(57)【要約】本発明は、Ｆｏｘｐ３とＰＴＤ（protein transduction domain）とのコンジュゲートを含有する、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を阻害する新規な薬剤組成物及びその伝達方法に関する。本発明によれば、Ｆｏｘｐ３−ＰＴＤはマウスの自己免疫疾患モデルでＴ細胞の活性化を効果的に阻害することにより自己免疫疾患を治療及び抑制する。
2009542631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を治療するための、薬剤学的有効量のＦｏｘｐ３−ＰＴＤコンジュゲートを含有する薬剤学的組成物。
【請求項２】
ＰＴＤが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９で構成された群から選ばれた一つ以上のペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
ＰＴＤが、５乃至３０個のアミノ酸で構成され、構成アミノ酸のうち３０％以上がアルギニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
自己免疫疾患は、クローン病（Crohn disease）、リウマチ関節炎（rheumatoid arthritis）、骨関節炎（osteoarthritis）、反応性関節炎（reactive arthritis）、乾癬性関節炎（psoriatic arthritis）、枯草熱（hay fever）、アトピー（atopy）、多発性硬化症（multiple sclerosis）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、サルコイドーシス（sarcoidosis）、インシュリン依存型糖尿病（insulin dependent diabetes mellitus）、自己免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis）、強直性脊椎炎（ankylosing spondylitis）、または硬皮症（scleroderma）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
自己免疫疾患は、クローン病（Crohn disease）、リウマチ関節炎（rheumatoid arthritis）、骨関節炎（osteoarthritis）、反応性関節炎（reactive arthritis）、乾癬性関節炎（psoriatic arthritis）、枯草熱（hay fever）、アトピー（atopy）、多発性硬化症（multiple sclerosis）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、サルコイドーシス（sarcoidosis）、インシュリン依存型糖尿病（insulin dependent diabetes mellitus）、自己免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis）、強直性脊椎炎（ankylosing spondylitis）、または硬皮症（scleroderma）であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
アレルギー性疾患は、喘息（Asthma）、接触性皮膚炎（contact dermatitis）、アレルギー性鼻炎（allergic rhinitis）、アレルギー性気管支炎（allergic bronchitis）、結節性紅斑（erythema nodosum）、またはアレルギー性結膜炎（allergic conjunctivitis）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
アレルギー性疾患は、喘息（Asthma）、接触性皮膚炎（contact dermatitis）、アレルギー性鼻炎（allergic rhinitis）、アレルギー性気管支炎（allergic bronchitis）、結節性紅斑（erythema nodosum）、またはアレルギー性結膜炎（allergic conjunctivitis）であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下内注射、結膜内注射、経皮デリバリーまたは気道吸入により体内に投与されることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
Ｆｏｘｐ３−ＰＴＤコンジュゲートで構成された組換え蛋白質で処理することで免疫抑制活性を有するＴ細胞。
【請求項１０】
Ｆｏｘｐ３−ＰＴＤコンジュゲートで構成された組換え蛋白質で処理することで免疫抑制活性を有するＴ細胞を製造する方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を治療するための、薬剤学的有効量の請求項９のＴ細胞を含有する薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、Ｆｏｘｐ３とＰＴＤ（protein transduction domain）とのコンジュゲートを含有する、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を阻害する新規な薬剤組成物及びその伝達方法に関するものである。
［背景技術］
