(57)【要約】  シゲラ・フレクスネリのｏｓｐＦ遺伝子は、ホスファターゼをコードする、ホスファターゼの新規クラスのメンバーである。ＯｓｐＦホスファターゼは、直接的なタンパク質修飾又は転写減少制御の何れかによって、幾つかのタンパク質の活性を阻害する。これらのタンパク質には、ＭＡＰキナーゼ、ＩＬ−８、ＣＣＬ２０、ＩＬ−２０、ＡＰ１、ＣＲＥＢ，ＲＰＡｐ３２及びＢＣＬ２関連タンパク質が含まれる。ＯｓｐＦホスファターゼを用いて疾病を治療する方法、ＯｓｐＦホスファターゼの活性を調節する因子を同定する方法、ＯｓｐＦホスファターゼの活性を模倣する因子を同定する方法及びＯｓｐＦホスファターゼを含む免疫原性組成物が提供される。不活化されたｏｓｐＦ遺伝子を含有するシゲラ・フレクスネリの株も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を治療又は予防する方法。
【請求項２】
癌が大腸癌及び膵臓癌から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物を含む抗癌治療。
【請求項５】
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を変化させる化合物を決定すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選択すること；
を含む、細胞におけるＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選別する方法。
【請求項６】
タンパク質制御活性が、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、ＨｅＬａ細胞、Ｃａｃｏ２細胞又は免疫系の細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記化合物のタンパク質制御活性を、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性と比較すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を同定すること；
を含む、ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を選別する方法。
【請求項９】
タンパク質制御活性が、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、ＨｅＬａ細胞、Ｃａｃｏ２細胞又は免疫系の細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における炎症性疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における移植に関連する疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物。
【請求項１６】
組成物がアジュバントである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組成物がＯｓｐＦ活性を増加させる化合物をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載の医薬組成物の有効用量を、免疫応答を制御することが必要な対象に投与することを含む、免疫応答を制御する方法。
【請求項１９】
ｏｓｐＦ遺伝子が不活化されている、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の株。
【請求項２０】
株が、受託番号ＣＮＣＭＩ−３４８０で、ＣＮＣＭに寄託されている、請求項１９に記載の株。
【請求項２１】
受託番号ＣＮＣＭＩ−３４９６で、ＣＮＣＭに寄託されている、ｍｙｃ標識とともにＯｓｐＦを発現するプラスミド。
【請求項２２】
請求項１９に記載の株及び医薬として許容される担体を含むワクチン。
【請求項２３】
シゲラ感染によって引き起こされる赤痢の治療又は予防を必要としている患者を、請求項１９に記載の株で予防接種することを含む、シゲラ感染によって引き起こされる赤痢を治療又は予防する方法。
【請求項２４】
シゲラ・フレクスネリが、受託番号ＣＮＣＭＩ−３４８０で、ＣＮＣＭに寄託されている株である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
シゲラ感染を治療又は予防することを必要としている患者に、ＯｓｐＦ活性を減少させる化合物を投与することを含む、シゲラ感染を治療又は予防する方法。
【請求項２６】
タンパク質制御活性が、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御から選択される、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性を模倣する物質。
【請求項２７】
物質がタンパク質である、請求項２６に記載の物質。
【請求項２８】
物質が化学物質である、請求項２６に記載の物質。
【請求項２９】
医薬組成物がＯｓｐＦ活性を増加させる化合物をさらに含む、請求項１１、１３又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重特異的ホスファターゼの新規クラスのメンバー、前記ホスファターゼを用いて疾病を治療する方法、ホスファターゼの活性を調節する因子を同定するための方法、ホスファターゼの活性を模倣する因子を同定するための方法、免疫応答を制御するための方法及び前記ホスファターゼを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、不活化されたｏｓｐＦ遺伝子を含有するシゲラ・フレクスネリの株及び不活化されたｏｓｐＦ遺伝子を含有するシゲラ・フレクスネリの株を含むワクチンにも関する。
【背景技術】
【０００２】
シゲラ・フレクスネリは、大腸の上皮細胞に感染することによって、ヒトに細菌性赤痢を引き起こすグラム陰性細菌病原体である。シゲラは、主に、腸上皮細胞（ＩＥＣ）に感染する（Ｊｕｎｇ  ｅｔａｌ．，１９９５）。シゲラは、食作用を介する、宿主細胞中への細菌の取り込みを誘導するエフェクターを送達するための機序を与える幾つかのタンパク質を発現する。これらのタンパク質は、ＩＩＩ型分泌系（ＴＴＳＳ）を形成し、２２０ｋｂの病原性プラスミドによってコードされる。次いで、シゲラ細菌は、食作用性液胞を溶解し、次いで、近くの他の細胞の感染を可能とする移動性表現型を発現することによって、細胞質に到達する。
【０００３】
首尾よく感染を確立するために、シゲラは、宿主の免疫応答、特に、炎症をもたらす免疫応答を精緻に制御しなければならない。サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）とは対照的に、シゲラは、分極されたＩＥＣの頂極に侵入する効率が低い。代わりに、シゲラは、上皮の障壁を破壊して、上皮細胞の側底極（ｂａｓｏｌａｔｅｒｌａ  ｐｏｌｅ）を介した細胞の侵入を促進するために、多形核白血球（ＰＭＮ）の血管外移動を必要とする（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。自然免疫系の細胞によって促進された宿主の炎症性応答は、炎症の部位にＰＭＮを惹きつける。従って、感染の初期段階で炎症の引き金を引くことが、シゲラによる細胞侵入のために必要とされる。ＩＥＣの細胞内区画に到達する細菌は、宿主免疫防御から保護された細胞から細胞へと、増殖し、伝播する。しかし、感染したＩＥＣは、細菌の侵入を検知する番人として、及び主要な媒介物質源（特に、炎症性応答を媒介するサイトカイン及びケモカイン）として、炎症性過程において大きな役割を果たす。これらの媒介物質には、粘膜の炎症を開始し、組織化するサイトカイン及びケモカインが含まれる（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＩＥＣによる細菌の認識は、微生物のモチーフであるペプチドグリカンを感知する細胞質分子Ｎｏｄ１／ＣＡＲＤ４を介して、主に、細胞内で起こる（Ｇｉｒａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＮｏｄＩの活性化は、インターロイキン８（ＩＬ−８）などのケモカインの発現をもたらすＮＦ−κＢ及びｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を含む（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、他の炎症促進性シグナル伝達経路を誘導する。これらのケモカインは、病原体の根絶のために極めて重要である（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。従って、過剰な炎症の引き金を引くことは、宿主におけるシゲラの生存にとって有害である。生き残るために、この細菌は、炎症促進性遺伝子の転写を調節するための戦略を進化させた。
【０００４】
植物及び動物病原体は、免疫を抑制するための様々な戦略を発達させてきたが、ＴＴＳＳを介したエフェクタータンパク質の転位は、多くの細菌性病原体が宿主の自然免疫応答を支配する機序である。シエラＩＩＩ型によって分泌されたＯｓｐＧ分子は、そのユビキチン化を遮断することによって、ｌκＢ−αの分解を拮抗することを示し、これにより、微生物が炎症性応答を制御する可能性を秘めていることを示した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。エルシニア偽結核症から得られるＹｏｐＥ、Ｔ及びＨのような幾つかのＴＴＳＳエフェクターは、主に、食作用から免れるための方法として、アクチン重合を標的とし（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，２００２）、他のＴＴＳＳエフェクターは、自然免疫応答によって媒介される炎症促進性防御応答を抑制する。後者の事例では、これらのエフェクターの多くは、防御シグナル伝達経路の不可欠な成分を標的とするシステインプロテアーゼである。例えば、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）のエフェクターＡｖＲｐｔ２は、基底防御の制御因子であるアラビドプシスＲＩＮ４タンパク質の排除を開始する（Ａｘｔｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ，２００３）。他のエフェクターは、可逆的なタンパク質修飾を誘導する。ＹｏｐＪ／Ｐ／ＡｖｒＢｓＴは、ユビキチン様タンパク質ＳＵＭＯのカルボキシ末端を標的タンパク質から切断し、これにより複数のシグナル伝達経路を妨害するシステインプロテアーゼのファミリーである（Ｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。また、ＹｏｐＪは、様々なキナーゼの活性化ループドメインをアセチル化することにより、複数のシグナル伝達経路を妨害する（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらのエフェクターが特定の宿主遺伝子の発現を修飾する過程に裏に潜む機序は、現在不明である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要旨
シゲラは、宿主細胞の感染を開始するために炎症応答を必要とするが、同時に、強力な炎症応答が起こると、細菌が根絶される。従って、炎症応答に関与し、最終的に、細胞応答ではなく、液性応答に対する養子免疫応答に影響を与えるケモカイン発現に関与する遺伝子を制御することは、細菌にとって有利である。本発明者らは、シゲラがこれらの宿主遺伝子の発現を制御する機序を決定するように努め、その過程で、二重特異的ホスファターゼ（ＤＳＰ）の新規クラスのメンバーであるホスファターゼを同定した。
【０００６】
ｏｓｐＦ遺伝子は、シゲラの病原性プラスミド上に存在する（Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ，２０００）。現在まで、この遺伝子によってコードされるタンパク質の機能は不明であった。本発明は、ｏｓｐＦがホスファターゼをコードすることを明らかにする。哺乳動物ＤＳＰ間のアミノ酸配列比較は、触媒性活性部位配列モチーフＨｉｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ａｒｇ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ内及びすぐ周囲内の類似性を明らかにする。このシグナチャー配列モチーフは、他の真核生物及び原核生物に記載されている全てのチロシンホスファターゼ中にも存在する（Ｋｅｎｎｅｌｌｙ，２００１）。驚くべきことに、ｏｓｐＦ遺伝子によってコードされるホスファターゼであるＯｓｐＦホスファターゼは、このシグナチャー配列を含有しておらず、何れのＤＳＰ又は他のチロシンホスファターゼとも、顕著な配列類似性を示さない。従って、ＯｓｐＦホスファターゼは、ＤＳＰの新規クラスのメンバーである。シゲラが宿主遺伝子を制御する機序の理解は、シゲラによって引き起こされる赤痢に対するより効果的な治療及びＯｓｐＦホスファターゼが制御する宿主遺伝子によって媒介される疾病に対する治療をもたらすことができる。
【０００７】
本明細書に記載されている実施例は、ｏｓｐＦ遺伝子がホスファターゼをコードしていること、並びにこのホスファターゼが、細胞外シグナル制御キナーゼ（Ｅｒｋ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を含むシグナル伝達経路を妨害できることを示す。以下の実施例は、ＯｓｐＦホスファターゼが、ｃ−ｆｏｓ及びＩＬ−８をコードする遺伝子など、様々な宿主遺伝子の転写を減少させ得ることも示す。ＩＬ−８発現の場合、実施例は、ＮＦ−κＢ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）のような転写タンパク質をＩＬ−８プロモーターに接近できるようにするために必要とされるクロマチン構造の変化を妨げることによって、ＯｓｐＦホスファターゼが、ＩＬ−８遺伝子の転写を減少させることを示す。さらに、実施例は、ＯｓｐＦホスファターゼが、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の発現を減少制御し、Ｔｈ２型養子免疫反応を誘導することも示す。
【０００８】
この理解に基づいて、本発明は、ＯｓｐＦホスファターゼを用いて疾病を治療する方法、ＯｓｐＦホスファターゼの活性を調節する因子を同定する方法、ＯｓｐＦホスファターゼの活性を模倣する因子を同定する方法、免疫応答を制御する方法及びＯｓｐＦホスファターゼを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、不活化されたｏｓｐＦ遺伝子を含有するシゲラ・フレクスネリの株、この株を含むワクチン及び赤痢を治療する方法にも関する。
【０００９】
具体的には、ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を治療又は予防する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む、炎症性疾患を治療又は予防する方法も提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む、移植に関連する疾患を治療又は予防する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、免疫応答を制御する方法を提供する。
【００１０】
ある種の実施形態において、本発明は、
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）異なる時間にわたって、細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記化合物のタンパク質制御活性を、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性と比較すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を同定すること；
を含む、ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を選別する方法を提供する。
【００１１】
ある種の実施形態において、本発明は、
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）異なる時間にわたって、細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を変化させる化合物を決定すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選択すること；
を含む、細胞におけるＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選別する方法を提供する。
【００１２】
ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣又は調節する物質を含む医薬組成物を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ｏｓｐＦ遺伝子が不活化されている、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の株を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、シゲラ感染によって引き起こされる赤痢の治療又は予防を必要としている患者を、ｏｓｐＦ遺伝子が不活化されている、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の株で予防接種することを含む、シゲラ感染によって引き起こされる赤痢を治療又は予防する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物を含む、抗癌治療、抗炎症治療又は移植に関連する疾患に対する治療を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、シゲラ感染を治療又は予防することを必要としている患者に、ＯｓｐＦ活性を減少させる化合物を投与することを含む、シゲラ感染を治療又は予防する方法を提供する。
【００１３】
図面の簡単な説明
本特許又は出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許又は特許出願公報のコピーは、請求及び必要な料金の支払いを行えば、米国特許商標庁によって付与される。
【００１４】
図１は、シゲラが核内のＥｒｋを不活化することを示している。（Ａ）ＨｅＬａ細胞は、処理しないままとする（ｎｓ）、又は、表記時間にわたって、非病原性株（ＶＰ−）若しくは病原性シゲラ株（ＷＴ）の何れかに感染させた。抗ホスホＭＥＫ１（ｐＭＥＫ１）、ＭＥＫ１、ホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）、Ｅｒｋ、ホスホ−ｃ−Ｊｕｎ（ｐｃ−Ｊｕｎ）、ｃ−Ｊｕｎ又はｌｋＢ−α抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｂ）ＶＰ−又はＷＴ株に、ＨｅＬａ細胞を感染させ、表記時間にわたって、ＰＭＡ（１μｇ／ｍＬ）によって同時刺激した。抗ホスホスレオニン１８３（ｐＴ１８３）及びホスホチロシン１８５（ｐＹ１８５）Ｅｒｋ抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｃ）表記の時間にわたって、ＰＭＡによってＨｅＬａ細胞を刺激し、又はＷＴ株に感染させた。ＭＥＫ１抗体を用いた免疫沈降に、可溶化液を供し、ＧＳＴ−Ｅｒｋ２Ｋ５２Ｒを基質として使用するインビトロキナーゼアッセイを行った。抗ホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｄ）表記の時間にわたって、（Ｃ）におけるように、ＨｅＬａ細胞を処理した。抗Ｅｒｋ１抗体を用いた免疫沈降に、可溶化液を供し、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を基質として使用して、インビトロキナーゼアッセイを行った。抗ホスホスレオニン９８ＭＢＰ（ｐＭＢＰ）抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。リン酸化されたＭＢＰの基底レベルは、アスタリスクで示されている。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞は、非処理のまま放置し（ｎｓ）、又はＰＭＡ、ＶＰ株若しくはＷＴ株によって、３０分間刺激し、又はＰＭＡによって、１５分間、前処理し、ＶＰ株若しくはＷＴ株によって、１５分間感染させた（ＰＭＡ＋ＷＴ）。モノクローナル抗ホスホＥｒｋ（赤／右パネル）及びポリクローナル抗Ｅｒｋ抗体（緑／左パネル）を用いて、免疫蛍光（ＩＦ）を実施した。
