(57)【要約】  本発明は、抗ウイルス薬としてのマクロライド抗生物質であるタイルバロシンの使用に関する。タイルバロシンは、ＰＲＲＳＶの治療に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスによる感染の予防又は治療のための薬剤の調製におけるタイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩の使用。
【請求項２】
前記ウイルスがエンドソーム経路又はリソソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ウイルスが後期エンドソーム経路又はリソソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ウイルスがリソソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ウイルスが後期エンドソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記ウイルスが６．５未満のエンドソーム又はリソソーム内のｐＨを要求する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ウイルスがマストアデノウイルス、アルテリウイルス、アスファルウイルス、ハンタウイルス、サーコウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、インフルエンザウイルスＡ、イサウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス又はアルファウイルスである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記ウイルスがアデノウイルス７、ＰＲＲＳＶ、インフルエンザウイルス、サケ貧血症ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、シン・ノンブレウイルス、フォーコーナーズウイルス、プーマラウイルス、感染性気管支炎ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、西ナイルウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウシ下痢ウイルス、イヌパルボウイルス、コクサッキーＢ３ウイルス、コクサッキーＢ５ウイルス、トリレオウイルス、ロタウイルス、セムリキ森林熱ウイルス及びブタサーコウイルス２型から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ウイルスがＰＲＲＳＶである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記薬剤が細菌感染も予防又は治療するためのものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬剤が細菌感染も予防又は治療するためのものである、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１３】
前記ウイルス感染がＰＰＲＳＶ又はブタインフルエンザウイルスによる感染である場合、前記細菌感染がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ、アクチノバチルス・プルロニューモニア、パスツレラ・マルトシダ、ブタ連鎖球菌及びボルデテラ・ブロンキセプチカのうちの1つ又は複数による感染である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記ウイルス感染がウシウイルス性下痢ウイルスによる感染である場合、前記細菌感染がマンヘミア（パスツレラ）ヘモリチカ又はマイコプラズマ・ボビスによる感染である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記ウイルス感染がヒトインフルエンザウイルスによる感染である場合、前記細菌感染が黄色ブドウ球菌、溶血連鎖球菌、肺炎球菌、緑膿菌及びインフルエンザ菌のうちの1つ又は複数による感染である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記ウイルス感染がトリインフルエンザウイルスによる感染である場合、前記細菌感染がマイコプラズマ・ガリセプチカムによる感染である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１７】
タイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩、或いはタイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩を含む薬学的組成物をウイルスに感染している被療者に投与することを含む、ウイルスによる感染の治療方法。
【請求項１８】
前記ウイルスがエンドソーム経路又はリソソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスが後期エンドソーム経路又はリソソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスがリソソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが後期エンドソーム経路を用いて宿主細胞に感染するウイルスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが６．５未満のエンドソーム又はリソソーム内のｐＨを要求する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスがマストアデノウイルス、アルテリウイルス、アスファルウイルス、ハンタウイルス、サーコウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、インフルエンザウイルスＡ、イサウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス又はアルファウイルスである、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスがアデノウイルス７、ＰＲＲＳＶ、インフルエンザウイルス、サケ貧血ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、シン・ノンブレウイルス、フォーコーナーズウイルス、プーマラウイルス、感染性気管支炎ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、西ナイルウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウシ下痢ウイルス、イヌパルボウイルス、コクサッキーＢ３ウイルス、コクサッキーＢ５ウイルス、トリレオウイルス、ロタウイルス、セムリキ森林熱ウイルス及びブタサーコウイルス２型から選択される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスがＰＲＲＳＶである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が細菌感染も予防又は治療するためのものである請求項１７〜２６のいずれか
１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス薬の調製における抗生物質の使用に関する。本発明は、ウイルスに感染している被療者に抗生物質を投与することを含むウイルス感染の治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タイルバロシンはアセチルイソバレリルチロシンに関する暫定的な国際一般名であって、マクロライド抗生物質である。タイルバロシンを含む製品は、アイブロシン（登録商標）として知られている。アイブロシンは、種々の治療に、特に家畜における種々の細菌感染を治療するために用いられる。タイルバロシンはタイロシンの誘導体であり、以下の科学式で表わされる：
【０００３】
【化１】
2009542790.tif 000002
【０００４】
（式中、Ｒはイソバレリル基である）。
【０００５】
家畜動物が大規模経営で、特に集約的経営で飼育される場合、それらは或る特定の疾患に罹患する傾向を有する。このような疾患は、家畜全体に急速に広がる傾向もある。このような疾患の一つが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）である。ＰＲＲＳは、ウイルスＰＲＲＳＶにより引き起こされ、そして全年齢のブタを冒す。それは呼吸器及び生殖器的徴候の両方を有し、そして毎年数百万英貨ポンドを全世界のブタ産業に費やさせると考えられる。
【０００６】
ＰＲＲＳはしばしば、細菌感染、特にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ−ｈｙｏ）による感染によって悪化される。この感染はブタ集団において広範に及び、そして肺炎を引き起こす。ブタがＭ−ｈｙｏ及びＰＲＲＳＶの両方に感染すると、肺炎は非常に重症になり得る。目下、ＰＲＲＳを有するブタ、有しないブタにおけるＭ−ｈｙｏを治療するためにアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）が用いられている。
【０００７】
アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）がＰＲＲＳＶそれ自体を治療するために用いられ得る、ということを本発明者らは意外にも見出した。アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）がウイルスに直接作用を及ぼす、ということを本発明者らは見出した。
【０００８】
今日まで、細菌感染、例えばＭ−ｈｙｏを治療するためにのみアイブロシン（登録商標）は用いられてきた。アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）は、ウイルス感染の治療に用いられてはいなかった。アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）はＰＲＲＳを有するブタにおけるＭ−ｈｙｏを治療するために用いられてきたが、それが細菌感染と同様にウイルスに作用を有し得ることは知られていなかった。
【０００９】
ウイルス感染に作用を有することは抗生物質に関しては普通ではない。タイルバロシンはマクロライド抗生物質である。他のマクロライドは、ウイルスに非常に多様な作用を有する。チルミコシンは、ＰＲＲＳＶを含めた幾つかのウイルスに対して有効であることが示されている。しかしながらチルミコシンは、抗ウイルス力価の細胞培養検査においてタイルバロシンより大きな毒性を有する。さらに、タイルバロシンが最も密接に関連する抗生物質であるタイロシンはＰＲＲＳＶに作用を有さず、そして他のウイルスに任意の作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Antohe F, Serban G, Radulescu L, Simionescu M. (1997). Transcytosis of albumin in endothelial cells is brefeldin A-independent. Endothelium, 5:125-36.
【非特許文献２】Bosnar, M, Kelneric, Z., Munic, V., Erakovic, V. and Parnham, M.J. (2005) Cellular uptake and efflux of azithromycin, erythromycin, clarithromycin, telithromycin and cethromycin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49: 2372-2377.
【非特許文献３】Carbon C. (1995). Clinical relevance of intracellular and extracellular concentrations of macrolides. Infection, 23: S10-14.
【非特許文献４】Chu JJ, Ng ML. (2002). Infection of polarized epithelial cells with flavivirus West Nile: polarized entry and egress of virus occur through the apical surface. Journal of General Virology, 83:2427-35.
【非特許文献５】Chin AC Morck DW Merrill JK Ceri H Olon ME Read RR Dick P Buret AG (1998) Antiinflammatory benefits of tilmicosin in calves with Pasteurella haemolytica-infected lungs. American Journal of Veterinary Research, 59: 765-771
【非特許文献６】Cordo SM, Cesio y Acuna M, Candurra NA. (2005). Polarized entry and release of Junin virus, a New World arenavirus. Journal of General Virology, 86: 1475-9.
【非特許文献７】Ellinger I, Rothe A, Grill M, Fuchs R. (2001). Apical to basolateral transcytosis and apical recycling of immunoglobulin G in trophoblast-derived BeWo cells: effects of low temperature, nocodazole, and cytochalasin D. Experimental Cell Research, 269: 322-31.
【非特許文献８】Gladue R. P and Snider M. E. 1990. Intracellular accumulation of azithromycin by cultured human fibroblasts. Antimicrob Agents Chemother. 34(6): 1056-60.
【非特許文献９】Ianaro A Ialenti A mafia P Sautebin L Rombola L Carnuccio R Iuvone T D'Acquisto F DiRosa M (2000). Anti-inflammatory activity of macrolide antibiotics. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 292 : 156- 163.
【非特許文献１０】Halbur PG, Paul PS, Frey ML, et al. Comparison of the pathogenicity of the two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus. Vet Pathol 1995; 32: 648-660.
【非特許文献１１】Halber PG, Miller LD, Paul PS, et al. Immunohistochemical identification of porcine reproductive and respiratory system virus (PRRSV) antigen in the heart and lymphoid system of three- week-old colostrum-deprived pigs. Vet Pathol. 1995; 32. -200-204.
【非特許文献１２】Jarvis MA, Wang CE, Meyers HL, Smith PP, Corless CL, Henderson GJ, Vieira J, Britt WJ, Nelson JA. (1999).
【非特許文献１３】Human cytomegalovirus infection of caco-2 cells occurs at the basolateral membrane and is differentiation state dependent. Journal of Virology, 73:4552-60.
【非特許文献１４】Kaiserlian D, Rigal D, Abello J, Revillard JP. (1991). Expression, function and regulation of the intercellular adhesion molecule- 1 (ICAM-I) on human intestinal epithelial cell lines. European Journal of Immunology, 21: 2415-21.
【非特許文献１５】Labro M-T (1993). Effects of macrolides on host natural defenses. In; Macrolides chemistry, pharmacology and clinical use. pp 389-408.
【非特許文献１６】Ed. Brysker A, Paris; Arnette-Blackweil. Labro M-T (1996). Intracellular bioactivity of macrolides. Clinical Microbiology and Infection, 1: S24-30.
【非特許文献１７】Labro, M-T. (2000). Interference of antibacterial agents with phagocyte functions: immunomodulation or "immuno-fairy tales"? Clinical Microbiology Reviews, 13: 615-650.
【非特許文献１８】Maples CJ, Ruiz WG, Apodaca G. (1997). Both microtubules and actin filaments are required for efficient postendocytotic traffic of the polymeric immunoglobulin receptor in polarized Madin-Darby canine kidney cells. The Journal of Biological Chemistry, 272:6741-51.
【非特許文献１９】Mengeling WL, Lager KM, Vorwald AC. Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome. J Vet Diagn Invest 1995;7:3-l6.
【非特許文献２０】Molmenti, EP Ziambaras T Perlmutter, DH(1993). Evidence for an acute phase response in human intestinal epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry, 268:14116-14124.
【非特許文献２１】Nightingale CH (1997). Pharmacokinetics and pharmacodynamics of newer macrolides. Pediatric Infectious Disease Journal, 16:438-443.
【非特許文献２２】Okamoto R, Tsuchiya M, Nomura H, Iguchi H, Kiyoshima K, Hori S, Inui T, Sawa T Takeuchi T Umezawa H (1981). Biological properties of new acyl derivatives of tylosin. The Journal of Antibiotics, 33: 1309-1315.
【非特許文献２３】Pelkmans L, Helenius A (2003). Insider information: what viruses tell us about endocytosis. Current opinion in cell biology, 15:414-22.
【非特許文献２４】Reeve- Johnson, L Kempf I. Gesbert F. Guittet M (1997a). Efficacy of tilmicosin in the control of experimental Mycoplasma gallisepticum infection in chickens. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics, 20: 148-149.
【非特許文献２５】Reeve- Johnson, L Kempf I. Charleston B (1997b). An evaluation of the efficacy of tilmicosin treatment and control measure against artificial infection with Mycoplasma gallisepticum in chickens Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 20: 132.
【非特許文献２６】Rossen JW3 Kouame J, Goedheer AJ, Vennema H, Rottier PJ. (2001). Feline and canine coronaviruses are released from the basolateral side of polarized epithelial LLC-PKl cells expressing the recombinant feline aminopeptidase-N cDNA. Archives of Virology, 146:791-9.
【非特許文献２７】Scomeaux B, Shryock TR. (1998a). Intracellular accumulation, subcellular distribution and efflux of tilmicosin in swine phagocytes. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics, 21:257-68.
【非特許文献２８】Scorneaux B, Shryock TR. (1998b). Intracellular accumulation, subcellular distribution, and efflux of tilmicosin in chicken phagocytes. Poultry Science 77: 1510-21.
【非特許文献２９】Scomeaux B, Shryock TR. (1999) . The determination of the cellular volume of avian, porcine and bovine phagocytes and bovine mammary epithelial cells and its relationship to uptake of tilmicosin. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 22:6-12.
【非特許文献３０】Sood R, Bear C, Auerbach W, Reyes E, Jensen T, Kartner N, Riordan JR, Buchwald M. (1992). Regulation of CFTR expression and function during differentiation of intestinal epithelial cells. The EMBO Journal 11: 2487-94.
【非特許文献３１】Stuart LM, Ezekowitz RA. (2005). Phagocytosis: elegant complexity. Immunity, 22:539-50.
【非特許文献３２】Sunazuka, T., Yoshida, K., Oohori, M., Haragaya, Y., Iwai, Y., Akagawa, K.S. and Omura, S. (2003) Effects of 14-membered macrolide compounds on monocyte to macrophage differentiation. The Journal of Antibiotics.. 56: 721-724.
