(57)【要約】  本発明は、紫外線を用いた紫外線吸光度測定を利用することにより、ヒト又は動物の細胞内の細胞核ＤＮＡの量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法に関する。本発明は、前述の原理に依拠することにより、生物学的試料内の癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する方法にも関する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における起こりそうな癌の発生を診断又は予測する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物学的試料内に存在する少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法であって：
（ａ）前記細胞内の核の位置及び／又は大きさをｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された前記核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさが、紫外線及び／又は位相差顕微鏡法を用いることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線がステップ（ａ）及び／又は（ｂ）において使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長の紫外線がステップ（ａ）及び／又は（ｂ）において使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの細胞が、該少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーと接触され、二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの細胞核信号強度が、適した光源を用いた励起により得られる信号によって決定される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞核の核酸が、免疫組織化学染色、化学反応、又は、蛍光マーカーで可視化されない、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの生物学的試料における少なくとも１つの推測上癌性の細胞を検出するために使用される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの癌性の細胞が、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）で得られた細胞核紫外線吸光度を、同様に請求項１のステップ（ａ）及び（ｂ）を用いて分析された少なくとも１つの非癌性の細胞の細胞核紫外線吸光度と比較することによって前記推測上癌性の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出するために、ステップ（ｂ）における細胞核紫外線吸光度が使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量における、２価から少なくとも１０％はずれた偏差が、癌性の細胞を示している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１．８から２．２という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近二倍体の状態を示し、３．６から４．４という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近四倍体の状態を示し、さらに、１．８から２．２及び３．６から４．４という範囲外にある倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量がＸ倍体の状態を示している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法であって：
（ａ）少なくとも１つの細胞を含んだ生物学的試料を前記ヒト又は動物の対象から提供するステップ；
（ｂ）前記細胞内の核の位置及び／又は大きさをｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定された前記核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記細胞核紫外線吸光度から、前記少なくとも１つの細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出するステップ；並びに、
（ｅ）前記細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞核の核酸の紫外線吸光度を測定することにより、ヒト又は動物の細胞の核内における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法に関する。
【０００２】
本発明は、細胞核の核酸の紫外線吸光度に依拠した、生物学的試料内の癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する方法にも関する。
【０００３】
本発明は、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関し、当該方法は、細胞核の核酸の紫外線吸光度に基づいている。
【背景技術】
【０００４】
癌の早期発見は、癌患者を治療することにおいて鍵となる要点である。生物学的試料内の癌性の細胞を検出する、従って、実在する癌を診断する、又は、少なくとも将来癌にかかるという見込みを推定するといった種々の可能性が存在する。これらの種々の取り組みには、癌組織の理学的検査、癌性の細胞の形態学的特徴づけ、膜及び核等の細胞構造体の免疫組織化学染色並びに特徴づけ、腫瘍特異的因子の発現の測定等が含まれる。
【０００５】
癌性の細胞を検出するという１つの可能性は、核ＤＮＡの量を測定して通常のＤＮＡ量との偏差を検出する、いわゆるＤＮＡサイメトリーである。突然変異誘発性の事象の結果としての細胞が、非癌性、すなわち、「健康」又は「正常」タイプの細胞として知られる既知の標準的な細胞よりも少ない又は多いＤＮＡを含んでいる場合、このＤＮＡ量における偏差は、重大な染色体再構築、従って進行中の癌発生を示し得るということが想定される。
【０００６】
従って、核酸特異的染色による核ＤＮＡの定量化は、癌診断という状況において、研究用途でも臨床用途でもますます慣例になってきている。
【０００７】
フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーによる核ＤＮＡ量の測定は、とりわけ（ｉ）ＤＮＡに結合した染料の量は存在するＤＮＡの量に比例する、及び、（ｉｉ）放出、吸収、又は伝導による染料から生じる光学信号は染料の量に比例するという想定に基づいている。
【０００８】
ＤＮＡイメージサイトメトリーにより核ＤＮＡを測定するという目的に対して一般的に使用される１つのＤＮＡ特異的染色法は、フォイルゲン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）とロッセンベック（Ｒｏｓｓｅｎｂｅｃｋ）の名にちなんだ、単にフォイルゲン反応と呼ばれる場合が多い、酸塩基反応である。実際に、フォイルゲン反応は、ＤＮＡが酸により加水分解され、遊離のアルデヒド基を有する、プリン塩基なしのＤＮＡ（すなわち、いわゆるアプリン酸、ＡＰＡ）を生じる発色反応である。次に、遊離のアルデヒド基に共有結合的に結合する染料を含有したシッフ試薬と反応させる。
【０００９】
フォイルゲン反応はＤＮＡに特異的だけれども、種々の欠点を有している。フォイルゲン反応は時間のかかる反応で、むしろ、再現性及び意味のある結果を生じるために、注意深く制御及び確認する必要がある複雑な反応である。プリン塩基の除去において一般的に使用されるＨＣｌがＡＰＡをより小さな断片に加水分解するという事実から１つの問題が生じる。しかし、ＡＰＡ分子の断片化により、これらの断片は細胞核から除去され、従って、染色可能なＤＮＡ物質は失われる。
【００１０】
従って、確実に、癌性の細胞を検出する、及び、癌を診断するために、形態学的特徴づけと免疫組織化学染色とＤＮＡ染色との組合せに依拠するという試みが、当技術分野において実行されてきた。
【００１１】
米国特許第２００４／０１９７８３９  Ａ１号は、癌性の細胞を同定するための２種類の染料の併用を開示しており、１つの染料は、例えば、形態学的特徴を検出するのに対して、第２の（免疫学的な）染料は、例えば、腫瘍特異的マーカーの発現を測定する。
【００１２】
しかし、信頼ができて迅速且つ能率的な、核ＤＮＡの量を測定する、並びに、癌性の細胞及び癌を検出する手段を可能にする方法が引き続き必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
細胞の核内にある核酸の量を決定する方法を提供することが、本発明の目的である。これらの核酸は、ＤＮＡ等、二重鎖であり得る。
【００１４】
検査されることになる生物学的試料において癌性の細胞の存在を検出する方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１５】
ヒト又は動物の対象における癌の存在、及び／又は、起こりそうな癌の発生の診断を可能にする方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、独立項において定義された方法が提供される。本発明の好ましい実施形態のうちいくつかは、特に従属項において見ることができる。
【００１７】
本発明の一実施形態によると、少なくとも１つの生物学的試料内に存在する少なくとも１つの細胞における、核ＤＮＡ等の細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）前記細胞内の核の位置及び／又は大きさをｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された前記核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ、
を含む。
【００１８】
１つの例証的な実施形態において、前記核の位置及び／又は大きさは、紫外線及び／又は位相差顕微鏡法を用いることにより前記少なくとも１つの細胞において（おおよそ）決定することができる。紫外線がステップ（ａ）において使用される場合、波長が約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの紫外線を使用することが好ましい。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍ等の波長である。
【００１９】
別の例証的な実施形態では、ステップ（ｂ）において紫外線吸光度を測定するために、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線が使用される。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍ等の波長である。
【００２０】
さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーに前記少なくとも１つの細胞を接触させることができ、次に、ステップ（ｂ）において、紫外線吸光度によって、細胞核の二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定する。この最終段階まで、例えば約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの波長を有する紫外線を使用することができる。
【００２１】
しかし、本発明の他の例証的な実施形態において、例えば免疫組織化学染色、フォイルゲン反応等の化学反応、又は、蛍光マーカーにより、前記細胞のＤＮＡ等、前記細胞核の核酸を可視化する必要はない。
【００２２】
このように、本発明の方法は、細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定する、並びに、前記核の境界線内の紫外線吸光度を決定するという基本概念を実現する種々の実施形態を含む。核の境界線を決定することに相当する核の位置及び／又は大きさを決定することに対して、可視光線を用いた位相差顕微鏡法、並びに、紫外線を用いた検出法を使用することができる。核の紫外線吸光度を決定することに対しては、二重鎖核酸と相互作用することができる蛍光マーカーを加えることなく、単に紫外線測定に依拠することができるか、又は、そのようなマーカーを使用することができる。
【００２３】
このように、原理的には、位相差顕微鏡法を用いて細胞核を局在化し、上記のマーカーを用いることなく核の紫外線吸光度を決定することができる、位相差顕微鏡法を用いて細胞核を局在化し、上記のマーカーを用いて核の紫外線吸光度を決定することができる、紫外線吸光の測定を利用し、核を局在化して上記のマーカーなしで細胞核紫外線吸光度を測定することができる、並びに、紫外線吸光の測定を利用し、核を局在化して上記のマーカーで細胞核紫外線吸光度を測定することができる。
【００２４】
その例証的な実施形態のうち２つの実施形態において、本発明は、位相差顕微鏡法を用いた細胞核の局在化、及び、上記のマーカーを用いた核の紫外線吸光度の決定に関すること、又は、紫外線吸光の測定を利用した、核の局在化、及び、上記のマーカーを使用しない細胞核紫外線吸光度の測定に関することである。これら２つの実施形態は、以下においてさらに詳細に記述される。しかし、使用されることになる好ましい波長、マーカーの性質、検出装置等、特定の態様がこれら２つの実施形態の状況において取りあげられた場合、他に明白に示されていない限り、これらの説明が上記の本発明の他の実施形態に同等に適用されるということは当業者には明らかである。「細胞」、「癌性の細胞」、「試料」、「異数性」等の用語の定義は、当然ながら、他に示されていない限り本発明の種々の実施形態を通して同じ意味を有している。本発明により構想された種々の方法も、同じ目的のために使用することができる。
【００２５】
本発明の１つの例証的な実施形態において、細胞内のＤＮＡ等、細胞核の核酸の量を決定するための上記の方法を使用して、少なくとも１つの生物学的試料内の少なくとも１つの癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することができる。
【００２６】
上記の方法のさらなる実施形態において、細胞核信号強度と呼ぶこともできる細胞核紫外線吸光度を使用して、細胞の倍（異）数性状態を算出することができる。
【００２７】
これは、非癌性の種類であると知られる、細胞核ＤＮＡの内容物が既知である細胞に対して実質的に類似又は同一の条件のもと得られた細胞核紫外線吸光度に、得られた細胞核紫外線吸光度を参照することにより行うことができる。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態において、２又は４から少なくとも１０％はずれた異数性状態は、癌性の細胞を示しているとみなされる。
【００２９】
本発明の１つの実施形態において、上記の、細胞内のＤＮＡ等、細胞核の核酸の量を決定する方法を使用して、少なくとも１つの生物学的試料内の少なくとも１つの癌性の細胞を検出する。その細胞は、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる。
【００３０】
