(57)【要約】本発明は、IL-17AおよびIL-17Fのアンタゴニストに関する。本発明のアンタゴニストは、IL-17RC単独またはIL-17RCおよびIL-17RAの双方(「IL-17RC/IL-17RA」)に基づく。このようなアンタゴニストは、IL-17F、IL-17A、またはIL-17AおよびIL-17Fの双方の活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するのに役立つ。IL-17AおよびIL-17Fは、炎症過程およびヒト疾患に関与するサイトカインである。IL-17RAはIL-17Aの受容体であり、IL-17RCはIL-17AおよびIL-17F双方の共通受容体である。本発明は、可溶性IL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストならびにその使用方法を含む。2009510093.tif 000043
2009510093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-17RA(配列番号:21)由来の少なくとも1つのエキソンおよびIL-17RC由来の少なくとも1つのエキソンを含む単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項２】
IL-17RCのポリペプチド配列が、配列番号:2、配列番号:166、配列番号:4、および配列番号:24からなる群より選択される、請求項1記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項３】
可溶性受容体がIL-17Fに結合する、請求項1記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項４】
さらにIL-17Aに結合する、請求項3記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項５】
IL-17FおよびIL-17Aの双方に特異的に結合する、請求項1記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号:175および配列番号:180からなる群より選択されるポリペプチドをさらに含む、請求項1記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項７】
ペグ化をさらに含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
IL-17RCのエキソン8〜16(配列番号:2のアミノ酸残基193〜447)を含む単離された可溶性ポリペプチドであって、IL-17AおよびIL-17Fに特異的に結合する可溶性ポリペプチド。
【請求項９】
少なくともIL-17RAのエキソン1をさらに含む、請求項8記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１０】
IL-17RAのエキソン1〜6を含む、請求項8記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１１】
図1に示すポリペプチドを含む、請求項8記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号:175および配列番号:180からなる群より選択されるポリペプチドをさらに含む、請求項8記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１３】
ペグ化をさらに含む、請求項8記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号:158のアミノ酸残基1〜458を含む単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号:158を含む、請求項14記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号:158のアミノ酸残基1〜458からなる、請求項14記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号:158からなる、請求項15記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１８】
ペグ化をさらに含む、請求項14記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項１９】
ペグ化をさらに含む、請求項15記載の単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号:2のアミノ酸残基193〜276、配列番号:166のアミノ酸残基208〜291、配列番号:2のアミノ酸残基277〜370、配列番号:166のアミノ酸残基292〜385、配列番号:2のアミノ酸残基371〜447、および配列番号:166のアミノ酸残基386〜462からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号:160、配列番号:162、および配列番号:164からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項20記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:78、配列番号:82、配列番号:86、配列番号:90、配列番号:94、配列番号:98、配列番号:102、配列番号:106、配列番号:110、配列番号:114、配列番号:118、配列番号:122、配列番号:140、および配列番号:152からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
ペグ化をさらに含む、請求項22記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
以下の段階を含む、ポリペプチドに対する抗体を作製する方法：配列番号:160、配列番号:162、および配列番号:164からなる群より選択されるポリペプチドを動物に接種する段階であって、ポリペプチドが動物において抗体を産生するように免疫応答を誘発する段階；ならびにIL-17RCポリペプチドに特異的に結合し、IL-17Aおよび/またはIL-17Fの活性を減少させる抗体を動物から単離する段階。
【請求項２５】
作製された抗体が、IL-17Aおよび/またはIL-17Fの炎症誘発活性を減少させる、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
作製された抗体が、IL-17Aおよび/またはIL-17FとIL-17RCまたはIL-17RAとの相互作用を中和する、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
抗体による中和が、インビトロでの細胞に基づく中和アッセイにおいてIL-17Aおよび/またはIL-17Fの中和を示すことによって測定される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
作製された抗体が、IL-17AおよびIL-17Fの双方の炎症誘発活性を減少させる、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
作製された抗体が、IL-17AおよびIL-17Fの双方とIL-17RCとの相互作用を中和する、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
抗体による中和が、インビトロでの細胞に基づく中和アッセイにおいてIL-17AおよびIL-17Fの双方の中和を示すことによって測定される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
炎症を有する哺乳動物に、炎症を軽減するのに十分な量の請求項1、8、14、または15のいずれか一項記載の可溶性ポリペプチドを投与する段階を含む、IL-17A誘発またはIL-17F誘発炎症を軽減するまたは阻害する方法。
【請求項３２】
炎症を有する哺乳動物に、炎症を軽減するのに十分な量の請求項1、8、14、または15のいずれか一項記載の可溶性ポリペプチドを投与する段階を含む、IL-17A誘発およびIL-17F誘発炎症を軽減する方法。
【請求項３３】
以下の段階を含む、IL-17AまたはIL-17Fが役割を果たす炎症性疾患に罹患した哺乳動物を治療する方法：a) 炎症が軽減されるようにIL-17AまたはIL-17Fのアンタゴニストを哺乳動物に投与する段階であって、アンタゴニストが請求項1記載の可溶性ポリペプチドを含み、IL-17AまたはIL-17Fの炎症活性が減少する段階。
【請求項３４】
疾患が喘息である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
疾患がIBSである、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
疾患が、内毒素血症、敗血症、毒性ショック症候群、または感染症を含む急性炎症性疾患である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
以下の段階を含む、IL-17AおよびIL-17Fが役割を果たす炎症性疾患に罹患した哺乳動物を治療する方法：a) 炎症が軽減されるようにIL-17AおよびIL-17Fのアンタゴニストを哺乳動物に投与する段階であって、アンタゴニストが請求項1記載の可溶性ポリペプチドを含み、IL-17AおよびIL-17Fの炎症活性が減少する段階。
【請求項４１】
疾患が喘息である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
疾患がIBSである、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
疾患が、内毒素血症、敗血症、毒性ショック症候群、または感染症を含む急性炎症性疾患である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
疾患が多発性硬化症である、請求項33記載の方法。
【請求項４８】
疾患が多発性硬化症である、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
疾患が関節リウマチである、請求項33記載の方法。
【請求項５０】
疾患が関節リウマチである、請求項40記載の方法。
【請求項５１】
疾患が変形性関節症である、請求項33記載の方法。
【請求項５２】
疾患が変形性関節症である、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
サイトカインは、多くの細胞型の増殖および分化の調節を含む様々な生物学的効果を媒介する可溶性の小さなタンパク質である(例えば、Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990)（非特許文献１）；Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991)（非特許文献２）；Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)（非特許文献３）を参照されたい)。サイトカイン群を構成するタンパク質には、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、およびその他の調節分子が含まれる。例えば、ヒトインターロイキン-17は、インターロイキン-6、細胞内接着分子1、インターロイキン-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびプロスタグランジンE2の発現を促進し、CD34+造血前駆細胞の好中球への選択的成熟において役割を果たすサイトカインである(Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995)（非特許文献４）；Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)（非特許文献５）)。
【０００２】
サイトカインと結合する受容体は典型的に、サイトカインと高親和性で結合し、この結合事象を特定の受容体サブユニットの細胞質部分を介して細胞に伝達する1つまたは複数の内在性膜タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、その細胞外リガンド結合ドメインの類似性に基づいて、いくつかのクラスに分類されている。
【０００３】
サイトカインおよびその受容体の実証されたインビボ活性から、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインアゴニスト、およびサイトカインアンタゴニストの臨床上の可能性およびそれらの必要性が明らかにされる。例えば、炎症誘発性サイトカインファミリーの実証されたインビボ活性から、炎症誘発性分子のアンタゴニストの非常に大きな臨床上の可能性およびその必要性が明らかにされる。
【０００４】
【非特許文献１】Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990)
【非特許文献２】Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991)
【非特許文献３】Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)
【非特許文献４】Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995)
【非特許文献５】Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)
【発明の開示】
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症誘発性サイトカインIL-17AおよびIL-17Fに対するアンタゴニストを提供することによって、これらの必要性に取り組む。具体的には、炎症誘発性サイトカインIL-17AおよびIL-17Fは高度の配列類似性を有し、多くの生物学的特性を共有し、いずれも活性化T細胞によって産生される。それらはいずれも、関節リウマチおよび喘息を含む種々の自己免疫疾患および炎症性疾患の進行に寄与する因子として関連づけられている。実際に、いくつかのヒト疾患マウスモデルにおいて、IL-17A機能を無効にする試薬により、疾患の発症率および重症度が有意に改善する。IL-17Aはその同族受容体、IL-17受容体(IL-17R)との相互作用を介してその効果を媒介するが、IL-17Fの受容体はいまだ同定されていない。以前に本発明者らは、IL-17RCがIL-17AおよびIL-17F双方の受容体であり、どちらとも同様の高親和性で結合することを報告した。一方、IL-17RはIL-17Aと高親和性で結合するが、IL-17Fとは非常に低い親和性で結合する。このことと一致して、可溶型のIL-17Rは、いずれの受容体を発現している細胞においてもIL-17Aの結合およびシグナル伝達を遮断するが、IL-17FのIL-17RCに対する結合または機能を妨げない。
【０００６】
IL-17Aの介入はいくつかの自己免疫疾患の有効な治療として提唱されているため、可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RA受容体を含む、IL-17A、IL-17F、またはIL-17AおよびIL-17Fの双方の活性を遮断し得る、阻害し得る、減少させ得る、拮抗し得る、または中和し得る本発明のアンタゴニストを使用することは、これら2つのサイトカインのうちの一方のみを標的化する治療に優る利点を有することになる。本発明はさらに、炎症性疾患におけるその使用と共に、関連する組成物および方法を提供する。
【０００７】
A) 概要
免疫関連疾患および炎症性疾患は、正常な生理機能においては、傷害または損傷に反応し、傷害または損傷からの修復を開始し、ならびに外来生物に対する生得的および後天的防御を開始するのに非常に重要である、かなり複雑で多くの場合は多重に相互接続した生物学的経路の顕在化または結果である。疾患または病態は、これらの正常な生理的経路が、反応の強さと直接関連して、異常な調節もしくは過度の刺激の結果として、自己に対する反応として、またはこれらの組み合わせとしてさらなる傷害または損傷を引き起こす場合に生じる。
【０００８】
これらの疾患の発生は、多段階経路およびしばしば複数の異なった生物学的系/経路を伴う場合が多く、これらの経路の1つまたは複数における重要な点での介入は寛解または治療効果をもたらし得る。治療的介入は、有害な過程/経路の拮抗作用または有益な過程/経路の促進によって起こり得る。
【０００９】
多くの免疫関連疾患が公知であり、広く研究されている。このような疾患には、免疫介在性炎症性疾患(関節リウマチ、免疫介在性腎疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、および喘息など)、非免疫介在性炎症性疾患、感染症、免疫不全症、新形成などが含まれる。
【００１０】
Tリンパ球(T細胞)は、哺乳動物の免疫応答の重要な成分である。T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)内の遺伝子によってコードされる自己分子と会合している抗原を認識する。抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片などの表面上にMHC分子と共に提示され得る。T細胞系は、宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの変化した細胞を除去する。T細胞には、ヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞が含まれる。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞上の抗原-MHC複合体を認識した後に大規模に増殖する。ヘルパーT細胞はまた、B細胞、細胞傷害性T細胞、および免疫応答に関与する種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を果たす種々のサイトカイン、すなわちリンホカインを分泌する。
【００１１】
体液性および細胞性免疫応答の双方における中心的事象は、ヘルパーT細胞の活性化およびクローン性増殖である。ヘルパーT細胞の活性化は、T細胞受容体(TCR)--CD3複合体と抗原提示細胞の表面上の抗原-MHCとの相互作用によって始まる。この相互作用は、休止ヘルパーT細胞が細胞周期に入る(G0からG1への移行)のを誘導する生化学的事象のカスケードを媒介し、結果としてIL-2および場合によってはIL-4の高親和性受容体の発現をもたらす。活性化T細胞は、増殖してメモリー細胞またはエフェクター細胞に分化する周期を通して進行する。
【００１２】
TCRによって媒介されるシグナルに加えて、T細胞の活性化は、抗原提示細胞によって放出されるサイトカインにより、または抗原提示細胞およびT細胞上の膜結合分子との相互作用を介して誘導される付加的な共刺激を伴う。サイトカインIL-1およびIL-6が、共刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面上に発現したB7分子とT細胞表面上に発現したCD28およびCTLA-4分子との間の相互作用により、T細胞活性化が生じる。活性化T細胞は、増加した数の細胞接着分子、例えばICAM-1、インテグリン、VLA-4、LFA-1、CD56などを発現する。
【００１３】
混合リンパ球培養または混合リンパ球反応(MLR)におけるT細胞増殖は、免疫系を刺激する化合物の能力の確立された指標である。多くの免疫応答において、炎症細胞は損傷または感染部位に浸潤する。この遊走細胞は、罹患組織の組織学的検査によって決定され得るように、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球であり得る。Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.
【００１４】
免疫関連疾患は、免疫応答を抑制することで治療することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する可溶性受容体および/または中和抗体を用いることは、免疫介在性疾患および炎症性疾患の治療に有益であると考えられる。免疫応答を阻害する分子を用いて(タンパク質を直接、または抗体アゴニストの使用を介する)、免疫応答を阻害し、ひいては免疫関連疾患を改善することができる。
【００１５】
インターロイキン-17(IL-17A)は、Tリンパ球指向性ヘルペスウイルスサイミリ(Saimiri)(HSV)によってコードされるタンパク質の細胞オーソログとして同定された[Rouvier et al., J. Immunol., 150(12): 5445-5456 (19993)；Yao et al., J. Immunol., 122(12):5483-5486 (1995)、およびYao et al., Immunity, 3(6):811-821 (1995)を参照されたい]。後の特徴づけにより、このタンパク質が、多種多様な末梢組織において炎症誘発性反応を誘導するよう作用する強力なサイトカインであることが示された。IL-17Aは、CD4+活性化メモリーT細胞によってのみ合成および分泌される、約32 kDaのジスルフィド結合されたホモ二量体サイトカインである(Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551 [1998]に概説されている)。具体的には、IL-17は、19〜23残基のN末端シグナル配列を有する155アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、ジスルフィド結合されたホモ二量体糖タンパク質として分泌される。Il-17Aは、WO9518826 (1995)、WO9715320 (1997)、およびWO9704097 (1997)、ならびに米国特許第6,063,372号に開示されている。
【００１６】
組織分布が限定されているにもかかわらず、IL-17Aは様々な型の細胞に対して多面的な生物活性を示す。IL-17Aは、多くのサイトカインの産生を促進することが見出されている。IL-17Aは、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮および内皮細胞のような接着細胞によるIL-6、IL-8、IL-12、白血病抑制因子(LIF)、プロスタグランジンE2、MCP-1、およびG-CSFの分泌を誘導する。IL-17Aはまた、ICAM-1の表面発現、T細胞の増殖、ならびにCD34.sup.+ヒト前駆細胞の増殖および好中球への分化を誘導する能力を有する。IL-17Aはまた骨代謝にも関連づけられており、関節リウマチおよび骨移植片の弛緩のような、活性化T細胞の存在およびTNF-α産生を特徴とする病態において重要な役割を果たすことが示唆されている(Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14: 1513-1521 [1999])。関節リウマチ患者由来の滑膜組織の活性化T細胞が、正常個体または変形性関節症患者由来のものよりも多量のIL-17Aを分泌することが見出された(Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 [1999])。この炎症誘発性サイトカインが、関節リウマチにおいて滑膜炎症に積極的に寄与することが示唆された。その炎症誘発性の役割を別として、IL-17Aは、さらに別の機構により関節リウマチの病理に寄与していると考えられる。例えば、IL-17Aは、骨芽細胞において破骨細胞分化因子(ODF) mRNAの発現を誘導することが示されている(Kotake et al., J. Clin. Invest., 103: 1345-1352 [1999])。ODFは、前駆細胞の、骨吸収に関与する細胞である破骨細胞への分化を促進する。
【００１７】
関節リウマチ患者の滑液ではIL-17Aのレベルが有意に増加していることから、IL-17A誘導性の破骨細胞形成が、関節リウマチの骨吸収において非常に重要な役割を果たすと考えられる。IL-17Aはまた、多発性硬化症などの特定の他の自己免疫疾患において重要な役割を果たすと考えられている(Matusevicius et al., Mult. Scler., 5: 101-104 [1999])。IL-17Aは、細胞内シグナル伝達によって、ヒトマクロファージにおけるCa.sup.2+流入および[cAMP]の減少を促進することがさらに示されている(Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 [1998])。IL-17Aで処理した線維芽細胞はNF-κBの活性化を誘導し[Yao et al., Immunity, 3:811 (1995)、Jovanovic et al.、前記]、IL-17Aで処理したマクロファージはNF-κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化する(Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273:27467 [1998])。
【００１８】
さらに、IL-17Aはまた、骨および軟骨の成長に関与する哺乳動物サイトカイン様因子7と配列類似性を共有する。IL-17Aポリペプチドが配列類似性を共有する他のタンパク質には、ヒト胎児由来インターロイキン関連因子(EDIRF)およびインターロイキン-20がある。
【００１９】
IL-17Aの幅広い効果と一致して、IL-17Aの細胞表面受容体が多くの組織および細胞型において広く発現していることが見出された(Yao et al., Cytokine, 9:794 [1997])。ヒトIL-17A受容体(IL-17R)(866アミノ酸)のアミノ酸配列から、1回膜貫通ドメインおよび長い525アミノ酸の細胞内ドメインを有するタンパク質が予測されるが、この受容体配列は独特であり、サイトカイン/増殖因子受容体ファミリー由来の受容体のいずれの配列とも類似していない。このことは、IL-17A自体が他の公知のタンパク質との類似性を欠くことと併せて、IL-17Aおよびその受容体が、シグナルタンパク質および受容体の新規なファミリーの一部であり得ることを示している。IL-17Aの活性は、その独特の細胞表面受容体への結合によって媒介されることが実証されており、これまでの研究から、T細胞を可溶型のIL-17A受容体ポリペプチドと接触させると、PHA、コンカナバリンA、および抗TCRモノクローナル抗体によって誘導されるT細胞増殖およびIL-2産生が阻害されることが示されている(Yao et al., J. Immunol., 155:5483-5486 [1995])。したがって、公知のサイトカイン受容体、具体的にはIL-17A受容体との相同性を有する新規ポリペプチドを同定し、特徴づけることに多大な関心が寄せられている。
【００２０】
IL-17Fの発現パターンはIL-17Aのものと類似していると考えられ、これには活性化CD4+ T細胞および単球のみが含まれる(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001])。IL-17Fは、線維芽細胞においてG-CSF、IL-6、およびIL-8を（Hymowitz et al, EMBO J. 20:5322-5341 [2001])、ならびに内皮細胞においてTGF-bを(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001])誘導することが実証されている。樹状細胞によって産生されるサイトカインであるIL-23が、主にメモリーT細胞におけるIL-17AおよびIL-17Fの産生を媒介し得ることが報告されている(Aggarwal et al. J. Biol. Chem. 278:1910-1914 [2003])。
【００２１】
さらに、関節炎および喘息個体において、IL-17AおよびIL-17Fの過剰発現または上方制御が示されている(Moseley et al. CytokineGrowth Factor Rev 14:155-174 [2003])。関節炎に関して、これらのサイトカインは、関節リウマチおよび変形性関節症に付随する軟骨および関節破壊に特徴的な様式で作用する。例えば、IL-17AおよびIL-17Fは、新たなプロテオグリカンおよびコラーゲンの合成を阻害しつつ、軟骨プロテオグリカングリコサミノグリカンおよびコラーゲン断片の放出を介して、関節軟骨外植片における基質破壊を増強することが実証されている(Cai et al. Cytokine 16:10-21 [2001]；Attur et al Arthritis Rheum 44:2078-2083 [2001])。
【００２２】
IL-17Aと同様に、マウスにおけるIL-17Fの過剰発現もまた、肺の好中球動員を増加させ、肺において、IL-6、IFN-γ、IP-10、およびMIGを含むTh-1関連サイトカインの発現増加をもたらすことが示されている(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001])。IL-17Fはまた、アレルゲン誘発喘息患者由来のT細胞において上方制御され(Kawaguchi et al J. Immunol 167:4430-4435 [2001])、NHBEにおいてIL-6およびIL-8産生を誘導することが見出された。IL-17Aとは対照的に、IL-17Fはインビトロで血管新生を阻害するようである(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001])。
【００２３】
IL-17F mRNAは、種々のヒト組織ではノーザンブロットにより検出されなかったが、CD4+ T細胞および単球細胞の活性化に際して劇的に誘導された。同文献。マウスでは、Th2細胞および肥満細胞が、活性化されてIL-17Fを発現することが見出された。Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003)を参照されたい。IL-17Aと同様に、IL-17Fの発現もまた、マウスにおいてIL-23によって上方制御されることが見出された。
【００２４】
Il-17サイトカイン/受容体ファミリーは、サイトカインネットワーク内の独特のシグナル伝達系を表すと考えられ、これは免疫応答および炎症反応の操作に革新的なアプローチを提供することになる。したがって、本発明は、新規なIL-17ファミリー受容体、IL-17RCの発見、ならびにIL-17AおよびIL-17Fの双方に結合するその能力に基づく。
【００２５】
IL-17RCは最初、IL-17RAに関連するタンパク質を探索するためのバイオインフォマティクスアプローチを用いて同定され、IL-17受容体関連タンパク質IL-17RCをコードするcDNAを介して同定された。IL-17ファミリーの原型メンバーIL-17Aに結合するIL-17受容体(IL-17RA)との明白な類似性、およびIL-17サイトカインファミリーの5つの他のメンバーの同定にもかかわらず、IL-17RCの特異的リガンドは以前には報告されていなかった。しかし、2005年6月10日に出願され、米国特許出願公開第20060002925号として公開されている米国特許出願第11/150,533号に記載されているように、IL-17AおよびIL-17FがIL-17RCの特異的リガンドとして同定された。具体的には、これらのリガンドは、ヒトIL-17RA(hIL-17RA)またはIL-17RC(hIL-17RC)のいずれかをコードする構築物を安定にトランスフェクションしたベビーハムスター腎細胞(BHK)を用いて同定された。表面上での受容体の発現は、hIL-17RAに対するモノクローナル抗体またはhIL-17RCに対するポリクローナル抗血清を用いて、FACS解析により確認された。サイトカインの結合を評価するため、ビオチン化型のヒトIL-17A、C、D、E、およびFならびに蛍光色素結合ストレプトアビジンを用いて、フローサイトメトリーによりトランスフェクション細胞に対するサイトカイン結合を検出した。結果から、hIL-17RAを発現する安定にトランスフェクションされたBHK細胞は、予想通りにヒトIL-17A(hIL-17A)と明らかに結合し、一方、空の発現ベクターをトランスフェクションしたBHK細胞は、試験したIL-17ファミリーのいずれのメンバーにも結合し得ないことが明らかに示された。hIL-17RAトランスフェクション細胞に対するヒトIL-17F(hIL-17F)の比較的弱い結合もまた観察されたが、試験したIL-17ファミリーの他のメンバーの有意な結合は認められなかった。他のIL-17ファミリーメンバーをhIL-17RCトランスフェクション細胞に対する結合に関して試験し、この細胞がhIL-17Fへの有意な結合を示すことが認められた。加えて、この細胞に対するhIL-17Aの有意な結合も認められたが、hIL-17C、D、およびEの結合は認められなかった。このデータから、hIL-17RCがhIL-17FおよびhIL-17A双方の受容体であることが判明した。
【００２６】
さらに、一定範囲のサイトカイン濃度にわたって蛍光レベルを調べて、hIL-17AおよびhIL-17FのhIL-17RAおよびhIL-17RCに対する相対的親和性を決定した。各トランスフェクタントにおいて個々のサイトカインの平均蛍光強度を比較することによって、hIL-17AがhIL-17Fよりも良好にhIL-17RAに結合すること、しかしいずれのサイトカインもhIL-17RCトランスフェクション細胞に同等に良好に結合するらしいことが認められた。興味深いことに、両受容体を発現する細胞に対するサイトカイン結合は付加的であると考えられ、協同性の証拠は認められなかった。
【００２７】
次に、この結合の特異性を、非標識サイトカインとの結合における競合を試みることによって調べた。トランスフェクションしたBHK細胞を固定濃度のビオチン化サイトカインおよび漸増濃度の非標識サイトカインと共にインキュベートし、結合したビオチン化物質の量をFACSにより定量した。漸増濃度の非標識サイトカインによってビオチン化物質の結合が妨げられたことから、hIL-17AおよびhIL-17FのhIL-17RCに対する結合が特異的であることが示された。実際に、非標識hIL-17AおよびhIL-17Fは、ビオチン化型の両サイトカインのhIL-17RCトランスフェクション細胞に対する結合において効率的に交差競合し、2つのサイトカインが同様の親和性でhIL-17RCと結合していること、およびそれらが同一の部位でないにせよ重複した部位に結合していることが示唆された。非標識hIL-17Aはまた、ビオチン化hIL-17AおよびhIL-17FのhIL-17RAトランスフェクション細胞に対する結合において効率的に競合したが、非標識hIL-17FはhIL-17RAに対するhIL-17A結合において競合する能力を本質的に示さなかった。このことから、hIL-17FはhIL-17RAに対する特異的結合を示すが、この相互作用の結合力はhIL-17AとhIL-17RAとの相互作用よりも有意に低いようであることが示された。
【００２８】
飽和結合試験を行い、hIL-17RCおよびhIL-17RAに対するhIL-17AおよびhIL-17F結合の親和性を測定した。hIL-17RAまたはhIL-17RCを安定して発現するBHK細胞株を、飽和結合条件下でヨウ素化hIL-17AまたはhIL-17Fと共にインキュベートして、各受容体に対する各サイトカインの親和定数を決定した。hIL-17Aは、同等の親和性でhIL-17RAおよびhIL-17RCと結合した(表1)。具体的には、表示の受容体をトランスフェクションしたBHK細胞を用いて、方法に記載する通りにhIL-17AおよびhIL-17FのKd値を確立した。示した結果は、3回繰り返しの測定に由来する平均Kd値である。
【００２９】
【表１】
2009510093.tif 000003
1hIL-17RCのx1スプライス変種を示す。
【００３０】
加えて、hIL-17RCに対するhIL-17Fの親和性は、この受容体に対するhIL-17Aの親和性と非常に類似していた(上記の表1を参照されたい)。しかし、ビオチン化サイトカインを用いて得られた結果と一致して、hIL-17RAに対するhIL-17Fの親和性は、測定された他方の親和性と比較しておよそ1000倍低かった(同文献)。このことから、hIL-17AおよびhIL-17Fは同様の親和性でhIL-17RCと結合するが、hIL-17RAに対するそれらの親和性は劇的に異なることが示される。
【００３１】
hIL-17RCが高親和性でhIL-17AおよびhIL-17Fと結合するという知見から、hIL-17RCを発現する細胞がhIL-17AおよびhIL-17Fに同等に応答し得るはずであることが示唆される。一方、hIL-17RAはhIL-17Aと高親和性で結合したが、hIL-17Fとは約1000倍低い程度で結合したことから、hIL-17RAを発現する細胞は生理的条件下においてhIL-17Aにのみ応答すると考えられる。以前に、hIL-17RAは偏在的に発現することが示されていたが、その発現は造血細胞において高く、他の組織では低く発現することが報告されている。したがって、hIL-17RCの発現を調べて、発現パターンにおける重複の程度を決定した。ノーザンブロット解析から、hIL-17RCは、副腎、前立腺、肝臓、および甲状腺などの腺組織において高レベルで発現し、造血組織では検出可能な発現のないことが示された。
【００３２】
造血細胞におけるこれら受容体の発現をさらに調べるため、多パラメータFACS解析により、末梢血単核細胞(PBMC)に対するビオチン化hIL-17AおよびhIL-17Fの結合もまた調べた。結果から、hIL-17Aは試験したすべてのPBMCサブセットに結合するが、hIL-17Fはこれらの集団のいずれに対しても検出可能な結合を示し得ないことが示された。このことは、hIL-17RAがhIL-17Aに高親和性で結合するが、hIL-17Fには結合しない能力と、およびPBMCにおいてhIL-17RC mRNAが検出されないことと一致した。まとめると、これらのデータから、IL-17RCは非造血組織において優先的に発現し、IL-17RAは造血細胞において優先的に発現することが示される。
【００３３】
hIL-17RCトランスフェクション細胞に対するhIL-17AおよびhIL-17Fの高親和性結合から、可溶型のhIL-17RCが有効な治療薬となり得ることが示唆される。そのような分子は、これら2つのサイトカインの有効なアンタゴニストであると考えられる。このことに関して直接試験するため、可溶型のヒトhIL-17RCをFc融合タンパク質として生成し、hIL-17AおよびhIL-17Fの結合を阻害する能力について試験した。次いで、これらの効果を、可溶型のhIL-17RAを用いて得られた結果と比較した。漸増濃度のhIL-17RC-IgまたはhIL-17RA-Igを結合反応に含め、FACS解析を用いて、安定してトランスフェクションされたBHK細胞に対するビオチン化サイトカインの結合に及ぼす可溶性受容体の効果を評価した。可溶性hIL-17RCは、hIL-17AおよびIL-17Fの結合を同程度に阻害し、IL-17Rファミリーの別のメンバー、hIL-17RDのFc融合タンパク質は効果を及ぼさなかった。一方、可溶性hIL-17RAはhIL-17Aの結合を効率的に遮断したが、hIL-17Fの結合には本質的に効果を及ぼさなかった。造血細胞に対するhIL-17Aの結合について試験しても、同様の結果が得られた。この結合は、hIL-17RA-IgおよびhIL-17RC-Igを用いて効率的に遮断されたが、hIL-17RD-IDでは遮断されなかった。これらのデータは親和性測定から得られた結果と一致し、これらのデータから、可溶性受容体がそれらの膜アンカー型と同様に挙動することが示される。
【００３４】
ヒトhIL-17RC-IgがhIL-17AおよびhIL-17Fに結合する能力のさらなる評価として、これらサイトカインに対する可溶性受容体の親和性をBiacore解析を用いて評価した。可溶性hIL-17RCはhIL-17AおよびhIL-17Fの双方に高親和性で結合し(表2)、インビボのhIL-17AおよびhIL-17Fの効果に対するアンタゴニストとしてこの試薬を用いるというアイデアに関してさらなる支持が提供される。具体的には、可溶性受容体をチップ上に捕獲し、結合実験を下記の通りに実施した。ND＝検出可能な結合なし。
【００３５】
【表２】
2009510093.tif 000004
【００３６】
ヒトにおけるスプライス変種の数ははるかに多く、したがって、本発明者らは最初の実験をこれらの分子のサブセットにおいてのみ実施した。この解析に選択したものはまたエキソン7の包含または排除の点で異なったが、マウスとは異なり、スプライス変種はいずれもエキソン8のすべてを組み込んでいた。マウスのエキソン8配列の中央に見出される潜在的スプライスアクセプターは、ヒトのエキソン8には存在しない。しかし、試験した他のスプライス変種は、hIL-17RCエキソン12を包含するかまたは排除していた。これらの変種は、hIL-17RCx1(上記のマウスx1とエキソン組成が同一である)、hIL-17RCx4(上記のマウスx4とエキソン組成が同一である)、hIL-17RCx2、およびhIL-17RCx7と命名された。再び、これらのスプライス変種を293F細胞において一過性に発現させ、ビオチン化マウスおよびヒトhIL-17AおよびhIL-17Fに結合する能力に関して試験し、その結果を表3に要約する。
【００３７】
【表３】
2009510093.tif 000005
1転写産物中に完全に含まれるエキソンを示す。2(+)は、FACSによって蛍光の有意な増加により評価される検出可能な有意なサイトカイン結合を示す。(-)は、蛍光に有意な変化がないことを示す。
【００３８】
先に示した実験と一致して、hIL-17RCx1はhIL-17AおよびhIL-17Fの双方に結合したが、いずれのマウスサイトカインにも結合しなかった。hIL-17RCx4もまた両ヒトサイトカインに結合したが、そのマウス対応物と同様に、mIL-17Fには結合したが、mIL-17Aには結合しなかった。hIL-17RCx2およびhIL-17RCx7は、試験した4つのサイトカインのいずれにも結合し得なかったが、hIL-17RCに対するポリクローナル抗血清によってCD8+細胞が染色されたことから(データは示さず)、これらはトランスフェクション細胞の表面上に明らかに発現していた。これらの結合結果は、安定にトランスフェクションされたBHK細胞においても忠実に反復された。まとめると、これらのデータから、ヒトサイトカインに対する結合に必要なIL-17RCタンパク質の必須部分に関する結論が支持される。
【００３９】
多くの出版物により、IL-17Aおよびより低い程度ではあるがIL-17Fは、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)およびヒト関節リウマチにおいて、疾患の進行およびの重症度に寄与すると関連づけられている。CIAを誘発するためにコラーゲンを免疫化したマウス由来の関節または流入領域リンパ節(DLN)におけるmIL-17AおよびmIL-17Fの発現を調べた。リアルタイムPCRによる解析により、両サイトカインが非免疫化対照と比較して罹患マウスの両組織において上方制御されることが明らかに実証され、発現が疾患と相関することが明白に示された。加えて、mIL-17RAおよびmIL-17RCの相対的発現を同じ組織で同様に調べた。しかし、この場合には、いずれの受容体の発現も疾患との再現性のある相関は認められなかった。さらに、自明であったのは、DLNと非造血組織(後足)を比較する実験における矛盾であった。ヒト受容体の発現を観察した以前の結果と一致して、mIL-17RAは造血組織においてより高度に発現し、mIL-17RCは非造血組織においてより高度に発現することが見出された。このデータから、mIL-17Aの発現およびmIL-17F発現が疾患と相関すること、ならびに必要な受容体がいずれも罹患組織および正常組織に存在することが示唆され、これらのサイトカインの中和が疾患の進行を妨げる有効な治療となり得ることが示唆される。
【００４０】
したがって、IL-17AおよびIL-17Fの同族受容体がIL-17RCであることが示された。顕著なことには、hIL-17RCはhIL-17AおよびhIL-17Fに同様の親和性で結合する。IL-17ファミリーのこれら2つのメンバーは55%の配列同一性を共有するため、これらが受容体を共有することはおそらくは驚くにはあたらない。しかし、hIL-17RAはhIL-17Aと高親和性で結合するが、hIL-17Fとはおよそ1000倍低い親和性で結合し、生理的条件下ではhIL-17RAはhIL-17Fと結合しないことが示唆される。hIL-17RCを発現する細胞はhIL-17AおよびhIL-17Fの両方に応答するはずであり、一方、hIL-17RAのみを発現する細胞はIL-17Aにのみ応答することになると考えられる。この相違は、いかにしてこれらのサイトカインが異なる組織に作用するかに影響を与え得る。発現解析を通して、IL-17RAは偏在的に発現するが、造血細胞においてより高度に発現し、IL-17RCは非造血組織において発現し、造血細胞では発現しない傾向があることが示された。このことと一致して、ヒト末梢血単核細胞のサブセットはすべてhIL-17Aと結合するが、hIL-17Fとは結合しない。さらに、このことから、非造血組織はIL-17AおよびIL-17Fの両方に応答するはずであり、一方、造血細胞はIL-17Aにのみ応答するはずであることが示唆される。
【００４１】
異なるIL-17RCスプライス変種に対するサイトカイン結合のこの試験により、サイトカイン結合に必須である受容体の2つの部分が明らかになり、またマウスおよびヒトサイトカインの結合特性にわずかな相違があることが明らかになった。さらに、これらの特徴は、試験した受容体の種にかかわらずサイトカインに関して一致する。表3に提示したデータから示されるように、hIL-17AおよびhIL-17Fはヒトx1変種およびヒトx4変種にのみ結合するため、これらのサイトカインがIL-17RCに結合するためにはエキソン12およびエキソン8のすべてが必要である。これらのアイソフォームはそれぞれ、エキソン8のすべておよびエキソン12を含むが、これらはエキソン7を含むか否かに関して異なる。これにより、エキソン7がヒトサイトカインの結合に不要であることが示唆される。
【００４２】
IL-17AおよびIL-17F機能の双方に対するアンタゴニストを作製する重要性は、IL-17AおよびIL-17F発現といくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患の進行との強い相関関係を示す入手可能な情報から明らかであると考えられる。これら2つのサイトカインは他の炎症性サイトカインおよびケモカインならびにマトリックスメタロプロテアーゼを誘導し、これらは自己免疫性関節炎におけるコラーゲンおよび骨破壊に寄与する。この試薬は、関節リウマチ、ならびにhIL-17AおよびhIL-17Fが役割を担う他の炎症性疾患の有効な治療薬となるはずである。
【００４３】
したがって、IL-17AおよびIL-17Fの双方に対するアンタゴニストとして役立つ可溶型のヒトIL-17RCを開発した。治療上、これらの可溶性IL-17RCポリペプチドは有効であった。しかし、多くの要因に起因して、可溶性IL-17RCは、当技術分野において利用可能な多くのかつ様々な産生系から容易に分泌されない。また、可溶性IL-17RCは、製造目的に必要な十分量分泌されない。したがって、当技術分野において、製造用に拡大できる量で発現および分泌され得るIL-17AおよびIL-17Fに対するアンタゴニストを開発する必要性が存在する。
【００４４】
したがって、本発明は、発現および分泌され得るIL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストを提供することによってこの必要性に答える。具体的には、本発明は、IL-17AおよびIL-17Fに結合する、IL-17AおよびIL-17Fのそれらの同族受容体に対する結合を拮抗するおよび/または遮断するいくつかの非天然可溶性分子または可溶性ポリペプチドの開発および発見に基づく。これらの可溶性ポリペプチドは、IL-17RCの一部を含む。これらの可溶性ポリペプチドはまた、IL-17RCおよびIL-17RA双方の一部を含み得る(「IL-17RC/IL-17RA」)。
【００４５】
1つのそのような好ましい態様を、図4Aおよび4Bならびに配列番号:157および158に記載する。この可溶性ポリペプチドは、ヒトIL-17RA(配列番号:21)のエキソン1〜6およびヒトIL-17RCx1(配列番号:2)のエキソン8〜16を含む。より具体的には、この可溶性ポリペプチドを、配列番号:157および158中に含まれるFc5などのFc分子に融合させる。しかし、当業者は、いかなるFc分子および二量体化をもたらすいかなる他の分子も利用できることを容易に認識すると考えられる。
【００４６】
したがって、本発明のIL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RA可溶性受容体などのIL-17FおよびIL-17A活性に対するアンタゴニストは、炎症性疾患の治療的処置において、特にこれらの分子が関与する疾患の治療においてIL-17FおよびIL-17Aの一つずつまたは双方に対するアンタゴニストとして有用である。さらに、本発明の可溶性受容体などのIL-17AおよびIL-17F活性に対するアンタゴニストは、他の炎症性疾患の治療的処置において、例えば乾癬、アトピー性および接触性皮膚炎、IBD、IBS、大腸炎、内毒素血症、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、成人呼吸器疾患(ARD)、敗血症ショック、多臓器不全、炎症性肺損傷、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気道過敏症、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、細菌性肺炎、乾癬、湿疹、ならびに潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患、ヘリコバクター・ピロリ(helicobacter pylori)感染症、腹膜炎症の結果としての(すなわち、感染症、損傷などによる)腹腔内癒着および/または膿瘍、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、全身性硬化症、ネフローゼ症候群、臓器同種移植片拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、腎臓、肺、心臓などの移植片拒絶、連鎖球菌細胞壁(SCW)誘発関節炎、変形性関節症、歯肉炎/歯周炎、疱疹間質性角膜炎、前立腺、腎臓、結腸、卵巣、子宮頸部を含む癌、白血病、血管新生、再狭窄、ならびに川崎病の治療において、IL-17FおよびIL-17Aを(個別にまたは共に)結合する、遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するものとして有用である。
【００４７】
サイトカイン受容体サブユニットは、リガンド結合ドメインおよび典型的にはシグナル伝達に関与するエフェクタードメインを含む多ドメイン構造を特徴とする。多量体サイトカイン受容体には、単量体、ホモ二量体(例えば、PDGF受容体ααおよびββアイソフォーム、エリスロポエチン受容体、MPL[トロンボポエチン受容体]、ならびにG-CSF受容体)、サブユニットがそれぞれリガンド結合ドメインおよびエフェクタードメインを有するヘテロ二量体(例えば、PDGF受容体αβアイソフォーム)、および異なる機能を有する成分サブユニットを有する多量体(例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、およびGM-CSF受容体)が含まれる。いくつかの受容体サブユニットは、複数の受容体に共通している。例えば、それ自体ではリガンドと結合できないが細胞内シグナル伝達ドメインを含むAIC2Bサブユニットは、IL-3およびGM-CSF受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造および機能に基づいて、4つの関連するファミリーの1つに分類され得る。例えば、クラスI造血受容体は、保存されたシステイン残基およびWSXWSモチーフを含むドメインの存在を特徴とする。プロテインキナーゼドメイン；フィブロネクチンIII型ドメイン；およびジスルフィド結合したループを特徴とする免疫グロブリンドメインを含むさらなるドメインが特定の造血受容体に存在する。サイトカイン受容体構造は、Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228 (1991)、およびCosman, Cytokine 5:95-106 (1993)により概説されている。生物が新規の生物学的機能を獲得するための選択的圧力下において、既存の受容体遺伝子の重複から新たな受容体ファミリーメンバーが生じ、多重遺伝子ファミリーの存在が生じたと一般的に考えられている。したがって、ファミリーメンバーは先祖遺伝子の痕跡を含み、これらの特徴的な性質を、さらなるファミリーメンバーの単離および同定において活用することができる。
【００４８】
したがって、本発明は、それぞれのリガンドがその対応する1つまたは複数の受容体と結合するおよび/またはそれを介してシグナル伝達するのを阻止するIl-17AおよびIL-17Fアンタゴニストに関する。
【００４９】
好ましい態様において、そのようなアンタゴニストは、図1〜4に示すようなIL-17RCのポリペプチド構造に基づく。IL-17RC受容体は、特定のエキソンの包含または排除に基づき、多くのスプライス変種を有する。以下に記載するように、これらのエキソンのうちのいくつかはリガンド(IL-17Aおよび/またはIL-17F)結合に必要である。
【００５０】
本発明は、IL-17RCと、IL-17RA(配列番号:21)などのIL-17ファミリーの他のメンバーとの間の構造類似性(「ドメイン」)の発見に一部基づく。具体的には、3つのドメインが同定された：
1) ドメイン1(配列番号:159および160)は、IL-17RCのエキソン8〜10を含む。これは、(配列番号:2)のIL-17RCx1のアミノ酸残基193〜276および(配列番号:166)のIL-17RCx4のアミノ酸残基208〜291に対応する。
2) ドメイン2(配列番号:161および162)は、IL-17RCのエキソン11〜13を含む。これは、(配列番号:2)のIL-17RCx1のアミノ酸残基277〜370および(配列番号:166)のIL-17RCx4のアミノ酸残基292〜385に対応する。
3) ドメイン3(配列番号:163および164)は、IL-17RCのエキソン8〜10を含む。これは、(配列番号:2)のIL-17RCx1のアミノ酸残基371〜447および(配列番号:166)のIL-17RCx4のアミノ酸残基386〜462に対応する。
【００５１】
したがって、本発明は、図1に示すエキソンの種々の組み合わせに基づく可溶性IL-17RCポリペプチドに関する。具体的には、これらの可溶性ポリペプチドの例には以下のものが含まれる：
1) リンカー(配列番号:176および177)を介してFc10(配列番号:174および175)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜6および8〜16を含む変種1210(配列番号:67および68)。変種1210はまた、otPA由来のプレプロシグナルペプチド(配列番号:178に示されるポリペプチド配列)を有する。Fc10の代わりに、Fc5、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
2) Fc10(配列番号:174および175)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜6および8〜16を含む変種1390(配列番号:69および70)。変種1390はまた天然シグナル配列を有する。Fc10の代わりに、Fc5、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
3) リンカー(配列番号:176および177)を介してFc10(配列番号:174および175)に融合された、マウスIL-17RAのエキソン1〜6およびヒトIL-17RCx1のエキソン8〜16を含む変種1341(配列番号:71および72)。変種1341はまた、マウスIL-17RA由来のシグナルペプチド(配列番号:181)を有する。Fc10の代わりに、Fc5、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
4) リンカー(配列番号:176および177)を介してFc10(配列番号:174および175)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン8〜16を含む変種1342(配列番号:73および74)。変種1342はまた、otPA由来のプレプロシグナルペプチド(配列番号:178に示されるポリペプチド配列)を有する。Fc10の代わりに、Fc5、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
5) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜7を含む変種S1(配列番号:77および78)。変種S1はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
6) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜8を含む変種S2(配列番号:81および82)。変種S2はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
7) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜9を含む変種S3(配列番号:85および86)。変種S3はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
8) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜10を含む変種S4(配列番号:89および90)。変種S4はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
9) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜11を含む変種S5(配列番号:93および94)。変種S5はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
10) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン14〜16を含む変種S6(配列番号:97および98)。変種S6はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
11) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン11〜16を含む変種S7(配列番号:101および102)。変種S7はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
12) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン7〜16を含む変種S10(配列番号:105および106)。変種S10はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
13) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜7および14〜16を含む変種S11(配列番号:109および110)。変種S11はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
14) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜7および11〜16を含む変種S12(配列番号:113および114)。変種S12はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
15) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜13およびヒトIL-17RAのエキソン7〜9を含む変種S13(配列番号:117および118)。変種S13はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
16) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、マウスIL-17RAのエキソン1〜6、ヒトIL-17RCx1のエキソン8〜13、およびマウスIL-17RAのエキソン7〜9を含む変種S14(配列番号:121および122)。変種S14はまた天然シグナル配列を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
17) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RAのエキソン1〜10およびヒトIL-17RCx1のエキソン8〜16を含む変種1407(配列番号:139および140)。変種1407はまた、ヒトIL-17RC由来の天然シグナルペプチドを有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
18) Leu21Ala置換(IL-17RCx1と比較して)を有する、Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RCx1のエキソン1〜6および8〜16を含む変種1459(配列番号:151および152)。変種1459はまた、otPA由来のプレプロシグナルペプチド(配列番号:178に示されるポリペプチド配列)を有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
19) Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RAのエキソン1〜6およびヒトIL-17RCx1のエキソン8〜16を含む変種1454(配列番号:157および158)。変種1454はまた、ヒトIL-17RA由来の天然シグナルペプチドを有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
【００５２】
上記の変種は、本発明の限られた数の態様のみを示している。当業者は、本出願の教示、特に本明細書に含まれる図1〜4に基づいて、容易にかつ過度に実験することなく、他のIL-17RCおよび/またはIL-17RC/IL-17RA変種を設計および試験することができると考えられる。例えば、上記のシグナルペプチドの代わりに使用できる他のシグナルペプチドには、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド(配列番号:168および169)、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域(VH 26-10)(配列番号:170および171)、またはヒトCD33(配列番号:172および173)が含まれる。
