(57)【要約】  本発明は、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物が使用される、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法を提供する。本発明はまた、上記の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド、並びにかかるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅反応混合物及びキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法であって、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物が使用される、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法。
【請求項２】
（ａ）前記標的核酸を含有すると考えられる試料を、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物と接触させる工程（該可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を前記化学物質及び／又は放射線照射及び／又は前記範囲の温度に、前記ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程、並びに
（ｃ）増幅反応を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がリボ核酸であり、前記方法が、
（ａ）前記標的リボ核酸を含有すると考えられる試料を、少なくとも１つの第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物と接触させる工程（該第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、第１の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は第１の範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、前記リボ核酸の逆転写を可能にする条件下でインキュベートする工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）の混合物を前記第１の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は前記第１の範囲の温度に、前記第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドの前記ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程、並びに
（ｄ）プライマー伸長産物を形成するために増幅反応を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅反応混合物が、少なくとも１つの第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドをさらに含み（該第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、第２の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は第２の範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、且つ前記方法が、前記工程（ｂ）の前に前記工程（ａ）の混合物を前記第２の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は前記第２の範囲の温度に、前記第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドの前記ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも逆転写酵素及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する二酵素系、又は逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方として機能するただ１つの酵素を使用する一酵素系を有する、一段階ＲＴ−ＰＣＲプロセスである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記非ヒドロキシル基３’末端の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％がヒドロキシル３’末端に変換される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、その３’末端にカルボン酸エステル基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記カルボン酸エステルがギ酸エステル、ベンゾイルギ酸エステル、ハロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、トリフェニルメトキシ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、マレイン酸エステル及びその誘導体、コハク酸エステル及びその誘導体、４−オキソペンタン酸エステル、ピバル酸エステル、クロトン酸エステル、４−メトキシクロトン酸エステル、並びに３−フェニルプロピオン酸エステルから成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
３’ヒドロキシル基を再生するために、アジド、イミダゾール、ピリジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、及び水酸化テトラブチルアンモニウムから成る群から選択される化学物質が使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
３’ヒドロキシル基を再生するために、化学物質を或る範囲の温度のインキュベーションと組合せて使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記カルボン酸エステルがマレイン酸エステルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにヒドロキシルアミン又はヒドラジンが使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記カルボン酸エステルがマレイン酸エステルであり、且つ或る範囲の温度のインキュベーションの際に、３’ヒドロキシル基を再生するためにヒドロキシルアミン又はヒドラジンが使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、その３’末端にシリルエーテル基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記シリルエーテルがトリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ジメチルイソプロピルシリルエーテル、ジエチルイソプロピルシリルエーテル、ジメチルヘキシルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテル、トリ−ｐ−キシルシリルエーテル、トリフェニルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテル、及びｔ−ブチルメトキシフェニルシリルエーテルから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
３’ヒドロキシル基を再生するためにフッ化物が使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記フッ化物がフッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、及びフッ化水素酸から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、その３’末端にエーテル基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エーテルがテトラヒドロフラニルエーテルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エーテルがアリルエーテルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにパラジウム触媒又はロジウム触媒が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記エーテルがｐ−メトキシフェニル又はｐ−メトキシベンジル又は３，４−ジメトキシベンジルエーテル又は（４−メトキシフェノキシ）メチルエーテルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するために硝酸セリウムアンモニウムが使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記エーテルがメトキシエトキシメチルエーテル、メトキシメチルエーテル、グアイアコールメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、及びテトラヒドロチオフラニルエーテルから成る群から選択され、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにルイス酸触媒が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記エーテルがシロキシメチルエーテル又は２−（トリメチルシリル）エトキシルメチルエーテルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにフッ化物が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記エーテルが２−（トリメチルシリル）エトキシ（dethoxy）メチルエーテルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにＬｉＢＦ４及び／又はフッ化物が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記エーテルがメチルエーテルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにＢＢｒ３、ＳｉＣｌ４、ＮａＩ、及びＡｌＸ３から成る群から選択される１つ又は複数の化学物質が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドがその３’末端に、光分解開裂を受けて３’ヒドロキシル基を再生することのできる修飾基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾基がｐ−メトキシベンジルエーテル、硝酸エステル、及びｏ−ニトロベンジルカーボネートから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
３’ヒドロキシル基を再生するために、放射線照射がそれ自体で、又は化学物質及び／又は或る範囲の温度と組合せて使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
インベーダーアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅、鎖置換増幅、転写媒介増幅、核酸配列ベース増幅、自律的配列複製、単一プライマー等温増幅、単一プライマー等温指数増幅、又はループ媒介増幅で使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
その３’末端にカルボン酸エステル基を有する、請求項２９に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記カルボン酸エステルがマレイン酸エステルである、請求項３０に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
その３’末端にエーテル基を有する、請求項２９に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記エーテルがシリルエーテルである、請求項３２に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