本発明のさらに別の実施形態において、上記の、細胞内のＤＮＡ等、細胞核の核酸の量を決定する方法は、生物学的試料の少なくとも１つの細胞の上で行われ、その生物学的試料は、骨髄細胞、リンパ節細胞、粘膜試料、末梢血試料、脳脊髄液試料、尿試料、浸出液試料、穿刺吸引液、末梢血擦過物、皮膚擦過物、パラフィン包埋組織、及び、凍結切片を含めた群から選択される。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態において、上記の特徴を有した、生物学的試料内の癌性の細胞を検出する方法は、紫外線吸光度信号、並びに、任意選択で位相差信号を検出、測定、及び算出することができる顕微鏡を使用する。好ましい実施形態では、共焦点レーザ走査顕微鏡が使用されるであろう。
【００３２】
前述の方法のうち全ての方法において、核を検出して細胞核紫外線吸光度を測定するために、所定の単一波長を有する（紫外）光線に依拠することができる。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）前記対象から生物学的試料を提供するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記試料のうち少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定された核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた細胞核信号強度から、前記少なくとも１つの細胞の倍数性状態を算出するステップ；並びに、
（ｅ）前記倍数性状態に応じて、癌の存在及び／又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【００３４】
本発明による診断方法は、細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定する、並びに、前記核の境界線内の紫外線吸光度を決定するという基本概念を実現する種々の実施形態も含む。核の境界線を決定することに相当する核の位置及び／又は大きさを決定することに対して、可視光線を用いた位相差顕微鏡法、並びに、紫外線を用いた検出法をここでも使用することができる。核の紫外線吸光度を決定することに対しては、二重鎖核酸と相互作用することができる蛍光マーカーを加えることなく、単に紫外線測定に依拠することができるか、又は、そのようなマーカーを使用することができる。
【００３５】
前記診断方法は、ここでも主に２つの例証的な実施形態、すなわち、位相差顕微鏡法を用いて細胞核を局在化し、上記のマーカーを用いて核の紫外線吸光度を決定すること、又は、紫外線吸光の測定を利用し、核を局在化して上記のマーカーなしで細胞核紫外線吸光度を測定することに関して記述されるが、使用されることになる好ましい波長、マーカーの性質、検出装置等、特定の態様がこれら２つの実施形態の状況において取りあげられた場合、他に明白に示されていない限り、これらの説明が上記の本発明の他の実施形態に同等に適用されるということを当業者は理解するであろう。「細胞」、「癌性の細胞」、「試料」、「異数性」等の用語の定義は、当然ながら、他に示されていない限りこれら本発明の種々の実施形態を通して同じ意味を有している。
【００３６】
当然ながら、特定の波長又は特定種類の顕微鏡を用いる等、上記の態様は、診断の状況において同等に適用される。
【００３７】
このように、１つの例証的な実施形態において、前記核の位置及び／又は大きさは、紫外線及び／又は位相差顕微鏡法を用いることにより前記少なくとも１つの細胞において（おおよそ）決定することができる。紫外線がステップ（ｂ）において使用される場合、波長が約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの紫外線を使用することが好ましい。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍ等の波長である。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態では、ステップ（ｂ）において、前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさは、単に位相差顕微鏡法によって決定される。
【００３９】
別の例証的な実施形態では、ステップ（ｃ）において紫外線吸光度を測定するために、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線が使用される。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍ等の波長である。
【００４０】
さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーに前記少なくとも１つの細胞を接触させることができ、次に、ステップ（ｃ）において、細胞核の二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定する。この最終段階まで、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの波長を有する紫外線を使用することができる。
【００４１】
前記診断方法の別の例証的な実施形態において、例えば免疫組織化学染色、フォイルゲン反応等の化学反応、又は、蛍光マーカーにより、前記細胞のＤＮＡ等、前記細胞核の核酸を可視化する必要はない。
【００４２】
蛍光マーカーが使用されることになる場合、上記及び下記の同じ種類のマーカーを１又は複数の細胞に接触させることができる。
【００４３】
本発明のこの態様におけるさらに別の実施形態は、前述の特徴を含んだ方法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関し、２ｎ又は４ｎ（ｎは染色体の数）から少なくとも１０％はずれた倍数性状態は、癌性の細胞、従って、癌の存在、又は、（今後）起こりそうな癌の発生を示している。
【００４４】
当然ながら、前記診断方法に関することであるこれらの本発明の態様に対して、上記と同じ試料から生物学的試料を選択することができる。
【００４５】
従って、記述された診断方法により診断及び／又は予測された癌を、上記と同じ群の癌から選択することができる。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態において、ヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法は、紫外線吸光度信号、蛍光信号を検出することができ、任意選択で、位相差の目的に対して使用することができる顕微鏡を使用する。核の位置及び／又は大きさ、並びに、細胞核紫外線吸光度の決定に対しては、共焦点レーザ走査顕微鏡を使用することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
ＤＮＡサイトメトリーによる癌性の細胞の同定は、一般的に、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて実行される。
【００４８】
ＩＣＭと呼ぶこともできるＤＮＡイメージサイトメトリーの場合には、ＤＮＡを可視化するために、ＤＮＡはマーカーで染色される。その後、一般的に異数性と呼ばれるＤＮＡの量における変化、又は、構造的染色体異常を使用して、癌性の細胞の存在を検出する。それは、異数性が、すでに実在している癌性の状態、又は、発生している移行期の癌性の状態の特徴であるとみなされるためである。従って、ＤＮＡ異数性の検出は、癌性の細胞を検出することによる早期且つ敏感な癌の診断を可能にし、その診断は、組織診の形態学的及び組織学的特徴づけより何年も前に進められる場合が多くある。
【００４９】
しかし、上記のように、フォイルゲン染色法等の確立されたＤＮＡ発色反応は、面倒で時間がかかる。
【００５０】
本発明者等は、細胞核ＤＮＡの量、従って、細胞の倍数性状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するのに、免疫組織化学染色、蛍光マーカー、又は化学反応も必要でないことを意外にも発見した。
【００５１】
その代わり、本発明者等は、細胞内の核の位置及び／又は大きさ／境界線が決定されると、単に紫外線に依拠して前記核による紫外線吸光度を決定することができるということを発見した。次に、決定された紫外線吸光度を使用して、細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出することができる。これらの発見は、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの好ましい波長を有した紫外線を使用する場合に特に適用される。
【００５２】
本発明者等は、以外にも、生物学的試料内の癌性の細胞を検出するというＤＮＡイメージサイトメトリーベースの方法において、細胞内にある二重鎖核酸に特異的に相互作用する能力がある蛍光マーカーも使用することができるということをさらに発見した。
【００５３】
このように、一実施形態における本発明は、少なくとも１つの生物学的試料に存在する少なくとも１つの細胞の細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法を対象としており、当該方法は：
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された前記核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップ、
を含む。
【００５４】
概説したように、基本的には、核の位置及び／又は大きさ、従って、境界線の決定を可能にするいかなる方法もステップ（ａ）において使用することができる。そのような例の１つは、位相差顕微鏡法である。しかし、ステップ（ａ）において、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの好ましい波長の紫外（ＵＶ）線のみを使用することが好ましい。ステップ（ａ）及び（ｂ）において特に好ましい波長は、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍである。
【００５５】
位相差顕微鏡法を使用する場合、１または複数の細胞を前記又は下記の蛍光マーカーの１つに接触させることにより、細胞核紫外線吸光度、すなわち細胞核信号強度を決定することが好ましい。
【００５６】
しかし、本発明の他の例証的な実施形態において、細胞を蛍光マーカーに接触させることにより細胞核の核酸の可視化に寄与する必要はない。
【００５７】
そのような方法を使用して、とりわけ個体又は種のゲノムサイズを決定することができる。当然ながら、そのような方法を使用して、少なくとも１つの生物学的試料内の少なくとも１つの癌性の細胞を検出することもできる。これは、得られた細胞核紫外線吸光度を、同じ手法を用いて分析された非癌性の細胞の細胞核紫外線吸光度と比較することにより行うことができる。
【００５８】
提示されたように、本発明の方法は、細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定する、並びに、前記核の境界線内の紫外線吸光度を決定するという基本概念を実現する種々の実施形態を含む。核の境界線を決定することに相当する核の位置及び／又は大きさを決定することに対して、可視光線を用いた位相差顕微鏡法、並びに、紫外線を用いた検出法を使用することができる。核の紫外線吸光度を決定することに対しては、二重鎖核酸と相互作用することができる蛍光マーカーを加えることなく、単に紫外線測定に依拠することができるか、又は、そのようなマーカーを使用することができる。
【００５９】
このように、原理的には、位相差顕微鏡法を用いて細胞核を局在化し、上記のマーカーを用いることなく核の紫外線吸光度を決定することができる、位相差顕微鏡法を用いて細胞核を局在化し、上記のマーカーを用いて核の紫外線吸光度を決定することができる、紫外線吸光度を測定し、核を局在化して上記のマーカーなしで細胞核紫外線吸光度を測定することができる、並びに、紫外線吸光度を測定し、核を局在化して上記のマーカーで細胞核紫外線吸光度を測定することができる。
【００６０】
その例証的な実施形態のうち２つの実施形態において、本発明は、位相差顕微鏡法を用いた細胞核の局在化、及び、上記のマーカーを用いた核の紫外線吸光度の決定に関すること、又は、紫外線吸光の測定を利用した、核の局在化、及び、上記のマーカーを使用しない細胞核紫外線吸光度の測定に関することである。これら２つの実施形態は、以下においてさらに詳細に記述される。しかし、使用されることになる好ましい波長、マーカーの性質、検出装置等、特定の態様がこれら２つの実施形態の状況において取りあげられた場合、他に明白に示されていない限り、これらの説明が上記の本発明の他の実施形態に同等に適用されるということは当業者には明らかである。「細胞」、「癌性の細胞」、「試料」、「異数性」等の用語の定義は、当然ながら、他に示されていない限り本発明の種々の実施形態を通して同じ意味を有している。本発明により構想された種々の方法も、同じ目的のために使用することができる。
【００６１】
本発明の実施形態のうちのいくつかがさらに詳細に記述される前に、以下の定義が導入される。
【００６２】
本明細書において、及び、添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数名詞は、何か他に明確に述べられていない限りその名詞の複数形も含む。従って、「マイクロキャリアビーズ」という用語は、１を超えたマイクロキャリアビーズ、すなわち、２個、３個、４個、５個等のマイクロキャリアビーズを含むことができる。
【００６３】
本発明の状況において「約」という用語は、問題における特徴の技術的効果を依然として確実にすると当業者は理解するであろう精度の差を意味している。その用語は、一般的に、＋／−１０％、好ましくは＋／−５％という示された数値からの偏差を示している。波長の状況において「約」という用語は、１．５％、好ましくは１％、最も好ましくは０．５％の偏差に関している。
【００６４】
本発明の目的に対して、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は細胞の分析を意味しており、前記細胞はその自然環境から単離され、ヒト又は動物の体外で調査される。
【００６５】
本発明の目的に対して、「癌性の細胞」という用語は、いかなる細胞、細胞組織、又は、細胞からなる器官にも関し、当該細胞の一部又は全てが、染色体の複製、欠失、挿入、転座等の結果として、非癌性の細胞に対して決定された細胞核ＤＮＡの量からはずれた細胞核ＤＮＡの量を含んでいる。
【００６６】
染色体ＤＮＡの挿入、複製、欠失、及び転座が、癌の発生に対する大きな原因であり、従って、癌性の細胞の特徴であるとみなすことができるということは既知である。
【００６７】
本発明の目的に対して、「生物学的試料」という用語は、ヒト又は動物の対象の細胞からなる物質、好ましくは細胞を含んだいかなる試料にも関し、これらの細胞における細胞核ＤＮＡの量、特に、癌性の細胞の存在が検査されることになる。
【００６８】
従って、そのような生物学的試料は、骨髄細胞、リンパ節細胞、リンパ球、赤血球、神経細胞、筋細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、粘膜試料、末梢血試料、脳脊髄液試料、尿試料、浸出液試料、穿刺吸引液、穿刺吸引細胞生検用生体組織、ブラシ生検用生体組織、末梢血擦過物、皮膚擦過物、剥離された細胞由来のスメア、体液由来の細胞遠心分離された標本（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、（機械的及び／又は酵素的分散後の）細胞分離標本、パラフィン包埋組織、並びに、凍結切片を含めた群から選択することができる。
【００６９】
