(57)【要約】ｍＲＮＡ転写産物プロファイリングが，原発ＮＰＣのための遠隔転移の分子的予測指標を定式化するために使用できる。予測された結果は，短い無転移生存及び全体的生存と高度な相関がある。予測は，５２個の遺伝子に基づく予測指標及び１２個の遺伝子に基づく予測指標を用いてなされる。
2009516501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鼻咽腔癌を有する患者における遠隔転移のリスクを評価する方法であって，該患者からのサンプルにおいて表４に掲げられた５２個の遺伝子の発現プロファイルを，表１のそれぞれの回帰モデル方程式を用いて表４に示された９個の遺伝子クラスターの各々について生み出されたロジットスコアの集団にｋ−近傍分類法を適用することによって生み出された予測ルールを用いて評価し；表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現プロファイルを，予測ルール，
〔遠隔転移につき低リスクである確率〕＝１／{１＋ｅ-(ロジットスコア)}
〔ここに，ロジットスコアは，表２の回帰モデル方程式を用いて該１２個の遺伝子の発現プロファイルに基づいて生み出される。〕を用いて評価し；そして該２つの予測ルールからのリスク結果を比較し，該方法の両方から決定される遠隔転移のリスクが低い又は高いときに，リスクを，それぞれ，低い又は高いと記録し，該決定されたリスクが不一致であるときにはリスクは不確定を記録されるものである，方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，一般に，鼻咽腔癌の状態及び結果を評価及び／又は予測するための，それらの癌患者のためにそのような癌に関連付けられた遺伝子の発現レベルを測定し，個々人に合わせた予測又は結果の評価を可能にすることを含んでなる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
鼻咽腔癌（ＮＰＣ）は，上部気道食道（upper aerodigestive tract）のその他の悪性腫瘍とは疫学，病理学，臨床像及び治療への応答の面で異なった，頭頚部癌の明確な１タイプである1,2。ＮＰＣの発症は，ＥＢ（Epstein-Barr）ウイルス（ＥＢＶ）の感染と関係していると考えられている3,4。このタイプの癌は，南中国，台湾及び東南アジアに特有のものである（一年あたり100,000人あたり，25〜30人）5-8。それは，隣接の器官に浸潤し，後咽頭リンパ節及び頚部リンパ節を侵し，遠隔部位へ播種し得る，比較的攻撃的な頭頚部癌の1つである9-11。
【０００３】
過去３０年間における放射線療法の進歩は，ＮＰＣの長期管理を成功させてきた12-16。放射線療法は，ＮＰＣ治療の，議論の余地のない支柱である。ステージＩ及びIIの疾患を有する患者は，放射線療法のみで高い率で治癒を得ている。それにも拘らず，新たにＮＰＣと診断される患者の７０％以上が，ステージIII及びIVの疾患を有している14,17。これらの患者は，治療結果を改善させるために，追加の現行の化学療法を受けることを必要とする15,16。更には，ステージIII及びIVa/bの疾患を有するＮＰＣ患者の約３０％で，最終的には遠隔転移，すなわち，ＮＰＣの局所領域の外側への転移が起きる14,17。全ＮＰＣ患者の１０ないし２０％が，遠隔転移を伴っており，最初の診断時点でステージIVcの疾患を有している14,17。大半の患者は，遠隔転移が生じた後まもなく，当該疾患で死亡する。遠隔転移は，しばしば，ステージIII及びIVのＮＰＣ患者において，局所領域の再発なしに起こり，最も重要な予後因子である。
【０００４】
最近のメタ分析は，進行したステージのＮＰＣを有する患者における生存の改善が，遠隔転移の予防と管理を見込んで同時に行われる全身的化学療法の結果であるらしいことを示した15,16。ＮＰＣ患者の７０％より多くがステージIII及びIVの疾患を呈しそして彼らの約３０が遠隔転移を起こし得ることを考えると14,17，これらの患者の生存の更なる改善は，遠隔転移のリスクが高い患者を，最初に疾患を呈した時に首尾よく同定することから始めなければならない。そのような予測が現実のものとなるとき，現時点で最適化されている治療を適用することができ，また，全体としての生存を改善するため，遠隔転移の一層効果的な防止及び管理のためのより新しい治療方式を試験するための臨床試験を設計することができる。
【０００５】
遠隔転移のリスクは，より進行したステージのＮＰＣで増大することが知られていることから14,17，遠隔転移の防止と長期生存の改善のために放射線療法と化学療法の適切な組み合わせの選択の指針を示すため，ＴＮＭステージ分類が使用されてきた15,16,31。例えば，ＡＪＣＣステージIIIの患者は，T1N2M0及びT2aN2M0疾患を有する患者を除き，Koo Foundation SYS Cancer Center（台北，台湾）では，同時的な化学−放射線療法（ＣＣＲＴ）及びシスプラチンと５−ＦＵによる２サイクルの補助的化学療法により，治療されてきた31。ステージIVa/bの患者は，ＣＣＲＴで治療され，これに補助的化学療法の２サイクルと，５−ＦＵとロイコボリンによる毎週の維持的化学療法が６ヶ月続く31。ステージIIIの疾患を有する相当多数の患者がこの治療によく応答して優れた生存を示したものの（図６），ステージIIIの患者の約２０％は遠隔転移を起こし，生存は不良であった。最初の治療から３年以内に遠隔転移を起こしたステージIIIの患者の，全体としての且つ無転移の生存は，ステージIVa/bのＮＰＣ患者のそれに重なった（図６）。
【０００６】
これらの知見は，遠隔転移を起こすリスクのあるステージIIIの患者は，ネオアジュバント（neoadjuvant）化学療法，より新しい又はより強力な補助療法，及び／又は維持療法により，一層積極的に治療されるべきであったか否か，という疑問を提示している。遠隔転移を起こすリスクのあるステージIVa/bのＮＰＣ患者のための治療の十分さも，また問われている（図６）。これらの知見全てが，診断時点でのそして治療開始前における，遠隔転移を起こすリスクのあるＮＰＣ患者の同定の臨床的重要性を際立たせている。そのような患者を同定して，遠隔転移のリスクの低いステージIII及びIVa/bのＮＰＣ患者を除外する能力は，より効果的な臨床試験を実施するためには重要である。
【０００７】
以前に報告されたように，マイクロアレイ分析は，腫瘍の分類18-22のための分子署名とそれらの臨床的挙動23-30，例えば遠隔転移のリスクや種々のタイプの悪性腫瘍を有する患者におけるおよその生存の予測等を同定するために，首尾よく用いられてきた。他の諸研究がＮＰＣに関わっている37-54。
【０００８】
2002年10月24日に提出された米国特許出願第60/420729；2002年10月25日提出の米国特許出願第60/421102；2002年10月25日提出の米国特許出願第60/421062；2002年11月8日提出の米国特許出願第60/424701；2002年11月8日提出の米国特許出願第60/424718；2002年11月8日提出の米国特許出願第60/424715；2002年11月12日提出の米国特許出願第60/425256；2003年2月21日提出の米国特許出願60/448462；2003年2月21日提出の米国特許出願60/448466；2003年3月27日提出の米国特許出願第60/457877；2003年3月31日提出の米国特許出願第60/458373；2002年11月12日提出の米国特許出願第10/291878；2002年11月12日提出の米国特許出願第10/291886；2002年11月12日提出の国際出願US02/38216；及び2002年11月12日提出の国際出願US02/38222；2004年12月20日提出の米国特許出願第11/015764；2005年3月28日提出の米国特許出願11/090294；及び2005年3月25日提出の米国仮特許出願第60/665652をも参照。これら全ての開示全体を，ここに用いる方法論に関する詳細につき，参照によりここに導入する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は，ＮＰＣ患者における遠隔転移に関するゲノム署名を同定している。ＮＰＣ患者における遠隔転移についてのこの改良された予測は，遠隔転移の防止及び／又は改善及び長期生存のために適切な治療（例えば，放射線及び／又は化学療法）が選択できる高リスクの個々の患者を同定することを可能にする。こうして，一面において，本発明は，ＮＰＣ患者における遺伝子発現レベルを，当該患者におけるリスク要因と臨床結果とに相関づける方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って本発明は，鼻咽腔癌を有する患者における，当該患者からのサンプルにおける，下の表４及び５に掲げられた少なくとも１つの遺伝子の発現プロファイルを評価することを含んでなる，遠隔転移のリスクを評価する方法に関する。好ましくは，本質的に全て，そして特に表４の５２個の遺伝子の全て，及び／又は本質的に全て，特に表５の１２個の遺伝子の全てが，例えば患者のサンプル，好ましくはＮＰＣ組織サンプルにおいて，発現レベルについて評価される。こうして，表４又は５の２個又はそれより多くの遺伝子を，確率解析のために評価されるそれら多くの遺伝子が当該疾患の結果（例えば，遠隔転移）と相関づけられる限り，用いることがきる。別の具体例においては，１２遺伝子の集合について，３個以上，４個以上，５個以上，６個以上，７個以上，８個以上，９個以上，１０個以上，又は１１個以上の遺伝子を用いることができる。そのような個数の遺伝子はまた，５２個遺伝子の集合に関して用いることができ，又は１２個以上・・・１５個以上・・・２０個以上・・・２５個以上・・・３０個以上・・・３５個以上・・・４０個以上・・・４５個以上・・・５０個以上・・・５１個以上といった数の遺伝子，並びに，ここに明示的には述べていない包含はされる数の他の遺伝子をも，用いることができる。各集合からの遺伝子のそのような数はまた，下に述べる方法との組み合わせにおいて用いることもできる。勿論，最適の結果のためには，全て又は本質的に全ての遺伝子が，一般に用いられる。従って，別の一面においては，上記の方法において用いられる遺伝子は，ここに掲げられたものの１個以上のものである。
【００１１】
本発明はまた，遠隔転移に関係づけられたそのような遺伝子の全て又は部分集合の，例えば媒質中又はキット等に入れた収集物に関し，また，本発明の方法を実施するに当たって使用される関連した方法，媒質及びキットに関する。
【００１２】
本発明の別の一面によれば，分析される患者試料は，血液，腫瘍又は細胞等，如何なる組織であってもよい。好ましくは，試料はＮＰＣ腫瘍からのものである。分析すべき試料を得る方法は，当該分野において知られている。
【００１３】
本発明は，ＮＰＣ患者における遠隔転移の評価又は予測に関係する遺伝子のコレクションを提供する。そのような遺伝子は，そのような癌の表現型の一つに少なくとも関連するある発現パターン（すなわち，発現レベル又は発現の欠如）を有する。更なる遺伝子がまたＮＰＣに関与している可能性も，理解されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のために，十分に資料付けられた臨床データを有するＮＰＣ患者からの生検バンクに基づいて，遺伝子発現プロファイリング研究が行われた。検討した全ての生検サンプルは，液体窒素中に保存した。総ＲＮＡにかなりの分解が起こっていないサンプルのみを検討した。オペレーター絡みの変動を最小限にするために，腫瘍サンプルの処理及びマイクロアレイデータの採取には，２名の高度に訓練された技術者のみを用いた。彼らは，遠隔転移のリスクの高い又は低い患者からの同様な数の標本を，無作為に取扱った。両名の技術者によって実施され収集されたマイクロアレイデータの統計解析は，如何なる統計学的偏りも示さなかった（図７）。我々はまた，研究全体を通して，同じフルイディックステーション（fluidic station）及び同じスキャナーを用いた。
【００１５】
チップの製造，サンプル処理，ｃＲＮＡの負荷量及びチップ操作に関連した変動を更に最小限にするために，各マイクロアレイのデータ遺伝子発現強度データは，Affymetrix MAS 5.0ソフトウェアを用い，続いて，我々の研究室で先に確立されたＮＰＣ参照標準による各プローブ集合の発現強度の分位値正規化を行って，５００のトリムド平均（trimmed mean）へと正規化した。実施例１を参照のこと。そのような正規化アプローチの有効性は，６つの無作為に選ばれたＮＰＣ標本に基づき反復測定されたGeneChip結果の比較により検証された。これらの結果は，プローブ集合レベルでの分位値正規化手順が，実験誤差を修正する上で実際に効果的であることを示した（図８）。
【００１６】
高度な監督下での分析が実施された。既に述べたように，最初の治療から３年以内に遠隔転移を起こしていない大半のＮＰＣ患者は，長期生存が良好であり，生存が不良という結果となるＮＰＣ患者は，通常，最初の治療から３年以内に遠隔転移を起こす。遠隔転移についてのより信頼できる分子署名を同定するために，疾患の両端において臨床的に十分定義づけられたこれら２つのグルーからの生検標本が分析に用いられた。信頼できる分子的予測指標を見出すためにそのようなアプローチを取ることの利点は，最近報告されている35。
【００１７】
