(57)【要約】固形腫瘍を含めた癌の治療に寄与する方法、組成物および製造物品を開示する。前記方法、組成物および製造物品は、化学療法薬の送達とそれによる効果を向上させるためにエンドセリンＢ作動薬（ＥＴＢ）を使用することができる。腫瘍は、結合時に血管拡張を引き起こす増加したＥＴＢ受容体を含む特有の血管系を有する。ＥＴＢ受容体は血管拡張剤であることから、ＥＴＢ受容体作動薬は、化学療法薬と組み合わせると、乳癌で見られるような固形腫瘍の治療に有用である。ＥＴＢ受容体作動薬は、化学療法薬をより効果的に腫瘍に送達して、治療を向上させることができる。
2009545609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に寄与する方法であって、エンドセリンＢ（ＥＴＢ）作動薬および化学療法薬を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記癌が固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固形腫瘍が、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、カポジ肉腫、乳房腫瘍、黒色腫、前立腺腫瘍、髄膜腫、肝臓腫瘍、乳房葉状腫瘍、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＴＢ作動薬が、ＥＴ‐１、ＥＴ‐２、ＥＴ‐３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ‐ｓｕｃ‐［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ‐１（８‐２１））、ｓａｒａｆｏｔｏｘｉｎ  ５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ‐１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、５‐フルオロウラシル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＴＢ作動薬が前記固形腫瘍への血液供給量を選択的に増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍への前記血液供給量の増加が、前記固形腫瘍への前記化学療法薬の送達を増加させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＴＢ作動薬および前記化学療法薬が実質的に同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＴＢ作動薬および前記化学療法薬が単一の組成物として投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＴＢ作動薬および前記化学療法薬が連続して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学療法薬が前記ＥＴＢ作動薬の前に投与されるか、または前記ＥＴＢ作動薬が前記化学療法薬の前に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化学療法薬、ＥＴＢ作動薬、および任意の補形剤を含む組成物。
【請求項１３】
ＥＴＢ作動薬を含む組成物、および固形腫瘍を治療するために前記組成物を化学療法薬とともに投与する方法を指示する取扱い情報を含む、製造物品。
【請求項１４】
前記化学療法薬もさらに含む、請求項１３に記載の製造物品。
【請求項１５】
前記ＥＴＢ作動薬および前記化学療法薬が同じ組成物の一部であるか、別の組成物として提供されるかのいずれか、またはそれらの両方である、請求項１４に記載の製造物品。
【請求項１６】
前記ＥＴＢ作動薬が、ＥＴ‐１、ＥＴ‐２、ＥＴ‐３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ‐ｓｕｃ‐［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ‐１（８‐２１））、ｓａｒａｆｏｔｏｘｉｎ  ５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ‐１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の製造物品。
【請求項１７】
前記ＥＴＢ作動薬がＩＲＬ１６２０である、請求項１４に記載の製造物品。
【請求項１８】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、５‐フルオロウラシル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の製造物品。
【請求項１９】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１４に記載の製造物品。
【請求項２０】
前記ＥＴＢ作動薬がＩＲＬ１６２０であり、前記化学療法薬がパクリタキセル、ドキソルビシン、５‐フルオロウラシル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の製造物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００６年８月２日に出願された米国特許出願第１１／４６１，９６１号に対する優先権を主張する。米国特許出願第１１／４６１，９６１号は、２００６年２月２２日に出願された米国特許出願第１１／３６０，２３６号の一部において継続であり、米国特許出願第１１／３６０，２３６号は、（全て２００５年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６５５，６５６号、同第６０／６５５，６５４号、および同第６０／６５５，６４３号の利益を主張し、）２００３年１０月２３日に出願された米国特許出願第１０／６９１，９１５号の一部において継続である。米国特許出願第１０／６９１，９１５号は、２００２年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／４２０，９６０号の利益を主張する。これら全ての出願の内容は、その全体が本明細書中に参照として援用される。
【０００２】
本発明は、エンドセリン作動薬および化学療法薬を投与することにより、固形腫瘍を含めた癌の治療に寄与する方法、組成物および製造物品に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍細胞の分子生物学への理解が深まり、より多くの可能性のある治療薬が得られやすくなったにもかかわらず、固形腫瘍を含めた癌の治療に成功するという医学目標は、依然として達成されていない。例えば、米国では乳癌の発生率が過去１０年間で著しく上昇しており、４０〜４９歳の女性の１つの主要な死因となっている。
【０００４】
癌治療における１つの問題は、可能性のある広範な化学療法薬が正常組織に対して非選択的にきわめて毒性の高い作用を及ぼすために、それらの薬剤の有効量を制限されている点である。その結果、多くの患者が、治療の恩恵を受けることなく、化学療法の副作用に苦しんでいる。例えば、化学療法薬であるパクリタキセルは、細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するが、過敏症、好中球減少症、および末梢神経障害を含めた投与量の制限を招く毒性によって、パクリタキセルの臨床的有用性は阻害されてきた。そのため、より特異的で毒性の低い癌療法を開発することが必要とされている。
【０００５】
化学療法薬の腫瘍への標的送達は、薬剤の全身性毒性作用を最小限に低減しながら化学療法薬の有益性を増強する利点を有すると考えられる。このような標的送達はまた、化学療法薬の必要量を低下させるのにも役立ち、それによってこれらの薬剤の許容されない副作用を低減する可能性があると考えられる。化学療法薬の標的送達を達成する可能性を持つ１つの方法は、腫瘍血管系の特異的な特徴を活用する方法である。
【０００６】
大きさが数ミリメートルを超える腫瘍は、継続的な栄養供給を必要とするため、独自の血管床と血流を発達させる（非特許文献１）。発達中の血管から継続的に栄養が供給されないと、腫瘍は低酸素状態となり、その結果死亡する。既存の血管からの新規の血管系を補充することを、「血管新生」と呼ぶ。
【０００７】
血管新生時に、腫瘍血管は、正常な血管系とは実質的に異なる方法で発達し、異なる特性を有する。単層の上皮細胞は、最初に急速に形成される腫瘍血管である。新規に形成される腫瘍血管は、平滑筋層や神経支配を有していない。また、腫瘍は、すべての自己調節機能を有する成熟した血管も組み込む（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００８】
血管緊張（血管が拡張または収縮する程度）は、Ｈ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、ｐＯ２、ＰＣＯ２、および一酸化窒素（ＮＯ）を含めた多くの内生要因、ならびにエンドセリン（ＥＴ‐１）などのその他の調整物質により支配される（非特許文献５；非特許文献６）。ＥＴ‐１は、血管緊張を調節するのに大いに寄与しており（非特許文献７）、試験者等は、乳癌を含めた固形腫瘍におけるＥＴ１およびＥＴＢ受容体の発現の増大を明らかにしている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。さらに、ＥＴＢ受容体の刺激は、腫瘍血管の血管拡張によって腫瘍への血液供給量の増加をもたらす。本発明は、化学療法薬の標的送達を増大させるために、腫瘍への血流を選択的に増加させるＥＴＢ受容体作動薬を使用することによって、この事実を活用している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４６：４６７（１９８６）
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．  １２９（１９７９）
【非特許文献３】Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．１１５（１９７９）
【非特許文献４】Ｗａｒｒｅｎ，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．２６（１９７９）
【非特許文献５】Ｓｅｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｄｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ｐｇ．４０（１９９４）
【非特許文献６】Ｌｕｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｇ．６１（１９９０）
【非特許文献７】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：４１１（１９８８）
【非特許文献８】Ａｌａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６：１６１（２０００）
【非特許文献９】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６）
【非特許文献１０】Ｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１６：５１４（１９９５）
【非特許文献１１】Ｐａｇｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５）
【非特許文献１２】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２）
【非特許文献１３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｃｈｅｍ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、固形腫瘍を含めた癌の治療に寄与するエンドセリン作動薬および化学療法薬の投与を対象とする。特に、腫瘍は、結合時に血管拡張を引き起こす増加したＥＴＢ受容体を含めた特有の血管系を有する。ＥＴＢ受容体は血管拡張剤であることから、ＥＴＢ受容体作動薬は、化学療法薬と組み合わせると、乳癌で見られるような固形腫瘍の治療に有用である。ＥＴＢ受容体作動薬は、化学療法薬をより効果的に腫瘍に送達して、治療を向上させることができる。
【００１１】
具体的に、本発明に基づく一実施形態は、癌の治療に寄与する方法であって、ＥＴＢ作動薬および化学療法薬を投与することを含む、方法を含む。本発明に基づく方法の種々の実施形態において、ＥＴＢ作動薬および化学療法薬は、実質的に同時に投与することができるか、または連続して投与する（化学療法薬をＥＴＢ作動薬より前に投与するか、またはＥＴＢ作動薬を化学療法薬より前に投与する）ことができる。本発明に基づく特定の実施形態において、ＥＴＢ作動薬および化学療法薬が実質的に同時に投与される場合、これらは単一の組成物として投与することができる。
【００１２】
本発明に基づく別の実施形態は、化学療法薬、ＥＴＢ作動薬、および任意の補形剤を含む組成物を含む。本発明に基づく別の実施形態は、ＥＴＢ作動薬を含む組成物、および固形腫瘍を治療するために前記組成物を化学療法薬とともに投与する方法を指示する取扱い情報を含む製造物品を含む。さらに、本発明に基づく製造物品は、１つ以上の化学療法薬を含んでもよい。本発明に基づく製造物品が１つ以上の化学療法薬を含む場合、ＥＴＢ作動薬および化学療法薬は、同じ組成物の一部であってもよければ、個別の組成物として提供してもよければ、あるいはそれらのいずれであってもよい。
【００１３】
本発明に基づく方法、組成物または製造物品で治療される癌には、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、カポジ肉腫、乳房腫瘍、黒色腫、前立腺腫瘍、髄膜腫、肝臓腫瘍、乳房葉状腫瘍、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない固形腫瘍が含まれてよい。
【００１４】
本発明の方法、組成物または製造物品に基づいて使用されるエンドセリンＢ作動薬は、固形腫瘍への血液供給量を選択的に増加させ、それによって化学療法薬の固形腫瘍への送達を増加させることができる。本発明に基づいて使用することができるエンドセリンＢ作動薬には、ＥＴ‐１、ＥＴ‐２、ＥＴ‐３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ‐ｓｕｃ‐［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ‐１（８‐２１））、ｓａｒａｆｏｔｏｘｉｎ  ５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ‐１の１つ以上、およびそれらの組み合わせが含まれてよいが、これらに限定されない。化学療法薬には、アドリアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタセル、パクリタキセル、トポテカン、５‐フルオロウラシルの１つ以上、およびそれらの組み合わせが含まれてよいが、これらに限定されない。本発明に基づく特定の方法、組成物または製造物品は、パクリタキセル、ドキソルビシン、５‐フルオロウラシル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される化学療法薬とともに、ＥＴＢ作動薬としてＩＲＬ１６２０を含むと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】パクリタキセルにより誘導された腫瘍灌流の変化に対するＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、癌を保有しないラットと乳房腫瘍保有ラットの全身血液動態に対するＥＴ‐１の効果を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、癌を保有しないラットと乳房腫瘍保有ラットの乳房組織における血流および局所血管抵抗に対するＥＴ‐１の効果を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、癌を保有しないラットと乳房腫瘍保有ラットの乳房組織における灌流、流動する血球濃度（ＣＭＢＣ）、および血球速度に対するＥＴ‐１の効果を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、癌を保有しないラットと乳房腫瘍保有ラットの乳房組織における血液灌流、ＣＭＢＣおよび血球速度の、ＥＴ‐１により誘導される変化に対するＢＱ７８８の効果を示す。
