(57)【要約】本発明は、被験体における体重増加もしくは脂肪過多症もしくは体脂肪率の調節因子として、または肥満およびそれに関連する状態のための医薬品としての１種以上の候補化合物をスクリーニングするためにＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を使用する方法に関する。本発明の逆作用薬および拮抗薬は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中を含む、肥満およびそれに関連する状態の予防または治療のための治療剤として有用である。本発明の作用薬および部分作用薬は、悪液質を含むがこれに限定されない、体重の増加によって改善される障害の予防または治療のための治療剤として有用である。
2009519007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体重の調節因子として、または哺乳動物の脂肪過多症の調節因子として、または哺乳動物の体脂肪率の調節因子としての候補化合物を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｖ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｉｖ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｖ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｉｘ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｘ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｘｘｉｉ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
を含むＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントと該候補化合物を接触させる工程であって、ここで、該受容体はＧタンパク質と共役している、工程；ならびに
（ｂ）該ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する該化合物の能力を決定する工程を包含し、該ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する該化合物の能力は、該化合物が該哺乳動物の体重の調節因子、該哺乳動物の脂肪過多症の調節因子、または該哺乳動物の体脂肪率の調節因子であることを示す、方法。
【請求項２】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＧＰＣＲが配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
肥満またはそれに関連する状態のための医薬品として候補化合物を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｖ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｉｖ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｖ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｉｘ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｘ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｘｘｉｉ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
を含むＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントと該候補化合物を接触させる工程であって、ここで、該受容体はＧタンパク質と共役している、工程；ならびに
（ｂ）該ＧＰＣＲの機能を阻害する該化合物の能力を決定する工程を包含し、該ＧＰＣＲの機能を阻害する該化合物の能力は、該化合物が肥満またはそれに関連する状態のための医薬品であることを示す、方法。
【請求項６】
請求項５の方法の工程を含む、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品として候補化合物を同定する方法であって、
（ｃ）哺乳動物に工程（ｂ）におけるＧＰＣＲの機能を阻害する化合物を投与する工程；および
（ｄ）該化合物が、該哺乳動物の体重増加からの保護を付与するか否かを決定する工程をさらに包含し、ここで、該哺乳動物の体重増加からの保護を付与する該候補化合物の能力は、該候補化合物が肥満またはそれに関連する状態のための医薬品であることを示す、方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＰＣＲが配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
二次メッセンジャーを検出する工程を包含する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記決定する工程が、メラニン保有細胞アッセイの使用を含むプロセス、または前記ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳの結合の測定を含むプロセスによる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記決定する工程が、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋からなる群より選択される二次メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｃＡＭＰのレベルが増加している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＰＣＲの逆作用薬を同定する工程を包含する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記逆作用薬を医薬品として製剤化する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＰＣＲの拮抗薬を同定する工程を包含する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記拮抗薬を医薬品として製剤化する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＰＣＲの作用薬を同定する工程を包含する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記作用薬が部分作用薬である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記作用薬または部分作用薬を医薬品として製剤化する工程をさらに包含する、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＰＣＲと前記候補化合物を接触させる工程が、該ＧＰＣＲを含む真核生物宿主細胞または該ＧＰＣＲを含むその膜と該候補化合物を接触させる工程を包含する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記真核生物宿主細胞がメラニン保有細胞宿主細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記真核生物宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法に従って同定可能である調節因子。
【請求項２７】
哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項２８】
哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを混合する工程を包含する、薬学的組成物を調製する方法。
【請求項２９】
哺乳動物の体重を減少させるため、該哺乳動物の脂肪過多症を減少させるため、または該哺乳動物の体脂肪率を減少させるための使用のための、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬。
【請求項３０】
哺乳動物の肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための使用のための、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬。
【請求項３１】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項３０に記載の逆作用薬または拮抗薬。
【請求項３２】
前記哺乳動物ＧＰＲ５０がヒトＧＰＲ５０である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の逆作用薬または拮抗薬。
【請求項３３】
哺乳動物の体重を増加させることによって改善される障害を予防または治療するための使用のための哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬または部分作用薬。
【請求項３４】
前記体重を増加させることによって改善される障害が、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症からなる群より選択される、請求項３３に記載の作用薬または部分作用薬。
【請求項３５】
前記哺乳動物ＧＰＲ５０がヒトＧＰＲ５０である、請求項３３または３４に記載の作用薬または部分作用薬。
【請求項３６】
哺乳動物の体重を減少させるため、該哺乳動物の脂肪過多症を減少させるため、または該哺乳動物の体脂肪率を減少させるための使用のための、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項３７】
哺乳動物の肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための使用のための、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項３８】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項３７に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記哺乳動物ＧＰＲ５０がヒトＧＰＲ５０である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
哺乳動物の体重を増加させることによって改善される障害を予防または治療するための使用のための哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬または部分作用薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
前記体重を増加させることによって改善される障害が、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症からなる群より選択される、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記哺乳動物ＧＰＲ５０がヒトＧＰＲ５０である、請求項４０または４１に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
体重を減少させるか、脂肪過多症を減少させるか、または体脂肪率を減少させる方法であって、該方法は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬、または該逆作用薬もしくは拮抗薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の治療有効量を該減少を必要とする哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬、または該逆作用薬もしくは拮抗薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の治療有効量を、予防または治療の必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療する方法。
【請求項４５】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬もしくは部分作用薬、または該作用薬もしくは部分作用薬および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の治療有効量を、予防または治療の必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する、体重を増加させることによって改善される障害を予防または治療する方法。
【請求項４８】
前記体重を増加させることによって改善される障害が、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物の体重を減少させるため、該哺乳動物の脂肪過多症を減少させるため、または該哺乳動物の体脂肪率を減少させるための医薬の製造における、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬の使用。
【請求項５１】
哺乳動物の肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための医薬の製造における、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬の使用。
【請求項５２】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記哺乳動物ＧＰＲ５０がヒトＧＰＲ５０である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
哺乳動物の体重を増加させることによって改善される障害を予防または治療するための医薬の製造における哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬または部分作用薬の使用。
【請求項５５】
前記体重を増加させることによって改善される障害が、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症からなる群より選択される、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記哺乳動物ＧＰＲ５０がヒトＧＰＲ５０である、請求項５４または５５に記載の使用。
【請求項５７】
ＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントのリガンドとしての候補化合物を同定する方法であって、該ＧＰＣＲは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｃ）該ＧＰＣＲが配列番号２の１〜６１７のアミノ酸を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｄ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｇ）該ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｈ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）のアミノ酸配列；
（ｉ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｎ）該ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｏ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｒ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｓ）該ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｔ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｕ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｖ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該方法は、
（ａ’）該候補化合物の存在下または非存在下で、該ＧＰＣＲに対する任意に標識された既知リガンドと、該ＧＰＣＲを接触させる工程；
（ｂ’）該既知リガンドと該ＧＰＣＲの間の複合体を検出する工程；および
（ｃ’）該候補化合物の非存在下よりも、該候補化合物の存在下で、該複合体がより少なく形成されるか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、該決定は、該候補化合物が該受容体のリガンドであることを示す、方法。
【請求項５８】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＧＰＣＲが配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項５７または請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記候補化合物が、肥満またはそれに関連する状態のリスクがあるか、または該肥満またはそれに関連する状態に向けて進行する哺乳動物を同定するための放射性イメージングにおいて有用である化合物としてスクリーニングされる、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記候補化合物が、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための化合物としてスクリーニングされる、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項６０または請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
内因性ＧＰＲ５０遺伝子の破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該破壊がホモ接合性であり、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物が機能的ＧＰＲ５０タンパク質の産生を欠き、野生型哺乳動物と比較して、高脂肪食によって誘導される体重増加の減少を示す、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６５】
哺乳動物の体重の調節因子として、または哺乳動物の脂肪過多症の調節因子として、または哺乳動物の体脂肪率の調節因子としての候補化合物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項６４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する工程；
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に該候補化合物を投与する工程；および
（ｃ）高脂肪食によって誘導される体重増加の減少が該候補化合物によって調節されるか否かを決定し、それによって、哺乳動物の体重の調節因子、または哺乳動物の脂肪過多症の調節因子、または哺乳動物の体脂肪率の調節因子としての該候補化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６６】
哺乳動物の体重の調節因子として、または哺乳動物の脂肪過多症の調節因子として、または哺乳動物の体脂肪率の調節因子として、または肥満もしくはそれに関連する状態のための医薬品としての候補化合物をスクリーニングするためのＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントの使用であって、該ＧＰＣＲは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｃ）該ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｄ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｇ）該ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｈ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）のアミノ酸配列；
（ｉ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｎ）該ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｏ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｒ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｓ）該ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｔ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｕ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｖ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項６７】
前記ＧＰＣＲが、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記ＧＰＣＲが配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項６６または請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記肥満に関連する状態が、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７１】
細胞中のＧＰＲ５０受容体の発現を減少させる薬剤として候補化合物を同定する方法であって、該方法は
（ａ）ＧＰＲ５０受容体を含む複数の細胞を、該候補化合物と接触させるか、または接触させない工程；
（ｂ）該候補化合物と接触させた細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベル、および該候補化合物と接触させなかった細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｃ）該候補化合物と接触させた細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベルを、該候補化合物と接触させなかった細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベルと比較する工程であって、該候補化合物と接触させなかった細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベルと比較した、該候補化合物と接触させた細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベルの減少は、該候補化合物が、細胞中のＧＰＲ５０受容体の発現を減少させる薬剤であることを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記候補化合物が、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための化合物としてスクリーニングされる、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、被験体における体重増加もしくは脂肪過多症もしくは体脂肪率の調節因子として、または肥満およびそれに関連する状態のための医薬品としての１種以上の候補化合物をスクリーニングするためにＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を使用する方法に関する。本発明の逆作用薬および拮抗薬は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中を含む、肥満およびそれに関連する状態の予防および治療のための治療剤として有用である。本発明の作用薬および部分作用薬は、悪液質を含むがこれに限定されない、体重の増加によって改善される障害の予防または治療のための治療剤として有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
以下の議論は、本発明の理解を容易にするために意図されるが、本発明に対する先行技術であることが意図されるのではなく、そのことが認められるわけでもない。
【０００３】
Ａ．肥満
脂肪組織の重量の増加によって定義される肥満は、２型糖尿病、高脂血症、および冠性心疾患などの心臓血管性障害および代謝性障害の高いリスク、ならびに付随する罹患率および死亡率を与える。循環器病の多重リスク要因であるメタボリック症候群は、肥満に関連するものを含む、５つの判断基準に基づいて定義される［非特許文献１］。
【０００４】
肥満は今や、西欧諸国における主要な保健医療問題であり、いくつかの第三世界諸国において増加しつつある。肥満の人数の増加は高脂肪含量の食事の嗜好の増加に大部分起因するが、これはまた、より重要な要因、多くの人々の生活における活動の減少であり得る。最近１０年間で、米国において肥満の発生率は３０％増加しており、現在米国の人口の約３０％が肥満と考えられている。
【０００５】
ある人が過体重または肥満に分類されるか否かは、一般的に、身長の平方（ｍ２）で体重（ｋｇ）を除算することによって計算される、肥満度指数（ＢＭＩ）に基づいて決定される。このように、ＢＭＩの単位はｋｇ／ｍ２であり、人生の各１０年間における最小死亡率と関連するＢＭＩ範囲を計算することが可能である。過体重は、２５．０〜２９．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩとして定義され、肥満は３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩとして定義される（以下の表Ａを参照のこと）。
【０００６】
表Ａ  肥満度指数（ＢＭＩ）による体重の分類
【０００７】
【表１】
2009519007.tif 000003
ＢＭＩが増加するに従って、他のリスク要因とは独立している種々の原因からの死亡のリスクが増加する。肥満に伴う最も一般的な疾患は、循環器病（特に高血圧）、糖尿病（肥満は糖尿病の発生を悪化させる）、胆嚢疾患、癌、および生殖疾患である。研究は、体重の適度な減少さえもが、冠性心疾患を発症するリスクの有意な減少に相当し得ることを示してきた。
【０００８】
しかし、脂肪（脂肪組織）に対する、筋肉である体重の割合を考慮に入れていないという点で、ＢＭＩの定義に伴う問題点が存在している。この点を考慮するために、肥満は、体脂肪含量に基づいて定義することもできる：男性では２５％より上、女性では３０％より上である。
【０００９】
肥満は、同様に、循環器病を発症するリスクを顕著に増加させる。冠不全、アテローム性疾患、および心不全は、肥満によって誘導される心血管系の合併症の最前線にある。全体の集団が理想体重であるならば、冠不全のリスクは２５％減少し、心不全のリスクおよび脳血管発作のリスクは３５％減少すると見積もられている。冠動脈疾患の発生は、３０％過体重である５０歳未満の被験体において２倍である。糖尿病患者は、寿命の３０％減少に直面している。４５歳以後、糖尿病の人は、糖尿病でない人よりも、顕著な心臓病になる可能性が約３倍であり、脳卒中になる可能性が約５倍までである。これらの知見は、２型糖尿病および冠性心疾患のリスク要因と、肥満の予防に基づくこれらの状態の予防に対する複合的なアプローチの潜在的な価値との間の相互関連を強調する［非特許文献２］。
【００１０】
糖尿病は、腎臓病、眼疾患、および神経系の問題の発生にもまた関係付けられてきた。腎症とも呼ばれる腎臓病は、腎臓の「フィルター機構」が損傷し、タンパク質が尿中に過剰量で漏れ出し、最終的には腎臓が機能しなくなるときに起こる。糖尿病は、眼の後ろの網膜に対する損傷の主要原因でもあり、白内障および緑内障のリスクを増加する。最後に、糖尿病は、痛みを感じる能力に干渉し、深刻な感染に寄与する、とりわけ、脚および足の神経損傷に関連する。まとめると、糖尿病合併症は、国家の主要な死因の１つである。
【００１１】
第１の治療は、患者に対して、彼らの食事の脂肪含量を減少すること、および彼らの身体的活動を増加することなどの、食事およびライフスタイルのアドバイスを提供することである。しかし、多くの患者はこのことが困難であることを見い出し、これらの努力からの結果を維持するために、薬物治療からのさらなる援助を必要とする。
【００１２】
大部分の現在市販されている製品は、効力の欠如または受け入れ難い副作用プロフィールのせいで、肥満のための治療としては成功していなかった。これまでに最も成功した薬物は、間接的に作用する５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）作用薬であるｄ−フェンフルラミン（レダックス（Ｒｅｄｕｘ）（登録商標））であったが、しかし患者の３分の１までにおける心臓弁欠損の報告が、１９９８年にＦＤＡによるその取り消しを招いた。
【００１３】
加えて、２種類の薬物が、米国および欧州において最近参入してきた：膵リパーゼの阻害によって脂肪の吸収を妨害する薬物であるオーリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）（ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（登録商標））、および５−ＨＴ／ノルアドレナリン再取り込み阻害剤であるシブトラミン（Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）（レダクチル（Ｒｅｄｕｃｔｉｌ）（登録商標））である。しかし、これらの製品に付随する副作用は、これらの長期的な有用性を制限する可能性がある。ゼニカル（登録商標）を用いる治療は、ある患者においては胃腸障害を誘導すると報告されているのに対して、シブトラミンは、ある患者においては血圧の上昇と関連付けられてきた。
【００１４】
安全に体重を減少させる薬剤についての医学的な満たされていない必要性が存在している。本発明は、この重要な目的、ならびに他の重要な目的に向けられている。
【００１５】
Ｂ．ＧＰＲ５０
ＧＰＲ５０は、Ｇタンパク質共役メラトニン受容体ファミリーに密接に関連するオーファンＧＰＣＲである。ＧＰＲ５０の遺伝子は、第Ｘ染色体上に位置している。ＧＰＲ５０の発現は、視床下部および下垂体に限定されると報告されている［Ｒｅｐｐｅｒｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９６）３８６：２１９−２２４］。ＧＰＲ５０のコード領域域は２つのエキソンにまたがっている。ヒトＧＰＲ５０のいくつかのアミノ酸多型が記述されている；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＡＩ０３６９７への参照により、これらには置換Ｔｈｒ５３２Ａｌａ、Ｖａｌ６０６Ｉｌｅ、および４アミノ酸（Ｔｈｒ．Ｔｈｒ．Ｇｌｙ．Ｈｉｓ）欠失Δ５０２−５０５が含まれる。
【００１６】
Ｃ．Ｇタンパク質共役受容体
多数の受容体クラスがヒトにおいて存在しているが、圧倒的に最も大量にあり、かつ治療的に関連性があるものは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）クラスに代表される。ヒトゲノムの中には約３０，０００〜４０，０００個の遺伝子が存在すると見積もられており、これらの中のおよそ２％がＧＰＣＲをコードすると見積もられている。
【００１７】
ＧＰＣＲは、医薬品の開発のための重要な領域を表している：１００個の既知のＧＰＣＲの中の約２０個から、すべての処方医薬品の約６０％が開発されてきた。例えば、１９９９年には、上位１００種類の処方薬物の商品名の中で、以下の薬物がＧＰＣＲと相互作用する（その薬物に関連して治療される主要な疾患および／または障害を括弧内に示す）：
クラリチン（Ｃｌａｒｉｔｉｎ）（登録商標）（アレルギー）
プロザック（Ｐｒｏｚａｃ）（登録商標）（うつ病）
バソテック（Ｖａｓｏｔｅｃ）（登録商標）（高血圧）
パキシル（Ｐａｘｉｌ）（登録商標）（うつ病）
ゾロフト（Ｚｏｌｏｆｔ）（登録商標）（うつ病）
ジプレキサ（Ｚｙｐｒｅｘａ）（登録商標）（精神異常）
コザール（Ｃｏｚａａｒ）（登録商標）（高血圧）
イミトレックス（Ｉｍｉｔｒｅｘ）（登録商標）（片頭痛）
ザンタック（Ｚａｎｔａｃ）（登録商標）（逆流）
プロプルシド（Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ）（登録商標）（逆流性疾患）
リスパーダル（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）（登録商標）（統合失調症）
セレベント（Ｓｅｒｅｖｅｎｔ）（登録商標）（喘息）
ペプシド（Ｐｅｐｃｉｄ）（登録商標）（逆流）
ガスター（Ｇａｓｔｅｒ）（登録商標）（潰瘍）
アトロベント（Ａｔｒｏｖｅｎｔ）（登録商標）（気管支痙攣）
エフェクソル（Ｅｆｆｅｘｏｒ）（登録商標）（うつ病）
デパコート（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）（登録商標）（てんかん）
カージュラ（Ｃａｒｄｕｒａ）（登録商標）（前立腺肥大）
アレグラ（Ａｌｌｅｇｒａ）（登録商標）（アレルギー）
ルプロン（Ｌｕｐｒｏｎ）（登録商標）（前立腺癌）
ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（登録商標）（前立腺癌）
ディプリバン（Ｄｉｐｒｉｖａｎ）（登録商標）（知覚麻痺）
ブスパー（ＢｕＳｐａｒ）（登録商標）（不安）
ベントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）（登録商標）（気管支痙攣）
ハイトリン（Ｈｙｔｒｉｎ）（登録商標）（高血圧）
ウェルブトリン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ）（登録商標）（うつ病）
ジルテック（Ｚｙｒｔｅｃ）（登録商標）（鼻炎）
プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ）（登録商標）（ＭＩ／脳卒中）
トプロール（Ｔｏｐｒｏｌ）−ＸＬ（登録商標）（高血圧）
テノーミン（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）（登録商標）（アンギナ）
キサラタン（Ｘａｌａｔａｎ）（登録商標）（緑内障）
シングレア（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ）（登録商標）（喘息）
ディオバン（Ｄｉｏｖａｎ）（登録商標）（高血圧）
ハルナール（Ｈａｒｎａｌ）（登録商標）（前立腺肥大）
（Ｍｅｄ  Ａｄ  Ｎｅｗｓ  １９９９データ）。
【００１８】
ＧＰＣＲは、７個のαヘリックスを形成する２２個から２４個の間の疎水性アミノ酸の７個の配列を有する、共通の構造モチーフを共有し、その各々が膜を貫通する（各貫通は、数字によって、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）などによって同定される）。これらの膜貫通ヘリックスは、膜貫通−２と膜貫通−３の間、膜貫通−４と膜貫通−５の間、および膜貫通−６と膜貫通−７の間の、細胞膜の外部、すなわち、「細胞外」側のアミノ酸の鎖（これらは、それぞれ、「細胞外」領域１、２、および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２、およびＥＣ−３）と呼ばれる）によって結合されている。膜貫通ヘリックスは、膜貫通−１と膜貫通−２の間、膜貫通−３と膜貫通−４の間、および膜貫通−５と膜貫通−６の間の、細胞膜の内部、すなわち、「細胞内」側のアミノ酸の鎖（これらは、それぞれ、「細胞内」領域１、２、および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２、およびＩＣ−３）と呼ばれる）によってもまた結合されている。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間に存在し、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の外部の細胞外空間に存在する。
【００１９】
一般的に、リガンドが受容体と結合するとき（しばしば、受容体の「活性化」と呼ばれる）、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」の間の結合を容易にする受容体のコンホメーションの変化が存在する。ＧＰＣＲがＧタンパク質に関して「乱交性」であること、すなわち、ＧＰＣＲが１種類より多くのＧタンパク質と相互作用し得ることが報告されてきた。Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８８）４３：１０９５−１１０１を参照のこと。他のＧタンパク質が存在しているが、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏが同定されているＧタンパク質である。リガンドによって活性化される、Ｇタンパク質とのＧＰＣＲの結合は、シグナルカスケードプロセスを開始する（「シグナル伝達」と呼ばれる）。通常の条件下では、シグナル伝達は、最終的には、細胞活性化または細胞阻害を生じる。理論に束縛されることを望まないが、受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられている。
【００２０】
Ｇｓ共役ＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる。Ｇｉ、Ｇｏ、またはＧｚに結合したＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる。Ｇｑ−共役ＧＰＣＲは、細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋レベルを上昇させる。
【００２１】
Ｇ１５もしくはＧ１６などの、ホスホリパーゼＣ経路にいくつかのクラスのＧＰＣＲを共役させるらしい乱交性のＧタンパク質［ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９５）２７０：１５１７５−８０］、または同じ経路、例えば、ホスホリパーゼＣ経路に多数の異なるＧＰＣＲを共役させるように設計されたキメラＧタンパク質［ＭｉｌｌｉｇａｎおよびＲｅｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９）２０：１１８−２４］もまた存在する。ホスホリパーゼＣ経路に共役されたＧＰＣＲは、細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋レベルを上昇させる。
【００２２】
生理的条件下では、ＧＰＣＲは、２つの異なるコンホメーション：「不活性状態」と「活性状態」の間の平衡状態で、細胞膜中に存在する。不活性状態の受容体は、生物学的応答に導くシグナル伝達を開始するために、細胞内シグナル伝達経路に連結することができない。受容体のコンホメーションを活性状態に変化させることは、シグナル伝達経路への連結を可能にし（Ｇタンパク質を介して）、そして生物学的応答を生じる。
【００２３】
受容体は、リガンド、または薬物のような化合物によって、活性化状態で安定化される可能性がある。受容体のアミノ酸配列に対する修飾を含むがこれに排他的に限定されない最近の発見は、受容体を活性状態のコンホメーションにあるように促進または安定化するための、リガンドまたは薬物以外の手段を提供している。これらの手段は、受容体へのリガンド結合の効果を刺激することによって、活性状態の受容体を安定化する。リガンドから独立したこのような手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と呼ばれている。
【非特許文献１】Ｇｒｕｎｄｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００４）１０９：４３３−４３８
【非特許文献２】Ｐｅｒｒｙら、ＢＭＪ（１９９５）３１０：５６０−５６４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の概要
ヒトＧＰＲ５０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号１に示され；上記コードされたヒトＧＰＲ５０ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２に示される。Δ５０２−５０５を含むヒトＧＰＲ５０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号３に示され；Δ５０２−５０５を含む上記コードされたヒトＧＰＲ５０ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示される。マウスＧＰＲ５０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号５に示され；上記コードされたマウスＧＰＲ５０ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６に示される。ラットＧＰＲ５０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号７に示され；上記コードされたラットＧＰＲ５０ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号８に示される。
【００２５】
出願人らは、ＧＰＲ５０欠損マウスが高脂肪食によって誘導される体重増加からの保護を示すことを示してきた。本発明は、被験体における体重もしくは脂肪過多症もしくは体脂肪率の調節因子としての候補化合物、または肥満およびそれに関連する状態のための医薬品を同定するためのＧＰＲ５０に関連する方法を特徴とする。本発明の逆作用薬および拮抗薬は、肥満、ならびに高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中を含む、肥満に関連する状態の予防または治療のための治療剤として有用である。
【００２６】
第１の態様において、本発明は、被験体の体重の調節因子としての候補化合物を同定する方法を特徴とし、この方法は以下の工程：
（ａ）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｖ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｉｖ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｖ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｉｘ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｘ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｘｘｉｉ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
を含むＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントと候補化合物を接触させる工程であって、ここで、この受容体はＧタンパク質と共役している、工程；ならびに
（ｂ）ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力を決定する工程
を包含し、
ここで、ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力は、この化合物が被験体の体重の調節因子であることを示す。
【００２７】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
ある実施形態において、体重は高脂肪食によって誘導された体重増加を含む。