【００５３】
いくつかある発明の中でも、本発明は、本発明の可溶性受容体の新規使用を提供する。これらの可溶性受容体は、IL-17RCのみに基づき得るか(「IL-17RC」または「可溶性IL-17RC」または「sIL-17RC」と命名するが、いずれも本明細書において互換的に用いられ得る)、またはIL-17RAとIL-17RCの部分の組み合わせに基づき得る(「IL-17RC/IL-17RA」または「ハイブリッドRC/RA」「RC/RA」またはそれらの任意の変化形、いずれも本明細書において互換的に用いられ得る)。本発明はまた、ヒト炎症性疾患および自己免疫疾患において用いるための可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチド断片および融合タンパク質を提供する。本発明の可溶性受容体は、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、IBD、IBS、大腸炎、喘息、同種移植片拒絶、免疫介在性腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、または変形性関節疾患、および本明細書に開示する他の炎症病態などの炎症および炎症性疾患の治療において、IL-17FもしくはIL-17Aのいずれか、またはIL-17AおよびIL-17Fの双方の活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するために用いることができる。
【００５４】
ヒトIL-17RC(「IL-17RCx1」)をコードする例示的ヌクレオチド配列を、配列番号:1により提供する；コードされるポリペプチドを配列番号:2に示す。IL-17RCは、IL-17A(配列番号:13および14)およびIL-17F(配列番号:15および16)双方の受容体として機能する。IL-17RCは、単量体、ホモ二量体、またはヘテロ二量体として作用し得る。好ましくは、IL-17RCは、IL-17Aおよび/またはIL-17Fの双方に対してホモ二量体受容体として作用する。本出願に記載する通り、単量体またはホモ二量体受容体はIL-17RCのみを含んでよく、またはIL-17RAなどの他のIL-17ファミリー受容体の一部を含んでもよい(IL-17RC/IL-17RA)。したがって、本発明は、IL-17RA、IL-17RE、または任意の他のIL-17ファミリー受容体と組み合わせてIL-17RCの一部を含む可溶性受容体を包含する。IL-17RCはまた、IL-17関連サイトカインに対してヘテロ二量体受容体サブユニットとして作用し得る。例えば、IL-17RCは、IL-17RAまたは別のIL-17様受容体と共にヘテロ二量体を形成し得る。IL-17RCは、同一出願人による米国特許出願第10/458,647号および同一出願人によるWO 01/04304に開示されており、これらはいずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる。IL-17RCをコードするヒトcDNAクローン(配列番号:1)の解析から、約20アミノ酸残基(配列番号:2のアミノ酸残基1〜20)の推定シグナル配列、約431アミノ酸残基(配列番号:2のアミノ酸残基21〜452；配列番号:3)の細胞外リガンド結合ドメイン、約20アミノ酸残基(配列番号:2のアミノ酸残基453〜473)の膜貫通ドメイン、および約203アミノ酸残基(配列番号:2のアミノ酸残基474〜677)の細胞内ドメインを含む692アミノ酸(配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。さらに、リガンド結合ドメインを配列番号:22により表す。
【００５５】
「IL-17RCx4」と命名された変種ヒトIL-17RCをコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列を、配列番号:165により提供し、コードされるポリペプチドを配列番号:166に示す。推定シグナルペプチドは配列番号:165の残基1〜60および配列番号:166の残基1〜20であり；細胞外ドメインは配列番号:165の残基61〜1401および配列番号:166の残基21〜467であり；膜貫通ドメインは配列番号:165の残基1402〜1464および配列番号:166の残基468〜488であり；細胞内ドメインは配列番号:165の残基1465〜2121および配列番号:166の残基489〜707である。
【００５６】
「IL-17RC-1」と命名された変種ヒトIL-17RCをコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列を、配列番号:4により提供し、コードされるポリペプチドを配列番号:5に示す。IL-17RC-1は、同一出願人による米国特許出願第10/458,647号および同一出願人によるWO 01/04304に開示されており、これらはいずれもその全体が参照により本明細書に組み入れられる。配列解析から、IL-17RC-1が切断型の受容体ポリペプチドであることが明らかになった。すなわち、IL-17RC-1は配列番号:2のアミノ酸残基1〜113を欠いている。配列番号:10は、IL-17RCのN末端部分を含むIL-17RC-1ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
IL-17RCおよびIL-17RC-1アミノ酸配列の比較により、これら2つのポリペプチドが選択的スプライス変種であることもまた示された。IL-17RCのアミノ酸配列は、IL-17RC-1が欠いている17アミノ酸部分(配列番号:2のアミノ酸残基339〜355)を含むと同時に、IL-17RCは、アミノ酸479の後に、IL-17RC-1において見出される13アミノ酸部分(配列番号:5のアミノ酸残基350〜362)を欠いている。両アミノ酸部分を含むポリペプチドを配列番号:11により提供する一方、配列番号:12は、13および17アミノ酸部分の両方を欠くポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５８】
「IL-17RC-6」と命名された変種ヒトIL-17RCをコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列を、配列番号:23により提供し、コードされるポリペプチドを配列番号:24に示す。IL-17RC-6は、配列番号:2に例示されるIL-17RCと比較して、25アミノ酸残基の欠失を含む。具体的には、IL-17RC-6は、配列番号:2のアミノ酸残基94〜アミノ酸残基118を含まない。IL-17RC-6をコードするヒトcDNAクローン(配列番号:23)の解析から、約427アミノ酸残基(配列番号:24のアミノ酸残基1〜427)の細胞外リガンド結合ドメイン、約20アミノ酸残基(配列番号:24のアミノ酸残基428〜448)の膜貫通ドメイン、および約218アミノ酸残基(配列番号:24のアミノ酸残基449〜667)の細胞内ドメインが明らかになった。
【００５９】
変種マウスIL-17RCをコードする例示的ヌクレオチド配列を、配列番号:25により提供する；コードされるポリペプチドを配列番号:26に示す。マウスIL-17RCは、マウスIL-17A(配列番号：17および18)およびマウスIL-17F(配列番号:19および20)双方の受容体として機能する。IL-17RCをコードするマウスcDNAクローン(配列番号:25)の解析から、約449アミノ酸残基(配列番号:27)の細胞外リガンド結合ドメインが明らかになった。さらに、リガンド結合ドメインを配列番号:28により表す。
【００６０】
変種マウスIL-17RCをコードするさらに別の例示的ヌクレオチド配列を、配列番号:29により提供する；コードされるポリペプチドを配列番号:30に示す。
【００６１】
IL-17RC遺伝子残基は、染色体3p25〜3p24に存在する。以下で考察するように、この領域は種々の障害および疾患と関連している。
【００６２】
ノーザン解析から、甲状腺、副腎、前立腺、および肝臓組織内にIL-17RC遺伝子の強い発現が存在し、心臓、小腸、胃、および気管組織内により少ない発現が存在することが示される。対照的に、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢血白血球、脊髄、リンパ節、および骨髄では、発現はほとんどまたは全く認められない。これらの知見から、種々の組織を区別するためにIL-17RC配列を使用できることが示される。
【００６３】
以下に記載するように、本発明は、配列番号:2の21〜692の参照アミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%、または95%を超えて、例えば96%、97%、98%、または99%を超えてもしくはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、(a) 配列番号:2のアミノ酸残基21〜452、(b) 配列番号:10のアミノ酸残基21〜435、(c) 配列番号:2のアミノ酸残基21〜677、および(d) 配列番号:2のアミノ酸残基1〜692からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸配列または配列番号:10のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。例示的ポリペプチドには、配列番号:2、配列番号:10、配列番号:11、または配列番号:12のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００６４】
本発明はまた、細胞外ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、細胞外ドメインが配列番号:2のアミノ酸配列のアミノ酸残基21〜452または配列番号:10のアミノ酸配列のアミノ酸残基21〜435を含む単離されたポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸残基453〜473を含む、細胞外ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在する膜貫通ドメインをさらに含み得る。これらのポリペプチドはまた、配列番号:2のアミノ酸残基474〜677または配列番号:10のアミノ酸残基457〜673を含む、膜貫通ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在する細胞内ドメイン、および任意に、配列番号:2のアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜20を含む、細胞外ドメインに対してアミノ末端位置に存在するシグナル分泌配列を含み得る。
【００６５】
本発明はまた、そのアミノ酸配列が配列番号:2のアミノ酸配列と、少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、または95%を上回る同一性からなる群より選択される同一性を共有する変種IL-17RCポリペプチドを含み、この場合、変種ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号:2のアミノ酸配列との間の任意の相違は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因する。
【００６６】
さらに、本発明はまた、IL-17F(例えば、配列番号:16に示されるヒトIL-17Fポリペプチド配列)と結合する上記の単離されたポリペプチドを提供する。ヒトIL-17Fポリヌクレオチド配列は、配列番号:15に示される。マウスIL-17Fポリヌクレオチド配列は配列番号:19に示され、対応するポリペプチドは配列番号:20に示される。本発明はまた、IL-17A(例えば、配列番号:14に示されるヒトIL-17Aポリペプチド配列)と結合する上記の単離されたポリペプチドを提供する。ヒトIL-17Aポリヌクレオチド配列は、配列番号:13に示される。マウスIL-17Aポリヌクレオチド配列は配列番号:17に示され、対応するポリペプチドは配列番号:18に示される。
【００６７】
本発明はまた、配列番号:2または3のアミノ酸配列の少なくとも15個連続したアミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドおよびエピトープを提供する。例示的ポリペプチドには、配列番号:2もしくは3を含むかもしくはそれからなるポリペプチド、その抗原エピトープ、またはその機能的IL-17AもしくはIL-17F結合断片が含まれる。さらに、本発明はまた、IL-17FまたはIL-17Aに結合する、その活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和する上記の単離されたポリペプチドを提供する。
【００６８】
本発明はまた、そのアミノ酸配列が配列番号:2のアミノ酸残基と、少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、または95%を上回る同一性、例えば96%、97%、98%の、または99%を上回るもしくはそれ以上の同一性からなる群より選択される同一性を共有する変種IL-17RCポリペプチドを含み、この場合、変種ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号:2の対応するアミノ酸配列との間の任意の相違は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因する。そのような保存的アミノ酸置換について、本明細書中に記載する。さらに、本発明はまた、IL-17FまたはIL-17Aに結合する、その活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和する上記の単離されたポリペプチドを提供する。
【００６９】
本発明は、薬学的に許容される担体、およびそのような発現ベクターまたはそのようなベクターを含む組換えウイルスの少なくとも1つを含む薬学的組成物をさらに提供する。本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載のポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物をさらに含む。
【００７０】
本発明はまた、IL-17RCポリペプチドおよび免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質において、免疫グロブリン部分は、ヒトFc断片などの免疫グロブリン重鎖定常領域であってよい。本発明は、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子をさらに含む。
【００７１】
本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明を参照することにより明らかになると考えられる。加えて、種々の参考文献が以下で確認されるが、これらは全体として参照により組み入れられる。
【００７２】
B) 定義
以下の説明においては、いくつかの用語が頻繁に用いられる。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００７３】
本明細書において用いる「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により作製された断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド(DNAおよびRNAなど)、もしくは天然ヌクレオチドの類似体(例えば、天然ヌクレオチドのα-鏡像異性体)、または両者の組み合わせである単量体から構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分に、および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による1つもしくは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、または糖はエーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造体と置換され得る。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似結合によって連結され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)、ホスホロジセレノエート(phosphorodiselenoate)、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホラニリデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミダートなどが含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に結合した天然または修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」もまた含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。
【００７４】
「核酸分子の相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較して逆方向の相補的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'と相補的である
【００７５】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００７６】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、その後そのmRNAが特定のポリペプチドに特有であるアミノ酸配列に翻訳される核酸分子を指す。
【００７７】
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNA中に組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された増殖因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００７８】
「核酸分子構築物」とは、天然には存在しない配置で組み合わせかつ並置された核酸の部分を含むように人間の介入により修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００７９】
「線状DNA」は、遊離の5'および3'末端を有する非環状DNA分子を意味する。線状DNAは、酵素消化または物理的破壊により、プラスミドなどの閉環状DNA分子から調製され得る。
【００８０】
「相補的DNA(cDNA)」とは、逆転写酵素によってmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的に、mRNAの一部と相補的なプライマーが、逆転写の開始に用いられる。当業者はまた、このような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指して、「cDNA」という用語を使用する。「cDNA」という用語はまた、RNA鋳型から合成されたcDNA分子のクローンも意味する。
【００８１】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、共通ヌクレオチド配列によって特徴づけられる場合が多い。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993))、サイクリックAMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990))、グルココルチコイド応答エレメント(GRE)、ならびにCRE/ATF(O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992))、AP2(Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994))、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB；Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993))、およびオクタマー因子などの他の転写因子の結合部位が含まれる(全般的には、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照されたい)。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質に応じて増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質による調節を受けない。抑制性プロモーターもまた公知である。
【００８２】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写開始点を含む、プロモーターの機能に不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し得るかまたは組織特異的活性を付与し得る特定の配列の非存在下で、検出可能な活性を有する場合もあれば有さない場合もある。
【００８３】
「調節エレメント」とは、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織、または細胞小器官において独占的にまたは優先的に転写を可能にする細胞因子と結合する核酸配列を含み得る。このような種類の調節エレメントは通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」様式で発現する遺伝子に付随している。
【００８４】
「エンハンサー」とは、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写効率を増大し得る調節エレメントの一種である。
【００８５】
「異種DNA」とは、所与の宿主細胞内に天然では存在しないDNA分子またはDNA分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち、外因性DNA)と結合している限り、宿主細胞種に由来するDNA(すなわち、内因性DNA)を含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNA部分に機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主DNA部分を含むDNA分子は、異種DNA分子であると見なされる。逆に、異種DNA分子は、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性遺伝子を含み得る。別の例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入される場合、異種DNAと見なされる。
【００８６】
「ポリペプチド」とは、天然で産生されようと合成で産生されようと、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは一般に、「ペプチド」と称される。
【００８７】
「タンパク質」とは、1本または複数本のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、糖質基などの非ペプチド成分を含み得る。糖質およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加され得、細胞の種類によって変化することになる。タンパク質は、本明細書ではそのアミノ酸骨格構造の観点から定義され；糖質基などの置換基は一般に規定しないが、それにもかかわらず存在する場合がある。
【００８８】
非宿主DNA分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００８９】
「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは典型的に、ベクターの必須の生物学的機能を失うことのない確定した様式で核酸分子の挿入を可能とする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択での使用に適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子には典型的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が含まれる。
【００９０】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において発現させる遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子はプロモーターに「機能的に連結された」と称される。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、機能的に連結されている。
【００９１】
「組換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本発明の状況において、組換え宿主の一例は発現ベクターからIL-17RCを産生する細胞である。対照的に、IL-17RCは、IL-17RCの「天然供給源」であり、発現ベクターを欠く細胞によって産生され得る。
【００９２】
「組込み形質転換体」とは、異種DNAが細胞のゲノムDNA中に組み込まれた組換え宿主細胞である。
【００９３】
「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば融合タンパク質は、親和性基質と結合するポリペプチドと融合されたIL-17RCポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより大量のIL-17RCを単離するための手段を提供する。
【００９４】
「受容体」という用語は、「リガンド」と称する生物活性分子に結合する細胞会合型タンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。受容体は、膜結合型受容体、細胞質受容体、または核内受容体であってよく；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、βアドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体、およびIL-6受容体)であってよい。膜結合型受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、および典型的にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造を特徴とする。特定の膜結合型受容体では、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別個のポリペプチド内に位置する。
【００９５】
一般に、リガンドが受容体に結合することで受容体の高次構造が変化し、これによって細胞内でエフェクタードメインと他の分子の相互作用が起こり、次いで細胞の代謝変化が生じる。受容体-リガンド相互作用と結びつけられることの多い代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【００９６】
「可溶性受容体」とは、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は最も一般的には、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびに糖ホスホイノシトール(gpi)を介するような細胞膜へのその他の結合を欠いているリガンド結合ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を提供するか、もしくは基材に対してポリペプチドを付着させるための部位を提供する親和性タグ、または免疫グロブリン定常領域配列などの付加的なアミノ酸残基を含み得る。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解により生成されるかまたは選択的スプライシングを受けたmRNAから翻訳される、天然の可溶性対応物を有する。可溶性受容体は単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体であってよく、多量体受容体は一般的に10個以上のサブユニットを含まず、好ましくは7個以上のサブユニットを含まず、最も好ましくは4個以上のサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドが膜貫通および細胞内ポリペプチド部分を実質的に含まないと称されるのは、このポリペプチドがこれらの部分のそれぞれ膜繋留またはシグナル伝達を提供するのに十分な部分を欠いている場合である。例えば、代表的な可溶性受容体には、配列番号:167(ポリヌクレオチド)および21(ポリペプチド)に示されるようなIL-17RAの可溶性受容体が含まれる。公知のサイトカイン受容体配列のどの配列が、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まずに細胞外サイトカイン結合ドメインを含むかを描写することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。さらに、当業者は遺伝子コードを用いて、そのような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００９７】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介してより大きなポリペプチドを方向づけるペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を示す。より大きなポリペプチドは通常、分泌経路を介した移行過程において、切断されて分泌ペプチドが除去される。
【００９８】
「単離されたポリペプチド」とは、天然状態でポリペプチドと会合している糖質、脂質、またはその他のタンパク質性不純物などの混入細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的に、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態の、すなわち少なくとも約80%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約95%純粋、95%を超えて純粋、例えば96%、97%、または98%もしくはそれ以上純粋、または99%を超えて純粋なポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後の、単一バンドの出現による。しかしながら「単離された」という用語は、二量体または他の様式でグリコシル化もしくは誘導体化された形態など、別の物理的形態での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００９９】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書において、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。その状況が可能である場合、これらの用語は、近接性または相対位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するとは限らない。
【０１００】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAから1つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。
【０１０１】
「スプライス変種」という用語は、本明細書において、遺伝子から転写される別の形態のRNAを示すために用いられる。スプライス変種は、転写後のRNA分子内の、またはあまり一般的ではないが転写後の別個のRNA分子間の、選択的スプライス部位の使用によって自然に起こり、同じ遺伝子から転写されたいくつかのmRNAを生じ得る。スプライス変種は、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。スプライス変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変種によってコードされるポリペプチドを示すために用いられる。
【０１０２】
本明細書において用いる「免疫調節物質」という用語には、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、共刺激分子、造血因子など、およびこれらの分子の合成類似体が含まれる。
【０１０３】
「相補体/抗相補体対」という用語は、適切な条件下において非共有結合された安定した対を形成する非同一な部分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補体/抗相補体対の典型的なメンバーである。その他の例示的な相補体/抗相補体対には、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンもしくはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対などが含まれる。相補体/抗相補体対が後に解離されることを所望する場合には、相補体/抗相補体対は109 M-1未満の結合親和性を有することが好ましい。
【０１０４】
「抗イディオタイプ抗体」とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本発明の状況において、抗イディオタイプ抗体は抗IL-17RC抗体の可変領域と結合し、したがって抗イディオタイプ抗体はIL-17RCのエピトープを模倣する。
【０１０５】
「抗体断片」とは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabなどの、抗体の一部である。構造とは無関係に、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗IL-17RCモノクローナル抗体断片は、IL-17RCのエピトープと結合する。
【０１０６】
「抗体断片」という用語には、軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位などの、特定の抗原に結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子改変ポリペプチドもまた含まれる。
【０１０７】
「キメラ抗体」とは、げっ歯類抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、抗体分子の残りの部分はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。
【０１０８】
「ヒト化抗体」とは、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域から、ヒト可変ドメインに移行された組換えタンパク質である。ヒトタンパク質に結合するかまたはそれを中和するような、ヒトにおける治療用途のためのマウス抗体に由来するヒト化抗体の構築は、当業者の技術の範囲内である。
【０１０９】
本明細書において用いる「治療薬」とは、抗体部分と結合されて治療に有用な複合体を生じる分子または原子である。治療薬の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が含まれる
【０１１０】
「検出可能な標識」とは、抗体部分と結合されて診断に有用な分子を生じる分子または原子である。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、またはその他のマーカー部分が含まれる。
【０１１１】
「親和性タグ」という用語は、本明細書において、第2ポリペプチドの精製もしくは検出を提供するか、または基材に対して第2ポリペプチドを付着させるための部位を提供する目的で、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチド部分を示すために用いられる。原理上は、抗体またはその他の特異的な結合剤が利用できる任意のペプチドまたはタンパク質を、親和性タグとして用いることができる。親和性タグには、ポリヒスチジン区域、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985)；Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991))、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988))、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985))、サブスタンスP、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。全般的には、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)を参照されたい。親和性タグをコードするDNA分子は、市販業者(例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から入手することができる。
【０１１２】
「裸の抗体」とは、抗体断片とは対照的に、治療薬と結合していない完全な抗体である。裸の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体などの特定の組換え抗体が含まれる。
【０１１３】
本明細書において用いる「抗体成分」という用語には、完全な抗体および抗体断片の両方が含まれる。
【０１１４】
「免疫複合体」とは、抗体成分と治療薬または検出可能な標識との複合体である。
【０１１５】
本明細書において用いる「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体成分およびIL-17RCポリペプチド成分を含む組換え分子を指す。抗体融合タンパク質の例には、IL-17RC細胞外ドメインおよびFcドメインまたは抗原結合領域を含むタンパク質が含まれる。
【０１１６】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」とは、少なくとも1つのエピトープを含み、かつ腫瘍細胞または感染性病原体抗原を保有する細胞などの標的細胞上に発現するアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対する主要組織適合遺伝子複合体分子によって提示されるペプチドエピトープを認識し、典型的に標的細胞を溶解するかまたは標的細胞の部位に他の免疫細胞を動員し、それにより標的細胞を死滅させる。
【０１１７】
「抗原ペプチド」とは、主要組織適合遺伝子複合体分子と結合して、T細胞によって認識されるMHC-ペプチド複合体を形成し、それによってT細胞への提示時に細胞傷害性リンパ球応答を誘導するペプチドである。したがって抗原ペプチドは、適切な主要組織適合遺伝子複合体分子に結合すること、および細胞溶解、または抗原を結合するもしくは発現する標的細胞に対する特定のサイトカインの放出などの細胞傷害性T細胞応答を誘導することができる。抗原ペプチドは、抗原提示細胞上でまたは標的細胞上で、クラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体分子に関して結合され得る。
【０１１８】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生させる。RNA転写産物が特定のmRNAの配列と相補的な配列を有するRNAポリメラーゼII鋳型を含むように、核酸分子を設計することができる。このようなRNA転写産物は「アンチセンスRNA」と称され、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合し、その結果mRNAの翻訳を阻害することができる。
【０１１９】
「IL-17RCに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「IL-17RCアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、(a) IL-17RC遺伝子の一部と安定した三重鎖を形成し得る、または(b) IL-17RC遺伝子のmRNA転写産物の一部と安定した二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１２０】
「リボザイム」とは、触媒中心を含む核酸分子である。この用語には、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己切断RNA、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子が含まれる。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と称される。
【０１２１】
「外部ガイド配列」とは、内因性リボザイムであるRNアーゼPを特定の細胞内mRNA種に導くことで、RNアーゼPによるmRNAの切断をもたらす核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と称される。
【０１２２】
「変種IL-17RC遺伝子」という用語は、配列番号:2の修飾物であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を指す。このような変種には、IL-17RC遺伝子の天然の多型、および配列番号:2のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子が含まれる。IL-17RC遺伝子のさらなる変種形態は、本明細書に記載するヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変種IL-17RC遺伝子は、その遺伝子が、配列番号:1もしくは配列番号:4のヌクレオチド配列またはその相補体を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかどうかを判定することによって、同定することができる。
【０１２３】
または、変種IL-17RC遺伝子は配列比較によって同定することができる。2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の一致を求めて整列させた際に同一である場合、2つのアミノ酸配列は「100%のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大の一致を求めて整列させた際に同一である場合、2つのヌクレオチド配列は「100%のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR(ウィスコンシン州、マディソン)製のLASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートに含まれるプログラムのような、標準的なソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。最適なアライメントを決定することによって2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するためのその他の方法は、当業者に周知である(例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)、Wu et al. (eds.), 「Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins」, Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)、およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)を参照されたい)。配列同一性を決定するための特定の方法については後述する。
【０１２４】
変種IL-17RC遺伝子または変種IL-17RCポリペプチドを同定するために用いる特定の方法にかかわらず、変種遺伝子または変種遺伝子によってコードされるポリペプチドは、抗IL-17RC抗体に特異的に結合する能力によって機能的に特徴づけられ得る。変種IL-17RC遺伝子または変種IL-17RCポリペプチドはまた、本明細書に記載の生物学的または生化学的アッセイ法を用いて、そのリガンド、例えばIL-17Aおよび/またはIL-17Fに結合する能力によって機能的に特徴づけられ得る。
【０１２５】
「対立遺伝子変種」という用語は、本明細書において、同じ染色体座を占める遺伝子の2つまたはそれ以上の別の形態のいずれかを示すために用いられる。対立遺伝子の変化は変異によって自然に生じ、集団内で表現型多型を生じ得る。遺伝子変異はサイレントである(コードされるポリペプチドに変化がない)場合もあれば、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。対立遺伝子変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされるタンパク質を示すために用いられる。
【０１２６】
「オーソログ」という用語は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示す。オーソログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【０１２７】
「パラログ」とは、生物によって作製される、異なるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは相互にパラログである。
【０１２８】
本発明は、IL-17RC遺伝子の機能的断片も含む。本明細書との関連において、IL-17RC遺伝子の「機能的断片」とは、本明細書に記載するドメインであるか、または少なくとも抗IL-17RC抗体と特異的に結合するIL-17RCポリペプチドの一部をコードする核酸分子を指す。
【０１２９】
標準的な解析法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは概数値であると理解される。このような値が「約」Xまたは「およそ」Xと表記される場合、Xの記載値は±10%で正確であると理解される。
【０１３０】
C) IL-17RAおよびIL-17RCポリヌクレオチドまたは遺伝子の作製
ヒトIL-17RAもしくはIL-17RC遺伝子をコードする核酸分子または本発明の可溶性ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドは、配列番号:1、配列番号:4に基づくポリヌクレオチドプローブを使用して、ヒトcDNAライブラリーまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技法は標準的であって十分に確立されており、市販業者より入手可能なクローニングキットを用いて達成することができる。例えば、Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons 1995；Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997；Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972)；Huynh et al., 「Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11」, DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49 (IRL Press, 1985)；Wu (1997), pages 47-52を参照されたい。
【０１３１】
ヒトIL-17RAまたはIL-17RC遺伝子をコードする核酸分子はまた、IL-17RAまたはIL-17RC遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列に基づいたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得ることができる。PCRを用いてライブラリーをスクリーニングする一般的な方法は、例えば、Yu et al., 「Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries」, Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993によって提供されている。さらに、PCRを用いて関連遺伝子を単離する技法は、例えば、Preston, 「Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members」, Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993によって記載されている。別法として、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載のヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することにより、IL-17RAまたはIL-17RC遺伝子を得ることもできる(例えば、Ausubel (1995)を参照されたい)。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法により、少なくとも2 kb長のDNA分子を合成する能力が提供される(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)、Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993)、Dillon et al., 「Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes」, Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press. Inc. 1993)、およびHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995))。ポリヌクレオチド合成の総説に関しては、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994)、Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984)、およびClimie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)を参照されたい。
【０１３２】
D) IL-17RAまたはIL-17RC遺伝子変種の作製
本発明は、本明細書に開示するIL-17RAまたはIL-17RCポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含む種々の核酸分子を提供する。当業者は、遺伝暗号の縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間で相当数の配列変化が可能であることを容易に認識すると考えられる。さらに本発明は、配列番号:2の受容体ポリペプチドと実質的に相同であるIL-17RCの少なくとも一部を含む単離された可溶性単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体ポリペプチドもまた提供する。したがって本発明は、配列番号:1または配列番号:4の縮重ヌクレオチドを含むIL-17RAまたはIL-17RCポリペプチドコード核酸分子およびそれらのRNA同等物を意図する。
【０１３３】
当業者は、遺伝暗号の縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間で相当数の配列変化が可能であることを容易に認識すると考えられる。配列番号:7は、配列番号:2のIL-17RCポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。配列番号:7の縮重配列はまた、TをUに置換することにより配列番号:2をコードするすべてのRNA配列を提供することを、当業者は認識すると考えられる。したがって本発明は、配列番号:1のヌクレオチド154〜ヌクレオチド2229を含むIL-17RCポリペプチドコード核酸分子およびそれらのRNA同等物を意図する。同様に、配列番号:6のIL-17RC-1縮重配列もまた、TをUに置換することにより、配列番号:5をコードするすべてのRNA配列を提供する。
【０１３４】
表4は、縮重ヌクレオチド位置を示すための1文字コードを示す。「解」とは、コード文字により示されるヌクレオチドである。「相補体」は、相補的ヌクレオチドのコードを示す。例えば、コードYはCまたはTを示し、その相補体RはAまたはGを示し、AはTと相補的であり、GはCと相補的である。
【０１３５】
【表４】
2009510093.tif 000006
【０１３６】
所与のアミノ酸について可能なすべてのコドンを包含する縮重コドンを表5に記載する。
【０１３７】
【表５】
2009510093.tif 000007
【０１３８】
当業者は、アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代表する縮重コドンの決定において、多少のあいまいさが導入されることを理解すると考えられる。例えば、セリンの縮重コドン(WSN)は、場合によってはアルギニン(AGR)をコードし、またアルギニンの縮重コドン(MGN)は、場合によってはセリン(AGY)をコードし得る。フェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間にも、同様の関係が存在する。このように、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードする可能性があるが、当業者は、配列番号:6のアミノ酸配列を参照することにより、そのような変種配列を容易に同定することができる。変種配列は、本明細書に記載する通りに機能性に関して容易に試験することができる。
【０１３９】
様々な種が「優先的コドン使用」を示し得る。全般的には、Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980)、Haas et al., Curr. Biol. 6:315 (1996)、Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981)、Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982)、Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986)、Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982)、Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994)、Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995)、およびMakrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996)を参照されたい。本明細書で用いる「優先的コドン使用」または「優先的コドン」という用語は、ある種の細胞で最も高い頻度で使用され、そのため各アミノ酸をコードする可能なコドン(表5を参照されたい)の中でも1個または少数のコドンが優先されるタンパク質翻訳コドンを指す専門用語である。例えば、アミノ酸スレオニン(Thr)はACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされ得るが、哺乳動物細胞では、ACCが最も一般的に用いられるコドンである；その他の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌では、異なるThrコドンが優先的であり得る。当技術分野で公知の様々な方法により、特定の種における優先的なコドンを、本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。例えば、優先的コドン配列を組換えDNAに導入することによって、特定の細胞型または種において、タンパク質の翻訳をより効率的にすることでタンパク質の産生を高めることができる。したがって、本明細書に開示する縮重コドン配列は、当技術分野で一般的に用いられ本明細書において開示する様々な細胞型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先的コドンを含む配列を、様々な種において発現に関して試験し、最適化することができ、また本明細書に開示するように機能性に関して試験することができる。
【０１４０】
完全なもしくは部分的なヒトcDNAで、または開示した配列に基づく1組もしくは複数組の縮重プローブでプロービングするなどの種々の方法により、IL-17RAまたはIL-17RCをコードするcDNAを単離することができる。また、本明細書に開示する代表的なヒトIL-17RAまたはIL-17RC配列から設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAをクローニングすることもできる。加えて、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができ、関心対象のcDNAの発現をIL-17RAまたはIL-17RCポリペプチドに対する抗体で検出することができる。
【０１４１】
当業者は、配列番号:1に開示する配列がヒトIL-17RCの1つの対立遺伝子を表すこと、ならびに対立遺伝子の変化および選択的スプライシングが起こると予想されることを理解すると考えられる。この配列の対立遺伝子変種は、異なる個体に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを標準的な手順に従ってプロービングすることにより、クローニングすることができる。サイレント変異を含む変種、および変異がアミノ酸配列の変化を生じる変種を含む、本明細書に開示するヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は本発明の範囲内であり、また本明細書に開示するアミノ酸配列の対立遺伝子変種であるタンパク質についても同様である。IL-17RCポリペプチドの特徴を保持する、選択的スプライシングを受けたmRNAから作製されたcDNA分子も本発明の範囲に含まれ、またこのようなcDNAおよびmRNAによってコードされるポリペプチドについても同様である。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当技術分野で公知の標準的な手順に従って、様々な個体または組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによって、クローニングすることができる。
【０１４２】
上記の方法を用いて、当業者は、配列番号:1もしくは配列番号:4と実質的に相同であるIL-17RC受容体サブユニットの一部を含むか、または配列番号:2もしくは配列番号:5のすべてもしくは断片またはその対立遺伝子変種をコードし、かつ野生型IL-17RC受容体のリガンド結合特性を保持する可溶性受容体をコードする種々のポリペプチドを調製することができる。このようなポリペプチドはまた、本明細書において一般的に開示するような付加的なポリペプチド部分を含んでもよい。
【０１４３】
本発明の特定の態様において、単離された核酸分子は、本明細書に開示するヌクレオチド配列を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。例えば、このような核酸分子は、配列番号:1もしくは配列番号:4のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、または配列番号:1もしくは配列番号:4と相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。
【０１４４】
一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱融点(Tm)より約5℃低く選択される。Tmとは、標的配列の50%が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする(規定のイオン強度およびpHにおける)温度である。ハイブリダイゼーション後に核酸分子を洗浄して、ハイブリダイズしていない核酸分子をストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下で除去することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987)；Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987)；およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照されたい。OLIGO 6.0(LSR；ミネソタ州、ロングレイク)およびPrimer Premier 4.0(Premier Biosoft International；カリフォルニア州、パロアルト)などの配列解析ソフトウェア、ならびにインターネット上のサイトは、ユーザー定義の基準に基づいた所与の配列の解析およびTmの計算に利用できるツールである。特定のポリヌクレオチドハイブリッドと共に用いるためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を適合化することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１４５】
本発明はまた、配列番号:2(IL-17RC)および配列番号:21(IL-17RA)のポリペプチドまたはそれらのオーソログと実質的に類似した配列同一性を有する、単離されたIL-17RAまたはIL-17RCポリペプチドを提供する。「実質的に類似した配列同一性」という用語は、本明細書において、配列番号:2に示される配列またはそれらのオーソログと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、例えば96%、97%、98%の、または95%を上回る配列同一性を有するポリペプチドを示すために用いられる。例えば、変種およびオーソログIL-17RAまたはIL-17RC受容体を用いて免疫応答を生じさせること、およびヒトIL-17RAまたはIL-17RCに対する交差反応性抗体を産生させることができる。このような抗体は、ヒト化すること、および本明細書に記載する通りに改変すること、ならびに乾癬、乾癬性関節炎、IBD、IBS、大腸炎、内毒素血症を治療するために、および本明細書に記載するその他の治療用途において治療的に用いることができる。
【０１４６】
