(57)【要約】  本発明は特に、ＰＣＲ及び制限消化に基づくアプローチを用いて当該遺伝子内の点突然変異を検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
注目の遺伝子内の点突然変異を検出する方法であって、該方法が：
ａ）  突然変異を包囲し且つ包含する領域を増幅することができる一対のプライマーを使用して、注目の遺伝子から得られたＤＮＡの抽出物に対してＰＣＲ反応を実施する工程；
ｂ）  制限消化物を得るために、野生型配列と突然変異を含有する配列とを区別する少なくとも１つの制限酵素で、工程（ａ）のＰＣＲ生成物を消化する工程；
ｃ）  該突然変異の存在を示すＤＮＡ抽出物を同定するために、工程（ｂ）の消化されたＰＣＲ生成物を分析する工程、を含んで成り、
該ＰＣＲプライマーの３’末端が、３つ以下のヌクレオチドによって分離され、該ヌクレオチドのうちの１つが該突然変異を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記プライマーの３’末端が、
ａ）  ３つのヌクレオチド；
ｂ）  ２つのヌクレオチド；
ｃ）  １つのヌクレオチド
によって分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも１つが、少なくとも３０ヌクレオチド長である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記一対のＰＣＲプライマーのうちの一方が、他方よりも少なくとも２０ｂｐだけ小さい、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、ＰＣＲ反応で使用される場合、該ヌクレオチド配列内に制限部位を導入する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、該制限部位は該突然変異部位を包含し、そして該野生型配列内又は該点突然変異を含有する配列内のいずれかにのみ存在するが、両方には存在しないことを特徴とする、方法。
【請求項６】
前記消化工程において２種類の制限酵素が使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、第１の制限酵素は野生型配列を消化することができるが、突然変異配列を消化することはできず、そして第２の制限酵素は突然変異配列を消化することができるが、野生型配列を消化することはできないことを特徴とする、方法。
【請求項７】
２つ以上の突然変異がプライマーの３’末端間の３つ以下のヌクレオチド内に存在し、そしてＰＣＲ反応の生成物は、制限時において、野生型配列が使用される制限酵素によって消化されるのに対して、２つ以上の突然変異体のそれぞれのＰＣＲ生成物が消化されないようになっている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上の当該突然変異がプライマーの３’末端間の３つ以下のヌクレオチド内に存在し、そしてＰＣＲ生成物は、該ＰＣＲ生成物を消化するために少なくとも１つの制限酵素が使用された場合に、各突然変異が異なる制限プロフィールを与え、この制限プロフィールが野生型配列の制限プロフィールとは異なるようになっている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２つ以上の注目の突然変異が存在する場合には２つ以上の制限酵素が使用され、該制限酵素の数は注目の突然変異の数プラス１に相当し、そして
（ｉ）  前記制限酵素のうちの１つは、野生型配列を消化することができるが、突然変異配列を消化することはできず、そして
（ｉｉ）  各追加的な制限酵素は、単一の突然変異配列を消化することができるが、野生型配列を消化することはできない、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記注目の点突然変異又は複数の突然変異が農薬耐性を付与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記注目の点突然変異又は複数の突然変異が除草剤耐性を付与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記注目の点突然変異又は複数の突然変異が、疾患をもたらす生物の生化学的又は生理学的変化を引き起こす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法において使用するための識別ＰＣＲプライマーを設計することができるコンピュータ・プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の点突然変異スクリーニング法に関する。特に、本発明は、他の突然変異が存在していてもこのような突然変異を迅速且つ一義的に検出するのを可能にする点突然変異スクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子のコード領域内の単一ヌクレオチド変化（点突然変異）は、生物に対して重大な生化学的及び生理学的な結果をもたらし得る。劇的な結果をもたらすこのような変化のよく知られた例は、鎌状赤血球症を引き起こす突然変異である。数多くの他の点突然変異も、例えば遺伝性癌、家族性肥大型心筋症、及び筋ジストロフィーに関与する突然変異を含む、糖尿病から心不全に及ぶ範囲の健康問題と関連している。農薬分野においては、農薬標的酵素におけるいくつかの点突然変異が、主要なクラスの農薬に対する耐性を付与することが判っている。例えば、標的部位突然変異は、主要な殺真菌剤、例えばストロビルリン、及び殺虫剤群、例えばピレスロイド、並びにトリアジン、グリホセート、ＡＣＣアーゼ、及びＡＬＳインヒビターを含む大抵の除草剤に対する耐性を付与することが知られている。多くの場合、正確な耐性突然変異が同定されている。
【０００３】
