(57)【要約】本発明は、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、前立腺炎、炎症性腸疾患、糖尿病及びリウマチ性関節炎からなる群より選択される疾患のような炎症性サイトカインの過剰産生に関連する疾患の治療のための免疫調節化合物の使用に関し、該化合物は、一般式(I)（式中、m及びnは互いに独立して、1〜4の範囲の整数であり、X及びYは、-COOH、-O-P(O)(OH)2、-O-SO2(OH)、-NH2、-OH、-CONH(CH2)n1-NH2、-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH、-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2、-O-CO-(CH2)n1-NH2、-O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH、-O-CO-(CH2)n1-OH、-O-CO-(CH2)n1-COOH、-O-CO-(CH2)n1-CHO、-O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOHを表し、R1及びR2はそれぞれ、2〜18炭素原子を有する飽和又は不飽和で、直鎖又は分岐鎖のカルボン酸に由来するアシル基を表し、該アシル基は非置換であるか、又はヒドロキシ、ジヒドロキシホスホリルオキシ、2〜18炭素原子のアルキル、2〜18炭素原子のアルコキシ、アシル部分に2〜18炭素原子を有するアシルオキシ、アミノ、アシルアミノから選択される1〜3置換基を有する）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式(I)：
【化１】
2009529523.tif 000010
（式中：
- m及びnは互いに独立して、1〜4の範囲の整数であり、
- X及びYはそれぞれ、以下の群：
* カルボキシル -COOH、
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* ヒドロキシ -OH、
* [アミノ(C1〜C10)アルキル]アミノカルボニル -CONH(CH2)n1-NH2 (n1は1〜10の整数である)、
* [ジカルボキシ(C1〜C5)アルキル]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ[アミノ(C1〜C5)アルキル]]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜5の整数である)、
* アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜15の整数である)、
* ジヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH (n1は1〜10の整数である)、
* ヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-OH (n1は1〜10の整数である)、
* カルボキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-COOH (n1は1〜10の整数である,
* オキソ(C1〜C5)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHO (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ(C1〜C10)アルカノイル]アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH (n1は1〜10の整数であり、n2は1〜15の整数である)、
から選択される中性又は荷電状態の基を表し；
- R1及びR2はそれぞれ、2〜18炭素原子を有する飽和又は不飽和で、直鎖又は分岐鎖のカルボン酸に由来するアシル基を表し、該アシル基は非置換であるか、又はヒドロキシ、ジヒドロキシホスホリルオキシ、2〜18炭素原子のアルキル、2〜18炭素原子のアルコキシ、アシル部分に2〜18炭素原子を有するアシルオキシ、アミノ、アシルアミノから選択される1〜3置換基を有し、
- C*1及びC*2は互いに独立して、立体配置R、S又はラセミ形RSにある不斉炭素である)
の少なくとも1つの免疫調節化合物、又はその医薬的に許容される塩、溶媒和物、若しくは異性体が、不活性で非毒性の医薬的に許容される希釈剤又はキャリアと任意に結合又は混合されて含まれる医薬組成物の適切な量を、必要とする患者に投与することを含む、炎症性サイトカインの過剰産生に関連する疾患又は障害に罹患しているヒトを含む恒温動物を治療する方法。
【請求項２】
* Xが以下の群：
* カルボキシル -COOH、
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* [アミノ(C1〜C10)アルキル]アミノカルボニル -CONH(CH2)n1-NH2 (n1は1〜10の整数である)、
* [ジカルボキシ(C1〜C5)アルキル]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ[アミノ(C1〜C5)アルキル]]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜5の整数である)、
* アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜15の整数である)
から選択され、
* Yが以下の群：
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* ヒドロキシ -OH、
* アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜15の整数である)、
* ジヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH (n1は1〜10の整数である)、
* ヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-OH (n1は1〜10の整数である)、
* カルボキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-COOH (n1は1〜10の整数である)、
* オキソ(C1〜C5)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHO (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ(C1〜C10)アルカノイル]アミノ(C1-C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH (n1は1〜10の整数であり、n2は1〜15の整数である)
から選択される請求項1に記載の方法。
【請求項３】
* Xが以下の群：
* カルボキシル -COOH、
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* [アミノ(C1〜C6)アルキル]アミノカルボニル -CONH(CH2)n1-NH2 (n1は1〜6の整数である)、
* [ジカルボキシ(C1〜C5)アルキル]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ[アミノ(C1〜C5)アルキル]]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜5の整数である)、
* アミノ(C2〜C12)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は2〜12の整数である)
から選択され、
* Yが以下の群：
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* ヒドロキシ -OH、
* アミノ(C2〜C12)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は2〜12の整数である)、
* ジヒドロキシ(C3〜C7)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH (n1は3〜7の整数である)、
* ヒドロキシ(C2〜C6)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-OH (n1は2〜6の整数である)、
* カルボキシ(C3〜C6)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-COOH (n1は3〜6の整数である)、
* オキソ(C2〜C5)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHO (n1は2〜5の整数である)、
* [カルボキシ(C3〜C6)アルカノイル]アミノ(C2〜C12)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH (n1は3〜6の整数であり、n2は2〜12の整数である)
から選択される請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
* Xが以下の群：
* -COOH、
* -O-P(O)(OH)2、
* -O-SO2(OH)、
* -NH2、
* -CO-NH-(CH2)3-NH2、又は-CONH-(CH2)6-NH2、
* -CO-NH-CH(COOH)-CH2-COOH、
* -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH2、
* -O-CO-(CH2)5-NH2
から選択され、
* Yが以下の群：
* -O-P(O)(OH)2、
* -O-SO2(OH)、
* -NH2、
* -OH、
* -O-CO-CH2-NH2 (2-アミノエタノイルオキシ)、-O-CO-(CH2)2-NH2 (3-アミノプロパノイルオキシ)、-O-CO-(CH2)5-NH2 (6-アミノヘキサノイルオキシ)、又は-O-CO-(CH2)11-NH2 (12-アミノドデカノイルオキシ)、
* -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH (6,7-ジヒドロキシヘプタノイルオキシ)、
* -O-CO-(CH2)5-OH (6-ヒドロキシヘキサノイルオキシ)、
* -O-CO-(CH2)2-COOH (3-カルボキシプロパノイルオキシ)
* -O-CO-(CH2)4-CHO (6-オキソヘキサノイルオキシ),
* -O-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-COOH (3-カルボキシプロパノイルアミノヘキサノイルオキシ)
から選択される請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
R1及びR2が：
-CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C12O)C14)、
-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14)、
-CO-CH3, (C2)、
-CO-CH2-NH-CO-C*H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2)、
-CO-C*H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3, (2(C6O)C8)、
-CO-(CH2)16-CH3, (C18)、
-CO-CH2-C*H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3, (3(BnO)C14)、
-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3, (3[(OH)2-P(O)O]C14)、
C*は、前記式中で、立体配置R、S又はラセミ形RSの不斉炭素に相当する
から選択される請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
- R1が：
-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C12O)C14)、
-CO-CH2-C**1HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14)、
-CO-CH3, (C2)、
-CO-CH2-NH-CO-C**1H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2)、
-CO-C**1H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3, (2(C6O)C8)、
-CO-(CH2)16-CH3, (C18)、
から選択され、
- R2が：
-CO-CH2-C**2H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C12O)C14)、
-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14)、
-CO-CH2-C**2H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3, (3(BnO)C14)、
-CO-CH2-C**2H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3, (3[(OH)2-P(O)O]C14)
から選択され、
C**1及びC**2は、前記式中で、立体配置R、S又はラセミ形RSの不斉炭素に相当する
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
投与される化合物が、一般式(II)：
【化２】
2009529523.tif 000011
(式中、X、Y、R1、R2及びmは、請求項1〜6で定義されるとおりであり、C*1は、立体配置R、Sであるか、又はラセミRSであり、C*2は立体配置Rである)
を有する請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
投与される化合物が：
- X = -O-P(O)(OH)2、Y = -O-P(O)(OH)2、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 2、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(3S,9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル アミノ]-デカン-1,10-ジオール (1,10)-ビス-ジヒドロゲノホスフェート (OM-294-DP (S,R))、
- X = -O-P(O)(OH)2、Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 2、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(3S,9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1, 10-ジオール 1-ジヒドロゲノホスフェート 10-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (OM-197-MP-HD (S,R))、
- X = -COOH、Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 1、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわちN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-L-アスパラギン酸, α-N-[(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル]アミド 5-O-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (OM-197-MC-HD (S,R))、
- X = -O-P(O)(OH)2、Y = -O-CO-(CH2)5-NH2、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 2、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(3S,9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジヒドロゲノホスフェート 10-(6-アミノヘキサノエート) (OM-197-MP-AC (S,R))、
- X = -NH2、Y = -O-P(O)(OH)2、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 4、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(5S,11R)-1-アミノ-5-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-6-オキソ-7-アザ-11-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-ドデカン-12-オール 12-ジヒドロゲンホスフェート (OM-294-BA-MP (S,R))
である式(II)の化合物から選択される請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
