(57)【要約】  本発明は、ヒト細胞中でのシアン化物非感受性代替的キシダーゼ（ＡＯＸ）の異地性発現によるミトコンドリアの酸化的リン酸化の系に影響を与える疾患に対抗するための方法に関する。ヒト細胞及びショウジョウバエ中で首尾よくＡＯＸを発現させることによって、ミトコンドリアに対して著しいシアン化物耐性を与え、酸化的ストレス、アポトーシスに対する感受性及び代謝性アシドーシスが軽減されることが示されている。ＡＯＸは、生物個体で遍在性に発現された場合に、十分耐容される。ＡＯＸ発現は、呼吸鎖欠乏の有害事象を制限するための価値あるツールである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２；及び
（ｂ）末端酸化酵素活性を有する（ａ）の断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とし、末端酸化酵素活性を有する、単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号２；及び
（ｂ）末端酸化酵素活性を有する（ａ）の断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、軟体動物門、線形動物門及び脊索動物門からなる群から選択される門からの生物に由来することを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、尾索動物亜門からの生物に由来することを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが、ホヤ綱からの生物に由来することを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、マメボヤ目からの生物に由来することを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが、ユウレイボヤ科からの生物に由来することを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが、チオナ・インテスティナリス（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）に由来することを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２に記載されているアミノ酸配列、又は末端酸化酵素活性を有するその断片を含むことを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項１０】
エピトープタグをさらに含むことを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の何れか一項のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、単離又は精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１１のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
植物、真菌又は原生生物由来の末端酸化酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列へ融合された動物由来のミトコンドリア輸送ペプチドのアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ミトコンドリア輸送ペプチドが、脊椎動物由来であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ミトコンドリア輸送ペプチドが、哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ミトコンドリア輸送ペプチドが、ヒト由来であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
末端酸化酵素活性を有するポリペプチドが、植物又は真菌由来の成熟型の末端酸化酵素であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
末端酸化酵素活性を有するポリペプチドが、植物由来であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
脊椎動物由来のミトコンドリア輸送ペプチドのアミノ酸配列と無脊椎動物由来の末端酸化酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸とを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
末端酸化酵素活性を有するポリペプチドが、無脊椎動物の脊索動物種からであることを特徴とする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ミトコンドリア輸送ペプチドが、哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
哺乳動物細胞中でのポリヌクレオチドの発現を促進するプロモーター配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１１ないし２１の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
プロモーターが、哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
プロモーターが、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子のプロモーターであることを特徴とする、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項２６】
発現調節配列へ作用可能に連結された、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項２７】
複製欠損アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター及びレンチウィルスベクターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２５ないし２６の何れか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドと、及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２９】
請求項２５ないし２７の何れか一項のベクターと、及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３０】
請求項１２ないし２５の何れか一項のポリヌクレオチドで、又は請求項２５ないし２７の何れか一項のベクターで形質転換又は形質移入されることを特徴とする、細胞。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項３０に記載の単離された細胞。
【請求項３２】
細胞が、ポリペプチドを発現すること、並びに野生型細胞と比較して、以下の特性：
（ａ）アンチマイシンＡに対する増大した耐性；
（ｂ）シアン化物（ＣＮ−）に対する増大した耐性；及び
（ｃ）オリゴマイシンに対する増大した耐性
の１つ又はそれ以上を示すことを特徴とする、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
脊椎生物細胞であり、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換又は形質移入されることを特徴とし、前記細胞がポリペプチドを発現し、並びに野生型細胞と比較して、以下の特性：
（ａ）アンチマイシンＡに対する増大した耐性；
（ｂ）シアン化物（ＣＮ−）に対する増大した耐性；及び
（ｃ）オリゴマイシンに対する増大した耐性
の１つ又はそれ以上を示す、前記細胞。
【請求項３４】
脊椎生物細胞であり、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換又は形質移入されることを特徴とし、
前記細胞が前記ポリペプチドを発現し；
前記細胞が酸化的リン酸化を示してチトクロム代謝経路を通じてＡＴＰを産生し；及び
前記細胞が前記酸化的リン酸化の阻害剤の存在下で、末端酸化酵素経路を通じてユビキノールを酸化する、前記細胞。
【請求項３５】
脊椎生物細胞であり、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質転換又は形質移入されることを特徴とし、
前記細胞が前記ポリペプチドを発現し；
前記細胞が酸化的リン酸化を示してチトクロム代謝経路を通じてＡＴＰを産生し；及び
代謝性アシドーシスを好む条件下で、末端酸化酵素活性が、代謝性アシドーシスを阻害するためのピルビン酸塩によってアロステリックに制御される、前記細胞。
【請求項３６】
請求項３０、３１及び３３ないし３５の何れか一項に記載の単離又は精製された細胞。
【請求項３７】
幹細胞であることを特徴とする、請求項３６に記載の単離された細胞。
【請求項３８】
胚性幹細胞であることを特徴とする、請求項３７に記載の単離された細胞。
【請求項３９】
成体幹細胞であることを特徴とする、請求項３７に記載の単離された細胞。
【請求項４０】
神経幹細胞であることを特徴とする、請求項３８に記載の単離された細胞。
【請求項４１】
哺乳動物細胞中で代謝性アシドーシスを減少させるための医学的組成物を製造するための、請求項１ないし１０の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４２】
哺乳動物細胞中で代謝性アシドーシスを減少させるための、形質転換又は形質移入された細胞を含む医薬を製造するための、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドの又は請求項２５ないし２７の何れか一項に記載のベクターの使用。
【請求項４３】
哺乳動物細胞中で酸化的ストレスを緩和するための医学的組成物を製造するための、請求項１ないし１０の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４４】
哺乳動物細胞中で酸化的ストレスを緩和するための、形質転換又は形質移入された細胞を含む医薬を製造するための、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドの又は請求項２５ないし２７の何れか一項に記載のベクターの使用。
【請求項４５】
哺乳動物対象の細胞中で代謝性アシドーシスを効果的に低下させる有効量で、ポリペプチドを含む医学的組成物を製造するための、請求項１ないし１０の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４６】
哺乳動物対象の細胞中で代謝性アシドーシスを低下させるための、請求項１ないし１０の何れかに記載のポリペプチドの有効量をコードする、医学的組成物を製造するための、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドの、請求項２５ないし２７の何れか一項に記載のベクターの、又は請求項３０ないし４０の何れか一項に記載の細胞の、使用。
【請求項４７】
哺乳動物対象において酸化的ストレスを緩和するための医薬を製造するための、哺乳動物対象の細胞中で酸化的ストレスを低下させるのに有効な量の、請求項１ないし１０の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４８】
哺乳動物対象において酸化的ストレスを低下させるための、請求項１ないし１０の何れか一項に記載のポリペプチドの有効量をコードする、医学的組成物を製造するための、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドの、請求項２５ないし２７の何れか一項に記載のベクターの、又は請求項３０ないし４０の何れか一項に記載の細胞の、使用。
【請求項４９】
哺乳動物対象がヒトである、請求項４５ないし４８の何れか一項に記載の使用。
【請求項５０】
リー症候群；ＭＥＲＲＦ症候群；パーキンソン病及び関連症状；進行性外眼筋麻痺、カーンズ・セイヤー症候群及びＭＥＬＡＳ症候群を含むミトコンドリア脳筋症；肝臓、腎臓、ＣＮＳ、心臓、骨格筋並びに内分泌系及び感音系等の臓器を冒す多様な多系統の小児科疾患；筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症及び抗酸化防御の欠損に起因する循環器疾患の形態を含む、ミトコンドリア中の活性酸素種の過剰な産生を伴うことが公知であり、又は伴うと考えられている疾病；ＰＯＬＧ、ｃ１０ｏｒｆ２（Ｔｗｉｎｋｌｅ）又はミトコンドリアＤＮＡの維持の系の他の成分における遺伝学的欠損から生じる他の運動失調及び神経症状；症候性及び非症候性のミトコンドリア聴力欠陥；ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系の欠損に起因する糖尿病の形態；ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系に影響する抗レトロウィルス療法の副作用；難治性肥満及び食物源の流動障害から生じる他の代謝性疾患；カーンズ・セイヤー症候群；ＮＡＲＰ症候群；アルパース・フッテンロッハー（Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ）病；感音性難聴；乳児良性筋障害；乳児致死性筋障害；小児筋障害；成人筋障害；横紋筋融解；レーバー遺伝性視神経ニューロパチー；心筋症；バース（Ｂａｒｔｈ）症候群；ファンコニー症候群；ｍｔＤＮＡ欠乏症候群；ピアソン症候群；糖尿病及び乳酸性酸血症からなる群から選択される損なわれたミトコンドリア呼吸機能の疾病又は疾患を治療するための、請求項４１ないし４９の何れか一項に記載の使用。
【請求項５１】
医薬又は医薬組成物が、代謝性アシドーシス又は酸化的ストレスによって影響された細胞を含む組織又は臓器へ局所的に又は全身的に投与可能である、請求項４１ないし５０の何れか一項に記載の使用。
【請求項５２】
ヒト又は他の後生動物の細胞においてＡＯＸの異地性発現を可能にすることによって、シアン化物に対するミトコンドリアの感受性を低下させるための、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５３】
ヒト又は他の後生動物の細胞においてＡＯＸの異地性発現を可能にすることによって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化における欠損から生じる病理学的症状兆候を治療するための、請求項１１ないし２４の何れか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアン化物非感受性の末端酸化酵素（ＡＯＸ）をコードするｃＤＮＡ；前記ｃＤＮＡを含む構築物及び組成物；並びに哺乳動物細胞又はヒト細胞において又は生物個体において、ミトコンドリア中の前記ＡＯＸの異地性発現によって呼吸鎖欠乏の有害事象を制限するための方法に関する。本方法を使用することによって、酸化的リン酸化の系の遮断の有害事象は克服され、ミトコンドリア病及び加齢に関する遺伝子治療に対する経路が提供される。
【背景技術】
【０００２】
１９１９年のＯｔｔｏ  Ｗａｒｂｕｒｇの先駆的研究（Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．，１００：２３０−２７０，  １９１９）以来、シアン化物耐性呼吸は、ほとんどの植物及び微小生物を、哺乳動物及び他のより高等な動物と区別することが知られている。従って、シアン発生化合物は、捕食動物に抵抗するために、最も頻繁に自然で遭遇する毒物である（Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：１８２６−１８２８，  ２００１）。植物及び微小生物には、シアン化物耐性の非一般的呼吸様式など、シアン化物耐性を与える多様な成分が付与されている。この代替的な呼吸は、一般に、独特なタンパク質であるいわゆる末端酸化酵素（ＡＯＸ）の存在に依存し、ＡＯＸは、ミトコンドリア呼吸鎖（ＲＣ）のキノンプールから酸素へと電子を直接伝達し、これにより、呼吸鎖のチトクロムセグメントを完全に迂回することによって（図１Ａ）（Ａｆｆｏｕｒｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５１０：１２１-１２６，  ２００２）、基質酸化に関連する水素イオン放出を強力に減弱させると同時に、ＡＴＰ産生を低下させる。従って、植物では、葉緑体のリン酸化活性から生じる高いＡＴＰレベルによって、ミトコンドリアの基質酸化の抑制を防止する（Ｒｕｓｔｉｎ  ａｎｄ  Ｑｕｅｉｒｏｚ−Ｃｌａｒｅｔ，Ｍａｎｉａ，１６４：４１５−４２２，  １９８５）。
【０００３】
さらに、ＡＯＸは、スーパーオキシド産生を好むことが知られているミトコンドリアキノンプールの過剰低下を防止することによって、抗酸化タンパク質として作用すると考えられている（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：８４８−８５３，  ２００１；Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳａ，９６：８２７１−８２７６，  １９９９）。植物では、電子流におけるＡＯＸタンパク質の何らかの顕著な関与は、非常に特異な条件によってのみ惹起される。第一に、この関与は、キノール基質に対するＡＯＸの低い親和性によるキノンプールの顕著な低下を必要とし（Ｂａｈｒ  ａｎｄ  Ｂｏｎｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８：３４４６−３４５０，  １９７３）、第二に、酵素をアロステリックに制御する有機酸、主としてピルビン酸塩のサブセットの存在を必要とする（Ｕｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５５４：１１８−１２８，  ２００２）。ＲＣ及び高レベルのピルビン酸塩の低下した酸化還元状態は、ミトコンドリアＲＣのチトクロムセグメントに限局された遺伝性のヒト代謝性疾患から生じる正確な状態である（Ｍｕｎｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．８ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  ２２６１−２２７４，  ２００１）。この知見に基づいて、電子流の救出が行われ得るようにする目的で、及び病的なＲＣ欠乏の有害事象を軽減する目的で、ヒト細胞中にＡＯＸを発現させることが、本発明者の長年の目標であった。ヒト細胞中で植物ＡＯＸ遺伝子を発現させるための最初の試みは、明らかに制御されない致死をもたらした（Ｐ．Ｒｕｓｔｉｎ、未刊行データ）。Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ及び共同研究者によるゲノムデータベース検索によって、幾つかの動物門中にＡＯＸが存在することが明らかとなっても、この目標は達成されなかったので、ヒト細胞中でＡＯＸ遺伝子を発現させる問題に対する解決策はなお未解決のままである。より一般的には、ＲＣ欠乏に関連する多様な疾病及び症状の効果を治療又は軽減するための新たな材料及び方法に関する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００４】
本発明において、ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の機能障害の主たる有害事象に対して、海洋無脊椎生物であるチオナ・インテスティナリス（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）由来の末端酸化酵素（ＡＯＸ）の、細胞中での異地性発現が細胞を保護することが示されている。これらには、基質酸化、（呼吸鎖を通じてではなく、乳酸脱水素酵素を通じてＮＡＤＨを再酸化する必要性があることによる）代謝性アシドーシス及び細胞損傷又は細胞死（アポトーシス）に至る酸素ラジカルの過剰産生が含まれる。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異の過剰蓄積は、早期老化の特性を誘導することが示されているので、ＡＯＸ発現が上記結果を低下又は遅延させることにより、おそらくは、加齢を遅延させ、寿命を延長し、又は生活の質を改善することが期待される。
【０００５】
治療戦略として使用するために、ＡＯＸ発現は、劇的で有害な生理学的効果なしに、生物個体によって耐容されるべきである。本発明において、前記ＡＯＸ発現の実施可能性が、生物個体での動物モデルにおいて示された。モデル系として、ショウジョウバエであるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を使用して検査を実施した。本発明において、ショウジョウバエの発達を通じてＡＯＸ発現が耐容されること、表現型に対して著しい有害な効果を有さず、呼吸鎖機能障害に対して、培養されたヒト細胞と同一の保護を与えることが示された。
【０００６】
ヒト及び他の哺乳動物における遺伝子治療ツールとしてのＡＯＸ発現の可能性を探るために、哺乳動物遺伝子に対して典型的なレベルで長期間安定的にＡＯＸを発現させることができる多用途の発現系を開発した。細胞増殖に何ら明らかな有害な効果を有さずに、ヒトＨＥＫ２９３に由来する細胞のレンチウィルスベクターを基礎とした形質導入後何週間も、ＡＯＸ発現が維持されることが示された。レンチウィルスベクターＡＯＸを発現する細胞は、没食子酸プロピルに対して感受性を有するシアン化物非感受性呼吸を示すことが示された。従って、レンチウィルスベクターによって形質導入されたＡＯＸは、代謝性疾患の種々の哺乳動物モデルにおいて呼吸鎖の迂回路を作るためのツールとして適切である。
【０００７】
本発明において使用されるポリヌクレオチド又はｃＤＮＡ配列は、好ましくは、配列番号１に示されているＤＮＡ配列である。前記ポリヌクレオチド又はｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列の断片、相同体又は類縁体でもあり得、ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの機能性に関して、すなわちポリペプチドの折りたたみ又は活性に関して有害ではないように、ヌクレオチド配列のわずかな付加、置換及び欠失させることができる。相同体は、第二配列が第一配列から誘導されたことを示唆する、２つの配列間の同一性の程度として決定される。ヌクレオチド配列の比較は、本分野で公知のアルゴリズム、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでのＳＩＢ  ＢＬＡＳＴ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｅｒｖｉｃｅ及びその初期設定のパラメータを使用することによって実施される。本発明のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列のコード領域と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性の程度を示すＤＮＡ配列である。
【０００８】
従って、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するシアン化物非感受性の末端酸化酵素（ＡＯＸ）又は少なくとも１３５のアミノ酸のブロックにわたって配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する類縁体若しくは相同体をコードするｃＤＮＡ配列に関する。チオナ・インテスティナリスＡＯＸ中の少なくとも１３５のアミノ酸の領域は、配列番号２のアミノ酸配列中の１４０から３６５までのアミノ酸の領域内にあり、異なる植物、真菌又はより下等な後生動物中で保存されているアミノ酸配列である。アミノ酸配列の比較は、ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでのＳＩＢ  ＢＬＡＳＴ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｅｒｖｉｃｅ及びその初期設定のパラメータ等の標準的なＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して実施することが可能である。
【０００９】
