(57)【要約】本発明は、化学修飾siRNA分子、およびそのようなsiRNA分子を用いて標的遺伝子発現を抑制する方法を提供する。好都合なことに、本発明の修飾siRNAは、それと対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さく、かつ標的配列に対するRNAi活性を保持する。本発明はまた、修飾siRNA、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子を提供し、これは粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質をさらに含むことができる。本発明はさらに、修飾siRNAを哺乳動物対象に投与することによって遺伝子発現を抑制する方法を提供する。免疫刺激特性を有するsiRNAを同定および／または修飾するための方法もまた提供される。2009513151.tif 000015
2009513151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さ約15〜約60ヌクレオチドの二本鎖領域を含む修飾siRNAであって、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約20％未満が修飾ヌクレオチドを含み、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さく、かつ標的配列の発現を抑制することができる、修飾siRNA。
【請求項２】
2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項1記載の修飾siRNA。
【請求項３】
2'OMeヌクレオチドを含む、請求項1または2記載の修飾siRNA。
【請求項４】
2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される2'OMeヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５】
2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない、請求項1〜4のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項６】
長さ約15〜約30ヌクレオチドの二本鎖領域を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項７】
一方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項８】
センスまたはアンチセンス鎖に修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項９】
2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む、請求項7または8記載の修飾siRNA。
【請求項１０】
両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１１】
2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む、請求項10記載の修飾siRNA。
【請求項１２】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約15％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１３】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約10％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１４】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約5％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１５】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約1％〜約20％が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１６】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約5％〜約20％が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１７】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約10％〜約20％が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１８】
対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％免疫刺激性が小さい、請求項1〜17のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項１９】
対応する未修飾siRNA配列のIC50の10倍以下のIC50を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２０】
対応する未修飾siRNA配列のIC50の3倍以下のIC50を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２１】
対応する未修飾siRNA配列のIC50の2倍以下のIC50を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２２】
リン酸骨格修飾を含まない、請求項1〜19のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２３】
二本鎖領域に2'-デオキシヌクレオチドを含まない、請求項1〜22のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２４】
一方の鎖に3'突出部を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２５】
両方の鎖に3'突出部を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２６】
3'突出部を含まない、請求項1〜23のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２７】
対応する未修飾siRNA配列が少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２８】
対応する未修飾siRNA配列がセンス鎖に少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項２９】
対応する未修飾siRNA配列がアンチセンス鎖に少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項３０】
ヘアピンループ構造を含む、請求項1〜29のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項３１】
担体系をさらに含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項３２】
担体系が、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム（virosome）、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項31記載の修飾siRNA。
【請求項３３】
担体系が核酸-脂質粒子である、請求項32記載の修飾siRNA。
【請求項３４】
核酸複合体が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、サイクロデキストリン、またはそれらの混合物との複合体を形成した修飾siRNAを含む、請求項32記載の修飾siRNA。
【請求項３５】
ポリエチレンイミン（PEI）であるカチオン性ポリマーと複合体を形成している、請求項34記載の修飾siRNA。
【請求項３６】
請求項1〜35のいずれか一項記載の修飾siRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項３７】
長さ約15〜約60ヌクレオチドの二本鎖領域を含む修飾siRNAであって、二本鎖領域におけるヌクレオチドのうちの少なくとも2つが、修飾グアノシンヌクレオチド、修飾ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含み、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さく、かつ標的配列の発現を抑制することができる、修飾siRNA。
【請求項３８】
2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項37記載の修飾siRNA。
【請求項３９】
長さ約15〜約30ヌクレオチドの二本鎖領域を含む、請求項37または38記載の修飾siRNA。
【請求項４０】
一方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む、請求項37〜39のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４１】
センスまたはアンチセンス鎖に修飾ヌクレオチドを含む、請求項37〜40のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４２】
両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含む、請求項37〜39のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４３】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約30％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項37〜42のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４４】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約25％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項37〜42のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４５】
二本鎖領域におけるヌクレオチドの約20％未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項37〜42のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４６】
対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％免疫刺激性が小さい、請求項37〜45のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４７】
対応する未修飾siRNA配列のIC50の10倍以下のIC50を有する、請求項37〜46のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４８】
対応する未修飾siRNA配列のIC50の3倍以下のIC50を有する、請求項37〜46のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項４９】
対応する未修飾siRNA配列のIC50の2倍以下のIC50を有する、請求項37〜46のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５０】
リン酸骨格修飾を含まない、請求項37〜47のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５１】
二本鎖領域に2'-デオキシヌクレオチドを含まない、請求項37〜50のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５２】
修飾siRNAの一方の鎖に3'突出部を含む、請求項37〜51のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５３】
修飾siRNAの両方の鎖に3'突出部を含む、請求項37〜51のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５４】
3'突出部を含まない、請求項37〜51のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５５】
対応する未修飾siRNA配列が少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを含む、請求項37〜54のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５６】
ヘアピンループ構造を含む、請求項37〜55のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５７】
担体系をさらに含む、請求項37〜56のいずれか一項記載の修飾siRNA。
【請求項５８】
請求項37〜57のいずれか一項記載の修飾siRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５９】
請求項1または37記載の修飾siRNA；
カチオン性脂質；および
非カチオン性脂質
を含む核酸-脂質粒子。
【請求項６０】
カチオン性脂質が、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTAP）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミン（DODMA）、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLendMA）、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６１】
カチオン性脂質がDLinDMAである、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６２】
非カチオン性脂質がアニオン性脂質である、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６３】
非カチオン性脂質が中性脂質である、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６４】
非カチオン性脂質が、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-フォスファチジルコリン（DPPC）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵（egg）フォスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６５】
非カチオン性脂質がDSPC、DPPC、またはDSPEである、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６６】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質をさらに含む、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６７】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質が、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項66記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６８】
PEG-脂質が、PEG-ジアシルグリセロール、PEG-ジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項67記載の核酸-脂質粒子。
【請求項６９】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール（PEG）-ジアルキルオキシプロピル（PEG-DAA）コンジュゲートを含む、請求項67記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７０】
PEG-DAAコンジュゲートがPEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）からなる群より選択されるメンバーである、請求項69記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７１】
PEG-DAAコンジュゲートがPEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）である、請求項69記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７２】
カチオン性脂質が粒子中に存在する全脂質の約20mol％〜約50mol％を含む、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７３】
カチオン性脂質が粒子中に存在する全脂質の約40mol％を含む、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７４】
非カチオン性脂質が粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約90mol％を含む、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７５】
非カチオン性脂質が粒子中に存在する全脂質の約20mol％を含む、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７６】
PEG-DAAコンジュゲートが粒子中に存在する全脂質の0mol％〜約20mol％を含む、請求項69記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７７】
PEG-DAAコンジュゲートが粒子中に存在する全脂質の約2mol％を含む、請求項69記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７８】
コレステロールをさらに含む、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項７９】
コレステロールが粒子中に存在する全脂質の約10mol％〜約60mol％を含む、請求項78記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８０】
コレステロールが粒子中に存在する全脂質の約48mol％を含む、請求項78記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８１】
核酸-脂質粒子中の核酸が、37℃で20分間のヌクレアーゼへの粒子の曝露後に実質的に分解されない、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８２】
核酸-脂質粒子中の核酸が、37℃で30分間の血清中での粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８３】
核酸が核酸-脂質粒子の中に完全に封入されている、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８４】
約0.01〜約0.2の核酸：脂質質量比を有する、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８５】
約0.02〜約0.1の核酸：脂質質量比を有する、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８６】
約0.08の核酸：脂質質量比を有する、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８７】
約50nm〜約150nmの直径中央値を有する、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８８】
約70nm〜約90nmの直径中央値を有する、請求項59記載の核酸-脂質粒子。
【請求項８９】
請求項59記載の核酸-脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項９０】
請求項1または37記載の修飾siRNAと細胞を接触させる工程
を含む、標的配列の発現を抑制するsiRNAを細胞内に導入するための方法。
【請求項９１】
修飾siRNAが担体系の中にある、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
担体系が、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
核酸複合体が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、サイクロデキストリン、またはそれらの混合物との複合体を形成した修飾siRNAを含む、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
修飾siRNAが、ポリエチレンイミン（PEI）であるカチオン性ポリマーと複合体を形成している、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
担体系が、
修飾siRNA；
カチオン性脂質；および
非カチオン性脂質
を含む核酸-脂質粒子である、請求項91記載の方法。
【請求項９６】
核酸-脂質粒子が粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質をさらに含む、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
核酸-脂質粒子の存在が、粒子の投与後少なくとも1時間で検出可能である、請求項95記載の方法。
【請求項９８】
複数の粒子の10％以上が、投与後約1時間で哺乳動物の血漿中に存在する、請求項95記載の方法。
【請求項９９】
投与の部位に対して遠位の部位での修飾siRNAの効果が、核酸-脂質粒子の投与後少なくとも72時間検出可能である、請求項95記載の方法。
【請求項１００】
細胞が哺乳動物のものである、請求項90記載の方法。
【請求項１０１】
哺乳動物がヒトである、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
請求項1または37記載の修飾siRNAを哺乳動物対象に投与する工程
を含む、標的配列の発現を抑制するsiRNAのインビボ送達のための方法。
【請求項１０３】
修飾siRNAが担体系の中にある、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
担体系が、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
核酸複合体が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、サイクロデキストリン、またはそれらの混合物との複合体を形成した修飾siRNAを含む、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
修飾siRNAがカチオン性ポリマーと複合体を形成し、該カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（PEI）である、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
担体系が、
修飾siRNA；
カチオン性脂質；および
非カチオン性脂質
を含む核酸-脂質粒子である、請求項103記載の方法。
【請求項１０８】
核酸-脂質粒子が粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質をさらに含む、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
投与が、経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、病変内投与、気管内投与、皮下投与、および皮内投与からなる群より選択される、請求項102記載の方法。
【請求項１１０】
哺乳動物対象がヒトである、請求項102記載の方法。
【請求項１１１】
以下の工程を含む、免疫刺激特性を有するsiRNAを修飾するための方法：
（a）標的配列の発現を抑制することができ、かつ長さ約15〜約60ヌクレオチドの二本鎖配列を含む未修飾siRNA配列を提供する工程；および
（b）センスまたはアンチセンス鎖における少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することによってsiRNAを修飾し、それによって未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さく、かつ標的配列の発現を抑制することができる修飾siRNAを作製する工程。
【請求項１１２】
修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
修飾ヌクレオチドが2'OMeヌクレオチドである、請求項111記載の方法。
【請求項１１４】
修飾ヌクレオチドが、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項111記載の方法。
【請求項１１５】
修飾ヌクレオチドが2'OMe-シトシンヌクレオチドではない、請求項111記載の方法。
【請求項１１６】
未修飾siRNA配列が5'-GU-3'モチーフを含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１７】
未修飾siRNA配列のセンス鎖が5'-GU-3'モチーフを含む、請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
未修飾siRNA配列のアンチセンス鎖が5'-GU-3'モチーフを含む、請求項116記載の方法。
【請求項１１９】
5'-GU-3'モチーフにおける少なくとも1つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドに置換されている、請求項116記載の方法。
【請求項１２０】
5'-GU-3'モチーフにおける両方のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドに置換されている、請求項116記載の方法。
【請求項１２１】
（c）レスポンダー細胞が検出可能な免疫応答を産生するのに好適な条件下で修飾siRNAを哺乳動物レスポンダー細胞と接触させることによって、修飾siRNAの免疫刺激性がより小さいことを確認する工程
をさらに含む、請求項111記載の方法。
【請求項１２２】
以下の工程を含む、免疫刺激特性を有するsiRNAを同定および修飾するための方法：
（a）レスポンダー細胞が検出可能な免疫応答を産生するのに好適な条件下で未修飾siRNA配列を哺乳動物レスポンダー細胞と接触させる工程；
（b）レスポンダー細胞における検出可能な免疫応答の存在によって未修飾siRNA配列を免疫刺激性のsiRNAとして同定する工程；および
（c）少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することによって免疫刺激性のsiRNAを修飾し、それによって未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さい修飾siRNA配列を作製する工程。
【請求項１２３】
修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル（2'OMe）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
修飾ヌクレオチドが2'OMeヌクレオチドである、請求項122記載の方法。
【請求項１２５】
修飾ヌクレオチドが、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項122記載の方法。
【請求項１２６】
修飾ヌクレオチドが2'OMe-シトシンヌクレオチドではない、請求項122記載の方法。
【請求項１２７】
未修飾siRNA配列が5'-GU-3'モチーフを含む、請求項122記載の方法。
【請求項１２８】
哺乳動物レスポンダー細胞が末梢血単核細胞である、請求項122記載の方法。
【請求項１２９】
検出可能な免疫応答が、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、およびその組み合わせからなる群より選択されるサイトカインまたは増殖因子の産生を含む、請求項122記載の方法。
【請求項１３０】
薬学的組成物を製剤化するための、請求項1〜35または37〜57のいずれか一項記載の修飾siRNAの使用。
【請求項１３１】
薬学的組成物を製剤化するための、請求項59〜88のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子の使用。
【請求項１３２】
細胞における標的配列の発現を抑制するための、請求項1〜35または37〜57のいずれか一項記載の修飾siRNAの使用。
【請求項１３３】
細胞における標的配列の発現を抑制するための、請求項59〜88のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子の使用。
【請求項１３４】
哺乳動物対象における標的配列の発現を抑制するための、請求項1〜35または37〜57のいずれか一項記載の修飾siRNAの使用。
【請求項１３５】
哺乳動物対象における標的配列の発現を抑制するための、請求項59〜88のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子の使用。
【請求項１３６】
哺乳動物対象における標的配列の発現を抑制する薬学的組成物を製剤化するための、請求項1〜35または37〜57のいずれか一項記載の修飾siRNAの使用。
【請求項１３７】
哺乳動物対象における標的配列の発現を抑制する薬学的組成物を製剤化するための、請求項59〜88のいずれか一項記載の核酸-脂質粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年11月2日に申請された、米国特許仮出願第60/732,964号、および2006年6月30日に申請された、米国特許仮出願第60/817,933号に対する優先権を主張し、その開示はあらゆる目的のために完全な形で参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
RNA干渉（RNAi）は、相補的な標的一本鎖mRNAの分解および対応する翻訳配列の「サイレンシング」を誘導する二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発される進化的に保存された、配列特異的な機構である（McManus et al., Nature Rev. Genet., 3: 737（2002）（非特許文献1））。RNAiは、長さ約21〜23ヌクレオチドの生物学的活性がある「短い干渉RNA」（siRNA）配列へのより長いdsRNA鎖の酵素的切断によって機能する（Elbashir et al., Genes Dev., 15: 188（2001）（非特許文献2））。siRNAを用いて、関心対象の遺伝子産物、すなわち、標的配列の転写および翻訳を下方調節または抑制することができる。
【０００３】
侵入する病原体に対する自然防御機構の一部として、哺乳動物の免疫系は多くの外来性RNA（Alexopoulou et al., Nature, 413: 732-738（2001）（非特許文献3）; Heil et al., Science, 303: 1526-1529（2004）（非特許文献4）; Diebold et al., Science, 303: 1529-1531（2004）（非特許文献5））およびDNA種（Krieg, Ann. Rev. Immunol., 20: 709-760（2002）（非特許文献6））によって活性化され、インターフェロンおよび炎症性サイトカインの放出を結果的にもたらす。この応答を活性化する結果は、毒性のあるショック様症候群を潜在的に引き起こす局所および全身の炎症反応を伴って、重篤であることができる。これらの免疫毒性は、ヒトを含む、より感受性の強い種において特に、非常にわずかな用量の免疫刺激薬剤で誘発することができる（Michie et al., N. Engl. J. Med., 318: 1481-1486（1988）（非特許文献7）; Krown et al., Semin. Oncol., 13: 207-217（1986）（非特許文献8））。細胞内送達を容易にする媒体と共に投与された場合、合成siRNAは先天免疫応答の強力なアクチベーターであることができるということが最近示された（Judge et al., Nat. Biotechnol., 23: 457-462（2005）（非特許文献9）; Hornung et al., Nat. Med., 11: 263-270（2005）（非特許文献10）; Sioud, J. Mol. Biol., 348: 1079-1090（2005）（非特許文献11））。依然としてきちんと明確にされていないが、siRNAの免疫認識は配列依存的であり、およびToll様受容体-7（TLR7）経路を介して先天免疫細胞を活性化し、インターフェロン-α（IFN-α）および炎症性サイトカインの強力な誘導を引き起こす可能性が高い。インビボでのsiRNAの投与と関連する毒性は、そのような応答が原因であるとされている（Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23: 1002-1007（2005）（非特許文献12）; Judge et al., 前記（非特許文献9））。
【０００４】
急速なヌクレアーゼ分解に対する合成siRNAの安定化は通常、インビボ適用および治療的適用のための必要条件とみなされている。リボザイムおよびアンチセンス分子などの、その他の核酸薬物のために以前に開発された様々な安定化化学反応を用いて、これを達成することができる（Manoharan, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 570-579（2004）（非特許文献13））。これらは、RNA合成の間に2'-修飾ヌクレオチドとしてsiRNAに容易に導入することができる2'-O-メチル（2'OMe）および2'-フルオロ（2'F）置換などの、リボース糖骨格における未変性な2'-OH基への化学修飾を含む。多くの報告により、機能的なRNAi活性を保持する2'OMe（Czauderna et al., Nucl. Acids Res., 31: 2705-2716（2003）（非特許文献14）; Allerson et al., J. Med. Chem., 48: 901-904（2005）（非特許文献15）; Prakash et al., J. Med. Chem., 48: 4247-4253（2005）（非特許文献16））、2'F（Chiu et al., RNA, 9: 1034-1048（2003）（非特許文献17）; Layzer et al., RNA, 10: 766-771（2004）（非特許文献18）; Allerson et al., 前記（非特許文献15）; Prakash et al., 前記（非特許文献16））、2'-デオキシ（Chiu et al., 前記（非特許文献17））、または「ロック核酸」（LNA）（Hornung et al., 前記（非特許文献10）; Elmen et al., Nucl. Acids Res., 33: 439-447（2005）（非特許文献18））修飾を含む化学的に安定化されたsiRNAを設計することができることが示されているが、そのような修飾は、ある種のあまり明確ではない位置的なまたは配列が関連する文脈でのみ許容されるように思われる。実際、未変性なsiRNA二重鎖への化学修飾の導入は、多くの場合、RNAi活性に対する負の影響を有することができる（Hornung et al., 前記（非特許文献10）; Czauderna et al., 前記（非特許文献14）; Prakash et al., 前記（非特許文献16）; Chiu et al., 前記（非特許文献17）; Elmen et al., 前記（非特許文献18））。結果として、化学修飾siRNAの設計は、強力な遺伝子サイレンシング活性を保持する二重鎖を同定するための確率的スクリーニングアプローチを必要としている。
【０００５】
細胞による外来核酸の不十分な摂取はsiRNAに基づく薬物の開発に対するさらなる障壁を表している。siRNAは、核酸の細胞内摂取を増大させかつ全身投与に好適である、安定な核酸-脂質粒子（SNALP）と呼ばれるリポソームの中に封入することができる。これらの系はインビトロでRNAiを媒介するのに効果的であり（Judge et al., 前記（非特許文献9））、およびB型肝炎のマウスモデルにおいて治療的に実行可能なsiRNA用量でウイルスの複製を阻害することが示されている（Morrissey et al., 前記（非特許文献12））。しかしながら、これらの検討は、90％超の修飾ヌクレオチドを含む合成siRNAで行なわれ、それによってRNAiを介する遺伝子サイレンシングの効力が損なわれる可能性がある。
【０００６】
したがって、RNAi活性に対する負の影響を有することなくsiRNAの免疫刺激活性を阻止する最小限に修飾されたsiRNA分子に対する当技術分野における強い必要性がある。本発明はこのおよびその他の必要性に取り組む。
【０００７】
【非特許文献１】McManus et al., Nature Rev. Genet., 3: 737（2002）
【非特許文献２】Elbashir et al., Genes Dev., 15: 188（2001）
【非特許文献３】Alexopoulou et al., Nature, 413: 732-738（2001）
【非特許文献４】Heil et al., Science, 303: 1526-1529（2004）
【非特許文献５】Diebold et al., Science, 303: 1529-1531（2004）
【非特許文献６】Krieg, Ann. Rev. Immunol., 20: 709-760（2002）
【非特許文献７】Michie et al., N. Engl. J. Med., 318: 1481-1486（1988）
【非特許文献８】Krown et al., Semin. Oncol., 13: 207-217（1986）
【非特許文献９】Judge et al., Nat. Biotechnol., 23: 457-462（2005）
【非特許文献１０】Hornung et al., Nat. Med., 11: 263-270（2005）
【非特許文献１１】Sioud, J. Mol. Biol., 348: 1079-1090（2005）
【非特許文献１２】Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23: 1002-1007（2005）
【非特許文献１３】Manoharan, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 570-579（2004）
【非特許文献１４】Czauderna et al., Nucl. Acids Res., 31: 2705-2716（2003）
【非特許文献１５】Allerson et al., J. Med. Chem., 48: 901-904（2005）
【非特許文献１６】Prakash et al., J. Med. Chem., 48: 4247-4253（2005）
【非特許文献１７】Chiu et al., RNA, 9: 1034-1048（2003）
【非特許文献１８】Layzer et al., RNA, 10: 766-771（2004）
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、化学修飾siRNA分子およびそのようなsiRNA分子を用いて標的遺伝子発現を抑制する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、一部は、siRNA二重鎖の1つまたは両方の鎖内の選択的位置での、2'-O-メチル（2'OMe）修飾などの、最小限の化学修飾がsiRNAの免疫刺激活性を低下させまたは完全に阻止するのに十分であるという驚くべき発見に基づく。ある種の例において、化学修飾をsiRNA二重鎖の非標的化センス鎖に制限することによって、完全なRNAi活性を保持しながらsiRNAの免疫刺激活性を無効にすることができる。あるいは、siRNA二重鎖のセンスおよびアンチセンス鎖内の選択的位置での、2'OMe修飾などの、最小限の化学修飾は、RNAi活性を保持しながらsiRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分である。アポリポタンパク質B（ApoB）および有糸分裂キネシンEg5を内在性遺伝子標的の非限定的な例として用いて、対応する未修飾siRNA配列によって誘発される免疫活性化と関連するサイトカイン誘導、免疫毒性、またはオフターゲット効果を伴わずに、本発明の修飾siRNA分子を用いて強力な遺伝子サイレンシングをインビボで達成することができる。結果として、患者は、そのような治療と関連する免疫刺激性のある副作用のいずれにも苦しむことなく、siRNA治療の完全な恩恵を受けると考えられる。
【００１０】
ある局面において、本発明は、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さくかつ標的配列の発現を抑制することができる、長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖領域を含む修飾siRNAを提供する。
【００１１】
典型的には、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約20％未満（例えば、約20％、15％、10％、もしくは5％未満）または約1％〜約20％（例えば、約1％〜20％、5％〜20％、10％〜20％、もしくは15％〜20％）が修飾ヌクレオチドを含む。非限定的な例として、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域における未変性な2'-OH位置の約5％に相当する、わずか2つの2'OMe-修飾ヌクレオチドを含むことができる。この最小限度の化学修飾は、極めて免疫刺激性のあるsiRNA配列の中に取り込まれた場合、インビトロおよびインビボでのsiRNAを介するインターフェロンおよび炎症性サイトカイン誘導を低下させまたは完全に阻止することができる（実施例1参照）。
【００１２】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、2'OMeヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNAは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾siRNAは2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。その他の態様において、修飾siRNAはヘアピンループ構造を含む。
【００１３】
修飾siRNAは、siRNAの二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドはsiRNA二重鎖の二本鎖領域における選択的位置で修飾されている。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるウリジンヌクレオチドの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くは2'OMe-ウリジンヌクレオチドなどの修飾ウリジンヌクレオチドであることができる。幾つかの態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるあらゆるウリジンヌクレオチドは2'OMe-ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるグアノシンヌクレオチドの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くは2'OMe-グアノシンヌクレオチドなどの修飾グアノシンヌクレオチドであることができる。幾つかの態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるあらゆるグアノシンヌクレオチドは2'OMe-グアノシンヌクレオチドである。
【００１４】
ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％免疫刺激性が小さい。好ましくは、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％（例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）免疫刺激性が小さい。例えば、（本明細書において開示されたSNALP送達系またはその他のリポプレックス（lipoplex）系などの）適当な脂質に基づく送達系を用いた哺乳動物における全身投与後2〜24時間後のINF-αおよび／またはIL-6レベルを測定することによって、修飾siRNA分子および対応する未修飾siRNA分子の免疫刺激特性を決定することができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。
【００１５】
ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍以下のIC50を有する（すなわち、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍に等しいか、またはそれより小さいIC50を有する）。その他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の3倍以下のIC50を有する。またその他の態様において、修飾siRNAは好ましくは、対応する未修飾siRNAのIC50の2倍以下のIC50を有する。当業者に公知の方法を用いて用量応答曲線を作成することができ、かつ修飾siRNAおよび対応する未修飾siRNAについてのIC50値を容易に決定することができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。
【００１６】
好ましくは、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％（例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）免疫刺激性が小さく、ならびに修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍（好ましくは3倍、およびより好ましくは、2倍）またはそれより小さいIC50を有する。
【００１７】
また別の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べて標的配列の発現の少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、またはそれより多くを抑制することができる。
【００１８】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖にリン酸骨格修飾を含まない。その他の態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖に2'-デオキシヌクレオチドを含まない。ある種の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある種のその他の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端付近（例えば、3’末端の1、2、3、または4ヌクレオチド以内）のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
【００１９】
本発明の修飾siRNAは、二本鎖領域の1つもしくは両方の側に1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くのヌクレオチドの3'突出部を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。好ましくは、修飾siRNAは、二本鎖領域の各々の側に2ヌクレオチドの3'突出部を有する。ある種の例において、アンチセンス鎖上の3'突出部は、標的配列に対する相補性を有し、およびセンス鎖上の3'突出部は、標的配列の相補鎖に対する相補性を有する（例えば、表3中のApoB siRNA二重鎖を参照）。あるいは、3'突出部は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有さない。幾つかの態様において、3'突出部は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれより多くの、2'-デオキシ（2'H）ヌクレオチドなどのヌクレオチドを含む。好ましくは、3'突出部は、デオキシチミジン（dT）ヌクレオチドを含む。
【００２０】
幾つかの態様において、対応する未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフを含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。
【００２１】
ある種の態様において、修飾siRNAは、例えば、修飾siRNAを哺乳動物の細胞内に送達するための、担体系をさらに含む。本発明での使用に好適な担体系の非限定的な例として、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム（virosome）、核酸複合体、およびそれらの混合物が含まれる。ある種の例において、修飾siRNA分子はカチオン性脂質などの脂質と複合体を形成し、リポプレックスを形成する。ある種のその他の例において、修飾siRNA分子はカチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（PEI））などのポリマーと複合体を形成し、ポリプレックス（polyplex）を形成する。修飾siRNA分子はまた、サイクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。好ましくは、修飾siRNA分子は核酸-脂質粒子の中に封入されている。
【００２２】
本発明はまた、本明細書において記載された修飾siRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００２３】
関連する局面において、本発明は、siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチドの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドを含み、かつsiRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチドが修飾ヌクレオチドではない、長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖領域を含む修飾siRNAを提供する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、二本鎖領域におけるヌクレオチドの少なくとも2つが修飾グアノシンヌクレオチド、修飾ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖領域を含む修飾siRNAを提供する。修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ顕著に免疫刺激性が小さくかつ標的配列の発現を抑制することができる。
【００２５】
典型的には、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約30％未満（例えば、約30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％未満）または約1％〜約30％（例えば、約1％〜30％、5％〜30％、10％〜30％、15％〜30％、20％〜30％、もしくは25％〜30％）が修飾ヌクレオチドを含む。非限定的な例として、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域における未変性な2'-OH位置の約30％未満を表す、10の2'OMe-グアノシンおよび／または2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含むことができる。この最小限度の化学修飾は、極めて免疫刺激性のあるsiRNA配列の中に取り込まれた場合、インビトロおよびインビボでのsiRNAを介するインターフェロンおよび炎症性サイトカイン誘導を低下させまたは完全に阻止することができる（実施例2〜4参照）。
【００２６】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'F-グアノシンヌクレオチド、2'F-ウリジンヌクレオチド、2'-デオキシグアノシンヌクレオチド、2'-デオキシウリジンヌクレオチド、2'OMOE-グアノシンヌクレオチド、2'OMOE-ウリジンヌクレオチド、LNAグアノシンヌクレオチド、LNAウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、修飾グアノシンおよび／またはウリジンヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物を含む。その他の態様において、修飾siRNAはヘアピンループ構造を含む。
【００２７】
修飾siRNAは、siRNAの二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多くが、siRNA二重鎖の二本鎖領域における選択的位置で修飾されている。
【００２８】
ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％免疫刺激性が小さい。好ましくは、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％（例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）免疫刺激性が小さく、かつ対応する未修飾siRNAのIC50の10倍以下のIC50を有する。その他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の3倍以下のIC50を有する。またその他の態様において、修飾siRNAは好ましくは、対応する未修飾siRNAのIC50の2倍以下のIC50を有する。
【００２９】
その他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べて標的配列の発現の少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、またはそれより多くを抑制することができる。
【００３０】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖にリン酸骨格修飾を含まない。その他の態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖に2'-デオキシヌクレオチドを含まない。ある種の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある種のその他の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端付近（例えば、3’末端の1、2、3、または4ヌクレオチド以内）のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
【００３１】
本発明の修飾siRNAは、二本鎖領域の1つもしくは両方の側に1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くのヌクレオチドの3'突出部を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。好ましくは、修飾siRNAは、二本鎖領域の各々の側に2ヌクレオチドの3'突出部を有する。幾つかの態様において、3'突出部は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれより多くの2'-デオキシ（2'H）ヌクレオチドなどのヌクレオチドを含む。好ましくは、3'突出部は、デオキシチミジン（dT）ヌクレオチドを含む。
【００３２】
幾つかの態様において、対応する未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフを含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。
【００３３】
ある種の態様において、修飾siRNAは、例えば、修飾siRNAを哺乳動物の細胞内に送達するための担体系をさらに含む。担体系の非限定的な例として、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物が含まれる。ある種の例において、修飾siRNA分子はカチオン性脂質などの脂質と複合体を形成し、リポプレックスを形成する。ある種のその他の例において、修飾siRNA分子はカチオン性ポリマー（例えば、PEI）などのポリマーと複合体を形成し、ポリプレックスを形成する。修飾siRNA分子はまた、サイクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。好ましくは、修飾siRNA分子は核酸-脂質粒子の中に封入されている。
【００３４】
本発明はまた、本明細書において記載された修飾siRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００３５】
また別の局面において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNA、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子を提供する。ある種の例において、核酸-脂質粒子は、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質をさらに含む。好ましくは、核酸-脂質粒子は、本明細書において記載された修飾siRNA、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。
【００３６】
カチオン性脂質は、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTAP）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミン（DODMA）、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLendMA）、またはそれらの混合物であってもよい。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約20mol％〜約50mol％または約40mol％を含んでもよい。
【００３７】
非カチオン性脂質は、例えば、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-フォスファチジルコリン（DPPC）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵（egg）フォスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であってもよい。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約90mol％または約20mol％を含んでもよい。
【００３８】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、またはそれらの混合物であってもよい。ある好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートのいずれかを含む。ある種の態様において、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートをCPLと共に用いる。粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、例えば、PEG-ジアシルグリセロール（DAG）、PEG-ジアルキルオキシプロピル（DAA）、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）、またはそれらの混合物を含むPEG-脂質を含んでもよい。PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）、またはPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）であってもよい。幾つかの態様において、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、Aが脂質部分、Wが親水性ポリマー、およびYがポリカチオン性部分である、式：A-W-Yを有するCPLである。Wは、約250〜約7000ダルトンの分子量を有する、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共ポリマー、またはその組み合わせからなる群より選択されるポリマーであってもよい。幾つかの態様において、Yは、選択されたpHで少なくとも4つの正電荷を有する。幾つかの態様において、Yは、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、その誘導体、またはその組み合わせであってもよい。粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質は、粒子中に存在する全脂質の0mol％〜約20mol％または約2mol％であってもよい。
【００３９】
幾つかの態様において、核酸-脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する全脂質の約10mol％〜約60mol％、約30mol％〜約50mol％、または約48mol％でコレステロールをさらに含む。
【００４０】
ある種の態様において、核酸-脂質粒子中の修飾siRNAは、37℃で少なくとも20、30、45、もしくは60分間のヌクレアーゼへの粒子の曝露後に；または37℃で少なくとも30、45、もしくは60分間の血清中での粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
【００４１】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、核酸-脂質粒子の中に完全に封入されている。その他の態様において、修飾siRNAは、粒子の脂質部分と複合体を形成している。
【００４２】
本発明は、本明細書において記載された核酸-脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００４３】
さらにまた別の局面において、本明細書において記載された修飾siRNAは、標的配列の発現を抑制するための方法において用いられる。特に、関心対象の標的遺伝子の転写および／または翻訳を下方調節または抑制することによる哺乳動物における疾患または障害の処置のためのインビトロおよびインビボ方法を提供することが本発明の目的である。ある態様において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNAと細胞を接触させることによって、標的配列の発現（例えば、mRNAおよび／またはタンパク質レベル）を抑制するsiRNAを細胞内に導入するための方法を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNAを哺乳動物に投与することによって、標的配列の発現を抑制するsiRNAのインビボ送達のための方法を提供する。修飾siRNAの投与は、例えば、経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、病変内投与、気管内投与、皮下投与、または皮内投与などの、当技術分野において公知の任意の経路によることができる。
【００４４】
これらの方法において、修飾siRNAは、典型的には担体系と共に製剤化され、および修飾siRNAを含む担体系は、そのような処置を必要とする哺乳動物に投与される。本発明での使用に好適な担体系の例として、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体（例えば、リポプレックス、ポリプレックスなど）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。担体系は、本明細書において記載された修飾siRNA分子の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多くを含んでもよい。あるいは、細胞をヒトなどの哺乳動物から除去し、修飾siRNAをインビトロで送達し、およびその後注射などによって、細胞を哺乳動物に投与する。
【００４５】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、修飾siRNA、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子中にある。好ましくは、修飾siRNAは、修飾siRNA、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む核酸-脂質粒子である。治療的有効量の核酸-脂質粒子を哺乳動物対象（例えば、マウスなどの齧歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサルなどの霊長類）に投与することができる。
【００４６】
別の態様において、核酸-脂質粒子の全投与用量の少なくとも約1％、2％、4％、6％、8％、または10％が、投与後約1、2、4、6、8、12、16、18、または24時間で血漿中に存在する。さらなる態様において、核酸-脂質粒子の全投与用量の約20％、30％、もしくは40％よりも多く、または約60％、70％、もしくは80％と同じ程度が、投与後約1、4、6、8、10、12、20、または24時間で血漿中に存在する。ある態様において、投与の部位に対して近位または遠位の部位での修飾siRNAの効果（例えば、標的配列の下方調節）は、核酸-脂質粒子の投与後約12、24、48、72、もしくは96時間、または約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、もしくは28日で検出可能である。別の態様において、標的配列の発現の下方調節は、投与後約12、24、48、72、もしくは96時間、または約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、もしくは28日で検出可能である。ある種の例において、遺伝子配列の発現の下方調節を、哺乳動物由来の生物学的試料におけるmRNAまたはタンパク質レベルを測定することによって検出する。
【００４７】
それらは循環中で安定であり、血管外部位への接近を結果的にもたらす薬力学的挙動に必要とされるサイズであり、および細胞集団を標的するので、核酸-脂質粒子は静脈内核酸送達での使用に好適である。本発明はまた、核酸-脂質粒子を含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００４８】
さらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む免疫刺激特性を有するsiRNAを修飾するための方法を提供する：（a）標的配列の発現を抑制することができかつ長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖配列を含む未修飾siRNA配列を提供する工程；および（b）センスまたはアンチセンス鎖における少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することによってsiRNAを修飾し、それによって未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さくかつ標的配列の発現を抑制することができる修飾siRNAを作製する工程。 
【００４９】
幾つかの態様において、修飾ヌクレオチドには、2'OMeヌクレオチド、2'Fヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'OMOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、修飾ヌクレオチドは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾ヌクレオチドは2'OMe-シトシンヌクレオチドではない。
【００５０】
ある種の例において、未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフを含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。好ましくは、5'-GU-3'モチーフにおける少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換する。非限定的な例として、5'-GU-3'モチーフにおける両方のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することができる。
【００５１】
幾つかの態様において、本方法は以下の工程をさらに含む：（c）レスポンダー細胞が検出可能な免疫応答を産生するのに好適な条件下で修飾siRNAを哺乳動物レスポンダー細胞と接触させることによって、修飾siRNAがより免疫刺激性が小さいということを確認する工程。哺乳動物レスポンダー細胞は、ナイーブな哺乳動物（すなわち、以前にsiRNA配列の遺伝子産物と接触していない哺乳動物）由来であってもよい。哺乳動物レスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージ、およびそれらと同様の細胞由来であってもよい。検出可能な免疫応答は、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、またはその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生を含んでもよい。
【００５２】
関連する局面において、本発明は、免疫刺激特性を有するsiRNAを同定および修飾するための方法を提供する。本方法は、以下の工程を含む：（a）レスポンダー細胞が検出可能な免疫応答を産生するのに好適な条件下で未修飾siRNA配列を哺乳動物レスポンダー細胞と接触させる工程；（b）レスポンダー細胞における検出可能な免疫応答の存在によって未修飾siRNA配列を免疫刺激性のsiRNAとして同定する工程；および（c）少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することによって免疫刺激性のsiRNAを修飾し、それによって未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さい修飾siRNA配列を作製する工程。
【００５３】
ある種の態様において、修飾ヌクレオチドには、2'OMeヌクレオチド、2'Fヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'OMOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、修飾ヌクレオチドは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾ヌクレオチドは2'OMe-シトシンヌクレオチドではない。
【００５４】
ある種の例において、未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフを含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。好ましくは、5'-GU-3'モチーフにおける少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換する。非限定的な例として、5'-GU-3'モチーフにおける両方のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することができる。
【００５５】
ある態様において、哺乳動物レスポンダー細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージ、およびそれらと同様の細胞由来である。別の態様において、検出可能な免疫応答は、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、またはその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生を含む。
【００５６】
さらなる局面において、本発明は、表1および2で示された修飾配列を含む単離された核酸分子を提供する。修飾配列はその相補鎖をさらに含み、それによって修飾siRNA二重鎖を作製することができる。関連する局面において、本発明は、表3、5、および6で示された修飾siRNA二重鎖を含む単離された核酸分子を提供する。
【００５７】
本発明のその他の特色、目的、および利点ならびにその好ましい態様は、以下に続く詳細な説明、実施例、および特許請求の範囲から明白になると考えられる。
【００５８】
発明の詳細な説明
I、序論
合成siRNAによる疾患関連遺伝子の標的抑制は、新規の治療戦略としてかなりの見込みを保有している。しかしながら、未修飾siRNAは、免疫刺激性であり得、例えば、特に細胞内摂取を容易にする送達媒体と関連する場合、先天免疫細胞由来の強力な炎症性応答を刺激し得る。これは、炎症性応答と関連する毒性およびオフターゲット遺伝子効果によるsiRNAの治療的開発に対する著しい障壁を表す。本発明は、siRNA二重鎖のいずれかまたは両方の鎖への2'-O-メチル（2'OMe）ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの選択的取り込みを用いて合成siRNAに対する免疫応答を低下させまたは完全に阻止することによって、これらの限界を克服する。特に、siRNA二重鎖の二本鎖領域内に選択的な2'OMe修飾を取り込ませることによって、完全な遺伝子サイレンシング活性を保持する免疫刺激性のないsiRNAを容易に作製することができる。非限定的な例として、アポリポタンパク質B（ApoB）を標的する2'OMe-修飾siRNAは、核酸-脂質粒子などの効果的な全身送達媒体の中に封入した場合、その標的mRNAの強力なサイレンシングを媒介し、血清ApoBおよびコレステロールの著しい減少を引き起こすことができる。これは、未修飾siRNAの使用と関連するサイトカイン誘導、毒性、およびオフターゲット効果を伴わずに、治療的に実行可能なsiRNA用量で達成される。好都合なことに、本明細書において記載されたsiRNA設計および送達に対するアプローチは幅広く適用でき、かつ合成siRNAを広範囲の治療領域に前進させる。
【００５９】
したがって、本発明は、化学修飾siRNA分子およびそのようなsiRNA分子を用いて標的遺伝子発現を抑制する方法を提供する。本発明はまた、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質をさらに含むことができる、本明細書において記載された修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子を提供する。本発明はさらに、本明細書において記載された修飾siRNA分子を哺乳動物対象に投与することによって遺伝子発現を抑制する方法を提供する。免疫刺激特性を有するsiRNAを同定および／または修飾するための方法も提供する。
【００６０】
II、定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は、そうでないように特定されない限り、それらに特有のものとされる意味を有する。
【００６１】
「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、干渉RNAが標的遺伝子と同じ細胞の中にある場合に、（すなわち、干渉RNAの配列に相補的であるmRNAの分解を媒介することによって）標的遺伝子の発現を低下させまたは阻害することができる二本鎖RNA（すなわち、二重鎖RNA）を指す。したがって、干渉RNAは、2つの相補的な鎖によってまたは1つの、自己相補的な鎖によって形成された二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子に対する実質的なもしくは完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでもよい。干渉RNAの配列は、全長標的遺伝子、またはそのサブ配列に対応することができる。
【００６２】
