(57)【要約】本発明は、ＳｔＸ細胞、幹細胞または生殖細胞を対象とした、表現型にしたがった細胞の特徴付けを可能とする、鳥類の細胞のマーカーの新規な組み合わせに関するものである。また、本発明は、前記マーカーを用いて鳥類の細胞を特徴付ける方法、ならびに、本発明の方法によって細胞を特徴付ける、鳥類の細胞の培養方法にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｔＸ型、幹細胞型または生殖細胞型の鳥類の細胞を特徴付けることを可能にするマーカーの組み合わせであり、同じグループ、あるいは異なる二つのグループから選択される少なくとも二つのマーカーを含む組み合わせであって、該グループが、
ａ．  １Ｐ０６、２ｃｏｎｔｉｇ５８、６０Ｓ−Ｌ１４、ＡＴＭ、ブルーム症候群、ＢＴＥＢ４、ＣＤ９、ＣＨＤヘリカーゼ、Ｃｌｏｃｋ、ｃｗｆ１６（ＦＬＪ１０３７４）、ＣＸＣＲ４、Ｄｎｍｔ２、ｅｎｘ１（ｈｏ−ｚｅｓｔｅ２）、ｅｏｍｅｓ、ＥＷＳ、ＦＧＦ−４、ＧＡＴＡ−５、ＨＯＪ−１、Ｎ−ＡＧＮ６Ｐデアセチラーゼ、Ｎ−Ｃｏｒ１、ＮＦ２、ｐ５３、ｐｍｌ、ｒｂｍ６、ＳＡ−２、ＳＡ−３、ＳＡＲＡ、ＳＣＹＥ１、ＳＥＦ、ｓｆ−１、ＳｎｏＮ、ＳＯＣＳ１３、ＳＳＢ−１、ＴＣ８７４７９、Ｔ細胞ＡＰＰ２Ｃ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２、ＷＤ４０／ＦＹＶＥ−ｄタンパク質２、ＷＤ−ＲＰ３、Ｚａｎ７５、ＺＰＣという遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、ＳｔＸ細胞で好適に発現する標的遺伝子の一つのマーカー、ならびに／または、
ｂ．  １Ｐ０６、１Ｐ０８−Ａ０９、アクチビンＲＩＩＢ、アスタシン、Ｃｌａｕｄｉｎ−３、ｄａｐｐｅｒ−１、Ｄｏｒｆｉｎ、ＦＰＰシンターゼ（ｆｐｓ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｇｃｎｆ、ＨＳＰｂ７、ＩＲＸ４、ＬＭＸ、ｐａｘ−６、Ｓｌｃ３８ａ２、ｓｏｘ−３、ｔｒａ１  ｇｐ９６、ｗｎｔ−１０ａ、ｗｎｔ−１１という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、幹細胞で好適に発現する標的遺伝子の一つのマーカー、ならびに／または、
ｃ．  アディポネクチン、ＢＭＰ−２ＩＫ、ｂｒｕｎｏ  ｌｉｋｅ、ＣＤ３４、ＣＤＫ５アクチベーター１、ｄｋｋ１、ｄｋｋ３、ＤＭＲＴ１、ｅｍｘ２、エンドグリン、ＦＡＳＴ−１、ＦＧＦ  Ｒ、ＦＬＪ００１８８、ｆｌｋ−１、ｇａｔａ−４、ｇｃｌ、ＬＨＸ９、ＮＯＳタイプＩＩＩ、ｐｌｚｆ、ＰＲＬ−Ｒ  ｂｏｘ１ｌ、ＰＴＥＮ、ＳＡＭＳＮ−１、ｓｌｕｇ、ｓｍａｄ３、Ｓｍａｒｃｄ３、ｓｏｘ−９、Ｓｔｒａｔ８、ＴＡＣＣ２、ＴＣ９５４０８、ＴＣ９７６９４、ＴＧＦ  ＲＩＩ、ＴＧＦ  ＲＩＩＩ、ｔｉｅ２、ｔｉｅ−２、ＴＲ−ａｌｐｈａ、ｖａｓａ、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｖｅｒａ、Ｗｉｓｐ−１という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子の一つのマーカー、
である、マーカーの組み合わせ。
【請求項２】
ＳｔＸ細胞で好適に発現する標的遺伝子のマーカーが、１Ｐ０６、ＡＴＭ、ＣＸＣＲ４、ｅｏｍｅｓ、ＦＧＦ−４、ＧＡＴＡ−５、ＮＦ２、ＳＯＣＳ１３、ＳＳＢ−１、ＴＣ８７４７９、Ｔ細胞ＡＰＰ２Ｃ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２、ＷＤ−ＲＰ３、ＺＰＣという遺伝子およびこれらの組み合わせのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項３】
ＺＰＣ遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
幹細胞で好適に発現する標的遺伝子のマーカーが、１Ｐ０６、アクチビンＲＩＩＢ、アスタシン、Ｃｌａｕｄｉｎ−３、ｄａｐｐｅｒ−１、ＦＰＰシンターゼ（ｆｐｓ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｇｃｎｆ、ＬＭＸ、ｐａｘ−６、ｔｒａ１  ｇｐ９６、ｗｎｔ−１０ａという遺伝子およびこれらの組み合わせのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項５】
１Ｐ０６遺伝子とｔｒａ−１遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項６】
生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子のマーカーが、アディポネクチン、ＤＭＲＴ１、エンドグリン、ＦＡＳＴ−１、ＦＧＦ  Ｒ、ＦＬＪ００１８８、ｇａｔａ−４、ＬＨＸ９、ｐｌｚｆ、ＰＲＬ−Ｒ、ｂｏｘ１ｌ、ＰＴＥＮ、Ｓｔｒａｔ８、ＴＧＦ  ＲＩＩＩ、ｖａｓａ、Ｗｉｓｐ−１という遺伝子およびこれらの組み合わせのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項７】
ＤＭＲＴ１遺伝子およびｖａｓａ遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項８】
マーカーが、標的遺伝子の発現産物、すなわちｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはポリペプチドまたはこれらの断片に特異的に結合する抗体と、前記標的遺伝子によって発現するｍＲＮＡもしくは対応するｃＤＮＡまたはこれらの断片に特異的にハイブリダイズする能力を有する核酸断片とから選択されることを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項９】
同一の担体、好ましくは標準的な担体上にまとめられることを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の組み合わせ。
【請求項１０】
標的遺伝子とハイブリダイズすることのできる核酸断片が好ましくは標準的な形で置かれている担体を含む、鋳型ＤＮＡの形であることを特徴とする、請求項９に記載の組み合わせ。
【請求項１１】
ＤＮＡチップ上に置かれることを特徴とする、請求項１０に記載の組み合わせ。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一つに記載のマーカーの組み合わせを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１３】
鳥類細胞を特徴付ける方法であり、請求項１〜請求項１１のいずれか一つに記載のマーカーの組み合わせを用いて前記細胞で発現する遺伝子の発現を分析することと、分析された細胞の表現型を特徴づけることを含む、鳥類細胞の特徴付けの方法。
【請求項１４】
鳥類細胞の培養方法であり、適切な培地での細胞の培養と、請求項１３に記載の方法を用いた該細胞の特徴付けを含む、鳥類細胞の培養方法。
【請求項１５】
ＳｔＸ細胞、幹細胞および生殖細胞から選択される細胞を単離することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
