(57)【要約】本発明は、哺乳類細胞を１以上の歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質または歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかまたはこれと共培養してPDL特性を有する細胞を得ることを含み、以下の少なくとも一つの要件：  i）リン酸カルシウム堆積物が茶色から黒色に染色されるフォンコッサ法により明らかにされる歯周特性を示すこと、  ii）オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大と同時に骨シアロタンパク質（骨シアロタンパク質IIまたはBSP）の減少を示すこと、  iii）歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができること、  iv）歯周病（歯周症とも称される）または歯周炎などの障害を歯への歯肉線の治癒により修復することができること、  v）有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストにより許容されることを満たす、哺乳類細胞を増殖させおよび／または分化させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞を１以上の歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質または歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかまたはこれと共培養してPDL特性を有する細胞を得ることを含み、以下の少なくとも一つの要件：
i）リン酸カルシウム堆積物が茶色から黒色に染色されるフォンコッサ法により明らかにされる歯周特性を示すこと、
ii）オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大と同時に骨シアロタンパク質（骨シアロタンパク質IIまたはBSP）の減少を示すこと、
iii）歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができること、
iv）歯周病（歯周症とも称される）または歯周炎などの障害を歯への歯肉線の治癒により修復することができること、
v）有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストにより許容されること
を満たす、哺乳類細胞を増殖させおよび／または分化させる方法。
【請求項２】
哺乳類細胞が成長培地にて増殖した後、得られたPDL特性を有する細胞を採取するとすぐに、成長培地を骨誘導培地などの分化培地に転換することにより分化を誘発する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳類細胞が哺乳類間葉細胞、臍帯および／または臍帯血に由来する同種哺乳類間葉細胞、自己哺乳類間葉細胞、自己哺乳類骨芽細胞、または骨芽細胞の前駆体／プロジェニターであり、これらの細胞が歯周靱帯タンパク質への曝露によりPDL細胞に分化する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
増殖した哺乳類間葉細胞が自己間葉細胞であり、得られた細胞が系中にてPDL細胞またはPDL特性を示す細胞に分化形質転換することができる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
PDL特性を有して得られる細胞がHLA-DR陽性（HLA-DR+）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）、Stro-1陽性（Stro-1 +）、CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性であり、場合によりCD146/MUC 18陽性であるが、CD31陰性である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項６】
PDL特性を有して得られる細胞がCD-34陰性である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の方法により得られうる、PDL特性を有する細胞集団。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか記載の方法により得られる細胞を歯周靱帯まで直接注射し、周囲の歯根管に細胞の付着をもたらすことを含む、歯周組織における障害の治療方法。
【請求項９】
細胞の移植に細胞と骨格の組合せを用いる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
主にPDL細胞特性を誘発しうる歯周靱帯タンパク質からなる組織の組成物であって、歯周靱帯外植片を培養培地にて培養して細胞の移動を得ることによりおよびこれらの細胞を採取することにより得られうる、組成物。
【請求項１１】
自己または同種ドナーからの骨髄細胞またはそのコロニーに由来する哺乳類細胞と共培養することができ、歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質または歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかまたはこれと共培養することができ、これらの因子により誘発されて：
a.  オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大および骨シアロタンパク質の減少を示す歯周特性を得ること、
b.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができること、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができること、
d.  歯周病（歯周症とも称される）などの障害を修復することができること、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストにより許容されること