「細胞核信号強度」という用語は、一般的に、蛍光マーカーを使用する状況において使用され、以下においてさらに説明される。核に局在化される蛍光マーカーによって、紫外線が吸収されるほど信号強度は通常高くなることを考慮に入れると、細胞核信号強度は細胞核紫外線吸光度と相互関係があるということを当業者は理解するであろう。
【００７０】
本発明の目的に対して、「蛍光マーカー」という用語は、二重鎖核酸と特異的に相互作用することができ、適した光源を用いた励起により蛍光信号を与えるいかなる分子も意味している。一般に、本発明による蛍光マーカーは、約１００ｎｍ（ＵＶ）から約８００ｎｍといった波長の光を吸収する。
【００７１】
そのような蛍光マーカーは、例えばＤＮＡの主溝又は副溝に結合することができる。蛍光マーカーは、核酸塩基挿入剤でありえ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、及び臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を含めた群から選択することができる。蛍光マーカーは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎも含む。
【００７２】
他の蛍光剤は、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰ−１、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＪＯＪＯ−１、ＰＯＰＯ−２、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＳＹＴＯ  ４０  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ）、ＳＹＴＯ  ４１  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４２  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４３  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４４  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４５  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ９  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １０  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １１  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １２  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １３  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １４  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １５  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １６  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２０  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２１  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２２  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２３  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２４  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２５  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２６  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２７  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ＢＣ  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８０  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８１  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８２  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８３  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８４  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８５  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８６  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １７  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ５９  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６１  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １７  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６２  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６３  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６４  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、アクリジンホモダイマー、アクリジンオレンジ、７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）、アクチノマイシンＤ、ＡＣＭＡ、ＤＡＰＩ、ジヒドロエチジウム、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）、エチジウムモノアジド、ヨウ化ヘキシジウム、ヘキスト３３２５８（ビスベンズイミド）、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３４５８０、ヒドロキシスチルバミジン、ＬＤＳ  ７５１、又は、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｙｅｌｌｏｗを含む。これら全ての化合物が、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  ＧｍｂＨ、ドイツから入手可能である。
【００７３】
本発明の目的に対して、「二重鎖核酸と相互作用する」という用語は、少なくとも１つの蛍光マーカーが二重鎖構造を有する核酸と相互作用する能力を意味している。
【００７４】
蛍光マーカーは、１つの好ましい実施形態において、特異的に二重鎖核酸と相互作用することができる。この状況において、「二重鎖核酸と特異的に相互作用する」という用語は、少なくとも１つの蛍光マーカーが二重鎖構造を有する核酸と優先的に相互作用する能力を意味している。
【００７５】
優先的な結合は、同一の条件下で二重鎖核酸とは相互作用するが、一重鎖核酸とは相互作用しない、又は、少なくとも相互作用したとしてもより少ない程度で相互作用する蛍光マーカーの能力を意味している。
【００７６】
蛍光マーカーが二重鎖核酸と優先的に相互作用するが、一重鎖核酸とは相互作用しないかどうかは、単離され不動化された二重鎖核酸及び単離され不動化された一重鎖核酸と同一の条件下で同時に接触させ、さらに、室温にてインキュベートさせるというｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験により決定することができる。その後、洗浄バッファーが適用される。上記のように波長を放出する適した光源を用いた励起後、二重鎖核酸において、一重鎖核酸よりも強い信号が観察された場合、その蛍光マーカーは二重鎖核酸に対して特異的であるとみなされる。
【００７７】
別の実施形態では、蛍光マーカーは、上記のように二重鎖核酸に対して特異的ではないが、核酸に結合されていない場合と比較して、核酸と結合された場合により強い蛍光信号を与えるという能力を有している場合がある。
【００７８】
例えば臭化エチジウムの場合、蛍光信号は、二重鎖核酸に結合された場合に２０倍まで、一重鎖の分子に結合された場合に１０倍まで増加する。ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉでは、蛍光信号は、二重鎖のＤＮＡに結合された場合に２００倍まで増加する。このように、本発明によると、以下に説明するように核染色と細胞質染色とを区別するため、二重鎖核酸に特異的なマーカーを有する必要が絶対にあるというわけではない。ＤＮＡに結合した時、より明るい信号を生じるマーカーを使用する場合に、以下において説明するように洗浄を回避することができるかもしれない。
【００７９】
当然ながら、好ましい実施形態において、例えば、二重鎖核酸と特異的に相互作用し、非結合の状態と比較して結合の状態においてより強い信号を与える能力を有する臭化エチジウム等のマーカーを使用することができる。
【００８０】
細胞の核の位置及び／又は大きさ、すなわち境界線を決定する前に、並びに、前記少なくとも１つの生物学的試料内の少なくとも１つの（推測上癌性の）細胞を、二重鎖核酸と特異的に結合することができる前記少なくとも１つの蛍光マーカーと接触させる前にも、本発明のいくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの（推測上癌性の）細胞が紫外線吸光の測定のために調製されるように生物学的試料を調製する必要がある及び／又は調製することが望ましい場合がある。
【００８１】
ＤＮＡイメージサイトメトリーにおいて生物学的試料内の細胞を調査するための生物学的試料の調製は当業者には既知であり、試料の希釈、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による同種の細胞集団の単離、イムノエンリッチメント、又は、酵素的加水分解、機械的若しくは浸透圧的破裂、（密度）遠心分離、クロマトグラフィー、バッファー透析（ｂｕｆｆｅｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ）等を含めた古典的な細胞生物学及び生化学技術を用いた、骨髄細胞、リンパ節細胞、リンパ球、赤血球、肝細胞、腎細胞、神経細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞等、特定の細胞型の集積及び精製を含むことができる。
【００８２】
必要に応じて、固体の基板上に不動化された細胞試料を固定させることができる。この状況において当業者は、乾燥性の、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、エタノール、プロパノール、メタノール−アセトン、メタノール−氷酢酸、メタノール−ホルマリン−氷酢酸等、典型的な固定エイドを検討するであろう。
【００８３】
いくつかの場合において固定は有用であり得るけれども、常に必要であるというわけではない。統合装置を用いて試料が調査される場合、細胞を固定するのではなく、単に不動化することを推薦できる。
【００８４】
しかし、固定が検討された場合、スタンダードプロトコールに従い実施することができ、前記スタンダードプロトコールは、例えば：
パラホルムアルデヒドの場合：
●  ４％ＰＦ含有ＰＢＳ溶液を細胞に添加するステップ
●  室温にて５〜３０分間インキュベートするステップ
●  ＰＢＳで洗浄するステップ
を含み、
メタノール／アセトンの場合：
●  細胞を有する基板を氷のように冷たい１００％メタノール内に置くステップ
●  −２０℃で５〜３０分間インキュベートするステップ
●  細胞を有する基板を１００％アセトンで洗い流すステップ
●  アセトンを蒸発させるステップ
を含んでいる。
【００８５】
上記の作業、すなわち、試料の単離及び調製、細胞の単離及び調製、細胞の不動化、透過化、及び固定化に使用することができるプロトコールは、例えば蛍光顕微鏡法に対する、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ，Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．ｅｄ（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ｅｄ．（１９９４）等の標準的な細胞生物学の教科書及び実験マニュアルから手に入れることができる。
【００８６】
次に、例えば、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという好ましい波長の紫外（ＵＶ）線を用いて、若しくは、例えば位相差顕微鏡法を用いて、前記細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するために、ステップ（ａ）に進むことができる。
【００８７】
以下において、本発明の２つの例証的な実施形態がさらに詳細に取りあげられている。以下で実施形態１と呼ばれる第一の実施形態において、核の局在化及び細胞核紫外線吸光度の決定が、好ましい波長の紫外線を用いて行われ、位相差顕微鏡法及び／又は蛍光マーカーの使用は必要としないことが好ましい。以下で実施形態２と呼ばれる第二の実施形態では、核の局在化及び細胞核紫外線吸光度の決定が、位相差顕微鏡法及び蛍光マーカーを用いて行われる。蛍光マーカーが使用される場合のインキュベーション及び洗浄ステップ、検出装置、並びに、紫外線の波長範囲等、より徹底的に詳しく取りあげられるこれら２つの実施形態の特定の態様は、それにもかかわらず、上記で構想された他の実施形態に同様に適用することができると当業者は理解する。この２つの実施形態の問題のうちいくつかが記述された後、どのように細胞核紫外線吸光度／細胞核信号強度を使用して細胞の倍数性状態、従って発癌特徴の存在及び／又は発生しそうな発癌特徴を決定することができるのかが次に取りあげられる。
【００８８】
実施形態１−核酸の量の決定
言及されたように、一実施形態において本発明は、少なくとも１つの生物学的試料に存在する少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法を対象とし、当該方法は：
（ａ）前記細胞内の核の位置及び／又は大きさをｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ；
（ｂ）約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという好ましい波長の紫外線を用いて、ステップ（ａ）で決定された前記核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ；
を含む。
【００８９】