ｃＤＮＡは、配列番号１に限定されないが、ｃＤＮＡ配列の機能性に有害ではないわずかなアミノ酸の置換、欠失及び付加を含むわずかな変動を含み得る。（遺伝コードの重複性のため）同一のポリペプチドをコードする全ての配列、同一の生化学的活性を有するバリアントポリペプチド（例えば、酵素の主要な機能に影響しないアミノ酸置換を有するもの）をコードする全ての配列、及び本発明に基づいて予測可能である同一の効果を有するポリペプチドをコードする別の生物体由来の全ての関連ＡＯＸ配列も含まれ得る。特に、配列の５’−末端又は３’−末端は、配列番号３及び配列番号５に開示されているように、フラッグ又はｍｙｃをコードする配列でタグ付けされ得る。可能性のある他の配列には、配列番号１のＤＮＡ配列へ融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００１０】
好ましくは、アミノ酸置換が使用される場合、置換は保存されており、すなわちアミノ酸は同様の大きさで同様の荷電特性を有するものによって置換される。
【００１１】
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、生物学的に類似する別の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン又はメチオニンを別のものと置換すること、又はアルギニンをリジンと置換すること、グルタミン酸をアスパラギン酸と置換すること、又はグルタミンをアスパラギンと置換することなど、ある極性を有し若しくは荷電された残基を、同様の極性若しくは荷電を有する別の残基と置換することが挙げられる。互いに置換されることが可能である中性の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニンが含まれる。「保存的置換」という用語には、置換されていない親アミノ酸の代わりに、置換されたアミノ酸を使用することも含まれる。
【００１２】
あるいは、保存されたアミノ酸は、以下に記載されているように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ，ｐｐ．７１−７７，  １９７５）に記載のとおりグループ化することが可能である。
【００１３】
非極性（疎水性）
Ａ．脂肪族：Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ
Ｂ．芳香族：Ｆ、Ｗ
Ｃ．硫黄含有：Ｍ
Ｄ．境界域：Ｇ
非荷電−極性
Ａ．ヒドロキシル：Ｓ、Ｔ、Ｙ
Ｂ．アミド：Ｎ、Ｑ
Ｃ．スルフヒドリル：Ｃ
Ｄ．境界域：Ｇ
正に荷電（塩基性）：Ｋ、Ｒ、Ｈ
負に荷電（酸性）：Ｄ、Ｅ
【００１４】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、その断片、類縁体又は相同体を有するシアン化物非感受性の末端酸化酵素（ＡＯＸ）をコードし、配列番号１とハイブリッド形成するｃＤＮＡ配列にも関し、ハイブリッド形成条件は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ  ９．５２−９．５５，  １９８９；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ  １１．４５−１１．４６，  １９８９；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．１１．５５-１１．５７，  １９８９）又は他の研究マニュアルに記載されているものである。配列番号１の１００ないし２００を超えるヌクレオチド又はより好ましくは配列番号１の完全なコード領域からなるＤＮＡプローブとのハイブリッド形成は、通常、高い厳密性条件で実施される。すなわち、完全ハイブリッドの算出された融解温度Ｔｍを下回る２０ないし２５℃の温度でハイブリッド形成が実施される。洗浄は、低塩濃度（例えば、０．１×ＳＳＣ）及びＴｍを下回る１２ないし２０℃の温度で実施される。１００ないし２００を超えるヌクレオチドのＤＮＡプローブのための典型的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｉｎｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）の９．５２ないし９．５５ページに示されている。短いオリゴヌクレオチドプローブ（又はオリゴヌクレオチドプローブの混合物）のためのハイブリダイゼーション条件は、１００ないし２００を超えるヌクレオチドを含むＤＮＡ配列に対する条件とは異なる。より長いＤＮＡ分子間で形成されるハイブリッドは、ハイブリダイゼーション洗浄のために使用される条件下で実質的に安定であるのに対し、短いオリゴヌクレオチドを包含するハイブリッドは安定ではない。それゆえ、このようなハイブリッドのハイブリダイゼーション後の洗浄は、プローブが、その標的配列から解離しないように、迅速に実施されなければならない。オリゴヌクレオチドプローブのための有用なハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕ��ａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）の１１．４５ないし１１．４６ページ及び１１．５５ないし１１．５７ページに示されている。
【００１５】
本発明のｃＤＮＡ配列は、ヒト又は後生動物の細胞中へ挿入されると、異局所的に発現してミトコンドリアの基質酸化をシアン化物に対して非感受性にし、代謝性アシドーシスを低下させ、酸化的ストレスを軽減し、ミトコンドリア呼吸鎖のチトクロムセグメントの迂回路を提供し、アポトーシス又は細胞死に至る細胞損傷に対する感受性を低下することのできるＡＯＸをコードする。
【００１６】
本発明において、ｃＤＮＡ配列は、植物、真菌及び無脊椎動物を含む多様な生物から取得することが可能である。好ましくは、ｃＤＮＡ配列は、ホヤ類から、より好ましくは尾索類のチオナ・インテスティナリスから得られる。
【００１７】
本発明は、上述のｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物も提供する。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、シグナル配列、エンハンサー、プロモーター及び終止配列を含む適切な制御配列へ機能的に連結された、シアン化物非感受性ＡＯＸをコードするｃＤＮＡを含む。好ましくは、ヒト細胞系における発現を誘導するプラスミドベクター又はウィルスベクター、例えばｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ若しくはｐＷＰＩベクター、又は動物個体における、例えばショウジョウバエにおける発現のためのペリカンシリーズの発現ベクター（Ｂａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：７２６−７３２，  ２０００）等の適切な発現ベクター中へ、組換えＤＮＡ構築物が挿入される。本発明の好ましい実施形態において、前記ベクターはレンチウィルスベクターである。
【００１８】
ＡＯＸをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を伝達するベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞又はげっ歯類、例えばラット、マウス、ハムスター等由来の細胞であり得る適切な細胞を形質転換又は形質移入するのに使用されるが、他の動物細胞も使用されることが可能である。適切なヒト細胞は、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞系から、又はＨＥＫ２９３由来の細胞系から得られる細胞である。
【００１９】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するシアン化物非感受性の末端酸化酵素（ＡＯＸ）ポリペプチド、その断片、類縁体又は相同体にも関する。相同体は好ましくは、少なくとも１３５のアミノ酸のブロックにわたって、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するべきである。チオナ・インテスティナリスＡＯＸ中の少なくとも１３５のアミノ酸の領域は、配列番号２のアミノ酸配列中の１４０から３６５までのアミノ酸の領域内にあり、異なる植物、真菌又はより下等な後生動物中で保存されるアミノ酸配列である。アミノ酸配列の比較は、ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでのＳＩＢ  ＢＬＡＳＴ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｅｒｖｉｃｅ及びその初期設定のパラメータ等の標準的なＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して実施されることが可能である。
【００２０】
本発明において有用なポリペプチドは、チオナ・インテスティナリスＡＯＸ配列、同一の生化学的活性を有するバリアントポリペプチド（例えば、酵素の主要機能に影響しないアミノ酸置換を有するもの）をコードする全ての配列、及び本発明に基づいて推定可能である同一効果を有する別の生物由来の全ての関連ＡＯＸアミノ酸配列を含む、植物、真菌及びより下等な後生動物門等の異なる生物から得られることが可能であるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
アミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端は、配列番号４及び配列番号６に開示されるフラッグ又はｍｙｃ配列でタグ付けされ得る。あるいは、他のタグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）も、配列番号２のアミノ酸配列へ融合され得る。
【００２２】
ＡＯＸをコードするｃＤＮＡと関連して上述に論議されるように、異局所的に発現するＡＯＸは、ミトコンドリアの基質酸化をシアン化物非感受性にし、代謝性アシドーシスを低下させ、酸化的ストレスを軽減し、ミトコンドリア呼吸鎖のチトクロムセグメントの迂回路を提供し、アポトーシス又は細胞死を含む細胞損傷に対する感受性を低下させる。
【００２３】
本発明のシアン化物非感受性ＡＯＸポリペプチドは、植物、真菌及びより下等な後生動物を含む多様な生物から得られることが可能である。好ましくは、ｃＤＮＡ配列は、ホヤ類から、より好ましくは尾索類のチオナ・インテスティナリスから得られる。
【００２４】
本発明は、ＡＯＸをコードするｃＤＮＡを導入した後、ヒト又は後生動物の細胞中でＡＯＸを異局所的に発現させることによって、ミトコンドリアの基質酸化をシアン化物非感受性にし、代謝性アシドーシスを低下させ、酸化定ストレスを軽減し、ミトコンドリア呼吸鎖のチトクロムセグメントを遮断又は迂回させ、好ましくは通性に迂回させ、アポトーシス又は細胞死に対する感受性を低下させるなど、呼吸鎖欠乏の多くの有害事象を制限することが可能である方法にも関する。
【００２５】
本発明は、ミトコンドリア呼吸鎖又は酸化的リン酸化の系における病変形成又は欠損を治療するための、本発明のＡＯＸをコードするｃＤＮＡを導入し、及びヒト又は後生動物の細胞中でＡＯＸを異局所的に発現させる方法にも関する。
【００２６】
本発明は、本発明のｃＤＮＡを導入し、ヒト又は後生動物の細胞中でＡＯＸを異局所的に発現させることによって、ヒトにおける加齢過程を遅延させるための方法を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のｃＤＮＡを導入し、ヒト又は後生動物の細胞中でＡＯＸを異局所的に発現させることによって、加齢と関連した疾病を治療するための方法を提供する。
【００２８】
本発明は、ミトコンドリアの基質酸化をシアン化物非感受性にし、代謝性アシドーシスを低下させるための、酸化的ストレスを軽減し、ヒト細胞における加齢過程を遅延させ、人細胞においてアポトーシスに対する感受性を低下させるための、本発明のｃＤＮＡ配列の医学的使用に関する。
【００２９】
また、本発明に含まれているのは、ミトコンドリア呼吸鎖又は酸化的リン酸化の系に影響する疾病を治療するための医薬の製造のための、本発明のｃＤＮＡ配列の使用である。これは、細胞中にｃＤＮＡを導入し、ヒト又は後生動物の細胞中で前記ｃＤＮＡを異局所的に発現させることによって達成される。
【００３０】
本発明の幾つかの態様は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ機能障害の主な有害事象に対する保護を補助するための、脊椎動物（特にヒト）細胞又は生物体中での（海洋無脊椎動物チオナ・インテスティナリス由来の末端酸化酵素（ＡＯＸ）等の）ＡＯＸの異局所的な発現の効果に関する。ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ機能障害と関連した障害の寛解のためのポリペプチド及びポリヌクレオチド材料並びに方法は、本発明の好ましい実施形態の範囲に属する。
【００３１】
本発明の一態様には、末端酸化酵素活性を有する単離及び／又は精製されたポリペプチドが含まれる。幾つかの実施形態において、末端酸化酵素活性を有する単離及び／又は精製されたポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列又は末端酸化酵素活性を有するその断片と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。典型的な断片は、アミノ末端のミトコンドリア輸送ペプチドを欠失し、ＡＯＸ活性に関与しない他の配列を欠失する断片である。他の実施形態において、単離及び／又は精製されたポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列又は末端酸化酵素活性を有するその断片とさらに大きな類似性、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。「末端酸化酵素活性」という用語は、標準的な電子伝達系から電子を迂回させ、前記電子をユビキノールから酸素まで転移させ、（酸化されたユビキノールとともに）水及び熱を生成物として発生することによって、ミトコンドリア中の幾つかの条件下で生じるユビキノールの酸化の触媒を指す。
【００３２】
幾つかのバリエーションにおいて、ポリペプチドは、全てＡＯＸ遺伝子が存在するという証拠がある軟体動物門、線形動物門及び脊索動物門からなる群から選択される門由来の生物に由来する。ＡＯＸは、数多くの他の動物門にも存在すると予想される。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、尾索動物亜門由来の生物に、又は他のマメボヤ目由来の生物に、又はユウレイボヤ科由来の生物に由来する。生物由来の野生型配列は、非常に好ましく、公知の技術を使用して単離される。ある態様において、ポリペプチドは、チオナ・インテスティナリス由来であり、配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明のポリペプチドの全て又は一部をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、本発明のさらなる態様である。幾つかの実施形態において、野生型配列が使用される。他の実施形態において、配列変動は、アミノ酸配列に関して上述のとおり考えられる。インビトロでの産生のための発現ベクター及びポリペプチドのインビボでの産生／発現のための遺伝子治療ベクターなどのベクターも、本発明の一態様である。
【００３４】
例えば、本発明には、上述に論議され、以下の明細書中にさらに詳細に記載されている末端酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離又は精製されたポリヌクレオチドが含まれる。一態様において、単離又は精製されたポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
別の態様において、本発明は、植物、真菌又は原生生物由来の末端酸化酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列に融合された動物由来のミトコンドリア輸送ペプチドのアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。動物輸送ペプチドの使用は、非動物ＡＯＸタンパク質の動物ミトコンドリアへの標的化を改良するためのツールとして考えられる。幾つかのバリエーションにおいて、ミトコンドリア輸送ペプチドは、脊椎動物、哺乳動物又はヒトに由来し、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドは、植物又は真菌由来の成体型末端酸化酵素である。他のバリエーションにおいて、ミトコンドリア輸送ペプチドは、脊椎動物由来であり、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドは、無脊椎動物由来である。具体的な実施形態において、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドは、無脊椎動物の脊索動物種由来であり、ミトコンドリア輸送ペプチドは、哺乳動物由来である。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中でのポリヌクレオチドの発現を促進するプロモーター配列をさらに含む。幾つかの態様において、プロモーター配列は、哺乳動物由来である。他の態様において、プロモーター配列は、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子のプロモーターである。
【００３７】
本発明には、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも含まれる。一態様において、ポリヌクレオチドは、発現調節配列へ作用可能に連結されている。発現ベクターは、核酸の発現に使用される全てのベクターであり得、例えば、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、及びレンチウィルスベクターからなる群から選択され得る。多くの適用において、このようなベクターの複製欠損形態が好ましい。本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド又はベクターが医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤中に存在する組成物として製剤され得、従って、本来ＡＯＸ活性を欠如する細胞へＡＯＸ活性を導入することによってエクスビボ及びインビボの両者に対して適用可能な医学組成物を製造するのに有用であり得る。
【００３８】
本発明の別の態様には、本発明のポリヌクレオチド又はベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞が含まれる。幾つかのバリエーションにおいて、細胞は、本発明のポリペプチドを発現させるために、例えば形質転換又は形質移入を通じて修飾されることが可能である全ての原核細胞又は真核細胞である。幾つかのバリエーションにおいて、細胞は、エクスビボデの形質移入又は形質転換に適しており、これにより、後に宿主生物中へ再度移植される医学的組成物を製造するための方法を提供する。
【００３９】
一態様において、本発明は、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドを発現し、アンチマイシンＡ、シアン化物（ＣＮ−）又はオリゴマイシンに対して野生型細胞と比較して増大した耐性の１つ又はそれ以上を呈する、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換又は形質移入された脊椎動物細胞を提供する。これらの耐性は、細胞中のＡＯＸ活性に関する証拠の３つの例である。他の例は、以下に詳述されている。
【００４０】
別の態様において、本発明は、末端酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換又は形質移入された、チトクロム代謝経路を通じてＡＴＰを産生するための酸化的リン酸化を示すポリペプチドを発現し、前記酸化的リン酸化の阻害剤の存在下で、末端酸化酵素経路を通じてユビキノールを酸化する脊椎動物細胞を提供する。一つのバリエーションにおいて、末端酸化酵素活性は、代謝性アシドーシスを好む条件下で代謝性アシドーシスを阻害するためにピルビン酸塩によってアロステリックに制御される。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチド又はベクターで形質転換又は形質移入された単離又は精製された細胞も提供される。幾つかのバリエーションにおいて、単離された細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞又は神経幹細胞を含む幹細胞である。全能性又は多能性又は多分化能さえ有する細胞は、本発明のエクスビボでの遺伝子治療の態様に関する好ましい細胞種に属する。
【００４２】
本発明の他の態様は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクター、又はこのようなポリヌクレオチド若しくはこのようなベクターで形質転換又は形質移入された細胞を使用する、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ機能障害と関連した疾患の治療のための医薬を製造するための方法に関する。一態様において、本発明のポリペプチドを含む組成物と細胞を接触させることによって、哺乳動物細胞における代謝性アシドーシスを低下させ又は酸化的ストレスを緩和するための方法が提供される。他の態様において、方法は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターで細胞を形質転換又は形質移入することを含む。
【００４３】
細胞中で代謝性アシドーシスを低下させるのに有効な量で本発明のポリペプチドを含み、治療を要する哺乳動物対象へ投与されたときに、該哺乳動物対象において代謝性アシドーシスを低下させる医学的組成物を製造するための方法も提供される。
【００４４】
一態様において、本方法は、ポリペヌクレオチド、ベクター又はこのようなポリヌクレオチド若しくはこのようなベクターで形質転換又は形質移入された細胞を含む医学的組成物を製造することを含み、該医学的組成物は、投与されたときに、哺乳動物対象の細胞中で代謝性アシドーシスを低下させるポリペプチドの有効量を発現させることが可能である。
【００４５】
本発明の他の実施形態は、本発明のポリペプチドの有効量を含み、治療を要する哺乳動物対象へ投与されたときに、哺乳動物対象中で酸化的ストレスを緩和できる医学的組成物を製造する方法に関する。
【００４６】
投与が必要な哺乳動物対象へ投与されたときに、本発明のポリペプチドの有効量を発現することができ、これにより該哺乳動物対象において酸化的ストレスを低下させる、ポリヌクレオチド、ベクター又は形質転換若しくは形質移入された細胞を含む医学的組成物を製造する方法も、本発明の一態様として想定される。
【００４７】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチド、ベクター又は形質転換若しくは形質移入された細胞の有効量を含み、肥満のための治療を要する哺乳動物対象へ投与されたときに、本発明のペプチドの有効量を発現させる医学的組成物を製造又は提供するための方法が想定され、これにより別の方法では難治性である肥満の治療を提供することが、幾つかのバリエーションにおいて想定される。
【００４８】
具体的な実施形態において、哺乳動物対象はヒトである。
【００４９】
幾つかの態様において、組成物は、酸化的ストレスの代謝性アシドーシスによって影響を受ける細胞を含む組織又は臓器へ局所的に投与可能である。他の態様において、組成物は、全身投与可能である。
【００５０】
本発明の具体的な実施形態において、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ機能障害と関連した疾患は、リー症候群；ＭＥＲＲＦ症候群；パーキンソン病及び関連疾患；進行性外眼筋麻痺、カーンズ・セイヤー症候群及びＭＥＬＡＳ症候群を含むミトコンドリア脳筋症；肝臓、腎臓、中枢神経系、心臓、骨格筋、並びに内分泌系及び感音系等の臓器に影響する多様な多系統の小児科疾患；筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症及び抗酸化防御における欠損に起因し得る循環器疾患の形態を含む、ミトコンドリア中の活性酸素種の過剰な産生を包含することが公知であるか又は包含すると信じられている疾病；ＰＯＬＧ、ｃ１０ｏｒｆ２（Ｔｗｉｎｋｌｅ）又はミトコンドリアＤＮＡの維持の系の他の成分における遺伝学的欠損から生じる他の運動失調及び神経疾患；症候性及び非症候性の両者のミトコンドリア聴力欠陥；ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系の欠損に起因し得る糖尿病の形態；ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系に影響する抗レトロウィルス療法の副作用；難治性肥満及び食物源の移動における障害から生じる他の代謝性疾患；カーンズ・セイヤー症候群；ＮＡＲＰ症候群；アルパース・フッテンロッハー（Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ）病；感音性難聴；乳児良性筋障害；乳児致死性筋障害；小児筋障害；成人筋障害；横紋筋融解；レーバー遺伝性視神経ニューロパチー；心筋症；バース（Ｂａｒｔｈ）症候群；ファンコニー症候群；ミトコンドリアＤＮＡ欠乏症候群；ピアソン症候群；糖尿病及び乳酸性酸血症等の、損なわれたミトコンドリア呼吸機能である。
