体に対して特異的である。好ましくは、それらは、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸置換を含むＧＤＦ−５関連タンパク質のシスチンノット領域に対して特異的である。好ましくは、その抗体は、アミノ酸４００−４９５、好ましくは４２０−４６０、さらに好ましくは４４０−４６０、さらに好ましくはアミノ酸４５３−４５６にわたる、本発明のＧＤＦ関連タンパク質由来の組換えタンパク質の領域に対して特異的である。本発明のこれらの抗体は、公知の方法によって抗体を生じさせるための免疫原として、上述のような本発明のタンパク質の断片を用いることによって作製される。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、それらはいずれのアイソタイプのものであってもよい。また、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ２フラグメントなどの抗体フラグメントも包含される。抗体はまた、ヒト化抗体またはキメラ抗体などであってもよい。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従うＧＤＦ−５関連タンパク質の少なくとも１つのＭＬ変異体もしくは核酸もしくはベクターもしくは宿主細胞を含有する医薬組成物および／または診断用組成物である。ＧＤＦ−５関連タンパク質との関連ですでに発表されている、ほぼ全ての医薬組成物が適している。発現ベクターまたは宿主細胞は、医薬組成物および／または診断用組成物中の有効成分として有利であると考えられる。本発明のタンパク質と他のタンパク質との組合せもまた、好ましい医薬組成物において使用され得る。神経への適用のために特に好ましいのは、ＧＤＮＦのような他のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質との組合せである（ＷＯ９７／０３１８８を参照されたい）。軟骨および／または骨に関する適用のためには、一般的にＢＭＰとの組合せ、またはＢＭＰ−９（例えばＷＯ９６／３９１７０を参照）などの軟骨維持誘導タンパク質との組合せが有用である。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、コーディン（chordin）および／またはヘッジホッグ（hedgehog）タンパク質のような他のタンパク質との組合せもまた可能である（ＷＯ９７／０３１８８などを参照されたい）。当然のことながら、本発明はまた、例えば製薬上許容される補助剤および担体物質などのさらなる物質を含有する医薬組成物をも包含する。製剤は酸化防止剤、防腐剤、着色剤、香味剤、および乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または製薬上の補助剤を含みうる。例えば、適切な担体またはビヒクルは、注射用の水、生理食塩水、または血清アルブミンなどの適切な担体タンパク質と混合された生理食塩水でありうる。本発明の組成物を調製するのに好ましい酸化防止剤はアスコルビン酸である。
【００４８】
当技術分野で知られている（好ましくは低アレルギー性でｐＨ調整された）化粧品組成物は特に好ましく、こうした化粧品組成物には化粧水、パック、ローション、スキンミルクまたはミルキーローションが含まれる。化粧品は、活性化合物のほかに、このような製品に通常用いられる成分を含有する。このような成分の例は、油、脂肪、ワックス、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、粘度安定剤、キレート剤、緩衝剤、防腐剤、香料、染料、低級アルカノールなどである。必要に応じて、例えば抗炎症薬、抗菌剤、抗真菌剤、殺菌剤、ビタミン、日焼け防止剤、抗生物質、または他のにきび抑制剤などの、さらなる成分を組成物に配合することができる。
【００４９】
医薬組成物の溶媒もしくは希釈剤は、水性または非水性のいずれでもよく、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、スケール、無菌状態、安定性、溶解速度もしくは製剤の臭いを改善および／または維持することができる他の製薬上許容される添加剤を含有しうる。同様に、医薬として有効な物質の放出速度を調節および／または維持するために、本発明の医薬組成物に他の成分を加えることもできる。このような調節成分は、単位投与剤形または複数回投与剤形のいずれかで非経口投与用の投与量を処方するために、当技術分野において通常使用される物質である。本発明に従って調製される、最終的に製剤化された医薬組成物および／または診断用組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水したもしくは凍結乾燥した粉末の形で滅菌バイアル中に保存される。これらの製剤は、即時使用可能な剤形で、または例えば凍結乾燥粉末の場合には、投与前に再調製が必要な剤形で保存することができる。上記および別の適切な製剤処方は当技術分野において知られており、例えば、Gus Remington's Pharmaceutical Sciences（第18版、Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712）に記載される。このような製剤は、医薬として有効な成分の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼしうる。他の効果的な投与剤形は、非経口の徐放性製剤すなわち遅延製剤、吸入ミスト、または経口活性型製剤を包含する。例えば、徐放性製剤は、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）もしくはリポソームの粒子状調製物と結合した、またはそれに取り込まれたタンパク質を含みうる。本発明の医薬組成物はまた、例えば注入または注射による非経口投与のために製剤化されてもよく、また徐放性製剤または持続性循環製剤をも含みうる。このような非経口投与される治療用組成物は一般的に、製薬上許容される担体および／または希釈剤中に医薬として有効な成分を含有する、発熱物質フリーの、非経口的に許容される水溶液の形態である。
