(57)【要約】  本発明は、コンパクチン生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）遺伝子およびコンパクチンからプラバスタチンへの変換のための遺伝子を含有する微生物を提供する。好適な（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）実施例では、前記コンパクチン生合成遺伝子はｍｌｃＡおよび／またはｍｌｃＢおよび／またはｍｌｃＣおよび／またはｍｌｃＤおよび／またはｍｌｃＥおよび／またはｍｌｃＦおよび／またはｍｌｃＧおよび／またはｍｌｃＨおよび／またはｍｌｃＲであり、そしてコンパクチンからプラバスタチンへの変換のための前記遺伝子はヒドロキシラーゼ遺伝子である。さらに、本発明は、スタチンのような目的の化合物を産生させるための方法を提供する。好適な実施例では、前記スタチンはプラバスタチンである。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパクチン生合成遺伝子およびコンパクチンからプラバスタチンへの変換のための遺伝子を含有する微生物。
【請求項２】
真菌である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来である、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、モナスカス・パクチー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐａｘｉ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）またはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
前記コンパクチン生合成遺伝子は、ｍｌｃＡおよび／またはｍｌｃＢおよび／またはｍｌｃＣおよび／またはｍｌｃＤおよび／またはｍｌｃＥおよび／またはｍｌｃＦおよび／またはｍｌｃＧおよび／またはｍｌｃＨおよび／またはｍｌｃＲである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
前記コンパクチン生合成遺伝子はｍｌｃＲではなく、かつ本来の宿主プロモーターは、遺伝子ｍｌｃＲによってコードされる経路特異的転写調節因子による制御下にはないプロモーターによって置き換えられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
コンパクチンからプラバスタチンへの変換のための前記遺伝子はヒドロキシラーゼ遺伝子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
前記ヒドロキシラーゼ遺伝子はＰ−４５０遺伝子またはその相同体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
前記Ｐ−４５０遺伝子は、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＰ−４５０ｓｃａ−２またはその相同体である、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
フェレドキシン遺伝子をさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
目的の化合物を産生させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）コンパクチン生合成のための最小限の要件をコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）コンパクチンヒドロキシラーゼをコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドおよび／または目的の遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドで前記宿主細胞を形質転換すること；
（ｃ）形質転換された細胞のクローンを選択すること；
（ｄ）前記選択された細胞を培養すること；
（ｅ）場合により、栄養供給源を前記培養細胞に供給すること、ならびに；
（ｆ）場合により、前記培養から目的の化合物を単離すること、
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の化合物はプラバスタチンである、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞は、改善された動態特徴を伴う相同タンパク質を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は酸化還元再生系を含んでなる、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
プラバスタチンを産生させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）コンパクチン産生宿主細胞とコンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞とを混合すること；
（ｂ）混合培養物として両方の宿主細胞を培養すること、および；
（ｃ）場合により、前記混合培養物からプラバスタチンを単離すること、
を含んでなる、方法。
【請求項１７】
コンパクチンもまた産生する宿主細胞において産生されるプラバスタチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、プラバスタチンの産生のための１工程発酵プロセスに関する。
【０００２】
［発明の背景］
コレステロールおよび他の脂質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によって体液に輸送される。ＬＤＬレベルは冠動脈疾患の危険性に正の相関を示すため、ＬＤＬ−コレステロールを降下させるための機構を遂行する物質は、有効な抗高コレステロール血症剤としての役割を果たし得る。スタチンクラスのコレステロール降下剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害することによって血液中のコレステロール濃度を降下させるため、それらは医学的に極めて重要な薬物である。後者の酵素は、コレステロール生合成、即ち、（３Ｓ）−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）からメバロン酸への変換における律速段階を触媒する。市場には、いくらかのタイプのスタチン系薬剤、中でも、アトルバスタチン、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチンおよびプラバスタチンが存在する。アトルバスタチンは化学合成を介して作製される一方、上記の他のスタチン系薬剤は、直接発酵または前駆体発酵のいずれかを介して産生される。これらの（前駆体）発酵は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属およびモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属の真菌によって行われる。
【０００３】
プラバスタチンは、２つの順次発酵を介して産生される。まず、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）がコンパクチンを産生し、そのラクトン環を水酸化ナトリウムで化学的に加水分解し；続いて、それをプラバスタチンにヒドロキシル化するストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）の培養にこれを供給する。これらの代謝物の産生のための産業用の種およびプロセスは、異なる方法を使用して最適化される。これによって、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）による産業的コンパクチン産生は、本来の４０ｍｇ／Ｌから５ｇ／Ｌに増加された。生体触媒変換のために、８０％変換収率を伴う３ｇ／Ｌのメバスタチンに対する耐性を伴うストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）変異株がＭｅｔｋｉｎｅｎにより得られた（Ｍｅｔｋｉｎｅｎ  Ｎｅｗｓ、２０００年３月、Ｍｅｔｋｉｎｅｎ  Ｏｙ、フィンランド；マンゾーニ（Ｍａｎｚｏｎｉ）およびロリーニ（Ｒｏｌｌｉｎｉ）、２００２年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：５５５−５６４により検討された）。これは実行可能な商業的プロセスであるが、コンパクチン力価が、例えば、産業的アミノ酸またはペニシリンＧ力価と比較して相対的に低いため、最適な状態からはかけ離れている。また、コンパクチンは希釈する必要があり、そうでなければ、それは、生体変換に使用されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株に毒性になり（ホソブチ（Ｈｏｓｏｂｕｃｈｉ）ら、１９８３年、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３６：８８７−８９１）、さらに、供給される２０％のコンパクチンがストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株によって変換されない。
【０００４】
上記の問題に対する解決として、いくらかの刊行物がプラバスタチンのための１工程発酵プロセスについて説明している（国際公開第９９／１０４９９号パンフレット、米国特許第６，２７４，３６０号明細書および欧州特許第１，２６６，９６７号明細書）。しかし、本発明の部分として、本発明者らは、問題を解決するためのこれらのすべての示唆が無効であり、さらなる問題、即ち、コンパクチンからプラバスタチンへの細胞内変換を解決する必要があることを実証する。国際公開第９９／１０４９９号明細書は、ｐ４５０酵素をコードするストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子を具備した組み換えペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）株について説明している。ここでは、国際公開第９９／１０４９９号明細書に従って構築された株がプラバスタチンを産生せず、コンパクチンのみを産生することが実証されている。米国特許第６，２７４，３６０号明細書は、コンパクチンをプラバスタチンに変換することができるアクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）種から単離することができる酵素系について説明し、そしてプラバスタチンを産生させるために異種の種においてこの酵素系を使用することを示唆している。しかし、タンパク質もまたＤＮＡ配列も提供されないため、そのような特許請求の範囲について立証することは不可能である。さらに、そのような酵素系は、異なるポリペプチドよりなり得、および／またはいくらかの宿主特異的酸化還元再生酵素もしくはシャペロンを必要とし、これは、この酵素系のすべての正規のメンバーの精製および単離を妨げる。さらに、上記で考察したように、プラバスタチン触媒酵素の既知のＤＮＡ配列（ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ｐ４５０−ｓｃａ２遺伝子）を、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、コンパクチン生産者に移し替えてもなお、プラバスタチン形成は生じない。欧州特許第１，２６６，９６７号明細書は、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）およびモナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）の変異株について説明している。野生型株はロバスタチンのみを産生する一方、これらの変異体は、ロバスタチンおよび／またはプラバスタチンを産生すると記載された。本発明の部分として、本発明者らは、欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に従う変異株がプラバスタチンを産生せず、ロバスタチンのみを産生することを実証する。
【０００５】
従って、プラバスタチンのための１工程発酵プロセスの問題を解決する経済的に可能な方法は、利用可能な状態ではなく、そして大いに所望されている。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、コンパクチン生合成遺伝子およびコンパクチンからプラバスタチンへの変換のための遺伝子を含有する微生物を提供する。より具体的には、前記コンパクチン生合成遺伝子はｍｌｃＡおよび／またはｍｌｃＢおよび／またはｍｌｃＣおよび／またはｍｌｃＤおよび／またはｍｌｃＥおよび／またはｍｌｃＦおよび／またはｍｌｃＧおよび／またはｍｌｃＨおよび／またはｍｌｃＲであり、そしてコンパクチンからプラバスタチンへの変換のための前記遺伝子はヒドロキシラーゼ遺伝子である。さらに、本発明は、以下の工程を含んでなる目的の化合物を産生させるための方法を提供する：
（ａ）コンパクチン生合成のための最小限の要件をコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）コンパクチンヒドロキシラーゼをコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドおよび／または目的の遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドで前記宿主細胞を形質転換すること；
（ｃ）形質転換された細胞のクローンを選択すること；
（ｄ）前記選択された細胞を培養すること；
（ｅ）場合により、栄養供給源を前記培養細胞に供給すること、ならびに；
（ｆ）場合により、前記培養から目的の化合物を単離すること。