が可能である、請求項１０記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分化された哺乳類細胞を産生するための新規な概念および方法に関し、該細胞は歯周炎および他の歯の病態の修復のためにインプラントすることができ、分化された歯周靱帯幹細胞（例えばPDLC）または歯周靱帯細胞（PDL）としての特性および挙動を有する。PDLは歯根セメント質を歯槽骨と連結するものであり、歯周創傷治癒のために重要である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨髄は、造血幹細胞（HSC）だけでなく、内皮および間葉幹細胞（ESC、MSC）も含む「幹細胞蓄積」の主要なプールであるものと示唆される。受容者に拒絶されないかまたは移植片対宿主反応を引き起こさないで、移植することができる細胞型に形質転換される適当な自己細胞および／または適当な同種細胞に分化される適切な細胞物質を得ることは、本発明に包含される目標領域の一つである。
【０００３】
例えば分化形質転換、例えば共培養により、例えば歯周靱帯組織もしくは歯周靱帯組織に由来する因子、任意の間葉骨芽細胞、または骨芽細胞もしくは線維芽細胞系統の前駆体およびプロジェニターと共培養される細胞として形質転換することができる他の細胞型のうち、生成PDL細胞に用いることができることが考えられる。
【０００４】
造血細胞の処理、組成物および使用は、先に開示されている。造血細胞は、骨芽細胞と共培養するときに成熟血球に分化することができる細胞である。具体的には、細胞を米国特許番号5733541に開示されている骨芽細胞と共培養することにより、造血細胞の未熟形態を増殖させ維持する方法である。
【０００５】
骨芽細胞は、造血細胞の未熟形態を増殖させ維持する、サイトカインおよび／または微環境を提供する。造血細胞は、いくつかの血液関連障害の治療に有用であり、造血細胞が必要な患者の治療に有用である。
【０００６】
本発明のねらいの一つは、実際に造血細胞の未熟形態を維持することではなく、むしろオステオポンチンおよびオステオカルシンの発現の増大と同時に、PDL細胞様または類似の細胞集団をもたらす骨シアロタンパク質（BSP）の発現の減少を示すなどの特徴を有する間葉幹細胞を得るために、歯周靱帯組織もしくは歯周靱帯組織からの因子への曝露またはこれとの共培養により間葉幹細胞（例えば臍帯または臍帯血からの間葉幹細胞など）、骨芽細胞および類似系統の細胞を分化形質転換することである。これは、歯周靱帯細胞または歯周靱帯幹細胞よりも他の任意の間葉細胞にて非常に異常となろう。
【０００７】
多能性成人プロジェニター細胞の注射
単一の多能性成人プロジェニター細胞の初期胚盤胞への注射後、該細胞は、３つすべての肺葉からのほとんどの体細胞型に寄与することが分かった。さらに、造血前駆細胞由来の骨髄は、非造血性組織、例えば文献（McKinney-Freeman et al. (McKinney-Freeman SL, Jackson, KA, et al., PNAS USA (2002) 99:1341)）に記載の筋組織に存在するようだ。
【０００８】
骨芽細胞様細胞は、間質細胞層内で観察され、間質細胞系を有するいくつかの表現型の特徴に分けられる（Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1992), 51:195-201; Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1991), 49:202-207; Mathieu E et al., Calcif Tissue Int. (1992), 50:362-371）。例えば、マウス骨髄間質細胞系BMS2は、高アルカリ性ホスファターゼコラーゲン(I)およびオステオポンチンなどの多くの骨芽細胞マーカーならびに骨シアロタンパク質（BSP）の増大を共有し、これは歯周靱帯幹細胞または歯周靱帯細胞の特徴ではない。さらに、オステオカルシンについてのmRNA、骨芽細胞特異的タンパク質もまたBMS2細胞、マウス間質細胞系にて検出され、骨シアロタンパク質II pr（BSP）とも称される骨シアロタンパク質の発現の増大も示し（Dorheim MA et al., J Cell Physiol. (1993)154:317-328）；Dorheimらによれば、前脂肪細胞および脂肪細胞でさえもこれらの骨芽細胞特徴を示すことができる。
【０００９】
いくつかの間質細胞系を用いた一連の実験において、Benayhuらは試験されたすべての細胞型（MBA-1：線維芽細胞、MBA-2内皮様、MBA-13線維内皮、13F1.1クローン化前脂肪細胞、MBA-15骨芽細胞）がいくつかの骨芽細胞特徴を有するが、発現の程度が異なることを見出した（Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1992), 51:195-201; Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1991), 49:202-207）。組換えヒト骨形態形成タンパク質2がW-20-17マウス間質細胞系における骨芽細胞分化を誘発することが見出されており；異所性骨髄移植実験は、新たに形成された骨髄間質および骨がドナーに由来するが血球がホスト起源であることを明らかに示す（Reddi AH, Coll Relat Res. (1981)1:209-226; Kataoka H, Urist MR, Clin Orthop Relat Res. (1993), 286:262-270）。
【００１０】
造血プロジェニター細胞と骨芽細胞の間の機能的連結のさらなる証拠は、骨幹細胞は骨髄が起源であるという観察により提供される。数人の研究者が、これらの細胞の拡散チャンバーへの移植後に骨形成がインビボにて観察されるので、原発性のおよび形質転換された骨髄間質細胞の両方が骨芽細胞表現型を取得することができることを示している（Grigoriadis et al. J Cell Biol. (1988) 106:2139-51）。血清不含状態における非接着性低密度骨髄細胞のインビトロインキュベーションはまた、骨芽細胞様細胞に発展することもでき、それらの細胞外マトリックスを鉱化することができる（Long et al., 1990 and Campbell et at., 1987）。
【００１１】
上記文献は、造血系統の特定の刺激に役立つことができるサイトカインおよび他の因子を産生することにより刺激細胞源として骨芽細胞を本質的に記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、本発明の範囲は、同種起源、成熟または未熟であることができるPDL特性を有するPDL細胞などの歯の疾患（歯周炎など）の修復に主に使用しうる細胞型を創製することであるが、好ましくは臍帯または臍帯血のレベルよりもさらに下流の系統ではない。実際に、例えばヒト歯周靱帯幹細胞および臍帯または骨髄が起源である幹細胞の組合せを共培養することにより分化形質転換することができる任意の間葉細胞である。あるいは、PDLまたはPDLCとして用いる目的のためのいずれの間葉細胞または幹細胞も、臼歯または親不知歯からの歯周靱帯から単離し培養することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
