(57)【要約】  本発明は、単離されたマイコバクテリア属に属する微生物であって、ＰｈｏＰ−表現型を付与する遺伝子Ｒｖ０７５７の不活性化と、ＤＩＭ（ＤＩＭ−表現型）の産生を阻止する第二遺伝子の不活性化とを含むことを特徴とする微生物に関する。さらに、本発明は、結核に対し免疫を与えるまたは結核を予防するワクチンを製造するための該微生物の使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された、マイコバクテリア属に属する微生物であって、
ａ）ｐｈｏＰ遺伝子と、
ｂ）ＤＩＭ産生を阻止する第二遺伝子と
の不活性化または除去を含むことを特徴とする微生物。
【請求項２】
前記ｐｈｏＰ遺伝子が、Ｒｖ０７５７遺伝子の不活性化または除去によって不活性化されている、請求項１に記載の単離された微生物。
【請求項３】
ＤＩＭ産生が、Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子の除去または不活性化によって不活性化されている、請求項１または２のいずれかに記載の単離された微生物。
【請求項４】
前記微生物が、前記Ｒｖ２９３０遺伝子および前記Ｒｖ０７５７遺伝子の除去または不活性化を含むことを特徴とする、請求項３に記載の単離された微生物。
【請求項５】
マイコバクテリア属の種が、ヒト結核菌複合体に属する、先の請求項のいずれかに記載の単離された微生物。
【請求項６】
ａ）前記ｐｈｏＰ遺伝子の不活性化または除去と、
ｂ）ＤＩＭ産生を阻止する第二遺伝子の不活性化または除去と、
を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された微生物を構築する方法。
【請求項７】
前記ｐｈｏＰ遺伝子が、前記Ｒｖ０７５７遺伝子の不活性化によって不活性化されている、先の請求項に記載の方法。
【請求項８】
ＤＩＭ産生が、前記Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子の除去または不活性化によって不活性化されている、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
結核によって引き起こされる症状に対して免疫を与えるまたは該症状を予防するワクチンであって、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された微生物を含むワクチン。
【請求項１０】
薬理学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、先の請求項に記載のワクチン。
【請求項１１】
結核によって引き起こされる症状に対して免疫を与えるまたは該症状を予防する請求項９〜１０のいずれかに記載のワクチンを調製する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の単離された微生物を、治療に効果的な用量をヒトまたは動物に投与するために適切な媒体に導入することと、
ｂ）ワクチンの製造に薬理学的に適切な賦形剤を選択的に加えることと、
を少なくとも含む方法。
【請求項１２】
医薬品としての使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された微生物。
【請求項１３】
ワクチンとしての使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された微生物。
【請求項１４】
膀胱癌治療において使用するための、請求項１２に記載の医薬品。
【請求項１５】
結核治療または予防において使用するための、請求項１２に記載の医薬品。
【請求項１６】
ベクターまたはアジュバントとしての使用のための、請求項１２に記載の医薬品。
【請求項１７】
ヒトまたは動物における結核を予防するまたはそれに対して免疫を与えるための請求項９または１０のいずれかに記載のワクチンを調整するための、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離されたマイコバクテリア属に属する微生物であって、ＰｈｏＰ−表現型を付与するＲｖ０７５７遺伝子の不活性化と、ＤＩＭ産生（ＤＩＭ−表現型）を阻止する第二遺伝子の不活性化とを含むことを特徴とする微生物に関する。さらに、本発明は、結核の免疫付与または予防のためのワクチンの調製のための前記微生物の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの結核を阻止するためにワクチンを使用することは、大きな挑戦であることが、このほぼ一世紀の間で証明されてきた。ウシ結核菌から誘導されるＢＣＧは、現在、使用されている唯一の結核ワクチンであり、世界中で最も広く使用されているワクチンである。１９２０年代から始まったＢＣＧワクチンの開発および全身投与は、大きな前進を見せ、世界から結核を撲滅する可能性があるように見えた。しかし、これらの最初の期待は達成されず、数多くの有効性試験の結果から、現在の形態でのＢＣＧワクチンでは、該疾患、特に該疾患が風土病である［４］第三世界の地域の成人における呼吸形態における制御においては、有用性に限界があることが明らかである。ヒト結核菌の毒性および感染防御免疫を発生させる免疫応答モデルのより多くの知識があれば、ＢＣＧより良好なワクチンを開発することが可能である。ホストにＢＣＧワクチンを接種した場合、より高い予防レベルを達成できるという観察は、生存能力および持続性が、結核ワクチンの成功に必要な基本的な性質であることを示唆する。本発明において我々は、原型単回投与生ワクチンとして、不活性化したＲｖ０７５７（ｐｈｏＰ）遺伝子を有するヒト結核菌株と、ＤＩＭ合成を阻止するｐｈｏＰの第二非依存性突然変異体とを使用し、免疫無防備状態のＳＣＩＤマウスにおいてＢＣＧより弱毒化されているとともに、マウスにおいてＢＣＧにより付与される予防レベルに匹敵し、モルモットにおいてはＢＣＧより高い予防を付与することを示す。
【０００３】
ｐｈｏＲを伴うｐｈｏＰ遺伝子は、細胞内病原体の主要な病原遺伝子の転写を制御する他の２成分系に対し高度な類似性を示す２成分系の一部を形成する。また、これは、病原性には直接関与しない他の多くの遺伝子の発現も制御する［１９］。病原性遺伝子の削減、それ自体が、ヒト結核菌を弱毒化する唯一の方法ではないようである。パントテン酸のデノボ合成が不可能なヒト結核菌のパントテン酸塩栄養要求性突然変異体は、疾患を起こすことなく、ＳＣＩＤマウス中に存続することが示された［１７］。個々のロイシン栄養要求株も、ＳＣＩＤマウスでは、生体内で強く弱毒化され、複製が不可能である［２８］。したがって、ヒト結核菌に基づくワクチン株は、ウシ結核菌ＢＣＧ中で抑制されている遺伝子を保持しながら、うまく弱毒化できるという原理は、現在では一般的に受け入れられている。
【０００４】
従来、ＢＣＧより効果的なワクチンの研究は、ＢＣＧによる病原性の喪失が、本質的に、完全な予防効果の欠如に関与する要因であるという考えに基づいていた［３２］。したがって、より小さな病原性を有するヒト結核菌の新しい弱体化突然変異が、ワクチンとしてより効果的ではないかと論じられていた。しかし、最近の研究では、ヒト結核菌による自然感染とＢＣＧのワクチン接種とでは、結核に対する感染防御免疫を作り出す能力において違いがないことが示されている［３４］。これは、ヒト結核菌の合理的な弱毒化によりＢＣＧを改良することができるかどうかということに関し、問題を提起する。このような状況下、１．−ＰｈｏＰタンパク質の合成における、および２．−ＤＩＭ合成における２つの非依存性突然変異の組合せを有する本発明の突然変異ヒト結核菌株は、たとえＢＣＧの用量より１０倍高い濃度で投与しても、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、ＢＣＧより弱毒化され、かつモルモットモデルにおいて、ＢＣＧより予防の程度が高いという観察は、特に予期しえぬ重大なことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第一の態様は、単離されたマイコバクテリア属に属する微生物であって、Ｒｖ０７５７（ｐｈｏＰ）遺伝子の不活性化と、ＤＩＭ（フィチオセロールジマイコセロセート）産生を阻止する第二遺伝子の不活性化とを含むことを特徴とする微生物に関する。以下、この単離された微生物を、本発明の微生物と言う。
【０００６】
本発明の第二の態様は、単離されたマイコバクテリア属に属する微生物であって、Ｒｖ０７５７（ｐｈｏＰ）遺伝子と、ＤＩＭ産生を阻止するｐｈｏＰの第二非依存性突然変異体とを不活性化することを含むことを特徴とする微生物に関する。本発明の好ましい態様では、前記第二の突然変異体は、ＤＩＭ合成に必須であるｆａｄＤ２６遺伝子の削減からなるＲｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子中にある。
【０００７】