その３’末端に、光分解開裂を受けて３’ヒドロキシル基を再生することのできる修飾基を有する、請求項２９に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅反応混合物。
【請求項３６】
請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅反応キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、核酸化学の分野に関する。より詳細には、本発明は核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法、及び非特異的増幅を低減する方法に関する。
【０００２】
本願は、２００７年７月３１日付で出願された米国特許出願第６０／８３４，４１０号（この出願は参照により本明細書中に完全に援用される）の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
核酸増幅技術は臨床微生物学、血液スクリーニング、食品安全、遺伝病の診断及び予後、環境微生物学、薬物標的の発見及びバリデーション、法医学（forensics）、及び他の生物医学研究に広く利用されている。核酸増幅のロバスト性、特異性、感度、正確度及び精度に関する信頼性、並びに供給可能性（affordability）が特に重要である。
【０００４】
核酸配列特異的増幅は、特異的配列の存在の高感度な検出を可能にしている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つの熱サイクル増幅技術である。
【０００５】
ＰＣＲ及びＬＣＲとは対照的に、等温増幅とは増幅が実質的に一定の温度で実行される類の増幅を指す。転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ（商標））及び単一プライマー等温指数増幅（Ｘ−ＳＰＩＡ（商標））、自律的配列複製（３ＳＲ）、並びにループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）は等温増幅の例である。核酸配列は、サイクリングプローブ及びインベーダーアッセイ等のシグナル増幅プロセスによっても検出することができる。検出可能なシグナルは、ハイブリダイズしたプローブのヌクレアーゼ開裂により発生する。
【０００６】
全ての酵素はその熱安定性に関わらず、或る範囲の温度で活性を有するため、このような特性は核酸増幅に特異性、感度及びシグナル／ノイズ比等に関して悪影響を及ぼし得る。このことはＰＣＲプロセスにおいて明確に示されている。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲに不可欠である。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの触媒活性の最適温度はおよそ６０℃〜７５℃であるが、低い温度でも活性を有する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは室温であっても有意な活性を保持する。低温でのその活性はプライマー二量体形成、非特異的増幅、及び検出感度の低下の原因となる。
【０００７】
ＤＮＡ  ＰＣＲの性能はホットスタート技術の採用によって向上する。「ホットスタート」とは、低温では反応成分の１つ又は複数を物理的又は機能的に残りの成分から分離しておき、高温で反応を開始させるＰＣＲ反応を構築する任意の方法を指す。ホットスタートＰＣＲ技術は以下のグループに分類される：
１．特許文献１、特許文献２、特許文献３、及び特許文献４（全て参照により本明細書中に援用される）に開示される、全ての必須成分を少なくとも２つの部分に分ける物理的障壁。障壁は高温で加熱することにより取り除かれる。
【０００８】
２．特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、及び特許文献１３（全て参照により本明細書中に援用される）に開示される、低温で酵素活性を抑制する可逆的酵素阻害因子。阻害因子の結合は非共有結合又は共有結合である。これらの方法によるホットスタートは均一であり、最も広く使用されている。
【０００９】
３．特許文献１４（参照により本明細書中に援用される）に開示される、補因子の相分離。Ｍｇ２＋は低温で沈殿しており、温度が上昇すると可溶になる。
【００１０】
一段階ＲＴ−ＰＣＲは、１つのバイアルで逆転写ＲＮＡ分子を結合し、相補的ＤＮＡ分子を増幅することによりＲＮＡ標的を増幅するプロセスである。標的ＲＮＡ分子としてはＨＩＶ、ＨＣＶ、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヒトインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス等が挙げられる。米国では、ドナー血液におけるＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、及びＷＮＶの存在を検査することが義務付けられている。一段階ＲＴ−ＰＣＲの性能は、これらの臨床検査及び血液スクリーニングにとって重要である。残念ながらどの既存のホットスタート技術も、以下の理由のためにこのプロセスに十分に適用することができない：
１．ほとんどの逆転写酵素、逆転写の主要な酵素は熱安定性ではなく、高温でのインキュベーション後に活性を失うためホットスタートプロセスの標的になり得ない。
【００１１】
２．試験の対象であるＲＮＡ分子は安定ではなく、高温で相当な分解を受ける。Ｍｇ２＋等の二価金属イオンの存在により、分解はさらに激しくなる。どの既存の技術も、標的ＲＮＡ分子に損傷を与えることなく適用することができない。
【００１２】
３．通常３０分以上の逆転写プロセスの長期インキュベーションは、検出感度を劇的に低減し得る副反応が起こる可能性を大いに増大する。これは、酵素阻害因子ベースホットスタート技術が一段階ＲＴ−ＰＣＲの性能を向上しないことを示している。
【００１３】
核酸増幅の実際的重要性のために、核酸増幅反応、特に一段階ＲＴ−ＰＣＲの性能を向上することができる新規の技術は需要が高い。本出願では、核酸増幅反応の新規の開始制御が記載される。本明細書中で言及される上記及び下記の全ての特許、特許出願、及び特許公報は、参照により本明細書中に援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，４１１，８７６号
【特許文献２】米国特許第５，５６５，３３９号
【特許文献３】米国特許第５，４１３，９２４号
【特許文献４】米国特許第５，６４３，７６４号
【特許文献５】米国特許第５，３３８，６７１号
【特許文献６】米国特許第５，６７７，１５２号
【特許文献７】米国特許第５，７７３，２５８号
【特許文献８】米国特許第６，１８３，９９８号
【特許文献９】米国特許第５，６９３，５０２号
【特許文献１０】米国特許第５，８７４，５５７号
【特許文献１１】米国特許第５，７６３，１７３号
【特許文献１２】米国特許第６，０２０，１３０号
【特許文献１３】米国特許第６，１８３，９６７号
【特許文献１４】米国特許第６，４０３，３４１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドに関するホットスタート技術がないこと、及び核酸増幅の必須成分として、オリゴヌクレオチドはホットスタート技術又は開始制御技術の理想的な標的であることを見出している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法であって、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物が使用される、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法であって、
（ａ）標的核酸を含有すると考えられる試料を、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物と接触させる工程（当該可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を上記化学物質及び／又は放射線照射及び／又は上記範囲の温度に、ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程、並びに
（ｃ）増幅反応を実施する工程を含む、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、標的リボ核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）標的リボ核酸を含有すると考えられる試料を、少なくとも１つの第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物と接触させる工程（当該第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、第１の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は第１の範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を、リボ核酸の逆転写を可能にする条件下でインキュベートする工程、
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を上記第１の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は上記第１の範囲の温度に、第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドのヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程、並びに
（ｄ）プライマー伸長産物を形成するために増幅反応を実施する工程を含む、標的リボ核酸配列を増幅する方法を提供する。
【００１９】
標的リボ核酸配列を増幅する方法の一実施形態では、増幅反応混合物が、少なくとも１つの第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドをさらに含み（当該第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、第２の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は第２の範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、且つ当該方法が、工程（ｂ）の前に工程（ａ）の混合物を当該第２の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は当該第２の範囲の温度に、第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドのヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程をさらに含む。
【００２０】
本発明はまた、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅反応混合物又はキットを提供する。
【００２２】
本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドの非ヒドロキシル３’末端の例は、カルボン酸エステル、シリルエーテルを含むエーテル基、及び光分解性基であるが、これらに限定されない。
【００２３】
好適な一実施の形態では、本発明の方法は少なくとも（at lease）逆転写酵素及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する二酵素系、又は逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方として機能するただ１つの酵素を使用する一酵素系を有する、一段階ＲＴ−ＰＣＲプロセスに有用である。
【００２４】
別の好適な実施の形態では、本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドの非ヒドロキシル基３’末端の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％がヒドロキシル３’末端に変換される。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドベース開始制御核酸増幅は、ホットスタート技術の代替であることに加えて、多様な核酸増幅反応、特にＲＴ−ＰＣＲ反応性能を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】オリゴヌクレオチドの無水物による修飾を示す図である。ＴＥＡ中の触媒ＤＭＡＰの存在下で、オリゴヌクレオチドのヒドロキシル基（５’ヒドロキシル基及び３’ヒドロキシル基の両方を含む）は、無水マレイン酸とエステルを形成する。