同時に，過剰適合（overfitting）は，Simon等36によって明示されたように，高次元の測定によって限られた数の患者からクラス予測指標（class predicator）を見出すについての重大な落とし穴である。過剰当てはめの問題を克服するために，真に独立の，検証用の症例のテスト集合が含められ，できる限り多数の患者が研究に含められた。１３８名の適格患者が含められた。更に，低リスク及び高リスクグループの患者からの１／３は，研究を正に開始する際に，検証目的で，独立のテスト集合に無作為に割り当てられた。年齢，性別，腫瘍の段階，追跡期間等のような重要な臨床変数は，無作為化のために考慮された。全てのテスト集合の症例は，訓練期間を通して予測指標遺伝子の選択及び予測ルールの確立には関与させなかった。テスト集合に関する本発明の結果は，感度，特異性及び全体的正確さが，他のタイプの固形癌についてこれまで文献23,24,27-30に報告されているものと同等又はそれより良好であることを示した。
【００１８】
生存能力のある腫瘍細胞及び周囲のリンパ球様／炎症性／間質性細胞の量は，異なる患者の生検標本間で有意に変動し得る（生物学的不均質性）。入手し得る生検組織の量が非常に限られていることと，ＲＮＡの不安定さのため，発現プロファイリングに用いた生検標本の組織学的検査は，しかしながら，実施しなかった。また，診断用生検の場所とGeneChip研究場所とが同じでなかったことから，診断目的の生検標本の組織学も，予測された結果の正確さと相関づけられなかった。生検標本の不均質性に関連するノイズは，予測の正確性を限定し得る。
【００１９】
２通りの好ましい予測ルールが本発明により生み出される。実施例ＩＶ及びＶを参照のこと。一方は，５２個の遺伝子の署名及びｋ−ＮＮ分類法に基づき，他方は，１２個の遺伝子及びロジスティック回帰分析に基づくものである。
【００２０】
ある集合においては，９個の異なったＳＯＭクラスターからの５２個の遺伝子が予測に使用される。それらは表４にまとめられている。NIAID-DAVIDツール（http://apps1.niaid.nih.gov/david/）によれば，５２個の遺伝子には，シグナルトランスダクション（ｎ＝９），ｍＲＮＡプロセシング（ｎ＝７），転写制御（ｎ＝３），タンパク質合成（ｎ＝４），ヌクレオチド代謝（ｎ＝４），脂質代謝（ｎ＝３），タンパク質の折り畳み（ｎ＝３），細胞質分裂（ｎ＝２），核輸送（ｎ＝２），タンパク質異化（ｎ＝２），抗アポトーシス（ｎ＝１），ＡＴＰ合成（ｎ＝１），細胞サイクル（ｎ＝１），免疫応答（ｎ＝１），細胞間タンパク質輸送（ｎ＝１），及びアミノ酸輸送（ｎ＝１）に関与するものが含まれている。残りの７個の遺伝子の機能は未知である。
【００２１】
高リスクグループにおいては，５２個の遺伝子のうち２２個は，発現が低下し，３０個は発現が上昇していた。高及び低リスクグループ間での予測指標遺伝子の発現強度を比較すると，ｍＲＮＡプロセシング，核輸送，核代謝，及びタンパク質の折り畳みに関与する殆ど全ての遺伝子の平均的発現が，予測された高リスクグループにおいて大きいと認めることができた。対照的に，転写制御及びタンパク質異化に関与する全ての遺伝子の発現は，遠隔転移についての高リスクグループにおいて低下していた。
【００２２】
１２個の遺伝子に基づく予測方法に関し，６個の遺伝子はまた，ｋ−ＮＮ法において予測に用いられる５２個の遺伝子にも属する。Affymterixプローブ集合識別番号によれば，他の６個は，この５２個の遺伝子には含まれない。これら１２個の遺伝子を表５にまとめてある。これら１２個の遺伝子のうち，３個の遺伝子は，タンパク質の折り畳みに，２個の遺伝子は，タンパク質合成に，２個の遺伝子はリボソーム生物発生に，２個の遺伝子は核酸代謝に，そして各１個の遺伝子が，ｍＲＮＡプロセシング及びタンパク質異化に，関与するものであった。最後の遺伝子（推定タンパク質FLJ12671）は，核小体エクソヌクレアーゼモチーフを有していることが知られており，その正確な機能は，知られていない。１２個の遺伝子全ての機能は，５２個の遺伝子の集合のそれらとかなり重複していることが示された。５２個の遺伝子の何れにも含まれなかったこの６個の遺伝子のうちの１つ（ＰＯＵドメイン不含タンパク質）は，この５２個かの遺伝子における異なったプローブ集合識別場番号により代表される遺伝子と実質的に同一であった。この遺伝子は，ｍＲＮＡプロセシングに関与している。１２個の遺伝子の集合における３個の遺伝子は，腫瘍細胞の増殖に関与していると見られているｔ−複合体１（ＴＣＰ−１）を含む同じシャペロニンのα，β及びγサブユニットである34。これらサブユニットα及びγの遺伝子は，１２個及び５２個の遺伝子集合の両方に存在していた。サブユニットβの遺伝子は，１２個の遺伝子集合にのみ存在していた。これら全ての知見が，これら２つの集合の予測指標遺伝子の間の整合性を示した。
【００２３】
この予測ルールの使用の結果は，５２個の遺伝子による予測の方法が，１２個の遺伝子による予測の方法より低い誤り検知（false positive）率を有したことを示している（１４％対２８％）。対照的に，５２個の遺伝子による予測の方法は，１２個の遺伝子による予測の方法より高い見逃し率（false negative）を有した（３１％対１５％）。臨床試験において遠隔転移の高いリスクを有する患者の選択にこれらの予測方法が使用されると，誤検知率及び見逃し率は最小限まで下がり，低リスク患者の安全性と高リスク患者の権利とが保護されるであろう。
【００２４】
例えば，予測のためのこれら２つの方法は，１つの方法へと組み合わせることができる。これら２つの方法の間で一致した結果のみが受け入れられる。一致しない結果は，不確定とみなされる（ｎ＝８）。実施例VIを参照のこと。そのようなアプローチを取ることにより，誤検知率は１０％にまで低下した。見逃し率は，約１５％であった。独立のテスト集合において，不確定の症例は全患者の約１９％（８／４２）を占めたが，２例の臨床的に高リスクの患者のみが，分子予測指標の組み合わせ使用により，不確定のカテゴリーに割り振られた。この仕方で，良好なリスクの患者を誤って高リスク患者のための試験に含める可能性を，臨床的に高リスクの１５％（２／１３）の患者を低リスクとして除外するという代償を払って，効果的に最小限にすることができよう。臨床的に高リスクの患者の残り１５％は，低リスクであると誤って予測されるであろう（表６）。それにも拘らず，少なくとも７０％の高リスクの患者が正しく識別され，高リスク患者のための試験に含めることができる。
【００２５】
こうして，遠隔転移を起こすリスクの高い又は低いＮＰＣ患者を予測するための，５２個の遺伝子及び１２個の遺伝子の信頼できる分子的署名が，同定された。この予測は，４２の独立したテスト集合症例により検証される。この独立のテスト集合により評価された全体的正確さは，５２個の遺伝子による署名，１２個の遺伝子による署名及び組み合わせた署名につき，それぞれ，８１％，７６％及び８５％であった。これらの結果は，検証にやはり独立のテスト集合を用いた，最近発表された予測研究28,30と同等である。ネオアジュバント化学療法に対する乳癌の応答の予測について７８％の正確さが28，及び頭頚部扁平上皮細胞癌によるリンパ節転移の予測について８６％の正確さが30，報告された。これらの分子署名は，ＮＰＣ患者における，遠隔転移の予防，緩解及び管理のため，また長期生存の更なる改善のための，新しいネオアジュバント，アジュバント，維持化学療法及び／又は標的療法をガイドするのに有用であろう。遠隔転移のリスクの低い又は高いＮＰＣ患者の同定もまた，過剰治療又は治療不足の率を減らす筈である。
【００２６】
ＮＰＣ転移に関連した遺伝子の本件コレクションは，物理的のもの又は仮想のものであってよい。物理的コレクションは，種々の核酸分子の集団を含むコレクションであり，そこでは，ＮＰＣ癌関連遺伝子はその集団中に表されている，すなわちその集団内に，そのコレクション内のゲノム配列，又はより典型的にはＮＰＣ癌関連遺伝子のコード配列にに対応した核酸分子がある。多くの具体例において，それら核酸分子は，それらが対応する遺伝子のセンス鎖と実質的同一若しくは同一であるか，又は，典型的には，ストリンジェントな条件下においてそれらが対応するセンス鎖にハイブリダイズできる程までに，それらに対応するセンス鎖に相補的である。ハイブリダイズ条件の決定（すなわち，低い，中程度の，又は高いストリンジェンシー）は，当業者の知識の範囲内である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は，５０℃又はそれより上での，そして０．１ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の一例は，溶液：すなわち５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６），５×デンハルト（Denhardt's）溶液，１０％デキストラン硫酸，及び２０ｍｇ／ｍＬの，変性させた剪断サケ精子ＤＮＡの中での４２℃で終夜インキュベーション，及びこれに続く０．１×ＳＳＣ中における６５℃でのフィルター洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は，上記の代表的条件と少なくとも同等にストリンジェントな条件であり，ここに，上記の特定のストリンジェント条件の少なくとも約８０％，典型的には約９０％ストリンジェントな条件である場合には，少なくともストリンジェントであると看做される。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件も，当該分野において既知であり，本発明のこの特別の具体例の核酸を同定するために採用してもよい。
【００２７】
本件の物理的コレクションを構成する核酸は，一本鎖でも二本鎖でもよい。加えて，物理的コレクションを構成する核酸は，線状であっても環状であってもよく，各々の核酸分子は，ＮＰＣ癌に関連した遺伝子に加えて，他の配列，例えばベクター配列を含んでいてもよい。種々の異なった核酸，例えばベクターライブラリー等のようなライブラリーが，本発明の物理的コレクションを構成してよく，を構成してもよく，ここに種々のタイプの核酸の例としては，限定するものではないが，ＤＮＡ例えばｃＤＮＡ，ＲＮＡ例えばｍＲＮＡ，ｃＲＮＡその他が挙げられる。物理的コレクションの核酸は，溶液中に又は固定した形で，すなわち，アレイの具体例に見出される基材のような，固体支持体に取り付けられた形で存在していてよく，そのような多様な具体例についての記述が，以下に与えられている。
【００２８】
更に提供されるのは，本件ＮＰＣ関連遺伝子の仮想コレクションである。「仮想コレクション」により，１つ又はより多くのデータファイルその他の，コレクションの遺伝子の配列情報を含んだコンピュータ読み取り可能なデータ組織の諸要素を意味しており，ここに配列情報はゲノム配列情報であってよいが，典型的にはコード配列情報である。仮想コレクションは，如何なる適宜のコンピュータやプロセッサによる読み取り可能な記憶媒体に記録してもよい。コンピュータやプロセッサによる読み取り可能な，コレクションデータを記憶させた記憶媒体は，ＣＤ，ＤＡＴ，フロッピーディスク，ＲＡＭ，ＲＯＭ等といった如何なる便利な媒体であってもよく，その媒体は，装置のハードウェア要素によって読まれることができる。
【００２９】
更に提供されるのは，ＮＰＣ関連遺伝子の発現プロファイルのデータベースである。そのようなデータベースは，典型的には，ＮＰＣの種々の段階，産物陰性プロファイル，予後プロファイル等のような，ＮＰＣ関連表現型を有する種々の細胞／組織の発現プロファイルを含み，それらのプロファイルが以下に更に記述されている。
【００３０】
発現プロファイル及びそのデータベースは，使用を円滑にする種々の媒体に入れて準備してよい。「媒体」は，本発明の発現プロファイル情報を含んだ製品をいう。本発明のデータベースは，コンピュータによる読み取り可能な媒体，例えばコンピュータによって読みアクセスできる如何なる媒体にも，記録することができる。そのような媒体として，限定するものではないが，例えばフロッピーディスク，ハードディスク記憶媒体，磁気テープなどのような磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭ等のような光記憶媒体；ＲＡＭ及びＲＯＭ等のような電気的記憶媒体；及び磁気／光記憶媒体のようなハイブリッド媒体が挙げられる。当業者は，現在知られているコンピュータ読み取り可能な媒体の何れについても，このデータベース情報の記録を含んだ製品を創るためにどのようにして使用できるかを，直ちに理解することができる。「記録」とは，コンピュータ読み取り可能な媒体に，当業者に知られている何れかのそのような方法を用いて情報を記憶させるためのプロセスをいう。任意の便利なデータ記憶構造を，記憶された情報にアクセスするために使用する手段に基づいて，選択すればよい。例えば文書処理テキストファイル，データベースフォーマット等，種々のデータプロセッサ・プログラム及びフォーマットを，記憶のために用いることができる。
【００３１】
ここに用いるものとして，「コンピュータに基づくシステム」とは，本発明の情報を分析するために使用されるハードウェア手段，ソフトウェア手段及びデータ記憶手段をいう。本発明のコンピュータに基づくシステムの最低限のハードウェアは，中央演算処理装置（ＣＰＵ），入力手段，出力手段，及びデータ記憶手段を含んでなる。当業者は，現在入手できるコンピュータに基づくシステムの何れでも，本発明において使用するのに適していることを，直ちに理解することができる。データ記憶手段は，上記したような本情報の記録を含んだ如何なる製品又はそのような製品にアクセスできる記憶アクセス手段を含んでもよい。
【００３２】
コンピュータに基づくシステムにおいて情報の入力及び出力に用いるために，入力及び出力手段のための種々の構造的フォーマットを使用することができる。出力手段のための１つのフォーマットは，参照発現プロファイルに対する類似性の種々の度合いを処理して，発現プロファイルをランクづけする。そのような提示は，テスト発現プロファイルに含まれる類似性のランクづけ及び類似性の度合いの識別標識を，当業者に提供する。
【００３３】