【００５０】
医薬組成物は、例えば骨または軟骨の再生を目的とする場合には、マトリックス材料を含むことができる。それは、タンパク質、核酸、発現ベクターまたは宿主細胞が生体適合性マトリックス材料の中および／またはマトリックス材料の上で用いられる場合、それらにとって有利である。本明細書で用いるマトリックス材料とは、細胞の動員、付着、増殖および分化の足場として、かつ／またはＧＤＦ−５関連タンパク質のＭＬ変異体の送達・貯蔵装置として機能する担体またはマトリックスを意味する。固体のマトリックスと対照的に、担体は、明確な表面や特定の形状を持たない、アルキルセルロース、プルロニック、ゼラチン、ポリエチレングリコール、デキストリン、植物油、糖類、および他の液体または粘性物質などの無定形の材料からなる。
【００５１】
マトリックス材料と併用した、ＧＤＦ−５関連タンパク質またはＢＭＰのような類似のモルフォゲンの使用は、広く発表されており、例えばＷＯ９８／２１９７２などに記載されている。これらのマトリックス材料は、本発明のＭＬ変異体に同様に適している。マトリックス材料は、例えば外科的に、患者に移植することができ、そこでタンパク質またはタンパク質をコードするＤＮＡはマトリックス材料から徐々に放出され、その後、長期間にわたって有効である。マトリックス材料が生体適合性であり、かつ意図した使用分野または適応症のために選択されるかぎり、あらゆるタイプのマトリックス材料が本発明に従って有用である。マトリックス材料は、天然の材料、改変された天然材料、および合成材料であり得る。形態形成タンパク質のためのすべての既知のマトリックスが含まれる。天然材料の例としては、例えば、自己由来の、異種の、もしくは異種相同（xenologous）の骨材料、コラーゲン、例えばＩ型およびIII型コラーゲン、またはチタンなどの金属がある。また、細胞外マトリックスの他の成分を使用することもできる。細胞外マトリックスは、例えば、様々なコラーゲン（例えばＩ、II、V、IX、X、XI、XIII型）、さらなるプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン（例えばコンドロイチン硫酸、バイグリカン、デコリンおよび／またはヒアルロン酸）、または非コラーゲン性タンパク質（例えばオステオポンチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、軟骨基質タンパク質、および象牙質リンタンパク質）を含む。上述したすべての天然材料は、人工的に改変された形態で使用することもできる。改変型天然材料の例としては、脱灰骨、熱灰化（thermoashed）骨鉱物、焼結骨もしくは化学的に架橋されたヒアルロン酸（ヒドロゲル）、または金属アロイがある。合成材料の例としては、ポリグリコール酸、ポリラクチドおよびポリラクチド誘導体（例えばポリ乳酸、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール、もしくはグリコリドＬ−ラクチドコポリマーなど）、さらにポリリン酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーのようなポリマー、またはリン酸カルシウムを含有する材料（βリン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、αリン酸三カルシウムおよびハイドロキシアパタイトなど）がある。上述の群の１つに属する他の有用なマトリックス材料のさらなる例は、Ｃａ（ＯＨ）２、サンゴ、天然の骨鉱物、キチン、非脱灰骨片、セラミック骨片、セラミック象牙質、放射線照射された海綿状骨粉、焼石膏、生体活性ガラス、アパタイト−ウォラストナイト含有ガラスセラミックである。また、上述の担体および／またはマトリックスの組合せ、例えばハイドロキシアパタイトとコラーゲンとの組合せ（例えば、以前は米国のOrquest社［現在はDePuy Acromed社］から入手可能なＨｅａｌｏｓ）、ポリグリコール酸とポリ乳酸もしくはポリラクチド誘導体との組合せ、またはサンゴ−コラーゲン複合材料もマトリックス材料を形成し得る。有用な担体およびマトリックスの非限定的なリストについては、さらにKirker-Head 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92を参照されたい。
【００５２】
以下の非限定的な実施例は、図面および配列表を参照して、本発明をさらに説明するためのものである。
【００５３】
配列番号１および２は、ヒトＧＤＦ−５前駆物質のＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。改善された生物学的活性を有する好ましいヒトＧＤＦ−５タンパク質変異体では、４５３位のメチオニン残基および／または４５６位のメチオニン残基が他のアミノ酸で置換されている。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ＭＬ変異体の作製、発現および精製