【００３０】
ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００３１】
本発明は、被験体の脂肪過多症の調節因子としての候補化合物を同定する方法もまた特徴とし、この方法は以下の工程：
（ａ）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｖ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｉｖ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｖ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｉｘ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｘ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｘｘｉｉ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
を含むＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントと候補化合物を接触させる工程であって、ここで、この受容体はＧタンパク質と共役している、工程；ならびに
（ｂ）ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力を決定する工程
を包含し、
ここで、ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力は、この化合物が被験体の脂肪過多症の調節因子であることを示す。
【００３２】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
ある実施形態において、脂肪過多症は高脂肪食によって誘導された脂肪過多症の増加を含む。
【００３５】
ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００３６】
本発明は、被験体の体脂肪率の調節因子としての候補化合物を同定する方法もまた特徴とし、この方法は以下の工程：
（ａ）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｖ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｉｖ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｖ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｉｘ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｘ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｘｘｉｉ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
を含むＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントと候補化合物を接触させる工程であって、ここで、この受容体はＧタンパク質と共役している、工程；ならびに
（ｂ）ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力を決定する工程
を包含し、
ここで、ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力は、この化合物が被験体の体脂肪率の調節因子であることを示す。
【００３７】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
ある実施形態において、体脂肪率は高脂肪食によって誘導された体脂肪率の増加を含む。
【００４０】
ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４１】
本発明は、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品としての候補化合物を同定する方法もまた特徴とし、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ’）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｉｖ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｉｖ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｘｖ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｉｘ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｘｘ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｘｘｉ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｘｘｉｉ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
を含むＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントと候補化合物を接触させる工程であって、ここで、この受容体はＧタンパク質と共役している、工程；ならびに
（ｂ’）ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物の能力を決定する工程であって、このＧＰＣＲの機能を阻害する化合物の能力が、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品であることを示す、工程。
【００４２】
本発明はさらに以下の工程：
（ｃ’）工程（ｂ’）においてＧＰＣＲの機能を阻害する化合物を任意に合成する工程；
（ｄ’）工程（ｂ’）においてＧＰＣＲの機能を阻害する化合物を哺乳動物に投与する工程；および
（ｅ’）この化合物が、哺乳動物の体重増加からの保護を付与するか否かを決定する工程
を包含する、この第１の態様の工程（ａ’）および（ｂ’）を含む、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品としての候補化合物を同定する方法をさらに特徴とし、ここで、哺乳動物の体重増加からの保護を付与する候補化合物の能力は、この候補化合物が肥満またはそれに関連する状態のための医薬品であることを示す。
【００４３】
ある実施形態において、上記哺乳動物の体重増加からの保護は、高脂肪食によって誘導された哺乳動物の体重増加からの保護を含む。
【００４４】
ある実施形態において、候補化合物は、高脂肪食によって誘導された哺乳動物の体重増加からの保護を付与することが示される。
【００４５】
ある実施形態において、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品は、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための化合物である。
【００４６】
ある実施形態において、工程（ｂ’）においてＧＰＣＲの機能を阻害する化合物は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００４７】
ある実施形態において、哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物は実験用動物である。ある実施形態において、哺乳動物は非ヒト霊長類である。ある実施形態において、哺乳動物は齧歯類である。ある実施形態において、哺乳動物はラットである。ある実施形態において、哺乳動物はマウスである。
【００４８】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性ＧＰＣＲである。
【００５１】
ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。
【００５２】
ある実施形態において、肥満には、高脂肪食によって誘導された体重増加が含まれる。
【００５３】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【００５４】
ある実施形態において、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品は、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための化合物である。
【００５５】
ある実施形態において、ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物は、ＧＰＣＲの逆作用薬である。ある実施形態において、ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物は、ＧＰＣＲの拮抗薬である。
【００５６】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは検出可能レベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。
【００５７】
ある実施形態において、上記接触させる工程は、ＧＰＣＲの既知の作用薬の存在下で接触させることを含む。ある実施形態において、ＧＰＣＲの既知の作用薬は、内因性ヒトＧＰＲ５０の既知の作用薬である。ＧＰＣＲの既知の作用薬の存在下で接触させることを含む上記接触させる工程に関連する、ある実施形態において、候補化合物は、既知の作用薬がＧＰＣＲと接触される前に、ＧＰＣＲと接触される。ＧＰＣＲの既知の作用薬の存在下で接触させることを含む上記接触させる工程に関連する、ある実施形態において、候補化合物は、既知の作用薬がＧＰＣＲと接触される前の数分間までの時間、ＧＰＣＲと接触される。ＧＰＣＲの既知の作用薬の存在下で接触させることを含む上記接触させる工程に関連する、ある実施形態において、候補化合物は、既知の作用薬がＧＰＣＲと接触される前の約５分間、約１０分間、または約３０分間までの時間、ＧＰＣＲと接触される。
【００５８】
ある実施形態において、上記接触させる工程は、ＧＰＣＲの既知のリガンドの非存在下で接触させることを含む。ある実施形態において、上記接触させる工程は、内因性ヒトＧＰＲ５０の既知のリガンドの非存在下で接触させることを含む。ある実施形態において、上記接触させる工程は、ＧＰＣＲの既知の作用薬の非存在下で接触させることを含む。ある実施形態において、上記接触させる工程は、内因性ヒトＧＰＲ５０の既知の作用薬の非存在下で接触させることを含む。
【００５９】
ある実施形態において、ＰＣＲはＲＴ−ＰＣＲである。
【００６０】
ある実施形態において、ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ５０を発現する組織または細胞型に由来するヒトｃＤＮＡである。ある実施形態において、ヒトｃＤＮＡは視床下部または下垂体由来である。
【００６１】
ある実施形態において、特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＲ５０  Ｇタンパク質共役受容体である。
【００６２】
ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。ある実施形態において、被験体は、マウス、ラット、およびヒトからなる群より選択される哺乳動物である。ある実施形態において、被験体はヒトである。
【００６３】
ある実施形態において、被験体は過体重または肥満である。ある実施形態において、被験体は過体重である。ある実施形態において、被験体は肥満である。
【００６４】
ある実施形態において、ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物の能力は、その化合物が被験体の体重を減少させる化合物であることを示す。
【００６５】
ある実施形態において、ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物の能力は、その化合物が被験体の脂肪過多症を減少させる化合物であることを示す。
【００６６】
ある実施形態において、ＧＰＣＲの機能を阻害する化合物の能力は、その化合物が被験体の体脂肪率を減少させる化合物であることを示す。
【００６７】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【００６８】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは組換えである。
【００６９】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは内因性である。ある実施形態において、内因性であるＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＲ５０である。ある実施形態において、ＧＰＣＲは非内因性である。
【００７０】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは哺乳動物ＧＰＲ５０である。
【００７１】
ある実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、内因性ＧＰＣＲである、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。特定の実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０を認識する抗体（内因性哺乳動物ＧＰＲ５０を認識する抗体は、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから商業的に入手可能である）を特異的に結合し、または哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドを特異的に結合する。特定の実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の内因性リガンドである。
【００７２】
ある実施形態において、配列番号２または配列番号４に対して、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２または配列番号４に対して、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号６に対して、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号６に対して、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号８に対して、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号８に対して、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。
【００７３】
ある実施形態において、上記接触させる工程は、宿主細胞、またはＧＰＣＲを発現する宿主細胞の膜と候補化合物を接触させることを含み、上記宿主細胞は、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【００７４】
ある実施形態において、本発明の方法は、ＧＰＣＲ、および甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）で宿主細胞を同時トランスフェクトする工程を包含する。
【００７５】
ある実施形態において、上記決定する工程は、ＧＰＣＲを含む膜を用いて実行される。
【００７６】
ある実施形態において、本発明の方法は、二次メッセンジャーを検出する工程を包含する。
【００７７】
ある実施形態において、上記決定する工程は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋からなる群より選択される二次メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによる。ある実施形態において、上記二次メッセンジャーはｃＡＭＰである。ある実施形態において、細胞内ｃＡＭＰのレベルが増加する。
【００７８】
ある実施形態において、上記決定する工程は、メラニン保有細胞アッセイの使用を含むプロセスによる。ある実施形態において、メラニン保有細胞は色素凝集を受ける。ある実施形態において、候補化合物は、作用薬によって誘導される色素凝集を阻害する。ある実施形態において、候補化合物は、構成的に誘導される色素凝集のレベルを阻害する。
【００７９】
ある実施形態において、上記決定する工程は、ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳの結合の測定を含むプロセスによる。ある実施形態において、ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳの結合は減少する。
【００８０】
ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、作用薬、部分作用薬、逆作用薬、および拮抗薬からなる群より選択されるＧＰＣＲの調節因子である。ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、ＧＰＣＲの逆作用薬である。ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、ＧＰＣＲの拮抗薬である。ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【００８１】
ある実施形態において、候補化合物は小分子である。
【００８２】
ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、候補化合物は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、候補化合物は脂質である。ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドではない。ある実施形態において、候補化合物は脂質ではない。ある実施形態において、候補化合物は非内因性である。ある実施形態において、候補化合物は内因性ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激することが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの作用薬であることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの部分作用薬であることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの逆作用薬であることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの拮抗薬であることが知られていない化合物である。
【００８３】
ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、ＧＰＣＲの作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００８４】
ある実施形態において、医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００８５】
ある実施形態において、本発明の方法は、候補化合物によって引き起こされる受容体の調節を、受容体の既知の調節因子と受容体を接触させることによって引き起こされる受容体の第２の調節に対して比較する工程をさらに包含する。
【００８６】
ある実施形態において、上記方法は、調節因子または医薬品を薬学的組成物に製剤化する工程をさらに包含する。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００８７】
ある実施形態において、上記方法は、調節因子または医薬品の合成をさらに包含する。ある実施形態において、この調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００８８】
ある実施形態において、上記方法は以下の工程をさらに包含する：任意に、調節因子または医薬品の構造を決定する工程；および調節因子もしくは医薬品、または調節因子もしくは医薬品の名称もしくは構造を提供する工程。ある実施形態において、この調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００８９】
ある実施形態において、上記方法は以下の工程をさらに包含する：任意に、調節因子または医薬品の構造を決定する工程；調節因子もしくは医薬品、または調節因子もしくは医薬品の名称もしくは構造を提供する工程；および調節因子または医薬品を製造または合成する工程。ある実施形態において、この調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。
【００９０】
ある実施形態において、本発明の方法は、ＧＰＣＲの作用薬を同定する工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、医薬品として上記作用薬を製剤化する工程をさらに包含する。ある実施形態において、この方法は、ＧＰＣＲの部分作用薬を同定する工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、医薬品として上記部分作用薬を製剤化する工程をさらに包含する。ある実施形態において、この方法は、ＧＰＣＲの逆作用薬を同定する工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、医薬品として上記逆作用薬を製剤化する工程をさらに包含する。ある実施形態において、この方法は、ＧＰＣＲの拮抗薬を同定する工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、医薬品として上記拮抗薬を製剤化する工程をさらに包含する。
【００９１】
ある実施形態において、ベースライン細胞内応答（例えば、既知の作用薬の非存在下での応答）は、逆作用薬の存在下で、逆作用薬の非存在下におけるベースライン応答と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％阻害される。
【００９２】
ある実施形態において、ベースライン細胞内応答（例えば、既知の作用薬の非存在下での応答）は、拮抗薬の存在下で、拮抗薬の非存在下におけるベースライン応答と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％阻害される。
【００９３】
ある実施形態において、上記ＧＰＣＲと候補化合物を接触させる工程は、ＧＰＣＲを含む真核生物宿主細胞またはＧＰＣＲを含むその膜と、候補化合物を接触させる工程を包含する。ある実施形態において、真核生物宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。ある実施形態において、哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＣＢ３９０１細胞、２９３細胞、または２９３Ｔ細胞である。ある実施形態において、真核生物宿主細胞はメラニン保有細胞宿主細胞である。ある実施形態において、真核生物宿主細胞は酵母宿主細胞である。ある実施形態において、真核生物宿主細胞は組換え真核生物宿主細胞である。
【００９４】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の方法に従って同定可能である調節因子または医薬品を特徴とする。
【００９５】
ある実施形態において、調節因子または医薬品は、第１の態様の方法に従って同定される。
【００９６】
ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。ある実施形態において、ＧＰＣＲの作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０はヒトＧＰＲ５０である。
【００９７】
ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ＧＰＣＲの拮抗薬である。ある実施形態において、ＧＰＣＲの逆作用薬または拮抗薬は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０はヒトＧＰＲ５０である。
【００９８】
ある実施形態において、調節因子または医薬品は小分子である。
【００９９】
ある実施形態において、調節因子または医薬品はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子または医薬品は脂質である。ある実施形態において、調節因子または医薬品はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は非内因性である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１００】
ある実施形態において、調節因子または医薬品は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子または医薬品は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１０１】
ある実施形態において、調節因子または医薬品は、経口で有効である。
【０１０２】
第３の態様において、本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を特徴とする。
【０１０３】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１０４】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１０５】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１０６】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は拮抗薬である。
【０１０７】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１０８】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１０９】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１１０】
ある実施形態において、調節因子は経口で有効である。
【０１１１】
第４の態様において、本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを混合する工程を包含する、薬学的組成物を調製する方法を特徴とする。
【０１１２】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１１３】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１１４】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１１５】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は拮抗薬である。
【０１１６】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１１７】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１１８】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１１９】
ある実施形態において、調節因子は経口で有効である。
【０１２０】
第５の態様において、本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子、またはこの調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の治療有効量を、その必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する、体重を減少し、脂肪過多症を減少し、または体脂肪率を減少する方法を特徴とする。
【０１２１】
ある実施形態において、この方法は体重を減少する方法である。
【０１２２】
ある実施形態において、この方法は脂肪過多症を減少する方法である。
【０１２３】
ある実施形態において、この方法は体脂肪率を減少する方法である。
【０１２４】
ある実施形態において、哺乳動物は過体重または肥満である。ある実施形態において、哺乳動物は過体重である。ある実施形態において、哺乳動物は肥満である。
【０１２５】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１２６】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１２７】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１２８】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。
【０１２９】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１３０】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１３１】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、またはヒトである。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１３２】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１３３】
ある実施形態において、上記投与する工程は経口である。
【０１３４】
第６の態様において、本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子、またはこの調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の治療有効量を、その必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療する方法を特徴とする。
【０１３５】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１３６】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０１３７】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１３８】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１３９】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。
【０１４０】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１４１】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１４２】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、またはヒトである。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１４３】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１４４】
ある実施形態において、上記投与する工程は経口である。
【０１４５】
第７の態様において、本発明は、哺乳動物の体重を減少させるため、または哺乳動物の脂肪過多症を減少させるため、または哺乳動物の体脂肪率を減少させるための医薬の製造における、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子の使用を特徴とする。
【０１４６】
ある実施形態において、この医薬は、哺乳動物の体重を減少させるためである。
【０１４７】
ある実施形態において、この医薬は、哺乳動物の脂肪過多症を減少させるためである。
【０１４８】
ある実施形態において、この医薬は、哺乳動物の体脂肪率を減少させるためである。
【０１４９】
ある実施形態において、哺乳動物は過体重または肥満である。ある実施形態において、哺乳動物は過体重である。ある実施形態において、哺乳動物は肥満である。
【０１５０】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１５１】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１５２】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１５３】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。
【０１５４】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１５５】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１５６】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１５７】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１５８】
ある実施形態において、調節因子は経口で有効である。
【０１５９】
第８の態様において、本発明は、哺乳動物の肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための医薬の製造における、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子の使用を特徴とする。
【０１６０】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０１６１】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１６２】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１６３】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１６４】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。
【０１６５】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１６６】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１６７】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１６８】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１６９】
ある実施形態において、調節因子は経口で有効である。
【０１７０】
第９の態様において、本発明は、哺乳動物の体重を減少させるための使用のため、哺乳動物の脂肪過多症を減少させるための使用のため、哺乳動物の体脂肪率を減少させるための使用のため、または哺乳動物の肥満もしくはそれに関連する状態を予防もしくは治療するための使用のための、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子の使用を特徴とする。
【０１７１】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０１７２】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１７３】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１７４】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１７５】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。
【０１７６】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１７７】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１７８】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１７９】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１８０】
ある実施形態において、調節因子は経口で有効である。
【０１８１】
第１０の態様において、本発明は、哺乳動物の体重を減少させるための使用のため、哺乳動物の脂肪過多症を減少させるための使用のため、哺乳動物の体脂肪率を減少させるための使用のため、または哺乳動物の肥満もしくはそれに関連する状態を予防もしくは治療するための使用のための、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の使用を特徴とする。
【０１８２】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０１８３】
ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子は、ヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０の調節因子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ５０の調節因子である。
【０１８４】
ある実施形態において、調節因子は第２の態様に従う。
【０１８５】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である。
【０１８６】
ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。
【０１８７】
ある実施形態において、調節因子は小分子である。
【０１８８】
ある実施形態において、調節因子はポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、調節因子は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、調節因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、調節因子は脂質である。ある実施形態において、調節因子はポリペプチドではない。ある実施形態において、調節因子は脂質ではない。ある実施形態において、調節因子は非内因性である。ある実施形態において、調節因子は内因性ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、調節因子は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０１８９】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１９０】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記のアッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０１９１】
ある実施形態において、調節因子は経口で有効である。
【０１９２】
第１１の態様において、本発明は、ＧＰＣＲまたはその改変体または生物学的に活性なフラグメントのリガンドとしての候補化合物を同定する方法を特徴とし、上記ＧＰＣＲは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｃ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｄ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｅ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｆ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）のアミノ酸配列；
（ｇ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｌ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｍ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｏ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｑ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｒ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｓ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｔ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列
を含み、上記方法は、
（ａ’）候補化合物の存在下または非存在下で、ＧＰＣＲに対する任意に標識された既知リガンドと、上記ＧＰＣＲを接触させる工程；
（ｂ’）既知リガンドと上記ＧＰＣＲの間の複合体を検出する工程；および
（ｃ’）候補化合物の非存在下よりも、候補化合物の存在下で、上記複合体がより少なく形成されるか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、上記決定は、候補化合物が上記受容体のリガンドであることを示す。
【０１９３】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性ＧＰＣＲである。
【０１９５】
ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。
【０１９６】
ある実施形態において、ＰＣＲはＲＴ−ＰＣＲである。
【０１９７】
ある実施形態において、ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ５０を発現する組織または細胞型に由来するヒトｃＤＮＡである。ある実施形態において、ヒトｃＤＮＡは視床下部または下垂体由来である。
【０１９８】
ある実施形態において、特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＲ５０  Ｇタンパク質共役受容体である。
【０１９９】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは組換えである。
【０２００】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは内因性である。ある実施形態において、内因性であるＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＲ５０である。ある実施形態において、ＧＰＣＲは非内因性である。
【０２０１】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは哺乳動物ＧＰＲ５０である。
【０２０２】
ある実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、内因性ＧＰＣＲである、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。特定の実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０を認識する抗体（内因性哺乳動物ＧＰＲ５０を認識する抗体は、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから商業的に入手可能である）を特異的に結合し、または哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドを特異的に結合する。特定の実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の内因性リガンドである。
