(57)【要約】  本発明は、いずれかの必要な目的のために、いずれかの有用なプロトコールにしたがって、生物材料に静水圧を適用すること；該生存しうる生物材料を予め定められた時間静水圧に維持すること；該静水圧を開放することを含む生存しうる生物材料の生存能力及び／又はストレス耐性の改善及び該材料の使用に関係する。該生物材料の使用は、補助生殖技術、バイオ技術及び／又はバイオテクノロジー操作の分野に適用できるいずれかの技術、プロトコールを取り入れている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体生物材料の生存能及び／又はストレス耐性を改善し、該材料を使用する方法であって、
（ａ）該生物材料に静水圧を適用し；
（ｂ）該生体生物材料を予め定められた時間静水圧において維持し；
（ｃ）該静水圧を開放し；
（ｄ）所望の目的のために、有用なプロトコールに従って該材料を使用する（但し、該使用は凍結保存を含まない）、
ことを含む、方法。
【請求項２】
前記静水圧が、１〜２００ＭＰａの範囲、好ましくは１０〜１００ＭＰａの範囲より好ましくは２０〜７５ＭＰａの範囲、最も好ましくは３０〜６０ＭＰａの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記静水圧が、０．００１秒〜６００分、好ましくは１秒〜３００分、より好ましくは１０秒〜１５０分、さらに好ましくは２０秒から９０分、最も好ましくは３０秒〜６０分適用される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記圧力が、瞬間的から６時間の時間をかけて徐々に開放される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記圧力が、予め定められた圧力プロフィールに従って適用され、維持され、開放される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記圧力が、予め定められた温度プロフィールに従って適用され、維持され、開放される請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生物材料が配偶子又は胚であり好ましくは脊椎動物の卵母細胞、精子、接合体、桑実胚、胚盤胞、胚、幹細胞からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記脊椎動物が、魚類、鳥類又は哺乳類、好ましくはウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジブタ、その他の家畜、ペット、ヒトを含む霊長類である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物材料が微生物の培養物である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物の培養物が細菌培養物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物材料の前記使用が、補助生殖技術（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、バイオ技術及び／又はバイオテクノロジーの操作の分野に適用できる技術、プロトコールのいずれかを組み込んでいる請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記使用が凍結乾燥である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ストレス耐容が温度上昇に対する耐性である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体生物材料（ｖｉａｂｌｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の生存能及び／又はストレス耐性を改善し、当該材料を使用する方法であって、生物材料へ静水圧を適用し；当該生物材料を予め定められた時間その静水圧に維持し；所望の目的のために有用なプロトコールに従って当該材料を使用することを含む、方法に関する。当該生物材料の使用には、生殖補助技術、バイオ技術及び／又はバイオテクノロジー操作の分野で適用することができる技術、プロトコールを取り入れることができる。
【背景技術】
【０００２】
増大したストレス耐性及びショックプロテインに関係するストレス要因として静水圧の作用は、軟骨細胞、イースト及び細菌において試験されてきたが、生殖体及び胚においては試験されていない。
【０００３】
致死以下のストレスが適用された微生物における生理学的機序は未だ充分に理解されていない。最近の試験では、細菌で正常なタンパク質合成があった際に、致死以下の寒冷ショックによって生じた不安定は、所謂寒冷ショックタンパク質（ＣＳＰｓ）の合成により克服されることが記述されている（Ｐｈａｄｔａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。これらのＣＳＰｓは、ＲＮＡシャペロン（Ｇｒａｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ，１９９９）又は転写活性化物質（ＬａＴｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）などの多くの機能を持つと考えられている；またそれらは凍結に対する保護の役割もしていると推測されている（Ｗｏｕｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。その他の調査では、ＣＳＰｓの生産は寒冷ショックのみならず、他の環境ストレスによっても誘発されることが認められた。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、あるタイプのＣＳＰは栄養ストレスにより生産される（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０００４】
他の試験は、高い静水圧処理は一定の寒冷誘発タンパク質及び熱ショックタンパク質の生産を引き起こすことを示した（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。寒冷ショックおよび高圧処理はいずれもＣＳＰレベルを増加させることから、交差防御の可能性に関して試験が行われた。Ｗｅｍｅｋａｍｐ−Ｋａｍｐｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、寒冷ショックを受けたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの加圧処理後の生存率のレベルは、３７℃で増殖したものより１００倍も高いことを発見した。
【０００５】