例えばブラック・グラス（Alopecurus myosuroides)の場合、アセチルｃｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子（ＡＣＣアーゼ・インヒビター、すなわち双子葉植物に対して影響を及ぼさない、単子葉植物の雑草をコントロールする除草剤群の標的酵素）のカルボキシルトランスフェラーゼ結合ドメイン内の単一点突然変異（Ｉｌｅ１７８１Ｌｅｕ）が、シクロヘキサンジオン（ＤＩＭ）及びアリールオキシプロピオネート（ＦＯＰ）除草剤に対する広範な耐性を付与することが判っている（Delye他 2002a）。同種の突然変異が、それ以来他の雑草種：ライグラス（Lolium rigidum; Delye他 2002b）；野生カラスムギ（Avena Fatua; Christoffers他 2002)、及びグリーン・フォックステイル（Setaria viridis; Delye他 2002c)にも見いだされている。Ｉｌｅ１７８１Ｌｅｕ突然変異は、チミン又はシトシンによってアデニン５３１４が置換されることに起因する。加えて、更なる耐性付与突然変異がＡＣＣアーゼ遺伝子内で現在同定されており、Ｉｌｅ２０４１Ａｓｎ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ突然変異が、ＦＯＰに対する耐性及びＤＩＭに対する何らかの耐性を付与し、このような突然変異は、位置６１２２においてアデニン又はシトシンによってチミンが置換されること（Ｉｌｅ２０４１Ａｓｎ／Ｔｈｒ）によって、又は位置６１２１においてグアニンによってアデニンが置換されること（Ｉｌｅ２０４１Ｖａｌ）によって引き起こされる（注：アミノ酸２０４１における突然変異に関して与えられたアミノ酸及びヌクレオチドの位置は、Alopecurus myosuroidesに由来する位置であり；相応の突然変異が他の種に見いだされる）。更なる突然変異（Ａｓｐ２０７８Ｇｌｙ）が、ＦＯＰ及びＤＩＭの両方に対する耐性を付与する。
【０００４】
今日使用されている恐らくは最も重要な非選択的除草剤である、除草剤グリホセートに関して、その標的は、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子である。４つの種（Lolium rigidum, Lolium multiflorum、Conzya canadensis、及びEleucine indica）において耐性が確認されており、いくつかの更なる種（Amaranthus及びChenopodium種を含む）において、耐性の疑いがある。これらの事例のうちのいくつかにおいて、耐性は、ＥＰＳＰＳ遺伝子におけるＰｒｏ１０６Ｔｈｒ／Ｓｅｒ突然変異に起因する。
【０００５】
農薬分野を例にとると、点突然変異及びこれらの相補体を検出するためにいくつかの方法が存在し、これらの方法はいくつかの事例では、骨の折れる、多大な時間のかかる耐性バイオアッセイの代わりになる。これらの検出方法は、これらが単一の個体に適用されるのか、又は個体群に適用されるのかに応じて、２つの主な群に分類することができる。例えば、単一植物アッセイは、ＰＡＳＡアッセイ（特異的対立遺伝子のＰＣＲ増幅）、ＳＳＣＰアッセイ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型）、ＣＡＰＳアッセイ（切断増幅多型配列）、及びｄＣＡＰＳアッセイ（誘導切断増幅多型配列）を含むのに対して、個体群に基づく定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）法はしばしば、対立遺伝子特異的ハイブリッド形成又は対立遺伝子特異的増幅アッセイに基づく。しかしながら、質的方法及び量的方法双方の１つの共通の特徴は、信頼性が、当該点突然変異の周りの他のヌクレオチドの保存に依存することである。植物の場合には特に、耐性になりやすい種が形態学的及び生理学的なレベルにおいて極めて多様である傾向があり、そしてこのことはＤＮＡレベルにおける変動性を反映することが知られており、既存の技術を用いて当該点突然変異の正確な検出を行うことは、極めて難しい。例えば、未知の多型が、プライマーのハイブリッド形成を阻むことによりＰＣＲ反応のプライミングを妨害するおそれがあり、加えて、例えば、ＰＣＲ反応に続いて制限酵素消化が必要となるＣＡＰＳ及びｄＣＡＰＳ法において、当該突然変異の近くの更なる突然変異の存在が、制限酵素認識を損ねることもある。両事例において、不正確な結果（例えば誤った陰性又は陽性の耐性指示）が得られるおそれがある。もちろん、ヒト又は動物における疾患を引き起こす突然変異に関して分析する際に、当該点突然変異部位の近くで多型が発生したときに同じ問題が生じることもある。
【０００６】
例えば、上記ＡＣＣアーゼ遺伝子内の位置２０４１における突然変異の事例を用いると、耐性表現型を引き起こす位置６１２２における２つの突然変異及び位置６１２１における更なる突然変異があるだけではなく、当該突然変異から５塩基上流側のヌクレオチド・レベル（Ｎ−５）（耐性に対して僅かな影響を与える）、及び当該突然変異から１塩基及び４塩基下流側のヌクレオチド・レベル（Ｎ＋１及びＮ＋４；両方ともサイレント突然変異）における更なる突然変異も、状況を複雑にし、また各被験試料に関する詳細な配列情報が存在しない場合には上記スクリーニング・アッセイの結果の解釈を難しくする。Ｐｒｏ１０６Ｔｈｒ／Ｓｅｒ突然変異部位に対してＮ−１及びＮ＋２の位置におけるヌクレオチド変動が、種全体にわたる又は種内部における信頼性のあるＰＡＳＡ及びＣＡＰＳアッセイの進展を阻むようなＥＰＳＰＳ遺伝子の事例においても、同様な複雑な状況が発生する。
【０００７】
従って、当該点突然変異を包囲するＤＮＡ配列の変動性によって影響を及ぼされない方法を開発する必要がある。当該点突然変異は例えば、農薬、例えば除草剤に対する耐性を付与する点突然変異であるか、又は疾患をもたらす、生物（具体的にヒト又は動物）中の生化学的又は生理学的変化を引き起こす点突然変異であってよい。
【発明の概要】
【０００８】
従って、本発明は、
ａ）  突然変異を包囲し且つ包含する領域を増幅することができる一対のプライマーを使用して、当該遺伝子から得られたＤＮＡの抽出物に対してＰＣＲ反応を実施し；
ｂ）  制限消化物を得るために、野生型配列と、該突然変異を含有する配列とを区別する少なくとも１つの制限酵素で、ステップ（ａ）のＰＣＲ生成物を消化し；
ｃ）  突然変異の存在を示すＤＮＡ抽出物を同定するために、ステップ（ｂ）の消化済ＰＣＲ生成物を分析する
ことを含む、当該遺伝子内の点突然変異を検出する方法において：