【０２０３】
ある実施形態において、ＧＰＣＲに対する既知のリガンドは、哺乳動物ＧＰＲ５０に対する既知のリガンドである。ある実施形態において、ＧＰＣＲに対する既知のリガンドは、ヒトＧＰＲ５０に対する既知のリガンドである。
【０２０４】
ある実施形態において、ＧＰＣＲに対する既知のリガンドは、配列番号２に対する既知のリガンドである。ある実施形態において、ＧＰＣＲに対する既知のリガンドは、配列番号４に対する既知のリガンドである。ある実施形態において、ＧＰＣＲに対する既知のリガンドは、配列番号６に対する既知のリガンドである。ある実施形態において、ＧＰＣＲに対する既知のリガンドは、配列番号８に対する既知のリガンドである。
【０２０５】
ある実施形態において、既知のリガンドは、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０２０６】
ある実施形態において、既知のリガンドは放射性標識されている。
【０２０７】
ある実施形態において、候補化合物は小分子である。
【０２０８】
ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、候補化合物は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、候補化合物は脂質である。ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドではない。ある実施形態において、候補化合物は脂質ではない。ある実施形態において、候補化合物は非内因性である。ある実施形態において、候補化合物は内因性ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲのリガンドであることが知られていない化合物である。
【０２０９】
ある実施形態において、本発明の方法は、被験体の体重もしくは脂肪過多症もしくは体脂肪率の調節因子として、または肥満もしくはそれに関連する状態のための医薬品としての候補化合物をスクリーニングするためである。ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。ある実施形態において、被験体は、マウス、ラット、およびヒトからなる群より選択される哺乳動物である。ある実施形態において、被験体はヒトである。
【０２１０】
ある実施形態において、本発明の方法は、肥満またはそれに関連する状態のリスクがある被験体を同定するための放射性イメージングにおいて有用である化合物として候補化合物をスクリーニングするためである。ある実施形態において、被験体はヒトである。
【０２１１】
第１２の態様において、本発明は、内因性ＧＰＲ５０遺伝子における破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を特徴とし、ここで、破壊はホモ接合性であり、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は機能的ＧＰＲ５０タンパク質の産生を欠き、野生型哺乳動物と比較して、高脂肪食によって誘導される体重増加の減少を示す。
【０２１２】
ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはブタである。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。
【０２１３】
第１３の態様において、本発明は、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子としての候補化合物を同定する方法を特徴とし、この方法は以下の工程を包含する：
第１２の態様に従うトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する工程；
このトランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補化合物を投与する工程；および
高脂肪食によって誘導される体重増加の減少がこの候補化合物によって調節されるか否かを決定し、それによって、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子としての候補化合物を同定する工程。
【０２１４】
ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、被験体の体重の調節因子である。
【０２１５】
ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、被験体の脂肪過多症の調節因子である。
【０２１６】
ある実施形態において、被験体の体重または脂肪過多症または体脂肪率の調節因子は、被験体の体脂肪率の調節因子である。
【０２１７】
ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはブタである。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。
【０２１８】
ある実施形態において、候補化合物は小分子である。
【０２１９】
ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、候補化合物は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、候補化合物は脂質である。ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドではない。ある実施形態において、候補化合物は脂質ではない。ある実施形態において、候補化合物は非内因性である。ある実施形態において、候補化合物は内因性ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。
【０２２０】
ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物である被験体は、マウス、ラット、およびヒトからなる群より選択される。ある実施形態において、哺乳動物である被験体はヒトである。
【０２２１】
第１４の態様において、本発明は、哺乳動物の体重の調節因子、または哺乳動物の脂肪過多症の調節因子、または哺乳動物の体脂肪率の調節因子、または肥満もしくはそれに関連する状態のための医薬品としての候補化合物をスクリーニングするためのＧＰＣＲの使用を特徴とし、ここで、このＧＰＣＲは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｃ）ＧＰＣＲが配列番号２のアミノ酸１〜６１７を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｄ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｇ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｈ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）のアミノ酸配列；
（ｉ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約９５％の同一性を有する、内因性Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｎ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｏ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｒ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｓ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｔ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｕ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｖ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその改変体または生物学的に活性なフラグメントを含む。
【０２２２】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【０２２３】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性ＧＰＣＲである。
【０２２５】
ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。
【０２２６】
ある実施形態において、哺乳動物の体重の調節因子は、哺乳動物の体重を減少させる化合物である。ある実施形態において、哺乳動物の脂肪過多症の調節因子は、哺乳動物の脂肪過多症を減少させる化合物である。ある実施形態において、哺乳動物の体脂肪率の調節因子は、哺乳動物の体脂肪率を減少させる化合物である。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０２２７】
ある実施形態において、哺乳動物の体重の調節因子は、哺乳動物の体重を増加させる化合物である。ある実施形態において、哺乳動物の脂肪過多症の調節因子は、哺乳動物の脂肪過多症を増加させる化合物である。ある実施形態において、哺乳動物の体脂肪率の調節因子は、哺乳動物の体脂肪率を増加させる化合物である。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。ある実施形態において、哺乳動物の体重を増加させ、または脂肪過多症を増加させ、または体脂肪率を増加させる化合物は、哺乳動物の悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症を予防または治療するための化合物である。ある実施形態において、哺乳動物の体重を増加させ、または脂肪過多症を増加させ、または体脂肪率を増加させる化合物は、哺乳動物の悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症を予防または治療するための使用のための化合物である。
【０２２８】
ある実施形態において、ＰＣＲはＲＴ−ＰＣＲである。
【０２２９】
ある実施形態において、ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ５０を発現する組織または細胞型に由来するヒトｃＤＮＡである。ある実施形態において、ヒトｃＤＮＡは視床下部または下垂体由来である。
【０２３０】
ある実施形態において、特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用する、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＲ５０  Ｇタンパク質共役受容体である。
【０２３１】
ある実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、内因性ＧＰＣＲである、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。特定の実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０を認識する抗体（内因性哺乳動物ＧＰＲ５０を認識する抗体は、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから商業的に入手可能である）を特異的に結合し、または哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドを特異的に結合する。特定の実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の内因性リガンドである。
【０２３２】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは組換えである。
【０２３３】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは内因性である。ある実施形態において、内因性であるＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＲ５０である。ある実施形態において、ＧＰＣＲは非内因性である。
【０２３４】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは哺乳動物ＧＰＲ５０である。
【０２３５】
ある実施形態において、候補化合物は小分子である。
【０２３６】
ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントではない。ある実施形態において、候補化合物は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件で、ポリペプチドである。ある実施形態において、候補化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、候補化合物は脂質である。ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドではない。ある実施形態において、候補化合物は脂質ではない。ある実施形態において、候補化合物は非内因性である。ある実施形態において、候補化合物は内因性ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物または真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、原核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、真核生物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、哺乳動物が天然に産生する物質ではない。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲのリガンドであることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの機能を阻害または刺激することが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの作用薬であることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの部分作用薬であることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの逆作用薬であることが知られていない化合物である。ある実施形態において、候補化合物は、ＧＰＣＲの拮抗薬であることが知られていない化合物である。
【０２３７】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０２３８】
ある実施形態において、スクリーニングは、ＧＰＣＲの作用薬のためである。ある実施形態において、スクリーニングは、ＧＰＣＲの部分作用薬のためである。ある実施形態において、スクリーニングは、ＧＰＣＲの逆作用薬のためである。ある実施形態において、スクリーニングは、ＧＰＣＲの拮抗薬のためである。
【０２３９】
ある実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群より選択される。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０２４０】
出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意の１種以上の候補化合物を除外する権利を保持している。出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意の１種以上の調節因子を除外する権利を保持している。例として、かつ限定としてではなく、出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意の１種以上の逆作用薬または拮抗薬を除外する権利を保持している。出願人らは、本発明の実施形態のいずれかから任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを除外する権利を保持している。出願人らは、さらに、本発明の実施形態のいずれかから任意の肥満に関連する状態を除外する権利を保持している。本発明の肥満に関連する状態を、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ることもまた、明確に意図される。出願人らは、さらに、本発明の実施形態のいずれかから体重の増加によって改善される任意の障害を除外する権利を保持している。本発明の体重の増加によって改善される障害を、個別に１つの実施形態に、または任意の組み合わせのいずれかに含め得ることもまた、明確に意図される。
【０２４１】
さらなる労力を伴うことなく、当業者は、先の記載を使用して、本発明をその全文の内容まで実施することができると考えられる。前述の詳細な説明は、理解の明確化のみのために与えられ、そこからの不必要な制限と理解されるべきではない。本発明の範囲内での改変が、当業者には明らかになり得るからである。
【０２４２】
本願の全体にわたって、種々の刊行物、特許、および公開特許出願が引用される。本願において引用されるこれらの刊行物、特許、および公開特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書で本開示に援用される。刊行物、特許、または公開特許出願の出願人による本明細書での引用は、出願人による、上記刊行物、特許、または公開特許出願の先行技術としての認可ではない。
【０２４３】
本願は、示された日付に米国速達郵便で米国特許商標庁に出願した、以下の仮特許出願からの優先権の利益を請求する：２００５年１１月１０日出願、米国仮特許出願番号６０／７３５，３４６。前述の仮特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２４４】
詳細な説明
定義
脂肪過多症とは、本明細書で使用される場合、体脂肪をいう。
【０２４５】
作用薬とは、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘発するために、ＧＰＣＲへの結合によってＧＰＣＲを活性化する因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０２４６】
本明細書で使用されるアミノ酸の省略形は表Ｂに示す：
（表Ｂ）
【０２４７】
【表２】
2009519007.tif 000004
拮抗薬とは、作用薬または部分作用薬とほぼ同じ部位でＧＰＣＲに結合し、好ましくは、競合的に結合するが、活性型のＧＰＣＲによって開始される細胞内応答を活性化せず、それによって、作用薬または部分作用薬による細胞内応答を阻害可能である因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。拮抗薬は、代表的には、作用薬または部分作用薬の非存在下でベースライン細胞内応答を減少しない。
【０２４８】
抗体は、本明細書では、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含めることを意図する。本発明の抗体は、当該分野で公知である任意の適切な方法によって調製されてもよい。
【０２４９】
ＧＰＣＲポリペプチドまたはアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントとは、天然に存在するＧＰＣＲの構造的な機能および生化学的な機能を有するポリペプチドまたはアミノ酸配列のフラグメントを意味する。特定の実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは、Ｇタンパク質と共役する。特定の実施形態において、生物学的に活性なフラグメントは、リガンドに結合する。
【０２５０】
候補化合物とは、スクリーニング技術が受け入れ可能である分子（例えば、非限定的に、化学化合物）を意味し、本明細書では、試験化合物と交換可能に使用される。
【０２５１】
コドンとは、一般的に、リン酸基に結合されたヌクレオシド［アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、およびチミジン（Ｔ）］を含み、翻訳されるときにアミノ酸をコードする、３個のヌクレオチド（またはヌクレオチドの等価物）の集団を意味する。
【０２５２】
組成物とは、少なくとも１つの成分を含む物質を意味する。
【０２５３】
化合物の効力または効力とは、例えば、候補化合物の存在下または非存在下におけるｃＡＭＰレベルの測定による、１つ以上のＧＰＣＲの機能を阻害または刺激する化合物の能力を意味する。化合物の効力を測定する例示的な手段は、本特許文書の実施例の節に開示されている。
【０２５４】
肥満に関連する状態は、以下を含むことを意図するがこれらに限定されない：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０２５５】
構成的に活性な受容体とは、受容体のリガンドまたはその化学的等価物への受容体の結合を通して以外の手段によって、活性状態で安定化されている受容体を意味する。構成的に活性な受容体は、内因性または非内因性であり得る。
【０２５６】
構成的に活性化された受容体とは、構成的に活性であるように、または構成的により活性であるように修飾されている内因性受容体を意味する。
【０２５７】
構成的な受容体活性化とは、受容体のリガンドまたはその化学的等価物への結合の非存在下での受容体の活性化を意味する。
【０２５８】
接触するまたは接触とは、インビトロ系においてまたはインビボ系においてに関わらず、少なくとも２つの部分が一緒にされることを意味する。
【０２５９】
直接的に同定するまたは直接的に同定されるとは、語句「候補化合物」または「試験化合物」との関連において、Ｇタンパク質共役受容体への既知のリガンド（例えば、既知の作用薬）の非存在下での、Ｇタンパク質共役受容体に対する化合物のスクリーニングを意味する。
【０２６０】
異脂肪血症とは、本明細書で使用される場合、異常な濃度の血清脂質、例えば、ＨＤＬ（低濃度）、ＬＤＬ（高濃度）、ＶＬＤＬ（高濃度）、トリグリセリド（高濃度）、リポタンパク質（ａ）（高濃度）、遊離脂肪酸（高濃度）、および他の血清脂質、またはその組み合わせをいう。
【０２６１】
内因性は、哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、しかし、非限定的に、用語「受容体」と関連する内因性は、哺乳動物（例えば、非限定的に、ヒト）によって天然に産生される物質を意味する。内因性は、遺伝子の対立遺伝子改変体、ならびにそのようにコードされている対立遺伝子ポリペプチド改変体を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、「内因性ＧＰＣＲ」および「ネイティブＧＰＣＲ」は交換可能に使用される。対照的に、非内因性という用語は、この状況において、哺乳動物（例えば、非限定的に、ヒト）によって天然に産生されない物質を意味する。
【０２６２】
発現ベクターは、発現ベクターのための適切な組換え宿主細胞中で、クローニングされたＤＮＡの転写および転写されたｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列を意味する。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞中での自律的な複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力、および活性なプロモーターを含むべきである。転写されるためにクローニングされるＤＮＡは、発現ベクターの中の構成的にまたは条件的に活性なプロモーターに作動可能に連結される。
【０２６３】
Ｇタンパク質共役受容体融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質は、本明細書に開示される本発明の状況において、各々が、少なくとも１つのＧタンパク質、最も好ましくは、このようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これはＧＴＰを結合するサブユニットである）に融合された、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲ、または非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを含む、非内因性タンパク質を意味し、このＧタンパク質は、好ましくは、内因性ＧＰＣＲと天然に共役するＧタンパク質と同じ型である。好ましい型において、Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲのＣ末端に直接的に融合可能であり、または２つの間にスペーサーが存在してもよい。
【０２６４】
宿主細胞は、そこに組み込まれたベクターを有することが可能である細胞を意味する。現在の状況において、ベクターは、代表的には、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ融合タンパク質の発現が起こることを可能にするために、適切なプロモーター配列との作動可能な接続にあるＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【０２６５】
予防または治療の必要があるとは、本明細書で使用される場合、介護者（例えば、ヒトの場合においては医師、看護師、ナース・プラクティショナーなど；非ヒト哺乳動物を含む動物の場合においては獣医）によって行われる、被験体または動物が治療を必要としているか、または治療から利益を受ける判断をいう。この判断は、介護者の経験の範囲にあるが、本発明の化合物によって治療可能である状態の結果として、被験体または動物が病気であるか、または病気になるであろうという知識を含む、種々の要因に基づいて行われる。
【０２６６】
阻害するまたは阻害とは、用語「応答」との関連において、化合物の非存在下においてとは反対に、化合物の存在下で、応答が減少または妨害されることを意味する。
【０２６７】
逆作用薬とは、ＧＰＣＲに結合し、活性型の受容体によって開始されたベースライン細胞内応答を、作用薬または部分作用薬の非存在下で観察される正常な基礎レベル活性より下に阻害する因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０２６８】
リガンドとは、本明細書で使用される場合、ＧＰＣＲに特異的に結合する分子を意味する。内因性リガンドは、ネイティブＧＰＣＲに結合する内因性分子である。ＧＰＣＲのリガンドは、ＧＰＣＲの作用薬、部分作用薬、逆作用薬、または拮抗薬である可能性があるが、これらに限定されない。
【０２６９】
メタボリック症候群とは、本明細書で定義されるように、および成人治療パネルＩＩＩ（ＡＴＰ  ＩＩＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ：Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ），Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２００１（ＮＩＨ  ｐｕｂ．Ｎｏ  ０１−３６７０））に従って、ヒトが、肥満、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬグリセロール、高血圧、および空腹時高血糖に関連する５つの判断基準の内の３つ以上に合致する場合に起こる。
【０２７０】
本明細書で使用される場合、調節するまたは修飾するという用語は、特定の活性、機能、または分子の量、質、または効果の増加または減少をいうことを意味する。
【０２７１】
調節因子は、本明細書中上記で定義された作用薬、部分作用薬、逆作用薬、および拮抗薬を含むと理解される。
【０２７２】
肥満は、本明細書で使用される場合、体重のＷＨＯ分類に従って、３０．０以上の肥満度指数（ＢＭＩ）として定義される［Ｋｏｐｅｌｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：６３５−６４３；この開示はその全体が参照により本明細書に援用される］。特定の実施形態において、肥満は、体脂肪含量に基づいて定義される：男性では２５％より上、女性では３０％より上である。
【０２７３】
過体重とは、本明細書で使用される場合、２７〜２９．９の肥満度指数（ＢＭＩ）として定義される。
【０２７４】
部分作用薬とは、完全作用薬よりも少ない範囲または程度ではあるが、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘発するために、ＧＰＣＲへの結合によってＧＰＣＲを活性化する因子（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０２７５】
薬学的組成物は、少なくとも１つの活性成分を含み、それによって、組成物が、哺乳動物（例えば、ヒトであるがこれに限定されない）における特定の有効な結果のための治験に受け入れ可能である組成物を意味する。当業者は、例えば、当業者の必要性に基づいて、活性成分が所望の有効な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解および評価する。
【０２７６】
ポリヌクレオチドとは、一本鎖または二重鎖型のいずれかである１つより多くのヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列をいう。本発明のポリヌクレオチドは、合成、組換え、エキソビボ生成、またはこれらの組み合わせ、ならびに当該分野で公知の任意の精製方法利用することを含む任意の公知の方法によって調製されてもよい。
【０２７７】
ポリペプチドとは、ポリマーの長さに関わらず、アミノ酸のポリマーをいう。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定または除外しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドは、ポリペプチドという用語に明確に含まれる。
【０２７８】
プライマーは、標的ヌクレオチド配列に相補的である特定のヌクレオチド配列を示すために本明細書で使用され、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするために使用される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として働く。
【０２７９】
受容体機能とは、遺伝子転写の調節、イオンの流入もしくは流出の調節、触媒反応をもたらすこと、および／またはＧタンパク質を通しての活性の調節、例えば、二次メッセンジャー応答を誘発することを含むがこれらに限定されない、細胞内で刺激を受け取り、効果を調節するための受容体の正常の操作をいう。
【０２８０】
二次メッセンジャーは、受容体活性化の結果として生じる細胞内応答を意味する。二次メッセンジャーには、例えば、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋を含めることができる。二次メッセンジャー応答は、受容体活性化の決定のために測定することができる。加えて、二次メッセンジャー応答は、例えば、受容体の逆作用薬、部分作用薬、作用薬、および拮抗薬としての候補化合物の同定のために測定することができる。
【０２８１】
選択的ＧＰＲ５０調節因子は、本明細書で使用される場合、１種以上の密接に関連する受容体、例えば、メラトニン受容体１Ａ（ＭＴＮＲ１Ａ）またはメラトニン受容体１Ｂ（ＭＴＮＲ１Ｂ）よりもＧＰＲ５０受容体に対して選択性を有する、ＧＰＲ５０の調節因子をいう。
【０２８２】
小分子とは、モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有する化合物を意味と解釈され、これには、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物を含む）、およびその塩、エステル、および他の薬学的に受容可能な型が含まれる。特定の好ましい実施形態において、小分子は、モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物である。特定の実施形態において、小分子は、モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物である。特定の好ましい実施形態において、小分子は、モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物である。
【０２８３】
刺激するまたは刺激とは、用語「応答」との関連において、化合物の非存在下においてとは反対に、化合物の存在下で、応答が増加されることを意味する。
【０２８４】
被験体とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物をいい、より好ましくは、マウスまたはラット、最も好ましくはヒトをいう。
【０２８５】
治療有効量とは、本明細書で使用される場合、研究者、獣医、医師、または他の臨床家によって探索される、組織、系、動物、被験体、またはヒトにおいて生物学的応答または医薬品の応答を誘発する活性化合物または医薬品の量をいい、この応答は以下の１つ以上を含む：
（１）疾患を予防すること；例えば、疾患、状態、または障害になる素因を有する可能性があるが、その疾患の病理または徴候をまだ経験していないかまたは示していない被験体において、疾患、状態、または障害を予防すること、
（２）疾患を抑制すること；例えば、疾患、状態、または障害の病理または徴候を経験しているかまたは示している被験体において、疾患、状態、または障害を抑制すること（すなわち、病理および／または徴候のさらなる発生を阻止すること）、および
（３）疾患を改善すること；例えば、疾患、状態、または障害の病理または徴候を経験しているかまたは示している被験体において、疾患、状態、または障害を改善すること（すなわち、病理および／または徴候を逆転すること）。
【０２８６】
改変体は、この用語が本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドからそれぞれ異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの代表的な改変体は、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよいし、または変化させなくてもよい。ポリペプチドの代表的な改変体は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。改変体および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせの１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なってもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体は、対立遺伝子改変体などの天然に存在するものであってもよいし、または天然に存在することが知られていない改変体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない改変体は、変異誘発技術または直接的合成によって作製されてもよい。
【０２８７】
Ａ．緒言
以下の節の順番は、提示の効率のために示され、本開示または添付の特許請求の範囲に対する限定として意図されておらず、そのように解釈されるべきでもない。
【０２８８】
Ｂ．受容体発現
１．目的のＧＰＣＲポリペプチド
本発明のＧＰＣＲは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体または生物学的に活性なフラグメントを含み得る：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｃ）ＧＰＣＲが配列番号２の１〜６１７のアミノ酸を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜６１７；
（ｄ）配列番号２が配列番号２のアミノ酸４９３位におけるセリンのアスパラギンによる置換、配列番号２のアミノ酸５３２位におけるスレオニンのアラニンによる置換、および配列番号２のアミノ酸６０６位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｇ）ＧＰＣＲが配列番号４のアミノ酸１〜６１３を含まない、配列番号４のアミノ酸２〜６１３；
（ｈ）配列番号４が配列番号４のアミノ酸４９３位におけるアスパラギンのセリンによる置換、配列番号４のアミノ酸５２８位におけるアラニンのスレオニンによる置換、および配列番号４のアミノ酸６０２位におけるバリンのイソロイシンによる置換の任意の組み合わせを含む、（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉ）特異的プライマー配列番号９および配列番号１０を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能であるポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１もしくは配列番号３の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｎ）ＧＰＣＲが配列番号６のアミノ酸１〜５９１を含まない、配列番号６のアミノ酸２〜５９１；
（ｏ）配列番号５の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｐ）配列番号６に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｒ）配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｓ）ＧＰＣＲが配列番号８のアミノ酸１〜５９４を含まない、配列番号８のアミノ酸２〜５９４；
（ｔ）配列番号７の相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
（ｕ）配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する、Ｇタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；および
（ｖ）配列番号２もしくは配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列。
【０２８９】
ある実施形態において、ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列を含む。
【０２９０】
ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有するＧタンパク質共役受容体は、非内因性ＧＰＣＲである。
【０２９１】
ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２または配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンであるＧタンパク質共役受容体は、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。
【０２９２】
ある実施形態において、ヒトＤＮＡは、ＧＰＲ５０を発現する組織または細胞型に由来するヒトｃＤＮＡである。ある実施形態において、ヒトｃＤＮＡは視床下部由来である。ある実施形態において、ヒトｃＤＮＡは下垂体由来である。
【０２９３】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは組換えである。ある実施形態において、組換えＧＰＣＲは組換えヒトＧＰＲ５０である。
【０２９４】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは内因性である。
【０２９５】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは非内因性である。
【０２９６】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは哺乳動物ＧＰＲ５０である。
【０２９７】
ある実施形態において、内因性であるＧＰＣＲは哺乳動物内因性ＧＰＣＲである。
【０２９８】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは構成的に活性である。ある実施形態において、本発明の内因性ＧＰＣＲは構成的に活性である。ある実施形態において、本発明の非内因性ＧＰＣＲは構成的に活性である。ある実施形態において、本発明の哺乳動物ＧＰＣＲは構成的に活性である。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０はヒトＧＰＲ５０である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０は配列番号２またはその対立遺伝子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０は配列番号４またはその対立遺伝子である。
【０２９９】
ある実施形態において、本発明のＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、本発明の内因性ＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、本発明の非内因性ＧＰＣＲは、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、本発明の哺乳動物ＧＰＲ５０は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、哺乳動物ＧＰＲ５０はヒトＧＰＲ５０である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０は配列番号２またはその対立遺伝子である。ある実施形態において、ヒトＧＰＲ５０は配列番号４またはその対立遺伝子である。
【０３００】
ある実施形態において、対象の方法において使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２を有する受容体の構成的に活性なバージョンである。ある実施形態において、配列番号２を有する受容体の構成的に活性なバージョンは、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２を有する受容体の構成的に活性なバージョンは、配列番号２を有する内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号２を有する受容体の構成的に活性なバージョンは、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、対象の方法において使用され得るＧＰＣＲは、配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンである。ある実施形態において、配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンは、内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンは、配列番号４を有する内因性Ｇタンパク質共役受容体である。ある実施形態において、配列番号４を有する受容体の構成的に活性なバージョンは、非内因性Ｇタンパク質共役受容体である。
【０３０１】
例示のためであり、限定としてではなく、Ｎ末端メチオニン残基またはＮ末端シグナルペプチドの欠失は、対象の発明において使用し得る生物学的に活性なフラグメントを提供することが想定される。ある実施形態において、本発明の生物学的に活性なフラグメントは、検出可能なレベルの構成的活性を示すフラグメントである。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。特定の実施形態において、本発明の生物学的に活性なフラグメントは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０を認識する抗体（内因性哺乳動物ＧＰＲ５０を認識する抗体は、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから商業的に入手可能である）を特異的に結合し、または哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドを特異的に結合するフラグメントである。特定の実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の内因性リガンドである。
