(57)【要約】造血細胞の表面におけるToll様受容体（TLR）の発見は、様々なクラスの前駆細胞の刺激および分化のための新規の方法を提供する。TLR2アゴニストおよびTLR4アゴニスト（天然リガンド、模倣物、抗体）は、これらの方法において特に有用である。これらの細胞は組織の再生および移植を含む様々な目的で単離および使用され得る。一方、TLRのアンタゴニストは、活性化および分化を阻害することにより、化学療法および放射線療法、急性感染および慢性感染、ならびに移植等の様々な傷害から細胞を保護するのに使用され得る。TLR2、TLR4、およびTLR9経路アンタゴニスト（可溶性TLR、模倣物、抗体）は、これらの方法において特に有用である。細胞は、移植を含む様々な目的で単離および使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞のToll様受容体（TLR）経路の一つまたは複数をTLR経路アンタゴニストとの接触を通じて阻害する工程を含む、リンパ系細胞の移植後の生着率を向上させる方法。
【請求項２】
細胞が患者から獲得され、アンタゴニストを用いてエクスビボで処置され、その後患者に戻される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が同種のドナーから獲得され、アンタゴニストを用いてエクスビボで処置され、その後患者に移植される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
TLR経路がTLR2アンタゴニストまたはTLR4アンタゴニストによって阻害される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
アンタゴニストが可溶性TLR、抗TLR抗体、または可溶性TLR二量体化模倣物である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
アンタゴニストがsiRNA、リボザイム、モルホリノオリゴ、またはscFvもしくはscAbである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
TLR経路がMyD88発現の阻害を通じて阻害される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
TLR経路がMyD88機能の阻害を通じて阻害される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
アンタゴニストがMAL/TIRAPアンタゴニストである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
アンタゴニストがMyD88非依存的な経路に作用する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
アンタゴニストがTRAMまたはTRIFに作用する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
患者が免疫無防備状態または免疫不全である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
患者が化学療法で処置されている、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
患者が臓器移植を受けた、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
患者が免疫抑制剤を投与されるまたは投与された、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
患者が自己免疫障害、または、自己免疫的要素を伴う別の障害もしくは疾患に罹患している、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
患者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
移植患者が、移植時にTLR経路アンタゴニストを用いてインビボで処置される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
（i）細胞をToll様受容体（TLR）アゴニストと接触させる工程；および
（ii）細胞を培養する工程
を含む、造血細胞の刺激法。
【請求項２０】
TLRアゴニストがTLRリガンド、抗TLR抗体、またはTLRリガンド模倣物である、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、概して、細胞生物学、発生生物学、および免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明はToll様受容体を発現する幹細胞の同定、刺激、および抑制に関連する方法および組成物に関する。なお本発明において、連邦政府は、アメリカ国立衛生研究所からの助成金第AI20069号および同第AI058162号に基づく権利を有する。また本発明は、2005年9月30日に出願された米国仮出願第60/722,174号および2006年6月30日に出願された同第60/806,351号に対する優先権の恩典を主張する。これらの出願の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
2. 関連技術の説明
生命は、微生物／ウイルス産物を素早く認識し反応し得る自然免疫系に支えられている。Toll様受容体（TLR）はその認識の多くに関与し、従って生存における役割を有する（Takeda et al., 2003）。TLRを通じた活性化は、自然免疫とリンパ球によって提供される適応免疫を結び付ける（Iwasaki and Medzhitov, 2004）。例えば、TLRリガンドは、Tヘルパー1（Th1）細胞を成熟させその分化を支持する樹状細胞（DC）を誘導する。自然免疫および適応免疫の両方に関与する細胞は、限られた寿命を有し、造血幹細胞（HSC）および骨髄中の前駆細胞から定期的に補充されなければならない（Kondo et al., 2003）。成熟免疫細胞のTLRは十分に研究されているが、骨髄中の成熟途中の細胞がいつ機能的なTLRを獲得するのかおよびそれらの受容体が造血系の発生に影響するのかどうかについてはほとんど知られていない。
【０００３】
HSCは、段階的に分化上の選択肢を失い所定のタイプの細胞を生成する、一連の前駆細胞を生成する。例えば、多能性前駆細胞（MPP）は骨髄系共通前駆細胞（common myeloid progenitor）（CMP）を産み出し、これは巨核球／赤血球前駆細胞（MEP）または顆粒球／マクロファージ前駆細胞（GMP）のいずれかを生じる（Akashi et al., 2000）。T細胞、B細胞、およびNK細胞を生成できる初期リンパ系前駆細胞（ELP)は、プロリンパ球／リンパ系共通前駆細胞（CLP）を生じ、これはその後プレB細胞になることができる（Igarashi et al., 2002; Kouro et al., 2002; Kondo et al., 1997）。今日までに入手できた全ての情報は、これらの系統への関与およびこれらの系統内での進行には、十分研究された成長因子および分化因子、例えばコロニー刺激因子が必要とされることを示している。これらおよびその他の細胞外の合図（cue）は、鍵となる転写因子、例えばEBF、C/EBPα、およびPU.1の発現を制御する（Henderson and Calame, 1998; Rosmarin et al., 2005）。
【０００４】
幹細胞／前駆細胞の可塑性に関しては相当な議論が行われており、多くの研究は、ある造血系の細胞が異なる種の細胞を生じる実験的環境を記載している（Kondo et al., 2000; Iwasaki-Arai et al., 2003; Iwasaki et al., 2003; Xie et al., 2004）。しかしこれは、一般的には、潜在的な分化能を表すものであり、生理学的条件下では利用されないであろうと考えられている。
【０００５】
TLRファミリーは、高度に保存された微生物／ウイルス成分を認識する。例えば、TLR4はグラム陰性細菌由来の細菌リポ多糖類（LPS）を認識し（Hoshino et al., 1999）、TLR2はグラム陽性細菌由来のペプチドグリカンおよびリポテイコ酸を認識する（Takeuchi et al., 1999）。いくつかのTLRを通じた細胞の効果的な刺激には、他の分子との協働が必要とされる。分泌型MD-2タンパク質はTLR4の細胞外部分に結合する、LPS認識に必須のタンパク質である（Nagai et al., 2002）。Bリンパ球においては、RP105/MD-1複合体がTLR2およびTLR4/MD-2と協働して微生物膜に対する抗体の産生をもたらす（Nagai et al., 2005）。CD14は、リポタンパク質およびLPSに対する反応において、それぞれTLR2およびTLR4/MD-2複合体と協働することが公知である（Yoshimura et al., 1999; Means et al., 1999）。さらに、TLRは、効果的なシグナル伝達のために細胞内アダプタータンパク質を必要とする。TLR3を除く全てのTLRは、炎症性サイトカインの産生のためにMyD88アダプタータンパク質を使用する（Takeda and Akira, 2005）。さらに、TLR3およびTLR4は、インターフェロン誘導性遺伝子の誘導に重要なTRIF/TICAMアダプターにより誘発される、MyD88非依存的な経路を使用する（Yamamoto et al., 2003; Oshiumi et al., 2003）。
【０００６】
微生物／ウイルス産物が自然免疫細胞のTLRと咬合すると、様々な防御機構が発動される。例えば、TLR2/4は、細菌のマクロファージによる貪食作用と関連する（Blander and Medzhitov, 2004）。MyD88を通じたTLRの活性化は、食胞の成熟に必要とされる（Doyle et al., 2004）。DCにおけるTLRのシグナル伝達は、組織適合性複合体（MHC）および共起刺激分子の発現ならびにTh1免疫反応の誘導の鍵となるサイトカインであるIL-12の産生を誘導する（Iwasaki and Medzhitov, 2004）。これらの成熟細胞に関する十分に研究された例に加えて、TLRが骨髄内での発生に影響し得るという示唆もいくつか存在する。例えば、内毒素により惹起されるような慢性的炎症は、骨髄における骨髄／リンパ系の比を変化させ（Ueda et al., 2004; Ueda et al., 2005）、破骨細胞の成熟はTLRリガンドにより変更される（Sato et al., 2004; Hayashi et al., 2003）。さらに、ショウジョウバエにおけるTollは、背／腹極性の決定における発生学的役割を有し、理論的には他の発生プロセスにも寄与し得る（Ferrandon et al., 2004）
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
従って、本発明によれば、（i）細胞をToll様受容体（TLR）アゴニストと接触させる工程；および（ii）細胞を培養する工程を含む、造血細胞の刺激法が提供される。TLRアゴニストは、TLRリガンド、抗TLR抗体、またはTLRリガンド模倣物であってよい。造血細胞は多能性前駆（MPP）細胞であってよく、TLRアゴニストはTLR2アゴニストまたはTLR4アゴニスト、例えばPam3CSK4またはリポ多糖類であってよい。刺激されたMPPは自然免疫系の単球／マクロファージに分化し得る。MPP細胞はまた、補助受容体成分アゴニスト、例えばCD14またはMD-2に対するアゴニストと接触され得る。MPP細胞は、各々が異なるTLRに対応する少なくとも二つのTLRアゴニストと接触され得る。この方法はさらに、刺激されたMPP細胞を、非TLR性の細胞成長因子または細胞分化因子と接触させる工程を含みうり、必要に応じてさらに培養する工程を含む。MPP細胞はプロフィールLin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+ Flk-2+に基づき単離または特徴付けられ得る。
【０００８】
造血細胞は骨髄系共通前駆（CMP）細胞であってよく、TLRアゴニストはTLR2アゴニスト、例えばPam3CSK4であり得る。刺激されたCMP細胞はマクロファージに分化し得る。CMP細胞はまた、補助受容体成分アゴニスト、例えばCD14またはMD-2に対するアゴニストと接触され得る。CMP細胞は、各々が異なるTLRに対応する少なくとも二つのTLRアゴニストと接触され得る。この方法はさらに、刺激されたCMP細胞を、非TLR性の細胞成長因子または細胞分化因子と接触させる工程を含んでもよく、必要に応じてさらに培養する工程を含む。CMP細胞は、工程（i）の前に、プロフィールLin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1-に基づき単離または特徴付けられ得る。この方法はさらに、CD34+ FcγRloに基づきCMP細胞を単離する工程を含みうる。
【０００９】
造血細胞は顆粒球／マクロファージ前駆細胞（GMP）であり得、TLRアゴニストはTLR2アゴニストまたはTLR4アゴニスト、例えばPam3CSK4またはリポ多糖類であってよい。刺激された細胞は、自然免疫系の単球／マクロファージに分化し得る。GMP細胞はまた、補助受容体成分アゴニスト、例えばCD14またはMD-2に対するアゴニストと接触されてもよい。GMP細胞は、各々が異なるTLRに対応する少なくとも二つのTLRアゴニストと接触され得る。この方法はさらに、刺激されたGMP細胞を、非TLR性の細胞成長因子または細胞分化因子と接触させる工程を含んでもよく、必要に応じてさらに培養する工程を含む。GMP細胞は、プロフィールLin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγRhiに基づき単離または特徴付けられ得る。
【００１０】
造血細胞はリンパ系共通前駆細胞（common lymphoid progenitor；CLP）であり得る。TLRアゴニストはTLR2アゴニストまたはTLR4アゴニスト、例えばPam3CSK4またはリポ多糖類であってよい。刺激されたCLP細胞は骨髄系樹状細胞に分化し得る。この細胞はまた、補助受容体成分アゴニスト、例えばCD14またはMD-2に対するアゴニストと接触されてもよい。CLP細胞は、各々が異なるTLRに対応する少なくとも二つのTLRアゴニストと接触され得る。この方法はさらに、刺激されたCLP細胞を、非TLR性の細胞成長因子または細胞分化因子と接触させる工程を含んでもよく、必要に応じてさらに培養する工程を含む。CLP細胞は、プロフィールLin- IL-7Rα+ c-Kitlo Sca-1loに基づき単離または特徴付けられ得る。
【００１１】
造血細胞は造血幹細胞（HSC）、例えば長期再構築性HSC（long-term repopulating HSC）（LTR?HSC）であり得る。TLRアゴニストはTLR2アゴニストまたはTLR4アゴニスト、例えばPam3CSK4またはリポ多糖類であってよい。刺激されたHSCまたはLTR-HSCは休止状態から呼び起こされ得る。HSC細胞はまた、補助受容体成分アゴニスト、例えばCD14またはMD-2に対するアゴニストと接触されてもよい。HSC細胞は、各々が異なるTLRに対応する少なくとも二つのTLRアゴニストと接触され得る。この方法はさらに、刺激されたHSCを非TLR性の細胞成長因子または細胞分化因子と接触させる工程を含んでもよく、必要に応じてさらに培養する工程を含む。HSCは、プロフィールLin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+ FLK-2-に基づき単離または特徴付けられ得る。
【００１２】
さらなる態様において、（i）支持体に結合されたToll様受容体（TLR）リガンドと細胞集団を接触させる工程；および（ii）リガンドに結合した細胞を単離する工程を含む、前駆細胞の単離方法が提供される。この方法はさらに、細胞ソーティングによる濃縮を含みうる。リガンドは、TLR2リガンドまたはTLR4リガンド、例えばリポ多糖類、Pam3CSK4、抗TLR2抗体または抗TLR4抗体であり得る。支持体は、ビーズ、カラムマトリクス、プレート、フィルターであり得る。細胞は、GMP、CMP、CLP、MMP、またはHSCであり得る。前駆細胞は、その細胞集団よりも10倍純粋、50倍純粋、100倍純粋、または1000倍純粋であり得る。
【００１３】
なおさらなる態様において、前駆細胞をToll様受容体（TLR）アゴニストと接触させる工程を含む、リンパ系前駆細胞が骨髄系樹状細胞になるよう誘導する方法が提供される。リンパ系前駆細胞は患者から獲得され、アゴニストを用いてエクスビボで処置され、その後患者に戻され得る。TLRアゴニストは、TLR2アゴニストまたはTLR4アゴニスト、例えばTLR2もしくはTLR4に対する抗体、Pam3CSK4またはリポ多糖類であり得る。患者は免疫無防備状態または免疫不全であり得、患者はヒトであり得る。
【００１４】
別の態様において、細胞をToll様受容体（TLR）経路アンタゴニストと接触させる工程を含む、TLRの結合に対する反応から造血幹細胞または原始前駆細胞（primitive progenitor cell）を保護する方法が提供される。アンタゴニストは可溶性TLR、抗TLR抗体、または可溶性TLR二量体化模倣物であり得る。アンタゴニストはsiRNA、リボザイム、モルホリノオリゴ、またはscFvもしくはscAbであり得る。アンタゴニスト、例えばMAL/TIRAPアンタゴニストは、MyD88の発現または機能を減少させ得る。アンタゴニスト、例えばTRAMまたはTRIFに作用するアンタゴニストは、MyD88非依存的な経路に作用し得る。TLR経路は、TLR2経路、TLR4経路、またはTLR9経路であり得る。細胞はまた、補助受容体成分アンタゴニストと接触され得る。補助受容体成分アンタゴニストは、CD14またはMD-2に対するアンタゴニストであり得る。この細胞の二つの別個のTLR経路が阻害され得る。この方法はさらに、骨髄幹細胞または造血幹細胞の移植が必要な患者を、移植時に、TLR経路アンタゴニストを用いて処置する工程を含みうる。この方法はまた、レシピエント患者への移植前にエクスビボで細胞を処置する工程をさらに含みうる。この方法はまた、細胞をTLR経路アンタゴニストで処置する前にCD34＋に基づき細胞を単離する工程をさらに含みうる。
【００１５】
なおさらに別の態様において、造血幹細胞のToll様受容体（TLR）経路の一つまたは複数をTLR経路アンタゴニストとの接触を通じて阻害する工程を含む、リンパ系細胞の患者への移植後の生着率を向上させる方法が提供される。細胞は患者から獲得され、アンタゴニストを用いてエクスビボで処置され、その後患者に戻され得る。細胞は同種のドナーから獲得され、アンタゴニストを用いてエクスビボで処置され、その後患者に移植され得る。TLR経路はTLR2アンタゴニストまたはTLR4アンタゴニストによって阻害され得る。アンタゴニストは可溶性TLR、抗TLR抗体、または可溶性TLR二量体化模倣物であり得る。アンタゴニストはsiRNA、リボザイム、モルホリノオリゴ、またはscFvもしくはscAbであり得る。例えばMAL/TIRAPアンタゴニストの場合、TLR経路は、MyD88発現の阻害を通じてまたはMyD88機能の阻害を通じて阻害され得る。アンタゴニスト、例えばTRAMまたはTRIFに作用するアンタゴニストは、MyD88非依存的な経路に作用し得る。患者は、免疫無防備状態もしくは免疫不全であるか、化学療法で処置されているか、かつ／または臓器移植を受ける患者であり得る。患者は、免疫抑制剤を投与されているまたは投与された患者であり得る。患者は、自己免疫障害、または自己免疫的要素を有する別の障害もしくは疾患に罹患した患者であり得る。患者はヒトであり得る。移植患者は、移植時にTLR経路アンタゴニストを用いてインビボで処置され得る。
【００１６】
造血細胞は、多能性前駆（MPP）細胞、骨髄系共通（CMP）、顆粒球／マクロファージ（GMP）細胞、リンパ系共通前駆（CLP）細胞、または造血幹細胞（HSC）であり得る。MPP細胞は、マウスにおいて、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+ Flk-2+として定義され得る。CMP細胞は、マウスにおいて、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1-として定義され得る。CMP細胞はまた、マウスにおいて、CD34+ FcγRloとして定義され得る。GMP細胞はまた、マウスにおいて、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγRhiとして定義され得る。CLP細胞は、マウスにおいて、Lin- IL-7Rα+ c-Kitlo Sca-1loとして定義され得る。HSC細胞はまた、マウスにおいて、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+ FLK-2-として定義され得る。マウスにおけるさらなる有用なマーカーはCD34（成体造血幹細胞に存在しない）およびCD15（HSCに存在する）である（Yilmaz et al., 2006）。
【００１７】
ヒトにおける造血組織は、異なるマーカー群で定義された等価な幹細胞および前駆細胞を含む。例えば、それらは、様々な血液細胞系統と関連するCD13、CD14、CD33、CD64、グリコホリンA、CD19、CD3、CD8、およびCD56を欠く。これらの系統マーカー陽性細胞を枯渇させた細胞懸濁物（Lin-）は、CD34+ CD38- HSCを含む。Lin- CD34+ CD10+リンパ系前駆細胞、Lin- CD34+ CD38+ CD123/IL-3RαLo CD45RA- CMP、Lin- CD34+ CD38+ CD123/IL-3RαLo CD45RA+ GMP、およびLin- CD34+ CD38+ CD123/IL-3Rα- CD45RA- MEPも存在する（Manz et al., 2002）。
【００１８】
本明細書中に記載されるいずれの方法または組成物も、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して使用され得ることが意図される。
【００１９】
「一つの」または「ある」という単語の使用は、添付の特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と関連して使用される場合、「一つの」を意味し得るが、「一つまたは複数の」、「少なくとも一つの」、および「一つまたは二つ以上の」の意味とも相反しない。
【００２０】
本発明のこれらおよびその他の態様は、以下の説明および添付図面と合わせて検討することで、十分認識および理解されるであろう。しかし、以下の説明は、本発明の様々な態様およびそれらの多くの具体的な詳細を示しているが、これらは例証の目的で提供されるものであり、限定を目的とするものではないことが理解されるはずである。本発明の範囲内でその意図から逸脱することなく多くの置換、修正、付加、および／または再構成がなされ得、本発明はこのような置換、修正、付加、および／または再構成の全てを含む。
【００２１】
例示的態様の説明