３０〜５０ＭＰａの範囲の静水圧は、通常種々生物の発育を阻害する：ＤＮＡ複製の開始は、最も圧力感受性の高い細胞内過程の一つである（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。その影響の程度は、圧縮の程度と時間によって変動する（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，１９７３）。細胞膜は圧力障害の主要な部位であることが認められている（Ｐａｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。高い静水圧による処理は、能動輸送又は受動的透過性のような膜機能を変化させることがあり、したがって細胞の物理‐化学的バランスを乱す可能性がある（Ｙａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，１９８３；Ａｌｄｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｂｒｕｎｅｒ，１９８５；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，１９８７；Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｌｅｙｔｒ，２００２；Ｒｏｕｔｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。圧力の適用により、部分的に又は完全に折りたたまれていない立体構造を含むタンパク質構造の変化を生じることがある。圧力はタンパク質の変性を引き起こすことがある（Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５；Ｗｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，１９８３；Ｊａｅｎｉｃｋｅ，１９９１；Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｃｋｅ，１９９４；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。最近の報告は、静水圧はショックタンパク質の生産を促進すると述べている（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｗｅｍｅｋａｍｐ−Ｋａｍｐｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００６】
変化する圧力条件における物理的又は生化学的過程はＬｅ  Ｃｈａｔｅｌｉｅｒの法則に支配される：容積の減少を伴う反応は総てかなり促進される（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，１９７３；Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐａｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。圧力効果の蓄積は一定のレベルを超えると致命的である；３００ＭＰａの高圧において一部の生体分子の不可逆的変化を生じるので、殆どの微生物及び多細胞生物は死ぬ。しかし、緩歩動物−活動状態では１００〜２００ＭＰａの間で死ぬ−は、脱水状態になった場合には６００ＭＰａまで生存することができる（Ｓｅｋｉ  ａｎｄ  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，１９９８）。初期の出版物は、圧力が徐々に減じられる限り、生物システムは高圧に耐えることができることを示した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９５４）。Ｐｒｉｂｅｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，２００４）も、加圧した胎仔を緩徐に回復できることを明らかにし、そして圧力を徐々に開放することにより有意に生存率を改善することを見出した。
【０００７】
種々のストレス刺激に応答して、熱ショック遺伝子が誘発され、熱ショックタンパク質（ＨＳＰｓ）を発現する。過去の試験では、熱ショック遺伝子の発現は、転写レベル及び転写後レベルの両者において調節され、そして熱ショック遺伝子の急速な転写誘導は特異的転写因子、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）の活性化に関係していることが明らかにされている。さらに、転写誘導は、シグナル‐及び細胞型に依存する様式で強度と動態の変動を生じることがある。Ｋａａｒｎｉｒａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）は、静水圧の形での力学的負荷はヒト軟骨細胞様細胞において熱ショック遺伝子の発現を増加させることを示した。継続的ＨＨＰに対する応答は、ＨＳＰ１の活性化及びｈｓｐ７０遺伝子の転写誘導なしに、ＨＳＰ７０のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを上昇させることが特徴である。ＨＳＰ７０の発現増加は、ｈｓｐ７０ｍＲＮＡ分子の安定化により仲介されていた。興味あることに、静的加圧とは逆に、周期的静水圧負荷は熱ショック遺伝子の誘導を生じなかった。Ｋａａｒｎｉｒａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）の知見は、ｈｓｐ７０遺伝子発現が、継続的高静水圧に応答して軟骨細胞様細胞において転写誘導を生じることなく、転写後調節されていることを示した。彼らは、ｍｓｐ７０ｍＲＮＡ安定化の形態での転写後調節が、ある形態のストレスにおいて著しく重要であるらしい熱ショック遺伝子調節の新たな様式を提供することを示唆した。
【０００８】
本発明者らは、致死以下のショックである高い静水圧（ＨＨＰ）は凍結マウス胚盤胞の解凍後生存率を有意に改善することを以前に発見した（Ｐｒｉｂｅｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ａ，ＷＯ２００５０２２９９６）。同様に、精液凍結保存において、平均解凍後運動能は、圧前処理して加圧したウシ精液では予め加圧せずに凍結した検体に比較して有意に優れていた。この結果は、凍結保存ウシ精液の解凍後運動能に対して予め加圧処理することの有用な効果を明確に記述している（Ｐｒｉｂｅｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ｂ）。ＨＨＰ工程の間の生物学的背景及び生化学的変化を探求するための今後の調査は、その保護効果の機序を明らかにするであろう。しかし、これらの試験は、ＨＨＰ前処理後の生物学的材料の冷凍保存に関係しており、それは多様な生物学的材料では、不可能であるか、或いは有効性が低い。
【０００９】
０℃以上の温度における精液の冷却又は保存の工程は、短時間精子を保存するために充分確立されている［Ｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｉｎｔｏ，１９９９；Ｏ‘Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４］。最適の精液処理（希釈）及び最適温度における保存により、採取後１〜２日以内では授精して、満足な生殖結果を得ることができる（しかし、新鮮な精液での授精に比較して受胎率は明らかに低い）［Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｉｎ，１９９３；Ｈａｒｒｏｐ，１９５４；ｌｊａｚ  ａｎｄ  Ｄｕｃｈａｒｍｅ，１９９５；Ｋａｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７］。これらの方法は極めて類似する基本的ステップに従っている：