【０３０２】
配列番号２または配列番号４のヒトＧＰＲ５０、配列番号６のマウスＧＰＲ５０、または配列番号８のラットＧＰＲ５０の対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内で想定される。ある実施形態において、対象の方法において使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４の対立遺伝子改変体を含み得る。
【０３０３】
配列番号２または配列番号４のヒトＧＰＲ５０の哺乳動物オルトログである改変体は、本発明の範囲内で想定される。例示のためでありかつ限定ではなく、マウスＧＰＲ５０およびラットＧＰＲ５０に加えて、ヒツジＧＰＲ５０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿００１００９７２６）、チンパンジーＧＰＲ５０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＸＰ＿００１１３６００５）、およびアカゲザルＧＰＲ５０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＸＰ＿００１０９２０２６）が本発明の範囲内で想定される。
【０３０４】
特定の実施形態において、対象の方法において使用され得る改変体ＧＰＣＲは、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列における１個または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加によって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から誘導されるＧＰＣＲである。
【０３０５】
特定の実施形態において、対象の方法において使用され得る改変体ＧＰＣＲは、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列における１０個を超えない保存性アミノ酸置換および／または３個を超えない非保存性アミノ酸置換によって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から誘導されるＧＰＣＲである。特定の実施形態において、アルギニン、リジン、およびヒスチジンは互いに保存性置換し得る；グルタミン酸およびアスパラギン酸は互いに保存性置換し得る；グルタミンおよびアスパラギンは互いに保存性置換し得る；ロイシン、イソロイシン、およびバリンは互いに保存性置換し得る；フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは互いに保存性置換し得る；そしてグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、およびメチオニンは互いに保存性置換し得る。アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加は任意の位置であり得る（例えば、Ｃ末端もしくはＮ末端、または内部の位置）。
【０３０６】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のそれぞれに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の改変体は、本発明の範囲内で想定される。ある実施形態において、上記改変体は配列番号２の改変体である。ある実施形態において、上記改変体は配列番号４の改変体である。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の改変体である改変体はＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の改変体である改変体は内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、内因性ＧＰＣＲである改変体は哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の改変体である改変体は非内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の改変体である改変体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。ある実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の改変体である改変体は、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０を認識する抗体（内因性哺乳動物ＧＰＲ５０を認識する抗体は、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから商業的に入手可能である）を特異的に結合し、または哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドを特異的に結合する抗体を特異的に結合する。特定の実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の内因性リガンドである。同一性パーセントは、公知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に決定することができる。
【０３０７】
特定の実施形態において、対象の方法において使用され得る改変体ＧＰＣＲは、配列番号２または配列番号４に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号２に対して９５％「同一性」を有する改変体ＧＰＣＲは、この改変体のアミノ酸配列が、配列番号２の各１００アミノ酸配列あたり５個までのアミノ酸の変化を含み得る以外は、配列番号２のアミノ酸１〜６１７に対して同一であることを意味する。従って、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を得るためには、配列中のアミノ酸残基の５％（１００個中５個）までが、配列番号２のアミノ酸１〜６１７と比較して、挿入され、欠失され、または別のアミノ酸で置換され得る。例えば、配列番号４に対して９５％「同一性」を有する改変体ＧＰＣＲは、この改変体のアミノ酸配列が、配列番号４の各１００アミノ酸配列あたり５個までのアミノ酸の変化を含み得る以外は、配列番号４のアミノ酸１〜６１３に対して同一であることを意味する。従って、例えば、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を得るためには、配列中のアミノ酸残基の５％（１００個中５個）までが、配列番号４のアミノ酸１〜６１３と比較して、挿入され、欠失され、または別のアミノ酸で置換され得る。これらの変化は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端において、またはこれらの末端位置間のどこかに存在し得、配列中の残基間で従属的に、または配列中の１つ以上の連続する基の中のいずれかで分散する。
【０３０８】
ある実施形態において、対象の方法において使用され得る改変体ＧＰＣＲは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧＰＣＲである。ある実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号３の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする。ある実施形態において、この改変体は内因性ＧＰＣＲである。ある実施形態において、内因性ＧＰＣＲである改変体は哺乳動物ＧＰＣＲである。ある実施形態において、この改変体は、検出可能なレベルの構成的活性を示す。ある実施形態において、この構成的活性は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるためである。ある実施形態において、この構成的活性は、メラニン保有細胞が色素凝集を受けることを引き起こすためである。特定の実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体は、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０を認識する抗体（内因性哺乳動物ＧＰＲ５０を認識する抗体は、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡから商業的に入手可能である）を特異的に結合し、または哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドを特異的に結合する。特定の実施形態において、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の既知のリガンドは、哺乳動物内因性ＧＰＲ５０の内因性リガンドである。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知である。ある実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬ  変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション；続いて、約５０℃、約５５℃、約６０℃、または約６５℃における０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が含まれる。
【０３０９】
ａ．配列同一性
特定の実施形態において、同一性パーセントは、当該分野において周知であるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して評価される［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−２７２；ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２を参照のこと；この各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトパラメーターを用いて、またはユーザーによって提供される改変パラメーターを用いて使用されてもよい。好ましくは、パラメーターはデフォルトパラメーターである。
【０３１０】
グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、照会配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）と取り調べる配列の間の最高の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら［Ｃｏｍｐ  Ａｐｐ  Ｂｉｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７−２４５；この開示はその全体が参照により本明細書に援用される］のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、照会配列と取り調べる配列の両方がアミノ酸配列である。上記グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸配列アラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは以下の通りである：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ  ０、ｋ−組（ｔｕｐｌｅ）＝２、ミスマッチペナルティー（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝ｌ、結合ペナルティー（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ランダム化グループ（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ）＝２５、長さ（Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ）＝ｌ、ウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ）＝配列長、ギャップペナルティー＝５、ギャップサイズペナルティー＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７または取り調べるアミノ酸配列の長さのうちのどちらか短い方。
【０３１１】
取り調べる配列が、内部欠失によってではなくＮ末端またはＣ末端の欠失に起因して照会配列よりも短い場合、同一性パーセントの結果は、手動で補正されなければならない。なぜなら、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバル同一性パーセントを計算するときに、取り調べる配列のＮ末端またはＣ末端の短縮を考慮しないからである。照会配列と比較して、Ｎ末端またはＣ末端において短縮された取り調べる配列については、照会配列の全体の塩基のパーセントとして、対応する取り調べる配列の残基と一致／アラインされない取り調べる配列のＮ末端およびＣ末端である照会配列の残基の数を計算することによって、同一性パーセントは補正される。残基が一致／アラインされるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、同一性パーセントから減算され、特定のパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されて、最終同一性パーセントスコアに到達する。この最終同一性パーセントスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。照会配列と一致／アラインされない取り調べる配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考慮される。これは、取り調べる配列の最も遠いＮ末端またはＣ末端の残基の外側の照会（ｑｕｅｒｅｙ）アミノ酸残基のみである。
【０３１２】
例えば、９０アミノ酸残基の取り調べる配列が、同一性パーセントを決定するために、１００残基の照会配列とアラインされる。欠失が取り調べる配列のＮ末端に存在し、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の残基とは一致／アラインしない。１０個の不対残基は配列の１０％を表し（Ｎ末端およびＣ末端で一致しない残基の数／照会配列中の残基の総数）、それゆえに、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントスコアから減算される。残りの９０％が完全に一致した場合、最終同一性パーセントは９０％になる。
【０３１３】
別の例において、９０残基の取り調べる配列は、１００残基の照会配列と比較される。今回は、欠失は内部であり、それゆえに、照会配列と一致／アラインしない取り調べる配列のＮ末端またはＣ末端には残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算される同一性パーセントは手動で補正されない。再度、照会配列と一致／アラインしない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示されるような対象の配列のＮ末端またはＣ末端の外側の残基の位置のみが、手動で補正される。他の補正は、本発明の目的のためには行われない。
【０３１４】
ｂ．融合タンパク質
特定の実施形態において、目的のポリペプチドは融合タンパク質であり、例えば、親和性タグドメインまたはレポータードメインを含み得る。適切な親和性タグは、別の部分、通常は別のポリペプチド、最も通常は抗体に特異的に結合し得る任意のアミノ酸配列を含む。適切な親和性タグには、当該分野において公知であるように、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス由来）、ｍｙｃタグなどが含まれる。適切な親和性タグには、当該分野において公知であるように、そのための結合する基質が知られているドメイン、例えば、ＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ、およびＭＢＰタグ、ならびに特定の結合パートナー、例えば、抗体、特に、モノクローナル抗体がそのために利用可能である他のタンパク質からのドメインもまた含まれる。適切な親和性タグは、適切な結合パートナー、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ受容体を使用して特異的に結合されかつ検出され得る、ＩｇＧ  Ｆｃ領域などの任意のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインもまた含む。このような融合タンパク質は、そのＮ末端メチオニン残基が欠失されたか、または代替的なアミノ酸で置換されたかのいずれかであるＧＰＣＲとインフレームで融合された異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含み得ることが明確に意図される。
【０３１５】
適切なレポータードメインには、ポリペプチドの存在下でレポート可能である任意のドメインが含まれる。親和性タグは、例えば、タグに特異的に結合する標識抗体を使用してポリペプチドの存在レポートするために使用され得ることが認識されているが、発光レポータードメインがより通常使用される。適切な発光レポータードメインには、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、またはＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来）、またはその発光改変体が含まれる。他の適切なレポータードメインには、蛍光タンパク質（例えば、クラゲ、サンゴ、および他の腔腸動物から、Ａｅｑｕｏｒｉａ種、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種からのこのような蛍光タンパク質として）、またはその発光改変体が含まれる。これらのレポータータンパク質の発光改変体は、当該分野において非常に周知であり、ネイティブなレポータータンパク質と比較して、より明るく、より薄暗く、または異なる励起および／もしくは発光スペクトルを有する可能性がある。例えば、ある改変体は、当該分野において公知であるように、これらがもはや、緑色に見えず、そして青色、シアンブルー色、黄色、濃い黄赤色（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ  ｅＹＦＰ、およびＲＦＰと呼ばれる）に見ることができ、または他の発光スペクトルを有するように、変化される。他の適切なレポータードメインは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌型胚性アルカリホスファターゼなどの、生化学的なまたは色の変化を通してポリペプチドの存在をレポートし得るドメインを含む。
【０３１６】
これもまた当該分野において公知であるように、親和性タグまたはレポータードメインは、目的のポリペプチド中の任意の位置に存在し得る。しかし、多くの実施形態において、これらは、目的のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に存在する。
【０３１７】
２．目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸
核酸を操作するための遺伝コードおよび組換え技術は公知であるので、および目的のＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列が上記のように記載されるので、目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸の設計および産生は、十分に当業者の範囲内にある。特定の実施形態において、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）の方法が使用される。例えば、ＧＰＣＲコード配列は、本明細書に記載される必要がない種々の組換え方法の任意の１つまたはその組み合わせを使用して、ＧＰＣＲコード配列のライブラリーから単離されてもよい。タンパク質をコードしている核酸配列中でのヌクレオチドの引き続く置換、欠失、および／または付加もまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して行われてもよい。
【０３１８】
例えば、部位特異的変異誘発およびサブクローニングが、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中で核酸残基を導入／欠失／置換するために使用されてもよい。他の実施形態において、ＰＣＲが使用されてもよい。目的のポリペプチドをコードする核酸はまた、オリゴヌクレオチドから化学合成によって完全に作製されてもよい（例えば、Ｃｅｌｌｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７：１０１６−８）。
【０３１９】
ある実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、またはヒトの種の細胞中での発現のために最適化される。ある実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に両生類種の細胞中での発現のために最適化される。
【０３２０】
ａ．ベクター
本発明はさらに、対象の核酸を含むベクター（「構築物」とも呼ばれる）を提供する。本発明の多くの実施形態において、対象の核酸配列は、配列が、例えば、プロモーターを含む発現制御配列に作動可能に連結された後で宿主中で発現される。対象の核酸はまた、代表的には、宿主染色体ＤＮＡのエピソームとして、またはその不可欠な部分としてのいずれかで、宿主細胞中で複製可能な発現ベクター中にも配置される。通例、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含む（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと、これは、参照により本明細書に援用される）。単一発現ベクターまたは二重発現カセットベクターを含むベクターは、当該分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。適切なベクターには、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体）、細菌人工染色体、酵母人工染色体など）、ミニ染色体などが含まれる。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクターが使用されてもよい。
【０３２１】
種々の発現ベクターが、細胞中で目的のポリペプチドを産生する目的のために当業者に利用可能であり、そしてこれには、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから）発現ベクターが含まれる。市販されている発現ベクターには、非限定的な例として、ＣＭＶプロモーターベースのベクターが含まれる。１つの適切な発現ベクターはｐＣＭＶである。発現ベクターはアデノウイルスであり得る。例示的なアデノウイルスベクターは、ＡｄＥａｓｙＴＭとしてＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し得る［Ｈｅ  ＴＣら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９８）９５：２５０９−２５１４；および米国特許第５，９２２，５７６号；これらの各々の開示はその全体が参照により本明細書に援用される］。他の適切な発現ベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０３２２】
対象の核酸は、通常、目的の対象のポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むが、しかし、特定の実施形態において、目的のポリペプチドの発現のための宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得、オープンリーディングフレームはイントロンによって中断され得る。対象の核酸は、代表的には、対象核酸に加えて、ＲＮＡの安定性、翻訳効率などを方向付け得る３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る、転写単位の一部である。対象の核酸は、対象の核酸に加えて、目的のポリペプチドの転写および発現を方向付けるプロモーター、および転写ターミネーターを含む発現カセットの一部でもあり得る。
【０３２３】
真核生物プロモーターは、真核生物宿主細胞中で機能的である任意のプロモーターであり得、これらには、ウイルスプロモーターおよび真核生物遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。例示的な真核生物プロモーターには以下が含まれるがこれらに限定されない：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期ウイルスプロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ，１９８４）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターなど。ウイルスプロモーターは、これらが一般的に特に強力なプロモーターであるので、特に目的のものであり得る。特定の実施形態において、標的病原体のプロモーターであるプロモーターが使用される。本発明における使用のためのプロモーターは、これらが導入される細胞型（および／または動物）において機能的であるように選択される。特定の実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【０３２４】
特定の実施形態において、対象のベクターは、選択マーカーの発現もまた提供し得る。適切なベクターおよび選択マーカーは当該分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）において議論されている。種々の異なる遺伝子が選択マーカーとして利用され、対象のベクターの中で選択マーカーとして利用される特定の遺伝子が、便宜上、主に選択される。既知の選択マーカー遺伝子には以下が含まれる：チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ｔｅｒｔ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒもしくはｃａｔ、ｋａｎｒもしくはｎｅｏｒ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子など。
【０３２５】
上述のように、目的のポリペプチドは、親和性ドメインおよび／またはレポータードメインを含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＧＰＣＲのＣ末端またはＮ末端においてレポーターまたはタグとＧＰＣＲの間の融合物を作製するための方法は十分に当業者の範囲内であり（例えば、ＭｃＬｅａｎら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  ５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１，３１５−３２３）、これ以上の説明はしない。このような融合タンパク質は、そのＮ末端メチオニン残基が欠失しているか、または代わりのアミノ酸で置換されているかのいずれかであるＧＰＣＲとインフレームで融合している異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含んでもよいことが明確に意図される。目的のポリペプチドは、ネイティブなポリペプチドから最初に作製されてもよく、次いで、上記のような適切なレポータータグに作動可能に連結されることが認識される。
【０３２６】
対象の核酸は、通常、目的のポリペプチドをコードしている核酸の構築を容易にするために、制限部位、マルチプルクローニングサイト、プライマー結合部位、ライゲーション可能末端、組換え部位などもまた含み得る。
【０３２７】
ｂ．宿主細胞
本発明はさらに、対象の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞には、原核生物細胞、例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）ならびに真核生物細胞、例えば、動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、または爬虫類細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシまたはシロイヌナズナ細胞）、または真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）が含まれる。特定の実施形態において、目的のポリペプチドをコードしている核酸の発現のために適切な任意の細胞が宿主細胞として使用され得る。通常、動物宿主細胞株が使用され、その例は以下の通りである：サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５  １）；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３［「２９３」］、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ＨＥＫ−２９３Ｔ［「２９３Ｔ」］細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；シリアゴールデンハムスター細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９５９５）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−Ｉ）。
【０３２８】
特定の実施形態において、メラニン保有細胞が使用される。メラニン保有細胞は、下等脊椎動物において見い出される皮膚細胞である。関連する材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および米国特許６，０５１，３８６号の開示に従う。これらの特許の開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０３２９】
さらなる細胞株は当業者に明らかになり、広範な種々の細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９から利用可能である。
【０３３０】
Ｃ．候補化合物のスクリーニング
１．一般的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
Ｇタンパク質受容体が活性になるとき、これは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合し、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。次いで、Ｇタンパク質はＧＴＰａｓｅとして働き、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それによって、受容体は、通常の条件下で、非活性化される。しかし、活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換することを継続する。ＧＴＰの加水分解不可能なアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化受容体を発現する膜への結合の増強をモニターするために使用することができる。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、リガンドの非存在下および存在下での膜へのＧタンパク質への結合をモニターするために使用できることが報告されている。このモニタリングの当業者に周知でありかつ利用可能である数ある例の中で、１つの例は、ＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって１９９５年に報告された。このアッセイ系の好ましい使用は、候補化合物の初期のスクリーニングのためである。なぜなら、この系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に関わりなく、すべてのＧタンパク質共役受容体に一般的に適用可能であるからである。
【０３３１】
２．特定のＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
一旦、化合物が、「一般的」Ｇタンパク質共役受容体アッセイ（すなわち、作用薬または逆作用薬である化合物を選択するためのアッセイ）を使用して同定されると、ある実施形態において、化合物が受容体部位において相互作用したことを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「一般的」アッセイによって同定された化合物は受容体に結合しないかもしれないが、しかし、その代わりに、細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「取り外す」可能性がある。
【０３３２】
ａ．Ｇｓ、Ｇｚ、およびＧｉ
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）はアデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの転換を触媒し；従って、Ｇｓタンパク質を結合する活性型ＧＰＣＲは細胞レベルのｃＡＭＰの増加と関連する。他方、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質を結合する活性型ＧＰＣＲは、細胞レベルのｃＡＭＰの減少と関連する。一般的には、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、受容体に対する逆作用薬（すなわち、このような化合物はｃＡＭＰのレベルを減少させる）であるか否かを決定するために利用することができる。ｃＡＭＰを測定するための当該分野で公知である種々のアプローチが利用できる；ある実施形態において、好ましいアプローチは、ＥＬＩＳＡベースの形式での抗ｃＡＭＰ抗体の使用に依存する。利用可能な別の型のアッセイは、全細胞二次メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進することによって遺伝子発現を駆動し、これが次には、ｃＡＭＰ応答性エレメントと呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合し、遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に、複数のｃＡＭＰ応答性エレメントを含むプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、活性化されたＧｓ結合受容体はｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、これは次には、遺伝子を活性化し、レポータータンパク質の発現を活性化する。次いで、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼなどのレポータータンパク質は、標準的な生化学的アッセイを使用して検出できる（Ｃｈｅｎら、１９９５）。
【０３３３】
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、これは次には、リン脂質ＰＩＰ２を加水分解し、２種の細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を放出する。ＩＰ３の蓄積の増加は、Ｇｑ−およびＧｏ−関連受容体の活性化に関連する。一般的には、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。ＩＰ３の蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、ＧｑまたはＧｏ関連受容体に対する逆作用薬（このような化合物はＩＰ３のレベルを減少させる）であるか否かを決定するために利用することができる。Ｇｑ関連受容体は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣが、ＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こすという点で、ＡＰ１レポーターアッセイを使用して試験することもできる；従って、活性化されたＧｑ−関連受容体はこのような遺伝子の発現の増加を証明し、それによって、それに対する逆作用薬がこのような発現の減少を証明し、アゴニストはこのような発現の増加を証明する。このような検出のための商業的に利用可能なアッセイが利用可能である。
【０３３４】
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
逆作用薬または作用薬の直接的同定のための候補化合物のスクリーニングにおける使用のための、内因性で構成的に活性なＧＰＣＲまたは非内因性で構成的に活性化されたＧＰＣＲの使用は、定義により、受容体がそれに結合した内因性リガンドの非存在下においてさえ活性であるという点で、興味深いスクリーニングの課題を提供する。従って、例えば、候補化合物の存在下での非内因性受容体と、その化合物の非存在下での非内因性受容体の間を区別するために、このような化合物が逆作用薬もしくは作用薬であり得るか、またはこのような受容体に対して効果を有さないか否かに関する理解を可能にするためのこのような区別の目的で、ある実施形態において、このような区別を増強し得るアプローチを利用することが好ましい。ある実施形態において、好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【０３３５】
一般的に、一旦、非内因性ＧＰＣＲが上記のアッセイ技術（ならびに当業者に公知の他の技術）を使用して構成的に活性化されたことが決定されると、内因性ＧＰＣＲと結合する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の結合は、評価することができるシグナル伝達経路を提供する。ある実施形態において、スクリーニングは、哺乳動物またはメラニン保有細胞発現系を使用して行うことが好ましい。このような系は、その中に内因性Ｇタンパク質を有することが予想されるからである。従って、定義により、このような系において、非内因性で構成的に活性化されたＧＰＣＲは、継続的にシグナル伝達を行う。ある実施形態において、例えば、受容体に対する逆作用薬の存在下で、特にスクリーニングの状況下で、逆作用薬と接触されるときに、受容体間でより容易に区別できる可能性がより高いように、このシグナルが増強されることが好ましい。
【０３３６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、ＧＰＣＲとのＧタンパク質結合の効率を増強することが意図される。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性で構成的に活性なＧＰＣＲまたは非内因性で構成的に活性化されたＧＰＣＲのいずれかを用いるスクリーニングのために好ましくあり得る。なぜなら、このようなアプローチは、このようなスクリーニング技術において生成されるシグナルを増加するからである。このことは、顕著な「シグナル対ノイズ」比を容易にする際に重要であり；このような顕著な比は、本明細書に開示されるような候補化合物のスクリーニングのために好ましい。
【０３３７】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現のために有用な構築物の構築は、当業者の範囲内にある。市販の発現ベクターおよび系は、研究者の特定の必要性に合致し得る種々のアプローチを提供する。このようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の構築における重要な判断基準には以下が含まれるがこれらに限定されない：ＧＰＣＲ配列とＧタンパク質配列の両方がインフレームにあること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲのための配列は、Ｇタンパク質の上流である）、およびＧＰＣＲの発現に際して、Ｇタンパク質もまた発現可能であるように、ＧＰＣＲの「終止」コドンが欠失または置換されること。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接的に連結することができ、またはこれらの２つの間にスペーサー残基が存在し得る（好ましくは、約１２を超えない残基であるが、この数は当業者によって容易に確認できる）。利便性に基づき、スペーサーを使用することが好ましい。ある実施形態において、非内因性ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質が、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の作製の前に同定されていることが好ましい。同定されているＧタンパク質がわずかなので、Ｇタンパク質の配列を含む構築物（すなわち、ユニバーサルＧタンパク質構築物、以下の実施例４（ａ）を参照のこと）がその中のＧＰＣＲ配列の挿入のために利用可能であることが好ましい；これは、異なる配列を有する種々の異なるＧＰＣＲの大スケールスクリーニングの状況においてさらなる効率を提供する。
【０３３８】
上記に述べたように、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏに結合する活性型ＧＰＣＲは、これらの型のＧＰＣＲのチャレンジに基づき、ｃＡＭＰ作製アッセイの形成を阻害することが予想される［すなわち、ｃＡＭＰシグナルは活性化の際に減少し、従って、例えば、作用薬（これはこのシグナルをさらに減少させる）チャレンジの直接的な同定を行う］。本明細書に開示されるように、これらの型の受容体については、実行可能なシクラーゼベースのアッセイを確立するための試みにおいて、ＧＰＣＲの内因性Ｇタンパク質に基づかないＧＰＣＲ融合タンパク質を作製することが可能であることが確認された。従って、例えば、内因性Ｇｉ共役受容体は、Ｇｓタンパク質−このような融合構築物に融合可能であり、発現の際に、内因性ＧＰＣＲを「駆動」または「強制」して、例えば、「天然の」Ｇｉタンパク質ではなくＧｓタンパク質と結合して、その結果、シクラーゼベースのアッセイを確立することができる。従って、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏ結合受容体については、ある実施形態において、ＧＰＣＲ融合タンパク質が使用され、アッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づく場合、融合構築物はＧｓ（または酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する等価なＧタンパク質）を用いて確立されることが好ましい。
【０３３９】
（表Ｃ）
【０３４０】
【表３】
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同等の効果があるものは、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、またはＧｏタンパク質と融合されたＧｑタンパク質を利用するＧタンパク質融合構築物である。ある実施形態において、好ましい融合構築物は、Ｇタンパク質αサブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６個のアミノ酸が欠失しており、ＧαｑのＣ末端の最後の５個のアミノ酸が、目的のＧタンパク質のＧαの対応するアミノ酸で置き換えられているＧｑタンパク質を用いて達成することができる。例えば、融合構築物は、Ｇｉタンパク質と融合したＧｑ（６アミノ酸欠失）を有することができ、「Ｇｑ／Ｇｉ」融合構築物を生じる。この融合構築物は、二次メッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがｃＡＭＰ産生の代わりに測定可能であるように、内因性Ｇｉ共役受容体をその非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑに結合させる。