本発明らの主たる目標は、TLRが造血前駆細胞において発現されるかどうか、機能的であるかどうかを決定することであった。本発明者らは本明細書において実際に、幹細胞濃縮骨髄画分およびいくつかの高度に精製された前駆細胞が機能的なTLR2およびTLR4/MD-2を示すことを実証した。成熟細胞におけるのと同様、TLR4/MD-2複合体は、細胞表面のCD14と協働する。前駆細胞におけるTLRシグナルは、LPSおよび合成リポペプチドに対する最適な反応のためにMyD88を必要とする。しかし、さらに驚くべきは、TLRの結合が、前駆細胞の分化に必要とされる成長因子のいくつかを排除し、それらが単球／マクロファージになるよう誘導するという発見である。さらに、リンパ系に傾斜した（lymphoid-biased）前駆細胞は、TLRシグナルに反応にして樹状細胞（DC）運命の方に導かれた。従って、TLRファミリーのメンバーは、造血幹／前駆細胞に微生物／ウイルス産物を直接的に検知させて、感染時の自然免疫を高揚させる手段を提供する。
【００２２】
本発明者らは、これらの細胞におけるTLRシグナル伝達系を用いて休止状態から呼び起こす、すなわち細胞を細胞周期のG0期から活発な細胞分裂および様々な分化パターンに誘導することによって、これらの観察を利用することを想起した。例えば、短期再構築性造血幹細胞は、自然免疫細胞へと分化するよう誘導できる。同様に、骨髄系共通前駆細胞はマクロファージを形成するよう誘導され得、顆粒球／マクロファージ前駆細胞も同様である。リンパ系共通前駆細胞は、骨髄系樹状細胞を形成するよう誘導できる。TLR2（Pam3CSK4）およびTLR4（LPS）に対するリガンドが具体的な関心対象である。
【００２３】
さらに、TLRのアンタゴニストは、全身性の微生物感染を併発し得る炎症促進性反応を相殺し、慢性的な傷害に直面しても免疫細胞を枯渇させずに維持し、望ましくない免疫反応、例えば自己免疫における反応を防止する上での有用性を証明し得る。この理由から、本発明者らは、ほぼ全てのTLRが効果的なシグナル伝達のために細胞内のMyD88アダプタータンパク質を必要とするという観察を活用して、TLR経路を阻害することで造血前駆細胞が免疫系の成熟成分へと分化するのを妨げられるかどうかを決定することを試みた。生着実験において、MyD88ノックアウトマウス由来の骨髄は、正常なMyD88機能を有するマウス由来の骨髄よりも多くの血液細胞を産生し、これによりTLR経路のシグナル伝達の非存在が移植された骨髄の血液産生細胞が最終分化するのを妨げることが示された。MyD88ノックアウト細胞は、免疫系の成分にならずに、血液産生性の幹細胞として機能し続けた。
【００２４】
従って本発明者らは、TLRリガンドの存在下で細胞を多能性状態で維持し、細胞を免疫系細胞にせず免疫系細胞を産生させ続けるために、造血前駆細胞のTLRシグナル伝達経路を阻害することを提案する。従って、例えば、骨髄移植に使用される造血前駆細胞におけるTLRシグナル伝達の一過的な阻害は、より迅速な免疫系の補充をもたらし得る。TLRの細胞外ドメインと干渉する低分子、可溶性TLR、または抗体もまた、天然のリガンドがエフェクター細胞の細胞表面のTLRと結合する前に細胞内シグナル伝達分子との相互作用を妨げるのに利用され得る。また、TLRの細胞内ドメインと干渉する低分子の開発は、リガンドがTLRと結合した後に細胞内シグナル伝達分子と相互作用するのを妨げ得る。さらに、TLRのアンタゴニストは、全身性の微生物感染を併発し得る炎症促進性反応を相殺し、慢性的な傷害に直面しても免疫細胞を枯渇させずに維持し、かつ有益でない免疫反応、例えば自己免疫を防止する上での有用性を証明し得る。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下に詳細に示されている。
【００２６】
I. Toll様受容体
自然免疫系（マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー細胞、および代替補体経路）は、微生物感染に対する初期の迅速な反応系である。侵襲してくる病原体に対する行動は、直接的なもの（例えば貪食作用および殺傷）かまたはB細胞およびT細胞を活性化することにより適応免疫系を誘発するサイトカインもしくは他の刺激因子の放出を通じた間接的なもののいずれかである。
【００２７】
Janeway（1992）およびPoltorakら（1998）は、自然免疫系はパターン認識受容体（PRR）を通じて保存された構造的特徴により感染因子を同定することを唱えた。免疫反応を誘発する微生物因子は、病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular pattern）（PAMP）と呼ばれる。Toll様受容体（TLR）の発見は、これらのPAMPを検出するPRRを提供した。
【００２８】
TLRは、微生物病原体の存在を伝達する重要なパターン認識分子である（Means et al., 2000; Casadeval et al., 1999）。これらの受容体は、高度に保存された微生物の構成要素を認識することができ、その際、これらは宿主・病原体の相互作用において重要な役割を果たす。ヒトは、微生物抗原に対する最も強力な宿主免疫反応の一種を有するが、この高感度のおかげで、ヒトは、任意の他の哺乳動物種よりもリポ多糖類（LPS）等の細菌毒素に対する感受性が高いのである（Heurmann et al., 1998）。
【００２９】
Tollは、ショウジョウバエにおいて胚形成時の背・腹極性を制御するI型膜貫通受容体として最初に記載された（Stein et al., 1991）。18ウィーラー（18Wheeler）（18W）タンパク質は、ショウジョウバエTollのホモログである。Tollおよび18Wは、相互に対しておよび哺乳動物IL-1R1の細胞質テイルに対して最も高い類似性を有する。Tollおよび18Wの細胞外領域は、複数のロイシンリッチリピートおよびカルボキシル末端システインリッチドメインを含む（Eldon 1994）。
【００３０】
異なる種のTLRは大きく相違し；マウスTLR4とヒトTLR4はわずか53％の同一性しかない。異なる個体間のロイシンリッチリピート構造の遺伝子研究により、多型が微生物負荷に対する異なる反応をもたらすことも明らかになった。細胞内部分は、進化上保存されているおよそ200アミノ酸の細胞質ドメインを含む。この高度に保存された領域は、TIRドメインとして公知である（O'Neill et al., 2000）。
【００３１】
ショウジョウバエTollの哺乳動物ホモログは、TLRとして公知である。今日までに、10個のヒトTLRが記載されている（Medzhitov et al., 1997; Chaudhary et al., 1998; Takeuchi et al., 1999; Du et al., 2000）。TLR1〜TLR6は、mRNA検出アッセイにおけるそれらの特有の発現パターンにより特徴付けられた。TLR1は、遍在的にある程度高レベルで発現される。TLR2は、末梢血単核球およびリンパ系組織において発現されることが公知である（Yang et al., 1999）。TLR3は、肺、筋肉、心臓、脳、および腸の細胞において発現され、選択的スプライシングが膵臓および胎盤において報告されている。末梢血細胞の中でも、TLR3は、樹状細胞の特定の部分集合で選択的に発現される（Kadowaki et al., 2001）。TLR4は、単球／マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、脾臓、および心臓により発現されることが公知であった。TLR5 mRNAは、末梢血単球、白血球、卵巣、および前立腺において見出される。TLR6の発現は脾臓、胸腺、卵巣、および肺において見出される（Takeuchi et al., 1999）。TLR mRNAはまた、様々な上皮細胞において発現され（Cario et al., 2000）、これは侵襲してくる微生物の監視の役割を示唆している。
【００３２】
A. 機能的役割
TLR2およびTLR4
TLR2およびTLR4は、ショウジョウバエTollの哺乳動物ホモログの中でも最も広く研究されているメンバーである。TLR2およびTLR4は両方ともシグナル伝達のためにアダプタータンパク質MyD88を必要とし、免疫沈降研究によってMyD88とIRAKの直接的相互作用が示された（Medzhitov et al., 1998）。MyD88は当初、骨髄分化初期反応遺伝子として同定および特徴付けられた。MyD88自体は、カルボキシル末端TIRドメインからなる。IRAKは、MyD88およびTRAF6の両方と相互作用することが示された（Chaudhary et al., 1998）。
【００３３】
TLR4シグナル伝達における別の細胞表面分子の必要性が研究により実証された（Shimazu et al., 1999）。タンパク質MD-2は、細胞内ドメインを有さないが、TLR4との共発現によってトランスフェクションモデルのLPS感受性を向上させる。MD-2のTLR2との共発現は、LPS反応性に対して効果を有さなかった。MD-2のLPSに対する直接的結合はデータにより支持されている。この効果は、CD14またはLPS結合タンパク質（LBP）に非依存的であり、このことはエフェクター細胞の炎症促進性反応の調整に寄与する、LPS認識におけるMD-2の特別かつ特有の役割を示唆している（Viriyakosol et al., 2001）。
【００３４】
TLR2は、他のTLRメンバー、例えばTLR1およびTLR6とヘテロ二量体構造を形成する。最近の報告は、ホスファチジルイノシトール-3'-キナーゼのp85調節サブユニットがTLR2の細胞内ドメインと直接的に結合できることを実証し（Arbibe et al., 2000）、Rho型GTPase Rac1もまたTLR2媒介性のシグナル伝達に関連するようである。この代替経路は多くのリン酸化脂質を活性化して、細胞内タンパク質キナーゼAktを生成する。この経路は、I-κBのリン酸化および分解に非依存的に、NF-κBを直接活性化する（Arbibe et al., 2000）。
【００３５】
TLR4はLPSに利用され、従って、長い間探し求められたLPS受容体である（Poltorak et al., 1998; Qureshi et al., 1999）。LPSは、IL-1にきわめて類似のシグナルを誘導することが公知であり、マクロファージのCD14に結合することも公知である。CD14は単球／マクロファージ表面における公知のPRRである。CD14はマクロファージ、単球、および好中球に対するLPSの作用において重要な役割を果たすこと、ならびにCD14はマクロファージのLPSに対する感受性を向上させることが数年前から明らかである（Schroder et al., 2000）。TLR4は、NF-κBにより制御されるサイトカインIL-1、IL-6、およびIL-8の発現を誘導し、このことは自然免疫におけるこの受容体の役割に関係している（Medzhitov et al., 1997）。その後、他者により、TLR4がLPSのシグナル伝達に関与することが遺伝子レベルで証明された（Poltorak et al., 1998）。
【００３６】
RP105
RP105は、配列相同性に基づきTLRファミリーに分類され、MD-1と複合体を形成することが示された。この複合体は、B系統のリンパ球、樹状細胞、およびマクロファージによって優先的に発現される（Kimoto et al., 2003）。Bリンパ球においては、RP105/MD-1複合体は、TLR2およびTLR4/MD-2と協働して微生物膜に対する抗体産生をもたらす（Nagai et al., 2005）。しかし、RP105/MD-1複合体は、マクロファージにおけるTLR4シグナル伝達の負の調節因子であり得る（Divanovic et al., 2005）。
【００３７】
TLR9
哺乳動物TLRファミリーの別のメンバーはTLR9である。Hemmiら（2000）は、TLR9分子が細菌DNAに対する受容体であると最初に定義した。豊富なTLR9のmRNA転写物が多くの組織において見出されたことからその生理学的役割が示唆され、これはTLR9-/-ノックアウトマウス系統の作製によって確認された。これらの動物は、合成オリゴヌクレオチドの非メチル化CpGモチーフに対して反応できないことが示された。
【００３８】
細菌DNAは、哺乳動物細胞に対する強力な免疫賦活因子であることが以前から公知である。非メチル化CpGモチーフは微生物DNAにおいて見出されるが、これらの配列はヒトDNAにおいては比較的稀である。これらの非メチル化CpG配列が、免疫賦活性核酸の5'側の二つのプリンおよび3'末端の二つのピリミジンに隣接する場合、細菌DNA内の配列が、ヒト免疫エフェクター細胞に対する強力な炎症促進性シグナルを誘導する（Krieg, 1999）。ヒト細胞による認識に適した具体的な配列はGT-C-p-G-TTであり、マウス細胞はGA-C-p-G-TTを認識する（Bauer et al., 2001）。
【００３９】
細菌DNAとヒトDNAを識別する分子的基礎は、TLR9-DN変異体が、微生物CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドに曝露された際にTNF、IL-12、IL-6、およびインターフェロン-γ反応を有さないことが観察されるまで分からなかった（Hemmi et al., 2000）。TLR9ノックアウトマウスもまた、通常は野生型マウスにおいて迅速な低血圧および死を誘導する非メチル化CpGモチーフを有する合成オリゴヌクレオチドからの致死性ショックに対して不応性である。
【００４０】
TLR9は免疫エフェクター細胞のエンドソーム（endomsome）において発現されることが証拠により示されている。興味深いことに、固体表面に固定されたオリゴヌクレオチドは哺乳動物細胞を刺激しないが、細胞取り込みの阻害剤はCpG DNAによるシグナル伝達を破壊する。このことは、原核生物DNAは特定のシグナル伝達カスケードを開始する前にエンドソーム画分に内部移行される必要があることを示す。MyD88は、タグを付加したTLR9と共にエンドソーム画分に局在化する（Hemmi et al., 2000）。
【００４１】
TLR5
TLR5の主要なリガンドは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌のいずれか由来の細菌フラゲリンである。これらのタンパク質は細菌病原体の間で高度に保存されており、高度な構造的相同性は、細菌生物の移動系の完全性を維持するために必須である。単離および精製されたべん毛タンパク質自体またはグラム陽性細菌もしくはグラム陰性細菌のいずれかの細胞表面上で発現されるフラゲリンタンパク質は、TLR5特異的、CD14非依存的な様式で単球／マクロファージ細胞を刺激する。従ってTLR5受容体は、免疫系が有べん毛細菌を認識する主要な経路であると考えられている（Hayashi et al., 2001）。
【００４２】
B. リガンド
TLR2は、多くの細菌産物についてのシグナル伝達因子であると認識されている。TLR2リガンドには、リポテイコ酸、合成リポペプチド（Pam3CSK4、MALP-2）、および酵母由来ザイモサンが含まれる。TLR4のシグナル伝達は、主としてリピドA/LPS負荷後に活性化される。ウシ感染病を引き起こすスピロヘータであるトレポネーマ・ブレナボレンス（Treponema brennaborense）から精製された糖脂質は、TLR4依存的なシグナル伝達と関連付けられた。
【００４３】
Ohashiらは、潜在的な最初の内因性のTLR4リガンドを報告した（Ohashi et al., 2000）。ウイルス粒子もまたTLR4のリガンドとして作用する。Kurt-Jonesら（2000）は、呼吸器合胞体ウイルスのコートタンパク質Fに対する自然免疫反応が、TLR4およびCD14を通じたシグナル伝達によって媒介されることを示した。呼吸器合胞体ウイルス感染は、正常なマウスと比較して、TLR4不全マウスの肺においてより長期間存続した（Haynes et al., 2001）。
【００４４】
TLR3リガンドであるポリイノシン-ポリシチジル酸（ポリ(I:C)）は、二重鎖RNA（dsRNA）の合成アナログであり、ウイルス感染に関連する分子パターンである。dsRNAは、MyD88依存的またはMyD88非依存的な別個の機構を通じてNF-κBの活性化およびインターフェロン-βの産生を誘導することが公知である。
【００４５】
TLR4のシグナル伝達は、主としてリピドA/LPS負荷後に活性化される。ウシ感染病を引き起こすスピロヘータであるトレポネーマ・ブレナボレンスから精製された糖脂質は、TLR4依存的なシグナル伝達と関連付けられた。Ohashiらは、潜在的な最初の内因性のTLR4リガンドを報告した（Ohashi et al., 2000）。他の内因性リガンドには、熱ショックタンパク質gp96（Liu et al., 2003）が含まれる。ウイルス粒子もまたTLR4のリガンドとして作用する。Kurt-Jonesら（2000）は、呼吸器合胞体ウイルスのコートタンパク質Fに対する自然免疫反応が、TLR4およびCD14を通じたシグナル伝達によって媒介されることを示した。呼吸器合胞体ウイルス感染は、正常なマウスと比較して、TLR4不全マウスの肺においてより長期間存続した（Haynes et al., 2001）。
【００４６】
TLR5リガンドであるフラゲリンは、広範囲の細菌種に運動性を付与する細菌べん毛フィラメントの主要成分である。フラゲリンは、哺乳動物および植物の両方を含む多くの真核生物細胞および生物における自然免疫反応の強力な刺激因子である。哺乳動物において、フラゲリンは、全身および上皮表面の両方においてTLR5依存的な防御反応を誘発する。フラゲリンは、TLR5シグナル伝達複合体の性質に依存してNF-κBの活性化ならびにサイトカインおよび一酸化窒素の産生を誘導する。
【００４７】
TLR7および8は当初、ヌクレオシドアナログに応答性のものとして発見されたが、最近になってその天然のリガンドがssRNAであることが見出された。グアノシンに対するイミダゾキノリンアミンアナログであるイミキモッド（R837）は、強力な間接的抗ウイルス活性を有する免疫反応修正剤（immune response modifier）である。この低分子量の合成分子は、IFN-α等のサイトカインの産生を誘導する。R848と異なり、イミキモッドはTLR7のみを活性化しTLR8を活性化しない。ロキソリビンは、N7位およびC8位が誘導体化されたグアノシンアナログである。このL-ヌクレオシドは免疫系の強力な刺激剤であるが、最近までこの免疫賦活活性を担う機構は知られていなかった。イミダゾキノリンと同様、イミキモッド、ロキソリビンを含む合成抗ウイルス低分子のファミリーは、TLR7を通じて自然免疫系を活性化する。イミキモットと同様に、ロキソリビンの認識はTLR7に限定される。この活性化はMyD88依存的であり、転写因子NF-κBの誘導をもたらす。
【００４８】
TLR9は、細菌DNAの特定の非メチル化CpG含有配列またはエンドソーム画分の合成オリゴヌクレオチド（ODN）によって活性化される。CpGモチーフと呼ばれるこれらの特定の配列は、細菌DNAに高頻度で存在するが、哺乳動物DNAにおいては稀である。そのメチル化状態は、細菌DNAと哺乳動物DNAの間の決定的な違いである。CpGモチーフを含む非メチル化ODNは細菌DNAの作用を模倣して、B細胞の増殖を誘導し、骨髄系細胞を活性化することができる。
【００４９】
II. Toll様受容体経路
A. MyD88
哺乳動物MyD88は、インターロイキン-1（IL-1）およびToll様受容体により媒介されるシグナル伝達経路におけるアダプタータンパク質である。ショウジョウバエにおいて、Toll経路は当初、胚の背腹パターン形成における役割によって特徴付けられた。Tollと同様、ショウジョウバエMyd88メッセンジャーRNAは、母方から胚に供給される。ホモ変異型Myd88の雌ハエは背側化した胚を産み、これはトランスジェニックMyd88相補的DNAの発現により救出される。ショウジョウバエMyd88変異は、機能獲得型Toll変異の腹側化活性を遮断する。これらの結果は、ショウジョウバエMyd88が背腹パターン形成におけるToll経路の必須成分をコードすることを示す（Kambris, 2003）。
【００５０】
第二の研究もまた、背腹パターン形成におけるMyd88の役割を確立した。Myd88は、胚のパターン形成に関与する新規の母系遺伝子についての遺伝子スクリーニングにおけるKrapfen（kra）の変異により明らかになった。ホモ接合型kra56雌から生まれた胚は、適切に原腸形成せず、背側クチクラの中空管（hollow tubes of dorsal cuticle）の状態で死亡する。この表現型は、背側遺伝子群における変異により引き起こされる表現型と区別できない。エピスタシス実験は、KrapfenがTollとTubeの間で作用することを明らかにした。酵母ツーハイブリッド実験において、KrapfenとTubeの間の直接的な相互作用が検出されたが、これは両方のタンパク質に存在するデスドメインにより媒介されると考えられる。Tubeは次いで、デスドメインとの会合を通じてその下流のエフェクターであるPelleと相互作用する。従って、Tollの活性化において、Myd88はPelleおよびTubeと、ヘテロ三量体複合体として会合することが示唆されている（Charatsi, 2002）。
【００５１】
Toll経路は、ショウジョウバエにおいて、初期の胚形成の間の背腹パターン形成における役割に基づき同定された。遺伝子スクリーニングにより、胚における背腹極性を指定するシグナルの発生、伝達、および解釈に関与する母性効果遺伝子が同定されるに至った。これらの遺伝子の中の11個における機能喪失型変異は、共通の母性効果致死的な表現型をもたらし：ホモ変異型の雌から生まれた受精卵は、通常は胚の背側表面上の細胞に制限される細胞運命を全ての細胞が採用し、それによって背側クチクラの中空管を生じる胚を生成する。12番目の遺伝子Cactusにおける機能欠失型変異は、反対の（腹側化した）表現型をもたらす。遺伝子研究および分子研究は、胚の腹側において活性化されるタンパク質分解性のカスケードが、膜貫通受容体Tollに対する活性なリガンドを生成するというモデルと一致する。活性化されたTollは阻害因子Cactusのリン酸化および分解を誘発して、Rel転写因子Dorsalを放出し、その核への転座をもたらす。核において、Dorsalは腹側特異的遺伝子、例えばtwistの発現を指示し、背側特異的遺伝子を抑制する。TollからCactusへのシグナル伝達は、TubeおよびPelleというタンパク質を必要とする。これらの二つのタンパク質は共に形質膜に局在し、それらのデスドメインを通じて相互作用する。Pelleは、それ自身ならびにTubeおよびTollをもリン酸化できるセリン／スレオニンキナーゼである。PelleがどのようにしてCactusにシグナルを送るかは未だ知られていない（Kambris, 2003）。
【００５２】