【００１０】
１．精液採取
２．体温における精液の希釈
３．希釈精液の任意の遠心分離。最適精子濃度に調節するために再懸濁。
４．（再）懸濁精液を室温又は４〜５℃又は検体の凍結温度以上のいずれかの温度に保つ。
５．精液による授精。
【００１１】
保存の間に生存能力を喪失する精子と同様に、胚又は卵母細胞の生存能力も、母体の生理的環境から取り出された後には減少する（例えば、インビトロ培養、活性化、胚の移植、分割、性別決定、バイオプシー、インビトロ成熟、ＩＣＳＩ、クローニング又はいずれかのタイプのバイオテクノロジー操作）。このために、日常の保存、授精又は移植から、最も複雑なバイオテクノロジーの方法までを含むいずれかの方法の前又は後の配偶子及び胚の生存能／生存能力の改善は、科学的及び経済的に非常に重要である。
【００１２】
同様に、例えば、細菌のような微生物の保存（例えば、凍結乾燥）の間に、微生物の生存能力は大きく損なわれる。生存能力の改善を伴う操作の有効性を改善することは、科学的にそして経済的に大きな意義を有する。
【００１３】
上記から明らかであるように、バイオテクノロジーのプロトコールに広く使用される生物材料の生存能力を改善することに対するニーズはこの技術分野において未だに存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、静水圧刺激の適用により、生物材料の生存能力を有意に改善することができ、そしてこの方法を適用することによりバイオテクノロジーのプロトコールの多くの状態をより有効に実施することができることを見出した。本明細書は、この知見に関する広範囲の実施例を示す：胚移植、授精に対して本方法を適用した後の受胎率及び出生率の改善；卵母細胞に対して本方法を適用することにより、そのストレス耐性は大きく増加し、その結果分裂率及び高い胚盤胞形成率を生じる；精液に本方法を適用し、続いて従来の希釈及び保存方法を行うことにより、精子の運動能は有意に長期間保存された。
【００１５】
この改善は、生物材料の保存及び／又は操作のいずれの段階においても培地の凍結点以下の温度の適用を避けた場合でさえ存在したことは、やはり驚くべきことであった。この結果は、本方法及び類似のＨＨＰ法の有用性にとって重要な実用的意義がある。
【００１６】
この文脈において、本発明の思想は、種々の補助生殖技術（ＡＲＴ）及びその他の方法に使用されるバイオ技術／バイオテクノロジーのプロトコール又は方法のいずれにも等しく適用することができ、そしてその選択は本発明により限定されないことを、われわれは強調する必要がある。改良されたプロトコールに含めるべき唯一の必要なステップは静水圧適用のステップである；そのパラメーターは、本説明の技術にしたがって、当業者によって容易に最適化することができる。
【００１７】
精液の凍結により雄ブタ（ウマでも同じ）での精子の解凍後生存率は悪くなるので、これらの動物種の繁殖のための最も一般的方法は、新鮮、懸濁、懸濁と冷却、又は懸濁と冷蔵を施した精液による授精である。ＨＨＰ前処理精液の使用により、与えられた温度における保存は有意に良くなり、また、高品質を維持した保存時間はかなり増加する。
【００１８】
同様に、インビトロ及びインビボ胚生産、胚のインビトロ培養、雌雄鑑別、分割、遺伝子導入、胚移植、卵母細胞成熟、活性化、ＩＣＳＩ，クローニング又は胚、卵母細胞又は精子における何らかのバイオ技術／バイオテクノロジー操作は、その生存能／生存能力を大きく減少させる。上記特徴の延長として、ＨＨＰ前処理の使用により、配偶子及び胚は増加した生存能力を持ちながら、いずれかのタイプの補助生殖技術（ＡＲＴ）又はバイオ技術／バイオテクノロジー操作に用いられるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の開示
以上のように、本発明は生体生物材料の生存能及び／又はストレス耐性を改善し、当該材料を使用する方法であって；
（ａ）当該生体生物材料に静水圧を適用し；
（ｂ）当該生体生物材料を予め定めた時間静水圧に維持し；
（ｃ）静水圧を開放し；
（ｄ）いずれか有用なプロトコールに従い所望の目的のために当該材料を使用する（但し、当該使用が冷凍保存を含まない場合に限る）方法に関する。
【００２０】
一態様において、本発明による方法において使用される圧力は１〜２００ＭＰａの範囲である。好ましい態様において、圧力は、好ましくは１０〜１００ＭＰａの範囲、より好ましくは２０〜７５ＭＰａの範囲、最も好ましくは３０〜６０ＭＰａの範囲である。
【００２１】
他の態様において、本発明の方法において使用される静水圧は「瞬間」から３００分の間の時間適用される。好ましい態様において、圧力は、０．００１秒〜６００分の間の時間適用されるのが好ましく、好ましくは１秒〜３００分、より好ましくは１０秒〜１５０分、さらに好ましくは２０秒〜９０分、最も好ましくは３０秒〜６０分適用する。
【００２２】
他の態様において、圧力を開放する時間は１０秒〜２時間、又は１分〜１時間、又は他の場合には１０分及び３０分である。圧力の開放は瞬間的ということもあり得る。
【００２３】
好ましい態様において、本発明は、予め定められた圧力プロフィールに従って圧力が適用され、維持され、開放される方法に関する。
【００２４】
他の好ましい態様において、本発明は、予め定められた温度プロフィールに従って圧力が適用され、維持され、開放される方法に関する。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の方法は、脊椎動物の卵母細胞、精子、接合体、桑実胚、胚盤胞、胚、幹細胞からなる群から選択される配偶子及び胚に関連して使用される。
【００２６】
好ましい態様は、当該脊椎動物が、魚類、鳥類又は哺乳類、好ましくはウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、その他の家畜、ペット、ヒトを含む霊長類である方法に関する。
【００２７】
他の態様において、本発明は当該生物材料が微生物の培養物である方法に関する。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、当該微生物の培養物は細菌培養物である。
【００２９】
本発明はさらに、上記のいずれかの方法であって、当該生物材料の使用が、補助生殖技術、バイオ技術及び／又はバイオテクノロジーの操作の分野において適用できる、技術、プロトコールを取り入れている、方法に関する。
【００３０】
好ましい態様において、本発明による方法に使用されるプロトコールは凍結乾燥である。
【００３１】
その他の態様において、本発明の方法は生体生物材料のストレス耐性を改善するために適用され、上昇した温度に対する耐性が改善される。
【００３２】