不活性化された支持細胞層「フィーダー」を添加していない適切な培地で培養されたＳｔＸ細胞から生殖細胞を得ることを特徴とする、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳｔＸ細胞、幹細胞または生殖細胞を対象とした、表現型にしたがった細胞の特徴付けを可能とする、鳥類の細胞のマーカーの新規な組み合わせに関するものである。また、本発明は、前記マーカーを用いて鳥類の細胞を特徴付ける方法、ならびに、本発明の方法によって細胞を特徴付ける、鳥類の細胞の培養方法にも関するものである。
【０００２】
本発明の目的は、胚性、生殖性あるいは成体性のいずれであれ、幹細胞の生殖能力、特に鳥類の幹細胞の生殖能力を正または負に定義、修飾、制御するためのマーカーとして利用することのできる遺伝子の独自の組み合わせを同定し、利用することである。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、胚または成体に由来する多能性細胞であり、該多能性細胞は、自己再生能力を有し、また、特化した分化細胞を生み出す能力を有している。換言すれば、幹細胞は、培養によって無限に分裂する能力および娘細胞を生み出す能力を有する非ガン性の細胞であり、該娘細胞は、自身の元となる母細胞と同じ増殖能力および分化能力を有している。
【０００４】
さまざまなクラスの幹細胞が、胚または成体といったそれらの由来と、体細胞組織または生殖組織といったそれらの組織的由来にしたがって単離されている。マウスの胚性幹細胞（ＭＥＳＣ）は、胚の中に再導入されたとき、生殖系を導く能力を有することが示されている。この生殖能力を制御する分子メカニズムは完全には特定されていない。
【０００５】
幹細胞は、該細胞が組織の維持と再生を保証するインビボと、該細胞を所定の培養条件で維持することのできるインビトロの両方で自己再生するという素晴らしい特性を有する細胞である。
【０００６】
幹細胞の組織的由来およびそれらの分化能力に応じて、胚に由来する多能性細胞である胚性幹細胞（ＥＳＣ）、生殖幹細胞（ＥＧＣ）、および組織に由来する体性幹細胞または成体幹細胞（ＡＳＣ）に区別される。体性幹細胞または成体幹細胞は、インビトロおよびインビボの両方において、それらの分化能力に一定の可塑性を有している。
【０００７】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）
ＭＥＳＣ細胞
胚性幹細胞（ＥＳＣ細胞）は８０年代にマウスで単離、同定され（Ｍａｒｔｉｎ，１９８１、Ｅｖａｎｓ＆Ｋａｕｆｍａｎ．，１９８１）、それらの単離は、それ以前に胚性癌腫細胞（すなわちＥＣ細胞）を用いて行われてきた、一連の多くの研究の一環をなしている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ＆Ｓｍｉｔｈ，２００４参照）。これらマウスのＥＳＣ細胞（ＭＥＳＣ）は、記載されているさまざまな手順（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９８７、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）にしたがって、１２９／ＳＶマウスの胚盤胞をインビトロで培養することで得られた。原腸形成前のマウスの胚盤胞は、５０から１００個の細胞からなる内部細胞塊すなわちＩＣＭを有しており、該ＩＣＭの分子の特徴付けはまだ進行中である。これらの細胞の生物学的宿命は、インビボとインビトロで同一ではない。
【０００８】
インビボでは、胚盤葉上層の細胞は胚組織を生じさせ、生殖細胞が、胚体外外胚葉による誘導の下、近位胚盤葉上層で形成される。こうして、さまざまな因子およびサイトカインの影響下で、生殖細胞はニッチにおいて現れる。この誘導の原因となる複雑な分子メカニズムはマウスにおいて特定されはじめたばかりである（Ｓａｉｔｏu  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００９】
インビトロでは、胚盤胞の培養により、該胚盤胞の孵化、適切な培養条件においてＭＥＳＣ細胞を生み出すＩＣＭの細胞の付着および増殖が得られる。これらインビトロでの培養条件は、とりわけ、培地にＬＩＦファミリーの少なくとも一つのサイトカインを添加することによって、以降、比較的良好に特定され、標準化されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。また、シグナル伝達の新しい経路も、ＭＥＳＣ細胞の多能性の表現型の維持に関与すると考えられる（Ｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＭＥＳＣ細胞の多能性を制御する分子メカニズムに関して非常に多くの研究が公開されている。このモデルにおいて、さまざまな分子アプローチおよび機能的アプローチによって、ｏｃｔ−３／４遺伝子（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｎａｎｏｇ遺伝子（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｍｉｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、およびｓｔａｔ３遺伝子（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）の、鍵となる役割が明らかになった。総意の概要によると、ＬＩＦとＢＭＰが有糸分裂シグナルの中心にあるとされ、Ｏｃｔ／ｎａｎｏｇおよびｓｔａｔ３遺伝子は、ＥＳ細胞の増殖−分化のバランスの調節因子およびエフェクターとされている（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。下流エフェクターの一つは、ＳＴＡＴ３によって直接調節されるｃ−ｍｙｃプロトオンコジーンである（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ｎａｎｏｇの発現レベルを制御していると考えられる（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）Ｐ５３タンパク質のようなその他のアクターも関与している。ＯＣＴ−３／４タンパク質は、ＳＯＸ−２および／またはＳＯＸ−３のようなＨＭＧファミリーのタンパク質との結合によって、該ＯＣＴ−３／４タンパク質の固有のプロモーターのレベルで自身の転写を制御する（Ｏｋｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。特に、マウスの生殖系でのＯｃｔ−３／４遺伝子の発現の制限は、ＧＣＮＦの抑制作用下にある（Ｆｕｒｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。Ｉｒｈ−１受容体に関しては、胚盤葉上層の細胞におけるように、発生のより早い段階での維持に関与している（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。少なくともマウスにおいては、生殖能力はとりわけ、このｏｃｔ−３／４遺伝子の発現が生殖系にとって不可欠であっても、強いレベルのＧＣＮＦと、比較的弱いレベルのＯＣＴ−３／４を必要とすると考えられる（Ｋｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。さまざまなシグナル伝達ネットワークのアクター間で多くの相互作用が存在することは、ＭＥＳＣ細胞の多能性の維持を理解するために未だ完全には解明されていない一つの事実である。
【００１０】
また、ＭＥＳＣ細胞の確立の成功は、用いるマウスの株にも依存し、１２９ＳＶの遺伝的背景からは確立が容易であることに注目すべきであろう。この限界の分子的な特定に関する記録はない。
【００１１】