Ｆｏｘｐ３は、胸腺（thymus）から由来する調節子Ｔ細胞（Regulatory T cell）に主に存在し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋標識抗原を持った細胞に存在する転写調節因子（transcriptional factor）であって、その機能は、Ｆｏｘｐ３を発現するＴ細胞に対する抗原認知時に抗原に対して低反応性を持つと同時に、胸腺から分化されてきたＦｏｘｐ３を発現しないＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のうち潜在的に自己免疫症を誘発できるＴ細胞らに対してＩＬ−２の生成と細胞分裂現象を抑制する抑制子Ｔ細胞（suppressor T cell）としての役割を持っている。また、Ｆｏｘｐ３は、Ｆｏｘｐ３を発現する調節子Ｔ細胞、及びこれとの細胞−細胞間接触（cell−cell contact）を通して、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＩＬ−２だけでなく、転写因子であるＮＦＡＴの影響を受けるＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマなどの転写調節を抑制する機能を行使することが明らかになっている。
【０００２】
このようなＦｏｘｐ３を発現しているＴ細胞を人為的に製作しまたこれを臨床的に応用するために、レトロウイルスを利用したマウスＦｏｘｐ３過発現Ｔ細胞をマウスの自己免疫疾患モデルであるＥＡＥ（Experimental Autoimmune Encephlaomyelitis）、ＩＢＤ（Inflammatory bowel disease）、ＮＯＤ（Non−Obese Diabetic）マウスを用いた第１型糖尿病モデル、そして臓器移植における臓器移植拒否反応に至るまで多様に適用して成功したことがあり、ヒトに存在するＦｏｘｐ３を発現するＣＤ４Ｔ細胞の自己抗原特異的Ｔ細胞（self-antigen specific T cell clone）に対して、高濃度のＩＬ−２サイトカイン処理、及び抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体との組合処理を施すことにより、その数を増加させて細胞治療方法に応用しようとする試みがあった。
【０００３】
Ｆｏｘｐ３は、胸腺から分化されてくる調節子Ｔ細胞の現在まで知られているＬｉｎ（lineage marker）としては最も正確なものと知られていて、Ｆｏｘｐ３に存在するＤＮＡ結合部位に発生したアミノ酸の突然変異及びＦｏｘｐ３のロイシンジッパー（leucine zipper）ドメインの突然変異は、ヒトにおいてＩＰＥＸ（Immune pathology/Polyendocrinopathy/Enteropathy/X-linked）シンドロームを引き起こし、特に湿疹（eczema）［皮膚炎（dermatitis）］及び第１型糖尿病を６〜９才の子供に引き起こしたり、２才以前に関連した遺伝的自己免疫疾患による死亡を引き起こしたりすることが知られている。また、ＩＰＥＸ患者の７０％がこのようなＦｏｘｐ３の突然変異により発生することと知られている。
【０００４】
一方、生体外で（in vitro）細胞内に巨大分子を伝達する方法には、電気衝撃（electroporation）、リポソーム（liposome）を用いた膜融合、表面にＤＮＡがコーティングされた微細投射体を用いた高濃度投射法、カルシウム−リン−ＤＮＡ沈殿体を用いた培養法、ＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション（transfection）、変形されたウイルス核酸を用いた感染、単一細胞に直接微細注入する方法などがある。また最近は、ナノ粒子（nano particle）を用いて巨大分子を、生体内外で細胞内に伝達しようとする試みがなされているが、技術的側面及び臨床的効果面でまだ初期段階にある。また、これら方法は、典型的に巨大分子を導入させようとする全体細胞のうちただの一部にしか伝達できず、これを細胞内に伝達する時間及び効率がまだ臨床的に適用可能な段階には達していない。また、目的細胞でない他の多数の細胞に望ましくない影響を与える恐れがある。
【０００５】
したがって、生体内外で細胞を損傷させずに生理活性をもった巨大分子を効果的に伝達する一般的な方法が要求された［参考文献：L.A. Sternson，Ann．N．Y．Acad．Sci., 57, 19-21(1987)］。かかる例として、脂質ペプチドの化学的な追加［参考文献：P．Hoffmann et al．Immunobiol., 177, 158-170(1988)］またはポリリシンやポリアルギニンのような塩基性重合体を使用する方法［参考文献：W-C. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1872-1876(1978)］などが提供されたことがあるが、これら方法はまだ検証されていない。輸送体として使われる葉酸［参考文献：C. P. Leamon and Low, Proc. Natl. Acd. Sci., USA, 88, 5572-5576(1991)］は、葉酸−塩結合体として細胞内に移動するという事実が報告されたが、細胞質中にまで伝えられるかはまだ確認されたことがない。また、シュードモナス外毒素（Pseudomonas Exotoxin）も輸送体の一種として使われている［参考文献：T. I. Prior et al., Cell, 64，1017-1023(1991)］。しかし、このシステムにおいても、生物学的に活性化した目的する物質の細胞内への移動に関する効果と、基礎医学的及び臨床的適用の可能性については明確でない。したがって、生きている細胞の細胞質や核内へ生物学的に活性化した物質をより安全且つ効果的に伝達できる方法が継続的に要求されている。
【０００６】