本発明の思想を実証する目的で、マウス胚、ウシ及びブタの精子、ブタ卵母細胞及び二つの細菌種を使用して、さらに詳細に本発明を記述する。開示された方法は、いずれかのＡＲＴの候補である哺乳類、鳥類又は魚類の配偶子及び胚の総てに、或いはより一般的に、バイオ技術またはバイオテクノロジーの方法に使用できる総てのタイプの生体生物材料に等しく適用されることが明らかになるはずである。入手及び操作が容易であるために、マウス胚、ブタ及びウシの精液、ブタ卵母細胞及び細菌２種類が、詳細な検討の対象として選択された。解釈と外挿が容易であるために、単純なＡＲＴ方法が選択された：胚移植、人工授精、卵母細胞のインビトロ活性化及び精液のインビトロ保存。微生物による発想立証実験に関しては、高静水圧前／処理の有益な効果を示すために、細菌の凍結乾燥が選択された。これらの方法は、その産業、医療及び研究への適用可能性の基礎にある細菌学、ＡＲＴ及び関連バイオ技術又はバイオテクノロジーの方法の基本的プロトコールである。しかし、本発明の方法において、同様に本説明において、「マウス胚」又は「ウシ又はブタの精液」は、用語「配偶子又は胚」と互換的に使用することがある。例えば、脊椎動物及びヒトの着床前及び後の胚、卵母細胞及び精子は等しく本方法を適用することができる。
【００３３】
本発明の文脈において、表現「生体生物材料」とは、一般的に好ましい条件下で生きる、発育する或いは発生する能力を持つ、生体生物の一部又はそれに由来することを意味する。限定せずに、生体生物材料は、細胞、細胞培養、組織検体、組織培養、臓器などであり得る。
【００３４】
微生物に関して、その用語は顕微鏡的な生物、すなわち、小さくて肉眼では見えない生物のことをいう。微生物は、細菌、真菌、古細菌又は真核生物であり得る。微生物は一細胞又は単細胞生物として記述されることが多い；しかし、一部の単細胞原生生物は肉眼で見ることができ、そして一部の多細胞動物種は顕微鏡的である。
【００３５】
高度に発達した真核生物として、マウス胚は、緩歩動物及び細菌より静水圧の影響を受けやすい。したがって、最初の目的はマウス胚の形態及び生存に関する基本的特徴を加圧下で確立することである。
【００３６】
マウス胚の圧力耐性を調べるために、慎重に計画された実験が実施された。使用された圧力及び時間のスケールの選択は、後の実用的応用に最大の適用範囲を与えるために決められた。したがって、本発明の方法に使用される圧力は１ＭＰａから１５０ＭＰａの範囲で選択された。より具体的には、拡大した胚盤胞段階の胚に適用できる静水圧は、１，５，１０，１５，２０，２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０又は１５０ＭＰａ又はこれらの中間範囲にあるいずれかの値である。同様に、マウス胚を高い静水圧の下に維持するために、広範囲の時間幅を選択することができる。特にマウス胚は選択された圧力の下に、１秒から６時間、より具体的には１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分、３００分、又は３６０分の時間維持される。圧力の下で胚が生存する時間は圧の増加に伴って減少する。
【００３７】
胚はその形態になんらの眼に見える変化を生ぜずにかなりの量の圧力に耐えて生存することができる（例えば、９０ＭＰａの１秒間、又は３０ＭＰａの２時間）。適用した圧力処理の大きさと時間に応じて、胚は圧縮された。理論により本発明の範囲を制限するものではないが、圧力は胚盤胞から水を搾り出す直接の原因にはなり得ないとわれわれは考えている。引用した文献に基づくと、胚の圧縮は、種々のタンパク質（寒冷ショックタンパク質、ＣＳＰｓ）の圧誘発生産、タンパク質構造及び代謝過程の可逆的変化の結果によるものであった。圧縮胚は４〜５時間のインビトロ培養の後に正常の形態を取り戻すことができ、そして対照に類似した発達を再開する（例えば、９０ＭＰａ，３０分間又は３０ＭＰａ，３時間を適用された胚）。
【００３８】
上記の「致死以下の範囲」（例えば、圧縮胚盤胞）の胚は、後の移植又はいずれかのＡＲＴ又はバイオテクノロジーの方法のために好ましく選択することができる。加圧後、拡大した胚盤胞は圧縮され、この形で３〜４時間留まり、次いで再拡大する。この現象に基づいて、前に圧力で処理された胚を選択することができる。胚の形態的変化及び圧力前処理の有用作用は、タンパク質構造の変化及び／又は特徴及び／又は種々の圧力誘導タンパク質の生産増強から生じる可能性があるので、これらのタンパク質を調べることは、何らかの更なる処理の前に生物材料に適用される静水圧の指標になる可能性がある。
【００３９】
圧力が高くなるほど、胚の生存時間は短い。圧力の影響がある大きさ及び時間を超えると不可逆的な変化を生じた：胚はインビトロ培養２時間後に崩壊するか又は除圧後に既に崩壊していた（例えば、９０ＭＰａの２時間又は３０ＭＰａの５時間を適用された胚）。使用した特定の生物材料に関する定型的な実験により、当業者はこれらの限界圧力及び限界時間を決定できるはずである。
【００４０】
加圧された胚は徐々に除圧することによりその生存率を増加させることができることは、理解されるであろう。試験により、加圧された胚は、圧を徐々に回復すると、その生存率は著しく増加することが示された。９０ＭＰａで６０分は致命的であるが、１２０分の緩徐な除圧が使用された場合には８０％が生存した。特定の応用を考慮して当業者が決定しなければならない除圧時間も本発明の特徴である。特に、選択された圧力の下に維持されたマウス胚は、１秒〜４時間の間、より具体的には、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分又は２４０分の時間で除圧される。
【００４１】
本発明による圧力処理が、所望の圧力プロフィールに従って実施することができることは、当業者により理解されるであろう。したがって、適用、維持及び開放されるときの圧力の時間依存性は、圧力処理の総ての時点、すなわち、圧力を適用する間、最高圧力期の間、及び圧力開放相の間を含めて、種々の時間‐圧力曲線に従って変動する可能性がある。いずれかの所与の時点における圧力レベルは、過剰の実験をせずに本教示に基づいて容易に実施される予備的実験にしたがって最適化し、セットすることができる。
【００４２】
他の好ましい態様において、本発明の方法は予め定めた温度プロフィールに従って実施することができる。用語「温度プロフィール」とは、圧力処理過程の間に測定しセットすることができ、そして適用した圧力と関係なく調節できるような時間‐温度プロフィールのことである。好ましい態様において、圧力処理は一つの温度において実施されるが、目的の生物材料が、圧力処理の異なる段階又は段階の一部において異なる温度を使用することを要求する可能性がある。セットする温度は、任意の温度、例えば、室温、環境温度、生物材料が由来した起源の自然体温、該自然体温より若干高い温度などである可能性がある。当業者は、圧力処理の有効性を対照実験と比較して分析することにより、いずれかの所与の温度プロフィールの適用可能性を容易に決定することができる。
【００４３】
