(57)【要約】  本発明は、異常なスーパーオキサイドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）に特異的に結合し、そして、ヒトのような動物に投与された際に、その病的な効果を中和する抗体に関する。本発明に係る抗体は、カナダの国際寄託機関に２００６年８月２９日付で寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０１、０２、および、０３として寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生された単クローン抗体である。本発明はまた、ヒトのような動物における筋萎縮性側索硬化、アルツハイマー病、および、パーキンソン病のような神経変性疾患の治療、予防、および、診断のよいて本発明に係る抗体を使用することにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナダ国際寄託機関に２００６年８月２９日付で寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０１として寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項２】
カナダ国際寄託機関に２００６年８月２９日付で寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０２として寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項３】
カナダ国際寄託機関に２００６年８月２９日付で寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０３として寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項４】
請求項1に記載のハイブリドーマ細胞株から産生された単クローン抗体。
【請求項５】
請求項２に記載のハイブリドーマ細胞株から産生された単クローン抗体。
【請求項６】
請求項３に記載のハイブリドーマ細胞株から産生された単クローン抗体。
【請求項７】
動物に投与された際に、異常なスーパーオキサイドジスムターゼ（以下、「ＳＯＤ１」という。）の病理効果を中和する活性を保有することを特徴とする異常なＳＯＤ１に特異的に結合する抗体。
【請求項８】
前記抗体が、単クローン抗体、または、多クローン抗体である請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、単クローン抗体である請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項1から３のいずれか一項に記載のハイブリドーマ細胞株によって産生された請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項４から１０のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体と、医薬的に許容可能な担体と、を含有する動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療および／または予防に適用される組成物。
【請求項１２】
前記動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患が、神経変性疾患である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化、アルツハイマー病、および、パーキンソン病からなる群から選ばれる疾患である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体を用いて、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療および／または予防用組成物を製造する方法。
【請求項１６】
１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体を用いて、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／または予防する方法。
【請求項１７】
前記抗体が、多クローン抗体、または、単クローン抗体である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、単クローン抗体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体を用いて、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を検査する方法。
【請求項２０】
１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１単クローン抗体を用いて、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患検査用の組成物を製造する方法。
【請求項２１】
前記抗体が、請求項４，５，６，９、および、１０のいずれか一項に記載の１つ以上の単クローン抗体である請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患が、神経変性疾患である請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化、アルツハイマー病、および、パーキンソン病からなる群から選ばれる疾患である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体を含む１つ以上の容器を有する動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患検査用キット。
【請求項２６】
抗−異常ＳＯＤ１抗体が、単クローン抗体である請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記抗体が、請求項４，５，９、および、１０のいずれか一項に記載の１つ以上の単クローン抗体である請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
請求項３に記載のハイブリドーマ細胞株により産生された抗体をコントロールとして含む請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患が、神経変性疾患である請求項２５から２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化、アルツハイマー病、および、パーキンソン病からなる群から選ばれる疾患である請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化である請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与して、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／または予防する方法。
【請求項３３】
前記動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患が、神経変性疾患である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化、アルツハイマー病、および、パーキンソン病からなる群から選ばれる疾患である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体を含む１つ以上の容器を有する動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療または予防に適用されるキット。
【請求項３７】
前記１つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体が、単クローン抗体である請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記抗体が、請求項４から１０のいずれか一項に記載の１つ以上の単クローン抗体である請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患が、神経変性疾患である請求項３６から３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化、アルツハイマー病、および、パーキンソン病からなる群から選ばれる疾患である請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化である請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）のようなＳＯＤ１異常と関連した神経変性疾患の分野に関する。より具体的に、本発明は、単クローン抗体、ならびに、前記神経変性疾患の治療、予防、および／または、診断方法、および、組成物における前記単クローン抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患とは、特定の神経細胞が変性していく病気をいう。これらの細胞に変化が起こると、前記細胞は正常に機能することができなくなり、結果的に、細胞壊死に至る。
【０００３】
典型的な神経変性疾患として、家族性および散発性筋萎縮性側索硬化（それぞれ、ＦＡＬＳおよびＡＬＳ）、家族性および散発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性および散発性アルツハイマー病、オリーブ橋小脳萎縮（olivopontocerebellar atrophy）、複合神経系萎縮（multiple system atrophy）、進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）、拡散性レヴィー小体症（diffuse lewy body）、皮質歯状核黒質変性症（corticodentatonigral degeneration）、進行性家族性間代性筋痙攣性癲癇（progressive familial myoclonic epilepsy）、線条体黒質変性（strionigral degeneration）、回転失調（torsion dystonia）、家族性振せん（familiar tremor）、ジル・ド・ラ・ツレット症候群（Gilles de la Tourette's syndrome）、および、ハレルフォルデン症候群（Hallervorden syndrome）などが挙げられる。これらの疾患の殆どは、中年の成人に発病して、神経系における特定のサブセットの神経が急速に変性していき、早期に死亡に至るという共通する特徴を有している。前述の疾患の進行を遅らせるに有効な療法は未だ知られていない。
【０００４】
筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）は大人における進行性筋衰弱を特徴とする。病理所見は、運動皮質、脳幹、脊髄における星状細胞増加（astrocytosis）、および、小膠細胞症（microgliosis）と共に、運動ニューロンの大量損失である。一般的に、発病は３０代から６０代の間で、通常６０代のほうが多い。ＡＬＳは均一に致命的で、通常５年以内に死亡する。ＡＬＳは、患者が非対称の四肢無力および疲労、上肢に限られた線維束性収縮、および／または、足における痙攣を感じ始めた時点で、診断される。
【０００５】
ＡＬＳにおいて、脊髄の前角および大脳皮質のニューロンと共に、脳幹の運動核の一部におけるそれらの相同体が影響を受ける。影響を受ける部類のニューロンはかなり特定のものに限られる。眼球の運動に必要な運動ニューロンおよび脊髄の括約筋における運動ニューロンは、前記症候性疾患が発病してからかなり進んだ時点においても、殆ど影響を受けることなく存在する。時折前記症候性疾患が発病してから直ぐに死亡に至るケースも見られるが、概して、横隔膜の衰弱が原因となった２次的な呼吸不全で死亡する。
【０００６】
ＡＬＳ症例のうち約１０％が家族性で、その他のＡＬＳの症例（即ち、約９０％）は散発性であると知られている。このような知見は、１０年前にロセン（Rosen）らがＳＯＤ１媒介疾患の機序を明かすために行なったＡＬＳ研究に関連して、家族性症例のサブセットにおけるＣｕ／Ｚｎスーパーオキサイドジスムターゼ（superoxide dismutase）1をコードする遺伝子におけるミスセンス突然変異の研究から得られたものである。現在に至るまで、ＳＯＤ１遺伝子の中から１１４個の異なる突然変異が観察されているが、それが家族性ＡＬＳ症例の０〜２０％の原因と思われる。
【０００７】
酵素であるスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）はスーパーオキサイドが酸素と過酸化水素とに不均化反応（dismutation）を触媒する。したがって、ＳＯＤは酸素に露出された殆どの細胞において重要な抗酸化防御機構である。ＳＯＤは動物、植物、又は、微生物のような生命体に広く分布されている。より詳細に、ＳＯＤ１は発現されたたんぱく質中に大量に偏在している。スーパーオキサイド負イオンから過酸化水素への転換を触媒するその機能に基づいて、異なるＳＯＤ1の突然変異体の毒性はフリーラジカル除去能力の低下に起因すると考えられる。しかしながら、異なるＳＯＤ１突然変異体は酵素活性における驚くほどの多様性を示す。突然変異ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ（位置９３でグリシンがアラニンに置き換えられている）、または、ＳＯＤ１  Ｇ３７Ｒを発現するマウスは、ＳＯＤ１活性レベルが高められたにもかかわらず、運動ニューロン疾患を発病させる。（Cleveland at al., 2001, Nat Rev Neurosc, 2, 806−819）。さらに、ＳＯＤ１ノックアウトマウス（knockout mouse）は運動ニューロ疾患は発病させない。（Reaume et al., 1996, Nat Genet, 13, 43-47）銅をＳＯＤ１触媒部位に送達するＳＯＤ１の銅シャペロン（ＣＣＳ）における遺伝子破壊（gene disruption）は突然変異ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて疾患の進行に対して何ら影響も及ぼさなかった。(Subramanian et al., 2002, Nat Neurosci, 5, 301-307)。最後に、触媒部位でＣｕと配位結合する４個のヒスチジン残基のうち２個を欠けている突然変異ＳＯＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウスの場合、ＳＯＤ１活性に顕著な減少があったのにもかかわらず、運動神経変性が現れた。（Wang et al., 2002, Neurobiol Dis, 10, 128-138）。総合すると、概して変異されたマウスを用いて行なわれたこれらの研究は、銅触媒部位を含めて、酵素活性と独立した新たな毒性特性を得るということで運動ニューロンの疾患を誘発することがわかった。
【０００８】
最も一般的な考え方は、突然変異ＳＯＤ１の毒性が、有毒なミスフォールドしたたんぱく質種またはその凝集体を形成する突然変異ＳＯＤ１の性向にかかわっているということである。さらに、野生型（ＷＴ）ＳＯＤ１とは違って、細胞突然変異ＳＯＤ１たんぱく質は、培養において小グリア細胞（microglia）を活性化させ、運動ニューロンの壊死をもたらし（Urushitani et al., 2006, Nat Neurosci, 9, 108-118）、そして、発病経路は、突然変異ＳＯＤ１と関連したＡＬＳにおける運動神経の壊死が必ずしも細胞自立的ではないという概念と一致する。（Boilee et al., 2006, Science, 312, 1389-1392）。興味深いのは、ＷＴ  ＳＯＤ１の酸化は、その凝集体形成を促がし得る現状であることである。（Furukawa, et al., 2006, PNAS USA, 103, 7148-7153）散発性ＡＬＳ患者における酸化的損傷（Ihara et al., 2005, Neurol Res, 27, 105-108）、および、細胞内に豊富に存在するＳＯＤ１たんぱく質に照らして、ＳＯＤ１分子が散発性ＡＬＳにおける酸化的損傷の標的を構成し得るということを推論できる。
