(57)【要約】  授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物、総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸および総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％アラキドン酸を含む乳児用調乳が開示される。この調乳は代表的には、少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質および少なくとも約２．５％が脂質結合シアル酸としてのものである少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸をも含み、これらはいずれも、完全もしくは部分的に強化乳清タンパク質濃縮物から提供されるものである。前記乳児用調乳を誕生から最初の２から４ヶ月の間、好ましくは唯一の栄養源として投与することで、乳児での脳の発達、神経遊走および認知発達を加速する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物、
（Ｂ）総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸、および
（Ｃ）総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％のアラキドン酸
を含む乳児用調乳。
【請求項２】
前記調乳が、少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質および少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸を含み、前記シアル酸の少なくとも約２．５％が脂質結合シアル酸としてのものである、請求項１に記載の乳児用製剤。
【請求項３】
ガングリオシド、リン脂質およびシアル酸の前記組み合わせの約５０重量％から１００重量％が強化乳清タンパク質濃縮物からのものである、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項４】
前記脂質結合シアル酸が、前記総シアル酸の約２．７重量％から約５重量％を占める、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項５】
授乳基準で、（Ａ）約７ｍｇ／Ｌから約５０ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌのリン脂質および（Ｃ）約９０ｍｇ／Ｌから約２５０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含む、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項６】
総脂肪酸の重量基準で約０．４％から約２．０％のアラキドン酸および約０．１５％から約１．０％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項７】
前記総リン脂質が少なくとも２０重量％のスフィンゴミエリンを含む、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項８】
前記リン脂質が、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリンを含む、請求項７に記載の乳児用調乳。
【請求項９】
前記調乳が、授乳基準で約０．５重量％未満の遊離グリコマクロペプチドを含む、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項１０】
前記乳児用調乳が、大豆リン脂質、卵リン脂質およびこれらの組み合わせを実質的に含まない、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項１１】
前記調乳が約０．２重量％未満の乳脂を含む、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項１２】
前記乳児用調乳が粉末である、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１３】
前記乳児用調乳が即時授乳用液体である、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１４】
授乳基準で、少なくとも約１９０ｍｇ／Ｌの総シアル酸を含み、該シアル酸の少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものである、請求項２に記載の乳児用調乳。
【請求項１５】
（Ａ）
（ｉ）授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物、
（ｉｉ）総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸、および
（ｉｉｉ）前記総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％のアラキドン酸
を含む乳児用調乳を製造する段階、
（Ｂ）生まれてから最初の２ヶ月の間、乳児に前記調乳を投与するまたは前記調乳を投与するよう介護者に指示する段階
を有する乳児での脳の発達を加速する方法。
【請求項１６】
前記乳児用調乳が、授乳基準で、
（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、
（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、および
（Ｃ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸を含み、前記シアル酸の少なくとも約２．５％が脂質結合シアル酸としてのものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記調乳を、誕生から最初の４ヶ月の間投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ガングリオシド、リン脂質およびシアル酸の前記組み合わせの約５０重量％から１００重量％が前記強化乳清タンパク質濃縮物からのものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂質結合シアル酸が、前記総シアル酸の約２．７重量％から約５重量％を占める、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記乳児用調乳が、授乳基準で、（Ａ）約７ｍｇ／Ｌから約５０ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌのリン脂質および（Ｃ）約９０ｍｇ／Ｌから約２５０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記調乳が総脂肪酸の重量基準で、約０．４％から約２．０％のアラキドン酸および約０．１５％から約１．０％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記総リン脂質が少なくとも２０重量％のスフィンゴミエリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記リン脂質が、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記調乳が、約０．２重量％未満の乳脂を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記調乳が、約０．５重量％未満の遊離グリコマクロペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記乳児用調乳が、大豆リン脂質および卵リン脂質を実質的に含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記乳児用調乳が、授乳基準で、少なくとも約１９０ｍｇ／Ｌの総シアル酸を含み、該シアル酸の少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
生まれてから最初の４ヶ月の間、乳児に請求項１に記載の乳児用調乳を唯一の栄養源として投与するまたは投与するよう介護者に指示する段階を有する、乳児での神経遊走を加速させる方法。
【請求項２９】
生まれてから最初の４ヶ月の間、乳児に請求項１に記載の乳児用調乳を唯一の栄養源として投与するまたは投与するよう介護者に指示する段階を有する、乳児での視覚発達を加速させる方法。
【請求項３０】
生まれてから最初の４ヶ月の間、乳児に請求項１に記載の乳児用調乳を唯一の栄養源として投与するまたは投与するよう介護者に指示する段階を有する、乳児での認知発達を加速させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強化乳清タンパク質濃縮物、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸の特定の組み合わせを含むことで、人乳の自然の組成により近づけ、乳児における早期脳発達を加速する乳児用調乳に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、市販の乳児用調乳は、若年期に補助または唯一の栄養源を提供することを目的として用いられるのが一般的である。これらの調乳は、成長期の乳児の栄養的ニーズを満足する上での広範囲の栄養素を含み、通常脂肪、炭水化物、タンパク質、ビタミン、ミネラルおよび至適な乳児の成長および発達に役立つ他の栄養素などを含む。
【０００３】
市販の乳児用調乳は、人乳の組成および機能にできるだけ近づくように設計されている。米国では、連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＦＤＣＡ）は、乳児用調乳を「人乳を模倣するものであること、または人乳の完全もしくは部分的代替物として好適であることを理由として、乳児向けの食品として単独で特殊な食事に使用されることを謳っているまたはそれが説明されている食品」と定義している（ＦＦＤＣＡ２０１（ｚ））。
【０００４】
ＦＦＤＣＡ規則下での市販の乳児用調乳は、米国において非免除乳児用調乳に製剤されるべき基本的栄養素によって規定されている。これらの栄養素には、調乳１００ｋｃａｌ当たり、タンパク質（１．８から４．５ｇの少なくとも栄養的にカゼインに等価）、脂肪（３．３から６．０ｇ）、リノール酸（少なくとも３００ｍｇ）、レチノール等価物としてのビタミンＡ（７５から２２５ｍｃｇ）、ビタミンＤ（４０から１００  ＩＵ）、ビタミンＫ（少なくとも４．０ｍｃｇ）、ビタミンＥ（少なくとも０．７  ＩＵ／ｇリノール酸）、アスコルビン酸（少なくとも８．０ｍｇ）、チアミン（少なくとも４０ｍｃｇ）、ボフラビン（少なくとも６０ｍｃｇ）、ピリドキシン（調乳中にタンパク質１５ｍｃｇ／ｇを含む少なくとも３５．０ｍｃｇ）、ビタミンＢ１２（少なくとも０．１５ｍｃｇ）、ナイアシン（少なくとも２５０ｍｃｇ）、葉酸（少なくとも４．０ｍｃｇ）、パントテン酸（少なくとも３００．０ｍｃｇ）、ビオチン（少なくとも１．５ｍｃｇ）、コリン（少なくとも７．０ｍｇ）、イノシトール（少なくとも４．０ｍｇ）、カルシウム（少なくとも５０．０ｍｇ）、リン（少なくとも２５．０ｍｇで、カルシウム／リンの比が１．１から２．０である）、マグネシウム（少なくとも６．０ｍｇ）、鉄（少なくとも０．１５ｍｇ）、ヨウ素（少なくとも５．０ｍｃｇ）、亜鉛（少なくとも０．５ｍｇ）、銅（少なくとも６０．０ｍｃｇ）、マンガン（少なくとも５．０ｍｃｇ）、ナトリウム（２０．０から６０．０ｍｇ）、カリウム（８０．０から２００．０ｍｇ）および塩素化物（５５．０から１５０．０ｍｇ）などがある。
【０００５】
厳しい規制管理があっても、市販の乳児用調乳は現在でもなお、人乳と組成面でも機能面でも同一ではない。人乳において、ほぼ２００種類の異なる化合物が同定されており、そのうちの１００を超えるものが、通常は人乳中で有意な量で認められず、市販の調乳では全く認められない。そのような化合物には、各種の免疫グロブリン類、酵素、ホルモン、ある種のタンパク質、ラクトフェリン、ガングリオシド類、リン脂質（スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール）などがある。これらの材料のうちの多くが人乳に特有のものである、あるいは牛乳や市販の乳児用調乳を製造するのに用いられる他のタンパク質源に低い濃度でのみ存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６０８０７８７号（カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）ら
【特許文献２】米国特許第６４９５５９９号（アウエスタッド（Ａｕｅｓｔａｄ）ら）
【特許文献３】米国特許第６３６５２１８号（ボルシェル（Ｂｏｒｓｃｈｅｌ））
【特許文献４】米国特許出願第２００３０１１８７０３Ａ１号（グエン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌａｄｉｓｃｈ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｇｉｌｌａｒｄ  Ｂ．  （１９８５）  Ａ．  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．    Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４６：  ２２０−２３１
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ  ａｎｄ  ＭｃＣｌｕｅｒ  Ｒ  （１９８０），  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｅｐ−ＰａｋＴＭ  Ｃ１８  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，  ３５：  ２６６−２６９
【非特許文献３】Ｇａｚｚｏｔｔｉ  Ｇ．，  Ｓｏｎｎｉｏｎ  Ｓ．，  Ｇｈｉｄｏｎｉａ  Ｒ  （１９８５），  Ｎｏｒｍａｌ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ３４８：３７１−３７８