また、蛋白質のような巨大分子だけでなく、生体内部（in vivo）または外部（in vitro）で細胞内へのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ伝達も、生命工学の基礎研究分野及び医薬学的応用分野で非常に重要な必須技術と見なされている。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの細胞内への伝達は、遺伝子治療、遺伝子が生体内部または外部で生成する蛋白質の機能を明らかにする基礎研究、及びそれらを利用した新しい治療剤の開発に決定的な役割を果たしている。しかし、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡも細胞膜を効果的に通過できないため、このような問題の解決は、遺伝子を利用した基礎研究及び臨床研究において成し遂げられなければならない最も大きな課題の一つである。
【０００７】
よって、生体内部（in vivo）または外部（in vitro）でＤＮＡ及び／又はＲＮＡの細胞内伝達のためにリポソーム、ナノ粒子及びウイルスベクターなどが開発されてその利用可能性が研究されたが、これらの効能及び副作用の面で改善しなければならない部分が多く存在しているのが実情である。特に、リポソームを利用した場合、細胞に対する副作用及び細胞毒性（cytotoxicity）の問題が深刻であるため細胞株を用いた基礎研究に局限されており、ナノ粒子の場合、最近大きな関心を集めているが、生体内での運搬粒子（carrier particle）の分解、伝達効能及びそれらに対する生体内での免疫反応についてより多くの研究が必要であるのが実情である。現在基礎研究及び臨床的効能面で重要なレトロウイルスベクターを利用する場合、高い力価のウイルス粒子を作り出すことに限界があって、分裂しない細胞には感染しないという短所が台頭しており、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus）を利用する場合も臨床的な利用が非常に制約されることが知られている。また、これら２つのウイルスベクターの場合、残存しているウイルス蛋白質に対する生体内での免疫反応が誘導されるため治療効果面で多くの疑問点が提示されている。したがって、生体内部または外部でＤＮＡ及び／又はＲＮＡを細胞内へ伝達するに当ってより効果的で副作用の少ない新しい細胞内伝達方法が要求され続けている。
【０００８】
一方、生体の多くの生理的現象を調節する医薬学的用途の蛋白質らは、大腸菌（E.coli）等のバクテリアで生産される組換え蛋白質の形態に製作されて最近まで多様な疾病の治療に使われている。しかし、バクテリアで生産された医薬学的用途の蛋白質らは、生体内の細胞内で生産される自然状態の蛋白質と比較してその実質的な構造及び機能が非常に非効率的であるため、これら蛋白質を酵母（yeast）、昆虫細胞または動物細胞で生産したり、バクテリアで生産された組換え蛋白質をリフォールディング（refolding）して使用したり、トランスジェニック動物（transgenic animal）を利用して生産しようとする研究が着実に行われてきた。しかし、このような新しい試みは、多くの分子細胞生物学的中間段階を要し、収率が非常に低く、生産費用面での経済性などが問題点として提起されている。したがって、バクテリアで生産された組換え医薬学蛋白質を自然状態の機能及び構造をもった蛋白質に経済的且つ容易に変換させることは、疾患の診断、治療及び予防のための新しい蛋白質薬物の開発に決定的な役割を果たすことと考えられる。
【０００９】
このような幾つかの重要な基礎研究及び臨床的要求に対する研究の結果として提示されたものが、ＰＴＤ（Protein Transduction Domain）である。このうち最も多くの研究がなされたのは、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1）の転写因子であるＴａｔ蛋白質であって［参考文献：Schwarze SR et al，3:285(5433):1569-1572，1999 Science］、この蛋白質は細胞膜を通過するに当たって、８６個のアミノ酸で構成された完全な形態の場合よりも、正電荷を持つアミノ酸らが集中的に分布している４７番目から５７番目のアミノ酸（YGRKKRRQRRR）で構成された形態の場合の方がより一層効果的であることが明らかになった［参考文献：Fawell S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994)］。このように、ＰＴＤとしての効果が確認された他の例には、ＨＳＶ−１（Herpes Simplex Virus type１）のＶＰ２２蛋白質の２６７番目から３００番目までのアミノ酸［参考文献：Elliott G. et al. Cell, 88, 223-233(1997)］、及びショウジョウバエ（Drosophila）のＡＮＴＰ（Antennapedia）蛋白質の３３９番目から３５５番目までのアミノ酸［参考文献：Schwarze S. R. et al. Trends Pharmacol Sci. 21, 45-48(2000)］などがある。これらＰＴＤのアミノ酸の配列を比較すると、リシンとアルギニンを多く含んでおり、特にアルギニンが細胞内物質伝達に重要なものと考えられた。このような事実は、電気的に陽性であるアミノ酸らを羅列した人為的なペプチドの場合も物質伝達効果が確認されることによって証明された［参考文献：Laus R. et al. Nature Biotechnol. 18, 1269-1272(2000)］。
【００１０】
上述された既存のＰＴＤとは異なる性格を持つ新しいＰＴＤであるＭＴＳが合成、製作され［参考文献：DaeWoong Jo et al., Nat. Biotech. Vol. 19, 2001］、これらのアミノ酸の配列はＦＧＦ（Fibroblast Growth Factor）のシグナルペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成された。
【００１１】