【図６】ＨＰＬＣで測定した、正常ラットと腫瘍保有ラットにおけるパクリタキセル分析の血漿薬物動態に対するビヒクルまたはＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図７】液体シンチレーション計数で測定した、［３Ｈ］‐パクリタキセルの血漿薬物動態に対するビヒクルまたはＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図８】液体シンチレーション計数で測定した、［３Ｈ］‐パクリタキセルの血漿薬物動態に対するビヒクルまたはＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、レーザードップラー流量計で測定した、乳房腫瘍灌流に対するＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図１０】乳房腫瘍保有ラットの腫瘍および主要組織中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度に対するＩＲＬ１６２０投与の時間依存的効果を示す。
【図１１】治療開始時と比較した、乳房腫瘍保有ラットの体重差の割合を示す。
【図１２】乳房腫瘍保有ラットの腫瘍容積に対するＩＲＬ１６２０投与の効果を示す。
【図１３】乳房腫瘍保有ラットにおける腫瘍の進行、静止および退縮に対するＩＲＬ１６２０投与の効果を示す。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、レーザードップラー流量計で測定した、前立腺腫瘍の灌流に対する種々の投与量のＩＲＬ１６２０の効果（図１４Ａ）、およびＩＲＬ１６２０投与後の前立腺腫瘍の灌流におけるベースラインからの変化率（図１４Ｂ）を示す。
【図１５】前立腺腫瘍保有ラットの腫瘍および他の主要組織中の［１４Ｃ］‐ドキソルビシン（ＤＯＸ）の濃度に対するＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図１６Ａ】ＩＲＬ１６２０およびＤＯＸの投与後の前立腺腫瘍保有ラットの体重を示す。
【図１６Ｂ】ＩＲＬ１６２０およびＤＯＸの投与後の前立腺腫瘍保有ラットの腫瘍容積を示す。
【図１６Ｃ】ＩＲＬ１６２０およびＤＯＸの投与後の前立腺腫瘍保有ラットの腫瘍重量を示す。
【図１７Ａ】ＩＲＬ１６２０および５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）の投与後の前立腺腫瘍保有ラットの体重を示す。
【図１７Ｂ】ＩＲＬ１６２０および５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）の投与後の前立腺腫瘍保有ラットの腫瘍容積を示す。
【図１７Ｃ】ＩＲＬ１６２０および５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）の投与後の前立腺腫瘍保有ラットの腫瘍重量を示す。
【図１８】レーザードップラー流量計で測定した、黒色腫腫瘍の灌流に対するＩＲＬ１６２０の効果（図１８Ａ）、およびＩＲＬ１６２０投与後の黒色腫腫瘍の灌流におけるベースラインからの変化率（図１８Ｂ）を示す。
【図１９】黒色腫腫瘍保有ラットの腫瘍および他の主要組織中の［３Ｈ］‐パクリタキセルの濃度に対するＩＲＬ１６２０の効果を示す。
【図２０】腫瘍容積に対する放射線を照射した場合と放射線を照射しない場合の種々の濃度のＩＲＬ１６２０の経時的な効果を示す。比較のため、生理食塩水と放射線を使用した場合の効果と、腫瘍容積への治療を行わない場合の効果も示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．定義
「取扱い情報」：本明細書で使用される「取扱い情報」という用語は、製品の使用に関して医師、薬剤師および患者が詳細な説明を受けた上で決断を下すことができるようにするために必要とされる安全性および有効性データとともに、製品を投与する方法に関する説明を提供する、医薬品に添付される資料を意味するものとする。一般的に、本取扱い情報は医薬品の「ラベル」と見なされる。取扱い情報は、紙の添付文書、ＣＤ‐ＲＯＭ、または医薬品に関連する情報を掲載したウェブサイトへの指示を含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。
【００１７】
「プロドラッグ」：本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、例えば、加水分解によって本発明に有用な化合物にｉｎ  ｖｉｖｏで急速に変換される化合物を意味するものとする。プロドラッグの詳細な考察については、Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４，ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｄ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，ａｎｄ  ｉｎ  Ｒｏｃｈｅ（ｅｄ．），Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７に示される。
【００１８】
「治療する、治療、または〜の治療に寄与する」：本明細書で使用される「治療する」、「治療」、および「〜の治療に寄与する」という用語は、固形腫瘍を含めた癌の進行もしくは増殖を予防・遅延する、癌を縮小する、または癌を排除することを意味するものとする。そのため、これらの用語は、治療投与および／または予防的投与を適宜包含する。
【００１９】
「実質的に同時に」：本明細書で使用される「実質的に同時に」という用語は、２つの医薬製剤（すなわち、ＥＴＢ作動薬および化学療法薬）が同時に投与されることを意味するものとする。この定義によると、「同時」とは、まさに同時だけでなく、約１０分以内も含むものとして解釈されるべきである。
【００２０】
ほとんどの化学療法薬は、癌細胞を破壊することを標的とする細胞毒性作用を有するが、このプロセスでは生体の正常な生理学系に対しても多大な損傷を与える。そのため、固形腫瘍に化学療法薬を選択的に送達することは大変有益であり、それによってこうした癌治療の負の作用を回避するのに役立つと考えられる。
【００２１】
腫瘍血管の脈管構造は、正常な血管の脈管構造と異なる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ＆Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９（２０００））。そのため、腫瘍の血管反応性は、正常組織の血管反応性と異なる。例えば、一酸化窒素供与体、ニコチンアミド、およびブラジキニン作動薬の投与により、腫瘍への血流が調節される（Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ，４８：５６５（２０００）；Ｆｕｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１５０：７１３（１９９７）；Ｈｉｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ，６７：７９５（１９９４））。
【００２２】
エンドセリンは、血流を調節する血管作動性物質であり、正常な乳房組織に比べて乳癌組織に高濃度で存在する（具体的に、エンドセリンは、正常な乳房組織に約０．１２ｐｇ／ｍｇの量が存在するのに対して、乳癌組織には約１２ｐｇ／ｍｇの量が存在する）（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ，４（６）：３０９（１９９５）；Ｋｕｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，５２（４）：３２９（１９９９）；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１２６（２）：１４３（１９９７）；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５２（１４）：４０４６（１９９２）；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｃｈｅｍ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４（３）：３６３（１９９１））。エンドセリンは、２１個のアミノ酸を有する環状ペプチドのファミリーであり、哺乳動物ではＥＴ‐１、ＥＴ‐２およびＥＴ‐３の３個のアイソフォームを含む（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２８６３（１９８９）；Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：４１１（１９８８））。エンドセリンは、２つの異なる細胞表面受容体であるＥＴＡおよびＥＴＢに結合することによって効果を発揮する。ＥＴＢ受容体は、等しい親和性を有する３個のペプチドアイソタイプを結合するのに対して、ＥＴＡ受容体は、その他のアイソフォームよりも高い親和性を有するＥＴ‐１を結合する。いずれの受容体も、Ｇタンパク質共役受容体系に属し、成長因子、血管作動性ポリペプチド、神経伝達物質、およびホルモンを含めた種々の刺激からの生体応答を媒介する（Ｍａｓａｋｉ，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５：Ｓ３（２０００）；Ｇｕｌａｔｉ，Ｐｒｅｆａｃｅ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，４０：１２９（２０００）；Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７３：Ｈ８２７（１９９７）；Ｌｅｖｉｎ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３３３：３５６（１９９５））。正常な乳房組織に比べると、本発明の対象であるＥＴＢ受容体は、内皮細胞（ＥＣ）と血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の両方で存在し、乳癌組織（ヒトでは、侵襲性乳癌組織ならびに乳管および小葉乳癌組織を含む）で増加する（Ｗｕｌｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ，１１：７９１（２００４）；Ｗｕｌｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，９：４１２５（２００３）；Ａｌａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６１（２０００））。エンドセリンは、ＥＴＢ受容体に作用して、血管拡張を引き起こし、乳房腫瘍組織への血流を増加させる。ＥＣで優位に存在するＥＴＢ受容体は、プロスタシクリンおよび一酸化窒素などの因子を放出することにより血管拡張を引き起こす（ｄｅ  Ｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：９７９７（１９８８））。ＥＴ‐１は、ＥＴＢ受容体を刺激することにより腫瘍への血流を増加させることから、ＥＴＢ受容体作動薬を使用することで、腫瘍への血液供給量を選択的に増加させ、それによって化学��法薬の標的送達とそれによる効果を増加させることができる。
【００２３】
ＥＴＢ受容体は、例えば以下に限定されないが、卵巣癌、筋線維芽細胞、カポジ肉腫および腫瘍内血管、乳癌、および黒色腫などにおいて認められている（Ｂａｇｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１５８：８４１（２００１）；Ａｌａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６１（２０００）；Ｂａｇｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５９：７２０（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，２１９：７３４（１９９６））。そのため、ＥＴＢ受容体作動薬と化学療法薬の併用投与を使用することで、卵巣癌、結腸癌、カポジ肉腫、乳癌、および黒色腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍の治療に寄与することができる。
【００２４】
本発明に基づき有用であるＥＴＢ作動薬には、ＥＴ‐１、ＥＴ‐２、ＥＴ‐３、ＢＱ３０２０、ＩＲＬ１６２０（Ｎ‐ｓｕｃ‐［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］ＥＴ‐１（８‐２１））、ｓａｒａｆｏｔｏｘｉｎ  ５６ｃ、［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ‐１、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。［Ａｌａ１，３，１１，１５］ＥＴ‐１は、Ｃｙｓ残基の代わりにＡｌａ残基を代用することによってジスルフィド架橋が除去された、ＥＴ‐１の直鎖類似体である（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１７９：２８６（１９９１））。ＢＱ３０２０およびＩＲＬ１６２０は、ＥＴ‐１の切断された直鎖合成類似体であり、最も広く使用されている選択的合成作動薬である。ＩＲＬ１６２０は、構造がＥＴ‐１のカルボキシ端末に基づく直鎖ＥＴ類似体であり、ＥＴＢ受容体に対して１２０，０００倍の選択性を有する（Ｏｋａｄａ＆Ｎｉｓｈｉｋｉｂｅ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ，２０：５３（２００２）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１１４：１５２９（１９９５））。ＩＲＬ１６２０は、きわめて選択性が高く強力なＥＴＢ作動薬であり、ＥＴＢ２受容体サブタイプよりも優先的にＥＴＢ１受容体サブタイプへの選択性を有する証拠が報告されている（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２６  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ３２２（１９９５））。
【００２５】
本発明に基づき有用である化学療法薬には、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモンおよびその拮抗薬、放射性同位元素、抗体、および天然産物、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＥＴＢ作動薬は、ドキソルビシンおよびその他のアントラサイクリン類似体などの抗生物質、シクロホスファミドなどがあるがこれに限定されないナイトロジェンマスタード、５‐フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシウレアなどがあるがこれらに限定されないピリミジン類似体、ならびにその天然および合成誘導体などとともに投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺腺癌などの混合腫瘍の場合、ＥＴＢ作動薬は、以下に限定されないが、ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ‐ＲＨの合成ペプチド類似体）などとともに投与することができる。本発明とともに使用することができる化学療法薬のさらなる非限定的な例には、アドリアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロン（アルファ、ベータおよび／またはガンマ）、インターロイキン２、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、ならびに治療効果のある類似体およびそれらの誘導体が含まれる。
【００２６】
本発明の一実施形態において、エンドセリン作動薬は、固形腫瘍の治療に寄与するために、化学療法薬とともに使用される。本方法において、エンドセリン作動薬、特にＥＴＢ作動薬は、ＥＴＢ受容体に豊富に存在する腫瘍への血流を増加させる。そのため、ＥＴＢ作動薬は、化学療法薬に対してより選択的な標的を提供し、前記薬剤の化学治療効果を改善する。
【００２７】
エンドセリン作動薬はＥＴＢ受容体を刺激して、腫瘍血管を拡張し、それによって腫瘍への化学療法薬の血流とそれによる送達を増加させることが理論付けられているが、本明細書ではこれに依拠していない。また、エンドセリン作動薬によって引き起こされる腫瘍の血液灌流の増加によって、組織の酸素化も増大する。酸素化を改善することで、化学療法薬の治療的作用を向上させることができる。また、エンドセリンは有糸裂誘発性を有することができる。エンドセリンの線維芽細胞増殖作用は、エンドセリンと化学療法薬とを一緒に投与した場合に、化学療法薬の作用を増加させる助けとなる。エンドセリン作動薬の線維芽細胞増殖作用は、分割細胞への化学療法薬の組み込みを改善し、それによって化学療法薬の作用を増加させることによって、化学療法薬の作用を増加させることができる。
