(57)【要約】  本発明は、非天然アミノ酸フェニルセレノシステインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの真正細菌宿主細胞内で生成されたタンパク質に組み込める、ｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの直交対に関する。本発明は、例えば新規な直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、新規なシンセターゼ分子をコードするポリヌクレオチド、新規なシンセターゼを同定して作成する方法、非天然アミノ酸フェニルセレノシステインおよび翻訳系を含有するタンパク質を生成する方法を提供するがこれに限定されるものではない。本発明は、タンパク質中のフェニルセレノシステイン残基を標的とした変性を通じて変性タンパク質（例えば脂質付加タンパク質）を生成する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フェニルセレノシステインである第１の非天然アミノ酸、
（ｂ）第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、および
（ｃ）第１の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
を含んでなり、前記第１のＯ−ＲＳが、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する、翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記フェニルセレノシステインと、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ＲＳが、配列番号４、６、８で記載されるアミノ酸配列とその保存的変異型とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡである、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが、配列番号１で記載されるポリヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれによってコードされる、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
対象とするタンパク質をコードする核酸をさらに含んでなり、前記核酸が少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識される、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
第２のＯ−ＲＳおよび第２のＯ−ｔＲＮＡをさらに含んでなり、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する、請求項６に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記第１の非天然アミノ酸、前記第１のＯ−ＲＳ、および前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含んでなる宿主細胞を含んでなる、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である、請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記真正細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号５、７または９で記載されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１４】
（ａ）（ｉ）フェニルセレノシステインである第１の非天然アミノ酸、
（ｉｉ）第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
（ｉｉｉ）第１の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および
（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸
を含んでなり、前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化し、前記核酸が前記第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなる、翻訳系を提供するステップと、
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して、前記タンパク質の翻訳中に、前記非天然アミノ酸を前記タンパク質中の前記選択された位置に組み込み、それによって前記非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなるタンパク質を生成するステップと
を含んでなる、選択された位置に非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を翻訳系中で生成する方法。
【請求項１５】
前記第１のＯ−ＲＳが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記フェニルセレノシステインと、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記翻訳系が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳系を提供する前記ステップが、配列番号４、６、８で記載されるアミノ酸配列とその保存的変異型とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＯ−ＲＳを提供するステップを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを提供する前記ステップが、部位特異的変異誘発によって野生型アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合ポケットを変異させるステップと、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択し、それによって前記第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを提供するステップを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択するステップが、前記部位特異的変異誘発に続いて生成した複数の突然変異アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ分子を含んでなるプールから、前記Ｏ−ＲＳをポジティブに選択し、およびネガティブに選択するステップを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳系を提供する前記ステップが、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供するステップを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
翻訳系を提供する前記ステップが、アンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供するステップを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
翻訳系を提供する前記ステップが、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするかまたはそれを含んでなる核酸を提供するステップを含んでなり、前記核酸が配列番号１で記載されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳系を提供する前記ステップが、前記Ｏ−ＲＳをコードする核酸を提供するステップを含んでなり、前記核酸が配列番号５、７または９で記載されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
翻訳系を提供する前記ステップが、アンバーセレクターコドンを含んでなる核酸を提供するステップを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
さらに前記タンパク質が前記第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を含んでなり、前記翻訳系が第２のＯ−ＲＳおよび第２のＯ−ｔＲＮＡをさらに含んでなり、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
翻訳系を提供する前記ステップが、宿主細胞を提供するステップを含んでなり、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸、前記第１のＯ−ＲＳ、前記第１のＯ−ｔＲＮＡ、および前記核酸を含んでなり、前記組み込むステップが前記宿主細胞を培養するステップを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記真正細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が前記Ｏ−ＲＳをコードする核酸を含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｏ−ＲＳをコードする前記核酸が、配列番号５、７または９で記載されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ｃ）前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の前記選択された位置で反応させ、前記選択された位置にデヒドロアラニンを含んでなるタンパク質を生成するステップをさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
前記反応させるステップが酸化的脱離による、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記反応させるステップが前記フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露するステップを含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）（ｉ）フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸、
（ｉｉ）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
（ｉｉｉ）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および
（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸
を含んでなり、前記Ｏ−ＲＳが前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化し、前記核酸が前記Ｏ−ｔＲＮＡによって認識される前記選択された位置にセレクターコドンを含んでなる、翻訳系を提供するステップと、
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して、前記タンパク質の翻訳中に、フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の前記選択された位置に組み込むステップと、
（ｃ）前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させて、選択された位置にデヒドロアラニンを含んでなるタンパク質を生成するステップと、
（ｄ）前記デヒドロアラニンを前記タンパク質中の選択された位置で脂質部分と反応させて、タンパク質中の選択された位置に脂質およびアミノ酸部分を含んでなるタンパク質を生成するステップと
を含んでなる、選択された位置に脂質部分を含んでなるタンパク質を翻訳系中で生成する方法。
【請求項３５】
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、酸化的脱離による、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、前記フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露するステップを含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記脂質部分が、チオパルミチン酸、ファルネシルメルカプタン、および１−ヘキサデカンチオールからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記脂質付加アミノ酸部分が、パルミトイルシステイン、ファルネシルシステイン、およびＳ−ヘキサデシルシステインからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記デヒドロアラニンを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、マイケル付加反応による、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）（ｉ）フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸、
（ｉｉ）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
（ｉｉｉ）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および
（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸
を含んでなり、前記Ｏ−ＲＳが前記フェニルセレノシステインで前記Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、前記核酸が前記Ｏ−ｔＲＮＡによって認識される前記選択された位置にセレクターコドンを含んでなる、翻訳系を提供するステップと、
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して、前記タンパク質の翻訳中に、前記フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸を前記タンパク質中の前記選択された位置に組み込むステップと、
（ｃ）前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させ、それによって前記デヒドロアラニン非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなる前記タンパク質を生成するステップ
を含んでなる、デヒドロアラニン非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなるタンパク質を翻訳系中で生成する方法。
【請求項４１】
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、酸化的脱離による、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、前記フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露するステップを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
配列番号４、６、８で記載されるアミノ酸配列とその保存的変異型とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項４４】
前記保存的変異型ポリペプチドが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察される効率の少なくとも５０％の効率で、同族直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物がポリペプチドを含んでなる細胞を含んでなる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項４３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号５、７または９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項４９】
請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる細胞。
【請求項５１】
配列番号５、７または９で記載されるヌクレオチド配列を含んでなる、ポリヌクレオチドを含んでなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその内容全体を参照によって本明細書に援用する、２００６年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／７８３，２７２号明細書、および２００６年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８６１，４５６号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、補助金番号ＧＭ６２１５９の下に、国立衛生研究所からの政府支援を受けて行われた。政府は本発明に対して特定の権利を有するかもしれない。
【０００３】
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む、直交性ｔＲＮＡ、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、およびその対を作成して使用するための組成物および方法に関する。本発明はまた、方法によって作成された対およびタンパク質を使用して、細胞内でタンパク質を生成する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質の構造および機能の研究は、歴史的に天然アミノ酸の反応性基を使用して入手できる特性および反応化学に依存してきた。不運にも細菌からヒトにおよぶあらゆる既知の生物は、同じ２０種の一般的なアミノ酸をコードする。これらの２０種のアミノ酸は、意外にも窒素塩基、カルボン酸およびアミド、アルコール、およびチオール基の限られた数の官能基を含んでなる。この限られたＲ−基の選択は、タンパク質の構造および機能の研究を制限しており、研究は天然アミノ酸の化学特性によって制限されている。例えば天然の反応性Ｒ−基の限られた数は、タンパク質中のその他のアミノ酸の排除のために、高度に標的を定めたタンパク質変性を行う能力を制限してきた。
【０００５】
タンパク質が関与する化学選択的ライゲーション反応は、タンパク質間相互作用および細胞シグナル伝達の研究、および治療的な新規なタンパク質の発生をはじめとするが、これに限定されるものではない多様な目的のために極めて重要である。当該技術分野で目下使用される最も選択的なタンパク質変性反応は、例えばα−ハロケトンとヒスチジンまたはシステイン側鎖との反応などのタンパク質アミノ酸側鎖中の天然求核性残基を標的とする、求核性および求電子性反応パートナー間の共有結合形成を伴う。これらの場合の選択性は、タンパク質中の求核性残基の数およびアクセスしやすさによって定まる。不運にも、天然タンパク質は、配置の悪い（例えばアクセスできない）反応部位または多重反応標的（例えばリジン、ヒスチジン、およびシステイン残基）を含有することが多く、変性反応における選択性不良をもたらし、求核性／求電子性試薬による高度に標的を定めたタンパク質変性を困難にする。さらに変性部位は典型的にリジン、ヒスチジンまたはシステインなどの天然の求核性側鎖に限定される。その他の部位における変性は、困難または不可能である。
【０００６】
当該技術分野で必要とされるのは、タンパク質の構造および機能を改変して研究する目的のために、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための新しいストラテジーであり、非天然アミノ酸は、例えば天然アミノ酸には見られない生物学的特性など、新規な反応化学特性またはその他の特性を有する。当該技術分野において、高度に選択的な様式でタンパク質を変性し、さらに生理学的条件下でタンパク質を変性する、タンパク質変性反応のための新しいストラテジーの創出がかなり必要とされている。当該技術分野で必要とされるのは、タンパク質変性を生じる新規な方法であり、例えば変性では天然のアミノ酸がいずれも交差反応または副反応の対象でないなど、変性は高度に特異的である。高度に特異的なタンパク質の変性ストラテジーのための新規な化学特性は、タンパク質構造および機能の研究、および治療的タンパク質生成において多種多様な用途がある。
【０００７】
タンパク質脂質化
タンパク質脂質化は、タンパク質局在化、適切な細胞内タンパク質輸送、およびタンパク質間相互作用に関与する重要な翻訳後変性である。タンパク質の脂質化は、適切な生物学的活性に必要とされることが多い。この特性はいくつかの治療的タンパク質の開発のために重要である。脂質化はまた、タンパク質間相互作用および細胞シグナル伝達を研究する上でも重要である。不運にもタンパク質の天然非脂質付加形態を使用して脂質付加タンパク質を生成する生体外化学選択的ライゲーションは極めて困難であり、一般にユニークな表面露出システイン残基の改変に限定される。
【０００８】
多くの細胞タンパク質の生物学的活動は、細胞膜との結び付きを必要とし、それはファルネシル、ミリストイル、およびパルミトイル部分などの脂質残基によるシステインの翻訳後変性に依存する（チェモモルディック（Ｃｈｅｍｏｍｏｒｄｉｋ）およびコズロフ（Ｋｏｚｌｏｖ）（２００３年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２：１７５〜２０７頁）。例えば多くのＧ−タンパク質結合受容体がパルミトイル化され、Ｒａｓタンパク質はファルネシル化されてパルミトイル化もされている（チェモモルディック（Ｃｈｅｍｏｍｏｒｄｉｋ）およびコズロフ（Ｋｏｚｌｏｖ）（２００３年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２：１７５〜２０７頁）。タンパク質ファルネシル化が安定した不可逆的変性であるのに対し、パルミトイル化は可逆的であり、タンパク質機能の動的調節および細胞膜への特異的ターゲティングをもたらす（ロックス（Ｒｏｃｋｓ）ら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７（５７１６）：１７４６〜１７５２頁）。さらにγ−カルボキシグルタミン酸は、凝固カスケード中のカルシウム依存膜接着に重要な必須変性である（デービー（Ｄａｖｉｅ）ら（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（４３）：１０３６３〜１０３７０頁）。
【０００９】
直交性翻訳系
限定的遺伝コードの制限を克服する１つのストラテジーは、遺伝コードを拡張し、生物学的レパートリーに新規な反応性特性を有するアミノ酸を加えることである。原核生物および真核生物双方において、多様な非天然アミノ酸をタンパク質内へ生体内部位特異的組み込みするための一般方法が開発されている。これらの方法は、生体内ポリペプチド翻訳中に、所望の非天然アミノ酸を規定位置に挿入する適切なセレクターコドンを認識する、直交性タンパク質翻訳構成要素に依存する。これらの方法は、セレクターコドンを認識する直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を利用し、対応する特異的直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を負荷する。これらの構成要素は、宿主生物の内在性ｔＲＮＡ、ＲＳ、アミノ酸またはコドンのいずれとも交差反応しない（すなわちそれは直交性でなくてはならない）。このような直交性ｔＲＮＡ−ＲＳ対の使用は、多数の構造的に多様な非天然アミノ酸を遺伝的にコードすることを可能にした。
【００１０】
１つ以上の非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質の作成に適した直交性翻訳系を使用する慣行は、一般に当該技術分野で知られており、直交性翻訳系を生成する一般方法についても同様である。例えば「直交性ｔＲＮＡ−アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対生成のための方法および組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−  ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」と題された国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／０１９４１５号パンフレット、２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／００７８７０号パンフレット、２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／００７６２４号パンフレット、および「非天然アミノ酸の生体内組み込みのための直交性翻訳構成要素（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ  ）」と題された２００５年１０月２７日に出願された国際公開第２００６／１１０１８２号パンフレットを参照されたい。これらの各出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。非天然アミノ酸を組み込む直交性翻訳系、およびそれらの生成方法と使用に関する追加的考察については、ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１：１〜１１頁（２００２年）；ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４〜６６頁（２００５年）；シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（３）：２２７〜２３８頁（２００５年）；シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝レパートリーへのアミノ酸の追加（Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（６）：５４８〜５５４頁（２００５年）；ワン（Ｗａｎｇ）ら「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５〜２４９頁（２００６年）；およびシェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「タンパク質のための化学ツールキット���遺伝コードの拡張（Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（１０）：７７５〜７８２頁（２００６年）もまた参照されたい。
【特許文献１】国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００５／０１９４１５号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／００７８７０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／００７６２４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００６／１１０１８２号パンフレット
【非特許文献１】チェモモルディック（Ｃｈｅｍｏｍｏｒｄｉｋ）およびコズロフ（Ｋｏｚｌｏｖ）（２００３年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２：１７５〜２０７頁
【非特許文献２】ロックス（Ｒｏｃｋｓ）ら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７（５７１６）：１７４６〜１７５２頁
【非特許文献３】デービー（Ｄａｖｉｅ）ら（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（４３）：１０３６３〜１０３７０頁
【非特許文献４】ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）１：１〜１１頁（２００２年）
【非特許文献５】ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４〜６６頁（２００５年）
【非特許文献６】シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（３）：２２７〜２３８頁（２００５年）
【非特許文献７】シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝レパートリーへのアミノ酸の追加（Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（６）：５４８〜５５４頁（２００５年
【非特許文献８】ワン（Ｗａｎｇ）ら「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５〜２４９頁（２００６年)
【非特許文献９】シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「タンパク質のための化学ツールキット−遺伝コードの拡張（Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（１０）：７７５〜７８２頁（２００６年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当該技術分野において、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む直交性翻訳構成要素の開発に対する必要性があり、そこでは非天然アミノ酸を規定位置に組み込むことができ、非天然アミノ酸が新規な化学特性を有して、アミノ酸が特異的変性（例えば脂質化）の標的の役割を果たせるようにして、タンパク質中のその他の部位との交差反応または副反応をなくす。本明細書に記載される本発明は、以下の開示を検討すれば明らかなように、これらおよびその他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生体内（例えば宿主細胞内）において、例えばアンバー停止コドンなどのセレクターコドンに応答して、生育するポリペプチド鎖に非天然アミノ酸フェニルセレノシステインを組み込むための組成物および方法を提供する。これらの組成物としては、宿主細胞翻訳機構と相互作用しない直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）の対が挙げられる。すなわちＯ−ｔＲＮＡは、内在性宿主細胞アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって、（天然または非天然）アミノ酸を負荷されない（または顕著なレベルに負荷されない）。同様に本発明によって提供されるＯ−ＲＳは、顕著なまたは場合によっては検出可能なレベルに、アミノ酸（天然または非天然）でいかなる内在性ｔＲＮＡも負荷しない。これらの新規な組成物は、翻訳的に組み込まれた非天然アミノ酸を有する、大量のタンパク質の生成を可能にする。フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸の化学特性はまた、その残基を標的とした変性も可能にし、例えば脂質抱合であるがこれに限定されるものではない所望の抱合を生成する。このような特異的に変性されたポリペプチドは、治療薬としておよび生物医学研究における用途がある。
【００１３】
いくつかの態様では、本発明は翻訳系を提供する。これらの系は、第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、第１の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、およびフェニルセレノシステインである第１の非天然アミノ酸を含んでなり、第１のＯ−ＲＳは、第１のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する。いくつかの態様では、Ｏ−ＲＳは同一Ｏ−ｔＲＮＡと、フェニルセレノシステインと、アミノ酸配列配列番号４、６または８を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察された効率の少なくとも５０％の効率で、Ｏ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する。
【００１４】
翻訳系は、多様な起源に由来する構成要素を使用できる。一実施態様では、系で使用されるＯ−ＲＳは、配列番号４、６または８のアミノ酸配列、およびその配列の保存的変異型を含んでなることができる。いくつかの実施態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡである。いくつかの実施態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１を含んでなり、またはそれによってコードされる。
【００１５】