干渉RNAは、「小さい干渉RNA」または「siRNA」、例えば、長さ約15〜60、15〜50、または15〜40（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さ約15〜30、15〜25、または19〜25（二重鎖）ヌクレオチドの干渉RNAを含み、および好ましくは長さ約20〜24、21〜22、または21〜23（二重鎖）ヌクレオチドである（例えば、二本鎖siRNAの各々の相補的配列は、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド、好ましくは長さ約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチドであり、および二本鎖siRNAは、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25塩基対、好ましくは長さ約20〜24、21〜22、または21〜23塩基対である）。siRNA二重鎖は、約1〜約4ヌクレオチドまたは約2〜約3ヌクレオチドの3'突出部および5'リン酸末端をを含んでもよい。siRNAの例として、一方の鎖がセンス鎖でかつ他方が相補的なアンチセンス鎖である、2つの別々の鎖の分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センスおよびアンチセンス領域が核酸に基づくまたは核酸に基づかないリンカーによって連結されている、一本鎖の分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を持つ二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに環状ポリヌクレオチドをインビボまたはインビトロで処理し、活性のある二本鎖siRNA分子を作製することができる、2つまたはそれより多くのループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを持つ環状一本鎖ポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６３】
好ましくは、siRNAを化学合成する。siRNAは、大腸菌（E. coli）RNアーゼIIIまたはDicerによるより長いdsRNA（例えば、長さ約25ヌクレオチド超のdsRNA）の切断によって作製することもできる。これらの酵素は、dsRNAを処理して生物学的活性のあるsiRNAにする（例えば、Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 9942-9947（2002）; Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14236（2002）; Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1): 4-6（2003）; Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31: 981-987（2003）; Knight et al., Science, 293: 2269-2271（2001）;およびRobertson et al., J. Biol. Chem., 243: 82（1968）参照）。好ましくは、dsRNAは、長さが少なくとも50ヌクレオチド〜約100、200、300、400、または500ヌクレオチドである。dsRNAは、長さが1000、1500、2000、5000ヌクレオチドと同じ程度であってもよく、またはそれより長くてもよい。dsRNAは、全体的な遺伝子転写物または部分的な遺伝子転写物をコードすることができる。ある種の例において、siRNAはプラスミドによってコードされ（例えば、ヘアピンループを持つ二重鎖に自動的に折り畳まれる配列として転写され）てもよい。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対する100％相補性を有さないsiRNA配列の部分を指す。siRNAは、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くのミスマッチ領域を有してもよい。ミスマッチ領域は連続的であってもよく、または1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、もしくはそれより多くのヌクレオチドだけ離れていてもよい。ミスマッチモチーフもしくはミスマッチ領域は1つのヌクレオチドを含んでもよく、または2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれより多くのヌクレオチドを含んでもよい。
【００６５】
siRNAの「有効量」または「治療的有効量」とは、所望の効果、例えば、siRNAの非存在下で検出される正常の発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害を産生するのに十分な量である。対照と比べてsiRNAで得られる値が約90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、または0％である場合、標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための好適なアッセイには、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能などの当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはmRNAレベルの調査だけでなく、当業者に公知の表現型アッセイも含まれる。
【００６６】
siRNAによる免疫応答の「減少（decrease）」、「減少（decreasing）」、「低下（reduce）」、または「低下（reducing）」によって、siRNA（例えば、修飾siRNA）に対する免疫応答の検出可能な減少を意味するよう意図される。未修飾siRNAの存在下での免疫応答のレベルと比べて修飾siRNAによる免疫応答の減少の量を決定してもよい。検出可能な減少は、未修飾siRNAの存在下で検出される免疫応答と比べ約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、またはそれより多く低下したものであることができる。siRNAに対する免疫応答の減少を、典型的にはインビトロでのレスポンダー細胞によるサイトカイン産生（例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6、もしくはIL-12）の減少またはsiRNAの投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン産生の減少によって測定する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「レスポンダー細胞」という用語は、免疫刺激性のあるsiRNAと接触させた場合に、検出可能な免疫応答を産生する細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。例示的なレスポンダー細胞として、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞（PBMC）、脾細胞、およびそれらと同様の細胞が含まれる。検出可能な免疫応答として、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TGF、およびその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生が含まれる。
【００６８】
「実質的同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする配列を指し、または参照配列の特定の領域に対する特定の同一性パーセントを有する配列を指す。
【００６９】
2つまたはそれより多くの核酸の文脈における、「実質的に同一」または「実質的同一性」という用語は、比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてもしくは手作業での整列および目視による検査によって測定されるような指定の領域に対する最大限の対応について比較および整列した場合に、同じであり、または特定のパーセンテージの同じであるヌクレオチド（すなわち、特定の領域に対する少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％同一性）を有する2つもしくはそれより多くの配列またはサブ配列を指す。この定義は、文脈が示す場合、配列の相補体も類似的に指す。好ましくは、実質的同一性は、長さが少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60ヌクレオチドである領域に対して存在する。
【００７０】
配列比較のために、典型的には1つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には、サブ配列座標を指定し、ならびに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを用いることができ、または代わりのパラメーターを指定することができる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメーターに基づいて、試験配列についての参照配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
【００７１】
本明細書において使用される場合の、「比較ウインドウ」は、2つの配列を最適に整列した後に同じ数の連続する位置の参照配列に対して配列を比較し得る、約5〜約60、通例として約10〜約45、より通例として約15〜約30からなる群より選択される多くの連続する位置のいずれか1つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列の整列の方法は当業者に周知である。例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2：482（1981）の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48：443（1970）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：2444（1988）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピュータ化した履行によって、または手作業での整列および目視による検査によって、比較のための配列の最適な整列を実施することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 編（1995補遺）参照）。
【００７２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの好ましい例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25：3389-3402（1977）およびAltschul et al., J. Mol. Biol., 215：403-410（1990）に記載されている、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。本明細書において記載されたパラメーターと共に、BLASTおよびBLAST 2.0を用いて、本発明の核酸についての配列同一性パーセントを決定する。BLAST解析を行なうためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に入手可能である。
【００７３】
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計的解析も行なう（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：5873-5787（1993）参照）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率（P(N)）であり、それは2つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に起こると考えられる確率の表示を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸との比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列と同様であると考えられる。
【００７４】
本明細書において使用される場合の「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にある少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むポリマーを指し、かつDNAおよびRNAを含む。DNAは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドDNA、凝縮前のDNA、PCR産物、ベクター（P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体および組み合わせの形態にあってもよい。RNAは、siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、vRNA、およびその組み合わせの形態にあってもよい。核酸は、合成、天然、および非天然であり、かつ参照核酸と同様の結合特性を有する、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは連結を含む核酸を含む。そのような類似体の例として、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する自然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。そうでないように示されない限り、ある特定の核酸配列は、明瞭に示された配列だけでなく、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、SNP、および相補的配列もまた暗に包含する。具体的には、1つもしくは複数の選択された（または全ての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換されている配列を作製することによって、縮重コドン置換を達成してもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19：5081（1991）；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260：2605-2608（1985）；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8：91-98（1994））。「ヌクレオチド」は糖であるデオキシリボース（DNA）またはリボース（RNA）、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドはリン酸基を介して互いに連結している。「塩基」はプリンおよびピリミジンを含み、それは自然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、および自然類似体、ならびにアミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハリドなどの、しかしこれらに限定されない、新しい反応基を置く修飾を含むが、これらに限定されない、プリンおよびピリミジンの合成誘導体をさらに含む。
【００７５】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長コード配列を含む核酸（例えば、DNAまたはRNA）配列を指す。
【００７６】
本明細書において使用される場合の、「遺伝子産物」は、RNA転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。
【００７７】
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むが、これに限定されず、および水に溶けないが、多くの有機溶媒には溶けることを特徴とする、一群の有機化合物を指す。それらは通例、少なくとも3つの部類：（1）脂肪および油だけでなくロウも含む、「単純脂質」；（2）リン脂質および糖脂質を含む、「複合脂質」；ならびに（3）ステロイドなどの「誘導脂質」に分けられる。
【００７８】
「脂質小胞」は、水性容量が両親媒性の脂質二重層によって封入され、もしくは脂質が、低下した水性内部を伴って、干渉RNA配列を含むプラスミドなどの、巨大な分子成分を含む内部をコーティングする、リポソーム；または封入された成分が比較的秩序のない脂質混合物の中に含まれる、脂質凝集体もしくはミセルを含むが、これに限定されない、siRNAなどの化合物を送達するのに用いることができる任意の脂質組成物を指す。脂質小胞という用語は、SPLP、pSPLP、SNALP、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、脂質-核酸複合体、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な脂質に基づく担体系のいずれかを包含する。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「封入された脂質」という用語は、完全封入、部分封入、または両方を伴ってsiRNAなどの化合物を提供する脂質製剤を指すことができる。好ましい態様において、（例えば、SPLP、pSPLP、SNALP、またはその他の核酸-脂質粒子を形成するために）核酸を脂質製剤中に完全に封入する。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「SNALP」という用語は、SPLPを含む、安定な核酸-脂質粒子を指す。SNALPは、核酸（例えば、siRNA、ssDNA、dsDNA、ssRNA、マイクロRNA（miRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、dsRNA、またはそれから干渉RNAが転写されるプラスミドを含む、プラスミド）を含む低下した水性内部をコーティングする脂質の小胞を表す。本明細書において使用される場合、「SPLP」という用語は、脂質小胞内に封入された核酸（例えば、プラスミド）を含む核酸-脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、PEG-脂質コンジュゲート）を含む。それらは静脈内（i.v.）注射後の延長された循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）で蓄積し、およびこれらの遠位部位でのトランスフェクトされた遺伝子の発現を媒介することができるので、SNALPおよびSPLPは全身適用に極めて有用である。SPLPには、PCT刊行物国際公開公報第00/03683号に示されたような封入された凝縮薬剤-核酸複合体を含む、「pSPLP」が含まれる。
【００８１】
本発明の核酸-脂質粒子は、典型的には約50nm〜の約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜の約110nm、最も典型的には約70nm〜の約90nmの平均直径を有し、かつ実質的に無毒である。さらに、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸はヌクレアーゼによる分解に対して水性溶液中で抵抗性である。核酸-脂質粒子およびそれらの調製の方法が、例えば米国特許第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410号；および第6,815,432号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/40964号に開示されている。  
【００８２】
「小胞形成脂質」という用語は、多くのリン脂質によって例示されるような、疎水性部分および極性頭部基を有し、かつそれだけで水中で二重層小胞を自然に形成する任意の両親媒性脂質を含むよう意図される。
【００８３】
「小胞導入脂質」という用語は、その疎水性部分を二重層膜の内部の、疎水性領域と接触させ、かつその極性頭部基部分を膜の外部の、極性表面の方に向け、その他の両親媒性脂質と組み合わせて脂質二重層に安定に取り込まれる任意の両親媒性脂質を含むよう意図される。小胞導入脂質は、それら自体で非ラメラ相を導入する傾向にはあるが、二重層安定化成分の存在下で二重層構造を取ることができる脂質を含む。典型的な例は、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）である。二重層安定化成分として、核酸-脂質粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質、ポリアミドオリゴマー（例えば、ATTA-脂質誘導体）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質-誘導体、ジアルキルオキシプロピルに共役したPEG、ジアシルグリセロールに共役したPEG、フォスファチジル-エタノールアミンに共役したPEG、セラミドにコンジュゲートされたPEG（例えば、米国特許第5,885,613号参照）、カチオン性PEG脂質などのPEG-脂質誘導体、、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。PEGは脂質に直接コンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結してもよい。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、PEGを脂質に共役するのに好適な任意のリンカー部分を用いることができる。
【００８４】
「両親媒性脂質」という用語は、一部は、脂質材料の疎水性部分が疎水相の中に向き、一方で親水性部分が水性相の方に向く任意の好適な材料を指す。両親媒性脂質は通例、脂質小胞の主要成分である。親水性の特徴は、炭水化物基、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、水酸基、およびその他の同様の基などの極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つもしくは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環基で置換されたそのような基を含むが、これらに限定されない、非極性基の含有によって与えることができる。両親媒性化合物の例として、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質の代表的な例として、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン、リソフォスファチジルコリン、リソフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン、およびジリノレオイルフォスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸などの、リンを欠くその他の化合物も、両親媒性脂質として指定される基の範囲内である。さらに、上記の両親媒性脂質をトリグリセリドおよびステロールを含むその他の脂質と混合することができる。
【００８５】
「中性脂質」という用語は、選択されたpHで無荷電形態または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種いずれかを指す。生理学的pHで、そのような脂質は、例えば、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールを含む。
【００８６】
「非カチオン性脂質」という用語は、上記のような任意の中性脂質だけでなくアニオン性脂質も指す。
【００８７】
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的pHで負に荷電している任意の脂質を指す。これらの脂質には、フォスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルフォスファチジルセリン、ジアシルフォスファチジン酸、N-ドデカノイルフォスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルフォスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルフォスファチジルエタノールアミン、リジルフォスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルフォスファチジルグリセロール（POPG）、および中性脂質に接続したその他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
「カチオン性脂質」という用語は、生理学的pH（例えば、約7.0のpH）などの、選択されたpHで正味の正の電荷を帯びる多くの脂質種のいずれかを指す。驚くべきことに、複数の不飽和の部位、例えば、少なくとも2つまたは3つの不飽和の部位を持つアルキル鎖を含むカチオン性脂質が、増大した膜流動性を持つ核酸-脂質粒子を形成するのに特に有用であるということが分かった。本発明においても有用である、多くのカチオン性脂質および関連類似体が、米国特許公報第20060083780号；米国特許第5,208,036号；第5,264,618号；第5,279,833号；第5,283,185号；第5,753,613号；および第5,785,992号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/10390号に記載されている。カチオン性脂質の例として、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（DODAC）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODMA）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTAP）、3-(N(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（DMRIE）、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、生理学的pH以下で正の電荷を有するカチオン性脂質には、DODAP、DODMA、およびDSDMAが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの場合において、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第3級アミン頭部基、C18アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖間のエーテル連結、および0〜3の二重結合を含む。そのような脂質には、例えば、DSDMA、DLinDMA、DLenDMA、およびDODMAが含まれる。カチオン性脂質はまた、エーテル連結およびpH滴定可能な頭部基を含んでもよい。そのような脂質には、例えば、DODMAが含まれる。
【００８９】
「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つもしくは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環基で置換されてもよいそのような基を含むが、これらに限定されない、非極性基を有する化合物を指す。好適な例として、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
「融合性」という用語は、リポソーム、SNALP、またはその他の薬物送達系が細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、形質膜または例えば、エンドソーム、核などのオルガネラを囲む膜のいずれかであることができる。
【００９１】
本明細書において使用される場合、「水性溶液」という用語は、全体として、または一部として、水を含む組成物を指す。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体として、または一部として、脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
【００９３】
本明細書において使用される場合の、「遠位部位」とは、近隣の毛細血管床に限定されないが、生物全体にわたって広範に分布する部位を含む、物理的に離れた部位を指す。
【００９４】
核酸-脂質粒子との関係における「血清安定性」とは、遊離のDNAまたはRNAを著しく分解すると考えられる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、粒子が著しくは分解されないということを意味する。好適なアッセイには、例えば、標準的な血清アッセイ、DNAseアッセイ、またはRNAseアッセイが含まれる。
【００９５】
本明細書において使用される場合の、「全身送達」とは、siRNAなどの化合物の生物内の広範な生体分布をもたらす送達を指す。幾つかの投与の技術は、ある種の化合物の全身送達をもたらすことはできるが、その他の化合物の全身送達をもたらすことができない。全身送達とは、有用な、好ましくは治療的な量の化合物を、体の大部分に曝露させるということを意味する。広範な生体分布を得るためには、投与の部位に対して遠部の疾患部位に到達する前に、（最初の通過臓器（肝臓、肺など）によって、または急速で、非特異的な細胞結合によってのように）化合物が速やかに分解または除去されないような血液寿命が、通常必要とされる。核酸-脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、および腹腔内を含む当技術分野において公知の任意の手段によるものであることができる。好ましい態様において、核酸-脂質粒子の全身送達は静脈内送達によるものである。
【００９６】
本明細書において使用される場合の、「局所送達」とは、siRNAなどの化合物を生物内の標的部位に直接送達することを指す。例えば、腫瘍などの疾患部位もしくは炎症の部位などのその他の標的部位または肝臓、心臓、膵臓、腎臓、およびそれらと同様の臓器などの標的臓器の中への直接注射によって化合物を局所的に送達することができる。
【００９７】
「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜、およびそれらと同様の動物などの任意の哺乳動物種を指す。
【００９８】
III、siRNA
本発明の修飾siRNA分子は標的配列の発現を抑制することができ、長さ約15〜60ヌクレオチドであり、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さく、かつ標的配列に対するRNAi活性を保持する。幾つかの態様において、修飾siRNAは、少なくとも1つの、2'OMe-グアノシン、2'OMe-ウリジン、2'OMe-アデノシン、および／または2'OMe-シトシンヌクレオチドなどの2'OMeプリンまたはピリミジンヌクレオチドを含む。好ましい態様において、1つまたは複数のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドを修飾する。修飾ヌクレオチドは、siRNAの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に存在することができる。siRNA配列は、突出部（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15：188（2001）もしくはNykanen et al., Cell, 107：309（2001）に記載されたような3'もしくは5'突出部）を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。
【００９９】
修飾siRNAは通常、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。ある好ましい態様において、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約20％未満（例えば、約20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満）または約1％〜約20％（例えば、約1％〜20％、2％〜20％、3％〜20％、4％〜20％、5％〜20％、6％〜20％、7％〜20％、8％〜20％、9％〜20％、10％〜20％、11％〜20％、12％〜20％、13％〜20％、14％〜20％、15％〜20％、16％〜20％、17％〜20％、18％〜20％、もしくは19％〜20％）が修飾ヌクレオチドを含む。別の好ましい態様において、例えば、siRNAの1つまたは両方の鎖がウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドで選択的に修飾された場合、結果として生じる修飾siRNAは、約30％未満の修飾ヌクレオチド（例えば、約30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満の修飾ヌクレオチド）または約1％〜約30％の修飾ヌクレオチド（例えば、約1％〜30％、2％〜30％、3％〜30％、4％〜30％、5％〜30％、6％〜30％、7％〜30％、8％〜30％、9％〜30％、10％〜30％、11％〜30％、12％〜30％、13％〜30％、14％〜30％、15％〜30％、16％〜30％、17％〜30％、18％〜30％、19％〜30％、20％〜30％、21％〜30％、22％〜30％、23％〜30％、24％〜30％、25％〜30％、26％〜30％、27％〜30％、28％〜30％、もしくは29％〜30％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。
【０１００】
A、siRNA配列の選択
当技術分野において公知の任意の手段を用いて、好適なsiRNA配列を同定することができる。典型的には、Elbashir et al., Nature, 411：494-498（2001）およびElbashir et al., EMBO J., 20：6877-6888（2001）に記載された方法をReynolds et al., Nature Biotech., 22(3)：326-330（2004）で示された合理的設計規則と組み合わせる。
【０１０１】
通常、関心対象の標的遺伝子由来の転写物のAUG開始コドンの3'のヌクレオチド配列をジヌクレオチド配列（例えば、N＝C、G、またはUである、AA、NA、CC、GG、またはUU）について走査する（例えば、Elbashir et al., EMBO J., 20：6877-6888（2001）参照）。ジヌクレオチド配列のすぐ3'にあるヌクレオチドを潜在的なsiRNA標的部位として同定する。典型的には、ジヌクレオチド配列のすぐ3'にある19、21、23、25、27、29、31、33、35、またはそれを上回るヌクレオチドを潜在的なsiRNA標的配列として同定する。幾つかの態様において、ジヌクレオチド配列はAAまたはNA配列であり、およびAAまたはNAジヌクレオチドのすぐ3'にある19ヌクレオチドを潜在的なsiRNA標的部位として同定する。siRNA標的部位は通例、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置で間隔が置かれている。siRNA配列のサイレンシング効率をさらに増強するために、潜在的なsiRNA標的部位を解析し、例えば、標的細胞または生物において、その他のコード配列に対する相同性のある領域を含まない部位を同定してもよい。例えば、約21塩基対の好適なsiRNA標的部位は、標的細胞または生物において、コード配列に対する相同性のある16〜17よりも多くの連続する塩基対を有しないと考えられる。siRNA配列をRNA Pol IIIプロモーターから発現させたい場合、4つよりも多くの連続するAまたはTを欠くsiRNA標的配列を選択する。
【０１０２】
ひとたび潜在的なsiRNA配列が同定されれば、当技術分野において公知の様々な基準を用いて配列を解析することができる。例えば、それらのサイレンシング効率を増強させるために、siRNA配列を合理的設計アルゴリズムによって解析し、以下の特色の1つまたは複数を有する配列を同定してもよい：（1）約25％〜約60％ G/CというG/C含有量；（2）センス鎖の位置15〜19における少なくとも3つのA/U；（3）内部反復がないこと；（4）センス鎖の位置19におけるA；（5）センス鎖の位置3におけるA；（6）センス鎖の位置10におけるU；（7）センス鎖の位置19にG/Cがないこと；および（8）センス鎖の位置13にGがないこと。これらの特色の各々の好適な値を割り当てるアルゴリズムを組み入れ、かつsiRNAの選択に有用であるsiRNA設計ツールを、例えば、http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNAで見出すことができる。当業者は、1つまたは複数の前述の特徴がある配列を、潜在的なsiRNA配列としてのさらなる解析および検査のために選択し得るということを正しく理解すると考えられる。
【０１０３】
さらに、以下の基準の1つまたは複数がある潜在的なsiRNA標的配列を多くの場合siRNAとして消去することができる：（1）4つまたはそれより多くの連続した同じ塩基のストレッチを含む配列；（2）Gのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特徴によるあり得る非特異的効果を低下させるため）；（3）三重の塩基モチーフ（例えば、GGG、CCC、AAA、またはTTT）を含む配列；（4）7つまたはそれより多くの連続したG/Cのストレッチを含む配列；および（5）内部の折り返し構造を結果的にもたらす候補の中に4つまたはそれより多くの塩基の直接反復を含む配列。しかしながら、当業者は、1つまたは複数の前述の特徴がある配列を、潜在的なsiRNA配列としてのさらなる解析および検査のために依然として選択し得るということを正しく理解すると考えられる。
【０１０４】
幾つかの態様において、例えば、Khvorova et al., Cell, 115；209-216（2003）；およびSchwarz et al., Cell, 115：199-208（2003）に記載されたようなsiRNA二重鎖非対称性に基づいて、潜在的なsiRNA標的配列をさらに解析してもよい。その他の態様において、例えば、Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318：303-310（2004）に記載されたようなmRNA標的部位における二次構造に基づいて、潜在的なsiRNA標的配列をさらに解析してもよい。例えば、Mfoldアルゴリズム（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgiで入手可能）を用いてmRNA二次構造を構築し、塩基対合およびステムループの形態におけるより少ない二次構造が存在する mRNA標的部位での接近可能性に有利に働くsiRNA配列を選択することができる。
【０１０５】
ひとたび潜在的なsiRNA配列が同定されれば、例えば、インビトロサイトカインアッセイまたはインビボ動物モデルを用いて、任意の免疫刺激特性の存在について解析することができる。GUに富むモチーフ（例えば、5'-GU-3'、5'-UGU-3'、5'-GUGU-3'、5'-UGUGU-3'など）のようなsiRNA配列のセンスおよび／またはアンチセンス鎖におけるモチーフは、配列が免疫刺激性であり得るかどうかについての指標を提供することもできる。ひとたびsiRNA分子が免疫刺激性であることが分かれば、その後、それを修飾し、本明細書において記載されたようなその免疫刺激特性を減少させることができる。非限定的な例として、細胞が検出可能な免疫応答を産生するような条件下で、siRNA配列を哺乳動物レスポンダー細胞と接触させ、siRNAが免疫刺激性のあるsiRNAであるかまたは免疫刺激性のないsiRNAであるかを決定することができる。哺乳動物レスポンダー細胞は、ナイーブな哺乳動物（すなわち、siRNA配列の遺伝子産物と以前に接触したことがない哺乳動物）由来であってもよい。哺乳動物レスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージ、およびそれらと同様の細胞であってもよい。検出可能な免疫応答は、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、またはその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生を含んでもよい。その後、センスおよび／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドの少なくとも1つを修飾ヌクレオチドと取り替えることによって、免疫刺激性であると同定されたsiRNA分子を修飾し、その免疫刺激特性を減少させることができる。例えば、siRNA二重鎖の二本鎖領域におけるヌクレオチドの約30％未満（例えば、約30％、25％、20％、15％、10％、または5％未満）を2'OMeヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドと取り替えることができる。その後、修飾siRNAを上記のような哺乳動物レスポンダー細胞と接触させ、その免疫刺激特性が低下しまたは阻止されたことを確認することができる。
【０１０６】
免疫応答を検出するための好適なインビトロアッセイには、Davidらの二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫アッセイ技術（米国特許第4,376,110号）；モノクローナル-ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Kirkham and Hunter, 編, Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh（1970）における、Wide et al.）；Gordonらの「ウェスタンブロット」法（米国特許第4,452,901号）；標識したリガンドの免疫沈降（Brown et al., J. Biol. Chem., 255：4980-4983（1980））；例えば、Raines et al., J. Biol. Chem., 257：5154-5160（1982）によって記載されたような酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）；フルオロクロムの使用を含む、免疫細胞化学技術（Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39：477（1980））；および活性の中和（Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：2396-2400（1984））が含まれるが、これらに限定されない。上記の免疫アッセイに加えて、米国特許第3,817,827号；米国特許第3,850,752号；米国特許第3,901,654号；米国特許第3,935,074号；米国特許第3,984,533号；米国特許第3,996,345号；米国特許第4,034,074号；および米国特許第4,098,876号に記載されたものを含む、多くのその他の免疫アッセイが利用可能である。
【０１０７】
免疫応答を検出するためのインビボモデルの非限定的な例として、以下のように行なうことができるインビボのマウスサイトカイン誘導アッセイが含まれる：（1）側部尾静脈における標準的な静脈注射によってsiRNAを投与することができる；（2）投与約6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカイン解析用の血漿として処理することができる；ならびに（3）製造元の取扱説明書に従ってサンドイッチELISAキット（例えば、マウスおよびヒトIFN-α（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）；ヒトIL-6およびTNF-α（eBioscience；San Diego, CA）；ならびにマウスIL-6、TNF-α、およびIFN-γ（BD Biosciences；San Diego, CA））を用いてサイトカインを定量化することができる。
【０１０８】
サイトカインおよび増殖因子に特異的に結合するモノクローナル抗体は複数の源から市販され、および当技術分野において公知の方法を用いて作製することができる（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256；495-497（1975）；ならびにHarlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York（1999）参照）。モノクローナル抗体の作製は以前に記載され、および当技術分野において公知の任意の手段によって遂行することができる（例えば、Hybridoma, 第10巻, 第1号, 77-78頁（1991）における、Buhring et al.参照）。幾つかの方法において、検出を容易にするために（例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、化学的手段、およびそれらと同様の手段によって検出可能な任意の組成物によって）モノクローナル抗体を標識する。
【０１０９】
B、siRNA分子の作製
例えば、1つまたは複数の単離された小さい干渉RNA（siRNA）二重鎖としての形態を含む幾つかの形態で、siRNA分子を提供することができる。siRNA配列は、突出部（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15：188（2001）もしくはNykanen et al., Cell, 107：309（2001）に記載されたような3'もしくは5'突出部）を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。
【０１１０】
好ましくは、siRNA分子を化学合成する。Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109：7845（1987）；Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18：5433（1990）；Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23：2677-2684（1995）；およびWincott et al., Methods Mol. Bio., 74：59（1997）に記載されたものなどの、当技術分野において公知の様々な技術のいずれかを用いて、siRNA分子を含む一本鎖分子を合成することができる。本発明での使用の一般的方法を開示するさらなる基礎的テキストとして、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第2版, 1989）；Kriegler, Gene Transfer and Expression：A Laborartory Manual（1990）およびCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al., 編, 1994）が含まれる。一本鎖分子の合成は、5’末端のジメトキシトリチルおよび3’末端のホスホロアミダイトなどの、共通の核酸保護基および共役基を利用する。非限定的な例として、2'-O-メチル化ヌクレオチド用の2.5分の共役工程を伴う0.2μmol規模のプロトコルを用いて、Applied Biosystems合成機で小規模合成を実施することができる。あるいは、Protogene（Palo Alto, CA）からの96-ウェルプレート合成機で0.2μmol規模での合成を行なうことができる。しかしながら、より大きいまたはより小さい規模の合成もまた、本発明の範囲内である。siRNA一本鎖分子の合成のための好適な試薬、RNA脱保護のための方法、およびRNA精製のための方法は当業者に公知である。
【０１１１】
その後切断されて、siRNA二重鎖を形成するようにハイブリダイズする別々の断片または鎖を提供する切断可能なリンカーによって隔てられた一本の連続的な断片または鎖として両方の鎖を合成する、タンデム合成技術によって、siRNA分子を合成することもできる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであることができる。siRNAのタンデム合成をマルチウェル／マルチプレート合成プラットフォームの両方だけでなく、バッチ反応器、合成カラム、およびそれらと同様のものを利用する大規模合成プラットフォームにも容易に適合させることができる。あるいは、一方の鎖がセンス鎖を含み、および他方がsiRNAのアンチセンス鎖を含む、2つの異なる一本鎖分子からsiRNA分子を組み立てることができる。例えば、各々の鎖を別々に合成し、ならびに合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションまたはライゲーションによってつなぎ合わせることができる。ある種のその他の例において、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域がハイブリダイズしてヘアピン二次構造を有するsiRNA二重鎖を形成する、一本の連続的断片として、siRNA分子を合成することができる。
【０１１２】
C、siRNA配列の修飾
ある種の局面において、本発明のsiRNA分子は、各々の鎖が長さ約15〜約60ヌクレオチドである、2つの鎖および二本鎖領域における少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを有する二重鎖を含む。好都合なことに、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さいが、標的配列の発現を抑制する能力を保持する。
【０１１３】
本発明での使用に好適な修飾ヌクレオチドの例として、2'-O-メチル（2'OMe）、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）、2'-デオキシ、5-C-メチル、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）、4'-チオ、2'-アミノ、または2'-C-アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag編（1984）に記載されたもののようなノーザン立体構造を有する修飾ヌクレオチドもまた、本発明のsiRNA分子での使用に好適である。そのような修飾ヌクレオチドには、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド（例えば、2'-O、4'-C-メチレン-(D-リボフラノシル)ヌクレオチド）、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、2'-メチル-チオ-エチルヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-クロロ（2'Cl）ヌクレオチド、および2'-アジドヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある種の例において、本発明のsiRNA分子には、1つまたは複数のG-クランプヌクレオチドが含まれる。G-クランプヌクレオチドは、その修飾によって二重鎖内部の相補的グアニンヌクレオチドのWatson-Crick面とHoogsteen面の両方に水素結合する能力が与えられる修飾されたシステイン類似体を指す。（例えば、Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 120：8531-8532（1998）参照）。さらに、例えば、C-フェニル、C-ナフチル、その他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに3-ニトロピロール、4-ニトロインドール、5-ニトロインドール、および6-ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体（例えば、Loakes, Nucl. Acids Res., 29：2437-2447（2001）参照）などのヌクレオチド塩基類似体を有するヌクレオチドを本発明のsiRNA分子の中に取り込ませることができる。
【０１１４】
ある種の態様において、本発明のsiRNA分子は、末端キャップ部分、リン酸骨格修飾、およびそれらと同様のものなどの1つまたは複数の化学修飾をさらに含む。末端キャップ部分の例として、反転デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、4',5'-メチレンヌクレオチド、1(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3',4'-セコヌクレオチド、非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3'-3'-反転ヌクレオチド部分、3'-3'-反転脱塩基部分、3'-2'-反転ヌクレオチド部分、3'-2'-反転脱塩基部分、5'-5'-反転ヌクレオチド部分、5'-5'-反転脱塩基部分、3'-5'-反転デオキシ脱塩基部分、5'-アミノ-アルキルリン酸、1,3-ジアミノ-2-プロピルリン酸、3-アミノプロピルリン酸、6-アミノヘキシルリン酸、1,2-アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、1,4-ブタンジオールリン酸、3'-ホスホロアミデート、5'-ホスホロアミデート、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、3'-リン酸、5'-アミノ、3'-ホスホロチオエート、5'-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および架橋もしくは非架橋メチルホスホネートまたは5'-メルカプト部分を含むが、これらに限定されるわけではない（例えば、米国特許第5,998,203号；Beaucage et al., Tetrahedron 49；1925（1993）参照）。リン酸骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間の連結を結果的にもたらす）の非限定的な例として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルフォリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、およびアルキルシリル置換が含まれる（例えば、Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417（1995）の中の、Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties；Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39（1994）の中の、Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides参照）。そのような化学修飾は、siRNAのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の5’末端および／または3’末端に生じることができる。
【０１１５】
幾つかの態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、約1つ〜約4つ（例えば、1つ、2つ、3つ、もしくは4つ）の3'-デオキシリボヌクレオチドならびに／または修飾および未修飾ヌクレオチドの任意の組み合わせを有する3’末端突出部をさらに含むことができる。本発明の修飾siRNA分子の中に導入することができる修飾ヌクレオチドおよび化学修飾の種類のさらなる例は、例えば、英国特許第GB2,397,818B号ならびに米国特許公報第2004019626号および第20050282188号に記載されている。
【０１１６】
本発明の修飾siRNA分子は、siRNAの1つまたは両方の鎖に1つまたは複数の非ヌクレオチドを任意で含むことができる。本明細書において使用する場合、「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはリン酸置換を含む、1つまたは複数のヌクレオチド単位の場所における核酸鎖の中に取り込ませることができ、ならびに残りの塩基がそれらの活性を示すのを可能にする任意の基または化合物を指す。基または化合物は、それがアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの一般的に認識されるヌクレオチド塩基を含まず、およびそれゆえに1’位置の塩基を欠くという点で、脱塩基である。
【０１１７】
その他の態様において、siRNAの化学修飾は、化学修飾siRNA分子にコンジュゲートを付着させる工程を含む。コンジュゲートは、例えば、生分解性リンカーなどの共有結合性の付着を介して化学修飾siRNAのセンスおよび／またはアンチセンス鎖の5'および／または3’末端に付着させることができる。コンジュゲートは、例えば、カルバメート基またはその他の連結基を通して化学修飾siRNAに付着させることもできる（例えば、米国特許公報第20050074771号、第20050043219号、および第20050158727号参照）。ある種の例において、コンジュゲートは、化学修飾siRNAの細胞内への送達を容易にする分子である。本発明の化学修飾siRNAへの付着に好適なコンジュゲート分子の例として、コレステロールなどのステロイド、ポリエチレングリコール（PEG）などのグリコール、ヒト血清アルブミン（HSA）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸塩（例えば、葉酸、葉酸塩類似体、およびその誘導体）、糖（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコースなど）、リン脂質、ペプチド、細胞摂取を媒介することができる細胞受容体のリガンド、ならびにその組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない（例えば、米国特許公報第20030130186号、第20040110296号、第20040249178号；および米国特許第6,753,423号参照）。その他の例として、米国特許公報第20050119470号および第20050107325に記載された親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、インターカーレーター、マイナーグルーブバインダー、切断薬剤、およびクロスリンキング薬剤のコンジュゲート分子が含まれる。またその他の例として、米国特許公報第20050153337号に記載された2'-O-アルキルアミン、2'-O-アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、C5-カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジニウム基、アミジニニウム基、カチオン性アミノ酸のコンジュゲート分子が含まれる。さらなる例として、米国特許公報第20040167090号に記載された疎水性基、膜活性化合物、細胞貫通性化合物、細胞標的化シグナル、相互作用修飾物、および立体安定化剤のコンジュゲート分子が含まれる。さらなる例として、米国特許公報第20050239739号に記載されたコンジュゲート分子が含まれる。使用されるコンジュゲートの種類および化学修飾siRNA分子へのコンジュゲーションの程度を、完全なRNAi活性を保持したままでの改善された薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、および／またはsiRNAの安定性について評価することができる。そのようなものとして、当業者は、様々な周知のインビトロ細胞培養またはインビボ動物モデルを用いて、それに付着した様々なコンジュゲートを有する化学修飾siRNA分子をスクリーニングし、改善された特性および完全なRNAi活性を有する化学修飾siRNA分子を同定することができる。
【０１１８】
D、標的遺伝子
本明細書において記載された修飾siRNA分子を用いて、関心対象の遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方調節または抑制することができる。関心対象の遺伝子には、ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子、代謝の疾患および障害（例えば、肝臓の疾患および障害）と関連する遺伝子、腫瘍発生および細胞形質転換と関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症性応答および自己免疫応答と関連する遺伝子などの免疫調節因子遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害と関連する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子には、細胞と結合し、細胞内に侵入し、細胞内で複製するためにウイルスによって発現される遺伝子が含まれる。特に対象となるのは、慢性ウイルス疾患と関連するウイルス配列である。特に対象となるウイルス配列には、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスなどのフィロウイルス（例えば、米国特許出願第11/584,341号；およびGeisbert et al., J. Infect. Dis., 193：1650-1657（2006）参照）；ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、およびサビアウイルスなどのアレナウイルス（FIELDS VIROLOGY, Knipe et al.（編）, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia,（2001）の中の、Buchmeier et al., Arenaviridae：the viruses and their replication）；インフルエンザA、B、およびCウイルスなどのインフルエンザウイルス（例えば、米国仮特許出願第60/737,945号；Steinhauer et al., Annu Rev Genet., 36：305-332（2002）；ならびにNeumann et al., J Gen Virol., 83：2635-2662（2002）参照）；肝炎ウイルス（Hamasaki et al., FEBS Lett., 543：51（2003）；Yokota et al., EMBO Rep., 4：602（2003）；Schlomai et al., Hepatology, 37：764（2003）；Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：2783（2003）；Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：2014（2003）；およびFIELDS VIROLOGY, Knipe et al.（編）, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia,（2001））；ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（Banerjea et al., Mol. Ther., 8：62（2003）；Song et al., J. Virol., 77：7174（2003）；Stephenson, JAMA, 289：1494（2003）；Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：183（2003））；ヘルペスウイルス（Jia et al., J. Virol., 77：3301（2003））；ならびにヒトパピローマウイルス（HPV）（Hall et al., J. Virol., 77：6066（2003）；Jiang et al., Oncogene, 21：6041（2002））の配列が含まれる。
【０１２０】
抑制することができる例示的なフィロウイルス核酸配列には、構造タンパク質（例えば、VP30、VP35、核タンパク質（NP）、ポリメラーゼタンパク質（L-pol））および膜関連タンパク質（例えば、VP40、糖タンパク質（GP）、VP24）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。エボラウイルスについての完全なゲノム配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_002549；AY769362；NC_006432；NC_004161；AY729654；AY354458；AY142960；AB050936；AF522874；AF499101；AF272001；およびAF086833に示されている。エボラウイルスVP24配列は、例えば、Genbankアクセッション番号U77385およびAY058897に示されている。エボラウイルスL-pol配列は、例えば、Genbankアクセッション番号X67110に示されている。エボラウイルスVP40配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058896に示されている。エボラウイルスNP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058895に示されている。エボラウイルスGP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058898；Sanchez et al., Virus Res., 29：215-240（1993）；Will et al., J. Virol., 67：1203-1210（1993）；Volchkov et al., FEBS Lett., 305：181-184（1992）；および米国特許第6,713,069号に示されている。さらなるエボラウイルス配列は、例えば、Genbankアクセッション番号L11365およびX61274に示されている。マールブルグウイルスについての完全なゲノム配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001608；AY430365；AY430366；およびAY358025に示されている。マールブルグウイルスGP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AF005734；AF005733；およびAF005732に示されている。マールブルグウイルスVP35配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AF005731およびAF005730に示されている。さらなるマールブルグウイルス配列は、例えば、Genbankアクセッション番号X64406；Z29337；AF005735；およびZ12132に示されている。
【０１２１】
抑制することができる例示的なインフルエンザウイルス核酸配列には、核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質（M1およびM2）、非構造タンパク質（NS1およびNS2、RNAポリメラーゼタンパク（PA、PB1、PB2）、ノイラミニダーゼ（NA）、ならびにヘマグルチニン（HA）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。インフルエンザA  NP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_004522；AY818138；AB166863；AB188817；AB189046；AB189054；AB189062；AY646169；AY646177；AY651486；AY651493；AY651494；AY651495；AY651496；AY651497；AY651498；AY651499；AY651500；AY651501；AY651502；AY651503；AY651504；AY651505；AY651506；AY651507；AY651509；AY651528；AY770996；AY790308；AY818138；およびAY818140に示されている。インフルエンザA  PA配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY818132；AY790280；AY646171；AY818132；AY818133；AY646179；AY818134；AY551934；AY651613；AY651610；AY651620；AY651617；AY651600；AY651611；AY651606；AY651618；AY651608；AY651607；AY651605；AY651609；AY651615；AY651616；AY651640；AY651614；AY651612；AY651621；AY651619；AY770995；およびAY724786に示されている。
【０１２２】
抑制することができる例示的な肝炎ウイルス核酸配列には、転写および翻訳に関与する核酸配列（例えば、En1、En2、X、P）ならびに構造タンパク質（例えば、Cタンパク質およびC関連タンパク質を含むコアタンパク質、S、M、および／もしくはLタンパク質を含むカプシドおよびエンベロープタンパク質、またはその断片）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない（例えば、FIELDS VIROLOGY, 前記参照）。抑制することができる例示的なC型肝炎核酸配列には、セリンプロテアーゼ（例えば、NS3/NS4）、ヘリカーゼ（例えば、NS3）、ポリメラーゼ（例えば、NS5B）、ならびにエンベロープタンパク質（例えば、E1、E2、およびp7）が含まれるが、これらに限定されない。A型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001489に示され；B型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_003977に示され；C型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_004102に示され；D型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001653に示され；E型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001434に示され；およびG型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001710に示されている。ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングを、ウイルス状態を処置するために用いられる従来の薬剤の投与と組み合わせて適宜用いることができる。
【０１２３】
代謝の疾患および障害（例えば、肝臓が標的である障害ならびに肝臓の疾患および障害）と関連する遺伝子には、例えば、脂質異常症（例えば、LXRαおよびLXRβなどの肝臓X受容体（Genbankアクセッション番号NM_007121）、ファルネソイドX受容体（FXR）（Genbankアクセッション番号NM_005123）、ステロール調節性エレメント結合タンパク質（SREBP）、部位1プロテアーゼ（S1P）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素-A還元酵素（HMG補酵素-A還元酵素）、アポリポタンパク質（ApoB）、およびアポリポタンパク質（ApoE））；ならびに糖尿病（例えば、グルコース6-リン酸）で発現する遺伝子が含まれる（例えば、Forman et al., Cell, 81：687（1995）；Seol et al., Mol. Endocrinol., 9：72（1995）、Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94：7909（1997）；Sakai et al., Cell, 85：1037-1046（1996）；Duncan et al., J. Biol. Chem., 272：12778-12785（1997）；Willy et al., Genes Dev., 9：1033-1045（1995）；Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272：3137-3140（1997）；Janowski et al., Nature, 383：728-731（1996）；およびPeet et al., Cell, 93：693-704（1998）参照）。当業者は、代謝の疾患および障害（例えば、肝臓が標的である疾患および障害ならびに肝臓の疾患および障害）と関連する遺伝子には、肝臓自体で発現する遺伝子だけでなく、その他の臓器および組織で発現する遺伝子も含まれるということを正しく理解すると考えられる。代謝の疾患および障害と関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングを、本疾患または障害を処置するために用いられる従来の薬剤の投与と組み合わせて適宜用いることができる。
【０１２４】
腫瘍発生および細胞形質転換と関連する遺伝子配列の例として、Eg5などの有糸分裂キネシン；MLL融合遺伝子、BCL-ABL（Wilda et al., Oncogene, 21：5716（2002）；Scherr et al., Blood, 101：1566（2003））、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO、およびAML1-MTG8（Heidenreich et al., Blood, 101：3157（2003））などの転座配列；多剤耐性遺伝子（Nieth et al., FEBS Lett., 545：144（2003）；Wu et al., Cancer Res., 63：1515（2003））、サイクリン（Li et al., Cancer Res., 63：3593（2003）；Zou et al., Genes Dev., 16：2923（2002））、β-カテニン（Verma et al., Clin Cancer Res., 9：1291（2003））、テロメラーゼ遺伝子（Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2：209（2003））、c-MYC、N-MYC、BCL-2、ERBB1、およびERBB2（Nagy et al. Exp. Cell Res., 285：39（2003））などの過剰発現した配列；ならびにRASなどの突然変異した配列が含まれる（Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2：158（2002）で概説されている）。DNA修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法薬剤の投与と組み合わせて使用できる（Collis et al., Cancer Res., 63：1550（2003））。例えば、インテグリン、セレクチン、およびメタロプロテイナーゼなど、腫瘍遊走と関連するタンパク質をコードする遺伝子もまた、関心対象の標的配列である。前述の例に限られるわけではない。腫瘍発生もしくは細胞形質転換、腫瘍増殖、または腫瘍遊走を容易にしまたは促進する任意の全体的または部分的遺伝子配列を鋳型配列として含めることができる。
【０１２５】
血管新生遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。特に対象となるのは、血管内皮増殖因子（VEGF）（Reich et al., Mol. Vis., 9：210（2003））またはVEGFrである。VEGFrを標的するsiRNA配列は、例えば、GB2396864；米国特許公報第20040142895号；およびCA2456444に示されている。
【０１２６】
抗血管新生遺伝子は、新血管形成を阻害することができる。これらの遺伝子は、血管新生が疾患の病理学的発生に役割を果たす癌を処置するのに特に有用である。抗血管新生遺伝子の例として、エンドスタチン（例えば、米国特許第6,174,861号参照）、アンジオスタチン（例えば、米国特許第5,639,725号参照）、およびVEGF-R2（例えば、Decaussin et al., J. Pathol., 188：369-377（1999）参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
免疫調節因子遺伝子は、1つまたは複数の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節因子遺伝子の例として、増殖因子などのサイトカイン（例えば、TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCFなど）、インターロイキン（例えば、IL-2、IL-4、IL-12（Hill et al., J. Immunol., 171：691（2003））、IL-15、IL-18、IL-20など）、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γなど）、およびTNFが含まれるが、これらに限定されるわけではない。FasおよびFasリガンド遺伝子もまた、関心対象の免疫調節因子標的配列である（Song et al., Nat. Med., 9：347（2003））。例えば、Brutonのチロシンキナーゼ（Btk）（Heinonen et al., FEBS Lett., 527：274（2002））などのTecファミリーキナーゼなど、造血系およびリンパ様細胞における二次的なシグナリング分子をコードする遺伝子もまた、本発明に含まれる。
【０１２８】
細胞受容体リガンドには、細胞表面受容体（例えば、インスリン受容体、EPO受容体、G-タンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ活性のある受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体など）に結合し、受容体が関与する生理学的経路（例えば、グルコースレベル調節、血液細胞発生、有糸分裂誘発など）を調節する（例えば、阻害する、活性化するなど）ことができるリガンドが含まれる。細胞受容体リガンドの例として、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（EPO）、インスリン、グルカゴン、G-タンパク質共役受容体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない。トリヌクレオチド反復（例えば、CAG反復）の伸長をコードする鋳型は、球脊髄性筋萎縮症およびハンティングトン病などの、トリヌクレオチド反復の伸長によって引き起こされる神経変性障害で病原性配列を抑制することにおいて使用できる（Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11：175（2002））。
【０１２９】