【００２８】
化学療法は、しばしば癌治療における手術の補助療法として適応されることが多い。補助療法における化学療法の目的は、原発性腫瘍が制御された場合に再発の危険性を低減し、無病生存率を高めることである。化学療法は、しばしば疾患が転移性の場合に、癌の補助療法として使用される。そのため、ＥＴＢ作動薬は、化学療法と組み合わせて固形腫瘍の治療において手術を行う前または行った後に特に有用である。
【実施例】
【００２９】
乳房腫瘍モデル
（実施例１）  乳房腫瘍の灌流に対するＩＲＬ１６２０およびパクリタキセルの効果
正常ラットと乳房腫瘍保有ラットにおける全身血液動態とＥＴ‐１の局所回路作用を検証するために、以下の試験を実施した。
【００３０】
広範な試験を行った乳房腫瘍モデルは、化学的に誘導されたラットの乳癌発症モデルである（ｖａｎ  Ｚｗｉｅｔｅｎ，Ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｓ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｇ．２０６（１９８４）；Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，７１：２０１（１９８３）；Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，６１：１４３９（１９７８）；Ｈｕｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３７（１９６２）；Ｈｕｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，４５：１２９４（１９５９））。ラットにおいて化学的に誘導された乳腺腫瘍形成は、ヒトの癌に最も類似したモデルである（Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，６２：２４４（１９９０））。組織構造の点で、ラットの乳腺は、ヒトの女性の乳腺と類似している。乳腺は、乳管および乳腺房、ならびにこの臓器の足場を形成する結合組織である基質を覆う上皮組織で形成される。これらの２つの区画は、胚発育時のほか、成年期を通して継続的に相互作用している。そのため、この自発性試験モデルが最もヒトの癌に類似していることから、このモデルを現在説明している試験のモデルとして選択した（前掲）。
【００３１】
通常、化学的に誘導されたラットの乳癌形成は、７，１２‐ジメチルベンゼン（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）またはＮ‐メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）の投与により達成される（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｆａｔ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２５５（１９９６））。ＤＭＢＡまたはＭＮＵによって誘導された腫瘍は、異なる形態学的特徴を有する。特に、ＭＮＵによって誘導された腫瘍は、乳房でより局所的に認められ、転移する可能性が低い（Ｍａｃｅｊｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｇｕｌ，３５：５３（２００１））。そのため、ＭＮＵはしばしば、ラットにおいて乳房腫瘍を特異的に誘導するための化学物質として選択される。これらの乳房腫瘍は、線維腺癌および乳頭腫とともに良性であることもあれば、悪性であることもある（ｖａｎ  Ｚｗｉｅｔｅｎ，Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｇ．２０６（１９８４））。ラットは６組の乳腺を有し、１組は頸部に、２組は胸郭に、１組は腹部に、そして２組は鼠径部に有する（前掲；Ａｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ａｎａｔ，６１（１９３７））。ＭＮＵで治療したバージンラットは、腹部よりも胸郭に腫瘍を発症した（Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，５７：１１２（１９８７））。
【００３２】
体重１８０〜２００グラム（ｇ）の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｃｏ．、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用した。すべての動物を、温度（２３±１℃）および湿度（５０±１０％）が制御され、人工光（６時〜１８時）を照射したかごに３匹ずつ収容した。動物には適宜食料と水を与えた。試験は、少なくとも４日間動物を環境に順応させてから実施した。
【００３３】
Ｎ‐メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）は、Ａｓｈ  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｉｎｃ．（米国ミシガン州デトロイト）から購入した。ＩＲＬ１６２０およびエンドセリン‐１（ＥＴ‐１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サニーベール）から入手した。ＥＴ‐１を０．１％のアルブミンに溶解させた。
【００３４】
ＭＮＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（１ｍＬ／ｋｇ）を、雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍が直径約２〜４ｃｍに達した後、血流試験を行った。
【００３５】
血流試験時には、ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、腹腔内）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミズーリ州セントルイス）でラットを麻酔し、薬剤投与のために左大腿静脈にカニューレ（ＰＥ５０チューブ、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ、米国ニュージャージー州パーシッパニー）を挿入した。
【００３６】
動物は以下の群に分けた：
第Ｉ群：正常ラット（４匹）における生理食塩水＋パクリタキセル（タキソル；３ｍｇ／ｋｇ；生理食塩水の投与から１５分後）の投与；
第ＩＩ群：正常ラット（４匹）におけるＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ；ＩＲＬ１６２０の投与から１５分後）の投与；
第ＩＩＩ群：腫瘍保有ラット（４匹）における生理食塩水＋パクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ；生理食塩水の投与から１５分後）の投与；および
第ＩＶ群：腫瘍保有ラット（４匹）におけるＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ；ＩＲＬ１６２０の投与から１５分後）の投与。
【００３７】
ラットの乳腺への血液灌流は、レーザードップラー流量計を使用して測定した。Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ，１８：９０３（１９９０）；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ，１７：１０４１（１９８９）を参照されたい。この手順で、動物の乳首周辺を除毛し、乳腺周囲の皮膚を切開した。標準モデルの光ファイバープローブを乳腺動脈に固定し、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ  ＰＦ２ｂ  ４０００レーザードップラー流量計に接続した（Ｐｅｒｉｍｅｄ  ＫＢ、スウェーデン  ストックホルム）。時定数を１．５秒に設定し、帯域幅を４ＫＨｚに設定した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してデータを分析した後、Ｄｕｎｃａｎ試験を行い、ｐ＜０．０５のレベルを有意と見なした。
【００３８】
生理食塩水またはＩＲＬ１６２０およびパクリタキセルの投与後に、正常ラットの乳房組織への血流に変化は見られなかった。ＩＲＬ１６２０注入後の腫瘍組織における血流（３６．３％、ｐ＜０．０５）と、ＩＲＬ１６２０の後にパクリタキセルを投与した後の血流（５１．９％、ｐ＜０．０５）との間には、ベースラインからの有意差が認められた（図１を参照）。したがって、本試験は、ＩＲＬ１６２０が化学療法薬の投与を含めた癌治療の重要な補助療法となり得ることを証明している。
【００３９】
（実施例２）  正常ラットおよび腫瘍保有ラットの全身血液動態ならびに乳房組織への血流に対するＥＴ‐１注入の効果
試験の３ヵ月前に、ＭＮＵおよび生理食塩水の治療を腹腔内注入として行った。治療から４週間後よりラットを定期的に触診した。腫瘍が直径約４〜８ｍｍに達したら、試験を開始した。
【００４０】
ラットをウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、腹腔内）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミズーリ州セントルイス）で麻酔し、すべての手術部位を除毛して、アルコールスワブで洗浄した。薬剤投与のために左大腿静脈にカニューレ（ＰＥ５０チューブ、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ、米国ニュージャージー州パーシッパニー）を挿入した。左大腿動脈にカニューレ（ＰＥ５０チューブ）を挿入し、採取ポンプ（モデル２２、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国マサチューセッツ州サウスナチック）を使用して、ミクロスフェア試験での基準血液試料の採取に使用した。右大腿動脈にカニューレ（ＰＥ５０チューブ）を挿入し、７ＰＩプリアンプを介してＧｒａｓｓＰ７Ｄポリグラフ（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、米国マサチューセッツ州クインシー）で血圧を記録するために、Ｇｏｕｌｄ  Ｐ２３  ＩＤ圧力変換器に接続した。血圧信号から発生した７Ｐ４Ｂ  Ｇｒａｓｓタコグラフ（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、米国マサチューセッツ州クインシー）を介して、心拍数（ＨＲ）を記録した。右頚動脈を露出させ、ＰＥ  ５０チューブを総頸動脈を介して左心室に誘導した。Ｓｔａｔｈａｍ  Ｐ２３ＤＣ圧力変換器（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、米国マサチューセッツ州クインシー）を使用してＧｒａｓｓポリグラフで圧力を記録することにより、左心室におけるカニューレの存在を確認した。カニューレが左心室に達すると、拡張期血圧はゼロに下降した。血液のｐＯ２、ｐＣＯ２およびｐＨを一定に維持するため、かつ血圧およびＨＲに対する呼吸の影響を回避するため、齧歯類用人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州サウスナチック）に接続した気管内カニューレを挿入することによって、動物を一定速度の人工呼吸で維持した。
【００４１】
最初にラットを以下の２つの群に分け、それぞれが以下の治療の１つを受けた：
第Ｉ群：生理食塩水で治療したラット（正常ラット）（６匹）においてＥＴ‐１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入；および
第ＩＩ群：ＭＮＵで治療したラット（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；腫瘍ラット）（６匹）においてＥＴ‐１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入。
【００４２】
ベースライン時、ならびにＥＴ‐１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）の注入を開始してから３０分後、６０分後および１２０分後に、全身血液動態および局所循環パラメータを測定した。ＥＴ‐１の注入が３０分間行われたことから、３０分間のデータはＥＴ‐１の効果を示し、６０分間および１２０分間のデータはＥＴ‐１効果の持続期間を示す。
【００４３】
全身血液動態および局所血液循環は、文献に記載された手順を使用して測定した。Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１２６：５５９（１９９５）；Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５５：８２７（１９９４）；Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：５９３（１９９４）を参照されたい。各測定時に、４６Ｓｃ（スカンジウム）、１１３Ｓｎ（スズ）、１４１Ｃｅ（セリウム）、または９５Ｎｂ（ニオブ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ボストン）で標識した約１００，０００個のミクロスフェア（直径１５±１μｍ）を０．２ｍＬの生理食塩水中で完全に混合した懸濁液を左心室に注入し、０．３ｍＬの生理食塩水で１５秒間洗浄した。血流を算出するため、右大腿動脈を介して０．５ｍＬ／分の速度で動脈血を採取した。ミクロスフェアを注入する約５〜１０秒前より９０秒間血液を採取した。
【００４４】
ラットの乳腺への血液灌流は、レーザードップラー流量計を使用して測定した。Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ，１８：９０３（１９９０）；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ，１７：１０４１（１９８９）を参照されたい。動物の乳首周辺を除毛し、乳腺周囲の皮膚を幅約６ｃｍ×長さ約４ｃｍの皮弁として切開した。標準モデルの光ファイバープローブを皮弁の表面に設置し、両面テープで組織に固定した。皮弁を金属ホルダーに配置し、動かないようにテープで留めた後、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ  ＰＦ２ｂ  ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ  ＫＢ、スウェーデン  ストックホルム）に接続した。時定数を１．５秒に設定し、帯域幅を４ｋＨｚに設定した。分散分析を使用してデータを分析した後、Ｄｕｎｃａｎ試験を行い、ｐ＜０．０５のレベルを有意と見なした。
【００４５】
試験の最後に、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与して動物を屠殺した。すべての組織および臓器を解剖、計量し、バイアルに入れた。標準試料、血液試料および組織試料の放射能を、アイソトープエネルギーを識別する事前設定ウィンドウを備えたＰａｃｋａｒｄ  Ｍｉｎａｘｉ  Ａｕｔｏ‐Ｇａｍｍａ  ５０００シリーズガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＩＩ．）で計数した。以下のパラメータを算出した：（１）心拍出量（ＣＯ）（（注入した放射能×動脈血の採取率）／試料採取した動脈血の放射能）、（２）拍出量（ＳＶ）（ＣＯ／ＨＲ）、（３）全末梢血管抵抗（ＴＰＲ）（平均動脈圧（ＭＡＰ）／ＣＯ）、（４）局所血流（（組織の放射能×動脈血の採取率）／試料採取した動脈血の放射能）、および（５）局所血管抵抗（ＭＡＰ／局所血流）。データの算出には、文献に記載したコンピュータプログラムを使用した（Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ，１２：６３（１９８０））。
【００４６】
正常（生理食塩水で治療した）ラットのベースライン時の全身血液動態パラメータは、ＭＡＰ：１１１．１±４．８ｍｍＨｇ；ＣＯ：２６８．６±１７．６ｍＬ／分；ＳＶ：０．８７±０．０６ｍＬ；ＴＰＲ：４１９．６±．２４．３７ｍｍＨｇ．分／ｍＬ；およびＨＲ：３１２．５±２０．２脈拍／分であった。正常ラットでは、ＥＴ‐１注入から３０分後（１４．５％；ｐ＜０．０５）にＭＡＰの有意な増加が認められ、１２０分後（１７．８％；ｐ＜０．０５）に減少が認められた。ＴＰＲは１２０分後に増加し（４９．２％；ｐ＜０．０５）、ＣＯは、ＥＴ‐１注入から６０分後および１２０分後に減少し（それぞれ２２．９％および４２．５％；ｐ＜０．０５）、ＳＶは６０分後および１２０分後に減少した（それぞれ２０．９％および３６％；ｐ＜０．０５）。ＨＲの有意な変化は認められなかった（図２Ａ〜２Ｅ）。