ある態様において、本発明は、例えば自己使用のためとして歯から直接採取されたPDL細胞、または理想的には口腔、より具体的には歯周領域、さらにより具体的には歯の固定および／または修復のための歯の領域、および歯の歯周領域にインプラントされたときに拒絶されない間葉細胞を、特に間葉型の細胞、より具体的にはPDLもしくはPDLC様細胞またはPDLもしくはPDLCに形質転換される細胞を用いて、増殖させる方法を提供する。この方法は、幹細胞または歯周靱帯に由来する前駆体を臍帯および／または臍帯血からの間葉幹細胞で共培養することにより開始され、いくつかのタンパク質の発現の観点から見て、少なくともHLA-DR陽性（HLA-DR+）、CD-34陰性（CD-34 -）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）、Stro-1陽性（Stro-1 +）、CD13陽性、CD44陽性、CD90陽性、CD73陽性、さらにおそらくCD146/MUC 18陽性（CD146/MUC 18 +）などのタンパク質の発現に関する可能性を有する間葉細胞をもたらすことができる。これらの幹細胞またはプロジェニターは、臍帯または臍帯血に由来する多能性細胞または間葉幹細胞またはプロジェニターでもある事実により受容者により低い免疫原性を示すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の開示
本発明は、PDL細胞の特徴を有する哺乳類間葉細胞系を得るための新規な概念および方法に関する。得られた細胞は、HLA-DR陽性（HLA-DR+）、CD-34陰性（CD-34 -）、Lin-1陽性（Lin-1 +）、Thy-1陽性（Thy-1+）、STRO-1陽性（STRO-1 +）、CD13陽性、CD44陽性、CD90陽性、CD73陽性であり、さらにおそらくCD146/MUC 18陽性（CD146/MUC 18 +）でもあり、そうあり続けるであろう。これらの細胞は、例えば共培養、例えば歯周靱帯組織または歯周靱帯組織からの因子と一緒に共培養することにより得られる、好ましくは歯周靱帯細胞または未熟型歯周靱帯幹細胞または好ましくはヒト型歯周靱帯幹細胞（hPDLC）または臍帯血もしくは好ましくはヒト臍帯血に由来する未熟間質もしくは間葉細胞である。これらの細胞はまた、歯周靱帯組織または該組織からの因子に曝露されるかまたは培養されるときにPDL細胞の特徴を示すであろう骨形成起源であることもできる。歯周靱帯細胞および／または歯周靱帯幹細胞は理論的に、オステオカルシンおよびオステオポンチンの発現により、およびほとんどの場合には骨シアロタンパク質の発現の減少またはその欠乏により特徴付けられ、そうでなければ骨形成および軟骨形成細胞培養にて正常に観察することができる。
【００１５】
PDL特性を有する細胞は、歯の障害、特に歯周炎の修復または治療のための使用に適している。
【００１６】
予想可能な歯周再生を得るために、PDL細胞の選択的接着および増殖が不可欠である。これらの細胞型は、歯周靱帯障害（例えば歯周炎および障害など）を修復すると同時に、例えば線維組織と骨を連結するセメント質を産生することができ、歯周欠陥を治療し従って歯周炎による欠乏の危険のある歯の接着を再構築することができる。
【００１７】
本発明によれば、これらのPDL細胞はまず、特殊な細胞であり、上記の例えば歯周炎などの修復に使用することができる細胞培養のための出発物質であろう。これらの細胞が自己移植であり、親不知歯などの歯から同時に採取されることを意味する場合、摘出される（細胞を摘出とともにすぐに採取することができるか、または摘出された歯を例えば24時間以内に輸送培地中にて研究室に届けることができ、PDL細胞を採取してすぐに培養するか、または後の使用のために液体窒素タンク中にて冷凍することができるように）ことがもちろん好ましいだろう。
【００１８】
他の細胞は患者の顎骨または他の骨構造から採取される、自己または同種骨芽細胞などの同一の目的のために使用することができることが可能であってよい。これらの間葉前駆細胞またはプロジェニター細胞はまた、歯周炎などを修復する目的のために使用することもできる。しかし、細胞の別の群は、臍帯または臍帯血が起源である多能性間葉幹細胞に由来することができ、自己細胞（保存された臍帯血から得、生まれたときの臍帯血を提供した患者における歯周炎を−後の人生で−修復するために用いられる）として由来することができる。あるいは、他の個体からの臍帯からのこれらの多能性間葉幹細胞は、免疫原性である傾向がより低いことを示し、それゆえ歯周炎などを修復するための「供与」細胞として使用することができる。そのような細胞が用いられるときに、それらは共培養過程（ここに、細胞はPDL特性を得るために、１以上の歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質または歯周靱帯組織に由来する因子と一緒に曝露または培養される）を受けた。
【００１９】
PDL細胞またはPDLCとして他の哺乳類間葉前駆細胞（例えば成人間葉前駆細胞などの任意の哺乳類間葉幹細胞）と作用するのに適切な細胞を共培養することができることは本発明の範囲内であろう。本発明によれば、PDL細胞はまた、例えば多能性間葉幹細胞、例えば臍帯または臍帯血が起源である幹細胞と共培養することもでき、この方法において、歯周炎などの修復における使用に適した共培養細胞を得ることができる。
【００２０】
歯周靱帯幹細胞集団を得るために、歯周細胞の内容が存在するかもしくはしないで、間葉幹細胞を歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質または歯周靱帯組織からの因子と共培養することができるか、またはむしろまず採取して培養培地（ここに、間葉細胞は培養されてPDL細胞に分化もしくは分化形質転換する）に加えられる歯周靱帯組織における生存細胞の存在を除去することによることができる。培養が、歯周靱帯組織またはタンパク質への細胞の短い曝露期間から、十分な量の細胞が得られるまでの数週間続く少なくとも歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質またはその因子を含む培養培地における完全な細胞培養の拡張までの範囲であることができることが予想される。この細胞培養技術は、臍帯および／または臍帯血に由来する間葉幹細胞にて用いることができる。従って、臍帯または臍帯血からの間葉幹細胞は、歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質および／またはそれに由来する因子と一緒に、間葉幹細胞を誘発し、歯周靱帯様特徴を得ることができ、従って歯周組織の修復および再生のための臨床適用における骨格を伴うかまたは伴わないで細胞インプラントとして使用することができる。