【図２】オリゴヌクレオチドのマレイン酸エステルの加水分解を示す図である。ヒドロキシルアミンは求核性の強い化学物質であり、カルボン酸エステル結合を効率的に切断することができる。その結果、５’ヒドロキシル基及び３’ヒドロキシル基の両方が再生し、ヒドロキシアミドが形成される。
【図３】オリゴヌクレオチドのトリアルキルシリルクロリドによる修飾を示す図である。オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基及び３’ヒドロキシル基は、イミダゾールの存在下でtert−ブチルジメチルシリルクロリドと反応し、tert−ブチルジメチルシリルエーテルを形成する。
【図４】シリルエーテルのフッ化物による開裂を示す図である。シリルエーテルはフッ化物により加水分解される。５’ヒドロキシル基及び３’ヒドロキシル基の両方が加水分解の結果、再生する。
【図５ａ】ＤＮＡ  ＰＣＲにおける、修飾オリゴヌクレオチドによるプライマー二量体形成の低減を示す図である。鋳型の存在下（Ｔ＋）、又は鋳型（temlate）の非存在下、即ち鋳型を含まない対照（ＮＴＣ）における標準非修飾オリゴヌクレオチド（Ｒ）及び修飾オリゴヌクレオチド（Ｍ）を用いた増幅曲線である。ＰＣＲは標準コールドスタートＴａｑポリメラーゼを用いて行われた。増幅は、二本鎖特異的核酸染色フルオロフォアであるＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（商標）色素を用いてモニタリングされた。Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（商標）は非配列特異的に二本鎖ＤＮＡを検出する。したがって、増幅されたプライマー二量体及び標的配列の両方が検出される。
【図５ｂ】ＤＮＡ  ＰＣＲにおける、修飾オリゴヌクレオチドによるプライマー二量体形成の低減を示す図である。プライマー二量体及び標的配列は増幅産物の融解曲線により区別される。
【図６ａ】標準非修飾オリゴヌクレオチドを用いた一段階ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下での、プライマー二量体形成の阻止に対するホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの無効性を示す図である。一段階ＲＴ−ＰＣＲ条件下では、標準Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｒｅｇＴ）及びホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｈｓＴ）の両方が、鋳型（Ｔ＋）の存在又は鋳型の非存在（鋳型を含まない対照、ＮＴＣ）に関わらずプライマー二量体のみを生成した。増幅曲線を示す。
【図６ｂ】標準非修飾オリゴヌクレオチドを用いた一段階ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下での、プライマー二量体形成の阻止に対するホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの無効性を示す図である。融解曲線を示す。
【図７】プライマー二量体形成の修飾オリゴヌクレオチドによる低減を示す図である。全てのＰＣＲ反応は、標準Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の非存在下で行われた。したがって、ここで観察される全ての産物はプライマー二量体である。これは異なる条件下でプライマー二量体が形成される量を測定する方法である。より多くのプライマー二量体が形成されるほど、増幅曲線の発生が早くなる。標準非修飾オリゴヌクレオチド（Ｒ）はプライマー二量体を生成した。約４サイクルでのＣｔ値の違いに反映されるように逆転写酵素の存在（ＲＴ＋）によって、逆転写酵素の非存在下（ＲＴ−）よりも多くのプライマー二量体が形成された。対照的に、修飾オリゴヌクレオチド（Ｍ）を用いると、プライマー二量体ははるかに減少した。逆転写酵素の存在がより多くのプライマー二量体形成を引き起こすとは限らなかった。
【図８ａ】修飾オリゴヌクレオチドによる一段階ＲＴ−ＰＣＲ性能の向上を示す図である。修飾オリゴヌクレオチド（Ｍ）を用いた場合のプライマー二量体のＣｔは、標準オリゴヌクレオチド（Ｒ）と比較すると１１サイクル遅れている。
【図８ｂ】修飾オリゴヌクレオチドによる一段階ＲＴ−ＰＣＲ性能の向上を示す図である。標準オリゴヌクレオチドを用いると、極度のプライマー二量体形成により、１２５０コピーの標的配列の存在下であっても標的配列の増幅は起こらなかった。対照的に、修飾オリゴヌクレオチドは増幅産物の融解曲線から明らかなように、プライマー二量体を生じない明白な標的配列増幅をもたらした。
【００２７】
表１は、増幅系に存在するオリゴヌクレオチドの数に対する考え得るプライマー二量体種の数を示している。
【００２８】
【表１】
2009545316.tif 000002
【００２９】
この表は以下の仮定を基に作成されている：
１．各標的は２つの異なるオリゴヌクレオチドにより増幅される。
【００３０】
２．各プライマー二量体（ＰＤ）は２つの異なるオリゴヌクレオチドにより形成される。
【００３１】
３．任意の２つのオリゴヌクレオチドは、プライマー二量体を１つだけ形成し得る。
【００３２】
考え得るプライマー二量体種の数（＃ＰＤ）は以下の等式により算出される：
＃ＰＤ＝Ｎ（２Ｎ−１）
Ｎは増幅する標的の数である。
【００３３】
Ｎが増加すると、必要なオリゴヌクレオチドの数は直線的に増加する。一方、＃ＰＤは等比級数的に上昇する。例えば、シングルプレックス増幅系には２つのオリゴヌクレオチドが存在する。このようなシングルプレックス系では、ただ１つの増幅対象である標的及び１つのプライマー二量体種が存在する。＃ＰＤ／Ｎの比は１である。デカプレックス（deca-plex）増幅系では、２０のオリゴヌクレオチド及び１０の標的配列が存在する。ここで＃ＰＤは１９０に増加する。＃ＰＤ／Ｎ種の比は１９になる。
【００３４】
プライマー二量体種の数の等比級数的な増加は、プライマー二量体形成の可能性を著しく増大し、特に一段階ＲＴ−ＰＣＲシステムにおけるマルチプレックスＰＣＲを非常に困難にしている。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法であって、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物が使用される、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法に関する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅」とは、核酸配列の増幅（例えばＲＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）又は核酸シグナルの増幅（例えばインベーダーアッセイ）を指す。
【００３７】
通常、核酸増幅に使用されるオリゴヌクレオチドは３’ヒドロキシル基を有する。３’ヒドロキシル基は、オリゴヌクレオチドにとって、ｉ．核酸ポリメラーゼにより伸張されるため、及びｉｉ．核酸リガーゼにより連結されるために必須である。３’ヒドロキシル基はまた、ｉ．３’→５’ヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性と呼ばれる）に対する感受性、及びｉｉ．インベーダーアッセイにおける開裂可能な構造の形成に影響を与える。したがって、オリゴヌクレオチドプライマーの３’ヒドロキシル基の修飾は、増幅反応におけるその機能を効率的に阻害し得る。
【００３８】
適切な修飾基の選択基準は以下である：
１．プロセスにより完全又はほぼ完全に修飾されたオリゴヌクレオチドが生成する。
【００３９】
２．修飾オリゴヌクレオチドが保存条件下で安定である。オリゴヌクレオチドは通常、４℃又は−２０℃で水溶液中に保存される。この条件下では、測定可能な自動的な戻りは起こらない。
【００４０】
３．修飾を戻すために使用される化学物質、及び開裂により生じた産物が核酸増幅プロセスに干渉しない。操作工程を付加することなく、均一系において開始制御を行うのが好ましいため、化学物質及び／又は開裂産物が酵素（ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ等）の活性を有意に阻害せず、又は反応の特異性を変化させないことが重要である。
【００４１】
４．戻しが効率的に行われる温度は、反応系の酵素の熱安定性に適合する。例えば、ＰＣＲシステムにおいて６０℃を超える温度で戻しを起こすことが最善であり得る。ＴＭＡによる核酸増幅については、戻しは４５℃未満で行なわれなくてはいけない。
【００４２】
好適な一実施形態では、本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、３’カルボン酸エステルを有する。３’ヒドロキシル基を再生するために、アジド、イミダゾール、ピリジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、水酸化テトラブチルアンモニウム（これらに限定されない）から選択される化学物質が使用される。
【００４３】
別の好適な実施形態では、本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは３’シリルエーテルを有する。３’シリル基を除去し、且つ３’ヒドロキシル基を再生するために、フッ化物を含有する化学物質が反応系に含まれる。
【００４４】
別の好適な実施形態では、本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは３’エーテル基を有する。
【００４５】
別の好適な実施形態では、本発明の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、光分解開裂を受けて３’ヒドロキシル基を再生することのできる３’修飾基を有する。光分解性基は光によって、又は化学物質と組み合わせることによって除去される。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドの修飾因子は、オリゴヌクレオチドに以下により結合する：
１．合成後修飾
２．修飾因子を有する合成担体を使用するオリゴヌクレオチド合成装置
３．修飾ヌクレオシドを有する合成担体を使用するオリゴヌクレオチド合成装置
４．修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを使用するオリゴヌクレオチド合成装置（合成方向は５’→３’又は３’→５’のいずれかである）
５．試薬を使用するオリゴヌクレオチド合成装置
ホットスタートＰＣＲ反応による核酸の定性的増幅の向上に加えて、本明細書中に開示される本発明は、等温増幅により核酸増幅を定性的且つ定量的に向上することが可能である。
【００４７】
ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ＲＣＡを含む多様な等温増幅技術による核酸の定量的検出が報告されている（Walker, 1996; Spears, 1997; Nadeau, 1999; Leone, 1998; Nilsson, 2002（全て参照により本明細書中に援用される））。しかしながら、これらのアッセイの正確度及び精度は明らかに向上させる必要がある。定量化不足の一因は増幅反応の開始が制御されていないことである。
【００４８】
本発明によれば、核酸増幅に使用されるオリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基以外の３’部分を有する。しかしながら、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露することにより３’ヒドロキシル基を発生することができる。３’ヒドロキシル基の再生は以下により核酸増幅を可能にする：
ｉ．核酸ポリメラーゼによる標的配列増幅
ポリメラーゼ媒介標的配列増幅プロセスとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ（商標））、単一プライマー等温指数増幅（Ｘ−ＳＰＩＡ（商標））、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、及び自律的配列複製（３ＳＲ）が挙げられる。
【００４９】
３’ヒドロキシル基は核酸重合反応に必要である。
ｉｉ．ライゲーション媒介標的配列増幅
