(57)【要約】本明細書において、可逆性ターミネーターヌクレオチドおよび使用方法を開示する。本明細書では、単一分子の配列決定を含めた、ポリヌクレオチドを配列決定するための組成物および方法が開示される。本明細書に開示される組成物は、可逆性ターミネーターヌクレオチドを含み、これは、鋳型依存的／特異的な形でポリメラーゼによってポリヌクレオチドの３’末端で取り込むことができる。いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、一般に、糖部分の３’位にヒドロキシル基、糖部分の２’位にブロック基、および塩基に結合した標識を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基および糖を含むヌクレオシドであって、標識が前記塩基に結合し、保護基が前記糖に結合しており、前記標識および前記保護基は、酵素によって前記ヌクレオシドから分離することができるヌクレオシド。
【請求項２】
前記標識および前記保護基が、同一条件下で前記ヌクレオシドから分離することができる、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項３】
前記標識および前記保護基がリン酸部分を含む、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項４】
前記標識および前記保護基がＳＯ３部分を含む、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項５】
前記標識および前記保護基がＣ（Ｏ）Ｒ部分を含む、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項６】
前記酵素がホスファターゼである、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項７】
前記ホスファターゼがエビアルカリホスファターゼである、請求項６に記載のヌクレオシド。
【請求項８】
前記酵素がスルファターゼである、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項９】
前記酵素がエステラーゼである、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項１０】
前記標識が蛍光標識である、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項１１】
前記標識が、断片化可能なリンカーによって前記塩基に結合している、請求項１に記載のヌクレオシド。
【請求項１２】
前記断片化可能なリンカーが、ＰＯ４、ＳＯ３、およびＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択されるトリガー部分を含む、請求項１１に記載のヌクレオシド。
【請求項１３】
前記トリガー部分が前記酵素の基質である、請求項１２に記載のヌクレオシド。
【請求項１４】
塩基および糖を含むヌクレオシドであって、標識が前記塩基に結合し、保護基が前記糖に結合しており、前記標識および前記保護基は、それぞれリン酸部分を含み、アルカリホスファターゼによって分離可能であるヌクレオシド。
【請求項１５】
塩基および糖を含むヌクレオチドであって、標識が前記塩基に結合し、保護基が前記糖に結合しており、前記標識および前記保護基は、酵素によって前記ヌクレオシドから分離することができるヌクレオチド。
【請求項１６】
前記標識および前記保護基が、同一条件下で前記ヌクレオシドから分離することができる、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項１７】
前記標識および前記保護基がリン酸部分を含む、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項１８】
前記標識および前記保護基がＳＯ３部分を含む、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項１９】
前記標識および前記保護基がＣ（Ｏ）Ｒ部分を含む、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項２０】
前記酵素がホスファターゼである、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ホスファターゼがエビアルカリホスファターゼである、請求項２０に記載のヌクレオチド。
【請求項２２】
前記酵素がスルファターゼである、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項２３】
前記酵素がエステラーゼである、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項２４】
前記標識が蛍光標識である、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項２５】
前記標識が、断片化可能なリンカーによって前記塩基に結合している、請求項１５に記載のヌクレオチド。
【請求項２６】
前記断片化可能なリンカーが、ＰＯ４、ＳＯ３、およびＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択されるトリガー部分を含む、請求項１１に記載のヌクレオチド。
【請求項２７】
前記トリガー部分が前記酵素の基質である、請求項１２に記載のヌクレオチド。
【請求項２８】
５’ヌクレオチド三リン酸である、請求項１２に記載のヌクレオチド。
【請求項２９】
塩基および糖を含むヌクレオチドであって、標識が前記塩基に結合し、保護基が前記糖に結合しており、前記標識および前記保護基は、それぞれリン酸部分を含み、アルカリホスファターゼによって分離可能であるヌクレオチド。
【請求項３０】
３’末端ヌクレオチドが塩基および糖を含むポリヌクレオチドであって、標識が前記塩基に結合し、保護基が前記糖に結合しており、前記標識および前記保護基は、酵素によって前記ヌクレオチドから分離することができるポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記標識および前記保護基が、同一条件下で前記ヌクレオシドから分離することができる、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記標識および前記保護基がリン酸部分を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記標識および前記保護基がＳＯ３部分を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記標識および前記保護基がＣ（Ｏ）Ｒ部分を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記酵素がホスファターゼである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記ホスファターゼがエビアルカリホスファターゼである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記酵素がスルファターゼである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記酵素がエステラーゼである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記標識が蛍光標識である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記標識が、断片化可能なリンカーによって前記塩基に結合している、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記断片化可能なリンカーが、ＰＯ４、ＳＯ３、およびＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択されるトリガー部分を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記トリガー部分が前記酵素の基質である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
プライマー核酸を伸長する方法であって、
鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたプライマーを、ポリメラーゼおよび請求項１５から２９のいずれか一項に記載のヌクレオチドと、前記プライマーの３’末端に前記ヌクレオチドを付加することにより前記ポリメラーゼが鋳型依存的な様式で前記プライマーを伸長するのに適した条件下で接触させるステップ
を含む方法。
【請求項４４】
鋳型ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
ａ）鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたプライマーを、ポリメラーゼおよび請求項１９から２９のいずれか一項に記載のヌクレオチドと、前記プライマーの３’末端に第１のヌクレオチドを付加することにより前記ポリメラーゼが鋳型依存的な様式で前記プライマーを伸長するのに適した条件下で接触させるステップと、
ｂ）前記ヌクレオチドの塩基を同定するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
前記塩基が前記標識を検出することによって同定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記伸長されたプライマーを、前記標識および前記保護基を分離する酵素と接触させるステップ
をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素がアルカリホスファターゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素がスルファターゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記酵素がエステラーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ａ）前記鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズした、前記伸長されたプライマーを、前記ポリメラーゼおよび請求項１２から２２のいずれか一項に記載のヌクレオチドと、前記伸長されたプライマーの３’末端に第２のヌクレオチドを付加することにより前記ポリメラーゼが鋳型依存的な様式で前記プライマーを伸長するのに適した条件下で接触させるステップと、
ｂ）前記第２のヌクレオチドの塩基を同定するステップと
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項３８】
前記鋳型ポリヌクレオチドが表面に結合している、請求項４３から４９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
可逆性ターミネーターヌクレオチドを使用するポリヌクレオチド配列決定の方法は、単一の塩基を決定し、ポリヌクレオチドのそれぞれの引き続く塩基の同定を可能にするのに必要な配列決定プライマーの３’末端を再生するために、多数のステップを一般に伴う。これらのステップには、プライマーの３’末端での可逆性ターミネーターの取込み、取り込まれなかった可逆性ターミネーターおよび他の配列決定試薬を洗い流すこと、取り込まれた可逆性ターミネーターに結合した標識の検出、取り込まれたターミネーターからの標識の除去、および可逆性ターミネーターからのブロック基の除去が一般に含まれる。したがって、可逆性ターミネーターを使用するポリヌクレオチド配列決定の現在の方法は、時間がかかり、大きな労働力を要し、各塩基の同定に関連する高い費用を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
したがって、当技術分野において、ポリヌクレオチドの各塩基の同定に必要とされるステップ数を低減する、可逆性ターミネーターヌクレオチドおよび使用方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
３．詳細な説明
この節では、本発明の様々な異なる実施形態が詳細に説明されるはずである。この節は、本発明の様々な構成要素部分の構成を助けるために、見出しを使用するものとする。
【０００４】
本明細書では、単一分子の配列決定を含めた、ポリヌクレオチドを配列決定するための組成物および方法が開示される。本明細書に開示される組成物は、可逆性ターミネーターヌクレオチドを含み、これは、鋳型依存的／特異的な形でポリメラーゼによってポリヌクレオチドの３’末端で取り込むことができる。いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、一般に、糖部分の３’位にヒドロキシル基、糖部分の２’位にブロック基、および塩基に結合した標識を含む。可逆性ターミネーターヌクレオチドが取り込まれると、ブロック基は、ポリメラーゼによってポリヌクレオチドを伸長不能にする。いくつかの実施形態では、取り込まれた可逆性ターミネーターはまた、３’−５’エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼの「校正活性」に対して一般に耐性である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】色素標識、リン酸ブロック基、およびリン酸トリガー部分を含む断片化可能なリンカーを含む、例示的な可逆性ターミネーターヌクレオチドの構造を提供する図である。
【図２】蛍光標識およびリン酸トリガー部分を含む断片化可能なリンカーの例を提供する図である。
【図３】蛍光標識およびリン酸トリガー部分を含む断片化可能なリンカーの例を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
３．２  定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、以下の意味を有することを意図する。
【０００７】
「ヌクレオシド」は、リボース、２’−デオキシリボース、または２’，３’−ジ−デオキシリボースなどのペントース糖の１位のアノマー炭素に連結された、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシンからなる化合物を指す。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位で結合しており、ヌクレオシド塩基がピリミジンである場合、ペントースは、ピリミジンの１位で結合している（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、２版（Ｆｒｅｅｍａｎ１９９２年）を参照されたい）。本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、一リン酸エステル、二リン酸エステル、または三リン酸エステルを指し、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合したヒドロキシル基である。「ヌクレオチド５’−三リン酸」は、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する用語「ヌクレオシド／チド」は、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの両方を含めた一連の化合物を指す。
【０００８】
「核酸塩基ポリマーまたはオリゴマー」は、生じる核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーが相補的な核酸塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にする連結によって結合した２個以上の核酸塩基を指す。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーとして、それだけに限らないが、ポリ−およびオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーおよびオリゴマー）、ポリ−およびオリゴヌクレオチド類似体ならびにポリ−およびオリゴヌクレオチド模倣体、例えば、ポリアミドまたはペプチド核酸などが挙げられる。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、数個の核酸塩基から、２から４０個の核酸塩基、数百個の核酸塩基、数千個の核酸塩基、またはそれ以上までサイズが変化し得る。
【０００９】
「ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド」は、核酸塩基が、糖リン酸連結（糖−リン酸バックボーン）によって結合されている、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを指す。例示的なポリ−およびオリゴヌクレオチドには、２’−デオキシリボヌクレオチドのポリマー（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチドのポリマー（ＲＮＡ）が含まれる。ポリヌクレオチドは、すべてリボヌクレオチド、すべて２’−デオキシリボヌクレオチド、またはその組合せからなることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、核酸塩基ポリマーは、ポリヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレオチド類似体である。「ポリヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレオチド類似体」とは、核酸塩基が、１種または複数種の糖リン酸類似体を含む糖リン酸バックボーンによって結合されている、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを意味する。一般的な糖リン酸類似体として、それだけに限らないが、糖アルキルホスホネート、糖ホスホラミダイト、糖アルキル−または置換アルキルホスホトリエステル、糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖が２’−デオキシリボースもしくはリボース以外である糖リン酸および糖リン酸類似体、正に帯電した糖−グアニジル連結（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）を有する核酸塩基ポリマー、例えば、米国特許第６０１３７８５号および米国特許第５６９６２５３号に記載されているものなど（Ｄａｇａｎｉ、１９９５年、Ｃｈｅｍ．  ＆  Ｅｎｇ．  Ｎｅｗｓ４〜５巻：１１５３頁；Ｄｅｍｐｅｙら、１９９５年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１１７巻：６１４０〜６１４１頁も参照されたい）が挙げられる。糖が２’−デオキシリボースである、そのような正に帯電した類似体は、「ＤＮＧ」と呼ばれ、糖がリボースであるものは、「ＲＮＧ」と呼ばれる。ロックド核酸（ＬＮＡ；例えば、Ｅｌａｙａｄｉら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１巻：９９７３〜９９８１頁；Ｋｏｓｈｋｉｎら、１９９８年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１２０巻：１３２５２〜３頁；Ｋｏｓｈｋｉｎら、１９９８年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３９巻：４３８１〜４３８４頁；Ｊｕｍａｒら、１９９８、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ８巻：２２１９〜２２２２頁；ＳｉｎｇｈおよびＷｅｎｇｅｌ、１９９８年、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１２巻：１２４７〜１２４８頁；ＷＯ００／５６７４６；ＷＯ０２／２８８７５；ならびにＷＯ０１／４８１９０を参照されたい）は、ポリ−およびオリゴヌクレオチド類似体の定義内に特に含まれる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、核酸塩基ポリマーは、ポリヌクレオチド模倣体またはオリゴヌクレオチド模倣体である。「ポリヌクレオチド模倣体またはオリゴヌクレオチド模倣体」は、１つまたは複数のバックボーンの糖−リン酸連結が、糖−リン酸類似体で置換された核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを指す。そのような模倣体は、相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体、または他のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣体とハイブリダイズすることができ、１つまたは複数の以下の連結を含むバックボーンを含んでもよい。米国特許第５７８６４６１号、同第５７６６８５５号、同第５７１９２６２号、同第５５３９０８２号およびＷＯ９８／０３５４２（Ｈａａｉｍａら、１９９６年、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｅｄ．  ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ３５巻：１９３９〜１９４２頁；Ｌｅｓｎｉｃｋら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ．１６巻：１７７５〜１７７９頁；Ｄ’Ｃｏｓｔａら、１９９９年、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．１巻：１５１３〜１５１６頁；Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０巻：７１〜７５頁も参照されたい）に記載されているような、アルキルアミン側鎖を有する、正に帯電したポリアミドバックボーン；ＷＯ９２／２０７０２および米国特許第５５３９０８２号に記載されているような、無電荷のポリアミドバックボーン；米国特許第５６９８６８５号、同第５４７０９７４号、同第５３７８８４１号、および同第５１８５１４４号（Ｗａｇｅｓら、１９９７年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３巻：１１１６〜１１２１頁も参照されたい）に記載されているような、無電荷のモルホリノ−ホスホラミデートバックボーン；ペプチドベースの核酸模倣体バックボーン（例えば、米国特許第５６９８６８５号を参照されたい）；カルバメートバックボーン（例えば、ＳｔｉｒｃｈａｋおよびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ、１９８７年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．５２巻：４２０２頁を参照されたい）；アミドバックボーン（例えば、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ、１９９４年、Ｓｙｎｌｅｔｔ．１９９４年２月：１３７頁を参照されたい）；メチルヒドロキシルアミンバックボーン（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１１４巻：４００６頁を参照されたい）；３’−チオホルムアセタールバックボーン（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．５８巻：２９８３頁を参照されたい）およびスルファメートバックボーン（例えば、米国特許第５４７０９６７号を参照されたい）。前述の参考文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【００１２】
「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５５３９０８２号、同第５５２７６７５号、同第５６２３０４９号、同第５７１４３３１号、同第５７１８２６２号、同第５７３６３３６号、同第５７７３５７１号、同第５７６６８５５号、同第５７８６４６１号、同第５８３７４５９号、同第５８９１６２５号、同第５９７２６１０号、同第５９８６０５３号、同第６１０７４７０号、同第６４５１９６８号、同第６４４１１３０号、同第６４１４１１２号および同第６４０３７６３号のうちの任意の１つまたは複数に記載されているような、核酸塩基がアミノ連結によって結合されている（無電荷のポリアミドバックボーン）、ポリ−またはオリゴヌクレオチド模倣体を指す。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、以下の刊行物に記載されているポリヌクレオチド模倣体の２つ以上のサブユニットを含む、任意のオリゴマーまたはポリマーにも適用されるものとする：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、１９９４年、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４巻：１０８１〜１０８２頁；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９６年、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６巻：７９３〜７９６頁；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、１９９６年、Ｔｅｔｔ．  Ｌｅｔｔ．３７巻：４７５〜４７８頁；Ｆｕｊｉｉら、１９９７年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．７巻：６３７〜６２７頁；Ｊｏｒｄａｎら、１９９７年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．７巻：６８７〜６９０頁；Ｋｒｏｔｚら、１９９５年、Ｔｅｔｔ．  Ｌｅｔｔ．３６巻：６９４１〜６９４４頁；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、１９９４年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．４巻：１０８１〜１０８２頁；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、１９９７年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２５  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７巻：１７４３〜１７４６頁；Ｌｏｗｅら、１９９７年、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、１巻：５３９〜５４６頁；Ｌｏｗｅら、１９９７年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１巻：５４７〜５５４頁；Ｌｏｗｅら、１９９７年、Ｉ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １１巻：５５５〜５６０頁；Ｈｏｗａｒｔｈら、１９９７年、Ｉ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．６２巻：５４４１〜５４５０頁；Ａｌｔｍａｎｎら、１９９７年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、７巻：１１１９〜１１２２頁；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、１９９８年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、８巻：１６５〜１６８頁；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、１９９８年、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  ｍｔ．  Ｅｄ．、３７巻：３０２〜３０５頁；Ｃａｎｔｉｎら、１９９７年、Ｔｅｔｔ．  Ｌｅｔｔ．、３８巻：４２１１〜４２１４頁；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、１９９７年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５３巻：１１６７〜１１７６頁；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、１９９７年、Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  １．３巻：９１２〜９１９頁；Ｋｕｍａｒら、２００１年、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅ��ｓ３巻（９号）：１２６９〜１２７２頁；およびＷＯ９６／０４０００に開示されているような、Ｓｈａｈらのペプチドベースの核酸模倣体（ＰＥＮＡＭ）。
【００１３】
ＰＮＡのいくつかの例は、核酸塩基がＮ−（２−アミノエチル）−グリシンバックボーン、すなわち、ペプチド様アミド連結単位に結合しているものである（例えば、米国特許第５７１９２６２号；Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９２年、ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４巻：１４９７〜１５００頁を参照されたい）。
【００１４】
いくつかの実施形態では、核酸塩基ポリマーは、キメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」とは、複数の異なるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体およびポリヌクレオチド模倣体を含む核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを意味する。例えば、キメラオリゴは、ＲＮＡの配列に連結したＤＮＡの配列を含むことができる。キメラオリゴヌクレオチドの他の例には、ＰＮＡの配列に連結したＤＮＡの配列、およびＰＮＡの配列に連結したＲＮＡの配列が含まれる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、核酸塩基ポリマーは、キメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」とは、複数の異なるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体およびポリヌクレオチド模倣体を含む核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを意味する。例えば、キメラオリゴは、ＲＮＡの配列に連結したＤＮＡの配列を含むことができる。キメラオリゴヌクレオチドの他の例には、ＰＮＡの配列に連結したＤＮＡの配列、およびＰＮＡの配列に連結したＲＮＡの配列が含まれる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、それだけに限らないが、プライマー、可逆性ターミネーターヌクレオチド、および他の反応コンパートメントを含めた、開示した方法の様々な成分は、検出可能部分を含むことができる。「検出可能部分」、「検出部分」または「標識」は、これが結合している分子を既知の検出システム（例えば、分光学、放射性、酵素、化学、光化学、生化学、免疫化学、クロマトグラフィー、物理（例えば、沈降、遠心分離、密度）、電気泳動、重量測定、または磁気のシステム）を使用して、検出可能または同定可能にする部分を指す。標識の限定しない例として、量子ドット、同位体標識（例えば、放射性または重同位体）、磁気標識；スピン標識、電子標識；熱標識；着色標識（例えば、発色団）、発光標識（例えば、蛍光剤、化学発光剤）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）（Ｉｃｈｉｋｉら、１９９３年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０巻（１２号）：５４０８〜５４１７頁；Ｎｏｌａｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８５巻（８号）：２６０３〜２６０７頁）、抗体標識、および化学修飾可能標識が挙げられる。さらに、いくつかの実施形態では、そのような標識として、リガンド結合パートナー対の成分（例えば、抗原−抗体（単鎖抗体および抗体断片、例えば、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、Ｆｖ，など（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４７〜１０５頁（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ  編、５版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３年））を含めて）、ホルモン−受容体結合、神経伝達物質−受容体結合、ポリメラーゼ−プロモーター結合、基質−酵素結合、阻害剤−酵素結合（例えば、スルホローダミン−バリル−アラニル−アスパルチル−フルオロメチルケトン（ＳＲ−ＶＡＤ−ＦＭＫ−カスパーゼ（複数も）結合））、アロステリックエフェクター−酵素結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ジゴキシン−抗ジゴキシン結合、炭水化物−レクチン結合、アネキシンＶ−ホスファチジルセリン結合（Ａｎｄｒｅｅら、１９９０年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６５巻（９号）：４９２３〜８頁；ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｅら、１９９５年、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．７３巻（２号）：１７２〜９頁；Ｔａｉｔら、１９８９年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６４巻（１４号）：７９４４〜９頁）、核酸のアニーリングもしくはハイブリダイゼーション、または一対の電子を供与もしくは受容することによって、配位錯体の中心金属原子と配位共有結合を形成する分子が挙げられる。様々な例示的な実施形態では、結合リガンドの解離定数は、約１０−４〜１０−６Ｍ−１未満、約１０−５から１０−９Ｍ−１未満、または約１０−７〜１０−９Ｍ−１未満であり得る。
【００１７】