ＰＣＲプライマーの３’末端が、３つ以下のヌクレオチドによって分離され、ヌクレオチドのうちの１つが突然変異を含む、ことを特徴とする、当該遺伝子内の点突然変異を検出する方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法（便宜上ＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳと呼ぶ：長プライマー（誘導）多型増幅・切断配列）は、当該点突然変異の近傍に更なる点突然変異／多型が存在していても、遺伝子内部の点突然変異の検出を可能にする。本発明の方法は、多数の点突然変異を互いに、そして（下で論じる）野生型配列から識別するように適合させることもでき、また、二倍体生物のホモ接合型個体とヘテロ接合型個体との区別を可能にする。
【００１０】
更なる点突然変異の存在において当該点突然変異を検出することは、２つのＰＣＲプライマーの３’端部間の小さな分離距離によって達成される。すなわち、当該点突然変異をフランキングする全てのヌクレオチドは、プライマー端部間の３つ以下のヌクレオチドを除いて、プライマーによって固定される。このように、消化ステップで使用される制限酵素の認識部位を異常プライミングさせるか又は破壊させる既知又は未知の点突然変異／多型の問題は克服され、不正確な結果（誤った陰性又は陽性の結果）が得られることはない。もちろん、特に当該突然変異により近接して突然変異が存在することが既知である場合には、ＰＣＲプライマー間の分離距離は、さらに２つ又は１つのヌクレオチドに低減されてよい。しかし注目されるのは、３つのヌクレオチドによる分離距離を有することの利点が、同じ表現型効果を有することもできる、アミノ酸コドン内の３つのヌクレオチドのいずれか１つに影響を及ぼす突然変異間を識別するように、プライマーを設計できることである。当業者ならばもちろん、当該突然変異に関する知識と組み合わせて当該種内のヌクレオチド配列の保存に関する知識を使用して、所与の事例において適切な分離距離を決定することができる。もちろん、当該点突然変異のすぐ周りに多型が存在しないことが判っているいくつかの事例において、本明細書に記載された本発明の方法においてプライマー間の分離距離を４、５又は６つのヌクレオチドに増大させることが可能な場合もある。
【００１１】
従って１実施態様の場合、本発明は、ＰＣＲプライマーの３’末端は、３つのヌクレオチドによって分離される方法を提供する。別の実施態様の場合、プライマーは２つのヌクレオチドによって分離され、そしてさらに別の実施態様の場合、プライマーは１つのヌクレオチドによって分離される。
【００１２】
なお、本発明の方法において使用するためのＰＣＲプライマーは、典型的なＰＣＲ反応において使用されるものより長い傾向がある。その理由は、プライマーが、制限消化後に、ＰＣＲ断片が当業者によって用いられる分析法において区別され得るのに十分な長さを有することが必要であるからである。典型的なＰＣＲ反応では、もちろん、ＰＣＲ成分の大部分は、全長のうちの小さな部分だけを占めるプライマーを有する増幅ＤＮＡから成る。しかしながら、本発明の方法の場合、プライマーは典型的には最大３つのヌクレオチドによって分離されているのにすぎないので、ＰＣＲ生成物の大部分はプライマー自体から成る。消化されたＰＣＲ断片を分析するために用いられる方法が、典型的なアガロース・ゲルを流動させることである場合、プライマーは、制限消化の生成物をゲル上で見て区別することができるのに十分な長さを有することが必要である。実際には、このことは、２つのプライマーの全長が約１００塩基でなければならないことを意味する。もちろん当業者には明らかなように、本発明の方法によって形成されたＤＮＡ断片を分析する他の方法（このような他の方法の一例としては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析）及びピロシーケンシング・アプローチが挙げられ、これらは両方とも当業者には明らかである）もあり、そして当業者ならば、このような方法において使用するための好適な長さのプライマーを設計することができる。
【００１３】
従って、１つの実施態様の場合、本発明は、一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも３０ヌクレオチド長である方法を提供する。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも５０ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも８０ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１００ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１２０ヌクレオチド長である。さらに別の実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１５０ヌクレオチド長である。
【００１４】
丁度ＰＣＲ生成物の長さがＰＣＲプライマーの長さによって制御されるのに伴って、制限消化時に生成される断片のサイズもそれだけ過剰になり、制限部位は必然的に、２つのプライマーの間の突然変異部位を包含することになり、ひいては制限時には、生成された断片は、プライマー長と事実上等しいサイズになる。従って、プライマー長の比は、用いられる分析法によって、消化済生成物から未消化ＰＣＲ生成物を区別することが可能であるように設定されることが必要である。アガロース・ゲル上では、例えば１３５ｂｐの未切断生成物と１００ｂｐの断片との差異は明らかであり（残りの３５ｂｐの断片の視覚化はもちろん必要ではない）、実際には、より小さなサイズ差も、用いられる条件に応じて分解することができる。
【００１５】