いくつかの態様では、翻訳系は対象とするタンパク質をコードする核酸をさらに含んでなり、核酸はＯ−ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを有する。
【００１６】
いくつかの態様では、翻訳系は、系が少なくとも２個の異なる非天然アミノ酸をポリペプチド中の異なる選択された部位に組み込むことができるように、第２の非天然アミノ酸を利用する第２の直交対（すなわち第２のＯ−ＲＳおよび第２のＯ−ｔＲＮＡ）を組み込む。この二重系では、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する。
【００１７】
いくつかの実施態様では、翻訳系は宿主細胞内に存在する（そして宿主細胞を含む）。Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡがそれらの宿主細胞環境内で直交性を保ちさえすれば、使用される宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの真正細菌細胞であることができる。宿主細胞は、Ｏ−ＲＳまたはＯ−ｔＲＮＡをはじめとする翻訳系の構成要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含んでなることができる。いくつかの実施態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号５、７または９のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１８】
本発明はまた、選択された位置に１つ以上の非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成する方法も提供する。これらの方法は、上述の翻訳系を利用する。一般にこれらの方法は、（ｉ）フェニルセレノシステインである第１の非天然アミノ酸、（ｉｉ）第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、（ｉｉｉ）第１の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸を含んでなる翻訳系を提供するステップで開始し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、核酸は第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドン（場合によりアンバーコドン）を含んでなる。次に方法は、セレクターコドンに応答して、タンパク質翻訳中に、非天然アミノ酸をタンパク質中の選択された位置に組み込み、それによって非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなるタンパク質を生成する。これらの方法のいくつかの態様では、Ｏ−ＲＳは、同一Ｏ−ｔＲＮＡと、フェニルセレノシステインと、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察された効率の少なくとも５０％の効率で、Ｏ−ｔＲＮＡをフェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する。いくつかの態様では、翻訳系はＯ−ＲＳをコードする核酸を含む。
【００１９】
これらの方法は、多様な試薬を使用して広く応用することができる。いくつかの実施態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施態様では、Ｏ−ＲＳは、配列番号４、６または８のアミノ酸配列、またはその保存的変異型を含んでなる。場合により方法で使用される翻訳系は、例えば配列番号５、７または９の核酸など、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を含む。
【００２０】
これらの方法のいくつかの実施態様では、翻訳系を提供するステップは、部位特異的変異誘発によって野生型アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合ポケットを変異させ、非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択するステップを含んでなる。選択するステップは、部位特異的変異誘発に続いて、得られたアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ分子のプールからＯ−ＲＳをポジティブに選択し、およびネガティブに選択するステップを含んでなることができる。いくつかの実施態様では、提供するステップは、例えばアンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡ、または配列番号１のポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれによってコードされるＯ−ｔＲＮＡなどのＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを与える。これらの方法では、提供するステップはまた、翻訳系によって利用されるアンバーセレクターコドンを含んでなる核酸も与えることができる。
【００２１】
これらの方法はまた修正して、１つを超える非天然アミノ酸をタンパク質内に組み込むことができる。これらの方法では、第１の翻訳系と併せて第２の直交性翻訳系が用いられ、第２の系は異なるアミノ酸およびセレクターコドン特異性を有する。例えば提供するステップは、第２のＯ−ＲＳおよび第２のＯ−ｔＲＮＡを提供するステップを含むことができ、第２のＯ−ＲＳは、第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは、第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する。
【００２２】
非天然アミノ酸があるタンパク質を生成する方法はまた、宿主細胞の文脈で行うことができる。これらの場合、宿主細胞が提供され、宿主細胞は非天然アミノ酸と、Ｏ−ＲＳと、Ｏ−ｔＲＮＡと、タンパク質をコードする少なくとも１つのセレクターコドンがある核酸とを含んでなり、宿主細胞の培養は非天然アミノ酸の組み込みをもたらす。いくつかの実施態様では、提供するステップは、真正細菌宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を提供するステップを含んでなる。いくつかの実施態様では、提供するステップは、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供するステップを含んでなる。例えばＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７または９のヌクレオチド配列を含んでなることができる。
【００２３】
これらの方法のいくつかの変形形態では、手順は、そのポリペプチド内への組み込みに続く、フェニルセレノシステインの変性をさらに含む。例えばフェニルセレノシステインは、選択された位置においてデヒドロアラニンの変換をもたらす特定の条件下で反応できる。この反応は、酸化的脱離によることができる。反応は、フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露することで実施できる。
【００２４】
本発明はまた、脂質付加タンパク質を生成する方法も提供し、脂質は指定の選択された位置で抱合される。これらの方法は上述の翻訳系を利用する。一般にこれらの方法は、（ｉ）フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸、（ｉｉ）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、（ｉｉｉ）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸を含んでなる翻訳系を提供するステップで開始し、Ｏ−ＲＳはフェニルセレノシステインでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、核酸はＯ−ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドン（場合によりアンバーコドン）を含んでなる。次に方法は、セレクターコドンに応答して、タンパク質翻訳中に、タンパク質中の選択された位置にフェニルセレノシステインを組み込む。次にフェニルセレノシステインを反応させて選択された位置にデヒドロアラニンを生成し、それは次にそれ自体が脂質と反応して脂質付加アミノ酸部分を生成し、それによってタンパク質中の選択された位置に脂質を有するタンパク質が生成する。
【００２５】
これらの方法のいくつかの態様では、フェニルセレノシステインを反応させるステップは、酸化的脱離または過酸化水素への曝露による。いくつかの態様では、デヒドロアラニンと反応させる抱合脂質は、チオパルミチン酸、ファルネシルメルカプタンまたは１−ヘキサデカンチオールであることができる。このようにして形成される脂質付加アミノ酸は、パルミトイルシステイン、ファルネシルシステイン、およびＳ−ヘキサデシルシステインである。デヒドロアラニンの変性は、典型的にマイケル付加反応による。
【００２６】
本発明はまた、選択された位置にデヒドロアラニン残基を有するタンパク質を生成する方法も提供する。これらの方法は、上述の翻訳系を利用する。一般にこれらの方法は、（ｉ）フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸、（ｉｉ）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、（ｉｉｉ）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸を含んでなる翻訳系を提供するステップで開始し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをフェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化し、核酸はＯ−ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドン（場合によりアンバーコドン）を含んでなる。次に方法は、セレクターコドンに応答して、タンパク質翻訳中に、タンパク質中の選択された位置にフェニルセレノシステインを組み込む。次にフェニルセレノシステインを反応させて、選択された位置にデヒドロアラニンを生成する。これらの方法のいくつかの態様では、フェニルセレノシステインを反応させるステップは、酸化的脱離または過酸化水素への曝露による。
【００２７】
本発明はまた、核酸およびタンパク質をはじめとする多様な組成物も提供する。組成物の性質は、組成物が規定の核酸またはタンパク質を含んでなること以外は特に制限されない。本発明の組成物は、あらゆる性質のあらゆる数の追加的構成要素を含んでなることができる。
【００２８】
例えば本発明はＯ−ＲＳポリペプチドを含んでなる組成物を提供し、ポリペプチドは配列番号４、６または８のアミノ酸配列、またはその保存的変異型を含んでなる。いくつかの態様では、保存的変異型ポリペプチドは、Ｏ−ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸と、配列番号４、６、８または１０のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察された効率の少なくとも５０％の効率で、同族の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明はまた、上のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施態様では、これらのポリヌクレオチドは、配列番号５、７または９のヌクレオチド配列を含んでなることができる。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは細胞中にある。
【００２９】
本発明はまた、配列番号５、７または９のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド組成物も提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、例えば発現ベクターなどのポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。いくつかの実施態様では、本発明は上述のベクターを含んでなる細胞を提供する。
【００３０】
定義
本発明について詳細に述べる前に、本発明は、特定の生物系に限定されるものではなく、当然ながら変更可能であることが理解される。またここで使用される用語法は、あくまで特定の実施態様について例示するためのものであり、限定されるものではないことが理解される。本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、特に断りのない限り単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は含複数指示対象を含む。したがって例えば「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞組み合わせを含み、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、実際問題としてポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
【００３１】
ここで、および下文の明細書の残り部分で断りのない限り、ここで使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３２】
直交性：本明細書での用法では、「直交性」という用語は、細胞または翻訳系に内在性の対応する分子と比較して、低下した効率で細胞の内在性構成要素と共に機能する分子、または細胞内在性構成要素と共に機能しない分子（例えば直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および／または直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ））を指す。ｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの文脈で、直交性とは、内在性ｔＲＮＡシンセターゼに機能する内在性ｔＲＮＡと比較して直交性ｔＲＮＡが内在性ｔＲＮＡシンセターゼに機能する、あるいは内在性ｔＲＮＡに機能する内在性ｔＲＮＡシンセターゼと比較して直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼが内在性ｔＲＮＡに機能する、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、または１％未満の効率などの不能または低下した効率を指す。直交性分子は、細胞内において機能的に正常な内在性相補分子を欠いている。例えば細胞内の直交性ｔＲＮＡは、内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較すると、低下したまたはゼロですらある効率で、細胞の内在性ＲＳによってアミノアシル化される。別の例では、直交性ＲＳは、内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、低下したまたはゼロでさえある効率で、対象とする細胞のあらゆる内在性ｔＲＮＡをアミノアシル化する。第１の直交性分子と共に機能する第２の直交性分子が、細胞内に導入できる。例えば直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対は、例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳの内在性対、または活性直交対（例えばチロシル直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対）である対照の効率と比較して、効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、または９９％以上の効率）で、細胞内において共に機能する、導入された相補的構成要素を含む。
【００３３】
直交性チロシル−ｔＲＮＡ：本明細書での用法では、直交性チロシル−ｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは、対象とする翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは、（１）天然のチロシル−ｔＲＮＡと同一であり、またはそれと実質的に類似し、（２）天然または人工変異誘発によって天然のチロシル−ｔＲＮＡから誘導され、（３）（１）または（２）の野生型配列または突然変異チロシル−ｔＲＮＡ配列を考慮するあらゆる処理から誘導され、（４）野生型または突然変異チロシル−ｔＲＮＡに相同的であり、（５）図２のチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼのための基質とされるあらゆる例示ｔＲＮＡと相同的であり、または（６）図２のチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼの基質とされるあらゆる例示ｔＲＮＡの保存的変異型である。チロシル−ｔＲＮＡは、アミノ酸を負荷されている、または負荷されていない状態で存在できる。また「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は、場合によりそれぞれ同族のシンセターゼによって、例えば非天然アミノ酸などチロシン以外のアミノ酸を負荷（アミノアシル化）されているものと理解される。実際、セレクターコドンに応答して、本発明のチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡが有利に使用され、翻訳中に、生長するポリペプチド中に、天然または非天然に関わらず本質的にあらゆるアミノ酸が挿入されるものと理解される。
【００３４】
直交性チロシルアミノ酸シンセターゼ：本明細書での用法では、直交性チロシルアミノ酸シンセターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）とは、対象とする翻訳系中でチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は、天然、非天然または人工に関わらず、あらゆるアミノ酸であることができ、限定されない。シンセターゼは、場合により天然のチロシルアミノ酸シンセターゼと同一でありまたはそれと相同的であり、または図２のＯ−ＲＳと称されるシンセターゼと同一でありまたはそれと相同的である。例えばＯ−ＲＳは、図２のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存的変異型であることができ、および／または図２のＯ−ＲＳと配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上同一であることができる。
【００３５】
同族：「同族」という用語は、例えば直交性ｔＲＮＡおよび直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼなどの一緒に機能するか、または互いにいくつかの特異性側面を有する構成要素を指す。構成要素はまた、相補的であるとも称することができる。
【００３６】
優先的アミノアシル化：直交性翻訳系に関連した本明細書での用法では、Ｏ−ＲＳが、それが発現系内のあらゆる内在性ｔＲＮＡを負荷するのよりもより効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷する場合に、Ｏ−ＲＳは同族のＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化」する。すなわちＯ−ｔＲＮＡおよびあらゆる特定の内在性ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系中に存在する場合、Ｏ−ＲＳはそれが内在性ｔＲＮＡを負荷するのよりもより頻繁にＯ−ｔＲＮＡを負荷する。好ましくはＯ−ＲＳによって負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳによって負荷される内在性ｔＲＮＡとの相対比は高く、好ましくはＯ−ｔＲＮＡと内在性ｔＲＮＡとが翻訳系中に等モル濃度で存在する場合に、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを排他的に、またはほぼ排他的に負荷する結果となる。Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合、Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在性ｔＲＮＡとの相対比は、１：１を超え、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、なおもより好ましくは１０：１、さらにより好ましくは２０：１、なおもより好ましくは５０：１、さらにより好ましくは７５：１、なおもより好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１またはそれ以上である。
【００３７】
（ａ）Ｏ−ＲＳが、内在性ｔＲＮＡと比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、および（ｂ）Ｏ−ＲＳによるＯ−ｔＲＮＡのあらゆる天然アミノ酸でのアミノアシル化と比較して、アミノアシル化が非天然アミノ酸に関して特異的である場合に、Ｏ−ＲＳは、「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。すなわちＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡを含んでなる翻訳系中に非天然および天然アミノ酸が等モル量で存在する場合、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに天然アミノ酸よりも頻繁に非天然アミノ酸を負荷する。好ましくは非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと、天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡとの相対比は高い。より好ましくはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡに、排他的に、またはほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷する。翻訳系中に天然および非天然アミノ酸の双方が等モル濃度で存在する場合、Ｏ−ｔＲＮＡへの非天然アミノ酸の負荷と、Ｏ−ｔＲＮＡへの天然アミノ酸の負荷との相対比は、１：１を超え、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、なおもより好ましくは１０：１、さらにより好ましくは２０：１、なおもより好ましくは５０：１、さらにより好ましくは７５：１、なおもより好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１またはそれ以上である。
【００３８】
セレクターコドン：「セレクターコドン」という用語は、翻訳過程においてＯ−ｔＲＮＡによって認識され、内在性ｔＲＮＡによって認識されないコドンを指す。Ｏ−ｔＲＮＡ抗コドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、例えば非天然アミノ酸などのそのアミノ酸をポリペプチド内のこの部位に組み込む。セレクターコドンとしては、例えばアンバー、オーカー、およびオパールコドンのような停止コドンなどのナンセンスコドンと、四塩基以上のコドンと、レアコドンと、天然または非天然塩基対に由来するコドンなどが挙げられる。
【００３９】
抑制因子ｔＲＮＡ：抑制因子ｔＲＮＡは、典型的に停止コドン（すなわち「読み過ごし」）に応答して、ポリペプチドの翻訳中にアミノ酸の組み込みを許すことで、所与の翻訳系中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変更するｔＲＮＡである。いくつかの態様では、本発明のセレクターコドンは、例えば停止コドン（例えばアンバー、オーカーまたはオパールコドン）、四塩基コドン、レアコドンなどの抑制因子コドンである。
【００４０】
抑制活性：本明細書での用法では、「抑制活性」という用語は、一般にｔＲＮＡ（例えば抑制因子ｔＲＮＡ）が、さもなければ翻訳終結または誤翻訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンまたは四塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み過ごしを可能にする能力を指す。抑制因子ｔＲＮＡ抑制活性は、第２の抑制因子ｔＲＮＡと比較して、または例えばＯ−ＲＳを欠く対照系などの対照系と比較して、観察された翻訳読み過ごし活性の百分率として表わせる。
【００４１】
本発明は、それによって活性抑制を定量化できる様々な方法を提供する。対象とするセレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定のＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳの％抑制は、対象とする翻訳系において、発現した試験マーカーをコードする核酸中における、セレクターコドンを含む所与の発現された試験マーカー（例えばＬａｃＺ）活性の百分率を指し、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、およびセレクターコドンを欠いている正の対照コンストラクトと比較して、対象とする翻訳系はＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡを含む。したがって例えばセレクターコドンを欠く活性の正の対照マーカーコンストラクトが、問題のマーカーアッセイに適切な単位で、所与の翻訳系において観察されたＸの活性を有すれば、セレクターコドンを含んでなる試験コンストラクトの％抑制は、試験マーカーコンストラクトがＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳもまた含む翻訳系内で発現されること以外は、正の対照マーカーがその下で発現されるのと本質的に同一の環境条件下で、試験マーカーコンストラクトが示すＸの百分率である。典型的に試験マーカーを発現する翻訳系は、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡによって認識されるアミノ酸もまた含む。場合により％抑制の測定は、試験マーカーと、試験マーカーと同じセレクターコドンを含むが、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳおよび／またはＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳによって認識される関連アミノ酸を含まない系中にある「背景」または「負の」対照マーカーコンストラクトとの比較によって、さらに正確にできる。この負の対照は、％抑制測定を正規化して、対象とする翻訳系中のマーカーからの背景シグナル効果を考慮するのに有用である。
【００４２】
抑制効率は、当該技術分野で知られているいくつかのアッセイのいずれかによって判定できる。例えばβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイが使用でき、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含んでなるプラスミドと共に、誘導体化ｌａｃＺプラスミド（コンストラクトがｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンを有する）を適切な生物（例えば直交性構成要素を使用できる生物）からの細胞内に導入する。同族のシンセターゼもまた（発現すると同族のシンセターゼをコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドのどちらかとして）導入できる。細胞は培地中で例えば約０．５のＯＤ６００などの所望の密度に生育させ、例えばノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのベータフルオー（ＢｅｔａＦｌｕｏｒ）（商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキットを使用して、β−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。％抑制は、例えばコンストラクトがセレクターコドンでなく対応するセンスコドンを所望の位置に有する、誘導体化ｌａｃＺコンストラクトから観察された値などの、比較対照に対するサンプル活性の百分率として計算できる。
【００４３】
翻訳系：「翻訳系」という用語は、生育するポリペプチド鎖（タンパク質）にアミノ酸を組み込む構成要素を指す。翻訳系の構成要素としては、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンセターゼ、ｍＲＮＡなどが挙げられる。本発明のＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは、生体外翻訳系に付加され、またはその一部であることができ、または例えば細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの）などの非真核生物の細胞において、または例えば酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞などの真核生物の細胞において、生体内翻訳系に付加され、またはその一部であることができる。
【００４４】
非天然アミノ酸：本明細書での用法では、「非天然アミノ酸」という用語は、２０個の一般的な天然アミノ酸の１つでない、あらゆるアミノ酸、変性アミノ酸、および／またはアミノ酸類似体を指す。例えば非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（図１の構造１参照）は、本発明において用途がある。
【００４５】
由来する：本明細書での用法では、「由来する」という用語は、それから単離された、または特定の分子または生物、または特定の分子または生物からの情報を使用して作成された構成要素を指す。例えば第２のポリペプチドに由来するポリペプチドは、第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一のまたは実質的に類似したアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合、誘導種は、例えば自然発生変異誘発、人工誘導変異誘発または人工ランダム変異誘発によって得ることができる。ポリペプチドを誘導するのに使用される変異誘発は、意図的定方向、または意図的ランダム、またはそれぞれの組み合わせであることができる。最初のものに由来する異なるポリペプチドを作り出すポリペプチドの変異誘発は、（例えばポリメラーゼの非忠実性によって引き起こされる）ランダム事象であることができ、誘導されたポリペプチドの同定は、例えばここで考察するような適切なスクリーニング方法によって実施できる。ポリペプチドの変異誘発は、典型的にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００４６】
正の選択またはスクリーニングマーカー：本明細書での用法では、「正の選択またはスクリーニングマーカー」という用語は、例えば発現される、活性化されるなどして存在する場合、例えば正の選択マーカーがある細胞などの形質を含んでなる細胞を形質のないものから同定できるマーカーを指す。
【００４７】
負の選択またはスクリーニングマーカー：本明細書での用法では、「負の選択またはスクリーニングマーカー」という用語は、例えば発現される、活性化されるなどして存在する場合、（例えば特質または形質を有する細胞と比較して）選択される特質または形質を含まない細胞を同定できるようにするマーカーを指す。
【００４８】
レポーター：本明細書での用法では、「レポーター」という用語は、対象とする系の標的構成要素を同定および／または選択するのに使用できる構成要素を指す。例えばレポーターとしては、例えば抗生物質抵抗性または感受性を与える酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）など）などのタンパク質と、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光タンパク質（例えば（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰなど）と、ルミネセンスマーカー（例えばホタルルシフェラーゼタンパク質）と、親和性ベースのスクリーニングマーカーと、またはｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、Ｉｅｕ２、Ｉｙｓ２などの正または負の選択可能なマーカー遺伝子などが挙げられる。
【００４９】
真核生物：本明細書での用法では、「真核生物」という用語は、真核生物界に属する生物を指す。真核生物は、一般にそれらの典型的に多細胞機構（例えば酵母などのように排他的に多細胞ではないが）と、膜結合核およびその他の膜結合細胞小器官の存在と、直鎖状遺伝物質（すなわち直鎖状染色体）と、オペロンの非存在と、イントロン、メッセージキャッピング、およびｐｏｌｙ−Ａ  ｍＲＮＡの存在と、識別リボソーム構造などのその他の生化学的特徴とによって、原核生物と区別できる。真核生物としては、例えば動物（例えば哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類など）、線毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類など）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などが挙げられる。