「蛍光標識」、「蛍光部分」、および「蛍光体」は、その固有の蛍光特性を介して検出することができる分子を指す。適当な蛍光標識の例として、それだけに限らないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、フィコエリトリン、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）およびタンデムコンジュゲート（ｔａｎｄｅｍ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、例えば、それだけに限らないが、Ｃｙ５ＰＥ、Ｃｙ５．５ＰＥ、Ｃｙ７ＰＥ、Ｃｙ５．５ＡＰＣ、Ｃｙ７ＡＰＣなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、適当な蛍光標識として、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｈａｌｆｉｅら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３巻（５１４８号）：８０２〜８０５頁）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ；Ｈｅｉｍら、１９９６年、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．６巻：１７８〜１８２頁；Ｓｔａｕｂｅｒ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２４巻（３号）：４６２〜４７１頁；）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびウミシイタケ（ＷＯ９２／１５６７３；ＷＯ９５／０７４６３；ＷＯ９８／１４６０５；ＷＯ９８／２６２７７；ＷＯ９９／４９０１９；米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、および同第５９２５５５８号）も挙げられる。蛍光標識のさらなる例は、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９版、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．  Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ  （ＩＳＢＮ  ０−９７１０６３６−０−５）中に見つけられる。
【００１８】
本明細書で「微粒子」、「マイクロスフェア」、「マイクロビーズ」、「ビーズ」およびそれらの文法的に等価なものは、小さな別個の合成粒子を意味する。当技術分野で知られているように、ビーズの組成物は、これらが使用されるアッセイの種類に応じて変更することができ、したがって、マイクロビーズ組成物を選択することは、専門家の能力の範囲内である。適当なビーズ組成物として、それだけに限らないが、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料（米国特許第４３５８３８８号、同第４６５４２６７号、同第４７７４２６５号、同第５３２０９４４号、同第５３５６７１３号）、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたはセファロースなどの架橋デキストラン、アガロース、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、タンパク性ポリマー、ナイロン、グロブリン、ＤＮＡ、架橋ミセルおよびテフロン（登録商標）を含めた、ペプチド、核酸および有機合成において使用されるものが挙げられ、これはすべて使用することができる（例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮからのＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅを参照されたい）。ビーズは、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）、ＬＫＢ  （Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＩＢＦ  （Ｆｒａｎｃｅ）、Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ．  （Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ、ＮＹ）からも市販されている。いくつかの実施形態では、ビーズは、架橋剤、例えば、それだけに限らないが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、Ｎ，Ｎ’メチレン−ビス−アクリルアミド、アジピン酸、セバシン酸、コハク酸、クエン酸、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸、もしくは１，１０−デカンジカルボン酸、または当技術分野で知られている他の機能的に等価な作用剤などを含有することができる。様々な例示的な実施形態では、ビーズは、球状、非球状、卵形、不整形などとすることができる。微粒子の平均直径は、専門家の自由裁量で選択することができる。しかし、一般に、微粒子の平均直径は、ナノメートル（例えば、約１００ｎｍ）からミリメートル（例えば、約１ｍｍ）の範囲とすることができ、約０．２μｍから約２００μｍのビーズが好ましく、約０．５から約１０μｍのビーズが特に好ましいが、いくつかの実施形態では、以下に説明されるように、より小さい、またはより大きいビーズを使用することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、微粒子は多孔質とすることができ、したがって、別の分子、部分、または化合物（例えば、プライマー）への結合に利用可能な表面積が増加する。したがって、微粒子は、追加の表面官能基を有することによって、結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）および／または結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）を促進することができる。これらの基として、カルボキシレート、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、アミン、硫黄酸化物、窒素酸化物、またはハロゲン化物を挙げることができる。別の分子または部分をビーズに結合させる方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第６２６８２２２号、同第６６４９４１４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、微粒子は、標識をさらに含むことができる。
【００２０】
「伸長されたポリヌクレオチド」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドが付加されたか、別の方法で取り込まれた（例えば、共有結合的に結合された）ポリヌクレオチドを指す。
【００２１】
「鋳型ポリヌクレオチド」は、プライマーがハイブリダイズし、伸長することができるポリヌクレオチドを指す。したがって、鋳型ポリヌクレオチドは、プライマーに対して少なくとも部分的に相補的な部分配列を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、本質的に任意の供給源から得ることができる。例えば、鋳型核酸は、場合により、例えば、培養微生物、非培養微生物、複雑な生物学的混合物、組織、血清、プール血清またはプール組織、多種の集合体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｎｓｏｒｔｉａ）、古代の、化石化した、もしくは他の生きていない生物遺骸、環境分離株、土壌、地下水、廃棄物施設、深海環境などから入手し、単離することができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチドは、場合により、例えば、個々のｃＤＮＡ分子、ｃＤＮＡのクローン化セット、ｃＤＮＡライブラリー、抽出ＲＮＡ、天然ＲＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、特徴付けされた、もしくは特徴付けされていないゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、酵素的に断片化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、化学的に断片化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、物理的に断片化されたＤＮＡもしくはＲＮＡなどを含み、またはこれらから得られる。鋳型核酸は、当技術分野で知られている技法を使用して化学的に合成することもできる。さらに、鋳型核酸は、場合により遺伝子の少なくとも一部に相当し、またはそれに対して相補的である。本明細書で使用する場合、「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子は、その発現に必要とされる、コード配列および場合により、制御配列を含む。遺伝子は、場合により、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する、非発現ＤＮＡセグメントも含む。
【００２２】
ポリヌクレオチドは、追加のヌクレオチド（または他の類似の分子、例えば、可逆性ターミネーターヌクレオチド）が核酸中に取り込まれる場合、「伸長される（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）」、または「延長される（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）」。例えば、ポリヌクレオチドは、場合により、一般にポリヌクレオチドの３’末端にヌクレオチドを付加する、ヌクレオチドを取り込むポリメラーゼによって伸長される。
【００２３】
「伸長可能なポリヌクレオチド」は、例えば、この伸長可能なポリヌクレオチドが取り込まれると、ポリメラーゼによって触媒される反応で、少なくとも１つの他のヌクレオチドを付加する、または共有結合することができるヌクレオチドを指す。伸長可能なポリヌクレオチドは、糖部分の３’位に別のヌクレオチドを付加することによって一般に伸長される。
【００２４】
「伸長不能な」ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中に取り込まれると、ポリヌクレオチドのさらなる伸長を少なくとも実質的に阻害するヌクレオチドを指す。
【００２５】
本明細書で使用する「並行反応」は、複数の反応を同時に実施するのに適した、複数の別個の領域を含む反応を指す。事実上、任意の数のポリヌクレオチドを並行して分析することができる。例えば、様々な例示的な実施形態では、数百、数千、数十万、数百万、およびさらに大きな数のポリヌクレオチドを、開示した方法によって並行して分析することができる。様々な例示的な実施形態では、また並行して分析されるポリヌクレオチドの数は、少なくとも、２、１００、５００、１０００、１００００、５００００、１０００００、３０００００、５０００００、または１００００００、およびさらに大きな数とすることができる。
【００２６】
「部分」または「基」は、分子などの何かが分割される部分の１つ指す（例えば、官能基、置換基など）。例えば、ヌクレオチドは、塩基性基（例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、または類似体塩基性基）、糖部分（例えば、糖環またはその類似体を含む部分）、および１つまたは複数のリン酸基を一般に含む。
【００２７】
「複素環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含む、単環または二環を指す。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して、本発明のヌクレオチドの糖部分、またはその類似体に結合することができる。例示的な複素環として、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍｙｌ）、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、アザインドリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニルなどが挙げられる。
【００２８】
「単素環」は、飽和または不飽和（しかし芳香族ではない）環状炭素、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロヘキセンなどを指す。
【００２９】
「アルキル基」は、直鎖、分岐、または環状の飽和炭化水素部分を指し、これには、すべての位置異性体、例えば、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピルおよび１−エチル−２−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどが含まれる。アルキル基は、一般的に約１〜２０個の炭素原子を含み、より一般的には、約２〜１５個の炭素原子を含む。アルキル基は、置換されていても、非置換であってもよい。
【００３０】
「アルケニル基」は、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を含む、直鎖、分岐、または環状の不飽和炭化水素部分を指す。例示的なアルケニル基として、エテニル、２−プロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１−エチル−２−プロペニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−３−ブテニル、１，２−ジメチル−２−ブテニル、１，２−ジメチル−３−ブテニル、１，３−ジメチル−２−ブテニル、１，３−ジメチル−３−ブテニル、２，２−ジメチル−３−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−３−ブテニル、３，３−ジメチル−２−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、２−エチル−２−ブテニル、２−エチル−３−ブテニル、１，１，２−トリメチル−２−プロペニル、１−エチル−１−メチル−２−プロペニル、１−エチル−２−メチル−２−プロペニル、などが挙げられる。アルケニル基は、一般的に約１〜２０個の炭素原子を含み、より一般的には、約２〜１５個の炭素原子を含む。アルケニル基は、置換されていても、非置換であってもよい。
【００３１】
「アルキニル基」は、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を含む、直鎖、分岐、または環状の不飽和炭化水素部分を指す。代表的なアルキニル基として、２−プロピニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−ペンチニル、１−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、２−メチル−４−ペンチニル、３−メチル−４−ペンチニル、４−メチル−２−ペンチニル、１，１−ジメチル−２−ブチニル、１，１−ジメチル−３−ブチニル、１，２−ジメチル−３−ブチニル、２，２−ジメチル−３−ブチニル、３，３−ジメチル−１−ブチニル、１−エチル−２−ブチニル、１−エチル−３−ブチニル、２−エチル−３−ブチニル  １−エチル−１−メチル−２−プロピニル、などが挙げられる。アルキニル基は、一般的に約１〜２０個の炭素原子を含み、より一般的には、約２〜１５個の炭素原子を含む。アルキニル基は、置換されていても、非置換であってもよい。
【００３２】
「アルコキシ基」は、酸素原子を含むアルキル基を指し、これには、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシなどが含まれる。
【００３３】
「ハロ基」は、ハロゲン原子、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを含む基を指す。
【００３４】
「アリール基」は、芳香族化合物に由来する、原子または部分の置換基を指す。例示的なアリール基として、例えば、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基などが挙げられる。アリール基は、場合により複数の芳香族環を含む（例えば、ジフェニル基など）。さらに、アリール基は、置換されていても、非置換であってもよい。
【００３５】
「アリールオキシ基」は、酸素原子を含むアリール基を指し、これには、例えば、フェノキシ、クロロフェノキシ、メチルフェノキシ、メトキシフェノキシ、ブチルフェノキシ、ペンチルフェノキシ、ベンジルオキシなどが含まれる。
【００３６】
「アルキル−アリール基」は、アルキルおよびアリール部分を含む基を指す。
【００３７】
「エーテル基」は、１個の酸素原子に結合した２個の炭素原子を含む、直鎖、分岐、または環状の部分を指す。例示的なエーテル基として、例えば、メトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、エトキシエチルなどが挙げられる。
【００３８】
「チオエーテル基」は、１個の硫黄原子に結合した２個の炭素原子を含む、直鎖、分岐、または環状の部分を指し、これには、例えば、メチルチオメチル、メチルチオエチル、メチルチオプロピルなどが含まれる。
【００３９】
「アルキルアミン基」は、少なくとも１つのアルキル基を含むアミノ基を指す。
【００４０】
「アルケニルアミン基」は、少なくとも１つのアルケニル基を含むアミノ基を指す。
【００４１】
「アルキニルアミン基」は、少なくとも１つのアルキニル基を含むアミノ基を指す。
【００４２】
「エステル基」は、一般式ＲＣＯＯＲ’（式中、ＲおよびＲ’は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはその組合せから独立に選択される）を含む有機化合物の分類を指す。
【００４３】
「ポリアミノ酸」は、２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物または基を指す。例示的なポリアミノ酸として、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質などが挙げられる。