推定TollリガンドであるSpatzleとCactusの間のこの経路の成分もまた、ショウジョウバエ成体における真菌感染およびグラム陽性細菌感染の制御において大きな役割を有する。成体におけるこの経路の帰結は、抗菌ペプチド遺伝子、例えばドロソマイシン（drosomycin）の転写をアップレギュレートするRelタンパク質であるDorsal関連免疫因子（Dif)の核への転座である。ハエの自然免疫におけるTollの重要な役割の発見により哺乳動物における相同遺伝子の同定がなされ、これらはToll様受容体（TLR）と命名され、微生物リガンドの認識に必要とされることが示された。TLRおよびインターロイキン-1（IL-1）ファミリーの受容体は、タンパク質MyD88と相互作用してRel転写因子NF-κBを活性化し、MyD88はIRAKファミリーのPelle関連キナーゼと相互作用する。これらの相互作用は、二つの十分定義されたMyD88の構造ドメインを巻き込んだ同種親和性の会合により媒介され：そのカルボキシ末端Toll／IL-1受容体（TIR）ドメインは、TLRの細胞質内テイルの同族ドメインと相互作用し、そのアミノ末端のデスドメインは、IRAKの対応するドメインとの相互作用を媒介する。ショウジョウバエゲノムの配列決定は、TollおよびキナーゼであるPelleと物理的に相互作用し、かつTubeおよびPelleの上流で機能するMyD88に関連する分子の同定をもたらした（Horng, 2001; Sun, 2002; Tauszig-Delamasure, 2002）。ショウジョウバエMyd88は、別個のエキソンによりコードされるTIRドメインの後ろに162アミノ酸のC末端延長部分が存在する点でその哺乳動物のカウンターパートと異なる。この遺伝子の5'末端にトランスポゾンが挿入されたハエは、感染に対する反応に欠陥を有する（Tauszig-Delamasure, 2002）。そのC末端延長部分を欠くタンパク質をコードするMyd88の別の対立遺伝子変異体が同定された。これらの変異型ハエの分析は、Myd88がショウジョウバエ胚における背腹経路の成分をコードすることを明らかにした（Kambris, 2003）。
【００５３】
TLR2およびTLR4を通じたシグナル伝達は、MyD88アダプター様（Mal）とも呼ばれるTIRドメイン含有アダプタータンパク質（TIRAP）を必要とする。TIRAPは、シグナル伝達アダプターMyD88を膜に動員する「仕分けアダプター（sorting adaptor）」として機能する（Fitzgerald & Chen, 2006）。
【００５４】
B. MyD88非依存的なシグナル伝達
少なくとも二つのToll様受容体、TLR3およびTLR4は、MyD88アダプタータンパク質を利用せずに生物学的反応のためのシグナルを伝達できる。これらはTRIFおよびいくつかの例においてはTRAMにより媒介され、インターフェロンを産生するものと考えられる（O'Neill, 2005）。造血幹細胞および前駆細胞がMyD88アダプタータンパク質を利用することはすでに明確であるが、代替経路もまた重要であり得る。従って、これらの分子に対するアゴニストおよびアンタゴニストは、治療適用のために、単独でまたはMyD88経路阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【００５５】
III. 細胞表面マーカーの検出
A. 抗体構築物
様々な細胞表面抗原に対する抗体が、商業的供給源から容易に入手できる。商業的供給源から入手できるが、本発明との関係で使用するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が当業者により構築され得ることもまた意図される。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、広義に、任意の免疫学的結合因子、例えばIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをさすことが意図される。一般的に、生理学的状況で最も一般的な抗体であり、研究室の環境で最も容易に作製されることから、IgGおよび／またはIgMが好ましい。
【００５７】
「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をさすのに使用され、これにはFab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体（DAB）、Fv、scFv（単鎖Fv）等の抗体フラグメントが含まれる。様々な抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用する技術は当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付ける手段もまた当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられるAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照のこと）。
【００５８】
モノクローナル抗体（MAb）は、一定の利点、例えば再現性およびラージスケールでの作製を有することが理解されており、一般的にはそれらの使用が好ましい。従って本発明は、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、さらにはニワトリ由来のモノクローナル抗体を提供する。調製が容易であり、試薬が入手しやすい点から、マウスモノクローナル抗体が好ましい場合が多いと考えられる。
【００５９】
モノクローナル抗体（MAb）の作製方法は、一般的にはポリクローナル抗体の調製と同じ方針で開始される。簡単に説明すると、ポリクローナル抗体は、本発明に従うLEEまたはCEE組成物で動物を免疫し、免疫した動物から抗血清を回収することによって調製される。
【００６０】
幅広い動物種が、抗血清の作製に使用され得る。典型的には、抗血清の作製に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。動物の選択は、取扱いの容易さ、費用、または望まれる血清の量に基づき決定され得るが、これらは当業者に公知である。
【００６１】
同じく当技術分野で周知であるが、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫反応の非特異的刺激因子の使用により強化され得る。適切なアジュバントには、全ての許容される免疫賦活化合物、例えばサイトカイン、ケモカイン、補因子、毒素、マラリア原虫、合成組成物、またはこのようなアジュバントをコードするLEEもしくはCEEが含まれる。
【００６２】
使用され得るアジュバントには、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、MDP化合物、例えばthur-MDPおよびnor-MDP、CGP（MTP-PE）、リピドA、およびモノホスホリルリピドA（MPL）が含まれる。2％スクアレン／Tween 80エマルジョン中に細菌から抽出された三成分、MPL、トレハロースジマイコレート（TDM）、および細胞壁骨格（CWS）を含むRIBIもまた意図される。MHC抗原さえも使用され得る。典型的な、多くの場合に好ましいアジュバントには、完全フロイントアジュバント（死滅した結核菌を含む免疫反応の非特異的刺激因子）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
【００６３】
アジュバントに加えて、T細胞免疫をアップレギュレートすることまたはサプレッサー細胞活性をダウンレギュレートすることが示された生物学的反応修正剤（BRM）を同時投与することが望ましい場合がある。このようなBRMには、シメチジン（CIM；1200mg/d）(Smith/Kline, PA)；低用量シクロホスファミド（CYP；300mg/m2）（Johnson/Mead, NJ）、サイトカイン、例えばγ-インターフェロン、IL-2、もしくはIL-12、または免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質、例えばB7（CD80）をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【００６４】
ポリクローナル抗体の作製に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質および免疫に使用する動物によって異なる。皮下、筋内、皮内、表皮内、静脈内、および腹腔内を含むがこれらに限定されない様々な経路が免疫原を投与するのに使用され得る。ポリクローナル抗体の作製は、免疫後の様々な時点で免疫動物の血液をサンプリングすることによって確認され得る。
【００６５】
第二のブースター量（例えば注射によって提供される）もまた提供され得る。ブーストおよび滴定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫動物から採血して血清を単離および保存するか、および／またはその動物がMAbを作製するのに使用され得る。
【００６６】
ウサギポリクローナル抗体の作製については、耳静脈を通じてあるいは心臓への穿刺によって動物から採血がなされ得る。採取された血液を凝血させ、次いで総細胞および血餅から血清成分を分離するために遠心分離する。血清は様々な適用のために使用され得り、それ以外では所望の抗体画分が、周知の方法、例えば固体マトリクスに結合させた別の抗体、ペプチドを用いるか、または例えばプロテインAもしくはプロテインGクロマトグラフィを用いるアフィニティクロマトグラフィによって、精製され得る。
【００６７】
MAbは、周知の技術、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,196,265号に例示される技術の使用を通じて容易に調製され得る。典型的には、この技術は、選択された免疫原組成物、例えば精製または部分精製されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはドメインによる適切な動物の免疫を必要とし、それらは野生型組成物または変異型組成物である。免疫用組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに効果的な様式で投与される。
【００６８】
モノクローナル抗体（MAb）の作製方法は、一般的にはポリクローナル抗体の調製と同じ方針で開始される。げっ歯類、例えばマウスおよびラットが好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、またはカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は特定の利点を提供し得る（Goding, 1986, pp. 60-61）が、マウスが好ましく、最も日常的に使用されており一般的に安定な融合物が得られる確率が高いBALB/cマウスが最も好ましい。
【００６９】
一般的には上記のようにして動物に抗原が注射される。抗原は、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバントと混合され得る。同一抗原または抗原をコードするDNAを用いたブースター投与は、およそ二週間間隔で行われ得る。
【００７０】
免疫後、抗体産生能力を有する体細胞、具体的にはBリンパ球（B細胞）が、MAb作製プロトコルで使用するために選択される。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから獲得され得る。脾細胞および末梢血細胞が好ましい。前者については、それらが分裂性の形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊かな供給源であるためであり、後者については、末梢血が容易に入手できるためである。
【００７１】
多くの場合、動物のパネルが免疫され、最も高い抗体価を有する動物の脾臓が取り出され、脾臓をシリンジ内でホモジナイズすることによって脾臓リンパ球が獲得される。典型的には、免疫マウス由来の脾臓は、およそ5×107〜2×108のリンパ球を含む。
【００７２】
次いで、免疫動物由来の抗体産生性Bリンパ球は、一般的には免疫した動物と同じ種の、不死性の骨髄腫細胞の細胞と融合される。ハイブリドーマを作製する融合手順において使用するのに適した骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地における成長を不可能にする酵素欠失性を有する。
【００７３】
当業者に公知の多くの骨髄腫細胞のいずれか一つが使用され得る（Goding, 1986; Campbell, 1984）。例えば、免疫動物がマウスの場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC11、MPC11-X45-GTG 1.7、およびS194/5XX0 Bulが使用され得；ラットの場合は、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F、および4B210が使用され得；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、およびUC729-6は全てヒト細胞の融合に関して有用である。
【００７４】
一つの好ましいマウス骨髄腫細胞はNS-1骨髄腫細胞株（P3-NS-1-Ag4-1とも称される）であり、これは細胞株保管番号GM3573を請求することによってNIGMS Human Genetic Mutant Cell Repositoryから容易に入出可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は、8-アザグアニン耐性マウスのマウス骨髄腫SP2/0非プロデューサー細胞株である。
【００７５】
抗体産生性の脾細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを作製する方法は、通常、細胞膜の融合を促進する薬剤または薬剤群（化学的または電気的）の存在下で、体細胞と骨髄腫細胞を2：1の比率（しかしこの比率はそれぞれ約20：1〜約1：1の間で変更され得る）で混合することを含む。センダイウイルスを用いる融合方法は、KohlerおよびMilstein（1975；1976）により記載され、ポリエチレングリコール（PEG）、例えば37％（v/v）PEGを用いる方法は、Gefterら（1977）により記載されている。電気誘導融合法の使用もまた適切である（Goding, 1986）。
【００７６】
融合手順は通常、約1×10-6〜1×10-8という低頻度で生きたハイブリッドを生成する。しかし、生きた融合ハイブリッドは、選択培地で培養することによって親の非融合細胞（具体的には通常無制限に分化を続ける非融合骨髄腫細胞）から分離されるため、これが問題となることはない。選択培地は一般的に、組織培養培地におけるヌクレオチドのデノボ合成を遮断する薬剤を含む培地である。典型的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を遮断し、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地にはヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補充される（HAT培地）。アザセリンが使用される場合、培地にはヒポキサンチンが補充される。
【００７７】
好ましい選択培地はHATである。ヌクレオチドサルベージ経路を稼働できる細胞のみがHAT細胞において生き残ることができる。骨髄腫細胞は、このサルベージ経路の鍵となる酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を欠いており、生き残ることができない。B細胞はこの経路を稼働できるが、それらは培養下では限られた寿命しか有さず、一般的に約二週間以内に死滅する。従って、選択培地において生き残れる唯一の細胞は、骨髄腫細胞およびB細胞から形成されたハイブリッドである。
【００７８】
この培養によりハイブリドーマの集団が得られ、この集団から特定のハイブリドーマが選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート上での単一クローン希釈によってこれらの細胞を培養し、その後に（約2〜3週間後に）個々の単クローン性の上清を所望の活性について試験することによって実施される。アッセイは、高感度で簡単で迅速なもの、例えば放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ等であるべきである。
【００７９】
次いで、選択されたハイブリドーマを連続希釈して、個々の抗体産生細胞株までクローニングし、次いでこのクローンをMAbを提供するために無限に増殖させる。この細胞株は、二つの基本的な方法でMAb産生に利用され得る。第一に、ハイブリドーマのサンプルが、最初の融合のために、体細胞および骨髄腫細胞を提供するのに使用されたタイプの組織適合性動物（例えば同系マウス）に注射（多くの場合腹腔に注射）され得る。必要に応じて、この動物は、注射の前に、炭化水素、特に油、例えばプリスタン（テトラメチルペンタデカン）で予め刺激される。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドにより産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生じる。次いで、MAbを高濃度で得るために、動物の体液、例えば血清または腹水は抜き取られ得る。第二に、個々の細胞株がインビトロで培養され得る。この場合、MAbは細胞培地に自然に分泌され、その培地から高濃度で容易に獲得され得る。
【００８０】
いずれかの手段によって生成されたMAbは、必要な場合、濾過、遠心分離、および様々なクロマトグラフィ法、例えばHPLCもしくはアフィニティクロマトグラフィを用いてさらに精製され得る。本発明のモノクローナル抗体のフラグメントは、ペプシンもしくはパパイン等の酵素による消化を含む方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって生成されたモノクローナル抗体から獲得され得る。あるいは、本発明に包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、全自動ペプチド合成機を用いて合成され得る。
【００８１】
モノクローナル抗体を作製するために分子クローニングアプローチが使用され得ることもまた意図される。一つの態様において、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリが、免疫動物の脾臓より単離されたRNAから調製され、適切な抗体を発現するファージミドが、抗原を発現する細胞および対照細胞を用いてパニング（panning）することによって選択される。このアプローチの、従来的なハイブリドーマ技術を超える利点は、およそ104倍多い抗体が一回のラウンドで生成およびスクリーニングされ得ること、ならびに、H鎖およびL鎖の組み合わせによって新たな特異性が形成され、これにより適切な抗体を見つける可能性がさらに増えることである。別の態様において、LEEまたはCEEが、無細胞系を用いてインビトロで抗原を生成するのに使用され得る。これらは単鎖抗体ライブラリをスキャンするための標的として使用され得る。これにより、多くの異なる抗体を、動物を使用せずに非常に迅速に同定できる。
【００８２】
あるいは、本発明に包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、全自動ペプチド合成機を用いて、または大腸菌における全長遺伝子または遺伝子フラグメントの発現によって合成され得る。
【００８３】
B. 抗体複合体
本発明は、一般的にモノクローナル型であり、少なくとも一つの薬剤と連結され抗体複合体を形成し得る、TLRを含む様々な標的抗原に対する抗体の使用を提供する。少なくとも一つの所望の分子または部分を連結または共有結合または複合体化することは従来的である。このような分子または部分は、レポーター分子であり得るがこれに限定されない。レポーター分子とは、アッセイを用いて検出され得る任意の部分であると定義される。抗体に結合されるレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子、またはリガンド、例えばビオチンが含まれる。
【００８４】
十分な選択性、特異性、または親和性を有する任意の抗体が、抗体複合体の基礎として使用され得る。このような特性は、当業者に公知の従来的な免疫学的スクリーニング法を用いて評価され得る。抗体分子における生物学的活性分子への結合部位には、標準的な抗原結合部位に加えて、病原体、B細胞スーパー抗原、T細胞補助受容体CD4、およびHIV-1エンベロープに結合できる可変ドメイン内に位置する部位が含まれる（Sasso et al., 1989; Shorki et al., 1991; Silvermann et al., 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberian et al., 1993; Kreier et al., 1991）。さらに、可変ドメインは、抗体の自己結合に関与し（Kang et al., 1988）、抗抗体により認識されるエピトープ（イディオトープ）を含む（Kohler et al., 1989)。
【００８５】
抗体複合体の特定の例とは、抗体が検出試薬に連結された複合体である。「検出試薬」とは、それらの特別な機能的特性および／または化学的特徴により検出でき、それを使用することによってそれに結合した抗体を検出および／または必要な場合はさらに定量することができる、化合物および／または要素である。
【００８６】
多くの適切な画像化剤が当技術分野で公知であり、それらを抗体に付加する方法も公知である（例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,021,236号；同第4,938,948号；および同第4,472,509号を参照のこと）。使用される画像化部分は、常磁性イオン；放射性同位元素；蛍光色素；NMR検出物質；X線像であり得る。
【００８７】
常磁性イオンの場合、例として、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、および／またはエルビウム（III）等のイオンが使用され得、ガドリニウムが特に好ましい。他の文脈、例えばX線像において有用なイオンには、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、および特にビスマス（III）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８８】
放射性同位元素の場合、治療適用および／または診断適用のために、例えば211アスタチン、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Eu、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレン、35硫黄、99mテクネチウム（technicium）、および／または90イットリウムが使用され得る。125Iは、特定の態様において使用するのに好ましい場合が多く、99mテクネチウムおよび／またはインジウム111もまた、多くの場合、それらの低エネルギー性および広範囲の検出への適性から好ましい。本発明の放射標識モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法に従い作製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウムならびに化学的酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウムもしくは酵素的酸化剤、例えばラクトペルオキシダーゼと接触させることによってヨウ素化され得る。本発明に従うモノクローナル抗体は、例えば第一スズ溶液でペルテクネート（pertechnate）を還元し、セファデックスカラム上で還元型テクネチウムをキレート化し、抗体をこのカラムにアプライすることによるリガンド交換プロセスによって、テクネチウム99mで標識され得る。あるいは、例えば、ペルテクネート、還元剤、例えばSNCl2、緩衝溶液、例えばフタル酸ナトリウムカリウム溶液、および抗体をインキュベートすることによる、直接標識技術が使用され得る。多くの場合、金属イオンとして存在する放射性同位元素を抗体に結合するのに使用される中継官能基（intermediary functional groups）は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