【００１５】
図２は、ＯｓｐＦホスファターゼが、Ｅｒｋを直接脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであることを示している。（Ａ）ホスホＥｒｋ２−ＧＳＴを基質として使用し、様々な細菌株からの上清を用いて、インビトロホスファターゼアッセイを行った。抗ホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｂ）それぞれ、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ又はＩｐａＨ融合タンパク質のＧＳＴ又はヒスチジンタグ化バージョンを用いて、インビトロホスファターゼアッセイを行った。（Ａ）におけるように、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｃ）１ｍＭオルトバナダート又は３ｎＭオカダ酸の存在下又は不存在下において、３０℃で１時間、ＯｓｐＦの５００ｎｇを、ホスホＥｒｋ２−ＧＳＴの５０ｎｇと混合した。抗ホスホスレオニン１８３（ｐＴ１８３）及びホスホチロシン１８５（ｐＹ１８５）Ｅｒｋ抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｄ）細菌によって発現された精製Ｅｒｋ２を、実施例１に記載されているように、ＭＥＫ１によってリン酸化した。３３Ｐ標識されたＥｒｋ２の３μｇを、３０℃で３０分間、ＯｓｐＦ又はＭＫＰ１の１μｇとともに温置すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されたように、基質のゲル移動度の増加がもたらされた。（Ｅ）ホスホＥｒｋ２抗体を用いて、ｐＴ１８３又はｐＴ１８５残基において３３Ｐ標識されたＥｒｋ２の脱リン酸化を確認するウェスタンブロット。（Ｆ）ＯｓｐＦによるＥｒｋ２脱リン酸化の定常状態速度論分析。３３Ｐ標識されたＥｒｋ２基質の様々な濃度とともに、３０℃で１０分間、１００ｎＭＯｓｐＦ（実線）又はＭＫＰ１（破線）の存在下で、二つ組みにて、反応を行った。実施例１に記載されているとおりに、無機ホスファートの放出を測定し、ソフトウェアＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈを用いて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ方程式に、データをフィットさせた。（Ｇ）ｐＲＫ５ｍｙｃ−ｏｓｐＦ、ｏｓｐＦ（Ｈ１０４Ｌ）、ｏｓｐＦ（Ｈ１７２Ｌ）の漸増用量で、ＨｅＬａ細胞を形質移入し、ＰＭＡで刺激した。抗ホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）、抗Ｅｒｋ１／２又は抗ＯｓｐＦ抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｈ）ＧＳＴ−ＯｓｐＦ又はＧＳＴ−ＯｓｐＦ融合タンパク質を、３０℃で１５分間、５０ｎｇのｐＥｒｋ２−ＧＳＴと混合した。（Ａ）におけるように、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｉ）様々なホスファート類縁体によるＯｓｐＦ活性の阻害。１０ｍＭバナダート、ベリロフルオリド（１ｍＭフッ化ナトリウムと１００μＭ塩化ベリリウムの組み合わせ）、フッ化アルミニウム（１ｍＭフッ化ナトリウムと１００μＭ塩化アルミニウムの組み合わせ）とともに、３０℃で１０分間、ｐＥｒｋ２−ＧＳＴの５０ｎｇを予め温置した。
【００１６】
図３は、ＯｓｐＦホスファターゼが、インビボで、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰＫを選択的に不活化することを示している。（Ａ）ｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦの漸増用量で、ＨｅＬａ細胞を形質移入し、ＰＭＡによって刺激した。抗ホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）又は抗Ｅｒｋ１／２抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｂ，Ｃ）ｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦの漸増用量で、ＨｅＬａ細胞を形質移入し、ＴＮＦによって刺激した。（Ｂ）では、抗ホスホｐ３８（ｐｐ３８）及び抗ｐ３８抗体を用いて、（Ｃ）では、抗ホスホＪＮＫ（ｐＪＮＫ）及び抗ｐ４６／ｐ５４ＪＮＫ抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｄ，Ｅ）野生型（ＷＴ）１ｏｓｐＦ（ｏｓｐＦ）又はトランス相補された株（ｏｓｐＦ／ｐＵＣ−ＯｓｐＦ）の何れかで、Ｃａｃｏ２細胞を感染させた。（Ｄ）では、抗ホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）又は抗Ｅｒｋ１／２抗体を用いて、（Ｅ）では、抗ホスホｐ３８（ｐｐ３８）又は抗ｐ３８抗体で、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｆ）ＷＴ、ｏｓｐＦ変異体又はトランス相補された株（ｏｓｐＦ／ｐｕｃ−ＯｓｐＦ）の何れかに、Ｃａｃｏ−２細胞を感染させた。抗ホスホＪＮＫ１／２（ｐＪＮＫ１／２）又は抗ＪＮＫ１／２抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｇ）５０ｎＭｐＥｒｋ２−ＧＳＴ、ホスホｐ３８−ＧＳＴ又はホスホＪＮＫ１ヒスチジンを用いて、インビトロホスファターゼアッセイを行った。パート（Ａ）におけるように、ウェスタンブロット分析を行った。（Ｈ）ＨｅＬａ細胞を、処理しないままとするか（ｎｓ）、又は、表記の時点で、ＷＴ若しくはｏｓｐＦ株によって刺激した。抗ＯｓｐＦ抗体を用いてＩＦを行った。（Ｉ）ＨｅＬａ細胞を、未処理のままとするか（ｎｓ）、又は、ＷＴ若しくはｏｓｐＦ株によって４５分間刺激した。抗核膜孔複合体（ＮＰＳ）（赤）及び抗ＯｓｐＦ抗体（緑）を用いてＩＦを行った。
【００１７】
図４は、遺伝子アレイ分析における、ＯｓｐＦで調節された遺伝子の階層的クラスター形成を示している。ＷＴ、ｏｓｐＦ変異体又はトランス相補された株の何れかに、Ｃａｃｏ−２細胞を、２時間感染させた。各列は遺伝子を表し、各行は試料を表す。カラースケールについては、青及び赤は、それぞれ、低いシグナル発現値及び高いシグナル発現値を表す。
【００１８】
図５は、ＯｓｐＦが、免疫応答に関与する極めて重要な遺伝子の発現を妨害する転写抑制因子であることを示している。（Ａ）表記時点における、ＷＴ又はｏｓｐＦ株に感染させたＣａｃｏ２細胞中でのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ経時分析。（Ｂ）表記の時点における、ＷＴ又はｏｓｐＦ株に、Ｃａｃｏ２細胞を感染させた。ウェスタンブロットによるｃ−ｆｏｓタンパク質発現の経時変化。（Ｃ）５時間にわたって、Ｃａｃｏ２細胞をＷＴ、ｏｓｐＦ株又はトランス相補された株に感染させた。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、培養上清中へのＩＬ−８分泌を測定した。（Ｄ、Ｅ）ＷＴ又はｏｓｐＦ株に、Ｃａｃｏ２細胞を感染させた。（Ｄ）ゲルシフトアッセイによって分析されたＮＦ−κＢ活性化の経時変化。（Ｅ）刺激されていない細胞（ｎｓ）又はＷＴ又はｏｓｐＦ変異体株に１時間感染させた細胞から得られた核抽出物から、スーパーシフトアッセイを行った。免疫前血清（ＰＩ）又はｐ５０若しくはｐ６５抗体とともに、核抽出物を予め温置した。免疫前血清（ＰＩ）は、矢印によって示されているように、非特異的なバンドをもたらす。抗ｐ５０スーパーシフトバンド（＊）及び抗ｐ６５スーパーシフトバンド（−）が示されている。（Ｆ）Ｃａｃｏ２細胞を、未処理のまま放置し（ｎｓ）、又は、表記時点で、ＷＴシゲラ株に感染させ、若しくはｏｓｐＦ株に感染させた。抗ｌｋＢα抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。
【００１９】
図６は、ＯｓｐＦが、ＭＰＡＫ依存性様式で、ヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化を標的とすることを示している。（Ａ）ＨｅＬａ細胞を、処理しないままとし（ｎｓ）、又は、表記の時点で、ＷＴ若しくはｏｓｐＦ株に感染させた。抗ホスホ−ヒストンＨ３Ｓ１０ポリクローナル抗体を用いて、間接的免疫蛍光検出を行った。（Ｂ）二重チミジンブロック（２ｍＭチミジン）によって、ＨｅＬａ細胞を同期化させ、非処理のままとし（ｎｓ）、又は表記の時点で、ＷＴ若しくはｏｓｐＦ株に感染させた。抗Ｈ３ホスホＳ１０（Ｈ３ｐＳ１０）、抗Ｈ３メチルＫ９−ホスホＳ１０（Ｈ３ｍｅｔＫ９−ｐＳ１０）、抗Ｈ３ホスホＳ１０アセチル−Ｋ１４（Ｈ３ｐ−Ｓ１０／Ａｃ−Ｋ１４）、抗ヒストンＨ３ポリクローナル抗ｐｐ３８及びｐＥｒｋ抗体で、イムノブロットをプローブした。（Ｃ）ＨｅＬａ細胞を、ｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦベクターで形質移入し、２００ｎＭオカダ酸で３時間処理した。抗ｍｙｃ（赤）及び抗Ｈ３メチルＫ９−ｐＳ１０（緑）抗体を用いて、ＩＦを行った。（Ｄ，Ｅ）ＯｓｐＦは、ヒストンＨ３のセリン１０を直接脱リン酸化しない。（Ｄ）ウシ胸腺ヒストン（Ｓｉｇｍａ）１μｇを、Ｈｉｓ−ＯｓｐＦの３００ｎｇ又はλホスファターゼ１２０Ｕとともに、３０℃で２時間温置した。抗ｍｅｔＫ９−ｐＳ１０抗体を用いて、ウェスタンブロットを行った。（Ｅ）３０℃で２時間、緩衝液、ＯｓｐＦ５μｇ／ｍＬ又はλホスファターゼ２０００Ｕ／ｍＬとともに温置されたニトロセルロース膜上に、ペプチドｍｅｔＫ９−Ｓ１０の１μｇを滴下した。抗ｍｅｔＫ９−ｐＳ１０抗体を用いて、ウェスタンブロットを行った。（Ｆ）ＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６（１０μＭ）又はｐ３８阻害剤ＳＢ２０３１８０（２．５μＭ）又は両者の何れかとともに、ＨｅＬａ細胞を、６０分間、前処理した。細胞を、処理しないままとし（ｎｓ）、又は、３０分間、ｏｓｐＦ株に感染させた。抗Ｈ３メチルＫ９−ｐＳ１０抗体を用いてＩＦを行った。（Ｇ）ＨｅＬａ細胞を、ｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦベクターで形質移入し、オカダ酸（２００ｎｍ）で３時間処理した。抗ｍｙｃ（赤）及び抗Ｈ３メチルＫ９−ｐＳ１０（緑）抗体を用いて、ＩＦを行った。
【００２０】
図７は、ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターにおいて、ヒストンＨ３のリン酸化及びＮＦ−κＢの動員を選択的に妨害することを示している。（Ａ）音波処理された、架橋されたクロマチン断片から単離されたＤＮＡを、２％アガロース／ＴＡＥゲル上で走行されるチップアッセイのための入力として使用した。（Ｂ）処理しないまま放置した（ｎｓ）、又は、表記の時点で、ＷＴ若しくはｏｓｐＦ株に感染させたＣａｃｏ２細胞から、架橋されたクロマチン断片を調製した。各時点に対して、無関係なＩｇＧ、抗Ｈ３メチルＫ９−ｐＳ１０又は抗ｐ６５抗体を用いて、分取試料を免疫沈降させた。ヒストグラムは、ＩＬ−８のプロモーター領域から得られたアンプリコンを用いたリアルタイムＰＣＲ分析によって得られた結果を示している。データは、同じ時点で免疫沈降された対応するＩｇＧで得られた結果と比較した相対濃縮として表されている。下側のパネルは、１時間の細菌攻撃誘発後に得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示している。（Ｃ）分取試料が無関係のＩｇＧ又は抗ＲＮＡＰＩＩ抗体で免疫沈降されたことを除き、データは、図（Ｂ）におけるように記されている。右側のパネルは、１時間の細菌攻撃誘発後に得られたＰＣＲ産物を示している。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）無関係なＩｇＧ又は抗Ｈ３メチルＫ９−ｐＳ１０抗体を用いて、分取試料を免疫沈降させた。ヒストグラムは、ＣＤ４４（Ｄ）、ＲＬＰ０（Ｅ）又はｌｋＢ−α（Ｆ）遺伝子のプロモーター領域から得られたアンプリコンを用いたリアルタイムＰＣＲ分析によって得られた結果を示している。右側のパネルは、１時間の細菌攻撃誘発後に得られたＰＣＲ産物を示している。（Ｇ）ＯｓｐＦ変異体の間接的免疫蛍光検出。ｐＲＫ５ｍｙｃ−ｏｓｐＦ、ｏｓｐＦ（Ｈ１０４Ｌ）又はｏｓｐＦ（１−２２１）でＨｅＬａ細胞を形質移入した。抗ＯｓｐＦ抗体を用いてＩＦを行った。（Ｈ）ｐＲＫ５ｍｙｃ−ＷＴｏｓｐＦ、ｏｓｐＦＨ１０４Ｌ、ｏｓｐＦ（１−２２１）でＨｅＬａ細胞を形質移入し、表記の時点でＴＮＦ−αによって刺激した。無関係なＩｇＧ又は抗ＯｓｐＦ抗体を用いて、分取試料を免疫沈降させた。ヒストグラムは、ＩＬ−８、ＣＤ４４、ＲＬＰ０及びｌｋＢ−α遺伝子のプロモーター領域から得られたアンプリコンを増幅するリアルタイムＰＣＲ分析によって得られた結果を示している。
【００２１】
図８は、感染から２４時間後に、２つの株に感染した肺からの細胞区分けによって回収されたマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）によって、サイトカインが産生されることを示している。３７℃で２４時間、これらの細胞をエキソビボで培養し、その後、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０及びＩＬ−１２産生を測定した。細胞ソーティングの効率は、ＦＡＣＳによって測定した。
【００２２】
図９は、ＷＴ及びＩＬ−１０ノックアウトマウスが、ＢＳ１７６又はＭ９０Ｔ株の何れかに感染したことを示している。感染後の異なる時点で、肺を採取した。細菌の負荷量は、プレーティングアッセイを用いて測定したのに対して、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの産生はＥＬＩＳＡによって測定した。
【００２３】
図１０は、感染から２４時間の時点で、Ｍ９０Ｔ又はｏｓｐＦ株に感染した肺からのサイトカインの産生が、肺の採取及び均質化後にＥＬＩＳＡによって測定されたことを示している。
【００２４】
図１１は、保護アッセイの結果を示している。３つの群が分析された。第一の群には、Ｍ９０Ｔ株を感染させ、第二の群には、ｏｓｐＦ株を感染させ、第三の群には、水を感染させた（対照群）。マウス当り１０８個の細菌でマウスに予防接種し、３週後に、マウス当り１０７個の細菌でマウスに強化免疫を施した。強化免疫から８週後、細菌の致死用量（５×１０８細菌／マウス）でマウスを攻撃し、生存について記録した。
【００２５】
図１２は、ＯｓｐＦがヒストンＨ３の特定の座を標的とし、炎症促進性シグナル伝達経路によって誘発される遺伝子活性化の程度を調節することを示すモデルである。ｏｓｐＦ株を用いて得られたデータから、シゲラは、未だ不明な機序によって、シグナル伝達経路の引き金を引き、ＭＡＰＫの活性化をもたらす。Ｈ３ｐＳ１０を誘導するためには、ｐ３８及びＥｒｋキナーゼ活性の両者が必要とされる。このリン酸化は、Ｋ９上でメチル化され、及びＫ１４上でアセチル化されたヒストンＨ３尾部上で起こり、クロマチンの脱凝縮及びＮＦ−κＢのような転写機構の主要成分の動員を促進するヒストンコードを与える。ＷＴ株は、そのＴＴＳＳを通じてＯｓｐＦを注入する。ＯｓｐＦは、核内のＭＡＰキナーゼを不活化し、選択された遺伝子に対してＨ３ｐＳ１０を阻害する。この修飾は、クロマチンの凝縮を促進し、転写機構へのプロモーターの接近を阻害する。ＷＴ株による感染後のヒストンＨ３のアセチル化及びメチル化状態は、なお不明であるが、ＯｓｐＦは、Ｋ１４上でのアセチル化に対して、直接的に影響を及ぼさない。
【００２６】
図１３は、他の病原性タンパク質候補とのＯｓｐＦホスファターゼ相同性を示している。シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）から得られた２つの病原性タンパク質候補Ｐｓｙｒ  Ｔ  ＤＣ３０００（ＮＰ ７９０７４５）及びＰｓｙｒ  Ｂ７２８Ａ（ＺＰ ００１２８１４３）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）から得られたＶｉｒＡ（ＮＰ ９００９７８）、サルモネラ・エンテリティカ血清型チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉ）から得られたＳｐｖＣ（ＮＰ ４９０５２８）との、ＯｓｐＦの配列アラインメント。同一のアミノ酸は赤で記されており、保存的置換は青で記されている。
【００２７】
図１４は、ＯｓｐＦが多形核白血球動員を抑制し、腸上皮の細菌侵入を制限することを示している。ＷＴ株（Ａ，Ｅ）、ｏｓｐＦ変異体株（Ｂ、Ｃ、Ｆ）又はトランス相補された変異体株（Ｂ、Ｇ）に８時間感染させたウサギの結紮された回腸ループの組織病理的切片。（Ａ−Ｄ）では、実施例１に記載されているように、抗ＬＰＳ免疫染色を行った。（Ａ、Ｂ）では、矢印は、ＷＴ及びトランス相補株に共通する、類似の局在化された上皮膿瘍を示している。（Ｃ、Ｄ）では、矢印は、ｏｓｐＦ変異体株での感染後における、上皮下固有層中での細菌の大規模な拡散及び管腔中への炎症性細胞の広範な蓄積の領域を表している。（Ｅ−Ｆ）抗ＮＰ−５免疫染色を行い、ＷＴ及びｐｕｃ−ＯｓｐＦでトランス相補されたｏｓｐＦ（Ｅ、Ｇ）を用いて観察された限定的な浸潤と比べて、固有層の大規模なＰＭＮ浸潤及びＰＭＮの広範な転位が、ｏｓｐＦ変異体株（Ｆ）で感染されたループにおける腸管腔内に存在しないことを確認した。バーは、１０μｍに等しい。
【００２８】
発明の詳細な説明
細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ  ｏｒ  ｂａｃｉｌｌａｒｙ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ）は、腸内細菌科に属するグラム陰性腸内細菌であるシゲラによって引き起こされる赤痢性症候群である。このヒトの疾病は、基本的に、発展途上国で発生し、５歳未満の子供が標的となる。侵入プロセスの分子的及び細胞的な基礎は、主に、近年になって研究された（Ｎｈｉｅｕ，１９９９及びＰａｒｓｏｔ，１９９４）。一連の複雑な工程によって、細菌は、腸の障壁を横切り、腸の上皮細胞に侵入することが可能となり、これにより、腸の障壁の大規模な破壊をもたらす急性炎症を誘発する。シゲラ感染の確立に、炎症は重要な役割を果たしているが、激しすぎる炎症反応は感染を払拭し得る。このため、シゲラは、特有のＤＳＰであるＯｓｐＦホスファターゼを介して、炎症応答を微調整するための機序を進化させている。本明細書で使用される「Ｏｓｐホスファターゼ」及び「ＯｓｐＦ」という用語は、ｏｓｐＦ遺伝子によってコードされるタンパク質を表す。４つのシゲラ種、すなわち、Ｓ．フレクスネリ（Ｓ．  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｓ．ソンネイ（Ｓ．  ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓ．ディセンテリアエ（Ｓ．  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）及びＳ．ボイディイ（Ｓ．  ｂｏｙｄｉｉ）が存在する。好ましい実施形態において、シゲラは、Ｓ．フレクスネリ（Ｓ．  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）である。