【００２１】
出発物質−哺乳類間葉細胞
PDL細胞ならびに上記いずれの組合せの間葉幹細胞または前駆細胞もこれらの細胞を曝露するか、および／またはそれらを歯周靱帯組織もしくは歯周靱帯に由来する因子と共培養することによりPDLまたはPDLCに分化することができ、これは前駆細胞を誘発するかまたはPDLなどの細胞の脱分化を防ぐことができる。
【００２２】
それゆえ、上記細胞型が歯周靱帯組織もしくは歯周靱帯に由来する因子に曝露され、これらと共培養しおよび／またはこれらにより誘発されるとき、PDLまたはPDLCに分化または分化形質転換することができるか−またはそれらが実際に開始からPDLであるときにはこれらの細胞が脱分化しないだろうことは理解され、本発明の範囲内であるべきである。同一の採取された歯周靱帯組織または該組織に由来する因子は、培地にて用いるとき、臍帯からの間葉幹細胞を共培養するための培地を用いるときに、PDLまたはPDLと同一の能力を有する細胞をもたらし、歯周炎などの治療のための使用を可能にすることができる。
【００２３】
上記方法の使用により、本発明者らは、例えば哺乳動物からの生検、例えば骨、特に患者から得られる骨構造からの生検の外植により得られる骨芽細胞または骨形成細胞のプロジェニターを培養し、後の患者の生活における歯周炎の治療のためのPDLまたはPDLの挙動を有する細胞に発展させることができ、PDLの主要培養へのアクセスを有しないときに、自己細胞インプラント法を利用したこの方法が意味をもつ。
【００２４】
PDLの誘発剤として細胞培養培地中に用いられる歯周靱帯組織
歯周靱帯組織の源
歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質および／または歯周靱帯に由来する因子の源は、自己、同種または異種起源（例えば抜歯またはブタ脱臼歯）であることができる。しかし、歯周靱帯、歯周靱帯または因子からの細胞が採取され処理されなければならないが、組織がまだ生存可能であり、PDLもしくはPDLCとして培養される細胞またはそれらをPDLもしくはPDLCとして発現する細胞を得、場合により維持するために必要ないずれの成分も崩壊しなかったことが予想される。歯周組織を取り扱うための提示は文献「Harvest and preservation of peridontal tissue」に記載される。
【００２５】
培養培地にて用いられ問題の培養された細胞における「PDL効果」を誘発する歯周靱帯は、例えば臼歯または親不知歯から採取することができる。それで、歯周靱帯は歯周靱帯にすでに組み込まれているPDL細胞と一緒に採取されるか、または歯周靱帯組織はこれらの細胞から使い尽くされて、上記他の間葉細胞をPDLに分化形質転換するためのPDL細胞培養またはその試みにおける将来の使用のために歯周靱帯組織または歯周靱帯組織に由来する因子からなることができる。
【００２６】
この「歯周靱帯組織」は、本発明によれば、誘発混合物として定義され、PDL細胞培養または間葉細胞培養（PDL細胞として用いられるものである）に加えることができる。これは冷凍保存（例えば窒素タンク中）することができるか、またはこれを用いて細胞がPDL細胞を他の非PDL細胞への脱分化を防ぎならびに他の選択された細胞を分化もしくは分化形質転換してPDLもしくはPDLCになるかまたは類似する目的のために培養される適切な成長培地（培養培地）と一緒に直接混合することができる。従って、歯周靱帯組織または歯周靱帯に由来する因子を含む培地組成物は成長培地として用いることができ、これはPDL細胞を維持し、従って脱分化または細胞「漂流」を回避するだろう。
【００２７】
上記のように、この歯周靱帯組織はまた（例えば細胞からの消耗）、集められ、特徴付けられ、プールされて、培養培地と一緒に用いて、そのタイプの歯周靱帯細胞または前駆細胞として特徴付けることができる細胞集団をもたらすPDL細胞特徴を誘発するために間葉細胞を培養することもできる。例えば歯周靱帯組織の誘発的使用による間葉細胞からの分化により得られるPDL細胞特徴は、PDLまたはPDL様細胞がオステオポンチンおよびオステオカルシンの発現の増大および骨シアロタンパク質（骨シアロタンパク質IIとも称される）の発現の減少（BSP発現の減少）を示すことを示すことにより明らかにすることができる。
【００２８】
歯周組織の採取および保存
間葉細胞の誘発、分化形質転換または形質転換が歯周靱帯細胞または歯周靱帯細胞のように挙動することができる細胞を産生するために必要であることができる量の歯周組織を利用するために、ロジスティック系を製造して摘出された歯の細胞を生存させ続けること（例えば種々の歯科医院から集められた摘出された親不知歯）ならびに摘出された歯からの歯周組織の崩壊を防ぐことが必要であることができ、これは摘出された歯を生存させ無菌状態に保ち、微生物汚染を予防することをほぼ意味する（微生物汚染はできるだけ無菌の方法を用いることにより最小限に保つことができ、保存に用いられる輸送培地または培養培地に存在する十分な量の抗生剤および抗真菌剤を加えることができる）。Sigalasらは近年、脱臼歯の細胞の生存を保つための方法を試験している。多くの解決法が脱臼歯のための可能な貯蔵媒体として試験されている。Sigalasらは近年、ヒト歯周靱帯（PDL）細胞を培養培地、ミルク、ハンクス緩衝塩類溶液（HBSS）、ソフト・ウエア、オプティ・フリーおよびソロ・ケア・コンタクト・レンズ溶液、ゲータレードおよび水道水に室温、氷上にて1時間曝露した場合を報告している。生存細胞数は曝露直後（0 h）、24および48 hにて、トリパンブルー排除法を用いてカウントし、細胞の増殖能力を治療後に試験した（Sigalas E, Regan JD et al. Dent. Traumatol. (2004) 20:21-28）。この研究は、ハンクス緩衝塩類溶液HBSSが脱臼歯のための最適貯蔵媒体であることが分かったことを示した。歯周靱帯組織の添加を含むかまたは含まない多くの他のタイプの培養培地が出発から与えられ、ほぼ血清タンパク質を含むことが考えられる。歯、歯周靱帯関連細胞または歯周靱帯組織は窒素タンク内にて冷凍することができる。
【００２９】