【００８９】
複合体として使用することが意図される蛍光標識には、アレクサ350、アレクサ430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが含まれる。
【００９０】
本発明において意図される別のタイプの抗体複合体は、色素形成性の基質との接触によって有色の生成物を生じ得る二次結合性リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に抗体が連結された、主としてインビトロ用途が意図される抗体複合体である。適切な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合性リガンドは、ビオチンならびに／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は当業者に周知であり、例えば各々参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号、および同第4,366,241号に記載されている。
【００９１】
C. 複合体化の方法
必要に応じて、関心対象の化合物は、生物学的に放出可能な結合、例えば選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列を通じて抗体に接続され得る。一般的に、特定のリンカーは、薬理学的特性および能力の相違に基づき、他のリンカーよりも優先され得る。例えば、立体的に「邪魔された」ジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでの安定性が高く、従って作用部位への結合前にその部分が放出されることが防止されるがゆえに好ましい。
【００９２】
さらに、当業者に公知の任意のその他の連結／カップリング剤および／または機構、例えばアビジン・ビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホラミド結合、無水結合、ジスルフィド結合、イオン性相互作用および疎水性相互作用、またはこれらの組み合わせが、成分または薬剤を本発明の抗体と結合するのに使用され得る。
【００９３】
架橋試薬、例えば安定剤および凝固剤は、二つの異なる分子の官能基をひとつに結合する分子架橋を形成するために使用される。しかし、同じアナログの二量体または多量体が作製可能であること、および異なるアナログで構成されるヘテロ複合体が構築可能であることが考慮される。二つの異なる化合物を段階的な様式で連結するため、望ましくないホモポリマーの形成を排除するヘテロ二機能性の架橋剤が使用され得る。
【００９４】
米国特許第4,680,338号は、リガンドとアミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質の複合体を作製するのに、特にキレート剤、薬物、酵素、検出標識等を含む抗体複合体を形成するのに有用な二機能性リンカーを記載する。米国特許第5,141,648号および同第5,563,250号は、様々な穏やかな条件下で切断できる不安定な結合を含む切断可能な複合体を開示する。このリンカーは特に、関心対象の薬剤がリンカーに直接的に結合され得、切断により活性な薬剤が放出される点で有用である。好ましい用法は、タンパク質、例えば抗体または薬物への遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基の付加を含む。
【００９５】
米国特許第5,856,456号は、融合タンパク質、例えば単鎖抗体を作製するためポリペプチド成分を接続するのに使用されるペプチドリンカーを提供する。このリンカーは、約50アミノ酸未満の長さであり、少なくとも一つの荷電アミノ酸の発生場所（好ましくはアルギニンまたはリジン）およびそれに続くプロリンを含み、かつ高い安定性および低い凝集性により特徴付けられる。米国特許第5,880,270号は、様々な免疫診断および分離技術において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示する。
【００９６】
アジド基を含む分子もまた、強度の低い紫外線により生じる反応性ニトレン中間体を通じてタンパク質への共有結合を形成するのに使用され得る（Potter & Haley, 1983）。特に、プリンヌクレオチドの2-および8-アジドアナログが、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして使用される（Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985）。2-および8-アジドヌクレオチドはまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており（Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; およびDholakia et al., 1989）、かつ抗体結合剤として使用され得る。
【００９７】
抗体のその結合部分への付加または結合について、いくつかの方法が当技術分野で公知である。いくつかの付加方法は、抗体に付加された、例えば有機キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物（DTPA）；エチレントリアミン四酢酸；N-クロロ-p-トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ-3α-6α-ジフェニルグリコウリル-3を用いる金属キレート錯体の使用を必要とする（各々参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,472,509号および同第4,938,948号）。モノクローナル抗体はまた、カップリング剤、例えばグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸の存在下で酵素と反応され得る。フルオレセインマーカーを含む複合体は、これらのカップリング剤の存在下でまたはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許第4,938,948号において、胸部腫瘍の画像化がモノクローナル抗体を用いて達成され、検出可能な画像化部分が、メチル-p-ヒドロキシベンゾイミデートまたはN-スクシニミジル-3-（4-ヒドロキシフェニル）プロピオネート等のリンカーを用いて抗体に結合されている。
【００９８】
他の態様において、抗体結合部位を変化させない反応条件を用いて、免疫グロブリンのFc領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる、免疫グロブリンの誘導体化が意図される。この方法に従って作製される抗体複合体は、改善された長寿命性、特異性、および感度を示すことが開示されている（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,196,066号）。Fc領域の糖残基に結合される、エフェクター分子またはレポーター分子の部位特異的な付加もまた、文献に開示されている（O'Shannessy et al., 1987）。このアプローチは、診断上および治療上見込みのある抗体を生成することが報告されており、これらは現在臨床評価の段階にある。
【００９９】
抗体は、特に以下に記載される様々な細胞分離技術において使用され得ることが特に意図される。
【０１００】
IV. 細胞分離技術
細胞集団および細胞部分集合を分離する方法は当技術分野で周知であり、本発明の細胞集団に適用され得る。この様式で精製された細胞は、その後、遺伝子操作／遺伝子交換療法に使用され得る。さらに、これらは組織再生目的で使用され得る。本発明者らは、胚性幹細胞、ならびに神経、内皮、心臓、および他の細胞型の幹細胞が機能的なTLRを発現するものと考える。TLRリガンド、模倣物、またはアゴニストを用いてこれらの幹細胞を休止状態から刺激することは、組織の再生、再構成、および治癒を促進するのに有益なはずである。これらは特に、以前から公知の成長因子および分化因子と組み合わせて使用されることが必要と考えられる。以下の記載は、TLRおよびその他の細胞表面マーカーを含む様々なマーカーの表面発現に基づく造血幹細胞の典型的な分離方法を提示する。
【０１０１】
A. 蛍光標識細胞分取（FACS）
FACSは、表面マーカーに基づき細胞の部分集合の定量および／または分離を容易にする。ソーティングされる細胞は、最初に蛍光標識抗体またはその他のマーカー特異的リガンドでタグ付けされる。一般的に、標識抗体およびリガンドは、表現型特異的な細胞表面分子の発現に特異的なものである。次いで、標識された細胞に対してレーザービームを通過させ、各細胞の蛍光強度を決定する。分取装置は、毎秒およそ3000細胞の流速で、陽性および陰性の細胞を標識プラスおよび標識マイナスのウェルに分配する。
【０１０２】
異なる波長を励起する多価蛍光タグを使用することにより、複数のまたは代替的な基準に基づくソーティングが可能になる。複合体として使用することが意図される蛍光標識には、アレクサ350、アレクサ430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが含まれる。従って、例えば、一つのPBMCサンプルは、代替的に標識された抗Ig抗体、抗CD3抗体、抗CD8抗体、および抗CD4抗体によって分析され、サンプル内のB細胞およびT細胞、ならびに超特異的（distinguishing specific）なT細胞部分集合の存在についてスクリーニングされ得る。
【０１０３】
FACS分析および細胞ソーティングは、フローサイトメーターを用いて行われる。フローサイトメーターは、一般的に、光源、通常はレーザー、集光用光学素子（collection optics）、電子機器、およびシグナルをデータに変換するコンピュータから構成される。散乱光および発光蛍光は、二つのレンズ（一方は光源の前面に設置され、もう一方は直角に設定されている）および特定の蛍光のバンドの測定を可能にする一連の光学素子、ビームスプリッター、およびフィルターにより回収される。
【０１０４】
フローサイトメーター装置は、毎秒数千細胞の速度で細胞の特性の定量的な多価パラメータ分析を行うことができる。これらの機器は、細胞型を区別する能力を提供する。多くの場合、データは、測定された変数の一次元的（ヒストグラム）または二次元的（輪郭図、散布図）な度数分布で表示される。多価パラメータデータファイルのパーティショニングは、対話型の一次元または二次元画像処理プログラムの連続使用を必要とする。
【０１０５】
迅速な細胞検出のための多価パラメータフローサイトメトリーデータの定量分析は、二つの段階：細胞クラスの特徴付けおよびサンプル処理から構成される。一般的に、細胞クラスの特徴付けのプロセスは、細胞の特徴を関心対象の細胞とそうでない細胞に分画する。次いで、サンプル処理において、各細胞は、それが含まれる領域に従って二つのカテゴリーのうちの一方に分類される。適切な細胞の特徴付けがなされた場合にのみ高い検出性能が期待され得るため、細胞のクラスの分析は非常に重要である。
【０１０６】
細胞の分析だけでなく、細胞のソーティングもフローサイトメトリーによって行われる。米国特許第3,826,364号において、粒子を物理的に、例えば機能的に異なる細胞型に分離する装置が開示されている。この機器において、レーザーは、適切なレンズまたはレンズ系により粒子の流れに集束される照明を提供し、内部の粒子から高度に限局的な散乱光を発生させる。さらに、その流れの中の蛍光粒子の励起のために、高輝度照明が粒子の流れに向けられる。その流れの中の特定の粒子は選択的に荷電され、次いで指定の容器にそれらを偏向させることによって分離され得る。この分離の従来型は、分離のために一つまたは複数の細胞型に印をつけるために使用される蛍光タグを付加した抗体を介するものである。
【０１０７】
フローサイトメトリーおよび蛍光抗体細胞ソーティングを実施するためのさらなる代替の方法は、米国特許第4,284,412号；同第4,989,977号；同第4,498,766号；同第5,478,722号；同第4,857,451号；同第4,774,189号；同第4,767,206号；同第4,714,682号；同第5,160,974号；および同第4,661,913号に記載されており、これらは明示的に参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
B. マイクロビーズ分離
懸濁物中の細胞は、マイクロビーズ技術を用いることで、それらの表面抗原に従い非常に高純度で分離され得る。マイクロビーズ分離における基本概念は、関心対象の生物物質（例えば特定の細胞、タンパク質、またはDNA配列）を粒子に選択的に結合し、次いでそれをその周囲のマトリクスから分離することである。マイクロビーズ分離は、細胞表面特異的抗体またはリガンドで標識されたマイクロビーズのスラリーを細胞懸濁物と接触させることを含む。次いでマイクロビーズで標識された細胞は、このビーズの何らかの特性に特異的な親和性捕捉法を用いて分離される。この形式は、陽性選択および陰性選択の両方を容易にする。
【０１０９】
磁気ビーズは一般的に、親和性のタグ、例えばビオチニル化免疫グロブリンまたは他のビオチニル化分子、例えばペプチド／タンパク質もしくはレクチンと結合し得る組換えストレプトアビジンでコーティングされた、均一な超常磁性のビーズである。磁気ビーズは一般的に、Fe3O4の均一な微粒子またはナノ粒子である。これらの粒子は超常磁性であり、このことは、これらが磁場に誘引されるが、磁場が取り除かれた後に残留磁力を保持しないことを意味する。関心対象の細胞にタグ付けされた超常磁性粒子懸濁物は、磁場を用いてマトリクスから収集され得るが、それらは磁場を取り除いた後に凝集しない（すなわちそれらは懸濁状態を維持する）。
【０１１０】
超常磁性ナノ粒子を用いる分離における一般的形式は、ビーズをそれより大きな微粒子の孔に分散させることである。これらの微粒子は、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体でコーティングされる。次いで抗体をタグ付けした超常磁性微粒子は、細胞懸濁物中に導入される。この粒子は関心対象の表面抗原を発現する細胞に結合し、磁場を適用することで分離され得る。これは、強磁場下に置かれた高勾配磁気分離カラムに懸濁物を流すことによって促進され得る。磁気標識された細胞はカラムに留まるが、非標識細胞は通過する。カラムが磁場から取り除かれた場合、磁気により保持されている細胞は溶出される。標識画分および非標識画分の両方を完全に回収できる。
【０１１１】
C. アフィニティクロマトグラフィ
アフィニティクロマトグラフィは、単離したい物質とそれに特異的に結合し得る分子の間の特異的親和性に基づくクロマトグラフィ手順である。これは受容体・リガンド型の相互作用である。カラム物質は、不溶性のマトリクスに結合パートナーの一方を共有結合することによって合成される。その後カラム物質は、溶液からその物質を特異的に吸着し得る。溶出は、結合が起こらない条件に変更する（pH、イオン強度、温度等を変更する）ことによって行われる。
【０１１２】
マトリクスは、それ自体は有意な規模で分子を吸着せず、かつ広範囲の化学的、物理的、および熱的な安定性を有する物質であるべきである。リガンドは、その結合特性に影響しない様式で結合させるべきである。リガンドはまた、比較的緊密な結合を提供するものであるべきである。かつサンプルまたはリガンドを破壊することなくその物質を溶出することを可能にするものであるべきである。最も一般的な形式のアフィニティクロマトグラフィの一つは、免疫アフィニティクロマトグラフィである。本発明に従って使用するのに適した抗体の作製は、本明細書の他所で議論されている。
【０１１３】
V. 細胞および細胞培養
本発明のマウスの造血前駆細胞は、多能性前駆（MPP）細胞、骨髄系共通（CMP）、顆粒球／マクロファージ（GMP）細胞、リンパ系共通前駆（CLP）細胞、または造血幹細胞（HSC）であり得る。MPP細胞系は、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+ Flk-2+として定義され得る。CMP細胞は、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1-として定義され得る。CMP細胞はまた、CD34+ FcγRloとして定義され得る。GMP細胞はまた、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγRhiとして定義され得る。CLP細胞は、Lin- IL-7Rα+ c-Kitlo Sca-1loとして定義され得る。HSC細胞はまた、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+ FLK-2-として定義され得る。長寿命HSC（Long-term HSC）は、成体マウスにおいて、Lin- Sca-1+ c-KitHi Thy 1.1Lo CD150+ CD34- Flk-2-であることが記載されている。これらの細胞型全てのヒトカウンターパートは記載されている。例えば、ヒトHSCは、骨髄または臍帯血における稀なLin- CD34+ CD38-細胞の画分に濃縮される。
【０１１４】
幹細胞は、一般的に、自己複製能（細胞分裂により多くの幹細胞を生成する）および、成熟、専門化した細胞への分化能の両方を有する細胞と定義される。前駆細胞は、分化はできるが自身をそれ以上複製できない幹細胞の初期の子孫である。対照的に、幹細胞は自身を複製すること（細胞分裂により多くの幹細胞を生成すること）も分化すること（異なるタイプの細胞へと次々に分裂および各々の細胞分裂によって発展すること）も可能である。前駆細胞は、多くの場合、成ることのできる細胞の種類が幹細胞よりも限られている。科学的な表現を用いれば、前駆細胞は幹細胞よりも分化していると言われる。
【０１１５】
細胞培養は、制御された条件下での細胞のインビトロでの維持および増殖を容易にする。細胞は、様々なタイプの容器、例えばガラスまたはプラスチック製の容器の中で培養され得る。培養容器の表面は、細胞の接着を容易にするため、例えばコラーゲン、ポリリジン、または細胞外マトリクスの成分で事前処理またはコーティングされ得る。一部の高度技術は、より厳しい成長要件を有する細胞の成長を補助するために使用される総接着細胞層であるフィーダー細胞を利用する。
【０１１６】
細胞は通常、インビボで観察される条件を厳密に模倣するよう設定された条件下で培養される。通常の生理学的環境を模倣するため、細胞は一般的に、半合成成長培地を用いてCO2雰囲気下でインキュベートされる。培養培地は緩衝化されたものであり、他の物質の中でも、アミノ酸、ヌクレオチド、塩、ビタミン、および血清サプリメントも、例えばウシ胎仔血清（FCS）、ウマ血清、またはヒト血清さえも含む。培養培地にはさらに、成長因子および阻害剤、例えばホルモン、トランスフェリン、インスリン、セレン、および接着因子が補充され得る。
【０１１７】
原則的に、インビトロで培養された細胞は、自身を組織化して組織となることはない。その代わり、培養細胞は、組織培養皿の表面で単層（または一部の例では多層）として成長する。細胞は通常、それらが相互に接触して単層を形成し、それらが相互に接触した際に接触阻害により成長を停止するまで倍加する。
【０１１８】
足場依存性の細胞は接着現象を示す、すなわちそれらは培養皿の不活性な表面または別の適切な支持体に接着した場合にのみ成長および倍加する。このような細胞は、通常、固体支持体なしでは成長できない。多くの細胞はこの固体表面を必要とせず、足場依存性の成長として公知の現象を示さない。従って、これらの細胞を培養により成長させる一つの変化型は、継続的に撹拌または震盪することによって単一細胞を培地中で自由に浮遊させ懸濁状態を維持する撹拌培養または懸濁培養の使用である。この技術は特に、バッチ培養において多量の細胞を成長させるのに有用である。
【０１１９】
足場依存性細胞は通常、半固体培地中でコロニーを形成できる。撹拌培養において足場依存性細胞を成長させることにも使用できるいくつかの技術が開発された。これらは、これらの細胞が接着できる微視的な正電荷デキストランビーズを使用する。
【０１２０】
細胞培養物を樹立するための出発物質は、典型的には、無菌条件下で獲得された適切なドナー由来の組織である。この組織は、培養皿に接種するのに使用できる単一細胞懸濁物を得るために切り刻まれ、タンパク質分解酵素、例えばトリプシン、コラゲナーゼ、またはディスパーゼで処理され得る。いくつかの例において、組織分散物はまた、EDTAを含有する緩衝液で処理することによっても効率的に達成される。細胞培養を開始する特定の形式は、組織の細片の使用であり、その中から細胞がインビトロで成長し得る。
【０１２１】
数継代維持された初代細胞培養物は、アズクリシス（ascrisis）を起こし得る。アズクリシスは通常、細胞の特性の変化に関連し、素早く進行する場合も何継代にもまたがる場合もある。接触阻害の喪失は、それらの通常の特徴を失った細胞の指標であることが多い。次いでこれらの細胞は組織培養皿において多層として成長する。異常細胞の最も顕著な特徴は染色体数の変化であり、このプロセスを生き延びた多くの細胞は異数体である。異常な染色体数への切り替わりは通常、細胞トランスフォーメーションと称され、このプロセスは、その後の連続継代により無制限に培養され得る細胞を生じ得る。トランスフォーメーションした細胞は、永続的な細胞株を生じる。
【０１２２】
本発明の特定の局面において、細胞は、分化剤、例えばTLRリガンドと接触する前に培養される。これらはまた、接触後、すなわちそれらが所定または特定の表現型に分化するよう誘導された後にも培養され得る。細胞は、特定のタイプの分化を達成するための特別な条件下で培養され、所望の分化を促進するのに必要とされる様々な因子が提供され得る。
【０１２３】
VI. 刺激／阻害因子
A. 細胞成長因子および細胞分化因子
細胞成長因子および細胞分化因子は、細胞の増殖を刺激するおよび／または機能性の成熟形態への細胞型の分化を促進する分子である。本発明のいくつかの態様において、細胞成長因子および細胞分化因子は、TLRリガンドと組み合わせて投与され、投与された細胞が特定の様式で増殖および分化するよう誘導され得る。当業者は、様々な因子が、TLRリガンドの投与の前に、同時に、または後に投与され得ることを認識しているであろう。さらに、成長因子および／または分化因子の投与は、必要な場合、繰り返され得る。
【０１２４】