【００２９】
シゲラｏｓｐＦ遺伝子の配列は、Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ，２０００に開示されたばかりである。シゲラの病原性プラスミド上に位置するｏｓｐＦ遺伝子は、このホスファターゼをコードする。哺乳動物のＤＳＰ間のアミノ酸配列比較は、触媒性活性部位配列モチーフＨｉｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ａｒｇ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ内及び該モチーフのすぐ周辺の類似性を明らかにしている。このシグナチャー配列モチーフは、他の真核生物及び原核生物において記載された全てのチロシンホスファターゼ中にも存在する（Ｋｅｎｎｅｌｌｙ、２００１）。驚くべきことに、ｏｓｐＦ遺伝子によってコードされるホスファターゼ（ＯｓｐＦホスファターゼ）はこのシグナチャー配列を含まず、且つ、何れのＤＳＰとも、又は他のチロシンホスファターゼとも著しい配列類似性を示さない。従って、ＯｓｐＦホスファターゼは、ＤＳＰの新規クラスに相当する。様々なプロテオバクテリアから得られた機能が未知の数個のタンパク質は、サルモネラ・エンテリティカ血清型チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉ）の病原性プラスミドによってコードされるＯｓｐＦ（図１３）：ＳｐｖＣ（６３％配列同一性）、クロモバクテリウム・ビオラセウムによってコードされたＶｉｒＡ  （６７％配列同一性）及びシュードモナス・シリンガエの２つの株から得られる２つの病原性タンパク質候補（４０％配列同一性）と類似性を示す。これらのタンパク質の機能は不明である。
【００３０】
細菌のホスタファターゼの一次構造は極めて多様であるが、比較分析によって、これらのタンパク質は、真核生物におけるそれらの対応物と類似する構造的特徴を示すことが示されている（Ｋｅｎｎｅｌｌｙ，２００１）。現在まで、それらの触媒機序及び活性部位の配列を共通に有するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の３つの異なるファミリー（従来型ＰＴＰ、低分子量ＰＴＰ及びＣｄｃ２５ＰＴＰ）が同定されてきた。ＹｏｐＨ及びＳｐｔＰを含む従来型ＰＴＰは、ホスホＴｙｒ残基に対する選択性の高い程度を示す（Ｋｅｎｎｅｌｌｙ，２００１）。非病原性シアノバクテリウムのノストク・コミューン（Ｎｏｓｔｏｃ  ｃｏｍｍｕｎｅ）から得られるＩｐｈＰは、哺乳動物のＤＳＰと幾らかの機能的及び構造的類似性を共有する唯一の記載された原核生物ＰＴＰである。本タンパク質は、ホスホセリン及びホスホチロシン残基をともに加水分解する（Ｐｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。従って、細菌におけるＤＳＰは、ほとんど性質決定されておらず、このような二重特異性の生物学的な関連性は、なお不明なままである。
【００３１】
ＯｓｐＦ及び他のＤＳＰとの間に相同性又は類似性が欠如しているため、ＯｓｐＦは真核生物起源ではないと主張されている。それにも関わらず、他のプロテオバクテリア由来の病原性タンパク質候補との、ＯｓｐＦの顕著な類似性は、細菌に対して「選択上の有利性」として獲得及び維持されてきた可能性がある共通の先祖の存在を示唆する。ノストク・コミューンの非病原性株由来のｌｐｈＰタンパク質は、染色体によってコードされた唯一の公知のＤＳＰであり、そのホスファターゼ活性は、病原体機序にとって重要な内在性細菌タンパク質を標的とし得る（Ｐｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。これに対して、ＯｓｐＦは、種の侵入表現型をコードする２２０ｋｂのプラスミドによってコードされる。従って、ＯｓｐＦは、これまでに同定された病原性プラスミドによってコードされる最初のＤＳＰに相当する。シゲラが細胞に感染すると、ＯｓｐＦが宿主細胞中に注入され、核内に転位し、そこで、核内のＭＡＰキナーゼを脱リン酸化することによって、哺乳動物のＤＳＰ機能を模倣する（図１２）。
【００３２】
ＯｓｐＦタンパク質配列は公知であり、受託番号ＣＡＣ０５７７３でＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉから入手可能）において入手可能である。ある種の実施形態において、本発明は、シゲラの変異株によるＯｓｐＦホスファターゼ発現を抑制するために、ｏｓｐＦ遺伝子が破壊されている、シゲラの変異株を提供する。このｏｓｐＦ変異体は、ブダペスト条約の規定に基づき、２００５年７月１２日に、受託番号ＣＮＣＭＩ−３４８０で、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、２８，Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅに寄託された。本発明は、シゲラ感染によって引き起こされる赤痢を治療又は予防するためのワクチンとしてのこのｏｓｐＦ変異体の使用にも関する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦを発現するプラスミドｐｕｃ−ＯｓｐＦも提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ−ＧＳＴ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＧＥＸ４Ｔ２を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ−ヒスチジン融合タンパク質を発現するプラスミドｐＫＪ−ＯｓｐＦを提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ｍｙｃ標識とともにＯｓｐＦを発現するプラスミドｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦを提供する。このｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦプラスミドは、ブダペスト条約の規定に基づき、２００５年９月１２日に、受託番号ＣＮＣＭＩ−３４９６で、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、２８，  Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅに寄託された。
【００３３】
ＯｓｐＦは、このホスファターゼが、２つの異なるアミノ酸残基スレオニン及びチロシンを脱リン酸化できるという点でＤＳＰである。多くのタンパク質活性が、ＯｓｐＦの発現によって影響を受け得る。以下の実施例において示されているように、ＯｓｐＦは、シグナル伝達経路及び遺伝子転写を実行する異なる機序を介して、タンパク質機能を制御し、最終的に、シゲラ感染に対する免疫応答に関与するタンパク質の制御をもたらす。
【００３４】
第一の機序は、そのアミノ酸残基の１つ又はそれ以上を脱リン酸化することによって、タンパク質の直接的な不活化を伴う。例えば、多くの炎症促進性遺伝子の発現を制御する転写因子ＡＰ−１は、ＪｕｎとＦｏｓファミリータンパク質の間でのホモ又はヘテロ二量体化によって形成される。シゲラ感染は、フォルボールミリスチン酢酸（ＰＭＡ）がＡＰ−１の活性化を誘導する能力を妨害し、ＭＡＰＫＥｒｋの不活化を通じて、ｃ−Ｆｏｓの転写誘導を抑制する。ＯｓｐＦの不活化は、ＰＭＡがｃ−Ｆｏｓ発現を誘導する能力を回復し、以下の実施例に示されているように、ＯｓｐＦ発現は、シゲラ感染時に、Ｅｒｋが細胞質から核へ移動できるようにする。しかし、ＯｓｐＦによる脱リン酸化のために、Ｅｒｋは、核内において、その不活化された状態のままである。ＯｓｐＦは、ＥｒｋのキナーゼサブドメインＶＩＩＩの活性化ループ内に位置する重要なホスホトレオニン及びホスホチロイン残基を脱リン酸化する。さらに、ＯｓｐＦは、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰＫを不活化するが、ＪＮＫは不活化しない点で、基質特異性を示す。
【００３５】
第二の機序において、ＯｓｐＦは、細胞の転写機構の一部であるタンパク質が遺伝子のプロモーターに接近できるようにするために必要とされるクロマチン構造の変化を妨げる。実施例が示すように、ＯｓｐＦは、このようにして、ＩＬ−８を制御する。遺伝子は、転写、プレｍＲＮＡプロセッシング、メッセンジャーリボヌクレオタンパク質粒子（ｍＲＮＰ）の輸出及び翻訳の協調された過程の結果として発現される。さらに、遺伝子の転写状態は、そのクロマチンの構造に密接に関連している。真核生物ゲノムのクロマチンへの詰め込みは、転写に不可欠な多くの制御タンパク質がゲノムＤＮＡに接近する能力を制限する。４つのコアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４）のアミノ末端がヌクレオソームから突出しており、アセチル化、リン酸化及びメチル化など、様々な共有性翻訳後修飾に対してこれらのヒストンを利用可能としている。これらの修飾は、クロマチン繊維の帯電された環境を変化させ、又はクロマチン再構築因子及び／又は遺伝子発現を制御する転写因子に対するドッキング部位として、ヒストンが作用できるようにする（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００３６】
重要なことに、特異的なヒストン尾部の修飾は、クロマチン関連タンパク質に対する相乗的又は拮抗的相互作用親和性を生じることが可能であり、次いで、これは、転写的に活性なクロマチン部位と転写的にサイレントなクロマチン部位間での動的な遷移を規定する。ヒストンタンパク質の修飾状態は、転写又は翻訳レベルで生じる遺伝子制御を超える遺伝子制御の別の層又はコードを与える（概説について、Ｊｅｎｕｗｅｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓ，２００１参照）。従って、この「ヒストンコード」は、所定の遺伝子の転写状態を決定する。
【００３７】
例えば、リジン９において既にメチル化されたヒストンＨ３尾部上のセリン１０のリン酸化は、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）中に含有されるクロモドメインとの相互作用を優先する。しかしながら、アセチル化されたリジン１４に関しては、このリン酸化現象は、タンパク質の非局在化をもたらすので、ＨＰ１によって媒介されるクロマチン凝集及び遺伝子サイレンシングを克服し得るヒストンコードモチーフの形成を示唆する（Ｍａｔｅｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。セリン１０のリン酸化は、ｃ−ｆｏｓ及びＮＦκＢ依存性の炎症促進性サイトカインの亜群及びＩＬ−８などのケモカイン遺伝子のような前初期（ＩＥ）遺伝子のプロモーターと関連するＨ３分子の少数においても起こる（Ｃｌａｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｃｌａｙｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｈａｄｃｖａｎ，２００３）。何れの事例でも、セリン１０のリン酸化は、刺激に応じて、Ｅｒｋ又はｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路によって誘導され得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。重要なことに、ＭＡＰＫによって誘導されるＨ３リン酸化は、未だ不明な機序を通じて、プロモーター特異的な様式で起こる（Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これらのプロモーター上では、ヒストンＨ３のセリン１０でのリン酸化は、次いでリジン１４をアセチル化するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）に対するドッキング部位を作出する。これらの修飾は、ヌクレオソーム構造を破壊することによって、プロモーターの接近性を増加させるクロマチン再構築酵素の結合を優先し得る（Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。従って、ＭＡＰＫ依存性のヒストンＨ３リン酸化は、選択的なプロモーター部位でのクロマチン再構築を誘導するための中心的な現象であると思われ、免疫応答に関与するＮＦκＦ応答性遺伝子のサブセットの発現を選択的に制御するための効率的な調節戦略を与える。
【００３８】
実際、実施例が示すように、ＯｓｐＦは、核内のＥｒｋ及びｐ３８ＭＡＰＫを直接脱リン酸化することによって、ＩＬ−８発現を制御して、ヒストンＨ３のセリン１０でのリン酸化を妨害する。ＯｓｐＦは、標的細胞中に注入され、核内に転位され、核内で、クロマチン再構築並びにＮＦ−κＢ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩのような転写機構の不可欠な成分の動員を変化させる。細胞刺激は、ＩＬ−８プロモーターなどの選択されたプロモーターへのＯｓｐＦの直接的局在化を誘導して、ＯｓｐＦが、遺伝子特異的な様式で、ＭＡＰＫ依存性Ｈ３リン酸化を妨害することを可能にする。ＩＬ−８を負に制御するＯｓｐＦの能力と合致して、ＯｓｐＦは、多形核白血球の動員を負に制御し、腸細胞の細菌侵入を制限することに寄与する。ＯｓｐＦによるヒストンコードの変化によって、シゲラは、免疫応答に主として関与する遺伝子の選択的プールを抑圧することが可能となり、感染を確立するためのシゲラの要求に最も適合する転写応答を「作り出す」ための精緻な戦略を与える。
【００３９】
ヒストンＨ３は、ＤＳＰ活性に対する直接的な基質となり得る可能性がある。しかしながら、ＯｓｐＦは、Ｅｒｋとｐ３８ＭＡＰＫ経路をともに遮断することができるので、Ｓｅｒ１０でのヒストンＨ３リン酸化を妨げる可能性がより高い。実際、これら２つのＭＡＰＫは、ヒストンＨ３のＳｅｒ１０を直接リン酸化する主なヒストンキナーゼであることが知られている核キナーゼＭＳＫ（有糸分裂促進因子及びストレス活性化キナーゼ）の主要な２つの活性化因子である（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。その結果、シゲラは、リン酸化されたヒストンＨ３の形成を効率的に妨げる武器としてＯｓｐＦを使用することが可能である。
【００４０】
重要なことに、ヒストンＨ３リン酸化に対するＯｓｐＦのこの効果は、ランダムに分配されず、特異的なプロモーターに対して標的化される。この特異性は、ＯｓｐＦのＭＡＰＫ遮断能の結果であり得る。ＭＡＰＫは、Ｓ．セレビシアエｐ３８ＭＡＰＫ相同体であるＨｏｇ１に対して示されたように、配列特異的転写因子との相互作用を介して、各プロモーターへ動員され得（Ａｌｅｐｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、部位特異的修飾をもたらすシグナル伝達経路を開始し得る。さらに、高解像度共焦点顕微鏡によるアプローチは、活性化されたＭＳＫ１が、未だ不明な機序によって、ヒストンＨ３の特異的な群をリン酸化することを示しており（Ｄｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ヒストンキナーゼが特定の座へ空間的に分布することによって、部位特異的なヒストンＨ３リン酸を決定し得ることを示唆する。その結果、ＯｓｐＦを注射することによって、シゲラが、遺伝子の限られた群、特に、ＩＬ−８のように、遺伝子転写が成功するために、プロモーターでのクロマチンの圧縮解除を必要とする遺伝子を抑圧することが可能となる。
【００４１】
ＩＬ−８遺伝子の場合、ヒストンＨ３のホスホアセチル化は、プロモーターを完全に露出させることに関与し、ＮＦ−κＢを首尾よく動員させ得る、クロマチン再構築タンパク質のブロモドメインに対してドッキング部位を提供することが示唆されている（Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。一般に、ブロモドメインは、ヒストンにおけるアセチルリジン部分を認識することができる保存されたタンパク質ドメインである。ブロモドメインは、多くのクロマチン再構築タンパク質中に存在し、ヒストンのアセチルリジン残基と相互作用する。実施例に記載されている結果は、このモデルと合致し、Ｋ９上でメチル化された、ホスホアセチル化されたヒストンＨ３の形成は、クロマチンの圧縮解除を促進することによって、プロモーターでのＮＦ−κＢ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）の付随的動員を促進する組み合わせパターンであることを示す（図１２）。
【００４２】
図４の遺伝子アレイ分析は、ＯｓｐＦが、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質並びにＣＣＬ２０及びＩＬ−８のような主要な炎症促進性遺伝子などの主な転写活性化因子の発現を特異的に減少制御することを示している。ＡＰ−１は、ｃ−ｆｏｓを含む炎症促進性転写因子のファミリーである（図４では、ｖ−ｆｏｓＦＢＪマウス骨肉種ウイルス発癌遺伝子相同体と称される。）。図５Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＯｓｐＦの不活化がｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ発現を強力に増加制御したことも示している。ＡＰ−１転写因子の過剰発現又は過剰活性化は、多くの癌で、広く記載されている。例えば、ＡＰ−１は、結腸直腸癌に関与している（Ａｓｈｉｄａ，２００５）。
【００４３】
ＣＲＥＢに関していえば、ＡＴＦ３が、転写因子のＣＲＥＢファミリーのメンバーであり、図４に示されているように、ＯｓｐＦは、そのｍＲＮＡ発現を減少制御した。
【００４４】
抗アポトーシスＢＣＬ２関連タンパク質に関しては、図４に示されているように、ＯｓｐＦは、ＢＣＬ−２抗アポトーシスタンパク質のメンバーであるＭＣＬ−１（骨髄系細胞白血病配列）の発現を減少制御した。ＭＣＬ−１の増加制御は、リンパ腫（Ｂａｉ，２００６）及び肝細胞癌（Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，２００６）など、様々な癌に関与している。図４は、ＯｓｐＦがケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０とも称されるＣＣＬ２０を減少制御したことも示している。ＣＣＬ２０は、インターフェロンγの産生を誘導することによって、細菌の内転移の調節において重要な役割を果たしていることが知られている樹状細胞（ＤＣ）化学誘引物質である。ＣＣＬ２０は、効率的な１型養子反応の発達にも関与している。しかしながら、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）では（Ｌｅｅ，２００５）、ＤＣによるＴ細胞の活性化は、疾病の誘発及び維持において中心的な役割を果たしていると考えられている。従って、このケモカインの発現はＩＢＤにおいて分析され、本疾患におけるその過剰発現が同定された（Ｋａｓｅｒ，２００４）。
【００４５】
ＩＬ−８に関しては、シゲラの場合、ＩＬ−８発現が、細菌の根絶のために極めて重要である。ＩＢＤにおけるように、ＵＣ及びＣＤの両者で、疾病の活動度と相関する上昇した腸のＩＬ−８濃度が見出された（Ｎｉｅｌｓｏｎ，１９９７）。
【００４６】
