(57)【要約】  生物学的に活性な分子のインビボでの特性を改善するために、生物学的に活性な分子を、ポリマー、高分子量の非免疫原性及び親油性化合物と抱合させることが記載されてきた。本発明は、ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結するシクリトールとを含む抱合体に関する。本発明は、ポリマーと、活性な官能基と、及び前記ポリマーを前記活性な官能基へ連結するシクリトールとを含む活性化されたポリマー組成物にも関する。
2009510182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結するシクリトール基とを含む、抱合体。
【請求項２】
シクリトール基が、６員のシクロアルカン又は５員のシクロアルカンである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項３】
シクリトール基が、トリ、テトラ、ペンタ及びヘキサヒドロキシシクロヘキサンからなる群から選択される、請求項１に記載の抱合体。
【請求項４】
シクリトール基が、アルキル、アミノ、チオ、カルボニル及びハロゲン置換基からなる群から選択される置換基を含む、請求項１に記載の抱合体。
【請求項５】
シクリトール基が、イノシトールである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項６】
イノシトールが、ミオイノシトール、Ｄ−キロイノシトール、Ｌ−キロイノシトール、ムコイノシトール、シロ（Ｓｃｙｌｌｏ）イノシトール、アロイノシトール、エピイノシトール、シスイノシトール及びネオイノシトールからなる群から選択される、請求項５に記載の抱合体。
【請求項７】
生物学的に活性な分子が、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、色素、脂質、細胞、ウィルス、リポソーム、微粒子及びミセルからなる群から選択される、請求項１に記載の抱合体。
【請求項８】
生物学的に活性な分子が、オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項９】
生物学的に活性な分子が、アプタマーである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１０】
生物学的に活性な分子が、抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１１】
生物学的に活性な分子が、配列
【化１】
2009510182.tif 000013
を有する抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１２】
ポリマーが水溶性である、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１３】
ポリマーが非ペプチド性ポリマーである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１４】
ポリマーが非核酸ポリマーである、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１５】
ポリマーが高分子量の立体的な基である、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１６】
ポリマーが、ポリエーテルポリオール、ポリエチレングリコール、多糖類、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、アルギナート、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリラート、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、キトサン、ポリアルデヒド及びポリエーテルからなる群から選択される、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１７】
ポリマーが、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１８】
ポリマーが、約２０ｋＤａ、４０ｋＤａ及び８０ｋＤａからなる群から選択される分子量を有する、請求項１に記載の抱合体。
【請求項１９】
式：
【化２】
2009510182.tif 000014
（式中、
Ａ１が、生物学的に活性な部分又は活性な官能基であり；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅが、−ＯＨ、−ＮＨ２及び−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２からなる群から各々独立に選択され；
Ａ２が、水素、ポリマー、生物学的に活性な部分及び活性な官能基からなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２が、結合及びスペーサー部分からなる群から各々独立に選択され；
Ｘ１及びＸ２が、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から各々独立に選択され；並びに；
Ｒ２が、水素及び低級アルキル基からなる群から各々独立に選択される。）
を有する化合物及び医薬として許容されるそれらの塩。
【請求項２０】
Ａ１が生物学的に活性な部分である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ａ１が活性な官能基である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
活性な官能基が求電子官能基である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
活性な官能基が、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸塩化物、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミドカルボナート、スクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルカルボナートエステル、Ｎ−ヒドロキシマレイミジルエステル、ビニルスルホン、アザラクトン、環状アミドチオンカルボニル、イミダゾールカルボニル、イソシアナート及びイソチオシアナートからなる群から選択される求電子官能基である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも１つが、−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも２つが、各々独立に−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも３つが、各々独立に−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも４つが、各々独立に−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの各々が独立に−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｌ１及びＬ２が、各々独立に、式：
−（ＣＨ２）ｎ−（Ｘ３）ｍ−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−（Ｘ５）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−
（ｎは、０から１０であり、
ｍは、０又は１であり、
ｐは、０又は１であり、
ｑは、０又は１であり、及び
ｒは、０から１０である。）
によって表されるスペーサー部分である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｌ１及びＬ２が、各々独立に、
−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−；
−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−（ＣＨ２）ｒ−；
−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−；及び
−（ＣＨ２）ｎ−；
（ｎは、０ないし１０であり；
ｐは、０又は１であり；及び
ｒは、０ないし１０である。）
からなる群から選択される式によって表されるスペーサー部分である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５が、各々独立に、−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群から選択される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５が、各々−Ｏ−である、請求項１９に記載の化合物。  
【請求項３３】
【化３】
2009510182.tif 000015
（Ｄは、生物学的に活性な部分であり；
ＰＯＬＹは、ポリマーであり；
Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、各々独立に、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から選択され；
Ｒ２は、水素及び低級アルキル基からなる群から選択され；
ｍは、０又は１であり；及び
ｎは、０から１０までの整数である。）
からなる群から選択される式を有する化合物及び医薬として許容されるその塩。
【請求項３４】
Ｄが核酸である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｄがアプタマーである、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｄが抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｄが、配列
【化４】
2009510182.tif 000016
を有する抗ＶＥＧＦアプタマーである、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３８】
【化５】
2009510182.tif 000017
2009510182.tif 000018
（Ｇは、脱離基であり；
ＰＯＬＹは、ポリマーであり；
Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、各々独立に、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から選択され；
Ｒ２は、水素及び低級アルキル基からなる群から選択され；
ｍは、０又は１であり；並びに
ｎは、０から１０までの整数である。）
からなる群から選択される式を有する化合物及び医薬として許容されるその塩。
【請求項３９】
Ｇが、ハロゲン化物、塩化物、Ｎ−スクシンイミド、１−ベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド、アザラクトン、環状アミドチオン及びイミダゾールからなる群から選択される脱離基である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
構造：
【化６】
2009510182.tif 000019
（式中、Ｚは、約４５０である。）
を有する化合物及び医薬として許容されるその塩。
【請求項４１】
構造：