【非特許文献３３】Tsuchiya M, Suzukake K, Hori M Sawa T Takeuchi T Umezawa H. (1981) Studies on the effects of 3-acetyl-4"-isovaleryltyIosin against multiple-drug resistant strains of Staphylococcus aureus. The Journal of Antibiotics 34: 305-312.
【非特許文献３４】Tulkens PM (1991). Intracellular distribution and activity of antibiotics. European journal of clinical microbiology and infectious diseases 10:100-106.
【非特許文献３５】Varilek GW, Neil GA, Bishop WP. (1994). Caco-2 cells express type I interleukin-1 receptors: ligand binding enhances proliferation. The American journal of physiology 267: G1101-7.
【非特許文献３６】Zweibaum A, Triadou N, Kedinger M, Augeron C, Robine-Leon S, Pinto M, Rousset M,Haffen K. (1983) Sucrase-isomaltase: a marker of foetal and malignant epithelial cells of the human colon. International journal of cancer, 15:407-12.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明に従って、ウイルスによる感染の予防又は治療のための薬剤の調製におけるタイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステルもしくは塩の使用が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記のように、タイルバロシンは３−Ｏアセチル−４’’−Ｏ−イソバレリルタイロシンと呼ばれるマクロライド抗生物質である。タイルバロシンは、当該技術分野でよく知られている。タイルバロシンの誘導体及び代謝産物としては、タイルバロシンと密接に関連するか、或いは溶液中である場合又は被療者に投与される場合にタイルバロシンがなる任意の化合物が挙げられる。タイルバロシンの誘導体及び代謝産物としては、タイルバロシンにおいて、特に溶液中で関連物質として見出される多くの化合物、例えば３−Ｏ−アセ
チルデスミコシン、３−Ｏ−アセチルチロシン、３，４’’−ジ−Ｏ−アセチルチロシン、ａ−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−プロピオニルチロシン、３−Ｏ−アセチル、−４’’−Ｏ−イソバレリルマクロシン、３−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−ブチルチロシン、３−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−イソバレリルレロマイシン、４’’−Ｏ−イソバレリルチロシン、３，２０−ジ−Ｏ−アセチル−４’’−イソバレリルレロマイシン、及び３，４’’’−ジ−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−イソバレリルチロシンが挙げられる。タイルバロシンは、アイブロシン（登録商標）の形であり得る。
【００１３】
タイルバロシンが薬学的に許容可能なエステルの形態で存在する場合、そのアルキルエステルが好ましい。タイルバロシンが薬学的に許容可能な塩の形態で存在する場合、任意の適切な塩が用いられ得る。有機酸を用いて形成される塩、特にアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸のような酸を用いて形成される塩が好ましい。
【００１４】
機能性誘導体、代謝産物、エステル及び塩はタイルバロシンと同様に機能し、言い換えると、それらは特定のウイルス感染に及ぼす類似の作用を有する。
【００１５】
本発明は、ウイルスによる感染の予防又は治療のための薬剤の調製におけるタイルバロシン又はそのエステルもしくは塩の使用に関するのが特に好ましい。
【００１６】
ウイルスによる感染という用語は、ウイルス粒子の宿主中の存在を意味する。特にそれは、その宿主中に普通は見出されないウイルス粒子の、或いは病原性であるか又は宿主において疾患を引き起こすウイルス粒子の被療者中の存在を意味する。
【００１７】
ウイルスによる感染の予防とは、ウイルスへの曝露後の未処置宿主の予測される状態と比較した場合の、宿主中のウイルス粒子の数の低減、或いは宿主中のウイルス粒子の複製の低減又は防止、或いはウイルス増殖の細胞変性作用の低減又は防止、或いは細胞の細胞質中へのウイルスの侵入の低減又は防止、或いはウイルス感染の病理学的作用又は徴候／症候の低減又は防止が認められることを意味する。
【００１８】
未処置宿主は、本発明に従って調製される薬剤を受容していない宿主である。
【００１９】
予測される状態は、ウイルスへの曝露後の未処置宿主におけるウイルス粒子の見込み数、或いは細胞変性作用のレベル、或いは病理学的作用又は徴候／症候である。当業者はこれを予測することが可能である。
【００２０】
ウイルスによる感染の治療とは、治療前の状態と比較した場合の、宿主中のウイルス粒子の数の低減、或いは宿主中のウイルス粒子の複製の低減又は防止、或いはウイルス増殖の細胞変性作用の低減又は防止、或いは細胞の細胞質中へのウイルスの侵入の低減又は防止、或いはウイルス感染の病理学的作用、臨床的徴候又は症候の低減又は防止が認められることを意味する。
【００２１】
宿主中のウイルス粒子の数の低減、或いは宿主中のウイルス粒子の複製の低減、或いはウイルス増殖の細胞変性作用の低減、或いは細胞の細胞質中へのウイルスの侵入の低減、或いはウイルス感染の病理学的作用、臨床的徴候又は症候の低減が認められる場合、低減は、統計学的に有意であることが好ましい。例えば好ましくは、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも４０％の低減が認められる。
【００２２】
宿主は高等生物体であり、その細胞は複製のためにウイルスにより用いられる。宿主は
、ヒト又は動物であり得る。宿主は、動物、特に家畜動物、例えばウシ、ウマ、家禽又はブタであるのが好ましい。宿主はブタであるのが特に好ましい。代替的には、宿主は好ましくはヒトである。
【００２３】
ウイルスは好ましくは、エンドソーム経路又はリソソーム経路を用いて宿主に感染するウイルスである。
【００２４】
エンドソーム経路及びリソソーム経路という用語は、当該技術分野で知られている。それらは、細胞に侵入するために幾つかのウイルスにより用いられるメカニズムを指す。ウイルスはすべて、複製を開始するために、標的細胞に侵入する方策を有さなければならない。ウイルスは一般的に、細胞の原形質膜での直接的メカニズムによる、或いはエンドソーム又はリソソームのような細胞区画中への内在化に従う２つの方法でこれを行なう。細胞に侵入するためにエンドソーム及びリソソームを用いるウイルスは、細胞質中に放出されるために、エンドソーム膜又はリソソーム膜と融合するか又はそれを貫通しなければならない。
【００２５】
エンドソームは、エンドサイトーシスにより新規に摂取される物質を輸送する細胞小器官である。当該用語は、当該技術分野で知られている。
【００２６】
リソソームは、分解酵素を含有する細胞小器官である。当該用語は、当該技術分野で知られている。
【００２７】
エンドソーム膜との融合及び細胞侵入を誘発する立体配座変化を受けるため、エンドソーム経路又はリソソーム経路を用いる多数のウイルスは特定のｐＨを要求する。
【００２８】
特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、タイルバロシンは細胞に侵入し、そしてエンドソーム及びリソソーム中で濃縮し、そしてそのエンドソーム及びリソソーム中のｐＨに影響を及ぼすと考えている。エンドソーム又はリソソームのｐＨにおけるこの変化は、エンドソーム又はリソソーム内のウイルス粒子とエンドソーム膜又はリソソーム膜との融合を阻止し、それゆえウイルスが細胞質に侵入し、複製しないようにする、と本発明者らは考える。
【００２９】
ウイルスは好ましくは、後期エンドソーム経路又はリソソーム経路を用いて宿主に感染するウイルスである。
【００３０】
後期エンドソームは、プレリソソーム性細胞小器官である。後期という用語は、エンドサイトーシスされた分子が後期エンドソームに送達されるのにかかる時間の量に由来する。後期エンドソームは早期エンドソームより球形であり、核の近くに配置される。後期エンドソームは、早期エンドソームより酸性のｐＨを有する。後期エンドソームという用語は、当該技術分野で知られている。
【００３１】
ウイルスは、好ましくは、Ｒａｂ７により制御されるエンドソーム経路又はリソソーム経路を用いるウイルスである。
【００３２】
Ｒａｂタンパク質は、或る特定の細胞区画の細胞質面に見出される小型ＧＴＰアーゼである。Ｒａｂタンパク質は、その区画の膜を横断する輸送の調節に関与する。Ｒａｂ７は、後期エンドソーム及びリソソームにおける輸送の調節に関与する。
【００３３】
ウイルスは、好ましくは、６．５未満、好ましくは６未満、より好ましくは５．５未満、さらに好ましくは５未満、最も好ましくは４．５未満のエンドソーム又はリソソーム内
のｐＨを要求するウイルスである。
【００３４】
エンドソーム又はリソソームのｐＨは、ｐＨ感受性染料、例えば中性ｐＨで青色の、そして低ｐＨで黄色／緑色の蛍光を発するものを用いて測定され得る。青色：黄色の比は、エンドソーム／リソソームｐＨの測定値を提供する（Diwu, Chen, Zhang, Klaubert and Haughland (1999) Chemistry and Biology Vol 6 Issue 7 411-418）。
【００３５】
細胞侵入を達成するためにウイルスがエンドソーム経路を用いるかリソソーム経路を用いるかは、一般的に知られている。万一知られていない場合には、当業者は、ウイルスがエンドソーム経路を用いるか、リソソーム経路を用いるかを確証し、経路のどの部分が用いられるかを検査し、或いはエンドソーム又はリソソームのｐＨを変更することが知られている化合物の存在下で細胞中へのウイルス侵入を試験することにより、或いは特定のＲａｂタンパク質に関して陰性である突然変異体を用いることにより、ｐＨ又はＲａｂタンパク質依存性を確証することができる。例えば以下の化学的阻害剤が用いられ得る：
・クロロキン及び塩化アンモニウム（これらはプロトン溜めとして作用することによりエンドソームｐＨを上げる）；並びに
・ノコダゾール（これは微小管を脱重合し、早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を遮断する）。
【００３６】
ウイルスがクロロキン又は塩化アンモニウムの存在下で細胞侵入を達成しない場合、ウイルスは細胞に感染するために酸性ｐＨを要求するｐＨ依存性であると考えられる。ウイルスがノコダゾールにより細胞に感染するのを妨げられる場合、細胞に侵入するために後期エンドソーム経路又はリソソーム経路を用いることが考えられ、これらの経路へのウイルスの侵入はノコダゾールにより遮断される。
【００３７】
代替的には、以下の優性陰性突然変異体が用いられ得る：
・ｒａｂ５  Ｓ３４Ｎ突然変異体（これは、原形質膜中のクラスリン被覆ピットから早期エンドソームへの移行を遮断する）；並びに
・ｒａｂ７  Ｔ２２Ｎ突然変異体（これは、早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を遮断する）。
【００３８】
ｒａｂ５  Ｓ３４Ｎ突然変異体により阻害されるウイルスは、約ｐＨ６．５で早期エンドソームを通過する必要がある。ｒａｂ７  Ｔ２２Ｎ突然変異体により阻害されるウイルスは、約ｐＨ５で後期エンドソームを通過する必要がある。
【００３９】
例えばウイルスは、以下の科のいずれかのウイルスでもよい：アデノウイルス科、アルテリウイルス科、アスファウイルス科、ブニヤウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、及びトガウイルス科。
【００４０】
さらにウイルスは例えば、以下の属のいずれかのウイルスでもよい：マストアデノウイルス、アルテリウイルス、アスファルウイルス、ハンタウイルス、サーコウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、インフルエンザウイルスＡ、イサウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス及びアルファウイルス。
【００４１】
特に、ウイルスという用語は、ウイルスがアデノウイルス７、ＰＲＲＳＶ、（ヒト、トリ、ブタ、ウマ、ウシ及びイヌインフルエンザを含む）インフルエンザウイルス、サケ貧血ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、プーマラウイルス、感染性気管支炎ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、Ｓ
ＡＲＳ  ＣｏＶ、マールブルグウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウシ下痢ウイルス、イヌパルボウイルス、コクサッキーＢ３ウイルス、コクサッキーＢ５ウイルス、トリレオウイルス、ロタウイルス、セムリキ森林熱ウイルス及びブタサーコウイルス２型の任意の１つ又は複数、或いは任意の組合せを意味し得る。
【００４２】
ウイルスは好ましくはＰＲＲＳＶである。
【００４３】
代替的には、ウイルスは好ましくはＰＲＲＳＶではないウイルスである。
【００４４】
別の代替法では、ウイルスはインフルエンザウイルス、特にヒトインフルエンザウイルス、特にヒトインフルエンザＡ又はＢ株ウイルス、特にＡ株ウイルスが好ましい。
【００４５】
好ましいウイルスの詳細を、表６に示す。
【００４６】
さらに、本発明は、アデノウイルス７、ＰＲＲＳＶ、（ヒト、トリ、ブタ、ウマ、ウシ及びイヌインフルエンザを含む）インフルエンザウイルス、サケ貧血ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、プーマラウイルス、感染性気管支炎ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、西ナイルウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウシ下痢ウイルス、イヌパルボウイルス、コクサッキーＢ３ウイルス、コクサッキーＢ５ウイルス、トリレオウイルス、ロタウイルス、セムリキ森林熱ウイルス及びブタサーコ２型ウイルスの任意の組合せを含む、任意の１つ又は複数の治療のための薬剤の調製におけるタイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩の使用を提供する。