【０００７】
［発明の詳細な説明］
用語「発現」は、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含み、そして転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含み得る。
【０００８】
核酸構築物が、特定の宿主生物体におけるコード配列の発現のために要求されるすべての制御配列を含有する場合、用語「核酸構築物」は、用語「発現ベクター」または「カセット」と同義である。
【０００９】
用語「制御配列」は、本明細書において、ポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての成分を含むものと規定される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に生来または外来性であってもよい。そのような制御配列として、プロモーター、リーダー、（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載のような）最適な翻訳開始配列、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられ得るが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、転写制御配列を含有する適切なプロモーター配列であってもよい。プロモーターは、変異、短縮型、およびハイブリッドプロモーターを含む細胞において転写調節活性を示す任意の核酸配列であってもよく、そして細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から入手してもよい。プロモーターは、細胞もしくはポリペプチドに対して同種または異種のいずれであってもよい。プロモーターは、ドナー種または他の任意の供給源から誘導してもよい。真核生物における発現レベルを制御するための代替的方法は、イントロンの使用である。高等な真核生物は、エキソンおよびイントロンよりなる遺伝子を有する。用語「エキソン」は、本明細書において、タンパク質に翻訳されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のすべての成分を含むものと規定される。用語「イントロン」は、本明細書において、オープンリーディングフレーム内には含まれないすべての成分を含むものと規定される。用語「オープンリーディングフレーム」は、本明細書において、配列ＡＴＧ、メチオニンに対するコドンで開始し、その後に、可能なすべてのアミノ酸をコードし、そして所定の数の後、終結コドンによって中断される連続的列のコドンが続くポリヌクレオチドとして規定される。このオープンリーディングフレームは、タンパク質に翻訳することができる。ゲノムから単離される遺伝子を含有するポリヌクレオチドは、すべてのエキソンおよびイントロンを含む遺伝子のいわゆるゲノムＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列である。逆転写酵素反応を介してｍＲＮＡから単離される遺伝子を含有するポリヌクレオチドは、エキソンのみを含むその遺伝子のいわゆるコピーＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列である一方、イントロンは、細胞機構を介してスプライシングにより切除される。この後者のタイプのＤＮＡは、原核生物宿主において目的の真核生物遺伝子を発現させる場合、特に使用される。両方のタイプのＤＮＡの変種もまた、合成的に作製することができ、イントロンの正確なヌクレオチド配列を変更するか、または目的の遺伝子におけるイントロンの数を変動するかのいずれかの可能性を広げる。これはまた、原核生物由来の目的の遺伝子にイントロンを付加して、真核生物宿主における発現を容易または改善する可能性を広げる。また、イントロンは、プロモーター、ポリアデニル化部位または転写ターミネーターのような上記で命名した制御配列に導入することもできる。イントロンの存在、非存在、変動または導入は、真核生物における遺伝子発現レベルを調節する手段である。
【００１０】
用語「作動可能に連結」は、本明細書において、制御配列が、ポリペプチドの産生を指令するようなＤＮＡ配列のコード配列に対する位置に、制御配列が適切に配置される配置形態として規定される。
【００１１】
用語「プラバスタチン」は、本明細書において、α−もしくはβ−配置、またはα−およびβ−配置の両方の混合物を伴うコンパクチンの６’−ヒドロキシル変種として規定され、そして（ラクトン環を伴う）閉じた構造および（ヒドロキシカルボン酸部分を伴う）開いた構造の両方を含む。
【００１２】
本発明の目的は、プラバスタチンの１工程発酵プロセスのための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の第１の態様では、以下の特徴の少なくとも１つを有するプラバスタチン産生株が提供される：
・コンパクチン生合成に必要なすべての遺伝子を含有すること、
・コンパクチンからプラバスタチンへの変換に必要なすべての遺伝子を含有すること（即ち、コンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞）、
・１回の発酵でプラバスタチンを産生することが可能であること。
【００１４】
本発明に関して、「プラバスタチン産生細胞」は、上記の特徴の少なくとも１つ、好適には、上記の特徴の少なくとも２つおよび最も好適には、上記の特徴のすべてを示す細胞によって規定される。
【００１５】
１つの実施態様では、産生株、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のコンパクチン産生宿主細胞が提供される。この生物体は、いくらかの回数の古典的な株改善、ならびに以後のプロセス適応および改善を経て、現在の高力価のペニシリンＧ発酵プロセスに至った。生物体のＤＮＡにおける多数の変化は、産物ペニシリンＧに対するフラックスおよび収率の増加（図１を参照のこと）だけではなく、さらにまた、１５０，０００リットル発酵容器における厳しい条件（即ち、酸素制限、せん断力、グルコース制限など）に対する形態学的変化および適応を生じた。β−ラクタム生合成機構を欠失することによって、任意のβ−ラクタム産生能を欠如するが、せん断力に対する耐性、大規模化に対する適合性、限定培地およびダウンストリームプロセシングに適応される代謝物に対する高い代謝フラックス、ならびに低粘度プロファイルのような産業規模に対する良好な性能を生じるすべての変異（即ち、形態学的、調節および代謝変異）をなお保持する株が得られる。本発明のペニシリン・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株では、少なくとも、イソペニシリンＮシンターゼをコードするβ−ラクタム生合成遺伝子、ｐｃｂＣが不活化される。また、好ましくは、他のβ−ラクタム生合成遺伝子、Ｌ−（α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリンシンテターゼをコードするｐｃｂＡＢ、および／またはアシル−コエンザイムＡ：イソペニシリンＮアシルトランスフェラーゼをコードするｐｅｎＤＥが不活化される。より好ましくは、遺伝子は、遺伝子の部分の取り出しによって不活化される。遺伝子配列が完全に取り出されることが最も好適である。何故なら、これらの遺伝子の完全な取り出しは、任意のβ−ラクタム生合成能を欠如し、従って、すべての種類の産物を産生するのに極めて有用な株であるするペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をもたらすためである。産業用生物体は取り扱いが極めて煩雑であり得るにもかかわらず、驚くべきことに、このペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株は、良好な形質転換が可能であり、そして天然の産生宿主細胞よりかなり高い力価でスタチン系薬剤を産生することが可能である。
【００１６】
本発明に不可欠というわけではないが、好ましくは、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）変異体は、産業環境において産生することが可能な生物体から得られる。そのような生物体は、典型的に、高い産生性および／または炭素源の消費量に対する高い産生収率および／またはバイオマスの産生量に対する高い産生収率および／または高い産生速度および／または高い産物力価を有するものとして規定することができる。そのような生物体は、コンパクチンのための宿主細胞への変換に極めて有用である。ペニシリンＧ産生ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株では、例えば、そのような高力価は、１．５ｇ／  Ｌより高い力価のペニシリンＧ、好ましくは、２ｇ／Ｌより高い力価のペニシリンＧ、より好ましくは、３ｇ／Ｌより高い力価のペニシリンＧ、最も好ましくは、４ｇ／Ｌより高い力価のペニシリンＧである。上記の力価は、（１リットルあたり：ラクトース、４０ｇ／Ｌ；コーンスティープ固体、２０ｇ／Ｌ；ＣａＣＯ３、１０ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、７ｇ／Ｌ；フェニル酢酸、０．５ｇ／Ｌ；ｐＨ６．０を含有する）複合的発酵培地における９６時間後の発酵力価に該当する。適切な産業用株は、実験の部（一般的方法）に記載のような株である。
【００１７】
ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のすべての産業用株系統は、３つの一般的なタイプの変異を生じる多数の回数の古典的な株改善を経た：
（ｉ）ペニシリン代謝物経路の酵素の活性の増加を生じる生合成遺伝子の直接的増幅
（ｉｉ）究極的に様々に適応された代謝の再配列を生じる一次代謝遺伝子における改変であって、これらはすべて最終産物に対してより高いフラックスを生じる。例：アミノ酸ビルディングブロックの合成の増加、フェニル酢酸の消費の減少など。
（ｉｉｉ）形態、膜組成、オルガネラ形成の改変を生じ、従って、産業規模において高い代謝フラックスおよび発酵を容易にする細胞構造の改変。例：ペニシリン合成の「組立ライン」の１つであるペルオキシソームの数の増加。
【００１８】
クラス（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と比較してクラス（ｉ）のタイプの変異におけるＤＮＡレベルに有意な区別が認められる。後者の２つのクラスは、ほとんどが、塩基対レベルにおいて単離された変異、欠失、重複および／または異常である一方、クラス（ｉ）における変異クラスは、ゲノムのいくらかの直接および逆方向反復を生じる６０〜１００ｋｂ領域の極めて異なる増幅である。これは、ときどき、顕著な遺伝的不安定性を生じ、不安定かつ変化する集団を生じる。事実、これは、所定のペニシリン産生株では、クラス（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のすべての変異が固定されるが、クラス（ｉ）の正確なコピー数の変異が変動し得ることを意味する。当業者に公知のこの原理および技術を使用して、１コピーのみのペニシリン生合成遺伝子がなお存在する安定な単離体を得ることができる。出発株のコピー数に依存して、１、２、３またはいくらかの回数のスクリーニングおよび選択で、この状況を得ることができる。次いで、この特定の特徴のため、単離体は、種、ＮＲＲＬ１９５１、および古典的な株改善後のその最初の子孫、ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）５４−１２５５までのタイプ株に匹敵し、それらのすべては、１コピーのペニシリン生合成遺伝子を含有する。主な差異は、高い産生性の株由来の１コピー単離体がなお、それを、ＮＲＲＬ１９５１からウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）５４−１２５５までの株に比べて、産業的に高い産生性の株にするクラス（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の他のすべての変異を含有することである。続いて、現存の組み換え技術を使用して、ペニシリン生合成遺伝子の最後の組を欠失することができる。これらの工程の詳細な全体像を実施例に示し、そして以下の工程において要約する：
（ａ）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株からペニシリン遺伝子クラスターの単一のゲノムコピーを伴う単離体を単離すること
（ｂ）工程（ａ）において得られる単離体から遺伝子ｐｃｂＣを欠失すること
（ｃ）場合により、工程（ａ）または（ｂ）において得られる単離体から遺伝子ｐｃｂＡＢおよび／またはｐｅｎＤＥを欠失すること
【００１９】
遺伝子は、部分的に不活化することができる。より好ましくは、遺伝子配列は、完全に取り出される。というのも、これらの遺伝子の完全な取り出しが、任意のβ−ラクタム生合成能のない、従って、すべての種類の産物を産生するのに極めて有用な株であるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をもたらすためである。適用することができる組み換え技術は、当業者に周知である（即ち、単一交差または二重相同組み換え）。
【００２０】