【非特許文献４】Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｅ．Ｒ．，  Ｕｌｌｒｅｙ，  Ｔｈｅ  ｐｉｇ  ａｓ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  １９８７；  ７：  ３６１−８２
【非特許文献５】Ｐｏｎｄ  ＷＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｒｉｎａｔａｌ  Ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｏｍｅｓｔｉｃ  Ｐｉｇ．  ＰＳＥＢＭ  ２０００，  ２２３：  １０２−１０８
【非特許文献６】Ｌａｄｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌａｒｄ，  １９８５，  Ａ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４６：  ２２０−２３１
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  ＭｃＣｌｕｅｒ，  １９８０，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｅｐ−ＰａｋＴＭ  Ｃ１８  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｎｇｆｉｏｓｉｄｅｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ３５：  ２６６−２６９
【非特許文献８】Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ．  Ｌ．，  １９５７，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ：  Ａ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ２４：  ６０４−６１１
【非特許文献９】Ｇａｚｚｏｔｔｉ，  Ｓｏｎｎｉｎｏ，  Ｇｈｉｄｏｎｉ，  １９８５，  Ｎｏｒｍａｌ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ３４８：３７１−３７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、人乳中で認められる天然成分をさらに多く含むことで、母乳栄養児が現在享受している栄養的利益のうちのより多くのものを提供できるようにする新たな乳児用調乳が、現在も必要とされている。
【０００９】
本発明は、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、リン脂質、ガングリオシド類、ラクトフェリンおよびシアル酸などの人乳中に固有に認められる特定の濃度および種類の化合物を含む乳児用調乳に関するものである。これらの特定の成分およびこれらの乳児用調乳での相当する濃度のため、本明細書に記載の乳児用調乳の栄養素プロファイルは、従来の乳児用調乳よりも人乳との類似性が高い。
【００１０】
しかしながら、これらの調乳は人乳で認められる天然成分により近いだけでなく、これらの調乳は、誕生から最初の３から４ヶ月間の神経芽細胞遊走をも加速可能であることで、乳児における脳および認知発達の加速を助ける乳児用調乳が得られることが発見された。興味深いことに、神経芽細胞遊走に対する効果は、早期乳児期時のみで認められたことから（本明細書に記載の動物試験を参照）、この早期乳児期におけるこれら調乳の特定の使用の重要性が強調される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明の第１の実施形態は、授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物ならびに総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸および総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％のアラキドン酸を含む乳児用調乳に関するものである。この調乳は授乳基準で少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質および少なくとも約２．５％を脂質結合シアル酸とする少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸をも含み、これらのいずれも完全もしくは部分的に、強化乳清タンパク質濃縮物から提供され得る。
【００１２】
本発明の第２の実施形態は、授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物、総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸および総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％のアラキドン酸を含む乳児用調乳を経口投与する段階を有する、誕生から最初の２から４ヶ月の間の神経芽細胞遊走を加速する方法に関するものである。この調乳は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質および少なくとも約２．５％を脂質結合シアル酸として含む少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸をも含むことができ、これらのいずれも完全もしくは部分的に、強化乳清タンパク質濃縮物から提供され得る。
【００１３】
本発明の第３の実施形態は、授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物、総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸および総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％のアラキドン酸を含む乳児用調乳を経口投与する段階を有する、特に誕生から最初の２から４ヶ月の間における乳児の認知発達を加速する方法に関するものである。この調乳は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質および少なくとも約２．５％を脂質結合シアル酸とする少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸をも含むことができ、これらのいずれも完全もしくは部分的に、強化乳清タンパク質濃縮物から提供され得る。
【００１４】
これらの調乳が人乳で認められる天然成分により近づけるだけでなく、これらの調乳が早期乳児期の神経芽細胞遊走をも加速することで、乳児における脳および認知発達の加速を助ける乳児用調乳が得られることが発見された。興味深いことに、神経芽細胞遊走に対する効果は、早期乳児期時のみで認められたことから（本明細書に記載の動物試験を参照）、誕生から最初の２から４ヶ月間におけるこれら調乳の特定の使用の重要性が強調される。
【００１５】
神経芽細胞遊走に対する効果は、強化乳清タンパク質濃縮物を、より高レベルのドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸と組み合わせて、同一組成で用いた場合のみ起こり、より低濃度のドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸では、選択された動物モデルで神経芽細胞遊走に有意な影響はないことも発見された。
【００１６】
神経芽細胞遊走に対する効果は、乳児用調乳が、本明細書で定義の最小閾値を超えるレベルの強化乳清タンパク質濃縮物を含む場合にのみ起こることも発見された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１．１】本明細書に記載の動物試験での組織学的測定のためのブタ脳切片を示す図である（実験１）。
【図１．２】ヘマトキシリン：エオシンで染色した上皮下領域を示す図１．１のブタ脳切片の拡大図である（相対的に濃く染色されているドットは核であり、神経芽細胞は上皮下領域から白質に遊走する。）（実験１）。
【図１．３】核カウントのための図１．２の拡大ブタ脳切片からの領域１、２および３を示す図である（領域１は梁下束、神経芽細胞遊走および増殖領域であり；領域２は神経芽細胞凝集物を回避する遊走領域であり；領域３は梁下束に隣接する白質である。）（実験１）。
【図２】ここに記載の試験期間の間、異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）を与えた仔ブタでの梁下束の領域１、領域２および領域３についての核カウントに相当する３つのグラフを含む図である（データは平均±ＳＤであり、ａ：ｐ＜０．０５で開始時と有意差があり；ｂ：ｐ＜０．０５で８から９日と有意差があり；＊：ｐ＜０．０５で飼料Ａと有意差がある。）（実験１）。
【図３．１】異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはブタ乳を与えた仔ブタの梁下束での、Ｈ＆Ｅで染色された数に相当するグラフを含む図である（実験ＩＩ）。
【図３．２】異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはブタ乳を与えた仔ブタの梁下束に隣接する白質での、Ｈ＆Ｅで染色された数に相当するグラフを含む図である（実験ＩＩ）。
【図３．３】異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはブタ乳を与えた仔ブタの梁下束でのＢｒｄＵ陽性細胞の数に相当するグラフを含む図である（実験ＩＩ）。
【図４．１】異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはブタ乳を与えた仔ブタの梁下束に隣接する白質での、ＢｒｄＵ陽性細胞の数に相当するグラフを含む図である（実験ＩＩ）。
【図４．２】異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはブタ乳を与えた仔ブタの梁下束でのＫｉ６７陽性細胞の数に相当するグラフを含む図である（実験ＩＩ）。
【図４．３】異なる飼料（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはブタ乳を与えた仔ブタの梁下束に隣接する白質での、Ｋｉ６７陽性細胞の数に相当するグラフを含む図である（実験ＩＩ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の組成物は、強化乳清タンパク質濃縮物、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸の特定の組み合わせを含むものであり、これらのそれぞれについて下記で詳細に説明する。
【００１９】
本明細書で使用される「乳児」という用語は、約年齢が約１歳以下の個人を指し、０ヶ月から約４ヶ月齢の乳児、約４から約８ヶ月齢の乳児、約８から約１２ヶ月齢の乳児、誕生時２５００ｇ未満の低出生体重児および約３７週妊娠期間未満、代表的には約２６週から約３４週の妊娠期間で生まれた早期産児を含む。
【００２０】
本明細書で使用される「授乳での」という用語は、別段の断りがない限り、乳児への直接経口投与に好適な液体調乳を指し、この調乳は即時投与液体、再生粉末または希釈用濃縮物である。
【００２１】
本明細書で使用される「乳児用調乳」という用語は、別段の断りがない限り、補助栄養源、主栄養源または唯一の栄養源として乳児に経口投与するのに好適な脂肪、タンパク質、炭水化物、ビタミンおよびミネラルを含む製剤を指し、その例には再生用粉末、希釈用濃縮物および即時投与用液体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の乳児用調乳を特徴付けるのに用いられる本明細書で使用される全ての成分範囲は、別段の断りがない限り、授乳基準において乳児用調乳の重量を基準としたものである。
【００２３】
本明細書で使用される全てのパーセント、部および比率は、別段の断りがない限り、組成全体の重量基準である。列挙された成分に関するそのような全ての重量は活性レベルに基づいたものであり、したがって、別段の断りがない限り、市販の材料に含まれる可能性がある溶媒や副生成物は含まない。
【００２４】
本発明の乳児用調乳は、本明細書に記載の場合による成分もしくは特定の必須成分や構成要素を実質的に含まないものであることもできるが、ただし、残りの調乳はなお、本明細書に記載の必要な成分や構成要素を全て含むものである。この文脈においておよび別段の断りがない限り、「実質的に含まない」という用語は、選択された組成物が、機能する量に満たない量の場合による成分、代表的には０．１重量％未満であって０重量％を含むそのような場合による成分もしくは選択された必須成分を含むことを意味する。
【００２５】
別段の断りがあるまたは言及が行われている文脈によって逆の内容が明瞭に示唆されていない限り、本発明の単数での特徴または限定についての言及はいずれも、相当する複数の特徴または限定を包含するものであり、その逆も当てはまる。
【００２６】
別段の断りがあるまたは言及が行われている文脈によって逆の内容が明瞭に示唆されていない限り、本明細書で使用される方法およびプロセスの組み合わせはいずれも、いかなる順序で行っても良い。
【００２７】
本発明の方法および成分を含めた組成物は、本明細書に記載の本発明の必須の要素および限定、ならびに栄養調乳用途において有用な本明細書その他で記載の別のもしくは場合による成分、構成要素もしくは限定を含むまたはこれらから成るまたは本質的にこれらからなるものであることができる。
【００２８】
強化乳清タンパク質濃縮物
本発明の乳児用調乳は、乳児用調乳中でのガングリオシド、リン脂質およびシアル酸の供給源として、選択されたレベルの強化乳清タンパク質濃縮物を含むものである。調乳中でのこのようなガングリオシド、リン脂質およびシアル酸の全てまたは一部は、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されるものであって良い。
【００２９】
乳児用調乳における強化乳清タンパク質濃縮物のレベルは、授乳基準で約６．５ｇ／Ｌ調乳を超えるものでなければならない。このような濃度は、授乳基準で、約６．５から約１０．９ｇ／Ｌ、例えば約６．６から約８．５ｇ／Ｌ、さらに例えば約６．７から約７．３ｇ／Ｌ調乳の範囲であり得る。
【００３０】