【００５１】
本発明のさらなる特性及びバリエーションは、図面及び詳細な記述を含む本願の全体から当業者に自明であり、このような特性は全て、本発明の態様であると考えられる。同様に、本明細書に記載されている本発明の特性は、特性の組み合わせが本発明の態様又は実施形態として具体的に上記されているかどうかに関わらず、本発明の態様としても予定されるさらなる実施形態の中に再度組み合わせることができる。本発明にとって不可欠であるとして本明細書中に記載されているこのような限定のみを限定とみなすべきであり、本明細書中に不可欠であるとして記載されていない限定を欠如する本方法の変形は、本発明の態様と考えられる。
【００５２】
前記に加え、具体的に上記されている変形より、何れかの点で範囲がより狭い本発明の実施形態が、さらなる態様として、本発明に含まれる。例えば、本発明の態様は、簡略化するために、属又は値の範囲に対する表記によって記載されている場合があり得るが、属の各要素及び前記範囲内の各値又は下位範囲が本発明の態様として予定されていることを理解すべきである。同様に、本発明の様々な態様及び特徴は組み合わせることが可能であり、本発明の範囲に属することが予定されたさらなる態様をもたらす。本出願人は、本明細書に添付されている特許請求の完全な範囲を発明したが、添付されている特許請求の範囲は、その範囲内に、他者の先行技術を包含することを意図するものではない。従って、特許庁又は他の団体若しくは個人によって、特許請求の範囲内に属する法定の先行技術が本出願人に告知された場合には、出願人は、このような特許請求の範囲の主題を定義し直して、このような特許請求の範囲からこのような法定先行技術又は法定先行技術の自明な変形を具体的に除外するために、準拠する特許法に基づいて補正を行う権利を留保するものとする。このような補正された特許請求の範囲によって定義される本発明の変形も、本発明の態様として予定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
定義
本発明において使用される用語は、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、発生生物学、細胞生物学及び生化学の分野において前記用語が通常有する意味を有する。しかしながら、幾つかの用語は、若干異なる様式で使用される場合があり得、幾つかの用語については、特許に関して正確に解釈されるためのさらなる説明が有益である。それゆえ、用語の幾つかは、以下により詳細に説明される。
【００５４】
「異地性発現」という用語は、異なる場所における発現を意味する。本発明において、本用語は、一つの生物（又は生物由来の細胞）における、相同的な遺伝子が第一の生物のゲノム中に見出されていない別の生物由来の遺伝子の発現を表すために使用される。ゲノム中にＡＯＸ遺伝子を有さない生物中でのＡＯＸ発現は、本発明の実験の部において示されているように、ミトコンドリアの生化学の劇的な形質転換をもたらした。結果は、異地性ＡＯＸ発現が、ミトコンドリア呼吸鎖及びＯＸＰＨＯＳ系に影響を及ぼす病理学的状態の遺伝子治療として実行可能な戦略であることを示している。
【００５５】
「ミトコンドリアの基質酸化」という用語は、分子状酸素の消費を伴う、ミトコンドリア内部での基質分子（例えば、糖、有機酸）の酸化、又はインビトロでのミトコンドリア懸濁液中での基質分子の酸化、又はインビトロで研究されている透過処理された細胞の内部での基質分子の酸化を意味する。
【００５６】
「ＮＡＤＨの再酸化」という用語は、ユビキノン等の下流の電子受容体が関与する、還元型ＮＡＤＨの酵素酸化を介したＮＡＤ＋（異化作用におけるほとんどの工程中で極めて重要な電子受容体）の再生を意味する。
【００５７】
本発明において、「代謝性アシドーシス」という用語は、「乳酸性アシドーシス」を意味する。「乳酸性アシドーシス」とは、呼吸鎖の封鎖の有害な副作用であり、この場合、ミトコンドリアは、ＮＡＤＨの再酸化のために正常な経路を使用することができず、細胞がＮＡＤＨを再酸化するために使用することが可能な唯一の代替的経路は、乳酸脱水素酵素と誤称される酵素を介してピルビン酸塩を乳酸塩へ変換する経路である。次に、乳酸塩は細胞から乳酸として排出され、細胞外環境の酸性化をもたらす。ＡＯＸは、ＮＡＤＨを再酸化するために、代替的であるが、なおミトコンドリアの経路である呼吸経路を提供することによってこれを全て防止し、これにより、細胞にとって不要な乳酸脱水素酵素経路を使用する。
【００５８】
本明細書で使用される「酸化的ストレスを軽減又は緩和すること」という用語は、スーパーオキシド、一重項酸素、ペルオキシナイトライト又は過酸化水素などの（但し、これらに限定されない。）活性酸素種によって引き起こされる動物細胞又は植物細胞に対する損傷を低下させ又は除去し、従って前記細胞から構成される臓器及び組織に対する損傷を低下させ又は除去することを表す。酸化的ストレスは、一般に、プロオキシダントが優越した状態にある、プロオキシダントと抗酸化剤との間の不均衡として定義される。
【００５９】
酸化的ストレスは、血液又は尿中のマロンアルデヒド又はチオバルビツール酸反応物質等の脂質酸化産物の測定（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１：２５０−２５７，  １９７８；Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，４５：３３７−３５１，  １９８７；Ｅｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，６６：１７７−１８７，  １９８８；Ｅｋｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，６７：２５−３１，  １９８８；Ｂｏｙｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，５０：３１−３７，  １９９０；Ｄｈａｎａｋｏｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，２２：６４３−６４６，  １９８７）；（ＬＤＬ等の）血液画分の易酸化性（Ｈａｒａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，７９：２４５−２５２，  １９８９）；末梢血液細胞（Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：４９２９−４９３５，  １９８９；Ｌｅａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ，３６：５０−５７，  １９９２）又は尿（Ｓｈｉｇｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｌ．Ｐａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｇｌａｚｅｒ  （ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８６，ｐｐ．５２１−５２９．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；Ｇｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３：３０７−３１０，  １９９０；Ｃｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍ．Ｇ．Ｓｉｍｉｃ，Ｋ．Ａ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｆ．Ｗａｒｄ，ａｎｄ  Ｃ．ｖｏｎ  Ｓｏｎｎｔａｇ（ｅｄｓ．），Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．４７９−４８２．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）中の修飾されたＤＮＡ塩基及び／又はＤＮＡ付加物；（ＬＤＬを含む）血液画分中のビタミンＥ又はビタミンＣレベル（Ｃｌａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．，２０：１３５−１５１，  １９８９；Ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２１５：１６７−１７２，  １９８９；Ｊｅｓｓｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉ．，２６５：３９９−４０５，  １９９０；Ｎｉｅｒｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｔ．Ｅ．Ｍｏｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｍｉｃｏｚｚｉ（ｅｄｓ．），Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｐｐ．１８１−２１２，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９）；血液画分中のカタラーゼ又はスーパーオキシドジスムターゼレベル（Ｈａｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２１４：１２９−１３６，  １９８９）；血中の脂質過酸化物（Ｐｒｙｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７：１７７−１７８，  １９８９；Ｆｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７５：１２０−１３０，  １９８８；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｌ．Ｐａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｇｌａｚｅｒ  （ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８６，ｐｐ．３７１−３７９．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；呼気中のエタン及びペンタン等の揮発性化合物（Ｒｅｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，１０：３９６−４０３，  １９９１；Ｋａｚｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１３：５０９−５１５，  １９９２；Ｋｎｅｅｐｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．，１５：１６３−１８６，  １９９２）；血液画分中のグルタチオン／グルタチオンジスルフィド（Ｂｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２：１２９４−１２９８，  １９８９；Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｌ．Ｐａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｇｌａｚｅｒ（ｅｄｓ．）Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８６，ｐｐ．６８１−６８５．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ，２９：１８７Ａ，１９８９；Ｓｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｌ．Ｐａｃｋｅｒ（ｅｄ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．４４５−４５１．Ｏｒｌａｎｄｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）；尿中のエイコサノイド（Ｊｕｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．，５：３８６−３９９，  １９８９）；血漿中の自己酸化的、非シクロオキシゲナーゼ由来のエイコサノイド（Ｍｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１０：１９５−２００，  １９９１）；血清のペルオキシルラジカル全体を捕捉する抗酸化剤の強さを測定する「ＴＲＡＰ」アッセイ（Ｗａｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９２４：４０８−４１９，  １９８７）などの、多様な方法で測定することが可能である。
【００６０】
本発明の一般的な記述
全ての植物、多くの真菌及び幾つかの原生動物由来のミトコンドリアは、電子伝達鎖上での末端オキシダーゼとして、チトクロムｃオキシダーゼの代替物として機能し、酸素を水２分子へと還元するシアン化物耐性の末端酸化酵素を含有する。この「代替的」経路への電子流は、ユビキノンプールのレベルで、従来の（しばしば、チトクロム経路と称される。）呼吸電子伝達経路から分岐する。従って、触媒的には、代替的経路は、ユビキノールオキシダーゼとして機能する単一の酵素（末端酸化酵素）からなる。末端酸化酵素を通じた電子伝達は、水素イオンの転位と共役されておらず、このため、エネルギー保存の３つの部位の２つが迂回され、放出される遊離エネルギーが熱として失われる。ＡＯＸは、ユビキノールプールから電子を受け取り、同時に分子状酸素を水へ還元する。チトクロム経路とは異なり、代替的経路は非リン酸化的であり、それゆえ、酸化的リン酸化に直接寄与しない。この代替的経路は呼吸の効率を低下させる可能性を有するので、ＡＯＸは、２つの機構によって厳格に制御される。ＡＯＸは、非共有結合された二量体として活性があり、ジスルフィド結合を介して共有結合されると不活性となる（Ｕｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０３：８４５−８５４，  １９９３）が、完全に活性状態となるためにはピルビン酸塩等の２−オキソ酸を必要とする（Ｍｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３２９：２５９−２６２，  １９９３）。ＡＯＸ経路が、ストレスの間、ＡＯＸを発現する植物等の生物を保護するように機能し得ることが一般的に想定されている（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６８：３３９−３４２，  １９９５；Ｒｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２９：１９０８−１９２０，  ２００２）多くの研究は、植物又は細胞培養物の多様なストレス処理の後にＡＯＸ合成の誘導を示しており（例えば、Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１１：５８９−５９５，  １９９６；Ａｍｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４７７：１７５−１８０，  ２０００；Ｓｗｅｅｔｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，３２：８９１−９０４，  ２００２）、ＡＯＸアンチセンスタバコ細胞培養物を利用する研究は、ミトコンドリア中に存在する活性酸素種（ＲＯＳ）のより高いレベルを示す一方で、ＡＯＸの過剰発現は、ＲＯＳのより低いレベルを生じた（Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：８２７１−８２７６，  １９９９）。
【００６１】
末端酸化酵素は、（ミキソチアゾール（ｍｙｘｏｔｈｉａｚｏｌ）及びアンチマイシンを含む）電子伝達複合体ＩＩＩ及び（シアン化物を含む）ＩＶにおいて作用する阻害剤に対して耐性があるが、サリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡＭ）及び没食子酸ｎ−プロピルを含む幾つもの化合物によって特異的に阻害されることが可能である（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０５９：１２１−１４０，  １９９１）。
【００６２】
現在、ＡＯＸの２つの構造モデルが存在する。Ｓｉｅｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｉｅｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６２：１０−１４，  １９９５；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，２７：３６７−３７７，  １９９１）によって提唱された最初のモデルは、比較的少数のＡＯＸ配列に基づいており、リボヌクレオチド還元酵素のＲ２サブユニット及びメタンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ成分も含むタンパク質の二鉄ファミリーの一員としてＡＯＸを分類した。疎水性親水性指標分析に基づいて、ＡＯＸは、膜間空間に局在する螺旋によって接続された２つの膜貫通螺旋を含有すると予測された（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，２７：３６７−３７７，  １９９５）。このモデルが提唱されたので、さらなるＡＯＸ配列が同定され、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｌｕｎｄ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４９：１７−２２，  １９９９）による別の構造モデルに関する提唱がもたらされた。この第二のモデルも、ＡＯＸを二鉄タンパク質として分類するが、二鉄中心の精確な連結球体が異なっている（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４９：１７−２２，  １９９９）。例えば、Ｇｌｕ−２７０を含有する、Ｓｉｅｄｏｗら（Ｓｉｅｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６２：１０−１４，  １９９５；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，２７：３６７−３７７，  １９９５）によって同定されたＣ末端のＧｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｈｉｓモチーフの１つは、新たに同定された配列中で完全に保存されているようには見受けられず、その結果、鉄を連結する機能を果たす可能性はないようである。替わりに、Ａｎｄｅｒｓｓｏ及びＮｏｒｄｌｕｎｄ（１９９９）は、鉄原子を配位するために、（Ｓｉｅｄｏｗらのモデルに従って膜間空間中に局在するＧｌｕ−２１７を含有する）第三のＧｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｈｉｓモチーフを使用した。このような選択は、膜貫通螺旋がもはや保持できないことを示唆するため、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ及びＮｏｒｌｕｎｄ（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｌｕｎｄ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４９：１７−２２，  １９９９）は、ＡＯＸが膜貫通タンパク質ではなく、界面タンパク質であると提唱した。
【００６３】
最近、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＩＭＭＵＴＡＮＳ（Ｉｍ）遺伝子が配列決定され、興味深いことに、ＡＯＸと関連性が低いと見られる色素体末端オキシダーゼ（ＰＴＯＸ）をコードすることが発見された（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１１：４３−５５，  １９９９；Ｃａｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：５７−６８，  １９９９）。Ｉｍ遺伝子とＡＯＸとの、限定的ではあるが有意な相同性には、鉄結合に関与し得る位置に配置された幾つものグルタミン酸残基及びヒスチジン残基が含まれる。また、二鉄中心を配位することがＡｎｄｅｒｓｓｏｎ及びＮｏｒｄｌｕｎｄ（１９９９）によって提唱されたアミノ酸残基の１つ（Ｇｌｕ−２６９）を除き、全てがＩｍ配列中に存在した。しかしながら、重要なことに、このモデルは僅かに適合され、その結果、Ｇｌｕ−２６９がＧｌｕ−２６８（ＡＯＸ配列及びＰＴＯＸ配列全てを通じて実際に完全に保存される残基である。）によって置換される。
【００６４】
多種多様な分類学的な基（表１）由来のＡＯＸタンパク質が全て、ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３：８６５−８７６，  ２００３）（その開示が参照により本明細書に組み入れられる。）中に記載されている多重配列比較で見出されるタンパク質の中央領域中の保存された重要なアミノ酸残基を共有することが報告されている。保存されたアミノ酸残基には、二鉄のカルボン酸タンパク質の特徴のある６個の鉄結合残基（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，５４：４９７−５１７，  ２００３）、４個の鉄結合モチーフ内の他の残基、及び幾つかの他のアミノ酸が含まれる。重要なことに、これらの残基は全て、動物タンパク質中でも完全に保存されている（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，５６：３３３−３４１，  ２００４）。
【００６５】
【表１】
2009513153.tif 000002
2009513153.tif 000003
【００６６】
同様に、多様な種由来の末端酸化酵素配列を検討することにより、末端酸化酵素がペプチドのＮ末端に（長さ５０なしい８０残基の範囲の）ミトコンドリア輸送ペプチドを含むことが示される。例えば、サウロマタム・グッタタム（Ｓａｕｒｏｍａｔｕｍ  ｇｕｔｔａｔｕｍ）（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２２１８５）由来のＡＯＸは、Ｎ末端（残基１ないし６２）に配置されたミトコンドリア輸送ペプチドの後に、成体ＡＯＸ配列（残基６３ないし３５４）を有する。
【００６７】
本発明において、ヒト細胞中でシアン化物非感受性ＡＯＸを発現させるための経路が開発され、その実施可能性が、生物個体のモデルにおいて示された。哺乳動物ミトコンドリアの内側に付随する代謝条件へ該経路を適応できることが、成功した結果によって示された。
【００６８】
シアン化物高感受性酵素であるチトクロムｃオキシダーゼのみを通じて分子状酸素を還元する点で、ヒトミトコンドリア呼吸は、ほとんどの植物、微生物及びさらには幾つかの後生動物のものとは異なる。本発明者は、シアン化物非感受性の末端酸化酵素（ＡＯＸ）の発現が、培養されたヒト細胞によって十分耐容されることを観察した。シアン化物非感受性ＡＯＸは、海洋由来のホヤ類、すなわちチオナ・インテスティナリス中に同定された。しかしながら、チオナ・インテスティナリスは、唯一のＡＯＸ源ではない。ＡＯＸは、他の生物中にも同様に見出され得る。
【００６９】