【００５０】
原核生物：本明細書での用法では、「原核生物」という用語は、モネラ界（原核生物界とも称される）に属する生物を指す。原核生物は、一般にそれらの単細胞機構と、出芽または分裂による無性生殖と、膜結合核またはその他の膜結合細胞小器官の欠如と、円形染色体と、オペロンの存在と、イントロン、メッセージキャッピング、およびｐｏｌｙ−Ａ  ｍＲＮＡの非存在と、識別リボソーム構造などのその他の生化学的特徴とによって、真核生物と区別できる。原核生物界は真正細菌および古細菌（時折「アーキバクテリア」と称される）亜界を含む。ラン藻（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ラン藻（ｂｌｕｅ  ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ））およびマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）は、モネラ界の下で時折別々の分類を与えられる。
【００５１】
細菌：本明細書での用法では、「細菌」および「真正細菌」という用語は、古細菌と区別できる原核生物を指す。同様に、古細菌とは、真正細菌と区別できる原核生物を指す。真正細菌および古細菌は、いくつかの形態学的および生化学的判定基準によって区別できる。例えばリボソームＲＮＡ配列の違いと、ＲＮＡポリメラーゼ構造と、イントロンの存在または非存在と、抗生物質感受性と、細胞壁ペプチドグリカンおよびその他の細胞壁構成要素の存在または非存在と、膜脂質の分枝対非分枝構造と、ヒストンおよびヒストン様タンパク質の存在／非存在とが、生物を真正細菌または古細菌に割り振るのに使用される。
【００５２】
真正細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。古細菌の例としては、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｍｊ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）（Ｍｍ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ａｆ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（Ｐｈ）、ピロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）（Ａｐ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、およびサーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）が挙げられる。
【００５３】
保存的変異型：本明細書での用法では、「保存的変異型」という用語は、翻訳構成要素の文脈で、例えば基準Ｏ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳと比較して配列中に変異型を有するＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳなどの、例えば保存的変異型が類似する塩基構成要素に類似した機能を果たす、保存的変異型Ｏ−ｔＲＮＡまたは保存的変異型Ｏ−ＲＳなどの翻訳構成要素を指す。例えばＯ−ＲＳ、またはそのＯ−ＲＳの保存的変異型は、フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸で同族のＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳおよび保存的変異型Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列を有さない。保存的変異型が同族の対応するＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳになおも相補的でありさえすれば（例えば共に機能する）、保存的変異型は、配列中に例えば１個の変異型、２個の変異型、３個の変異型、４個の変異型、または５個以上の変異型を有することができる。
【００５４】
いくつかの実施態様では、保存的変異型Ｏ−ＲＳは、それからそれが誘導されたＯ−ＲＳと比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含んでなる。いくつかの実施態様では、保存的変異型Ｏ−ＲＳは、それからそれが誘導されたＯ−ＲＳと比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含んでなり、さらにＯ−ＲＳ生物学的活性を維持する。例えば保存的変異型Ｏ−ＲＳは、それからそれが誘導された親Ｏ−ＲＳ分子の生物学的活性の少なくとも１０％、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％を維持する。いくつかの好ましい実施態様では、保存的変異型Ｏ−ＲＳは、それからそれが誘導された親Ｏ−ＲＳ分子の生物学的活性の少なくとも５０％を維持する。保存的変異型Ｏ−ＲＳの保存的アミノ酸置換は、アミノ酸結合ポケットをはじめとするＯ−ＲＳのあらゆる領域で生じることができる。
【００５５】
選択または遮断剤：本明細書での用法では、「選択または遮断剤」という用語は、存在する場合、集団から特定の構成要素を選択／スクリーニングできるようにする薬剤を指す。例えば選択または遮断剤は例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチドなどであることができるが、これに限定されるものではない。選択剤は、例えば濃度、強度などによって変動できる。
【００５６】
応答して：本明細書での用法では、「応答して」という用語は、その中で本発明のＯ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、生長するポリペプチド鎖へのｔＲＮＡ結合非天然アミノ酸の組み込みを仲介する過程を指す。
【００５７】
コードする：本明細書での用法では、「コードする」という用語は、それによってポリマー高分子または配列ストリング中の情報が使用され、第１の分子または配列ストリングとは異なる第２の分子または配列ストリング生成が指示されるあらゆる過程を指す。本明細書での用法では、用語は広範に使用されて多様な用途を有することができる。いくつかの態様では「コードする」という用語は、ＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼによって新たに合成される相補的姉妹鎖をコードするためのテンプレートとして、二本鎖ＤＮＡ分子の１本の鎖が使用される半保存的ＤＮＡ複製過程について述べる。
【００５８】
別の態様では「コードする」という用語は、それによって１個の分子中の情報が使用され、第１の分子とは異なる化学的性質を有する第２の分子の生成が指示されるあらゆる過程を指す。例えばＤＮＡ分子は、（例えばＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ酵素を組み込む転写過程によって）ＲＮＡ分子をコードできる。またＲＮＡ分子は、翻訳過程におけるようにポリペプチドをコードできる。翻訳過程について述べるのに使用する場合、「コードする」という用語はまた、アミノ酸をコードするトリプレットコドンにも及ぶ。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼを組み込む逆転写過程によって、ＤＮＡ分子をコードできる。別の態様ではＤＮＡ分子はポリペプチドをコードでき、その場合の用法では、「コードする」とは転写および翻訳過程の双方を取り込むものと理解される。
【００５９】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（構造１）の化学構造、ならびにフェニルセレノシステインから誘導できる構造を提供する。これらの構造としては、デヒドロアラニン（２）、パルミトイルシステイン（３）、ファルネシルシステイン（４）、Ｓ−ヘキサデシルシステイン（５）、およびγ−カルボキシグルタミン酸（６）が挙げられる。
【００６０】
〔図２〕本発明で有用な様々なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明は、２０個の天然アミノ酸によって制限される翻訳系を使用することの固有の制限の解決法を提供する。解決法は、直交性翻訳系を使用した、タンパク質中への非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（図１の構造１）のプログラムされた部位特異的生合成的組み込みに関する、組成物および方法を含む。タンパク質中へのフェニルセレノシステインの組み込みは、生長するポリペプチド鎖への非天然アミノ酸の組み込みをシグナルするセレクターコドンを含むように、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを操作することで、あらゆる所望の位置に生じるようプログラムできる。
【００６２】
本発明は、適切な同族抑制因子Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば配列番号１のＯ−ｔＲＮＡ）にフェニルセレノシステインを負荷する能力を有する、新規なアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む新規な組成物を提供する。これらのＯ−ＲＳは、細菌宿主細胞中で、Ｏ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸フェニルセレノシステインを選択的に負荷する、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼの新規な突然変異体である。最も好ましくは、直交性構成要素は、宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）の翻訳機構の内在性宿主構成要素と交差反応しない。
【００６３】
本発明のＯ−ＲＳとしては、配列番号４、６または８のＯ−ＲＳが挙げられる。本発明はまた、これらのＯ−ＲＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本開示はまた、セレクターコドンに応答して、フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸を部位特異的に組み込む、真正細菌中で機能する新規なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の発生方法について述べる。
【００６４】
本発明はまた、セレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン、ＴＡＧ）に応答する、（好ましくは生体内）タンパク質へのフェニルセレノシステイン（図１の構造１）の高度に効率的かつ部位特異的な遺伝的組み込み方法も提供する。これらの新規な方法および組成物は、例えば細菌宿主系内で使用できる。
【００６５】
場合によっては、フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸は、次に本開示で述べられるように、ポリペプチド中へのその組み込み後に、特異的かつ位置選択的に変性できる。フェニルセレン含有基の反応化学特性のために、非天然アミノ酸がその中に組み込まれたタンパク質は極めて高選択性に変性できる。場合によっては、フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸反応性基は、生体内系に完全に異質であることにより反応選択性を改善する利点を有する。いくつかの態様では、変性反応は、生体外および生体内の双方でタンパク質が関与する抱合反応ができるようにし、宿主細胞生存度および／またはタンパク質の生物学的活性を保つ、比較的穏やかな反応条件を使用して行うことができる。
【００６６】
いくつかの態様では、組み込まれたフェニルセレノシステイン部分は変性され、次にその変性生成物は、例えば抱合反応によって再度変性される。
【００６７】
最終的にタンパク質中の選択された位置（タンパク質をコードする読み取り枠中のセレクターコドンに対応する）で抱合する材料の性質は、特に限定されず、例えば脂質、染料、フルオロフォア、架橋剤、糖類誘導体、ポリマー（例えばポリエチレングリコール誘導体）、光架橋剤、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチン誘導体、樹脂、ビーズ、第２（またはそれ以上）のタンパク質またはポリペプチド、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど）、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物などのあらゆる所望の実体であることができる。
【００６８】
いくつかの態様では、本発明を実証するために、本明細書の開示は、例えばミオグロビン、ヒト成長ホルモン、およびＧＦＰなどのモデルタンパク質中に組み込まれたフェニルセレノシステイン非天然アミノ酸部分について述べる（しかし限定はされない）。フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸の組み込みをいかなる特定のタンパク質に限定することも意図されない。フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸のいかなる所望の関心あるタンパク質への組み込みも、本開示の指針を使用して達成できることは明らかである。１つ以上のフェニルセレノシステイン非天然アミノ酸を（単独で、またはその他の異なる非天然アミノ酸と組み合わせて）含んでなるタンパク質生成は、例えば治療的タンパク質での使用および研究目的などの多様な目的のために有利である。
【００６９】
フェニルセレノシステインの変性
いくつかの態様では、本発明は、ポリペプチドへの組み込みに続く、フェニルセレノシステインアミノ酸残基の変性方法を提供する。例えばこのような１つの変性である酸化的開裂は、フェニルセレノシステインアミノ酸残基をα，β−不飽和アミノ酸デヒドロアラニン（図１の構造２参照）に有益に変換できる。このデヒドロアラニン非天然アミノ酸もまた、反応性であり引き続いて変性できる。
【００７０】
本発明をフェニルセレノシステインからデヒドロアラニンへの変換のいかなる特定の機序（例えば酸化的脱離）または特異的反応条件（例えば過酸化水素への曝露）に限定することも意図されない。当業者は、フェニルセレノシステイン残基からデヒドロアラニンへの変換のために本発明で同様に役立つ、多様な適切な代案の機序および反応条件を認識するであろう。
【００７１】
デヒドロアラニンの変性
いくつかの態様では、本発明は、ポリペプチド中のデヒドロアラニン非天然アミノ酸残基のさらなる変性方法を提供する。デヒドロアラニン残基は反応性であり、高度に特異的な変性反応中で標的にすることができる。これらの方法は、脂質抱合体を形成し、脂質付加タンパク質を生成するのに特に有用である。
【００７２】
本明細書に記載されるように非天然アミノ酸デヒドロアラニンのマイケル付加反応は、プログラムされた部位特異的翻訳後変性を有するタンパク質をもたらす。例えばデヒドロアラニンとチオ−脂質との反応は、脂質付加タンパク質を生じることができる。例えばチオパルミチン酸との反応はパルミトイルシステイン（図１の構造３参照）をもたらし、ファルネシルメルカプタンとの反応はファルネシルシステイン（図１の構造４参照）を生じ、マロネートとの反応はγ−カルボキシグルタミン酸（図１の構造６参照）を生じる。さらに１−ヘキサデカンチオールとの反応はＳ−ヘキサデシルシステインをもたらす（図１の構造５参照）。
【００７３】
本明細書はこれらの例を提供するが、本発明をデヒドロアラニン変性（抱合）においていかなる特定の機序（例えばマイケル付加経路）、または特異的試薬（チオ−脂質）に限定することも意図されない。当業者は、デヒドロアラニン残基の変性のために、本発明で同様に役立つ、多様な適切な代案の機序、反応条件、および試薬を認識するであろう。実際、デヒドロアラニン残基の変性は脂質抱合に限定されず、この抱合機序を使用して、デヒドロアラニンの部位であらゆる所望の部分をポリペプチドに抱合できる。
【００７４】
直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ技術
本発明の新規な組成物および方法の理解は、直交性ｔＲＮＡおよび直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対と関連付けられている活性の理解を必要とする。追加的非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するために、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼおよび適切なｔＲＮＡを含んでなる新しい直交対が必要であり、それは宿主翻訳機構内で効率的に機能できるが、問題の翻訳系に対して「直交性」であり、すなわち翻訳系に内在性のシンセターゼおよびｔＲＮＡとは独立して機能する。直交対の所望の特徴としては、例えばいかなる内在性ｔＲＮＡによっても解読されないセレクターコドンなどの特異的コドンのみを解読するかまたはそれを認識するｔＲＮＡ、および１つの特異的非天然アミノ酸のみがあるその同族のｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する（または「負荷する」）アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡはまた、内在性シンセターゼによって典型的にアミノアシル化されない（または不十分にアミノアシル化、すなわち負荷される）。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主系内では、直交対は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に４０個ある内在性ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に２１個ある内在性シンセターゼのいずれによってもアミノアシル化されない直交性ｔＲＮＡとを含む。
【００７５】
１つ以上の非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を作成するのに適した直交性翻訳系の一般原理は当該技術分野で知られており、直交性翻訳系を生成する一般方法についても同様である。例えば「直交性ｔＲＮＡ−アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対を生成するための方法および組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＹＬ−  ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」と題された国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、「真核生物の遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／０１９４１５号パンフレット、２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／００７８７０号パンフレット、２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／００７６２４号パンフレット、および２００５年１０月２７日に出願された「非天然アミノ酸の生体内組み込みのための直交性翻訳構成要素（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００６／１１０１８２号パンフレットを参照されたい。これらの各公報は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。非天然アミノ酸を組み込む直交性翻訳系、およびそれらの生成方法と使用に関する考察については、その内容全体を参照によってそれぞれ援用する、ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４〜６６頁（２００５年）；シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（３）：２２７〜２３８頁（２００５年）；シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝レパートリーへのアミノ酸の追加（Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（６）：５４８〜５５４頁（２００５年）；ワン（Ｗａｎｇ）ら「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５〜２４９頁（２００６年）；およびリュー（Ｒｙｕ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるタンパク質への非天然アミノ酸の率的な組み込み（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  ��ｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（４）：２６３〜２６５頁（２００６年）もまた参照されたい。
【００７６】
直交性翻訳系
直交性翻訳系は、一般に直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、および非天然アミノ酸を含む細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの原核生物細胞であることができる）を含んでなり、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対は、例えば抑制因子ｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡなどの、Ｏ−ｔＲＮＡと同族のＯ−ＲＳとを含む。本発明の直交系は、宿主細胞の文脈でまたは宿主細胞なしで、典型的にＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含んでなることができる。複数構成要素系に加えて、本発明はまた、例えば新規な直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチド（例えば配列番号４、６または８）、およびそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号５、７または９）などの新規な個々の構成要素も提供する。
【００７７】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷する場合、直交対はセレクターコドンを「抑制する」と言われる。すなわち翻訳系の（例えば細胞の）内在性機構によって認識されないセレクターコドンは通常負荷されず、さもなければ核酸から翻訳されるポリペプチドの生成の遮断をもたらす。直交対系では、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを特異的非天然アミノ酸でアミノアシル化する。負荷されたＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識して、セレクターコドンによって引き起こされる翻訳遮断を抑制する。
【００７８】
いくつかの態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して、同族のシンセターゼの存在下で、本明細書の配列一覧に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるまたはそれによってコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑制効率と比較して、少なくとも例えば４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％以上程度の抑制効率を含む。
【００７９】
いくつかの実施態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを合わせた抑制効率は、Ｏ−ＲＳを欠くＯ−ｔＲＮＡの抑制効率よりも例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍以上程度大きい。いくつかの態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを合わせた抑制効率は、本明細書の配列一覧に記載の直交性シンセターゼ対の抑制効率の少なくとも、例えば３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％以上程度である。
【００８０】
宿主細胞はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用して、例えば対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を通じて、非天然アミノ酸を生長するポリペプチド鎖に組み込み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。特定の好ましい態様では、細胞は１つ以上の追加的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、追加的Ｏ−ｔＲＮＡは、追加的Ｏ−ＲＳによって異なる非天然アミノ酸を負荷される。例えばＯ−ｔＲＮＡの１つが四塩基コドンを認識でき、その他のＯ−ｔＲＮＡは停止コドンを認識できる。あるいは、複数の異なる停止コドンまたは複数の異なる四塩基コドンが、同一コーディング核酸内で使用できる。
【００８１】
言及されたように、いくつかの実施態様では、細胞またはその他の翻訳系中に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が存在し、それは１つを超える非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みができるようにする。例えば細胞は、追加的な異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および第２の非天然アミノ酸をさらに含むことができ、この追加的Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この追加的Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡが例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は、第２の直交対をさらに含んでなることができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは、例えばオパールコドン、四塩基コドンなどの異なるセレクターコドンを認識する。望ましくは、異なる直交対は異なる起源に由来し、それは異なるセレクターコドンの認識を容易にできる。
【００８２】
特定の実施態様では、系は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの細胞を含んでなり、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。翻訳系はまた、例えば本明細書に記載されるようなＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および非天然アミノ酸と組み合わさった、多様な市販される「生体外」転写／翻訳系のいずれかなどの無細胞系であることができる。
【００８３】
Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは天然であることができ、または例えば多様な生物のいずれかからｔＲＮＡのライブラリーおよび／またはＲＳのライブラリーを発生させることで、および／または多様な利用できる突然変異ストラテジーのいずれかを使用することで、例えば天然のｔＲＮＡおよび／またはＲＳの突然変異によって得られる。例えば直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対を生成する１つのストラテジーは、例えば宿主細胞以外の起源、または複数の起源から、（宿主細胞にとって）異種のｔＲＮＡ／シンセターゼ対を宿主細胞に移入することを伴う。異種のシンセターゼ候補の特性としては、例えばそれがいかなる宿主細胞ｔＲＮＡも負荷しないことが挙げられ、異種のｔＲＮＡ候補の特性としては、例えばそれがいかなる宿主細胞シンセターゼによってもアミノアシル化されないことが挙げられる。さらに異種のｔＲＮＡは、全ての宿主細胞シンセターゼに対して直交性である。直交性対を発生させる第２のストラテジーは、それからＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳをスクリーンおよび／または選択する突然変異体ライブラリーを発生させることを伴う。これらのストラテジーはまた、組み合わせることもできる。
【００８４】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
本発明の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は、望ましくは例えば生体内または生体外でＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質への非天然アミノ酸の組み込みを仲介する。特定の実施態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンに応答して、同族のシンセターゼの存在下で、本明細書の配列一覧のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるまたはそれによってコードされるＯ−ｔＲＮＡと比較して、少なくとも例えば４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％以上程度の抑制効率を含む。
【００８５】
抑制効率は、当該技術分野で知られているいくつかのアッセイのいずれかによって判定できる。例えばβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用でき、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含んでなるプラスミドと共に、誘導体化ｌａｃＺプラスミド（コンストラクトがｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンを有する）を適切な生物（例えば直交性構成要素が使用できる生物）からの細胞に導入する。同族のシンセターゼもまた、導入できる（発現すると同族のシンセターゼをコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかとして）。細胞を培地中で、例えば約０．５のＯＤ６００などの所望の密度に生育させ、例えばノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのベータフルオー（ＢｅｔａＦｌｕｏｒ）（商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキットを使用して、β−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。％抑制は、例えばコンストラクトが、セレクターコドンでなく対応するセンスコドンを所望の位置に有する、誘導体化ｌａｃＺコンストラクトから観察された値などの比較できる対照に対する、サンプル活性の百分率として計算できる。
【００８６】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例は本明細書の配列一覧に記載され、例えば図２および配列番号１を参照されたい。本明細書開示はまた、追加的な等価Ｏ−ｔＲＮＡ種の設計のための指針も提供する。Ｏ−ＲＳｍＲＮＡまたはＯ−ｔＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子中では、所与の配列（またはコーディングＤＮＡについては逆もまた同様）、またはその相補体と比較して、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）によって置換される。塩基に対する追加的変性もまた存在でき、ほぼ機能的に同等の分子を発生させる。
【００８７】
本発明はまた、本明細書の特定のＯ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存的変異型も包含する。例えばＯ−ｔＲＮＡの保存的変異型は、例えば本明細書の配列一覧のような特定のＯ−ｔＲＮＡのように機能し、適切な自己−相補性によってｔＲＮＡのＬ−型構造を保持するが、例えば配列一覧または図２のものと同一の配列を有さず、望ましくは野性型ｔＲＮＡ分子以外である分子を含む。
【００８８】