図１０に示されているようにＯｓｐＦは、インビボで、ＩＬ−１２産生も減少制御した。ＣＤは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の増加した産生によって生成された、過剰なＴ−ヘルパー１サイトカイン応答と関連していることが示唆されている（Ｓｃｈｍｉｄｔ，２００５）。抗ＩＬ−１２抗体は、現在、臨床試験で検査されている（Ａｒｄｉｚｚｏｎｅ，２００５）。
【００４７】
ＣＣＬ２０発現及びＩＬ−８発現に影響を与えることに加えて、シゲラは、他の方法でも、宿主の免疫応答を制御するように作用する。自然免疫が、一次感染の回復のために不可欠であり、養子免疫の誘導において中心的な役割を果たしている（概説については、Ｊａｎｅｗａｙ、２００２を参照されたい。）。哺乳動物は、自然免疫、すなわち、侵入する病原体に対して一般的に作用し、リンパ球によって直接媒介されない免疫の全ての側面を含む免疫応答によって保護されている。貪食マクロファージ及びナチュラルキラー細胞などの細胞は、「獲得免疫」とは異なる生得的応答を媒介する。獲得免疫は、特定の病原体に対して特異的である免疫系の成分を含む。これらの成分には、細胞性免疫と液性免疫が含まれる。細胞免疫では、Ｔ細胞は、感染された細胞によって提示された特異的抗原に応答する。液性免疫では、Ｂ細胞は、特異的な病原体上の抗原に結合する抗体を産生する。サイトカイン及びケモカインは、自然免疫と養子免疫間の主要な関連の１つである（Ｍａｃｋａｙ，２００１）。炎症性プロセスの誘導に加えて、シゲラ感染は、特異的な液性免疫も誘導する。液性応答は、腸のレベルで、特異的な分泌ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）の産生によって、及び血清中でのＩｇＧの産生によって特徴付けられる（Ｐｈａｌｉｐｏｎ，１９９９）。
【００４８】
生弱毒化ワクチンを用いたヒトでのワクチン試験は、誘導された液性応答の強度が、ワクチン株によって誘発された炎症性応答の強度に依存することを示した。換言すれば、高度に弱毒化された生ワクチン候補は、弱い炎症性応答を誘導し、従って、弱い液性応答を誘導する（概説については、Ｐｈａｌｉｐｏｎ、２００３を参照されたい。）。しかしながら、シゲラによる天然感染時に誘導された液性保護は持続時間が短く、細胞性免疫の開始が非効率であることを示唆している。本発明者らは、一次感染時にシゲラによって誘導された急性炎症が、特異的免疫及び保護的免疫の発達に対して及ぼす影響を調べた。
【００４９】
以下の実施例に示されているように、ＯｓｐＦは、上皮細胞内で、炎症促進性応答を調節するための転写抑制因子として作用する。ＯｓｐＦは、おそらく樹状細胞によるものと推定される、感染後の初期の時点で観察されるＩＬ−１２産生の調節のためにも必要である。ＯｓｐＦによって誘導されたＩＬ−１２阻害は、シゲラ感染にとって有害なサイトカインであるＩＦＮγ産生の阻害をもたらす。シゲラは、宿主内での生存を可能とするために、好ましくないＴｈ１型応答の誘導を阻害する。ＩＬ−１０は、感染後の初期の時点で、侵入性の株によって産生される主なサイトカインであるので、このＴｈ１型経路は、続いて、免疫抑制環境において、養子免疫を液性応答の方向に強制する。このように、シゲラは、細菌感染に対して有効である細胞性免疫応答の生成を回避する。
【００５０】
実際、転写分析は、ＯｓｐＦが、ＩＬ−８及びＣＣＬ２０などの免疫遺伝子並びに炎症促進性ＡＰ−１ファミリーメンバーであるｃ−ｆｏｓなどの幾つかの炎症促進性初期応答遺伝子及び初期増殖因子ファミリーメンバーをコードする遺伝子の発現を減少制御することを示している。ＯｓｐＦは、シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマトから得られる機能が未知の２つの病原性タンパク質候補と顕著な相同性を有している。Ｐ．シリンガエは、多くの植物において、黒葉枯れ病及び関連疾患の原因因子である。植物病原体は、耐性（Ｒ）タンパク質と称される植物防御系の成分によって認識されるので、当初非病原性（Ａｖｒ）タンパク質と名づけられた幾つかのＩＩＩ型エフェクターを注入する。Ｒタンパク質は、Ｎｏｄタンパク質などの、病原体に対する哺乳動物受容体と構造的な相同性を有しており、植物防御応答の引き金を引く（Ｎｕｒｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。興味深いことに、シュードモナス・シリンガエＨｏｐＰｔｏＤ２ＩＩＩ型エフェクターは、未だ不明な機序によって、Ａｖｒ媒介性植物免疫応答を抑制することができるチロシンホスファターゼであり、Ａｖｒシグナル伝達経路を打ち消すように作用するさらなるＩＩＩ型エフェクターを獲得することによって、病原体が、自然免疫系の真核生物監視系を回避する能力を回避するというシナリオが示唆される（Ｅｓｐｉｎｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。類推により、シゲラは、ＮｏｄＩによって開始された炎症促進性シグナル伝達経路を打ち消すように作用することができるＯｓｐＦのような幾つかのＩＩＩ型タンパク質エフェクターを獲得して、上皮細胞中で典型的な転写シグナチャーを付与した可能性がある（図１２）。
【００５１】
ＩＬ−８をインビボで中和することによって、固有層中での細菌の過剰増殖及び腸間膜血液に通じる腸の上皮障壁を通じた大規模な転移がもたらされるので、シゲラに対する生物学的な利点は、それ自身の生存である（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。しかしながら、Ｉｌ−８は、上皮細胞の側底極を介した細菌の侵入を容易にする多形核白血球（ＰＮＮ）に対する重要な化学誘引物質であるので、シゲラ感染の初期段階において、重要な役割を果たす。従って、ＯｓｐＦによるＩＬ−８転写の制御は、一時的に制御され得る。病原体は、自身のエフェクタータンパク質の半減期を調節するために、宿主のタンパク質分解機構を活用して、病原性エフェクター機能の一時的な制御を与え得ることが、巧妙な研究によって示された（Ｋｕｂｏｒｉ  ａｎｄ  Ｇａｌａｎ，２００３）。
【００５２】
ＯｓｐＦ自体に加え、本発明は、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質も提供する。ある種の実施形態において、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、上記タンパク質制御活性の１つ又はそれ以上を有する。ある種の実施形態において、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、上記タンパク質制御活性の２つ又はそれ以上を有する。ある種の実施形態において、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、上記タンパク質制御活性の３つ又はそれ以上を有する。タンパク質制御活性とは、タンパク質の活性を制御する能力である。このような制御は、例えば、脱リン酸化など、タンパク質の直接的な修飾を含む（但し、これらに限定されない。）異なる機序を介して、又はタンパク質をコードする遺伝子の発現の制御を介して達成され得る。ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、別のタンパク質に限定されず、例えば、化学的物質でもあり得る。幾つかの実施形態において、タンパク質制御活性には、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質並びにＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような主要な炎症促進性遺伝子のタンパク質発現及び／又は活性の制御が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
化合物が、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性の少なくとも１つを増加又は減少させることが可能である場合に、この化合物はＯｓｐＦ活性を調節する。ある種の実施形態において、本発明は、シゲラ感染を治療又は予防することを必要としている患者に、ＯｓｐＦ活性を減少させる化合物を投与することを含む、シゲラ感染を治療又は予防する方法を提供する。ある種の実施形態において、ＯｓｐＦ活性を増加させる化合物は、ＯｓｐＦと組み合わせて、又はＯｓｐＦを模倣する化合物と組み合わせて、医薬組成物中で使用される。
【００５４】
幾つかの実施形態において、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、ＯｓｐＦバリアントである。本明細書において使用される「ＯｓｐＦバリアント」という用語は、ＯｓｐＦのアミノ酸配列に対する１つ又はそれ以上の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を表す。幾つかの実施形態において、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、ＯｓｐＦ断片である。本明細書で使用される「Ｏｓｐ断片」という用語は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するＯｓｐＦタンパク質を表す。ある種の実施形態において、断片は、少なくとも５から２３８アミノ酸長である。ある種の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１５０、２００又は２３８アミノ酸長であることが理解される。
【００５５】
幾つかの実施形態において、ＯｓｐＦの活性を模倣する物質は、ＯｓｐＦペプチド模倣物である。本明細書において使用される、「ＯｓｐＦペプチド模倣物」という用語は、非ペプチド性構造要素を含有し、ＯｓｐＦの生物学的特性の１つ又はそれ以上を模倣する化合物を表す。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。一般的に、ペプチド模倣物は、ＯｓｐＦなどの模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、本分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合によって、場合によって置換された１つ又はそれ以上のペプチド結合を有する。ある種の実施形態において、コンセンサス配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を同種のＤアミノ酸で体系的に置換すること（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）は、より安定な化合物を作製するために使用し得る。
【００５６】
ＯｓｐＦが、Ｅｒｋ並びにｐ３８並びにＩＬ−８、ＩＬ−１２及びＣＣＬ２０などの免疫調節サイトカインの活性を制御できるということは、ＯｓｐＦがＥｒｋ又はｐ３８シグナル伝達が関与する疾病及び炎症が関与する疾病に罹患した患者に対して有益な治療を与え得ることを示唆する。このような疾病には、大腸癌及び膵臓癌などの（但し、これらに限定されない。）癌並びにクローン病が含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、ＯｓｐＦは、移植拒絶の重度を抑制又は減少させるための免疫抑制剤として使用される。ある種の実施形態において、ＯｓｐＦは、免疫応答を制御するために使用される。
【００５７】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物における癌を治療する方法であり、ＯｓｐＦ又は癌を有する患者に対するＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含み、治療が疾病の軽減をもたらす前記方法を提供する。一実施形態において、本発明は、癌を発症するリスクがある哺乳動物における癌を予防する方法であり、ＯｓｐＦ又は癌を有する患者に対してＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物を哺乳動物に投与することを含み、治療が疾病の予防又は発症の遅延をもたらす前記方法を提供する。疾病の低減は、疲労の軽減又は腫瘍サイズの低下など、癌の症候の低減を含む幾つかの指標によって表され得る。有効量とは、症候の低減又は症候の根絶を引き起こす量である。当業者は、関与する疾病の種類、治療の開始時における疾病の段階並びに患者の年齢及び体重などのその他の因子に基づいて、適切な用量がどのようにあるべきか及び投与の計画を決定することが可能である。幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物を含む抗癌治療を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物を含む抗炎症性治療を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物を含む移植に伴う疾患に対する治療を提供する。
【００５８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、炎症性疾患を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物の有効量を、炎症性疾患を発症するリスクがある哺乳動物に投与することを含む、炎症を予防する方法を提供する。炎症性疾患には、クローン病、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、乾癬及び増殖性ループス腎炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、移植に関連する疾患を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む組成物の有効量を、移植を受ける予定の哺乳動物に投与することを含む、移植に関連する疾患を予防する方法を提供する。このような疾患には、移植片対宿主病、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺（肺移植気道閉塞）などの固形臓器移植又は骨髄移植及び遺伝子治療などの他の移植から生じる合併症が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）異なる時間にわたって、細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を変化させる化合物を決定すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選択すること；
を含む、細胞におけるＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選別する方法を提供する。
【００６１】
ある種の実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ｃａｓｏ２細胞及び免疫系の細胞から選択される。免疫系の細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び抗原提示細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）異なる時間にわたって、細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記化合物のタンパク質制御活性を、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性と比較すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を同定すること；
を含む、ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を選別する方法を提供する。
【００６３】
細胞中におけるＯｓｐＦタンパク質制御活性には、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ０２、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御が含まれるが、これらに限定されない。ノーザンブロット及びＰＣＲをベースとしたＲＮＡ検出を含む遺伝子転写制御を検出するために、当業者は、本分野で周知の技術を使用することが可能である。ＯｓｐＦ発現によって影響を受けるタンパク質をコードする核酸配列は公知であるので、当業者は、各タンパク質標的のｍＲＮＡ配列の一部又は全部を増幅するＰＣＲプリマーを定型的に設計することが可能である。当業者は、以下の実施例で使用されているウェスタンブロット技術など、脱リン酸化を検出するための周知の技術を使用することも可能である。
【００６４】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、ＯｓｐＦ及び／又はＯｓｐＦ活性を模倣若しくは調節する物質と、並びに医薬として許容される担体とを含む。医薬として許容される担体は、本分野において公知である。ある種の実施形態において、医薬組成物における主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水性の性質であり得る。例えば、ある種の実施形態において、適切なビヒクル又は担体は、非経口投与用組成物と共通の他の材料を補充し得る、注射用の水、生理的食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得る。ある種の実施形態において、中性に緩衝化された生理的食塩水又は血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的ビヒクルである。ある種の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０から８．５のＴｒｉｓ緩衝液又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含み、これらの緩衝液は、ソルビトール又は適切なソルビトール代替物をさらに含み得る、ある種の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液、ポリオール（ポリアルコール）を含み、場合によって界面活性剤を含む水性又は液体製剤であり、前記組成物は、塩（例えば、塩化ナトリウム）を含まず、前記組成物は患者に対して等張である。典型的なポリオールには、スクロース、グルコース、ソルビトール及びマニトールが含まれるが、これらに限定されない。典型的な界面活性剤には、ポリソルベートが含まれるが、これに限定されない。ある種の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ５．０の酢酸緩衝液、ソルビトール及びポリソルベートを含む水性又は液体製剤であり、前記組成物は、塩（例えば、塩化ナトリウム）を含まず、前記組成物は患者に対して等張である。ある種の典型的な組成物は、例えば、米国特許第６，１７１，５８６号に記載されている。追加の医薬担体には、石油、動物油、植物油、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの油が含まれるが、これに限定されるものではない。水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液に対して、液体担体として使用することも可能である。ある種の実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤とともに、又は少なくとも１つの追加の治療剤なしにＯｓｐＦを含む組成剤は、純度の所望される程度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形態の、場合によって使用される製剤因子（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって保存のために調製され得る。さらに、ある種の実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤あり又はなしでＯｓｐＦを含む組成物は、適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として用いて、凍結乾燥物質として調合され得る。例えば、医薬組成物は、ＯｓｐＦが、他の補助成分と協調して、抗原に対する免疫応答を制御する佐剤であり得る。