本発明の乳児用調乳で使用される強化乳清タンパク質濃縮物は、高濃度の乳脂肪球皮膜物質を有するものである。乳脂肪球皮膜物質は、ウシその他の哺乳動物乳中のトリアシルグリセロール豊富乳脂肪球を囲む膜および膜関連物質である。乳脂肪球皮膜物質中で確認されている化合物の多くが、市販の乳児用調乳中よりもかなり高い濃度で人乳中に存在する。このような物質が強化された乳清タンパク質濃縮物を乳児用調乳に加えることで、得られる調乳は、人乳と組成がより類似するようになり、特にガングリオシド、リン脂質およびシアル酸の人乳濃度に関してそうなる。
【００３１】
本明細書で使用される「強化乳清タンパク質濃縮物」という用語は、別段の断りがない限り、少なくとも約３％、より代表的には少なくとも約５重量％のリン脂質（そのうち、少なくとも約２０重量％がスフィンゴミエリン）；少なくとも約０．５％、代表的には少なくとも約１．２重量％のシアル酸；および少なくとも約０．０５％、代表的には少なくとも約０．１重量％のガングリオシドを有する乳清タンパク質濃縮物を指す。濃縮物からの少なくとも約２から５重量％のシアル酸が脂質に結合している。
【００３２】
本発明での使用に好適な強化乳清タンパク質濃縮物の入手源には、強化成分のレベルが上記のものである乳清タンパク質濃縮物などがあり、その例には、ＬＡＣＰＲＯＤＡＮ（登録商標）ＭＦＧＭ−１０、すなわち濃縮物の重量基準で、６．５％リン脂質、０．２％ガングリオシド、１．８０％シアル酸（総脂肪酸の重量基準で少なくとも２．５％が脂質結合シアル酸）および１．５％ラクトフェリンを含むアルファ・フード・イングレディエンツ（Arfa Food Ingredients, Denmark）から入手可能な乳清タンパク質濃縮物などがあるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
強化乳清タンパク質濃縮物は好ましくは、乳児用調乳中における総リン脂質、ガングリオシドおよびシアル酸のうちの約１０％から１００％、例えば約５０％から約１００％、さらには例えば約５０％から約９０％、さらに例えば約６０％から約８５％を与える。後者の化合物は、哺乳動物乳その他の好適な供給源からの単離化合物として個別に加えることができるが、そのような化合物の全てではなくともほとんどが強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されることが好ましい。
【００３４】
シアル酸
本発明の乳児用調乳は、授乳基準で、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、例えば約９０ｍｇ／Ｌから約４０００ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約１９０ｍｇ／リットルから約２０００ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約３００ｍｇ／Ｌから約９００ｍｇ／Ｌの濃度でシアル酸を含み、重量基準で少なくとも２．５％、例えば約２．６％から約１０％、例えば約２．７％から約５％のシアル酸が脂質結合している。シアル酸の一部または全てが、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されるものであり得る。
【００３５】
乳児用調乳の脂質結合シアル酸成分は、最も代表的には、本質的に脂質結合シアル酸を含むガングリオシドの形態である。従って、下記に記載されている本発明のガングリオシド成分は、本発明の脂質結合シアル酸成分の主要もしくは唯一の供給源であることができる。
【００３６】
本明細書で使用される「シアル酸」という用語は、別段の断りがない限り、シアル酸誘導体を含む、全ての複合型および非複合型のシアル酸を指す。従って、本発明の乳児用調乳におけるシアル酸には、遊離のシアル酸、タンパク質結合シアル酸、脂質結合シアル酸（ガングリオシドなど）、炭水化物結合シアル酸およびこれらの組み合わせもしくは誘導体などがあり得る。本明細書に記載の全てのシアル酸濃度は、タンパク質、脂質、炭水化物その他のシアル酸構造に結合した複合体を除く、シアル酸化合物もしくは部分自体の重量パーセントに基づいたものである。
【００３７】
乳児用調乳で使用されるシアル酸源は、別個の成分として加えたり、得ることができる。しかしながら、より代表的には、シアル酸は主として、乳清タンパク質濃縮物成分からの、好ましくは本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物からの固有の成分として提供される。さほど好ましくはないが、シアル酸は別個の成分として乳児用調乳から得たり、乳児用調乳に加えても良く、この場合、加えられるシアル酸は、他の成分からの固有のシアル酸と組み合わせて、乳児用調乳中における総シアル酸含有量を得る。
【００３８】
個々の化合物もしくは部分として、シアル酸は炭素数９個のアミノ糖であり、その構造は、化学文献に容易に記載されている。Ｎ−アセチルノイラミン酸に関して他の一般に認められている名称には、シアル酸；ｏ−シアル酸；５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロソン酸；５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヌロソン酸；アセノイラミン酸；Ｎ−アセチル−ノイラミネート；Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＮＡＮＡ；ＮＡＮＡ、Ｎｅｕ５Ａｃ；およびＮｅｕＳＡｃなどがある。
【００３９】
好適なシアル酸源は、天然もしくは合成のいずれであっても良く、４０を超える天然の現在確認されているシアル酸誘導体のいずれかを含み、これらには遊離シアル酸、オリゴ糖結合体（例：シアリルオリゴ糖）、脂質結合体（すなわち、糖脂質）、タンパク質結合体（すなわち、糖タンパク質）およびこれらの組み合わせなどがある。
【００４０】
本発明での使用に好適なシアル酸には、天然であるか合成であるかを問わず、一般に人乳で認められるシアリルオリゴ糖などがあり、これらの最も豊富な二つのものは３′シアリルラクトース（３′ＳＬ、ＮｅｕＮＡｃα２−３ガラクトースβ１−４グルコース）および６′シアリルラクトース（６’ＳＬ、ＮｅｕＮＡｃα２−６ガラクトースβ１−４グルコース）である。他の好適なシアリルオリゴ糖には、より大きい人乳その他のより複雑なオリゴ糖に結合した１以上のシアル酸分子を含むものなどがある。
【００４１】
本明細書で使用される他の好適なシアル酸には、乳児用調乳での使用にやはり好適である相当する糖脂質などがあり、これらには脂肪酸、スフィンゴシン、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルノイラミン酸分子を含むシアル酸含有糖脂質のようなガングリオシド類などがある。これらのシアル酸化合物は、シアリル化されていることが知られている人乳中で一般に認めらていれるいくつかの糖タンパク質（例：κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン）のうちのいずれか１以上を含むこともできる。
【００４２】
本明細書での使用に好適なシアル酸源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳もしくは乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物のように、牛乳が本発明での使用に好ましい入手源である。
【００４３】
本発明での使用に好適なシアル酸の個々の入手源には、アルファ・フード・イングレディエンツ（デンマーク）から入手可能なラクプロダン（Lacprodan）ＣＧＭＰ−１０（４．２％シアル酸を含むカゼイノグリコマクロペプチド）およびダビスコ・フーズ・インターナショナル（Davisco Foods International, Eden Prairie, Minnesota, USA）から入手可能なバイオピュア・グリコマクロペプチド（Biopure glycomacropeptide）（７から８％のシアル酸含有）などがある。
【００４４】
乳児用調乳は、シアル酸源としてグリコマクロペプチドを含むことができるが、この調乳は好ましくは、グリコマクロペプチドの含有率がかなり低下されている。グリコマクロペプチドは、牛乳タンパク質カゼイン分子の一部である。スキムミルク中では、ごく微量の遊離グリコマクロペプチドが認められるが、乳清タンパク質濃縮物は、比較的高い量の遊離グリコマクロペプチドを含む。グリコマクロペプチドが、乳児によっても、さらには他のシアル酸源によっても耐容されないことが認められている。従って、乳清タンパク質濃縮物を用いて製造された乳児用調乳は、比較的高いグリコマクロペプチド含有率を有するが、乳児による耐容性も低いものと考えられる。この文脈において、「実質的に低下」という用語は、乳児用調乳が好ましくは、授乳基準で遊離グリコマクロペプチドとして、調乳の重量基準で０．５％未満、例えば０．４％未満、および例えば０．３５％未満、さらには例えば０パーセントを含むことを意味する。従来の乳児用調乳は代表的には、チーズ乳清からの代表的な乳清タンパク質濃縮物からの固有成分として、０．６から０．８％のグリコマクロペプチドを含む。
【００４５】
ガングリオシド
本発明の乳児用調乳は、オリゴ糖鎖に連結された１以上のシアル酸（ｎ−アセチルノイラミン酸）を有するグリコスフィンゴ糖脂質（セラミドおよびオリゴ糖）からなる化合物群である１以上のガングリオシドを強化濃度で含むこともできる。ガングリオシドの一部または全体は、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され得る。
【００４６】
ガングリオシドは、哺乳動物細胞の原形質膜の通常の成分であり、ニューロン膜で特に豊富である。これは、疎水性部分であるセラミドおよび親水性部分である１以上のシアル酸分子を含むオリゴ糖鎖を含む酸性スフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドのオリゴ糖部分は、ガングリオシドの分離およびこれらの個々の物質としての認識についての基準を構成する異なる化学構造を有する。最も一般的なガングリオシドのセラミド部分は、Ｃ１８およびＣ２０の誘導体が多い不均一な脂肪酸組成を有する。
【００４７】
ガングリオシドは、それぞれモノ、ジおよびトリシアロガングリオシドを指すＭ、ＤおよびＴの呼称を用いて呼ばれることが最も一般的であり、１、２、３などの数字は薄層クロマトグラフィーでのガングリオシドの移動順を指す。例えば、モノシアロガングリオシド類の移動順序は、ＧＭ３＞ＧＭ２＞ＧＭ１である。塩基性構造内での変化を示すのに、さらに下付文字を加え、例えばＧＭ１ａ、ＧＤ１ｂなどとする。
【００４８】
本発明の乳児用調乳は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、例えば約７ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約１０から約３０ｍｇ／Ｌのガングリオシドを含むことができる。これらのガングリオシド濃度は、人乳で認められるものと類似しており、人乳は代表的には少なくとも約３ｍｇ／Ｌのガングリオシド、より代表的には約３ｍｇ／Ｌから約３０ｍｇ／Ｌのガングリオシドを含む。乳児用調乳で用いられるこれらのガングリオシドは代表的には、ガングリオシド類であるＧＤ３、Ｏ−アセチル−ＧＤ３およびＧＭ３のうちの１以上、より代表的には全てを含む。これらのガングリオシドは一般に、本発明における乳児用調乳中の総ガングリオシドの少なくとも約８０重量％、より代表的には少なくとも約９０重量％を占める。
【００４９】
本発明で使用される好適なガングリオシド源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳または乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物など、牛乳が、本発明で使用される好ましいガングリオシド源である。
【００５０】
本発明での使用に好適な個々のガングリオシド源には、フォンテラ（Fonterra, New Zealand）から入手可能なガングリオシド５００（＞０．５％ＧＭ３および＜１．０％ＧＤ３）およびガングリオシド６００（＞１．２％ＧＤ３）などがある。
【００５１】
本発明の乳児用調乳の定義に関してのガングリオシド濃度は、下記に記載のガングリオシド法に従って測定される。
【００５２】
リン脂質
本発明の乳児用調乳は、強化濃度のリン脂質を含むことができる。このような濃度は、従来の乳児用調乳で認められるものより高く、人乳で認められるものと同様である。リン脂質の一部または全てが、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されて良い。
【００５３】
本発明での使用に好適なリン脂質には、牛乳その他の哺乳動物の乳汁で一般に認められるものなどがある。好ましいリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンおよびこれらの組み合わせなどがある。最も好ましいものは、５種類全てのリン脂質の組み合わせであり、特にはスフィンゴミエリンが総リン脂質の少なくとも２０重量％を占めるような組み合わせである。
【００５４】
本発明の乳児用調乳でのリン脂質濃度は、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、例えば約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約２５０から約４５０ｍｇ／Ｌであることができる。比較のため、人乳は一般に、約１６３から約４０４ｍｇ／Ｌのリン脂質を含み、スフィンゴミエリンは総リン脂質の約５１％を占める。
【００５５】
本発明での使用に好適なリン脂質源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳または乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物など、牛乳が本発明での使用に好ましいリン脂質源である。
【００５６】
他の好適なリン脂質源には、大豆、例えば大豆レシチンなどがある。しかしながら、本発明の乳児用調乳は、好ましくは、大豆源からのリン脂質は実質的に含まないものとする。乳児用調乳は、また好ましくは、卵リン脂質を実質的に含まないものとする。この文脈では、「実質的に含まない」という用語は、乳児用調乳が０重量％を含めて０．５重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満の大豆または卵リン脂質を含むことを意味する。
【００５７】