【００４７】
付加的には、本発明は、本明細書中に記載したようなウイルスによる感染の予防又は治療、並びに細菌感染の予防又は治療のための薬剤の調製におけるタイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩の使用を提供する。
【００４８】
ウイルスによる感染の予防又は治療は、細菌感染の予防又は治療と同時であるか、又は後であるか、又は前であってもよい。
【００４９】
細菌感染という用語は、細菌の宿主中の存在を意味する。特にそれは、宿主中で通常では見出されない細菌の、或いは病原性であるか又は宿主において疾患を引き起こす細菌の被療者中での存在を、或いは細菌が通常では見いだされない宿主内の場所におけるこのような細菌の存在を意味する。
【００５０】
細菌感染の予防とは、細菌に曝露後に未処置宿主に予測される状態と比較した場合、宿主中の細菌の数の低減、或いは宿主中の細菌の複製の低減又は防止、或いは細菌感染の病理学的作用或いは臨床的徴候又は症候の低減又は防止が認められる、ということを意味する。
【００５１】
未処置宿主は、本発明に従って調製される薬剤を摂取していない宿主である。
【００５２】
予測される状態は、細菌への曝露後の未処置宿主における細菌の見込み数、或いは病理学的作用或いは徴候又は症候である。当業者はこれを予測することが可能である。
【００５３】
細菌感染の治療とは、治療前の状態と比較した場合の、宿主中の細菌の数の低減、或いは宿主中の細菌の複製の低減又は防止、或いは細菌感染の病理学的作用或いは臨床的徴候
又は症候の低減又は防止が認められることを意味する。
【００５４】
細菌感染は、タイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩で治療されやすい任意の感染であり得る。特に細菌感染は以下の細菌の任意の１つ又は複数による感染であり得る：
マイコプラズマ種（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、マイコプラズマ・ヒオシノビエ、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・ガリセプチカム、マイコプラズマ・シノビエ、マイコプラズマ・メレアグリディス、マイコプラズマ・ボビス、マイコプラズマ・ボビリニス）
オルニソバクテリウム・ライノトラキア
気管支敗血症菌
アクチノバチルス・プルロニューモニア
パスツレラ・マルトシダ
マンヘミア（パスツレラ）ヘモリチカ
ロドコッカス（コリネバクテリウム）エクイ
連鎖球菌（ブタ連鎖球菌、化膿性連鎖球菌）
ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌）
ブラキスピラ・ヒオディセンテリア
ブラキスピア・ピロシコリ
ローソニア・イントラセルラリス
クロストリジウム・パーフリンジェンス
（クロストリジウム種）
コリネバクテリウム・ジフテリエ
アエロコッカス・カタラシカス
アルカリゲネス・ビスコラクティス
ルテウス菌
ミクロバクテリウム・フラバム
枯草菌
バチルス・サーキュランス
バチルス・リケニフォルミス
リッケチア種
クラミジア種
リステリア種
ブタ丹毒菌
バルトネラ・ヘンセラ
ピロリ菌
ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ウベリス
フソバクテリウム・ネクロホラム
レプトスピラ種。
【００５５】
細菌感染は、好ましくは、マイコプラズマ種、特にマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染である。
【００５６】
多数のウイルス感染はしばしば他のウイルス感染及び／又は細菌感染と関連して観察され、そして２つ以上の感染を治療するために１つの薬剤が使用可能であることが特に有用である。例えば商業的ブタ生産の最も重要な経済学的疾患のうちの１つは、ブタ呼吸器病複合感染症（ＰＲＤＣ）と呼ばれている疾患である。それは多因子性であり、そして多数のウイルス及び細菌、例えばＰＲＲＳＶ、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルス、ブタコロナウイルス及び仮性狂犬病ウイルス（アウエスキー病）、並びに細菌病原体であるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ、アクチノバチルス・プルロニューモ
ニア、パスツレラ・マルトシダ、ブタ連鎖球菌及びボルデテラ・ブロンキセプチカが包含される。したがって、ウイルス感染がＰＰＲＳＶ及び／又はブタインフルエンザウイルスによる感染である場合、細菌感染は好ましくは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、アクチノバチルス・プルロニューモニア、パスツレラ・マルトシダ、ブタ連鎖球菌及びボルデテラ・ブロンキセプチカのうちの1つ又は複数による感染である。
【００５７】
畜牛の場合、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）及びパスツレラに関連した類似の呼吸器疾患複合感染が存在する。マイコプラズマ・ボビスもこの疾患を悪化させる。
【００５８】
したがって、ウイルス感染がウシウイルス性下痢ウイルスによる感染である場合、細菌感染は好ましくはマンヘミア（パスツレラ）ヘモリチカ又はマイコプラズマ・ボビスによる感染である。
【００５９】
家禽においては多数の低病原性トリインフルエンザウイルスが存在し、そしてこれらはマイコプラズマ・ガリセプチカムも存在する場合に疾患の非常な増大に関連づけられてきた。高い死亡率及び罹病率が、二重感染群で観察される。
【００６０】
したがって、ウイルス感染がトリインフルエンザウイルスによる感染である場合、細菌感染は好ましくはマイコプラズマ・ガリセプチカムによる感染である。
【００６１】
ヒトにおけるインフルエンザウイルス感染は、黄色ブドウ球菌、溶血連鎖球菌、肺炎球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌のような二次細菌感染に個体がかかり易くなり得る。
【００６２】
したがって、ウイルス感染がヒトインフルエンザウイルスによる感染である場合、細菌感染は好ましくは黄色ブドウ球菌、溶血連鎖球菌、肺炎球菌、緑膿菌及びインフルエンザ菌のうちの1つ又は複数による感染である。
【００６３】
マイコプラズマ・ニューモニエは呼吸器疾患の一般的原因であり、そしてマイコプラズマ・ニューモニエウイルスがインフルエンザ発生中に重複感染し得るという事実があるように、インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスとの同時感染が報告されている。
【００６４】
それゆえ、代替的には、ウイルス感染がインフルエンザウイルスによる感染である場合、細菌感染は好ましくはマイコプラズマ・ニューモニエによる感染である。
【００６５】
また、ウイルスによる感染の予防又は治療の方法であって、タイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステルもしくは塩、或いはタイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステルもしくは塩を含む薬学的組成物をウイルスに感染している被療者に投与することを含む方法が提供される。
【００６６】
当該方法は、細菌感染を同時に治療するか又は予防するためにも用いられ得る。
【００６７】
本発明の方法で投与される薬学的組成物は、任意の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクルと共に、タイルバロシン又はその機能性誘導体、代謝産物、エステル若しくは塩を含む。薬学的組成物に使用され得る、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及びビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えばリン酸塩）、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物
、水、塩若しくは電解質（例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース製の物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、直腸に、鼻に、頬に、膣に、局所的に、経皮的に又は埋込みレザバーにより投与され得る。本発明の薬学的組成物は、任意の慣用的非毒性の薬学的に許容可能な担体、アジュバント又はビヒクルを含有し得る。非経口的という用語は、本明細書中で用いる場合、皮下、皮膚内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下腔内、病変内及び頭蓋内注射又は注入技術を包含する。
【００６９】
薬学的組成物は、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液として、滅菌注射用調製物の形態であってもよい。この懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤（例えばトゥイーン８０）及び沈殿防止剤を用いて、当該技術分野で既知の技法に従って処方され得る。滅菌注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液でもあってもよい。用いられ得る許容可能なビヒクル及び溶媒の例としては、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌不揮発性油は、慣用的には、溶媒又は沈殿防止媒質として用いられる。この目的のために、任意の低刺激性不揮発性油、例えば合成モノグリセリド又はジグリセリドが用いられ得る。脂肪酸、例えばオレイン酸、並びにそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油又はヒマシ油（特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで）と同様に、注射液の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、例えばＰｈ．Ｈｅｌｖ又は類似のアルコールも含有し得る。
【００７０】
薬学的組成物は、任意の経口的に許容可能な剤形で、例えばカプセル、錠剤、並びに水性懸濁液及び溶液（これらに限定されない）で経口投与してもよい。経口使用のための錠剤の場合、一般に用いられる担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的には添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口投与される場合、活性成分は乳化剤及び沈殿防止剤と組合される。所望により、或る特定の甘味剤及び／又は風味剤及び／又は着色剤が添加され得る。
【００７１】
薬学的組成物は、直腸投与のための座薬の形態でも投与してもよい。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温度で液体であり、したがって直腸中で融解して活性構成成分を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得る。このような物質としては、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
薬学的組成物は、鼻エアロゾル又は吸入により投与され得る。このような組成物は、薬学的処方物の業界で既知の技法により調製され、そしてベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、吸収促進剤（生物学的利用能を増強するため）、フルオロカーボン及び／又は当該技術分野で既知のその他の可溶化剤又は分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００７３】
ウイルスに感染している任意の被療者を対象にし得る。特に、ヒト又は動物を被療者とし得る。宿主は、動物、特に家畜動物、例えばウシ、ウマ、家禽又はブタであるのが好ま
しい。宿主はブタであることが特に好ましい。代替的には、宿主は好ましくはヒトである。
【００７４】
以下、本発明を、例示のみを目的として、図面を参照しながら詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の存在下で、ＰＲＲＳＶへの曝露後に感染した細胞の数に関する検査の結果を示す図である。
【図２】アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の存在下で、インフルエンザウイルスへの曝露後に感染したＭＤＣＫ細胞の数に関する検査の結果を示す図である。
【図３】アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の存在下で、インフルエンザウイルスへの曝露後に感染したＣａｃｏ−２細胞の数に関する検査の結果を示す図である。
【図４】アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の存在下で、インフルエンザウイルスへの曝露後に感染したＨｅＬａ細胞の数に関する検査の結果を示す図である。
【図５】ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積に及ぼす時間及び濃度の作用を示す図である。ａ）ＨＲＴ−１８細胞を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬのタイルバロシンとともに、４時間又は２４時間インキュベートした。培地（白色及び明灰色のバー）及び細胞（黒色及び暗灰色のバー）の試料を、二重反復実験で採取した。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのタイルバロシンのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのタイルバロシンのμｇである。  ｂ）タイルバロシンの細胞内：細胞外濃度の比を各試料（黒色バーでの試料１及び白色バーでの試料２）に関して算定し、プロットした。
【図６】ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積を示す図である。ａ）ＨＲＴ−１８細胞を、１０μｇ／ｍＬの各抗生物質とともに、４時間又は２４時間インキュベートした。細胞の二重反復実験試料を、各時点で採取し（白色及び黒色のバー）、そして培地の試料を採取した（灰色バー）。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのマクロライドのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのマクロライドのμｇである。  ｂ）各マクロライドの細胞内：細胞外濃度比を算定し、プロットした（黒色バーでの試料１及び白色バーでの試料２）。