【化７】
2009510182.tif 000020
（Ｚは、約４５０である。）
を有する化合物及び医薬として許容されるその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年７月２８日に出願された米国仮出願第６０／７０３，１３３号、代理人整理番号ＥＹＥ−０３４Ｐ（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結する炭素環式基とを含む抱合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的に活性な分子のインビボでの特性を改善するために、生物学的に活性な分子を、ポリマー、高分子量の非免疫原性及び親油性化合物と抱合させることが記載されてきた。ポリマー、高分子量の非免疫原性及び親油性化合物で修飾された生物学的に活性な分子は、修飾されていない様式のものと比較して、低下した免疫原性／抗原性及び改善された安定性等の薬物動態学的特性を示す。例えば、米国特許第６，０１１，０２０号は、アプタマーのインビボでの循環半減期を延長させるために、高分子量の非免疫原性化合物をアプタマーに抱合させることを開示している。
【０００４】
活性化されたポリマーは、結合部位として機能する求核性官能基を有する生物学的に活性な分子と反応させる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコールは、最も広範に使用されるポリマーに属する。米国特許第４，１７９，３３７号は、ＰＥＧをペプチド又はポリペプチドに結合する初期モデルについて記載する。米国特許第５，１２２，６１４号は、Ｎ−スクシンイミドカルボナート官能基で活性化されたＰＥＧ分子が、水性塩基性条件下で、ポリペプチドのアミン基へのウレタン結合によって結合され得ることを開示する。米国特許第５，９３２，４６２号は、活性化された多アーム化ＰＥＧ分子及び多アーム化ＰＥＧ抱合体について記載する。多アーム化ＰＥＧ抱合体は、ＰＥＧ鎖と生物学的に活性な分子の間のリンカーとして、リジン等の多機能性中央部分に結合された２つの直鎖ＰＥＧ単位を含有する。
【０００５】
生物学的に活性な分子へ結合させるのに有用な新たな活性化されたポリマー誘導体及び、生物学的に活性な分子とポリマーを含む新たな抱合体に対する必要性が継続的に存在する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結するシクリトールとを含む抱合体に関する。
【０００７】
本発明は、ポリマーと、活性な官能基と、及び前記ポリマーを前記活性な官能基へ連結するシクリトールとを含む活性化されたポリマー組成物にも関する。
【０００８】
本発明は、ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結するシクリトールとを含む抱合体を形成する方法にも関する。
【０００９】
ある態様において、本発明は、式：
【００１０】
【化８】
2009510182.tif 000003
（Ａ１は、生物学的に活性な部分又は活性な官能基であり；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅが、−ＯＨ、−ＮＨ２及び−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２からなる群から各々独立に選択され；
Ａ２は、水素、ポリマー、生物学的に活性な部分及び活性な官能基からなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２は、結合及びスペーサー部分からなる群から各々独立に選択され；
Ｘ１及びＸ２は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から各々独立に選択され；並びに
Ｒ２は、水素及び低級アルキル基からなる群から選択される。）
を有する化合物に関する。
【００１１】
本発明は、幾つかの利点を有する。シクリトールは、単一のリンカー単位を通じて生物学的に活性な分子の広範なスペクトルへ最大５個のポリマーを結合できる万能多官能性部分である。シクリトールは、加水分解に対して安定した結合を有する抱合体を与える頑強な部分でもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結するシクリトールとを含む抱合体に関する。
【００１３】
本発明は、ポリマーと、活性な官能基と、及び前記ポリマーを前記活性な官能基へ連結するシクリトールとを含む活性化されたポリマー組成物にも関する。
【００１４】
ある態様において、前記組成物は、式：
【００１５】
【化９】
2009510182.tif 000004
（Ａ１は、生物学的に活性な部分又は活性な官能基であり；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅは、−ＯＨ、−ＮＨ２及び−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２からなる群から各々独立に選択され；
Ａ２は、水素、ポリマー、生物学的に活性な部分及び活性な官能基からなる群から選択され；
Ｌ１及びＬ２は、結合及びスペーサー部分からなる群から各々独立に選択され；
Ｘ１及びＸ２は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から各々独立に選択され；並びに
Ｒ２は、水素及び低級アルキル基からなる群から選択される。）
を有する。
【００１６】
一実施形態において、Ａ１は、生物学的に活性な部分である。別の実施形態において、Ａ１は、核酸である。別の実施形態において、Ａ１は、アプタマーである。別の実施形態において、Ａ１は、抗ＶＥＧＦアプタマーである。
【００１７】
一実施形態において、Ａ１は、活性な官能基である。別の実施形態において、Ａ１は、求電子官能基である。別の実施形態において、Ａ１は、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸塩化物、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミドカルボナート、スクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルカルボナートエステル、Ｎ−ヒドロキシマレイミジルエステル、ビニルスルホン、アザラクトン、環状アミドチオンカルボニル、イミダゾールカルボニル、イソシアナート又はイソチオシアナートを含む活性な官能基である。
【００１８】
一実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも１つは、独立に、−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である。別の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも２つは、独立に、−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である。別の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも３つは、独立に、−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である。別の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの少なくとも４つは、独立に、−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である。別の実施形態において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ及びＲ１ｅの各々は、独立に、−Ｘ２−Ｌ２−Ａ２である。
【００１９】
一実施形態において、Ａ２はポリマーである。別の実施形態において、少なくとも１つのＡ２はポリマーである。別の実施形態において、Ａ２は生物学的に活性な部分である。別の実施形態において、Ａ２は活性な官能基である。
【００２０】
一実施形態において、Ｌ１及びＬ２は各々独立に、式：
−（ＣＨ２）ｎ−（Ｘ３）ｍ−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−（Ｘ５）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−
（ｎは、０ないし１０であり；
ｍは、０又は１であり；
ｐは、０又は１であり；
ｑは、０又は１であり；及び
ｒは、０ないし１０である。）
によって表されるスペーサー部分である。
【００２１】
別の実施形態において、Ｌ１及びＬ２は、各々独立に、
−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−、
−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−（ＣＨ２）ｒ−、
−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−、及び
−（ＣＨ２）ｎ−
（ｎ、ｐ及びｒは、上述のとおりである。）
からなる群から選択される式によって表されるスペーサー部分である。
【００２２】
一実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、各々独立に、−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群から選択される。別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、各々、−Ｏ−である。
【００２３】
別の態様において、抱合体は、
【００２４】
【化１０】
2009510182.tif 000005
（Ｄは、生物学的に活性な部分であり；
ＰＯＬＹは、ポリマーであり；
各Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から各々独立に選択され；
Ｒ２は、水素及び低級アルキル基からなる群から選択され；
ｍは、０又は１であり、及び
ｎは、０から１０までの整数である。）
からなる群から選択される式を有する。
【００２５】
一実施形態において、Ｄは核酸である。別の実施形態において、Ｄはアプタマーである。別の実施形態において、Ｄは抗ＶＥＧＦアプタマーである。
【００２６】
ある具体的な実施形態において、前記抱合体は、
【００２７】
【化１１】
2009510182.tif 000006
（Ｚは、約４５０である。）
からなる群から選択される式を有する。
【００２８】
別の態様において、前記活性化されたポリマー組成物は、
【００２９】
【化１２】
2009510182.tif 000007
（Ｇは、脱離基であり；
ＰＯＬＹは、ポリマーであり；
各Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ２−からなる群から各々独立に選択され；
Ｒ２は、水素及び低級アルキル基からなる群から選択され；
ｍは、０又は１であり；並びに
ｎは、０から１０までの整数である。）
からなる群から選択される式を有する。
【００３０】
一実施形態において、Ｇは、ハロゲン化物、塩化物、Ｎ−スクシンイミド、１−ベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド、アザラクトン、環状アミドチオン及びイミダゾールからなる群から選択される脱離基である。
【００３１】