本発明での使用に好適な個々のリン脂質源には、フォンテラ（ニュージーランド）から入手可能なリン脂質濃縮物６００（＞１８．０％スフィンゴミエリン、＞３６．０％ホスファチジルコリン、＞９．０％ホスファチジルエタノールアミン、４．０％ホスファチジルセリン）などの牛乳由来の入手源などがある。
【００５８】
ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸
本発明の乳児用調乳はさらに、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸またはこれらの供給源を含むものであり、この調乳は少なくとも約０．１３％のドコサヘキサエン酸および少なくとも約０．２５％のアラキドン酸を含まなければならない。これらの２つの多価不飽和脂肪酸は、人乳でも認められる。
【００５９】
従って、本発明の乳児用調乳は、アラキドン酸を含むものでなければならず、これの最小濃度は、調乳中で総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．２５％、好ましくは少なくとも約０．３％、より好ましくは少なくとも約０．４％でなければならない。乳児用調乳中のアラキドン酸濃度は、調乳中の総脂肪酸の約２．０重量％以下、例えば約１．０重量％以下、さらに例えば約０．６重量％以下の範囲であることができる。
【００６０】
本発明の乳児用調乳は同様に、ドコサヘキサエン酸を含むものでなければならず、これの最小濃度は、調乳中で総脂肪酸の重量基準で少なくとも約０．１３％、好ましくは少なくとも約０．１４％、より好ましくは少なくとも約０．１５％でなければならない。乳児用調乳中のドコサヘキサエン酸濃度は、調乳中の総脂肪酸の約１．０％重量以下、例えば約０．５重量％以下、さらに例えば約０．２５重量％以下の範囲であることができる。
【００６１】
アラキドン酸および／またはドコサヘキサエン酸の一部の好適な供給源の例としては、魚油、卵由来油、乳脂肪、菌類油、藻類油、他の単細胞油およびこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。これらの組成物は好ましくは、卵由来油を実質的に含まないものであり、このことはその文脈において、そのような卵由来油の重量基準で０％を含む約０．０５％未満であることを意味する。
【００６２】
アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸は、乳児が使用するのに好適な形態で調乳に加えることができ、それには乳児への投与時または投与後にこのような遊離脂肪酸源を他の形で提供することができる化合物もしくは材料などがあり、例えばリン脂質および多価不飽和脂肪酸のグリセリドエステル（モノ、ジ、トリ）などがある。多価不飽和脂肪酸およびそれの供給源については、米国特許第６０８０７８７号（カールソン（Carlson）ら）および米国特許第６４９５５９９号（アウエスタッド（Auestad）ら）に記載されており、これらの記載は参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の定義に関して、アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸のリン脂質源は、本明細書で前述したリン脂質成分としては含まれない。
【００６３】
これらの脂肪酸は、米国特許第６４９５５９９号（アウエスタッドら）にも記載されており、この記載は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６４】
他の栄養素
本発明の乳児用調乳は、脂肪、タンパク質、炭水化物、ビタミンおよびミネラルを含み、これらはいずれも、対象となる乳児または所定の乳児群の栄養上のニーズを満足する種類および量で選択される。
【００６５】
多くの異なる入手源および種類の炭水化物、脂肪、タンパク質、ミネラルおよびビタミンが知られており、本発明における基本調乳で用いることができるが、ただし、このような栄養素は特定の製剤中で添加される成分と適合性のものであり、さもなければ乳児用調乳での使用に好適なものである。
【００６６】
本発明での使用に好適な炭水化物は、単純もしくは複合の、乳糖を含有するまたは乳糖を含まないまたはこれらの組み合わせであることができ、例としては加水分解、無処理、天然および／または化学修飾されたコーンスターチ、マルトデキストリン、グルコースポリマー、ショ糖、コーンシロップ、コーンシロップ固体、米またはジャガイモ由来の炭水化物、グルコース、果糖、乳糖、高果糖コーンシロップならびにフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）およびこれらの組み合わせなどの消化可能なオリゴ糖などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
本発明における調乳での使用に好適なタンパク質には、加水分解、部分加水分解および非加水分解もしくは無処理のタンパク質もしくはタンパク質源などがあり、牛乳（例えば、カゼイン、乳清、人乳タンパク質）、動物（例えば、肉、魚）、穀類（例えば、米、トウモロコシ）、野菜（例えば、大豆）またはこれらの組合せなどの公知であるまたはさもなければ好適な供給源由来のものであることができる。
【００６８】
本発明で使用されるタンパク質は、乳児用調乳での使用に関して公知であるまたはさもなければ好適な遊離アミノ酸を含みまたは遊離アミノ酸によって完全もしくは部分的に置き換わっていても良く、これらのアミノ酸の例には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、カルニチン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、タウリン、チロシン、バリンおよびこれらの組合せなどがあるが、これらに限定されるものではない。これらのアミノ酸は、最も代表的にはＬ型で使用されるが、相当するＤ−異性体も、栄養的に等価であれば使用可能である。ラセミ混合物または異性体混合物も使用可能である。
【００６９】
本発明における調乳で使用するのに好適な脂肪には、ヤシ油、大豆油、トウモロコシ油、オリーブ油、紅花油、高オレイン酸紅花油、藻類油、ＭＣＴ油（中鎖脂肪酸トリグリセリド）、ひまわり油、高オレイン酸ひまわり油、パーム油およびパーム核油、パームオレイン、カノーラ油、魚油、綿実油ならびにこれらの組合せなどがある。本発明の乳児用調乳には、授乳基準で約１重量％未満、例えば０重量％を含む約０．２重量％未満の乳脂を含む実施形態などがある。
【００７０】
調乳での使用に好適なビタミン類および同様の他の成分には、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビタミンＢ１２、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コリン、イノシトール、これらの塩および誘導体ならびにこれらの組み合わせなどがある。
【００７１】
基本調乳での使用に好適なミネラルには、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、クロム、ヨウ素、ナトリウム、カリウム、クロライドおよびこれらの組み合わせなどがある。
【００７２】
本発明の乳児栄養調乳は好ましくは、対象となる消費者もしくはユーザー群に関する関連の乳児用調乳ガイドラインに従って栄養素を含むものであり、このガイドラインの例としては、乳児調乳法２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション３５０（ａ）があろう。調乳で使用する上で好ましい炭水化物、脂質およびタンパク質濃度を、下記の表に示してある。
【００７３】
【表１】
2009542227.tif 000002
【００７４】
乳児用調乳は、調乳１００ｋｃａｌ当たり、ビタミンＡ（約２５０から約７５０ＩＵ）、ビタミンＤ（約４０から約１００ＩＵ）、ビタミンＫ（約４μｍより多い）、ビタミンＥ（少なくとも約０．３ＩＵ）、ビタミンＣ（少なくとも約８ｍｇ）、チアミン（少なくとも約８μｇ）、ビタミンＢ１２（少なくとも約０．１５μｇ）、ナイアシン（少なくとも約２５０μｇ）、葉酸（少なくとも約４μｇ）、パントテン酸（少なくとも約３００μｇ）、ビオチン（少なくとも約１．５μｇ）、コリン（少なくとも約７ｍｇ）およびイノシトール（少なくとも約２ｍｇ）のうちの１以上を含むこともできる。
【００７５】
乳児用調乳は、調乳１００ｋｃａｌ当たり、カルシウム（少なくとも約５０ｍｇ）、リン（少なくとも約２５ｍｇ）、マグネシウム（少なくとも約６ｍｇ）、鉄（少なくとも約０．１５ｍｇ）、ヨウ素（少なくとも約５μｇ）、亜鉛（少なくとも約０．５ｍｇ）、銅（少なくとも約６０μｇ）、マンガン（少なくとも約５μｇ）、ナトリウム（約２０から約６０ｍｇ）、カリウム（約８０から約２００ｍｇ）、クロライド（約５５から約１５０ｍｇ）およびセレン（少なくとも約０．５ｍｃｇ）のうちの１以上を含むこともできる。
【００７６】
乳児用調乳はさらに、フルクト多糖（fructopolysaccharides）を含むことができ、その濃度は授乳基準で調乳の約５重量％以下の範囲、例えば約０．０５％から約３％、さらに例えば約０．１％から約２％の範囲であることができる。これらのフルクト多糖は、長鎖（例：イヌリン）、短鎖（例：ＦＯＳまたはフルクト多糖）またはこれらの組み合わせであることができ、混合物は多様な鎖長の構造を有しており、ほとんどの場合、約２から約６０のＤＰ（重合度）を有する。
【００７７】
乳児用調乳はさらに、組成物の物理的、化学的、美的または加工上の特性を変えることができ、対象の乳児もしくは乳児群で用いた場合に医薬成分または追加の栄養成分として役立ち得る他の場合による成分を含むことができる。多くのそのような場合による成分は、公知でありまたはさもなければ栄養製品での使用に好適であり、本発明の乳児用調乳で使用することもでき、そのような適宜材料は、本明細書に記載の必須材料と適合性であり、さもなければ乳児用調乳での使用に好適である。
【００７８】
このような場合による成分の例としては、追加の酸化防止剤、乳化剤、緩衝剤、着色剤、香味剤、ラクトフェリン、別のアルファラクトアルブミン、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよび関連誘導体、増粘剤ならびに安定剤などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
使用方法
本発明はさらに、本明細書に記載の乳児用調乳を製造し、次に、生まれてから最初の２ヶ月の間、好ましくは最初の４ヶ月の間、乳児にこの調乳を投与するまたはこの調乳を投与するよう介護者に指示することで、乳児における脳発達を加速させる方法に関するものでもある。
【００８０】
本発明はさらに、本明細書に記載の乳児用調乳を製造し、次に、生まれてから最初の２ヶ月の間、好ましくは最初の４ヶ月の間、乳児にこの調乳を投与するまたはこの調乳を投与するよう介護者に指示することで、神経遊走を加速させる方法に関するものでもある。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書に記載の乳児用調乳を製造し、次に、生まれてから最初の２ヶ月の間、好ましくは最初の４ヶ月の間、乳児にこの調乳を投与するまたはこの調乳を投与するよう介護者に指示することで、視覚発達を加速させる方法に関するものでもある。
【００８２】
本発明はさらに、本明細書に記載の乳児用調乳を製造し、次に、生まれてから最初の２ヶ月の間、好ましくは最初の４ヶ月の間、乳児にこの調乳を投与するまたはこの調乳を投与するよう介護者に指示することで、認知発達を加速させる方法に関するものでもある。
【００８３】
本発明はさらに、本明細書に記載の乳児用調乳を製造し、次に、生まれてから最初の２ヶ月の間、好ましくは最初の４ヶ月の間、乳児にこの調乳を投与するまたはこの調乳を投与するよう介護者に指示することで、乳児に対して唯一の供給源、補助または主要栄養素を与える方法に関するものでもある。
【００８４】
本発明の方法はいずれも、誕生から最初の２から４ヶ月の間での乳児用調乳の選択使用に関するものであるが、理解すべき点として、そのような方法に別の投与を含めることで、最初の２から４ヶ月期間以後に、乳児に対して、９から１２ヶ月までの間、同じ調乳での授乳を継続しても良い。しかしながら、本発明の効果を実現するためには、誕生から最初の２から４ヶ月の間での投与はやはり行うべきであり、そのような投与をその期間をかなり超えて延長するとしても行うべきである。
【００８５】
本発明の方法の文脈において、乳児用調乳は、単一、主要または補助栄養を提供することができるが、単一栄養源であることが好ましい。粉末の実施形態において、各方法は、水系媒体、最も代表的には水もしくは人乳で粉末を再生して（または介護者に対して再生するよう指示して）、所望のカロリー密度を形成する段階を有することもでき、その後にそれを乳児に経口もしくは非経口的に与えることで、所望の栄養を提供する。粉末は、一定量の水または人乳などの他の好適な流体で再生して、約１回の授乳に好適な容量および栄養プロファイルを得る。
【００８６】
本発明の乳児用調乳は、最も代表的には授乳基準で約１９から約２４ｋｃａｌ／液量オンス、より代表的には約２０から約２１ｋｃａｌ／液量オンスのカロリー密度を有する。
【００８７】
ガングリオシド分析法
本発明で使用されるガングリオシド濃度は、下記の分析方法に従って測定される。
【００８８】
総脂質を、ラクプロダン（Lacprodan）ＭＦＧＭ−１０または乳児用調乳サンプルから、クロロホルム：メタノール：水の混合物で抽出する。ガングリオシドを、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）／１−ブタノール／水相分配およびＣ−１８カートリッジによる固相抽出の組み合わせによって総脂質抽出物から精製する。精製ガングリオシド中の脂質結合シアル酸（ＬＢＳＡ）を、レゾルシノールとの反応によって分光光度的に測定する。ＬＢＳＡに変換係数を掛けることで、サンプル中のガングリオシドの量を得る。この係数は、ガングリオシド単位およびシアル酸単位の分子重量比から得られる。ガングリオシドは異なる分子量およびシアル酸残基数を有する化合物のファミリーであることから、ＨＰＬＣ分離を用いて個々のガングリオシド分布を測定することで、この変換係数をより正確に計算する。
【００８９】
標準
・ウシ脳からのジシアロガングリオシドＧＤ１ａ、最低９５％（ＴＬＣ）、シグマ（SIGMA）参照番号Ｇ−２３９２。
・ウシ脳からのモノシアロガングリオシドＧＭ１、最低９５％（ＴＬＣ）、シグマ参照番号Ｇ−７６４１。