理論により限定するものではないが、この特徴の可能な解釈は、圧力の下にかなりの量のＣＯ２が発生することであろう（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ  １９９５）。適用された圧力の大きさに依存する形で反応は容積の減少を伴うので（−０．２６ｍｌ／ｍｏｌ）、圧の上昇によりＣＯ２の水和及びイオン化（ＨＣＯ３−及びＨ＋）は促進される（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３）。細胞内で生産された二酸化炭素は直ちに溶解し、解離してＨＣＯ３−及びＨ＋を生じて、細胞内ｐＨを低下させる（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ  １９９５，１９９７，１９９８，Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。上昇した圧力により維持される平衡は、大気圧における胚にとっては致命的であることが想像される。圧力の瞬間的低下は細胞質の水和されイオン化している形からＣＯ２の発生増加を生じ、直ちに胚の死を生じると考えることもできる。静水圧上昇により可逆的に不活化された原形質膜タンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）（Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．１９７５，Ｐｅｑｕｅｕｘ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｅｓ  １９７８）は、一定の除圧時間の条件において、再び機能し始め、（受動的拡散と共に）徐々に平衡を生理的状態の方向にシフトする。
【００４４】
注意深く選択した加圧パラメーターによる処理の後に、胚をインビトロにおいて培養し、次いで偽妊娠母体に移植した。胚を圧力処理した後に生まれた仔の数は、圧力処理せずに生まれた仔の数より多かった。
【００４５】
胚の処理と同様に、ブタ卵母細胞を加圧し、その圧耐性を試験した。次いで、注意深くパラメーターを選択して、卵母細胞を前処理し、最適値よりも１０倍強い電気衝撃で刺激して、分裂とその後の分化を胚盤胞段階まで試験した。分裂しさらに分化したインビトロ活性化卵母細胞の数は、圧力処理をしないより、処理を行ったほうが多かった。
【００４６】
胚の処理と同様に、ウシ及びブタの精液を加圧して、精子の圧耐性を試験した。次いで注意深く選択したパラメーターを使用して、精液を前処理し、そしてインビトロで種々の温度に維持した。精液採取からの種々の時点における運動性精子の数は、圧力処理しないより、圧力処理したほうが多かった。圧力処理ブタ精液による授精は、この施設において通常達成されるより多い産仔数を生じた。
【００４７】
上記処理と同様に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ検体を加圧し、凍結乾燥後の細菌の生存率を増加するか否かを試験した。選択した圧力／時間における凍結乾燥後生存細菌の数は、圧力処理を行わないより行った場合に多かった。
【００４８】
本説明では、モデル系としてマウス胚盤胞、ブタ卵母細胞、ブタ及びウシ精子及び二種の細菌を使用して、静水圧の適用により、生物材料の生存能／生存能力の改善を示す。これは、処理した後、加圧された胚を培地へ及び／又は偽妊娠レシピエントへ移植；又はインビトロ活性化；又は処理精液による授精又は凍結乾燥後の細菌の生存を計測することによりそれぞれ評価される。インビトロの発達、着床及びその後の子宮内成長並びに分裂及びその後の成長は、胚及び卵母細胞の生存能力の明白な証明である。同様に、精液のインビトロ保存及び授精は、高い運動性精子数（インビトロ）及び高い妊娠率を生じ、この方法の適用可能性を支持している。
【００４９】
加圧は、本発明のプロトコールに適用できる入手可能ないずれの加圧装置を使用して実施できる。このような装置の非限定的例は、例えば、ＷＯ２００５０２２９９６又は本願明細書に記載されている装置である。
【００５０】
本発明は、以下に記述される実験的実施例によりさらに説明されるが、本発明の範囲は実施例に記述された特別な態様によって決して限定されない。
【実施例１】
【００５１】
室温における種々の圧力のマウス胚の生存、着床及び出生率に対する影響
【００５２】
胚の生産及び培養
一細胞期マウス胚を過排卵６〜８週齢ＣＢ６Ｆ１ドナーから採取し、そして３７℃において５％ＣＯ２、最大湿度の空気中、Ｇ１．２及びＧ２．２培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ）で拡大胚盤胞段階まで培養した。
【００５３】
加圧
胚盤胞を０．０８ｍｌプラスチックストローの中（７〜９個の胚／ストロー）にＭ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で装填した。加圧液としてＭ２を充たしたストローを、１５０ＭＰａまでの静水圧を発生し、正確に検出できる特注のチャンバーに入れた。必要量の圧を達成するのに２０秒間から５分間を要した（それぞれ１０ＭＰａから１５０ＭＰａ）；圧力の開放時間は２〜４秒であった。
【００５４】
移植
インビボ評価のために、６００バールで３０分間加圧した胚を上記のようにＧ２．２中で２時間培養した。次いで、３日目の偽妊娠レシピエントに移植した（動物当たり７〜１２個の胚）。非処理の未分化胚芽細胞を対照として移植した。
【００５５】
評価及び統計解析
結論は、インビトロで２４時間継続培養の間の４００×拡大において検査した胚の外観的形態の変化、及び移植胚の出生率から導いた。割球の顕微鏡的形態変化なし、胞胚腔の再拡張及び透明帯の孵化をインビトロ生存の徴候とした。妊娠雌動物の１８日目の解剖における胎仔の数、又は健康出生仔の数を胚のインビボ生存の証拠とした。
生存率を、χ２（カイ二乗）検定により対照と比較した。
【００５６】
本実験において、胚は、１０〜１５０ＭＰａ（１０ＭＰａ間隔）の種々の静水圧に、１秒〜３００分の種々の時間、室温で暴露された。
【００５７】
一定の量の圧力及び時間を越える圧力と時間の処理は可逆的な形態変化を生じた。拡張した胚盤胞は透明帯を内側へ圧縮した：胚盤腔は消失し、割球の大きさは減少したが、その構造の統合性は変化を示さなかった。インビトロ培養の４〜５時間後、これらの胚盤胞は再拡張し、そして２４時間において透明帯から孵化した（ａ）。少ない衝撃を受けた胚は形態的変化を示さず、インビトロ培養２４時間以内に孵化したが（ｂ）、一方大きな衝撃を受けた胚は圧縮段階から再拡張せず、２時間以内に崩壊するか又は除圧後既に崩壊していた（ｃ）。
【００５８】
インビボ評価については、処理胚を除圧後２時間インビトロ培養して「生存」（ａ及びｂ）及び「死亡」（ｃ）を判定し、レシピエントに別々に移植した。圧力処理胚２９個を偽妊娠母動物に移植し、そのうち２８が出生した。この率は、非処理胚により達成された率より高かった。現行技術水準のデータ（約８５％）より優れる有意な改善も、圧力前処理の確実さを示している。最適圧力及び時間のパラメーターが適用された場合には、生物材料の生存能力の改善は、ベースラインの値が極めて高く、既に産業にとって充分であったとしても、それでも有意であり得る。しかし、ＡＲＴの技術分野においては、総てのパーセンテージで経済的意義を付加する可能性がある。
【実施例２】
【００５９】
室温の種々の圧力におけるウシ精子の生存能力、精子運動性の減少予防に対する圧力処理の影響
【００６０】
ウシ精液は通常凍結保存されるが、本方法の実用性を産業的に重要な系においてさらに試験した。
【００６１】