遺伝子発現プロファイルは，単一の時点で測定することも，ある期間にわたって数個の時点をカバーすることもできる。遺伝子の発現レベルは，当該分野で知られている〔例えば，定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），逆転写酵素／ポリメラーゼＰＣＲ〕，又は将来考案される，遺伝子発現に関する定量的情報を提供することのできる如何なる方法によっても決定できる。
【００３４】
別の一具体例においては，遺伝子発現は，タンパク質，ポリペプチド又は核酸分子（例えば，ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ）等のような遺伝子発現産物を定量することによって決定される。核酸の定量は，核酸を直接に定量することにより，又は，対応する制御遺伝子又は制御配列要素を定量することにより，行うことができる。加えて，スプライス変異体及び多形変異体等のような，遺伝子の変異体を定量することができる。
【００３５】
別の一具体例においては，ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質又はポリペプチドのレベルを定量することによって，遺伝子発現が測定される。サンプル中のタンパク質やポリペプチドのレベルを定量してそのようなデータを発現レベルと関連付けるための方法は，当該分野において既知である。例えば，あるタンパク質やポリペプチドに特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を，当該分野において既知の方法によって取得して，サンプルや標本中のそのタンパク質やポリペプチドを検出及び／又は測定するために使用することができる。
【００３６】
好ましい一具体例においては，遺伝子発現は，サンプル又は標本中のｍＲＮＡのレベルを定量することによって測定される。これは，当該分野において知られている方法のうち任意のものを用いて行うことができる。一具体例においては，問題の遺伝子に特異的な核酸プローブを固定化して含んだ適当なマイクロアレイにｍＲＮＡを接触させ，マイクロアレイ上のそれらプローブに対するサンプル中のｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの程度を測定する。そのようなマイクロアレイもまた，本発明の範囲内にある。オリゴヌクレオチドマイクロアレイを作る方法の例が，例えばＷＯ ９５／１１９９５に記述されている。その他の方法は，当該分野において既に知られている。
【００３７】
測定され又は評価される遺伝子発現値は，遺伝子発現レベルを測定することのできる装置から得られる数値である。それらの数値は，装置からの生の値であるか，又は，好ましくは尺度を正し及び／又は正規化された値である。例えば実施例Ｉを参照のこと。特にストリンジェントな条件に付されたサンプルからの核酸（例えば，ｍＲＮＡ）は，チップ上のプローブにハイブリダイズする。分析すべき核酸（例えば，標的）は，アレイへのハイブリダイゼーションに先だって，単離され，増幅され，そして検出可能な標識で標識される（例えば，32Ｐ又は蛍光標識）。ハイブリダイゼーション後に，アレイは，ハイブリダイゼーションのパターンを検出することのできるスキャナーに挿入される。それらのパターンは，マイクロアレイに今や付着した標識された標的を検出することによって検出され，例えば，もし標的が蛍光標識されている場合には，ハイブリダイゼーションデータは，標識基から放射される光として収集される。標識された標的は，当業者に知られた適当なストリンジェンシーのもとでは，マイクロアレイに含まれる相補的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることから，そしてまた，アレイ中の各々のオリゴヌクレオチドの配列と位置とが知られていることから，プローブに加えられた標的核酸の同定がなされる。
【００３８】
本発明はまた，本発明の遺伝子発現プロファイルをモニタリングすることによって個人における治療効果をモニターするための方法をも提供する。例えば，個人についてのベースライン遺伝子発現プロファイルを決定することができ，治療中の各時点で，反復して遺伝子発現プロファイルを決定することができる。乏しい治療成績に関連付けられるプロファイルから，改善された治療成績に関連付けられるプロファイルへの遺伝子発現のシフトは，効果的な治療方法であることの証拠であり，一方，乏しい治療成績に関連付けられるプロファイルの反復は，効果の無い治療方法であることの証拠である。
【００３９】
本発明の診断応用において，ＮＰＣ転移の存在及び／又はそれが起こる確率を決定するために，細胞又はそのコレクション，例えば組織，並びに細胞／組織を含んだ動物（患者，宿主等，例えばペット，家畜，及びヒト等の動物）が，アッセイされる。そのようなものとして，診断方法は，そのような表現型の存在を決定する方法を含む。ある具体例においては，ある表現型の存在のみでなく重症度又はステージも決定される。加えて，診断方法はまた，そのような表現型が存在していないが起こり易いということを決定するよう，そのような癌の表現型を発現する傾向を決定する方法も含む。この診断方法の実施において，診断すべき細胞，組織又は患者から得られた又は由来の核酸サンプルが，発現プロファイルを作成するためにアッセイされ，次いで本発明の方法が行われる。
【００４０】
上に示したように，この診断方法において用いられる発現プロファイルを作るためにアッセイされるサンプルは，核酸サンプルである。核酸サンプルは，診断される細胞又は組織の，問題のＮＰＣ関連遺伝子の発現情報を含んだ個別の核酸の複数又は集団を含む。核酸としては，サンプルが，それらが得られたところの宿主細胞又は組織の発現情報を保持している限り，ＲＮＡ又はＤＮＡ核酸，例えば，ｍＲＮＡ，ｃＲＮＡ，ｃＤＮＡ等が挙げられる。サンプルは，例えば，単離されたｍＲＮがそのまま使用される場合には，細胞からのｍＲＮＡ単離，差次的発現技術において知られているような，増幅，ｃＤＮＡ，ｃＲＮＡ等を調製するための使用等，当該分野において知られている多数の様々な方法で調製することができる。サンプルは，典型的には，診断すべき患者から，例えば，標準の手順を用いた組織の生検等により得られた細胞又は組織から調製され，そのような核酸が作られる細胞タイプ又は組織としては，単球，内皮，及び／又は平滑筋を含むがこれらに限定されず，ＮＰＣ表現型を決定するための発現パターンが存在している如何なる組織をも含む。
【００４１】
発現プロファイルは，如何なる便利なプロトコールを用いて最初の核酸サンプルから作ってもよい。差次的遺伝子発現解析の分野において用いられているもののような，種々の異なった発現プロファイル作成方法が知られているが，代表的で簡便なタイプの発現プロファイル作成プロトコールの１つは，アレイに基づく遺伝子発現プロファイル作成プロトコールである。そのような応用はハイブリダイゼーションアッセイであり，そこでは，作るべきプロファイルにおいてアッセイされる／プロファイルされるべき各遺伝子についての「プローブ」核酸を提示する核酸が用いられる。これらのアッセイにおいて，標的核酸のサンプルは，アッセイされる最初の核酸サンプルから最初に調製され，そこでは，調製は，標的核酸を，例えばシグナル発生システムのメンバーの１つ等の標識で標識することを含んでよい。標的核酸サンプルの調製に続いて，ハイブリダイゼーション条件下にサンプルがアレイに接触させられ，それによりアレイ表面に取り付けられているプローブ配列に相補的である標的核酸との間に複合体が形成される。ハイブリダイゼーション複合体の存在が，次いで，定性的に又は定量的に検出される。本方法において用いられる発現プロファイルを作成するために行ってよい具体的ハイブリダイゼーション技術としては，米国特許5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,800,992;に記述された技術が挙げられ，それらの開示は参照により本明細書に導入され，並びに，WO 95/21265; WO 96/31622; WO97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; 及びEP 785 280が挙げられる。これらの方法において，発現が評価されようとしているＮＰＣ関連遺伝子の各々に対する「プローブ」核酸を含んだアレイが，上記の標的核酸と接触させられる。接触は，例えば上記したストリンジェントな条件のようなハイブリダイゼーション条件で行われ，結合しなかった核酸が，次いで除去される。得られたハイブリダイズした核酸のパターンは，プローブされた各遺伝子についての発現に関する情報を提供し，そこでは，発現情報は，その遺伝子が発現しているか否か，そして典型的には，発現データすなわち発現プロファイルが定性的且つ定量的であるような場合には，如何なるレベルで，という点についてのものである。
【００４２】
多くの具体例において，アッセイされる細胞／組織についての上記で得られた情報は，経過と結果を予測するために，既に発生している場合にはその存在又は状態又は傾向に関して，宿主，被験者又は患者を診断するのに用いられる。例えば，アッセイされる細胞／組織がＮＰＣ転移表現型を有すると決定される場合には，その情報は，その細胞／組織がとられた患者を，癌再発の可能性を有するものと診断するのに用いることができる。
【００４３】
特定の治療の有効性をモニターすることに加えて，本発明は，ＮＰＣ転移の起こり易さを治療することにおける有効性について，潜在的薬物候補のスクリーニングに適用することができる。この具体例においてはサンプルの発現プロファイルが，候補薬物による治療の前後で比較され，そこでは，治療を受けたサンプルにおける遺伝子発現プロファイルの，乏しい治療成績に関連付けられるプロファイルから，改善された治療成績に関連付けられるプロファイルへのシフトは，当該薬物の有効性の証拠である。そのようなアッセイは，慣用の手順を用いてインビトロ又は動物モデルで行うことができる。
【００４４】
ＮＰＣ関連遺伝子の本コレクションが用途を見出している別の応用の１つは，与えられた治療プロトコールのモニター又は評価である。そのような方法においては，治療を受けている患者の細胞／組織サンプルが，ここに記載の手順を用いてモニターされ，得られた発現プロファイルが，治療を受けている疾患に対する望ましい影響を有する治療プロトコールであるか否かを決定するために，得られた発現プロファイルが１つ又はより多くの参照プロファイルと比較される。例えば，定期的な発現プロファイルが治療中の患者より得られ，種々のＮＰＣ転移ステージ発現のプロファイル及び正常な発現のプロファイルを含む，一連の参照／対照と比較される。モニターされている発現プロファイルにおける正常なプロファイルへ向けた変化は，与えられている治療プロトコールが望ましい仕方で働いていることを示している。
【００４５】
〔治療剤スクリーニングへの適用〕
本発明はまた，ＮＰＣ転移の表現型を調節する，例えばそれを増強又は減弱させる能力を有する薬剤の同定のための方法も包含し，これは治療剤の同定に用いることができる。
【００４６】
そのような表現型を調節する化合物の同定は，種々の薬物スクリーニング技術の何れを用いても達成することができる。本発明のスクリーニングアッセイは，一般に，ＮＰＣ転移表現型決定遺伝子の発現プロファイルを調節するための薬剤の能力に，基づく。
【００４７】
「薬剤」の語は，例えばタンパク質，小分子又は他の薬剤等，差次的に発現される遺伝子産物の生物学的活性を調節する能力を有する如何なる分子をもいう。一般に，複数のアッセイ混合物が，種々の濃度に対する差次的応答を得るために試薬濃度を異にして，並行して操作される。典型的には，これらの濃度の１つが陰性対照として，すなわちゼロ濃度又は検出限界未満で，用いられる。
【００４８】
候補薬剤は，膨大な数の化学群を包含する，典型的にはそれらは有機分子，好ましくは，５０ダルトンより大きく２５００ダルトンより小さい分子量を有する有機化合物である。候補化合物は，しばしば，タンパク質との構造的相互作用，特に水素結合に必要な官能基を含み，しばしば，アミン，カルボニル，ヒドロキシル又はカルボキシル基を少なくとも１個含み，好ましくは少なくとも２個の官能性化学基を含む。候補化合物は，しばしば，１個又はより多くの上記官能基で置換された，環状炭素又はヘテロ環構造及び／又は芳香族又は多環芳香族構造を含む。候補薬剤はまた，タンパク質，糖類，脂肪酸，ステロイド，プリン類，ピリミジン類，誘導体，構造的類縁体又はそれらの組み合わせを含むがそれに限られない，生物分子の間にも見出される。
【００４９】
候補薬剤は，合成の又は天然の化合物のライブラリーを含む種々の源から得られる。例えば，非常の多数の手段が，広範な種々の有機化合物及び，無作為化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む生物分子の，無作為の又は方向付けられた合成のために利用できる。代わりとして，細菌，真菌，植物及び動物の抽出物の形の天然の化合物のライブラリー（差次的発現遺伝子産物に影響を及ぼす内因性の因子を同定するためのヒト組織からの抽出物を含む）を利用できるか，又は直ちに作ることができる。加えて，天然の又は合成的に製造されたライブラリー及び化合物は，慣用の化学的，物理的及び生物化学的手段を用いて容易に修飾され，そして組み合わせライブラリーを作るために使用できる。構造的類縁体を得るために，既知の薬剤を，アシル化，アルキル化，エステル化，アミド化などのような，方向付けられた又は無作為の化学修飾に付してもよい。
【００５０】
特に興味深い典型的な候補薬剤としては，限定する物ではないが，アンチセンスポリヌクレオチド，及び抗体，可溶性受容体等が挙げられる。標的の差次的発現遺伝子産物が分泌され又は細胞表面においてアクセス可能（例えば，細胞膜表面と安定に結合した受容体及び他の分子）である場合には，抗体及び可溶性受容体は，候補薬剤として特に興味深いものである。
【００５１】