・ウシバターミルクからのジシアロガングリオシドＧＤ３アンモニウム塩、最低９８％（ＴＬＣ）、カルバイオケム（Calbiochem）参照番号３４５７５２またはマトレヤ（Matreya）参照番号１５０３。
・牛乳からのモノシアロガングリオシドＧＭ３アンモニウム塩、最低９８％（ＴＬＣ）、カルバイオケム参照番号３４５７３３またはマトレヤ参照番号１５０４。
・大腸菌からのＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮＡＮＡ）、最低９８％シグマ、参照番号Ａ−２３８８。
【００９０】
供給者が濃度を保証しないのが普通であることから、ガングリオシド標準は真の標準とは見なされない。そのため、濃度はレゾルシノール法によって測定されるＬＢＳＡとして計算される。ガングリオシドの種類に応じて、標準をクロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）１：１（体積比）で１から２．５ｍｇ／ｍＬの理論濃度まで希釈する。少量サンプル１０、２０および４０μＬを取り、Ｎ２気流下に乾燥させ、下記の説明する方法に従って測定する（ＬＢＳＡの測定）。３つの少量サンプルの平均濃度を、ＬＢＳＡとして表されるガングリオシド標準の濃度と見なす。ガングリオシド濃度は、分子量比から得られる変換係数をＬＢＳＡに掛けることで得られる（変換係数：
【００９１】
【数１】
2009542227.tif 000003
式中、ｎ＝シアル酸単位数である）。
【００９２】
【表２】
2009542227.tif 000004
【００９３】
手順
脂質抽出：脂質抽出物は次のように得る。調乳１ｇまたはラクロプロダン（Lacprodan）ＭＦＧＭ−１０  １００ｍｇのサンプルを、丸底ガラス製遠心管（調乳には５０ｍＬ管およびラクロプロダンＭＦＧＭ−１０には１０ｍＬ管）中に秤量する。サンプル１ｇ当たりクロロホルム：メタノール：水（Ｃ：Ｍ：Ｗ）５０：５０：１０（体積比）２５ｍＬを加え、渦攪拌および超音波処理を１分間交互に行うことで、サンプルを完全に分散させる。１５分ごとに１分の浴超音波パルスを用いて、激しく継続的な渦攪拌（２０００ｒｐｍ）を行いながら、室温で４５分間にわたって管を温置する。サンプルを遠心する（１５００×ｇ、１０分間、１５℃）。上清を４０ｍＬ円錐底ガラス遠心管に移し、Ｎ２下に３７℃での乾燥を開始させる。一方で、ペレットについて、連続的渦攪拌（２０００ｒｐｍ）および７．５分ごとに１分間の浴超音波パルスを行いながら、室温て１５分間にわたり、１ｇ当たりＣ：Ｍ：Ｗ  １２．５ｍＬによって再抽出する。遠心後、上清を４０ｍＬ管中で最初のものと合わせ、溶媒留去を続ける。ペレットをＣ：Ｍ１：１（体積比）で洗浄し、超音波パルスは５分ごととして、前記と同じ条件で１０分間温置する。遠心後、上清をさらに、４０ｍＬ管に加え、溶媒留去する。
【００９４】
ガングリオシド画分を、ラディシュら（Ladisch S. and Gillard B. (1985) A. solvent partition method for microscale ganglioside purification. Anal. Biochem. 146: 220-231）が記載しているジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）／１−ブタノール／水相分配の組み合わせによって総脂質抽出物から精製する。これに続いて、ウィリアムスらの報告（Williams M and McCluer R (1980), The use of Sep-PakTM C18 cartridges during the isolation of gangliosides, J. Neurochem, 35: 266-269）に記載の方法に変更を加えたものに従って、Ｃ−１８カートリッジによる固相抽出を行う。
【００９５】
ジイソプロピルエーテル／１−ブタノール／水系ＮａＣｌ分配：ＤＩＰＥ／１−ブタノール６０：４０（体積比）４ｍＬを、乾燥させた脂質抽出物に加える。サンプルを渦攪拌および超音波処理して、脂質抽出物の微細懸濁液とする。０．１％ＮａＣｌ水溶液２ｍＬを加え、管について、２分間にわたって渦攪拌と１５秒パルスでの超音波処理を交互に行い、遠心する（１５００×ｇ、１０分間、１５℃）。境界相を除去しないように注意を払いながら、パスツールピペットを用いて、上層の有機相（中性脂質およびリン脂質を含有）を注意深く除去する。ガングリオシドを含む下層の水相を、最初の容量の有機溶媒で２回抽出する。容量が最初の容量の約半分に減るまで（ほぼ２ｍＬ）、３０から４５分間にわたり、３７℃でＮ２気流下に、サンプルを部分的に溶媒留去する。
【００９６】
逆相Ｃ−１８カートリッジによる固相抽出（ＳＰＥ）：５００ｍｇＣ−１８カートリッジを、２４ポートライナーＳＰＥ真空多岐管に取り付け、メタノール５ｍＬ、Ｃ：Ｍ２：１（体積比）５ｍＬおよびメタノール２．５ｍＬの３回の連続洗浄で活性化させる。次に、カートリッジを０．１％ＮａＣｌ水溶液：メタノール６０：４０（体積比）２．５ｍＬで平衡とする。部分的に溶媒留去した下側の相の容量を測定し、水で１．２ｍＬとし、メタノール０．８ｍＬを加える。次に、これを遠心して（１５００×ｇ、１０分間）、不溶物を除去し、Ｃ−１８カートリッジに２回乗せる。ＳＰＥカートリッジを蒸留水１０ｍＬで流して塩および水溶性汚染物を除去し、３０秒間真空乾燥する。ガングリオシドをメタノール５ｍＬおよびＣ：Ｍ２：１（体積比）５ｍＬで溶離し、Ｎ２気流下に乾燥させ、Ｃ：Ｍ  １：１（体積比）２ｍＬに再度溶解させる。サンプルおよび溶媒を重力によってカートリッジを通過させるまたは強制的に１から１．５ｍＬ／分の流量で弱い減圧を行う。ガングリオシドを分析まで−３０℃で保存する。総ガングリオシドを、ＬＢＳＡとして測定する。少量サンプル５００μＬを１０ｍＬガラス製遠心管に入れ、Ｎ２下に乾燥させ、レゾルシノールアッセイによって測定する（３）。
【００９７】
ＬＢＳＡの測定：レゾルシノール試薬１ｍＬおよび水１ｍＬを加える。管にキャップを施し、沸騰水浴で１００℃にて１５分間加熱する。加熱後、管を氷浴水で冷却する。酢酸ブチル：ブタノール８５：１５（体積比）２ｍＬを加え、管を１分間激しく振盪し、７５０×ｇで１０分間遠心する。上側の相を取り、分光光度計にて５８０ｎｍで測定する。ＮＡＮＡの標準溶液（０、２、４、８、１６、３２および６４μｇ／ｍＬ）を同様にして処理し、それを用いて、サンプル中のシアル酸濃度を計算する。
【００９８】
レゾルシノール試薬は次のように調製する。レゾルシノールの２％脱イオン水溶液１０ｍＬ、０．１Ｍ硫酸銅０．２５ｍＬ、濃塩酸８０ｍＬに水を加えて１００ｍＬとする。試薬は日光から保護して毎日調製する。
【００９９】
ＨＰＬＣによるガングリオシドの分離：フェノメネックス（Phenomenex）からのルナ（Luna）−ＮＨ２カラム、５μｍ、１００Å、２５０×４．６ｍｍ（参照番号００Ｇ−４３７８−ＥＯ）を用い、ウォーターズからのデュアル吸光度検出器（Dual Absorbance Detector）を搭載したアライアンス（Alliance）２６９０装置でのＨＰＬＣによって、ガングリオシドを分離する。それを、文献（Gazzotti G., Sonnion S., Ghidonia R (1985), Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. J Chromatogr. 348:371-378）の方法に従って、各種容量比および張度でのアセトニトリル−リン酸緩衝液の溶媒系を用いて、室温で溶離する。２つの移動相での勾配を用いる。
溶媒Ａ：アセトニトリル−５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．６（８３：１７）。この緩衝液は、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．６８９９ｇを水１リットルに加えて調製し、ｐＨを５．６に調節する。
溶媒Ｂ：アセトニトリル−２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．６（１：１）。この緩衝液は、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ２．７５６０ｇを水１リットルに加えて調製し、ｐＨを５．６に調節する。
【０１００】
下記の勾配溶離プログラムを用いる。
【０１０１】
【表３】
2009542227.tif 000005
【０１０２】
サンプルを、上記で説明した方法に従って、液相抽出し、分配し、固相抽出する。サンプルのＣ：Ｍ１：１溶液２ｍＬからの０．５ｍＬの少量サンプルを窒素下に溶媒留去し、水０．１５０ｍＬに溶かす。完全に再生させるため、サンプルを渦攪拌および超音波処理する。最終溶液をＨＰＬＣバイアルに移す。注入容量は、サンプルおよび標準について３０μＬである。
【０１０３】
ＧＤ３およびＧＭ３標準を、レゾルシノール法によって測定し、真の濃度を上記の方法に従って計算する。ＧＤ３およびＧＭ３を含む４つの標準溶液ならびにブランクを、水で調製する。較正標準の濃度は、ＧＤ３に関して約０から０．５ｍｇ／ｍＬ、ＧＭ３に関して０から０．２ｍｇ／ｍＬの範囲とした。各組の標準の正確な濃度は、標準の純度に応じて変わり得る。
【０１０４】
例えば新たなカラムに関して、システムを調整する都度、１組の標準を注入する。１０回の測定ごとに中間濃度の標準一つを注入することで、システムの適正な性能をチェックする。内挿濃度が理論濃度の９５％から１０５％の間にない場合、新たな較正セットを注入し、以後の計算に用いる。
【０１０５】
製造方法
本発明の乳児用調乳は、乳児用調乳その他の調乳の製造および調合に好適な公知であるまたはさもなければ有効な技術によって製造することができる。いずれか所定の調乳を得る上でのそのような技術およびそれの変法は、本明細書に記載の調乳の製造における乳児栄養の製剤または製造の業界での当業者であれば、容易に決定および使用するものである。
【０１０６】
本発明の乳児用調乳の製造方法は、水および１以上の下記の成分：炭水化物、タンパク質、脂質、安定剤、ビタミンおよびミネラルを含むことができる１以上の溶液からスラリーを形成する段階を含むことができる。このスラリーを、乳化、均質化および冷却する。得られた乳濁液に、各種の他の溶液、混合物その他の材料を加えてから、加える途中、または加える前に、別の加工を行うことができる。この乳濁液を、さらに希釈、安定化および包装することで、即時授乳液または濃縮液を形成することができるまたはそれを安定化してから、処理し、再生可能な粉末（例：スプレー乾燥品、乾燥混合品、凝集品）として包装することができる。
【０１０７】
乳児用調乳製造に関しての他の好適な方法は、例えば米国特許第６３６５２１８号（ボルシェル（Borschel））および米国特許出願第２００３０１１８７０３Ａ１号（グエン（Nguyen）ら）（これらの記載は、参照によって本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【実施例】
【０１０８】
実験１
本試験の目的は、対照調乳または強化濃度のガングリオシド、リン脂質およびシアル酸ならびに多様な濃度のアラキドン酸およびドコサヘキサエン酸を含む２つの異なる調乳のうちの一方のいずれかを与えた新生仔ブタでの成績効果を比較することにある。
【０１０９】
背景
新生仔ブタは、ヒト臨床試験の設計および実施に先だって、栄養介入を評価するための適切なモデルを構成する。この好適性は、仔ブタの消化器生理がヒト新生児のものと類似している点にある。このモデルは、乳児用調乳の耐容性を予測する上で有用な手段である（Miller, E.R., Ullrey, The pig as model for human nutrition, Annu Rev Nutr 1987; 7: 361-82）。さらに、ヒトの場合のように、仔ブタ脳の急成長は、出生前後期から誕生後早期の範囲で起こり、このことによっても、本動物モデルは非常に有用となる（Pond WG et al., Perinatal Ontogeny of Brain Growth in the Domestic Pig. PSEBM 2000, 223: 102-108）。考慮すべき非常に重要な時期は、受胎後７０から１４０日である（誕生は、受胎後１１２から１１３日当たりで起こる）。本試験は、３つの被験調乳の効果の生物学的評価を提供するよう設計されており、これらの調乳のうちの一つは従来の乳児用調乳対照である。
【０１１０】
要約
本試験からのデータは、新生仔ブタにおいて１２から１３日齢で有意な神経遊走を示している。仔ブタにおけるこの時期は、ヒト乳児での３から４ヶ月に相当するものと考えられる（Miller, E.R., Ullrey, The pig as model for human nutrition, Annu Rev Nutr 1987; 7: 361-82）。
【０１１１】
実験計画
本試験は長期試験であり、実験飼料Ａ、ＢまたはＣを与える３つの仔ブタ群（表２参照）を含み、授乳８から９日、１５から１６日および２９から３０日後の３回の屠殺を行う。試験開始時に屠殺した別の群を、基準として用いる。本試験は２つの実験に分かれている。本試験における仔ブタは、認定された農場から供給される。
【０１１２】
本試験における２つの実験のうちの第１の実験では、３３頭の条件を合わせた家畜の仔ブタ（４から５日齢）を、２７から３０℃で適応前処置した部屋で、ステンレス製の飼育ケージ（ケージ当たり動物２頭）にて飼育する。動物には、栄養上の要件に従って、調整ブタ飼料を１日４回与える。３日間の馴致期間後、仔ブタ３頭を屠殺する。これらの動物を屠殺する時点を、本試験における「時間ゼロ」と見なす。残りの仔ブタは、体重および同腹仔によってペアとし、３つの群に分け（それぞれ、ｎ＝１０．ｎ＝１０およびｎ＝１０）、やはり下記の飼料を１日４回与える。
・飼料Ａ：アボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories, Columbus, Ohio, USA）から入手可能なシミラック（Similac；登録商標）アドバンス（Advance；登録商標）乳児用調乳と同様（総脂肪酸の重量基準で０．４％のアラキドン酸、０．１５％のドコサヘキサエン酸、ならびに従来の乳清タンパク質濃縮物）、
・飼料Ｂ：総調乳脂肪酸の重量基準で０．４％のアラキドン酸および０．１５％のドコサヘキサエン酸、ならびに授乳基準で７．１ｇ／Ｌ調乳のレベルでの強化乳清タンパク質濃縮物を含む本発明の乳児用調乳、
・飼料 Ｃ：アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸濃度が低く（それぞれ総調乳脂肪酸の重量基準で０．２％および０．１％）、強化乳清タンパク質濃縮物を授乳基準で７．１ｇ／Ｌ調乳のレベルで含む以外は飼料Ｂと同様の乳児用調乳。