成長因子および／または分化因子は、細胞間のメディエーターとして作用するホルモン、サイトカイン、ヘマトポイエチン（hematapoietin）、コロニー刺激因子、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、その他の内分泌因子、またはそれらの組み合わせを構成し得ることが想定される。このような細胞間メディエーターの例は、リンホカイン、モノカイン、成長因子、および従来的なポリペプチドホルモンである。成長因子の中には、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体化ホルモン（LH）；肝成長因子（hepatic growth factor）；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；OBタンパク質；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経発育因子、例えばNGF-β；血小板増殖因子；トランスホーミング増殖因子（TGF）、例えばTGF-αおよびTGF-β；インスリン様成長因子IおよびII；エリトロポイエチン（EPO）；骨誘導因子（osteoinductive factor）；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、およびγ；コロニー刺激因子（CSF）、例えばマクロファージ-CSF（M-CSF）；顆粒球／マクロファージ-CSF（GM-CSF）；ならびに顆粒球-CSF（G-CSF）；インターロイキン（IL）、例えばIL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18が含まれる。CD14またはMyD88経路のシグナル伝達因子もまた意図される。本明細書中で使用する場合、成長因子および／または分化因子という用語には、天然源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質ならびに合成分子および模倣物を含む、生物学的に活性な天然配列の等価物が含まれる。
【０１２５】
B. さらなる細胞表面リガンド
CD14抗原は、リポ多糖類（LPS）およびLPS結合タンパク質（LBP）の複合体に対する高親和性の受容体である。CD14抗原は、CD14、TLR4、およびMD-2で構成される機能性ヘテロマーLPS受容体複合体の一部である。CD14は、末梢血中のほとんどのヒト単球およびマクロファージ、その他の体液、ならびに様々な組織、例えばリンパ節および脾臓において強く発現される。CD14は、ヒト好中球および骨髄系樹状細胞の部分集団において弱く発現される。
【０１２６】
MD-2タンパク質は、細胞表面上のToll様受容体4と会合してリポ多糖類（LPS）に対する反応性を付与し、それによってこの受容体とLPSのシグナル伝達の間の結びつきを提供するようである。MD-2内の塩基性アミノ酸クラスターは、細胞のリポ多糖類認識に関与する。
【０１２７】
C. アンタゴニスト
可溶性受容体
一つの態様において、本発明は、本発明のTLR、特にTLR2およびTLR4の可溶性を利用する。TLRを可溶性にするために、膜貫通領域が除去される。組換え発現においては、これは、膜貫通領域に対するコード領域の除去を含む。タンパク質レベルでは、TLRを消化してその受容体の細胞外ドメインを遊離させるために適切なプロテアーゼが使用され得る。組換えによりまたは消化により生成された受容体は、それに結合する抗体を用いて精製され得る。
【０１２８】
抗体
TLRの活性化の遮断に使用するのに適した別の薬剤は、この受容体に結合するがTLRリガンドのように活性化させない抗体である。本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、広義に、任意の適切な免疫学的結合因子、例えばIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをさすことが意図される。一般的に、生理学的状況下で最も一般的な抗体であり、かつ研究室の環境で最も容易に作製される点から、IgGおよび／またはIgMが好ましい。
【０１２９】
「抗体」という用語はまた、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をさし、これらには、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体（DAB）、Fv、scFv（単鎖Fv）等の抗体フラグメントが含まれる。様々な抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用する技術は当技術分野で周知である。
【０１３０】
モノクローナル抗体（MAb）は、例えば、再現性およびラージスケールでの製造などの特定の利点を有することが理解されており、一般的にはそれらの使用が好ましい。従って本発明は、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、さらにはニワトリ由来のモノクローナル抗体を提供する。調製が容易であり、試薬が入手しやすい点から、マウスモノクローナル抗体が好ましい場合が多い。
【０１３１】
単鎖抗体は、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,946,778号および同第5,888,773号に記載される。
【０１３２】
「ヒト化」抗体もまた意図され、ヒト定常領域および／または可変領域のドメインを有する、マウス、ラット、または他の種由来のキメラ抗体、二機能性抗体、組換え抗体および人工抗体（engineered antibody）、ならびにそれらのフラグメントも同様である。患者の疾患に対する「特注（custom-tailored）」抗体を作製する方法も同様に公知であり、そのような特注抗体もまた意図される。
【０１３３】
アンチセンス
アンチセンス方法論は、核酸が「相補的な」配列と対を形成する傾向を有するという事実を活用する。相補的とは、ポリヌクレオチドが標準的なワトソン・クリックの相補性規則に従って塩基対を形成できることを意味する。すなわち、大型のプリンは小型のピリミジンと塩基対を形成し、グアニンとシトシンの対（G：C）およびDNAの場合はアデニンとチミジン（A：T）またはRNAの場合はアデニンとウラシル（A：U）のいずれかの組み合わせを形成する。一般的でない塩基、例えばイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチン等がハイブリダイズする配列に含まれることは、対の形成を妨害しない。
【０１３４】
ポリヌクレオチドを用いた二重鎖（ds）DNAの標的化は三重らせんの形成をもたらし；RNAの標的化は二重らせんの形成をもたらし得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入された場合、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨げる。アンチセンスRNA構築物またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAは、インビトロまたはインビボのいずれかの宿主細胞内、例えばヒト被検体を含む宿主動物内での遺伝子の転写もしくは翻訳またはその両方を阻害するために使用され得る。
【０１３５】
アンチセンス構築物は、遺伝子のプロモーターおよびその他の制御領域、エキソン、イントロン、またはエキソン・イントロンの境界領域にさえも結合するよう設計され得る。最も効果的なアンチセンス構築物はイントロン／エキソンのスプライシングの連結点に相補的な領域を含み得ることが意図される。従って、好ましい態様は、イントロン・エキソンのスプライシングの連結点の50〜200塩基内の領域に対する相補性を有するアンチセンス構築物を含むことを提示する。いくつかのエキソン配列は、その標的選択性に重大な影響を及ぼすことなく構築物に含まれ得ることが観察された。含まれるエキソン要素の量は、使用される特定のエキソンおよびイントロンの配列に依存して変化し得る。過剰なエキソンDNAが含まれるかどうかは、単に、正常な細胞機能が影響を受けるかどうかまたは相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けるかどうかを決定するためインビトロでその構築物を試験することによって、容易に試験され得る。
【０１３６】
上記のように、「相補的」または「アンチセンス」とは、それらの全長配列に対して実質的に相補的でありかつごく僅かな塩基のミスマッチしか有さないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、15塩基長の配列は、それらが13箇所または14箇所で相補的なヌクレオチドを有する場合に相補的であると称され得る。当然ながら、完全に相補的な配列とは、それらの全長を通じて完全に相補的でありかつ塩基のミスマッチを有さない配列である。相同性の程度の低い他の配列もまた意図される。例えば、限定的な高相同性領域を有するが、非相同領域も含むアンチセンス構築物（例えばリボザイム；以下を参照のこと）が設計され得る。これらの分子は、50％未満の相同性しか有さないが、適切な条件下で標的配列に結合し得る。
【０１３７】
特定の構築物を作製するために、ゲノムDNAの一部をcDNAまたは合成配列と結合することが有利であり得る。例えば、最終構築物でイントロンが望まれる場合、ゲノムクローンを使用する必要があろう。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、その構築物の残存部分により都合の良い制限部位を提供し得るので、それらは配列の残りの部分に使用され得る。
【０１３８】
RNAi
RNA干渉（「RNA媒介性干渉」またはRNAiとも称される）は、遺伝子発現を減少または消滅させ得る機構である。二重鎖RNA（dsRNA）はこの減少を媒介することが観察されており、それらは多段階プロセスである。dsRNAは、細胞をウイルス感染およびトランスポゾン作用から防御するよう機能すると考えられる転写後遺伝子発現監視機構を活性化する（Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin and Avery et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp and Zamore, 2000; Tabara et al., 1999）。これらの機構の活性化は、成熟したdsRNA相補的なmRNAを破壊の標的とする。RNAiは、遺伝子機能の研究にとって大きな実験上の利点を提供する。これらの利点には、非常に高い特異性、細胞膜通過の容易さ、および標的遺伝子の長期的ダウンレギュレーションが含まれる（Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin and Avery et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp et al., 1999; Sharp and Zamore, 2000; Tabara et al., 1999）。さらに、dsRNAは、植物、原生動物、真菌、線虫、トリパノゾーマ、ショウジョウバエ、および哺乳動物を含む幅広い系において遺伝子を沈静化することが示された（Grishok et al., 2000; Sharp et al., 1999; Sharp and Zamore, 2000; Elbashir et al., 2001）。RNAiは、分解標的のRNA転写物に転写後に作用することが一般に理解されている。核および細胞質の両方のRNAが標的化され得るようである（Bosher and Labouesse, 2000）。
【０１３９】
siRNAは、関心対象の遺伝子の発現の抑制に特異的かつ効果的なように設計されなければならない。標的配列、すなわち関心対象の遺伝子または遺伝子群に存在し、siRNAがそれに対して分解機構を誘導する配列を選択する方法は、その遺伝子または遺伝子群に特異的な配列を含みつつも、siRNAの誘導機構と干渉し得る配列を回避するよう進められる。典型的には、約21〜23ヌクレオチド長のsiRNA標的配列が最も効果的である。この長さは、上記のように、それよりもずっと長いRNAのプロセシングにより生じる消化産物の長さを反映する（Montgomery et al., 1998）。
【０１４０】
siRNAの作製は、主として直接的な化学合成を通じて；ショウジョウバエ胚溶解産物への曝露を通じたより長い二重鎖RNAのプロセシングを通じて；またはS2細胞由来のインビトロ系を通じて行われる。細胞溶解産物またはインビトロプロセシングの使用にはさらに、その後溶解産物から短い21〜23ヌクレオチドのsiRNAを単離すること等が必要であり得、このことは、このプロセスをいくぶん煩わしく、費用のかかるものとしている。化学合成は、二つの単鎖RNAオリゴマーを作製した後、二つの単鎖オリゴマーをアニーリングさせて二重鎖RNAにすることにより進められる。化学合成の方法は多様である。非限定的な例は、参照により明示的に本明細書に組み入れられる米国特許第5,889,136号、同第4,415,723号、および同第4,458,066号、ならびにWincott et al.（1995）に提供されている。
【０１４１】
その安定性を変化させるかまたは有効性を改善するため、siRNA配列に対する様々なさらなる修飾が示唆されている。2ヌクレオチドオーバーハングを有する合成の相補的21merRNA（すなわち、19個の相補的ヌクレオチド＋3'非相補的二量体）は最も高い抑制レベルを提供し得る。これらのプロトコルは、主として、2ヌクレオチドオーバーハングとして二つの（2'-デオキシ）チミジンヌクレオチドの配列を使用する。これらの2ヌクレオチドオーバーハングは、RNAに組み込まれる典型的なヌクレオチドと区別するため、dTdTと表記される場合が多い。文献は、dTオーバーハングの使用は、主としてRNAの化学合成の費用を減らす必要性に端を発するものであることを示している。dTdTオーバーハングはUUオーバーハングよりも安定であろうこともまた示唆されているが、UUオーバーハングを有するsiRNAと比較して、dTdTオーバーハングによる改善はわずかしかない（＜20％）ことが、利用可能なデータにより示されている。
【０１４２】
化学合成されたsiRNAは、それらが25〜100nMの濃度で細胞培養物中に存在する場合に最適に作用することが見出されたが、哺乳動物細胞においては約100nMの濃度が効果的な発現抑制を達成した。siRNAは、哺乳動物細胞培養物においては約100nMで最も効果的であった。しかし、様々な例において、それよりも低濃度の化学合成siRNAが使用されている（Caplen, et al., 2000; Elbashir et al., 2001）。
【０１４３】
WO 99/32619およびWO 01/68836は、siRNAにおいて使用するRNAが化学的または酵素的に合成され得ることを示唆する。これらの文献は両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの参考文献において意図される酵素的合成は、当技術分野で公知の発現構築物の使用および作製を通じた、細胞のRNAポリメラーゼまたはバクテリオファージのRNAポリメラーゼ（例えばT3、T7、SP6）によるものである。例えば、米国特許第5,795,715号を参照のこと。意図する構築物は、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むRNAを生成するテンプレートを提供する。これらの参考文献によって提供される同一配列の長さは少なくとも25塩基であり、400またはそれ以上の塩基長の場合もある。この参考文献の重要な局面は、その著者が、インビボで長鎖dsRNAをsiRNAに変換する内因性のヌクレアーゼ複合体で長鎖dsRNAを21〜25merの長さにまで消化することを意図していることである。彼らは、インビトロ転写された21〜25merのdsRNAを合成および使用することについて記載しておらずデータも示していない。RNA干渉において使用する上での化学合成または酵素合成されたdsRNAの予想される特性についての差別化がなされていない。
【０１４４】
同様に、参照により本明細書に組み入れられるWO 00/44914は、RNAの単鎖が、酵素的にまたは部分／全有機合成によって作製され得ることを示唆する。好ましくは、単鎖RNAは、DNAテンプレート、好ましくはクローニングされたcDNAテンプレートのPCR産物から酵素的に合成され、RNA産物は、このcDNAの完全な転写物であり、数百ヌクレオチドを含み得る。参照により本明細書に組み入れられるWO 01/36646は、siRNAを合成する様式に制限を設けておらず、RNAが、手作業でおよび／または全自動化された手順を用いて、インビトロまたはインビボで合成され得ることを提供する。この参考文献はまた、インビトロ合成が、化学的もしくは酵素的な合成、例えば内因性のDNA（もしくはcDNA）テンプレートの転写のためにクローニングされたRNAポリメラーゼ（例えばT3、T7、SP6）を使用する合成、またはその組み合わせであり得ることを提供する。ここでも、化学合成または酵素合成されたsiRNAの間で、RNA干渉において使用する上での望ましい特性に関する差別化はなされていない。
【０１４５】
米国特許第5,795,715号は、単一の反応混合物中で二つの相補的なDNA配列鎖を同時転写し、その二つの転写物を直ちにハイブリダイズさせることを報告している。使用されるテンプレートは、好ましくは40〜100塩基対で、各末端にプロモーター配列を備えるものである。テンプレートは、好ましくは固体表面に結合される。RNAポリメラーゼによる転写後に得られるdsRNAフラグメントは、核酸標的配列を検出および／またはアッセイするのに使用され得る。
【０１４６】
リボザイム
伝統的に、核酸の触媒にはタンパク質が使用されるが、別のクラスの高分子がこの試みに有用であることが明らかになった。リボザイムは、部位特異的な様式で核酸を切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保持する特異的な触媒ドメインを有する（Kim and Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symons, 1987）。例えば、多くのリボザイムは、高い特異性でホスホエステル転移反応を促進し、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質内の数個のホスホエステルのうちの一つのみを切断する（Cook et al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992）。この特異性は、化学反応の前に基質が特異的な塩基対形成性の相互作用を通じてリボザイムの内部ガイド配列（internal guide sequence）（「IGS」）に結合するのを要求することに起因する。
【０１４７】
リボザイム触媒は、主として核酸に対する配列特異的な切断／連結反応の一部として観察される（Joyce, 1989; Cook et al., 1981）。例えば、米国特許第5,354,855号は、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼのそれよりも高く、DNA制限酵素のそれに迫る配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、配列特異的なリボザイムにより媒介される遺伝子発現の阻害は、治療適用に特に適し得る（Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990）。最近、リボザイムを適用したいくつかの細胞株において遺伝子的変化が誘発されること；変化した遺伝子には癌遺伝子であるH-ras、c-fos、およびHIVの遺伝子が含まれることが報告された。この研究の大部分は、特定のリボザイムにより切断される特定の変異コドンに基づく標的mRNAの修飾に関する。
【０１４８】
モルホリノオリゴ
モルホリノオリゴは、各々が6員モルホリン環に連結された4つの塩基 - アデニン、シトシン、グアニン、およびチミジンのうちの一つを含む4つの異なるモルホリノ基質から構築されることからそのように呼ばれる。これらの塩基は、非イオン性のホスホロジアミデートサブユニット間結合により接続され、モルホリノオリゴを形成する。モルホリノオリゴヌクレオチド（MO）は、アフリカツメガエル胚における機能欠失分析にとって強力なアプローチである。ドミナントネガディブ構築物と異なり、それらは特定の標的遺伝子に対する特異性が高いという利点を有する。
【０１４９】
VII. 方法
Toll様受容体（TLR）リガンド、TLRに対する抗体、またはTLRリガンドの模倣物を用いて造血幹細胞（HSC）を刺激する方法が本明細書中に提供される。この発見は、部分的に、高度の精製されたHSCが機能的なTLRを発現するという観察による。TLR2またはTLR4と、それぞれ、Pam3CSK4またはリポ多糖類の連結は、HSCを休止状態から活性化させる。これは、移植および他の適用のためにHSCを増殖する必要がある環境で望ましい。HSC上のその他のTLRもおそらく機能的であり、単一のTLRまたはTLRの組み合わせを通じた刺激が、特定の幹細胞反応の誘導に有利であり得る。TLRに対する抗体またはTLRリガンドに類似する低分子は、幹細胞において望ましい反応を誘発するために、細菌／ウイルス産物の代わりに使用され得る。これらの受容体の下流で細胞内シグナル伝達経路メディエーター、例えばMyD88、TRAM、またはTRIFに対して作用する薬剤もまたこの様式で使用され得る。
【０１５０】
別の態様は、TLRリガンド、TLRに対する抗体、またはTLRリガンドの模倣物を用いて骨髄系前駆細胞を刺激する方法に関する。本発明者らは、高度に精製された前駆細胞が、TLRとの結合によって、通常の成長因子および分化因子の非存在下で刺激され得ることを発見した。従って、TLRのアゴニストは、血液細胞の形成を刺激または調節するため、単独でまたはコロニー刺激因子およびサイトカインと共に補助的な薬剤として使用され得る。
【０１５１】
さらに別の態様は、TLRリガンドで造血幹／前駆細胞を刺激することによって、それらが自然免疫系を補充するよう誘導する方法を提供する。驚くべきことに、リンパ系前駆細胞は、TLRリガンドに曝されると、リンパ球ではなく骨髄系樹状細胞になるよう誘導され得る。これらの樹状細胞は、自然免疫のいくつかの局面を提供し、特異的な適応免疫反応に関与することが公知である。従ってTLRアゴニストは、特に免疫不全または免疫無防備状態の患者において、骨髄系樹状細胞の産生を促進するのに使用され得る。
【０１５２】
本明細書中に開示される別の方法は、免疫抑制、骨髄破壊、骨髄移植、または慢性感染の際に、造血幹／前駆細胞を保護するためのTLRアンタゴニストの使用である。本発明者らの知見は、TLRを通じた望ましくない刺激によって、幹細胞が枯渇、消耗、老化、またはそれ以外では損傷し得ることを明らかにした。この方法の特に有用な形式は、化学療法の間、幹細胞を休止状態で維持することである。TLRまたは下流の細胞内メディエーターを通じた活性化を遮断する任意の薬剤が、これらの環境下で保護性を発揮し得る。この態様の別の局面は、自己免疫疾患における自然免疫系の細胞の過剰産生を防止することである。TLRリガンドを通じた胎児造血細胞の活性化が流産または胎児に対する損傷を引き起こし得ることから、TLR阻害のさらに別の局面とは、子宮内感染からの胎児の保護であり得る。
【０１５３】
本発明はまた、造血幹／前駆細胞を非造血細胞への分化から保護する方法におけるTLRアゴニストの使用を意図する。初期の造血前駆細胞が機能的なTLRを示すという発見に基づく本発明者らの知見は、TLRを通じた望ましくない刺激によって、幹細胞が枯渇、消耗、老化、またはそれ以外では損傷し得ることを明らかにした。
【０１５４】
従って、本発明は、TLRアンタゴニストが、例えば破壊的な化学療法または放射線療法の後の骨髄再移植の関係で、幹細胞を保護しそれらの造血細胞への発展を確保するために使用され得る様々な状況を意図する。このような方法は、インビボおよびエクスビボの両方の文脈で本明細書中の他所で議論されたアンタゴニストの使用を必要とし得る。破壊的治療法は当業者に周知であり、これらは本発明の幹細胞保護法と組み合わせるのが有利であり得る。