【００６５】
本明細書を通じて引用されている参考文献に対する完全な引用は、本明細書の末尾、特許請求の範囲の直前に記載されている。本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、これらの公報の開示内容全体が、参照により、本願に組み込まれる。組み込まれた参考文献の教示が、本願の教示と抵触し得る程度まで、本願の教示は、組み込まれた参考文献の教示に優越するものとする。
【００６６】
以下の実施例は、ｏｓｐＦ遺伝子がホスファターゼをコードすること、並びにタンパク質修飾及び転写抑制を介して、このホスファターゼがタンパク質機能を制御することを示すために与えられている。これらの実施例は、ＯｓｐＦホスファターゼを使用する上で、当業者を補助することを意図しており、いかなる意味においても、その他、開示内容の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【００６７】
材料及び方法
細胞培養。大腸癌由来のヒト腸管上皮細胞系Ｃａｃｏ−２及びＨｅＬａ細胞を使用した。二重チミジンブロックによる細胞の同期化は、既に記載されているとおりに実施した（Ｈａｒｐｅｒ，２００５）。
【００６８】
細菌の株
シゲラ・フレックスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）５ａ血清型の野生型（ＷＴ）浸潤株及び２２０ｋＢの病原性プラスミドを欠如するＷＴ株の非浸潤性バリアント（ＶＰ−）を使用した。ｉｐａ変異株は既に記載されている（Ｍａｖｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。ｏｓｐＦ変異体を構築するために、ｏｓｐＦのヌクレオチド６１から４２０を包含する、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を、自殺プラスミドｐＳＷ２３ＴのＸｂａＩとＥｃｏＲＩとの間でクローニングし、ｐＳＷＯｓｐＦＴｒを作製した。ＷＴ株ＷＴ−Ｓｍへの抱合によって、このプラスミドを転移させた。ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にｏｓｐＦ遺伝子を包含するＰＣＲ断片を挿入することによって、ｏｓｐＦ遺伝子を発現するプラスミドを構築し、ｐＵＣ１８−ＯｓｐＦを形成した。ｏｓｐＦ変異体を補完するために、このプラスミドを使用した。
【００６９】
プラスミド及びタンパク質精製。ｏｓｐＦをコードする配列をＰＣＲにより増幅させ、ｐＫＪ１のＮｃｏＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間にクローニングして、ＯｓｐＦ−ＨｉｓをコードするｐＫＪ−ＯｓｐＦを構築した。同様に、ｏｓｐＦをコードする配列を担持するＰＣＲ断片を、ｐＧＥＸ４Ｔ２のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でクローニングして、ＧＳＴ−ＯｓｐＦをコードするｐＧＥＸ４Ｔ２−ＯｓｐＦを構築した。ｐＫＪ−ＯｓｐＦ又はｐＧＥＸ４Ｔ２−ＯｓｐＦを有するイー・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の誘導体から、Ｈｉｓタグ及びＧＳＴタグが付加されたＯｓｐＦ組換えタンパク質を精製した。ｏｓｐＦコード配列を担持するＰＣＲ断片を、ｐＲＫ５ｍｙｃのＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングして、ｍｙｃ標識されたＯｓｐＦ（ｍｙｃ−ＯｓｐＦ）をコードするｐＲＫ５ｍｙｃ−ＯｓｐＦを構築した。Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の標準的な手法に従って、点変異を作製した。
【００７０】
間接的免疫蛍光法。ＰＢＳにおける３．７％パラホルムアルデヒドで細胞を１０分間固定し、ＰＢＳにおける０．５％トリトン−Ｘで透過処理した。以下の抗体、すなわち抗ホスホｐ４２／ｐ４４抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗ｐ４２／ｐ４４抗体、抗ホスホヒストンＨ３Ｓ１０抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗アセチルヒストンＨ４（Ｌｙｓ１４）抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。抗Ｈ３メチルＫ９ホスホＳ１０抗体は以前に性質決定された（Ｍａｔｅｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。製造元（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に従って、完全な分子でマウスを免疫化することによって、抗ＯｓｐＦ抗体を産生した。
【００７１】
３３Ｐ標識されたＥｒｋ２キナーゼ基質の調製。ビーズへ連結された精製ＧＳＴ−Ｅｒｋ２の５００μｇを、１００μＭのＡＴＰ（γ−３３Ｐ  ＡＴＰ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有するキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）における２０μｇのＨｉｓ６タグ付加された、活性化されたＭＥＫ１（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに、３０℃で２時間温置することによって、ＧＳＴ−Ｅｒｋ２融合タンパク質のインビトロでのリン酸化を実施した。１×ＰＢＳ３０ｍＬで５回、前記ビーズを洗浄し、５０ｍＭトリスｐＨ８、１０ｍＭグルタチオン及び１０％グリセロール中で溶出した。画分を一晩透析し、５０ｍＭトリスｐＨ８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロールにおける残余ＡＴＰを除去した。
【００７２】
インビトロホスファターゼアッセイ。１００ｎＭＯｓｐＦ又はＭＰＫ１（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに温置された、３３Ｐ標識されたＥｒｋ２の様々な濃度を含有するホスファターゼアッセイ緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５０ｍＭトリスｐＨ８）において、３３Ｐ標識されたＥｒｋ２ホスファターゼアッセイを実施した。予備実験において、ＯｓｐＦによる３３Ｐ標識されたＥｒｋ２脱リン酸化の時間経過を測定し、基質の加水分解の最大速度に１０分で到達することを示した。従って、ホスファターゼの添加により反応を開始し、３０℃で１０分間温置し、２００μＬの冷２０％トリクロロ酢酸を添加することによって終結させた。１０，０００×ｇで試料を遠心分離し、上清２００μＬをシンチレーション液５ｍＬと混合し、放射能測定を行った。生じた産物（無機ホスファート）を、初期基質濃度の５％未満に維持した。Ｅｒｋ２基質とホスファターゼを有さない緩衝液とを含有する反応物を、各データ点に対するブランクとして使用した。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用して、データをＭＩｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式へ当てはめた。
【００７３】
キナーゼアッセイ。キナーゼアッセイを記載のとおり実施した（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）５μｇ又は位置５２のＬｙｓがＡｒｇに変化している（Ｌｙｓ５２Ａｒｇ）Ｅｒｋ２の不活性形態２μｇを基質として使用した。
【００７４】
ゲルシフト実験及びスーパーシフト実験。核抽出物を使用するゲルシフトアッセイを、記載のとおり実施した（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。スーパーシフトアッセイのため、抗ｐ５０（１１４１）抗体及び抗ｐ６５（１２０７−２）抗体または無関係なＩｇＧの存在下で、核抽出物を温置した。
【００７５】
ウェスタンブロット分析。尿素緩衝液（８Ｍ尿素、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ及びプロテアーゼ阻害剤）中に細胞を溶解することによって、ヒストンの可溶化物を得た。以下の抗体、すなわち抗ホスホＥｒｋ１／２抗体、抗ホスホｐ３８抗体、抗ホスホＳＡＰＫ抗体、抗ホスホＭＥＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホスレオニン１８３抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び抗ホスホチロシン１８５（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）Ｅｒｋ抗体、抗ｌκＢ−α抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホ（Ｓ１０）−アセチル（Ｋ１４）ヒストンＨ３ポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗ヒストンＨ３抗体（Ａｂｃａｍ）を使用した。
【００７６】
遺伝子チップハイブリド形成及び分析。ＲＮＡの合成、ハイブリド形成及び標識を、記載のとおり実施した（Ｐｅｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ベースライン（ＷＴに感染した細胞）及び実験（変異株又はトランス相補された株に感染した細胞）間でのｄＣｈｉｐソフトウェア（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，２００１）による比較分析は、０．０５のｐ値閾値及び０．６のシグナル対数比（ＳＬＲ）閾値を用いた対応のないＷｅｌｃｈのｔ検定を使用して、ｄＣｈｉｐを用いて行った。ＳＬＲ閾値は、１．５倍の変化に相当した。このソフトウェアは、ユークリッド距離及び平均を連結方法として使用する階層的クラスター分析に対しても使用した。クラスター分析の前に、平均を０にするために、全ての試料にわたって、１つの遺伝子に対する発現値を標準化する。次いで、増加又は減少した値を並べて、この平均と比較した。
【００７７】
クロマチン免疫沈降及び定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）。固定されていない成分を除去するために、ホルムアルデヒドで固定したＣａｃｏ２細胞を抽出した。無関係なＩｇＧ３μｇ、抗Ｈ３メチルＫ９−ｐＳ１０ポリクローナル抗体、抗ｐ６５（１２２６）ポリクローナル抗体及び抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩポリクローナル抗体（ＳＣ−８９９  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する免疫沈降へ、５×１０６個の細胞に相当する超音波処理されたクロマチンを供した。徹底した洗浄の後、架橋を逆転させ、フェノール／クロロホルム法によって核酸を単離した。ＱＰＣＲのために、分取試料を使用した。製造元の説明書に従い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ）を使用して、ＱＰＣＲを実施した。以下の特異的プロモーターを使用した。
【００７８】
ＩＬ−８：センス５’−ＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＴＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＧ−３’（配列番号１）
アンチセンス５’−ＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＣ−３’（配列番号２）
ＣＤ４４：センス５’−ＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴ−３’（配列番号３）
アンチセンス５’−ＣＣＴＣＧＧＡＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴ−３’（配列番号４）
ｈＲＬＰ０：センス５’−ＡＣＡＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号５）
アンチセンス５’−ＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＡＡ−３’（配列番号６）
ｌκＢ−α：センス５’−ＡＴＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＡ−３’（配列番号７）
アンチセンス５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＣＣＡ−３’（配列番号８）
９５℃で１０分間、ＰＣＲ試料を予め温置した後、９４℃で１５分間、６０℃で５０秒間、７２℃で６０秒間の４５周期を実施した。最後の周期の後、７２℃で１０分間の最終伸長温置を実施した。
【００７９】
インビボ感染及び組織学。ウサギ腸管ループ感染を、記載のとおり実施した（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ）。５×１０９個の細菌の懸濁液（０．５ｍＬ）を５ｃｍのウサギ小腸ループ中へ注射した。ループを腹腔へ戻し、８時間後にウサギを安楽死させた。各細菌株を３羽のウサギ中で検査した。ヘマトキシリンによる組織染色及び組織病理学的分析を、記載のとおり実施した（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４ｂ）。抗シゲラフレックスネリ５ａＬＰＳ抗血清を使用して、免疫標識実験を実施し、ＰＭＮを抗ＮＰ５抗血清（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。
【実施例２】
【００８０】
シゲラは、Ｅｒｋを不活化し、Ｅｒｋを核内に隔離する
ＭＡＰＫ経路は、転写因子、共制御因子及びクロマチン再構築成分をリン酸化することによって、真核細胞中での遺伝子発現を制御する上で重要な役割を担う。哺乳動物細胞におけるＭＡＰＫの３つの主要なサブファミリーは、Ｅｒｋ１及び２、ＪＮＫ１、２及び３、並びにｐ３８タンパク質（ｐ３８α／β／γ／δ）を含む。ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）は、ＭＡＰＫの活性化ループドメイン中に配置されたＴＥＹ配列におけるスレオニン（Ｔｈｒ）及びチロシン（Ｔｙｒ）をリン酸化することによって、ＭＡＰＫを活性化する。ＭＡＰＫＫは、次に、ＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）によって行われるセリン（Ｓｅｒ）残基及びＴｈｒ残基でのリン酸化により活性化される。静止状態の細胞では、ＭＡＰＫの２つのイソフォームであるＥｒｋ１及びＥｒｋ２は不活性であり、それらの上流活性化因子であるキナーゼＭＥＫ１との直接的な結合を介して、細胞質中に保持される。細胞が活性化すると、活性化されたＭＥＫ１が、ＴＥＹ配列上のＥｒｋ１及びＥｒｋ２をリン酸化し、ＭＥＫ−Ｅｒｋ複合体の解離後にＥｒｋが核内へ転位する（Ｂｕｒａｃｋ  ａｎｄ  Ｓｈａｗ，２００５）。以下の実験は、シゲラがＨｅＬａ細胞中でＭＡＰＫの活性化をどのように調節するかを示す。
【００８１】
野生型浸潤性シゲラ株（ＷＴ）又は病原性プラスミドを欠如する非浸潤性ＶＰ株にＨｅＬａ細胞を感染させた。病原性プラスミドの除去を確認するために、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化をモニターした。浸潤性ＷＴ株は、ＪＮＫキナーゼの主な標的であるタンパク質ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を誘導するのに対して、非浸潤性ＶＰ株は、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を誘導しなかった（図１Ａ、レーン５及び１０を比較されたい。）。ＷＴ株での感染によって、ｌκＢ−αの分解も生じ、既に記載されているとおり（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ＩＦ−κＢ（ＩＫＫ）経路の活性化に関する証拠を提供した。
【００８２】
サブドメインＶＩＩＩの活性化ループにおける２つのＳｅｒ残基（Ｓ２１７及びＳ２２１）において二重にリン酸化されたＭＥＫ１に特異的な抗体又はＴ１８３ＥＹ１８５配列において二重にリン酸化されたＥｒｋ１／２に特異的な抗体の何れかを使用することによって、２つのキナーゼＭＥＫ１及びＥｒｋ１／２のリン酸化に及ぼすシゲラ感染の効果を測定した。シゲラ感染は、ＭＥＫ１の２つのセリン残基においてリン酸化されたＭＥＫ１の活性形態の形成を誘導した（図１Ａ、レーン７ないし１１）。しかしながら、活性型ＭＥＫ１は、Ｅｒｋリン酸化を誘導しなかった（図１Ａ）。更に、Ｅｒｋ１／２のホスホＴｈｒ１８３（ｐＴ）又はホスホＴｙｒ１８５（ｐＹ）の何れかを検出する抗体で示されたように、Ｒａｆキナーゼの強力な活性化因子であるＰＭＡは、ＷＴに感染した細胞において、両残基でのＥｒｋリン酸化を有意には誘導しなかった。これに対して、ＶＰ株に感染した細胞は、Ｅｒｋリン酸化を示した（図１Ｂ、レーン２ないし４を６ないし８と比較されたい。）。総合すると、これらの結果は、ＷＴ株がＭＥＫ１から下流のシグナル伝達経路を中断する能力を有することを示唆した。実際、キナーゼアッセイは、シゲラが迅速且つ強力なＭＥＫ１活性化因子である（図１Ｃ、レーン４ないし６）が、奇妙なことにＥｒｋの下流の酵素的活性化を誘導できないことを確認した。
【００８３】
シゲラは、その空間的局在性を変化させることによって、又はその重要なホスホスレオニン残基及びチロシン残基の二重脱リン酸化に必要とされる細胞内ホスファターゼ活性を制御することによって、Ｅｒｋを不活化し得る。哺乳動物において、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）は、様々なＭＡＰキナーゼに対して基質選好性を示し、異なる細胞内区画を占有するＤＳＰである。従って、ＭＫＰ−３が専ら細胞質性であると思われるのに対し、ＭＫＰ−１及びＭＫＰ−２は、核中に局在し、脱リン酸化された形態でＥｒｋ１／２を核内に蓄積する（Ｖｏｌｍａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。シゲラ感染後のＥｒｋの細胞内局在化を評価し、総Ｅｒｋの局在化を活性なＥｒｋの局在化と比較した。ＰＭＡ刺激は、リン酸化された活性な形態でＥｒｋの完全な核内転位を誘導した（図１Ｅ）。興味深いことに、シゲラによる感染は、Ｅｒｋの核内蓄積を誘導するが、Ｅｒｋの脱リン酸化された不活性な形態では誘導しなかった。シゲラの存在下で行われたＰＭＡ刺激は、修飾されていないＥｒｋ核内局在をもたらすが、核は、リン酸化されたＥｒｋを欠如したままであった。この効果は、ＶＰ株による感染の間には観察されなかった。
【００８４】
これらの結果は、浸潤性シゲラタンパク質が一度核内へ転位すると、浸潤性シゲラが、Ｅｒｋを標的とする核ホスファターゼ活性の引き金を引き得ることを示唆した。核内でのＥｒｋ不活化の候補となり得る哺乳動物ＭＫＰ−１又は２は、様々な刺激に応答して新たに合成される（Ｂｒｏｎｄｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。しかし、シゲラ感染後のタンパク質合成を遮断するためのシクロヘキシミド処理によって証明されたように、シゲラによるＥｒｋの不活化は、新たなタンパク質の合成とは無関係である。これらの見解に基づいて、病原性プラスミドによってコードされる細菌タンパク質エフェクターは、ＴＴＳＳを介して細胞内へ注入され、Ｅｒｋの核内不活化を誘導し得る。