スクリーニングアッセイは，容易に利用でき当業者に知られている種々の技術の何れに基づくものであってもよい。一般には，スクリーニングアッセイは，ＮＰＣ転移表現型を有することが知られている細胞又は組織を候補化合物と接触させ，表現型決定遺伝子から構成された遺伝子発現プロファイルに対する効果を評価することを含む。効果は，慣用のプロトコールの何れを用いても検出でき，多くの具体例においては上記の診断プロトコールが用いられる。一般に，そのようなアッセイは，インビトロで行われるが，多くのアッセイは，例えば癌の動物モデルにおいて，インビボ分析に適合させることができる。
【００５２】
〔薬物標的のスクリーニング〕
別の一具体例においては，本発明は，ここに治療標的としてリストしたものから，遺伝子とそれらの産物とを同定することを意図している。幾つかの点において，これは，ＮＰＣ転移表現型を調節（増大又は低下）する活性を有する薬剤の同定のための上記アッセイの逆であり，治療標的として，特に表現型決定性の，又はそれらの発現産物の遺伝子の同定に向けられている。
【００５３】
この具体例においては，ＮＰＣ表現型を調節（例えば，そのような表現型を阻害又は抑制）することを示すことができる又は既に示されている薬剤の効果を試験することにより，治療標的が同定される。例えば，薬剤は，選択された遺伝子転写産物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであることができる。例えば，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，本明細書の表に見られる遺伝子の配列に対応する配列を有してよい。
【００５４】
治療標的の同定のためのアッセイは，当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば，候補遺伝子，例えばここにおける表に見出される遺伝子を発現又は過剰発現している試験細胞が，既知のＮＰＣ薬剤と接触させられ，ＮＰＣ表現形及び候補遺伝子の産物の生物学的活性に対する効果が評価される。候補遺伝子の産物の生物学的活性は，例えば，候補遺伝子産物をコードする遺伝子の発現の調節（例えば，転写レベル又はポリペプチドレベルの増大又は低下）又は遺伝子産物の酵素的若しくはその他の活性の調節を，試験することにより評価することができる。
【００５５】
ＮＰＣ転移表現型の阻害又は抑制は，候補遺伝子産物が適切な治療標的であることを示している。ここに記述する及び／又は当該分野において既知のアッセイを，治療標的の同定のためのアッセイに容易に適合させることができる。一般に，そのようなアッセイは，インビトロで行われるが，多くのアッセイは，インビボ分析に（例えば，適当な，当該分野において承認されている動物モデルにおいて）適合させることができる。
【００５６】
〔試薬及びキット〕
更に提供されるのは，上記方法の１つ又は２以上を実施するための試薬及びそのキットである。本試薬及びそのキットは，様々なものであってよい。興味深い試薬としては，ＮＰＣ表現型決定遺伝子の上記発現プロファイルを作るために特に設計された試薬を含む。
【００５７】
そのような試薬のタイプの１つは，関心のあるＮＰＣ転移表現型決定遺伝子をその内に代表している核酸のプローブのアレイである。広範な様々のプローブ構造，基質組成物及び取り付けの技術とともに，種々の異なったアレイフォーマットが当該分野において知られている。興味深い代表的なアレイ構造として，米国特許5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,800,992に記載されているものが挙げられ，参照によりここに導入され，並びに，WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; 及び EP 785 280にも記載されている。多くの具体例において，アレイは，ここに掲げた遺伝子の少なくとも２個に対するプローブを含む。ある具体例においては，アレイ上に表される遺伝子の数は，少なくとも５個，少なくとも１０個，少なくとも２５個，少なくとも５０個，又はより多数であり，ここに掲げた遺伝子のすべてを含む。本アレイは，ここに掲げた遺伝子のみを含んでもよく，ここに掲げていない追加の遺伝子を含んでもよい。本アレイが追加の遺伝子に対するプローブを含む場合，ある具体例においては，代表される追加の遺伝子の％数は，約５０％を超えず，通常約２５％を超えない。そのような追加の遺伝子が含まれる多くの具体例において，コレクション中の大多数の遺伝子は，ＮＰＣ癌表現型決定遺伝子であり，そこでは「大多数」は，少なくとも約７５％，通常少なくとも約８０％，及び時には少なくとも約８５，９０，９５％又はこれより高く，コレクション中の遺伝子の１００％がＮＰＣ癌表現型決定遺伝子である具体例も含まれる。多くの具体例において，少なくともアレイ上に代表される遺伝子の少なくとも１つは，その機能が，ＮＰＣ表現型を作るのに直ちには関与しない遺伝子である。
【００５８】
ＮＰＣ癌表現型決定遺伝子の発現プロファイルを作るのに特にあつらえた別のタイプの試薬は，そのような遺伝子を増幅するように設計された遺伝子特異的プライマーのコレクションである。遺伝子特異的プライマー及びこれを使用する方法は，米国特許5,994,076に記載されており，この開示を参照によりここに導入する。特に興味深いものは，ここに掲げた遺伝子のうち少なくとも２個に対するプライマーを有する遺伝子特異的プライマーである。ある具体例においては，コレクション中のプライマーを有する遺伝子の数は，少なくとも５個，少なくとも１０個，少なくとも２５個，少なくとも５０個，又はより多数であり，ここに掲げた遺伝子の全てを含む。本遺伝子特異的プライマーコレクションは，ここに掲げた遺伝子のみを含むものであってもよく，又はここに掲げられていない追加の遺伝子に対するプライマーを含んでいてもよい。そのような追加の遺伝子を本遺伝子特異的プライマーコレクションが含む場合には，ある具体例においては，代表されている追加の遺伝子の％数は，約５０を超えず，通常は約２５％を超えない。そのような追加の遺伝子が含まれる多くの具体例において，コレクション中の大多数の遺伝子は，ＮＰＣ表現型決定遺伝子であり，ここに「大多数」は，少なくとも約７５％，通常少なくとも約８０％，そして時には少なくとも約８５，９０，９５％，又はより高く，コレクション中の１００％の遺伝子がＮＰＣ表現型決定遺伝子である具体例も含む。多くの具体例において，遺伝子特異的プライマーのコレクションに代表されている遺伝子のうちの少なくとも１個は，その機能が，ＮＰＣ癌表現型をつくるのに直ちには関与しない遺伝子である。
【００５９】
本発明のキットは，上記のアレイ及び／又は遺伝子特異的プライマーコレクションを含むものであってよい。このキットは，更に，種々の方法に用いられる１つ又は２つ以上の追加の試薬，例えば標的核酸を作るためのプライマー，ｄＮＰＴ及び／又はｒＮＴＰ（予め混合されていても分離されていてもよい），Ｃｙ３又はＣｙ５タッグｄＮＴＰのような，１つ又はより多くの独特の標識を施されたｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ，種々の散乱スペクトルを有する金又は銀粒子，又はたの合成後標識を施した試薬例えば，蛍光色素の化学的に活性な誘導体，逆転写酵素，ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素，種々の緩衝剤，例えば，ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝剤，製造済みプローブアレイ，標識プローブ精製試薬及び遠心カラム等のような部品，シグナル発生及び検出試薬例えばストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ接合体，化学蛍光又は化学発光基質その他を含んでいてよい。
【００６０】
上記の構成要素に加えて，本キットは，更に本方法を実施するための指示書を含むであろう。これらの指示書は，本キットに種々の形で存してよく，それらの１つ又はより多くがキット内に存在していてよい。これらの指示書が存在する場合における形態の１つは，適当な媒質又は基質上の印刷情報としてであり，例えばキットのパッケージ内に，パッケージ挿入物としてある，情報が印刷されている紙片等である。尚も別の一手段は，コンピュータ読み取り可能な媒体，例えば，ディスケット，ＣＤ等であり，それに情報が記録されている。尚も別の一手段は，インターネットを介して遠隔地にある情報にアクセスするために使用されるウェブサイトアドレスである。如何なる簡便な手段も，キットに含まれていてよい。
【００６１】
〔ＮＰＣ転移の治療のための化合物及び方法〕
更に提供されるのは，ＮＰＣ転移の起こり易さを緩和する方法及び組成物である。本発明は，そのような状態を緩和する，例えば，１個又は２個以上の遺伝子の発現を，又は１個又は２個以上の遺伝子産物の活性を調節することによって治療する方法を提供し，標的遺伝子は，ここに掲げたＮＰＣ表現型決定遺伝子の１個又は２個以上である。
【００６２】
ある種のＮＰＣ疾患状態は，少なくとも部分的には，遺伝子産物の過剰レベルによって，又は異常な若しくは過剰な活性を示すある遺伝子産物の存在によってもたらされる。そのようなものとして，そのような遺伝子産物のレベル及び／又は活性の減少は，疾患の再発の緩和をもたらすであろう。標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物活性レベルを低下させるための技術が，以下に論じられている。
【００６３】
代わりとして，ある種の他のＮＰＣ疾患状態は，少なくとも部分的には，遺伝子発現のレベルの欠損又は低下，又は遺伝子産物活性の低下によってもたらされる。そのようなものとして，遺伝子発現レベル及び／又はそのような遺伝子産物の活性の上昇は，疾患の緩解をもたらすであろう。標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物活性レベルを高めるための技術が，以下に論じられている。
【００６４】
〔変異標的遺伝子活性の発現，合成又は活性を阻害する化合物〕
上に論じたように，ＮＰＣ疾患に関与する標的遺伝子は，標的遺伝子活性のレベルの増大を介してそのような疾患を引き起こし得る。ある遺伝子が疾患状態にある細胞／組織内において上方制御されている場合，種々の技術が標的遺伝子及び／又はタンパク質の発現，合成又は活性を阻害するために利用できる。例えば，アッセイによって阻害活性を有することが記述された化合物を，本発明に従って疾患症状を緩解するために使用することができる。上に論じたように，そのような分子としては，限定するものではないが，小さい有機分子，ペプチド，抗体その他が含まれる。阻害的な抗体技術が，以下に記載されている。
【００６５】
例えば，標的遺伝子産物が内因性リガンドに結合する場合には，標的遺伝子産物に対する内因性リガンドと競合する化合物を投与することができる。その結果もたらされる，リガンド結合遺伝子標的の量の低下は，内皮細胞の生理学を調節するであろう。この目的で特に有用であり得る化合物としては，例えば，可溶性タンパク質又はペプチド，例えば１個又は２個以上の，胞外ドメインを含むペプチド，又はその部分及び／又はその類縁体，標的遺伝子産物例えば可溶性融合タンパク質例えばＩｇ付与（Ig-tailed）融合タンパク質(Ｉｇ付与融合タンパク質の議論については，例えば米国特許5,116,964を参照のこと)が挙げられる。代わりとして，標的遺伝子産物受容体部位に結合するがタンパク質を活性化はさせないリガンド類縁体又は抗体のような化合物（例えば，受容体−リガンドアンタゴニスト）は，標的遺伝子産物活性の阻害において有効であり得る。更には，標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス及びリボザイム分子もまた，標的遺伝子活性を阻害するために本発明に従って使用してよい。そのような技術は，以下に記載されている。尚も更には，やはり記述されているように，三重螺旋分子が，異常な遺伝子活性を阻害するのに利用できる。
【００６６】
〔阻害的アンチセンス，リボザイム及び三重螺旋アプローチ〕
ＮＰＣ転移を緩解する能力を示し得る化合物に，アンチセンス，リボザイム，及び三重螺旋分子がある。そのような分子を，変異体標的遺伝子活性を低下させるために設計してよい。そのような分子を製造し使用するための技術は，当業者に周知である。
【００６７】
アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は，標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質の翻訳を妨害することにより，ｍＲＮＡの翻訳を直接にブロックするように働く。アンチセンスＤＮＡに関しては，翻訳開始部位から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチド，例えば，問題の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０〜＋１０の領域の間が好ましい。リボザイムは，ＲＮＡの特異的切断を職倍する能力を有する酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズムは，相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションを伴う。リボザイム分子の組成は，