欠失および置換のための好適なストラテジーは、欧州特許第３５７，１２７号明細書に記載の遺伝子置換である。遺伝子および／またはプロモーター配列の特異的欠失は、好ましくは、欧州特許第６３５，５７４号明細書に記載のように、ａｍｄＳ遺伝子を選択マーカー遺伝子として使用して実施される。フルオロアセトアミド培地（欧州特許第６３５，５７４号明細書）に対する対抗選択によって、得られる株は、選択マーカーを含まず、そしてさらなる遺伝子改変に使用することができる。あるいは、他の前述の技術との組み合わせで、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるコスミドのインビボ組み合わせに基づく技術を、チャヴェロチェ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ）ら（２０００年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２８，Ｅ９７）によるように使用することができる。この技術は、例えば、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のような他の糸状菌にも適用可能である。また、増幅されたゲノムフラグメントを取り出すための同じ原理を、古典的な株改善プログラムが遺伝子およびゲノム重複を誘導している他の産業用産生種に適用することができる。また、ここで、クラス（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のさらなる変異は、固定され、そして株が産業的発酵プロセスにおいて良好に生育することができることを確実にする。
【００２１】
そのようなペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）細胞は、コンパクチン生合成に必要なすべてのタンパク質および酵素をコードする遺伝子を具備することができる。ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）の９つの遺伝子、ポリケチドシンターゼをコードするｍｌｃＡ；ポリケチドシンターゼをコードするｍｌｃＢ；Ｐ４５０モノオキシゲナーゼをコードするｍｌｃＣ；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするｍｌｃＤ；排出ポンプをコードするｍｌｃＥ；オキシドレダクターゼをコードするｍｌｃＦ；デヒドロゲナーゼをコードするｍｌｃＧ；トランスエステラーゼをコードするｍｌｃＨ；転写因子をコードするｍｌｃＲについては、コンパクチン生合成に関与することが記載されている（アベ（Ａｂｅ）ら、２００２年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６７：６３６−６４６；アベ（Ａｂｅ）ら、２００２年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６８：１３０−１３７）。
【００２２】
コンパクチン産生宿主細胞を得るために、単離されたペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株は、上記の遺伝子の少なくとも１つ、好適には、上記の遺伝子の２つ以上、より好適には、上記の遺伝子のすべてで形質転換される。
【００２３】
別の実施態様でも、同じ原理を適用して：限定されないが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、ペニシリウム・ブレビコンパクタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、モナスカス・パキシー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐａｘｉｉ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ピキア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような他の真核生物種の適切なコンパクチン産生宿主細胞ならびにそれらの産業的誘導体に至ることができる。これらの種の産業的誘導体は、様々な回数の古典的変異誘発、その後、それらを本発明の特定の用途に適合する改善された産業的産生特徴のためにスクリーニングおよび選択を経た。所望されない産物の部分または完全な経路を取り出す（即ち、欠失する）ことによって、株は、それらの所望される産業的発酵特徴および（酵素を含む）代謝物への高いフラックスを維持する。
【００２４】
なお別の実施態様では、コンパクチンの産生は、改善された動態特徴を伴う相同タンパク質を使用することによって改善することができる。そのような「相同体」または「相同配列」は、ドナー種から単離される本来のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を示し、そして特定されたＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対してある程度の同一性を所有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列として規定される。コンパクチン生合成遺伝子に対して「実質的に相同」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、特定されたアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも６０％、なおより好ましくは、少なくとも７０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９８％、および最も好ましくは、少なくとも９９％の程度の同一性を所有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとして規定され、実質的に相同なペプチドは、コンパクチンおよび／またはコンパクチン−前駆体の合成に対する活性を示す。このアプローチを使用して、フィードバック阻害を克服すること、分泌の改善および副産物形成の減少のような様々な利点が得られる。相同配列は、異なる集団由来の細胞または天然の対立遺伝子または株内の変動による集団内に存在し得る多型を包含してもよい。相同体は、さらに、特定されたＤＮＡ配列を生じる種以外の種から誘導してもよく、または人工的に設計および合成してもよい。特定されたＤＮＡ配列に関連し、そして遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡ配列もまた、本発明の部分である。相同体はまた、全長配列の生物学的に活性なフラグメントを包含してもよい。
【００２５】
合成手段によって単離される相同配列は、特に興味深い。この方法によって、コンパクチンを産生する宿主細胞に誘導しようとする遺伝子の可能なすべての変種を、インシリコで設計することができる。これは、遺伝子が、コンパクチン産生宿主細胞において至適に発現され；制限酵素および／または部位特異的リコンビナーゼに関連する配列を取り出し、および誘導し；異なる組み合わせの遺伝子を作製するなどのように、遺伝子のコドン使用頻度を適応する機会を広げる。
【００２６】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一の程度は、２つの配列間で同一であるアミノ酸の百分率を指す。同一の程度は、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）において記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプラグラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９年）を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００２７】
実質的に相同なポリペプチドは、単に、特定されたアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の保存的置換または非必須アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を含有してもよい。従って、非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変更することなく、これらの配列の１つにおいて変更することができる残基である。例えば、表現型性サイレントアミノ酸置換の作製方法に関する指針は、ボウイ，Ｊ．Ｕ．（Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０年）に提供されており、ここで、著者らは、アミノ酸配列の変更に対する忍容性を研究するための主な２つのアプローチが存在することを示している。第１の方法は、変異が天然の選択によって許容されるかまたは拒絶されるかのいずれかである進化のプロセスに依存する。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を誘導し、そして選択またはスクリーニングして、機能性を維持する配列を同定する。著者らが述べているように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど忍容性であることを示している。著者らは、どの変化が、タンパク質の所定の位置において許容されやすいかをさらに示している。例えば、ほとんどの埋没されるアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般的にほとんど保存されない。他のそのような表現型性サイレント置換については、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、および本明細書において引用した参考文献に記載されている。
【００２８】
用語「保存的置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換を意味することが意図される。これらのファミリーは、当該技術分野において公知であり、そして塩基側鎖（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン類、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニントリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。
【００２９】
さらに、相同ではないが、スタチン合成の同じ生合成ビルディング原理に従う生合成遺伝子クラスターを使用することができる。
【００３０】
本発明の核酸構築物、例えば、発現構築物は、少なくとも１つの目的の遺伝子を含有するが、一般に、いくらかの目的の遺伝子を含有し；それぞれ、コンパクチン産生宿主細胞においてコードされるポリペプチドの発現を指令する１つ以上の制御配列に作動可能に連結される。核酸構築物は、１つのＤＮＡフラグメント上にあってもまたは個別のフラグメント上にあってもよい。最も高い可能な産生性を得るために、目的のすべての遺伝子のバランスの取れた発現は、極めて重要である。従って、プロモーターの範囲は有用であり得る。ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のような糸状菌細胞の適用に好適なプロモーターは、当該技術分野において公知であり、そして例えば、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来の遺伝子のプロモーター；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター；ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ｐｃｂＡＢ、ｐｃｂＣおよびｐｅｎＤＥプロモーター；ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣのようなプロテアーゼプロモーター；グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター；アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター；カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター；グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター；β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター；α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター；翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター；ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤのようなキシラナーゼプロモーター；ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡのようなセルラーゼプロモーター；ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｔＴ、ａｌｃＲのような転写調節因子のプロモーターなどであり得る。前記プロモーターは、当業者によって、特に、ＮＣＢＩインターネットウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）において容易に見出すことができる。糸状菌種以外から誘導されるコンパクチン産生宿主細胞の場合、プロモーターの選択は、宿主の選択によって決定される。
【００３１】
好適な実施態様では、プロモーターは、高度に発現される（本明細書において、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。プロモーターは、中程度に発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。好適な実施態様では、プロモーターは、低度で発現される（本明細書において、０．０１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。
【００３２】
なおより好適な実施態様では、遺伝子、およびそれ故、所定の転写レベルおよび調節を有するそれらの遺伝子のプロモーターを選択するために、マイクロアレイデータが使用される。この方法では、遺伝子発現カセットを、それが機能すべき条件に至適に適応することができる。これらのプロモーターフラグメントは、多くの供給源、即ち、異なる種から、ＰＣＲ増幅、合成などによって誘導することができる。