【実施例３】
【００８５】
ｏｓｐＦ遺伝子は、直接及び二重にＥｒｋを脱リン酸化する細菌ホスファターゼをコードする
上皮細胞表面に接触すると、シゲラＴＴＳＳ装置は活性化し、分泌を通じて、約２０個のタンパク質が分泌される。ＴＴＳＳ装置は、インビトロにおける３７℃での細菌増殖中に弱い活性を有し、ｉｐａＢ遺伝子又はｉｐａＤ遺伝子の不活化によって調節解除される（Ｍｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００８６】
哺乳動物に関して記載された主要なＥｒｋホスファターゼは、可溶性酵素であるので、ｉｐａＢ遺伝子が不活化され（ｉｐａＢ２株）又は破壊されて、ｉｐａＢタンパク質の末端切断型（ｉｐａＢ４株）をもたらす、調節解除された変異株由来の細菌上清を使用する、細菌ＤＳＰ候補を同定するための戦略が開発された（Ｍａｖｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。市販のホスホＥｒｋ２−グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ｐＥｒｋ２−ＧＳＴ）融合ペプチドを基質として使用して、ホスファターゼ活性に関してこれらの変異株由来の上清をアッセイした。
【００８７】
両ｉｐａＢ変異体由来の上清は、ｐＥｒｋ２−ＧＳＴを強く脱リン酸化した（図２Ａ、レーン１ないし２を３ないし４と比較されたい。）。これらの結果は、分泌された細菌タンパク質がＥｒｋホスファターゼとして作用できることを示した。ｉｐａＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ遺伝子（デルタｉｐａＡＢＣＤ変異株）の不活化は、上清による基質の脱リン酸化を損なわず（図２Ａ、レーン６）、ＩｐａＡないしＤタンパク質がこの過程に関与していないことを示した。
【００８８】
シゲラタンパク質エフェクターの転写は、転写調節因子のＡｒａＣファミリーに属する病原性プラスミドによってコードされる転写活性化因子であるＭｘｉＥの調節下で、分泌活性によって制御される。ＭｘｉＥは、分泌されたタンパク質をコードする１１個のプラスミド遺伝子の発現に必要である（Ｍａｖｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。興味深いことに、ｉｐａＢ４ｍｘｉＥ二重変異株の上清にはホスファターゼ活性が存在しない（図２Ａレーン５）。これらの結果は、ＭｘｉＥによって転写調節される１１個の分泌されたタンパク質の１つがホスファターゼであることを示した。
【００８９】
精製されたタンパク質を使用して、これらの１１個のタンパク質のうちの３つであるＯｓｐＧ、ＯｓｐＦ及びＩｐａＨをホスファターゼ活性に関して検査した。精製されたＯｓｐＦは、Ｅｒｋ２を直接脱リン酸化した（図２Ｂ）。活性化ループドメインのＴＥＹ配列に位置するホスホＴｈｒ１８３（ｐＴ１８３）又はホスホＴｙｒ１８５（ｐＹ１８５）の何れかを検出する抗体を使用して、Ｅｒｋのこれらの残基における特異的脱リン酸化を検出した。ＯｓｐＦは、Ｔｈｒ残基とＴｙｒ残基の両者を脱リン酸化した（図２Ｃ、レーン２）。従って、ＯｓｐＦは、二重特異的ホスファターゼであった。ＯｓｐＦのホスファターゼ活性は、チロシンホスファターゼ阻害剤であるバナダートによって阻害された（図２Ｃレーン３）が、セリンスレオニンホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸によっては阻害されなかった（図２Ｃレーン４）。
【００９０】
ＯｓｐＦによって触媒される脱リン酸化の速度論的パラメータを決定するために、キナーゼＭＥＫ１を使用するインビトロリン酸化によって組換えＥｒｋ２を３３Ｐ標識し（図２Ｄ、レーン１）、ｐＴ１８３残基又はｐＹ１８５残基においてリン酸化されたＥｒｋ２が生成されることを、リン酸特異的Ｅｒｋ２抗体を用いて検証した（図２Ｅ、レーン１）。ＯｓｐＦ又は対照としての公知の二重特異的ホスファターゼＭＫＰ１とともに、基質を温置した。ホスホ−Ｅｒｋシグナルの強力な阻害とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィー及びウェスタンブロッティングにおいて明らかにされた基質のゲル移動度の増大によって、両酵素によるＥｒｋ２の脱リン酸化を確認した（図２Ｄ及び２Ｅ、レーン１をレーン２及び３と比較されたい。）。
【００９１】
放射性無機ホスファートの生成を追跡することによって、速度論的パラメータを測定した。図２Ｆは、ＭＰＫ１と比較した、ｐＨ８及び３０℃での初速度と組換えｐＥｒｋ２濃度の典型的なセットを示す。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式へ、データを、直接カーブフィッティングさせると、それぞれ９．８９ｐＭｓ−１、２０４ｎＭ、及び０．０００１ｓ−１のＶｍａｘ、Ｋｍ、及びｋｃａｔが得られた。これらの値は、ＭＫＰ１で観察された値（それぞれ６．０１ｐＭｓ−１、２２９ｎＭ、及び０．０００６ｓ−１のＶｍａｘ、Ｋｍ、及びｋｃａｔ）と似ていた。従って、ＯｓｐＦによって触媒されるＥｒｋ２の脱リン酸化に対する速度論的パラメータは、哺乳動物ＤＳＰＭＫＰ１で得られた値と同程度である。特筆すべきことに、ＯｓｐＦの一次アミノ酸配列は、全てのＤＳＰ中に存在する標準的な触媒的活性部位の配列Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ａｒｇ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含有していない（総説に関しては、Ｚｈａｎｇ，２００２を参照されたい。）標準的触媒モチーフ内で、システイン（ｃｙｓ）残基は、基質によって提供されるホスファートに対する共有結合を形成し、従って触媒作用に必須である。そのイミダゾール環がＣｙｓと相互作用し、ホスファターゼのＰループ中にこの残基の適切な位置を維持するので、ヒスチジン（Ｈｉｓ）も、触媒作用において中心的な役割を担っている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００９２】
触媒作用部位において起こり得るそれらの関与を探索するために、ＯｓｐＦの保存されたＣｙｓ残基（Ｃｙｓ８８、１６３、及び１８０）並びにＨｉｓ残基を、それぞれセリン（Ｓｅｒ）及びロイシン（Ｌｅｕ）へ変異させた。これらの各変異体のための発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中へ形質移入した。ＯｓｐＦの３つのＣｙｓ残基のＳｅｒへの変異（Ｃ８８Ｓ、Ｃ１６３Ｓ、及びＣ１８０Ｓ）は何れも、ＰＭＡ刺激後にＥｒｋを二重に脱リン酸化するタンパク質の能力を損なわなかった。同様に、位置１７２でのＨｉｓからＬｅｕへの変異は、ホスファターゼ活性を保持する結果となった（図２Ｇ、レーン１３ないし１７）。これに対して、Ｈｉｓ１０４残基のＬｅｕへの単一点変異（Ｈ１０４Ｌ）は、インビボでＥｒｋを脱リン酸化するＯｓｐＦの能力を損なった（図２Ｇ、レーン８ないし１２）。並行して、Ｈ１０４Ｌ変異体は、ＧＳＴ融合タンパク質として精製された。このタンパク質は、高濃度においてさえ、組換えホスホＥｒｋ２基質を脱リン酸化できなかった（図２Ｈ、レーン７ないし１１）。総合すると、これらの結果は、ＯｓｐＦがＣｙｓをベースとしたＰＴＰではないことを示しており、ホスファターゼの活性にＨｉｓ１０４が必要であることを示唆する。
【００９３】
ＤｘＤＧＳの配列モチーフが、ＯｓｐＦのＣ末端ドメイン中に特定された（Ａｓｐ２１７−Ｘ−Ａｓｐ２１９−Ｇｌｙ−Ｓｅｒモチーフ）（配列番号９）。この配列は、第一のアスパラギン酸塩が、触媒作用中に、金属によって補助されるリン酸化を経験するのに対して、第二のアスパラギン酸塩は、一般的な酸として作用するアスパラギン酸塩をベースとしたＰＴＰにおいて見られるＤｘＤＧ（Ｔ／Ｖ）保存モチーフと類似している（Ｃｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、総説に関してはＡｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。酵素のこのクラスは、ホスホアスパラギン酸塩中間体を構造的に模倣することがわかっているベリロフルオライド（ｂｅｒｙｌｌｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）陰イオンＢｅＦ３−によって阻害される（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｋａｍｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。同様に、ＯｓｐＦ活性は、オルトバナダート、フッ化アルミニウム及びベリロフッ素等の様々なホスファート類縁体によって阻害され、触媒作用性アスパラギン酸塩残基の存在を示唆した（図２ｌ、レーン４ないし９）。しかし、その活性がＥＤＴＡによって遮断されなかったので、ＯｓｐＦは、金属とは無関係な様式で作用する。更に、２つのアスパラギン酸塩残基Ｄ２１７及びＤ２１９のアスパラギンへの保存的変異は、ＧＳＴ−Ｅｒｋ２基質に対するホスファターゼ活性を損なわなかった。従って、ＯｓｐＦのホスファターゼ活性は、新規の反応機構に依存し、ＯｓｐＦはおそらく、チロシンホスファターゼの新たなクラスに相当する。
【００９４】
ＯｓｐＦがインビボでホスファターゼ活性を有するか否かを研究するために、ｍｙｃ標識されたＯｓｐＦをコードするプラスミドの増大する量をＨｅＬａ細胞に形質移入し（これは、免疫検出可能なタンパク質の用量依存的な増大をもたらした。）、ＰＭＡ（図３Ａ）又はＴＮＦ（図３Ｂ及びＣ）によって刺激した。ｍｙｃ標識されたＯｓｐＦの発現は、内因性Ｅｒｋ（図３Ａ）及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ（図３Ｂ）の両者のリン酸化を妨げたが、ｐ４６及びｐ５４ＪＮＫキナーゼのリン酸化は妨げなかった（図３Ｃ）。
【００９５】
ｏｓｐＦの内部断片を担持する自殺プラスミドの挿入によって、ｏｓｐＦ遺伝子の不活化が得られ、遺伝子発現の破壊がもたらされるｏｓｐＦ変異株（ｏｓｐＦ株）を構築した。ｏｓｐＦ変異体は、上皮細胞中への移行及び細胞から細胞への細胞内細菌の播種に関して、野生型の株と比較して全く差異を呈さなかった。ｏｓｐＦでトランス相補されたｏｓｐＦ株（ｏｓｐＦ／ｐＵＣ−ＯｓｐＦ）を内部対照として使用した。
【００９６】
ｏｓｐＦ変異体によるＣａｃｏ２細胞の感染は、Ｅｒｋ（図３Ｄレーン７ないし９）及びｐ３８ＭＡＰＫ（図３Ｅレーン７ないし１１）のリン酸化を誘導し、ｐ４６及びｐ５４ＪＮＫキナーゼのリン酸化状態は、ＯｓｐＦが発現した試料と比較して変化しなかった（図３Ｆ）。同様の結果が、ＨｅＬａ細胞で得られた。ＯｓｐＦでのｏｓｐＦ変異体の補完は、この表現型を逆転させ、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化が生じなかった（図３Ｄ及び３Ｅ）。従って、ＯｓｐＦは、別個のＭＡＰキナーゼを選択的に不活化する二重特異的活性をインビボで示す。
【００９７】
精製されたホスホＭＡＰキナーゼタンパク質に対するホスファターゼ活性をアッセイすることによって、ＯｓｐＦの基質特異性を更に研究した。ＯｓｐＦは、Ｅｒｋもｐ３８ＭＡＰキナーゼも直接脱リン酸化したが、ＭＫＰ１とは異なり、ＪＮＫ１を脱リン酸化することはできなかった（図３Ｇ）。従って、ＯｓｐＦは、細菌の侵入時に活性化されたＭＡＰＫのサブセットを不活化するために必要とされる。
【００９８】
図１Ｅは、ＭＡＰキナーゼが、核内で脱リン酸化されることを示唆した。細菌曝露後におけるＯｓｐＦの細胞内分布を研究した。抗ＯｓｐＦ抗体を使用して、間接的免疫蛍光法を実施した。この抗体は、何れの細胞タンパク質とも交差反応せず、細胞中で過剰発現された場合に、ＯｓｐＦと強く免疫反応した。ＨｅＬａ細胞をＷＴシゲラ株又は対照としてのｏｓｐＦ株で感染させた。これらの細胞において、ＯｓｐＦは、ＷＴによる感染の１５分以内に、核内に蓄積したのに対し、ｏｓｐＦ欠損株ではシグナルが観察されなかった（図３Ｈ）。抗ＯｓｐＦ抗体及び抗核膜孔複合体タンパク質（ＮＰＣ）抗体を用いて行われた二重標識は、シゲラ感染におけるＯｓｐＦの核局在性を確認した（図３Ｉ）。従って、ＯｓｐＦの核局在性は、シゲラ感染後に観察される脱リン酸化された形態のＥｒｋの核内蓄積と合致する（図１Ｅ）。
【実施例４】
【００９９】
ＯｓｐＦホスファターゼは、上皮細胞中でのシゲラ感染の間に免疫遺伝子の遺伝子転写を抑制する
上皮細胞中でシゲラによって誘導される転写反応をＯｓｐＦが調節するかどうかを研究するため、シゲラのＷＴ、ｏｓｐＦ変異体（ｏｓｐＦ株）又はトランス相補された株（ｏｓｐＦ／ｐＵＣ−ＯｓｐＦ）に２時間感染させたＣａｃｏ２細胞を使用して、トランスクリプトーム分析を実施した。２つの独立したマイクロアレイハイブリド形成実験を、各系に対して実施した。ｏｓｐＦ株での感染時に、（ＷＴと比較して）転写が１．５倍超増加制御された合計４６個の遺伝子を同定した（図４）。トランス相補された株に感染させると、わずか３個の遺伝子が増加制御され、変異株で観察された増加制御が、ＯｓｐＦタンパク質の発現が存在しないことを反映することを示した。増加制御された遺伝子は、細胞の生存に関与する幾つかの古典的なＭＡＰＫ依存性標的遺伝子（ＢＣＬ２ファミリーのメンバー）並びに早期増殖因子及びＡＰ−１タンパク質をコードする遺伝子等の幾つかの前初期（ＩＥ）遺伝子及びＣＣＬ−２０等の幾つかのＮＦ−κＢ依存性サイトカインを主として含んだ。調節された遺伝子発現の階層クラスター分析が図４に示されている。Ｅｒｋ又はｐ３８の過剰活性化を伴うかなりの数の炎症性疾患又は癌疾患が存在する。関節リウマチ（ＲＡ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような慢性炎症性疾患（Ｗａｅｔｚｉｇ，２００２）では、ｐ３８有糸分裂活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの産生において中心的な役割を占め、両サイトカインは、これらの疾患のための治療標的として明確に同定されている（Ｍｉｗａｔａｓｈｉ，２００５、Ｐｅｉｆｅｒ，２００６）。
【０１００】
ケモカインをコードする遺伝子の場合、ＯｓｐＦの不存在は、ＷＴ株によって誘導されたものと類似のｍＲＮＡ発現パターンをシゲラに誘導させたが、発現レベルは全体的に増加していた。この増加は、樹状化学誘引物質ケモカインＣＣＬ２０及びＩＬ−８遺伝子の場合に、特に重要であり、炎症性ケモカインの発現を調節する上でのＯｓｐＦに対する役割を示した。これらの知見は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認された。本結果は、ｏｓｐＦ変異体が、野生型の株と比較して、ｃ−ｆｏｓ及びＩＬ−８の両ｍＲＮＡ発現を強く増加制御することを示した（図５Ａ）。これらの遺伝子については、タンパク質レベルでの増加制御も観察された。ウェスタンブロット分析は、ｃ−ｆｏｓタンパク質の蓄積がｏｓｐＦ変異体株での感染後の初期時点で強く増加するが、ＷＴ株での感染では増加しないことを示し（図５Ｂ、レーン２ないし３を６ないし７と比較されたい。）、表現型は、トランス相補された株と正反対であった（図５Ｂ、レーン１０ないし１３）。細菌性赤痢の病変形成におけるＩＬ−８の主要な役割（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を考慮して、ＩＬ−８ｍＲＮＡの発現をモニターした。ｍＲＮＡをコードするＩＬ−８は、ｏｓｐＦ変異系によって強く増加制御された（図５Ａ）。同様に、細菌感染の５時間後に観察されるＩＬ−８分泌のレベルは、ＷＴ株及びトランス相補された株と比較して、ｏｓｐＦ株に応答して強力に増加された（図５Ｃ）。
【０１０１】
総合すると、これらの結果は、ＯｓｐＦは炎症性反応及び自然免疫反応に主に関与している遺伝子の選択的セットを抑制していることを示す。上皮細胞におけるＥｒｋ１／２及びｐ３８シグナル伝達経路を標的にすることによって、シゲラは、上皮細胞における炎症促進過程を調節することが可能である。
【実施例５】
【０１０２】
ＯｓｐＦホスファターゼは、シゲラ感染した細胞において、ＭＡＰＫの不活化を通じてヒストンＨ３のリン酸化を妨害する
古典的なＭＡＰＫ依存性標的遺伝子に加え、ＯｓｐＦもＩＬ−８等の幾つかのＮＦ−κＢ依存性ケモカイン遺伝子の発現を抑制した。ＩＬ−８プロモーターは、この遺伝子の発現に不可欠なＮＦ−κＢ結合部位を含有する（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。従って、本発明者は、ＯｓｐＦがＮＦ−κＢシグナル伝達経路に妨害するかどうかを観察した。Ｃａｃｏ２核抽出物を使用して実施される電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、ＷＴ株及びｏｓｐＦ株が何れも、感染から１時間後に検出される類似の核ＮＦ−κＢ結合活性を誘導することを示した（図５Ｄ）。抗ｐ５０抗体及び抗ｐ６５抗体を用いて実施されるスーパーシフト分析は、両シゲラ株が典型的なｐ５０−ｐ６５ＮＦ−κＢ二量体を生じることを示した（図５Ｅ）。更に、典型的なＮＦ−κＢ依存性遺伝子であるｌκＢ−αが、転写レベル及び翻訳レベルで、ＷＴ株及びｏｓｐＦ株で同様に増加制御されるので、ＮＦ−κＢ転写活性自体は、影響を受けなかった（図５Ｆ）。最後に、Ｃａｃｏ２細胞中でのＯｓｐＦの過剰発現は、ＮＦ−κＢリポーターコンストラクトのＴＮＦ−α誘発性活性化を妨害しなかった。これらの結果は、ＯｓｐＦが、シゲラによって誘発されるＩＫＫ−ＮＦ−κＢ経路の活性化を妨害しないことを示した。
【０１０３】
本発明者は、ＯｓｐＦによって媒介されるＭＡＰＫの阻害が、ＮＦ−κＢ反応性遺伝子の選択的セットの抑制をどのように生じ得るかについて研究した。ＭＡＰＫは、ＩＬ−８を含むサイトカイン遺伝子及びケモカイン遺伝子のサブセット上のＮＦ−κＢ結合部位を遮蔽するクロマチン構造を開封するのに必要である（Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。実際、Ｓｅｒ１０でのヒストンＨ３のＭＡＰＫ誘発性リン酸化等のヒストンの共有結合性修飾は、ＮＦ−κＢ動員のためのプロモーターを遮蔽する（同文献）。更に、このヒストン修飾は、ＩＥ遺伝子と相関していた（Ｃｌａｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。上述のように、ＩＥ遺伝子の誘導は、ＯｓｐＦによって抑制される。ＯｓｐＦは、Ｓｅｒ１０でのヒストンＨ３リン酸化（Ｈ３ｐＳ１０）に関与する主要なＭＡＰＫ、すなわちｐ３８及びＥｒｋを阻害することによって、転写抑制因子として作用し得る。
【０１０４】
この仮説を調べるために、ＨｅＬａ細胞をＷＴシゲラ又はｏｓｐＦ変異株に感染させ、抗ホスホヒストンＨ３Ｓｅｒ１０抗体を使用して、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイを実施した（図６Ａ）。ＷＴ株は、Ｓｅｒ１０でのヒストンＨ３のリン酸化（Ｈ３ｐＳ１０）の引き金を引けなかったのに対し、ｏｓｐＦ株は、強い一過性のＨ３ｐＳ１０シグナルを誘導した（図６Ａ）。同様の結果は、Ｃａｃｏ２細胞を使用して観察された。有糸分裂Ｈ３ｐＳ１０の検出を回避するために、二重チミジンブロックを使用して、Ｓ期でＨｅＬａ細胞を静止させた。前記細胞をｏｓｐＦ株に感染させると、ウェスタンブロットによってＨ３Ｓ１０のリン酸化の誘導が可視化された（図６Ｂ）。ＷＴ株による感染の際のＨ３ｐＳ１０シグナルの欠如が、エピトープを遮蔽する可能性を秘める修飾によるものではないことを確認するため、二重修飾に特異的な抗体を検査した。図５Ｂに示されるように、メチル化されたＫ９及びリン酸化されたＳｅｒ１０の両者（Ｈ３ｍｅｔＫ９−ｐＳ１０）並びにリン酸化されたＳｅｒ１０及びアセチル化されたＫ１４（Ｈ３ｐＳ１０／Ａｃ−Ｋ１４）の両者を担持するヒストンＨ３に対する抗体によって、抗Ｈ３ｐＳ１０抗体と同じ結果が得られた。
【０１０５】