しかし、好ましい実施形態において、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという好ましい波長の紫外（ＵＶ）線が使用されるであろう。ステップ（ａ）及び（ｂ）において特に好ましい波長は、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍである。
【００９０】
上記で明示された、少なくとも１つの生物学的試料内の少なくとも１つの癌性の細胞の検出に使用されることが好ましい細胞核の核酸の量を決定する方法は、次に、１つのステップ（ａ）から（ｂ）に関してより詳細に記述される。
【００９１】
前述されたように細胞が調製されると、次に、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという好ましい波長の紫外（ＵＶ）線を用いて前記細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するために、ステップ（ａ）に進むことができる。
【００９２】
ＤＮＡは、蛋白質と比較して異なる能率で、２３０から２９０ｎｍという波長の紫外線を吸収する。図４では、蛋白質及びＤＮＡのこの波長領域における吸光度が、波長を関数として曲線で表されている。この図から、２５０ｎｍ等、約２４０ｎｍから２８０ｎｍという波長の紫外線を用いた場合に、ＤＮＡが蛋白質よりもはるかに多く（約５０倍以上）光を吸収するということをはっきりと見ることができる。
【００９３】
この作用を使用して、細胞核の境界線、すなわち、位置及び／又は大きさを決定することができる。
【００９４】
例えば、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの光を放出する光点を使用し、この光点を細胞中に用いて、該細胞の１つの面内を走査することができる。これは、例えば、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて行うことができる。核は細胞のＤＮＡをほぼ全て含み、さらに、細胞質は主として蛋白質からなるため、光点が細胞質から細胞核まで横断すると、吸光度において急な増加を観察するであろう。従って、そのような光点で細胞の面の断面が走査された場合、吸光度の変化を測定することにより細胞核の境界線を明白に同定することができる。
【００９５】
従って、本発明の目的に対して細胞内の核の境界線は、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという好ましい波長の紫外線を用いて決定することができる。本発明のさらに好ましい実施形態では、波長は、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍである。
【００９６】
共焦点顕微鏡装置を用いて、細胞の核の内部にあるプローブに焦点を合わせることができる。一般的に、共焦点装置のプローブスポットは核よりも小さくなるようにする。
【００９７】
この方法を用いて、１つのフレーム内の核の位置を突きとめるだけでなく、核全体の大きさ、すなわちその容積を実際に決定することができる。
【００９８】
これは、以下のように行うことができる。記述されたように１つの面において光点を走査させることによって、反射光の強度を記述されたように決定することができる。移動の方向において信号が比較的低い箇所の距離により、核の局所的な厚さが測定される。
【００９９】
核の一面内での一走査を図５が示しているように、これら１−Ｄ走査を三次元まで広げて、異なる面に対して同じ測定を行うことにより、核の全形を得ることができる。異なる座標（ｘｙ）で、核の局所的な厚さがｚ方向において測定される。このように、種々の面の異なる１−Ｄ画像から３−Ｄ画像を再構築することにより、核の外見を再構築して、核の容積を算出することができる。
【０１００】
共焦点装置により測定された、核から反射された紫外線の量は、スポットによりプローブされた領域によって吸収された光の量に逆に関係している。吸光は核を通してほぼ等しいと仮定すると、次に、好ましくは、その測定値を較正して、細胞核の核酸の紫外線吸光度を決定することができる。
【０１０１】
較正は、共焦点走査において同じ面内にある核及び核外の領域により紫外線の吸光度を決定することからなる。核内及び核外における測定どちらに対しても、光は、関心のある細胞に到達する前に組織のほぼ同じ量及び同じ距離だけ伝わり、どちらの測定においても、類似のバックグラウンド信号を生じた。従って、細胞核による吸光対細胞核によらない吸光に対する測定値間の比は、細胞核の吸光に対する絶対測定として利用することができる。しかし、単層の細胞が分析される場合、必ずしも信号を較正する必要があるわけではない。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態では、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線が使用される。特に好ましい実施形態では、２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長を有した紫外線が使用される。
【０１０３】
紫外線、特に、２４０ｎｍから２８０ｎｍという波長の紫外線を使用する理由は、ここでも、細胞の核に存在するＤＮＡが、この波長範囲において、その細胞の蛋白質よりもはるかに高い吸光度を示すためである（図４参照）。
【０１０４】
従って、蛋白質もＤＮＡも含有している核は、ＤＮＡではなく主に蛋白質を含有する残りの細胞よりも光を吸収するであろう。
【０１０５】
共焦点レーザ走査顕微鏡を好んで使用することにより、核内の物質による紫外線の反射を測定し、その値を核外の細胞物質による反射と比較することができる。従って、核により吸収された紫外線対核外の領域により吸収された紫外線の比を算出することによって、共焦点走査で得られた一面内のＤＮＡの密度に対する測定値である信号が得られる。
【０１０６】
このように、細胞核の紫外線吸光の測定値は、本発明によると、特に核内の紫外線吸光度信号を較正することにより得られる。１つの面の（較正された）信号を、同じ面の信号のみが比較された場合に、紫外線吸光の測定値として利用することができる。しかし、核の容積の決定に使用された種々の面（上記参照）の（較正された）信号を加算して、核全体の紫外線吸光の測定値を得ることもできる。
【０１０７】
この全ては、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線を用いた共焦点レーザ走査顕微鏡法を使用して行われることが好ましい。特に好ましい実施形態では、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという紫外線が使用される。
【０１０８】
当業者は、当然ながら、紫外線吸光度信号を記録する方法、並びに、これらの信号を使用して、例えば細胞核の画像を算出する方法に精通している。
【０１０９】
信号強度、すなわち、吸収された又は透過された光の量の決定は、一般的にこれらの目的のために使用される機器を用いて行われる。
【０１１０】
信号の検出に対しては、紫外線吸光度信号を検出する能力がある顕微鏡を使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、同じ顕微鏡が、１又は複数の細胞を見るために必要とされた装置、及び、位相差においてもその細胞を検査するために必要とされた装置を提供することができる。紫外線吸光度信号を検出するために好んで使用することができる１つの顕微鏡のタイプは、共焦点レーザ走査顕微鏡であり得る。
【０１１１】
共焦点顕微鏡法は、従来の光学顕微鏡法と比較していくつか利点を提供しており、最も重要な利点のうちの１つは、画像を歪めてしまう焦点がずれた情報の除去、制御可能な被写界深度、及び、サブミクロン解像度である。共焦点顕微鏡法のさらなる利点は、標本のうち焦点がずれた種々の部分における蛍光を取り除くことができるので、焦点の合った部分又は切片を妨害せず、その結果、古典的な光学顕微鏡法によって得られた類似の画像よりもかなり鮮明でより良い解像度を示す画像を生じることである。
【０１１２】
共焦点走査顕微鏡法の基本原理は、対物レンズの焦点が合わされた点に「結合」された顕微鏡レンズシステムの焦点にピンホールを有したスクリーンの使用である。対物レンズの焦点からの光のみがピンホールにて集められ、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）であり得る検出器を通り抜けることができる。試料のうち焦点がずれた切片からの光は、ほぼ完全に取り除かれる。
【０１１３】
このように、共焦点顕微鏡は、ｘ及びｙ方向に対して従来の顕微鏡よりも有意に優れた解像度を有している。さらに、共焦点顕微鏡は、ｚ方向においてより浅い被写界深度を有している。このように、試料中焦点を走査することにより、試料の異なる面を見ることが可能であり、従って、試料の３次元画像を再構築することが可能である。さらに、共焦点顕微鏡法は、種々の波長の光と両立し得る。
【０１１４】
核の局在化に対して、共焦点走査顕微鏡は、単色光又は多色光を使用することができる。しかし、２４０ｎｍから２８０ｎｍという波長を有した単色紫外線が好ましい。特に好ましいのは、２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長の紫外線であり得る。
【０１１５】
共焦点レーザ走査顕微鏡として、ＬＥＩＣＡ  ＤＭＬＭ等で、蛍光信号の信号強度を測定するためのＱｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｇｉｔａ  ２０００Ｒ  ＦＡＳＴＣｏｏｌｅｄ  Ｍｏｎｏ  １２−ｂｉｔカメラ装置（ｗｗｗ．ｑｉｍａｇｉｎｇ．ｃｏｍ）を有した顕微鏡を使用することができる。
【０１１６】
信号強度、すなわち、吸収された又は透過された光の量の決定は、一般的にこれらの目的のために使用される機器を用いて行われる。
【０１１７】
従って、例えば、前述の光源を用いて励起された場合にその細胞を見るために使用される顕微鏡の口径につながれた電荷結合素子又はデジタルカメラを使用することができる。当然ながら、フィルム等も使用することができる。
【０１１８】
検出装置は、例えば、ＢＱ６０００フレームグラバーボードを介してコンピュータに接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７００  ＣＥ  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラであり得る。或いは、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＶ−Ｃ２０  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラを使用することができる。画像分析用ソフトウェアパッケージは、例えば、Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｔｒｕｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ９８  ｖ３．５０．６  画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ社，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）、又は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ３．０画像分析ソフトウェアであり得る。使用することができる別のシステムは、デュアル・モードに基づいたＢｉｏＶｉｅｗ  Ｄｕｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＶｉｅｗ  Ｌｔｄ社，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）、全自動の顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＸＹ電動８スライドステージ（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ社，Ｗｅｔｚｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３ＣＣＤプログレッシブスキャンカラーカメラ（ＤＸＣ９０００，Ｓｏｎｙ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、並びに、システムの制御及びデータの分析用コンピュータである。
【０１１９】
本発明の利点のうちの１つは、細胞核の境界線の決定及び細胞核紫外線吸光の測定が、共焦点レーザ走査顕微鏡等の同じ機器で行われることである。
【０１２０】
別の利点は、２４０ｎｍから２８０ｎｍ、特に２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、及び／又は２６０ｎｍという好ましいＵＶ波長が、核、及び、存在する細胞核ＤＮＡの量を算出するために使用することができる紫外線吸光値を確実に同定するのに十分であるので、本発明には、例えば蛍光マーカー（これらは使用される可能性があるけれども）、化学反応、又は、免疫組織化学染色で細胞核ＤＮＡを可視化する必要がないことである。
【０１２１】
実施形態２−核酸の量の決定
言及されたように、一実施形態において本発明は、少なくとも１つの生物学的試料に存在する少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法を対象とし、当該方法は：
（ａ）前記少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーに前記少なくとも１つの細胞を接触させるステップ；
（ｂ）適した光源を用いた励起により得られる信号によって、二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの信号強度を決定するステップ；
（ｃ）位相差顕微鏡法により、前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）で得られた信号強度をステップ（ｃ）で得られた核の位置及び／又は大きさと相関させることにより、細胞核の二重鎖核酸に結合している蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定するステップ；
を含む。
【０１２２】
本発明の別の実施形態において、ステップ（ｃ）からステップ（ａ）に進み、ステップ（ｄ）はステップ（ｂ）に続くことができる。
【０１２３】
検査されることになる前記少なくとも１つの生物学的試料の少なくとも１つの（推測上癌性の）細胞を含んだ細胞が適した様式で調製されると、不動化され、任意選択で透過化及び固定化された細胞を、細胞内にある二重鎖核酸に特異的に相互作用する能力がある前記少なくとも１つの蛍光マーカーと接触させることができる。
【０１２４】
この目的のために、前記少なくとも１つの蛍光マーカーを、適したインキュベーションバッファーにおいて配合することができる。原理的には、いかなる中性ｐＨの等張バッファーも使用することができる。
【０１２５】
そのような溶液含有の蛍光マーカーを用いて、細胞試料を少なくとも４℃の温度で少なくとも１０秒間インキュベートすることができる。一般的に、及び、好ましくはいくつかの例において、インキュベーションは室温（例えば２０〜２５℃）にて数分間行われる。
【０１２６】
前記少なくとも１つの生物学的試料から得られた前記細胞試料のうちの少なくとも１つの（推測上癌性の）細胞が、二重鎖核酸に特異的に相互作用する能力がある前記少なくとも１つの蛍光マーカーと接触させられると、上記でステップ（ｂ）と呼ばれた第２のステップにおいて、適した光源を用いた励起により得られた、インキュベートされた細胞内にある二重鎖核酸に特異的に結合されている前記少なくとも１つの蛍光マーカーの信号強度が決定される。