【０００９】
ＡＬＳと関連したＳＯＤ１突然変異体の過剰発現に基づいた優れたマウスモデルの発展、および、家族性ＡＬＳ患者の２０％におけるスーパーオキサイドジスムターゼ１(ＳＯＤ１)の遺伝子突然変異の発見のお陰で、たんぱく質のミスフォールド現状および凝集体形成、プロテアソームの機能障害、炎症、反応性酸素種、興分毒性（excitotoxicity）、および、ミトコンドリアの機能障害を含めて、運動ニューロン壊死に至る様々な発病経路が明らかになった。これらの仮定に基づいて、ウイルス媒介分子送達および薬理学的なアプローチを含めて、ＡＬＳマウスにおいて治療のための種々のアプローチが試みられた。
【００１０】
米国特許第５，７６２，９２９号は経口または非経口投与により筋萎縮性側索硬化のような運動ニューロン疾患の症状を和らげることができる薬剤について報告している。米国特許第５，６８０，４８９号はグルタチオン誘導体または非−システイングルタチオン前駆体の有効量を患者に投与することで筋萎縮性側索硬化の症状を治療し、または、和らげる方法について報告している。米国特許第６，４２０，４２９号は筋萎縮性側索硬化のような疾患の治療に抗酸化剤を用いることについて報告している。米国特許第５，８４３，６４１号、５，８４９，２９０号、および、第６，７２３，８９３号は神経変性疾患、より具体的に、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）を治療するためにＳＯＤたんぱく質をコードするＤＮＡまたはＳＯＤたんぱく質の有効量を使用することについて報告している。これらの特許文献はまた、ＰＣＲ反応においてＳＯＤたんぱく質をコードするＤＮＡまたはその断片を用いて筋萎縮性側索硬化を診断する方法について開示している。
【００１１】
ＳＯＤ１が特定の転座配列を有していないサイトソルたんぱく質であることが知られているが、正常なＳＯＤ１および突然変異ＳＯＤ１両方が分泌経路を通じて分泌され得るという有力な証拠がある。（Urushitani, et al., 2006, Nature Neurosci, 9, 108-118）さらに、ウルシタニら（２００６）は、細胞外のＳＯＤ１突然変異体が、培養した運動ニューロンの壊死および小膠細胞症を引き起こすことができるということを明らかにしたが、それは分泌されたＳＯＤ１突然変異たんぱく質の毒性に基づいた発病機構を示唆するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療、予防、および／または、診断に有効な単クローン抗体のような新物質に対する強い必要性が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、ＳＯＤ１と関連した疾患の治療および／または診断用ツールを提供して、上記ニーズを満足させることにある。
【００１４】
本発明の目的は、動物に投与された際に、異常なスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ１）の病理効果を中和する活性を保有することを特徴とする異常なＳＯＤ１に特異的に結合する抗体を提供することにより達成される。
【００１５】
詳細には、本発明の単クローン抗体は、カナダの国際寄託機関に２００６年８月２９日付で寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０１，０２、およびお０３として寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生されたものであるのが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、本発明に係る１つ以上の抗体、および、医薬的に許容可能な担体を含有する動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療および／または予防用の組成物にも関する。
【００１７】
さらに、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／または予防するに本発明に係る抗体を１つ以上使用することや、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療および／または予防用の組成物を製造するに本発明に係る抗体を使用することに関する。
【００１８】
さらに、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を診断するに本発明に係る抗体を１つ以上使用することや、動物におけるＳＯＤ１と関連した疾患診断用の組成物を製造するに本発明に係る抗体を１つ以上使用することに関する。
【００１９】
さらに、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患診断用キットに関する。このキットは、本発明に係る抗体を１つ以上含む１つ以上の容器を有している。
【００２０】
さらに、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療または予防用のキットに関する。このキットは、本発明に係る抗体を１つ以上含む１つ以上の容器を有している。
【００２１】
さらに、本発明は、本発明に係る組成物の有効量を投与して、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／または予防する方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明にかかる単クローン抗体は、ＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療、予防、および／または、診断において非常に有効である。本発明のその他の目的や有利な効果は、添付した図面を参照して後述の発明を実施するための最良の形態を読んだならば明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を説明するために、本明細書においては、下記のように定義される用語を用いる。
【００２４】
本明細書に使用する場合に、“ＳＯＤ１異常と関連した疾患（a disease associated with SOD1 abnormalities）”は、好適には、神経変性疾患を示す。神経変性疾患は神経組織の漸進損失を特徴とする中枢神経系における疾病の一種である。神経変性疾患の典型的な例としては、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ハレルフォルデン・スパッツ病（ HYPERLINK "javascript:goWordLink(%22Hallervorden-Spatz%22)" Hallervorden-Spatz  HYPERLINK "javascript:goWordLink(%22disease%22)" disease）、オリーブ橋小脳萎縮（olivopontocerebellar atrophy）、複合神経系萎縮（multiple system atrophy）、進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）、拡散性レヴィー小体症（diffuse lewy body）、皮質歯状核黒質変性症（corticodentatonigral degeneration）、進行性家族性間代性筋痙攣性癲癇（myoclonic epilepsy）、線条体黒質変性（strionigral degeneration）、回転失調（torsion dystonia）、家族性振せん（familiar tremor）、ジル・ド・ラ・ツレット症候群（Gilles de la Tourette's syndrome）、および、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）などが挙げられる。
【００２５】
非ヒト（例えば、マウスの）抗体の“ヒト化”型は非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または、その断片（例えば、Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ'）２、または、抗体の抗原決定配列）である。殆どの場合、ヒト化抗体は、受容者（recepient）の補体決定部位（ＣＤＲ）の残基を、所定の特異性（specificity）、親和性(affinity)、および、容量(capacity)を有するマウス、ラット、又は、ラビットのような非ヒト種（供与者の抗体）のＣＤＲの残基で置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者の抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、それに相当する非ヒトの残基に置き換えたものである。さらに、ヒト化抗体は、移入性ＣＤＲまたはフレームワーク配列においても、受容者の抗体においてもない残基を含み得る。これらの改質は抗体の作用をよりよくし、又は、最大化するために行なわれる。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも一つ、典型的に２つの可変領域（variable domain）を含むが、ここで、ほぼ全てのＣＤＲ部位は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ部位に相当し、ほぼ全てのＦＲ部位はヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ部位に相当する。ヒト化抗体は選択的に免疫グロブリンの不変領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部を含む。詳細は、文献［Jones et al., Nature 321:522 (1986）; Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)］を参照すること。
【００２６】
野生型とは遺伝子又はたんぱく質の突然変異しない正常な、天然のものをいう。
【００２７】
異常、異常な：異常なＳＯＤ１たんぱく質とは、野生型ＳＯＤたんぱく質と実質的に同一または類似したアミノ酸配列を有するが、野生型ＳＯＤ１たんぱく質と異なるたんぱく質の構造を有し、かつ、病原性活性を有する異常なＳＯＤ１たんぱく質をいう。ここにいう“病原性活性”は前述の神経変異性疾患の発病に関与するものである。前記“異常／異常な”という用語は、突然変異、酸化型、または、凝集したＳＯＤたんぱく質をいう。
【００２８】
本明細書に使用する場合における“免疫性を与える・免疫化する（immunizing）”または“免疫付与・免疫化(immunization)”は、疾患の兆候無傷の（intact）宿主免疫系に依存しない。
【００２９】
本発明に使用する場合に、用語“動物”はヒト、家畜、酪農動物、動物園の動物、スポーツ用の動物、又は、ペット、例えば、イヌ、ウマ、および、ネコなどを含む任意の動物を含む。好適には、動物はヒトである。
【００３０】
本明細書に使用する場合に、用語“診断”とは、その徴候、症状、および、様々な診断の結果により特定の疾患を同定するプロセスをいう。診断は、被験者、好ましくは、動物、より好ましくは、ヒトから採取した生体標本に対して行なわれ得る。そのような生体標本は，血清又は血漿、全血、尿、痰、結腸流出物（colonnic effluent）、能脊髄液、リンパ液、骨髄、組織標本（例えば、外科生検または経口の塗布標本からの組織標本）、又は、異常なＳＯＤ１を含むと疑われるそのほかの任意の標本を含むが、それらに限られるものではない。診断に用いられる標本は血漿又は血清であるのが好ましい。
【００３１】
本明細書に使用される場合、用語“単クローン抗体”とは、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体（即ち、前記集団を成す個別の抗体は、少量に存在し得る自然発生突然変異を除いて同一である）をいう。単クローン抗体は単一の抗原部位に対する高度の特異性を有している。さらに、異なる数種の決定基（エピトープ）に対して特異性を有する異なる数種の抗体を有する従来の（多クローン性の）抗体製剤に比べると、各々の単クローン抗体は、抗原上の1つの決定基に対する特異性を有する。それらの特異性に加えて、単クローン抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、その他の免疫グロブリンに汚染されない、といった、メリットを有する。
【００３２】
１．本発明に係る抗体および組成物
本発明者は、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）のような神経変性疾患を引き起こす推定薬剤（putative agent）であるスーパーオキサイドジスムターゼポリペプチドの突然変異体で動物を免疫化した場合、その疾患の治療および／または予防効果が得られることを発見した。
【００３３】
また、本発明者は、スーパーオキサイドジスムターゼポリペプチドの突然変異体に対する抗体で受動免疫を行なった場合、前記疾患の治療および／又は予防効果が得られることを初めて確認した。
【００３４】
それにより、本発明は、異常なスーパーオキサイドジスムターゼ1（ＳＯＤ１）に特異的に結合する抗体に関するものである。異常なスーパーオキサイドジムターゼ１とは、病原性活性を保有し、そして、突然変異した、酸化した、凝集体形成した、または、変形された構造を有し得るスーパーオキサイドジムターゼ1を意味する。
【００３５】
本発明の抗体は、ヒトのような動物に投与されえる際に、異常なＳＯＤ１に特異的に結合し、その病理活性を中和するものである。本発明の抗体は後述の実施例２に記載されているように作製される。
【００３６】
本発明の抗体に関連して、用語“に特異的に結合する”とは、ＳＯＤ１ポリペプチドの1つ以上のエピトープに比較的高度な親和性を有して結合するが、本発明に定義されたＳＯＤ１ポリペプチド以外の分子を実質的に認識せず、かつ、それに結合しない抗体を意味する。本明細書に使用する場合、用語“比較的高度な親和性”とは、関心エピトープ（epitope of interest）と抗体間の結合親和性（binding affinity）が、少なくとも１０6Ｍ-1以上、好ましくは１０7Ｍ-1以上、より好ましくは、１０8Ｍ-1〜１０10Ｍ-1を意味する。そのような親和性の測定は、当業者に良く知られている標準競合結合の免疫学的検定法の条件下で行なわれるのが好ましい。
【００３７】
本発明の好ましい実施例においては、抗体は単クローン抗体である。本発明の単クローン抗体は後述の実施例１に記載したように作製することができる。
【００３８】
本発明はまた、カナダの国際寄託機関に２００６年８月２９日付で寄託した寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０１，ＡＤＩ−２９０８０６−０２、およびＡＤＩ−２９０８０６−０３のハイブリドーマ細胞株に関する。最も好ましい実施例において、本発明の単クローン抗体は、それぞれＢ１Ｇ９，Ｃ４Ｆ６，および、Ｄ３Ｈ５と名付けられた前記寄託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０１，ＡＤＩ−２９０８０６−０２、およびＡＤＩ−２９０８０６−０３のハイブリドーマ細胞株から産生された単クローン抗体である。図３および表３から明らかなように、（ＥＬＩＳＡ分析結果から）、単クローン抗体Ｂ１Ｇ９が突然変異ＳＯＤ１に対しては特異的な親和性を有するが、正常なまたは野生型ＳＯＤ１に対しては親和性を有さないし；Ｄ４Ｆ６が突然変異体ＳＯＤ１に非常に高いレベルの親和性を有し；そして、Ｄ３Ｈ５がＳＯＤ１たんぱく質の両方のタイプに対して親和性を有することがわかる。特異的な免疫組織化学検定法において、Ｃ４Ｆ６は、突然変異ＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウスＧ９３Ａから採取した組織（実施例ＡおよびＢに示したような脊髄および血液標本）でＳＯＤ１種を特異的に検出することができた。したがって、本発明に係る単クローン抗体、より具体的には、Ｃ４Ｆ６，Ｄ３Ｈ５，および、Ｂ１Ｇ９は、異常なＳＯＤ１、最も具体的には、突然変異ＳＯＤ１と強く結合して、受動免疫に有効であると評価することができる。