ＰＥＳＣ細胞とＨＥＳＣ細胞
霊長類では、はじめて猿のＥＳＣ細胞（ＰＥＳＣ）が、マディソン大学（ＷＳ）のＪ．Ｔｈｏｍｓｏｎによって胚盤胞から単離された（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。それ以降、その他の研究所もさまざまな種から猿の新しい細胞系を単離してきている。生化学的特徴のレベル（ＡＰ、テロメラーゼ、表面抗原など）と同時に、多能性の維持に関与する遺伝子のレベルでの、これらの細胞の特徴付けもまた、多くの研究発表の対象となってきた。
【００１２】
ヒトにおいては、ＥＳＣ細胞（ＨＥＳＣ）が胚盤胞の培養によってインビトロで得られた（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。これらの細胞は、ＭＥＳＣ細胞と多くの共通点を有しているが、同時に、さまざまな成長因子に対する感受性など、大きな違いも有している。
【００１３】
ＰＥＳＣ細胞およびＨＥＳＣ細胞の多能性の維持に関与するメカニズムにおいては、マウスで同定された遺伝子も関与していると考えられるが、状況はより複雑である。たとえば、ＬＩＦおよびＪａｋ／ｓｔａｔ経路の活性化に対するＰＥＳＣ細胞およびＨＥＳＣ細胞の感受性は、マウス細胞の感受性ほど決定的ではないと考えられている（Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがって、これらの細胞はこの単一のサイトカインのみに依存しているわけではなく、このことが増殖シグナルの分析をより複雑にしている。霊長類のＥＳＣ細胞において、ｏｃｔ−３／４、ｎａｎｏｇおよびｓｔａｔ３という主要なアクター、並びに、ｒｅｘ１、ｆｏｘＤ３などのようなその他のアクターの発現が見られても、これらの遺伝子の役割はそれほど決定的ではなく、別の経路の存在が考えられる。
【００１４】
ＣＥＳＣ細胞
ニワトリの胚性幹細胞（ＣＥＳＣ）は、ステージＸのニワトリの胚盤葉細胞を培養することによって単離された（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、仏国特許出願公開第９４／１２５９８号明細書）。これらＣＥＳＣ細胞は、体細胞性および生殖性のコロニー形成を含む、胚性幹細胞（ＥＳＣ）のあらゆる特徴を有している。しかし、この生殖性のコロニー形成は、マウスのＥＳ細胞とは逆に、インビトロでの数代の継代培養の後の維持が難しいと考えられる。ＣＥＳ細胞の採取段階および培養段階では、ニワトリの胚は、既に５００００から６００００個の細胞で構成される胞胚だと考えられ、該胞胚は、二つの胚葉、すなわち胚盤葉上層と胚盤葉下層で組織されている。細胞の三次元分布と配置という形態的な基準だけでは、さまざまな細胞の亜型、とりわけ生殖能力を有する細胞の亜型を確実に、特異的に同定することができない（Ｐｅｔｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｃａｒｓｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｔｈｏｒａｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。非常に早期（Ｅｇ＆ＫのステージＩＩＩ−ＩＶ）のニワトリの胚でＶＡＳＡタンパク質についての陽性細胞が検出されたことで、ニワトリにおける生殖系の前成説が提示された。細胞は、マウスで観察される誘導モデル（Ｅｘｔａｖｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｓａｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）よりもショウジョウバエのモデルにより近いモデルにおいて、胚の最初の分裂後すぐに生殖系における特徴を与えられる（Ｔｓｕｋｅｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの細胞は、連続する分裂の過程で、ステージＸまで存続することになる。
【００１５】
ニワトリのＣＥＳＣ細胞について、ニワトリの胚における生殖系の多能性と出現の維持に関わる遺伝子に関する利用可能なデータはない。その他の種で同定されている大半の遺伝子の発現プロファイルならびにその調節はまったく分かっていない。
【００１６】
成体幹細胞（ＡＳＣ細胞）
インビトロおよびインビボでの自己再生と分化の特性を有する細胞が組織から単離され、ＡＳＣ「成体幹細胞」（Ａｄｕｌｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）と呼ばれている（Ｗａｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，２００４）。これらの細胞は、主に哺乳類であるさまざまな種において、さまざまな組織、とりわけ造血組織（ＨＳＣ、  Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、造血幹細胞）および神経組織（ＮＳＣ、  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、神経幹細胞）から単離された。非常に多くの文献がこれらの細胞を説明し、特徴付けることを目的としている（Ｓｈｉｚｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｍａｙｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４参照）。幹細胞の特性を部分的に有するその他の多くの細胞型が同定された。
−間葉細胞（ＭＳＣ）（Ｈａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、
−筋衛星細胞（Ｃｈａｒｇｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，２００４、Ｓｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、
−多能性前駆細胞「ＭＡＰＣ」（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、
−中胚葉性血管芽細胞（Ｃｏｓｓｕ  ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｏ，２００３、Ｍｉｎａｓｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２）、
を挙げることができる。
【００１７】
観察された該細胞の高い分化の可塑性によって、成体幹細胞を、背景、場所、そして該細胞が受けるシグナルにしたがって分化の決定論を変えることのできる細胞として見なすことが可能となる（Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ，２００５、Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。少なくともインビトロでＥＳＣ細胞とＡＳＣ細胞の間に存在する関連性は、限定された分化の過程の連続として現れうる。実際、分化のとある特定の経路において、ＥＳＣ細胞から、完全に分化した配列をインビトロで再産生することができる。分化経路の誘導というこれらの複雑なメカニズムの制御は、これらの細胞の決定論を理解する上で大きな重要性を有する。
【００１８】
生殖幹細胞（ＥＧＣ細胞）と生殖能力