【００４７】
腫瘍保有（ＭＮＵで治療した）ラットのベースライン時の全身血液動態パラメータは、正常ラットのパラメータと類似していた。腫瘍ラットでは、ＥＴ‐１注入から３０分後（１９．１％；ｐ＜０．０５）および６０分後（１５．３％；ｐ＜０．０５）にＭＡＰの有意な増加が認められた。ＴＰＲは、ＥＴ‐１投与から３０分後（７３．９％；ｐ＜０．０５）、６０分後（３９．７％；ｐ＜０．０５）、および１２０分後（７１．４％；ｐ＜０．０５）に増加した。ＣＯは、３０分後、６０分後および１２０分後に減少した（それぞれ２９．４％、１６．７％および３６．１％；ｐ＜０．０５）。ＳＶは、３０分後、６０分後および１２０分後に有意に減少した（それぞれ３１．１％、１７．９％および３２．１％；ｐ＜０．０５）。ＨＲの変化は認められなかった（図２Ａ〜２Ｅ）。
【００４８】
ＥＴ‐１投与後に、生理食塩水で治療した正常ラットの乳房組織への血流にも、血管抵抗にもなかった。正常（生理食塩水で治療した）ラットに比べると、腫瘍（ＭＮＵで治療した）ラットの乳房組織への血流と局所血管抵抗には有意差が認められた。正常ラットに比べると、腫瘍保有ラットの乳房組織への血流には、ＥＴ‐１投与から６０分後に有意な増加（１５３％；ｐ＜０．０５）が認められた。また、正常ラットに比べると、腫瘍保有ラットの血管抵抗は、ベースライン時（１０２％；ｐ＜０．０５）、およびＥＴ‐１投与から６０分後（１４７％；ｐ＜０、０５）に有意差が見られた（図３Ａ〜３Ｂ）。
【００４９】
図４Ａ〜４Ｃは、腫瘍保有ラットおよび正常ラットの乳房組織における灌流、流動する血球濃度（ＣＭＢＣ）、および赤血球（ＲＢＣ）の速度の変化を示す。正常ラットの乳房組織における血液灌流は、ＥＴ‐１投与後に有意に変化しなかった。正常ラットに比べると、腫瘍ラットの乳房組織における灌流は、ＥＴ‐１投与から３０分後に有意に増加した（１７６％；ｐ＜０．０５）。腫瘍ラットの場合、この灌流の増加は、ＥＴ‐１投与から６０分後および１２０分後にベースラインに戻った。
【００５０】
正常ラットに比べると、腫瘍保有ラットのＣＭＢＣは、ＥＴ‐１投与から６０分後に有意に増加した（５４％；ｐ＜０．０５）。ＣＭＢＣは、ＥＴ‐１投与から１２０分後にベースラインに戻った。正常ラットに比べると、ＲＢＣの速度は、ＥＴ‐１投与から３０分後に有意に増加した（２５２％；ｐ＜０．０５）。腫瘍ラットのＲＢＣの速度は、ＥＴ‐１投与から２時間（１２０分）後にベースラインに戻った（図４Ａ〜４Ｃ）。
【００５１】
別の試験では、正常ラットおよび乳房腫瘍ラットの全身血液動態ならびに乳房組織への血流における、ＥＴ‐１注入により誘導された変化に対するＥＴＢ受容体の役割を評価した。ＢＱ７８８（すなわち、Ｎ‐シス‐２，６‐ジメチルピペリジノカルボニル‐Ｌ‐ガンマ‐メチル‐ロイシル‐Ｄ‐１‐メトキシカルボニルトリプトファニル‐Ｄ‐ノルロイシン）は、ＩＣ５０値が１．２ｎＭであるＥＴＢ受容体への結合を阻害する特異的なＥＴＢ受容体拮抗薬である。そのため、ＢＱ７８８を、乳房腫瘍でＥＴ‐１により誘導される血管拡張におけるＥＴＢ受容体の役割を判定するのに使用した。本試験では、動物を以下の群に分けた点を除いて、先の試験で説明した方法を使用した。
第Ｉ群：生理食塩水で治療した正常ラット（５匹）においてＢＱ７８８（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サニーベール）、０．５ｐｍｏｌ／ｋｇにて生理食塩水に溶解）を２０分間注入した後、ＥＴ‐１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入；および
第ＩＩ群：ＭＮＵで治療した腫瘍保有ラット（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）（５匹）においてＢＱ７８８（０．５ｐｍｏｌ／ｋｇ）を２０分間注入した後、ＥＴ‐１（５０ｎｇ／ｋｇ／分）を３０分間注入。
【００５２】
図５Ａ〜５Ｃはそれぞれ、腫瘍保有ラットおよび正常ラットにおける血液灌流、ＣＭＢＣ、およびＲＢＣの速度における、ＥＴ‐１により誘導された変化に対するＢＱ７８８の効果を示す。正常ラットの乳房組織における血液灌流は、ＢＱ７８８の投与後にもＥＴ‐１の注入後にも有意に変化しなかった。しかし、ＢＱ７８８で事前に治療したラットの場合、腫瘍保有ラットの乳房腫瘍組織における灌流は、ＥＴ‐１注入から３０分後（２５．２５±５．７％；Ｐ＜０．０５）および６０分後（２５．１７±２．８％；Ｐ＜０．０５）に有意に減少した。ＢＱ７８８で事前に治療すると、腫瘍保有ラットにおいてＥＴ‐１により誘導される灌流の増加が緩和された。ＢＱ７８８で事前に治療したラットでは、ＥＴ‐１の投与後に、腫瘍ラットと正常ラットの乳房組織における灌流の間に差が認められなかった。この結果は、ＥＴ‐１により誘導される血管拡張反応がＥＴＢ受容体により媒介されることを示唆している。
【００５３】
腫瘍保有ラットのベースライン時のＣＭＢＣは、正常ラットの乳房組織のベースライン時のＣＭＢＣよりも有意に高かった（４２．４％；Ｐ＜０．０５）が、ＢＱ７８８の注入後には、腫瘍保有ラットと正常ラットのＣＭＢＣの間に差が認められなかった。さらに、２群間のＲＢＣの速度にも差は認められなかった（図５Ａ〜５Ｃ）。
【００５４】
上述の試験は、生理食塩水で治療した正常ラットとＭＮＵで治療した腫瘍保有ラットの全身血液動態ならびに乳房組織への血流に対するＥＴ‐１の効果を示す。ＥＴ‐１は、ＶＥＧＦの産生を促進することにより血管新生を刺激することが知られている。ＥＴ‐１は、乳癌（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｃｈｅｍ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７４：３６３（１９９１））、乳房葉状腫瘍（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５２：４０４６（１９９２））、前立腺癌（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５６：６６３（１９９６））、肝癌（Ｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１６：５１４（１９９５））、およびいくつかの髄膜腫（Ｐａｇｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２０１７（１９９５））などの多くの癌組織で増加することが、試験で明らかにされている。上述の試験は、乳房腫瘍でＥＴ‐１により誘導される血管反応の変化を示す。これらの試験で使用した方法は、全身血液動態および局所血液循環を試験するために十分に確立された放射性ミクロスフェア法であった（Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７３：Ｈ８２７（１９９７）；Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２４：１３７（１９９６）；Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１２６：５５９（１９９５）；Ｇｕｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，５５：８２７（１９９４））。
【００５５】
（実施例３）  パクリタキセルの薬物動態に対するＩＲＬ１６２０の効果
生体内の血流力学を変化させることにより、治療成分の薬物動態に有意な作用を及ぼすことができ、パクリタキセルは複雑な薬物動態学的特性を有することが知られている。例えば、Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：２１１２（１９９６ａ）；Ｇｉａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８７：１１６９（１９９５ｂ）；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ＆Ｒｅｌｌｉｎｇ，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ２７：２５６（１９９４）；Ｈｕｉｚｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１：２１２７（１９９３）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９：１２６１（１９９１）；Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  ７１：５３（１９８７）；Ｗｉｅｍｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：２４８６（１９８７ｂ）を参照されたい。そのため、パクリタキセルの血漿薬物動態に対するＩＲＬ１６２０の影響を理解することが重要である。そのため、現在説明している試験は、選択的なＥＴＢ受容体作動薬であるＩＲＬ１６２０が、乳房腫瘍保有ラットにおけるパクリタキセルの薬物動態を変化させるか否かを判定するために実施した。
【００５６】
本試験には４８日齢（１２０〜１４０ｇ）の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙバージンラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｃｏ．、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用した。到着後すぐに、すべてのラットを、温度（２３±１℃）および湿度（５０±１０％）が制御され、人工光（６時〜１８時）を照射したかごに３匹ずつ収容した。動物には適宜食料と水を与えた。試験は、少なくとも４日間動物を環境に順応させてから実施した。
【００５７】
ＩＲＬ１６２０は、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入し、パクリタキセル（６ｍｇ／ｍＬ溶液）は、Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国オハイオ州ベッドフォード）から購入し、ケタミンおよびキシラジンは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントジョセフ）から購入し、［３Ｈ］‐パクリタキセル（ＩｍＣｉ、６．４Ｃｉ／ｍｍｏｌ、比放射能）は、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国カリフォルニア州）から購入し、ウレタンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００５８】
Ｎ‐メチル‐ｎ‐ニトロソウレア（ＭＮＵ）を５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、ラットを週２回触診した。腫瘍が約７５〜１００ｍｍ３に達したら、薬物動態試験を行った。
【００５９】
ＨＰＬＣ‐ＵＶ試験：ウレタン（１．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国ミズーリ州セントルイス）を単回腹腔内注入して、ラットを麻酔した。右大腿部を除毛し、外科用消毒剤とアルコールで洗浄した。右大腿動脈と静脈を露出させ、滅菌したＰＥ‐５０チューブを挿入した。首を除毛し、外科用消毒剤とアルコールで洗浄した。頸部周辺で正中切開を行い、気管に挿管し、齧歯類用人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州サウスナチック）に接続した。すべての手術は無菌条件下で実施した。感染を予防するため、ネオスポリン抗生物質クリーム（Ｐｆｉｚｅｒ、米国ニュージャージー州モリスプレーンズ）を創傷部に塗布した。薬剤を投与する前に４５分間の回復期間を与えた。
【００６０】
ラットは、正常（生理食塩水で治療した）ラットと腫瘍保有（ＭＮＵで治療した）ラットを使用した。ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）または賦形剤（生理食塩水、３ｍＬ／ｋｇ）を投与してから１５分後に、パクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。ＩＲＬ１６２０の投与前に血液を収集し、ベースライン値を得た。ベースライン時、ならびにパクリタキセル投与から５分後、３０分後、ならびに２時間後、６時間後および１０時間後に、ラットから０．５ｍＬの血液をヘパリンシリンジで採取した。試料を遠心分離して、血漿を採取し、分析まで−８０℃で保存した。
【００６１】
血漿試料中のパクリタキセルは、ＨＰＬＣシステムを使用して分析した。簡潔に言うと、血漿を解凍し、１３×１００のガラス培養チューブで５０μＬの内部標準Ｎ‐シクロヘキシルベンズアミド（３ｍＭ（低検量線）、および３０ｍＭ（高検量線））および３ｍＬのエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国イリノイ州シカゴ）と混合した。この混合物を、往復式振盪培養機を使用して５分間振盪させた後、４℃、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清を１３×１００のホウケイ酸ガラス培養チューブに移して、湯浴（３７℃）中の窒素流下で蒸発させた。残留物を移動相Ａ（５０％の脱イオン水、５０％のアセトニトリル）２００μＬで再構成した。再構成した物質のアリコート１００μＬ（低検量線、および静脈内投与後に収集した試料）を、２２７ｎｍに設定したＷａｔｅｒｓ  ２４８７吸光度検出器に接続したＷａｔｅｒｓ  ２６９５分離モジュールを使用して、４ｍｍのＮｏｖａＰａｋ  ２０×３．９ｍｍのＣ１８プレカラムに注入した後、４ｍｍのＮｏｖａＰａｋ  １５０×３．９ｍｍのＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。１ｍＬ／分の流速で送出する１００％の移動相Ａで線形グラジエントを開始した。次いで、次の注入前にカラムから緩徐に溶出している物質を除去するため、１０分〜１１分後の間に移動相Ａを７０％まで減少させ、１１分〜１６分後の間に移動相Ａを７０％に維持した。その後、１６分〜１７分後まで移動相Ａを１００％に増加させ、３分間移動相Ａを１００％に維持し、合計の実行時間を２０分とした。血漿中のパクリタキセルの濃度は、最小二乗線形回帰および１／ｘによる重み付けを使用して、Ｎ‐シクロヘキシルベンズアミドのピーク面積に対するパクリタキセルのピーク面積の比率から算出した。変動係数で測定した１日以内および数日間の変動性は１０％未満であった。正常ラットと腫瘍保有ラットの血漿濃度プロファイルを比較した。
【００６２】
液体シンチレーション計数試験：ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを単回腹腔内注入して、ラットを麻酔した。首を除毛し、外科用消毒剤とアルコールで洗浄した。右頚動脈を露出させ、滅菌したＰＥ‐５０チューブを挿入した。頸部周辺で正中切開を行い、血液試料を採取するために左頚動脈にＰＥ５０チューブを挿入した。カテーテルの皮下トンネルを形成し、首の付け根で体外に露出させた後、外科用ステープルを使用して切開部を閉鎖した（Ｂｕｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ３７：１２４（２００４））。開放型チューブに釣り糸で栓をした。すべての手術は無菌条件下で実施した。感染を予防するため、ネオスポリン抗生物質クリーム（Ｐｆｉｚｅｒ、米国ニュージャージー州モリスプレーンズ）を創傷部に塗布した。薬剤を投与する前に４５分間の回復期間を与えた。
【００６３】
ＩＲＬ１６２０を腫瘍動物に３ｎｍｏｌ／ｋｇ静脈内投与した。［３Ｈ］‐パクリタキセル（１６０ｕＣｉ／ｋｇ）を非標識パクリタキセルと混合した。ビヒクルまたはＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後に、パクリタキセルを静脈内投与した。
【００６４】
ビヒクルまたはＩＲＬ１６２０の投与前に血漿を収集し、ベースライン値を得た。ベースライン時、１分後、５分後、１５分後および３０分後、ならびに１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後および２４時間後に、ラットから約０．２ｍＬの血液をヘパリンシリンジで採取した。試料を遠心分離して、血漿を分離し、分析まで−８０℃で保存した。
【００６５】
血漿試料中の［３Ｈ］‐パクリタキセルの濃度は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ液体シンチレーションカウンター（モデルＬＳ６５００）を使用して測定した。簡潔に言うと、血漿を解凍し、２０ｍＬの液体シンチレーションカクテルと混合して、試料を計数し、以下の公式を使用して、この数を「ｄｐｍ」単位から「ｆｍｏｌ／ｍＬ」に変換した：