【図７ａ−ｂ】極性化Ｃａｃｏ−２細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送を示す図である。Ｃａｃｏ−２細胞を、頂端（ａ）又は側底（ｂ）チャンバ中で、３０分間（明灰色バー）、６０分間（黒色バー）、１２０分間（白色バー）及び２４０分間（暗灰色バー）、１００μｇ／ｍＬのタイルバロシンとともにインキュベートした。両チャンバからの細胞及び培地の二重反復実験試料を、各時点で採取した。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのタイルバロシンのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのタイルバロシンのμｇである。
【図７ｃ−ｆ】極性化Ｃａｃｏ−２細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送を示す図である。タイルバロシンが頂端（ｃ）及び側底（ｄ）チャンバ中に添加される試料の細胞内：細胞外濃度比を算定し、プロットした（黒色バーでの試料１及び白色バーでの試料２）。頂端チャンバの培地への投与後の側底からの培地（ｅ）及び側底チャンバの培地への投与後の頂端チャンバからの培地（ｆ）をサンプリングし、タイルバロシンの濃度を入力データのパーセンテージとしてプロットした。
【図８】極性化Ｃａｃｏ−２細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送を示す図である。ａ）Ｃａｃｏ−２細胞を、頂端チャンバで、３０分間（明灰色バー）、６０分間（黒色バー）、１２０分間（白色バー）及び２４０分間（暗灰色バー）、１０μｇ／ｍＬのタイルバロシン、タイロシン又はチルミコシンとともにインキュベートした。両チャンバからの細胞及び培地の二重反復実験試料を、各時点で採取した。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのマクロライドのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのマクロライドのμｇである。ｂ）試料の細胞内：細胞外濃度比を算定し、プロットした（黒色バーでの試料１及び白色バーでの試料２）。ｃ）頂端チャンバの培地への投与後の側底チャンバからの培地をサンプリングし、抗生物質の濃度を入力データのパーセンテージとしてプロットした。
【図９】ブタ腎臓上皮細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積を示す図である。ａ）ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、腎臓において、示された時間の間、１０μｇ／ｍＬの各抗生物質とともにインキュベートした。細胞及び培地の二重反復実験試料を、各時点で採取した（灰色バー：３２分試料、白色バー：７５分試料、及び黒色バー：１２０分試料）。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのマクロライドのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのマクロライドのμｇである。ｂ）各マクロライドの細胞内：細胞外濃度比を算定し、プロットした（灰色バー：３２分試料、白色バー：７５分試料、及び黒色バー：１２０分試料）。
【図１０ａ−ｃ】ブタ及びニワトリ白血球におけるマクロライド抗生物質の細胞内蓄積を示す図である。ａ）ブタ白血球を、１０分間又は２０分間、１０μｇ／ｍＬのタイルバロシン又はタイロシンとともにインキュベートした。２０分のインキュベーション後にマクロライドを負荷された細胞を培地に移し、さらに３０分間インキュベートした。細胞及び培地の二重反復実験試料を、各時点で採取した（灰色バー：１０分、白色バー：２０分、及び黒色バー：３０分洗浄）。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのマクロライドのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのマクロライドのμｇである。ｂ）各マクロライドの細胞内：細胞外濃度比を算定し、プロットした（灰色バー：１０分、及び白色バー：２０分）。ｃ）洗浄後に細胞中に残存するマクロライドの量を評価し、細胞の保持％を算定し、プロットした（黒色バー：３０分洗浄試料）。
【図１０ｄ−ｅ】ブタ及びニワトリ白血球におけるマクロライド抗生物質の細胞内蓄積を示す図である。ｄ）ニワトリ白血球を、１０μｇ／ｍＬのタイルバロシン、タイロシン又はチルミコシンとともに、１５分間、３０分間又は６０分間インキュベートした。細胞及び培地の二重反復実験試料を各時点に採取した（灰色バー：１５分、白色バー：３０分、及び黒色バー：６０分）。培地中の濃度は培地１ｍＬ当たりのマクロライドのμｇとして示されるが、一方、細胞からのものは細胞１ｍｇ当たりのマクロライドのμｇである。ｅ）各マクロライドの細胞内：細胞外濃度比を算定し、プロットした（灰色バー：１５分、白色バー：３０分、及び黒色バー：６０分）。
【図１１】ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルス感染に及ぼすアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）、チルミコシン及びタイロシンの作用を示す図である。
【図１２】感染後のＰＲＲＳＶ伝播に及ぼすアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の作用を示す図である。
【図１３】ＰＲＲＳＶに及ぼす種々の化学物質（クロロプロマジン、クロロキン、サイトカラシンＤ、ノコダゾール）及びアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の作用を示す図である。
【図１４】ＰＲＲＳＶ、ＥＡＶ（ウマ動脈炎ウイルス）及びＦＣＶ（ネコカリシウイルス）の複製に及ぼす種々の用量のクロロキンの作用を示す図である。
【図１５】インフルエンザウイルス（ウドーン株）に及ぼすアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の作用を示す図である：    ａ）細胞単一層中のウイルス感染細胞のパーセンテージ、    ｂ）アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）で前処理された又は処理されない細胞中のウイルス力価を定量するために用いられるプラーク検査。ＰＲＲＳＶウイルスの複製は処理細胞単一層において阻害され、残存ウイルス接種物のみが検出される。
【図１６】ＶＲ２３３２（アメリカ型１  ＰＲＲＳＶ株）の複製に及ぼす種々のマクロライドの作用を示す図である。
【図１７】ＶＲ２３３２の侵入に関する検査の結果を示す図である。
【図１８】ＨｅＬａ細胞及びＨＴ２９細胞のウイルス感染に及ぼすタイルバロシンの作用を示す図である。
【図１９】エンドソームｐＨに及ぼすチルバロシンの作用を試験するためのアクリジンオレンジ検査の結果を示す図である。
【実施例】
【００７６】
＜実施例１＞
ＰＲＲＳＶ検査
ＭＡ１０４細胞をアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）又はチルミコシンで４時間前処理した。次に細胞を、タイルバロシン又はチルミコシンの存在下でＰＲＲＳＶに曝露した。次に細胞をＰＢＳで３回洗浄して、非結合ウイルスを除去し、そしてタイルバロシン又はチルミコシンを含有する新たな培地を添加した。細胞をさらに２４時間インキュベートした後、４％ホルムアルデヒドで固定した。ブタポリクローナル抗ＰＲＲＳＶ一次抗体及びＦＩＴＣ標識抗ブタ二次抗体を用いて、間接的免疫蛍光法により、ウイルス感染を検出した。ライカ共焦点顕微鏡を用いて、免疫蛍光を検出した。ＤＡＰＩ染色核毎に緑色蛍光（ＦＩＴＣ染色から）を示す細胞を陽性であるとして計測した。
【００７７】
＜実施例２＞
インフルエンザ検査
種々の濃度で２時間又は４時間、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ又はＣａＣｏ−２細胞にタイルバロシンを添加した。次に細胞を、Ａ型インフルエンザウイルスのＰＲ８株（感染多重度  １０）に曝露した。次に４時間後に細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗ＮＰ一次抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗ウサギ二次抗体を用いてインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）に関して染色した。ライカ共焦点顕微鏡を用いて、免疫蛍光を検出した。ＤＡＰＩ染色核毎に緑色蛍光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８染色から）を示す細胞を陽性であるとして計測した。
【００７８】
＜実施例３＞
アイブロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送の比較
マクロライド抗生物質であるタイルバロシン、チルミコシン及びタイロシンを、３つの細胞型、上皮（腸、腎臓）及び白血球内に侵入し、蓄積するそれらの能力に関して試験した。タイルバロシン（３−アセチル４−イソバレリルチロシン）は３つの細胞型すべてに迅速に侵入し、そして白血球の細胞質中で最大濃度になった。それは、頂端面又は側底面により極性化Ｃａｃｏ−２上皮細胞にも侵入し、細胞内に濃縮され、そして反対面に輸送された。タイロシンは、すべての細胞型に相対的に不十分に侵入したが、一方、チルミコシンは細胞中に侵入し、蓄積するその能力において中程度であった。タイルバロシンによるより大きな取込みはイソバレリル基の存在に関連づけられ得る。３つの抗生物質はすべてマクロライドであるが、それらは、臨床的疾患を治療するに際してのそれらの効力に関して、分布の少なくとも１つの態様が異なることが示された。
【００７９】
マクロライド抗生物質は細胞に浸透し、それらの中に濃縮されることが知られている。弱塩基性抗生物質は、細胞中の酸性環境、特にリソソーム中に閉じ込められるようになり（Tulkens, 1991）、そして他の細胞内細胞小器官中にも濃縮され得る。しかしながら細胞内浸透及び濃縮の程度は、マクロライド間で、そして細胞型間で変化する（Bosnar et al., 2005、Labro, 1993）。チルミコシンは、細胞中に濃縮されることがこれまでに報告されている（Scorneaux and Shrycock, 1998a,b）。
【００８０】
同様の効力要求を有する３つのマクロライド抗生物質は、アセチルイソバレリルチロシン（タイルバロシン、ECO Animal Health）、タイロシン（タイラン、Elanco Animal Health）及びチルミコシン（プルモチル、Elanco Animal Health）である。タイルバロシンは、ブタにおける流行性肺炎（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の治療及び予防のため、回腸炎（ローソニア・イントラセルラリス）の治療のため、並びにブタ赤痢（ブラキスピラ・ハイオディセンテリアエ）の治療及び予防のため、集中審査方式により、欧州連合（ＥＵ）全体を通して近年認可されてきている。それは、ニワトリにおけるマイコプ
ラズマ病（マイコプラズマ・ガリセプチカム、マイコプラズマ・シノビエ）の治療及び予防のために、或る特定の非ＥＵの国々で用いられている。チルミコシンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエにより引き起こされる肺炎の治療のためにブタにおいて、そしてマイコプラズマ・ガリセプチカムに関連したニワトリ群における呼吸器感染の治療のために用いられる。タイロシンは、流行性肺炎の予防及び治療のために、ブタ赤痢の予防及び制御又は治療のために、そしてローソニア・イントラセルラリスの治療及び制御のために用いられる。それは、ニワトリにおけるマイコプラズマ・ガリセプチカムＳ６株の制御にも用いられる。
【００８１】
それゆえ、腸細胞及び呼吸器上皮細胞はこれらの病原体の標的であると思われる。生得的又は非特異的免疫系に及ぼすマクロライドの作用についての幾つかの報告が存在する（Ianaro et al., 2000；Labro, 1993；Labro, 2000；Sunazuka et al., (2003)）。微生物性疾患との闘いに関与する身体中の２つの主要食細胞型は、マクロファージ及び好中球（ニワトリにおける偽好酸球）である。血液単球由来のマクロファージは相対的に長命細胞であるが、好中球は短命である。両細胞型は生得的免疫系において重要である、ということが知られている。
【００８２】
種々の細胞型、例えば腸細胞、上皮細胞及び白血球（ＷＢＣ）における３つの抗生物質の取込み及び濃度を調べた。調査は、確立されたヒト腸上皮細胞株（ＨＲＴ−１８及びＣａｃｏ−２）（これらの細胞型はともに、ｉｎ  ｖｉｖｏ腸細胞の特性の幾つかを保有するので）を用いた。Ｃａｃｏ−２細胞は、半透膜上で増殖される場合、極性化単一層（ここで、それらは頂端面及び側底面を有する）を形成し得る。培地は半透膜の上及び下の両方に配置され、分子の経上皮輸送がこれらの細胞を用いて試験され得る。腸細胞は、腸（腸管腔）からの抗生物質の取込みに関与する。ブタ腎臓細胞を上皮細胞型の一例として用い、そしてニワトリ及びブタＷＢＣもともに用いた。
【００８３】
材料及び方法
抗生物質ストック溶液
水溶性製品（ECO Animal Health）として酒石酸塩形態で、タイルバロシンを得た。活性成分タイルバロシン（３−アセチル４−イソバレリルチロシン）は、分析証明書によると、経口溶液用の７０．７１％のタイルバロシン顆粒を含む。本明細書全体に亘って、タイルバロシンは、活性成分アセチルイソバレリルチロシンを指す。タイランＳｏｌｕｂｌｅ（ELANCO Animal Health）の形態でタイロシンを、酒石酸塩として用いた。チルミコシンは、プルモチルＡＣ（ELANCO Animal Health）の形態で用いた。チルミコシンは、タイロシンのＢ分画の発酵産物から得られる。
【００８４】
細胞株
ＨＲＴ−１８、Ｃａｃｏ−２及びＬＬＣ−ＰＫ１細胞をECACCから入手した。ＨＲＴ−１８細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中に保持した。Ｃａｃｏ−２細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中に保持した。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する培地１９９中に保持した。
【００８５】
ブタ及びニワトリ白血球の調製