ｍｙｃ標識されたＯｓｐＦをコードするプラスミドを使用して、ＨｅＬａ細胞中にＯｓｐＦを過剰発現させた。ＯｓｐＦの過剰発現は、デアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンがＫ１４上で高アセチル化を誘導する能力を損なわなかった。免疫蛍光は、ＯｓｐＦが主として核に局在し、オカダ酸によって誘導されるＨ３ｐＳ１０の誘導を効率的に防止することを示した（図６Ｃ）。従って、ホスホアセチル化されるヒストンＨ３のレベルの変動は、ＯｓｐＦがＳｅｒ１０でのリン酸化レベルを低下させる唯一の能力を反映するようである。
【０１０６】
合せ考えると、これらの結果は、ＯｓｐＦがシゲラ感染におけるヒストンＨ３Ｓ１０リン酸化を防止することを示した。この過程に関与する分子機構を同定するため、本発明者は、ＯｓｐＦがＨ３を直接脱リン酸化するかどうかを決定した。ウシ胸腺から精製されたヒストンＨ３又は、ｍｃｔＫ９−ｐＳ１０若しくはｐＳ１０修飾を有するヒストンＨ３尾部を模倣する様々なペプチドとともに、精製されたＯｓｐＦを温置した（図６Ｄ及び６Ｅ）。これらの結果は、λホスファターゼとは対照的に、酵素濃度が１００倍上昇した場合でさえ、ＯｓｐＦがこれらの基質を直接脱リン酸化しなかったことを示す。興味深いことに、ｏｓｐＦ株によって誘導されるＨ３ｐＳ１０シグナルは、２つの特異的なＥｒｋ阻害剤及びｐ３８キナーゼ阻害剤であるＵ０１２６及びＳＢ２０３１８０によって、ｐ３８活性化及びＥｒｋ活性化の両者が遮断されると、完全に阻害された（図６Ｆ）。この知見は、これら２つのキナーゼが、ｏｓｐＦ株による感染の際に観察されるＨ３ｐＳ１０に関与することを示し、ＭＡＰＫに対するＯｓｐＦによって媒介されるＤＳＰ活性が、ヒストンＨ３のシゲラ誘発性リン酸化を遮断する上で中心的な役割を担うことを示唆した。
【０１０７】
ヒストンＨ３の柔軟なＮ末端尾部も、Ｓｅｒ１０近傍の他の共有結合性修飾が施される。これらの修飾は、転写活性化を伴うＬｙｓ１４（Ｋ１４）アセチル化、及び抑制の特徴であることが知られているＬｙｓ９（Ｋ９）メチル化を含む。シゲラＷＴ株での感染の際にＨ３ｐＳ１０が存在しないことが、エピトープを遮蔽する可能性を秘めている修飾によるものではないことを確認するために、二重修飾に特異的な抗体を検査した。図６Ｂに示されているように、Ｋ９でのメチル化及びＳｅｒ１０でのリン酸化の両者（Ｈ３ｍｅｔＫ９−ｐＳ１０）を担持し、又は、Ｓｅｒ１０リン酸化及びＬｙｓ１４アセチル化の両者（Ｈ３ｐＳ１０／Ａｃ−Ｋ１４）を担持するヒストンＨ３尾部に対する抗体によって、抗ホスホヒストンＨ３Ｓｅｒ１０抗体と同じ結果が得られた。
【０１０８】
これらの結果は、ＯｓｐＦがヒストンＨ３Ｓ１０のシゲラ誘発性リン酸化を妨害することを裏付けた。ＯｓｐＦが、Ｓｅｒ１０−Ｋ１４でホスホアセチル化されたヒストンＨ３の形成を防止したことも示す。しかしながら、ＯｓｐＦを過剰発現させることによって、デアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンがＫ１４での高アセチル化を誘導する能力が妨害されなかったので、ホスホアセチル化されたヒストンＨ３のレベルの変動は、ＯｓｐＦがＳｅｒ１０でのリン酸化レベルを低下させる能力を反映するようである（図６Ｇ）。これらの結果は、ＯｓｐＦがＳｅｒ１０でヒストンＨ３を選択的に標的にしていることを示した。
【実施例６】
【０１０９】
ＯｓｐＦは、遺伝子選択的な様式で、ヒストンＨ３によってリン酸化されたプロモーターの形成を阻害し、ＩＬ−８プロモーター部位でのＮＦ−κＢ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの両者の動員を妨害する
ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターの近傍でヒストンＨ３のリン酸化を変化させるかどうかを研究するために、抗Ｈ３ｍｅｔＫ９−ｐＳ１０抗体又は対照として、アイソタイプが同一の無関係なＩｇＧを使用して、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実施した。超音波処理されたクロマチンの平均の大きさは、約５００ｂｐであり、ＰＣＲ産物（１５０ｂｐ）の分析が可能であり（図７Ａ）、リアルタイム定量的ＰＣＲによってデータを分析した。
【０１１０】
対照として、ＣＤ４４遺伝子及びリボソームタンパク質ラージＰ０（ＲＬＰ０）をコードする遺伝子を使用した。これらの遺伝子は、Ｃａｃｏ２細胞中で良好に転写されたが、Ｅｒｋ又はｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路とは無関係であった。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＣＤ４４ｍＲＮＡ発現レベルがＷＴ株及びｏｓｐＦ株での感染に際して、変化しないままであることを示した（図５Ａ）。本発明者は、リボソームタンパク質ラージＰ０（ＲＬＰ０）をコードする遺伝子も検討した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、細菌への曝露が、ＯｓｐＦとは無関係の様式で、ＲＬＰ０ｍＲＮＡ発現を増加制御し、これらの実験に関する興味深い陽性対照を提供することを示した（図５Ａ）。ＯｓｐＦによって抑制されないＮＦ−κＢ反応性遺伝子の典型的な一員として、ＩκＢ−α遺伝子を検討した。この遺伝子は、樹状細胞において、ＭＡＰＫとは無関係の様式でＨ３リン酸化を経験することが既に報告されていた（Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。上述のように、この遺伝子は、転写レベル及び翻訳レベルの両者で、ＷＴ株及びｏｓｐＦ株によって同様に増加制御された。
【０１１１】
等電点電気泳動及びウェスタンブロットによって得られるデータ（図６Ａ及び６Ｂ）と一致して、ｏｓｐＦ株によるＣａｃｏ２細胞の感染の結果、感染３０分以内に、ＩＬ−８プロモーターにおいて、Ｓｅｒ１０でのヒストンＨ３リン酸化（Ｈ３ｐＳ１０）のレベルが約４００倍増加したのに対し、ＷＴ株は、ほぼ全く効果がなかった（図７Ｂ、左パネル）。従って、ＯｓｐＦは、ＩＬ−８プロモーターでのＨ３ｐＳ１０の形成を強力に抑制した。興味深いことに、ＯｓｐＦは、ＣＤ４４及びｌκＢ−αアンプリコンにおいてＨ３リン酸化を修飾しなかった（図７Ｄ及び７Ｆ）。更に、ＯｓｐＦの存在は、ＲＬＰ０プロモーターと接触するリン酸化されたヒストンＨ３の両細菌による曝露によって誘導される強固な動員に全く影響を及ぼさなかった（図７Ｅ）。これらの結果は、ヒストンＨ３に及ぼすＯｓｐＦの効果が遺伝子特異的であることを示した。
【０１１２】
この遺伝子特異性は、標的プロモーターでの細菌エフェクターの直接的な空間的局在化によって、より容易に達成され得る可能性がある。この可能性を調査するために、ＷＴＯｓｐＦ、触媒作用上不活性型であるＯｓｐＦＨ１０４Ｌ又は対照として核へ局在できない、ＯｓｐＦの最後の３０個のアミノ酸のＣ末端欠失変異体（１−２２１）をコードするプラスミドを、ＨｅＬａ細胞に形質移入した（図７Ｇ）。抗ＯｓｐＦ抗体を使用するＣｈＩＰアッセイのためにこれらのＨｅＬａ細胞を処理した。
【０１１３】
酵母及びヒトの両系における最近の証拠は、一度活性化されると、ＭＡＰＫは核内に局在し、標的遺伝子を内部に有するクロマチンと安定して結合することを示しており（Ａｌｅｐｕｚ，２００１、Ｐｏｋｈｏｌｏｋ，２００６）、キナーゼ活性が、クロマチンレベルでの遺伝子特異的修飾に至るシグナル伝達経路を開始し得る可能性を開いた。ＯｓｐＦは、核内でＭＡＰＫを脱リン酸化するホスファターゼとして作用するので、選択されたプロモーターにおいてＯｓｐＦを標的として、細胞活性化は、Ｈ３リン酸化に至るＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードを中断するであろう。
【０１１４】
ＭＡＰＫ誘発性Ｈ３ｐＳ１０がＩＬ−８プロモーターの近傍であるかどうかを検討するために、ＷＴ  ｓｐＦ、又は対照として核内に局在できない最後の３０個のアミノ酸のＣ末端欠失変異体ｏｓｐＦ（１−２２１）（図７Ｇ）をコードするプラスミドを発現させるＨｅＬａ細胞を、抗ＯｓｐＦ抗体を使用するクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイのために処理し、ＩＬ−８プロモーターでのＯｓｐＦの濃縮をリアルタイム定量的ＰＣＲにより分析した。更なる対照として、ＯｓｐＦによって抑制されない様々な遺伝子、すなわち、ＩκＢ−α、ＣＤ４４及びＯｓｐＦ非依存性の様式でシゲラ曝露によって転写的に誘導されるリボソームタンパク質ラージＰ０（ＲＬＰ０）をコードする遺伝子も、この転写分析において検討した（図５Ａ）。
【０１１５】
免疫蛍光が、核内へのＯｓｐＦの強い蓄積を示した（図７Ｇ）のに対し、ＯｓｐＦは、刺激されていない細胞中では、ＩＬ−８プロモーターにおいて検出できなかった（図７Ｈ）。これに対して、ＴＮＦ−α刺激は、ＩＬ−８においてＯｓｐＦの一過性の動員を誘導したが、ＩκＢ−α、ＲＬＰ０又はＣＤ４４プロモーターにおいては誘導しなかった。刺激されていない細胞中では、ＩＬ−８プロモーターでシグナルは検出されなかった（図７Ｈ）。この結果は、炎症性刺激が、選択されたプロモーターにおいて、このエフェクターを駆動し得る可能性を秘めていることを示唆するものであり、プロモーターレベルでＭＡＰＫ誘発性Ｈ３Ｓ１０リン酸化の部位特異的減少制御を誘導するための興味ある機構を提供した。従って、細胞刺激は、選択されたプロモーターにおいてＯｓｐＦを標的にし、特定の座位に対して部位特異的後成的修飾を誘導するための魅力的な機序を与えた。
【０１１６】
ＭＡＰＫキナーゼの活性化によるＨ３のリン酸化が、特定の遺伝子上のＮＦ−κＢ結合部位を遮蔽しないために必要であることを示唆するモデルが提唱された（Ｍｕｅｇｇｅ，２００２）。主として、薬理学的ＭＡＰＫ阻害剤による細胞の処理がｐ６５ＮＦ−κＢサブユニットのＩＬ−８プロモーターへの動員を低下させるという事実によって、このモデルは支持された（Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ｐ３８及びＥｒｋに対するＯｓｐＦの高度に選択的なＤＳＰ活性によって、このプロセスでのそれらの役割が直接評価することが可能となった。
【０１１７】
ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットに対する抗体を使用するＣｈＩＰアッセイを実施した。ＣＤ４４アンプリコンはＮＦ−κＢ結合部位を一切含有しないので、この遺伝子を陰性対照として使用した。図７Ｂ（右パネル）において示されるように、ｏｓｐＦの不活化は、シゲラによって誘導されるＩＬ−８プロモーターへのｐ６５の動員をかなり容易にしたのに対し、ＣＤ４４プロモーターではシグナルを検出することはできなかった。ｐ６５サブユニットが、ＲＮＡＰＩＩを動員することによって転写を活性化した（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）ので、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの総プールを免疫沈降させる抗体を使用して、ＣｈＩＰアッセイを実施した。予測されたように、本実験は、ＯｓｐＦの不存在下で、ＩＬ−８プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を増大させることを示した（図７Ｃ）。従って、ＯｓｐＦは、選択されたプロモーターにおいて主要な転写成分の動員を変化させた。
【実施例７】
【０１１８】
ＯｓｐＦホスファターゼは、ＩＬ−１２産生を阻害する
病原性プラスミドを有する浸潤株（ＩＮＶ＋）及び非浸潤性無プラスミド株（ＩＮＶ−）に感染した際に得られるプロファイルを比較することによって、シゲラ・フレックスネリに感染した際に誘導されるサイトカイン／ケモカインネットワークを分析した。シゲラ感染の際の特異的宿主免疫応答を分析するための唯一の妥当なモデルであるので、肺感染のネズミモデルを使用した。ＩＮＶ−による感染後に、Ｔｈ１型ネットワーク（ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１３及びＣＣＬ４）が誘導された。これに対して、ＩＮＶ＋に感染させると、Ｔｈ２／Ｔｒ１プロファイル（ＩＬ−１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２４及びＣＣＬ２）が誘導された。観察された差異は、感染に使用された細菌用量によるものではなく、病原性プラスミドの存在又は不存在に依存した。これらの結果は、浸潤性シゲラが、ＩＬ−１２／ＩＦＮ−γの産生を阻害することを示した。
【０１１９】
感染後の早期の時点で、ＩＬ−１２の主要源の１つである樹状細胞（ＤＣ）は、シゲラによって標的とされた。実際、ＩＮＶ＋感染したマウスから回収されたＤＣは、ＩＬ−１２を産生しなかったのに対し、ＩＮＶ感染したマウスから回収されたＤＣはＩＬ−１２を産生した（図８）。細菌の感染プロセスを確立するために、細菌は、一次感染の根絶のために必要である。従ってシゲラに対して有害であるＩＦＮ−γが除去された好ましい局所的な環境を作り出したという仮設が立てられた（Ｌｅ  Ｂａｒｉｌｌｅｃ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．）。他の感染性モデル（ＭｃＧｕｉｒｋ，２００２及びＳｉｎｇ，２００２）とは対照的に、これらのサイトカインの産生がＩＮＶ＋に感染したＩＬ−１０ＫＯマウスにおいてなおも阻害された（図９）ので、ＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて、このサイトカインは、ＩＬ−１２／ＩＦＮ−γ経路の阻害における中心的な役割を担わなかった。この結果は、１つ又はそれ以上の病原性因子がこの阻害に関与することを示唆した。
【０１２０】
これらの細菌エフェクターの幾つかは、ＩＩＩ型分泌装置によって、宿主細胞内へ注入される。免疫調節に関与する細菌エフェクターがＩＩＩ型分泌装置によって分泌されるエフェクターであることが、異なる細菌変異体の使用によって明らかとされた。最後に、ＩＩＩ型分泌される細菌エフェクターであるＯｓｐＦは、ＩＬ−１２産生の調節のために必要であった（図１０）。
【実施例８】
【０１２１】
保護的免疫応答の発達に対するＯｓｐＦホスファターゼの影響
養子免疫の誘導に及ぼすシゲラ感染に伴う免疫調節の影響を研究した。３つの群を分析した。第１群はＭ９０Ｔ株に感染させ、第２群はｏｓｐＦ株に感染させ、第３群は水に感染させた（対照群）。１匹あたり１０８個の細菌をマウスに予防接種し、３週間後、１匹あたり１０７個の細菌でマウスに追加免疫を行った。追加免疫の８週間後、マウスを細菌の致死量（１匹あたり５×１０８個の細菌）へ曝露し、生存をモニターした。図１１に示されるように、ＯｓｐＦ変異体が予防接種されたマウスは、ＩＮＶ＋が予防接種されたマウスよりも曝露に対してより効率的に保護された。
【実施例９】
【０１２２】
ＯｓｐＦは、インビボでの多形核白血球動員の抑制因子である
ＯｓｐＦは、免疫遺伝子のサブセットの発現に影響する。従って、感染のウサギ結紮回腸ループモデルを使用することによって、この制御のインビボでの関連性を研究した。ＷＴ株、ｏｓｐＦ変異体又は対照としてのトランス相補株（ｏｓｐＦ／ｐＵＣ−ＯｓｐＦ）に、ウサギ腸ループを８時間感染させた。ヘマトキシリン染色は、ＷＴ株と比較して、ｏｓｐＦ変異体がより重度の粘膜障害、絨毛の短縮及び拡大の増大、一般的には膿瘍に相当する上皮破壊のより拡大された領域を引き起こすことを示した。相補された変異体は、ＷＴ株の表現型と類似した表現型を回復させた。
【０１２３】
免疫標識実験のために、抗シゲラフレックスネリ５ａＬＰＳ抗血清で細菌を染色し（図１４ＡないしＤ）、多形核白血球（ＰＭＮ）を抗ＮＰ５抗血清で染色した（図１４ＥないしＧ）が、この抗菌性ペプチドはこれらの細胞において強く発現された。ＬＰＳ染色は、ＷＴ細菌が、膿瘍における上皮領域及び上皮直下領域へ実質的に局在したままであることを示した。これらの膿瘍は、上皮裏打ち構造を破壊し、多くの場合、絨毛構造中に形成される深い陥入の底部に局在した（図１４Ａ）。更に、遊走している炎症性細胞の制限された流出がしばしば見られたが、これらの潰瘍病変からの流れであった（図１４Ａの矢印参照）。ＮＰ５染色は、これらの感染領域中にＰＭＮが存在することを確認し、固有層、浮腫状粘膜下組織、及び管腔中にＰＭＮ浸潤の幾らかのレベルを示した（図１４Ｅ）。
【０１２４】
ｏｓｐＦ変異体によって感染された組織の抗ＬＰＳ染色は、ＷＴ感染に伴う表層の潰瘍をはるかに超える、固有層中への大規模な細菌の浸潤物を特徴とする感染の劇的に異なるパターンを示した（図１４Ｄの矢印参照）。並行して、炎症性細胞の大量の管腔流出物が観察され、それらの多くは細菌を伴っていた（図１４Ｄの矢印参照）。ＮＰ５染色は、固有層の広範なＰＭＮ浸潤及び腸管腔中への大量のＰＭＮの流出を確認した（図１４Ｆ）。両染色は、トランス相補された変異体が、野生型表現型を回復させたことを示した（図１４Ｂ、矢印及び１４Ｇ）。総じて、これらの実験は、ＯｓｐＦが、シゲラに感染した組織におけるＰＭＮ動員の主要な負の調節因子であることを示した。
【０１２５】
結論
グラム陰性動物及び植物病原体は、特殊化された分泌系を使用して宿主細胞中へのエフェクタータンパク質を転位させる。これらのエフェクターの幾つかは、チロシンホスファターゼであり、エルシニア・シュードチュバキュロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＹｏｐＨは、アクチン重合化を抑制し（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のＳｐｔＰは、アクチン骨格を破壊し（Ｆｕ及びＧａｌａｎ，１９９８）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＨｏｐＰｔｏＤ２は、植物中でのプログラムされた細胞死の抑制因子である（Ｅｓｐｉｎｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩｐｈＰタンパク質が、インビトロでホスホＳｅｒ残基及びホスホＴｙｒ残基の両者を加水分解する非病原性シアノバクテリアであるノストック・コミュン（Ｎｏｓｔｏｃ  ｃｏｍｍｕｎｅ）を形成することを除き（Ｐｏｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、一般的に、これらのエフェクターは、ホスホＴｙｒ残基に対して選択性の高い程度を示す（Ｋｅｎｎｅｌｌｙ，２００１）。ＩｐｈＰは、染色体によりコードされ、おそらく周辺質中に局在する。ＩｐｈＰは、哺乳動物ＤＳＰと構造上の類似性を共有するが、その機能はまだわかっていない（同文献）。これに対して、ＯｓｐＦは、シゲラの浸潤性表現型をコードする２２０ｋｂの病原性プラスミドによりコードされる。ＯｓｐＦは、標的真核細胞中へ転位し、本発明において、細菌病原性に関与する第一ＤＳＰとして特徴付けられる。
【０１２６】
興味深いことに、ＯｓｐＦは、全ての他のＤＳＰ中に存在する標準触媒活性配列Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ａｒｇ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含有せず、このタンパク質が真核生物起源ではないという議論がなされる。しかしながら、他のプロテオバクテリア由来の病原性タンパク質候補とのＯｓｐＦの著しい配列相同性（図１３）は、これらの細菌に対する選択的利点として獲得及び維持された共通の祖先の存在を示唆する。今日まで、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の４つのクラスが、それらの触媒作用ドメインのアミノ酸配列に基づいて同定されている（総説に関しては、Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４参照）。これらの群のうちの３つは、システインベースのＰＴＰであり、ＹｏｐＨ、ＳｐｔＰ、ＨｏｐＰｔｏＤ２及びＤＳＰ等のチロシン特異的な従来のＰＴＰを含む。本発明者は、全てのシステイン残基を変異させたが、触媒活性に対して何ら効果が見出されなかったので、ＯｓｐＦは、これらのクラスの一員ではない。