標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な１つ又は２つ以上の配列を含まなければならず，ｍＲＮＡ切断を担う周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については，参照によりここにその全体が導入される米国特許No. 5,093,246を参照のこと。そのようなものとして，本発明の範囲内には，標的遺伝子産物をコードするＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的且つ十分に触媒する，設計されたハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子が含まれる。如何なる潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位も，配列GUA，GUU及びGUCを含むリボザイム切断部位について，興味のある分子をスキャンすることによって最初に同定される。一旦同定されると，切断部位を含む標的遺伝子の範囲に対応する１５ないし２０ヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を，予測された構造的特徴，例えば，オリゴヌクレオチド配列を不適当にする二次構造について，評価できる。候補配列の適切性もまた，リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて，相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性を試験することによって，評価してよい。転写の阻害のために三重螺旋形成において用いられる核酸分子は，一本鎖のもの及びデオキシリボヌクレオチドよりなるものである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は，プリン又はピリミジンのかなり大きなストレッチが二本鎖の一方の鎖に存在することを一般に要求するHoogsteen塩基対ルールを介して，三重螺旋を促進するよう設計されなければならない。ヌクレオチド配列は，ピリミジンに基づくものでよく，それは，結果として得られる三重螺旋を横切る３本の結合した鎖をTAT及びCGC+トリプレットをもたらす。ピリミジンに富んだ分子は，その鎖に対して平行に配向した二本鎖の一本の鎖のプリンに富んだ領域に対して，塩基の相補性を提供する。加えて，プリンに富んだ核酸分子，例えば一続きのＧ残基を含んだ核酸分子を選んでよい。これらの分子は，ＧＣ対に富んだＤＮＡ二本鎖（これにおいては，大半のプリン残基が標的二本鎖の一本鎖上に位置している）と三重螺旋を形成し，三本鎖中の３本の鎖を横切ってＧＧＣトリプレットをもたらす。代わりとして，三重螺旋形成に標的化させることのできる潜在的な配列を，いわゆる「スイッチバック」核酸分子を創り出すことによって増加させてもよい。スイッチバック分子は，それらが二本鎖の第１の鎖と，そして次いでもう一方と塩基対を形成するような，交互する５’−３’，３’−５’の形式で合成され， その結果，二本鎖のうちの一本の鎖上にプリン又はピリミジンの大きなストレッチが存在するという必要性を無くす。ここに記載のアンチセンス，リボザイム，及び／又は三重螺旋分子が，正常な及び変異した標的遺伝子アレルの双方によって産生されるｍＲＮＡの転写（三重螺旋）及び／又は翻訳（アンチセンス，リボザイム）を低下させ又は阻害する可能性がある。実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性が維持されることを保証するために，正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし発現する，如何なるアンチセンス，リボザイム，又は三重螺旋治療が利用されてもそれに影響を受ける配列を含んでない核酸分子を，以下に記述されている遺伝子療法の手法で細胞に導入してもよい。代わりとして，細胞又は組織における標的遺伝子活性の必須レベルを維持するために，正常な標的遺伝子タンパク質を細胞又は組織に同時投与することが好ましい。
【００６８】
本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ，リボザイム，及び三重螺旋分子は，ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成のための当該分野で知られている如何なる方法によって調製してもよい。それらは，固相ホスホアミダイト化学合成等のような当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成を含む。代わりに，ＲＮＡ分子は，アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボでの転写により産生させてもよい。そのようなＤＮＡ配列は，Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモータのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを組み込んだ種々のベクターに組み込んでよい。代わりに，用いたプロモータに依存して構成的に又は誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を，細胞株に導入することもできる。
【００６９】
細胞内安定性と半減期を延長するための手段として，ＤＮＡ分子に対して種々の周知の改変を導入してもよい。可能な改変としては，限定するものではないが，分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドよりなるフランキング（flanking）配列の付加，又はオリゴデオキシリボヌクレオチド中心骨格内の，ホスホジエステラーゼ連鎖でなく，ホスホロチオエート又は２’Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
【００７０】
〔標的遺伝子産物に対する抗体〕
標的遺伝子タンパク質に特異的でその活性に干渉する抗体を，標的遺伝子機能を阻害するために用いてもよい。そのような抗体は，タンパク質それ自体に対する又は当該タンパク質の部分に対応するペプチドに対して，当該分野における標準的技術を用いて作り出してもよい。そのような抗体としては，限定するものではないが，ポリクローナル，モノクローナル，Ｆａｂ断片，一本鎖抗体，キメラ抗体等が含まれる。
【００７１】
標的遺伝子タンパク質が細胞内にありそして抗体全体が用いられる場合には，内化抗体が好ましいであろう。しかしながら，抗体を，又は標的遺伝子エピトープに結合して細胞内に入るＦａｂ領域の断片を送達するためにリポフェクチンリポソームを用いてもよい。抗体の断片を用いる場合には，標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば，標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の種々の領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。そのようなペプチドは，当該分野において既知の方法で化学的に合成してもよく又は組換えＤＮＡ技術によって産生させてもよい（例えば，上記Creighton, 1983,; 及び上記Sambrook et al., 1989, 参照のこと）。代わりとして，細胞内標的遺伝子エピトープに結合する一本鎖中和抗体を投与してもよい。そのような一本鎖抗体は，例えば，Marasco等 (Marasco, W. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893)に記述されているような技術を利用することにより，標的細胞集団内に，１本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって，投与してよい。
【００７２】
幾つかの例では，標的遺伝子タンパク質は細胞外のものであり，又は膜貫通タンパク質である。遺伝子産物の１個又は２個以上の細胞外ドメインに対して特異的でありその活性に干渉する抗体が，乳癌を治療するのに特に有用である。そのような抗体は，標的ドメインに血流から直接アクセスできるため，特に効率的である。ペプチド投与に適している以下に記載された投与技術の如何なるものも，作用部位へと阻害性標的遺伝子抗体を効果的に投与するために利用してよい。
【００７３】
〔標的遺伝子活性を回復させる方法〕
ＮＰＣ転移に寄与する標的遺伝子は，疾患状況においては過少発現（underexpressed）しているかもしれない。遺伝子が，疾患状態において下方制御されているか又は標的遺伝子産物の活性が低下していて，その結果疾患の症状が現われている場合には，標的遺伝子の活性レベルをＮＰＣ疾患症状が緩解されるレベルにまで高める方法を用いることができる。遺伝子活性レベルは，例えば，存在する標的遺伝子産物のレベルを高めることにより，又は存在する活性な標的遺伝子産物のレベルを高めることによって，高めることができる。
【００７４】
例えば，ＮＰＣ転移を緩和するに十分なレベルの標的遺伝子産物を，そのような症状を呈している患者に投与してよい。以下に論ずる技術の何れも，そのような投与に利用してよい。当業者は，効果的で正常な標的遺伝子タンパク質に対して毒性のない濃度を如何にして決定するかを，以下に記述されているような技術を用いて，直ちに知るであろう。
【００７５】
加えて，ＮＰＣ転移を呈している患者に対して直接に，標的遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列を，そのような症状が緩和されるようなレベルの標的遺伝子タンパク質を産生するに十分な濃度で，投与してよい。物質の細胞内投与，例えばリポソーム等の投与を達成する以下に論ずる何れの技術も，そのようなＲＮＡ分子の投与のために利用してよい。ＲＮＡ分子は，例えば当該分野で知られている組換え技術を用いて，産生させてよい。
【００７６】
更に，遺伝子補充療法により患者を治療してもよい。正常な標的遺伝子又は標的遺伝子機能を備えた正常な標的遺伝子タンパク質の産生を導く遺伝子部分の１個又は２個以上のコピーを，ＤＮＡを細胞内に導入する他の粒子，例えばリポソーム等に加えて，例えば，限定するものではないが，アデノ関連ウイルス及びレトロウイルスベクターを用いて，細胞内に挿入してもよい。加えて，上述のような技術は，ヒト細胞に正常な標的遺伝子配列を導入するために利用してもよい。
【００７７】
標的遺伝子発現遺伝子配列を含んだ細胞，好ましくは，自家細胞を，次いで症状の緩和を可能にする患者の部位に導入又は再導入してもよい。標的遺伝子産物が分泌性の，細胞外遺伝子産物である場合には，そのような細胞補充技術が好ましいかも知れない。
【００７８】
〔製剤及び投与方法〕
標的遺伝子の発現，合成及び／又は活性を阻害することが確認された化合物は，ＮＰＣ転移を治療又は緩和する治療的に有効な投与量で患者に投与できる。治療的に有効な投与量とは，症状の緩和をもたらすに十分な化合物の量をいう。
【００７９】
〔有効投与量〕
そのような化合物の毒性及び治療的有効性は，細胞培養における，又はＬＤ５０（集団の５０％に致死的である投与量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である投与量）等，実験動物における，標準の薬剤学的手順により決定できる。毒性効果と治療効果の間の投与量比は，治療指数であり，ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物も使用してよいが，侵されていない細胞の損傷を最小限にすることで副作用を低減させるために，侵されている組織部位にそのような化合物を標的化させる送達システムを設計するよう，注意を払わなければならない。
【００８０】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは，ヒトにおいて使用される投与範囲を定めるために使用できる。そのような化合物の投与量は，好ましくは，殆ど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は，用いられる投与形態と利用される投与経路とに依存して，この範囲内で変化させ得る。本発明の方法において使用される如何なる化合物についても，治療的有効量は，最初は細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち，症状の半最大（half-maximal）阻害を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度を達成するよう，動物モデルで投与量を決定してよい。そのような情報は，ヒトにおける有用な投与量をより正しく決定するために使用できる。血漿におけるレベルは，例えば，高速液体クロマトグラフィーにより測定してよい。
【００８１】
〔処方化及び使用〕
本発明に従って用いるための薬剤組成物は，１種又は２種以上の生理学的に許容し得る担体又は賦形剤を用いて慣用の仕方で処方化してよい。
【００８２】
こうして，当該化合物及びそれらの生理学的に許容し得る塩及び溶媒を，吸入（口又は鼻を介して）又は経口，舌下，非経口，又は直腸内投与によって投与するために，処方化してよい。
【００８３】
経口投与のためには，薬剤組成物は，例えば，結合剤（例えば，部分アルファー化トウモロコシデンプン，ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース），充填剤（例えば，乳糖，微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム），滑沢剤（例えば，ステアリン酸マグネシウム，タルク又はシリカ），崩壊剤（例えば，馬鈴薯デンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム），又は湿潤剤（例えば，ラウリル硫酸ナトリウム）等のような，薬剤学的に許容し得る賦形剤と共に，慣用の仕方で調製した状剤又はカプセル剤の形態としてよい。状剤は，当該分野において周知の方法で被覆してよい。経口投与のための液剤は，例えば，溶液，シロップ若しくは懸濁液，又は使用前に水その他の適当な媒質で再構成するための乾燥した製品として，提供してよい。そのような液剤は，懸濁化剤（例えば，ソルビトールシロップ，セルロール誘導体又は水素添加食用油脂），乳濁化剤（例えば，レシチン又はアカシアゴム），非水性媒質（例えば，落花生油，油性エステル，エチルアルコール又は分画食用油），及び保存剤（例えば，メチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）等のような，薬剤学的に許容し得る添加剤を用いて慣用の仕方で調製してよい。製剤はまた必要に応じて，緩衝剤，矯味剤，着色剤及び甘味剤を含有していてよい。