治療目的のために上記遺伝子のいずれかの発現を抑制することにおけるその有用性に加えて、本明細書において記載されたsiRNAは、診断的適用、予防的適用、予後適用、臨床的適用、およびその他の健康管理上の適用だけでなく、研究適用および開発適用にも有用である。非限定的な例として、本発明の修飾siRNA分子を、関心対象の遺伝子が治療標的となるべき潜在的可能性を有するかどうかを試験することに向けられた標的バリデーション研究において用いることができる。本発明の修飾siRNA分子を、潜在的治療標的としての遺伝子を発見することを目指した標的同定研究において用いることもできる。
【０１３０】
IV、siRNAを含む担体系
ある局面において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNA分子を含む担体系を提供する。幾つかの態様において、担体系は、安定化された核酸-脂質粒子（例えば、SNALPもしくはSPLP）、カチオン性脂質もしくはリポソーム核酸複合体（すなわち、リポプレックス）、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、またはそれらの混合物などの脂質に基づく担体系である。その他の態様において、担体系は、カチオン性ポリマー-核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）などのポリマーに基づく担体系である。さらなる態様において、担体系は、サイクロデキストリンポリマー-核酸複合体などのサイクロデキストリンに基づく担体系である。さらなる態様において、担体系は、カチオン性ペプチド-核酸複合体などのタンパク質に基づく担体系である。好ましくは、担体系は、SNALPまたはSPLPなどの安定化された核酸-脂質粒子である。当業者は、本発明の修飾siRNA分子を裸のsiRNAとして送達することもできるということを正しく理解すると考えられる。
【０１３１】
A、安定化された核酸-脂質粒子
本発明の安定化された核酸-脂質粒子（SNALP）は典型的には、本明細書において記載されたような修飾siRNA分子、カチオン性脂質（例えば、式IまたはIIのカチオン性脂質）、および非カチオン性脂質を含む。SNALPは二重層安定化成分（すなわち、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質）をさらに含むことができる。SNALPは、単独でまたは少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、もしくはそれより多くの未修飾siRNA分子と組み合わせて、本明細書において記載された修飾siRNA分子の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、もしくはそれより多くを含んでもよい。
【０１３２】
本発明のSNALPは、典型的には約50nm〜約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜約110nm、最も典型的には約70nm〜約90nmの平均直径を有し、および実質的に無毒である。さらに、核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸はヌクレアーゼによる分解に対して水性溶液中で抵抗性である。核酸-脂質粒子およびそれらの調製の方法は、例えば、米国特許第5,753,613号；第5,785,992号；第5,705,385号；第5,976,567号；第5,981,501号；第6,110,745号；および第6,320,017号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/40964号に開示されている。
【０１３３】
1、カチオン性脂質
様々なカチオン性脂質のいずれかを、単独かまたは1つもしくはその他の複数のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせるかのいずれかで、本発明の安定化された核酸-脂質粒子で使用してもよい。
【０１３４】
本発明において有用であるカチオン性脂質は、生理学的pHで正味の正の電荷を帯びる多くの脂質種のいずれかであることができる。そのような脂質には、DODAC、DODMA、DSDMA、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOSPA、DOGS、DC-Chol、DMRIE、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。多くのこれらの脂質および関連類似体は、米国特許公報第20060083780号；米国特許第5,208,036号；米国特許第5,264,618号；米国特許第5,279,833号；米国特許第5,283,185号；および米国特許第5,753,613号；および米国特許第5,785,992号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/10390号に記載されている。さらに、多くの市販のカチオン性脂質の調製物が入手可能であり、および本発明において用いることができる。これらには、例えば、LIPOFECTIN（登録商標）（GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USAからの、DOTMAおよびDOPEを含む市販されているカチオン性リポソーム）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（GIBCO/BRLからの、DOSPAおよびDOPEを含む市販されているカチオン性リポソーム）；ならびにTRANSFECTAM（登録商標）（Promega社, Madison, Wisconsin, USAからのDOGSを含む市販されているカチオン性リポソーム）が含まれる。
【０１３５】
さらに、以下の構造を有する式Iのカチオン性脂質が、本発明において有用である。
2009513151.tif 000003
式中、R1およびR2は独立に選択され、かつHまたはC1〜C3アルキルであり、R3およびR4は独立に選択され、かつ約10〜約20の炭素原子を含むアルキル基であり、ならびにR3およびR4の少なくとも1つは少なくとも2つの不飽和の部位を含む。ある種の例において、R3およびR4は両方とも同じであり、すなわち、R3およびR4は両方ともリノレイル（C18）などである。ある種のその他の例において、R3およびR4は異なり、すなわち、R3はテトラデカトリエニル（C14）であり、およびR4はリノレイル（C18）である。好ましい態様において、式Iのカチオン性脂質は対称的であり、すなわち、R3およびR4は両方とも同じである。別の好ましい態様において、R3およびR4の両方ともが少なくとも2つの不飽和の部位を含む。幾つかの態様において、R3およびR4は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、およびイコサジエニルから独立に選択される。好ましい態様において、R3およびR4は両方ともリノレイルである。幾つかの態様において、R3およびR4は少なくとも3つの不飽和の部位を含み、かつ例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、およびイコサトリエニルから独立に選択される。特に好ましい態様において、式Iのカチオン性脂質はDLinDMAまたはDLenDMAである。
【０１３６】
さらに、以下の構造を有する式IIのカチオン性脂質が、本発明において有用である。
2009513151.tif 000004
式中、R1およびR2は独立に選択され、かつHまたはC1〜C3アルキルであり、R3およびR4は独立に選択され、かつ約10〜約20の炭素原子を含むアルキル基であり、ならびにR3およびR4の少なくとも1つは少なくとも2つの不飽和の部位を含む。ある種の例において、R3およびR4は両方とも同じであり、すなわち、R3およびR4は両方ともリノレイル（C18）などである。ある種のその他の例において、R3およびR4は異なり、すなわち、R3はテトラデカトリエニル（C14）であり、およびR4はリノレイル（C18）である。好ましい態様において、本発明のカチオン性脂質は対称的であり、すなわち、R3およびR4は両方とも同じである。別の好ましい態様において、R3およびR4の両方ともが少なくとも2つの不飽和の部位を含む。幾つかの態様において、R3およびR4は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、およびイコサジエニルから独立に選択される。好ましい態様において、R3およびR4は両方ともリノレイルである。幾つかの態様において、R3およびR4は少なくとも3つの不飽和の部位を含み、かつ例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、およびイコサトリエニルから独立に選択される。
【０１３７】
カチオン性脂質は典型的には、粒子中に存在する全脂質の約2mol％〜約60mol％、約5mol％〜約50mol％、約10mol％〜約50mol％、約20mol％〜約50mol％、約20mol％〜約40mol％、約30mol％〜約40mol％、または約40mol％を含む。粒子の意図される使用に応じて、成分の割合を変えることができ、および例えば、エンドソーム放出パラメーター（ERP）アッセイを用いて特定の製剤の送達効率を測定することができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。例えば、全身送達のために、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約15mol％を含んでもよく、および局所または局部送達のために、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約30mol％〜約50mol％、または約40mol％を含んでもよい。
【０１３８】
2、非カチオン性脂質
本発明の安定化された核酸-脂質粒子において使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体を産生することができる様々な中性で無荷電性の、双性イオン性の、またはアニオン性の脂質のいずれかであることができる。それらは代わりに正または負に荷電していることができるが、それらは好ましくは中性である。非カチオン性脂質の例として、レシチン、フォスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾフォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ESM）、セファリン、カルジオリピン、フォスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（DOPG）、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール（DPPG）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルグリセロール（POPG）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン 4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート（DOPE-mal）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE）、およびステアロイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE）などのリン脂質関連材料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。コレステロールなどの非カチオン性脂質またはステロールもまた、存在してもよい。さらなる非リン含有脂質には、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノールエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン-ラウリルスルフェート、アルキル-アリールスルフェート、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド、セラミド、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、およびそれらと同様のものが含まれる。リゾフォスファチジルコリンおよびリゾフォスファチジルエタノールアミンなどのその他の脂質もまた、存在してもよい。非カチオン性脂質には、米国特許出願第08/316,429号に記載されたような、PEG 2000、PEG 5000、およびリン脂質にコンジュゲートされたポリエチレングリコールまたはセラミドにコンジュゲートされたポリエチレングリコール（PEG-Cerと称される）などのポリエチレングリコールに基づくポリマーも含まれる。
【０１３９】
好ましい態様において、非カチオン性脂質は、ジアシルフォスファチジルコリン（例えば、ジステアロイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、およびジリノレオイルフォスファチジルコリン）、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン）、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は好ましくは、C10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非カチオン性脂質は、コレステロール、DOPE、またはESMの1つまたは複数を含む。
【０１４０】
非カチオン性脂質は典型的には、粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約90mol％、約10mol％〜約85mol％、約20mol％〜約80mol％、または約20mol％を含む。粒子は、コレステロールをさらに含んでもよい。存在する場合、コレステロールは典型的には、粒子中に存在する全脂質の約0mol％〜約10mol％、約2mol％〜約10mol％、約10mol％〜約60mol％、約12mol％〜約58mol％、約20mol％〜約55mol％、約30mol％〜約50mol％、または約48mol％を含む。
【０１４１】
3、二重層安定化成分
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明の安定化された核酸-脂質粒子は、ATTA-脂質または例えば、PCT刊行物国際公開公報第05/026372号に記載されたようなジアルキルオキシプロピルに共役したPEG（PEG-DAA）、例えば、米国特許公報第20030077829号および第2005008689号に記載されたようなジアシルグリセロールに共役したPEG（PEG-DAG）、フォスファチジルエタノールアミンのようなリン脂質に共役したPEG（PEG-PE）、セラミドにコンジュゲートされたPEG、もしくはそれらの混合物などのPEG-脂質のような二重層安定化成分（BSC）を含むことができる（例えば、米国特許第5,885,613号参照）。好ましい態様において、BSCは粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質である。好適なコンジュゲートされた脂質には、PEG-脂質コンジュゲート、ATTA-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。別の好ましい態様において、粒子は、CPLと一緒にPEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートのいずれかを含む。
【０１４２】
PEGは、2つの末端水酸基を持つ線状で、水溶性のエチレンPEG繰り返し単位のポリマーである。PEGはそれらの分子量によって分類される；例えば、PEG 2000は約2,000ダルトンの平均分子量を有し、およびPEG 5000は約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、Sigma Chemical社およびその他の会社から市販され、ならびに例えば、以下のものを含む：モノメトキシポリエチレングリコール（MePEG-OH）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシネート（MePEG-S）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシニミジルスクシネート（MePEG-S-NHS）、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン（MePEG-NH2）、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレート（MePEG-TRES）、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル（MePEG-IM）。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール-酢酸（MePEG-CH2COOH）は、例えば、PEG-DAAコンジュゲートを含むPEG-脂質コンジュゲートを調製するのに特に有用である。
【０１４３】
好ましい態様において、PEGは、約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、およびさらにより好ましくは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。任意で、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基でPEGを置換することができる。PEGを直接脂質にコンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結してもよい。例えば、エステルを含有しないリンカー部分およびエステルを含有するリンカー部分を含む、PEGを脂質に共役するための好適な任意のリンカー部分を用いることができる。好ましい態様において、リンカー部分はエステルを含有しないリンカー部分である。本明細書において使用する場合、「エステルを含有しないリンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル（-OC(O)-）を含まないリンカー部分を指す。好適なエステルを含有しないリンカー部分には、アミド（-C(O)NH-）、アミノ（-NR-）、カルボニル（-C(O)-）、カルバメート（-NHC(O)O-）、ウレア（-NHC(O)NH-）、ジスルフィド（-S-S-）、エーテル（-O-）、スクシニル（-(O)CCH2CH2C(O)-）、スクシンアミジル（-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-）、エーテル、ジスルフィドだけでなく、（カルバメートリンカー部分およびアミドリンカー部分の両方を含むリンカーなどの）その組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、カルバメートリンカーを用いてPEGを脂質に共役する。
【０１４４】
その他の態様において、エステルを含むリンカー部分を用いて、PEGを脂質に共役させる。好適なエステルを含むリンカー部分には、例えば、カルボネート（-OC(O)O-）、スクシノイル、リン酸エステル（-O-(O)POH-O-）、スルホン酸エステル、およびその組み合わせが含まれる。
【０１４５】
種々の鎖長および飽和の程度の様々なアシル鎖基を有するフォスファチジルエタノールアミンをPEGにコンジュゲートし、二重層安定化成分を形成することができる。そのようなフォスファチジルエタノールアミンは市販され、または当業者に公知の従来の技術を用いて単離もしくは合成することができる。C10〜C20の範囲の炭素鎖長を持つ飽和または不飽和脂肪酸を含むフォスファチジルエタノールアミンが好ましい。一価または二価不飽和脂肪酸ならびに飽和および不飽和脂肪酸の混合物を持つフォスファチジルエタノールアミンを用いることもできる。好適なフォスファチジルエタノールアミンには、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号に開示された化合物を指すが、これらに限定されるわけではない。これらの化合物は、以下の式を有する化合物を含む：
2009513151.tif 000005
式中、Rは水素、アルキル、およびアシルからなる群より選択されるメンバーであり；R1は水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであり；または任意で、RおよびR1ならびにそれらが結合する窒素がアジド部分を形成し；R2は水素、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、およびアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるメンバーであり；R3は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ、ならびにR4およびR5が独立に水素またはアルキルである、NR4R5であり；nが4〜80であり；mが2〜6であり；pが1〜4であり；ならびにqが0または1である。その他のポリアミドを本発明の化合物において用いることができるということが当業者には明白であると考えられる。
【０１４７】
「ジアシルグリセロール」という用語は、その両方がエステル連結によってグリセロールの1-および2-位置に結合した2から30の炭素を独立に有する、2つの脂肪アシル鎖、R1およびR2、を有する化合物を指す。アシル基は飽和しまたは種々の程度の不飽和を有することができる。好適なアシル基には、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）、およびイコシル（C20）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、R1およびR2は同じであり、すなわち、R1およびR2は両方ともミリスチル（すなわち、ジミリスチル）、R1およびR2は両方ともステアリル（すなわち、ジステアリル）などである。ジアシルグリセロールは以下の一般式を有する。
2009513151.tif 000006
【０１４８】
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、その両方が2から30の炭素を独立に有する、2つのアルキル鎖、R1およびR2、を有する化合物を指す。アルキル基は飽和しまたは種々の程度の不飽和を有することができる。ジアルキルオキシプロピルは以下の一般式を有する。
2009513151.tif 000007
【０１４９】
好ましい態様において、PEG-脂質は、以下の式を有するPEG-DAAコンジュゲートである：
2009513151.tif 000008
式中、R1およびR2は独立に選択され、かつ約10〜約22の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり；PEGはポリエチレングリコールであり；ならびにLは上記のようなエステルを含有しないリンカー部分またはエステルを含有するリンカー部分である。長鎖アルキル基は飽和したものまたは不飽和のものであることができる。好適なアルキル基には、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）、およびイコシル（C20）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、R1およびR2は同じであり、すなわち、R1およびR2は両方ともミリスチル（すなわち、ジミリスチル）、R1およびR2は両方ともステアリル（すなわち、ジステアリル）などである。
【０１５０】
上の式VIにおいて、PEGは、約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、およびさらにより好ましくは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの範囲に及ぶ平均分子量を有する。任意で、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基でPEGを置換することができる。好ましい態様において、メトシキまたはメチル基で末端水酸基を置換する。
【０１５１】
好ましい態様において、「L」はエステルを含有しないリンカー部分である。好適なエステルを含有しないリンカー部分には、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、ウレアリンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、エステルを含有しないリンカー部分は、カルバメートリンカー部分（すなわち、PEG-C-DAAコンジュゲート）である。別の好ましい態様において、エステルを含有しないリンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわち、PEG-A-DAAコンジュゲート）である。また別の好ましい態様において、エステルを含有しないリンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分（すなわち、PEG-S-DAAコンジュゲート）である。
【０１５２】
当業者に公知の標準的な技術および試薬を用いて、PEG-DAAコンジュゲートを合成する。PEG-DAAコンジュゲートは、様々なアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメート、およびウレア連結を含むということが認識されると考えられる。当業者は、これらの結合を形成するための方法および試薬が周知でありかつ容易に入手可能であるということを認識すると考えられる。例えば、March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY（Wiley 1992）、Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS（VCH 1989）；およびFurniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 第5版（Longman 1989）を参照されたい。存在する任意の官能基が、PEG-DAAコンジュゲートの合成において異なる点での保護および脱保護を必要とし得るということも正しく理解されると考えられる。当業者は、そのような技術が周知であるということを認識すると考えられる。例えば、Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS（Wiley 1991）を参照されたい。
【０１５３】
好ましくは、PEG-DAAコンジュゲートは、ジラウリルオキシプロピル（C12）-PEGコンジュゲート、ジミリスチルオキシプロピル（C14）-PEGコンジュゲート、ジパルミチルオキシプロピル（C16）-PEGコンジュゲート、またはジステアリルオキシプロピル（C18）-PEGコンジュゲートである。当業者は、その他のジアルキルオキシプロピルを本発明のPEG-DAAコンジュゲートに用いることができるということを容易に正しく理解すると考えられる。
【０１５４】
前述のことに加えて、その他の親水性ポリマーをPEGの代わりに用いることができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。PEGの代わりに用いることができる好適なポリマーの例として、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミドおよびポリメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
前述の成分に加えて、本発明の粒子（例えば、SNALPまたはSPLP）は、正の電荷を与えるために脂質二重層への挿入が設計されているカチオン性ポリ（エチレングリコール）（PEG）脂質またはCPLをさらに含むことができる（例えば、Chen et al., Bioconj. Chem., 11：433-437（2000）参照）。本発明での使用のための好適なSPLPおよびSPLP-CPL、ならびにSPLPおよびSPLP-CPLを作製および使用する方法は、例えば、米国特許第6,852,334号およびPCT刊行物国際公開公報第00/62813号に開示されている。本発明において有用なカチオン性ポリマー脂質（CPL）は以下の構造上の特色を有する：（1）CPLを脂質二重層の中に取り込ませるための、疎水性脂質などの、脂質アンカー；（2）脂質アンカーをカチオン性頭部基に連結するための、ポリエチレングリコールなどの、親水性スペーサー；および（3）プロトン化可能なカチオン性頭部基を産生するための、天然のアミノ酸などの、ポリカチオン性部分。
【０１５６】
好適なCPLは、A、W、およびYが下記のようなものである、以下の式VIIの化合物を含む：
A-W-Y（VII）。
【０１５７】
式VIIに関して、「A」は、脂質アンカーとして作用する両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質などの脂質部分である。好適な脂質の例として、小胞形成脂質または小胞導入脂質が含まれ、ならびにジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
「W」は、親水性ポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは非免疫原性でありまたは低い固有の免疫原性を保有する生体適合性ポリマーである。あるいは、親水性ポリマーは、適当なアジュバントと共に用いられる場合、弱抗原性であることができる。好適な非免疫原性ポリマーには、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共ポリマー、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ポリマーは約250〜約7,000ダルトンの分子量を有する。
【０１５９】
「Y」はポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択されたpH、好ましくは生理学的pHで、正の電荷、好ましくは少なくとも2つの正の電荷を有する化合物、誘導体、官能基を指す。好適なポリカチオン性部分には、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；ならびにアミノ多糖が含まれる。ポリカチオン性部分は、構造が線状テトラリジンのような、線状、分岐状、またはデンドリマー状であることができる。ポリカチオン性部分は、選択されたpH値で、約2〜約15の正の電荷、好ましくは約2〜約12の正の電荷、およびより好ましくは約2〜約8の正の電荷を有する。望ましい粒子適用の種類によって、どのポリカチオン性部分を利用するかという選択を決定してもよい。
【０１６０】
ポリカチオン性部分上の電荷は、粒子部分の全体にわたって分布することができるか、またはあるいは、それらは粒子部分のある特定の区域における個別的な濃度の電荷密度、例えば、電荷スパイクであることができるかのいずれかである。電荷密度が粒子上に分布する場合、電荷密度は均等に分布することができまたは不均等に分布することができる。ポリカチオン性部分の電荷分布の全ての変形が本発明によって包含されている。
【０１６１】
脂質「A」および非免疫原性ポリマー「W」を、様々な方法によっておよび好ましくは共有結合性の付着によって付着させることができる。「A」および「W」の共有結合性の付着のために、当業者に公知の方法を用いることができる。好適な連結には、アミド、アミン、カルボキシル、カルボネート、カルバメート、エステル、およびヒドラゾン連結が含まれるが、これらに限定されない。「A」および「W」は、連結をもたらすように相補的な官能基を有しなければならないということが当業者には明白であると考えられる。一方は脂質上および他方はポリマー上にある、これら2つの基の反応は、所望の連結を提供すると考えられる。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、ならびに末端ヒドロキシルが、例えば、NHSおよびDCCによって、活性化されて活性エステルを形成し、その後ポリアミドと反応するように（例えば、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号参照）、アミノ基を含むポリマーと反応する場合、アミド結合が2つの基の間に形成されると考えられる。
【０１６２】
ある種の例において、ポリカチオン性部分は、標的化リガンドまたはカルシウムを複合体化するためのキレート部分などの、付着したリガンドを有することができる。好ましくは、リガンドが付着した後に、カチオン性部分は正の電荷を維持する。ある種の例において、付着するリガンドは正の電荷を有する。好適なリガンドとして、反応性官能基を持つ化合物または素子が含まれるが、これらに限定されず、および脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、生体材料、生体ポリマー、生物医学的素子、分析的に検出可能な化合物、治療的活性のある化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射性標識、フルオロゲン、ビオチン、薬物、ハプテン、DNA、RNA、多糖、リポソーム、ウイロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他の標的化部分、または毒素が含まれる。
【０１６３】
二重層安定化成分（例えば、PEG-脂質）は典型的には、粒子中に存在する全脂質の約0mol％〜約20mol％、約0.5mol％〜約20mol％、約1.5mol％〜約18mol％、約4mol％〜約15mol％、約5mol％〜約12mol％、または約2mol％を含む。当業者は、利用される二重層安定化成分および核酸-脂質粒子が融合性になる割合に応じて、二重層安定化成分の濃度を変えることができるということを正しく理解すると考えられる。
【０１６４】
二重層安定化成分の組成物および濃度を制御することによって、二重層安定化成分が核酸-脂質粒子から交換される割合および、今度は、核酸-脂質粒子が融合性になる割合を制御することができる。例えば、ポリエチレングリコール-フォスファチジルエタノールアミンコンジュゲートまたはポリエチレングリコール-セラミドコンジュゲートを二重層安定化成分として用いる場合、例えば、二重層安定化成分の濃度を変えることによって、ポリエチレングリコールの分子量を変えることによって、またはフォスファチジルエタノールアミンもしくはセラミド上のアシル鎖基の鎖長および飽和の程度を変えることによって、核酸-脂質粒子が融合性になる割合を変えることができる。さらに、例えば、pH、温度、イオン強度などを含むその他の変数を用いて、核酸-脂質粒子が融合性になる割合を変えおよび／または制御することができる。核酸-脂質粒子が融合性になる割合を制御するために用いることができるその他の方法は、この開示を読むと同時に、当業者に明白になると考えられる。
【０１６５】
B、さらなる担体系
本発明での使用に好適なさらなる脂質に基づく担体系の非限定的な例として、リポプレックス（例えば、米国特許公報第20030203865号；およびZhang et al., J. Control Release, 100：165-180（2004）参照）、pH感受性リポプレックス（例えば、米国特許公報第20020192275号参照）、逆に被覆されたリポプレックス（例えば、米国特許公報第20030180950号参照）、カチオン性脂質に基づく組成物（例えば、米国特許第6,756,054号；および米国特許公報第20050234232号参照）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許公報第20030229040号、第20020160038号、および第20020012998号；米国特許第5,908,635号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第01/72283号参照）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許公報第20030026831号参照）、pH感受性リポソーム（例えば、米国特許公報第20020192274号；および豪州特許第2003210303号参照）、抗体でコーティングされたリポソーム（例えば、米国特許公報第20030108597号；およびPCT刊行物国際公開公報第00/50008号参照）、細胞型特異的リポソーム（例えば、米国特許公報第20030198664号参照）、核酸およびペプチドを含むリポソーム（例えば、米国特許第6,207,456号参照）、放出可能な親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含むリポソーム（例えば、米国特許公報第20030031704号参照）、脂質でトラップされた核酸（例えば、PCT刊行物国際公開公報第03/057190号および第03/059322号参照）、脂質で封入された核酸（例えば、米国特許公報第20030129221号；および米国特許第5,756,122号参照）、その他のリポソーム組成物（例えば、米国特許公報第20030035829号および第20030072794号；ならびに米国特許第6,200,599号参照）、リポソームおよびエマルジョンの安定化された混合物（例えば、欧州特許第1304160号参照）、エマルジョン組成物（例えば、米国特許第6,747,014号参照）、ならびに核酸マイクロエマルジョン（例えば、米国特許公報第20050037086号参照）が含まれる。
【０１６６】
本発明での使用に好適なポリマーに基づく担体系の例として、カチオン性ポリマー-核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）が含まれるが、これに限定されない。ポリプレックスを形成するために、核酸（例えば、siRNA）は典型的には、細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用し、およびエンドサイトーシスによって細胞を侵入させることができる正に荷電した粒子の中に核酸を凝縮させる線状、分岐状、星状、または樹状のポリマー構造を有するカチオン性ポリマーと複合体を形成する。幾つかの態様において、ポリプレックスは、ポリエチレンイミン（PEI）（例えば、米国特許第6,013,240号参照；Qbiogene社（Carlsbad, CA）から、線状型のPEI である、In vivo jetPEI（商標）として市販されている）、ポリプロピレンイミン（PPI）、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリ-L-リジン（PLL）、ジエチルアミノエチル（DEAE）-デキストラン、ポリ（β-アミノエステル）（PAE）ポリマー（例えば、Lynn et al, J. Am. Chem. Soc., 123：8155-8156（2001）参照）、キトサン、ポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマー（例えば、Kukowska-Latallo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93：4897-4902（1996）参照）、ポルフィリン（例えば、米国特許第6,620,805号参照）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許公報第20040156909号参照）、多環式アミジニウム（例えば、米国特許公報第20030220289号参照）、第一級アミン、イミン、グアニジン、および／またはイミダゾール基を含むその他のポリマー（例えば、米国特許第6,013,240；PCT刊行物国際公開公報第9602655；PCT刊行物国際公開公報第95/21931；Zhang et al, J. Control Release, 100：165-180（2004）；およびTiera et al, Curr. Gene Ther., 6：59-71（2006））、ならびにそれらの混合物などのカチオン性ポリマーとの複合体を形成した核酸（例えば、siRNA）を含む。その他の態様において、ポリプレックスは、米国特許公報第20060211643号、第20050222064号、第20030125281号、および第20030185890号、ならびにPCT刊行物国際公開公報第03/066069号に記載されたようなカチオン性ポリマー-核酸複合体；米国特許公報第20040071654号に記載されたような生分解性ポリ（β-アミノエステル）ポリマー-核酸複合体；米国特許公報第20040142475号に記載されたようなポリマー性マトリックスを含む微粒子；米国特許公報第20030157030号に記載されたようなその他の微粒子組成物；米国特許公報第20050123600号に記載されたような凝縮した核酸複合体；ならびに豪州特許第2002358514号およびPCT刊行物国際公開公報第02/096551号に記載されたようなナノカプセルおよびマイクロカプセル組成物を含む。
【０１６７】
ある種の例において、修飾siRNA分子は、サイクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。サイクロデキストリンに基づく担体系の非限定的な例として、米国特許公報第20040087024号に記載されたサイクロデキストリン修飾ポリマー-核酸複合体；米国特許第6,509,323号、第6,884,789号、および第7,091,192号に記載された線状サイクロデキストリン共ポリマー-核酸複合体；ならびに米国特許第7,018,609号に記載されたサイクロデキストリンポリマー複合体化薬剤-核酸複合体が含まれる。ある種のその他の例において、修飾siRNA分子は、ペプチドまたはポリペプチドと複合体を形成してもよい。タンパク質に基づく担体系の例として、PCT刊行物国際公開公報第95/21931号に記載されたカチオン性オリゴペプチド-核酸複合体が含まれるが、これに限定されない。
【０１６８】
V、核酸-脂質粒子の調製
連続混合法、直接希釈処理、界面活性剤透析法、または有機溶媒を利用して成分の混合の間に単一相を提供する逆相法の修正を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によって、本明細書において記載された修飾siRNAが脂質二重層の中に封入されおよび分解から保護される、本発明の血清安定性の核酸-脂質粒子を形成することができる。
【０１６９】
好ましい態様において、カチオン性脂質は、式IおよびIIの脂質またはその組み合わせである。その他の好ましい態様において、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ESM）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（DOPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、ジパルミトイル-フォスファチジルコリン（DPPC）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、14:0 PE（1,2-ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE））、16:0 PE（1,2-ジパルミイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE））、18:0 PE（1,2-ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE））、18:1 PE（1,2-ジオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（DOPE））、18:1 trans PE（1,2-ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE））、18:0-18:1 PE（1-ステアロイル-2-オレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE））、16:0-18:1 PE（1-パルミトイル-2-オレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE））、ポリエチレングリコールに基づくポリマー（例えば、PEG 2000、PEG 5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、もしくはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、またはその組み合わせである。さらにその他の好ましい態様において、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはその組み合わせである。
【０１７０】
好ましい態様において、本発明は、例えば、核酸（例えば、siRNA）を封入したリポソームを実質的に瞬時に産生するよう有機脂質溶液が水性溶液と混合するように、第一の貯留槽にsiRNAなどの核酸を含む水性溶液を提供する工程、第二の貯留槽に有機脂質溶液を提供する工程、および水性溶液を有機脂質溶液と混合する工程を含む処理などの、連続混合法によって産生される核酸-脂質粒子を提供する。この処理およびこの処理を進めるための装置は、米国特許公報第20040142025号に詳細に記載されている。
【０１７１】
混合チャンバーのような、混合環境に脂質および緩衝剤溶液を連続的に導入する行為によって、緩衝剤溶液による脂質溶液の連続希釈がもたらされ、それによって混合時に実質的に瞬時にリポソームが産生される。本明細書において使用される場合、「緩衝剤溶液によって脂質溶液を連続的に希釈する」という語句（および変化形）は通常、脂質溶液が小胞発生をもたらすほどの十分な力を伴って水和処理において十分に速やかに希釈されるということを意味する。核酸を含む水性溶液を有機脂質溶液と混合することによって、有機脂質溶液は、緩衝剤溶液（すなわち、水性溶液）の存在下で連続的で段階的な希釈を経て、核酸-脂質粒子を産生する。
【０１７２】
連続混合法を用いる形成された血清安定性の核酸-脂質粒子は典型的には、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、および均一な粒子サイズを達成するために任意でサイズが合わせられる。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、リポソーム溶液を形成する工程および即座にかつ直接的に制御された量の希釈緩衝剤を含む回収容器中にリポソーム溶液を導入する工程を含む直接希釈処理によって産生される核酸-脂質粒子を提供する。好ましい局面において、回収容器は、希釈を容易にするために回収容器の中身をかき混ぜるように構成された1つまたは複数の要素を含む。ある局面において、回収容器中に存在する希釈緩衝剤の量は、そこに導入されるリポソーム溶液の容量と実質的に等しい。非限定的な例として、等しい容量のエタノールを含む回収容器中に導入された場合の45％エタノール中のリポソーム溶液は、好都合なことに、約22.5％、約20％、または約15％エタノール中でよりも小さい粒子を産出すると考えられる。
【０１７４】
また別の態様において、本発明は、希釈緩衝剤を含む第三の貯留槽が第二の混合領域と流動的に接続された直接希釈処理によって産生される核酸-脂質粒子を提供する。この態様において、第一の混合領域で形成されたリポソーム溶液は、第二の混合領域で即座にかつ直接的に希釈緩衝剤と混合される。好ましい局面において、第二の混合領域は、リポソーム溶液および希釈緩衝剤が反対する180°の流れとして出会うように配置されたT字型コネクターを含む；しかしながら、例えば、約27°〜約180°の、より浅い角度を提供するコネクターを用いることができる。ポンプ機構は制御可能な希釈剤の流れを第二の混合領域に送達する。ある局面において、第二の混合領域に提供される希釈緩衝剤の流速は、第一の混合領域からそこに導入されるリポソーム溶液の流速と実質的に等しいように制御される。この態様は、好都合なことに、第二の混合領域でリポソーム溶液と混合する希釈緩衝剤の流れのより多くの制御を可能にし、およびそれゆえに第二の混合処理全体にわたる緩衝剤中でのリポソーム溶液の濃縮も可能にする。希釈緩衝剤の流速のそのような制御は、好都合なことに、低下した濃度での小さい粒子サイズの形成を可能にする。
【０１７５】
これらの処理およびこれらの直接希釈処理を実行するための装置は、米国特許出願第11/495,150号に詳細に記載されている。
【０１７６】
直接希釈処理を用いて形成される血清安定性の核酸-脂質粒子は典型的には、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、および均一な粒子サイズを達成するために任意でサイズが合わせられる。
【０１７７】
幾つかの態様において、界面活性剤透析を用いて粒子を形成する。任意の特定の形成の機構に束縛されることを意図しないが、siRNAなどの核酸をカチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させて、コーティングされた核酸複合体を形成する。これらのコーティングされた核酸は、凝集および沈殿する可能性がある。しかしながら、界面活性剤の存在は、この凝集を低下させ、かつコーティングされた核酸が過剰な脂質（典型的には、非カチオン性脂質）と反応し、核酸が脂質二重層の中に封入される粒子を形成することを可能にする。したがって、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）コーティングされた核酸-脂質複合体を形成するために、界面活性剤溶液中でカチオン性脂質と核酸を組み合わせ；
（b）核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成するために、コーティングされた核酸-脂質複合体と非カチオン性脂質を接触させ；ならびに
（c）核酸が脂質二重層の中に封入され、および粒子が血清安定性でかつ約50〜約150nmのサイズを有する、血清安定性の核酸-脂質粒子の溶液を提供するために、工程（b）の界面活性剤溶液を透析する。
【０１７８】
界面活性剤溶液中でカチオン性脂質と核酸を組み合わせることによって、コーティングされた核酸-脂質複合体の最初の溶液を形成する。これらの態様において、界面活性剤溶液は、好ましくは15〜300mM、より好ましくは20〜50mMの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水性溶液である。好適な界面活性剤の例として、例えば、N,N-((オクタノイルイミノ)-ビス-(トリメチレン))-ビス-(D-グルコンアミド)（BIGCHAP）；BRIJ 35；デオキシ-BIGCHAP；ドデシルポリ(エチレングリコール)エーテル；Tween 20；Tween 40；Tween 60；Tween 80；Tween 85；Mega 8；Mega 9；Zwittergent（登録商標）3-08；Zwittergent（登録商標）3-10；Triton X-405；ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、およびノニル-β-D-グルコピラノシド；ならびにヘプチルチオグルコピラノシドが含まれ；オクチルβ-D-グルコピラノシドおよびTween-20が最も好ましい。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は、典型的には約100mM〜約2M、好ましくは約200mM〜約1.5Mである。
【０１７９】
カチオン性脂質および核酸は典型的には、約1:1〜約20:1の電荷比（+/-）を産生するよう、約1:1〜約12:1の比で、または約2:1〜約6:1の比で、組み合わされると考えられる。さらに、溶液中の核酸の全体としての濃度は典型的には、約25μg/ml〜約1mg/ml、約25μg/ml〜約200μg/ml、または約50μg/ml〜約100μg/mlであると考えられる。典型的には、室温でコーティングされた複合体が形成されるのに十分な期間、界面活性剤溶液中の核酸およびカチオン性脂質の組み合わせを保つ。あるいは、核酸およびカチオン性脂質を界面活性剤溶液中で組み合わせ、および約37℃、約50℃、約60℃、または約70℃までの温度にまで暖めることができる。温度に特に感受性のある核酸については、より低い温度で、典型的には約4℃まで下げて、コーティングされた複合体を形成することができる。
【０１８０】
幾つかの態様において、形成された核酸-脂質粒子中の核酸 対 脂質比（質量／質量比）は、約0.01〜約0.2、約0.02〜約0.1、約0.03〜約0.1、または約0.01〜約0.08の範囲に及ぶと考えられる。出発材料の比もこの範囲内に収まる。その他の態様において、核酸-脂質粒子調製は、10mgの全脂質当たり約400μgの核酸を用い、または約0.01〜約0.08の、およびより好ましくは、50μgの核酸当たり1.25mgの全脂質に対応する、約0.04の核酸 対 脂質質量比を用いる。その他の好ましい態様において、粒子は、約0.08の核酸：脂質質量比を有する。
【０１８１】
その後、コーティングされた核酸-脂質複合体の界面活性剤溶液を非カチオン性脂質と接触させ、核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質の界面活性剤溶液を提供する。この工程に有用である非カチオン性脂質として、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、およびセレブロシドが含まれる。好ましい態様において、非カチオン性脂質は、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはC10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非カチオン性脂質は、DSPC、DOPE、POPC、卵フォスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、またはそれらの混合物である。最も好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、インビボでの増強された特性を持つ融合性粒子であり、および非カチオン性脂質はDSPCまたはDOPEである。さらに、本発明の核酸-脂質粒子は、コレステロールをさらに含んでもよい。その他の好ましい態様において、非カチオン性脂質は、例えば、米国特許第5,820,873号および米国特許公報第20030077829号に記載されたような、PEG 2,000、PEG 5,000、およびジアシルグリセロール、セラミド、またはリン脂質にコンジュゲートされたPEGなどのポリエチレングリコールに基づくポリマーをさらに含むことができる。さらに好ましい態様において、非カチオン性脂質は、PEG 2,000、PEG 5,000、およびジアルキルオキシプロピルにコンジュゲートされたPEGなどのポリエチレングリコールに基づくポリマーをさらに含むことができる。
【０１８２】
本方法において用いられる非カチオン性脂質の量は典型的には、50μgの核酸に対して約2〜約20mgの全脂質である。好ましくは、全脂質の量は、50μgの核酸当たり約5〜約10mgである。
【０１８３】
核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質の界面活性剤溶液の形成後、好ましくは透析によって、界面活性剤を除去する。界面活性剤の除去は、核酸を取り囲む脂質二重層の形成を結果的にもたらし、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズを有する血清安定性の核酸-脂質粒子を提供する。このように形成された粒子は凝集せず、および均一な粒子サイズを達成するために任意でサイズが合わせられる。
【０１８４】
リポソームのサイズを合わせるために利用可能な方法のいずれかによって、血清安定性の核酸-脂質粒子のサイズを合わせることができる。所望のサイズ範囲および比較的狭い分布の粒子サイズを達成するために、サイジングを実施してもよい。
【０１８５】
粒子のサイズを所望のサイズに合わせるために、幾つかの技術が利用可能である。リポソーム用に用いられかつ本粒子にも等しく適用可能な、あるサイジング法が、米国特許第4,737,323号に記載されている。バス型またはプローブ型超音波処理のいずれかによって粒子懸濁を超音波処理することによって、サイズが約50nm未満の粒子まで下がった漸進的なサイズ低下が産生される。ホモジナイゼーションは、より大きい粒子をより小さい粒子に断片化するのを剪断エネルギーに頼る別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順において、典型的には約60から約80nmの、選択された粒子サイズが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して粒子を再循環させる。両方の方法において、従来のレーザービーム粒子サイズ識別、またはQELSによって、粒子サイズ分布をモニターすることができる。
【０１８６】
小さい孔のポリカーボネート膜または非対称のセラミック膜を通した粒子の押し出しもまた、粒子サイズを比較的明確なサイズ分布まで低下させるための有効な方法である。典型的には、所望の粒子サイズ分布が達成されるまで、1回または複数回、膜を通して懸濁を循環させる。粒子を、連続的により小さい孔の膜を通して押し出し、サイズの段階的低下を達成してもよい。
【０１８７】
別の群の態様において、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）有機溶媒中でカチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む混合物を調製し；
（b）きれいな単一相を提供するために、工程（a）における混合物と核酸の水性溶液を接触させ；ならびに
（c）核酸が脂質二重層の中に封入され、および粒子が血清中で安定でありかつ約50〜約150nmのサイズを有する、核酸-脂質粒子の懸濁を提供するために、有機溶媒を除去する。
【０１８８】
この群の態様において有用である核酸（例えば、siRNA）、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質は、上の界面活性剤透析法について記載された通りである。
【０１８９】
有機溶媒の選択は典型的には、溶媒極性および粒子形成のより後ろの段階で溶媒を除去することができる容易さについての考慮を伴う。可溶化薬剤としても用いられる、有機溶媒は、核酸および脂質のきれいな単一相混合物を提供するのに十分な量にある。好適な溶媒には、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、またはプロパノール、イソプロパノール、ブタノール、tert-ブタノール、iso-ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールなどのその他の脂肪族アルコールが含まれるが、これらに限定されない。2つまたはそれより多くの溶媒の組み合わせもまた、本発明において用いてもよい。
【０１９０】
典型的には水性溶液である、第一の核酸の溶液および第二の脂質の有機溶液を一緒に混合することによって、カチオン性および非カチオン性脂質の有機溶液と核酸を接触させることを遂行してもよい。当業者は、任意の数の方法によって、例えば、ボルテックスミキサーを用いることによるような機械的手段によって、この混合が起こることができるということを理解すると考えられる。
【０１９１】
核酸を脂質の有機溶液と接触させた後、有機溶媒を除去し、このようにして血清安定性の核酸-脂質粒子の水性懸濁を形成させる。有機溶媒を除去するのに用いられる方法は典型的には、低下した圧力での蒸発または不活性ガス（例えば、窒素もしくはアルゴン）の蒸気を混合物のいたる所に吹き付けることを伴うと考えられる。
【０１９２】
このようにして形成された血清安定性の核酸-脂質粒子は典型的には、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズに合わされていると考えられる。さらなるサイズ低下または粒子におけるサイズの均一性を達成するために、上記のようにサイジングを実施することができる。
【０１９３】
その他の態様において、本方法は、本組成物を用いた細胞への送達を結果としてもたらすのに有用である非脂質性ポリカチオンを添加する工程をさらに含むと考えられる。好適な非脂質性ポリカチオンの例として、臭化ヘキサジメトリン（Aldrich Chemical社, Milwaukee, Wisconsin, USAから、POLYBRENE（登録商標）というブランド名で販売されている）またはその他のヘキサジメトリンの塩が含まれるが、これらに限定されない。その他の好適なポリカチオンとして、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。
【０１９４】
ある種の態様において、単相系（例えば、BlighおよびDyer単相もしくは同様の水性溶媒および有機溶媒の混合物）または好適な混合を伴う2相系のいずれかで、核酸-脂質粒子の形成を実行することができる。
【０１９５】
複合体の形成を単相系で実行する場合、カチオン性脂質および核酸を大量の単相混合物中で各々溶解させる。2つの溶液の組み合わせは、複合体が形成される単一の混合物を提供する。あるいは、カチオン性脂質が（水性相の中に存在する）核酸に結合し、かつ有機相の中にそれを「引っ張る」2相混合物中で複合体が形成されることができる。
【０１９６】
別の態様において、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）核酸-脂質混合物を形成するために、非カチオン性脂質および界面活性剤を含む溶液と核酸を接触させ；
（b）核酸の負の電荷の部分を中和し、かつ電荷が中和された核酸および脂質の混合物を形成するために、核酸-脂質混合物とカチオン性脂質を接触させ；ならびに
（c）核酸を分解から保護する、核酸-脂質粒子を提供するために、電荷が中和された混合物から界面活性剤を除去する。
【０１９７】
ある群の態様において、非カチオン性脂質および界面活性剤の溶液は水性溶液である。第一の核酸の溶液ならびに第二の脂質および界面活性剤の溶液を一緒に混合することによって、非カチオン性脂質および界面活性剤の溶液と核酸を接触させることを典型的に遂行する。当業者は、任意の数の方法によって、例えば、ボルテックスミキサーを用いることによるような機械的手段によって、この混合が起こることができるということを理解すると考えられる。好ましくは、核酸溶液は界面活性剤溶液でもある。本方法において用いられる非カチオン性脂質の量は典型的には、用いられるカチオン性脂質の量に基づいて決定され、および典型的にはカチオン性脂質の量の約0.2〜約5倍、好ましくは用いられるカチオン性脂質の量の約0.5〜約2倍である。
【０１９８】
幾つかの態様において、例えば、米国特許出願第09/744,103号に記載されたように、核酸を事前に凝縮させる。
【０１９９】
このようにして形成された核酸-脂質混合物をカチオン性脂質と接触させ、存在する核酸（またはその他のポリアニオン性材料）と関連する負の電荷の部分を中和する。用いられるカチオン性脂質の量は典型的には、核酸の負の電荷の少なくとも50％を中和するのに十分であると考えられる。好ましくは、負の電荷は、少なくとも70％中和され、より好ましくは少なくとも約90％中和されると考えられる。本発明において有用であるカチオン性脂質には、例えば、DLinDMAおよびDLenDMAが含まれる。これらの脂質および関連類似体は米国特許公報第20060083780号に記載されている。
【０２００】
多くの技術のいずれかによって、好ましくはカチオン性脂質の溶液および核酸-脂質混合物を含む溶液を一緒に混合することによって、核酸-脂質混合物とカチオン性脂質を接触させることを遂行する。2つの溶液を混合する（または任意のその他のやり方で接触させる）と同時に、核酸と関連する負の電荷の部分は中和される。それでもなお、核酸は未凝縮の状態にとどまり、かつ親水性の特徴を獲得する。
【０２０１】
カチオン性脂質を核酸-脂質混合物と接触させた後、界面活性剤（または界面活性剤および有機溶媒の組み合わせ）を除去し、このようにして核酸-脂質粒子を形成させる。界面活性剤を除去するのに用いられる方法は典型的には、透析を伴うと考えられる。有機溶媒が存在する場合、典型的には、低下した圧力での蒸発によってまたは不活性ガス（例えば、窒素もしくはアルゴン）の蒸気を混合物のいたる所に吹き付けることによって、除去を遂行する。
【０２０２】
このようにして形成された粒子は典型的には、約50nm〜数ミクロン、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズに合わされていると考えられる。さらなる粒子のサイズ低下またはサイズの均一性を達成するために、核酸-脂質粒子を超音波処理し、濾過し、またはリポソーム製剤化で用いられかつ当業者に公知であるその他のサイジング技術に供することができる。
【０２０３】
その他の態様において、本方法は、本組成物を用いた細胞のリポフェクションをもたらすのに有用である非脂質性ポリカチオンを添加する工程をさらに含むと考えられる。好適な非脂質性ポリカチオンの例として、臭化ヘキサジメトリン（Aldrich Chemical社, Milwaukee, Wisconsin, USAから、POLYBRENE（登録商標）というブランド名で販売されている）またはその他のヘキサジメトリンの塩が含まれる。その他の好適なポリカチオンとして、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩の添加は、好ましくは粒子が形成された後である。
【０２０４】
別の局面において、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）疎水性の核酸-脂質複合体を提供するために、溶液中で核酸と大量のカチオン性脂質を接触させ；溶液は約15〜35％の水および約65〜85％の有機溶媒を含み、かつカチオン性脂質の量は約0.85〜約2.0の+/-電荷比を産生するのに十分であり；
（b）核酸-脂質混合物を提供するために、溶液中の疎水性の、核酸-脂質複合体を非カチオン性脂質と接触させ；ならびに
（c）核酸を分解から保護する核酸-脂質粒子を提供するために、核酸-脂質混合物から有機溶媒を除去する。
【０２０５】
本発明のこの局面において有用である核酸（例えば、siRNA）、非カチオン性脂質、カチオン性脂質、および有機溶媒は、界面活性剤を用いた上の方法について記載されたものと同じである。ある群の態様において、工程（a）の溶液は単相である。別の群の態様において、工程（a）の溶液は2相である。
【０２０６】
好ましい態様において、非カチオン性脂質は、ESM、DSPC、DOPC、POPC、DPPC、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、DMPE、DPPE、DSPE、DOPE、DEPE、SOPE、POPE、PEGに基づくポリマー（例えば、PEG 2000、PEG 5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、もしくはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、またはその組み合わせである。さらにその他の好ましい態様において、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはその組み合わせである。
【０２０７】
ある態様において、核酸は本明細書において記載されたようなsiRNAであり；カチオン性脂質は、DLindMA、DLenDMA、DODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGS、またはその組み合わせであり；非カチオン性脂質は、ESM、DOPE、PEG-DAG、DSPC、DPPC、DPPE、DMPE、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、DSPE、DEPE、SOPE、POPE、コレステロール、またはその組み合わせ（例えば、DSPCおよびPEG-DAA）であり；ならびに有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはその組み合わせである。
【０２０８】
上のように、好ましくはボルテックスミキサーを用いることによるような機械的手段によって、第一の核酸の溶液ならびに第二の脂質の溶液を一緒に混合することによって、カチオン性脂質と核酸を接触させることを典型的に遂行する。結果として生じる混合物は、上記のような複合体を含む。その後、非カチオン性脂質の添加および有機溶媒の除去によって、これらの複合体を粒子に変換する。複合体を含む混合物に非カチオン性脂質の溶液を単に添加することによって、非カチオン性脂質の添加を典型的に遂行する。逆の添加も用いることができる。当業者に公知でかつ上で記載もされた方法によって、その後の有機溶媒の除去を遂行する。
【０２０９】
本発明のこの局面において用いられる非カチオン性脂質の量は典型的には、電荷が中和された核酸-脂質複合体を提供するのに用いられたカチオン性脂質の（モル基準での）量の約0.2〜約15倍の量である。好ましくは、量は用いられたカチオン性脂質の量の約0.5〜約9倍である。
【０２１０】
ある態様において、上記の方法に従って調製する核酸-脂質粒子は、正味の電荷が中性であるかまたはより大きい遺伝子リポフェクション活性を粒子に提供する全体としての電荷を帯びるかのいずれかである。好ましくは、粒子の核酸成分は、非所望のタンパク質の産生を干渉する核酸である。その他の好ましい態様において、非カチオン性脂質はコレステロールをさらに含んでもよい。
【０２１１】
SNALP-CPL（CPL含有SNALP）を作るための様々な一般的方法を本明細書において議論する。2つの一般的技術として、「挿入後」技術、すなわち、例えば、予め形成されたSNALPの中へのCPLの挿入、および例えば、SNALP形成工程の間にCPLを脂質混合物中に含む、「標準」技術が含まれる。挿入後技術は、主にSNALP二重層膜の外面にCPLを有するSNALPを結果的にもたらすのに対し、標準技術は内面および外面の両方にCPLを有するSNALPを提供する。本方法は、（コレステロールを含むことができる）リン脂質から作られた小胞にとりわけ有用であり、ならびに（PEG-DAAおよびPEG-DAGなどの）PEG-脂質を含む小胞にもとりわけ有用である。SNALP-CPLを作る方法は、例えば、米国特許第5,705,385号；米国特許第6,586,410号；米国特許第5,981,501号；米国特許第6,534,484号；および米国特許第6,852,334号；米国特許公報第20020072121号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第00/62813号に教示されている。
【０２１２】
VI、キット
本発明はまた、キット形態での核酸-脂質粒子を提供する。キットは、核酸-脂質粒子の様々な要素（例えば、核酸および粒子の個々の脂質成分）を収納するために区画化されている容器を含んでもよい。幾つかの態様において、キットは、エンドソーム膜不安定化剤（例えば、カルシウムイオン）をさらに含んでもよい。キットは典型的には、それらの再水和および投与のための取扱説明書と共に、好ましくは脱水和形態で、本発明の核酸-脂質粒子組成物を含む。ある種の例において、粒子および／または粒子を含む組成物は、粒子の表面に付着した標的化部分を有してもよい。（本粒子中に用いられるもののような）脂質に標的化部分（例えば、抗体、タンパク質）を付着させる方法は当業者に公知である。
【０２１３】
VII、核酸-脂質粒子の投与
ひとたび形成されれば、本発明の血清安定性の核酸-脂質粒子は、細胞内への核酸（例えば、siRNA）の導入に有用である。したがって、本発明はまた、細胞内に核酸（例えば、siRNA）を導入するための方法を提供する。最初に上記のような粒子を形成し、その後核酸の細胞への送達が起こるのに十分な期間、粒子を細胞と接触させることによって、本方法をインビトロまたはインビボで実行する。
【０２１４】
本発明の核酸-脂質粒子を、そ共に混合または接触させるほとんど全ての細胞型に吸着させることができる。ひとたび吸着すれば、粒子は、細胞のある部分によってエンドサイトーシスされるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合するのいずれかが可能である。粒子の核酸部分の移動または取り込みは、これらの経路のいずれか1つを介して起こることができる。特に、融合が起こる場合、粒子膜は細胞膜に統合され、および粒子の中身が細胞内の流体と組み合わさる。
【０２１５】
本発明の核酸-脂質粒子を、単独でまたは投与の経路および標準的な薬学的慣例に一致して選択される薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水もしくはリン酸緩衝剤）との混合物としてのいずれかで投与することができる。通常、規定の緩衝食塩水（例えば、135〜150mM NaCl）が薬学的に許容される担体として利用されると考えられる。その他の好適な担体として、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような、安定性の増強のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、およびそれらと同様のものが含まれる。さらなる好適な担体は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版（1985）に記載されている。本明細書において使用される場合、「担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散剤、媒体、コーティング剤、希釈剤、抗菌薬剤および抗真菌薬剤、等張でかつ吸収を遅延させる薬剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁、コロイド、ならびにそれらと同様のものを含む。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与された場合にアレルギー性のまたは同様の都合の悪い反応を産生しない分子実体および組成物を指す。
【０２１６】
薬学的に許容される担体は通常、粒子形成後に添加される。したがって、粒子が形成された後、粒子を規定の緩衝食塩水などの薬学的に許容される担体の中に希釈することができる。
【０２１７】
薬学的製剤中の粒子の濃度は、幅広く、すなわち、重量で約0.05％未満から、通例約2〜5％でまたは少なくとも約2〜5％で、約10〜90％と同じ程度まで変化することができ、および選択される投与の特定の様式に一致して、主として流体容量、粘度などによって選択されると考えられる。例えば、処置と関連する流体負荷を下げるために濃度を増大させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症関連のうっ血性心不全または重症高血圧を有する患者において特に望ましい可能性がある。あるいは、刺激性のある脂質から構成される粒子を低濃度まで希釈して、投与の部位での炎症を緩和してもよい。
【０２１８】
本発明の薬学的組成物を、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。水性溶液を使用のために包装し、または無菌条件下で濾過し、および凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌水性溶液と組み合わせる。組成物は、pH調整薬剤およびpH緩衝薬剤、張性調整薬剤、ならびにそれらと同様のものなどの、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含むことができる。さらに、粒子懸濁は、保管時のフリーラジカルおよび過酸化傷害から脂質を保護する脂質保護薬剤を含んでもよい。αトコフェロールなどの、親油性のフリーラジカルクエンチャーおよびフェリオキサミンなどの、水溶性の鉄特異的キレート剤が好適である。
【０２１９】
A、インビボ投与
インビボ治療のための全身送達、すなわち、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療的核酸の送達が、PCT刊行物国際公開公報第96/40964号ならびに米国特許第5,705,385号；第5,976,567号；第5,981,501号；および第6,410,328号に開示されたものなどの核酸-脂質粒子を用いて達成されている。この後者の形式は、血清におけるヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性であり、サイズが小さく、かつ反復投薬に好適である完全に封入された核酸-脂質粒子を提供する。
【０２２０】
インビボ投与について、投与は、当技術分野において公知の任意の様式、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内もしくは気管内）、経皮適用、または直腸投与によるものであることができる。単回または分割用量で、投与を遂行することができる。非経口的に、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に、薬学的組成物を投与することができる。幾つかの態様において、薬学的組成物をボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与する（例えば、米国特許第5,286,634号参照）。細胞内核酸送達はまた、Straubringer et al., Methods Enzymol., 101：512（1983）；Mannino et al., Biotechniques, 6：682（1988）；Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6：239（1989）；およびBehr, Acc. Chem. Res., 26：274（1993）で議論されている。脂質に基づく治療薬を投与するさらにその他の方法は、例えば、米国特許第3,993,754号；第4,145,410号；第4,235,871号；第4,224,179号；第4,522,803号；および第4,588,578号に記載されている。疾患の部位での直接注射によってまたは疾患の部位から遠位の部位での注射によって、脂質-核酸粒子を投与することができる（例えば、Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert社, Publishers, New York. 70-71頁（1994）参照）。
【０２２１】
本発明の組成物を、単独かまたはその他の好適な成分と組み合わせるかのいずれかで、吸入（例えば、鼻腔内もしくは気管内）によって投与されるべきエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）（Brigham et al., Am. J. Sci., 298：278（1989）参照）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、およびそれらと同様のものなどの、圧縮された許容される推進剤の中に置くことができる。
【０２２２】