【００３９】
前述のおとり、本発明に係る抗体は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／又は予防するための組成物を製造するに用いられる。したがって、本発明はまた、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／または予防するために供される組成物に関する。この組成物は、抗‐異常ＳＯＤ１抗体、および、医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書に使用する場合、用語“医薬的に許容可能な担体”とは、宿主に副作用を起こすことなく宿主に投与され得る本発明に係る組成物を含有させるためのべジクル（vesicle）を意味する。適当な医薬的に許容可能な担体は当業者に良く知られているが、例えば、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、又は、緩衝液などが挙げられる。担体（carrier）は賦形剤、安定剤（例えば、糖およびアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度増強剤、色素などのような補助剤を含み得る。
【００４０】
本発明に係る組成物に用いられる抗体は、好ましくは、異常なＳＯＤ１たんぱく質、より好ましくは、突然変異ＳＯＤ１たんぱく質に結合する。本発明に係る組成物は、ヒトのような動物に投与された場合、該動物に、異常なＳＯＤ１たんぱく質、より好ましくは、突然変異ＳＯＤ１たんぱく質に対する治療および／または予防効果を与える。本発明に係る好ましい具体例によれば、本発明に係る組成物に用いられる抗体は、後述の実施例２の記載内容にしたがって作製された多クローン抗体、または、後述の実施例１の記載内容にしたがって作製された単クローン抗体であり得る。最も好ましい具体例によれば、単クローン抗体はＣ４Ｆ６，Ｄ３Ｈ５，および、Ｂ１Ｇ９である。
【００４１】
２．本発明に係る抗体および組成物の使用（用途）
別の具体例によれば、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療および／または予防に、１つ以上の抗‐異常ＳＯＤ１抗体を使用することを提供する。更なる別の具体例によれば、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患を治療および／または予防するための組成物の製造において１つ以上の抗‐異常ＳＯＤ１抗体を使用する方法を提供する。
【００４２】
好ましい具体例によれば、１つ以上の抗‐異常ＳＯＤ１抗体は多クローン抗体または単クローン抗体であり、より好ましくは、単クローン抗体である。本発明に係る最も好ましい具体例において、抗体は、単クローン抗体であり、さらに好ましくは、Ｃ４Ｆ６，Ｄ３Ｈ５，および／または、Ｂ１Ｇ９である。
【００４３】
本発明に係る組成物に存在する抗‐ＳＯＤ抗体の量は治療的に有効な量（therapeutically effective amount）であるのが好ましい。本発明に係る組成物に存在する抗‐ＳＯＤ抗体の治療的に有効な量は、その組成物を投与した宿主に著しく否定的な効果を引き起こすこことなく、その生物学的な機能を発揮するに必要とされる量を意味する。使用又は投与されるべき本発明に係る組成物に存在する抗‐ＳＯＤ１抗体の正確な量は、治療すべき病態、治療すべき動物の年齢およびサイズ、投与形態のようなファクタ、並びに、組成物に存在する他の成分などによって異なってくる。本発明に係る組成物は液体溶液又は懸濁液の形態で；錠剤又はカプセルのような経口投与形態で；散剤、点鼻液、または、エアロソールのような鼻腔内投与形態で製造され得る。
【００４４】
本発明に係る抗体又は組成物は、ヒトのような動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の治療又は予防に使用され得る。
【００４５】
本明細書に使用する場合、用語“予防する”、および、“予防用”とは、ＳＯＤ１異常と関連した疾患を阻害又は遅延させるプロセスを意味する。
【００４６】
本明細書に使用する場合、用語“治療する”、および、“治療用”とは、所定の薬理学的および／または生理学的な効果が得られることを意味する。このような効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという観点から予防的なものであってもよく、および／または、疾患および／または、前記疾患に起因した副作用に対する完全な又は部分的な治療という観点から治療的なものであっても良い。したがって、次のようなものを含めて動物における疾患に対する任意の治療に及ぶ：
（ａ）疾患にかかっていると診断されたものではないがその疾患にかかりやすい被験者に前記疾患が発病しないように予防すること；
（ｂ）前記疾患を阻害すること（即ち、前記病気の発病を抑制すること）；および
（ｃ）前記疾患の症状を和らげること（即ち、前記病気の退行を促すこと）
【００４７】
ここで、用語“治療”とは、本発明において、ＳＯＤ１異常と関連した疾患の症状が減少され、または、完全に除去されることを意味する。
【００４８】
治療が必要とされる個体には、既に前記疾患を患っている個体や、前記疾患にかかりやすい個体、または、前記疾患の予防が必要とされる個体が含まれる。
【００４９】
更なる別の具体例によれば、本発明は、動物においてＳＯＤ１異常と関連した疾患の診断のために１つ以上の抗‐異常ＳＯＤ１抗体を使用することや、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の診断のために供される組成物の製造において1つ以上の抗−異常ＳＯＤ１抗体を使用することを提供する。好ましい具体例において、前記診断のために用いられる抗体は、単クローン抗体であり、より好ましくは、Ｃ４Ｆ６，Ｄ３Ｈ５，および及び／または、Ｂ１Ｇ９である。
【００５０】
３．本発明のキット
更なる別の具体例によれば、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患診断用キットを提供する。
【００５１】
本発明に係るキットには、診断テストを遂行するに必要とされる１つ以上の様々な構成要素をそれぞれ含んでいるパッケージを含む。前記構成要素は、化合物、試薬、容器、および／又は、装置であってよい。一般的に、薬剤は濃縮された形態である。例えば、キット内部の容器は異常なＳＯＤ１に特異的に結合する単クローン抗体を含有し得る。本発明に係るキットは、生物標本（又はその他の種の標本）における異常なＳＯＤ１たんぱく質を検出および／または定量するに有用であると解される。１つ以上の別の容器は、テスト（検定法ともいう）に用いられるべき構成要素、例えば、試薬又は緩衝液を含んでも良い。そのようなキットはまた、抗体結合を直接又は間接的に検出することができるレポーター（reporter）グループを含む前述の検出試薬を含んでも良い。
【００５２】
前述のとおり、抗‐異常ＳＯＤ１抗体は単クローン抗体であるのが好ましい。より好ましくは、抗‐異常ＳＯＤ１抗体はＢ１Ｇ９およびＣ４Ｆ６またはＤ３Ｈ５である。本発明の単クローン抗体は本発明に係るキットにコントロールとして用いられ得る。
【００５３】
更なる別の具体例において、本発明は、動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患治療又は予防用のキットを提供する。
【００５４】
抗‐異常ＳＯＤ１抗体は、ヒトのような動物に投与された場合、異常なスーパーオキサイドジムターゼ１（ＳＯＤ１）に特異的に結合して、異常なＳＯＤ１の病理効果を中和することのできる抗体と解される。本発明の好ましい具体例において、治療又は予防用キットの抗体は単クローン抗体である。最も好ましくは、抗体はＳ４Ｆ６，Ｄ３Ｈ５，および、Ｂ１Ｇ９である。
【００５５】
４．治療方法
更なる具体例において、本発明は、ヒトのような動物におけるＳＯＤ１異常と関連した疾患の予防および／または治療方法を提供する。この方法は、治療的に有効な量の組成物を投与するステップを含む。
【００５６】
本発明に係る組成物は様々な投与経路を通じて動物に投与され得る。たとえば、前記組成物は無菌注射剤（sterile injectable preparation）、例えば、無菌注射用水溶液又は無菌注射用油性懸濁液の形態で投与され得る。これらの懸濁液は適当な分散剤又は湿潤剤、および懸濁化剤を用いて当業者に知られている技法で製造され得る。無菌注射剤は非毒性経口用賦形剤無菌注射用眼窩内に（intraorbital）、眼内に、脳室内に、筋肉内に、脊髄内に、腹腔内に、鼻腔内に、エアロゾールで、注入などにより投与可能である。適当な容量は、組成物における各々構成成分の量、所期の効果（長期又は短期）、投与経路、治療すべき動物の体重および年齢のようなファクタなどに基づいて異なってくる。当業者に良く知られているその他の方法も本発明の組成物を投与するために用いられる。
【００５７】
本発明は、次の実施例に基づいてよりわかりやすく説明される。これらの実施例は、本発明の適用範囲を例示したものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものと解されてはならない。本発明の範囲および本質を逸脱しない範囲でこれらに対する変更または改質も可能である。本明細書に記載されたものに類似しまたは同等と評価できる方法および材料は本発明をテストするために用いられるが、好ましい方法および材料は以下に示したものである。
【実施例１】
【００５８】
突然変異体ＳＯＤ１に対する本発明の好ましい具体例に係る単クローン抗体の作製
Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１に対するマウスの単クローン抗体を作製した。ヒトＳＯＤ１突然変異体に対する単クローン抗体を作製するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをｒｅｃ  Ｇ９３Ａたんぱく質（即ち、組み換えＧ９３Ａたんぱく質ともいう）を用いて免疫を与えた（即ち、免疫化した）。その後、脾細胞（splenocyte）由来のハイブリドーマを作製した。作製された６個のクローンのうち２個は、ＥＬＩＳＡ検定法を行なった結果、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１に対する特異的な免疫反応性を示した。Ｃ４Ｆ６と名付けられた１個のクローンは、Ｇ９３Ａ，Ｇ３７Ｒ、および、Ｇ８５Ｒを含んだ突然変異ＳＯＤ１に対して選択的な反応性を奏したが、ＷＴ  ＳＯＤ１に対しては反応性が悪かった。
【実施例２】
【００５９】
抗‐ｈＳＯＤ１抗体の脳室内注入（intraventricular infusion）により行なわれる受動免疫
８匹の３ヶ月齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウスに対して、組み換えヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質で免疫化し、その血清を親和性精製（affinity purification）し、生理食塩水に対すて透析を行なった。浸透圧ミニポンプ（モデル２００４、アルゼット社製）と接続された脳注入カニューレ（cannula）を通じて前記抗体を脳室（ventricle）へ注入した。前記浸透圧ミニポンプの速度は０．２５μｌ／時間で、マウスに対する処理を２８日間続けた。（１．８μｇ／１日）受動免疫の効果は体重、後肢反射から得た反射点数（reflex score from hindlimb reflex）、および、寿命によって評価した。突然変異ＳＯＤ１に対するマウス抗血清を得るために、８匹の３ヶ月齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウスを組み換えヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質で免疫化し、その血清を親和性精製し、そして、生理食塩水に対すて透析を行なった。３回目の免疫化が終わってから２週後、全血を採取し、室温で、１２，０００ｇで１０分間遠心分離を行なって、血清を得た。この血清を、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質と予め結合させたアフィニティカラム(アミノーリンクキット、ピアース、ロックフォード、ＩＬ）を用いて親和性精製を行なった。抗体を０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に対して透析して、使用するまでに−８０℃に保管した。抗血清の特異性および滴定（titration）がウエスタンブロット法により測定した。コントロールに対して、本発明者は、非処理のＣ５７Ｂｌ／６マウスから得たマウス免疫グロブリン又は生理食塩水を注入した。浸透圧ミニポンプ（モデル２００４、アルゼット社製）を２００μｌの精製した抗体、又は、コントロールとしての生理食塩水で満たして、長さ２．５ｃｍの塩化ポリビニルカテーテルを用いて脳注入用カニューラ（３０ゲージ、高さ３．０ｍｍ、ＣＡ，パルロアルトに所在するアルゼット社製）につないだ。８５日齢のトランスジェニックマウスＧ９３Ａ  ＳＯＤ１をキシラジン‐ケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）で麻酔した。無菌脳注入用カニューラを右側の脳室の定位に移植した。移植後、注入用カニューラを歯科用セメントで固定した。浸透圧ミニポンプを皮膚の下に移植した。ポンプの注入速度は０．２５μｌ／時間で、マウスに対する処理を２８日間続けた。（１．８μｇ／日）脳室内に注入された抗体が腰部の脊髄内に浸透したことを証明するために、浸透圧ミニポンプで注入する前に、市販のラビット多クローン性抗ヒトＳＯＤ１抗体（ストレスゲン社製）またはラビットコントロール免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ピアース社製）と共役させた。ポンプを導入してから１６日後、免疫蛍光検定法およびウエスタンブロット法を行なうためにマウスを犠牲にして、ポンプ内に残存していた抗体の活性を検定・測定した。
【００６０】
ロッタロッドテスト（Rotarod test）がポンプ損傷をもたらす卒倒(fall-down)の危険性を示していたため、臨床効果を評価するために体重および後肢反射の測定結果を用いた。マウスの尻尾を引っ張ったときの拡張性および後肢の反射を評価した。点数３は正常な後肢反射と完全な拡張を示す。点数２は正常な後肢反射と中等度の拡張を示す。点数１は貧弱した後肢反射と拡張性を示すが、点数０は後肢の動きがないことを示す。前記採点は、動物の試験者がその処理について何ら情報も得られない盲検試験により行なわれた。
【実施例３】
【００６１】
ＡＬＳのマウスモデルにおける突然変異スーパーオキサイドジスムターゼで免疫化した場合の治療効果