一実施形態において、ＰＯＬＹは、高分子量ポリマーである。別の実施形態において、ＰＯＬＹは、ポリエーテルポリオール、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリラート、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、他のセルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド及びポリエーテルからなる群から選択されるポリマーである。別の実施形態において、ＰＯＬＹは、ポリアルキレングリコールである。別の実施形態において、ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００３２】
別の実施形態において、ＰＯＬＹは、５ｋＤａから１００ｋＤａまでの分子量を有するＰＥＧである。別の実施形態において、ＰＯＬＹは、約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。
【００３３】
一実施形態において、各Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、各々独立に、−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群から選択される。
【００３４】
一実施形態において、ｎは、０ないし６の整数である。別の実施形態において、ｎは、５である。
【００３５】
具体的な実施形態において、２つ以上のポリマーが存在し、各ポリマーは、同一又は別異であり得ることが理解される。
【００３６】
具体的な実施形態において、２つ以上の生物学的に活性な分子が存在し、生物学的に活性な各分子は、同一又は別異であり得ることが理解される。
【００３７】
本明細書において「シクリトール」とは、１つ又はそれ以上の環原子上にヒドロキシル基を含むシクロアルカンである。Ｔ．Ｈｕｄｌｉｃｋｙらは、公知のシクリトール及びそれらの誘導体についてまとめている（Ｃｙｃｌｉｔｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ，Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄａｔａ，Ｔ．Ｈｕｄｌｉｃｋｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃｅｂｕｌａｋ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  １９９３（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。））。
【００３８】
一実施形態において、シクリトールは、６員のシクロアルカンである。一実施形態において、シクリトールは、５員のシクロアルカンである。一実施形態において、シクリトールは、トリ−、テトラ−、ペンタ−及びヘキサ−ヒドロキシシクロヘキサンである。シクリトール誘導体は、場合によって、アルキル、アミノ、チオ、カルボニル又はハロゲン置換基を含む置換基を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３９】
一実施形態において、シクリトールは、イノシトールである。イノシトールは、ミオイノシトール、Ｄ−キロイノシトール、Ｌ−キロイノシトール、ムコイノシトール、シロ（Ｓｃｙｌｌｏ）イノシトール、アロイノシトール、エピイノシトール、シスイノシトール及びネオイノシトールを含むが、これらに限定されるわけではない。（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．Ｂ．Ｒｅｉｔｚ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１参照（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。）
本明細書でいう「活性化されたポリマー」とは、活性な官能基を含むポリマーである。活性化されたポリマーは、抱合体を形成するために、生物学的に活性な分子と結合するために使用することが可能である。
【００４０】
本明細書でいう「活性な官能基」とは、他の分子上の求電子基又は求核基と迅速に反応できる官能基である。例えば、本分野で理解されるように、「活性なエステル」という語は、アミン等の求核基と迅速に反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボキシラートエステル等のエステルを含む。活性なエステルの他の例は、Ｎ−ヒドロキシマレイミドカルボキシラートエステル及び１−ベンゾトリアゾリルカルボナートエステルを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
活性な官能基は、脱離基を含み得る。適切な脱離基の例は、ハロゲン化物、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−スクシンイミド、１−ベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド、環状アミドチオン及びイミダゾールを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４２】
求核試薬と反応する活性な官能基の例は、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸塩化物、Ｎ−スクシンイミドカルボナート、スクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルカルボナートエステル、Ｎ−ヒドロキシマレイミジルエステル、ビニルスルホン、アザラクトン、環状アミドチオンカルボニルイミダゾール、イソシアナート及びイソチオシアナートを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
求電子試薬と反応する活性な官能基の例は、第一級アミン、アルコール、ヒドラジン及びヒドラジド官能基、アシルヒドラジド、カルバザート（ｃａｒｂａｚａｔｅ）、セミカルバザート（ｓｅｍｉｃａｒｂａｚａｔｅ）及びチオカルバザート（ｔｈｉｏｃａｒｂａｚａｔｅ）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
例えば、酸化ポリアルキレンを求核試薬に結合させるために、酸化ポリアルキレンのヒドロキシル末端基のうちの１つを、活性な官能基へと転化する。この工程は、「活性化」と称され、その生成物は、「活性化されたポリアルキレンオキシド」と称される。
【００４５】
本明細書に使用される「スペーサー」又は「スペーサー部分」という用語は、シクリトールを、生物学的に活性な部分又は活性な官能基と共有結合させる部分を指す。
【００４６】
一実施形態において、前記スペーサーは、式：
−（ＣＨ２）ｎ−（Ｘ３）ｍ−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−（Ｘ５）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−
（ｎは、０ないし１０であり；
ｍは、０又は１であり；
ｐは、０又は１であり；
ｑは、０又は１であり；及び
ｒは、０ないし１０である。）
によって表される。
【００４７】
別の実施形態において、前記スペーサーは、
−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−、
−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−（ＣＨ２）ｒ−、
−（Ｃ（Ｘ４））ｐ−、及び
−（ＣＨ２）ｎ−
（ｎ、ｐ及びｒは、上述のとおりである。）
からなる群から選択される式によって表される。
【００４８】
「低級アルキル基」は、Ｃ１−Ｃ８直鎖又は分岐鎖炭化水素、又はＣ３−Ｃ８環状炭化水素である。低級アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４９】
「加水分解に対して安定である」又は「加水分解できない」結合又は連結という語は、本明細書において、水中で実質的に安定であるか、又は水と実質的に反応しない結合又は連結を表すために使用される。例えば、加水分解に対して安定である連結は、延長した期間、水性条件下で反応しない。加水分解に対して安定である連結は、水性条件下で無限に存在し得る。
【００５０】
「生理学的に安定である」結合又は連結という語は、本明細書において、インビボでの開裂又は加水分解に対して実質的に安定であるが、他のインビトロ因子の存在下においても安定であり得る結合又は連結を指すよう使用される。生理学的に安定した結合又は連結は加水分解に対して安定であり、患者の細胞、臓器、皮膚、膜又は身体内のその他の部分における生理学的プロセスに対して安定である。生理学的に安定である連結は、生理学的条件下で無限に存在し得る。
【００５１】
「エステラーゼ耐性のある」又は「エステラーゼに対して安定である」結合又は連結は、エステラーゼの存在下で安定である。
【００５２】
全ての結合又は連結が水性条件下又は生理学的条件下で適度の安定性を有することが好ましいが、特定の態様において、選択的に加水分解可能な結合又は連結の使用が想定される。選択的に加水分解可能な結合又は連結は、循環中において、適度な安定性をなお有する。「選択的に加水分解可能な」結合又は連結は、特定の条件下でのみ、又は特定の条件下で優先的に、放出可能な、開裂可能な又は加水分解可能な全ての連結を含む。
【００５３】
選択的に加水分解可能な結合の例は、ジスルフィド結合及びトリスルフィド結合並びに酸不安定性結合を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」又は「生物学的に活性な因子」は、ウィルス、細菌、真菌、植物、動物及びヒトを含む（但し、これらに限定されるわけではない。）生物体の何らかの物理的又は生化学的特性に影響を及ぼし得る全ての物質であり得る。生物学的に活性な分子は、ヒト又は他の動物における疾病の診断、治癒緩和、治療若しくは予防を目的とするか、又はヒト若しくは動物の肉体的又は精神的健康を増進するようことを目的とする全ての物質を含み得る。生物学的に活性な分子の例は、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、色素、脂質、細胞、ウィルス、リポソーム、微粒子及びミセルを含むが、これらに限定されるわけではない。本発明で使用するのに適した生物学的に活性な物質のクラスは、抗生物質、殺真菌薬、抗ウィルス薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、心臓血管薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤等を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５５】
「治療すること」の意味するところは、疾病、病理学的状態又は疾患の治癒、寛解、静止若しくは予防が得られることを目的とした、患者の医学的管理である。この用語は、積極的な治療、すなわち特に疾病、病理学的状態又は疾患から回復することを目指す治療を含み、原因の治療、すなわち疾病、病理学的状態又は疾患の原因を除去することを目指した治療を含む。更に、本用語は、緩和治療、すなわち疾病、病理学的状態又は疾患の治癒ではなく、むしろ症状の緩和を意図した治療、予防治療、すなわち疾病、病理学的状態又は疾患を予防することを目指した治療、及び補強治療、すなわち疾病、病理学的状態又は疾患からの回復を目指した別の特定の療法を補充するために使用される治療を含む。「治療すること」という語は、対症治療、すなわち疾病の全身症状、病理学的状態又は疾患に対する治療も含む。