従って、本発明の１実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも１０ｂｐだけ小さい。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも１５ｂｐだけ小さい。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも２０ｂｐだけ小さい。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも２５ｂｐだけ小さい。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも３０ｂｐだけ小さい。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも３５ｂｐだけ小さい。更なる実施態様の場合、一対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、他方よりも少なくとも４０ｂｐだけ小さい。
【００１６】
本発明の方法によって必要される識別制限消化を実施するために、野生型配列又は突然変異配列に対応するＰＣＲ生成物内に、制限部位が存在しなければならないが、しかし制限部位はその両方には存在しない。この制限部位は、野生型配列及び突然変異配列のうちの一方又は他方の配列内に天然に存在してよいが、しかしもし存在しないならば、ｄＣＡＰＳアッセイ（例えば国際公開第２００５／１２３９４６号パンフレット及びNeff他、1998）において用いられるのと同様の方法で、ＰＣＲプライマーのうちの一方又は他方、或いは両方を使用して導入することができる。識別制限酵素認識部位が存在するかどうかを見極めるために、当業者ならば、当該点突然変異を包囲するヌクレオチド配列を視覚的に走査することができる。このような部位が存在しない場合には、当業者ならば、既知の酵素に対する既知の認識部位を参照することにより、このような識別制限酵素認識部位を導入するプライマーを設計することができる。２つ以上のヌクレオチド変化が必要とされるならば、制限部位を形成するために両プライマーを使用して変化させることが必要な場合がある。
【００１７】
従って、１実施態様の場合、本発明は、前記一対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、ＰＣＲ反応で使用されると、ヌクレオチド配列内に制限部位を導入し、制限部位は突然変異部位を包含し、そして野生型配列内又は点突然変異を含有する配列内にのみ存在し、しかし両方には存在しない、方法を提供する。
【００１８】
なお、制限条件の問題に起因して誤った結果が得られないように、プライマーは、野生型及び突然変異型双方の対立遺伝子を陽性に同定することが好ましい。従って、上記の状況において、２つの制限消化が行われ、これらのうちの１つは、野生型配列を消化することができる酵素によるものであり、また１つは突然変異配列を消化することができる酵素によるものであることが好ましいが、必須というわけではない。天然に存在しないならば、当業者であれば、もちろんこれらの制限酵素部位が導入されるのを保証するのに必要なプライマーを設計することができる。
【００１９】
従って、１実施態様の場合、本発明は、消化ステップで２つの制限酵素が使用され、第１の制限酵素は野生型配列を消化することができるが、しかし突然変異配列を消化することはできず、そして第２の制限酵素は突然変異配列を消化することができるが、しかし野生型配列を消化することはできない、方法を提供する。
【００２０】
言うまでもなく、何らかの環境では、２つ以上の当該突然変異が存在することになる。具体的には、種々異なる個体群内で、同じヌクレオチドに、又は恐らく異なるヌクレオチドではあるがしかし同じコドン内部に異なる突然変異が存在することが可能である。これらの突然変異は、単一の突然変異アミノ酸配列、又は数多くの種々異なる突然変異アミノ酸配列をもたらすことがあり、結果として、これらの突然変異は、表現型に対して異なる効果を与える場合がある。例えばＡＣＣアーゼ遺伝子の場合、上記Ｉｌｅ１７８１Ｌｅｕ突然変異は、チミン又はシトシンによってアデニン５３４１が置換されるのに起因する。この場合、ヌクレオチド５３４１における両置換は、同じアミノ酸をもたらす。やはりＡＣＣアーゼ遺伝子におけるＩｌｅ２０４１Ａｓｎ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ突然変異、及びＥＰＳＰＳ遺伝子におけるＰｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒ突然変異において、同じヌクレオチドにおける且つ／又は同じコドン内の突然変異は、異なるアミノ酸をもたらし、また場合によっては異なる表現型をもたらす。ＡＬＳ遺伝子（アセトラクターゼ・シンターゼ）内では極端な事例が見いだされる。この遺伝子において、下記表に示したようなＣＣＧ野生型コドンの突然変異に起因して６つの異なる耐性突然変異がアミン酸１９７に発生する：
【００２１】
【表１】
2009540854.tif 000002
【００２２】
上に詳しく説明した状況の全ては、単独ＰＣＲ反応及び１つ又は２つ以上の選択的制限酵素消化を伴う本発明の方法を用いるだけでアッセイすることができる。例えばブラック・グラスの１７８１におけるアデニンからチミンへの突然変異、又はアデニンからシトシンへの突然変異の場合、特定の部位における突然変異の有無が関心の全てであり、（例えば、その部位における全ての既知の突然変異が同様にアミノ酸配列を変化させるという理由から）その正確な配列は関係がない場合、野生型配列と突然変異配列とを区別する制限酵素を見いだすことで十分である。例えば、ｄＣＡＰＳアッセイが実施され、そしてＮｓｉＩ部位を１７８１で野生型配列内に導入するがしかし突然変異形のいずれにも導入しないプライマーが提供され、すなわち野生型配列だけが制限時に消化される国際公開第２００５／１２３９４６号パンフレットを参照されたい。本発明の方法が講じられたからには、当業者には明らかなように、これらのｄＣＡＰＳアッセイにおいて使用された識別制限部位を本発明の方法に使用することもできる。当業者に明らかなように、このような場合、消化されなければならないのは野生型配列であり、そして野生型配列を切断することなしに両突然変異配列を消化することができる制限酵素を見いだすことが可能でない限り、突然変異型は未消化のまま残らなければならない。
【００２３】
従って、更なる実施態様の場合、本発明は、２つ以上の当該突然変異が、プライマーの３’末端間の（典型的には）３つ又は２つ以下のヌクレオチド内に存在し、そしてＰＣＲ反応生成物は、制限時に野生型配列が、使用される制限酵素によって消化されるのに対して、２つ以上の突然変異体のそれぞれのＰＣＲ生成物が消化されないようになっている、方法を提供する。