ＡＬＳと関連したスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ１）突然変異体、および、細胞外の突然変異ＳＯＤ１の神経毒性に対する従来の分泌経路の存在に関する有力な証拠がある。これにより、本発明者は、ＡＬＳのマウスモデルにおける神経組織で細胞外ＳＯＤ１突然変異体の心配を減らすために、免疫源として細菌を精製した組み換えＳＯＤ１突然変異たんぱく質を用いて、免疫化プロトコールを検定するに至った。アジュバント−ＳＯＤ１突然変異体を反復して注射し、６ヶ月齢において症状が現れる前に最後に追加免疫を実施したｈＳＯＤ１G37Rマウスのワクチン接種は，疾患の発病を遅延させ、４週以上寿命を延ばせるに有効であった。精髄標本に対する顕微鏡検査の結果、生理食塩水‐アジュバントを注射したものに比べて、免疫化したｈＳＯＤ１G37Rマウスにおいてより高いレベルの小グリア活性化が見られ、そして、疾患の末期において運動ニューロンの生存率が高かった。さらに、浸透圧ミニポンプを用いて行なった、精製した抗‐ｈＳＯＤ１抗体の脳室内注入を通じて行なわれた受動免疫により、疾患の症状を和らげ、そして、ｈＳＯＤ１G93Aマウスの寿命を延ばすことができた。このような免疫化は、ＳＯＤ１突然変異化により誘発された家族性ＡＬＳの症例に対する治療にも適用可能なアプローチであると判断された。
【００６２】
方法
トランスジェニックマウス
マウスの内因性ＳＯＤ１に比べてヒトＳＯＤ１たんぱく質を５倍までに過剰発現するＧ３７Ｒ突然変異ＳＯＤ１（株２９）を保有するトランスジェニックマウスを、ディ・クリブランド博士（サンディエゴ、カリフォルニア大学）からもらった。突然変異Ｇ３８Ａ  ＳＯＤ１を保有したトランスジェニックマウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］ｄｌ  Ｇｕｒ）はジャックソン研究所から購入した。マウスはＣ５７Ｂｌ／６バックグラウンドマウスにおいてヘテロ接合性（heterozygous）を維持していた。
【００６３】
免疫化プロトコールおよびマウスの分析
前述の通り、ヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ１組み換えたんぱく質を作製し、それを細菌から精製した。（Urushitani, et al., 2004 J. Neurochem, 90, 231-233）この研究は、Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウス（ワクチン接種したマウスおよびコントロールマウスに対してそれぞれＮ＝８および７）、または、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１マウス（ワクチン接種したマウスおよびコントロールマウスに対してそれぞれＮ＝１２および８）の同腹子（littermate）を用いて遂行した。Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスを処理するために、８匹のＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１  トランスジェニックマウス（メス＝５、オス＝３）を組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１でワクチン接種した。一方で、７匹のＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウス（メス＝４、オス＝３）には生理食塩水‐アジュバントを注射した。４匹の非トランスジィニック同腹子を組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質で処理して副反応および血清適定を評価した。２ヶ月齢で免疫化を始め、３週ごとに２回注射し、６ヶ月齢になったら最後の追加免疫を実施した。１２匹のＧ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスを組み換えＧ９３Ａでワクチン接種し、そして、８匹のＧ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスには生理食塩水‐アジュバントを注射した。Ｒｉｂｉアジュバント（シグマ社製）を用いて免疫化を実施した。１つのバイアルは、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質を含むか、あるいは、含んでない２ｍｌの無菌生理食塩水から再構成された。強力なボルテックスにより乳化した後、２００μｌのアジュバント‐抗体の溶液（２箇所に対してたんぱく質５０μｇ）を皮下注射した。終末点は、マウスが側臥位（lateral position）から３０秒以内にもとに戻れないときの時間として定義した。生存データはカプラン・マイヤースパン（span）テストおよびログ‐ランク（log-rank）テストにしたがって分析した。平均発病又は生存の統計的有意性はステューデントテストによって検定した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡ検定法
脊髄組織または抗血清のヒトＳＯＤ１に対する抗体の力価（titer）はＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルプレートを１μｇ／ｍｌの組み換えＳＯＤ１たんぱく質（ＷＴ，Ｇ８５Ｒ、または、Ｇ９３Ａ）で被覆した。室温にて（ＰＢＳ中の）ＢＳＡの５％溶液中で２時間遮断させ、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で連続的に希釈させたマウス血清を前記各々のウェルに加え、前記プレートを室温で１時間インキュベートした。基材とし2,2'-アジノ−ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、および、ペルオキシダーゼと共役した抗‐マウス免疫グロブリンを用いて検出を行なった。ＥＬＩＳＡ読み取り装置（カリフォルニア州、サニバルに所在するモレキュウラーディバイス社製）を用いて４０５ｎｍ波長で吸光度値を読み取った。
【００６５】
ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット検定を行なうために無傷の脊髄溶解物（lysate）を用意して、ワクチン接種したマウスの血清を滴定し、または、ワクチン接種後におけるＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１の量を測定した。Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤ１  トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック同腹子から得られた完全な組織の溶解物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ，１０％グリセロール、１％トリトンＸ１００を含む、５倍体積のＴＮＧ−Ｔ緩衝液中で均質化によって製造した。テフロン（登録商標）（Teflon）均質化装置で２０ストロック（stroke）を行った後、組織懸濁液を４℃にて１０００ｘｇで１０分間遠心分離し、得られた上清を、２−メルカプトエタノールおよびＳＤＳを含むサンプリング緩衝液（sampling buffer）中で加熱しながら変性させた。
【００６６】
ワクチン接種したマウスから得た抗血清を滴定するために、ワクチン接種したマウス、又は、生理食塩水を注射したコントロールマウスから得た抗血清の１０００倍希釈液、２５ｍｇの溶解物を用いて、ウエスタンブロット検定法を行なった。コントロールとして、市販の抗‐ヒトＳＯＤ１（ＳＯＤ−１００、ストレスゲン社製）、および、抗−アクチン（actin）抗体（ケミコン社製）を用いて膜を再びブロットした。ワクチン接種したマウスから得た脊髄に含まれたＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１たんぱく質の量を分析するために、各々のマウスから得た２つの異なる量のたんぱく質（５および１０μｇ／レーン）を、本発明者が作製した単クローンマウス抗‐ＳＯＤ１抗体、抗‐アクチン抗体、または、ＳＯＤ１００抗体を用いて、ウエスタンブロット検定法により分析した。（実施例1を参照）化学蛍光法、および、ペルオキシダーぜと共役した免疫グロブリンを用いて、前記ブロットを検出した。ウエスタンバンド（Western band）をスキャンし、ソフトウェアシオンイメージ（マリーランド州、フレデリックに所在するシオン社製）を用いる密度測定法により分析した。
【００６７】
組織化学的分析
マウスに、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）でかん流させ、固定させ、そして、凍結防止剤中にインキュベートした。次のような標準プロトコールに基づいて組織化学的分析を実施した。２５μｍの脊髄分画（section）を一次抗体（抗‐Ｍａｃ２抗体に対して１：８００）で４℃にて一晩インキュベートした。免疫蛍光検定実験において、前記分画を、蛍光染料（アレクサ４８８、モレキュラープローブ社製）と共役した二次抗体で室温にて１時間インキュべーとした。脊髄組織における内因性免疫グロブリンＧを検出するために、アレクサ５９４と共役した抗‐マウスＩｇＧを、アレクサ４８８と共役した別の二次抗体と共にインキュベートした。この分画を、ＰＭＴ，得る（Ｇａｉｎ）、オフセット（ｏｆｆｓｅｔ）、Ｃ．Ａ．、および、ＨｅＮｅ−Ｇを含めて、同一のソフトウェア設定の条件下で共焦点レーザ顕微鏡（東京所在のオリンプス社製）を用いて観察した。ベックタステインＡＢＣキット（ＵＳＡのカルフォルニア、ブルリンカームに所在するベクターラボラトリーズ社製）、および、３，３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ；シグマ社製）を用いてアビジン-ビオチン複合体（ＡＢＣ）法（avidin-biotinimmunoperosidase complex method）により一次抗体を可視化した。脊髄分画における運動ニューロンの数を数えて、トルイジンブルー（ニッスル染色法）を用いて染色した各々のマウス（各々のグループに対してｎ＝４）の５枚のスライスから平均を求めた。
【００６８】
結果
免疫化はＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスにおいて疾患の発病および死亡を遅延させる
本発明者は突然変異ＳＯＤ１G37R（株４２）を中等度（内因性ＳＯＤ１のレベルの４倍まで）で過剰発現すると報告されたマウスモデルにおけるワクチン接種アプローチを検定した（２４）。免疫化に用いられる抗体として、本発明者はＥ．ｃｏｌｉから精製された、金属を含んでない(metal-free)組み換えヒトＳＯＤ１突然変異体（ａｐｏ−Ｇ９３Ａ）を用いたが、それは、出願人の研究室に利用可能であったことや、そのミスフォールド特性（misfolded nature）に起因したものである。アジュバント中に含まれた５０μｇの組み換えＳＯＤ１突然変異たんぱく質、または、生理食塩水を用いたＳＯＤ１G37Rマウスの免疫化を２ヶ月齢でスタートした後、３週ごとに２回の皮下注射を行なった。抗原‐アジュバント、または、生理食塩水‐アジュバントの最後の注射は６ヶ月齢で行なわれた。（図１ａ）
【００６９】
ＳＯＤ１G37Rマウスの運動性（motor performance）はロッタロッドテストによって評価された。図１Ｂに示したように、生理食塩水‐アジュバントを注射したＡＬＳマウスにおいて５０週で運動性の急激な減少が見られたが、ＳＯＤ１突然変異体でワクチン接種したＡＬＳマウスにおいては前記運動不全が最長３週間遅延された。（図１ｂ）運動性の３０％の損失として定義される疾患の発病は、生理食塩水‐アジュバントを注射したＡＬＳマウスにおいて平均５０．２±０．４週（年齢）であるに対して、ワクチン接種したＡＬＳマウスにおいては平均５３．１±０．２週（年齢）であった。（図１ｃ、ｐ＝０．００１１）ＡＬＳマウスの寿命に対するｈＳＯＤ１免疫化の効果はまた、生理食塩水−アジュバントを注射したコントロールマウスの場合に平均５６．１２±０．７４週であったのに対して、平均６０．４±０．４週であり、その効果は驚くべきものであった。（図１ｄ、ｐ＜０．０００１）したがって、免疫化アプローチはＡＬＳマウスの寿命を最大４．３週までに延ばした。
【００７０】
免疫化したＡＬＳマウスにおける運動ニューロンの損失および高度の小膠細胞症(microgliosis)における減衰
突然変異ＳＯＤ１が神経保護効果を奏するか否かを調べるために、本発明者は、疾患の末期にあるＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスの脊髄分画におけるニッスル染色された運動ニューロンの数を数えた。（図１ｅ）生理食塩水−アジュバントで処理したＡＬＳマウスにおける残存する脊髄運動ニューロンの数は、非トランスジェニック同腹子における運動ニューロンの数の２４．１±２．０パーセントに相当する。比較結果、突然変異ＳＯＤ１でワクチン接種した末期のＡＬＳマウスの場合、より長く生存する運動ニューロンが見られ、残存した運動ニューロンの数は４１.９±３．１パーセントに相当した。抗‐ＮｅｕＮ抗体を用いた免疫組織化学検定法を実施した結果、生理食塩水‐アジュバントで処理したコントロールに比べてワクチン接種したＡＬＳマウスの脊髄で、末期において、より多くの運動ニューロンが生存していることがわかった。（図１ｆ）
【００７１】
免疫化が高度な神経炎症反応を伴うかどうかを調べるために、脊髄分画を、Ｍａｃ２（活性化された小グリアのマーカ）に対するラットの単クローン抗体を用いて免疫染色を行なった。顕微鏡観察結果、生理食塩水‐アジュバントを注射したＡＬＳマウスに比べてＳＯＤ１突然変異で免疫化したＡＬＳマウスにおいて高度の小グリア活性化が見られた。（図２ａ）アレクサ４８８と共役した抗−ラットＩｇＧ抗体が現れる前の抗−Ｍａｃ２抗体の免疫蛍光信号は、生理食塩水−アジュバントを注射したマウスに比べてワクチン接種したＡＬＳマウスから得た脊髄標本においてより高く見られた。（図２ｂ−ｅ）本発明者はまた、赤色の蛍光（アレクサ５９４）と共役した抗‐マウスＩｇＧを用いて、脊髄標本中の内因性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の免疫蛍光信号を検査した。内因性ＩｇＧに対する免疫検出信号のレベルはワクチン接種したマウスから得た標本においてより高かった。（図２ｂ−ｅ、中間）
【００７２】
Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤマウスの寿命と抗体力価との相関性
ＡＬＳマウスの血清における抗体の力価を、疾患の末期を迎えた４ヶ月齢のＡＬＳマウスに対して、抗原として組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。（表１）初期に免疫化したグループの場合該動物が６ヶ月齢で最後の抗原注射を受けたにもかかわらず、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１に対する抗体の力価は、疾患の末期にいたるまでに、ワクチン接種したマウスのほうが常に高かった。（図３ａ，表１）Ｇ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１に対してより低い力価を有する抗体は、組み換えＧ９３Ａを注射した非トランスジェニック同腹子マウスで観察された。（図３ａ、表１）さらに、図３ｂの散布図によれば、ＡＬＳマウスの寿命と４ヶ月齢の血清における抗体の力価との直接的な関連性が見られた。（スピアマンの順位相関係数）これは、ＳＯＤ１突然変異体に対する抗体の治療効果と合致するものであった。
【００７３】