ヒトＧＤＦ−５、ヒトＧＤＦ−６およびヒトＧＤＦ−７タンパク質の成熟部分をコードするＤＮＡを、ヒトＲＯＢ−Ｃ２６骨原性細胞（Yamaguchiら 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225）からＲＴ−ＰＣＲ法によって単離し、その後原核生物のプラスミドベクターにライゲーションした。ＧＤＦ−５、−６および−７の成熟部分において機能的に重要なアミノ酸残基を特定するために、部位特異的変異誘発によってこれらの配列に様々な単一変異を導入した。個々の変異体はすべて、Stratageneから入手したＰｆｕＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰＮ Ｉエンドヌクレアーゼを含むＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キットを用いて、製造業者の取扱説明書に従って作製した。
【００５５】
そのプラスミドを用いて形質転換した細菌株Ｗ３１１０ＢＰをＩＰＴＧで誘導して、タンパク質を封入体として発現させた。標準的な方法に従って、ホモジナイズバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ＮａＯＨ ｐＨ８、８Ｍ 尿素）および洗浄バッファー（１Ｍ 尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．３、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ＮａＯＨ ｐＨ８．０）を用いてこれらの封入体を単離した。さらなる精製は、逆相カラムＡｑｕａｐｏｒｅ Ｏｃｔｙｌ（Applied Biosys、（ＣＶ＝７．８ｍＬ）１００×１０、２０μ、No 186470）で、１０４分間に１００％の溶出液Ａ（０．１％ＴＦＡ、ＨＰＬＣ Ｈ２Ｏ）から１００％の溶出液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、９０％ＣＨ３Ｎ、ＨＰＬＣ Ｈ２Ｏ）への勾配（流速：３ｍＬ／分）を用いて行った。ウェスタンブロット管理の後、変異体タンパク質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。
【００５６】
変異体タンパク質を溶解バッファー（６Ｍ グアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ＝８．０）に溶解し、タンパク質濃度を正確に２．６ｍｇ／ｍＬに調整し、ｐＨを８〜９に調整した。室温で２時間のインキュベーション後、穏やかに撹拌しながらリフォールディングバッファー（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＧＳＳＧ、２ｍＭ ＧＳＨ、３３ｍＭ Ｃｈａｐｓ、ｐＨ＝９．５）を添加して、０．１６ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。
【００５７】
この溶液をその後２２℃で４８時間インキュベートし、１８％ＨＣｌを添加してｐＨを３〜４に変化させることによりリフォールディングを停止させた。遠心分離後、２回目のＲＰ−ＨＰＬＣを同一条件下で行うことによって、リフォールディングしていない単量体を二量体型から分離した。二量体化したタンパク質を含有する画分をプールし、凍結乾燥させて−７０℃で保存した。
【００５８】
実施例２
ＡＬＰアッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＬ変異体の生物学的活性の測定
１×１０４個の骨原性／軟骨原性細胞株ＡＴＤＣ−５細胞を、９６ウェルプレートに加えた細胞培養液（α−ＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ）中で３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和で一晩インキュベートした。翌日、指定されたリガンド濃度を用いて、細胞をＧＤＦ−５関連タンパク質およびその変異体で７２時間刺激した。その後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。１００μＬのアルカリ溶解バッファー１（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ９．６、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で、室温にて１時間、細胞溶解を行った。その後、１００μＬのアルカリ溶解バッファー２を添加した（０．１Ｍ グリシン、ｐＨ９．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２＋２ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰＰ）。そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２、Ｈ２Ｏ飽和でインキュベートした。その後、１００μＬの３０ｇ／Ｌ ＮａＯＨによってＡＬＰ反応を停止させ、最後に、自動マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでの光学密度を測定したが、その際ブランク値の引き算を考慮した。
【００５９】
一例として、ｈＧＤＦ−５変異体Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖについての結果（２回の独立した実験の平均値）を図５に示す。変異体タンパク質は、このアッセイにおいて、野生型タンパク質（ｒｈＧＤＦ−５）の活性の５８５．５％（１３３ｎｇ／ｍｌで）、３５６．３％（４００ｎｇ／ｍｌで）、および２３６．３％（１２００ｎｇ／ｍｌで）の生物学的活性（複数回の実験の平均値）を示す。単一のタンパク質濃度および単一の実験で該変異体について測定された最低の活性は、野生型タンパク質の活性の１５０％であった。
【００６０】
実施例３
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異所性骨形成：ｒｈＧＤＦ−５、ｒｈＧＤＦ−５ Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６ＶおよびＢＭＰ−２についてのＳＣＩＤマウスモデル