このカテゴリーでは、ライゲーションは標的配列を増幅するのに重要な工程である。技術としてはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、米国特許第６,５１１,８１０号に記載の使用可能なＬＣＲ、ギャップＬＣＲ（米国特許第５，４２７，９３０号）、及びライゲーション媒介ＰＣＲが挙げられる。
【００５０】
ライゲーション媒介ＰＣＲでは、ライゲーションはＰＣＲプロセスの前に起こる。ライゲーションによりプライマー配列が標的に付加される。ライゲーション反応及びＰＣＲの両方に対するオリゴヌクレオチドは本発明の主題である。
ｉｉｉ．インベーダーアッセイ
インベーダーアッセイ（米国特許第６，３４８，３１４号、同第６，０９０，５４３号、同第６，００１，５６７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，８４６，７１７号、及び同第５，８３７，４５０号（全て参照により本明細書中に援用される））はシグナル増幅アッセイである。標的鋳型、上流の侵入型（invasive）オリゴヌクレオチド、及び侵入型オリゴヌクレオチドと部分的に重なる下流のオリゴヌクレオチドは、侵入型構造を形成する。フラップエンドヌクレアーゼは下流のオリゴヌクレオチドを開裂し、検出シグナルを発生させる。侵入型オリゴヌクレオチドの３’末端は開裂に多大な影響を与えることが見出されてきた。実際のところ、非ヒドロキシル３’末端を有する侵入型オリゴヌクレオチドにより形成される開裂構造は、開裂の劇的な減少を示した。
【００５１】
反応温度未満でプライマー二量体形成／非特異的反応を抑制すること、及び反応の開始を制御することにより、本発明は上記核酸増幅法の感度及び定量能を向上する。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、所望の標的核酸配列と特異的にハイブリダイズ可能な配列を含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは標的核酸配列のみに相補的な配列を含有する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは標的配列に相補的ではない領域を有する。非相補的配列はオリゴヌクレオチドの５’領域に位置する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは変化する、例えば増幅によって起こる二重鎖形成時に減少又は消失する二次構造を有する。
【００５４】
オリゴヌクレオチドは５つの部分：
ｉ．塩基
ｉｉ．糖基
ｉｉｉ．ヌクレオシド間の結合
ｉｖ．検出用のシグナル発生基
ｖ．他の基
から構成され得る。
【００５５】
ｉ．塩基としては、任意の天然の塩基、アデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、グアニン、７−メチルグアニン、キューオシン、ワイオシン、イノシン、シトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、ウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、４−チオウラシル、及びチミンが挙げられるが、これらに限定されない。同様に使用してもよい塩基類似体としては、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン（アデニン及びグアニン）、２−及び／又は６−チオプリン（アデニン及びグアニン）、５−ブロモウラシル、５−ニトロインドール、５−プロピニルウラシル、イソシトシン、イソグアニン、５−フェニルウラシル、２−Ｎ−メチルグアニン、５−ブチニルウラシル、ジメチルチアゾールウラシル、５−プロピニルシトシン（cytocine）、５−フェニルシトシン、５−ブチニルシトシン、ジメチルチアゾールシトシン、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン、５−（Ｎ−アミノヘキシル）カルバモイルウラシル、６−アザチミン、Ｎ２−イミダゾリルプロピル−２−アミノアデニン、Ｎ２−イミダゾリルプロピルグアニン、米国特許第６，００１，６１１号に開示の修飾塩基が挙げられるが、これらに限定されない。最も一般的に使用される塩基はアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンである。
【００５６】
ｉｉ．オリゴヌクレオチドの主鎖は標準５’→３’ホスホジエステル結合又はその多様な修飾から構成され得る。修飾の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなペプチド結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’→Ｏ５’ホスホロアミデート、Ｏ３’→Ｎ５’ホスホロアミデート、３’ホスホロチオレート、５’ホスホロチオレート、逆結合（inverted linkage）、メチルホスホネート、モルホリノ核酸、ボラノホスホネート、ホスホロ−Ｎ−ブチルアミデート、及びメチレンメチルイミン、ｄ−スペーサー、及び炭素リンカーが挙げられる。
【００５７】
ｉｉｉ．本発明に使用されるオリゴヌクレオチドの糖基は通常、リボース及び／又は２−デオキシリボースである。オリゴヌクレオチドは１つ又は複数の他の種類の糖部分、例えば、２−Ｏ−アルキルリボース、２−アミノリボース、２−フルオロリボース、アラビノース、２−デオキシアラビノース、２−デオキシ−２−フルオロアラビノース、１，５−無水ヘキシトール、ロックト核酸（ＬＮＡ：locked nucleic acid）に見られるような２−Ｏ，４−Ｃ−メチレンリボース、及びシクロヘキセン主鎖を含有してもよい。
【００５８】
ｉｖ．本発明によれば、オリゴヌクレオチドはシグナル伝達部分を含んでもよい。シグナル伝達部分は物理的、化学的、光化学的、免疫化学的、及び生化学的な方法、例えば、限定されるものではないが、蛍光、化学発光、生物発光、電気化学発光、リン光、時間分解分光、蛍光偏光、酵素反応、放射能、測色、質量分析、磁気、電気泳動移動度、及びクロマトグラフィーによる検出に適した任意の部分であり得る。
【００５９】
一実施形態では、シグナル伝達部分は、ヌクレアーゼ又はリボザイムの開裂部位を形成し得る配列により隔てられた指示部分及び調整部分を含む。一例はTakara/ClontechのＱ−ｚｙｍｅアッセイである。
【００６０】
別の実施形態では、シグナル伝達部分は標識部分、及びオリゴヌクレオチドが一本鎖の状態である場合、標識部分を消光するクエンチャー部分を含む。２本鎖構造の形成時にシグナルが発生する。Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標）及びＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）は、このカテゴリーで典型的な２つの技術である。標識部分とクエンチャー部分との間のこのような相互作用は、小分子、例えばフルオロフォア及びそのクエンチャー、並びに巨大分子、例えばタンパク質分子（Boute, 2002）（これらに限定されない）を含む任意の適切な要素間に生じ得る。相互作用は任意の適切な機構にも基づき得る。例えば、標識部分及びクエンチャー部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、発光（luminanscence）共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）、リン光共鳴エネルギー移動（ＰＲＥＴ）、及び生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（これらに限定されない）を含む共鳴エネルギー移動に基づき、互いに相互作用し得る。
【００６１】
多様な標識部分及びクエンチャー部分の中でも、ＦＲＥＴプローブが増幅された標的分子の検出に広く使用されている。最も一般的なＦＲＥＴプローブは、２つの相互作用部分を有する。一方は蛍光ドナー基であり、もう一方は蛍光アクセプター基である。アクセプター基は蛍光性であってもよいが、アクセプターとして非蛍光基を有するのが好ましい。ドナー基は５’末端、中央、又は３’末端に位置し得る。アクセプター基も同様である。ドナー基を５’末端に置くのが好ましい。プローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、構造特異的ヌクレアーゼによるプローブの開裂がドナー基をアクセプター基から分離し、アクセプターによりドナーの蛍光を消光させる。
【００６２】
また本発明のプローブのシグナル伝達部分は、相互作用部分を３つ以上有する。例えば、米国特許第５，９５２，１８０号は、識別可能な蛍光発光スペクトルを有する可変長オリゴヌクレオチドの作製方法を開示している。コンビナトリアル蛍光エネルギー移動により固有の蛍光発光スペクトルが発生する。別の例は、米国特許第６，０３７，１３０号に開示の３つの相互作用基を有する波長シフトプローブである。
【００６３】
また別の実施形態では、オリゴヌクレオチド自体が指示部分と相互作用する調整部分であり得る。例えば、Nurmiは単一標識蛍光テルビウムキレートプローブの合成、及びＰＣＲ産物の検出におけるその使用を報告している（Nurmi, 2000）。
【００６４】
オリゴヌクレオチドは、二成分（binary）又は三成分（trinary）のシグナル発生系の一部であってもよい。例えば、本発明のプローブは、米国特許第６，４３２，６４２号に開示されている方法に従って調製した二成分系のオリゴヌクレオチドであり得る。２つの相補的オリゴヌクレオチドを含有する別の二成分系のプローブはLi et al.（Li, 2002）に記載されている。本発明のプローブはまた、三連（tripartite）分子指標の作製に関して記載される方法（Nutiu, 2002）によって調製した三連分子であり得る。１つの違いは、オリゴヌクレオチドが増幅反応及び検出反応の両方に関与することである。
【００６５】
ｖ．本発明のオリゴヌクレオチドはまた、選択位置に基を含有してもよい。基としては、表面若しくは他の分子への標的の結合、複合体化、又はキャピラリー電気泳動による検出を促進するためのマイナーグルーブ結合物質、ピレン、コレステロール、アクリジン、ビオチン、キャピラリー電気泳動移動度修飾因子、アミン、カルボキシル、ホスフェート、チオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
オリゴヌクレオチド上のヒドロキシル基の修飾は、ヒドロキシル基を保護する、オリゴヌクレオチドを標識する、特別な官能基を付加する、各種特性（ヌクレアーゼ耐性、結合親和性等）を変更するための一般的な方法である。例えば、Ｎ−メチルイミダゾール及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の存在下で、無水酢酸が自動オリゴヌクレオチド合成においてキャッピングを行なうために使用される。
【００６７】
本発明に関しては、適切な修飾基は以下の基準を満たさなければならない。
１．  ３’ヒドロキシル基を再生する能力
修飾オリゴヌクレオチドの１０％〜１００％がその３’ヒドロキシル基を再生することが好ましい。修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも５０％がその３’ヒドロキシル基を再生することがより好ましい。修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも７５％がその３’ヒドロキシル基を再生することがさらに好ましい。修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％がその３’ヒドロキシル基を再生することが最も好ましい。再生は核酸増幅が開始又は発生する前に、増幅プロセスが進行するにつれて徐々に起こり得る。
２．ロバスト修飾プロセスにより完全に又はほぼ完全に修飾されたオリゴヌクレオチドが生じる。核酸増幅系における非修飾オリゴヌクレオチドの存在によって本発明の利益が損なわれ得る。このような悪影響をもたらす非修飾オリゴヌクレオチドの割合は、個々の増幅系によって異なる。
３．修飾オリゴヌクレオチドは、測定可能な自動的な戻りが生じることなく保存条件下で安定であるべきである。保存溶液は核酸増幅反応系に適合しなくてはならない。
【００６８】
修飾オリゴヌクレオチドは同様に、全ての反応成分が存在する反応混合物中で十分な安定性を有するべきである。これは、化学物質補助（chemical assisted）活性化に特に重要である。高温が活性化プロセスを大幅に加速可能であることが好ましい。
４．逆反応の条件は核酸増幅プロセスに適合する。３’修飾オリゴヌクレオチドの活性化は、核酸増幅系と同じ反応系で選択的に行なわれる。したがって、活性化に使用される化学物質、活性化産物、温度、ｐＨ、イオン強度、溶媒、光活性化プロセスにおける光の波長及び強度等は全て核酸増幅プロセスに適合させる必要がある。
【００６９】