【０１２７】
前記信号強度が測定される前に、任意選択で、インキュベーション溶液含有の蛍光マーカーでインキュベートされた生物試料を洗浄して、信号のＳＢ比を高めることができる。そのような洗浄液は、非特異的な相互作用及びバックグラウンド信号を減らすために、より高い生理的塩濃度のバッファー、及び／又は、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ１００等の界面活性剤を有したバッファーを含むことができる。そのような洗浄バッファーは、例えば０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を有したＰＢＳ（ｐＨ７．４）を含むことができる。いかなる生理ｐＨの等張バッファーも使用することができる。蛍光マーカーは、非結合のマーカーと比較して、二重鎖核酸に結合した場合に増加した信号強度を示すので、洗浄ステップは任意である。しかし、改善されたＳＢ比のために、洗浄ステップは好ましいステップであり得る。
【０１２８】
励起は、蛍光マーカーを励起することができる光源を用いて行われる。一般に、光源は、約１００ｎｍから約８００ｎｍの波長を放出する。励起波長は、使用される蛍光マーカーの性質に依拠するであろう。臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、及びＤＡＰＩの場合、一般的に、約３００ｎｍから約５５０ｎｍに及ぶ紫外線が使用される。この後者の波長範囲は、ヨウ化プロピジウム等の他のマーカーに対しても好ましい場合がある。
【０１２９】
使用される蛍光マーカーの吸収スペクトルに応じて、光源は単色光又は多色光を放出することができる。
【０１３０】
蛍光マーカーの信号強度は細胞ごとに個別に測定され、それは、細胞の空間的分離を可能にするために顕微鏡の使用を必須にするということを理解されたい。
【０１３１】
信号の検出のために、蛍光信号を検出する能力を持つ顕微鏡を使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、同じ顕微鏡が、１又は複数の細胞を見るために必要とされた装置、及び、位相差においてもその細胞を検査するために必要とされた装置を提供することができる。蛍光信号を検出するために使用することができる１つの顕微鏡のタイプは、共焦点レーザ走査顕微鏡であり得る。しかし、本発明の方法に対して一般的に構想される用途には、必要とされたフィルター、検出装置、ソフトウェア等を装備した位相差顕微鏡が十分であり得る。
【０１３２】
信号強度、すなわち、吸収された又は透過された光の量の決定は、これらの目的のために一般的に使用される機器を用いて行われる。これらの機器のうちいくつかは、実施形態１の状況においてすでに記述されている。
【０１３３】
従って、例えば、前述の光源を用いて励起された場合にその細胞を見るために使用される顕微鏡の口径につながれた電荷結合素子又はデジタルカメラも使用することができる。当然ながら、フィルム等も使用することができる。
【０１３４】
発光スペクトルが総合感度のスペクトル範囲内にある場合、蛍光の測定は、ここでも、いかなる標準的な（バリアフィルター、励起フィルター、及びダイクロイックミラーからなる）フィルターキューブ、又は、特別な用途に対してカスタマイズされたいかなるフィルターキューブを用いても行うことができる。暗視野顕微鏡法及び位相差顕微鏡法等のいかなる標準的な空間フィルタリング方法と共にスペクトルバイオイメージングを使用することができ、さらには、偏向顕微鏡法と共に使用することさえもできる。
【０１３５】
蛍光マーカーにより生じた信号の蛍光光学読み取り（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅａｄ−ｏｕｔｓ）は、上記のように、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）を用いて記録することができ、前記電荷結合素子は、光学効果（拡散、反射）の定性的区別という目的のために（反射光顕微鏡（ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ−ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）又は透過光顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ−ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）による）暗視野及び蛍光物質の励起を得る。この工程において、細胞のイメージングは、高解像度オプティクスを用いた露光又は復元により生じる。米国特許第５３０４８１０号に記述されたもの等の共焦点走査システムは、試料のうち選択された面からの蛍光信号を評価することも可能にしている。共焦点走査システムは、ピンホールによる光軸に沿った蛍光信号の選択に基づき、強力なオートフォーカスシステムが装備される場合が多くある。そのようなシステムにより、蛍光マーカーから生じる信号を正確に突きとめること、及び、その信号強度を測定することが可能である。
【０１３６】
検出装置は、ここでも、例えば、ＢＱ６０００フレームグラバーボードを介してコンピュータに接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７００  ＣＥ  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラであり得る。或いは、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＶ−Ｃ２０  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラを使用することができる。画像分析用ソフトウェアパッケージは、例えば、Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｔｒｕｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ９８  ｖ３．５０．６  画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ社，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）、又は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ３．０画像分析ソフトウェアであり得る。使用することができる別のシステムは、デュアル・モードに基づいたＢｉｏＶｉｅｗ  Ｄｕｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＶｉｅｗ  Ｌｔｄ社，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）、全自動の顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＸＹ電動８スライドステージ（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ社，Ｗｅｔｚｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３ＣＣＤプログレッシブスキャンカラーカメラ（ＤＸＣ９０００，Ｓｏｎｙ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、並びに、システムの制御及びデータの分析用コンピュータである。
【０１３７】
このように、位相差を用いたＬＥＩＣＡ  ＤＭＬＭ等で、蛍光信号の信号強度を測定するためのＱｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｇｉｔａ  ２０００Ｒ  ＦＡＳＴＣｏｏｌｅｄ  Ｍｏｎｏ  １２−ｂｉｔカメラ装置（ｗｗｗ．ｑｉｍａｇｉｎｇ．ｃｏｍ）を有した顕微鏡も使用することができる。
【０１３８】
蛍光信号の信号強度を測定するための検出装置が飽和制限に達し得るということが既知である場合に、細胞試料を蛍光マーカーに接触させるために使用される蛍光マーカー溶液の希釈、及び／又は、対応して細胞試料の希釈が必要な場合がある。
【０１３９】
上記でステップ（ｃ）と呼ばれた第３のステップにおいて、前記少なくとも１つの（推測上癌性の）細胞を含んだ生物学的試料内の細胞の核の位置及び／又は大きさは、位相差顕微鏡法を用いて決定される。この目的のために、位相差を用いたＬＥＩＣＡ  ＤＭＬＭ等の典型的な顕微鏡を使用することができる。
【０１４０】
当業者は、位相差顕微鏡法による固定化及び不動化された細胞の顕微鏡分析に精通している。
【０１４１】
本発明の目的のために、蛍光マーカーにより生じた信号の検出を可能にし、同時に、位相差顕微鏡法によって、同じ細胞の目視、従って核の位置及び／又は大きさの決定を可能にする顕微鏡が使用されることが望ましい場合がある。この場合、前述された顕微鏡等の共焦点レーザ走査顕微鏡を使用することができる。蛍光信号と位相差の写真の記録を同時に可能にする顕微鏡は、特に、ＮＰｌａｎ  ２０ｘ／０．４０  ＰＨ１対物レンズ又はＮｐｌａｎ  ４０ｘ／０．６５  ＰＨ２対物レンズを有したＬＥＩＣＡ  ＤＭＬＭ等の顕微鏡を含む。しかし、蛍光信号の検出及び位相差顕微鏡法による細胞核の位置及び／又は大きさの決定は、異なる装置を用いても行うことができる。
【０１４２】
適した光源を用いた励起後に蛍光マーカーの信号強度が決定され、試料内の観察された細胞の核の位置及び／又は大きさが決定されると、上記でステップ（ｄ）と呼ばれた第４のステップにおいて、前記方法にうちの前述のステップ（ｂ）で得られた信号強度を前述のステップ（ｃ）で得られた核の位置及び／又は大きさと相関させることにより、二重鎖核酸、好ましくは細胞核ＤＮＡに特異的に結合している蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定することができる。蛍光信号強度を決定するモードにおいて細胞核を検出することは一般的にできないため、このステップは必要である。
【０１４３】
「細胞核信号強度」という用語は、細胞の核内にある（二重鎖の）核酸に結合した蛍光マーカーから生じる信号強度を意味している。
【０１４４】
「前述のステップ（ｂ）［又は、以下に記述される診断方法の状況においてはステップ（ｃ）］で得られた信号強度を前述のステップ（ｃ）［又は、以下に記述される診断方法の状況においてはステップ（ｄ）］で得られた核の位置及び／又は大きさと相関させる」という句は、蛍光信号強度を測定する際に細胞に対して得られた画像を、同じ細胞の位相差画像と重ね合わせ、次に、核から放出されている蛍光マーカー信号の信号強度を決定するということを意味している。それぞれの画像を重ね合わせること、及び、細胞核信号強度の決定は、当然ながら、上記のように既知の画像分析ソフトウェアパッケージを用いて行うことができる。
【０１４５】
従って、コンピュータベースのアルゴリズム、及び、一般的に、例えば共焦点レーザ走査顕微鏡が装備されたソフトウェアを用いて行うことができる相関において、細胞の核から放出されている信号のみが考慮に入れられる。位相差顕微鏡法を用いた核の大きさ及び／又は位置の決定は、細胞核からではなく、細胞質等の他の細胞構造体から生じ、ステップ（ｂ）において決定された全ての信号強度を無視するために必要な情報を用いたコンピュータベースのアルゴリズムを提供するのに必要である。
【０１４６】
この相関を行う理由は、大部分の二重鎖核酸が細胞核内に染色体ＤＮＡの形状で存在している場合、細胞核から生じる信号の方がより強いけれども、二重鎖核酸と特異的に相互作用する能力を持つ本発明による蛍光マーカーは、細胞核だけでなく、細胞中に蛍光信号を生じてしまうためである。
【０１４７】
例えば細胞の細胞質内にある二重鎖核酸分子から生じる信号は、例えば細胞核ＤＮＡ含有量の決定に負の影響を与えるので、本発明の方法は、細胞核から放出された信号のみを使用する。これにより、例えばＤＮＡ含有量測定の精度は有意に増加する。
【０１４８】
しかし、細胞核の大きさ及び／又は位置は、従来技術において行われてきた面倒な染色方法ではなく位相差顕微鏡法を用いて決定されるので、本発明による方法を行うのに必要とされる時間は有意に減少される。
【０１４９】
このように、細胞核の位置及び／又は大きさ、並びに、考慮されることになる蛍光信号の細胞核から放出された蛍光信号への後の制限を決定するために特異的に二重鎖核酸と相互作用することができる蛍光マーカーと位相差顕微鏡法を使用するという組合せによって、迅速で簡単な、細胞核内の二重鎖核酸の量の決定が可能になり、その結果、生物学的試料内にある癌性の細胞の検出が可能になる。
【０１５０】
考慮されることになる信号強度を、位相差顕微鏡法による生物学的試料内にある潜在的に癌性の細胞の核から放出される信号強度へ制限することによって、本発明による方法は、以下において説明されるように、迅速で正確な、細胞核内にある二重鎖核酸の量の決定を可能にする。
【０１５１】
本明細書において記述されるマーカーは、詳細に記述されてきたマーカーそのものであり得る。ＤＮＡの主溝又は副溝に結合する薬剤、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、臭化エチジウム、又は、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを含めた群から選択される蛍光マーカーが好ましいマーカーであり得る。臭化エチジウムは、生物学的なブラシ生検用試料内の上皮癌と関連した癌性の細胞の検出を特に可能にするので、特に好ましい場合がある。
【０１５２】
上記のように、二重鎖核酸に特異的な蛍光マーカーを位相差顕微鏡法と組み合わせて使用することによる生物学的試料内の少なくとも１つの癌性の細胞を検出する方法は、例えばフォイルゲン染色法と比較すると、ＤＮＡ−サイトメトリー法を早めることができる。
【０１５３】
位相差顕微鏡法のステップを介して、核を正確に突きとめてその大きさを決定し、次に、検査中の細胞の核から放出された蛍光信号のみを考慮することによってこの情報をさらなるＤＮＡ含有量の決定に使用することが可能である。位相差顕微鏡法が核の位置及び／又は大きさの決定に使用されるので、時間がかかり面倒である第２の反応においても核を染色する必要がない。
【０１５４】
核のサイズ及び位置が位相差顕微鏡法により決定されると仮定すれば、ＤＮＡ含有量測定は核から放出されている蛍光信号に基づき、従って、ＤＮＡサイトメトリー測定の精度が損なわれることはない。蛍光染色法は分の事柄であり、位相差測定は秒の事柄であるため、ＤＮＡイメージサイトメトリー測定は、以前から知られているＤＮＡイメージサイトメトリー法よりも有意に速いタイムトラックで行われる。従って、本発明のいくつかの実施形態において、本発明は、医院内での細胞のＤＮＡ含有量の測定さえも可能にする。
【０１５５】
本発明の一実施形態において、癌性の細胞は、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけることができる。
【０１５６】
本発明は、このように、細胞内の二重鎖核酸と相互作用することができる蛍光マーカーを使用することにより、生物学的試料内にある少なくとも１つの癌性の細胞を検出する方法を特に提供する。位相差顕微鏡法を行うことによって、核の位置及び／又は大きさを決定する。次に、細胞核から生じた信号のみがさらなる計算に使用されるように、この後者の情報を、例えばオーバーレイ写真において、例えば適切なソフトウェアパッケージを使用することにより、細胞全体に対して得られた蛍光マーカーの信号強度と相関させることができる。少なくとも１つの推測上癌性の細胞における蛍光マーカーの細胞核信号強度が得られると、この細胞核信号強度は、非癌性であると知られる、デンシトグラムの形状で倍数性状態（２又は４）が既知である類似又は同一の細胞型に対して同じ方法により得られた標準細胞核信号強度に参照される。次に、参照デンシトグラムの２若しくは４、又は、ピーク領域の値からの有意な偏差が、癌の発生を示しているとみなされる。