【００８４】
経口投与用の製剤は，活性化合物の制御された放出を与えるように適切に処方化してよい。舌下投与のためには，組成物は，慣用の仕方で処方される状剤又はロゼンジの形をとってよい。吸入による投与のためには，本発明に従って使用される化合物は，例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロメタン，二酸化炭素その他の適当な気体等のような，適当な噴射剤を用いて，加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー製剤の形で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合には，投与量単位は，計量された量を放出するバルブを備えることによって決定してよい。吸入剤において用いるための，例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは，当該化合物と乳糖又はデンプン等のような適当な粉末基剤との粉末混合物を含んで処方してよい。
【００８５】
当該化合物は，例えばボーラス又は連続注入によって注射で非経口投与されるように処方してよい。注射用製剤は，例えば，アンプル又は保存剤を添加したマルチドーズ容器に入れる等の，単位投与形態で提供してよい。組成物は，溶液又は油中若しくは水性媒質中のエマルジョン等のような形態をとることができ，処方化のための薬剤例えば懸濁化剤，安定化剤及び／又は分散剤等を含有してよい。代わりとして，活性成分は，例えば無菌の，発熱物質不含の水等のような適切な媒質を用いて使用前に構成するための粉末形態であってもよい。
【００８６】
化合物はまた，例えばカカオ脂その他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤を含有した，例えば坐剤又は貯留浣腸剤等の直腸組成物の形に処方化してもよい。
【００８７】
上述した処方に加えて，当該化合物はまた，デポ（depot）製剤として処方化してもよい。そのような持続型処方は，埋め込み（例えば，皮下又は筋肉内），又は筋肉内注射により投与してよい。こうして，当該化合物は，適したポリマー性又は疎水性材料（例えば，許容し得る油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂，又は難溶性誘導体例えば難溶性塩と共に，処方化してよい。
【００８８】
組成物は，所望により，活性成分を含有する１種又は２種以上の単位投与形態を含んでいてよいパック又はディスペンサー器具に入れて提供してよい。パックは，ブリスターパック等のよう，金属又はプラスチックのホイルを含んでなるものであってよい。パック又はディスペンサー器具は，投与のための指示書を伴っていることができる。
【００８９】
更なる詳述なしで，当業者は上の記述を用いて本発明を完全に利用するものと信ずる。以下の好ましい特定の具体例は，従って，単に例示的であって，如何なる形でも本開示の残り部分を限定するものと看做してはならない。
【００９０】
上記において，及び以下の実施例において，別途に示さない限り，全ての温度は摂氏でそのまま示されており，全ての部及びパーセントは重量によるものである。
【００９１】
好ましい面において，本発明は以下を提供する：
１．鼻咽腔癌を有する患者における遠隔転移のリスクを評価する方法であって，該患者からのサンプル中の表４及び５に掲げられた遺伝子の少なくとも１個の発現プロファイルを評価することを含むものである，方法。
２．表４に掲げられた５２個の遺伝子の２個又は３個以上の発現プロファイルを評価することを含むものである，上記１の方法。
３．表４に掲げられた５２個の遺伝子の発現プロファイルを評価することを含むものである，上記１の方法。
４．表４に掲げられた５２個の遺伝子の発現の評価が，表４に示された遺伝子の９個のクラスターの各々について回帰モデルを用いて行われるものである，上記３の方法。
５．９個の遺伝子クラスターの各々について，表１のそれぞれの回帰モデル方程式を用いて，ロジット（logit）スコアが生み出されるものである，上記４の方法。
６．遠隔転移のリスクについての予測ルールが，該９個の遺伝子クラスターについてのロジットスコアに適用されるｋ−近傍分類法により生み出されるものである，上記５の方法。
７．表５に掲げられた１２個の遺伝子の２個又は３個以上の発現プロファイルを評価することを含むものである，上記１の方法。
８．表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現プロファイルを評価することを含むものである，上記１の方法。
９．表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現の評価が，ロジスティック回帰モデルを用いて行われるものである，上記８の方法。
１０．ロジットスコアが，該１２個の遺伝子の発現プロファイルに基づき表２の回帰モデル方程式を用いて生み出され，そして該ロジットスコアが遠隔転移のリスクと相関付けられるものである，上記９の方法。
１１．遠隔転移につき低リスクであることの予測ルールが，
［遠隔転移につき低リスクである確率］＝１／{１＋ｅ-(ロジットスコア)}
である，上記１０の方法
１２．該予測ルールによる遠隔転移のリスクが，該リスクを方程式
［遠隔転移につき低リスクである確率］＝１／{１＋ｅ-(ロジットスコア)}
を用いて評価するものである第２の独立の予測ルールによる遠隔転移のリスクと比較され，ここにロジットスコアが，表２の回帰モデル方程式と表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現プロファイルとを用いて生み出されるものである，上記６の方法。
１３．上記方法の双方により決定された遠隔転移のリスクが，低く又は高い場合に，リスクを，それぞれ，低い又は高いと記録し，決定されたリスクが不一致の場合は，リスクを不確定と記録するものである，上記１２の方法。
１４．該発現プロファイルがＮＰＣ腫瘍標本において評価されるものである，上記１の方法。
１５．該発現プロファイルがｍＲＮＡ転写産物から生み出されるものである，上記１の方法。
１６．鼻咽腔癌を有する患者における遠隔転移のリスクを決定するために有用な核酸マイクロアレイであって，(a) 表４に掲げられた５２個の遺伝子，(b) 表５に掲げられた１２個の遺伝子，又は(c) 該５２個及び１２個の遺伝子双方の発現プロファイルを決定するためのプローブより本質的になるものである，核酸マイクロアレイ。
１７．表４に掲げられた５２個の遺伝子の全て及び／又は表５に掲げられた１２個の遺伝子の全て，及び／又は該５２個の遺伝子の又は該１２個の遺伝子の又は双方の部分集合であって各場合において鼻咽腔癌患者における遠隔転移のリスクを予測するために有効なものである部分集合より本質的になるものである，媒質中の又はキット形態のコレクション。
【実施例】
【００９２】
〔実施例１〕
ｍＲＮＡ転写産物プロファイリングを，治療前の原発ＮＰＣの１３８の生検標本について行った。それらの標本は，２つの相対するＮＰＣ患者の臨床群を代表するものであった。すなわち，最初の治療から３年以内の遠隔転移（高リスク群，ｎ＝４７）と，３年を超える追跡期間後の遠隔転移無し（低リスク群，ｎ＝９１）とである。１３８個の標本の２／３がトレーニング集合へと，そして１／３がテスト集合へと無作為化された。トレーニング集合（ｎ＝９６）における遠隔転移の発生に関係付けられる遺伝子発現署名を発見するよう，監督下の分析が指導された。発見された分子予測指標は，４２個の標本よりなる独立のテスト集合において検証された。
【００９３】
＜患者及び腫瘍組織の選択＞
Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center (KF-SYSCC)の腫瘍バンクにおいて１９９２年から２００４年までの間に集められた３７５名のＮＰＣ患者の原発腫瘍からの新鮮な凍結生検サンプルが，総ＲＮＡ抽出のために入手できた。全ての患者から書面によるインフォームド・コンセントが得られ，そして研究は，審議会により承認された。１０５名の患者のＲＮＡは，ひどく分解されており，研究から除外された。残りの２７０サンプルのうち，１３８サンプルのみが次の基準の何れにも合致し，研究のために選ばれた。最初の選択基準は，遠隔転移を起こしておらず最初の治療から３年以上定期的に追跡されている患者を要求した。この群の患者（ｎ＝９１）は，遠隔転移につき臨床的に低リスクに指定された。第２の選択基準は，最初の治療を受けた時点で既に遠隔転移を起こしていたか又は最初の治療から３年以内に遠隔転移を起こした患者を要求した。遠隔転移は，ＮＰＣの，肺，骨，肝臓，腎臓，脳その他の臓器における転移と定義された。転移は，細針吸引により組織学的に，又はコア生検により確認された。この群の患者（ｎ＝４７）は，遠隔転移につき臨床的に高リスクであると指定された。
【００９４】
１９９２年に収集された１個のサンプル以外は，適格患者全てからの原発腫瘍の生検サンプルが，１９９８年から２００４年までの間に収集された。診断時点での患者の年齢は１１〜７１歳に及び，メジアンと平均値は，それぞれ，４４歳及び４５歳であった。最初の診断及びステージの決定後，患者は，施設のプロトコールに従って治療された31。追跡期間のメジアン及び平均値は，それぞれ，３．３４年及び３．２９年であった。追跡期間中に，２９名の患者が死亡し，そのうち２８名は臨床的に高リスク群に属していた。ＮＰＣ患者のステージ決定は，１９９７年のＡＪＣＣの定義に従って行った。
【００９５】
＜ｍＲＮＡ転写産物プロファイリング研究＞
液体窒素中で冷凍してあった組織から， Trizol試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を製造元の指示書に従って用いて，総ＲＮＡを単離した。単離されたＲＮＡを，RNAEaxy Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いて更に精製し，そしてAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）中でRNA6000 Nano アッセイにより質を評価した。遺伝子発現プロファイリング研究に用いた全てのＲＮＡサンプルは，６．０〜１０．０（７．８±１．１，平均±ＳＤ）のＲＮＡ完全性数（RNA Integrity number, ＲＩＮ）を有していた。ハイブリダイゼーション標的は，Affymetrixプロトコールに従って総ＲＮＡから調製し，そしてAffymetrix U133A GeneChipsにハイブリダイズさせた。このU133 A GeneChipは，約13000のヒト遺伝子についての22238個のプローブ集合を含んでいた。このアレイの特徴は慣用のものであり，例えば，Affymetrixのウェブサイト(www.affymetrix.com/products/arrays)に詳述されている。要するに，二本鎖ｃＤＮＡを８μｇの総ＲＮＡサンプルから合成した。ビオチン標識した相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を，ｃＤＮＡからのインビトロ転写により産生させた。このｃＲＮＡは，精製し，ハイブリダイゼーションの前に化学的に断片化した。製造元のプロトコールに従って，特定量の断片化ｃＲＮＡ，プローブアレイ対照，ウシ血清アルブミン，及びニシンの精子ＤＮＡを合わせてカクテルを調製した。このｃＲＮＡカクテルを，U133A GeneChip上のオリゴヌクレオチドプローブに，１６時間４５℃にてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後すぐに，プロトコールEukGE WS2v4を用いて，ハイブリダイゼーズしたプローブアレイを自動洗浄に，そしてAffymetrix GeneChipフルイディックスステーション400 (fluidics station 400)中での染色に付した。その後，U133A GeneChipsをArrymetrix GeneArray スキャナー2500中でスキャンした。
【００９６】
＜スキャニング及びマイクロアレイデータの正規化＞
Affymetrix Microarray Analysis Suite (MAS) 5.0 ソフトウェアを用いて，標的のトリムド平均である５００に対してスケール調節することにより，各遺伝子の発現強度を決定した。この，U133A GegeChip上の全ヒト遺伝子のスケール調節した発現強度を，２を底として対数変換し，分位値正規化32の方法を用いて正規化した。分位値正規化のための参照標準は，我々の研究室において，１６４名の原発ＮＰＣのU133A GeneChipデータ，１５名の正常な鼻咽腔組織，及び２３名の転移性ＮＰＣ患者から先に確立されたものである。参照により各々の内容の全体がここに導入されるものである2004年12月20日に提出の米国特許出願11/015764，及び2004年3月28日に提出の11/090294を参照のこと。U133A GeneChip データのその他の追加の質的尺度には，「存在（present）」と検出された遺伝子のパーセント（５２．１±５．８％，平均±ＳＤ），及びＧＡＰＤＨ３’〜５’（０．９６±０．１８，平均±ＳＤ）が含まれる。両方のパラメータは，サンプルとアッセイの全体的な質を支持していた。
【００９７】
〔実施例II〕
＜データの統計解析＞
統計解析に用いた方法は，図１に纏めて図解されている。