本発明のオリゴヌクレオチドは非ヒドロキシル基から成る３’基を有する。好適な基は：
１．カルボン酸エステル基
２．シリルエーテル基を含むエーテル
３．光分解性基
である。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチドの修飾因子はオリゴヌクレオチドに：
１．合成後修飾
２．修飾因子を有する合成担体を使用するオリゴヌクレオチド合成装置
３．修飾ヌクレオシドを有する合成担体を使用するオリゴヌクレオチド合成装置
４．修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを使用するオリゴヌクレオチド合成装置（合成方向は５’→３’又は３’→５’のいずれかである）
５．試薬を使用するオリゴヌクレオチド合成装置
により結合する。
【００７１】
オリゴヌクレオチド合成装置による合成は合成後修飾よりも好適である。
【００７２】
合成後修飾が修飾因子基を３’末端に結合するのに利用される場合、遊離５’ヒドロキシル基も同様に修飾される可能性が非常に高い。
【００７３】
好適な一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、カルボン酸エステル基から成る３’基を有する。エステルはギ酸エステル、ベンゾイルギ酸エステル、ハロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、トリフェニルメトキシ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、マレイン酸エステル及びその誘導体、コハク酸エステル及びその誘導体、４−オキソペンタン酸（oxopentaoate）エステル、及びピバル酸エステル、クロトン酸エステル、４−メトキシクロトン酸エステル、並びに３−フェニルプロピオン酸エステル（これらに限定されない）から選択される。
【００７４】
３’ヒドロキシル基を再生するために、化学物質が使用される。化学物質は、アジド、イミダゾール、ピリジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、水酸化テトラブチルアンモニウム（これらに限定されない）から選択される。
【００７５】
オリゴヌクレオチドのアシル化が合成後に行われる場合、３’ヒドロキシル基の無水物によるアシル化は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）等の塩基性溶媒を必要とする。他の塩基性溶媒はピリジン、アニリン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、及びピロリドンである。触媒、例えばジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、フッ化物、１−メチルイミダゾール、４−ピロリノピリジン、２−ヒドロキシピリジンが反応において存在するのが好ましい。
【００７６】
好適な一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは３’マレイン酸エステルを有する。ヒドロキシルアミンが３’ヒドロキシル基を再生するために使用される。
【００７７】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは３’シリルエーテル基を有する。
【００７８】
シリルエーテルはトリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ジメチルイソプロピルシリルエーテル、ジエチルイソプロピルシリルエーテル、ジメチルヘキシル（thexyl）シリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテル、トリ−ｐ−キシルシリルエーテル、トリフェニルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテル、及びｔ−ブチルメトキシフェニルシリルエーテルから成る群から選択される。
【００７９】
−ＯＨ基は第３級アミン塩基、例えばイミダゾール、ピリジン、及びトリエチルアミンの存在下で、トリアルキルシリルクロリドで処理することによりシリルエーテルに変換させることができる。
【００８０】
シリルエーテルは、ほとんどの酸化剤及び還元剤には影響されず、ほとんどの非水系の酸及び塩基に安定である。ｔ−ブチルジメチルシリル基はｐＨ２〜ｐＨ１２の範囲内の水溶液中では安定であるため、最も広く使用されるヒドロキシル修飾基の１つである。
【００８１】
シリルエーテルの安定性はよく研究されている。トリメチルシリルは最も容易にシリル化される。しかしながら、トリメチルシリルは加水分解に最も不安定でもある。トリメチルシリル基のメチル基の１つをｔ−ブチルで置換することにより、ＴＭＳ基よりも約１０４倍安定なｔ−ブチルジメチルシリル基が生じる。
【００８２】
シリルエーテル基は最も一般的には、フッ化物イオンで処理することにより除去される。フッ化物はフッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、フッ化水素酸から成る化学基から選択される。
【００８３】
別の好適な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは３’エーテル基を有する。好適なエーテル基はテトラヒドロフラニルエーテルである。
【００８４】
エーテル基はアリルエーテルである。アリルエーテルは、パラジウム触媒又はロジウム触媒により加水分解される。
【００８５】
別のエーテル基は、ｐ−メトキシフェニル若しくはｐ−メトキシベンジル若しくは３，４−ジメトキシベンジルエーテル又は（４−メトキシフェノキシ）メチルエーテルである。エーテルは硝酸セリウムアンモニウムにより開裂される。
【００８６】
また、ルイス酸触媒媒介加水分解に敏感なエーテルを使用してもよい。エーテルとしてはメトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）エーテル、メトキシメチル（ＭＯＭ）、グアイアコールメチル（ＧＵＭ）エーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロチオフラニルエーテルが挙げられる。
【００８７】
この目的に適切なルイス酸触媒はＺｎＸ２、ＭｇＸ２、ＡｇＸ、ＣｕＸ２、ＭｎＸ２、ＳｎＸ２、ＦｅＸ、ＣｏＸ、ＰｄＸ２、ＨｇＸ２、ＦｅＸ３、ＡｌＸ３、ＬｉＢＦ４、ＴｉＣｌ４等から選択される。Ｘはハロゲン原子である。
【００８８】
３’シロキシメチルエーテル又は２−（トリメチルシリル）エトキシルメチルエーテルは、フッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、フッ化水素酸から成る化学基から選択されるフッ化物により除去することができる。
【００８９】
３’２−（トリメチルシリル）エトキシ（dethoxy）メチルエーテルは、ＬｉＢＦ４及び／又はフッ化物により加水分解され、ヒドロキシル基を再生する。
【００９０】
３’メチルエーテルは、１つ又は複数のＢＢｒ３、ＳｉＣｌ４、ＮａＩ、及びＡｌＸ３から成る群から選択される化学物質を用いて加水分解される。
【００９１】
別の好適な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは光分解開裂を受けて３’ヒドロキシル基を再生することのできる３’修飾基を有する。３’修飾基はｐ−メトキシベンジルエーテル、硝酸エステル、及びｏ−ニトロベンジルカーボネートを含む化学基から選択される。
【００９２】
光分解開裂に加えて、放射線照射の強度及び／又は時間の必要量を低減するために化学物質を反応系に加えてもよい。例えば、ｐ−メトキシベンジルエーテルはＵＶ光（＞２８０ｎｍ）により開裂されるが、加水分解反応を加速するために硝酸セリウムアンモニウムを反応系に加えることができる。
【００９３】
修飾因子除去プロセスの動力学及び熱力学は、修飾基、化学物質の活性化特性、化学物質の濃度、温度、反応系の他の要素、例えばｐＨ、イオン強度等により影響され得る。３’ヒドロキシル基を再生するために放射線照射が使用される場合、その強さ及び波長も活性化プロセスの速度及び完全性に影響し得る。
本発明の各種核酸増幅プロセスへの適用
本発明を各種核酸増幅プロセスに使用し得る方法をよりよく理解するために、本発明を幾つかの現在利用可能な核酸増幅法及び関連の酵素について説明する。
本発明のインベーダーアッセイへの適用
インベーダーアッセイはシグナル増幅法であり、米国特許第６，３４８，３１４号、同第６，０９０，５４３号、同第６，００１，５６７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，８４６，７１７号、及び同第５，８３７，４５０号（全て参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【００９４】
インベーダーアッセイでは、上流の侵入型オリゴヌクレオチド及び下流のシグナル発生プローブオリゴヌクレオチドは標的分子とハイブリダイズして、開裂構造を形成する。ハイブリダイズしたプローブのフラップエンドヌクレアーゼによる開裂によって、検出可能なシグナルが発生する。他の熱安定性酵素と同様に、フラップエンドヌクレアーゼは広範囲の温度で活性を有する。フラップエンドヌクレアーゼは所望の開裂構造のほか、多数の構造を開裂することが可能である。反応系に存在するオリゴヌクレオチドは、多様な分子内構造及び分子間構造を形成し得る。その大部分は低温でのみ安定である。これらの構造の開裂により、バックグラウンドの増加又は検出可能なシグナルの低下が起きる。これらの不要な開裂を低減するか、さらには排除することで、検出アッセイの品質を向上することができる。
【００９５】
本明細書中に開示の修飾された３’末端を有するオリゴヌクレオチドの使用は、鋳型に依存しない開裂を低減する優れた方法である。上流の侵入型オリゴヌクレオチドの３’基が、開裂に多大な影響を与えることが報告されている（Kaiser, 1999）。３’デオキシ、３’ホスフェート、及び３’ｄ−スペーサーを含む３’ヒドロキシル基の置換は全て、劇的な阻害をもたらす。場合によっては、置換によりほぼ完全な阻害が生じる。開裂現象における３’ヒドロキシル基の重要性が明らかに実証された。本発明は、その定量能を向上するためにインベーダーアッセイの開始を制御する、可逆的に修飾された３’末端を有するオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
【００９６】
インベーダーアッセイでは、逆転写（transcrition）せずにＲＮＡ分子を検出することも可能である。ＲＮＡ分子は、特にヌクレアーゼ作用に必須のＭｇ２＋等の二価金属イオンの存在下で熱に弱い。ＲＮＡ標的が検出されると、ホットスタート条件が緩和されるのが好ましい。本発明は、多様な活性化条件を有する多数の修飾因子を提示している。穏和な活性化条件は容易に特定することができる。穏和な活性化の一例は、標的ＲＮＡ分子に損傷を与えないほど穏やかな放射線照射（irradition）である。この態様では、本発明は化学修飾ベースの酵素ホットスタート技術に対して明らかな利点を有する。
本発明のポリメラーゼ連鎖反応への適用
ホットスタートがＰＣＲ増幅を劇的に向上し得ることは十分に立証されている。多数のホットスタート法がＰＣＲ増幅を向上するように開発されてきた。これらは以下のグループに分類することができる：
ｉ．低温での副反応に必要とされる成分を隔てる物理的障壁の作製
特許文献１、特許文献２、特許文献３、及び特許文献４は、温度が上昇すると消失するような障壁を作製する技術を開示している。しかしながら、これは不便である。このような不均一系で全ての成分を混合することもまた、非常に困難である。
ｉｉ．マグネシウム沈殿（特許文献１４）
マグネシウムはＤＮＡポリメラーゼ活性に重要な元素である。本発明によれば、マグネシウムは低温で沈殿し、ＤＮＡ重合反応に関与することができない。適温でマグネシウムの溶解度は上昇する。その結果、マグネシウムは沈殿から放出され、ＤＮＡポリメラーゼを活性化する。これが不均一ホットスタート系であり、「ｉ」に述べたものと同様の問題がある。沈殿したマグネシウムの分取は難しい。
ｉｉｉ．阻害分子のＤＮＡポリメラーゼへの可逆的非共有結合
このような阻害分子は抗体（特許文献５）、又はオリゴヌクレオチド（特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、及び特許文献１３）であり得る。阻害因子／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の安定性は温度に依存する。温度が或る特定の点に達すると、阻害因子はＤＮＡポリメラーゼから脱落し、その後活性化する。非共有阻害因子としては、完全な阻害を達成するのは難しい。阻害因子、特にオリゴヌクレオチド阻害因子は或る程度まで増幅にも干渉する。