本発明の第三の態様は、動物の結核を予防する、さらにより好ましくはヒトの結核を予防するワクチンを調製するために、本発明の単離された微生物を使用すること、ならびに結核ワクチンが膀胱癌のようなヒトの疾患の治療において現在有している他の用途に使用することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の内容において、以下、「ヒト結核菌ＳＯ２株」は、単離されたヒト結核菌株の微生物であって、Ｐｅｌｉｃｉｃらが記載する方法（１９９７）（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４：１０９５５−１０９６０）による相同組換えを使用して、ヒト結核菌のＲｖ０７５７遺伝子のＢｃｌｌ部位に、カナマイシン耐性マーカーの導入により、ヒト結核菌ＭＴ１０３臨床株から構築されたＲｖ０７５７遺伝子によって不活性化された微生物を言うために使用し、これはさらにＤＩＭ（フィチオセロールジマイコセロセート）産生を阻止する第二遺伝子の不活性化も含む。したがって、本発明の該菌株は、ヒト結核菌から誘導された弱毒化生ワクチン中に２つの非依存性突然変異が存在し、個々のｐｈｏＰ突然変異は、前記遺伝子の不活性化より誘導されたワクチンの特性に影響を及ぼさない。実施例９には、ヒト結核菌ＳＯ２株に関して記載したのと同じ表現型を付与する個々の二重突然変異体を持つ、単離されたマイコバクテリア属の微生物をどのように構築するかが記載されている。
【０００９】
以下、本発明の内容において、ワクチンは、投与により阻止すべき疾患に対する予防を作り出す薬物を言うために使用する。
【００１０】
以下、本発明の内容において、ＢＣＧは、１９２１年以来結核に対して使用されている現在のワクチンを言うために使用する。これは、研究室で継代培養された後、その病原性を喪失したウシ結核菌株から誘導される弱毒化生ワクチンであり、百を超える欠損遺伝子を有することが現在わかっているものである（５）。
【００１１】
以下、本発明の内容において、Ｈ３７Ｒｖは、配列が決定されている病原性ヒト結核菌株を言うために使用し、Ｃｏｌｅらにより、これらの遺伝子はＲｖと称されている（Ｃｏｌｅら、１９９８  Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ３９３：５３７−５４４参照）。
【００１２】
以下、本発明の内容において、ＭＴ１０３は、ヒト結核菌臨床分離株を言うために使用する（参考文献１５Ｃａｍａｃｈｏら）。
【００１３】
以下、本発明の内容において、ＤＩＭ−菌株は、ヒト結核菌の病原性に関連する重要な脂質である、フィチオセロールジマイコセロセートを合成することができないヒト結核菌複合体の菌株を言うために使用する。図１１では、１Ａ２９菌株が使用され、これは、参考文献１５（Ｃａｍａｃｈｏら、１９９９  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３４：２５７−２６７）に記載のトランスポゾン１０９６によって不活性化されたＲｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子を有するＭＴ１０３菌株で構成される。
【００１４】
以下、本発明の内容において、ＳＯ２＋ｐＳＯ５は、Ｒｖ０７５７における突然変異が、マイコバクテリアｐｈｏＰ遺伝子を有する複製プラスミドの形質変換により、Ｒｖ０７５７遺伝子によって補完されるが、ＤＩＭ合成を補完することはできないヒト結核菌ＳＯ２株を言うために使用され、その表現型はｐｈｏＰ＋ＤＩＭ−である。
【００１５】
以下、本発明の内容において、ヒト結核菌ｐｈｏＰ−は、ＥｃｏＲＶ−ＢｓｐＥｌ部位の間での削除により、Ｒｖ０７５７遺伝子によって不活性化されているヒト結核菌株を言うために使用され、その表現型は、ｐｈｏＰ−ＤＩＭ＋である。
【００１６】
以下、本発明の内容において、Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）は、フィチオセロールジマイコセロセートの合成（参考文献１５、Ｃａｍａｃｈｏら、１９９９年）の原因であるオペロンの初期に存在する遺伝子を言うために使用し、ヒト結核菌中のこの遺伝子の削減により安定なＤＩＭ−表現型が付与される。
【００１７】
本発明の一態様は、単離されたマイコバクテリア属に属する微生物であって、ＰｈｏＰ−表現型を付与するＲｖ０７５７遺伝子の不活性化と、ＤＩＭ産生（ＤＩＭ−表現型）を阻止する第二遺伝子の不活性化とを含むことを特徴とする微生物に関する。さらに、本発明は、結核を予防するためのワクチンの調製における該微生物の使用、およびワクチン自体をも含む。
【００１８】
本発明を通して、いかにして、単離されたマイコバクテリア属のｐｈｏＰ−ＤＩＭ−菌株を、それらが獲得する弱毒化のレベルおよびそれらが付与する予防のレベルに基づき、ワクチンとしての使用に特に適切にされた特徴を有するようにするかを示す。
【００１９】
弱毒化を確認するために、免疫機能が低下したＳＣＩＤマウスに、ＳＯ２（ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−）菌株を噴霧によって接種した。該マウスは、野生型菌株を感染させたマウスより有意に長く生存する（図２ａ）。さらに、この弱毒化を、ＳＯ２＋ｐＳＯ５（ｐｈｏＰ＋ＤＩＭ−）菌株においてｐｈｏＰで補完する（図８ａ）。
【００２０】
さらに、弱毒化試験を、静脈注射による免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃマウスで行う場合（図７）、野生型ＭＴ１０３菌株に対して、ＳＯ２の明らかな弱毒化があるが、驚くべきことに、ＳＯ２＋ＰＳＯ５（ｐｈｏＰ＋ＤＩＭ−）菌株は、免疫適格マウスに関し、野生型菌株と同じように毒性であるため、この弱毒化は、ｐｈｏＰで補完されない。ＳＯ２（ＤＩＭ−、ｐｈｏＰ−）菌株をＤＩＭ−菌株のみと比較したＢａｌｂ／Ｃマウスでの生存試験は、ＳＯ２に関して驚くほど高い生存率を示す（図１１）。
【００２１】
静脈内投与感染されたＳＣＩＤマウスにおけるＳＯ２およびＢＣＧの比較生存試験は、ＳＯ２菌株の弱毒化のレベルが、ＢＣＧ、すなわちヒトの結核に対して現在使用されているワクチンのレベルより高いことを示す（図２ｂ）。ＢＣＧワクチンのバッチ用の品質制御で使用されるワクチン５０倍の用量を用いたモルモットの毒性試験は、６ヶ月の試験の間、モルモットの体重は増加し、結核と共存する肉眼的または顕微鏡的に見える組織学的病変が存在しないことを示し、これにより、ＳＯ２の弱毒化および非毒性が確認される（図１２）。この驚くべき弱毒化および毒性の欠如は、ＰｈｏＰ−ＤＩＭ−表現型に起因し、またこれらの突然変異体は、抗結核薬に対する感応性を残し、従来の治療を可能にする。
【００２２】
本明細書では、Ｂａｌｂ／ｃマウスで行われるワクチン接種実験において、本発明のヒト結核菌ＳＯ２株およびＢＣＧにより付与された予防のレベルが、感染から４週間後まで、肺および脾臓の両方において類似していることを示す。ワクチン接種されたマウスの脾臓からのＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の相対比率を比較すると、本発明のＳＯ２菌株のワクチンを接種されたマウスは、ＢＣＧワクチンを接種されたマウスに比べ、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の両方で比率が高いことがわかった。さらに、これらの細胞を培養ろ液から誘導した抗原で刺激すると、ワクチン接種から４５日および６０日後に、本発明のＳＯ２菌株のワクチンを接種したマウスで、ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋の有意により高い比率が測定された。各時点では有意ではないが、類似の傾向がＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋について、本発明のＳＯ２菌株のワクチンを接種されたマウスで測定された。ＩＦＮ−γ合成によって測定されたデータは、本発明のＳＯ２菌株のワクチン接種が、ＢＣＧワクチン接種に比べて、より良好にＴ細胞を活性化する結果となることを示唆する。ヒト結核菌に対する防御免疫は、一般的に、抗原の特異的Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの分泌を特徴とするＴＨ１−型細胞性免疫応答の発生に依存すると仮定すると、本発明のＳＯ２菌株により誘発された比較的高いレベルのＴ細胞活性は、強い保護的応答を付与する能力に寄与すると結論付けることができる。
【００２３】
さらに、ＳＯ２と比較したＢＣＧの予防における差を試験するために、異なるシステム、試験モデルおよび種々の条件を使用して、マウスモデルの相対的能力の提示を行った。２種類のワクチン、ＳＯ２（ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−）およびＢＣＧが、マウスのモデルに予防を付与することが示された。
【００２４】