【００３３】
最も好適な実施態様では、すべてのコンパクチン産生宿主細胞における至適産生のために、本来のペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）プロモーターが、遺伝子ｍｌｃＲによってコードされる経路特異的転写調節因子による制御下にはないプロモーターによって置き換えられる。この遺伝子により、ｍｌｃＲは、コンパクチン産生宿主細胞において含む必要はなく、そして代替的な制御機構を導入することができる。
【００３４】
制御配列はまた、適切な転写終結配列、転写を終結するために真核細胞によって認識される配列を含んでもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なターミネーターは、以下をコードする遺伝子：麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ；ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ｐｃｂＡＢ、ｐｃｂＣおよびｐｅｎＤＥターミネーター；アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ；アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ；アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ；アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子；アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ；アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ；フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼから得られる。さらにより好適なターミネーターは、天然の生産者、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）から誘導される遺伝子の１つである。糸状菌種以外から誘導されるコンパクチン産生宿主細胞の場合、終結配列の選択は、宿主の選択によって決定される。
【００３５】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのリーダー配列も本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なリーダーは、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼおよびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡをコードする遺伝子から得られる。
【００３６】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写される場合、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして糸状菌細胞に認識されるポリアデニル化配列であってもよい。細胞において機能的であるいずれのポリアデニル化配列も本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なポリアデニル化配列は、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００３７】
分泌させようとするポリペプチドのための制御配列はまた、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けることができる、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。核酸コード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを伴う翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含有してもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来性のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然には含有しない場合に要求され得る。あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域と単純に置き換わってもよい。
【００３８】
真核生物のコンパクチン産生宿主細胞の場合、制御配列は、オルガネラターゲティングシグナルを含んでもよい。そのような配列は、細胞内の最終目的地（即ち、コンパートメントまたはオルガネラ）を指向することができるポリペプチドに連結されるアミノ酸配列によってコードされる。核酸配列のコード配列の５’または３’末端は、ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを伴う翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるターゲティングシグナルコード領域を本質的に含有してもよい。様々な配列が当業者に周知であり、そしてミトコンドリア、ペルオキシソーム、小胞体、ゴルジ装置、液胞、核などのようなコンパートメントにタンパク質を標的化するために使用することができる。核酸構築物は、発現ベクターであってもよい。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得るいずれのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。糸状菌の自律的に維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含んでなり得る（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照のこと）。あるいは、ベクターは、細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体の無作為または予め決定された標的遺伝子座に組込み得る。本発明の好適な実施態様では、組込みクローニングベクターは、この予め決定された座位へのクローニングベクターの組込みを標的化するための宿主細胞のゲノムにおける予め決定された標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでなる。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも０．１ｋｂ、なお好ましくは、さらに少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは、少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。
【００３９】
相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸構築物の標的化された組込み、即ち、予め決定された遺伝子座における組込みの効率は、好ましくは、宿主細胞の増大した相同組換え能によって増加する。細胞のそのような表現型は、好ましくは、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに記載の欠損ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子に関与する。国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットは、上昇した効率の標的化された組み込みを含んでなる糸状菌細胞を得るための好適な方法を開示する。
【００４０】
ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つ以上のベクターまたはプラスミドであってもよい。しかし、本発明では、構築物は、好ましくは、宿主株のゲノムに組み入れられる。これは無作為なプロセスであるため、これはさらに、大量の酵素、およびそれに続いて、高い産生性を生じる遺伝子発現を駆動するのに高度に適するゲノム座位への組込みを生じ得る。
【００４１】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラスト形質転換、および細胞壁の再生によって、形質転換してもよい。真菌宿主細胞の形質転換に適切な手順については、欧州特許第２３８，０２３号明細書およびエルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら（１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４）に記載されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用する糸状菌宿主細胞の形質転換に適切な手順については、デ・グルートＭ．Ｊ．（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  Ｍ．Ｊ．）ら（１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６：８３９−８４２；正誤表：１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６：１０７４）によって記載されている。アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）について記載のエレクトロポレーションのような他の方法もまた、適用してよい。
【００４２】
真菌細胞は、同時形質転換を使用して形質転換される（即ち、目的の遺伝子に伴って、選択マーカー遺伝子も形質転換される）。これは、目的の遺伝子（即ち、プラスミド上）または個別のフラグメント上のいずれかに物理的に連結することができる。トランスフェクション後、形質転換体を、この選択マーカー遺伝子の存在についてスクリーニングし、続いて、目的の遺伝子の存在について分析する。選択マーカーは、殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に原栄養性などを提供する産物である。有用な選択マーカーとして、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣもしくはｓｕｔＢ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、またはそれらの均等物が挙げられる。
【００４３】
別の実施態様でも、同じ原理を適用して：限定されないが、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、アミコラトピス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような原核生物種の適切なコンパクチン産生宿主細胞ならびにそれらの産業的誘導体に至ることができる。これらの種の産業的誘導体は、様々な回数の古典的変異誘発、その後、それらを本発明の特定の用途に適合する改善された産業的産生特徴のためにスクリーニングおよび選択を経た。所望されない産物の部分または完全な経路を取り出す（即ち、欠失する）ことによって、株は、それらの所望される産業的発酵特徴および（酵素を含む）代謝物への高いフラックスを維持する。ここでは、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）コンパクチン遺伝子のリスト（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ、ｍｌｃＦ、ｍｌｃＧ、ｍｌｃＨおよび／またはｍｌｃＲ）から選択されるすべての遺伝子は、原核細胞において機能的に発現されるように、現存の方法によって改変する必要がある。当業者であれば、これが、制限されないが、以下を含む真核生物について上記の概説に匹敵する様々な工程に関与することを理解するであろう：
・（真核生物のイントロンを排除するために）ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを得ること
・場合により、コドン最適化を使用すること
・原核細胞において機能的なプロモーターを備え付けること
・原核細胞において機能的なターミネーターを備え付けること
・原核細胞において機能的なベクターを介して導入すること
【００４４】