生体中の活性Tリンパ球、単球又は抗原提示細胞による炎症性サイトカインの過剰産生に関連する疾患又は障害に罹患しているヒトを含む恒温動物を治療するための請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、炎症性サイトカイン又は炎症性マーカーが、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IFN-γ、TNF-α及びMCP-1からなる群に属する方法。
【請求項１０】
疾患が、喘息、糖尿病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、前立腺炎、炎症性腸疾患及びリウマチ性関節炎からなる群より選択される請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
医薬的に許容されるキャリア、賦形剤又は製剤にある請求項1〜8のいずれか1項で定義される化合物の治療有効量を、粘膜又は非経口経路を介して投与することからなる請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜8のいずれか1項で定義される化合物の治療有効量を、腹腔、皮下、経口、鼻内、舌下又はエアロソル経路を介して優先的に投与することからなる請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜8のいずれか1項で定義される免疫調節分子の必要投与量が、ヒトにおいて0.01〜50mg/m2の範囲である請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、前立腺炎、炎症性腸疾患、糖尿病及びリウマチ性関節炎からなる群より選択される疾患のような、炎症性サイトカインの過剰産生に関連する疾患の治療のための免疫調節化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物のシグナルによる先天性免疫系の活性化の機構に対する理解が、最近、大きく進んでいる。先天性免疫系のこのような活性化が、適応免疫応答の開始及び生じる適応応答の型の決定のために必須であることも明らかになってきている。これらの知見を合わせて、免疫療法の開発に対する合理的なアプローチにおける興味が大きく更新されている。
【０００３】
先天性免疫活性化の理解の増加のために、2つの主要な発見が重大であった：
1) 1次免疫応答の誘導の原因である抗原提示細胞としての樹状細胞(DC)の役割、
2) 先天性免疫系の刺激を導く、微生物構造物の存在を検出するToll様受容体(TLR)及び他の「パターン認識」受容体の発見。
【０００４】
Sallusto及びLanzavecchiaは、まず、未熟DCが、GM-CSF及びIL-4を補充した培地中のヒト単球から生じ得ることを報告した(Sallusto F, Lanzavecchia A. J Exp Med 1994,179:1109〜18)。しかし、抗原提示細胞(APC)として完全に機能的な成熟DCを得るためには、GM-CSF及びIL-4に加えて、さらなる成熟因子が必要であることが、すぐに明らかになった。成熟DCは、適応免疫応答を開始し、方向付けることができる。
このような成熟シグナルは、微生物産物により提供され得る。これらの産物は、TLRを介して作用することが示されている。異なる微生物産物を認識し得る11種のTLRが同定されている。TLR4は、既知の先天性免疫系の最も強力な刺激物質の1つである細菌リポ多糖(LPS)を特異的に認識する受容体である。
【０００５】
国際出願WO 2005 007699号は、特異的結合メンバー、特にヒト抗-IL-13抗体分子、特にIL-13活性を中和するものを、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫を含むIL-13関連障害の診断又は治療に用いることを記載している。
【０００６】
しかし、免疫調節におけるIL-13の正確な役割を理解するためには、研究がまだ必要であり、IL-13/IL-4経路の研究に関する結果の解釈は、以下の2つの最近の出版物により示されるように、いまだに仮定の性質を有する。
Michael Kabeschらによる出版物「IL-4/IL-13経路の遺伝的性質は、血清IgEレベル及び小児喘息に強く影響する」("IL-4/IL-13 pathway genetics strongly influence serum IgE levels and childhood asthma" ) (J. Allergy Clin. Immunol. 117巻, 2号)は、喘息及びアトピー性疾患の顕著な特徴であるIgE産生が、IL-4及びIL-13経路の遺伝子に関係する遺伝子的制御下にあり得ることを述べている。IgEスイッチはヒト免疫及び生存の基本であるので、IgEの調節は繊細である。IL-4/IL-13経路は、IgE調節に対するその影響により主に喘息の進展に影響し得るが、示された結果は、それが完全には事実でないであろうことを示している。
【０００７】
David B Corry及びFarrah Kheradmandによる出版物「免疫調節によるアレルギー性気道炎症の制御」("Control of allergic airway inflammation through immunomodulation") (J. Allergy Clin. Immunol. 117巻, 2号)は、喘息の管理を変更するか又はしない臨床試験に関連する主要な発見を記載しており、これはさらなる研究に値する。B細胞IgE応答に必要なサイトカインであるIL-4が、I型超過敏応答に重要であり、よってIL-4は、IL-4に結合しこれを不活性化するIL-4受容体α鎖(sIL-4Rα)の可溶形を用いることによる喘息臨床試験において最初に標的にされるサイトカインの1つであることが報告されている。IL-13は、IL-4と同じ効果の多くを有するが、sIL-4αにより阻害されない別のサイトカインである。結論としては、喘息の治療のために、IL-4及びIL-13の両方を同時に阻害するためのさらなる研究を行うべきであるということである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以下に記載される分子が、良好な安全性プロフィールを有するTLR4の効果的なアゴニストであり、機能的単球由来DCの完全な成熟化を誘導できるとともに、TLR4を発現する他の細胞種を活性化できるという本発明者らによる証明に依拠する。本発明による化合物により処理されたDCは、1次T細胞活性化を誘導でき、Th1細胞性免疫応答に好都合であり得る。
【０００９】
本発明者らは、本発明による化合物が、抗-CD3及び抗-CD28抗体によりポリクローン性で活性化されたCD4+ T細胞によるIL-13の分泌を著しく低減させ得ることも示している。
さらに、化合物の1つがi.p.又はi.n.経路でマウスの喘息モデルに投与されたときに、本発明者らは、抗原感作及びその後の抗原へのエアロソル曝露により生じるアレルギー性応答の防止を証明している。測定された免疫学的パラメータは、Th2応答の相対的減少を示唆し、このことは、本発明の化合物がこの喘息モデルにおいて作用する機構を説明し得る。さらに、本発明者らは、本発明の化合物が、非肥満糖尿病マウスでの糖尿病の出現率を低減し得ることを示している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の一般式(I)：
【化１】
2009529523.tif 000002
【００１１】
(式中、
- m及びnは互いに独立して、1〜4の範囲の整数であり、
- X及びYはそれぞれ、以下の群から選択される中性又は荷電状態の基を表し：
* カルボキシル -COOH、
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* ヒドロキシ -OH、
* [アミノ(C1〜C10)アルキル]アミノカルボニル -CONH(CH2)n1-NH2 (n1は1〜10の整数である)、
* [ジカルボキシ(C1〜C5)アルキル]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ[アミノ(C1〜C5)アルキル]]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜5の整数である)、
* アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜15の整数である)、
* ジヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH (n1は1〜10の整数である)、
* ヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-OH (n1は1〜10の整数である)、
* カルボキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-COOH (n1は1〜10の整数である)、
* オキソ(C1〜C5)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHO (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ(C1〜C10)アルカノイル]アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH (n1は1〜10の整数であり、n2は1〜15の整数である)、
【００１２】
- R1及びR2はそれぞれ、2〜18炭素原子を有する飽和又は不飽和で、直鎖又は分岐鎖のカルボン酸に由来するアシル基を表し、該アシル基は非置換であるか、又はヒドロキシ、ジヒドロキシホスホリルオキシ、2〜18炭素原子のアルキル、2〜18炭素原子のアルコキシ、アシル部分に2〜18炭素原子を有するアシルオキシ、アミノ、アシルアミノから選択される1〜3置換基を有し、
- C*1及びC*2は互いに独立して、立体配置R、S又はラセミ形RSにある不斉炭素である)
の少なくとも1つの免疫調節化合物、又はその医薬的に許容される塩、溶媒和物、若しくは異性体が、不活性で非毒性の医薬的に許容される希釈剤又はキャリアと任意に結合又は混合されて含まれる医薬組成物の適切な量を、必要とする患者に投与することを含む、炎症性サイトカインの過剰産生に関連する疾患又は障害に罹患しているヒトを含む恒温動物を治療する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、より具体的には、
* Xが以下の群：
* カルボキシル -COOH、
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* [アミノ(C1〜C10)アルキル]アミノカルボニル -CONH(CH2)n1-NH2 (n1は1〜10の整数である)、
* [ジカルボキシ(C1〜C5)アルキル]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ[アミノ(C1〜C5)アルキル]]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜5の整数である)、
* アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜15の整数である)
から選択され、
【００１４】
* Yが以下の群：
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* ヒドロキシ -OH、
* アミノ(C1〜C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜15の整数である)、
* ジヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH (n1は1〜10の整数である)、
* ヒドロキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-OH (n1は1〜10の整数である)、
* カルボキシ(C1〜C10)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-COOH (n1は1〜10の整数である)、
* オキソ(C1〜C5)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHO (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ(C1〜C10)アルカノイル]アミノ(C1-C15)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH (n1は1〜10の整数であり、n2は1〜15の整数である)
から選択される、上記で定義される方法に関する。
【００１５】
本発明は、より具体的には、
* Xが以下の群：
* カルボキシル -COOH、
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* [アミノ(C1〜C6)アルキル]アミノカルボニル -CONH(CH2)n1-NH2 (n1は1〜6の整数である)、
* [ジカルボキシ(C1〜C5)アルキル]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-COOH (n1は1〜5の整数である)、
* [カルボキシ[アミノ(C1〜C5)アルキル]]アミノカルボニル -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)n1-NH2 (n1は1〜5の整数である)、
* アミノ(C2〜C12)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は2〜12の整数である)
から選択され、
【００１６】
* Yが以下の群：
* ジヒドロキシホスホリルオキシ -O-P(O)(OH)2、
* ヒドロキシスルホニルオキシ -O-SO2(OH)、
* アミノ -NH2、
* ヒドロキシ -OH、
* アミノ(C2〜C12)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH2 (n1は2〜12の整数である)、
* ジヒドロキシ(C3〜C7)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHOH-CH2OH (n1は3〜7の整数である)、
* ヒドロキシ(C2〜C6)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-OH (n1は2〜6の整数である)、
* カルボキシ(C3〜C6)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-COOH (n1は3〜6の整数である)、
* オキソ(C2〜C5)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-CHO (n1は2〜5の整数である)、
* [カルボキシ(C3〜C6)アルカノイル]アミノ(C2〜C12)アルカノイルオキシ -O-CO-(CH2)n1-NH-CO-(CH2)n2-COOH (n1は3〜6の整数であり、n2は2〜12の整数である)
から選択される、上記で定義される方法に関する。
【００１７】
本発明は、より具体的には、
* Xが以下の群：
* -COOH、
* -O-P(O)(OH)2、
* -O-SO2(OH)、
* -NH2、
* -CO-NH-(CH2)3-NH2、又は-CONH-(CH2)6-NH2、
* -CO-NH-CH(COOH)-CH2-COOH、
* -CO-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH2、
* -O-CO-(CH2)5-NH2
から選択され、
* Yが以下の群：
* -O-P(O)(OH)2、
* -O-SO2(OH)、
* -NH2、
* -OH、
* -O-CO-CH2-NH2 (2-アミノエタノイルオキシ)、-O-CO-(CH2)2-NH2 (3-アミノプロパノイルオキシ)、-O-CO-(CH2)5-NH2 (6-アミノヘキサノイルオキシ)、又は-O-CO-(CH2)11-NH2 (12-アミノドデカノイルオキシ)、
* -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH (6,7-ジヒドロキシヘプタノイルオキシ)、
* -O-CO-(CH2)5-OH (6-ヒドロキシヘキサノイルオキシ)、
* -O-CO-(CH2)2-COOH (3-カルボキシプロパノイルオキシ)
* -O-CO-(CH2)4-CHO (6-オキソヘキサノイルオキシ),
* -O-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)2-COOH (3-カルボキシプロパノイルアミノヘキサノイルオキシ)
から選択される、上記で定義される方法に関する。
【００１８】
本発明は、より具体的には、R1及びR2が：
-CO-CH2-C*H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C12O)C14)、
-CO-CH2-C*HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14)、
-CO-CH3, (C2)、
-CO-CH2-NH-CO-C*H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2)、
-CO-C*H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3, (2(C6O)C8)、
-CO-(CH2)16-CH3, (C18)、
-CO-CH2-C*H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3, (3(BnO)C14)、
-CO-CH2-C*H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3, (3[(OH)2-P(O)O]C14)、
C*は、前記式中で、立体配置R、S又はラセミ形RSの不斉炭素に相当する