免疫ブロット法は実施して、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質突然変異体で免疫したマウスから得た抗血清がＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１突然変異たんぱく質を認識することができるかどうかを調べた。生理食塩水‐アジュバントを注射したマウスとは違って、免疫化したマウスは、ＡＬＳマウスの脊髄標本から得たＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１たんぱく質に対する免疫ブロット（immunoblot）上に強い信号（signal）を産出する抗血清を産生することができた。（図３ｃ）さらに、本発明者は、組み換えＧ９３Ａでワクチン接種したＡＬマウスから得た抗血清が、ＷＴ  ＳＯＤ１よりもＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１に対してより高い反応性を示すことを発見した。（図３ｄ、表２）逆に、組み換えＷＴ  ＳＯＤ１たんぱく質（ｒｅｃ  ＷＴ）でワクチン接種したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスから得た抗血清はＳＯＤ１の突然変異型に対して低い力価を示した。（図３ｄ、表２）これらのデータは、ＳＯＤ１の突然変異型により産生された抗体がＳＯＤ１のミスフォルドした形態を優先的に認識するということを示している。
【００７４】
抗‐ＳＯＤ１抗体の存在に対して、ワクチン接種したマウスの脊髄溶解物を分析した。
組み換えＧ９３Ａ−アジュバントまたは生理食塩水‐アジュバントで免疫化したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１を、その抗体力価が最も高い７週齢で犠牲にして、その後、脊髄溶解物をサイトゾル、重細胞膜、および軽細胞膜の分画にそれぞれ分けた。そのＥＬＩＳＡ分析結果、組み換えＧ９３Ａ−アジュバントでワクチン接種したマウスから得た脊髄の、１％トリトンＸ１００に可溶性の細胞膜分画において、および、界面活性剤（detergent）を含まない緩衝液に可溶性の細胞膜分画において、組み換え‐Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１に対する抗体の力価が上昇したことがわかった。
【００７５】
ワクチン接種したマウスの脊髄におけるＳＯＤ１種のクリアランスの証拠
Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤ１種のクリアランス（clearance）における免疫化の効果を検査するために、本発明者らにより作製された突然変異ＳＯＤ１種に対して特異性を有する本発明における好ましい単クローン抗体（Ｃ４Ｆ６）、または、ラビットの多クローン抗‐ヒトＳＯＤ１抗体（ＳＯＤ１００）を用いるウエスタンブロット法を実施して、脊髄の全溶解物（total spinal cord lysate）を分析した。Ｃ４Ｆ６単クローン抗体は、組み換えＧ９３Ａたんぱく質でマウスを免疫化した後、前述の標準プロトコールに従って作製した。（実施例１参照）この多クローン抗体は、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１を認識するが、Ｇ３７Ａ  ＳＯＤ１およびＧ８５Ｒを含むその他の突然変異ＳＯＤ１をより低いレベルで認識する。（図４ａ，ｂ）しかしながら、Ｃ４Ｆ６はＷＴ  ＳＯＤ１に対して非常に弱い反応性を示す。（図４ａ）Ｃ４Ｆ６単クローン抗体を用いて脊髄溶解物に対してウエスタンブロット検定法を実施した結果、アジュバント‐生理食塩水のコントロールマウスに比べて、ワクチン接種したマウスにおいてより低量の突然変異ＳＯＤ１種が見られた。（図４ｃ、ｄ）他方で、多クローン性の抗‐ヒトＳＯＤ１（ＳＯＤ１００）抗体を用いた場合、ワクチン接種したグループとコントロールグルップとの間に、ＳＯＤ１のレベルにおける差は見られなかった。（図４ｃ）これらの結果は、免疫化が、突然変異ＳＯＤ１のサブセット（推定するには、Ｃ４Ｆ６単クローンで検出可能なミスフォールドした種）の含量（burden）を減少させることで、Ｇ３７Ｒマウスの疾患を改善するということを示唆する。
【００７６】
突然変異ＳＯＤ１を過度な（extreme）レベルで発現するＡＬＳマウスにおけるワクチン接種の限定された効果
前述の結果は、ＡＬＳの発病が遅延されるモデル、即ち、突然変異ＳＯＤ１を５倍までに中等度で過剰発現するＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウス株を利用した能動免疫の有利な効果を示している。突然変異ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを４０倍までに過剰発現し、たんぱく質を１７倍までに過剰発現する、広く使われているＧ９３Ａ  ＳＯＤ１マウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ１］１Ｇｕｒ）でワクチン接種した場合の効果についてもテストを行なった。その結果、これらのマウスにおいて、早くも９０日でＡＬＳの症状が現れ、その後、疾患が進んで、１３０日で死亡に至った。
【００７７】
抗原として組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１を用いて前述のプロトコールに従い能動免疫を実施した。しかしながら、このワクチン接種というアプローチによっては、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスにおける疾患の臨床的な発病およびその寿命を有意に変化させることができなかった。（図５ａ，ｂ）ＡＬＳマウスモデルにおけるワクチン接種というアプローチの失敗に対して最も妥当と考えられる原因は、血液脳関門を通った抗‐ＳＯＤ１抗体の量が、神経組織における突然変異ＳＯＤ１たんぱく質の前記極端的なレベルを中和するに不十分であるとのことである。
【００７８】
その代案として、浸透圧ミニポンプ（アルゼットポンプ、デュレット）を用いて抗体を直接脳室内に注入そて、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスにおける受動免疫化法についてテストした。受動免疫用の抗血清は、前述の通り、組み換えヒトＳＯＤ１突然変異体でワクチン接種したＣ５７Ｂｌ／６マウスから得た。生理食塩水に対する親和性精製および透析を行ない（図５ｃ）、その後、抗体の溶液またはコントロール生理食塩水を、発症前の（presymptomatic）Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１マウス（８３日齢、抗‐ＳＯＤ１抗体に対してＮ＝５、および、コントロールに対してＮ＝５）の脳室内の空間へ注入した。疾患の進行状況は、体重の一時的なプロファイルおよび後肢の反射により監視した。（方法の欄を参照）腰部の脊髄内への抗体の近接（approach）および貫通（penetrance）を立証するために、本発明者は先ず、ＦＩＴＣと共役したラビット多クローン性抗‐ヒトＳＯＤ１抗体の脳室内への注入を行なった。ポンプを設置してから１６日が経った後、免疫組織検査により脊髄を検査するためにマウスを犠牲にした。免疫蛍光法を実施した結果、ＦＩＴＣで標識した抗‐ヒトＳＯＤ１抗体は、小嚢状の分布（vesicular distribution）を有しながら、主に脊髄のニューロンで検出されたが（図６ａ、矢の根）、時折活性小グリアで検出された。（図６ａ、矢印）これはコントロールＩｇＧ−ＦＩＴＣ注入においてはそれほどはっきりしていなかった。（図６ａ，右側）ミニポンプに残存した抗体を集めて、ウエスタンブロット法で分析した。この結果、ミニポンプを皮下に移植してから１６日後にも抗体は活性を維持していることがわかった。（図６ｂ）この受動免疫法は体重の減少および後肢反射の損傷の両方を有意に遅らせた。（図５ｄ、ｅ．Ｐ＜０．０５，２ウェイＡＮＯＶＡ）さらに、免疫化したマウスの平均（median）寿命は１４３日であったのに対して、コントロールマウスの場合１３５日であった。（Ｐ＝０．０２５６，カプランーメイヤー寿命スパンテストおよびログ‐ランクテスト）ワクチン接種したマウスの平均寿命は１４１±１．４日であったのに対して、コントロールマウスの場合１３５±１．５日であった。（平均値±標準偏差、ステューデントｔ−検定によるＰ＜０．０５）したがって、１週間に至る有意な寿命の延長が見られた。
【実施例４】
【００７９】
本発明の好ましい具体例に係るＳＯＤ１単クローン抗体の反応性
ＳＯＤ１に対する単クローン抗体に関するＥＬＩＳＡ分析
ウェルプレートを１μｇ／ｍｌの組み換えＳＯＤ１たんぱく質（ＷＴまたはＧ９３Ａ）で被覆した。室温にて（ＰＢＳ中の）ＢＳＡの５％溶液中で２時間遮断させた後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ中に連続的に希釈したマウス血清（１／２、１／１０、１／２０、および、１／４０）を前記各々のウェルに加え、前記プレートを室温で１時間インキュベートした。基材として2,2'-アジノ−ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸) ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、および、ペルオキシダーゼと共役した抗‐マウス免疫グロブリンを用いて検出を行なった。４５０ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。
【００８０】
図６および表３から明らかなように、単クローン抗体のクローンＢ１Ｇ９およびＣ４Ｆ６は突然変異体ＳＯＤ１に対して特異的な反応性を示したが、その一方、その他のクローンは正常なＳＯＤ１または突然変異ＳＯＤ１のいずれかに対して反応性を示した。クローンＤ３Ｈ５は正常なＳＯＤ１種および突然変異ＳＯＤ１種に対して高度の親和性を有する。
【実施例５】
【００８１】
本発明の好ましい単クローン抗体による、マウスの脊髄標本における突然変異ＳＯＤ１種の特異的な免疫組織化学検出法
ヒトＷＴ  ＳＯＤ１（Ｊ２４２９）または突然変異ＳＯＤ１（Ｇ９３ＡまたはＧ３７Ｒ）を発現する正常なマウスまたはトランスジェニックマウスに、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）でかん流させ、固定させ、そして、凍結防止剤中にインキュベートした。発症前の突然変異体ＳＯＤ１トランスジェニックマウス（Ｇ３７ＲおよびＧ９３Ａ）またはンヒトＷＴトランスジェニックマウスから得た２５μｍの脊髄分画を、マウス単クローン抗体‐ヒトＳＯＤ１抗体（Ｃ４Ｆ６クローン）を用いて染色した。前記脊髄分画を一次抗体（Ｃ４Ｆ６抗体に対して１：５００）で４℃にて一晩インキュベートし、その後、ビオチン化抗‐ＩｇＧ抗体でインキュベートした。ベックタステインＡＢＣキット（ＵＳＡのカルフォルニア、ブルリンカームに所在するベクターラボラトリーズ社製）、および、３，３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ；シグマ社製）を用いてアビジン-ビオチン複合体（ＡＢＣ）法により一次抗体を可視化した。
【００８２】
標本において、ヒトＷＴ  ＳＯＤ１（Ｊ２４２９）を発現するマウスからではなく、突然変異ＳＯＤ種を発現するトランスジェニックマウスからの標本において免疫染色を検出した。
【実施例６】
【００８３】
突然変異型ＳＯＤ１に対する本発明の好ましい単クローン抗体（Ｃ４Ｆ６）の特異性
図１６を参照すると、ＳＯＤ１突然変異体でワクチン接種した場合、Ｃ４Ｆ６抗体に反応する突然変異ＳＯＤ１種のＣＮＳ量を減らすことで保護作用を奏することがわかる。
【００８４】
図１６ａはウエスタンブロット分析の結果を示しているが、ここで、Ｃ４Ｆ６マウスの単クローン抗体は突然変異型ＳＯＤ１（Ｇ３７ＲおよびＧ９３Ａ）を認識するが、トランスジェニックマウスの脊髄抽出物から得たＷＴ  ＳＯＤ１を認識しない。図１６ｂはＥＬＩＳＡ分析の結果を示しているが、ここで、Ｃ４Ｆ６単クローン抗体はＧ８５Ｒ金属化（metallated）ＳＯＤ１たんぱく質を検出するが、ＷＴ金属化ＳＯＤ１組み変えたんぱく質を検出しない。さらに、最後の図１６ｃは、脊髄抽出物のウエスタンブロット分析結果、Ｃ４Ｆ６抗体により検出された突然変異体ＳＯＤ１種の量は、アジュバント−生理食塩水コントロールマウスに比べて、ワクチン接種したマウスのほうがもっと少ないことがわかった。各々のマウスから５ないし１０ｍｇのたんぱく質を各々のウェルに負荷し、ウエスタンブロット法を行なった。ワクチン接種したマウス、および、生理食塩水を注入したマウスの両方から選んだ３匹のマウスに対する分析を行なった。
【実施例７】
【００８５】
本発明の好ましい単クローン抗体を用いる血液標本のウエスタンブロットによる突然変異ＳＯＤ１のスクリーニング
突然変異ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａを発現するトランスジェニックマウス、ヒトＷＴ  ＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス、または、正常なマウスから得た血液標本（１００μＬ）を１０００ｘｇで４℃にて１５分間遠心分離した。そのペレットを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で、アイス上に１時間インキュベートした。標本を２０，０００ｘｇで４℃にて２０分間遠心分離し、上清を集め、ＳＯＤ−試料標本緩衝液中に５分間加熱した。この標本をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画化し、標準プロトコールにしたがってブロットした。バンドを検出するために、ブロットを、ペルオキシダーぜと共役したＩｇＧで処理して、化学発光法による分析を実施した。
【００８６】
図１７において、上部のパネルは、正常なマウス（１〜５）、突然変異体ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａを発現するマウス（レーン６〜１０）、および、ヒトＷＴ  ＳＯＤ１を発現するマウス（レーン１１〜１４）から得たＣ４Ｆ６単クローン抗体を用いて血液標本の免疫ブロット法を実施した結果を示している。また、下部のパネルは、正常なマウス（１〜５）、突然変異ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａを発現するマウス（レーン６〜１０）、および、ヒトＷＴ  ＳＯＤ１を発現するマウス（レーン１１〜１４）から得たラビット多クローン抗−ヒトＳＯＤ１（ＢＣ，ヴィクトリアに所在するストレスゲン社製）を用いて血液標本の免疫ブロット法を実施した結果を示している。
【００８７】
図１７には、単クローン抗体Ｃ４Ｆ６が、ヒトＳＯＤ１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから得た血液標本で、正常なＷＴ  ＳＯＤ１種を除いて、突然変異ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）を検出することが示されている。この結果より、この抗体が、簡単な血液テストを通じて突然変異ＳＯＤ１種の診断スクリーンに用いられることがわかった。
【実施例８】
【００８８】
本発明に係る好ましい単クローン抗体（Ｄ３Ｈ５）による、マウスの脊髄標本中のＷＴまたは突然変異ＳＯＤ１種の免疫組織化学的検出法
正常なマウス、ヒトＷＴ  ＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス（Ｊ２４２９）、または、突然変異ＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス（Ｇ９３ＡまたはＧ３７Ｒ）を、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）でかん流させ、固定させ、そして、凍結防止剤中にインキュベートした。発症前の突然変異ＳＯＤ１トランスジェニックマウス（Ｇ３７ＲおよびＧ９３Ａ）、または、ヒトＷＴトランスジェニックマウスから得た２５μｍの脊髄分画を、本発明において好ましいとされている単クローン性の抗−ヒトＳＯＤ１抗体（Ｄ３Ｈ５）を用いて染色した。前記脊髄分画を一次抗体（Ｄ３Ｈ５抗体に対して１：５００）で４℃にて一晩インキュベートし、その後、ビオチン化抗‐ＩｇＧ抗体でインキュベートした。ベックタステインＡＢＣキット（ＵＳＡのカルフォルニア、ブルリンカームに所在するベクターラボラトリーズ社製）、および、３，３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ；シグマ社製）を用いてアビジン-ビオチン複合体（ＡＢＣ）法により一次抗体を可視化した。（図１８を参照）