本発明者達は、以前の研究にてラット（rat）の蛋白質転写因子からＨｐｈ−１−ＢＴＭ（配列番号：１）を、ヒトの転写因子からＳｉｍ−２−ＢＴＭ（配列番号：２）を発見し、特にＨｐｈ−１−ＰＴＤの場合、ヒトの蛋白質であるＨｐｈ−１を含んだ２０個余りのヒト蛋白質でこれらアミノ酸配列が１００％保存されたことを発見した。また本発明者達は、Ｔ細胞の活性化を阻害する膜蛋白質であるＣＴＬＡ−４の細胞質部分とＨｐｈ−１−ＰＴＤとが融合された新しい蛋白質新薬を製作し、この融合蛋白質がＴ細胞の活性化を効果的に阻害し、気道を通して伝達した時に、炎症性免疫疾患である喘息を非常に効果的に治療することを明らかにした［参考文献：Choi JM, et al, 2006, Nat Med, May;12(5):574-579］。
【００１２】
このようなＰＴＤを利用した巨大分子の細胞内伝達作用メカニズムとしては、細胞表面の細胞膜を破壊して細胞内に伝達するという仮説と、ＰＴＤが細胞膜の一部を利用して細胞内に新しい小胞（vesicle）を形成することで、細胞外部に存在する巨大分子を移動させ、細胞内で放出するという仮説の２つが存在する。また、巨大分子の細胞内伝達を可能にするＰＴＤは、小さなサイズのペプチドや自体内の構造的特性を持っていることから細胞膜に新しいチャンネルを形成できるという仮説も提示されている［参考文献：Becker-Hapak M, et al, 2001, Methods, Jul:24(3):247-256］。
［発明の開示］
本発明の目的は、Ｆｏｘｐ３とＰＴＤとのコンジュゲートを含有する新規な薬剤組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、上記新規な薬剤組成物を使用して自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を効果的に阻害する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明者達は、Ｆｏｘｐ３蛋白質の効率的な細胞内伝達のために、Ｍｐｈ−１−ＰＴＤとＦｏｘｐ３とのコンジュゲートを製造し、これを含有する新規な薬剤組成物が、Ｔ細胞の活性化を効果的に阻害し、炎症性免疫疾患である喘息とリウマチ関節炎の動物モデルにおいて優れた疾患治療効果があることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
本発明によるＦｏｘｐ３とＰＴＤとのコンジュゲートを含有する薬剤組成物は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患の発病を効果的に阻害できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のｐＲＳＥＴ−Ｂ−Ｈ２ＦＸ３のベクター構造を示すものであって、ｐＲＳＥＴ−ＢベクターにＨｐｈ−１とＦｏｘｐ３をコーディングするＤＮＡが挿入されている。
【図２】本発明のＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３（Ｈｐｈ−１−Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３）の蛋白質の精製を示す写真で、溶出緩衝液（Elution buffer）で最終精製しクマシーブルー染色法によって蛋白質が発現されてきたことを確認したものである。
【図３】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の細胞内伝達結果を示すもので、各濃度別にＦｏｘｐ３蛋白質を細胞に処理してＦｏｘｐ３蛋白質が濃度に比例して細胞内に入っていくのを確認した図面である。
【図４】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の阻害性転写因子としての効果を示すもので、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３蛋白質の濃度が増加するに従って、細胞内に以前にトランスフェクションして発現させたルシフェラーゼの活性が減少したことを確認した図面である。
【図５】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３のＩＬ−２発現阻害効果を示すもので、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の濃度が増加するに従ってＩＬ−２の発現量が減少したことをＥＬＩＳＡ方法で確認した図面である。
【図６】Ｔａｔ−Ｆｏｘｐ３のＩＬ−２発現阻害効果を示すもので、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の濃度が増加するに従ってＩＬ−２の発現量が減少したことをＥＬＩＳＡ方法で確認した図面である。
【図７】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞分裂阻害効果を示すもので、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を処理し、濃度に従って細胞分裂の阻害程度が大きくなることを確認した図面である。
【図８】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の炎症抑制効果を示すもので、気管支肺胞洗滌液（BAL fluid）におけるリンパ球の数を表したグラフである。
【図９】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の炎症抑制効果を示すもので、Ｐｅｎｈ値で測定された気道抵抗性を示す図面である。
【図１０】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３のリウマチ関節炎が誘発された動物における治療効果を示すもので、臨床スコア（clinical score）を示す図面である。
【図１１】Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３のリウマチ関節炎が誘発された動物における治療効果を示すもので、病理学的発見（pathological finding）を示す図面である。