【００５６】
一実施形態において、本発明の方法は、眼の血管新生疾患を抑制又は治療するための手段を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の方法による治療又は抑制の影響を受けやすい眼の血管新生疾患は、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、加齢黄斑変性、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、早産児網膜症、網膜血管閉塞、糖尿病網膜虚血、糖尿病黄斑浮腫又は増殖糖尿病網膜症を含む。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、これを必要としている患者又はこのような疾患を発症していると診断されたか若しくは発症のリスクを有する患者において、乾癬又は関節リウマチを抑制又は治療するための手段を提供する。
【００５７】
本明細書で使用される「血管新生」及び「血管形成」という用語は、同一の意味で使用される。血管新生及び血管形成とは、細胞、組織又は臓器中への新たな血管の発生を表す。血管形成の調節は、典型的には、ある種の疾病の状態において変化し、多くの場合、前記疾病と関連した病理学的損傷は、変化した、制御されていない、又は調節されていない血管形成と関連する。持続的で制御されていない血管形成は、上皮細胞による異常な増殖によって特徴付けられるものを含む複数の疾病状態において生じ、血管の漏れ及び透過性など、これらの状態で見られる病理学的損傷の基礎となる。
【００５８】
「眼の血管新生疾患」の意味するところは、患者の眼における変化した又は制御されていない血管形成によって特徴付けられる疾患である。典型的な眼の血管新生疾患は、視神経乳頭血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性症、ぶどう膜炎、網膜の炎症性疾患及び増殖硝子体網膜症を含む。
【００５９】
アプタマー及びＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦの活性又は生成を阻害する多様な抗ＶＥＧＦ薬が利用可能であり、本発明の方法において使用できる。特定の抗ＶＥＧＦ薬は、米国特許第６，１６８，７７８号、第６，１４７，２０４号、第６，０５１，６９８号、第６，０１１，０２０号、第５，９５８，６５１号、第５，８１７，７８５号、第５，８１１，５３３号、第５，６９６，２４９号、第５，６８３，８６７号、第５，６７０，６３７号及び第５，４７５，０９６号（参照により、その全体が本明細書に組み入れられる）に記載のもの等の、ＶＥＧＦの核酸リガンドである。ある具体的な抗ＶＥＧＦ薬は、ペガプタニブナトリウムである。
【００６０】
生物学的に活性な物質のクラスは、抗生物質、抗ウィルス薬及び抗真菌薬を含む（但し、これらに限定されるわけではない。）抗感染薬、鎮痛薬、抗アレルギー薬、肥満細胞安定化剤、ステロイド性及び非ステロイド性抗炎症薬、鬱血除去薬、アドレナリン作用薬、βアドレナリン遮断薬、αアドレナリン遮断薬、副交感神経刺激薬、コリンエステラーゼ阻害剤、炭酸脱水酵素阻害剤、並びにプロスタグランジンを含むがこれに限定されるわけではない抗緑内障薬、抗酸化剤、栄養補助食品、血管新生阻害剤、代謝拮抗薬、線維素溶解薬、創傷調節薬、神経保護薬、血管新生抑制ステロイド、散瞳薬、毛様体筋麻痺散瞳薬、縮瞳薬、血管収縮薬、血管拡張薬、抗凝固薬、抗癌薬、免疫調節薬、ＶＥＧＦアンタゴニスト、免疫抑制剤、並びにこれらの組み合わせ及びこれらのプロドラッグを含む。他の生物学的に活性な物質は、色素、脂質、細胞、ウィルス、リポソーム、微粒子及びミセルを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
生物学的に活性な物質の例は、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アプタマー、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素、融合タンパク質、ポルフィリン、及び小分子薬を含むが、これらに限定されるわけではない。抗体の例は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ社製のＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））及びラニズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））を含むが、これに限定されるわけではない。アプタマーの例は、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）；（ＯＳＩ）Ｅｙｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）を含むが、これらに限定されるわけではない。ステロイドの例は、酢酸アネコルタブ（Ｒｅｔａａｎｅ（登録商標）；Ａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を含むが、これに限定されるわけではない。融合タンパク質の例は、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ（商標）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を含むが、これに限定されるわけではない。ＲＮＡｉの例は、Ｄｉｒｅｃｔ  ＲＮＡｉ（商標）（Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含むが、これに限定されるわけではない。
【００６２】
本発明の組成物は、血管新生疾患の治療に効果的な濃度をもたらす何れかの適切な手段によって投与され得る。例えば、各組成物は、適切な担体物質と混合され得、一般に、前記組成物の総重量の１ないし９５重量％の量で存在する。前記組成物は、眼科的、経口的、非経口的（例、静脈内、筋肉内、皮下的）、直腸内、経皮的、経鼻的、又は吸入投与に適した剤形で提供され得る。従って、前記組成物は、例えば、錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、懸濁液、乳剤、溶液、ヒドロゲルを含むゲル、ペースト、軟膏剤、クリーム、硬膏剤、送達デバイス、坐薬、浣腸、注射液、インプラント、スプレー又はエアロゾルの形態であり得る。単一のアンタゴニスト又は２つ若しくはそれ以上のアンタゴニストを含有する医薬組成物は、従来の薬学的慣例に従って製剤され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（２０ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−２００２，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００６３】
本明細書に開示されている生物学的に活性な物質の、医薬として許容されるプロドラッグも本発明に含まれ、本明細書に開示される組成物及び方法において使用できることは理解される。
【００６４】
本明細書に開示されている生物学的に活性な物質の、医薬として許容される塩も本発明に含まれ、本明細書に開示される組成物及び方法において使用できることは理解される。
【００６５】
本発明のある態様において、抗ＶＥＧＦ薬は、徐放性製剤中に付与される。徐放性微粒子の例は、米国特許仮出願第６０／７９６，０７１号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載される。
【００６６】
一実施形態において、徐放性製剤は、ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体からなる群から選択される生体適合性、生分解性ポリマーを含む。
【００６７】
本発明の製剤は、眼の全ての疾病の治療において使用され得る。本発明の製剤は、抗ＶＥＧＦ薬を特定の眼の組織、例えば網膜又は脈絡膜へ誘導するためにも使用され得る。抗ＶＥＧＦ薬又は生物学的に活性な物質の組み合わせは、治療される疾病、疾患又は状態に基づいて選択される。特定の状態のための抗ＶＥＧＦ薬に加え、他の化合物、例えば、微生物の増殖を予防するための抗生物質が、二次的な効果のために含まれ得る。製剤の量及び投薬頻度は、治療される疾病、疾患又は状態及び使用される生物学的に活性な物質に依存する。当業者は、この決定をなし得る。
【００６８】
「オリゴマー」という語は、ポリマーと考えるには小さすぎる分子量を有するポリマーを指す。オリゴマーは、典型的には、数百の分子量を有するが、ポリマーは、典型的には、数千又はそれ以上の分子量を有する。
【００６９】
「オリゴヌクレオチド」という語は、自然に存在する塩基、糖及び糖間（主鎖）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド単量体のオリゴマー又はポリマーを指す。この語には、同様に機能する天然には存在しない単量体又はその一部を含む修飾された又は置換されたオリゴマーも含まれる。置換されたオリゴマーの組み込みは、細胞内取り込みの増強又はヌクレアーゼ抵抗性の亢進などの要因に基づいており、本分野で周知のように選択される。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「アプタマー」という語は、非共有結合の物理的相互作用を介して、ポリヌクレオチドではない分子に対する選択的な結合親和性を有する全てのポリヌクレオチド又はその塩を意味する。アプタマーは、抗体のエピトープへの、抗体の結合と類似した様式で、リガンドに結合するポリヌクレオチドであり得る。標的分子は、すべての興味深い分子であり得る。ポリヌクレオチドではない分子の例は、タンパク質である。アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインへ結合し、これにより天然のリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用できる。
【００７１】
「抗ＶＥＧＦアプタマー」又は「ＶＥＧＦアプタマー」は、ＶＥＧＦへ結合し、ＶＥＧＦの活性を阻害するポリヌクレオチドアプタマーを包含するものとする。このような抗ＶＤＧＦアプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー又は混合した（つまり、ＲＮＡ及びＤＮＡ）組成物を有するアプタマーであり得る。このようなアプタマーは、公知の方法を使用して同定できる。例えば、試験管内進化法又はＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，４７５，０９６号及び第５，２７０，１６３号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されるように使用できる。抗ＶＥＧＦアプタマーは、米国特許第６，１６８，７７８号、第６，０５１，６９８号、第５，８５９，２２８号及び第６，４２６，３３５号その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられるに記載されている配列を含む。前記配列は、５’−５’反転されたキャップ及び／又は３’−３’反転されたキャップを含むように修飾できる。（Ａｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，公開された出願ＷＯ２００５／０１４８１４（その全体の内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。）を参照されたい。）。