【実施例９】
【００８９】
野生型ＳＯＤ１は酸化を通じてＡＬＳに関連した突然変異型の毒性および結合性を獲得した。
材料および方法
プラスミドおよび抗体
ＨＡで標識したマウスのクロモグラニンＢ（ｐｃＤＮＡ−３−ＣｇＢ−ＨＡ）、または、ＦＬＡＧで標識したヒトＳＯＤ１（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＳＯＤ１）を保有する（carrying)哺乳動物の発現プラスミドを参考文献［Urushitani et al., 2006, Nature Neurosc, 9, 108-118］の記載内容に従って作製した。ラビット単クローン性抗−ヒトＳＯＤ１（ＳＯＤ−１００）、および、マウスの単クローン抗体Ｈｓｐ／Ｈｓｃ７０をストレスゲン社から購入した。ラットの単クローン性抗‐ＨＡ（３Ｆ１０），マウスの単クローン性の、リン酸化されていない神経フィラメントＨ（ＳＭ１３２），マウスの単クローン性抗‐アクチン（Ｃ４）抗体をそれぞれローシュ社（スイスのバゼルに所在する）、ステインベルガーモノクロナル社（ＭＡのバルチモアーに所在する）、および、ケミコン社（ＣＡのテメクラに所在する）から購入した。抗‐クロモグラニンＢ（２６１０２）およびＣＯＸ−ＩＶ（Ａ−６４３１）抗体はＱＥＤバイオサイエンス社（ＣＡのサンディエゴに所在する）、および、モレキュラープローブ社（ＯＲのユージンに所在する）から購入した。マウスの単クローン性抗‐シンタクシン（syntaxin）−１（ＨＰＣ１）およびＡｋｔ１（Ｂ−１）はサンタクルーズ社（ＣＡのサンタクルーズに所在する）から購入した。マウス／ラットＴＧＮ−３８に対するラビットの多クローン抗体は参考文献［Urushitani et al., 2006, Nature Neurosc, 9, 108-118］の記載内容に従って作製した。
【００９０】
培養、トランスフェクション、および、薬物治療
マウスの神経芽腫細胞株であるＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコの改質必須培地（ＤＭＥＭ）の中で維持させた。トランスフェクション（transfection）は、製造者のプロットコールにしたがってリポペックタミンＰＬＵＳ（Ｃａのカルスバドに所在するインヴィトロゲン社製）を用いて行なわれた。トランスフェクション後３時間が経過した時点で、前記培地を２ｍＭジブチリルサイクリック‐ＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ）を含有する栄養培地に置き換えた。トランスフェクション後２４時間が経過した時点で、更なる分析を行なうために、細胞を１．５ｍＭ過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）または無菌水（コントロール）に４５分間露出させた。マウスの小グリア細胞株ＢＶ２の細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２ハム培地（ＤＦ）中で維持させた。最初のプレーティングを除き、培養培地は抗生物質を含んでいなかった。
【００９１】
免疫ブロットおよび免疫沈降
前記培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、および、プロテアーゼ阻害剤カクテルからなるＴＮＧ−Ｔ緩衝液（ドイツのマンハイムに所在するローシュ社製）中で採取した。アイス上に１時間インキュベートしてから、細胞懸濁液を遠心分離して（１５０００ｒｐｍで２０分間）、上清を集めた。細胞を過酸化水素で処理した場合に得られる効果を評価するために、細胞溶解物を抗‐ＦＬＡＧ親和性ゲル（ＭＯのセイントルイスに所在するシグマ社製のＭ２）を用いて４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物を、４％ＳＤＳ試料標本緩衝液中で溶離させ、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そして、二フッ化ポリ二塩化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＭＡのボストンに所在するパーキンエルマー社製）に転写した。ウエスタン電光化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用いてウエスタンブロット映像を得た。
【００９２】
インビボユビキチン化
ポリ‐ユビキチン鎖によるヒトＳＯＤ１の改質はインビボユビキチン化実験により行なわれた。参考文献（Urshitani et al., 2002, J. Neurochem 83, 1030-1042）Ｎｅｕｒ２ａ細胞に対し、ＦＬＡＧで標識したｈＳＯＤ１（ＷＴまたはＧ９３Ａ突然変異体）およびＨＡで標識したユビキチンで共トランスフェクション（cotransfection）を行なった。過酸化水素に露出させてから、前述したプロトコールに従い、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＴＮＧ−Ｔ緩衝液中で細胞を採取した。この溶解物を抗−ＦＬＡＧ親和性ゲル（シグマ社製のＭ２）を用いて免疫沈降を行い、そして、免疫ビードからの溶出物（elute）を、抗−ＨＡ（ローシュ社製）および抗−ヒトＳＯＤ１（ストレスゲン社製）抗体を用いてウエスタンブロット法により分析した。
【００９３】
組み換えたんぱく質の精製
組み換えグルタチオンＳ−トランスフェラーぜと融合したｈＳＯＤ１（ＧＳＴ−ｈＳＯＤ１）を、参考文献［Urushitani et al., 2002, J. Neurochem 83, 1030-104］の記載内容に従って作製した。ｈＳＯＤ１の金属化（metallation）は２０ｍＭのＺｎＣｌ2で一晩インキュベートし、２０ｍＭのＣｕＣｌ2と３時間インキュべートとし、そして、ＰＢＳに対する透析を一晩行なうことによって行なわれた。さらに、組み換えｈｏｌｏ−ｈＳＯＤ１の酸化は０．１ｍＭの過酸化水素で室温にて1時間インキュベートした後、ＰＢＳに対して一晩透析を行なうことによって行われた。組み換えたんぱく質は使用するまでに―８０℃の温度にて保管した。
【００９４】
細胞内分画化（subcellular fractionation）
Ｎｕｅｒｏ２ａ細胞に対し、６ウェル細胞プレートにてＦＬＡＧで標識したＳＯＤ１（ＷＴおよびＧ９３Ａ）で一時的にトランスフェクションを行なった。トランスフェクション後２４時間が経過した時点で、細胞をＤＭＥＭ中の１．５ｍＭの過酸化水素溶液で３０分間処理した後、過酸化水素を除去した栄養培地内で３０分間さらにインキュベートした。収穫した細胞を均一化緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭのＭｇＣｌ2、および、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で均一化し、１０００ｇで１５分間遠心分離を実施して、細胞破片を除去した。その上清を８０００ｇで１５分間さらに遠心分離して、ペレット（重分画）および上清を分離した。この上清は１０５，０００ｇで６０分間超遠心分離を行い、細胞質分画（上清）、および、軽い細胞膜の分画（ペレット）を得た。超音波処理して、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する均一化緩衝液中に前記各々のペレットを再び懸濁させた。ブラッドフォード検定法（ＣＡのヘルクレスに所在するＢｉｏＲａｄ社製）でたんぱく質の濃度を測定した後、等量のたんぱく質をウエスタンブロット法により分析した。
【００９５】
判定量ＲＴ−ＰＣＲ
６ウェル培養プレートにおいて９０％の密集度を示すマウスの小グリア細胞株であるＢＶ２細胞を、ＰＢＳ，  ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、ＷＴ  ＳＯＤ１（１０μｇ／ｍｌ）、酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１（１０μｇ／ｍｌ），または、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１（１０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。全てのＳＯＤ1組み変えたんぱく質は予め金属化した。製造者の指示に従ってトリゾル試薬（インビトロゲン社製）を用いて、全細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素およびオリゴ−ｄＴプライマー（インビトロゲン社製）を用いて、全ＲＮＡから第1のストランドｃＤＮＡを合成した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、誘導可能な酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、および、ＧＡＰＤＨの発現レベルをＰＣＲにより評価した。この実験において用いられた１対のプライマーは、ＴＮＦ−αに対しては5' TCAGTGAGACCACTGCAATG 3'(配列番号１)、および、5'GTGGAGTGAGACTTTGGATG 3'(配列番号２) であり；ｉＮＯＳに対しては、5' CCTTGTGTCAGCCCTCAGA 3'(配列番号３)、および、5'CACTCTCTTGCGGACCATCTC 3' （配列番号４)であり；そして、ＧＡＰＤＨに対しては、5'GGCATTGTGGAAGGGCTCA 3'(配列番号５)、および、5'TCCACCACCCTGTTGCTGT 3'(配列番号６)であった。
【００９６】
マウス胚の脊髄の1次培養物
胚児マウスの脊髄から得た1次解離培養物を参考文献［Urushitani et al., 2002, J. Neurochem 83, 1030-104］に記載された方法にしたがって作製した。プレーチィングを行なってから１２日経過後、培養物を組み換えたんぱく質（ヒトＷＴ  ＳＯＤ１、ヒト酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１、および、ヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ１）で２４時間処理し、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）の中で固定した。抗−リン酸化されいない神経フィラメントＨ（ＳＭ１３２；１：５００）を用いる免疫組織化学検定法によって運動ニューロンの生存率を測定した。運動ニューロンは、単一の伸張型軸索を有するＳＭＩ３２−免疫反応性（２０Ｕｍを超える大きさの）ニューロンとして同定された。アレクサ４８８と共役した項−マウスＩｇＧを二次抗体として用いた。培養物を蛍光顕微鏡下で観察し、３つの姉妹培養物から任意に選んだ領域からの4つの映像を得た。前記各々の領域から運動ニューロンの数を得て、そして、細胞の密度（細胞数／ｃｍ２）を計算した。
【００９７】
結果
酸化ストレスによるＷＴ  ＳＯＤ１のミスフォールド現状
ＳＯＤ１が神経変性における酸化的なストレスの標的たんぱく質であるとの仮定を検証するために、本発明者は、細菌を精製した組み換えＳＯＤ１たんぱく質を１ｍＭ過酸化水素で３７℃にて３０分間処理し、その後、その移動パターンおよび溶解度を分析した。過酸化水素で処理した組み換えＳＯＤ１の全分画に対してウエスタンブロット法を実施した結果、移動パターン、分画化、および、高分子凝集体の形成において著しい変化が見られた。（図１０Ａ，レーン２，４、および、６）さらに、過酸化水素で処理した後、組み換えたんぱく質に対して超遠心分離を行なった結果、そのような酸化に関連した種が上清ではなく、もっぱらペレット分画において検出された。（図１０Ｂ）単量体および二量体のＳＯＤ１種だけが上清において検出された。ＷＴ  ＳＯＤ１が突然変異ＳＯＤ１に比べてより酸化的ストレスに影響されにくいにもかかわらず、ウエスタンブロット分析から得られた分子における変化は突然変異と類似していることは明らかであった。インビトロにおけるこれらの実験結果により、酸化が突然変異ＳＯＤ１だけでなくＷＴ  ＳＯＤ１のミスフォールド現状、および、凝集体形成に影響を及ぼすということがわかった。本発明に基づいたこの結果は、ＷＴ  ＳＯＤ１の酸化が、光散乱分析法によりインビトロで行なわれた凝集体形成を促すという以前の報告と一致するものであった。さらに進んで、インビボでのＷＴ  ＳＯＤ１の酸化を検証するために、Ｎ末端においてＦＬＡＧペプチドで標識したＷＴおよびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１でＮｅｕｒｏ２ａ細胞に対するトランスフェクションを行い、そのトランスフェクションが終わってから２４時間が経過した時、１．５ｍＭ過酸化水素に４５分間露出させた。その後、抗−ＦＬＡＧ親和性ゲルを用いて、トランスフェクトされた細胞の溶解物のプルダウン分析（pull-down assay）を行なった。その結果、Ｈｓｐ／Ｈｓｃ７０は突然変異Ｇ９３Ａ、酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１と共免疫沈降されたが、非酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１とは共免疫沈降されなかった。（図１１Ａ）過酸化水素による酸化は、ＷＴ  ＳＯＤ１のミスフォールド現状を引き起こすと共に、Ｈｓｐ／Ｈｓｃ７０との相互作用を保証するということがわかった。
【００９８】
酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１は多−ユビキチンと共役し得る
ＡＬＳと関連したＳＯＤ１突然変異たんぱく質のうち殆どのタイプは、ユビキチン−プロテアソーム経路により分解される。この概念に基づいて、本発明者は、酸化がＷＴ  ＳＯＤ１たんぱく質を形質変換させ（transform）、多−ユビキチン化（ubiquitination）に適した種をミスフォールドするかどうかを調べるために、インビボユビキチン化実験を行なった。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に対し、ＨＡで標識したユビキチンと共に、ＦＬＡＧで標識したＷＴまたはＧ９３Ａ ＳＯＤ１でトランスフェクションを行い、その後、採取する前に１．５ｍＭ過酸化水素に４５分間露出させた。全細胞溶解物および抗−ＦＬＡＧ免疫沈降物に対するウエスタンブロット分析を行なった結果、過酸化水素で処理した細胞中のＷＴ  ＳＯＤ１が、未処理細胞から得たＷＴ  ＳＯＤ１とは違って多−ユビキチン鎖と共役していることがわかった。同様の現状はＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１においても観察された。（図１１Ｂ）
【００９９】
酸化型ＷＴ−ＳＯＤ１はクロモグラニンＢと相互作用する。