本発明の別の実施態様では、コンパクチンをプラバスタチンに変換するのに必要な遺伝子を含んでなる宿主微生物が提供される。実施例３のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）コンパクチン産生宿主細胞のペニシリン産生親株は、驚くべきことに、コンパクチンをプラバスタチンに変換するのに特に有用である。ｐ４５０酵素をコードするストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子Ｐ−４５０ｓｃａ−２は、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら（１９９５年、Ｇｅｎｅ１６３：８１−８５）により、コンパクチンからプラバスタチンへの変換のための触媒であることが記載された。これまでのところ、この遺伝子は、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）においてのみ発現が成功した（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）、１９９５年）。ｐ４５０酵素は、幾分特異的な補因子再生系を必要とすることが公知であり（ピリペンコ（Ｐｙｌｙｐｅｎｋｏ）およびシュリチング（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ）、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：９９１−１０１８を検討のために参照のこと）、そのため、良好な異種発現のために、この再生系は、同時誘導する必要がある（例えば、クボタ（Ｋｕｂｏｔａ）ら、２００５年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：２４２１−２４３０を参照のこと）。驚くべきことに、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）由来の構造Ｐ−４５０ｓｃａ−２遺伝子のみを具備するコンパクチン産生ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞は、コンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能であり、従って、プラバスタチンの１工程発酵の最初の例である。プラバスタチンの産生レベルは、前記ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞にフェレドキシン遺伝子を備え付けることによっても有意に改善することができる。好ましくは、前記フェレドキシン遺伝子は、米国特許出願公開第２００６／０１７２３８３号明細書に記載のストレプトマイセス・ヘルバチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｅｌｖａｔｉｃｕｓ）またはストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）由来である。本発明の範囲は、これらの具体例に制限されない。
【００４５】
本発明の第２の態様では、以下の工程を含んでなる目的の化合物を産生させるための方法が開示される：
（ａ）コンパクチン生合成のための最小限の要件をコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）コンパクチンヒドロキシラーゼをコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドおよび／または目的の遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドで前記宿主細胞を形質転換すること；
（ｃ）形質転換された細胞のクローンを選択すること；
（ｄ）前記選択された細胞を培養すること；
（ｅ）栄養供給源を前記培養細胞に供給すること、ならびに；
（ｆ）前記培養物から目的の化合物を単離すること。
【００４６】
好適な実施態様では、目的の化合物はプラバスタチンである。
【００４７】
別の実施態様では、コンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞におけるプラバスタチンの産生は、改善された動態特徴を伴う相同タンパク質を使用することによって、改善することができる。そのような「相同体」または「相同配列」は、ドナー種から単離される本来のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を示し、そして特定されたＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対してある程度の同一性を所有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列として規定される。コンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子に対して「実質的に相同」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、特定されたアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも６０％、なおより好ましくは、少なくとも７０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９８％、および最も好ましくは、少なくとも９９％の程度の同一性を所有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとして規定され、実質的に相同なペプチドは、プラバスタチンの合成に対する活性を示す。このアプローチを使用して、フィードバック阻害を克服すること、分泌の改善および副産物形成の減少のような様々な利点が得られる。相同配列は、異なる集団由来の細胞または天然の対立遺伝子または株内の変動による集団内に存在し得る多型を包含してもよい。相同体は、さらに、特定されたＤＮＡ配列を生じる種以外の種から誘導してもよく、または人工的に設計および合成してもよい。特定されたＤＮＡ配列に関連し、そして遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡ配列もまた、本発明の部分である。合成で単離される相同配列は特に重要である。この方法によって、適切なｐ４５０酵素をコードする遺伝子の可能なすべての変種を、インシリコで設計することができる。これは、遺伝子が、コンパクチン産生宿主細胞および／またはコンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞において至適に発現され；制限酵素および／または部位特異的リコンビナーゼに関連する配列を取り出し、および誘導し；異なる組み合わせの遺伝子を作製するなどのような方法で、遺伝子のコドン使用頻度を適応する機会を広げる。あるいは、改善された動態学的特性を伴う相同配列を得るための方法として、エラープローンＰＣＲ、ファミリーシャッフリングおよび／または定向進化のようなインビトロでの進化論的アプローチを使用することができる。相同体はまた、全長配列の生物学的に活性なフラグメントを包含してもよい。さらに、相同体ではないが、コンパクチンまたはいずれかのコンパクチン−前駆体由来のプラバスタチンからの形成を触媒する遺伝子を使用することができる。
【００４８】
さらなる実施態様では、コンパクチンからプラバスタチンへの変換の効率は、ｐ４５０酵素に必要な特異的酸化還元再生系を単離し、そしてこれをコンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞に導入することによって改善してもよい。そのような系を宿主細胞に導入する方法は、コンパクチンヒドロキシラーゼの導入に関する説明と同じであり、上記で概説している。そのような酸化還元再生系は、コンパクチンヒドロキシラーゼ（即ち、ｐ４５０）をコードするポリヌクレオチドが入手され得る種と同じ種から入手され得るか、または例えば、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種（即ち、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（即ち、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ））、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）種（即ち、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ））、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）種（即ち、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、モナスカス・パキシー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐａｘｉｉ））、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・フラビドビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｉｄｏｖｉｒｅｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・エクスフォリエーテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種（即ち、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＮＲＲＬ１８０９８、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９７９５）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（即ち、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（即ち、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、もしくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（即ち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））である種において異種発現され得るまた、代替的系を適用することもできる。代替的系の例には、本発明のコンパクチン���ドロキシラーゼをクラスＩＶｐ４５０系に組込み、それによって、それを酸化還元パートナーに融合すること（例えば、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、２００２年、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：３８９８−３９０８およびノダテ（Ｎｏｄａｔｅ）ら、２００５年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９月３０日；：１−８［電子版］を参照のこと）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼのようなＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成非ｐ４５０連結酵素（ヨハネス（Ｊｏｈａｎｎｅｓ）ら、２００５年、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５７２８−５７３４）、または非酵素的手段（例えば、ホールマン（Ｈｏｌｌｍａｎｎ）ら、２００６年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４：１６３−１７１を参照のこと）があるが、これらに限定されない。それ故、得られる宿主細胞は、プラバスタチンを産生させるために使用してもよい。
【００４９】
別の実施態様では、コンパクチン産生宿主細胞とコンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞とを混合し、続いて、混合培養物として両方の宿主細胞を培養することによって、プラバスタチンの１工程発酵が行われ、このことから、コンパクチンを産生する宿主細胞によって産生され、そして分泌されるコンパクチンが、インポートされ、そしてコンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞によってプラバスタチンに変換されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の略図である。野生型（ＷＴ）株は、取り入れられる炭素を、増殖、産物（ペニシリンＧ）および維持に分配するための固定比率を有する。産業用株では、このバランスは、産物の方に偏る。コンパクチン産生宿主細胞では、ペニシリンＧ経路が取り出され、そのため、増殖と維持との間で、再度、炭素フラックスのバランスがとられる。新規産生株では、産業的炭素フラックスのバランスは、新規産生経路を導入することによって回復する。説明：Ｉ＝野生型ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株；ＩＩ＝産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株；ＩＩＩ＝ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）β−ラクタムを含まない株；ＩＶ＝新たな産物を産生するペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）β−ラクタムを含まない株；Ｓ＝炭素源（即ち、糖）；Ｇ＝ペニシリンＧ；Ｘ＝バイオマス；Ｍ＝維持；Ｐ＝コンパクチンおよび／またはプラバスタチン。
【図２】ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）においてストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ｐ−４５０ｓｃａ−２酵素を発現させるために使用されるｐ−４５０ｓｃａ−２発現ベクターｐＡＮｐ４５０ａを示す。
【図３】単一コピーのペニシリン生合成遺伝子クラスターを伴う産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）単離体のサザンブロット分析を示す。説明：＃＝単離体の番号；Ｎ＝ｎｐｅ１０；Ｗ＝Ｗｉｓ５４−１２５５；Ｉ＝中間的親；Ｎ＝ｎｉａＡ遺伝子フラグメント；Ｐ＝ｐｃｂＣ遺伝子フラグメント。
【図４】フェノキシ酢酸を伴う無機培地上、振盪フラスコにおける様々な株の相対的ペニシリンＶ力価を示す。Ｙ軸上に、ペニシリンＶの百分率を示す（産業用親のレベルを１００に設定する）。説明：Ｃ＝産業用親；Ｉ＝中間的親；Ｗ＝Ｗｉｓ５４−１２５５；Ｎ＝ｎｐｅ１０；＃＝単離体の番号。
【図５】産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株の誘導体からペニシリン遺伝子クラスターの最終コピーを取り出すための欠失ストラテジーの概念図である。説明：Ａ＝ｐｃｂＡＢ遺伝子；Ｂ＝ｐｃｂＣ遺伝子；Ｃ＝ｐｅｎＤＥ遺伝子；Ｍ＝ａｍｄＳ遺伝子カセット；３＝３ｋｂフランク長；５＝５ｋｂフランク長；７＝７ｋｂフランク長。ハッチングを施された領域は相同フランキング領域を示し；斜めのハッチングは左フランキングを示し、そして縦のハッチングは右フランキングを示す。