Ｏ−ｔＲＮＡを含んでなる組成物は、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。特定の実施態様では、Ｏ−ｔＲＮＡをはじめとする組成物は、（例えば生体外または生体内）翻訳系をさらに含むことができる。対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸もまた、細胞中に存在することができ、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドン、またはこれらの１つ以上の組み合わせを含んでなる。
【００８９】
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生成する方法もまた、本発明の特徴である。方法によって生成されるＯ−ｔＲＮＡもまた、本発明の特徴である。本発明の特定の実施態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作り出すことで生成できる。突然変異ｔＲＮＡのライブラリーは、当該技術分野で知られている様々な変異誘発技術を使用して作り出せる。例えば突然変異ｔＲＮＡは、例えば配列番号１のＯ−ｔＲＮＡの部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同的組換え、ＤＮＡシャフリングまたはその他の再帰的変異誘発法、キメラ構築またはその任意の組み合わせによって作り出せる。
【００９０】
追加的突然変異は、例えばアンチコドンループ、アクセプターステム、Ｄアームまたはループ、可変ループ、ＴＰＣアームまたはループ、ｔＲＮＡ分子のその他の領域、またはその組み合わせなどのｔＲＮＡの所望のループまたは領域内の例えば非保存的位置、または保存的位置、無作為化位置、または双方の組み合わせなどの特異的位置に導入できる。典型的にｔＲＮＡ中の突然変異は、突然変異ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを変異させて、セレクターコドンの認識を可能にするステップを含む。方法は、Ｏ−ｔＲＮＡに追加的配列を付加するステップをさらに含むことができる。典型的にＯ−ｔＲＮＡは、所望のＲＳに対するその親和性を保ちながら、例えば複数のｔＲＮＡ配列などの出発原料と比較して、所望の生物のための直交性の改善を有する。
【００９１】
方法は、場合により、ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ配列の類似性（および／または推測される相同性）を分析して、特定生物に対して直交性であるように見えるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳおよび／またはその対のための可能な候補を判定するステップを含む。当該技術分野で知られており、本明細書に記載されるコンピュータプログラムが分析のために使用でき、例えばＢＬＡＳＴおよびＰｉｌｅＵｐプログラムが使用できる。一例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で使用される可能な直交性翻訳構成要素を選択するために、真正細菌生物に近い配列類似性を示さない、シンセターゼおよび／またはｔＲＮＡが選択される。
【００９２】
典型的に、例えば複数の可能なＯ−ｔＲＮＡのメンバーを含んでなる第１の種の細胞集団に、負の選択を施すことによってＯ−ｔＲＮＡが得られる。負の選択は、細胞に内在性のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化された、可能なＯ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含んでなる細胞を排除する。これは第１の種の細胞に直交性であるｔＲＮＡのプールを提供する。
【００９３】
特定の実施態様では、負の選択において、例えばβ−ラクタマーゼなどの抗生物質抵抗性を与える酵素と、例えばβ−ガラクトシダーゼやクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）などの検出可能生成物を与える酵素と、例えばバーナーゼなどの毒性産物などの負の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドに、非必須位置などでセレクターコドンが導入される（例えば機能性バーナーゼをなおも生成する）。スクリーニング／選択は、場合により、選択的因子（例えばアンピシリンなどの抗生物質）存在下で、細胞集団を生育させて行われる。一実施態様では、選択因子の濃度は変動する。
【００９４】
例えば抑制因子ｔＲＮＡの活性を測定するために、例えばナンセンス（例えば停止）などのセレクターコドンの生体内抑制、または例えばβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子などの負の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドに導入されたフレームシフト突然変異に基く選択系を使用する。例えば特定の位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンがある、例えばｂｌａ変異型などのポリヌクレオチド変異型が構築される。例えば細菌などの細胞が、これらのポリヌクレオチドで形質転換される。内在性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シンセターゼによって効率的に負荷することができない直交性ｔＲＮＡの場合、例えばアンピシリン抵抗性などの抗生物質抵抗性は、プラスミドなしで形質転換された細菌と同程度かより低い。ｔＲＮＡが直交性でない場合、またはｔＲＮＡを負荷できる異種のシンセターゼが系内で同時発現する場合、例えばアンピシリンなどの抗生物質に対するより高レベルの抵抗性が観察される。プラスミドなしで形質転換された細胞とほぼ等しい抗生物質濃度のＬＢ寒天プレート上で生育できない、例えば細菌などの細胞が選択される。
【００９５】
毒性産物（例えばリボヌクレアーゼまたはバーナーゼ）の場合、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの宿主の内在性シンセターゼによって複数の可能なｔＲＮＡのメンバーがアミノアシル化されると（すなわちそれは例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの宿主シンセターゼと直交性でない）、セレクターコドンが抑制されて毒性ポリヌクレオチド産物が生成され、細胞死を導く。直交性ｔＲＮＡまたは非機能性ｔＲＮＡを宿す細胞は生存する。
【００９６】
一実施態様では、次に所望の生物に直交性のｔＲＮＡのプールに正の選択を施し、例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子などの薬剤抵抗性遺伝子によってコードされるセレクターコドンを正の選択マーカー中に入れる。細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするかまたはそれを含んでなるポリヌクレオチド、正の選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、および同族のＲＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなる細胞に正の選択を実施する。特定の実施態様では、第２の細胞集団は、負の選択によって排除されなかった細胞を含んでなる。ポリヌクレオチドを細胞中で発現させ、細胞を例えばアンピシリンなどの選択剤存在下で生育させる。次に同時発現した同族のシンセターゼによってアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入するそれらの能力について、ｔＲＮＡを選択する。典型的に、非機能性ｔＲＮＡ、または対象とするシンセターゼによって効率的に認識されることができないｔＲＮＡを宿す細胞と比較して、これらの細胞は抑制効率の増強を示す。非機能性ｔＲＮＡまたは対象とするシンセターゼによって効率的に認識されないｔＲＮＡを宿す細胞は、抗生物質に感応性である。したがって（ｉ）例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの宿主内在性シンセターゼの基質でなく、（ｉｉ）対象とするシンセターゼによってアミノアシル化されることができ、（ｉｉｉ）翻訳において機能性であるｔＲＮＡは、双方の選択を乗り切る。
【００９７】
したがって同一マーカーが、その中でそれがスクリーンされる文脈次第で、正または負のマーカーのどちらかであることができる。すなわちそれを求めてスクリーンされればマーカーは正のマーカーであるが、それを排除するのにスクリーンされれば負のマーカーである。
【００９８】
上述の方法において、例えば正の選択、負の選択、または正および負の選択の双方などの選択のストリンジェンシーは、場合により変動する選択のストリンジェンシー含む。例えばバーナーゼは極めて有毒なタンパク質であるので、負の選択のストリンジェンシーは、異なる数のセレクターコドンをバーナーゼ遺伝子に導入することで、および／または誘導性プロモーターを使用することで制御できる。別の例では、選択または遮断剤の濃度は変動する（例えばアンピシリン濃度）。本発明のいくつかの態様では、初期段階では所望の活性が低くあることができるので、ストリンジェンシーは変動する。したがって選択初期段階ではより低いストリンジェンシーの選択判定基準が適用され、より後期の段階ではよりストリンジェントな判定基準が適用される。特定の実施態様では、負の選択、正の選択、または負および正の選択の双方を複数回繰り返すことができる。複数の異なる負の選択マーカー、正の選択マーカー、または負および正の選択マーカーの双方を使用できる。特定の実施態様では、正および負の選択マーカーが同一であることができる。
【００９９】
本発明において、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する、例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、およびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対などの直交性翻訳構成要素を生成するために、その他のタイプの選択／スクリーニングが使用できる。例えば負の選択マーカー、正の選択マーカー、または正および負の選択マーカーの双方は、適切な反応物質存在下で、蛍光を発するかまたはルミネセンス反応を触媒するマーカーを含むことができる。別の実施態様では、マーカーの生成物は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはルミネセンスによって検出される。場合により、マーカーは親和性ベースのスクリーニングマーカーを含む。フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），Ｊ．Ａ．ら（１９９３年）「外面に機能性抗体断片を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の生成および蛍光活性化細胞選別（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０４４４〜８頁もまた参照されたい。
【０１００】
組み換え直交性ｔＲＮＡを生成する追加的方法は、例えば「直交性ｔＲＮＡ−アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対を生成するための方法および組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−  ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」と題された国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、および２００４年７月７日に出願された国際公開第２００５／０１９４１５号パンフレットにある。フォルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）ら（２００３年）「新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）に設計された遺伝コードの翻訳によるペプチド模倣シンセターゼのプログラム（Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ）」ＰＮＡＳ，１００（１１）：６３５３〜６３５７頁、およびフォン（Ｆｅｎｇ）ら（２００３年）「単一アミノ酸変化によるｔＲＮＡシンセターゼのｔＲＮＡ認識の拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ）」ＰＮＡＳ，１００（１０）：５６７６〜５６８１頁もまた参照されたい。
【０１０１】
直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明のＯ−ＲＳは、生体外または生体内でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳは、Ｏ−ＲＳを含むポリペプチドによって、および／またはＯ−ＲＳまたはその一部をコードするポリヌクレオチドによって、例えば細胞などの翻訳系に提供できる。例えばＯ−ＲＳの例は、配列番号４、６または８で記載されるアミノ酸配列、またはその保存的変異型を含んでなる。別の例では、Ｏ−ＲＳまたはその一部は、本明細書の配列一覧または実施例中の配列を含んでなるアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。例えば配列番号５、７または９のポリヌクレオチドを参照されたい。
【０１０２】
Ｏ−ｔＲＮＡと共に使用するための、例えばＯ−ＲＳなどの直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を同定する方法もまた、本発明の特徴である。例えば方法は、第１の種の細胞集団に、例えば正の選択などの選択を施すステップを含み、細胞は、１）複数のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは、突然変異ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、または突然変異ＲＳおよび第１の種以外の種に由来するＲＳの双方を含むことができる）、２）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（例えば１つ以上の種からの）、および３）（例えば正の）選択マーカーをコードして少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチドを個々に含んでなる。細胞は、複数のＲＳのメンバーが欠けているまたはその量が低下している細胞と比較して、抑制効率の増強を示すものについて選択され、またはスクリーンされる。抑制効率は、当該技術分野で知られている技術によって、本明細書に記載されるようにして測定できる。抑制効率の増強を有する細胞は、Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含んでなる。第１の種からの第１の組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（生体外または生体内）アミノアシル化レベルが、第２の種からの第２の組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（生体外または生体内）アミノアシル化レベルと比較される。アミノアシル化レベルは、検出可能な物質（例えば標識された非天然アミノ酸）によって判定できる。第１の組のｔＲＮＡと比較して、第２の組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳが典型的に選択され、それによってＯ−ｔＲＮＡと共に使用するための効率的な（最適化された）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを提供する。方法によって同定されたＯ−ＲＳもまた、本発明の特徴である。
【０１０３】
いくつかのアッセイのいずれかを使用して、アミノアシル化を判定できる。これらのアッセイは、生体外または生体内で実施できる。例えば生体外アミノアシル化アッセイについては、例えばホーベン（Ｈｏｂｅｎ）およびソル（Ｓｏｌｌ）（１９８５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１３：５５〜５９頁で述べられる。アミノアシル化はまた、直交性翻訳構成要素と一緒にレポーターを使用して、タンパク質をコードする少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチドを発現する細胞中のレポーターを検出することで、判定できる。「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、および「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレットもまた参照されたい。
【０１０４】
同定されたＯ−ＲＳをさらに操作して、一般的な２０個のアミノ酸のいずれでもなく、所望の非天然アミノ酸のみがＯ−ｔＲＮＡに負荷されるように、シンセターゼの基質特異性を変更できる。非天然アミノ酸に対する基質特異性がある直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを発生させる方法は、シンセターゼの異なる領域などを組み合わせることで、例えばシンセターゼ中の活性部位で、シンセターゼ中の編集機序部位で、異なる部位で、シンセターゼを変異させるステップと、選択過程を適用するステップを含む。正の選択と、それに続く負の選択の組み合わせに基づいたストラテジーが使用される。正の選択において、正のマーカーの非必須位置に導入されたセレクターコドンの抑制は、細胞が正の選択圧力下で生存できるようにする。したがって天然および非天然アミノ酸双方の存在下で、生存細胞は直交性抑制因子ｔＲＮＡに天然または非天然アミノ酸のどちらかを負荷する、活性シンセターゼをコードする。負の選択において、負マーカーの非必須位置に導入されたセレクターコドンの抑制は、天然アミノ酸特異性があるシンセターゼを除去する。負および正の選択の生存細胞は、直交性抑制因子ｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）する、シンセターゼをコードする。次にこれらのシンセターゼに、例えばＤＮＡシャフリングまたはその他の再帰的変異誘発方法などのさらなる変異誘発を施すことができる。
【０１０５】
突然変異Ｏ−ＲＳのライブラリーは、当該技術分野で知られている様々な変異誘発技術を使用して作り出せる。例えば突然変異ＲＳは、部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同的組換え、ＤＮＡシャフリングまたはその他の再帰的変異誘発方法、キメラ構築またはその任意の組み合わせによって作り出すことができる。例えば突然変異ＲＳのライブラリーは、例えばより小さく多様性の少ない、２つ以上のその他の「下位ライブラリー」などから作ることができる。ＲＳのキメラライブラリーもまた、本発明に含まれる。自然多様性を含んでなるライブラリーなどの様々な生物（例えば真正細菌または古細菌などの微生物）からのｔＲＮＡシンセターゼのライブラリー（例えばショート（Ｓｈｏｒｔ）らに付与された米国特許第６，２３８，８８４号明細書、シャレンバーガー（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）らに付与された米国特許第５，７５６，３１６号明細書、ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）らに付与された米国特許第５，７８３，４３１号明細書、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）らに付与された米国特許第５，８２４，４８５号明細書、ショート（Ｓｈｏｒｔ）らに付与された米国特許第５，９５８，６７２号明細書を参照されたい）が場合により構築され、直交対についてスクリーンされることに留意すべきである。
【０１０６】
シンセターゼに正および負の選択／スクリーニングストラテジーを施したら、次にこれらのシンセターゼにさらなる変異誘発を施すことができる。例えばＯ−ＲＳをコードする核酸を単離でき、（例えばランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、遺伝子組み換えまたはその任意の組み合わせによる）変異Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドの組を核酸から発生させることができ、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する変異Ｏ−ＲＳが得られるまで、これらの個々のステップまたはこれらのステップの組み合わせを繰り返すことができる。本発明のいくつかの態様では、ステップを例えば少なくとも２回など、複数回実施する。
【０１０７】
本発明の方法において、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、またはその対を生成するために、選択／スクリーニングストリンジェンシーの追加的レベルもまた使用できる。方法の片方または双方のステップで、選択またはスクリーニングストリンジェンシーを変動させてＯ−ＲＳを生成できる。これには、例えば使用される選択／遮断剤量を変動させることなどが含まれる。正および／または負の選択の追加的段階もまた実施できる。選択またはスクリーニングはまた、アミノ酸透過度における１つ以上の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化なども含んでなることができる。典型的に１つ以上の変化は、その中で直交性ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対が使用されてタンパク質が生成される、生物中の１つ以上の遺伝子内の突然変異に基づく。
【０１０８】
Ｏ−ＲＳを生成し、シンセターゼの基質特異性を改変するための追加的一般詳細は、「直交性ｔＲＮＡ−アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対生成のための方法および組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」と題された国際公開第２００２／０８６０７５号パンフレット、および「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレットにある。その内容全体を参照によって援用する、ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４〜６６頁（２００５年）もまた参照されたい。
【０１０９】
起源および宿主生物
本発明の直交性翻訳構成要素（Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳ）は、あらゆるその他の種からの宿主翻訳系内で使用するためのあらゆる生物（または生物の組み合わせ）に由来することができるが、ただしＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ構成要素および宿主系は直交様式で機能する。直交対からのＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳが同一生物に由来することは要件ではない。いくつかの態様では、直交性構成要素は真正細菌宿主系で使用するための古細菌遺伝子（すなわち古細菌）に由来する。
【０１１０】
例えば直交性Ｏ−ｔＲＮＡは、例えばメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）（Ｍｍ）、ピロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）などの古細菌などの古生物、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの真正細菌に由来することができる一方、直交性Ｏ−ＲＳは、例えばメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）およびハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、エアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）、ピロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）などの古細菌、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの真正細菌などの生物または生物の組み合わせに由来することができる。一実施態様では、例えば植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物（例えば哺乳類、昆虫、節足動物など）などの真核生物源もまた、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳ源として使用できる。
【０１１１】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の構成要素は、同一生物または異なる生物に由来することができる。一実施態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物からのものである。代案としては、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳは異なる生物からのものである。
【０１１２】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳまたはＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は、生体内でまたは生体外で選択またはスクリーンでき、および／または例えば真正細菌細胞などの細胞内で使用されて、非天然アミノ酸があるポリペプチドを生成する。使用される真正細菌細胞は限定されず、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などである。本発明の翻訳構成要素を含んでなる真正細菌細胞の組成物もまた、本発明の特徴である。
【０１１３】
１つの種のＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳを別の種で使用するためにスクリーニングすることについては、２００４年４月１６日に出願され「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレットもまた参照されたい。
【０１１４】
（例えばＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および非天然アミノ酸を含んでなる）直交性翻訳系は、培養宿主細胞を利用して非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成できるが、本発明の直交性翻訳系が無傷の生存宿主細胞を必要とすることは意図されない。例えば直交性翻訳系は、細胞抽出物存在下で無細胞系を利用できる。実際、タンパク質生成のための無細胞生体外転写／翻訳系の使用は、十分確立された技術である。本明細書に記載される直交性翻訳系構成要素を使用する非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成するためのこれらの生体外系の応用は、十分本発明の範囲内である。
【０１１５】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝的コドンフレームワークを拡張する。例えばセレクターコドンとしては、例えばユニークな三塩基コドン、例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）またはオパールコドン（ＵＧＡ）などの停止コドンなどのナンセンスコドン、非天然コドン、少なくとも四塩基のコドン、レアコドンなどが挙げられる。いくつかのセレクターコドンが、例えば１つ以上、２つ以上、３つを超えるような所望の遺伝子中に導入できる。例えばこれらの異なるセレクターコドンを使用するなど、異なるセレクターコドンを使用することで、複数の直交性ｔＲＮＡ／シンセターゼ対が使用でき、それは少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組み込みを可能にする。
【０１１６】
一実施態様では、方法は、細胞内の生体内非天然アミノ酸組み込みのために、停止コドンであるセレクターコドンの使用を伴う。例えば停止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳによって非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡが生成する。このＯ−ｔＲＮＡは、宿主の天然アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって認識されない。従来の部位特異的変異誘発を使用して、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の対象とする部位に停止コドンを導入できる。例えばセイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ），Ｊ．Ｒ．，ら（１９８８年）「ホスホロチオエートベースのオリゴヌクレオチドに向けた突然変異誘発における５’，３’エキソヌクレアーゼ（５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７９１〜８０２頁を参照されたい。Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡと対象とするポリペプチドをコードする核酸とを例えば生体内で組み合わせると、停止コドンに応答して非天然アミノ酸が組み込まれ、非天然アミノ酸を規定の位置に含有するポリペプチドが得られる。本発明の一実施態様では、セレクターコドンとして使用される停止コドンは、アンバーコドン（ＵＡＧ）、および／またはオパールコドン（ＵＧＡ）である。一例では、その中でセレクターコドンとしてＵＡＧおよびＵＧＡの双方が使用される遺伝コードは、最も豊富にある終結シグナルのオーカーナンセンスコドン（ＵＡＡ）を保存しながら、２２個のアミノ酸をコードできる。
【０１１７】
生体内での非天然アミノ酸の組み込みは、宿主細胞の顕著な撹乱なしに実施できる。例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの非真核生物細胞では、ＵＡＧコドンの抑制効率は、例えばアンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡなどのＯ−ｔＲＮＡ間の競合、および終結因子１（ＲＦ１）（ＵＡＧコドンに結合してリボソームからの生長ペプチドの放出を開始する）に左右されるので、抑制効率は、例えば抑制因子ｔＲＮＡなどのＯ−ｔＲＮＡの発現レベルの増大、またはＲＦ１欠損株の使用のどちらかによって調節できる。真核生物細胞では、ＵＡＧコドンの抑制効率は、例えばアンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡなどのＯ−ｔＲＮＡ間の競合、および真核生物の終結因子（例えばｅＲＦ）（停止コドンに結合してリボソームからの生長ペプチドの放出を開始する）に左右されるので、抑制効率は、例えば抑制因子ｔＲＮＡなどのＯ−ｔＲＮＡの発現レベルを例えば増大させることで調節できる。さらに例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤などの追加的化合物もまた存在できる。
【０１１８】
非天然アミノ酸はまた、レアコドンによってもコードできる。例えば生体外でタンパク質合成反応中のアルギニン濃度が低下した場合、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａ挿入のために、レアアルギニンコドン（ＡＧＧ）が効率的であることが判明した。例えばマー（Ｍａ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９頁（１９９３年）を参照されたい。この場合、合成ｔＲＮＡは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中の微量な種として存在する天然のｔＲＮＡＡｒｇと競合する。さらにいくつかの生物は、３つ組みコドンの全部は使用しない。生体外転写／翻訳抽出物中のアミノ酸挿入のために、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）中の割り当てられていないコドンＡＧＡが利用されている。例えばコワル（Ｋｏｗａｌ）およびオリバー（Ｏｌｉｖｅｒ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５頁（１９９７年）を参照されたい。本発明の構成要素は、生体内でこれらのレアコドンを使用して発生させることができる。
【０１１９】