本発明者は、突然変異ＳＯＤ1の結合パートナーとしてのクロモグラニンＢ（ＣｇＢ）を予め同定した。クロモグラニンは突然変異ＳＯＤ１種と相互作用して、その分泌を促すことがわかった。酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１種がクロモグラニンと相互作用するかどうかを調べるためにＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、マウスのＨＡで標識したＣｇＢと共に、ＦＬＡＧで標識したＷＴまたはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後２４時間が経過した時点で、細胞を採取する前に、１．５ｍＭ過酸化水素に４５分間露出させた。分画化されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞溶解物に対するウエスタンブロット検定を行った結果、ＷＴおよび突然変異ＳＯＤ１両方が、ＣｇＢが豊富に発現されるミクロソーム分画に分布されていることがわかった。（図１２Ａ）過酸化水素で処理することは、細胞内の分画におけるＷＴおよび突然変異ＳＯＤ１のたんぱく質のレベルに影響を及ぼすことはなかった。全細胞溶解物を、抗−ＦＬＡＧ親和性ゲルで免疫沈降を行い、ウエスタンブロット法によって分析した。図１２Ｂに示すように、ＣｇＢは、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１または酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１のいずれかと共免疫沈降されたが、完全なＷＴ  ＳＯＤ１とは共免疫沈降することはなかった。この結果は、ＥＲ−Ｇｏｌｇｉ区画（compartment）に分布されているＷＴ  ＳＯＤ１の酸化がクロモグラニンに対する結合を誘発するということを意味する。
【０１００】
酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１は運動ニューロンの壊死および小グリア活性化を引き起こす
ＷＴおよび突然変異ＳＯＤ1種の両方が分泌される証拠がある。しかしながら、ＷＴ  ＳＯＤ１とは違って、分泌された突然変異ＳＯＤ１はＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ，および、ＣＯＸ２のような炎症反応を促進する分子を生じさせる。小グリアを活性化するに酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１が突然変異ＳＯＤ１と類似した作用をするかどうかを調べるために、マウスの小グリアのＢＶ２細胞を、過酸化水素で処理したか又は処理していない、細菌精製した組み換えｈｏｌｏ−ＳＯＤ１に露出させた。半定量ＲＴ−ＰＣＲ実験により、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１または酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１のいずれかにＢＶ２細胞を露出させると、ＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳの発現が誘発されることがわかった。（図１３）
【０１０１】
ＷＴ  ＳＯＤ１とは違って、細胞外の突然変異ＳＯＤ１は、小グリアがない場合にも、培養された運動ニューロンの壊死を誘発することができる。ここで、胚児の脊髄培養物を、組み換えＷＴ  ＳＯＤ１、酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１、またはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１（０．５および１．０μｇ／ｍｌ）に２４時間露出させた。予想の通り、ＷＴ  ＳＯＤ１はこのような濃度範囲において毒性を示すことはなかった。しかしながら、酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１は、Ｇ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１と同様、培養された運動ニューロンに対して容量依存的に毒性を示した。（図１４）本発明者は、アメーバ様細胞の形態を特徴とする混合された培養物における小グリア活性化を観察した。（データは示さない）これらの結果は、酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１が突然変異ＳＯＤ１種の神経毒性を獲得したことを示している。
【０１０２】
考察
ここに示した結果から、本発明者は、ＷＴ  ＳＯＤ１が、ＡＬＳと関連した突然変異ＳＯＤ１の毒性および結合特性の多くを、酸化を通じて獲得するという結論に至った。この結論は次の結果により裏付けられている。１）過酸化水素で処理した組み換えＷＴ  ＳＯＤ１が突然変異ＳＯＤ１種の凝集体に類似した凝集体を産出するということ；２）Ｈｓｐ／Ｈｓｃ７０および多−ユビキチン化によって明らかになったように、酸化がＷＴ  ＳＯＤ１のミスフォールド現状を引き起こすということ；３）酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１が膜の分画に分布され、そして、トランスフェクトされた神経細胞における神経分泌たんぱく質であるＣｇＢと相互作用するということ；４）細胞外の酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１が小グリア活性化および培養された運動ニューロンの壊死を引き起こすということ。
【０１０３】
パーキンソン病、アルツハイマー病およびＡＬＳを含めて神経変性疾患の発病機序に酸化的ストレスが関与することについての証拠は数多くある。総たんぱく質の１％を構成する程度のＳＯＤ１の豊富さ、および、抗酸化剤としてその機能を考慮すると、ＳＯＤ１は神経変性疾患における酸化的ストレスの標的であり得ると推定することができる。事実上、ＷＴ  ＳＯＤ１の酸化は既に確立されている現状である。過酸化水素はＷＴ  ＳＯＤ１の活性部位と相互作用することができ、そして、ヒドロキシル基を生産することで酵素を活性化し得る。参考文献［Rakhit et al., 2004, J. Biol. Chem., 279. 15499-15504］によれば、ＷＴ  ＳＯＤ１は酸化しがちな４つのアミノ酸（Ｈｉｓ４８，８０，１２０、および、Ｐｈｅ２０）を保有しており、これらの酸化はＳＯＤ１の凝集体形成を引き起こす。さらに、ＷＴ  ＳＯＤ１におけるシステイン残基の酸化はミスフォールド現状を引き起こし、また分子間ジスルフィド（disulfide）を介する凝集体形成を引き起こすことができる。
【０１０４】
本発明における結果は、酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１が突然変異ＳＯＤ１のような神経分泌たんぱく質ＣｇＢと相互作用するということを示している。環境（milieu）に分泌されてしまうと、細胞外の酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１は小グリア細胞を活性化させ、そして、運動ニューロンの壊死を引き起こす（図１４）。分泌された酸化型ＷＴ又は突然変異体ＳＯＤ１に基づいた前記毒性モデルは、前記疾患が運動ニューロンと厳格に自立したものではないし、種々の細胞が運動ニューロン、介在ニューロン（interferone）、小グリア、および、星状膠細胞を含む疾患に寄与するという観点と競合する。また、突然変異ＳＯＤ１を発現するキメラマウスの分析結果から明らかなように、損傷がどのようにして１つの細胞から別の細胞に広がることができるのかを説明する。
【０１０５】
ここに示された結果に照らして、他の神経変性疾患の発病機序におけるＳＯＤ１の役割ははやり除外することができない。最近の報告［Choi et al., 2005, J. Biol. Chem, 280, 11648-11655］によれば、アルツハイマー病およびパーキンソン病を患っている患者から得た脳の溶解物において酸化型ＳＯＤ１が見られ、そして、老人斑レヴィー小体においても酸化型ＳＯＤ１たんぱく質が存在する。
【０１０６】
以下に示す表１は、免疫化したマウスにおいて、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１に対する抗体に対してＥＬＩＳＡ検定により血清滴定を行なった結果である。ワクチン接種したマウスから得た血清に対する抗体滴定はＥＬＩＳＡにより行なわれた。表２は、ＷＴおよび突然変異ＳＯＤ１種で免疫化したマウスから得た抗血清の異なる反応性を示すＥＬＩＳＡデータである。そして、表３は、ＥＬＩＳＡにより測定された、組み換えヒトＷＴ，  Ｇ８５Ｒ，またはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１金属化たんぱく質に対する抗体の力価を示す。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１はワクチン接種したＧ３７  ＳＯＤ１マウスにおける寿命の延長、及び、遅延された発病を示す。図１ａは、免疫化のスケジュールを示す。図１ａは免疫化の初期。２ヶ月齢に始まり、マウスに４回注射した。末期（end-stage）の４ヶ月齢の時点で滴定分析のために血液を集めた。図１ｂは、初期の免疫化プロトコールにしたがってワクチン接種したマウスのロッタロッド分析結果を示す。ロッタロッド上の時間は、組み換え（ｒｅｃ）Ｇ９３Ａ−アジュバント（Ｎ＝８）、または、生理食塩水−アジュバント（Ｎ＝７）で注射したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスに対して決められた。ワクチン接種は運動性を有意に改善させた。（多重比較、Ｐ＜０．０００１）図１ｃは、組み換え（ｒｅｃ）Ｇ９３Ａ−アジュバント、または、生理食塩水−アジュバントで注射したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウス発病の遅延に対する免疫化の効果を示す。（ログランク検定、Ｐ＜０．００１１）図１ｄは、免疫がＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスの寿命を延長する。生存に関するカプランマイヤー曲線を示す。組み換えＧ９３Ａ−アジュバントに対してはＮ＝８、そして、生理食塩水−アジュバントに対してはＮ＝７。（ログランク検定、Ｐ＜０００１）図１ｅによれば、疾患の末期において、ワクチン接種したマウスの場合、残存する運動ニューロンの数が多かった。トルイジンブルーで該分画を染色した後、各グループごとに４匹のマウスから４つの分画における運動ニューロンの数を数えた。（スチューデント検定、＊Ｐ＜０．０１）図１ｆは、ＮｅｕＮに対する抗体を用いて、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１たんぱく質（上部）または生理食塩水（下部）で免疫化した末期のＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脊髄に対する免疫組織化学検定法を実施した結果である。
【図２】図２ａは、Ｍａｃ２抗体を用いて免疫化したマウスから得た脊髄の免疫化学分析検定の結果を示す。組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１でワクチン接種したマウスの反応性小グリア細胞においてＭａｃ２染色が目立っている。（左側の２つのパネル）図２ｂは、ワクチン接種したＡＬＳマウスの脊髄においてＩｇＧの染色および小膠細胞症が増加したことを示す。ワクチン接種し、または生理食塩水／アジュバントを注射したグループからのＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脊髄分画は、ラット単クローン性項−Ｍａｃ２抗体で処理した後に、アレクサ４８８と共役した抗−ラットＩｇＧ（左カラム）と共にアレクサ２９４と共役した抗−マウスＩｇＧと処理して、内因性ＩｇＧを検出する。（中間カラム）。各々の色素につき、固定された条件（fixed condition）下で写真を撮った。ワクチン接種したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスにおいてＩｇＧ信号が増加したことがわかる。スケールバー(scale bar)＝５０μｍ
【図３】抗体の力価がワクチン接種したマウスの寿命との関連性を示す。図３ａは、ＥＬＩＳＡを用いて、免疫化したマウスの血清の抗体を滴定した結果を示す。組み換えＧ９３Ａで処理したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスに対してＮ＝７であり、生理食塩水を注射したマウスに対してはＮ＝６である。４ヶ月齢の末期のマウスから得た血清をテストした。組み換えＧ９３Ａで処理した非−トランスジェニックマウスに対してはＮ＝４（全て４ヶ月齢）であった。図３ｂは、免疫化したマウスにおける寿命と抗−ヒトＳＯＤ１力価との関連性を示すものである。４ヶ月齢における抗−ヒトＳＯＤ１の力価に対するＥＬＩＳＡ値および寿命（週）を散布図(scatter diagram)上にプロットした。組み換えヒトＳＯＤ１で処理したグループに対してＮ＝７であり、生理食塩水を注射したグループに対してＮ＝６である。Ｐ＝０．００１１（スピアマンのローテスト）図３ｃは、組み換えＧ９３Ａでワクチン接種したマウスから得た抗血清がヒトＧ３８Ｒ  ＳＯＤ１突然変異体を検出するというウエスタンブロット検定結果を示す。各々のグループから選んだ２匹の異なるマウス、即ち、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１でワクチン接種したグループから選んだマウス７５２および７５４、ならびに、生理食塩水−アジュバントを注射したグループから選んだマウス７５８および７５９から得た血清を、Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスから得た脊髄溶解物と反応させ、非トランスジェニック同腹子を形成した（ＷＴ坑血清）。矢印の根（arrowhead）はＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１を示し、星印はマウスの内因性ＳＯＤ１を示す。膜を、ヒトＳＯＤ１（ＷＴαｈＳＯＤ１）およびアクチン（ＷＢ  α  ａｃｔｉｎ）に対する市販の抗体を用いて再びブロットした。図３ｄは、ＷＴまたは突然変異ＳＯＤ１たんぱく質に対して免疫化したマウスから得た抗血清の異なる反応性を示す。金属化した組み換えヒトＷＴ，Ｇ８５ＲまたはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１金属化たんぱく質に対する抗体の力価はＥＬＩＳＡにより測定される。組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１または組み換えＷＴ  ＳＯＤ１でワクチン接種したＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスで構成されたグループ、および、組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１でワクチン接種したトランスジェニックマウスで構成されたグループに対してそれぞれＮ＝３であった。そのデータは各々のマウスのグループにおける組み換えＷＴ  ＳＯＤ１に対する力価に比した力価の百分率として示した。（平均±標準偏差）＊Ｐ＜０．０５（ボンフェロニ法を利用した２ウェイＡＮＯＶＡにより求めた）図３ｅは、ワクチン接種したマウスから得た脊髄溶解物の抗体滴定を行うためのＥＬＩＳＡ検定を示している。７ヶ月齢で組み換えＧ９３Ａ  ＳＯＤ１を注射したマウス（Ｎ＝３）、または、生理食塩水−アジュバントを注射したマウス（Ｎ＝３）から得た脊髄溶解物を細胞より小さく分画化して、界面活性剤を含まない緩衝液に溶解性の（溶解性）、および、不溶性の（膜）分画を得た。＊Ｐ＜０．０５（１ウェイＡＮＯＶＡにより求めた）