から選択される、上記で定義される方法に関する。
【００１９】
本発明は、より具体的には、
- R1が：
-CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C12O)C14)、
-CO-CH2-C**1HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14)、
-CO-CH3, (C2)、
-CO-CH2-NH-CO-C**1H[O-CO-(CH2)8-CH3]-(CH2)5-CH3, ([2(C10O)C8]NC2)、
-CO-C**1H[O-CO-(CH2)4-CH3]-(CH2)5-CH3, (2(C6O)C8)、
-CO-(CH2)16-CH3, (C18)、
から選択され、
- R2が：
-CO-CH2-C**2H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3, (3(C12O)C14)、
-CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3, (3(HO)C14)、
-CO-CH2-C**2H[O-CH2-C6H5]-(CH2)10-CH3, (3(BnO)C14)、
-CO-CH2-C**2H[O-P(O)(OH)2]-(CH2)10-CH3, (3[(OH)2-P(O)O]C14)
から選択され、
C**1及びC**2は、前記式中で、立体配置R、S又はラセミ形RSの不斉炭素に相当する、上記で定義される方法に関する。
【００２０】
本発明は、投与される化合物が、一般式(II)：
【化２】
2009529523.tif 000003
(式中、X、Y、R1、R2及びmは、上記で定義されるとおりであり、C*1は、立体配置R、Sであるか、又はラセミRSであり、C*2は立体配置Rである)
を有する、上記で定義される方法にも関する。
【００２１】
本発明は、より具体的には、投与される化合物が：
- X = -O-P(O)(OH)2、Y = -O-P(O)(OH)2、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 2、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(3S,9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル アミノ]-デカン-1,10-ジオール (1,10)-ビス-ジヒドロゲノホスフェート (OM-294-DP (S,R))、
- X = -O-P(O)(OH)2、Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 2、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(3S,9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1, 10-ジオール 1-ジヒドロゲノホスフェート 10-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (OM-197-MP-HD (S,R))、
【００２２】
- X = -COOH、Y = -O-CO-(CH2)4-CHOH-CH2OH、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 1、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわちN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-L-アスパラギン酸, α-N-[(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル]アミド 5-O-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (OM-197-MC-HD (S,R))、
- X = -O-P(O)(OH)2、Y = -O-CO-(CH2)5-NH2、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 2、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(3S,9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジヒドロゲノホスフェート 10-(6-アミノヘキサノエート) (OM-197-MP-AC (S,R))、
- X = -NH2、Y = -O-P(O)(OH)2、R1 = -CO-CH2-C**1H[O-CO-(CH2)10-CH3]-(CH2)10-CH3、R2 = -CO-CH2-C**2HOH-(CH2)10-CH3、m = 4、C*1は立体配置Sであり、C*2は立体配置Rであり、C**1及びC**2は立体配置Rであり、すなわち(5S,11R)-1-アミノ-5-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-6-オキソ-7-アザ-11-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-ドデカン-12-オール 12-ジヒドロゲンホスフェート (OM-294-BA-MP (S,R))
である式(II)の化合物から選択される、上記で定義される方法に関する。
【００２３】
本発明は、生体中の活性Tリンパ球、単球又は抗原提示細胞による炎症性サイトカイン又は炎症性疾患マーカーの過剰産生に関連する疾患又は障害に罹患しているヒトを含む恒温動物を治療するための上記で定義される方法であって、炎症性サイトカイン又は炎症性疾患マーカーが、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IFN-γ、TNF-α及びMCP-1からなる群に属する方法にも関する。
【００２４】
本発明は、より具体的には、疾患が、喘息、糖尿病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、前立腺炎、炎症性腸疾患及びリウマチ性関節炎からなる群より選択される、上記で定義される方法に関する。
【００２５】
本発明は、医薬的に許容されるキャリア、賦形剤又は製剤にある上記で定義される本発明の式(I)のいずれかの化合物の治療有効量を、粘膜又は非経口経路を介して投与することからなる、上記で定義される方法にも関する。
【００２６】
本発明は、より具体的には、上記で定義される本発明の式(I)の化合物の治療有効量を、腹腔、皮下、経口、鼻内、舌下又はエアロソル経路を介して優先的に投与することからなる、上記で定義される方法にも関する。
【００２７】
本発明は、より具体的には、上記で定義される式(I)の化合物の治療有効量を、ポロキサマー407 (Lutrol F-127)のような親水性ポロキサマー界面活性剤のような胃耐性キャリアと組み合わせて含む胃耐性医薬組成物に関する。ポリマー性ナノ粒子又はマイクロ粒子のようなコロイド状キャリアも、メタクリル酸ポリマーのような腸溶性ポリマーを用いる場合は、式(I)の経口送達に適する製剤である。
【００２８】
より通常の様式において、腸溶コーティングを用いることにより得られる胃耐性錠剤又はカプセル剤の使用も、経口経路の選択肢になり得る。
【００２９】
本発明は、より具体的には、上記で定義される本発明の式(I)の免疫調節分子の必要投与量が、ヒトにおいて0.01〜50mg/m2の範囲である、上記で定義される方法にも関する。
【００３０】
本発明は、上記で定義される式(I)の少なくとも1つの化合物の、喘息、糖尿病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、前立腺炎、炎症性腸疾患及びリウマチ性関節炎のような、炎症性サイトカイン又は炎症性疾患マーカーの過剰産生に関連する疾患又は障害の予防又は治療用の薬剤の製造のための使用にも関する。
【００３１】
本発明は、上記で定義される式(I)の化合物、及び該化合物を、生理的に許容されるキャリアと組み合わせて含む医薬品にも関する。
【００３２】
上記で定義される本発明の式(I)の化合物は、式(I)の化合物の製造、及び癌の治療における又は免疫アジュバントとしての使用に関するWO 00/00462及びWO 01/46127に記載される方法を用いて製造できる。
【００３３】
本発明は、化合物OM-294-DP (S,R)、OM-197-MP-HD (S,R)、OM-197-MC-HD (S,R)、OM-197-MP-AC (S,R)及びOM-294-BA-MP (S,R)の合成、並びにそれらの生物学的特性についての以下の記載において、さらに詳細に記載される。
【実施例】
【００３４】
実施例1：
(3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1, 10-ジオール 1-ジヒドロゲノホスフェート 10-(6-アミノヘキサノエート) (= OM-197-MP-AC (S,R)) (スキーム1)
1.    (2R)-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-1-(2-テトラヒドロピラニルオキシ)ペンタン (C-1)
(2R)-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラ-デカノイルアミノ]ペンタン-1-オール(PCT WO00146127A1) (2.5 g ; 4.39 mmol)の無水CH2Cl2 (83 ml)溶液に、室温にて、アルゴン下で、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(DHP) (1.4 ml, 15.38 mmol)、次いで、ピリジニウムp-トルエンスルホネート(PPTS) (441 mg, 1.75 mmol)を連続的に加えた。溶液を室温にて18時間撹拌し、次いで、CH2Cl2 (100 ml)で希釈し、5% NaHCO3水溶液、次いでH2Oで洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(AcOEt/ 石油エーテル4/1)による精製により、化合物C-1 (2.86 g ; 100%)を、白色の結晶固体として得た。(AcOEt/石油エーテル4/1中でRf = 0.66; U.V. 及びホスホモリブデート).
C39H60N2O6. IS/MS : m/z 653.5 ([M+H]+), 675.5 ([M+Na]+). Mp = 84〜86℃.
【００３５】
2.    (2R)-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-1-(2-テトラヒドロピラニルオキシ)-ペンタン (C-2)
化合物C-1 (2.5 g ; 4.4 mmol)のトリエチルアミン(4 ml)含有EtOH (150 ml)溶液を、C上の10% Pdの存在下で、室温にて、大気圧の水素の下で3.5時間水素化した。次いで、触媒をろ過により除去し、エタノールで洗浄し、ろ液を濃縮し、高圧下で乾燥させて、遊離アミンC-2 (2.15 g ; 96%)を、非晶質の白色固体として得た。
C31H54N2O4. IS/MS : m/z 519.5 ([M+H]+).
【００３６】
3.    (S)-(α)-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-γ-ブチロラクトン (C-3)
(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸[Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205〜2214] (2.16 g ; 5.1 mmol)の無水THF (28 ml)溶液に、-15℃にて、アルゴン下で、N-メチルモルホリン(0.56 ml ; 5.1 mmol ; 1eq)及びクロロギ酸イソブチル(657μl ; 5.1 mmol ; 1eq)を連続的に加えた。-15℃にて1時間撹拌した後に、L-ホモセリンラクトン臭化水素酸塩(916 mg ; 5.1 mmol ; 1eq)を、0.72 M NaHCO3水溶液(14 ml, 2 eq)中の溶液として加えた。反応混合物を、室温にて20時間撹拌した。混合物をEt2O (130 mL)で希釈し、有機相を分離し、H2Oで洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。結晶化による精製(CH2Cl2の最小容量及び過剰のペンタン、0℃にて)により、化合物C-3 (2.17 g ; 85%)を白色固体として得た。C30H55NO5. IS/MS : m/z 510.5 ([M+H]+), 532.5 ([M+Na]+). mp = 79〜80℃.
【００３７】
4.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-10-(2-テトラヒドロピラニル)オキシ-デカン-1-オール(C-4)
化合物C-2 (638 mg, 1.23 mmol, 1.3 eq)の無水CH2Cl2 (1.5 mL)溶液に、20〜21℃にて、化合物C-3 (483 mg, 0.95 mmol)を加えた。溶液を20〜21℃にて3日間撹拌し、溶媒を減圧下に蒸発させた。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/アセトン 5/1〜1/1)による精製により、アルコールC-4 (829 mg, 85%)を白色固体として得た。C61H109N3O9. IS/MS : m/z 1029.0 ([M+H]+), 1051.0 ([M+Na]+). mp = 81〜82℃.
【００３８】
5.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-10-(2-テトラヒドロピラニル)オキシ-デカン-1-オール ジベンジルホスフェート(C-5)
アルコールC-4 (120 mg ; 0.12 mmol)及び1H-テトラゾール(25 mg ; 0.35 mmol ; 3 eq)の無水THF (5 ml)溶液に、室温にて、アルゴン下で、N,N-ジベンジル ジエチルホスホラミダイト(85%, 95μl ; 0.27 mmol ; 2.3 eq)を加えた。45分間の撹拌の後に、反応混合物を-40℃に冷却し、次いで、mCPBA (57〜86% ; 75 mg ; 0.43 mmol ; 3,7 eq)のCH2Cl2 (3 ml)溶液を加えた。-40℃にて45分間の後に、混合物を温め、Na2S2O3の飽和溶液(3 ml)を加え、混合物を10分間撹拌した。溶液をエーテルで希釈し、有機相を分離し、飽和Na2S2O3 (5×)、次いで飽和NaHCO3 (2×)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/ アセトン 4/1、次いで2/1)による精製により、ジベンジルホスフェートC-5 (126 mg ; 84%)を、非晶質の固体として得た。
【００３９】
6.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-(ジベンジルホスフェート) (C-6)
1% HClのメタノール溶液(25 ml)に、0℃にて、化合物C-5 (700 mg, 0.54 mmol)のCH2Cl2 (2.5 ml)溶液を加えた。0℃にて45分間撹拌した後に、反応混合物を、5% NaHCO3水溶液で中和し、CH2Cl2で希釈し、次いで、有機相を分離した。水相をCH2Cl2 (3×)で抽出し、次いで、有機相を合わせ、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮してアルコールC-6 (640 mg ; 98%)を得た。
【００４０】
7.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジベンジルホスフェート 10-(6-ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサノエート (C-7)
上記のようにして調製した化合物C-6 (640 mg, 0.53 mmol.)及び6-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸(423 mg, 1.60 mmol.)の、乾燥CH2Cl2 (25 ml)溶液に、0℃にて、アルゴン気流の下で、市販で入手可能な1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド 塩酸塩(306 mg, 1.60 mmol.)及び4-ジメチルアミノピリジン(20 mg, 160μmol.)を連続的に加えた。反応混合物を、次いで、0℃にて30分間、その後、室温にて一晩撹拌した。次いで、反応媒体を水、及び1N HCl溶液で洗浄し、続いて相分離した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(4/1、次いで2/1 CH2Cl2/アセトン溶離液)を行うことにより、カップリング反応生成物C-7 (537 mg; 71%)を得た。13C-NMR (62,89 MHz, CDCl3), ppmでのδ: 173.18, 171.16, 170.38, 169.60, 156.30, 138.23, 136.50, 135.38, 135.28, 128.42, 128.26, 128.17, 127. 79 , 127.74, 127.44, 76.48, 71.15, 70.84, 69.47, 69.39, 69.31, 66.25, 65.62, 64.37, 49.78, 47.76, 41.41, 41.34, 40.57, 38.97, 34.22, 34.16, 33.96, 33.57, 32.95, 31.70 , 29.15, 28.95, 28.32, 25.87, 25.46, 25.02, 28.80, 24.18, 22.49, 13.94.