本発明はまた、2つの基準：コードされるポリペプチドと配列番号:2(IL-17RC)または配列番号:21(IL-17RA)のアミノ酸配列との間の類似性の決定、およびハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて同定され得るIL-17RAまたはIL-17RC変種核酸分子も意図する。そのような変種には、(1) 洗浄のストリンジェンシーが55〜65℃での0.1% SDSを含む0.5x〜2x SSCと同等であるストリンジェントな洗浄条件下で、IL-17RCに関する配列番号:1または配列番号:4のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズした状態を維持する、および(2) 配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を上回る、例えば96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。または、IL-17RC変種は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが50〜65℃での0.1% SDSを含む0.1x〜0.2x SSCと同等である高度にストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号:1または配列番号:4のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズした状態を維持する、および(2) 配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を上回る、例えば96%、97%、98%、または99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１４７】
パーセント配列同一性は従来の方法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。簡潔に説明すると、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ1、および表6(アミノ酸は標準的な1文字コードで表示)に示すHenikoff and Henikoff(前記)の「BLOSUM62」スコア行列を用いて、2つのアミノ酸配列をアライメントスコアが最適となるように整列させる。次いで、パーセント同一性を以下のように算出する：([完全な一致の総数]/[長い方の配列の長さ＋2つの配列を整列させる目的で長い方の配列に導入されたギャップの数])(100)。
【０１４８】
【表６】
2009510093.tif 000008
【０１４９】
当業者であれば、2つのアミノ酸配列を整列させるために利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性探索アルゴリズムは、本明細書に開示するアミノ酸配列と推定IL-17RC変種のアミノ酸配列によって共有される同一性レベルを調べるのに適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムについては、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)によって記載されている。簡潔に説明すると、FASTAでは最初に、問い合わせ配列(例えば、配列番号:2または配列番号:3)と試験配列によって共有される、最も高い同一性密度(ktup変数が1の場合)または同一性対(ktup＝2の場合)を有する領域を、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく同定することにより、配列類似性を特徴づける。次いで、同一性密度の最も高い10個の領域を、アミノ酸置換行列を用いて対のアミノ酸すべての類似性を比較することにより再スコア化し、最高のスコアに寄与する残基のみを含めるように領域の末端を「切り詰める」。「カットオフ」値(配列の長さおよびktup値に基づき、所定の式により算出される)よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合には、切り詰めた当初の領域を調べて、その領域を結合してギャップを含む近似のアラインメントを形成できるかどうかを決定する。最後に、2つのアミノ酸配列の最もスコアの高い領域を、アミノ酸の挿入および欠失を認める改良Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))を用いて整列させる。FASTA解析の例示的なパラメータは：ktup＝1、ギャップオープンペナルティ＝10、ギャップ伸長ペナルティ＝1、および置換行列＝BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のAppendix 2に説明されているようにスコア行列ファイル(「SMATRIX」)を改良することによって、FASTAプログラムに導入することができる。
【０１５０】
FASTAを使用して、上記の比を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列を比較する場合には、ktup値を1〜6、好ましくは3〜6、最も好ましくは3とし、他のパラメータを上記の通りに設定し得る。
【０１５１】
本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、IL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中のアルキルアミノ酸に対してアルキルアミノ酸が置換された、IL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中の芳香族アミノ酸に対して芳香族アミノ酸が置換された、IL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸に対して硫黄含有アミノ酸が置換された、IL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中の水酸基含有アミノ酸に対して水酸基含有アミノ酸が置換された、IL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中の酸性アミノ酸に対して酸性アミノ酸が置換された、IL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸に対して塩基性アミノ酸が置換された、またはIL-17RAもしくはIL-17RCアミノ酸配列中の二塩基性一カルボキシル基アミノ酸に対して二塩基性一カルボキシル基アミノ酸が置換された、配列番号:2または21の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む変種を得ることができる。一般的なアミノ酸の中で、例えば「保存的アミノ酸置換」は、以下の群のそれぞれにおけるアミノ酸間の置換によって説明される：(1) グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2) フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3) セリンおよびスレオニン、(4) アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5) グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6) リジン、アルギニン、およびヒスチジン。BLOSUM62表は、500を超える関連タンパク質群の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列部分の約2,000の局所的多重アライメントに由来するアミノ酸置換行列である(Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))。したがって、BLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を規定することができる。(上記のように)化学的特性のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という用語は好ましくは、-1を上回るBLOSUM62値で示される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3というBLOSUM62値により特徴づけられる場合に保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、1、2、または3)というBLOSUM62値により特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2(例えば、2または3)というBLOSUM62値により特徴づけられる。IL-17RCの特定の変種は、アミノ酸配列の変化が1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因して、対応するアミノ酸配列(例えば、配列番号:2または21)と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を上回る、例えば96%、97%、98%、または99%もしくはそれ以上の配列同一性を有することにより特徴づけられる。
【０１５２】
IL-17RAまたはIL-17RC遺伝子における保存的アミノ酸変化は、例えば、配列番号:1または配列番号:4に列挙されるヌクレオチドに対してヌクレオチドを置換することにより導入することができる。そのような「保存的アミノ酸」変種は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる突然変異誘発などにより得ることができる(Ausubel (1995)；およびMcPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)を参照されたい)。変種IL-17RCポリペプチドは、抗IL-17RC抗体と特異的に結合する能力により同定することができる。
【０１５３】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基も含み得る。天然に存在しないアミノ酸には、非限定的に、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンが含まれる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に導入するいくつかの方法が、当技術分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑制するインビトロ系を用いることができる。アミノ酸を合成する方法およびtRNAをアミノアシル化する方法は、当技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳は典型的に、大腸菌(E. coli) S30抽出物、ならびに市販の酵素およびその他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーによって精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)、Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)、Chung et al., Science 259:806 (1993)、およびChung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)を参照されたい。
【０１５４】
第2の方法では、変異mRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAをマイクロインジェクションすることにより、アフリカツメガエル卵母細胞において翻訳を行う(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996))。第3の方法では、置換しようとする天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の非存在下、かつ天然に存在しない所望のアミノ酸(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で、大腸菌細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然対応物の代わりにタンパク質中に取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994)を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾を部位特異的突然変異誘発と併用して、置換の範囲をさらに拡張することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395 (1993))。
【０１５５】
IL-17RAまたはIL-17RCのアミノ酸残基に対して、限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、および非天然アミノ酸を置換することができる。
【０１５６】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャン突然変異誘発などの、当技術分野において公知の手順に従って同定することができる(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989)、Bass et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991)、Coombs and Corey, 「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」, Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998))。後者の技法においては、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入し、得られた変異分子を生物活性について試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)もまた参照されたい。
【０１５７】
配列解析を用いてIL-17RAまたはIL-17RCリガンド結合領域をさらに規定することができるが、IL-17RAまたはIL-17RC結合活性(Il-17AまたはIL-17Fに対するIL-17RCの結合、およびIL-17Aに対するIL-17RAの結合など)において役割を果たすアミノ酸はまた、推定接触部位アミノ酸の変異と併用して、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または光親和性標識のような技法で決定される構造の物理的解析によって決定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992)を参照されたい。具体的には、3つのドメインが同定された：
1) ドメイン1(配列番号:159および160)は、IL-17RCのエキソン8〜10を含む。これは、(配列番号:2)のIL-17RCx1のアミノ酸残基193〜276および(配列番号:166)のIL-17RCx4のアミノ酸残基208〜291に対応する。
2) ドメイン2(配列番号:161および162)は、IL-17RCのエキソン11〜13を含む。これは、(配列番号:2)のIL-17RCx1のアミノ酸残基277〜370および(配列番号:166)のIL-17RCx4のアミノ酸残基292〜385に対応する。
3) ドメイン3(配列番号:163および164)は、IL-17RCのエキソン8〜10を含む。これは、(配列番号:2)のIL-17RCx1のアミノ酸残基371〜447および(配列番号:166)のIL-17RCx4のアミノ酸残基386〜462に対応する。
【０１５８】
Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53 (1988))またはBowie and Sauer(Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))によって開示されているような、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換を作製して試験することができる。簡潔に説明すると、これらの著者らは、ポリペプチド中の2か所またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで変異誘発ポリペプチドの配列を決定して、各位置における許容可能な置換の範囲を決定する方法について開示している。用いることができるその他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991)、Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Huse, WO 92/06204)、および領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986)、およびNer et al., DNA 7:127, (1988))が含まれる。さらに、ビオチンまたはFITCで標識したIL-17RCまたはIL-17RAを、IL-17RCリガンドの発現クローニングのために用いることができる。
【０１５９】
開示するIL-17RCまたはIL-17RAのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の変種は、Stemmer, Nature 370:389 (1994)、Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)、およびWO 97/20078により開示されているDNAシャフリングによって作製することもできる。簡潔に説明すると、親DNAのランダムな断片化およびこれに続くPCRを用いた再構築による、ランダムに導入された点変異を生じるインビトロ相同組換えによって、変種DNA分子が作製される。この技法は、対立遺伝子変種または異なる種に由来するDNA分子などの親DNA分子のファミリーを用いて改良することで、この過程にさらなる多様性を導入することができる。所望の活性の選択またはスクリーニングの後に、突然変異誘発およびアッセイをさらに繰り返すことにより、所望の変異を選択しつつ同時に有害な変化に対して選択することによる配列の速やかな「進化」が提供される。
【０１６０】
本明細書に開示する突然変異誘発法をハイスループット自動スクリーニング法と併用して、宿主細胞内のクローン化変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる。生物活性のあるポリペプチド、または抗IL-17RC抗体もしくは抗IL-17RA抗体と結合するポリペプチドをコードする変異誘発DNA分子を宿主細胞から回収し、最新装置を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法により、関心対象のポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができ、またこれらの方法は未知の構造のポリペプチドにも適用することができる。
【０１６１】
本発明はまた、IL-17RCまたはIL-17RAポリペプチドの「機能的断片」、およびそのような機能的断片をコードする核酸分子を含む。これらの機能的断片は、1つまたは複数のリガンド(すなわち、IL-17AおよびIL-17F)と個々にまたは共に結合し得る。核酸分子の常用的な欠失解析を行い、IL-17RCまたはIL-17RAポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。例として、配列番号:1または配列番号:4のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連の入れ子状態の欠失体を得ることができる。次いで、これらの断片を適切な読み枠で発現ベクターに挿入し、発現したポリペプチドを単離して、抗IL-17RC抗体と結合する能力に関して試験する。エキソヌクレアーゼ消化に代わる別の方法では、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて、所望の断片の産生を特定化するために欠失または終止コドンを導入する。または、ポリメラーゼ連鎖反応により、IL-17RCまたはIL-17RA遺伝子の特定の断片を合成することができる。
【０１６２】
この一般的アプローチは、Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)によって要約されている、インターフェロンの片側または両側の末端における切断に関する研究によって例証される。さらに、タンパク質の機能解析の標準的な技法は、例えば、Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993)、Content et al., 「Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon」, Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff, 1987)、Herschman, 「The EGF Receptor」, Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985)、Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995)；Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995)；Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)、およびMeisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)により記載されている。
【０１６３】
本発明はまた、本明細書に開示するアミノ酸配列と比較してアミノ酸変化を有する、IL-17RCまたはIL-17RA遺伝子の機能的断片を意図する。変種IL-17RCまたはIL-17RA遺伝子は、上記のように、開示のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することにより、構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変種遺伝子を同定する別のアプローチでは、潜在的変種IL-17RCまたはIL-17RA遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号:1または配列番号:4などのヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズし得るかどうかを決定する。
【０１６４】
本発明はまた、IL-17RCまたはIL-17RAポリペプチドの機能的断片、IL-17RCおよび/またはIL-17RAポリペプチドの抗原エピトープ、エピトープ含有部分、またはリガンド結合部分、ならびにIL-17RCおよび/またはIL-17RAポリペプチドのそのような機能的断片、抗原エピトープ、エピトープ含有部分、またはリガンド結合部分をコードする核酸分子の使用を含む。そのような断片は、IL-17AもしくはIL-17FまたはIL-17AおよびIL-17Fの双方と結合する、その活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和する可溶性受容体または結合分子の作製において使用するためのポリペプチドを作製するために用いられる。本明細書において定義する「機能的な」IL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドまたはその断片は、IL-17Aおよび/もしくはIL-17F炎症、増殖、もしくは分化活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、もしくは中和する能力、特殊な細胞機能を誘導もしくは阻害する能力、またはIL-17Aおよび/もしくはIL-17Fに特異的に結合する能力を特徴とする。本明細書において先に記載したように、IL-17RAおよびIL-17RCは、本明細書に記載する独特のサイトカイン受容体構造およびドメインを特徴とする。したがって本発明は、(a) 上記のドメインの1つまたは複数を含むポリペプチド分子；および(b) これらのドメインの1つまたは複数を含む機能的断片を含む融合タンパク質の使用をさらに意図する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、IL-17様受容体、IL-17RA、IL-17RE、IL-17RDなどの別のサイトカイン受容体により、または融合タンパク質の分泌を促進する非天然および/もしくは非関連の分泌シグナルペプチドにより付与され得る。
【０１６５】
本発明はまた、本明細書に記載のIL-17RCまたはIL-17RAポリペプチドのリガンド結合部分を含むポリペプチド断片またはペプチドを提供する。このような断片またはペプチドは、それぞれのリガンド(IL-17Aおよび/またはIL-17F)に結合するIL-17RCまたはIL-17RAの部分を含み得る。
【０１６６】
変種および融合タンパク質を含む任意のIL-17RCまたはIL-17RAポリペプチドに関して、当業者は、上記の表1および表2に記載の情報を用いて、そのような変種をコードする完全な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に作製することができる。さらに当業者は、標準的なソフトウェアを用いて、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に基づいてIL-17RCまたはIL-17RA変種を考案することができる。
【０１６７】
E) IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの産生
全長ポリペプチド；可溶性の単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体；全長受容体；受容体断片(例えば、リガンド結合断片および抗原エピトープ)、機能的断片、および融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って組換え宿主細胞において産生させることができる。IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA遺伝子を発現させるには、ポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにおいて転写発現を制御する調節配列に機能的に連結し、次いでこれを宿主細胞に導入しなければならない。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、翻訳調節配列、および発現ベクターを有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含み得る。
【０１６８】
真核細胞における外来タンパク質の産生に適した発現ベクターは典型的に、(1) 細菌宿主における発現ベクターの増殖および選択を提供するための細菌複製開始点および抗生物質耐性マーカーをコードする原核生物DNAエレメント；(2) プロモーターなどの、転写の開始を制御する真核生物DNAエレメント；および（3）転写終結/ポリアデニル化配列などの、転写産物のプロセシングを制御するDNAエレメントを含む。上述したように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導く分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、IL-17RC発現ベクターは、IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA遺伝子、ならびに任意の分泌遺伝子に由来する分泌配列を含み得る。
【０１６９】
本発明のIL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RAタンパク質は、哺乳動物細胞において発現させることができる。適切な哺乳動物宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎細胞(Vero；ATCC CRL 1587)、ヒト胚腎細胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、ベビーハムスター腎細胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、イヌ腎細胞(MDCK；ATCC CCL 34)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986))、ラット下垂体細胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC CCL2.2)、ラット肝細胞癌細胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40形質転換サル腎細胞(COS-1；ATCC CRL 1650)、およびマウス胚細胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)が含まれる。
【０１７０】
哺乳動物宿主の場合、転写および翻訳調節シグナルは、調節シグナルが高レベル発現を有する特定の遺伝子と関連している、例えばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどの哺乳動物ウイルス起源に由来し得る。適切な転写および翻訳調節配列は、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネイン遺伝子などの哺乳動物遺伝子から得ることもできる。
【０１７１】
転写調節配列は、RNA合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982))、ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight, Cell 31:355 (1982))、SV40初期プロモーター(Benoist et al., Nature 290:304 (1981))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982))、サイトメガロウイルスプロモーター(Foecking et al., Gene 45:101 (1980))、およびマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターが含まれる(一般的には、Etcheverry, 「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照されたい)。
【０１７２】
または、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合には、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターなどの原核生物プロモーターを用いて、哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御することができる(Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990)、およびKaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991))。
【０１７３】
特定の態様において、IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA可溶性受容体ポリペプチド、またはIL-17RC、IL-17RA、もしくはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの断片をコードするDNA配列は、発現ベクターにおいて、一般的に転写プロモーターおよびターミネーターを含むその発現に必要な他の遺伝子エレメントに機能的に連結させる。ベクターはやはり一般的に、1つまたは複数の選択マーカーおよび1つまたは複数の複製開始点を含むが、当業者であれば、特定の系においては選択マーカーが別個のベクターに提供されてもよく、外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノムへの組込みによって提供され得ることを認識すると考えられる。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、およびその他のエレメントの選択は、当業者のレベル内での日常的な設計事項である。そのような多くのエレメントが文献に記載されており、市販業者を通して入手することができる。可溶性受容体複合体の複数の成分は、個々の発現ベクターにおいて同時にトランスフェクションすることができ、または単一の発現ベクターに含めることができる。タンパク質複合体の複数の成分を発現させるそのような技術は、当技術分野において周知である。
【０１７４】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、微粒子銃を介した送達、エレクトロポレーションなどを含む種々の標準的な技法を用いて、宿主細胞に導入することができる。トランスフェクションされた細胞を選択して増殖させることで、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞が得られる。ベクターを真核細胞に導入する技法、および優性選択マーカーを用いてそのような安定した形質転換体を選択する技法は、例えば、Ausubel (1995)、およびMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)によって記載されている。
【０１７５】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を提供する遺伝子である。この場合、選択はG-418などのネオマイシン系薬剤の存在下で行われる。選択系を用いて関心対象の遺伝子の発現レベルを増大させることもでき、この過程は「増幅」と称される。増幅は、形質転換体を低レベルの選択薬剤の存在下で培養し、次いで選択薬剤を増量して、導入遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択することによって行われる。適切な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)である。その他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。または、緑色蛍光タンパク質などの表現型変化を導入するマーカー、またはCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼなどの細胞表面タンパク質を用いて、FACS選別または磁気ビーズ分離技術のような手段により、トランスフェクションされていない細胞からトランスフェクションされた細胞を選別することができる。
【０１７６】
本発明のポリペプチドはまた、ウイルス送達系を用いて培養哺乳動物細胞によって産生され得る。この目的における例示的なウイルスには、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)が含まれる。2本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは、現在最も詳しく研究されている異種核酸送達用の遺伝子移入ベクターである(総説に関しては、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)、およびDouglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)を参照されたい)。アデノウイルス系の利点には、比較的大きなDNA挿入物を収容できること、高力価になるまで増殖可能なこと、広範囲の哺乳動物細胞型に感染可能なこと、および種々のプロモーターを含む多くの利用可能なベクターとの使用を可能にする柔軟性が含まれる。
【０１７７】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることにより、異種DNAのより大きな挿入物(最長7 kb)を収容することができる。これらの挿入物は、直接連結によって、または同時にトランスフェクションしたプラスミドとの相同組換えによって、ウイルスDNAに取り込まれ得る。1つの選択肢はウイルスベクターから必須のE1遺伝子を欠失させることであって、その結果ウイルスベクターは、E1遺伝子が宿主細胞から提供されない限り、複製することができない。アデノウイルスベクター感染ヒト293細胞(ATCC番号CRL-1573、45504、45505)を、例えば、接着細胞としてまたは比較的高い細胞密度の懸濁培養で培養して、かなりの量のタンパク質を産生させることができる(Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)を参照されたい)。
【０１７８】
本発明のポリペプチドは、鳥類、真菌、昆虫、酵母、または植物細胞などの他の高等真核細胞で発現させることもできる。バキュロウイルス系は、クローニングされた遺伝子を昆虫細胞に導入するための効率的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcMNPV)に基づき、ショウジョウバエ熱ショックタンパク質(hsp)70プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス前初期遺伝子プロモーター(ie-1)および遅延型初期39Kプロモーター、バキュロウイルスp10プロモーター、ならびにショウジョウバエメタロチオネインプロモーターなどの周知のプロモーターを含む。組換えバキュロウイルスを作製する第2の方法では、Luckow(Luckow  et al., J. Virol. 67:4566 (1993))によって記載されているトランスポゾンに基づく系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系は、BAC-to-BACキット(Life Technologies、メリーランド州、ロックビル)として販売されている。この系は、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、PFASTBAC(Life Technologies)を利用して、「バクミド(bacmid)」と称される大型プラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムに、ポリペプチドをコードするDNAを移動させる。Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、およびChazenbalk, and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照されたい。加えて、トランスファーベクターは、発現させるポリペプチドのC末端またはN末端における、エピトープタグ、例えばGlu-Gluエピトープタグ(Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985))をコードするDNAとのインフレームの融合体を含み得る。当技術分野において公知の技法を用いて、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含むトランスファーベクターを大腸菌に形質転換し、組換えバキュロウイルスの指標となる中断されたlacZ遺伝子を含むバクミドをスクリーニングする。次いで、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAを、通常の技法により単離する。
【０１７９】
例示的なPFASTBACベクターは、かなりの程度まで改変することができる。例えば、ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現し、分泌タンパク質の発現に有利なことが示されているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Pcor、p6.9、またはMPプロモーターとしても知られている)と置換することができる(例えば、Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、およびChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照されたい)。このようなトランスファーベクター構築物では、短いまたは長い種類の塩基性タンパク質プロモーターを使用することができる。さらに、天然の分泌シグナル配列を、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列と置換するトランスファーベクターを構築することができる。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen Corporation；カリフォルニア州、カールズバッド)、またはバキュロウイルスgp67(PharMingen：カリフォルニア州、サンディエゴ)に由来する分泌シグナル配列を構築物において使用し、天然のIL-17RC分泌シグナル配列を置換することができる。
【０１８０】
組換えウイルスまたはバクミドは、宿主細胞をトランスフェクションするために用いられる。適切な昆虫宿主細胞には、Sf9(ATCC CRL 1711)、Sf21AE、およびSf21(Invitrogen Corporation；カリフォルニア州、サンディエゴ)などのヨトウガ(Spodoptera frugiperda)蛹卵巣細胞株IPLB-Sf-21由来細胞株、ならびにショウジョウバエSchneider-2細胞、およびイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来HIGH FIVEO細胞株(Invitrogen)(米国特許第5,300,435号)が含まれる。市販の無血清培地を用いて、これらの細胞を培養および維持することができる。適切な培地は、Sf9細胞に関してはSf900 II(商標)(Life Technologies)またはESF 921(商標)(Expression Systems)であり；およびイラクサギンウワバ細胞に関してはEx-cellO405(商標)(JRH Biosciences、カンザス州、レネックサ)またはExpress FiveO(商標)(Life Technologies)である。組換えウイルスを使用する場合、細胞は典型的に約2〜5 x 105個細胞の播種密度から1〜2 x 106個細胞の密度まで増殖させ、その時点で組換えウイルス保存液を0.1〜10、より典型的には約3の感染効率(MOI)で添加する。
【０１８１】
バキュロウイルス系で組換えタンパク質を産生させるための確立された技法は、Bailey et al., 「Manipulation of Baculovirus Vectors」, Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991)、Patel et al., 「The baculovirus expression system」, DNA Cloning 2: Expression Systems. 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995）、Ausubel (1995), pages 16-37〜16-57、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995）、およびLucknow, 「Insect Cell Expression Technology」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996）によって提供されている。
【０１８２】
酵母細胞を含む真菌細胞を用いて、本明細書に記載の遺伝子を発現させることもできる。この点において特に対象となる酵母種には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)が含まれる。酵母における発現に適したプロモーターには、GAL1(ガラクトース)、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、ADH(アルコール脱水素酵素)、AOX1(アルコールオキシダーゼ)、HIS4(ヒスチジノール脱水素酵素)などのプロモーターが含まれる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手することができる。これらのベクターには、YIpに基づくベクター(Yip5など)、YRpベクター(YRp17など)、YEpベクター(YEp13など)、およびYCpベクター(YCp19など)が含まれる。外因性DNAでS. セレビシエ細胞を形質転換し、それらから組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasaki et al.、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Welch et al.、米国特許第5,037,743号、およびMurray et al.、米国特許第4,845,075号によって開示されている。形質転換細胞は、選択マーカーによって決定される表現型、一般的に薬剤耐性または特定の栄養素(例えば、ロイシン)の非存在下で増殖する能力により選択される。サッカロミセス・セレビシエにおける使用に適したベクター系は、Kawasaki et al.(米国特許第4,931,373号)によって開示されているPOT1ベクター系であり、これはグルコース含有培地中での増殖により形質転換細胞の選択を可能にする。酵母における使用に適したさらなるプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素遺伝子(例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsman et al.、米国特許第4,615,974号、およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照されたい)およびアルコール脱水素酵素遺伝子のものが含まれる。米国特許第4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号、および第4,661,454号もまた参照されたい。
【０１８３】
ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギリエルモンジイ(Pichia guillermondii)、およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含むその他の酵母の形質転換系も、当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986)、およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス属(Aspergillus)細胞は、McKnight et al.、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用することができる。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、Sumino et al.、米国特許第5,162,228号によって開示されている。ニューロスポラ属(Neurospora)を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号によって開示されている。
【０１８４】
例えば、組換えタンパク質を産生させるための宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、Raymond、米国特許第5,716,808号、Raymond、米国特許第5,736,383号、Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998)により、ならびにWO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536、およびWO 98/02565において開示されている。P. メタノリカの形質転換に使用するDNA分子は通常、二本鎖環状プラスミドとして調製し、好ましくは線状化してから形質転換に使用する。P. メタノリカでポリペプチドを産生させる場合、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、P. メタノリカアルコール利用遺伝子(AUG1またはAUG2)などのP. メタノリカ遺伝子のものであってよい。その他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸脱水素酵素(FMD)、およびカタラーゼ(CAT)遺伝子のものが含まれる。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するには、プラスミドの発現部分全体が、両末端において宿主DNA配列と隣接していることが好ましい。ピキア・メタノリカにおける使用に適した選択マーカーはP. メタノリカADE2遺伝子であり、これはホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC；EC 4.1.1.21)をコードし、アデニンの非存在下でade2宿主細胞の増殖を可能とする。メタノールの使用を最小限に抑えることが望ましい大規模な産業工程の場合には、両メタノール利用遺伝子(AUG1およびAUG2)が欠損している宿主細胞を用いることができる。分泌タンパク質を産生させる場合、宿主細胞は、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4およびPRB1)が欠損していてよい。関心対象のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドのP. メタノリカ細胞への導入を促進するには、エレクトロポレーションが用いられる。P. メタノリカ細胞は、電場強度2.5〜4.5 kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cm、および時定数(t) 1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の指数関数的に減衰するパルス電場を用いるエレクトロポレーションにより形質転換することができる。
【０１８５】
発現ベクターは、植物プロトプラスト、無傷の植物組織、または単離された植物細胞に導入することもできる。発現ベクターを植物組織に導入する方法には、植物組織のアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いた直接感染または共培養、微粒子銃を介した送達、DNA注入、エレクトロポレーションなどが含まれる。例えば、Horsch et al., Science 227:1229 (1985)、Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)、およびMiki et al., 「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993）を参照されたい。
【０１８６】
または、原核生物宿主細胞において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることができる。原核生物宿主においてIL-17RCポリペプチドを発現させるために用いることのできる適切なプロモーターは当業者に周知であり、これには、T4、T3、Sp6、およびT7ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、バクテリオファージλのPRおよびPLプロモーター、大腸菌のtrp、recA、熱ショック、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA、およびlacZプロモーター、枯草菌(B. subtilis)のプロモーター、バシラス属(Bacillus)のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセス属(Streptomyces)プロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターが含まれる。原核生物のプロモーターについては、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987)、およびAusubel et al. (1995)により概説されている。
【０１８７】
有用な原核生物宿主には、大腸菌および枯草菌が含まれる。大腸菌の適切な株には、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF'、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、およびER1647が含まれる(例えば、Brown (ed.),  Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照されたい)。枯草菌の適切な株には、BR151、YB886、MI119、MI120、およびB170が含まれる(例えば、Hardy, 「Bacillus Cloning Methods」, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)を参照されたい)。
【０１８８】
本発明のポリペプチドを大腸菌などの細菌で発現させる場合、ポリペプチドは、典型的に不溶性の顆粒として細胞質中に維持され得るか、または細菌の分泌配列によって細胞膜周辺腔に導かれ得る。前者の場合は、細胞を溶解し、顆粒を回収して、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性させる。次いで、尿素溶液ならびに還元および酸化グルタチオンの混合物に対して透析を行い、次に緩衝生理食塩水溶液に対して透析を行うなどして、変性剤を希釈することにより、変性ポリペプチドを再び折りたたんで二量体化することができる。後者の場合は、細胞を破砕して(例えば、超音波処理または浸透圧ショックによる)細胞膜周辺腔の内容物を放出させ、タンパク質を回収することにより、変性および再折りたたみを必要とすることなく、ポリペプチドを細胞膜周辺腔から可溶型でかつ機能的な形態で回収することができる。
【０１８９】
タンパク質を原核生物宿主で発現させる方法は、当業者に周知である(例えば、Williams et al., 「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995）、Ward et al., 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995）、およびGeorgiou, 「Expression of Proteins in Bacteria」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照されたい）。
【０１９０】
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫、および植物細胞に導入する標準的な方法は、例えばAusubel (1995)によって提供されている。
【０１９１】
哺乳動物細胞系により産生される外来タンパク質を発現させて回収する一般的な方法は、例えば、Etcheverry, 「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)によって提供されている。細菌系により産生されたタンパク質を回収する標準的な技法は、例えば、Grisshammer et al., 「Purification of over-produced proteins from E. coli cells」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995）によって提供されている。組換えタンパク質をバキュロウイルス系から単離する確立された方法は、Richardson (ed.),  Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)によって記載されている。
【０１９２】
別の方法として、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分的固相法、断片縮合、または古典的な溶液合成により合成することができる。これらの合成法は当業者に周知である(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)、Stewart et al., 「Solid Phase Peptide Synthesis」 (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)、Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)、Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)、Fields and Colowick, 「Solid-Phase Peptide Synthesis」, Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)、およびLloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を参照されたい)。「天然の化学的連結」および「発現タンパク質連結」などの、全体的な化学合成戦略の変法もまた標準的である(例えば、Dawson et al., Science 266:776 (1994)、Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997)、Muir et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998)、およびSeverinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)を参照されたい)。
【０１９３】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2、5、または21の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む。例として、ポリペプチドは、配列番号:2、5、および/または21の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含み得る。本発明の特定の態様において、ポリペプチドは、これらのアミノ酸配列の20、30、40、50、100個、またはそれ以上の連続した残基を含む。そのようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーおよびプローブとして有用である。
【０１９４】
さらに、本発明のポリペプチドおよびその断片は、高等真核細胞において、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体として発現させることができる。そのような細胞を用いて、IL-17RCポリペプチドの少なくとも一部を(「IL-17RC含有受容体」または「IL-17RC含有受容体ポリペプチド」)、IL-17RCおよびIL-17RAの一部を共に(単量体、ホモ二量体、またはヘテロ二量体として)含むIL-17RC単量体、ホモニ量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体ポリペプチドを産生させることができ、またはそのような細胞をスクリーニング系におけるアッセイ細胞として用いることができる。本発明の1つの局面においては、IL-17RCまたはIL-17RA細胞外ドメインの少なくともリガンド結合部分を含む本発明のポリペプチドを培養細胞によって産生させ、この細胞を用いて、天然受容体、IL-17FおよびIL-17Aを含む受容体のリガンド、またはさらには天然リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする。このアプローチを要約すると、受容体をコードするcDNAまたは遺伝子を、その発現に必要な他の遺伝子エレメント(例えば、転写プロモーター)と結合し、得られた発現ベクターを宿主細胞に挿入する。DNAを発現し、機能的受容体を産生する細胞を選択して、これを種々のスクリーニング系において用いる。単量体、ホモニ量体、ヘテロニ量体、および多量体受容体複合体の各成分は、同じ細胞で発現させることができる。さらに、単量体、ホモニ量体、ヘテロニ量体、および多量体受容体複合体の成分を、膜貫通ドメインまたはその他の膜融合部分に融合して、上記のように複合体を構築させ、トランスフェクタントをスクリーニングすることもできる。
【０１９５】
本発明のポリペプチドをアッセイするために、IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RA受容体またはIL-17AもしくはIL-17Fに結合することが公知である他の受容体の発現(例えば、IL-17Rを発現する細胞)、ならびに受容体媒介性シグナルの伝達に使用するのに適した哺乳動物細胞には、IL-17RCと機能的複合体を形成し得る他の受容体サブユニットを発現する細胞が含まれる。発現させようとする受容体と同じ種由来の細胞を用いることもまた好ましい。好ましい態様において、細胞は、その増殖のために外因的に提供される造血増殖因子に依存する。この種の好ましい細胞株は、GM-CSF依存性ヒト白血病細胞株であるヒトTF-1細胞株(ATCC番号CRL-2003)およびAML-193細胞株(ATCC番号CRL-9589)、ならびにIL-3依存性マウスプレB細胞株であるBaF3(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985))である。その他の細胞株には、BHK、COS-1、およびCHO細胞が含まれる。適切な宿主細胞を、必要な受容体サブユニット、または所望の細胞応答に必要とされるその他の細胞成分を産生するよう操作することができる。細胞株は任意の種に由来する受容体サブユニットを発現するように操作することができ、それによって種特異性から生じる潜在的限界が克服されるため、このアプローチは有利である。ヒト受容体cDNAの種オーソログをクローニングし、例えばBaF3細胞株におけるマウスcDNAのように、同じ種に由来する細胞株において用いることができる。GM-CSFまたはIL-3などの1つの造血増殖因子に依存的である細胞株をこのように操作して、IL-17FまたはIL-17Aなどの、IL-17RCまたはIL-17RA受容体を介して作用する別のサイトカインに依存するようにさせることができる。
【０１９６】