【００４４】
「アルデヒド基」は、式ＣＨＯを含む有機基を指す。
【００４５】
「アルコール基」は、少なくとも１つのヒドロキシ基を含む有機基を指す。
【００４６】
「シリル基」は、一般式ＳｉＲＲ’Ｒ’’（式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、独立に、Ｈ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはそのような基の組合せである）を含む化合物の分類である。
【００４７】
「リン酸類似体」は、アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによって開裂され得る部分を指す。
【００４８】
ポリヌクレオチドの「配列」は、核酸中のヌクレオチドの順序および素性を指す。配列は、５’から３’方向で一般的に読まれる。
【００４９】
「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」は、それだけに限らないが、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄｉｎｇ）、イオン結合（ｉｏｎｉｃ  ｂｏｎｄｉｎｇ）、化学吸着、物理吸着、およびその組合せを含めた相互作用を指す。
【００５０】
「リンカー」または「スペーサー」は、化合物または置換基を、例えば、固体担体、別の化合物または基などに、共有結合的または非共有結合的に（例えば、イオン的になど）結合させる化学部分を指す。例えば、リンカーは、場合により、標識（例えば、蛍光色素、放射性同位元素など）を、２’−ターミネーターヌクレオチドなどに結合させる。リンカーは、一般的に二官能性化学部分であり、ある特定の実施形態では、リンカーは、開裂可能な結合を含み、これは、例えば、熱、酵素、化学剤、電磁放射などによって開裂されることによって、例えば、固体担体、別の化合物などから物質または化合物を放出することができる。リンカーの慎重な選択により、化合物の安定性およびアッセイ方法に適合した適切な条件下で開裂を実施することが可能になる。一般に、リンカーは、例えば、化学種を一緒に結合すること、またはそのような種同士間のある最小距離もしくは他の空間的関係を維持すること以外に特定の生物活性を有さない。しかし、リンカーの成分は、連結される化学種のある性質、例えば、３次元配座、正味の電荷、疎水性などに影響を与えるように選択することができる。リンカー分子のさらなる説明は、例えば、Ｌｙｔｔｌｅら、（１９９６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４巻（１４号）：２７９３頁、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏら（２００１年）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ２０巻：３６９頁、Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００１年）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ２０巻：１００７頁、Ｔｒａｗｉｃｋら、（２００１年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２巻：９００頁、Ｏｌｅｊｎｉｋら（１９９８年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２９１巻：１３５頁、Ｐｌｊｅｖａｌｊｃｉｃら（２００３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１２５巻（１２号）：３４８６頁、Ｗａｒｄら、米国特許第４７１１９５５号、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、米国特許第４７０７３５２号、およびＳｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、米国特許第４７０７４４０号に提供されており、これらはそれぞれ参照により組み込まれている。
【００５１】
「修飾」酵素は、例えば、２つの配列が最大の同一性に関して並べられる場合に、少なくとも１つのアミノ酸が、参照配列、例えば、天然型もしくは野生型の酵素または別の修飾型の酵素などと異なる配列を含む酵素を指す。例示的な修飾には、モノマーの挿入、欠失、および置換が含まれる。修飾酵素（例えば、ポリメラーゼ）は、様々な多様性生成方法によって作製することができる。本質的には、修飾酵素を作製するのに任意の方法を使用することができるが、ある特定の例示的な技法には、１つまたは複数の親酵素をコードしている２つ以上の核酸を組み換えること（例えば、再帰的組換え、合成組換えなどによって）、または例えば、再帰的アンサンブル変異誘発、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、ｉｎ  ｖｉｖｏ変異誘発、部位特異的変異誘発などを使用して、酵素をコードする１つまたは複数の核酸を変異させることによるものが含まれる。親酵素をコードしている核酸は、一般的に、転写および翻訳の機構を通じて、親酵素、例えば天然型の酵素に対応するアミノ酸配列を産生する遺伝子を含む。修飾酵素には、２つ以上の親に由来する同定可能な成分配列（例えば、構造的および／または機能的ドメインなど）を有するキメラ酵素も含まれる。修飾酵素の定義の範囲内には、参照配列に対して化学修飾（例えば、結合した置換基、変更された置換基など）を含むものも含まれる。
【００５２】
「固体担体」は、ポリヌクレオチドなどの化学部分で誘導体化する、またはさもなければこの化学部分に結合することができる固体材料を指す。例示的な固体担体として、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、繊維、ウィスカー、コーム、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、スライド、自己集合単層などが挙げられる。
【００５３】
「開裂」は、物質または化合物または部分を、別の物質または化合物または部分から放出するプロセスを指す。
３．３  詳細な説明
図面を含めた前述の概括的な説明、および以下の詳細な説明の両方は、例示的および説明的であるだけであり本開示を限定しないことが理解されるべきである。本開示では、単数形の使用には、特に別段の指定のない限り、複数形が含まれる。また、「または」の使用には、別段の指定のない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含めて（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定することを意図していない。
【００５４】
本明細書では、単一分子の配列決定を含めた、ポリヌクレオチドを配列決定するための組成物および方法が開示される。本明細書に開示される組成物には、鋳型依存的／特異的な形でポリメラーゼによってポリヌクレオチドの３’末端で取り込むことができる可逆性ターミネーターヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、一般に、糖部分の３’位にヒドロキシル基、糖部分の２’位にブロック基、および塩基に結合した標識を含む。可逆性ターミネーターヌクレオチドが取り込まれると、ブロック基は、ポリメラーゼによってポリヌクレオチドを伸長不能にする。いくつかの実施形態では、取り込まれた可逆性ターミネーターはまた、３’−５’エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼの「校正活性」に対して一般に耐性である。
【００５５】
取込み後に、可逆性ターミネーターヌクレオチドの標識を検出することによって、ターミネーターヌクレオチドの塩基、したがって鋳型ポリヌクレオチドの対応塩基を同定することができる。さらなるラウンドの伸長を可能にするために、ポリヌクレオチドは、ブロック基および標識を除去する条件下で、１種または複数種の試薬で処理することができる。したがって、ブロック基および標識は、同一条件下で除去することができる。標識およびブロック基を除去すると、ポリヌクレオチドの３’末端は、鋳型依存的な様式でさらに伸長することができる。
【００５６】
例示的な可逆性ターミネーターヌクレオチドの構造を式Ｉに示す：
【００５７】
【化１】
2009542220.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、親水基、または疎水基を表し、
Ｂは、少なくとも１つの単素環、少なくとも１つの複素環（環外のヘテロ原子の有無にかかわらず）、もしくは少なくとも１つのアリール基、またはその組合せを含む核酸塩基を表し、
ＢＧは可逆性ブロック基を表し、
Ｚは、Ｏ、ＣＨ２、またはＳを表し、
【００５８】
【化２】
2009542220.tif 000003
は、単結合または二重結合を表す）。
【００５９】
いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、５’位に結合した少なくとも１、２、もしくは３個のリン酸基および／またはリン酸類似体を含むことができる。いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、標識を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＢＧは、それぞれ２’および３’位にあることができる。
【００６０】
式ＩのＢ基の限定しない例として、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、Ｎ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、ｉｓｏＣおよびｉｓｏＧが挙げられる。適当なＢ基の他の限定しない例には、米国特許第５４３２２７２号、同第６００１９８３号、同第６０３７１２０号、同第６１０４０４９６号、同第６３５７１６３号、同第６６１７１０６号、同第６９７７１６１号；米国特許公開第２００４０１０６１０８号、同第２００５００３７３９８号、同第２００６００７８９３６；ＥＰ１３５８３５２、ＥＰ１５９０４８２；ならびにＷＯ９２２０７０２、ＷＯ９２２０７０３、ＷＯ０２３３１２６およびＷＯ０４０６５５５０に開示されている核酸塩基が含まれる。したがって、当業者は、式ＩのＢ基は、配列特異的な形でポリヌクレオチドとハイブリダイズするのに適した、任意の天然に存在する核酸塩基または合成核酸塩基とすることができることを理解するだろう。
【００６１】
ブロック基（ＢＧ）は、式Ｉの３’可逆性ターミネーターヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの伸長を実質的に阻害するのに適した任意の部分とすることができる。ＢＧが伸長を阻害する機構は、それだけに限らないが、電荷（例えば、正電荷または負電荷）または立体阻害を含めた様々な方法によるものとすることができる。いくつかの実施形態では、ＢＧは、場合により、ポリヌクレオチドを、３’−５’エキソヌクレアーゼ、および／またはポリメラーゼの「校正活性」に対して実質的に耐性にすることができる。伸長を実質的に阻害することに加えて、式ＩのＢＧは可逆性である。本明細書で「可逆性」とは、ＢＧが実質的に除去されることによって、鋳型特異的な形でプライマーを伸長するのに適した３’末端を生じることができることを意味する。ＢＧの除去は、それだけに限らないが、アルカリホスファターゼなどの酵素を含めた、様々な方法および試薬を使用して達成することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＢＧはＳＯ３とすることができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＢＧは、Ｃ（Ｏ）Ｒ９（式中、Ｒ９は、Ｈ、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、またはその組合せを表す）とすることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＢＧは、式ＩＩを含むことができる：
【００６５】
【化３】
2009542220.tif 000004
（式中、
ＸがＯ、Ｓ、ＮＲ３、ＣＲ３Ｒ４、またはＳｉＲ３Ｒ４を表す場合、
Ｙは、ＣＲ５Ｒ６Ｒ７、ＳｉＲ５Ｒ６Ｒ７、ＯＲ５、ＳＲ５、またはＮＨＲ５を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ８、ＳＲ８、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、またはその組合せを表し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、Ｈ、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、またはその組合せから独立に選択される）。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＢＧは、式ＩＩＩを含むことができる：
【００６７】
【化４】
2009542220.tif 000005
（式中、
Ｘは、ＣＲ３Ｒ４Ｒ５、ＳｉＲ３Ｒ４Ｒ５、ＯＲ３、ＳＲ３、またはＮＨＲ３を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＮＨＲ６、ＳＲ６、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、またはその組合せを表し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｈ、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、またはその組合せから独立に選択される）。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＢＧは、リン酸（−ＰＯ４）とすることができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＢＧは、ＳＯ３とすることができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＢＧは、Ｃ（Ｏ）Ｒとすることができる。
【００７１】
ＢＧ基およびその等価物を合成する方法は、当技術分野で知られている。
【００７２】
本明細書に開示した可逆性ターミネーターは、場合により、少なくとも１つの標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、例えば、単素環、複素環、またはアリール基で（例えば、ピリミジンのＣ−５、シチジンのＮ−４、プリンのＮ−７、アデノシンのＮ−６、プリンのＣ−８、または当技術分野における別の結合部位を介して）、可逆性ターミネーターの核酸塩基（Ｂ）に付加することができる。いくつかの実施形態では、標識は、アミド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、炭素−炭素、または他の種類の共有結合を介して結合することができる。いくつかの実施形態では、標識は、可逆性ターミネーターヌクレオチドの糖部分（例えばリボース糖）、またはその類似体に結合することができる。いくつかの実施形態では、標識は、アミド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、炭素−炭素、または他の結合などによって、ＢＧ、例えば式ＩＩおよびＩＩＩのＢＧまたはリン酸に結合することができる。いくつかの実施形態では、標識は、本明細書で説明したリンカーを介して可逆性ターミネーターヌクレオチドに付加することができる。
【００７３】