【０３４１】
４．シグナルエンハンサーＧｓ結合ＧＰＣＲとの標的Ｇｉ結合ＧＰＣＲの同時トランスフェクション（ｃＡＭＰベースアッセイ）
Ｇｉ共役受容体はアデニリルシクラーゼを阻害することが知られており、それゆえに、ｃＡＭＰ産生のレベルを減少し、これは、ｃＡＭＰレベルの評価を困難にし得る。特定の実施形態において、活性化の際にＧｉを優勢に結合する受容体の活性化の表示として、ｃＡＭＰの産生の減少を測定する際の有効な技術は、シグナルエンハンサー、例えば、活性化の際にＧｓと優勢に結合する、非内因性で構成的に活性化された受容体（例えば、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ；以下を参照のこと）を、Ｇｉ結合ＧＰＣＲとともに同時トランスフェクトによって達成することができる。明白であるように、Ｇｓ共役受容体の活性化は、ｃＡＭＰの産生の増加に基づいて決定することができる。Ｇｉ共役受容体の活性化は、ｃＡＭＰ産生の減少に導く。従って、同時トランスフェクションアプローチは、これらの「反対の」影響を有利に利用することが意図される。例えば、非内因性で構成的に活性化されたＧｓ共役受容体（「シグナルエンハンサー」）の、発現ベクター単独との同時トランスフェクションは、ベースラインｃＡＭＰシグナルを提供する（すなわち、Ｇｉ共役受容体はｃＡＭＰレベルを減少させるが、この「減少」は、構成的に活性化されたＧｓ共役シグナルエンハンサーによって確立されるｃＡＭＰレベルの実質的な増加と関連する）。「標的受容体」とのシグナルエンハンサーの同時トランスフェクションまでには、Ｇｉ共役標的受容体の逆作用薬は測定されるｃＡＭＰレベルを増加させるのに対して、Ｇｉ共役標的受容体の作用薬はこのシグナルを減少させる。
【０３４２】
このアプローチを使用して直接的に同定される候補化合物は、これらが受容体を増強するシグナルを標的としないこと確実にするために独立して評価されるべきである（このことは、同時トランスフェクトされた受容体に対するスクリーニングの前またはその後で行うことができる）。
【０３４３】
Ｄ．医薬品化学
候補化合物
当該分野で公知である任意の分子を、本明細書のＧＰＣＲの活性を調節（増加または減少）するその能力について試験することができる。活性を調節する化合物を同定するために、候補化合物は、受容体を発現する細胞に直接的に提供することができる。
【０３４４】
本発明のこの実施形態は、受容体の量または活性を調節、例えば、これを阻害、これに拮抗、またはこれを作用させる分子の化学ライブラリーをスクリーニングするために十分に適している。化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチド模倣物ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え、例えば、ファージディスプレイライブラリー、およびインビトロ翻訳に基づくライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどであり得る。本発明のこの実施形態は、血漿および組織抽出物を含むがこれらに限定されない、内因性候補化合物を含有する生物学的材料をスクリーニングするため、ならびに生物学的活性を有することが知られている内因性化合物のライブラリーをスクリーニングするためにも十分に適している。
【０３４５】
ある実施形態において、候補化合物の直接的同定は、コンビナトリアルケミストリー技術を介して生成される化合物とともに実施され、それによって、数千もの化合物が、このような分析のためにランダムに調製される。候補化合物は、化学ライブラリーのメンバーであり得る。これは、任意の便宜的な数の対象メンバー、例えば、１０個から数百個、数千個、数百万個までの適切な化合物、例えば、ペプチド、ペプトイド、および他のオリゴマー性化合物（環状または直鎖状）、ならびに鋳型に基づく小分子、例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環式化合物および多環式化合物（例えば、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、炭水化物およびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル、ならびに複素環（例えば、トリジン、インドール、チアゾリジンなど）を含み得る。引用される数字および列挙される化合物の型は、例示であるが限定ではない。好ましい化学ライブラリーは、低分子量の化学化合物および潜在的な治療剤を含む。
【０３４６】
例示的な化学ライブラリーは、いくつかの供給元から市販されている（ＡｒＱｕｌｅ，Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ，ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）。ある場合において、これらの化学ライブラリーは、メンバー化合物が付着された基材上のライブラリーの各メンバーの同一性をコードするコンビナトリアルストラテジーを使用して生成され、従って、有効な調節因子である分子の直接的かつ即時的な同定を可能にする。従って、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上での位置が化合物の組成を特定する。また、１つの例において、単一のプレート位置は、目的の相互作用を含むウェルへの投与によってスクリーニング可能である１〜２０種の化学物質を有し得る。従って、調節が検出されるならば、相互作用する対のますます小さなプールが調節活性のためにアッセイできる。このような方法によって、多くの候補化合物がスクリーニングできる。
【０３４７】
使用のために適切な多くの多様なライブラリーは当該分野で公知であり、本発明に従って試験される化合物を提供するために使用できる。代替的には、ライブラリーは、標準的な方法を使用して構築できる。さらに、より一般的な、構造的に制約された、有機的な多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーもまた使用できる。例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が使用されてもよい。
【０３４８】
本発明の別の実施形態において、コンビナトリアルケミストリーは、本発明のＧＰＣＲの調節因子を同定するために使用できる。コンビナトリアルケミストリーは、その多くが構造的に類似している可能性がある数百万もの化合物を含むライブラリーを作製することが可能である。高スループットスクリーニングプログラムは、既知の標的についての親和性のためにこれらの膨大なライブラリーをスクリーニングすることが可能であるが、より小さな寸法のライブラリーを達成するが最大の化学的多様性を提供する新たなアプローチが開発されてきた（例えば、Ｍａｔｔｅｒ、１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１２１９−１２２９を参照のこと）。
【０３４９】
コンビナトリアルケミストリーの１つの方法である、親和性フィンガープリンティングは、タンパク質の規定されたパネルの結合親和性について、小分子の個別のライブラリーを試験するために以前に使用されてきた。スクリーニングによって得られるフィンガープリントは、他のタンパク質または目的の受容体（本発明においては、本発明の受容体）についての対象のライブラリーメンバーの親和性を予測するために使用される。このフィンガープリントは、ライブラリー化合物が同様に反応し得るか否かを予測するために、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られたフィンガープリントと比較される。例えば、複合体またはタンパク質成分との相互作用について、大きなライブラリー中のすべてのリガンドを試験するよりはむしろ、その活性を有することが知られている他の化合物と類似のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することができる（例えば、Ｋａｕｖａｒら、１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ、１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ、Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．ＳｔａｎｋｅｒおよびＪ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．編，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２を参照のこと）。
【０３５０】
ある実施形態において、候補化合物はポリペプチドである。ある好ましい実施形態において、候補化合物は小分子である。ある実施形態において、候補化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０３５１】
調節因子として同定された候補化合物
一般的に、このようなスクリーニングの結果は、独特なコア構造を有する化合物であり；その後、これらの候補化合物は、その医薬品特性をさらに増強するために、好ましいコア構造の周辺にさらなる化学修飾を受けてもよい。このような技術は当業者に公知であり、本特許文書中で詳細には扱わない。
【０３５２】
特定の実施形態において、本発明の調節因子は経口で有効である。当業者に利用可能である多数のコンピュータによるアプローチが、薬物の経口的な生物学的利用能の予測のために開発されてきた［Ｏｏｍｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；ＣｌａｒｋおよびＧｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ、Ｃｕｒｒ  ＯｐｉｎＤｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ（２００２）２３：１７２−８３；ＮｏｒｉｎｄｅｒおよびＨａｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５３−７５；ＰｏｄｌｏｇａｒおよびＭｕｅｇｇｅ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２００１）１：２５７−７５；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）が、非ヒト霊長類およびヒトの身体を含む、薬物の経口投与後の哺乳動物の身体の中で、経口生物学的利用能の評価を含む、薬物分布の直接的測定を得るために多くのグループによって首尾よく使用されてきた［Ｎｏｄａら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ＭｏＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：７６−８１；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。ある実施形態において、本発明の調節因子は経口で有効である。
【０３５３】
特定の実施形態において、経口で有効である本発明の調節因子は、血液脳関門を通過することが可能である。当業者に利用可能である多数のコンピュータによるアプローチが、血液脳関門の浸透の予測のために開発されてきた［Ｏｏｍｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；ＣｌａｒｋおよびＧｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ、Ｃｕｒｒ  ＯｐｉｎＤｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ（２００２）２３：１７２−８３；ＮｏｒｉｎｄｅｒおよびＨａｅｂｅｒｌｅｉｎ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５３−７５；ＰｏｄｌｏｇａｒおよびＭｕｅｇｇｅ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２００１）１：２５７−７５；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。多数のインビトロ方法が、薬物の血液脳関門の浸透性を予測するために開発されてきた［Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ（２００２）１０：２６３−７６；Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ（２００２）２７：９４５−５８；Ｏｔｉｓら、Ｊ  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１）４５：７１−７；Ｄｅｈｏｕｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９０）５４：１７９８−８０１；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。さらに、多数のストラテジーが、血液脳関門を通過する薬物送達を増強するために開発されてきた［Ｓｃｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｖａｓｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００２）３８：３４９−５４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ（２００２）５９：３５−４０；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、Ｎｅｕｒｏｎ（２００２）３６：５５５−８；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。最後に、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）が、非ヒト霊長類およびヒトの身体を含む、哺乳動物の身体の中で、脳内でのそれを含む薬物分布の直接的測定を得るために多くのグループによって首尾よく使用されてきた。［Ｎｏｄａら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：７６−８１；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。
【０３５４】
ある実施形態において、上記調節因子はＧＰＲ５０に対して選択的であり、ここで、ＧＰＲ５０に対して選択的である調節因子は、１種以上の密接に関連する受容体、例えば、メラトニン受容体１Ａ（ＭＴＮＲｌＡ；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿００５９４９）またはメラトニン受容体１Ｂ（ＭＴＮＲｌＢ；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿００５９５０）を超えて、ＧＰＲ５０に対する選択性を有する調節因子をいうことが理解される。特定の実施形態において、ＧＰＲ５０選択性調節因子は、ＭＴＮＲｌＡまたはＭＴＮＲｌＢよりも、ＧＰＲ５０に対して少なくとも約１０倍または少なくとも約１００倍の選択性を有するＧＰＲ５０選択性逆作用薬または拮抗薬である。特定の実施形態において、ＧＰＲ５０選択性調節因子は、ＭＴＮＲｌＡおよびＭＴＮＲｌＢよりも、ＧＰＲ５０に対して少なくとも約１０倍または少なくとも約１００倍の選択性を有するＧＰＲ５選択性逆作用薬または拮抗薬である。ある好ましい実施形態において、ＧＰＲ５０はヒトＧＰＲ５０である。
【０３５５】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、上記調節因子は、上記アッセイにおける１０μＭ未満、上記アッセイにおける９μＭ未満、上記アッセイにおける８μＭ未満、上記アッセイにおける７μＭ未満、上記アッセイにおける６μＭ未満、上記アッセイにおける５μＭ未満、上記アッセイにおける４μＭ未満、上記アッセイにおける３μＭ未満、上記アッセイにおける２μＭ未満、上記アッセイにおける１μＭ未満、上記アッセイにおける９００ｎＭ未満、上記アッセイにおける８００ｎＭ未満、上記アッセイにおける７００ｎＭ未満、上記アッセイにおける６００ｎＭ未満、上記アッセイにおける５００ｎＭ未満、上記アッセイにおける４００ｎＭ未満、上記アッセイにおける３００ｎＭ未満、上記アッセイにおける２００ｎＭ未満、上記アッセイにおける１００ｎＭ未満、上記アッセイにおける９０ｎＭ未満、上記アッセイにおける８０ｎＭ未満、上記アッセイにおける７０ｎＭ未満、上記アッセイにおける６０ｎＭ未満、上記アッセイにおける５０ｎＭ未満、上記アッセイにおける４０ｎＭ未満、上記アッセイにおける３０ｎＭ未満、上記アッセイにおける２０ｎＭ未満、または上記アッセイにおける１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ��０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を有する逆作用薬または拮抗薬である。
【０３５６】
ある実施形態において、調節因子は、ヒト、マウス、またはラットのＧＰＲ５０、好ましくはヒトＧＰＲ５０に対して、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、トランスフェクトＣＨＯ細胞からの膜を用いて実行されるＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、またはトランスフェクトメラニン保有細胞中で実行される色素凝集アッセイにおいて、または任意にＴＳＨＲで同時トランスフェクトされた、トランスフェクト２９３細胞中で実行されるｃＡＭＰアッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬であり、ここで、トランスフェクトＣＨＯ細胞、またはトランスフェクトメラニン保有細胞、またはトランスフェクト２９３細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する組換えＧＰＲ５０を発現する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組換えＧＰＲ５０は配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、上記調節因子は、上記アッセイにおける１０μＭ未満、上記アッセイにおける９μＭ未満、上記アッセイにおける８μＭ未満、上記アッセイにおける７μＭ未満、上記アッセイにおける６μＭ未満、上記アッセイにおける５μＭ未満、上記アッセイにおける４μＭ未満、上記アッセイにおける３μＭ未満、上記アッセイにおける２μＭ未満、上記アッセイにおける１μＭ未満、上記アッセイにおける９００ｎＭ未満、上記アッセイにおける８００ｎＭ未満、上記アッセイにおける７００ｎＭ未満、上記アッセイにおける６００ｎＭ未満、上記アッセイにおける５００ｎＭ未満、上記アッセイにおける４００ｎＭ未満、上記アッセイにおける３００ｎＭ未満、上記アッセイにおける２００ｎＭ未満、上記アッセイにおける１００ｎＭ未満、上記アッセイにおける９０ｎＭ未満、上記アッセイにおける８０ｎＭ未満、上記アッセイにおける７０ｎＭ未満、上記アッセイにおける６０ｎＭ未満、上記アッセイにおける５０ｎＭ未満、上記アッセイにおける４０ｎＭ未満、上記アッセイにおける３０ｎＭ未満、上記アッセイにおける２０ｎＭ未満、または上記アッセイにおける１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０ｎＭから１０μＭまでの間隔から選択され��値未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０ｎＭから１μＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は、上記アッセイにおいて、約１０ｎＭから１００ｎＭまでの間隔から選択される値未満のＥＣ５０を有する作用薬または部分作用薬である。
【０３５７】
Ｅ．薬学的組成物
本発明の化合物は、当該分野で周知である技術を使用して、薬学的組成物に製剤化することができる。
【０３５８】
本発明は、本発明の調節因子またはリガンドの治療有効量を、上記治療（または予防）の必要がある被験体への投与による治療（および予防）の方法を提供する［例えば、２００２年８月２９日にＷＯ  ０２／０６６５０５として公開されたＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１もまた参照のこと；この各々の開示はその全体が参照により本明細書に援用される］。１つの態様において、調節因子またはリガンドは小分子である。１つの態様において、調節因子は逆作用薬または拮抗薬である。１つの態様において、調節因子は逆作用薬である。１つの態様において、調節因子は拮抗薬である。１つの態様において、調節因子は実質的に精製されている。１つの態様において、被験体は、ウシ、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【０３５９】
本発明の調節因子は、単独で、または、当業者に周知である技術を使用して調節因子が適切なキャリアもしくは賦形剤と混合されている薬学的組成物中で、非ヒト哺乳動物［下記の実施例を参照のこと］および／またはヒトに投与することができる。適切な薬学的に受容可能なキャリアは当業者に利用可能であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏら編）を参照のこと。
【０３６０】
次いで、薬学的組成物は、治療有効量で提供される。治療有効量とは、例示的にかつ非限定的に、本明細書に記載される方法によって決定されるように、障害の徴候または生理学的状態の予防または改善を生じるために十分な量の調節因子の量をいい、ここで、障害の徴候または生理学的状態の予防または改善には、被験体の体重の減少、被験体の脂肪過多症の減少、被験体の体脂肪率の減少、および肥満またはそれに関連する状態の予防または治療が含まれるがこれらに限定されない。
【０３６１】
本発明の調節因子が、単独で、または、他の薬学的にもしくは生理学的に受容可能な化合物と組み合わせて提供されてもよいことが明確に考慮される。本発明の障害の治療のための他の化合物は、本発明の障害の治療には、被験体の体重の減少、被験体の体脂肪率の減少、および肥満またはそれに関連する状態の予防または治療が含まれるがこれらに限定されない場合のものである。
【０３６２】
本発明の化合物は、単独の活性医薬品として投与できる（すなわち、単独療法）のに対して、本発明の化合物は、本明細書に記載される疾患／状態／障害の治療のための他の医薬品と組み合わせて使用することもできる（すなわち、組み合わせ治療）。それゆえに、本発明の別の態様は、本明細書に記載されるような１種以上のさらなる医薬品と組み合わせて、本発明の拮抗薬または逆作用薬の治療有効量を、治療の必要がある被験体に投与する工程を包含する治療の方法を含む。
【０３６３】
他の医薬品との本発明の化合物の組み合わせ治療の範囲は、本明細書中、上記または下記に列挙したものに限定されないことが理解されるが、しかし、被験体における本発明の疾患、状態、または障害の治療のために有用である任意の医薬品または薬学的組成物との任意の組み合わせを原理的には含む。
【０３６４】
本発明の１つの態様において、他の薬学的または生理学的に受容可能な化合物は、以下のような抗肥満剤である：アポリポタンパク質−β分泌／ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ａｐｏ−Ｂ／ＭＴＰ）阻害剤、ＭＣＲ−４拮抗薬、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｓｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）作用薬、セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤（例えば、シブトラミン）、交感神経様作動薬、β３アドレナリン作動性受容体作用薬、ドーパミン作用薬（例えば、ブロモクリプチン）、メラニン細胞刺激ホルモン受容体アナログ、５−ＨＴ２Ｃセロトニン受容体作用薬（例えば、塩酸ロルカセリン）、カンナビノイド１受容体拮抗薬［例えば、ＳＲ１４１７１６；Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド］、メラニン凝集ホルモン拮抗薬、レプトン（ＯＢタンパク質）、レプチンアナログ、レプチン受容体作用薬、ガラニン拮抗薬、リパーゼ阻害剤（テトラヒドロリプスタチン、すなわち、オーリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）など）、食欲抑制剤（ボンベシン作用薬など）、ニューロペプチド−Ｙ拮抗薬、甲状腺ホルモン様剤、ジヒドロエピアンドロステロンまたはそのアナログ、糖質コルチコイド受容体作用薬または拮抗薬、オレキシン受容体拮抗薬、ウロコルチン結合タンパク質拮抗薬、グルカゴン様ペプチド−１受容体作用薬、毛様体神経栄養因子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹおよびＰｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨから利用可能であるＡｘｏｋｉｎｅ（商標）など）、ヒトアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）拮抗薬、グレリン受容体拮抗薬、ヒスタミン３受容体拮抗薬または逆作用薬、ニューロメディンＵ受容体作用薬、ノルアドレナリン作動性食欲減退剤（例えば、フェンテルミン、マジンドールなど）、および食欲抑制剤（例えば、ブプロピオン）。ある実施形態において、抗肥満剤は、オーリスタット、シブトラミン、ブロモクリプチン、エフェドリン、レプチン、およびプソイドエフェドリンからなる群より選択される。
【０３６５】
本発明の態様に従って、本発明の化合物は、本明細書に引用される医薬品、または１種以上のクラスの薬物に属する薬剤と組み合わせて使用することができる。
【０３６６】
投与の経路
投与の適切な経路には、当該分野で公知である方法を使用する、経口、鼻、直腸、経粘膜、経皮、または腸の投与、筋肉内、皮下、髄内注射を含む非経口送達、ならびに、くも膜下腔内、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、肺内（吸入）、または眼球内の注射が含まれる。他の特に好ましい投与の経路は、エアロゾルおよびデポー製剤である。持続放出製剤、特に、本発明の医薬のデポーは明確に意図される。特定の実施形態において、投与の経路は経口である。
【０３６７】
組成物／製剤
本発明に従う使用のための薬学的または生理学的に受容可能な組成物および医薬は、賦形剤および助剤を含む、１種以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用する従来的な様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。
【０３６８】
本明細書に記載される特定の医薬には、薬学的または生理学的に受容可能なキャリアおよび少なくとも１種の本発明の調節因子が含まれる。注射のためには、本発明の薬剤は、水溶液中で、好ましくは、Ｈａｎｋｓ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、または生理食塩水緩衝液、例えば、リン酸もしくは重炭酸緩衝液などの生理学的に適合可能な緩衝液中で製剤化されてもよい。経粘膜投与のためには、障壁に透過されるために適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。
【０３６９】
経口的に摂取することができる薬学的にまたは生理学的に受容可能な調製物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチン製のソフト密封カプセル、およびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤が含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および選択的に、安定剤と混合した活性成分を含み得る。ソフトカプセル中では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与のためのすべての製剤は、このような投与のために適切な投薬量であるべきである。口腔投与のためには、組成物は、従来的な様式で製剤化した錠剤またはロゼンジの型で摂取されてもよい。
【０３７０】
吸入による投与のためには、本発明に従う使用のための化合物は、噴霧器のための加圧パックからのエアロゾルスプレー提示の型で首尾よく送達され、適切な気体噴霧剤、例えば、二酸化炭素の使用を伴う。加圧エアロゾルの場合においては、投薬量単位は、定量した量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンを含む、吸入剤または吸入器における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化されてもよい。
【０３７１】
化合物は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続的注入によって、非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、単位投薬量で、例えば、アンプルまたは複数用量容器中で、保存剤の添加を伴って、提示されてもよい。組成物は、水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような型を取り得、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。
【０３７２】
非経口投与のための薬学的または生理学的に受容可能である製剤には、水溶型の活性化合物の水溶液が含まれる。水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでもよい。任意選択で、懸濁液は、適切な安定剤、または、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加する薬剤もまた含んでもよい。
【０３７３】
代替的には、活性成分は、使用前に、滅菌した、ピロゲンを含まない水などの適切なビヒクルとの構成のための粉末型または凍結乾燥型であってもよい。
【０３７４】
以前に記載された製剤に加えて、化合物は、デポー調製物としても製剤化され得る。このような長時間作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下または筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー性もしくは疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂とともに、または溶けにくい誘導体として、例えば、溶けにくい塩として製剤化されてもよい。
【０３７５】
特定の実施形態において、化合物は、制御放出系を経由して送達できる。１つの実施形態において、ポンプが使用されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ編，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による概説において議論されている。
【０３７６】
加えて、化合物は、治療剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出系を使用して送達されてもよい。種々の持続放出材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日を超えるまでの期間、化合物を放出する可能性がある。
【０３７７】
治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、調節因子安定化のためのさらなるストラテジーが利用されてもよい。
【０３７８】
薬学的または生理学的に受容可能な組成物は、適切な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤もまた含んでもよい。このようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれるがこれらに限定されない。
【０３７９】
有効投薬量
本発明における使用のために適切な薬学的または生理学的に受容可能な組成物には、活性成分がそれらの意図される目的を達成するための有効量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、治療される被験体の徴候の発生を予防するため、または既存の徴候を改善するために有効な量を意味する。有効量の決定は、とりわけ、本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力内にある。
【０３８０】
本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、用量は、インビトロアッセイにおいて、ＧＰＲ５０を含む細胞中のｃＡＭＰの細胞内レベルを増加することが示された濃度の点または範囲を含むかまたは網羅する循環濃度範囲を達成するために、動物モデルの中で処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０３８１】
治療有効量とは、患者における徴候の改善を生じる化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（試験集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（試験集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験用動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の間の比として表現することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０３８２】
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないか、または全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この投薬量は、利用される剤形および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して、担当医が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」所収、第１章を参照のこと）。
【０３８３】
投薬量および投薬間隔は、患者の状態に依存して、本発明の障害を予防または治療するために十分である活性化合物の血漿レベルを提供するために、従属的に調整されてもよい。これらの効果を達成するために必要な投薬量は、対象の特性および投与の経路に依存する。
【０３８４】
投薬間隔もまた、最小有効濃度の値を使用して決定することができる。化合物は、そのときの１０〜９０％、好ましくは、３０〜９９％の間、および最も好ましくは５０〜９０％について、最小有効濃度より上の血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与されるべきである。局所的投与または選択的取り込みの場合において、薬物の有効局所的濃度は、血漿濃度とは関連しなくてもよい。
【０３８５】
当然、投与される組成物の量は、治療される被験体、被験体の体重、苦痛の重篤度、投与の様式、および処方する担当医の判断に依存している。
【０３８６】
所望の結果を達成するために、毎日または規則的な基準で投与可能である本発明の調節因子の量についての好ましい投薬量範囲は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重である。当然、これらの毎日の投薬量は、一日の経過の間に定期的に、少量で送達または投与することができる。これらの投薬量範囲は、好ましい範囲であるのみであって、本発明に対する限定であることは意味しないことが注目される。上記所望の結果には、被験体の体重の減少、被験体の脂肪過多症の減少、被験体の体脂肪率の減少、および肥満またはそれに関連する状態の予防または治療が含まれるがこれらに限定されない。
【０３８７】
Ｆ．治療の方法
本発明は、とりわけ、本発明の調節因子を用いて、上記減少、予防、または治療の必要がある被験体に投与する工程を包含する、被験体の体重を減少する方法、被験体の脂肪過多症を減少する方法、被験体の体脂肪率を減少する方法、および肥満またはそれに関連する状態を予防または治療する方法が含まれるがこれらに限定されない方法に及ぶ。ある実施形態において、調節因子は、逆作用薬または拮抗薬である。ある実施形態において、調節因子は逆作用薬である。ある実施形態において、調節因子は拮抗薬である。ある実施形態において、上記調節因子は経口で有効である。ある実施形態において、上記経口で有効である調節因子は、さらに血液脳関門を通過可能である。ある実施形態において、調節因子は、薬学的組成物中で被験体に投与される。ある実施形態において、調節因子は、薬学的組成物中で被験体に供給される。ある実施形態において、調節因子は、経口摂取される薬学的組成物中で被験体に供給される。ある実施形態において、被験体は、非ヒト哺乳動物である。ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物はマウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。特定の実施形態において、被験体または哺乳動物はヒトである。
【０３８８】
ある実施形態において、被験体は、体重を減少する必要がある。ある実施形態において、被験体は、体脂肪率を減少する必要がある。ある実施形態において、被験体は、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療する必要がある。
【０３８９】
ある実施形態において、被験体は、過体重または肥満である。ある実施形態において、被験体は過体重である。ある実施形態において、被験体は肥満である。
【０３９０】
ある実施形態において、肥満は、高脂肪食によって誘導される体重増加を含む。
【０３９１】
ある実施形態において、肥満に関連する状態は以下からなる群より選択される：高血圧、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓症、冠性心疾患、脳卒中、特発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠時無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動、変形性関節症、腰痛、線状萎縮または「皮膚線条」、脚の静脈うっ滞、リンパ浮腫、蜂巣炎、間擦疹、癰、黒色表皮症、軟性線維腫、胃食道逆流障害、非アルコール性脂肪肝／脂肪性肝炎、胆石症、ヘルニア、結腸癌、緊張性尿失禁、肥満関連糸球体症、乳癌および子宮癌、うつ病および低い自己評価、損なわれた生活の質、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、女性の高アンドロゲン血症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、および男性の性腺機能低下症。ある実施形態において、肥満に関連する状態は、高血圧、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、２型糖尿病、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患、および脳卒中からなる群より選択される。
【０３９２】
本発明は、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、および過食症を含むがこれらに限定されない、体重を増加させることによって改善される障害を予防または治療する方法もまた意図し、この方法は、本発明の調節因子を用いて上記予防または治療する必要がある被験体に投与する工程を包含する。ある実施形態において、調節因子は、作用薬または部分作用薬である。ある実施形態において、調節因子は作用薬である。ある実施形態において、調節因子は部分作用薬である。ある実施形態において、上記調節因子は経口で有効である。ある実施形態において、上記経口で有効な調節因子は、さらに血液脳関門を通過することが可能である。ある実施形態において、調節因子は、薬学的組成物中で被験体に投与される。ある実施形態において、調節因子は、薬学的組成物中で被験体に供給される。ある実施形態において、調節因子は、経口摂取される薬学的組成物中で被験体に供給される。ある実施形態において、被験体は、非ヒト哺乳動物である。ある実施形態において、被験体は哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物はマウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。特定の実施形態において、被験体または哺乳動物はヒトである。
【０３９３】
Ｇ．他の有用性
哺乳動物ＧＰＲ５０などの本発明のＧＰＣＲの受容体機能を調節する（すなわち、増加、減少、または遮断する）薬剤は、ＧＰＣＲと候補化合物を接触させること、および受容体機能に対する候補化合物の効果を決定することによって同定されてもよい。ヒトＧＰＲ５０などの哺乳動物のＧＰＲ５０の機能を調節する化合物の選択性は、１種以上の他のＧタンパク質共役受容体に対するその効果に対して、ＧＰＲ５０に対するその効果を比較することによって評価することができる。特定の実施形態において、ＧＰＲ５０選択性調節因子は、ＭＴＮＲ１ＡまたはＭＴＮＲ１Ｂよりも、ＧＰＲ５０に対して少なくとも約１０倍、または少なくとも約１００倍の選択性を有する、ＧＰＲ５０選択性逆作用薬または拮抗薬である。特定の実施形態において、ＧＰＲ５０選択性調節因子は、ＭＴＮＲ１ＡおよびＭＴＮＲ１Ｂよりも、ＧＰＲ５０に対して少なくとも約１０倍、または少なくとも約１００倍の選択性を有する、ＧＰＲ５０選択性逆作用薬または拮抗薬である。ＧＰＲ５０の機能を調節する化合物の同定後、このような候補化合物は、それらの活性を確認または定量するために、インビボモデルを含むがこれに限定されない他のアッセイにおいてさらに試験されてもよい。例示のために、かつ限定のためではなく、対象の発明は、医薬品としての使用のための哺乳動物ＧＰＲ５０  ＧＰＣＲの調節因子としての化合物の同定を明確に意図する。ＧＰＲ５０機能の調節因子は、例えば、正常なまたは異常なＧＰＲ５０の機能が含まれる疾患および生理学的状態の治療において、治療的に有用である。
【０３９４】
哺乳動物ＧＰＲ５０などの哺乳動物のＧＰＣＲのリガンドである薬剤は、ＧＰＣＲと候補化合物を接触させること、および候補化合物が受容体に結合するか否かを決定することによって同定されてもよい。ヒトＧＰＲ５０などの哺乳動物ＧＰＲ５０に結合する化合物の選択性は、１種以上の他のＧタンパク質共役受容体に対するその結合に対して、ＧＰＲ５０に対するその結合を比較することによって評価することができる。ＧＰＲ５０受容体機能の調節因子であるリガンドは、正常なまたは異常なＧＰＲ５０の機能が含まれる疾患および生理学的状態の治療において、治療的に有用である。
【０３９５】
他の実施形態において、被験体の体重、脂肪過多症、もしくは体脂肪率の調節因子であり（例えば、増加または減少する）、または肥満およびそれに関連する状態のための医薬品として有用である薬剤は、ＧＰＲ５０受容体と候補化合物を接触させること、およびＧＰＲ５０受容体発現に対する候補化合物の効果を決定することによって同定される。ある実施形態において、薬剤は、細胞中のＧＰＲ５０受容体の発現を減少する。ある実施形態において、薬剤は、ニューロン細胞中のＧＰＲ５０受容体の発現を減少する。ある実施形態において、薬剤は、ヒトニューロン細胞中のＧＰＲ４０受容体の発現を減少する。ある実施形態において、ＧＰＲ５０受容体は、細胞またはニューロン細胞によって内因的に発現される。ある実施形態において、ＧＰＲ５０受容体発現のレベルは、抗ＧＰＲ５０受容体抗体を使用して測定される。当業者は、ヒト、ラット、またはマウスのＧＰＲ５０受容体に対する抗体を産生する能力があると考えられ、これが、細胞中のＧＰＲ５０発現のレベルを測定するために使用されてもよい。ある実施形態において、ＧＰＲ５０受容体発現のレベルは、ＧＰＲ５０受容体に特異的な放射性標識リガンドを使用して測定される（下記を参照のこと）。ある実施形態において、ＧＰＲ５０受容体発現のレベルは、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲによって測定される。