【００７２】
本発明の適切な抗ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列ＧＡＡＧＡＡＵＵＧＧ（配列番号１）、又はヌクレオチド配列
【００７３】
【化１３】
2009510182.tif 000008
を含む。
【００７４】
抗ＶＥＧＦアプタマーの例は、以下のものを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７５】
（ｉ）配列ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ（米国特許第６，０５１，６９８号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載される配列番号４）を有する抗ＶＥＧＦアプタマー。各Ｃ、Ｇ、Ａ及びＵはそれぞれ、天然のヌクレオチドであるシチジン、グアニジン、アデニン及びウリジン、又はこれらに対応する修飾されたヌクレオチドを表し、好ましくは、
（ｉｉ）配列
【００７６】
【化１４】
2009510182.tif 000009
を有する抗ＶＥＧＦアプタマー。
【００７７】
ＰＥＧ化されたアプタマーの例は、構造
【００７８】
【化１５】
2009510182.tif 000010
を有するペガプタニブ（ＥＹＥ００１；ＭａｃＩ）である。
【００７９】
５’−５’キャップ形成された抗ＶＥＧＦアプタマーの例は、構造
【００８０】
【化１６】
2009510182.tif 000011
を有するＥＹＥ００２（ＭａｃＩＩ）であり、式中、「Ｇｍ」は、２’−メトキシグアニル酸を表し、「Ａｍ」は、２’−メトキシアデニル酸を表し、「Ｃｆ」は、２’−フルオロシチジル酸を表し、「Ｕｆ」は、２’−フルオロウリジル酸を表し、「Ａｒ」は、リボアデニル酸を表し、「Ｔｄ」は、デオキシリボチミジル酸を表す（Ａｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，公開された出願ＷＯ２００５／０１４８１４（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。
【００８１】
本発明のポリマーは、（ポリエチレングリコール等の）ポリエーテルポリオール、（カルボキシメチルセルロース、他のセルロース誘導体、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン及びアルギナート等の）多糖類、ポリエステル、（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）等の）高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリラート、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、キトサン、ポリアルデヒド又はポリエーテルを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８２】
一実施形態において、本発明のポリマーは、水溶性である。別の実施形態において、前記ポリマーは、非ペプチド性ポリマーである。別の実施形態において、前記ポリマーは、非核酸性ポリマーである。別の実施形態において、前記ポリマーは、高分子量の立体的な基である。
【００８３】
一実施形態において、前記ポリマーは、ポリエーテルポリオールである。一実施形態において、前記ポリマーは、ポリアルキレングリコールである。一実施形態において、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。前記ＰＥＧは、遊離ヒドロキシル基を有し得るか、又はアルキル化され得る。一実施形態において、リンカーへ結合されていない前記ＰＥＧの末端は、シクリトール、活性な官能基又は生物学的に活性な化合物は、メトキシ基を有する。末端のメトキシ基を含むＰＥＧは、「ｍＰＥＧ」とも呼ばれ得る。別の実施形態において、ポリアルキレングリコールは、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）及びその共重合体（例、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体）、それらのターポリマー、それらの混合物等である。
【００８４】
「ポリエチレングリコール」、「ポリ（エチレングリコール）」又は「ＰＥＧ」という語は、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨの全てのポリマーを指す。一実施形態において、ｎは、４以上である。一実施形態において、ｎは、約４から約４０００までである。別の実施形態において、ｎは、約２０から約２０００までである。一実施形態において、ｎは、約４５０である。一実施形態において、ＰＥＧは、約８００ダルトン（Ｄａ）から約１００，０００Ｄａの分子量を有する。更なる実施形態において、前記ポリエチレングリコールは、２０ｋＤａ  ＰＥＧ、４０ｋＤａ  ＰＥＧ、又は８０ｋＤａ  ＰＥＧである。
【００８５】
ポリエチレングリコールの平均的な相対分子量は、時には接尾の数によって示される。例えば、４０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するＰＥＧは、「ポリエチレングリコール４０００」と呼ばれ得る。ＰＥＧと抱合した生成物は、ＰＥＧ化された生成物と呼ばれ得る。
【００８６】
ＰＥＧという語の使用は、包括的であり、排他的であることを意図するものではない。他の関連したポリマーも本発明の実施における使用に適していることを理解されるべきである。ＰＥＧという語は、その形態の全てにおけるポリエチレングリコールを含み、二機能性ＰＥＧ、多分岐ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分岐鎖ＰＥＧ及びペンダント型ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格へ懸垂された１つ又はそれ以上の官能基を有するＰＥＧ又は関連ポリマー）を含む。
【００８７】
ＰＥＧは、幾つもの利点を有する。ＰＥＧは、典型的には、透明で、無色で、無臭で、水溶性で、熱安定性で、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解せず、又は劣化せず、一般に非毒性である。ＰＥＧは、生体適合性であると考えられる。例えば、ＰＥＧは、害を生じることなく、生組織又は生臓器と共存できる。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性である。例えば、ＰＥＧは、身体中で免疫反応を生じる傾向がない。身体中で生物学的に活性な物質等の、幾つかの望ましい機能を有する分子へ結合すると、ＰＥＧは、前記物質を遮蔽する傾向があり、生物体が前記物質の存在を耐容できるように、全ての免疫反応を低下又は除去することが可能である。ＰＥＧ抱合体は、実質的な免疫反応を生じない傾向にあるか、又は凝固若しくは他の望ましくない効果を生じない傾向にある。更に、ＰＥＧ等の可溶性の高分子量の立体的な基の付加は、アプタマーのアンタゴニスト特性を改善し得る（米国特許出願第１１／１０５，２７９号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。
【００８８】
一実施形態において、前記ポリマーは、多糖類である。多糖類の例は、デキストラン、セルロース、キトサン、ポリグルコサミン及びこれらの誘導体を含むが、これらに限定されるわけではない。多糖の還元末端は、抱合におけるシッフ塩基化学反応による分子のアミン基への結合に利用可能である。多糖類は、還元的アミノ化によって、アミン置換型シクリトール又は生物学的に活性な化合物のアミン末端等のアミンへ結合し得る。
【００８９】
別の実施形態において、前記ポリマーは、デキストランである。前記デキストランは、直鎖又は分岐鎖デキストランであり得る。別の実施形態において、前記デキストランは、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤｅｘ）である。
【００９０】
別の実施形態において、前記ポリマーは、セルロース誘導体である。別の実施形態において、前記ポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。
【００９１】
別の実施形態において、前記ポリマーは、ポリアルデヒドである。更なる実施態様において、前記ポリアルデヒド基は、合成により得られ得るか又はオリゴ糖の酸化によって得られ得る。
【００９２】
別の実施形態において、前記ポリマーは、アルギナートである。具体的な実施形態において、前記アルギナート基は、ナトリウム又はカルシウム等の陽イオン性対イオンを有する塩として提供される陰イオン性アルギナート基である。
【００９３】
別の実施形態において、前記ポリマーは、ポリエステルである。具体的な実施形態において、前記ポリエステル基は、共ブロック重合体のポリエステル基であり得る。
【００９４】
別の実施形態において、前記ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はポリ乳酸コグリコリド（ＰＬＧＡ）である。適切なＰＬＧＡ基及びＰＬＧＡ基を抱合するための方法は、Ｊ．Ｈ．Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，  １２，  ９１７−９２３；Ｊ．Ｅ．Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９９，  ５７，  ２６９−２８０及びＪ．Ｅ．Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，５８９，５４８号に見られ、各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００９５】
別の実施形態において、前記ポリマーは、生物学的に活性な分子である。別の実施形態において、前記ポリマーは、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド又はタンパク質である。
【００９６】
別の実施形態において、前記ポリマーは、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギナート、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）（酸化エチレンと酸化プロピレンとをベースにしたブロック共重合体）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリラート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリカプロラクトン又はポリペプチドである。
【００９７】
別の実施形態において、前記ポリマーは、デンドロン（ｄｅｎｄｒｏｎ）である。前記デンドロンは、単量体及び表面修飾の何れかの組み合わせから構成され得る。有用な単量体の例は、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）を含むが、これに限定されるわけではない。有用な表面修飾の例は、陽イオン性アンモニウム、Ｎ−アシル及びＮ−カルボキシメチル基を含むが、これらに限定されるわけではない。前記デンドロンは、多価陰イオン性、多価陽イオン性、疎水性又は親水性であり得る。ある具体的な実施形態において、前記デンドロンは、約１個ないし約２５６個の表面修飾基を有する。別の具体的な実施形態において、前記デンドロンは、約４、８、１６、３２、６４又は１２８個の表面修飾基を有する。