ある種の態様において、鼻腔内スプレー、吸入、および／またはその他のエアロゾル送達媒体によって、薬学的組成物を送達してもよい。鼻エアロゾルスプレーによって直接肺に核酸組成物を送達するための方法は、例えば、米国特許第5,756,353号および第5,804,212号に記載されている。同じく、鼻腔内微粒子樹脂およびリゾフォスファチジル-グリセロール化合物（米国特許第5,725,871号）を用いた薬物の送達もまた、薬学の技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態での経粘膜的な薬物送達は、米国特許第5,780,045号に記載されている。
【０２２３】
例えば、関節内（関節における）、静脈内、筋肉内、経皮、腹腔内、および皮下経路によるなどの、非経口的な投与に好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピアントの血液と等張にする溶質を含むことが出来る、水性および非水性で、等張の滅菌注射溶液、ならびに懸濁薬剤、可溶化剤、増粘薬剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁が含まれる。この発明の実施において、組成物は好ましくは、例えば、静脈内注入で、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄空内に投与される。
【０２２４】
通常、静脈内に投与される場合、核酸-脂質製剤は好適な薬学的担体と共に製剤化される。多くの薬学的に許容される担体を本発明の組成物および方法において利用してもよい。本発明での使用のための好適な製剤が、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版（1985）に見出される。例えば、水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、およびそれらと同様のものなどの、様々な水性担体が用いられてもよく、ならびにアルブンミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような、安定性の増大のための糖タンパク質を含んでもよい。通常、規定の緩衝食塩水（135〜150mM NaCl）が薬学的に許容される担体として利用されると考えられるが、その他の好適な担体で十分間に合うと考えられる。濾過などの、従来のリポソーム滅菌技術によって、これらの組成物を滅菌することができる。組成物は、pH調整薬剤およびpH緩衝薬剤、張性調整薬剤、浸潤薬剤、ならびにそれらと同様のものなどの、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。これらの組成物を上で参照された技術を用いて滅菌することができまたは、あるいは、それらを滅菌条件下で産生することができる。結果として生じる水性溶液を使用のために包装し、または無菌条件下で濾過し、および凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌水性溶液と組み合わせる。
【０２２５】
ある種の適用において、本明細書において開示された核酸-脂質粒子を、経口投与によって個人に送達してもよい。粒子を賦形剤と共に取り込ませ、かつ摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、ピル、薬用ドロップ、エリキシル、うがい薬、懸濁、経口スプレー、シロップ、ウエハー、およびそれらと同様のものの形態で用いてもよい（例えば、米国特許第5,641,515号、第5,580,579号、および第5,792,451号参照）。これらの経口投薬形態はまた、以下のものを含んでもよい：結合剤、ゼラチン；賦形剤、潤滑剤、および／または風味を付ける薬剤。単位投薬形態がカプセルである場合、それは、上記の材料に加えて、液体担体を含んでもよい。様々なその他の材料が、コーティング剤としてまたは投薬単位の物理的形態をそうでないように修飾するために存在してもよい。勿論、任意の単位投薬形態を調製する際に用いられる任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ利用される量では実質的に無毒であるべきである。
【０２２６】
粒子のパーセンテージは、勿論、様々に異なり得、かつ便宜的に全製剤の重量または容量の約1％もしくは2％から約60％もしくは70％の間またはそれより多くであり得るが、典型的には、これらの経口製剤は、核酸-脂質粒子の少なくとも約0.1％またはそれより多くを含んでもよい。当然、好適な投薬が任意の所与の単位用量の化合物において得られるようなやり方で、各々の治療的に有用な組成物中の粒子の量を調製してもよい。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品の貯蔵期限などの要因だけでなく、その他の薬理学的考慮も、そのような薬学的製剤を調製する当業者によって企図されると考えられ、ならびにそのようなものとして、様々な投薬および処置計画が望ましい可能性がある。
【０２２７】
経口投与に好適な製剤は以下からなることができる：（a）水、食塩水、またはPEG 400のような希釈剤に懸濁された有効量の包装された核酸（例えば、siRNA）などの、液体溶液；（b）所定の量の核酸（例えば、siRNA）を、液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして各々含む、カプセル、小袋、または錠剤；（c）適当な液体中の懸濁；ならびに（d）好適なエマルジョン。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびその他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝薬剤、湿潤薬剤、防腐剤、風味を付ける薬剤、色素、崩壊薬剤、ならびに薬学的に適合する担体の1つまたは複数を含むことができる。薬用ドロップ形態は、例えば、スクロースなどの、風味の付いた核酸（例えば、siRNA）だけでなく、核酸（例えば、siRNA）に加えて、当技術分野において公知の担体を含む、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアエマルジョンなどの、不活性基材中に核酸（例えば、siRNA）を含む香錠、ゲル、ならびにそれらと同様のものも含むことができる。
【０２２８】
それらの使用の別の実施例において、核酸-脂質粒子を幅広い範囲の局所投薬形態に取り込ませることができる。例えば、核酸-脂質粒子を含む懸濁を、ゲル、油、エマルジョン、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、フォーム、ムース、およびそれらと同様のものとして製剤化および投与することができる。
【０２２９】
本発明の核酸-脂質粒子の薬学的調製物を調製する場合、精製して空の粒子を減少させもしくは排除した多量の粒子、または外部表面と関連した核酸を持つ多量の粒子を用いることが好ましい。
【０２３０】
本発明の方法を様々な宿主において実施してもよい。好ましい宿主として、鳥類（例えば、アヒル）、霊長類（例えば、ヒトおよびチンパンジーのみならずその他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、ならびにブタなどの、哺乳動物種が含まれる。
【０２３１】
投与される粒子の量は、核酸の脂質に対する比、用いられる特定の核酸、診断されている疾患状態、患者の年齢、体重、および様態、ならびに臨床医の判断によると考えられるが、通常体重のキログラム当たり約0.01から約50mgの間、好ましくは約0.1から約5mg/体重のkgの間、または投与（例えば、注射）当たり約108〜1010粒子であると考えられる。
【０２３２】
B、インビトロ投与
インビトロ適用のために、核酸（例えば、siRNA）の送達は、植物または動物起源、脊椎動物または無脊椎動物のどちらかの、および任意の組織または型の、培養で増殖した任意の細胞に対してであることができる。好ましい態様において、細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、および最も好ましくはヒト細胞である。
【０２３３】
インビトロで実行される場合、細胞と核酸-脂質粒子間の接触は、生物学的に適合性のある培地中で起こる。粒子の濃度は特定の適用に応じて幅広く変化するが、通常約1μmolから約10mmolの間である。通常、生理学的温度（約37℃）で約1〜48時間、好ましくは約2〜4時間の間、核酸-脂質粒子による細胞の処置を実行する。
【０２３４】
ある群の好ましい態様において、約103〜約105細胞/ml、より好ましくは約2×104細胞/mlの細胞密度を有する60〜80％コンフルエントなプレーティングされた細胞に、核酸-脂質粒子懸濁を添加する。細胞に添加される懸濁の濃度は、好ましくは約0.01〜0.2μg/ml、より好ましくは約0.1μg/mlである。
【０２３５】
エンドソーム放出パラメーター（ERP）アッセイを用いて、SNALPまたはその他の脂質に基づく担体系の送達効率を最適化することができる。ERPアッセイは米国特許公報第20030077829号に詳細に記載されている。より特に、ERPアッセイの目的は、エンドソーム膜の結合／摂取またはエンドソーム膜との融合／エンドソーム膜の不安定化に対するそれらの相対的な効果に基づいて、様々なカチオン性脂質とSNALPのヘルパー脂質成分の効果を区別することである。このアッセイにより、SNALPまたはその他の脂質に基づく担体系の各々の成分がどのくらい送達効率に影響を及ぼすのかを定量的に決定し、それによってSNALPまたはその他の脂質に基づく担体系を最適化することが可能となる。通例、ERPアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）など）の発現を測定し、および幾つかの例において、発現プラスミド用に最適化されたSNALP製剤は、干渉RNAを封入するのにも適当であると考えられる。その他の例において、干渉RNA（例えば、siRNA）の存在下または非存在下での標的配列の転写または翻訳の下方調節を測定するために、ERPアッセイを採用することができる。様々なSNALPまたはその他の脂質に基づく製剤の各々についてのERPを比較することによって、最適化された系、例えば、細胞における最大の摂取を有するSNALPまたはその他の脂質に基づく製剤を容易に決定することができる。
【０２３６】
C、干渉RNAの送達のための細胞
本発明の組成物および方法を用いて、インビボおよびインビトロで、多種多様な細胞型を処置する。好適な細胞として、例えば、造血前駆（幹）細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、骨格筋および平滑筋細胞、骨芽細胞、ニューロン、休止リンパ球、終末分化細胞、ゆっくりとした周期または非周期の初代細胞、柔組織細胞、リンパ様細胞、上皮細胞、骨細胞、ならびにそれらと同様の細胞が含まれる。
【０２３７】
干渉RNA（例えば、siRNA）を封入した核酸-脂質粒子のインビボ送達は、任意の細胞型の細胞を標的するのに適している。例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）、ウサギ、ブタ、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）などの、哺乳動物を含む、多種多様な脊椎動物の細胞と共に、本方法および組成物を利用することができる。
【０２３８】
細胞の組織培養が必要とされ得る程度は、当技術分野において周知である。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 第3版, Wiley-Liss, New York（1994）, Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross社（1977）、およびそこに引用された参照は、細胞の培養に対する一般的指針を提供している。培養細胞系は多くの場合、細胞の単層の形態にあると考えられるが、細胞懸濁も用いられる。
【０２３９】
D、SNALPの検出
幾つかの態様において、核酸-脂質粒子は、粒子の投与後約8、12、24、48、60、72、もしくは96時間、または、6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25、もしくは、28日で対象において検出可能である。対象由来の細胞、組織、またはその他の生物学的試料中で、粒子の存在を検出することができる。例えば、粒子の直接的検出、干渉RNA（例えば、siRNA）配列の検出、関心対象の標的配列の検出（すなわち、関心対象の配列の発現もしくは発現の低下を検出することによる）、またはその組み合わせによって、粒子を検出してもよい。
【０２４０】
1、粒子の検出
当技術分野において公知の任意の方法を用いて、核酸-脂質粒子を検出することができる。例えば、当技術分野において周知の方法を用いて、直接的にまたは間接的に、SNALPまたはその他の担体系の成分に標識を共役させることができる。多種多様な標識を用いることができ、標識の選択は、必要とされる感度、SNALP成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要求性、ならびに利用可能な器具類および使い捨て設備による。好適な標識として、蛍光色素（例えば、フルオレセインならびにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）などの、誘導体；ローダミンおよびTexas Red、テトラローダミンイソチオシアネート（TRITC）などのような誘導体）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、AMCA、CyDyes（商標）、ならびにそれらと同様のものなどのスペクトル標識；3H、125I、35S、14C、32P、33Pなどのような放射性標識；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのような酵素；コロイド金もしくは着色ガラスなどのスペクトル比色標識またはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどのようなプラスチックビーズが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野において公知の手段を用いて、標識を検出することができる。
【０２４１】
2、核酸の検出
当業者に周知の多くの手段のいずれかによって、本発明において核酸（例えば、siRNA）を検出および定量する。核酸の検出は、サザン解析、ノーザン解析、ゲル電気泳動、PCR、放射性標識、シンチレーションカウンティング、およびアフィニティクロマトグラフィーなどの周知の方法によって進める。分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、および高拡散クロマトグラフィーなどのさらなる分析的で生化学的な方法も利用してもよい。
【０２４２】
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に公知である。例えば、共通の形式として、サンドイッチアッセイおよび競合または置き換えアッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば、「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」, Hames and Higgins編, IRL Press（1985）に概ね記載されている。
【０２４３】
検出されている標的核酸を増やす核酸増幅系の使用を通じて、ハイブリダイゼーションアッセイの感度を増強させてもよい。分子プローブとして使用するための配列を増幅するのにまたはその後のサブクローニングのための核酸断片を作製するのに好適なインビトロ増幅技術が公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Qβ-レプリカーゼ増幅、およびその他のRNAポリメラーゼを介する技術（例えば、NASBA（商標））を含む、そのようなインビトロ増幅法を通じて当業者を導くのに十分な技術の例は、Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2002）の中の、Sambrook et al.；およびAusubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Current Protocols, Greene Publishing Associates社およびJohn Wiley & Sons社（2002）だけでなく；米国特許第4,683,202号；PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications（Innis et al編）Academic Press社 San Diego, CA（1990）；Arnheim & Levinson（1990、October 1）, C&EN 36；The Journal Of NIH Research, 3：81（1991）；Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1173（1989）；Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：1874（1990）；Lomell et al., J. Clin. Chem., 35：1826（1989）；Landegren et al., Science, 241：1077（1988）；Van Brunt, Biotechnology, 8：291（1990）；Wu and Wallace, Gene, 4：560（1989）；Barringer et al., Gene, 89：117（1990）；ならびにSooknanan and Malek, Biotechnology, 13：563（1995）にも見出される。インビトロ増幅された核酸をクローニングする改良された方法は、米国特許第5,426,039号に記載されている。当技術分野において記載されたその他の方法は、核酸配列に基づく増幅系（NASBA（商標）, Cangene, Mississauga, Ontario）およびQβ-レプリカーゼ系である。これらの系を用いて突然変異体を直接同定することができ、この系では、選択配列が存在する場合にのみ、PCRまたはLCRプライマーが伸長しまたはライゲーションされるように設計されている。あるいは、通常、例えば、非特異的PCRプライマーを用いて選択配列を増幅し、および増幅された標的領域を、突然変異を示す特異的配列について後でプロービングすることができる。
【０２４４】
例えば、インビトロ増幅法において、プローブとして使用するための、遺伝子プローブとして、または阻害剤成分として使用するための核酸を、例えば、Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12：6159（1984）に記載されたような、自動化された合成機を用いて、Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22：1859（1981）によって記載された固体相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、典型的には化学的に合成する。必要な場合には、ポリヌクレオチドの精製を典型的には、未変性なアクリルアミドゲル電気泳動によるかまたはPearson et al., J. Chrom., 255：137-149（1983）に記載されたようなアニオン交換HPLCによるかのいずれかで行なう。Grossman and Moldave（編）Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65：499の中のMaxam and Gilbert（1980）の化学的分解法を用いて、合成ポリヌクレオチドの配列を確かめることができる。
【０２４５】
転写のレベルを決定するための代わりの手段は、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、かつAngerer et al., Methods Enzymol., 152：649（1987）に概ね記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を固体支持体、典型的にはガラススライドに固定する。DNAをプロービングしたい場合、熱またはアルカリで細胞を変性させる。その後、細胞を適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識されている特異的プローブのアニーリングを可能にする。好ましくは放射性同位元素または蛍光レポーターでプローブを標識する。
【０２４６】
VIII、実施例
本発明を以下の実施例によってより詳細に記載する。以下の実施例は例証的目的のために提示され、および決して本発明を限定するよう意図されない。当業者は、本質的に同じ結果を生み出すために変化させまたは修正することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識すると考えられる。
【０２４７】
実施例1、インビボで強力な遺伝子サイレンシングを媒介する非炎症性の合成siRNAの設計
この実施例は、siRNA二重鎖の一方の鎖における選択的位置での最小限の2'-O-メチル（2'OMe）修飾が、その配列とは無関係に、siRNAの免疫刺激活性を低下させまたは完全に阻止するのに十分であるということを例証する。実際、2'OMe修飾をsiRNA二重鎖の非標的化センス鎖に制限することによって、完全なRNAi活性を保持しながら、siRNAの免疫刺激活性を無効にすることができる。
【０２４８】
結果
ssRNA内部の2'OMe修飾は免疫刺激を阻止する。RNAによる免疫細胞活性化を阻害するのに必要とされる化学修飾の程度および種類を調べるために、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）siRNAに由来する一本鎖RNAポリヌクレオチド（ssRNA）のGUに富む免疫刺激モチーフ（Judge et al., Nat. Biotechnol., 23：457-462（2005））の中に2'OMeヌクレオチドを選択的に導入した。この検討で用いられたポリヌクレオチド配列を表1に提供する。β-galセンスssRNAにおける免疫刺激性のある5'-UGUGU-3'モチーフ（2'OMe GU）を含む5つのヌクレオチドの2'OMe修飾は、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）培養を脂質で封入されたssRNAで処置した場合、インターフェロン-α（IFN-α）誘導を完全に阻止した（図1A）。インターフェロン応答の阻害は、モチーフ内の2つのグアノシン（2'OMe 2×G）または3つのウリジン（2'OMe 3×U）ヌクレオチドのいずれかを選択的に修飾することによっても達成された。β-gal ssRNAの末端に向かって、UGUGUモチーフより3'の2つのグアノシン残基（2'OMe 2×G 3'）の選択的修飾もPBMC培養におけるインターフェロン応答の完全な阻止を結果的にもたらしたので、2'-O-メチル化の阻害的効果は、免疫刺激性のあるGUに富むモチーフ内のヌクレオチドの直接的な修飾を要求するようには見えなかった（図1A）。以前に記載されたように、未修飾の相補的なアンチセンス（AS）ssRNA配列は、これらのアッセイにおいてそもそも免疫刺激性がなかった（Judge et al., 前記）。カチオン性ポリマーのポリエチレンイミン（PEI）を用いてβ-gal ssRNAをPBMCに送達した場合、同様の結果が得られた（図2A）。
【０２４９】
ヒトおよびマウスApoBを標的するsiRNA二重鎖（Soutscheck et al., Nature, 432：173-178（2004））の構成要素である21および23塩基鎖の修飾に対して、同様のアプローチを適用した。そのGUに富むヌクレオチド配列（Heil et al., Science, 303：1526-1529（2004）；Judge et al., 前記）によって予想される通り、未修飾のApoB（AS）ssRNAは、低濃度でさえも、PBMC培養における強いIFN-α応答を刺激した（図1B）。この応答は、ApoB（AS）ssRNAにおける5'-GUGUG-3'モチーフ（2'OMe GU）を含む5つのヌクレオチドまたは6つのグアノシン（2'OMe G）もしくは7つのウリジン（2'OMe U）残基のいずれかの2'OMe修飾によって完全に阻害された（図1B）。脂質粒子の中に封入された未修飾で、相補的なApoBセンスポリヌクレオチド（ApoB（S））は、PBMCにおけるIFN-αを誘導しなかったが（図1B）、PEIポリプレックスとして送達される高用量のこのポリヌクレオチドはサイトカイン応答を活性化することが分かった。PEIとの複合体を形成したApoB（S）ssRNAに対するこの弱い応答も、2'OMeウリジン修飾によって阻害された。これらの知見は、ssRNA内部の2'OMe修飾ヌクレオチドの選択的取り込みが先天免疫細胞からのインターフェロン応答の刺激を防ぐのに十分であるということを示す。
【０２５０】
（表1）この検討で用いられたRNAポリヌクレオチド
2009513151.tif 000009
β-gal、ApoB、ApoBミスマッチ、およびvFLIP siRNAのセンス（S）およびアンチセンス（AS）鎖に対応する未修飾の（未変性な）および2'OMe修飾したRNAポリヌクレオチド。2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す。アステリスクは5'リン酸を表す。「dT」＝デオキシチミジン。
【０２５１】
siRNA内部の選択的なヌクレオチド修飾は免疫刺激を阻止する
siRNA二重鎖内部の選択的な2'OMe修飾もまた免疫刺激を阻害するかどうかを調べるために、それらの相補的な未修飾ポリヌクレオチドにアニールした2'OMe修飾センスまたはAS鎖を含む一連のβ-galおよびApoB siRNAを作製した（表1参照）。未修飾の（免疫刺激性のない）AS鎖とアニールした2'OMe修飾UGUGU、2×G、または3×Uセンス鎖のいずれかを含む脂質で封入された二本鎖β-gal siRNAは、ヒトPBMCからの検出可能なインターフェロン応答を誘導しなかった（図3A）。興味深いことに、センス鎖における未修飾の5'-UGUGU-3'モチーフと並置された、AS鎖における相補的な5'-ACACA-3'モチーフの選択的な2'OMe修飾もまた、未修飾の（免疫刺激性のある）センス鎖を含むアニールした二重鎖であるにもかかわらず、IFN‐α誘導のレベルを低減させた（図3A）。PEIを用いてβ-gal siRNAをPBMCに送達した場合、同様の結果が得られた（図2B）。同じく、未修飾ApoB siRNAはPBMCにおける強いIFN-α応答を誘導し、およびこの反応は、2'OMe GU、U、またはG修飾したAS鎖をApoB二重鎖に取り込ませた場合、完全に阻止された（図3B）。際立つことに、未修飾で、免疫刺激性のあるAS鎖にアニールした2'OMe GまたはU修飾したセンス鎖を含む修飾ApoB siRNAもまた、免疫刺激性がなくなった（図3B）。高濃度（675nM、〜9μg/ml）の修飾siRNAでさえもPBMC培養におけるIFN-αまたはTNFなどの炎症性サイトカインを誘導しなかったので、修飾ApoB siRNAのセンス鎖に対する2'OMe GまたはU修飾によるサイトカイン誘導の阻止は、完全であるように見えた（図3Bおよび3C）。
【０２５２】
しかしながら、2'OMe修飾シチジン残基を含むApoB siRNAが未変性な二重鎖によって誘導されるものと同様のサイトカインレベルを誘導したので、siRNAによる免疫刺激に対する2'-O-メチル化の阻害的効果が全てのパターンの修飾で観察されたわけではない（図3B）。2'OMeアデノシンの取り込みは、重大だが、完全ではない、サイトカイン応答の阻害を結果的にもたらした。2'OMe G、U、C、およびA修飾ApoBはそれぞれ、センス鎖に2つ、5つ、6つ、および8つの修飾ヌクレオチドを含むので、これらの相違は化学修飾の程度を単純には反映しなかった。これは、未修飾のUおよび／またはG残基が二重鎖siRNAの免疫認識において鍵となる役割を果たし得るということを示唆する。
【０２５３】
siRNA設計に対するこのアプローチが、siRNAに対する炎症性応答をインビボで首尾よく阻害するかどうかを確認するために、2'OMe修飾したβ-galおよびApoB siRNAの免疫刺激活性をマウスで検討評価した。センスまたはアンチセンス鎖のいずれかに2'OMe修飾グアノシンまたはウリジン残基を含む脂質で封入されたβ-gal（図4Aおよび4B）またはApoB（図4Cおよび4D）siRNAの静脈内投与は、血清のIFN-αまたはTNFなどの炎症性サイトカインの検出可能な増大をもたらさなかった。これは、これらのサイトカインのレベルの実質的な亢進を誘導した未修飾またはシトシン修飾siRNAとは著しく対照的であった。同様のアプローチをApoBミスマッチ（Soutschek et al., Nature, 432：173-178（2004））およびvFLIP（Guasparri et al., J. Exp. Med., 199：993-1003（2004））siRNA配列（表1参照）を修飾することに適用することによって、選択的な2'OMe修飾のこれらの際立った効果を確認した。ApoBミスマッチ（図4E）およびvFLIP（図4F）siRNA二重鎖について、RNA鎖のいずれか1つにおけるGUに富む領域またはウリジン残基のみのいずれかを修飾することによって、siRNA二重鎖によるサイトカイン誘導が完全に阻止された。修飾ApoBミスマッチsiRNAに対するサイトカイン応答の阻害は、ヒトPBMC培養でも確認された（図3Bおよび3C）。ApoBに関して、vFLIP siRNAへの2'OMe修飾シトシン残基の選択的取り込みは、IFN-α応答を実質的に低下させなかった（図4F）。試験された各々のsiRNA配列について、同様の結果が一貫して得られ、2'OMe修飾ウリジンまたはグアノシン残基の導入によって非炎症性のsiRNA二重鎖が生み出される。例えば、図5〜7は、2'OMeウリジンまたはグアノシン残基の導入が、表2で提供された5つのさらなるsiRNA配列の各々について、非炎症性のsiRNA二重鎖を産生するということを示す。総合すると、これらの知見は、短いRNA二重鎖の免疫認識のための根本的な機構はマウスとヒトの間で保存されているという結論を支持する（Judge et al, 前記；Hornung et al., Nat. Med., 11：263-270（2005））。これらの結果は、siRNA二重鎖のいずれかの鎖内のわずか2つの2'OMe修飾ヌクレオチドの取り込みによって、いずれの種でもこの機構を大いに混乱させることができるということを示す。
【０２５４】
（表2）この検討で用いられたさらなるRNAポリヌクレオチド
2009513151.tif 000010
β-gal、ルシフェラーゼ（Luc）、シクロフィリンB（Cyp B）、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（NP）、およびインフルエンザポリメラーゼ（PA） siRNAのセンス（S）およびアンチセンス（AS）鎖に対応する未修飾の（未変性な）および2'OMe修飾したRNAポリヌクレオチド。2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す。アステリスクは5'リン酸を表す。「dT」＝デオキシチミジン。
【０２５５】
siRNAセンス鎖に修飾を制限することによってRNAi活性が維持される
未変性なおよび2'OMe修飾したApoB siRNAの遺伝子サイレンシング活性をインビトロで検討評価した。リポソーム中に封入された未修飾ApoBは、HepG2細胞培養上清において、強力で、用量依存的なApoBタンパク質の阻害を引き起こした（図8）。推定IC50値（〜1.5nM）は、同様のインビトロモデルにおいてOligofectamineトランスフェクションを用いてこのsiRNA配列について確立されたものと一致した（Soutschek et al., 前記）。2'OMe修飾が非標的化センスまたはパッセンジャー鎖に制限されている修飾ApoB二重鎖は、未変性なsiRNAの活性と同様のApoBサイレンシング活性を示した（図8）。対照的に、標的化アンチセンス（AS）またはガイド鎖に対する修飾は、二重鎖のRNAi活性に重大な影響を与えた。AS鎖における2'OMeウリジンまたはグアノシン残基の取り込みがApoB遺伝子サイレンシングを阻止したのに対し、5'-GUGUG-3'修飾したAS鎖を含む二重鎖は、未変性なまたはセンスを修飾した二重鎖と比較して実質的に低下した活性（推定IC50＝〜15nM）を示した。未修飾または修飾ApoBミスマッチ対照siRNAはApoBタンパク質発現の有意な阻害をもたらさなかった（図8）。2'OMe修飾をβ-gal 728およびルシフェラーゼsiRNAのセンス鎖に制限するという同様の戦略もまた、完全なRNAi活性を保持する非炎症性siRNAを作製するのに成功することが分かった（図6〜7）。遺伝子サイレンシング活性に対するAS鎖修飾の負の影響は、特に5'末端での、siRNA二重鎖のAS鎖の2'OMe修飾がRNAi活性を低下させることができるということを示す以前の仕事（Prakash et al., J. Med. Chem., 48：4247-4253（2005））と一致するが、AS鎖に対する広範囲にわたる2'OMe修飾を許容することができるsiRNA配列が同定されている（Morrissey et al., Hepatology, 41：3149-1356（2005）；Czauderna et al., Nucl. Acids Res., 31：2705-2716（2003））。これらのデータは、siRNAのセンス鎖に制限された、選択的な2'OMe修飾が、RNAi活性に負に影響を与えるという機会を低下させながら、siRNAによる免疫活性化の問題を克服する強固なアプローチを提示するということを例証する。これらの結果は、従来設計された合成siRNAの大部分を包含する、先天免疫応答を刺激する本来備わっている潜在能力を持つ、全てではないが、多くのsiRNA配列に対して、このアプローチを適用することができるということを示す。
【０２５６】
インビボでの免疫刺激を伴わない強力なRNAi活性
インビボでの遺伝子発現および免疫刺激を抑制するそれらの能力について、2'OMe修飾したApoB siRNAを検討評価した。2'OMe U(S)およびGU（AS）修飾したApoBを非炎症性の二重鎖として選択した（図3および4参照）。これはまた、AS修飾したsiRNAのインビトロRNAi活性を低下させる化学修飾の影響を検討評価する好機を与えた（図8参照）。siRNAを肝臓に送達することが以前に示された安定な核酸-脂質粒子（SNALP）（Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23：1002-1007（2005））の中に、未変性なまたは2'OMe修飾したApoBおよびミスマッチsiRNAを製剤化した。全身適用での使用のために、核酸に基づく薬物は、安定化またはヌクレアーゼ分解からの保護を必要とする。脂質二重層の内側への封入によって、未修飾でかつさもなければ不安定なsiRNAが、インビトロで37℃で24時間以上の間、血清ヌクレアーゼ分解から保護され、封入によって、siRNAに対する広範囲にわたる化学修飾を必要とせずに、十分なヌクレアーゼ保護が提示されるということが示唆されている。比較すると、裸のsiRNAは、同様の条件下で4時間以内に完全に分解された（図9）。
【０２５７】
封入されたApoB siRNAを、5mg/kg/日で3日間、BALB/cマウスに静脈内投与した。この処方計画は、コレステロールがコンジュゲートされた、化学修飾ApoB siRNAを利用する実験で効き目があると最初に報告された（Soutschek et al., 前記）ApoB siRNA用量の10倍の低下に相当する。未変性で、免疫刺激性のあるApoBまたはミスマッチsiRNAを受けた動物は、3日までにそれぞれ初めの体重の10.5％および9％の喪失（図10A）ならびに処置の経過中の全般的な身体状態における軽い減退によって明白になるような明らかな毒性の症状を示した。対照的に、2'OMe修飾したsiRNAによる処置は、最小限（1％未満）の体重喪失を伴いまたは体重喪失を伴わず、十分に許容された（図10A）。これらの有効性検討における先天的なサイトカイン応答の阻止を生存中の血清IFN-α解析によって確認し（図10B）、およびしたがって未修飾siRNAの投与と関連する毒性は、全身のサイトカイン応答が原因であるとした。留意すべきことに、未修飾ミスマッチsiRNAによって誘導されるサイトカインレベルおよび体重喪失は、対応する活性のあるApoB二重鎖についてよりも低かった。この場合のミスマッチ対照は、ApoB配列内の4つのG/C置換によって作製され（Soutschek et al., 前記）、RNA二重鎖による免疫刺激に対する配列依存的な効果のさらなる証拠を提供している。
【０２５８】
RNAiを介するノックダウンの直接的な測定として、最後のsiRNA処置の2日後に肝臓でApoB mRNAを決定した（図10C）。未変性なApoB処置群および2'OMe U(S)修飾したApoB処置群の両方において、ApoB mRNAレベルはPBS処置動物と比較して有意に低下した（それぞれ、PBS対照の18±2％および18±5％）。比較すると、2'OMe GU(AS)修飾したApoB siRNAで処置したマウスは、あまり顕著ではないApoB mRNAのサイレンシングを示し（対照の44±4％）、この修飾siRNAの低下したインビトロRNAi活性と相関した（図8参照）。修飾したミスマッチ群におけるApoB mRNAレベルは、PBS対照におけるApoB mRNAレベルと同等であったが（図10C）、その一方で未変性なミスマッチsiRNAはApoB mRNAレベルの適度な低下をもたらした（PBS対照の79±12％）。未変性なミスマッチsiRNAで観察された肝臓ApoB mRNAの適度な低下は、3回の別々の実験で明白であり、かつ未修飾siRNAの全身投与および送達と関連するインターフェロン放出および毒性の症状と相関した。
【０２５９】
肝臓でのApoB mRNAのサイレンシングは、血清ApoBタンパク質の比例的で、配列特異的な低下を結果的にもたらした。未変性な、2'OMe U(S)修飾した、またはGU(AS)修飾したApoB siRNAで処置したマウスは、それぞれPBS処置した動物の血清ApoBタンパク質レベルの26％、28％、および47％である血清ApoBタンパク質レベルを有した（図10D）。ApoB発現の機能的サイレンシングはまた、ApoB二重鎖によるmRNAおよびタンパク質ノックダウンの相対的な効力と相関する血清コレステロールの有意な低下に反映された。未変性な、2'OMe U(S)修飾、またはGU(AS)修飾したApoB siRNAで処置したマウスは、PBS対照群におけるコレステロールレベルの48％、51％、および69％である血清コレステロールレベルを示した（図10E）。ミスマッチsiRNAはいずれも、血清コレステロールに対していかなる効果も有しなかった（図10E）。別の実験において、非炎症性の2'OMe G(S)修飾したApoB siRNAは、IFN誘導がない中で、ApoB mRNA、タンパク質、および血清コレステロールの同様の低下を媒介した。
【０２６０】
これらの検討からの結果は、siRNAの脂質封入が、全身適用のための十分な血清安定性を提供し、かつRNAに対する広範囲にわたる化学修飾の必要性の存在を否定することを示す。これは、標的臓器、この場合は肝臓へのsiRNA積み荷の効果的な送達と対になって、高コレステロール血症のための潜在的な治療標的を代表するタンパク質である、ApoBによってこれらの検討で例示された、内在性遺伝子のサイレンシングを容易にする。重要なことに、非炎症性であるように設計された、2'OMe修飾siRNAは、未修飾siRNAと同等ではあるが、未修飾siRNAの全身投与と関連する免疫毒性およびその他のオフターゲット効果を伴わない効力をインビボで示した。本明細書において記載されたアプローチは、幅広い範囲の遺伝子標的に通常適用可能であることができ、かつ様々な治療方法での使用に好適である。
【０２６１】
考察
siRNAによる免疫活性化は配列依存的であるという知見に基づいて、GUに富むモチーフを欠く配列を選択することによって、ごくわずかの免疫刺激活性を持つ活性のあるsiRNAを設計することが可能であるということが以前に示された（Judge et al., Nat. Biotechnol., 23：457-462（2005））。しかしながら、この戦略は、所与の標的に対して設計することができる新規のsiRNA配列の数を著しく限定する。さらに、それは現在、推定上のRNA免疫刺激モチーフの比較的曖昧な性質によって、ある程度のスクリーニングを必要とする。この検討は、siRNA二重鎖への2'OMe修飾ヌクレオチドの選択的取り込みによって合成siRNAを介する免疫刺激を阻止する新規でかつ強固なアプローチを強調する。注目すべきことに、極めて免疫刺激性のあるsiRNA分子におけるわずか2つの2'OMeグアノシンまたはウリジン残基の取り込みによって、ヒトPBMCにおけるおよびマウスにおけるsiRNAを介するインターフェロンおよび炎症性サイトカイン誘導がインビボで完全に阻止された。この化学修飾の程度は、siRNA二重鎖における未変性な2'-OH位置の〜5％に相当する。免疫応答の完全な阻止には、RNA鎖の一方のみが選択的に修飾される必要があったので、2'OMe修飾を二重鎖のセンス鎖に限定し、その結果siRNAの効力を弱める潜在的可能性を最小限にすることができた。これらの知見は、証明されたRNAi活性を持つ未変性な配列に基づく免疫刺激性のないsiRNAの合成についての単純な理由付けを提供している。選択的に修飾されたsiRNAと核酸-脂質粒子などの効果的な全身送達媒体を組み合わせることによって、先天免疫応答の全身活性化と関連する有害な副作用を伴わずに、治療的に実行可能な用量で内在性遺伝子標的の強力なサイレンシングをインビボで達成することができる。
【０２６２】
リボース骨格における2'-OHはRNAの特徴となる特色であるので、この位置での広範囲にわたる化学的置換は、RNA結合受容体経路による修飾核酸の認識を混乱させると予期された。しかしながら、この検討は、明確なRNAの免疫刺激領域を含むリボヌクレオチドを含む、それらの未変性なリボヌクレオチドの95％までを保持するにもかかわらず、2'OMe修飾siRNAが免疫刺激性のないものになるということを思いもよらず示す。2'OMeは、そのA型らせん構造を著しくねじ曲げることなく、RNA二重鎖のマイナーグルーブの内部に存在する2'位置の比較的嵩高い化学基であるとみなされている（Chiu et al., RNA, 9：1034-1048（2003）：Cummins et al., Nucl. Acids Res., 23：2019-2024（1995））。これは、二本鎖RNA二重鎖とその推定上の免疫受容体またはアクセサリー分子の間の相互作用を混乱させるのに十分である可能性がある。それによって未修飾で免疫刺激性のあるssRNAにアニールした2'OMe修飾ssRNAが免疫刺激性のない二重鎖を生み出す、 2'-O-メチル化のトランスの阻害効果は、siRNAの二本鎖分子としての認識が関わるような仮説と一致する。
【０２６３】
免疫認識およびRNAiにも影響し得るヌクレアーゼ抵抗性を与えようと努力して、多くのその他の安定化化学反応が合成siRNA設計において日常的に用いられている。糖環に2'-O、4'-Cメチレン架橋を含むロック核酸（LNA）は、siRNAの免疫刺激活性を一部低下させることが示されている（Hornung et al., Nat. Med., 11：263-270（2005））。反転デオキシ脱塩基末端キャップを含むsiRNAは、免疫刺激活性を保持することが分かっている（Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23：1002-1007（2005））。トランスの阻害効果の証拠は、LNA修飾した二重鎖では観察されなかった。これらの観察は、siRNAによる免疫刺激が、その他の、よく特徴付けられた、安定化化学反応に対して、2'OMe修飾による阻害に特に敏感であるということを示す。
【０２６４】
この検討は、未修飾の合成siRNAおよび2'OMe修飾した合成siRNAの両方が、脂質粒子の中に封入され、かつ全身に投与された場合、内在性遺伝子標的ApoBの強力なサイレンシングを媒介することができるということを示す。封入された未修飾または修飾ApoB siRNAの静脈内投与は、肝臓におけるApoB mRNAレベルの有意な低下およびそれに付随する血中のApoBタンパク質の低下を結果的にもたらした。重要なことに、高コレステロール血症のための治療標的としてのApoBへの関心を所与として、ApoBサイレンシングは血清コレステロールの有意な低下を結果的にもたらした。脂質封入は、血清ヌクレアーゼによる分解に対する優れた抵抗性を与え、最小限に修飾したsiRNA二重鎖のインビボ使用を可能にする。インターフェロンおよび炎症性サイトカインの誘導を防ぐことにより、遺伝子発現に対する非特異的な効果の潜在的可能性が限定され、その一方でsiRNA製剤の許容性が改善されている。具体的に、封入された2'OMe修飾siRNAの静脈内投与は、効き目がありかつ十分に許容される。これらの知見は、幅広い範囲のインビボ適用および治療的適用における合成siRNAの使用を前進させる。
【０２６５】
方法
siRNA
これらの検討で用いられた全てのsiRNAはDharmacon（Lafayette, CO）によって化学合成され、および脱塩、脱保護されたポリヌクレオチドとして受け取られた。二重鎖を標準的な手順によってアニールした。等モル濃度の相補鎖を90℃まで2分間加熱し、その後37℃で60分間ゆっくりと冷却した。アニールした二重鎖の形成を非変性PAGE解析によって確認した。この検討で用いられた全ての未変性な配列および2'OMe修飾した配列を表1および2に列挙する。
【０２６６】
RNAの脂質封入
Jeffs et al., Pharm. Res., 22：362-372（2005）によってpDNAについて記載されたような自発的な小胞形成の過程、それに続く段階的なエタノール希釈によって、siRNAまたはssRNAをリポソームの中に封入した。リポソームは以下の脂質から構成された：モル比48：20：2：30の合成コレステロール（Sigma；St. Louis, MO）、リン脂質DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォコリン；Avanti Polar Lipids；Alabaster, AL）、PEG-脂質PEG-cDMA（3-N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）、およびカチオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン）。脂質PEG-cDMAおよびDLinDMA（Heyes et al., J. Control Release, 107：276-287（2005））は、Protiva Biotherapeuticsで合成された。結果として生じる安定化された脂質粒子をPBS中で透析し、および使用前に0.2μmフィルターを通して濾過滅菌した。各々のリポソーム調製物の粒子サイズは100〜130nmの範囲に及び、および典型的にはリポソーム内に封入されたsiRNAの90〜95％を含んだ。脂質二重層を混乱させるための界面活性剤の添加の前および後に、膜不透過性蛍光色素、RiboGreen（登録商標）（Molecular Probes；Eugene, OR）を用いて、製剤化されたsiRNAの濃度および封入パーセントを決定した（Jeffs et al., 前記）。
【０２６７】
血清ヌクレアーゼ保護アッセイ
未修飾で裸のまたは脂質で封入されたsiRNA（0.25mg/ml）を50％マウス血清中で37℃でインキュベートした。示された時間で、アリコートを採取して、0.1％ SDSを含むゲル充填緩衝剤に直接入れ、および液体窒素中で凍結した。最後の時点の後、siRNA試料を非変性20％ポリアクリルアミドTBEゲル上で走らせ、およびエチジウムブロマイド染色で可視化した。siRNAのヌクレアーゼ保護が脂質封入によって与えられたということを確認するために、血清とのインキュベーションの前に、0.1％ Triton-X100を添加して、脂質二重層の完全性を混乱させた。
【０２６８】
細胞単離および培養
標準的なFicoll-Hypaque密度遠心分離技術によって、健康ドナー由来の全血からヒトPBMCを単離した。免疫刺激アッセイのために、3×105の新たに単離したPBMCを3通りで96ウェルプレートに播種し、ならびに10％ FBS、2mMグルタミン、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン入りのRPMI1640培地中で培養した。リポソームで封入されたsiRNAを示された最終核酸濃度で細胞に添加し、ならびに培養上清を16〜20時間後に集め、ならびにサンドイッチELISAによってIFN-α、IL-6、およびTNF-αについてアッセイした。
【０２６９】
インビトロRNA干渉アッセイ
HepG2細胞を24ウェルプレート中に20,000細胞／ウェルで播種した。2'OMe修飾したApoB siRNAのインビトロRNAi活性を決定するために、HepG2培養を、0.6nMから45nMの間の核酸濃度で封入されたsiRNAで、3通りに、処置した。siRNAの添加の24時間後に培地を変え、その後さらに48時間インキュベートした。ポリクローナルヤギ抗ヒトApoB捕捉抗体（Chemicon International）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトApoB-100抗体（Academy Bio-medical）を用いて、Soutschek et al., Nature, 432：173（2004）で詳述されたような、サンドイッチELISAによって培養上清中でヒトApoBタンパク質レベルを決定し、結合したApoBを検出した。ELISAプレートをTMB基質を用いて見えるようにし、2N硫酸で停止し、および吸収を450nm〜570nmで読み取った。未処置のHepG2馴化培地から作成された標準曲線に対して、A450値を正規化し、ELISAの線形範囲を定義した。siRNA処置した培養上清中の平均の、残存ApoBタンパク質レベルをPBS処置した対照のパーセンテージとして計算した。
【０２７０】
インビボサイトカイン誘導
local Animal Care and Use Committee at Protiva Biotherapeuticsによる承認後、Canadian Council on Animal Care指針に従って、動物の検討を完了した。6〜8週齢のCD1 ICRマウス（Harlan；Indianapolis, IN）を、使用前に3週間の検疫および順応期間に供した。0.2ml PBS中で側部尾静脈における標準的な静脈内注射によって封入されたsiRNA製剤を投与した。投与6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカインアッセイ用の血漿として処理した。RNAi有効性実験において、最初のsiRNA投与の6時間後に、50μl試験出血から血漿を集めた。
【０２７１】
サイトカインELISA
製造元の取扱説明書に従ってサンドイッチELISAキットを用いて、全てのサイトカインを定量した。これらには、マウスおよびヒトIFN-α（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）、ヒトIL-6およびTNF-α（eBioscience；San Diego, CA）、ならびにマウスIL-6、TNF-α、およびIFN-γ（BD Biosciences；San Diego, CA）が含まれた。
【０２７２】
インビボRNA干渉
連続3日間、1日に1回、5匹のBalb/Cマウスの群を、側部尾静脈を経由した標準的な静脈内注射によって5mg/kgで脂質封入されたsiRNA（未変性な、2'OMe U(S)、2'OMeまたはGU(AS)ApoBおよび未変性なまたは2'OMe U(S)ミスマッチ）によって処置した。検討の期間中ずっと、体重および全般的な観察を記録した。最後のsiRNA処置の48時間後、マウスを屠殺した。ApoBタンパク質およびコレステロールの血清解析のために、血液を心穿刺によって集めた。肝臓の重さを測り、およびQuantiGeneアッセイ（Genospectra；Fremont, CA）によるApoB mRNA解析のために6ml RNALater（Sigma）の中に集めた。
【０２７３】
製造元の取扱説明書（Thermo electron社；Melbourne, Australia）に従って市販のコレステロール検出キットを用いて、血清コレステロールを測定した。モノクローナルマウスApoB-100捕捉抗体LF3（Zlot et al., J. Lipid Res., 40：76-84（1999））を用いたサンドイッチELISAによって、個々の動物由来の血清中でApoB-100を検出した。ポリクローナルウサギ抗マウスApoB（Biodesign International；Saco, Maine）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗ウサギIg（Jackson Immunoresearch；West Grove, PA）によって、結合したApoB-100を検出した。ELISAの線形範囲を定義するために、正常マウス血清で作成した標準曲線を用いて、A450値から血清ApoBレベルを決定し、およびPBS処置した対照群のパーセンテージとして表した。
【０２７４】
QuantiGeneアッセイ（Genospectra）を用いて、siRNA処置後の肝臓組織におけるマウスApoB mRNAの低下を定量した。最後の注射の48時間後に集め、およびRNAlater（Sigma）の中で保存していた肝臓から、小さい均一な組織試料を採取した。ApoBおよびGAPDH mRNA定量化のために、ライセートを直接用い、ならびにApoBおよびGAPDH mRNAの比を計算し、およびPBS対照群と比べた群平均として表した。mRNAの検出用に用いられた特定のプローブセットは、以下の領域を標的するよう、Genospectraによって設計された：ApoB mRNAについては、アクセッション番号XM_137955の位置5183-5811；GAPDH mRNAについては、アクセッション番号NM_008084の位置9-319。
【０２７５】
実施例2、選択的な化学修飾のあるApoB siRNAの設計
この実施例は、ApoB siRNA二重鎖のセンスおよびアンチセンス鎖における選択的位置での最小限の2'OMe修飾が、RNAi活性を保持しながら、ApoB siRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分であるということを例証する。特に、両方の鎖における約30％未満のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシン修飾が、サイレンシングおよび非免疫刺激特性の望ましい組み合わせをApoB siRNAに提供する。
【０２７６】
結果
メスのBALB/cマウスモデルを用いて、センスおよびアンチセンス鎖に選択的な化学修飾のあるApoB siRNAを含むSNALP製剤の有効性および毒性プロファイルを決定した。この検討で用いられたApoB siRNA二重鎖を表3に提供する。
【０２７７】
（表3）センスおよびアンチセンスApoB RNAポリヌクレオチドを含むsiRNA二重鎖
2009513151.tif 000011
列1：数は、マウスApoB mRNA配列XM_137955に対するセンス鎖の5'塩基のヌクレオチド位置を指す。列2：数は、各々の鎖における2'OMe化学修飾の分布を指す。例えば、「U2/4」は、センス鎖における2つのウリジンの2'OMe修飾およびアンチセンス鎖における4つのウリジンの2'OMe修飾を示す。列3：2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す。列4：siRNA二重鎖における2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。列5：siRNA二重鎖の二本鎖（DS）領域における修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。
【０２７８】
ApoB 10048 siRNAファミリーの配列について、siRNA二重鎖における16.7％または23.8％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、未修飾siRNAと同様のサイレンシング活性を産生した（図11、レーン2〜6）。同様の結果が、19％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾があるApoB 10048 siRNA配列について得られた。しかしながら、siRNA二重鎖における35.7％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、活性の低下を結果的にもたらした（図11、レーン7〜8）。ApoB 10886 siRNA配列について、siRNA二重鎖における16.7％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、未修飾siRNAと比較した場合の活性の増大をもたらした（図11、レーン9〜10）。ApoB 10346 siRNA配列について、siRNA二重鎖における16.7％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、未修飾siRNAと比較した場合の活性の減少をもたらした（図11、レーン11〜12）。
【０２７９】
2'OMe置換を用いたsiRNAの化学修飾は、サイトカイン応答を阻止することによってインビボsiRNA処置の毒性プロファイルを改善した。図12で示されたように、このパネル中の試験された修飾ApoB siRNAのどれ1つとしてインターフェロン-αの放出を刺激しなかったのに対し、3つの未修飾siRNA対応物のいずれかでの処置は、6時間でかなりの濃度の血漿中のインターフェロン-αを結果的にもたらした。
【０２８０】
考察
この実施例は、センスおよびアンチセンス鎖内の選択的位置での最小限の2'OMe修飾を含むSNALPで製剤化したApoB標的siRNAが、IV処置後7日という延長された時点で、PBS対照と比べて77％の血漿ApoBタンパク質レベルまで抑制することができるということを示す。実際、siRNA二重鎖の両方の鎖の約30％未満（例えば、16.7％、19％、または23.8％）のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシン修飾が、未修飾siRNA配列と同様のサイレンシング活性を典型的に産生した。さらに、そのような2'OMe修飾は、ApoB siRNAの免疫刺激特性を減少させることによって、インビボ処置の毒性プロファイルを改善させた。
【０２８１】
方法
siRNA
2つの脱保護および脱塩されたRNAポリヌクレオチドをアニールさせることによってsiRNA二重鎖を調製した。各々のポリヌクレオチドを長さが21塩基となるように設計し、および各々の二重鎖を、二本鎖領域の各々の側に3'突出部を持つ19塩基の二本鎖領域を含むように設計した。全ての二重鎖をマウスおよびヒトApoBに対して交差反応するように設計した。ApoB 10048 siRNAセンス鎖は、ヒトApoB mRNA配列NM_000384のヌクレオチド10164-10184に対応する。ApoB 10886 siRNAセンス鎖は、ヒトApoB mRNA配列NM_000384のヌクレオチド11002-11022に対応する。ApoB 10346 siRNAセンス鎖は、ヒトApoB mRNA配列NM_000384のヌクレオチド10462-10482に対応する。
【０２８２】
RNAの脂質封入
0.04の標的核酸 対 脂質比で直接希釈処理を用いて、「2：40：10」DSPC：コレステロール：PEG-C-DMA：DLinDMA（モル比10：48：2：40）SNALP製剤を調製した。
【０２８３】
インビボ処置計画
BALB/cマウス（メス、4週齢）をHarlan Labから入手した。少なくとも7日間の順応期間の後、検討0、1、および2日目に、1日に1回、側部尾静脈における静脈内（IV）注射によって、表4に示されたSNALP製剤を動物に投与した（動物当たり全部で3用量）。投薬は、kg体重当たり2mgのsiRNAで、10ml/kgに相当した（最も近い10μlまで四捨五入した）。陰性対照として、ある群の動物にPBS媒体のIV注射を与えた。体重ならびに動物行動および／または外観のケージ側面からの観察を検討0〜3、9、および16日目に記録した。尾の切り込みを施し、血漿用として処理する少量（50μl）の全血を集めた。検討16日目に、致死用量のケタミン／キシラジンで動物を麻酔し、および頚椎脱臼の前に心穿刺によって血液を集めた。血液をラベンダー色のEDTAマイクロテイナーの中に集め、および血漿用として処理した。
【０２８４】
（表4）この検討で用いられたインビボ処置計画およびSNALP製剤
2009513151.tif 000012
【０２８５】
解析方法
本質的にZlot et al., J. Lipid Res., 40：76-84（1999）に記載されたようなELISA法を用いて、血漿中のApoBタンパク質レベルを測定した。製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて、血漿中のインターフェロン-αレベルを測定した。
【０２８６】
実施例3、選択的な化学修飾のあるEg5 siRNAの設計
この実施例は、Eg5 siRNA二重鎖のセンスおよびアンチセンス鎖における選択的位置での最小限の2'OMe修飾が、RNAi活性を保持しながら、Eg5 siRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分であるということを例証する。特に、1つまたは両方の鎖における約20％未満のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシン修飾が、サイレンシングおよび非免疫刺激特性の望ましい組み合わせをEg5 siRNAに提供する。
【０２８７】
結果
Eg5 siRNAに対する選択的修飾は抗増殖活性を保持する。2'OMe修飾したEg5 siRNA分子のパネルを調製し、ならびにそれらのRNAi活性をヒトHeLa細胞およびマウスNeuro2A細胞において評価した。この検討で用いられたEg5 siRNA二重鎖を表5に提供する。修飾は、siRNA二重鎖が約20％未満の2'OMe 修飾ヌクレオチドを含む、Eg5 2263 siRNA配列のセンスおよび／またはアンチセンス鎖における選択された位置に2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシンを導入する工程を伴った。抗増殖活性は、細胞生存率バイオアッセイで評価した。特に、Eg5 2263 siRNAを含むSNALP製剤による処置の48時間後に、細胞培養の細胞生存率を測定し、および平均蛍光単位として表した。図13は、Eg5 2263 siRNA二重鎖に対する選択的な化学修飾が、ヒトHeLa細胞におけるRNAi活性を保持したということを示す。同様に、図14は、Eg5 2263 siRNA二重鎖に対する選択的な化学修飾が、マウスNeuro2A細胞におけるRNAi活性を保持したということを示す。
【０２８８】
（表5）センスおよびアンチセンスEg5 RNAポリヌクレオチドを含むsiRNA二重鎖
2009513151.tif 000013
列1：「0/0」＝未修飾siRNA二重鎖；「U/0」＝2'OMe-ウリジン修飾したセンス鎖（SS）；「G/0」＝2'OMe-グアノシン修飾したSS；「0/U」＝2'OMe-ウリジン修飾したアンチセンス鎖（AS）；「0/G」＝2'OMe-グアノシン修飾したAS；「U/U」＝2'OMe-ウリジン修飾したsiRNA二重鎖；「U/G」＝2'OMe-ウリジン修飾したSSおよび2'OMe-グアノシン修飾したAS；「G/G」＝2'OMe-グアノシン修飾したsiRNA二重鎖；ならびに「G/U」＝2'OMe-グアノシン修飾したSSおよび2'OMe-ウリジン修飾したAS。列2：2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す；「dT」＝デオキシチミジン。列3：siRNA二重鎖における2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。列4：siRNA二重鎖の二本鎖（DS）領域における修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。
【０２８９】
Eg5 siRNAに対する選択的修飾はインビボサイトカイン誘導を阻止する
未修飾のEg5 2263 siRNA（すなわち、0/0）ならびにある種の2'OMe修飾したその変異体（すなわち、U/0、G/0、U/U、およびG/G）を、2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロールを有するSNALPの中に封入した。これらのSNALPで製剤化されたEg5標的化siRNAをインビボで試験し、免疫応答の誘導、例えば、サイトカイン誘導について調べた。BALB/cマウス（処置群当たりn=3）に、Eg5 2263 siRNA を含む40μgのSNALP製剤を注射した。処置後6時間で試料を集め、およびELISAアッセイでインターフェロン-αレベルについて試験した。図15は、Eg5 2263 siRNAに対する選択的2'OMe修飾が、未変性な（すなわち、未修飾の）二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止したということを示す。
【０２９０】
Eg5 siRNAに対する選択的修飾は送達媒体に対する抗体応答を阻止する
未修飾のEg5 2263 siRNA（すなわち、0/0）ならびにある種の2'OMe修飾したその変異体（すなわち、U/0およびU/U）を、2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロールを有するSNALPの中に封入した。これらのSNALPで製剤化されたEg5標的化siRNAをマウスにおいてインビボで試験し、PEGなどの送達媒体の成分に対する免疫応答の誘導について調べた。特に、Eg5 2263 siRNA を含むSNALP製剤を1日に3×2mg/kgでマウス（n=4）に処置し、および10日目に抗-PEG IgMおよびIgG抗体の血清レベルをアッセイした。図16は、Eg5 2263 siRNA二本鎖（すなわちU/U）の両方の鎖に対する選択的な2'OMe修飾が、未変性な（すなわち、未修飾の）二重鎖の全身投与と関連するSNALP送達媒体のPEG成分に対する抗体応答を完全に阻止するのに必要とされたということを示す。
【０２９１】
方法
siRNA
これらの検討で用いた全てのsiRNAは、Protiva Biotherapeutics（Burnaby, BC）、University of Calgary（Calgary, AB）、またはDharmacon社（Lafayette, CO）によって化学合成された。標準的な手順を用いて、siRNAを脱塩およびアニールした。Eg5 2263 siRNAセンス鎖は、ヒトEg5 mRNA配列NM_004523のヌクレオチド2263-2281に対応する。
【０２９２】
siRNAの脂質封入
そうでないように示されない限り、siRNAは以下の脂質から構成されるリポソーム中に封入された；モル比48：1：2：40の合成コレステロール（Sigma；St. Louis, MO）、リン脂質DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォコリン；Avanti Polar Lipids；Alabaster, AL）、PEG-脂質PEG-cDMA（3-N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）、およびカチオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン）。言い換えると、そうでないように示されない限り、siRNAは以下のSNALP製剤のリポソーム中に封入された；2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロール。媒体対照用として、同一の脂質組成を持つ空のリポソームをsiRNAの非存在下で形成させた。
【０２９３】
インビボサイトカイン誘導
local Animal Care and Use Committee at Protiva Biotherapeuticsによる承認後、Canadian Council on Animal Care指針に従って、動物の検討を完了した。6〜8週齢のCD1 ICRマウス（Harlan；Indianapolis, IN）を、使用前に3週間の検疫および順応期間に供した。0.2ml PBS中での側部尾静脈における標準的な静脈内注射によって、封入されたsiRNA製剤を投与した。投与6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカインアッセイ用の血漿として処理した。RNAi有効性実験において、最初のsiRNA投与の6時間後に、50μl試験出血から血漿を集めた。製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて、血漿中のインターフェロン-αレベルを測定した。
【０２９４】
細胞生存率アッセイ
代謝活性のある細胞によって蛍光産物レゾルフィンに還元されるレサズリン色素である、市販の試薬CellTiter-Blue（商標）（Promega社；Madison, WI）を用いて、インビトロ細胞培養の細胞生存率を検討評価した。標準的な組織培養技術を用いて、様々な癌細胞株をインビトロで培養した。siRNA製剤または低分子薬物による処置後48〜72時間で、CellTiter-Blue（商標）を培養に添加し、細胞生存率の尺度である、細胞の代謝活性を定量した。
【０２９５】
抗体アッセイ
PEG-脂質およびSNALPのその他の脂質成分に対するIgMおよびIgG抗体を検出するために、ELISAを開発した。簡潔に述べると、10μgのPEG-cDSAを20μlの100％エタノール中でPVDF膜（Millipore社；Bedford, MA）を含む96ウェルプレートに添加した。10％ FBSを含むPBSで1時間ブロッキングする前に、PEG-cDSAでコーティングされた膜を2時間完全に風乾させた。その後、100μlの連続的に希釈したブロッキング緩衝剤中の血清試料を2通りのウェルに1時間適用し、および1％ FBSを含むPBSで4回洗浄した。HRPがコンジュゲートされたヤギ抗IgM FcμまたはIgG Fcγで、プレートに結合した抗体を検出した。結合した酵素をTMB基質で見えるようにし、2N硫酸で停止し、その後分光光度計において450nm〜570nmで読み取った。
【０２９６】
実施例4、選択的な化学修飾のある抗インフルエンザsiRNAの設計
この実施例は、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（NP）siRNA二重鎖のセンス鎖における選択的位置での最小限の2'OMe修飾が、RNAi活性を保持しながら、NP siRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分であるということを例証する。特に、センス鎖における約20％未満のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジン修飾が、サイレンシングおよび非免疫刺激特性の望ましい組み合わせをNP siRNAに提供する。
【０２９７】
結果
NP siRNAに対する選択的修飾はウイルスのノックダウン活性を保持する
2'OMe修飾したNP siRNA分子のパネルを調製し、ならびにそれらのRNAi活性をMadin-Darby Canine Kidney（MDCK）細胞において評価した。この検討で用いられたNP siRNA二重鎖を表6に提供する。修飾は、siRNA二重鎖が約20％未満の2'OMe 修飾ヌクレオチドを含む、NP siRNA配列のセンス鎖における選択された位置に2'OMe-ウリジンを導入する工程を伴った。NP siRNA分子をリポプレックスとして製剤化し、および感染後約48時間でインフルエンザウイルスによって産生される細胞変性効果（CPE）を有意に低下させるそれらの能力について試験した。NP siRNA分子を、ウイルスのみの対照と比べた産生されたHAの量（すなわち、HA単位／ウェル）および産生されたHAのパーセンテージ（すなわち、ノックダウンパーセント）についても試験した。
【０２９８】
（表6）センスおよびアンチセンスNP RNAポリヌクレオチドを含むsiRNA二重鎖
2009513151.tif 000014
列1：数は、インフルエンザAウイルスNP ssRNA配列NC_004522に対するセンス鎖の5'塩基のヌクレオチド位置を指す。列2：数は、各々の鎖における2'OMe化学修飾の分布を指す。例えば、「U5/0」は、センス鎖における5つのウリジンの2'OMe修飾およびアンチセンス鎖におけるウリジンの2'OMe修飾なしを示す。列3：2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す；「dT」＝デオキシチミジン。列4：siRNA二重鎖における2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。列5：siRNA二重鎖の二本鎖（DS）領域における修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。
【０２９９】
図17および18は、NP siRNA二重鎖のセンス鎖に対する選択的な2'OMe修飾が、未修飾対応物の配列または対照配列と比較した場合に、インフルエンザノックダウン活性に負に影響を及ぼさなかったということを示す。図19は、2'OMe修飾したNP siRNA分子の様々な組み合わせが、対照と比べたMDCK細胞におけるインフルエンザウイルスのノックダウンの増強を提供したということを示す。
【０３００】
NP siRNAに対する選択的な修飾はインビトロおよびインビボサイトカイン誘導を阻止する
未修飾のNP 1496 siRNA（すなわち、0/0）および2'OMe修飾したその変異体（すなわち、U8/0）を、2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロールを有するSNALPの中に封入するか、またはポリプレックスを形成するためにポリエチレンイミン（PEI）と複合体を形成させるかのいずれかにした。SNALPで製剤化されたNP標的化siRNAをインビボで試験し、免疫応答の誘導、例えば、サイトカイン誘導について調べた。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）に、NP 1496 siRNAを含む40μgのSNALP製剤をトランスフェクトし、および16時間でサイトカイン解析用に上清を集めた。ポリプレックス製剤をインビボで試験し、免疫応答の誘導、例えば、サイトカイン誘導について調べた。マウスにポリプレックスを120μg siRNA/マウスで静脈内注射し、ならびに血漿試料を処置後6時間で集め、およびELISAアッセイによってインターフェロン-αレベルについて試験した。図20は、NP 1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が、インビトロ細胞培養系でインターフェロン誘導を阻止したということを示す。図21は、NP 1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が、未変性な（すなわち、未修飾の）二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止したということを示す。
【０３０１】
方法
siRNA
これらの検討で用いた全てのsiRNAは、Protiva Biotherapeutics（Burnaby, BC）、University of Calgary（Calgary, AB）、またはDharmacon社（Lafayette, CO）によって化学合成された。標準的な手順を用いて、siRNAを脱塩およびアニールした。
【０３０２】
siRNAの脂質封入
そうでないように示されない限り、siRNAは以下の脂質から構成されるリポソーム中に封入された；モル比48：10：2：40の合成コレステロール（Sigma；St. Louis, MO）、リン脂質DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォコリン；Avanti Polar Lipids；Alabaster, AL）、PEG-脂質PEG-cDMA（3-N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）、およびカチオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン）。言い換えると、そうでないように示されない限り、siRNAは以下のSNALP製剤のリポソーム中に封入された；2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロール。
【０３０３】
リポプレックス処置およびインビトロインフルエンザ感染
インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザA/PR/8/34 H1N1）は、トリプシンの存在下で感染時にMDCK細胞において細胞変性効果を産生する。以下のプロトコルに従って、MDCK細胞のリポプレックス処置およびインビトロインフルエンザ感染を行なった：
1、播種24時間後に細胞が約50％の密度になるように、MDCK細胞を約8000細胞／ウェル（約4×104細胞／ml）で96ウェルプレートに播種した。
2、約24時間後、培地を新しい完全培地（抗生物質なし）に変え、およびLipofectamine（商標）2000（LF2000）（Invitrogen社；Camarillo, CA）の中に核酸（例えば、NP siRNA）を含むリポプレックスを1：4の核酸：LF2000の比で細胞にトランスフェクトした。
3、約4時間後、複合体を除去し、細胞をPBSで洗浄し、および約50μl希釈ウイルス／ウェルを添加して、ウイルス感染培地（DMEM、0.3％ BSA、10mM HEPES）の中で様々な希釈のインフルエンザウイルスを細胞に感染させた。
4、ウイルスを37℃で1〜2時間、細胞上でインキュベートし、その後ウイルスを除去しおよび約200μlのウイルス増殖培地（DMEM、0.3％ BSA、10mM HEPES、0.25μg/mlトリプシン）を添加した。
5、約48時間での細胞変性効果について、細胞をモニターした。
6、インフルエンザHA酵素免疫アッセイ（EIA）を上清で行なった。
【０３０４】
ポリプレックス処置およびインビボサイトカイン誘導