【０３９６】
本発明は、候補化合物が細胞中のＧＰＲ５０受容体の発現を減少させる薬剤であるか否かを同定する方法にも関し、上記方法は以下の工程を包含する：
（ａ）ＧＰＲ５０受容体を含む複数の細胞を候補化合物と接触させ、または接触させない工程；
（ｂ）候補化合物と接触させた細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベル、および候補化合物と接触させなかった細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｃ）候補化合物と接触させた細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルを、候補化合物と接触させなかった細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルと比較する工程であって；候補化合物と接触させなかった細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルと比較した、
候補化合物と接触させた細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルの減少は、候補化合物が細胞中でのＧＰＲ５０受容体の発現を減少する薬剤であることを示す、工程。
【０３９７】
本発明は、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品として候補化合物を同定する方法にも関し、上記方法は以下の工程を包含する：
（ａ）ＧＰＲ５０受容体を含む複数の細胞を候補化合物と接触させ、または接触させない工程；
（ｂ）候補化合物と接触させた細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベル、および候補化合物と接触させなかった細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｃ）候補化合物と接触させた細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルを、候補化合物と接触させなかった細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルと比較する工程であって；候補化合物と接触させなかった細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルと比較した、
候補化合物と接触させた細胞中でのＧＰＲ５０受容体発現のレベルの減少は、候補化合物が肥満またはそれに関連する状態のための医薬品であることを示す、工程。
【０３９８】
特定の実施形態において、肥満またはそれに関連する状態のための医薬品は、肥満またはそれに関連する状態を予防または治療するための化合物である。
【０３９９】
ある実施形態において、候補化合物が細胞中のＧＰＲ５０受容体の発現を減少する薬剤であるか否かを同定する上記方法は、インビトロ方法である。
【０４００】
ある実施形態において、工程（ａ）において候補化合物と接触させ、または接触させない上記複数の細胞は、上記細胞中のＧＰＲ５０受容体発現のレベルが工程（ｂ）において測定される前に、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、または少なくとも約４８時間培養される。
【０４０１】
本発明は、細胞（例えば、ニューロン細胞）中のＧＰＲ５０発現を減少する上記薬剤、上記薬剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、および上記組成物を使用する方法（例えば、肥満またはそれに関連する状態の治療または予防のため）に関し、ここで、化合物は小分子である。本発明は、細胞（例えば、ニューロン細胞）中のＧＰＲ５０発現を減少する上記薬剤、上記薬剤（例えば、薬学的組成物）を含む組成物、および上記組成物を使用する方法（例えば、肥満またはそれに関連する状態の治療または予防のため）に関し、ここで、化合物はアンチセンス核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）である。本発明は、細胞（例えば、ニューロン細胞）中のＧＰＲ５０発現を減少する上記薬剤、上記薬剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、および上記組成物を使用する方法（例えば、肥満またはそれに関連する状態の治療または予防のため）に関し、ここで、化合物は、標準的な手順に従って、ＧＰＲ５０受容体コード遺伝子のヌクレオチド配列から誘導された核酸配列を含む低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。当業者に公知であるように、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡは、一般的に、標的遺伝子の発現を調節することが可能である［例えば、Ｈｏｌｍｌｕｎｄ  ＪＴ、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（２００３）１００２：２４４−２５１；およびＤｅｖｒｏｅら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００４）４：３１９−３２７を参照のこと；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。
【０４０２】
本発明は、放射性イメージングにおいて有用であるのみならず、ヒトを含む組織サンプル中でＧＰＲ５０を位置決めおよび定量するため、ならびにＧＰＲ５０の既知リガンドなどの放射性同位元素標識化合物の結合の阻害に関連する方法においてＧＰＲ５０リガンドを同定するためのインビトロとインビボの両方のアッセイにおいてもまた有用である、哺乳動物ＧＰＲ５０などの本発明のＧＰＣＲの調節因子またはリガンドとして同定された本発明の化合物の放射性標識されたバージョンにもまた関する。このような放射性同位元素標識化合物を含む、哺乳動物ＧＰＲ５０、例えば、ヒトＧＰＲ５０の本発明のＧＰＣＲなどに関する新規なアッセイを開発することは、本発明のさらなる目的である。例示のため、かつ限定ではなく、放射性イメージングによって可視化された正常範囲よりも上の脳ＧＰＲ５０の上昇は、肥満またはそれに関連する状態のリスクがある被験体を同定することが想定される。ある実施形態において、脳ＧＰＲ５０は視床下部ＧＰＲ５０である。ある実施形態において、脳ＧＰＲ５０は下垂体ＧＰＲ５０である。ある実施形態において、被験体はヒトである。
【０４０３】
本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０受容体の調節因子またはリガンドである放射性標識化合物を、上記放射性イメージングの必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する、放射性イメージングの方法にも関する。１つの態様において、哺乳動物ＧＰＲ５０受容体のリガンドは、哺乳動物ＧＰＲ５０の調節因子ではない。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。ある実施形態において、放射性イメージングの方法は、哺乳動物が肥満またはそれに関連する状態のリスクがあるか、またはそれに向かって進行しているか否かを同定するためであり、ここで、哺乳動物における正常範囲より上の脳ＧＰＲ５０のレベルは、哺乳動物が肥満またはそれに関連する状態のリスクがあるか、またはそれに向かって進行していることを示す。ある実施形態において、放射性イメージングの方法は、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬を用いる、または細胞中のＧＰＲ５０を減少させる薬剤を用いる、または逆作用薬もしくは拮抗薬もしくは薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を用いる、肥満またはそれに関連する状態の予防または治療のための哺乳動物を同定するためであり、ここで、哺乳動物における正常範囲より上の脳ＧＰＲ５０のレベルは、哺乳動物ＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬を用いる、または細胞中のＧＰＲ５０発現を減少させる薬剤を用いる、または逆作用薬もしくは拮抗薬もしくは薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を用いる、肥満またはそれに関連する状態の予防または治療のための哺乳動物を同定する。ある実施形態において、脳ＧＰＲ５０は視床下部ＧＰＲ５０である。ある実施形態において、脳ＧＰＲ５０は下垂体ＧＰＲ５０である。
【０４０４】
本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０、例えば、ヒトＧＰＲ５０などの本発明のＧＰＣＲの調節因子またはリガンドとして同定される、本発明の化合物の放射性標識されたバージョンを含む。
【０４０５】
本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０、例えば、ヒトＧＰＲ５０などの本発明のＧＰＣＲに結合するリガンドを検出するために有用である試験リガンドの放射性標識されたバージョンにも関する。ある実施形態において、本発明は、哺乳動物ＧＰＲ５０、例えば、ヒトＧＰＲ５０などの本発明のＧＰＣＲに結合するリガンドを検出するために有用である上記放射性標識された試験リガンドのライブラリーを明確に意図する。特定の実施形態において、上記ライブラリーは、少なくとも約１０個、少なくとも約１０２個、少なくとも約１０３個、少なくとも約１０５個、または少なくとも約１０６個の上記放射性標識された試験化合物を含む。このような放射性同位元素標識された試験リガンドを含む、哺乳動物ＧＰＲ５０、例えば、ヒトＧＰＲ５０などの本発明のＧＰＣＲに関連する新規なアッセイを開発することは本発明のさらなる目的である。
【０４０６】
ある実施形態において、化合物の放射性標識されたバージョンは、１つ以上の原子が、典型的には天然に見い出される（すなわち、天然に存在する）原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する原子によって置き換えまたは置換されているという事実を別にすれば、その化合物と同一である。本発明の化合物中に取り込まれ得る適切な放射性核種には、２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれるがこれらに限定されない。即時性の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射性標識される化合物の特定の適用に依存する。例えば、インビトロＧＰＲ５０受容体標識および競合アッセイのためには、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または３５Ｓを取り込んでいる化合物が一般的に最も有用である。放射性イメージング適用のためには、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、または７７Ｂｒが一般的に最も有用である。ある実施形態において、放射性核種は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および８２Ｂｒからなる群より選択される。
【０４０７】
放射性同位元素を有機化合物に取り込むための適切な方法は、本発明の化合物に適用可能であり、当該分野で周知である。これらの合成方法、例えば、活性レベルのトリチウムを標的分子に取り込むことは、以下の通りである：
Ａ．トリチウムガスを用いる触媒還元−この手順は、通常、高比活性生成物を生じ、ハロゲン化または不飽和前駆体を必要とする。
【０４０８】
Ｂ．水素化ホウ素ナトリウム［３Ｈ］を用いる還元−この手順はやや高価であり、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含む前駆体を必要とする。
【０４０９】
Ｃ．水素化アルミニウムリチウム［３Ｈ］を用いる還元−この手順は、ほぼ理論的な比活性で生成物を提供する。これもまた、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含む前駆体を必要とする。
【０４１０】
Ｄ．トリチウムガス曝露標識−この手順は、適切な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含む前駆体をトリチウムガスに曝露することを含む。
【０４１１】
Ｅ．ヨウ化メチル［３Ｈ］を使用するＮ−メチル化−この手順は、通常、高比活性ヨウ化メチル［３Ｈ］で適切な前駆体を処理することによって、Ｏ−メチルまたはＮ−メチル（３Ｈ）生成物を調製するために利用される。この方法は、一般的に、より高い比活性、例えば、約７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌなどを可能にする。
【０４１２】
活性レベルの１２５Ｉを標的分子に取り込むための合成方法には以下が含まれる：
Ａ．Ｓａｎｄｍｅｙｅｒおよび同様の反応−この手順は、アリールまたはヘテロアリールアミンを、ジアゾニウム塩、例えば、テトラフルオロホウ酸塩に転換し、続いて、Ｎａ１２５Ｉを使用して１２５Ｉ標識化合物に転換する。代表的な手順は、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ．および共同研究者により、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８において報告された。
【０４１３】
Ｂ．フェノールのオルト１２５ヨウ素化−この手順は、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌ．および共同研究者によってＪ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６において報告されたように、フェノールのオルト位における１２５ヨウ素の取り込みを可能にする。
【０４１４】
Ｃ．臭化アリールおよび臭化ヘテロアリールの１２５Ｉとの交換−この方法は、一般的に、２段階プロセスである。第１段階は、ハロゲン化トリアルキルスズまたはヘキサアルキル二スズ［例えば、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下で、例えば、Ｐｄ触媒反応を使用して［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］、またはアリールまたはヘテロアリールリチウムを通しての、臭化アリールおよび臭化ヘテロアリールの、対応するトリアルキルスズ中間体への転換である。代表的な手順は、Ｂａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者によって、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２において報告された。
【０４１５】
ある実施形態において、化合物の放射性標識されたバージョンは、放射性核種を含む１つ以上の置換基の付加を別にすれば、その化合物と同一である。さらなるある実施形態において、化合物はポリペプチドである。さらなるある実施形態において、化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらなるある実施形態において、上記抗体はモノクローナルである。適切な上記放射性核種には、２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれるがこれらに限定されない。即時性の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射性標識される化合物の特定の適用に依存する。例えば、インビトロＧＰＲ５０受容体標識および競合アッセイのためには、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または３５Ｓを取り込んでいる化合物が一般的に最も有用である。放射性イメージング適用のためには、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、または７７Ｂｒが一般的に最も有用である。ある実施形態において、放射性核種は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および８２Ｂｒからなる群より選択される。
【０４１６】
放射性核種を含む１個以上の置換基を付加するための方法は当業者の範囲内にあり、酵素的方法［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｃ  ＪＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６９）１１３：２９９−３０５；Ｔｈｏｒｅｌｌ  ＪＩおよびＪｏｈａｎｓｓｏｎ  ＢＧ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９６９）２５１：３６３−９；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］による、およびまたはクロラミン（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ）−Ｔ／ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）／ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄ）法［Ｈｕｎｔｅｒ  ＷＭおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ、Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９４：４９５−６；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６３）８９：１１４−２３；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］による、放射性同位元素ヨウ素の付加を含むがこれに限定されない。
【０４１７】
開示された受容体および方法の他の使用は、とりわけ、本特許文書の再検討に基づき
当業者に明らかになる。
【実施例】
【０４１８】
以下の実施例は、本発明の説明のために提示され、限定のためではない。特定の核酸配列およびアミノ酸配列が本明細書に開示されるが、当業者は、以下に報告されるものと同じかまたは実質的に同様の結果を達成しながら、これらの配列に対してわずかな修飾を作成する能力があると考えられる。このような修飾アプローチは、本開示の範囲内にあると見なされる。さらなる労力を伴うことなく、当業者は、先の記載を使用して、その最も完全な程度まで、本発明を実施することができると考えられている。以下の詳細な実施例は、単に例示として解釈されるべきであり、いかなる場合においても、何であれ、先の開示の限定であると解釈されるべきではない。当業者は、これらの手順からの適切なバリエーションを即座に認識する。
【０４１９】
本発明の対象に関連し、かつ当業者に公知である組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許第６，３９９，３７３号；およびＷＯ  ０２／０６６５０５として２００２年８月２９日に公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１において見い出すことができ；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０４２０】
実施例１
内因性ヒトＧＰＲ５０の全長クローニング
内因性ヒトＧＰＲ５０をコードするポリヌクレオチドは、ＧＰＲ５０特異的プライマー
５’−ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号９；ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有し、最後の２つのヌクレオチドが開始コドンの一部であるセンス）および
５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１０；ＢａｍＨＩ部位および終止コドンのアンチセンスとしてＴＣＡを有するアンチセンス）、
ならびに鋳型としてヒト下垂体ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用する、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってクローニングした。クローニングしたｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、以下のサイクルによって、ステップ２からステップ４を２５回反復して、増幅のために使用した：
９４℃、３分間；９４℃、１分間；６２℃、１分間；７２℃、３分間；７２℃、１０分間。
【０４２１】
予想サイズの１．９Ｋｂ  ＰＣＲフラグメントを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ならびにｐＣＭＶ発現ベクターにクローニングし、Ｔ７  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して配列決定した。この様式で得られた第１の核酸配列についての配列番号１、および推定アミノ酸配列についての配列番号２を参照のこと。この様式で得られた第２の核酸配列についての配列番号３、および推定アミノ酸配列についての配列番号４を参照のこと。
【０４２２】
実施例２
受容体発現
タンパク質の発現の技術のために種々の細胞が利用可能であるが、哺乳動物細胞またはメラニン保有細胞が利用されることが最も好ましい。この主な理由は実用性に基礎を置いており、すなわち、例えば、ＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用性は、可能である場合、哺乳動物系のために進化させてきた、受容体が共役する遺伝機構および分泌（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ）経路を含まない可能性がある（確かに、酵母の場合においては含まない）非哺乳動物細胞を、プロトコールに導入する−従って、非哺乳動物細胞において得られる結果は、潜在的に有用であるが、哺乳動物細胞またはメラニン保有細胞から得られた結果と同程度に好ましいわけではない。哺乳動物細胞のＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＭＣＢ３９０１、２９３、および２９３Ｔ細胞は特に好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は、当業者の特定の必要性に基礎を置くことができる。実施例９を含む、メラニン保有細胞に関連するような下記を参照のこと。
【０４２３】
ａ．一過性トランスフェクション
１日目に、１０ｃｍディッシュあたり４×１０６個の２９３細胞をプレートする。２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについての以下の割合はプレートあたりである）：チューブＡは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で４μｇ  ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；本発明のＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むｐＣＭＶベクターなど）を混合することによって調製し；チューブＢは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ中で２４μＬリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することによって調製する。チューブＡおよびＢは、逆さまにすること（数回）によって混合し、続いて、室温で３０〜４５分間のインキュベーションを行う。この混合物は、「トランスフェクション混合物」と称する。プレートした２９３細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍＬ無血清ＤＭＥＭの添加を行う。１ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて３７℃／５％  ＣＯ２で４時間のインキュベーションを行う。トランスフェクション混合物は吸引によって取り出し、１０ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清の添加を行う。細胞は３７℃／５％  ＣＯ２でインキュベートする。４８時間のインキュベーション後、細胞を収集し、分析のために利用する。
【０４２４】
ｂ．安定な細胞株
約１２×１０６個の２９３細胞を、１５ｃｍ組織培養プレートにプレートする。１０％のウシ胎仔血清、ならびに１％のピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含むＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。２９３細胞のプレーティングの２４時間後（または〜８０％コンフルエンシーまで）、細胞を、１２μｇのＤＮＡ（例えば、本発明のＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むｐＣＭＶ−ｎｅｏｒベクター）を使用してトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを、６０μＬのリポフェクタミンおよび血清を含まない２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。培地をプレートから吸引し、細胞を１回、血清を含まない培地で洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および培地の混合物を、血清を含まない１０ｍＬの培地とともにプレートに加える。３７℃で４時間から５時間のインキュベーション後、培地を吸引し、血清を含まない２５ｍＬの培地を加える。トランスフェクションの２４時間後、培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、５００μｇ／ｍＬの最終濃度でジェネティシン（Ｇ４１８薬物）を含む、血清を含む培地を加える。トランスフェトした細胞は、ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むポジティブにトランスフェクトした細胞の選択を受ける。培地は、選択を行うときに、４日から５日毎に置き換える。選択の間、細胞は、安定なプールを作製するため、または安定なクローン選択のために分けるために増殖させる。
【０４２５】
実施例３
ＧＰＣＲ活性化の決定のためのアッセイ（例えば、スクリーニングアッセイ）
種々のアプローチが、目的のＧＰＣＲまたは「標的ＧＰＣＲ」の活性化を評価するために利用可能である。以下は例示である；当業者は、当業者の必要性のために優先的に有益であるこれらの技術を決定する能力があると考えられている。
【０４２６】
１．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役受容体がその活性状態にあるときに、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、受容体はＧタンパク質に結合し、ＧＤＰの放出を刺激し、続いてＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットはＧＴＰａｓｅとして働き、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、その時点で、受容体は通常非活性化される。活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換することを継続する。ＧＴＰの加水分解不可能なアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の増強を実証するために使用することができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用することの利点は以下の点である：（ａ）これは、一般的にすべてのＧタンパク質共役受容体に適用可能であること；（ｂ）これは、膜の表面において近接しており、細胞内カスケードに影響を与える分子を拾い上げる可能性をより少なくすること。
【０４２７】
このアッセイは、関連する受容体を発現している膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を刺激する、Ｇタンパク質共役受容体の能力を利用する。それゆえに、このアッセイは、ＧＰＣＲの調節因子として候補化合物をスクリーニングために使用することができる。このアッセイは一般的であり、すべてのＧタンパク質共役受容体において薬物発見への適用を有する。
【０４２８】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１〜約２０ｍＭの間のＭｇＣｌ２（この量は結果の最適化のために調整可能であるが、２０ｍＭが好ましい）、ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭの間の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合緩衝液（この量は結果の最適化のために調整可能であるが、１．２が好ましい）、および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（例えば、本発明のＧＰＣＲを発現している２９３細胞；この量は最適化のために調整可能である）、および１０μＭ  ＧＤＰ（この量は結果の最適化のために調整可能である）中で、１時間インキュベートする。次いで、コムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加え、この混合物をさらに３０分間、室温でインキュベートする。次いで、チューブを１５００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、次いで、シンチレーションカウンターで計数する。
【０４２９】
２．アデニリルシクラーゼ
細胞ベースのアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、粗原形質膜を用いる使用のために改変することができる。Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含むことができ、これはまた、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含む。ウェル中で生成したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射活性ｃＡＭＰトレーサーの結合に対する直接的競合によって定量することができる。以下は、受容体を発現する全細胞中でのｃＡＭＰレベルの変化の測定のための短いプロトコールとして役立つ。
【０４３０】
トランスフェクト細胞は、一過性トランスフェクションの約２４時間から４８時間後に収集する。培地を注意深く吸引して除き、廃棄する。１０ｍＬのＰＢＳを、細胞の各ディッシュに穏やかに加え、その後注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ細胞脱離緩衝液および３ｍＬのＰＢＳを各プレートに加える。細胞をピペットを用いてプレートから取り出し、細胞懸濁液を、５０ｍＬコニカル遠心分離チューブに収集する。次いで、細胞を、室温にて１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な量（約３ｍＬ／プレート）のＰＢＳに注意深く再懸濁する。次いで、血球計を使用して細胞を計数し、さらなるＰＢＳを加えて、適切な数の細胞を得る（約５０μＬ／ウェルの最終量）。
【０４３１】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍＬ検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μＬ）を含む）を調製し、製造業者の指示書に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新鮮に調製し、これは５０μＬの刺激緩衝液、３μＬの試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）および５０μＬ細胞を含む。アッセイ緩衝液は、利用するまで氷上に保存する。例えば、９６ウェルプレート中で好ましく実行されるアッセイは、適切なウェルへの５０μＬのｃＡＭＰ標準の添加、続いてウェルＨ−１１およびＨ１２への５０μＬのＰＢＳの添加によって開始する。５０μＬの刺激緩衝液はすべてのウェルに加える。ＤＭＳＯ（または選択した候補化合物）は、３μＬの化合物溶液を分散可能であるピンツールを使用して適切なウェルに加え、試験化合物は１２μＭの最終アッセイ濃度および１００μＬの全体のアッセイ容量となる。次いで、細胞をウェルに加え、室温で６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。次いで、プレートは、さらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター中で計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値は、各アッセイプレート中に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０４３２】
３．Ｇｉ共役標的ＧＰＣＲのための細胞ベースのｃＡＭＰアッセイ
ＴＳＨＲは、活性化の際にｃＡＭＰの蓄積を引き起こすＧｓ共役ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を変異させること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化させること）によって継続的に活性化される。Ｇｉ共役受容体は、アデニリルシクラーゼを阻害し、それゆえに、ｃＡＭＰ産生のレベルを減少させることが予想され、このことがｃＡＭＰレベルの評価を困難にする可能性がある。Ｇｉ共役受容体の活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の減少を測定するための有効な技術は、最も好ましくは、ベースラインレベルのｃＡＭＰを確立するためのＧｉ共役標的ＧＰＣＲとともに、「シグナルエンハンサー」としての、非内因性で構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（または、内因性で構成的に活性なＧｓ共役受容体）を同時トランスフェクトすることによって達成することができる。Ｇｉ共役受容体は、シグナルエンハンサーとともに同時トランスフェクトされ、スクリーニングのために使用できるのはこの物質である。このようなアプローチは、ｃＡＭＰアッセイが使用される場合に効果的にシグナルを生成するために利用できる。ある実施形態において、このアプローチは、Ｇｉ共役受容体に対抗する候補化合物の同定において好ましく使用される。Ｇｉ共役ＧＰＣＲについては、このアプローチが使用される場合、標的ＧＰＣＲの逆作用薬がｃＡＭＰシグナルを増加し、作用薬がｃＡＭＰシグナルを減少することが注目される。
【０４３３】
１日目に、１０ｃｍディッシュあたり４×１０６個の２９３細胞をプレートする。２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについての以下の割合はプレートあたりである）：チューブＡは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中で、全体で４μｇＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；変異誘発ＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉおよび標的ＧＰＣＲなど）のために、トランスフェクトされた各受容体の２μｇＤＮＡを哺乳動物細胞に混合することによって調製し；チューブＢは、０．５ｍＬ無血清ＤＭＥＭ中で、２４μＬリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することによって調製する。次いで、チューブＡおよびＢは、逆さまにすること（数回）によって混合し、続いて、室温で３０〜４５分間のインキュベーションを行う。この混合物は、「トランスフェクション混合物」と称する。プレートした２９３細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍＬ無血清ＤＭＥの添加を行う。次いで、１．０ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、３７℃／５％ＣＯ２で４時間のインキュベーションを行う。次いで、トランスフェクション混合物は、吸引によって取り出し、続いて、１０ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清の添加を行う。次いで、細胞は３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。約２８〜４８時間のインキュベーション後、次いで、細胞を収集し、分析のために利用する。
【０４３４】
Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、細胞ベースのアッセイのために設計されているが、当業者の必要性に依存して、粗原形質膜を用いる使用のために改変することができる。Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含み、これはまた、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含む。ウェル中で生成したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接的競合によって定量することができる。以下は、受容体を発現する全細胞中でのｃＡＭＰレベルの変化の測定のための短いプロトコールとして役立つ。
【０４３５】
トランスフェクト細胞は、一過性トランスフェクションの約２４時間から４８時間後に収集する。培地を注意深く吸引して除き、廃棄する。１０ｍＬのＰＢＳを、細胞の各ディッシュに穏やかに加え、その後注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ細胞脱離緩衝液および３ｍＬのＰＢＳを各プレートに加える。細胞をピペットを用いてプレートから取り出し、細胞懸濁液を、５０ｍＬコニカル遠心分離チューブに収集する。次いで、細胞を、室温にて１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な量（約３ｍＬ／プレート）のＰＢＳに注意深く再懸濁する。次いで、血球計を使用して細胞を計数し、さらなるＰＢＳを加えて、適切な数の細胞を得る（約５０μＬ／ウェルの最終量）。
【０４３６】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍＬ検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μＬ）を含む）を調製し、製造業者の指示書に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新鮮に調製し、これは５０μＬの刺激緩衝液、３μＬの試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）および５０μＬ細胞を含むべきである。アッセイ緩衝液は、利用するまで氷上に保存することができる。アッセイは、適切なウェルへの５０μＬのｃＡＭＰ標準の添加、続いてウェルＨ−１１およびＨ１２への５０μＬのＰＢＳの添加によって開始することができる。５０μＬの刺激緩衝液はすべてのウェルに加える。選択した候補化合物（例えば、ＴＳＨ）は、３μＬの化合物溶液を分散可能であるピンツールを使用して適切なウェルに加え、１２μＭの最終アッセイ濃度の試験化合物および１００μＬの全体のアッセイ容量となる。次いで、細胞をウェルに加え、室温で６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。次いで、プレートは、さらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター中で計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値は、各アッセイプレート中に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０４３７】
４．レポーターベースのアッセイ
ａ．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ関連受容体）
２９３および２９３Ｔ細胞は、ウェルあたり２×１０４細胞の密度で、９６ウェルプレート上にプレートし、翌日に、リポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を使用して、製造業者の指示書に従ってトランスフェクトした。ＤＮＡ／液体混合物は、以下のようにして各６ウェルトランスフェクションについて調製する：１００μＬのＤＭＥＭ中２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μＬのＤＭＥＭ中の２μＬの液体と穏やかに混合する（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、内因性受容体または非内因性受容体またはｐＣＭＶ単独を含む５０ｎｇのｐＣＭＶ、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＧＰＲＳ）からなる）。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、以下のようにして調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって得た。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントを、アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８からＰＣＲによって入手し［Ｓｕｚｕｋｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１９９６）７：１８８３−１８９３；この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにクローニングし、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを生じた。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位においてｐＧＬ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られたルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって生成した。３０分間の室温でのインキュベーション後、ＤＮＡ／脂質混合物は、４００μＬのＤＭＥＭで希釈し、１００μＬの希釈混合物を各ウェルに加える。１０％  ＦＣＳを有する１００μＬのＤＭＥＭを、４時間のインキュベーション後に、細胞培養インキュベーター中で各ウェルに加える。翌日、トランスフェクト細胞は、１０％  ＦＣＳを有する２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭで交換する。８時間後、ウェルは、ＰＢＳを用いる１回の洗浄後、フェノールレッドを含まない１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに交換する。ルシフェラーゼ活性は、翌日、製造業者の指示書に従って、ＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して測定し、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）上で読み取る。