【図１２】ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を形質導入した細胞の接触阻止（contact inhibition）効果を示すもので、ＭＡＣＳを用いたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の分離を示す図面である。
【図１３】ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を形質導入した細胞の接触阻止（contact inhibition）効果を示すもので、リウマチ関節炎が誘発された動物における、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３が形質導入された細胞による臨床スコア減少効果を示す図面である。
【図１４】ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を形質導入した細胞の接触阻止（contact inhibition）効果を示すもので、リウマチ関節炎が誘発された動物における、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３が形質導入された細胞による炎症媒介サイトカインの抑制効果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明はペプチドであるＰＴＤ（protein transduction domain）とＦｏｘｐ３とのコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートは、ＰＴＤをコーディングしているヌクレオチド配列とＦｏｘｐ３の遺伝子とをクローニングで融合して製造できる。
【００１８】
本発明によるＦｏｘｐ３は、ＰＴＤの細胞内浸透及び伝達効果により容易に細胞膜を通過して病巣部位の細胞内に伝えられる。その結果、分離されたＰＴＤ−Ｆｏｘｐ３融合蛋白質は疾病の抑制、治療及び阻害効果を表す。本発明で使われたＰＴＤは、蛋白質、ペプチド及び化学化合物などを皮膚、眼球または気道を通して体内に伝達する特性に非常に優れているため、薬物とのコンジュゲートとして提供される場合、多様な投与経路を通してこれを体内局所部位に伝達できることを証明した。
本発明においてＰＴＤは、本発明者達が開発して特許出願したもので、下記配列番号：１及び配列番号：２のペプチドを固相合成法により製作したものを利用したが、目的する伝達部位及び使用するリンカーによって他の種類のＰＴＤが利用され得るのはもちろんである。ＰＴＤは、３乃至３０個のアミノ酸で構成されアミノ酸のうち少なくとも３０％以上はアルギニンであることが望ましい。
【００１９】
Ｈｐｈ−１−ＢＴＭ：
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg（配列番号：１）;
Ｓｉｍ−２−ＢＴＭ：
Ala Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Arg（配列番号：２）;
ＨＩＶ−１ ＴＡＴ：
YGRKKRRQRRR（配列番号：３）;
ＡＮＴＰ：
RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号：４）; 
Ｖｐ２２：
DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE（配列番号：５）;
Ｒ７：
RRRRRRR（配列番号：６）;
ＭＴＳ：
AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP（配列番号：７）;
Ｐｅｐ−１：
KETWWETWWTEWSQPKKKRKV（配列番号：８）;及び
Ｐｅｐ−２
KETWFETWFTEWSQPKKKRKV（配列番号：９）
本発明によるＦｏｘｐ３とＰＴＤとのコンジュゲートを含有する薬剤学的組成物は、クローン病（Crohn disease）、リウマチ関節炎（rheumatoid arthritis）、骨関節炎（osteoarthritis）、反応性関節炎（reactive arthritis）、乾癬性関節炎（psoriatic arthritis）、枯草熱（hay fever）、アトピー（atopy）、多発性硬化症（multiple sclerosis）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、サルコイドーシス（sarcoidosis）、インシュリン依存型糖尿病（insulin dependent diabetes mellitus）、自己免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis）、強直性脊椎炎（ankylosing spondylitis）、硬皮症（scleroderma）などの自己免疫疾患；喘息（Asthma）、接触性皮膚炎（contact dermatitis）、アレルギー性鼻炎（allergic rhinitis）、アレルギー性気管支炎（allergic bronchitis）、結節性紅斑（erythema nodosum）、アレルギー性結膜炎（allergic conjunctivitis）などのアレルギー性疾患；及び炎症性疾患を効果的に治療できる。
【００２０】
以下、本発明を下記の実施例に基づいてより一層詳細に説明する。下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明に開示されたあらゆる文献は参照として統合される。
実施例１：Ｆｏｘｐ３を含む発現ベクターの製造