機能的受容体を発現する細胞は、スクリーニングアッセイにおいて用いられる。種々の適切なアッセイ法が当技術分野において公知である。これらのアッセイ法は、標的細胞における生物学的応答の検出に基づく。このような1つのアッセイ法は、細胞増殖アッセイ法である。細胞を被験化合物の存在下または非存在下で培養し、例えば、トリチウムチミジンの取り込みを測定することにより、または3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)の代謝分解に基づく比色アッセイ法により、細胞増殖を検出する(Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983))。別のアッセイ形式では、レポーター遺伝子を発現するようにさらに操作された細胞を使用する。レポーター遺伝子を、受容体連関経路に応答するプロモーターエレメントと連結し、アッセイによりレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。この点で好ましいプロモーターエレメントは、血清応答エレメントまたはSREである。例えば、Shaw et al., Cell 56:563-572, (1989)を参照されたい。そのような好ましいレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である(de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987))。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当技術分野において公知の方法を用いて発光により検出する(例えば、Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-29101, (1994)；Schenborn and Goiffin, Promega_Notes 41:11, 1993)。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えばPromega Corp.、ウィスコンシン州、マディソンから市販されている。この種の標的細胞株を用いて、化学物質のライブラリー、細胞馴化培地、真菌ブロス、土壌試料、水試料などをスクリーニングすることができる。例えば、細胞馴化培地試料のバンクを標的細胞においてアッセイしてリガンドを産生する細胞を同定することができる。次いで、陽性細胞を用いて哺乳動物発現ベクターにおけるcDNAライブラリーを作製し、これをプールに分割し、宿主細胞にトランスフェクションして、発現させる。次に、トランスフェクションした細胞に由来する培地試料をアッセイし、続いて陽性細胞のプールを分割し、再度トランスフェクションして継代培養し、再度アッセイして、リガンドをコードするクローン化cDNAを単離する。
【０１９７】
本発明により提供されるさらなるスクリーニングアプローチは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を含む。これらのハイブリッドポリペプチドは、2つの一般的クラスに分類される。第1のクラスでは、IL-17RCの細胞内ドメインが、第2受容体のリガンド結合ドメインに連結されている。第2のクラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第2受容体、好ましくは造血サイトカイン受容体の細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインと共に、IL-17RC(配列番号:3)およびIL-17RA(配列番号:X)の細胞外(リガンド結合)ドメインを含む。この第2クラスの本発明の受容体のこのようなハイブリッド単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体は、第2受容体によって伝達されるシグナルに応答し得ることが公知である細胞において発現させる。同時に、これら2つのクラスのハイブリッド受容体は、IL-17FまたはIL-17Aを検出するアッセイ法を開発するための応答細胞型の同定を可能にする。さらに、このような細胞は、IL-17FまたはIL-17Aの存在下で用いて、競合型のアッセイ法において本発明の可溶性受容体アンタゴニストをアッセイすることができる。このようなアッセイでは、本発明の可溶性受容体の存在下におけるIL-17FまたはIL-17Aの増殖またはシグナル伝達活性の減少によって、拮抗活性が実証される。さらに、細胞に基づくアッセイ法であるIL-17RC可溶性受容体結合アッセイ法を用いて、可溶性受容体がIL-17FまたはIL-17Aと結合するかどうか、その活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するかどうかを評価することができる。
【０１９８】
F) IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA融合タンパク質および複合体の作製
IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA類似体の1つの一般的なクラスは、本明細書に開示するアミノ酸配列の変異であるアミノ酸配列を有する変種である。IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA類似体の別の一般的なクラスは、後述するように抗イディオタイプ抗体およびその断片によって提供される。さらに、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体を類似体として使用することができる(例えば、Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)を参照されたい）。抗イディオタイプIL-17RC抗体の可変ドメインはIL-17RCに類似しているため、これらのドメインはIL-17RC結合活性を提供し得る。抗イディオタイプ触媒抗体を作製する方法は、当業者に公知である(例えば、Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992)、Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994)、およびAvalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)を参照されたい）。
【０１９９】
IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA類似体を同定するための別のアプローチは、コンビナトリアルライブラリーの使用により提供される。ファージディスプレイライブラリーおよびその他のコンビナトリアルライブラリーを構築してスクリーニングする方法は、例えば、Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996)、Verdine、米国特許第5,783,384号、Kay, et al.、米国特許第5,747,334号、およびKauffman et al.、米国特許第5,723,323号によって提供される。
【０２００】
IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドは、インビボおよびインビトロ用途の両方を有する。例として、可溶型のIL-17RCを細胞培養液に添加して、培養細胞によって産生されるIL-17RCリガンド(すなわち、IL-17F、IL-17A、またはその両方)の効果を阻害することができる。
【０２０１】
IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RAの融合タンパク質を用いて、対応するポリペプチドを発現させ単離することができる。後述するように、特定のIL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA融合タンパク質はまた、診断および治療において用途を有する。ある種の融合タンパク質は、組換え宿主細胞からIL-17RCポリペプチドを導くペプチドを含む。IL-17RCポリペプチドを真核生物宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列(シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる)がIL-17RC発現ベクター中に提供される。分泌シグナル配列はIL-17RCに由来してもよいが、適切なシグナル配列は別の分泌タンパク質に由来してもよく、または新規に合成してもよい。分泌シグナル配列は、2つの配列が正確な読み枠で結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くよう配置されるように、IL-17RCコード配列に機能的に連結する。分泌シグナル配列は一般的に、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'側に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象のヌクレオチド配列の他所に位置してもよい(例えば、Welch et al.、米国特許第5,037,743号；Holland et al.、米国特許第5,143,830号を参照されたい)。
【０２０２】
哺乳動物細胞によって産生されるIL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RAの分泌シグナル配列(例えば、米国特許第5,641,655号に記載されている組織型プラスミノーゲンアクチベーターのシグナル配列)は、組換え哺乳動物宿主における対応するポリペプチドの発現に有用であるが、酵母細胞における発現には酵母のシグナル配列が好ましい。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母接合フェロモンα因子(MFα1遺伝子によりコードされる)、インベルターゼ(SUC2遺伝子によりコードされる)、または酸性ホスファターゼ(PHO5遺伝子によりコードされる)に由来するものである。例えば、Romanos et al., 「Expression of Cloned Genes in Yeast」, DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), pages 123-167 (Oxford University Press 1995)を参照されたい。
【０２０３】
本発明の可溶性受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、配列番号:3のすべてもしくは一部を含むポリペプチド、または非ヒト受容体の対応する領域をコードする切断型DNAを発現させることにより調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通および細胞内ポリペプチド部分を実質的に含まない形態で調製することが好ましい。宿主細胞からの受容体ドメインの輸送を指示するため、受容体DNAは、t-PA分泌ペプチドなどの分泌ペプチドをコードする第2のDNA部分と連結させる。分泌された受容体ドメインの精製を容易にするため、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988)；Eastman Kodak Co.、コネチカット州、ニューヘブンから市販されている)、または抗体もしくはその他の特異的結合剤が利用できる別のポリペプチドもしくはタンパク質などのC末端伸長物を、受容体ポリペプチドに融合させることができる。
【０２０４】
別のアプローチにおいては、IL-17RC、IL-17RA、またはIL-17RC/IL-17RAの受容体細胞外ドメインまたはその一部を共に、免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的には2つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが可変領域を欠くFc断片との融合体として発現させることができる(Sledziewski, AZ et al.、米国特許第6,018,026号および第5,750,375号を参照されたい)。本発明の可溶性ポリペプチドには、このような融合体が含まれる。このような1つの融合体を配列番号:64に示す。このような融合体は典型的に、Fc部分が相互にジスルフィド結合し、2つの受容体ポリペプチドが相互に近接して配置された多量体分子として分泌される。この種の融合体は、インビトロアッセイ手段として溶液から同族リガンドをアフィニティー精製するため、リガンドを特異的に滴定することによりインビトロでシグナルを遮断する、阻害する、または減少させるため、および融合体を非経口投与して循環するリガンドと結合させ、それを循環から除去することによるインビボでのアンタゴニストとして用いることができる。リガンドを精製するためには、IL-17RC、IL-17RA、およびIL-17RC/IL-17RA-Igキメラを、受容体-リガンド結合を促進する条件(典型的には、生理的温度、pH、およびイオン強度近傍)下で、リガンドを含む試料(例えば、細胞馴化培地または組織抽出物)に添加する。次いで、キメラ-リガンド複合体を、固体支持体(例えば、不溶性樹脂ビーズ)上に固定化されたプロテインAを用いて混合物から分離する。次に、塩またはpH勾配を用いるなど従来の化学的技法により、リガンドを溶出する。別法では、キメラ自体を固体支持体に結合し、結合および溶出を上記の通り行うことができる。キメラは、血清アミロイドA(SAA)、C反応性タンパク質(CRP)などの急性期応答を含む炎症反応を調節するために、インビボで用いることができる。結合親和性が高いキメラを、(例えば、筋肉内、皮下、または静脈内注入により)非経口投与する。循環する分子はリガンドと結合し、通常の生理的過程により循環から除去される。アッセイに用いるためには、Fc領域を介してキメラを支持体に結合し、ELISA形式で使用する。
【０２０５】
本発明のポリペプチドの単離を支援するためには、リガンド結合受容体(または、抗体、相補体/抗相補体対の1つのメンバー)またはその結合断片および市販のバイオセンサー装置(BIAcore、Pharmacia Biosensor、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)を用いるアッセイ系を有利に使用することができる。そのような受容体、抗体、相補体/抗相補体対のメンバー、または断片は、受容体チップの表面上に固定化する。この装置の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991、およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993により開示されている。受容体、抗体、メンバー、または断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金フィルムに結合しているデキストラン繊維に共有結合する。被験試料をセルに通過させる。リガンド、エピトープ、または相補体/抗相補体対の逆のメンバーが試料中に存在する場合、これは固定化された受容体、抗体、またはメンバーにそれぞれ結合し、媒体の屈折率の変化が生じ、金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系により、そこから結合親和性を計算することができる結合速度および解離速度の決定、ならびに結合の化学量論の評価が可能になる。または、リガンド/受容体結合は、SELDI(商標)技術(Ciphergen, Inc.、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて解析することもできる。
【０２０６】
リガンド結合受容体ポリペプチドはまた、当技術分野において公知の他のアッセイ系において使用することもできる。そのような系には、結合親和性を決定するためのスキャッチャード解析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949を参照されたい)、および熱量測定アッセイ法(Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991；Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991)が含まれる。
【０２０７】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体、および1つまたは複数のポリペプチド融合体を含む関連の多量体タンパク質を提供する。例えば、可溶性IL-17RC、IL-17RA、またはIL-17RC/IL-17RA受容体ポリペプチドは、米国特許第5,155,027号および第5,567,584号に開示されている二量体化タンパク質との融合体として調製することができる。この点における好ましい二量体化タンパク質には、免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えばIgGγ1、およびヒトκ軽鎖が含まれる。本発明の免疫グリブリン-可溶性融合体を遺伝子改変細胞において発現させて、種々の多量体IL-17RC、IL-17RA、またはIL-17RC/IL-17RA受容体類似体を生成することができる。補助的ドメインを本発明の可溶性ポリペプチドに融合して、これを特定の細胞、組織、または高分子(例えば、コラーゲン、またはIL-17FもしくはIL-17Aを発現している細胞)に標的化することができる。本発明のポリペプチドは、精製のための親和性タグおよび標的化ドメインなどの2つまたはそれ以上の部分に融合させることもできる。ポリペプチド融合体はまた、1つまたは複数の切断部位を特にドメイン間に含んでもよい。Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996を参照されたい。
【０２０８】
細菌細胞では、発現させるタンパク質の毒性を低減し、安定性を高め、また回収を増進させるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現させることが望ましい場合がある。例えば、IL-17RC(または本発明の任意のポリペプチド)は、グルタチオンS-トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質として発現させることができる。グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質は典型的に可溶性であり、固定化グルタチオンカラムで大腸菌溶解物から容易に精製することができる。同様のアプローチにおいて、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むIL-17RC融合タンパク質を、アミロース樹脂カラムで単離することができ、また切断型プロテインA遺伝子のC末端を含む融合タンパク質を、IgG-セファロースを用いて精製することができる。異種ポリペプチドを融合タンパク質として細菌細胞中で発現させる確立された技法は、例えば、Williams et al., 「Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies」, DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)により記載されている。さらに、市販の発現系を利用することができる。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム(Promega Corporation；ウィスコンシン州、マディソン)は、発現中にビオチン化されるポリペプチドを含む融合タンパク質を、アビジンを含む樹脂によって単離する方法を提供する。
【０２０９】
原核細胞または真核細胞によって発現される異種ポリペプチドを単離するのに有用なペプチドタグには、ポリヒスチジンタグ(ニッケルキレート樹脂に対する親和性を有する)、c-mycタグ、カルモジュリン結合タンパク質(カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーで単離される)、サブスタンスP、RYIRSタグ(抗RYIRS抗体と結合する)、Glu-Gluタグ、およびFLAGタグ(抗FLAG抗体と結合する)が含まれる。例えば、Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996)、Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996)、およびZheng et al., Gene 186:55 (1997)を参照されたい。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えばSigma-Aldrich Corporation(ミズーリ州、セントルイス)から入手することができる。
【０２１０】
融合タンパク質の別の形態は、本発明のポリペプチドおよび免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的には2つまたは3つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが可変領域を欠くFc断片を含む。例として、Chang et al.、米国特許第5,723,125号では、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンFc断片を含む融合タンパク質について記載している。インターフェロンのC末端は、ペプチドリンカー部分によりFc断片のN末端に連結される。ペプチドリンカーの一例は、免疫学的に不活性である主にT細胞不活性配列を含むペプチドである。例示的なペプチドリンカーは、アミノ酸配列：GGSGG SGGGG SGGGG S(配列番号:9)を有する。このような融合タンパク質において、例示的なFc部分はヒトγ4鎖であり、これは溶液中で安定であり、かつ補体活性化活性をほとんどまたは全くもたない。したがって本発明は、配列番号:2、5、または21のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドのような、IL-17RC部分のC末端がペプチドリンカーを介してFc断片のN末端に結合している、IL-17RCまたはIL-17RCおよびIL-17RA部分ならびにヒトFc断片を含むIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA融合タンパク質を意図する。IL-17RCおよびIL-17RA部分はいずれも、細胞外ドメインまたはその任意の断片であってよい。例えば、融合タンパク質は、配列番号:3のアミノ酸およびFc断片(例えば、ヒトFc断片)を含み得る(配列番号:64)。そのような融合タンパク質の別の例は、Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RAのエキソン1〜6およびIL-17RCx1のエキソン8〜16を含む変種1454(配列番号:157および158)である。変種1454はまた、ヒトIL-17RA由来の天然シグナルペプチドを有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
【０２１１】
別の変形例では、本発明の融合タンパク質は、IgG配列、IgG配列のアミノ末端に共有結合しているIL-17RC、IL-17RA、またはIL-17RC/IL-17RA部分、およびIL-17RCまたはIL-17RA部分のアミノ末端に共有結合しているシグナルペプチドを含み、IgG配列は以下の順序で以下のエレメントからなる：ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。したがって、IgG配列はCH1ドメインを欠いている。これらの部分は、IL-17Aおよび/またはIL-17Fと結合する能力など、本明細書に記載の生物活性を示すべきである。抗体部分および非抗体部分の両方を含む融合タンパク質を作製するこの一般的なアプローチは、LaRochelle et al., EP 742830(WO 95/21258)により記載されている。
【０２１２】
IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA部分およびFc部分を含む融合タンパク質は、例えばインビトロアッセイ手段として使用することができる。例えば、IL-17RC-免疫グロブリン融合タンパク質を用いて生物試料中のIL-17Fの存在を検出することができ、この場合、IL-17RC部分はリガンドを結合するために用いられ、プロテインAまたは抗Fc抗体などの高分子は、融合タンパク質を固体支持体に結合させるために用いられる。このような系を用いて、アゴニスト、ならびにIL-17ファミリーリガンド、例えばIL-17FまたはIL-17AおよびIL-17F双方のそれらの受容体に対する結合を妨げるアンタゴニストを同定することができる。
【０２１３】
本発明はさらに、様々な他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、所望の生物学的機能を付与する(例えば、IL-17Aを結合する)ドメインの一部またはすべてをIL-17RCの一部に付加して、このサイトカイン受容体ファミリーの別のメンバー(すなわち、IL-17RA)に由来する機能的に等価なドメインを加え、異なる分子(すなわち、IL-17RC/IL-17RA)を作製することができる。ポリペプチド融合体を組換え宿主細胞で発現させて、種々のこれら融合類似体を生成することができる。IL-17RC、IL-17RA、またはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドは、精製のための親和性タグおよび標的化ドメインなどの2つまたはそれ以上の部分またはドメインに融合させることができる。ポリペプチド融合体はまた、1つまたは複数の切断部位を特にドメイン間に含んでもよい。例えば、Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996)を参照されたい。
【０２１４】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製して、それらを化学的に結合することにより、当業者に公知の方法によって調製することができる。または、融合タンパク質の両成分を適切な読み枠でコードするポリヌクレオチドを公知の技法で作製して、本明細書に記載する方法により発現させることができる。融合タンパク質の酵素的切断および化学的切断の一般的な方法は、例えば、Ausubel (1995), pages 16-19〜16-25によって記載されている。
【０２１５】
IL-17RCおよび/またはIL-17RA結合ドメインは、リガンドアゴニストの推定接触部位アミノ酸の変異と併用して、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または光親和性標識のような技法で決定される構造の物理的解析によって、さらに特徴づけることができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992)を参照されたい。
【０２１６】
本発明はまた、ポリペプチドがポリマーと連結された、化学的に修飾されたIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA組成物を意図する。例示的なIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドは、アミノ酸残基配列番号:3またはXからなるポリペプチドのような、機能的な膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチドである。典型的にポリマーは水溶性であり、そのため複合体は生理環境などの水性環境で沈殿しない。適切なポリマーの一例は、アシル化用の活性エステルまたはアルキル化用のアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾されたポリマーである。このようにすることで、重合の程度を制御することができる。反応性アルデヒドの一例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノ-(C1〜C10)アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である(例えば、Harris et al.、米国特許第5,252,714号を参照されたい)。このようなポリマーは、分枝状であっても非分枝状であってもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いてIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA複合体を作製することもできる。
【０２１７】
治療に用いられる本発明の複合体は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含み得る。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1〜C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマーが含まれる。適切なPEGは、例えば5,000、12,000、20,000、および25,000を含む約600〜約60,000という分子量を有し得る。IL-17RC複合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物を含んでもよい。
【０２１８】
IL-17RC複合体の一例は、IL-17RC部分(またはIL-17RC/IL-17RA部分)、およびIL-17RC部分のN末端に結合されたポリアルキルオキシド部分を含む。PEGは、1つの適切なポリアルキルオキシドである。例として、IL-17RC(またはIL-17RC/IL-17RA)はPEGで修飾することができ、その過程は「ペグ化」として知られている。IL-17RCのペグ化は、当技術分野において公知であるペグ化反応のいずれかによって行うことができる(例えば、EP 0 154 316、Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)、および Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)を参照されたい)。例えば、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いたアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。別のアプローチでは、IL-17RC複合体は、PEGの末端水酸基またはアミノ基が活性化リンカーによって置換されている活性化PEGを縮合することによって形成される(例えば、Karasiewicz et al.、米国特許第5,382,657号を参照されたい)。
【０２１９】
アシル化によるペグ化は典型的に、PEGの活性エステル誘導体をIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドと反応させることを必要とする。活性化PEGエステルの一例は、N-ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたPEGである。本明細書で用いる「アシル化」という用語には、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAと水溶性ポリマーとの間の以下の種類の結合が含まれる：アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によってペグ化IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAを調製する方法は、典型的に、(a) 1つまたは複数のPEG基がIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAに結合する条件下で、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドをPEG(PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステルなど)と反応させる段階、および(b) 反応産物を得る段階を含む。一般に、アシル化反応の最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、PEG:IL-17RC(またはPEG:IL-17RC/IL-17RA)の比が大きいほど、ポリペグ化IL-17RC(またはIL-17RC/IL-17RA)産物の割合は大きくなる。
【０２２０】
アシル化によるペグ化産物は典型的に、リジンε-アミノ基がアシル連結基を介してペグ化されたポリペグ化産物である。連結する結合の一例はアミドである。典型的に、得られたIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAは少なくとも95%がモノペグ化、ジペグ化、またはトリペグ化されているが、反応条件に応じてより高次のペグ化が形成される場合もある。ペグ化種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの標準的な精製法を用いて、非結合IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドから分離することができる。
【０２２１】
アルキル化によるペグ化は一般に、還元剤の存在下で、PEGの末端アルデヒド誘導体をIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAと反応させることを含む。PEG基は、-CH2-NH基を介してポリペプチドに結合され得る。
【０２２２】
モノペグ化産物を生成するための還元的アルキル化による誘導体化は、誘導体化に利用される異なる種類の一級アミノ基の異なる反応性を利用している。典型的に反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のN末端残基のα-アミノ基とのpKaの差を利用できるpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される。ポリマーとの結合は、リジン側鎖アミノ基などの他の反応基を有意に修飾することなく、主にタンパク質のN末端で起こる。本発明は、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAモノポリマー複合体の実質的に均一な調製物を提供する。
【０２２３】
モノポリマーIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA複合体分子の実質的に均一な集団を生成するための還元的アルキル化は、(a) IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAのアミノ末端でのα-アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したpHにおける還元的アルキル化条件下で、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドを反応性PEGと反応させる段階、および(b) 反応産物を得る段階を含み得る。還元的アルキル化に使用する還元剤は、水溶液中で安定であり、還元的アルキル化の初期過程で形成されるシッフ塩基のみを還元し得るべきである。例示的な還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランが含まれる。
【０２２４】
モノポリマーIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA複合体の実質的に均一な集団に関して、還元的アルキル化反応条件は、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAのN末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能とする条件である。そのような反応条件は一般に、リジンアミノ基とN末端のα-アミノ基とのpKaの差を提供する。pHはまた、使用するポリマーとタンパク質の比に影響を及ぼす。一般に、N末端α-基の反応性が低いほど最適な条件を得るためにより多くのポリマーを必要とすることから、pHが低いほど、タンパク質に対してより過剰なポリマーが必要となる。pHが高ければ、より多くの反応基を利用できることから、ポリマー:IL-17RC(またはポリマー:IL-17RC/IL-17RA)はそれほど大きい必要はない。典型的に、pHは3〜9または3〜6の範囲内である。この方法は、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA含有ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体可溶性受容体複合体を作製するために用いることができる。
【０２２５】
検討すべき別の要因は、水溶性ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合され得るポリマー分子の数は減少する。ペグ化反応に関して、典型的な分子量は、約2 kDa〜約100 kDa、約5 kDa〜約50 kDa、または約12 kDa〜約25 kDaである。水溶性ポリマーとIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAのモル比は、一般に1:1〜100:1の範囲である。典型的に、水溶性ポリマーとIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAのモル比は、ポリペグ化に関して1:1〜20:1であり、モノペグ化に関して1:1〜5:1である。
【０２２６】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含む複合体を作製する一般的な方法は、当技術分野において公知である。例えば、Karasiewicz et al.、米国特許第5,382,657号、Greenwald et al.、米国特許第5,738,846号、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996)、Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)を参照されたい。この方法は、IL-17RC含有ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体可溶性受容体複合体を作製するために用いることができる。
【０２２７】
本発明は、本明細書に記載の可溶性受容体または抗体などのペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を意図する。そのような組成物は担体をさらに含み得る。担体は、従来の有機または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０２２８】
G) IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して少なくとも約80%の純度まで、少なくとも約90%の純度まで、少なくとも約95%の純度まで、または95%を超える、例えば96%、97%、98%の、もしくは99%を超える純度まで精製することができ、感染物質および発熱物質を含まない。本発明のポリペプチドはまた、99.9%を超えて純粋である薬学的に純粋な状態まで精製することもできる。特定の調製物において、精製ポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０２２９】
分画法および/または従来の精製法を用いて、天然源(例えば、ヒト組織源)から精製されたIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAの調製物、合成IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチド、ならびに組換え宿主細胞から精製された組換えIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドおよび融合IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドを得ることができる。一般に、試料の分画には、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出を用いることができる。例示的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC、および逆相高速液体クロマトグラフィーを含み得る。適切なクロマトグラフィー媒体には、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどが含まれる。PEI、DEAE、QAE、およびQ誘導体が適している。例示的なクロマトグラフィー媒体には、フェニル-セファロースFF(Pharmacia)、Toyopearlブチル650(Toso Haas、ペンシルバニア州、モンゴメリービル)、オクチル-セファロース(Pharmacia)などの、フェニル基、ブチル基、もしくはオクチル基で誘導体化された媒体；またはAmberchrom CG 71(Toso Haas)などのポリアクリル樹脂が含まれる。適切な固体支持体には、使用時の条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などが含まれる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、および/または炭水化物部分によってタンパク質の結合を可能にする反応基で修飾することができる。
【０２３０】
カップリング化学の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体が含まれる。これらおよびその他の固体媒体は当技術分野において周知であって、広く使用されており、また市販業者から入手することができる。ポリペプチドを単離および精製するための特定の方法の選択は、常用的な設計の問題であり、一つには選択した支持体の性質によって決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988)、およびDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照されたい。
【０２３１】
IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAの単離および精製のさらなる変形例を、当業者は考案することができる。
【０２３２】
本発明のポリペプチドはまた、特定の性質を利用して単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーを用いて、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質をはじめとする、ヒスチジンに富んだタンパク質を精製することができる。簡潔に説明すると、最初にゲルに二価金属イオンを充填し、キレートを形成する(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985))。ヒスチジンに富んだタンパク質は、使用した金属イオンに応じて様々な親和性でこの基質に吸着され、競合溶出、pHの低下、または強力なキレート剤の使用により溶出される。他の精製法には、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が含まれる(M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990))。本発明のさらなる態様では、関心対象のポリペプチドとアフィニティータグ(例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン)との融合体を構築することで、精製が促進され得る。さらに、本発明の可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドのリガンド結合特性を、例えばIL-17RC含有可溶性受容体の精製に利用することができ；例えばこれは、IL-17Fリガンドをカラムに結合しておき、IL-17RC含有受容体を結合させ、その後標準的なクロマトグラフィー法を用いて溶出するアフィニティークロマトグラフィーによる。
【０２３３】
IL-17RC、IL-17RA、もしくはIL-17RC/IL-17RAポリペプチド、またはその断片は、上記のように化学合成により調製することもできる。これらのポリペプチドは、単量体であっても多量体であってもよく；グリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよく；ペグ化されてもペグ化されなくてもよく；および最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０２３４】
H) IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAタンパク質に対する抗体の作製
IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAに対する抗体は、例えばIL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RA発現ベクターの産物、または天然源から単離されたIL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RAを抗原として用いることで得ることができる。特に有用な抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体は、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAと「特異的に結合する」。抗体が以下の2つの特徴の少なくとも1つを示す場合に、抗体は特異的に結合すると見なされる：(1) 抗体がIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAに結合活性の閾値レベルで結合する、および(2) 抗体がIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAに関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【０２３５】
第1の特徴に関しては、抗体がIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチド、ペプチド、またはエピトープに106 M-1またはそれ以上、好ましくは107 M-1またはそれ以上、より好ましくは108 M-1またはそれ以上、最も好ましくは109 M-1またはそれ以上の結合親和性(Ka)で結合する場合に、抗体は特異的に結合する。抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード解析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949))により、当業者によって容易に決定され得る。第2の特徴に関しては、例えば抗体が標準的なウェスタンブロット解析を用いてIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAを検出するが、現在知られているポリペプチドを検出しない場合に、抗体は関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。公知の関連ポリペプチドの例には、公知のサイトカイン受容体が含まれる。
【０２３６】
抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体は、抗原性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドを用いて作製することができる。本発明の抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:5、または本明細書に開示する別のアミノ酸配列内に含まれる少なくとも9個、または15〜約30個のアミノ酸の配列を含む。しかし、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体を含むまでの任意の長さを含む、本発明のアミノ酸配列のより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチドも、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAと結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ含有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択されることが望ましい(すなわち、配列は比較的親水性の残基を含み、疎水性残基は典型的に回避される)。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列も抗体産生に望ましい場合がある。
【０２３７】
例として、IL-17RCの潜在的抗原部位は、LASERGENE(DNASTAR；ウィスコンシン州、マディソン)のPROTEANプログラム(バージョン3.14)により実行されるJameson-Wolf法(Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988))を用いて同定した。この解析では、初期設定パラメータを用いた。
【０２３８】
Jameson-Wolf法では、タンパク質構造予測の6つの主要なサブルーチンを組み合わせることにより、潜在的抗原決定基を予測する。簡潔に説明すると、最初にHopp-Woods法(Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981))を用いて、局所的親水性が最も高い領域を示すアミノ酸配列を同定した(パラメータ：平均7残基)。第2段階では、Eminiの方法(Emini et al., J. Virology 55:836 (1985))を用いて表面確率を計算した(パラメータ：表面決定閾値(0.6)＝1)。第3に、Karplus-Schultz法(Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985))を用いて、骨格鎖の柔軟性を予測した(パラメータ：柔軟性閾値(0.2)＝1)。解析の第4および第5段階では、Chou-Fasman(Chou, 「Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition」, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), pages 549-586 (Plenum Press 1990))およびGarnier-Robson(Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978))の方法を用いて、二次構造予測をデータに適用した(Chou-Fasmanパラメータ：高次構造表＝64タンパク質；α領域閾値＝103；β領域閾値＝105；Garnier-Robsonパラメータ：αおよびβ決定定数＝0)。第6のサブルーチンでは、柔軟性パラメータとヒドロパシー/溶媒露出度因子を組み合わせて、「抗原指標」と称される表面輪郭値を決定した。最後に、内部領域に対する表面領域の可動性に由来するさらなる自由エネルギーを説明するために、各ピーク値の20、40、60、または80%を付加することによって主要な表面ピークを拡大するピーク拡大関数を抗原指標に適用した。しかし、ヘリックス領域は柔軟性に劣る傾向があるため、この計算はヘリックス領域内に存在する主要なピークには適用しなかった。Hopp/Woods親水性プロファイルを用いて、配列番号:3において最も抗原性が高い可能性がある領域を決定することができる(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78:3824-3828, 1981；Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986、およびTriquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998）。このプロファイルは、スライドする6残基領域に基づく。埋もれたG、S、およびT残基、ならびに露出しているH、Y、およびW残基は無視した。さらに、例えばDNASTAR Proteanプログラム(DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州、マディソン)を用いてJameson-Wolfプロットにより予測される、配列番号:3におけるIL-17RC抗原エピトープは、好ましい抗原エピトープとして役立ち、当業者によって決定することができる。このような抗原エピトープには、(1) 配列番号:3のアミノ酸残基73〜アミノ酸残基82；(2) 配列番号:3のアミノ酸残基95〜アミノ酸残基104；(3) 配列番号:3のアミノ酸残基111〜アミノ酸残基119；(4) 配列番号:3のアミノ酸残基179〜アミノ酸残基186；(5) 配列番号:3のアミノ酸残基200〜アミノ酸残基205；(6) 配列番号:3のアミノ酸残基229〜アミノ酸残基236；(7) 配列番号:3のアミノ酸残基264〜アミノ酸残基268；および(8) 配列番号:3のアミノ酸残基275〜アミノ酸残基281が含まれる。本発明は、IL-17RCに対する抗体を作製するため、または本発明の中和モノクローナル抗体をスクリーニングもしくは同定するための手段としての、抗原ペプチドX〜Yのいずれか1つの使用を意図する。本発明はまた、抗原ペプチドX〜Yの少なくとも1つを含むポリペプチドを意図する。本発明は、IL-17RCに対する抗体を作製するため、ならびに中和性であって、IL-17FおよびIL-17Aと(個別にまたは共に)結合し得る、その活性を(個別にまたは共に)遮断し得る、阻害し得る、��少させ得る、拮抗し得る、または中和し得る抗IL-17RCモノクローナル抗体を同定およびスクリーニングするための、本明細書に記載の任意の抗原ペプチドまたはエピトープの使用を意図する。
【０２３９】
さらに、適切な抗原には、可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAヘテロ二量体または多量体ポリペプチドなどを形成し得るポリペプチドのような、クラスIまたはIIサイトカイン受容体ドメインといった別のサイトカイン細胞外ドメインと組み合わせて、上記のIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAサイトカイン結合または細胞外ドメインを含むIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドが含まれる。
【０２４０】
組換えIL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RAタンパク質、または天然源から単離されたIL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RAに対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。例えば、Green et al., 「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)、およびWilliams et al., 「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)を参照されたい。IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン(水酸化アルミニウム)またはフロイントの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを使用することで増大させることができる。免疫化に有用なポリペプチドには、IL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RAまたはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合体などの融合ポリペプチドもまた含まれる。ポリペプチド免疫原は、全長分子であってもまたはその一部であってもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合には、免疫化のために、このような部分を高分子担体(キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイドなど)に有利に結合または連結させることができる。
【０２４１】
ポリクローナル抗体は典型的に、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジなどの動物で産生させるが、本発明の抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体は類人猿の抗体に由来してもよい。診断上および治療上有用な抗体をヒヒで作製する一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.、 WO 91/11465、およびLosman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)に見出すことができる。
【０２４２】
または、モノクローナル抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体を作製することができる。特定抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる(例えば、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)、Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [「Coligan」]、Picksley et al., 「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)を参照されたい)。
【０２４３】
簡潔に説明すると、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してBリンパ球を取得し、Bリンパ球と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。
【０２４４】
さらに、本発明の抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来してもよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)によって記載されている。
【０２４５】
モノクローナル抗体は、十分に確立された種々の技法により、ハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離技法には、プロテインAセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる(例えば、Coligan, pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3；Baines et al., 「Purification of Immunoglobulin G (IgG)」, Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい)。
【０２４６】
特定の用途に関しては、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体の断片を調製することが望ましい場合がある。このような抗体断片は、例えば抗体のタンパク質加水分解によって得ることができる。抗体断片は、従来法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例として、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素切断してF(ab')2と称される5S断片を提供することにより、作製され得る。この断片をチオール還元剤でさらに切断することで、3.5S Fab'一価断片を作製することができる。任意に、ジスルフィド結合の切断で生じるスルフヒドリル基に対する保護基を用いて、切断反応を行うことができる。別法として、ペプシンによる酵素切断により、2つの一価Fab断片およびFc断片が直接得られる。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960)、Porter, Biochem. J. 73:119 (1959)、Edelman et al., Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967)、ならびにColigan, pages 2.8.1-2.8.10および2.10.-2.10.4によって記載されている。
【０２４７】
断片が、完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいて、重鎖の分離による一価の軽鎖-重鎖断片の形成、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技法などの他の抗体切断法を用いることも可能である。
【０２４８】
例えば、Fv断片はVH鎖とVL鎖の会合を含む。この会合は、Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)によって記載されるように、非共有結合であってよい。または、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され得るか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質により架橋され得る(例えば、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照されたい)。
【０２４９】
Fv断片は、ペプチドリンカーにより連結されたVH鎖およびVL鎖を含み得る。このような1本鎖抗原結合タンパク質(scFv)は、オリゴヌクレオチドにより連結されたVHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、この発現ベクターは次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを伴う1本のポリペプチド鎖を合成する。scFvを作製する方法は、例えば、Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)により記載されている(Bird et al., Science 242:423 (1988)、Ladner et al.、米国特許第4,946,778号、Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)、およびSandhu、前記もまた参照されたい)。
【０２５０】