【０４３８】
ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための方法は、遺伝子のプロモーター中にＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こす、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＡＰ−１シス−レポーティング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２１９０７３）は、リン酸カルシウム沈殿の成分が、４１０ｎｇ  ｐＡＰｌ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌性アルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率の変動について制御するために、トランスフェクション細胞の培地中で測定する）であったこと以外は、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して、上記に示すプロトコールに従って利用することができる。
【０４３９】
ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための１つの方法は、遺伝子のプロモーター中に血清応答因子を含む遺伝子の活性化を引き起こす、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−レポーティング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、例えば、ＣＯＳ７細胞中でのＧｑ共役活性についてアッセイするために利用することができる。細胞は、この系のプラスミド成分、および内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする示された発現プラスミドを用いて、製造業者の指示書に従って、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００２８５）を使用してトランスフェクトする。手短に述べると、４１０ｎｇ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰを、製造業者の指示書に従って、リン酸カルシウム沈殿中で合わせる。沈殿物の半分を、９６ウェルプレートの３ウェルに対して均一に分配し、無血清培地中の細胞上に２４時間保持した。最後の５時間に、細胞は、例えば、１μＭ試験化合物とともにインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、製造業者の指示書に従って、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ番号６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して分析することができる。
【０４４０】
ｄ．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
１日目に、受容体（内因性または非内因性）を含む細胞を、２４ウェルプレートに、通常は１×１０５細胞／ウェル（この数は最適化することができる）でプレートすることができる。２日目に、細胞は、５０μＬ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の０．２５μｇ  ＤＮＡおよび５０μＬ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の２μＬリポフェクタミンを最初に混合することによってトランスフェクトすることができる。溶液を穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートする。細胞を０．５ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、そして４００μＬの無血清培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に加える。次いで、細胞は、３７℃／５％ＣＯ２で３〜４時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を除去し、１ｍＬ／ウェルの通常増殖培地で置き換える。３日目に、３Ｈ−ミオ−イノシトールで細胞を標識する。手短に述べると、培地を除去し、細胞を０．５ｍＬ  ＰＢＳで洗浄する。次いで、ウェルあたり０．５ｍＬイノシトールなし／血清なし培地（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｆｒｅｅ／ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を、０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオ−イノシトール／ウェルで加え、細胞は、３７℃／５％  ＣＯ２にて、１６〜１８時間で一晩インキュベートする。４日目に、細胞は０．５ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、イノシトールなし／血清なし培地、１０μＭ  パーギリン、１０ｍＭ塩化リチウム、または０．４ｍＬのアッセイ培地および任意に５０μＬの試験化合物を１０μＭの最終濃度まで含む０．４５ｍＬのアッセイ培地を加える。次いで、細胞を３０分間、３７℃でインキュベートする。次いで、細胞を、０．５ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、ウェルあたり２００μＬの新鮮な／氷冷停止溶液（１Ｍ  ＫＯＨ；１８ｍＭホウ酸Ｎａ；３．８ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加える。この溶液を、５〜１０分間、または細胞が溶解するまで氷上に保持し、次いで、細胞が２００μＬの新鮮な／氷冷中和溶液（７．５％  ＨＣＬ）によって中和する。次いで、この溶解物を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、チューブあたり１ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２）を加える。この溶液を１５秒間ボルテックスし、上相をＢｉｏｒａｄ  ＡＧｌ−Ｘ８（商標）陰イオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。最初に、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖの水で洗浄し、０．９ｍＬの上相をカラムにロードする。このカラムを、１０ｍＬの５ｍＭ  ミオ−イノシトール、および１０ｍＬの５ｍＭホウ酸Ｎａ／６０ｍＭギ酸Ｎａで洗浄する。イノシトール三リン酸を、２ｍＬの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを用いて、１０ｍＬのシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアルに溶出させる。カラムを１０ｍＬの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムを用いる洗浄により再生し、ｄｄＨ２Ｏで２回すすぎ、水中にて４℃で保存する。
【０４４１】
実施例４
融合タンパク質の調製
ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計は、以下のようにして達成することができる：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長鎖型；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ら、８３  ＰＮＡＳ  ３７７６（１９８６））の５’末端と３’末端の両方を、その上にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含むように操作する。正確な配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩを含む）の確認後、全体の配列を、このベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用するサブクローニングによってｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９５−２０）にシャトルする。Ｇｓα配列の正確な方向を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）へのサブクローニング後に決定する。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列においてラットＧｓα遺伝子を含む修飾ｐｃＤＮＡ３．１（−）を確証する；このベクターは、ここで、「汎用」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用可能である。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の周知の制限部位を含み、従って、Ｇｓタンパク質の上流に、内因性で構成的に活性なＧＰＣＲのコード配列を挿入する能力を有利に提供する。この同じアプローチは、他の「汎用」Ｇタンパク質ベクターを作製するために利用することができ、そして、当然ながら、当業者に高知である他の市販のまたは私有のベクターが利用可能である−重要な判断基準は、ＧＰＣＲの配列が上流にあり、Ｇタンパク質の配列とインフレームにあることである。
【０４４２】
ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物はキメラＧタンパク質であり、それによって、Ｇｑタンパク質αサブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６アミノ酸が欠失し、ＧαｑのＣ末端の最後の５アミノ酸が、Ｇαｉサブユニットの最後のアミノ酸と置き換えられる。Ｇｑ（欠失）Ｇｉ融合構築物は、内因性Ｇｉ共役受容体を、その非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑ（Ｇｑ（欠失）／Ｇｉの型である）に結合させ、その結果、二次メッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールまたはＣａ２＋が、ｃＡＭＰ産生の代わりに測定できる。
【０４４３】
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物は以下のようにして設計した：ＴＬＥＳＩＭ（配列番号１１）の配列を有する、ＧαｑサブユニットのＮ末端の６アミノ酸（アミノ酸２〜７）を欠失させ、配列ＥＹＮＬＶ（配列番号１２）を有するＣ末端の５アミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号１３）を有する、Ｇαｉタンパク質の対応するアミノ酸で置き換えた。この融合構築物は、以下のプライマー：
５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔｃＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１４）および
５’−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１５）
ならびに、ヘマグルチニンタグとともにマウスＧαｑ野生型バージョンを含む、鋳型としてのプラスミド６３３１３（ＡＴＣＣ（登録商標）番号６３３１３）を使用するＰＣＲによって得た。小文字のヌクレオチドには、Ｈｉｎｄｌｌｌ／ＢａｍＨＩのクローニング部位およびスペーサーが含まれる。
【０４４４】
ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、以下のサイクルによって、ステップ２からステップ４を３５回反復して、増幅のために利用した：９５℃、２分間；９５℃、２０秒間；５６℃、２０秒間；７２℃、２分間；および７２℃、７分間。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列決定した。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローンからの挿入物は、２段階クローニングプロセスにより、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位で発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にシャトルした。Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ構築物の核酸配列については配列番号１６を、そのコードされるアミノ酸配列については配列番号１７を参照のこと。
【０４４５】
実施例５
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
１．膜の調製
ある実施形態において、標的ＧＰＣＲを含み、および、例えば、逆作用薬、作用薬、または拮抗薬としての候補化合物の同定における使用のための膜は、好ましくは、以下のように調製する。
【０４４６】
ａ．方法
「膜かき取り緩衝液（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｒａｐｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４から構成され；「膜洗浄緩衝液」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４から構成され；「結合緩衝液」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４から構成される。
【０４４７】
ｂ．手順
すべての材料は、手順の全体を通して氷上に保持する。最初に、培地を、コンフルエントな細胞の単層から吸引し、続いて、１０ｍＬ冷ＰＢＳですすぎ、続いて吸引する。その後、５ｍＬの膜かき取り緩衝液を、細胞をかき取るために加える；これに続き、５０ｍＬ遠心チューブへの細胞抽出物の移動を行う（２０，０００ｒｐｍにて４℃、１７分間、遠心分離する）。その後、上清を吸引し、ペレットを３０ｍＬ膜洗浄緩衝液に再懸濁し、続いて、２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃の遠心分離を行う。次いで、上清を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁する。次いで、これを、Ｂｒｉｎｋｎａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを使用して均質化する（すべての物質が懸濁するまで１５〜２０秒間のバースト）。これを、本明細書では「膜タンパク質」と称する。
【０４４８】
２．Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ
均質化後、膜のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定する（タンパク質は、約１．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、アリコートとし、そして後での使用のために凍結する（−８０℃）ことができ、凍結する場合、使用のためのプロトコールは以下の通りである：アッセイの日に、凍結した膜タンパク質を室温にて融解し、続いてボルテックスし、次いで、Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いて、約１２×１，０００ｒｐｍで約５〜１０秒間均質化する；複数の試料のためには、ホモジナイザーは、異なる調製物の均質化の間に徹底的に洗浄するべきであることが注意される）。
【０４４９】
ａ．材料
結合緩衝液（上記に従う）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬；Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準を、製造業者の指示書に従って利用する（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号５００−０００６）。
【０４５０】
ｂ．手順
２つ組のチューブを調製し、１つは膜を含み、１つは対照「ブランク」としてである。各々が８００μＬ結合緩衝液を含んだ。その後、１０μＬのＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準（ｌｍｇ／ｍＬ）を各チューブに加え、次いで、１０μＬの膜タンパク質を一方のチューブのみに加える（ブランクには加えない）。その後、２００μＬのＢｒａｄｆｏｒｄ色素試薬を各チューブに加え、続いて、各々のボルテックスを行う。５分後、チューブを再ボルテックスし、その中の物質をキュベットに移す。次いで、このキュベットを、５９５ｎｍの波長にて、ＣＥＣＩＬ  ３０４１分光光度計を使用して読み取る。
【０４５１】
３．同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰ緩衝液は、３７．５ｍＬ結合緩衝液および２ｍｇ  ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ−７１２７）から構成され、次いて、０．２μＭ  ＧＤＰを得るために、結合緩衝液中での一連の希釈を行う（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は０．１μＭ  ＧＤＰであった）；候補化合物を含む各ウェルは、１００μＬ  ＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１μＭ  ＧＤＰ）、結合緩衝液中の５０μＬ膜タンパク質、および結合緩衝液中の５０μＬ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（１０ｍＬ結合緩衝液あたり２．５μＬ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）からなる２００μＬの最終容量を有する。
【０４５２】
ｂ．手順
候補化合物は、好ましくは、９６プレート形式を使用してスクリーニングする（これらは−８０℃で凍結可能である）。膜タンパク質（または対照として、標的ＧＰＣＲを除外している発現ベクターを有する膜）は、懸濁するまで手短に均質化する。次いで、タンパク質濃度を、上記のようなＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定する。次いで、膜タンパク質（および対照）を、結合緩衝液中で０．２５ｍｇ／ｍＬまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μＬ  ＧＤＰ緩衝液を、Ｗａｌｌａｃ  Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ（商標）（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに加える。次いで、５μＬピンツールを使用して、５μＬの候補化合物をこのようなウェルに移す（すなわち、２００μＬの全体のアッセイ容量中５μＬは、１：４０比率であり、その結果、候補化合物の最終スクリーニング濃度は１０μＭである）。再度、夾雑を回避するために、各移動工程後、ピンツールは、水（１×）、エタノール（１×）、および水（２×）を含む３つのリザーバー中ですすぐべきであり−過剰の液体は、各すすぎ後にツールから振り落とし、紙およびキムワイプを用いて乾燥させるべきである。その後、５０μＬの膜タンパク質を各ウェルに加え（標的ＧＰＣＲなしの膜を含む対照ウェルもまた利用する）、室温にて５〜１０分間、プレインキュベートする。その後、結合緩衝液中の５０μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに加え、続いて、室温にて６０分間、シェーカー上でのインキュベーションを行う（再度、この例においては、プレートをホイルで覆った）。次いで、プレートを、２２℃にて、４０００ＲＰＭで１５分間遠心分離することによって、アッセイを停止させる。次いで、プレートを、８チャンネルマニフォールドを用いて吸引し、プレートカバーで密封する。次いで、プレートを、設定「Ｐｒｏｔ．＃３７」を使用して、Ｗａｌｌａｃ  １４５０上で読み取る（製造業者の指示書に従う）。
【０４５３】
実施例６
サイクリックＡＭＰアッセイ
例えば、逆作用薬、作用薬、または拮抗薬のような候補化合物を同定するための別のアッセイアプローチは、シクラーゼベースのアッセイを利用することによって達成する。候補化合物をそのように同定することに加えて、このアッセイアプローチは、前出の実施例５に示されるような［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の確認を提供するための独立したアプローチとして利用することができる。
【０４５４】
修飾したＦｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を、以下のプロトコールに従って、標的ＧＰＣＲの調節因子としての候補化合物の同定のために好ましく利用する。
【０４５５】
標的ＧＰＣＲでトランスフェクトした細胞は、トランスフェクションの約３日後に収集する。膜は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中での懸濁細胞の均質化によって調製する。均質化は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（商標）を使用して、約１０秒間、氷上で実施する。得られるホモジネートは、４℃にて、４９，０００×ｇで１５分間遠心分離する。次いで、得られるペレットは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中に再懸濁し、１０秒間均質化し、続いて、４℃にて、４９，０００×ｇで１５分間の遠心分離を行う。次いで、得られるペレットを、利用するまで−８０℃で保存する。直接的同定スクリーニングの日に、膜ペレットは、室温でゆっくりと融解し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液に再懸濁して、０．６０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を生じる（再懸濁した膜は、使用するまで氷上に配置する）。
【０４５６】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍＬの検出緩衝液中に２μＣｉのトレーサー｛［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μＬ）を含む）は、製造業者の指示書に従って、調製および維持する。アッセイ緩衝液は、スクリーニングのために新鮮に調製し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１単位／ｍＬクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含み；次いで、アッセイ緩衝液は、利用されるまで氷上で保存する。
【０４５７】
候補化合物は、４０μＬ膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５０μＬのアッセイＢ緩衝液とともに、好ましくは、例えば、９６ウェルプレートウェル（３μＬ／ウェル；１２μＭ最終アッセイ濃度）に加える。次いで、この混合物は、穏やかに振盪しながら、室温で３０分間インキュベートした。
【０４５８】
インキュベーション後、１００μＬの検出緩衝液を各ウェルに加え、続いて、２〜２４時間のインキュベーションを行う。次いで、プレートを、「Ｐｒｏｔ．＃３１」を使用して、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）プレートリーダー中で計数する（製造業者の指示書に従う）。
【０４５９】
例として、かつ限定としてではなく、得られた例示的なスクリーニングアッセイプレート（９６ウェル形式）の結果は、図１に提示する。各バーは、各ウェル中で異なる化合物についての結果を表し、「標的ＧＰＣＲ」は、ＧＰＲ５０とは無関係の、内因性で構成的に活性なＧｓ共役ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築物である。図１に提示した結果は、各プレートの平均結果（ｍ）に基づく標準偏差もまた提供し、そして、一次スクリーニングからの「リード」としての逆作用薬の選択のための、平均プラス２つの任意の選択は、少なくとも平均プレート応答マイナス２標準偏差でパーセント応答を減少する候補化合物の選択を含む。逆に、一次スクリーニングからの「リード」としての作用薬の選択のための任意選択は、少なくとも平均プレート応答プラス２標準偏差でパーセント応答を増加する候補化合物の選択を含む。これらの選択プロセスに基づいて、以下のウェルの候補化合物は、それぞれ、ウェルＡ２およびＧ９において、上記内因性ＧＰＣＲに対する推定の逆作用薬（化合物Ａ）および作用薬（化合物Ｂ）として直接的に同定した。図１を参照のこと。明確化のために以下のことに注意のこと：これらの化合物は、このＧＰＣＲの内因性リガンドのいかなる治験もなしで直接的に同定した。受容体機能に基づき、化合物の結合親和性に基づかないアッセイ技術に焦点を当てることによって、この受容体の機能的活性を減少可能な化合物（化合物Ａ）ならびに受容体の機能的活性を増加可能な化合物（化合物Ｂ）を確認することが可能である。
【０４６０】
実施例７
細胞内カルシウム濃度の測定のための蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ
標的受容体（実験用）およびｐｃＭＶ（陰性対照）が安定にトランスフェクトされた、それぞれのクローン性株からの細胞を、翌日のアッセイのために、完全培養培地（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ）を有するウェルあたり、５．５×１０４細胞で、ポリ−Ｄ−リジンで前処理した９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３５６６４０）に播種する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｆ１４２０２）インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、１ｍｇ  Ｆｌｕｏ４−ＡＭを、４６７μＬ  ＤＭＳＯおよび４６７μＬプルオロニック酸（Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｐ３０００）に溶解して１ｍＭストック溶液を得、これは、１ヶ月間、−２０℃で保存可能である。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指標色素である。
【０４６１】
候補化合物は、洗浄緩衝液（１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で調製する。
【０４６２】
アッセイの時点で、培養培地はウェルから除去し、細胞に、１００μＬの４μＭ  Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／完全培地、ｐＨ７．４をロードする。３７℃／５％  ＣＯ２でのインキュベーションは、６０分間進行することを許容する。
【０４６３】
１時間のインキュベーション後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液を除去し、細胞は１００μＬ洗浄緩衝液で２回洗浄する。各ウェルに、１００μＬ洗浄緩衝液を残す。プレートを、３７℃／５％  ＣＯ２で６０分間、インキュベーターに戻す。
【０４６４】
ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）は、３０秒で５０μＬ候補化合物を加えるために、および次の１５０秒間の間に候補化合物によって誘発される細胞内カルシウム濃度（「Ｃａ２＋」）の一過性の変化を記録するために、プログラムする。全体の蛍光変化の計数は、ＦＬＩＰＲソフトウェアを使用して作用薬活性を決定するために使用する。機器のソフトウェアは、蛍光の読み取りを標準化して、ゼロ点における等価な初期の読み取りを与える。
【０４６５】
例示として、かつ限定ではなく、当業者は、既知の作用薬との引き続く接触によって誘発される細胞内（「Ｃａ２＋」）の一過性の増加を阻害する候補化合物の能力を評価することによって、候補化合物が受容体の逆作用薬としてスクリーニング可能であることを認める。ある実施形態において、標的受容体を含む細胞は、Ｇα１５、Ｇα１６、またはＧｑ（欠失）／ＧｉキメラＧタンパク質をさらに含む。
【０４６６】
前述は、安定にトランスフェクトされた細胞を使用して作用薬活性についてのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者は、拮抗薬活性を特徴付けするためにアッセイを容易に改変可能である。当業者は、代替的に、一過性にトランスフェクトされた細胞が使用可能であることもまた容易に認識する。
【０４６７】
実施例８
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）が、受容体活性化を評価するためにモニターされてもよい。ＭＡＰキナーゼは、いくつかのアプローチによって検出することができる。１つのアプローチは、非リン酸化（不活性型）またはリン酸化（活性型）のいずれかである、リン酸化状態の評価に基づく。リン酸化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより遅い移動度を有し、それゆえに、ウェスタンブロッティングを使用して、刺激されていないタンパク質と比較することができる。代替として、リン酸化タンパク質に特異的な抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が利用可能であり、これは、リン酸化キナーゼの増加を検出するために使用することができる。いずれの方法においても、細胞は試験化合物を用いて刺激し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用し、タンパク質は、ニトロセルロースまたはイモビリン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ）に電気泳動的に転写する。免疫反応性バンドは、標準的なウェスタンブロッティング技術によって検出する。可視シグナルまたは化学発光シグナルはフィルム上に記録し、デンシトメトリーによって定量され得る。
【０４６８】
別のアプローチは、リン酸化アッセイを介するＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細胞は、試験化合物を用いて刺激し、可溶性抽出物を調製する。この抽出物は、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、およびＭＡＰキナーゼの特異的基質、例えば、インスリンまたはＰＨＡＳ−１によって調節されるリン酸化される熱および酸安定性タンパク質とともに、３０℃で１０分間インキュベートする。反応は、Ｈ３ＰＯ４の添加によって終結させ、サンプルは氷に移す。アリコートを、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１クロマトグラフィーペーパーにスポットし、これは、リン酸化タンパク質を保持する。このクロマトグラフィーペーパーを洗浄し、液体シンチレーションカウンターによって３２Ｐを計数する。代替として、細胞抽出物は、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、およびフィルター支持体にストレプトアビジンによって結合されたビオチン化ミエリン塩基性タンパク質とともにインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化ＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応は、３０℃で１０分間実行する。次いで、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質を保持しているフィルターを通して、抽出物を吸引することができる。このフィルターを洗浄し、液体シンチレーションカウンターによって３２Ｐを計数する。
【０４６９】
実施例９
メラニン保有細胞技術
メラニン保有細胞は、下等脊椎動物において見い出される皮膚細胞である。これらは、メラノソームと呼ばれる、色素を有するオルガネラを含む。メラニン保有細胞は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性化の際に、微小管ネットワークに沿ってこれらのメラノソームを再分配可能である。この色素移動の結果は、細胞の見かけの明化または暗化である。メラニン保有細胞の中では、Ｇｉ共役受容体の活性から生じる細胞内ｃＡＭＰのレベルの減少は、メラノソームが細胞の中心部に移動することを引き起こし、色の劇的な明化を生じる。次いで、ｃＡＭＰレベルが上昇すると、Ｇｓ共役受容体の活性化の後に、メラノソームが再分配され、細胞は再度暗く見える。Ｇｑ共役受容体の活性化から生じるジアシルグリセロールのレベルの増加もまた、この再分配を誘導することができる。加えて、この技術は、特定の受容体型チロシンキナーゼの研究にもまた適している。メラニン保有細胞の応答は、受容体活性化の数分以内に起こり、単純で強固な色の変化を生じる。この応答は、従来的な吸収マイクロプレートリーダーまたは適当なビデオイメージングシステムを使用して、容易に検出することができる。他の皮膚細胞とは異なり、メラニン保有細胞は神経堤に由来し、シグナル伝達タンパク質の完全な相補物を発現するようである。特に、この細胞は極度の広範囲のＧタンパク質を発現し、それゆえに、ほとんどすべてのＧＰＣＲを機能的に発現可能である。
【０４７０】
メラニン保有細胞は、天然のリガンドを含む、ＧＰＣＲに対する化合物を同定するために利用することができる。この方法は、特定の刺激に応答する細胞の色素を分散または凝集することが可能である色素細胞株の試験細胞を導入すること、およびＧＣＰＲをコードする外因性クローンを発現させることによって、実施することができる。刺激剤、例えば、メラトニンは、色素配置の初期状態を設定し、ＧＰＣＲの活性化が色素分散を誘導する場合、色素は試験細胞中で凝集する。しかし、色素配置の初期状態を設定するために刺激剤を用いて細胞を刺激するとき、ＧＰＣＲの活性化が色素凝集を誘導する場合、色素は分散する。次いで、試験細胞は、化学化合物と接触され、細胞中の色素配置が、色素配置の初期の状態から変化したか否かを決定する。ＧＰＣＲに結合するリガンドを含むがこれに限定されない候補化合物に起因する色素細胞の分散はペトリディッシュ中で暗く見えるのに対して、色素細胞の凝集は明るく見える。
【０４７１】
材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および同第６，０５１，３８６号の開示に従うことができる。これらの特許の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０４７２】
細胞は、例えば、９６ウェル形式（プレートあたり１種の受容体）でプレートする。トランスフェクションの４８時間後、各プレート上の細胞の半分を、１０ｎＭメラトニンで処理する。メラトニンは、メラニン保有細胞中の内因性Ｇｉ共役受容体を活性化し、これらの色素が凝集することを引き起こす。細胞の残りの半分は、無血清培地０．７×Ｌ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移す。１時間後、無血清培地中の細胞は色素分散状態のままであるが、メラトニン処理細胞は色素凝集状態である。この時点で、細胞を、試験／候補化合物の用量反応で処理する。プレートしたＧＰＣＲは試験／候補化合物に結合し、メラニン保有細胞は、化合物に応答して色の変化を受けることが予想される。受容体がＧｓまたはＧｑのいずれかの共役受容体であるならば、メラトニンが凝集したメラニン保有細胞は色素分散を受ける。対照的に、受容体がＧｉ共役受容体であるならば、色素分散細胞は、用量依存性色素凝集を受けることが予測される。
【０４７３】
実施例１０
ＧＰＲ５０遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウス／ラット／ブタ
マウス
好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端までを含む：（ａ）マウスＧＰＲ５０ゲノム配列中に含まれる第１のヌクレオチド配列；（ｂ）ネオマイシン耐性のためのマーカー（ｎｅｏ）などの、ポジティブ選択マーカーを含むヌクレオチド配列；および（ｃ）マウスＧＰＲ５０ゲノム配列中に含まれ、かつ第１のマウスＧＰＲ５０ヌクレオチド配列（ａ）の下流のゲノム上に位置する、第２のヌクレオチド配列。マウスＧＰＲ５０ゲノム配列は、当業者に周知の方法を使用して単離する（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。マウスＧＰＲ５０ゲノム配列の上記単離のためのプローブは、マウスＧＰＲ５０をコードするｃＤＮＡに由来し、ここで、上記ｃＤＮＡは、マウス心臓、肺、または脂肪組織からのｍＲＮＡを鋳型として使用して入手し得る。
【０４７４】
好ましい実施形態において、このＤＮＡ構築物は、ヌクレオチド配列（ａ）の上流またはヌクレオチド配列（ｃ）の下流に位置するネガティブ選択マーカーもまた含む。好ましくは、ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子［Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−２８］、ハイグロマイシンβ遺伝子［Ｔｅ  Ｒｉｅｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：６４９−５１］、ｈｐｒｔ遺伝子［Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｕｇｔら、Ｇｅｎｅ（１９９１）１０５：２６３−７；Ｒｅｉｄら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：４２９９−４３０３］またはジフテリア毒素Ａフラグメント（Ｄｔ−Ａ）遺伝子［Ｎａｄａら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１２５−３５；Ｙａｇｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：９９１８−９９２２］を含み、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。好ましくは、ポジティブ選択マーカーは、マウスＧＰＲ５０をコードする配列を中断するように、マウスＧＰＲ５０エキソン配列の中に配置する。これらの置き換えベクターは、例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−２８；Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３−１２；Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−５２；Ｋｏｌｌｅｒら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１０：７０５−３０；および米国特許第５，６３１，１５３号によって記載されており、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０４７５】
第１のヌクレオチド配列（ａ）および第２のヌクレオチド配列（ｃ）は、マウスＧＰＲ５０調節配列、イントロン配列、エキソン配列、または、調節配列および／もしくはイントロン配列および／もしくはエキソン配列の両方を含む配列の中に、区別なく配置し得る。ヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）のサイズは、１〜５０ｋｂまでの範囲、好ましくは、１〜１０ｋｂまで、より好ましくは、２〜６ｋｂまで、および最も好ましくは、２〜４ｋｂの範囲である。
【０４７６】
選択した遺伝子の中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法は当業者に周知であり、広範な遺伝子を首尾よく不活性化するために使用されてきた。
【０４７７】
ラット
類似のまたは代替的な方法［例えば、Ｚａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）２１：６４５−５１を参照のこと；この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］が、ＧＰＲ５０遺伝子の破壊を含むトランスジェニックラットを作製するために使用され得る。
【０４７８】
ブタ
類似のまたは代替的な方法が、ＧＰＲ５０遺伝子の破壊を含むトランスジェニックラットを作製するために使用され得る［例えば、Ｌａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５：１０８９−１０９２；を参照のこと；この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。
【０４７９】
実施例１１
内因性ＧＰＲ５０は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを減少するための構成的活性を阻害する
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨまたはチロトロピン）受容体（ＴＳＨＲ）は、そのリガンドであるＴＳＨによる活性化の際に、細胞内ｃＡＭＰの蓄積を引き起こす。ＧＰＲ５０などの受容体の活性化に対応するｃＡＭＰの産生の減少を測定するための有効な技術は、ＴＳＨＲをＧＰＲ５０と同時トランスフェクトすること、およびＴＳＨの存在下で基礎レベルのｃＡＭＰを上昇させるためのアッセイを実行することであり、それによって、ＴＳＨＲは「シグナルウィンドウエンハーサー」として働く。このようなアプローチをここで使用した。
【０４８０】
ヒトＨＥＫ２９３細胞を、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨまたはチロトロピン）受容体（ＴＳＨＲ）、および内因性ＧＰＣＲをコードするｐＣＭＶベクターまたはｃＤＮＡプラスミドのいずれかとともに同時トランスフェクトした。トランスフェクションは、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実行した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、種々の濃度のナイアシンおよび１００ｎＭ  ＴＳＨ（Ｓｉｇｍａ）を用いて１時間刺激し、その後、全細胞ｃＡＭＰを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号：ＳＭＰ００４Ｂからのアデニリルシクラーゼ  フラッシュプレートアッセイ（Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙ）キットを使用して、以下に記載するように決定した。
【０４８１】