モルモットを使用して、より重大で、徐々により厳しくなる臨床試験でワクチンを比較する方法を用いた。このワクチンを比較する体系的なアプローチは、さらにトライアルを行うべき、一番の候補ワクチンを識別するために、有用な出発点を示すことができた。モルモットは、結核による感染に対し、より感受性があり、したがって、この疾患に関してより重要なモデルとなり得ることは、一般的に認められている［３０］。マウスと比べたモルモットの長所は、疾患の病理が、ヒトの結核で観察される病理と類似し、したがって、ワクチンの効能を試験するために適正なモデルであることである。ヒト結核菌の二重パントテン酸塩およびロイシン栄養要求株突然変異体を用いた最近の噴霧ワクチン試験において、ヒト結核菌の噴霧投与の５週間後、ウシ結核菌ＢＣＧに等しい予防レベルが、ワクチン接種されたモルモットの肺および脾臓で得られるとともに、両ワクチンにより誘発された脾臓への感染の拡大が制限されていた［３４］。ＥＳＡＴ−６を発現した組換えＢＣＧを使用した他の試験では、ウシ結核菌ＢＣＧより高い予防レベルが、脾臓でのみ観察され［６］、これは、予防の改善は、肺からの拡大による感染を阻止する能力に限定されることを示唆する。
【００２５】
この感染を起こすために、モルモットに、低用量のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖを接種した。本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧのワクチン接種によって付与された予防レベルは、感染から４週間後まで、肺および脾臓において類似していた。両ワクチンとも、非常に効果的な予防を付与し、肺および脾臓において、生理食塩水を投与された対照群に比べ、約２ｌｏｇ、ＣＦＵを減少させた。しかし、該２つのワクチン群の間に統計学的は有意差はなかった。感染後このような短期間では、ＢＣＧより新しいワクチンがより大きな効能があることを証明するのは困難であることが推定できる。これは、今のところ、ＢＣＧのワクチンを接種された動物の器官のＣＦＵ（コロニー形成単位）は非常に低いため、試験には、ＣＦＵの有意な更なる減少を示すための差別化能力はないという事実による。モルモットを用いる他の生存試験では、ＢＣＧワクチン接種は、ワクチン接種されていない対照（あるいは無効ワクチンを接種された）と比べて、統計的に有意な予防を示しているが、この予防は、低用量のヒト結核菌を使用した攻撃感染に対する部分的なものにすぎない。感染から６０〜８０週間後の間に実施された低用量の投与に関する試験では、ＢＣＧを用いた対照の中には、どのモルモットも保護しなかったものもあり［３５］、また他には、低い割合（２０％と３０％との間）で動物を保護したものもあった［３６］［３７］。一方、高用量の投与は、ＴＢワクチンの予防効果を評価するために通常使用される疾患より重い疾患を引き起こすかもしれない。
【００２６】
本発明では、比較的高用量のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの噴霧感染を用い、試験期間を１８０日間に延長した。我々は、本発明のＳＯ２菌株の潜在的な予防効果を示すことができる、より厳しいレベルの攻撃感染を生み出すと同時に、ＢＣＧに関して差別化のレベルを上げるために、これを実施した。生存の点から見ると、ＢＣＧワクチンを接種された群の動物は、ワクチン接種されていない対照と比べ有意に保護され、我々の試験で使用された比較的高用量の感染であるにもかかわらず、それらは、他の試験で観察された全体予防レベルと類似のレベルを示した。さらに我々は、本発明のＳＯ２（ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−）菌株の予防効果は、生存期間の延長および肺病変の硬化の程度を始めとする数種の標識によって測定し、ＢＣＧと比べて統計的に有意な増加があることも発見した。疾患のこのそれほど重症でない形態が、本発明のＳＯ２菌株をワクチン接種された動物のより高い生存率に直接関与している可能性がある。
【００２７】
本発明において記載する結果は、ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−表現型を有するＳＯ２菌株、したがってマイコバクテリア属に属する微生物（特に、ヒト結核菌複合体からの）が、数多くの判定基準に従って、ＢＣＧより効果的なワクチンであることを示す。それは、ＳＣＩＤマウスにおいて、ＢＣＧより弱毒化されており、少なくともＢＣＧと同程度に良好な防御免疫を持つマウスを提供し、より強い細胞性免疫応答を生み出す。さらに、Ｈ３７Ｒｖの高用量感染に対するモルモットで実施された予防実験において、表現型ＤＩＭ−ｐｈｏＰ−を有する菌株は、ＢＣＧでは３３％の生存率しか達成されなかった状況下で、モルモットの１００％の生存率をもたらす。この予防は、疾患の重篤度および細菌量の減少に結び付けられる。
【００２８】
ＳＯ２（ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−）の予防レベルがｐｈｏＰ突然変異によるものか、あるいはＤＩＭにおける更なる突然変異によるものかを調べるために、別のワクチン接種実験を、高用量の感染を受けたモルモットで実施した。６匹の動物群に、ＢＣＧ、ＳＯ２（ＰｈｏＰ−ＤＩＭ−）およびヒト結核菌ｐｈｏＰ−ＤＩＭ＋のワクチンを接種し、対照として使用した６匹の動物にはワクチンを接種しなかった。実験は４００日間続けた。
【００２９】
この他の実験で、ワクチン接種されなかったモルモットは、７０日目の前に死亡した。感染から３００日後、ＢＣＧおよびｐｈｏＰ−Ｄ１Ｍ＋のワクチンを接種された３匹のモルモットが死亡したが、ＳＯ２のワクチン接種を受けた群では１匹だけ死亡し、ｐｈｏＰ−ＤＩＭ＋突然変異によって付与された予防は、現在のワクチンのＢＣＧに類似していることを示唆した。一方、ＳＯ２、二重ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−突然変異のワクチン接種は、モルモットモデルにおいてより良好に予防する（図１３）。４００日後、ＳＯ２のワクチンを接種された群中の３匹のモルモット（図１４ａ）が生存し、一方、ＢＣＧのワクチンを接種されたモルモット（図１４ａおよび図１４ｂ）およびｐｈｏＰ−ＤＩＭ＋を接種されたモルモット（図１４ｂ）は、１匹しか生存せず、ｐｈｏＰ−ＤＩＭ＋突然変異の予防はＢＣＧに類似することを示唆した。一方ＳＯ２、ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−二重突然変異のワクチン接種は、４００日間の実験後より良好に予防し、ＢＣＧより大きな予防の驚くべき効果は、ｐｈｏＰ−突然変異ばかりでなく、ＳＯ２二重突然変異体、ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−にも起因していた。
【００３０】
したがって、本発明の第一の態様は、単離されたマイコバクテリア属に属する微生物であって、
ａ．ｐｈｏＰ遺伝子、あるいはｐｈｏＰ遺伝子を制御するまたはｐｈｏＰによって制御される１種以上の遺伝子と、
ｂ．ＤＩＭ産生を阻止する第二遺伝子と
の不活性化または除去を含むことを特徴とする微生物に関する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の単離された微生物は、ｐｈｏＰ遺伝子が、Ｒｖ０７５７遺伝子の不活性化または除去によって不活性化されていることを特徴とする。
【００３２】
本発明のより好ましい実施形態では、本発明の単離された微生物は、ＤＩＭ産生が、Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子の除去または不活性化によって不活性化されていることを特徴とする。
【００３３】
本発明のさらにより好ましい実施形態では、本発明の単離された微生物は、Ｒｖ２９３０遺伝子およびＲｖ０７５７遺伝子の除去または不活性化を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の他の実施形態では、本発明の単離された微生物は、マイコバクテリア属の種が、ヒト結核菌複合体に属することを特徴とする。
【００３５】
本発明の第二の態様は、本発明の単離された微生物を調製する方法であって、
ａ．ｐｈｏＰ遺伝子、あるいは１種以上のｐｈｏＰ遺伝子を制御する遺伝子の不活性化または除去、好ましくはＲｖ０７５７遺伝子の不活性化または除去と、
ｂ．ＤＩＭ産生を阻止する第二遺伝子の不活性化または除去と、好ましくはＲｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子の除去または不活性化と、
を含む方法に関する。
【００３６】
本発明の第三の態様は、結核によって引き起こされた症状に対して、個体に免疫付与するワクチン（以下、本発明のワクチン）であって、少なくとも本発明の単離された微生物を含むワクチンに関する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、ワクチンは、薬理学的に許容し得る賦形剤も含む。
【００３８】