例として、インビトロでリンパ球をIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドに曝露し、ファージまたは類似のベクターの抗体ディスプレイライブラリーを選択することにより(例えば、固定化または標識IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAタンパク質またはペプチドを用いて)、scFvを得ることができる。潜在的なIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレイ)または大腸菌などの細菌上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成によるなど、いくつかの方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、リガンドもしくは受容体などのタンパク質もしくはポリペプチド、生体高分子もしくは合成高分子、または有機もしくは無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする技法は当技術分野において公知であり(Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Ladner et al.、米国特許第4,946,778号、Ladner et al.、米国特許第5,403,484号、Ladner et al.、米国特許第5,571,698号、およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996))、またランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.(カリフォルニア州、パロアルト)、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州、サンディエゴ)、New England Biolabs, Inc.(マサチューセッツ州、ベバリー)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から市販されている。本明細書に開示したIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA配列を用いてランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングし、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAに結合するタンパク質を同定することができる。
【０２５１】
別の形態の抗体断片は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識単位」)は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することで得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される(例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991)、Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)、およびWard et al., 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照されたい)。
【０２５２】
または、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体に由来してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からヒト可変ドメインに移すことによって作製される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基が、マウス対応物のフレームワーク領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することで、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が回避される。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングする一般的な技法は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技法は、例えば、Jones et al., Nature 321:522 (1986)、Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)、Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993)、Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995)、Kelley, 「Engineering Therapeutic Antibodies」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)、およびQueen et al.、米国特許第5,693,762号 (1997)によって記載されている。
【０２５３】
さらに、本発明の抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体または抗体断片を、本明細書に記載する当技術分野における方法を用いてペグ化することができる。
【０２５４】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準的な技法を用いて、動物を抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体または抗体断片で免疫化することによって調製することができる。例えば、Green et al., 「Production of Polyclonal Antisera」, Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992)を参照されたい。また、Coligan, pages 2.4.1-2.4.7も参照されたい。または、上記の技法で抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体または抗体断片を免疫原として用いて、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を調製することもできる。もう1つの別法として、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人猿の抗イディオタイプ抗体を、上記の技法を用いて調製することができる。抗イディオタイプ抗体を作製する方法は、例えば、Irie、米国特許第5,208,146号、Greene, et al.、米国特許第5,637,677号、およびVarthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996)によって記載されている。
【０２５５】
抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体を検出可能な標識と結合させて、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA免疫複合体を形成することができる。適切な検出用標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、またはコロイド金が含まれる。このような検出可能に標識された免疫複合体を作製および検出する方法は当業者には周知であり、以下にさらに詳述する。
【０２５６】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であってよい。本発明の目的に特に有用な同位体は、3H、125I、131I、35S、および14Cである。
【０２５７】
抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA免疫複合体は、蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識された抗体の存在は、免疫複合体を適切な波長の光に曝露し、生じる蛍光を検出することにより判定される。蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンが含まれる。
【０２５８】
または、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA免疫複合体は、抗体成分を化学発光化合物と結合させることにより検出可能に標識することができる。化学発光タグ化免疫複合体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより判定される。化学発光標識化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが含まれる。
【０２５９】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA免疫複合体を標識することができる。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系において見られる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより判定される。標識に有用な生物発光化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが含まれる。
【０２６０】
または、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA免疫複合体は、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体成分を酵素と連結することにより、検出可能に標識することができる。抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA-酵素複合体を適切な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度手段、蛍光定量手段、または可視的手段によって検出され得る化合物部分を生じる。多特異的な免疫複合体を検出可能に標識するために用いることのできる酵素の例には、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる。
【０２６１】
当業者は、本発明に従って使用できるその他の適切な標識を熟知していると考えられる。マーカー部分と抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体との結合は、当技術分野に公知の標準的な技法を用いて達成することができる。この関連における典型的な方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976)、Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977)、Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990)、Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990)、およびColigan、前記によって記載されている。
【０２６２】
さらに、免疫化学的検出の利便性および汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンと結合させた抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体を用いることにより高めることができる(例えば、Wilchek et al. (eds.), 「Avidin-Biotin Technology」, Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990)、およびBayer et al., 「Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology」, Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい)。
【０２６３】
免疫測定を実施するための方法は十分に確立されている。例えば、Cook and Self, 「Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays」, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 180-208, (Cambridge University Press, 1995)、Perry, 「The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、およびDiamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)を参照されたい。
【０２６４】
本発明はまた、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA遺伝子発現の免疫学的診断アッセイを行うためのキットを意図する。このようなキットは、抗IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体または抗体断片を含む容器を少なくとも1個含む。キットはまた、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体または抗体断片の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第2の容器を含み得る。そのような指示試薬の例には、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド金などの検出可能な標識が含まれる。キットはまた、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA抗体または抗体断片を用いてIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAタンパク質を検出する旨を使用者に伝える手段を含み得る。例えば、書面による説明書には、同梱された抗体または抗体断片を用いてIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAを検出できることが記載され得る。書記情報は容器に直接記載され得るか、または書記情報は添付文書の形態で提供され得る。
【０２６５】
I) 本発明のIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの治療的使用
可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA活性を有するアミノ酸配列を用いて、リガンドIL-17AおよびIL-17Fと(個々にまたは共に)結合させ、ひいてはこれらのリガンドと内因性IL-17RCおよび/またはIL-17RA受容体との結合を妨げることにより、免疫系を調節することができる。可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAなどのアンタゴニストを用いて、IL-17Aおよび/またはIL-17Fと内因性IL-17RCおよび/またはIL-17RA受容体との結合を阻害することにより、免疫系を調節することもできる。したがって本発明は、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA活性を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド(可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチド、IL-17RCまたはIL-17RAポリペプチド断片、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA類似体、およびIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA融合タンパク質など)を、十分量のこのポリペプチドを欠く、または過剰量のIL-17Aおよび/もしくはIL-17Fを産生する対象に対して用いることを含む。本発明のポリペプチド(例えば、可溶性IL-17RCおよび/またはIL-17RC/IL-17RA)を用いて、過剰量のIL-17A、IL-17F、IL-17RA、またはIL-17RCを産生する対象を治療することもできる。適切な対象には、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。例えば、そのような可溶性ポリペプチドは、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、IBD、IBS、大腸炎、喘息、同種移植片拒絶、免疫介在性腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、または変形性関節疾患、および本明細書に開示する他の炎症病態などの炎症および炎症性疾患の治療において、IL-17AおよびIL-17Fを(個々にまたは共に)結合する、遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するのに有用である。
【０２６６】
好ましい態様において、可溶性受容体はIL-17RC(配列番号:3)を含み、インビボでIL-17FおよびIL-17Aに(個別にまたは共に)結合する、それらを(個別にまたは共に)遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和する単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体である。このようなIL-17RC単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体に対する抗体および結合ポリペプチドもまた、本明細書に記載するように、IL-17RC活性のアンタゴニストとして、ならびにIL-17AおよびIL-17Fアンタゴニスト(個々にまたは共に)として役立つ。
【０２６７】
他の好ましい態様において、可溶性受容体はIL-17RCおよびIL-17RA双方の一部を含む。1つのそのような好ましい態様は、Fc5(配列番号:179および180)に融合された、ヒトIL-17RAのエキソン1〜6およびIL-17RCx1のエキソン8〜16を含む変種1454(配列番号:157および158)である。変種1454はまた、ヒトIL-17RA由来の天然シグナルペプチドを有する。Fc5の代わりに、Fc10、または当技術分野において公知である任意の同等物を用いることも可能である。
【０２６８】
加えて、本発明者らは、ポリクローナルおよびモノクローナル中和抗IL-17F抗体が、細胞に基づく中和アッセイにおいてIL-17FおよびIL-17Aに結合する、その活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和することを本明細書において記載した。IL-17RC cDNAに対応するmRNAの組織分布の解析から、IL-17RC遺伝子のmRNAが、甲状腺、副腎、前立腺、および肝臓組織において強く発現し、心臓、小腸、胃、および気管組織においてより低度に発現することが示された。特に、IL-17RCは、単球、B細胞、および骨髄系統の細胞を含む非T細胞末梢血細胞株で一貫して発現する。また、IL-17RC mRNAは、皮膚由来の細胞株において確実に発現する。IL-17RCを発現する他の細胞株は、アレイ上に存在した全部で5つの大腸細胞株である。対照的に、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢血白血球、脊髄、リンパ節、および骨髄では、発現はほとんどまたは全く認められない。IL-17RCが結合するリガンド(IL-17Fおよび/またはIL-17A)は、IL-1b、IL-6、およびTNF-aを含む炎症性メディエータ、ならびに好中球の増殖、成熟、および走化性に関与するメディエータの産生を増強するその能力を主に介して、炎症反応の誘導および炎症性疾患への寄与に関与する(Witowski et al., Cell. Mol. Life Sci. 61:567-579 [2004]に概説されている)。
【０２６９】
したがって、本発明の特定の態様は、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、IBD、IBS、クローン病、憩室症、喘息、膵炎、I型糖尿病(IDDM)、膵癌、膵炎、グレーブス病、結腸癌および腸癌、自己免疫疾患、敗血症、臓器または骨髄移植；内毒素血症、外傷、手術、または感染症に起因する炎症；アミロイドーシス；脾腫；移植片対宿主病；ならびに炎症の阻害、免疫抑制、造血細胞、免疫細胞、炎症細胞、もしくはリンパ球系細胞、マクロファージ、T細胞(Th1およびTh2細胞を含む)の増殖の減少、病原体もしくは抗原に対する免疫応答の抑制、またはIL-17Fおよび/もしくはIL-17Aの阻害が望ましいその他の例などの炎症性および免疫性の疾患または病態における、アンタゴニストとしての可溶性IL-17RCおよび可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドの使用を対象とする。
【０２７０】
さらに、可溶性IL-17RCおよび可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドは、以下に対して有用である：
【０２７１】
(1) 外傷、組織損傷、手術、敗血症、または感染症の結果としての炎症である急性炎症、および喘息、炎症性腸疾患(IBD)、IBS、慢性大腸炎、脾腫、関節リウマチ、再発性急性炎症の発症(例えば、結核)などの慢性炎症性疾患の治療において、ならびにアミロイドーシス、およびアテローム性動脈硬化症、キャッスルマン病、喘息、および急性期反応の誘導に関連する他の疾患の治療において、IL-17RAまたはIL-17RCを介するシグナル伝達を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するため。
【０２７２】
(2) 免疫細胞(例えば、リンパ球、単球、白血球)におけるシグナル伝達を妨げるまたは阻害するために、IDDM、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、関節リウマチ、IBS、およびIBDなどの自己免疫疾患の治療において、IL-17RAまたはIL-17RCを介するシグナル伝達を、遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するため。本発明のポリペプチドを用いて、IL-17RCおよび/またはIL-17RAを介するシグナル伝達を遮断する、阻害する、減少させる、または拮抗することはまた、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患に恩恵をもたらす場合もある。IDDM、NIDDM、膵炎、および膵癌が恩恵を受ける可能性がある。IL-17RCおよび/またはIL-17RAは、本発明のアンタゴニストが癌の増殖を阻害し、免疫介在性死滅を標的とする癌の治療の標的として役立つ可能性がある(Holliger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998)。本発明の可溶性ポリペプチドはまた、糸球体硬化症、膜性腎症、アミロイドーシス(他の組織の中でも腎臓を侵す)、腎動脈硬化症、様々な原因の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患、ならびにSLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、腎腫瘍、およびその他の疾患に関連した腎機能障害などの腎症を治療するのに有用である可能性がある。
【０２７３】
(3) IDDM、MS、SLE、重症筋無力症、関節リウマチ、IBS、IBDなどの自己免疫疾患の治療において、IL-17RAまたはIL-17RCを介するシグナル伝達を作動させる、増強する、増加させる、または惹起するため。本発明の可溶性ポリペプチドは、分化する、増殖を変更する、または自己免疫を改善するサイトカインもしくは細胞表面タンパク質の産生を変更するよう、リンパ球またはその他の免疫細胞にシグナルを伝達し得る。具体的には、Tヘルパー細胞反応をサイトカイン分泌の別のパターンへと調節すると、自己免疫応答が逸脱されて、疾患が改善される可能性がある(Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998)。同様に、作動性可溶性ポリペプチドを用いて、喘息、アレルギー、およびアトピー性疾患に関与する免疫細胞にシグナルを伝達する、そのような細胞を枯渇させる、および逸脱させることができる。IL-17RCおよび/またはIL-17RAを介するシグナル伝達はまた、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患に恩恵をもたらす場合もある。IDDM、NIDDM、膵炎、および膵癌が恩恵を受ける可能性がある。
【０２７４】
本明細書に記載の可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAポリペプチドは、上記のように自己免疫疾患、アトピー性疾患、NIDDM、膵炎、および腎不全の治療において、IL-17FまたはIL-17Aと個々にまたは共に結合する、その活性を個々にまたは共に遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和するために用いることができる。可溶型のIL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAを用いて、Th細胞によって媒介される抗体応答を促進すること、および/またはリンパ球もしくはその他の免疫細胞によるIL-4もしくは他のサイトカインの産生を促進することができる。
【０２７５】
本発明の可溶性ポリペプチドは、IL-17Aおよび/またはIL-17Fのアンタゴニストとして有用である。このような拮抗効果は、IL-17AまたはIL-17Fの直接的中和または結合により達成され得る。拮抗的使用に加えて、本発明の可溶性受容体は、体内の異なる組織、器官、および細胞にリガンドを輸送するために、IL-17FまたはIL-17Aと結合して、リガンドの担体タンパク質として作用し得る。したがって、本発明の可溶性受容体は、組織、特定の免疫細胞、または腫瘍などの特定の部位に可溶性受容体-リガンド複合体を導く分子、ポリペプチド、または化学物質部分に融合または結合させることができる。例えば、急性感染症またはいくつかの癌においては、IL-17Fの作用により、炎症および局所急性期反応タンパク質の誘導から利益が得られる場合がある。このように、本発明の可溶性受容体を用いて、IL-17AまたはIL-17Fの作用を特異的に方向づけることができる。Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993；およびFernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000を参照されたい。
【０２７６】
炎症は、侵入物質を回避するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性および液性メディエータを含むカスケード事象である。一方、炎症反応を抑制すると、宿主は免疫無防備状態になり得る；しかしそのままにしておくと、炎症は、慢性炎症性疾患(例えば、乾癬、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患など)、敗血症ショック、および多臓器不全を含む重篤な合併症を引き起こし得る。重要なことに、これらの多様な疾患状態は、共通の炎症性メディエータを共有する。炎症により特徴づけられる総体的疾患は、ヒトの罹患率および死亡率に大きな影響を及ぼす。したがって、本発明の可溶性ポリペプチドなどの抗炎症タンパク質が、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血症ショックに至る膨大な数のヒトおよび動物疾患にとって非常に重要な治療可能性を有し得ることは明白である。
【０２７７】
1. 関節炎
変形性関節炎、関節リウマチ、損傷の結果としての関節炎関節などを含む関節炎は、本発明の可溶性ポリペプチドなどの抗炎症タンパク質の治療的使用から恩恵を受けると考えられる一般的な炎症病態である。例えば、関節リウマチ(RA)は全身を侵す全身性疾患であり、関節炎の最も多く見られる形態の1つである。これは関節を裏打ちする膜の炎症を特徴とし、これによって疼痛、硬直、発熱、発赤、および腫脹が生じる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節内層、滑膜が骨および軟骨に侵入して損傷を与え、いくつかある生理的影響の中でも特に関節悪化および激痛をもたらし得る。罹患関節はその形状および配置構造を失って、疼痛および運動障害を生じ得る。
【０２７８】
関節リウマチ(RA)は、重度の障害および死亡率の上昇を引き起こす炎症およびそれに続く組織損傷を特に特徴とする免疫介在性疾患である。リウマチ様関節では、種々のサイトカインが局所的に産生される。2つの原型炎症誘発性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜炎症および進行性関節破壊に関与する機構において重要な役割を果たすことが、多くの研究から実証されている。実際に、RA患者にTNF-αおよびIL-1阻害剤を投与すると、炎症の臨床学的および生物学的徴候が飛躍的に改善し、骨浸食および軟骨破壊の放射線学的徴候が低減した。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、かなりの割合の患者がこれらの薬剤に応答せず、このことから、他のメディエータもまた関節炎の病態生理に関与していることが示唆される(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002)。そのようなメディエータの1つはIL-17AまたはIL-17Fであると考えられ、したがって可溶性IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RAなどのIL-17FまたはIL-17Aと結合するまたはその活性を阻害する分子は、関節リウマチおよびその他の関節炎疾患における炎症を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２７９】
当技術分野において公知である関節リウマチの動物モデルがいくつか存在する。例えば、コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルでは、マウスはヒトの関節リウマチに非常によく似た慢性炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと類似の免疫学的および病理学的特徴を共有するため、これは潜在的なヒト抗炎症化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。CIAモデルは、発症するために免疫応答および炎症反応の両方に依存する、マウスの周知のモデルである。免疫応答は、抗原として投与されたコラーゲンに応答したB細胞およびCD4+ T細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体の産生をもたらす。炎症期は、これらの抗体のいくつかがマウスの天然コラーゲンと交差反応し、補体カスケードを活性化する結果としての、炎症のメディエータによる組織応答の結果である。CIAモデルを用いることの利点は、発症の基本的機構が公知である点である。II型コラーゲン上の関連するT細胞およびB細胞エピトープが同定されており、また免疫介在性関節炎に関連する種々の免疫学的パラメータ(例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体)および炎症パラメータ(例えば、サイトカイン、ケモカイン、および基質分解酵素)が決定されており、したがってこれらを用いてCIAモデルにおける被験化合物の有効性を評価することができる(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999；Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992；Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997；およびWang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995)。
【０２８０】
抗マウスIL-17抗体により、対照マウスと比較してマウスCIAモデルにおいて症状が軽減されることをあるグループが示しており、したがって本発明の可溶性ポリペプチドがヒト疾患の治療に有益であることが概念的に示される。単一のマウスIL-17特異的ラット抗血清を投与すると、予防的に導入した場合に、またはモデルにおいて関節炎の症状が既に存在した後でも、動物における関節炎の症状は軽減された(Lubberts et al, Arthritis Rheum. 50:650-9, 2004)。したがって、IL-17RC-FcまたはIL-17RC/IL-17RA-Fcは、関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、IBS、大腸炎、および本明細書に開示する他の炎症病態などの特定のヒト疾患の治療において、IL-17Aおよび/またはIL-17Fを中和するために用いることができる。
【０２８１】
IL-17RC-Fcまたはその他のIL-17RC/IL-17RA可溶性および融合タンパク質などの本発明の可溶性ポリペプチドをこれらのCIAモデルマウスに投与することにより、疾患の症状を改善し疾患の経過を変更するためのIL-17FおよびIL-17Aに対するアンタゴニストとしてのそれらの使用が評価される。さらに、本発明の可溶性ポリペプチドによるIL-17Fおよび/またはIL-17Aの阻害または中和を示す結果から、他のIL-17AまたはIl-17Fアンタゴニストもまた、疾患の症状を改善し疾患の経過を変更するために用いることができるという概念の証拠が提供される。さらに、IL-17Aおよび/またはIL-17Fは、いずれも関節リウマチの発症および進行に関与しているIL-1bおよびTNF-aの産生を誘導するため、これらの可溶性ポリペプチドの全身または局所投与により、RAにおける炎症反応を潜在的に抑制することができる。一例として非限定的に、10〜200 ug IL-17RC-Fc/マウスの注射(皮下、腹腔内、または筋肉内投与経路により週に1〜7回であり、これに限定されるわけではないが最長で4週間)により、疾患スコア(足スコア、炎症または疾患の発生率)が有意に減少し得る。IL-17RC-Fc投与の開始に応じて(例えば、コラーゲン免疫化の前もしくはその時点で、または疾患が既に進行した時点を含む、2回目のコラーゲン免疫化後の任意の時点で)、IL-17RCは、関節リウマチを予防する上でおよびその進行を妨げる上で有効であり得る。その他の潜在的治療薬には、IL-17RC/IL-17RAポリペプチドなどが含まれる。
【０２８２】
2. 内毒素血症
内毒素血症は、一般に細菌およびその他の感染病原体などの感染体、敗血症、毒性ショック症候群に起因する、または日和見感染などにさらされた免疫不全患者における重篤な状態である。本発明の可溶性ポリペプチドなどの治療上有用な抗炎症タンパク質は、ヒトおよび動物における内毒素血症の予防および治療を助け得る。これらの可溶性ポリペプチドは、内毒素血症における炎症および病理学的影響を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２８３】
リポ多糖(LPS)により誘発される内毒素血症は、感染症において病理学的影響を生じる多くの炎症誘発性メディエータを作動させ、げっ歯動物におけるLPS誘発内毒素血症は、潜在的炎症誘発剤または免疫調節薬の薬理学的効果を試験するために広く用いられている許容されるモデルである。グラム陰性菌で産生されるLPSは、敗血症ショックの発症における主要な原因物質である(Glausner et al., Lancet 338:732, 1991)。ショック様状態は実際に、LPSを動物に1回注射することにより実験的に誘発することができる。LPSに応答する細胞によって産生される分子は、病原体を直接または間接的に標的化し得る。これらの生物学的応答は侵入する病原体から宿主を防御するが、それらはまた害をもたらす可能性がある。したがって、重度のグラム陰性菌感染症の結果として起こる先天性免疫の大規模な促進により、サイトカインおよびその他の分子の過剰な産生が起こり、発熱、低血圧、播種性血管内凝固、および多臓器不全を特徴とする致死的症候群である敗血症ショック症候群が発症する(Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000)。
【０２８４】
LPSのこれらの毒性作用は、主に、複数の炎症性メディエータの放出をもたらすマクロファージ活性化と関連がある。これらのメディエータの中で、TNFは、中和性抗TNF抗体の投与によるLPS毒性の予防によって示されるように、重要な役割を担っているようである(Beutler et al., Science 229:869, 1985)。C57Bl/6マウスに大腸菌LPSを1 ug注射すると、注射の約2時間後に、循環するIL-6、TNF-α、IL-1、および急性期タンパク質(例えば、SAA)の有意な上昇が起こることは十分に確立されている。これらのメディエータに対する受動免疫により死亡率が低下し得ることから、LPSの毒性はこれらのサイトカインによって媒介されると考えられる(Beutler et al., Science 229:869, 1985)。敗血症ショックを予防および/また治療するための潜在的免疫介入戦略には、抗TNF mAb、IL-1受容体アンタゴニスト、LIF、IL-10、およびG−CSFが含まれる。
【０２８５】
本発明の可溶性ポリペプチドをこれらのLPS誘発モデルに投与することにより、LPS誘発疾患の症状を改善しその疾患の経過を変更するためのIL-17RCまたはIL=17RC/IL-17RAの使用を評価することができる。さらに、これらの可溶性ポリペプチドによるIL-17FまたはIL-17Aの阻害を示す結果から、他のこのようなアンタゴニストもまた、LPS誘発モデルにおける症状を改善し疾患経過を変更するために用いることができるという概念の証拠が提供される。モデルは、LPS注射によるIL-17Fの誘導、および可溶性ポリペプチドによる疾患治療の可能性を示すと考えられる。LPSは、おそらく内毒素血症の病理に寄与する炎症誘発性因子の産生を誘導するため、アンタゴニスト可溶性ポリペプチドによるIL-17F活性またはその他の炎症誘発性因子の中和を用いて、エンドトキシンショックにおいて認められるような、内毒素血症の症状を軽減することができる。
【０２８６】
3. 炎症性腸疾患 IBD
米国では、約500,000人の人々が、結腸および直腸(潰瘍性大腸炎)、または小腸および大腸の両方(クローン病)に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患(IBD)に罹患している。これらの疾患の病因は不明であるが、これらの疾患は罹患組織の慢性炎症を伴う。本発明の可溶性ポリペプチドは、IBD、UC、および関連疾患における炎症および病理学的影響を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２８７】
潰瘍性大腸炎(UC)は、結腸の粘膜または最内層の炎症および潰瘍形成を特徴とする、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は高い頻度で結腸を空にし、下痢を引き起こす。症状には、軟便および関連する腹部痙攣、発熱、ならびに体重減少が含まれる。UCの正確な原因は不明であるが、最近の研究から、身体が異物と見なす体内のタンパク質に対して身体の天然の防御が作用すること(「自己免疫反応」)が示唆されている。おそらくはそれらが腸内の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質が、結腸の内層を破壊し始める炎症過程を誘導または促進する可能性がある。結腸の内層が破壊されると、潰瘍が形成されて粘液、膿、および血液が放出される。この疾患は通常、直腸領域で始まり、最終的に大腸全体に広がり得る。炎症を繰り返して発症することで、腸壁および直腸壁は瘢痕組織を伴い肥厚する。結腸組織の死滅または敗血症は、重篤な疾患を併発し得る。潰瘍性大腸炎の症状は重症度が多様であり、その発症は段階的である場合もあれば、突発性である場合もある。呼吸器感染症またはストレスを含む多くの要因により、発作が誘発され得る。
【０２８８】
現在のところUCについての治療法は存在しないが、治療は結腸内層の異常な炎症過程の抑制に重点が置かれている。この疾患を治療するためには、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキセ−ト)、およびアミノサリチル酸を含む治療が利用できる。しかし、副腎皮質ステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤の長期使用は、骨の菲薄化、白内障、感染症、ならびに腎臓および骨髄への影響を含む重度の副作用をもたらし得る。現在の治療法で良好な結果が得られない患者では、手術も選択肢の1つである。手術は結腸全体および直腸の摘出を含む。
【０２８９】
慢性潰瘍性大腸炎を部分的に模倣し得る動物モデルがいくつか存在する。最も広く用いられているモデルは2,4,6-トリニトロベンスルホン酸/エタノール(TNBS)誘発大腸炎モデルであり、これは結腸において慢性炎症および潰瘍形成を誘発する。直腸内点滴によりTNBSを感受性マウスの結腸に導入すると、TNBSは結腸粘膜においてT細胞媒介性免疫応答を誘導し、この場合、大腸壁全体にわたるT細胞およびマクロファージの高密度浸潤を特徴とする重度の粘膜炎症が起こる。さらに、この組織病理像は、進行性体重減少(消耗)、出血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000)。
【０２９０】
別の大腸炎モデルではデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を使用し、これにより出血性下痢、体重減少、結腸短縮、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍形成を呈する急性大腸炎が誘発される。DSS誘発大腸炎は、リンパ過形成、局所的陰窩損傷、および上皮潰瘍形成を伴う、固有層への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴づけられる。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性作用に起因して、固有層細胞の食作用ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって生じると考えられている。一般的に使用されているにもかかわらず、ヒト疾患との関連性についてのDSSの機構に関するいくつかの問題点は末解決のままである。DSSは、SCIDマウスなどのT細胞欠損動物においても認められるため、T細胞非依存性モデルと見なされる。
【０２９１】
本発明の可溶性ポリペプチドをこれらのTNBSまたはDSSモデルに投与することにより、胃腸疾患の症状を改善しその疾患の経過を変更するためのそれらの使用を評価することができる。さらに、これらの可溶性ポリペプチドによるIL-17Fおよび/またはIL-17Aの阻害または中和を示す結果から、それら(または類似の分子)が、大腸炎/IBDモデルにおける症状を改善し疾患経過を変更するためにも用いることができるという概念の証拠が提供される。
【０２９２】
4. 乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人が罹患している慢性皮膚疾患である。乾癬は新しい皮膚細胞が異常に増殖する場合に起こり、古い皮膚が十分に素早く脱落しない部位に、炎症性の肥大したかつ鱗状の皮膚斑を生じる。最もよく見られる形態である斑状乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた炎症性皮膚斑(「病変」)を特徴とする。乾癬は少数の斑に限定される場合もあれば、皮膚の中程度から広範囲の領域を侵す場合もあり、頭皮、膝、肘、および体幹に最もよく現れる。乾癬は目立つものの、感染性の疾患ではない。この疾患の病因は、罹患組織の慢性炎症を含む。本発明の可溶性ポリペプチドは、乾癬、その他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜のアレルギー、ならびに関連疾患における炎症および病理学的影響を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２９３】
乾癬は、相当な不快感を招き得る、皮膚のT細胞媒介性炎症性疾患である。乾癬は、治療法がなく、あらゆる年齢の人々が罹患する疾患である。ヨーロッパおよび北アメリカの人口の約2%が乾癬に罹患している。軽度の乾癬を有する個体は局所薬により疾患を制御できる場合が多いが、世界中の100万人を超える患者は、紫外線または全身免疫抑制療法を必要とする。不運なことには、紫外線照射の不便性および危険性、ならびに多くの治療法の毒性のために、長期使用が制限される。さらに、患者は通常、乾癬を再発し、場合によっては免疫抑制療法の停止直後にリバウンドが起こる。
【０２９４】
本発明の可溶性ポリペプチドはまた、IL-17FまたはIL-17Aの循環レベルを検出する診断系において、および急性期炎症反応に関連したIL-17FまたはIL-17Aの検出において用いることも可能である。関連する態様では、本発明の可溶性ポリペプチドを用いて、循環しているまたは局所的に作用しているIL-17FまたはIL-17Aポリペプチドを検出することができる。リガンドまたは受容体ポリペプチドのレベルの上昇または低下は、炎症または癌を含む病態を示し得る。IL-17Fは、関連する急性期炎症反応を誘導することが知られている。さらに、IL-17AまたはIL-17Fなどの急性期タンパク質または分子の検出は、特定の疾患状態(例えば、喘息、乾癬、関節リウマチ、大腸炎、IBD、IBS)における慢性炎症状態を示し得る。そのような状態の検出は、疾患の診断において役立つと共に、医師が適切な治療を選択する上で役立つ。
【０２９５】
本明細書に記載する他の疾患モデルに加えて、ヒト乾癬病変に由来する炎症組織に及ぼす本発明の可溶性ポリペプチドの活性は、重症複合免疫不全(SCID)マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。ヒト細胞を免疫不全マウスに移植したいくつかのマウスモデルが開発されている(まとめて異種移植モデルと称される)；例えば、Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994、およびFlavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996を参照されたい。乾癬のインビボ異種移植モデルとして、ヒト乾癬皮膚組織をSCIDマウスモデルに移植し、適切なアンタゴニストを投与する。さらに、ヒト乾癬皮膚移植片をAGR129マウスモデルに移植し、適切なアンタゴニストを投与するなど、当技術分野におけるその他の乾癬動物モデルを用いて、IL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストを評価することも可能である(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Boyman, O. et al., J. Exp. Med. Online publication #20031482, 2004を参照されたい)。IL-17FまたはIL-17AおよびIL-17Fの双方と結合する、その活性を遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和する本発明の可溶性ポリペプチドは好ましいアンタゴニストであるが、その他のIL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストをこのモデルにおいて用いることもできる。同様に、ヒト大腸炎、IBD、IBS、関節炎、またはその他の炎症病変に由来する組織または細胞をSCIDモデルにおいて用いて、本明細書に記載のIL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストの抗炎症特性を評価することもできる。
【０２９６】
本発明の可溶性ポリペプチドを用いて炎症を消失させる、遅延させる、または軽減するように設計された治療は、ヒト炎症組織(例えば、乾癬病変など)を有するSCIDマウスまたは本明細書に記載の他のモデルに投与することによって試験することができる。治療の有効性は、当技術分野で周知の方法を用いて、治療集団における抗炎症効果の経時的な増加として測定され、統計学的に評価される。いくつかの例示的な方法には、例えば乾癬モデルでの表皮肥厚、真皮上層における炎症細胞数、および不全角化の等級の測定が含まれるが、これらに限定されない。そのような方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。例えば、Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001；Zollner, T. M. et al. J. Clin. Invest. 109:671, 2002；Yamanaka, N. et al. Microbio.l Immunol. 45:507, 2001；Raychaudhuri, S. P. et al. Br. J. Dermatol. 144:931, 2001；Boehncke, W. H. et al.  Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999；Boehncke, W. H. et al.. J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001；Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995；Boehncke, W. H. et al. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997；Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998；およびVilladsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003を参照されたい。炎症はまた、試料中に存在する炎症または損傷細胞数、IBDのスコア(体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ)、足疾患スコア、およびCIA RAモデルの炎症スコアを定量するために、フローサイトメトリー(またはPCR)などの周知の方法を用いて経時的にモニターしてもよい。例えば、そのようなモデルにおいて試験するのに適した治療戦略には、IL-17RCおよび/またはIL-17RAとそれらの対応するリガンドとの相互作用の破壊に基づく、可溶性IL-17RCもしくはIL-17RC/IL-17RA、またはその他のIL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストを(個々にまたは共に)用いる直接治療が含まれる。
【０２９７】
乾癬は、過形成性表皮核化細胞、ならびにCD4+メモリーT細胞、好中球、およびマクロファージを含む浸潤性単核細胞に関連する慢性炎症性皮膚疾患である(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996)。現在、環境抗原が、この疾患の惹起およびその病理への寄与において重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら、乾癬の病理を媒介すると考えられているのは、自己抗原に対する寛容の喪失である。樹状細胞およびCD4+ T細胞は、病態に至る免疫応答を媒介する抗原提示および認識において重要な役割を果たすと考えられている。本発明者らは、最近、CD4+CD45RB移入モデルに基づく乾癬のモデルを開発した(Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672)。本発明の可溶性ポリペプチドをマウスに投与する。疾患スコア(皮膚病変、炎症性サイトカイン)の阻害により、乾癬におけるそれら可溶性ポリペプチドの有効性が示される。
【０２９８】
5. アトピー性皮膚炎
ADは、ヘルパーT細胞サブセット2(Th2)の過活性化サイトカインを特徴とする一般的な慢性炎症性疾患である。ADの正確な病因は不明であるが、過活性Th2免疫応答、自己免疫、感染症、アレルゲン、および遺伝的素因を含む多くの要因が関連づけられている。疾患の重要な特徴には、乾皮症(皮膚の乾燥)、そう痒症(皮膚の痒み)、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染症、血中好酸球増加、血清IgEおよびIgG1の上昇、ならびにT細胞、肥満細胞、マクロファージ、および好酸球浸潤を伴う慢性皮膚炎が含まれる。黄色ブドウ球菌による定着または感染症はADを悪化させ、この皮膚疾患の慢性性を持続させることが認識されている。
【０２９９】
ADは喘息およびアレルギー性鼻炎患者において認められる場合が多く、アレルギー疾患の最初の症状であることが多い。西欧諸国における人口の約20%がこれらのアレルギー疾患に罹患しており、先進諸国におけるADの発症率は理由がわからないものの上昇している。ADは典型的に小児期に始まり、青年期を通して成人期まで持続し得る場合が多い。ADの現在の治療には、外用副腎皮質ステロイド、経口シクロスポリンA、タクロリムス(FK506軟膏)などの非副腎皮質ステロイド免疫抑制剤、およびインターフェロン-γが含まれる。ADに関する多様な治療にもかかわらず、多くの患者の症状は改善せず、または患者は投薬に対する副作用を有して、他のより有効な治療薬を探す必要がある。本発明の可溶性ポリペプチドは、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、および本明細書に開示する他の炎症病態などの特定のヒト疾患の治療において、IL-17FおよびIL-17Aを中和するために用いることができる。
【０３００】
6. 喘息
IL-17は、気道におけるアレルゲン誘発性T細胞活性化および好中球流入において重要な役割を果たす。IL-17の受容体は気道で発現しており(Yao, et al. Immunity 3:811 (1995))、アレルギー性喘息におけるIL-17媒介性好中球動員は、主として、IL-17刺激を受けたヒト気管支上皮細胞(HBEC)およびヒト気管支線維芽細胞によって産生される化学誘引物質IL-8、GRO-□、およびマクロファージ炎症性タンパク質-2(MIP-2)により誘導される(Yao, et al. J Immunol 155:5483 (1995)；Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001))。IL-17はまたHBECを刺激して好中球活性化因子であるIL-6を放出させ(Fossiez, et al, J Exp Med 183:2593 (1996)、およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001))、TNF-□と相乗作用してインビトロでヒト好中球の生存を延長することが示されている(Laan, et al. Eur Respir J 21:387 (2003))。さらに、IL-17は、気道再構築に関連したサイトカイン、例えば、線維化促進性(profibrotic)サイトカインであるIL-6およびIL-11、ならびに炎症性メディエータ顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の分泌を増強するその能力により、喘息における炎症反応を増幅し得る(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001))。
【０３０１】
臨床的証拠から、喘息の急性重症悪化が気道における好中球の動員および活性化と関連していることが示され、したがってIL-17が喘息において重要な役割を果たしている可能性は高い。軽症喘息患者は、遊離可溶性IL-17Aタンパク質の局所濃度の検出可能な増加を示し(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001))、ブタ舎に曝露されたために重度の気道炎症を誘発された健常ヒトボランティアは、気管支肺胞腔中の遊離可溶性IL-17Aタンパク質濃度の顕著な増加を示す(Fossiez, et al, J Exp Med 183:2593 (1996)、およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001))。さらに、喀痰中のIL-17レベルは、気道過敏性が増加した個体と相関していた(Barczyk, et al. Respir Med 97:726 (2003))。
【０３０２】
気道過敏症の動物モデルにおいて、感作マウスにオボアルブミンを長期吸入させると、気管支好中球増加と共に、気管支好酸球性炎症および炎症肺組織におけるIL-17 mRNA発現の早期誘導が起こった(Hellings, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003))。抗IL-17モノクローナル抗体により気管支好中球流入は大きく減少したが、気管支肺胞洗浄液および血清中のIL-5レベルが有意に増強され、またアレルゲン誘発性気管支好酸球流入が悪化し、IL-17Aが抗原攻撃後の好中球蓄積と好酸球蓄積と間の平衡の決定に関与している可能性が示唆される(同文献)。
【０３０３】
IL-17ファミリーメンバーの中で、IL-17FはIL-17Aと最も密接に関連している。IL-17Fが媒介する生物活性はIL-17Aのものと類似しており、IL-17FはIL-6、IL-8、およびG-CSFの産生を促進する(Hurst, et al. J Immunol 169:443 (2002))。IL-17Fはまた、内皮細胞においてIL-2、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-□、および単球走化性タンパク質(MCP)の産生を誘導する(Starnes, et al. J Immunol 167:4137 (2001))。同様に、アレルゲン誘発により、アレルギー性喘息患者では局所IL-17Fが増加し得る(Kawaguchi, et al. J Immunol 167:4430 (2001))。マウス肺にIL-17Fを遺伝子送達すると、気管支肺胞腔中の好中球が増加し、IL-17F遺伝子を粘膜移入すると、Ag誘発性の肺の好中球増加およびメタコリンに対する気道反応性のレベルが増強される(Oda, et al. Am J Respir Crit Care Med 171:12 (2005))。
【０３０４】
喘息のほかに、いくつかの慢性炎症性気道疾患も気道中の好中球動員を特徴とし、IL-17は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、細菌性肺炎、および嚢胞性線維症などの呼吸器疾患の発症において重要な役割を果たすことが報告されている(Linden, et al. Eur Respir J 15:973 (2000)、Ye, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25:335 (2001)、Rahman, et al. Clin Immunol 115:268 (2005))。抗IL-17Aおよび/または抗IL-17F治療分子は、炎症のインビトロモデルにおいて慢性炎症性気道疾患に有効であることが実証され得た。IL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17RC可溶性受容体、ならびに本発明の抗ヒトIL-17RCモノクローナルおよび中和抗体を含むそれに対する抗体が、培養HBECまたは気管支線維芽細胞からのIL-17Aまたはおよび/またはIL-17F誘導性サイトカインおよびケモカイン産生を阻害する能力は、IL-17Aおよび/またはIL-17F刺激に直接起因する炎症性メディエータの産生の防止におけるこのようなアンタゴニストの有効性の測定値として用いることができる。IL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対する、本発明の可溶性ポリペプチドなどのアンタゴニストを添加することで、炎症性メディエータの産生および発現が顕著に減少するならば、そのアンタゴニストは慢性気道炎症と関連する炎症局面において有効であることが予測される。
【０３０５】
7. 過敏性腸症候群(「IBS」)
過敏性腸症候群は、腹痛もしくは腹部不快感および排便習慣異常を特徴とする疾患である。IBS患者は、排便習慣に基づいて3つの主要な群に特徴づけられ得る：主に軟便または頻回便である群、主に硬便または低頻度便である群、および交互便または通常便である群(Talley et al., 2002)。腸運動の変化、上皮機能の異常、便およびガスの通過異常、ならびにストレスが症状に寄与し得るが、内臓過敏が大部分の患者における重要な特徴である。疼痛シグナル伝達に影響する遺伝要因および求心性シグナルの中央処理障害が、特定の環境曝露後に個体をIBSにかかりやすくすると仮定される。研究から、結腸における炎症反応が平滑筋および腸神経の感受性増加に寄与し、ひいては腸における感覚-運動機能を撹乱し得ることもまた実証されている(Collins et al., 2001)。IBSとIBDとの間には臨床的重複が認められ、IBDと診断される前の患者ではIBS様症状が頻繁に報告され、確定されたIBDからの寛解期にある患者には予想を上回るIBS症状が存在する。このように、これらの病態は予想よりも高い頻度で共存し得るか、または連続体上に存在して、IBSとIBDが両極端に位置し得る。しかし、大部分のIBS患者では、結腸生検試料は正常に見えることに留意されたい。それにもかかわらず、IBSは非常に多くの個体に重大な影響を及ぼし(米国における2000年の罹患率は、約1千600万人である)、総費用負担は17億ドルに上る(2000年)。このように、最も蔓延しかつ費用のかかる胃腸の疾患および障害の中でも、IBSは胃食道逆流症(GERD)に次いで第2位である。しかしGERDとは異なり、IBSの治療は不十分なままであり(Talley et al., 2002；Farhadi et al., 21001；Collins et al., 2001)、IBSでは医学的な必要性が明らかに満たされていないことが実証される。
【０３０６】