ヒトの転写因子であるＨｐｈ−１（GenBank accession no.：NP 004417.2）のＮ−末端より８５０番目アミノ酸であるチロシンから８６０番目アミノ酸であるアルギニンまでのペプチドをコーディングする塩基配列（5'-TATGCACGTGTTCGGAGGCGTGGACCCCGCCGC-3'）（配列番号：１０）と、Ｆｏｘｐ３（入手所：Shimon Sakaguchi，Kyoto大学，GenBank accession no. NM 054039, 配列番号：１３）をコーディングする塩基配列とを結合させるために、Ｈｐｈ−１のＮ−末端より８５０番目アミノ酸であるチロシンから８６０番目アミノ酸であるアルギニンまでの塩基配列を２回重複して持っているｐＲＳＥＴＢベクター（入手所：Invitrogen，cat.# V351-20）に、クローニングのための制限酵素ＥｃｏＲＩに該当する塩基配列（5'-GAATTC-3'）と、Ｆｏｘｐ３塩基配列の５'末端（5'-CCCAACCCTAGGCCAGCC-3'）（配列番号：１１）と、Ｆｏｘｐ３塩基配列の３'末端に該当する配列（5'-ACGAGGTTAGGGACGGGAACT-3'）（配列番号：１２）と、クローニングのための制限酵素ＨｉｎｄIIIに該当するプライマー（5'-AAGCTT-3'）とを合成し、蛋白質の全体遺伝子が含まれているｐＧＥＸ（Shimon Sakaguchi，Kyoto大学）を鋳型としてｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ重合酵素（Stratagene，cat.# 600252-51）を用いてＰＣＲを遂行した。
【００２１】
ＰＣＲで収得した反応生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIによって切断し、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（QIAGEN, cat. # 28104）を用いて精製した後、ゲル抽出方法で精製したｐＲＳＥＴＢ（入手所：Invitrogen，Cat．No．V351-20）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII位置にクローニングして組換え発現ベクターを製造し、これをｐＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３と命名した。
実施例２：大腸菌形質転換体の製造、並びに融合蛋白質の発現及び精製
実施例１で製造された発現ベクターｐＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｓｔａｒ（入手所：Stratagene）を熱衝撃形質転換法（heat shock transformation）で形質転換させた後、形質転換された大腸菌を４ｍｌのＬＢ培地（入手所：BD Biosciences）に接種し１４時間３７℃で撹拌しながら前培養した。次に、これを再び２５０ｍｌのＬＢ培地［１０００ｍｌ当りカセインのパンクレアティックダイジェスト（casein pancreatic digest）１０ｇ、酵母エキス（yeast extract）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ含有］に接種し３７℃で３時間培養した後、１ｍＭ濃度のＩＰＴＧ（GibcoBRL cat.# 15529-019）を添加して３７℃で４時間培養することで融合蛋白質の発現を誘導した。この培養液を４℃、６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しペレット（pellet）だけ残して上澄液を除去した後、１０ｍｌの緩衝溶液１（100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 6M GuHCl, pH 8.0）でペレットを溶かしてから、氷で、超音波粉砕機（Heat systems, ultrasonic processor XL）を用いて３００Ｗの強度で６秒間超音波を注入し６秒間冷却する過程を、累積超音波注入時間を５分として、ペレットが完全に溶けて溶液の色が透明になるまで繰り返し行った。溶出液を４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して大腸菌の破砕物を除去し、純粋な溶出液だけを分離した。分離された溶出液に０．５ｍｌの５０％Ｎｉ2+−ＮＴＡアガローススラリー（Qiagen, cat# 30230）を入れ常温、２００ｒｐｍで１時間攪拌して融合蛋白質とＮｉ2+−ＮＴＡアガロースとを結合させ、この混合液をクロマトグラフィー用の０．８×４ｃｍコラム（BioRad, cat．# 731-1550）に入れて流した。１０ｍｌの緩衝溶液２（100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 4M GuHCl, pH 6.3）を用いて２度洗浄をした後、１ｍｌの緩衝溶液３（100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 2M GuHCl, pH4.5）で融合蛋白質を分画し、ＰＤ−１０塩除去コラム（Amersham Pharmacia Biotech., cat. # 17-0851-01）で塩を除去した。分離精製されたＰＴＤ−Ｆｏｘｐ３融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施してからクマシーブルー染色法で確認した（図２及び図３）。
実施例３：ＰＴＤ−Ｆｏｘｐ３の阻害性転写因子（repressive transcriptional factor）としての効果
Ｆｏｘｐ３の機能は、Ｆｏｘｐ３内に存在するフォークヘッド（forkhead）ＤＮＡ結合ドメインがゲノム内に存在するフォークヘッド結合部位に結合して遺伝子転写を阻害する役割を果たすことと知られている。フォークヘッド結合部位が３個連続して配列されその後ろにルシフェラーゼ遺伝子がコーディングされたＦＫＨ−ｌｕｃリポーター作製物を、トランスフェクション効率を標準化するためのレニラ（Renilla）ＴＫプラスミド（Promega）と共にトランスフェクションしてから、ＰＴＤ−Ｆｏｘｐ３を２９３細胞に２４時間１００ｎＭで導入させた時に、ルシフェラーゼ活性が阻害された（図４）。