セレクターコドンはまた、例えば四、五、六塩基以上のコドンなどの四塩基以上のコドンなどの拡張コドンを含んでなることができる。四塩基コドンの例としては、例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。五塩基コドンの例としては、例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の方法は、フレームシフト抑制に基づいく拡張コドンを使用するステップを含む。四塩基以上のコドンは、例えば１つまたは複数の非天然アミノ酸を同一タンパク質中に挿入できる。別の実施態様では、アンチコドンループが、例えば少なくとも四塩基のコドン、少なくとも五塩基のコドン、または少なくとも六塩基のコドンまたはそれ以上を解読できる。２５６個の可能な四塩基コドンがあるので、四塩基以上のコドンを使用して、同一細胞中で複数の非天然アミノ酸をコードできる。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら（２００２年）「コドンおよびアンチコドンのサイズ限界の探索（Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ）」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７〜２４４頁、およびマグリエリー（Ｍａｇｌｉｅｒｙ）（２００１年）「遺伝コードの拡張：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における四塩基コドンの効率的抑制因子の選択、およびライブラリーアプローチによる『シフティ（Ｓｈｉｆｔｙ）』四塩基コドンの同定（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０７：７５５〜７６９頁もまた参照されたい。
【０１２０】
例えば生体外生合成法を使用して、四塩基コドンが使用されて非天然アミノ酸がタンパク質中に組み込まれている。例えばマー（Ｍａ）ら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９頁、およびホウサカ（Ｈｏｈｓａｋａ）ら（１９９９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４頁を参照されたい。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵを使用して、２つの化学的にアシル化されたフレームシフト抑制因子ｔＲＮＡと共に、生体外で２−ナフチルアラニンおよびリジンのＮＢＤ誘導体がストレプトアビジンに同時に組み込まれた。例えばホウサカ（Ｈｏｈｓａｋａ）ら（１９９９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４頁を参照されたい。生体内研究においてムーア（Ｍｏｏｒｅ）らは、ＮＣＵＡアンチコドンがあるｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ、またはＣであることができる）を抑制する能力を調べ、ＵＣＵＡアンチコドンのあるｔＲＮＡＬｅｕによって、四つ組みＵＡＧＡが１３〜２６％の効率で解読でき、０または−１フレームでは解読がほとんどないことを発見した。ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５頁を参照されたい。一実施態様では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンが発明で使用でき、それはその他の望ましくない部位におけるミスセンス読み過ごし、およびフレームシフト抑制を低下できる。四塩基コドンは多様な直交系で、セレクターコドンとして使用されている。例えば国際公開第２００５／０１９４１５号パンフレット、国際公開第２００５／００７８７０号パンフレット、および国際公開第２００５／０７６２４号パンフレットを参照されたい。その内容全体を参照によって援用する、ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４〜６６頁（２００５年）もまた参照されたい。下の実施例はアンバーセレクターコドンを利用するが、本明細書の実施例を修正して、四塩基Ｏ−ｔＲＮＡと、様々な非天然アミノ酸Ｏ−ＲＳについて前述されたものに類似する突然変異を含むように変性されたシンセターゼとを含めることで、四塩基以上のコドンも同様に使用できる。
【０１２１】
所与の系では、セレクターコドンはまた、天然の三塩基コドンの１つを含むことができ、内在系は天然塩基コドンを使用しない（またはほとんど使用しない）。例えばこれには、天然三塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠く系、および／または三塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０１２２】
セレクターコドンは、場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は、既存の遺伝的アルファベットをさらに拡張する。１つの余分な塩基対は、３つ組コドンの数を６４から１２５に増大させる。第３の塩基対の特性としては、安定したおよび選択的塩基対形成、ポリメラーゼによる高忠実度でのＤＮＡへの効率的な酵素的組み込み、および新生の非天然塩基対合成後の効率的な持続的プライマー延長が挙げられる。方法および組成物のために応用できる非天然塩基対の説明は、例えばヒラオ（Ｈｉｒａｏ）ら（２００２年）「アミノ酸類似体をタンパク質に組み込むための非天然塩基対（Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７〜１８２頁にある。ウー（Ｗｕ），Ｙ．ら（２００２年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１２４：１４６２６〜１４６３０頁もまた参照されたい。その他の関連出版物を下に列挙する。
【０１２３】
生体内での使用のために、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応する三リン酸を形成する。さらに増大した遺伝的情報は安定しており、細胞酵素によって破壊されない。ベンナー（Ｂｅｎｎｅｒ）およびその他による先の努力は、標準ワトソン・クリック対中のものとは異なる水素結合パターンを利用し、特筆すべき例はイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対である。例えばスウィツァー（Ｓｗｉｔｚｅｒ）ら（１９８９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１１１：８３２２頁、およびピッチリーリ（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ）ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３頁、クール（Ｋｏｏｌ）（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｑｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２頁を参照されたい。これらの塩基は、一般に天然塩基とある程度誤対合されて酵素的に複製できない。クール（Ｋｏｏｌ）および共同研究者らは、塩基間の疎水性充填相互作用が、水素結合を置換して塩基対形成を推進できることを実証した。クール（Ｋｏｏｌ）（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２頁、およびガッキアン（Ｇｕｃｋｉａｎ）およびクール（Ｋｏｏｌ）（１９９８年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５頁を参照されたい。上の全ての要件に適合する非天然塩基対を開発する努力において、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、ロメスベルグ（Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ）、および共同研究者らは、一連の非天然疎水性塩基を系統的に合成して研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対より安定しており、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（ＫＦ）によって効率的にＤＮＡに組み込めることが分かった。例えばマクミン（ＭｃＭｉｎｎ）ら（１９９９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６頁、およびオガワ（Ｏｇａｗａ）ら（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４を参照されたい。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に十分な効率および選択性をもってＫＦにより合成でき、例えばオガワ（Ｏｇａｗａ）ら（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３を参照されたい。しかしどちらの塩基もさらなる複製の連鎖停止剤として機能する。ＰＩＣＳ自己対を複製するのに使用できる突然変異ＤＮＡポリメラーゼが最近導き出された。さらに７ＡＩ自己対が複製できる。例えばタエ（Ｔａｅ）ら（２００１年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９頁を参照されたい。Ｃｕ（ＩＩ）に結合すると安定した対を形成する、新規な金属塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙもまた開発されている。メガーズ（Ｍｅｇｇｅｒｓ）ら（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４頁を参照されたい。拡張コドンおよび非天然コドンは天然コドンに対して内因的に直交性であるので、本発明の方法はこの特質を活用してそれらから直交性ｔＲＮＡを生じることができる。
【０１２４】
翻訳バイパス系もまた使用して、非天然アミノ酸を所望のポリペプチドに組み込むことができる。翻訳バイパス系では、大型配列が遺伝子に挿入されるが、タンパク質に翻訳されない。配列はリボソームが配列を跳び越して、挿入下流で翻訳を再開するよう合図する役割を果たす構造を含有する。
【０１２５】
非天然アミノ酸
本明細書での用法では、非天然アミノ酸とは、セレノシステインおよび／またはピロリジンおよび次の２０個の遺伝的にコードされるα−アミノ酸以外の変性されたあらゆるアミノ酸、またはアミノ酸類似体を指す。アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン。α−アミノ酸の一般構造は、式Ｉによって図示される。
【化１】
2009529877.tif 000002
【０１２６】
非天然アミノ酸は、典型的に式Ｉを有するあらゆる構造であり、式中、Ｒ基は２０個の天然アミノ酸で使用されるもの以外のあらゆる置換基である。例えば２０個の天然アミノ酸の構造については、「ストライヤー生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｙ  Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）」第３版，１９８８年，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の非天然アミノ酸は、上の２０個のアミノ酸以外の天然化合物であることができることに留意されたい。
【０１２７】
本発明の非天然アミノ酸は、典型的に天然アミノ酸とは側鎖が異なるので、非天然アミノ酸は、天然タンパク質中で形成するのと同じ様式で、例えば天然または非天然のその他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかし非天然アミノ酸は、それらを天然アミノ酸から区別する側鎖基を有する。
【０１２８】
ここで特に興味深いのは、非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（図１の構造１参照）である。例えば本発明によって提供される直交対と併せて適切な第２のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対を使用して、フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸に加えて、その他の非天然アミノ酸を対象とするポリペプチドに同時に組み込むことができる。このような多数の追加的な非天然アミノ酸および適切な直交対が知られている。本開示、および本明細書で引用される参考文献を参照されたい。その内容全体を参照によってそれぞれ援用する、ワン（Ｗａｎｇ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４〜６６頁（２００５年）；シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝コードの拡張（Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（３）：２２７〜２３８頁（２００５年）；シェ（Ｘｉｅ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）「遺伝レパートリーへのアミノ酸の追加（Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（６）：５４８〜５５４頁（２００５年）；およびワン（Ｗａｎｇ）ら「遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５〜２４９頁（２００６年）もまた参照されたい。
【０１２９】
図１の構造１で示すフェニルセレノシステイン非天然アミノ酸を、本明細書に記載の実施例において主に対象としているが、本発明をその構造に厳密に限定することは意図されない。実際多様な容易に誘導される、構造的に関連した類似体を容易に生成でき、それは図１の構造１に示すフェニルセレノシステインの主要特性を保ち、特異的に本発明のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（例えば配列番号４、６、および８のＯ−ＲＳ）によってもまた認識される。これらの関連アミノ酸類似体は、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１３０】
その他の非天然アミノ酸では、例えば式Ｉ中のＲは、場合により、アルキル−、アリール−、アシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル，エーテル、ホウ酸塩、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミンなど、またはその任意の組み合わせを含んでなる。その他の対象とする非天然アミノ酸としては、光活性化可能架橋剤を含んでなるアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光性アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規な官能基があるアミノ酸、共有結合的にまたは非共有結合的にその他の分子と反応するアミノ酸、光ケージ化および／または光異性化可能アミノ酸、ビオチンまたはビオチン−類似体含有アミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖に付着する糖類部分、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的切断可能または光切断可能アミノ酸、天然アミノ酸と比較して引き伸ばされた側鎖があるアミノ酸（例えばポリエーテルまたは例えば約５を超える、約１０を超える炭素などの長鎖炭化水素）、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および１つ以上の有毒部分を含有するアミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、下の式ＩＶで図示される一般構造を有する非天然アミノ酸を提供する。
【化２】
2009529877.tif 000003
【０１３２】
この構造を有する非天然アミノ酸は、典型的にＲ１が２０個の天然アミノ酸（例えばチロシンまたはフェニルアラニン）の１つで使用される置換基であり、Ｒ２が置換基である、あらゆる構造である。したがってこのタイプの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸誘導体と見なすことができる。
【０１３３】
図１の構造１で示されるフェニルセレノシステイン構造を含有する非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸はまた、場合により、例えば式ＩＩおよびＩＩＩの構造によって図示されるような改変主鎖構造を含んでなることができる。
【化３】
2009529877.tif 000004
式中、Ｚは典型的にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’を含んでなり、同一であるかまたは異なっていることができるＸおよびＹは典型的にＳまたはＯを含んでなり、場合により同一であるかまたは異なっているＲおよびＲ’は典型的に式Ｉを有する非天然アミノ酸に関して上述されたＲ基と同じ構成物一覧ならびに水素から選択される。例えば本発明の非天然アミノ酸は、場合により、式ＩＩおよびＩＩＩによって図示される、アミノまたはカルボキシル基中の置換を含んでなる。このタイプの非天然アミノ酸としては、例えば一般的な２０個の天然アミノ酸に相当する側鎖または非天然側鎖がある、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸α−アミノチオカルボン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにα−炭素における置換は、場合によりＤ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などのＬ、Ｄ、またはα−α−二置換アミノ酸を含む。その他の構造的代案としては、プロリン類似体、ならびに３、４、６、７、８、および９員環プロリン類似体などの環式アミノ酸、置換されたβ−アラニンおよびγ−アミノ酪酸などのβおよびγアミノ酸が挙げられる。
【０１３４】
いくつかの態様では、本発明はＬ−配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし本発明をＬ−配置の非天然アミノ酸の使用に限定することは意図されない。これらの非天然アミノ酸のＤ−鏡像異性体もまた、本発明で有用であることが考察される。
【０１３５】
本発明で有用な非天然アミノ酸は、図１の構造１で示すフェニルセレノシステイン非天然アミノ酸に厳密に限定されない。当業者は、天然のアミノ酸の多種多様な非天然類似体が、容易に誘導されることを認識する。例えばチロシンに由来する非天然物が容易に生成されるが、これに限定されるものではない。チロシン類似体としては、例えばパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、およびメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンは、アルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖または分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などを含んでなる。さらに多重置換アリール環もまた考察される。本発明のグルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環式誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。フェニルアラニン類似体の例としては、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、およびメタ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されるものではなく、置換基は、アルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基、またはケト基などを含んでなる。非天然アミノ酸の特定例としては、フェニルセレノシステイン、スルホチロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアミノ酸、７−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−ｌ−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシンおよびｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されるものではない。またｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３、４、６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンなど。多様な非天然アミノ酸の構造は、本明細書で引用される参考文献において開示される。「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、および２００５年１０月２７日に出願された「非天然アミノ酸の生体内組み込みのための直交性翻訳構成要素（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００６／１１０１８２号パンフレットもまた参照されたい。
【０１３６】
非天然アミノ酸の化学合成
上で提供される非天然アミノ酸の多くは、例えば米国のシグマ（Ｓｉｇｍａ）または米国ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ））から市販される。市販されないものは、場合により、様々な出版物で提供されるように、または当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については、例えばフェッセンデン（Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ）およびフェッセンデン（Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ）「有機化学（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（１９８２年）第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．；マーチ（Ｍａｒｃｈ）「高等有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第３版，１９８５年，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびケアリー（Ｃａｒｅｙ）およびサンドバーグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）「高等有機化学（ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第３版，パートＡおよびＢ，１９９０年，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。非天然アミノ酸合成について述べている追加的な出版物としては、例えば「非天然アミノ酸の生体内組み込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット；マツオカ（Ｍａｔｓｏｕｋａｓ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０〜４６６９頁；キング（Ｋｉｎｇ）およびキッド（Ｋｉｄｄ）（１９４９年）「フチル化中間体からのグルタミンおよびグルタミン酸のγ−ジペプチドの新しい合成（Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５〜３３１９頁；フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）およびチャテジー（Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ）（１９５９年）「抗腫瘍剤のためのモデル基質としてのグルタミン誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ）」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８１，３７５０〜３７５２頁；クレイグ（Ｃｒａｉｇ）ら（１９８８年）「７−クロロ−４［［４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル］アミノ］キノリン（クロロキノン）鏡像異性体の絶対配置（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ））」Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３、１１６７〜１１７０頁；アズレイ（Ａｚｏｕｌａｙ）ら（１９９１年）「可能な抗マラリア剤としてのグルタミン類似体（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６、２０１〜５頁；コスキネン（Ｋｏｓｋｉｎｅｎ）およびラポポート��Ｒａｐｏｐｏｒｔ）（１９８９年）「立体配座制限アミノ酸類似体としての４−置換プロリンの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，１８５９〜１８６６頁；クリスティ（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ）およびラポポート（Ｒａｐｏｐｏｒｔ）（１９８５年）「Ｌ−アスパラギンからの光学的に純粋なピペコラートの合成−アミノ酸脱カルボニル化およびイミニウムイオン環化を通じた（＋）−アポビンカミンの全合成への応用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９年：１８５９〜１８６６頁；バートン（Ｂａｒｔｏｎ）ら（１９８７年）「ラジカル化学合成を使用した新規なα−アミノ酸および誘導体の合成：Ｌ−およびＤ−α−アミノ−アジピン酸、Ｌ−α−アミノピメリン酸、および適切な不飽和誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−  ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４３：４２９７〜４３０８頁；およびスバシンハ（Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ）ら（１９９２年）「キスカル酸類似体：β−複素環式２−アミノプロパン酸誘導体の合成と、新規なキスカル酸感作部位におけるそれらの活性（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５：４６０２〜７頁が挙げられる。２００３年１２月２２日に出願された「タンパク質配列（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」と題された国際公開第２００４／０５８９４６号パンフレットもまた参照されたい。
【０１３７】
非天然アミノ酸の細胞取り込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは、例えばタンパク質への組み込みのために非天然アミノ酸を設計および選択する際に、典型的に考察される１つの問題である。例えばα−アミノ酸の高い負荷密度は、これらの化合物が細胞に透過しにくいことを示唆する。天然アミノ酸は、様々な程度のアミノ酸特異性を示すことが多いタンパク質ベースの輸送系の一群を通じて、細胞内に取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞によって取り込まれるのかを評価する迅速なスクリーンが実行できる。例えば２００３年１２月２２日に出願された「タンパク質配列（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」と題された国際公開第２００４／０５８９４６号パンフレット、およびリュー（Ｌｉｕ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）（１９９９年）「拡張された遺伝コードがある生物の進化に向けた過程（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）」ＰＮＡＳ，９６：４７８０〜４７８５頁中の毒性アッセイを参照されたい。取り込みは様々なアッセイによって容易に分析されるが、細胞取り込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代案は、生合成経路を提供して生体内でアミノ酸を作り出すことである。
【０１３８】
非天然アミノ酸の生合成
多くの生合成経路は、アミノ酸およびその他の化合物の生成のために細胞内に既に存在する。特定の非天然アミノ酸のための生合成方法は、例えば細胞内などの自然界に存在しないかもしれないが、本発明はこのような方法を提供する。例えば場合により新しい酵素を添加することで、または既存の宿主細胞経路を改変することで、非天然アミノ酸のための生合成経路を宿主細胞内で発生させる。追加的な新しい酵素は、場合により天然酵素または人工的に発生させた酵素である。例えばｐ−アミノフェニルアラニン（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットの実施例で提示されるように）の生合成は、その他の生物からの既知の酵素の組み合わせの添加に依存する。これらの酵素のための遺伝子は、遺伝子を含んでなるプラスミドで細胞を形質転換して、細胞内に導入できる。遺伝子は、細胞内で発現されると、所望の化合物を合成する酵素的経路を提供する。場合により添加される酵素タイプの例を下の実施例に提供する。追加的な酵素配列は、例えばジェンバンクにある。人工的に発生させた酵素もまた、場合により同様に細胞内に添加される。この様にして、細胞機構および細胞資源を操作し、非天然アミノ酸を生成する。
【０１３９】
実際、生体外または生体内における非天然アミノ酸の生成のために、生合成経路で使用するための、または既存経路の発生のための、新規な酵素を生成するために、多様な方法のいずれかを使用できる。多くの利用できる酵素およびその他の生合成経路構成要素を発生させる方法を本発明に応用して、非天然アミノ酸を生成できる（または実際、新しい基質特異性または対象とするその他の活性を有するようにシンセターゼを発生させる）。例えば生体外または生体内における非天然アミノ酸生成（または新しいシンセターゼ生成）のために、場合によりＤＮＡシャフリングを使用して、新しい酵素および／またはこのような酵素の経路を開発する。例えばステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）（１９９４年）「ＤＮＡシャフリングによる生体外タンパク質の迅速な進化（Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」Ｎａｔｕｒｅ，３７０（４）：３８９〜３９１頁、およびステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）（１９９４）「ランダム断片化および再構築によるＤＮＡシャフリング：分子進化のための生体外遺伝子組み換え（ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７〜１０７５１頁を参照されたい。関連アプローチは、関連した（例えば相同的な）遺伝子ファミリーをシャッフルして、所望の特徴がある酵素を迅速に発生させる。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の例は、クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）ら（１９９８年）「多様な種からの遺伝子ファミリーのＤＮＡシャフリングは定方向進化を加速する（ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８〜２９１頁にある。新しい酵素（生合成経路構成要素であるかまたはシンセターゼであるかを問わずに）はまた、例えばオスターマイアー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）ら（１９９９年）「ＤＮＡ相同性から独立したハイブリッド酵素のためのコンビナトリアルアプローチ（Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：１２０５頁で述べられるように、「ハイブリッド酵素創出のためのインクリメンタルトランケーション」（「ＩＴＣＨＹ」）として知られているＤＮＡ組み換え手順を使用して発生させることもできる。このアプローチは、１つ以上の生体外または生体内組み換え法の基質の役割を果たす、酵素またはその他の経路変異型のライブラリーを発生させるのにも使用できる。オスターマイアー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）ら（１９９９年）「インクリメンタルトランケーションによるコンビナトリアルタンパク質エンジニアリング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍ���ｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２〜６７頁、およびオスターマイアー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）ら（１９９９年）「新しい生体触媒のエンジニアリングにおけるストラテジーとしてのインクリメンタルトランケーション（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９〜４４頁もまた参照されたい。別のアプローチは、指数的アンサンブル変異誘発を使用して、例えば非天然アミノ酸（または新しいシンセターゼ）を生成するのに関連した生合成反応を触媒する能力について選択される、酵素またはその他の経路変異型のライブラリーを生成する。このアプローチでは、対象とする配列中の残基の小さな群を並行して無作為化し、各変性位置で機能性タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する。本発明に適応して、非天然アミノ酸（または新しいシンセターゼ）生成のための新しい酵素を生成できる手順の例は、デレグレーブ（Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ）およびユーバン（Ｙｏｕｖａｎ）（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：１５４８〜１５５２頁にある。さらに別のアプローチでは、例えばアーキン（Ａｒｋｉｎ）およびユーバン（Ｙｏｕｖａｎ）（１９９２年）「半ランダム変異誘発のためのアミノ酸の特異的サブセットをコードするヌクレオチド混合物の最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：２９７〜３００頁、またはレイダー−オルソン（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ）ら（１９９１年）「オリゴヌクレオチドカセットを使用したタンパク質配列のランダム変異誘発（Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０８：５６４〜８６頁の一般変異誘発方法を使用することで、酵素および／または経路構成要素エンジニアリングのためのドープまたは縮重オリゴヌクレオチを使用した、ランダムまたは半ランダム変異誘発が使用できる。ポリヌクレオチド再構築および部位飽和変異誘発を使用する、「非確率論的」変異誘発と称されることが多いさらに別のアプローチを使用して、酵素および／または経路構成要素を生成でき、それは次に（例えば生体内での非天然アミノ酸生成のために）１つ以上のシンセターゼまたは生合成経路機能を果たす能力についてスクリーンできる。例えばショート（Ｓｈｏｒｔ）に付与された「遺伝的ワクチンおよび酵素の非確率論的産生（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ）」国際公開第００／４６３４４号パンフレットを参照されたい。