ブタ血液をヘパリン被覆ＢＤバキュテナー（６）中に回収した。２０ｍＬの血液及び３０ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、５０ｍＬ円錐遠心管中で混合した。これを反復して、３本のこのような管を得た。混合物を、２０５０×ｇで１０分間遠心分離した。白血球を、下記の幾らかの赤血球と一緒に、５０ｍＬ円錐遠心管中で中に採取した。
ＰＢＳを添加して、約５０ｍＬにした。パーコールの６３％溶液を、以下のように作製した：６．３ｍＬのパーコール（Sigma）、１．０ｍＬの１．５ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＬのＨ2Ｏ。１０ｍＬの６３％パーコールを、２つの５０ｍＬ円錐遠心管の各々に添加した。２５ｍＬの再懸濁白血球を、パーコール溶液の各々の上面に層になるように注意深く添加した。鮮明な界面を生じた。材料を、３０００×ｇで１０分間遠心分離した。白血球の明白な帯域が、ＰＢＳ／パーコール界面に観察された。白血球をＰＢＳ（５０ｍＬ）中に採取し、５００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを培地（ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するグラスゴー最小必須培地）中に再懸濁した。トリパンブルーを用いて、生菌数の計測を行なった。
【００８６】
ブタＷＢＣの単離に用いたのと同一方法を、ニワトリＷＢＣに関して用いたが、但し、ヘパリン（１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬ）を調製し、等容積のニワトリ白血球と混合した。
【００８７】
ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積に関する時間及び濃度の影響
ＨＲＴ−１８細胞（６ｃｍ組織培養皿中）を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬのタイルバロシンの存在下でインキュベートした。４時間後、各タイルバロシン濃度に対して２つの皿及び抗生物質を含有しない２つの皿をインキュベータから取り出した。培地の試料（約１ｍＬ）を取り出し、ラベルを付したエッペンドルフ管中に入れ、−２０℃で貯蔵した。次に培地の残りを除去した。細胞単一層の各々を、各洗浄に関して約５ｍＬを用いてＰＢＳ中で２回洗浄した。２ｍＬプラスチック注射器のプランジャを用いて、細胞を静かに擦り取った。ＰＢＳ（５００μＬ）を皿に添加し、マイクロピペットを用いて細胞を静かにこの媒地中に取り出した。次に試料をエッペンドルフ管に入れて、卓上遠心機（Biofuge pico, Heraeus instruments）中で８０００×ｇで１３秒間遠心分離した。明らかな細胞ペレットが生じた。上清をマイクロピペットにより取り出し、細胞物質をラベルを付したエッペンドルフ管中に−２０℃で貯蔵した。約２４時間後、残りの組織培養皿をインキュベータから取り出して、４時間試料に関して上記したように処理した。４時間試料を含めて全試料を、次に−７０℃で貯蔵した。
【００８８】
ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積
ＨＲＴ−１８細胞を上記のように調製し、４２継代で用いた。抗生物質（タイルバロシン、タイロシン又はチルミコシン）のストック溶液を成長培地で希釈し、１０μｇ／ｍＬの各抗生物質を融合性細胞単一層に添加した。細胞を、５％ＣＯ2大気中で３７℃で４時間又は２４時間インキュベートした。培地及び細胞を採取し、上記と同様に抗生物質に関して試験した。
【００８９】
Ｃａｃｏ−２細胞における細胞内蓄積及び経上皮輸送
０．４μｍの孔サイズのＴｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒフィルター６ウエルプレートの１つのウエル当たり０．８×１０6細胞の密度で、Ｃａｃｏ−２細胞を播種した。頂端及び側底チャンバ中で、２ｍＬの培地とともに細胞をインキュベートした。この培地を１０日〜１４日間、２日毎に取り替えた。細胞が極性化するようになった場合を同定するために、７日、１０日及び／又は１４日目にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ装置（Millipore）を用いて経上皮抵抗を測定した。１０００Ωを超える読取値は、極性化細胞を示した。
【００９０】
異なる薬剤（１００μｇ／ｍＬで）を、頂端又は側底チャンバ中に入れて、２４０分まで種々の時点で、頂端及び側底区画の両方における培地及び細胞を採取し、マクロライド含量に関して分析した。
【００９１】
ブタ腎臓細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積
６ｃｍ2プラスチック組織培養皿中のＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、１０μｇ／ｍＬの異なるマクロライドとともにインキュベートした。細胞及び培地を、３０分、７５分及び１２０
分に、上記と同様に採取した。
【００９２】
ブタ白血球及びニワトリ白血球におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積
細胞を、１０ｍｇ／ｍＬの各抗生物質とともにインキュベートした。全管を、３７℃で回転混合機上に置いた。上清及び細胞試料を図面の説明文に記載した時間で採取した。各時点に関する各抗生物質に対して、二重反復試料を用いた。
【００９３】
タイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンを含有する試料の分析
すべての上清及び細胞試料を、分析のためにYork Bioanalytical Solutions（York, England）に（約−２０℃で）凍結輸送した。要するに、０．２５ｇの緩衝液（１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地）をポリプロピレン管中で秤量した。５０μＬ容積の適切な希釈標準溶液を、品質管理（ＱＣ）試料に添加した。較正標準、回収試料及び試薬ブランクの調製のために用いられる各ブランク試料に、メタノール（５０μＬ）を添加した。２．５ｍＬ容積の０．１Ｍリン酸塩緩衝液を各試料に添加し、約１分間ボルテックス混合して、次に４℃で１０分間、３２２０×ｇで遠心分離した。
【００９４】
液体−液体浄化相に関して、上清の分注試料（１００μＬ）をポリプロピレン管に移した。０．１ＭのＮａＯＨの添加によりｐＨを８〜８．５に調整し、ボルテックス混合した。酢酸エチル（５ｍＬ）を添加し、封をした後、全混合物を１０分間振盪し、次に４℃で１０分間、３２２０×ｇで遠心分離した。
【００９５】
酢酸アンモニウム（２０ｍＭ；ｐＨ未変性）−蟻酸、１０００：３（ｖ／ｖ）（１００μＬ）を、２ｍＬのポリプロピレン回収プレート中の各ウエルに添加した。酢酸エチル混合物の分注試料（１００μＬ）をポリプロピレン回収プレートに移し、酢酸アンモニウムは残しながら酢酸エチルが完全に蒸発するまで、窒素（４０℃）下でエバポレートした。メタノール（１００μＬ）を、較正標準を除いて、各ウエルに添加した。
【００９６】
較正標準を含有する各ウエルに、１００μＬの適切な較正希釈標準溶液を添加した。次に試料を少なくとも１０分間ボルテックス混合し、タンデム質量分光分析を用いて液体クロマトグラフィーに供した。上述の方法は、培地の試料（並びに較正標準及び品質管理試料）に適用可能であった。
【００９７】
細胞に関しては、試料管を秤量し、１００μＬのアセトニトリルを添加した。試料を１０秒間ボルテックス混合し、次に４℃で５分間、１０２８５×ｇで遠心分離した。試料をポリプロピレン管に移した。元の試料管を、０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（１ｍＬ）で洗浄した。これをポリプロピレン管に移した。１ｍＬの二次洗浄を行なって、次に０．５ｍＬを最終洗浄した。ポリプロピレン管はここでは液体抽出の終了と同一段階であったが、培地よりむしろ細胞に関して存在していた。次にこれは、上記のような試料調製を通して採用した。元の試料管を乾燥させ（即ちあらゆる残存溶媒をエバポレートにより取り除き）、次に再秤量して、試料中の細胞の重量を確定し、細胞１ｇ当たりの濃度を確定した。
【００９８】
結果
ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積に関する時間及び濃度の影響
上皮腸細胞株ＨＲＴ−１８におけるタイルバロシンの細胞内蓄積に及ぼす経時的に増大する濃度の影響を調べるために、初期実験を実行した。図５ａで分かるように、培地中の濃度に直接比例するＨＲＴ−１８細胞中へのタイルバロシンの急速な（４時間以内）取込みが認められた。細胞は、高濃度のタイルバロシン（少なくとも５８５μｇ／細胞１ｇ）を蓄積した。細胞：培地濃度比（図５ｂに示されている）は、培地中のタイルバロシンの３つの初期濃度すべてに関して、約１：１２であった。同様の結果を２４時間インキュベ
ーション後に得たが、その比はより低かった。
【００９９】
ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積
次に、ＨＲＴ−１８細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積を、関連マクロライドであるタイロシン及びチルミコシンの蓄積と比較した。図６ａに示したように、タイルバロシンはＨＲＴ−１８腸上皮細胞により迅速に侵入した。６１．８μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇという平均値が４時間で検出されたが、一方、同時点で検出されたのは平均７．２４μｇのチルミコシン／細胞１ｍｇに過ぎなかった。２４時間では、５７．６μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇ、及び３２．４５μｇのチルミコシン／細胞１ｍｇが見られた。両時点で、タイロシンは容易にはＨＲＴ−１８細胞に侵入しなかった。細胞内：細胞外濃度比を、図６ｂに示す。４時間後、タイルバロシン蓄積は、５．１３倍の細胞内濃度に関する平均値を生じた。１つのチルミコシン試料のみが濃縮され、これは１．３２倍であった。２４時間後、平均濃度比は、タイルバロシン（５．３４倍）及びチルミコシン（４．６４倍）に関して同程度であった。タイロシンがＨＲＴ−１８上皮細胞に侵入することができないということは、濃度比が１未満である、ということを意味した。
【０１００】
極性化Ｃａｃｏ−２細胞におけるタイルバロシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送
次に、別の腸上皮細胞株Ｃａｃｏ−２におけるタイルバロシンの細胞内蓄積を調べた。これらの細胞は、透過化支持体上で増殖される場合、分化し、極性化される。この場合、それらは細胞間に密な接合を形成し、そしてその結果頂端（上部）及び側底（側面及び底部）膜を形成する。
【０１０１】
図７ａは、タイルバロシンを頂端チャンバの培地に添加した場合の、頂端及び側底チャンバの細胞及び培地中のタイルバロシンの濃度を示す。図７ｂは、タイルバロシンを側底チャンバに添加した場合の同様の結果を示す。タイルバロシンは、極性化Ｃａｃｏ−２細胞における迅速な侵入を示す。４２８μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇの平均細胞内濃度が頂端チャンバの培地への投与の３０分後（図７ａの明灰色バー）、そして４９３μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇが側底チャンバの培地への投与後（図７ｂの明灰色バー）に検出された。頂端チャンバの培地への投与後、細胞中のタイルバロシン濃度は６０分〜１２０分に最大（５５９．５μｇ〜６２０μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇ）に達し、次に、２４０分で３７５μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇに低減した。側底チャンバ中に投与されたタイルバロシンを摂取した細胞は、頂端チャンバに投与されたものと同レベルの細胞内濃度に到達しなかった。到達された平均最大濃度は、３０分インキュベーション後であり、この時点の後、細胞内濃度は２４０分で１５５．５μｇのタイルバロシン／細胞１ｍｇに低減した。
【０１０２】
細胞内：細胞外濃度比は、図７ｃ及び図７ｄに示されている。頂端チャンバの培地への投与後（図７ｃ）、タイルバロシンはＣａｃｏ−２細胞内で急速に濃縮されるようになり、３０分後の比率は４．６４になった。この比率は、６０分〜１２０分でピークとなり（平均値１０．２３〜１５．５８）、次に、２４０分で５．８５の平均値に低減した。タイルバロシンは、側底チャンバの培地への投与後も急速濃縮を示した。７という平均細胞内：細胞外濃度比はわずか３０分後に観察された。この時点後、比率は２４０分後に３．５７に減少した。
【０１０３】
タイルバロシンが極性化上皮細胞を通って輸送され得るか否かを調べるために、投与部位の反対側のチャンバ（即ち、タイルバロシンを頂端チャンバに投与した場合は側底チャンバ）中の培地も検査した。図７ｅ（頂端チャンバの培地への投与）及び７ｆ（側底チャンバの培地への投与）で示されるように、類似レベルのタイルバロシンが反対側チャンバ中で検出され、２４０分後に投与チャンバと比較して、１９％（図７ｅ）又は２２．０５％（図７ｆ）タイルバロシンのレベルに到達した。反対側チャンバの培地におけるタイル
バロシンの濃度増大は、細胞内で検出されるタイルバロシンレベルの低減と同時に起こり、これは、細胞内濃度低減が細胞の反対側にある培地中にタイルバロシンが出て行くためであり得る、ということを示唆する。
【０１０４】
Ｃａｃｏ−２細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送
タイルバロシンの細胞内蓄積及び経上皮輸送をタイロシン及びチルミコシンのものと比較するために同様の実験を実行したが、頂端チャンバの培地への投与後の影響のみを調べた。図８ａに示されるように、タイルバロシンはまた、１２０分後に４２．２μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇの最大平均濃度に達する迅速な侵入及び蓄積を示した。上記のように、タイルバロシンの細胞内濃度は、２４０分時点で（３４．３μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇの平均値に）低減した。タイロシンは極性化Ｃａｃｏ−２細胞に容易に侵入せず、２４０分後、１．８６μｇタイロシン／細胞１ｍｇが検出されただけであった。チルミコシンは、タイルバロシンより遅い侵入及び蓄積を示した。１２０分での平均細胞内濃度は、（同時点での４２．２μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇと比較して）８．６μｇチルミコシン／細胞１ｍｇであった。２４０分では、チルミコシンは１６．０５μｇチルミコシン／ｍｇの平均濃度に到達した。
【０１０５】