原腸形成段階の前に得られる胚に直接由来するＥＳＣ細胞とは異なり、生殖性の胚性幹細胞（ＥＧＣ細胞）は、胚内で既に形成されている生殖隆起から得られるものであり、該隆起は生殖性の前駆細胞がコロニー形成したものである。生殖系の出現の過程で、かつ種にしたがって、前駆細胞は胚のさまざまな領域における特徴を与えられる。もっともよく研究され、分子レベルでもっともよく解明されはじめている例は、マウスの生殖系の例である。
【００１９】
マウスのＥＧ細胞（ＭＥＧＣ）はＭＥＳＣ細胞との多くの共通性を有しているが、主要な差異の一つは、特定の遺伝子のエピジェネティックな状態に関するものである（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｒｅｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。エピジェネティックな状態とは、ＤＮＡおよびヒストンのような関連タンパク質の直接的な修飾の程度を意味する。この状態は、ユークロマチン、または転写的に不活性のヘテロクロマチンドメインに対応するＤＮＡの転写活性の大半を決定する。この状態を、とりわけｄｎｍｔ遺伝子のような特定のメチル基転移酵素を修飾および制御するために、多くの分子が介入するが、ＥＳＣ細胞に対する、かつ発生の過程における、該分子の効果が研究されはじめている（Ｇａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｂｉｎｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００２０】
生殖能力とは、機能的な性細胞の分化した前駆細胞を産生する細胞の能力を意味する。始原生殖細胞は雄性細胞（精原細胞）または雌性細胞（卵母細胞）を生み出し、該細胞はそれぞれ成熟した精子と成熟した卵母細胞を生み出す能力がある。
【００２１】
この生殖能力はインビボまたはインビトロで観察することができる。
【００２２】
インビボでは、種にしたがって、生殖細胞は、組織およびニッチ内の周辺細胞による誘導プロセスにしたがって特徴を与えられる。もっとも研究されている例はキイロショウジョウバエと線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの例であり、これらは多くの突然変異体が得られている種である。このプロセスは、初めての誘導モデルが提案されたものであるマウスにおいては分子レベルで記載され始めている（Ｓａｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｏｈｉｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。該モデルは、生殖細胞が特徴を与えられる特異的なニッチという概念を利用している。誘導は、ｏｃｔ−３／４、ｂｌｉｍｐ−１、ｓｔｅｌｌａマーカー、ｆｒａｇｉｌｉｓマーカーなどのような鍵遺伝子の転写レベルを修飾するＢＭＰ−４因子およびＢＭＰ−８因子を介して周辺細胞によって制御される。
【００２３】
その他の種では、生殖系への特徴の付与は母親由来の構成要素の影響を強く受ける。ＲＮＡ結合タンパク質はこのとき、分節していない胚において特定の構成要素（タンパク質およびＲＮＡ）の勾配を確立する上で主要な役割を果たすことになるのだが、該ＲＮＡ結合タンパク質は、胚の所定の位置における生殖細胞の同一性を誘導する能力を有するこれらのタンパク質および／またはメッセンジャーＲＮＡの「隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）」を誘導するものでもある。この区画化に関与する遺伝子は、キイロショウジョウバエやＣ．ｅｌｅｇａｎｓのようなモデル生物で特に研究され始めている（Ｅｘｔａｖｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００４）。この決定論におけるさまざまな遺伝子の記載、数および関与性は、とりわけ科学雑誌およびｈｔｔｐ：／／ｇｅｒｍｏｎｌｉｎｅ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐのようなさまざまなアクセス可能なサイトを通して記録されている。
【００２４】
インビトロでは、最近の例によって、生殖能力のある細胞へのマウスの胚性幹細胞（ＭＥＳＣ）の分化条件を部分的に再現することが可能であることが示されている。この過程は、実験的には成長因子と特定の三次元的な条件に依存している。ＭＥＳＣから生殖細胞を得るための、ＢＭＰ−４因子およびＢＭＰ−８因子、ならびに、エストロゲンやＦＳＨのようなホルモンが発見されている（Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｇｅｉｊｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００２５】
とりわけ、ウイルスを複製するため、あるいは、異種タンパク質の産生、場合によってはワクチンを産生するための、鳥類の細胞、ステージＸ（ＳｔＸ）の胚盤葉細胞、幹細胞、または生殖細胞のさまざまな培養方法が知られている。これらの方法は特に、以下の特許出願および特許に記載されている。すなわち、国際公開第０３／０４３４１５号パンフレット、国際公開第２００５／００７８４０号パンフレット、国際公開第０３／０７６６０１号パンフレット、国際公開第０１／８５９３８号パンフレット、国際公開第９６／１２７９３号パンフレット、欧州特許第１１４９８９９号明細書、米国特許出願公開第２００２／１９２８１５号明細書または米国特許第６５００６６８号明細書である。
【特許文献１】仏国特許出願公開第９４／１２５９８号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０４３４１５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
以上のさまざまな形状の細胞を分化させるさまざまな手段が知られている。しかし、使用がより簡単でより効果的な、さまざまな細胞の表現型を特徴付ける技術を利用できるようにすることが重要である。
【００２７】
複数の遺伝子がニワトリの胚性幹細胞（ＣＥＳＣ）あるいはニワトリの生殖幹細胞（ＣＥＧＣ）で発現するものとして同定されている。これらさまざまなアクターの相対的な発現レベルを比較することによって、これらの細胞それぞれの分子プロファイルと、ＣＥＳＣ細胞の確かな生殖能力を得るために必要な修飾とを規定する、特異的かつ新規の組み合わせを提案することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明によるマーカーの組み合わせと方法によって、とりわけ、鳥類の細胞系の良好なトレーサビリティを保証することが可能となるだけではなく、培養された細胞系の時間経過後の良好な安定性を保証することも可能となる。
−幹細胞とは、インビトロで自己再生する能力を有し、特化した分化細胞を生み出す能力を有するあらゆる細胞を意味する。
−生殖細胞とは、前駆細胞または雄性あるいは雌性の性分化した細胞を生み出す能力を有するあらゆる細胞を意味する。
−「ＳｔＸ細胞」とも呼ばれるステージＸの胚盤葉細胞とは、産卵されたばかりの受精卵から胚を分離することで得られ、発生段階がＥＧ＆Ｋ（Ｅｙａｌ  Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｖａｋ，１９７６）の表にしたがったステージＸに対応する、胚盤葉細胞を意味する。
−ＤＮＡチップとは、高濃度で担体（ガラス片、ナイロン膜など）に置かれた遺伝子の集合、遺伝子断片の集合、オリゴヌクレオチドの集合を意味する。