本発明の具体的な一実施形態において、ＡＯＸの発現は、ミトコンドリアの基質酸化に多大なシアン化物耐性を与え、酸化的ストレス、アポトーシス、すなわち細胞死感受性、及び代謝性アシドーシスを軽減する。さらに、ＡＯＸは、生物個体のモデル中で遍在性に発現された場合に、十分に耐容されることが示された。それゆえ、同素形のＡＯＸ発現は、ヒト細胞及び動物個体モデルにおいて呼吸鎖欠乏の有害事象を制限するための価値あるツールであることが示された。ＡＯＸの発現は、ミトコンドリアに限局されるように見受けられた。電子流におけるＡＯＸの関与は、呼吸鎖の非常に低下した酸化還元状態によって惹起され、ピルビン酸塩によって亢進され、さもなければ、酵素は実質的に不活性のままである。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、ヒト細胞中で発現された場合に、チオナ・インテスティナリスの末端酸化酵素（ＡＯＸ）は、ミトコンドリアへ正確に標的化され、呼吸鎖阻害剤であるシアン化カリウムに対して、ミトコンドリアの基質酸化を非感受性にすることが示された。ＡＯＸ阻害剤である没食子酸プロピルを使用した場合、呼吸鎖が正常に機能している条件下で、ＡＯＸが酵素的に不活性であることがさらに示される。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態において、呼吸鎖複合体ＩＩＩのレベルで呼吸鎖を遮断する薬物であるアンチマイシンＡで細胞を処理すると、間接的アッセイによって、ＡＯＸは、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生を阻害することが示された。通常、この処理は、キニンプールが高度に還元された場合に、活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生の結果として、ミトコンドリアのスーパーオキシドジスムターゼであるＳＯＤ２に対するｍＲＮＡの大幅な誘導を導く。これは、基質酸化の遮断を克服するための経路を提供することによって、ＡＯＸが、ＲＯＳ産生の増大により損傷を与えるという副作用も防止するという予測と一致して、ＡＯＸを発現する細胞中で軽減される。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態において、ＡＯＸ発現は、培養中のヒト細胞の増殖速度に影響を及ぼさないことが示された。
【００７３】
本発明の一実施形態は、アポトーシス又は細胞死の防御に関する。本発明において、細胞中でのＡＯＸ発現が、呼吸鎖の遮断及びＲＯＳの大幅な過剰産生を生じる、ＡＴＰ合成酵素の阻害剤である薬物オリゴマイシンによって誘導されるアポトーシス又は細胞死から細胞を完全に保護することを示す実験研究が開示される。
【００７４】
これらの観察は、毒素の摂取によるものであれ、又はミトコンドリアＤＮＡ若しくはミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の系の成分をコードする核遺伝子の、発病性変異若しくは加齢関連の変異の結果によるものであれ、呼吸鎖のチトクロムセグメントが阻害された場合に、ヒト細胞中でのＡＯＸ発現が、呼吸を回復させるための効果的な方法であり得ることを示した。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態において、ＡＯＸ発現が、早期老化の特性を誘導することが他の研究者によって示されているｍｔＤＮＡ変異の過剰蓄積の結果を制限又は防止し得ることが示された。従って、本発明の前記実施形態において、体重減少、皮下脂肪の減少、脱毛症（毛髪の損失）、脊柱後弯症（脊椎の弯曲）、骨粗鬆症、貧血、低下した受精能及び心肥大等の、加齢の生理学的効果が遅延され、寿命が延長されるはずである。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態は、ＲＣ機能障害の結果を研究するためのツールを提供することである。ＲＣの多くを通じた電子流をリン酸化過程から断絶するという特有の可能性を与えるので、ヒト細胞中におけるチオナ・インテスティナリスＡＯＸの発現の成功は、ＲＣの機能障害の結果をさらに研究するための有望なツールとなる。別の実施形態において、ＡＯＸの異地的な発現は、現在、難治性であるＲＣ疾病に対する有効な治療法として考えられる。この試行における第一段階は、生物個体モデル、例えばＲＣ欠乏症を示すマウス又はショウジョウバエにおけるＡＯＸの発現である。
【００７７】
従って、本発明の実験部分において、培養されたヒト細胞中でホヤ類のチオナ・インテスティナリス由来の末端酸化酵素（ＡＯＸ）を発現させる効果が、ドキシサイクリンによる誘導に反応して高レベルの導入遺伝子発現を支持するＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ発現系を使用することによって示された。この系によって、ＡＯＸがミトコンドリアに標的化され、呼吸鎖のチトクロムセグメントの迂回路として公知の特性によって予測されるように、代謝変化をもたらすことが示された。従って、ＡＯＸ発現によって、ヒト細胞は、対照細胞中での呼吸を完全に遮断するシアン化物の濃度の存在下で回復することが可能である。
【００７８】
シアン化物非感受性呼吸は、ＡＯＸの特異的な阻害剤である没食子酸プロピルによって阻害された。逆に、呼吸鎖への毒素の不在下での酸素消費は、没食子酸プロピルに対して非感受性であり、呼吸鎖が正常に機能しているときの電子流に関与していないことを示す。ＡＯＸ発現は、呼吸鎖活性に対して有意な効果を有さないが、アンチマイシン等の呼吸毒の存在下でスーパーオキシドジスムターゼ活性の誘導を遮断し、呼吸鎖が不適切に低下されると、亢進したＲＯＳ産生を軽減することを示した。さらに、呼吸鎖が利用できない場合には、ＮＡＤＨを再酸化するために乳酸産生に依存することによって生じるシアン化物の存在下で細胞を一晩培養することによって生じた培地の酸性化は、ＡＯＸ発現によって大きく低下した。最終的に、ＡＯＸ発現は、培養６時間で、オリゴマイシン誘発性細胞死に対する有意な防御を供与した。
【００７９】
これらの寛解は全て、ＡＯＸ発現が、毒素によるものであろうと変異によるものであろうと、呼吸鎖又はＡＴＰ合成酵素のチトクロムセグメントの阻害の有害な効果に対抗する上で有益な効果を有し得ることを示す。このように、心虚血又は脳虚血、並びに神経変性疾患、例えばパーキンソン病等の、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の系の病理学的阻害によって特徴付けられる多種多様な状態などのＯＸＰＨＯＳの疾患に対して処方される広範な範囲の遺伝子治療法として、ＡＯＸが有用である可能性が示唆される。
【００８０】
本発明の特に好ましい実施形態は、ＡＯＸの異地的発現を使用することによる遺伝子治療ツールの提供である。遺伝子治療ツールとしてのＡＯＸの潜在能力及び実施可能性を探索するために、長期間にわたって哺乳動物遺伝子に関して典型的なレベルでＡＯＸが安定して発現できる、より多用途の発現系が、最新のレンチウィルスベクターを使用することによって開発された（Ｗｉｚｎｅｒｏｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｔｒｏｎｏ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：４２−４７，  ２００５）。前記発現系によって、さまざまな標的細胞の型及び種を形質転換できるようになる。これにより、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系による妨害が病理学的機構として提唱される、ヒト疾病の多様な動物モデルにおいて有害な表現型を軽減するための戦略としてのＡＯＸの有効性を検査するための道が開かれる。レンチウィルスベクター−ＡＯＸは、罹患した組織及び臓器中の特異的な病変部位に注射することが可能である。形質導入の成功及び注射部位で形質導入された細胞の生存は、ｐＷＰＩのＧＦＰリポーターを使用して都合よく観察することが可能である。
【００８１】
本発明において、チオナ・インテスティナリスＡＯＸは、遍在性に作用する、生理学的に適切なプロモーターの調節下でレンチウィルスベクターの形質導入を用いて、ヒト細胞中で発現された。この経路によって達成されるｍＲＮＡレベルでの発現は、最大の形質導入の下でＦｌｐ−Ｉｎ(商標)Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３系を使用した場合より約２桁低かったが、ミトコンドリア呼吸代謝に及ぼす顕著な効果は、実質的に同一であった。従って、レンチウィルスベクターにより送達されるＡＯＸは、呼吸鎖のチトクロムセグメントが、例えば毒素、変異又は一過性の低酸素等の他の侵襲によって阻害される条件下で、呼吸鎖のチトクロムセグメントの条件的迂回路を提供するために使用することが可能である。
【００８２】
レンチウィルスベクターによって送達されるＡＯＸ発現である本発明の特に好ましい実施形態において、形質導入された細胞は、増殖上の検出不可能な利点又は欠点を有しながら、少なくとも３週間維持されることが可能である。多くの外来タンパク質とは異なり、ヒト細胞中でこのレベルで発現するＡＯＸは、それゆえ、何ら毒性効果を有さないように見える。さらに、ＴＣＡ回路酵素であるフマル酸ヒドラターゼ及びコハク酸脱水素酵素に変異を包含するミトコンドリア異化反応における多様な妨害が、細胞増殖又は腫瘍形成能さえも刺激し得（Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２３：３０９−３１４，  １９５６；Ｐｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３５：６３２−６３９，  ２００３）、レンチベクターにより送達されるＡＯＸは、この点において実質的に不活性であるように見える。これは、動物検査によって、その有用性が確認される場合、遺伝子治療ツールとして安全に採用されることが可能であるという論拠を強める。
【００８３】
従って、本発明の実験の部において、ショウジョウバエ−ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるＡＯＸ発現の効果が示された。ドロソフィラ中での遍在性発現は、ヒト生物個体が、付与された外来遺伝子産物の発現を許容できるかどうかの最初の検査である。ドロソフィラ細胞は、ヒト細胞と同一の遺伝的及び生体エネルギー原理で機能し、同一の主要な細胞種、組織が全てショウジョウバエ中に存在し、臓器さえも存在する。利用可能なハエ遺伝系を使用して、多くの異なる遺伝的背景における効果を短時間にチェックすることが可能である。その知見は、その全般的な生理がさらに類似している哺乳動物、例えばマウス中での実験を設計し、最終的には、ヒトを用いた臨床試験での実験を設計するために使用することができる。
【００８４】
ショウジョウバエ実験の結果によって、ＡＯＸの生物個体全体での発現が十分に許容されていることが示され、有害事象なしに正常に発達することが裏付けられた。ＡＯＸを発現するハエは、形態学的に正常であるように見え、繁殖性があり、非遺伝子組換えハエと交配されると、子孫の正常な数を産生した。ＡＯＸ遺伝子組換えハエは、最も長命の野生型と同じくらい長命であるように見えた。さらに、酵素は、培養されたヒト細胞中で活性を有するものと同様の生化学的条件下で成体ハエのミトコンドリア中で活性を有していた。ドロソフィラ中でのＡＯＸの発現によって、ミトコンドリアの基質酸化がシアン化物非感受性となり、シアン化物毒性からハエをさらに部分的に保護した。１ｍＭＫＣＮにおいてでさえ、ＡＯＸを発現しているハエは、３０分以内で完全に麻痺し、処置を生存し、１６時間後に再度活動を示した。ＡＯＸを発現しているハエは、ハエの餌へ添加すると野生型のハエに対して毒性のある複合体ＩＩＩ阻害剤であるアンチマイシンに対しても耐性があった。呼吸鎖活性は、対照ハエと比較して、ＡＯＸを発現しているハエ由来のミトコンドリア中において有意に変化せず、ヒト培養細胞中と同様に、必要とされる条件下を除き、生物個体においてＡＯＸが酵素的に不活性であることを示した。
【００８５】
遺伝子治療
ＤＮＡが、多様なウィルスベクターを使用して、細胞中へ導入され得ることは、いまや広く認識されている。このような実施形態において、対象遺伝子を含有するウィルスベクターを含む発現構築物は、アデノウィルスベクター（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第５，８２４，５４４号、米国特許第５，７０７，６１８号、米国特許第５，６９３，５０９号、米国特許第５，６７０，４８８号、米国特許第５，５８５，３６２号参照）、レトロウィルスベクター（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第５，８８８，５０２号、米国特許第５，８３０，７２５号、米国特許第５，７７０，４１４号、米国特許第５，６８６，２７８号、米国特許第４，８６１，７１９号参照）、アデノ随伴ウィルスベクター（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第５，４７４，９３５号、米国特許第５，１３９，９４１号、米国特許第５，６２２，８５６号、米国特許第５，６５８，７７６号、米国特許第５，７７３，２８９号、米国特許第５，７８９，３９０号、米国特許第５，８３４，４４１号、米国特許第５，８６３，５４１号、米国特許第５，８５１，５２１号、米国特許第５，２５２，４７９号参照）、アデノウィルス−アデノ随伴ウィルスハイブリッドベクター（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５６，１５２号参照）、ワクシニアウィルスベクター若しくはヘルペスウィルスベクター（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第５，８７９，９３４号、米国特許第５，８４９，５７１号、米国特許第５，８３０，７２７号、米国特許第５，６６１，０３３号、米国特許第５，３２８，６８８号参照）又はレンチウィルスベクター（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第６，２０７，４５５号及び米国特許第６，２３５，５２２号）であり得る。多くの使用において、ウィルスの複製欠損系が好ましい。
【００８６】
当業者は、インビボ及びエクスビボでの状況へ遺伝子送達を適用どのように適用するかを知悉している。ウィルスベクターの場合、当業者は、一般的に、ウィルスベクターストックを調製する。ウィルスの種類及び達成可能な力価に応じて、当業者は、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１又は１×１０１２の感染粒子を患者へ送達する。同様の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製剤又は他の非ウィルス製剤に関して推定され得る。医薬として許容される組成物としての製剤は、以下に論述されている。
【００８７】
多様な経路が、多様な細胞の種類に対して想定される。実際に全ての細胞、組織又は臓器の種類に関して、全身送達が想定される。他の実施形態において、多様な直接的、局部的及び局所的アプローチが採用され得る。例えば、細胞、組織又は臓器は、発現ベクター又はタンパク質を直接注射され得る。
【００８８】
本発明において使用するための遺伝子治療用の好ましいプロモーターには、ＥＦ−αプロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、レトロウィルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、ケラチン１４プロモーター、及びαミオシン重鎖プロモーターが含まれる。臓器特異的プロモーターは、限局化されたＡＯＸ発現が望ましい疾病又は状態に関して有利であり得る。
【００８９】
本明細書中に論述されているポリヌクレオチド又はベクターで（安定的に又は一過性に）形質転換又は形質移入された原核細胞及び真核細胞を含む宿主細胞は、本発明の一態様として考えられる。本発明のポリヌクレオチドは、環状プラスミドの一部として、又は単離されたタンパク質コード領域若しくはウィルスベクターを含む直鎖ＤＮＡとして宿主細胞中へ導入され得る。本分野で周知であり、定型的に実施される、ＤＮＡを宿主細胞中へ導入するための方法には、形質転換、形質移入、電気穿孔法、核注入、又はリポソーム、ミセル、ゴースト菌体、及びプロトプラスト等の担体との融合がある。上述のように、このような宿主細胞は、ポリヌクレオチドを増幅させるために、及びポリヌクレオチドによってコードされる本発明のポリペプチドを発現させるために有用である。宿主細胞は、単離され得るか及び／又は精製され得る。宿主細胞は、インビボでのポリペプチドの一過性又は持続性発現を生じるための、インビボで形質転換された細胞でもあり得る。宿主細胞は、例えば、治療目的のためにインビボでポリペプチドを産生するために、エクスビボで形質転換され、形質転換後に導入される単離された細胞でもあり得る。宿主細胞の定義は、遺伝子導入ヒトを明確に排除する。一態様において、エクスビボでの治療は、特定の組織／臓器の種類の分化した、未分化の又は部分的に分化した細胞中へ導入される。典型的な分化した細胞には、体細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、膵臓細胞、肝細胞及び心筋細胞が含まれる。細胞の典型的な種類には、以下に限定されるものではないが、幹細胞、全能性細胞、多能性細胞、胚性幹細胞、内部細胞塊、成体幹細胞、骨髄細胞、臍帯血由来の細胞及び外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来の細胞がある。
【００９０】
このような宿主細胞は、本明細書に記載のアッセイにおいて有用である。本発明のポリペプチドの発現に関し、細菌、酵母、植物、無脊椎動物（例えば、昆虫）、脊椎動物、及び哺乳動物の宿主細胞を含む（がそれらに限定されない）全ての宿主細胞が許容される。治療用調製物を開発するために、哺乳動物細胞系、特にヒト細胞系における発現が好ましい。本発明の組換え発現産物に関する最適な生物活性を付与することが望ましい場合があり得るように、哺乳動物宿主細胞の使用は、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、切り詰め、脂質付加、及びリン酸化）を提供することが予想される。ポリペプチドのグリコシル化された形態及び非グリコシル化された形態が、本発明によって包含される。同様に、本発明はさらに、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等の１つ又はそれ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有結合で修飾された上述のポリペプチドを包含する。
【００９１】
同様に、本発明は、ミトコンドリア呼吸鎖中での欠損によって特徴付けられる疾患及び細胞中での酸化的損傷によって特徴付けられる疾患を含む（がそれらに限定されない）本明細書に記載の疾患の治療のための医薬の製造における、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチド又は宿主細胞の使用を提供する。関連した実施形態において、本発明は、容器へ装着されるか又は容器とともに梱包され、容器の含有物を記載し、本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の疾病を治療するために容器の含有物の使用に関する表示及び／又は説明を提供するラベルをさらに含む、バイアル又は瓶等の容器中に詰められた本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は組成物を含むキットを提供する。
【００９２】
他の実施形態において、非ウィルス送達が考えられる。これらには、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，  １９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：２７４５−２７５２，  １９８７；Ｒｉｐｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，  １９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，  １９８５）、電気穿孔法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，  １９８６；Ｐｏｔｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，  １９８４）、直接的微量注入法（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４−１０９９，  １９８５）、ＤＮＡ入りのリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，  １９８２；Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，  １９７９；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２７６（６）：１０２−６，  １９９７；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７（１５）：１７９１−３，  １９９６）、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，  １９８７）、高速微粒子銃を使用する遺伝子照射（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，  １９９０）、及び受容体仲介性形質移入（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，  １９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，  １９８８；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，  １９９３）が含まれる。
【００９３】
本発明の具体的な実施形態において、発現構築物（又はタンパク質）は、リポソーム中に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二層膜及び内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離される複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が水溶液の過剰量中で懸濁されると、自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖された構造の形成前に自己再編成を経験し、脂質二層間に水及び溶解された溶質を捕捉する（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｗｕ，Ｇ．，Ｗｕ，Ｃ．，ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ｐｐ．８７−１０４，  １９９１）。陽イオン性リポソームへのＤＮＡの添加によって、リポソームから、光学的に複屈折の液体−結晶により濃縮された小球への形態的な移行が生じる（Ｒａｄｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５（５３０１）：８１０−４，  １９９７）。これらのＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療及び送達において使用するための有望な非ウィルスベクターである。リポソームにより媒介される核酸送達及びインビトロでの外来ＤＮＡの発現は、大きな成功を収めている。また、本発明において考えられるのは、「リポフェクション」技術を包含する多様な商業的アプローチである。本発明のある実施形態において、リポソームは、センダイウィルス（ＨＶＪ）と複合体を形成され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームにより被包されたＤＮＡの細胞流入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，  １９８９）。他の実施形態において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに複合体形成され得、又は核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに使用され得る（Ｋａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，  １９９１）。さらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両者とともに複合体形成され得、又はＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両者とともに使用され得る。このような発現において、構築物は、核酸のインビトロ及びインビボでの転移及び発現においてうまく使用された後、本発明に適用することが可能である。