local Animal Care and Use Committee at Protiva Biotherapeuticsによる承認後、Canadian Council on Animal Care指針に従って、動物の検討を完了した。6〜8週齢のCD1 ICRマウス（Harlan；Indianapolis, IN）を、使用前に3週間の検疫および順応期間に供した。製造元の取扱説明書に従って、室温で20分間、5というN/P比で、siRNAをIn vivo jetPEI（商標）（Qbiogene社；Carlsbad, CA）と混合した。0.2ml PBS中での側部尾静脈における標準的な静脈内注射によって、120μg siRNA/マウスに相当する、In vivo jetPEI（商標）をマウスに投与した。投与6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカインアッセイ用の血漿として処理した。製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて、血漿中のインターフェロン-αレベルを測定した。PEIポリプレックス形成についてのさらなる方法は、Judge et al., Nat. Biotechnol., 23：457-462（2005）に提供されている。
【０３０５】
インビトロサイトカイン誘導
PBMCに40μgのSNALPで製剤化されたsiRNAをトランスフェクトし、および製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて16時間後に、インターフェロン-αレベルを細胞培養上清中でアッセイした。
【０３０６】
上の説明は例証的であり、かつ制限的でないよう意図されるということが理解されるべきである。上の説明を読むと同時に、多くの態様が当業者には明白であると考えられる。したがって、本発明の範囲は、上の説明に関して決定されるべきではなく、その代わりに、そのような特許請求項の範囲に与えられる全範囲の同等物と共に、付随する特許請求項の範囲に関して決定されるべきである。特許出願、特許、PCT刊行物、およびGenbankアクセッション番号を含む全ての記事および参照の開示は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】2'OMe修飾がヒトPBMCにおける免疫刺激性のあるssRNAを介するインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。封入されたリポソーム、（A）β-galおよび（B）ApoB siRNAのセンス（S）またはアンチセンス（AS）鎖を表す未修飾の（未変性な）ssRNA、および2'OMe U-、G-、またはGU-修飾したssRNAを増大する濃度（5〜135nM）でPBMCと共に培養した。配列を表1に示す。24時間での培養上清中でIFN-αをアッセイした。値は3通りの培養の平均＋SDである。
【図２】ポリエチレンイミン（PEI）との複合体を形成したssRNAおよびsiRNAによる免疫刺激が2'OMe修飾によって阻止されることを示すデータを例証する。PEIで複合体を形成した（A）未変性なβ-galセンス（S）、アンチセンス（AS）、および2'OMe修飾センスssRNA、ならびに（B）未変性な、2'OMe GU(S)修飾した、およびAC(AS)修飾したβ-gal対照siRNA二重鎖で処置したヒトPBMC培養由来のインターフェロン-α応答。RNAを225nMの最終濃度で添加し、および16時間後に培養上清中でIFN-αをアッセイした。RNA配列を表1に示す。
【図３】siRNA二重鎖に対する選択的な2'OMe修飾がヒトPBMCにおけるサイトカイン誘導を阻止することを示すデータを例証する。増大する濃度（25〜675nM）の封入された（A）β-galまたは（B、C）ApoBもしくはApoBミスマッチsiRNAと共に培養したヒトPBMC由来の（A、B）IFN-αおよび（C）TNF-α誘導。未修飾の（未変性な）siRNAに対するサイトカイン応答を、示されたようなセンス（S）またはアンチセンス（AS）鎖のいずれかに2'OMe U、G、C、またはA残基を含む二重鎖と比較した（siRNA配列については表1参照）。24時間の培養後に、分泌されたサイトカインをアッセイした。値は3通りの培養の平均＋SDである。
【図４】siRNA二重鎖に対する選択的な2'OMe修飾がインビボでサイトカイン誘導を阻止することを示すデータを例証する。封入された（A、B）β-gal、（C、D）ApoB、（E）ApoBミスマッチ、または（F）vFLIP siRNAの静脈内投与後6時間の（A、C、E、F）血清IFN-αならびに（B、D）TNF-αおよびIL-6レベル。未修飾の（未変性な）siRNAに対する応答を、示されたようなセンス（S）またはアンチセンス（AS）鎖のいずれかに2'OMe U、G、またはC残基を含む二重鎖と比較した（siRNA配列については表1参照）。全てのマウスは40μgの封入されたsiRNAを受けた。値は3〜4匹の動物からの平均＋SDである。より低いレベルの定量は、IFN-αについて75pg/mL、TNF-αについて30pg/mL、およびIL-6について60pg/mLである。
【図５】インビボでのsiRNAに対するサイトカイン応答がsiRNAセンス鎖への2'OMe-ウリジンの選択的取り込みによって阻止されることを示すデータを例証する。（A）インフルエンザ核タンパク質（NP1496）およびポリメラーゼ（PA2087）または（B）シクロフィリンB（CypB）を標的するsiRNAを含むSNALPの静脈内投与6時間後に、マウスにおける血清インターフェロン-αレベルを決定した。未変性な、未修飾siRNAに対する応答を2'OMe U(S)修飾した二重鎖と比較した。配列を表2に提供する。
【図６】完全なRNAi活性を保持する非炎症性β-gal siRNAの作製を示すデータを例証する。2'OMe-ウリジン（U）、グアノシン（G）、シチジン（C）、またはアデノシン（A）のいずれかのsiRNA二重鎖のセンス鎖（S）への取り込みによって、免疫刺激性のあるβ-gal 728 siRNAを化学合成した。（A）SNALPに封入された20μg siRNAの投与後6時間のマウスにおけるインターフェロン-α誘導。（B）同じβ-gal 728 SNALP製剤のインビトロRNA干渉活性。大腸菌LacZ遺伝子を安定にトランスフェクトしたNeuro2A細胞でRNAiアッセイを行なった。SNALPへの曝露の48時間後にβ-gal活性を検討評価し、および平均値をPBS処置した細胞と比べて表した。これらの検討で用いられたSNALPは、モル比48：10：40：2でコレステロール：DSPC：DLinDMA：PEG-C-DMAという脂質を含み、および直径80〜90nmの範囲に及ぶ粒子サイズを有した。RNA配列を表2に提供する。
【図７】完全なRNAi活性を保持する非炎症性ルシフェラーゼ（Luc）siRNAの作製を示すデータを例証する。2'OMe-ウリジン（U）のsiRNA二重鎖のセンス鎖（S）への取り込みによって、免疫刺激性のあるルシフェラーゼ（Luc）siRNAを化学合成した。（A）SNALPに封入された20μg siRNAの投与後6時間のマウスにおけるインターフェロン-α誘導。B）Luc SNALP製剤のインビトロRNA干渉活性。ホタルルシフェラーゼを安定にトランスフェクトしたNeuro2A細胞でRNAiアッセイを行なった。SNALPへの曝露の48時間後にルシフェラーゼ活性を検討評価し、および平均値をPBS処置した細胞に対して表した。これらの検討で用いたSNALPは、モル比48：10：40：2でコレステロール：DSPC：DLinDMA：PEG-C-DMAという脂質を含み、および直径75〜85nmの範囲に及ぶ粒子サイズを有した。RNA配列を表2に提供する。
【図８】2'OMe修飾siRNAによるApoB発現のインビトロサイレンシングを示すデータを例証する。示された濃度（0〜45nM）で封入されたApoBまたはミスマッチsiRNAによってHepG2細胞を処置した。未修飾の（未変性な）ApoB siRNAを、示されたようなセンス（S）鎖に2'OMe U、G、もしくはC残基、またはアンチセンス（AS）鎖にGUモチーフ、U、もしくはG残基を含むApoB二重鎖と比較した（修飾siRNA配列については表1参照）。未修飾および2'OMe U(S)ApoBミスマッチsiRNAは対照二重鎖としての役割を果たした。48時間後に培養上清中のApoBタンパク質をELISAで測定した。ApoBレベルをPBS処置した対照培養の％として表す。各々の値は2通りの培養の平均に由来し、および3回の別々の実験の代表的なものである。
【図９】脂質粒子中へのsiRNAの封入によって血清ヌクレアーゼ分解から保護されることを示すデータを例証する。未修飾で裸の（上）またはSNALPで封入された（真ん中）ApoB siRNAを50％マウス血清中で37℃でインキュベートした。示された時点で非変性PAGE解析により二重鎖の完全性を検討評価した。脂質粒子の完全性を混乱させるためのTriton-Xの添加（下）により、siRNAのヌクレアーゼ感受性が回復した。
【図１０】先天免疫応答の活性化を伴わないインビボでのApoB発現のサイレンシングを示すデータを例証する。（A）〜（E）マウスにおける封入されたApoBまたはミスマッチsiRNAの静脈内投与後のインビボ効果。1日当たり5mg/kgで、封入された未修飾、2'OMe U(S)、またはGU(AS)修飾ApoB、および未修飾または2'OMe U(S)修飾ミスマッチsiRNAで、0、1、2日目にマウスを処置した。（A）4日の検討期間にわたるApoB（黒塗りの記号）およびミスマッチ（白抜きの記号）siRNAで処置したマウスの体重（0日目の重さの％）の日々の変化。（B）最初の処置の6時間後の試験出血由来の血清IFN-α。ND＝検出されず；より低いレベルの定量＝75pg/ml。（C）肝臓におけるApoB mRNAレベル。（D）血清中のApoBタンパク質。（E）最後のsiRNA処置の2日後の血清コレステロール（mM）。PBS処置した動物と比較したApoB mRNAまたはApoBタンパク質の％としてApoBレベルを表す。全ての値は、5匹の動物の平均＋SDである。全てのデータは、2回の別々の実験の代表的なものである。
【図１１】様々な未修飾および化学修飾ApoB siRNAのサイレンシング活性を示すデータを例証する。3連続日の間の2mg/kgという日々のsiRNA投薬量でのIV処置の終了の7日後に、SNALPで製剤化されたsiRNAのサイレンシング効力を測定した。PBS処置した対照と比較した血漿ApoB-100タンパク質レベルの低下という点でApoBサイレンシング活性を測定した。各々の棒は群平均（n＝5）±標準偏差（SD）を表す。
【図１２】様々な未修飾および化学修飾ApoB siRNAの免疫刺激特性を示すデータを例証する。サイトカイン放出によって特徴付けられるような、各々のsiRNAの免疫刺激特性を、SNALPで製剤化されたsiRNAの最初のIV投薬の6日後に測定した。ELISAを用いて、サイトカインであるインターフェロン-αの血漿濃度を測定した。重大な応答（200pg/mLを超える値）を引き起こす処置については、血漿試料を10倍希釈し、および図中の棒が群平均（n＝5）±標準偏差（SD）を表すように各々の動物を別々に解析した。非常にわずかな応答（200pg/mLを下回る値）を引き起こす処置については、試料をプールし、および4倍希釈でアッセイした。
【図１３】Eg5 2263 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾がヒトHeLa細胞におけるRNAi活性を保持することを示すデータを例証する。
【図１４】Eg5 2263 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾がマウスNeuro2A細胞におけるRNAi活性を保持することを示すデータを例証する。
【図１５】Eg5 2263 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が未変性な二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。
【図１６】Eg5 2263 siRNAの両方の鎖に対する選択的な2OMe修飾がSNALP送達媒体のPEG成分に対する抗体応答を完全に阻止するために必要とされることを示すデータを例証する。
【図１７】センス鎖に対する選択的な2'OMe修飾を含むNP411、NP929、NP1116、およびNP1496 siRNAが、MDCK細胞におけるインビトロでのインフルエンザノックダウン活性を維持することを示すデータを例証する。図17Aは、修飾または未修飾siRNAによる5時間の前処置後48時間でのMDCK細胞のインフルエンザウイルス感染を示す。図17Bは、1：800希釈のインフルエンザウイルスを感染させかつ2μg/mlの修飾または未修飾siRNAをトランスフェクトしたMDCK細胞における48時間でのウイルスのみの対照と比べたHAのパーセンテージを示す。
【図１８】NP1496 siRNAのセンス鎖に対する選択的な2'OMe修飾が、未修飾の対応物配列または対照配列と比較した場合、インフルエンザノックダウン活性に負に影響を及ぼさないことを示すデータを例証する。
【図１９】2'OMe修飾siRNAの組み合わせが、MDCK細胞におけるインビトロでの増強されたインフルエンザノックダウン活性を提供することを示すデータを例示する。図19Aは、様々な組み合わせの修飾siRNAによる5時間の前処置後48時間でのMDCK細胞のインフルエンザウイルス感染を示す。図17Bは、1：800希釈のインフルエンザウイルスを感染させかつ2μg/mlの修飾siRNAをトランスフェクトしたMDCK細胞における48時間でのウイルスのみの対照と比べたHAのパーセンテージを示す。
【図２０】NP1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾がインビトロ細胞培養系におけるインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。
【図２１】NP1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（PEI）との複合体を形成した未変性な二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。
【図１】
2009513151.tif 000016
【図２】
2009513151.tif 000017
【図３Ａ】
2009513151.tif 000018
【図３Ｂ】
2009513151.tif 000019
【図３Ｃ】
2009513151.tif 000020
【図４Ａ】
2009513151.tif 000021
【図４Ｂ】
2009513151.tif 000022
【図４Ｃ】
2009513151.tif 000023
【図４Ｄ】
2009513151.tif 000024
【図４Ｅ】
2009513151.tif 000025
【図４Ｆ】
2009513151.tif 000026
【図５】
2009513151.tif 000027
【図６】
2009513151.tif 000028
【図７】
2009513151.tif 000029
【図８】
2009513151.tif 000030
【図９】
2009513151.tif 000031
【図１０Ａ】
2009513151.tif 000032
【図１０Ｂ】
2009513151.tif 000033
【図１０Ｃ】
2009513151.tif 000034
【図１０Ｄ】
2009513151.tif 000035
【図１０Ｅ】
2009513151.tif 000036
【図１１】
2009513151.tif 000037
【図１２】
2009513151.tif 000038
【図１３】
2009513151.tif 000039
【図１４】
2009513151.tif 000040
【図１５】
2009513151.tif 000041
【図１６】
2009513151.tif 000042
【図１７】
2009513151.tif 000043
【図１８】
2009513151.tif 000044
【図１９】
2009513151.tif 000045
【図２０】
2009513151.tif 000046
【図２１】
2009513151.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月21日(2008.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年11月2日に申請された、米国特許仮出願第60/732,964号、および2006年6月30日に申請された、米国特許仮出願第60/817,933号に対する優先権を主張し、その開示はあらゆる目的のために完全な形で参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
RNA干渉（RNAi）は、相補的な標的一本鎖mRNAの分解および対応する翻訳配列の「サイレンシング」を誘導する二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発される進化的に保存された、配列特異的な機構である（McManus et al., Nature Rev. Genet., 3: 737（2002）（非特許文献1））。RNAiは、長さ約21〜23ヌクレオチドの生物学的活性がある「短い干渉RNA」（siRNA）配列へのより長いdsRNA鎖の酵素的切断によって機能する（Elbashir et al., Genes Dev., 15: 188（2001）（非特許文献2））。siRNAを用いて、関心対象の遺伝子産物、すなわち、標的配列の転写および翻訳を下方調節または抑制することができる。
【０００３】
侵入する病原体に対する自然防御機構の一部として、哺乳動物の免疫系は多くの外来性RNA（Alexopoulou et al., Nature, 413: 732-738（2001）（非特許文献3）; Heil et al., Science, 303: 1526-1529（2004）（非特許文献4）; Diebold et al., Science, 303: 1529-1531（2004）（非特許文献5））およびDNA種（Krieg, Ann. Rev. Immunol., 20: 709-760（2002）（非特許文献6））によって活性化され、インターフェロンおよび炎症性サイトカインの放出を結果的にもたらす。この応答を活性化する結果は、毒性のあるショック様症候群を潜在的に引き起こす局所および全身の炎症反応を伴って、重篤であることができる。これらの免疫毒性は、ヒトを含む、より感受性の強い種において特に、非常にわずかな用量の免疫刺激薬剤で誘発することができる（Michie et al., N. Engl. J. Med., 318: 1481-1486（1988）（非特許文献7）; Krown et al., Semin. Oncol., 13: 207-217（1986）（非特許文献8））。細胞内送達を容易にする媒体と共に投与された場合、合成siRNAは先天免疫応答の強力なアクチベーターであることができるということが最近示された（Judge et al., Nat. Biotechnol., 23: 457-462（2005）（非特許文献9）; Hornung et al., Nat. Med., 11: 263-270（2005）（非特許文献10）; Sioud, J. Mol. Biol., 348: 1079-1090（2005）（非特許文献11））。依然としてきちんと明確にされていないが、siRNAの免疫認識は配列依存的であり、およびToll様受容体-7（TLR7）経路を介して先天免疫細胞を活性化し、インターフェロン-α（IFN-α）および炎症性サイトカインの強力な誘導を引き起こす可能性が高い。インビボでのsiRNAの投与と関連する毒性は、そのような応答が原因であるとされている（Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23: 1002-1007（2005）（非特許文献12）; Judge et al., 前記（非特許文献9））。
【０００４】
急速なヌクレアーゼ分解に対する合成siRNAの安定化は通常、インビボ適用および治療的適用のための必要条件とみなされている。リボザイムおよびアンチセンス分子などの、その他の核酸薬物のために以前に開発された様々な安定化化学反応を用いて、これを達成することができる（Manoharan, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 570-579（2004）（非特許文献13））。これらは、RNA合成の間に2'-修飾ヌクレオチドとしてsiRNAに容易に導入することができる2'-O-メチル（2'OMe）および2'-フルオロ（2'F）置換などの、リボース糖骨格における未変性な2'-OH基への化学修飾を含む。多くの報告により、機能的なRNAi活性を保持する2'OMe（Czauderna et al., Nucl. Acids Res., 31: 2705-2716（2003）（非特許文献14）; Allerson et al., J. Med. Chem., 48: 901-904（2005）（非特許文献15）; Prakash et al., J. Med. Chem., 48: 4247-4253（2005）（非特許文献16））、2'F（Chiu et al., RNA, 9: 1034-1048（2003）（非特許文献17）; Layzer et al., RNA, 10: 766-771（2004）（非特許文献18）; Allerson et al., 前記（非特許文献15）; Prakash et al., 前記（非特許文献16））、2'-デオキシ（Chiu et al., 前記（非特許文献17））、または「ロック核酸」（LNA）（Hornung et al., 前記（非特許文献10）; Elmen et al., Nucl. Acids Res., 33: 439-447（2005）（非特許文献18））修飾を含む化学的に安定化されたsiRNAを設計することができることが示されているが、そのような修飾は、ある種のあまり明確ではない位置的なまたは配列が関連する文脈でのみ許容されるように思われる。実際、未変性なsiRNA二重鎖への化学修飾の導入は、多くの場合、RNAi活性に対する負の影響を有することができる（Hornung et al., 前記（非特許文献10）; Czauderna et al., 前記（非特許文献14）; Prakash et al., 前記（非特許文献16）; Chiu et al., 前記（非特許文献17）; Elmen et al., 前記（非特許文献18））。結果として、化学修飾siRNAの設計は、強力な遺伝子サイレンシング活性を保持する二重鎖を同定するための確率的スクリーニングアプローチを必要としている。
【０００５】
細胞による外来核酸の不十分な摂取はsiRNAに基づく薬物の開発に対するさらなる障壁を表している。siRNAは、核酸の細胞内摂取を増大させかつ全身投与に好適である、安定な核酸-脂質粒子（SNALP）と呼ばれるリポソームの中に封入することができる。これらの系はインビトロでRNAiを媒介するのに効果的であり（Judge et al., 前記（非特許文献9））、およびB型肝炎のマウスモデルにおいて治療的に実行可能なsiRNA用量でウイルスの複製を阻害することが示されている（Morrissey et al., 前記（非特許文献12））。しかしながら、これらの検討は、90％超の修飾ヌクレオチドを含む合成siRNAで行なわれ、それによってRNAiを介する遺伝子サイレンシングの効力が損なわれる可能性がある。
【０００６】
したがって、RNAi活性に対する負の影響を有することなくsiRNAの免疫刺激活性を阻止する最小限に修飾されたsiRNA分子に対する当技術分野における強い必要性がある。本発明はこのおよびその他の必要性に取り組む。
【０００７】
【非特許文献１】McManus et al., Nature Rev. Genet., 3: 737（2002）
【非特許文献２】Elbashir et al., Genes Dev., 15: 188（2001）
【非特許文献３】Alexopoulou et al., Nature, 413: 732-738（2001）
【非特許文献４】Heil et al., Science, 303: 1526-1529（2004）
【非特許文献５】Diebold et al., Science, 303: 1529-1531（2004）
【非特許文献６】Krieg, Ann. Rev. Immunol., 20: 709-760（2002）
【非特許文献７】Michie et al., N. Engl. J. Med., 318: 1481-1486（1988）
【非特許文献８】Krown et al., Semin. Oncol., 13: 207-217（1986）
【非特許文献９】Judge et al., Nat. Biotechnol., 23: 457-462（2005）
【非特許文献１０】Hornung et al., Nat. Med., 11: 263-270（2005）
【非特許文献１１】Sioud, J. Mol. Biol., 348: 1079-1090（2005）
【非特許文献１２】Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23: 1002-1007（2005）
【非特許文献１３】Manoharan, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 570-579（2004）
【非特許文献１４】Czauderna et al., Nucl. Acids Res., 31: 2705-2716（2003）
【非特許文献１５】Allerson et al., J. Med. Chem., 48: 901-904（2005）
【非特許文献１６】Prakash et al., J. Med. Chem., 48: 4247-4253（2005）
【非特許文献１７】Chiu et al., RNA, 9: 1034-1048（2003）
【非特許文献１８】Layzer et al., RNA, 10: 766-771（2004）
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、化学修飾siRNA分子およびそのようなsiRNA分子を用いて標的遺伝子発現を抑制する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、一部は、siRNA二重鎖の1つまたは両方の鎖内の選択的位置での、2'-O-メチル（2'OMe）修飾などの、最小限の化学修飾がsiRNAの免疫刺激活性を低下させまたは完全に阻止するのに十分であるという驚くべき発見に基づく。ある種の例において、化学修飾をsiRNA二重鎖の非標的化センス鎖に制限することによって、完全なRNAi活性を保持しながらsiRNAの免疫刺激活性を無効にすることができる。あるいは、siRNA二重鎖のセンスおよびアンチセンス鎖内の選択的位置での、2'OMe修飾などの、最小限の化学修飾は、RNAi活性を保持しながらsiRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分である。アポリポタンパク質B（ApoB）および有糸分裂キネシンEg5を内在性遺伝子標的の非限定的な例として用いて、対応する未修飾siRNA配列によって誘発される免疫活性化と関連するサイトカイン誘導、免疫毒性、またはオフターゲット効果を伴わずに、本発明の修飾siRNA分子を用いて強力な遺伝子サイレンシングをインビボで達成することができる。結果として、患者は、そのような治療と関連する免疫刺激性のある副作用のいずれにも苦しむことなく、siRNA治療の完全な恩恵を受けると考えられる。
【００１０】
ある局面において、本発明は、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さくかつ標的配列の発現を抑制することができる、長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖領域を含む修飾siRNAを提供する。
【００１１】
典型的には、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約20％未満（例えば、約20％、15％、10％、もしくは5％未満）または約1％〜約20％（例えば、約1％〜20％、5％〜20％、10％〜20％、もしくは15％〜20％）が修飾ヌクレオチドを含む。非限定的な例として、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域における未変性な2'-OH位置の約5％に相当する、わずか2つの2'OMe-修飾ヌクレオチドを含むことができる。この最小限度の化学修飾は、極めて免疫刺激性のあるsiRNA配列の中に取り込まれた場合、インビトロおよびインビボでのsiRNAを介するインターフェロンおよび炎症性サイトカイン誘導を低下させまたは完全に阻止することができる（実施例1参照）。
【００１２】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、2'OMeヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNAは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾siRNAは2'OMe-シトシンヌクレオチドを含まない。その他の態様において、修飾siRNAはヘアピンループ構造を含む。
【００１３】
修飾siRNAは、siRNAの二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドはsiRNA二重鎖の二本鎖領域における選択的位置で修飾されている。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるウリジンヌクレオチドの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くは2'OMe-ウリジンヌクレオチドなどの修飾ウリジンヌクレオチドであることができる。幾つかの態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるあらゆるウリジンヌクレオチドは2'OMe-ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるグアノシンヌクレオチドの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くは2'OMe-グアノシンヌクレオチドなどの修飾グアノシンヌクレオチドであることができる。幾つかの態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖におけるあらゆるグアノシンヌクレオチドは2'OMe-グアノシンヌクレオチドである。
【００１４】
ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％免疫刺激性が小さい。好ましくは、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％（例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）免疫刺激性が小さい。例えば、（本明細書において開示されたSNALP送達系またはその他のリポプレックス（lipoplex）系などの）適当な脂質に基づく送達系を用いた哺乳動物における全身投与後2〜24時間後のINF-αおよび／またはIL-6レベルを測定することによって、修飾siRNA分子および対応する未修飾siRNA分子の免疫刺激特性を決定することができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。
【００１５】
ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍以下のIC50を有する（すなわち、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍に等しいか、またはそれより小さいIC50を有する）。その他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の3倍以下のIC50を有する。またその他の態様において、修飾siRNAは好ましくは、対応する未修飾siRNAのIC50の2倍以下のIC50を有する。当業者に公知の方法を用いて用量応答曲線を作成することができ、かつ修飾siRNAおよび対応する未修飾siRNAについてのIC50値を容易に決定することができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。
【００１６】
好ましくは、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％（例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）免疫刺激性が小さく、ならびに修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の10倍（好ましくは3倍、およびより好ましくは、2倍）またはそれより小さいIC50を有する。
【００１７】
また別の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べて標的配列の発現の少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、またはそれより多くを抑制することができる。
【００１８】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖にリン酸骨格修飾を含まない。その他の態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖に2'-デオキシヌクレオチドを含まない。ある種の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある種のその他の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端付近（例えば、3’末端の1、2、3、または4ヌクレオチド以内）のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
【００１９】
本発明の修飾siRNAは、二本鎖領域の1つもしくは両方の側に1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くのヌクレオチドの3'突出部を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。好ましくは、修飾siRNAは、二本鎖領域の各々の側に2ヌクレオチドの3'突出部を有する。ある種の例において、アンチセンス鎖上の3'突出部は、標的配列に対する相補性を有し、およびセンス鎖上の3'突出部は、標的配列の相補鎖に対する相補性を有する（例えば、表3中のApoB siRNA二重鎖を参照）。あるいは、3'突出部は、標的配列またはその相補鎖に対する相補性を有さない。幾つかの態様において、3'突出部は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれより多くの、2'-デオキシ（2'H）ヌクレオチドなどのヌクレオチドを含む。好ましくは、3'突出部は、デオキシチミジン（dT）ヌクレオチドを含む。
【００２０】
幾つかの態様において、対応する未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフ（SEQ ID NO: 1）を含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。
【００２１】
ある種の態様において、修飾siRNAは、例えば、修飾siRNAを哺乳動物の細胞内に送達するための、担体系をさらに含む。本発明での使用に好適な担体系の非限定的な例として、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム（virosome）、核酸複合体、およびそれらの混合物が含まれる。ある種の例において、修飾siRNA分子はカチオン性脂質などの脂質と複合体を形成し、リポプレックスを形成する。ある種のその他の例において、修飾siRNA分子はカチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（PEI））などのポリマーと複合体を形成し、ポリプレックス（polyplex）を形成する。修飾siRNA分子はまた、サイクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。好ましくは、修飾siRNA分子は核酸-脂質粒子の中に封入されている。
【００２２】
本発明はまた、本明細書において記載された修飾siRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００２３】
関連する局面において、本発明は、siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチドの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドを含み、かつsiRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチドが修飾ヌクレオチドではない、長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖領域を含む修飾siRNAを提供する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、二本鎖領域におけるヌクレオチドの少なくとも2つが修飾グアノシンヌクレオチド、修飾ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される修飾ヌクレオチドを含む、長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖領域を含む修飾siRNAを提供する。修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ顕著に免疫刺激性が小さくかつ標的配列の発現を抑制することができる。
【００２５】
典型的には、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約30％未満（例えば、約30％、25％、20％、15％、10％、もしくは5％未満）または約1％〜約30％（例えば、約1％〜30％、5％〜30％、10％〜30％、15％〜30％、20％〜30％、もしくは25％〜30％）が修飾ヌクレオチドを含む。非限定的な例として、修飾siRNAは、siRNA二重鎖の二本鎖領域における未変性な2'-OH位置の約30％未満を表す、10の2'OMe-グアノシンおよび／または2'OMe-ウリジンヌクレオチドを含むことができる。この最小限度の化学修飾は、極めて免疫刺激性のあるsiRNA配列の中に取り込まれた場合、インビトロおよびインビボでのsiRNAを介するインターフェロンおよび炎症性サイトカイン誘導を低下させまたは完全に阻止することができる（実施例2〜4参照）。
【００２６】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'F-グアノシンヌクレオチド、2'F-ウリジンヌクレオチド、2'-デオキシグアノシンヌクレオチド、2'-デオキシウリジンヌクレオチド、2'OMOE-グアノシンヌクレオチド、2'OMOE-ウリジンヌクレオチド、LNAグアノシンヌクレオチド、LNAウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、修飾グアノシンおよび／またはウリジンヌクレオチドを含む。好ましい態様において、修飾siRNAは、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、およびそれらの混合物を含む。その他の態様において、修飾siRNAはヘアピンループ構造を含む。
【００２７】
修飾siRNAは、siRNAの二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドの少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多くが、siRNA二重鎖の二本鎖領域における選択的位置で修飾されている。
【００２８】
ある種の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％免疫刺激性が小さい。好ましくは、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ少なくとも約80％（例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）免疫刺激性が小さく、かつ対応する未修飾siRNAのIC50の10倍以下のIC50を有する。その他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNAのIC50の3倍以下のIC50を有する。またその他の態様において、修飾siRNAは好ましくは、対応する未修飾siRNAのIC50の2倍以下のIC50を有する。
【００２９】
その他の態様において、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べて標的配列の発現の少なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、またはそれより多くを抑制することができる。
【００３０】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖にリン酸骨格修飾を含まない。その他の態様において、修飾siRNAは、例えば、二本鎖領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖に2'-デオキシヌクレオチドを含まない。ある種の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある種のその他の例において、センスおよび／またはアンチセンス鎖における二本鎖領域の3’末端付近（例えば、3’末端の1、2、3、または4ヌクレオチド以内）のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
【００３１】
本発明の修飾siRNAは、二本鎖領域の1つもしくは両方の側に1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くのヌクレオチドの3'突出部を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。好ましくは、修飾siRNAは、二本鎖領域の各々の側に2ヌクレオチドの3'突出部を有する。幾つかの態様において、3'突出部は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれより多くの2'-デオキシ（2'H）ヌクレオチドなどのヌクレオチドを含む。好ましくは、3'突出部は、デオキシチミジン（dT）ヌクレオチドを含む。
【００３２】
幾つかの態様において、対応する未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフ（SEQ ID NO: 1）を含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。
【００３３】
ある種の態様において、修飾siRNAは、例えば、修飾siRNAを哺乳動物の細胞内に送達するための担体系をさらに含む。担体系の非限定的な例として、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、およびそれらの混合物が含まれる。ある種の例において、修飾siRNA分子はカチオン性脂質などの脂質と複合体を形成し、リポプレックスを形成する。ある種のその他の例において、修飾siRNA分子はカチオン性ポリマー（例えば、PEI）などのポリマーと複合体を形成し、ポリプレックスを形成する。修飾siRNA分子はまた、サイクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。好ましくは、修飾siRNA分子は核酸-脂質粒子の中に封入されている。
【００３４】
本発明はまた、本明細書において記載された修飾siRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００３５】
また別の局面において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNA、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子を提供する。ある種の例において、核酸-脂質粒子は、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質をさらに含む。好ましくは、核酸-脂質粒子は、本明細書において記載された修飾siRNA、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む。
【００３６】
カチオン性脂質は、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（DODAC）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTAP）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミン（DODMA）、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLendMA）、またはそれらの混合物であってもよい。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約20mol％〜約50mol％または約40mol％を含んでもよい。
【００３７】
非カチオン性脂質は、例えば、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミトイル-フォスファチジルコリン（DPPC）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE）、ステアロイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE）、卵（egg）フォスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であってもよい。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約90mol％または約20mol％を含んでもよい。
【００３８】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、ポリエチレングリコール（PEG）-脂質コンジュゲート、ポリアミド（ATTA）-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、またはそれらの混合物であってもよい。ある好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートのいずれかを含む。ある種の態様において、PEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートをCPLと共に用いる。粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、例えば、PEG-ジアシルグリセロール（DAG）、PEG-ジアルキルオキシプロピル（DAA）、PEG-リン脂質、PEG-セラミド（Cer）、またはそれらの混合物を含むPEG-脂質を含んでもよい。PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリルオキシプロピル（C12）、PEG-ジミリスチルオキシプロピル（C14）、PEG-ジパルミチルオキシプロピル（C16）、またはPEG-ジステアリルオキシプロピル（C18）であってもよい。幾つかの態様において、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、Aが脂質部分、Wが親水性ポリマー、およびYがポリカチオン性部分である、式：A-W-Yを有するCPLである。Wは、約250〜約7000ダルトンの分子量を有する、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共ポリマー、またはその組み合わせからなる群より選択されるポリマーであってもよい。幾つかの態様において、Yは、選択されたpHで少なくとも4つの正電荷を有する。幾つかの態様において、Yは、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、その誘導体、またはその組み合わせであってもよい。粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質は、粒子中に存在する全脂質の0mol％〜約20mol％または約2mol％であってもよい。
【００３９】
幾つかの態様において、核酸-脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する全脂質の約10mol％〜約60mol％、約30mol％〜約50mol％、または約48mol％でコレステロールをさらに含む。
【００４０】
ある種の態様において、核酸-脂質粒子中の修飾siRNAは、37℃で少なくとも20、30、45、もしくは60分間のヌクレアーゼへの粒子の曝露後に；または37℃で少なくとも30、45、もしくは60分間の血清中での粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
【００４１】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、核酸-脂質粒子の中に完全に封入されている。その他の態様において、修飾siRNAは、粒子の脂質部分と複合体を形成している。
【００４２】
本発明は、本明細書において記載された核酸-脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００４３】
さらにまた別の局面において、本明細書において記載された修飾siRNAは、標的配列の発現を抑制するための方法において用いられる。特に、関心対象の標的遺伝子の転写および／または翻訳を下方調節または抑制することによる哺乳動物における疾患または障害の処置のためのインビトロおよびインビボ方法を提供することが本発明の目的である。ある態様において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNAと細胞を接触させることによって、標的配列の発現（例えば、mRNAおよび／またはタンパク質レベル）を抑制するsiRNAを細胞内に導入するための方法を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNAを哺乳動物に投与することによって、標的配列の発現を抑制するsiRNAのインビボ送達のための方法を提供する。修飾siRNAの投与は、例えば、経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、病変内投与、気管内投与、皮下投与、または皮内投与などの、当技術分野において公知の任意の経路によることができる。
【００４４】
これらの方法において、修飾siRNAは、典型的には担体系と共に製剤化され、および修飾siRNAを含む担体系は、そのような処置を必要とする哺乳動物に投与される。本発明での使用に好適な担体系の例として、核酸-脂質粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体（例えば、リポプレックス、ポリプレックスなど）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。担体系は、本明細書において記載された修飾siRNA分子の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多くを含んでもよい。あるいは、細胞をヒトなどの哺乳動物から除去し、修飾siRNAをインビトロで送達し、およびその後注射などによって、細胞を哺乳動物に投与する。
【００４５】
幾つかの態様において、修飾siRNAは、修飾siRNA、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子中にある。好ましくは、修飾siRNAは、修飾siRNA、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を含む核酸-脂質粒子である。治療的有効量の核酸-脂質粒子を哺乳動物対象（例えば、マウスなどの齧歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサルなどの霊長類）に投与することができる。
【００４６】
別の態様において、核酸-脂質粒子の全投与用量の少なくとも約1％、2％、4％、6％、8％、または10％が、投与後約1、2、4、6、8、12、16、18、または24時間で血漿中に存在する。さらなる態様において、核酸-脂質粒子の全投与用量の約20％、30％、もしくは40％よりも多く、または約60％、70％、もしくは80％と同じ程度が、投与後約1、4、6、8、10、12、20、または24時間で血漿中に存在する。ある態様において、投与の部位に対して近位または遠位の部位での修飾siRNAの効果（例えば、標的配列の下方調節）は、核酸-脂質粒子の投与後約12、24、48、72、もしくは96時間、または約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、もしくは28日で検出可能である。別の態様において、標的配列の発現の下方調節は、投与後約12、24、48、72、もしくは96時間、または約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、もしくは28日で検出可能である。ある種の例において、遺伝子配列の発現の下方調節を、哺乳動物由来の生物学的試料におけるmRNAまたはタンパク質レベルを測定することによって検出する。
【００４７】
それらは循環中で安定であり、血管外部位への接近を結果的にもたらす薬力学的挙動に必要とされるサイズであり、および細胞集団を標的するので、核酸-脂質粒子は静脈内核酸送達での使用に好適である。本発明はまた、核酸-脂質粒子を含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００４８】
さらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む免疫刺激特性を有するsiRNAを修飾するための方法を提供する：（a）標的配列の発現を抑制することができかつ長さ約15〜約60ヌクレオチド（例えば、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド）の二本鎖配列を含む未修飾siRNA配列を提供する工程；および（b）センスまたはアンチセンス鎖における少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することによってsiRNAを修飾し、それによって未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さくかつ標的配列の発現を抑制することができる修飾siRNAを作製する工程。 
【００４９】
幾つかの態様において、修飾ヌクレオチドには、2'OMeヌクレオチド、2'Fヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'OMOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、修飾ヌクレオチドは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾ヌクレオチドは2'OMe-シトシンヌクレオチドではない。
【００５０】
ある種の例において、未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフ（SEQ ID NO: 1）を含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。好ましくは、5'-GU-3'モチーフにおける少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換する。非限定的な例として、5'-GU-3'モチーフにおける両方のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することができる。
【００５１】
幾つかの態様において、本方法は以下の工程をさらに含む：（c）レスポンダー細胞が検出可能な免疫応答を産生するのに好適な条件下で修飾siRNAを哺乳動物レスポンダー細胞と接触させることによって、修飾siRNAがより免疫刺激性が小さいということを確認する工程。哺乳動物レスポンダー細胞は、ナイーブな哺乳動物（すなわち、以前にsiRNA配列の遺伝子産物と接触していない哺乳動物）由来であってもよい。哺乳動物レスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージ、およびそれらと同様の細胞由来であってもよい。検出可能な免疫応答は、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、またはその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生を含んでもよい。
【００５２】
関連する局面において、本発明は、免疫刺激特性を有するsiRNAを同定および修飾するための方法を提供する。本方法は、以下の工程を含む：（a）レスポンダー細胞が検出可能な免疫応答を産生するのに好適な条件下で未修飾siRNA配列を哺乳動物レスポンダー細胞と接触させる工程；（b）レスポンダー細胞における検出可能な免疫応答の存在によって未修飾siRNA配列を免疫刺激性のsiRNAとして同定する工程；および（c）少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することによって免疫刺激性のsiRNAを修飾し、それによって未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さい修飾siRNA配列を作製する工程。
【００５３】
ある種の態様において、修飾ヌクレオチドには、2'OMeヌクレオチド、2'Fヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2'OMOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、修飾ヌクレオチドは、例えば、2'OMe-グアノシンヌクレオチド、2'OMe-ウリジンヌクレオチド、2'OMe-アデノシンヌクレオチド、2'OMe-シトシンヌクレオチド、およびそれらの混合物などの2'OMeヌクレオチド（例えば、2'OMeプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチド）を含む。ある種の例において、修飾ヌクレオチドは2'OMe-シトシンヌクレオチドではない。
【００５４】
ある種の例において、未修飾siRNA配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、またはそれより多くの5'-GU-3'モチーフを含む。5'-GU-3'モチーフは、未修飾siRNA配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖にあることができる。好ましくは、5'-GU-3'モチーフにおける少なくとも1つのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換する。非限定的な例として、5'-GU-3'モチーフにおける両方のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することができる。
【００５５】
ある態様において、哺乳動物レスポンダー細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージ、およびそれらと同様の細胞由来である。別の態様において、検出可能な免疫応答は、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、またはその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生を含む。
【００５６】
さらなる局面において、本発明は、表1および2で示された修飾配列を含む単離された核酸分子を提供する。修飾配列はその相補鎖をさらに含み、それによって修飾siRNA二重鎖を作製することができる。関連する局面において、本発明は、表3、5、および6で示された修飾siRNA二重鎖を含む単離された核酸分子を提供する。
【００５７】
本発明のその他の特色、目的、および利点ならびにその好ましい態様は、以下に続く詳細な説明、実施例、および特許請求の範囲から明白になると考えられる。
【００５８】
発明の詳細な説明
I、序論
合成siRNAによる疾患関連遺伝子の標的抑制は、新規の治療戦略としてかなりの見込みを保有している。しかしながら、未修飾siRNAは、免疫刺激性であり得、例えば、特に細胞内摂取を容易にする送達媒体と関連する場合、先天免疫細胞由来の強力な炎症性応答を刺激し得る。これは、炎症性応答と関連する毒性およびオフターゲット遺伝子効果によるsiRNAの治療的開発に対する著しい障壁を表す。本発明は、siRNA二重鎖のいずれかまたは両方の鎖への2'-O-メチル（2'OMe）ウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの選択的取り込みを用いて合成siRNAに対する免疫応答を低下させまたは完全に阻止することによって、これらの限界を克服する。特に、siRNA二重鎖の二本鎖領域内に選択的な2'OMe修飾を取り込ませることによって、完全な遺伝子サイレンシング活性を保持する免疫刺激性のないsiRNAを容易に作製することができる。非限定的な例として、アポリポタンパク質B（ApoB）を標的する2'OMe-修飾siRNAは、核酸-脂質粒子などの効果的な全身送達媒体の中に封入した場合、その標的mRNAの強力なサイレンシングを媒介し、血清ApoBおよびコレステロールの著しい減少を引き起こすことができる。これは、未修飾siRNAの使用と関連するサイトカイン誘導、毒性、およびオフターゲット効果を伴わずに、治療的に実行可能なsiRNA用量で達成される。好都合なことに、本明細書において記載されたsiRNA設計および送達に対するアプローチは幅広く適用でき、かつ合成siRNAを広範囲の治療領域に前進させる。
【００５９】
したがって、本発明は、化学修飾siRNA分子およびそのようなsiRNA分子を用いて標的遺伝子発現を抑制する方法を提供する。本発明はまた、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質をさらに含むことができる、本明細書において記載された修飾siRNA分子、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質を含む核酸-脂質粒子を提供する。本発明はさらに、本明細書において記載された修飾siRNA分子を哺乳動物対象に投与することによって遺伝子発現を抑制する方法を提供する。免疫刺激特性を有するsiRNAを同定および／または修飾するための方法も提供する。
【００６０】
II、定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は、そうでないように特定されない限り、それらに特有のものとされる意味を有する。
【００６１】
「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、干渉RNAが標的遺伝子と同じ細胞の中にある場合に、（すなわち、干渉RNAの配列に相補的であるmRNAの分解を媒介することによって）標的遺伝子の発現を低下させまたは阻害することができる二本鎖RNA（すなわち、二重鎖RNA）を指す。したがって、干渉RNAは、2つの相補的な鎖によってまたは1つの、自己相補的な鎖によって形成された二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子に対する実質的なもしくは完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでもよい。干渉RNAの配列は、全長標的遺伝子、またはそのサブ配列に対応することができる。
【００６２】
干渉RNAは、「小さい干渉RNA」または「siRNA」、例えば、長さ約15〜60、15〜50、または15〜40（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さ約15〜30、15〜25、または19〜25（二重鎖）ヌクレオチドの干渉RNAを含み、および好ましくは長さ約20〜24、21〜22、または21〜23（二重鎖）ヌクレオチドである（例えば、二本鎖siRNAの各々の相補的配列は、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド、好ましくは長さ約20〜24、21〜22、または21〜23ヌクレオチドであり、および二本鎖siRNAは、長さ約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25塩基対、好ましくは長さ約20〜24、21〜22、または21〜23塩基対である）。siRNA二重鎖は、約1〜約4ヌクレオチドまたは約2〜約3ヌクレオチドの3'突出部および5'リン酸末端をを含んでもよい。siRNAの例として、一方の鎖がセンス鎖でかつ他方が相補的なアンチセンス鎖である、2つの別々の鎖の分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センスおよびアンチセンス領域が核酸に基づくまたは核酸に基づかないリンカーによって連結されている、一本鎖の分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を持つ二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに環状ポリヌクレオチドをインビボまたはインビトロで処理し、活性のある二本鎖siRNA分子を作製することができる、2つまたはそれより多くのループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを持つ環状一本鎖ポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６３】
好ましくは、siRNAを化学合成する。siRNAは、大腸菌（E. coli）RNアーゼIIIまたはDicerによるより長いdsRNA（例えば、長さ約25ヌクレオチド超のdsRNA）の切断によって作製することもできる。これらの酵素は、dsRNAを処理して生物学的活性のあるsiRNAにする（例えば、Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 9942-9947（2002）; Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14236（2002）; Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1): 4-6（2003）; Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31: 981-987（2003）; Knight et al., Science, 293: 2269-2271（2001）;およびRobertson et al., J. Biol. Chem., 243: 82（1968）参照）。好ましくは、dsRNAは、長さが少なくとも50ヌクレオチド〜約100、200、300、400、または500ヌクレオチドである。dsRNAは、長さが1000、1500、2000、5000ヌクレオチドと同じ程度であってもよく、またはそれより長くてもよい。dsRNAは、全体的な遺伝子転写物または部分的な遺伝子転写物をコードすることができる。ある種の例において、siRNAはプラスミドによってコードされ（例えば、ヘアピンループを持つ二重鎖に自動的に折り畳まれる配列として転写され）てもよい。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対する100％相補性を有さないsiRNA配列の部分を指す。siRNAは、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多くのミスマッチ領域を有してもよい。ミスマッチ領域は連続的であってもよく、または1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、もしくはそれより多くのヌクレオチドだけ離れていてもよい。ミスマッチモチーフもしくはミスマッチ領域は1つのヌクレオチドを含んでもよく、または2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれより多くのヌクレオチドを含んでもよい。
【００６５】
siRNAの「有効量」または「治療的有効量」とは、所望の効果、例えば、siRNAの非存在下で検出される正常の発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害を産生するのに十分な量である。対照と比べてsiRNAで得られる値が約90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、または0％である場合、標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための好適なアッセイには、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能などの当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはmRNAレベルの調査だけでなく、当業者に公知の表現型アッセイも含まれる。
【００６６】
siRNAによる免疫応答の「減少（decrease）」、「減少（decreasing）」、「低下（reduce）」、または「低下（reducing）」によって、siRNA（例えば、修飾siRNA）に対する免疫応答の検出可能な減少を意味するよう意図される。未修飾siRNAの存在下での免疫応答のレベルと比べて修飾siRNAによる免疫応答の減少の量を決定してもよい。検出可能な減少は、未修飾siRNAの存在下で検出される免疫応答と比べ約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、またはそれより多く低下したものであることができる。siRNAに対する免疫応答の減少を、典型的にはインビトロでのレスポンダー細胞によるサイトカイン産生（例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6、もしくはIL-12）の減少またはsiRNAの投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン産生の減少によって測定する。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「レスポンダー細胞」という用語は、免疫刺激性のあるsiRNAと接触させた場合に、検出可能な免疫応答を産生する細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。例示的なレスポンダー細胞として、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞（PBMC）、脾細胞、およびそれらと同様の細胞が含まれる。検出可能な免疫応答として、例えば、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TGF、およびその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生が含まれる。
【００６８】
「実質的同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする配列を指し、または参照配列の特定の領域に対する特定の同一性パーセントを有する配列を指す。
【００６９】
2つまたはそれより多くの核酸の文脈における、「実質的に同一」または「実質的同一性」という用語は、比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてもしくは手作業での整列および目視による検査によって測定されるような指定の領域に対する最大限の対応について比較および整列した場合に、同じであり、または特定のパーセンテージの同じであるヌクレオチド（すなわち、特定の領域に対する少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％同一性）を有する2つもしくはそれより多くの配列またはサブ配列を指す。この定義は、文脈が示す場合、配列の相補体も類似的に指す。好ましくは、実質的同一性は、長さが少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60ヌクレオチドである領域に対して存在する。
【００７０】
配列比較のために、典型的には1つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には、サブ配列座標を指定し、ならびに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを用いることができ、または代わりのパラメーターを指定することができる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメーターに基づいて、試験配列についての参照配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
【００７１】
本明細書において使用される場合の、「比較ウインドウ」は、2つの配列を最適に整列した後に同じ数の連続する位置の参照配列に対して配列を比較し得る、約5〜約60、通例として約10〜約45、より通例として約15〜約30からなる群より選択される多くの連続する位置のいずれか1つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列の整列の方法は当業者に周知である。例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2：482（1981）の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48：443（1970）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：2444（1988）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピュータ化した履行によって、または手作業での整列および目視による検査によって、比較のための配列の最適な整列を実施することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 編（1995補遺）参照）。
【００７２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの好ましい例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25：3389-3402（1977）およびAltschul et al., J. Mol. Biol., 215：403-410（1990）に記載されている、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。本明細書において記載されたパラメーターと共に、BLASTおよびBLAST 2.0を用いて、本発明の核酸についての配列同一性パーセントを決定する。BLAST解析を行なうためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に入手可能である。
【００７３】
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計的解析も行なう（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：5873-5787（1993）参照）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率（P(N)）であり、それは2つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に起こると考えられる確率の表示を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸との比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列と同様であると考えられる。
【００７４】
本明細書において使用される場合の「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にある少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むポリマーを指し、かつDNAおよびRNAを含む。DNAは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドDNA、凝縮前のDNA、PCR産物、ベクター（P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体および組み合わせの形態にあってもよい。RNAは、siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、vRNA、およびその組み合わせの形態にあってもよい。核酸は、合成、天然、および非天然であり、かつ参照核酸と同様の結合特性を有する、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは連結を含む核酸を含む。そのような類似体の例として、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する自然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。そうでないように示されない限り、ある特定の核酸配列は、明瞭に示された配列だけでなく、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、SNP、および相補的配列もまた暗に包含する。具体的には、1つもしくは複数の選択された（または全ての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換されている配列を作製することによって、縮重コドン置換を達成してもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19：5081（1991）；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260：2605-2608（1985）；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8：91-98（1994））。「ヌクレオチド」は糖であるデオキシリボース（DNA）またはリボース（RNA）、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドはリン酸基を介して互いに連結している。「塩基」はプリンおよびピリミジンを含み、それは自然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、および自然類似体、ならびにアミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハリドなどの、しかしこれらに限定されない、新しい反応基を置く修飾を含むが、これらに限定されない、プリンおよびピリミジンの合成誘導体をさらに含む。