−減数分裂とは、二倍体細胞の遺伝物質を半数体レベルになるまで減らす生物学的プロセスを意味する。このプロセスは少なくとも一回の細胞分裂を伴う。
−機能的な性細胞とは、一組の染色体をもう一方の半数体細胞に融合するか、または与えることで、受精の際に、胚で発生する能力を有する２倍体細胞である卵を形成する能力を有する半数体細胞を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
したがって、本発明はＳｔＸ型の鳥類の細胞、幹細胞または生殖細胞を特徴付けることを可能にするマーカーの組み合わせに関するものであり、該組み合わせは、
ａ．  １Ｐ０６、２ｃｏｎｔｉｇ５８、６０Ｓ−Ｌ１４、ＡＴＭ、ブルーム症候群、ＢＴＥＢ４、ＣＤ９、ＣＨＤヘリカーゼ、Ｃｌｏｃｋ、ｃｗｆ１６（ＦＬＪ１０３７４）、ＣＸＣＲ４、Ｄｎｍｔ２、ｅｎｘ１（ｈｏ−ｚｅｓｔｅ２）、ｅｏｍｅｓ、ＥＷＳ、ＦＧＦ−４、ＧＡＴＡ−５、ＨＯＪ−１、Ｎ−ＡＧＮ６Ｐデアセチラーゼ、Ｎ−Ｃｏｒ１、ＮＦ２、ｐ５３、ｐｍｌ、ｒｂｍ６、ＳＡ−２、ＳＡ−３、ＳＡＲＡ、ＳＣＹＥ１、ＳＥＦ、ｓｆ−１、ＳｎｏＮ、ＳＯＣＳ１３、ＳＳＢ−１、ＴＣ８７４７９、Ｔ細胞  ＡＰＰ  ２Ｃ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２、ＷＤ４０／ＦＹＶＥ−ｄタンパク質２、ＷＤ−ＲＰ３、Ｚａｎ７５、ＺＰＣという遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、ＳｔＸ細胞で好適に発現する標的遺伝子の、少なくとも一つのマーカー、ならびに／または、
ｂ．  １Ｐ０６、１Ｐ０８−Ａ０９、アクチビンＲＩＩＢ、アスタシン、Ｃｌａｕｄｉｎ−３、ｄａｐｐｅｒ−１、Ｄｏｒｆｉｎ、ＦＰＰシンターゼ（ｆｐｓ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｇｃｎｆ、ＨＳＰｂ７、ＩＲＸ４、ＬＭＸ、ｐａｘ−６、Ｓｌｃ３８ａ２、ｓｏｘ−３、ｔｒａ１  ｇｐ９６、ｗｎｔ−１０ａ、ｗｎｔ−１１という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、幹細胞で好適に発現する標的遺伝子の、少なくとも一つのマーカー、ならびに／または、
ｃ．  アディポネクチン、ＢＭＰ−２ＩＫ、ｂｒｕｎｏ  ｌｉｋｅ、ＣＤ３４、ＣＤＫ５アクチベーター１、ｄｋｋ１、ｄｋｋ３、ＤＭＲＴ１、ｅｍｘ２、エンドグリン、ＦＡＳＴ−１、ＦＧＦ  Ｒ、ＦＬＪ００１８８、ｆｌｋ−１、ｇａｔａ−４、ｇｃｌ、ＬＨＸ９、ＮＯＳタイプＩＩＩ、ｐｌｚｆ、ＰＲＬ−Ｒ  ｂｏｘ１ｌ、ＰＴＥＮ、ＳＡＭＳＮ−１、ｓｌｕｇ、ｓｍａｄ３、Ｓｍａｒｃｄ３、ｓｏｘ−９、Ｓｔｒａｔ８、ＴＡＣＣ２、ＴＣ９５４０８、ＴＣ９７６９４、ＴＧＦ  ＲＩＩ、ＴＧＦ  ＲＩＩＩ、ｔｉｅ２、ｔｉｅ−２、ＴＲ−ａｌｐｈａ、ＶＥ−カドヘリン、ｖｅｒａ、Ｗｉｓｐ−１という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子の、少なくとも一つのマーカー、
を含んでいる。
【００３０】
ＳｔＸ細胞、幹細胞および生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子のリストは、ＰＣＲによって該標的遺伝子を単離するために用いたプライマーとともに、それぞれ図１〜図３に示している。
【００３１】
本発明による組み合わせが、同一のグループあるいは前もって規定された異なる二つのグループから選択される少なくとも二つのマーカー（ＳｔＸ細胞、幹細胞または生殖細胞で発現する遺伝子のマーカー）を含むことが理解される。
【００３２】
好ましくは、ＳｔＸ細胞で好適に発現する遺伝子のマーカーは、１Ｐ０６、ＡＴＭ、ＣＸＣＲ４、ｅｏｍｅｓ、ＦＧＦ−４、ＧＡＴＡ−５、ＮＦ２、ＳＯＣＳ１３、ＳＳＢ−１、ＴＣ８７４７９、Ｔ細胞ＡＰＰ２Ｃ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２、ＷＤ−ＲＰ３、ＺＰＣという遺伝子のマーカー、およびこれらの組み合わせから選択される。より好ましくは、本発明による組み合わせはＺＰＣ遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含む。
【００３３】
本発明のもう一つの好ましい実施態様によると、幹細胞で好適に発現する遺伝子のマーカーは、１Ｐ０６、アクチビンＲＩＩＢ、アスタシン、Ｃｌａｕｄｉｎ−３、ｄａｐｐｅｒ−１、ＦＰＰシンターゼ（ｆｐｓ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｇｃｎｆ、ＬＭＸ、ｐａｘ−６、ｔｒａ１、ｇｐ９６、ｗｎｔ−１０ａという遺伝子のマーカー、およびこれらの組み合わせから選択される。より好適には、本発明による組み合わせは１Ｐ０６遺伝子およびｔｒａ−１遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含む。
【００３４】
本発明の更なるもう一つの実施態様によると、生殖細胞で好適に発現する遺伝子のマーカーは、アディポネクチン、ＤＭＲＴ１、エンドグリン、ＦＡＳＴ−１、ＦＧＦ  Ｒ、ＦＬＪ００１８８、ｇａｔａ−４、ＬＨＸ９、ｐｌｚｆ、ＰＲＬ−Ｒ  ｂｏｘ１ｌ、ＰＴＥＮ、Ｓｔｒａｔ８、ＴＧＦ  ＲＩＩＩ、Ｗｉｓｐ−１という遺伝子のマーカー、およびこれらの組み合わせから選択される。より好適には、組み合わせはｄｍｒｔ−１遺伝子およびｖａｓａ遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含む。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様によると、組み合わせは、１Ｐ０６、ｔｒａ−１、ＦＰＰシンターゼ、アスタシン、ＧａｌｎａｃＴ３、ｌｍｘ、ｇｃｎｆ、ｅｏｍｅｓ、ｉｄ２、ＦＧＦ−４、ＺＰＣ、ｇａｔａ−５、ｄｍｒｔ−１、ｌｒｈ−１、ｐｔｅｎという遺伝子のマーカーの組み合わせを含む。
【００３６】
「マーカー」とは、本発明によると、本発明による細胞、すなわち鳥類の細胞における標的遺伝子の発現を同定すること、かつ場合によって定量化することを可能にする、生物学的、化学的または物理的なあらゆる手段を意味する。このようなマーカーは当業者には良く知られている。その組成は特に、標的遺伝子および該標的遺伝子の発現を検出する方法によって決まる。とりわけ、抗体／抗原の結合体を利用する方法が挙げられ、当該結合体において、抗体は抗原と特異的に結合し、該抗原は、上記の同定される遺伝子の発現産物、すなわち、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡもしくはポリペプチド、またはこれらの断片で構成される。また、前記遺伝子によって発現するｍＲＮＡもしくは対応するｃＤＮＡまたはそれらの断片に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸断片を挙げることができる。
【００３７】
当然、さまざまなタイプのマーカーを本発明による組み合わせに組み込むことができる。
【００３８】
有利には、本発明によるマーカーは、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ、すなわち上記で特定した標的遺伝子の発現産物とハイブリダイズする能力を有する核酸配列である。
【００３９】
これらの核酸配列のうち、図１〜図３で特定されているプライマーの特定の配列を挙げることができる。
【００４０】
