(57)【要約】軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞および靭帯細胞からなる群より選択される結合組織細胞の増殖または培養のためのインビトロ方法であって、前記細胞を、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖と接触させる工程を含む方法である。本発明はまた、アミノ糖を前記細胞と組み合わせて含有する組成物に関する。これらの組成物は、軟骨、骨、腱および靭帯の病変または欠陥、骨質量の損失、および骨軟骨欠陥または病変の処置に有用である。
2009545299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞および靭帯細胞からなる群より選択される結合組織細胞の増殖または培養のためのインビトロ方法であって、前記細胞を、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記結合組織細胞が、生体適合性支持体マトリックスに見出されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生体適合性支持体マトリックスが、重合性物質を含有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記生体適合性支持体マトリックスが、ヒトまたは動物の身体移植に適するものである請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミノ糖が、マンノサミン塩酸塩である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖を、軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞および靭帯細胞からなる群より選択される結合組織細胞と組み合わせて含有する組成物。
【請求項７】
さらに生体適合性支持体マトリックスを含有する請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記生体適合性支持体マトリックスが、重合性物質を含有する請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記アミノ糖が、マンノサミン塩酸塩である請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記結合組織細胞が、軟骨細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記結合組織細胞が、骨芽細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記結合組織細胞が、軟骨前駆細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記結合組織細胞が、骨前駆細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記結合組織細胞が、腱細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記結合組織細胞が、靭帯細胞である請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１０または１２に記載の組成物の使用であって、軟骨欠陥または病変の処置または予防用の移植薬物調製のための使用。
【請求項１７】
前記軟骨欠陥または病変が、骨関節症疾患に存在する請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、骨質量損失の処置または予防用の移植薬物調製のための使用。
【請求項１９】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、骨欠陥または病変の処置用の移植薬物調製のための使用。
【請求項２０】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、骨軟骨欠陥または病変の処置用の移植薬物調製のための使用。
【請求項２１】
請求項１４または１５に記載の組成物の使用であって、腱病変の処置用の移植薬物調製のための使用。
【請求項２２】
請求項１４または１５に記載の組成物の使用であって、靭帯病変の処置用の移植薬物調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖または培養のためのインビトロ方法に関する。同様に、本発明は、新規の組成物、並びに軟骨欠陥もしくは病変、骨質量損失、骨病変、骨軟骨病変、腱病変および靭帯病変の処置のためにそれらを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節面上の欠陥または病変は、それらが軟骨下の骨に浸透しているか否かによって、軟骨および骨軟骨の病変または欠陥として分類し得る。
【０００３】
軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）病変としても知られる軟骨（ｃｈｏｎｄｒａｌ）病変は、長年の間、解決すべき難しい問題であった。
【０００４】
軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）は、成人の関節、肋骨、耳、鼻中隔および呼吸気道などに見出される結合組織の特別の形状である。関節の軟骨は、骨が互いに滑り合うようにしている。それはまた、身体の動きが惹き起こすストレスをも吸収する。骨関節症は、関節軟骨の変性を特徴とし、それが骨同士の摩擦の原因となり、関節の疼痛、腫脹および運動機能の喪失を惹き起こす。関節は、時の経過とともに変形していく。
【０００５】
数々の研究は、軟骨、骨および軟組織、例えば、靭帯および腱などは、とりわけ成人において、その再生能力が制限されていることを確認している。正常な状態で、軟骨の再生は、細胞外マトリックス成分の定常的な合成（同化作用）と分解（異化作用）からなる非常にゆっくりとした経過である。軟骨細胞は、この代謝を統括する細胞であり、従って、それらが浸漬している細胞外マトリックスの形成、維持および修復を統括する細胞である。
【０００６】
１９８７年、スエーデンにおいて、軟骨欠陥を修復するための他の処置に替わる治療法として、自己由来軟骨細胞の最初の移植が、ヒトにおいて実施された（ＡＣＩ技法）。この技法により最も頻繁に処置された関節は、膝である。
【０００７】
自己由来軟骨細胞の移植は、２段階で実施する技法である。最初の外科的介入では、関節軟骨のシートを摘出する。このサンプルを、移植に十分な数の軟骨細胞に達するまで培養する。２回目の外科的介入では、損傷領域を注意深く壊死組織切除し、培養した軟骨細胞を注入するために残した小孔を骨膜パッチで蔽う。軟骨細胞を移植した後、それを閉鎖し、骨膜を密封する。最近、骨膜の替わりに、Ｉ／ＩＩＩ型コラーゲン膜を使用することが記載された（非特許文献１）。
【０００８】
ヒトにおける自己由来軟骨細胞の最初の移植から、細胞を用いる軟骨の欠陥または病変の処置または修復に対する興味が、増大しつつあった。
【０００９】
１９９４年、ＡＣＩ技法を用いた臨床研究が公表された。当該研究は、膝に軟骨欠陥をもつ患者２３人について実施された（非特許文献２）。
【００１０】
異なるマトリックスもしくはスカフォールドを用いるか、または常用の培地に替わる別の培地を用いることによる新しい軟骨細胞増殖方法が、多くの公表文献に記載されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献３）。
【００１１】
骨の組織は、他の結合組織と同様に、細胞、線維および基本的物質により形成される特別の結合組織であるが、他の組織とは異なって、細胞外の成分が石灰化して、それをその支持と保護機能に適する硬い堅固な物質に変化させる。それが身体内部の支持体を供給し、運動にとって必須の筋肉と靭帯に、組み込みの場所を提供する。
【００１２】
活発に成長する骨においては、４つのタイプの骨細胞が識別される。骨前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞である。骨前駆細胞は、間葉系細胞から生産される細胞であり、増殖して、骨芽細胞または破骨細胞にのみ分化することができる。骨芽細胞は、骨の形成に関与する。
【００１３】
骨の欠陥は、重大な医療上の、また社会経済上の難問である。現在、異なるタイプの生体材料が開発されつつあり、また損傷を受けた骨組織の再構築に適用されている（非特許文献４）。
【００１４】
腱は、筋肉を骨につなぐ解剖学的構造体であり、靭帯は、骨を他の骨につなぐ同様の構造体である。それらは、円筒状の細長い構造体であり、密度の高い結合組織から形成され、平行にあるコラーゲン線維により一方向に引き伸ばされるように作られている。
【００１５】
腱において支配的な細胞は、腱細胞という。腱細胞は、改造を含む分解と合成の過程を介してマトリックスの構造を維持する機能を有し、ある程度まで修復にも寄与し得る。それにもかかわらず、腱の細胞密度は比較的低く、成熟分裂活性は小さいが、そのことは組織の再生速度が低下していることと、その細胞がどの程度まで固有の修復を促進し得るかの問題を説明するものである。このことは、外来性細胞による処置が、腱組織工学において重要な戦略となり得ることを意味する。
【００１６】
１９９４年、腱工学用の移植片を開発するために、予備的な研究が合成ポリマ線維および腱細胞について実施された（非特許文献５）。それ以来、様々な研究が、腱細胞移植片について公表されている（特許文献３、特許文献４）。
【００１７】
腱の病変は、最も共通の整形外科の病変である。例えば、米国では各年、少なくとも１００，０００例がアキレス腱病変と診断され、治療を受けている（非特許文献６）。米国では毎年、前十字靭帯（ＡＣＬ）の病変が、７５，０００から１２５，０００例存在するとも推計されており（非特許文献７）、また世界全体では約３００，０００例と報告された。これらの症状はすべて、患者において重要な作業不能の原因となり得る。