【００７５】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長コード配列を含む核酸（例えば、DNAまたはRNA）配列を指す。
【００７６】
本明細書において使用される場合の、「遺伝子産物」は、RNA転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。
【００７７】
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むが、これに限定されず、および水に溶けないが、多くの有機溶媒には溶けることを特徴とする、一群の有機化合物を指す。それらは通例、少なくとも3つの部類：（1）脂肪および油だけでなくロウも含む、「単純脂質」；（2）リン脂質および糖脂質を含む、「複合脂質」；ならびに（3）ステロイドなどの「誘導脂質」に分けられる。
【００７８】
「脂質小胞」は、水性容量が両親媒性の脂質二重層によって封入され、もしくは脂質が、低下した水性内部を伴って、干渉RNA配列を含むプラスミドなどの、巨大な分子成分を含む内部をコーティングする、リポソーム；または封入された成分が比較的秩序のない脂質混合物の中に含まれる、脂質凝集体もしくはミセルを含むが、これに限定されない、siRNAなどの化合物を送達するのに用いることができる任意の脂質組成物を指す。脂質小胞という用語は、SPLP、pSPLP、SNALP、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、脂質-核酸複合体、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な脂質に基づく担体系のいずれかを包含する。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「封入された脂質」という用語は、完全封入、部分封入、または両方を伴ってsiRNAなどの化合物を提供する脂質製剤を指すことができる。好ましい態様において、（例えば、SPLP、pSPLP、SNALP、またはその他の核酸-脂質粒子を形成するために）核酸を脂質製剤中に完全に封入する。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「SNALP」という用語は、SPLPを含む、安定な核酸-脂質粒子を指す。SNALPは、核酸（例えば、siRNA、ssDNA、dsDNA、ssRNA、マイクロRNA（miRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、dsRNA、またはそれから干渉RNAが転写されるプラスミドを含む、プラスミド）を含む低下した水性内部をコーティングする脂質の小胞を表す。本明細書において使用される場合、「SPLP」という用語は、脂質小胞内に封入された核酸（例えば、プラスミド）を含む核酸-脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、PEG-脂質コンジュゲート）を含む。それらは静脈内（i.v.）注射後の延長された循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）で蓄積し、およびこれらの遠位部位でのトランスフェクトされた遺伝子の発現を媒介することができるので、SNALPおよびSPLPは全身適用に極めて有用である。SPLPには、PCT刊行物国際公開公報第00/03683号に示されたような封入された凝縮薬剤-核酸複合体を含む、「pSPLP」が含まれる。
【００８１】
本発明の核酸-脂質粒子は、典型的には約50nm〜の約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜の約110nm、最も典型的には約70nm〜の約90nmの平均直径を有し、かつ実質的に無毒である。さらに、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸はヌクレアーゼによる分解に対して水性溶液中で抵抗性である。核酸-脂質粒子およびそれらの調製の方法が、例えば米国特許第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410号；および第6,815,432号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/40964号に開示されている。  
【００８２】
「小胞形成脂質」という用語は、多くのリン脂質によって例示されるような、疎水性部分および極性頭部基を有し、かつそれだけで水中で二重層小胞を自然に形成する任意の両親媒性脂質を含むよう意図される。
【００８３】
「小胞導入脂質」という用語は、その疎水性部分を二重層膜の内部の、疎水性領域と接触させ、かつその極性頭部基部分を膜の外部の、極性表面の方に向け、その他の両親媒性脂質と組み合わせて脂質二重層に安定に取り込まれる任意の両親媒性脂質を含むよう意図される。小胞導入脂質は、それら自体で非ラメラ相を導入する傾向にはあるが、二重層安定化成分の存在下で二重層構造を取ることができる脂質を含む。典型的な例は、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）である。二重層安定化成分として、核酸-脂質粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質、ポリアミドオリゴマー（例えば、ATTA-脂質誘導体）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質-誘導体、ジアルキルオキシプロピルに共役したPEG、ジアシルグリセロールに共役したPEG、フォスファチジル-エタノールアミンに共役したPEG、セラミドにコンジュゲートされたPEG（例えば、米国特許第5,885,613号参照）、カチオン性PEG脂質などのPEG-脂質誘導体、、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。PEGは脂質に直接コンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結してもよい。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、PEGを脂質に共役するのに好適な任意のリンカー部分を用いることができる。
【００８４】
「両親媒性脂質」という用語は、一部は、脂質材料の疎水性部分が疎水相の中に向き、一方で親水性部分が水性相の方に向く任意の好適な材料を指す。両親媒性脂質は通例、脂質小胞の主要成分である。親水性の特徴は、炭水化物基、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、水酸基、およびその他の同様の基などの極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つもしくは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環基で置換されたそのような基を含むが、これらに限定されない、非極性基の含有によって与えることができる。両親媒性化合物の例として、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質の代表的な例として、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン、リソフォスファチジルコリン、リソフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン、およびジリノレオイルフォスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸などの、リンを欠くその他の化合物も、両親媒性脂質として指定される基の範囲内である。さらに、上記の両親媒性脂質をトリグリセリドおよびステロールを含むその他の脂質と混合することができる。
【００８５】
「中性脂質」という用語は、選択されたpHで無荷電形態または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種いずれかを指す。生理学的pHで、そのような脂質は、例えば、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールを含む。
【００８６】
「非カチオン性脂質」という用語は、上記のような任意の中性脂質だけでなくアニオン性脂質も指す。
【００８７】
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的pHで負に荷電している任意の脂質を指す。これらの脂質には、フォスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルフォスファチジルセリン、ジアシルフォスファチジン酸、N-ドデカノイルフォスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルフォスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルフォスファチジルエタノールアミン、リジルフォスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルフォスファチジルグリセロール（POPG）、および中性脂質に接続したその他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
「カチオン性脂質」という用語は、生理学的pH（例えば、約7.0のpH）などの、選択されたpHで正味の正の電荷を帯びる多くの脂質種のいずれかを指す。驚くべきことに、複数の不飽和の部位、例えば、少なくとも2つまたは3つの不飽和の部位を持つアルキル鎖を含むカチオン性脂質が、増大した膜流動性を持つ核酸-脂質粒子を形成するのに特に有用であるということが分かった。本発明においても有用である、多くのカチオン性脂質および関連類似体が、米国特許公報第20060083780号；米国特許第5,208,036号；第5,264,618号；第5,279,833号；第5,283,185号；第5,753,613号；および第5,785,992号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/10390号に記載されている。カチオン性脂質の例として、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライド（DODAC）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODMA）、ジステアリルジメチルアンモニウム（DSDMA）、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロマイド（DDAB）、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTAP）、3-(N(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（DMRIE）、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、生理学的pH以下で正の電荷を有するカチオン性脂質には、DODAP、DODMA、およびDSDMAが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの場合において、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第3級アミン頭部基、C18アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖間のエーテル連結、および0〜3の二重結合を含む。そのような脂質には、例えば、DSDMA、DLinDMA、DLenDMA、およびDODMAが含まれる。カチオン性脂質はまた、エーテル連結およびpH滴定可能な頭部基を含んでもよい。そのような脂質には、例えば、DODMAが含まれる。
【００８９】
「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つもしくは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環基で置換されてもよいそのような基を含むが、これらに限定されない、非極性基を有する化合物を指す。好適な例として、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
「融合性」という用語は、リポソーム、SNALP、またはその他の薬物送達系が細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、形質膜または例えば、エンドソーム、核などのオルガネラを囲む膜のいずれかであることができる。
【００９１】
本明細書において使用される場合、「水性溶液」という用語は、全体として、または一部として、水を含む組成物を指す。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体として、または一部として、脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
【００９３】
本明細書において使用される場合の、「遠位部位」とは、近隣の毛細血管床に限定されないが、生物全体にわたって広範に分布する部位を含む、物理的に離れた部位を指す。
【００９４】
核酸-脂質粒子との関係における「血清安定性」とは、遊離のDNAまたはRNAを著しく分解すると考えられる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、粒子が著しくは分解されないということを意味する。好適なアッセイには、例えば、標準的な血清アッセイ、DNAseアッセイ、またはRNAseアッセイが含まれる。
【００９５】
本明細書において使用される場合の、「全身送達」とは、siRNAなどの化合物の生物内の広範な生体分布をもたらす送達を指す。幾つかの投与の技術は、ある種の化合物の全身送達をもたらすことはできるが、その他の化合物の全身送達をもたらすことができない。全身送達とは、有用な、好ましくは治療的な量の化合物を、体の大部分に曝露させるということを意味する。広範な生体分布を得るためには、投与の部位に対して遠部の疾患部位に到達する前に、（最初の通過臓器（肝臓、肺など）によって、または急速で、非特異的な細胞結合によってのように）化合物が速やかに分解または除去されないような血液寿命が、通常必要とされる。核酸-脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、および腹腔内を含む当技術分野において公知の任意の手段によるものであることができる。好ましい態様において、核酸-脂質粒子の全身送達は静脈内送達によるものである。
【００９６】
本明細書において使用される場合の、「局所送達」とは、siRNAなどの化合物を生物内の標的部位に直接送達することを指す。例えば、腫瘍などの疾患部位もしくは炎症の部位などのその他の標的部位または肝臓、心臓、膵臓、腎臓、およびそれらと同様の臓器などの標的臓器の中への直接注射によって化合物を局所的に送達することができる。
【００９７】
「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜、およびそれらと同様の動物などの任意の哺乳動物種を指す。
【００９８】
III、siRNA
本発明の修飾siRNA分子は標的配列の発現を抑制することができ、長さ約15〜60ヌクレオチドであり、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さく、かつ標的配列に対するRNAi活性を保持する。幾つかの態様において、修飾siRNAは、少なくとも1つの、2'OMe-グアノシン、2'OMe-ウリジン、2'OMe-アデノシン、および／または2'OMe-シトシンヌクレオチドなどの2'OMeプリンまたはピリミジンヌクレオチドを含む。好ましい態様において、1つまたは複数のウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドを修飾する。修飾ヌクレオチドは、siRNAの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に存在することができる。siRNA配列は、突出部（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15：188（2001）もしくはNykanen et al., Cell, 107：309（2001）に記載されたような3'もしくは5'突出部）を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。
【００９９】
修飾siRNAは通常、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1％〜約100％（例えば、約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％）の修飾ヌクレオチドを含む。ある好ましい態様において、二本鎖領域におけるヌクレオチドの約20％未満（例えば、約20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満）または約1％〜約20％（例えば、約1％〜20％、2％〜20％、3％〜20％、4％〜20％、5％〜20％、6％〜20％、7％〜20％、8％〜20％、9％〜20％、10％〜20％、11％〜20％、12％〜20％、13％〜20％、14％〜20％、15％〜20％、16％〜20％、17％〜20％、18％〜20％、もしくは19％〜20％）が修飾ヌクレオチドを含む。別の好ましい態様において、例えば、siRNAの1つまたは両方の鎖がウリジンおよび／またはグアノシンヌクレオチドで選択的に修飾された場合、結果として生じる修飾siRNAは、約30％未満の修飾ヌクレオチド（例えば、約30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満の修飾ヌクレオチド）または約1％〜約30％の修飾ヌクレオチド（例えば、約1％〜30％、2％〜30％、3％〜30％、4％〜30％、5％〜30％、6％〜30％、7％〜30％、8％〜30％、9％〜30％、10％〜30％、11％〜30％、12％〜30％、13％〜30％、14％〜30％、15％〜30％、16％〜30％、17％〜30％、18％〜30％、19％〜30％、20％〜30％、21％〜30％、22％〜30％、23％〜30％、24％〜30％、25％〜30％、26％〜30％、27％〜30％、28％〜30％、もしくは29％〜30％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。
【０１００】
A、siRNA配列の選択
当技術分野において公知の任意の手段を用いて、好適なsiRNA配列を同定することができる。典型的には、Elbashir et al., Nature, 411：494-498（2001）およびElbashir et al., EMBO J., 20：6877-6888（2001）に記載された方法をReynolds et al., Nature Biotech., 22(3)：326-330（2004）で示された合理的設計規則と組み合わせる。
【０１０１】
通常、関心対象の標的遺伝子由来の転写物のAUG開始コドンの3'のヌクレオチド配列をジヌクレオチド配列（例えば、N＝C、G、またはUである、AA、NA、CC、GG、またはUU）について走査する（例えば、Elbashir et al., EMBO J., 20：6877-6888（2001）参照）。ジヌクレオチド配列のすぐ3'にあるヌクレオチドを潜在的なsiRNA標的部位として同定する。典型的には、ジヌクレオチド配列のすぐ3'にある19、21、23、25、27、29、31、33、35、またはそれを上回るヌクレオチドを潜在的なsiRNA標的配列として同定する。幾つかの態様において、ジヌクレオチド配列はAAまたはNA配列であり、およびAAまたはNAジヌクレオチドのすぐ3'にある19ヌクレオチドを潜在的なsiRNA標的部位として同定する。siRNA標的部位は通例、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置で間隔が置かれている。siRNA配列のサイレンシング効率をさらに増強するために、潜在的なsiRNA標的部位を解析し、例えば、標的細胞または生物において、その他のコード配列に対する相同性のある領域を含まない部位を同定してもよい。例えば、約21塩基対の好適なsiRNA標的部位は、標的細胞または生物において、コード配列に対する相同性のある16〜17よりも多くの連続する塩基対を有しないと考えられる。siRNA配列をRNA Pol IIIプロモーターから発現させたい場合、4つよりも多くの連続するAまたはTを欠くsiRNA標的配列を選択する。
【０１０２】
ひとたび潜在的なsiRNA配列が同定されれば、当技術分野において公知の様々な基準を用いて配列を解析することができる。例えば、それらのサイレンシング効率を増強させるために、siRNA配列を合理的設計アルゴリズムによって解析し、以下の特色の1つまたは複数を有する配列を同定してもよい：（1）約25％〜約60％ G/CというG/C含有量；（2）センス鎖の位置15〜19における少なくとも3つのA/U；（3）内部反復がないこと；（4）センス鎖の位置19におけるA；（5）センス鎖の位置3におけるA；（6）センス鎖の位置10におけるU；（7）センス鎖の位置19にG/Cがないこと；および（8）センス鎖の位置13にGがないこと。これらの特色の各々の好適な値を割り当てるアルゴリズムを組み入れ、かつsiRNAの選択に有用であるsiRNA設計ツールを、例えば、http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNAで見出すことができる。当業者は、1つまたは複数の前述の特徴がある配列を、潜在的なsiRNA配列としてのさらなる解析および検査のために選択し得るということを正しく理解すると考えられる。
【０１０３】
さらに、以下の基準の1つまたは複数がある潜在的なsiRNA標的配列を多くの場合siRNAとして消去することができる：（1）4つまたはそれより多くの連続した同じ塩基のストレッチを含む配列；（2）Gのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特徴によるあり得る非特異的効果を低下させるため）；（3）三重の塩基モチーフ（例えば、GGG、CCC、AAA、またはTTT）を含む配列；（4）7つまたはそれより多くの連続したG/Cのストレッチを含む配列；および（5）内部の折り返し構造を結果的にもたらす候補の中に4つまたはそれより多くの塩基の直接反復を含む配列。しかしながら、当業者は、1つまたは複数の前述の特徴がある配列を、潜在的なsiRNA配列としてのさらなる解析および検査のために依然として選択し得るということを正しく理解すると考えられる。
【０１０４】
幾つかの態様において、例えば、Khvorova et al., Cell, 115；209-216（2003）；およびSchwarz et al., Cell, 115：199-208（2003）に記載されたようなsiRNA二重鎖非対称性に基づいて、潜在的なsiRNA標的配列をさらに解析してもよい。その他の態様において、例えば、Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318：303-310（2004）に記載されたようなmRNA標的部位における二次構造に基づいて、潜在的なsiRNA標的配列をさらに解析してもよい。例えば、Mfoldアルゴリズム（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgiで入手可能）を用いてmRNA二次構造を構築し、塩基対合およびステムループの形態におけるより少ない二次構造が存在する mRNA標的部位での接近可能性に有利に働くsiRNA配列を選択することができる。
【０１０５】
ひとたび潜在的なsiRNA配列が同定されれば、例えば、インビトロサイトカインアッセイまたはインビボ動物モデルを用いて、任意の免疫刺激特性の存在について解析することができる。GUに富むモチーフ（例えば、5'-GU-3'、5'-UGU-3'、5'-GUGU-3'、5'-UGUGU-3'など）のようなsiRNA配列のセンスおよび／またはアンチセンス鎖におけるモチーフは、配列が免疫刺激性であり得るかどうかについての指標を提供することもできる。ひとたびsiRNA分子が免疫刺激性であることが分かれば、その後、それを修飾し、本明細書において記載されたようなその免疫刺激特性を減少させることができる。非限定的な例として、細胞が検出可能な免疫応答を産生するような条件下で、siRNA配列を哺乳動物レスポンダー細胞と接触させ、siRNAが免疫刺激性のあるsiRNAであるかまたは免疫刺激性のないsiRNAであるかを決定することができる。哺乳動物レスポンダー細胞は、ナイーブな哺乳動物（すなわち、siRNA配列の遺伝子産物と以前に接触したことがない哺乳動物）由来であってもよい。哺乳動物レスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）、マクロファージ、およびそれらと同様の細胞であってもよい。検出可能な免疫応答は、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12、またはその組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生を含んでもよい。その後、センスおよび／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドの少なくとも1つを修飾ヌクレオチドと取り替えることによって、免疫刺激性であると同定されたsiRNA分子を修飾し、その免疫刺激特性を減少させることができる。例えば、siRNA二重鎖の二本鎖領域におけるヌクレオチドの約30％未満（例えば、約30％、25％、20％、15％、10％、または5％未満）を2'OMeヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドと取り替えることができる。その後、修飾siRNAを上記のような哺乳動物レスポンダー細胞と接触させ、その免疫刺激特性が低下しまたは阻止されたことを確認することができる。
【０１０６】
免疫応答を検出するための好適なインビトロアッセイには、Davidらの二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫アッセイ技術（米国特許第4,376,110号）；モノクローナル-ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Kirkham and Hunter, 編, Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh（1970）における、Wide et al.）；Gordonらの「ウェスタンブロット」法（米国特許第4,452,901号）；標識したリガンドの免疫沈降（Brown et al., J. Biol. Chem., 255：4980-4983（1980））；例えば、Raines et al., J. Biol. Chem., 257：5154-5160（1982）によって記載されたような酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）；フルオロクロムの使用を含む、免疫細胞化学技術（Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39：477（1980））；および活性の中和（Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：2396-2400（1984））が含まれるが、これらに限定されない。上記の免疫アッセイに加えて、米国特許第3,817,827号；米国特許第3,850,752号；米国特許第3,901,654号；米国特許第3,935,074号；米国特許第3,984,533号；米国特許第3,996,345号；米国特許第4,034,074号；および米国特許第4,098,876号に記載されたものを含む、多くのその他の免疫アッセイが利用可能である。
【０１０７】
免疫応答を検出するためのインビボモデルの非限定的な例として、以下のように行なうことができるインビボのマウスサイトカイン誘導アッセイが含まれる：（1）側部尾静脈における標準的な静脈注射によってsiRNAを投与することができる；（2）投与約6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカイン解析用の血漿として処理することができる；ならびに（3）製造元の取扱説明書に従ってサンドイッチELISAキット（例えば、マウスおよびヒトIFN-α（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）；ヒトIL-6およびTNF-α（eBioscience；San Diego, CA）；ならびにマウスIL-6、TNF-α、およびIFN-γ（BD Biosciences；San Diego, CA））を用いてサイトカインを定量化することができる。
【０１０８】
サイトカインおよび増殖因子に特異的に結合するモノクローナル抗体は複数の源から市販され、および当技術分野において公知の方法を用いて作製することができる（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256；495-497（1975）；ならびにHarlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York（1999）参照）。モノクローナル抗体の作製は以前に記載され、および当技術分野において公知の任意の手段によって遂行することができる（例えば、Hybridoma, 第10巻, 第1号, 77-78頁（1991）における、Buhring et al.参照）。幾つかの方法において、検出を容易にするために（例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、化学的手段、およびそれらと同様の手段によって検出可能な任意の組成物によって）モノクローナル抗体を標識する。
【０１０９】
B、siRNA分子の作製
例えば、1つまたは複数の単離された小さい干渉RNA（siRNA）二重鎖としての形態を含む幾つかの形態で、siRNA分子を提供することができる。siRNA配列は、突出部（例えば、Elbashir et al., Genes Dev., 15：188（2001）もしくはNykanen et al., Cell, 107：309（2001）に記載されたような3'もしくは5'突出部）を有してもよく、または突出部を欠いて（すなわち、平滑末端を有して）もよい。
【０１１０】
好ましくは、siRNA分子を化学合成する。Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109：7845（1987）；Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18：5433（1990）；Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23：2677-2684（1995）；およびWincott et al., Methods Mol. Bio., 74：59（1997）に記載されたものなどの、当技術分野において公知の様々な技術のいずれかを用いて、siRNA分子を含む一本鎖分子を合成することができる。本発明での使用の一般的方法を開示するさらなる基礎的テキストとして、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第2版, 1989）；Kriegler, Gene Transfer and Expression：A Laborartory Manual（1990）およびCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al., 編, 1994）が含まれる。一本鎖分子の合成は、5’末端のジメトキシトリチルおよび3’末端のホスホロアミダイトなどの、共通の核酸保護基および共役基を利用する。非限定的な例として、2'-O-メチル化ヌクレオチド用の2.5分の共役工程を伴う0.2μmol規模のプロトコルを用いて、Applied Biosystems合成機で小規模合成を実施することができる。あるいは、Protogene（Palo Alto, CA）からの96-ウェルプレート合成機で0.2μmol規模での合成を行なうことができる。しかしながら、より大きいまたはより小さい規模の合成もまた、本発明の範囲内である。siRNA一本鎖分子の合成のための好適な試薬、RNA脱保護のための方法、およびRNA精製のための方法は当業者に公知である。
【０１１１】
その後切断されて、siRNA二重鎖を形成するようにハイブリダイズする別々の断片または鎖を提供する切断可能なリンカーによって隔てられた一本の連続的な断片または鎖として両方の鎖を合成する、タンデム合成技術によって、siRNA分子を合成することもできる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであることができる。siRNAのタンデム合成をマルチウェル／マルチプレート合成プラットフォームの両方だけでなく、バッチ反応器、合成カラム、およびそれらと同様のものを利用する大規模合成プラットフォームにも容易に適合させることができる。あるいは、一方の鎖がセンス鎖を含み、および他方がsiRNAのアンチセンス鎖を含む、2つの異なる一本鎖分子からsiRNA分子を組み立てることができる。例えば、各々の鎖を別々に合成し、ならびに合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションまたはライゲーションによってつなぎ合わせることができる。ある種のその他の例において、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域がハイブリダイズしてヘアピン二次構造を有するsiRNA二重鎖を形成する、一本の連続的断片として、siRNA分子を合成することができる。
【０１１２】
C、siRNA配列の修飾
ある種の局面において、本発明のsiRNA分子は、各々の鎖が長さ約15〜約60ヌクレオチドである、2つの鎖および二本鎖領域における少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを有する二重鎖を含む。好都合なことに、修飾siRNAは、対応する未修飾siRNA配列と比べ免疫刺激性が小さいが、標的配列の発現を抑制する能力を保持する。
【０１１３】
本発明での使用に好適な修飾ヌクレオチドの例として、2'-O-メチル（2'OMe）、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）、2'-デオキシ、5-C-メチル、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）、4'-チオ、2'-アミノ、または2'-C-アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag編（1984）に記載されたもののようなノーザン立体構造を有する修飾ヌクレオチドもまた、本発明のsiRNA分子での使用に好適である。そのような修飾ヌクレオチドには、ロック核酸（LNA）ヌクレオチド（例えば、2'-O、4'-C-メチレン-(D-リボフラノシル)ヌクレオチド）、2'-O-(2-メトキシエチル)（MOE）ヌクレオチド、2'-メチル-チオ-エチルヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'F）ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-クロロ（2'Cl）ヌクレオチド、および2'-アジドヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある種の例において、本発明のsiRNA分子には、1つまたは複数のG-クランプヌクレオチドが含まれる。G-クランプヌクレオチドは、その修飾によって二重鎖内部の相補的グアニンヌクレオチドのWatson-Crick面とHoogsteen面の両方に水素結合する能力が与えられる修飾されたシステイン類似体を指す。（例えば、Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 120：8531-8532（1998）参照）。さらに、例えば、C-フェニル、C-ナフチル、その他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに3-ニトロピロール、4-ニトロインドール、5-ニトロインドール、および6-ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体（例えば、Loakes, Nucl. Acids Res., 29：2437-2447（2001）参照）などのヌクレオチド塩基類似体を有するヌクレオチドを本発明のsiRNA分子の中に取り込ませることができる。
【０１１４】
ある種の態様において、本発明のsiRNA分子は、末端キャップ部分、リン酸骨格修飾、およびそれらと同様のものなどの1つまたは複数の化学修飾をさらに含む。末端キャップ部分の例として、反転デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、4',5'-メチレンヌクレオチド、1(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3',4'-セコヌクレオチド、非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3'-3'-反転ヌクレオチド部分、3'-3'-反転脱塩基部分、3'-2'-反転ヌクレオチド部分、3'-2'-反転脱塩基部分、5'-5'-反転ヌクレオチド部分、5'-5'-反転脱塩基部分、3'-5'-反転デオキシ脱塩基部分、5'-アミノ-アルキルリン酸、1,3-ジアミノ-2-プロピルリン酸、3-アミノプロピルリン酸、6-アミノヘキシルリン酸、1,2-アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、1,4-ブタンジオールリン酸、3'-ホスホロアミデート、5'-ホスホロアミデート、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、3'-リン酸、5'-アミノ、3'-ホスホロチオエート、5'-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および架橋もしくは非架橋メチルホスホネートまたは5'-メルカプト部分を含むが、これらに限定されるわけではない（例えば、米国特許第5,998,203号；Beaucage et al., Tetrahedron 49；1925（1993）参照）。リン酸骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間の連結を結果的にもたらす）の非限定的な例として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルフォリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、およびアルキルシリル置換が含まれる（例えば、Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417（1995）の中の、Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties；Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39（1994）の中の、Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides参照）。そのような化学修飾は、siRNAのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の5’末端および／または3’末端に生じることができる。
【０１１５】
幾つかの態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、約1つ〜約4つ（例えば、1つ、2つ、3つ、もしくは4つ）の3'-デオキシリボヌクレオチドならびに／または修飾および未修飾ヌクレオチドの任意の組み合わせを有する3’末端突出部をさらに含むことができる。本発明の修飾siRNA分子の中に導入することができる修飾ヌクレオチドおよび化学修飾の種類のさらなる例は、例えば、英国特許第GB2,397,818B号ならびに米国特許公報第2004019626号および第20050282188号に記載されている。
【０１１６】
本発明の修飾siRNA分子は、siRNAの1つまたは両方の鎖に1つまたは複数の非ヌクレオチドを任意で含むことができる。本明細書において使用する場合、「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはリン酸置換を含む、1つまたは複数のヌクレオチド単位の場所における核酸鎖の中に取り込ませることができ、ならびに残りの塩基がそれらの活性を示すのを可能にする任意の基または化合物を指す。基または化合物は、それがアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの一般的に認識されるヌクレオチド塩基を含まず、およびそれゆえに1’位置の塩基を欠くという点で、脱塩基である。
【０１１７】
その他の態様において、siRNAの化学修飾は、化学修飾siRNA分子にコンジュゲートを付着させる工程を含む。コンジュゲートは、例えば、生分解性リンカーなどの共有結合性の付着を介して化学修飾siRNAのセンスおよび／またはアンチセンス鎖の5'および／または3’末端に付着させることができる。コンジュゲートは、例えば、カルバメート基またはその他の連結基を通して化学修飾siRNAに付着させることもできる（例えば、米国特許公報第20050074771号、第20050043219号、および第20050158727号参照）。ある種の例において、コンジュゲートは、化学修飾siRNAの細胞内への送達を容易にする分子である。本発明の化学修飾siRNAへの付着に好適なコンジュゲート分子の例として、コレステロールなどのステロイド、ポリエチレングリコール（PEG）などのグリコール、ヒト血清アルブミン（HSA）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸塩（例えば、葉酸、葉酸塩類似体、およびその誘導体）、糖（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコースなど）、リン脂質、ペプチド、細胞摂取を媒介することができる細胞受容体のリガンド、ならびにその組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない（例えば、米国特許公報第20030130186号、第20040110296号、第20040249178号；および米国特許第6,753,423号参照）。その他の例として、米国特許公報第20050119470号および第20050107325に記載された親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、インターカーレーター、マイナーグルーブバインダー、切断薬剤、およびクロスリンキング薬剤のコンジュゲート分子が含まれる。またその他の例として、米国特許公報第20050153337号に記載された2'-O-アルキルアミン、2'-O-アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、C5-カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジニウム基、アミジニニウム基、カチオン性アミノ酸のコンジュゲート分子が含まれる。さらなる例として、米国特許公報第20040167090号に記載された疎水性基、膜活性化合物、細胞貫通性化合物、細胞標的化シグナル、相互作用修飾物、および立体安定化剤のコンジュゲート分子が含まれる。さらなる例として、米国特許公報第20050239739号に記載されたコンジュゲート分子が含まれる。使用されるコンジュゲートの種類および化学修飾siRNA分子へのコンジュゲーションの程度を、完全なRNAi活性を保持したままでの改善された薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、および／またはsiRNAの安定性について評価することができる。そのようなものとして、当業者は、様々な周知のインビトロ細胞培養またはインビボ動物モデルを用いて、それに付着した様々なコンジュゲートを有する化学修飾siRNA分子をスクリーニングし、改善された特性および完全なRNAi活性を有する化学修飾siRNA分子を同定することができる。
【０１１８】
D、標的遺伝子
本明細書において記載された修飾siRNA分子を用いて、関心対象の遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方調節または抑制することができる。関心対象の遺伝子には、ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子、代謝の疾患および障害（例えば、肝臓の疾患および障害）と関連する遺伝子、腫瘍発生および細胞形質転換と関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症性応答および自己免疫応答と関連する遺伝子などの免疫調節因子遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害と関連する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子には、細胞と結合し、細胞内に侵入し、細胞内で複製するためにウイルスによって発現される遺伝子が含まれる。特に対象となるのは、慢性ウイルス疾患と関連するウイルス配列である。特に対象となるウイルス配列には、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスなどのフィロウイルス（例えば、米国特許出願第11/584,341号；およびGeisbert et al., J. Infect. Dis., 193：1650-1657（2006）参照）；ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、およびサビアウイルスなどのアレナウイルス（FIELDS VIROLOGY, Knipe et al.（編）, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia,（2001）の中の、Buchmeier et al., Arenaviridae：the viruses and their replication）；インフルエンザA、B、およびCウイルスなどのインフルエンザウイルス（例えば、米国仮特許出願第60/737,945号；Steinhauer et al., Annu Rev Genet., 36：305-332（2002）；ならびにNeumann et al., J Gen Virol., 83：2635-2662（2002）参照）；肝炎ウイルス（Hamasaki et al., FEBS Lett., 543：51（2003）；Yokota et al., EMBO Rep., 4：602（2003）；Schlomai et al., Hepatology, 37：764（2003）；Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：2783（2003）；Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：2014（2003）；およびFIELDS VIROLOGY, Knipe et al.（編）, 第4版, Lippincott-Raven, Philadelphia,（2001））；ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（Banerjea et al., Mol. Ther., 8：62（2003）；Song et al., J. Virol., 77：7174（2003）；Stephenson, JAMA, 289：1494（2003）；Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100：183（2003））；ヘルペスウイルス（Jia et al., J. Virol., 77：3301（2003））；ならびにヒトパピローマウイルス（HPV）（Hall et al., J. Virol., 77：6066（2003）；Jiang et al., Oncogene, 21：6041（2002））の配列が含まれる。
【０１２０】
抑制することができる例示的なフィロウイルス核酸配列には、構造タンパク質（例えば、VP30、VP35、核タンパク質（NP）、ポリメラーゼタンパク質（L-pol））および膜関連タンパク質（例えば、VP40、糖タンパク質（GP）、VP24）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。エボラウイルスについての完全なゲノム配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_002549；AY769362；NC_006432；NC_004161；AY729654；AY354458；AY142960；AB050936；AF522874；AF499101；AF272001；およびAF086833に示されている。エボラウイルスVP24配列は、例えば、Genbankアクセッション番号U77385およびAY058897に示されている。エボラウイルスL-pol配列は、例えば、Genbankアクセッション番号X67110に示されている。エボラウイルスVP40配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058896に示されている。エボラウイルスNP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058895に示されている。エボラウイルスGP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY058898；Sanchez et al., Virus Res., 29：215-240（1993）；Will et al., J. Virol., 67：1203-1210（1993）；Volchkov et al., FEBS Lett., 305：181-184（1992）；および米国特許第6,713,069号に示されている。さらなるエボラウイルス配列は、例えば、Genbankアクセッション番号L11365およびX61274に示されている。マールブルグウイルスについての完全なゲノム配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001608；AY430365；AY430366；およびAY358025に示されている。マールブルグウイルスGP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AF005734；AF005733；およびAF005732に示されている。マールブルグウイルスVP35配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AF005731およびAF005730に示されている。さらなるマールブルグウイルス配列は、例えば、Genbankアクセッション番号X64406；Z29337；AF005735；およびZ12132に示されている。
【０１２１】
抑制することができる例示的なインフルエンザウイルス核酸配列には、核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質（M1およびM2）、非構造タンパク質（NS1およびNS2、RNAポリメラーゼタンパク（PA、PB1、PB2）、ノイラミニダーゼ（NA）、ならびにヘマグルチニン（HA）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。インフルエンザA  NP配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_004522；AY818138；AB166863；AB188817；AB189046；AB189054；AB189062；AY646169；AY646177；AY651486；AY651493；AY651494；AY651495；AY651496；AY651497；AY651498；AY651499；AY651500；AY651501；AY651502；AY651503；AY651504；AY651505；AY651506；AY651507；AY651509；AY651528；AY770996；AY790308；AY818138；およびAY818140に示されている。インフルエンザA  PA配列は、例えば、Genbankアクセッション番号AY818132；AY790280；AY646171；AY818132；AY818133；AY646179；AY818134；AY551934；AY651613；AY651610；AY651620；AY651617；AY651600；AY651611；AY651606；AY651618；AY651608；AY651607；AY651605；AY651609；AY651615；AY651616；AY651640；AY651614；AY651612；AY651621；AY651619；AY770995；およびAY724786に示されている。
【０１２２】
抑制することができる例示的な肝炎ウイルス核酸配列には、転写および翻訳に関与する核酸配列（例えば、En1、En2、X、P）ならびに構造タンパク質（例えば、Cタンパク質およびC関連タンパク質を含むコアタンパク質、S、M、および／もしくはLタンパク質を含むカプシドおよびエンベロープタンパク質、またはその断片）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない（例えば、FIELDS VIROLOGY, 前記参照）。抑制することができる例示的なC型肝炎核酸配列には、セリンプロテアーゼ（例えば、NS3/NS4）、ヘリカーゼ（例えば、NS3）、ポリメラーゼ（例えば、NS5B）、ならびにエンベロープタンパク質（例えば、E1、E2、およびp7）が含まれるが、これらに限定されない。A型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001489に示され；B型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_003977に示され；C型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_004102に示され；D型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001653に示され；E型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001434に示され；およびG型肝炎核酸配列は、例えば、Genbankアクセッション番号NC_001710に示されている。ウイルスの感染および生存と関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングを、ウイルス状態を処置するために用いられる従来の薬剤の投与と組み合わせて適宜用いることができる。
【０１２３】
代謝の疾患および障害（例えば、肝臓が標的である障害ならびに肝臓の疾患および障害）と関連する遺伝子には、例えば、脂質異常症（例えば、LXRαおよびLXRβなどの肝臓X受容体（Genbankアクセッション番号NM_007121）、ファルネソイドX受容体（FXR）（Genbankアクセッション番号NM_005123）、ステロール調節性エレメント結合タンパク質（SREBP）、部位1プロテアーゼ（S1P）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素-A還元酵素（HMG補酵素-A還元酵素）、アポリポタンパク質（ApoB）、およびアポリポタンパク質（ApoE））；ならびに糖尿病（例えば、グルコース6-リン酸）で発現する遺伝子が含まれる（例えば、Forman et al., Cell, 81：687（1995）；Seol et al., Mol. Endocrinol., 9：72（1995）、Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94：7909（1997）；Sakai et al., Cell, 85：1037-1046（1996）；Duncan et al., J. Biol. Chem., 272：12778-12785（1997）；Willy et al., Genes Dev., 9：1033-1045（1995）；Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272：3137-3140（1997）；Janowski et al., Nature, 383：728-731（1996）；およびPeet et al., Cell, 93：693-704（1998）参照）。当業者は、代謝の疾患および障害（例えば、肝臓が標的である疾患および障害ならびに肝臓の疾患および障害）と関連する遺伝子には、肝臓自体で発現する遺伝子だけでなく、その他の臓器および組織で発現する遺伝子も含まれるということを正しく理解すると考えられる。代謝の疾患および障害と関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングを、本疾患または障害を処置するために用いられる従来の薬剤の投与と組み合わせて適宜用いることができる。
【０１２４】
腫瘍発生および細胞形質転換と関連する遺伝子配列の例として、Eg5などの有糸分裂キネシン；MLL融合遺伝子、BCL-ABL（Wilda et al., Oncogene, 21：5716（2002）；Scherr et al., Blood, 101：1566（2003））、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO、およびAML1-MTG8（Heidenreich et al., Blood, 101：3157（2003））などの転座配列；多剤耐性遺伝子（Nieth et al., FEBS Lett., 545：144（2003）；Wu et al., Cancer Res., 63：1515（2003））、サイクリン（Li et al., Cancer Res., 63：3593（2003）；Zou et al., Genes Dev., 16：2923（2002））、β-カテニン（Verma et al., Clin Cancer Res., 9：1291（2003））、テロメラーゼ遺伝子（Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2：209（2003））、c-MYC、N-MYC、BCL-2、ERBB1、およびERBB2（Nagy et al. Exp. Cell Res., 285：39（2003））などの過剰発現した配列；ならびにRASなどの突然変異した配列が含まれる（Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2：158（2002）で概説されている）。DNA修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法薬剤の投与と組み合わせて使用できる（Collis et al., Cancer Res., 63：1550（2003））。例えば、インテグリン、セレクチン、およびメタロプロテイナーゼなど、腫瘍遊走と関連するタンパク質をコードする遺伝子もまた、関心対象の標的配列である。前述の例に限られるわけではない。腫瘍発生もしくは細胞形質転換、腫瘍増殖、または腫瘍遊走を容易にしまたは促進する任意の全体的または部分的遺伝子配列を鋳型配列として含めることができる。
【０１２５】
血管新生遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。特に対象となるのは、血管内皮増殖因子（VEGF）（Reich et al., Mol. Vis., 9：210（2003））またはVEGFrである。VEGFrを標的するsiRNA配列は、例えば、GB2396864；米国特許公報第20040142895号；およびCA2456444に示されている。
【０１２６】
抗血管新生遺伝子は、新血管形成を阻害することができる。これらの遺伝子は、血管新生が疾患の病理学的発生に役割を果たす癌を処置するのに特に有用である。抗血管新生遺伝子の例として、エンドスタチン（例えば、米国特許第6,174,861号参照）、アンジオスタチン（例えば、米国特許第5,639,725号参照）、およびVEGF-R2（例えば、Decaussin et al., J. Pathol., 188：369-377（1999）参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
免疫調節因子遺伝子は、1つまたは複数の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節因子遺伝子の例として、増殖因子などのサイトカイン（例えば、TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCFなど）、インターロイキン（例えば、IL-2、IL-4、IL-12（Hill et al., J. Immunol., 171：691（2003））、IL-15、IL-18、IL-20など）、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γなど）、およびTNFが含まれるが、これらに限定されるわけではない。FasおよびFasリガンド遺伝子もまた、関心対象の免疫調節因子標的配列である（Song et al., Nat. Med., 9：347（2003））。例えば、Brutonのチロシンキナーゼ（Btk）（Heinonen et al., FEBS Lett., 527：274（2002））などのTecファミリーキナーゼなど、造血系およびリンパ様細胞における二次的なシグナリング分子をコードする遺伝子もまた、本発明に含まれる。
【０１２８】
細胞受容体リガンドには、細胞表面受容体（例えば、インスリン受容体、EPO受容体、G-タンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ活性のある受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体など）に結合し、受容体が関与する生理学的経路（例えば、グルコースレベル調節、血液細胞発生、有糸分裂誘発など）を調節する（例えば、阻害する、活性化するなど）ことができるリガンドが含まれる。細胞受容体リガンドの例として、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（EPO）、インスリン、グルカゴン、G-タンパク質共役受容体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない。トリヌクレオチド反復（例えば、CAG反復）の伸長をコードする鋳型は、球脊髄性筋萎縮症およびハンティングトン病などの、トリヌクレオチド反復の伸長によって引き起こされる神経変性障害で病原性配列を抑制することにおいて使用できる（Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11：175（2002））。
【０１２９】
治療目的のために上記遺伝子のいずれかの発現を抑制することにおけるその有用性に加えて、本明細書において記載されたsiRNAは、診断的適用、予防的適用、予後適用、臨床的適用、およびその他の健康管理上の適用だけでなく、研究適用および開発適用にも有用である。非限定的な例として、本発明の修飾siRNA分子を、関心対象の遺伝子が治療標的となるべき潜在的可能性を有するかどうかを試験することに向けられた標的バリデーション研究において用いることができる。本発明の修飾siRNA分子を、潜在的治療標的としての遺伝子を発見することを目指した標的同定研究において用いることもできる。
【０１３０】
IV、siRNAを含む担体系
ある局面において、本発明は、本明細書において記載された修飾siRNA分子を含む担体系を提供する。幾つかの態様において、担体系は、安定化された核酸-脂質粒子（例えば、SNALPもしくはSPLP）、カチオン性脂質もしくはリポソーム核酸複合体（すなわち、リポプレックス）、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、またはそれらの混合物などの脂質に基づく担体系である。その他の態様において、担体系は、カチオン性ポリマー-核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）などのポリマーに基づく担体系である。さらなる態様において、担体系は、サイクロデキストリンポリマー-核酸複合体などのサイクロデキストリンに基づく担体系である。さらなる態様において、担体系は、カチオン性ペプチド-核酸複合体などのタンパク質に基づく担体系である。好ましくは、担体系は、SNALPまたはSPLPなどの安定化された核酸-脂質粒子である。当業者は、本発明の修飾siRNA分子を裸のsiRNAとして送達することもできるということを正しく理解すると考えられる。
【０１３１】
A、安定化された核酸-脂質粒子
本発明の安定化された核酸-脂質粒子（SNALP）は典型的には、本明細書において記載されたような修飾siRNA分子、カチオン性脂質（例えば、式IまたはIIのカチオン性脂質）、および非カチオン性脂質を含む。SNALPは二重層安定化成分（すなわち、粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質）をさらに含むことができる。SNALPは、単独でまたは少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、もしくはそれより多くの未修飾siRNA分子と組み合わせて、本明細書において記載された修飾siRNA分子の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、もしくはそれより多くを含んでもよい。
【０１３２】
本発明のSNALPは、典型的には約50nm〜約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜約110nm、最も典型的には約70nm〜約90nmの平均直径を有し、および実質的に無毒である。さらに、核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸はヌクレアーゼによる分解に対して水性溶液中で抵抗性である。核酸-脂質粒子およびそれらの調製の方法は、例えば、米国特許第5,753,613号；第5,785,992号；第5,705,385号；第5,976,567号；第5,981,501号；第6,110,745号；および第6,320,017号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/40964号に開示されている。
【０１３３】
1、カチオン性脂質
様々なカチオン性脂質のいずれかを、単独かまたは1つもしくはその他の複数のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせるかのいずれかで、本発明の安定化された核酸-脂質粒子で使用してもよい。
【０１３４】
本発明において有用であるカチオン性脂質は、生理学的pHで正味の正の電荷を帯びる多くの脂質種のいずれかであることができる。そのような脂質には、DODAC、DODMA、DSDMA、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOSPA、DOGS、DC-Chol、DMRIE、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。多くのこれらの脂質および関連類似体は、米国特許公報第20060083780号；米国特許第5,208,036号；米国特許第5,264,618号；米国特許第5,279,833号；米国特許第5,283,185号；および米国特許第5,753,613号；および米国特許第5,785,992号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第96/10390号に記載されている。さらに、多くの市販のカチオン性脂質の調製物が入手可能であり、および本発明において用いることができる。これらには、例えば、LIPOFECTIN（登録商標）（GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USAからの、DOTMAおよびDOPEを含む市販されているカチオン性リポソーム）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（GIBCO/BRLからの、DOSPAおよびDOPEを含む市販されているカチオン性リポソーム）；ならびにTRANSFECTAM（登録商標）（Promega社, Madison, Wisconsin, USAからのDOGSを含む市販されているカチオン性リポソーム）が含まれる。
【０１３５】
さらに、以下の構造を有する式Iのカチオン性脂質が、本発明において有用である。
2009513151.tif 000048
式中、R1およびR2は独立に選択され、かつHまたはC1〜C3アルキルであり、R3およびR4は独立に選択され、かつ約10〜約20の炭素原子を含むアルキル基であり、ならびにR3およびR4の少なくとも1つは少なくとも2つの不飽和の部位を含む。ある種の例において、R3およびR4は両方とも同じであり、すなわち、R3およびR4は両方ともリノレイル（C18）などである。ある種のその他の例において、R3およびR4は異なり、すなわち、R3はテトラデカトリエニル（C14）であり、およびR4はリノレイル（C18）である。好ましい態様において、式Iのカチオン性脂質は対称的であり、すなわち、R3およびR4は両方とも同じである。別の好ましい態様において、R3およびR4の両方ともが少なくとも2つの不飽和の部位を含む。幾つかの態様において、R3およびR4は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、およびイコサジエニルから独立に選択される。好ましい態様において、R3およびR4は両方ともリノレイルである。幾つかの態様において、R3およびR4は少なくとも3つの不飽和の部位を含み、かつ例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、およびイコサトリエニルから独立に選択される。特に好ましい態様において、式Iのカチオン性脂質はDLinDMAまたはDLenDMAである。
【０１３６】
さらに、以下の構造を有する式IIのカチオン性脂質が、本発明において有用である。
2009513151.tif 000049
式中、R1およびR2は独立に選択され、かつHまたはC1〜C3アルキルであり、R3およびR4は独立に選択され、かつ約10〜約20の炭素原子を含むアルキル基であり、ならびにR3およびR4の少なくとも1つは少なくとも2つの不飽和の部位を含む。ある種の例において、R3およびR4は両方とも同じであり、すなわち、R3およびR4は両方ともリノレイル（C18）などである。ある種のその他の例において、R3およびR4は異なり、すなわち、R3はテトラデカトリエニル（C14）であり、およびR4はリノレイル（C18）である。好ましい態様において、本発明のカチオン性脂質は対称的であり、すなわち、R3およびR4は両方とも同じである。別の好ましい態様において、R3およびR4の両方ともが少なくとも2つの不飽和の部位を含む。幾つかの態様において、R3およびR4は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、およびイコサジエニルから独立に選択される。好ましい態様において、R3およびR4は両方ともリノレイルである。幾つかの態様において、R3およびR4は少なくとも3つの不飽和の部位を含み、かつ例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、およびイコサトリエニルから独立に選択される。
【０１３７】
カチオン性脂質は典型的には、粒子中に存在する全脂質の約2mol％〜約60mol％、約5mol％〜約50mol％、約10mol％〜約50mol％、約20mol％〜約50mol％、約20mol％〜約40mol％、約30mol％〜約40mol％、または約40mol％を含む。粒子の意図される使用に応じて、成分の割合を変えることができ、および例えば、エンドソーム放出パラメーター（ERP）アッセイを用いて特定の製剤の送達効率を測定することができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。例えば、全身送達のために、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約15mol％を含んでもよく、および局所または局部送達のために、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約30mol％〜約50mol％、または約40mol％を含んでもよい。
【０１３８】
2、非カチオン性脂質
本発明の安定化された核酸-脂質粒子において使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体を産生することができる様々な中性で無荷電性の、双性イオン性の、またはアニオン性の脂質のいずれかであることができる。それらは代わりに正または負に荷電していることができるが、それらは好ましくは中性である。非カチオン性脂質の例として、レシチン、フォスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾフォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ESM）、セファリン、カルジオリピン、フォスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（DOPG）、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール（DPPG）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE）、パルミトイルオレオイル-フォスファチジルグリセロール（POPG）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン 4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート（DOPE-mal）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE）、およびステアロイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE）などのリン脂質関連材料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。コレステロールなどの非カチオン性脂質またはステロールもまた、存在してもよい。さらなる非リン含有脂質には、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノールエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン-ラウリルスルフェート、アルキル-アリールスルフェート、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド、セラミド、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、およびそれらと同様のものが含まれる。リゾフォスファチジルコリンおよびリゾフォスファチジルエタノールアミンなどのその他の脂質もまた、存在してもよい。非カチオン性脂質には、米国特許出願第08/316,429号に記載されたような、PEG 2000、PEG 5000、およびリン脂質にコンジュゲートされたポリエチレングリコールまたはセラミドにコンジュゲートされたポリエチレングリコール（PEG-Cerと称される）などのポリエチレングリコールに基づくポリマーも含まれる。
【０１３９】
好ましい態様において、非カチオン性脂質は、ジアシルフォスファチジルコリン（例えば、ジステアロイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、およびジリノレオイルフォスファチジルコリン）、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン）、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は好ましくは、C10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非カチオン性脂質は、コレステロール、DOPE、またはESMの1つまたは複数を含む。
【０１４０】