【０１５５】
VIII. 薬学的組成物
宿主への投与のために、TLRリガンド、他の細胞表面リガンド、サイトカインまたは成長因子、可溶性TLR、抗体、他の阻害因子、および刺激／分化細胞は、宿主への投与に適した製剤として懸濁され得ることが想定される。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される製剤および／または水性媒体中に分散された有効量のリガンド、因子、または細胞を含む。「薬学的および／または薬理学的に許容される」という語句は、動物に、特にヒトに適切に投与された場合に有害な、アレルギー性のおよび／またはその他の不都合な反応を生じない組成物を意味する。
【０１５６】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」には、任意の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および／または抗真菌剤、等張剤および／または吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質に対してこのような媒体または薬剤を使用することは当技術分野で周知である。任意の従来的な媒体または薬剤が活性成分と不適合な場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分もまた、この組成物に組み込まれ得る。ヒトへの投与については、製剤は、FDAの生物部門の基準により要求される、無菌性、発熱性、一般安全性、および／または純度の基準を満たさなくてはならない。
【０１５７】
投与する可溶性受容体、抗体、阻害因子もしくは細胞、リガンド、または細胞は一般的に、非経口投与用に製剤化され得、例えば静脈内経路、筋内経路、皮下経路、病巣内経路、または腹腔内経路を通じた注射用にさえも製剤化され得る。生きた要素または成分としての細胞を含む水性組成物の調製は、本明細書の開示に照らせば当業者に公知となろう。全ての場合において、その形式は無菌的であるべきであり、かつ注射容易性（easy syringability）が存在し細胞の生存が維持される程度に流体でなければならない。一般的に、培養培地の大部分が投与前に細胞から除去されることが意図される。
【０１５８】
一般的に、分散物は、基礎分散媒体および細胞の生存の維持に必要な他の成分ならびに場合によりインビボでの増殖または分化をもたらす追加の成分を含む無菌媒体に、様々な可溶性受容体、抗体、阻害因子、または生きた細胞を組み込むことによって調製される。溶液は、製剤化され、その投与製剤と適合する様式でまたは治療的に有効な量で投与され得る。処置される被検体の状態に依存して、ある程度の用量のばらつきが必然的に生じ得る。いずれにしても、投与責任者が個々の被検体に適した用量を決定する。
【０１５９】
IX. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者らによって本発明の実施において十分機能することが確認された技術であり、従って、その実施の好ましい様式を構成するものとみなすことができることが当業者に理解されるはずである。しかし、当業者は、本明細書の開示に照らせば、本発明の意図および範囲から逸脱することなく開示される特定の態様において多くの変更をなすことができ、かつそれでも同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
【０１６０】
実施例1 - 材料および方法
マウス
C57BL/6およびMyD88-/-マウスは8〜10週齢のものを使用した。C57BL/6マウスは、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した。MyD88-/-マウスはOklahoma Medical Research Foundation内の本発明者らの研究動物用設備（LARC）で管理した。
【０１６１】
試薬
組換えマウスIL-7、幹細胞因子（SCF）、Flt-3リガンド（FL）、M-CSF、GM-CSF、組換えマウスCD14／Fcキメラタンパク質、および組換えヒトCD14は、R&D Systems（Minneapolis, MN）から購入した。大腸菌由来LPS、055：B5は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。合成リポペプチドPam3CSK4は、InvivoGen（San Diego, CA）から購入した。
【０１６２】
抗体およびフローサイトメトリー
以下のフローサイトメトリー用AbをeBioscience（San Diego, CA）から購入した：ビオチニル化抗TLR4/MD-2（クローンMTS510）、ビオチニル化抗RP105（クローンRP/14）、ビオチニル化抗MD-1（クローンMD113）、ビオチニル化抗CD14（クローンSa2-8）、PE結合型抗CD62L（クローンMEL-14）、アロフィコシアニン（APC）結合型抗F4/80（クローンBM8）、抗c-Kit（クローンACK2）、フィコエリトリン（PE）-Cy5結合型抗Sca-1（クローンD7）、ビオチニル化抗Flk-2（クローンA2F10）、精製抗マウスCD115（CSF-1R、クローンAFS98）、精製抗マウスGM-CSF（クローンMP1-22E9）、および精製抗マウスTNFα（クローンMP6-XT22）。
【０１６３】
以下のフローサイトメトリー用AbをBD Pharmingen（San Diego, CA）から購入した：FITC結合型抗CD2（クローンRM2-5）、抗CD3ε（クローン145-2C11）、抗CD8α（クローン53-6.7）、抗CD45R（B220；クローンRA3-6B2）、抗Ly6G（クローンRB6-8C5）、抗CD11b/Mac-1（クローンM1/70）、抗TER119、抗CD34（クローンRAM34）、抗CD11c（クローンHL3）、PE結合型IL-7Rα（クローンSB/119）、抗CD19（クローン1D3）、抗Ly6G（クローンRB6-8C5）、抗CD11c（クローンHL3）、抗FcγR2/3（クローン2.4G2）、抗AA4.1、抗CD86（クローンGL1）、APC結合型抗CD45R（クローンRA3-6B2）、抗CD11b/Mac-1（クローンM1/70）、ビオチン結合型抗VCAM-1（クローン429、MVCAM.A）、PE結合型ストレプトアビジン、およびPEテキサスレッド結合型ストレプトアビジン。フローサイトメトリーにより培養細胞を分析するため、7-AAD（BD Pharmingen）を常に使用して死滅細胞を排除した。
【０１６４】
フローサイトメトリー分析は、FACSCan（商標）、FACSCalibur（商標）、またはFACSAria（商標）（Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA）を用いて行い、データはFlow Joソフトウェア（Treestar, San Carlos, CA）を用いて分析した。
【０１６５】
抗マウスTLR4モノクローナル抗体（クローンUT49）の構築
この試薬の調製および検証についての全ての記載は他で公開されている。簡単に説明すると、TLR4欠損マウスに、マウスTLR4およびマウスMD-2を発現する1×107のBa/F3細胞を、一週間の期間に4回、腹腔内注射した。最後の注射から三日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。脾細胞を分散させ、ポリエチレングリコール1500（Roche, Basel, Switzerland）による標準的な融合プロトコルを用いてSP2/0細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン培地において選択し、マウスTLR4/MD-2複合体を発現するBa/F3細胞および親のBa/F3細胞を用いたフローサイトメトリーによりスクリーニングした。ビオチンが結合したこの抗体をフローサイトメトリーに使用した。
【０１６６】
幹細胞および前駆細胞の単離
骨髄細胞を収集し、CD11b/Mac-1（クローンM1/70）に対する抗体、抗Ly6G（クローンRB6-8C5）、抗CD45R（B220；クローンRA3-6B2）、抗CD19（クローン1D3）、および抗TER119を共にインキュベートした後、MACS細胞分離系（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いて陰性選択を行うことによって系統陰性細胞（lineage-negative cells）を濃縮した。Flk-2-またはFlk-2+ LKS+（Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+）、LKS-（Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1-）、およびCLP（Lin- IL-7Rα+ c-Kitlo Sca-1lo）のソーティングについては、これらの部分系統枯渇細胞（partially lineage-depleted cells）をFITC結合型系統マーカー：抗CD2、抗CD3ε、抗CD8α、抗CD45R、抗Ly6G、抗CD11b/Mac-1、抗TER119、PE結合型IL-7Rα、APC結合型抗c-Kit、PE-Cy5結合型抗Sca-1、およびビオチニル化抗Flk-2 とPEテキサスレッド結合型ストレプトアビジンの組み合わせでさらに染色した。CMP（Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγR2/3lo）、GMP（Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγR2/3hi）、およびMEP（Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34- FcγR2/3lo）のソーティングについては、ソーティングしたLKS-細胞を、FITC結合型抗CD34およびPE結合型抗FcγR2/3でさらに染色した。細胞はFACSAria（商標）（Becton Dickinson & Co.）を用いてソーティングした。
【０１６７】
無血清、無間質細胞性の細胞培養
これらの培養には、丸底96ウェルプレートまたは平底24ウェルプレート（Corning Inc.）を使用した。ソーティングした細胞を、X-VIVO15培地（Biowhittaker, Walkersville, MD）またはStemPro-34 SFM培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて培養した。リンパ系の培養に最適と考えられるX-VIVO15培地は、1％解毒済ウシ血清アルブミン（Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada）、5×10-5 M 2-メルカプトエタノール（2-ME）、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン、および100mg/ml ストレプトマイシンを含んだ。2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン、および100mg/ml ストレプトマイシンを含有する。StemPro-34 SFM培地は、主に骨髄系の培養に使用した。サイトカインの濃度は、IL-7、1ng/ml；FL、100ng/ml；SCF、20ng/ml；M-CSF、20ng/ml；GM-CSF、20ng/mlであった。細胞は、5％ CO2の加湿雰囲気下、37℃で好気的にインキュベートした。
【０１６８】
OP9間質細胞上での単一細胞培養
ソーティングしたCLPを、SCF（20ng/ml）、FL（100ng/ml）およびIL-7（1ng/ml）の存在下、LPS（10μg/ml）またはPam3CSK4（1μg/ml）を含むまたは含まないX-VIVO15を用いて培養した。24時間後、培養細胞を収集して培地で三回洗浄した。次いで、FACSAria（商標）を用いて、培養細胞についての単一細胞ソーティングを行い、単一細胞を96ウェルプレート上のOP9間質細胞上にプレーティングし、SCF（20ng/ml）、FL（100ng/ml）およびIL-7（1ng/ml）の存在下で10日間培養した。OP9用のならし培地は、20％ FCS、5×10-5 M 2-ME、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン、および100mg/ml ストレプトマイシンを含有するMEMα培地（Invitrogen）であった。顕微鏡下での観察により陽性のウェル（30細胞超）を決定した。細胞を収集し、次いでCD19、CD11c、およびMac-1に対するmAbで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞はまた、間質細胞を排除するため、VCAM-1に対するmAbによっても染色した。OP9間質細胞株は、林眞一教授（鳥取大学）から提供していただいた。
【０１６９】
インビトロでのBrdU取り込み
ソーティングしたFlk-2- LKS+細胞（10,000細胞／ウェル）を、LPS（10μg/ml）またはPam3CSK4（1μg/ml）を含むまたは含まない、SCF（20ng/ml）の存在下で50時間培養し、最後の18時間は10μM 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）でパルスした。次いでこの細胞を抗BrdUで染色した。BrdUフローキットはBD Pharmingenから購入した。フローサイトメトリーによる分析はFACSCan（商標）を用いて行った。
【０１７０】
LPSとTLR4/MD-2複合体の相互作用
C57BL/6マウス由来の総骨髄細胞を、10% FCS、5×10-5 M 2-ME、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン、および100mg/ml ストレプトマイシンを含有するRPMI 1640培地（Mediatech, Inc. Herndon, VA）中で培養し、1μg/ml LPSを用いてまたは用いずに1時間刺激した。次いで細胞を収集し、TLR4/MD-2、Mac-1、系統マーカー（CD2、CD3e、CD8a、CD45R/B220、CD11b/Mac-1、Ly6G、TER119）、およびc-Kitに対するmAbで染色した。あるいは、C57BL/6マウスに、PBSまたは100μg LPSを静脈内注射または腹腔内注射した。1時間後、総骨髄細胞を大腿および脛骨から収集し、TLR4/MD-2、Mac-1、系統マーカー、およびc-Kitに対するmAbで染色した。MTS 10試薬は、TLR4/MD-2の立体配座依存的エピトープを検出する唯一の試薬である（Gilliet et al., 2002）。
【０１７１】
細胞の形態
培養した前駆細胞のサイトスピンを、ギムザ・メイ・グルンワルド（Sigma Diagnostics, St. Louis, MO）で染色し、イマーゾル（Immersol）（Zeiss, Thornwood, NY）中に浸し、100×/1.4 NA Plan Achromat対物レンズを備えたZeiss Axioplan 2i顕微鏡で分析した。AxioCam MRcカラーカメラ（Zeiss）およびAxio Vision 3.1ソフトウェア（Zeiss）を用いて顕微鏡写真を撮影した。
【０１７２】
遺伝子発現の逆転写酵素（RT）-PCR分析
mRNAを、マイクロポリ(A)ピュア（Ambion, Austin, TX）を用いてソーティングした細胞から単離した。次いで、cDNAを、オリゴdTおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Invitrogen）を用いてDNaseI処理したmRNAから調製した。PCR反応は、200μM dATP、dGTP、dTTP、100μM dCTP、および0.5μCi[α32P]dCTPを含有する緩衝液中で行った。βアクチンのために25、28、および31サイクルで、および他の全てのために32、35、および38サイクルでアリコートを取り、PCRが指数関数的増幅範囲内であることを確認した。5マイクロリットルのアリコートをホルムアミドローディング緩衝液中で変性させ、7M尿素を含有する6％ポリアクリルアミドゲルにアプライした。PCR産物のバンドへの［α32P］dCTPの取り込みは、ホスホイメージャー（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）により定量した。各遺伝子についてのプライマー配列を表1に示す。
【０１７３】
統計分析
グループ平均値間の統計的な有意差は、スチューデントt検定を用いて決定した。0.05未満のP値を有意であるとみなした。
【０１７４】
実施例2 - 結果
Toll様受容体および関連分子は、幹細胞および初期の造血前駆細胞において発現される。本研究の主要目的は、TLRが造血細胞において発現されるかどうか、およびそれらが骨髄において発生的な役割を有するかどうかを決定することであった。従って、本発明者らは、フローサイトメトリーにより骨髄細胞におけるTLRおよびそれらの補助受容体の発現を追跡し、幸運にも新規のTLR4特異的モノクローナル抗体を得た（実施例1を参照のこと）。最初の知見は、系統マーカー陰性（Lin-）細胞およびLin+細胞がTLR2およびTLR4ならびにMD-2およびCD14を発現するというものであった（図9A）。HSCおよび初期前駆細胞は、Lin- c-Kit+の部分集合に濃縮される。これらの原始細胞は相当量のTLRおよび補助因子成分を示した（図9A）。
【０１７５】
次に、本発明者らは、フローサイトメトリーによってLin- c-Kit+細胞を五つの大きな部分集合に分けてそれらを評価した（図1A）。HSCが濃縮されたLin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1+（LKS+）画分は、高レベルのTLR2を均一に含み、Lin- IL-7Rα+ c-Kitlo Sca-1loのプロリンパ球／リンパ系共通前駆細胞（CLP）についても同様であった。Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1-（LKS-）の骨髄／赤血球系前駆細胞画分は、TLR2染色において不均一であった（データは示さず）。次いで、この画分を、CD34およびFcγRレベルに基づき細分した（Akashi et al., 2000）。他の画分と異なり、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34- FcγRloの巨核球／赤血球前駆細胞（MEP）は、ごく僅かなTLR2しか有さなかった（図1A）。Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγRhiの顆粒球／マクロファージ前駆細胞（GMP）部分集合は均一にTLR2+であり、Lin- IL-7Rα- c-Kithi Sca-1- CD34+ FcγRloの骨髄系共有前駆細胞（CMP）はこの受容体に関して不均一であった（図1A）。事実、FcγRの密度は、総じてLKS-細胞におけるTLR2の発現に大いに対応した（図1B）。新規のTLR4特異的抗体またはTLR4/MD-2複合体に対する抗体はHSC濃縮画分を染色し、CD14もまた顕著であった。HSCと対照的に、CLPは、高密度のTLR2および微量のTLR4/MD-2またはCD14を有する成熟脾B細胞と非常に類似であった（Nagai et al., 2005）。TLR4およびCD14は、二つのLSK-の同類の部分集合よりもGMPにおいてより容易に観察された（図1A）。
【０１７６】
いくつかのTLRは細胞表面上に出ていないので、上記画分の各々をRT-PCRにより分析した（図1B）。概ね、転写レベルとフローサイトメトリーの結果の間には良好な相関関係があった。長期再構築性HSCは、LKS+画分のFlk-2-部分集合に濃縮されることが公知である（Christensen and Weissman, 2001）。興味深いことに、この集団は、最も高いTLR2、TLR4、およびMD-2 mRNAレベルを有したが、CD14はほとんど有さなかった。
【０１７７】
この分析を、RP105およびMD-1に対する抗体で前駆細胞を染色することにより拡張した（図10）。RP105は、MD-1と複合体を形成し（Miyake et al., 1998; Nagai et al., 2002）、TLR2およびTLR4/MD-2を通じた微生物膜に対するAb反応を制御する（Nagai et al., 2005）。B細胞の場合と異なり、RP105は、マクロファージにおけるTLR4シグナル伝達の陰性調節因子であり得ることが報告されている（Divanovic et al., 2005）。本発明者らは、本発明において、Lin+骨髄細胞の三つの集団がRP105/MD-1複合体の密度に基づき区別され得ることを見出した。少量のRP105/MD-1がLin-またはLin- c-Kit+細胞に存在した。前駆細胞の中でも、RP105はCLPにおいて最も高く、GMPにおいて検出可能であり、他の部分集合においてはバックグラウンドに近かった。これらの前駆細胞の大部分におけるMD-1の密度は、RP105の発現に対応した。
【０１７８】
本発明者らは、骨髄における造血前駆細胞の最も原始的な、特に稀な幹細胞濃縮画分がTLRおよび関連分子を発現するとの結論に至った。
【０１７９】
原始造血細胞のMyD88依存的な骨髄分化を誘導するTLRシグナル伝達
本実験では次に、造血前駆細胞におけるTLRの潜在的な機能に着目した。本発明者らは、LKS+細胞を単離し、それらを無血清、無間質細胞培養物中で、LPS、TLR4リガンド、またはTLR2のリガンドであるPam3CSK4のいずれかで刺激した。予備的な実験において、サイトカインFLおよびSCFが細胞の生存性を促進するが、単独ではこれらの条件下でほとんど違いが見られないことを決定した。Lin+細胞の出現率は、24時間という短い時間のTLR刺激の結果として増加し、時間と共にそれが進行した（図2Aおよび図11A）。Lin+細胞の絶対数は72時間以内におよそ8倍増加し、この反応は、MyD88欠損マウス由来の細胞では生じなかった（図2A）。拡大培養した細胞はCD11b/Mac-1および／またはGr-1という骨髄マーカーを発現したが、CD45R/B220は発現しなかった（図2B）。成熟単球／マクロファージマーカーF4/80は、72時間という短い時間でいくつかの細胞によって獲得され、これは時間と共に劇的に増加した（図2C）。これらの変化と並行して、相当数のLKS＋骨髄細胞が、LPSまたはPam3CSK4の曝露に反応して24時間以内にFcγR2/3を獲得した（データは示さず）。
【０１８０】
無血清条件下で造血細胞を刺激するのに必要とされるLPSの用量は高く、本発明者らは、10μg/ml未満の濃度で最小反応を見出した（図2D）。血清は、成熟細胞によるLPSおよびTLR2リガンドの認識を亢進する可溶性CD14を含むことが公知である（Yoshimura et al., 1999; Means et al., 1999）。従って、本発明者らは、この培養系にマウスCD14-Fcタンパク質を加え、72時間後にLPSに対するLKS+細胞の感度が顕著に上昇することを見出した（図2dおよび図11B）。すなわち、本発明者らは、0.1μg/mlという少ないLPSに対する反応を記録し、72時間以内のCD11b/Mac-1およびF4/80の共発現を見出した（図3B）。組換えヒトCD14は、LPSの反応性を亢進する点でマウスCD14-Fcと類似した（データは示さず）。外因性のCD14は、Pam3CSK4に対する反応に対してほとんど影響しなかった（図2D）。