【００４１】
8.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジヒドロゲンホスフェート 10-(6-アミノヘキサノエート) (C-8) (= OM-197-MP-AC (S,R))
化合物C-7 (500 mg, 0.35 mmol.)の酢酸(10 ml)含有5/2 CH2Cl2/エタノール混液(70 ml)中の溶液を、10% Pd含有Pdカーボンの存在下で室温にて、大気圧の水素の下で12〜24時間水素化した。触媒をろ去した。ろ液を蒸発乾燥させ、次いで、残渣を真空ポンプからの吸引により乾燥させて、C-8を得た(368 mg, 量的収率). ES/MS : m/z比 1047.9 [M+H]+ ; 1069.8
【００４２】
【化３】
2009529523.tif 000004
【００４３】
実施例2 
(3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジヒドロゲノホスフェート 10-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (= OM-197-MP-HD (S,R)) (スキーム2)
1.    6-ヘプテン酸ベンジル (C-9)
6-ヘプテン酸(4.71 g, 36.75 mmol)のAcOEt (80 mL)溶液に、0℃にて、トリエチルアミン(15.3 mL, 110.24 mmol)、臭化ベンジル(13.1 mL, 110.24 mmol)及びBu4NI (6.79 g, 18.37 mmol)を連続的に加えた。反応混合物を0℃にて2時間撹拌し、真空濃縮した。残渣をAcOEtに採取し、有機相を飽和NaHCO3水溶液及びH2Oで洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、溶媒を真空除去した。残渣のシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(n-ヘプタン/EtOAc, 9:1)により、化合物C-9 (6.00 g ; 75%)を無色の油として得た。13C-NMR (62.89 MHz, CDCl3): 24.42, 28.34, 33.37, 34.13, 66.08, 114.73, 128.19, 128.55, 136.16, 138.37, 173.43.
【００４４】
2.    6,7-エポキシヘプタン酸ベンジル(C-10)
m-CPBA (2.76 g, 12.29 mmol)のCH2Cl2 (50 mL)溶液に、0℃にて、C-9 (1.79 g, 8.19 mmol)のCH2Cl2 (20 mL)溶液をゆっくりと加えた。溶液を0℃にて2時間、次いで室温にて18時間撹拌した。溶液を、CH2Cl2で希釈し、有機相を飽和Na2S2O3水溶液で洗浄した(5×)。有機相をMgSO4で乾燥させ、溶媒を真空除去した。残渣のシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(n-ヘプタン/EtOAc, 5:1)により、化合物C-10 (1.54 g ; 80%)を無色の油として得た。13C-NMR (62.89 MHz, CDCl3): 24.60, 25.39, 32.00, 34.02, 46.86, 51.91, 66.04, 128.11, 128.46, 136.01, 173.17.
【００４５】
3.    ベンジル 6,7-イソプロピリデンヘプタノエート(C-11)
C-10 (1.54 g, 6.59 mmol)のアセトン(50 mL)溶液に、室温にて、硫酸(0.42 mL, 7.9 mmol)を加えた。溶液を3時間撹拌し、ジエチルエーテルで希釈し、有機相を飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、溶媒を真空除去して、C-11 (1.73 g)を淡黄色の油として得て、これをさらなる精製を行わずに次の工程で用いた。
【００４６】
4.    6,7-イソプロピリデンヘプタン酸(C-12)
化合物C-11 (1.53 g)のEt3N (3.65 mL, 26.16 mmol)含有EtOAc (20 ml)溶液を、10% Pd含有Pdカーボンの存在下で、室温にて、大気圧の水素の下で3時間水素化した。触媒をろ去し、ろ液を蒸発乾燥させる。残渣のシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH, 5:1)により、化合物C-12 (0.63 g ; 2工程で54%)を、無色の油として得た。
【００４７】
5.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジベンジルホスフェート 10-(6,7-イソプロピリデンヘプタノエート (C-13)
上記のようにして調製した化合物C-6 (248 mg, 0.21 mmol.)及び化合物6,7-イソプロピリデンヘプタン酸(C-12) (92 mg, 0.45 mmol.)の、乾燥CH2Cl2 (5 ml)中の溶液に、0℃にて、アルゴン気流の下で、市販で入手可能な1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド 塩酸塩(91 mg, 0.47 mmol.)及び4-ジメチルアミノピリジン(触媒)を連続的に加えた。反応混合物を、次いで、0℃にて30分間、その後、室温にて一晩撹拌する。反応媒体を、次いで、水、及び1N HCl溶液で洗浄し、続いて、相分離する。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させる。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH, 99:1)精製を行うことにより、カップリング反応生成物C-13 (240 mg; 83%)を回収する。ES/MS : m/z 1390 [M+H]+ ; 1411 [M+Na]+.
【００４８】
6.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1-ジヒドロゲンホスフェート 10-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (C-14) (= OM-197-MP-HD (S,R))
化合物C-13 (180 mg, 0.13 mmol.)の、酢酸 (3 ml)含有5/2 CH2Cl2/エタノール混液(21 ml)中の溶液を、10% Pd含有Pdカーボンの存在下で、室温にて、大気圧の水素の下で12〜36時間水素化する。触媒をろ去する。ろ液を蒸発乾燥させ、次いで、残渣を真空ポンプからの吸引により乾燥させて、C-14 (139 mg, 量的収率)を得た。ES/MS : m/z 1079 [M+H]+ ; 1101 [M+Na]+.
【００４９】
【化４】
2009529523.tif 000005
【００５０】
実施例3 
(3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1,10-ビス-ジヒドロゲノホスフェート) (= OM-294-DP (S,R)) (スキーム3)
1.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール (C-15)
(2R)-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オール(PCT WO00146127A1) (8 g, 18.4 mmol)の無水CH2Cl2 (60 mL)溶液に、25℃にて、無水CH2Cl2 (28 mL)中の化合物C-3 (9 g, 17.5 mmol)を加えた。溶液を20〜21℃にて3日間撹拌した。懸濁物を、CH2Cl2 (66 mL)で希釈し、30℃まで温めて、澄明な溶液を得た。アセトニトリル(320 mL)を、溶液にゆっくりと加えた。溶液を20℃まで冷却し、2時間撹拌した。沈殿物をろ過し、アセトニトリルで洗浄し、真空乾燥して、C-15 (13.7 g, 83%) を白色固体として得た。 mp = 103℃.
【００５１】
2.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1,10-ビス-(ジベンジルホスフェート) (C-16)
C-15 (1.02 g ; 1.08 mmol)及び1H-テトラゾール(454 mg ; 6.48 mmol ; 6 eq)の無水THF (46 mL)溶液に、室温にて、アルゴンの下で、N,N-ジベンジルジエチルホスホラミダイト(85%, 1.50 mL ; 4.97 mmol ; 4.6 eq)を加えた。30分間の撹拌の後に、反応混合物を-20℃に冷却し、次いで、mCPBA (57〜86% ; 1.32 g ; 7.67 mmol ; 7.4 eq)のCH2Cl2 (30 mL)溶液を加えた。-20℃にて45分間の後に、溶液を0℃まで温め、Na2S2O3飽和溶液(25 mL)を加え、混合物を10分間撹拌した。溶液をエーテルで希釈し、有機相を分離し、飽和Na2S2O3 (5×)、次いで飽和NaHCO3 (2×)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/アセトン 4/1次いで3/1)による精製により、C-16 (1.38 g ; 87%)を無色の油として得た。
【００５２】
3.    (3S, 9R)-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1,10-ジオール 1,10-ビス-ジヒドロゲノホスフェート) (C-17) (= OM-294-DP (S,R))
化合物C-16 (2.7 g, 1.84 mmol)のイソプロパノール(150 mL)溶液を、C上の10% Pd (320 mg)で、室温にて、大気圧の水素の下で3時間水素化した。触媒を、ミリポアメンブレンを介してろ過することにより除去した。ろ液を濃縮し、高真空下で乾燥して、C-17 (1.8 g; 98%)を非晶質の固体として得た。
【００５３】
【化５】
2009529523.tif 000006
【００５４】
実施例4
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-L-アスパラギン酸,α-N-[(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-ペンチル]アミド 5-O-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート) (=OM-197-MC-HD (S,R)) (スキーム4)
1.    N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-L-アスパラギン酸, α-N-[(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル]アミド-β-ベンジルエステル, 5-O-(6, 7-イソプロピリデンヘプタノエート) (C-18)
化合物N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-L-アスパラギン酸, α-N-[(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル] アミド-β-ベンジルエステル (PCT WO00146127A1) (1.14 g, 1.09 mmol.)及び化合物6,7-イソプロピリデンヘプタン酸(C-12) (487 mg, 2.48 mmol.)の乾燥CH2Cl2 (30 mL)溶液に、0℃にて、アルゴン気流の下で、市販で入手可能な1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド 塩酸塩(485 mg, 2.53 mmol.)、及び4-ジメチルアミノピリジン(43 mg, 0.35 mmol)を連続的に加える。反応混合物を、次いで、0℃にて30分間、その後、室温にて一晩撹拌する。反応媒体を、次いで、水及び1N HCl溶液で洗浄し、続いて、相分離する。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させる。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/アセトン, 9:1)を行うことにより、カップリング反応生成物C-18 (1.20 g; 76%)を、白色固体として回収する。ES/MS : m/z 1255 [M+Na]+.
【００５５】
2.    N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-L-アスパラギン酸,α-N-[(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-ペンチル]アミド 5-O-(6, 7-ジヒドロキシヘプタノエート) (C-19) (= OM-197-MC-HD (S,R))
化合物C-18 (1.20 g, 0.97 mmol.)の、酢酸(5 mL)含有2/1 CH2Cl2/エタノール混液(50 mL)の溶液を、10% Pd含有Pdカーボンの存在下で、室温にて大気圧の水素の下で12〜36時間水素化する。触媒をろ去する。ろ液を蒸発乾燥させ、残渣を、次いで、真空ポンプからの吸引により乾燥させて、C-19 (1 g, 量的収率)を得る。ES/MS : m/z 1012 [M+H]+ ; 1034 [M+Na]+.
【００５６】
【化６】
2009529523.tif 000007
【００５７】
実施例5 
(5S,11R)-1-アミノ-5-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-6-オキソ-7-アザ-11-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-ドデカン-12-オール 12-ジヒドロゲノホスフェート (= OM-294-BA-MP (S,R)) (スキーム5)
1.    Nα-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル] Nε-ベンジルオキシカルボニル-L-リジン(C-20)
(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸P-109 [Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205〜2214] (153 mg ; 0.36 mmol)の無水THF (4 ml)溶液に、-15℃にて、アルゴンの下で、N-メチルモルホリン (40μl ; 0.36 mmol ; 1eq)及びクロロギ酸イソブチル(47μl ; 0.36 mmol ; 1eq)を、連続的に加えた。-15℃にて30分間撹拌した後に、市販で入手可能なH-L-リジン(Z)-OH (100 mg ; 0.36 mmol ; 1eq)のEt3N (0.16 mL)含有CH3CN/H2O (3.5/1 (4.5 mL)溶液を加えた。反応混合物を、室温にて20時間撹拌した。有機溶媒を、次いで蒸発させ、水相を0℃に冷却し、10%クエン酸水溶液でpH = 3まで酸性化し、AcOEt (3×)で抽出した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(0.25%酢酸含有1/1 石油エーテル/AcOEt溶離液)、続いてトルエンとの共蒸発を行うことにより、C-20 (172 mg ; 70%)を白色の結晶固体として得た。MS: (IS+) m/z  690.0 [M+H]+, 707.0 [M+NH4]+, 712.0 [M+Na]+, 727.5 [M+K]+. 13C-NMR (62.89 MHz, CDCl3), ppmでのδ: 174.90, 173.73, 170.66, 156.98, 136.53, 128.57, 128.17, 128.05, 71.27, 66.79, 52.24, 41.32, 40.47, 34.59, 34.24, 31.99, 31.45, 29.72, 29.43, 29.25, 25.29, 25.07, 22.76, 22.27, 14.19.