実施例４：Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３のマウスＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株でのＩＬ−２分泌阻害効果
Ｆｏｘｐ３の機能は、Ｔ細胞でＩＬ−２サイトカインの生成を阻害することと知られている。Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３がこのような役割を果たせるのかを調べるために、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３をマウスのＴ細胞株であるＥＬ−４ Ｔ ｃｅｌｌに導入した。マウスのＴ細胞受容体を通しての活性化、及び補助蛋白質ＣＤ２８を通してのＴ細胞活性化を同時に誘導するために、抗−ＣＤ３（eBioscience，Cat No．16-0031）及び抗−ＣＤ２８（eBioscience，Cat No．16-0281）各々１ｍｇ／ｍｌで、底面が扁平な９６ウェルプレート（TPP. Cat No．92096）をコーティングしてからＰＢＳ（Phosphate buffered Saline）で１回洗浄した後、ＰＴＤ−Ｆｏｘｐ３を各々１０ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭで導入してからＰＢＳで３回洗浄した１×１０5のＥＬ−４Ｔ細胞を、予めコーティングされたプレートに入れ、１０％のウシ胎仔血清（FBS）が含まれたＲＰＭＩ−１６４０（Biowhittaker，Cat．No．12-702F）培地を添加した後、２４時間Ｔ細胞に刺激を与え、細胞及び上澄液を遠心分離して、これから上澄液を得た後、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡ（R&D system，Cat No．M2000）を実施した結果を図５に示した。ＥＬ−４Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を濃度別に（0, 100nM, 500nM, 1μM）処理した時、濃度に比例してＩＬ−２の濃度が減少したことが図５の如く確認された。
実施例５：Ｔａｔ−Ｆｏｘｐ３のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株でのＩＬ−２分泌阻害効果
他の種類のＰＴＤでも同じ効果が表れるかを確認するために、最もよく研究用に使われているＨＩＶ由来のＰＴＤであるＴａｔ−ＰＴＤを用いて組換え蛋白質を製造した。発現ベクターの製造工程は実施例１と同一でＨｐｈ−１の代りにＴａｔの遺伝子（配列番号：３）を挿入し、組換え蛋白質の発現及び精製工程は実施例２と同一の方法で行った。Ｔａｔ−Ｆｏｘｐ３のＩＬ−２分泌阻害効果を確認するために、Ｔａｔ−Ｆｏｘｐ３蛋白質を濃度別に０、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ処理し、ＩＬ−２のＥＬＩＳＡ分析は実施例４の方法に従った。図５に示すように、ＰＴＤの種類に関係なくＩＬ−２分泌が抑制されたことが確認された。
実施例６：Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株での細胞分裂阻害効果
Ｆｏｘｐ３の機能は、Ｔ細胞の分裂及び生成を阻害することと知られている。Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３がこのような役割を果たせるのかを調べるために、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３をＪｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌに導入した。Ｔ細胞受容体を通しての活性化、及び補助蛋白質ＣＤ２８を通してのＴ細胞活性化を同時に誘導するために、抗−ＣＤ３（BD Pharmingen, Cat No. 555329）及び抗−ＣＤ２８（BD Pharmingen, Cat No. 555725）各々１ｇ／ｍｌで、底面が扁平な９６ウェルプレート（TPP. Cat No．92096）をコーティングしてからＰＢＳ（Phosphate buffered Saline）で１回洗浄した後、ＨＰＨ−１−Ｆｏｘｐ３を各々１０ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭで導入してからＰＢＳで３回洗浄した１×１０5の細胞を、予めコーティングされたプレートに入れ、１０％のウシ胎仔血清（FBS）が含まれたＲＰＭＩ−１６４０（Biowhittaker, Cat．No．12-702F）培地を添加した後、２４時間Ｔ細胞に刺激を与え、ＣＣＫ−８（Company, Cat．No．CK04）を２０μｌずつ９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した後、細胞培養用途の３７℃のインキュベーターに２時間放置し、４２０ｎｍでＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（Molecular Devices, Cat No．BN02423）により吸光度を測定して得た結果を図７に示した。図７に示すように濃度別にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を処理した時、濃度に比例してＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の細胞分裂程度が減少することが確認できる。
実施例７：ＰＴＤ−Ｆｏｘｐ３のマウスにおける喘息阻害効果