【０１８１】
同様の研究を、Flk-2に基づき細分したLSK+画分を用いて行った（図3A）。これにより、長期再構築性幹細胞が豊富なFlk-2-部分集合がTLR刺激に対して反応するが、多能性Flk-2+前駆細胞ほど劇的でないことが明らかになった。次いで、休止状態の長期再構築性HSC部分集合がTLRの結合により細胞周期に誘導され得るかどうかを知るために、BrdU標識実験を行った（図3B）。これは実際にその通りであり、刺激された細胞は高い割合で増殖標識を取り込んだ。
【０１８２】
TLRリガンド誘導性の分化を検証するため、予備的なRT?PCR分析を同じ実験デザインを用いて行った。幹細胞が豊富なLin- c-Kithi Sca-1+ Flk-2-画分を、TLRリガンドと共にまたはそれを加えずに24時間培養した。M-CSF受容体（c-fms）の転写物は、TLRリガンドによる刺激によって増加し、単球／マクロファージ分化についても同様であったが、GM-CSF受容体は相当レベルで発現され変化しなかった（図12）。別の目的は、系統の運命の決定に関与する重要な転写因子が変化するかどうかを決定することであった。骨髄系前駆細胞について予想されていた通り（Akashi et al., 2000）、SCLおよびGATA2転写物の抑制およびPU.1において僅かな増加が観察された。しかし、マクロファージ分化を誘導し得るC/EBPα転写因子（Rosmarin et al., 2005; Xie et al., 2004）は、予想外にもTLR刺激によって低下した（図12）。
【０１８３】
これらの知見から、二つのTLRリガンドがMyD88依存的なシグナルを送達し、原始造血細胞の骨髄系統の進行を促進することが明らかである。さらに、高度に濃縮されたHSC集団は、これらの物質に対する機能的な受容体を示した。可溶性CD14は、LPSに対する感受性を劇的に向上させたが、Pam3CSK4に対してはそうならなかった。
【０１８４】
成長因子および分化因子の必要性を排除する、顆粒球／マクロファージ前駆細胞におけるTLRを通じたシグナル伝達
上記の知見は、高度に濃縮された造血幹細胞が、TLRを通じて、骨髄系の細胞を生成するよう刺激され得ることを示す。本発明者らは次に、コミットした（committed）LKS-の骨髄／赤血球系前駆細胞が同様に反応性であるかどうかを検討した。無血清、無間質細胞培養条件を用いて、通常の分化の指令が覆るかどうかを決定した。TLRリガンドとの反応によるF4/80の獲得は、劇的かつ完全なものであった（図4A）。事実、72時間での反応は、同じ集団をM-CSFで刺激した場合に得られるものと見分けがつかなかった。これらの三つの分化刺激とは対照的に、LKS-骨髄系前駆細胞の部分集合のみがGM-CSFと反応した。TLRを通じたシグナル伝達はMyD88に依存するが、これらのCSFについてはそうではなかった（図4A〜B）。いくつかの実験において、LPSによって得られたF4/80+細胞の収量は、CSF刺激によって得られたものとほぼ等しかったが、Pam3CSK4は一貫して刺激が小さかった（図4B）。TLRとCSF受容体のシグナル伝達を比較するため、より短い培養時間を使用した（図13）。TLRリガンドは、刺激後24時間または48時間で見られる迅速なF4/80の獲得をもたらした。
【０１８５】
造血細胞はそれら自身の成長因子および分化因子を産生するよう誘導されることが可能と考えられる。従って、M-CSF受容体またはGM-CSFのいずれかに対する中和モノクローナル抗体を培養系に添加した（図4C）。使用した量は、M-CSFに対する反応を完全に遮断するのに十分であり、GM-CSFに対するそれは大いに減少したが、この抗体は、TLR刺激に対しては有意な効果を有さなかった。
【０１８６】
次いで、TLR刺激の細胞標的を正確に同定するため、LKS-細胞の三つの部分集合をソーティングし、TLRリガンドで刺激した（図4D）。培養物中のMEPは刺激に関わらず死滅し、本発明者らは赤血球関連のTER 119マーカーを発現する細胞を回収しなかった（データは示さず）。対照的に、GMPは、24時間以内にF4/80+細胞を生じた（図4D）。CMPもまた反応したが、より長い時間が必要であり、72時間でのF4/80+の収量計算値はずっと低かった。この培養物に外因性のCD14を添加するとTLRを通じた刺激が亢進されたが（データは示さず）、幹細胞についての上記の刺激よりも小さかった。
【０１８７】
本発明者らは、分化段階の範囲にある骨髄系前駆細胞が、規定された培養条件下でMyD88依存的経路を通じてTLRリガンドと反応することならびに典型的な成長因子および分化因子は必要とされないことを結論付ける。GMPは、骨髄中の骨髄／赤血球系前駆細胞の中で最も反応性であった。この反応は、必要とする時間およびMyD88に対する依存性の点でCSFにより観察される反応とは別個のものであった。
【０１８８】
コミットした骨髄系前駆細胞から迅速に生成される単球／マクロファージ部分集合
本発明者らは、TLRの結合に反応して正常範囲の骨髄系の細胞型が生成されるかどうかに疑問を抱いた。従って、GMPを規定の培養条件に72時間おき、回収した細胞を徹底的な分析に供した（図5A〜C）。典型的な泡沫状のマクロファージまたは好中球が支配的な、M-CSFまたはGM-CSFにより刺激された培養物と対照的に、LPS含有培養物中のマクロファージ様細胞は、小さな顆粒を含むより好塩基性の細胞質を有した。Pam3CSK4で刺激した培養物から回収した細胞は、均一性が低いように見えた（図5A）。LPSまたはPam3CSK4に反応して生成された事実上全ての細胞が、CD11b/Mac-1+であったが、密度に関しては不均一であり、これはF4/80の密度と相関する傾向があった（図5B）。GM-CSFと反応する明確なMac-1+ F4/80-細胞の部分集合は、TLRリガンド培養物に存在しなかった。LPSは、Mac-1hi F4/80hi細胞の生成を誘導するのに特に効果的であった（図5C）。以前の研究は、Gr-1およびCD62Lが炎症性のMac-1+ F4/80+単球に存在するが、正常組織に属するよう運命付けられたものには存在しないことを示した（Geissman et al., 2003）。この炎症性の表現型は、TLRリガンドまたはGM-CSFにより刺激されたMac-1hi F4/80hi細胞に存在するが、M-CSFにより刺激された細胞には存在しなかった（図5B）。共起刺激性CD86分子はTLRにより生成された細胞に存在するが、M-CSFによって生成された細胞には少ない。さらに、LPSで刺激した培養物から回収した細胞のわずか9％が、72時間以内にDCに関連するMac-1およびCD11cの両方のマーカーを示し、これらは他の培養物のいずれにおいても見出されなかった（データは示さず）。
【０１８９】
これらの結果は、TLR刺激が、コミットした骨髄系前駆細胞を、外因性の成長因子に非依存的に、炎症性の特徴を有するMac-1hi F4/80hiの単球／マクロファージへと分化させることを示す。これは、自然免疫系の病原体に対する反応および多機能性細胞の維持のために有効な機構であり得る。
【０１９０】
TLRリガンドとの反応による、リンパ球産生を犠牲にした骨髄系樹状細胞の産生
次に本実験を、リンパ系に傾斜した前駆細胞を考慮するところまで拡張した。実験条件下で、CLPは、T、B、NK、およびDCを生成し得る（Kouro et al., 2002; Karsunky et al., 2003; Shigematsu et al., 2004）。サイトカインを含む無血清、無間質細胞培養物中にCLPを置くと、ほぼ純粋なCD19+ B系統細胞の集団が得られる（図6A）。しかし、LPSを添加した場合はMac-1+細胞のみが現れ、Pam3CSK4含有培養物中では二つの細胞型の混合物が見られた。MyD88欠損マウス由来のCLPから出発した培養物中ではCD19+リンパ球のみが生成されることから、この劇的な変化はMyD88依存的であった。大部分のMac-1+細胞は、ギムザ・メイ・グルンワルド染色したスライドにおいて骨髄系DCの形態を有した（図6B）。これらの培養物のさらなる分析は、LPSに反応してCLPから生じたMac-1+細胞のほとんど全てがCD11c+ Gr-1-でることを明らかにした（図6C）。Pam3CSK4含有培養物から収集した細胞はGr-1-であったが均一性は低かった。
【０１９１】
TLRの結合はサイトカイン産生を誘導し、その後これが観察された分化を促進し得る可能性があるようである。GM-CSFおよびTNFαは、インビトロで骨髄からの骨髄系DCの産生を促進し得るため（Gilliet et al., 2002）、特に関心対象であるといえる。さらに、TNFαは、Bリンパ球産生を抑制し得る（Sedger et al., 2002）。しかし、GM-CSFまたはTNFαのいずれかに対する中和抗体は、TLRリガンドにより誘導されるCLPからのDCの産生を抑制しなかった（データは示さず）。
【０１９２】
上記（図1A〜B）のように、CLPは、成熟B細胞ではフローサイトメトリーにより検出可能なTLR4/MD-2またはCD14をほとんど発現しない。図6Aに記載の実験は無血清培地を用いて行ったものなので、これがTLR4/MD-2シグナルの効果に影響するかどうかを決定するため外因性のCD14を培養物に添加した。事実、外因性のCD14は、無血清培養物中での低用量のLPSによるDC産生を劇的に亢進した（図6D）。対照的に、外因性のCD14は、任意の用量のPam3CSK4に対する反応に対してほとんど効果がなかった（データは示さず）。
【０１９３】
CLPは、規定の条件下に置かれた場合に大部分がB系統に拘束されるが、これらの前駆細胞は、間質細胞共培養および移植アッセイにおいてDCを生成する（Karsunky et al., 2003; Shigematsu et al., 2004）。TLRの結合は許容的なシグナルの代わりをし、完全にB系統の方にコミットしていないクローンを選択する可能性があるようである。従って、CLPを高純度にソーティングし、LPS、Pam3CSK4、または培地のみと共に24時間インキュベートした。次いで各グループの細胞を収集し、分化能力を評価するために、単一細胞を、サイトカインを含有するOP9間質細胞上にプレーティングした（図7）。10日後に4つのタイプのクローンが検出された。TLRリガンドなしでは、CLPは、純粋なCD19+ B系統だけでなくCD11c+もしくはCD11c+ CD19+の混合コロニー、またはCD11c- CD19-のコロニーを生じた。純粋なB細胞コロニーはこの状況下で最も大きかった（データは示さず）。CD11c+細胞の大部分はCD11b/Mac-1+でもあり、骨髄系DCまたは混合コロニーは非常に小さかった（データは示さず）。純粋なB細胞コロニーの数は、LPSが存在する場合に一貫して減少したが、同じ処置は純粋なmDCコロニーの数を増加させた。Pam3CSK4もまた、純粋なmDCを含むコロニーの生成を促進したが、CD19+ B細胞クローンの生成は変化させなかった。従って、これらのクローンアッセイの結果は、無血清、無間質細胞バルク培養物を用いて得られた結果と一致する（図6Aおよび6D）。
【０１９４】
次にRT-PCRを用いて、TLRリガンドによる刺激から24時間後のCLPを評価した（図14）。成熟DCにおいて予想されたように、GM-CSF受容体に対応する転写物は刺激によって増加した。M-CSF受容体の増加と並行して、リンパ球産生に必要とされるEBF、E12、およびRAG-1転写因子において減少が記録されたが、その他の三つ、PU.1、E47、およびPax-5の変化は顕著でなかった。幹細胞について上述されたように、C/EBPα転写因子はTLRの結合後に実際に減少した。
【０１９５】
これらの結果は、リンパ系に傾斜した前駆細胞がMyD88依存的なTLRシグナルによってDCの運命へと誘導され得ることを実証する。CLPはTLR4/MD-2をほとんど発現しないが、LPSは十分量のCD14によってそれらの分化を変化させる。TLRシグナルはBリンパ球産生を抑制し、リンパ系に傾斜した前駆細胞の潜在的な骨髄性を明らかにする。
【０１９６】
造血前駆細胞におけるTLR4/MD-2複合体をインビボで調節する、LPSに対する曝露
上記の結果は、高度に精製された幹／前駆細胞が規定の培養条件下でTLRリガンドに反応し得ることを示した。これらの現象が骨髄における前駆細胞に関係があるものなのかどうかを知ることが重要であった。LPSは、TLR4/MD-2複合体における非常に迅速な変化をもたらすことが公知であり、このLPS特異的な見かけ上の立体配座的変化は、独自のTLR4/MD-2特異的mAbによる染色を減少させる（Akashi et al., 2003）。本発明者らは、LPSが生理学的状況下で造血前駆細胞と直接的に相互作用し得るかどうかを確認するため、この現象を利用した。最初に、総骨髄細胞をインビトロでLPSにより刺激し、次いで1時間後にこのmAbで染色した（図8A）。Mac-1+骨髄性細胞、未処理の骨髄細胞のLin-およびLin- c-Kit+の部分集合は、このmAbによりはっきりと認識された。対照的に、TLR4/MD-2の染色は、LPS曝露のちょうど1時間後に実質的に陰性であった。次いで、本発明者らは、LPSまたはPBSで処理した無傷のマウスから骨髄細胞を収集した（図8B）。注目すべきは、TLR4/MD-2の染色が、LPSに対するこの短い曝露によって消滅したことであった。
【０１９７】
次いで、この処理が造血細胞において混乱を引き起こしたかどうかを決定するため、骨髄および脾臓をLPS注射後に評価した。以前の研究において指摘された通り（Ueda et al., 2004）、LPSは、骨髄において新しく形成されるAA4.1+ CD45R/B220+ B系統のリンパ球の数を低下させた（図15A）。反対に、CD11b/Mac-1+ F4/80+単球／マクロファージの数は、骨髄および脾臓の両方において増加した（図7B）。脾臓におけるCD11b/Mac-1+ CD11c+の骨髄系DCの数においても増加が記録された（図15C）。
【０１９８】
本発明者らは、骨髄内の造血前駆細胞がこのTLRリガンドの曝露により直接的かつ即座に影響を受けると結論付ける。インビボでの造血細胞における変化は、高度に規定された培養条件下で見られる分化のパターンと類似する。
【０１９９】
実施例3 - 考察
血液細胞の形成は従来、枝分かれ工程の連続であり、それらを通じて造血幹細胞（HSC）およびそれらの子孫が順次分化能を失っていくものと表現されていた。しかし、これは段階的なプロセスであり、ある細胞型になる経路に入った前駆細胞が特定の環境下で顕在化され得る他の能力も保持することが、目下明らかとなった。リンパ系統の細胞を実験的にマクロファージに変換させることができるという例は数多くある（Kondo et al., 2000; Iwasaki-Arai et al., 2003; Xie et al., 2004）。しかし、現在に至るまで、この現象の生理学的基礎は見出されていなかった。この文脈で、形質細胞様DCがウイルス感染時に骨髄系DCに変換され得るというのは興味深いことである（zuniga et al., 2004）。系統可塑性の大きさは、微生物／ウイルス産物に対して反応する手段を提供し得る。
【０２００】
鍵となる問題は、TLRシグナルがどのようにして造血細胞を特定の運命に導き、どのようにして正常環境のサイトカインの合図の必要性を除去するかである。MyD88欠損マウス由来の幹／前駆細胞は、二つのTLRリガンドに対して非反応性であり、従って以前に記載された細胞内TLRシグナル伝達経路の少なくとも一部が使用される。I型IFNの産生に寄与するMyD88非依存的なTRIF/TICAM経路（Ueda et al., 2004; Ueda et al., 2005）は、ここで観察された反応にとって重要でないのかもしれない。幹細胞のTLR刺激は、SCLおよびGATA2転写物を減少させ、PU.1はわずかに変化したにすぎなかったが、本発明らは、マクロファージ分化を誘導し得るC/EBPα転写因子（Rosmarin et al., 2005; Xie et al., 2004）の減少が見られたことに驚かされた。多くのその他の転写因子の変化は、骨髄系への分化が増加することと矛盾しない。本発明者らは、TLRリガンドが、それらの独自の因子を生成するよう造血細胞を刺激する可能性を検討した。しかし、M-CSF、GM-CSF、またはTNFαに対する中和抗体の添加は、自己分泌刺激に関する証拠を提供しなかった。他のサイトカインの潜在的な寄与を排除するためには、さらなる実験が必要である。
【０２０１】
単一CLPから始めた間質細胞共培養の結果は、バルクの無間質細胞培養において獲得された結果を拡張し、これは二つの可能性のある解釈のいずれかと一致する。TLRリガンドは、生まれながらにしてリンパ球産生の方に傾斜した個々の前駆細胞を抑制すると同時にDCを生成するよう運命付けられたそれらを刺激する可能性がある。あるいは、単一の前駆細胞は、TLR刺激の結果として異なる運命を選択するよう「再プログラム」されている可能性がある（Xie et al., 2004）。
【０２０２】
HSCは正常な環境下でほとんど分裂せず、それら独自の自己複製能の保持は、骨内膜表面付近の特定の微小環境（niche）における滞在に必要とされ得る（Zhang et al., 2003）。このような環境は、潜在的に有害な作用を有する全身性の現象から幹細胞の大部分を保護し得る。さらなる予測は、幹細胞がそれらの休止状態を維持するのに、または血液細胞集団の補充が必要な場合にそれらを活発に分化させるのに必要とされる受容体のみを発現することである。従って、機能的なTLRおよび関連分子が幹細胞段階で存在するという知見は予想外であり、TLRリガンドが、処理した動物における幹細胞の数および特徴に影響する可能性が高まった。反復的な感染は、理論的には、自己複製能を消耗させ得るかまたは幹細胞プールにとっての他の長期的な結果をもたらし得る。その結果、この反応を遮断する防御機構が展開され得る。細胞型依存的な様式で作用し得るTLRシグナル伝達における様々な陰性調節因子が報告されている（Liew et al., 2005）。さらに、RP105/MD-1複合体は、マクロファージにおけるTLR4シグナル伝達の陰性調節因子であり得る（Divanovic et al., 2005）。従って、阻害性分子を通じて送達されたシグナルが幹細胞の挙動に影響するかどうかを理解することが重要である。他方、機能的なTLRが幹／前駆細胞において発現されるという認識は、治療目的でそれらの活性を操作する新しい方法を示唆している。
【０２０３】
内毒素性ショックに対する生理学的反応に関する文献は多数存在する（Beutler and Rietschel, 2003; Taylor et al., 2001）。複数の細胞型が多くの細菌成分に反応し、様々な細胞型が体内で再配分され、サイトカインが放出され、その後凝固系が活性化される。別々の刺激経路および機構を分析することはこれらの環境下ではきわめて困難である。しかし、炎症プロセスに対する反応としての造血細胞の移動および再配分は以前から公知である（Ueda et al., 2004; Ueda et al., 2005）。本発明者らによる実験において、LPS注射は、以前に他者によって記載されたように（Ueda et al., 2004）、骨髄からB系統のリンパ球を枯渇させ、それに対応してマクロファージおよびDCを増加させた。複数の機構がこれらの変化を担っているが、それらは規定された培養条件下にある高度に精製された前駆細胞の反応と一致する。TLR4/MD-2複合体はLPSとの相互作用によって迅速な変化を起こし、MTS510 mAbによる染色を消滅させる（Akashi et al., 2003）。本発明者らは、注射したLPSが骨髄腔に拡散し、幹細胞／前駆細胞の受容体と咬合することを理解するため、この反応を活用した。Lin- c-Kit+前駆細胞およびMac-1+骨髄性細胞についてはその通りであった（図8）。従って、これらの知見は、外来物質と造血前駆細胞の間の迅速な相互作用が、骨髄において起こり得ることを示唆する。
【０２０４】
これらの新たな知見は、疾患に関連するプロセスという観点から幹細胞／前駆細胞を調査する必要があることを示唆する。一つの例にすぎないが、破骨細胞前駆細胞の最終成熟型は、造血細胞におけるTLRの結合により変更されることが公知である27, 28。破骨細胞対骨芽細胞の活性の不均衡および異常な骨密度は、慢性的な微生物／ウイルス感染に起因し得る。従って、TLRを発現する造血細胞が病原性機構に関与するかどうかを理解することが重要である。
【０２０５】
病原関連分子パターンの検知におけるTLRの重要性に加えて、多くの内因性TLRリガンドが記載されている（Tsan and Gao, 2004）。これらの物質に対する実験的なTLR依存的反応は、細菌物質のわずかな混入に基づくものであり得る。しかし自然免疫系は、この機構を使用して、炎症または再モデリングした組織により示される危険を検知し得る（Seong and Matzinger, 2004）7。本発明者らは、TLR遺伝子ターゲティングマウスにおける造血系の成熟性の欠陥についての公開された記述を認めていないが、これはTLR間の機能的な冗長性を反映している。
【０２０６】
Toll受容体は当初、ショウジョウバエ胚における背腹極性の確立において重要であることから発見されたものであり、これはこの種において免疫機能も有する（Ferrandon et al., 2004）。従って、本明細書中で報告された結果は、TLRが高度に保存された発生上および免疫上の役割を有し得ることを示す。事実、自己／非自己の識別は、造血系幹／前駆細胞のレベルで開始され得、TLRがそれらに自然免疫系を補充するよう指示する。
【０２０７】
実施例4 - 幹細胞移植
MyD88-/-マウスの造血前駆細胞が正常マウスのそれと比較してどのように機能するかを理解するため、骨髄移植実験を行った。MyD88-/-マウス由来の骨髄を、1：1の比率でMyD88+/+マウス由来の骨髄（計2×106細胞）と共に、致死量の照射（650R×2）を与えたC57BL/6(Ly5.1)マウスに移植した。キメラ現象の程度をフローサイトメトリーにより決定した。移植から三ヶ月後、レシピエント骨髄における血液産生細胞の大部分はMyD88-/-細胞由来であった（図16）。具体的には、胸腺細胞および末梢血顆粒球は主にMyD88-/-細胞から生成された。脾臓におけるMyD88-/-リンパ球の割合はほぼ1：1の比率であり、これはおそらく、リンパ球が長い半減期を有し、それらの生存が一部、有効なTLRシグナル伝達に依存し得るからであろう。
【０２０８】
実施例5 - リンパ系に傾斜した前駆細胞が樹状細胞になる
本発明者らは、リンパ・造血細胞が、リポペプチドおよびLPSによるそれぞれTLR2およびTLR4の刺激に反応することを実証した。この知見は、これらの細胞が、ウイルスに対する受容体であるTLR9およびそのリガンドであるCpG ODNを発現および利用することを示すことによって拡張された。インビボまたは培養下におけるリンパ系前駆細胞のCpG ODNへの曝露により、それらはリンパ球ではなく樹状細胞になるよう再指示された。
【０２０９】
次に、リンパ系細胞産生対樹状細胞産生において実験的に誘導した変化がウイルス感染時に観察され得るかどうかを確認した。角膜乱切法により送達された用量1,000 PFUのヒトHSV-1は、一週間で20％致死率の急性疾患および多臓器性炎症を引き起こすことから選択した。350 PFUを与えた別個の動物における潜伏性感染を研究し、これらの動物の全てが少なくとも30日間生存した。プロB細胞、プレB細胞、およびB細胞は全て急性感染マウスの骨髄において減少したが、pDCおよびIKDCは増加し、cDCにおいては有意な変化がなかった。潜伏性感染を有するマウスを30日間試験したところ、顕著な変化は見られなかった。