【００５８】
2.    (5S,11R)-1-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル-アミノ]-6-オキソ-7-アザ-11-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-ドデカン-12-オール(C-21).
C-20 (150 mg; 0.22 mmol.)及び(2R)-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシ-テトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オールWZ-10b (PCT WO00146127A1) (95 mg; 0.22 mmol.; 1.0 eq)の無水CH2Cl2 (3 ml)溶液に、0℃にて、市販で入手可能なHOAt (1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール) (36 mg, 0.26 mmol., 1.2 eq.)、及び市販で入手可能なN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(41μl, 0.22 mmol., 1.2 eq.)を加えた。反応混合物を0℃にて1時間、その後、室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、その後、水、1N HCl溶液、及びNaHCO3飽和溶液で洗浄した後に、相分離した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(3/1 CH2Cl2/アセトン溶離液)を行うことにより、C-21 (165 mg ; 68%)を白色結晶固体として回収した。MS: (IS+) m/z 1105.8 [M+H]+, 1128.0 [M+Na]+, 13C-NMR (62.89 MHz, CDCl3), ppmでのδ: 173.56, 172.20, 171.87, 170.23, 156.82, 138.32, 136.69, 128.53, 128.47, 128.09, 128.00, 127.91, 127.82, 76.77, 71.48, 71.15, 66.59, 64.77, 53.1, 51.39, 41.71, 41.63, 40.46, 39.45, 34.57, 34.51, 34.12, 31.97, 29.70, 29.51, 29.41, 29.25, 28.69, 25.38, 25.29, 25.19, 25.09, 22.74, 22.50, 14.18.
【００５９】
3.    (5S,11R)-1-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-6-オキソ-7-アザ-11-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-ドデカン-12-オール 12-ジベンジルホスフェート (C-22).
C-21 (150 mg ; 0.14 mmol)及び1H-テトラゾール(29 mg ; 0.41 mmol ; 3 eq)の無水THF (8 mL)溶液に、室温にて、アルゴンの下でN,N-ジベンジル ジエチルホスホラミダイト(85%, 110μL ; 0.31 mmol ; 2.3 eq)を加えた。30分間の撹拌の後に、反応混合物を-20℃まで冷却し、次いで、mCPBA (57〜86% ; 87 g ; 0.50 mmol ; 3.7 eq)のCH2Cl2 (6 mL)溶液を加えた。-20℃にて45分間の後に、溶液を0℃まで温め、Na2S2O3飽和溶液(5 mL)を加え、混合物を10分間撹拌した。溶液をエーテルで希釈し、有機相を分離し、飽和Na2S2O3 (5×)、次いで飽和NaHCO3 (2×)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/アセトン 4/1、次いで2/1)による精製により、C-22 (149 mg ; 81%)を非晶質の固体として得た。MS: (IS+) m/z 1366.0 [M+H]+, 1383.5 [M+NH4]+, 1388.5 [M+Na]+, 1088.0 [M-(BnO)2OPOH)+H]+, 13C-NMR (62.89 MHz, CDCl3), ppmでのδ: 173.51, 171.77, 171.27, 169.95, 156.67, 138.32, 136.69, 135.66 (d), 135.55 (d), 128.69, 128.51, 128.43, 128.03, 127.77, 127.69, 76.49, 71.28, 71.20, 69.66 (d), 69.58 (d), 68.72 (d), 66.51, 52.82, 48.62 (d), 41.76, 41.46, 40.46, 39.01, 34.54, 34.06, 31.96, 29.68, 29.49, 29.39, 29.22, 27.95, 25.29, 25.18, 25.05, 22.73, 22.45, 14.17.
【００６０】
4.    (5S,11R)-1-アミノ-5-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-6-オキソ-7-アザ-11-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-ドデカン-12-オール 12-ジヒドロゲノホスフェート (C-23) (= OM-294-BA-MP (S,R))
化合物C-22 (130 mg, 0.095 mmol.)の酢酸(3 mL)含有3/1 CH2Cl2/エタノール混液(20 mL)中の溶液を、10% Pd含有Pdカーボンの存在下で、室温にて、大気圧の水素の下で36時間水素化する。触媒をろ去する。ろ液を蒸発乾燥させ、次いで、残渣を真空ポンプからの吸引により乾燥させて、C-23 (84 mg, 91%)を得る。MS: (IS+) m/z 962.0 [M+H]+, 984.0 [M+Na]+.
【００６１】
【化７】
2009529523.tif 000008
【００６２】
本発明による化合物の生物学的活性
実施例6
マウスDC細胞上のLPS誘導炎症性(IL-12及びTNF-α)及び抗炎症性(IL-10)サイトカインに対するOM 197-MP-AC及びOM-294-DPのインビトロ調節効果
プロトコル：
骨髄細胞は、以下に記載するようにして単離して培養した。
6週齢の2匹の雄性C57BL/7の大腿骨及び脛骨(Charles River Laboratories France)を回収し、筋肉及び腱を除き、70%エタノールで消毒した。各骨の両端を切断し、26ゲージの針を有するシリンジを用いて髄をHBSS (Gibco BRL)で流し出した。得られた細胞懸濁物を5分間、500gにて遠心分離し、HBSSで洗浄した。細胞を3×105細胞/mlで、2 mM L-グルタミン(Sigma)、100 U/mlペニシリン(Sigma)、100μg/mlストレプトマイシン(Sigma)、50μM β-メルカプトエタノール (Sigma)、10%熱不活化FCS (Sigma)及び15 ng/ml マウスrGM-CSF (R&D)を補ったRPMI-1640 (Gibco BRL)中に再懸濁した。
【００６３】
骨髄(BM)由来樹状細胞(DC)を作製するために、BM白血球を、100-mm細菌ペトリディッシュ(Falcon 1029)内で8日間、37℃にて5% CO2中で培養した。0日目に、10 mlの細胞懸濁物をディッシュあたりに播種した。3日目に、別の10 mlの新たに調製した培地を各プレートに加え、6日目に、9 mlの上部の培地を、各プレートから注意深く回収し、10 mlの新鮮な培地で置き換えた。
【００６４】
8日経過したBM細胞培養の非接着細胞を回収し、500gにて5分間遠心分離し、1.25×106細胞/mlで、10 ng/ml GM-CSFを含有する補足RPMIに再懸濁した。次いで、細胞を、24ウェル組織培養プレートに播種し(1×106細胞/ウェル)、37℃にて1時間30分、5% CO2中で、OM-294-DP又はOM-197-MP-AC (0.01〜100μg/ml/200μl/ウェル)の存否でインキュベートした。LPS (E.coli O26:B6, Sigma)を、次いで、1μg/mlで加え、プレートをさらにインキュベートした。20時間のインキュベーションの後に、上清をサイトカインの分析のために回収した。
【００６５】
DC培養上清中のIL-12p70、IL-10及びTNF-αの濃度は、BD PharmingenからのOptEIAマッチAb対を用いるELISAにより測定した。Supersignal ELISA Pico化学発光ペルオキシダーゼ基質(BD Pharmingen)を、ルミノメトリによる検出に用いた(Wallac 1420マルチラベルカウンタVictor-2)。アッセイは、製造者の指示書に従って行った。
【００６６】
結果：
a)    LPS-誘発IL-12及びIL-10産生に対するOM-197-MP-AC及びOM-294-DPの影響
LPS-誘発IL-12及びIL-10産生についての結果を、図1に示す。
【００６７】
b)    LPS-誘発TNF-α産生に対するOM-197-MP-AC及びOM-294-DPの影響
LPS-誘発TNF-α産生についての結果を、図2に示す。
【００６８】
結論：
上記の結果は、OM-197-MP-AC及びOM-294-DPがともに、炎症性サイトカイン(IL-12及びTNF-α)のLPS-誘発産生を減少させ、非常に対照的に、抗炎症性サイトカインIL-10の産生を増加させ、このことは、本発明の化合物が、治療的抗炎症剤として作用しうることを示唆することを示す。
【００６９】
実施例7 
ヒトCD4+ T細胞に対する一連の4つのトリアシル化誘導体の直接的影響
プロトコル：
一連の4つの本発明の化合物(OM-197-MP-AC, OM-197-MC-HD, OM-294-BA-MP, OM-197-MP-HD)を、以下にまとめるようにして直接試験した。
ナイーブCD4+ T細胞を、健康な血液提供者から磁気により選別した(バフィーコート)。細胞を、段階的用量のトリアシル誘導体(0,02; 0,2; 2及び20μg/ml)の存在下又は非存在下で、プレートに結合した抗-CD3 (5μg/ml)及び可溶性抗-CD28 (1μg/ml)を用いて刺激した。6日後に、サイトカインのレベル(IFN-γ及びIL-13)を、ELISAを用いて、培養上清中で試験した。
【００７０】
結果：
サイトカイン産生についての結果を、図3に示す。T細胞増殖も試験したが、本発明の化合物により変更されなかった。
【００７１】
結論：
CD4+ T細胞によるIL-13産生(白の柱状グラフ)は、OM-197-MP-AC、OM-197-MC-HD、OM-294-BA-MP、OM-197-MP-HDの存在下で減少したが、IFN-γ産生(濃い柱状グラフ)及びT細胞増殖は、影響を受けないままである。このことは、試験した4つのトリアシル化分子の存在下でのTh1応答に向かうシフトを表す。
【００７２】
実施例8
喘息モデルでのOM-197-MP-ACの影響
前の実施例では、試験したトリアシル化分子が、喘息の病理に関連していると考えられるサイトカイン(すなわちIL-13)の産生を減少させたので、本発明者らは、ナイーブTヘルパー細胞のTh2分化の調節及びその後のアレルギー性喘息の発生における、この系列のメンバー(OM-197-MP-AC)のインビボでの影響を探索することを目的とした。
この研究では、本発明者らは、まず(パートa) LACK-誘発アレルギー性喘息の発生に対する、感作期間の間に与えられたOM-197-MP-ACの影響と、治療的に試験された分子の影響(パートb)とについて調べた。
【００７３】
パートa) 喘息の「予防的」処置
プロトコル：
マウス及びアレルギー性喘息の誘発：
6週齢の雌性Balb/c ByJマウスを、Centre d'Elevage Janvier (CERJ, Le Genest-St-Isle, France)から購入した。全てのマウスを、2 mgのミョウバン (PerBio Science France SAS, Brebieres, France)で沈殿させた10μgのLACKタンパク質の2回のi.p.注射により、0及び7日目に感作した。
【００７４】
動物は、以下のような群に分けた：
-     LACK感作及び塩水攻撃されたマウス(4匹)