【００１８】
腱および軟骨と骨組織でのように、靭帯の自己修復能力は限られている。このことを理由として、細胞にもとづく治療による組織工学は、これらのタイプの組織の新世代の療法として、大いに興味のある分野の代表である。靭帯用移植片についての研究が、最近公表されている（非特許文献８、非特許文献９）。
【００１９】
上記の結合軟骨、骨、腱および靭帯組織は、筋骨格系の基本的成分である。
【００２０】
Ｄ−マンノサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノース）は、シアル酸とその誘導体の合成に使用されるアミノ糖である。
【００２１】
他のアミノ糖の使用による軟骨細胞の増殖について、それを考察または記載する文献が存在する。
【００２２】
特許文献５は、アミノ糖グルコサミンの存在下での軟骨細胞の培養について、特許請求している。
【００２３】
特許文献６は、グルコサミンのＮ−アシル誘導体を使用するとき、軟骨細胞の増殖が増大することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８２４３３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５４４４６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／２６６６７号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０６００３３号明細書
【特許文献５】国際公開第２００４／１０４１８３号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，４７９，４６９号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｃ．Ｒ．Ｇｏｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｋｎｅｅ，１３（３），２０３−２１０（２００６）
【非特許文献２】Ｍ．Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１，８８９−８９５（１９９４）
【非特許文献３】Ｋ．Ｆ．Ａｌｍｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，６０，７８１−７９０（２００１）
【非特許文献４】Ｕ．Ｋｎｅｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，骨の組織工学；再構成外科医の観点、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０（１），７−１９（２００６）
【非特許文献５】Ｙ．Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，「腱細胞を種とする合成ポリマを用いての新腱の生成」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２６，３３９０−３３９１（１９９４）
【非特許文献６】Ａ．Ｐｒａｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「米国における筋骨格症状」第１版、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，パークリッジ、ＩＬ，１９９２
【非特許文献７】Ｄ．Ｌ．Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「前十字靭帯：その正常な応答と置換」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７（６），９１０−９１２（１９８９）
【非特許文献８】Ｋ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．「軟骨細胞、靭帯細胞および間葉幹細胞の接着に対する細胞接着分子の効果」、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃ１７，７９−８２（２００１）
【非特許文献９】Ｊ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊｒ．「組織工学靭帯用細胞源としての前十字靭帯、側副靭帯、アキレス腱および膝蓋靭帯の評価」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７，２７４７−２７５４（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