ＧＤＦ−５関連タンパク質のＭＬ変異体の改善された骨誘導能についてもｉｎ  ｖｉｖｏで検証した。βリン酸三カルシウムセラミックス（ｃｈｒｏｎＯＳ（登録商標）、Synthes/ RMS Foundation）を３×３×３．５ｍｍの大きさの生体分解性の生体材料として用いた。増殖因子を次のように酢酸ナトリウムｐＨ４に溶解した：ｒｈＧＤＦ−５は７μｌ中１０μｇの濃度；ｒｈＧＤＦ−５ Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖは９μｌ中１０μｇの濃度。ＢＭＰ−２（ｉｎｄｕｃｔ  ＯＳ  Ｗｙｅｔｈ（登録商標）、ロット番号20603）は最初に滅菌水中に３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、次いで酢酸ナトリウムに７μｌ中１０μｇの濃度で溶解した。対照は７μｌの酢酸ナトリウムで飽和させた。コーティングした後、足場を１０分間乾燥させ、−２０℃で保存した。移植に先立って、足場に１０μｌのフィブロネクチンを付着させた。本研究では、重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）（３０＋／−２ｇ）を使用した。腹腔内全身麻酔のもとで、背中の１ｃｍの切開を介して皮下ポケットを手短に作製した。付着させた足場をポケットに挿入した。単一の結節縫合で傷口を閉じた。４週間後、動物を犠牲にして足場を回収した。組織検査とμＣＴスキャン（μＣＴ  ８０  ＳＣＡＮＣＯ  ＭＥＤＩＣＡＬ）を行った。組織検査の場合は、足場をパラフィンワックスに埋め込み、厚さ５μｍの切片をアリザリンレッドＳ（０．５％）とファーストグリーン（０．０４％）で染色して、足場内部の新しい構築カルシウムを検証した。
【００６１】
結果を図６および７に示す。対照には異所性の新骨形成の徴候がまったくなかった。ｒｈＧＤＦ−５を付着させた足場は、足場上にいくらかの骨が形成されて、中くらいの量の新骨形成を示した。ｒｈＧＤＦ−５ Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖは新骨形成の最高値を有し、ｒｈＧＤＦ−５ Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖを付着させた足場は、足場上に顕著な骨を示した。ＢＭＰ−２で処理した足場も足場上に顕著な骨を示したが、ｒｈＧＤＦ−５ Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖを付着させた足場ほどには均質でなかった。要約すると、これらの結果からは、ｒｈＧＤＦ−５ Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６ＶがこのＳＣＩＤマウスモデルにおいて非常に増大した骨形成に導くことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】配列番号１のヒトＧＤＦ−５前駆体タンパク質のさらなる構成を示す。アミノ酸００１−３８１はプレプロドメイン（太字体）、アミノ酸３８２−５０１は成熟タンパク質部分、アミノ酸４００−５０１はシスチンノットドメイン（下線）、アミノ酸４５３は残基メチオニン４５３（灰色の囲み）、アミノ酸４５６は残基メチオニン４５６（灰色の囲み）である。
【図２】ヒトＧＤＦ−５（配列番号１）、ヒトＧＤＦ−６（米国特許第５，６５８，８８２号からの配列２）およびヒトＧＤＦ−７（米国特許第５，６５８，８８２号からの配列２６）の１０２アミノ酸のシスチンノットドメインの比較を示す。３つの分子すべてにおいて同一のアミノ酸残基は、黒背景で強調表示される。ヒトＧＤＦ−５の残基Ｍ４５３およびＭ４５６、ならびにヒトＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７の対応する残基は矢印で示される。
【図３】Homo属（ヒト属）、さらにCercopithecus属（オナガザル属）、Macaca属（マカク属）、Bos属（ウシ属）、Mus属（ハツカネズミ属）、Gallus属（野鶏属）、Danio属（コイ科ダニオ属）およびXenopus属（ツメガエル属）由来の脊椎動物ＧＤＦ−５、−６および−７配列の１０２アミノ酸のシスチンノットドメインの比較を示す。これらの配列は図面に示された登録番号に基づいて「Entrez」NCBIタンパク質データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/）で入手可能である。ヒトＧＤＦ−５の残基Ｍ４５３およびＭ４５６、ならびに他のタンパク質の対応する残基は矢印で示される。
【図４】ヒトＧＤＦ−５のシスチンノットドメインに対する、既知のＢＭＰおよびＧＤＦのシスチンノットドメインの配列同一性の表を示す。
【図５】組換えヒトＧＤＦ−５（ｒｈＧＤＦ−５）およびｈＧＤＦ−５ ＭＬ変異体Ｍ４５３Ｖ／Ｍ４５６Ｖによるアルカリホスファターゼアッセイ（ＡＬＰ）の結果（実施例２に記載）を示す。
【図６】実施例３に記載されるＳＣＩＤマウスにおける移植４週間後の増殖因子処理足場の組織学的横断切片（新たに形成されたカルシウムのアリザリンレッドＳ染色）およびμＣＴスキャンを示す。
【図７】実施例３に記載される足場上の新骨形成の評価を示す。各群において、３匹の動物を試験し（ｎ＝３）、累積値を求めた。次の尺度を採用した：骨なしは０；１〜１０％の骨は１；１０〜５０％の骨は２；５０〜１００％の骨は３。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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