１３頭の雄ウシの精液を、ＡｎｄｒｏＭｅｄ希釈液（ＭｉｎｉＴｕｂ，Ｔｉｅｆｅｎｂａｃｈ，ドイツ）で、８×１０７／ｍＬの精子濃度に希釈した。希釈した精子を２５℃で０．２５‐ｍＬのストローの中に装填した。ストローを処理群と非処理群に分けた。処理群を、コンピューターで調節した加圧装置（Ｃｒｙｏ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，ブダペスト、ハンガリー）を使用して、９種類のプロフィールで加圧した。総合／段階的運動性検査には、ＣＡＳＡ装置、Ｓｐｅｒｍ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ｍｉｎｉｔｕｂ，Ｔｉｅｆｅｎｂａｃｈ，ドイツ）を使用した。
【００６２】
６００バール領域以下の圧力処理は精子生存に悪影響はないことが結論された。室温における精液保存の８時間後、処理／非処理検体の運動性を再度分析した：運動細胞の比率は処理検体の方が多かった。
【実施例３】
【００６３】
室温の種々の圧力におけるブタ精子の生存能力、精子運動性の減少予防に対する圧力処理の影響
【００６４】
本発明による方法の応用性をさらに調べるために、ブタ精子の生存を調べた。この場合は、室温保存がむしろ産業上の標準である。
【００６５】
精液採取
雄ブタから週２回精液を採取した。濾過した精子リッチなフラクションをグローブハンド法により２５０−ｍｌ真空保温壜に採取し、次いで精子を評価した（Ｈａｎｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ｈｏｖｅｌｌ，１９５９）。射精のうち７０％超の運動精子を含む精子リッチなフラクションを使用した。
【００６６】
精液の調製
凍結精液の調製は、若干の変更を加えて、以前に記述した方法に従った（Ａｌｍｌｉｄ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８；Ｍａｘｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９７）。簡単に記述すると、精液を保温壜中で、３７℃Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ  Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＴＳ）希釈液で１：２に希釈し、次いで採取後１時間室温（２０〜２３℃）に冷却した。冷却後、精液を１０ｍｌの試験管に移し、室温で３分間２４００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを室温でラクトース及び卵黄希釈液に再懸濁した。次いで、グリセロール希釈液（第二希釈液）及びＥｑｕｅｘペースト（Ｍｉｎｉｔｕｂ，Ｔｉｅｆｅｎｂａｃｈ，ドイツ）を精液に加えて、６％グリセロール及び０．５％Ｅｑｕｅｘの最終濃度にした。ミニストロー、０．２５ｍｌ（ＩＭＶ，Ｌ’Ａｉｇｌｅ，フランス）に精液を充填し、ストローをヒートシールした。濃度は、３００×１０６精子／ｍｌになるようにした。
【００６７】
加圧
ストローを、加圧装置の加圧チャンバーに入れ、加圧媒体として水を充たし、そして予め定めた圧力プロトコールを適用した。特注の加圧装置は、１０〜１０００バールの範囲で正確に調節した圧力を供給することができた。それはステンレススチール（ＫＯ  ３３）製で、内径２０×２２０ｍｍ、圧力ゲージが連結されていた。加圧チャンバー内を移動するピストンが静水圧を発生させた。加圧及び除圧の速さは２００バール／分であった。
【００６８】
検体は、室温（ＲＴ）において、２００、４００、又は８００バールのいずれかで、４０，８０又は１２０分間のいずれかで、加圧した。非加圧検体は、対応する時間、室温に維持した。
【００６９】
評価
２０分インキュバーションの後、５μｌの２滴をスライドクラス上に移し、２枚の２２ｍｍ×２２ｍｍカバースリップで覆った。検体を、３７℃顕微鏡ステージ及び位相差光源（２０Ｘ，Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）を装着した顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ３０）に挿入し、ＣＡＳＡ装置、ＳｐｅｒｍＶｉｓｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０（Ｍｉｎｉｔｕｂ，Ｔｉｅｆｅｎｂａｃｈ，ドイツ）により各液滴の５−５視野を評価した。ＶＳＬ＞１０  μｍ／ｓ及びＡＯＣ＞１０の精子を進行性運動性と判断した。
【００７０】
結果
混合モデル（因子：時間、圧力、日付（ランダム））を使用して運動能パラメーターを分析した後、圧力因子は有意であることが立証された（Ｐ＝０．００１，総運動能；Ｐ＜０．００１，進行性運動能）。圧力処理の多重比較の後に、８００バール処理は、他のレベルより有意に悪影響があることが立証された（Ｐ＜０．００１，総運動能；Ｐ＝０．０１０３，進行性運動能）（表１）。
【００７１】
表１．種々の圧力処理後の運動能パラメーター（平均運動能（標準偏差））
【００７２】
【表１】
2009516523.tif 000002
【００７３】
ｔｍ：総運動能；ｐｍ：進行性運動能。処理組合せ毎に２回反復した。
【００７４】
次に、圧力処理の適用が、５時間の寒冷順応時間後の精子運動率に影響するか否か調べた。混合モデルを再度圧力、時間及び検査（二つのレベル：５時間の順応時間の前後）、固定因子の相互作用及びランダム因子としての日付に適用した。圧力及び検査因子のみが有意であることが立証された（表２）。
【００７５】
表２．：５時間の寒冷順応時間後の運動能パラメーター（平均運動能（標準偏差））
【００７６】
【表２】
2009516523.tif 000003
【００７７】
ｔｍ：総運動能；ｐｍ：進行性運動能。４０，８０及び１２０分間の圧力処理のそれぞれについて、４，３及び２回の反復を行った。
【００７８】
非加圧（ａｔｍ）検体の総運動能は有意に減少し、一方、２００及び４００バール処理後の運動能は、最初の運動能に比較して、５時間の寒冷順応時間後に減少しなかった。
【実施例４】
【００７９】
ブタ精子の授精能力に対する圧力処理の影響
【００８０】
圧力処理した精子の受精能力を観察すると共に出生仔に奇形を生じるか調べるために、生産から除外された５匹の雌ブタを、圧力処理した雄ブタの精液で受精させた。
【００８１】
２匹の雄ブタの射精を、体温において市販希釈剤で１：３に希釈し、次いで、検体を３０分間で室温に冷却し、この希釈精液を注入バッグに充填した。この注入バッグを自動加圧装置（Ｃｒｙｏ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．，ブダペスト、ハンガリー）の圧力チャンバーに入れ、室温において圧力プログラムを実施した。
【００８２】
使用した圧力処理は、３００バール、９０分間であった。処理後、室温において精液検体を同じ市販の希釈剤でさらに希釈し、加圧後１時間以内に５匹の雌ブタに授精を行った最初の授精の１２時間後に５℃で対応する時間置いた処理精液で再度授精を行った。
【００８３】
超音波検査により、５匹の雌ブタは総て妊娠していることが示された。正常な出産により、５８匹の健康な仔ブタが出生した。この仔ブタには欠陥又は奇形は全くなかった。
【００８４】
適用した圧力処理はブタ精子の授精能力を維持し、また出生仔に欠陥及び奇形を全く生じないことが結論された。この農場における平均産仔数は９．８仔ブタ／雌ブタであったが、圧力処理の適用により、１００％の妊娠率及び１１．６の平均産仔数を生じた。したがって、圧力処理の適用により、達成される平均産仔数も増加することも結論された。