従って、本発明にて解決すべき問題は、軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞および靭帯細胞からなる群より選択される結合組織細胞の増殖または培養のための代替方法を提供すること、並びに、軟骨欠陥もしくは軟骨病変、骨質量損失、骨病変、骨軟骨病変、腱病変および靭帯病変の処置に使用される代替組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞および靭帯細胞からなる群より選択される結合組織細胞の増殖または培養のためのインビトロ方法であって、前記細胞を、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖と接触させる工程を含む方法について記載する。
【００２８】
好適な実施態様において、結合組織細胞は、生体適合性支持体マトリックスに見出され、このマトリックスは、好ましくは重合性物質を含み、また、ヒトまたは動物の体内に移植するのに適している。
【００２９】
より好適な実施態様において、前記アミノ糖は、マンノサミン塩酸塩である。
【００３０】
本発明はまた、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖を、軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞および靭帯細胞からなる群より選択される結合組織細胞と組み合わせて含有する組成物を開示する。好適な実施態様において、前記組成物は、生体適合性支持体マトリックス、好ましくは重合性物質のマトリックスをさらに含有する。最も好適なアミノ糖は、マンノサミン塩酸塩である。
【００３１】
本発明の別の側面は、前記細胞が軟骨細胞または軟骨前駆細胞である場合の本発明の組成物の使用であって、軟骨欠陥または病変の処置または予防用の移植薬物調製のための使用である。好適な実施態様において、軟骨の欠陥または病変は、骨関節症疾患に存在する。
【００３２】
本発明の別の側面は、前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞または骨前駆細胞である場合の本発明の組成物の使用であって、骨質量の損失の処置または予防用の移植薬物調製のための使用である。
【００３３】
本発明の別の側面は、前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞または骨前駆細胞である場合の本発明の組成物の使用であって、骨欠陥または病変の処置用の移植薬物調製のための使用である。
【００３４】
本発明の別の側面は、前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞または骨前駆細胞である場合の本発明の組成物の使用であって、骨軟骨欠陥または病変の処置用の移植薬物調製のための使用である。
【００３５】
本発明の別の側面は、前記細胞が腱細胞または靭帯細胞である場合の本発明の組成物の使用であって、腱または靭帯病変の処置用の移植薬物調製のための使用である。
【００３６】
好ましくは、本発明に使用されるアミノ糖であるマンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびマンノサミン塩は、Ｄ−系統のものである。
【００３７】
前記アミノ糖は、アノマ型αまたはβで存在し得る。本発明は、個々のαおよびβ別個のアノマ両方およびそれらの混合物の使用を包含する。
【００３８】
医薬的に許容される酸とのマンノサミン塩は、限定されるものではないが、以下の酸との塩である。塩酸、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、ピルビン酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アスコルビン酸、グルクロン酸およびリンゴ酸である。
【００３９】
マンノサミン塩は、標準的アミノ糖塩調製法に従って調製し得る。一つの方法は、先にマンノサミン塩酸塩からマンノサミン塩基を得て、次いで、入手を欲する塩に応じて、対応する酸を加えることを含む。別の方法は、入手を欲する塩の、または酸の金属塩のアニオンを含む酸で予め条件づけたアニオン交換樹脂を用いて、マンノサミン塩酸塩から直接塩を得ることを含む。電気透析法を用いることもできる。
【００４０】
マンノサミン塩酸塩は工業製品である（ＮＺＰ、ニュージーランド・ファーマシュティカル（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ））が、所望により、このものは、Ｎ−アセチルグルコサミンをＣａ（ＯＨ）２水溶液でエピマ化し、次いで、その異性体を分離し、塩酸で処理し、脱色し、溶媒で沈殿させることにより調製することができる（Ｓｕｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６８，３５８１−３５８９（１９９５）；Ｓｕｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３（７），２３９７−２４００（１９９７））。
【００４１】
本発明において、「インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）方法」という用語は、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）と呼ぶ方法をも含む。