ｆｍｏｌ／ｍＬ＝ｄｐｍ値×崩壊因子×２．２×１０‐１２／１０‐１２×試料容量（ｍＬ）。
【００６６】
ｆｍｏｌ／ｍＬへの変換後、非標識パクリタキセルに対する［３Ｈ］‐パクリタキセルの比率を使用して、全パクリタキセルの薬物動態を算出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ４．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）で実施した非コンパートメント解析とコンパートメント解析の両方を使用して、血漿中のパクリタキセルの薬物動態の推定値を測定した。
【００６７】
非コンパートメント解析では、最後の測定可能濃度（Ｃｌａｓｔ）の台形公式を使用して曲線下領域（ＡＵＣ０‐∞）を予測し、対数線形血漿濃度対時間曲線の末端傾斜（λ）の負数でＣｌａｓｔを除算することにより、無限大に外挿した。また、以下のパラメータも算出した。平均滞留時間（ＭＲＴｉｖ）をλの逆数として算出し、全身クリアランス（ＣＬ）をＡＵＣ０‐∞に対する投与量の比率として算出し、見かけ上の体積分布をＣＬとλの比率として算出した。血漿の半減期は０．６９３（自然対数２）とＭＲＴｉｖの積として算出した。
【００６８】
コンパートメント解析では、一連の非線形コンパートメントモデルを、血漿濃度対時間曲線データに適合させた。具体的には、１コンパートメントモデルと２コンパートメントモデルと３コンパートメントモデルとを比較し、統一データと予測データに基づく重み付けを試験した。モデルの最終選択は、診断プロット（実測値対予測値、および残りのプロット）であるＡｋａｉｋｅ情報基準（ＡＩＣ）とＳｃｈｗａｒｔｚ情報基準（ＳＣ）に基づいて行い、ＡＩＣとＳＣが低いモデルを最終モデルと見なした。
【００６９】
データは、一元配置分散分析（Ｏｎｅ  Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を行った後、ＨＰＬＣ‐ＵＶ試験の場合はＤｕｎｃａｎ検定を、液体シンチレーション試験の場合はｔ検定を行うことにより分析し、ｐ＜０．０５を有意と見なした。これらの薬理反応試験で測定した主な結果は、血漿中のパクリタキセルの濃度差であった。
【００７０】
正常ラットまたは腫瘍保有ラットのいずれにおいても、パクリタキセルの薬物動態プロファイルは、ＩＲＬ１６２０の投与（図６および図７）による影響を受けなかった。血漿の薬物動態プロファイルのＨＰＬＣ分析は、放射性パクリタキセルのより広範囲なプロファイルと類似している。図７は、ビヒクルで治療した腫瘍保有ラットとＩＲＬ１６２０で治療した腫瘍保有ラットにおけるパクリタキセル放射能の薬物動態プロファイルを示す。薬物動態プロファイルは、非コンパートメント解析法とコンパートメント解析法によって分析した。
【００７１】
非コンパートメント解析では、ビヒクル＋パクリタキセル群の算出したＡＵＣが、９４３３．５３±１４６５．００ｎｇ＊時間／ｍＬであり、ＩＲＬ１６２０で治療した腫瘍ラットのＡＵＣと類似していた（ｐ＞０．０５）。排出半減期は０．１４±０．０８時間として算出した。投与量／ＡＵＣとして算出したクリアランスは、０．５６±０．０７Ｌ／時／ｋｇと推定された。クリアランス／Ｋｅｌとして算出した分布容積は、１０．１１±４．１７Ｌ／ｋｇであった。全体としては、以下の表から分かるように、ＩＲＬ１６２０は、パクリタキセルの薬物動態プロファイルに影響を及ぼさなかった。
【００７２】
【化１】
2009545609.tif 000003
血漿中のパクリタキセルの濃度は、血漿試料中のｄｐｍ数から算出した。３コンパートメントモデルが、パクリタキセルの薬物動態を最も良く示した。図８は、ビヒクルで治療したラットとＩＲＬ１６２０で治療したラットの両方について観察した薬物動態と予測した薬物動態のプロットを示す。ビヒクルで治療したラットにおけるパクリタキセルのＡＵＣは、９．４２±３．１８μｇ‐時／ｍＬであった。定常分布容積（Ｖｓｓ）は、１０．３１±４．５４Ｌ／Ｋｇであった。クリアランスは、０．６９±０．１７Ｌ／時／Ｋｇと推定した。αｔ1/2、βｔ1/2、γｔ1/2は、それぞれ０．０３±０．０１時間、１．０±０．３２時間、および２５．８７＋１７．８１時間であった。平均滞留時間は、２７．９２±１９．８４時間であった。以下の表から分かるように、ＩＲＬ１６２０治療群で推定されたこれらのパラメータは、ビヒクル治療群のパラメータとの有意な差は見られなかった。
【００７３】
【化２】
2009545609.tif 000004
本試験では、３コンパートメントモデルが、血漿中のパクリタキセルの薬物動態を最も良く示した。このモデルは、臓器中の血液灌流が高いか、中程度であるか、低いかにかかわらず、パクリタキセルが種々の臓器に分布することを示唆している。ＩＲＬ１６２０の投与によって、パクリタキセルの分布が変化することはなかった。３コンパートメントモデルで生成した血漿の薬物動態パラメータは、ビヒクル治療群とＩＲＬ１６２０治療群で同等のクリアランス、分布容積および吸収体積、ならびに分布半減期および排出半減期を示した。しかし、ＩＲＬ１６２０は、腫瘍の血液灌流と腫瘍のパクリタキセル濃度を増加させる（Ｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００４）；Ｒａｉ＆Ｇｕｌａｔｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５１：２１（２００３））。そのため、ＩＲＬ１６２０は、パクリタキセルの薬物動態プロファイルを大きく変化させることなく、腫瘍の灌流を選択的に増加させる。
【００７４】
これらの試験は、ＩＲＬ１６２０を使用してもパクリタキセルの薬物動態に影響を及ぼすことがないことを示している。多くの場合、薬物動態は、化合物の安全性の代わりになるものと考えることができる。そのため、これらの結果はまた、ＩＲＬ１６２０の投与によってパクリタキセルの安全性が変化することがないことも示唆している。この結果、ＩＲＬ１６２０を使用することで、パクリタキセルの有効性を改善し、重度の毒性を最小限に低減するために適切な用量を滴定することができると考えられる。
【００７５】
（実施例４）  ＩＲＬ１６２０の用量応答効果、主要組織および腫瘍組織における［３Ｈ］パクリタキセルの生体内分布に対するＩＲＬ１６２０の効果、ならびに腫瘍状態でのパクリタキセルの有効性に対するＩＲＬ１６２０の効果
本実施例で説明する試験は、（ａ）正常ラットと腫瘍保有ラットの乳房灌流に対するＥＴＢ受容体作動薬ＩＲＬ１６２０の用量応答効果、（ｂ）主要組織および腫瘍組織における［３Ｈ］パクリタキセルの生体内分布に対するＩＲＬ１６２０の効果、ならびに（３）ＭＮＵにより誘導された乳房腫瘍保有ラットの腫瘍状態でのパクリタキセルの有効性に対するＩＲＬ１６２０の効果を詳細に評価するために設計した。
【００７６】
４０日齢の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙバージンラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ウィスコンシン州マディソン）を購入し、温度を２３±１℃に制御したかごに２匹ずつ収容し、１２時間間隔の明暗スケジュールで維持した。これらのラットには適宜水と標準の齧歯類用食料を与えた。
【００７７】
ＩＲＬ１６２０は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。［３Ｈ］パクリタキセルは、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国カリフォルニア州ブレア）から購入し、パクリタキセル（６ｍｇ／ｍＬ溶液）は、Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国オハイオ州ベッドフォード）から購入し、ケタミンおよびキシラジンは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントジョセフ）から購入し、組織可溶化剤（ＴＳ‐２）は、ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ．（米国イリノイ州シカゴ）から購入した。
【００７８】
生後４８日に、各動物に５０ｍｇ／ｋｇの用量のＮ‐メチルニトロソウレア（ＭＮＵ、Ａｓｈ  Ｓｔｅｖｅｎｓ、米国ミシガン州デトロイト）を単回腹腔内注入した。ＭＮＵを３％の酢酸に溶解して、０．９％のＮａＣｌに希釈し（最終濃度１２．５ｍｇ／ｍＬ）、調製から３０分内に投与した。この治療により、発癌物質治療を行ってから約１００日目に、ラットにおけるほぼ１００％の乳腺腺癌の発症率が引き起こされる（Ｍｅｈｔａ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，３６：１２７５（２０００））。腫瘍の出現および箇所を、乳腺触診によって監視し、デジタルカリパスで腫瘍表面を測定した。本試験では、５００〜８００ｍｍ３の腫瘍を有するラットを選択した。
【００７９】
灌流試験：ラットの乳房組織および腫瘍への灌流は、記述の通り、Ｐｅｒｉｆｌｕｘ  ＰＦ２ｂ  ４０００レーザードップラー流量計（Ｐｅｒｉｍｅｄ、スウェーデン  ストックホルム）を使用して測定した。簡潔に言うと、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を単回腹腔内併用注入薬として使用し、ラットを麻酔した。乳首周辺の体毛を除毛し、温度変化を最小限にするために、動物を加温パッド（３７℃）の上に置いた。乳腺周囲の皮膚を幅約６ｍｍ×長さ約４ｍｍに切開した。標準モデルの光ファイバープローブ（ＭＰ３流量プローブ、Ｍｏｏｒｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国デボン州）を露出した組織の表面に設置した後、これをＰｅｒｉｆｌｕｘ  ＰＦ２ｂ  ４０００レーザードップラー流量計に接続した。時定数を１．５秒に設定し、帯域幅を４ｋＨｚに設定した。本方法によりレーザー光（束）におけるドップラー偏移が測定されるが、これは、赤血球の数と速度によって決定され、所与の組織容積における総血流に比例する。流束値はＰｏｌｙｖｉｅｗソフトウェアを使用して得た。生理食塩水またはＩＲＬ１６２０の投与前に、安定した記録による１５分間のベースラインを得た。動物に１ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与し、灌流を３時間記録した。各投与量を少なくとも４匹の動物に投与した。
【００８０】
腫瘍灌流に対するＩＲＬ１６２０の投与の効果は、一時的なものであり、投与量と関連があることが明らかになった（図９Ａ）。３ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与してから３０分後に、ベースラインから最大２４４．０％（ｐ＜０．００１）の腫瘍灌流の増加が認められた。ベースライン時、ならびに生理食塩水で治療したラットに比べると、１５分後、３０分後および６０分後における灌流の増加は有意であった（図９Ａおよび９Ｂ）。また、ベースライン時の灌流、ならびに生理食塩水で治療したラットの灌流に比べると、１ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与しても、乳房腫瘍の灌流にはわずかな増加しか生じなかった。１ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与してからそれぞれ１２０分後および３０分後には、最大の灌流増加（６０．９％および６３．３％）が記録された。しかし、生理食塩水で治療したラットに比べると、９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０で治療した動物では、１５分後、３０分後および６０分後に灌流の増加が有意なものであった（図９Ａ）。ベースライン時に比べると、腫瘍保有ラットに生理食塩水を投与しても、血液灌流の有意な変化は全く生じなかった（図９Ａ）。また、生理食塩水、または１ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇもしくは９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与しても、雌の正常ラットにおける乳房灌流には有意な変化が全く生じなかった。（データ図示なし）。
【００８１】
これらの結果は、ベースライン時ならびにビヒクルで治療したラットに比べると、３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与することで、腫瘍灌流が増加することを示している。１ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０のいずれを投与しても腫瘍灌流はいくらか増加するが、３ｎｍｏｌ／ｋｇを投与した場合に最大の効果が生じる。
【００８２】
生体内分布試験：既述のように腫瘍が形成された後に、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内併用注入薬として使用し、ラットを麻酔した。ラットの体重、腫瘍箇所および腫瘍容積を記録した後、動物を無作為にグループ分けし、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）のいずれかを最終容積０．２ｍＬにて尾静脈を介して投与した。次いで、ＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後、１２０分後および２４０分後に、［３Ｈ］パクリタキセル（５０：５０のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール中４０μＣｉ／匹）を最終容積１．０ｍＬにて各群のラットに投与した。各時点で６匹のラットを試験し、合計３６匹のラットを使用した。［３Ｈ］パクリタキセルを投与してから３時間後に、動物を屠殺し、腫瘍組織、腎臓、肝臓、肺および脾臓における［３Ｈ］パクリタキセルの濃度を測定した。具体的には、腫瘍および臓器を小片にスライスし、約５００ｍｇの組織または腫瘍を、組織可溶化剤（６ｍＬ）を含有する個別のバイアルに入れて、５０℃の水浴中でインキュベートした。組織または腫瘍が溶解したら、水浴からバイアルを取り出し、１０％の氷酢酸１．２ｍＬを添加した。バイアルの内容物を３つのバイアルに均等に分け、１５ｍＬの液体シンチレーションカクテル（Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｏｌｖｅ、ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ、米国イリノイ州シカゴ）を各バイアルに添加し、一晩平衡状態に維持した。そしてチューブ内の放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＬＳ  ６５００）を使用して計数した。
【００８３】
生理食塩水で治療したラットに比べると、ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）で治療したラットにおいて、腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が有意に増加した。パクリタキセル投与群では、ＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後に最大の効果が認められた。ＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後、１２０分後および２４０分後にパクリタキセルを投与すると、腫瘍中のパクリタキセルの濃度がそれぞれ２７７．１％、１５１．９％および３４．７％増加した（図１０）。対照動物に比べると、ＩＲＬ１６２０を投与しても、肝臓、肺、腎臓および脾臓におけるパクリタキセルの蓄積が有意に変化することはなかった（図１０）。
【００８４】
有効性試験：腫瘍保有（ＭＮＵで治療した）動物を以下の７群に無作為にグループ分けした（１群当たり１２匹）：
第Ｉ群：生理食塩水；
第ＩＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）；
第ＩＩＩ群：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール；
第ＩＶ群：ビヒクル（生理食塩水）＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）；
第Ｖ群：ビヒクル（生理食塩水）＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）；
第ＶＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）；および
第ＶＩＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）。
【００８５】
投与スケジュールは、３日に１回、合計５回の投与であった。最後の投与を行ってから３日毎に合計３０日間、体重、腫瘍サイズおよび腫瘍箇所を監視した。スコアリングには以下のカテゴリーを使用した：「進行」：治療開始時に比べて腫瘍の面積が４０％超増大している；「静止」：治療過程全体を通して腫瘍が初発時の面積から４０％を超えて変動していない；「部分再生」：腫瘍が初発時の面積から４０％を超えて退縮した；「完全寛解」：腫瘍がもはや触知または測定できない；「腫瘍多発」：治療中および３０日間の観察期間中に新規腫瘍が発生する。最後（５回目）の投与から３０日後に、動物を屠殺した。分散分析を使用してデータを分析した後、Ｄｕｎｃａｎ試験を行い、Ｐ＜０．０５レベルを有意と見なした。
【００８６】
体重：図１１には、ベースライン（治療開始前）から最後の投与より３０日後までの動物の体重差の割合を示す。生理食塩水で治療した対照ラットの試験終了時点における体重の増加率は、ベースライン時の体重に比べて７．２±１．７％であった。ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）、ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物群では、それぞれ５．１±３．６％、９．４±２．４％、１４．３±３．１％、および１３．１±１．８％の体重増加が見られた（図１１）。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノールおよびＩＲＬ１６２０を投与された動物の体重の、ベースライン時と比較した増加率は、１０％未満であった（データ図示なし）。
【００８７】
腫瘍容積：種々の群の腫瘍サイズは、治療開始時点では互いに類似しており、有意差がなかった（図１２）。対照ラットの腫瘍容積は急速かつ可変速度で増加した。腫瘍増殖の大きな変動は、特発的に増殖する腫瘍の不規則な増殖パターンに起因する可能性がある。３０日間の観察期間が終了した時点で、対照腫瘍は、２６９３．４±７９０．９ｍｍ３の腫瘍容積を有していた。ＩＲＬ１６２０で治療したラットも、最終腫瘍容積が２５６０．５±８４４．４ｍｍ３となる類似の発症パターンを有していた。また、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノールで治療した場合も、最終腫瘍容積が２３３８±１３２９ｍｍ３となる類似の増殖パターンを生じた。そのため、ＩＲＬ１６２０を投与しても、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ｅｌ：エタノールを投与しても、それ自体がＭＮＵにより誘導された乳房腫瘍の増殖に対して有意な効果を示すことはなかった（データ図示なし）。ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットは、腫瘍サイズの拡大にわずかな減少を示した（１９６０．８±６１１．９ｍｍ３）。ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群は、対照ラットに比べて大幅な腫瘍容積の減少（１６８２．７±４９７．３ｍｍ３）を示した。また、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットも、腫瘍サイズの減少を示した（１７０７．２±６２１．１ｍｍ３）。それに対し、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物群では、平均腫瘍サイズの最低の減少（７３０．１±２１９．４ｍｍ３）が認められた。ＩＲＬ１６２０の投与後に５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを３日毎に合計５回投与すると、生理食塩水＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットに比べて、腫瘍容積が有意に（ｐ＜０．０５）減少した（図１２）。また、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）投与群では、ＩＲＬ１６２０またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノールのいずれかで治療したラットに比べて、腫瘍容積が少ないことが明らかになった（データ図示なし）。
【００８８】
腫瘍多発：すべての治療群の動物は、３０日間の観察期間が終了した時点までに新規腫瘍を発生した。生理食塩水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール、およびＩＲＬ１６２０で治療した動物では、新規腫瘍出現がそれぞれ５８．４％、５７．１％および６０．８％増加した。ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）を投与された両動物における新規腫瘍発生率は、それぞれ７８．３％および４１％であった。それに対し、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）の両投与群の新規腫瘍率は、それぞれ６９．２％および４４．８％であった（データ図示なし）。
【００８９】
腫瘍進行：進行、静止、退縮または消滅した腫瘍の割合を、既述の通りに算出した。生理食塩水治療群の腫瘍の７３．５％が、初発時の腫瘍サイズから４０％を超えて進行した。ＩＲＬ１６２０（８２．７％）およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール（８０．４％）治療群では、初発時の腫瘍サイズから４０％を超えて進行した腫瘍の割合が類似していた。ビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群（７１．４％）、ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群（６１．１％）、およびＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群（６９％）では、進行した腫瘍の割合が前述の治療群よりも低かったが、割合が最低（４０％）であったのは、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）群であった（図１３）。
【００９０】
腫瘍静止：生理食塩水で治療したラットの腫瘍の１６．９％が、静止状態を維持し、３０日間が終了する時点までに４０％の範囲を超えて増殖することがなかった。その他の対照群では、静止状態を維持した腫瘍の割合がこれよりも若干低かった：ＩＲＬ１６２０（１３．７％）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール（１５．２％）。ビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２２．２％）およびビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（１９．５％）で治療したラットでは、静止状態を維持した腫瘍の割合が高かった。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２３．８％）およびＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（２６．６％）で治療したラットで、静止状態を維持した腫瘍の割合が最も高かった（図１３）。
【００９１】
腫瘍退縮：５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルの前にＩＲＬ１６２０を投与すると、対照動物に比べて腫瘍の進行が有意に減少した。生理食塩水で治療したラットでは、９．２％の腫瘍が初発時の腫瘍容積から退縮した。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール（４．３％）、ＩＲＬ１６２０（３．４％）、およびビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（９．５％）で治療したラットは、退縮した腫瘍の割合において対照群との有意差が見られなかった。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットでは、対照ラットに比べて、５回目の投与の終了時点で腫瘍がそれぞれ７６．１±１０．５％および４５．９±１１．５％退縮した。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物では、それぞれ８０．２±６．９％（ｐ＜０．０５）および３３．８±１９．４％の退縮が見られた（図１３）。ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）群の腫瘍退縮率は、それぞれ４７．１±１５．４％および３７．７±１６．２％であることが明らかになった。ＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後にパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を投与すると、生理食塩水を投与してから１５分後にパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合に比べて、より有意な腫瘍退縮が生じた。いずれの時においても、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ｅｌ：エタノールおよびＩＲＬ１６２０治療群では、対照ラットに比べて腫瘍退縮に有意差が見られなかった（データ図示なし）。
【００９２】
腫瘍寛解：腫瘍が完全に消滅した完全退縮は、ＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇ）（２．３％）およびＩＲＬ１６２０＋パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）（１５％）で治療したラットの２つの群でしか認められなかった（図１３）。
【００９３】
これらの有効性試験の結果は、ＩＲＬ１６２０を投与すると、生理食塩水で治療したラットにパクリタキセルを投与した場合に比べて、パクリタキセルにより誘導された腫瘍容積の減少が有意に増大することを示している。５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルの投与で見られる治療効果の増大は、最後の投与を行ってから３０日後まで維持された。このことは、腫瘍容積増大の再発がなく、パクリタキセルの有効性を増強するＩＲＬ１６２０の効果が、試験の終了まで一定に維持されたことを示している。しかし、生理食塩水で治療した後にパクリタキセル（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）で治療すると、このような腫瘍増殖の有意な変化が生じなかった。さらに、ＩＲＬ１６２０で治療した後にパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラット群では、腫瘍多発が減少した。そのため、パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）の前にＩＲＬ１６２０を投与すると、パクリタキセルの有効性に対する有意な効果が認められる。このことは、腫瘍量、腫瘍退縮の割合、変化のない体重および多発の減少により例証される。さらに、ＩＲＬ１６２０で治療した後にパクリタキセル１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇで治療した動物群では、その他いずれの群と比べても、それぞれ２．３％および１５％の初発時の腫瘍の完全寛解が見られた。
【００９４】
これらの実施例で説明した乳房腫瘍モデルの試験では、ＥＴＢ受容体作動薬であるＩＲＬ１６２０が腫瘍の血流を有意に増加させることが明確に示されている。ＩＲＬ１６２０を投与することにより、腫瘍の血流が増加したのに対して、対照の正常組織の灌流は変化しなかった。腫瘍灌流の増加は３時間持続した。高灌流期間中に［３Ｈ］パクリタキセルを投与すると、［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が腫瘍組織でのみ有意に増加するが、他の臓器では増加しなかった。さらに、本実施例で説明した試験の結果からは、ＩＲＬ１６２０を投与するとパクリタキセルの制癌効果が促進される証拠が得られている。対照ラットに比べると、パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を３日毎に合計５回投与することにより治療したラットの腫瘍容積は、６０．０％減少した。しかし、パクリタキセルを最後に投与してから１ヵ月間記録を取った結果、ＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後にパクリタキセルを投与すると、対照ラットに比べて腫瘍容積が２６８．９％減少した。ＩＲＬ１６２０を投与したラットでは、パクリタキセルのみで治療したラットに比べて、腫瘍容積が１３０．４％減少した。腫瘍の灌流が増加すると、栄養物質が入手しやすくなり、これらの栄養物質が腫瘍の増殖を促進する可能性がある。こうした結果は、ＩＲＬ１６２０で治療したラットの腫瘍容積と腫瘍多発には、生理食塩水で治療したラットに比べて有意な増加が見られず、ＩＲＬ１６２０のみを投与しても腫瘍容積と腫瘍多発に効果がもたらされなかったことを示している。
前立腺腫瘍モデル
（実施例５）  前立腺腫瘍の灌流、生体内分布、ならびにドキソルビシンおよび５‐フルオロウラシルの有効性に対するＩＲＬ１６２０の効果
ＩＲＬ１６２０が乳房腫瘍モデルでパクリタキセルの有効性を増強できることを実証したことを受けて、前立腺腫瘍モデルにおけるＩＲＬ１６２０の効果も検証した。具体的には、ＩＲＬ１６２０が前立腺癌腫瘍モデルでドキソルビシン（ＤＯＸ）および５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）の制癌効果を増強できるかどうかを検証した。
【００９５】
以下に説明する前立腺腫瘍モデル試験では、体重１００〜１２０グラムの５週齢の前立腺腫瘍保有コペンハーゲンラット（Ｈａｒｌａｎ、米国インディアナ州インディアナポリス）を選択した。動物施設は、温度（２３±１℃）および湿度（５０±１０％）の制御下にて、１２時間間隔の明暗スケジュール（照明６時〜１８時）で維持した。ラットをおりに３匹ずつ収容し、適宜食料と水を与えた。動物試験および試験開始前にラットが少なくとも１週間環境に順応するようにした。すべての手術および動物の管理は、イリノイ大学シカゴ校の動物ケア委員会が設定したガイドライン基づいて行った。動物施設は連邦規制に基づいて維持し、米国実験動物管理認定協会の認定を受けた。
【００９６】
ＩＲＬ１６２０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（米国カリフォルニア州サニーベール）から購入し、［１４Ｃ］塩酸ドキソルビシン（［１４Ｃ］アドリアマイシン）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（英国バッキンガムシャー州）から購入し、ケタミンおよびキシラジンは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントジョセフ）から購入した。組織可溶化剤（ＴＳ‐２）は、ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ．（米国イリノイ州シカゴ）から入手した。
【００９７】
ＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス）から入手したＪＨＵ‐４（ＭＡＴ‐ＬｙＬｕ）細胞を使用して、雄コペンハーゲンラットで前立腺腫瘍を誘導した。参考として本明細書で援用されるＧａｄｄｉｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ，４（３）：２０３‐１２（２００４）を参照されたい。これらの細胞を、３７℃にて５％のＣＯ２を含有する加湿インキュベーターで、ウシ胎仔血清（１０％）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。首の背側から体毛を除毛し、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水中の１０，０００個のＪＨＵ‐４（ＭＡＴ‐ＬｙＬｕ）細胞を、動物に皮下（ｓ．ｃ．）注入して接種した。腫瘍の出現と箇所を触診により監視し、デジタルカリパスで腫瘍直径を測定した。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に達したら、試験手順を開始した。
【００９８】