-     LACK感作及び攻撃されたマウス(8匹)
-     OM-197-MP-AC処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(8匹)
【００７５】
第3群のマウスを、1 mg/Kg (マウスあたり20μg)のOM-197-MP-ACで腹腔内処置した。マウスは、-1、1、2、3、6、8、9、10及び11日目に処置した。
16日目から21日目まで、B及びC群のマウスを、LACK溶液(0.15%)での毎日20分間のエアロソル攻撃に曝露し、塩水群のマウスは、対照として塩水溶液を受容した。
【００７６】
気道応答性亢進(AHR)：
AHRは、吸入メタコリン(アセチルメチルコリン, Sigma)の漸増濃度(6〜25 mg/ml)に応答する全身体積変動記録法(Emka)により、最後の抗原攻撃の1日後の全てのマウスについて測定した。AHRは、気道コンプライアンスと完全に相関関係がある次元のないパラメータである増進された休止期(enhanced pause) (Penh, 図4を参照)、及び気道抵抗、インピーダンス及び胸内圧の測定と相関関係がある抵抗算出値として表される。
【００７７】
試薬：
-     LACK組換えタンパク質は、E. coliで産生され、Mougneauら, 1995により記載されるようにして精製した。
-     0.98 mg/mlの濃度のOM-197-MP-AC, バッチDL040906は、OM PHARMAからであった。
-     抗-IgE EM-95 mAbは、DNAX (Palo Alto, CA, USA)から贈呈された。
-     メタコリン(アセチルメチルコリン)は、Sigma (Saint Quentin Fallavier, France)から購入した。
-     CBAアレイビーズ(Flexセット)は、BD Biosciencesから購入した。
【００７８】
抗体力価：
全てのマウスは、最後のエアロソルの1日後に、心臓穿刺により放血させた。合計IgEは、コーティング抗体としてラットEM-95抗-IgE mAb、及び2次抗体としてビオチンに結合したラット抗-IgE mAbを、記載されたようにして(Juliaら, 2002)用いるELISAにより定量した。
気管支肺胞洗浄(BAL)細胞の分析(好酸球のパーセンテージ)：
個別のマウスから放血させ、カニューレをそれらの気管に挿入した。肺を、1 mlの温PBSで3回洗浄した。細胞をPBSで洗浄し、300μlに再懸濁し、ビュルケル-チュルクチャンバを用いて計数した。示差的BAL細胞計数のために、サイトスピン調製物を作製し、ライト/ギムザ染色で染色した。好中球、好酸球及びその他の単核細胞のそれぞれの数を、顕微鏡検査により決定した。好酸球のパーセンテージのみをここでは報告する(図5)。
【００７９】
肺サイトカイン含量の分析：
処置及び未処置の動物の肺サイトカイン含量を調べるために、タンパク質抽出物を、LACK感作及びPBS攻撃されたwtマウス(「対照」群)、LACK感作及び攻撃されたwtマウス(「喘息」群)、OM-197-MP-AC処置されたwtマウス(「OM-197」群)の肺から調製した。IL-4、IL-5、IL-13含量を、FACSArrayを用いる多重分析により分析した。
【００８０】
結果：
気道応答性亢進(AHR)の測定：
処置又は未処置のLACK感作されたマウス(上記を参照)を、次に、5日間連続で、毎日、エアロソルのLACKで攻撃した。最後のエアロソルの1日後に、AHRを、エアロソルにしたメタコリンの漸増濃度に応答する全身体積変動記録法により測定した。
予期されたように、LACK感作及び塩水攻撃されたマウスは、メタコリンに曝露されたときにAHRを生じなかったが、未処置のLACK感作及び攻撃されたマウスは、高いPenh値により反映されるように、強いAHRを生じた(図4)。明らかに対照的に、OM-197-MP-ACで処置したLACK感作及び攻撃されたマウスは、AHRを示さなかった。
【００８１】
結論：
メタコリンの存在下で測定された、エアロソル抗原に曝露したマウスにおける気道応答性亢進は、OM-197-MP-ACでの処置により対照レベル(塩水)まで減少して戻った。
【００８２】
気管支肺胞洗浄(BAL)における好酸球のパーセンテージの特徴づけ
結果を、図5に報告する。
塩水のエアロソルを受けたLACK感作されたマウスは、BALにおいて好酸球を示さなかったが、LACKエアロソル攻撃を受けたLACK感作されたマウスは、示した。さらに、OM-197-MP-AC処置マウスは、未処置の対照マウスよりも3倍少ない(1／3)好酸球を示した(図5)。
【００８３】
結論：
OM-197-MP-ACでの処置は、BAL好酸球増加を強く減少させる。
【００８４】
血清中の免疫グロブリン(Ig)の測定：
IgEについての結果を、図6に示す。
合計IgEの力価(図6)は、マウスをOM-197-MP-AC化合物で処置したときに、著しく減少した。
結論：
従って、OM-197-MP-ACで処置したマウスの血清は、未処置の感作、攻撃されたマウス(すなわち「喘息性動物」)の血清に比べて、2倍少ない(1／2)合計IgEを含んでいた。
【００８５】
肺サイトカインの測定：
アレルギー性気道炎症に対する予防的OM-197-MP-AC効果をさらに調べるために、タンパク質を、処置及び未処置のWTマウスの両方から抽出し、喘息において重要な役割を有することが知られているサイトカイン(IL-4、IL-5及びIL-13)を、CBAアレイビーズ及びFACSarrayを用いる多重分析により定量した。データは、タンパク質の合計量に標準化し、肺タンパク質1 mgあたりのサイトカインのpgとして得た。
【００８６】
IL-4、IL-13及びIL-5の量は、LACK感作及びPBS攻撃されたマウスの肺においては検出限界未満であったが(図7の「対照」を参照)、これらのサイトカインの量は、LACK攻撃により劇的に増加した(図7の「喘息」を参照)。対照的に、OM-197-MP-ACで処置されたLACK感作及び攻撃されたマウスの肺は、未処置マウスよりも5倍少ない(1／5) IL-4 (p=0.0003)、5倍少ない(1／5)IL-5 (p=0.0003)、及び3.5倍少ない(1／3.5) IL-13 (p=0.003)を含んでいた(図7の「OM-197」を参照)。
【００８７】
IL-4、IL-5及びIL-13に加えて、その他のサイトカインを、CBAアレイビーズ及びFACSarrayを用いる多重分析により定量した。主な結果を、以下に報告する。IFN-γは、LACK感作及びPBS攻撃されたマウスに比べて、LACK感作及び攻撃されたマウスの肺でもアップレギュレートされたことが見出された。OM-197-MP-AC処置されたマウスの肺はともに、未処置マウスの2倍少ない(1／2) IFN-ガンマを含んでいた。
KCは、ヒトIL-8又はCXCL8の機能的に相同なケモカインであり、好中球及び好酸球の両方により発現されるCXCR2に結合する。実際に、KCは、炎症の起きた組織への顆粒球の補充を可能にし得る。KCは、LACK感作及びPBS攻撃されたマウスの肺では非常に低い量で存在するが、その発現は、LACKエアロソル攻撃により大きく増加した。肺で産生されたKCの量は、OM-197-MP-ACでの処置により半分に減少した。
【００８８】
炎症誘発性サイトカインであるIL-6は、LACK感作及びPBS攻撃された肺で見出され、LACKエアロソルによりわずかに増加した。OM-197-MP-AC処置されたマウスの肺は、未処置のマウスのものよりも1.5倍少ない(1／1.5) IL-6を示した。ケモカインMCP-1は、感作及びPBS攻撃されたマウスの肺で発現されたことが見出され、攻撃によりわずかにアップレギュレートされた。OM-197-MP-ACで処置されたマウスの肺は、未処置の動物のものよりも1.8倍少ない(1／1.8)MCP-1を含んでいた。
処置及び未処置のマウスの肺におけるTNF-αの量は、著しい違いを生み出さなかった。
IL-9は、いずれの試料においても検出されなかった。
【００８９】
これらのデータを合わせると、予防的OM-197-MP-ACは、アレルギー性気道炎症及びAHRの誘導に重要なTh2サイトカインの強い減少だけでなく、肺炎症及び好酸球のような炎症性エフェクター細胞の補充に貢献する他のサイトカイン及びケモカインの減少も誘発することが明確に示されている。
【００９０】
実施例8 aについての総括的な結論：
この研究は、本発明の分子の1つ、OM-197-MP-ACの、アレルギー性喘息の発生における防御的役割を明確に示す。感作段階の直前に開始されたOM-197-MP-ACでの処置は、AHRの発生を阻害し、BAL好酸球増加を強く減少させた。さらに、合計IgE量は、OM-197-MP-ACで処置されたマウスの血清において減少した。
データは、OM-197-MP-AC処置が、喘息に関連するサイトカインの発生及び他の炎症性サイトカインの分泌を主に減じたことも示す。1つの可能な機構は、OM-197-MP-ACが、Th2発生を制御するであろう特異的免疫抑制応答及びその後の気道炎症を誘導することであろう。
【００９１】
パートb) 喘息の「治療的」処置
プロトコル：
前の(パートa)プロトコルに比較した主な相違点は、以下のとおりである：
・    マウスは、OM-197-MP-ACでi.p.により、15日目、17日目及び19日目(すなわち、2回目の感作の少なくとも1週間後)に、1 mg/Kg (マウスあたり20μg)の容量で処置した。
・    FACSArrayを用いる多重分析により測定した肺のサイトカインは、IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ及びIL-10であった。
【００９２】
結果：
BALにおける合計細胞数及び好酸球
最後のエアロソルの2日後に、マウスを犠牲にし、BAL細胞を採集した。予測されたように、未処置のLACK感作マウスは、LACK攻撃により、BALにおける細胞の大規模の流入を示した(PBS攻撃マウスに比較して20倍多い細胞) (図8)。非常に興味深いことに、BAL細胞補充は、OM-197-MP-ACの治療的投与により90%減少し(p＜0.01) (図9)、未処置のマウスに比較して40〜45倍少ない(1／(40〜45))好酸球であった。
【００９３】
結論：
治療的に3回与えられたOM-197-MP-ACは、BAL中の肺細胞の溢出(extravasion)及び好酸球増加を劇的に減少させることができた。
【００９４】
肺のサイトカインの測定：
気道好酸球増加は、OM-197-MP-ACでの治療的処置で劇的に減少したので、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10及びIFN-γの肺含量について分析した(図10)。実際に、未処置のマウスの肺と比較したときに、Th2-サイトカイン：IL-4、IL-5及びIL-13の量は、処置マウスの肺において大きく減少した。OM-197-MP-ACでの処置により、IL-4レベルは90%、IL-13の量は85%、IL-5の量は70%減少した(p＜0.00005から0.005まで)。
【００９５】
結論：
治療的に3回だけ与えられたOM-197-MP-ACは、明らかに、Th2サイトカインのレベルを減少させることができた。このことは、Th1サイトカインへのシフトによるのではない。なぜなら、IFN-γレベルは全てのマウスにおいて低いままであり(1.5〜3 pg/ml)、処置マウスでは減少したからである。Th2及び免疫抑制サイトカインの両方であるIL-10の量は、処置により著しくは増加しなかった。
【００９６】
IgEレベルの測定：
OM-197-MP-ACでの治療的処置の後のマウスの免疫状態をさらに特徴付けるために、処置マウス及び未処置マウスの血清中のLACK特異的IgEを、ELISAにより分析した。LACK特異的IgEレベルは、LACKエアロソルへの曝露により7倍増加したが、OM-197-MP-AC処置マウスの血清は、未処置のLACK攻撃マウスに比較して、2倍少ない(1／2) (p<0.05) LACK特異的IgEを含んでいた。
【００９７】
結論：
治療的に与えられたOM-197-MP-ACは、明らかに、血清LACK特異的IgEレベルを減少させた。
【００９８】
実施例8bについての総括的な結論：
ここでは、本発明の生成物であるOM-197-MP-ACが、治療的に提供されたときに、好酸球増加とともに、IL-4、IL-5及びIL-13のようなTh2サイトカインのレベル、及び抗原特異的IgEのレベルも明らかに減少させたことを示した。
【００９９】