【００４２】
本発明において、「軟骨前駆細胞」および「骨前駆細胞」という用語は、すでに部分的分化を達成している細胞に、また幹細胞の分化多能受容能力を失っている細胞に関する。換言すると、それらは進化の進行において、ある種の細胞系列に加わって、特異的な特殊化された細胞を与える幹細胞である。従って、軟骨前駆細胞は、軟骨細胞を生じ、骨前駆細胞は骨芽細胞と破骨細胞を生じるであろう。
【００４３】
本発明において、「支持体マトリックス」という用語はまた、支持体スカフォールドをも含む。
【００４４】
好ましくは、本発明にて使用される生体適合性支持体マトリックスまたはスカフォールドは、生物分解性物質、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、セルロース、ゼラチン、コラーゲン、ペクチン、アルギン酸塩、デキストラン、ヒアルロン酸またはその誘導体などから構成される。
【００４５】
生体非分解性物質、例えば、テフロン（登録商標）、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルまたはポリビニルなどから構成されるマトリックスも使用することができる。この場合、所望により、そのものをゼラチンなどの第二の物質で被覆して、細胞とポリマの結合を増強することもできる。
【００４６】
マトリックスは、柔軟であっても、堅いものであってもよい。また、海綿状構造も使用することができる。
【００４７】
本発明方法に従って、軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、腱細胞または靭帯細胞を増殖または培養するためには、細胞を、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩またはそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖と接触しておく。それらにアミノ糖を加える前に、栄養分、抗生物質、成長因子および分化もしくは脱分化誘発剤を含み得る培地中に、細胞を浸漬することができる。選択肢として、アミノ糖は栄養分、抗生物質、成長因子および分化もしくは脱分化誘発剤を含み得る培地の一部を形成し得る。一旦増殖させた細胞は移植可能であるか、または選択肢として引き続く移植操作のために支持体マトリックスに移行させることが可能である。このことは、培養後に細胞が分化してしまっている場合に有用である。その理由は、細胞を支持体マトリックスに移行させるに際し、細胞の再分化および細胞外マトリックスの成分の合成が起こるからである。
【００４８】
別法として、増殖する細胞は、予め支持体マトリックスに移行させ、その後、アミノ糖を含む培地を加え、細胞が支持体マトリックス上で増殖するようにする。
【００４９】
移植を実施する前に、細胞を含む支持体マトリックスの細胞を洗浄して、培地を除去することができる。別法として、増殖した細胞とアミノ糖を含む組成物、または増殖した細胞、支持体マトリックスおよびアミノ糖（マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩またはそれらの混合物）を含む組成物を移植することもできる。この組成物はさらに、栄養分または培地の一部を形成する他の物質を含み得る。
【００５０】
細胞は適切な細胞体積に成長するまでインビトロで増殖させ、次いで、その細胞をアミノ糖と一緒に移植し（マトリックスとともに、または無しに）、細胞がインビボで増殖し続けるようにすることができる。別法として、所望により、マトリックスの存在下または不存在下に、細胞を直接アミノ糖とともに移植し、増殖がインビボで起こるようにすることもできる。
【００５１】
細胞培養と外科的移植の専門家にとって既知の培養法および移植法を用いることができる。
【００５２】
本発明の目的とする組成物は、傷害を受けた軟骨、骨、腱または靭帯を修復および／または再生するために、マトリックスの存在下または不存在下の細胞の移植に替わるものである。
【００５３】
細胞とアミノ糖は、本発明の組成物中に異なる濃度で存在し得る。
【００５４】
軟骨細胞および／または軟骨前駆細胞（マトリックスの存在または不存在下）並びにマンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖を含有する本発明の組成物は、身体のいずれもの関節に存在し得る軟骨欠陥または病巣を処置するために有用である。前記欠陥は、外傷性全身傷害、出産欠陥または骨関節症などの疾患の結果であり得る。
【００５５】
軟骨細胞、骨芽細胞、軟骨前駆細胞および／または骨前駆細胞（マトリックスの存在または不存在下）並びにマンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖を含有する本発明の組成物は、外傷性全身傷害、遺伝子欠陥または疾患の結果であり得る骨または骨軟骨の欠陥または病巣を処置するために有用である。それらはまた、例えば、加齢、閉経とともに、または疾患の結果として生じ得る骨質量損失を処置するために有用である。