【０１５７】
上記のステップの順序は変更することができるということに当業者は気づくであろう。従って、まず試料を蛍光マーカーに接触させインキュベートさせて、位相差顕微鏡法を行い、次に蛍光信号強度を決定することによって、開始することができる。特定の状況において、例えば、まず位相差顕微鏡法を行い、次に試料を蛍光マーカーに接触させインキュベートさせて、最後に蛍光信号強度を測定することも可能な場合がある。
【０１５８】
或いは、ステップ（ｃ）からステップ（ａ）に進み、ステップ（ｄ）はステップ（ｂ）に続くことができる。
【０１５９】
倍数性状態の決定
以下において、実施形態１、実施形態２、又は、前述の他の実施形態のうちどれかによって得られた細胞核紫外線吸光度／細胞核信号強度が、どのようにして細胞の（推測上）癌性の状態を決定するために使用することができるかが記述される。
【０１６０】
大抵の哺乳動物細胞が各２対の染色体を含んでいることは常識である。従って、染色体の数は、ｎを染色体の数として２ｎで算出することができる。しかし、細胞は複製する時、娘細胞への染色体の分離が起こる前に染色体の数を２倍にする。
【０１６１】
従って、ＤＮＡ複製中及び細胞分裂の前に、哺乳動物細胞は、ここでもｎを染色体の数として４ｎで算出することができる多数の染色体を含む。
【０１６２】
哺乳動物細胞のＤＮＡ量が染色体の数に参照された場合、「健康な」又は「正常な」細胞と呼ぶこともできる非癌性の細胞のＤＮＡ含有量には、従って、細胞の複製状態に応じて２又は４の価を割り当てることができる。
【０１６３】
本発明の状況において「倍数性」という用語は、正常で非癌性の細胞のＤＮＡ含有量を意味し、説明されたように、２及び４の価を有することができる。
【０１６４】
例えば前述されたフォイルゲン染色法を使用することによる非癌性の細胞の倍数性状態の決め方も当技術分野では常識である。この状況においては、Ｈａｒｄｉｅ  ｅｔ  ａｌ．の刊行物（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２），５０（６），７３５−７４９）を、ＤＮＡ染色法を用いた細胞のＤＮＡ含有量の決定を記載している限り援用する。
【０１６５】
Ｈａｒｄｉｅ  ｅｔ  ａｌ．による参考文献の７３８頁にある“Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ”という項において、例えばフォイルゲン染色法、
蛍光マーカー、又は紫外線吸光度信号により得られた信号強度をどのようにして濃度測定値に変換することができるかが説明されている。上記において説明されたように、健康で非癌性の細胞は、ｎを染色体の数として、２ｎ又は４ｎの染色体を含む。従って、本発明において使用された細胞核紫外線吸光度信号から得られた信号強度の濃度測定分析は、２つのピーク領域を有した濃度プロファイルを生じる。
【０１６６】
（細胞が増殖している場合）これら２つのピーク領域には、２又は４の価がそれぞれ割り当てられる。そのような濃度プロファイルの例が図１に提供されている。特定の場合において、非増殖の細胞集団を分析し、なぜ４に対応するピークがないのかを説明した。一般的に非増殖性としても知られる同じ組織の細胞集団に対して４の価が観察された場合、増殖、この状況では癌性の状態を示している。
【０１６７】
手短に言えば、画像分析デンシトメトリーに対して、細胞を目視するため及び細胞核紫外線信号を測定するために使用される顕微鏡視野は、コンピュータに接続された、顕微鏡に取り付けられたＣＣＤ（電荷結合素子）検出装置又はデジタルカメラにより捕らえられる。デジタル化された画像の写真は、一連のピクセルとして記録され、各ピクセルには特有の色及び彩度が割り当てられる。次に、前記彩度は、一般的にコンピュータベースのアルゴリズムによって吸光度に変換され、次に、前述のデンシトグラムとして画像分析ソフトウェアにより表示される。
【０１６８】
当然ながら、正常で非癌性の細胞における、意義があり信頼できるデンシトグラムは、好ましくは数多くの細胞からなる集団から算出するべきであり、好ましくは、２５〜１００という多数の細胞が一般的には十分であるということに当業者は気づいている。従って、本発明の好ましい実施形態において細胞核ＤＮＡの量は、上記のように少なくとも約３０、４０、５０、又は６０個の細胞の細胞核紫外線吸光度を測定することにより決定される。
【０１６９】
本発明のさらなる実施形態では、細胞核紫外線吸光度を使用して、少なくとも１つの生物学的試料において癌性の細胞を検出することができる。当然ながら、前述の実施形態２に従い得られた、細胞核二重鎖核酸に結合している蛍光マーカーの細胞核信号強度を使用して、少なくとも１つの生物学的試料における少なくとも１つの癌性の細胞を検出することもできる。
【０１７０】
これは、本発明による上記の方法を用いて推測上癌性の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を決定することにより達成される。決定された倍数性状態は、次に、同一の方法により得られた細胞核信号強度から決定された非癌性の細胞の倍数性状態と比較される。
【０１７１】
従って、推測上癌性の細胞が実際に癌になりやすい細胞かどうかを決定するために、上記のようにデンシトグラムが決定される。非癌性の細胞に対して観察されたデンシトグラムは、「標準」又は「参照」デンシトグラムと呼ばれる。
【０１７２】
好ましくは、そのような参照デンシトグラムは癌性の細胞を検出するのと同じ方法を用いて測定されるが、非癌性の細胞のみが使用されることが確実にされる。これは、同じ個体の細胞だが、癌性であると思われる組織部位ではない他の組織部位由来の細胞を使用することにより達成することができる。或いは、又は、さらに、同一若しくは類似だが、癌に苦しんでいないと知られる異なる個体由来の細胞型を使用することができる。同じ個体の細胞が使用される場合、好ましくは類似の細胞型を、非癌性であると保証されている限り使用するべきである。標準デンシトグラム（すなわち、ヒストグラム）を得るために調査されることになる細胞の数及び細胞型は、当業者の知識内のもので十分であり、２５から１００個の細胞までさまざまで、好ましくは、約３０、４０、５０、又は６０個の細胞である。
【０１７３】
従って、本発明の目的に対して「類似の細胞型」という用語は、疑われた癌性の細胞と類似の由来で類似の細胞特徴を有した細胞型に関している。例えば、粘膜の細胞が癌発生に対して検査される場合、標準対照細胞も粘膜由来のものであるべきである。一方、リンパ系細胞が癌発生に対して検査される場合、標準対照細胞も、類似の細胞型であるためにリンパ由来のものであるべきである。
【０１７４】
典型的な標準又は類似の細胞型は、従って、リンパ球、顆粒球、正常な上皮細胞、又は、ストロマ細胞であり得る。
【０１７５】
非癌性であると知られ、推測上癌性の細胞に対して得られた細胞核信号強度の標準対照として使用される類似の細胞型の細胞核紫外線吸光度／細胞核強度は、同一の条件下ではない場合、可能な限り、非常に類似の条件下で測定されるべきである。
【０１７６】
従って、標準又は対照細胞と呼ぶこともできる類似の細胞型は、類似の生物学的プローブから調製及び単離され、分析中の細胞と実質的に同じく固定化及び（必要に応じて）透過化されるべきである。さらに、対照細胞は、実際の癌性の細胞と同じラン中に、同じ顕微鏡条件を用いて分析されるべきである。
【０１７７】
特定の細胞に対して、前述された２又は４の価からはずれた倍数性状態が決定された場合、これは、実質的な複製、挿入、欠失、又は、染色体再構築を示し、従って、癌性の細胞を示している。この場合のように、そのような細胞の倍数性状態は２及び４の価からはずれており、異数性状態も表している。このことは、当然ながら、正常な状態においてでさえも一般的に増殖性である細胞型が考慮されていると仮定している。
【０１７８】
このように、非増殖性であると通常知られる細胞を検査する場合、４という倍数性の価は、癌発生を示している場合がある。
【０１７９】
正常な状態において増殖性であると知られる細胞が検査された場合、４の価は癌発生を示しているとはみなされない。この場合、２及び４の価からの偏差のみが癌発生を示すことになる。
【０１８０】
本発明の状況における「異数性状態」という用語は、従って、細胞内の細胞核ＤＮＡの異常量に関している。
【０１８１】
信頼できる物を得るために、細胞核ＤＮＡの量、従って、推測上癌性の細胞のデンシトグラム（ヒストグラム）は、細胞の集団から算出されることが好ましく、約１００から７００個、好ましくは約１００から３００個の細胞が測定されることが好ましい。
【０１８２】
例えば肝組織由来の癌性の細胞が検査される場合、例えば、２及び４の価が割り当てられた２つの主なピークを有したデンシトグラムが得られる。しかし、非癌性の細胞の場合以外では、前記２つの主なピークのデンシトグラムはそれほど鋭く細くないが、いくぶん広い。さらに、２未満、２を越える、４未満、及び４を越えるデンシトグラムにおけるピーク及び信号が観察される。例が図２に提供されている。
【０１８３】
いかなる試料においても過半数の細胞が２というＤＮＡ含有量を有するはずであるため、その過半数からの偏差も異常又は不審であるとみなすことができる。正常な細胞が過半数である癌性試料の事象においても、試料を不審であるとラベルするために使用することができるＤＮＡ含有量における大きな変動が依然として存在する。
【０１８４】
従って、上記のように本発明により得られる細胞核紫外線吸光度を基準として算出されるデンシトグラムが２価（及び、正常状態における細胞の増殖性状態に応じて４価）に対応するピーク外でピーク信号を示す場合、細胞は癌性と評価される。
【０１８５】
しかし、２（及び４）の価に対応するピークがいくぶん広い曲度を示す場合、そのピーク自体が細胞の癌の可能性を示すことができる。２（及び４）価に対応するピークの形状を考慮してデンシトグラムが実際に癌の発生を示しているかどうかを決めるために、推測上癌性の細胞試料のデンシトグラムが上記の標準又は参照デンシトグラムと重ねられる。
【０１８６】
標準デンシトグラムの２価及び４価を示しているデンシトグラムのピークにおける曲線下の面積（ＡＵＣ）は非癌性の細胞を示していると解され、推測上癌性の細胞のデンシトグラムの対応するピークのＡＵＣにおける少なくとも１０％のいかなる偏差も癌性の細胞又は状態を示しているとみなされる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。
【０１８７】
細胞が正常又は癌性であるとみなされる場合について詳細に説明されている、ハロスク（Ｈａｒｏｓｋｅ）等の刊行物“１９９７  ＥＳＡＣＰ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＤＮＡ  ｉｍａｇｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７（１９９８）１８９−２００に明記された基準も適用することができる。
【０１８８】
このように、類似の非癌性の細胞型に対して得られた細胞核紫外線吸光度と比較した不審な癌性の細胞（集団）の細胞核紫外線吸光度／細胞核信号強度の有意な偏差は、進行中の癌発生又は今後起こりそうな癌発生を示している。
【０１８９】
本発明の目的に対して、不審な癌性の細胞の倍数性状態が、２価（及び、正常状態における細胞が増殖している場合は４価））の倍数性から少なくとも１０％はずれている場合、ＤＮＡ含有量における有意な異常は、癌発生を示しているとみなされる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。デンシトグラムにおけるピークには、該ピークのうち、参照デンシトグラムにおいて対応するピークと同一の部分に対して２価又は４価が割り当てられる。
【０１９０】
慣習によると、参照デンシトグラムの２価のピークに対応するピークが１．８から２．２に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近二倍体（ｐｅｒｉｄｉｐｌｏｉｄ）と呼ぶことができる。
【０１９１】
参照デンシトグラムの４価のピークに対応するピークが３．６から４．４に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近四倍体（ｐｅｒｉｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ）であるとみなされる。
【０１９２】
これらの範囲外にある価はどれも、Ｘ倍体（Ｘ−ｐｌｏｉｄ）とみなされる。
【０１９３】
近二倍体、近四倍体、及びＸ倍体の価を有した細胞及び組織は、本発明の目的に対して癌性の細胞とみなされる。
【０１９４】
このように、本発明の方法に従い得られた推測上癌性の細胞に対する細胞核紫外線吸光度を、同じ方法を用いた、非癌性であると知られる類似の細胞型に対する細胞核紫外線吸光度と参照させることによって生物学的試料における推測上癌性の細胞の倍数性（異数性）状態を算出するために、上記の方法を使用することができる。
【０１９５】
本発明の目的に対して、「非癌性の」という用語は、癌発生の徴候を示していないとして知られる細胞を意味している。
【０１９６】
本発明の一実施形態において、癌性の細胞は、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけることができる。
【０１９７】
診断方法
言及されたように、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法にも関し、当該方法は：
（ａ）ヒト又は動物の対象から生物学的試料を提供するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記試料のうち少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定された核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた細胞核信号強度から、前記少なくとも１つの細胞の倍数性状態を算出するステップ；
（ｅ）前記倍数性状態に応じて、癌の存在及び／又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【０１９８】
本発明による診断方法も、細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定する、並びに、前記核の境界線内の紫外線吸光度を決定するという基本概念を実現する種々の実施形態を含む。核の境界線を決定することに相当する核の位置及び／又は大きさを決定することに対して、可視光線を用いた位相差顕微鏡法、並びに、紫外線を用いた検出法をここでも使用することができる。核の紫外線吸光度を決定することに対しては、二重鎖核酸と相互作用することができる蛍光マーカーを加えることなく、単に紫外線測定に依拠することができるか、又は、そのようなマーカーを使用することができる。
【０１９９】
以下において、これら診断方法の一般的な態様が取りあげられる。さらなる問題が２つの特定の実施形態に関して取りあげられる。より徹底的に詳しく取りあげられるこれら２つの実施形態の特定の態様は、それにもかかわらず、上記で構想された他の実施形態に同様に適用することができると当業者は理解する。
【０２００】
ステップ（ａ）に関して、生物学的試料は、例えばブラシ生検、吸引、穿刺吸引細胞診、内視鏡生検等、従来の方法を用いてヒト又は動物の対象から得ることができる。
【０２０１】