ｉｖ．ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾（特許文献６、特許文献７、及び特許文献８）
非共有阻害因子と同様に、これらも均一ホットスタート系である。ジカルボン酸無水物及びアルデヒドのそれぞれが、これらの修飾に使用される。修飾因子は高温での長時間インキュベーションによって、ＤＮＡポリメラーゼから除去される。ＤＮＡポリメラーゼ活性は修飾因子の除去により回復する。これらは酵素活性抑制の完了に関しては非常に厳密である。しかしながら、活性化プロセスは酵素にとって非常に過酷である。実際のところ、活性化プロセス自体によって、酵素分子のかなりの部分も同様に変性する。
【００９７】
本発明は化学修飾系でもある。化学的に修飾されたＰＣＲ酵素を使用する代わりに、３’修飾オリゴヌクレオチドを使用する。
【００９８】
ＤＮＡ標的がＰＣＲにより増幅されると、化学的に可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、化学的に修飾された酵素と同様の高い厳密性をもってホットスタートをもたらす。３’修飾オリゴヌクレオチドは活性化されなければ、低温でＤＮＡポリメラーゼにより伸張されることができない。したがって、プライマー二量体又は副反応は低温では起こり得ない。化学物質補助活性化から放射線照射媒介活性化に及ぶ多様な活性化の方法により、穏和な活性化条件にすることが可能である。
【００９９】
ＲＮＡ標的を増幅する場合、ＲＮＡ鋳型はまず、逆転写プロセスを介してＤＮＡに変換されねばならない。逆転写が別個の管で行われ、一定分量の逆転写産物がＰＣＲ増幅に使用される場合、ＰＣＲプロセスは上述したＤＮＡ鋳型のものと本質的に同様である。
【０１００】
一段階ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写及びＰＣＲの両方が同じ管で順次に実行されるプロセスである。「背景技術」のセッションで述べたように、既存のホットスタートＰＣＲはいずれも一段階ＲＴ−ＰＣＲに効果的ではない。本発明により一段階ＲＴ−ＰＣＲを有意に向上することができる。
【０１０１】
シングルプレックス一段階ＲＴ−ＰＣＲについては、本発明が適用される場合、正常３’ヒドロキシル基を持つオリゴヌクレオチドは１つしかない。この１つが逆転写用である。プライマー二量体が１つの単一プライマーから生じ得ないことは知られている。
【０１０２】
トリプレックス一段階ＲＴ−ＰＣＲプロセス、例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、及びＨＣＶの存在をモニタリングするドナー血液試験用のRocheの製品については、６つのプライマーがある。ＨＩＶ及びＨＣＶはＲＮＡ標的であり、ＨＢＶはＤＮＡ標的である。従来の技術により形成され得るプライマー二量体は１５種ある（表１）。本発明によれば、オリゴヌクレオチドのうち４つが３’修飾基を有する。したがって、生成され得るプライマー二量体は１種のみである。現行の技術の利益は明白且つ有意である。
【０１０３】
本発明を採用することにより、一段階ＲＴ−ＰＣＲを二重修飾を利用してさらに向上することができる。一方の修飾は逆転写に必要とされるオリゴヌクレオチドに対し、もう一方はＰＣＲ増幅に関与するオリゴヌクレオチドに対する。この２つの修飾は、逆転写及びＰＣＲプロセスの開始が別々に制御可能なように２つの異なる活性化条件を有する。このアプローチはマルチプレックス一段階ＲＴ−ＰＣＲに特に有用である。ＲＴプライマー（複数可）は、逆転写の開始直前に活性化され、ＲＴ反応に利用可能になる。一方、残りのプライマーはＰＣＲの開始まで不活性のままである。これにより、ＲＴの開始前に起こるプライマー二量体形成／非特異的反応が排除される。活性化工程は多様な方法で行なわれ得る。例えば、一方の修飾が放射線照射により除去され、もう一方が化学物質補助活性化により除去される。別の例は、両方の修飾は、同じ化学物質／放射線照射のいずれかに異なる感受性を有することである。温度は、３’ヒドロキシル基の生成に影響を及ぼす別の主要因である。
本発明のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）への適用
ＰＣＲと同様に、ＬＣＲは熱サイクルを伴う指数関数的標的増幅方法である。ＬＣＲに関連する低感度の検出は主に、その反応温度未満の温度での熱安定性リガーゼの残効性に起因する。ＬＣＲでは、非鋳型指示（non-template directed）増幅と鋳型指示増幅とは識別不可能である。
【０１０４】
３’ヒドロキシル基はライゲーション反応に必須であるため、本明細書中に開示の本発明を利用する３’修飾オリゴヌクレオチド（oligonucletides）によるホットスタートＬＣＲは低温での非鋳型指示ライゲーションを低減するか、さらには排除することができる。
【０１０５】
米国特許第６，５１１，８１０号は、ライゲーション反応を可能にするために熱安定性フラップエンドヌクレアーゼを使用する方法を開示している。ＦＲＥＴプローブが系に加えられる場合、標的分子のリアルタイム定量化を行なうために使用され得る。本発明はＬＣＲ検出を有意に向上するが、非鋳型指示増幅は排除されない。本明細書中に開示の方法はバックグラウンドをさらに低減することができる。本発明はこのプロセスにおけるホットスタートの実行によく適している。
本発明のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ＋）、単一プライマー等温指数増幅（Ｘ−ＳＰＩＡ＋）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）への適用
これらの技術は米国特許第５，８５４，０３３号、同第６，１８３，９６０号、同第６，２１０，８８４号、同第６，３４４，３２９号、同第５，２７０，１８４号、同第５，９１６，７７９号、同第６，２５１，６３９号、及び同第６，４１０，２７８号にそれぞれ開示されている。上記等温増幅プロセスの全てに共通する要素は、強い鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用である。これらの技術に最も広く使用されるＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）である。
【０１０６】
Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）は６５℃までの温度で活性を有するが、熱安定性ではない。したがって、酵素の化学修飾はホットスタートに実行可能な方法ではない。実際のところ、ホットスタート系はこれらの技術については未だ開発されていない。本発明に関係する多様な活性化条件により、個々の増幅技術に適合する条件を見出すことが可能になる。
【０１０７】
本発明をこれらのアッセイに適用することで、増幅の開始前に起こる全ての副反応を排除することができる。従来のオリゴヌクレオチドは本発明のオリゴヌクレオチドに置き換えられる。理想的には、３’ヒドロキシル基は増幅反応の開始直前に再生される。
【０１０８】
本発明をこれらのプロセスに適用することで、増幅感度の向上だけでなく、標的定量化の向上が可能になる。標的定量化の向上は増幅の開始制御により達成される。
ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、及び３ＳＲに関する本発明の使用
これらは主に、一定の温度でＲＮＡ標的を増幅するために使用される。増幅は以下の工程を含む：
ｉ．相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するための逆転写
逆転写の結果、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖（heterduplex）が形成される。逆転写に使用されるオリゴヌクレオチドは、３’領域に標的結合配列を有し、５’領域にＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域を有する。一本鎖プロモータ配列は、二本鎖になるまで転写機能を有しない。
ｉｉ．ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるＲＮＡ鎖のＲＮａｓｅ  Ｈ分解
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、逆転写酵素又は単独のＲＮａｓｅ  Ｈによりもたらされる。
ｉｉｉ．二本鎖ＤＮＡの合成
第２のオリゴヌクレオチドが一本鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズし、逆転写酵素により伸張されてＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を生じる。ここで、対応するＲＮＡポリメラーゼに関するプロモータ領域は二本鎖であり、且つ機能的である。
ｉｖ．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による一本鎖ＲＮＡの合成
機能的プロモータ及びＲＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の各々が何百ものＲＮＡ分子を生じる。これで増幅サイクルが完了する。結果として、各ＲＮＡ鋳型分子は数百倍にまで増幅される。
ｖ．工程ｉ〜ｉｖの繰返し
これにより標的核酸が指数関数的に増幅される。
【０１０９】
これらのアッセイの感度は概して、ＰＣＲほど良くはない。これらの定量能もＰＣＲほど良くはない。開始制御をこれらのアッセイに適用することにより、これら２つの重要な態様を向上することができる。開始制御は副反応を効率的に低減するか、さらには排除する。これによりアッセイの感度が向上する。
【０１１０】
本発明をこれらのプロセスに使用すると、その標的定量能も向上する。開始制御系がなければ、増幅反応は全成分の混合直後、急激に開始する。高速の増幅反応速度と共に、試料及び標準物質間で異なる増幅開始時刻は、正確且つ厳密な定量化を極めて困難にする。開始制御により全増幅が同時に開始される。定量化は有意に向上することができる。
【０１１１】
本発明のオリゴヌクレオチドは核酸増幅に、３’ヒドロキシル基を有する従来のそのオリゴヌクレオチドの対応物に置き換えて使用される。オリゴヌクレオチドの配列は同じままである。
【０１１２】
当業者は、本発明の利益の大きさが核酸増幅技術、オリゴヌクレオチドの配列、反応系、インキュベーション条件等によって異なることを理解するであろう。
【０１１３】
当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドを従来のオリゴヌクレオチドと置き換える場合、調整を行なうことが可能である。特異的修飾因子基、及び３’ヒドロキシル基を再生するために使用される化学物質に応じて、最適反応条件を実現するためにオリゴヌクレオチド濃度、緩衝系、及びインキュベーション条件を調整する必要があり得る。
【０１１４】
本発明は、プライマー二量体形成／非特異的反応を低減可能な他の技術と併せて使用することができる。前述のホットスタート技術がこのような技術の例とされる。また、プライマー二量体形成をさらに低減し、検出特異性を増大するために一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を反応系に加えてもよい。
【０１１５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマー二量体形成及び非特異的反応をさらに低減するための、第１の３つのヌクレオチド中の特別な塩基及び糖基の使用に適合する。これら２つの技術は、米国特許第６，００１，６１１号及び同第６，７９４，１４２号（その両方が参照により本明細書中に援用される）にそれぞれ開示されている。
【０１１６】
本発明はまた、核酸増幅を実行するために使用されるキットに関する。各キットの構成は多様であり得るが、少なくとも１つの本発明のオリゴヌクレオチドが増幅を行なうために必要とされる。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明の実行及び使用の方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるが、本発明者らが自らの発明であると見なすものの範囲を限定するとは意図されず、下記の実験が実行される全て又は唯一の実験であることを意味するとも意図されない。使用される数（例えば量、温度等）に関して正確性を確かにする試みは為されてはいるが、幾らかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。
[実施例]
【実施例１】
【０１１８】
オリゴヌクレオチドの無水マレイン酸による修飾