【００５６】
腱細胞および／または靭帯細胞（マトリックスの存在または不存在下）並びにマンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、マンノサミン塩およびそれらの混合物からなる群より選択されるアミノ糖を含有する本発明の組成物は、腱病変または靭帯病変を処置するために有用である。
【００５７】
本発明における「処置」という用語は、「修復」と「再生」という用語を含む。
【００５８】
本発明において、我々が「欠陥」または「病巣」について言うとき、この用語は「磨耗」または「損失」という用語を含む。
【００５９】
本発明の有利な点は、マンノサミン塩酸塩を使用する場合、軟骨細胞の増殖が、標準的な培地を用いた場合より、またはアミノ糖、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンを用いた場合よりも、より大きいということである。
【００６０】
もう一つの有利な点は、軟骨細胞培養にマンノサミン塩酸塩を用いた場合、ＧＡＧの放出が、メタロプロテアーゼ活性であるとしたとき、標準的培地に比べて低下することである。
【００６１】
本発明のもう一つの重要な利点は、軟骨細胞培養にＮ−アセチルマンノサミンを用いた場合に、ＧＡＧの合成が増加することである。活性を刺激する同化作用は、ＧＡＧが細胞外マトリックスの一部を形成するので重要である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】アルギン酸ビーズ１個あたりのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のレベルに対するマンノサミン塩酸塩、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンの影響を３段階の濃度（１、５および１０ｍＭ）で示す図である。
【図２】ＩＬ−１βでの刺激後、アルギン酸ビーズ１個あたりの軟骨細胞によりグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）総量に関連して放出されるＧＡＧの百分率に対するマンノサミン塩酸塩、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンの影響を２段階の濃度（１および１０ｍＭ）で示す図である。
【図３】ＩＬ−１βでの刺激およびＡＰＭＡ（酢酸４−アミノフェニル水銀）での活性化後、アルギン酸ビーズ１個あたりの軟骨細胞のメタロプロテアーゼ活性（ＭＭＰ）に対するマンノサミン塩酸塩、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンの影響を２段階の濃度（５および１０ｍＭ）で示す図である。
【図４】ＤＮＡのレベルに関し、ＧＡＧレベルに対するＮ−アセチルマンノサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの影響を２段階の濃度（５および１０ｍＭ）で示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
以下の実施例は単なる説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
＜ＤＮＡレベルを介して測定される軟骨細胞の増殖＞
本目的は、インビトロ培養モデルにおける軟骨細胞増殖に対するマンノサミン塩酸塩の影響を判定することであった。
【００６５】
マンノサミン塩酸塩の活性を、以下の化合物、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンと比較した。
【００６６】
軟骨細胞の増大を定量化するために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）レベルの増大を定量した。
【００６７】
＜材料と方法＞
ウシ起源の軟骨細胞を、すでに記載されている方法（Ｂ．Ｂｅｅｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３７，１３５−１４１（１９９７））に従って、コラゲナーゼによる消化により単離した。
【００６８】
単離したウシ軟骨細胞は、文献（Ｊ．ＤｅＧｒｏｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，２６６、３０３−３１０（２００１））に記載された方法に従って培養した。軟骨細胞をアルギン酸支持体マトリックスに移行させ、濃度２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞を含むアルギン酸ビーズを形成させ、そこにアスコルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＦＣＳ（ウシ胎児血清）を補填し、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に加えた。２４時間後に培地を取替え、アルギン酸ビーズ（５個のビーズ／ウエル、２５０μｌの培地／ウエル、４８ウエルのプレート）に含まれる軟骨細胞を試験化合物（１、５および１０ｍＭ濃度）の存在下または不存在下（対照）に培養した。培地は週に２回取り替えた。１０日の最終日に、ビーズを集め（各ウエルにビーズ５個；１条件につきｎ＝３ウエル）、分析するまで−２０℃の温度で保存した。