本発明の第四の態様は、医薬品、好ましくはワクチンを調製する方法であって、本発明の単離された微生物の治療に効果的な用量を、ヒトまたは動物における投与に適切な媒体に導入することと、ワクチンの産生に関し薬理学的に適切な賦形剤を選択的に添加することとを含む方法に関する。
【００３９】
前記医薬品は、膀胱癌の治療、結核の治療または予防、あるいはベクターまたはアジュバントとして適切なものである。結核によって引き起こされる症状に対して、個体に免疫付与することが好ましい。
【００４０】
本発明の第五の態様は、ヒトまたは動物における結核の予防および／または治療のための本発明のワクチンを調製するための、本発明の単離された微生物の使用に関する。
【００４１】
明細書および請求項の全体を通して、用語「含む」およびこの変形表現は、別の技術的特長、添加物、成分またはステップの排除を意味するものではない。当業者には、明細書から、および本発明を実践する場合、本発明の他の目的、長所および特徴が一部生じるであろう。以下の実施例および図面は、限定的ではなく、本発明の例を説明するためのものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
【実施例１】
【００４３】
物質および方法
１．１．−タンパク質抽出および免疫ブロッティング法。タンパク質に対するポリクローナル化抗体を得、これらは、それぞれ、０、４、８、１２および１６週間目に、ＰｈｏＰ（０．５ｍｇ）の４回投与を受けた。ＥＬＩＳＡ試験（ＺＥＵ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ  Ｚａｒａｇｏｚａ、スペイン）を使用して、抗ＰｈｏＰ抗体を検出した。ＥＳＡＴ−６に対するモノクロナール抗体を、Ｓ．Ｃｏｌｅによって穏やかに供給した［２４］。マイコバクテリアの無細胞タンパク質抽出物を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９−ＡＤＣブロス中で成長させられる、対数増殖期の初期培養物から、通常の方法に倣って調製した［２５］。該ヒト結核菌タンパク質抽出物を、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＰフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）でろ過した。５〜６週間培養したヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ培養ろ液を集め、培養ろ液タンパク質を、４５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムで析出させた。正規の方法に従って、ウェスタンブロット法による分析を行った。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼで標識化したヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を二次抗体として使用した。
【００４４】
１．２．−ヒト結核菌によるＳＣＩＤマウスの感染。ＳＣＩＤマウスを用いた操作を、動物実験委員会の監督の下、「Ｇｅｒｍａｎｓ  Ｔｒｉａｓ  ｉ  Ｐｕｊｏｌ」大学病院で、実験動物の保護に関するＥＵの規則に従って実施した。ＳＣＩＤ  ＣＢ−１７／ｌｃｒ  ｌｃｏ特定病原体未感染（ｓｐｆ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（Ｂａｇｎｅｕｘ  フランス、セデックス）から入手した。噴霧感染では、マウスを、空気感染装置（Ｇｌａｓ−ｃｏｌ社、Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ、米国インディアナ州）の暴露チャンバー内に置いた。噴霧器区画を、７ｍｌのヒト結核菌懸濁物で充填し、肺の内部に約２０の生存菌の吸収量を与えた。各実験群につき１０匹のマウスを使用した。静脈内感染では、７匹のマウスの群に、２×１０５、２×１０４および２×１０３の用量の生存ＢＣＧと、５．４×１０６、５．４×１０５および５．４×１０４の用量の生存ヒト結核菌ｐｈｏＰ株とを含む２００□ｌのＰＢＳを、外側尾静脈から感染させた。処置マウスの間の生存期間内の差の有意性を、マンテルヘンツェル検定を用いて測定した。生菌数計測をホモジネートの連続希釈で行い、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１１＋ＯＡＤＣ寒天上で培養し、３週間後、成長を判定した。組織学的分析では、組織を緩衝化ホルマリン−生理食塩水中に固定し、パラフィン中に埋め込んだ。５□ｍ厚の切片を切り出し、チール・ネルゼン染色液で染色した。
【００４５】
１．３．−本発明のＳＯ２およびＢＣＧの皮下注射によるワクチン接種後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける細胞性免疫の活性化の測定。４匹のＢａｌｂ／Ｃマウス群を、８×１０３ＣＦＵのＢＣＧ（フィプス）または２．５×１０３ＣＦＵの本発明のＳＯ２菌株の皮下注射によるワクチン接種の後、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４５日目および６０日目に致死させた。脾臓を取り出し、２ｍｌのＲＰＭＩ媒体および０．５ｍｇ／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）および２Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼ（ＧＩＢＣＯ）を含む１０％胎仔牛血清（ＧＩＢＣＯ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に置き、５％ＣＯ２を使用して、３７℃で１時間培養した。次いで、７０μｍの細胞ふるい（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ７０μｍナイロン３５−２３５０）に通し、シリンジのプランジャーで粉砕し、前記媒体で濯いだ。細胞を遠心分離し、上澄み液を廃棄し、赤血球を溶解緩衝液で除去した［２６］。遠心分離およびＲＰＭＩ媒体で洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１×、ｐＨ７．２、１％ＢＳＡ）に再懸濁し、計測した。１０６個の細胞を１００μｌの抗ＣＤ４−ＦＩＴＣまたは抗ＣＤ８−ＦＩＴＣモノクロナール抗体で培養することによって、細胞表面に標識を付け、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに、４℃で２０分、１：２０で希釈し、ＦＡＣＳｃａｎ血球計算器を使用して分析した。
【００４６】
ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ株を、ＯＡＤＣ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９媒体（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で培養した。１ヶ月の培養の後、細菌の固まりを分離し、培養ろ液を集めた。該ろ液の抗原を４５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムで析出させ、ＰＢＳで洗浄し、再びこれに溶解した。細胞を刺激するため、１×１０６個の脾臓細胞を、１ウェル当たり１００μｌのＲＰＭＩ媒体に再懸濁し、１０μｇのヒト結核菌培養ろ液抗原で培養し、５％ＣＯ２を用いながら、１００μｌのＰＢＳに３７℃で７２時間懸濁した。細胞および培養媒体を遠心分離し、上澄み液を廃棄し、生存能を計測し、確かめた後、先に記載したように、１試験管当たり２．５×１０５個の細胞を、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の表面に標識化した。洗浄した後、細胞を再懸濁し、０．１％サポニンが溶解したＰＢＳ中で４℃で２０分培養した。フィコエリスリン（ＰＥ）で標識化されたモノクロナール抗ＩＦＮ−γの１／２０希釈物１００μｌを用い、細胞を４℃で２０分暗室中で培養することによって、細胞内ＩＦＮ−γを検出した。細胞を、ＰＢＳで希釈した４％パラホルムアルデヒド１００μｌで固定した。２０分後、サンプルをＦＡＣＳｃａｎ血球計算器を用いて分析した。アイソタイプ対照は、Ａｂ−ＦＩＴＣ（１：２０希釈物）＋Ａｂ−ＰＥ（１：２０希釈物）であった。
【００４７】