【図６】フェニル酢酸を伴う無機培地上、振盪フラスコにおける様々な株の相対的ペニシリンＧ力価を示す。Ｙ軸上に、ペニシリンＧの百分率を示し、産業用親株のレベルを１００に設定する。説明：Ｃ＝産業用親；Ｉ＝中間的親；Ｗ＝Ｗｉｓ５４−１２５５；Ｎ＝ｎｐｅ１０；＃＝単離体の番号。
【図７】コンパクチン遺伝子クラスター（長さは３８２３１ｂｐである）の略図である。破線矢印は、遺伝子およびその場所での配向を示す。小さな実線矢印は、クローニングストラテジーにおいて使用されるＰＣＲプライマーの位置を示す。上部のサイズは、ＰＣＲを介して増幅されるフラグメントの長さを示す（１つの１８ｋｂフラグメントに対するいくらかのクローニング工程を介して、１０および８ｋｂのフラグメントが組み合わされるが、詳細については実施例を参照のこと）。説明：Ａ＝ｍｌｃＡ遺伝子；Ｂ＝ｍｌｃＢ遺伝子；Ｃ＝ｍｌｃＣ遺伝子；Ｄ＝ｍｌｃＤ遺伝子；Ｅ＝ｍｌｃＥ遺伝子；Ｆ＝ｍｌｃＦ遺伝子；Ｇ＝ｍｌｃＧ遺伝子；Ｈ＝ｍｌｃＨ遺伝子；Ｒ＝ｍｌｃＲ遺伝子。
【図８】コンパクチン遺伝子クラスターの中間部分（１４．３ｋｂ）および右側の部分（６ｋｂ）のＰＣＲ増幅を示す。
【図９】コンパクチンクラスターの１８ｋｂの左側部分のクローニングストラテジーの概略図である。パネルＡ：ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯＴ／Ａにおいてクローニングされた１０ｋｂおよび８ｋｂのフラグメントのＰＣＲ増幅。パネルＢ：１０および８ｋｂのフラグメントの融合−クローニング。ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ消化１０ｋｂプラスミドに連結される８ｋｂのフラグメントのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ消化。ｍｌｃＡオープンリーディングフレームを回復するための内部の６ｋｂのフラグメントのＰＣＲ増幅。パネルＣ：最終的な１８ｋｂのフラグメント。ｐＤＯＮＲ４１Ｚｅｏへのゲートウェイ反応を介して移し替えされる。説明：ＣＧＣ＝コンパクチン遺伝子クラスター；Ｎ＝ＮｏｔＩ；Ａ＝Ａｃｃ６５Ｉ；Ｘ＝ＸｂａＩ；Ｓ＝ＳｐｅＩ。
【図１０】発酵ブロスの上清のＨＰＬＣ分析を示す。パネルＡ：すべてのペニシリン生合成遺伝子クラスターを取り出したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株。パネルＢ：組込まれたコンパクチン遺伝子クラスターを伴うペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の形質転換体の１つ。ＭＬ−２３６Ａに対応するピークが、２．６分において認められる。説明：Ｘ軸＝分；Ｙ軸＝相対的ピーク強度を示す任意単位。
【図１１】ＨＰＬＣによって検出されるプラバスタチンの形成を示す。パネルＡは、コンパクチン生合成遺伝子およびストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＰ−４５０ｓｃａ−２遺伝子を具備するペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株由来のブロスである。パネルＢは、パネルＡと同じであるが、但し、この化合物に対応するピークを示すために、純粋なプラバスタチンがスパイクされている。プラバスタチンに対応するピークが、９．７分において認められる。他の主要なピークは、ＭＬ−２３６Ａ（８．７分）およびコンパクチン（１１．５分）由来である。説明：Ｘ軸＝分；Ｙ軸＝相対的ピーク強度を示す任意単位。
【図１２】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって検出されるプラバスタチンの形成を示す。パネルＡは、ＬＣを介して分析したコンパクチン生合成遺伝子およびストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＰ−４５０ｓｃａ−２遺伝子を具備するペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株由来のブロスである。プラバスタチンに対応するピークが、８．７分において認められる。説明：Ｘ軸＝分；Ｙ軸＝相対的ピーク強度を示す任意単位。パネルＢは、パネルＡのサンプルのＭＳ／ＭＳ分析である。ピークパターンは、正確な質量（４２３）およびフラグメント化パターン（３２１、３０３および１９８）を伴うプラバスタチンに対応する。説明：Ｘ軸＝質量；Ｙ軸＝相対的ピーク強度を示す任意単位。
【実施例】
【００５１】
［一般的方法］
標準的なＤＮＡ手順は、その他（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載のとおりに行った。特定のＤＮＡ方法を適用した場合は、これらについて具体的に説明する。ＤＮＡは、プルーフリーディング酵素Ｈｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、増幅した。制限酵素は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製であった。
【００５２】
［比較例１］
［欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載の株によるスタチン産生］
マンゾーニ（Ｍａｎｚｏｎｉ）らは、３つの異なる刊行物（１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｔｅｃｈｎ  １２：５２９−５３２；１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ２１：２５３−２５７；欧州特許第１，２６６，９６７号明細書）において、様々なスタチン産生株の単離について記載している。前者の２つの刊行物の株は利用可能ではないが、欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載の株は利用可能である。モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）ＧＮ／３３およびアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ＧＮ／２２１８は、それぞれ、コレクション番号ＤＳＭ１３５５４およびＤＳＭ１３５９６の下でＧｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌで入手した。コントロール株として：ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＮＲＲＬ８０８２およびアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０５４２を使用した。ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）スラント上、２〜７日間、２５℃で株の胞子形成を誘導した。胞子を０．５％Ｔｗｅｅｎ８０に回収し、そして欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載のプレ培養培地（グルコース（２５ｇ／Ｌ）；カゼイン加水分解物（１０ｇ／Ｌ）；酵母抽出物（１５ｇ／Ｌ）；ＮａＮＯ３（２ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２０（０．５ｇ／Ｌ）；ＮａＣｌ（１ｇ／Ｌ）；１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ６．２に調整した）に播種するために使用し、そして培養を、欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載のとおりにインキュベートした。２日後、プレ培養物由来のブロスを使用して、主培養物に播種した。これは、欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載の培地（グリセロール（６０ｇ／Ｌ）；グルコース（２０ｇ／Ｌ）；ペプトン（１０ｇ／Ｌ）；全ダイズ粉（３０ｇ／Ｌ）；ＮａＮＯ３（２ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２０（０．５ｇ／Ｌ）；１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ５．８に調整した）における１０％の最終容積で行い、そして培養を、欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載のとおりに１４４についてインキュベートした。産生されたスタチン系薬剤の分析のために、ブロスサンプル（１ｍＬ）を採取した。この目的のために、ＣＨ３ＣＮ（０．５ｍＬ）をサンプルに添加し、そして混合物をボルテックスで激しく攪拌した。細胞破砕物を、３０分間、１４，０００ｒｐｍでスピンした。上清を、ＬＣ／ＭＳ分析に使用した。プラバスタチン、ロバスタチンおよびコンパクチンを、いくらかの希釈（１５、５、５、２．５、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬ）でコントロールとして使用した。以下の条件を使用して、ＬＣ／ＭＳを実施した。
【００５３】
【表１】
2009540811.tif 000002
【００５４】
欧州特許第１，２６６，９６７号明細書に記載の条件下でプラバスタチンを産生する株は認められない（表１）。
【００５５】
【表２】
2009540811.tif 000003
【００５６】
［比較例２］
［国際公開第９９／１０４９９号パンフレットに記載の株によるスタチン産生］
［Ｐ−４５０ｓｃａ−２遺伝子の単離］
国際公開第９９／１０４９９号パンフレットに従って、野生型ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）細胞に、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）Ｐ−４５０ｓｃａ−２遺伝子を備え付けた。それ故、株ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ−ＢＰ１１４５を、２５ｍｌ液体培地（ｇ／Ｌで：酵母抽出物、１；カザミノ酸、４；グリセロール、４；ＭｇＳＯ４、Ｉ；ＣａＣＩ２、０．１；微量元素、２ｍＩ（０．１％ＺｎＳＯ４．７Ｈ２０、０．１％ＦｅＳＯ４．７Ｈ２０、０．１％ＭｎＣＩ２．４Ｈ２０）；０．５％グリシン）に播種し、そして２８℃、２８０ｒｐｍで、７２時間、インキュベートした。菌糸体を遠心分離により回収し、０．７％ＮａＣｌで１回洗浄し、続いて、ゲノムＤＮＡを、ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら（１９８５年、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ）に従って、単離した。遺伝子特異的順方向および逆方向プライマー（配列番号１および２）を使用して、単離された染色体ＤＮＡに対して実施されるＰＣＲによって、コンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子Ｐ−４５０ｓｃａ−２をクローニングした。ＰＣＲ反応混合物を、５０μｌにおいて、テンプレートとしての１２５ｎｇのゲノムＤＮＡ、２５０ｎｇの両方のプライマー、２単位のＰｗｏポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１×Ｐｗｏ緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰおよび４μｌ  ＤＭＳＯにより実施した。１．２ｋｂの平滑ＰＣＲ  ＤＮＡ−フラグメントを、ベクターｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして、構築物ｐＣＲＰ４５０ａを得た。ｐＣＲＰ４５０ａにおいてヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するＰＣＲ挿入物を、ＤＮＡ配列解析によって確認した。ＮｃｏＩによる部分消化およびＥｃｏＲＶによる完全消化後、１．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ｐＣＲＰ４５Ｏａから単離し、そしてＮｃｏＩおよびＳｍａＩ消化された真菌発現ベクターｐＡＮ８−Ｉ（Ｐｕｎｔ  ＆  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１６：４４７−４５７）にクローニングした。得られた組込み構築物ｐＡＮＰ４５０ａは、制限分析によって確認され、これは、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターの下流にストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有する。得られたプラスミドを図２に示す。
【００５７】
［Ｐ−４５０ｓｃａ−２遺伝子によるペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）形質転換体の入手］