【００６９】
ＤＮＡレベルを定量化するために、ビーズをパパインで消化し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８（ビスベンズイミド）色素を用いた。アルギン酸ビーズ１個あたりのＤＮＡレベルを定量した。
【００７０】
すべての化合物と対照条件間の差の評価は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりアッセイした。次いで、ＬＳＤ試験を実施し、各化合物と対照条件間の差を決定した。それらはｐ≦０．０５である場合、統計的に有意であると見なした。
【００７１】
＜結果＞
３段階の試験濃度（１、５および１０ｍＭ）において、測定したＤＮＡ／ビーズの最高レベルは、マンノサミン塩酸塩で培養した細胞で得られた（図１）。
【００７２】
マンノサミン塩酸塩およびグルコサミン塩酸塩双方が、ＤＮＡレベルの用量依存性増大を惹き起こした。有意差は、マンノサミン塩酸塩およびグルコサミン塩酸塩間に３段階の試験濃度で見出された。マンノサミン塩酸塩は、１０ｍＭの濃度で対照（化合物なし）よりも１０倍高い増大をもたらし、一方、グルコサミン塩酸塩のもたらした増大は、４倍高であった。
【００７３】
ＤＮＡ含量に対する有意な影響は、Ｎ−アセチルグルコサミンでは観察されなかった。
【００７４】
我々は、マンノサミン塩酸塩が軟骨細胞の増殖を刺激し、グルコサミン塩酸塩よりも遥かに有効であると結論し得る。
【００７５】
（実施例２）
＜アルギン酸ビーズにおける軟骨細胞からのグリコサミノグリカンの放出＞
本目的は、アルギン酸ビーズにおいて、ＩＬ−１βによる刺激後の軟骨細胞からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の放出に対するマンノサミン塩酸塩の影響を判定することであった。
【００７６】
ＧＡＧの放出は、軟骨細胞においてＩＬ−１βが誘発するプロテオグリカンに対する化合物の影響を評価するために使用する試験である。これは、軟骨細胞の異化作用活性の評価を可能とする。ＩＬ−１βが誘発するＧＡＧの放出は、主としてアグリカナーゼにより仲介される。
【００７７】
マンノサミン塩酸塩の活性を以下の化合物、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンと比較した。
【００７８】
＜材料と方法＞
ウシ起源の軟骨細胞を、支持体マトリックスとしてのアルギン酸ビーズ中で、２１日間培養した。試験すべき化合物は加えずに、７５ｃｍ２の培養皿にて、培地２５ｍｌ中、約１００個のビーズとする。培地は週に２回取り替えた。培養２１日後、ビーズを４８穴プレートに移し、１ウエルあたりビーズ５個、１ウエルあたり培地２５０μｌとした。２１日目に試験化合物を加え（マンノサミン塩酸塩、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミン）、ＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した後、細胞外マトリックスの分解に対する影響を評価した。各化合物は、１および１０ｍＭの濃度で試験した。各実験において、各濃度は、対照（ｎ＝８ウエル）を例外として、ｎ＝３ウエルで試験した。アルギン酸ビーズをＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）および化合物とともに４８時間インキュベートした後、培地を集めた（２１日目から２３日目）。２３日目のビーズ中および培地中のＧＡＧ含量を測定した（アグリカナーゼが仲介するＧＡＧの放出）。ＧＡＧ含量は、パパインでの消化後に、ブリスキャン（Ｂｌｙｓｃａｎ；商標）アッセイキット（バイオカラー（株）（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｌｔｄ．））により定量した。
【００７９】
結果は、総計のＧＡＧに関連して放出されたＧＡＧの百分率で表わした。
【００８０】
すべての化合物と対照条件間の差の評価は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりアッセイした。次いで、ＬＳＤ試験を実施し、各化合物と対照条件間の差を決定した。それらはｐ≦０．０５である場合、統計的に有意であると見なした。
【００８１】
＜結果＞
上限濃度（１０ｍＭ）で、マンノサミン塩酸塩は、グルコサミン塩酸塩でのように、軟骨細胞によるＧＡＧの放出を低下させた（図２）。
【００８２】
マンノサミン塩酸塩は、対照（化合物を含まない培養）と比べて３０％、ＧＡＧの放出を低下させた。
【００８３】