１．４．−Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける本発明のＳＯ２の予防効果。パリにあるパスツール研究所の動物施設のＰ３高安全度実験室内の制御された条件下で、実験動物の保護に関するＥＵの指令に従って、全ての動物を管理した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群に付き７匹）の群に、１０７ＣＦＵの本発明のＳＯ２菌株またはＢＣＧ（パスツール）のワクチンを、尾の根元の部分で皮下注射により接種した。ワクチン接種から８週間後、全マウスに、２．５×１０５ＣＦＵのヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖを静脈注射で投与した。注射から４週間後、マウスを致死させた。生細胞数計測を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１１＋寒天ＯＡＤＣブロスで培養したホモジネートの連続希釈で行い、３週間後、本発明のＳＯ２菌株のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの成長を、後者の菌株のカナマイシン耐性表現型に基づいて判定した。
【００４８】
１．５．−モルモットにおける本発明のＳＯ２の予防効果。モルモットを用いた実験操作を、動物実験に関する英国の法律に従って行い、医療保護局の地元の治験倫理委員会、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、英国によって承認された。メスのダンキン・ハートレイモルモットを、承認されている市販業者（英国本社）（Ｄａｖｉｄ  Ｈａｌｌ、Ｂｕｒｔｏｎ−ｏｎ−Ｔｒｅｎｔ，ＵＫ  ｏｒ  Ｈａｒｌａｎ，ＵＫ、英国、バイセスター）から入手し、完全に隔離した中で再育した。図６に示されている結果は、ＳＯ２菌株がＢＣＧより大きな予防を付与することを示している。図１３および図１４に示されている結果は、ＳＯ２突然変異のこの驚くべき予防は、二重表現型ＤＩＭ−ｌＰｈｏＰ−に起因することを示している。
【００４９】
１．６．−低用量投与。６匹のモルモットの群に、５×１０４ＣＦＵのＢＣＧパスツールのワクチン、５×１０４ＣＦＵの本発明のＳＯ２のワクチン２５０μｌ、または生理食塩水を、首の後ろに、皮下注射により接種した。噴霧攻撃感染の前、先に記載したように、収納式ヘンダーソン装置を用いて、１２週間の間動物を休養させた［２７］。コリソン噴霧器を使用して、平均径が２μｍ（粒径範囲：０．５〜７μｍ）のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの微粒子からエアロゾルを作り、動物の鼻に直接当てた。約１０〜５０ＣＦＵ／肺と計算される残留吸入用量を達成するために、エアロゾルは、２×１０６ＣＦＵ／ｍｌを含む水の懸濁液から作った。
【００５０】
投与から４週間後、予防を評価した。ペントバルビタールナトリウム塩の腹腔過剰投与により、動物を致死させた。組織を脾臓および肺（左および中間葉、右中葉および右後部葉）から無菌的に除去し、滅菌容器中に置いた。物質を、−２０℃で保存し、次いで細菌の数を数えるために調製した。回転羽根マセレーターシステム（Ｙｓｔｒａｌ）を使用して、１０ｍｌ（肺）または５ｍｌ（脾臓）の滅菌脱イオン水中に、組織を均質化した。生細胞数計測は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１１＋寒天ＯＡＤＣで培養したホモジネートの連続希釈で行い、ヒト結核菌成長は３週間後に調べた。これらの分析のデータは、ｌｏｇ１０に変換し、ワクチン群それぞれに関する生ヒト結核菌の数を、スチューデントのｔ−検定により、生理食塩水を使用した対照群と比較した。
【００５１】
１．７．−高用量のヒト結核菌による感染後のモルモットにおける予防試験。６匹のモルモットの群に、ヒト結核菌を噴霧投与する１０週間前に、５×１０４ＣＦＵの本発明のＳＯ２またはＢＣＧ（Ｄａｎｉｓｈ．１３３１）のワクチンを皮下注射により接種した。噴霧投与は、先の段落に記載したように行い、５×１０７ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液を使用し、肺に約５００ＣＦＵを付与した。投与後、動物を、封じ込めレベル３（ＡＣＤＰ）に保ち、体重の変化を定期的に管理し、投与から１８０日後、あるいはヒト終止点（最大体重の２０％の喪失）で、人道的に致死させた。肺硬化を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）で染色され、ホルマリンに固定された肺組織の切片の画像分析を使用して測定したこと以外は、死後サンプル収集および処理を先の記載のように行った。動物生存率は、カプラン・マイヤー生存率予測を使用して比較し、ログランク分布分析を使用して、統計学的有意差を確認した。ＣＦＵおよび病変硬化データは、ＡＮＯＶＡにより分析し、フィッシャーの対比較を用いて、群の平均値を比較した。
【実施例２】
【００５２】
ヒト結核菌ｐｈｏＰの特性評価
マイコバクテリア遺伝回路の全般的な調節におけるｐｈｏＰ遺伝子の関与の証拠は、バシラスサイズの変化および不活性化ｐｈｏＰ遺伝子が存在する増殖細胞のコーディング特性の観察により提供されている。結核に対する予防の決定因子として分泌された抗原の重要な特性が与えられたので、我々は、ｐｈｏＰ遺伝子の突然変異の多面的効果が、主要な免疫優性抗遺伝子ＥＳＡＴ−６の合成の影響に及ぶかどうかを決定することを望んだ。ウェスタンブロット法による分析を、ＰｈｏＰタンパク質およびＥＳＡＴ−６に対する抗体を使用して、ＳＯ２菌株、ＢＣＧおよびＭＴ１０３について行った。結果は、ＰｈｏＰタンパク質は、本発明のＳＯ２菌株中には全く存在しないが、ヒト結核菌ＭＴ１０３およびＢＣＧ菌株中で、構成的に発現されることを明らかに示した。それとは対照的に、ＳＯ２菌株の培養物の上澄み液中のＥＳＡＴ−６の発現レベルは、ＭＴ１０３の親株から検出したレベルに類似し、予測通り、ＥＳＡＴ−６タンパク質は、ＢＣＧ中で検出されなかった。
【実施例３】
【００５３】
本発明の菌株およびＢＣＧを感染させたマウスの生存
ＭＴ１０３菌株、ＳＯ２およびｐｈｏＰ遺伝子が補完されたＳＯ２（ＳＯ２＋ｐＳＯ５）を用いて噴霧感染（約２０ＣＦＵ）後の免疫無防備状態ＳＣＩＤマウスの生存を評価した［２３］。ＳＯ２を感染させたマウスは全て２４５日間を超えて生存した。それとは対照的に、ＭＴ１０３または補完ヒト結核菌、ＳＯ２−ｐＳＯ５を感染させたＳＣＩＤマウスは全て感染から６２日目には死亡していた。これは、補完菌株の病原性が回復することを示している（図２ａ）。
【００５４】
また、静脈内投与後、ＳＣＩＤマウスにおいて、ＳＯ２菌株の弱毒化をＢＣＧと比較した。ＳＣＩＤマウスの群に、数多くの用量（２×１０５、２×１０４および２×１０３ＣＦＵ）のＢＣＧパスツールまたはＳＯ２菌株（５．４×１０６、５．４×１０５および５．４×１０４ＣＦＵ）を、外側尾静脈から接種した。感染から３週間後に致死させたマウスのサブグループの感染肺胞マクロファージの組織学的染色によって、ヒト結核菌ＳＯ２株を感染させたマウスの肺中のアルコール−酸耐性菌の数が、ＢＣＧと比べて少ないことが明らかになった。より高い用量のＢＣＧ（２×１０５ＣＦＵ）を接種されたマウスは、全て、感染後９２日で死亡した（平均生存期間：８９±３．５日間）（図２ｂ）。それとは対照的に、最高用量のＳＯ２（５．４×１０６ＣＦＵ）に感染されたマウスは、全て、１２０日後生存していた（図２ｂ）。死亡時、ＢＣＧ、２×１０５ＣＦＵを感染させたマウスの肺の細菌量は、ＳＯ２、５．４×１０６ＣＦＵを感染させたマウスと比べるとすると、少なくとも１００倍を超えていた。
【実施例４】
【００５５】
ワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスの定量的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答
本発明のＳＯ２およびＢＣＧをワクチン接種によって誘発された細胞性免疫の活性化を比べるために、ワクチン接種後７日目、１４日目、３０日目、４５日目および６０日目に、細胞懸濁液を、本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧフィプスのワクチンを皮下注射により接種された少なくとも４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群の脾臓から採取し、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の相対比率を、細胞蛍光測定法により測定した（図３）。ＳＯ２のワクチン接種により、ワクチン接種から１４日後に、ＢＣＧのワクチン接種と比較して有意に高い数のＣＤ４＋細胞が、および４５日後に、有意に高い数のＣＤ８＋細胞が誘発された。これらの脾臓細胞を、ヒト結核菌培養ろ液から誘導された全抗原で刺激した。３日後、リンパ球集団をフローサイトメトリーによって分析し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞およびＩＦＮ−□の細胞内合成の検出のために特異的抗体を合わせた。ＳＯ２のワクチン接種により、ワクチン接種から４５日後、ＢＣＧと比較して有意に高い比率のＣＤ４＋／ＩＦＮ−□＋産生細胞が誘発された（図３）。所定時間後、ＣＤ８＋／ＩＦＮ−□＋を産生する細胞の比率は、常に、ＳＯ２群の方が高かった（１４日目に有意差）。