図８ｂに示した細胞内：細胞外濃度比は、タイルバロシンが極性化Ｃａｃｏ−２細胞中で急速に濃縮される、ということを示す。タイロシンはこれらの細胞中で濃縮せず、そしてチルミコシンはより遅い濃縮動態を有する中間的作用を示したが、類似倍濃縮が２４０分後に到達された（タイルバロシンに関しては３．４９倍濃縮、チルミコシンに関しては２．５倍濃縮）。
【０１０６】
図８ｃに示したデータは、タイロシン又はチルミコシンより効率的な側底流体へのタイルバロシンの輸送を示す。タイルバロシンとの２４０分のインキュベーション後、側底チャンバは、頂端チャンバ値の１０．４７％（平均）を含有した。これは、タイロシンに関する値の０．５２％、チルミコシンに関する値の１．０８％という平均に匹敵する。
【０１０７】
ブタ腎臓細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積
典型的にはタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンで処置される宿主動物は、ブタ及び家禽である。ブタ腎臓上皮細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１におけるこれらのマクロライドの細胞内蓄積を調べた。図９ａに示したように、タイルバロシンはＬＬＣ−ＰＫ１細胞中に迅速に侵入し、蓄積して、７５分後、５３．９５μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇという平均濃度が検出されたが、これに比してタイロシンは２．４１μｇ／細胞１ｍｇ，そしてチルミコシンは４．９８μｇ／細胞１ｍｇであった。図９ｂに示したように、タイルバロシンは、１２０分で最大細胞内：細胞外濃度比８．９に達した。タイロシンはＬＬＣ−ＰＫ１細胞中では全く濃縮されず、そしてチルミコシンは１２０分で１．７倍濃縮を示した。
【０１０８】
ブタ及びニワトリ白血球におけるタイルバロシン及びチルミコシンの細胞内蓄積
ニワトリ及びブタから単離された白血球中のマクロライドの細胞内蓄積も調べた。タイルバロシンは、ブタ白血球に迅速に侵入した（図１０ａ）。１０分後、５７．４μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇの平均濃度が検出され、これに比してチルミコシンは３１．２５μｇ／細胞１ｍｇであった。これらの値における増大は２０分ではほとんど検出されず、この場合、６１．４５μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇ及び３６μｇチルミコシン／細胞１ｍｇが検出された。図１０ｂに示したように、平均細胞内：細胞外濃度比はタイルバロシンに関しては８．６８であったが、これに比してチルミコシンに関しては４．３３であった。同様の比率は、２０分後の両抗生物質に関して見出された。抗生物質負荷細胞が抗生物質を有しない培地中に残された場合、細胞からの輸送が認められた。細胞内に保有さ
れる量は、約１４％〜１５％で両抗生物質に関して同程度であった（図１０ｃ）。それゆえ、抗生物質の大多数は、これらの条件下で細胞から失われた。
【０１０９】
ニワトリにおける哺乳類好中球の細胞型等価物は、偽好酸球である。白血球をニワトリ血液から単離し、抗生物質の蓄積に関して試験した。結果は、図１０ｄに示したように、タイルバロシンは細胞内に迅速に蓄積する、ということを実証した。１５分で、細胞中のタイルバロシン濃度は８９．８μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇの平均値を有し、この濃度は６０分後に、１２２．９μｇタイルバロシン／細胞１ｍｇというこの検査に関する最大値に達した。タイロシンは、これらの細胞に侵入可能であり、そして１５分での１０．１μｇタイロシン／細胞１ｍｇから６０分での３２．１μｇタイロシン／細胞１ｍｇに増大するタイロシンの細胞内濃度を示した。チルミコシンはさらにまた、中間的作用を示し、そして１５分での３７．１μｇチルミコシン／細胞１ｍｇから６０分での７１．３μｇチルミコシン／細胞１ｍｇに増大した。
【０１１０】
細胞内：細胞外濃度比（図１０ｅ）は、１５分で、タイルバロシンの細胞内濃度は、培地中の濃度の約１８倍である、ということを示した。６０分後には、１９倍濃度が検出された。チルミコシン及びタイロシンはともに細胞中で濃縮したが、これは実験期間中に、チルミコシンに関しては約４．２倍から８倍まで、タイロシンに関しては２．６５倍から約４．７倍まで変化した。
【０１１１】
考察
細胞における抗生物質の取込み及び蓄積は、ウイルスの複製に影響を及ぼし得る重要な因子であり得る。ウイルスは複製のための細胞機構を要するので、ウイルス複製は細胞内で専ら起こる。通常は、抗生物質はウイルス複製に影響を及ぼすと予測されない。しかしながらこの場合、アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）がＰＲＲＳＶ及びＡ型インフルエンザウイルスの複製に影響を及ぼす、ということが予期せず見出されている。マクロライド間の細胞侵入に関する比較データは、ウイルス複製の作用における考え得る差異を説明するのに役立つかもしれない。
【０１１２】
これらの研究において、本発明者らは、ヒト及びブタ上皮細胞並びにニワトリ及びブタ白血球（ＷＢＣ）における３つのマクロライド（タイルバロシン、タイロシン及びチルミコシン）の取込み及び細胞内蓄積を調べてきた。それにより、タイルバロシンは、すべての細胞型において、タイロシン又はチルミコシンより大きい程度に侵入し、濃縮し得る、ということが実証された。しかしながら、細胞間の培地（細胞間流体）の存在のため、そのデータは細胞内濃縮の程度を明らかに過少評価していた（Scorneaux and Shryock, 1999）。さらにマクロライドは、酸性細胞区画、特にリソソーム内に局在することが示されている（Tulkens, 1991, Carbon, 1995）。これらの区画は、上皮細胞株中の相対的に小さい細胞質容積比率を構成し、したがって抗生物質の局在濃度は高い。
【０１１３】
腸上皮（ＨＲＴ−１８）細胞中のタイルバロシン蓄積を試験するための初期実験は、培地中の濃度に直接依存するレベルに効率的に抗生物質が濃縮される、ということを示した。ＨＲＴ−１８及びＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの取込み及び濃縮を比較するさらなる実験は、それらの間の挙動における顕著な差異を実証した。最も著しい差異は、タイロシンが両細胞株に非効率的に侵入し、そして濃縮されない、という点であった。ＨＲＴ−１８データから、したがって、腸上皮細胞を介した宿主中への取込みはタイロシンに関しては、タイルバロシンに関してよりも遅いと予測され得た。ｉｎ  ｖｉｖｏデータ（Okamoto et al., 1981）は、経口投与タイルバロシンがタイロシンより高い血中レベルを生じた、ということを示している。それらの密接に関連する分子構造にもかかわらず、タイルバロシン及びタイロシン間の挙動に顕著な差異が明らかに認められる。３−アセチルタイロシン（未発表データ）及びタイロシンが同じ
ように挙動するという観察は、タイルバロシン（３−アセチル−４’’−イソバレリルタイロシン）中に存在する疎水性イソバレリル基がその効率的取込み及びその後の酸性区画中での蓄積に重要であるという見解を支持する。チルミコシンは細胞侵入／蓄積の速度に関して中間的であるが、達成される最終レベルはタイルバロシンにより達成されるものと非常に類似する。これは、チルミコシンの中間的疎水性を反映し得る。薬剤の報告されたｐＫａ値は、すべて、リソソームのような酸性区画中でのプロトン付加及び蓄積と一致する。２４時間を越えてもタイロシン蓄積が為されないことは、原形質膜及び細胞内細胞小器官膜の両方を通るその限定された能力を反映すると考えられる。
【０１１４】
Ｃａｃｏ−２細胞を用いるマクロライド抗生物質の取込み及び排出の研究は、ＨＲＴ−１８細胞研究を拡大した。Ｃａｃｏ−２細胞は、ヒト結腸腺癌細胞である。それらは、成熟腸細胞、例えば微絨毛、密な接合部、酵素、例えば小腸ヒドロラーゼ、栄養運搬体並びに膜タンパク質、例えばＣＴＦＲ、ＩＣＡＭ−１、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−６受容体及びα１抗トリプシン受容体の特質を示す上皮細胞である（Varilek et al., 1994、Kaiserlian et al., 1991、Zweibaum et al., 1983、Sood et al., 1992、Molmenti et al., 1993）。これらの特徴は、指向的やり方で上皮を通過する薬剤の能力を評価するのにそれらを良好に適合させる。
【０１１５】
極性化細胞は、幾つかの異なる型の分子、例えば免疫グロブリン及びアルブミンの侵入経路及び輸送を調べるために多数の研究において用いられてきた（Ellinger et al., 2001、Maples et al., 1997、Antohe et al., 1997）。これらの細胞は、ウイルスの極性化侵入及び放出を研究するためにも用いられてきた（Cordo et al., 2005、Chu and Ng 2002、Rossen et al., 2001、Jarvis et al., 1999）。
【０１１６】
本発明の研究におけるＣａｃｏ−２細胞の結果は、頂端及び側底チャンバの培地の両方への投与のための３０分（用いられた最初の時点）でのタイルバロシンの迅速濃縮を実証する。いずれかの投与経路を用いても同様の値を得たが、これは、両表面での取り込みの類似のメカニズムを示唆する。タイルバロシンは細胞を横断して反対表面に移動し、培地中に放出された。したがって頂端面で投与される抗生物質は、基本培地中で検出され得る。この作用は経時的に増大し、したがって、４時間後にタイルバロシンの総量の約２０％が輸送された。これは、輸送に関与する細胞が少数であることを考慮すると、効率的プロセスであると思われる。タイルバロシンの動きは、濃度勾配を下げる。これが起こるメカニズムは知られていない。タイロシンはＣａｃｏ−２細胞において細胞内で濃縮されず、チルミコシンは中間的挙動を示し、迅速侵入は起きなかったが、経時的に抗生物質を細胞内に濃縮し、適度の量が上皮を横断して輸送された。腸上皮細胞を用いるこのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗生物質が腸の管腔から身体に、そして身体から腸管腔にも輸送され得る、ということを示唆する。これは、マクロライドであるクラリスロマイシン及びアジスロマイシンに関して示されている。アジスロマイシンは肝臓経路により、幾らかの胆汁中排泄を伴って排出され、そして小腸の管腔中に分泌されることにより、直接的にも排出される、とNightingale (1997)は報告した。この経腸経路は、総投与用量の３０％〜３５％の排出を占めると考えられる。クラリスロマイシンは、肝臓及び腎臓排出、そしてさらに経腸排出（このマクロライドの総用量の約１０％の排泄を占める）の両方を経る、と同著者は記述した。
【０１１７】
これまでの研究は、好中球、並びに単球／マクロファージ系の細胞によるマクロライドの取込み増大及びより大きな蓄積を強調してきた。タイルバロシンは、１０分間だけのインキュベーション後、ニワトリ及びブタ白血球の両方において、迅速に侵入し、蓄積する、ということを本発明者らのデータは実証した。その取込みは、タイロシン又はチルミコシンに関して観察されたものより大きかった。好中球の主な機能は、病原性生物体を貪食することである。抗生物質を負荷された細胞は、細胞内での致死能力を増大することによ
り、感受性生物体の宿主を良好に除去し得る。さらにまた、細胞は、直ぐ周りの培地に抗生物質を放出することにより、高濃度の抗生物質を局所的に産生させることができるし、これが細胞外死を起こさせる。
【０１１８】
本発明の試験において、われわれの技法は、ブタＷＢＣにおけるタイルバロシン及びチルミコシンの取込みの比較を可能にした。タイルバロシンはブタ白血球（その大多数が好中球である）により迅速に取り込まれ、そしてちょうど１０分間のインキュベーション後、９という細胞内：細胞外濃度比が得られた。チルミコシンもブタＷＢＣに迅速に侵入するが、得られた濃度はより低かった（４倍）。トリＷＢＣを用いた場合、タイルバロシンは、１５分以内に高い細胞内：細胞外濃度比（約１８倍）に到達し、これは保持された。タイロシン及びチルミコシンもともに濃縮されたが、程度はより低かった。
【０１１９】
マクロライドは生得的免疫系に及ぼす作用を有することが示されており、例としては、好中球のアポトーシス増大を引き起こすこと（Chin et al., 1998）並びに感染部位への好中球の補充を低減すること（Ianaro et al., 2000）により炎症を低減することが挙げられる。これらの作用は、炎症に関連づけられ得る病態を防止する際にも宿主を補助し得る。
【０１２０】
分子が細胞に侵入し得る幾つかの異なるメカニズムが存在する。これらの例としては、濃度勾配を下げる受動的拡散（脂溶性分子に関して）、能動輸送、及び種々の形態でのエンドサイトーシス（Pelkmans and Helenius 2003、Stuart and Ezekowitz 2005により記載されたようなクラスリン媒介性、カベオラ媒介性、ピノサイトーシス、マクロピノサイトーシス及び食作用）が挙げられる。細胞中へのマクロライド抗生物質の動きが研究されてきたが、情報はむしろ不足気味である。多くの研究が、細胞質中への原形質膜を横断するプロセスと酸性化小胞中の蓄積のプロセスとを区別することができていない。細胞質中への侵入は、受動的な濃度勾配依存性プロセスであると思われる。マクロライドの取込みは、アルカリ性ｐＨでより大きいことが示されている。これは、非荷電分子の受動的拡散が好ましい、という見解を確証する。マクロライドの蓄積は、４℃では起きない。したがって、このことは、エンドソーム及びリソソームを酸性にするプロトンポンプが、原形質膜での能動的プロセスが阻害されるというよりむしろ、この温度で活性ではないためであると考えられるが、アジスロマイシンが代謝阻害剤で前処理された細胞中で依然として濃縮されるという観察（Gladue and Snider, 1990）は、先在するｐＨ勾配がエンドソーム及びリソソーム中でのマクロライド蓄積を可能にするのに十分であるべきだ、ということを示唆する。したがって低温の作用は、これらの細胞小器官中での低ｐＨの消失のため、又はおそらくは、拡散速度に及ぼす温度の通常作用から予測されるよりも劇的に拡散を遅くする原形質膜構造の再構成のためであり得る。特定チャンネル又は輸送体の非存在下で膜を通る分子の能力は、膜の脂質相で「溶解する」それらの能力に強く依存している。したがって疎水性は、マクロライド侵入及び蓄積の効率の重要決定因子であると考えられ、ｐＫａ値が関与する場合もある。この出版物中で報告されたタイルバロシンの特性は、タイルバロシンがイソバレリル基及び７．６というｐＫａを保有する点で一致する。
【０１２１】