喘息を誘発させるために、６週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（Charles River Technology）の腹腔内に１日目及び１４日目に、水酸化アルミニウム（Sigma, 1330-44-5）２０ｍｇにエマルジョン化させたＯＶＡ（Ovalbumin, Sigma, 9006-59-1）１００μｇずつを注射した。また１５日目、１６日目、１７日目にＯＶＡ１．５ｍｇを注射して喘息を誘発した。喘息が誘発されたマウスにおけるＦｏｘｐ−３の効果を把握するために、本実験ではマウスのＦｏｘｐ−３を利用した新しい組換え蛋白質を製造した。ヒト由来のＦｏｘｐ−３とマウス由来のＦｏｘｐ−３は８３％の適合性を持っているが、試験の正確性を考慮してマウスＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３（マウス、配列番号：１４、Genbank NM054039）を製造した。製造方法は実施例１及び２に基づいて行った。喘息が誘導されたマウスにＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を鼻腔伝達（nasal delivery）を通して１μｇ、１０μｇ、２５μｇずつ週２回総４週間投与し、４週後動物を犠牲にし気管支肺胞洗滌液（BAL fluid）での炎症媒介細胞の個数（図８）及び気道抵抗性（図９）を分析した。
実施例８：リウマチ関節炎モデルにおけるＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の効果
リウマチ関節炎を誘発させるために、ＤＢＡ／１マウス（中央実験動物）に、完全フロイントアジュバント（Sigma，F5881）にエマルジョン化したタイプIIコラーゲン（Sigm
a，C1188）を１００μｇずつ試験開始日及び２週目に皮下注射して免疫化させた。免疫化を始めて４週経過後から、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を週に２回４週間１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇずつ投与し臨床スコア（図１０）及び組織化学染色（図１１）を通してＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３の効果を検証した。
実施例９：Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３が形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を用いた細胞治療効果
Ｆｏｘｐ３を発現する調節子Ｔ細胞は、細胞−細胞間接触（cell-cell contact）を通して、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＩＬ−２だけでなく、転写因子であるＮＦＡＴの影響を受けるＩＬ−４、ＩＦＮ−ｇａｍｍａなどの転写調節を抑制する機能を発揮することが明らかになっている。よって、マウスの脾臓（spleen）から分離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を形質導入し、Ｈｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３が形質導入された細胞を自己免疫疾患が誘導されたマウスに処理することによって、移植された細胞の接触阻止（contact inhibition）を通して治療効果を表すことができる。本発明者達は、まずＤＢＡ／１マウス（入手所：中央実験動物）の脾臓を取り外し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋断離キット（Miltenyi Biotec，130-091-041）を利用してＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec）でＣＤ４＋ＣＤ２５（−）（＋）を分離した（図１２）。このように分離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を１μＭ濃度で処理し、３時間培養した。このように培養した細胞を１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＰＢＳ（phosphate-buffered Saline，137 mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4）で洗浄し、この工程を３回反復した。このように準備された細胞を１ｘ１０4細胞／１００μｇの濃度でＰＢＳに懸濁し、実施例８と同様にリウマチ関節炎が誘導されたマウスに細胞懸濁液１００μｇを尻尾静脈を通して１分間ゆっくり注射した。細胞懸濁液を１回注射し４週間マウスをモニターリングしながら臨床スコアを測定（図１３）し、４週後血液内でＴＮＦ−α、ＩＬ−６を分析（図１４）した。分析の結果、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞にＨｐｈ−１−Ｆｏｘｐ３を形質導入した細胞は、接触抑制を通して免疫抑制細胞治療剤として機能することができることが確認された。
［産業上の利用可能性］
以上、本発明の望ましい実施例を参照して説明したが、本技術分野の熟練した当業者ならば下記の特許請求の範囲上に記載された本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明を様々に修正及び変更可能であることを理解できるであろう。
【００２２】
上記した通り、本発明によるＦｏｘｐ３とＰＴＤとのコンジュゲートを含有する薬剤組成物は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患の発病を効果的に阻害することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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