【０１４０】
このような突然変異法の代案は、生物の全ゲノムを組み換えて特定の経路機能について得られた子孫を選択することを伴う（「全ゲノムシャフリング」と称されることが多い）。例えばゲノム組み換え、および非天然アミノ酸（またはその中間体）を生成する能力についての生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその他の細胞）の選択によって、このアプローチを本発明に応用できる。例えば細胞内における既存のおよび／または新しい経路発生のために、以下の出版物で教示される方法を経路設計に応用して、生体内で非天然アミノ酸を生成できる。パトナイク（Ｐａｔｎａｉｋ）ら（２００２年）「改善された酸耐性のための乳酸桿菌のゲノムシャフリング（Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７〜７１２頁、およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）「細菌において迅速な表現型改善をもたらすゲノムシャフリング（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）」Ｎａｔｕｒｅ，４１５（６８７２）：６４４〜６４６頁。
【０１４１】
例えば所望の化合物を生成するための生物および代謝経路エンジニアリングのためのその他の技術もまた利用でき、非天然アミノ酸の生成にも応用できる。有用な経路エンジニアリングアプローチを教示する出版物の例としては、ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ）（２００３年）「１，３−プロパンジオールの微生物産生のための代謝エンジニアリング（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４（５）：４５４〜９頁；ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら（２００２年）「バイオテックインディゴの生成および使用の双方を改善する代謝エンジニアリングの応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ）」Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８：１２７〜１３３頁；バンタ（Ｂａｎｔａ）ら（２００２年）「人工代謝経路の最適化：ビタミンＣ生合成で使用するためのコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素補助因子の特異性のエンジニアリング（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０）、６２２６〜３６頁；セリボノバ（Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａ）ら（２００１年）「微生物における新規形質の迅速な発生（Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５頁およびその他多数が挙げられる。
【０１４２】
使用される方法にかかわらず、典型的に本発明の改変生合成経路で生成される非天然アミノ酸は、例えば天然細胞量など、効率的なタンパク質生合成のために十分な濃度であるが、その他の細胞アミノ酸の濃度に顕著に影響したり、または細胞資源を枯渇させたりしない程度に生成される。この様式で生体内において生成される典型的濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。細胞が特異的経路のための所望の酵素を生成するように改変され、非天然アミノ酸が発生すると、生体内選択が場合により使用されて、リボソームタンパク質合成および細胞生育の双方のための非天然アミノ酸の生成がさらに最適化される。
【０１４３】
非天然アミノ酸を組み込むための直交性構成要素
本発明は、例えば生体内で、例えばアンバー停止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドンなどのセレクターコドンに応答して、非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（図１の構造１参照）を生長ポリペプチド鎖内に組み込むための直交性構成要素を生成する組成物および方法を提供する。例えば本発明は、直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、およびその対を提供する。これらの対を使用して、非天然アミノ酸を生長するポリペプチド鎖に組み込むことができる。
【０１４４】
本発明の組成物は、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをフェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する。特定の実施態様では、Ｏ−ＲＳは、配列番号４、６または８を含んでなるアミノ酸配列、およびその保存的変異型を含んでなる。本発明の特定の実施態様では、Ｏ−ＲＳは、Ｏ−ｔＲＮＡをいかなる内在性ｔＲＮＡよりも優先的に特定の非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと同一非天然アミノ酸を負荷された内在性ｔＲＮＡとの比は１：１を超え、より好ましくはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを排他的にまたはほぼ排他的に負荷する。
【０１４５】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は、場合により直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をさらに含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。典型的に本発明のＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンに応答して、同族のシンセターゼ存在下で、本明細書の配列一覧（例えば配列番号１）および実施例に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるまたはそれによってコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑制効率と比較して、少なくとも例えば４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、または９０％以上程度の抑制効率を含む。一実施態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを合わせた抑制効率は、例えばＯ−ＲＳ非存在下のＯ−ｔＲＮＡの抑制効率の５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍以上である。いくつかの態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを合わせた抑制効率は、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来する直交性チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対の抑制効率の少なくとも４５％である。
【０１４６】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は、場合により細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの真正細菌細胞、または酵母細胞などの真核生物細胞）および／または翻訳系を含むことができる。
【０１４７】
翻訳系を含んでなる細胞（例えば真正細菌細胞または酵母細胞）もまた、本発明によって提供され、翻訳系は直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、およびフェニルセレノシステイン非天然アミノ酸を含む。典型的にＯ−ＲＳは、Ｏ−ｔＲＮＡをいかなる内在性ｔＲＮＡよりも優先的に非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を負荷された内在性ｔＲＮＡとの比は１：１を超え、より好ましくはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを排他的にまたはほぼ排他的に負荷する。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。一実施態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列、またはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれによってコードされる。一実施態様では、Ｏ−ＲＳは、配列番号４、６、８または１０で記載されるアミノ酸配列、およびその保存的変異型を含んでなる。
【０１４８】
本発明の細胞は、場合により追加的な異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対および第２の非天然アミノ酸をさらに含んでなり、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは対応するＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のアミノ酸は第１の非天然アミノ酸とは異なる。場合により本発明の細胞は、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含み、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。
【０１４９】
特定の実施態様では、本発明の細胞は、直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸とを含む真正細菌細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など）であり、ポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含んでなる。本発明の特定の実施態様では、Ｏ−ＲＳは、Ｏ−ＲＳがあらゆる内在性ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率を超える効率で、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【０１５０】
本発明の特定の実施態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、本明細書の配列一覧（例えば配列番号１）または実施例中の配列に記載のポリヌクレオチド配列、またはその相補的ポリヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれによってコードされる。本発明の特定の実施態様では、Ｏ−ＲＳは配列一覧記載のアミノ酸配列、またはその保存的変異型を含んでなる。一実施態様では、Ｏ−ＲＳまたはその一部は、本明細書の配列一覧または実施例中の配列に記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的ポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１５１】
本発明のＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳは、多様な生物（例えば真核生物および／または非真核生物）のいずれかに由来することができる。
【０１５２】
ポリヌクレオチドもまた、本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号５、７または９）は、本明細書の配列一覧に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、人工（例えば人造であり、天然でない）ポリヌクレオチドを含み、および／またはそのポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明のポリヌクレオチドはまた、高度にストリンジェントな条件下で、実質的に核酸の全長にわたって上述のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば天然のｔＲＮＡまたは対応するコーディング核酸と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上同一のポリヌクレオチドを含み、（しかし本発明のポリヌクレオチドは、天然ｔＲＮＡまたは対応するコーディング核酸以外のものである）、ｔＲＮＡは例えば四塩基コドンなどのセレクターコドンを認識する。例えば上のいずれかおよび／または上のいずれかの保存的変異型を含んでなるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上の同一の人工ポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１５３】
本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターもまた、本発明の特徴である。例えば本発明のベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクターなどが挙げられる。本発明のベクターを含んでなる細胞もまた、本発明の特徴である。
【０１５４】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の構成要素を生成する方法もまた、本発明の特徴である。これらの方法によって生成される構成要素もまた、本発明の特徴である。例えば細胞（Ｏ−ｔＲＮＡ）に対して直交性の少なくとも１つのｔＲＮＡを生成する方法は、突然変異ｔＲＮＡライブラリーを発生させるステップと、突然変異ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させてセレクターコドンの認識を可能にし、それによって可能なＯ−ｔＲＮＡライブラリーを提供するステップと、第１の種の細胞の第１の集団に負の選択を施すステップとを含み、細胞は可能なＯ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる。負の選択は、細胞に内在性のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される、可能なＯ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含んでなる細胞を排除する。これは第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡのプールを提供し、それによって少なくとも１つのＯ−ｔＲＮＡを提供する。本発明の方法によって生成されるＯ−ｔＲＮＡもまた提供される。
【０１５５】
特定の実施態様では、方法は、第１の種の細胞の第２の集団に正の選択を施すステップをさらに含んでなり、細胞は、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡのプールのメンバー、同族のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、および正の選択マーカーを含んでなる。正の選択を使用して、細胞は、同族のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによってアミノアシル化され、正の選択マーカーの存在下で所望の応答を示すｔＲＮＡのプールのメンバーを含んでなる細胞について選択またはスクリーンされ、それによってＯ−ｔＲＮＡが提供される。特定の実施態様では、細胞の第２の集団は、負の選択によって排除されない細胞を含んでなる。
【０１５６】
Ｏ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を負荷する、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを同定する方法もまた提供される。例えば方法は、第１の種の細胞集団に選択を施すステップを含み、細胞はそれぞれ１）複数のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは、突然変異ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、または突然変異ＲＳおよび第１の種以外の種に由来するＲＳの双方を含むことができる）、２）直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（例えば１つ以上の種からの）、および３）正の選択マーカーをコードして少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる。
【０１５７】
細胞（例えば宿主細胞）は、複数のＲＳのメンバーを欠く、またはその量の少ない細胞と比較して抑制効率の改良を示すものについて、選択またはスクリーンされる。これらの選択／スクリーンされた細胞は、Ｏ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含んでなる。方法によって同定される直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼもまた、本発明の特徴である。
【０１５８】
選択された位置に非天然アミノ酸を有するタンパク質を細胞内（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの真正細菌細胞内、または酵母細胞内）で生成する方法もまた、本発明の特徴である。例えば方法は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、タンパク質をコードする核酸を含んでなる細胞を適切な培地内で生育させるステップと、非天然アミノ酸を提供するステップと、少なくとも１つのセレクターコドンがある核酸の翻訳中に、非天然アミノ酸をタンパク質中の規定の位置に組み込み、それによってタンパク質を生成するステップを含む。細胞は、細胞内で機能してセレクターコドンを認識する直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、およびＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含んでなる。この方法によって生成されるタンパク質もまた、本発明の特徴である。
【０１５９】
本発明はまた、タンパク質をはじめとする組成物も提供し、タンパク質はフェニルセレノシステインを含んでなる。特定の実施態様では、タンパク質は、例えばヒト成長ホルモン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、工業用酵素、またはその一部などの既知のタンパク質と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなる。場合により組成物は、医薬的に許容可能なキャリアを含んでなる。
【０１６０】
核酸およびポリペプチド配列および変異型
本明細書に記載されるように、本発明は、例えばＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、および例えばＯ−ＲＳなどのポリペプチドアミノ酸配列、および前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含んでなる、例えば組成物、系、および方法を提供する。例えばＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳアミノ酸およびヌクレオチド配列などの前記配列の例は、本明細書で開示される（図２参照）。しかし当業者は、本発明が、ここで例えば実施例および配列一覧などで具体的に列挙される配列に、限定されるものではないことを理解するであろう。当業者は、本発明がまた、例えば本明細書で開示されるＯ−ＲＳの保存的変異型をコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドなど、本明細書に記載される機能がある多数の関連配列も提供することを理解するであろう。
【０１６１】
同族のＯ−ｔＲＮＡをフェニルセレノシステインでアミノアシル化できる直交性シンセターゼ種（Ｏ−ＲＳ）の構築および分析については、実施例１で述べられる。この実施例は、非天然アミノ酸フェニルセレノシステインを組み込むことができるＯ−ＲＳ種の構築および分析について述べる。
【０１６２】
本発明は、ポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）と、例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドまたはその一部、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼクローンを単離するのに使用されるオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドとを提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１つ以上のセレクターコドンがある本発明の対象とするタンパク質またはポリペプチドをコードするものが挙げられる。さらに本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号５、７または９に記載のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、およびそのポリヌクレオチド配列に相補的な、またはそれをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号４、６または８を含んでなるＯ−ＲＳアミノ酸配列をコードする、あらゆるポリヌクレオチドも含む。同様に、実質的に核酸の全長にわたり、高度にストリンジェントな条件下で、上で示したポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（そして天然ポリヌクレオチド以外）は、本発明のポリヌクレオチドである。一実施態様では、組成物は、本発明のポリペプチドおよび賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤など）を含む。本発明はまた、本発明のポリペプチドと特異的に免疫反応性である抗体または抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドは、人造および天然でないポリヌクレオチドである。
【０１６３】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば天然ｔＲＮＡと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上の同一の（しかし天然のｔＲＮＡ以外の）人工ポリヌクレオチドも含む。ポリヌクレオチドはまた、例えば天然ｔＲＮＡと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上同一の（しかし１００％同一でない）人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１６４】
特定の実施態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなど）は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。一実施態様では、ベクターは発現ベクターである。別の実施態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１つ以上と作動的に結合するプロモーターを含む。別の実施態様では、細胞は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含んでなる。
【０１６５】
当業者はまた、開示される配列の多数の変異型が本発明に含まれることも理解するであろう。例えば機能的に同一の配列を生じる、開示された配列の保存的変異型は本発明に含まれる。変異型が少なくとも１つの開示された配列とハイブリダイズする、核酸ポリヌクレオチド配列の変異型は、本発明に含まれると見なされる。例えば標準配列比較技術によって判定される、本明細書で開示される配列のユニーク部分配列もまた、本発明に含まれる。
【０１６６】
保存的変異型
遺伝コード縮重のために、「サイレント置換」（すなわちコードされるポリペプチドの改変をもたらさない核酸配列中の置換）は、アミノ酸配列をコードする各核酸配列の暗示される特徴である。同様にアミノ酸配列中の１つまたは限られた数のアミノ酸が、高度に類似した特性がある異なるアミノ酸で置換される「保存的アミノ酸置換」もまた、開示されるコンストラクトに類似性が高いとして容易に同定される。開示される各配列のこのような保存的変異型は、本発明の特徴である。
【０１６７】
特定の核酸配列の「保存的変異型」は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列を指す。当業者は、コードされた配列中で、単一アミノ酸またはわずかな百分率のアミノ酸（典型的に５％未満、より典型的に４％、２％または１％未満）を変性、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加が「保存的に改変された変異型」であり、変性が、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、または化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらすことを認識する。したがって本発明の列挙されたポリペプチド配列の「保存的変異型」は、同じ保存的置換基のアミノ酸による、ポリペプチド配列のアミノ酸の典型的に５％未満、より典型的に２％または１％未満のわずかな百分率の置換を含む。最後に、非機能性配列の添加などの核酸分子のコードされる活性を改変しない配列の添加は、基本の核酸の保存的変異型である。
【０１６８】
機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野で周知であり、１つのアミノ酸残基が同様の化学特性（例えば芳香族側鎖または正に帯電した側鎖）を有する別のアミノ酸残基で置換され、したがってポリペプチド分子の機能特性は実質的に変化しない。下記は類似した化学特性の天然アミノ酸を含有する実例群を記載し、群内の置換は「保存的置換」である。
【表１】
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【０１６９】
核酸ハイブリダイゼーション
比較ハイブリダイゼーションを使用して、本発明の核酸の保存的変異型を含めた本発明の核酸を同定でき、この比較ハイブリダイゼーション法は、本発明の核酸を識別する好ましい方法である。さらに高、超高、および超超高ストリンジェント条件下で、配列番号５、７、９または１１で表される核酸とハイブリダイズする標的核酸は、本発明の特徴である。このような核酸の例としては、特定の核酸配列と比較して、１個または数個のサイレントまたは保存的核酸置換のあるものが挙げられる。
【０１７０】
試験核酸は、完全にマッチする相補的標的の少なくとも５０％の良好さで、すなわちマッチしない標的核酸のいずれかとのハイブリダイゼーションについて観察されたものの少なくとも約５〜１０倍の信号対雑音比で、完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的標的と結合する条件下における、プローブの標的とのハイブリダイゼーションの少なくとも１／２の信号対雑音比で、それがプローブとハイブリダイズすれば、プローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言われる。
【０１７１】
核酸は、それらが典型的に溶液内で会合する場合に「ハイブリダイズする」。核酸は、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなどの多様な十分に特徴づけられた物理化学的な力のためにハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、チジュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３年）「生化学および分子生物学検査手技−核酸プローブとのハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）」の第１部第２章「ハイブリダイゼーション原理の概要および核酸プローブアッセイストラテジー（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙｓ）」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の共同事業、現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（２００４年を通して補遺発行）である、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」にあり、またどちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＥｎｇｌａｎｄのＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓからのヘイムス（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）（１９９５年）「遺伝子プローブ１（Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １）」および「遺伝子プローブ２（Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２）」は、オリゴヌクレオチドをはじめとする、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識、検出、および定量化の詳細を提供する。
【０１７２】
サザンまたはノーザンブロット中のフィルター上に１００個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らを参照されたい；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版，第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１年）。高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を行って、背景プローブシグナルを除去することが多い。低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分の２×ＳＳＣである。一般に特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係のプローブについて観察されたものの５倍（またはそれ以上）の信号対雑音比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示唆する。