次に、ステップ（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、生物学的試料内にある少なくとも１つの癌性の細胞を検出するために好んで適用することができる、細胞内の細胞核二重鎖核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する上記の方法のステップ（ａ）及び（ｂ）として行うことができる。
【０２０２】
上記でステップ（ｅ）と呼ばれた最後のステップでは、癌の存在及び／又は今後起こりそうな癌の発生が、検査中の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態に応じて決定される。この最後のステップは、前記２つの実施形態が示された後、より徹底的に詳しく取りあげられる。
【０２０３】
当然ながら、推測上癌性の細胞に対するデンシトグラム、及び、参照又は標準デンシトグラムの決定に関する上記の説明、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、「約」、「倍数性」、「異数性」、「近二倍体」、「近四倍体」、「Ｘ倍体」、「ＡＵＣ」等の用語の意味は、本発明による癌を診断及び／又は予測する方法の状況において等しく適用される。
【０２０４】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、上記の診断方法のうち全てのステップが、ヒト又は動物の身体に直接触れることなく行われることを意味している。
【０２０５】
実施形態１−診断方法
１つの例証的な実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関し、当該方法は：
（ａ）少なくとも１つの細胞を含んだ生物学的試料を前記対象から得るステップ；
（ｂ）前記細胞内の核の位置及び／又は大きさをｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ；
（ｃ）紫外線を用いて、ステップ（ｂ）で決定された核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた細胞核紫外線吸光度から、前記少なくとも１つの細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出するステップ；並びに、
（ｅ）前記細胞核ＤＮＡ含有量若しくは前記倍数性状態に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【０２０６】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）は、生物学的試料内にある少なくとも１つの癌性の細胞を検出するために好んで適用することができる、細胞内の細胞核二重鎖核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する上記の実施形態１のステップ（ａ）及び（ｂ）として行うことができる。
【０２０７】
本発明のこれらの態様の好ましい実施形態では、ステップ（ａ）及び／又は（ｂ）において紫外線吸光度を測定するために、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線が使用される。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍ等の波長である。
【０２０８】
ステップ（ｄ）も上記のように行うことができる。
【０２０９】
上記でステップ（ｅ）と呼ばれた最後のステップでは、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生が、検査中の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態に応じて決定される。
【０２１０】
癌を診断及び／又は予測するこの方法を行うことにおいて、生物学的試料を単離するために、細胞試料を調製するために、問題の細胞をことによると蛍光マーカーと接触させるために、信号強度を決定するために、同じ方法を使用することができる。
【０２１１】
従って、好ましい実施形態では、核の境界線を同定するため、及び、細胞核紫外線吸光度を測定するために、共焦点レーザ走査顕微鏡法が使用されるであろう。この最終段階まで、例えば上記の機器を使用することができる。
【０２１２】
実施形態２−診断方法
別の例証的な実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関し、当該方法は：
（ａ）生物学的試料を前記対象から得るステップ；
（ｂ）前記対象の体外で、前記少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーに前記少なくとも１つの細胞を接触させるステップ；
（ｃ）適した光源を用いた励起により得られる信号によって、二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの信号強度を決定するステップ；
（ｄ）位相差顕微鏡法により、前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）で得られた信号強度をステップ（ｄ）で得られた核の位置及び／又は大きさと相関させることにより、細胞核の二重鎖核酸に結合している蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定するステップ；
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた細胞核信号強度から、前記少なくとも１つの細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出するステップ；
（ｇ）前記細胞核ＤＮＡ含有量若しくは前記倍数性状態に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【０２１３】
ステップ（ｂ）から（ｅ）は、生物学的試料内にある少なくとも１つの癌性の細胞を検出するために好んで適用することができる、細胞内の細胞核二重鎖核酸の量を決定する上記の実施形態２のステップ（ａ）から（ｄ）として行うことができる。
【０２１４】
ステップ（ｆ）も上記のように行うことができる。
【０２１５】
上記でステップ（ｇ）と呼ばれた最後のステップでは、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生が、検査中の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態に応じて決定される。
【０２１６】
癌を診断及び／又は予測するこの方法を行うことにおいて、生物学的試料を単離するために、細胞試料を調製するために、問題の細胞を蛍光マーカーと接触させるために、信号強度を決定するために、細胞核内の二重鎖核酸の量を決定する方法に対して上記で概説された位相差顕微鏡法を行うために、同じ方法を使用することができる。
【０２１７】
従って、蛍光マーカーは、二重鎖核酸と特異的に相互作用することができ、適した光源を用いた励起により蛍光信号を与えるいかなる分子でもあり得る。
【０２１８】
そのような蛍光マーカーは、例えばＤＮＡの主溝又は副溝に結合することができる。蛍光マーカーは、核酸塩基挿入剤でありえ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、及び臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を含めた群から選択することができる。蛍光マーカーは、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎも含む。
【０２１９】
上記のステップの順序は変更することができるということに当業者は気づくであろう。従って、まず試料を蛍光マーカーに接触させインキュベートさせて、位相差顕微鏡法を行い、次に蛍光信号強度を決定することによって、開始することができる。特定の状況において、例えば、まず位相差顕微鏡法を行い、次に試料を蛍光マーカーに接触させインキュベートさせて、最後に蛍光信号強度を測定することも可能な場合がある。
【０２２０】
本発明の一実施形態において、ヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法は、本質的に前述のステップに依拠し、ステップ（ｄ）はステップ（ｂ）から（ｃ）に進み、ステップ（ｃ）の後にはステップ（ｅ）、（ｆ）、及び（ｇ）が続くことができる。
【０２２１】
診断方法−評価
前述の方法では、最後のステップ（ｅ）（又は、実施形態２の場合はステップ（ｇ））において、今後起こりそうな癌の発生の存在が決定される。
【０２２２】
前記対象から得られた生物学的試料の細胞に対して決定された細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性の価が、非癌性であると知られる、非常に類似の条件下若しくは同一の条件下で細胞核信号強度が測定された類似の細胞型の細胞核ＤＮＡ含有量又は２価（及び、正常状態における細胞が増殖している場合は４価）の倍数性から少なくとも１０％はずれている場合、癌の診断は陽性であると考えることができる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。
【０２２３】
標準デンシトグラムの２価及び４価を示しているピークの曲線下の面積（ＡＵＣ）は非癌性の細胞を示していると解され、推測上癌性の細胞のデンシトグラムの対応するピークのＡＵＣにおける少なくとも１０％のいかなる偏差も癌性の細胞を示しているとみなされ、従って、陽性の診断をもたらす。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。
【０２２４】
慣習によると、参照デンシトグラムの２価のピークに対応するピークが１．８から２．２に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近二倍体と呼ばれる。
【０２２５】
参照デンシトグラムの４価のピークに対応するピークが３．６から４．４に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近四倍体であるとみなされる。
【０２２６】
これらの範囲外にある価はどれも、Ｘ倍体とみなされる。
【０２２７】
近二倍体、近四倍体、及びＸ倍体の価を有した細胞は、本発明の目的に対して癌性の細胞とみなされ、従って、ＤＮＡ含有量が近二倍体、近四倍体、及びＸ倍体であるとみなされた場合、陽性の癌の診断が下される。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌を診断及び／又は予測する方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌を診断及び／又は予測することができる。
【０２２９】
癌を診断及び／又は予測する方法を使用して、骨髄細胞、リンパ節細胞、リンパ球、赤血球、神経細胞、筋細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、粘膜試料、末梢血試料、脳脊髄液試料、尿試料、浸出液試料、穿刺吸引液、穿刺吸引細胞生検用生体組織、末梢血擦過物、皮膚擦過物、剥離された細胞由来のスメア、体液由来の細胞遠心分離された標本、（機械的及び／又は酵素的分散後の）細胞分離標本、パラフィン包埋組織、並びに、凍結切片を含めた群から選択される試料を分析することができる。
【０２３０】
以下において、上記の実施形態１及び２に関する本発明の特定の態様が、明確に提案されている。
【０２３１】
実施形態１−特定の態様
１．少なくとも１つの生物学的試料内に存在する少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する方法であって、当該方法は：
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ、
（ｂ）紫外線を用いて、ステップ（ａ）で決定された前記核の境界線内の紫外線吸光度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップ、
を含む。
【０２３２】
２．１に記載の方法は、
前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさが、紫外線及び／又は位相差顕微鏡法を用いることにより決定される方法である。
【０２３３】
３．１又は２に記載の方法は、
約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線が、ステップ（ａ）及び／又は（ｂ）において使用される方法である。
【０２３４】
４．３に記載の方法は、
約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長の紫外線が、ステップ（ａ）及び／又は（ｂ）において使用される方法である。
【０２３５】
５．１から４のいずれかに記載の方法は、
前記細胞核の核酸が、免疫組織化学染色、化学反応、又は、蛍光マーカーで可視化されない方法である。
【０２３６】
６．１から５のいずれかに記載の方法は、
前記少なくとも１つの生物学的試料における少なくとも１つの推測上癌性の細胞を検出するために使用される方法である。
【０２３７】
７．１から６のいずれかに記載の方法は、
前記少なくとも１つの癌性の細胞が、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる方法である。
【０２３８】
８．６に記載の方法は、
ステップ（ｂ）で得られた細胞核紫外線吸光度を、同様に請求項１のステップ（ａ）及び（ｂ）を用いて分析された少なくとも１つの非癌性の細胞の細胞核紫外線吸光度と比較することによって推測上癌性の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出するために、ステップ（ｂ）における細胞核紫外線吸光度が使用される方法である。
【０２３９】
９．８に記載の方法は、
倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量における、２価から少なくとも１０％はずれた偏差が、癌性の細胞を示している方法である。
【０２４０】
１０．８に記載の方法は、
１．８から２．２という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近二倍体の状態を示し、３．６から４．４という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近四倍体の状態を示し、さらに、これらの範囲外にある倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量がＸ倍体の状態を示している方法である。
【０２４１】
実施形態２−特定の態様
１．少なくとも１つの生物学的試料内に存在する少なくとも１つの細胞における細胞核の二重鎖核酸の量を決定する方法であって、当該方法は：
（ａ）前記少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーに前記少なくとも１つの細胞を接触させるステップ；
（ｂ）適した光源を用いた励起により得られる信号によって、二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの信号強度を決定するステップ；
（ｃ）位相差顕微鏡法により、前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）で得られた信号強度をステップ（ｃ）で得られた核の位置及び／又は大きさと相関させることにより、細胞核の二重鎖核酸に結合している蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定するステップ；