【００２４】
もちろん、例えば各突然変異体が異なる表現型効果を有するという理由から、各突然変異間を区別することが必要である場合、野生型及び各突然変異体に対して独自の制限プロフィールが形成されるように２つ以上の制限酵素を使用することによりこれを行うことが、本発明の方法を用いて可能である。例えば例１及び例２を参照されたい。
【００２５】
従って、更なる実施態様の場合、本発明は、２つ以上の当該突然変異が、プライマーの３’末端間の（典型的には）３つ又は２つ以下のヌクレオチド内に存在し、そしてＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ生成物を消化するために少なくとも１つの制限酵素が使用されたときに、各突然変異が異なる制限プロフィールを与え、この制限プロフィールが野生型配列の制限プロフィールとは異なるようになっている、方法を提供する。
【００２６】
もちろん、２つ以上の当該突然変異が存在する上記状況において、野生型及びそれぞれの個々の突然変異を陽性に同定することが好ましい場合もある。
【００２７】
従って、１実施態様の場合、本発明は、２つ以上の当該突然変異が存在する時には、２つ以上の制限酵素が使用され、制限酵素の数は、当該突然変異の数プラス１に相当し、また、（ｉ）  前記制限酵素のうちの１つは、野生型配列を消化することができるが、しかし突然変異配列を消化することはできず、そして（ｉｉ）  各付加的な制限酵素は、単一の突然変異配列を消化することができるが、しかし野生型配列を消化することはできない、方法を提供する。
【００２８】
もちろん、本発明の全ての実施態様の場合、必要とされる識別制限部位は、野生型及び突然変異型のヌクレオチド配列内に存在することが可能である。このような制限部位が存在しない場合には、ＰＣＲプライマーのうちの一方又は両方を使用することにより、これらの制限部位を導入することが可能である。識別制限部位を導入するために順方向及び逆方向双方のＰＣＲプライマーを使用することが、本発明の方法において可能である。なぜならば、両プライマーは、（ＰＣＲに基づく典型的なアッセイ、例えばｄＣＡＰＳアッセイとは異なり）当該突然変異の近くで終わるからである。
【００２９】
当業者には明らかなように、本発明の方法において使用するためのＰＣＲ条件は、使用されるＰＣＲプライマーの長さ、及び、ＰＣＲプライマーが当該ヌクレオチド配列内に導入するミスマッチの数、並びに、ＰＣＲプライマー間の分離距離、ひいてはＰＣＲ断片長に依存することになる。しかし一般にはプライマー長に起因して、典型的なＰＣＲ反応に対して、ハイブリッド形成のための温度を低下させることが必要となると考えられる。ミスマッチ数が増大するのに伴って、ハイブリッド形成温度をさらに低下させることが必要になると考えられるものの、本発明者は、使用されるプライマーの長さに起因して、ミスマッチがハイブリッド形成効率に大きな影響を与えることはないらしいことを見いだした。好適には、１分間のアニーリング時間に対するアニーリング温度６０℃を用いることができる。加えて、ハイブリッド形成ステップに必要な時間はまた、典型的なＰＣＲ反応に対して長くなるはずである。さらに、伸長ステップは、毎回加えられるヌクレオチドが（典型的には）ただ３つ又は２つ以下だけであることに伴って、著しく短くなることが可能である。
【００３０】
本発明の目的はまた、当該点突然変異を包囲するヌクレオチド配列の走査を実施し、そして本発明の方法において使用するための、可能なプライマー、制限部位、及び制限酵素を同定するコンピュータ・プログラムを提供することである。このプログラムは、野生型及び突然変異型のＤＮＡ配列に従って、当該ヌクレオチド配列内の既存の識別制限部位を同定し、且つ／又は、所要の制限部位を生成するために、順方向又は逆方向プライマー内に導入することができる突然変異のリスト、並びに、当該点突然変異の有無を明らかにする相応の制限酵素のリストを生成する。
【００３１】
従って、別の観点において、本発明は、本発明の方法において使用するための識別ＰＣＲプライマーを設計することができるコンピュータ・プログラムを提供する。
【００３２】
本発明の方法は、主として除草剤耐性の雑草における種々異なる耐性対立遺伝子間を区別するために用いられており、また本発明の方法は、種々異なる雑草種全体にわたって、そして実際には遠隔種において、ＰＣＲプライマーの変更を必要とすることなしに、そしてこれらの遠隔種における当該遺伝子内のヌクレオチド配列に関する事前の知識なしにロバストに作業することが判っている。例えばグース・グラスＥＰＳＰＳ配列を使用して設計されたＰＣＲプライマー対が、綿花、トウモロコシ、ライグラス、大豆、及びキビから正しい長さのＤＮＡを増幅することが判っている（例２参照）。このことは、本発明の方法において使用されるプライマーの増大した長さに起因するものと思われる。すなわち、ミスマッチの比率の増大は、典型的なＰＣＲプライマーと比較して、欠陥のあるハイブリッド形成を引き起こすことなしに調節することができる。加えて、例１及び例２の両方から明らかなように、本発明の方法は、２つの異なる除草剤耐性状況において働くことが判っている。さらに、本発明の方法は、個体群内の耐性バイオタイプの存在を検出して確認するために用いることができるだけでなく、個体群内部の耐性植物の発生頻度の評価を提供するために用いることもできる。
【００３３】
下記配列リストと組み合わせて、以下の非限定的な例を用いて本発明をここで説明する：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−Ｉｌｅ２０４１Ａｓｎ／Ｖａｌ／Ｔｈｒに対するＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳ順方向プライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２−Ｉｌｅ２０４１Ａｓｎ／Ｖａｌ／Ｔｈｒに対するＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳ逆方向プライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３−ＥｃｏＲＩ認識部位