反応機構を図１に示す。Ｂ型肝炎ウイルス検出に使用される３つのオリゴヌクレオチドの配列は表２に列挙される。
【０１１９】
【表２】
2009545316.tif 000003
【０１２０】
凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、１×ＴＥ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１００μＭで溶解する。４−（ジメチルアミノ）−ピリジン（ＤＭＡＰ）（Aldrich）溶液を、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（Aldrich）で３ｍｇ／ｍｌに調製する。４Ｍ無水マレイン酸（Aldrich）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド。（ＤＭＦ）（Sigma）で調製する。
【０１２１】
工程１．  １６μｌのオリゴヌクレオチドと３２０μｌのＤＭＡＰ溶液を２．０ｍｌ微小遠心管中で混合する
工程２．  ６μｌの４Ｍ無水マレイン酸をオリゴヌクレオチド／ＤＭＡＰ混合液に添加する
工程３．  最高速度で２分間、室温でボルテックスする
工程４．  １０２６μｌのイソプロパノールを添加し、よく混合する
工程５．  −２０℃で２時間インキュベートする
工程６．  １４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離する
工程７．  上清を取り除く→８００μｌのイソプロパノールを添加する→１４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離する
工程８．  工程７を一度繰り返す
工程９．  上清（supernant）を取り除く→管を室温で乾燥させる→このオリゴヌクレオチドを水に溶解する
【実施例２】
【０１２２】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの調製
サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、ＧｅｎｅＢａｎｋからの配列（アクセッション番号Ｊ０４６３９）を用いてＰＣＲによりクローニングした。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの精製は、Lawyer et al.により記載される手順（Lawyer et al., 1989, JBC 264(11): 6427-37; Lawyer et al. 1989, PCR Meth. Appl. 2(4): 275-87）を用いて実行した。
【実施例３】
【０１２３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのシトラコン酸による修飾
シトラコン酸（Aldrich）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Aldrich）及びＮＨＳ（Aldrich）を全てＤＭＦに１Ｍで溶解した。２００μｌのＤＣＣ、２００μｌのＮＨＳ、及び１００μｌのシトラコン酸を１．５ｍｌ微小遠心管中で混合した。混合物を次に室温で１時間インキュベートした。その後、混合物を１２０００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離した。ペレットを捨て、上清はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの修飾のためにとっておいた。
【０１２４】
精製Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭ  ＫＣｌ中で１ｍｇ／ｍｌに調整した。１容量の活性シトラコン酸を９９容量のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと混合した。次に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを不活化するために混合液を室温で１時間インキュベートした。
【実施例４】
【０１２５】
修飾オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ増幅
Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎは、一本鎖ＤＮＡの１０００倍を超える高い親和性で二本鎖ＤＮＡに優先的に結合する。Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎは、ＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニタリングするために広く使用されている。このような結合は配列特異的ではないが、各々の増幅産物は或る特定の融解温度を有するため、融解曲線分析を行うことで異なる増幅産物を見分けることが可能である。Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎアッセイは本発明において、プライマー二量体形成並びに標的の増幅をモニタリングするために使用された。
【０１２６】
ＰＣＲシステムは５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．００５％ゼラチン、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ、５００ｎＭ  ５−ＲＯＸ、７．５ｍＭ  塩化ヒドロキシルアミン（Aldrich）、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｎＭの非修飾ＨＢＶプライマー又は無水マレイン酸（maleid anhydride）修飾ＨＢＶプライマーを含有する。反応体積は２５μｌである。０コピーのＨＢＶ鋳型（鋳型を含まない対照若しくはＮＴＣ）又は５００コピーのＨＢＶをシステムに加えた。
【０１２７】
反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００で行われた。熱サイクル条件は：９５℃、１０分→（９５℃、５秒→６０℃、３０秒）×４０サイクルである。
【０１２８】
修飾を戻すために、高温、すなわち９５℃で１０分のプレインキュベーション、及び塩化ヒドロキシルアミンの存在の両方が重要である。
【０１２９】
結果を図５ａに示す。標準非修飾プライマーによるＮＴＣ反応（ＮＴＣ／Ｒ）と比較すると、無水マレイン酸修飾プライマーによるＮＴＣ反応（ＮＴＣ／Ｍ）は、７サイクルを上回る増幅の遅れを示した。言い換えると、ＮＴＣ増幅又はプライマー二量体形成が７サイクルを上回る程遅れていた。修飾プライマーがプライマー二量体形成の低減に効果的であることが明らかに実証された。
【実施例５】
【０１３０】
ＰＣＲ産物の融解曲線分析
図５ａでは、標準プライマーによるＨＢＶ鋳型プラス反応（Ｔ＋／Ｒ）は、修飾プライマーによるＨＢＶ鋳型プラス反応（Ｔ＋／Ｍ）よりもほぼ５サイクル早い増幅を示している。プライマー二量体形成のような副反応がなければ、その両方は同数のＨＢＶ鋳型を含有するため、同様の増幅速度を有することが予想される。増幅産物のさらなる分析が必要である。
【０１３１】
融解曲線分析を実施した。結果を図５ｂに示す。標準プライマーによるＨＢＶ鋳型プラス反応（Ｔ＋／Ｒ）は、融解温度が約７７℃のプライマー二量体である主産物と、融解温度が約８３℃の鋳型指示増幅産物である副産物の２つの産物を生じた。一方、修飾プライマーによるＨＢＶ鋳型プラス反応（Ｔ＋／Ｍ）は明白な増幅を示した。唯一の鋳型指示増幅産物が存在する。
【実施例６】
【０１３２】
逆転写酵素の存在下での標準Ｔａｑポリメラーゼ及び化学的に修飾されたＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ
多様な酵素ベースホットスタートＰＣＲ技術の中でも、ＰＣＲ  ＤＮＡポリメラーゼの可逆的化学修飾が最も厳密で効果的である。この可逆的化学修飾がＤＮＡ鋳型増幅を効率的に向上し、マルチプレックスＰＣＲ増幅を可能にすることが示されている。
【０１３３】
しかしながら、一段階ＲＴ−ＰＣＲシステムでは、「背景技術」に述べたような問題に直面する。化学的に修飾された酵素を、逆転写酵素の存在下でプライマー二量体形成を低減する能力について試験した。
【０１３４】
ＰＣＲシステムは５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭ塩化ヒドロキシルアミン（Aldrich）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．００５％ゼラチン、５００ｎＭ  ５−ＲＯＸ、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ、４ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Invitrogen）、各２００ｎＭの非修飾ＨＢＶプライマー、１Ｕの標準非ホットスタート又は化学的に修飾されたホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する。反応体積は２５μｌである。０コピーのＨＢＶ鋳型（鋳型を含まない対照若しくはＮＴＣ）又は５００コピーのＨＢＶをシステムに加えた。
【０１３５】
反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００で行った。熱サイクル条件は：５５℃、１５分→９５℃、１０分→（９５℃、５秒→６０℃、３０秒）×４０サイクルである。
【０１３６】
増幅を図６ａに示す。化学的に修飾されたＴａｑによるＮＴＣ増幅（ＮＴＣ／ｈｓＴ）は、標準ＴａｑによるＮＴＣ増幅（ＮＴＣ／ｒｅｇＴ）と比較すると約２サイクル遅れていたが、化学的に修飾されたＴａｑによるＮＴＣ増幅は非常に厳密であった。ＨＢＶ鋳型プラス反応、標準Ｔａｑ及び化学的に修飾されたＴａｑの両方による増幅は、通常よりも早く閾値に達した（図５ａを参照）。融解曲線分析によって、実験では４種の増幅全てにおいてプライマー二量体が１つしか存在しないことが明らかになった（図６ｂ）。これにより：ｉ．逆転写酵素はプライマー二量体形成を媒介可能であること、ｉｉ．逆転写酵素が反応系中に存在する場合、化学的に修飾されたＰＣＲ酵素はプライマー二量体形成の低減に効果がないことが実証された。
【実施例７】
【０１３７】
修飾オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ
プライマー二量体形成を促進する逆転写酵素の役割、及びプライマー二量体形成の阻止に対する可逆的に修飾されたプライマーの有効性の両方をさらに実証するために、以下の実験が行われた。
【０１３８】
ＰＣＲシステムは５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭ塩化ヒドロキシルアミン（Aldrich）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．００５％ゼラチン、５００ｎＭ  ５−ＲＯＸ、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ、１Ｕの標準非修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０Ｕ又は４ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Invitrogen）、各２００ｎＭの非修飾ＨＢＶプライマー又は修飾ＨＢＶプライマーを含有する。反応体積は２５μｌである。ＨＢＶ鋳型はシステムに加えなかった。
【０１３９】
反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００で行った。熱サイクル条件は：５５℃、１５分→９５℃、１０分→（９５℃、５秒→６０℃、３０秒）×４０サイクルである。
【０１４０】
標準非修飾プライマーでは、ＮＴＣ反応における逆転写酵素の存在（ＲＴ＋／Ｒ）により、逆転写酵素の非存在下（ＲＴ−／Ｒ）よりもほぼ４サイクル早く、有意に多いプライマー二量体（図７）が生じた。
【０１４１】
修飾プライマーはプライマー二量体形成を劇的に低減した。４Ｕの逆転写酵素の非存在下又は存在下では、プライマー二量体形成は標準プライマーと比較すると、それぞれ７サイクル（ＲＴ−／Ｒ対ＲＴ−／Ｍ）及び１１サイクル（ＲＴ＋／Ｒ対ＲＴ＋／Ｍ）遅れた。さらに重要なことに、修飾プライマーが使用される場合、逆転写酵素の存在は、プライマー二量体形成に有意に影響しないことが示された（ＲＴ−／Ｍ対ＲＴ＋／Ｍ）。
【実施例８】
【０１４２】
修飾プライマーによる標的増幅
一段階ＲＴ−ＰＣＲ設定におけるＰＣＲ増幅の向上について、可逆的に修飾されたプライマーの有効性をさらに示すために、以下の実験を行った。
【０１４３】