抗菌活性と効率的細胞蓄積との間の関係を取り巻く問題は、複雑である。所定の型の細胞及び所定の型の細胞内感染に関して、抗菌薬がｉｎ  ｖｉｖｏで有効であるのに必要となる実際の細胞内濃度を予測することは非常に難しい、とCarbon（1995）は言及した。しかしながら重要な考察は、細菌と抗生物質を蓄積する細胞との間の空間的関係である。３つの型の相互作用は、タイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンのようなマクロライドの状況では特に興味深い。第一の型は、エンドソーム／ファゴリソソームの低ｐＨ環境で生存可能である細胞内細菌に伴って起こる。この場合、酸性区画中の薬剤の蓄積は、それらを非常に効果的にする。相互作用の第二の型は、小胞から細胞質中への脱出を包含する。この場合、小胞中の抗生物質の蓄積は、細菌の脱出前に関連性を有するだけであるが
、小胞蓄積材料は細胞質中への放出のための抗生物質の貯蔵所を提供し得る。相互作用の第三の型は、細菌が典型的には「宿主」細胞の原形質膜と結合する密接な細胞外相互作用を包含する。この場合も、周囲環境にゆっくり放出される薬剤の貯蔵所として細胞が作用する場合のみ、蓄積は関連性を有する。この論文に記載されたタイルバロシンの特性は、細胞との関連性を有するこれらの型のいずれかに入る細菌に対する有効性と一致する。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性から推測することの難しさは、他の効率的に蓄積された相対的に疎水性のマクロライドを用いた経験により例証される。したがって、アジスロマイシンの細胞取込みは相対的に高く、取り込みは他のマクロライドの細胞取込みより遅いが、これは効率の増大により釣り合わされない（Labro, 1996）。同様に、高い細胞内対細胞外濃度比がチルミコシンに関して報告されているが（Scorneaux and Shryock, 1998a,b, 1999）が、ニワトリにおけるマイコプラズマ病に関してReeve-Johnson et al., (1997a,b)により実証されたように、特に用いられる商業的投与量では、有効性は例外的でない。高細胞内濃度で見出される、そして相対的に容易に細胞膜を通って動くこの抗生物質は、例えばマイコプラズマに対して高度に有効であると予測されている。３’アセチル４’イソバレリルタイロシン分子のどの特徴が一連の重要な細胞関連病原体に対するその特定の有効性の要因になっているかは、依然として確定されていない。
【０１２３】
ブタからの上皮細胞（ＰＫ）を用いた本発明者らの結果は、ヒト（ＨＲＴ−１８、Ｃａｃｏ−２）を用いたものと同様の結果を生じた。実際、結果は非常に明快であり、そしてまた、タイルバロシンは細胞中で迅速に濃縮されるが、一方、タイロシンは濃縮されず、そしてチルミコシンは中間的特性を有した。
【０１２４】
したがってこの研究で提示されたデータは、たとえチルミコシンがタイロシンのＢ分画に由来し、そしてタイルバロシンがＡ分画に由来する場合でも、マクロライド分子の細胞取込みにおいて顕著な差異を示す。３’アセチル４’イソバレリルタイロシンは、イソバレリル基を有するため、３’アセチルタイロシン（３ＡＴ）とは異なる。細胞に迅速に浸透するタイルバロシンの能力はイソバレリル基によるものであると考えられ、これはこの研究からのデータに、そしてタイルバロシンがタイロシン又は３ＡＴより親油性であることを示唆したこれまでの研究（Tsuchiya et al., 1981）からのデータにも示されている。３ＡＴはタイルバロシンの主要代謝産物であり、そして細胞内で生成される。おそらく、代謝産物は、タイルバロシンと比較して、細胞を出る能力が低減している。３ＡＴは依然として代謝的に活性でありそして親分子より細胞中に長く残存すると考えられるという事実は、臨床的に有益であり得る。
【０１２５】
＜実施例４＞
実施例１に関して、ウマインフルエンザ・マイアミ株（ヒトＰＲ８及びウドーン株と比較）によるＭＤＣＫ細胞の感染に及ぼすタイルバロシンの作用を調べるための実験を実行した。１μｇ／ｍＬのタイルバロシン、タイロシン又はチルミコシンを用いて４時間、ＭＤＣＫ細胞を前処理した。次に細胞を、薬剤の存在下でＰＲ８、ウドーン株又はマイアミ株（感染多重度１０で）に感染させた。感染後、細胞を４時間固定し、インフルエンザ核タンパク質に対する間接的免疫蛍光法により感染を評価した。結果を図１１に示す。
【０１２６】
タイルバロシン（１μｇ／ｍＬで）は、ウマインフルエンザ・マイアミ株によるＭＤＣＫ細胞の感染を９２％、ウドーン株による感染を７６％阻害し、そしてＰＲ８感染を完全に阻害した。
【０１２７】
＜実施例５＞
ＰＲＲＳＶ感染、及び低多重度での感染後の細胞伝播に及ぼすタイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンの作用、並びに感染後に薬剤を添加する作用も調べるために、実験
を実行した。
【０１２８】
ＭＡ１０４細胞を、０．０１のｍｏｉ（初回に細胞のおよそ１０％を感染するはずである）でＰＲＲＳＶに感染させた。感染８時間後、タイルバロシン、タイロシン及びチルミコシンを１μｇ／ｍＬで添加した。感染後２８時間で細胞を採取し、間接的免疫蛍光法により感染を評価した。各処理に関するウイルス陽性細胞の数を示す結果を、図１２に示す。
【０１２９】
上記のように、０．０１のｍｏｉは、細胞のおよそ１０％を感染するはずである。しかしながら２８時間後、ウイルスは初回感染を完了し、隣接細胞に感染した。ウイルス抗原は低レベルで感染後１０時間で検出され得ることが見出された。この検出は、感染後１６時間〜２０時間増大し、そして２４時間までに、隣接細胞における低レベルの発現が検出され得る。
【０１３０】
感染後８時間の薬剤の添加は、一次感染に及ぼす影響を有しないはずである（即ち、投入ウイルスの侵入に影響を及ぼさない）。しかしながらそれは、初期感染細胞により産生されるウイルスが隣接細胞に感染する場合、その他のメカニズムにより直接又は間接的にウイルス複製に作用し、そして二回目の感染中のウイルス侵入にも影響を及ぼし得る。
【０１３１】
感染後８時間のアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の添加は、ＰＲＲＳＶ感染を阻害し、感染を１％ウイルス陽性細胞に低減する。アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）は、ウイルス複製を阻害すると思われ（より少ない感染細胞を検出した）、隣接細胞へのウイルスの伝播を防止し、そして非処理／感染細胞で観察されるバイスタンダー効果も低減したが、この場合、隣接細胞はウイルス抗原発現回数切り上げを示さなかった。
【０１３２】
＜実施例６＞
タイルバロシンがウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）に及ぼす影響を有するか否かを確定するために、実験を実行した。ＥＡＶ感染がタイルバロシンにより、又はノコダゾールにより遮断されない、ということを本発明者らは見出したが、これは、ＥＡＶが後期エンドソームに移行しないことを示唆する。
【０１３３】
＜実施例７＞
感染前及び後の種々の時点で添加される場合のＰＲＲＳＶ感染の既知の阻害剤の作用を調べるための試験
感染４時間前に添加した場合、クロルプロマジン、クロロキン、ノコダゾール、サイトカラシンＤ及びアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）は初期ＰＲＲＳＶ感染を阻害し、したがって伝播は観察されない。
【０１３４】
感染時に添加した場合、クロルプロマジン、クロロキン、サイトカラシンＤ及びタイルバロシンは初期ＰＲＲＳＶ感染を阻害し、したがって伝播は観察されない。ノコダゾールは、初期感染を阻害しなかった。ノコダゾール処理細胞は依然として長期プロセスを生じたが、これは、それらを含有する場合でさえ、それらの生成が微小管によっていない、ということを示す。
【０１３５】
感染の２時間又は４時間後に添加した場合、アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）のみが感染初期部位の感染並びに伝播を阻害した。クロルプロマジン処理細胞は感染の初期部位を示したが、当該薬剤は伝播を防止するように見えた。ノコダゾールは感染に影響を及ぼさず（毒性のため、伝播に及ぼすその作用も不明瞭である）、そしてまたウイルスを含有する長期プロセスが観察された。サイトカラシンＤは、感染細胞が検出されたよ
うに、初期感染に及ぼす影響を有さなかったが、長期プロセスは存在せず、伝播は検出され得なかった。これは、当該プロセスがアクチン重合により駆動され、そしてそれらが感染の初期部位からのウイルスの伝播に必要である、ということを示唆する。クロロキンは、感染後に添加した場合、初期感染又はウイルス伝播に及ぼす影響を有さなかった。
【０１３６】
結果を、図１３に示す。
【０１３７】
＜実施例８＞
クロロキンに対するＰＲＲＳＶ、ＥＡＶ及びＦＣＶの感受性の比較
ネコカリシウイルス、ウマ動脈炎ウイルス及びＰＲＲＳＶはすべて、それらの宿主細胞を首尾よく感染させるためにはエンドソーム酸性化を要する。クロロキンのような薬剤でエンドソームｐＨを上げることは、これを実証している。クロロキンは弱塩基性であり、陽子を封鎖することによりエンドソームｐＨを上げる（即ち、クロロキンの濃度が高いほど、多くの陽子を封鎖し、そしてｐＨはより高くなる）。クロロキンの濃度増大の作用を、図１４に示す。データは、相対的に低濃度のクロロキン（５μＭ未満）がＰＲＳＶ感染を阻害するために必要とされることを示し、このことは、エンドソームｐＨの少しの上昇でもウイルス侵入を阻害するのに十分であることを示唆する。ＦＣＶの阻害は、高濃度のクロロキン（２００μＭ以上）を必要とし、そしてＥＡＶは５０μＭ以上により阻害される。高濃度のクロロキンは、ＦＣＶ及びＥＡＶを阻害するためにはｐＨ上昇増大が必要とされる、ということを示唆する。これらのデータはすべて、ＰＲＲＳＶが、ＥＡＶ又はＦＣＶ（即ち早期エンドソーム中）より非常に低いｐＨ（即ち後期エンドソーム中）でエンドソームを通過する必要がある、ということを示す。
【０１３８】
＜実施例９＞
ＰＲＲＳＶのＵＳ株
感染に及ぼすタイルバロシンの作用を調べるために、本発明者らは、ＶＲ２３３２（ＰＲＲＳＶのＵＳ株）を用いてＭＡ１０４細胞も感染させた。結果を、図１６に示す。
【０１３９】
ＭＡ１０４細胞を、４時間、示された濃度で、アイブロシン（登録商標）、タイルバロシン、タイロシン又はチルミコシンとともに前インキュベートした。次に、薬剤の存在下で、１０のｍｏｉで、細胞をＶＲ２３３２に感染させた。次に細胞を２０時間インキュベートした。間接的免疫蛍光法により、感染を評価した。
【０１４０】
結果は、前に検査した欧州株に関して観察されたものに匹敵する。
【０１４１】
＜実施例１０＞
ＶＲ２３３２（ＰＲＲＳＶのＵＳ株）侵入検査
ＭＡ１０４細胞を、クロルプロマジン、クロロキン、ノコダゾール又はサイトカラシンＤで３０分間；或いはタイルバロシン、タイロシン又はチルミコシンで４時間、前処理した。次にｍｏｉ  １０で細胞にＶＲ２３３２を感染させて、一晩インキュベートした。
【０１４２】
図１７に示した結果は、ＰＲＲＳＶのＵＳ株はタイルバロシンにも感受性であるが、タイロシンには感受性でない、ということを示す。チルミコシンは、用いた濃度で部分阻害を示す。
【０１４３】
＜実施例１１＞
ＨｅＬａ又はＨＴ２９細胞のウイルス感染に及ぼすタイルバロシンの作用：高及び低多重度でのウイルス
研究により、タイルバロシン処理ＨｅＬａ細胞はウイルス感染に対して高度に耐性である、ということが示された。本発明者らは、多数のウイルスを用いてこの検査を反復し、
これをＨＴ２９細胞（エンテロウイルス感染に関してルーチンに用いられる細胞株）のウイルス感染と比較した。ウイルスを高多重度（侵入を見るため）及び低多重度（細胞単一層におけるウイルス伝播を見るため）で添加した。
【０１４４】
細胞を、タイルバロシン、タイロシン、チルミコシン及びクロロキンで４時間処理した。次にｍｏｉ  １０で４時間又はｍｏｉ  ０．１で１６時間、細胞をウイルスに感染させた。
【０１４５】
タイルバロシンは、インフルエンザウイルス侵入及びコクサッキーＢ５ウイルス侵入を阻害した。クロロキンも、３つのウイルスすべての侵入を阻害した。タイロシン及びチルミコシンは、作用を有しなかった。ＥＶ１１は、如何なる処理にも影響されなかった。
【０１４６】
タイルバロシン及びクロロキンは、低多重度でインフルエンザウイルス及びコクサッキーＢ５ウイルス感染を阻害した。タイロシン及びチルミコシンは作用を有しなかった。意外にも、ＥＶ１１は、低多重度検査においてタイルバロシンにより阻害された。感染の初期部位が免疫蛍光法により認められるが、二次部位は観察され得なかったので、タイルバロシンはウイルス伝播を阻害していると思われた。結果を図１８に示す。
【０１４７】
＜実施例１２＞
インフルエンザウイルス経時変化
ＭＤＣＫ細胞を、カバーガラスを用いて又は用いずに（カバーガラス上で増殖させた細胞は免疫蛍光検査に用いられる）、２４個のプレートで増殖させた。１μｇ／ｍＬで４時間、タイルバロシンを用いて細胞を処理した。次に細胞をウドーン株（ｍｏｉ  ０．１）に感染させた。
【０１４８】
試料を、４時間、８時間、１６時間及び２４時間で採取した。
【０１４９】
図１５ａは免疫蛍光検査の結果を示し、そして図１５ｂはプラーク検査の結果を示す。
【０１５０】
両検査において、アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）は、２４時間の検査期間に亘って、インフルエンザウドーン株感染を阻害した。
【０１５１】
＜実施例１３＞
アクリジンオレンジ検査
アクリジンオレンジは細胞を緑色蛍光発光させる色素であるが、但し、酸性区画（例えばエンドソーム）では、色素のプロトン付加及び緑色蛍光の消光のために赤色になる。エンドソームｐＨを上げる物質は、赤色蛍光の出現を防止する。多数の細胞株におけるアクリジンオレンジによるエンドソームの染色に及ぼすアイブロシン（登録商標）及び他のマクロライド抗生物質の作用を確定した（図１９参照）。最初に、カバーガラス上で増殖した細胞の領域をＤＡＰＩ染色を用いて選択する。この株は、細胞の核を青色として示す。この選択手順は、結果におけるあらゆる偏りを低減するのに役立つ。次に落射蛍光顕微鏡上の緑色及び赤色フィルターを用いて、約２０個の細胞を調べた。赤色スポット（エンドソーム小胞）の数を確定した。アクリジンオレンジ染色エンドソームの平均数を計測した。
【０１５２】
タイロシンは、任意の細胞株のエンドソームにおけるｐＨの上昇にほとんど作用を及ぼさなかった。アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）及びチルミコシンは、ＲＡＷ細胞において同様の作用を有した。しかしながらアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）は、上皮細胞中ではチルミコシンより大きな作用を有した。
【０１５３】
これらの結果は、アイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）がエンドソームにおけるｐＨを上げる、ということを示す。ＰＲＲＳＶは、融合及び細胞質中への侵入のために酸性条件を要求する。ｐＨの上昇は、この融合プロセス並びに細胞におけるその後のウイルス侵入及び増殖を防止できた。
【０１５４】
＜実施例１４＞