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４−ＸｍｎＩ認識部位
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５−ＤｄｅＩ認識部位
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６−２０４１順方向ＰＣＲプライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７−２０４１逆方向ＰＣＲプライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８−Ｐｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対するＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳ順方向プライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９−Ｐｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対するＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳ逆方向プライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０−ＡｓｕＩ認識部位
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１−ＰｖｕＩ認識部位
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２−１０６順方向ＰＣＲプライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３−１０６順方向ＰＣＲプライマー
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４−Ｐｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対する代替ＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳ逆方向プライマー
【実施例】
【００３４】
Sambrook他(1989)“Molecular cloning: A laboratory manual”、第2版、Cold Spring Harbour Lab. Pressにしたがって、一般的な分子生物学的方法を実施する。
【００３５】
例１−ＡＣＣアーゼ遺伝子におけるＩｌｅ２０４１Ａｓｎ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ突然変異の研究
被験植物から個々の葉試料：Lolium rigidum及びAlopecurus myosuroidesを集めた。各植物毎に、Spex Certiprep 2000モデルGenogrinder上で３ｃｍの葉切片を粉砕した。粉砕された材料のＤＮＡを続いて、Wizard Magnetic 96 DNA plant Systemキット（Promega）を使用してBeckman Coulter Biotek Fxロボットにおいて抽出した。
【００３６】
ＡＣＣアーゼ遺伝子内のＩｌｅ２０４１Ａｓｎ／ＶａＩ／Ｔｈｒ突然変異を同定するために、ＰＣＲプライマーを設計した。順方向プライマーは長さ１２０塩基対であり、また突然変異部位の上流側のコンセンサスLolium rigidum配列にマッチングさせた。逆方向プライマーは長さ３５塩基対であり、コンセンサス配列に対して突然変異させた。プライマーの３’末端は２つの塩基対によって分離されているので、３つの全ての潜在的な突然変異を同定することができた。
【００３７】
順方向プライマー配列：
CCAGATTCTGCTACCAAGACAGCGCAGGCAATGATGGACTTCAACCGTGAAGGA
TTACCTCTGTTCATCCTTGCTAACTGGAGAGGCTTCTCTGGTGGGCAAAGAGACC
TTTTTGAAGGA［SEQ ID No:1］
【００３８】
逆方向プライマー配列：
TAAGGTTCTCAACAATTGTTGATCCAGCCTGCTGA［SEQ ID No:2］
【００３９】
ＥｃｏＲＩ（認識部位＝GAATTC［SEQ ID No:3］）、ＸｍｎＩ（認識部位＝GAANNNNTTC［SEQ ID No:4］）及びＤｄｅＩ（認識部位＝CTNAG［SEQ ID No:5］）で制限消化すると、下記制限プロフィールが予期された：
【００４０】
【表２】
2009540854.tif 000003
【００４１】
もちろん、植物試料がこの遺伝子座においてヘテロ接合体であるときには、上記制限プロフィールの混合物が各試料に対して得られる。例えばその試料がヘテロ接合型であり、野生型対立遺伝子とＡｓｎ突然変異対立遺伝子とを含有する場合、制限プロフィールは、ＥｃｏＲＩ及びＸｍｎＩで試料のほぼ半分が消化されたことを示すが、しかし未消化帯域が３つの全ての消化アッセイにおいて残ることになる。
【００４２】
０．８μＭの各プライマーと１０〜５０ｎｇの植物ゲノムＤＮＡとを含有する総容積２５μｌで、puReTaq Ready-To-Go PCRビーズ（Amersham Biosciences）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した。９４℃２分間の初期変性ステップ、これに続いて９４℃３０秒間、６４℃３０秒間、及び７２℃１分間を４０サイクルを行うようにプログラミングされたEppendorf Master Cycle Gradient Thermocycler Model 96においてＰＣＲを実施した。７２℃１０分間の最終伸長ステップも含まれた。
【００４３】
また、位置６１２１／６１２２（位置２０４１におけるアミノ酸の状態と等価）の周りに重要なヌクレオチド残基を包含するＰＣＲ生成物を発生させる典型的なＰＣＲプライマー対を使用して、各試料を増幅した。
【００４４】
順方向プライマー配列：
TGTTGGACTTCAACCGTGAAGG［SEQ ID No:6］