実施例8についての総括的な結論：
OM-197-MP-ACは、多くの喘息関連の読出しに対するその効果から判断するに、明らかに、喘息モデルでインビボにおいて予防的及び治療的に活性であった。
【０１００】
実施例9
喘息のマウスモデルにおける他の投与経路によるOM-197-MP-ACの影響
実施例8に示す結果は、OM-197-MP-ACが、i.p.経路で投与したときに、喘息のマウスLACKモデルにおけるアレルギー性応答の予防に効果的であることを示す。よって、ヒトでの使用により適合する他の投与様式を、このモデルにおいて調べた(鼻内、胃内、皮下)。
【０１０１】
プロトコル：
43匹の6週齢の雌性BALB/c ByJマウスは、Centre d'Elevage Janvier (CERJ, Le Genest-St-Isle, France)から購入した。全てのマウスは、1及び8日目に、2 mgのミョウバン (PerBio Science France SAS, Brebieres, France)で沈殿させた10μgのLACKタンパク質の2回のi.p.注射により感作させた(Juliaら, 2002)。
【０１０２】
OM-197-MP-ACは、以下に記載するようにして、0日目から12日目まで与えた。全てのマウスは、以下に示すように、16日目から20日目まで、LACK溶液(0.15%)又はPBSで攻撃された。
実験群は、以下のとおりであった：
- A群: 未処置で、LACK感作及びPBS攻撃されたマウス(3匹)
- B群: 未処置で、LACK感作及び攻撃されたマウス(7匹)
- C群: i.p. OM-197-MP-AC処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(5匹)
- D群: i.g. OM-197-MP-AC処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(7匹)
- E群: s.c. OM-197-MP-AC処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(7匹)
- F群: i.n. OM-197-MP-AC処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(7匹)
- G群: エアロソルOM-197-MP-AC処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(7匹)
【０１０３】
C、D、E及びG群のマウスは、0、2、3、4、7、9、10、11日目に処置したが、F群のマウス(鼻内経路)は、0、4、7及び11日目にしか処置しなかった。
C及びE群のマウスは、1 mg/Kg (マウスあたり20μg)のOM-197-MP-ACで、それぞれi.p.及びs.c.処置した。
D群のマウスは、50 mg/Kg (マウスあたり1 mg)のOM-197-MP-ACで胃内処置した。
F群のマウスは、20μlの容量の20μgのOM-197-MP-ACでi.n.処置した(2 mg/mlのOM-197-MP-AC、10μl/鼻孔)。
G群のマウスは、0.2%のOM-197-MP-AC溶液(2 mg/ml)のエアロソルを10分間受けた。
【０１０４】
試薬：
- LACK組換えタンパク質は、E. coliで産生し、記載されているようにして精製した(Mougneauら, 1995)。
- OM-197-MP-AC、2.2 mg/ml濃度のバッチ#050323、及び2.17 mg/ml濃度のバッチ#050322は、OM PHARMAにより提供され、それぞれ経口及びその他の全ての投与に用いた。
- ビオチンに結合した抗IgE (R35-118)は、BD Biosciences (Le Pont de Claix, France)から購入した。抗IgE EM-95 mAbは、DNAX (Palo Alto, CA, USA)から贈呈された。
- 鼻内処置は、イソフルラン(Aerrane, Baxter)を用いてマウスを軽く麻酔した後に行った。
【０１０５】
抗体力価：
全てのマウスは、最後のエアロソルの2日後に、心臓穿刺により放血させた。合計IgEは、コーティング抗体としてラットEM-95抗IgE mAb、2次抗体としてビオチンに結合したラット抗IgE mAbを用いるELISAにより、他のところに記載されているようにして(Juliaら, 2002)定量した。
【０１０６】
気管支肺胞洗浄(BAL)細胞の分析：
個別のマウスから放血させ、カニューレをそれらの気管に挿入した。肺を、1 mlの温PBSで3回洗浄した。細胞をPBSで洗浄し、300μlに再懸濁し、ビュルケル-チュルクチャンバを用いて計数した。示差的BAL細胞計数のために、サイトスピン調製物を作製し、ライト/ギムザ染色で染色した。
【０１０７】
結果：
a) 好中球、好酸球、リンパ球及びその他の単核細胞のそれぞれの数を、顕微鏡検査により決定し、試験した各投与経路について図11に報告する。
本発明者らが実施例8において前に示したように、OM-197-MP-ACでi.p.処置されたマウスは、BAL中の好酸球のパーセンテージ及び数がともに減少していた。しかし、OM-197-MP-ACでs.c.及びi.g処置されたマウスのBAL細胞含量は、未処置マウスのものと違いを生じなかった。対照的に、好酸球の頻度(示さず)及び数(図11)は、i.n. OM-197-MP-ACを受けたマウスのBALにおいて半分に減少した。さらに、OM-197-MP-AC エアロソルで処置されたマウスは、i.n.処置動物と同様の傾向を示した。
【０１０８】
結論：
少なくともOM-197-MP-ACは、i.p.及び鼻内経路において著しく効果的であり、このモデルにおいて、アレルゲンで感作されたマウスの気管支肺胞洗浄における好酸球の数を著しく減少させた。
【０１０９】
b)    次に、血漿IgEレベルを、方法の部分に記載したようにして測定した。
我々の以前のデータ(実施例8)に一致して、OM-197-MP-ACでi.p.処置されたマウスにおいて、合計IgEの量が減少されたことが見出された(図12)。さらに、OM-197-MP-ACのi.n.注射を受けたマウスは、合計血清IgEの力価も減少していた。対照的に、i.g.、s.c.又はエアロソルで処置されたマウスは、未処置のマウスに比較して、合計血清IgEの量は同様であった。
【０１１０】
結論：
i.p.又は鼻内経路のいずれかで投与されたOM-197-MP-ACは、この喘息モデルにおいて、合計IgEレベルを著しく低減させた。
【０１１１】
実施例10
喘息のマウスモデルでの経口投与による、処方されたOM-197-MP-ACの効果の増加
実施例9に示す結果は、OM-197-MP-ACが、処方されずに経口投与したときに、喘息のマウスLACKモデルにおいてアレルギー性応答の予防に効果的でないことを示した。よって、経口経路によるOM-197-MP-ACの活性を増大させるために、製剤のアッセイを、このモデルにおいて行った。よって、この研究においては、トリアシル化OM PHARMA 化合物OM-197-MP-ACが、胃腸耐性製剤(OM-197-MP-AC及びLutrol (登録商標) F 127、ポロキサマー407としても知られる)として提供されたときに、アレルギー性気道炎症に対してマウスを防御するかを調べた。
【０１１２】
プロトコル：
OM-197-MP-AC / Lutrol (登録商標) F 127製剤は、12.875 mlの4.35 mg/mlのOM-197-MP-AC溶液と、5.6 mLの50 mg/mlのLutrol F127とを混合することにより調製した。投与容量は330μlであった。
【０１１３】
試薬及び設備
-     塩水は、対照エアロソルとして用いた。
-     組換えLACKタンパク質はE. coliで産生させ、Ni-NTAアフィニティカラムで精製した。
-     水酸化アルミニウム(ミョウバン)は、Pierceから購入した。
-     用いた細胞遠心分離機は、サイトスピン4 (Thermo-Shandon, Cheschire, U.K.)であり、細胞スライドはThermo-Shandonから、ライト-ギムザ染色はSigmaから購入した。
-     エアロソルは、超音波(ultra-son)ネブライザーUltramed (Medicalia, Forenze, Italy)を用いて行った。
-     CBAビーズアレイIL-4は、BD Biosciencesから購入した。
-     フローサイトメータFACSarrayは、BD Biosciencesから購入した。
【０１１４】
動物：
-     6週齢の雌性BALB/c ByJマウスは、The Centre d'Elevage Janvier, Franceから購入し、特別な病原菌フリーの条件下に動物施設にて維持した。動物には、Safe (Augy, France)からの標準食を供給した。
【０１１５】
プロトコル：
15匹のBAL/cマウス(実施例8及び9にも示す対照群A及びBのマウスを含む)を、この実験において用いた。
A: 未処置のLACK感作及び塩水攻撃されたマウス(3匹)
B: 未処置のLACK感作及び攻撃されたマウス(6匹)
予防的処置
F: OM-197-MP-AC (経口)処置され、LACK感作及び攻撃されたマウス(6匹)
群Fのマウスは、0、2、3、4、7、9、10、11及び12日目に、1 mgのOM 197 MP AC処方で経口処置された。
【０１１６】
1日目及び8日目に、マウスをLACK/ミョウバンでi.p.感作した。16日目から20日目まで、群A以外の全ての群を、LACK溶液(0.15%)のエアロソルで攻撃した。群Aは、代わりに、塩水(NaCl 0.9%)を40分間受けた。
22日目に、全てのマウスを犠牲にした。全ての動物について、BALと、気管支周囲のリンパ節を除く肺とを採集した。
【０１１７】
BAL細胞を計数し、細胞含量を、ライト／ギムザ染色の後のサイトスピンの顕微鏡検査の後に分析した。さらに、各群の肺を採集し、さらなるサイトカイン含量分析のために液体窒素で凍結させた。サイトカイン含量を調べるために、タンパク質抽出物を、LACK感作及びPBS攻撃されたマウス(群A)、LACK感作及び攻撃されたマウス(群B)、及び処方されたOM-197-MP-AC処置されたwtマウス(群F)から調製する。IL-4の量を、FACSArrayを用いる多重分析により分析した。
【０１１８】
結果：
好中球、好酸球、リンパ球及びその他の単核細胞のそれぞれの数を、顕微鏡検査により決定し、図13に報告する。
OM-197-MP-AC (処方されていない)でi.g処置されたマウスのBAL細胞含量の実施例8 (及び図11)に報告する結果とは対照的に、OM-197-MP-ACがLutrolと処方されている場合、好中球、好酸球(p＜0.05)、リンパ球、及びその他の単核細胞の数は、処方されたOM-197-MP-ACを受けたマウスのBALで半分に減少した(図13を参照)。
【０１１９】
さらに、IL-4量を、処置及び未処置マウスの肺で分析した。IL-4肺含量は非常に低く、PBS攻撃動物で検出できなかったが、IL-4量は、LACK攻撃された未処置対照マウスで20倍に増加した。処方されたOM-197-MP-ACで経口処置すると(図14を参照)、肺でのIL-4 の量は、75%減少した(p＜0.01)。
【０１２０】
結論：
適切に処方されると、経口OM-197-MP-ACは、このモデルにおいて、アレルゲンに感作されたマウスの気管支肺胞洗浄中の好酸球の数を著しく低減できた。この減少は、IL-4の減少と相関関係があった。
【０１２１】
実施例11
非肥満糖尿病(NOD)マウスに対するOM 197-MP-ACの影響
今までのところ、喘息のマウスモデルのみでのOM-197-MP-ACのインビボでの効力の例を示した。この実施例において、OM-197-MP-ACが、別の炎症性の病理：糖尿病でも活性であるといういくつかの証拠を提供する。
【０１２２】
プロトコル：
我々は、OM-197-MP-AC及び他のトリアシル化分子が、喘息性動物における気道炎症を減少させることを以前に示した。
この研究では、我々は、別の炎症性疾患のマウスモデル：NOD糖尿病モデル(非肥満糖尿病)において、OM-197-MP-ACが防御を誘導できるかについて調べた。
【０１２３】
10匹の雌性6週齢NODマウスの群を、0.01、0.1及び1 mg/kgのいずれかのOM-197-MP-ACで10週間処置した。200μlのPBSをi.p.で1週あたり3回受けた6匹の雌性MODマウスを、対照として用いた。