ＰＣＲシステムは５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭ塩化ヒドロキシルアミン（Aldrich）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．００５％ゼラチン、５００ｎＭ  ５−ＲＯＸ、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ、１Ｕの標準非修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、４ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Invitrogen）、各２００ｎＭの非修飾ＨＢＶプライマー又は修飾ＨＢＶプライマーを含有する。反応体積は２５μｌである。０コピーのＨＢＶ鋳型（鋳型を含まない対照若しくはＮＴＣ）又は５００コピーのＨＢＶをシステムに加えた。
【０１４４】
反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍ  ７０００で行った。熱サイクル条件は：５５℃、１５分→９５℃、１０分→（９５℃、５秒→６０℃、３０秒）×４０サイクルである。
【０１４５】
図８ａに示すように、修飾プライマーはプライマー二量体形成を効率的に低減した（１１サイクル；ＮＴＣ／Ｍ対ＮＴＣ／Ｒ）。修飾プライマーによる鋳型指示増幅は（Ｔ＋／Ｍ）、図８ｂに示されるようにプライマー二量体を含まず、５００コピーのＨＢＶ鋳型の存在下であっても、標準プライマーによる増幅のみがプライマー二量体を生じた（図８ａ及び図８ｂのＴ＋／Ｒ）。
参照文献
【０１４６】
【表３】
2009545316.tif 000004
【図１】
2009545316.tif 000005
【図２】
2009545316.tif 000006
【図３】
2009545316.tif 000007
【図４】
2009545316.tif 000008
【図５ａ】
2009545316.tif 000009
【図５ｂ】
2009545316.tif 000010
【図６ａ】
2009545316.tif 000011
【図６ｂ】
2009545316.tif 000012
【図７】
2009545316.tif 000013
【図８ａ】
2009545316.tif 000014
【図８ｂ】
2009545316.tif 000015
2009545316.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月30日(2009.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法であって、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物が使用される、標的核酸配列又は核酸シグナルを増幅する方法。
【請求項２】
（ａ）前記標的核酸を含有すると考えられる試料を、少なくとも１つの可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物と接触させる工程（該可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を前記化学物質及び／又は放射線照射及び／又は前記範囲の温度に、前記ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程、並びに
（ｃ）増幅反応を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がリボ核酸であり、前記方法が、
（ａ）前記標的リボ核酸を含有すると考えられる試料を、少なくとも１つの第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含有する増幅反応混合物と接触させる工程（該第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、第１の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は第１の範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、
（ｂ）前記工程（ａ）の混合物を、前記リボ核酸の逆転写を可能にする条件下でインキュベートする工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）の混合物を前記第１の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は前記第１の範囲の温度に、前記第１の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドの前記ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程、並びに
（ｄ）プライマー伸長産物を形成するために増幅反応を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅反応混合物が、少なくとも１つの第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドをさらに含み（該第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、第２の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は第２の範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する）、且つ前記方法が、前記工程（ｂ）の前に前記工程（ａ）の混合物を前記第２の化学物質及び／又は放射線照射及び／又は前記第２の範囲の温度に、前記第２の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドの前記ヒドロキシル３’末端を再生するのに十分な時間曝露する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも逆転写酵素及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する二酵素系、又は逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方として機能するただ１つの酵素を使用する一酵素系を有する、一段階ＲＴ−ＰＣＲプロセスである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、その３’末端にカルボン酸エステル基を有し、当該カルボン酸エステルがギ酸エステル、ベンゾイルギ酸エステル、ハロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、トリフェニルメトキシ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、マレイン酸エステル及びその誘導体、コハク酸エステル及びその誘導体、４−オキソペンタン酸エステル、ピバル酸エステル、クロトン酸エステル、４−メトキシクロトン酸エステル、並びに３−フェニルプロピオン酸エステルから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
３’ヒドロキシル基を再生するために、化学物質が単独で又は或る範囲の温度のインキュベーションと組合せて使用され、当該化学物質がアジド、イミダゾール、ピリジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、及び水酸化テトラブチルアンモニウムから成る群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記カルボン酸エステルがマレイン酸エステルであり、且つ３’ヒドロキシル基を再生するためにヒドロキシルアミン又はヒドラジンが使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボン酸エステルがマレイン酸エステルであり、且つ或る範囲の温度のインキュベーションの際に、３’ヒドロキシル基を再生するためにヒドロキシルアミン又はヒドラジンが使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、その３’末端にシリルエーテル基を有し、当該シリルエーテルがトリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ジメチルイソプロピルシリルエーテル、ジエチルイソプロピルシリルエーテル、ジメチルヘキシルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテル、トリ−ｐ−キシルシリルエーテル、トリフェニルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテル、及びｔ−ブチルメトキシフェニルシリルエーテルから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
３’ヒドロキシル基を再生するためにフッ化物が使用され、当該フッ化物がフッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、及びフッ化水素酸から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドが、その３’末端にエーテル基を有し、当該エーテルがテトラヒドロフラニルエーテル、アリルエーテル、ｐ−メトキシフェニルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、（４−メトキシフェノキシ）メチルエーテル、メトキシエトキシメチルエーテル、メトキシメチルエーテル、グアイアコールメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロチオフラニルエーテル、シロキシメチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシルメチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシ（dethoxy）メチルエーテル及びメチルエーテルから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
化学物質又は触媒が３’ヒドロキシル基を再生するために使用され、当該化学物質又は触媒がパラジウム触媒又はロジウム触媒、硝酸セリウムアンモニウム、ルイス酸、ＬｉＢＦ４、フッ化物、ＢＢｒ３、ＳｉＣｌ４、ＮａＩ、及びＡｌＸ３から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドがその３’末端に、光分解開裂を受けて３’ヒドロキシル基を再生することのできる修飾基を有し、当該修飾基がｐ−メトキシベンジルエーテル、硝酸エステル、及びｏ−ニトロベンジルカーボネートから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
３’ヒドロキシル基を再生するために、放射線照射がそれ自体で、又は化学物質及び／又は或る範囲の温度と組合せて使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
インベーダーアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅、鎖置換増幅、転写媒介増幅、核酸配列ベース増幅、自律的配列複製、単一プライマー等温増幅、単一プライマー等温指数増幅、又はループ媒介増幅で使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
化学物質及び／又は放射線照射及び／又は或る範囲の温度に曝露されるとヒドロキシル３’末端に変換可能な非ヒドロキシル基３’末端を有する、可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記非ヒドロキシル基がカルボン酸エステル基、エーテル基、又は光分解性基である、請求項１７に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記非ヒドロキシル基がマレイン酸エステル又はシリルエーテルである、請求項１７に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅反応混合物。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅反応キット。
【国際調査報告】
2009545316.tif 000017
2009545316.tif 000018
2009545316.tif 000019