様々な例示的な実施形態では、標識は、蛍光色素（例えば、ローダミン色素（例えば、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなど）、フルオレセイン色素（例えば、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭなど）、ハロフルオレセイン（ｈａｌｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）色素、シアニン色素（例えば、ＣＹ３、ＣＹ３．５、ＣＹ５、ＣＹ５．５など）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素（例えば、ＦＬ、５３０／５５０、ＴＲ、ＴＭＲなど）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素（例えば、４８８、５３２、５４６、５６８、５９４、５５５、６５３、６４７、６６０、６８０など）、ジクロロローダミン色素、エネルギー移動色素（例えば、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ１色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ２色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ３色素など）、ルシファー色素（例えば、ルシファーイエローなど）、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、オレゴングリーンなどを含む。他の例示的な色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、９版（２００３年）およびその最新版において提供されている。蛍光色素は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐ．／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｒｏｕｐ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含めた、様々な民間供給者から一般に容易に入手可能である。他の例示的な標識として、例えば、ビオチン、弱蛍光標識（Ｙｉｎら（２００３年）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９巻（７号）：３９３８頁；Ｂａｂｅｎｄｕｒｅら（２００３年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１７巻（１号）：１頁；およびＪａｎｋｏｗｉａｋら（２００３年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６巻（３号）：３０４頁）、非蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識（Ｗｉｌｓｏｎら（２００３年）Ａｎａｌｙｓｔ．１２８巻（５号）：４８０頁；Ｒｏｄａら（２００３年）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ１８巻（２号）：７２頁）、ラマン標識、電気化学的標識、生物発光標識（Ｋｉｔａｙａｍａら（２００３年）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７７巻（３号）：３３３頁；Ａｒａｋａｗａら（２００３年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１４巻（２号）：２０６頁；およびＭａｅｄａ（２００３年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｎａｌ．３０巻（６号）：１７２５頁）、および例えば、２００２年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／４２８４８４号に記載されているようなα−メチル−ＰＥＧ標識試薬が挙げられる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、標識は、放射性同位元素、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、２２Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、４２Ｋ、４５Ｃａ、５９Ｆｅ、１２５Ｉ、２０３Ｈｇなどを含む。いくつかの実施形態では、標識は、それだけに限らないが、重水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓ、Ｎ３、ＸＹ、ＣＨ３、ＳＰＯ４、ＢＨ３、ＳｉＹ３、Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ２Ｈ５）、Ｓｉ（ＣＨ３）（Ｃ２Ｈ５）２、Ｓｉ（Ｃ２Ｈ５）３、（ＣＨ２）ｎＣＨ３、（ＣＨ２）ｎＮＹ２、ＣＨ２ＣＯＮＹ２、（ＣＨ２）ｎＯＨ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、およびホスホロチオエート基（Ｘは、Ｏ、ＮＨ、ＮＹ、Ｓ、ＮＨＣ（Ｓ）、ＯＣＯ（ＣＨ）ｎＣＯＯ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ、ＯＳＯ２Ｏ、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＳ、ＯＣＯ（ＣＨ２）Ｓ，ＮＣ４Ｏ２Ｈ２Ｓ、ＯＰＯ（Ｏ−アルキル）、またはＯＰ（Ｏ−アルキル）であり、ｎは、１から２０の整数（両端を含む）であり、Ｙは、Ｈ、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化ポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化シリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ／ポリアミノ酸基、またはポリエチレングリコール基である）を含めた、少なくとも１つの質量修飾基を含むことができる。
【００７５】
非常に様々なリンカーは、場合により標識およびＢＧを可逆性ターミネーターヌクレオチドに連結するのに使用することができ、当業者に明らかとなろう。リンカーは、一般に、ポリヌクレオチド中への取込みに対して立体的および電子的に適した構造をしている。いくつかの実施形態では、リンカーとして、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、尿素、ウレタン、ヒドラジンまたは他の部分を挙げることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓｉ、Ｓなどから選択される、約１から約２５個の非水素原子を含むことができ、本質的に任意の組合せの例示的な基、例えば、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合、芳香族またはヘテロ芳香族結合などを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、炭素−炭素単結合およびカルボキサミドまたはチオエーテル結合の組合せを含む。いくつかの実施形態では、リンカーのより長い直鎖セグメントを利用することができ、最も長い直鎖セグメントは、一般的に、１個または複数個のヘテロ原子を含めて、約３から約１５個の間の非水素原子を含有する。
【００７６】
リンカー部分の限定しない例として、置換された（例えば、官能化された）または非置換の基、例えば、イミダゾール／ビオチンリンカー、ポリメチレン基、アリーレン基、アルキルアリーレン基、アリーレンアルキル基、アリールチオ基、アミドアルキル基、アルキニルアルキル基、アルケニルアルキル基、アルキル基、アルコキシル基、チオ基、アミノアルキル基、モルホリン誘導体化リン酸（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ペプチド核酸（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンなど）などが挙げられる。（例えば、米国特許第４７１１９５８号、同第５０４７５１９号、同第５１７５２６９号、同第５３２８８２４号、同第６３３９３９２号；および米国特許公開第２００２０１５１７１１号を参照されたい）。標識化およびリンカーの追加の例は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）に提供されている。
【００７７】
いくつかの実施形態では、適当なリンカーは、光開裂性（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）部分、例えば、２−ニトロベンジル部分、α置換２−ニトロベンジル部分（例えば、１−（２−ニトロフェニル）エチル部分）、３，５−ジメトキシベンジル部分、チオヒドロキサム酸、７−ニトロインドリン部分、９−フェニルキサンチル部分、ベンゾイン部分、ヒドロキシフェナシル部分、ＮＨＳ−ＡＳＡ部分などを含む。例示的な光開裂性リンカーは、米国特許公開第２００３００９９９７２号に記載されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、白金原子などの金属を含む（例えば、米国特許第５７１４３２７号を参照されたい）。いくつかの種々の長さのリンカーは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ／Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  （Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を含めて様々な供給者から市販されている。
【００７８】
いくつかの実施形態では、適当なリンカーは、断片化可能な（ｆｒａｇｍｅｎｔａｂｌｅ）リンカーとすることができる。本明細書で使用する「断片化可能なリンカー」とは、電子カスケード自己脱離反応（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｃａｓｃａｄｅ  ｓｅｌｆ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で断片化することができるリンカーを指す。様々な例示的な実施形態では、リンカーの断片化は、本明細書に開示した可逆性ターミネーターヌクレオチドからの標識および／またはＢＧの除去をもたらすことができる。断片化可能なリンカーの例は、米国特許公開第２００６０００３３８３号に開示されている。
【００７９】
いくつかの実施形態では、断片化可能なリンカーは、リンカー部分とトリガー部分を含む。リンカー部分、トリガー部分、ならびに任意選択の標識および／またはＢＧは、これらがそのそれぞれの機能を実施することを可能にする任意の方法でリンカー部分に連結することができる。トリガー部分は、特定のトリガー剤によって開裂または「活性化」することができる基質を含む。トリガー部分の活性化によって自発転位が開始され、これは、リンカーの断片化ならびに標識および／またはＢＧの放出をもたらす。いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドからの標識および／またはＢＧの放出は、閉環機構によって引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは脱離反応を介して断片化する。それだけに限らないが、１，４−、１，６−および１，８−脱離反応を含めた様々な脱離反応が、プロドラッグの設計において使用されており、本明細書に記載された組成物および方法における使用に適応することができる（例えば、ＷＯ０２０８３１８０、ＧｏｐｉｎらＡｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ｉｎｔ  Ｅｄ．３２巻：３２７〜３３２頁（２００３年）、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４１巻：５２９７〜５３０９頁（１９９８年）、ＦｌｏｒｅｎｔらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４１巻：３５７２〜３５８１頁（１９９８年）、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２巻：２４８５〜２４８９頁（１９９９年）、ＧｒｅｅｎｗａｌｄらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２巻：３６５７〜３６６７頁（１９９９年）、ｄｅ  ＧｒｏｏｔらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２巻：２３７１〜２３７６頁（２００２年）、ＧｈｏｓｈらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ４１巻：４８７１〜４８７４頁（２０００年）、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋらＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３巻：８５５〜８６９頁（２００２年）、ＭｉｃｈｅｌらＡｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ（編）２１巻：１５７〜１８０頁（２０００年）、ＤｉｎａｕｔらＣｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．１３８６〜１３８７頁（２００１年）、ＯｈｗａｄａらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２巻：２７７５〜２７８０頁（２００２年）、ｄｅ  ＧｒｏｏｔらＪ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．６６巻：８８１５〜８８３０頁（２００１年）、ＬｅｕらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２巻：３６２３〜３６２８頁（１９９９年）、ＳａｕｅｒｂｒｅｉらＡｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．３７巻：１１４３〜１１４６頁（１９９８年）、ＶｅｉｎｂｅｒｇらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１４巻：１００７〜１０１０頁（２００４年）、ＧｒｅｅｎｗａｌｄらＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１４巻：３９５〜４０３頁（２００３年）、およびＬｅｅらＡｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．４３巻：１６７５〜１６７８頁（２００４年）を参照されたい）。
【００８０】
トリガー部分を活性化する任意の手段を使用することができるが、ただし、トリガー部分を活性化するのに使用される手段が、検出可能な変化、例えば、蛍光の減少および／またはＢＧの除去および／またはプライマー伸長などを生じさせることができるという条件がある。活性化の特定の手段、したがってトリガー部分の選択は、特定の断片化反応ならびに他の要因にある程度依存し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、活性化は、トリガー部分の開裂に基づく。これらの実施形態では、トリガー部分は、化学試薬または開裂酵素によって開裂可能な開裂部位を含む。限定しない例示的な実施形態では、トリガー部分は、スルファターゼ（例えば、ＳＯ３およびその類似体）、エステラーゼ（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｒ９およびその類似体）、またはホスファターゼ（例えば、ＰＯ４およびその類似体）によって開裂可能な開裂部位を含むことができる。（ＰａｒｅｎｔらＣｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１９９７年；７巻（３号）：３８６〜３９１頁；ＥｌｌｉｓらＡｐｐｌｉｅｄ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２００２年；６８巻（１号）：３１〜３６頁；ＢｏｇａｅｒｔｓらＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９８年；１７巻（８号）：１６００〜１６０５頁；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９７２年；２０巻（７号）：５０７〜５１７頁）。具体的な例として、トリガー部分は、アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによって開裂可能な開裂部位を含むことができる。
【００８２】
トリガー部分は、開裂酵素の特異性、親和性および／または動態を促進する追加の残基および／または特徴をさらに含むことができる。特定の開裂酵素の必要条件に応じて、そのような開裂酵素の「認識部分」は、開裂部位を含むことができ、あるいは開裂部位は、認識部分の外部とすることができる。
【００８３】
トリガー部分の化学組成物は、他の要因の中でも、開裂酵素の必要条件に依存することになる。例えば、開裂酵素がホスファターゼである場合、トリガー部分は、特定のホスファターゼによって認識され、開裂されるリン酸またはリン酸類似体を含むことができる。開裂酵素がヌクレアーゼである場合、トリガー部分は、特定のヌクレアーゼによって認識され、開裂されるオリゴヌクレオチド（またはその類似体）を含むことができる。開裂酵素がグリコシダーゼである場合、トリガー部分は、特定のグリコシダーゼによって認識され、開裂される炭水化物を含むことができる（例えば、ＦｌｏｒｅｎｔらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４１巻：３５７２〜３５８１頁（１９９８年）、ＧｈｏｓｈらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ４１巻：４８７１〜４８７４頁（２０００年）、ＭｉｃｈｅｌらＡｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ（編）２１巻：１５７〜１８０頁（２０００年）、およびＬｅｕらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２巻：３６２３〜３６２８頁（１９９９年）を参照されたい）。リパーゼおよびホスファターゼなどのエストラーゼによって認識され、開裂される例示的な構造も周知であり、ＯｈｗａｄａらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２巻：２７７５〜２７８０頁（２００２年）、ＳａｕｅｒｂｒｅｉらＡｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．３７巻：１１４３〜１１４６頁（１９９８年）、ＧｒｅｅｎｗａｌｄらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ４３巻：４７５〜４８７頁（２０００年）、ＤｉｌｌｏｎらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１４巻：１６５３〜１６５６頁（１９９６年）、およびＧｒｅｅｎｗａｌｄらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４７巻：７２６〜７３４頁（２００４年）に開示されている構造を含む。プロテアーゼ／タンパク質分解酵素によって認識され、開裂される例示的な構造は、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４１巻：５２９７〜５３０９頁（１９９８年）、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚらＪ．  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２巻：２４８５〜２４８９頁（１９９９年）、ＧｒｅｅｎｗａｌｄらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４２巻：３６５７〜３６６７０頁（１９９９年）、ｄｅ  ＧｒｏｏｔらＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２巻：２３７１〜２３７６頁（２００２年）、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋらＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３巻：８５５〜８６９頁（２００２年）、およびｄｅ  ＧｒｏｏｔらＪ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．６６巻：８８１５〜８８３０頁（２００１年）に開示されている。触媒抗体によって認識され、開裂される例示的な構造は、ＧｏｐｉｎらＡｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．４２巻：３２７〜３３２頁（２００３年）、ＤｉｎａｕｔらＣｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．１３８６〜１３８７頁（２００１年）に開示されている。