【０１７３】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメータの下では異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、チジュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３年）「生化学および分子生物学検査手技−核酸プローブとのハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）」の第１部第２章「ハイブリダイゼーション原理の概要および核酸プローブアッセイストラテジー（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙｓ）」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびどちらもＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＥｎｇｌａｎｄのＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓからのヘイムス（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）（１９９５年）「遺伝子プローブ１（Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １）」および「遺伝子プローブ２（Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２）」にある。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、あらゆる試験核酸について経験的に容易に判定できる。例えばストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を判定するにあたり、選択された判定基準セットが満たされるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を徐々に増大させる（例えば温度上昇、塩濃度低下、洗剤濃度増大および／またはハイブリダイゼーションまたは洗浄中のホルマリンなどの有機溶剤濃度増大によって）。例えば高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件において、プローブが、プローブとマッチしない標的とのハイブリダイゼーションについて観察されたものの少なくとも５倍の信号対雑音比で、完全にマッチする相補的標的と結合するまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を徐々に増大させる。
【０１７４】
「非常にストリンジェントな」条件は、特定のプローブの熱融点（Ｔｍ）と等しくなるように選択される。Ｔｍは、試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である（規定のイオン強度およびｐＨ下で）。本発明の目的では、一般に「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列のＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。
【０１７５】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブと完全にマッチする相補的標的核酸との結合の信号対雑音比が、マッチしない標的核酸のいずれかとのハイブリダイゼーションについて観察されたものの少なくとも１０倍になるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーが増大される条件である。このような条件下において、完全にマッチする相補的標的核酸の少なくとも１／２の信号対雑音比でプローブとハイブリダイズする標的核酸は、超高ストリンジェンシー条件下でプローブに結合すると言われる。
【０１７６】
同様に、なおもより高レベルのストリンジェンシーは、適切なハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を徐々に増大させることで判定できる。例えばプローブと完全にマッチする相補的標的核酸との結合の信号対雑音比が、マッチしない標的核酸のいずれかのハイブリダイゼーションについて観察されたものの少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または５００倍以上になるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーが増大される条件である。このような条件下において、完全にマッチする相補的標的核酸の少なくとも１／２の信号対雑音比でプローブとハイブリダイズする標的核酸は、超超高ストリンジェンシー条件下でプローブに結合すると言われる。
【０１７７】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であればなおも実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードにより許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーが作り出される場合に起きる。
【０１７８】
ユニーク部分配列
いくつかの態様では、本発明は、本明細書で開示されるＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳの配列から選択される、核酸中のユニーク部分配列を含んでなる核酸を提供する。ユニーク部分配列は、あらゆる既知のＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳ核酸配列に相当する核酸と比較してユニークである。アラインメントは、例えばデフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴを使用して実施できる。あらゆるユニーク部分配列が、例えば本発明の核酸または関連核酸を同定するプローブとして有用である。
【０１７９】
同様に、本発明は、本明細書で開示されるＯ−ＲＳの配列から選択される、ポリペプチド中のユニーク部分配列を含んでなるポリペプチドを含む。ここで、ユニーク部分配列は、既知のポリペプチド配列のいずれかに相当するポリペプチドと比較してユニークである。
【０１８０】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、Ｏ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニーク部分配列をコードするユニークなコーディングオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする標的核酸も提供し、ユニーク部分配列は、対照ポリペプチド（例えば突然変異によって、例えば本発明のシンセターゼがそれから誘導される親配列）のいずれかに相当するポリペプチドと比較してユニークである。ユニーク配列は上述したようにして判定される。
【０１８１】
配列比較、アイデンティティ、および相同性
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一」または「％同一性」という用語は、下述する配列比較アルゴリズムの１つ（または当業者が利用できるその他のアルゴリズム）を使用して測定されるように、または目視検査によって、最大一致について比較および整列すると、同一である、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの規定の百分率を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。
【０１８２】
２つの核酸またはポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡまたはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ、またはＯ−ＲＳのアミノ酸配列）の文脈において、「実質的に同一」という語句は、配列比較アルゴリズムを使用して測定されるように、または目視検査によって、最大一致について比較および整列すると、少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。このような「実質的に同一」配列は、典型的に実際の祖先への言及なしに「相同的」と見なされる。好ましくは、長さが少なくとも約５０個の残基の配列領域にわたり、より好ましくは少なくとも約１００個の残基領域にわたり「実質的な同一性」が存在し、最も好ましくは、配列は少なくとも約１５０個の残基にわたり、または比較される２つの配列の全長にわたり実質的に同一である。
【０１８３】
タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらが、天然にまたは人工的に、共通の祖先タンパク質またはタンパク質配列に由来する場合に「相同的」である。同様に核酸および／または核酸配列は、それらが、天然にまたは人工的に、共通の祖先核酸または核酸配列に由来する場合に「相同的」である。例えばあらゆる利用できる変異誘発法によって、あらゆる天然の核酸を変性して１つ以上のセレクターコドンを含めることができる。発現すると、この変異誘発された核酸は１つ以上の非天然アミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする。突然変異過程は当然ながら、さらに１つ以上の標準コドンを改変でき、それによって、得られた突然変異タンパク質中でも１つ以上の標準アミノ酸を変化させる。相同性は一般に、２つ以上の核酸またはタンパク質（またはその配列）間の配列類似性から推論される。相同性を確立するのに有用な正確な配列間類似性百分率は、問題の核酸およびタンパク質によって変動するが、相同性を確立するのに２５％程度に小さい配列類似性が日常的に使用される。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上のより高いレベルの配列類似性もまた使用して、相同性を確立できる。配列類似性百分率を判定する方法（例えばデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）について本明細書に記載され、一般に利用できる。
【０１８４】
配列比較および相同性判定のために、典型的に１つの配列が、それに対して試験配列を比較する参照配列の機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータにインプットして、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列について％配列アイデンティティを計算する。
【０１８５】
比較のための最適配列アラインメントは、例えばスミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ），Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化施行（ウィスコンシン州マディソン５７５サイエンス・ドライブのジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の共同事業、現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（２００４年を通して補遺発行）である、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」参照）によって、行うことができる。
【０１８６】
％配列同一性および配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの一例は、アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年）で述べられるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に入手可能である（ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一長の単語と整列させると一致するか、またはいくつかの正値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷの短い単語を同定することで、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近隣単語スコア閾値と称される（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））。これらの最初の近隣単語ヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見いだすための検索を開始するのためのシードとして機能する。次に累積アラインメントスコアが増大できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に拡張させる。ヌクレオチド配列のために、パラメータＭ（マッチ残基対に対するリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して、累積スコアを計算する。アミノ酸配列では、採点マトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ下落し、累積スコアが１つ以上の負の採点の残基アラインメント蓄積のためにゼロ以下になり、またはどちらかの配列端に達したら、両方向への単語ヒットの延長は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を定める。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、単語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方のストランド比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、単語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリックスをデフォルトとして使用する（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５頁参照）。
【０１８７】
％配列同一性を計算するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する（例えばカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３〜５７８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、それによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶発する確率の指標を提供する、最少確率和（Ｐ（Ｎ））である。例えば試験核酸と参照核酸との比較において、最少確率和が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は参照配列に類似していると見なされる。
【０１８８】
変異誘発およびその他の分子生物学技術
本発明の、および本発明で使用されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、分子生物学的技術を使用して操作できる。分子生物学的技術について述べる一般テキストとしては、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）「分子クローニング技術ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」「酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」第１５２巻（１９８７年），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版，第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１年；およびＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の共同事業、現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（２００４年を通して補遺発行）である、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」が挙げられる。これらのテキストは、例えば非天然アミノ酸、直交性ｔＲＮＡ、直交性シンセターゼ、およびその対を含むタンパク質生成のためのセレクターコドンを含む遺伝子生成に関する、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、および多くのその他の関連事項について述べる。
【０１８９】
本発明では、例えばｔＲＮＡ分子を変異させ、ｔＲＮＡライブラリーを生成し、シンセターゼライブラリーを生成し、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを対象とするタンパク質またはポリペプチド中に挿入するために、様々なタイプの変異誘発が使用される。それらとしては、部位特異的、ランダム点変異誘発、相同的組換え、ＤＮＡシャフリングまたはその他の再帰的変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを使用した変異誘発、オリゴヌクレオチド−誘導変異誘発、ホスホロチオエート−変性ＤＮＡ変異誘発、ギャップド二本鎖ＤＮＡを使用した変異誘発など、またはその任意の組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。追加的な適切な方法としては、点ミスマッチ修復、修復−欠損宿主株を使用した変異誘発、制限−選択および制限−精製、欠失変異誘発、総遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復、などが挙げられる。例えばキメラコンストラクトを伴う変異誘発もまた本発明に含まれる。一実施態様では、変異誘発は、例えば配列、配列比較、物理特性、結晶構造などの天然分子または変性または変異天然分子の既知の情報によって導くことができる。
【０１９０】
宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで、または例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであることができる例えば本発明のベクターなどの本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトで、遺伝子改変されている（例えば形質転換、形質導入または形質移入されている）。例えば直交性ｔＲＮＡ、直交性ｔＲＮＡシンセターゼ、および誘導体化されるタンパク質のためのコード領域は、所望の宿主細胞中で機能性である遺伝子発現制御要素と作動的に結合する。典型的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、および特定の標的核酸の発現の制御のために有用なプロモーターを含有する。ベクターは、場合により少なくとも１つの独立したターミネーター配列と、真核生物、または原核生物、または双方（例えばシャトルベクター）中でのカセット複製を可能にする配列と、原核生物および真核生物系双方のための選択マーカーとを含有する、一般的な発現カセットを含んでなる。ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくは双方の中の複製および／または組み込みに適する。ギリマン（Ｇｉｌｉｍａｎ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｇｅｎｅ，８：８１頁（１９７９年）；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１頁（１９８７年）；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６４３５：１０頁（１９９５年）；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の共同事業、現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（２００４年を通して補遺発行）である、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版，第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１年；およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）「分子クローニング技術ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」「酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」第１５２巻（１９８７年）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい。ベクターは、例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または抱合型ポリヌクレオチドの形態であることができる。ベクターは、電気穿孔（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，５８２４頁（１９８５年））、ウイルス性ベクターによる感染、小型ビーズまたは粒子マトリックス内または表面のどちらかに核酸がある小型粒子による高速弾道貫通（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２７．７０〜７３頁（１９８７年））などをはじめとする標準方法によって、細胞および／または微生物に導入される。
【０１９１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、アンバー停止コドン（ＵＡＧ）に応答する、タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的組み込みのために、高度に効率的で用途の広い単一プラスミド系が開発された。新しい系では、Ｍ．ヤナシィ（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）抑制因子ｔＲＮＡｔｙｒ（ＣＵＡ）およびチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼの対が、ほとんどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターと適合性の単一プラスミド中にコードされる。最適二次構造およびｔＲＮＡプロセシングのために、ｐｒｏＫプロモーターおよびターミネーターの支配下にある単シストロン性のｔＲＮＡオペロンを構築した。シンセターゼのためのｇｌｎＳプロモーターの突然変異型の導入は、抑制効率および忠実度の双方の顕著な増大をもたらした。抑制効率の増大はまた、ｔＲＮＡ遺伝子の複数コピーによって、ならびにシンセターゼ上の特異的突然変異（Ｄ２８６Ｒ）によっても得られた（コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら「遺伝コード拡張のためのチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼの直交性ｔＲＮＡ特異性のための構造的基礎（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０（６）：４２５〜４３２頁（２００３年））。最適化された系の普遍性はまた、タンパク質の機能および構造の研究におけるそのユニークな有用性が以前証明された、いくつかの異なる非天然アミノ酸の高度に効率的および正確な組み込みによっても実証された。
【０１９２】
クローニングのために有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えばＡＴＣＣによって出版される「ＡＴＣＣ細菌およびバクテリオファージカタログ（ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）」（１９９６年）ゲルナ（Ｇｈｅｒｎａ）ら編など、例えばＡＴＣＣによって提供される。配列決定、クローニング、および分子生物学のその他の側面のための追加的な基礎的手順、および根本的な理論的考察はまた、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版，第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１年；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の共同事業、現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（２００４年を通して補遺発行）である、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」；およびワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら（１９９２年）「組み換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）」第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹにもある。さらに本質的にあらゆる核酸（および規格または規格外に関わらず実質的にあらゆる標識核酸）は、テキサス州ミッドランドのミッドランド・サーティファイド・リージェント・カンパニー（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ））、カリフォルニア州ラモーナのザ・グレート・アメリカン・ジーン・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ））、イリノイ州シカゴのエクスプレジェン・インコーポレーテッド（ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）），カリフォルニア州アラメダのオペロン・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））、およびその他多数などの多様な商業的供給源のいずれかから、特注または標準注文できる。
【０１９３】
改変宿主細胞は、例えばスクリーニングステップ、プロモーター活性化または形質転換体選択などの活動のために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養できる。これらの細胞は、場合により遺伝子導入生物内で培養できる。例えば細胞単離および培養のための（例えば引き続く核酸単離のための）その他の有用な参考文献としては、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９９４）「動物細胞培養、基礎技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中で引用される参考文献；ペイン（Ｐａｙｎｅ）ら（１９９２年）「液体系内の植物細胞および組織培養（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）およびフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編（１９９５年）「植物細胞−組織および器官培養：基礎的方法、スプリンガー実験室マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびアトラス（Ａｔｌａｓ）およびパークス（Ｐａｒｋｓ）編「微生物学培地ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ）」（１９９３年）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０１９４】
対象とするタンパク質およびポリペプチド
細胞内で、規定の位置に非天然アミノ酸があるタンパク質を生成する方法もまた、本発明の特徴である。例えば方法は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなりタンパク質をコードする核酸を含んでなる細胞を適切な培地内で生育させるステップと、非天然アミノ酸を提供するステップを含み、細胞は、細胞内で機能してセレクターコドンを認識する直交性−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、およびＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）をさらに含んでなる。この方法によって生成されるタンパク質もまた、本発明の特徴である。
【０１９５】
特定の実施態様では、Ｏ−ＲＳは、発現系内のあらゆる内在性ｔＲＮＡと比較して、同族のＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ＲＳによって負荷されるＯ−ｔＲＮＡおよび内在性ｔＲＮＡ間の相対比は、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合、１：１を超え、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、なおもより好ましくは１０：１、さらにより好ましくは２０：１、なおもより好ましくは５０：１、さらにより好ましくは７５：１、なおもより好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１またはそれ以上である。
【０１９６】
本発明はまた、非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を含む組成物も提供する。特定の実施態様では、タンパク質は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、工業用酵素、またはその一部と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなる。
【０１９７】
本発明の組成物および本発明の方法によって作られる組成物は、場合により細胞中にある。次に本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対または個々の構成要素は、宿主系の翻訳機構中で使用でき、それはタンパク質に組み込まれた非天然アミノ酸をもたらす。２００４年４月１６日に出願され「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、および「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットはこの過程について述べており、参照によって本明細書に援用する。例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞などの宿主に導入すると、対は、セレクターコドンに応答して、タンパク質へのフェニルセレノシステインなどの非天然アミノ酸の生体内組み込みをもたらす。系に添加される非天然アミノ酸は、外来性に増殖培地に添加できる、フェニルアラニンまたはチロシン誘導体などの合成アミノ酸であることができる。場合により本発明の組成物は、生体外翻訳系、または生体内系中にあることができる。
【０１９８】
本発明の細胞は、有用な高い量で非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を合成する能力を提供する。いくつかの態様では、組成物は、場合により例えば非天然アミノ酸を含んでなる少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、または生体内タンパク質生成法によって達成できる量のタンパク質を含む（組み換えタンパク質生成および精製に関する詳細は本明細書で提供される）。別の態様では、タンパク質は、場合により例えば細胞溶解産物、緩衝液、製薬緩衝液、またはその他の液体懸濁液中に（例えば約１ｎＬから約１００Ｌ程度の容積中に）、例えば１Ｌあたり少なくとも１０μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも５０μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも７５μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも１００μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも２００μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも２５０μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも５００μｇのタンパク質、１Ｌあたり少なくとも１ｍｇのタンパク質、または１Ｌあたり少なくとも１０ｍｇのタンパク質またはそれ以上の濃度で組成物中に存在する。細胞内における少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む大量の（例えば生体外翻訳などのその他の方法によって典型的に可能なものよりも多い）タンパク質の生成は、本発明の特徴である。
【０１９９】