灌流試験：ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）併用注入薬として使用して、ラットを麻酔した。腫瘍部位周辺の体毛を除毛し、温度変化を最小限にするために、動物を加温パッド（３７℃）の上に置いた。腫瘍組織周囲の皮膚を幅約３ｍｍ、長さ約３ｍｍ切り離し、腫瘍を露出させた。Ｐｅｒｉｆｌｕｘ  ＰＦ２ｂ  ４０００レーザードップラー流量計（ＭＰ３流量プローブ、Ｍｏｏｒｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国デボン州）に接続した標準モデルの光ファイバープローブを、露出した腫瘍の表面に設置した。時定数を１．５秒に設定し、帯域幅を４ｋＨｚに設定した。本方法によりレーザー光（束）におけるドップラー偏移が測定されるが、これは、赤血球の数と速度によって決定され、所与の組織容積における総血流に比例する。流束値はＰｏｌｙｖｉｅｗソフトウェアを使用して得た。生理食塩水またはＩＲＬ１６２０の投与前に、安定した記録による１５分間のベースラインを得た。動物にＩＲＬ１６２０（１ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは６ｎｍｏｌ／ｋｇ）を最終容積０．２ｍＬにて尾静脈を介して投与し、灌流を３時間記録した。
【００９９】
図１４Ａおよび図１４Ｂから分かるように、生理食塩水または１ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与しても、腫瘍保有ラットの腫瘍の血液灌流に有意な変化は全く生じなかった。３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは６ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与すると、ベースラインからそれぞれ１０２．８％および７９．１２％という腫瘍血液灌流の最大の増加が生じた。この灌流の増加は、ベースライン時および生理食塩水で治療したラットに比べて１５分後、３０分後および６０分後に有意であった（ｐ＜０．００５）。そのため、ＩＲＬ１６２０を適切に投与すると、前立腺癌動物モデルの腫瘍の血液灌流が一時的に増加する。
【０１００】
生体内分布試験：腫瘍保有ラットを無作為にグループ分けし（１群当たり６匹）、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０（１ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは６ｎｍｏｌ／ｋｇ）を最終容積０．２ｍＬにて尾静脈を介して投与した。次いで、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後に、［１４Ｃ］ドキソルビシン（１μＣｉ／匹）を最終容積１．０ｍＬにて各群のラットに静脈内投与した。次いで、［１４Ｃ］ドキソルビシンを投与してから３時間後に、動物を屠殺し、腫瘍、心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、骨髄、前立腺、骨格筋および脾臓における［１４Ｃ］ドキソルビシンの濃度を検証した。具体的には、腫瘍および臓器を小片にスライスし、両脚の大腿骨を分離して計量し、組織可溶化剤を含有するシリンジを使用して骨髄を洗浄した。約５００ｍｇの組織または腫瘍を、組織可溶化剤（６ｍＬ）を含有する個別のバイアルに入れて、５０℃の水浴中でインキュベートした。組織または腫瘍が溶解したら、水浴からバイアルを取り出し、１０％の氷酢酸１．２ｍＬを添加した。次いで、バイアルの内容物を３つのバイアルに均等に分け、１５ｍＬの液体シンチレーションカクテル（Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｏｌｖｅ，ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ、米国イリノイ州シカゴ）を各バイアルに添加し、一晩平衡状態に維持した。そしてチューブ内の放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＬＳ  ６５００）を使用して計数した。
【０１０１】
図１５から分かるように、１ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０を投与しても、腫瘍またはその他の組織における［１４Ｃ］ドキソルビシンの摂取量が有意に変化することはなかった。しかし、３ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０（増加率１１５．８５％；ｐ＜０．０１）または６ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＲＬ１６２０（増加率８０．０２％；ｐ＜０．０５）を投与したラットでは、生理食塩水で治療したラットに比べて、腫瘍中の［１４Ｃ］ドキソルビシンの濃度が有意に増加した。ＩＲＬ１６２０を投与しない場合には、対照動物に比べて、心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、骨髄、前立腺、骨格筋または脾臓における［１４Ｃ］ドキソルビシンの蓄積が有意に増加しなかった。そのため、ＩＲＬ１６２０は、腫瘍組織への化学療法薬の送達を選択的に増加させることができる。
【０１０２】
有効性試験：ドキソルビシン（ＤＯＸ）の有効性に対するＩＲＬ１６２０の効果
本試験では、ＩＲＬ１６２０（Ｎ‐スクシニル‐［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］エンドセリンフラグメント８〜２１）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（米国カリフォルニア州サニーベール）から入手した。塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン、２ｍｇ／ｍＬ溶液）は、Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国オハイオ州ベッドフォード）から購入し、５‐フルオロウラシル（５０ｍｇ／ｍＬ）は、Ｃａｄｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（インド  アーメダバード）から購入し、ケタミンおよびキシラジンは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントジョセフ）から購入した。
【０１０３】
既述の通りに、５週齢の雄コペンハーゲンラット（Ｈａｒｌａｎ、米国インディアナ州インディアナポリス）で前立腺腫瘍を誘導した。腫瘍サイズが２００ｍｍ３に達したら、試験手順を開始した。腫瘍保有動物を以下の６群に無作為にグループ分けした（１群当たり８匹）：
第Ｉ群：生理食塩水；
第ＩＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）；
第ＩＩＩ群：ビヒクル（生理食塩水）＋ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）；
第ＩＶ群：ビヒクル（生理食塩水）＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）；
第Ｖ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）；および
第ＶＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）。
【０１０４】
ＤＯＸを最終容積１．０ｍＬにて生理食塩水中に希釈し、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後に尾静脈を介して注入した。投与スケジュールは、３日に１回、合計４回であった。最後の投与を行ってから１２日後まで３日毎に体重および腫瘍サイズを監視した。最後（４回目）の投与から１２日後に、動物を屠殺し、腫瘍を分離して計量し、全体に転移がないか組織を観察した。組織および腫瘍を病理組織学分析のために１０％の緩衝ホルマリン中に保存した。
【０１０５】
体重：生理食塩水またはＩＲＬ１６２０のみで治療したラット群では、体重の増加が見られた。生理食塩水またはＩＲＬ１６２０のみで治療した動物の試験開始始時の体重は、それぞれ１５２±６．９７ｇおよび１４８．８±２．５２ｇであり、試験１９日目にはこれらがそれぞれ１７８．８±４．７ｇおよび１７５．７２±２．３５ｇに増加した。生理食塩水およびＤＯＸ、またはＩＲＬ１６２０およびＤＯＸを投与したラットでは、体重の減少が見られた。最も体重が減少したのは、生理食塩水＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）およびＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラット群であり、それぞれ１３日目に−８．４６±３．８８ｇおよび−１０．０３±２．１２ｇであることが明らかになった。しかし、治療開始からＤＯＸを投与された群ではすべて、いずれの時点においても体重の減少が有意でないことが明らかになった（図１６Ａ）。
【０１０６】
腫瘍容積：生理食塩水またはＩＲＬ１６２０で治療したラットの腫瘍容積は急速に増加し、これらの群のラットはすべて腫瘍量の増大により１９日目に屠殺した。その他の群はすべて２２日目に屠殺した。生理食塩水またはＩＲＬ１６２０で治療したラットは、屠殺時の腫瘍容積がそれぞれ１０１６６±９５７ｍｍ３および１１０３３±８７３ｍｍ３であった。生理食塩水＋ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）および生理食塩水＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットの腫瘍容積は、それぞれ９１０２±１４４２ｍｍ３および４２０４±２９９ｍｍ３であることが明らかになった。ＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットは、５５４４±８４５ｍｍ３の腫瘍容積を記録した。最低の腫瘍容積（１９６５±３３２ｍｍ３）は、ＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラット群で認められた。ＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットでは、生理食塩水＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットに比べて、１０日目、１３日目、１６日目、１９日目および２２日目における腫瘍容積の減少が有意であることが明らかになった（図１６Ｂ）。
【０１０７】
腫瘍重量：生理食塩水、ＩＲＬ１６２０、および生理食塩水＋ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットは、屠殺時の腫瘍重量が類似していた（それぞれ１９．１４±１．８ｇ、２０．７７±１．６４ｇ、および１７．１４±２．４２ｇ）。生理食塩水＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットの腫瘍重量は、２２日目の屠殺時にそれぞれ７．１９±０．５６ｇ、１０．４４±１．４２ｇ、および３．３１±１．６４ｇに減少した。生理食塩水＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットとＩＲＬ１６２０＋ＤＯＸ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットの間では、腫瘍重量に有意差が見られた（ｐ＜０．００５）。これらの試験は、ＩＲＬ１６２０がＤＯＸの制癌効果を有意に増加させたことを示している（図１６Ｃ）。
【０１０８】
有効性試験：５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）の有効性に対するＩＲＬ１６２０の効果
追跡調査では、５‐ＦＵの有効性に対するＩＲＬ１６２０の効果を検証するために、同じ手順を使用したが、但し、腫瘍保有ラットは以下の６群に無作為に割り付けた（１群当たり６匹）：
第Ｉ群：生理食塩水；
第ＩＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）；
第ＩＩＩ群：ビヒクル（生理食塩水）＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）；
第ＩＶ群：ビヒクル（生理食塩水）＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）；
第Ｖ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）；および
第ＶＩ群：ＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）。
【０１０９】
５‐ＦＵを最終容積１．０ｍＬにて生理食塩水中に希釈し、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後に尾静脈を介して注入した。投与スケジュールおよび手順は、前述のＤＯＸ試験と同じであった。
【０１１０】
体重：生理食塩水またはＩＲＬ１６２０で治療した動物の試験開始時の体重は、それぞれ１７２±４．８７ｇおよび１７６．９±６．１９ｇであり、１６日目にはこれらがそれぞれ２００．３±２．５７ｇおよび２０２．２±７．２８ｇに増加した。生理食塩水またはＩＲＬ１６２０で治療した動物の試験開始から１６日目における体重増加率の差は、それぞれ１６．１７±１．６４および１４．１９±１．６６であることが明らかになった。その他の群のラットの体重は、治療開始時に類似しており、生理食塩水＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群が１７０．３８±２．６１ｇ、生理食塩水＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）投与群が１７４．６±３．４５ｇ、ＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群が１７４．７±５．７８ｇ、ＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）投与群が１７９．４５±２．５３ｇであった。しかし、治療期間中に体重は以下の量減少した：生理食塩水＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群：−５．４６±３．３９ｇ、生理食塩水＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）：−１０．９７±２．１８ｇ、ＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群：−８．２７±２．３１ｇ、およびＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）投与群：−１１．２０±２．４１ｇ（図１７Ａ）。
【０１１１】
腫瘍容積：生理食塩水またはＩＲＬ１６２０で治療したラットでは、腫瘍サイズが急速かつ漸進的に増大し、これら群のラットはすべて腫瘍量の増大により１６日目に屠殺した。生理食塩水＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットとＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットの間では、腫瘍サイズに有意差が見られなかった。しかし、ＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットでは、生理食塩水＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットに比べて、１３日目、１６日目、１９日目および２２日目に腫瘍容積の一定の有意な減少が見られた（図１７Ｂ）。
【０１１２】
腫瘍重量：生理食塩水またはＩＲＬ１６２０を投与したラットでは、１６日目の屠殺時に腫瘍重量の有意差が見られなかった（重量はそれぞれ１７．９２±２．０１ｇおよび１９．５０±２．３７ｇ）。ＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットでは、生理食塩水＋５‐ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物に比べて、腫瘍重量が３８．１８％減少した。さらに、ＩＲＬ１６２０＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットと生理食塩水＋５‐ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）で治療したラットの間では、腫瘍重量に１６７．１９％の差があった（ｐ＜０．０１）（図１７Ｃ）。これらの結果は、腫瘍容積と腫瘍重量を減少させる５‐ＦＵの効果をＩＲＬ１６２０が有意に増加させることを示している。