細胞がPDLに分化していないか、またはPDL細胞が骨シアロタンパク質（骨シアロタンパク質IIまたはBSPとも称される）を脱分化または漂流していることを構築する方法が増えており、実際に培養されている細胞が骨芽細胞であり、確実にPDL細胞ではないことを実際に示すだろう。実際に、シアロタンパク質IIまたはBSPを同定する（または増大が見られる）ことができたときに、PDL細胞培養が骨形成細胞（例えば骨芽細胞および非PDL-または非PDLC-分化間葉細胞）に変化していることに気付く（Fisher LW, McBride OW, et al. J. Biol. Chemistry (1990), 265:2347-2351）。この遺伝子によりコード化されているBSPタンパク質は骨マトリックスの主な構造タンパク質である。これはおよそ12％のヒト骨における非コラーゲン性タンパク質からなり、肥大軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞などの骨格関連細胞型により合成される。このタンパク質はその酸性アミノ酸クラスターによりカルシウムおよびヒドロキシアパタイトに結合し、ビトロネクチンレセプターを認識するRGD配列を通した細胞接着を媒介する。BSP遺伝子はまた、遺伝子ID：3381として同定されており、インテグリン結合シアロタンパク質（骨シアロタンパク質、骨シアロタンパク質IIとも称され、IBSPと略される）を発現する。
【００３０】
我々は先に、ビトロネクチンレセプターの発現がまた変形性関節炎患者および非変形性関節炎（O.A.）患者（自己観察）の両方からの軟骨細胞にも存在することをAffymetrixのジーン・チップ分析により発見している。しかし、この発現は今のところ、PDLまたはPDLCにて試験されていない。
【００３１】
歯周修復および／または歯の修復のためにインプラントされた細胞が例えば歯周領域または歯周靱帯からの幹細胞または前駆体として採取されるような自己間葉幹細胞、前駆細胞またはプロジェニターであることができるか、または顎骨生検が起源である間葉細胞でさえも歯周靱帯組織に曝露されたときにPDLに分化することができることもまた、本発明の範囲内である。それゆえ、我々は理論的におよび実際には実践的に、移植片培養技術を用いて間葉細胞もしくはむしろ骨芽細胞またはその前駆体に拡張し、PDL細胞を産生することができる。次いでこれらのPDL細胞は患者におけるインプラントに用いて歯周炎などを修復することができる。
【００３２】
これらの細胞は、さらに哺乳類間葉細胞に分化することが予期されてよく、むしろ複合過程にて包含され、哺乳類間葉細胞系と類似する細胞同一性を産生し、これは少なくともHLA-DR陽性（HLA-DR+）、CD-34陰性（CD-34 -）、Lin-1陽性（Lin-1 +）、Thy-1陽性（Thy-1+）およびStro-1陽性（Stro-1 +）、CD13陽性、CD44陽性、CD90陽性、CD73陽性であり、場合により別のタンパク質CD146/MUC18に陽性であるが、CD31（造血マーカー）に陰性であり続けることにより同定することができる。
【００３３】
アポトーシスとならずもしくはアポトーシスを誘発せず、または移植されたときに不死化細胞系に変化しないで、移植されたもしくはインプラントされた細胞の拒絶を引き起こさずにヒトなどの哺乳動物に移植されうる一つまたはいくつかの哺乳類細胞型にて達するか、または「移植片対宿主」（GVH）拒絶を産生することは、本発明の範囲内である。
【００３４】
軟骨または変形性関節炎修復のための方法を発展させる試みで例えば関節におけるインプラントのために胎児性間葉幹細胞を用いたときに、そのような胎児性間葉幹細胞によるインプラントは、これらの細胞が実験下における有意な量のSCIDマウスにて奇形腫として見られる不死化された挙動を有する混合内胚葉、中胚葉、外胚葉細胞への分化の間に形質転換する機能を保持することができることを示しており、ここに、該胎児性幹細胞は実際に、これらの不死化された奇形腫を誘発し（Wakitani S, Takaoka K, Hattori T, Miyazawa N, Iwanaga T, Takeda S, Watanabe TK and Tanigami A, Rheumatology (2003), 42:162-165）、例えば歯周靱帯細胞を産生する目的のためにより未熟な細胞を用いたときに、そのような分化形質転換が実際に腫瘍、例えば奇形腫を産生することができるので、この目的のために胎児性幹細胞の使用の代わりに臍帯または臍帯もしくは臍帯血からの間葉幹細胞を用いることがより妥当でありうることが示される。
【００３５】
成人同種移植におけるヒト臍帯血（UCB）の使用の増大についての主な限定因子の一つは、集められ注入されうる少数のプロジェニター細胞である。UCBの生体外拡張はこの限定を克服するのに役立ちうる。UCB細胞の培養がまた、母親細胞を汚染し、従って細胞拒絶の発生の増大を引き起こす移植片特性を変化させる共拡張も引き起こすことができるかどうかは、今までのところ見ていないが、臍帯血からの間葉幹細胞を用いたときには考慮に入れるべきである。
【００３６】
これは例えば、幹細胞因子（SCF）、flt-3L、Il-3、IL-6、EPOおよびG-CSFを含む標準培地中のUCB単核細胞（MNC）の培養を開始することにより、UCB細胞などの間葉幹細胞を単離する方法を調査することにより取り調べることができる。母親細胞を汚染する問題に当たるために、XおよびY染色体のいわゆる間期FISH分析を同時に行うことができる。雄（XY）臍帯血サンプルは0日目および培養中のいくつかの時点にて母親（XX）細胞について調査することができる。
【００３７】
PDL細胞を得るための方法
哺乳類細胞、例えば哺乳類間葉細胞、UCもしくはUCB細胞などの同種哺乳類間葉細胞、自己哺乳類間葉細胞、自己哺乳類骨芽細胞または骨芽細胞の前駆体／プロジェニターは、１以上の歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質または歯周靱帯組織に由来する因子と一緒に培養される。これらの細胞をチェックし、CD13、CD44、CD90、CD73およびCD31に対してコンジュゲートしたモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーで分析した。CD13、CD44、CD90、CD73などのマーカーはすべて、間葉幹細胞マーカーであると考えられるが、CD31は造血マーカーである。hPDLCは４つすべての幹細胞マーカーに陽性であるが、CD31に陰性であることを示した。
【００３８】
歯周靱帯組織を用いる場合、この組織はまず、例えば本明細書の実施例1または6記載の適切な培地を用いて培養される。成長培地は通常、例えば全培養期間中3〜4日ごとなど1〜5日ごとに変える。細胞（hPDLC）が靱帯から移動し、十分に融合して通常8〜11日の期間後、例えばトリプシン／EDTA処置などの酵素的処置を用いて細胞を採取する。
【００３９】
哺乳類細胞およびhPDLC細胞は適切な培養皿にて培養し、成長培地（例えば16％FCS、アスコルビン酸、ゲンタマイシンおよびファンギゾンを含む、DMEM/F12）を37℃および5％CO2にて与えた。成長培地は全培養期間中3〜4日ごとに変えた。