【００４５】
逆方向プライマー配列：
AGGCTGATTGTATGTCCTAAGG［SEQ ID No:7］
【００４６】
続いて、逆方向ＰＣＲプライマーを使用して、ニートのＰＣＲ生成物１μｌ上で直接配列決定を実施した。これは、配列決定の結果とＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳアッセイの結果とを比較するために行った。
【００４７】
ニートのＰＣＲ生成物の４μｌアリコートをＥｃｏＲＩ、ＸｍｎＩ、及びＤｄｅＩ（New England Biolabs）で消化し（各反応は製造業者の推奨に従って２０μｌの総容積で行った）、そして１  Ｘ  ＴＢＥ緩衝剤中２％のアガロース（これらは両方とも０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を含有する）上で分離した。
【００４８】
１６種の野生型及び突然変異型Lolium試料に関して、下記表は、アッセイ法を用いて得られた結果と、試料の配列決定による結果との相関関係を示す。
【００４９】
【表３】
2009540854.tif 000004
注：有／無は、ＰＣＲ生成物の半分が消化され、残りが切断されていないことを示す。
【００５０】
加えて、ＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳアッセイ及び配列決定の両方を用いて更なる試料もアッセイし、そしてこれがヘテロ接合型であり、１つのＩｌｅ対立遺伝子と１つのＶａｌ対立遺伝子とを含有することが見いだされた（ＥｃｏＲＩ：有／無；ＸｍｎＩ：有；ＤｄｅＩ：無）。
【００５１】
さらに、１３種のAlopecurus試料における同じ２０４１突然変異を研究するために、同じプライマー及びＰＣＲ条件を用いた。全ての事例において、アッセイは、配列分析によって確認された正しい突然変異の存在を予測した。このように、ＰＣＲプライマー、サイクル条件、及び制限消化を、LoliumからAlopecurusへ転用することができる。
【００５２】
例２−ＥＰＳＰＳ遺伝子におけるＰｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒ突然変異の研究
Eleucine indica植物から個々の葉試料を集めた。各植物毎に、Spex Certiprep 2000モデルGenogrinder上で３ｃｍの葉切片を粉砕した。粉砕された材料のＤＮＡを続いて、Wizard Magnetic 96 DNA plant Systemキット（Promega）を使用してBeckman Coulter Biotek Fxロボットにおいて抽出した。
【００５３】
ＥＰＳＰＳ遺伝子内のＰｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒ突然変異を同定するように、ＰＣＲプライマーを設計した。順方向プライマーは長さ１２０塩基対であり、また突然変異部位の上流側のコンセンサスEleucine indica配列にマッチングさせ、このプライマーをＰｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位に対してＮ−４位置におけるコンセンサス配列に対して突然変異させた。逆方向プライマーは長さ３５塩基対であり、またコンセンサス配列に基づいており、そしてＰｒｏ１０６Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位に対してＮ＋２位置におけるコンセンサス配列に対して突然変異させた。プライマーの３’末端を単一塩基対によって分離した。
【００５４】
順方向プライマー配列：
GAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCAGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTC
CCAGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAGGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGA
ACTGCAATTCGA［SEQ ID No:8］
【００５５】
逆方向プライマー配列：
ATTTCCTCCAGCAGCAGTTACGGCTGCTGTCAACG［SEQ ID No:9］
【００５６】
ＡｓｕＩ（認識部位＝TTCGAA［SEQ ID No:10］）、及びＰｖｕＩ（認識部位＝CGATCG［SEQ ID No:11］）で制限消化すると、下記制限プロフィールが予期された：
【００５７】
【表４】
2009540854.tif 000005
【００５８】
もちろん、植物試料がこの遺伝子座においてヘテロ接合体であるときには、上記制限プロフィールの混合物が各試料に対して得られる。例えばその試料がヘテロ接合型であり、野生型対立遺伝子とＴｈｒ対立遺伝子とを含有する場合、制限プロフィールは、ＡｓｕＩＩで試料のほぼ半分が消化されたことを示すが、しかしＰｖｕＩでは全く消化を示さない。
【００５９】
０．８μＭの各プライマーと１０〜５０ｎｇの植物ゲノムＤＮＡとを含有する総容積２５μｌで、puReTaq Ready-To-Go PCRビーズ（Amersham Biosciences）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した。９４℃２分間の初期変性ステップ、これに続いて９４℃３０秒間、６４℃３０秒間、及び７２℃１分間を４０サイクルを行うようにプログラミングされたEppendorf Master Cycle Gradient Thermocycler Model 96上でＰＣＲを実施した。７２℃１０分間の最終伸長ステップも含まれた。
【００６０】
また、位置６１２１／６１２２（位置２０４１におけるアミノ酸の状態と等価）の周りに重要なヌクレオチド残基を包含するＰＣＲ生成物を発生させる典型的なＰＣＲプライマー対を使用して、各試料を増幅した。
【００６１】
順方向プライマー配列：
CTCTTCTTGGGGAATGCTGGA［SEQ ID No:12］
【００６２】
逆方向プライマー配列：
TAACCTTGCCACCAGGTAGCCCTC［SEQ ID No:13］