【００８４】
リンカー部分、トリガー部分、ならびに任意選択の標識およびＢＧは、これらがそのそれぞれの機能を実施することを可能にする任意の方法でリンカー部分に連結される。いくつかの実施形態では、トリガー部分、標識および／またはＢＧはそれぞれ、他と独立して、リンカー部分に直接連結される。他の実施形態では、トリガー部分、標識および／またはＢＧは、他と独立して、１つまたは複数の任意選択の連結を介してリンカー部分に間接的に連結することができる。任意選択の連結は、脱離基を含むことができ、これは、基質化合物が断片化すると、それに結合している部分とともにリンカーのバックボーンから放出される。例えば、いくつかの実施形態では、標識は、脱離基を含む連結を介してリンカー部分のバックボーンに結合することができ、一方、ＢＧは、安定な連結、例えば、断片化反応後にリンカーのバックボーンから解離しない連結を介して、リンカー部分のバックボーンに結合することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、トリガー部分は、リンカー部分としても役割を果たす。これらの実施形態では、特定のトリガー剤によるトリガー部分の開裂により、リンカーの断片化ならびに標識および／ＢＧの放出ももたらされる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、トリガー部分はＢＧとしても役割を果たす。これらの実施形態では、特定のトリガー剤によるトリガー部分の開裂により、リンカーの断片化およびＢＧの除去がもたらされる。したがって、これらの実施形態では、リンカーの断片化およびＢＧの除去は、１回のステップで同一の条件下で起こり得る。結果として、断片化可能なリンカーに結合した標識、およびＢＧは、１回のステップで同一の条件下で除去することができる。ＢＧとしても役割を果たすことができるトリガー部分の例には、それだけに限らないが、−ＰＯ４、ＳＯ３、およびＣ（Ｏ）Ｒ９が含まれる。
【００８７】
断片化可能なリンカーがシトシン塩基に付加されている、リン酸ＢＧおよびトリガー部分を含む可逆性ターミネーターヌクレオチドの例を図１に示す。断片化可能なリンカー上のリン酸は、トリガー部分として役割を果たす。リン酸トリガー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒｉｇｇｅｒ）部分の開裂により、リンカーの断片化およびシトシン塩基からの色素の除去が生じる。リボース糖の２’位でのリン酸ＢＧの開裂により、３’位での追加のヌクレオチドの付加が可能になる。断片化可能なリンカーが蛍光色素を含む、リン酸トリガー部分を含む断片化可能なリンカーの他の例を、図２および図３に示す。これらおよび他の例示的な断片化可能なリンカーを作製する方法は、米国特許公開第２００６０００３３８３号に開示されている。
【００８８】
いくつかの実施形態では、リン酸ＢＧおよびトリガー部分は、アルカリホスファターゼ（「ＡＬＰ」）（オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ［アルカリ性最適］；（ＥＣ３．１．３．１））によって開裂することができる。一般にＡＬＰは、ホスホモノエステラーゼ反応を触媒する、ホモダイマー非特異的金属酵素である。（Ｃｏｌｅｍａｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．１９９２年；２１巻：４４１〜４８３頁；ＨｏｌｔｚらＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９年；４６２巻：７〜１１頁；ＨｏｌｔｚらＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９年；２７４巻：８３５１〜８３５４頁；ＫｉｍらＣｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ１９８９年；１８６巻；１７５〜１８８頁；ＭａｎｅｓらＧｅｎｏｍｉｃｓ１９９０年；８巻：５４１〜５５４頁；ＭｃＣｏｍｂらＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ１９７９年Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ＴｒｏｗｓｄａｌｅらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｓａｃ  Ｔｒａｎｓ．１９９０年；１８巻：１７８〜１８０頁）。ＡＬＰについての反応条件は、当技術分野で周知であり、開示した方法において使用するのに適したＡＬＰの限定しない例として、エビアルカリホスファターゼ（ｄｅ  ＢａｃｋｅｒらＪ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００２年５月１７日；３１８巻（５号）：１２６５〜７４頁；ＯｌｓｅｎらＣｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９１年９９Ｂ巻：７５５〜６１頁）、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＷｅｉｓｓｉｇらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９３年；２９０巻：５０３〜５０８頁）、およびパイロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）（ＥｒａｕｓｏらＡｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３年；１６０巻：３３８〜３４９頁；ＺａｐｐａらＡｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１年１０月；６７巻（１０号）：４５０４〜１１頁）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）種（ＧｏｎｚａｌｅｚらＥｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ１９９８年；２巻：１２３〜１３０頁）、サーマトガ・ネオポリタナ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）（ＤｏｎｇらＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年；２１巻：３３５〜３４０頁）、テルムス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＧＫ２４（ＰａｒｋらＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９年；１８０巻：１３３〜１３９頁）、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＰａｎｔａｚａｋｉらＡｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年；７５巻：２４９〜２５９頁）、ハロアルキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）（ＧｏｌｄｍａｎらＪ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０年；１７２巻：７０６５〜７０７０頁）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＢｏｎｅｔらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．１９９４年；３４巻：１１０９〜１１２０頁；ＦｉｔｔらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９７９年；１８１巻：３４７〜３５３頁）、プレボテロ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌｏ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＡｎｓａｉらＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８年；４２８巻：１５７〜１６��頁）、バチルス（Ｈｕｌｅｔｔ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６年；１９巻：９３３〜９３９頁；ＭｏｒｉらＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１９９９年；２９巻：２３５〜２３９頁；ＳｈａｒｉｐｏｖａらＢｉｏｃｈｅｍ．（Ｍｏｓｃｏｗ）１９９８年；６３巻：１１７８〜１１８２頁；ＳｈａｒｉｐｏｖａらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．１９９６年；３８巻：７５３〜７６１頁；ＳｐｅｎｃｅｒらＪ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８１年；１４５巻：９２６〜９３３頁）、ビブリオ（ＨａｕｋｓｓｏｎらＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０００年；２７巻：６６〜７３頁）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｃｏｌｅｍａｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．１９９２年；２１巻：４４１〜８３頁；ＤｅｒｍａｎらＪ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１年１２月；１７３巻（２３号）：７７１９〜２２頁；ＨｕｌｅｔｔらＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１年；２６６巻：１０７７〜１０８４頁；ＪａｎｅｗａｙらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３年；３２巻：１６０１〜１６０９頁；Ｋａｎｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５年；６巻：４９４〜５００頁；ＫａｒａｍｙｓｈｅｖらＪ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８年４月１０日；２７７巻（４号）：８５９〜７０頁；ＫｉｍらＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９８年；２０巻：２０７〜２１０頁；ＭｕｒｐｈｙらＪ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５年；２５３巻：６０４〜６１７頁；ＭｕｒｐｈｙらＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３年；２６８巻：２１４９７〜２１５００頁）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ＹａｍａｓｈｉｔａらＩｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９０年；５８巻：２８８２〜２８８７頁）、タイセイヨウマダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）（ＡｓｇｅｉｒｓｓｏｎらＣｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５年；１１０Ｂ巻：３１５〜３２９頁）、アミメノコギリガザミ（Ｓｃｙｌｌａ  ｓｅｒｒａｔａ）（Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００年；３２巻：８７９〜８８５頁）、ヒト（ＢｅｒｇｅｔらＰＮＡＳ  ＵＳＡ１９８７年；８４巻：６９５〜６９８頁；ＷｅｉｓｓらＰＮＡＳ  ＵＳＡ１９８６年；８３巻：７１８２〜７１８６頁）、昆虫（Ｅｇｕｃｈｉ．  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５年；１１１Ｂ巻：１５１〜１６２頁）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（ＭｏｒａｌｅｓらＢｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．２０００年；３３巻：９０５〜９１２頁）、南極株（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎ）ＴＡＢ５（ＲｉｎａらＥｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２０００年；２６７巻：１２３０〜１２３８頁）から単離されたＡＬＰが挙げられる。
【００８９】
可逆性ターミネーターヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを分析または検出する、事実上任意の方法において使用することができる。様々な限定しない例では、適当なポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖あるいはその組合せ、直鎖または環状、染色体または遺伝子あるいはその一部または断片、制御ポリヌクレオチド、例えば、プラスミドＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、コンストラクトもしくはコンストラクトのライブラリー由来の（例えば、ＹＡＣ、ＢＡＣ、またはＰＡＣライブラリー由来の）ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｖＲＮＡ）またはｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー由来の制限酵素断片とすることができる。当技術分野で知られているように、ｃＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型の逆転写によって産生される一本鎖または二本鎖のＤＮＡである。したがって、いくつかの実施形態には、ＲＮＡ鋳型を逆転写してｃＤＮＡにするのに適した、逆転写酵素および１つまたは複数のプライマーが含まれる。そのような「ＲＴ」反応を実施するための反応、試薬および条件は、当技術分野で知られている（例えば、Ｂｌａｉｎら、１９９３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．５巻：２３５８５〜２３５９２頁；Ｂｌａｉｎら、１９９５年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６９巻：４４４０〜４４５２頁；ＰＣＲ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６１〜６３頁、８０〜８１頁、（Ｂｕｒｋｅ編、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ１９９６年）；Ｇｕｂｌｅｒら、１９８３年、Ｇｅｎｅ２５巻：２６３〜２６９頁；Ｇｕｂｌｅｒ、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２巻：３３０〜３３５頁；Ｓｅｌｌｎｅｒら、１９９４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄ．４９巻：４７〜５８頁；Ｏｋａｙａｍａら、１９８２年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．２巻：１６１〜１７０頁；および米国特許第５３１０６５２号、同第５３２２７７０号、同第６３０００７３号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドとして、単一のポリヌクレオチド（例えば、染色体、プラスミド）を挙げることができ、これから興味対象の１つまたは複数の異なる配列をクローン的に増幅し、分析することができる。