【００９４】
治療用遺伝子をコードする核酸を細胞中へ送達するために使用されることができる他のベクター送達系には、受容体媒介性送達媒体がある。前記媒体は、ほぼ全ての真核細胞における受容体仲介性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。多様な受容体の細胞種特異的分布のため、送達は非常に特異的であり得る（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，  １９９３）。
【００９５】
受容体仲介性遺伝子を標的とする媒体は、一般的には、２つの成分、すなわち細胞受容体特異的リガンド及びＤＮＡ結合剤からなる。幾つものリガンドが、受容体仲介性遺伝子移入に使用されてきた。最も詳しく性質が明らかとなっているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８７）、上述）及びトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，  １９９０）である。近年、ＡＳＯＲと同一の受容体を認識する新たな合成糖タンパク質が、遺伝子送達媒体として使用されており（Ｆｅｒｋｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ．  Ｊ．，７：１０８１−１０９１，  １９９３；Ｐｅｒａｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９１：４０８６−４０９０，  １９９４）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）も扁平上皮癌細胞へ遺伝子を送達するのに使用されている（Ｍｙｅｒｓ，欧州特許庁０２７３０８５）。
【００９６】
他の実施形態において、送達媒体は、リガンド及びリポソームを含み得る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７）は、リポソーム中へ組み込まれるガラクトース末端アシアルガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）であるラクトシル−セラミドを採用し、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの亢進を観察した。従って、治療用遺伝子をコードする核酸も、リポソームを有すか又は有さないあらゆる受容体−リガンド系によって、特定の細胞種中へ特異的に送達され得ることが実施可能である。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、発現構築物は単純に、むき出しの組換えＤＮＡ又はプラスミドからなり得る。構築物の転移は、細胞膜を物理的又は化学的に透過処理する上述の方法の何れかによって実施され得る。これは、インビトロでの転移に対して特に適用可能であるが、インビボでの使用に対しても同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７５２９−７５３３（１９８４）は、活発なウィルス複製及び一過性の感染を示す成体マウス及び新生児マウスの肝臓及び脾臓中へ、ＣａＰＯ４沈殿物の形態にあるポリオーマウィルスＤＮＡを注射することに成功した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｎｅｓｈｉｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９５５１−９５５５（１９８６）も、ＣａＰＯ４で沈殿したプラスミドの直接的な腹腔内注射が、形質移入された遺伝子の発現をもたらすことを示した。
【００９８】
むき出しのＤＮＡ発現構築物を細胞中へ転移させるための本発明の別の実施形態は、粒子の照射を包含し得る。本方法は、細胞膜を貫通することができ、細胞を死滅させずに細胞に移入できる高速度へ、ＤＮＡコーティングされた微粒子銃を加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３，  １９８７）。小粒子を加速させるための幾つもの装置が開発されてきた。このような一装置は、電流を発生させるための高電位放電に依存し、前記電流が次に、動力を供与する（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，  １９９０）。使用された微粒子銃は、タングステン又は金のビーズ等の生物学的に不活性な物質からなっている。
【００９９】
考えられる他の非ウィルス送達機構には、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，  １９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：２７４５−２７５２，  １９８７；Ｒｉｐｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，  １９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，  １９８５）、電気穿孔法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，  １９８６；Ｐｏｔｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，  １９８４）、直接的微量注入法（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４−１０９９，  １９８５）、ＤＮＡ入りのリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，  １９８２；Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，  １９７９；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２７６（６）：１０２−６，  １９９７；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７（１５）：１７９１−３，  １９９６）、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，  １９８７）、高速微粒子銃を使用する遺伝子照射（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，  １９９０）、及び受容体仲介性形質移入（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，  １９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，  １９８８；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，  １９９３）が含まれる。
【０１００】
ミトコンドリアに対する標的化
さらに他の実施形態において、送達媒体は、ポリヌクレオチドをミトコンドリアへ特異的に送達し得る（その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられる開示である米国特許出願公開第２００６／０２１１６４７号）。
【０１０１】
小器官への特異的ポリペプチドの標的化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを修飾して、特異的な小器官標的化シグナルを発現させることによって達成されることが可能である。これらのシグナルは、特異的小器官を標的にするが、幾つかの実施形態においては、標的化シグナルと小器官との相互作用は、古典的な受容体：リガンド相互作用を通じて生じることはない。真核細胞は、分散した多くの膜結合区画、又は小器官を含む。各小器官の構造及び機能は大部分が、構成体のポリペプチドのその特異的な補体によって決定される。しかしながら、これらのポリペプチドの大部分は、細胞質中でそれらの合成を開始する。従って、小器官の生合成及び優れた状態での維持は、新たに合成されたタンパク質がそれらの適切な区画を正確に標的とし得ることを必要とする。これは、しばしば、アミノ末端シグナル伝達配列、並びに翻訳後修飾及び二次構造によって達成される。ミトコンドリアに関して、幾つものアミノ末端標的化シグナルが推定されてきた。典型的なミトコンドリア標的化シグナルには、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ６３３５９０、Ｑ９ＤＣＷ４、ＮＰ００００９９、ＮＰ０６７２７４、ＮＰ０８０７２０、ＡＡ０３１７６３、ＮＰ０３２６４１、ＡＡＨ４９８０２、ＮＰ０００２７３、ＮＰ０３１６４７、ＸＰ３３１７４８、ＮＰ０００００８、ＷＰ０００１１７、ＮＰ００２１４７、ＸＰ３２６１２５、ＮＰ００２２１６、ＮＰ８９８８７１、ＮＰ００２３８７、ＮＰ００４１０１、ＮＰ００１５９９、ＮＰ００５７２０、Ｐ２２５７２、ＡＡＰ８８７９４、ＡＡＨ５５０３０、ＡＡＨ５３６６１、ＮＰ０３６２１６、ＮＰ０３２３２９、ＮＰ００１６００、Ｐ４２１２６、ＮＰ０３１４０８、ＮＭ２０１２６３、ＮＰ０６０２９７、ＡＡＨ２７４１２、ＡＡＣ２５５６０、ＮＰ００６５５８、ＮＰ００１６８８、ＡＡＰ３５３２７、ＮＰ０６１８２０、ＣＡＡ２９０５０、ＮＰ０５６１５５、ＡＡＧ３１６５８、ＮＰ０３２３２８９、ＮＰ４９７４２９、ＮＰ０００６８１、ＮＰ００５２６２、ＮＰ００００９９、ＮＰ０００２７５、ＡＡＨ００４３９、ＮＰ００５３８１、ＮＰ０００７００、Ｐ０８２４９、ＮＰ００４０８３、ＪＣ４０２２、ＡＡＰ３５３５２、ＮＰ０３２１２３、ＮＰ４９９０７５、ＮＰ５０９５８４、ＮＰ０３４６０７、ＡＡＢ２７９６５、ＡＡＣ５２１３０、ＡＡＨ０５４７６、ＮＰ０００００７、ＡＡＨ３９１５８、ＤＳＨＵＮ、ＡＡＣ４２０１０、ＮＰ００５３８２、ＡＡＡ５６６６４、ＮＰ０００１７４、ＡＡＨ１１６１７、ＮＰ００５３１８、ＡＡＨ１６１８０、ＡＡＦ２１９４１、ＡＡＨ０１９１７、ＡＡＣ５２１３０、ＮＰ４９５６９３、ＮＰ０００５２２、ＣＡＡ３０１２１、ＮＰ００００２１、ＮＰ７３３８４４、ＮＰ００９３２０、ＮＰ０５５９７５、ＮＰ００２６０３、ＣＡＡ４２０６０、ＮＰ０３４４５５、ＮＰ０２３６７６、ＣＡＡ３９６９５、ＰＩ９９７４、ＡＡＨ５７３４７、ＮＰ０３２８３６、ＣＡＡ３２０５２、Ｐ３３５４０、ＮＰ００１９７６、Ｐ４２１２５、ＮＰ０００２４６、ＣＡＥ３５１３７、ＮＰ４９９２６４、ＮＰ００２１４８、ＮＰ００６６７１、ＮＰ０３２０２３、ＮＰ０３４１５２、ＮＰ０３１５５９、ＮＰ０００４２７、ＮＰ４９２２９０、ＮＰ５１０７６４、ＮＰ０００６７９、ＮＰ０５６１５５、ＸＰ３２３１１５、ｔ１５７６１、ＮＰ０３３４６３、ＮＰ００５９２３、ＮＰ００３４６８、ＮＰ００２０７１、ＮＰ０００２６５、ＮＰ００００２１、ＡＡＨ０８１１９、Ｐ３９７２６、ＮＰ００９５３１、ＮＰ００９５１５、ＮＰ００９４７３、ＮＰ００９４６３、ＮＰ００９６７８、ＣＡＡ５５６２４、ＮＰ００９７０４、ＮＰ００９７８０、ＮＰ００９７８６、ＮＰ００９８１０、ＮＰ００９８２７、ＮＰ００９８４１、ＮＰ００９９２９、ＮＰ００９９５３、ＮＰ００９９５８、ＮＰ００９９７５、ＮＰ０１００７９、ＮＰ０１０４３２、ＮＰ０１０４８０、ＮＰ０１０７５０、ＮＰ１１６６３５、ＮＰ０１１７６０、ＮＰ０１１８７２、ＮＰ０１２１９４、ＣＡＡ８９３９０、ＮＰ０１２６４７、ＮＰ０１２８８４、ＮＰ０１３０７３、ＮＰ０１３１６０、ＮＰ０１３５９７、ＮＰ０１３７７８、ＮＰ０１３７８８、ＮＰ０１４５４６、ＮＰ０１４６８３、ＮＰ０１４７８５、ＮＰ０１５２０７、ＮＰ０１５１９０、ＮＰ０１５０７１、ＮＰ０１５０６１、ＣＡＡ８９１６７及びＮＰ０１５３９２として列挙されるものがある。
【０１０２】
一実施形態において、小器官標的化シグナルは、少なくとも２つの、少なくとも５ないし１５の、又は約１１の荷電基を含有することが可能であり、正味の反対の電荷を有する小器官へ標的化シグナルを引き込ませる。別の実施形態において、標的化シグナルは、電磁ポテンシャル勾配に逆らって又は前記勾配に沿って標的化シグナルを小器官中へと輸送させる一連の荷電基を含有することが可能である。適切な荷電基は、荷電された官能基、アミノ基、核酸等を有するアミノ酸等の、細胞内条件下で荷電された基である。ミトコンドリア局在化／標的化シグナルは、一般に、タンパク質が高度に負に荷電されたミトコンドリアへ標的化できるようにする高度に正に荷電されたアミノ酸のリーダー配列からなる。リガンドが受容体に接近するために確率論的ブラウン運動に依存する受容体：リガンドアプローチとは異なり、幾つかの実施形態のミトコンドリア局在化シグナルは、電荷のために、ミトコンドリアへ引っ張られる。
【０１０３】
ミトコンドリアに進入するために、タンパク質は一般的に、Ｔｉｍ及びＴｏｍ複合体（ミトコンドリア内膜／外膜のトランスロカーゼ）からなるミトコンドリア輸入装置と相互作用しなければならない。ミトコンドリア標的化シグナルに関して、正の電荷は、前記複合体と連結されたタンパク質を引っ張り、前記タンパク質をミトコンドリア中へ引っ張り続ける。Ｔｉｍ及びＴｏｍ複合体によって、タンパク質は膜を通過できる。従って、本発明の幾つかの実施形態は、正に荷電した標的化シグナル及びミトコンドリア輸入装置を利用して、組成物をミトコンドリア内部空間へと送達する。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明には、小器官局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドへ、翻訳領域内で作用可能に接続された成熟ＡＯＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。このようなキメラ構築物は、細胞の小器官中へ導入されることが可能である。細胞は、細胞培養物中で無制限に維持されることができる形質転換された細胞系であり得、又は細胞は、一次細胞培養由来であり得る。典型的な細胞系には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なものが含まれる。核酸は、形質移入された細胞系の細胞の核内で複製及び転写されることが可能である。成熟ＡＯＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標的小器官中に残存できるように、標的化シグナルは、必要であれば、酵素的に切断することができる。
【０１０５】
特異的な核酸、例えば代謝性遺伝子を発現する小器官を生じるためにあらゆる真核細胞を形質移入することが可能であり、前記細胞には、初代培養細胞及び確立された細胞系が含まれる。細胞の典型的な種類には、以下に限定されるものではないが、幹細胞、全能性細胞、多能性細胞、胚性幹細胞、内部細胞塊、成体幹細胞、骨髄細胞、臍帯血由来の細胞、及び外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来の細胞が含まれる。典型的な分化した細胞には、体細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、膵臓細胞、肝細胞及び心筋細胞が含まれる。
【０１０６】
ヒトの疾病、細胞増殖、細胞死及び加齢におけるミトコンドリアの重要性を考えると、本発明の実施形態は、（ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳを含む）公知のミトコンドリアの疾病及び（加齢、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病、心臓病を含む）ミトコンドリアの推定上の疾病が治療される手段を供給するためのミトコンドリアゲノムの操作も包含する。
【０１０７】
本発明のＡＯＸポリヌクレオチド及びポリペプチドの治療上の使用
本発明は、本発明のＡＯＸポリペプチド及びポリヌクレオチドを使用するインビトロ及びインビボでの数多くの方法を提供する。一態様において、ＡＯＸは、遺伝されると、又は老化中に体細胞性に生じるとに関わらず、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系に影響を及ぼす変異から生じる生体エネルギー欠損を補正するための遺伝子治療ツールとして使用される。ミトコンドリア呼吸鎖が、チトクロムセグメント又はＡＴＰ合成酵素内で部分的に遮断されている条件下で、ＡＯＸは電子流を再開させる。しかしながら、ＡＯＸにより支持される電子流は、非水素イオンポンピングであり、従って、ＡＴＰ生成に直接関与しない。これに対して、チトクロム鎖が、複合体ＩＩＩ又はＩＶにおいて遮断される場合、複合体Ｉを流れる電子及び水素イオンの流れは、ＡＯＸによって再開することが可能であり、これは、ＡＴＰ生成を少なくとも部分的に回復させるはずである。本発明者の知見からの予測は、例えば、構造的なサブユニットにおけるミスセンス変異又は、チトクロム鎖に幾らかの活性を残留させ、従って臨界閾値を下回ってＡＴＰ生成を低下させない集合因子及びシャペロン（例えば、Ｓｕｒｆ１）の喪失からもたらされる、複合体ＩＩＩにおいて又は複合体ＩＩＩを越えて呼吸鎖を部分的に遮断する条件下で、ＡＯＸは有用性を有するはずであるということである。これらの状況下で、逆向きの電子流を遮断し、ＮＡＤＨの再酸化を支持し、これにより、有害なＲＯＳ生成、代謝性アシドーシス及びアポトーシス促進性シグナルの発生を最小化する上でのＡＯＸの保護的効果は、呼吸鎖の生理学的機能障害の結果を軽減することを補助すべきである。
【０１０８】
従って、ＡＯＸ発現が、生物個体において害がなく、且つ有益であることが示されるているので、遺伝子治療を介して、ミトコンドリア呼吸鎖に対して影響を受けるヒトの疾患の広範な範囲を治療するための有用なツールであることが推察され得る。
【０１０９】
ミトコンドリア呼吸鎖の疾病は、神経、筋肉、眼科系、心臓、腎臓、肝臓、血液、胃腸管、内分泌系及び代謝性代償不全を含む身体の多くの領域にそれ自体存在し得る。ミトコンドリア呼吸鎖疾患に関する総説は、その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられるＭｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ，Ｍｅｄ，８８：２１７Ｐ−２２２Ｐ，１９９５）に見出され得る。典型的なミトコンドリア呼吸鎖疾患には、（ＡＴＰ合成酵素若しくは他のＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに関してミトコンドリア遺伝子における、又は複合体ＩＶ集合因子ＳＵＲＦ１若しくは、ＯＸＰＨＯＳ系の生合成に関与する他のタンパク質に関する核遺伝子における変異によって引き起こされる）リー症候群；（ミトコンドリアｔＲＮＡ−Ｌｙｓ又はミトコンドリア翻訳装置の他の成分における変異によって引き起こされる）ＭＥＲＲＦ症候群；パーキンソン病及び（ｍｔＤＮＡポリメラーゼＰＯＬＧ、ミトコンドリアタンパク質キナーゼシグナル伝達、タンパク質代謝又は酸化的ストレスに対する耐性を含む、ミトコンドリア機能に関する遺伝子における変異によって引き起こされる）関連疾患；進行性外眼筋麻痺、カーンズ・セイヤー症候群及び（ミトコンドリアＤＮＡ、ｍｔＤＮＡの維持に関与する核遺伝子又は呼吸鎖の生合成の欠失又は点変異によって引き起こされる）ＭＥＬＡＳ症候群；（ＯＸＰＨＯＳサブユニット、集合因子、ミトコンドリアタンパク質合成成分、ミトコンドリアタンパク質の移入、加工及び代謝回転、ＯＸＰＨＯＳに関する補欠分子族及び電子担体の代謝産物輸送又は合成に関する遺伝子の変異の結果として生じる）肝臓、腎臓、中枢神経系、心臓、骨格筋、並びに内分泌系及び感音系等の臓器に影響する多系統性小児疾患；病変形成が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症及び抗酸化剤防御の欠損に起因し得る循環器疾患の形態を含む、ミトコンドリア中での活性酸素種の過剰産生を包含することが公知であるか又は包含すると考えられている、疾病；ＰＯＬＧ、ｃ１０ｏｒｆ２（Ｔｗｉｎｋｌｅ）又はミトコンドリアＤＮＡの維持の系の他の成分における遺伝的欠損の結果生じる他の運動失調症及び神経学的疾患；（１２Ｓ  ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡＳｅｒ（ＵＣＮ）又はミトコンドリア翻訳装置の他の成分に関するミトコンドリア遺伝子における変異によって生じる）症候性及び非症候性の両方のミトコンドリア性聴力機能障害；（ｍｔＤＮＡの欠失、点変異又は配列多形性の結果生じる）ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系の欠損に起因し得る糖尿病の形態；ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系に影響を与える抗レトロウィルス治療の副作用；食物源の流動における障害の結果生じる難治性肥満及び他の代謝性疾患；ＮＡＲＰ症候群；アルパース・フッテンロッハー病；感音性難聴；乳児良性筋障害；乳児致死性筋障害；小児筋障害；成人筋障害；横紋筋融解；レーバー遺伝性視神経ニューロパチー；心筋症；バース症候群；ファンコニー症候群；ｍｔＤＮＡ欠乏症候群；ピアソン症候群；糖尿病及び乳酸性酸血症がある。
【０１１０】
ミトコンドリアの疾病は、脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓並びに内分泌系及び呼吸器系の細胞に対して最も多大な損傷を生じるようである。従って、これらの細胞及び組織中のミトコンドリアのＡＯＸによる形質移入は、本発明の範囲に属する。ミトコンドリアが、ミトコンドリア中に天然に存在するかどうかに関わらず、又はｍｔＤＮＡ若しくは核ＤＮＡにより自然にコードされるかどうかに関わらず、全てのタンパク質を発現するように形質移入され得ることが理解される。どの細胞が影響を受けるかに依存して、治療されるべき疾病の症状には、運動調節の損失、筋肉の脆弱さ及び疼痛、胃腸管疾患及び嚥下障害、成長不足、心臓病、肝臓病、糖尿病、呼吸器合併症、痙攣、視覚／聴覚障害、乳酸性アシドーシス、発達遅延並びに感染に対する感受性が含まれ得る。
【０１１１】
動物モデル
（ショウジョウバエ及びマウスを含む）動物モデルは、ミトコンドリア呼吸鎖のさまざまな疾患の治療における本発明のＡＯＸ治療に関する治療上の有効性を示すために使用されることが可能である。典型的なショウジョウバエモデルには、ｏｘｅｎ（Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５６：１７２７−１７３６，  ２０００）、Ｓｕｒｆ１−ＫＤ（Ｚｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７２：２２９−２４１，  ２００６）、ｐａｒｋ（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：７９９−８１１，  ２００５；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１５７−１１６１，  ２００６）、ｄｊ−１β（Ｍｕｅｌｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３：１２５１７−１２５２２，  ２００６）、ｃｙｃｌｏｐｅ（Ｓｚｕｂｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５８：１６２９−１６４３，  ２００１）、Ｈｔｔｅｘ１ｐ  Ｑ９３（Ｍａｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２６：４８５−４９６，  ２００４）、及びｄｆｈ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３３９７−３４０５，  ２００５）が含まれ、前記モデルは次の疾患、すなわち複合体ＩＩＩ欠乏症、チトクロムｃオキシダーゼ欠乏性リー症候群、パーキンソン病、乳児性チトクロムｃオキシダーゼ欠乏症、ハンチントン病及びフリードライヒ運動失調症の１つを示す。
【０１１２】