【００９８】
「デンドロン」という語は、デンドリマー構造の半分を表す分子を指す。デンドロンは、典型的には、デンドリマーコアの半分の上に、又はデンドリマーの構築後のデンドリマーコアの開裂によって構築される。デンドロンは、単量体及び表面修飾の何れかの組み合わせから構成され得る。有用な単量体の例は、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）を含むが、これに限定されるわけではない。有用な表面修飾の例は、陽イオン性アンモニウム修飾、Ｎ−アシル修飾及びＮ−カルボキシメチル修飾を含むが、これらに限定されるわけではない。これに替わる表面修飾によって、広範囲の様々な特性が可能になる。例えば、デンドロンは、多価陰イオン性、多価陽イオン性、疎水性又は親水性であり得る。デンドロンは、それにより単量体の正確な数及び表面修飾基がデンドロンの発生によって決定され得るように、合理的にオーダーメイドされ得る。（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５及びＧ６は、それぞれ４、８、１６、３２、６４及び１２８個の基を有する）。デンドロン及びデンドリマー抱合技術の例は、本明細書に組み入れられる米国特許第５，７１４，１６６号並びに米国特許出願公報第２００５／０００９９８８号及び第２００２／０１２３６０９号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に見られる。１：１の化学量論でのデンドロン−生物学的に活性な分子の抱合体の構築は、シスタミンコアを含有するデンドリマー中のジスルフィドの還元によって達成され得る。この還元は、単一のチオール反応基を含有するように、修飾されている全ての生物学的に活性な分子へ結合され得る単一のオルソゴナルスルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）官能性の形成をもたらす。これは、アミンを含有する生物学的に活性な分子を、一方の末端にあるアミン反応基及びもう一方の末端にあるチオール反応基を含有する二機能性リンカーと反応させることによって達成され得る。ジスルフィドを含有する樹状ポリマー及び樹状ポリマー抱合体の例は、本明細書に組み入れられる米国特許第６，０２０，４５７号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に見られる。溶液中でミセルを形成するポリオールを有する星状のポリマー化合物の例は、米国特許出願公報第２００４／１９８６４１号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に見られる。本発明の一実施形態において、シクリトール部分自体は、デンドロンのためのコアとして機能する。
【００９９】
別の実施態様において、前記可溶性の高分子量の立体的な基は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。ＢＳＡ上に遊離チオールが存在するので、一方の末端にチオール反応基を、もう一方の末端にアミン反応基を含有する二機能性リンカーを使用することによって、アミンを含有するアプタマーをＢＳＡへ抱合することが可能になる。
【０１００】
前記ポリマー主鎖は、直鎖又は分岐鎖であり得る。分岐鎖ポリマー主鎖は一般に、本分野で公知である。典型的には、分岐鎖ポリマーは、中央分岐コア部分及び前記中央分岐コアへ連結された複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトール等の多様なポリオールへ酸化エチレンを添加することによって調製できる分岐鎖形態で普遍的に使用される。前記中央分岐部分は、リジン等、幾つかのアミノ酸から誘導することも可能である。分岐鎖ポリ（エチレングリコール）は、Ｗ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｘとしての一般的な形態で表され得、式中Ｗは、グリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトール等の中央部分から誘導され、ｘは、分岐数を表す。
【０１０１】
当業者は、ポリマーに関する前述のリストが、決して排他的なものではなく、例示に過ぎず、前述の質を有するポリマー材料が全て想定されることを認識する。
【０１０２】
本発明のポリマーは、約８００Ｄａから約３，０００，０００Ｄａまでの分子量を有し得る。一実施形態において、前記ポリマーは、約２０キロダルトン（ｋＤａ）から約１０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態において、前記ポリマーは、約５ｋＤａから約１００ｋＤａまでの分子量を有する。ある具体的な実施形態において、前記ポリマーは約２０ｋＤａの分子量を有する。別の具体的な実施形態において、前記ポリマーは約４０ｋＤａの分子量を有する。別の具体的な実施形態において、前記ポリマーは約８０ｋＤａの分子量を有する。
【０１０３】
本発明のポリマーは、核酸へ抱合され得る。前記核酸の５’末端を通じて、前記核酸の３’末端を通じて、又は５’末端と３’末端との間の核酸配列に沿った全ての位置を通じて、前記ポリマーが核酸へ抱合され得る。前記ポリマーへ接合するのに適した内部核酸配列の位置（すなわち、５’末端でも３’末端でもない位置）の例は、前記核酸配列の塩基上の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸塩のヒドロキシル基、又はリボース基のヒドロキシル基を含む。
【０１０４】
末端活性化基又はシクリトールは、スペーサー部分も含み得る。前記スペーサー部分は、酸化ポリアルキレン近く又は前記末端活性化基近くに配置できる。前記スペーサー部分は、最大１８個の炭素原子を含有し、１８個の炭素原子又は更なるポリマー鎖でさえ包含するヘテロアルキル基、アルコキシ基又はアルキル基であり得る。前記スペーサー部分は、標準的な合成技術を使用して付加できる。
【０１０５】
本発明の具体的な化合物は、立体異性体（例えば、ジアステレオマー及び鏡像異性体）として得られ得、本発明が、（純粋な異性体及びそのラセミ混合物を含む）開示された化合物の全ての分子種形態及びその混合物を含むことが理解される。
【０１０６】
本発明の具体的な化合物が、医薬として許容される様々な塩として得られ得ることは理解される。「医薬として許容される塩」という語は、本発明の化合物の非毒性酸付加塩及びアルカリ土類金属塩を指す。前記塩は、このような化合物の最終的な単離及び精製の間に原位置で、又は遊離塩基又は酸の官能基を、例えば適切な有機酸又は塩基と反応させることによって個別に調製できる。代表的な酸付加塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩等を含むが、これらに限定されるわけではない。代表的なアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩及びマグネシウム塩を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１０７】
本発明は、ポリマーと、生物学的に活性な分子と、及び前記ポリマーを前記生物学的に活性な分子へ連結するシクリトールとを含む抱合体を形成する方法にも関する。
【０１０８】
イノシトールは、ＰＥＧ鎖を有する位置が選択的に官能化され得るように調製され得る。
【０１０９】
コンデュリトールは、イノシトール断片への前駆体として使用され得る。コンデュリトールの合成は、Ｂａｌｃｉ，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐ．Ｃｈｅｍ．１９９７，  ６９，  ９７−１０４、Ｓｕｔｂｅｙａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８８，  １３３０−１３３１（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）及び本明細書中の参考文献に記載される。
【０１１０】
イノシトールによって連結されたＰＥＧ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体１の調製の例が、図１及び実施例３に示されている。２０ｋＤａのｍＰＥＧの活性化されたエステル誘導体に対する２の結合を、有機溶媒（ＤＭＦ／ＤＣＭ  ２：１）中で実施し、望ましい４０ｋＤａ抱合体を得た。これに代わる水性緩衝液を含有する条件が、場合によって使用される。２工程、１容器の１の合成は、化合物３を過剰量のテトラフルオロホウ酸Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウム（ＴＳＵ）によって原位置で活性化した後、アプタマーを付加することにより達成された。
【０１１１】
イノシトールリンカー２及びイノシトールにより活性化されたポリマー３の調製が、図２及び実施例１ないし２に示されている。ミオイノシトール−１，３，５−オルトフォルマートのアルキル化は、化合物５を与える。５に対称性の要素が存在することによって、ＮＭＲによる位置化学反応の確認が簡略化され、最終的には、光学的に活性なＡＰＩに抱合した際に、ジアステレオマー産物の形成が排除される。シリル保護基の５からの除去によって、中間体６が得られた。これに代わる求電子試薬を使用し得る。次に、７の連続的な脱保護に際して、望ましいリンカー２が、調製される。これは、０．１ＭメタノールＨＣｌ中でまず１５分間還流した後、０．４Ｍメタノールヒドラジン中で６０分間還流することによって達成された。
【０１１２】
イノシトールにより連結されたＰＥＧ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体１０の調製例が、図３並びに実施例４及び５に示されている。
【０１１３】
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害する本発明のＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力を測定するための受容体結合アッセイが、実施例６に記載されている。アッセイの結果は、実施例７に示されている。ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害する、イノシトールにより連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体１の能力を、ペガプタニブ（ＭａｃＩ）及び５’−５’キャップ形成された抗ＶＥＧＦアプタマーであるＥＹＥ００２（ＭａｃＩＩ）の能力と比較した。前記イノシトールにより連結されたＰＥＧ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体は、ペガプタニブの活性と区別できない活性を示した。
【０１１４】
実施例
以下の例は、本発明の具体的な有用な実施形態及び態様を説明する役割を果たし、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。同様の結果を得るために、別の材料及び方法を利用できる。
【実施例１】
【０１１５】
ミオイノシトールリンカー（２）の合成
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０００，  ３２５，  ３１３−３２０に記載されている手法を使用して、市販のミオイノシトール−１，３，５−オルトフォルマートから化合物２を調製した。