【実施例５】
【００５６】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、本発明のＳＯ２により生み出される防御免疫
本発明のＳＯ２菌株がＳＣＩＤマウスで弱毒化されることが証明されたので、観察された病原性の減少により、突然変異菌株に対し、ある種の予防特性が付与されるのかどうかを決定することに関心がもたれた。本発明のＳＯ２菌株またはＢＣＧ（パスツール）のワクチンを、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下注射により接種した。ワクチン接種から８週間後、全てのマウスに、２．５×１０５ＣＦＵのヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖを、静脈内注射で投与した。注射から４週間後、マウスを致死させた。マウスの両群の肺および脾臓から回収された生存ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの数を求めることによって、予防レベルを決定した（図４）。両ワクチンとも、生理食塩水で処置された対照と比べると、類似した、しかし有意なレベルの予防を付与した（ｐ＜０．０５）。ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ増殖の阻止が、肺および脾臓の両方において記録され、減少は、それぞれ、約１．５ｌｏｇ１０および１．３ｌｏｇ１０ＣＦＵであった。
【実施例６】
【００５７】
モルモットにおける本発明のＳＯ２の防御免疫
マウスワクチン接種実験で得られた結果は、本発明のＳＯ２菌株の弱毒化により、ＢＣＧパスツールの特性に類似するワクチン特性を該菌株に付与されることを示した。しかし、モルモットは、ヒト結核に関してより適切なモデルであり、疾患の進行および病理の点において多くの類似性を有することが一般的に認められている。したがって、この動物モデルは、ワクチンの効能を評価するために、より適正なシステムである。本発明のＳＯ２菌株の予防効果を調べるために、我々は、ワクチン接種された動物に対する低用量（１０〜５０ＣＦＵ）および高用量（５００ＣＦＵ）での噴霧投与に関連する実験を行った。６匹のモルモットの群に、本発明のＳＯ２またはＢＣＧのワクチンを、皮下注射により接種した。ワクチン接種から１０週間後、モルモット全てにヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの吸入量を投与した。
【００５８】
４週間後、低用量を受けた動物を致死させ、肺および脾臓中の細菌量を計測した。各処置群のモルモットの器官から回収した生存ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの数を比較することによって、予防効果を測定した。この実験で、肺および脾臓におけるＣＦＵの減少は、ワクチン接種されていない対照動物と、ＢＣＧまたはヒト結核菌ＳＯ２のワクチンを接種されたものとの間では有意差があった（ｐ＝０．００５）。しかし、ワクチンを接種された群の間では有意差は見出せなかった（図５）。
【００５９】
高用量を受けたモルモットを、投与から１８０日後、または体重の２０％喪失が記録された時、致死させた。予防レベルを、各処置群のモルモットの生存期間を比較することによって決定した。病変発生の進行もワクチン接種された／感染されたモルモットにおいて試験し、ワクチン接種されていない／感染されていない動物において観察されたものと比較した。吸引に続く実験段階で、ワクチン接種されていない全てのモルモットおよびＢＣＧワクチンを接種された４匹のモルモットは、ヒト終止点、重篤で進行性の疾患のため終止点前の時点（１８０日目）で、致死させた（図６ａ）。一方、本発明のＳＯ２菌株のワクチンを接種されたモルモットは全て、試験期間の間中生存した。本発明のＳＯ２菌株のワクチンを接種されたモルモットは、ＢＣＧワクチンを接種されたものより、有意に長く生存し（ｐ＝０．０１８）し、同様に、生理食塩水で処置された対照モルモットより有意に長く生存した（ｐ＝０．００４９）。さらに、ＳＯ２菌株をワクチン接種されたモルモットは、体重を増やし、疾患の視覚的なまたは臨床的ないかなる兆候も存在しなかった。
【００６０】
全肺硬化によって測定した肺疾患の程度も、異なる処置群の間で様々であった。疾患の進行の最高レベルは、予測通り、ワクチン接種されていないモルモットにおいて観察され、この動物群で測定された硬化の平均比率は、７６％であった（図６ｂ、６ｃ）。肉腫の融合がＢＣＣワクチンを接種されたモルモットにおいても発現し、肺で測定した平均硬化は、７０％であった。一方、本発明のＳＯ２のワクチンを接種されたモルモットでは、より少ない硬化（約５０％）が観察された。この硬化は、ワクチン接種されていない動物およびＢＣＧのワクチンを接種された動物に比べ、有意に少なかった（ｐ＜０．０５）（図６ｃ）。疾患の重篤度に関するこの減少も、肺および脾臓のホモジネートの細菌計測に反映された。ワクチン接種された群では、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ増殖阻止のレベルの差が、両器官で観察された。ＳＯ２ワクチンを接種されたモルモットから回収されたＣＦＵの数は、ＢＣＧワクチンを接種されたモルモットからの数に比べ、１×ｌｏｇ１０を超えて減少し、この減少は、脾臓において統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図６ｄ）。これらのデータは、感染モルモットにより高い生存率を付与し、肺における疾患の重篤度を減少し、感染が脾臓に広がるのを阻止する点で、本発明のＳＯ２菌株が、ＢＣＧより良好であることを示した。
【実施例７】
【００６１】
本発明のＳＯ２の弱毒化は、ＰｈｏＰ−ＤＩＭ−二重突然変異に起因する。
【００６２】
ＳＯ２（ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−）菌株の静脈注射によるＢａｌｂ／Ｃマウスの感染試験を、野生型ＭＴ１０３菌株と比較し、ｐｈｏＰ（ＳＯ２＋ｐＳＯ５）で補完された菌株は、ＢａｌｂＣマウスへの静脈注射によるＳＯ２の感染の弱毒化が、ｐｈｏＰでの補完により復元されないことを示した。３週間および６週間後に測定された脾臓（７ａ脾臓）および肺（７ｂ肺）におけるコロニー（ＣＦＵ）の減少は、免疫適格マウスにおいてそれは毒性がないため、補完菌株では復元されなかった。これらの実験は、驚くべき弱毒化は、第二の更なる突然変異に起因する可能性があることを示唆している（図７）。
【００６３】
薄層クロマトグラフィーによるヒト結核菌の異なる菌株の脂質試験により、ＳＯ２菌株はＤＩＭを産生せず、これがｐｈｏＰ突然変異とは無関係であることが示された（図８）。
【００６４】
ＳＯ２に毒性がないことを示すために、６匹のモルモットにワクチンを５０回接種した。６ヶ月の実験期間後の生存率は１００％であった。６ヵ月後、体重増加が全ての動物で観察され、これは、ＳＯ２菌株に毒性がないことを示している（Ｙ＝体重（グラム）および感染の週、Ｘ＝時間（週））図１２。
【００６５】
抗結核薬に対する感受性も試験した。ヒト結核菌株Ｈ３７Ｒｖ、対照としてＭＴ１０３（野生型）、およびＳＯ２菌株に対する抗結核薬、エタンブトール、イソニアジド、リファンピシンおよびストレプトマイシンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。数値（ミクログラム／ｍｌ）は、ｐｈｏＰ遺伝子の不活性化後、ＳＯ２候補ワクチン菌株は、結核に対して臨床的に使用される最も一般的な薬物に対する感受性を保存することを示す。
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【００６６】
気管内に接種されたＢａｌｂＣ−マウスにおける弱毒化の試験は、２０週間後、ヒト結核菌ＤＩＭ−（１Ａ２９）株に関し、マウスの５０％が生存したことを示した。驚くべきことに、ＳＯ２（ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−突然変異）を接種された動物は、全て、実験の２０週間の間生存した（図１１）。
【実施例８】
【００６７】
本発明のＳＯ２予防は、ＰｈｏＰ−ＤＩＭ−二重突然変異に起因する。
【００６８】
ワクチン接種され、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖを噴霧によって感染されたモルモットに関して、予防を試験した。モルモットは３００日後生存していた。皮下注射によるワクチン接種後、動物を高用量のヒト結核菌（Ｈ３７Ｒｖ）の毒性のある菌株で感染させ、生存性を試験した。６０日後、ワクチン接種されなかった６匹のモルモットが死亡した一方、ＳＯ２、ｐｈｏＰ−およびＢＣＧのワクチンを接種された群は生存した。感染から３００日後、ＢＣＧおよびｐｈｏＰ−のワクチンを接種された３匹のモルモットは死亡したが、ＳＯ２のワクチンを接種された群は１匹だけ死亡した。これは、ｐｈｏＰ突然変異の予防は、現在のワクチン、ＢＣＧの予防に類似し、一方、ＳＯ２、ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−二重突然変異ワクチン接種は、モルモットモデルにおいて、より良好に予防していることを示す（図１３）。