典型的なマウスモデルには、Ｃｏｘ６ａ２（Ｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８２：Ｈ７２６−Ｈ７３３，  ２００２）、Ｃｏｘ１０（Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：２７３７−２７４８，  ２００５）、Ｍｅｃｐ２（Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：５０３３−５０４２，  ２００６）、Ｈａｒｌｅｑｕｉｎ（Ｖａｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２３：４６７９−４６８９，  ２００４；Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：１９８７−１９９５，  ２００４）並びに次の疾患、すなわち拡張期心不全、貧血、難聴、心筋症、リー症候群、レット症候群、神経細胞変性及び網膜変性を伴う複合体Ｉ欠乏症、冠状動脈疾患並びに脳卒中の１つを示す他のもの（Ｍａｄｄｅｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００６  Ａｕｇ  ２２；［印刷前の電子刊行］；Ｔｒａｙｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＬＡＲ  Ｊ．，４４：８５−９５，  ２００３；Ｓｚｅｎｔｉｒｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ５５：２８３-２８６，  ２００４）がある。
【０１１３】
一態様において、ＡＯＸ  ｃＤＮＡは、遺伝子治療を介して、ミトコンドリア呼吸鎖のヒト疾患のための動物モデルへ（全身的に又は、カテーテル若しくは他の適切な医用装置を通じて臓器へ局所的にの何れかで）投与される。考えられる治療効果には、低下した代謝性アシドーシス、低下又は排除された酸化的ストレス、アポトーシスに対する低下した感受性又はアポトーシスの低下した速度がある。
【０１１４】
遺伝子導入動物を作製する方法
遺伝子導入動物は、多くの方法で作製することができる。遺伝子導入生物は、そのゲノム中へ組み込まれたＤＮＡの過剰の若しくは外来性の断片を有する生物であり、ＤＮＡの内因性断片を置換する場合がある。少なくとも本発明において、ゲノムがＡＯＸを本来含まず、ＡＯＸ遺伝子（又はＡＯＸ活性を有するＡＯＸバリアント）を導入するように修飾された全ての動物及び形質転換／形質移入されたその子孫は、遺伝子導入動物と考えられる。過剰の若しくは外来性のＤＮＡの安定した遺伝を達成するために、組み込み事象は、機能的生殖細胞を生じることが可能である細胞種において生じなければならない。遺伝子導入動物を作製するために使用される２つの動物細胞種は、受精卵細胞及び胚性幹細胞である。
【０１１５】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、インビトロでの培養物から、その中でＥＳ細胞が発育している動物中へ組み入れられ、生殖細胞を含む全ての組織中の遺伝子導入細胞を生じることが可能である「宿主」胚へと戻されることが可能である。ＥＳ細胞は、培養中に形質移入された後、細胞を胚中へ注入することによって変異を生殖系へと伝達する。次に、変異を受けた生殖細胞を有する動物が交配されて、遺伝子導入子孫をもたらす。マウス生殖系中に遺伝的を施すためのＥＳ細胞の使用は、十分認識されている。本技術の総説に関して、当業者は、Ｂｒｏｎｓｏｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４）：２７１５５−２７１５８，  １９９４；Ｔｏｒｒｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３６：９９−１１４，  １９９８及びそれらの文献に含有される参考文献に付託される。
【０１１６】
一般的に、胚盤胞は、発達中の一定の段階で妊娠中のマウスから単離され、例えば、マウス由来の胚盤胞は、発達第４日（第１日は、交配日として定義される。）に、未分化の多能性状態にあるＥＳ細胞を持続させる適切な緩衝液中へと単離され得る。ＥＳ細胞系は、当業者に周知の多くの方法によって単離され得る。例えば、胚盤胞は、培養皿へ付着させられ、約７日後に、増殖している内部細胞塊を取り出し、トリプシン処理され、同一培地中で別の培養皿へ転移され得る。ＥＳ細胞コロニーは、外植された各内部細胞塊から生じる５ないし７個の各コロニー間で、２ないし３週間後に現れる。次に、ＥＳ細胞系は、さらなる分析のために増殖させることが可能である。あるいは、ＥＳ細胞系は、内部細胞塊を外植する前に抗マウス抗体を使用して栄養外胚葉細胞が破壊される免疫手術技術（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４−７６３８，  １９８１に記載）を使用して単離されることが可能である。
【０１１７】
遺伝子導入動物を作出する上で、相同組換えによって操作されたＥＳ細胞系は、（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５２：１２１−１３１，  １９８８に記載のとおり）胚盤胞注入によって胚性環境中へ再度導入される。簡潔に述べると、胚盤胞は、妊娠中のマウスから単離され、増殖される。増殖された胚盤胞は、培養前に油滴培養物中で４℃で１０分間維持される。ＥＳ細胞は、個々のコロニーを取り出した後、リン酸緩衝塩類溶液、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ中で５分間温置されることによって調製され、単一細胞懸濁液は、１％（ｖ／ｖ）ヒヨコ血清を含有するトリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で、４℃でさらに５分間温置することによって調製される。（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ８］中で緩衝された１０％（ｖ/ｖ）ウシ胎仔血清及び３，０００単位／ｍＬのＤＮＡａｓｅ  １を有するダルベッコ変法イーグル培地中の）５ないし２０個のＥＳ細胞を各胚盤胞中へ注入する。次に、擬似妊娠レシピエント中へ胚盤胞を転移させ、正常に発達させる。コートマーカーによって遺伝子導入マウスを同定する（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。ＥＳ細胞を単離及び増殖するさらなる方法は、例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，１６６，０６５号、米国特許第５，４４９，６２０号、米国特許第５，４５３，３５７号、米国特許第５，６７０，３７２号、米国特許第５，７５３，５０６号、米国特許第５，９８５，６５９号において見出され得る。
【０１１８】
遺伝子導入動物を作出するための接合体注入方法を包含する別の方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，７３６，８６６号に記載されている。遺伝子導入動物を作出するためのさらなる方法は一般的に、Ｗａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｐｐｅ（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，８７３，１９１号）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２（１３）：４４３８−４４４２，  １９８５；その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる）及びＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．，Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４；その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる）によって記載されている。
【０１１９】
簡潔に述べると、本方法は、受精卵又は接合体中へＤＮＡを注入した後、擬似妊娠中の母親において前記卵を発達させることを包含する。接合体は、同系のオス及びメスの動物を使用して、及び異なる系のオス及びメスの動物から得られることが可能である。創始生物である生まれた遺伝子導入動物を交配して、同一のＤＮＡ挿入を有するより多くの動物を作出する。遺伝子導入動物を作出する方法において、新たなＤＮＡが典型的に、非相同性組換え事象によってゲノム中へ無作為に組み込む。ＤＮＡのコピーの１ないし何千もが、ゲノム中の一部位で組み込み得る。
【０１２０】
一般的に、ＤＮＡは、前核、通常はより大きなオスの前核の１つの中へ注入される。次に、接合体が同日に転移され、又は一晩培養して２細胞胚を形成した後、擬似妊娠中のメスの卵管中へ転移される。組み込まれた望ましいＤＮＡの存在に関して、生まれた動物をスクリーニングする。
【０１２１】
微量注入のためのＤＮＡクローンは、本分野で公知のいずれかの手段によって調製されることが可能である。微量注入のためのＤＮＡクローンは、細菌プラスミド配列を除去するために適切な酵素で切断され、ＤＮＡ断片は、標準的な技術を使用して、ＴＢＥ緩衝液中、１％アガロースゲル上で電気泳動されることが可能である。臭化エチジウムによる染色によって、ＤＮＡバンドを可視化し、発現配列を含有するバンドを切り出す。次に、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含有する透析バッグ中に、切り出されたバンドを配置する。ＤＮＡを、透析バッグ中へと電気溶出し、１：１のフェノール：クロロホルム溶液で抽出し、エタノール２容積によって沈殿させる。低塩緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍＬ中でＤＮＡを再度溶解し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラムで精製する。カラムをまず高塩緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）３ｍＬでまず刺激した後、低塩緩衝液５ｍＬで洗浄する。ＤＮＡ溶液をカラムに３回通過させ、ＤＮＡをカラムマトリクスへ結合させる。低塩緩衝液３ｍＬで１回洗浄した後、ＤＮＡを０．４ｍＬの高塩緩衝液で溶出し、エタノール２容積によって沈殿させる。紫外線分光光度計において２６０ｎｍでの吸収により、ＤＮＡ濃度を測定する。微量注入のため、５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でＤＮＡ濃度を３ｍｇ／ｍＬへ調整する。
【０１２２】
微量注入のためのＤＮＡの生成のためのさらなる方法は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３００：６１１，  １９８２）、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡによって刊行されるＴｈｅ  Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されている。
【０１２３】
典型的な微量注入手法において、過排卵するように、６週齢のメスのマウスを誘導する。過排卵しているメスをオスとともに配置し、交配させる。約２１時間後、交配したメスを屠殺し、摘出した卵管から胚を回収し、適切な緩衝液、例えば０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）含有のダルベッコリン酸緩衝塩類溶液中に配置する。取り囲んでいる卵丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）で除去する。次に、前核胚を洗浄し、５％ＣＯ２、９５％空気で加湿された大気を有する３７．５℃のインキュベータ中の０．５％ＢＳＡを含有するイーグル平衡化塩類溶液中に、注入時まで配置する。胚は、２細胞期で移植されることが可能である。
【０１２４】
無秩序に発情周期に入っている成メスマウスを、精管切除されたオスと対形成させる。Ｃ５７ＢＬ／６若しくはＳｗｉｓｓマウス又は他の同等の系は、本目的のために使用されることが可能である。レシピエントのメスを、ドナーのメスと同時に交配させる。胚転移のとき、体重１ｇあたり２．５％アベルチン（ａｖｅｒｔｉｎ）０．０１５ｍＬの腹腔内注射を使用して、レシピエントのメスを麻酔する。単一正中線背側切開によって、卵管を露出させる。次に、体壁を通じて、直接的に卵管にわたって切開部を作製する。次に、卵巣嚢を時計製造用ピンセットで摘出する。転移されるべき胚をＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝塩類溶液）中に配置し、転移ピペットの先に配置する（約１０ないし１２個の胚）。ピペットの先を卵管漏斗中へ挿入し、胚を転移させる。転移後、切開部を２回の縫合によって封鎖する。次に、妊娠中の動物は、遺伝子導入系を確立するために使用される創始動物を出産する。
【０１２５】
医薬製剤及び投与経路
本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドは、医薬として許容される適切な媒体、例えば、医薬として許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤又は担体を使用する何れかの適切な様式で投与され得る。医薬媒体、賦形剤、又は培地として機能する液体、半固体又は固体の希釈剤が好ましい。本分野で公知の全ての希釈剤が使用され得る。典型的な希釈剤には、水、塩類溶液、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、アルギン酸塩、デンプン、乳糖、ショ糖、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、ミネラルオイル、及びカカオバターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。このような製剤は、例えば投薬計画にある（ヒトを含む）哺乳動物対象へ、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを投与するために有用である。
【０１２６】
本発明の方法に従って投与されるべき組成物は、好ましくは、水、塩類溶液、リン酸緩衝塩類溶液、グルコース、又は静脈内注射で治療薬を送達するのに通常使用される他の担体等の、医薬として許容される担体を含む。多重遺伝子治療も考えられ、その場合、組成物は、場合によって、本発明のポリヌクレオチド／ベクター、及びミトコンドリア性疾患若しくはそれらの症状を治療するために選択される別のポリヌクレオチド／ベクターの両者を含む。
【０１２７】
本方法に従って実施される「投与」は、治療薬を哺乳動物対象の血管中へ直接的に又は間接的に導入するための医学的に許容される何れかの手段を使用して実施され得、それには、注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、又はカテーテル）、経口摂取、鼻内投与又は局所投与等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、静脈内注射、動脈内注射、又は冠動脈内注射等、血管内で実施される。治療組成物は、患者へ複数の部位で送達され得る。複数の投与は、同時に与えられ得、又は何時間にもわたって投与され得る。特定の場合、治療組成物の連続流を提供することは有益であり得る。さらなる治療法が、定期的に、例えば毎日、毎週又は毎月投与され得る。標的以外の組織における副作用を最小化するため、投与の好ましい方法は、筋肉内注射による投与等の局所投与の方法である。
【０１２８】
ウィルス送達を採用する遺伝子治療の実施形態において、単位用量は、投与されているウィルス粒子の用量に関して算出され得る。ウィルス用量には、ウィルス粒子又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）の具体的な数が含まれる。アデノウィルスを包含する実施形態に関して、具体的な単位用量には、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３又は１０１４ｐｆｕが含まれる。粒子用量は、感染の不完全な粒子が存在することにより、幾分高め（１０ないし１００倍）であり得る。
【０１２９】
ウィルスベクターを採用する実施形態において、好ましいポリヌクレオチドにはさらに、適切なプロモーター及び上述のようなポリアデニル化配列が含まれる。さらに、これらの実施形態において、ポリヌクレオチドにはさらに、本発明のポリペプチドをコードする配列へ作用可能に接続されたベクターポリヌクレオチド配列（例えば、アデノウィルスポリヌクレオチド配列）が含まれる。
【０１３０】
同様に、本発明には、本発明の方法を実施するために、本発明の化合物又は組成物の使用を容易にする様式で包装された本発明の化合物又は組成物を含むキットが含まれる。最も単純な実施形態において、このようなキットには、容器へ固定されたか又はパッケージ中に含まれる、本発明の方法を実施するための化合物又は組成物の使用を記載するラベルとともに、密封された瓶又は管等の容器中に詰められ、本発明の実施に有用な、本明細書に記載の化合物又は組成物（例えば、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド）が含まれる。好ましくは、前記化合物又は組成物は、単位剤形で包装される。別の実施形態において、本発明のキットには、本発明の方法を実施するのに有用な、ステント、カテーテル、血管外カラー、ポリマーフィルム、包帯、縫合糸又はそれらの類似物等の身体用デバイスとともに包装されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの両者の組成物が含まれる。別の実施形態において、本発明のキットには、ヒドロゲルポリマー、又は微粒子ポリマー、又は患者へ前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドを送達するのに有用な、本明細書に記載の他の担体とともに包装される、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの両者の組成物が含まれる。
【０１３１】
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して更に記載される。
【実施例１】
【０１３２】
ＡＯＸ発現ベクターの構築
ホヤ類チオナ・インテスティナリスから得られるＡＯＸ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を、ドキシサイクリン誘導性哺乳動物ベクターｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯベクター中へ、エピトープタグあり又はなしの何れかで直接連結した。
【０１３３】
エピトープタグ発現ベクターの構築のため、アニールされたオリゴヌクレオチド対
ＧＪ２４７（配列番号７）：
５’ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＡ３’プラス
ＧＪ２４８（配列番号８）：
５’ＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＧＣ３’（ｍｙｃ）及び
ＧＪ２４９（配列番号９）：
５’ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＧＡ３’（配列番号９）プラス
ＧＪ２５０（配列番号１０）：
５’ＴＣＧＡＴＣＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＧＣ３’（フラッグ）
を、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断したｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ連結した。チオナ・インテスティナリスＡＯＸ  ｃＤＮＡの重複する伸展を運搬するＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩクローン（ｃｉｅｇ０３２ｇ１４及びｃｉｃ１０２２ｃ０３、ｈｔｔｐ：／／ｇｈｏｓｔ．ｚｏｏｌ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘｒｌ．ｈｔｍｌ）を使用して、プライマー対：
ＧＪ２４１（配列番号１１）：
５’ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＣ３’プラス
ＧＪ２４２（配列番号１２）：
ｃｉｅｇ０３２ｇ１４上の５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＡＧＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣ３’、及び
ＧＪ２４３（配列番号１３）：
５’ＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＡＧＡＴＧＡＧ３’プラス
ＧＪ２４４（配列番号１４）：
５’ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＴＴＣ３’又は
ＧＪ２４５（配列番号１５）
ｃｉｃ１０２２ｃ０３上の５’ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＴＴＣ３’
を使用するＰＣＲによって、完全長ｃＤＮＡを集合させた。
【０１３４】
配列を確認した後、サブクローニングされたＮ末端及びＣ末端の断片を、ｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ中へ、又はＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ及びＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片のようにそれぞれ、修飾されエピトープタグを含有するベクター中へ連結した。
【実施例２】
【０１３５】
ヒト細胞培養の形質移入
２００μＭウリジン及び２ｍＭピルビン酸及び５％ＴＥＴ非含有ウシ胎仔血清（Ｏｚｙｍｅ）（Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２４８１８−２４８２８，  ２０００）プラス導入遺伝子選択のための適切な抗菌剤を補充された標準的なＤＭＥＭ培地中で、市販のヒト胚性腎臓由来の細胞であるＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養し、実施例１のｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＡＯＸ発現構築物を、又は製造元の説明書に従ってリポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して空ベクターを形質移入した。
【０１３６】
１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを培地へ添加することによって染色体上の正確な位置中に挿入されたＡＯＸ導入遺伝子（又は空ベクター）の単一コピーを含有する、抗菌剤による細胞生存処理（Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ発現系の完全な説明に関しては、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍを参照）を誘導して、ＡＯＸを発現させた。
【０１３７】
誘導２４時間後、ＡＯＸ発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングによって確認した（図１Ｂ）。ミトコンドリア移入後のｃＤＮＡ配列（４２ｋＤａ）によって推定される大きさで遊走する、チオナ・インテスティナリスＡＯＸ  ＡＯＸ−ｍｙｃ（配列番号６）及びＡＯＸ−フラッグ（配列番号４）のエピトープタグのついた両バージョンを検出した。機能に関してあらかじめ要求されるように、ＡＯＸタンパク質は、ミトコンドリアに対して標的化されなければならない。これは、フラッグをタグ付けされたＡＯＸによって生じるシグナルが、ミトコンドリアのマーカーであるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄのシグナルと重複する免疫細胞化学（Ｇａｒｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１４：１５８３−１５９６，  ２００３）によって確認された（図１ＣないしＥ）。同様の重複は、前記タンパク質のｍｙｃをタグ付けされたバージョンで観察された（非表示）。
【実施例３】
【０１３８】
ｐｃＤＮＡ／ＦＲＴ／ＴＯ−ＡＯＸを形質移入されたヒト細胞の生化学的分析
細胞可溶化液を調製し、ＡＯＸ発現に関して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のイムノブロッティングによって分析した。使用された一次抗体は、マウス抗Ｍｙｃモノクローナル９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及び抗フラッグＭ２抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であった。ペルオキシダーゼ抱合型ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用した（Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２４８１８−２４８２８，  ２０００）。