【０１２７】
第４のクラスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤホスファターゼ及びＥｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔファミリー由来の転写調節因子などのアスパラギン酸塩ベースのＰＴＰを規定する（総説に関しては、Ｒｅｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５参照）。これらのＰＴＰは、保存されたＤｘＤＧ（Ｔ／Ｖ）触媒作用モチーフを共有し、著しくマグネシウム依存性であり、塩化ベリリウムによって阻害される（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＫａｍｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＯｓｐＦ活性も塩化ベリリウムによって阻害され、触媒作用性のアスパラギン酸塩残基の存在を示唆した。更に、ＯｓｐＦは、ＤｘＤＧ（Ｔ／Ｖ）モチーフに類似する配列を含有する。しかしながら、触媒活性は、この配列に割り当てられることができなかった。総合すると、これらの観察は、ＯｓｐＦが古典的なアスパラギン酸塩ベースのＰＴＰではなく、チロシンホスファターゼの新たなクラスを定義し得ることを示唆する。
【０１２８】
ＯｓｐＦは、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰキナーゼの不活化に対して極めて選択的であり、転写分析は、ＩＥ遺伝子及びＩＬ−８のような幾つかのＮＦ−κＢ応答性遺伝子を包含する、少数であるが必須の遺伝子セットの発現を、ＯｓｐＦが抑圧することを示す。これは、野生型シゲラと比較して、ｏｓｐＦ変異体は、ＰＭＮによる圧倒的な粘膜浸潤及び腸管腔中へのその後大規模な経上皮遊走を生じることを示すインビボ実験によって反映される。十分な証拠は、ＩＬ−８が、実験的なシゲラ感染の経過においてＰＭＮ粘膜輸送の主要なエフェクターであり（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、シゲラにより感染したマウスにおける腸管炎症の欠如は、概ね、ネズミの系列における、このケモカインの不存在によるものである（Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，２００４）ことを示す。ＯｓｐＦ等の注射されたエフェクターは、極めて焦点が絞られているが、必須の生理的機能に専ら寄与し、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ等の注射された各エフェクター（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、及び最終的には、他のエフェクターの加算的効果が、宿主の転写の生得的反応の非常に特異的な微調整をもたらす可能性が最も高い。
【０１２９】
ＯｓｐＦ不活化の際に刺激されるプロモーターの制限された範囲は、この細菌エフェクターが、ＭＡＰＫ経路によって活性化される可能性を秘めた全ての遺伝子を調節しないことを示唆した。多くの場合、誘導可能なプロモーターが、炎症誘発性刺激によって活性化された更なるシグナル伝達経路に対して応答することができるので、このことは予想されなかった。しかしながら、ＯｓｐＦの特異性は、この細菌ホスファターゼが、標的遺伝子の選択的なセット、より具体的にはＮＦ−κＢ応答性遺伝子のサブセットの抑圧をどのように確保できるかという問題を提起する。ＮＦ−κＢが、ＩＬ−８のような幾つものＮＦ−κＢ応答性遺伝子へ結合することをどのように回避するかを説明するために、最近、ＮＦ−κＢの動員に対して非許容的な特異的なクロマチン立体構造の存在が取り上げられた（総説に関しては、Ｎａｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５参照）。これらの遺伝子の場合、Ｓｅｒ１０でのＨ３リン酸化等のＭＡＰＫ依存的ヒストン修飾は、プロモーター部位でのクロマチンの圧縮解除を促進し、これによりＮＦ−κＢを首尾よく動員することができた（Ｍｕｅｇｇｅ，２００２、Ｓａｃｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本発明者らは、ヒストンＨ３のリン酸化状態に対するＯｓｐＦの機能的効果を研究し、ＯｓｐＦがＳｅｒ１０でのヒストンＨ３リン酸化を妨げることを発見した。この効果は、無作為に分布されておらず、むしろ遺伝子特異的である。調節のこのようなレベルは、選択された標的プロモーターにおける細菌エフェクターの直接的な空間的局在化によってより簡単に達成することができた。クロマチン免疫沈降は、ＴＮＦ−αのような炎症誘発刺激による細胞刺激が、選択されたプロモーターにおけるこのエフェクターの直接的な局在化を誘導することを示した。
【０１３０】
プロモーター部位でのＯｓｐＦの存在は、ＭＡＰＫｐ３８が標的プロモーターへと直接動員され、そこで転写に影響する部位特異的修飾に至るシグナル伝達経路を開始することを示す、酵母及びヒトでの初期の研究と一致する（Ａｌｅｐｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｓｉｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｅｄｍｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍａｈｅｄｅｖａ，２００４）。ＯｓｐＧの遺伝子動員は、関連性するプロモーター部位での核内でのＭＡＰＫ脱リン酸化を誘導し得、局在化されたＨ３リン酸化をもたらすタンパク質キナーゼカスケードを不活化する。幾つものプロモーターを調べることによって、不適切なＨ３Ｓｅｒ１０リン酸化がＯｓｐＦによって制御される遺伝子でのみ観察されることが明らかとなった。総合すると、これらの見解は、ＯｓｐＦによって媒介される選択的転写調節のための１つの重要な機序が、プロモーターレベルでのＭＡＰＫ誘導性Ｈ３Ｓｅｒ１０リン酸化の部位特異的減少制御であることを示唆する。明らかに、ＯｓｐＦが、プロモーター結合型転写因子等の他の局所標的も有し得る可能性がある。この点に関して、触媒的に不活性なＯｓｐＦ変異体は、ＷＴＯｓｐＦよりもＩＬ−８プロモーターとより安定して（少なくとも２時間）結合し、ＯｓｐＦがそれ自体の核アンカーを標的にし得、プロモーター部位でのそれ自体の繋留の脱安定化をもたらすことを示唆した。
【０１３１】
自然免疫反応、特に感染の初期段階で病原体による粘膜表面での炎症の調節は、感染の過程及び実質的に誘導される養子免疫の性質の両者を確立するための決定的な必要条件である。本明細書の結果は、腸の固有層及び上皮裏打ち構造を通じて、遺伝子、特に、ＰＭＮ等の炎症細胞の流れを調節するＩＬ−８の特異的プールを制御するために必要とされる正確な後成的修飾をＯｓｐＦが誘導することを示す。ＯｓｐＦは、抗菌性ペプチド（Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）として及び免疫細胞の化学誘引物質（Ｄｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）として機能するＣＣＬ−２０等の他の重要な遺伝子も減少制御する。このようにする際に、ＯｓｐＦは、侵入しているシゲラの生存を改良し得、感染部位への樹状細胞の動員を遮断することによって養子免疫反応を低下させ得る。しかしながら、上述の仮説は、ＯｓｐＦ変異体が、上皮下組織（すなわち固有層）を通じて、ＷＴシゲラよりも広範囲に散在することを示した逆説的な見解を説明するものではない。本観察に鑑みれば、インビトロモデル及びインビボモデルによって示されるように（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ、Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ）、腸粘膜中でのシゲラ感染の過程において、腸管腔へと遊走するＰＭＮの流れが、上皮性関門を破裂させ、上皮下組織への細菌の接近を容易にするのを説明する。ＯｓｐＦ変異体の場合には、ＷＴ株と比較して、過剰な遊走が粘膜の浸潤を増大するはずであることは明確である。
【０１３２】
宿主免疫反応を制御する必要において、シゲラは、特異的な攻撃を選択しており、外科的な精確さで宿主の免疫系を攻撃する。このようなアプローチは、免疫遺伝子の必須のセットの不活化のために必要とされる遺伝子特異的な後成的修飾を通じて転写反応を再プログラミングするＯｓｐＦなどの非常に洗練された戦略を想定している。この適応は、微生物病原体とその宿主との相互作用の洗練された性質の例である。
【０１３３】
参照文献
以下の刊行物のそれぞれの全体の開示に依存し、これら全体の開示を参照によりここに取り込む。
【０１３４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】シゲラが核内のＥｒｋを不活化することを示している。
【図１−２】シゲラが核内のＥｒｋを不活化することを示している。
【図２】ＯｓｐＦホスファターゼが、Ｅｒｋを直接脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであることを示している。
【図２−２】ＯｓｐＦホスファターゼが、Ｅｒｋを直接脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであることを示している。
【図２−３】ＯｓｐＦホスファターゼが、Ｅｒｋを直接脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであることを示している。
【図３】ＯｓｐＦホスファターゼが、インビボで、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰＫを選択的に不活化することを示している。
【図３−２】ＯｓｐＦホスファターゼが、インビボで、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰＫを選択的に不活化することを示している。
【図３−３】ＯｓｐＦホスファターゼが、インビボで、Ｅｒｋ及びｐ３８ＭＡＰＫを選択的に不活化することを示している。
【図４】遺伝子アレイ分析における、ＯｓｐＦで調節された遺伝子の階層的クラスタリングを示している。
【図５】ＯｓｐＦが、免疫応答に関与する極めて重要な遺伝子の発現を妨害する転写抑制因子であることを示している。
【図５−２】ＯｓｐＦが、免疫応答に関与する極めて重要な遺伝子の発現を妨害する転写抑制因子であることを示している。
【図６】ＯｓｐＦが、ＭＰＡＫ依存性様式で、ヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化を標的とすることを示している。
【図６−２】ＯｓｐＦが、ＭＰＡＫ依存性様式で、ヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化を標的とすることを示している。
【図６−３】ＯｓｐＦが、ＭＰＡＫ依存性様式で、ヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化を標的とすることを示している。
【図７】ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターにおいて、ヒストンＨ３のリン酸化及びＮＦ−κＢの動員を選択的に妨害することを示している。
【図７−２】ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターにおいて、ヒストンＨ３のリン酸化及びＮＦ−κＢの動員を選択的に妨害することを示している。
【図７−３】ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターにおいて、ヒストンＨ３のリン酸化及びＮＦ−κＢの動員を選択的に妨害することを示している。
【図７−４】ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターにおいて、ヒストンＨ３のリン酸化及びＮＦ−κＢの動員を選択的に妨害することを示している。
【図７−５】ＯｓｐＦが、ＩＬ−８プロモーターにおいて、ヒストンＨ３のリン酸化及びＮＦ−κＢの動員を選択的に妨害することを示している。
【図８】感染から２４時間後に、２つの株に感染した肺からの細胞ソーティングによって回収されたマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）によって、サイトカインが産生されることを示している。３７℃で２４時間、これらの細胞をエキソビボで培養し、その後、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０及びＩＬ−１２産生を測定した。細胞ソーティングの効率は、ＦＡＣＳによって測定した。
【図９】ＷＴ及びＩＬ−１０ノックアウトマウスが、ＢＳ１７６又はＭ９０Ｔ株の何れかに感染したことを示している。感染後の異なる時点で、肺を採取した。細菌の負荷量は、プレーティングアッセイを用いて測定したのに対して、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの産生はＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１０】感染から２４時間の時点で、Ｍ９０Ｔ又はｏｓｐＦ株に感染した肺からのサイトカインの産生が、肺の採取及び均質化後にＥＬＩＳＡによって測定されたことを示している。
【図１１】保護アッセイの結果を示している。
【図１２】ＯｓｐＦがヒストンＨ３の特定の座を標的とし、炎症促進性シグナル伝達経路によって誘発される遺伝子活性化の程度を調節することを示すモデルである。
【図１３】他の病原性タンパク質候補とのＯｓｐＦホスファターゼ相同性を示している。
【図１４】ＯｓｐＦが多形核白血球動員を抑制し、腸上皮の細菌侵入を制限することを示している。
【図１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−２】
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【図６】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月16日(2008.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における癌を治療又は予防するための医薬の製造のための、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質の使用。
【請求項２】
癌が大腸癌及び膵臓癌から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む、抗癌治療における使用のための医薬組成物。
【請求項５】
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記細胞において、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を変化させる化合物を決定すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選択すること；
を含む、細胞におけるＯｓｐＦ活性を調節する化合物を選別する方法。
【請求項６】
タンパク質制御活性が、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、ＨｅＬａ細胞、Ｃａｃｏ２細胞又は免疫系の細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（Ａ）培養された細胞に化合物を添加すること；
（Ｂ）細胞を温置すること；
（Ｃ）前記細胞中で、１つ又はそれ以上のＯｓｐＦタンパク質制御活性を検出すること；
（Ｄ）前記化合物のタンパク質制御活性を、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性と比較すること；及び
（Ｅ）ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を同定すること；
を含む、ＯｓｐＦ活性を模倣する化合物を選別する方法。
【請求項９】
タンパク質制御活性が、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、ＨｅＬａ細胞、Ｃａｃｏ２細胞又は免疫系の細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物中における炎症性疾患を治療又は予防するための医薬を製造するための、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質の使用。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
哺乳動物中における移植に関連する疾患を治療又は予防するための医薬の製造のための、ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質の使用。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＯｓｐＦ又はＯｓｐＦ活性を模倣する物質を含む医薬組成物。
【請求項１６】
組成物がアジュバントである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組成物がＯｓｐＦ活性を増加させる化合物をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
免疫応答を制御することが必要な対象における免疫応答の制御における、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ｏｓｐＦ遺伝子が不活化されている、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の株。
【請求項２０】
株が、受託番号ＣＮＣＭＩ−３４８０で、ＣＮＣＭに寄託されている、請求項１９に記載の株。
【請求項２１】
受託番号ＣＮＣＭＩ−３４９６で、ＣＮＣＭに寄託されている、ｍｙｃ標識とともにＯｓｐＦを発現するプラスミド。
【請求項２２】
請求項１９に記載の株及び医薬として許容される担体を含むワクチン。
【請求項２３】
シゲラ感染によって引き起こされる赤痢の治療又は予防のためのワクチンとしての使用のための、請求項１９又は２０に記載の株。
【請求項２４】
シゲラ感染によって引き起こされる赤痢の治療又は予防のためのワクチンの製造のための、請求項１９又は２０に記載の株の使用。
【請求項２５】
シゲラ感染を治療又は予防するための医薬の製造のための、ＯｓｐＦ活性を減少させる必要がある患者への、ＯｓｐＦ活性を減少させる化合物の使用。
【請求項２６】
タンパク質制御活性が、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、ＲＰＡｐ３２（ＳＴＡＴ活性化因子）、ＢＣＬ２に関連する抗アポトーシスタンパク質及び主要な炎症促進性遺伝子（ＣＣＬ２０、ＩＬ−８及びＩＬ−１２のような）のタンパク質の発現及び／又は活性の制御から選択される、ＯｓｐＦのタンパク質制御活性を模倣する物質。
【請求項２７】
物質がタンパク質である、請求項２６に記載の物質。
【請求項２８】
物質が化学物質である、請求項２６に記載の物質。
【請求項２９】
医薬組成物がＯｓｐＦ活性を増加させる化合物をさらに含む、請求項１１、１３又は１８に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月4日(2008.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009509938000001.app
【国際調査報告】
2009509938.tif 000038
2009509938.tif 000039