正常な恒常性の中枢性(心理社会的)または末梢性(組織刺激、炎症、感染)撹乱に至る、中枢神経系(CNS)におけるまたは腸における神経、免疫、または神経免疫回路の反応増強を仮定した、収束疾患モデルが提唱されている（Talley et al., 2002）。この反応増強が腸運動、上皮機能(免疫、透過性)、および内臓過敏の調節不全を引き起こし、次にこれがIBS症状を引き起こす。
【０３０７】
IBSの病因には、ニューロンを刺激する分子および炎症過程の開始に関与する分子の役割を含む、いくつかの異なる分子の役割が存在すると考えられる。IL-17D、IL-17B、およびIL-31を含む本発明者らの社内のいくつかの分子は、ニューロンによる直接発現またはニューロン上のそれらの受容体の発現に起因して、ニューロンに対する活性可能性に関連していることが知られている。さらに、IL-17A、IL-17F、IL-23、およびIL-31を含むいくつかのIL-17ファミリーメンバーおよび関連分子が、腸における炎症と関連づけられている。
【０３０８】
これら分子の阻害剤の有効性は、動物疾患モデルにおいてインビボで試験することができる。IBSの重要な特徴を模倣し、中枢標的化刺激(ストレス)または末梢標的化刺激(感染、炎症)に伴って生じるいくつかの動物モデルが提唱されている。IBSの治療における阻害剤の有効性を判定するために用いることのできるインビボ動物モデルの2つの例には、(i) IBSの初期CNS標的化病因に焦点をおいたモデル(ストレスモデル)、および(ii) 腸標的化ストレス誘導因子(すなわち、腸炎症、感染、または身体的ストレス)に焦点をおいたモデルがある。しかしながら、CNSにおけるまたは胃腸(GI)管における事象は分離して起こらないこと、およびIBSの症状は、CNSからGIに対するシグナルとその逆のシグナルとの間の複雑な相互作用によって生じる可能性が非常に高いことに留意されたい。
【０３０９】
J) 薬学的製剤
薬学的使用のために、本発明の可溶性ポリペプチドは、従来法に従って非経口送達、特に静脈内または皮下送達用に製剤化する。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプもしくはその他の適切な技術を用いる制御放出、または典型的に1〜数時間にわたる注入による。一般的に、薬学的製剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、5%デキストロース水溶液などの薬学的に許容される溶媒と共に造血タンパク質を含む。製剤は、1つまたは複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミンをさらに含み得る。そのような併用療法を利用する場合、サイトカインは単一製剤中に併用してもよく、または別の製剤として投与してもよい。製剤化方法は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990に開示されている。治療用量は一般的に、0.1〜100 mg/kg患者体重/日の範囲であり、好ましくは0.5〜20 mg/kg/日の範囲であり、正確な用量は、治療しようとする病態の性質および重症度、患者の体質などを考慮して、容認される基準に従って臨床医により決定される。用量の決定は当業者のレベルの範囲内である。タンパク質は一般的に、化学療法もしくは骨髄移植後最長28日までの期間にわたり、または血小板数＞20,000個/mm3、好ましくは＞50,000個/mm3が得られるまで投与する。より一般的には、タンパク質は1週間またはそれ未満にわたり、多くの場合1〜3日間にわたり投与する。概して、本発明の可溶性ポリペプチドの治療有効量は、リンパ系または骨髄系前駆細胞の増殖および/または分化の臨床的に有意な増加を生じるのに十分な量であり、これは成熟細胞(例えば、血小板または好中球)の循環レベルの増加として現れる。したがって、血小板障害の治療は、血小板数が少なくとも20,000個/mm3、好ましくは50,000個/mm3に達するまで継続する。本発明の可溶性ポリペプチドはまた、IL-3、IL-6、およびIL-11；幹細胞因子；エリスロポエチン；G-CSFおよびGM-CSFなどの他のサイトカインと併用して投与することもできる。併用療法の投与計画において、他のサイトカインの1日量は一般的に：EPO、150 U/kg；GM-CSF、5〜15 lg/kg；IL-3、1〜5 lg/kg；およびG-CSF、1〜25 lg/kgである。例えばEPOとの併用療法は、EPOレベルが低い貧血患者において適応とされる。
【０３１０】
一般的に、投与する可溶性ポリペプチドの用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、および既往歴などの要因に応じて変動する。典型的には、約1 pg/kg〜10 mg/kg(薬剤量/患者体重)という用量範囲のそのような可溶性ポリペプチドをレシピエントに提供することが望ましいが、状況に応じてこれよりも低用量または高用量を投与してもよい。
【０３１１】
対象に対する本発明の可溶性ポリペプチドの投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、局所カテーテルによる潅流、または直接的病巣内注射であってよい。注射により治療タンパク質を投与する場合、投与は持続注入または単回もしくは複数回のボーラス投与によるものであってよい。
【０３１２】
さらなる投与経路には、経口、経粘膜、経肺、および経皮が含まれる。経口送達は、ポリエステル微粒子、ゼイン微粒子、プロテイノイド微粒子、ポリシアノアクリレート微粒子、および脂質に基づく系に適している(例えば、DiBase and Morrel,「Oral Delivery of Microencapsulated Proteins」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)を参照されたい)。鼻腔内送達の実行可能性は、インスリン投与のような様式で例証される(例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)を参照されたい)。可溶性IL-17RCまたは抗IL-17RC抗体を含む乾燥または液体粒子を調製し、乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を用いて吸入させることができる(例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998)；Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999))。このアプローチは、エアロゾル化されたインスリンを肺に送達する携帯式の電動吸入装置である、AERX糖尿病管理システムによって例証される。研究の結果、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波数超音波を利用することで皮膚を介して治療濃度で送達されることが示されており、これは経皮投与の実行可能性を示すものである(Mitragotri et al., Science 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、本発明の可溶性ポリペプチドを投与するための別の手段を提供する(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997))。
【０３１３】
本発明の可溶性ポリペプチドを含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより治療タンパク質は薬学的に許容される担体との混合物中に組み込まれる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合に、「薬学的に許容される担体」と表現される。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。その他の適切な担体は当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)を参照されたい。
【０３１４】
治療目的のために、本発明の可溶性ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を、治療有効量で患者に投与する。本発明の治療分子と薬学的に許容される担体との混合物は、投与量が生理学的に有意である場合に、「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在によりレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化が生じる場合に、生理学的に有意である。例えば、炎症の治療に用いられる薬剤は、その存在により炎症反応が軽減する場合に、生理学的に有意である。
【０３１５】
本発明の可溶性ポリペプチドを含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射用溶液および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, 「Implants in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., 「Protein Delivery with Infusion Pumps」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., 「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。
【０３１６】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達するための1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である(全般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, 「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは組成が細胞膜と類似しており、その結果リポソームは安全に投与することができ、また生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームの大きさは0.02μm〜10μm超の直径で様々であり得る。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができる：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照されたい)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより、封入薬剤の治療利用能を制御することが可能である。
【０３１７】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985))。静脈内投与後、小さなリポソーム(0.1〜1.0μm)は典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０３１８】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984))。加えて、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３１９】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはリガンドを挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するように調製することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている(Hayakawa et al.、日本国特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993))。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油(HCO-60)を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的化することが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997))。
【０３２０】
または、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的化リガンドをリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面上に発現するアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的化することができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することにより阻害され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997))。ポリアコニチル化(polyaconitylated)ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997))。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号は、肝臓の特殊化した代謝細胞に会合している肝胆道受容体に対して特異性を有する肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０３２１】
組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞を、標的細胞によって発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体で前標識する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。
【０３２２】
ポリペプチドおよび抗体は、タンパク質微小カプセル化の標準的な技法を用いてリポソーム内に封入することができる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al. 「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」, Liposome Technology, 2nd Edithion, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照されたい)。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３２３】
分解性ポリマー微粒子は、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するように設計されている。微粒子は、ポリラクチド・グリコリド共重合体(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、このポリマー内にタンパク質が封入される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, 「Role of Polymers in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, 「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(PEG)で被覆されたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照されたい)。
【０３２４】
本発明はまた、IL-17RCまたはIL-17RC/IL-17RA単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体可溶性受容体などの、IL-17Aおよび/またはIL-17F結合活性を有するポリペプチドであって、上記のポリマーに連結された化学修飾ポリペプチドを意図する。
【０３２５】
当業者は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されるように、他の投与剤形を考案することができる。
【０３２６】
例として、薬学的組成物は、本発明の可溶性ポリペプチドの1つを含む容器を含むキットとして提供され得る。治療ポリペプチドは、単回もしくは複数回用量の注射用溶液の形態で、または注射前に再構成される滅菌粉末として提供され得る。または、このようなキットは、治療ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を含み得る。このようなキットは、薬学的組成物の適応および用法に関する書面情報をさらに含み得る。さらに、このような情報は、組成物が、IL-17RCまたはIL-17RAに対する公知の過敏症を有する患者には禁忌であるという記述を含み得る。
【０３２７】
本発明の可溶性ポリペプチドを含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射用溶液、エアロゾル、滴剤、トポロジー溶液(topological solution)、および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, 「Implants in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., 「Protein Delivery with Infusion Pumps」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., 「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。その他の固体形態には、クリーム剤、ペースト剤、その他のトポロジー適用(topological application)などが含まれる。
【０３２８】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達するための1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である(全般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, 「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは組成が細胞膜と類似しており、その結果リポソームは安全に投与することができ、また生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームの大きさは0.02μm〜10μm超の直径で様々であり得る。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができる：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照されたい)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより、封入薬剤の治療利用能を制御することが可能である。
【０３２９】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985))。静脈内投与後、小さなリポソーム(0.1〜1.0μm)は典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０３３０】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984))。加えて、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３３１】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはリガンドを挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するように調製することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている(Hayakawa et al.、日本国特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993))。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油(HCO-60)を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的化することが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997))。
【０３３２】
または、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的化リガンドをリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面上に発現するアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的化することができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することにより阻害され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997))。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997))。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号は、肝臓の特殊化した代謝細胞に会合している肝胆道受容体に対して特異性を有する肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０３３３】
組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞を、標的細胞によって発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体で前標識する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。
【０３３４】
本発明の可溶性ポリペプチドは、タンパク質微小カプセル化の標準的な技法を用いてリポソーム内に封入することができる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al. 「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」, Liposome Technology, 2nd Edithion, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照されたい)。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３３５】
分解性ポリマー微粒子は、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するように設計されている。微粒子は、ポリラクチド・グリコリド共重合体(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、このポリマー内にタンパク質が封入される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, 「Role of Polymers in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, 「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(PEG)で被覆されたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照されたい)。
【０３３６】
当業者は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されるように、他の投与剤形を考案することができる。
【０３３７】
本発明は、本発明の可溶性ポリペプチドの組成物、ならびに本明細書に記載の同ポリペプチドを含む方法および治療的使用を意図する。そのような組成物は担体をさらに含み得る。担体は、従来の有機または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０３３８】
K) トランスジェニックマウスの作製
あらゆる組織において、または組織特異的もしくは組織選択的調節エレメントの制御下でIL-17F、IL-17A、IL-17RA、またはIL-17RC遺伝子を過剰発現するように、トランスジェニックマウスを操作することができる。これらの過剰産生体を用いて、過剰発現に起因する表現型を特徴づけることができ、またトランスジェニック動物は、過剰なIL-17F、IL-17A、IL-17RA、またはIL-17RCに起因するヒト疾患のモデルとなり得る。これらのいずれかを過剰に発現するトランスジェニックマウスはまた、大型動物の乳汁または血液中での、本発明の可溶性ポリペプチドのいずれかのようなIL-17RAまたはIL-17RCの産生に関するモデルバイオリアクターを提供する。トランスジェニックマウスを作製する方法は、当業者には周知である(例えば、Jacob, 「Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice」, Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995)、およびAbbud and Nilson, 「Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice」, Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)を参照されたい)。
【０３３９】
例えば、IL-17RC遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法は、生殖能力のある成体雄(繁殖用雄)(B6C3f1、2〜8月齢(Taconic Farms、ニューヨーク州、ジャーマンタウン))、精管切除雄(繁殖不能雄)(B6D2f1、2〜8月齢、(Taconic Farms))、性的成熟前の生殖能力のある雌(ドナー)(B6C3f1、4〜5週齢、(Taconic Farms))、および生殖能力のある成体雌(レシピエント)(B6D2f1、2〜4月齢、(Taconic Farms))を用いて開始し得る。ドナーを1週間順化させた後、約8 IU/マウスの妊馬血清ゴナドトロピン(Sigma Chemical Company；ミズーリ州、セントルイス)を腹腔内に注射し、46〜47時間後に、8 IU/マウスのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG (Sigma))を腹腔内に注射して過排卵を誘発する。ホルモン注射後に、ドナーを繁殖用雄と交配させる。排卵は通常、hCG注射の13時間以内に起こる。交配翌朝、膣栓の存在により交尾を確認する。
【０３４０】
受精卵を外科用顕微鏡下で採取する。卵管を採取し、ヒアルロニダーゼ(Sigma)を含む尿検査用スライド上に卵を放出させる。卵をヒアルロニダーゼで1回洗浄し、37℃で5% CO2、5% O2、および90% N2下でインキュベートしたWhittenのW640培地(例えば、Menino and O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986)、およびDienhart and Downs, Zygote 4:129 (1996)に記載されている)で2回洗浄する。卵はその後、マイクロインジェクションを行うまで、37℃/5% CO2インキュベーター内で保存する。
【０３４１】
IL-17RCコード配列を含むプラスミドDNA 10〜20マイクログラムを線状化し、ゲル精製し、マイクロインジェクション用に最終濃度が5〜10 ナノグラム/マイクロリットルとなるよう、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、0.25 mM EDTA (pH 8.0)に再懸濁する。例えば、IL-17RCコード配列は、配列番号:2のアミノ酸残基21〜452を含むポリペプチドをコードし得る。
【０３４２】
加温したCO2平衡化ミネラルオイルを重層したW640培地の液滴中に含まれる回収卵に、プラスミドDNAをマイクロインジェクションする。DNAを注射針内に引き込み(内径0.75 mm、外径1 mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き抜く)、個々の卵に注入する。個々の卵に注射針を差し込み、一倍体前核の一方または両方まで到達させる。
【０３４３】
数ピコリットルのDNAを前核に注入し、注射針を核小体に接触しないように引き抜く。この手順を、すべての卵への注入が終わるまで繰り返し行う。マイクロインジェクションが成功した卵を、事前にガスを加えておいたW640培地を含む器官組織培養皿に移して、37℃/5% CO2インキュベーター内で一晩保存する。
【０３４４】
翌日、2細胞胚を偽妊娠レシピエントに移す。レシピエントは、精管切除繁殖不能雄との交尾後に交尾栓の存在によって同定する。レシピエントを麻酔して背部の左側を剪毛し、外科用顕微鏡に移す。胸郭、鞍部、および後肢、膝と脾臓の間の中程で囲まれた腹部中央の皮膚および筋肉壁を小さく切開する。小さな外科用布上に生殖器官を露出させる。脂肪塊を外科用布上に広げ、小型止血小鉗子(Roboz、メリーランド州、ロックビル)を脂肪塊に取り付け、マウスの背中側につるしておき、臓器が滑り込んで戻るのを防ぐ。
【０３４５】
ミネラルオイルならびにその後に交互にW640および気泡を含む微細移入用ピペットを用いて、前日の注入で得られた12〜17個の健常2細胞胚をレシピエントに移す。卵管膨大部の位置を確認し、膨大部と卵巣嚢との間に卵管を保持し、膨大部および卵巣嚢を断裂させないように、卵管の卵巣嚢の近傍に28g針で切れ目を入れる。
【０３４６】
ピペットを卵管の切れ目に挿入し、1番目の気泡がピペットから出るように胚を注入する。脂肪塊を緩やかに腹膜へ押しつけ、生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を1回の縫合で閉じ、皮膚を創傷クリップで閉じる。マウスを、37℃のスライドウォーマーで最低4時間かけて回復させる。
【０３４７】
レシピエントを対でケージに戻し、19〜21日の妊娠期間をおく。出生後は、分娩後19〜21日おいて離乳させる。離乳仔の性別を確認し、性別隔離ケージに収容し、清潔なハサミで尾部から0.5 cmの生検試料(遺伝子型決定用)を切り取る。
【０３４８】
例えばQiagen Dneasyキットを製造業者の説明書に従って用いて、尾部切片からゲノムDNAを調製する。IL-17RC遺伝子または同じプラスミド中に導入された選択マーカー遺伝子を増幅するように設計されたプライマーを使用して、PCRによりゲノムDNAを解析する。動物がトランスジェニックであることを確認した後、トランスジェニック雌と野生型雄、またはトランスジェニック雄と1匹もしくは2匹の野生型雌を一緒にすることで、近交系と戻し交配する。仔が生まれて離乳させたら、性別に分けて、遺伝子型決定用に尾部を切り取る。
【０３４９】
生体動物における導入遺伝子の発現を調べるために、部分的肝切除を行う。剣状突起直下の上腹部で手術の準備を行う。無菌的技法を用いて胸骨下を小さく1.5cm〜2 cm切開し、肝臓の左側葉を露出させる。4-0絹糸を用いて下葉の周囲を結紮し、体腔の外側に固定する。非外傷性鉗子を用いて結び目を抑えながら、吸収性Dexon(American Cyanamid；ニュージャージー州、ウェーン)の第2のループを、第1の結び目の近位に配置する。Dexonの結び目から遠位部を切断し、約100 mgの切除肝組織を滅菌ペトリ皿に入れる。切除肝切片を14 mlポリプロピレン丸底チューブに移し、液体窒素中で急速凍結させ、その後ドライアイス上で保存する。外科処置部位を縫合および創傷クリップで閉じ、37℃に加熱したパッド上に動物のケージを術後24時間静置する。術後は動物を毎日調べ、創傷クリップを術後7〜10日目に除去する。RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法またはポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、各トランスジェニックマウスについてIL-17RC mRNAの発現レベルを調べる。
【０３５０】
IL-17F、IL-17A、IL-17RA、またはIL-17RCを過剰発現するトランスジェニックマウスの作製に加えて、これら遺伝子のいずれかの発現が異常に低いかまたは遺伝子を発現しないトランスジェニックマウスを操作することも有用である。このようなトランスジェニックマウスは、IL-17F、IL-17A、IL-17RA、またはIL-17RCの欠損に関連する疾患の有用なモデルを提供する。上述したように、IL-17RC遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、または外部ガイド配列遺伝子を用いて阻害することができる。例えば、IL-17RC遺伝子を低発現するトランスジェニックマウスを作製するためには、このような阻害配列をIL-17RC mRNAに標的化する。特定の遺伝子の発現が異常に低いトランスジェニックマウスを作製する方法は、当業者には公知である(例えば、Wu et al., 「Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies」, Methods in Gene Biotechnology, pages 205-224 (CRC Press 1997)を参照されたい)。
【０３５１】
IL-17RC遺伝子発現がほとんどまたは全くないトランスジェニックマウスを作製する別のアプローチでは、少なくとも一方の正常IL-17RC対立遺伝子が非機能的IL-17RC遺伝子によって置換されたマウスを作製する。非機能的IL-17RC遺伝子を設計する1つの方法では、選択マーカー遺伝子などの別の遺伝子を、IL-17RCをコードする核酸分子内に挿入する。このようないわゆる「ノックアウトマウス」を作製する標準的な方法は、当業者には公知である(例えば、Jacob, 「Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice」, Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994)、およびWu et al., 「New Strategies for Gene Knockout」, Methods in Gene Biotechnology, pages 339-365 (CRC Press 1997)を参照されたい)。
【０３５２】
本発明を以下の非制限的な実施例によりさらに説明する。
【０３５３】
実施例1
IL-17RC遺伝子の発現
ヒト多組織ブロット(Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて、ノーザン解析を行った。ゲル精製したPCR産物から、2つのプローブを作製した。第1プローブは、プライマーとして
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および
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を用いて作製した。製造業者の手順に従ってAmersham(イリノイ州、アーリントンハイツ)のマルチプライム標識化キットを用いて、プローブを放射能標識した。NucTrapプッシュカラム(Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ)を用いて、プローブを精製した。ノーザンブロットのためのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液には、ExpressHyb(Clontech)溶液を使用した。ハイブリダイゼーションは、65□Cで一晩行った。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、以下のように0.1% SDSおよびSSCを含む溶液中でそれぞれ30分間洗浄した：2xSSC中で室温で2回、0.1x SSC中で50℃で3回、0.1x SSC中で55℃で1回、および0.1x SSC中で65℃で1回。結果から、IL-17RC遺伝子が、甲状腺、副腎、前立腺、および肝臓組織において強く発現し、心臓、小腸、胃、および気管組織においてより低度に発現することが実証された。対照的に、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、結腸、末梢血白血球、脊髄、リンパ節、および骨髄では、発現はほとんどまたは全く認められない。
【０３５４】
実施例2
PCRを用いた細胞株パネルにおけるmRNAの分布
社内で増殖させた休止および刺激化細胞株から全RNAを精製し、製造業者の説明書に従ってQiagen(カリフォルニア州、バレンシア) RNeasyキット、または酸-フェノール精製手順(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987)を用いて精製した。一定分量をAgilentバイオアナライザーに供して、RNAの質を評価した。RNAが有意に分解していた場合には、その後の第1鎖cDNAの作製に使用しなかった。遺伝子間ゲノムDNAの単一部位を増幅するプライマーである
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および
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を用いて、RNAの一定分量でPCRアッセイすることにより、混入ゲノムDNAの存在を評価した。混入ゲノムDNAアッセイのPCR条件は以下の通りであった：最終量25 ul中の、10X緩衝液2.5μlおよびAdvantage 2 cDNAポリメラーゼ混合物0.5μl(BD Biosciences Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)、2.5 mM dNTP混合物2 ul(Applied Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティー)、10X Rediload 2.5μl(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバット)、ならびに20 uM zc41011およびzc41012 0.5μl。サイクルパラメータは、94℃で20秒、94℃で20秒、60℃で1分20秒の40サイクル、および72℃で7分の1サイクルであった。各反応物10 ulをアガロースゲル電気泳動に供し、混入ゲノムDNA由来のPCR産物の存在に関してゲルを調べた。混入ゲノムDNAが認められた場合には、製造業者の説明書に従ってDNAフリー試薬(Ambion, Inc、テキサス州、オースチン)を用いて全RNAをDNアーゼ処理し、次いで上記の通りに再度試験した。混入ゲノムDNAを含まないと考えられるRNAのみを、その後の第1鎖cDNAの作製に使用した。
【０３５５】
82のヒト細胞株に由来する全RNA 20μgをそれぞれH2Oで98μlにし、次いでそれぞれ全RNA 10μgを含む2つの49 ul一定分量に分割し、2枚の96ウェルPCRプレートに入れた。各分割量に、第1鎖cDNA合成のための試薬(Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System、カリフォルニア州、カールズバッド)：25 mM MgCl2 20μl、10X RT緩衝液10 ul、0.1M DTT 10 ul、オリゴdT 2μl、RNAseOut 2 ulを添加した。次に、各細胞株由来の一方の分割量に、Superscript II逆転写酵素2μlを添加し、対応する細胞株分割量にH2O 2μlを添加して、マイナス逆転写酵素陰性対照を作製した。全試料を以下の通りにインキュベートした：25℃で10分、42℃で50分、70℃で15分。試料をディープウェルプレートに配置し、H2Oで1.7 mlに希釈した。Multipette(Saigan)ロボットを用いて、96ウェルPCRプレートの各ウェル中に16.5μlずつ複数回分注し、細胞株の使い切りPCRパネルを多数作製し、次いで密封して−20℃で保存した。これらのパネル中の各ウェルは、全RNA約100 ngに由来する第1鎖cDNAを表す。82の細胞株は、2つのパネル：アレイ#118Aおよび#118Bに散在している。広範に発現するが中程度にのみ豊富な2つの遺伝子、CLTC(クラスリン)およびTFRC(トランスフェリン受容体C)に対するプライマーを用いて、1組のパネルにおいて多重PCRアッセイにより、パネルにおける第1鎖cDNAの質を評価した。クラスリンプライマー
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およびTFRCプライマー
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各0.5 ulを、10X緩衝液2.5μlおよびAdvantage 2 cDNAポリメラーゼ混合物0.5μl(BD Biosciences Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)、2.5 mM dNTP混合物2μl(Applied Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティー)、10X Rediload 2.5μl(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバット)と混合し、アレイ#118Aおよびアレイ#118Bのパネルの各ウェルに添加した。サイクルパラメータは以下の通りであった：94℃で20秒、94℃で20秒、67℃で80秒の35サイクル、および72℃で7分の1サイクル。各反応物10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、各細胞株について、+RTウェルに特異的な各遺伝子の強いPCR産物の存在に関してゲルをスコア化した。
【０３５６】
試料毎にこれらのPCR条件：10X緩衝液2.5μlおよびadvantage 2 cDNAポリメラーゼ混合物0.5μl(BD Biosciences Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)、2.5 mM dNTP混合物2μl(Applied Biosystems、)、10X Rediload 2.5 ul(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバット)、ならびにそれぞれ20 uMのセンスおよびアンチセンスプライマー0.5μl下で、センスオリゴ
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およびアンチセンスオリゴ
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を用いてPCRすることにより、ヒト第1鎖cDNAパネルにおけるIL-17RCのmRNAの発現をアッセイした。サイクル条件は、94℃で2分、94℃で1分、66℃で30秒、72℃で1.5分の35サイクル、および72℃で7分の1サイクルであった。各反応物10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、IL-17RCの陽性または陰性発現に関してゲルをスコア化した。
【０３５７】
IL-17RC mRNAは、広範囲の組織および細胞型を表す多くの細胞株で広範に発現する。特に、IL-17RCは、単球、B細胞、および骨髄系統の細胞を含む非T細胞末梢血細胞株で一貫して発現する。また、IL-17RC mRNAは、皮膚由来の細胞株において確実に発現する。IL-17RCを発現する他の細胞株は、アレイ上に存在した全部で5つの大腸細胞株である。
【０３５８】
実施例3
RT PCRを用いたマウス細胞株パネルにおけるmRNAの分布
社内で増殖させた60の休止および刺激化細胞株から全RNAを精製し、製造業者の説明書に従ってQiagen(カリフォルニア州、バレンシア) RNeasyキット、酸-フェノール精製手順(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987)、またはTrizol試薬手順(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)を用いて精製した。
【０３５９】
各細胞株に由来する全RNA 5μgをディープウェル96ウェルプレートに配置し、3 M NaOAc 125μlおよびPellet Paint 100μl(Novagen、ウィスコンシン州、マディソン)を各ウェルに添加し、次いで最終量をH2Oで1.25 mlに調整した。Multipette(Saigan)ロボットを用いて、96ウェルPCRプレートの各ウェル中にRNA混合物25μlおよびその後EtOH 75 ulを複数回分注し、細胞株の使い切りRT PCRパネルを多数作製し、次いで密封して−20℃で保存した。Qiagen(カリフォルニア州、バレンシア) 96ウェル遠心分離機でパネルをまず6000 RPMで10分間遠心分離することにより、RT PCRスクリーニングを行った。吸収紙上にプレートを逆さに置き、上清を除去した。RNAペレットを70% EtOH 100μlで洗浄し、その後6000 RPMで5分間遠心分離した。上清を再度除去し、残りのEtOHが蒸発するまでプレートを風乾した。RNAペレットをH2O 15μlに再懸濁した。
【０３６０】
試料毎にこれらのRT PCR条件：SuperScript One-Step PCR with Platinum Taqキット(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)下で、
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を用いてRT PCRすることにより、マウス細胞株RNAパネルにおけるIL-17RC mRNAの発現をアッセイした。サイクル条件は、48℃で30分、94℃で2分の1サイクル、その後94℃で15秒、55℃で30秒、72℃で1.5分の35サイクル、その後72℃で7分の1サイクルであった。各反応物10μlをアガロースゲル電気泳動に供し、IL-17RCの陽性または陰性発現に関してゲルをスコア化した。
【０３６１】
マウスIL-17RC mRNAは、いくつかのマウス細胞株において、特に骨芽細胞、脂肪細胞、および前脂肪細胞株を含む骨髄由来の細胞株において発現する。また、マウスIL-17RC mRNAは、膵臓間質細胞株、膵臓島細胞株、ならびに視床下部、唾液腺、および精巣細胞株などの内分泌系由来のいくつかの試料において表わされる。
【０３６２】
実施例4
大腸菌で産生されたpIL-17Fの再折りたたみおよび精製
A) 封入体単離およびpIL-17Fの抽出
バッチ発酵または振盪フラスコ培養でタンパク質発現を誘導した後、大腸菌ブロスを1リットルボトル中で、Sorvallスウィングバケットローターで3000 RPMにて遠心分離する。200 mM NaClおよび5 mM EDTAを含む50 mM Tris pH 8.0を用いて、上清が透明になるまで、ブロス混入物を除去するための細胞ペーストの洗浄を行う。
【０３６３】
次に細胞ペレットを、600 nmで10〜20光学濃度単位となるよう、氷冷溶解緩衝液(50 mM Tris pH 8.0；5 mM EDTA；200 mM NaCl、10%スクロース(w/v)；5 mM DTT；5 mMベンズアミジン)に懸濁する。次いでこのスラリーを冷却APV 2000 Labホモジナイザーで8500〜9000 psiに3回供し、破壊細胞溶解物を生成する。細胞溶解物を20,000 x G、4℃で1時間遠心分離し、不溶性画分(封入体)を回収する。
【０３６４】
20,000 x Gの遠心で生じた封入体ペレットを秤量した後、洗浄緩衝液10 ml/グラム封入体で洗浄緩衝液(200 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mM DTT、5 mMベンズアミジンを含む50 mM Tris pH 8)に再懸濁する。OMNI internationalローターステーター発生装置を用いてホモジナイズすることにより、完全な分散を達成する。この懸濁液を、20,000 x G、4℃で30分間遠心分離する。上清が透明になるまで、洗浄サイクルを3〜5回繰り返す。
【０３６５】
0.1 M亜硫酸ナトリウムおよび0.02 Mテトラチオン酸ナトリウムを含む40 mM Tris緩衝液 pH 8中の7 MグアニジンHCl中で、最終洗浄ペレットを可溶化する。4℃で一晩穏やかに撹拌しながら、抽出および亜硫酸分解反応を進行させる。その結果生じるピンク色がかった溶液を35,000 X g、4℃で1時間遠心分離し、可溶性pIL-17Fを含む清澄化上清を0.45 umで濾過する。
【０３６６】
B) pIL-17F再折りたたみ手順
55 mM MES、10.56 mM NaCl、0.44 mM KCl、0.055% PEG(3400 K)、1.1 mM EDTA、20%グリセロール、0.5 MグアニジンHCl、0.75 Mアルギニン、および1:1比でのグルタチオン酸化還元対(1 mM GSH:1 mM GSSG)を含む氷冷再折りたたみ緩衝液中に滴下希釈することにより、可溶化亜硫酸分解pIL-17Fを再折りたたみさせる。再折りたたみ緩衝液のpHをHClで6.5に調整し、pIL-17Fを最終濃度100 ug/mlとなるよう添加する。一旦希釈したら、混合物を低温室において72時間ゆっくりと撹拌させておく。
【０３６７】
C) 生成物の回収および精製
再折りたたみしたpIL-17Fを、ラボスケールTFFシステムにおいて対10 kDaカットオフ膜で10倍濃縮する。次いで、0.45ミクロン膜を用いてこれを濾過し、酢酸を添加してpHを5.1に調整する。50 mM酢酸緩衝液、pH 5.1で平衡化したPharmacia SP Fast Flowカラムでの陽イオン交換クロマトグラフィーにより、pH調整した物質を捕獲する。流速190 cm/時間で平衡緩衝液により1:5でインライン配分することにより、pIL-17Fを負荷する。この希釈によりイオン強度が減少して、標的の基質に対する効率的結合が可能になる。試料の負荷が完了した後、カラムを平衡緩衝液で基準吸光度になるまで洗浄する。カラムを50 mM酢酸緩衝液 pH 5.1中の0.4 M NaClで洗浄した後、結合しているタンパク質を、50 mM酢酸緩衝液 pH 5.1中の0.4 M〜1.5 M NaClの5 CV勾配で溶出する。タンパク質は約1 M NaClで溶出し、溶出液画分のSDS PAGE解析によると約85%が二量体である。pIL-17Fを含む画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製および緩衝液交換のため、Amicon撹拌セルを用いて、10 kDaカットオフ限外濾過膜に対して濃縮する。
【０３６８】
D) サイズ排除緩衝液交換および処方化
109 mM NaClを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2で平衡化したPharmacia Superdex 75サイズ排除カラムに、濃縮陽イオンプール(CVの3〜4%の量)を流速30 cm/時間で注入する。生成物を含む対称的溶出液ピークを、109 mM NaClを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2で1 mg/ml濃度に希釈する。最後に、pIL-17Fを0.2ミクロンで滅菌濾過し、分注して−80℃で保存する。最終的な工程収率は20%である。
【０３６９】
実施例5
哺乳動物可溶性IL-17RC発現構築物の構築
ヒトIL-17RC [L21-K451]-mFc1(マウスBALB/c μ2a Fc)を含む発現構築物を、IL-17RCポリペプチド(配列番号:43)をコードするDNA断片(配列番号:42)、mFc1をコードするDNA断片(配列番号:44)、および発現ベクターpZMP20を用いて、重複PCRおよび相同組換えにより構築する。断片は、PCR増幅により作製する。
【０３７０】
IL-17RC [L21-K451]をコードするPCR断片は、最適化組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ分泌リーダー配列コード領域中のpZMP20ベクター配列との5'重複、[L21-K451]をコードするIL-17RC細胞外ドメイン、およびmFc1コード領域との3'重複を含む。PCR増幅反応は、5'オリゴヌクレオチド
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、3'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000019
、および鋳型としての以前に作製されたIL-17RCのDNAクローンを使用する。
【０３７１】
mFc1をコードするPCR断片は、IL-17RC配列との5'重複、mFc1コード領域、およびポリオウイルス内部リボソーム侵入部位領域中のpZMP20ベクターとの3'重複を含む。PCR増幅反応は、5'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000020
、3'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000021
、および鋳型としての以前に作製されたmFc1のDNAクローンを使用する。
【０３７２】
PCR増幅反応条件は以下の通りである：94℃で5分の1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分の35サイクル；72℃で10分の1サイクル。PCR反応混合物を1%アガロースゲルで泳動し、予測される大きさに相当するDNA断片を、QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)を用いてゲルから抽出する。
【０３７３】
2つのPCR断片を、重複PCRにより結合させる。2つのゲル抽出断片それぞれ約1μlを、5'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000022
および3'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000023
を用いて、PCR増幅反応で結合させる。使用するPCR条件は以下の通りである：94℃で5分の1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分の35サイクル；72℃で10分の1サイクル。PCR反応混合物を1%アガロースゲルで泳動し、挿入物の大きさに相当するDNA断片を、QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)を用いてゲルから抽出する。
【０３７４】
プラスミドpZMP20は、MPSVプロモーター、酵母組換え前の線状化のためのBglII部位、otPAシグナルペプチド配列、ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入エレメント、膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン；大腸菌複製開始点；SV40プロモーター、エンハンサー、および複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現単位；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。
【０３７５】
ゲル抽出したIL-17RC[L21-K451]-mFc1 PCR断片との酵母中での組換えの前に、プラスミドpZMP20をBglIIで消化する。コンピテント酵母(S. セレビシエ)細胞100μlを、IL-17RC[L21-K451]-mFc1挿入DNA 10μlおよびBglII消化したpZMP20ベクター100 ngと混合し、混合物を0.2 cmエレクトロポレーションキュベットに移す。0.75 kV(5 kV/cm)、∞オーム、および25μFというパワーサプライ(BioRad Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)の設定を用いて、酵母/DNA混合物に電気パルスをかける。1.2 Mソルビトール600μlをキュベットに添加し、酵母を2枚のURA-Dプレートに100μlおよび300μl分割量でプレーティングし、30℃でインキュベートする。約72時間後、単一プレートからのUra+酵母形質転換体をH2O 1 mlに再懸濁し、短時間遠心して酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA) 0.5 mlに再懸濁する。溶解混合物500μlを、酸洗浄ガラスビーズ250μlおよびフェノール-クロロホルム300μlを含むエッペンドルフチューブに添加し、3分間ボルテックスし、エッペンドルフ遠心機で最大速度にて5分間遠心する。水相300μlを新たなチューブに移し、エタノール600μlでDNAを沈殿させた後、最大速度で30分間遠心分離する。チューブをデカントし、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄する。チューブをデカントし、DNAペレットを、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA 30μlに再懸濁する。
【０３７６】
酵母DNA調製物5μlおよび大腸菌細胞50μlを用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(DH12S)の形質転換を行う。2.0 kV、25 μF、および400オームで細胞に電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、SOC(2% Bacto(商標)トリプトン(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 1 mlを添加し、次いで2枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標)アガー(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)に50μlおよび200μl分割量でプレーティングする。
【０３７７】
構築物のDNAクローン3個の挿入物を配列解析に供し、正しい配列を含むクローン1個を選択する。製造業者の説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit、Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離する。
【０３７８】
実施例6
IL-17RC-CEE、IL-17RC-CHIS、およびIL-17RC-CFLAGを発現する哺乳動物可溶性IL-17RC発現構築物の構築
ヒトIL-17RC [L21-K451]を、C末端タグ、Glu-Glu(CEE)、6His(CHIS)、またはFLAG(CFLAG)と共に含む発現構築物を、IL-17RC [L21-K451]をコードするDNA断片(配列番号:42)および発現ベクターpZMP20を用いて、PCRおよび相同組換えにより構築する。
【０３７９】
IL-17RCCEEをコードするPCR断片は、最適化組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ分泌リーダー配列コード領域中のpZMP20ベクター配列との5'重複、[L21-K451]をコードするIL-17RC細胞外ドメイン、Glu-Gluタグの配列(Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu；配列番号:53)、およびポリオウイルス内部リボソーム侵入部位領域中のpZMP20ベクターとの3'重複を含む。PCR増幅反応は、5'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000024
、3'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000025
、および鋳型としての以前に作製されたIL-17RCのDNAクローンを使用する。
【０３８０】
PCR増幅反応条件は以下の通りである：94℃で5分の1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分の35サイクル；72℃で10分の1サイクル。PCR反応混合物を1%アガロースゲルで泳動し、予測される大きさに相当するDNA断片を、QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)を用いてゲルから抽出する。
【０３８１】
ゲル抽出したIL-17RCCEE PCR断片との酵母中での組換えの前に、プラスミドpZMP20をBglIIで消化する。コンピテント酵母(S. セレビシエ)細胞100μlを、IL-17RCCEE挿入DNA 10μlおよびBglII消化したpZMP20ベクター100 ngと混合し、混合物を0.2 cmエレクトロポレーションキュベットに移す。0.75 kV(5 kV/cm)、∞オーム、および25μFというパワーサプライ(BioRad Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)の設定を用いて、酵母/DNA混合物に電気パルスをかける。1.2 Mソルビトール600μlをキュベットに添加し、酵母を2枚のURA-Dプレートに100μlおよび300μl分割量でプレーティングし、30℃でインキュベートする。約72時間後、単一プレートからのUra+酵母形質転換体をH2O 1 mlに再懸濁し、短時間遠心して酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA) 0.5 mlに再懸濁する。溶解混合物500μlを、酸洗浄ガラスビーズ250μlおよびフェノール-クロロホルム300μlを含むエッペンドルフチューブに添加し、3分間ボルテックスし、エッペンドルフ遠心機で最大速度にて5分間遠心する。水相300μlを新たなチューブに移し、エタノール600μlでDNAを沈殿させた後、最大速度で30分間遠心分離する。チューブをデカントし、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄する。チューブをデカントし、DNAペレットを、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA 30μlに再懸濁する。
【０３８２】
酵母DNA調製物5μlおよび大腸菌細胞50μlを用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(DH12S)の形質転換を行う。2.0 kV、25 μF、および400オームで細胞に電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、SOC(2% Bacto(商標)トリプトン(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 1 mlを添加し、次いで2枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標)アガー(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)に50μlおよび200μl分割量でプレーティングする。