【実施例５】
【００８５】
種々の圧力処理後のブタ卵母細胞の生存（インビトロ活性化後の分裂）
【００８６】
卵母細胞の圧力耐性を測定するために、種々の組合せによる圧力処理後に、インビトロ成熟ブタ卵母細胞をインビトロ電気活性化により活性化した。
【００８７】
インビトロで成熟し、裸にした６００個の卵母細胞を、処理群（ｎ＝１５〜２０卵母細胞／群）及び対照群に分けた。処理群は、０．５ｍｌ人工ストロー中ＴＣＭ−ＨＥＰＥＳ媒体（ストローは鉱物油及び金属ボールでシールした）の中で、２００〜４００バール、３０〜９０分間、２４℃及び３８．５℃において加圧した。対照群は同じ環境に維持し、一つの対照群は、対応する時間、サーモスタット中ＩＶＭ培地中に置いた。処理後、卵母細胞をインビトロで活性化し、さらに発達させるために、３８．５℃のサーモスタットの中の培地中に入れた。活性化の４８時間後に分裂をチェックした。表３は、インビトロ活性化の後に分裂した卵母細胞の種々の群におけるパーセンテージを示す。
【００８８】
表３．２４℃及び３８．５℃において加圧処理した後、インビトロ活性化の後に分裂した卵母細胞のパーセンテージ
【００８９】
【表３】
2009516523.tif 000004
【００９０】
３０〜９０分間の２００〜４００バール処理は成熟ブタ卵母細胞に対して有害ではないことが結論された。また、２４℃における３０〜６０分間の４００バール処理、及び３８．５℃における３０〜６０分間の２００バール処理は、対応する対照群よりも高い分裂率を生じた。６００〜８００バール／３０〜９０分間の処理も行われた。これらの群において、この処理下で生存した卵母細胞はない；このような圧力パラメーターは有害である。
【実施例６】
【００９１】
種々の組合せによる圧力処理後に、最適より１０倍強い電気パルスにより活性化されたインビトロ成熟ブタ卵母細胞の生存
【００９２】
処理した卵母細胞は有害な電気ショックに対してより良く生存するか否かを調べるために、種々の組合せによる圧力処理後に、インビトロで１０倍強い電気活性化により、インビトロ成熟ブタ卵母細胞を活性化した。
【００９３】
３００〜６００個のインビトロ成熟卵母細胞（毎日）を処理群（ｎ＝１５〜２０卵母細胞／群）及び対照群に分けた。卵丘細胞の群を、０．５ｍｌ人工ストロー中ＴＣＭ−ＨＥＰＥＳ媒体（ストローは鉱物油及び金属ボールでシールした）の中で、２００〜８００バール、３０〜１２０分間、２４℃において加圧した。対照群は同じ環境に維持し、一つの対照群は、対応する時間、サーモスタット中ＩＶＭ培地中に置いた。処理後、卵母細胞をボルテックスで裸にし、次いで、最適条件より１０倍強い電気インパルスでインビトロにおいて活性化し、次いで、さらに発達させるために３８．５℃のサーモスタット中培地の中に入れた。活性化後４８時間分裂をチェックし、胚盤胞形成を６日目に検査した。実験は３回反復した。
【００９４】
表４．種々の群における、１０倍の電気パルスによるインビトロ活性化後に分裂し、さらに発達した卵母細胞のパーセンテージ
【００９５】
【表４】
2009516523.tif 000005
【００９６】
３０〜６０分間の２００〜４００バール処理により、処理しない場合又は６００〜８００バール処理の場合より有意に多い数の生存卵母細胞を生じた。３０〜６０分間の２００バール処理は、対照又は他の群に比較して有意に優れた分裂率及び胚盤胞率を与えることが示されたと結論された。
【実施例７】
【００９７】
種々の組合せによる圧力処理後の凍結乾燥による細菌の生存
【００９８】
この実験ために、二種の微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍが使用された。細胞数はＴＧＥ（Ｔｒｉｐｔｏｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ）栄養培地（ＭＥＲＣＫ）及びＭＲＳ寒天培地（ＭＥＲＣＫ）上でそれぞれ測定した。細胞数は、処理群調製前、圧力処理後及び凍結乾燥の後３７℃で９６時間インキュベーション後に測定した（ｃ．ｆ．ｕ．）。圧力処理は、下記表に従って同時に９個の加圧装置を使用して行った：
【００９９】
【表５】
2009516523.tif 000006
【０１００】
検体を０．５ｍｌの滅菌人工ストローに充填し、滅菌鉄ボールでシールした。凍結乾燥はＥｄｗａｒｄｓ凍結乾燥装置で行った。実験は２回反復した。結果を以下の表に示す。
【０１０１】
表５．凍結乾燥の前と後の生存Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの細胞数（２回の反復）。（処理前の最初の細胞数（ｃ．ｆ．ｕ．／ｍｌ）：９．０×１０６〜１．１×１０７）
【０１０２】
【表６】
2009516523.tif 000007
【０１０３】
表６．凍結乾燥の前と後の生存Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの細胞数（２回の反復）。（処理前の最初の細胞数（ｃ．ｆ．ｕ．／ｍｌ）：４．０８×１０８〜４．１０×１０８）
【０１０４】
【表７】
2009516523.tif 000008
【０１０５】
太字の数字で示した処理群は対照群に比較して有意に高い細胞生存率を示している。処理群の中では、群Ｎｏ．２及びＮｏ．４が優れていることが示された。凍結乾燥の前の特定の高静水圧処理は凍結乾燥後の細胞生存率を有意に増強することが結論された。
【実施例８】
【０１０６】
圧力処理のあり／なしによる胚−バイオプシー又は性別鑑定（ｓｅｘｉｎｇ）後のウシ胎児の生存
【０１０７】
卵母細胞採取及びインビトロ成熟（ＩＶＭ）
ＣＯＣｓ（屠殺場の卵巣から吸引）を、ＦＣＳ、ＬＨ（Ｓｉｇｍａ）、ＦＳＨ（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＴＣＭ−１９９  Ｅａｒｌ中、鉱物油で覆い、３８℃の５．１％ＣＯ２、最大湿度の空気中で２２時間成熟させた。
【０１０８】
精子調製、インビトロ授精（ＩＶＦ）及びインビトロ培養（ＩＶＣ）
授精培地：ＢＳＡ、ペニシリン、ヒポタウリン、エピネフリン及びヘパリンを添加したＴＡＬＰを鉱物油で覆った。
【０１０９】
解凍精子を、Ｐｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配（２ｍｌの９０％Ｐｅｒｃｏｌｌの上に２ｍｌの４５％Ｐｅｒｃｏｌｌ）により室温２０分間７００ｇで遠心分離して、運動性精子を得た。再懸濁した後、精子を授精液滴に加えた。プレートを１９時間５％ＣＯ２、加湿空気中３９℃でインキュベートした。推定接合子を鉱物油下のＳＯＦ液滴中５％ＣＯ２、加湿雰囲気中３９℃でインビトロ培養した。
【０１１０】
加圧
拡大した胚盤胞を気泡のない０．２５ｍｌプラスチックストローに胚を保持する培地中と共に装填し（７〜９胚／ストロー）、ストローをＰＶＣでシールする。ストローを加圧装置（Ｃｒｙｏ−Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．，ブダペスト、ハンガリー）に入れる。室温において、６０〜９０ＭＰａ（１０ＭＰａずつ増加）の静水圧に、種々の時間（１５，３０，４５，６０，９０，１００分）胚を暴露する。
【０１１１】
結果
性別鑑定胚又はバイオプシー後の胚の生存率は、特別に選択した圧処理をした場合に、しない場合より有意に高かった。
【実施例９】