クローン増幅の方法は、＊米国出願第１１／３７７７６３号に開示されている。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、並行した形で分析することができる。例えば、別個の、または単離したポリヌクレオチドは、多ウェルプレートのウェル中で、表面の別個の領域または隔離部（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）へ結合させる結果、並行して分析することができる。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１００、５００、１０００、１００００、５００００、１０００００、３０００００、５０００００、または１００００００のポリヌクレオチドを並行して分析することができる。一般に、並行反応により、個々のポリヌクレオチドに関連付けるまた結びつけることができる、別個の検出可能なシグナルが生じる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成による配列決定技法に基づいて、可逆性ターミネーターヌクレオチドを使用して配列決定することができる。合成による配列決定技法では、段階的様式で、核酸の制御合成（例えば、プライマー伸長）およびそれぞれの取り込まれた可逆性ターミネーターヌクレオチドの検出が使用される。例えば、いくつかの実施形態では、プライマーは、それぞれスペクトル的に分解可能な蛍光色素およびポリメラーゼで標識された４つの可逆性ターミネーターヌクレオチド三リン酸の存在下で表面に固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。配列決定プライマーの３’末端で、第１の可逆性ターミネーターが取り込まれることにより、さらなる伸長が防止される。取り込まれた可逆性ターミネーターを検出するために、取り込まれなかった可逆性ターミネーターが洗い流され、取り込まれた可逆ターミネーターは、その蛍光標識によって検出される。伸長と検出のさらなるサイクルを可能にするために、取り込まれた可逆ターミネーターから標識とＢＧが除去される。リン酸ＢＧおよび可逆性ターミネーターに対するリン酸トリガー部分を含む断片化可能なリンカーを使用する実施形態では、ＢＧおよび標識は、上述したように、エビアルカリホスファターゼなどのアルカリホスファターゼを使用して同一の条件下で除去することができる。したがって、同一条件下で標識およびＢＧを効率的に除去するために、酵素的反応を使用することができる。取り込まれた可逆ターミネーターから標識およびＢＧを除去した後、４つの可逆性ターミネーターヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼを再導入する前に、アルカリホスファターゼを不活化する、または洗い流すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、エビアルカリホスファターゼは、６５℃で１５分間インキュベートすることによって不活化することができる。
【００９２】
開示した方法を実行することにおいて、分子生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来の技法を使用することができる。これらの技法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ巻、１９９７年（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ編）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩおよびＩＩ巻、１９８５年（Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４年（Ｍ．  Ｌ．  Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８５年、（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、１９８４年（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８６年（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、１９８６年（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ、１９８４年、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、１９８７年（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５４巻および１５５巻（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、ならびにＷｕ編）に開示されている。
【００９３】
ポリヌクレオチドを共有結合または非共有結合のいずれかにより固体担体または表面に結合させる方法は、当技術分野で周知である。固体担体は、それだけに限らないが、プラスチック、ガラス、セラミック、金属、樹脂、および膜のうちの任意の１つまたは複数を含めた、様々な材料を含むことができる。固体担体の例示的な種類として、それだけに限らないが、プレート、スライド、ビーズ、マイクロビーズ、ウィスカー、繊維、コーム、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック、自己集合単層などが挙げられる。
【００９４】
ポリヌクレオチドは、共有結合、例えば、カップリング剤との接合などによって、または非共有結合、例えば、静電相互作用、水素結合もしくは抗体−抗原カップリングなどによって、またはその組合せによって固体担体に結合することができる。例示的なカップリング剤として、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ／ＩｇＧ抗体Ｆｃ断片、およびストレプトアビジン／プロテインＡキメラ（参照により組み込まれている、Ｓａｎｏら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９巻：１３７８頁）、またはこれらの作用剤の誘導体もしくは組合せが挙げられる。核酸は、光開裂性結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、またはこれらの結合の組合せによって固体担体に結合することができる。核酸は、場合により、選択的に解放できる結合、例えば、４，４’−ジメトキシトリチルまたはその誘導体などによっても固体担体に結合される。有用であると判明した誘導体として、３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−ヒドロキシメチル安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−クロロメチル−安息香酸、およびこれらの酸の塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、核酸と固体担体の間のスペーサー部分を介して固体担体に結合することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは開裂可能な結合を介して固体担体に結合することができる。開裂可能な結合は、例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴアクリルアミド、オリゴエチレングリセロール、約６から２０個の間の炭素原子のアルキル鎖、およびその組合せを含めて、ポリヌクレオチドと固体担体の間に開裂可能な化学部分を結合させることによって作製することができる。これらの部分は、例えば、添加される化学剤、電磁放射、または酵素を用いて開裂することができる。酵素によって開裂可能な例示的な結合には、プロテアーゼによって開裂することができるペプチド結合およびヌクレアーゼによって開裂することができるリン酸ジエステル結合が含まれる。
【００９６】
化学剤、例えば、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＤＴ）および他の還元剤により、ジスルフィド結合が開裂される。有用となり得る他の作用剤として、酸化剤、水和剤、および他の選択的に活性な化合物が挙げられる。電磁照射、例えば、紫外光、赤外光、および可視光により、光開裂性結合が開裂される。結合は、例えば、熱処理もしくは酵素的処理、または可逆性化学結合もしくは磁気的結合を使用して可逆性にすることもできる。解放および再結合は、磁場または電場を使用して実施することができる。
【００９７】
様々な核酸ポリメラーゼを、配列決定および本明細書に記載した他の方法において使用することができる。様々な例示的な実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼまたは熱分解性ポリメラーゼとすることができる。適当な熱安定性ポリメラーゼには、それだけに限らないが、テルムス・アントラニキアニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ）、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、テルムス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、テルムス・チリアロフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルムス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、テルムス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、テルムス・イグニテラエ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）、テルムス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、テルムス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ）、テルムス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、テルムス・ルベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ）、テルムス・スコトヅクツス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、テルムス・シルヴァヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）、テルムス種Ｚ０５、テルムス種ｓｐｓ１７、高度好熱菌、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、アナエロセラム・サーモフィラム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パイロコッカス・ウォエセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、およびサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）から単離されたポリメラーゼが含まれる。例えば、ポリメラーゼは、酵素のへリックスＯにおいてＦからＹへの変異を場合により欠いており、またはさもなければ、酵素による３’−デオキシヌクレオチドの取込みを増強する変異を欠いている。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは熱分解性とすることができ、例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼなどである。
【００９８】
本明細書に記載した方法に適した、市販されているポリメラーゼの限定しない例として、それだけに限らないが、ＴａｑＦＳ（登録商標）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＣＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、Ｋｅｎｔａｑｌ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、Ｔａｑｕｅｎａｓｅ（ＳｃｉｅｎＴｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ｂｓｔポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｅａｄｅｒ（商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＰＦＵＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ−１ポリメラーゼ、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（商標）１．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＳＥＱＵＥＮＡＳＥ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは修飾することができ、これは、本明細書に開示した可逆性ターミネーターヌクレオチドの取込みを増強することができる。例示的な修飾ポリメラーゼは、米国特許第４８８９８１８号、同第５３７４５５３号、同第５４２００２９号、同第５４５５１７０号、同第５４６６５９１号、同第５６１８７１１号、同第５６２４８３３号、同第５６７４７３８号、同第５７８９２２４号、同第５７９５７６２号、同第５９３９２９２号、および米国特許公開第２００２００１２９７０号、同第２００４０００５５９９号に開示されている。修飾ポリメラーゼの限定しない例として、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＺＯ５Ｒポリメラーゼ、および米国特許公開第２００５００３７３９８号に開示されているＧ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。修飾ポリメラーゼの生成は、多くの分子生物学における従来の技法および本明細書に記載され、当技術分野で知られている組換えＤＮＡを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、２’−リン酸をブロックしないことにより、２’−ヒドロキシル、すなわちリボヌクレオチドが生成される場合、ＮＴＰならびにｄＮＴＰを取り込む、米国特許第５９３９２９２号に記載されたものなどのポリメラーゼ変異体を使用することができる。
【０１００】
本明細書に開示した方法の生成物は、専門家の自由裁量で選択することができる、多種多様の方法によって分析することができる。分析方法として、それだけに限らないが、様々なポリマー（例えば、分離ポリマー（例えば、ＰＯＰ−４（商標）、ＰＯＰ−６（商標）、またはＰＯＰ−７（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、直鎖ポリアクリルアミド（ＬＰＡ：Ｋｌｅｐａｒｎｉｋら、２００１年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２２巻（４号）：７８３〜８頁；Ｋｏｔｌｅｒら、２００２年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２３巻（１７号）：３０６２〜７０頁；Ｍａｎａｂｅら、１９９８年Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１９巻：２３０８〜２３１６頁））を使用するゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ：例えば、３７３０  ＤＮＡ分析装置、３７３０ｘ１  ＤＮＡ分析装置、３１００−Ａｖａｎｔ遺伝子分析装置、および２７０Ａ−ＨＴ  キャピラリー電気泳動システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））（例えば、米国特許第ＲＥ３７９４１号、同第５３８４０２４号、同第６３７２１０６号、同第６３７２４８４号、同第６３８７２３４号、同第６３８７２３６号、同第６４０２９１８号、同第６４０２９１９号、同第６４３２６５１号、同第６４６２８１６号、同第６４７５３６１号、同第６４７６１１８号、同第６４８５６２６号、同第６５３１０４１号、同第６５４４３９６号、同第６５７６１０５号、同第６５９２７３３号、同第６５９６１４０号、同第６６１３２１２号、同第６６３５１６４号、および同第６７０６１６２号を参照されたい）、レーザー誘起蛍光（例えば、米国特許第５９４５５２６号、同第５８６３７２７号、同第５８２１０５８号、同第５８００９９６号、同第５３３２６６６号、同第５６３３１２９号、および同第６３９５４８６号を参照されたい）によるクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、またはペーパークロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、化学発光、質量分析法（例えば、米国特許第６２２５４５０号および同第５１０４１２号を参照されたい）、マイクロキャピラリー電気泳動法が挙げられる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら、２００４年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６巻：５２４９〜５２５６頁；Ｅｒｔｌら、２００４年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６巻：３７４９〜３７５５頁；Ｈａａｂら、１９９９年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７１巻：５１３７〜５１４５頁（１９９９年）；Ｋｈｅｔｅｒｐａｌら、１９９９年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７１巻：３１Ａ〜３７Ａ頁；Ｌａｇａｌｌｙら、２０００年、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ６３巻：１３８〜１４６頁；Ｌａｇａｌｌｙら、２００１年、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．