【００４０】
8〜11日後に、細胞（hPDLCと称する）は一般に、歯周靱帯の小片から移動し始める。培養が70〜80％融合となったとき（約3週間）に、細胞はトリプシン／EDTA処置を用いて分離し、下記の実験に用いた。
【００４１】
あるいは、哺乳類細胞は、FCSおよび上記他の成分を含む上記DMEM/F12にて適切な培養皿中で、全細胞培養期間中3〜4日ごとに培地を変えて培養することができ、11日以上の期間後に、例えば歯周靱帯タンパク質などの因子を細胞における誘発剤として加えることができ、これらをPDLに分化形質転換することを試みる。
【００４２】
骨格
種々の生分解性骨格にて培養される骨細胞または骨形成細胞は、移植またはインプラントの間に粘着させることができるときに、骨格と細胞の間の相互作用を創製することができる。これは、他のもののうちPLGA骨格などの種々の生物吸収性（bioresorbable）ポリマーを用いることにより達成することができる。
【００４３】
いくつかのタイプの骨格を試験し、歯周靱帯細胞および／または歯周靱帯幹細胞または間葉幹細胞のためにうまく用いることができることが予期され、これは誘発されて歯周靱帯組織として用いられている。
【００４４】
インプラントされた細胞は、例えばヒドロキシルアパタイト担体などの骨格と一緒にインプラントされ、歯周靱帯およびセメント質さえも増強しならびにシャーピー線維と類似する線維構造を産生することができ、セメント質と骨の両方に挿入されるが歯を適当な位置に保つ。
【００４５】
歯周炎の治療のために移植またはインプラントされた細胞の使用
分化または分化形質転換された細胞を用いる目的の一つは、例えば破壊された歯周組織を治療するために用いることができる細胞または組織物質を発展させることであり、他のもののうち「歯周炎」を引き起こす。歯周炎と称される経口障害は通常、例えば歯肉炎または急性歯肉炎と診断された歯肉線における微生物（例えば細菌または真菌）感染により誘発される感染症として開始する。このタイプの感染症は初めは無害のようであるが、この感染症の間、歯が歯槽骨（セメント質と一緒に）に結合する口腔に不可欠な組織、特に歯周靱帯の壊死を引き起こしうる。この壊死は他のもののうち、例えばコラゲナーゼなどの組織破壊的酵素の合成の増大ならびに破骨細胞により引き起こされる骨組織崩壊の活性化により引き起こされる。これらの過程は組織構造を破壊することができ、通常、上顎および下顎の骨にて歯を固定し続ける（Figure 1を参照のこと）。
【００４６】
これらの方法は、歯周炎の治療を場合により骨格と一緒に細胞インプラント修復に大幅に変化させることができた。
【００４７】
歯根は、正確には健康な歯周組織における骨構造（歯槽骨）の「ポケット」に適合する（Figure 1を参照のこと）。歯は歯周靱帯により系中にて維持される。
【００４８】
歯周炎の間、Figure 2に示されるように、影響して最終的に歯の弛緩を生じさせるであろうものは実際に歯周靱帯である。
【００４９】
従って細胞処置は、歯周靱帯もしくはその誘導体に曝露するかもしくはこれと共培養することにより例えば上記種々の方法にて得ることができるかまたは間葉幹細胞集団を例えばプロジェニターもしくは前駆体として骨細胞に結合させることにより創製することができ、そして、例えば細胞の拒絶などの反応を起こす傾向が低い同種細胞として例えば臍帯もしくは臍帯血からの細胞が起源である間葉多能性幹細胞からの間葉幹細胞と結合することもできるかまたは自己起源でありそれゆえ拒絶の証拠を示さないこともできる例えばPDLおよび／またはPDLCなどの間葉細胞の他のタイプであることができる、PDLおよび／またはPDLCなどの細胞の生体外細胞培養に基づく。自己間葉細胞は、骨形成起源または線維芽細胞起源でさえ、または分化間葉細胞から得ることができる任意の細胞型であることさえできる。
【００５０】
出願の特定の領域を対象とした生成物を形成し適合することができるように細胞を結合して適当な骨格でインプラントし、さらに移植された細胞を覆い、それらの機能を維持し、感染を防止し、口腔内の所望でない領域への成長から細胞を限定することもまた、本発明の範囲内である。
【００５１】
本発明は次の非限定的な実施例に例示される。
【実施例】
【００５２】
実施例1
hPDLC培養
ヒト第三大臼歯をペトリ皿に置き、成長培地2 ml（16％FCS、ゲンタマイシン、アスコルビン酸およびファンギゾンを含む、DMEM/F12）を該臼歯に適用した。
歯周靱帯は、滅菌された外科用メスで歯根の表面からそっと分離し、組織を新しいペトリ皿に移した。
2 ml成長培地を歯周靱帯組織に適用し、小外植片を滅菌された外科用メスで生成した。
歯周靱帯組織からの外植片を成長培地を含む75 cm2培養フラスコに移し、37℃にてCO2インキュベーター中で培養した。主な細胞培地からの単位を形成するコロニーにて細胞培地を生成した外植片を単離した。
【００５３】
実施例2
表面マーカー発現
初期培養物（E1P0）からのhPDLC（外植片から最初に生じる細胞の初期CFUとして定義され、未だ継代されていない）は、CD13、CD44、CD90、CD73およびCD31に対するコンジュゲートしたモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーで分析した。
CD13、CD44、CD90、CD73はすべて、間葉幹細胞マーカーであると考えられるが、CD31は造血マーカーである。
hPDLCは、４つすべての幹細胞マーカーに陽性であるが、CD31に陰性を示した。
これはhPDLC集団が間葉プロジェニター細胞からなることを示唆する。
【００５４】
実施例3
骨形成分化（遺伝子発現）
hPDLCを6ウェルプレートに播種し、誘発して、標準の成長培地から骨形成培地（10% FCS、アスコルビン酸、10-7Mデキサメタゾン、8 mM    -グリセロホスフェートを含む、DMEM/F12）に変化することにより骨形成経路に沿って分化させた。
対照として、hPDLCは10% FCSを含む標準の成長培地にて培養した。
培養の14日後に、hPDLCはPBSにて洗浄し、RNAを誘発された培養物および対照培養物から単離した。
RT-PCRを用いることにより、アルカリ性ホスファターゼ（ALP）、コラーゲンタイプ1（Col1）およびオステオカルシン（OC）の発現を評価した。
【００５５】
実施例4
骨形成分化（組織化学的分析）
hPDLCを6ウェルプレートに播種し、誘発して、標準の成長培地から骨形成培地（10% FCS、アスコルビン酸、10-7Mデキサメタゾン、8 mM    -グリセロホスフェートを含む、DMEM/F12）に変化させることにより骨形成経路に沿って分化させた。対照として、hPDLCを10% FCSを含む標準の成長培地中にて培養した。