本発明のより具体的な実施態様によると、マーカーの組み合わせは同一の担体、好ましくは標準的な担体上にまとめられる。当業者であればこれらさまざまな担体を知っており、該担体のサイズは、マーカーのタイプと、一つまたは複数の標的遺伝子の発現を検出するために用いることのできる装置のタイプにしたがって変わる。
【００４１】
有利には、本発明によるマーカーの組み合わせは鋳型ＤＮＡの形であり、好ましくは標準的な形で、標的遺伝子とハイブリダイズすることができる核酸断片が置かれる担体を含む。このような担体のサイズは、用いる調製技術および検出技術にしたがって変わってもよい。また、小さなサイズのこのような担体はＤＮＡチップとも呼ばれる。
【００４２】
有利には、本発明によるマーカーの組み合わせは、ＤＮＡチップ上に置かれる。本発明によるマーカーの組み合わせを含むＤＮＡチップもまた、本発明の一部をなす。
【００４３】
本発明の具体的な実施態様によると、マーカーの組み合わせはさらに、二つのグループの細胞、すなわち、ＳｔＸ細胞と幹細胞、幹細胞と生殖細胞、生殖細胞とＳｔＸ細胞で発現する遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことができる。
【００４４】
このような遺伝子はそれぞれ、対応する「プライマー」と共に図４〜図６で特定されている。
【００４５】
「発現産物」とマーカーとの相互作用を検出する手段は当業者には良く知られている。学術研究機関、またはＤＮＡチップの調製手段および利用手段（読み取り機器、シグナル処理ソフトウェア、データベースなど）を市販している企業に関するような、ＤＮＡチップの調製および利用に関する多くの科学的刊行物の参考文献は、とりわけｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｃｈｉｐｓ．ｃｏｍ、ｗｗｗ．ｄｅａｔｈｓｔｒａｍｉｃ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｃｈｉｐｓ．ｈｔｍｌ、またはｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌといったウェブサイトに示されており、該サイトの内容および引用した参考文献の内容は、本発明に参照により組み込まれる。
【００４６】
また、本発明は、鳥類の細胞を特徴付ける方法であって、前記で定義される、および実施例で定義されるマーカーの組み合わせを用いた、前記細胞内で発現する遺伝子の発現の分析と、分析された細胞の表現型の特徴付けとを含む方法にも関するものである。遺伝子の発現を分析する具体的な方法は、前記で定義される、および実施例で定義される本発明による組み合わせで用いられるマーカーによって決まるものである。
【００４７】
また、本発明は、適切な培地での細胞の培養と、前記で定義される、および実施例で定義される本発明によるマーカーの組み合わせを用いる、本発明による方法を用いる該細胞の特徴付けとを含む、鳥類の細胞の培養方法にも関するものである。有利には、本発明による培養方法はまた、ＳｔＸ細胞、幹細胞および生殖細胞から選択された細胞を単離する過程も含んでいる。
【００４８】
また、本発明は、ＳｔＸ細胞から生殖細胞を得るための、鳥類の細胞の培養方法にも関するものである。本発明による方法は、不活性化された支持細胞層「フィーダー」が添加されることなく、適切な培地においてＳｔＸ細胞が培養されるため、このような形質転換が不可能な先行技術の方法とは区別される。
【００４９】
本発明者らは、「フィーダー」の添加という通常の技術が幹細胞を得るために必要であるのに対し、このような「フィーダー」を添加しないことによって、まったく予期しないことに、生殖型の細胞を得ることが可能となることを確認することができた。
【００５０】
「フィーダー」の特徴は当業者には良く知られており、とりわけ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、ｋａｒａｇｅｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０００に記載されているが、これらの内容は本発明に参照により組み込まれる。
【００５１】
生殖型であって胚性幹細胞ではない細胞の特徴付けは、本発明によるマーカーの組み合わせを用いる本発明による特徴付けの方法を利用することで実施した。
【００５２】
本発明のその他の特徴は、以下に示す実施例を読むことで明らかになるものである。
【００５３】
図１：ＳｔＸ細胞で発現する遺伝子の表。
図２：幹細胞で発現する遺伝子の表。
図３：生殖細胞で発現する遺伝子の表。
図４：ＳｔＸ細胞および幹細胞で発現する遺伝子の表。
図５：幹細胞および生殖細胞で発現する遺伝子の表。
図６：生殖細胞およびステージＸの細胞で発現する遺伝子の表。
図７：ＧＦ５８細胞の成長曲線。
図８：ＧＦ５８細胞におけるいくつかの遺伝子の発現レベル（ｐ７）。
図９：性腺で観察されたレベル（＝１）と比較した、ｐ３ｇ画分とｐ４ｇ画分における遺伝子発現の分析。＞１という比率は、遺伝子が、胚の性腺全体におけるよりも試験した画分においてより多く発現したこと、またその逆であることを示している。
図１０：試験した遺伝子クラスの分類。
図１１：分化誘導過程における、クラス１遺伝子の発現レベルの変動。
図１２：分化誘導過程における、クラス２遺伝子の発現レベルの変動。
図１３：分化誘導過程における、クラス３遺伝子の発現レベルの変動。
図１４：ステージＸの胚盤葉細胞、ＣＥＳＣ細胞およびＣＥＧＣ細胞間の、発現プロファイルの比較。
図１５：ＣＥＳＣ細胞、ステージＸの胚盤葉細胞およびＣＥＧＣ細胞間の発現プロファイルの比較。
図１６：ＣＥＧＣ細胞、ステージＸの胚盤葉細胞およびＣＥＳＣ細胞間の発現プロファイルの比較。
図１７：ニワトリのｎａｎｏｇ遺伝子のタンパク質配列とｃＤＮＡ配列。
図１８：ニワトリのｇｃｎｆ遺伝子のタンパク質配列とｃＤＮＡ配列。
【実施例１】
【００５４】
実施例１：インビトロでの胚性幹細胞の取得
ニワトリの胚性幹細胞を孵化卵からインビトロで得た。インビトロで増殖中の胚性幹細胞の集団を得るために二つのアプローチを用いた。
【００５５】
第一の態様として、先行研究に記載されている条件と同様の条件で細胞を得た（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。簡単に説明すると、インキュベートしていない孵化卵を洗浄し、破壊した。卵黄を卵白から分離し、パスツールピペットまたはＣａｒｓｃｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３に記載されているような紙のリングを用いて胚を採取した。こうして得られた細胞を、ウシ胎児血清、アミノ酸、およびサイトカインのような細胞の増殖に必要な要素、ならびに成長因子を含んだ増殖培地の中にある不活性化した支持細胞層上に置いた。
【００５６】
本発明のもう一つの態様では、細胞は、細菌培養の用途に用いられる、処理していないプラスチックの細胞培養箱に直接播種されている。このもう一つの態様の場合、細胞は軽い撹拌にかけられる。数日の懸濁後に、増殖した幹細胞の集合体が形成される。
【００５７】
数日後、胚性幹細胞は小さくまとまった塊を形成し、該塊を、タンパク質分解酵素によって分離し、インビトロでの増幅のために新しい培養箱に播種した。
【００５８】
数回の継代後、培養物はより均質になり、主な細胞型はニワトリの胚性幹細胞（ＣＥＳＣ）であった。これらＣＥＳＣ細胞は、前述したさまざまなマーカー、とりわけ、アルカリホスファターゼ活性、内因性のテロメラーゼ活性、および特異的抗体に対する反応性の有無（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）によって特徴付けした。