【０１１６】
０℃の無水Ｎ−メチルピロリドン７５ｍＬ中の４（２．５ｇ、８．２ｍｍｏｌ）の撹拌している溶液へ、水素化ナトリウム（１．６ｇ、ミネラルオイル中の６０％分散液４１ｍｍｏｌ）を添加した。氷槽を直ちに除去し、溶液を３０分撹拌し、この時点でＮ−（３−ブロモプロピル）−フタルイミド（１１．０ｇ、４１ｍｍｏｌ）及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（３．０ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を添加した。アルゴン雰囲気下、室温で、反応物を１８時間撹拌した後、氷冷水１０ｍＬを滴下して添加することによって急冷した。得られた溶液をクロロホルム（３×１５ｍＬ）で抽出し、有機層をプールし、真空下で濃縮した。Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｆｌａｓｈ＋クロマトグラフィーシステムにおいて７：３のヘキサン／酢酸エチルを使用することによって、フラッシュシリカゲルから粗材料を溶出した。化合物５、４．０ｇを単離した（収率７２％）。
【０１１７】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）（５００μＬ、１Ｍ）の溶液を、１，４−ジオキサン２ｍＬ中の５（２００ｍｇ、２９５μｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を室温で１６時間撹拌した後、真空濃縮した。２：３のヘキサン／酢酸エチルを使用してフラッシュシリカゲルから溶出することによって、上記から得られた油を精製すると、化合物６、油５２ｍｇ（収率３１％）が得られた。
【０１１８】
水素化ナトリウム（６５ｍｇ、ミネラルオイル中の６０％分散液１．６１ｍｍｏｌ）を、０℃の無水ＤＭＦ４ｍＬ中の６（９１．０ｍｇ、１６１μｍｏｌ）の撹拌溶液へ添加した。氷槽を即時除去し、溶液を３０分間撹拌し、この時点で、８−ブロモオクタン酸（１４４ｍｇ、６４５μｍｏｌ）を添加した。アルゴン雰囲気下、室温で、反応物を２４時間撹拌した後、０℃で水５ｍＬを滴下して添加することによって急冷した。得られた溶液のｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで４に調整し、前記溶液をクロロホルム（４×４ｍＬ）で抽出した。有機層をプールし、真空濃縮した。１：１のヘキサン／酢酸エチル（５００ｍＬ）を使用した後、１：２のヘキサン／酢酸エチル（５００ｍＬ）を使用した後、１００％酢酸エチル（７５０ｍＬ）を使用して、フラッシュシリカゲルから粗材料を溶出した。純粋な材料の単離した収量は、３５ｍｇ（収率３１％）であった。  
メタノール性の０．１Ｍ  ＨＣｌ５ｍＬ中に、粗生成物７を溶解し、１５分間還流した。得られた溶液を真空濃縮し、メタノール５ｍＬで３回同時蒸発させた。得られた残渣をメタノール４０ｍＬ中に再度溶解した後、ヒドラジン５０３μＬを添加した。この溶液を１時間還流した。次に、留出物を回収することによって、前記溶液をもとの容積の半分に濃縮した。得られた溶液を冷却した後、真空濃縮した。Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムを使用するクロマトグラフィーに、上述の得られた材料を供した（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａｐａｋ、１５μｍ、３００、１８．５分）。
【実施例２】
【０１１９】
活性型ＰＥＧ化合物（３）の合成
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍＬ中の化合物２（７５０μｇ、１．７μｍｏｌ）の溶液へ、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）１ｍＬ中のｍＰＥＧ−ＳＰＡ（７５ｍｇ、３．７μｍｏｌ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＬＮ  ＰＴ−０１Ｅ−１６）を添加した後、ピリジン１００μＬを添加した。アルゴン雰囲気下、室温で２８時間、この溶液を撹拌した後、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）８ｍＬを添加して、全てのＰＥＧ種を沈殿させた。遠心分離（１０００×ｇで５分間）によってＰＥＧ沈殿物を堆積させ、容器を傾けて溶液を採取した。得られたペレットをＤＣＭ４ｍＬ中に再度溶解し、Ｅｔ２Ｏ３６ｍＬで再度沈殿させ、遠心分離し（１０００×ｇで５分間）、ＰＥＧ種をペレットにした。前記ＰＥＧ種を真空下で更に乾燥させた後、ＳＥＣ（Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０４、溶離液として均一濃度の１００％ＰＢＳ）で精製した。４０ｋＤａ画分を白色粉末に凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。
【実施例３】
【０１２０】
イノシトールにより連結されたＰＥＧ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体（１）の合成
トルエンで同時蒸発させることによって化合物３（２．１ｍｇ、５２．９ｍｍｏｌ）を乾燥させた後、ＤＭＳＯ４２０μＬ中に溶解した。この溶液へ、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、ＴＳＵ溶液（ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍＬ、１．１モル当量）１６μＬを添加した後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）溶液（ＤＭＳＯ中の８．９μＬ／ｍＬ、２．０当量）１μＬを添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。アプタマー（１ｍｇ）を、前記溶液へ凍結乾燥粉末として添加し、反応物を更に１時間撹拌した。この反応混合物へ、ＤＭＳＯ１００μＬ中に溶解したＴＳＵ１ｍｇを１０μＬの一定分量として、材料を全て添加するまで１０分ごとに添加した。ＴＥＡ５μＬをＴＳＵ添加の完了時に添加した。
【０１２１】
「ＲＰＨＰＬＣ １ｍＬｍｉｎ ＰＤＡ」法（溶媒Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム、溶媒Ｂ：アセトニトリル）を使用する分析用ＨＰＬＣ（Ｃ−１８、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１）を使用して、化合物１を精製した。２回の１００μＬ注入を同一カラムで実施した。各試行において２５．６分で溶出された材料をプールし、濃縮した後、白色粉末へ凍結乾燥した。この粉末をＰＢＳ５０μＬ中に再度溶解し、Ｂｅｅｒの法則の計算（２６０ｎｍ）によってアプタマーの濃度を測定し、ＨＰＬＣにおけるペガプタニブ注入の標準曲線に対して確認した。
【実施例４】
【０１２２】
活性化されたミオイノシトールオルトフォルマートリンカー（８）の合成
０℃のＮ−メチルピロリジノン２０ｍＬ中のミオイノシトール−１，３，５−オルトギ酸塩（１．００ｇ、５．２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液へ、水素化ナトリウム（１．０５ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃で３０分間撹拌した後、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（１０．０ｍｇ）及び臭化アリル（３．５６ｍＬ、４２．１ｍｍｏｌ）を前記溶液へ添加した。前記溶液を０℃の氷槽中に保ち、その後、氷が融解するにつれて、ゆっくり加温した。大気温で１４時間、前記溶液を撹拌し続けた後、脱イオン水（２０ｍＬ）の滴下による添加によって急冷した。反応混合物をクロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせ、生成物を約０．１ｍｍＨｇ及び３０℃で濃縮した。ヘキサン及び酢酸エチル（８５：１５）の２成分混合物を使用して、シリカゲル上でのクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓフラッシュカラム）に供し、溶出した。ヘキサン及び酢酸エチル（８５：１５）を使用して溶出する、Ｒｆ０．３でのシリカＴＬＣ上で、望ましい生成物を観察した。得られたジアリル化合物１．１２ｇを回収した（３．６２ｍｍｏｌ、収率６９％）。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ。ＥＳＩ−ＭＳ（陰イオンモード）Ｃ１６Ｈ２２Ｏ６に関する算出値３１０．１４、実測値３１１．３（Ｈ＋付加物）及び３３３．２（Ｎａ＋付加物）。
【０１２３】
１，４−ジオキサン１５ｍＬ中のジアリル化合物（１３０ｍｇ、４１９μｍｏｌ）の撹拌溶液へ、カテコールボラン（２ｍＬ）を添加した。溶液を１時間還流しながら撹拌した後、０℃でアルカリ性過酸化水素溶液（１Ｍ  ＮａＯＨの５ｍＬ及び３０％Ｈ２Ｏ２の５ｍＬ）を滴下により添加することによって急冷した。反応物を室温に加温し、１４時間撹拌した後、クロロホルム（３×２５ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせ、生成物を真空濃縮した。ヘキサン及び酢酸エチル（１：２）の２成分混合物を使用するシリカゲル上でのクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ２５＋フラッシュカラム）に未精製油を供し、溶出した。ヘキサン及び酢酸エチル（１：２）を使用して溶出する、Ｒｆ０．２２でのシリカＴＬＣ上で、望ましい生成物を観察した。得られたホウ酸塩化合物３８．８ｍｇを回収した。ＥＳＩ−ＭＳ（陰イオンモード）Ｃ１６Ｈ２５Ｏ９に関する算出値３７１．２０、実測値３７１．２３（Ｈ＋付加物）。
【０１２４】
脱イオン水２ｍＬ及び１Ｍ  ＮａＯＨ２ｍＬ中のホウ酸塩化合物（２ｍｇ）の撹拌溶液へ、酸化銀（１０ｍｇ）を添加した。次に、アセトニトリル（４ｍＬ）を添加し、溶液を室温で２時間撹拌した。次に、溶液をろ紙でろ過して、ガラスフラスコの壁上に鏡として沈殿しなかった全ての銀付加物を除去した。ろ液を濃縮し、ＭＳにより分析した。ＥＳＩ−ＭＳ（陰イオンモード）Ｃ１６Ｈ２２Ｏ１２に関する算出値４０６．１１、実測値４３０．０１（Ｎａ＋付加物）。
【実施例５】
【０１２５】
イノシトールにより連結されたＰＥＧ−ＶＥＧＦアプタマー抱合体（１０）の合成
ＭＥＳ緩衝液（２．５ｍＬ、０．１４Ｍ、ｐＨ５．５）中の８（２５μｍｏｌ）の撹拌溶液へ、アセトニトリル（２．５ｍＬ）中の２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ−ＮＨ２（１．０ｇ、５０μｍｏｌ）及び固形ＥＤＣ（９５．８ｍｇ、５００μｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１４時間撹拌した後、ジエチルエーテル（９０ｍＬ）を添加した。得られた沈殿物を単離し、ブフナー漏斗上で乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、この材料が、２０ｋＤａと４０ｋＤａの種の混合物であることを示した（ＴＨＡＰ−ＮＨ４Ｃｉｔｒａｔｅマトリクス）。ＰＥＧ種のこの混合物を無水ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中に溶解し、ＤＣＣ（１００ｍｇ）を添加した。アルゴン雰囲気下、室温で溶液を１４時間撹拌した。ジエチルエーテル（９０ｍＬ）を添加することによって、ＰＥＧ種を再度沈殿させ、ブフナー漏斗で単離した。ＰＥＧ付加物をアセトニトリル（８ｍＬ）中に溶解した後、ホウ酸塩緩衝液（６ｍＬ、１００ｍＭ、ｐＨ８．５）中のアミノ末端を含有する抗ＶＥＧＦアプタマー（２５０ｍｇ）の溶液へ添加した後、１４時間振盪した。得られた溶液を濃縮した後、脱イオン水中に９ｍＬに希釈した。この材料を逆相ＨＰＬＣによって分析すると、生成物とペガプタニブ標準物質の同時溶出が示された。Ｃ−１８ＨＰＬＣからの複数の溶出を用いた化合物９の精製によって、ペガプタニブと同時溶出する５０ｋＤａの生成物８．５ｍｇが得られた。