＜トレーニング集合及びテスト集合へのサンプルの分割＞
我々の研究に含められた１３８名のＮＰＣ症例において，９１例は，最初の治療を開始した後，全く遠隔転移を起こさず，３年を超えて追跡された。これら９１例は，臨床的に遠隔転移につき低リスクと分類された。残り４７例においては，全て最初の治療の時点又は最初の治療開始から３年以内の時点で，遠隔移転を起こしていた。彼等は臨床的に遠隔転移につき高リスクと分類された。全ての患者についての最初の診断日と最初の治療日との間の平均間隔は，２０±５１日（平均±ＳＤ）であった。各リスクグループとも，２／３の患者が，ＳＡＳソフトウェア（バージョン 9.1）を用いて，トレーニング集合に割り当てられた（ＳＡＳソフトウェアはSAS Institute Inc., Cary, NC より入手可能である）。患者の１／３は，テスト集合に割り当てられた。低リスク患者の割り当ては，性別，年齢（≦及び＞４５歳），1997 AJCC TNM ステージ（Ｉ及びII対III及びIV），及び追跡期間（≦及び＞４．５年）に従って階層分けされた。高リスク患者は，性別，年齢，ＴＮＭステージ，及び最初の治療から遠隔転移までの時間（≦及び＞１．５年）に従って，階層分けされた。トレーニング集合には６２の低リスク例及び３４の高リスク例が，独立のテスト集合には２９の低リスク例および１３の高リスク例が存在した。独立のテスト集合サンプルは，トレーニングプロセスには，関与しなかった。
【００９８】
＜分析用の遺伝子の選択＞
テスト集合サンプルを除外した全ＮＰＣサンプル中，Affymetrix MAS5.0 ソフトウェアにより「存在」と判定された発現を有するプローブ集合のみが，分析用に選択された。各遺伝子の正規化され対数変換された発現データは，先ず，低及び高リスク群の間で，GeneLinker Platinum 4.5 ソフトウェア (Predictive Patterns Software, Inc., Inverary, Canada)を用いKruskal-Wallis検定で解析した。ｐ値＜０．０５を有した７９８個の遺伝子が，自己組織化マップ（ＳＯＭ）法 (GeneLinker Platinum 4.5 ソフトウェア) による更なる研究のために選択された。
【００９９】
＜ＳＯＭ解析＞
上記７９８個の遺伝子が，ＳＯＭにより解析された。ＳＯＭ解析用のパラメータ集合は，遺伝子による方向付けを含んだ。間隔距離に関するピアソン相関，及び２（高さ）×３（幅）のマップ次元。参照ベクトル及びアルゴリズム特性については，初期値を用いた。２×３次元の選択は，トレーニング集合に基づく７９８個の遺伝子の階層的クラスター分けによって導かれた（図２）。このアプローチは，ＳＯＭ解析のためのマップ次元を選択するための客観的手段を提供した。７９８個の遺伝子全てが，従って，６つの異なったＳＯＭクラスターに分類された（ＩないしVI）。
【０１００】
各ＳＯＭクラスターの遺伝子が，SPSS 9.0 ソフトウェア (SPSS, Inc., Chicago, Illinois) を用いて，バイナリフォワードロジスティック回帰により更に選択された。フォワードロジスティック回帰のためのｐ値のエントリー及び除去は，それぞれ「＜０．０５」及び「＞０．１」であった。ロジスティック回帰分析の後，ＳＯＭクラスターII，Ｖ及びVIから選択された遺伝子の数は，それぞれ，６，６及び５であった。ロジステック回帰分析の過程で，ＳＯＭクラスターＩ，III及びIVについて完全な分離がなされた。その後，２次元のＳＯＭ解析が，ＳＯＭクラスターＩ，III及びIVの遺伝子について，別々に実施された。ＳＯＭクラスターIa，Ib，IIIa，IIIb，IVa，及びIVb中の選択された遺伝子の個数は，それぞれ，９個，５個，８個，４個，６個及び３個という結果であった。こうして，９個のＳＯＭクラスター内に５２個の遺伝子があった。
【０１０１】
＜予測方法の確立＞
遠隔転移を起こすリスクの高いＮＰＣ患者の同定のための２つの予測方法が確立された。第１の方法は，９個のＳＯＭクラスター内の５２個の遺伝子に基づくものであった。各クラスターの遺伝子について回帰モデルが確立された。各回帰モデルの方程式は，表１に掲げられている。何れのサンプルについても各方程式から１個のロジットスコアが生み出された。SAS 9.0ソフトウェアを用いたｋ−近傍分類法により予測ルールを発生させるために，トレーニング集合内の各サンプルについてのこれら９個のロジットスコアが用いられた。１，３，５，１０及び３０という「ｋ」値が，トレーニング集合を用いて別々に試験された。Leave-one-out交差検定法が実施された。試験された１０というｋ値が，Leave-one-out交差検定法によれば最良の結果を与え，予測方法のために選択された。
【０１０２】
第２の予測方法は，元のＳＯＭクラスター内の１９７個の遺伝子から導かれた１２個の遺伝子に基づくものであった。上述のように，遺伝子の３個のＳＯＭクラスターが，前進的選択法によるロジスティック回帰に際して完全な分離を示した。その結果は，これら３個のＳＯＭクラスターの遺伝子の潜在的に高い予測値を示唆した。そのＳＯＭクラスターが信頼をもって予測に用いることができるものである遺伝子を同定するために，トレーニング集合の症例を用いてバイナリフォワードロジスティック回帰（SPSS 9.0 ソフトウェア）により各ＳＯＭクラスターからの遺伝子選択が行われ，遺伝子の選択は，完全な分離に出会う直前に停止させた。各クラスターから選択された遺伝子が，確率を推定するために用いるロジットスコアを導くために使用された。０．５より大きい確率は，遠隔転移につき低リスクに振り分けられ，０．５より小さい確率は，遠隔転移につき高リスクに振り分けられた。その結果は，ＳＯＭクラスターＩから選択された１２個の遺伝子が，トレーニング集合内の症例を用いて最良の結果を与えることを示した。ＳＯＭクラスターＩからの１２個の遺伝子に基づく回帰モデルの方程式を，表２に示す。
【０１０３】
＜生存解析＞
無転移の，及び全体としての生存の解析を，SAS 9.0 ソフトウェアを用いて，カプラン・マイヤーのログランク (log rank) 検定により実施した。生存は，最初の治療開始日から最後の追跡日又は死亡日までの期間の長さと定義された。無転移生存は，最初の治療開始日から最初の遠隔転移が診断された日までの期間の長さと定義された。
【０１０４】
〔実施例III〕
＜結果の要約＞
示すように，遠隔転移を起こすリスクの高い又は低いＮＰＣ患者の同定のための２つの予測指標が確立された。第１の予測因子は，９個の異なった自己組織化マップクラスター内の５２個の遺伝子及びｋ−近傍分類法に基づくものであった。第２の予測因子は，１２個の遺伝子及びロジスティック回帰モデルに基づくものであった。独立のテスト集合において，どちらの方法も，遠隔転移への期間の短さ及び全体としての生存の短さについて，予測性が強かった。両方法について独立のテスト集合の症例において評価された全体的正確さは，それぞれ，８１％及び７６％であった。両予測方法を組み合わせたとき，正確さは８５％にまで高められた。高リスク署名の群における遠隔転移についての予測危険率は，低リスク署名の群との比較では，１１．９であった（９５％信頼区間２．４〜５２．４，ｐ＝０．００２）。
【０１０５】
＜患者の特徴＞
乏しい又は良好な全体としての生存を伴った，遠隔転移を起こすリスクの高い又は低いＮＰＣ患者の予測のための遺伝子署名を同定するため，臨床的に十分定義されたＮＰＣ患者の２つの群の間で，監督下での分析が行われた。最初の治療から３年以内に遠隔転移を起こさなかったＮＰＣ患者が，良好な長期の，無転移及び全体としての生存期間を有したことはよく認識されている31,32。対照的に，最初の治療から３年以内の時点で遠隔転移を起こしたＮＰＣ患者は，当該疾患で死亡し乏しい生存期間であった。我々の研究に加わった１３８名の患者の間で，９１名の患者が臨床的に低リスク群に属し，４７名の患者が臨床的に高リスク群に属した。低及び高リスク患者の２／３がトレーニング集合に無作為に割り当てられ，１／３がテスト集合に割り当てられた。これらの患者の特徴が，表３に纏められている。低及び高リスク群の双方について，トレーニング集合とテスト集合の間において，掲げられている臨床的特徴については，有意差はなかった。加えて，トレーニング集合（ｎ＝３４）及びテスト集合（ｎ＝１３）の間での，遠隔転移部位の分布は，骨については５０％対６９％，肝臓については５０％対５４％，肺については３８％対２３％，その他については１５％対２３％であった。他には，脳，腎臓，脾臓及び骨盤器官が含まれた。分布は，これら２つ群間で同様であった。
【０１０６】
〔実施例IV〕
＜５２個の遺伝子の署名による遠隔転移の予測＞
予測指標遺伝子を同定するために，高度に監督された分析が実施された。テスト集合の症例を除外した全てのＮＰＣサンプルにおいてAffymetrix MAS 5.0 ソフトウェアにより「存在」と判定できた遺伝子（4,814のプローブ集合）のみが，研究に使用された。我々は，次いで，トレーニング集合の臨床的に低い及び高いリスク群の間で，Kruskal-Wallis検定を実施した。発現に関して有意差（ｐ＜0.05）を示した７９８個の遺伝子を，研究のために選択した。これら７９８個の遺伝子を用いてトレーニング集合の症例に関して，階層的クラスター分析が，監督下でなく行われた。その結果は，６個の主要な遺伝子クラスターを示した（図２）。この階層的クラスター化の結果に基づいて，ＳＯＭ解析用に２×３のマップ次元が選ばれた。各ＳＯＭクラスター内の大半の遺伝子は，塊っており，階層的クラスター化により作られた遺伝子クラスターとパラレルであった。
【０１０７】
トレーニング集合内の低及び高リスク症例について，これら６個のＳＯＭクラスターの各々の中の遺伝子が，前進的選択法を用いたロジスティック回帰により，更に解析された。遺伝子の３個のＳＯＭクラスターが，完全な分離という問題を示した。これら３個のクラスターの各々の中の遺伝子が，２個のサブクラスターについてＳＯＭにより更に解析された。９個のＳＯＭクラスターから計５２個の遺伝子が選択され，遠隔転移についての予測モデルを開発するために使用された。これら５２個の遺伝子は，表４に纏められている。各ＳＯＭクラスター内の遺伝子からのロジットスコアを決定するために用いられた方程式は，表１に纏められている。
【０１０８】
こうして，各症例について，これら５２個の遺伝子の発現強度から９個のロジットスコアが生み出された。トレーニング集合内の各症例についてのこれら９個のロジットスコアは，ｋ−ＮＮ分類法による予測ルールを確立するために使用された。予測ルールのためのLeave-one-out交差検定法は，遠隔転移のリスクの高いトレーニング集合の症例についての予測の特異性及び感度が，それぞれ，９８％（61/62）及び８８％（30/34）であることを示した。全体的正確さは，９５％（91/96）であった。独立のテスト集合の症例（ｎ＝４２）を，この確立された予測ルールに従って分析すると，特異性，感度及び全体的正確さは，それぞれ，８６％（25/29），６９％（9/13）及び８１％（34/42）であった。関連についてのフィッシャーの正確確率検定（ｐ＝0.0007）は，これら５２個の遺伝子よりなる予測指標の信頼性を確認した。遠隔転移及び短い全体としての生存についての，予測された高リスク及び予測された低リスク署名群の間で評価された危険率は，それぞれ，７．１（ｐ＝0.002，９５％信頼区間２．２〜２３．５）及び５．４（ｐ＝0.001，９５％信頼区間１．５〜１９．４）であった。
【０１０９】
遠隔転移について低（ｎ＝２９）及び高（ｎ＝１３）リスクと予測されたテスト集合内の患者を無転移及び全体としての生存について比較したとき，遠隔転移について高リスクを有すると予測された患者は，有意に無転移生存が短く（ｐ＝0.0001），且つ全体としての生存が短かった（ｐ＝0.003）（図３）。
【０１１０】
〔実施例Ｖ〕
＜１２個の遺伝子の署名による遠隔転移の予測＞
第２の予測方法は，ＳＯＭクラスターＩ内の遺伝子からのロジスティック回帰分析により選択された１２個の遺伝子に基づくものであった。遠隔転移について低リスクの予測を計算するために用いられた方程式は，表２に纏められている。これら１２個の遺伝子は，表５に掲げられている。この１２個の遺伝子による予測ルールをテスト集合の症例（ｎ＝４２）に適用すると，高リスク転移の予測についての感度，特異性及び全体的正確さは，それぞれ，８５％（11/13），７２％（21/29）及び７６％（32/42）であった。この１２個の遺伝子による予測指標について，関連性についてのフィッシャーの正確確率検定（p=0.0008）は，５２個の遺伝子よりなる予測指標と同様の信頼性を確認した。遠隔転移及び短い全体的生存について予測された高リスク及び低リスク署名群の間での危険率の評価は，それぞれ，８．２（ｐ＝0.006，９５％信頼区間１．８〜３７．４）及び６．３（ｐ＝0.02，９５％信頼区間１．３〜２９．７）であった。
【０１１１】
１２個の遺伝子よりなる予測指標により低リスク（ｎ＝２３）又は高リスク（ｎ＝１９）と予測された症例を無転移の，及び全体としての生存について分析すると，結果は，遠隔転移の高いリスクを有すると予測された患者について，無転移の（ｐ＝0.0007）及び全体的としての（ｐ＝0.007）生存が，有意に短いことを示した（図４）。
【０１１２】
〔実施例VI〕
＜組み合わせた署名による遠隔転移の予測＞
独立のテスト集合症例において，実施例IV及びＶの２つの予測方法の結果をそれらの一致性について分析したところ，何れの方法によっても，２２症例（５２％）が低リスク，１２症例（２９％）が高リスクと予測された（表６）。８症例（１９％）は，両方法の間で不一致があり，不確定とみなされた。一致した症例（ｎ＝３４）のうち，５例は，予測が正しくなかった。３例が誤検知及び２例が見逃しであった。従って，全体的正確さは８５％（29/34）であった。遠隔転移及び短い全体としての生存についての高リスク及び低リスクの署名群の間での予測された危険率は，それぞれ，１１．１（ｐ＝0.002，９５％信頼区間２．４〜５２．４）及び８．５（ｐ＝0.009，９５％信頼区間１．７〜４２．８）であった。低リスク，高リスク及び不確定と予測された症例の生存分析は，低リスクと予測された患者に比して，高リスク症例は無転移の，及び全体としての生存が有意に悪いことを示した（図５）。低リスク症例及び不確定症例の間での無転移及び生存の差は，統計学的に有意でなかった。