ＰＲＲＳＶの制御のためのタイルバロシンの有効性の確定
材料及び方法
実験計画
全試験手順及び動物管理は、Iowa State University Institutional Committee on Animal Care and Useのガイドラインによりそしてそれに従って認可された。
【０１５５】
主任研究員により指示されたように、ＰＲＲＳＶ又はマイコプラズマ・ハイオニューモニエに関して血清陰性で、ワクチン接種されていない群から、６８匹の１０日齢〜１２日齢交雑種去勢ブタを入手した。すべてのブタにタグを付して、到着時に秤量した。各１６匹の４群にブタを割り当てた（表１）。統計学者により、群へのブタの配分を実施した。群がブタの重量で釣り合うよう、ブロック（重量で）無作為化を用いて、ブタを群に割り当てた。各群を別個に収容したが、単離施設中の同一室であった。餌箱及び吸い口付水を各デッキに置き、そこでブタは試験中、自由に餌を食べ、水を飲むことができた。さらに４匹のブタを試験前０日で試験を完了させて、試験から除外した。
【０１５６】
各処置群は、各々８匹のブタを有する２つの檻から成っていた。到着時に、如何なる既知の汚染物質又は殺虫剤も含まず、そして５０ｇ／トンのＭｅｃａｄｏｘ（Philbro Animal Health）を含有する市販の濃縮薬用餌をブタに与えた。ラベルの指示に従って、到着後３日間、塩酸セフチオフル（エクセネル（登録商標）、Pfizer Inc.）で全ブタを処置した。
【０１５７】
生産パラメーター
到着時に、そして試験０日目、７日目、１４日目、１７日目及び２８日目にブタを個別に秤量して、重量増分（平均１日増分）を評価した。
【０１５８】
臨床評価
これまでに記載されているように1、咳及び呼吸率増大を含めた臨床的呼吸器徴候に関して、１０日間毎日、ブタを評価した。スコアリングは：０＝正常；１＝軽度の呼吸困難及び／又は呼吸促迫（ストレスを受けた場合）；２＝軽度の呼吸困難及び／又は呼吸促迫（休止時）；３＝中等度の呼吸困難及び／又は呼吸促迫（ストレスを受けた場合）；４＝中等度の呼吸困難及び／又は呼吸促迫（休止時）；５＝重度の呼吸困難及び／又は呼吸促迫（ストレスを受けた場合）；並びに６＝重度の呼吸困難及び／又は呼吸促迫（休止時）であった。さらに、観察された任意の咳は、０＝咳なし、及び１＝咳有りと記録した。獣医又は有資格者が観察を行なった。
【０１５９】
処置
ECO Animal Healthにより提供された３つの異なる濃度のタイルバロシンを含有する薬用餌を、３群のブタに摂取させた。３群のブタは、試験０日目から試験２８日目まで試験の全期間、薬用餌を摂取した。第四群には、同一の非薬用餌を与えた。
【０１６０】
餌検査
餌の代表的１ポンド試料を、試験１７日目及び２８日目に回収した。試験開始時には、餌試料を回収しなかった。全試料に、コード番号、試料回収場所、プロトコル番号、試料回収日及び署名で印を付けて、プラスチック冷凍袋に入れた。餌のサイズは約０．５ｋｇ
であった。二重反復実験試料を回収した。１組の試料をドライアイスに載せて、ECO Animal Healthに送り分析実験室により検査して、そして二重反復実験試料をその場に留めた。
【０１６１】
感染誘発手順
強毒性ＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５株の培地２ｍＬ中の１×１０5組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）50の接種用量を、全ブタに鼻内投与した。
【０１６２】
剖検
各処置群からのブタ６匹を、試験１７日目（感染後１０日目）に剖検し、残りのブタを試験２８日目（感染後２１日目）に剖検した。試験１７日目に、各檻からの２匹の無作為選択ブタを剖検し、残りのブタ（ｎ＝１０）を試験２８日目に剖検した。ブタにＡＶＭＡ承認安楽死溶液（Fatal-Plus, Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI）を投与した後、放血させた。気管及び肺を鉗子で留めて、ブタから取り出した。前に記載されたようにＰＲＲＳＶと一致する肉眼的病変に関して、肺を評価した。標準微生物学的方法を用いて、細菌単離のために無菌的に気管スワブを採取した。抗生物質（９μｇのゲンタマイシン／ｍＬ、１００Ｕのペニシリン／ｍＬ及び１００μｇのストレプトマイシン／ｍＬ）を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０ｍＬで、肺を洗浄した。
【０１６３】
各肺葉の一部を回収し、組織病理学的検査のために加工処理した。組織病理学的病変を、前記のようにスコアリングした。要するに、０＝顕微鏡的病変なし、２＝中等度の多病巣性間質肺炎、３＝中等度の散在性間質肺炎、及び４＝重度の間質肺炎。免疫組織化学知見を前記と同様にスコアリングした。要するに、０＝ＰＲＲＳＶ抗原陽性細胞なし、１＝１〜１０個の陽性細胞／視野、２＝１１〜３０個の陽性細胞／視野、３＝３１〜１００個の陽性細胞／視野、及び４＝１００個を超える陽性細胞／視野。
【０１６４】
リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲのための血液を、試験０日目、１０日目、１７日目、２１日目及び２８日目に回収した。
【０１６５】
製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（QIAGEN）を用いて、総ＲＮＡを抽出し、６０μｌの溶離溶液中で可溶化した。ＲＮＡ抽出物を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅を実行するまで、−８０℃で貯蔵した。
【０１６６】
ＰＲＲＳＶの定量に用いられる順方向プライマー及びプローブは、ＯＲＦ７領域である。プローブを、５’末端で蛍光受容体色素６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、そして３’末端で消光色素ブラックホールクエンサー１（ＢＨＱ  １）で標識した。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ＲＧ−３００（Corbett Research, Sydney, AU）上でのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＰＲＲＳＶの定量を実施した。２０μｌの反応混合物は、１０μｌの２×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス緩衝液（Applied Biosystems, Foster City, CA）；０．１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）（Invitrogen, Carlsbad, CA）；０．２μｌのＲＮａｓｅｏｕｔ（４０Ｕ／μｌ）（Invitrogen, Carlsbad, CA）；２μｌの順方向プライマー及び逆方向プライマー（最適濃度を有する）；０．８μｌのＴａｑＭａｎプローブ（最適濃度を有する）；２．９μｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ無含有水、及び２μｌのＲＮＡ標準１０倍希釈液又は２μｌの抽出総ＲＮＡ（各試料から）で構成された。５５℃で４５分、９５℃で１０分；次に各々９５℃で１５秒及び６０℃で６０秒を４５回で、増幅を実施した。増幅終了時に毎回、蛍光を読み取った。標準希釈液及び未知の試料をすべて、二重反復実験で実行した。相関係数（ｒ2）が０．９９を超える場合、標準曲線は許容された。投入試料ＲＮＡの閾値サイクル（ＣT）値を標準ＲＮＡの異なる希釈液のＣT値と比較することによ
り、ＰＲＲＳＶの定量を達成した。
【０１６７】
血清学的知見
到着時、試験０日目、１７日目及び２８日目に、血液を採取した。市販のＥＬＩＳＡ検査（HerdChek: PRRS; IDEXX Laboratories, Westbrook, ME）を用いて、ＰＲＲＳＶ抗体レベルを確定した。
【０１６８】
統計学的分析
先ずデータを要約して（平均、標準偏差及びヒストグラムを用いて）、データの質及び分布仮定を評価した。データを連続（スコアの平均を含む）として又は不連続（例えば、スコア）として処理し、データの幾つかは毎日の反復測定であり（温度及び呼吸器スコア）そして最大又は平均スコアを有する個々のブタの値を先ず要約することにより分析し、次に一変量データとして分析した。他の反復測定値をすべて、断面的に分析した。データ型及び分布によってＡＮＯＶＡ、クルスカル・ワリス非パラメーターＡＮＯＶＡ又はカイ自乗検定を用いて、データを分析した。統計学的に有意なオムニバス検定の後、テューキーＨＳＤ補正（連続データ）又はボンフェローン補正（不連続データ）を用いて事後対検定した。１つの例外は１７日目のＡＤＧ変数で、これに関するオムニバス検定は統計学的に有意であったが、対検定補正検定は、群の間の有意を示さなかった。その場合に関しては、補正を伴わない対検定を報告した。肺葉データを平均した。
【０１６９】
結果
生産パラメーター
重量及び平均１日増分（ＡＤＧ）により、ブタの全体的成長成績を評価した（表２）。如何なる群における如何なるブタの平均重量にも、統計学的差異は観察されなかった。１７日目に、群４におけるブタの平均１日増分は、群１のブタと比較して、群４において有意に異なった。他の差異は、如何なる試験時点でも観察されなかった。
【０１７０】
臨床的疾患
臨床的疾患に関するスコアを、表４に要約する。臨床的呼吸器スコア及び直腸温度を、各ブタに関する経時的な最大値としてスコアリングし、次に最大スコアの平均を分析した。さらに、平均直腸温度の平均を分析した。呼吸器スコアに関しては、群１及び群２のブタは群３及び群４で観察されたよりも有意に低いスコアを有した。最大直腸温度に関しては、群３のブタは他のすべての群よりも平均直腸温度の平均が有意に高かった。しかしながら各群で観察された平均直腸温度に差は認められなかった。
【０１７１】
肉眼的、顕微鏡的及び免疫組織化学的（ＩＨＣ）スコア
顕微鏡的肺病変スコアを、表５に要約する。平均肉眼的肺病変スコアにおける差異は、如何なる群に関しても観察されなかった。細菌感染と一致する肺炎は、試験における４０匹のブタで観察された。これは、この試験におけるＰＲＲＳＶ肺炎の重症度にも強い影響を与え得る。
【０１７２】
顕微鏡的には、群１のブタは、他のすべての群と比較して、初回剖検で有意に低い病変スコアを有した。２回目の剖検では、顕微鏡的病変スコアにおける差異は観察されなかった。
【０１７３】
気管気管支リンパ節、扁桃及び肺に関する免疫組織化学的スコア（２つの切片の平均）は、群間の統計学的差異を示さなかった。
【０１７４】
細菌学的知見
大多数のブタの気道から、ボルデテラ・ブロンキセプチカを単離した。さらに、多数の
動物を培養して、ブタマイコプラズマが存在するか否かを評価した。これらのうち、マイコプラズマ・ヒオリニスを、２３匹のうち７匹のブタから単離した。
【０１７５】
リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）検査
ＲＴ−ＰＣＲの結果を、表５に要約する。試験１０日目に差異が観察され、ＰＲＲＳＶ
ＲＮＡコピー数のレベルは、群２におけるレベルと比較して、群３及び群４において有意に高かった。さらに、群４におけるＰＲＲＳＶ  ＲＮＡのレベルは、群１と比較して、同一時点で有意に大きかった。ＰＲＲＳＶ血清ＲＮＡレベルにおけるその他の差異は、試験の如何なる時点でも観察されなかった。ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡは、感染誘発前の試験０日目には検出されなかった。
【０１７６】
血清学的知見
ブタはすべて、試験０日目には血清抗体陰性であった。試験１７日目に、群１及び群２におけるブタ２匹並びに群３及び群４の各々におけるブタ１匹が、ＰＲＲＳＶ抗体に関して血清陰性のままであった。他のブタはすべて、血清陽性であった。残りのブタがすべて、試験終了までに血清陽性であった。
【０１７７】
考察
ＰＲＲＳＶは、ブタ産業にとっては依然として重大な問題である。ECO Animal Healthは、ＰＲＲＳＶ感染に関連した臨床的疾患及びウイルス血症を低減するアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）の能力を評価することに関心があった。試験１７日目の平均１日増分において、並びに呼吸器スコアリング及び最大直腸温度により測定されるような臨床的疾患の重症度において、差異が観察された。さらに、ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡのレベルは、試験１０日目（ＰＲＲＳＶ接種の３日後）での群間で異なった。レベルの他の差異は観察されなかったが、個々の群の各々で測定されたＲＮＡのレベルに広範な変動が認められ、これがデータの解釈を難しくした。興味深いことに、より低用量のアイブロシン（登録商標）（タイルバロシン）が、平均１日増分の増大並びに臨床的疾患及びＰＲＲＳＶウイルス血症のレベルの低減に最も有効であると思われた。
【０１７８】
タイルバロシンのより少ない作用は、ＰＲＲＳＶ誘導性肺炎で観察された。ブタの肉眼的肺炎の重症度に差異は観察されなかったが、ＰＲＲＳＶ肺炎はこの感染誘発モデルにおいてはかなり重症であった。さらにまた、ウイルス血症、臨床的疾患及び平均１日増分と同様に、低用量のタイルバロシンの投与は、初回剖検時の顕微鏡的病変低減により観察されたように、疾患を制御するのにより有効であると思われた。
【０１７９】
この試験は、低用量でのタイルバロシンはＰＲＲＳＶ感染に関連した臨床的疾患及びウイルス血症を低減すると思われる、ということを示した。
【０１８０】
【表１】
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【０１８１】
【表２】
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【０１８２】
【表３】
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【０１８３】
【表４】
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【０１８４】
【表５】
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【０１８５】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ−ｂ】
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【図７ｃ−ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ−ｃ】
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【図１０ｄ−ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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