【０２１０】
次いで、CLPをHSV-1感染マウスから回収し、リンパ系培養物中での分化能を試験した（図17A）。Bリンパ球産生は、急性感染マウス由来の細胞においてほぼ完全に消滅していたが、樹状細胞の形成は極めて優良であった。これは、投入前駆細胞あたりの収量の観点でも見られた（図17B）が、潜伏性感染を有する動物から採取されたCLPにおいては異常が見られなかった（図17C）。次いで、同じ疾患モデルをTLR9遺伝子ターゲティングマウスと共に使用した。変異動物の骨髄におけるリンパ系細胞および樹状細胞は、急性感染に対して不応性であった。さらに、TLR9受容体が不在の場合、リンパ系前駆細胞から樹状細胞運命への刺激はごく僅かであった。
【０２１１】
これらの観察は、造血細胞が機能的なTLR9を発現することおよびこの受容体が急性ウイルス感染に対する反応を媒介することを実証する。TLRシグナル伝達の治療的操作は、いくつかの環境下で幹細胞を保護するのに、および自然免疫系の補充を促進するのに有利であり得る。
【０２１２】
本明細書中に開示され、添付の特許請求の範囲に記載される組成物および／または方法は全て、本開示に照らせば過度の実験を要せずに作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関連して記載されているが、本発明の概念、意図、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および／または方法ならびにその方法の工程または工程の順序に改変を加え得ることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じまたは類似の結果が達成され得ることが理解されるであろう。そのような類似の置換および修正は全て、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の意図、範囲、および概念に含まれるものとみなされることが当業者に明らかである。
【０２１３】
X. 参考文献
以下の参考文献は、それらが典型的な手順または本明細書に示される内容を補助する他の詳細を提供する範囲で、具体的に参照により本明細書に組み入れられる。
米国特許第3,817,837号
米国特許第3,826,364号
米国特許第3,850,752号
米国特許第3,939,350号
米国特許第3,996,345号
米国特許第4,196,265号
米国特許第4,275,149号
米国特許第4,277,437号
米国特許第4,284,412号
米国特許第4,366,241号
米国特許第4,472,509号
米国特許第4,498,766号
米国特許第4,661,913号
米国特許第4,680,338号
米国特許第4,714,682号
米国特許第4,767,206号
米国特許第4,774,189号
米国特許第4,857,451号
米国特許第4,938,948号
米国特許第4,989,977号
米国特許第5,021,236号
米国特許第5,141,648号
米国特許第5,160,974号
米国特許第5,196,066号
米国特許第5,478,722号
米国特許第5,563,250号
米国特許第5,856,456号
米国特許第5,880,270号
2009509540.tif 000002
2009509540.tif 000003
2009509540.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示された具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の一つまたは複数を参照することによってより理解が深まるであろう。
【図１】TLRおよび関連分子は造血幹／前駆細胞によって発現される。（図1A）系統マーカー陰性細胞を骨髄懸濁物から濃縮した後、造血系部分集合およびTLR2、TLR4、TLR4/MD-2、またはCD14に対する抗体で染色した。LKS+、GMP、CMP、MEP、またはCLPのゲーティングおよびフローサイトメトリー分析は、Kondoら（Konda et al., 2003）に記載の通りに行った。白抜きのヒストグラムは、適切なアイソタイプと一致するAbによる染色を表す。示される結果は、三つの独立した実験の典型例である。（図1B）各前駆細胞の部分集合から総RNAを抽出し、TLR4、MD-2、TLR2、およびCD14をコードするmRNAを検出するため半定量RT?PCRを行った。結果は、転写物の各々についてのピーク発現に対して標準化した値として示す。
【図２】LKS+細胞におけるMyD88を通じたTLRの活性化は、骨髄性細胞の分化をもたらす。（図2A）左、C57BL/6またはMyD88-/-マウスからソーティングしたLKS+細胞（10,000細胞/ウェル）を、FLおよびSCFの存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）と共に培養した。72時間の培養後、系統マーカーの発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。百分率は、Lin+またはLin-細胞の度数を示す。右、棒グラフは、投入した前駆細胞あたりの回収されたLin+細胞の収量、すなわち数を表し、データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表す（*P＜0.01）。結果は、五つの独立した実験の典型例である。（図2B）培養細胞におけるCD45R/B220または骨髄性細胞マーカー（Mac-1および／またはGr-1）の発現。棒グラフは、回収したB220、CD11b/Mac-1、および／またはGr-1系統マーカー保持細胞の割合を表す。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表す（*P＜0.001）。同様の結果は、三つの独立した実験において得られた。（図2C）左、C57BL/6マウスからソーティングしたLKS+細胞（10,000細胞/ウェル）を、FLおよびSCFの存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）と共に培養した。72時間または96時間の培養後、Mac-1およびF4/80について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。右、棒グラフは、細胞の収量を表す。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表し、これは三つの独立した実験の典型例である（*P＜0.002）。（図2D）C57BL/6マウスからソーティングしたLKS+細胞を、FLおよびSCFの存在下、一定濃度範囲のLPS（左、白抜きの丸印）、Pam3CSK4（右、白抜きの丸印）、またはマウスCD14-Fcタンパク質（1μg/ml）およびLPS（左、黒塗りの丸印）もしくはPam3CSK4（右、黒塗りの丸印）の組み合わせと共に培養した。72時間の培養後、系統マーカーの発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表す（*P＜0.001）。結果は、三つの独立した実験の典型例である。
【図３】幹細胞の豊富なFlk-2-細胞はTLRリガンドと反応し、細胞周期に入る。（図3A）左、ソーティングしたFlk-2-またはFlk-2+ LKS+細胞（10,000細胞/ウェル）を、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）と共に培養した。Flk-2- LKS+細胞は、SCFと共に培養した。Flk-2+ LKS+細胞は、SCFおよびFLと共に培養した。72時間の培養後、系統マーカーの発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。象限に記された百分率はLin+またはLin-細胞の度数を示し、右側の棒グラフは細胞の収量を表す。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表し、結果は、三つの独立した実験の典型例である（*P＜0.03；Flk-2- LKS+、*P＜0.002；Flk-2+ LKS+）。（図3B）ソーティングしたFlk-2- LKS+（10,000細胞/ウェル）を、SCFの存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）と共に50時間培養し、最後の18時間は10μM BrdUを用いてパルスを行った。次いで細胞を抗BrdUで染色した。百分率はBrdU+細胞の度数を示し、結果は三つの独立した実験の典型例である。
【図４】MyD88を通じたTLRの活性化は正常な分化の合図を迂回し、骨髄系前駆細胞の単球／マクロファージ分化を誘導する。（図4A）C57BL/6またはMyD88-/-マウスからソーティングしたLKS-細胞を、培地のみ、LPS（10μg/ml）、Pam3CSK4（1μg/ml）、M-CSF、またはGM-CSFで刺激した。72時間の培養後、F4/80の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。白抜きのヒストグラムは、F4/80についてのアイソタイプ一致Abによる染色を表す。各ヒストグラムに記される百分率はF4/80+細胞の度数を示し、結果は、三つの独立した実験の典型例である。（図4B）棒グラフは、投入した前駆細胞あたりの回収されたF4/80+細胞の収量、すなわち数を表す。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表し、結果は三つの独立した実験の典型例である（*P＜0.005）。（図4C）C57BL/6マウスからソーティングしたLKS-細胞を、抗M-CSFR（10μg/ml）または抗GM-CSF（10μg/ml）の存在下、LPS（10μg/ml）、Pam3CSK4（1μg/ml）、M-CSF、またはGM-CSFで刺激した。72時間の培養後、F4/80の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表し、結果は、三つの独立した実験の典型例である（*P＜0.01）。（図4D）左、C57BL/6マウスからソーティングしたCMPまたはGMPを、LPS（10μg/ml）またはPam3CSK4（1μg/ml）で刺激した。24時間または48時間の培養後、F4/80の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。白抜きのヒストグラムは、F4/80についてのアイソタイプ一致Abによる染色を表す。F4/80+細胞の度数を各ヒストグラムに記し、右側の棒グラフは細胞の収量を表す。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表し、これは三つの独立した実験の典型例である（*P＜0.02）。
【図５】TLR刺激はGMPからF4/80hi単球／マクロファージへの分化を誘導する。（図5A）これらの顕微鏡写真は、ギムザ・メイ・グルンワルド染色した細胞遠心分離スライド（cytocentrifuged slide）を用いて撮影した。（図5B〜C）ソーティングしたGMPを、LPS（1μg/ml）、Pam3CSK4（100ng/ml）、M-CSF、またはGM-CSFで刺激した。72時間の培養後、F4/80およびMac-1の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。百分率は、Mac-1lo F4/80loまたはMac-1hi F4/80hi細胞の度数を示す。CD86、Gr-1、またはCD62Lは、Mac-1hi F4/80hi細胞においてフローサイトメトリーにより分析した。白抜きのヒストグラムは、適切なアイソタイプ一致Abによる染色を表す。結果は二つの独立した実験から得られた結果の典型例である。（図5C）。棒グラフは、Mac-1lo F4/80loまたはMac-1hi F4/80hi細胞の細胞収量を表す。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表し、これは三つの独立した実験の典型例である。
【図６】TLRの刺激によりリンパ系に傾斜した前駆細胞は、Bリンパ球産生を犠牲にして骨髄系樹状細胞を生成する。（図6A）C57BL/6またはMyD88-/-マウスからソーティングしたCLP（5,000/ウェル）を、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（100ng/ml）、ならびにSCF、FL、およびIL-7を含むX-VIVO15中で刺激した。7日間の培養後、CD19およびMac-1の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した（左）。棒グラフはCD19+細胞またはMac-1+細胞の細胞収量を表し（右）、データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表す（*P＜0.02）。結果は五つの独立した実験において得られた結果の典型例である。（図6B）図6Aに記載される回収した細胞の部分集合をソーティングし、ギムザ染色スライドを調製するのに使用した。（図6C）C57BL/6マウス由来の培養細胞を、Gr-1およびCD11cの発現についてもフローサイトメトリーにより分析した。（図6D）C57BL/6マウスからソーティングしたCLPを、SCF、FL、およびIL-7の存在下、一定濃度範囲のLPSまたは組換えマウスCD14-Fcタンパク質（1μg/ml）およびLPSの組み合わせと共に培養した。7日間の培養後、CD19およびMac-1の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した（左）。棒グラフはCD19+細胞またはMac-1+細胞の細胞収量を表す（右）。データは、三連の培養物からの平均値を標準偏差と共に表す（*P＜0.003）。結果は三つの独立した実験の典型例である。
【図７】TLRを通じて活性化された単一のリンパ系前駆細胞の分化パターンの変化。ソーティングしたCLPを、SCF、FL、およびIL-7の存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）と共に培養した。24時間後、培養細胞を収集し、培地で三回洗浄した。次いで、単一の培養細胞をソーティングし、SCF、FL、およびIL-7の存在下、96ウェルプレート上のOP9間質細胞上で10日間再培養した。陽性のコロニーをフローサイトメトリーにより試験した（典型例を上段に示す）。これらの分化パターンの各々を有するウェルの度数を、観察された総クローン数に沿って示す。
【図８】LPSは、造血前駆細胞においてTLR4/MD-2複合体を迅速に変化させる。（図8A）C57BL/6マウス由来の総骨髄細胞を培地のみまたはLPS（1μg/ml）と共に1時間培養した。次いでこれらの細胞を収集し、TLR4/MD-2、Mac-1、方法の節に記載される系統マーカー、およびc-Kitに対するmAbで染色した。MTS 10試薬は、TLR4/MD-2における立体配座依存的エピトープを検出する唯一の試薬である（Gilliet et al., 2002）。白抜きのヒストグラムは、TLR4/MD-2についてのアイソタイプ一致Abによる染色を表す。結果は三つの独立した実験の典型例である。（図8B）C57BL/6マウスに、PBSまたは100μgの大腸菌由来LPSを静脈内注射または腹腔内注射した。1時間後、マウスを屠殺し、総骨髄細胞を収集し、TLR4/MD-2、Mac-1、系統マーカー、およびc-Kitに対するmAbで染色した。白抜きのヒストグラムは、TLR4/MD-2についてのアイソタイプ一致Abによる染色を表す。結果は三つの独立した実験の典型例である。
【図９】骨髄中のLin-またはLin- c-Kit+前駆細胞はTLRおよび関連分子を発現し、FcγRの密度は骨髄／赤血球系前駆細胞におけるTLRの発現に対応する。（図9A）TLR2、TLR4、TLR4/MD-2、またはCD14を、Lin+、Lin-、またはLin- c-Kit+骨髄細胞においてフローサイトメトリーにより分析した。C57BL/6マウス由来の総骨髄細胞を、TLR2、TLR4、TLR4/MD-2、またはCD14に対するmAbと共に実施例に記載の系統マーカーおよびc-Kitに対するmAbで染色した。白抜きのヒストグラムは、アイソタイプ一致Abによる染色を表す。示される結果は二つの独立した実験の典型例である。（図9B）二色フローサイトメトリーを用いて、LKS-細胞におけるFcγR2/3、TLR2、TLR4、TLR4/MD-2、およびCD14の発現を評価した。示される結果は、二つの独立した実験において得られた結果の典型例である。
【図１０】Lin-幹／前駆細胞はRP105/MD-1複合体を発現する。（図10A）ゲーティングしたLin+、Lin-、またはLin- c-Kit+骨髄細胞の集団におけるRP105およびMD-1の発現。C57BL/6マウス由来の総骨髄細胞を、RP105またはMD-1に対するmAbと共に系統マーカーおよびc-Kitに対するmAbで染色した。白抜きのヒストグラムは、関連するアイソタイプ一致Abによる染色を表し、結果は二つの独立した実験の典型例である。（図10B）異なるフローサイトメーターおよびバックグラウンド設定を用いて、RP105およびMD-1を、骨髄中の幹／前駆細胞において分析した。白抜きのヒストグラムは、アイソタイプ一致Abによる染色を表し、結果は二つの独立した実験の典型例である。
【図１１】TLRの刺激はLKS+細胞からLin+細胞への進行をもたらし、可溶性CD14はMac-1およびF4/80の獲得を亢進する。（図11A）C57BL/6マウスからソーティングしたLKS+細胞（10,000細胞／ウェル）を、FLおよびSCFの存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）と共に培養した。24時間または48時間後、系統マーカーの発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析し、Lin+またはLin-細胞の割合を示す。（図11B）左、C57BL/6マウスからソーティングしたLKS+細胞を、FLおよびSCFの存在下、1μg/ml LPS（左、白抜きの丸印）または組換えマウスCD14-Fcタンパク質（1μg/ml）およびLPSの組み合わせ（左、黒塗りの丸印）と共に培養した。24時間、48時間、または72時間の培養後、系統マーカーの発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。グラフは細胞の収量を表し、結果は二つの独立した実験の典型例である。右、C57BL/6マウスからソーティングしたLKS+細胞を、FLおよびSCFの存在下、一定濃度範囲のLPS（右、白塗りの丸印）または組換えマウスCD14-Fcタンパク質（1μg/ml）およびLPSの組み合わせ（右、黒塗りの丸印）と共に培養した。72時間の培養後、Mac-1およびF4/80の発現について細胞をフローサイトメトリーにより分析した。グラフは細胞の収量を表し、データは二つの独立した実験の典型例である。
【図１２】TLRの刺激はFlk-2- HSCにおけるいくつかの系統関連遺伝子のパターンを変化させる。C57BL/6マウスからソーティングしたFlk-2- LKS+細胞を、SCFの存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）またはPam3CSK4（1μg/ml）で刺激した。24時間後、細胞を収集し、mRNAを培養細胞から単離した。各集団内の示される遺伝子の転写物を増幅するため、半定量RT?PCRを行った。（図12A）結果は、各転写物についてのピーク発現に対して標準化した値として示し、実際のバンドを（図12B）に示す。
【図１３】TLRの刺激はLKS-細胞からのF4/80+細胞の迅速な生成をもたらす。C57BL/6マウスからソーティングしたLKS-細胞（10,000細胞／ウェル）を、LPS（10μg/ml）、Pam3CSK4（1μg/ml）、M-CSF、またはGM-CSFと共に培養した。刺激を行わなかったウェルからは実質的に生存細胞が記録されず、さらに研究を行わなかった。刺激された細胞は、24時間または48時間の培養後にF4/80の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。白抜きのヒストグラムはF4/80についてのアイソタイプ一致Abによる染色を表す。F4/80+細胞の百分率は、三つの独立した実験の典型例である。
【図１４】TLRが結合したCLPにおけるいくつかの系統関連遺伝子パターンの変化。C57BL/6マウスからソーティングしたCLPを、IL-7、FL、およびSCFの存在下、培地のみ、LPS（10μg/ml）、またはPam3CSK4（1μg/ml）で刺激した。24時間の培養後、細胞を収集し、mRNAを培養細胞から単離した。各集団内の示される遺伝子の転写物を増幅するため、半定量RT?PCRを行った。（図14A）。結果は、各転写物についてのピーク発現に対して標準化した値として示し、実際のバンドを（図14B）に示す。
【図１５】LPS処理マウスにおけるB系統、単球／マクロファージ、および樹状細胞の劇的な変化。C57BL/6マウスに、100μgの大腸菌由来LPSを腹腔内注射した。3日または7日後、大腿骨および脛骨由来の骨髄細胞または脾細胞を示されたマーカーに対するmAbで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。B220lo AA4.1+（図15A）、Mac-1+ F4/80+（図15B）、またはMac-1+ CD11c+（図15C）の細胞の割合が示される。グラフは、B220lo AA4.1+（図15A）、Mac-1+ F4/80+（図15B）、またはMac-1+ CD11c+（図15C）細胞の細胞数を表す。データは4匹のマウスからの平均値を標準偏差と共に示す、二つの独立した実験の典型例である。
【図１６】MyD88-/-幹細胞は正常マウス由来の幹細胞よりも生着性がよい。C57BL/6（Ly5.1）マウスに致死量の照射（650R×2）を与え、次いで計2×106の骨髄細胞を移植した。五つの実験動物グループのうちの二つに、示されるような50：50混合物を与えた。骨髄レシピエントにおけるキメラ現象の程度は、移植から3ヶ月後にフローサイトメトリーにより決定した。
【図１７】ヘルペス感染マウスの骨髄におけるリンパ系に傾斜した前駆細胞は樹状細胞になるよう再指示される。HSV-1を眼に感染させてから7日後のマウスから骨髄細胞を収集した。次いでLin- c-KitLo Sca-1+ IL-7Rα+のプロリンパ球／CLPを高純度にソーティングし、組換えSCF、FL、およびIL-7を含有する無血清、無間質細胞培養物中での分化能について試験した。対照動物由来のプロリンパ球は純粋なCD19+リンパ球を生成したが（図17A）、HSV-1感染前駆細胞から始めた培養物においては実質的にそれらは存在しなかった（図17B）。他方、CD45R/B220+ CD19- CD11c+形質細胞様樹状細胞およびCD45R/B220- CD19- CD11c+ CD11b+骨髄系樹状細胞の劇的な生成があった。これらの各細胞型の投入前駆細胞あたりの実際の収量を棒グラフに示す（図17C）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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