培養の14日後、hPDLCをPBS中で一度洗浄した。次いで、誘発培養物および対照培養物をALP活性についてまたはカルシウム堆積物の存在により染色した（フォンコッサ（Von Kossa）染色）。
ALP活性の増大およびカルシウム堆積の増大の両方は、遺伝子発現結果を支持する誘発培養物について示した。
３つすべてのマーカーは誘発培養物に上方調節され；hPDLCは骨形成経路に沿って分化することができることを示し、この細胞集団が未熟間葉幹細胞からなることを示唆した。
【００５６】
実施例5
hPDLCの冷凍
hPDLCをトリプシン化し、70μm滅菌フィルターに通してろ過した後、遠心分離した。ペレットを冷凍培地（FCS＋10% DMSO）中にて再懸濁し、細胞をクライオ容器に移した。
段階的冷凍工程を開始し、4℃にて1時間、-20℃にて4時間、-80℃にて一晩で始め、最後に液体N2を用いた。
【００５７】
実施例6
3個体から摘出後すぐに正常なヒト第三大臼歯を集めた。歯周靱帯を歯根の表面からそっと分離した後、小片に刻んだ。次いでそれらをT-75培養フラスコに移し、37℃、5% CO2にて成長培地（16% FCS、アスコルビン酸、ゲンタマイシンおよびファンギゾンを含む、DMEM/F12）を与えた。成長培地を全培養期間中3〜4日ごとに変化させた。
8〜11日後に、細胞（hPDLCと称される）を歯周靱帯の小片から移動し始めた。培養が70〜80%融合となった（約3週）ときに、細胞をトリプシン／EDTA処置を用いて分離し、下記の実験に用いた。
hPDLCのサブコンフルエント（subconfluent）培養をFigure 3に示す。
【００５８】
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析は、hPDLCの幹細胞特性を研究するために行った。
hPDLCの単一細胞懸濁物を室温にて間葉幹細胞マーカーとして知られるCD73、CD90に対するFITCコンジュゲートモノクローナル抗体でインキュベーションした。インキュベーション後、サンプルをBeckman Coulter Epics XLフローサイトメーターで分析した。死亡細胞および残骸を前方散乱光および散乱光ゲート法（forward- and sidescatter gating）により分析物から排除した。
結果をFigure 4に示す。
【００５９】
骨形成分化
細胞を0.5×104細胞/cm2にて播種し、成長培地にて一晩培養した。成長培地から10% FBS、85    g/mL L-アスコルビン酸 2-ホスフェート、10-7Mデキサメタゾンおよび8 mMβ-グリセロホスフェートを含むDMEMF12からなる骨誘導培地（OIM）にシフトすることにより、骨形成分化を3週間誘発した。分化刺激のない対照培養物を10% FBSを含むSCMにて培養した。培地変化を毎週２回行った。
細胞外マトリックス（ECM）の石灰化は、リン酸カルシウム蓄積物を茶色から黒色に染色するフォンコッサ法により検出することができる。0.5×104細胞/cm2の密度にて6ウェルプレートにて細胞を播種し、OIM中21日間培養した。さらに、特異的染色プロトコールを用いてアルカリ性ホスファターゼ活性を研究した。
骨形成分化からの結果をFigure 5に示す。
上記発見に基づき、我々は、上記成長培地中にて培養されたhPDLCは骨形成経路に沿って分化することができると結論付けた。
さらに、細胞集団は間葉幹細胞について特徴的な２つの表面マーカーを示す。
【００６０】
本発明の具体的態様
1.  歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質もしくは歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかおよび／またはこれと共培養し、これらの因子により誘発されて：
a.  歯周特性を得、
b.  オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大、および骨シアロタンパク質IIまたはBSPとも称される骨シアロタンパク質の減少を示し、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病（paradentitis）などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容される、
哺乳類間葉細胞を増殖させる方法。
【００６１】
2.  歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質もしくは歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかまたはこれと共培養し、これらの因子により誘発されて：
a.  歯周特性を得、
b.  オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大、および骨シアロタンパク質の減少を示し、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容される、
臍帯および／または臍帯血に由来する同種哺乳類間葉細胞を増殖させる方法。
【００６２】
3.  歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質もしくは歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかまたはこれと共培養し、これらの因子により誘発されて：
a.  歯周特性を得、
b.  オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大、および骨シアロタンパク質の減少を示し、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容される、
自己間葉細胞を増殖させる方法。
【００６３】
4.  歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質もしくは歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかおよび／またはこれと共培養し、これらの因子により誘発されて：
a.  歯周特性を得、
b.  オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大、および骨シアロタンパク質の減少を示し、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容される、
自己骨芽細胞または前駆体／プロジェニター細胞を増殖させる方法。
【００６４】
5.  残存する歯周靱帯まで直接注射する、上記項目1〜4に記載の細胞を増殖させる方法。