【０１１３】
飼料Ａ、ＢおよびＣについては、新生仔ブタの特殊な要件に対して、微量栄養素（ミネラルおよびビタミン）に関しての調整を行う。下記の表に、標準ブタ飼料ならびに飼料Ａ、ＢおよびＣの組成を示してある。
【０１１４】
【表４】
2009542227.tif 000006
【０１１５】
【表５】
2009542227.tif 000007
【０１１６】
いずれの飼料も一旦製造したら、直ちに使用するまたは不活性雰囲気の缶の中で４℃にて保存し、２４時間以内に用いる。飼料は粉末形態であり、調整ブタ飼料の場合には水で再生して１８．８重量％とし、飼料Ａ、ＢおよびＣの場合には１２．８５重量％とする。再生した液体飼料はケージの餌入れに注ぐ。残った液体を除去して測定し、餌入れを洗浄してから、次の飼料を投入する。
【０１１７】
各群について、３または４頭の仔ブタを、対照（飼料Ａ）または実験調乳（飼料ＢおよびＣ）による給餌開始から８から９日、１５から１６日および２９から３０日に屠殺する。
【０１１８】
本試験の第２の実験では、４４頭の雄家畜仔ブタ（４から５日齢）を、第１の実験に記載のものと同じ種類のケージおよび同じ部屋で個別に飼育する。給餌プロトコールは同じであり、馴致期間後に４頭の仔ブタを屠殺して、基準群を完成する。仔ブタの残りのものは、体重および同腹仔でペアとし、飼料Ａ，ＢおよびＣを与える３つの群に分ける（それぞれ、ｎ＝１３、ｎ＝１３およびｎ＝１４）。各群にはさらに１もしくは２頭の仔ブタを含めることで、中止の場合の代わりとする。
【０１１９】
飼料摂取および体重増を、各仔ブタについてそれぞれ１日４回および２週間に２回記録する。
【０１２０】
適切な時点で、終夜絶食後にケタミン／ドムトル（Domtor）で各仔ブタに麻酔を施し、頸静脈穿刺での致死的放血によって屠殺する。その後に、脳の組成および組織学を評価する。
【０１２１】
サンプル製造
仔ブタは終夜絶食させ、麻酔下に頸静脈穿刺によって放血させて屠殺する。トリカリウムＥＤＴＡ（２．７ｍｍｏｌ／Ｌ）を抗凝血剤として用いて採血を行い、１５００×ｇで４℃にて１０分間遠心する。
【０１２２】
頭蓋を開け、脳を摘出し、秤量する。左半球を切開し、緩衝させた４％ホルムアルデヒドｐＨ７．４およびエタノール中にて７０℃で１週間浸漬させて組織学的分析に供する。右半球は−８０℃で保存して生化学分析に供する。全眼を摘出する。左眼球もホルムアルデヒドに浸漬する。２時間後、その眼球の前極をメスによって分離し、眼球は再度ホルムアルデヒド中で１８時間維持する。右眼球を切開し、網膜を摘出し、秤量する。血漿、右半球および網膜は、分析まで−８０℃で保存する。
【０１２３】
血漿の脂肪酸組成
血漿サンプルを、レページ（Lepage）およびロイ（Roy）（６）の方法によってメチル化し、ガス液体クロマトグラフィーによって分析する。血漿２００ミクロリットル（μＬ）に、内部標準としてのペンタデカン酸（０．０４ｍｇ／サンプル）、メタノール：ヘキサン（４：１）の混合物２ｍＬおよび塩化アセチル０．２ｍＬを加える。管にキャップを施し、１００℃で１時間加熱する。これらを氷浴で冷却し、６％Ｋ２ＣＯ３  ５ｍＬを加え、１５００×ｇで１０分間遠心する。ヘキサン上層３μＬを、水素炎イオン化検出器および長さ６０ｍ、内径０．３２ｍｍ、層厚０．２μｍのキャピラリーＳＰ２３３０カラム（スペルコ（Supelco））を取り付けたヒューレット・パッカード（Hewlett-Packard）６８９０クロマトグラフィー装置に注入する。分割比１：４０で、キャリアガスとしてヘリウム流量１ｍＬ／分を用いる。温度プログラミングは、１６５℃で３分間、２℃／分で１９５℃まで昇温、２分間維持、３℃／分で２１１℃まで昇温、１０分間維持からなるものとした。注入部および検出器の温度は２５０℃である。脂肪酸は、それらの保持時間を信頼性のある標準（シグマ（Sigma））のものと比較することで確認する。結果は、各脂肪酸メチルエステルについての面積もしくは濃度の正規化されたパーセントとして表す。
【０１２４】
脳組成
右半球は、ハイドルフ（Heidolph）ホモジナイザーで均質化する。均質化した大脳１ｇを、ウルトラツラックス（ultraturrax）で１分間にわたり、ＰＢＳ  １５ｍＬとともにさらに均質化し、ＰＢＳで希釈して１００ｍＬとする。ヘキスト（Hoechst）試薬との反応およびモレキュラー・プローブス（Molecular Probes）キットＦ−２９６２を用いる蛍光定量法によって、小分けサンプル１０μＬにおいて３連でＤＮＡの含有量を測定する。
【０１２５】
マイクロプレートで測定するよう変更して、シグマ（Sigma）キットＴＰ０３００を用いてローリー法によって１ｇ／１００ｍＬホモジネートの１：４希釈液で、タンパク質含有量を求める。すなわち、３連でのサンプルまたは標準２０□Ｌを９６ウェルのマイクロプレートに入れる。水８０μＬおよびローリー試薬１００μＬを加え、混合しながら２０分間温置する。フォリン−ショカルトー（Folin-Ciocalteau）試薬５０μＬを加え、混合しながら３０分間温置する。吸光度を６９０ｎｍで測定する。
【０１２６】
コレステロールは、サンプルを有機溶媒で抽出した後に分光測光−比色法によって測定する。均質化した脳２００ｍｇを、ハイドルフ・ホモジナイザーで水１ｍＬ中にてさらに均質化する。サンプルに、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）５ｍＬを加え、１分間渦攪拌し、５分間超音波処理し、４℃で１５００×ｇにて１０分間遠心する。上層を回収し、下層は溶媒３ｍＬで再抽出する。上層を回収し、最初のものと合わせ、Ｎ２気流下に溶媒留去する。抽出物をクロロホルム３ｍＬに溶かし、２０μＬを２連で取ってコレステロール分析に供する。溶媒を留去し、イソプロパノール１００μＬを加える。供給者の説明に従い、ランドクス（Randox）キットｎ０ＣＨ２０１を用いてコレステロール測定を行う。コレステロール較正線を０．２５から２ｍｇ／ｍＬで用いる。
【０１２７】
ホモジネート４０ｍｇを用い、内部標準は用いずに、血漿について上記で説明の方法に従って、脂肪酸組成を測定する。結果は、各脂肪酸メチルエステルについての正規化した面積パーセントとして表す。
【０１２８】
ガングリオシド含有率は、抽出、分配および脂質精製後に脂質結合シアル酸（ＬＢＳＡ）としてのＨＰＬＣおよび分光測定の両方によって測定する。均質化した脳の一部（１．２５０ｇ）を、クロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）１：１（体積比）１９ｍＬで抽出し、混合物を４℃で４５分間攪拌し、４℃で１５００×ｇにて１０分間遠心する。上清を回収し、ペレットを、それぞれ１８ｍＬおよび１２ｍＬの溶媒混合物で再抽出する。その３つの上清を集め、溶媒混合物で５０ｍＬとし、２０ｍＬずつの２つの小分けサンプルを取り、−３０℃で終夜温置する。温置後、サンプルを遠心し、上清を回収し、Ｎ２気流下に乾燥させる。ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）／１−ブタノール／水相分配の組み合わせ（ラディッシュらの報告（Ladisch and Gillard, 1985, A solvent partition method for microscale ganglioside purification, Anal. Biochem., 46: 220-231）に記載）と、それに続くＣ−１８カートリッジによる固相抽出（ウィリアムスらの報告（Williams and McCluer, 1980, The use of Sep-PakＴＭ C18 cartridges during the isolation of gangfiosides, J. Neurochem. 35: 266-269）の方法に変更を加えたものによる）によって、総脂質抽出物からガングリオシドを精製する。
【０１２９】
ＤＩＰＥ／１−ブタノール６０：４０（体積比）４０ｍＬを乾燥脂質抽出物に加える。サンプルを渦攪拌し、超音波処理して、脂質の微細懸濁液を得る。０．３％ＮａＣｌ水溶液２ｍＬを加え、管を２分間で１５秒ずつ渦攪拌と超音波処理を交互に行い、遠心する。上の有機相（中性脂質およびリン脂質を含む）を、境界相を除去しないように注意しながら、パスツールピペットを用いて注意深く除去する。ガングリオシドを含む下層の水相を、最初の容量の有機溶媒で２回抽出する。容量が最初の容量の約半分に減るまで（ほぼ２ｍＬ）、３０から４５分間にわたり、３７℃でＮ２気流下に、サンプルを部分的に溶媒留去する。
【０１３０】
５００ｍｇＣ−１８カートリッジを、２４ポートライナーＳＰＥ真空多岐管に取り付け、メタノール５ｍＬ、Ｃ：Ｍ２：１（体積比）５ｍＬおよびメタノール２．５ｍＬの３回の連続ディッシュ（dish）で活性化させる。次に、カートリッジを０．３％ＮａＣｌ水溶液：メタノール６０：４０（体積比）２．５ｍＬで平衡とする。部分的に溶媒留去した下側の相の容量を測定し、水で１．２ｍＬとし、メタノール０．８ｍＬを加える。次に、それを遠心して不溶物を除去し、Ｃ−１８カートリッジに２回乗せる。ＳＰＥカートリッジを蒸留水１０ｍＬで流して塩および水溶性汚染物を除去し、３０秒間真空乾燥する。ガングリオシドをメタノール５ｍＬおよびＣ：Ｍ２：１（体積比）５ｍＬで溶離し、Ｎ２気流下に乾燥させ、Ｃ：Ｍ  １：１（体積比）１ｍＬに再度溶解させる。ガングリオシドを分析まで−３０℃で保存する。総ガングリオシドを、ＬＢＳＡとして測定する。少量サンプル５０μＬを１０ｍＬガラス製遠心管に入れ、Ｎ２下に乾燥させ、レゾルシノールアッセイ（Svennerholm. L., 1957, Quantitative estimation of sialic acid: A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method, Biochem. Biophys. Acta., 24: 604-611）によって測定する。
【０１３１】
レゾルシノール試薬１ｍＬおよび水１ｍＬを加える。管にキャップを施し、沸騰水浴で１００℃にて１５分間加熱する。加熱後、管を氷浴水で冷却する。酢酸ブチル：ブタノール８５：１５（体積比）２ｍＬを加える。管を１分間激しく振盪し、７５０×ｇで１０分間遠心する。上側の相を取り、分光光度計にて５８０ｎｍで測定する。２から６４  ｇ／ｍＬのＮＡＮＡの標準溶液を同様にして処理し、それを用いて、サンプル中のシアル酸濃度を計算する。
【０１３２】
レゾルシノール試薬は次のように調製する。レゾルシノールの２％脱イオン水溶液１０ｍＬ、０．１Ｍ硫酸銅０．２５ｍＬ、濃塩酸８０ｍＬに水を加えて１００ｍＬとする。試薬は日光から保護して毎日調製する。
【０１３３】
精製脂質抽出物の残り１５０ｍｃｇを、ＨＰＬＣによるガングリオシド分析に用いる。フェノメネックス（Phenomenex）からのルナ（Luna）−ＮＨ２カラム、５μｍ、１００Å、２５０×４．６ｍｍを用い、ウォーターズからのデュアル吸光度検出器（Dual Absorbance Detector）を搭載したアライアンス（Alliance）２６９０装置でのＨＰＬＣによって、ガングリオシドを分離する。
【０１３４】
ガングリオシドを、各種容量比および張度でのアセトニトリル−リン酸緩衝液の溶媒系を用いて、室温で溶離する（文献（Gazzotti, Sonnino, Ghidoni, 1985, Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. J Chromatogr. 348:371-378）の方法に従って）。２つの移動相での勾配を用いる。
・溶媒Ａ：アセトニトリル−５ｍＭリン酸緩衝液、
・溶媒Ｂ：アセトニトリル−２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．６（１：１）。
【０１３５】
下記の勾配溶離プログラムを用いる。
【０１３６】
【表６】
2009542227.tif 000008
【０１３７】
０から０．４ｍｇ／ｍＬのＧＤ３溶液を較正標準として用い、ウシ脳溶液を用いて、ガングリオシドの分類を確認する。
【０１３８】
網膜組成
網膜は、ウルトラツラックスで１分間にわたり、Ｃ：Ｍ１：１（体積比）３．５ｍＬで均質化し、４５分間渦攪拌し、遠心する。上清を回収し、ペレットを溶媒混合物２ｍＬで２回再抽出する。３つの上清を集め、Ｎ２下に乾燥させる。抽出物をクロロホルム１ｍＬに溶かし、１００μＬ小分けサンプルを取って、脂肪酸およびリン脂質の分析に供する。抽出液の残りを再度乾燥させ、脳サンプルの場合と同じ分配および精製の手順を行う。
【０１３９】
精製した抽出物をＣ：Ｍ１：１  １ｍＬに溶かす。０．５ｍＬをレゾルシノール法によって測定し、０．５ｍＬをＨＰＬＣによるガングリオシド分析に用いる。
【０１４０】
脂肪酸組成を、血漿について上記で説明した方法に従って、１００μＬの小分けサンプルで測定する。結果は、各脂肪酸メチルエステルについての正規化した面積パーセントとして表す。
【０１４１】
網膜サンプルのリン脂質含有量は、各種容量比およびイオン強度でのアセトニトリル−リン酸緩衝液という溶媒系を用いるスフェリソルブ（Spherisorb）シリカカラム、５μｍ、１５０×４．６ｍｍでのＨＰＬＣによって測定する。
【０１４２】
２つの移動相での勾配を用いる。
溶媒Ａ：アセトニトリル．
溶媒Ｂ：アセトニトリル−５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５（８０：２０）。
【０１４３】
下記の勾配溶離プログラムを、５５℃でのカラム操作で用いる。
【０１４４】
【表７】
2009542227.tif 000009
【０１４５】
１００μＬ小分けサンプルのうちの２０μＬを、システム（ウォーターズからのデュアル吸光度検出器（Dual Absorbance Detector）を搭載したアリアンス２６９０）に注入する。検出は、２０１ｎｍで行う。ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）の複数の化合物較正標準を、０．２から５ｍｇ／ｍＬで用いる。ホスファチジルイノシトールは、汚染物としてＰＥを含んでいたことから、別個に注入する。同じ濃度範囲を用いる。
【０１４６】
脳および眼球の組織学的分析
脳の各半球を、横方向に切り取って、厚さ５０ｍｍの試料とする。予備分析後、中央ブロック（脳の大きさに従って４、５または６）を定量用に選択する。
【０１４７】
最小長さ５ｍｍの視神経のサンプルを横方向に切り取り、緩衝ホルマリン中で３時間固定し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４から６℃にて保存する。
【０１４８】