【０１３９】
０．３Ｍマンニトール、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンからなる培地２５０μＬ中で、３７℃で維持された磁石で撹拌された２５０μＬチャンバーへ取り付けられたＣｌａｒｋ酸素電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ，ＵＫ）を使用して、ジギトニンで透過処理された細胞による細胞呼吸及びコハク酸酸化を、４８時間のドキシサイクリン誘導後に測定した。ＫＣＮ、１００μＭシアン化カリウム；ＰＧ、１００μＭ没食子酸ｎ−プロピル；Ｐｙｒ、１０ｍＭピルビン酸塩；Ｓｕｃｃ、１０ｍＭコハク酸塩。ＳＯＤによる自己酸化速度の５０％の低下が１Ｕとして定義されるピロガロール自己酸化アッセイによって、全体のＳＯＤ活性（ＥＣ１．１５．１．１；Ｍｎ−及びＣｕＺｎ−依存性酵素）を測定した（Ｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７：５０−５３，  １９８４）。結果をＵ／タンパク質ｍｇとして表した。
【０１４０】
誘導４８時間後に、ＡＯＸ又は空ベクターのタグ付けされたか又はタグ付けされていないかの何れかのバージョンを有する細胞の３７℃での呼吸特性を比較した。形質移入されていない親細胞系と同様、空ベクターを有する細胞の呼吸は、１００μＭシアン化カリウムに対して完全に感受性があった（図２Ａ、トレースａ）。対照的に、ＡＯＸを発現するよう誘導された細胞の呼吸は、タグ付けされていようといまいと、シアン化物に対して２０％から４０％までの耐性を一貫して示した（図２Ａ、トレースｂ）。シアン化カリウムの３倍亢進した濃度は、さらなる阻害を何ら生じなかった（非表示）。
【０１４１】
次に、ジギトニンで透過処理された細胞によるミトコンドリア基質であるコハク酸の酸化を研究した。（全ての阻害性オキサロ酢酸の産生を回避するためのロテノンの存在下での）対照細胞によるコハク酸の酸化は、シアン化物に対して完全に感受性があった（図２Ａ、トレースｃ）。対照的に、ＡＯＸを発現するよう誘導された細胞によるコハク酸の酸化は、シアン化物に対して６０％まで有意に耐性があった（図２Ａ、トレースｄ）。このシアン化物耐性酸化は、植物ミトコンドリアにおけるＡＯＸの特異的阻害剤である（Ｓｉｅｄｏｗ  ａｎｄ  Ｂｉｃｋｅｔｔ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０７：３２−３９，  １９８１）１００μＭ没食子酸プロピルのその後の添加によって完全に阻害された。重要なことに、シアン化物の不在下での没食子酸プロピルの添加は、酸素の取り込みを５％阻害しただけであり（図２Ａ、トレースｆ）、ＡＯＸが、このような条件下で概して不活性であるが、シアン化物の存在によって活性化されることを示した。残留コハク酸の酸化は、１００μＭシアン化物によって完全に阻害された。驚くべきことに、ＡＯＸは、冷海水生物であるチオナ・インテスティナリスにおいて非常により低温でおそらく作用するが、ヒト細胞において発現されるタンパク質は、３７℃で容易に活性があり、安定していた。
【０１４２】
ＡＯＸは、ミトコンドリアにより産生されるＡＴＰを有意に減少させ得るため、構成的に活性のあるリン酸化していないＡＯＸが、細胞生存に有害ではないことを確認することが重要であった。細胞増殖（図２Ｂ）及び培地の酸性化（非表示）に及ぼすＡＯＸの長期発現の効果を検査した。（４回までの細胞継代、１８日間）ＡＯＸを発現する細胞及び対照細胞の増殖の間で、差異は観察できなかった。乳酸排出により誘発される培地の酸性化において何れの変化もなかったことは、ＡＯＸを発現している細胞（ＡＴＰ産生のための解糖に依存している細胞）において、解糖とミトコンドリア呼吸との相対的な使用における検出可能な移行がなかったことを示す。これは、正常条件下で、電子流が、リン酸化しているチトクロムセグメントを使用するのに対し、ＡＯＸが本質的に不活性であるという解釈と一致する。
【０１４３】
従って、ＡＯＸタンパク質の存在が、インビトロで測定されるコハク酸−チトクロムｃ還元酵素の活性の有意な変化、すなわち、電子が、機能的ＡＯＸによって酸素へ直接迅速に運搬される場合に予測されるであろう低下がないことも観察された（非表示）。さらに、植物において、ＡＯＸは、非常に還元されたキノンプールから生じるスーパーオキシド生成を防止することによって、抗酸化剤酵素として作用することも示されている（Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：８２７１−８２７６，  １９９９）。それゆえ、持続的に活性のあるＡＯＸは、スーパーオキシド性性を低下させるべきであり、誘導性スーパーオキシドジスムターゼ活性（ＳＯＤ）の低下したレベルを誘導すべきである（Ｇｅｒｏｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：１２２１−１２２８，  ２００１）。これを研究するため、誘導性及び非誘導性ＡＯＸ細胞の両者におけるＳＯＤ活性を比較すると、有意差は見出されなかった（図２Ｃ）。総合すると、エピトープをタグ付けされた（ｍｙｃ又はｆｌａｇ）及びタグ付けされていないＡＯＸバージョンの両者に関して複製されたこれらのデータは、ミトコンドリアキノンプールが非常に還元されない限り、すなわち、ＲＣのチトクロムセグメントが機能的なままである限り、酵素が不活性なままであることを支持する。
【０１４４】
ピルビン酸は、植物ミトコンドリアＡＯＸのアロステリックな作動体として公知であり、ミトコンドリアの疾病において非常に重要である（Ｓｔａｃｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９８：５２６−５３０，  １９７８）。この有機酸が、発現されたチオナ・インテスティナリスＡＯＸにも影響を及ぼすかどうかを決定するため、実験を実施した。それゆえ、ロテノンを添加して、ピルビン酸の不在下又は存在下で、状態４の条件下でのコハク酸酸化のシアン化物感受性を、透過処理されたＡＯＸ誘導性細胞において比較した（図２Ａ、トレースｄ、ｇ）。複合体Ｉに特異的なこの後者の阻害剤（ロテノン）を添加し、添加されたピルビン酸の持続された酸化に必要なＮＡＤＨの再酸化を遮断した。ピルビン酸の存在下で、シアン化物耐性のあるコハク酸酸化における有意な亢進（６０％から８０％まで）が留意された。これは、推定アミノ酸配列におけるおそらく決定的に重要なシステイン残基がないにもかかわらず、発現されたチオナ・インテスティナリスＡＯＸが、有機酸による植物酵素と同様のアロステリックな制御へ供されたことを示唆する（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ａｎｄ  Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，５６：３３３−３４１，  ２００４）。
【０１４５】
最後に、（上述の）シアン化物の存在下で一晩培養した後、ＡＯＸを発現していない細胞は、約１．０のｐＨ単位ほど培地酸性化を示したのに対し、ＡＯＸを発現している細胞は、０．２ないし０．３のｐＨ単位のみの培地酸性化を付与した。これは、ミトコンドリア呼吸鎖のチトクロムセグメントが遮断される条件下で、ＡＯＸ発現が、ピルビン酸の乳酸への亢進した還元から生じる代謝性アシドーシスを緩和し、そのことが、チトクロム鎖が機能していないとき、ＮＡＤＨを再酸化する細胞の唯一の利用可能な手段であることを示す。
【実施例４】
【０１４６】
後生動物個体におけるＡＯＸの発現
次に、ＡＯＸが、後生動物の個体、すなわちショウジョウバエにおいて、副作用なしで遍在性に発現することが可能であるかどうかを検査した。
【０１４７】
導入遺伝子が絶縁体要素によって隣接され、酵母転写活性因子Ｇａｌ４ｐによるトランス活性化に依存する最小のプロモーターの調節下に配置される、挿入部位遺伝子中への又は挿入部位遺伝子中からの読み過ごし転写を防止する、（ベクターのペリカンシリーズ（Ｂａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９：７２６−７３２，  ２０００）をベースにして）注文に応じて作られたショウジョウバエＰ要素ベクター中で、チオナ・インテスティナリス由来のＡＯＸ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を再度クローニングした（図３）。並行して作製された遺伝子導入系における発現を確認するため、本発明者は、ＡＯＸがＣ末端でＭｙｃエピトープによりタグ付けされたこの構築物の一バージョンも作製した（配列番号５）。
【０１４８】
ＡＯＸに関する８個の遺伝子導入創始者系並びに、ＡＯＸ−ｍｙｃに関するこのような系の数十個を、ベクターによって運搬される白色＋（赤色）眼色マーカーに関して、標準的な方法を使用して、微量注入及び選択によって確立した（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０１４９】
標準的な逆方向ＰＣＲを使用して、ＡＯＸ導入遺伝子のゲノム挿入部位を同定し、系の１つ（ＡＯＸ系Ｆ６−１）に関して結果を図５に示した。この系は、ホモ接合体として生存可能であり繁殖性であり、第二染色体において単一のＡＯＸ導入遺伝子挿入を有した。系Ｆ６−１をその後の研究に使用し、１つ以上の他のＡＯＸ遺伝子導入系と並行した各場合において、観察された表現型がＡＯＸに起因し、単一の遺伝子導入系における挿入効果又は他の変異原性効果に起因しないことを確認した。
【０１５０】
娘を持たない遺伝子の遍在性に作用するプロモーターの調節下で、遺伝子導入創始者を、ＧＡＬ４を運搬するＧａｌ４駆動因子ハエと交配した。ＡＯＸ又はＡＯＸ  ｍｙｃを発現するハエは、発達し、予測された数で囲い込み、健常に見えた。図６Ａは、ＡＯＸを遍在性に発現させるために娘を持たないＧＡＬ４駆動因子を使用してセットアップされる交配を示す。図６Ｂは、発現するハエを表現型でどのように同定するか、及び前記ハエが、生存可能で表現型として正常であることを示す。
【０１５１】
図７は、ＲＮＡレベルでＡＯＸ導入遺伝子の発現がどのように、すなわち生体内原位置でのハイブリダイゼーションを使用して確認されるかを示す。
【０１５２】
図８は、ＡＯＸ−ｍｙｃ発現がｄａ−ＧＡＬ４駆動因子によって誘導されるハエ個体における、抗ｍｙｃ抗体に対するウェスタンブロッティングを使用するＡＯＸ−ｍｙｃの発現の確認を示す。
【０１５３】
両方の性別のＡＯＸを発現するハエは、形態学的に正常であるように見え、繁殖性があり、遺伝子導入していないハエと交配されると、子孫の正常な数を産じた。ＡＯＸを発現するハエは、対照ハエと比較して、非常にわずかな発達の遅延を示した（表２）。
【０１５４】
表２：発達時間
ＡＯＸを発現する（ＡＯＸ＋）オスは、発現しない（ＡＯＸ−）対照オスよりも、２５℃で半日遅く孵化し、メスの孵化時間において顕著な差異はほとんどなかったが、反復した実験の多い数のため、有意差はなおもある（スチューデントのｔ検定によるｐ＞０．００１）。
【０１５５】
【表２】
2009513153.tif 000004
【０１５６】
生涯期間に関する予備測定結果において、ＡＯＸ遺伝子導入ハエは、最も長命の野生型の系（最長生涯期間〜１０５日）と同じくらい長命であるように見えた。実際の交配において、ＡＯＸ発現ハエ及びＡＯＸ遺伝子導入「非発現ハエ」のオスは両者とも、対照の野生型のオスよりも有意に長命であった。しかしながら、「非発現ハエ」のオスは、発現ハエのオスよりも一貫して長命であり、ＡＯＸ発現の低レベルが、長期の健常な生涯期間を促進するのに有益でありうることを示唆した。異なるＡＯＸ遺伝子導入系は、異なる程度まで、オスの生涯期間の延長を示した。導入遺伝子挿入部位はそれゆえ、結果に影響を及ぼし得る。又、ＡＯＸ遺伝子導入した処女メスは、本アッセイにおいて最小の生涯期間の延長を示した。
【０１５７】
図９は、成体としての生涯期間の第１週の間、対照ハエよりも、より迅速でより顕著な体重減少をＡＯＸ発現ハエが経験したことを示す。これは、ミトコンドリアのエネルギー産生の効率が、一定の食餌摂取量に関してわずかに低下することをさらに示す。この観察が、哺乳動物においても当てはまることが示される場合、ＡＯＸがなければ難治性である肥満の治療におけるＡＯＸの有用性を示す。非常に有害な副作用を有する脱共役剤による従来の疑われる治療とは異なり、ＡＯＸは、ＯＸＰＨＯＳ系の完全に天然で自己制御する迂回路を呈する。さらに、制限された食餌摂取量は、多くの他の実験生物（Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌ．，７：１６９−１７１，  ２００６）と同様に、ハエにおける生涯期間を長期化することが公知である（Ｂｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，４：３０９−３１７，  ２００５；Ｐｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４０：８５７−８６２，  ２００５）ため、ミトコンドリアでの異化作用の効率のわずかな変調は、加齢及び生涯期間に及ぼすＡＯＸ発現の有益な効果の根底にあり得る。
【０１５８】
総じて、これらの研究は、ＡＯＸが、後生動物の個体で発達を損なわず、有害な生理学的効果ではなく、わずかに有益な効果を有しながら、発現することが可能であるという原理の証明を提供する。
【実施例５】
【０１５９】
ＡＯＸを発現するハエ由来のミトコンドリアにおけるＡＯＸ活性
本実験において、ショウジョウバエにおいて発現するチオナ・インテスティナリスＡＯＸは酵素活性があり、ヒト細胞におけるのと同様の特性を呈することが確認された。図１０は、ＡＯＸを発現するハエが、シアン化カリウムに対する顕著な耐性を示し、数分以内で野生型のハエを死滅させる濃度の毒素を含有する培地上で、数時間まで生存可能なままであったことを示す。図１１及び１２は、ハエ全体由来のミトコンドリア懸濁液を使用した、代表的な酸素電極トレースの１セットを示す。
【０１６０】
ＡＯＸを発現するハエ及び発現していないハエ由来のミトコンドリア調製物を、多様な基質の存在下における呼吸鎖阻害剤に対する感受性に関して比較した。ＡＯＸを発現していないハエ由来のミトコンドリアによるピルビン酸＋リンゴ酸の酸化は、シアン化カリウムに対して感受性があったのに対し、ＡＯＸを発現しているハエ由来のものは、シアン化物に対して主として耐性があった（＞７０％）（図１２）。残留しているシアン化物非感受性の呼吸鎖活性は、没食子酸ｎ−プロピル又はサリチルヒドロキサム酸等のＡＯＸの阻害剤（ＳＨＡＭ，Ｓｃｈｏｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７：１２４−１２８，  １９７１）に対して感受性があったのに対し、これらの阻害剤は、シアン化物が不在のとき、わずかな効果のみを有した。ヒト細胞内と同様、ピルビン酸の存在は、ＡＯＸを発現している細胞由来のミトコンドリアの生体エネルギーわずかに修飾し、呼吸調節比（ＲＣＲ、ＡＴＰ産生の際の呼吸の依存状態に関する測定結果）を約２０％低下させ、従って、ピルビン酸等の有機酸が主要基質であるとき、リン酸化する条件下で呼吸性電子流に対し、ＡＯＸがわずかな程度関与することを示した。ＲＣＲは、加齢の間に進行性の低下を示す（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３９０：５０１−５１１，  ２００５）が、検査される全ての齢で、ＡＯＸを発現しているハエは、同齢の対照又はＡＯＸを発現していないハエよりも低いＲＣＲを呈した。ＡＯＸを発現しているハエにおいて、酵素（ＡＯＸ）は、ミトコンドリア懸濁液の呼吸のシアン化物耐性に基づいて、１ヶ月齢及び２ヶ月齢でなおも活性があった。
【実施例６】
【０１６１】
ＡＯＸは、呼吸鎖毒からハエを保護する
ＡＯＸを発現しているハエは、シアン化カリウムの毒性効果に対し、顕著な耐性を示し、数分以内で野生型のハエを死滅させる濃度の毒素を含有する培地上で、数時間まで生存可能なままであることを示した（図１３）。１ｍＭ  ＫＣＮでさえ、ＡＯＸを発現しているハエは、３０分以内で完全に麻痺し、処置を生き残り、１６時間後に再度活動的であった。ＡＯＸを発現しているハエは、ハエの餌へ添加すると野生型のハエに対して毒性のある複合体ＩＩＩ阻害剤であるアンチマイシンに対しても耐性があった（図１４）。１０μｇ／ｍＬの用量で、野生型の胚は、孵化して幼生を形成したが、蛹の段階に一度も到達できなかったのに対し、ＡＯＸを発現している幼生は、正常に成ハエへと発達した。３０μｇ／ｍＬで、アンチマイシンは、野生型のハエの幼生段階への発達さえ完全に遮断したが、ＡＯＸを発現しているハエは、発達を完了でき、生存可能な繁殖性の成体を形成したが、発達の完了は、数日間ほど遅延した。ＡＯＸ発現は、複合体Ｖ（ＡＴＰ合成酵素）の阻害剤であるオリゴマイシンの中程度の用量に対する保護も生じた。
【０１６２】
これらの知見は、遺伝されていようと加齢中に体細胞性に発生しようと、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ系に影響する変異から生じる生体エネルギー的欠損を補正するための遺伝子治療ツールとしてのＡＯＸの潜在的な有用性を確認する。ミトコンドリア呼吸鎖が、チトクロムセグメント又はＡＴＰ合成酵素内で部分的に遮断される条件下で、ＡＯＸによって電子流が再開できる。しかしながら、ＡＯＸにより支持される電子流は、非水素イオンポンピングであり、それゆえ、ＡＴＰ生成に直接関与しない。その一方で、チトクロム鎖が、複合体ＩＩＩ又はＩＶにおいて遮断される場合、複合体Ｉを流れる電子及び水素イオンの流れは、ＡＯＸによって再開することが可能であり、そのことは、ＡＴＰ生成を少なくとも部分的に回復させるべきである。本発明者の知見からの予測は、例えば、構造的なサブユニットにおけるミスセンス変異又は、チトクロム鎖に残留する幾らかの活性を残し、従って臨界閾値を下回ってＡＴＰ生成を低下させない集合因子及びシャペロン（例えば、Ｓｕｒｆ１）の損失から結果的に生じる、複合体ＩＩＩにおいて又は複合体ＩＩＩを越えて呼吸鎖を部分的に遮断する条件下で、ＡＯＸは有用性を有するべきであるということである。これらの状況下で、逆向きの電子流を遮断し、ＮＡＤＨの再酸化を支持し、従って有害なＲＯＳ生成、代謝性アシドーシス及びアポトーシス促進性シグナルの発生を最小化する上でのＡＯＸの保護的効果は、呼吸鎖の生理学的機能障害の結果を軽減するのを補助すべきである。
【０１６３】
これは、より穏やかな効果を有する他のもの、例えばｏｘｅｎ（Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５６：１７２７−１７３６，  ２０００）又はＳｕｒｆ１のノックダウン（Ｚｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７２：２２９−２４１，  ２００６）の何れかによってチトクロム鎖を完全に遮断する変異（ｃｙｃｌｏｐｅ等）とＡＯＸ発現を組み合わせることによって、ショウジョウバエにおいて直接及び簡便に検査されることが可能である。
【実施例７】
【０１６４】
レンチウィルス−ＡＯＸ発現構築物の構築
レンチウィルスベクターｐＷＩ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ；Ｋｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１２：８９２−８９９，  ２００５）のＰｍｅＩ部位中での平滑末端クローニングを介してＳｍａＩ断片として、上述の実施例１に記載のベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へクローニングされたチオナ・インテスティナリスＡＯＸ  ｃＤＮＡを２段階で再度クローニングし、構築物ｐＷＰＩ−ＡＯＸを作製した（図１５）。ｐＷＰＩは、安定した単一コピーの挿入を確立するための機会を生じるだけでなく、導入遺伝子の発現を持続した。ｐＷＰＩは又、導入遺伝子が、内部リボソーム移入部位（ＩＲＥＳ）の先行する同一ｍＲＮＡにおいてシス位で不活性なリポーター（ＧＦＰ）のコード配列の挿入された上流であるという事実により、うまく形質導入された細胞の簡単で非侵襲的な検出も可能にする。
【０１６５】
不活性で取り囲んでいるベクターの配列は、両者の鎖に関して認証され、チオナ・インテスティナリスＡＯＸ（Ｄｅｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９８：２１５７−２１６７，  ２００２；ＭｃＤｏｎａｌｄ  ａｎｄ  Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，５６：３３３−３４１，  ２００４；Ｈａｋｋａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，７：３４１−３４５，  ２００６）及びｐＷＩ（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）に関して既に報告されている配列に相当したが、例外は、供給されるようなベクターＤＮＡの単離物中でも発見された導入遺伝子構築物：
５’ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＣ３’（配列番号１７）の替わりの
５’ＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＣＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＣ３’（配列番号１６）
の核局在化を亢進させるベクターのｃＰＰＴ領域内での１つの置換であった。
【実施例８】
【０１６６】
ウィルスのパッケージング、細胞培養及びヒト細胞培養物の形質導入
ウィルス生成は、標準的な手法（Ｂｏｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：１７２７−１７３３，  ２００３；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：８７１−８７５，  １９９７）、及び既に記載されているように（Ｐｅｌｌｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２５：１７５３−１７６２，  ２００４）、内蔵の安全特性を組み込む第二世代パッケージングシステム（ｗｗｗ．ｌｅｎｔｉｗｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｈｐ）を使用した。２００μＭウリジン、２ｍＭピルビン酸及び５％ＴＥＴ非含有ウシ胎仔血清（Ｏｚｙｍｅ）で補充された標準的なＤＭＥＭ培地中で、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養した。形質導入は、標準的な方法を使用した（Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ｌｅｎｔｉｗｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＬＶｔｉｔｒａｔｉｏｎ．ｐｈｐ参照）。１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで細胞を処理することによって、形質移入されたＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞中でＡＯＸ発現を誘導した（Ｈａｋｋａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，７：３４１−３４５，  ２００６）。
【０１６７】
インビトロでのｐＷＰＩ−ＡＯＸのウィルスパッケージングは、５．３×１０７ＴＵ／ｍＬにまで上るウィルス力価を生じた。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞中への形質導入を、低い感染効率（ＭＯＩ１）で実施した。この細胞系の使用によって、先行の誘導性発現系との直接的な比較が可能となった。２４時間後、細胞の約２５％が、ＧＦＰに関して陽性であり、選択の何れの種類もなしで３週間細胞を増殖した後の場合でさえＧＦＰに関して陽性であった。
【実施例９】
【０１６８】
レンチウィルス−ＡＯＸベクター構築物によって形質移入されたヒト細胞の、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）及び顕微鏡による分析