この一連の実験において、マウスが16週齢に達するまで処置を継続した。これは、対照動物が顕性糖尿病を発症し始める時である。
【０１２４】
糖尿病発生率の点での結果を、対照動物で得られたものと比較した。糖尿病は、テストストリップ(Glukotest (登録商標), Roche, France)を用いて糖尿を試験することにより1週当たり1回、糖尿病が出現したときに1週あたり2回確認した。糖尿病は、テストストリップ(Glucotrend (登録商標))を用いて血糖症(＞3mg/ml)を評価することにより確かめた。
異なる実験群での糖尿病の出現率を、Kaplan-Meier法、すなわち非母数累積生存プロットを用いてプロットする(図15を参照)。カーブ同士の統計的比較を、対応するχ2値を与えるlogrank (Mantel-Cox)検定を用いて行う。1 mg/kgの用量でのOM-197-MP-ACは、著しく活性であり(p = 0.0321)、0.1 mg/kgの用量では、本発明の化合物は陽性の傾向を示した(p=0.0543)。
【０１２５】
0.3 mg/kgの用量のOM-197-MP-ACを用いる別の実験において、27週目に得られた結果は、有意なp値0.0362を示す。27週目において、82%の動物は、対照群において糖尿病性であることが見出され、OM-197-MP-AC処置群(0.3 mg/kg)は27%だけが疾患を示した。
【０１２６】
実施例13
毒性学：LAL内毒素性(endotoxicity)
内毒素性は、リムルス変形細胞分解産物色素産生試験(Bio-Whittaker のChromogenic - LAL, キット番号50-65OU)により、OM-197-MP-AC及びOM-294-DPについてまず決定した。
【０１２７】
プロトコル：
この試験は、LALに存在する酵素カスケードによる、リポ多糖(LPS)又は同等の構造の生成物による活性化に基づく。この酵素活性化は、ペプチドに結合した色素原のプロテアーゼによる分解により示される。この酵素反応は、37℃にて行い、時間経過につれての色素原の形成を405 nmで測定する。0.2単位のD.O.に到達するのに必要な時間を記録し、内毒素活性を、LPS標準物質(標準曲線)との関連で算出した。結果は、E. coli LPSの標準化調製物(1 EUは0.08 ng等価LPSに相当する)に関連するEU (内毒素単位)で示す。
【０１２８】
結果：
OM-197-MP-AC及びOM-294-DPはともに、色素産生LALアッセイにおいて、ほとんど又は全くリムルス活性を示さなかった。
【０１２９】
結論：
OM-197-MP-AC及びOM-294-DPは、LPSに比較したときに、非常に弱い内毒素性である(少なくとも106倍の減少)。
【０１３０】
実施例14
毒性学：ウサギにおける発熱原性
最後に、OM-197-MP-AC及びOM-294-DPを、ウサギにおけるそれらの発熱原性の可能性について試験した。
【０１３１】
プロトコル：
1群あたり3匹のニュージーランドシロウサギに、OM-197-MP-AC又はOM-294-DPを異なる用量でi.v.注射した(欧州薬局方2001、方法2.6.8に従う)。
製品：0.0009、0.009、0.09、0.9 mg/kgでのOM 197-MP-AC、及び0.001、0.01、0.1及び1 mg/kgでのOM-294-DP。
動物：読出し：温度増加
【０１３２】
結果：
OM-197-MP-ACは、試験した最高用量(0.9 mg/kg)で発熱原性閾値に到達せず、OM-294-DPは、0.01と0.1 mg/kgの間で発熱原性に到達しなかったので、両方の化合物は、インビボで発熱原性でないとみなされた。
【０１３３】
【表１】
2009529523.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】LPS (1μg/ml)単独、又はまず90分の間にOM-197-MP-AC (A)又は294-DP (B)の記載する濃度(μg/mlで)、次いでさらに20時間LPS (1μg/ml)により刺激したマウスDCによるIL-12 (左のパネル)及びIL-10 (右のパネル)の分泌。上清は、DC培養物から回収し、ELISAにより、IL-12及びIL-10の存在について分析した。
【図２】LPS (1μg/ml)単独、又はまず90分の間に294-DP (294)又はOM-197-MP-AC (197)の記載する濃度(μg/mlで)、次いでさらに20時間LPS (1μg/ml)により刺激したマウスDCによるTNF-α分泌。上清は、DC培養物から回収し、ELISAにより、TNF-αの存在について分析した。
【０１３５】
【図３】ポリクローン性活性化の後のヒトCD4+ T細胞のIFN-γ及びIL-13産生に対する、試験した4つの化合物の漸増用量の影響(OM-197-MP-AC, n=5; OM-197-MC-HD, n=5; OM-294-BA-MP, n=7; OM-197-MP-HD, n=3)。結果は、n回の独立した実験の中央値(±p25/p75)として表し、未処置細胞(100%とみなす、点線を参照)に対する処置細胞のパーセンテージ(%)増殖又はサイトカイン産生を示す。統計学的分析は、非母数で対応のないマン-ホイットニーt検定(両側)を用いて行った。
【図４】最後の抗原攻撃の1日後の漸増濃度(6〜25 mg/ml)の吸入メタコリンに応答する全身体積変動記録法(Emka)によるAHR。動物は、プロトコルの部分に記載するようにして処置した。結果(平均「増進された休止期の値」+/- SEM)は、塩水攻撃された動物(陰性対照群として、n=4)、未処置のLACK攻撃された動物(陽性対照群として、n=8)、及びOM-197-MP-AC処置され、LACK攻撃されたマウス(n=8)について示す。
【０１３６】
【図５】ライト／ギムザ染色で染色されたサイトスピン調製物の顕微鏡検査により分析された気管支肺胞洗浄中の好酸球のパーセンテージ。調べた群は、図4で用いたものと同じである。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【図６】全てのマウスは、プロトコルの部分に記載するようにして処置し、最後のエアロソルの1日後に心臓穿刺により放血させた。合計IgEは、ラットEM-95抗-IgE mAbをコーティング抗体として、及びビオチンに結合したラット抗-IgE mAbを2次抗体として用いるELISAにより、記載されるようにして(Juliaら, 2002)定量した。各点は、単独の動物に相当する。研究した群は、図4及び5で用いたものと同じであった。
【０１３７】
【図７】タンパク質抽出物(400μl)は、LACK感作及びPBS攻撃されたwtマウス(対照)、LACK感作及び攻撃されたwtマウス(喘息)、OM-197-MP-AC処置されたwtマウス(OM-197)の左肺から調製した。IL-4、IL-5及びIL-13含量は、FACSArrayを用いる多重分析により分析した。結果は、pg/mlで示す。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【図８】マウスは、方法の部分に記載されるようにして、治療的に3回処置され、洗浄を、気管に挿入したカニューレを用いて放出させた個別のマウスにおいて行った。肺を、1 mlの温PBSで3回洗浄した。細胞をPBSで洗浄し、300μlに再懸濁し、ビュルケル-チュルクチャンバを用いて計数した。示唆的BAL細胞計数のために、サイトスピン調製物を作製し、ライト/ギムザ染色で染色した。試験した群は：LACK感作及びPBS攻撃されたwtマウス(対照)、LACK感作及び攻撃されたwtマウス(喘息)、及びOM-197-MP-AC処置されたwtマウス(OM-197)であった。BAL中の合計の細胞数を、ライト/ギムザ染色で染色されたサイトスピン調製物の顕微鏡検査により決定した。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【０１３８】
【図９】ライト/ギムザ染色で染色されたサイトスピン調製物の顕微鏡検査により分析したBAL中の好酸球のパーセンテージ。マウスは、方法の部分に記載するようにして、治療的に3回処置され、BALからの細胞を、図8で説明したようにして採集した。(治療)群は、図8で用いたものと同じである。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【図１０】肺のサイトカイン含量を分析するために、肺を採集し、左肺を用いてタンパク質抽出物を調製した。400μlを各左肺から回収した。サイトカインは、FACSArrayを用いる多重分析により測定し、結果をpg/mlで示す。(治療)群は、図8及び9で用いたものと同じである。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【０１３９】
【図１１】マウスBAL中の好酸球、好中球及びリンパ球の数。細胞は、プロトコルの部分に記載するようにして得て、洗浄した。示差的BAL細胞計数のために、サイトスピン調製物を得て、ライト/ギムザ染色した。少なくとも400細胞が各スライドについて評価され、好酸球、好中球及びリンパ球の数は、顕微鏡検査により決定した。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【図１２】マウス血清中の抗原特異的IgEの測定は、最後のエアロソルの2日後に心臓穿刺により放血させ、血清を調製した。LACK特異的IgEは、ELISAにより測定した。個別のマウスからの結果(ng/ml)を報告し、各群の平均値をバーで示す。* = P＜0.05。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【０１４０】
【図１３】マウスBAL中の好酸球、好中球及びリンパ球の数。細胞は、プロトコルの部分に記載するようにして得て、洗浄した。示差的BAL細胞計数のために、サイトスピン調製物を得て、ライト/ギムザ染色した。少なくとも400細胞が各スライドについて評価され、好酸球、好中球、リンパ球及びその他の細胞(マクロファージ、樹状細胞及び肺細胞) の数は、顕微鏡検査により決定した。試験した3群は、実施例10のプロトコルの部分で記載した。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【図１４】肺のサイトカイン含量を分析するために、肺を採集し、左肺を用いてタンパク質抽出物を調製した。400μlを各左肺から回収した。IL-4はFACSArrayにより測定し、結果をpg/mlで示す。試験した3群は、実施例10のプロトコルの部分で記載した。点線は、グラフにわたって、未処置の喘息性動物で得られた値を示す。
【０１４１】
【図１５】NODマウスにおける糖尿病の出現率。マウスは、PBS (6匹の動物)、又はOM-197-MP-AC の3つの記載する用量(10匹の動物の3群)でi.p.処置した。糖尿病は、糖尿試験により(Glukotest)、1週あたり1回、及び糖尿病が出現したときは1週あたり2回確認した。糖尿病は、テストストリップ(Glucotrend (登録商標))を用いて血糖症(＞3mg/ml)を評価することにより確認した。異なる実験群における糖尿病の出現率を、Kaplan-Meier法、すなわち非母数累積生存プロットを用いてプロットした(図15を参照)。カーブ同士の統計学的比較は、対応するχ2値を与えるlogrank (Mantel-Cox)検定を用いて行う：OM-197-MP-AC 1 mg/kg p= 0.321; 0.1 mg/kg = 0.0543。
【図１】
2009529523.tif 000012
【図２】
2009529523.tif 000013
【図３−１】
2009529523.tif 000014
【図３−２】
2009529523.tif 000015
【図４】
2009529523.tif 000016
【図５】
2009529523.tif 000017
【図６】
2009529523.tif 000018
【図７】
2009529523.tif 000019
【図８】
2009529523.tif 000020
【図９】
2009529523.tif 000021
【図１０】
2009529523.tif 000022
【図１１】
2009529523.tif 000023
2009529523.tif 000024
【図１２】
2009529523.tif 000025
2009529523.tif 000026
【図１３】
2009529523.tif 000027
【図１４】
2009529523.tif 000028
【図１５】
2009529523.tif 000029