眼球を正面で切り取って３個の試料とし、ラベル表示し、パラフィンに包埋する。一連の切片は、後の染色用に全パラフィンブロック製とする。
【０１４９】
ミクロトームでの一連の切断および通常のスライドグラスおよび免疫組織化学的方法用の特殊なスライドグラス上に乗せた後、これらをヘマトキシリン−エオシン、過ヨウ素酸シフ（ＰＡＳ）反応およびクリューバー−バレラ・ルクソール・ファスト・ブルー（Kluver-Barrera Luxol Fast Blue）の従来の染色法によって染色する。免疫組織化学的染色を、従来の染色法で用いたものと同じ一連の試料からの組織切片についても行う。下記のマーカーを用いる。
【０１５０】
モノクローナル抗体Ｓ１００タンパク質Ａｂ−１。Ｓ１００は、カルモジュリンおよびトロポニンＣなどのカルシウム結合タンパク質のファミリーに属する。Ｓ１００タンパク質は、皮膚でのランゲルハンス細胞およびリンパ節の副皮質での指状突起細胞などの抗原提供細胞でも発現され、星状膠細胞を染色する。使用する免疫原は、精製ウシ脳Ｓ１００タンパク質（動物種反応性：ヒト、ウシ、ラットおよびマウス）である。
【０１５１】
モノクローナル抗体抗神経核（ＮｅｕＮ）。ＮｅｕＮ（またはニューロン核）はほとんどのニューロン細胞種と反応する。発達的には、免疫反応性は最初に、ニューロンが有糸分裂後となって間もなく認められる。増殖帯では、染色は認められていない。免疫組織化学的染色は主としてニューロンの核に局在しており、細胞質では染色は相対的に軽い。動物種反応性：ヒト、マウス、ラット、ブタ、フェレット、ひよこおよびサンショウウオ。
【０１５２】
モノクローナル抗体ｂｃｌ−２。ｂｃｌ−２α腫瘍タンパク質の発現は、プログラム細胞死（アポトーシス）を阻害する。動物種反応性：ヒトおよびブタ。
【０１５３】
梁下束および隣接する白質からの他のものの画像３０個をＭＴＶ−３アダプターを取り付けたオリンパスＢＨ−２顕微鏡（２０ワット）（オリンパス光学株式会社、東京、日本）に接続された白黒ソニーＸＣ−ＳＴ５００ＣＥビデオカメラ（ソニー社、東京、日本）でキャプチャーする。パワー２０×および６０×の対物レンズ・オリンパスＰＬＣＮ６０Ｘ（６０Ｘ／０．８０）を用いることで、全体の倍率は６００倍となった。画像処理は、ビジログ（Visilog）６．０ソフトウェア（Noesis S. A. Courteboeuf, France）を用いて行う。
【０１５４】
結果
中止
実験１：群Ａからの仔ブタ１頭は誕生時に非常に小さく、残りの仔ブタに成長が追いつかない。群Ｃのブタ１頭は、登録から１０日後に死亡している。群Ｃの別のブタ１頭は、実験終了後に確認された雌である。結果的に、２９から３０日での群Ａにおけるｎは４ではなく３であり、同動物齢での群Ｃのｎは４ではなく２である。
【０１５５】
実験２：仔ブタ１頭が馴致期間中に死亡している。群Ｂの別の仔ブタ１頭が、登録から６日後に死亡している。群Ａの２頭のブタおよび群Ｂにおける１頭は、誕生児に非常に小さく、残りの仔ブタのように成長しないことから、試験から除外している。
【０１５６】
結果的に、各時間点および群について仔ブタ７頭の完全試験目的が、２９から３０日での群Ａ（ｎ＝６）を除く全ての群で満足されている。
【０１５７】
体重および飼料摂取
体重および飼料摂取の発達は３つの異なる飼料群で非常に類似している。実験期間にわたって、群間で体重発達に差はない。飼料摂取は、１６日と２８日の間の期間のみで、群ＡおよびＢより群Ｃの方が有意に高い。それ以外の期間では、群間に差はない。摂取を累積飼料摂取として表すと、群間に差はない。同様に、体重ｇ数／摂取１００ｋｃａｌとして計算される飼料効率の発達は、３群において同様である。異なる時間間隔を考慮する場合、または全試験期間にわたり、群間に差はない。
【０１５８】
血漿の脂肪酸組成
いずれの脂肪酸も、８から９日で減少する傾向があり、それ以後授乳２９から３０日まで経時的に増加した。これは、下痢および／または順応の問題発生のために試験の最初の１週間で調乳摂取低下が生じたためであると考えられる。長鎖多価不飽和脂肪酸に関しては、各時間点で群間に有意差はない。しかしながら、群Ｃでは、調乳の組成が似ている試験の終了後に、これら脂肪酸の濃度が最低であった。
【０１５９】
脳組成
脳におけるタンパク質、ＤＮＡおよびコレステロールの含有量は、タンパク質重量、細胞数（ＤＮＡ）およびミエリン形成（コレステロール）の指数として測定される。いずれの時間点でも、群間に有意差はない。しかしながら、これらのデータから結論付けることができるいくつかの証拠がある。脳においてＤＮＡの量は増えなかったが、タンパク質は増加傾向にあり、脳での細胞密度が試験期間中において仔ブタでは同様であること、および脳の成長の結果として細胞増殖が起こることが示された。コレステロールはいずれも組織１ｇ当たりで増加しており、脳全体を考えると、これは、少なくとも実験計画で考慮した試験期間中においてミエリン形成が生じることを意味している。
【０１６０】
脂肪酸組成に関しては、いずれの時間点においても、脂肪酸濃度に群間で有意差はない。試験群においては経時的に若干の傾向があり、１６：０および２０：４ｎ−６の低下およびジメチルアセタール、１８：１ｎ−９および１８：２ｎ−６の上昇がある。
【０１６１】
臓器当たりで示される総ガングリオシドおよび脂質結合シアル酸（ＬＢＳＡ）濃度には、経時的にも群間でも変化はなかったが、特に低濃度のガングリオシドについては高いばらつきが認められる。しかしながら、ＬＢＳＡおよびガングリオシドの総含有量は、３つの群いずれにおいても経時的に増加した。従って、ＬＢＳＡおよびガングリオシドは脳成長の関数として脳で上昇しており、組織１ｇ当たりについては経時的に濃度上昇は起こらない。
【０１６２】
網膜組成
授乳群間で、網膜の脂肪酸組成に有意差はない。２２：６ｎ−３のパーセントが経時的に上昇した以外は、脂肪三パーセントの時間的経過に関しては、脳と同様の傾向が網膜でも認められる。この結果は、網膜発達におけるこの脂肪酸の重要な役割と一致するものである。
【０１６３】
網膜におけるＬＢＳＡの含有量、総ガングリオシドおよび主要ガングリオシドの種類に関して、各群内で、いかなる時点または時間の中でも、群間に有意差はない。リン脂質および主要な個々の種類、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の総含有量についても同じことが当てはまる。有意差がないにも拘わらず、これらの重要な脂質が経時的に増加する傾向があり、群Ｂでは授乳１週間後に含有量が相対的に高いことが認められていることは、やはり注目すべきことである。
【０１６４】
脳の組織学
ニューロン遊走ならびに中枢神経系の発達および成熟を評価する。脳の肉眼的および顕微鏡的分析で、肉眼的病変（出血、虚血領域、奇形または腫瘍性病変）も疾患の徴候も示されなかった。
【０１６５】
通常の組織学的技術を用いて、梁下束および隣接する白質の特定の領域における総細胞数を定量する。神経芽細胞が上衣細胞のすぐ背後のいくつかの層を通過して移動および分化することから、この領域を選択している（図１．１および１．２参照）。梁下束の３つの異なる領域で核カウントを行う（図１．２および１．３を参照する）。
領域１：側脳室に隣接する遊走および増殖領域、
領域２：上衣細胞での神経芽細胞凝集を回避する領域１（図１．３参照）、
領域３：梁下束の隣の白質。
【０１６６】
領域１では、飼料群とは無関係に、授乳８から９日に核数にピークがある。このピークは主として、この時点で群Ｂにおいて核数が相対的に大きいためであるが（図２）、他の群との差は統計的有意差には達していなかった（群Ｃに対してｐ＝０．１０８）。これは、側脳室の境界の隣にある染色された核の凝集のためにである可能性があり、これによって測定にばらつきが生じたものである。凝集核の領域が回避されると（領域２での測定）、小さいばらつきで同じパターンが得られることから、群Ｂでの核数は他の群の場合より大きく、群Ａとは統計的に有意差がある。領域３では差は認められない。
【０１６７】
結論
脳におけるタンパク質、ＤＮＡおよびコレステロールの含有量については、いずれの時間点でも群間に有意差はない。経時的な脳タンパク質およびコレステロール含有量の増加は、試験期間中に起こった脳の成長およびミエリン形成の正常なプロセスを反映したものである。
【０１６８】
網膜の脂肪酸組成は脳で認められたものと同様の傾向に従っていて群間に有意差はなく、経時的に上昇した２２：６ｎ−３以外は脂肪酸パーセントの時間経過は同様であった。脂質結合シアル酸、ガングリオシドおよびリン脂質の総網膜含有量ならびに個々のガングリオシドおよびリン脂質について、いずれの時点でも、そして各群内の時点間でも有意差はない。有意差がないにも拘わらず、これら全ての脂質の含有量が群Ｂにおいて授乳８から９日で相対的に高いことが認められることは、指摘すべき重要な点である。実際、群Ａ、ＢおよびＣ間で実験計画を分け、８から９日で一元配置ＡＮＯＶＡを行うと、群Ｂにおいて、総リン脂質および脂肪酸、ならびにホスファチジルエタノールアミンおよび２０：４ｎ−６および２２：６ｎ−３脂肪酸の含有量が相対的に高いことに関して、有意差が認められる。
【０１６９】
梁下束および隣接する白質の選択された領域、すなわち神経芽細胞遊走の領域における総細胞数の脳組織学的分析では、群Ｂにおいてより高い核数が検出される。この一時的効果は、ラクプロダンＭＦＧＭ−１０と相対的に高レベルのアラキドン酸およびドコサヘキサエン酸の両方を含む飼料Ｂを与えた動物での授乳８から９日（誕生後１２から１３日）での神経芽細胞遊走の割合が相対的に高いためである。
【０１７０】
上記の結論２および３に記載の結果は、神経および視覚の発達に対して飼料Ｂ（ラクプロダンＭＦＧＭ−１０と相対的に高レベルのアラキドン酸およびドコサヘキサエン酸の両方を含む）が効果を有する可能性を示唆している。やはりラクプロダンＭＦＧＭ−１０を含む群Ｃや同じレベルのアラキドン酸およびドコサヘキサエン酸を含む群Ａでは、これらの効果は認められないという事実は、アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸が少なくとも飼料Ｂで用いられたレベルである場合に限り、両方の成分（ラクプロダンＭＦＧＭ−１０とアラキドン酸およびドコサヘキサエン酸）の相乗効果があることを示した。これは、神経遊走および神経突起成長における飼料Ｂ成分（ガングリオシド、リン脂質、ｎ−アセチルノイラミン酸およびならびに高いアラキドン酸およびドコサヘキサエン酸濃度（特に、ガングリオシドおよびドコサヘキサエン酸））の原因的役割を示唆している。
【０１７１】
実験２
第２の動物試験は、この試験で下記の飼養の成績効果を比較する以外は、実験１で用いたものと同様のプロトコールで行う。
・飼料Ａ（群Ａ）：総調乳脂肪酸の重量基準で０．４％のアラキドン酸および０．２％のドコサヘキサエン酸ならびに授乳基準で６．４ｇ／Ｌ調乳のレベルでの強化乳清タンパク質濃縮物を含む本発明の乳児用調乳、
・飼料Ｂ（群Ｂ）：アボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories, Columbus, Ohio, USA）から入手可能なシミラック（Similac；登録商標）アドバンス（Advance；登録商標）乳児用調乳（総脂肪酸の重量基準で０．４％のアラキドン酸、０．１５％のドコサヘキサエン酸および従来の乳清タンパク質濃縮物）、
・飼料Ｃ（群Ｃ）：ブリストル−マイヤーズ・スクイブ（Bristol-Myers Squibb；タイ）から入手可能なエンファラク（Enfalac；商標名）１タイ乳児用調乳（総調乳脂肪酸の重量基準で０．６５％のアラキドン酸および０．３５％のドコサヘキサエン酸ならびに従来の乳清タンパク質濃縮物）、
・対照群投与ブタ乳。
【０１７２】
要約
試験からのデータは、ブタ乳を与えた新生仔ブタにおいて１４から１６日齢で有意な神経増殖を示している。
【０１７３】
これらのデータはさらに、低レベルの強化乳清タンパク質濃縮物（授乳基準で６．４ｇ／Ｌ）を含む調乳は、相対的に高いレベルの強化乳清タンパク質濃縮物（授乳基準で７．１ｇ／Ｌ）を用いる第１の試験（実験１）で示された神経芽細胞遊走加速を再現するには不十分であることも示している。
【０１７４】
実験計画
本試験は長期試験であり、実験飼料Ａ、ＢまたはＣを与える３つの仔ブタ群（表４参照）を含み、授乳７から８日および１４から１５日後の２回の屠殺を行う。ブタ乳栄養の仔ブタの別の群を試験に基準として含める。ブタ乳群における動物は動物齢を合わせることで、実験試料を与えた動物の屠殺時点が同時になるようにする。ブタ乳群からの動物は、試験開始時、１４から１６日齢後、２３から２４日齢後に屠殺する。
【０１７５】
家畜仔ブタ６０頭（３から４日齢）を、認定された農場から供給される。ブタ乳基準群からの仔ブタ８頭を屠殺する。仔ブタ４８頭を体重、同腹仔および性別でペアとし、３つの群に分ける（それぞれ、ｎ＝１６、ｎ＝１６およびｎ＝１６）。残りの仔ブタ４頭は、その３つの群に無作為に割り当てる（群Ａに１頭、群Ｂに１頭、群Ｃに２頭）。
【０１７６】
仔ブタは、２７℃で適応前処置した部屋で、ステンレス製の飼育ケージにて飼育する。動物には、栄養上の要件に従って、３日間にわたり、調整ブタ飼料を１日４回与える。３日間の馴致期間後、仔ブタには３種類の実験飼料のうちのいずれかを１日４回与える。動物に最初に実験飼料を与えた時点を、本試験における「時間ゼロ」と見なす。
【０１７７】
下記の表に、標準ブタ飼料ならびに飼料Ａ、ＢおよびＣの組成を示してある。
【０１７８】
【表８】
2009542227.tif 000010
【０１７９】
【表９】
2009542227.tif 000011
【０１８０】
いずれの飼料も一旦製造したら、直ちに使用するまたは不活性雰囲気の缶の中で４℃にて保存し、２４時間以内に用いる。飼料は粉末形態であり、飼料Ａ、ＢおよびＣの場合には水で再生して１２．８５重量％とする。再生した液体飼料はケージの餌入れに注ぐ。残った液体を除去して測定し、餌入れを洗浄してから、次の飼料を投入する。
【０１８１】
各群について、８頭の仔ブタを、対照（飼料ＢおよびＣ）または実験調乳（飼料Ａ）による給餌開始から７から８日および１４から１５日に屠殺する。
【０１８２】
結果
中止
各群からの４頭の仔ブタが死亡している。群Ａにおける仔ブタのうちの１頭および群Ｂにおける仔ブタのうちの１頭が、馴致期間中に死亡している。群Ｂからの仔ブタ１頭が非常に小さく、残りの仔ブタのように成長しなかったことから、この仔ブタは除外している。
【０１８３】
結果的に、７から８日の時点では、群Ａのｎは７であり、群Ｂのｎは８であり、群Ｃのｎは８である。１４から１５日の時点では、群Ａのｎは６であり、群Ｂのｎは４であり、群Ｃのｎは６である。
【０１８４】
体重および飼料摂取