ＧＦＰを発現している実施例８由来のＦＩｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞を、製造元の説明書に従って、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）により分取した。クリプトンランプ（励起フィルター４９２／１８ｎｍ）及び白色光（ハロゲンランプ）による同時照射を使用するＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１  Ｌｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇステーションを使用して、ＧＦＰ発現に関して細胞を分析した。Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲ（高解像デジタルＢ／Ｗ  ＣＣＤ）カメラを取り付けられた４０倍のＬＵＭＰｌａｎＦｌ水浸対物レンズ（開口数０．８）によって、励起蛍光及び送信された光を同時に検出し、ＧＦＰを発現している細胞（明るい）と発現していない細胞（あまり明るくない）とを識別した。
【０１６９】
形質導入された細胞の表現型をより詳細に評価するため、ＧＦＰリポーターに基づいた蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を採用して、形質導入された細胞集団を選択した。ＧＦＰを発現している細胞は、濃縮された細胞集団の８０ないし９０％であった（図１６）。ＡＯＸ特異的プローブに対するノザンハイブリダイゼーションによって、ＡＯＸ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡの存在を確認した（図１７）。もとの発現構築物ｐｃＤＮＡ５−ＡＯＸからＡＯＸを発現するように誘導されたＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞と比較すると、転写産物はより長く（１．８ｋｂとは反対の４．１ｋｂ、ＩＲＥＳ、ＧＦＰ及びさらなる３’非翻訳配列のさらなる存在を反映）、約２オーダー分という非常により低い存在量で存在し、生理学的により関連性のあるプロモーター（最初期のＣＭＶとは反対のＥＦ１α）からの発現に加え、レンチウィルス形質導入が、プラスミド由来の配列の組み込まれたタンデム配列よりもむしろ単一のゲノム挿入を生じるという事実を反映していた。ＧＦＰ発現に基づいて分取された形質導入された細胞の複数のバッチは、ｍＲＮＡレベルでの同様の発現を付与した。空ベクターを形質移入されたＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞は、シグナルを付与しなかった。
【実施例１０】
【０１７０】
レンチウィルス−ＡＯＸベクター構築物で形質移入されたヒト細胞における酸素消費
Ｃｌａｒｋ酸素電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ，ＵＫ）並びに阻害剤としての終濃度１００μＭのシアン化カリウム（ＫＣＮ）及び終濃度１０μＭの没食子酸ｎ−プロピル（ＰＧ）を使用して、ジギトニンで透過処理された細胞における呼吸を既に記載のとおり測定した（Ｈａｋｋａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，７：３４１−３４５，  ２００６）。
【０１７１】
次に、元の発現構築物ｐｃＤＮＡ５−ＡＯＸからＡＯＸを発現するよう誘導されたＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ−２９３細胞、及びネガティブ対照として空ベクターを形質移入された細胞と比較して、分取された形質導入済みの細胞のミトコンドリアの生化学的特性を分析した（図１８）。空ベクターを形質移入された細胞の呼吸は、１００μＭのシアン化カリウムによって完全に阻害されたのに対し、ｐｃＤＮＡ５−ＡＯＸを形質移入された細胞から誘導されたＡＯＸ発現は、シアン化物に対して呼吸が〜７０％非感受性であり、先行研究（Ｈａｋｋａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，７：３４１−３４５，  ２００６）と同様であった。しかしながら、シアン化物の存在下で、呼吸は、１０μＭの没食子酸ｎ−プロピルによってほぼ完全に阻害された。ｐＷＰＩ−ＡＯＸを形質導入された細胞は、同様に挙動した。呼吸活性のわずかに低い割合（〜６０％）は、シアン化物に対して非感受性であり、分取後のＧＦＰを発現している細胞の割合を反映していた。しかしながら、この残留呼吸は、期待されたように、１０μＭの没食子酸ｎ−プロピルをさらに添加することによって、完全に阻害された。
【実施例１１】
【０１７２】
チオナ・インテスティナリスＡＯＸを発現する遺伝子導入マウスの系の構築
産物がミトコンドリアへ標的化され、ＯＸＰＨＯＳ系に関与するが、穏やかな表現型効果のみを有しながらヘテロ接合性に欠失されることが可能である遺伝子のコード配列を置換するノックイン戦略を介して、ＡＯＸをコードする配列をマウスの生殖系列へと導入する。これによって、ＡＯＸ導入遺伝子が「典型的なミトコンドリアパターン」で発現され、無秩序な遺伝子導入的挿入と関連した問題の多くを確実に克服できるようになる。Ｔｆａｍヘテロ接合性マウスは、心臓における減少したミトコンドリアＤＮＡコピー数及び穏やかな生化学的欠損を示すに過ぎず、明白な病理学的徴候を示さないので、マウスＴｆａｍ（ミトコンドリア転写因子Ａ）遺伝子は、適切なこのような置換の標的である（Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：２３１−２３６，  １９９８）。ｐＤＥＬＢＯＹシリーズ又はそのバリアント等の典型的な遺伝子標的化ベクターが使用される。具体的な組織及び発達段階におけるＡＯＸの発現を研究すること、及びＡＯＸの発現が生物個体で許容されることが可能であるかどうかを厳密に検査することが望ましいので、ｌｏｘＰ組換え部位によって隣接される（及び選択可能なマーカーを含む）ＳＴＯＰカセット（Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６２３２−６２３６，  １９９２）が導入される。これは、ＡＯＸ導入遺伝子を含有する系が、望ましい組織特異的パターンでＣｒｅリコンビナーゼを発現する系と交配されるときを除き、ＡＯＸの発現を防止する。Ｃｒｅリコンビナーゼを遍在性に発現する系との交配は、全ての組織においてＡＯＸ導入遺伝子を活性化するので、全ての組織におけるＡＯＸ発現が生物個体で支持される正規の検査である。制限された組織においてのみ、例えば黒質においてのみＣｒｅリコンビナーゼを発現する系との交配は、ＡＯＸ発現が、前記組織において何らかの有害な効果を生じるかどうかのみならず、前記組織に制限されたＡＯＸ発現が、付与された疾病モデルにおいて、前記組織で明らかにする病理学的表現型を代償するかどうかも検査する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、ＡＯＸが、ヒト細胞中で発現可能であり、ミトコンドリアへと標的化されることを示す。Ｇａｒｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇａｒｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１４：１５８３−１５９６，  ２００３）によって記載のとおり、免疫細胞化学を実施した。図１Ａは、ミトコンドリア呼吸及び、ＡＯＸによって付与されるチトクロムセグメントの迂回路の簡素化された生化学的仕組みである。ＲＣの５つの複合体が、ローマ数字によって示される。図１Ｂは、ＡＯＸ−フラッグ若しくはＡＯＸ−ｍｙｃ構築物又は空ベクターのいずれかで形質移入され、示される一次抗体で探索されたＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞クローン由来の２０μｇの細胞可溶化液全体のイムノブロットである。（＋）で示されるレーンは、導入遺伝子発現を誘導するための１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで処理された細胞由来の可溶化液であった。使用された一次抗体は、マウス抗Ｍｙｃモノクローナル９Ｅ１０及び抗フラッグＭ２抗体であった。図１Ｃは、フラッグ一次抗体を使用する免疫細胞化学によるＡＯＸ−フラッグ構築物で形質移入された細胞の蛍光顕微鏡図のパネルである。図１Ｄは、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）レッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）での染色を適用する、ＡＯＸ−フラッグ構築物で形質移入された細胞の蛍光顕微鏡図である。図１Ｅは、図１Ｃ及び図１Ｄに示されるパネルからの画像が重ね合わせられた、ＡＯＸ−フラッグ構築物で形質移入された細胞の蛍光顕微鏡図のパネルである。
【図２】図２は、ＡＯＸ発現が、ヒト細胞においてミトコンドリアの生化学的反応を修飾することを示す。図２Ａは、本文中に記載の多様な有機酸及び阻害剤の添加の際の、細胞全体（トレースａ、ｂ）に関する及びジギトニン透過処理（Ｃｔｒｌ−ｄ、ＡＯＸ−ｄ）細胞（トレースｃないしｇ）に関する４８時間のドキシサイクリン誘導後の酸素電極トレースを示し、その中で、Ｃｔｒｌは、空ベクターで形質移入された細胞を意味し、ＡＯＸは、タグ付けされていないＡＯＸ構築物で形質移入された細胞を意味する。Ｃｌａｒｋ酸素電極を使用して、細胞呼吸及びコハク酸塩の酸化を測定した。ＫＣＮ、１００μＭシアン化カリウム；ＰＧ、１０μＭ没食子酸ｎ−プロピル；Ｐｙｒ、１０ｍＭピルビン酸塩；Ｓｕｃｃ、１０ｍＭコハク酸塩。図２Ｂは、細胞増殖曲線を示し、その中で、ＡＯＸは、タグ付けされていないＡＯＸ構築物で形質移入された細胞を意味し、Ｃｔｒｌ．は、ウリジン及びピルビン酸塩で補充された標準的なＤＭＥＭ培地及びドキシサイクリン中で増殖された、空ベクターで形質移入された細胞を意味する（Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２４８１８−２４８２８，  ２０００）。図２Ｃは、ドキシサイクリン誘導のある（＋）又はない（−）の何れかとともに増殖された、空ベクターを形質移入された細胞及びタグ付けされていないＡＯＸを形質移入された細胞のＳＯＤ活性を示す。
【図３】図３は、特注されたショウジョウバエ遺伝子導入発現ベクター中へのＡＯＸ及びＡＯＸ−ｍｙｃのクローニングを示す。ｐ｛ＵＡＳ｝ＡＯＸ  Ｈ−ペリカン（左）は、ベクターのペリカンシリーズの修飾されたバージョン（Ｂａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９：７２６−７３２，  ２０００）であり、その中で、ｐＧｒｅｅｎ  ＨペリカンのｅＧＦＰコード配列は、チオナ・インテスティナリスＡＯＸのものによって置換され、Ｇａｌ４ｐ反応性５×ＵＡＳ配列は、最小プロモーター要素（Ｈｓｐ７０  ＴＡＴＡボックス）の上流のベクターのもとのマルチクローニング部位中に挿入される。遺伝子導入ベクターの他の要素は、次のように示される。Ｐ要素５’及び３’−Ｐ−要素トランスポサーゼをコードする同時注入されたプラスミドの存在下でショウジョウバエの胚においてＰ要素トランスポゾンの動員を可能にするＰ要素トランスポゾンの末端配列；ｗ−レシピエント白色−胚中での集積後に赤い眼の色を与える白色＋マーカー遺伝子；インスレーター−染色体集積部位にあるＡＯＸ導入遺伝子へ又はＡＯＸ導入遺伝子からの転写を遮断するｇｙｐｓｙトランスポゾン由来のインスレーター要素；ｐＵＣ８プラスミドＤＮＡ及び白色リンカー配列  −  イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での増殖に必要なプラスミドの要素又は得られた遺伝子導入系において集積されない白色＋マーカー遺伝子の一部。遺伝子導入的に挿入されるＤＮＡは、より明確に示される（右）。インスレーター要素（Ｉ）は、明灰色で示され、Ｇａｌ４ｐ反応性プロモーター要素（ＰＵＡＳ）の後に暗灰色のＡＯＸコード遺伝子があり、Ｐ要素末端は黒色で、染色体集積部位のＤＮＡは太線で示される。
【図４Ａ】図４は、個々のハエから独立した遺伝子導入系を生じる遺伝子導入ハエの微量注入及び選択を示す。図４Ａは、遺伝子導入ハエの微量注入及び第一選択を示す。遺伝子導入ベクターｐ｛ＵＡＳ｝ＡＯＸ  Ｈ−ペリカン（図３参照）及びＰ要素トランスポサーゼをコードするプラスミドを白色−レシピエントのショウジョウバエ胚（卵）中へ同時注入すると、子孫の体細胞及び生殖細胞の両者において遺伝子導入カセットの無作為な集積が生じる。子孫は主としてキメラであるため、眼の色は、遺伝子型の信頼できる指標ではない。全ての生存ハエは、白色−ハエへと交配され、次世代において（水平線で記される）黄色又は（格子で記される）淡オレンジ色の眼を示す遺伝子導入子孫を選択する。
【図４Ｂ】図４は、個々のハエから独立した遺伝子導入系を生じる遺伝子導入ハエの微量注入及び選択を示す。図４Ｂは、遺伝子導入ショウジョウバエの系の作出を示す。黄色又は淡オレンジ色の眼を示す、図４Ａに記載のとおり選択された遺伝子導入子孫を順に、白色−ハエと交配し、単一の常染色体性挿入（すなわち、性別に無関係に５０／５０を分離する）、又は望まれる場合、Ｘ染色体挿入を含有する系を確立する。ホモ接合体としての前記系の生存率に関して前記系を検査した後、さらなる研究のためにヘミ接合体として維持する。異なる常染色体性部位での単一挿入を含有するＡＯＸ遺伝子導入ハエの８つのこのような系を本研究において確立した。淡オレンジ色の眼を格子で標識し、赤色の眼を黒色で標識する。
【図５】図５は、その後の研究に使用された、確立された系（ＡＯＸのＦ６−１系）の１つにおける導入遺伝子のゲノム挿入部位を示す。本図は、（図３にあるように示される）ＡＯＸ遺伝子導入カセットが、（ｗｗｗ．ｆｌｙｂａｓｅ．ｎｅｔでゲノムブラウザから出力される）遺伝子導入系であるＦ６−１中に挿入したキイロショウジョウバエ染色体２Ｒの一領域の模式的なマップを示す。８つのＡＯＸ遺伝子導入系は全て、異なる挿入部位を示したが、ＡＯＸ導入遺伝子発現レベル及びヘミ接合体の表現型は、各実験において検査された系全てに関して同一であった。
【図６Ａ】図６は、ヘミ接合体のＡＯＸハエとＴｍ３Ｓｂバランス装置染色体を有するヘミ接合体のｄａ−ＧＡＬ４駆動因子ハエとの間の交雑を示す。この設定において、娘のないＧＡＬ４駆動因子を使用して、適切な遺伝的体質の子孫においてＡＯＸ又は（ＡＯＸ−ｍｙｃ）導入遺伝子を一様に発現させた。図６Ａは、白色＋の眼の色に基づいて、ＡＯＸ発現ハエを発生及び選択するための模式図である。遺伝子導入カセット中の白色＋マーカーの単一コピーの結果として淡オレンジ色の眼を有する白色−背景にあるヘミ接合性ＡＯＸ遺伝子導入ハエを、ｄａ−ＧＡＬ４導入遺伝子カセット中で伝達されもする白色＋マーカーの非常に低い発現の結果として均一なより淡い黄色の眼を有する、娘のない（ｄａ）−ＧＡＬ４導入遺伝子のための平衡の取れたヘミ接合体と交配する。後者のバランス装置染色体は、（刈り株状に）短い剛毛を与える個別の（優性）マーカーＳｂを伝達する。交雑による子孫は、存在する場合、遺伝した導入遺伝子がどれかに依存して異なる眼の色を有する。これらは個別の常染色体上にあるため、独立して分離する。Ｓｂマーカーは、ＡＯＸを発現するもの（赤色の眼）を、ＡＯＸを発現しない遺伝子導入ハエ（淡オレンジ色の眼）と識別するためにさらなるチェックを提供する。黄色の眼は、水平線で標識され、淡オレンジ色の眼は、格子で標識され、赤色の眼は黒色で標識される。
【図６Ｂ】図６は、ヘミ接合体のＡＯＸハエとＴｍ３Ｓｂバランス装置染色体を有するヘミ接合体のｄａ−ＧＡＬ４駆動因子ハエとの間の交雑を示す。この設定において、娘のないＧＡＬ４駆動因子を使用して、適切な遺伝的体質の子孫においてＡＯＸ又は（ＡＯＸ−ｍｙｃ）導入遺伝子を一様に発現させた。図６Ｂは、ＡＯＸを発現するハエの眼の色及び剛毛の形態によって、前記ハエが表現型的にどのように同定されたかを示す。写真は、同様の数で脱蛹した実際の子孫の４つのクラスの各々の例である。白色の眼のハエは、白色＋を含有しない導入遺伝子を伝達する。黄色の眼（及び正常な剛毛）を有するものは、ｄａ−ＧＡＬ４導入遺伝子のみを遺伝した。淡オレンジ色の眼（及び短い剛毛）を有するものは、ＡＯＸ導入遺伝子のみを遺伝した。赤色の眼を有するものは、白色＋マーカー遺伝子の２つのコピー、すなわち両者の導入遺伝子を遺伝した。遍在性のｄａプロモーターからのＧＡＬ４の発現は、ＡＯＸ導入遺伝子の遍在的及び高レベルの転写を支持し、そのことは、ＡＯＸ特異的プライマーを使用する半定量的蛍光ＲＴ−ＰＣＲによって赤色の眼の子孫において確認された。黄色の眼は、水平線で標識され、淡オレンジ色の眼は、格子で標識され、赤色の眼は黒色で標識される。
【図７】図７は、胚におけるＡＯＸｍＲＮＡ発現の生体内原位置でのハイブリダイゼーションによる確認を示す。ｄａプロモーターからのＧａｌ４ｐの発現（ＡＯＸ／ｄａ−Ｇａｌ４胚）は、ＡＯＸ導入遺伝子の遍在性の高レベルの転写を支持するのに対し、遺伝子導入「非発現因子」（ＡＯＸ／−）胚は、発現を示さない。発現は、ネガティブ対照としてのアンチセンスプローブ（ＡＯＸコード配列）とともに、ＡＯＸに特異的なプローブ（アンチセンスプローブのｍＲＮＡと相補的な鎖であるセンスプローブ）を使用して発現を確認した。ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイト中へ挿入されたＡＯＸコード配列の３７６ｂｐ断片のインビトロでの転写（Ｒｏｃｈｅキット）によってプローブを発生させた。本ベクターにおいて、インサートは、使用されるポリメラーゼに依存する両者の向きで転写が可能である２つのバクテリオファージプロモーターによって隣接されている。産卵の開始１６時間後に、胚を回収した。卵黄膜及び絨毛膜を除去し、胚をメタノール中で固定した。標準的な手法を使用して、再度水和した胚中で生体内原位置でのハイブリダイゼーションを実施した（Ｔｏｍａｎｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，３：ｒｅｓｅａｒｃｈ００８８．１−００８８．１４，  ２００３）。
【図８】図８は、ＡＯＸ−ｍｙｃ発現がｄａ−ＧＡＬ４駆動因子によって誘導されるハエの個体における、抗ｍｙｃ抗体に対するウェスタンブロッティングを使用するＡＯＸ−ｍｙｃ（配列番号６）の発現の確認を示す。図６に示される同様の模式図の下で選択される、ＡＯＸを発現する及び発現しないオス及びメスからタンパク質全体を抽出する。ＡＯＸ−ｍｙｃタンパク質をｍｙｃ−エピトープ特異的モノクローナル抗体で検出した。ヒト細胞由来のタンパク質抽出物の等価の量は、ポジティブ対照と並行して、同一のエピトープでタグ付けされたＡＯＸ−ｍｙｃタンパク質を発現するよう誘導した。淡オレンジ色の眼を格子で標識し、赤色の眼を黒色で標識する。
【図９】図９は、成体の生涯期間の間にＡＯＸを発現する及び発現しないハエの体重における変化を示す。ハエを回収し、標準的な補充された食品バイアル中で、バイアル当たり最大１５匹のハエで生存させ、１週間当たりバイアルを３回交換した。ハエを氷上で麻酔し、ハエの体重を２週間ごとに脱蛹後に測定した。
【図１０】図１０は、部分的なシアン化物耐性を示す、ＡＯＸを発現するハエの表現型の分析を示す。
【図１１】図１１は、ＡＯＸを発現するハエ由来のミトコンドリア中のＡＯＸ活性を示す。
【図１２】図１２は、図６の模式図の下で選択されるＡＯＸを発現する及び発現しないショウジョウバエから単離されたミトコンドリア懸濁液に関する酸素消費トレースを示す。Ｔｏｉｖｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるとおりショウジョウバエミトコンドリアを調製し（Ｔｏｉｖｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５９：２４１−２５４，  ２００１）、多様な基質及び阻害剤の存在下での酸素消費量を先行技術のとおり測定した（Ｈａｋｋａａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，７：３４１−３４５，  ２００６）。添加物は、ピルビン酸塩＋リンゴ酸塩（各５ｍＭ）、ＡＤＰ（１．５μｍｏｌ）、ＫＣＮ（１００μＭ）及びＳＨＡＭ（１ｍＭ）であった。呼吸調節比（ＲＣＲ）は、状態３の呼吸に対する状態４の比、すなわち、外部基質又阻害剤が添加されなかった地点でのトレースにおける不連続性によって示される、ＡＤＰと、ＡＤＰが消費された後の呼吸の安静状態とによって駆動される呼吸である。ＲＣＲは、ミトコンドリアの連関の程度の測定結果であり、すなわちＡＴＰ合成酵素を通じての流動によって呼吸がどの程度まで制限されているかである。
【図１３】図１３は、図６の模式図の下で選択される、ＡＯＸを発現するハエ、発現しないハエ、ＡＯＸ遺伝子導入ハエ及び遺伝子導入をしていないハエの生存率に及ぼすシアン化物の効果を示す。バイアル中のアガロースプラグ円柱へ、ＫＣＮを多様な濃度でドラフト中で添加した。１群１０匹の群中のハエをバイアルの内側に配置し、気密性ではない栓によってバイアルを封鎖し、ドラフト中に放置した。実験の開始から測定される時点で、ハエが全ての移動を停止したとき、ハエを生存可能ではないとして点数化した。実験の開始から測定される時点で、ハエが全ての移動を停止したとき、ハエを生存可能ではないとして点数化した。図１３Ａは、１００μＭ  ＫＣＮを含浸させたアガロースプラグを含有するバイアル中で３０分間温置した後、ＡＯＸを発現するハエが全て生存可能であり、バイアルの側部をゆっくり這い上がることができるのに対し、発現因子を有さないハエは全て倒れ、アガロースの表面上に横になって死滅していた。図１３Ｂは、示されるように、異なる遺伝子型のオス及びメスのハエの群の、１ｍＭ  ＫＣＮを含浸させたアガロースプラグを含有するバイアル中での平均生存時間（±ＳＤ）を示す。遺伝子導入しない（ＷＴ）ハエ及び発現因子を有しないハエは約５分後に死滅したのに対し、ＡＯＸを発現するハエは、約３０分間生存可能なままであり、致死的効果のないまま麻痺から一晩で回復することも可能であった。
【図１４】図１４は、１０又は３０μｇ／ｍＬのアンチマイシンを含有する培地上での、ＡＯＸを発現するショウジョウバエ及び遺伝子導入しない（野生型）ハエの発達を示す。ハエは、産卵後約７日（左）又は１０日（右）のハエが示されている。３０μｇ／ｍＬのアンチマイシンで、野生型のハエは、孵化しないか又は幼生が生存可能でないかの何れかである。１０μｇ／ｍＬのアンチマイシンで、野生型のハエは、早期の幼生段階に到達したが、さらに発達することはなかった。ＡＯＸを含有するハエは、第三齢の幼生段階に到達し、囲蛹殻化（ｐｕｐａｒｉａｔｉｏｎ）のための準備においてチューブを上り始めた後、ハエは健常な成体として脱蛹する。
【図１５】図１５は、ｐＷＰＩ−ＡＯＸの構成を示す。ｐＷＰＩのマップ（左）は、ｗｗｗ．ａｄｇｅｎｅ．ｃｏｍに示されるものから再描画されている。開始コドン及び終止コドンを含み、示されるＳｍａＩ半分部位によって隣接される１１１０ｂｐのＡＯＸコード配列（陰影のついたボックス、右）は、ＥＦ１α−プロモーター／ｃＰＰＴセグメントとＥＭＣＶ  ＩＲＥＳセグメントとの間で、ベクターの独自のＰｍｅＩ部位中へ平滑末端クローニングされた。
【図１６】図１６は、選別されていない細胞を示すｐＷＰＩ−ＡＯＸにより形質導入された細胞（左）又はＦＡＣＳ濃縮後に再度播種された細胞（右）の生細胞画像である。ＧＦＰ蛍光細胞は、単色の画像において明るい細胞として現れる。個別の対照画像（非表示）は、クリプトンランプの励起を使用する連続的な画像化（励起フィルター４９２／１８ｎｍ、発光フィルター５３５／３０）によって作製され、白色光（ハロゲンランプ）は、この解釈を確認した。
【図１７】図１７は、ＡＯＸ発現のノザンブロット分析を示す。ＦＡＣＳにより濃縮され、ｐＷＰＩ−ＡＯＸで形質導入された細胞由来のＲＮＡ、並びにドキシサイクリンにより誘導されたｐｃＤＮＡ５−ＡＯＸの形質移入された細胞由来及び空のベクターの形質移入された細胞由来のＲＮＡを、ＡＯＸ特異的プローブとハイブリダイズさせた。ａ及びｂと標識されたレーンは、二つ組のＲＮＡ調製物を表す。１ａ、２ａ等と標識されたレーンは、ｐＷＰＩ−ＡＯＸで形質導入された細胞の２つのバッチを表す。ＲＮＡサイズマーカーから転写産物の大きさを推定したところ、ベクターマップから推定されるものと一致する。
【図１８】図１８は、ｐＷＰＩ−ＡＯＸで形質導入された細胞の呼吸を示す。透過処理され、ＦＡＣＳ濃縮され、ｐＷＰＩ−ＡＯＸで形質導入された細胞由来の酸素消費トレース、並びにドキシサイクリンにより誘導されるｐｃＤＮＡ５−ＡＯＸで形質移入された細胞及び空ベクターで形質移入された細胞由来の酸素消費トレースを示す。矢印は、シアン化カリウム（ＫＣＮ）を１００μＭまで、及び没食子酸ｎ−プロピル（ＰＧ）を１０μＭまで添加した時点を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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