非カチオン性脂質は典型的には、粒子中に存在する全脂質の約5mol％〜約90mol％、約10mol％〜約85mol％、約20mol％〜約80mol％、または約20mol％を含む。粒子は、コレステロールをさらに含んでもよい。存在する場合、コレステロールは典型的には、粒子中に存在する全脂質の約0mol％〜約10mol％、約2mol％〜約10mol％、約10mol％〜約60mol％、約12mol％〜約58mol％、約20mol％〜約55mol％、約30mol％〜約50mol％、または約48mol％を含む。
【０１４１】
3、二重層安定化成分
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明の安定化された核酸-脂質粒子は、ATTA-脂質または例えば、PCT刊行物国際公開公報第05/026372号に記載されたようなジアルキルオキシプロピルに共役したPEG（PEG-DAA）、例えば、米国特許公報第20030077829号および第2005008689号に記載されたようなジアシルグリセロールに共役したPEG（PEG-DAG）、フォスファチジルエタノールアミンのようなリン脂質に共役したPEG（PEG-PE）、セラミドにコンジュゲートされたPEG、もしくはそれらの混合物などのPEG-脂質のような二重層安定化成分（BSC）を含むことができる（例えば、米国特許第5,885,613号参照）。好ましい態様において、BSCは粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質である。好適なコンジュゲートされた脂質には、PEG-脂質コンジュゲート、ATTA-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-脂質コンジュゲート（CPL）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。別の好ましい態様において、粒子は、CPLと一緒にPEG-脂質コンジュゲートまたはATTA-脂質コンジュゲートのいずれかを含む。
【０１４２】
PEGは、2つの末端水酸基を持つ線状で、水溶性のエチレンPEG繰り返し単位のポリマーである。PEGはそれらの分子量によって分類される；例えば、PEG 2000は約2,000ダルトンの平均分子量を有し、およびPEG 5000は約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、Sigma Chemical社およびその他の会社から市販され、ならびに例えば、以下のものを含む：モノメトキシポリエチレングリコール（MePEG-OH）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシネート（MePEG-S）、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシニミジルスクシネート（MePEG-S-NHS）、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン（MePEG-NH2）、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレート（MePEG-TRES）、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル（MePEG-IM）。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール-酢酸（MePEG-CH2COOH）は、例えば、PEG-DAAコンジュゲートを含むPEG-脂質コンジュゲートを調製するのに特に有用である。
【０１４３】
好ましい態様において、PEGは、約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、およびさらにより好ましくは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。任意で、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基でPEGを置換することができる。PEGを直接脂質にコンジュゲートすることができ、またはリンカー部分を介して脂質に連結してもよい。例えば、エステルを含有しないリンカー部分およびエステルを含有するリンカー部分を含む、PEGを脂質に共役するための好適な任意のリンカー部分を用いることができる。好ましい態様において、リンカー部分はエステルを含有しないリンカー部分である。本明細書において使用する場合、「エステルを含有しないリンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル（-OC(O)-）を含まないリンカー部分を指す。好適なエステルを含有しないリンカー部分には、アミド（-C(O)NH-）、アミノ（-NR-）、カルボニル（-C(O)-）、カルバメート（-NHC(O)O-）、ウレア（-NHC(O)NH-）、ジスルフィド（-S-S-）、エーテル（-O-）、スクシニル（-(O)CCH2CH2C(O)-）、スクシンアミジル（-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-）、エーテル、ジスルフィドだけでなく、（カルバメートリンカー部分およびアミドリンカー部分の両方を含むリンカーなどの）その組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、カルバメートリンカーを用いてPEGを脂質に共役する。
【０１４４】
その他の態様において、エステルを含むリンカー部分を用いて、PEGを脂質に共役させる。好適なエステルを含むリンカー部分には、例えば、カルボネート（-OC(O)O-）、スクシノイル、リン酸エステル（-O-(O)POH-O-）、スルホン酸エステル、およびその組み合わせが含まれる。
【０１４５】
種々の鎖長および飽和の程度の様々なアシル鎖基を有するフォスファチジルエタノールアミンをPEGにコンジュゲートし、二重層安定化成分を形成することができる。そのようなフォスファチジルエタノールアミンは市販され、または当業者に公知の従来の技術を用いて単離もしくは合成することができる。C10〜C20の範囲の炭素鎖長を持つ飽和または不飽和脂肪酸を含むフォスファチジルエタノールアミンが好ましい。一価または二価不飽和脂肪酸ならびに飽和および不飽和脂肪酸の混合物を持つフォスファチジルエタノールアミンを用いることもできる。好適なフォスファチジルエタノールアミンには、ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号に開示された化合物を指すが、これらに限定されるわけではない。これらの化合物は、以下の式を有する化合物を含む：
2009513151.tif 000050
式中、Rは水素、アルキル、およびアシルからなる群より選択されるメンバーであり；R1は水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであり；または任意で、RおよびR1ならびにそれらが結合する窒素がアジド部分を形成し；R2は水素、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、およびアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるメンバーであり；R3は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ、ならびにR4およびR5が独立に水素またはアルキルである、NR4R5であり；nが4〜80であり；mが2〜6であり；pが1〜4であり；ならびにqが0または1である。その他のポリアミドを本発明の化合物において用いることができるということが当業者には明白であると考えられる。
【０１４７】
「ジアシルグリセロール」という用語は、その両方がエステル連結によってグリセロールの1-および2-位置に結合した2から30の炭素を独立に有する、2つの脂肪アシル鎖、R1およびR2、を有する化合物を指す。アシル基は飽和しまたは種々の程度の不飽和を有することができる。好適なアシル基には、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）、およびイコシル（C20）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、R1およびR2は同じであり、すなわち、R1およびR2は両方ともミリスチル（すなわち、ジミリスチル）、R1およびR2は両方ともステアリル（すなわち、ジステアリル）などである。ジアシルグリセロールは以下の一般式を有する。
2009513151.tif 000051
【０１４８】
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、その両方が2から30の炭素を独立に有する、2つのアルキル鎖、R1およびR2、を有する化合物を指す。アルキル基は飽和しまたは種々の程度の不飽和を有することができる。ジアルキルオキシプロピルは以下の一般式を有する。
2009513151.tif 000052
【０１４９】
好ましい態様において、PEG-脂質は、以下の式を有するPEG-DAAコンジュゲートである：
2009513151.tif 000053
式中、R1およびR2は独立に選択され、かつ約10〜約22の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり；PEGはポリエチレングリコールであり；ならびにLは上記のようなエステルを含有しないリンカー部分またはエステルを含有するリンカー部分である。長鎖アルキル基は飽和したものまたは不飽和のものであることができる。好適なアルキル基には、ラウリル（C12）、ミリスチル（C14）、パルミチル（C16）、ステアリル（C18）、およびイコシル（C20）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、R1およびR2は同じであり、すなわち、R1およびR2は両方ともミリスチル（すなわち、ジミリスチル）、R1およびR2は両方ともステアリル（すなわち、ジステアリル）などである。
【０１５０】
上の式VIにおいて、PEGは、約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、およびさらにより好ましくは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの範囲に及ぶ平均分子量を有する。任意で、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基でPEGを置換することができる。好ましい態様において、メトシキまたはメチル基で末端水酸基を置換する。
【０１５１】
好ましい態様において、「L」はエステルを含有しないリンカー部分である。好適なエステルを含有しないリンカー部分には、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、ウレアリンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、エステルを含有しないリンカー部分は、カルバメートリンカー部分（すなわち、PEG-C-DAAコンジュゲート）である。別の好ましい態様において、エステルを含有しないリンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわち、PEG-A-DAAコンジュゲート）である。また別の好ましい態様において、エステルを含有しないリンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分（すなわち、PEG-S-DAAコンジュゲート）である。
【０１５２】
当業者に公知の標準的な技術および試薬を用いて、PEG-DAAコンジュゲートを合成する。PEG-DAAコンジュゲートは、様々なアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメート、およびウレア連結を含むということが認識されると考えられる。当業者は、これらの結合を形成するための方法および試薬が周知でありかつ容易に入手可能であるということを認識すると考えられる。例えば、March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY（Wiley 1992）、Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS（VCH 1989）；およびFurniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 第5版（Longman 1989）を参照されたい。存在する任意の官能基が、PEG-DAAコンジュゲートの合成において異なる点での保護および脱保護を必要とし得るということも正しく理解されると考えられる。当業者は、そのような技術が周知であるということを認識すると考えられる。例えば、Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS（Wiley 1991）を参照されたい。
【０１５３】
好ましくは、PEG-DAAコンジュゲートは、ジラウリルオキシプロピル（C12）-PEGコンジュゲート、ジミリスチルオキシプロピル（C14）-PEGコンジュゲート、ジパルミチルオキシプロピル（C16）-PEGコンジュゲート、またはジステアリルオキシプロピル（C18）-PEGコンジュゲートである。当業者は、その他のジアルキルオキシプロピルを本発明のPEG-DAAコンジュゲートに用いることができるということを容易に正しく理解すると考えられる。
【０１５４】
前述のことに加えて、その他の親水性ポリマーをPEGの代わりに用いることができるということが当業者には容易に明白であると考えられる。PEGの代わりに用いることができる好適なポリマーの例として、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミドおよびポリメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
前述の成分に加えて、本発明の粒子（例えば、SNALPまたはSPLP）は、正の電荷を与えるために脂質二重層への挿入が設計されているカチオン性ポリ（エチレングリコール）（PEG）脂質またはCPLをさらに含むことができる（例えば、Chen et al., Bioconj. Chem., 11：433-437（2000）参照）。本発明での使用のための好適なSPLPおよびSPLP-CPL、ならびにSPLPおよびSPLP-CPLを作製および使用する方法は、例えば、米国特許第6,852,334号およびPCT刊行物国際公開公報第00/62813号に開示されている。本発明において有用なカチオン性ポリマー脂質（CPL）は以下の構造上の特色を有する：（1）CPLを脂質二重層の中に取り込ませるための、疎水性脂質などの、脂質アンカー；（2）脂質アンカーをカチオン性頭部基に連結するための、ポリエチレングリコールなどの、親水性スペーサー；および（3）プロトン化可能なカチオン性頭部基を産生するための、天然のアミノ酸などの、ポリカチオン性部分。
【０１５６】
好適なCPLは、A、W、およびYが下記のようなものである、以下の式VIIの化合物を含む：
A-W-Y（VII）。
【０１５７】
式VIIに関して、「A」は、脂質アンカーとして作用する両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質などの脂質部分である。好適な脂質の例として、小胞形成脂質または小胞導入脂質が含まれ、ならびにジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
「W」は、親水性ポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは非免疫原性でありまたは低い固有の免疫原性を保有する生体適合性ポリマーである。あるいは、親水性ポリマーは、適当なアジュバントと共に用いられる場合、弱抗原性であることができる。好適な非免疫原性ポリマーには、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共ポリマー、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ポリマーは約250〜約7,000ダルトンの分子量を有する。
【０１５９】
「Y」はポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択されたpH、好ましくは生理学的pHで、正の電荷、好ましくは少なくとも2つの正の電荷を有する化合物、誘導体、官能基を指す。好適なポリカチオン性部分には、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；ならびにアミノ多糖が含まれる。ポリカチオン性部分は、構造が線状テトラリジンのような、線状、分岐状、またはデンドリマー状であることができる。ポリカチオン性部分は、選択されたpH値で、約2〜約15の正の電荷、好ましくは約2〜約12の正の電荷、およびより好ましくは約2〜約8の正の電荷を有する。望ましい粒子適用の種類によって、どのポリカチオン性部分を利用するかという選択を決定してもよい。
【０１６０】
ポリカチオン性部分上の電荷は、粒子部分の全体にわたって分布することができるか、またはあるいは、それらは粒子部分のある特定の区域における個別的な濃度の電荷密度、例えば、電荷スパイクであることができるかのいずれかである。電荷密度が粒子上に分布する場合、電荷密度は均等に分布することができまたは不均等に分布することができる。ポリカチオン性部分の電荷分布の全ての変形が本発明によって包含されている。
【０１６１】
脂質「A」および非免疫原性ポリマー「W」を、様々な方法によっておよび好ましくは共有結合性の付着によって付着させることができる。「A」および「W」の共有結合性の付着のために、当業者に公知の方法を用いることができる。好適な連結には、アミド、アミン、カルボキシル、カルボネート、カルバメート、エステル、およびヒドラゾン連結が含まれるが、これらに限定されない。「A」および「W」は、連結をもたらすように相補的な官能基を有しなければならないということが当業者には明白であると考えられる。一方は脂質上および他方はポリマー上にある、これら2つの基の反応は、所望の連結を提供すると考えられる。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、ならびに末端ヒドロキシルが、例えば、NHSおよびDCCによって、活性化されて活性エステルを形成し、その後ポリアミドと反応するように（例えば、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号参照）、アミノ基を含むポリマーと反応する場合、アミド結合が2つの基の間に形成されると考えられる。
【０１６２】
ある種の例において、ポリカチオン性部分は、標的化リガンドまたはカルシウムを複合体化するためのキレート部分などの、付着したリガンドを有することができる。好ましくは、リガンドが付着した後に、カチオン性部分は正の電荷を維持する。ある種の例において、付着するリガンドは正の電荷を有する。好適なリガンドとして、反応性官能基を持つ化合物または素子が含まれるが、これらに限定されず、および脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、生体材料、生体ポリマー、生物医学的素子、分析的に検出可能な化合物、治療的活性のある化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射性標識、フルオロゲン、ビオチン、薬物、ハプテン、DNA、RNA、多糖、リポソーム、ウイロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他の標的化部分、または毒素が含まれる。
【０１６３】
二重層安定化成分（例えば、PEG-脂質）は典型的には、粒子中に存在する全脂質の約0mol％〜約20mol％、約0.5mol％〜約20mol％、約1.5mol％〜約18mol％、約4mol％〜約15mol％、約5mol％〜約12mol％、または約2mol％を含む。当業者は、利用される二重層安定化成分および核酸-脂質粒子が融合性になる割合に応じて、二重層安定化成分の濃度を変えることができるということを正しく理解すると考えられる。
【０１６４】
二重層安定化成分の組成物および濃度を制御することによって、二重層安定化成分が核酸-脂質粒子から交換される割合および、今度は、核酸-脂質粒子が融合性になる割合を制御することができる。例えば、ポリエチレングリコール-フォスファチジルエタノールアミンコンジュゲートまたはポリエチレングリコール-セラミドコンジュゲートを二重層安定化成分として用いる場合、例えば、二重層安定化成分の濃度を変えることによって、ポリエチレングリコールの分子量を変えることによって、またはフォスファチジルエタノールアミンもしくはセラミド上のアシル鎖基の鎖長および飽和の程度を変えることによって、核酸-脂質粒子が融合性になる割合を変えることができる。さらに、例えば、pH、温度、イオン強度などを含むその他の変数を用いて、核酸-脂質粒子が融合性になる割合を変えおよび／または制御することができる。核酸-脂質粒子が融合性になる割合を制御するために用いることができるその他の方法は、この開示を読むと同時に、当業者に明白になると考えられる。
【０１６５】
B、さらなる担体系
本発明での使用に好適なさらなる脂質に基づく担体系の非限定的な例として、リポプレックス（例えば、米国特許公報第20030203865号；およびZhang et al., J. Control Release, 100：165-180（2004）参照）、pH感受性リポプレックス（例えば、米国特許公報第20020192275号参照）、逆に被覆されたリポプレックス（例えば、米国特許公報第20030180950号参照）、カチオン性脂質に基づく組成物（例えば、米国特許第6,756,054号；および米国特許公報第20050234232号参照）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許公報第20030229040号、第20020160038号、および第20020012998号；米国特許第5,908,635号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第01/72283号参照）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許公報第20030026831号参照）、pH感受性リポソーム（例えば、米国特許公報第20020192274号；および豪州特許第2003210303号参照）、抗体でコーティングされたリポソーム（例えば、米国特許公報第20030108597号；およびPCT刊行物国際公開公報第00/50008号参照）、細胞型特異的リポソーム（例えば、米国特許公報第20030198664号参照）、核酸およびペプチドを含むリポソーム（例えば、米国特許第6,207,456号参照）、放出可能な親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含むリポソーム（例えば、米国特許公報第20030031704号参照）、脂質でトラップされた核酸（例えば、PCT刊行物国際公開公報第03/057190号および第03/059322号参照）、脂質で封入された核酸（例えば、米国特許公報第20030129221号；および米国特許第5,756,122号参照）、その他のリポソーム組成物（例えば、米国特許公報第20030035829号および第20030072794号；ならびに米国特許第6,200,599号参照）、リポソームおよびエマルジョンの安定化された混合物（例えば、欧州特許第1304160号参照）、エマルジョン組成物（例えば、米国特許第6,747,014号参照）、ならびに核酸マイクロエマルジョン（例えば、米国特許公報第20050037086号参照）が含まれる。
【０１６６】
本発明での使用に好適なポリマーに基づく担体系の例として、カチオン性ポリマー-核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）が含まれるが、これに限定されない。ポリプレックスを形成するために、核酸（例えば、siRNA）は典型的には、細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用し、およびエンドサイトーシスによって細胞を侵入させることができる正に荷電した粒子の中に核酸を凝縮させる線状、分岐状、星状、または樹状のポリマー構造を有するカチオン性ポリマーと複合体を形成する。幾つかの態様において、ポリプレックスは、ポリエチレンイミン（PEI）（例えば、米国特許第6,013,240号参照；Qbiogene社（Carlsbad, CA）から、線状型のPEI である、In vivo jetPEI（商標）として市販されている）、ポリプロピレンイミン（PPI）、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリ-L-リジン（PLL）、ジエチルアミノエチル（DEAE）-デキストラン、ポリ（β-アミノエステル）（PAE）ポリマー（例えば、Lynn et al, J. Am. Chem. Soc., 123：8155-8156（2001）参照）、キトサン、ポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマー（例えば、Kukowska-Latallo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93：4897-4902（1996）参照）、ポルフィリン（例えば、米国特許第6,620,805号参照）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許公報第20040156909号参照）、多環式アミジニウム（例えば、米国特許公報第20030220289号参照）、第一級アミン、イミン、グアニジン、および／またはイミダゾール基を含むその他のポリマー（例えば、米国特許第6,013,240；PCT刊行物国際公開公報第9602655；PCT刊行物国際公開公報第95/21931；Zhang et al, J. Control Release, 100：165-180（2004）；およびTiera et al, Curr. Gene Ther., 6：59-71（2006））、ならびにそれらの混合物などのカチオン性ポリマーとの複合体を形成した核酸（例えば、siRNA）を含む。その他の態様において、ポリプレックスは、米国特許公報第20060211643号、第20050222064号、第20030125281号、および第20030185890号、ならびにPCT刊行物国際公開公報第03/066069号に記載されたようなカチオン性ポリマー-核酸複合体；米国特許公報第20040071654号に記載されたような生分解性ポリ（β-アミノエステル）ポリマー-核酸複合体；米国特許公報第20040142475号に記載されたようなポリマー性マトリックスを含む微粒子；米国特許公報第20030157030号に記載されたようなその他の微粒子組成物；米国特許公報第20050123600号に記載されたような凝縮した核酸複合体；ならびに豪州特許第2002358514号およびPCT刊行物国際公開公報第02/096551号に記載されたようなナノカプセルおよびマイクロカプセル組成物を含む。
【０１６７】
ある種の例において、修飾siRNA分子は、サイクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。サイクロデキストリンに基づく担体系の非限定的な例として、米国特許公報第20040087024号に記載されたサイクロデキストリン修飾ポリマー-核酸複合体；米国特許第6,509,323号、第6,884,789号、および第7,091,192号に記載された線状サイクロデキストリン共ポリマー-核酸複合体；ならびに米国特許第7,018,609号に記載されたサイクロデキストリンポリマー複合体化薬剤-核酸複合体が含まれる。ある種のその他の例において、修飾siRNA分子は、ペプチドまたはポリペプチドと複合体を形成してもよい。タンパク質に基づく担体系の例として、PCT刊行物国際公開公報第95/21931号に記載されたカチオン性オリゴペプチド-核酸複合体が含まれるが、これに限定されない。
【０１６８】
V、核酸-脂質粒子の調製
連続混合法、直接希釈処理、界面活性剤透析法、または有機溶媒を利用して成分の混合の間に単一相を提供する逆相法の修正を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によって、本明細書において記載された修飾siRNAが脂質二重層の中に封入されおよび分解から保護される、本発明の血清安定性の核酸-脂質粒子を形成することができる。
【０１６９】
好ましい態様において、カチオン性脂質は、式IおよびIIの脂質またはその組み合わせである。その他の好ましい態様において、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ESM）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（DOPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-フォスファチジルコリン（POPC）、ジパルミトイル-フォスファチジルコリン（DPPC）、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、14:0 PE（1,2-ジミリストイル-フォスファチジルエタノールアミン（DMPE））、16:0 PE（1,2-ジパルミイル-フォスファチジルエタノールアミン（DPPE））、18:0 PE（1,2-ジステアロイル-フォスファチジルエタノールアミン（DSPE））、18:1 PE（1,2-ジオレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（DOPE））、18:1 trans PE（1,2-ジエライドイル-フォスファチジルエタノールアミン（DEPE））、18:0-18:1 PE（1-ステアロイル-2-オレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（SOPE））、16:0-18:1 PE（1-パルミトイル-2-オレオイル-フォスファチジルエタノールアミン（POPE））、ポリエチレングリコールに基づくポリマー（例えば、PEG 2000、PEG 5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、もしくはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、またはその組み合わせである。さらにその他の好ましい態様において、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはその組み合わせである。
【０１７０】
好ましい態様において、本発明は、例えば、核酸（例えば、siRNA）を封入したリポソームを実質的に瞬時に産生するよう有機脂質溶液が水性溶液と混合するように、第一の貯留槽にsiRNAなどの核酸を含む水性溶液を提供する工程、第二の貯留槽に有機脂質溶液を提供する工程、および水性溶液を有機脂質溶液と混合する工程を含む処理などの、連続混合法によって産生される核酸-脂質粒子を提供する。この処理およびこの処理を進めるための装置は、米国特許公報第20040142025号に詳細に記載されている。
【０１７１】
混合チャンバーのような、混合環境に脂質および緩衝剤溶液を連続的に導入する行為によって、緩衝剤溶液による脂質溶液の連続希釈がもたらされ、それによって混合時に実質的に瞬時にリポソームが産生される。本明細書において使用される場合、「緩衝剤溶液によって脂質溶液を連続的に希釈する」という語句（および変化形）は通常、脂質溶液が小胞発生をもたらすほどの十分な力を伴って水和処理において十分に速やかに希釈されるということを意味する。核酸を含む水性溶液を有機脂質溶液と混合することによって、有機脂質溶液は、緩衝剤溶液（すなわち、水性溶液）の存在下で連続的で段階的な希釈を経て、核酸-脂質粒子を産生する。
【０１７２】
連続混合法を用いる形成された血清安定性の核酸-脂質粒子は典型的には、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、および均一な粒子サイズを達成するために任意でサイズが合わせられる。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、リポソーム溶液を形成する工程および即座にかつ直接的に制御された量の希釈緩衝剤を含む回収容器中にリポソーム溶液を導入する工程を含む直接希釈処理によって産生される核酸-脂質粒子を提供する。好ましい局面において、回収容器は、希釈を容易にするために回収容器の中身をかき混ぜるように構成された1つまたは複数の要素を含む。ある局面において、回収容器中に存在する希釈緩衝剤の量は、そこに導入されるリポソーム溶液の容量と実質的に等しい。非限定的な例として、等しい容量のエタノールを含む回収容器中に導入された場合の45％エタノール中のリポソーム溶液は、好都合なことに、約22.5％、約20％、または約15％エタノール中でよりも小さい粒子を産出すると考えられる。
【０１７４】
また別の態様において、本発明は、希釈緩衝剤を含む第三の貯留槽が第二の混合領域と流動的に接続された直接希釈処理によって産生される核酸-脂質粒子を提供する。この態様において、第一の混合領域で形成されたリポソーム溶液は、第二の混合領域で即座にかつ直接的に希釈緩衝剤と混合される。好ましい局面において、第二の混合領域は、リポソーム溶液および希釈緩衝剤が反対する180°の流れとして出会うように配置されたT字型コネクターを含む；しかしながら、例えば、約27°〜約180°の、より浅い角度を提供するコネクターを用いることができる。ポンプ機構は制御可能な希釈剤の流れを第二の混合領域に送達する。ある局面において、第二の混合領域に提供される希釈緩衝剤の流速は、第一の混合領域からそこに導入されるリポソーム溶液の流速と実質的に等しいように制御される。この態様は、好都合なことに、第二の混合領域でリポソーム溶液と混合する希釈緩衝剤の流れのより多くの制御を可能にし、およびそれゆえに第二の混合処理全体にわたる緩衝剤中でのリポソーム溶液の濃縮も可能にする。希釈緩衝剤の流速のそのような制御は、好都合なことに、低下した濃度での小さい粒子サイズの形成を可能にする。
【０１７５】
これらの処理およびこれらの直接希釈処理を実行するための装置は、米国特許出願第11/495,150号に詳細に記載されている。
【０１７６】
直接希釈処理を用いて形成される血清安定性の核酸-脂質粒子は典型的には、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、および均一な粒子サイズを達成するために任意でサイズが合わせられる。
【０１７７】
幾つかの態様において、界面活性剤透析を用いて粒子を形成する。任意の特定の形成の機構に束縛されることを意図しないが、siRNAなどの核酸をカチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させて、コーティングされた核酸複合体を形成する。これらのコーティングされた核酸は、凝集および沈殿する可能性がある。しかしながら、界面活性剤の存在は、この凝集を低下させ、かつコーティングされた核酸が過剰な脂質（典型的には、非カチオン性脂質）と反応し、核酸が脂質二重層の中に封入される粒子を形成することを可能にする。したがって、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）コーティングされた核酸-脂質複合体を形成するために、界面活性剤溶液中でカチオン性脂質と核酸を組み合わせ；
（b）核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成するために、コーティングされた核酸-脂質複合体と非カチオン性脂質を接触させ；ならびに
（c）核酸が脂質二重層の中に封入され、および粒子が血清安定性でかつ約50〜約150nmのサイズを有する、血清安定性の核酸-脂質粒子の溶液を提供するために、工程（b）の界面活性剤溶液を透析する。
【０１７８】
界面活性剤溶液中でカチオン性脂質と核酸を組み合わせることによって、コーティングされた核酸-脂質複合体の最初の溶液を形成する。これらの態様において、界面活性剤溶液は、好ましくは15〜300mM、より好ましくは20〜50mMの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水性溶液である。好適な界面活性剤の例として、例えば、N,N-((オクタノイルイミノ)-ビス-(トリメチレン))-ビス-(D-グルコンアミド)（BIGCHAP）；BRIJ 35；デオキシ-BIGCHAP；ドデシルポリ(エチレングリコール)エーテル；Tween 20；Tween 40；Tween 60；Tween 80；Tween 85；Mega 8；Mega 9；Zwittergent（登録商標）3-08；Zwittergent（登録商標）3-10；Triton X-405；ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、およびノニル-β-D-グルコピラノシド；ならびにヘプチルチオグルコピラノシドが含まれ；オクチルβ-D-グルコピラノシドおよびTween-20が最も好ましい。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は、典型的には約100mM〜約2M、好ましくは約200mM〜約1.5Mである。
【０１７９】
カチオン性脂質および核酸は典型的には、約1:1〜約20:1の電荷比（+/-）を産生するよう、約1:1〜約12:1の比で、または約2:1〜約6:1の比で、組み合わされると考えられる。さらに、溶液中の核酸の全体としての濃度は典型的には、約25μg/ml〜約1mg/ml、約25μg/ml〜約200μg/ml、または約50μg/ml〜約100μg/mlであると考えられる。典型的には、室温でコーティングされた複合体が形成されるのに十分な期間、界面活性剤溶液中の核酸およびカチオン性脂質の組み合わせを保つ。あるいは、核酸およびカチオン性脂質を界面活性剤溶液中で組み合わせ、および約37℃、約50℃、約60℃、または約70℃までの温度にまで暖めることができる。温度に特に感受性のある核酸については、より低い温度で、典型的には約4℃まで下げて、コーティングされた複合体を形成することができる。
【０１８０】
幾つかの態様において、形成された核酸-脂質粒子中の核酸 対 脂質比（質量／質量比）は、約0.01〜約0.2、約0.02〜約0.1、約0.03〜約0.1、または約0.01〜約0.08の範囲に及ぶと考えられる。出発材料の比もこの範囲内に収まる。その他の態様において、核酸-脂質粒子調製は、10mgの全脂質当たり約400μgの核酸を用い、または約0.01〜約0.08の、およびより好ましくは、50μgの核酸当たり1.25mgの全脂質に対応する、約0.04の核酸 対 脂質質量比を用いる。その他の好ましい態様において、粒子は、約0.08の核酸：脂質質量比を有する。
【０１８１】
その後、コーティングされた核酸-脂質複合体の界面活性剤溶液を非カチオン性脂質と接触させ、核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質の界面活性剤溶液を提供する。この工程に有用である非カチオン性脂質として、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、およびセレブロシドが含まれる。好ましい態様において、非カチオン性脂質は、ジアシルフォスファチジルコリン、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはC10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非カチオン性脂質は、DSPC、DOPE、POPC、卵フォスファチジルコリン（EPC）、コレステロール、またはそれらの混合物である。最も好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、インビボでの増強された特性を持つ融合性粒子であり、および非カチオン性脂質はDSPCまたはDOPEである。さらに、本発明の核酸-脂質粒子は、コレステロールをさらに含んでもよい。その他の好ましい態様において、非カチオン性脂質は、例えば、米国特許第5,820,873号および米国特許公報第20030077829号に記載されたような、PEG 2,000、PEG 5,000、およびジアシルグリセロール、セラミド、またはリン脂質にコンジュゲートされたPEGなどのポリエチレングリコールに基づくポリマーをさらに含むことができる。さらに好ましい態様において、非カチオン性脂質は、PEG 2,000、PEG 5,000、およびジアルキルオキシプロピルにコンジュゲートされたPEGなどのポリエチレングリコールに基づくポリマーをさらに含むことができる。
【０１８２】
本方法において用いられる非カチオン性脂質の量は典型的には、50μgの核酸に対して約2〜約20mgの全脂質である。好ましくは、全脂質の量は、50μgの核酸当たり約5〜約10mgである。
【０１８３】
核酸-脂質複合体および非カチオン性脂質の界面活性剤溶液の形成後、好ましくは透析によって、界面活性剤を除去する。界面活性剤の除去は、核酸を取り囲む脂質二重層の形成を結果的にもたらし、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズを有する血清安定性の核酸-脂質粒子を提供する。このように形成された粒子は凝集せず、および均一な粒子サイズを達成するために任意でサイズが合わせられる。
【０１８４】
リポソームのサイズを合わせるために利用可能な方法のいずれかによって、血清安定性の核酸-脂質粒子のサイズを合わせることができる。所望のサイズ範囲および比較的狭い分布の粒子サイズを達成するために、サイジングを実施してもよい。
【０１８５】
粒子のサイズを所望のサイズに合わせるために、幾つかの技術が利用可能である。リポソーム用に用いられかつ本粒子にも等しく適用可能な、あるサイジング法が、米国特許第4,737,323号に記載されている。バス型またはプローブ型超音波処理のいずれかによって粒子懸濁を超音波処理することによって、サイズが約50nm未満の粒子まで下がった漸進的なサイズ低下が産生される。ホモジナイゼーションは、より大きい粒子をより小さい粒子に断片化するのを剪断エネルギーに頼る別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順において、典型的には約60から約80nmの、選択された粒子サイズが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して粒子を再循環させる。両方の方法において、従来のレーザービーム粒子サイズ識別、またはQELSによって、粒子サイズ分布をモニターすることができる。
【０１８６】
小さい孔のポリカーボネート膜または非対称のセラミック膜を通した粒子の押し出しもまた、粒子サイズを比較的明確なサイズ分布まで低下させるための有効な方法である。典型的には、所望の粒子サイズ分布が達成されるまで、1回または複数回、膜を通して懸濁を循環させる。粒子を、連続的により小さい孔の膜を通して押し出し、サイズの段階的低下を達成してもよい。
【０１８７】
別の群の態様において、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）有機溶媒中でカチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む混合物を調製し；
（b）きれいな単一相を提供するために、工程（a）における混合物と核酸の水性溶液を接触させ；ならびに
（c）核酸が脂質二重層の中に封入され、および粒子が血清中で安定でありかつ約50〜約150nmのサイズを有する、核酸-脂質粒子の懸濁を提供するために、有機溶媒を除去する。
【０１８８】
この群の態様において有用である核酸（例えば、siRNA）、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質は、上の界面活性剤透析法について記載された通りである。
【０１８９】
有機溶媒の選択は典型的には、溶媒極性および粒子形成のより後ろの段階で溶媒を除去することができる容易さについての考慮を伴う。可溶化薬剤としても用いられる、有機溶媒は、核酸および脂質のきれいな単一相混合物を提供するのに十分な量にある。好適な溶媒には、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、またはプロパノール、イソプロパノール、ブタノール、tert-ブタノール、iso-ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールなどのその他の脂肪族アルコールが含まれるが、これらに限定されない。2つまたはそれより多くの溶媒の組み合わせもまた、本発明において用いてもよい。
【０１９０】
典型的には水性溶液である、第一の核酸の溶液および第二の脂質の有機溶液を一緒に混合することによって、カチオン性および非カチオン性脂質の有機溶液と核酸を接触させることを遂行してもよい。当業者は、任意の数の方法によって、例えば、ボルテックスミキサーを用いることによるような機械的手段によって、この混合が起こることができるということを理解すると考えられる。
【０１９１】
核酸を脂質の有機溶液と接触させた後、有機溶媒を除去し、このようにして血清安定性の核酸-脂質粒子の水性懸濁を形成させる。有機溶媒を除去するのに用いられる方法は典型的には、低下した圧力での蒸発または不活性ガス（例えば、窒素もしくはアルゴン）の蒸気を混合物のいたる所に吹き付けることを伴うと考えられる。
【０１９２】
このようにして形成された血清安定性の核酸-脂質粒子は典型的には、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズに合わされていると考えられる。さらなるサイズ低下または粒子におけるサイズの均一性を達成するために、上記のようにサイジングを実施することができる。
【０１９３】
その他の態様において、本方法は、本組成物を用いた細胞への送達を結果としてもたらすのに有用である非脂質性ポリカチオンを添加する工程をさらに含むと考えられる。好適な非脂質性ポリカチオンの例として、臭化ヘキサジメトリン（Aldrich Chemical社, Milwaukee, Wisconsin, USAから、POLYBRENE（登録商標）というブランド名で販売されている）またはその他のヘキサジメトリンの塩が含まれるが、これらに限定されない。その他の好適なポリカチオンとして、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。
【０１９４】
ある種の態様において、単相系（例えば、BlighおよびDyer単相もしくは同様の水性溶媒および有機溶媒の混合物）または好適な混合を伴う2相系のいずれかで、核酸-脂質粒子の形成を実行することができる。
【０１９５】
複合体の形成を単相系で実行する場合、カチオン性脂質および核酸を大量の単相混合物中で各々溶解させる。2つの溶液の組み合わせは、複合体が形成される単一の混合物を提供する。あるいは、カチオン性脂質が（水性相の中に存在する）核酸に結合し、かつ有機相の中にそれを「引っ張る」2相混合物中で複合体が形成されることができる。
【０１９６】
別の態様において、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）核酸-脂質混合物を形成するために、非カチオン性脂質および界面活性剤を含む溶液と核酸を接触させ；
（b）核酸の負の電荷の部分を中和し、かつ電荷が中和された核酸および脂質の混合物を形成するために、核酸-脂質混合物とカチオン性脂質を接触させ；ならびに
（c）核酸を分解から保護する、核酸-脂質粒子を提供するために、電荷が中和された混合物から界面活性剤を除去する。
【０１９７】
ある群の態様において、非カチオン性脂質および界面活性剤の溶液は水性溶液である。第一の核酸の溶液ならびに第二の脂質および界面活性剤の溶液を一緒に混合することによって、非カチオン性脂質および界面活性剤の溶液と核酸を接触させることを典型的に遂行する。当業者は、任意の数の方法によって、例えば、ボルテックスミキサーを用いることによるような機械的手段によって、この混合が起こることができるということを理解すると考えられる。好ましくは、核酸溶液は界面活性剤溶液でもある。本方法において用いられる非カチオン性脂質の量は典型的には、用いられるカチオン性脂質の量に基づいて決定され、および典型的にはカチオン性脂質の量の約0.2〜約5倍、好ましくは用いられるカチオン性脂質の量の約0.5〜約2倍である。
【０１９８】
幾つかの態様において、例えば、米国特許出願第09/744,103号に記載されたように、核酸を事前に凝縮させる。
【０１９９】
このようにして形成された核酸-脂質混合物をカチオン性脂質と接触させ、存在する核酸（またはその他のポリアニオン性材料）と関連する負の電荷の部分を中和する。用いられるカチオン性脂質の量は典型的には、核酸の負の電荷の少なくとも50％を中和するのに十分であると考えられる。好ましくは、負の電荷は、少なくとも70％中和され、より好ましくは少なくとも約90％中和されると考えられる。本発明において有用であるカチオン性脂質には、例えば、DLinDMAおよびDLenDMAが含まれる。これらの脂質および関連類似体は米国特許公報第20060083780号に記載されている。
【０２００】
多くの技術のいずれかによって、好ましくはカチオン性脂質の溶液および核酸-脂質混合物を含む溶液を一緒に混合することによって、核酸-脂質混合物とカチオン性脂質を接触させることを遂行する。2つの溶液を混合する（または任意のその他のやり方で接触させる）と同時に、核酸と関連する負の電荷の部分は中和される。それでもなお、核酸は未凝縮の状態にとどまり、かつ親水性の特徴を獲得する。
【０２０１】
カチオン性脂質を核酸-脂質混合物と接触させた後、界面活性剤（または界面活性剤および有機溶媒の組み合わせ）を除去し、このようにして核酸-脂質粒子を形成させる。界面活性剤を除去するのに用いられる方法は典型的には、透析を伴うと考えられる。有機溶媒が存在する場合、典型的には、低下した圧力での蒸発によってまたは不活性ガス（例えば、窒素もしくはアルゴン）の蒸気を混合物のいたる所に吹き付けることによって、除去を遂行する。
【０２０２】
このようにして形成された粒子は典型的には、約50nm〜数ミクロン、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、または約70nm〜約90nmのサイズに合わされていると考えられる。さらなる粒子のサイズ低下またはサイズの均一性を達成するために、核酸-脂質粒子を超音波処理し、濾過し、またはリポソーム製剤化で用いられかつ当業者に公知であるその他のサイジング技術に供することができる。
【０２０３】
その他の態様において、本方法は、本組成物を用いた細胞のリポフェクションをもたらすのに有用である非脂質性ポリカチオンを添加する工程をさらに含むと考えられる。好適な非脂質性ポリカチオンの例として、臭化ヘキサジメトリン（Aldrich Chemical社, Milwaukee, Wisconsin, USAから、POLYBRENE（登録商標）というブランド名で販売されている）またはその他のヘキサジメトリンの塩が含まれる。その他の好適なポリカチオンとして、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩の添加は、好ましくは粒子が形成された後である。
【０２０４】
別の局面において、血清安定性の核酸-脂質粒子を以下のように調製することができる：
（a）疎水性の核酸-脂質複合体を提供するために、溶液中で核酸と大量のカチオン性脂質を接触させ；溶液は約15〜35％の水および約65〜85％の有機溶媒を含み、かつカチオン性脂質の量は約0.85〜約2.0の+/-電荷比を産生するのに十分であり；
（b）核酸-脂質混合物を提供するために、溶液中の疎水性の、核酸-脂質複合体を非カチオン性脂質と接触させ；ならびに
（c）核酸を分解から保護する核酸-脂質粒子を提供するために、核酸-脂質混合物から有機溶媒を除去する。
【０２０５】
本発明のこの局面において有用である核酸（例えば、siRNA）、非カチオン性脂質、カチオン性脂質、および有機溶媒は、界面活性剤を用いた上の方法について記載されたものと同じである。ある群の態様において、工程（a）の溶液は単相である。別の群の態様において、工程（a）の溶液は2相である。
【０２０６】
好ましい態様において、非カチオン性脂質は、ESM、DSPC、DOPC、POPC、DPPC、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、DMPE、DPPE、DSPE、DOPE、DEPE、SOPE、POPE、PEGに基づくポリマー（例えば、PEG 2000、PEG 5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、もしくはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、またはその組み合わせである。さらにその他の好ましい態様において、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはその組み合わせである。
【０２０７】
ある態様において、核酸は本明細書において記載されたようなsiRNAであり；カチオン性脂質は、DLindMA、DLenDMA、DODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGS、またはその組み合わせであり；非カチオン性脂質は、ESM、DOPE、PEG-DAG、DSPC、DPPC、DPPE、DMPE、モノメチル-フォスファチジルエタノールアミン、ジメチル-フォスファチジルエタノールアミン、DSPE、DEPE、SOPE、POPE、コレステロール、またはその組み合わせ（例えば、DSPCおよびPEG-DAA）であり；ならびに有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはその組み合わせである。
【０２０８】
上のように、好ましくはボルテックスミキサーを用いることによるような機械的手段によって、第一の核酸の溶液ならびに第二の脂質の溶液を一緒に混合することによって、カチオン性脂質と核酸を接触させることを典型的に遂行する。結果として生じる混合物は、上記のような複合体を含む。その後、非カチオン性脂質の添加および有機溶媒の除去によって、これらの複合体を粒子に変換する。複合体を含む混合物に非カチオン性脂質の溶液を単に添加することによって、非カチオン性脂質の添加を典型的に遂行する。逆の添加も用いることができる。当業者に公知でかつ上で記載もされた方法によって、その後の有機溶媒の除去を遂行する。
【０２０９】
本発明のこの局面において用いられる非カチオン性脂質の量は典型的には、電荷が中和された核酸-脂質複合体を提供するのに用いられたカチオン性脂質の（モル基準での）量の約0.2〜約15倍の量である。好ましくは、量は用いられたカチオン性脂質の量の約0.5〜約9倍である。
【０２１０】
ある態様において、上記の方法に従って調製する核酸-脂質粒子は、正味の電荷が中性であるかまたはより大きい遺伝子リポフェクション活性を粒子に提供する全体としての電荷を帯びるかのいずれかである。好ましくは、粒子の核酸成分は、非所望のタンパク質の産生を干渉する核酸である。その他の好ましい態様において、非カチオン性脂質はコレステロールをさらに含んでもよい。
【０２１１】
SNALP-CPL（CPL含有SNALP）を作るための様々な一般的方法を本明細書において議論する。2つの一般的技術として、「挿入後」技術、すなわち、例えば、予め形成されたSNALPの中へのCPLの挿入、および例えば、SNALP形成工程の間にCPLを脂質混合物中に含む、「標準」技術が含まれる。挿入後技術は、主にSNALP二重層膜の外面にCPLを有するSNALPを結果的にもたらすのに対し、標準技術は内面および外面の両方にCPLを有するSNALPを提供する。本方法は、（コレステロールを含むことができる）リン脂質から作られた小胞にとりわけ有用であり、ならびに（PEG-DAAおよびPEG-DAGなどの）PEG-脂質を含む小胞にもとりわけ有用である。SNALP-CPLを作る方法は、例えば、米国特許第5,705,385号；米国特許第6,586,410号；米国特許第5,981,501号；米国特許第6,534,484号；および米国特許第6,852,334号；米国特許公報第20020072121号；ならびにPCT刊行物国際公開公報第00/62813号に教示されている。
【０２１２】
VI、キット
本発明はまた、キット形態での核酸-脂質粒子を提供する。キットは、核酸-脂質粒子の様々な要素（例えば、核酸および粒子の個々の脂質成分）を収納するために区画化されている容器を含んでもよい。幾つかの態様において、キットは、エンドソーム膜不安定化剤（例えば、カルシウムイオン）をさらに含んでもよい。キットは典型的には、それらの再水和および投与のための取扱説明書と共に、好ましくは脱水和形態で、本発明の核酸-脂質粒子組成物を含む。ある種の例において、粒子および／または粒子を含む組成物は、粒子の表面に付着した標的化部分を有してもよい。（本粒子中に用いられるもののような）脂質に標的化部分（例えば、抗体、タンパク質）を付着させる方法は当業者に公知である。
【０２１３】
VII、核酸-脂質粒子の投与
ひとたび形成されれば、本発明の血清安定性の核酸-脂質粒子は、細胞内への核酸（例えば、siRNA）の導入に有用である。したがって、本発明はまた、細胞内に核酸（例えば、siRNA）を導入するための方法を提供する。最初に上記のような粒子を形成し、その後核酸の細胞への送達が起こるのに十分な期間、粒子を細胞と接触させることによって、本方法をインビトロまたはインビボで実行する。
【０２１４】
本発明の核酸-脂質粒子を、そ共に混合または接触させるほとんど全ての細胞型に吸着させることができる。ひとたび吸着すれば、粒子は、細胞のある部分によってエンドサイトーシスされるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合するのいずれかが可能である。粒子の核酸部分の移動または取り込みは、これらの経路のいずれか1つを介して起こることができる。特に、融合が起こる場合、粒子膜は細胞膜に統合され、および粒子の中身が細胞内の流体と組み合わさる。
【０２１５】
本発明の核酸-脂質粒子を、単独でまたは投与の経路および標準的な薬学的慣例に一致して選択される薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水もしくはリン酸緩衝剤）との混合物としてのいずれかで投与することができる。通常、規定の緩衝食塩水（例えば、135〜150mM NaCl）が薬学的に許容される担体として利用されると考えられる。その他の好適な担体として、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような、安定性の増強のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、およびそれらと同様のものが含まれる。さらなる好適な担体は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版（1985）に記載されている。本明細書において使用される場合、「担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散剤、媒体、コーティング剤、希釈剤、抗菌薬剤および抗真菌薬剤、等張でかつ吸収を遅延させる薬剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁、コロイド、ならびにそれらと同様のものを含む。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与された場合にアレルギー性のまたは同様の都合の悪い反応を産生しない分子実体および組成物を指す。
【０２１６】
薬学的に許容される担体は通常、粒子形成後に添加される。したがって、粒子が形成された後、粒子を規定の緩衝食塩水などの薬学的に許容される担体の中に希釈することができる。
【０２１７】
薬学的製剤中の粒子の濃度は、幅広く、すなわち、重量で約0.05％未満から、通例約2〜5％でまたは少なくとも約2〜5％で、約10〜90％と同じ程度まで変化することができ、および選択される投与の特定の様式に一致して、主として流体容量、粘度などによって選択されると考えられる。例えば、処置と関連する流体負荷を下げるために濃度を増大させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症関連のうっ血性心不全または重症高血圧を有する患者において特に望ましい可能性がある。あるいは、刺激性のある脂質から構成される粒子を低濃度まで希釈して、投与の部位での炎症を緩和してもよい。
【０２１８】
本発明の薬学的組成物を、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。水性溶液を使用のために包装し、または無菌条件下で濾過し、および凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌水性溶液と組み合わせる。組成物は、pH調整薬剤およびpH緩衝薬剤、張性調整薬剤、ならびにそれらと同様のものなどの、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含むことができる。さらに、粒子懸濁は、保管時のフリーラジカルおよび過酸化傷害から脂質を保護する脂質保護薬剤を含んでもよい。αトコフェロールなどの、親油性のフリーラジカルクエンチャーおよびフェリオキサミンなどの、水溶性の鉄特異的キレート剤が好適である。
【０２１９】
A、インビボ投与
インビボ治療のための全身送達、すなわち、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療的核酸の送達が、PCT刊行物国際公開公報第96/40964号ならびに米国特許第5,705,385号；第5,976,567号；第5,981,501号；および第6,410,328号に開示されたものなどの核酸-脂質粒子を用いて達成されている。この後者の形式は、血清におけるヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性であり、サイズが小さく、かつ反復投薬に好適である完全に封入された核酸-脂質粒子を提供する。
【０２２０】
インビボ投与について、投与は、当技術分野において公知の任意の様式、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内もしくは気管内）、経皮適用、または直腸投与によるものであることができる。単回または分割用量で、投与を遂行することができる。非経口的に、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に、薬学的組成物を投与することができる。幾つかの態様において、薬学的組成物をボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与する（例えば、米国特許第5,286,634号参照）。細胞内核酸送達はまた、Straubringer et al., Methods Enzymol., 101：512（1983）；Mannino et al., Biotechniques, 6：682（1988）；Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6：239（1989）；およびBehr, Acc. Chem. Res., 26：274（1993）で議論されている。脂質に基づく治療薬を投与するさらにその他の方法は、例えば、米国特許第3,993,754号；第4,145,410号；第4,235,871号；第4,224,179号；第4,522,803号；および第4,588,578号に記載されている。疾患の部位での直接注射によってまたは疾患の部位から遠位の部位での注射によって、脂質-核酸粒子を投与することができる（例えば、Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert社, Publishers, New York. 70-71頁（1994）参照）。
【０２２１】
本発明の組成物を、単独かまたはその他の好適な成分と組み合わせるかのいずれかで、吸入（例えば、鼻腔内もしくは気管内）によって投与されるべきエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）（Brigham et al., Am. J. Sci., 298：278（1989）参照）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、およびそれらと同様のものなどの、圧縮された許容される推進剤の中に置くことができる。
【０２２２】
ある種の態様において、鼻腔内スプレー、吸入、および／またはその他のエアロゾル送達媒体によって、薬学的組成物を送達してもよい。鼻エアロゾルスプレーによって直接肺に核酸組成物を送達するための方法は、例えば、米国特許第5,756,353号および第5,804,212号に記載されている。同じく、鼻腔内微粒子樹脂およびリゾフォスファチジル-グリセロール化合物（米国特許第5,725,871号）を用いた薬物の送達もまた、薬学の技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態での経粘膜的な薬物送達は、米国特許第5,780,045号に記載されている。
【０２２３】
例えば、関節内（関節における）、静脈内、筋肉内、経皮、腹腔内、および皮下経路によるなどの、非経口的な投与に好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピアントの血液と等張にする溶質を含むことが出来る、水性および非水性で、等張の滅菌注射溶液、ならびに懸濁薬剤、可溶化剤、増粘薬剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁が含まれる。この発明の実施において、組成物は好ましくは、例えば、静脈内注入で、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄空内に投与される。
【０２２４】
通常、静脈内に投与される場合、核酸-脂質製剤は好適な薬学的担体と共に製剤化される。多くの薬学的に許容される担体を本発明の組成物および方法において利用してもよい。本発明での使用のための好適な製剤が、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版（1985）に見出される。例えば、水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、およびそれらと同様のものなどの、様々な水性担体が用いられてもよく、ならびにアルブンミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような、安定性の増大のための糖タンパク質を含んでもよい。通常、規定の緩衝食塩水（135〜150mM NaCl）が薬学的に許容される担体として利用されると考えられるが、その他の好適な担体で十分間に合うと考えられる。濾過などの、従来のリポソーム滅菌技術によって、これらの組成物を滅菌することができる。組成物は、pH調整薬剤およびpH緩衝薬剤、張性調整薬剤、浸潤薬剤、ならびにそれらと同様のものなどの、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。これらの組成物を上で参照された技術を用いて滅菌することができまたは、あるいは、それらを滅菌条件下で産生することができる。結果として生じる水性溶液を使用のために包装し、または無菌条件下で濾過し、および凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した調製物は投与前に滅菌水性溶液と組み合わせる。
【０２２５】
ある種の適用において、本明細書において開示された核酸-脂質粒子を、経口投与によって個人に送達してもよい。粒子を賦形剤と共に取り込ませ、かつ摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、ピル、薬用ドロップ、エリキシル、うがい薬、懸濁、経口スプレー、シロップ、ウエハー、およびそれらと同様のものの形態で用いてもよい（例えば、米国特許第5,641,515号、第5,580,579号、および第5,792,451号参照）。これらの経口投薬形態はまた、以下のものを含んでもよい：結合剤、ゼラチン；賦形剤、潤滑剤、および／または風味を付ける薬剤。単位投薬形態がカプセルである場合、それは、上記の材料に加えて、液体担体を含んでもよい。様々なその他の材料が、コーティング剤としてまたは投薬単位の物理的形態をそうでないように修飾するために存在してもよい。勿論、任意の単位投薬形態を調製する際に用いられる任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ利用される量では実質的に無毒であるべきである。
【０２２６】
粒子のパーセンテージは、勿論、様々に異なり得、かつ便宜的に全製剤の重量または容量の約1％もしくは2％から約60％もしくは70％の間またはそれより多くであり得るが、典型的には、これらの経口製剤は、核酸-脂質粒子の少なくとも約0.1％またはそれより多くを含んでもよい。当然、好適な投薬が任意の所与の単位用量の化合物において得られるようなやり方で、各々の治療的に有用な組成物中の粒子の量を調製してもよい。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品の貯蔵期限などの要因だけでなく、その他の薬理学的考慮も、そのような薬学的製剤を調製する当業者によって企図されると考えられ、ならびにそのようなものとして、様々な投薬および処置計画が望ましい可能性がある。
【０２２７】
経口投与に好適な製剤は以下からなることができる：（a）水、食塩水、またはPEG 400のような希釈剤に懸濁された有効量の包装された核酸（例えば、siRNA）などの、液体溶液；（b）所定の量の核酸（例えば、siRNA）を、液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして各々含む、カプセル、小袋、または錠剤；（c）適当な液体中の懸濁；ならびに（d）好適なエマルジョン。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびその他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝薬剤、湿潤薬剤、防腐剤、風味を付ける薬剤、色素、崩壊薬剤、ならびに薬学的に適合する担体の1つまたは複数を含むことができる。薬用ドロップ形態は、例えば、スクロースなどの、風味の付いた核酸（例えば、siRNA）だけでなく、核酸（例えば、siRNA）に加えて、当技術分野において公知の担体を含む、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアエマルジョンなどの、不活性基材中に核酸（例えば、siRNA）を含む香錠、ゲル、ならびにそれらと同様のものも含むことができる。
【０２２８】
それらの使用の別の実施例において、核酸-脂質粒子を幅広い範囲の局所投薬形態に取り込ませることができる。例えば、核酸-脂質粒子を含む懸濁を、ゲル、油、エマルジョン、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、フォーム、ムース、およびそれらと同様のものとして製剤化および投与することができる。
【０２２９】
本発明の核酸-脂質粒子の薬学的調製物を調製する場合、精製して空の粒子を減少させもしくは排除した多量の粒子、または外部表面と関連した核酸を持つ多量の粒子を用いることが好ましい。
【０２３０】
本発明の方法を様々な宿主において実施してもよい。好ましい宿主として、鳥類（例えば、アヒル）、霊長類（例えば、ヒトおよびチンパンジーのみならずその他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、ならびにブタなどの、哺乳動物種が含まれる。
【０２３１】
投与される粒子の量は、核酸の脂質に対する比、用いられる特定の核酸、診断されている疾患状態、患者の年齢、体重、および様態、ならびに臨床医の判断によると考えられるが、通常体重のキログラム当たり約0.01から約50mgの間、好ましくは約0.1から約5mg/体重のkgの間、または投与（例えば、注射）当たり約108〜1010粒子であると考えられる。
【０２３２】
B、インビトロ投与
インビトロ適用のために、核酸（例えば、siRNA）の送達は、植物または動物起源、脊椎動物または無脊椎動物のどちらかの、および任意の組織または型の、培養で増殖した任意の細胞に対してであることができる。好ましい態様において、細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、および最も好ましくはヒト細胞である。
【０２３３】
インビトロで実行される場合、細胞と核酸-脂質粒子間の接触は、生物学的に適合性のある培地中で起こる。粒子の濃度は特定の適用に応じて幅広く変化するが、通常約1μmolから約10mmolの間である。通常、生理学的温度（約37℃）で約1〜48時間、好ましくは約2〜4時間の間、核酸-脂質粒子による細胞の処置を実行する。
【０２３４】
ある群の好ましい態様において、約103〜約105細胞/ml、より好ましくは約2×104細胞/mlの細胞密度を有する60〜80％コンフルエントなプレーティングされた細胞に、核酸-脂質粒子懸濁を添加する。細胞に添加される懸濁の濃度は、好ましくは約0.01〜0.2μg/ml、より好ましくは約0.1μg/mlである。
【０２３５】
エンドソーム放出パラメーター（ERP）アッセイを用いて、SNALPまたはその他の脂質に基づく担体系の送達効率を最適化することができる。ERPアッセイは米国特許公報第20030077829号に詳細に記載されている。より特に、ERPアッセイの目的は、エンドソーム膜の結合／摂取またはエンドソーム膜との融合／エンドソーム膜の不安定化に対するそれらの相対的な効果に基づいて、様々なカチオン性脂質とSNALPのヘルパー脂質成分の効果を区別することである。このアッセイにより、SNALPまたはその他の脂質に基づく担体系の各々の成分がどのくらい送達効率に影響を及ぼすのかを定量的に決定し、それによってSNALPまたはその他の脂質に基づく担体系を最適化することが可能となる。通例、ERPアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）など）の発現を測定し、および幾つかの例において、発現プラスミド用に最適化されたSNALP製剤は、干渉RNAを封入するのにも適当であると考えられる。その他の例において、干渉RNA（例えば、siRNA）の存在下または非存在下での標的配列の転写または翻訳の下方調節を測定するために、ERPアッセイを採用することができる。様々なSNALPまたはその他の脂質に基づく製剤の各々についてのERPを比較することによって、最適化された系、例えば、細胞における最大の摂取を有するSNALPまたはその他の脂質に基づく製剤を容易に決定することができる。
【０２３６】
C、干渉RNAの送達のための細胞
本発明の組成物および方法を用いて、インビボおよびインビトロで、多種多様な細胞型を処置する。好適な細胞として、例えば、造血前駆（幹）細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、骨格筋および平滑筋細胞、骨芽細胞、ニューロン、休止リンパ球、終末分化細胞、ゆっくりとした周期または非周期の初代細胞、柔組織細胞、リンパ様細胞、上皮細胞、骨細胞、ならびにそれらと同様の細胞が含まれる。
【０２３７】
干渉RNA（例えば、siRNA）を封入した核酸-脂質粒子のインビボ送達は、任意の細胞型の細胞を標的するのに適している。例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）、ウサギ、ブタ、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）などの、哺乳動物を含む、多種多様な脊椎動物の細胞と共に、本方法および組成物を利用することができる。
【０２３８】
細胞の組織培養が必要とされ得る程度は、当技術分野において周知である。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 第3版, Wiley-Liss, New York（1994）, Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross社（1977）、およびそこに引用された参照は、細胞の培養に対する一般的指針を提供している。培養細胞系は多くの場合、細胞の単層の形態にあると考えられるが、細胞懸濁も用いられる。
【０２３９】
D、SNALPの検出
幾つかの態様において、核酸-脂質粒子は、粒子の投与後約8、12、24、48、60、72、もしくは96時間、または、6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25、もしくは、28日で対象において検出可能である。対象由来の細胞、組織、またはその他の生物学的試料中で、粒子の存在を検出することができる。例えば、粒子の直接的検出、干渉RNA（例えば、siRNA）配列の検出、関心対象の標的配列の検出（すなわち、関心対象の配列の発現もしくは発現の低下を検出することによる）、またはその組み合わせによって、粒子を検出してもよい。
【０２４０】
1、粒子の検出
当技術分野において公知の任意の方法を用いて、核酸-脂質粒子を検出することができる。例えば、当技術分野において周知の方法を用いて、直接的にまたは間接的に、SNALPまたはその他の担体系の成分に標識を共役させることができる。多種多様な標識を用いることができ、標識の選択は、必要とされる感度、SNALP成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要求性、ならびに利用可能な器具類および使い捨て設備による。好適な標識として、蛍光色素（例えば、フルオレセインならびにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）などの、誘導体；ローダミンおよびTexas Red、テトラローダミンイソチオシアネート（TRITC）などのような誘導体）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、AMCA、CyDyes（商標）、ならびにそれらと同様のものなどのスペクトル標識；3H、125I、35S、14C、32P、33Pなどのような放射性標識；セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのような酵素；コロイド金もしくは着色ガラスなどのスペクトル比色標識またはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどのようなプラスチックビーズが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野において公知の手段を用いて、標識を検出することができる。