【００６３】
続いて、逆方向ＰＣＲプライマーを使用して、ニートのＰＣＲ生成物１μｌ上で直接配列決定を実施した。これは、配列決定の結果とＬＰ−（ｄ）ＰＡＣＳアッセイの結果とを比較するために行った。
【００６４】
ニートのＰＣＲ生成物の４μｌアリコートをＡｓｕＩＩ及びＰｖｕＩ（New England Biolabs）で消化し（各反応は製造業者の推奨に従って２０μｌの総容積で行った）、そして１  Ｘ  ＴＢＥ緩衝剤中２％のアガロース（これらは両方とも０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を含有する）上で分離した。
【００６５】
この方法を、マレーシア産の混合グリホセート耐性のグース・グラス個体群に適用した。下記表から明らかなように、アッセイは、配列決定によって確認されているように、各植物中に含有された対立遺伝子を正しく同定した。
【００６６】
【表５】
2009540854.tif 000006
【００６７】
プライマー対を他の種において試験し、そしてこれが綿花、トウモロコシ、ライグラス、大豆、及びキビから正しい長さのＤＮＡを増幅することを見いだし、こうして、単子葉植物から双子葉植物へさえ転用可能な、プライマーの幅広い転用可能性を実証した。
【００６８】
同じ１２０ｂｐ順方向プライマーをまた、Ｎ＋３に付加的な強制突然変異を有する異なる逆方向プライマーと組み合わせて使用した。これは、野生型プロリン残基をも陽性に同定可能にするために行った。
【００６９】
順方向プライマー配列：
GAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCAGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTC
CCAGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAGGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGA
ACTGCAATTCGA［SEQ ID No:8］
【００７０】
逆方向プライマー配列：
ATTTCCTCCAGCAGCAGTTACGGCTGCTGTCACCG［SEQ ID No:14］
【００７１】
ＰＣＲ増幅時には、この付加的な突然変異は、野生型プロリン・アミノ酸残基の検出に対して特異的な酵素ＨｐａＩＩに対する特徴的な制限部位を形成する。
【００７２】
３つの強制突然変異（１つは順方向プライマー内、２つは逆方向プライマー内）があるのにもかかわらず、第２のプライマー・セットは、転用可能性が極めて高く、幅広い多様な植物種範囲全体にわたって成功裡に増幅されることが判った。ＨａｐＩＩによる消化は、プロリン残基を陽性に同定し、そして配列決定の結果と相関関係を有した。逆方向プライマー内にこの第２の突然変異を含むことによって、２つのセリン又はトレオニン残基をそれぞれＰｖｕＩ及びＡｓｕＩＩ制限酵素で陽性に識別する可能性を変えることはない。この例は、本発明のアッセイのロバスト性のさらなる証明である。
【００７３】
言うまでもなく、本明細書中に記載された例及び実施態様は、例示を目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲から逸脱することなしに、種々の変更形が当業者には明らかである。本明細書に引用した全ての刊行物を、それぞれの個々の刊行物が参考のため引用されることを具体的且つ個別に示したのと同じ程度に、全ての目的において参考のため全体的に本明細書中に引用する。
【００７４】
参考文献
Christoffers, M.J.; Berg, M.L.; Messersmith, C.G.  アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ内のイソロイシンからロイシンへの突然変異は、野生カラスムギにおける除草剤耐性を付与する。Genome, 2002. Vol. 45, No.6, p. 1049-1056。
Delye, C.; Calmes, E.; Matejicek, A.  アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ阻害除草剤に対して耐性のブラック・グラス(Alopecurus myosuroides Huds.）遺伝子型に対するＳＮＰマーカー。Theoretical and applied genetics, 2000a, Vol. 104, p. 1114-1120。
Delye, C.; Matejicek, A.; Gasquez, J.  ブラック・グラス(Alopecurus myosuroides Huds）及びライグラス(Lolium rigidum Gaud)におけるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ阻害除草剤に対する耐性の、ＰＣＲに基づく検出。Pest Management Science, 2002b. Vol 58, p. 474-478。
Delye, C.; Wang, T.; Darmency, H.  グリーン・フォックステイル（Setaria viridis L. Beauv.)に由来する葉緑体アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼにおけるイソロイシン−ロイシン置換が、シクロヘキサンジオン除草剤セトキシジムに対する耐性の原因となる。Planta, 2002c. Vol. 214, No. 3, p. 421-427。
Neff. M.M.; Neff, J.D.; Chory, J; Pepper, A. E. dCAPS、単一ヌクレオチド多型の遺伝子分析のためのシンプルな技術：Arabidopsis thalianaの遺伝的特性における実験的応用、Plant Journal, 1998, Vol. 14, p. 387-392。
【国際調査報告】
2009540854.tif 000007
2009540854.tif 000008
2009540854.tif 000009
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