【０１１２】
圧力処理をした場合としない場合の、遺伝子導入後のウシ胚の生存
【０１１３】
圧力条件を変えた場合の結果がマウス胚における結果と類似するか否かを確認するために、本実験において、ウシ胚が静水圧に暴露される。静水圧を適用した後、検体に遺伝子導入を行う。インビトロ培養及び導入を行った後、検体の生存は、事前に圧で処理しなかった検体に比較して増強される。
【実施例１０】
【０１１４】
圧力処理をした場合としない場合の、ＩＣＳＩ及び胚バイオプシー後のヒト胚の生存
【０１１５】
圧力条件を変えた場合の結果がマウス胚における結果と類似するか否かを確認するために、本実験において、ウシ胚が静水圧に暴露される。静水圧を適用した後、検体にＩＳＣＩ又はバイオプシーを行う。インビトロ培養及び導入を行った後、検体の生存は、事前に圧で処理しなかった検体に比較して増強される。
【実施例１１】
【０１１６】
インビトロの保存及び成熟における圧力処理後の卵母細胞（ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ）の生存
【０１１７】
本実験の目的は、事前に静水圧で処理された場合に、卵母細胞がいずれの過程にも（インビトロ保存／成熟を含めて）非常に高い効力を持って耐容することを立証することである。卵母細胞は静水圧で処理され、検体は圧を解放後インビトロに維持される。卵母細胞のインビトロ及びインビボ生存は、事前に圧力で処理されなかった検体に比較して増強される。
【実施例１２】
【０１１８】
インビトロ保存における、圧力処理後の胚性幹細胞の生存
【０１１９】
本実験の目的は、事前の圧力処理により胚性幹細胞の生存が増強されることを立証することである。マウス胚性幹細胞は静水圧で処理され、圧力解放後検体は保存され処理される。細胞のインビトロ及びインビボ生存は、事前に圧力で処理されなかった検体に比較して増強される。
【０１２０】
本実施例に提示された結果は、いずれかのタイプの補助生殖又はバイオテクノロジーの技術にも先立って行う圧力処理は、配偶子及び胚（及び幹細胞）の生存（ストレス耐性）を改善することを示している。また、マウス胚、ウシ及びブタ精子、ブタ卵母細胞及び細菌に関して示されたデータは、この発明思想の広範囲の応用性を示している。ヒトを除外せずに、他の哺乳動物種を含めて、本発明による方法の応用は、総ての種類の補助生殖技術又はバイオテクノロジーの技術、胚の取り扱いにおける成功率の改善に有用であり得る。本方法はまた、生殖体及び胚の操作がその応用を見出すことができる他の分野において可能性を広げる。
【０１２１】
ブタ（ウマも同じ）において、精液の凍結は、精子の解凍後生存率の低下を生じるので、この動物種における繁殖の最も一般的手段は、新鮮な、希釈した、希釈と冷却又は希釈と冷蔵した精液の授精である。ＨＨＰ前処理の使用により、精液は与えられた温度において有意により良く保存され、また、高品質での保存時間はかなり増加する。
【０１２２】
同様に、インビトロ及びインビボ胚生産、胚のインビトロ培養、性鑑別、分離及びいずれかのバイオ技術／バイオテクノロジーの操作、胚移植、卵母細胞成熟、ＩＣＳＩ又は卵母細胞や精液におけるバイオ技術／バイオテクノロジーの操作は、その生存能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）／生存能力（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を大きく減少させる。上記の特徴の延長として、ＨＨＰ前処理の使用により生殖体及び胚は、増大した生存能力を持って、どのようなタイプの補助生殖技術（ＡＲＴ）又はバイオ技術／バイオテクノロジー操作にも用いられて行くであろう。［Ｃ１］
引用文献
2009516523.tif 000009
2009516523.tif 000010
2009516523.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月20日(2007.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体生物材料の生存能力を改善し、該材料を使用する方法であって、
（ａ）該生物材料に静水圧を適用し；
（ｂ）該生体生物材料を予め定められた時間静水圧において維持し；
（ｃ）該静水圧を開放し；
（ｄ）所望の目的のために有用なプロトコールに従って該材料を使用すること（但し、該使用が凍結保存を含まず、該静水圧の該適用が該生物材料の異質３倍体を生じない）、
を含む、方法。
【請求項２】
前記静水圧が、１〜２００ＭＰａの範囲、好ましくは１０〜１００ＭＰａの範囲より好ましくは２０〜７５ＭＰａの範囲、最も好ましくは３０〜６０ＭＰａの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記静水圧が、０．００１秒〜６００分、好ましくは１秒〜３００分、より好ましくは１０秒〜１５０分、さらに好ましくは２０秒から９０分、最も好ましくは３０秒〜６０分適用される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記圧力が、瞬間的から６時間の時間をかけて徐々に開放される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記圧力が、予め定められた圧力プロフィールに従って適用され、維持され、開放される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記圧力が、予め定められた温度プロフィールに従って適用され、維持され、開放される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物材料が、配偶子又は胚であり、好ましくは脊椎動物の卵母細胞、精子、接合体、桑実胚、胚盤胞、胚、及び幹細胞からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記脊椎動物が、魚類、鳥類又は哺乳類、好ましくはウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジブタ、その他の家畜、ペット、ヒトを含む霊長類である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物材料が微生物の培養物である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物の培養物が細菌培養物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物材料の前記使用が、補助生殖技術（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、バイオ技術及び／又はバイオテクノロジーの操作の分野に適用できる技術、又はプロトコールのいずれかを組み込んでいる請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記使用が凍結乾燥である請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2009516523.tif 000012
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