骨関節症の軟骨におけるＧＡＧの放出は、正常の軟骨と比較して大きく、それは冒された組織中のプロテオグリカン含量の低下を必然的に伴う。それ故、ＧＡＧ放出の低下は、骨関節症病理におけるプロテオグリカン損失の低下につながるので、有益である。
【００８４】
（実施例３）
＜メタロプロテアーゼ活性の阻害＞
本目的は、ＩＬ−１βによる刺激の後、アルギン酸ビーズ中の軟骨細胞のメタロプロテアーゼ活性に対するマンノサミン塩酸塩の影響を判定することであった。
【００８５】
メタロプロテアーゼ活性は、軟骨細胞において、ＩＬ−１βにより誘発されるメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の放出に対する化合物の影響を評価するために使用する。これは軟骨細胞の異化作用活性を評価するために有用な試験である。メタロプロテアーゼは不活性な酵素前駆体として軟骨細胞により分泌されるが、ＡＰＭＡ（酢酸４−アミノフェニル水銀）を用いて予め活性化する。
【００８６】
軟骨の病理学的破壊の第一の原因は、高いタンパク質分解活性である。メタロプロテアーゼは、関節軟膏の細胞外マトリックスを分解する酵素の１種である。これらの酵素は、コラーゲンの三重へリックスを分解する大きな許容能力を有する。高レベルのコラゲナーゼは、骨関節症の患者に見出されているが、これらのレベルと骨関節症病変の重篤度との間の関係にも見出されている。
【００８７】
マンノサミン塩酸塩の活性を、以下の化合物、グルコサミン塩酸塩およびＮ−アセチルグルコサミンと比較した。
【００８８】
＜材料と方法＞
ウシ軟骨細胞を出発点として用い、実施例２の方法に従って実施したが、この事例では、各化合物を２段階の濃度（５および１０ｍＭ）で試験した。
【００８９】
軟骨細胞は、細胞外マトリックスを産生させるために、アルギン酸中、２１日間培養した。化合物の存在または不存在下にＩＬ−１βで２日間刺激した後、培地を取り替えた。次いで、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１ｍＭのＡＰＭＡとともに、化合物の存在下または不存在下に、２時間インキュベーションした後、培地中のメタロプロテアーゼ活性を定量した。メタロプロテアーゼ活性は、メタロプロテアーゼＴＮＯ２１１−Ｆ用の基質（Ｉ．Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２１，７１１−８（２００３））を用いて定量化した。
【００９０】
すべての化合物と対照条件間の差の評価は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりアッセイした。次いで、ＬＳＤ試験を実施し、各化合物と対照条件間の差を決定した。それらはｐ≦０．０５である場合、統計的に有意であると見なした。
【００９１】
＜結果＞
図３に見られるように、試験したすべての化合物の中、マンノサミン塩酸塩のみがメタロプロテアーゼ活性を低下させた唯一の化合物である。
【００９２】
マンノサミン塩酸塩は、１０ｍＭの濃度で、対照と比べ、メタロプロテアーゼ活性を３０％低下させた。
【００９３】
（実施例４）
＜軟骨細胞を基準とするグリコサミノグリカンの定量＞
本目的は、ＤＮＡによるＧＡＧ含量（すなわち、軟骨細胞数により補正）に対するマンノサミン塩酸塩の影響を判定することであった。
【００９４】
これは、軟骨細胞を基準とするＧＡＧの析出に対する化合物の影響を評価することを可能とするアッセイ法であり、軟骨細胞の異化作用活性を評価するために有用である。
【００９５】
Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチルグルコサミンと比較した。
【００９６】
＜材料と方法＞
ウシ軟骨細胞を出発点として用い、実施例１と同じ方法（ＤＮＡレベルにより測定した軟骨細胞増殖）に従って実施したが、この事例では、各化合物を２段階の濃度（５および１０ｍＭ）で試験した。
【００９７】
ＧＡＧ含量は、パパインでの消化後に、ブリスキャン（Ｂｌｙｓｃａｎ；商標）アッセイキット（バイオカラー（株））により定量した。
【００９８】
すべての化合物と対照条件間の差の評価は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりアッセイした。次いで、ＬＳＤ試験を実施し、各化合物と対照条件間の差を決定した。それらはｐ≦０．０５である場合、統計的に有意であると見なした。
【００９９】
＜結果＞
図４に見られるように、Ｎ−アセチルマンノサミンは、軟骨細胞ごとにＧＡＧレベルを用量依存的に増大させた。
【０１００】
Ｎ−アセチルマンノサミンは、１０ｍＭの濃度で、対照（生成物なしの培養）と比べて、軟骨細胞あたりのＧＡＧ含量を６３％増大させた。
【０１０１】
軟骨細胞あたりのＧＡＧ含量に対する有意な影響は、Ｎ−アセチルグルコサミンでは観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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