【０３８３】
構築物のDNAクローン3個の挿入物を配列解析に供し、正しい配列を含むクローン1個を選択する。製造業者の説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit、Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離する。
【０３８４】
同様の工程を用いて、Gly Ser Gly Gly His His His His His Hisから構成されるC末端hisタグ(IL-17RCCHIS；配列番号:51)、またはGly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysから構成されるC末端FLAGタグ(IL-17RCCFLAG；配列番号:52)を有するIL-17RCを調製する。これらの構築物を調製するには、配列番号:50の3'オリゴヌクレオチドの代わりに、3'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000026
を用いてIL-17RCCHISを作製するか、または3'オリゴヌクレオチド
2009510093.tif 000027
を用いてIL-17RCCFLAGを作製する。
【０３８５】
実施例7
IL-17RC-mFc1融合タンパク質ならびにIL-17RC-CEE、IL-17RC-CHIS、およびIL-17RC-CFLAG C末端タグ化タンパク質を発現する可溶性IL-17RC受容体発現構築物のトランスフェクションおよび発現
可溶性IL-17RC融合またはタグ化発現構築物それぞれの200μgの3組を別々に、PvuI 200単位で37℃で3時間消化し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、1.5 mLマイクロチューブ中で遠心分離する。上清をペレットからデカント除去し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートする。チューブを微量遠心機で14,000 RPMで10分間遠心し、上清をペレットからデカント除去する。次いで、ペレットを滅菌環境においてCHO細胞組織培地750μlに再懸濁し、60℃で30分間インキュベートし、室温まで冷却する。約5 x 106個CHO細胞を3本のチューブそれぞれにおいてペレット化し、DNA-培地溶液を用いて再懸濁する。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップキュベットに入れ、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションする；950 μF、高容量、300 V。次いで、キュベットの内容物を取り出してプールし、CHO細胞組織培地で25 mLに希釈し、125 mL振盪フラスコに入れる。フラスコを振盪器上の37℃、6% CO2のインキュベーターに入れ、120 RPMで振盪させる。
【０３８６】
CHO細胞を栄養選択に供した後、200 nMメトトレキセート(MTX)、次いで1μM MTXへの段階増幅に供する。融合またはタグ化タンパク質発現をウェスタンブロットにより確認し、タンパク質精製用に回収するためにCHO細胞プールを拡大する。
【０３８７】
実施例8
可溶性IL-17RCの発現
IL-17RC-Tbx-C(Fc9)(配列番号:64)を含む発現プラスミドを、IL-17RC _TbxのDNA断片および発現ベクターpZMP40を用いて相同組換えにより構築した。断片は、プライマーzc44531およびzc44545を用いて、PCR増幅により作製した。
【０３８８】
PCR断片IL-17RC_Tbxは、部分的IL-17RC細胞外ドメインコード領域を含むが、これは鋳型として以前に作製されたIL-17RCのクローンを用いて作製した。断片は、otPAコード領域中のpZMP40ベクター配列との5'重複、IL-17RC部分(配列番号:2のアミノ酸残基21〜451)、リンカー配列、トロンビン切断部位、およびFc9コード領域中のpZMP40ベクターとの3'重複を含む。用いたPCR条件は以下の通りであった：94℃で5分の1サイクル；94℃で1分、その後55℃で2分、その後72℃で3分の35サイクル；72℃で10分の1サイクル。
【０３８９】
PCR反応混合物を1%アガロースゲルで泳動し、挿入物の大きさに相当するバンドを、QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)を用いてゲル抽出した。
【０３９０】
プラスミドpZMP40は、MPSVプロモーター、コード配列を挿入するための複数制限部位、otPAシグナルペプチド配列、Fc9の配列；ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン；大腸菌複製開始点；SV40プロモーター、エンハンサー、および複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現単位；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。pZMP21（米国特許公開第2003/0232414 A1；American Type Culture Collectionに寄託され、ATCC# PTA-5266が付与された）から構築された。
【０３９１】
PCR断片との酵母中での組換えの前に、プラスミドpZMP40をBglIIで切断した。コンピテント酵母(S. セレビシエ)細胞100μlを個々に、挿入DNA(配列番号:66) 10μlおよび切断したpZMP40ベクター100 ngと混合し、混合物を0.2-cmエレクトロポレーションキュベットに移した。0.75 kV(5 kV/cm)、∞オーム、および25μFというパワーサプライ(BioRad Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)の設定を用いて、酵母/DNA混合物に電気パルスをかけた。1.2 Mソルビトール600μlをキュベットに添加し、酵母を2枚のURA-Dプレートに100-μlおよび300μl分割量でプレーティングし、30℃でインキュベートした。約72時間後、単一プレートからのUra+酵母形質転換体をH2O 1 mlに再懸濁し、短時間遠心して酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA) 0.5 mlに再懸濁した。溶解混合物500μlを、酸洗浄ガラスビーズ250μlおよびフェノール-クロロホルム300μlを含むエッペンドルフチューブに添加し、3分間ボルテックスし、エッペンドルフ遠心機で最大速度にて5分間遠心した。水相300μlを新たなチューブに移し、エタノール(EtOH) 600μlでDNAを沈殿させた後、最大速度で30分間遠心分離した。チューブをデカントし、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄した。チューブをデカントし、DNAペレットをTE 30μlに再懸濁した。
【０３９２】
酵母DNA調製物5μlおよび細胞50μlを用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(DH12S)の形質転換を行った。2.0 kV、25 μF、および400オームで細胞に電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、SOC(2% Bacto(商標)トリプトン(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 1 mlを添加し、次いで2枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標)アガー(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)に50μlおよび200μl分割量でプレーティングした。
【０３９３】
構築物のクローン3個の挿入物を配列解析に供し、正しい配列を含む各構築物クローン1個を選択した。製造業者の説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit、Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離した。
【０３９４】
次に、IL-17RC[L21-K451]_Tbx_C(Fc9)構築物200μgの3組をそれぞれ、PvuI 200単位で37℃で3時間消化し、次いでIPAで沈殿させ、1.5 mLマイクロチューブ中で遠心沈降させた。上清をペレットからデカント除去し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機で14,000 RPMで10分間遠心し、上清をペレットからデカント除去した。次いで、ペレットを滅菌環境においてPF-CHO培地750μlに再懸濁し、60℃で30分間インキュベートし、室温まで冷却した。5E6 APFDXB11細胞を3本のチューブそれぞれにおいて遠心沈降させ、DNA-培地溶液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップキュベットに入れ、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションした：950 μF、高容量、および300 V。次いで、キュベットの内容物を取り出してプールし、PF-CHO培地で25 mLに希釈し、125 mL振盪フラスコに入れた。フラスコを振盪器上の37℃、6% CO2のインキュベーターに入れ、120 RPMで振盪させた。
【０３９５】
細胞を栄養選択に供した後、200 nMメトトレキセート(MTX)、次いで1μM MTXへの段階増幅に供した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞株を拡大し、続いてタンパク質精製を行った。
【０３９６】
実施例9
CHO細胞からの可溶性IL-17RCの精製
IL-17RC-TbX-Fc9(配列番号:64)を発現するCHO細胞の馴化培地を、2つのBiomax 0.1 m2 30 kD分子量カットオフ膜カセット(Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォード)に対して、Pellicon-II接線流システムを用いて約10倍濃縮した。濃縮培地を氷酢酸で5.5にpH調整し、0.2 □mで滅菌濾過した後、バッチクロマトグラフィーにより、プロテインGセファロースfast flow樹脂(Pharmacia、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)に4℃で一晩負荷した。pH調整した馴化培地を負荷する前に、5カラム体積(約150 ml)の25 mM酢酸ナトリウム、150 mM NaCl、pH 5.5でプロテインG樹脂を平衡化した。濾過しpH調整した馴化培地と樹脂の比は、33:1(v/v)であった。
【０３９７】
バッチクロマトグラフィー工程は、周囲室温(約21C)で行った。バッチ処理したpH調整、0.22 μm濾過済み馴化培地を空の5.5 x 20.5 cmガラスカラム(BioRad、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)に流し込み、重力で充填した。カラムを10カラム体積(約300 ml)の25 mM酢酸ナトリウム、150 mM NaCl、pH 5.5で洗浄した。次に、結合しているタンパク質を100 mMグリシン、pH 2.7で溶出した。9.0 ml画分を収集し、1.0 mlの2.0 M Tris、pH8.0で直ちに中和した。収集画分をSDS-PAGEクーマシー染色により解析した。IL-17RC-Tbx-Fc9を含む画分をプールし、製造業者の説明書に従って5 kD分子量カットオフBiomax膜遠心濃縮器(Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォード)を用いて約6倍に濃縮した。
【０３９８】
次いで、プールした濃縮画分を、7 kD分子量カットオフ膜Slide-A-Lyzer(Pierce、イリノイ州、ロックフォード)を用いて、1Xリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.3(Sigma、ミズーリ州、セントルイス)に対して4℃で十分に透析した。1xリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.3中に処方されたIL-17RC-TbX-Fc9を0.22μmで滅菌濾過した後、分注して−80℃で保存した。
【０３９９】
実施例10
IL-17AおよびIL-17FのヒトIL-17RCへの結合
A) ビオチン化サイトカインのトランスフェクション細胞への結合
ヒトIL-17受容体(配列番号:21)、ヒトIL-17RC(配列番号:2)、またはこれらの受容体の両方をコードする発現ベクターをトランスフェクションしたベビーハムスター腎(BHK)細胞を、ビオチン化ヒトIL-17AおよびヒトIL-17Fと結合する能力に関して評価する。細胞をベルセンを用いて回収し、計数し、染色媒体(SM)(HBSS＋1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、10 mM Hepes、および0.1%アジ化ナトリウム(w/v))で107個細胞/mlとなるよう希釈する。ビオチン化ヒトIL-17A(配列番号:14)およびヒトIL-17F(配列番号:16)を、種々の濃度で細胞と共に氷上で30分間インキュベートする。30分後、過剰なサイトカインをSMで洗浄除去し、細胞をフィコエリトリン結合ストレプトアビジン(SA-PE)の1:100希釈液と共に氷上で30分間インキュベートする。過剰なSA-PEを洗浄除去し、細胞をフローサイトメトリーにより解析する。サイトカイン結合の量を、サイトカイン染色の平均蛍光強度から定量した。この解析から、ヒトIL-17AはヒトIL-17RおよびIL-17RCと同程度に結合するということを見出した。また、ヒトIL-17FはIL-17RCと同レベルで結合するものの、IL-17Rとは検出可能であるが、IL-17Aで認められたレベルよりもはるかに低いレベルで結合する。
【０４００】
B) ビオチン化サイトカインのヒト末梢血単核細胞への結合
フィコール密度勾配遠心分離により、全血からヒト末梢血単核細胞(PBMC)を調製した。107個細胞/mlのPBMCを、1μg/mlのビオチン化IL-17AまたはIL-17F、および種々の白血球系統を識別するように設計された特異的細胞表面タンパク質に対する蛍光色素結合抗体と同時にインキュベートした。これらのマーカーには、CD4、CD8、CD19、CD11b、CD56、およびCD16が含まれる。過剰の抗体およびサイトカインを洗浄除去し、上記の通りにSA-PEと共にインキュベートすることにより、特異的サイトカイン結合を検出する。試料をフローサイトメトリーにより解析し、この解析から、IL-17Aは、試験した実質的にすべてのPBMC集団に結合するが、ヒトIL-17Fはいずれの集団とも検出可能的に結合しないことを見出した。
【０４０１】
C) 非標識サイトカインによるビオチン化ヒトIL-17AおよびIL-17Fの特異的結合の阻害
上記の通りに結合試験を行うが、過剰の非標識ヒトIL-17AおよびIL-17Fを結合反応中に含める。BHK細胞を用いた試験において、非標識サイトカインの量を一定範囲の濃度にわたって変更し、非標識IL-17Aの添加が、IL-17AおよびIL-17FのIL-17RCおよびIL-17Rへの結合において競合したことを見出した。しかし、非標識IL-17Fは、IL-17AおよびIL-17FのIL-17RCへの結合においては競合したが、IL-17Rへの結合においては効率的に競合しなかった。このことから、IL-17AおよびIL-17FがIL-17RCに特異的に結合すること、ならびにそれらが結合において交差競合することから、それらが同一であるかまたは顕著に重複する部位で結合することが示される。また、IL-17AはIL-17FのIL-17Rに対する比較的弱い結合において競合し、これら2つのサイトカインがIL-17R中の類似の領域に結合するが、IL-17FはIL-17RCと比較してはるかに低い親和性でIL-17Rと結合することが示される。
【０４０２】
D) 可溶性IL-17RCおよびIL-17Rによるビオチン化ヒトIL-17AおよびIL-17Fの特異的結合の阻害
可溶型のIL-17RCまたはIL-17Rを結合反応中に含めることを除いては、上記の通りに結合試験を行う。これらの可溶性受容体は、ヒトIgG定常(Fc)領域に融合された各受容体の細胞外ドメインに由来する融合タンパク質である。可溶性IL-17RCが、ヒトIL-17AおよびIL-17FのIL-17RおよびIL-17RCトランスフェクションBHK細胞への結合を阻害することを見出した。しかしながら、可溶性IL-17Rは、IL-17Aの両受容体への結合は阻害するが、IL-17FのIL-17RCへの結合は効率的に遮断せず、このことはIL-17FのIL-17Rに対する不十分な結合と一致する。
【０４０３】
実施例11
IL-17RCに結合するIL-17AおよびIL-17F
A) 非放射性リガンドによる結合阻害
hIL-17RC(配列番号:2)およびIL-17R(配列番号:21)をトランスフェクションしたBHK細胞を、24ウェルディッシュ(Costar 3527)に40,000個細胞/ウェルでプレーティングし、2日おいてからアッセイした。ヨードビーズ法により放射標識しておいたIL-17A(配列番号:14)およびIL-17F(配列番号:16)を、結合緩衝液(10 mg/mlウシ血清アルブミン(Gibco 15260-037)を含むRPMI 1640培地(JRH 51502-500M))による全量250 ul/ウェルでの10 ng/mlで、三つ組にてウェルに個別に添加した。非放射性競合体を100倍モル過剰で添加した。試験した競合体には、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、およびIL-21が含まれた。ウェルを氷上で1時間インキュベートし、その後PBS(Invitrogen 20012-027)で2回洗浄し、高塩濃度溶液(1.5 M NaCL、50 mM HEPES pH 7.4)で1回洗浄した。ウェルを0.8 M NaOH 500 ulで室温で30分間抽出し、カウント/分をγカウンター(Packard Cobra II A5005)で測定した。
【０４０４】
結果から、100xモル濃度の非放射性IL-17AおよびIL-17Fは、125I IL-17AのBHK hIL-17RCへの結合を約7倍減少させ得るが、IL-17B、C、D、E、およびIL-21は結合に影響を及ぼさないことが示された。100xモル濃度の非放射性IL-17Aは、125I IL-17AのBHK IL-17Rへの結合を約4倍減少させたが、IL-17B、C、D、E、F、およびIL-21は結合に影響を及ぼさなかった。100xモル濃度の非放射性IL-17AおよびIL-17Fは、125IL-17FのBHK hIL-17RCへの結合をそれぞれ約4倍および5倍減少させたが、IL-17B、C、D、E、およびIL-21は結合に影響を及ぼさなかった。
【０４０５】
B) 可溶性受容体による結合阻害：
hzytor14(配列番号:2)およびIL-17R(配列番号:21)トランスフェクションBHK細胞への結合を1と同様に行ったが、100倍モル過剰の可溶性hIL-17RCx1/Fc9(実施例8)および可溶性IL-17R/Fc(R&Dから入手；Ref. 177-IR)を、競合において非放射性リガンドの代わりに使用した。パート1と同様に細胞を洗浄し、抽出し、カウントした。
【０４０６】
可溶性hIL-17RC/Fcは、125IL-17FのBHK hIL-17RCへの結合を、3回の実験から平均して10Xモル過剰のIC50で阻害した。同一細胞株に対する125IIL-17Aの可溶性hIL-17RC/Fc阻害は、20Xモル過剰の平均IC50を示し、125I IL-17Aの可溶性IL-17R/Fc阻害は、20xモル過剰の平均IC50を示した。
【０４０７】
C) 結合飽和
トランスフェクションBHK細胞を、1と同様に24ウェルディッシュにプレーティングした。放射標識IL-17AおよびIL-17Fを、結合緩衝液での全量250μl/ウェルで、4 nM濃度から開始して8回の1:3希釈(1.83 pM濃度まで)で三つ組にて添加した。別に、100倍モル過剰の非放射性リガンドを各希釈点で添加した。1と同様に細胞を洗浄し、抽出し、カウントした。各希釈点において非競合カウントから100倍過剰のカウントを差し引いて、添加した放射標識リガンドの濃度に対して比カウント/分をプロットした。これらの標準化データをプロットして、放射標識リガンドとトランスフェクションBHK細胞の各組み合わせに関する飽和結合曲線を作成した。表7は、全3回の実験から算出した親和性値を示す。
【０４０８】
【表７】
2009510093.tif 000028
【０４０９】
一部位結合曲線フィットは、IL-17Rに対するIL-17AおよびIL-17F結合と最も密接に一致した。二部位結合曲線フィットは、hIL-17RCに対するIL-17AおよびIL-17F結合と最も密接に一致した。高親和性結合部位は、上記に示す値である。低親和性結合部位は非常に低い親和性を有し、3回の実験間で大きく異なった。
【０４１０】
実施例12
ヒトIL-17AおよびIL-17Fに応答するマウスnih3t3細胞
A) 細胞のプレーティングおよびkz142アデノウイルスレポーター感染
マウス線維芽細胞に由来するnih3t3細胞(ATCCに記載)nih3t3を、グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/10% FBSを用いて、固体白色細胞培養被覆96ウェルプレート(カタログ番号3917、Costar)に5000個細胞/ウェルでプレーティングし、37℃および5% CO2で一晩培養した。この第2日目に、プレーティング培地を除去し、感染効率5000粒子/細胞のKz142アデノウイルス粒子を、グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/1% FBSで調製し、37℃および5% CO2で一晩培養した。
【０４１１】
B) kz142アデノウイルスレポーター感染nih3t3細胞のIL-17AおよびIL-17F活性化を測定するルシフェラーゼアッセイ
アデノウイルス粒子レポーターと共に一晩インキュベートした後、ヒトIL-17AおよびIL-17Fリガンド処理物を、.28% BSAに改良した無血清培地()で調製した。アデノウイルス粒子および培地を除去し、適切なリガンド用量を三つ組で付与した。37℃および5% CO2でのインキュベーションを4時間継続し、その後培地を除去し、細胞を15分かけて溶解し、ルシフェラーゼアッセイ系および試薬(カタログ番号e1531 Promega、ウィスコンシン州、マディソン)ならびにマイクロプレートルミノメーターを用いて平均蛍光強度(MFI)を測定した。.1〜1000 ng/mlヒトIL-17AおよびIL-17Fの範囲の濃度で活性を検出し、両リガンドに関して約50 ng/mlというEC50値を得た。これらのデータから、nih3t3細胞がこれらのリガンドに対する受容体を保有すること、ならびにIL-17AおよびIL-17FがNfKb/Ap-1転写因子を活性化することが示唆される。
【０４１２】
実施例13
IL-17RAおよびIL-17RCを両方発現するマウスnih3t3細胞
nih3t3 RNAのRTPCR解析から、これらの細胞がIL-17RAおよびIL-17RCの両方に関して陽性であることが実証され、これは、ヒトIL-17AおよびIL-17F媒介に対するそのnfkb/ap1応答がこれらの受容体の一方または両方を介して媒介されることと一致する。
A) マウスIL-17RC PCR
標準的な方法を用いて、nih3t3細胞から単離した全RNAから、第1鎖cDNAを調製した。hot starポリメラーゼおよび製造業者(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)の推奨により、センスプライマー、
2009510093.tif 000029
およびアンチセンスプライマー、
2009510093.tif 000030
、ならびに35サイクルの増幅を用いてPCRを適用した。アガロースゲル電気泳動から、予測される850 bpの大きさの単一の強い単位複製配列が明らかになった。
【０４１３】
B） マウスIL-17RA PCR
標準的な方法を用いて、nih3t3細胞から単離した全RNAから、第1鎖cDNAを調製した。hot starポリメラーゼおよび製造業者(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)の推奨により、センスプライマー、
2009510093.tif 000031
およびアンチセンスプライマー、
2009510093.tif 000032
、ならびに35サイクルの増幅を用いてPCRを適用した。アガロースゲル電気泳動から、予測される498 bpの大きさの単一の強い単位複製配列が明らかになった。
【０４１４】
実施例14
ap1/nfkb転写因子を発現する安定したnih3t3アッセイクローンの作製
上記のマウスnih3t3細胞株に、ネオマイシン選択マーカーを含むkz142 ap1/nfkbレポーター構築物を安定にトランスフェクションした。Neo耐性トランスフェクションプールを、クローン密度でプレーティングした。クローニングリングを用いてクローンを単離し、誘導物質としてヒトIL-17Aリガンドを用いてルシフェラーゼアッセイによりクローンをスクリーニングした。最も高い平均蛍光強度(MFI)(ap1/NfkBルシフェラーゼによる)および最も低いバックグラウンドを有するクローンを選択した。安定したトランスフェクタント細胞株を選択し、nih3t3/kz142.8と命名した。
【０４１５】
実施例15
可溶性IL-17RCおよびIL-17RA/FCキメラを用いたマウスnih3t3細胞におけるヒトIL-17AおよびIL-17Fによる活性化の阻害
ルシフェラーゼアッセイにおいて、可溶型のIL-17RCまたはIL-17RAを、ap1/nfkbエレメントのヒトIL-17AおよびIL-17F活性化のアンタゴニストとして使用した。これらの可溶性受容体は、ヒトIgG1定常(Fc)領域に融合された各受容体の細胞外ドメインに由来する融合タンパク質である。可溶性ヒトIL-17R FC融合タンパク質は購入した(組換えヒトIL-17R/FCキメラ、カタログ番号177-IR-100、R&D Systems, Inc.、ミネソタ州、ミネアポリス)。可溶性ヒトIL-17RC FCキメラ(IL-17RCsR/FC9)は、上記と同様に構築した。過剰なIL-17RCsR/FC9およびヒトIL17RsR/FCキメラが、マウスnih3t3/kz142.8アッセイ細胞株のap1/nfkb活性化のヒトIL-17AおよびIL-17F媒介双方のEC50レベルを阻害することを見出した。
【０４１６】
IL-17RCsR/FC9タンパク質は、IL-17F活性化の拮抗において最大効力を示し、IL17RsR/FCキメラは、IL-17A活性化の拮抗において最大効力を示した。
【０４１７】
実施例16
喘息のマウスモデルにおいて上方制御されるIL-17F mRNA
マウスの感作および気道誘発モデルで、IL-17F mRNAレベルを測定した。8〜10週齢のマウス群を、50% Imject Alum(Pierce)中の10 ug組換えヤケヒョウダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)アレルゲン1(DerP1)(Indoor biotechnologies、英国、カーディフ)を0日目および7日目に腹腔内注射することにより感作した。7日後から、マウスに、PBS 50 ul中のDerP1 20 ugを3日間連続して(14、15、および16日目)投与した。この群にはマウス4匹が存在した。陰性対照には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)感作およびその後のPBS投与を施したマウス5匹が含まれた。さらに3匹のマウスには、DerP1感作およびその後のPBS投与を施した。アレルゲンまたは対照投与の48時間後に、全肺組織を摘出し、全RNAを単離した。
【０４１８】
各対象由来の同量の全RNAを用いて、第1鎖cDNAを調製した。Qiagen hotstarポリメラーゼ(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)および製造業者の推奨を用いて、IL-17F PCRを適用した。IL-17F PCRは、センスプライマー、
2009510093.tif 000033
およびアンチセンスプライマー、
2009510093.tif 000034
による35サイクルの増幅を使用した。鋳型の質が全対象間で均一であることを確証するため、IL-17F増幅に使用した同量の各鋳型に対して、βアクチンPCRを適用した。BアクチンPCRは、センスプライマー、
2009510093.tif 000035
およびアンチセンスプライマー、
2009510093.tif 000036
による25サイクルのPCRを包含した。
【０４１９】
DerP1感作、DerP1投与処置群(喘息シミュレーション)の全4匹のマウスは、強いIL-17F増幅を示した。対照的に、DerP1感作/PBS投与処置群を表わす対象3匹のうちの3匹、およびPBS感作/PBS投与処置群の対象5匹のうちの5匹を含む陰性対照では、弱いIL-17F増幅が認められた。Bアクチンの増幅は、陰性対照に関して、喘息シミュレーション対象と少なくとも同様に強く、陰性対照の弱いIL-17F増幅が鋳型の問題によるものではないことが実証される。
【０４２０】
実施例17
COS細胞トランスフェクションおよび分泌捕獲
A. IL-17RCsR/Fc9およびIL-17Fが受容体/リガンド対であることを示すCos細胞トランスフェクションおよび分泌捕獲アッセイ
分泌捕獲アッセイ法を用いて、ヒトIL-17RC(配列番号:2)をヒトIL-17F(配列番号:16)に対合させた。可溶性IL-17RCsR/Fc9融合タンパク質(実施例8)を、分泌アッセイにおける結合試薬として用いた。ヒトIL-17B、C、D、E、およびFのcDNAを含むSV40 ori含有発現ベクターを、COS細胞に一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションしたCOS細胞に対するIL-17RCsR/Fc9の結合を、以下に記載する分泌捕獲アッセイ法を用いて行った。IL-17RCsR/Fc9の陽性結合は、ヒトIL-17Fに対してのみ認められた。これらの結果から、ヒトIL-17RCおよびIL-17Fが受容体/リガンド対であるという新規の知見が実証される。
【０４２１】
B) COS細胞トランスフェクション
COS細胞のトランスフェクションは以下の通りに行った：無血清DMEM培地(DMEM 500 ml中のピルビン酸ナトリウム55 mg、L-グルタミン146 mg、トランスフェリン5 mg、インスリン2.5 mg、セレン1μg、およびフェツイン5 mg) 92 ul中、プールDNA 3 ulおよびLipofectamine(商標) 5 ulを混合し、室温で30分間インキュベートし、次に無血清DMEM培地400 ulを添加する。この混合物500 ulを、12ウェル組織培養プレートにプレーティングした1.5x105個COS細胞/ウェルに添加し、37℃で5時間インキュベートする。20% FBS DMEM培地(DMEM 500 ml中のFBS 100 ml、ピルビン酸ナトリウム55 mg、およびL-グルタミン146 mg) 500 ulを添加し、一晩インキュベートする。
【０４２２】
C) 分泌捕獲アッセイ
分泌捕獲は以下の通りに行った：PBSで細胞から培地を洗浄除去した後、PBS中の1.8%ホルムアルデヒドで15分間固定した。次いで細胞をTNT(H20中の0.1 M Tris-HCL、0.15 M NaCl、および0.05% Tween-20)で洗浄し、PBS中の0.1% Triton-Xで15分間透過処理し、再度TNTで洗浄した。細胞をTNB(H20中の0.1 M Tris-HCL、0.15 M NaCl、および0.5%ブロッキング試薬(NEN Renaissance TSA-Direct Kit))で1時間ブロッキングし、TNTで再度洗浄した。細胞を、1μg/ml ヒトIL-17RCx1sR/FC9可溶性受容体融合タンパク質と共に1時間インキュベートした。次いで、細胞をTNTで洗浄した。細胞を、1:200希釈したヤギ抗ヒトIg-HRP(Fc特異的)と共にさらにもう1時間インキュベートした。再度、細胞をTNTで洗浄した。
【０４２３】
希釈緩衝液(NENキット)で1:50希釈したフルオレセインチラミド試薬で陽性結合を検出し、4〜6分間インキュベートして、TNTで洗浄した。細胞は、TNTで1:5希釈したVectashield Mounting Media(Vector Labs、カリフォルニア州、バーリンゲーム)を用いて保存した。蛍光顕微鏡においてFITCフィルターを用いて、細胞を可視化した。
【０４２４】
実施例18
マウス抗ヒトIL-17RCモノクローナル抗体の作製
A. 抗IL-17RC抗体の作製のための免疫化
1. 可溶性IL-17RC-muFc
隔週スケジュールで、Ribiアジュバント(Sigma)と1:1(v/v)混合した可溶性ヒトIL-17RC-muFcタンパク質(実施例23) 25〜50 ugを腹腔内注射することにより、6〜12週齢の無傷またはIL-17RCノックアウトマウスを免疫化する。3回目の免疫化から7〜10日目に、眼窩後採血により血液試料を採取し、血清を回収し、中和アッセイ(例えば、本明細書中に記載)においてIL-17RCに対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害する能力、ならびにFACS染色アッセイにおいてIL-17RCトランスフェクション対非トランスフェクション293細胞を染色する能力に関して評価した。中和力価がプラトーに達するまで、上記のようにマウスの免疫化、ならびに血液試料の採取および評価を継続した。その時点で、最も高い中和力価を有するマウスに、PBS中の可溶性IL-17RC-Fcタンパク質25〜50 ugを血管内注射した。3日後、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を摘出し、例えば当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F. et al., J Immunol. 123:1548-50, 1979；およびLane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985を参照されたい)により、マウス骨髄腫(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)細胞または当技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、ハイブリドーマの作製に使用した。
【０４２５】
2. 可溶性IL-17RC、IL-17RC-CEE、IL-17RC-CHIS、IL-17RC-CFLAG
隔週スケジュールで、Ribiアジュバント(Sigma)と1:1(v/v)混合した可溶性ヒトIL-17RC-CEE、IL-17RC-CHIS、またはIL-17RC-CFLAG 25〜50 ugを腹腔内注射することにより、6〜12週齢の無傷またはIL-17RCノックアウトマウスを免疫化する。3回目の免疫化から7〜10日目に、眼窩後採血により血液試料を採取し、血清を回収し、中和アッセイ(例えば、本明細書中に記載)においてIL-17RCに対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害する能力、ならびにFACS染色アッセイにおいてIL-17RCトランスフェクション対非トランスフェクション293細胞を染色する能力に関して評価する。中和力価がプラトーに達するまで、上記のようにマウスの免疫化、ならびに血液試料の採取および評価を継続する。その時点で、最も高い中和力価を有するマウスに、PBS中の可溶性IL-17RC、IL-17RC-CEE、zcytor-CHIS、またはIL-17RC-CFLAG抗原タンパク質25〜50 ugを血管内注射する。3日後、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を摘出し、例えば当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F. et al., J Immunol. 123:1548-50, 1979；およびLane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985を参照されたい)により、マウス骨髄腫(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)細胞または当技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、ハイブリドーマの作製に使用する。
【０４２６】
3. IL-17RCを発現するP815トランスフェクタント
1 x 105個のトランスフェクション済み生存P815細胞、例えばP815/IL-17RC細胞の腹腔内注射(例えば、2 x 105細胞/mlの細胞密度で0.5 ml)により、6〜10週齢の雌DBA/2マウスを免疫化する。注射前に、細胞を指数増殖期に維持する。注射用に、細胞を回収してPBSで3回洗浄し、次いで2 x 105細胞/mlの密度になるようPBSに再懸濁する。このモデルでは、マウスは2〜3週間以内に腹水腫瘍を発症し、トランスフェクションした標的抗原に対する免疫応答が開始されていない限り、4〜6週までに死に進行する。3週の時点で、明白な腹部膨満(腹水を示す)のないマウスを、2〜3週間隔で上記のように再免疫化する。2回目の免疫化から7〜10日目に、眼窩後採血により血液試料を採取し、血清を回収し、中和アッセイ(例えば、本明細書中に記載)においてIL-17またはIL-17RCに対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害する能力、ならびにFACS染色アッセイにおいてIL-17RCトランスフェクション対非トランスフェクション293細胞を染色する能力に関して評価する。中和力価がプラトーに達するまで、上記のようにマウスの免疫化、ならびに血液試料の採取および評価を継続する。その時点で、最も高い中和力価を有するマウスに、1 x 105個のトランスフェクション済み生存P815細胞を腹腔内注射する。4日後、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を摘出し、例えば当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F. et al.、前記；およびLane, R.D. 前記を参照されたい)により、マウス骨髄腫(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)細胞または当技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、ハイブリドーマの作製に使用する。
【０４２７】
トランスフェクション済み生存P815細胞を用いる上記の免疫化図式の別法は、2〜3週間毎に1〜5 x 106個のトランスフェクション済み照射細胞を腹腔内注射することを含む。このアプローチでは、動物が発症して、腹水で死亡することはない。代わりに、2回目の免疫化後の採血から開始して、上記のように血清中のIL-17RCに対する中和免疫応答に関して動物をモニターする。中和力価が最大レベルに達した時点で、最も高い力価を有するマウスに5 x 106個照射細胞の融合前の腹腔内注射を施し、その4日後に、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を摘出し、例えば当技術分野で公知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F. et al.、前記；およびLane, R.D. 前記を参照されたい)により、マウス骨髄腫(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)細胞または当技術分野におけるその他の適切な細胞株を用いて、ハイブリドーマの作製に使用する。
【０４２８】
B. IL-17RCと結合し、IL-17RCに対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害する抗体に関するハイブリドーマ融合体のスクリーニング
融合後8〜10日目に、ハイブリドーマ上清で3つの異なる主要なスクリーニングを行う。一次アッセイでは、上清中の抗体を、プレート結合の可溶性ヒトIL-17RC、IL-17RC-muFc、IL-17RC-CEE、IL-17RC-CHIS、またはIL-17RC-CFLAGタンパク質に結合する能力に関して、結合したマウス抗体を同定するためにHRP結合ヤギ抗マウスκおよび抗λ軽鎖二次試薬を用いてELISAにより試験した。IL-17RC融合タンパク質のIL-17RC部分に対する特異性を実証するため、初期アッセイにおける陽性上清を、同様のマウスFc領域(mG2a)、EE配列、HIS配列、またはFLAG配列に融合された無関連タンパク質において評価した。IL-17RC融合タンパク質に結合するが、無関連muFcまたは融合タンパク質配列を含む他のタンパク質に結合しない上清中の抗体を、IL-17RCに特異的であると見なした。二次アッセイでは、すべてのハイブリドーマ上清中の抗体を、プレート結合のIL-17RC-muFcまたはIL-17RC融合タンパク質に対するビオチン化ヒトIL-17またはビオチン化ヒトIL-17Fの結合を阻害する能力に関して、ELISAにより評価した。
【０４２９】
ELISAアッセイにおいてIL-17RCに対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害しようともまたは阻害しなくとも、IL-17RCに特異的に結合した抗体を含むすべての上清を次に、IL-17RCトランスフェクションBaf3もしくはBHK細胞または正常ヒト気管支上皮細胞に対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害する能力に関して試験した。IL-17もしくはIL-17F阻害アッセイのいずれか、またはIL-17およびIL-17F阻害アッセイの双方において中和陽性であったすべての上清を次に、FACS解析により、IL-17RCトランスフェクション対非トランスフェクションBaf3またはBHK細胞を染色する能力に関して評価した。この解析は、IL-17RCに対するIL-17またはIL-17F結合の阻害が実際に、IL-17RC受容体と特異的に結合する抗体によるものであることを確認するために設計した。さらに、FACS解析は抗IgG二次試薬を用いて実施したため、特異的なFACS陽性結果から、中和抗体がIgGクラスのものである可能性が高いことが示される。これらの手段により、プレート結合ELISAにおいてIL-17RCと結合し、ELISAに基づく阻害アッセイにおいてIL-17RCに対するIL-17またはIL-17Fの結合を阻害し、IL-17およびIL-17FとIL-17RCトランスフェクションBaf3またはBHK細胞それぞれとの相互作用を遮断し、かつ抗マウスIgG二次試薬によるIL-17RCトランスフェクションBaf3またはBHK細胞の染色に関して強く陽性であるマスターウェルを同定した。
【０４３０】
三次アッセイは、IL-17RCを発現し、IL-17F処理に応答してIL-8またはIL-6を分泌するよう誘導され得る初代ヒト気管支上皮細胞からなる。これらの細胞によるIL-17またはIL-17F刺激性IL-8またIL-6産生を阻害する能力により、特異的モノクローナル抗体をアッセイする。IL-8およびIL-6産生は、本明細書に記載するようIL-17またはIL-17Fを受けてアッセイする。
【０４３１】
または、NIH 3T3またはその他のIL-17RC含有細胞におけるIL-17またはIL-17F誘導性ルシフェラーゼ産生のモノクローナル抗体；抗IL-17RC媒介性阻害を、上記の生物活性中和アッセイの1つと共に、またはその代わりに用いることもできる。NIH 3T3細胞におけるNFkB媒介性ルシフェラーゼアッセイは、本明細書中に記載してある。
【０４３２】
C) 抗IL-17RC特異的抗体産生ハイブリドーマのクローニング
適切にトランスフェクションしたBaF3またはBHK細胞に対するIL-17およびIL-17Fの結合を交差中和した特異的抗IL-17RC mAbを産生するハイブリドーマ細胞株を、標準的な低密度希釈(細胞1個未満/ウェル)アプローチによりクローニングする。プレーティングの約5〜7日後に、例えばプレート結合ヒトIL-17RC-muFcおけるELISA、およびその後の上記のような無関連のmuFc含有融合タンパク質におけるELISAによる陽性ウェルの再試験によって、クローンをスクリーニングする。その上清がIL-17RC-muFcと結合するが無関連のmuFc含有融合タンパク質とは結合しない選択されたクローンを、中和アッセイおよびFACS解析を繰り返すことにより、特異的抗体活性に関してさらに確認する。選択されたIL-17RC抗体陽性クローンはすべて、クローン性の保証に役立つよう、および抗体産生の安定性を評価するために、少なくとも2回クローニングする。好ましくは得られるクローンの少なくとも95%が中和抗IL-17RC抗体産生に関して陽性となるまで、上記の通りにクローニングのさらなるラウンドを行い、スクリーニングする。
【０４３３】
D) 抗IL-17RC mAbによって認識される分子の生化学的特徴づけ
推定抗IL-17RC mAbによって認識される標的分子、IL-17RCが実際にIL-17RCであることの生化学的確認を、いずれもIL-17RCトランスフェクション対非トランスフェクションBaf3またはBHK細胞由来の可溶性膜調製物を用いて、標準的な免疫沈降法およびその後のSDS-PAGE解析またはウェスタンブロット手法により行う。さらに、IL-17RCを発現する非トランスフェクション細胞株の可溶性膜調製物を用いて、mAbがトランスフェクションされた受容体鎖と共に天然の受容体鎖を認識することが示される。または、可溶性IL-17RC-muFcタンパク質を特異的に免疫沈降するまたはウェスタンブロットする能力に関して、mAbを試験する。
【０４３４】
実施例19
ヒトIL-17RCをトランスフェクションしたP815細胞を注射したマウス由来の血清によるヒトIL-17RCの中和
細胞に基づく中和アッセイ法を用いて、生存ヒトIL-17RCトランスフェクションP815細胞(実施例17)を注射したマウス由来の血清を、1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.06%、0.03%、0.02%、および0%の連続希釈液として添加する。アッセイプレートを37□C、5% CO2で4日間インキュベートし、アラマーブルー(Accumed、イリノイ州、シカゴ)を20μl/ウェルで添加する。プレートを再度、37□C、5% CO2で16時間インキュベートする。結果から、動物4匹の血清が、ヒトIL-17RCを介するhuIL-17およびhuIL-17F双方のシグナル伝達を中和し得ることが示された。
【０４３５】
このような結果から、例えば本発明のIL-17RCに対する中和モノクローナル抗体により、IL-17またはIL-17Fと(個別にまたは共に)結合する、その活性を(個別にまたは共に)遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、または中和することによってIL-17RCを効率的に遮断することが、インビボでIL-17およびIL-17F(単独でまたは共に)の効果を減少させる上で有利であり得、また例えば乾癬、IBD、大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、またはIBD、関節炎、喘息、乾癬性関節炎、大腸炎、炎症性皮膚疾患、およびアトピー性皮膚炎を含むIL-17およびまたはIL-17Fによって誘発される他の炎症性疾患において認められるような、IL-17および/またはIL-17F誘発炎症を軽減し得るというさらなる証拠が提供される。
【０４３６】
実施例20
抗ヒトIL-17RCモノクローナル抗体の薬物動態
試験モノクローナル抗体、抗ヒトIL-17RC mAbを、例えば約1 mg/mL濃度(280 nMでのUV吸光度により決定)の3x 3 mL分割量で提供し、使用時まで-80℃で保存した。溶媒は1X PBS(50 mM NaPO4、109 mM NaCl)、pH 7.3である。mAbを使用前に室温で融解し、分割量1および2を、それぞれ100 μg IVおよびSC投与群をもたらすよう使用する。分割量3の半分を50μg SC用量群用に1X PBSで1:2希釈し、分割量3のもう半分を10μg SC用量群用に1X PBSで1：10希釈する。雌SCIDマウス(n＝96)をCharles River Labsから入手する。到着時に動物の健康状態を調べ、群別に収容する(動物3匹/ケージ)。マウスは、試験開始時に12週齢であり、平均体重は約22 gである。
【０４３７】
A) 投与手順
雌SCIDマウス(n＝24/用量群)を4つの投与群に無作為に割付する(表8)。群1には、抗ヒトIL-17RC mAb約93μLを尾静脈からIV注射により投与し、群2、3、および4には、首筋にmAb約93μLをSC注射により投与する。
【０４３８】
B) 試料の採取
採血の前に、マウスをハロタンまたはイソフルオランによって十分に麻酔した。血液試料を、168時間の時点(眼窩採血により採取し、同じ動物から504時間の時点で心穿刺により再度採血した)を除くすべての時点で心穿刺により採取した。血液を血清分離チューブに採取し、15分間凝固させた。その後、試料を14,000 rpmで3分間遠心分離した。遠心分離後、分割量125〜150 uLをラベルを付したエッペンドルフチューブに分注し、解析時まで−80℃で直ちに保存した。
【０４３９】
【表８】
2009510093.tif 000037
*同じ動物を168時間および504時間の時点で使用した。
【０４４０】
C) ELISAによる血清抗ヒトIL-17RC mAb濃度の定量
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を開発し、薬物動態研究において抗IL-17RC mAbを投与した動物からのマウス血清試料を解析するために適合させる。このアッセイ法は、市販の二次抗体およびTMBを用いる比色検出を利用できるよう設計する。検量線用に使用する希釈液は、検量線の直線部分の明確さを改良するよう改善した。2倍希釈による100 ng/mL〜0.231 ng/mLの範囲の検量線により、マウス血清試料の定量が可能になる。QC試料を、10% SCIDマウス血清で1:100、1:1000、および1:10000希釈し、検量線から逆算する。
【０４４１】
D) 薬物動態解析
血清濃度対時間データを、薬物動態解析のためにWinNonlin Professional 4.0ソフトウェア(Pharsight, Inc.；ノースカロライナ州、キャリー）にダウンロードする。ノンコンパートメント解析を用いて、各時点での平均データに基づく薬物動態パラメータを決定する。
【０４４２】
実施例21
抗ヒトIL-17RCモノクローナル抗体によるIL-17AおよびIL-17F活性の中和
細胞に基づく中和アッセイ法を用いて、精製マウス抗ヒトIL-17RCモノクローナル抗体を、例えば10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、625 ng/ml、313 ng/ml、156 ng/ml、および78 ng/mlの連続希釈液として添加する。アッセイプレートを37℃、5% CO2で4日間インキュベートし、アラマーブルー(Accumed、イリノイ州、シカゴ)を20μl/ウェルで添加する。プレートを再度、37□C、5% CO2で16時間インキュベートする。このアッセイは、精製抗ヒトIL-17RCモノクローナル抗体が、ヒトIL-17RCを介するhuIL-17およびhuIL-17F双方のシグナル伝達を中和し得るということを実証し得る。非常に効果的な抗体の場合、約10μg/ml濃度で使用した際に、huIL-17またはhuIL-17Fによって誘導される増殖を完全に中和し、増殖阻害はより低い濃度では用量依存的様式で減少する。上記の濃度で試験するアイソタイプ一致陰性対照マウスmAbは、いずれかのサイトカインの増殖阻害も提供しないと予測される。これらの結果は、IL-17RCに対するモノクローナル抗体が実際に、低濃度で炎症誘発性リガンド、IL-17およびIl-17Fの活性を拮抗し得るということをさらに実証し得る。
【０４４３】
実施例22
ヒト末梢血単核細胞において高レベルのIFN-γおよびTNF-αを誘導するIL-17A
フィコール密度勾配遠心分離によりヒト末梢血単核細胞(PBMC)を精製し、次いで培地単独、50 ng/ml抗ヒトCD3抗体、または50 ng/ml抗ヒトCD3抗体＋1 □g/ml抗ヒトCD28抗体の組み合わせ中で37℃で一晩インキュベートする。これらの条件それぞれについて同型培養物を設定し、サイトカインなし、25 ng/mlヒトIL-17A、または25 ng/mlヒトIL-17Fを付与する。24時間インキュベートした後、各培養物の上清を回収し、B-D BioscienceのヒトTh1/Th2 Cytometric Bead Array(CBA)を用いて、サイトカイン含量についてアッセイする。抗CD3または抗CD3＋抗CD28で刺激し、かつIL-17Aを添加した培養物が、サイトカインを添加しなかった培養物またはIL-17Fを付与した培養物を上回る有意に高レベルのIFN-γおよびTNF-α(それぞれ3〜5倍の上昇)を含むことを見出した。抗CD3刺激を加えなかった培養物は、サイトカインレベルの有意な変化を示さなかった。加えて、IL-17Aの添加は、IL-2、IL-4、IL-5、およびIL-10を含む、CBAを用いてアッセイした他のサイトカインの有意な変化を誘導しなかった。このデータから、IL-17Aは抗CD3または抗CD3＋抗CD28で刺激したPBMC培養物においてIFN-γおよびTNF-αの産生を増強し得るが、IL-17Fはそのような産生を増強し得ないことが示される。
【０４４４】
実施例23
マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルにおける疾患の発症率および進行を減少させるIL-17RC-Fc
A) マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデル
10週齢雄DBA/1Jマウス(Jackson Labs)を、マウス13匹/群の3群に分割する。21日目に、動物に、完全フロイントアジュバント中に処方された1 mg/mlヒヨコII型コラーゲン(Chondrex、ワシントン州、レッドモンドにより調製された) 50〜100μlを皮内尾部注射し、0日目とする3週間後に、不完全フロイントアジュバントで調製すること以外は同様の注射をする。0日目から大部分のマウスが疾患の中等度症状を示す日までの様々な時点で、4週間にわたって週に3回、IL-17RC-Fcを腹腔内注射として投与する。群にIL-17RC-Fcの10または100μg/動物/用量を投与し、対照群には溶媒対照、PBS(Life Technologies、メリーランド州、ロックビル)を投与する。動物は2回目のコラーゲン注射後に関節炎の症状を示し始め、大部分の動物は1.5〜3週間以内に炎症を発症する。疾患の程度は、ノギスを用いて足厚を測定することにより、および各足に対して臨床スコア(0〜3)：0＝正常、0.5＝つま先の炎症、1＝足の軽度炎症、2＝足の中等度炎症、および3＝足の重度炎症(以下に詳述する)を割り当てることにより、各足において評価する。
【０４４５】
B) 疾患のモニタリング
動物は2回目のコラーゲン注射後まもなく足の炎症の徴候を示し始め得て、動物によっては2回目のコラーゲン注射の前にも、つま先炎症の徴候を有し始め得る。大部分の動物は追加免疫注射の1.5〜3週間以内に関節炎を発症するが、動物によってはより長い時間を必要とする場合もある。このモデルにおける疾患発症率は典型的に95〜100%であり、動物40匹を用いた試験において、0〜2匹の非応答動物(観察の6週間後に決定される)が典型的に認められる。炎症が始まると、様々に低度の足またはつま先の炎症の一般的な一時的発生が起こり得ることに留意されたい。そのため、動物は、顕著で持続的な足の腫脹が生じるまで、確立した疾患を有すると見なされない。
【０４４６】
全動物を毎日観察して、足における疾患状態を評価するが、これは個々の足に対して定性的臨床スコアを割り当てることによって行う。各動物について毎日、4つの足を臨床疾患の状態に従ってスコア化する。臨床スコアを決定するため、足は3つの領域、すなわちつま先、足自体(手または足)、および手首または足首関節を有すると見なし得る。これらの領域に関する炎症の程度および重症度は、以下を含めて留意する：腫脹に関する各つま先の観察；爪の裂けまたはつま先の発赤；いずれかの足における浮腫または発赤の任意の証拠の表記；腱または骨の微細な解剖学的境界の任意の消失の表記；任意の浮腫または発赤に関する手首または足首の評価；ならびに炎症が脚まで近接して広がっているかどうかの表記。1、2、または3という足スコアは、第1には重症度の全体的な印象に、および第2には罹患領域の数に基づく。臨床学的スコア化に用いる基準を以下に示す。
【０４４７】
C) 臨床スコア
0＝正常
0.5＝1つまたは複数のつま先が罹患しているが、つま先のみが炎症を起こしている
1＝足を含む軽度炎症(1領域)、1つまたは複数のつま先を含んでもよい
2＝足における中等度炎症、いくつかのつま先および/または手首/足首を含んでもよい(2領域)
3＝足、手首/足首、およびいくつかのまたはすべてのつま先における重度炎症(3領域)
【０４４８】
確立した疾患は、2日間続けて持続する、2またはそれ以上の等級の足炎症の定性的スコアとして定義する。確立した疾患が存在する時点で、その日にちを記録し、この日を「確立した疾患」を有した動物の最初の日として指定する。
【０４４９】
実験期間を通して血液を採取し、抗コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清免疫グロブリンおよびサイトカインのレベルをモニターする。血清抗コラーゲン抗体は、疾患の重症度と良好に相関する。21日目に動物を安楽死させ、血清およびCBC用に血液を回収する。各動物から、組織学的検査のために罹患足1つを10% NBF中に採取し、1つをmRNA解析のために液体窒素中で凍結して-800Cで保存する。同様に、脾臓1/2、胸腺1/2、腸間膜リンパ節1/2、肝葉1、および左腎をRNA解析のためにRNAlater中に採取し、脾臓1/2、胸腺1/2、腸間膜リンパ節1/2、残りの肝臓、および右腎を組織学的検査のために10% NBF中に採取する。血清を回収し、免疫グロブリンおよびサイトカインアッセイのために−800Cで凍結する。
【０４５０】
いずれの時点においてもIL-17RC-Fcを投与したマウス群は、足の炎症の発症および/または進行の遅延によって特徴づけられる。これらの結果から、IL-17RCが炎症ならびにこのモデルに付随する疾患の発症率および進行を軽減し得ることが示される。これらの結果は、IL-17RC-Fcが血清TNFa、IL-1b、および抗コラーゲン抗体のレベルの減少をもたらしたという知見によりさらに支持される。
【０４５１】
実施例24
ap1/nfkb転写因子を発現するマウスアッセイ細胞株、nih3t3/kz142.8におけるIL-17RCの安定した過剰発現
マウスnih3t3/kz142.8アッセイ細胞株に、メトトレキセート耐性遺伝子(ジヒドロ葉酸還元酵素、DHFR)を有する発現ベクター中のヒトIL-17RCx1(配列番号:2)をトランスフェクションした。このトランスフェクションは、市販のキットおよび製造業者の推奨(Mirus、ウィスコンシン州、マディソン、カタログ番号MIR218)を用いて実施した。細胞を1μM mtx修正増殖培地中に置き、ヒトIL-17RCX1導入遺伝子を含む発現ベクターに関して選択した。選択後、ヒトIL-17RCx1トランスフェクションプールを作製し、これをnih3t3/kz142.8/hcytor14x1と命名した。
【０４５２】
A) nih3t3/kz142.8アッセイ細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイ
nih3t3/kz142.8は安定したkz142レポーターを有するため、このレポーターを付加するためにアデノウイルス感染を必要としない。したがってルシフェラーゼアッセイ手順を短縮し、以下の方法で実施した：
【０４５３】
1. 細胞のプレーティング
グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/10% FBSを用いて、nih3t3/kz142.8細胞を固体白色細胞培養被覆96ウェルプレート(カタログ番号3917、Costar)に5000個細胞/ウェルでプレーティングし、37℃および5% CO2で一晩培養した。この第2日目に、プレーティング培地を除去し、グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/1% FBSに置換し、37℃および5% CO2で一晩培養した。
【０４５４】
2. 安定したkz142レポーターのIL-17AおよびIL-17F活性化を測定するルシフェラーゼアッセイ
1% fbs、DMEM培地中で一晩インキュベートした後、ヒトIL-17AおよびIL-17Fリガンド希釈物を、BSA .28%レベルで改良した無血清培地で作製した。リガンド希釈物を添加した後、細胞を37℃および5% CO2で4時間インキュベートし、その後培地を除去し、細胞を15分かけて溶解し、ルシフェラーゼアッセイ系および試薬(カタログ番号e1531 Promega、ウィスコンシン州、マディソン)ならびにマイクロプレートルミノメーターを用いて平均蛍光強度(MFI)を測定した。.1〜1000 ng/mlの濃度範囲で、両リガンドについて活性を検出した。nih3t3/kz142.8/hcytor14x1トランスフェクションプールは、マウスIL-17Aリガンドに関して親細胞株(実施例14)と同様の活性を示した。しかし、cytor14x1トランスフェクタントプールは、これらのリガンド濃度が20フェムトグラムという低い場合でさえ、ヒトIL-17AおよびIL-17F処理に対する応答性の上昇を示した。mIL-17Aシグナル伝達が親細胞株(実施例14)におけるシグナル伝達に匹敵するという事実から、ヒトIL-17RC発現細胞において一般的な非特異的問題が存在しないということ、およびマウスIL-17Aはおそらく内因性マウスnih3t3細胞IL-17RまたはIL-17RC受容体を介してシグナル伝達するということが示唆される。したがって、ヒトIL-17AおよびIL-17Fがこのような低いリガンド濃度でMFIの上昇を引き起こすという事実から、過剰発現させたヒトIL-17RC受容体によって媒介されるそれらのリガンドに対する細胞の特異的過剰応答性が示され得る。
【０４５５】