【０１２６】
化合物９を、メタノール性０．１Ｍ  ＨＣｌ中に溶解し、還流する。得られた溶液を真空濃縮し、メタノール５ｍＬで同時蒸発させる。得られた材料１０をＣ−１８ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａｐａｋ、１５μｍ、３００）上でのクロマトグラフィーに供する。  
【実施例６】
【０１２７】
受容体結合アッセイ
受容体プレートコーティング
結合実験の各セットに関して、９６ウェルのＩｓｏｐｌａｔｅ  Ｐｌａｔｅの１行（１２ウェル）を使用する。前記１２ウェルの各々を、まず、４℃のＰＢＳ１００マイクロリットル（μｌ）中の抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片特異的抗体の２ピコモル（３００ナノグラム（ｎｇ））でコーティングする。翌日、各ウェルに結合する更なるタンパク質を、室温でＳｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液の３００μｌで、各回５分で３回洗浄することによってブロックする。次に、各ウェルを室温で２回、結合緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＨＳＡ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）３００μＬで洗浄する。ＫＤＲ／Ｆｃについては、結合緩衝液１００μＬ中のキメラ受容体０．２５ｐｍｏｌ（８５ｎｇ）を最初の１１ウェルへ添加するのに対し、１２番目のウェルには、バックグラウンド対照ウェルとしてヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃキメラタンパク質０．５ピコモル（１１８ｎｇ）を与える。Ｆｌｔ−１／Ｆｃについては、各結合緩衝液１００μＬ中のキメラ受容体０．１２５ｐｍｏｌ（３０．８ｎｇ）を最初の１１ウェルへ添加するのに対し、バックグラウンド対照（１２番）には、ヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃキメラタンパク質０．５ピコモル（１１８ｎｇ）を与える。ニューロピリン−１／Ｆｃについては、結合緩衝液１００μＬ中のキメラ受容体の０．２ｐｍｏｌ（４８ｎｇ）を、１２ウェル全てへ添加する。各ウェル中に固定された抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片特異的抗体に、室温で、２ないし３時間結合させることによって、前記キメラ受容体及びヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質をウェル上に捕捉する。遊離キメラ受容体及びヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を除去するため、結合緩衝液３００μＬを使用して各ウェルを室温で洗浄する。
【０１２８】
１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５−ペガプタニブ結合混合物の調製
１μＭ（又は２μＭ）から０．５１２ピコモラー（ｐＭ）（又は１．０２４ｐＭ）までの範囲のペガプタニブ（チューブ１番ないし１０番）の１０個の５倍希釈物の１セットを各々、それぞれ計１００μＬの最終容積の、焦げつかない加工の１．５ｍＬ微量遠心チューブ中の結合緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＨＳＡ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）中の１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の約０．０１μＣｉと混合する。チューブ１１番及び１２番については、１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の０．０１μＣｉのみを、ペガプタニブを全く加えずに添加し、それぞれ陽性対照及びバックグラウンド対照とする。１２本の全てのチューブは、（ＫＤＲ及びＦｌｔ−１については）３７℃で、又は（ニューロピリン−１については）室温で、１５ないし２０分間温置し、ペガプタニブをＶＥＧＦへ結合させて平衡に到達させる。次に、各チューブから得た１００μＬの結合混合物を、受容体がコーティングされたＩｓｏｐｌａｔｅ上の対応するウェルへ適用する。前記プレートを（ＫＤＲ及びＦｌｔ−１については）３７℃で、又は（ニューロピリン−１については）室温で、２ないし３時間温置し、結合を平衡化する。前記プレートを室温で、（ＫＤＲ及びニューロピリン−１に関しては）０．０５％トゥイーン２０入りの、又は（Ｆｌｔに関しては）０．０５％トゥイーン２０なしの、結合緩衝液３００μＬ／ウェルで４回洗浄する。プレートを約１０分間空気乾燥し、シンチレーション液約２００μＬを各ウェルへ添加する。各ウェルの放射能をシンチレーション計数により測定する。実験の陰性対照については、ペガプタニブに関する上述の全工程後に、結合アッセイにおいてペガプタニブを置換するために、同一のモル濃度でポリエチレングリコール分子量４０，０００（４０ｋＤａ  ＰＥＧ）を使用する。
【０１２９】
ＶＥＧＦ受容体結合の５０％阻害（ＩＣ５０）のための効果的な濃度の測定
前記ウェル（１番ないし１１番）上に保持されたカウント数からバックグラウンド（ウェル１２番）を差し引いたものを、最大結合（陽性対照、ウェル１１番）からバックグラウンド（ウェル１２番）を差し引いたものによって除するものとして、前記ウェルにおける１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５：受容体結合比を計算する。異なるペガプタニブ濃度で得られた結合比を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭプログラム（１部位競合）による非線形回帰を使用することによって分析し、得られた曲線を使用して、ＶＥＧＦ１６５への受容体結合の阻害におけるペガプタニブの最大半量阻害（ＩＣ５０）を決定する。ＰＥＧを使用する実験の陰性対照からのデータを、同一方法によって分析する。
【実施例７】
【０１３０】
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）の比較阻害
ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦ結合を阻害するシクリトール連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力を、リジン連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体及び非立体的に増強されたＶＥＧＦアプタマー抱合体の能力と比較した。
【０１３１】
実施例６に記載されているアッセイを使用して、化合物（１）のＦｌｔ−１受容体結合活性を測定した。各試料に対して、％阻害、ＩＣ５０、ＩＣ５０範囲及びＲ２を測定した。イノシトール連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体（１）のアッセイを二つ組みで実施し、「イノシトール抱合体（１）−１」及び「イノシトール抱合体（１）−２」と標識した。結果が、表１及び図３に示されている。「イノシトール抱合体（１）−１」及び「イノシトール抱合体（１）−２」は、それぞれ、０．５８９０ｎＭ及び０．８２５９ｎＭのＩＣ５０を有する。ＭａｃＩは、０．４５６９ｎＭのＩＣ５０を有する。ＭａｃＩＩは、０．３７５ｎＭのＩＣ５０を有する。結果は、イノシトール連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体（１）がリジン連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体であるペガプタニブ（ＥＹＥ−００１、ＭａｃＩ）と同程度に効果的であるのに対して、イノシトール連結及びリジン連結されたＶＥＧＦアプタマー抱合体の両者が、ＥＹＥ−００２（ＭａｃＩＩ）等の増強されていないＶＥＧＦアプタマーと比べて、ＶＥＧＦ結合を阻害する上で非常により効果的であることを示す。
【０１３２】
【表１】
2009510182.tif 000012
【０１３３】
参照による組み込み
本明細書に参照される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願及び公開された参考文献は、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
均等物
当業者は、定型的な実験操作を使用して、本明細書に具体的に記載されている具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識又は解明できる。このような均等物は、上述の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、２つのＰＥＧ部分とイノシトールリンカーとを含むアプタマー抱合体の合成に対する模式的な表示である。
【図２】図２は、三機能性イノシトール結合剤の合成に関する模式的な表示である。
【図３】図３は、２つのＰＥＧ部分とイノシトールリンカーとを含むアプタマー抱合体の合成に関する模式的な表示である。
【図４】図４は、イノシトールリンカー（化合物１）と、ペガプタニブ（ＭａｃＩ）と、５’−５’キャップ形成された抗ＶＥＧＦアプタマー（ＭａｃＩＩ）とを有するペグ化したＶＥＧＦアンタゴニストアプタマーを使用するＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）阻害アッセイに関する結果のグラフ表示である。
【図５】図５は、イノシトールリンカーを有するＰＥＧ化されたＶＥＧＦアンタゴニストアプタマー（化合物１）の化学構造に関する模式的な表示である。
【図６】図６は、イノシトールリンカーを有するＰＥＧ化されたＶＥＧＦアンタゴニストアプタマー（化合物１０）の化学構造に関する模式的な表示である。
【図１】
2009510182.tif 000021
【図２】
2009510182.tif 000022
【図３】
2009510182.tif 000023
【図４】
2009510182.tif 000024
【図５】
2009510182.tif 000025
【図６】
2009510182.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月21日(2009.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009510182000001.app
【国際調査報告】
2009510182.tif 000027
2009510182.tif 000028
2009510182.tif 000029