【００６９】
モルモットを使用するこれらの予防試験は、４００日間続けたが、ワクチン接種していない６匹のモルモットは、６０日後に死亡した。感染から４００日後、ＳＯ２のワクチンを接種された群の３匹のモルモット（図１４ａ）は生存しており、一方、ＢＣＧ（図１４ａおよび図１４ｂ）およびｐｈｏＰ−（図１４ｂ）のワクチンを接種されたモルモットは、１匹のみ生存した。これもまた、ｐｈｏＰ突然変異の予防は、ＢＣＧの予防と類似し、一方、４００日間の実験後、ＳＯ２、ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ二重突然変異のワクチン接種は、より良好に予防したことを示している。
【実施例９】
【００７０】
ｆａｄＤ２６遺伝子の除去による突然変異に基づく候補結核ワクチンの構築
ｆａｄＤ２６（ΔｆａｄＤ２６）遺伝子の除去による突然変異の構築のために使用されるヒト結核菌株は、ＳＯ２であり、これは、カナマイシン耐性カセットの挿入により不活性化されたｐｈｏＰ遺伝子と、ＭＴ１０３臨床菌株とを含む。
【００７１】
１．プラスミドの構築
１．１．ＤＩＭ合成に関与するｆａｄＤ２６遺伝子のクローニング。ヒト結核菌Ｈ３７ＲｖからのゲノムＤＮＡを使用し、プライマーｆａｄＤ２６Ｆｗ（配列番号：１）およびｆａｄＤ２６Ｒｖ（配列番号：２）を使用し、ＰＣＲによって、ｆａｄＤ２６遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、プラスミドｐＡＺ１を構築した。
１．２．ｆａｄＤ２６遺伝子の除去およびヒグロマイシン耐性カセットの挿入。ｒｅｓ−Ωｈｙｇ−ｒｅｓカセット（γδレゾルバーゼにより認識されるｒｅｓ部位は、二代継代において耐性マーカーの除去を可能にする）を含む、ｐＷＭ２７のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント（Ｍａｌａｇａら、２００３）を、ｐＡＺ１中のｆａｄＤ２６のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ部位の間に挿入し、ｐＡＺ３を構築した。
１．３．相同組換えによる遺伝子の不活性化用の自己不活化ベクターの構築。プラスミドｐＡＺ３をＸｈｏｌで消化し、ｆａｄＤ２６：：Ωｈｙｇ挿入物を放出し、これをｐＪＱ２００Ｘベクターに導入し、同じ酵素で直線化した。最終プラスミドをｐＡＺ５と命名した。
【００７２】
２．ヒト結核菌ＤＩＭ−株の構築
２．１．プラスミドｐＡＺ５を、ヒト結核菌ＳＯ２およびＭＴ１０３菌株に挿入した。
２．２．単一組換えの選択。プラスミドを含む細菌のヒグロマイシン（２０μｇ／ｍｌ）における培養、およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）に対するその耐性の検査。
２．３．二重組換えの選択。サッカロース２％（Ｐｅｌｉｃｉｃら、１９９７）およびヒグロマイシンにおける単一組換えの培養、およびゲンタマイシンに対するそれらの耐性の検査。
【００７３】
３．ΔｆａｄＤ２６突然変異からの抗生物質耐性マーカーの削除
３．１．ｒｅｓ−Ωｈｙｇ−ｒｅｓカセットを削除し、抗生物質耐性マーカーのない突然変異体を産生するために、γδレゾルバーゼを含むプラスミドｐＷＭ１９を挿入し、ゲンタマイシン耐性によって選択する。次いで、サッカロース２％中で３９℃で培養することによってプラスミドを削除する。（Ｍａｌａｇａら、２００３）。
実施例２．２．除去ΔｐｈｏＰΔｆａｄＤ２６による二重突然変異の構築のために使用されるヒト結核菌株は、ＭＴ１０３ΔｆａｄＤ２６である。
【００７４】
４．プラスミドの構築
４．１．ｐｈｏＰ遺伝子のクローニング。ヒト結核菌Ｈ３７ＲｖからのゲノムＤＮＡを使用し、およびプライマーｐｈｏＰＦ（配列番号：３）およびｐｈｏＰＲ（配列番号：４）を使用して、ＰＣＲによってｐｈｏＰ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、プラスミドｐＡＺ１１を構築した。
４．２．ｐｈｏＰ遺伝子の除去およびカナマイシン耐性カセットの挿入。ｒｅｓ−Ωｋｍ−ｒｅｓカセットを含むｐＣＧ１２２のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント（Ｍａｌａｇａら、２００３）を、ｐＡＺ１１中のｐｈｏＰのＢｃ／Ｉ−ＥｃｏＲＶ部位の間に挿入し、ｐＡＺ１３を構築した。
４．３．相同組換えによる遺伝子の不活性化のための自己不活化ベクターの構築。プラスミドｐＡＺ１３をＸｈｏｌで消化し、ｐｈｏＰ：：Ωｋｍ挿入物を放出させ、これをｐＪＱ２００Ｘベクターに導入し、同じ酵素で直線化した。最終プラスミドをｐＡＺ１５と命名した。
【００７５】
５．ヒト結核ΔｐｈｏＰΔｆａｄＤ２６二重突然変異菌株の構築
５．１．プラスミドｐＡＺ１５を、ヒト結核菌ＭＴ１０３ΔｆａｄＤ２６株に挿入する。
５．２．単一組換えの選択。細菌プラスミドを含む細菌のカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）における培養、およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）に対するその耐性の検査。
５．３．二重組換えの選択。サッカロース２％（Ｐｅｌｉｃｉｃら、１９９７）およびカナマイシンにおける単一組換えの培養、およびゲンタマイシンに対するそれらの感受性の検査。
【００７６】
６．ΔｐｈｏＰ突然変異からの抗生物質抵抗性マーカーの削除
６．１．ｒｅｓ−Ωｋｍ−ｒｅｓカセットを削除し、抗生物質耐性マーカーのない突然変異体を産生するため、γδレゾルバーゼを含むプラスミドｐＷＭ１９を挿入し、ヒグロマイシン耐性（２０μｇ／ｍｌ）によって選択する。次いで、サッカロース２％中、３９℃で培養することによってプラスミドを削除する（Ｍａｌａｇａら、２００３）。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ウェスタンブロット法による分析。ＰｈｏＰおよびＥＳＡＴ−６に対するポリクローナル抗体を使用する、ＭＴ１０３、本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧパスツールの細胞外タンパク質抽出物のウェスタンブロット画像。ＭＴ１０３菌株はＥＳＡＴ６＋およびｐｈｏＰ＋表現型を有し、ＳＯ２菌株はＰｈｏＰ−およびＥＳＡＴ６＋表現型を有し、ＢＣＧワクチン菌株はＰｈｏＰ＋およびＥＳＡＴ６−である。
【図２】ＳＣＩＤマウスにおける本発明のＳＯ２菌株の弱毒化。ａ  ２０ＣＦＵのＳＯ２、ｐＳＯ５が補完されたＳＯ２（ＳＯ２＋ｐＳＯ５）およびＭＴ１０３を噴霧感染させたＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）に関する生存率曲線。生存の平均日数は、２４５日超（ＳＯ２）、６２．１±５．８８日（ＳＯ２＋ｐＳＯ５）および３６．７±０．６７日（ＭＴ１０３）であった。噴霧によりＳＯ２菌株を感染させたマウスは、実験の２４５日間生存したが、ＭＴ１０３およびＰｈｏＰを補完したＳＯ２菌株を感染させたマウスは、６２日目前に死亡した。ｂ  静脈注射によって５．４×１０６ＣＦＵのＳＯ２および２×１０５ＣＦＵのＢＣＧパスツールを感染させたＳＣＩＤマウス（ｎ＝７）に関する生存率曲線。これは、ＳＯ２菌株の弱毒化のレベルは、現在ヒトに使用されている結核ワクチンであるＢＣＧのレベルより大きいことを示す。
【図３】本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧのワクチンを接種されたマウスにおける細胞性免疫応答。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、皮下注射により、８×１０３ＣＦＵのＢＣＧ（フィプス）または２．５×１０３ＣＦＵの本発明の菌株のワクチンを接種した。結果を、ワクチン接種後、所定の間隔をあけた脾臓内のＣＤ４＋／ＣＤ８＋の合計個数の比率、および完全ヒト結核菌抗原で刺激した後、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の合計個数のＩＦＮ−γを発現した細胞の比率として示す。＊は、ある時点における群の間の統計学的有意差（ｐ＜０．００５）を表す。細胞性免疫応答の結果は、ＢＣＧのワクチンを接種されたマウスに対して、ＳＯ２菌株のワクチンを接種された動物のＣＤ４＋リンパ球の数は、１４日目、３０日目、４５日目および６０日目でより多く、ヒト結核菌抗原に対し特異的なＩＦＮγの産生は、４５日目および６０日目において有意であることを示す。ＢＣＧのワクチンを接種されたマウスに対して、ＳＯ２菌株のワクチンを接種された動物のＣＤ８＋リンパ球の数は、４５日目および６０日目において多く、ヒト結核菌抗原に対し特異的なＩＦＮγの産生は、１４日目において有意である。