プロトプラスト形質転換、糸状菌に使用される典型的な手順を介して、ｐＡＮＰ４５０ａをペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＮＲＲＬ８０８２に導入した。方法の詳細については、国際公開第９９／１０４９９号パンフレットに記載されている。また、本発明者らは、ｐＡＮＰ４５０ａおよびｐＡＮ７−１（プント（Ｐｕｎｔ）およびファン・デン・ホンデル（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）、１９９３年）を同時導入し、そしてハイグロマイシンに対し形質転換体を選択した。ハイグロマイシンポジティブ形質転換体を入手し、そして新鮮ハイグロマイシンプレート上で再度、画線培養した。ＰＣＲを適用して、ハイグロマイシンポジティブコロニーがまた、ｐＡＮ４５０ａプラスミドも入手したことを立証した。この目的のために、コロニー材料の小片を５０μｌのＴＥ緩衝液（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）に再懸濁し、そして９５℃で１０分間、インキュベートした。細胞破砕物を、５分間、３０００ｒｐｍでスピンした。５μｌの上清を、Ｐ−４５０ｓｃａ−２特異的順方向および逆方向プライマー（配列番号３および４）を使用するＰＣＲ反応に使用した。合計で、８つのハイグロマイシン耐性体、Ｐ−４５０ｓｃａ−２ポジティブかつ安定な形質転換体を得た。
【００５８】
［振盪フラスコはＰ−４５０ｓｃａ−２遺伝子によるペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）形質転換体を試験する］
ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）スラント上、２〜７日間、２５℃で株の胞子形成を誘導した。胞子を０．５％Ｔｗｅｅｎ８０に回収し、そして実施例１に記載のプレ培養培地に播種するために使用した。２日後、プレ培養物由来のブロスを使用して、主培養物に播種した。これは、実施例１に記載の培地における１０％の最終容積で行った。産生されたスタチン系薬剤の分析のために、１ｍＬのブロスサンプルを採取した。この目的のために、０．５ｍＬのアセトニトリルをサンプルに添加し、そして混合物をボルテックスで激しく攪拌した。細胞破砕物を、３０分間、１４０００ｒｐｍでスピンした。実施例１のように、上清をＬＣ／ＭＳ分析に使用した。表２において見ることができるように、国際公開第９９／１０４９９号パンフレットに記載の条件下でプラバスタチンを産生する株は認められない。
【００５９】
【表３】
2009540811.tif 000004
【００６０】
［実施例３］
［ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）コンパクチン産生宿主細胞の単離］
ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）は、天然のコンパクチン生産者である（Ｙ．アベ（Ｙ．Ａｂｅ）ら、２００２年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６７，６３６−６４６）。代謝経路をコードする遺伝子は、ゲノム上で１つのフラグメントにクラスター形成する。これらの遺伝子のいくつかの機能的役割については、文献ならびに全クラスターまたは特異的調節因子の過剰発現によりコンパクチン力価が増加するという事実から説明される（アベ（Ａｂｅ）ら、２００２年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６８：１３０−１３７；アベ（Ａｂｅ）ら、２００２年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８：３５２−３６１）。しかし、野生型株および組み換え株の力価は極めて低く、そのためより良好な産生宿主が有望である。コンパクチン産生宿主細胞のための出発株として、その株の性能を改善するためのいくらかの回数の株改善を経た任意の産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株を使用することができる。これらの株の例には：ＣＢＳ４５５．９５（ゴウカ（Ｇｏｕｋａ）ら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１８９−２００）、Ｐａｎｌａｂｓ  Ｐ２（ライン（Ｌｅｉｎ）、１９８６年、Ｔｈｅ  Ｐａｎｌａｂｓ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ，ｉｎ‘Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ’、ヴァネク（Ｖａｎｅｋ）およびホスタレック（Ｈｏｓｔａｌｅｋ）（編）、１０５−１４０；Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ、マサチューセッツ州）、Ｅ１およびＡＳ−Ｐ−７８（フィエロ（Ｆｉｅｒｒｏ）ら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６２００−６２０４）、ＢＷ１８９０およびＢＷ１９０１（ニューバート（Ｎｅｗｂｅｒｔ）ら、１９９７年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：１８−２７）がある。コンパクチン産生宿主細胞として使用することができるβ−ラクタムを含まない誘導体を単離するためには、産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株のβ−ラクタム生合成タンパク質をコードする遺伝子のすべてのコピーを欠失しなければならない。これらの遺伝子は、産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株系統において複数のコピーに増幅されるため、単一遺伝子の欠失を介してこれを行うことは実行可能ではない。最良のアプローチは、まず、生合成遺伝子の組の僅か１コピーを伴う産業用株の誘導体を単離することである。すべての遺伝子増幅は、同じ染色体上の直接反復であるため（フィエロ（Ｆｉｅｒｒｏ）ら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６２００−６２０４）、コピーの消失を生じる異なる反復の間に組み換えが存在し得る（ニューバート（Ｎｅｗｂｅｒｔ）ら、１９９７年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：１８−２７）。これは、無作為なプロセスであり、そして変異誘発処置を介して誘導することができる。誘導体は、ペニシリン産生の減少およびペニシリン生合成遺伝子のコピー数の減少についてスクリーニングすべきである。十分な誘導体がスクリーニングされるならば、これらの単一コピー単離体を見出すことが可能である。次いで、それらの単離体は、相同組み換えを介する標的化された遺伝子ノックアウトに使用される。
【００６１】
［単一コピー単離体の単離］
ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）プロトプラストの調製は、カントラル（Ｃａｎｔｏｒａｌ）ら、１９８７年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９４−４９７に記載のように行ったが、但し、溶解酵素としてノボザイム（ｎｏｖｏｚｙｍｅ）の代わりにグルカネックス（ｇｌｕｃａｎｅｘ）を使用した。プロトプラストを菌糸体から分離し、洗浄し、そしてフェニル酢酸を伴わないが、１５ｇ／Ｌ寒天および１Ｍサッカロースで補充された無機培地寒天（米国特許出願公開第２００２／００３９７５８号明細書）上でプレート化した。再生コロニーを、サッカロースを伴わないプレートに移し、胞子形成を誘導した。胞子を回収し、０．９ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、希釈し、そしてＹＥＰＤ寒天プレート（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコースおよび１５ｇ／Ｌ寒天）上でプレート化した。単離されたコロニーを、ストック培養プレートとしての役割を果たす無機培地寒天プレートに移した。２７個の無作為な単離体を、サザンブロット分析のために選択して、相対的な遺伝子−コピー数を決定した。このため、細胞を、液体無機培地において４８時間、２５℃および２８０ｒｐｍで増殖させた。細胞を回収し、０．９ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、そしてペレットを液体Ｎ２中で凍結した。乳棒および乳鉢を使用して凍結細胞を破砕し、プラスチックチューブに移し、そして等容積のフェノール：ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加した。この混合物をボルテックスで激しく撹拌し、遠心分離し、そして水相を新鮮なチューブに移した。これを２回繰り返したが、各操作で所定容積の新鮮なフェノール：ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を使用した。最後に、エタノール沈殿（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）によって、水相からＤＮＡを単離した。ＤＮＡ（３μｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、０．６％アガロース上で分離し、そしてサザンブロッティングによってナイロン膜に移した。プローブとして、ｐｃｂＣおよびｎｉａＡを適用した。前者はペニシリン生合成遺伝子のコピー数を表し、そして後者はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株における単一コピーとして存在する内部コントロール（遺伝子は亜硝酸レダクターゼをコードする）である。プローブ配列を、遺伝子特異的プライマー（表３を参照のこと）を使用して増幅し、そして供給者の指示に従って、ＥＣＬ非放射性ハイブリダイゼーションキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。両方のシグナルの強度の間の比率（ｐｃｂＣ：ｎｉａＡ）を使用して、ペニシリン遺伝子クラスターの相対的な遺伝子コピー数を見積もった。親株および単一コピー研究用株Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５をコントロールとして適用した。
【００６２】
【表４】
2009540811.tif 000005
【００６３】
最も低い比率を伴う株を、フェノキシ酢酸を伴う液体無機培地におけるペニシリン産生について試験した。ペニシリンＶ産生を、ＮＭＲにより決定した。ｐｃｂＣ：ｎｉａＡ比の減少を伴う株はまた、ペニシリンＶ力価の減少を示した。上記と全く同様に、２回のプロトプラスト化、スクリーニングおよび分析を経た１つの株を選択した。さらに、２７個の無作為な単離体を選択し、そして詳細に分析した。いくらかの推定的な「単一コピーの」ペニシリン生合成遺伝子クラスター候補（矢印で示す）が、研究用株Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５に匹敵するｐｃｂＣ：ｎｉａＡ比を示したため、サザンブロット（図３を参照のこと）から、これらを同定した。これらのうち３つを選択し、そして振盪フラスコにおいて、ペニシリンＶ産生について試験した。コントロールとして、本来の産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）親、中間的親、研究用株Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５およびこの研究用株を含まない性誘導体、ｎｐｅ１０（カントラル（Ｃａｎｔｏｒａｌ）ら、１９９３年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７３７−７４４）を使用した。３個のすべての単離体は、劇的に減少したペニシリンＶ力価を示し、単一コピーの研究用株Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５に匹敵し、従って、これらの３つの単離体は、僅か１コピーのペニシリン遺伝子クラスターを保持するが、古典的な株改善を介して誘導されるすべての変異も保持する産業用単一コピー単離体であると結論付けられた（図４）。
【００６４】
［欠失最終コピーペニシリン生合成遺伝子］
保持された最終コピーのペニシリン遺伝子クラスターの３つの生合成遺伝子を不活化するために、二重相同組み換えストラテジーを適用した。生合成遺伝子の隣の配列を、この遺伝子座に対するａｍｄＳ選択マーカーを標的化するためのフランキングとして使用した。二重相同的交差が生じる場合、形質転換体は、（ａｍｄＳ遺伝子の存在のため）アセトアミドを唯一の炭素源として使用し、ペニシリン系薬剤を産生すべきではなく、そしてｐｃｂＣプローブにハイブリダイズすべきではない。二重相同的交差は、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）において稀な事象であるため、次の３つの構築物が産生された：ａｍｄＳ遺伝子のいずれか一方の側に３ｋｂフランクを伴うもの、５ｋｂを伴うものおよび７ｋｂフランクを伴うもの（図５を参照のこと）。適応したオリゴヌクレオチドを表４に列挙する。
【００６５】
【表５】
2009540811.tif 000006
【００６６】