トランスフェクト細胞を、１００ｎＭ  ＴＳＨおよび種々の濃度のナイアシンまたはビヒクルのいずれかを含む、抗ｃＡＭＰ抗体コートしたウェルにプレートした。すべての条件を３連で試験した。ｃＡＭＰの刺激を可能にするための室温で１時間のインキュベーション後、１２５Ｉ−ｃＡＭＰを含む検出ミックス（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒキットの中に供給される）を各ウェルに加え、プレートを、室温でさらに１時間、インキュベートさせた。次いで、ウェルを吸引して、未結合の１２５Ｉ−ｃＡＭＰを除去した。結合した１２５Ｉ−ｃＡＭＰを、Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して検出した。各サンプル中のｃＡＭＰの量は、標準曲線に対する比較によって決定し、プレート上のいくつかのウェル中に既知の濃度のｃＡＭＰを配置することによって得た。結果を図２に図示する。
【０４８２】
図２に示されるように、内因性ＧＰＲ５０は、検出可能に構成的に活性であり、細胞内ｃＡＭＰのレベルを減少させるための構成的活性を示す。
【０４８３】
実施例１２
ＧＰＲ５０ノックアウト（「欠損」）マウスの樹立
ＧＰＲ５０ノックアウト（「欠損」）マウスは本実施例に記載するように樹立した。
【０４８４】
標的化ベクターは、完全なエキソン２配列および隣接するイントロン配列を不活性化すること、およびネオマイシン耐性カセットによりそれを置き換えることによって生成した（図３Ａを参照のこと）。図３Ａにおいて、小さな斜字体で示すヌクレオチド番号は、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｖｉｅｗ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに従う染色体位置を表す。
【０４８５】
標的化ベクターは、エレクトロポレーションによって、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ胚性幹（ＥＳ）細胞に挿入した。ポジティブクローンを単離し、エキソン２欠失を、サザンブロットによって確認した。３’末端における標的化を確認するために、サザンブロット分析を、８５４ｂｐ  ＤＮＡフラグメント（図３Ａに示されるような「３’外部プローブ」）を用いて、ＥＳ細胞からのＥｃｏＲＶ消化ゲノムＤＮＡに対して実施した。正しく標的化された細胞は、〜７．８ｋｂ修飾バンド（３’アームの５’末端におけるＥｃｏＲＶ部位の導入に起因する）を実証した。１５．９ｋｂ野生型バンドは、ＧＰＲ５０がＸ連鎖であるので、標的化クローンには存在しなかった。
【０４８６】
エキソン２配列が欠失していることをさらに確認するために、エキソン２配列の大部分を含んでいる１０３１ｂｐ  ＤＮＡフラグメント（図３Ａに示されるような「内部プローブ」）を有するＥｃｏＲＩ消化ゲノムＥＳ細胞ＤＮＡに対して、サザンブロット分析を実施した。ＧＰＲ５０はＸ連鎖であるので、正しく標的化されたクローンにおいてはバンドは検出されなかったのに対して、７．１ｋｂバンドが、野生型細胞において検出された。すべてのサザンブロットは、以前に公開された方法に従って実施した［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと；この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される］。
【０４８７】
次いで、標的化されかつ核型が正常であるＥＳ細胞を、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｉ／Ｂにマイクロインジェクションし、注入した胚盤葉をＣ５７Ｂ１／６代理母マウスの子宮に移植した。雄性キメラを、雌性Ｃ５７Ｂ１／６Ｊと交配してＦ１マウスを生成し、ＧＰＲ５０エキソン２欠失の生殖細胞系伝達を、マウス尾ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによってさらに確認した。
【０４８８】
ＧＰＲ５０ゲノム配列の異なる領域からの５種類の特異的プライマーセットを生成した（図３Ａに示すような「＃１」〜「＃５」）。プライマー配列は以下の表Ｄに示す。プライマー＃３〜＃５のみがノックアウトマウスにおいて検出されるはずであるのに対して、＃５以外のすべてのプライマーが、野生型マウスにおいて検出されるはずである。マウスから尾を切断し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）に従って、フェノール／クロロホルム抽出を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。５０μＬの反応量中、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２００ｎｇ／μＬのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの各々、ならびに１００〜５００ｎｇゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物は、１．８％アガロースゲル上で泳動し、各プライマー対についての増幅産物の存在または非存在を検査し、そして予測サイズを確認した。結果を図３Ｂに示す。
【０４８９】
図３Ｂに示す結果は、ＧＰＲ５０ノックアウト「（欠損）」マウスを樹立したことを確認する。
【０４９０】
ＧＰＲ５０ノックアウト（欠損）マウスを樹立したことは、視床下部におけるＧＰＲ５０発現のインサイチュハイブリダイゼーション分析によってもまた、確認した。
【０４９１】
表Ｄ
【０４９２】
【表４】
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実施例１３
高脂肪食の野生型マウスと比較した、高脂肪食または固形飼料のＧＰＲ５０ノックアウトマウスの体重
高脂肪食によって誘導される体重増加に対するＧＰＲ５０活性の効果を図４に示す。３０週齢の雄性マウスの３つのグループを個別に収容し、水および食料に自由な接近を許容した。マウスは、１２時間の人工光／１２時間の暗サイクルで維持し、定常的な湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下に保持した。第１のグループの野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス（ｎ＝６）（図４の「ＷＴ」）および第２のグループのＧＰＲ５０−ノックアウトマウス（ｎ＝２）（図４の「ＫＯ」）は、高脂肪食に自由に接近可能であったのに対し（図４の「ＨＦＤ」）（Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ）、第３のグループのＧＰＲ５０−ノックアウトマウス（ｎ＝３）は、固形飼料ペレットに接近可能であった（図４の「固形飼料」）（Ｔｅｋｌａｂ  ８６０４、４．４％脂肪）。接近可能なのは１５週間であった
体重は、平均±ＳＥＭとして図４Ａに示す。初期体重のパーセンテージとしての体重増加は、平均±ＳＥＭとして図４Ｂに示す。図４の精査（例えば、高脂肪食のＧＰＲ５０ノックアウトマウスの、高脂肪食の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスとの比較）より、ＧＰＲ５０ノックアウトマウスにおけるＧＰＲ５０活性の損失は、高脂肪食によって誘導される体重増加からの保護を付与した（すなわち、体重増加を減少した）ことが明らかである。
【０４９３】
高脂肪食（Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ）の７０週齢雄性ＧＰＲ５０ノックアウト（「ＫＯ」）マウス（ｎ＝６）および野生型同腹仔（「ＷＴ」）マウス（ｎ＝６）において３週間実行した類似の実験は、図５に示す。
【０４９４】
実施例１４
マウスにおいて高脂肪食によって誘導される脂肪過多症の増加に対するＧＰＲ５０逆作用薬および拮抗薬のインビボ効果
ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬は、高脂肪食によって誘導される脂肪過多症の増加からの保護を付与することを示すことができる。齢および性別の一致した５〜３０週齢の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの２つのグループを個別に収容し、水および食物に自由に接近可能にする。これらのマウスを、１２時間の人工光／１２時間の暗サイクルで維持し、定常的な湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下に保持する。マウスは、４〜１５週間の期間の間、高脂肪食（Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ）に自由に接近可能にする。４〜１５週間の期間にわたり、マウスＧＰＲ５０に対して逆作用薬もしくは拮抗薬活性を有するＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬、またはビヒクル単独を、尾静脈に毎日注射する。ＧＰＲ５０逆作用薬または拮抗薬の好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
【０４９５】
４〜１５週間の期間の最後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、精巣上体および鼠径部足蹠を収集し、脂肪過多症の尺度として秤量する。結果は、ＧＰＲ５０の逆作用薬および拮抗薬が、高脂肪食によって誘導される脂肪過多症の増加（精巣上体および鼠径部足蹠（ｉｎｇｕｉｎａｌ  ｆｏｏｔｐａｄｓ）の重量の増加）からの保護を付与する（すなわち、この増加を減少する）ことを実証することができる。
【０４９６】
ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬は、ＧＰＲ５０の選択的な逆作用薬または拮抗薬であり得ることが明白に意図される。３１．８％脂肪／Ｋｃａｌより少ないかまたは多い高脂肪食を使用し得ることが明白に意図される。逆作用薬または拮抗薬の投与は、静脈内以外であり得ること、例えば、逆作用薬または拮抗薬の投与は、腹腔内または経口であり得ることが明白に意図される。５週齢よりも若いマウス、または３０週齢よりも高齢のマウスを使用し得ることが明確に意図される。注射の期間は、４週間未満または１５週間より長くあり得ることが明白に意図される。マウス以外の非ヒト哺乳動物、例えば、ラットを使用し得ることが明白に意図される。
【０４９７】
実施例１５
マウスにおいて高脂肪食によって誘導される体脂肪率の増加に対する、ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬のインビボ効果
ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬は、高脂肪食によって誘導される体脂肪率の増加からの保護を付与することを示すことができる。齢および性別の一致した５〜３０週齢の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの２つのグループを個別に収容し、水および食物に自由に接近可能にする。これらのマウスを、１２時間の人工光／１２時間の暗サイクルで維持し、定常的な湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下に保持する。マウスは、４〜１５週間の期間の間、高脂肪食（Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ）に自由に接近可能にする。４〜１５週間の期間にわたり、マウスＧＰＲ５０に対して逆作用薬もしくは拮抗薬活性を有するＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬、またはビヒクル単独を、尾静脈に毎日注射する。ＧＰＲ５０逆作用薬または拮抗薬の好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
【０４９８】
４〜１５週間の期間の最後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、体脂肪率を、二重エネルギーＸ線吸光光度法（Ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（ＤＥＸＡ）（Ｌｕｎａｒ  ＰＩＸＩｍｕｓ，Ｌｕｎａｒ  ＰＩＸＩｍｕｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用するデンシトメトリーによって身体組成を決定することによって評価する。データは、製造業者の指示書に従って、Ｌｕｎａｒ  ＰＩＸＩｍｕｓ  ２．２．０ソフトウェアを使用して分析する。結果は、ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬が、高脂肪食によって誘導される体脂肪率の増加からの保護を付与する（すなわち、この増加を減少する）ことを実証することができる。
【０４９９】
ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬は、ＧＰＲ５０の選択的な逆作用薬または拮抗薬であり得ることが明白に意図される。３１．８％脂肪／Ｋｃａｌより少ないかまたは多い高脂肪食を使用し得ることが明白に意図される。逆作用薬または拮抗薬の投与は、静脈内以外であり得ること、例えば、逆作用薬または拮抗薬の投与は、腹腔内または経口であり得ることが明白に意図される。５週齢よりも若いマウス、または３０週齢よりも高齢のマウスを使用し得ることが明確に意図される。注射の期間は、４週間未満または１５週間より長くあり得ることが明白に意図される。マウス以外の非ヒト哺乳動物、例えば、ラットを使用し得ることが明白に意図される。
【０５００】
実施例１６
マウスにおいて高脂肪食によって誘導される体重増加に対する、ＧＰＲ５０の逆作用薬および拮抗薬のインビボ効果
ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬は、高脂肪食によって誘導される体重増加からの保護を付与することを示すことができる。齢および性別の一致した５〜３０週齢の野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの２つのグループを個別に収容し、水および食物に自由に接近可能にする。これらのマウスを、１２時間の人工光／１２時間の暗サイクルで維持し、定常的な湿度（７０％）および温度（２２℃）条件下に保持する。マウスは、４〜１５週間の期間の間、高脂肪食（Ｄ１２２６６Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、３１．８％脂肪／Ｋｃａｌ）に自由に接近可能にする。４〜１５週間の期間にわたり、マウスＧＰＲ５０に対して逆作用薬もしくは拮抗薬活性を有するＧＰＲ５０の逆作用薬もしくは拮抗薬、またはビヒクル単独を、尾静脈に毎日注射する。ＧＰＲ５０逆作用薬または拮抗薬の好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。
【０５０１】
４〜１５週間の期間の過程にわたり、一週間間隔で、マウスを秤量する。結果は、ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬が、高脂肪食によって誘導される体重増加からの保護を付与する（すなわち、この増加を減少する）ことを実証することができる。
【０５０２】
ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬は、ＧＰＲ５０の選択的な逆作用薬または拮抗薬であり得ることが明白に意図される。３１．８％脂肪／Ｋｃａｌより少ないかまたは多い高脂肪食を使用し得ることが明白に意図される。逆作用薬または拮抗薬の投与は、静脈内以外であり得ること、例えば、逆作用薬または拮抗薬の投与は、腹腔内または経口であり得ることが明白に意図される。５週齢よりも若いマウス、または３０週齢よりも高齢のマウスを使用し得ることが明確に意図される。注射の期間は、４週間未満または１５週間より長くあり得ることが明白に意図される。マウス以外の非ヒト哺乳動物、例えば、ラットを使用し得ることが明白に意図される。
【０５０３】
実施例１７
ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＮＰＹニューロンによるＧＰＲ５０の同時発現の分析
ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）ニューロンによるＧＰＲ５０の同時発現を、ＮＰＹのためのジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識アンチセンスプローブと組み合わせた、ＧＰＲ５０のための放射性標識アンチセンスプローブを使用して、インサイチュハイブリダイゼーションによって研究した。配列番号７のヌクレオチド３９７〜９１８に対応するラットＧＰＲ５０プローブを、ｐＢＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に挿入した。コード配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＭ＿０１２６１４を参照のこと）にまたがるラットＮＰＹ  ｃＤＮＡ配列（５１１ヌクレオチド）に対応するＮＰＹプローブを、ｐＢＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した。インサイチュハイブリダイゼーションは、本質的に以下に記載するように実行した。
【０５０４】
ラットを、光サイクルの開始の１〜２時間後に、迅速な断頭により屠殺した。脳を取り出し、イソペンタン（−４０℃）中で凍結し、そして−８０℃で保存した。視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分からの一連の１２μｍ切片をクリオスタット上で調製し、ポリリジンを下塗りしたスライドに融解装着し、そして処理まで−８０℃で保存した。
【０５０５】
センスおよびアンチセンス３３Ｐ放射性標識プローブは、ＲＮａｓｉｎ（４０単位）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ（０．３３ｍＭ）、［α−３３Ｐ］−ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、５０μＣｉ、ＮＥＧ３０７  Ｈ００１ＭＣ）、ならびに適切なポリメラーゼ（Ｔ７  ５０単位またはＴ３  ２０単位）を含む転写緩衝液中で線状化プラスミドをインキュベートすることによるインビトロ転写によって生成した。プローブは、ＤＮａｓｅ処理し、エタノール沈殿によって精製し、そして２×ハイブリダイゼーション緩衝液（８×ＳＥＴ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．４％  ＳＤＳ、２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、５０μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙＡ、５０μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙＣ）中に再懸濁した。
【０５０６】
アンチセンスジゴキシゲニン標識プローブは、ＲＮａｓｉｎ（４０単位）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、ジゴキシゲニン標識ＵＴＰを含むヌクレオチドミックス（ｒＮＴＰジゴキシゲニンＲＮＡ標識ミックス（ｒＮＴＰ  ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｉｘ）、Ｒｏｃｈｅ  ＃１２７７０７３）、および適切なポリメラーゼ（Ｔ７  ５０単位またはＴ３  ２０単位）を含む転写緩衝液中で線状化プラスミドをインキュベートすることによるインビトロ転写によって生成した。プローブはＤＮａｓｅ処理し、セントリセップ（ｃｅｎｔｒｉｓｅｐ）カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、＃ＣＳ−９０１）を通して清浄化した。
【０５０７】
組織切片をフリーザーから取り出し、１５分間空気乾燥した。次に、切片を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド中で、室温にて３０分間固定し、１×ＰＢＳ中で３回すすぎ、そして０．１Ｍトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ８．０中で２分間、次いで、０．２５％無水酢酸を含む同じ緩衝液中で手短にアセチル化した。次いで、スライドを、１×ＰＢＳ中で５分間すすぎ、次いで、段階的な濃度のエタノールを通して脱水し、そして空気乾燥した。放射性標識プローブを２×ハイブリダイゼーション緩衝液中で希釈し、スライドあたり適切な濃度の１６×１０６ｃｐｍを生じた。サケ精子を２０μｇ／スライドの最終濃度で加え、ジゴキシゲニン標識プローブを、５００ｎｇ／スライドの最終濃度で加えた。硫酸デキストラン／ホルムアミド（２０％）を加えて、２×ハイブリダイゼーション緩衝液との１：１比率を生じた。希釈プローブをスライド上に配置し、カバーガラスを付け、そして１×ＰＢＳで加湿したプラスチックトレイ中で５５℃、１６〜１８時間インキュベートした。カバーガラスを、１ｍＭ  ＤＴＴ／４Ｘ  ＳＳＣ（６００ｍＭ塩化ナトリウムおよび６０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いて浮かせて取り、続いて切片を４×ＳＳＣ中で１０分間、１回洗浄し、リボヌクレアーゼＡ（２００μｇ／ｍＬ）中で、６０分間、３７℃のウォーターバス中でインキュベートし、次いで、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、および０．５×ＳＳＣで各５分間すすいだ。切片を、０．１×ＳＳＣの最終ストリンジェンシーまで、６５℃で１時間洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ中で２回洗浄し、次いで、ＴＮ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で５分間洗浄した。次いで、切片を０．５％カゼイン／ＴＮブロッキング溶液中に３０分間配置し、次いで、０．５％カゼイン／ＴＮ溶液中で１：３００希釈した抗ジゴキシゲニン−ＡＰ抗体（Ｒｏｃｈｅ、＃１０９３２７４）とともに２時間インキュベートした。次いで、切片を、ＴＮ中で３回、各２分間洗浄し、次いで、ＴＮＭ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３回、各５分間洗浄した。最終洗浄後、切片を、着色反応液（ＴＮＭ中、０．２ｍｇ／ｍＬレバミゾール、３．４μＬ／ｍＬ  ＮＢＴ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１３８３２１３）、３．５μ／ｍＬ  ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１３８３２２１）、および０．２２μ濾過滅菌）中で２０〜３０分間インキュベートし、反応は、３０分間ＴＥ中で停止した。０．１Ｍグリシンおよび０．５％  ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００中で切片を１０分間インキュベートすることによって抗体をはぎ取り、水中で洗浄した。切片を、２．５％グルタルアルデヒド中で１〜２時間固定し、水で洗浄し、次いで空気乾燥した。一旦切片が乾燥すると、これらはｘ線感光性フィルム（Ｂｉｏ−Ｍａｘ，Ｋｏｄａｋ，Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に２〜７日間露光し、写真乳剤（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃１７５３７からのゲル型のＩｌｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．５Ｄ乳剤）に浸漬し、乾燥させ、そして乾燥剤入りのスライドボックス中で、発現のレベルに依存して４〜８週間保存した。���造業者の推奨（Ｋｏｄａｋ  Ｄ１９）に従う、浸漬したスライドの現像後、切片は水中で広範に洗浄し、空気乾燥し、次いで顕微鏡検査のためにカバーガラスを装着した。
【０５０８】
ＧＰＲ５０およびＮＰＹ  ｍＲＮＡ含有細胞の分布の画像は、Ｓｔｅｒｅｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（登録商標）ｖ６．５５．２ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ，ＶＴ）を使用する、ビデオカメラ（ＮＴＳＣ  ７５０ＣＥ）に接続したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡を使用して得た。非放射活性リボプローブは、紫色の沈殿として明視野にて可視化し、放射活性プローブは銀粒子分布により暗視野下で可視化した。
【０５０９】
ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＧＰＲ５０およびＮＰＹの発現を図示する代表的な顕微鏡写真画像を図６Ａに提示する。ＧＰＲ５０のみを発現しているニューロン（白くさび形）、ＮＰＹのみを発現しているニューロン（黒くさび形）、ならびにＧＰＲ５０およびＮＰＹを同時発現しているニューロン（矢印）の存在に注目のこと。
【０５１０】
ＧＰＲ５０を同時発現しているラットＤＭＨｃ中のＮＰＹニューロン（「二重ＧＰＲ５０／ＮＰＹ」）のパーセンテージは、図６Ｂに示されるように、２匹のラットの各々からの組織切片の分析によって見積もった。各ラットについて、分析は、位置１における２つの連続区域ａおよびｂ上で、ならびに位置２における２つの連続区域ａおよびｂ上で実行し、位置１および位置２は、１２０ミクロン離れていた。ＧＰＲ５０を同時発現しているＮＰＹニューロンのパーセンテージは、個々のスライドについてのパーセンテージの平均±ＳＥＭとして取られ、図６Ｂに示すように、５４．３±２．８であると決定した。
【０５１１】
実施例１８：ＧＰＲ５０調節因子（例えば、逆作用薬または拮抗薬）活性のための酵母レポーターアッセイ
酵母細胞ベースのレポーターアッセイは、文献において以前に記載されてきた（例えば、Ｍｉｒｅｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：６８８１−６８８７；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９９９）９：２４１３−２４１８；Ｋｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１２１−１２３；ＷＯ  ９９／１４３４４；ＷＯ  ００／１２７０４；および米国特許第６，１００，０４２号を参照のこと）。手短に述べると、酵母細胞は、内因性酵母Ｇα（ＧＰＡ１）が欠失され、複数の技術を使用して構築されたＧタンパク質キメラで置き換えされるように操作されてきた。加えて、内因性酵母α−細胞ＧＰＣＲであるＳｔｅ３は、選択した哺乳動物ＧＰＣＲの相同的発現を可能にするように欠失されてきた。酵母において、真核生物細胞において保存されているフェロモンシグナル伝達経路（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ回路）の成分は、Ｆｕｓ１の発現を駆動する。Ｆｕｓ１プロモーター（Ｆｕｓ１ｐ）の制御下にβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）を配置することによって、系が開発され、それによって、受容体活性化は酵素的読み出しに導く。
【０５１２】
酵母細胞は、Ａｇａｔｅｐらによって記載された酢酸リチウム法（Ａｇａｔｅｐら、１９９８，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（ＬｉＡｃ／ｓｓ−ＤＮＡ／ＰＥＧ）ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｔｉｐｓ  Ｏｎｌｉｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）の適用によって形質転換する。手短に述べると、酵母細胞は、酵母トリプトンプレート（ＹＴ）で一晩増殖させる。キャリア一本鎖ＤＮＡ（１０μｇ）、各々２μｇの２種のＦｕｓｌｐ−ＬａｃＺレポータープラスミド（１つはＵＲＡ選択マーカーを有し、１つはＴＲＰを有する）、ヒト酵母発現ベクター中の２μｇのＧＰＲ５０（例えば、ヒト受容体）（２μｇ複製起点）および酢酸リチウム／ポリエチレングリコール／ＴＥ緩衝液をエッペンドルフチューブにピペッティングする。受容体／受容体なし対照を含む酵母発現プラスミドはＬＥＵマーカーを有する。酵母細胞をこの混合物に接種し、反応を３０℃で６０分間進行させる。次いで、酵母細胞に、４２℃で１５分間、熱ショックを与える。次いで、細胞を洗浄し、選択プレート上に広げる。選択プレートは、合成的に規定された酵母培地マイナスＬＥＵ、ＵＲＡ、およびＴＲＰ（ＳＤ−ＬＵＴ）である。３０℃で２〜３日間インキュベートした後、次いで、選択プレート上で増殖するコロニーを、ＬａｃＺアッセイで試験する。
【０５１３】
β−ガラクトシダーゼについての蛍光分析的酵素アッセイを実施するために、対象のＧＰＲ５０レポーターを有する酵母細胞は、飽和しない濃度まで、液体ＳＤ−ＬＵＴ細胞中で一晩増殖させる（すなわち、細胞はまだ分裂しており、まだ定常期に達していない）。細胞は新鮮な培地中で最適なアッセイ濃度まで希釈し、９０μＬの酵母細胞を、９６ウェルの黒色ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に加える。ＤＭＳＯに溶解し、１０％ＤＭＳＯ溶液中で１０×濃度まで希釈した試験化合物をプレートに加え、このプレートを４時間、３０℃に配置する。４時間後、β−ガラクトシダーゼの基質を各ウェルに加える。これらの実験において、フルオレセインを遊離する酵素のための基質であり、蛍光分析的な読み出しを可能にする、フルオレセイン  ジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（ＦＤＧ）を使用する。ウェルあたり２０μＬの５００μＭ  ＦＤＧ／２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を加える（界面活性剤は、細胞を透過性にするために必要である）。基質との細胞の６０分間のインキュベーション後、ウェルあたり２０μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて、反応を終結させ、蛍光シグナルを増強する。次いで、プレートを、４８５／５３５ｎｍにて蛍光光度計で読み取る。
【０５１４】
空のベクターで形質転換した酵母細胞における蛍光シグナルの減少を超えた、ＧＰＲ５０形質転換酵母細胞における蛍光シグナルの減少は、試験化合物が、ＧＰＲ５０受容体機能を阻害する化合物（例えば、ＧＰＲ５０の逆作用薬または拮抗薬である化合物）であることを示す。特定の実施形態において、本発明の化合物は、バックグラウンドシグナル（ビヒクル単独の存在下で得られるシグナル）よりも下である、蛍光シグナルの減少を与える。
【０５１５】
空のベクターで形質転換した酵母細胞における蛍光シグナルの増加を超えた、ＧＰＲ５０形質転換酵母細胞における蛍光シグナルの増加は、試験化合物が、ＧＰＲ５０受容体機能を刺激する化合物（例えば、ＧＰＲ５０の作用薬または部分作用薬である化合物）であることを示す。特定の実施形態において、本発明の化合物は、バックグラウンドシグナル（ビヒクル単独の存在下で得られるシグナル）よりも上である、蛍光シグナルの増加を与える。
【０５１６】
実施例１９
受容体結合アッセイ
試験化合物は、本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドであることが知られている化合物と、受容体との間の複合体の形成を減少するその能力について評価することができる。特定の実施形態において、既知のリガンドは放射性標識されている。放射性標識された既知のリガンドは、化合物を同定／評価するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。一般論として、新規に合成されたか、または同定された化合物（すなわち、試験化合物）は、放射性標識された既知のリガンドと受容体との間の複合体の形成を減少するその能力によって、放射性標識された既知のリガンドの受容体への結合を減少するその能力について評価することができる。
【０５１７】
他の態様において、試験化合物は放射性標識することができ、そして、対象のＧＰＣＲを含む細胞に、または対象のＧＰＣＲを含む膜に結合するその能力を評価することによって、本発明の対象のＧＰＣＲのリガンドであることを示すことができる。
【０５１８】
放射性標識された既知のリガンドの試験化合物の非存在下での特異的結合のレベルよりも少ない、放射性標識された既知のリガンドの試験化合物の存在下での特異的結合のレベルは、試験化合物の非存在下よりも、試験化合物の存在下で、上記放射性標識された既知のリガンドと、上記受容体との間でより少ない複合体が形成されることを示す。
【０５１９】
本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドであることが知られている化合物と、受容体との間の複合体を検出するためのアッセイプロトコール
Ａ．受容体の調製
２９３細胞を、６０μＬリポフェクタミン（１５ｃｍディッシュあたり）を使用して、本発明のＧタンパク質共役受容体をコードするポリヌクレオチドを含む１０μｇ発現ベクターで一過性にトランスフェクトする。一過性にトランスフェクトされた細胞は、培地を交換しながら、ディッシュ中で２４時間増殖させ（７５％コンフルエンシー）、１０ｍＬ／ディッシュのＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いて取り出す。次いで、細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ遠心分離機で１７，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離する（ＪＡ−２５．５０ローター）。続いて、ペレットを２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋ＩｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｍＬ  Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化し、そして再度遠心分離する。上清を除去した後、ペレットは、結合アッセイにおいて使用するまで、−８０℃で保存する。アッセイで使用する場合、膜は氷上で２０分間融解し、次いで１０ｍＬのインキュベーション緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を加える。次いで、膜をボルテックスして、粗膜ペレットを再懸濁し、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ＰＴ−３１００  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いて、６の設定で１５秒間均質化する。膜タンパク質の濃度は、ＢＲＬ  Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定する。
【０５２０】
Ｂ．結合アッセイ
全体の結合について、総量５０μＬの適切に希釈した膜（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むアッセイ緩衝液中で希釈；５〜５０μｇタンパク質）を９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに加え、続いて、１００μＬのアッセイ緩衝液および５０μＬの放射性標識された既知のリガンドの添加を行う。非特異的結合のために、５０μＬのアッセイ緩衝液を１００μＬの代わりに加え、放射性標識されていない１０μＭの上記既知のリガンドをさらに５０μＬ加え、その後上記放射性標識された５０μＬの既知のリガンドを加える。次いで、プレートを室温で６０〜１２０分間、室温でインキュベートする。結合反応は、Ｂｒａｎｄｅｌｌ  ９６−ウェルプレートハーベスターを用いて、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＧＦ／Ｃ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ濾過プレートを通してアッセイプレートを濾過すること、続いて、０．９％  ＮａＣｌを含む冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄することによって終結させる。次いで、濾過プレートの底を密封し、５０μＬのＯｐｔｉｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを各ウェルに加え、プレートの上端を密封し、そしてプレートをＴｒｉｌｕｘ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数する。上記放射性標識した既知のリガンドと、上記受容体の間の複合体が、試験化合物の存在下で、より少なく形成するか否かを決定するために、１００μＬのアッセイ緩衝液を加える代わりに、１００μＬの適切に希釈した上記試験化合物を適切なウェルに加え、続いて、５０μＬの上記放射性標識された既知のリガンドの添加を行った。
【０５２１】
実施例２０
ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＧＰＲ５０の発現に対する食物制限の効果の分析
ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＧＰＲ５０の発現に対する食物制限の効果は、インサイチュハイブリダイゼーションによって決定した。食欲促進分子であるニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）の発現に対する食物制限の効果もまた、決定した。ＤＭＨｃの組織切片は、本質的に、実施例１７において前出に記載されているように、３３Ｐ放射性標識されたアンチセンスプローブを使用して実行されたインサイチュハイブリダイゼーションと同様に、調製した。
【０５２２】
２０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、各７匹の２つのグループに分け、１匹ずつケージに収容した。１つのグループ、自由に食物がとれるグループには、１２日間の期間にわたり各日、未制限の量の食物（Ｔｅｋｌａｂ  ８６０４、４．４％脂肪）を供給した。第２のグループ、食物制限グループには、同じ１２日間の期間にわたり各日、１６ｇの同じ食物（自由な条件下でのラットの１日の平均食物摂取の７０％）を供給した。食物は朝に供給した。以前の２４時間の期間の間のラットの食物摂取の量もまた、朝に決定した。ラットの体重もまた朝に決定した。自由に食物を与えたラット、および食物制限したラットでの食物摂取は、図７Ａの上のパネルに示す。ラットのもともとの体重のパーセンテージ（すなわち、実験開始時、０日目におけるラットの体重のパーセンテージとして表現されるラットの体重）は、図７Ａの下のパネルに示す。図７Ａの精査から、食物制限は、食物制限したラットにおける体重減少として証明されることが明らかである。
【０５２３】
１２日間の期間の最後に、ラットを屠殺した。ＤＭＨｃの組織切片を調製し、３３Ｐ放射性標識したＧＰＲ５０アンチセンスプローブまたは３３Ｐ放射性標識したＮＰＹアンチセンスプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションに供した。センスプローブは、特異性対照として使用した。結合した放射性プローブは、銀粒子分布によって暗視野下で可視化した。自由に食物を与えたグループの２匹の異なるラット、および食物制限したグループの２匹の異なるラットからの代表的な顕微鏡写真画像を、ＧＰＲ５０について、図７Ｂに示す。図７Ｂの精査から、食物制限は、ＤＭＨｃにおけるＧＰＲ５０発現の顕著なアップレギュレーションに導くことが明らかである。
【０５２４】
インサイチュハイブリダイゼーションによって証明されるように、自由に食物を与えたグループおよび食物制限したグループのついてのＤＭＨｃにおけるＧＰＲ５０  ｍＲＮＡ発現の相対レベルは、オートラジオグラムの光学密度のＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅバージョン１．６３分析を使用して決定し、結果は、図７Ｃの下のパネルに提示する。ＤＭＨｃにおけるＮＰＹ  ｍＲＮＡ発現の相対レベルは、自由に食物を与えたグループおよび食物制限したグループについて同様に決定し、結果は図７Ｃの上のパネルに提示する。図７Ｃの精査から、食物制限は、ＤＭＨｃにおけるＧＰＲ５０発現の顕著なアップレギュレーションに導いたこと、およびこのアップレギュレートされたＧＰＲ５０発現は、ＤＭＨｃにおいて、ＮＰＹのアップレギュレートされた発現と関連したことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０５２５】
【図１】例示目的で、かつ限定目的ではなく、図１は、ＧＰＲ５０とは無関係な、内因性で構成的に活性なＧｓ共役ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築物である、「標的受容体」に対する候補化合物の一次スクリーニングからの結果を示す。「化合物Ａ」についての結果はウェルＡ２に提供される。「化合物Ｂ」についての結果はウェルＧ９に提供される（実施例６を参照のこと）。
【図２】ＧＰＲ５０は細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させるための検出可能な構成的活性を示す（実施例１１を参照のこと）。
【図３Ａ】ＧＰＲ５０ノックアウト（欠損）マウスの樹立。Ａ．ＧＰＲ５０ノックアウトマウスを生成するための遺伝子標的化ストラテジー。
【図３Ｂ】ＧＰＲ５０ノックアウト（欠損）マウスの樹立。Ｂ．ＧＰＲ５０ノックアウトマウス（上のパネル）および野生型マウス（下のパネル）のゲノムＰＣＲによる遺伝子型決定（実施例１２を参照のこと）。
【図４Ａ】高脂肪食での野生型マウスと比較した、高脂肪食または固形飼料でのＧＰＲ５０ノックアウトマウスの体重（実施例１３を参照のこと）。
【図４Ｂ】高脂肪食での野生型マウスと比較した、高脂肪食または固形飼料でのＧＰＲ５０ノックアウトマウスの体重（実施例１３を参照のこと）。
【図５Ａ】高脂肪食でのＧＰＲ５０ノックアウトマウスおよび野生型マウスの体重の比較（実施例１３を参照のこと）。
【図５Ｂ】高脂肪食でのＧＰＲ５０ノックアウトマウスおよび野生型マウスの体重の比較（実施例１３を参照のこと）。
【図６Ａ】ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＮＰＹニューロンによるＧＰＲ５０の同時発現の分析。Ａ．ラットＤＭＨｃにおけるＧＰＲ５０およびＮＰＹの発現を図示する代表的な顕微鏡写真像。
【図６Ｂ】ラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＮＰＹニューロンによるＧＰＲ５０の同時発現の分析。Ｂ．ＧＰＲ５０を同時発現するラットＤＭＨｃにおけるＮＰＹニューロンのパーセンテージ（実施例１７を参照のこと）。
【図７Ａ】Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＧＰＲ５０発現に対する食事制限の効果。Ａ．上のパネル、自由に食事を摂取したラットおよび食事制限したラットでの食物の取り込み。下のパネル、自由に食事を摂取したラットおよび食事制限したラットでのもともとの体重。
【図７Ｂ】Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＧＰＲ５０発現に対する食事制限の効果。Ｂ．自由に食事を摂取したラットおよび食事制限したラットでの、ＤＭＨｃにおけるＧＰＲ５０の発現を図示する代表的な顕微鏡写真像。
【図７Ｃ】Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの視床下部背内側核（ＤＭＨｃ）の中心部分におけるＧＰＲ５０発現に対する食事制限の効果。Ｃ．自由に食事を摂取したラットおよび食事制限したラットでの、ＮＰＹ  ｍＲＮＡ（上のパネル）およびＧＰＲ５０  ｍＲＮＡ（下のパネル）の相対的レベル（実施例２０を参照のこと）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2009519007.tif 000017
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009519007.tif 000022
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