この結果は、重要な臨床的および生物学的波及効果および有用性を有する。例えば、生理的状況によってIL-17RC受容体の局所的上方制御が起こり得、そのため次にこれらの領域がIL-17AおよびIL-17Fに対して過剰応答性となって、IL-17RCの過剰発現なしで示唆された濃度よりもはるかに低いリガンド濃度で生物活性化が起こり得る。したがって、仮定上低いこれらの受容体レベルを拮抗するには、当業者がこれまで考えていたまたは認識していたよりもはるかに低い可溶性受容体レベルで十分である可能性がある。
【０４５６】
実施例25
炎症性腸疾患(IBD)モデルにおける疾患の発症率および進行を減少させるIL-17FおよびIL-17A活性に対するアンタゴニスト
IBD患者由来の培養腸組織が、健常対照由来の組織と比較してより高レベルの炎症性メディエータを産生することを示すために、このモデルを設計する。炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなど)のこの産生増強は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)などのIBDに関連した症状および病理に寄与する。次いでこれらの経路および成分は、インビボで認められる組織および細胞の損傷/破壊をもたらす。したがってこのモデルは、IBDのこの炎症性メディエータ増強局面をシミュレートし得る。さらに、健常対照由来の腸組織またはヒト腸上皮細胞(IEC)株をこれらの炎症成分の存在下で培養すると、炎症経路シグナル伝達、ならびに組織および細胞損傷の証拠が観察され得る。
【０４５７】
インビボでヒトIBDに有効であると考えられる治療薬は、炎症性メディエータの産生および/または存在を阻害するおよび/または中和することにより、上記のエクスビボまたはIECモデルで作用すると考えられる。
【０４５８】
このモデルでは、腸生検、切除を受けているIBD患者もしくは健常対照から、または死後組織収集物からヒト腸組織を採取し、Alexakis et al(Gut 53:85-90; 2004)の変法を用いて処理する。無菌条件下で試料を大量のPBSで穏やかに清浄化し、その後、完全組織培地(細菌の過剰増殖を防ぐために抗生物質を添加)の存在下で組織の細分切片を培養する。細分組織の同一プールによる試料を、以下のうちの1つで処理する：媒体(PBS)；組換えヒト(rh)IL-17A；rhIL-17F；またはrhIL-17A＋rhIL-17F。さらに、これらを、IL-17AまたはIL-17Fのアンタゴニストを単独でまたは組み合わせて(可溶性IL-17RCなど)用いて、または用いずに処理する。細胞を既存の保存液から継代すること以外は、ヒトIEC株での研究にこの実験手順を適用する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータのレベルについて解析する。IBD患者由来の試料またはrhIL-17Aおよび/もしくはIL-17Fで処理した試料では、炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルは、未処理の健常対照組織試料と比較して上昇している。IL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17RC可溶性受容体、ならびに本発明の抗ヒトIL-17RCモノクローナルおよび中和抗体を含むそれに対する抗体を添加すると、炎症性メディエータの産生が顕著に減少し、したがってヒトIBDに有効であると予測される。
【０４５９】
実施例26
多発性硬化症(MS)モデルにおける疾患の発症率および進行を減少させるIL-17FおよびIL-17A活性に対するアンタゴニスト
多発性硬化症(MS)は、リンパ球および単核細胞炎症性浸潤の存在ならびにCNS全体にわたる脱髄を含む多くの要因によって媒介されると考えられる複合疾患である。ミクログリアは中枢神経系(CNS)に存在するマクロファージ様細胞であり、損傷または感染時に活性化される。ミクログリアは、MSを含む種々のCNS疾患において重大な役割を果たすと関連づけられており、疾患の開始、進行、および治療の機構を研究するために用いられ得る(Nagai et al. Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001；Olson et al. J. Neurosci Methods 128:33-43; 2003)。したがって、不死化ヒトミクログリア細胞株および/または確立されたヒトアストログリア細胞株を用いて、これらの細胞型に及ぼす炎症性メディエータの効果のうちのいくつか、およびそれらの中和の可能性を試験することができる。炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、RANTES、IP-10、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなど)は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、MSに関連した症状および病理に寄与し得る。
【０４６０】
IL-17AおよびIL-17Fの炎症誘発作用、ならびにIL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17RC可溶性受容体、および本発明の抗ヒトIL-17RCモノクローナルおよび中和抗体を含むそれに対する抗体がこれらの効果を中和するまたは減少させる能力を評価するために、培養グリア細胞を以下のうちの1つで処理する：媒体；rhIL-17A；rhIL-17F；rhIL-17A＋IL-17F。さらに、これらを、IL-17AまたはIL-17Fのアンタゴニストを単独でまたは組み合わせて(可溶性IL-17RCなど)用いて、または用いずに処理する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清および細胞を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータのレベルおよび/または発現について解析する。炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルは、媒体単独で処理した培養物と比較して、rhIL-17Aおよび/またはIL-17Fの存在下で上昇する。IL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17RC可溶性受容体、ならびに本発明の抗ヒトIL-17RCモノクローナルおよび中和抗体を含むそれに対する抗体を添加すると、炎症性メディエータの産生および発現が顕著に減少し、したがってヒトMSに関連した炎症局面に有効であると予測される。
【０４６１】
実施例27
関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)モデルにおける疾患の発症率および進行を減少させるIL-17FおよびIL-17A活性に対するアンタゴニスト
RAおよびOA患者由来のヒト滑膜培養物(滑膜マクロファージ、滑膜線維芽細胞、および関節軟骨細胞を含む)および外植片が、健常対照由来の培養物/外植片と比較してより高レベルの炎症性メディエータを産生することを示すために、このモデルを設計する。炎症性メディエータ(これらに限定されないが、オンコスタチンM、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、IP-10、RANTES、RANKL、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSF、一酸化窒素など)のこの産生増強は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、RAおよびOAに関連した症状および病理に寄与する。次いでこれらの経路および成分は、炎症性浸潤、軟骨および基質の損失/破壊、骨量減少、ならびにプロスタグランジンおよびシクロオキシゲナーゼの上方制御をもたらす。したがってこのモデルは、インビトロおよびエクスビボ実験においてRAおよびOAの破壊的炎症局面をシミュレートし得る。さらに、健常対照由来の外植片および滑膜培養物をこれらの炎症成分のいくつか(例えば、オンコスタチンM、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17AおよびIL-17F、IL-15など)の存在下で培養すると、炎症経路シグナル伝達が観察され得る。インビボでヒトRAに有効であると考えられる治療薬は、炎症性メディエータの産生および/または存在を阻害するおよび/または中和することにより、上記のインビトロおよびエクスビボモデルで作用すると考えられる。
【０４６２】
このモデルでは、関節置換術を受けているRA、OA患者もしくは健常対照から、または死後組織収集物からヒト滑膜外植片を採取し、Wooley and Tetlow(Arthritis Res 2: 65-70; 2000)およびvan 't Hof et al(Rheumatology 39:1004-1008; 2000)の変法を用いて処理する。滑膜線維芽細胞、滑膜マクロファージ、および関節軟骨細胞の培養物も同様に試験する。複製試料を以下のうちの1つで処理し：媒体(PBS)；組換えヒト(rh)IL-17A；rhIL-17F；またはrhIL-17A＋rhIL-17F、いくつかの試料には、オンコスタチンM、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F、およびIL-15の種々の組み合わせを含める。さらに、これらを、IL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17RC可溶性受容体、ならびに本発明の抗ヒトIL-17RCモノクローナルおよび中和抗体を含むそれに対する抗体を用いて、または用いずに処理する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータのレベルについて解析する。RAもしくはOA患者由来の試料、またはrhIL-17Aおよび/もしくはIL-17F(単独でまたは他の炎症性サイトカインと組み合わせて)で処理した試料では、炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルは、未処理の健常対照外植片または未処理の細胞培養物と比較して上昇している。IL-17Fおよび/またはIL-17A活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17RC可溶性受容体、ならびに本発明の抗ヒトIL-17RCモノクローナルおよび中和抗体を含むそれに対する抗体を添加すると、炎症性メディエータの産生が顕著に減少し、したがってヒトRAおよびOAに有効であると予測される。
【０４６３】
実施例28
IL-17AおよびIL-17F機能的反応
NIH-3T3/KZ142細胞に、ヒトIL-17RCx1(配列番号:1)およびマウスIL-17RCx1(配列番号:25)を安定にトランスフェクションした。上記のように、各株を用量反応のIL-17A、IL-17F、マウスIL-17F、および適切な対照で7分および15分間処理した。IL-17RCx1(配列番号:1)をトランスフェクションした場合、IL-17AおよびIL-17Fはいずれも、対照株による固有のシグナル伝達よりも約30%高い、リン酸化IκB-αおよびp38 MAPK転写因子の用量依存的反応をもたらした。マウスIL-17RCx1(配列番号:25)をトランスフェクションした場合には、IL-17AおよびIL-17Fはシグナル伝達の増加をもたらさなかった。マウスIL-17Fは、ヒトまたはマウスIL-17RCx1のいずれに対してもシグナル伝達の増加をもたらさなかった。
【０４６４】
実施例29
マウス疾患モデルにおけるIL-17A、IL-17F、IL-17RA、およびIL-17RC発現
4種のマウス疾患モデル(喘息、DSS大腸炎、アトピー性皮膚炎、および実験的アレルギー性脳脊髄炎)を、IL-17A、IL-17F、IL-17R、およびIL-17RCの発現について、公知の技法を用いて解析した。
【０４６５】
喘息モデルでは、IL-17AおよびIL-17Fは、罹患および非罹患マウスにおいて、肺、脾臓、肺流入領域リンパ節、および肺浸潤細胞で非常に低いレベル〜検出不能レベルで発現する。IL-17RCメッセージは、脾臓およびリンパ節と比較して肺でより高度に発現することが判明したが、疾患に伴って調節されなかった。IL-17Rは、肺と比較して脾臓および肺流入領域リンパ節でより高度に発現したが、やはり疾患に伴って調節されなかった。
【０４６６】
喘息モデルに反してDSS-大腸炎モデルでは、IL-17AおよびIL-17Fは、罹患マウスにおいて近位および遠位結腸で高度に上方制御されたが、正常マウスでは上方制御されなかった。いずれのサイトカインも、腸間膜リンパ節では有意に上方制御されなかった。さらに、両サイトカインの上方制御は急性DSS誘発大腸炎の状況で認められるが、慢性DSS誘発大腸炎では認められないことが判明した。IL-17Rは、近位および遠位結腸と比較して腸間膜リンパ節で顕著に発現するが判明したが、疾患に伴って調節されなかった。一方、IL-17RCは、腸間膜リンパ節と比較して近位遠位結腸組織でより高度に発現した。IL-17RC発現もまた、疾患に伴って調節されなかった。
【０４６７】
アトピー性皮膚炎では、IL-17A mRNAは検出されなかった。IL-17Fは、皮膚および皮膚-流入領域リンパ節で発現することが判明したが、疾患に伴って有意に調節されないと考えられた。IL-17R mRNAは、皮膚と比較して皮膚-流入領域リンパ節でより高度に発現したが、疾患に伴って調節されなかった。IL-17RCは、皮膚-流入領域リンパ節と比較して皮膚でより高度に発現したが、やはり疾患に伴って調節されなかった。
【０４６８】
実験的アレルギー性脳脊髄炎では、IL-17AおよびIL-17Fはいずれも、罹患マウスにおいて脊髄で上方制御されるが、健常マウスでは上方制御されないと考えられた。IL-17Fは、脊髄と比較してリンパ節でより高度に発現した可能性があるが、リンパ節での発現は疾患に伴って調節されなかった。しかしながら、これらの組織における発現の全体的なレベルは非常に低かった。IL-17Rは、脳および脊髄と比較してリンパ節でより高度に発現した。IL-17RCは試験しなかった。
【０４６９】
要するに、IL-17AおよびIL-17F発現は、DSS誘発大腸炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎モデルの状況では疾患に伴って調節されるが、喘息およびアトピー性皮膚炎に関してはおそらく調節されないと考えられる。IL-17RおよびIL-17RC発現は疾患に伴って調節されないと考えられるが、IL-17R発現はリンパ系組織において高いようであり、一方IL-17RC発現は非リンパ系組織において高いようである。
【０４７０】
実施例30
IL-17AおよびIL-17F双方に対する活性化のメディエータであるIL-17RC
マウスnih3t3/kz142.8アッセイ細胞株に、メトトレキセート耐性遺伝子(ジヒドロ葉酸還元酵素、DHFR)を有する発現ベクター中のヒトIL-17RCX1(配列番号:2)をトランスフェクションした。ヒトIL-17RA(配列番号:21)も同様に、この細胞株にトランスフェクションした。トランスフェクションは、市販のキットおよび製造業者の推奨(Mirus、ウィスコンシン州、マディソン、カタログ番号MIR218)を用いて実施した。細胞を1μM mtx修正増殖培地中に置き、発現構築物を含む発現ベクターに関して選択した。選択後、トランスフェクションプールを作製し、これをnih3t3/kz142.8/hcytor14X1およびnih3t3/kz142.8/IL-17Rと命名した。
【０４７１】
A) nih3t3/kz142.8に基づく細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイ
nih3t3/kz142.8に基づく細胞株は安定したap1/nfkbレポーター(kz142)を有するため、このレポーターを付加するためにアデノウイルス感染を必要としない。したがってルシフェラーゼアッセイ手順を短縮し、以下の方法で実施した：
【０４７２】
1. 細胞のプレーティング
グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/10% FBSを用いて、細胞を固体白色細胞培養被覆96ウェルプレート(カタログ番号3917、Costar)に5000個細胞/ウェルでプレーティングし、37℃および5% CO2で一晩培養した。この第2日目に、プレーティング培地を除去し、グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/1% FBSに置換し、37℃および5% CO2で一晩培養した。
【０４７３】
2. 安定したkz142レポーターのIL-17AおよびIL-17F活性化を測定するルシフェラーゼアッセイ
1% fbs、DMEM培地中で一晩インキュベートした後、ヒトIL-17AおよびIL-17Fリガンド希釈物を、BSA .28%レベルで改良した無血清培地で作製した。リガンド希釈物を添加した後、細胞を37℃および5% CO2で4時間インキュベートし、その後培地を除去し、細胞を15分かけて溶解し、ルシフェラーゼアッセイ系および試薬(カタログ番号e1531 Promega、ウィスコンシン州、マディソン)ならびにマイクロプレートルミノメーターを用いて平均蛍光強度(MFI)を測定した。.1〜100 ng/mlの濃度範囲で、両リガンドについて活性を検出した。
【０４７４】
下記のEC50は、少なくとも4回の実験の平均である。nih3t3/kz142.8/hcytor14x1トランスフェクションプールは、マウスIL-17Aリガンドに関して、約4 ng/mlというEC50を有する親細胞株(実施例14)と同様の活性を示した。hcytor14x1組換え株におけるmIL-17Aシグナル伝達が親細胞株(実施例14)におけるシグナル伝達に匹敵するという事実から、マウスIL-17Aはおそらく内因性マウスnih3t3細胞IL-17RAまたはIL-17RC受容体を介してシグナル伝達し、hcytor14X1を介して細胞を活性化しないということが示唆される。しかし、hIL-17RCX1トランスフェクタントプールはヒトIL-17A処理に対して応答性の上昇を示し、EC50は親株における2.8 ng/ml(実験4回の平均)に対して.41 ng/mlであった(組換え株においてEC50は6.8倍強力)。さらに、hIL-17RCX1組換え株はhIL-17Fに対して応答性が増強し、EC50は親株における10 ng/mlに対して組換え株において.61 ng/mlであった(組換え株においてEC50は17倍強力)。hIL-17RCX1株におけるhIL-17AおよびhIL-17Fに対する効力増加は、ヒトIL-17RCX1がヒトIL-17AおよびIL-17F双方の高親和性受容体であることと一致する。一方、hIL-17RA組換え株はhIL-17Aに対してのみ感受性が増強し、EC50は親株の2.8 ng/mlに対して.6 ng/mlであった。hIL-17RA組換え株ではhIL-17F EC50の増強は認められず、IL-17F EC50は親株における8.9 ng/mlに対して12.4 ng/mlであった。
【０４７５】
この結果は、これがhIL-17RCX1をhIL-17AおよびhIL-17F双方に対する活性化のメディエータとして具体的に関連づけるという理由で重要であり、またこの結果から、hIL-17RAがhIL-17A活性化に対してのみシグナル伝達を媒介し、hIL-17Fに対しては媒介しないことが示唆される。
【０４７６】
実施例31
IL-17AおよびIL-17Fの静脈内投与
種々の時点におけるBALB/cマウスの全血球数(CBC)および血清サイトカイン/ケモカインに及ぼすマウスまたはヒトIL-17AまたはIL-17Fの静脈内送達の影響を決定するため。
【０４７７】
1 ug mIL-17Aを静脈内投与すると、投与から1〜2時間後に、循環好中球(CBCによる)の約2倍増、ならびに血清KCおよびMCP-1(Luminexによる)の約10倍増が起こった；これらのケモカインにおける同様の結果は、5 ug hIL-17Aでも認められた。血中単球レベルもまた、2時間の時点で、1 ug mIL-17A(最大増加を示した)、5 ug hIL-17A、または5 ug hIL-17Fで処理したマウスで有意に増加した。mIL-17FおよびhIL-17Fを静脈内投与すると、1時間および2時間の時点で血清IL-15(Luminexによる)の顕著な増加が起こり、これらと同じ時点で血清KCおよびMCP-1のわずかな増加が起こった。
【０４７８】
実施例32
静脈内投与IL-17AおよびIL-17Fの中和
腹腔内可溶性受容体(マウスリガンド用のmIL-17RA:Fc；ヒトリガンド用の可溶性ヒトIL-17RC)により、サイトカインおよびケモカインの静脈内IL-17AおよびIL-17F媒介性増加を中和するため。雌BALB/cマウスに、PBS、100 ug mIL-17RA:Fc、または100 ug可溶性ヒトIL-17RCを腹腔内注射により投与し、その3時間後に、PBS；2 ugのmIL-17A、mIL-17Fのいずれか、もしくは2 ugのmIL-17AおよびmIL-17Fの両方(mIL-17RA:Fcを投与したマウス用)；または2 ugのhIL-17A、hIL-17Fのいずれか、もしくは2 ugのhIL-17AおよびhIL-17Fの両方(可溶性ヒトIL-17RCを投与したマウス用)を静脈内尾部注射により投与した。リガンド投与の1時間後に血清を採取し、少数の血清サイトカインおよびケモカインについて解析した。
【０４７９】
腹腔内可溶性受容体で前処置したマウスでは、PBS＋IL-17Aで処置したマウスと比較して、IL-17AおよびKC血清濃度のIL-17A媒介性増加が顕著に減少した。
【０４８０】
実施例33
可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドのプレートに基づくタンパク質結合アッセイ
捕獲EIAの形式は以下の通りである：ELISAプレートを1μg/mlヤギ抗ヒトIgGで被覆し、4℃で一晩インキュベートする。洗浄し、200μl/ウェルの1% BSAでプレートを室温で1時間ブロッキングする。洗浄し、可溶性受容体変種(A1586F、A1587F)またはIL17RCx1(A1034F)希釈系列(100μg/ml〜0.10μg/ml)をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、10:1(IL17A)または6:1(IL17F)のビオチン標識リガンドを添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、0.5μg/mLストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、TMB基質を添加して4分置く。停止溶液を添加して、反応を停止させる。(注記：特記しない限り、試薬量はすべて50μl/ウェルであった)。陽性結果は、一般的に0.5を上回る高いOD値になると考えられる。結果から、このアッセイにおいて構築物1342(配列番号:74)はIL-17Aと結合せず、IL-17Fと弱く結合することが示された。構築物1341(配列番号:72)は、IL-17AおよびIL-17Fの双方と非常に強く結合する。IL-17RCx1はIL-17AおよびIL-17Fと結合する。
【０４８１】
中和EIAの形式は以下の通りである：ELISAプレートを1μg/ml可溶性受容体(A1034F)で被覆し、4℃で一晩インキュベートする。洗浄し、200μl/ウェルの1% BSAでプレートを室温で1時間ブロッキングする。ブロッキング中、別のプレートで、可溶性受容体変種(A1586F、A1587F)希釈系列(50μg/ml〜0.05μg/ml)を、等量の10:1(IL17A)または6:1(IL17F)のビオチン標識リガンドと共に室温で1時間インキュベートする。ブロッキングしたプレートを洗浄し、ブロッキングしたプレートに受容体-リガンド複合体を添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、0.5μg/mLストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、TMB基質を添加して7分置く。停止溶液を添加して、反応を停止させる。(注記：特記しない限り、試薬量はすべて50μl/ウェルであった)。陽性結果は、一般的に0.5を下回る低いOD値になると考えられる。結果から、構築物1342(配列番号:74)は、IL17RCx1に対するIL17Aの結合を弱く中和し、IL17RCx1に対するIL17Fの結合を強く中和することが示された。構築物1341(配列番号:72)は、IL-17RCx1に対するIL17Aの結合を弱く中和し、IL17RCx1に対するIL17Fの結合を弱く中和する。中和により、変種タンパク質がビオチン化リガンドと結合していることが示される。
【０４８２】
実施例34
FACS結合アッセイ手順
本発明の可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドがリガンドIL-17AおよびIL-17Fに結合する能力を評価するため、フローサイトメトリーに基づく競合結合アッセイ法を使用した。全長IL17RCx4を安定にトランスフェクションしたBHK細胞株を、リガンドIL-17AまたはIL-17Fおよびリガンドに結合するよう標的化させる可溶性受容体と共にインキュベートすることにより、細胞表面に結合した(ひいては、可溶性受容体により非結合の)リガンドの検出および相対的定量化が可能になる。リガンドのビオチン化により、二次ストレプトアビジン結合フルオロフォアを用いたFACS検出が可能となる。可溶性受容体の滴定にわたる細胞結合リガンドの減少を、細胞の平均蛍光の減少として記録する。100 ul量の染色媒体(HBSS＋1% BSA＋0.1%アジ化Na＋10 mM HEPES)中、1 ug/mlビオチン化リガンドを滴定量の可溶性受容体と個々に前もって混合し、室温で15分間インキュベートする。全長IL17RCx4を安定にトランスフェクションしたBHK細胞株を、ベルセン(Invitrogen cat.15040-066)で再懸濁し、2 x 10e5個細胞/100 ulに平衡化し、ペレット化し、リガンド/可溶性受容体予混合物で再懸濁することにより、リガンド染色用に調製する。染色した細胞を4℃で30分間インキュベートし、染色媒体で1回洗浄し、1:100比のストレプトアビジン-PE(BD Pharmingen cat. 554061)で染色する。細胞を暗下で4℃で30分間インキュベートし、染色媒体で2回洗浄し、1:1比の染色媒体およびCytofix(BD Bioscience 554655)で再懸濁する。BD LSRIIフローサイトメーターまたは類似の装置を、データ収集および解析に使用する。図5は標準的なグラフを示す。グラフは、Prizmソフトウェアプログラムを用いて作成した。Y値は、リガンドのみおよびリガンドなし/可溶性受容体なし対照ウェルに基づいて最大および最小(100%および0%)に標準化したMFI、したがって細胞に対するリガンドの結合率を示す。ソフトウェアにより、各曲線のIC50を算出する。
【０４８３】
実施例35
可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドによるビオチン化ヒトIL-17AおよびIL17Fの特異的結合の阻害
可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドがIL-17AおよびIL17Fに結合する能力を決定するために用いる結合アッセイ法は、本明細書に記載してある。配列番号:157および158などのさらなる可溶性ポリペプチドを結合反応に含めること以外は、上記の通りに結合試験を行う。この可溶性ポリペプチドは、IL-17RCトランスフェクションBHK細胞に対するヒトIL-17AおよびIL-17F双方の結合を、可溶性ヒトIL-17RCx1 Fc融合タンパク質(配列番号:64)と同程度まで阻害した。配列番号:157および158の可溶性ポリペプチドを含む残りの可溶性ポリペプチドを、以下の表9に含める。
【０４８４】
【表９】
2009510093.tif 000038
*細胞に基づく競合結合IC50(ng/uL)；各リガンドに対するIC50に基づき、最も強い結合体から最も弱い結合体という構築物の順。
【０４８５】
実施例36
IL-17AおよびIL-17Fに対するIL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RA可溶性ポリペプチドの結合親和性
IL-17RCx1、IL-17RA、および可溶性IL-17RC/IL-17RA可溶性ポリペプチド(配列番号:157および158)を、以下の通りに、IL-17AおよびIL-17Fに対する結合親和性について試験した：Gt抗Hu IgG-Fc特異的抗体(Jackson #109-005-008)をpH 5.0酢酸Naで50 ug/mlに希釈し、CM5 Biacoreチップ上に固定化した。手順を最適化して理論上の結合最大で受容体を捕獲し、その後、会合および解離を観察するために濃度系列の各リガンドを注入した。可溶性受容体およびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドを、濃度系列の各リガンドの結合に関して試験した。サイクル間には、pH 1.75グリシンを2 x 30秒間注入して表面を再生した。Biacore Evaluationソフトウェアを用いてデータを評価して動態値を決定し、これを以下の表10に示す。
【０４８６】
【表１０】
2009510093.tif 000039
*平衡定数および速度定数を示し、値は装置の検出限界内に入る。
Chi2は、結合曲線と評価適合曲線との間の残差の平方の和を指す。0に近いほど、データの信頼度は高くなる。このデータは、良好な信頼度で示される。
【０４８７】
これらのデータから、ヒトIL-17RAおよびヒトIL-17RCに対するヒトIL-17AおよびヒトIL-17Fの結合が実証される。具体的には、ヒトIL-17RCは、400ピコモル(pM)範囲内の解離平衡定数(KD)を有して、ヒトIL-17AおよびヒトIL-17Fの双方に対して同様の結合親和性を示す。可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドは、ヒトIL-17F、KD約140 pMとよりもわずかに高い親和性、KD約40 pMでヒトIL-17Aと結合した。ヒトIL-17RAはリガンド親和性の最も大きな相違をもたらし、ヒトIL-17A、KD約300 pMとヒトIL-17F、KD約30ナノモル(nM)結合との間で100倍の差があった。
【０４８８】
実施例37
組換えヒトIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8およびIL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8レポーターアッセイ細胞株の作製
本明細書に記載するマウスNIH3T3/KZ142.8レポーター細胞株を用いて、ヒトIL-17RA(配列番号:21)またはIL-17RCx4(配列番号:166)に関する組換え体である新たなアッセイ細胞株を作製した。これは、この細胞にこれらのcDNAをそれぞれ含む発現構築物をトランスフェクションすることによって達成した。発現ベクターには、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むpzmp11を利用した。したがって、1 uMメトトレキセート改良増殖培地を用いてトランスフェクタントを選択し、安定したプールを作製した。これらのアッセイ細胞株を、hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8およびhIL-17RCX4/NIH3T3/KZ142.8と命名した。
【０４８９】
実施例38
組換えヒトIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8細胞のヒトIL-17A活性化を拮抗する可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド
組換えhIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8細胞のヒトIL-17A活性化に対する可溶性IL-17RC/IL-17RA可溶性ポリペプチド(配列番号:157および158)競合の有効性を、以下の通りに測定した：細胞のプレーティングおよびルシフェラーゼアッセイの調製は、本明細書に記載したものと同様であった。アッセイ当日、この細胞に最初に、上記の可溶性ポリペプチド、IL-17RA、およびIL-17RCを含む最終濃度の2倍の可溶性受容体1倍量の、2 ug/ml(リガンドと混合した場合に1 ug/ml最終濃度となる)から開始する2倍用量系列を三つ組にて添加した。次に、最終濃度.5 ng/mlの2倍である1 ng/ml IL-17Aを1倍量添加したが、この最終濃度は受容体-リガンドの混合によって得られる。受容体なしで.5 ng/ml IL-17Aを添加した三つ組セットを用いて、最大活性化を決定した。リガンドも可溶性受容体も含まないアッセイ培地のみを添加した三つ組セットを用いて、基礎活性化を決定した。データ解析から、可溶性ポリペプチドによる上記細胞株のIL-17A活性化のIC50は7 ng/mlであることが明らかになった。1 ug/ml可溶性受容体という最高用量を用いた場合でさえ、この細胞株の.5 ng/ml hIL-17A活性化を信憑性をもって拮抗する可溶性IL-17RAまたはIL-17RCの十分な効力は認められなかった。
【０４９０】
実施例39
組換えヒトIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8細胞のヒトIL-17F活性化を拮抗する可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド
組換えhIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8細胞(上記)のヒトIL-17F活性化に対する可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:157および158)競合の有効性を、以下の通りに測定した：細胞のプレーティングおよびルシフェラーゼアッセイの調製は、本明細書に記載したものと同様であった。アッセイ当日、この細胞に最初に、上記の可溶性ポリペプチド、IL-17RA、およびIL-17RCを含む最終濃度の2倍の可溶性ポリペプチド1倍量の、4 ug/ml(リガンドと混合した場合に2 ug/ml最終濃度となる)から開始する2倍用量系列を三つ組にて添加した。次に、最終濃度20 ng/mlの2倍である40 ng/ml IL-17Fを1倍量添加したが、この最終濃度は受容体-リガンドの混合によって得られる。受容体なしで20 ng/ml IL-17Fを添加した三つ組セットを用いて、最大活性化を決定した。リガンドも可溶性受容体も含まないアッセイ培地のみを添加した三つ組セットを用いて、基礎活性化を決定した。データ解析から、IL-17RC/IL-17RA可溶性ポリペプチドによる上記細胞株のIL-17F活性化のIC50は0.48 ug/mlであることが明らかになった。2 ug/ml可溶性受容体という最高用量を用いた場合でさえ、この細胞株の20 ng/ml IL-17F活性化の拮抗作用を示す可溶性IL-17RAまたはIL-17RCの十分な効力は認められなかった。
【０４９１】
実施例40
組換えヒトIL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8細胞のヒトIL-17F活性化を拮抗する可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド
組換えhIL-17RCX4/NIH3T3/KZ142.8細胞(上記)のIL-17F活性化に対する可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:157および158)競合の有効性を、以下の通りに測定した：細胞のプレーティングおよびルシフェラーゼアッセイの調製は、本明細書に記載したものと同様であった。アッセイ当日、この細胞に最初に、上記の可溶性ポリペプチド、IL-17RA、およびIL-17RCを含む最終濃度の2倍の可溶性受容体1倍量の、4 ug/mlから開始する5倍系列用量を三つ組にて添加した。次に、最終濃度1 ng/mlの2倍である2 ng/ml IL-17FロットA1275Fを1倍量添加したが、この最終濃度は受容体-リガンドの混合によって得られる。受容体なしで1 ng/ml IL-17Fを添加した三つ組セットを用いて、最大活性化を決定した。リガンドも可溶性受容体も含まないアッセイ培地のみを添加した三つ組セットを用いて、基礎活性化を決定した。データ解析から、可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドのIL-17F活性化のIC50は0.8 ug/mlであり、IL-17RCでは6 ug/mlであり、IL-17RAはいずれの用量においても拮抗作用を有さないことが明らかになった。
【０４９２】
実施例41
G-CSF、IL-6、およびIL-8のヒトIL-17AおよびIL-17F誘導の活性を中和する可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド
ヒト小気道上皮細胞(SAEC)をヒトIL-17AまたはヒトIL-17Fで処理し、48時間上清を回収した。これらの上清をアッセイしたところ、以下の表11に示すようなG-CSF、IL-6、およびIL-8の用量依存的誘導が示された：
【０４９３】
【表１１】
2009510093.tif 000040
【０４９４】
また、SAECを、10 ng/mlヒトIL-17Aまたは50 ng/mlヒトIL-17Fと組み合わせた0.01〜10 ug/ml用量の可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:157および158)で処理し(リガンドおよび可溶性受容体を共に37℃で30分間インキュベートしてから、細胞に添加した)、48時間上清を回収した。以下の表12に示すように、これらの上清はG-CSF、IL-6、およびIL-8の減少を示し、可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドがこれらのサイトカインのヒトIL-17AおよびヒトIL-17F誘導の活性を効率的に中和し得ることが実証される。IL-6の中和に関してはIC50値を決定することができなかったが、それは試験した最低用量(0.01 ug/ml)の可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチドにおいて、中和が最大の約50%にしか戻らなかったためであることに留意されたい。
【０４９５】
【表１２】
2009510093.tif 000041
【０４９６】
実施例42
ヒト多発性硬化症試料における可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの有効性
多発性硬化症(MS)は、リンパ球および単核細胞炎症性浸潤の存在ならびにCNS全体にわたる脱髄を含む多くの要因によって媒介されると考えられる複合疾患である。ミクログリアは中枢神経系(CNS)に存在するマクロファージ様細胞であり、損傷または感染時に活性化される。ミクログリアおよび神経細胞はいずれも、MSを含む種々のCNS疾患において重大な役割を果たすと関連づけられており、疾患の開始、進行、および治療の機構を研究するために用いられ得る(Nagai et al. Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001；Olson et al. J. Neurosci Methods 128:33-43; 2003；Giuliani et al. J Neuroimmunol 165: 83 - 91; 2005)。したがって、初代神経細胞培養物、不死化ヒトミクログリア細胞株、および/または確立されたヒトアストログリア細胞株を用いて、これらの細胞型に及ぼす炎症性メディエータの効果のうちのいくつか、およびそれらの中和の可能性を試験することができる。炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、RANTES、IP-10、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなど)は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、MSに関連した症状および病理に寄与し得る。
【０４９７】
これらの細胞型に対するIL-17AおよびIL-17Fの炎症誘発作用、および可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドがこれらの効果を中和するまたは減少させる能力を評価するために、培養神経細胞またはグリア細胞を以下のうちの1つで処理する：媒体；rhIL-17A；rhIL-17F；rhIL-17A＋IL-17F。さらに、これらを、可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドを用いて、または用いずに処理する。培養物の別のセットでは、ヒト対象から単離し、抗CD3で活性化した循環T細胞を、外因性IL-17AまたはIL17-Fの非存在下において培養神経細胞およびグリア細胞に添加し、これらの細胞型に及ぼす活性化T細胞の破壊効果を調べる共培養法を提供する。T細胞を可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドを用いて、または用いずに処理する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清および細胞を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータのレベルおよび/または発現について解析し、また細胞生存についても解析する。炎症性サイトカインおよびケモカインのレベル、ならびに神経細胞の死滅は、媒体単独で処理した培養物と比較して、rhIL-17Aおよび/またはIL-17Fの存在下で上昇する。可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドを添加すると、これらの培養物における炎症性メディエータの産生および発現は顕著に減少し、神経細胞における細胞生存は増加する。
【０４９８】
したがって、これらのエクスビボ実験から、可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドが、ヒトMSの病理生物学と関連している破壊および炎症作用を軽減できることが実証されるため、このような可溶性ポリペプチドによる治療は、ヒトMSに関連した炎症局面、神経細胞死、および/または脱髄を軽減する上で有効であると予測される。
【０４９９】
実施例43
ヒト関節リウマチ(「RA」)および変形性関節症(「OA」)試料における可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの有効性
RAおよびOA患者由来のヒト滑膜培養物(滑膜マクロファージ、滑膜線維芽細胞、および関節軟骨細胞を含む)および外植片が、健常対照由来の培養物/外植片と比較してより高レベルの炎症性メディエータを産生し、この炎症性メディエータがこれらの疾患の特徴である細胞外基質成分(例えば、骨、軟骨など)の分解に寄与し得ることを示すために、これらのモデルを設計する。さらに、RA/OA滑液中に存在する炎症性メディエータおよび/または活性化T細胞もまた、より大きな炎症および基質分解をもたらし得ることを示すために、以下に記載する共培養モデルを設計する。
【０５００】
炎症性メディエータ(これらに限定されないが、オンコスタチンM、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、IP-10、RANTES、RANKL、MIPファミリーメンバー、MCP-1、MMP-9、G-CSFおよびGM-CSF、一酸化窒素など)の産生増強は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、RAおよびOAに関連した症状および病理に寄与する。次いでこれらの経路および成分は、炎症性浸潤、軟骨および基質の損失/破壊、骨量減少、ならびにマトリックスメタロプロテアーゼ、プロスタグランジン、およびシクロオキシゲナーゼの上方制御をもたらす。したがってこれらのモデルは、インビトロおよびエクスビボ実験においてRAおよびOAの破壊的炎症局面をシミュレートし得る。さらに、健常対照由来の外植片および滑膜培養物を、外因的に添加した炎症成分(例えば、オンコスタチンM、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17AおよびIL-17F、IL-15など)の存在下で、またはあるいはRA患者由来の滑液(炎症成分を内因的に含むと考えられる)の存在下で培養すると、炎症および分解経路シグナル伝達が観察され得る。インビボでヒトRAに有効であると考えられる治療薬は、炎症性メディエータの産生および/または存在を阻害するおよび/または中和することにより、上記のインビトロおよびエクスビボモデルで作用すると考えられる。
【０５０１】
これらのモデルでは、関節置換術を受けているRA、OA患者もしくは健常対照から、または死後組織収集物からヒト滑膜外植片を採取し、Wooley and Tetlow(Arthritis Res 2: 65-70; 2000)およびvan 't Hof et al(Rheumatology 39:1004-1008; 2000)の変法を用いて処理する。滑膜線維芽細胞、滑膜マクロファージ、および関節軟骨細胞の培養物も同様に試験する。複製試料を以下のうちの1つで処理し：媒体(PBS)；組換えヒト(rh)IL-17A；rhIL-17F；またはrhIL-17A＋rhIL-17F、いくつかの試料には、オンコスタチンM、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F、およびIL-15の種々の組み合わせを含める。試料の別のセットを、活性化ヒトT細胞、または健常対照またはRAもしくはOA患者由来の滑液で処理する。さらに、これらの試料をすべて、可溶性IL-17RCポリペプチドまたは可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドを用いて、または用いずに処理する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清および細胞を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータおよび軟骨/骨/基質バイオマーカーのレベルについて解析する。RAもしくはOA患者由来の試料、またはRA/OA滑液、活性化T細胞、rhIL-17Aおよび/もしくはrhIL-17F(単独でまたは他の炎症性サイトカインと組み合わせて)で処理した試料では、炎症性サイトカインおよびケモカイン、ならびに軟骨/骨/基質分解マーカーのレベルは、未処理の健常対照外植片または未処理の細胞培養物と比較して上昇している。本発明の可溶性ポリペプチドを添加すると、炎症性メディエータおよび軟骨/骨/基質分解性メディエータの産生が顕著に減少し、したがってヒトRAおよびOAに有効であると予測される。
【０５０２】
実施例44
粘膜生検培養物でのヒト炎症性腸疾患(「IBD」)試料における可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの有効性
IBD患者由来の培養腸組織が、健常対照由来の組織と比較してより高レベルの炎症性メディエータを産生することを示すために、このモデルを設計する。炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなど)のこの産生増強は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)などのIBDに関連した症状および病理に寄与する。次いでこれらの経路および成分は、インビボで認められる組織および細胞の損傷/破壊をもたらす。したがってこのモデルは、IBDのこの炎症性メディエータ増強局面をシミュレートし得る。さらに、健常対照由来の腸組織またはヒト腸上皮細胞(IEC)株をこれらの炎症成分の存在下で培養すると、炎症経路シグナル伝達、ならびに組織および細胞損傷の証拠が観察され得る。
【０５０３】
インビボでヒトIBDに有効であると考えられる治療薬は、炎症性メディエータの産生および/または存在を阻害するおよび/または中和することにより、上記のエクスビボまたはIECモデルで作用すると考えられる。
【０５０４】
このモデルでは、腸生検、切除を受けているIBD患者もしくは健常対照から、または死後組織収集物からヒト腸組織を採取し、Alexakis et al(Gut 53:85-90; 2004)の変法を用いて処理する。無菌条件下で試料を大量のPBSで穏やかに清浄化し、その後、完全組織培地(細菌の過剰増殖を防ぐために抗生物質を添加)の存在下で組織の細分切片を培養する。細分組織の同一プールによる試料を、以下のうちの1つで処理する：媒体(PBS)；組換えヒト(rh)IL-17A；rhIL-17F；またはrhIL-17A＋rhIL-17F。さらに、これらを、可溶性IL-17RCポリペプチドまたは可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドを用いて、または用いずに処理する。細胞を既存の保存液から継代すること以外は、ヒトIEC株での研究にこの実験手順を適用する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータのレベルについて解析する。IBD患者由来の試料またはrhIL-17Aおよび/もしくはIL-17Fで処理した試料では、炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルは、未処理の健常対照組織試料と比較して上昇している。本発明の可溶性ポリペプチドを添加すると、炎症性メディエータの産生が顕著に減少し、したがってヒトIBDに有効であると予測される。
【０５０５】
この試験のさらなる群には、有効な治療を受けているIBD患者と、現在のところ薬物療法を受けていないかまたは治療に対する非応答者と見なされるIBD患者の組織生検試料からの炎症性メディエータの産生の比較を含めることができる。
【０５０６】
実施例45
上皮障壁機能でのヒトIBD試料における可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの有効性
健常な胃腸管の保護において、上皮障壁の完全性の維持は重要な要素である。実験的証拠から、腸における上皮障壁の漏出性がIBDの発症に寄与し得ることが示唆される。腸固有層に位置する免疫細胞は一般的に、細胞間接触または可溶性因子の産生を介して腸上皮細胞と相互作用して免疫監視を維持し、上皮障壁の完全性に寄与する。しかしながら、免疫の長期化または調節不全を介した炎症は、上皮障壁細胞の完全性および機能の欠陥の一因となり得る。T細胞由来IL-17Aおよび/またはIL-17Fが上皮障壁の完全性に及ぼす直接的な影響を測定するために、以下の試験を設計する。
【０５０７】
本実施例では、Caco-2細胞のような腸上皮細胞株を半透膜上で分化させ、基底外側面において、IBD患者または正常個体の生検試料に由来するT細胞または単球と共培養する。経上皮電気抵抗または色素拡散に対する単層の抵抗性の評価を用いて、上皮単層の完全性を経時的にモニターする。共培養における単層の経上皮抵抗性の減少により、共培養物中のT細胞または単球の活性によって誘導された単層の破壊が示唆される。可溶性IL-17RCポリペプチドまたは可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドのようなIL-17AおよびIL-17Fの阻害剤を用いて、上皮単層の破壊に対するIL-17AおよびIL-17Fの相対的寄与を決定すること、ならびにIL-17AおよびIL-17Fの阻害剤が上皮障壁の完全性の維持に有効であるかどうかを試験することができる。活性化T細胞によって誘導される上皮単層破壊のそのような分子による保護から、本発明の可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドがヒトのIBDの治療的処置に有効であり得ることが示唆される。
【０５０８】
また、IBD患者由来の初代上皮により形成された単層を用いて共培養系を作製して、これらの細胞が、正常個体に由来する上皮細胞と比較して、IL-17AおよびIL-17Fに対して感受性がより高いかどうかを決定することができる。そうであるならば、これらのデータから、IL-17AおよびIL-17Fを阻害することがIBDの治療的処置の適切な戦略であることが示唆される。
【０５０９】
実施例46
正常およびヒトIBD試料由来の固有層T細胞および単球/マクロファージに及ぼすIL-17AおよびIL-17Fの影響
免疫の調節不全または持続を介した炎症は、組織損傷または不適切なもしくは長期的な免疫応答への永続的歪みにより、IBDに関連した症状および病理に寄与し得る。このモデルでは、腸組織の周辺環境のサイトカイン環境中に存在し得るIL-17AおよびIL-17Fに対する疾患関連T細胞および単球の曝露の潜在的下流事象を決定することができる。
【０５１０】
インビボでヒトIBDに有効であると考えられる治療薬は、炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなど)の産生および/または存在を阻害するおよび/または中和することにより、上記のエクスビボモデルで作用すると考えられる。
【０５１１】
このモデルでは、HBSS中で生検試料をハサミで慎重に細分し、コラゲナーゼおよびディスパーゼIIで処理し、振盪機中で37℃にて1時間インキュベートすることにより、T細胞および単球/マクロファージを生検試料から単離する。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を濾過して、残屑および細胞凝集塊を除去し、HBSSで複数回洗浄する。直接的細胞選別またはビーズ枯渇/濃縮手順を用いて、T細胞およびマクロファージ/単球を単離し得る。単離した細胞を、IL-17AおよびIL-17Fの存在下でインキュベートする。これによって、T細胞および単球/マクロファージによる炎症性メディエータの産生が誘導されるか、またはその後のT細胞応答が高度に炎症誘発性の応答へと偏る。IBD患者由来の細胞により産生される炎症性メディエータの種類と正常個体の細胞によるものとを比較することができ、この比較から、IBD患者由来のT細胞および単球/マクロファージが、IL-17AおよびIL-17Fの存在下においてより炎症誘発性の高いプロファイルを生じることが示唆され得る。IL-17AおよびIL-17Fによって誘導される下流炎症性メディエータの産生を中和するための、可溶性IL-17RCポリペプチドまたは可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドの添加から、このような可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドがIBD患者の治療的処置に有効であり得ることが示唆される。
【０５１２】
実施例47
過敏性腸症候群(「IBS」)における可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの有効性：CNS標的化病因
IBSに特有の症状を誘発するためにストレス刺激を使用する、IBSの初期CNS標的化病因に焦点をおいたモデル。新生仔心理社会的ストレスモデルは、内臓痛覚過敏、下痢、およびストレス感受性を含む、IBS患者に付随するいくつかの臨床的特徴を模倣する。出生後4〜18日の間、同腹仔を母親から毎日180分間分離すると、母性行動の変化が起こり、身体をなめる/毛づくろいをする行動回数が有意に減少する。新生仔へのストレスは、CNSの永続的変化を生じて、ストレス誘発性の内臓および体性痛覚感受性の変化が起こる。これらの動物ではストレスに応答して結腸運動機能が高まり、予備データから、腸透過性の増加の証拠が示される(Mayer et al., 2002)。可溶性IL-17RCポリペプチドまたは可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドで処置し、結腸運動機能、上皮透過性、およびストレス刺激に対する応答をその後解析することで、IBSのこの動物モデルにおける有効性を決定することができる。これらの阻害剤による処置後に症状の発生率が減少すれば、IBSの治療における潜在的有効性が示唆される。
【０５１３】
実施例48
過敏性腸症候群(「IBS」)における可溶性IL-17RCおよびIL-17RC/IL-17RAポリペプチドの有効性：初期腸標的化ストレス誘導因子
これは、初期腸標的化ストレス誘導因子(すなわち、腸炎症、感染、または身体的ストレス)に焦点をおいたモデルである。動物試験から、軽度の炎症または免疫活性化が、腸の運動性ならびに/または求心性および上皮機能の変化の根拠となり得ることが示されている(Mayer et al., 2002)。このモデルでは、カラシ油を結腸内に毎日注射する方式で、新生仔動物(8〜21日)において常時的結腸過敏を生じさせる。カラシ油は神経刺激薬であり、結腸内投与後に内臓痛覚過敏を誘発することが示されている。このモデルは、内臓痛覚過敏および排便習慣の変化を含むIBSの重要な特徴を模倣する。動物はまた、IBS患者の重要な特徴である下痢または便秘を呈する(Mayer et al., 2002；Kimball et al., 2005)。可溶性IL-17RCポリペプチドまたは可溶性IL-17RC/IL-17RAポリペプチド(配列番号:158)などの本発明の可溶性ポリペプチドを送達して、このモデルに関連した症状の発症の変化を判定することができる。本発明者らの阻害剤による治療的処置後に、内臓痛覚過敏および腸運動性の変化の発生率または程度が減少すれば、これらの分子がIBSの治療に有効である可能性が示唆される。
【０５１４】
実施例49
可溶性IL-17AおよびIL-17Fアンタゴニストの大規模化可能なタンパク質生産工程の設計
可溶型IL-17RCの大規模化可能なタンパク質生産工程の開発に焦点をおいた戦略を設計する上で、馴化培地中の高レベルタンパク質濃度を可能にする発現系の同定で多くの困難に遭遇した。ウェスタンブロット解析から、タンパク質が細胞中に蓄積し、タンパク質分泌が低レベルであることが実証された。本発明の可溶性ポリペプチドの発見においては、70を超える異なる発現構築物を設計し、作製し、BHK細胞、CHO細胞、またはHEK 293細胞において発現を試験した。いくつかは、2つ以上の宿主細胞株で試験した。試験した可溶性IL-17RC発現カセットの変更点は、以下のものを含んだ：
1) a) 天然；b) otPA；c) マウス免疫グロブリン重鎖可変領域；d) ヒト成長ホルモン；e) マウスIL17RAなどの代替シグナル配列。
2) 2つの異なる天然スプライス変種(IL-17RCx1、配列番号:2；およびIL-17RCx4、配列番号:166)。
3) a) リンカーなし；b) GlyGlyGlySerに基づく9アミノ酸リンカー；およびc) GlyGlyGlySerに基づく20アミノ酸リンカーなどの、IL-17RC細胞外ドメイン(ECD)とFcタンパク質との間のリンカー配列の付加。
4) Hisタグ化単量体型。
5) アミノ末端およびカルボキシ末端Fc融合タンパク質。
6) N結合糖鎖結合部位の除去。
7) AsnからGlnへのアミノ酸置換。
8) IL17RAとIL17RCとのハイブリッド融合タンパク質。
【０５１５】
可溶性IL-17RC変種発現構築物はすべて、HEK 293細胞における一過性トランスフェクションによりタンパク質発現について試験した。ウェスタンブロット解析を用いて、細胞溶解物の試料採取による細胞中に保持されたタンパク質と比較した、馴化培地中に分泌されたタンパク質を検出した。大部分の構築物は、ウェスタンブロットによりかろうじて検出可能な、馴化培地中に分泌されるタンパク質を発現した。さらに、シグナルは馴化培地試料と比較して細胞溶解物試料でより高く、タンパク質が効率的に分泌され得ないことが示された。馴化培地中に最も高いシグナルをもたらした発現構築物を用いて、安定したCHO細胞プールをトランスフェクションした。安定したCHOプールからタンパク質力価を測定し、可能な場合には、細胞に基づく競合結合アッセイ法で精製タンパク質をIL-17AおよびIL-17F結合について解析した。以下の表は、CHO細胞安定プールにおいて最も高く発現する構築物によるタンパク質発現結果を示す。絶対タンパク質濃度測定値が検出レベル未満である場合には、タンパク質力価は＜0.5 mg/mLと表示する。
【０５１６】
IL-17RCおよびIL-17RC/RAタンパク質発現構築物の番号命名、含まれるエキソンの簡単な説明、安定にトランスフェクションしたCHO細胞プールからのタンパク質力価、ならびにIL-17AおよびIL-17F結合能。表13に含まれる変種の配列すべてを、本明細書に含めたわけではない。
2009510093.tif 000042
【０５１７】
本発明の特定の態様を説明の目的で本明細書において記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得ることが前述より理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０５１８】
【図１】図1Aおよび1Bは、ヒトIL-17RCx1(配列番号:2)のエキソン構造の図による表示である。コドンがエキソン/イントロン接合部により接合されたアミノ酸に関しては、コドン全体を含むように接合部を移動した。
【図２】図2Aおよび2Bは、ヒトIL-17RCx4(配列番号:166)のエキソン構造の図による表示である。
【図３】ヒトIL-17RA(配列番号:21)のエキソン構造の図による表示である。
【図４】図4Aおよび4Bは、本明細書ならびに配列番号:157および158に記載する本発明の好ましい可溶性ポリペプチドのエキソン構造の図による表示である。この可溶性ポリペプチドは、IL-17RA(配列番号:21)およびヒトIL-17RCx1(配列番号:2)の双方に由来するエキソンを含む。
【図５】実施例34に概説した手順を用いた典型的なアッセイ結果のグラフ表示である。グラフは、Prizmソフトウェアプログラムを用いて作成した。Y値は、リガンドのみおよびリガンドなし/可溶性受容体なし対照ウェルに基づいて最大および最小(100%および0%)に標準化したMFI、したがって細胞に対するリガンドの結合パーセントを示す。ソフトウェアにより、各曲線のIC50を算出する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2009510093.tif 000049
【図４Ｂ】
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【図５】
2009510093.tif 000051
【配列表】
2009510093000001.app
【国際調査報告】
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2009510093.tif 000053
2009510093.tif 000054
2009510093.tif 000055
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