【０１１３】
これらの試験は、ＩＲＬ１６２０が、前立腺癌動物モデルにおいて腫瘍の血液灌流を増強し、腫瘍への化学療法薬の送達を増加させ、化学療法薬の有効性を増強するのに有効であることを総合的に実証している。
黒色腫モデル
（実施例６）  腫瘍灌流およびパクリタキセルの生体内分布に対するＩＲＬ１６２０の効果
以下に説明する黒色腫モデル試験では、雄のヌードマウスを使用した。すべての手術および動物の管理は、イリノイ大学シカゴ校の動物ケア委員会が設定したガイドライン基づいて行った。動物施設は、温度（２３±１℃）および湿度（５０±１０％）の制御下にて、人工光（照明６時〜１８時）を照射して維持した。動物施設は連邦規制に基づいて維持し、米国実験動物管理認定協会の認定を受けた。
【０１１４】
ＩＲＬ１６２０（Ｎ‐スクシニル‐［Ｇｌｕ９、Ａｌａ１１，１５］エンドセリンフラグメント８〜２１）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。［３Ｈ］パクリタキセルは、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国カリフォルニア州ブレア）から購入し、パクリタキセル（６ｍｇ／ｍＬ溶液）は、Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国オハイオ州ベッドフォード）から購入し、ケタミンおよびキシラジンは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントジョセフ）から購入した。組織可溶化剤（ＴＳ‐２）は、ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ．（米国イリノイ州シカゴ）から入手した。
【０１１５】
本試験では、細胞株を接種した移植黒色腫モデルを使用した。マウスは１００万個のヒトメラノーマ細胞（ＵＩＳＯ‐ＭＥＬ‐２）を皮下接種した。本試験には、腫瘍容積が２００〜４００ｍｍ３であるマウスを選択した。
【０１１６】
灌流試験：ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内併用注入薬として使用して、マウスを麻酔した（１群当たり４匹）。温度変化を最小限にするために、動物を加温パッド（３７℃）の上に置いた。腫瘍周囲の皮膚を長さ１０ｍｍに切開した。Ｐｅｒｉｆｌｕｘ  ＰＦ２ｂ  ４０００レーザードップラー流量計（ＭＰ３流量プローブ、Ｍｏｏｒｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国デボン州）に接続した標準モデルの光ファイバープローブを、露出した腫瘍の表面に設置した。時定数を１．５秒に設定し、帯域幅を４ｋＨｚに設定した。流束値はＰｏｌｙｖｉｅｗソフトウェアを使用して得た。安定した記録による１５分間のベースラインを得てから、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）を尾静脈を介して投与し、灌流を３時間記録した。
【０１１７】
生理食塩水を投与しても、黒色腫マウスの腫瘍の血液灌流に有意な変化は全く生じなかった。ＩＲＬ１６２０を投与してから３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後および１５０分後に、ベースラインからそれぞれ１５４．４％、１８９．０％、１９８．１％、１７２．８％および９４．０７．１２％の腫瘍灌流の増加が認められた。そのため、ＩＲＬ１６２０は、生理食塩水で治療した対照に比べて、黒色腫マウスの腫瘍の血液灌流を有意に増加させた。この効果は一時的なものであり、約２時間持続した（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。
【０１１８】
生体内分布試験：ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内併用注入薬として使用して、腫瘍保有マウスを麻酔した。これらの動物を無作為にグループ分けし（１群当たり４匹）、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）を最終容積０．１ｍＬにて尾静脈を介して投与した。また、生理食塩水またはＩＲＬ１６２０を投与してから１５分後に、２０：８０の［３Ｈ］パクリタキセル：生理食塩水の濃度に希釈した［３Ｈ］パクリタキセル（５０：５０のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬとエタノール中で１０μＣｉ／匹）を最終容積１．０ｍＬにて各群のマウスに（静脈内）投与した。［３Ｈ］パクリタキセルを投与してから３時間後に、動物を屠殺し、腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、肺および脾臓で［３Ｈ］パクリタキセルの濃度を測定した。腫瘍および臓器を小片にスライスし、５００ｍｇの組織または腫瘍を、組織可溶化剤（６ｍＬ）を含有する個別のバイアルに入れて、５０℃の水浴中でインキュベートした。組織または腫瘍が溶解したら、水浴からバイアルを取り出し、１０％の氷酢酸１．２ｍＬを添加した。バイアルの内容物を３つのバイアルに均等に分け、１５ｍＬの液体シンチレーションカクテル（Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｏｌｖｅ、ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ、米国イリノイ州シカゴ）を各バイアルに添加し、一晩平衡状態に維持した。そしてチューブ内の放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＬＳ６５００）を使用して計数した。
【０１１９】
図１９に示す通り、ＩＲＬ１６２０で治療したマウスでは、生理食塩水で治療したマウスに比べて、腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が有意に増加した。生理食塩水またはＩＲＬ１６２０を注入した動物では、［３Ｈ］パクリタキセルを投与する１５分前の腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が、それぞれ４０．７７ｎｍｏｌ／ｇ組織および２７４．２８ｎｍｏｌ／ｇ組織であることが明らかになった。ＩＲＬ１６２０で治療した動物では、ビヒクルで治療したマウスに比べて、腫瘍中の［３Ｈ］パクリタキセルの濃度が５７２．９９％増加した。しかし、生理食塩水で治療した動物に比べると、ＩＲＬ１６２０を投与しても、心臓、腎臓、肝臓、肺または脾臓における［３Ｈ］パクリタキセルの蓄積が有意に増加することはなかった。そのため、ＩＲＬ１６２０は、他の臓器への送達に影響を及ぼすことなく、腫瘍組織におけるパクリタキセルの摂取量と腫瘍組織へのパクリタキセルの送達を有意に増強することができる。
【０１２０】
結論として、ＩＲＬ１６２０は、腫瘍選択的な血管拡張剤として使用することができ、化学療法薬の送達および有効性を選択的に増強させるのに使用することができる。本試験では、この治療戦略を採用することによって、腫瘍組織における何十倍もの薬物濃度を達成できることが明確に示されている。最後に、ＥＴＡ受容体拮抗薬はまた、腫瘍の血流を改善することも提言されており（Ｓｏｎｖｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６４：３２０９（２００４））、本発明に基づいて腫瘍への抗癌剤の送達を増強させるのに使用することができる。
【０１２１】
記載の有効成分を含有する医薬組成物は、ヒトまたはその他の哺乳動物への投与に適している。通常、医薬組成物は滅菌されており、投与時に副作用を生じる毒性、発癌性または突然変異誘発性の化合物を含有しない。医薬組成物は、固形腫瘍の増殖の発症前、発症時または発症後に投与することができる。
【０１２２】
本発明の方法は、上述の有効成分、またはそれらの生理学的に許容される塩、誘導体、プロドラッグもしくは溶媒和物を使用して達成することができる。有効成分は、純粋な化合物、または一方もしくは両方の要素を含有する医薬組成物として投与することができる。
【０１２３】
医薬組成物は、有効成分が所期の目的を達成するのに有効な量投与されるものを含む。より具体的には、「治療有効量」とは、固形腫瘍の発症を予防する、固形腫瘍を除去する、固形腫瘍の進行を遅らせる、または固形腫瘍のサイズを縮小させるのに有効な量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容に鑑みれば、当業者の能力の範囲に十分含まれる。
【０１２４】
「治療に有効な投与量」とは、所望の効果の達成をもたらす有効成分の量を指す。このような有効成分の毒性および治療効果は、細胞培養物または試験動物での標準的な薬学手順（例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％が致死する投与量）およびＥＤ５０（母集団の５０％での治療に有効な投与量）の測定）によって測定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の間の比率として表される。より高い治療指数が好ましい。得られたデータは、ヒトに使用する広範な投与量を配合するのに使用することができる。有効成分の投与量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む広範な血中濃度内に含まれる。投与量は、使用する投与形態および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変動することがある。
【０１２５】
正確な配合および投与量は、患者の病態に鑑みて、個々の医師により決定される。投与量および投与間隔は、治療効果または予防効果を維持するのに十分な有効成分の濃度が得られるように、個別に調節することができる。
【０１２６】
投与する医薬組成物量は、治療中の被験体、被験体の体重、苦痛の重症度、投与様式、および処方医師の判断により異なる。
【０１２７】
有効成分は、単独で投与することもできれば、所期の投与経路および標準的な薬務を考慮して選択される医薬担体と混合して投与することもできる。そのため、本発明に基づいて使用する医薬組成物は、薬学で使用することのできる製剤への有効成分の加工を促進する補形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方法で配合することができる。
【０１２８】
治療有効量の有効成分を投与すると、組成物は、ピロゲンを含まない非経口的に許容される水溶液の形態をとることができる。ｐＨ、等張性、安定性などが十分に考慮されたこのような非経口的に許容される溶液の製剤は、当該技術分野の技術範囲内に含まれる。通常、静脈注射に好ましい組成物は、等張性ビヒクルを含有するが、この特性は必ずしも必要なわけではない。
【０１２９】
動物に使用する場合、有効成分は、通常の獣医学診療に基づいて、適切に許容される製剤として投与される。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与レジメンを容易に決定することができる。
【０１３０】
前記実施形態の種々の適応および改変は、本発明の適用範囲および趣旨から逸脱することなく実施および使用することができ、これは本明細書に具体的に記載した方法で実施することができる。上述の説明は、例示的なものとして意図され、限定的なものとして意図されない。本発明の適用範囲は、特許請求の範囲によってのみ決定されるものとする。
【０１３１】
本明細書で使用した用語および表現は、説明する用語として使用され、限定する用語としては使用されず、このような用語および表現の使用においては、図示および説明した特徴の等価物またはその一部を除外する意図がなく、請求される本発明の適用範囲内で種々の改変が可能であることが認められる。さらに、本発明の適用範囲を逸脱することなく、本発明のいずれかの実施形態のいずれか１つ以上の特徴を、本発明のその他いずれかの実施形態のその他いずれか１つ以上の特徴と組み合わせることができる。
【０１３２】
特に記載がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される、成分量、特性（例えば、分子量）、反応条件などを表すすべての数値は、いずれの場合も「約」という用語によって修正されるものとして理解されるものとする。そのため、特に相反する記載がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動する場合がある近似値である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとすることなく、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告された有効桁数に鑑みて、一般的な丸め法を適用することによって解釈されなければならない。本発明の広範な適用範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるものの、特定の実施例に示す数値は可能な限り正確に報告する。しかし、いずれの数値も、それぞれの試験測定で見られる標準偏差により必然的に生じる特定の誤差を本質的に含有する。
【０１３３】
本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「この／その／前記（ｔｈｅ）」という用語、ならびに同様の指示語は、特に本明細書に記載がない限り、または文脈上明確に否定されない限り、単数と複数の両方を網羅するものとして解釈されるものとする。本明細書の値の範囲に関する記載は、その範囲内に含まれる個々の値を個別に言及する簡略的な方法として単に使用されることを意図するものである。特に本明細書に記載がない限り、それぞれの個々の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法はすべて、特に本明細書に記載がない限り、または文脈上明確に否定されない限り、いずれの適切な手順でも実施することができる。本明細書に示すあらゆる実施例または例示的言語（例えば、「〜など」）の使用は、特に請求がない限り、単に本発明をより詳細に例示するものとして意図され、本発明の適用範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中のいずれの言語も、請求されていないいずれかの構成要素が本発明の実施に必須のものであることを示すものとして解釈されることはない。
【０１３４】
本明細書に開示する本発明の他の要素または実施形態の分類は、限定として解釈されないものとする。各群の構成要素は、個々に言及および請求される場合もあれば、前記群の他の構成要素または本明細書に記載のその他の要素とのいずれかの組み合わせとして言及および請求される場合もある。一群の１つ以上の構成要素が、便宜上および／または特許上の理由で、一群に包含される場合もあれば、一群から削除される場合もあることが予想される。このような包含または削除が生じる場合、本明細書は改変された群を含有し、それによって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのＭａｒｋｕｓｈ群の書面の説明を果たすものとして見なされる。
【０１３５】
本明細書には、本発明者等に既知である本発明を実施するための最良形態を含めた、本発明の特定の実施形態が記載されている。当然ながら、前述の説明を一読すれば、これらの特定の実施形態における変形が当業者に明らかになるであろう。本発明者等は、このような変形を当業者が適宜使用することを予想しており、本明細書に具体的に記載した以外の方法で本発明が実施されることを意図している。そのため、本発明は、適用法で許容される本明細書に添付される特許請求の範囲に記載した主題の改変および等価物をすべて包含する。さらに、特に本明細書に記載がない限り、または文脈上明確に否定されない限り、すべての可能な変形における前述の要素の組み合わせもまたいずれも本発明に包含される。
【０１３６】
さらに、本明細書全体では、特許および刊行物を多数参照した。上述の参考文献および刊行物はすべて、全体が参考として本明細書で個別に援用される。
【０１３７】
最後に、本明細書に開示する本発明の実施形態は本発明の原理を例示するものであることが理解されるものとする。使用される場合があるその他の改変は、本発明の適用範囲内に含まれる。そのため、本発明の他の構成が、一例として限定されることなく、本明細書の教示内容に基づいて使用される場合がある。したがって、本発明は、まさに図示および記載されたものに限定されるわけではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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