【図４】ワクチンを接種されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ＢＣＧに比べた本発明のＳＯ２の予防効果。本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧのワクチンを接種し、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖを静脈内投与で感染させたＢａｌｂ／ｃマウスの肺（ａ）および脾臓（ｂ）から回収したＣＦＵ数。ＳＯ２のワクチンを接種されたマウスの肺および脾臓中のＣＦＵの減少は、ＢＣＧのワクチンを接種された場合に得られたものと類似し、ワクチンを接種されていないマウスに対して、有意な予防を示す。
【図５】低用量のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖに対する本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧのワクチンを接種されたモルモットにおける予防効果。低用量のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖを含む生理食塩水を注射された、ワクチン接種モルモットおよび対照モルモットの肺（ａ）および脾臓（ｂ）中のｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの平均値。データは、４週間後に致死させた動物（ｎ＝６）全ての平均ＣＦＵを表す。エラーバーは、標準偏差を示す。低用量のヒト結核菌が感染した、ＳＯ２のワクチンを接種されたモルモットの肺および脾臓中のＣＦＵの減少は、ＢＣＧのワクチンを接種した場合に得られたものと類似し、ワクチンを接種されていないマウスに対して有意である。
【図６】高用量のヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ感染に対する本発明のＳＯ２菌株およびＢＣＧのワクチンを接種したモルモットにおける予防効果。ａ  低用量で感染したマウスおよびモルモットにおける予防実験により、ＳＯ２およびＢＣＧのワクチンを接種したマウスにおいて明らかな予防が示されたが、ＢＣＧとＳＯ２との間に差がない場合は、高用量で感染したモルモットモデルを使用した。ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖの噴霧感染後のモルモットに関する生存率曲線。ｂ  全肺硬化により測定した肺疾患の程度および感染の程度。ヒト終点で致死させたそれぞれ個々の動物の数値を「ｘ」で印をつける。破線は、群（ＳＯ２における数は２匹の動物に対応する）の比率の平均値を示す。ｃ  それぞれの治療群のモルモットから採取した肺葉の代表的な部分の低解像度（×３０）の画像。バーは１ｍｍを表わす。ｄ  ワクチン接種されたおよびされていないモルモットの脾臓および肺における平均ＣＦＵ数。この実験では、ヒト結核菌を高用量感染されたモルモットモデルにＳＯ２のワクチンを接種したモルモットは、ＢＣＧワクチンを接種されたものより有意に長く生存し、また、現在のＢＣＧワクチンに対して、肺病変がより少なく、脾臓および肺におけるＣＦＵ数がより少ないことが示される。
【図７】ＢａｌｂＣマウスにおいて本発明のＳＯ２の静脈内感染の弱毒化は、ｐｈｏＰを補完することによって復元されない。野生型ＭＴ１０３菌株およびｐｈｏＰが補完された菌株（ＳＯ２＋ｐＳＯ５）と比較した、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける１０５ＣＦＵのＳＯ２（ｐｈｏＰ−ＤＩＭ−）菌株の静脈内感染の試験。３週間および６週間後に測定すると、コロニー（ＣＦＵ）の減少が、脾臓（７ａ：脾臓）および肺（７ｂ：肺）の両方に観察された。野生型菌株のＣＦＵのレベルは、補完された菌株には復元されなかった。免疫適格マウスにおけるこれらの実験は、予期し得ない弱毒化が、ｐｈｏＰ補完によって復元されない第二の更なる突然変異体に起因する可能性があることを示唆する。
【図８】本発明のＳＯ２菌株はＤＩＭを産生せず、ＤＩＭ合成はｐｈｏＰ突然変異とは無関係である。薄層クロマトグラフィーによる、ヒト結核菌の異なる菌株からの脂質の分析。８ａ  ＤＩＭ産生は、ＭＴ１０３菌株で観察することができるが、一方ＤＩＭは、ＳＯ２菌株およびｐｈｏＰ（ＳＯ２ｐＳＯ５）による補完では産生されない。これは、ＳＯ２に関し、ＤＩＭの不在は、ｐｈｏＰとは無関係であることを示す。８ｂは、ＭＴ１０３菌株およびｐｈｏＰ（ＭＴ１０３ΔｐｈｏＰ：：ｈｙｇ）遺伝子のみを不活性化するＭＴ１０３菌株を示し、両方ともＤＩＭを合成することができる。これにより、ＤＩＭ産生がｐｈｏＰ突然変異とは無関係であることが確認される。
【図９】ｆａｄＤ２６遺伝子の不活性化に関するプラスミドの構築。
【図１０】ｐｈｏＰ遺伝子の不活性化に関するプラスミドの構築。
【図１１】マウスにおける弱毒化の試験。ヒト結核菌の異なる菌株の弱毒化を試験するために、気管内に接種されたＢａｌｂ／Ｃマウスの生存率曲線。Ｈ３７ＲｖおよびＭＴ１０３は、突然変異のないヒト結核菌の菌株に相当し、全てのマウスは、第１０週目の前に死亡した。ヒト結核菌ＤＩＭ−（１Ａ２９）株に関し、マウスの５０％は、２０週後も生存していた。ＳＯ２（ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−突然変異体）を接種された動物は全て、実験の２０週間の間生存した。
【図１２】５０回分のワクチン用量によるＳＯ２の毒性を試験するための、モルモットの生存率と体重曲線。ＳＯ２に毒性がないことを示すために、６匹のモルモットに、５０回分のワクチン用量を接種した。６ヶ月の実験期間後、生存率は１００％であった。６ヶ月間で、体重の増加が全ての動物に観察され、ＳＯ２菌株に毒性がないことが示された（Ｙ＝体重（グラム）および感染週。Ｘ＝期間（週））。
【図１３】ヒト結核菌感染後のワクチン接種されたモルモットの生存率。モルモットにおける予防試験、３００日後の生存率。ワクチン接種されていないモルモット（生理食塩水）、現在のＢＣＧワクチンを接種された、およびヒト結核菌ｐｈｏＰ−株またはＳＯ２（ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−突然変異）を接種されたモルモットの生存率曲線。生存率を試験するために、皮下ワクチン接種後、動物に、高用量のヒト結核菌（Ｈ３７Ｒｖ）の毒性菌株を感染させた。６０日後、ワクチン接種されていない６匹のモルモットは死亡し、一方Ｓ０２、ｐｈｏＰ−およびＢＣＧのワクチンを接種された群は、生存していた。感染から３００日後、ＢＣＧおよびｐｈｏＰ−のワクチンを接種された３匹のモルモットは死亡したが、ＳＯ２のワクチンを接種された群は１匹だけが死亡した。これは、ｐｈｏＰ突然変異による予防は、現在のワクチンＢＣＧによる予防に類似し、一方モルモットモデルにおいて、ＳＯ２、ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ−二重突然変異のワクチン接種は、より良好に予防することを示す。
【図１４】モルモットにおける予防試験、４００日後の生存率。図１３に示された実験の継続。ワクチン接種されていない６匹のモルモットは、６０日後に死亡した。感染から４００日後、ＳＯ２のワクチン接種をされた群のうち３匹のモルモット（図１４ａ）は生存し、一方ＢＣＧのワクチン（図１４ａおよび図１４ｂ）およびｐｈｏＰ−（図１４ｂ）を接触されたモルモットは１匹のみ生存し、これもｐｈｏＰ突然変異の予防は、ＢＣＧの予防に類似し、一方、ＳＯ２、ｐｈｏＰ−およびＤＩＭ二重突然変異のワクチン接種は、４００日の実験後、より良好に予防することを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ１】
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【図１４ａ２】
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【図１４ａ３】
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【図１４ｂ１】
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【図１４ｂ２】
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【図１４ｂ３】
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【図６ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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