【００５９】
培養で得られたＣＥＳＣ細胞を特徴付けるために、電子顕微鏡での観察を行った。該観察は、単離された細胞が表面に非常に多くの微絨毛を有することを示したのだが、これはＣＥＳＣ細胞についてはいまだかつて提示および記載されたことがないことである。また、該観察は、細胞が塊になるとすぐ、あるいは、その他の均質または不均質な細胞（フィーダー細胞）と相互作用するとすぐに、前記微絨毛が消失することを示した。また、電子顕微鏡によって認識されたさまざまな構造および超微細構造が、重要な代謝（リボソーム、網状組織、多くのミトコンドリア）と、重要な核小体が存在することによる強い転写活性とを示すことを示した。これらＣＥＳＣ細胞が平均で７μｍ〜１５μｍのサイズであり、多かれ少なかれ球状の平均が４μｍ〜８μｍのサイズの比較的均質の核を有することが示された。細胞が特に強く結び付いているため、塊状の細胞の細胞間隙は非常に狭かった。
【実施例２】
【００６０】
実施例２：インビトロでの生殖細胞の取得
鳥において、生殖細胞の決定論の分子アクターは未だ同定されていない。この決定論は依然として比較的記録の少ないプロセスである。産卵時の胚の発生段階は、Ｅｙａｌ  Ｇｉｌａｄｉ  ＆  Ｋｏｖａｋ（１９７６）によって提案された発生の表によるとステージＩＸ〜ＸＩである。このステージで、胚は既に推定４００００〜６００００個の細胞を有し、二つの葉層、すなわち胚盤葉上層と胚盤葉下層で構成されている。この段階では、ｖａｓａ遺伝子についての陽性細胞の存在（Ｔｓｕｋｅｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）は、生殖細胞が既に決定されていることを示している。さまざまな刊行物が、ニワトリの胚の生殖隆起の細胞を培養することによる、生殖幹細胞（ＥＧ）のインビトロでの取得を記載している。とりわけ、発生のおよそ５〜６日目に対応する、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ＆Ｈａｍｉｌｔｏｎ（１９５１）によって提案された発生の表によるステージ２８の胚に基づいた、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３の研究を挙げることができる。
【００６１】
本発明のもう一つの態様では、胚細胞は実施例１で説明したように採取されるが、該細胞は、支持細胞層を有さない培養箱に播種される。培養箱は、前もって、卵白溶液、または血清アルブミンのような血清タンパク質が豊富なその他の溶液を用いて、少なくとも１時間またはそれ以上処理した。この卵白溶液は直接採取した卵白またはＰＢＳで希釈した卵白とすることができる。好ましくは、５倍から１０倍希釈した溶液を用いる。したがってこの溶液は、オボアルブミン、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチンおよびリゾチームのような、卵のアルブミンからなる主成分と、より少量のその他の成分を含んでいる。また、精製したオボアルブミン溶液またはコンアルブミン溶液も用いることができる。
【００６２】
本発明の態様では、ステージＩＸ〜ＸＩＩＩの胚盤葉細胞を、「ｖａｓａ」陽性の生殖細胞の増殖を促進する培養条件下で培養箱に播種する。そして、不活性化した支持細胞層「フィーダー」を添加することなく、細胞の接着を促進し、分化を促進しないことを目的として、細胞外基質と同等の「コーティング」を実現するために、培養箱を血清で処理した。数日後、細胞巣が現れたのだが、該細胞の増殖は遅かった。このプロセスは持続し、ＧＦ５８と呼ばれる細胞は少なくとも２００日間、増殖し続けた。この増殖は、特に遅くはあったが、いくつかの小さな細胞巣の形で続いた。細胞を分離することが難しいため、継代は困難である。（希少な）各継代において個別に細胞を計数することが不可能だと考えられたため、細胞の継代時に、希釈係数に基づいて成長「曲線」を作成した（図７）。
【００６３】
これらの細胞は特徴的な形態を有し、大きな核を有する接着性の扁平上皮細胞巣の中心で、小さな塊に増殖した。巣のサイズは非常にゆっくり拡大した。
【００６４】
細胞を「フィーダー」の存在下に戻すためのテストは壊滅的なものであり、細胞がこの環境に耐えられなかった。培地にＢＭＰ−４、ＦＧＦ−４を添加する試験は増殖に対してマイナスの影響は有さず、大きな形態的変化ももたらさなかった。弱い刺激が観察された。
【００６５】
７継代目（培養７９日後）では、細胞は強い外因性のアルカリホスファターゼ活性を有し、ＳＳＥＡ−１抗体およびＥＭＡ−１抗体に対して陽性であった。同じ７継代目で、いくつかの細胞を採取し、分子レベルでの分析を行った。結果（図８）は、１Ｐ０６遺伝子、ｇｃｎｆ遺伝子およびｖａｓａ遺伝子の発現プロファイルが、ＣＥＳＣ細胞よりも性腺のプロファイルに近かったことを示している。
【００６６】
この非常に重要な結果は、ステージＸの胚盤葉細胞の培養によって得られた、培養８０日後のｖａｓａ陽性の生殖細胞を維持するという考えを支持している。これらの細胞はインビトロで維持される生殖細胞である。
【実施例３】
【００６７】
実施例３：胚の性腺の細胞選別による生殖細胞の取得
分子分析に利用可能な量の精製した生殖細胞を得るために、ＦＡＣＳによる選別アプローチを開始した。選別アプローチは、膜タンパク質、すなわちＡＢＣトランスポーターＢｃｒｐ１／ＡＢＣＧ２の受容体の存在に依存するものであり、その発現は最初に、造血幹細胞で同定されている（Ｇｏｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。この分子は造血幹細胞のマーカーとして記載されている。この分子は、解毒という生理学的役割を保証すると考えられ、ヘキストが細胞に導入されたとき、該薬品を細胞外に運ぶ能動輸送の役割を負っている。この特性は幹細胞に特異的であると考えられ、現状では、さまざまな組織における細胞選別の際の特徴付けにしたがって「ＳＰ細胞」すなわち「ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」を同定するために利用されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。興味深いことに、マウスの生殖細胞がこの特性を有すると考えられている（Ｌａｓｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００６８】
最初のアプローチで、ｂｃｒｐ１メッセンジャーの発現レベルは、ＣＥＳＣ幹細胞よりもニワトリの生殖細胞でより高かった（以下参照）。したがって、この遺伝子は、ニワトリにおける幹細胞と生殖細胞を同定するための補助的なマーカーとなる。
【００６９】
ＣＥＳＣ細胞とニワトリの生殖細胞におけるマーカーとしてのこの分子の役割をテストするため、ニワトリの胚の性腺の分画試験を行った。発生の１５日〜２１日目の男性胚の性腺を、胚を切除した後に採取し、氷の中に置いた。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６．６ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５％の乳酸塩、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質混合物を含有する、１×ＨＢＳＳ完全培地（ＧＩＢＣＯ、品番１４１７５−０４６）に性腺を置いた。単細胞の懸濁液が得られるまで１８Ｇ１／２次いで２０Ｇ１／２のニードルに連続して通すことによって、性腺を機械的に分離し、そして該懸濁液を１００μＭのナイロン膜（Ｆａｌｃｏｎ３５２３６０）で濾過し、トリパンブルーを用いた細胞計数によって計算し、そして４℃、４００ｇで１０分間、遠心分離した。沈渣物はＨＢＳＳ完全培地に戻した。