【０１１３】
〔実施例VII〕
＜ステージIII及びIVのＮＰＣ患者の間での生存の比較＞
確立された予測方法の潜在的な臨床的重要性を知るため，１３３例のステージIII及び８２例のステージIVa及びIVb（IVa/b）患者が集められた。これらの患者のうち，９０名のみが，上記ｍＲＮＡ転写産物プロファイリング研究の一部であった。施設のプロトコール31に従って，全ての患者が１９９７年から２００３年にかけて，治療され，定期的に追跡された。ＴＮＭステージIII及びIVa/bの患者は，その後の遠隔転移の発生に従って更に２つの群に分けられた。これら４群の患者の全体的としての及び無転移の生存が，比較された。結果は，その後に遠隔転移を起こしたステージIIIのＮＰＣ患者が，全体としての，及び無転移の生存について，やはり遠隔転移を起こしたステージIVa/bの患者と近似していることを示した（ｎ＝３５）（図６）。対照的に，遠隔転移を起こさなかったステージIII（ｎ＝１０６）又はIVa/b（ｎ＝４７）の患者は，遠隔転移を起こしたそれらの患者に比して，全体的生存がずっと良好であった（図６）。
【０１１４】
これらの結果は，ステージIII及びIVa/bの患者に２つの様相の異なる群が存在することを示した。一方の群は，遠隔転移を起こすリスクが低く，良好な臨床結果を有していた。他方は，最初の治療から３年以内に遠隔転移を起こし，乏しい生存結果であった（図６）。これらの知見は，遠隔転移を起こすリスクの高い患者を正しく予測することは単に予後的な意味のみならず，長期の治療結果を改善するために新たな治療法を試みる上で適切な患者を選択するための手段をも提供する。
【０１１５】
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【０１１６】
【表１】
2009516501.tif 000003
【０１１７】
【表２】
2009516501.tif 000004
【０１１８】
【表３】
2009516501.tif 000005
【０１１９】
【表４−１】
2009516501.tif 000006
【０１２０】
【表４−２】
2009516501.tif 000007
【０１２１】
【表５】
2009516501.tif 000008
【０１２２】
【表６】
2009516501.tif 000009
【０１２３】
ここに引用した出願，特許及び出版物の全ての開示全体が，参照によりここに導入される。
上記実施例は，それら上記の実施例において用いられたものの代わりに概括的に又は具体的に記述された本発明の反応物及び／又は操作条件に置き換えることによっても，同様に首尾よく反復することができる。
上の記述から，当業者は，本発明の本質的特徴を容易に確認し，そして，本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに，種々の用途及び条件に適合させるように本発明に種々の変更及び修正を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
本発明の様々な特徴及びこれに伴う利点が，添付の図面（そこでは，類似の参照番号は，数枚の図を通じて同一の又は類似の部分を示す）と共に考察して本発明がよく理解されるとき，完全に理解されよう。
【図１】図１は，ｍＲＮＡ転写プロファイリングデータに基づく分子的予測指標の開発及び検証のために使用される戦略のアウトラインを示す。
【図２】図２は，９６個のトレーニング集合の症例から選択した７９８個の遺伝子を用いた階層的クラスター分析を示す。個々の遺伝子は，列において左及び右に示されている。個々の症例は，欄の最上位に示されている。この結果は，左側の色つきバーによって示されているように，遺伝子が６個のグループにクラスター化されたことを示している。
【図３】図３は，５２個の遺伝子による署名及びｋ−近傍分類法により遠隔転移のリスクが低い及び高いと予測される症例について，無転移の，及び全体としての生存確率のカプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）分析結果を示す。示した結果は，独立のテスト集合の症例から得られたものである。ｐ値は，ログランク検定により計算された。
【図４】図４は，１２個の遺伝子による署名及びロジスティック回帰分析によって遠隔転移のリスクが低い及び高いと予測される症例について，無転移の，及び全体としての生存確率のカプラン・マイヤー分析結果を示す。示した結果は，独立のテスト集合症例から得られたものである。ｐ値は，ログランク検定により計算された。
【図５】図５は，５２個の遺伝子による署名と１２個の遺伝子による署名との組み合わせ予測結果による，無転移の，及び全体としての生存確率のカプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）分析結果を示す。２通りの署名の間で一致しない結果を示す症例は，「不確定」とみなした（表６）。一致する結果を示した症例は，遠隔転移についてのリスクの低い又は高い方の何れかに属した。低又は高リスクの署名群を転移がないこと及び全体としての生存について比較したとき，ｐ値は，それぞれ，＜０．０００１及び０．００２であった。無転移生存（ｐ＝０．０９及び０．０５）及び全体としての生存（ｐ＝０．３１及び０，０９）について不確定群と低又は高リスク群との間には，有意な差はなかった。
【図６】図６は，遠隔転移を伴う又は伴わないステージIII又はIVa/bのＮＰＣ患者の間の全体としての生存及び無転移の生存の確率のカプラン・マイヤー分析結果を示す。施設のプロトコールによれば，試験に含められた殆どの患者が１９９７年と２００２年との間に治療を受け始め，定期的に追跡された。上側のパネルは，これら４群の患者の全体としての生存曲線を示す。遠隔転移を有しない又は有する，それぞれ，１０６及び２７名のステージIIIの患者がいた。同様に，４７名及び３５名のステージIVの患者がいた。ステージIII又はIVa/bについて遠隔転移の発生を有する又は有しない患者の間での全体的生存の差は，有意であり，共にｐ値＜０．０００１であった。遠隔転移を有する（ｐ＝０．３９）又は有しない（ｐ＝０．３５）ステージIII及びIVa/b患者の間では， 有意な差はなかった。下側のパネルは，結局遠隔転移を起こしたステージIII及びIVa/b患者の転移無しの生存の確率を示す。ステージIIIの全ての患者は，同時になされる化学・放射線療法及び補助的化学療法のみで治療され，これに対しステージIVa/bの患者には維持的化学療法が加えられた。
【図７】図７は，２人の異なったオペレーター間での「存在（present）」プローブ集合のメジアン強度の相関を示す。トレーニング集合における全てのＮＰＣ標本は，２名のオペレーターにより無作為に行われた。このトレーニング集合において，オペレーターＡは２４の無転移及び１４の陽性転移症例について行った。オペレーターＢは，３５の無転移及び１８の陽性転移症例について行った。各オペレーターにより行われた各プローブ集合の正規化された発現強度のメジアンが計算された。結果は，オペレーターに関連したシステムのバイアスのないことを示す完全な対角直線相関を示した。
【図８】図８は，実験誤差の補正のための，プローブ集合のレベルにおける分位値正規化の結果を示す。６個の異なったＮＰＣ標本（Ｉ−VI）からのｃＲＮＡサンプルを２つの部分に分け，異なった日に２つのU133-A GeneGhipsにハイブリダイズさせた。U133-A GeneChip上のヒト遺伝子に対する全てのプローブ集合の強度の相関は，各症例につき図に示されている。上側のパネルは，ｃｈｐファイルからのプローブ集合の強度の相関を，正規化せずに示す。中間パネルは，トリムド平均５００に対してスケール調節した後のプローブ集合強度の相関を示す。下側のパネルは，全てのヒトプローブ集合の発現強度の分位値正規化後のプローブ集合強度の，先に確立された標準に対する相関を示す。この結果は，プローブ集合レベルでの分位値正規化が，実験誤差を補正するのに有効であることを示している。
【図１】
2009516501.tif 000010
【図２】
2009516501.tif 000011
【図３】
2009516501.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009516501.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月22日(2008.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鼻咽腔癌を有する患者における遠隔転移のリスクを評価する方法であって，該患者からのサンプル中の表４及び５に掲げられた遺伝子の少なくとも１個の発現プロファイルを評価することを含むものである，方法。
【請求項２】
表４に掲げられた５２個の遺伝子の２個又は３個以上の発現プロファイルを評価することを含むものである，請求項１の方法。
【請求項３】
表４に掲げられた５２個の遺伝子の発現プロファイルを評価することを含むものである，請求項１の方法。
【請求項４】
表４に掲げられた５２個の遺伝子の発現の評価が，表４に示された遺伝子の９個のクラスターの各々について回帰モデルを用いて行われるものである，請求項３の方法。
【請求項５】
９個の遺伝子クラスターの各々について，表１のそれぞれの回帰モデル方程式を用いて，ロジットスコアが生み出されるものである，請求項４の方法。
【請求項６】
遠隔転移のリスクについての予測ルールが，該９個の遺伝子クラスターについてのロジットスコアに適用されるｋ−近傍分類法により生み出されるものである，請求項５の方法。
【請求項７】
表５に掲げられた１２個の遺伝子の２個又は３個以上の発現プロファイルを評価することを含むものである，請求項１の方法。
【請求項８】
表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現プロファイルを評価することを含むものである，請求項１の方法。
【請求項９】
表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現の評価が，ロジスティック回帰モデルを用いて行われるものである，請求項８の方法。
【請求項１０】
ロジットスコアが，該１２個の遺伝子の発現プロファイルに基づき表２の回帰モデル方程式を用いて生み出され，そして該ロジットスコアが遠隔転移のリスクと相関付けられるものである，請求項９の方法。
【請求項１１】
遠隔転移につき低リスクであることの予測ルールが，
［遠隔転移につき低リスクである確率］＝１／{１＋ｅ-(ロジットスコア)}
である，請求項１０の方法
【請求項１２】
該予測ルールによる遠隔転移のリスクが，該リスクを方程式，
［遠隔転移につき低リスクである確率］＝１／{１＋ｅ-(ロジットスコア)}
を用いて評価するものである第２の独立の予測ルールによる遠隔転移のリスクと比較され，ここにロジットスコアが，表２の回帰モデル方程式と表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現プロファイルとを用いて生み出されるものである，請求項６の方法。
【請求項１３】
上記方法の双方により決定された遠隔転移のリスクが低い又は高い場合に，リスクを，それぞれ，低い又は高いと記録し，決定されたリスクが不一致の場合は，リスクを不確定として記録するものである，請求項１２の方法。
【請求項１４】
該発現プロファイルがＮＰＣ腫瘍標本において評価されるものである，請求項１の方法。
【請求項１５】
該発現プロファイルがｍＲＮＡ転写産物から作られるものである，請求項１の方法。
【請求項１６】
鼻咽腔癌を有する患者における遠隔転移のリスクを決定するために有用な核酸マイクロアレイであって，(a) 表４に掲げられた５２個の遺伝子，(b) 表５に掲げられた１２個の遺伝子，又は(c) 該５２個及び１２個の遺伝子双方の発現プロファイルを決定するためのプローブより本質的になるものである，核酸マイクロアレイ。
【請求項１７】
表４に掲げられた５２個の遺伝子の全て及び／又は表５に掲げられた１２個の遺伝子の全て，及び／又は該５２個の遺伝子の部分集合又は該１２個の遺伝子の部分集合又は双方の部分集合であって各場合において鼻咽腔癌患者における遠隔転移のリスクを予測するために有効なものである部分集合より本質的になるものである，媒質中の又はキット形態のコレクション。
【請求項１８】
鼻咽腔癌を有する患者における遠隔転移のリスクを評価する方法であって，該患者からのサンプルにおいて表４に掲げられた５２個の遺伝子の発現プロファイルを，表１のそれぞれの回帰モデル方程式を用いて表４に示された９個の遺伝子クラスターの各々について生み出されたロジットスコアの集合にｋ−近傍分類法を適用することによって生み出された予測ルールを用いて評価し；表５に掲げられた１２個の遺伝子の発現プロファイルを，予測ルール，
〔遠隔転移につき低リスクである確率〕＝１／{１＋ｅ-(ロジットスコア)}
〔ここに，ロジットスコアは，表２の回帰モデル方程式を用いて該１２個の遺伝子の発現プロファイルに基づいて生み出される。〕を用いて評価し；そして該２つの予測ルールからのリスク結果を比較し，該方法の両方から決定される遠隔転移のリスクが低い又は高いときに，リスクをそれぞれ低い又は高いと記録し，該決定されたリスクが不一致であるときにはリスクを不確定と記録するものである，方法。
【国際調査報告】
2009516501.tif 000018
2009516501.tif 000019