【図４】本発明の好ましい単クローン抗体でワクチン接種したことによる、脊髄における突然変異ＳＯＤ１種のクリアランス（clearance）を示す。図４ａは、本発明の好ましい１つの単クローン抗体、いわゆるＣ４Ｆ６単クローン抗体が突然変異ＳＯＤ１（Ｇ３７ＲおよびＧ９３Ａ）を認識するが、トランスジェニックマウスの脊髄抽出物からのＷＴ  ＳＯＤ１を特異的に認識しないことを示すウエスタンブロット検定結果である。図４ｂは、Ｃ４Ｆ６単クローン抗体が、Ｇ８５Ｒ金属化ＳＯＤ１たんぱく質を検出するが、ＷＴ金属化ＳＯＤ１組み換えたんぱく質を検出しないことを示す。図４ｃは、脊髄抽出物に対するウエスタンブロット検定を実施した結果、アジュバント−生理食塩水コントロールマウスに比べて、ワクチン接種したマウスにおいてＣ４Ｆ６抗体により検出された突然変異ＳＯＤ１種の量がより少ないことを示す。各マウスから得た５および１０μｇのたんぱく質を、ウエスタンブロット検定を実施するために各々のウェルに負荷した。ワクチン接種したマウスおよび生理食塩水−アジュバントを注射したマウスの両方から選んだ各３匹のマウスに対して分析を行なった。図４ｄは、図４ｃにおけるウエスタンブロットのデータに対し密度測定分析を行った結果である。コントロールグループの平均値を１つに標準化した。データは平均±標準偏差を意味する。（Ｎ＝各グループから３匹）
【図５】極端なレベルの突然変異ＳＯＤ１たんぱく質を有するＧ９３Ａマウスにおける能動または受動免疫化の効果を示す。図５ａ，ｂはカプランマイヤー曲線により示したように、Ｇ９３ＡＧｕｒ  ＳＯＤ１マウスの疾患の発病（ａ）、および、生存の蓋然性（ｂ）に対して能動免疫化の限られた効果を示す。マウスに対して、Ｇ３７Ｒ  ＳＯＤ１マウスに用いられたプロトコールと同様のプロトコールにしたがってワクチン接種を行なった。組み換えＧ９３Ａで処理したマウスに対してＮ＝１２であり、生理食塩水−アジュバントで処理したマウスに対してＮ＝８であった。データはログ−ランク検定法によって分析された。  図５ｃ〜５ｅには、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスにおける受動免疫化の有意な効果が示されている。マウスに対して、８５日齢で始まり、坑−ＳＯＤ１抗体（Ｎ＝５）、または、コントロール生理食塩水（Ｎ＝５）の脳室内注入を行った。図５ｃにおいて、ウエスタンブロット検定の結果は、免疫化されたマウスの坑血清から得た親和性精製された坑−Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１抗体の存在が証明された。図５ｄ〜ｆは、体重（図５ｄ）および後肢反射点数（図５ｅ）により監視したように、坑−ヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ１抗体を用いて行った受動免疫化が疾患の症状を和らげることができるということを示している。その結果は統計学的に有意義なものである。（ｐ＜０．０５、２ウェイＡＮＯＶＡ）。図５ｆは、受動免疫化が、生理食塩水を注射したマウスに比べてＧ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスの寿命を延ばしたことを示す。（ｐ＜０．０２５、カプランマイヤー生存検定法、ログ−ランク検定法、および、スチューデントｔ−検定法による）
【図６】浸透圧ミニポンプを通じて注入した坑−ヒトＳＯＤ１抗体は腰部の脊髄内へ浸透し、前記ポンプを設置してから１６日が経過した時点においてもその活性を保持していた。ラビット多クローン性坑−ヒトＳＯＤ１抗体またはコントロールＩｇＧを、ＦＩＴＣと共役させ、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１マウス（１００日齢）を対象にして、浸透圧ミニ−ポンプを通じて脳室内へ注入させた。  図６ａは、ＦＩＴＣと共役した坑−ヒトＳＯＤ１抗体（左カラム）またはコントロールＩｇＧ（右カラム）を脳室内へ注入して治療したＧ９３Ａ  ＳＯＤ１マウスの腰部の脊髄の免疫蛍光分析の結果を示す。グリーン色はＦＩＴＣと共役した抗体またはコントロールＩｇＧを示し；赤色は坑−ＮｅｕＮを示し；青色は坑−Ｍａｃ２抗体を示す。ＦＩＴＣと共役したＳＯＤ１抗体を脊髄のニューロン（矢印の根）、および、小グリア（矢印）の付近で検出した。図６ｂは、ポンプを設置してから１６日が経過した時点で標本から得たＦＩＴＣと共役した坑−ヒトＳＯＤ１抗体またはコントロールＩｇＧを用いて、脊髄の抽出物に対してウエスタンブロットを行った結果を示している。
【図７】突然変異ＳＯＤ１およびＷＴ  ＳＯＤ１に対する、本発明の好ましい単クローン抗体の親和性のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【図８】配列番号7のスーパーオキサイドジスムターゼ1のアミノ酸の配列を示す。
【図９】配列番号８のスーパーオキサイドジスムターゼ１の核酸の配列を示す。
【図１０】酸化が、インビトロでＷＴ  ＳＯＤ１の凝集体形成を誘発することを示す。図１０ａは過酸化水素で処理してＳＯＤ１凝集体を形成したことについて示す。細菌を精製した組み換えＳＯＤ１たんぱく質（１ｍｇ／ｍｌ、Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａ）を、１ｍＭの過酸化水素を含む溶液で３７℃にてインキュベートした。５０Ｕ／ｍｌのカタラーぜを加えて反応を中断させ、坑−ヒトＳＯＤ１抗体を用いるウエスタンブロット検定法によりたんぱく質の標本を分析した。過酸化水素処理を行った場合、ＷＴ  ＳＯＤ１は突然変異ＳＯＤ１たんぱく質の標本において多く見られる凝集体の形成と同様、高分子凝集体を形成した。矢印はその配列が質量分析により確認されたＳＯＤ１の断片を示す。（そのデータは示さない）星印は過酸化水素を除去するために加えられたカタラーゼを示す。図５Ｂは、酸化により引き起こされた凝集体の形成およびＳＯＤ１の断片がＰＢＳ中で溶解度が変化されたことについて示す。過酸化水素で組み換えＳＯＤ１たんぱく質を処理した後、たんぱく質をＰＢＳに対して透析し、その後、超遠心分離を行なった（１０５，０００ｇｘ１時間）。上清およびペレットを、抗ヒトＳＯＤ１抗体を用いてウエスタンブロット検定により分析した。様々なパターンの分画化、および、ＳＯＤＦ１断片を含む可能な複合体が矢印で示したように現れた。
【図１１】インビボにおける酸化的なストレスによるＷＴ  ＳＯＤ１のミスフォールド現状を示す。図１１Ａは、Ｈｓｐ／Ｈｓｃ７０と、インビボにおける突然変異ＳＯＤ１、または、ＷＲ  ＳＯＤ１との相互作用を示す。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、培養プレートにおいてＦＬＡＧで標識されたｈＳＯＤ１（ＷＴおよびＧ９３Ａ；２μｇ／ウェル）で一時的にトランスフェクションさせた。トランスフェクション後２４時間が経過した時点で、細胞を１．５ｍＭ過酸化水素を含有する緩衝液で４５分間インキュベートした。溶解物を抗−ＦＬＡＧ親和性ゲルで免疫沈降し、ブロットを抗−ＳＯＤ１または抗−Ｈｓｐ／Ｈｓｃ７０抗体でプローブした。空っぽの矢印はＩｇＧの重鎖を示す。それに対して、ブラックの矢印は酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１または突然変異ＳＯＤ１で共免疫沈降されたＨｓｐ／Ｈｓｃ７０たんぱく質を示す。図１１Ｂは酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１たんぱく質と多ユビキチン（multi-ubiquitin）の共役に関する。ＨＡ−ユビキチン（ＨＡ−Ｕｂ；１μｇ／ウェル）をＦＬＡＧ−ｈＳＯＤ１で共トランスフェクションさせ、その後、Ａに記載した実験を行なった。抗−ＦＬＡＧ親和性ゲルでの免疫沈降物（immunoprecipitate）を１２．５％ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上に溶解させた。免疫沈降物（左側のパネル）および１０％投入（流入）溶解物（input lysate)(右側のパネル)を、ＳＯＤ１または抗−ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロット検定法で分析した。空っぽの矢印はＩｇＧの軽鎖を示す。多−ユビキチンは酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１種だけでなく、突然変異ＳＯＤ１とも共役した。
【図１２】酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１または突然変異ＳＯＤ１とクロモグラニンＢとの相互作用を示す。図１２Ａは、トランスフェクションされたＮｅｕｒｏ２ａにおけるヒトＳＯＤ１の細胞内分布（subcellular distribution）脳エスタンブロット検定結果を示す。ｈＳＯＤ１−ＦＬＡＧ（ＷＴおよびＧ９３Ａ突然変異）でトランスフェクションしてから２４時間が経過した時点で、細胞を１．５ｍＭ過酸化水素で４５分間処理し、その後、採取した。その後、細胞を細胞内分画化処理し、サイトゾルの分画（レーン１〜４）、重量膜(heavy membrane)の分画（レーン５〜８）、および、軽量膜(light membrane)の分画（レーン９〜１２）を得た。ヒトＳＯＤ１およびＣｇＢの分布を分析した。Ａｋｔ−キナーゼ、ＣＯＸ−ＩＶ，ＴＧＮ−３８，および、シンタクシン−１は、それぞれサイトゾル、ミトコンドリア、ミクロソーム、および膜成分に対するマーカであった。図１２Ｂにおいて、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞はｈＳＯＤ１−ＦＬＡＧ（ＷＴおよびＧ９３Ａ、１μｇ／ウェル）で一時的なトランスフェクションを行なった。トランスフェクション後２４時間が経過した時点で、細胞を１．５ｍＭ過酸化水素に４５分間露出させた。その後、細胞の溶解物を抗−ＦＬＡＧ親和性ゲルで免疫沈降させた。免疫沈降物および１０％投入溶解物を、抗−ＳＯＤ１または抗−ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロット検定により分析した。（１２．５％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル）
【図１３】酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１により引き起こされた小グリアの活性化を示す。小グリアＢＶ２細胞を、過酸化水素で処理し、または、無傷の（intact）ＷＴ  ＳＯＤ１(Ｏｘ−ＷＴ  ＳＯＤ１、または、ＷＴ  ＳＯＤ１，１０μｇ／ｍｌ)、非酸化型Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、または、コントロール用のＰＢＳに３７℃にて２４時間露出させた。全ＲＮＡを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、誘導可能な酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、および、ＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）に対する１対のプライマーを用いて、半定量逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。図１３ＡはＲＴ−ＰＣＲの代表的なデータである。図１３ＢはＰＢＳコントロールとの比較により得られた発現比（expression ratio)およびＧＡＰＤＨで標準化した濃度測定値を示す。（ボトム；平均±標準偏差）
【図１４】酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１および突然変異ＳＯＤ１が培養された運動ニューロンに対して同様の毒性を有することを示す。Ｅ１３胎児マウスの脊髄からインビトロで１２日間培養させた培養物（解離したもの）を、過酸化水素で処理した組み換えＷＴ  ＳＯＤ１（Ｏｘ．ＷＴ  ＳＯＤ１）、未処理の組み換えＷＴ  ＳＯＤ１（ＷＴ  ＳＯＤ１）、または、Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１（０．５および１．０μｇ／ｍｌ）に３７℃２４時間露出させた。培養物を固定して、抗−非リン酸化神経フィラメントＨ（ＳＭ１３２）で標識した。図１４ＡはコントロールＰＢＳ（最上、左側）ＷＴ  ＳＯＤ（最上、右側）、過酸化水素で処理したＷＴ  ＳＯＤ１（最下、右側）、およびＧ９３Ａ  ＳＯＤ１（最下、左側）の顕微経写真である。図１４Ｂは、処理後の運動ニューロンの生存について示している。ＳＭ１３２−ポジティブニューロンの数がコントロールに対して％で表されている。酸化型ＷＴ  ＳＯＤ１またはＧ９３Ａ  ＳＯＤ１に露出した運動ニューロンの生存率（viability）は無傷のＷＴ  ＳＯＤ１で処理した培養物またはコントロール培養物に比べて少なかった。データは平均±標準偏差で示した。データは多様性分析（analysis of variance）により推定された。（ＡＮＯＶＡ，Ｐ＜０．０５）
【図１５】ヒトトランスジェニクマウスから得た脊髄分画を用いて行なった免疫組織化学検定の結果を示す。クローンＣ４Ｆ６で染色したとき、ＳＯＤ１突然変異体を優先して認識した。発症前の突然変異ＳＯＤ１トランスジェニックマウス（Ｇ３７ＲおよびＧ９３Ａ）またはヒトＷＴトランスジェニックマウスから得た脊髄のスライス（厚さ２５μｍ）を、本発明の好ましい単クローン抗体、いわゆるＣ４Ｆ６を用いて染色し、ビオチン化二次抗体、およびアビジン−ビオチン複合体システム（ベックタステイン社製）で処理した。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色原体
【図１６】本発明の好ましい単クローン抗体を用いて行なわれたウエスタンブロット検定の結果を示す。図１６ａは本発明の好ましい単クローン抗体、いわゆるＣ４Ｆ６が、ヒトＳＯＤ１トランスジェニックマウスからのＷＴ  ＡＳＯＤ１マウスよりＧ３７Ｒ  ＳＯＤ１をよりよく認識することを示すウエスタンブロット検定結果である。コントロールとして、ラビット多クローン抗−ヒトＳＯＤ１抗体（Ｓ１００，ストレスゲン社製）を用いた。図１６ｂは、Ｃ４Ｆ６抗体が、ＷＴ金属化組み換えたんぱく質より、Ｇ８５Ｒ金属化ＳＯＤ１たんぱく質に対して反応することを示している。図１６ｃは、本発明の好ましい別の単クローン抗体、いわゆるＤ３Ｈ５がＷＴおよび様々な突然変異ＳＯＤ１１たんぱく質を認識することを示すＥＬＩＳＡ分析結果である。マウスの神経芽細胞腫
【図１７】本発明の好ましい単クローン抗体、いわゆるＣ４Ｆ６を用いてヒトＳＯＤ１  Ｔｇマウスを検出した結果を示す。マウスから得た血液（５０〜１００μＬ／マウス）をＥＤＴＡで処理した試料チューブ（sampling tube）に移した。１０００ｘｇで４℃にて１５分間遠心分離してから、ペレットをアイス上で１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１時間インキュベートした。標本を２０，０００ｇで４℃にて２０分間遠心分離して、上清を集めて、ＳＤＳ標本緩衝液中で５分間加熱した。図１７は、本発明の好ましい単クローン抗体、いわゆるＣ４Ｆ６マウス単クローン抗体（上部パネル）、および、ラビット多クローン抗−ヒトＳＯＤ１抗体（ＢＣ，ヴィクトリアに所在するストレスゲン社製）を用いてウエスタンブロット検定を行なった結果を示している。各レーンはたんぱく質を１０μｇ含有する。
【図１８】ヒトＳＯＤ１トランスジェニックマウスから得た脊髄分画を用いて実施した免疫組織化学検定の結果を示す。本発明に係る単クローン抗体、いわゆるＤ３Ｈ５で染色した場合、ＷＴおよび突然変異ＳＯＤ１の両方を認識した。発症前の突然変異ＳＯＤ１トランスジェニックマウス（Ｇ３７ＲおよびＧ９３Ａ）およびヒトＷＴトランスジェニックマウスから得た脊髄スライス（２５μｍ）を、マウス単クローン抗−ヒトＳＯＤ１抗体（Ｄ３Ｈ５クローン）を用いて染色し、ビオチン化二次抗体、および、アビジン−ビオチン複合体システム（ヴェックタステイン社製）で処理した。ミノベンジジン（ＤＡＢ）を色原体として用いた。ハイブリドーマ培養培地の上清から抗体を得た。（１：５００）図１８ｅおよびｆは一次抗体なしの負のコントロールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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