７３巻：５６５〜５７０頁；Ｌａｇａｌｌｙら、２００３年、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  ＰＣＲ−ＣＥ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ，  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ２巻、Ｎｏｒｔｈｒｕｐら（編）１２８３〜１２８６頁；Ｌｉｕら、１９９９年、Ａｎａ��．  Ｃｈｅｍ．７１巻：５６６〜５７３頁；Ｍｅｄｉｎｔｚら、２０００年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２１巻：２３５２〜２３５８頁；Ｍｅｄｉｎｔｚら、２００１年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１巻：４１３〜４２１頁；Ｐａｅｇｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：４２〜５０頁；Ｓｃｈｅｒｅｒら、１９９９年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２０巻：１５０８〜１５１７頁；Ｓｈｉら、１９９９年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７１巻：５３５４〜５３６１頁；Ｗｅｄｅｍａｙｅｒら、２００１年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３０巻：１２２〜１２８頁；米国特許第６７８７０１５号、同第６７８７０１６号；米国出願第２００２０１６６７６８号、同第２００２０１９２７１９号、同第２００２００２９９６８号、同第２００３００３６０８０号、同第２００３００８７３００号、同第２００３０１０４４６６号、同第２００４００４５８２７号、同第２００４００９６９６０；ＥＰ１３０５６１５；およびＷＯ０２／０８７４４を参照されたい）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示した標識によって生成される検出可能なシグナルは、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、増倍型ＣＣＤ、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光学センサー、走査検出器などを使用して検出することができる。これらなどの検出器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含めた様々な商業的供給源から容易に入手可能である。本発明の方法を実行するのに使用する検出システムは、例えば、Ｓｋｏｏｇら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、５版、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８年）およびＣｕｒｒｅｌｌ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２０００年）にさらに記載されている。
【０１０２】
本明細書に開示した方法において使用されるプライマー（例えば、配列決定プライマー）は、一般に、反応条件下で、鋳型特異的合成を刺激するために十分に長くすべきである。プライマーの正確な長さは、それだけに限らないが、プライマーとポリヌクレオチドの間の所望のハイブリダイゼーション温度、異なる標的ポリヌクレオチド配列の複雑性、塩濃度、イオン強度、ｐＨおよび他の緩衝液条件、ならびにプライマーおよびポリヌクレオチドの配列を含めた、多くの要因に依存し得る。特定の用途に適したプライマーの長さおよび配列を選択する技量は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ９．５０〜９．５１、１１．４６、１１．５０（２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ１０．１〜１０．１０（３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするのに適した、約１５から約３５個のヌクレオチドを含有し、ＤＮＡ合成に適した基質を形成するが、プライマーは、より多い、またはより少ないヌクレオチドを含有してもよい。より短いプライマーは、標的配列と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに、一般により低い温度で済む。ポリヌクレオチドのアニールする能力は、ハイブリッド複合体の融解温度（「Ｔｍ」）によって決定することができる。Ｔｍは、ポリヌクレオチド鎖の５０％およびその完全な相補体が二本鎖ポリヌクレオチドを形成する温度である。したがって、選択されたポリヌクレオチドについてのＴｍは、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす（ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｆｆｅｃｔ）要因によって異なる。熱サイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を行ういくつかの実施形態では、プライマーは、約６０から７５℃の範囲で融解温度（「Ｔｍ」）を有するように設計することができる。この範囲内の融解温度は、プライマー伸長の開始時に、プライマーが依然としてアニールされており、または標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしていることを保証する傾向がある。プライマー伸長反応に使用される実際の温度は、他の要因の中でも、例えば、プライマーの濃度に依存し得る。例示的な実施形態における、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼを用いて実施される反応については、プライマーは、約６０から約７８℃、または約５５から約７０℃の範囲でＴｍを有するように設計することができる。異なるプライマーの融解温度は、異なる場合があるが、代替の実施形態では、この温度は、すべておよそ同じであるべきであり、すなわち、例えば、並行反応における各プライマーのＴｍは、約５℃以下の範囲内とすることができる。様々なプライマーのＴｍは、当技術分野で周知の融解技法を利用して経験的に求めることができる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ１１．５５���１１．５７（２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。あるいは、プライマーのＴｍは計算することができる。プライマーのＴｍを計算するための多数の参考文献および補助資料が、当技術分野で利用可能であり、これらには、例として、限定することなく、ＢａｌｄｉｎｏらＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１６８巻：７６１〜７７７頁；Ｂｏｌｔｏｎら、１９６２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ４８巻：１３９０頁；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８３巻：８８９３〜８８９７頁；Ｆｒｅｉｅｒら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８３巻：９３７３〜９３７７頁；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５巻：７８４０〜７８４６頁；Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ３６巻：１１９〜１２８頁；Ｏｓｂｏｒｎｅ、１９９１年、ＣＡＢＩＯＳ８巻：８３頁；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８巻：６４０９〜６４１２頁（正誤表、１９９１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９巻：６９８頁）；Ｒｙｃｈｌｉｋ．  Ｊ．  ＮＩＨ  Ｒｅｓ．６巻：７８頁；ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ９．５０〜９．５１、１１．４６〜１１．４９（２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ１０．１〜１０．１０（３版Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ、１９９８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９５巻：１４６０〜１４６５頁；Ｓｕｇｇｓら、１９８１年、Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら編）、６８３〜６９３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｗｅｔｍｕｒ、１９９１年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６巻：２２７〜２５９頁が含まれ、その開示は参照により組み込まれている。これらの方法のいずれも、プライマーのＴｍを求めるのに使用することができる。
【０１０３】
当業者が理解するように、一般に、各鎖について同一の配列を有するＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの相対的安定性、したがってＴｍは、異なる場合がある。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは最も安定であり（最高の相対Ｔｍ）、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、最も安定でない（最低の相対Ｔｍ）。したがって、いくつかの実施形態では、プライマーを設計する場合、上述したものに加えて、考慮する別の要因は、プライマーおよび標的ポリヌクレオチドの構造である。例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドが逆転写されることによって、ｃＤＮＡを産生する実施形態では、逆転写反応に関するＤＮＡプライマーの適合性の判定は、プライマーのＴｍへのＲＮＡポリヌクレオチドの効果を含むべきである。様々なハイブリッドのＴｍは、上述したように経験的に求めることができるが、様々なハイブリッドのＴｍを計算する方法の例は、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ９．５１（２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）で見出される。
【０１０４】
開示した方法に有用なプライマーの配列は、標的ポリヌクレオチドの領域に対して実質的に相補的であるように設計される。本明細書で「実質的に相補的な」とは、プライマーの配列が、反応で使用される濃度、ならびに温度および条件下で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるのに十分な相補性を含むことを意味する。
【０１０５】
本明細書に記載した組成物および試薬は、梱包してキットにすることができる。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の可逆性ターミネーターヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、それぞれの可逆性ヌクレオチドは、標識（例えば、蛍光色素、放射性同位元素、質量修飾基など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、標識は、断片化可能なリンカーによって可逆性ターミネーターヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、可逆性ターミネーターヌクレオチドのＢＧおよびトリガー部分は、アルカリホスファターゼなどの酵素の作用によって、同一の条件下で除去することができる。したがって、いくつかの実施形態では、キットは、トリガー部分を活性化し、可逆性ターミネーターヌクレオチドからＢＧを除去するのに適したトリガー剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、それだけに限らないが、本明細書に記載したような修飾ポリメラーゼを含めたポリメラーゼを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の配列決定プライマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、配列決定に適した鋳型ポリヌクレオチドをさらに含むことができ、これは、表面または固体担体に場合により結合することができる。いくつかの実施形態では、キットは、専門家の自由裁量で選択される、配列決定反応などの反応を実施するのに適した試薬を含む、１つまたは複数の反応コンパートメント含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の配列決定試薬を含む、１つまたは複数の反応コンパートメントを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットの成分は、それだけに限らないが、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（すなわち、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キット）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（すなわち、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（商標）サイクル配列決定キット）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（すなわち、ＤＹＥｎａｍｉｃ直接色素−プライマーサイクル配列決定キット）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（すなわち、ＣｙｃｌｅＲｅａｄｅｒ（商標）ＤＮＡ配列決定キット）、Ｂｉｏｎｅｘｕｓ  Ｉｎｃ．（すなわち、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＤＮＡ配列決定キット）より入手可能なもの、およびＵＳＢサイクル配列決定キット（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）サイクル配列決定キット）を含めた、市販のキットからの１つまたは複数の試薬とともに使用することができる。
【０１０６】
キットに含められる様々な成分は、別々の容器に一般に入っているが、いくつかの実施形態では、１種または複数種の成分は、同じ容器中に存在することができる。さらに、キットは、任意の組合せの本明細書に記載した組成物および試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、開示した方法を実施するために必要であるか、または任意選択であり得る、追加の試薬を含むことができる。そのような試薬として、それだけに限らないが、緩衝液、分子サイズ標準、対照ポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【０１０７】
本願では、単数形の使用には、特に別段の指定のない限り、複数形が含まれる。本明細書に使用した節の見出しは、編集目的のためだけであり、何らかの方法で記載した主題を限定するものとして解釈されない。本教示は、様々な実施形態とともに説明されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。逆に、本教示は、当業者によって理解されることになるように、様々な代替物、改変物、および等価物を包含する。
【０１０８】
本願に引用したすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願および他の文献が、すべての目的に対して参照により組み込まれることを個々に示したのと同じ程度に、すべての目的に対してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。様々な具体的な実施形態を例示し、説明してきたが、本発明（複数も）の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されよう。
【図１】
2009542220.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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