【０２４１】
2、核酸の検出
当業者に周知の多くの手段のいずれかによって、本発明において核酸（例えば、siRNA）を検出および定量する。核酸の検出は、サザン解析、ノーザン解析、ゲル電気泳動、PCR、放射性標識、シンチレーションカウンティング、およびアフィニティクロマトグラフィーなどの周知の方法によって進める。分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、および高拡散クロマトグラフィーなどのさらなる分析的で生化学的な方法も利用してもよい。
【０２４２】
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に公知である。例えば、共通の形式として、サンドイッチアッセイおよび競合または置き換えアッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば、「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」, Hames and Higgins編, IRL Press（1985）に概ね記載されている。
【０２４３】
検出されている標的核酸を増やす核酸増幅系の使用を通じて、ハイブリダイゼーションアッセイの感度を増強させてもよい。分子プローブとして使用するための配列を増幅するのにまたはその後のサブクローニングのための核酸断片を作製するのに好適なインビトロ増幅技術が公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Qβ-レプリカーゼ増幅、およびその他のRNAポリメラーゼを介する技術（例えば、NASBA（商標））を含む、そのようなインビトロ増幅法を通じて当業者を導くのに十分な技術の例は、Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2002）の中の、Sambrook et al.；およびAusubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Current Protocols, Greene Publishing Associates社およびJohn Wiley & Sons社（2002）だけでなく；米国特許第4,683,202号；PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications（Innis et al編）Academic Press社 San Diego, CA（1990）；Arnheim & Levinson（1990、October 1）, C&EN 36；The Journal Of NIH Research, 3：81（1991）；Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1173（1989）；Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：1874（1990）；Lomell et al., J. Clin. Chem., 35：1826（1989）；Landegren et al., Science, 241：1077（1988）；Van Brunt, Biotechnology, 8：291（1990）；Wu and Wallace, Gene, 4：560（1989）；Barringer et al., Gene, 89：117（1990）；ならびにSooknanan and Malek, Biotechnology, 13：563（1995）にも見出される。インビトロ増幅された核酸をクローニングする改良された方法は、米国特許第5,426,039号に記載されている。当技術分野において記載されたその他の方法は、核酸配列に基づく増幅系（NASBA（商標）, Cangene, Mississauga, Ontario）およびQβ-レプリカーゼ系である。これらの系を用いて突然変異体を直接同定することができ、この系では、選択配列が存在する場合にのみ、PCRまたはLCRプライマーが伸長しまたはライゲーションされるように設計されている。あるいは、通常、例えば、非特異的PCRプライマーを用いて選択配列を増幅し、および増幅された標的領域を、突然変異を示す特異的配列について後でプロービングすることができる。
【０２４４】
例えば、インビトロ増幅法において、プローブとして使用するための、遺伝子プローブとして、または阻害剤成分として使用するための核酸を、例えば、Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12：6159（1984）に記載されたような、自動化された合成機を用いて、Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22：1859（1981）によって記載された固体相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、典型的には化学的に合成する。必要な場合には、ポリヌクレオチドの精製を典型的には、未変性なアクリルアミドゲル電気泳動によるかまたはPearson et al., J. Chrom., 255：137-149（1983）に記載されたようなアニオン交換HPLCによるかのいずれかで行なう。Grossman and Moldave（編）Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65：499の中のMaxam and Gilbert（1980）の化学的分解法を用いて、合成ポリヌクレオチドの配列を確かめることができる。
【０２４５】
転写のレベルを決定するための代わりの手段は、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、かつAngerer et al., Methods Enzymol., 152：649（1987）に概ね記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を固体支持体、典型的にはガラススライドに固定する。DNAをプロービングしたい場合、熱またはアルカリで細胞を変性させる。その後、細胞を適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識されている特異的プローブのアニーリングを可能にする。好ましくは放射性同位元素または蛍光レポーターでプローブを標識する。
【０２４６】
VIII、実施例
本発明を以下の実施例によってより詳細に記載する。以下の実施例は例証的目的のために提示され、および決して本発明を限定するよう意図されない。当業者は、本質的に同じ結果を生み出すために変化させまたは修正することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識すると考えられる。
【０２４７】
実施例1、インビボで強力な遺伝子サイレンシングを媒介する非炎症性の合成siRNAの設計
この実施例は、siRNA二重鎖の一方の鎖における選択的位置での最小限の2'-O-メチル（2'OMe）修飾が、その配列とは無関係に、siRNAの免疫刺激活性を低下させまたは完全に阻止するのに十分であるということを例証する。実際、2'OMe修飾をsiRNA二重鎖の非標的化センス鎖に制限することによって、完全なRNAi活性を保持しながら、siRNAの免疫刺激活性を無効にすることができる。
【０２４８】
結果
ssRNA内部の2'OMe修飾は免疫刺激を阻止する。RNAによる免疫細胞活性化を阻害するのに必要とされる化学修飾の程度および種類を調べるために、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）siRNAに由来する一本鎖RNAポリヌクレオチド（ssRNA）のGUに富む免疫刺激モチーフ（Judge et al., Nat. Biotechnol., 23：457-462（2005））の中に2'OMeヌクレオチドを選択的に導入した。この検討で用いられたポリヌクレオチド配列を表1に提供する。β-galセンスssRNAにおける免疫刺激性のある5'-UGUGU-3'モチーフ（2'OMe GU）を含む5つのヌクレオチドの2'OMe修飾は、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）培養を脂質で封入されたssRNAで処置した場合、インターフェロン-α（IFN-α）誘導を完全に阻止した（図1A）。インターフェロン応答の阻害は、モチーフ内の2つのグアノシン（2'OMe 2×G）または3つのウリジン（2'OMe 3×U）ヌクレオチドのいずれかを選択的に修飾することによっても達成された。β-gal ssRNAの末端に向かって、UGUGUモチーフより3'の2つのグアノシン残基（2'OMe 2×G 3'）の選択的修飾もPBMC培養におけるインターフェロン応答の完全な阻止を結果的にもたらしたので、2'-O-メチル化の阻害的効果は、免疫刺激性のあるGUに富むモチーフ内のヌクレオチドの直接的な修飾を要求するようには見えなかった（図1A）。以前に記載されたように、未修飾の相補的なアンチセンス（AS）ssRNA配列は、これらのアッセイにおいてそもそも免疫刺激性がなかった（Judge et al., 前記）。カチオン性ポリマーのポリエチレンイミン（PEI）を用いてβ-gal ssRNAをPBMCに送達した場合、同様の結果が得られた（図2A）。
【０２４９】
ヒトおよびマウスApoBを標的するsiRNA二重鎖（Soutscheck et al., Nature, 432：173-178（2004））の構成要素である21および23塩基鎖の修飾に対して、同様のアプローチを適用した。そのGUに富むヌクレオチド配列（Heil et al., Science, 303：1526-1529（2004）；Judge et al., 前記）によって予想される通り、未修飾のApoB（AS）ssRNAは、低濃度でさえも、PBMC培養における強いIFN-α応答を刺激した（図1B）。この応答は、ApoB（AS）ssRNAにおける5'-GUGUG-3'モチーフ（2'OMe GU）を含む5つのヌクレオチドまたは6つのグアノシン（2'OMe G）もしくは7つのウリジン（2'OMe U）残基のいずれかの2'OMe修飾によって完全に阻害された（図1B）。脂質粒子の中に封入された未修飾で、相補的なApoBセンスポリヌクレオチド（ApoB（S））は、PBMCにおけるIFN-αを誘導しなかったが（図1B）、PEIポリプレックスとして送達される高用量のこのポリヌクレオチドはサイトカイン応答を活性化することが分かった。PEIとの複合体を形成したApoB（S）ssRNAに対するこの弱い応答も、2'OMeウリジン修飾によって阻害された。これらの知見は、ssRNA内部の2'OMe修飾ヌクレオチドの選択的取り込みが先天免疫細胞からのインターフェロン応答の刺激を防ぐのに十分であるということを示す。
【０２５０】
（表1）この検討で用いられたRNAポリヌクレオチド
2009513151.tif 000054
β-gal、ApoB、ApoBミスマッチ、およびvFLIP siRNAのセンス（S）およびアンチセンス（AS）鎖に対応する未修飾の（未変性な）および2'OMe修飾したRNAポリヌクレオチド。2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す。アステリスクは5'リン酸を表す。「dT」＝デオキシチミジン。
【０２５１】
siRNA内部の選択的なヌクレオチド修飾は免疫刺激を阻止する
siRNA二重鎖内部の選択的な2'OMe修飾もまた免疫刺激を阻害するかどうかを調べるために、それらの相補的な未修飾ポリヌクレオチドにアニールした2'OMe修飾センスまたはAS鎖を含む一連のβ-galおよびApoB siRNAを作製した（表1参照）。未修飾の（免疫刺激性のない）AS鎖とアニールした2'OMe修飾UGUGU、2×G、または3×Uセンス鎖のいずれかを含む脂質で封入された二本鎖β-gal siRNAは、ヒトPBMCからの検出可能なインターフェロン応答を誘導しなかった（図3A）。興味深いことに、センス鎖における未修飾の5'-UGUGU-3'モチーフと並置された、AS鎖における相補的な5'-ACACA-3'モチーフの選択的な2'OMe修飾もまた、未修飾の（免疫刺激性のある）センス鎖を含むアニールした二重鎖であるにもかかわらず、IFN‐α誘導のレベルを低減させた（図3A）。PEIを用いてβ-gal siRNAをPBMCに送達した場合、同様の結果が得られた（図2B）。同じく、未修飾ApoB siRNAはPBMCにおける強いIFN-α応答を誘導し、およびこの反応は、2'OMe GU、U、またはG修飾したAS鎖をApoB二重鎖に取り込ませた場合、完全に阻止された（図3B）。際立つことに、未修飾で、免疫刺激性のあるAS鎖にアニールした2'OMe GまたはU修飾したセンス鎖を含む修飾ApoB siRNAもまた、免疫刺激性がなくなった（図3B）。高濃度（675nM、〜9μg/ml）の修飾siRNAでさえもPBMC培養におけるIFN-αまたはTNFなどの炎症性サイトカインを誘導しなかったので、修飾ApoB siRNAのセンス鎖に対する2'OMe GまたはU修飾によるサイトカイン誘導の阻止は、完全であるように見えた（図3Bおよび3C）。
【０２５２】
しかしながら、2'OMe修飾シチジン残基を含むApoB siRNAが未変性な二重鎖によって誘導されるものと同様のサイトカインレベルを誘導したので、siRNAによる免疫刺激に対する2'-O-メチル化の阻害的効果が全てのパターンの修飾で観察されたわけではない（図3B）。2'OMeアデノシンの取り込みは、重大だが、完全ではない、サイトカイン応答の阻害を結果的にもたらした。2'OMe G、U、C、およびA修飾ApoBはそれぞれ、センス鎖に2つ、5つ、6つ、および8つの修飾ヌクレオチドを含むので、これらの相違は化学修飾の程度を単純には反映しなかった。これは、未修飾のUおよび／またはG残基が二重鎖siRNAの免疫認識において鍵となる役割を果たし得るということを示唆する。
【０２５３】
siRNA設計に対するこのアプローチが、siRNAに対する炎症性応答をインビボで首尾よく阻害するかどうかを確認するために、2'OMe修飾したβ-galおよびApoB siRNAの免疫刺激活性をマウスで検討評価した。センスまたはアンチセンス鎖のいずれかに2'OMe修飾グアノシンまたはウリジン残基を含む脂質で封入されたβ-gal（図4Aおよび4B）またはApoB（図4Cおよび4D）siRNAの静脈内投与は、血清のIFN-αまたはTNFなどの炎症性サイトカインの検出可能な増大をもたらさなかった。これは、これらのサイトカインのレベルの実質的な亢進を誘導した未修飾またはシトシン修飾siRNAとは著しく対照的であった。同様のアプローチをApoBミスマッチ（Soutschek et al., Nature, 432：173-178（2004））およびvFLIP（Guasparri et al., J. Exp. Med., 199：993-1003（2004））siRNA配列（表1参照）を修飾することに適用することによって、選択的な2'OMe修飾のこれらの際立った効果を確認した。ApoBミスマッチ（図4E）およびvFLIP（図4F）siRNA二重鎖について、RNA鎖のいずれか1つにおけるGUに富む領域またはウリジン残基のみのいずれかを修飾することによって、siRNA二重鎖によるサイトカイン誘導が完全に阻止された。修飾ApoBミスマッチsiRNAに対するサイトカイン応答の阻害は、ヒトPBMC培養でも確認された（図3Bおよび3C）。ApoBに関して、vFLIP siRNAへの2'OMe修飾シトシン残基の選択的取り込みは、IFN-α応答を実質的に低下させなかった（図4F）。試験された各々のsiRNA配列について、同様の結果が一貫して得られ、2'OMe修飾ウリジンまたはグアノシン残基の導入によって非炎症性のsiRNA二重鎖が生み出される。例えば、図5〜7は、2'OMeウリジンまたはグアノシン残基の導入が、表2で提供された5つのさらなるsiRNA配列の各々について、非炎症性のsiRNA二重鎖を産生するということを示す。総合すると、これらの知見は、短いRNA二重鎖の免疫認識のための根本的な機構はマウスとヒトの間で保存されているという結論を支持する（Judge et al, 前記；Hornung et al., Nat. Med., 11：263-270（2005））。これらの結果は、siRNA二重鎖のいずれかの鎖内のわずか2つの2'OMe修飾ヌクレオチドの取り込みによって、いずれの種でもこの機構を大いに混乱させることができるということを示す。
【０２５４】
（表2）この検討で用いられたさらなるRNAポリヌクレオチド
2009513151.tif 000055
β-gal、ルシフェラーゼ（Luc）、シクロフィリンB（Cyp B）、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（NP）、およびインフルエンザポリメラーゼ（PA） siRNAのセンス（S）およびアンチセンス（AS）鎖に対応する未修飾の（未変性な）および2'OMe修飾したRNAポリヌクレオチド。2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す。アステリスクは5'リン酸を表す。「dT」＝デオキシチミジン。
【０２５５】
siRNAセンス鎖に修飾を制限することによってRNAi活性が維持される
未変性なおよび2'OMe修飾したApoB siRNAの遺伝子サイレンシング活性をインビトロで検討評価した。リポソーム中に封入された未修飾ApoBは、HepG2細胞培養上清において、強力で、用量依存的なApoBタンパク質の阻害を引き起こした（図8）。推定IC50値（〜1.5nM）は、同様のインビトロモデルにおいてOligofectamineトランスフェクションを用いてこのsiRNA配列について確立されたものと一致した（Soutschek et al., 前記）。2'OMe修飾が非標的化センスまたはパッセンジャー鎖に制限されている修飾ApoB二重鎖は、未変性なsiRNAの活性と同様のApoBサイレンシング活性を示した（図8）。対照的に、標的化アンチセンス（AS）またはガイド鎖に対する修飾は、二重鎖のRNAi活性に重大な影響を与えた。AS鎖における2'OMeウリジンまたはグアノシン残基の取り込みがApoB遺伝子サイレンシングを阻止したのに対し、5'-GUGUG-3'修飾したAS鎖を含む二重鎖は、未変性なまたはセンスを修飾した二重鎖と比較して実質的に低下した活性（推定IC50＝〜15nM）を示した。未修飾または修飾ApoBミスマッチ対照siRNAはApoBタンパク質発現の有意な阻害をもたらさなかった（図8）。2'OMe修飾をβ-gal 728およびルシフェラーゼsiRNAのセンス鎖に制限するという同様の戦略もまた、完全なRNAi活性を保持する非炎症性siRNAを作製するのに成功することが分かった（図6〜7）。遺伝子サイレンシング活性に対するAS鎖修飾の負の影響は、特に5'末端での、siRNA二重鎖のAS鎖の2'OMe修飾がRNAi活性を低下させることができるということを示す以前の仕事（Prakash et al., J. Med. Chem., 48：4247-4253（2005））と一致するが、AS鎖に対する広範囲にわたる2'OMe修飾を許容することができるsiRNA配列が同定されている（Morrissey et al., Hepatology, 41：3149-1356（2005）；Czauderna et al., Nucl. Acids Res., 31：2705-2716（2003））。これらのデータは、siRNAのセンス鎖に制限された、選択的な2'OMe修飾が、RNAi活性に負に影響を与えるという機会を低下させながら、siRNAによる免疫活性化の問題を克服する強固なアプローチを提示するということを例証する。これらの結果は、従来設計された合成siRNAの大部分を包含する、先天免疫応答を刺激する本来備わっている潜在能力を持つ、全てではないが、多くのsiRNA配列に対して、このアプローチを適用することができるということを示す。
【０２５６】
インビボでの免疫刺激を伴わない強力なRNAi活性
インビボでの遺伝子発現および免疫刺激を抑制するそれらの能力について、2'OMe修飾したApoB siRNAを検討評価した。2'OMe U(S)およびGU（AS）修飾したApoBを非炎症性の二重鎖として選択した（図3および4参照）。これはまた、AS修飾したsiRNAのインビトロRNAi活性を低下させる化学修飾の影響を検討評価する好機を与えた（図8参照）。siRNAを肝臓に送達することが以前に示された安定な核酸-脂質粒子（SNALP）（Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23：1002-1007（2005））の中に、未変性なまたは2'OMe修飾したApoBおよびミスマッチsiRNAを製剤化した。全身適用での使用のために、核酸に基づく薬物は、安定化またはヌクレアーゼ分解からの保護を必要とする。脂質二重層の内側への封入によって、未修飾でかつさもなければ不安定なsiRNAが、インビトロで37℃で24時間以上の間、血清ヌクレアーゼ分解から保護され、封入によって、siRNAに対する広範囲にわたる化学修飾を必要とせずに、十分なヌクレアーゼ保護が提示されるということが示唆されている。比較すると、裸のsiRNAは、同様の条件下で4時間以内に完全に分解された（図9）。
【０２５７】
封入されたApoB siRNAを、5mg/kg/日で3日間、BALB/cマウスに静脈内投与した。この処方計画は、コレステロールがコンジュゲートされた、化学修飾ApoB siRNAを利用する実験で効き目があると最初に報告された（Soutschek et al., 前記）ApoB siRNA用量の10倍の低下に相当する。未変性で、免疫刺激性のあるApoBまたはミスマッチsiRNAを受けた動物は、3日までにそれぞれ初めの体重の10.5％および9％の喪失（図10A）ならびに処置の経過中の全般的な身体状態における軽い減退によって明白になるような明らかな毒性の症状を示した。対照的に、2'OMe修飾したsiRNAによる処置は、最小限（1％未満）の体重喪失を伴いまたは体重喪失を伴わず、十分に許容された（図10A）。これらの有効性検討における先天的なサイトカイン応答の阻止を生存中の血清IFN-α解析によって確認し（図10B）、およびしたがって未修飾siRNAの投与と関連する毒性は、全身のサイトカイン応答が原因であるとした。留意すべきことに、未修飾ミスマッチsiRNAによって誘導されるサイトカインレベルおよび体重喪失は、対応する活性のあるApoB二重鎖についてよりも低かった。この場合のミスマッチ対照は、ApoB配列内の4つのG/C置換によって作製され（Soutschek et al., 前記）、RNA二重鎖による免疫刺激に対する配列依存的な効果のさらなる証拠を提供している。
【０２５８】
RNAiを介するノックダウンの直接的な測定として、最後のsiRNA処置の2日後に肝臓でApoB mRNAを決定した（図10C）。未変性なApoB処置群および2'OMe U(S)修飾したApoB処置群の両方において、ApoB mRNAレベルはPBS処置動物と比較して有意に低下した（それぞれ、PBS対照の18±2％および18±5％）。比較すると、2'OMe GU(AS)修飾したApoB siRNAで処置したマウスは、あまり顕著ではないApoB mRNAのサイレンシングを示し（対照の44±4％）、この修飾siRNAの低下したインビトロRNAi活性と相関した（図8参照）。修飾したミスマッチ群におけるApoB mRNAレベルは、PBS対照におけるApoB mRNAレベルと同等であったが（図10C）、その一方で未変性なミスマッチsiRNAはApoB mRNAレベルの適度な低下をもたらした（PBS対照の79±12％）。未変性なミスマッチsiRNAで観察された肝臓ApoB mRNAの適度な低下は、3回の別々の実験で明白であり、かつ未修飾siRNAの全身投与および送達と関連するインターフェロン放出および毒性の症状と相関した。
【０２５９】
肝臓でのApoB mRNAのサイレンシングは、血清ApoBタンパク質の比例的で、配列特異的な低下を結果的にもたらした。未変性な、2'OMe U(S)修飾した、またはGU(AS)修飾したApoB siRNAで処置したマウスは、それぞれPBS処置した動物の血清ApoBタンパク質レベルの26％、28％、および47％である血清ApoBタンパク質レベルを有した（図10D）。ApoB発現の機能的サイレンシングはまた、ApoB二重鎖によるmRNAおよびタンパク質ノックダウンの相対的な効力と相関する血清コレステロールの有意な低下に反映された。未変性な、2'OMe U(S)修飾、またはGU(AS)修飾したApoB siRNAで処置したマウスは、PBS対照群におけるコレステロールレベルの48％、51％、および69％である血清コレステロールレベルを示した（図10E）。ミスマッチsiRNAはいずれも、血清コレステロールに対していかなる効果も有しなかった（図10E）。別の実験において、非炎症性の2'OMe G(S)修飾したApoB siRNAは、IFN誘導がない中で、ApoB mRNA、タンパク質、および血清コレステロールの同様の低下を媒介した。
【０２６０】
これらの検討からの結果は、siRNAの脂質封入が、全身適用のための十分な血清安定性を提供し、かつRNAに対する広範囲にわたる化学修飾の必要性の存在を否定することを示す。これは、標的臓器、この場合は肝臓へのsiRNA積み荷の効果的な送達と対になって、高コレステロール血症のための潜在的な治療標的を代表するタンパク質である、ApoBによってこれらの検討で例示された、内在性遺伝子のサイレンシングを容易にする。重要なことに、非炎症性であるように設計された、2'OMe修飾siRNAは、未修飾siRNAと同等ではあるが、未修飾siRNAの全身投与と関連する免疫毒性およびその他のオフターゲット効果を伴わない効力をインビボで示した。本明細書において記載されたアプローチは、幅広い範囲の遺伝子標的に通常適用可能であることができ、かつ様々な治療方法での使用に好適である。
【０２６１】
考察
siRNAによる免疫活性化は配列依存的であるという知見に基づいて、GUに富むモチーフを欠く配列を選択することによって、ごくわずかの免疫刺激活性を持つ活性のあるsiRNAを設計することが可能であるということが以前に示された（Judge et al., Nat. Biotechnol., 23：457-462（2005））。しかしながら、この戦略は、所与の標的に対して設計することができる新規のsiRNA配列の数を著しく限定する。さらに、それは現在、推定上のRNA免疫刺激モチーフの比較的曖昧な性質によって、ある程度のスクリーニングを必要とする。この検討は、siRNA二重鎖への2'OMe修飾ヌクレオチドの選択的取り込みによって合成siRNAを介する免疫刺激を阻止する新規でかつ強固なアプローチを強調する。注目すべきことに、極めて免疫刺激性のあるsiRNA分子におけるわずか2つの2'OMeグアノシンまたはウリジン残基の取り込みによって、ヒトPBMCにおけるおよびマウスにおけるsiRNAを介するインターフェロンおよび炎症性サイトカイン誘導がインビボで完全に阻止された。この化学修飾の程度は、siRNA二重鎖における未変性な2'-OH位置の〜5％に相当する。免疫応答の完全な阻止には、RNA鎖の一方のみが選択的に修飾される必要があったので、2'OMe修飾を二重鎖のセンス鎖に限定し、その結果siRNAの効力を弱める潜在的可能性を最小限にすることができた。これらの知見は、証明されたRNAi活性を持つ未変性な配列に基づく免疫刺激性のないsiRNAの合成についての単純な理由付けを提供している。選択的に修飾されたsiRNAと核酸-脂質粒子などの効果的な全身送達媒体を組み合わせることによって、先天免疫応答の全身活性化と関連する有害な副作用を伴わずに、治療的に実行可能な用量で内在性遺伝子標的の強力なサイレンシングをインビボで達成することができる。
【０２６２】
リボース骨格における2'-OHはRNAの特徴となる特色であるので、この位置での広範囲にわたる化学的置換は、RNA結合受容体経路による修飾核酸の認識を混乱させると予期された。しかしながら、この検討は、明確なRNAの免疫刺激領域を含むリボヌクレオチドを含む、それらの未変性なリボヌクレオチドの95％までを保持するにもかかわらず、2'OMe修飾siRNAが免疫刺激性のないものになるということを思いもよらず示す。2'OMeは、そのA型らせん構造を著しくねじ曲げることなく、RNA二重鎖のマイナーグルーブの内部に存在する2'位置の比較的嵩高い化学基であるとみなされている（Chiu et al., RNA, 9：1034-1048（2003）：Cummins et al., Nucl. Acids Res., 23：2019-2024（1995））。これは、二本鎖RNA二重鎖とその推定上の免疫受容体またはアクセサリー分子の間の相互作用を混乱させるのに十分である可能性がある。それによって未修飾で免疫刺激性のあるssRNAにアニールした2'OMe修飾ssRNAが免疫刺激性のない二重鎖を生み出す、 2'-O-メチル化のトランスの阻害効果は、siRNAの二本鎖分子としての認識が関わるような仮説と一致する。
【０２６３】
免疫認識およびRNAiにも影響し得るヌクレアーゼ抵抗性を与えようと努力して、多くのその他の安定化化学反応が合成siRNA設計において日常的に用いられている。糖環に2'-O、4'-Cメチレン架橋を含むロック核酸（LNA）は、siRNAの免疫刺激活性を一部低下させることが示されている（Hornung et al., Nat. Med., 11：263-270（2005））。反転デオキシ脱塩基末端キャップを含むsiRNAは、免疫刺激活性を保持することが分かっている（Morrissey et al., Nat. Biotechnol., 23：1002-1007（2005））。トランスの阻害効果の証拠は、LNA修飾した二重鎖では観察されなかった。これらの観察は、siRNAによる免疫刺激が、その他の、よく特徴付けられた、安定化化学反応に対して、2'OMe修飾による阻害に特に敏感であるということを示す。
【０２６４】
この検討は、未修飾の合成siRNAおよび2'OMe修飾した合成siRNAの両方が、脂質粒子の中に封入され、かつ全身に投与された場合、内在性遺伝子標的ApoBの強力なサイレンシングを媒介することができるということを示す。封入された未修飾または修飾ApoB siRNAの静脈内投与は、肝臓におけるApoB mRNAレベルの有意な低下およびそれに付随する血中のApoBタンパク質の低下を結果的にもたらした。重要なことに、高コレステロール血症のための治療標的としてのApoBへの関心を所与として、ApoBサイレンシングは血清コレステロールの有意な低下を結果的にもたらした。脂質封入は、血清ヌクレアーゼによる分解に対する優れた抵抗性を与え、最小限に修飾したsiRNA二重鎖のインビボ使用を可能にする。インターフェロンおよび炎症性サイトカインの誘導を防ぐことにより、遺伝子発現に対する非特異的な効果の潜在的可能性が限定され、その一方でsiRNA製剤の許容性が改善されている。具体的に、封入された2'OMe修飾siRNAの静脈内投与は、効き目がありかつ十分に許容される。これらの知見は、幅広い範囲のインビボ適用および治療的適用における合成siRNAの使用を前進させる。
【０２６５】
方法
siRNA
これらの検討で用いられた全てのsiRNAはDharmacon（Lafayette, CO）によって化学合成され、および脱塩、脱保護されたポリヌクレオチドとして受け取られた。二重鎖を標準的な手順によってアニールした。等モル濃度の相補鎖を90℃まで2分間加熱し、その後37℃で60分間ゆっくりと冷却した。アニールした二重鎖の形成を非変性PAGE解析によって確認した。この検討で用いられた全ての未変性な配列および2'OMe修飾した配列を表1および2に列挙する。
【０２６６】
RNAの脂質封入
Jeffs et al., Pharm. Res., 22：362-372（2005）によってpDNAについて記載されたような自発的な小胞形成の過程、それに続く段階的なエタノール希釈によって、siRNAまたはssRNAをリポソームの中に封入した。リポソームは以下の脂質から構成された：モル比48：20：2：30の合成コレステロール（Sigma；St. Louis, MO）、リン脂質DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォコリン；Avanti Polar Lipids；Alabaster, AL）、PEG-脂質PEG-cDMA（3-N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）、およびカチオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン）。脂質PEG-cDMAおよびDLinDMA（Heyes et al., J. Control Release, 107：276-287（2005））は、Protiva Biotherapeuticsで合成された。結果として生じる安定化された脂質粒子をPBS中で透析し、および使用前に0.2μmフィルターを通して濾過滅菌した。各々のリポソーム調製物の粒子サイズは100〜130nmの範囲に及び、および典型的にはリポソーム内に封入されたsiRNAの90〜95％を含んだ。脂質二重層を混乱させるための界面活性剤の添加の前および後に、膜不透過性蛍光色素、RiboGreen（登録商標）（Molecular Probes；Eugene, OR）を用いて、製剤化されたsiRNAの濃度および封入パーセントを決定した（Jeffs et al., 前記）。
【０２６７】
血清ヌクレアーゼ保護アッセイ
未修飾で裸のまたは脂質で封入されたsiRNA（0.25mg/ml）を50％マウス血清中で37℃でインキュベートした。示された時間で、アリコートを採取して、0.1％ SDSを含むゲル充填緩衝剤に直接入れ、および液体窒素中で凍結した。最後の時点の後、siRNA試料を非変性20％ポリアクリルアミドTBEゲル上で走らせ、およびエチジウムブロマイド染色で可視化した。siRNAのヌクレアーゼ保護が脂質封入によって与えられたということを確認するために、血清とのインキュベーションの前に、0.1％ Triton-X100を添加して、脂質二重層の完全性を混乱させた。
【０２６８】
細胞単離および培養
標準的なFicoll-Hypaque密度遠心分離技術によって、健康ドナー由来の全血からヒトPBMCを単離した。免疫刺激アッセイのために、3×105の新たに単離したPBMCを3通りで96ウェルプレートに播種し、ならびに10％ FBS、2mMグルタミン、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン入りのRPMI1640培地中で培養した。リポソームで封入されたsiRNAを示された最終核酸濃度で細胞に添加し、ならびに培養上清を16〜20時間後に集め、ならびにサンドイッチELISAによってIFN-α、IL-6、およびTNF-αについてアッセイした。
【０２６９】
インビトロRNA干渉アッセイ
HepG2細胞を24ウェルプレート中に20,000細胞／ウェルで播種した。2'OMe修飾したApoB siRNAのインビトロRNAi活性を決定するために、HepG2培養を、0.6nMから45nMの間の核酸濃度で封入されたsiRNAで、3通りに、処置した。siRNAの添加の24時間後に培地を変え、その後さらに48時間インキュベートした。ポリクローナルヤギ抗ヒトApoB捕捉抗体（Chemicon International）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトApoB-100抗体（Academy Bio-medical）を用いて、Soutschek et al., Nature, 432：173（2004）で詳述されたような、サンドイッチELISAによって培養上清中でヒトApoBタンパク質レベルを決定し、結合したApoBを検出した。ELISAプレートをTMB基質を用いて見えるようにし、2N硫酸で停止し、および吸収を450nm〜570nmで読み取った。未処置のHepG2馴化培地から作成された標準曲線に対して、A450値を正規化し、ELISAの線形範囲を定義した。siRNA処置した培養上清中の平均の、残存ApoBタンパク質レベルをPBS処置した対照のパーセンテージとして計算した。
【０２７０】
インビボサイトカイン誘導
local Animal Care and Use Committee at Protiva Biotherapeuticsによる承認後、Canadian Council on Animal Care指針に従って、動物の検討を完了した。6〜8週齢のCD1 ICRマウス（Harlan；Indianapolis, IN）を、使用前に3週間の検疫および順応期間に供した。0.2ml PBS中で側部尾静脈における標準的な静脈内注射によって封入されたsiRNA製剤を投与した。投与6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカインアッセイ用の血漿として処理した。RNAi有効性実験において、最初のsiRNA投与の6時間後に、50μl試験出血から血漿を集めた。
【０２７１】
サイトカインELISA
製造元の取扱説明書に従ってサンドイッチELISAキットを用いて、全てのサイトカインを定量した。これらには、マウスおよびヒトIFN-α（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）、ヒトIL-6およびTNF-α（eBioscience；San Diego, CA）、ならびにマウスIL-6、TNF-α、およびIFN-γ（BD Biosciences；San Diego, CA）が含まれた。
【０２７２】
インビボRNA干渉
連続3日間、1日に1回、5匹のBalb/Cマウスの群を、側部尾静脈を経由した標準的な静脈内注射によって5mg/kgで脂質封入されたsiRNA（未変性な、2'OMe U(S)、2'OMeまたはGU(AS)ApoBおよび未変性なまたは2'OMe U(S)ミスマッチ）によって処置した。検討の期間中ずっと、体重および全般的な観察を記録した。最後のsiRNA処置の48時間後、マウスを屠殺した。ApoBタンパク質およびコレステロールの血清解析のために、血液を心穿刺によって集めた。肝臓の重さを測り、およびQuantiGeneアッセイ（Genospectra；Fremont, CA）によるApoB mRNA解析のために6ml RNALater（Sigma）の中に集めた。
【０２７３】
製造元の取扱説明書（Thermo electron社；Melbourne, Australia）に従って市販のコレステロール検出キットを用いて、血清コレステロールを測定した。モノクローナルマウスApoB-100捕捉抗体LF3（Zlot et al., J. Lipid Res., 40：76-84（1999））を用いたサンドイッチELISAによって、個々の動物由来の血清中でApoB-100を検出した。ポリクローナルウサギ抗マウスApoB（Biodesign International；Saco, Maine）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗ウサギIg（Jackson Immunoresearch；West Grove, PA）によって、結合したApoB-100を検出した。ELISAの線形範囲を定義するために、正常マウス血清で作成した標準曲線を用いて、A450値から血清ApoBレベルを決定し、およびPBS処置した対照群のパーセンテージとして表した。
【０２７４】
QuantiGeneアッセイ（Genospectra）を用いて、siRNA処置後の肝臓組織におけるマウスApoB mRNAの低下を定量した。最後の注射の48時間後に集め、およびRNAlater（Sigma）の中で保存していた肝臓から、小さい均一な組織試料を採取した。ApoBおよびGAPDH mRNA定量化のために、ライセートを直接用い、ならびにApoBおよびGAPDH mRNAの比を計算し、およびPBS対照群と比べた群平均として表した。mRNAの検出用に用いられた特定のプローブセットは、以下の領域を標的するよう、Genospectraによって設計された：ApoB mRNAについては、アクセッション番号XM_137955の位置5183-5811；GAPDH mRNAについては、アクセッション番号NM_008084の位置9-319。
【０２７５】
実施例2、選択的な化学修飾のあるApoB siRNAの設計
この実施例は、ApoB siRNA二重鎖のセンスおよびアンチセンス鎖における選択的位置での最小限の2'OMe修飾が、RNAi活性を保持しながら、ApoB siRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分であるということを例証する。特に、両方の鎖における約30％未満のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシン修飾が、サイレンシングおよび非免疫刺激特性の望ましい組み合わせをApoB siRNAに提供する。
【０２７６】
結果
メスのBALB/cマウスモデルを用いて、センスおよびアンチセンス鎖に選択的な化学修飾のあるApoB siRNAを含むSNALP製剤の有効性および毒性プロファイルを決定した。この検討で用いられたApoB siRNA二重鎖を表3に提供する。
【０２７７】
（表3）センスおよびアンチセンスApoB RNAポリヌクレオチドを含むsiRNA二重鎖
2009513151.tif 000056
列1：数は、マウスApoB mRNA配列XM_137955に対するセンス鎖の5'塩基のヌクレオチド位置を指す。列2：数は、各々の鎖における2'OMe化学修飾の分布を指す。例えば、「U2/4」は、センス鎖における2つのウリジンの2'OMe修飾およびアンチセンス鎖における4つのウリジンの2'OMe修飾を示す。列3：2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す。列4：siRNA二重鎖における2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。列5：siRNA二重鎖の二本鎖（DS）領域における修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。
【０２７８】
ApoB 10048 siRNAファミリーの配列について、siRNA二重鎖における16.7％または23.8％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、未修飾siRNAと同様のサイレンシング活性を産生した（図11、レーン2〜6）。同様の結果が、19％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾があるApoB 10048 siRNA配列について得られた。しかしながら、siRNA二重鎖における35.7％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、活性の低下を結果的にもたらした（図11、レーン7〜8）。ApoB 10886 siRNA配列について、siRNA二重鎖における16.7％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、未修飾siRNAと比較した場合の活性の増大をもたらした（図11、レーン9〜10）。ApoB 10346 siRNA配列について、siRNA二重鎖における16.7％のヌクレオチド位置での2'OMe修飾は、未修飾siRNAと比較した場合の活性の減少をもたらした（図11、レーン11〜12）。
【０２７９】
2'OMe置換を用いたsiRNAの化学修飾は、サイトカイン応答を阻止することによってインビボsiRNA処置の毒性プロファイルを改善した。図12で示されたように、このパネル中の試験された修飾ApoB siRNAのどれ1つとしてインターフェロン-αの放出を刺激しなかったのに対し、3つの未修飾siRNA対応物のいずれかでの処置は、6時間でかなりの濃度の血漿中のインターフェロン-αを結果的にもたらした。
【０２８０】
考察
この実施例は、センスおよびアンチセンス鎖内の選択的位置での最小限の2'OMe修飾を含むSNALPで製剤化したApoB標的siRNAが、IV処置後7日という延長された時点で、PBS対照と比べて77％の血漿ApoBタンパク質レベルまで抑制することができるということを示す。実際、siRNA二重鎖の両方の鎖の約30％未満（例えば、16.7％、19％、または23.8％）のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシン修飾が、未修飾siRNA配列と同様のサイレンシング活性を典型的に産生した。さらに、そのような2'OMe修飾は、ApoB siRNAの免疫刺激特性を減少させることによって、インビボ処置の毒性プロファイルを改善させた。
【０２８１】
方法
siRNA
2つの脱保護および脱塩されたRNAポリヌクレオチドをアニールさせることによってsiRNA二重鎖を調製した。各々のポリヌクレオチドを長さが21塩基となるように設計し、および各々の二重鎖を、二本鎖領域の各々の側に3'突出部を持つ19塩基の二本鎖領域を含むように設計した。全ての二重鎖をマウスおよびヒトApoBに対して交差反応するように設計した。ApoB 10048 siRNAセンス鎖は、ヒトApoB mRNA配列NM_000384のヌクレオチド10164-10184に対応する。ApoB 10886 siRNAセンス鎖は、ヒトApoB mRNA配列NM_000384のヌクレオチド11002-11022に対応する。ApoB 10346 siRNAセンス鎖は、ヒトApoB mRNA配列NM_000384のヌクレオチド10462-10482に対応する。
【０２８２】
RNAの脂質封入
0.04の標的核酸 対 脂質比で直接希釈処理を用いて、「2：40：10」DSPC：コレステロール：PEG-C-DMA：DLinDMA（モル比10：48：2：40）SNALP製剤を調製した。
【０２８３】
インビボ処置計画
BALB/cマウス（メス、4週齢）をHarlan Labから入手した。少なくとも7日間の順応期間の後、検討0、1、および2日目に、1日に1回、側部尾静脈における静脈内（IV）注射によって、表4に示されたSNALP製剤を動物に投与した（動物当たり全部で3用量）。投薬は、kg体重当たり2mgのsiRNAで、10ml/kgに相当した（最も近い10μlまで四捨五入した）。陰性対照として、ある群の動物にPBS媒体のIV注射を与えた。体重ならびに動物行動および／または外観のケージ側面からの観察を検討0〜3、9、および16日目に記録した。尾の切り込みを施し、血漿用として処理する少量（50μl）の全血を集めた。検討16日目に、致死用量のケタミン／キシラジンで動物を麻酔し、および頚椎脱臼の前に心穿刺によって血液を集めた。血液をラベンダー色のEDTAマイクロテイナーの中に集め、および血漿用として処理した。
【０２８４】
（表4）この検討で用いられたインビボ処置計画およびSNALP製剤
2009513151.tif 000057
【０２８５】
解析方法
本質的にZlot et al., J. Lipid Res., 40：76-84（1999）に記載されたようなELISA法を用いて、血漿中のApoBタンパク質レベルを測定した。製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて、血漿中のインターフェロン-αレベルを測定した。
【０２８６】
実施例3、選択的な化学修飾のあるEg5 siRNAの設計
この実施例は、Eg5 siRNA二重鎖のセンスおよびアンチセンス鎖における選択的位置での最小限の2'OMe修飾が、RNAi活性を保持しながら、Eg5 siRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分であるということを例証する。特に、1つまたは両方の鎖における約20％未満のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシン修飾が、サイレンシングおよび非免疫刺激特性の望ましい組み合わせをEg5 siRNAに提供する。
【０２８７】
結果
Eg5 siRNAに対する選択的修飾は抗増殖活性を保持する。2'OMe修飾したEg5 siRNA分子のパネルを調製し、ならびにそれらのRNAi活性をヒトHeLa細胞およびマウスNeuro2A細胞において評価した。この検討で用いられたEg5 siRNA二重鎖を表5に提供する。修飾は、siRNA二重鎖が約20％未満の2'OMe 修飾ヌクレオチドを含む、Eg5 2263 siRNA配列のセンスおよび／またはアンチセンス鎖における選択された位置に2'OMe-ウリジンおよび／または2'OMe-グアノシンを導入する工程を伴った。抗増殖活性は、細胞生存率バイオアッセイで評価した。特に、Eg5 2263 siRNAを含むSNALP製剤による処置の48時間後に、細胞培養の細胞生存率を測定し、および平均蛍光単位として表した。図13は、Eg5 2263 siRNA二重鎖に対する選択的な化学修飾が、ヒトHeLa細胞におけるRNAi活性を保持したということを示す。同様に、図14は、Eg5 2263 siRNA二重鎖に対する選択的な化学修飾が、マウスNeuro2A細胞におけるRNAi活性を保持したということを示す。
【０２８８】
（表5）センスおよびアンチセンスEg5 RNAポリヌクレオチドを含むsiRNA二重鎖
2009513151.tif 000058
列1：「0/0」＝未修飾siRNA二重鎖；「U/0」＝2'OMe-ウリジン修飾したセンス鎖（SS）；「G/0」＝2'OMe-グアノシン修飾したSS；「0/U」＝2'OMe-ウリジン修飾したアンチセンス鎖（AS）；「0/G」＝2'OMe-グアノシン修飾したAS；「U/U」＝2'OMe-ウリジン修飾したsiRNA二重鎖；「U/G」＝2'OMe-ウリジン修飾したSSおよび2'OMe-グアノシン修飾したAS；「G/G」＝2'OMe-グアノシン修飾したsiRNA二重鎖；ならびに「G/U」＝2'OMe-グアノシン修飾したSSおよび2'OMe-ウリジン修飾したAS。列2：2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す；「dT」＝デオキシチミジン。列3：siRNA二重鎖における2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。列4：siRNA二重鎖の二本鎖（DS）領域における修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。
【０２８９】
Eg5 siRNAに対する選択的修飾はインビボサイトカイン誘導を阻止する
未修飾のEg5 2263 siRNA（すなわち、0/0）ならびにある種の2'OMe修飾したその変異体（すなわち、U/0、G/0、U/U、およびG/G）を、2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロールを有するSNALPの中に封入した。これらのSNALPで製剤化されたEg5標的化siRNAをインビボで試験し、免疫応答の誘導、例えば、サイトカイン誘導について調べた。BALB/cマウス（処置群当たりn=3）に、Eg5 2263 siRNA を含む40μgのSNALP製剤を注射した。処置後6時間で試料を集め、およびELISAアッセイでインターフェロン-αレベルについて試験した。図15は、Eg5 2263 siRNAに対する選択的2'OMe修飾が、未変性な（すなわち、未修飾の）二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止したということを示す。
【０２９０】
Eg5 siRNAに対する選択的修飾は送達媒体に対する抗体応答を阻止する
未修飾のEg5 2263 siRNA（すなわち、0/0）ならびにある種の2'OMe修飾したその変異体（すなわち、U/0およびU/U）を、2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロールを有するSNALPの中に封入した。これらのSNALPで製剤化されたEg5標的化siRNAをマウスにおいてインビボで試験し、PEGなどの送達媒体の成分に対する免疫応答の誘導について調べた。特に、Eg5 2263 siRNA を含むSNALP製剤を1日に3×2mg/kgでマウス（n=4）に処置し、および10日目に抗-PEG IgMおよびIgG抗体の血清レベルをアッセイした。図16は、Eg5 2263 siRNA二本鎖（すなわちU/U）の両方の鎖に対する選択的な2'OMe修飾が、未変性な（すなわち、未修飾の）二重鎖の全身投与と関連するSNALP送達媒体のPEG成分に対する抗体応答を完全に阻止するのに必要とされたということを示す。
【０２９１】
方法
siRNA
これらの検討で用いた全てのsiRNAは、Protiva Biotherapeutics（Burnaby, BC）、University of Calgary（Calgary, AB）、またはDharmacon社（Lafayette, CO）によって化学合成された。標準的な手順を用いて、siRNAを脱塩およびアニールした。Eg5 2263 siRNAセンス鎖は、ヒトEg5 mRNA配列NM_004523のヌクレオチド2263-2281に対応する。
【０２９２】
siRNAの脂質封入
そうでないように示されない限り、siRNAは以下の脂質から構成されるリポソーム中に封入された；モル比48：1：2：40の合成コレステロール（Sigma；St. Louis, MO）、リン脂質DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォコリン；Avanti Polar Lipids；Alabaster, AL）、PEG-脂質PEG-cDMA（3-N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）、およびカチオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン）。言い換えると、そうでないように示されない限り、siRNAは以下のSNALP製剤のリポソーム中に封入された；2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロール。媒体対照用として、同一の脂質組成を持つ空のリポソームをsiRNAの非存在下で形成させた。
【０２９３】
インビボサイトカイン誘導
local Animal Care and Use Committee at Protiva Biotherapeuticsによる承認後、Canadian Council on Animal Care指針に従って、動物の検討を完了した。6〜8週齢のCD1 ICRマウス（Harlan；Indianapolis, IN）を、使用前に3週間の検疫および順応期間に供した。0.2ml PBS中での側部尾静脈における標準的な静脈内注射によって、封入されたsiRNA製剤を投与した。投与6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカインアッセイ用の血漿として処理した。RNAi有効性実験において、最初のsiRNA投与の6時間後に、50μl試験出血から血漿を集めた。製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて、血漿中のインターフェロン-αレベルを測定した。
【０２９４】
細胞生存率アッセイ
代謝活性のある細胞によって蛍光産物レゾルフィンに還元されるレサズリン色素である、市販の試薬CellTiter-Blue（商標）（Promega社；Madison, WI）を用いて、インビトロ細胞培養の細胞生存率を検討評価した。標準的な組織培養技術を用いて、様々な癌細胞株をインビトロで培養した。siRNA製剤または低分子薬物による処置後48〜72時間で、CellTiter-Blue（商標）を培養に添加し、細胞生存率の尺度である、細胞の代謝活性を定量した。
【０２９５】
抗体アッセイ
PEG-脂質およびSNALPのその他の脂質成分に対するIgMおよびIgG抗体を検出するために、ELISAを開発した。簡潔に述べると、10μgのPEG-cDSAを20μlの100％エタノール中でPVDF膜（Millipore社；Bedford, MA）を含む96ウェルプレートに添加した。10％ FBSを含むPBSで1時間ブロッキングする前に、PEG-cDSAでコーティングされた膜を2時間完全に風乾させた。その後、100μlの連続的に希釈したブロッキング緩衝剤中の血清試料を2通りのウェルに1時間適用し、および1％ FBSを含むPBSで4回洗浄した。HRPがコンジュゲートされたヤギ抗IgM FcμまたはIgG Fcγで、プレートに結合した抗体を検出した。結合した酵素をTMB基質で見えるようにし、2N硫酸で停止し、その後分光光度計において450nm〜570nmで読み取った。
【０２９６】
実施例4、選択的な化学修飾のある抗インフルエンザsiRNAの設計
この実施例は、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（NP）siRNA二重鎖のセンス鎖における選択的位置での最小限の2'OMe修飾が、RNAi活性を保持しながら、NP siRNAの免疫刺激特性を減少させるのに十分であるということを例証する。特に、センス鎖における約20％未満のヌクレオチド位置での選択的な2'OMe-ウリジン修飾が、サイレンシングおよび非免疫刺激特性の望ましい組み合わせをNP siRNAに提供する。
【０２９７】
結果
NP siRNAに対する選択的修飾はウイルスのノックダウン活性を保持する
2'OMe修飾したNP siRNA分子のパネルを調製し、ならびにそれらのRNAi活性をMadin-Darby Canine Kidney（MDCK）細胞において評価した。この検討で用いられたNP siRNA二重鎖を表6に提供する。修飾は、siRNA二重鎖が約20％未満の2'OMe 修飾ヌクレオチドを含む、NP siRNA配列のセンス鎖における選択された位置に2'OMe-ウリジンを導入する工程を伴った。NP siRNA分子をリポプレックスとして製剤化し、および感染後約48時間でインフルエンザウイルスによって産生される細胞変性効果（CPE）を有意に低下させるそれらの能力について試験した。NP siRNA分子を、ウイルスのみの対照と比べた産生されたHAの量（すなわち、HA単位／ウェル）および産生されたHAのパーセンテージ（すなわち、ノックダウンパーセント）についても試験した。
【０２９８】
（表6）センスおよびアンチセンスNP RNAポリヌクレオチドを含むsiRNA二重鎖
2009513151.tif 000059
列1：数は、インフルエンザAウイルスNP ssRNA配列NC_004522に対するセンス鎖の5'塩基のヌクレオチド位置を指す。列2：数は、各々の鎖における2'OMe化学修飾の分布を指す。例えば、「U5/0」は、センス鎖における5つのウリジンの2'OMe修飾およびアンチセンス鎖におけるウリジンの2'OMe修飾なしを示す。列3：2'OMe修飾ヌクレオチドを太字で示し、かつ下線を付す；「dT」＝デオキシチミジン。列4：siRNA二重鎖における2'OMe修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。列5：siRNA二重鎖の二本鎖（DS）領域における修飾ヌクレオチドの数およびパーセンテージを提供する。
【０２９９】
図17および18は、NP siRNA二重鎖のセンス鎖に対する選択的な2'OMe修飾が、未修飾対応物の配列または対照配列と比較した場合に、インフルエンザノックダウン活性に負に影響を及ぼさなかったということを示す。図19は、2'OMe修飾したNP siRNA分子の様々な組み合わせが、対照と比べたMDCK細胞におけるインフルエンザウイルスのノックダウンの増強を提供したということを示す。
【０３００】
NP siRNAに対する選択的な修飾はインビトロおよびインビボサイトカイン誘導を阻止する
未修飾のNP 1496 siRNA（すなわち、0/0）および2'OMe修飾したその変異体（すなわち、U8/0）を、2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロールを有するSNALPの中に封入するか、またはポリプレックスを形成するためにポリエチレンイミン（PEI）と複合体を形成させるかのいずれかにした。SNALPで製剤化されたNP標的化siRNAをインビボで試験し、免疫応答の誘導、例えば、サイトカイン誘導について調べた。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）に、NP 1496 siRNAを含む40μgのSNALP製剤をトランスフェクトし、および16時間でサイトカイン解析用に上清を集めた。ポリプレックス製剤をインビボで試験し、免疫応答の誘導、例えば、サイトカイン誘導について調べた。マウスにポリプレックスを120μg siRNA/マウスで静脈内注射し、ならびに血漿試料を処置後6時間で集め、およびELISAアッセイによってインターフェロン-αレベルについて試験した。図20は、NP 1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が、インビトロ細胞培養系でインターフェロン誘導を阻止したということを示す。図21は、NP 1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が、未変性な（すなわち、未修飾の）二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止したということを示す。
【０３０１】
方法
siRNA
これらの検討で用いた全てのsiRNAは、Protiva Biotherapeutics（Burnaby, BC）、University of Calgary（Calgary, AB）、またはDharmacon社（Lafayette, CO）によって化学合成された。標準的な手順を用いて、siRNAを脱塩およびアニールした。
【０３０２】
siRNAの脂質封入
そうでないように示されない限り、siRNAは以下の脂質から構成されるリポソーム中に封入された；モル比48：10：2：40の合成コレステロール（Sigma；St. Louis, MO）、リン脂質DSPC（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォコリン；Avanti Polar Lipids；Alabaster, AL）、PEG-脂質PEG-cDMA（3-N-[(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン）、およびカチオン性脂質DLinDMA（1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン）。言い換えると、そうでないように示されない限り、siRNAは以下のSNALP製剤のリポソーム中に封入された；2mol％ PEG-cDMA、40mol％ DLinDMA、10mol％ DSPC、および48mol％コレステロール。
【０３０３】
リポプレックス処置およびインビトロインフルエンザ感染
インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザA/PR/8/34 H1N1）は、トリプシンの存在下で感染時にMDCK細胞において細胞変性効果を産生する。以下のプロトコルに従って、MDCK細胞のリポプレックス処置およびインビトロインフルエンザ感染を行なった：
1、播種24時間後に細胞が約50％の密度になるように、MDCK細胞を約8000細胞／ウェル（約4×104細胞／ml）で96ウェルプレートに播種した。
2、約24時間後、培地を新しい完全培地（抗生物質なし）に変え、およびLipofectamine（商標）2000（LF2000）（Invitrogen社；Camarillo, CA）の中に核酸（例えば、NP siRNA）を含むリポプレックスを1：4の核酸：LF2000の比で細胞にトランスフェクトした。
3、約4時間後、複合体を除去し、細胞をPBSで洗浄し、および約50μl希釈ウイルス／ウェルを添加して、ウイルス感染培地（DMEM、0.3％ BSA、10mM HEPES）の中で様々な希釈のインフルエンザウイルスを細胞に感染させた。
4、ウイルスを37℃で1〜2時間、細胞上でインキュベートし、その後ウイルスを除去しおよび約200μlのウイルス増殖培地（DMEM、0.3％ BSA、10mM HEPES、0.25μg/mlトリプシン）を添加した。
5、約48時間での細胞変性効果について、細胞をモニターした。
6、インフルエンザHA酵素免疫アッセイ（EIA）を上清で行なった。
【０３０４】
ポリプレックス処置およびインビボサイトカイン誘導
local Animal Care and Use Committee at Protiva Biotherapeuticsによる承認後、Canadian Council on Animal Care指針に従って、動物の検討を完了した。6〜8週齢のCD1 ICRマウス（Harlan；Indianapolis, IN）を、使用前に3週間の検疫および順応期間に供した。製造元の取扱説明書に従って、室温で20分間、5というN/P比で、siRNAをIn vivo jetPEI（商標）（Qbiogene社；Carlsbad, CA）と混合した。0.2ml PBS中での側部尾静脈における標準的な静脈内注射によって、120μg siRNA/マウスに相当する、In vivo jetPEI（商標）をマウスに投与した。投与6時間後に心穿刺によって血液を集め、およびサイトカインアッセイ用の血漿として処理した。製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて、血漿中のインターフェロン-αレベルを測定した。PEIポリプレックス形成についてのさらなる方法は、Judge et al., Nat. Biotechnol., 23：457-462（2005）に提供されている。
【０３０５】
インビトロサイトカイン誘導
PBMCに40μgのSNALPで製剤化されたsiRNAをトランスフェクトし、および製造元の取扱説明書（PBL Biomedical；Piscataway, NJ）に従ってサンドイッチELISA法を用いて16時間後に、インターフェロン-αレベルを細胞培養上清中でアッセイした。
【０３０６】
上の説明は例証的であり、かつ制限的でないよう意図されるということが理解されるべきである。上の説明を読むと同時に、多くの態様が当業者には明白であると考えられる。したがって、本発明の範囲は、上の説明に関して決定されるべきではなく、その代わりに、そのような特許請求項の範囲に与えられる全範囲の同等物と共に、付随する特許請求項の範囲に関して決定されるべきである。特許出願、特許、PCT刊行物、およびGenbankアクセッション番号を含む全ての記事および参照の開示は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】2'OMe修飾がヒトPBMCにおける免疫刺激性のあるssRNAを介するインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。封入されたリポソーム、（A）β-galおよび（B）ApoB siRNAのセンス（S）またはアンチセンス（AS）鎖を表す未修飾の（未変性な）ssRNA、および2'OMe U-、G-、またはGU-修飾したssRNAを増大する濃度（5〜135nM）でPBMCと共に培養した。配列を表1に示す。24時間での培養上清中でIFN-αをアッセイした。値は3通りの培養の平均＋SDである。
【図２】ポリエチレンイミン（PEI）との複合体を形成したssRNAおよびsiRNAによる免疫刺激が2'OMe修飾によって阻止されることを示すデータを例証する。PEIで複合体を形成した（A）未変性なβ-galセンス（S）、アンチセンス（AS）、および2'OMe修飾センスssRNA、ならびに（B）未変性な、2'OMe GU(S)修飾した、およびAC(AS)修飾したβ-gal対照siRNA二重鎖で処置したヒトPBMC培養由来のインターフェロン-α応答。RNAを225nMの最終濃度で添加し、および16時間後に培養上清中でIFN-αをアッセイした。RNA配列を表1に示す。
【図３】siRNA二重鎖に対する選択的な2'OMe修飾がヒトPBMCにおけるサイトカイン誘導を阻止することを示すデータを例証する。増大する濃度（25〜675nM）の封入された（A）β-galまたは（B、C）ApoBもしくはApoBミスマッチsiRNAと共に培養したヒトPBMC由来の（A、B）IFN-αおよび（C）TNF-α誘導。未修飾の（未変性な）siRNAに対するサイトカイン応答を、示されたようなセンス（S）またはアンチセンス（AS）鎖のいずれかに2'OMe U、G、C、またはA残基を含む二重鎖と比較した（siRNA配列については表1参照）。24時間の培養後に、分泌されたサイトカインをアッセイした。値は3通りの培養の平均＋SDである。
【図４】siRNA二重鎖に対する選択的な2'OMe修飾がインビボでサイトカイン誘導を阻止することを示すデータを例証する。封入された（A、B）β-gal、（C、D）ApoB、（E）ApoBミスマッチ、または（F）vFLIP siRNAの静脈内投与後6時間の（A、C、E、F）血清IFN-αならびに（B、D）TNF-αおよびIL-6レベル。未修飾の（未変性な）siRNAに対する応答を、示されたようなセンス（S）またはアンチセンス（AS）鎖のいずれかに2'OMe U、G、またはC残基を含む二重鎖と比較した（siRNA配列については表1参照）。全てのマウスは40μgの封入されたsiRNAを受けた。値は3〜4匹の動物からの平均＋SDである。より低いレベルの定量は、IFN-αについて75pg/mL、TNF-αについて30pg/mL、およびIL-6について60pg/mLである。
【図５】インビボでのsiRNAに対するサイトカイン応答がsiRNAセンス鎖への2'OMe-ウリジンの選択的取り込みによって阻止されることを示すデータを例証する。（A）インフルエンザ核タンパク質（NP1496）およびポリメラーゼ（PA2087）または（B）シクロフィリンB（CypB）を標的するsiRNAを含むSNALPの静脈内投与6時間後に、マウスにおける血清インターフェロン-αレベルを決定した。未変性な、未修飾siRNAに対する応答を2'OMe U(S)修飾した二重鎖と比較した。配列を表2に提供する。
【図６】完全なRNAi活性を保持する非炎症性β-gal siRNAの作製を示すデータを例証する。2'OMe-ウリジン（U）、グアノシン（G）、シチジン（C）、またはアデノシン（A）のいずれかのsiRNA二重鎖のセンス鎖（S）への取り込みによって、免疫刺激性のあるβ-gal 728 siRNAを化学合成した。（A）SNALPに封入された20μg siRNAの投与後6時間のマウスにおけるインターフェロン-α誘導。（B）同じβ-gal 728 SNALP製剤のインビトロRNA干渉活性。大腸菌LacZ遺伝子を安定にトランスフェクトしたNeuro2A細胞でRNAiアッセイを行なった。SNALPへの曝露の48時間後にβ-gal活性を検討評価し、および平均値をPBS処置した細胞と比べて表した。これらの検討で用いられたSNALPは、モル比48：10：40：2でコレステロール：DSPC：DLinDMA：PEG-C-DMAという脂質を含み、および直径80〜90nmの範囲に及ぶ粒子サイズを有した。RNA配列を表2に提供する。
【図７】完全なRNAi活性を保持する非炎症性ルシフェラーゼ（Luc）siRNAの作製を示すデータを例証する。2'OMe-ウリジン（U）のsiRNA二重鎖のセンス鎖（S）への取り込みによって、免疫刺激性のあるルシフェラーゼ（Luc）siRNAを化学合成した。（A）SNALPに封入された20μg siRNAの投与後6時間のマウスにおけるインターフェロン-α誘導。B）Luc SNALP製剤のインビトロRNA干渉活性。ホタルルシフェラーゼを安定にトランスフェクトしたNeuro2A細胞でRNAiアッセイを行なった。SNALPへの曝露の48時間後にルシフェラーゼ活性を検討評価し、および平均値をPBS処置した細胞に対して表した。これらの検討で用いたSNALPは、モル比48：10：40：2でコレステロール：DSPC：DLinDMA：PEG-C-DMAという脂質を含み、および直径75〜85nmの範囲に及ぶ粒子サイズを有した。RNA配列を表2に提供する。
【図８】2'OMe修飾siRNAによるApoB発現のインビトロサイレンシングを示すデータを例証する。示された濃度（0〜45nM）で封入されたApoBまたはミスマッチsiRNAによってHepG2細胞を処置した。未修飾の（未変性な）ApoB siRNAを、示されたようなセンス（S）鎖に2'OMe U、G、もしくはC残基、またはアンチセンス（AS）鎖にGUモチーフ、U、もしくはG残基を含むApoB二重鎖と比較した（修飾siRNA配列については表1参照）。未修飾および2'OMe U(S)ApoBミスマッチsiRNAは対照二重鎖としての役割を果たした。48時間後に培養上清中のApoBタンパク質をELISAで測定した。ApoBレベルをPBS処置した対照培養の％として表す。各々の値は2通りの培養の平均に由来し、および3回の別々の実験の代表的なものである。
【図９】脂質粒子中へのsiRNAの封入によって血清ヌクレアーゼ分解から保護されることを示すデータを例証する。未修飾で裸の（上）またはSNALPで封入された（真ん中）ApoB siRNAを50％マウス血清中で37℃でインキュベートした。示された時点で非変性PAGE解析により二重鎖の完全性を検討評価した。脂質粒子の完全性を混乱させるためのTriton-Xの添加（下）により、siRNAのヌクレアーゼ感受性が回復した。
【図１０】先天免疫応答の活性化を伴わないインビボでのApoB発現のサイレンシングを示すデータを例証する。（A）〜（E）マウスにおける封入されたApoBまたはミスマッチsiRNAの静脈内投与後のインビボ効果。1日当たり5mg/kgで、封入された未修飾、2'OMe U(S)、またはGU(AS)修飾ApoB、および未修飾または2'OMe U(S)修飾ミスマッチsiRNAで、0、1、2日目にマウスを処置した。（A）4日の検討期間にわたるApoB（黒塗りの記号）およびミスマッチ（白抜きの記号）siRNAで処置したマウスの体重（0日目の重さの％）の日々の変化。（B）最初の処置の6時間後の試験出血由来の血清IFN-α。ND＝検出されず；より低いレベルの定量＝75pg/ml。（C）肝臓におけるApoB mRNAレベル。（D）血清中のApoBタンパク質。（E）最後のsiRNA処置の2日後の血清コレステロール（mM）。PBS処置した動物と比較したApoB mRNAまたはApoBタンパク質の％としてApoBレベルを表す。全ての値は、5匹の動物の平均＋SDである。全てのデータは、2回の別々の実験の代表的なものである。
【図１１】様々な未修飾および化学修飾ApoB siRNAのサイレンシング活性を示すデータを例証する。3連続日の間の2mg/kgという日々のsiRNA投薬量でのIV処置の終了の7日後に、SNALPで製剤化されたsiRNAのサイレンシング効力を測定した。PBS処置した対照と比較した血漿ApoB-100タンパク質レベルの低下という点でApoBサイレンシング活性を測定した。各々の棒は群平均（n＝5）±標準偏差（SD）を表す。
【図１２】様々な未修飾および化学修飾ApoB siRNAの免疫刺激特性を示すデータを例証する。サイトカイン放出によって特徴付けられるような、各々のsiRNAの免疫刺激特性を、SNALPで製剤化されたsiRNAの最初のIV投薬の6日後に測定した。ELISAを用いて、サイトカインであるインターフェロン-αの血漿濃度を測定した。重大な応答（200pg/mLを超える値）を引き起こす処置については、血漿試料を10倍希釈し、および図中の棒が群平均（n＝5）±標準偏差（SD）を表すように各々の動物を別々に解析した。非常にわずかな応答（200pg/mLを下回る値）を引き起こす処置については、試料をプールし、および4倍希釈でアッセイした。
【図１３】Eg5 2263 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾がヒトHeLa細胞におけるRNAi活性を保持することを示すデータを例証する。
【図１４】Eg5 2263 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾がマウスNeuro2A細胞におけるRNAi活性を保持することを示すデータを例証する。
【図１５】Eg5 2263 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が未変性な二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。
【図１６】Eg5 2263 siRNAの両方の鎖に対する選択的な2OMe修飾がSNALP送達媒体のPEG成分に対する抗体応答を完全に阻止するために必要とされることを示すデータを例証する。
【図１７】センス鎖に対する選択的な2'OMe修飾を含むNP411、NP929、NP1116、およびNP1496 siRNAが、MDCK細胞におけるインビトロでのインフルエンザノックダウン活性を維持することを示すデータを例証する。図17Aは、修飾または未修飾siRNAによる5時間の前処置後48時間でのMDCK細胞のインフルエンザウイルス感染を示す。図17Bは、1：800希釈のインフルエンザウイルスを感染させかつ2μg/mlの修飾または未修飾siRNAをトランスフェクトしたMDCK細胞における48時間でのウイルスのみの対照と比べたHAのパーセンテージを示す。
【図１８】NP1496 siRNAのセンス鎖に対する選択的な2'OMe修飾が、未修飾の対応物配列または対照配列と比較した場合、インフルエンザノックダウン活性に負に影響を及ぼさないことを示すデータを例証する。
【図１９】2'OMe修飾siRNAの組み合わせが、MDCK細胞におけるインビトロでの増強されたインフルエンザノックダウン活性を提供することを示すデータを例示する。図19Aは、様々な組み合わせの修飾siRNAによる5時間の前処置後48時間でのMDCK細胞のインフルエンザウイルス感染を示す。図17Bは、1：800希釈のインフルエンザウイルスを感染させかつ2μg/mlの修飾siRNAをトランスフェクトしたMDCK細胞における48時間でのウイルスのみの対照と比べたHAのパーセンテージを示す。
【図２０】NP1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾がインビトロ細胞培養系におけるインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。
【図２１】NP1496 siRNAに対する選択的な2'OMe修飾が、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（PEI）との複合体を形成した未変性な二重鎖の全身投与と関連するインターフェロン誘導を阻止することを示すデータを例証する。
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月21日(2008.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009513151000001.app
【国際調査報告】
2009513151.tif 000060
2009513151.tif 000061
2009513151.tif 000062
2009513151.tif 000063