ＰＣＲ増幅後、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して、フラグメントをｐＣＲＸＬにクローニングした。続いて、３つのすべてのフランキング（３、５および７ｋｂ）を、Ａｃｃ６５１およびＮｏｔＩで消化し、その後、Ａｃｃ６５１およびＮｏｔＩで予め消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。得られたフランキングプラスミドを、ＮｏｔＩで消化して、ＮｏｔＩおよびＥｃｏ５２１で予め消化した右側フランクのクローニングを容易にした。得られた３、５および７ｋｂフランキングプラスミドは、すべて、左側フランクと右側フランクとの間に独特なＮｏｔＩ部位を有し、選択マーカーとしてのａｍｄＳ遺伝子をクローニングするのに使用した。これは、ｐＨＥＬＹ−Ａ１（国際公開第０４／１０６３４７号パンフレットに記載されている）をＮｏｔＩで消化し、そして３．１ｋｂのＰｇｐｄＡ−ＡｎａｍｄＳ発現カセットを単離することによって、入手した。ＫｐｎＩによる消化後に、このようにして得られた欠失フラグメントを単離し、そして、ペニシリン遺伝子クラスター単一コピー単離体に形質転換した。形質転換体を、アセトアミド選択プレート上で増殖するそれらの能力に対して選択し、以後、コロニーを無機培地にレプリカプレーティングし、そして４日間の増殖後、それらに、β−ラクタム感受性生物インジケーター、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＥＳＳを重層することによって、抗生物質産生についてスクリーニングした。コロニーがなおβ−ラクタム系薬剤を産生する場合、これは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の増殖を阻害する。試験した２７，０７６個の形質転換体のうちの２２個（０．０８％）は阻害ゾーンを示さず、そしてさらなる分析のために選択した。これらの２２個の単離体を、次の３つのプライマーの組によるコロニーＰＣＲを介して分析した：単一コロニー遺伝子の内部コントロールとしてのｎｉａＡ；選択マーカーのためのａｍｄＳ；ペニシリン生合成遺伝子の有無のインジケーターとしてのｐｅｎＤＥ。
【００６７】
【表６】
2009540811.tif 000007
【００６８】
【表７】
2009540811.tif 000008
【００６９】
すべての２２個の推定変異体は、ペニシリン生合成の最後の工程を触媒するアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｐｅｎＤＥのシグナルを示さなかった。２個の変異体がａｍｄＳのシグナルを示さなかったことから、選択マーカー遺伝子の自然消失が示唆される。すべての２２個の単離体は、β−ラクタム生合成遺伝子を伴う産業用ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株誘導体であり、そしてコンパクチン産生の可能な宿主として適任であることが結論付けられた。
【００７０】
［振盪フラスコ試験］
すべての２２個の変異体を、振盪フラスコにおいて試験して、前駆体としてフェニル酢酸を伴う液体無機培地に変異体を播種することによって、ペニシリンネガティブ表現型を確認した。サンプルをＮＭＲで分析し、ペニシリンＧを産生することが可能な変異体が存在しないことを確認し（図６）、従って、すべてが、正確にペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）β−ラクタムを含まない単離体であることが結論付けられた。
【００７１】
［コンパクチン遺伝子の組の単離］
ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＮＲＲＬ８０８２から染色体ＤＮＡを単離した。全遺伝子クラスターは、そのサイズ（３８ｋｂ；図７）のためＰＣＲを介して増幅することが困難であるため、それを、３つのフラグメント：１８ｋｂ、１４ｋｂおよび６ｋｂに分割した。１４および６ｋｂのフラグメントを容易にＰＣＲ増幅し（図８）、そしてＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、いわゆるＬＲゲートウェイ反応により、供給者の指示に従って、エントリーベクターｐＤＯＮＲＰ４−Ｐ１ＲおよびｐＤＯＮＲ２２１にクローニングした。１８ｋｂのフラグメントを、２段階の手順でクローニングした。まず、１０および８ｋｂのフラグメントを増幅した。両方のフラグメントを、個別に、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、続いて、制限酵素クローニングおよび連結を介して共に融合した（図９を参照のこと）。最終的に、Ｇａｔｅｗａｙ工学を使用して、フラグメントを、ｐＤＯＮＲ４１Ｚｅｏベクターに移し替えた。増幅したフラグメントを、配列決定によって立証した。いわゆるＭｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（マニュアルＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎを参照のこと）使用して、コンパクチン生合成遺伝子クラスターのすべての遺伝子を含有するこれらの３つの遺伝子フラグメントを、全領域に及ぶ１つのフラグメントに再結合することができた。
【００７２】
【表８】
2009540811.tif 000009
【００７３】
［ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）形質転換］
３つのコンパクチン遺伝子クラスターフラグメントを、フレオマイシン耐性を仲介するタンパク質をコードするｂｌｅ発現カセットと共にペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）プラットフォーム株に同時形質転換した。このカセットは、ｐＡＭＰＦ７から１．４ｋｂのＳａｌＩフラグメントとして単離することができた（フィエロ（Ｆｉｅｒｒｏ）ら、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）。５０μｇ／ｍＬフレオマイシンおよび１Ｍサッカロースを伴う無機培地寒天プレート上で、形質転換体の選択を行った。これらのプロトプラスト再生プレート上に出現するフレオマイシン耐性コロニーを、サッカロースを伴わない新鮮フレオマイシン寒天プレート上で再度、画線培養し、そして胞子形成まで増殖させた。フレオマイシン耐性形質転換体を、コロニーＰＣＲを介して、１つ以上のコンパクチン遺伝子フラグメントの存在についてスクリーニングした。これのために、コロニー材料の小片を５０μｌのＴＥ緩衝液（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）に懸濁し、そして９５℃で１０分間、インキュベートした。細胞破砕物を廃棄するために、混合物を、５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清（５μｌ）を、ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ製ＳＵＰＥＲ  ＴＡＱによるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製Ｅ−ｇｅｌ９６システム上でＰＣＲ反応を分析した。
【００７４】
【表９】
2009540811.tif 000010
【００７５】
まず、１８ｋｂのフラグメントの存在を確認した。４８０個のコロニーのうち１１２個（約２３％）について、１８ｋｂのフラグメントが安定に組入れられていることが確認された。続いて、他の２つのフラグメント（１４および６ｋｂ）の存在を立証した。４５個の１８ｋｂポジティブ形質転換体はまた、コンパクチン遺伝子クラスターの両方の他の部分を有し、それによって推定コンパクチン産生株として適任であった。
【００７６】
コンパクチン振盪フラスコ試験
全コンパクチン遺伝子クラスターを伴うペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）プラットフォーム株形質転換体を、（加水分解された）コンパクチンおよびＭＬ−２３６Ａ（６−（２−（１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−８−ヒドロキシ−２−メチル−１−ナフタレニル）エチル）テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オン）の存在について、（フェニル酢酸を伴わない）液体無機培地において評価した。２５℃、２５ｍｌにおいて１６８時間の培養後、上清を、以下の装置および条件を使用するＨＰＬＣで分析した：
【００７７】
【表１０】
2009540811.tif 000011
【００７８】
２つの異なる勾配を使用した：
【００７９】
【表１１】
2009540811.tif 000012
【００８０】
【表１２】
2009540811.tif 000013
【００８１】
野生型ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）株は、いずれのスタチン系薬剤を十分には産生しない一方、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）形質転換体は、有意な量を産生する（表９）。ＨＰＬＣクロマトグラムの例を図１０に示す。これらのデータから、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）産業用産生株の誘導体をコンパクチンの産生のための宿主細胞として使用する高い可能性が確認される。
【００８２】
【表１３】
2009540811.tif 000014
【００８３】
［実施例４］
［ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）プラバスタチン産生宿主細胞の単離］
［株の構築］
実施例２に記載のプラスミドｐＡＮ４５０ａを使用して、実施例３に記載のようにペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）β−ラクタムを含まない株を形質転換した。この目的のために、すべての３つのコンパクチン遺伝子フラグメント、ｐＡＮ４５０ａおよびフレオマイシン遺伝子カセットを、実施例３に記載のようにペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞に同時形質転換した。フレオマイシン選択プレートに対する最初の選択後、コロニーを選択プレート上で再度、画線培養し、そしてコロニーＰＣＲに使用した。第１に、表８に示されるプライマーを使用して、実施例３に記載のコンパクチン遺伝子の存在を確認した。第２に、配列番号３および４のプライマーを使用して、実施例２に記載のＰ−４５０ｓｃａ−２遺伝子の存在を確認した。２つの形質転換体、Ｔ１．４８およびＴ１．３７は、すべての遺伝子を含有することが示され、続いて、振盪フラスコ分析に使用した。
【００８４】
［プラバスタチン振盪フラスコ培養およびＨＰＬＣ分析］
両方の形質転換体を、以下を（ｇ／Ｌで）含有する尿素を含まない真菌用無機培地において培養した：グルコース（５）；ラクトース（８０）；（ＮＨ４）２ＳＯ４（２．５）；Ｎａ２ＳＯ４（２．９）；ＫＨ２ＰＯ４（５．２）；Ｋ２ＨＰＯ４（４．８）およびクエン酸を含有する１０ｍｌ／ｌの溶液（１５０）；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（１５）；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（１５０）；Ｈ３ＢＯ３、０．００７５；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．２４；ＣｏＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．３７５；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（０．５）；ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ（２．２８）およびＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（０．９９）；滅菌前のｐＨ６．５。培養物を２５℃、オービタルシェーカー中、２８０ｒｐｍで１２０時間、インキュベートした。ＨＰＬＣ分析は、実施例３と同じであった。勾配２を使用して、保持時間は：加水分解されたコンパクチン、１１．５分；プラバスタチン、９．７分およびＭＬ−２３６Ａ、８．６分であった。
【００８５】
親のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）コンパクチン形質転換体、野生型ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）株、または実施例２のペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）形質転換体は、いずれも何らプラバスタチンを産生しない一方、コンパクチンおよびＰ−４５０ｓｃａ−２遺伝子の両方を具備するペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）形質転換体は、プラバスタチンを産生する。形質転換体Ｔ１．４７のＨＰＬＣクロマトグラムの例を図１１に示す。
【００８６】
［形質転換体Ｔ１．４８ブロスのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析］
ＨＰＬＣを介して同定されるピークが実際にプラバスタチンであったことを立証するために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。この目的のために、サンプルを水で１：１に希釈し、そして以下のとおりにＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入した：
【００８７】
【表１４】
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【００８８】
プラバスタチンは、ＬＣ方法を使用して、８．７分に溶出する。プラバスタチンは、ＥＳＩ／ネガティブモードで、ｍ／ｚ４２３における脱プロトン化分子［Ｍ−Ｈ］−によって特徴付けられる。ＭＳ／ＭＳモードでは、１０２（メチル酪酸）および１２０（１０２−Ｈ２Ｏ）の特徴的な消失が観察され（図１２）、コンパクチンおよびＰ−４５０ｓｃａ−２遺伝子を具備するこのペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）形質転換体は、単純および限定された栄養素から出発する単一の発酵培養においてプラバスタチンを産生することが可能であることが確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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