非天然アミノ酸の組み込みを実施して、例えばタンパク質構造および／または機能の変化を調整し、例えばサイズ、酸度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位近接性、部分へのターゲット（例えばタンパク質配列のための）、標識または反応性基の組み込みなどを変化させることができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された、または完全に新しくさえある触媒または物理特性を有することができる。例えば次の特性が、場合により非天然アミノ酸のタンパク質への包含によって改変される。毒性、生体内分布、構造的特性、分光学的特性、化学および／または光化学特性、触媒能力、半減期（例えば血清半減期）、例えば共有結合的にまたは非共有結合的にその他の分子と反応する能力など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、例えば新規な治療薬、診断薬、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（例えば抗体）、および例えばタンパク質構造および機能の研究のために有用である。例えばドウアティ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ）（２０００年）「タンパク質構造および機能のプローブとしての非天然アミノ酸（Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５〜６５２頁を参照されたい。
【０２００】
本発明のいくつかの態様では、組成物は、少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０以上の非天然アミノ酸がある、少なくとも１つのタンパク質を含む。天然アミノ酸は同一であるかまたは異なっていることができ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる部位があることができる。別の態様では、組成物はタンパク質を含み、タンパク質中に存在する特定のアミノ酸の全部ではないが少なくとも１つは非天然アミノ酸である。１つを超える非天然アミノ酸がある所与のタンパク質では、非天然アミノ酸は同一であるかまたは異なっていることができる（例えばタンパク質は、２つ以上の異なるタイプの非天然アミノ酸を含むことができ、または同一非天然アミノ酸を２つ含むことができる）。２つを超える非天然アミノ酸がある所与のタンパク質では、非天然アミノ酸は同一であることも、異なることも、または少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸がある同種の複数の非天然アミノ酸の組み合わせであることもできる。
【０２０１】
本質的に、非天然アミノ酸（および例えば１つ以上のセレクターコドンを含むようなあらゆる対応するコーディング核酸）を含むあらゆるタンパク質（またはその一部）は、本明細書の組成物および方法を使用して生成できる。例えばあらゆる利用できる突然変異法を調整して、適切な翻訳系に１つ以上の適切なセレクターコドンを含めることで、そのいずれかを変性して、１つ以上の非天然アミノ酸を含めることができる、数十万の既知のタンパク質を同定する試みはなされない。既知のタンパク質の一般的な配列寄託機関としては、ジェンバンクＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩが挙げられる。その他の寄託機関は、インターネットを検索することで容易に同定できる。
【０２０２】
典型的に、タンパク質はあらゆる入手できるタンパク質（例えば治療用タンパク質、診断用タンパク質、工業用酵素、またはその一部など）と、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％以上同一であり、それらは１つ以上の非天然アミノ酸を含んでなる。１つ以上の非天然アミノ酸を含んでなるように変性できる治療用、診断用、およびその他のタンパク質の例は、２００４年４月１６日に出願された、「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、および「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットにあるが、これに限定されるものではない。１つ以上の非天然アミノ酸を含んでなるように変性できる治療用、診断用、およびその他のタンパク質の例としては、例えばヒルジン、ヒト成長ホルモン、ＲＡＳ、α−１アンチトリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体（抗体についてさらに詳しくは下にある）、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、相補体阻害剤、相補体受容体１、サイトカイン、（例えば上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮性成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、剥脱性毒素ＡおよびＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、ヘッジホッグタンパク質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＥＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２など）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、��ンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、発熱性菌体外毒素Ａ、Ｂ、およびＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性相補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、すなわちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、サイモシンα１、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ  β）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ  α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、およびその他多数が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０３】
本明細書に記載される非天然アミノ酸の生体内組み込みのための組成物および方法を使用して作成できる１つの種類のタンパク質は、転写調節因子またはその一部を含む。転写調節因子の例としては、細胞生育、分化、制御などを調節する遺伝子および転写調節因子タンパク質が挙げられる。転写調節因子は、原核生物と、ウイルスと、真菌、植物、酵母、昆虫、および哺乳類をはじめとする動物をはじめとする真核生物に見られ、広範な治療標的を提供する。発現および転写活性化因子は、例えば受容体に結合する、情報伝達カスケードを刺激する、転写因子の発現を制御する、プロモーターおよびエンハンサーに結合する、プロモーターおよびエンハンサーに結合する、タンパク質に結合する、ＤＮＡを巻戻す、ｍＲＮＡ前駆体をスプライシングする、ＲＮＡをポリアデニル化する、およびＲＮＡを分解するなどの多くの機序によって、転写を制御すると理解される。
【０２０４】
本発明の１つの種類のタンパク質（例えば１つ以上の非天然アミノ酸があるタンパク質）は、サイトカイン、炎症分子、成長因子、それらの受容体、および例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８など）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、およびヒアルリン／ＣＤ４４などの発癌遺伝子産物；情報伝達分子および例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびＭｅｔなどの対応する発癌遺伝子産物；例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌなどの転写活性化因子および抑制因子；およびエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド、およびコルチコステロンなどのためのステロイドホルモン受容体などの生物学的に活性のタンパク質を含む。
【０２０５】
少なくとも１つの非天然アミノ酸がある酵素（例えば工業用酵素）またはその一部もまた、本発明によって提供される。酵素の例としては、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセミ化酵素、アシラーゼ、脱ハロゲン酵素、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシド加水分解酵素、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシル基転移酵素、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、サブチリシン、アミノ基転移酵素、およびヌクレアーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０６】
これらのタンパク質の多くは市販され（例えばシグマ・バイオサイエンシズ（Ｓｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を参照されたい）、対応するタンパク質配列および遺伝子、および典型的にその多数の変異型については周知である（例えばジェンバンクを参照されたい）。それらのいずれも本発明に従った１つ以上の非天然アミノ酸の挿入によって変性でき、例えば対象とする１つ以上の治療用、診断用または酵素的特性に関してタンパク質を変性する。治療的に適切な特性の例としては、血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、可検出性（例えば非天然アミノ酸中へのレポーター基（例えば標識群または標識結合部位）の包含による）、ＬＤ５０低下またはその他の副作用、胃路（例えば経口利用能）を通じて体内に入る能力などが挙げられる。診断用特性の例としては、貯蔵半減期、安定性、診断用活性、可検出性などが挙げられる。適切な酵素的特性の例としては、貯蔵半減期、安定性、酵素活性、生産能力などが挙げられる。
【０２０７】
多様なその他のタンパク質もまた、本発明の組成物および方法を使用して変性させて、１つ以上の非天然アミノ酸を含めることができる。例えば本発明は、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種などの感染性真菌；特に病原菌モデルの役割をする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、ならびにブドウ球菌（例えば黄色ブドウ球菌）、または連鎖球菌（例えば肺炎連鎖球菌）などの医学的に重要な細菌；胞子虫（例えばプラスモディウム）、根足虫（例えばエントアメーバ）、および鞭毛虫（トリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ジアルジアなど）などの原虫；（＋）ＲＮＡウイルスなどのウイルス（例としては例えばワクシニアなどのポックスウイルス、例えばポリオなどのピコマウイルス、例えば風疹などのトガウイルス、例えばＨＣＶなどのフラビウイルス、およびコロナウイルスが挙げられる）；（−）ＲＮＡウイルス（例えばＶＳＶなどのラブドウイルス、例えばＲＳＶなどのパラミクソウイルス、例えばインフルエンザなどのオルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、およびアレナウイルス）；ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）；例えばＨＴＶおよびＨＴＬＶなどのＲＮＡ→ＤＮＡウイルス、すなわちレトロウイルス；およびＢ型肝炎などの特定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルスからのタンパク質中の１つ以上のワクチンタンパク質中の１つ以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換するステップを含むことができる。
【０２０８】
昆虫抵抗性タンパク質（例えばＣｒｙタンパク質）、デンプンおよび脂質産生酵素、植物および昆虫毒素、毒素抵抗性タンパク質、マイコトキシン解毒タンパク質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）、およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼなどの農業関連タンパク質もまた、非天然アミノ酸変性の適切な標的である。
【０２０９】
特定の実施態様では、本発明の方法および／または組成物中の対象とするタンパク質またはポリペプチド（またはその一部）は、核酸によってコードされる。典型的に核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含んでなる。
【０２１０】
対象とするタンパク質またはポリペプチドのための遺伝子コーディングを、当業者に周知であり、ここで「変異誘発およびその他の分子生物学技術」の後述される方法を使用して変異誘発して、例えば非天然アミノ酸の組み込みのための１つ以上のセレクターコドンを含めることができる。例えば対象とするタンパク質のための核酸を変異誘発して１つ以上のセレクターコドンを含め、１つ以上の非天然アミノ酸の挿入を提供する。本発明は、例えば突然変異体などのあらゆる変異型、例えば少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むなどのあらゆるタンパク質の変形を含む。同様に、本発明はまた、対応する核酸、すなわち１つ以上の非天然アミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンがあるあらゆる核酸を含む。
【０２１１】
非天然アミノ酸を含むタンパク質を作成するために、直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対を通じた非天然アミノ酸の生体内組み込みに適応できる、宿主細胞および生物が使用できる。宿主細胞は、直交性ｔＲＮＡと、直交性ｔＲＮＡシンセターゼと、誘導体化するタンパク質をコードするベクターとを発現する１つ以上のベクターで遺伝子改変される（例えば形質転換、形質導入または形質移入される）。これらの各構成要素は同一ベクター上にあることができ、またはそれぞれ別個のベクター上にあることができ、または２つの構成要素が１つのベクター上に、および第３の構成要素が第２のベクター上にあることができる。ベクターは、例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または抱合型ポリヌクレオチドの形態であることができる。
【０２１２】
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは、多様な新しいポリペプチド配列（例えば本明細書の翻訳系で合成されるタンパク質の場合は非天然アミノ酸を含んでなるポリペプチド、または例えば新規なシンセターゼの場合は標準アミノ酸の新規な配列）を提供するので、ポリペプチドはまた、例えば免疫学的アッセイで認識できる新しい構造的特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清産生、ならびにこのような抗血清によって結合されるポリペプチドは、本発明の特徴である。「抗体」という用語としては、本明細書での用法では、実質的に免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子、またはその断片によってコードされ、特異的に分析物（抗原）に結合してそれを認識する、ポリペプチドが挙げられるがこれに限定されるものではない。例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および一本鎖抗体などが挙げられる。Ｆａｂ断片をはじめとする免疫グロブリン断片、およびファージディスプレイをはじめとする発現ライブラリーによって生成される断片もまた、本明細書での用法で「抗体」という用語に含まれる。抗体構造および用語法については、例えばパウル（Ｐａｕｌ）「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第４版，１９９９年，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０２１３】
免疫測定法で使用するための抗血清を生成するために、免疫原性ポリペプチドの１つ以上を本明細書に記載されるように生成および精製する。例えば組み換えタンパク質は、組み換え細胞内で生成できる。マウスの同系交配株（マウスの実質上の仮想遺伝的同一性のために結果がより再現可能であるので、このアッセイで使用される）をフロイントアジュバントなどの標準アジュバントと組み合わさった免疫原性タンパク質、および標準マウス免疫化プロトコルを用いて免疫する（抗体産生、免疫測定形式、および特異的免疫反応性を判定するのに使用できる条件の標準的説明については、例えばハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８年）「抗体−実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。タンパク質、抗体、抗血清に関する追加的詳細は、「真核生物遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」と題された国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、「糖タンパク質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」と題された国際公開第２００４／０３５６０５号パンフレット、および「タンパク質配列（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」と題された国際公開第２００４／０５８９４６号パンフレットにある。
【０２１４】
Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
本発明の組成物および本発明の方法によって作成される組成物は、場合により細胞内にある。次に本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対または個々の構成要素を宿主系の翻訳機構中で使用でき、タンパク質中に組み込まれた非天然アミノ酸がもたらされる。「非天然アミノ酸の生体内組み込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットはこの過程について述べており、参照によって本明細書に援用する。例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）または酵母などの宿主内に導入すると、対は例えばアンバーナンセンスコドンなどのセレクターコドンに応答して、例えばミオグロビン試験タンパク質または治療用タンパク質などのタンパク質中に、増殖培地に外来性に添加できる非天然アミノ酸の生体内組み込みをもたらす。場合により本発明の組成物は、生体外翻訳系内、または細胞生体内系内にあることができる。非天然アミノ酸があるタンパク質は、広範な用途のいずれかにおいて使用できる。例えばタンパク質中に組み込まれた非天然部分は、例えばその他のタンパク質との架橋、標識または染料および／または生体分子などの小型分子との架橋などのあらゆる広範な変性のための標的の役割を果たすことができる。これらの変性により、非天然アミノ酸の組み込みは改善された治療用タンパク質をもたらすことができ、酵素の触媒機能を改変または改善するのに使用できる。いくつかの態様では、タンパク質中への非天然アミノ酸の組み込みと引き続く変性は、タンパク質の構造、その他のタンパク質との相互作用などの研究を容易にすることができる。
【０２１５】
キット
キットもまた、本発明の特徴である。例えば細胞中に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を生成するためのキットが提供され、キットは、Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、および／またはＯ−ＲＳおよび／またはＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含有する少なくとも１つの容器を含む。一実施態様では、キットは非天然アミノ酸フェニルセレノシステインをさらに含む。別の実施態様では、キットはタンパク質および／または宿主細胞を生成するための説明書をさらに含んでなる。
【実施例】
【０２１６】
以下の実施例は、特許請求される発明を例示するために提供されるが、限定されるものではない。当業者は、特許請求される発明の範囲を逸脱することなく変更してもよい多様な重大でないパラメータを認識するであろう。本明細書に記載される実施例および実施態様は、あくまで例示を目的とし、それを考慮して様々な修正または変更が当業者に示されて、本出願の趣旨および範囲、および添付の特許請求の範囲内に含まれるものと理解される。
【０２１７】
実施例
フェニルセレノシステインに特異的な突然変異シンセターゼの遺伝的選択
フェニルセレノシステイン反応性化学
セレンは有機合成および生物学の双方における必須元素である。フェニルセレン含有部分は穏やかな条件で酸化でき、セレノキシドの自発性ｓｙｎ排除はオレフィン形成をもたらすことが実証されている。このストラテジーは、全合成で広範に使用されている。
【０２１８】
セレンを含有する非天然アミノ酸のタンパク質への組み込みは、例えば選択的に脂質付加タンパク質生成するための、タンパク質の高度に選択的な翻訳後変性のための誘引性標的を作り出す。このような非天然セレン含有アミノ酸の１つはフェニルセレノシステイン（ＣＡＳ登録番号７１１２８−８２−０）であり、同意語としてフェニルセレン化物またはＳｅ−フェニル−Ｌ−セレノシステインと称される。この構造は図１の構造１に提供される。この非天然アミノ酸は、例えばシグマ（登録商標）−アルドリッチ（登録商標）・カンパニー・インコーポレーテッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）（カタログ番号５０８２７）から得ることができる。
【０２１９】
フェニルセレノシステインアミノ酸残基の酸化的開裂は、α，β−不飽和アミノ酸デヒドロアラニンをもたらす（図１の構造２参照）。デヒドロアラニンはいくつかの天然ペプチドに見られる（チャテジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）（２００５年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０５（２）：６３３〜６８３頁）。保護されていないシステイン残基を含有するデヒドロペプチドは、分子内立体選択的共役付加を受けて、環式ランチオニンを生じる（チャテジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら（２００５年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０５（２）：６３３〜６８３頁）。ランチオニンは、翻訳後変性された抗生物質の種類（チャテジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら（２００５年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０５（２）：６３３〜６８３頁）であるランチビオティックス中に見られる構造である。
【０２２０】
非天然アミノ酸デヒドロアラニン（図１の構造２参照）のマイケル付加反応は、翻訳後変性があるタンパク質をもたらすことができ、例えばチオ−脂質との反応によって脂質付加タンパク質を発生させる。より具体的には、チオパルミチン酸との反応はパルミトイルシステイン（図１の構造３参照）をもたらし、ファルネシルメルカプタンとの反応はファルネシルシステイン（図１の構造４参照）を与え、マロネートとの反応はγ−カルボキシグルタミン酸（図１の構造６参照）を生じる。さらに１−ヘキサデカンチオールとの反応はＳ−ヘキサデシルシステイン（図１の構造５参照）をもたらす。Ｓ−ヘキサデシルシステインは天然の翻訳後変性でないが、タンパク質中のこの残基の存在は所望の特性を有することができ、例えばそれはヒト血清アルブミン結合、および生体内でより高いタンパク質安定性をもたらすことができる。
【０２２１】
標的を定めたフェニルセレノシステイン残基変性によるポリペプチドの脂質化は、膜局在化、改善された生体内安定性（すなわち改善された半減期）、および脂質溶解性などの所望の特性を有することができる。さらにいくつかのタンパク質の脂質付加形態は、生物学的活性形態である。
【０２２２】
フェニルセレノシステインを含んでなるタンパク質の生成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、および哺乳類細胞の遺伝コードへの系統立った非天然アミノ酸付加を可能にする方法については前述されている。このような方法は、ユニークなコドンに応答して、内在性宿主ｔＲＮＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、またはアミノ酸と交差反応することなく、所与のアミノ酸を選択的に組み込む能力と定義される直交性特性を有する、ナンセンス抑制因子ｔＲＮＡおよびアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）対の発生に基づく。
【０２２３】
本発明は、この非天然アミノ酸を生長するポリペプチド鎖に直接、遺伝子にプログラムされた翻訳組み込みができるようにする直交性試薬を創出することで、非天然アミノ酸フェニルセレノシステインを含有するポリペプチドの生体内発生のための組成物および方法を提供する。さらにこれらの直交系の使用は、非天然アミノ酸を含有する大量のポリペプチド（すなわちその他の合成方法を使用して可能なよりはるかに多いポリペプチド）の生成を可能にする。フェニルセレノシステインを含んでなるポリペプチドは、例えば本明細書の教示に従った、人工的脂質付加ポリペプチド生成などであるが、これに限定されるものではない、標的を定めた変性反応で使用できる。このような変性タンパク質には、改善された治療薬をはじめとするがこれに限定されるものではない多様な用途がある。
【０２２４】
フェニルセレノシステイン（図１の構造１）をユニークに挿入する、直交性ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を発生させるために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シンセターゼによって認識されない変性されたＭ．ヤナシィ（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ナンセンス抑制因子（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）を特異的に負荷する、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）の活性部位突然変異体のライブラリーを使用した。ワン（Ｗａｎｇ）ら（２００６年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，３５：２２５〜２４９頁で述べられるようにシンセターゼライブラリーｐＢＫ−ｌｉｂ５をスクリーニングで使用し、一連の正および負の選択を施した。正の選択における生存は、フェニルセレノシステイン存在下でのクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子中のアンバー変異の抑制を条件とし、負の選択における生存は、フェニルセレノシステイン非存在下での毒性バーナーゼタンパク質をコードする遺伝子中の不十分なアンバー変異抑制を条件とした。クローンは、それらがアンバーコドンに応答してユニークにフェニルセレノシステインを組み込む場合に限り、一連の正および負双方の選択を乗り切る。
【０２２５】
これらの選択に続いて、許容部位にアンバー変異セレクターコドンがあるＣＡＴ遺伝子を宿す細胞が、フェニルセレノシステイン存在下でのみ、クロラムフェニコール存在下で生存できるようにするクローン候補が同定された。フェニルセレノシステイン非存在下では、同一細胞はクロラムフェニコール存在下で生育せず、内在性アミノ酸組み込みからの背景生存がほとんどないかまたは皆無である、効率的なフェニルセレノシステイン組み込みと両立した。
【０２２６】
候補突然変異シンセターゼクローンの配列決定は、そのそれぞれが直交性翻訳系中で機能できる、３つの異なるシンセターゼ単離物を明らかにした。
クローン１（ＰｈＳｅＲＳ−ＳＤ）：Ｙ３２Ｗ、Ｌ６５Ｅ、Ｈ７０Ｇ、Ｄ１５８Ｑ、Ｌ１６２Ｓ
クローン２（ＰｈＳｅＲＳ−Ｋ４）：Ｙ３２Ｗ、Ｌ６５Ｈ、Ｈ７０Ｇ、Ｆ１０８Ｎ、Ｑ１０９Ｓ、Ｄ１５８Ｓ、Ｌ１６２Ｅ
クローン３（ＰｈＳｅＲＳ−Ｋ５）：Ｙ３２Ｗ、Ｌ６５Ｈ、Ａ６７Ｇ、Ｈ７０Ｇ、Ｆ１０８Ｋ、Ｑ１０９Ｓ、Ｄ１５８Ｅ、Ｌ１６２Ｅ
【０２２７】
これらのクローンを下の表でさらに要約する。
【表２】
2009529877.tif 000006
【０２２８】
この３つの単離された突然変異シンセターゼの内、クローン２シンセターゼ（ＰｈＳｅＲＳ−Ｋ４）は、最も高い活性および特異性を有した。これらの各クローンおよび対応する野生型種の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２に提供する。
【０２２９】
直交性シンセターゼ検証
本明細書に記載される突然変異シンセターゼを使用して、位置４（ＴＡＧ４）にアンバーセレクターコドンを含有するミオグロビンモデルタンパク質が、フェニルセレノシステイン非存在下で背景発現なしに１．５〜２ｍｇ／Ｌの収率で発現された。フェニルセレノシステインを含有するこのモデルタンパク質に翻訳後変性をさらに施して、γ−カルボキシグルタミン酸（図１の構造６）を生成し、高解像度質量分析を使用してそれを確認した。
【０２３０】
本明細書に記載される突然変異シンセターゼおよび生体内直交生成系を使用して、フェニルセレノシステインを含んでなる２つの追加的モデルタンパク質もまた、３〜５ｍｇ／Ｌの収率で発現された。フェニルセレノシステインを含有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を生成させた。フェニルセレノシステイン形態の生成に続いてタンパク質を変性させ、Ｓ−ヘキサデシルシステインを含有するｈＧＨを生成させた。マウスにおける変性ｈＧＨのヒト血清アルブミン結合特性および生体内半減期については、目下試験中である。
【０２３１】
本明細書に記載される直交性試薬はまた、フェニルセレノシステインを含有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を生成するのにも使用した。代案としては、その形態のタンパク質をまた引き続いて変性して、ＧＦＰのＳ−ヘキサデシルシステイン、ファルネシルシステイン、およびパルミトイルシステイン形態を形成した。これらの脂質付加形態ＧＦＰの膜−ターゲティング特性については、目下試験中である。
【０２３２】
したがって本発明は、非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（図１の構造１参照）を含有するタンパク質の遺伝的にプログラムされた生成のための組成物および方法を提供する。引き続く過酸化水素による酸化的脱離は、所望の位置にデヒドロアラニン（図１の構造２参照）を生成する。次にこのデヒドロアラニン部分は、様々な二次変性反応において標的とすることができる。
【０２３３】
明確さおよび理解の目的で、前述の発明についていくらか詳細に述べたが、この開示を読めば、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態および詳細に様々な変更を加えられることが、当業者には明らかであろう。本明細書に引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および／またはその他の文献は、あらゆる目的のために個々の刊行物、特許、特許出願、および／またはその他の文献のそれぞれが個々に援用されたかのように、あらゆる目的のためにその内容全体を参照によって本明細書に援用したものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】非天然アミノ酸フェニルセレノシステイン（構造１）の化学構造、ならびにフェニルセレノシステインから誘導できる構造を提供する。これらの構造としては、デヒドロアラニン（２）、パルミトイルシステイン（３）、ファルネシルシステイン（４）、Ｓ−ヘキサデシルシステイン（５）、およびγ−カルボキシグルタミン酸（６）が挙げられる。
【図２−１】本発明で有用な様々なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【図２−２】本発明で有用な様々なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【図２−３】本発明で有用な様々なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【国際調査報告】
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