体重および飼料摂取の発達は３つの異なる飼料群で非常に類似している。実験期間にわたって、群間で体重発達に差はない。摂取を累積飼料摂取として表すと、群間に差はない。体重ｇ数／摂取１００ｋｃａｌとして計算される飼料効率の発達は、７日と１４日の間の期間のみで、群ＡおよびＢと比較して群Ｃの方が高いが、有意差はない。０日と６日の間の期間については高い変動性が認められるが、群間に差はない。
【０１８５】
脳の組織学
通常の組織学的技術を用いて、梁下束および隣接する白質の特定の領域における総細胞数を定量する。
【０１８６】
梁下束に隣接する白質において、いかなる時間点でも群間に有意差はない（図３．２、図４．１および図４．３）。梁下束におけるＨ＆Ｅ染色細胞数に、いかなる時間点でも群間に有意差はない（図３．１）。しかしながら、ブタ乳群において１４から１６日齢で、梁下束でのＢｒｄＵおよびＫｉ６７染色細胞の量が相対的に高い（図３．３および図４．２）。ブタ乳群と群Ｂの間の差は、ＢｒｄＵ陽性細胞に関して、有意差である。
【０１８７】
結論
特に下記の所見に基づくと、実験１および２からのデータからは、強化乳清タンパク質濃縮物、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸のある一定の組み合わせの間での相乗的関係が示唆される。
【０１８８】
実験１は、強化乳清タンパク質濃縮物（授乳基準で７．１ｇ／Ｌ）、ドコサヘキサエン酸（０．１５％）およびアラキドン酸（０．４％）を含む乳児用調乳（飼料Ｂ）は神経芽細胞遊走を加速することを示している。
【０１８９】
実験１は、強化乳清タンパク質濃縮物（授乳基準で７．１ｇ／Ｌ）および相対的に低い濃度のドコサヘキサエン酸（０．１％）およびアラキドン酸（０．２％）を含む乳児用調乳（飼料Ｃ）は神経芽細胞遊走を加速しないことを示している。
【０１９０】
実験２は、ドコサヘキサエン酸（０．２％）およびアラキドン酸（０．４％）ならびに相対的に低いレベルの強化乳清タンパク質濃縮物（授乳基準で６．４ｇ／Ｌ）を含む乳児用調乳（飼料Ａ）は神経芽細胞遊走を加速しないことを示している。
【０１９１】
実験２はさらに、ドコサヘキサエン酸（０．１５％）およびアラキドン酸（０．４％）を含むが、強化乳清タンパク質濃縮物を含まない乳児用調乳（飼料Ｂ）は神経芽細胞遊走を加速しないことを示している。
【０１９２】
従って、両方の実験の結果は、強化乳清タンパク質濃縮物、ドコサヘキサエン酸およびアラキドン酸の一定の組み合わせは、調乳中でのこれらの個々の濃度は本明細書で定義の閾値レベルを超えているとき、神経芽細胞 遊走を加速させることを示している。逆に、これらの実験は、これらの成分であるＤＨＡ／ＡＲＡおよび強化乳清タンパク質濃縮物が、単独で使用した場合に、調べたパラメータについては有効ではないことも示している。
【０１９３】
実施例
下記の実施例は、本発明の範囲に含まれる具体的な実施例を代表するものであり、そのそれぞれは例示のみを目的として提供されているものであり、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて、これらの多くの変形形態が可能であることから、本発明の限定と解釈されるべきではない。例示されている量は、別段の断りがない限り、組成物の総重量に基づいた重量パーセントである。
【０１９４】
粉末乳児用調乳
下記のものは、乳児での調乳の使用方法を含めた本発明の粉末調乳実施形態である。各調乳における成分を、以下の表に挙げてある。
【０１９５】
【表１０】
2009542227.tif 000012
【０１９６】
例示のものはそれぞれ、少なくとも２つの別個のスラリーを作ることで、同様にして製造することができ、これらのスラリーはその後混合し、加熱処理し、標準化し、溶媒留去し、乾燥し、包装する。
【０１９７】
最初に、オイル混合槽で、窒素条件下に、高オレイン酸ヒマワリ油、大豆油およびやし油を合わせ、次にパルミチン酸アスコルビル、βカロテン、ビタミンＡＤＥＫおよび混合トコフェロールを加えることで、オイルスラリーを調製する。槽を２０分間攪拌し、ＱＡ分析を行う。ＱＡクリアランス後であって加工直前に、ＡＲＡオイルおよびＤＨＡオイルを、オイル混合槽に加える。得られたオイルスラリーを、他方の調製スラリーと混合するまで、室温（＜３０℃）で中程度の攪拌下に保持する。
【０１９８】
連続攪拌プロセスで３５から４５℃にて、約４０％の流体スキムミルク中でオイル混合スラリーを合わせ、次に強化乳清タンパク質濃縮物を加えることで、スキムミルク−オイルスラリーを調製する。このオイル−タンパク質スラリーを加熱して６５から７０℃とし、１５．４から１９．０ＭＰａ（１５４から１９０バール）／２．５から４．５ＭＰａ（２５から４５バール）で２段階で均質化し、冷却して３から６℃とし、プロセスサイロ中で保存する。
【０１９９】
乳糖およびスキムミルク粉末を６０から７５℃で約６０％の流体スキムミルクに溶かすことで、スキムミルク−炭水化物スラリーを調製する。このスラリーを約２分間にわたって可溶化槽中で攪拌下に保持してから、プレート熱交にポンプ送りし、そこで冷却して３から６℃とし、プロセスサイロに運び、そこでスキムミルク−オイルスラリーと混合する。
【０２００】
塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびクエン酸カリウムを室温で水に溶かすことでミネラルスラリー１を調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ミネラルスラリー１をプロセスサイロに加える。
【０２０１】
リン酸三カルシウムおよび炭酸カルシウムを４０から６０℃で水に溶かすことでミネラルスラリー２を調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ミネラルスラリー１をプロセスサイロに加える。ミネラルスラリー２をプロセスサイロに加える。
【０２０２】
オリゴ果糖を４０から６０℃で水に溶かすことでオリゴ果糖スラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。オリゴ果糖スラリーをプロセスサイロに加える。
【０２０３】
バッチをプロセスサイロで最低４５分間攪拌してから、サンプルを分析試験用に採取する。品質管理試験の分析結果に基づいて、適切な標準化プロセスを行う。
【０２０４】
クエン酸カリウムおよびアスコルビン酸を室温で水に溶かすことでビタミンＣスラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ビタミンＣスラリーをプロセスサイロに加える。
【０２０５】
クエン酸カリウム、水溶性ビタミンプレミックスおよびイノシトールを４０から６０℃で水に溶かすことで水溶性ビタミン−イノシトールスラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。水溶性ビタミン−イノシトールスラリーをプロセスサイロに加える。
【０２０６】
クエン酸カリウムおよび硫酸第一鉄を室温で水に溶かすことで硫酸第一鉄スラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。
【０２０７】
ヌクレオチド−コリンプレミックスを室温で水に溶かすことでヌクレオチド−コリンスラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ヌクレオチド−コリンスラリーをプロセスサイロに加える。
【０２０８】
最終バッチをプロセスサイロ中にて最低６０分間攪拌してから、分析試験用にサンプルを採取する。品質管理試験の分析結果に基づいて、適切なビタミンＣおよびｐＨ補正を実施することが可能であると考えられる。最終バッチを３から６℃で中程度の攪拌下に保持する。
【０２０９】
７日以内の期間待機した後、得られた混合物を９０から９６℃まで前加熱し、１１０から１３０℃で３秒間加熱する。加熱した混合物をフラッシュ冷却器に通すことで、温度を９３から９７℃に下げ、エバポレータに通すことで所望の固体を得る。次に、生成物を加熱して７５から７８℃とし、スプレー乾燥塔にポンプ送りする。得られた粉末生成物を回収し、バルク粉末サイロ中で保存し、品質試験を行う。最終生成物を好適な容器に入れる。プロセス中および最終生成物段階の両方での微生物試験および分析試験用にサンプルを採取する。
【０２１０】
別法
例示のものはそれぞれ、少なくとも２つの別個のスラリーを作ることで、同様にして製造することができ、これらのスラリーは、その後混合し、加熱処理し、標準化し、乾燥し、乾燥混合し、包装する。
【０２１１】
最初に、約８０％のスキムミルク粉末を脱塩水に６０から８５℃で溶かし、次にクエン酸カリウムおよび水酸化カリウムを加えることで、スキムミルク−ミネラルスラリーを調製する。得られた混合物のｐＨを、水酸化カリウムまたはクエン酸を用いて７．７から８．７に調節する。
【０２１２】
残りのスキムミルク粉末および塩化マグネシウムを、前記の混合物に加える。得られた混合物のｐＨを、水酸化カリウムまたはクエン酸を用いて６．７から７．２に調節する。
【０２１３】
別の槽中で、塩化コリンおよびイノシトールを脱塩水に室温で溶かすことで、新たなスラリーを調製する。得られたスラリーをスキムミルク−ミネラルスラリーと合わせ、後に別の成分と混合するまで、１時間以内の期間にわたり、６０から６５℃で中等度の攪拌下に保持する。
【０２１４】
別の槽中、タウリンを脱塩水に７０℃で溶かすことで、新たなスラリーを調製する。得られたスラリーをスキムミルク−ミネラルスラリーと合わせ、後に別の成分と混合するまで、１時間以内の期間にわたり、６０から６５℃で中等度の攪拌下に保持する。
【０２１５】
強化乳清タンパク質濃縮物をスキムミルク−ミネラルスラリーに加え、次に乳糖およびオリゴ果糖を加える。スラリーを最低３０分間プロセスサイロ中で攪拌してから、分析試験用にサンプルを採取する。得られた混合物のｐＨを水酸化カリウムまたはクエン酸を用いて６．５から７．１に調節する。
【０２１６】
オイルプロセス槽で、窒素条件下に、高オレイン酸ヒマワリ油、大豆油およびやし油を合わせ、次にビタミンＡＤＥＫ、βカロテン、混合トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ＡＲＡオイルおよびＤＨＡオイルを加えることで、オイルスラリーを調製する。得られたオイルスラリーを、後にタンパク質−炭水化物−ミネラルスラリーと混合するまで６時間以内にて、室温で中程度の攪拌下に保持する。
【０２１７】
３０分以上で６時間以内の期間にわたって待機した後、タンパク質−炭水化物−ミネラルスラリーを７０から８０℃で脱気し、さらに加熱して８４から８６℃とする。プロセスのこの時点で、オイルスラリーを５０から８０℃でオンラインにて注入する。最終混合物を冷却して６８から７２℃とし、二段ホモジナイザーによって、第１段階では１４．５から１５．５ＭＰａ（１４５から１５５バール）、第２段階では３．０から４．０ＭＰａ（３０から４０バール）で乳化させる。加熱した混合物をプレート冷却器に通すことで、温度を３から５℃まで下げ、プロセスサイロで保存する。
【０２１８】
下記の成分を処理した混合物に加えることで、ミネラル溶液およびアスコルビン酸溶液を別個に調製する。ミネラル溶液は、クエン酸、硫酸マンガン、セレン酸ナトリウムおよび硫酸亜鉛という成分を十分な量の脱塩水に攪拌下で加えることで調製する。アスコルビン酸溶液は、成分を溶解させるだけの量の脱塩水にアスコルビン酸を加えることで調製する。処理した混合物を４８時間以内で、３から５℃で中等度の攪拌下に保持する。分析試験用にサンプルを採取する。
【０２１９】
冷却した混合物を６９から７３℃で加熱し、６．０から７．０／３．０から４．０ＭＰａ（６０から７０／３０から４０バール）で均質化し、スプレー乾燥塔に送る。その基本粉末生成物を回収し、バルク粉末容器中で保存する。微生物試験および分析試験用にサンプルを採取する。
【０２２０】
相当する分析試験および微生物試験が完了した後、基本粉末生成物を、残りの成分との乾燥混合に供する。最終粉末生成物を得るのに必要な残りの成分の量を決定し、自動重量システムに入力する。そのシステムは、乾燥混合プレミックスの全ての成分を秤量する（乳糖、炭酸カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、水溶液プレミックス、ヌクレオチドシチジン５−１リン酸、ヌクレオチドウリジン５−１リン酸二ナトリウム、ヌクレオチドグアノシン５−１リン酸二ナトリウム、ヌクレオチドアデノシン５−１リン酸、硫酸銅および第三リン酸カルシウム）。基本粉末生成物および乾燥混合プレミックスを混合機に運搬する。混合物を、２０分以内の期間で攪拌下に保持する。
【０２２１】
混合が完了した後、最終生成物を包装機に運搬し、好適な容器に入れる。微生物試験および分析試験用にサンプルを採取する。
【０２２２】
例示の調乳（実施例１から４）は、本発明の粉末調乳実施形態の例であるが、これらに限定されるものではない。各調乳は、使用前に水で再生して約１９から約２４ｋｃａｌ／液量オンスの範囲のカロリー密度としてから、誕生から最初の２ヶ月間を含む誕生から最初の４ヶ月間にわたり、唯一の栄養源として乳児に与える。それらの調乳は、乳児における神経遊走、脳の発達および認知発達を加速する上で役立つ。
【０２２３】
液体乳児用調乳
実施例１から４を従来の手段によって変えることで、本発明の即時投与液体調乳実施形態（実施例５から８）を形成する。実施例５から８の成分は、それぞれ実施例１から４で列記した成分リストに相当する。
【０２２４】
例示の調乳（実施例５から８）は、本発明の液体調乳実施形態の例であるが、これらに限定されるものではない。各調乳は、約１９から約２４ｋｃａｌ／液量オンスの範囲のカロリー密度に調節する。その最終調製された調乳を、誕生から最初の２ヶ月間を含む誕生から最初の４ヶ月間にわたり、唯一の栄養源として乳児に与える。それらの調乳は、乳児における神経遊走、脳の発達および認知発達を加速する上で役立つ。
【図１．１】
2009542227.tif 000013
【図１．２】
2009542227.tif 000014
【図１．３】
2009542227.tif 000015
【図２】
2009542227.tif 000016
【図３．１】
2009542227.tif 000017
【図３．２】
2009542227.tif 000018
【図３．３】
2009542227.tif 000019
【図４．１】
2009542227.tif 000020
【図４．２】
2009542227.tif 000021
【図４．３】
2009542227.tif 000022
【国際調査報告】
2009542227.tif 000023
2009542227.tif 000024
2009542227.tif 000025
2009542227.tif 000026