【００６５】
6.  系中にて歯周靱帯に直接注射し、それにより系中にて分化形質転換することができる、自己間葉細胞を増殖させる方法。
【００６６】
7.  HLA-DR陽性（HLA-DR+）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）、Stro-1陽性（Stro-1 +）、CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性、場合によりCD146/MUC 18陽性として定義される未熟形態が：
a.  臍帯からの哺乳類間葉幹細胞と共培養することができ、
b.  臍帯血からの哺乳類間葉幹細胞と共培養することができ、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容される、
哺乳類細胞の未熟形態を増殖させ維持する方法。
【００６７】
8.  HLA-DR陽性（HLA-DR+）、CD-34陰性（CD-34 -）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）、Stro-1陽性（Stro-1 +）、CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性、場合によりCD146/MUC 18陽性として定義される未熟形態が：
a.  臍帯からの哺乳類間葉幹細胞と共培養することができ、
b.  臍帯血からの哺乳類間葉幹細胞と共培養することができ、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容される、
哺乳類細胞の未熟形態を増殖させ維持する方法。
【００６８】
9.  自己もしくは同種ドナーからの骨髄細胞もしくはそのコロニーに由来する哺乳類細胞と共培養することができ、歯周靱帯組織、歯周靱帯タンパク質もしくは歯周靱帯組織に由来する因子に曝露するかまたはこれと共培養することができ、これらの因子により誘発されて：
a.  歯周特性を得、
b.  オステオポンチンおよびオステオカルシンの増大、および骨シアロタンパク質の減少を示し、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
e.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
f.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容されうる。
【００６９】
10.  未熟形態がHLA-DR陽性（HLA-DR+）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）、Stro-1陽性（Stro-1 +）、CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性、場合によりCD146/MUC 18陽性として定義される、哺乳類細胞の未熟形態を増殖させ維持する方法であって、哺乳類歯周靱帯細胞の同一性の一部が：
a.  臍帯からの哺乳類間葉幹細胞と共培養することができ、
b.  臍帯血からの哺乳類間葉幹細胞と共培養することができ、
c.  歯周組織を修復しおよび／または再生するためにインプラントすることができ、
d.  歯周症とも称される歯周病などの障害を修復することができ、
e.  有意な免疫反応または細胞拒絶を伴わないでホストに許容されうる、方法。
【００７０】
11.  1および2に記載されているように処理して得られ、HLA-DR陽性（HLA-DR+）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）およびStro-1陽性（Stro-1 +）、CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性、場合によりCD146/MUC 18陽性として定義される集団は、哺乳動物に：
a.  拒絶を伴わないでその口腔に
b.  拒絶を伴わないでその歯周領域に
c.  拒絶を伴わないでその歯の欠陥に
移植可能であろう。
【００７１】
12.  1および2に記載されているように処理して得られ、HLA-DR陽性（HLA-DR+）、Lin陽性（Lin +）、Thy-1陽性（Thy-1+）およびStro-1陽性（Stro-1 +）、CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性、場合によりCD146/MUC 18陽性として定義される集団は、哺乳動物に：
d.  拒絶を伴わないでその口腔に
e.  拒絶を伴わないでその歯周領域に
f.  拒絶を伴わないでその歯の欠陥に
移植可能であろう。
【００７２】
13.  細胞および骨格の組合せを用いる、上記項目1〜11に記載の細胞をインプラントする方法。
【００７３】
14.  a.  拒絶を伴わないで口腔に
b.  拒絶を伴わないで歯周領域に
c.  拒絶を伴わないで歯の欠陥に
移植可能である、哺乳類自己歯周靱帯陽性細胞（幹細胞）を増殖させる方法。
【００７４】
15.  細胞および骨格の組合せを用いる、上記請求項記載の細胞をインプラントする方法。
【００７５】
16.  細胞が分化することができるための自己、同種および／または異種源からの歯周靱帯またはその抽出物の使用。
【００７６】
17.  細胞が歯周細胞、歯周幹細胞および／または歯周挙動発現細胞に分化することができるための自己、同種および／または異種源からの歯周靱帯またはその抽出物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】Figure 1.  歯槽における正しい位置の歯の図
【００７８】
【図２】Figure 2.  歯周炎、歯と顎骨の間の付着の欠乏により特徴付けられる歯茎の慢性的感染症は、歯肉炎と称される軽症型で開始する（1を参照のこと）。
【００７９】
【図３】Figure 3.  hPDLCのサブコンフルエント培養を示す。細胞は70%融合であるとき、トリプシン化される。
【００８０】
【図４】Figure 4.  サンプルをBeckman Coulter Epics XLフローサイトメーターで分析した。死亡細胞および残骸を前方散乱光および散乱光ゲート法により分析物から排除した。
【００８１】
【図５】Figure 5.  細胞は、特異的染色プロトコールを用いて研究し、アルカリ性ホスファターゼ活性のために染色し、骨形成分化がこの図にて示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2009509512.tif 000009
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