を含む。
【０２４２】
２．１に記載の方法は、
前記少なくとも１つの生物学的試料内の少なくとも１つの推測上癌性の細胞を検出するために使用される方法である。
【０２４３】
３．２に記載の方法は、
ステップ（ｄ）で得られた信号強度を、同様に請求項１のステップ（ａ）から（ｄ）を用いて得られた非癌性の細胞の細胞核信号強度と比較することによって細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を算出するために、ステップ（ｄ）で得られた細胞核信号強度が使用される方法である。
【０２４４】
４．１に記載の方法は、
倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量における、２価又は４価からの少なくとも１０％の偏差が、癌性の細胞を示している方法である。
【０２４５】
５．４に記載の方法は、
１．８から２．２という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近二倍体の状態を示し、３．６から４．４という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近四倍体の状態を示し、さらに、これらの範囲外にある倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量がＸ倍体の状態を示している方法である。
【０２４６】
６．２に記載の方法は、
前記少なくとも１つの癌性の細胞が、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる方法である。
【０２４７】
７．１に記載の方法は、
前記生物学的試料が、骨髄細胞、リンパ節細胞、粘膜試料、末梢血、脳脊髄液、尿、浸出液、穿刺吸引液、末梢血擦過物、皮膚擦過物、パラフィン包埋組織、並びに、凍結切片を含めた群から選択される方法である。
【０２４８】
８．１に記載の方法は、
前記蛍光マーカーが、ＤＮＡの主溝又は副溝に結合した薬剤、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰ−１、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＪＯＪＯ−１、ＰＯＰＯ−２、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＳＹＴＯ  ４０  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４１  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４２  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４３  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４４  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ４５  ｂｌｕｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ９  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １０  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １１  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １２  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １３  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １４  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １５  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １６  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２０  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２１  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２２  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２３  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２４  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２５  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２６  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ２７  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ＢＣ  ｇｒｅｅｎ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８０  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８１  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８２  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８３  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８４  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８５  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ８６  ｏｒａｎｇｅ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １７  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ５９  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６１  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  １７  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６２  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６３  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、ＳＹＴＯ  ６４  ｒｅｄ−蛍光核酸染色、アクリジンホモダイマー、アクリジンオレンジ、７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）、アクチノマイシンＤ、ＡＣＭＡ、ＤＡＰＩ、ジヒドロエチジウム、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）、エチジウムモノアジド、ヨウ化ヘキシジウム、ヘキスト３３２５８（ビスベンズイミド）、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３４５８０、ヒドロキシスチルバミジン、ＬＤＳ  ７５１、及び、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｙｅｌｌｏｗを含めた群から選択される方法である。
【０２４９】
９．１に記載の方法は、
前記蛍光マーカーの臭化エチジウムが、生物学的なブラシ生検用試料内の口腔上皮癌と関連した癌性の細胞を検出するために使用される方法である。
【０２５０】
１０．ヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関し、当該方法は：
（ａ）生物学的試料を前記対象から得るステップ；
（ｂ）前記対象の体外で、前記少なくとも１つの細胞内にある二重鎖核酸と相互作用することができる少なくとも１つの蛍光マーカーに前記少なくとも１つの細胞を接触させるステップ；
（ｃ）適した光源を用いた励起により得られる信号によって、二重鎖核酸に結合している前記少なくとも１つの蛍光マーカーの信号強度を決定するステップ；
（ｄ）位相差顕微鏡法により、前記少なくとも１つの細胞内の核の位置及び／又は大きさを決定するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）で得られた信号強度をステップ（ｄ）で得られた核の位置及び／又は大きさと相関させることにより、細胞核の二重鎖核酸に結合している蛍光マーカーの細胞核信号強度を決定するステップ；
（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた細胞核信号強度から、前記少なくとも１つの細胞の倍数性状態を算出するステップ；
（ｇ）前記倍数性状態に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【０２５１】
以下において、本発明は、特定の実験的な例を考慮して例示される。しかし、これらの実施例は、決して本発明をその範囲に関して限定するよう意味しているのではなく、その例証的な実施形態のうちいくつかにより本発明を例示するよう提供されている。
実験
実験１−半固定された細胞に対するＤＮＡイメージサイトメトリー測定
第１のステップにおいて、試料は、例えばブラシ生検によって手に入れることができる（図３を参照）。
【０２５２】
第２のステップにおいて、次に、例えばＰＢＳ（ｐＨ７．４）等の生理的なバッファーを用いて試料採取単位を洗い流すことにより、細胞が前記ブラシから溶出される。
【０２５３】
第３のステップにおいて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような穏やかに作用する界面活性剤の添加により、前記細胞を染色に対して浸透性にすることができる。この目的のために、例えばＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだバッファーを使用することができる。（半）固定された細胞への取り組みの場合、浮遊細胞を顕微鏡スライドに適用し、不動化のために乾燥させることができる。
【０２５４】
次のステップにおいて、例えば、３００から６００ｎｍの波長を放出するＬＥＩＣＡ  ＥＬ６０００光源で前記顕微鏡スライドを照射することによって、次に蛍光測定を行うことができる。例えば、４５０ｎｍの光源を使用することができる。
【０２５５】
前記細胞中を走査することにより、核の位置を決定することができる。
【０２５６】
次に、Ｑｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｇｉｔａ  ２０００Ｒ  ＦＡＳＴＣｏｏｌｅｄ  Ｍｏｎｏ  １２−ｂｉｔカメラ装置（ｗｗｗ．ｑｉｍａｇｉｎｇ．ｃｏｍ）を用いて細胞核紫外線吸光度を記録することができる。
【０２５７】
この細胞核紫外線吸光度を、同一の条件下で得られた非癌性であると知られる細胞のＤＮＡ含有量と比較した場合、検査中の細胞の倍数性状態を算出し、前記細胞が癌を発生しそうかどうかを決定することができる。
【０２５８】
実験２−半固定された細胞に対するＤＮＡイメージサイトメトリー測定
第１のステップにおいて、試料は、例えばブラシ生検によって手に入れることができる（図３を参照）。
【０２５９】
第２のステップにおいて、次に、例えばＰＢＳ（ｐＨ７．４）等の生理的なバッファーを用いて試料採取単位を洗い流すことにより、細胞が前記ブラシから溶出される。
【０２６０】
第３のステップにおいて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような穏やかに作用する界面活性剤の添加により、前記細胞を染色に対して浸透性にすることができる。この目的のために、例えばＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだバッファーを使用することができる。（半）固定された細胞への取り組みの場合、浮遊細胞を顕微鏡スライドに適用し、不動化のために乾燥させることができる。
【０２６１】
次に、臭化エチジウム等の蛍光挿入染料の添加により、細胞ＤＮＡを染色することができる。この蛍光染料及び他の多くの蛍光染料は、ＤＮＡに結合した場合にはるかに強い蛍光を有するので、遊離の染料を洗い流す必要がない場合がある。しかし、ＳＢ比を改善することが可能な場合に、洗浄を行うことができる。
【０２６２】
次のステップにおいて、例えば、３００から６００ｎｍの波長を放出するＬＥＩＣＡ  ＥＬ６０００光源で前記顕微鏡スライドを照射することによって、次に蛍光測定を行うことができる。例えば、４８８ｎｍの光源を使用することができる（図６を参照）。
【０２６３】
次に、Ｑｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｇｉｔａ  ２０００Ｒ  ＦＡＳＴＣｏｏｌｅｄ  Ｍｏｎｏ  １２−ｂｉｔカメラ装置（ｗｗｗ．ｑｉｍａｇｉｎｇ．ｃｏｍ）を用いて放出された蛍光信号を記録することができる。
【０２６４】
別のステップにおいて、次に、核の位置及び／又は大きさを同定するために、位相差顕微鏡法の下で同じ試料を記録することができる（図７を参照）。
【０２６５】
さらなるステップにおいて、蛍光及び位相差顕微鏡法により得られた画像はマージされるので、核から生じた蛍光信号のみが記録される（図７を参照）。
【０２６６】
この信号を、同一の条件下で得られた非癌性であると知られる細胞のＤＮＡ含有量と比較した場合、検査中の細胞の倍数性状態を算出し、前記細胞が癌を発生しそうかどうかを決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】非癌性の細胞集団の細胞核ＤＮＡ含有量が決定される場合に一般的に得られるヒストグラム、すなわち濃度プロファイルを示している。前記細胞は、非増殖性の状態にある。
【図２】癌性の細胞集団の細胞核ＤＮＡ含有量が決定される場合に一般的に得られるヒストグラムプロファイル、すなわち濃度プロファイルを示している。正常な状態が非増殖性である細胞型が検査される場合に、４価に対応するピークは進行中の癌発生を示している。
【図３】眼（写真左）及び口（写真右）におけるブラシ生検の例を示している。
【図４】約２３０ｎｍから３００ｎｍという波長の範囲におけるＤＮＡ及び蛋白質の異なる吸光度の動きを示している。
【図５】約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線を用いて細胞核の境界線を決定するための本発明の一実施形態の原理を概略的に示している。
【図６】ＥｔＢｒで染色した粘膜の細胞に対する蛍光の測定を示している。細胞核ははっきりと可視であるが、細胞の他の部分もいくらかの蛍光を示している。
【図７】ＥｔＢｒで染色した粘膜の細胞の位相差画像（写真左）、蛍光画像（写真中央）、及び、組み合わされた画像（写真右）を示している。位相差顕微鏡画像を蛍光画像とマージ及び相関させることにより、核の位置及びその大きさを正確に決定することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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