【００７０】
細胞の一部（１０５〜２×１０６個の細胞）をＨＢＳＳ完全培地において、それぞれ最終濃度が７５μｇ／ｍｌおよび２００ｎＭ／ｍｌのベラパミル（Ｖ４６２９、ＳＩＧＭＡ）または薬品Ｋｏ１４３（Ｌａｓｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）による処理に付した。細胞を２０分間、３７．５℃、７．５％ＣＯ２のインキュベーターに置いた。このインキュベーションの後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４００ｇで１０分間遠心分離し、そして沈渣物を１ｍｌのＨＢＳＳ完全培地に戻した。ベラパミルまたはＫｏ１４３で処理していない対照の細胞を氷の中に置いた。
【００７１】
ベラパミルで処理した細胞、Ｋｏ１４３で処理した細胞、そして処理していない細胞を、１〜２×１０６細胞／ｍｌの濃度でＨＢＳＳ完全培地に戻し、最終濃度が５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（品番Ｂ２２６１、Ｓｉｇｍａ）と共に、３７．５℃、７．５％ＣＯ２のインキュベーター内で４５分間インキュベートした。このインキュベーションの後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４００ｇで１０分間遠心分離し、そして沈渣物を、０．５％のＳＶＦを添加した１ｍｌのＨＢＳＳ完全培地に戻した。それから全体を氷の中に置いた。２μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウムをその場で添加し、その後ＦＡＣＳ分析を行った。
【００７２】
ＦＡＣＳにおける分類のプロファイルは、さまざまな薬品の存在下または不存在下でのさまざまな細胞集団の存在を示している。そこで、二つの主要な集団、ｐ３ｇ（Ｒ１）とｐ４ｇ（Ｒ２）を規定することができる。ｐ３ｇと呼ばれる集団は、ａｂｃｇ２のチャネルを阻害することで知られている薬品、とりわけＫｏ１４３の作用に対して最も感受性が高い。
【００７３】
ｐ３ｇ集団およびｐ４ｇ集団をＦＡＣＳによって選別し、これらの細胞のＲＮＡをＱ−ＰＣＲで分析した（図９）。試験したいくつかの遺伝子について、ｐ３ｇ画分を生殖細胞に富むものとして同定することができる。なぜなら、この画分のみがｂｃｒｐ−１（ａｂｃｇ２）に富んでおり、逆に、ｐ４ｇ画分は、支持細胞に特徴的なマーカーであるｄｍｒｔ−１およびｇａｔａ−４が豊富であることにより区別されるからである。
【００７４】
この亜集団ｐ３ｇでより多く発現する生殖細胞のマーカーの検出は、精製した生殖細胞を得るためのこの濃縮法の利点を確証するものである。
【実施例４】
【００７５】
実施例４：鳥類の胚性幹細胞（ＣＥＳＣ）の多能性に関与する遺伝子の同定
ＣＥＳ細胞の多能性の維持に関与する遺伝子を同定するためには、さまざまな相補的なスクリーニング戦略によって、転写レベルでＣＥＳＣ細胞を特徴付けることが可能である。アプローチのうち、発現ライブラリーのディファレンシャルスクリーニング、データバンクのインシリコでのスクリーニング、ニワトリの特異的ＤＮＡチップのスクリーニング、およびＳＡＧＥライブラリーのスクリーニングを挙げることができる。これらさまざまなアプローチを用いて、候補となる遺伝子のリストを決定した。これらの遺伝子の発現レベルを半定量ＰＣＲおよび定量ＰＣＲのアプローチでテストした。テストした８００の異なる遺伝子はさまざまなクラスに分類された（図１０）。
【００７６】
ＲＮＡ−Ｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、品番７４１０４）を用いて増殖中のＣＥＳＣ細胞からメッセンジャー（ｍＲＮＡ）を抽出した。カラムでの調製後、リボヌクレアーゼを含まない５０uｌの水にＲＮＡを回収し、滴定し、そして−８０℃のエタノール内に沈殿させた状態で保存した。ｏｌｉｇｏｄＴプライマーを用いた逆転写反応を、増殖中の未分化ＣＥＳＣ細胞に由来する２μｇの全ＲＮＡで、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて、４２℃で１時間にわたって３’で行った。ＲＴ産物をミリポア水で１００倍に希釈し、Ｍｘ３５００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）機器を用いてプレート上で定量ＰＣＲ反応を開始した。水中の２５μｌの反応混合物は、希釈した２μｌのＲＴ産物、１２．５μｌのＭｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ、品番２０４２４５）、１０ｐＭの各プライマーを含む。１５分間の変性の後、混合物を、９５℃で３０秒の変性過程と、５５℃で３０秒のハイブリダイゼーション過程と、７２℃で３０秒の伸張過程とから構成されるサイクルに４０回かけた。各遺伝子について独立した二つまたは三つの試験を行い、平均を発現の相対値として記録した。
【００７７】
定量ＰＣＲで得られたデータを有効であるとするため、二つの補完的な方法、すなわち融解曲線と、内部標準法によるＰＣＲの効率の計算を用いた。この後者の分析によって、各ＤＮＡ分子が各ＰＣＲサイクルで確かに特異的に増幅されたかどうか評価することが可能となる。融解曲線は、増幅が終わった時点の、試験管内にある異なる性質のアンプリコンの数を示し、該融解曲線によって、単一のアンプリコンが形成されるべき、用いたプライマー対の特異性をテストすることを可能にする。また、この曲線によって、プライマーが遺伝子の二つのエクソンから選択されていれば、ゲノムＤＮＡによる偶発的な汚染を検出することも可能となる。この曲線は、定量ＰＣＲの４０サイクルの最後に、９５℃で１分間の変性と、５５℃で１分間のハイブリダイゼーション、および５５℃から９５℃への温度の上昇を含む最後のサイクルと、０．２秒ごとの蛍光の読み取りによって行った。こうして、５５℃で、ＰＣＲの４０サイクルの間に増幅されたＤＮＡ断片はハイブリダイズし、測定された蛍光性は最大となる。極めて漸次的に温度を上げていき、ＤＮＡ二本鎖が分離する温度をかなり正確に測定したのだが、前記分離は、蛍光色素が二本鎖ＤＮＡにしか組み込まれないため、蛍光性の降下を引き起こすものである。この温度はアンプリコンのサイズと塩基組成に応じて決定される。非特異的な産物が存在すると、蛍光性の降下は、それぞれアンプリコンに対応している２つの水平域を示すことになる。単一の水平域を呈するプライマー対と実験のみを有効であるとした。同時に、２ｕｇのＲＮＡについて逆転写（ＲＴ）反応を行うことで、前述の条件にしたがったＰＣＲの効果を有効であるとした。このＲＴ産物の一連の連続希釈を行い、定量ＰＣＲ機器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＭＸＰ３５００）と共に提供されている分析ソフトウェアによって提示されたデータ表に任意の量を当てはめた。各希釈について、試験すべきプライマー対を用いて定量ＰＣＲを行い、ＰＣＲの特定のサイクルで、アンプリコンの指数関数的な増幅が開始された。各希釈について得られたこのＣｔ値によって、直線Ｙ＝ａＸ＋ｂを得ることが可能となり、該直線において、Ｙは所与の地点についてのＣｔの値であり、Ｘは各希釈についての物質の初期量であり、そしてａは直線の傾きを表している。このとき、ＰＣＲの効率Ｅは式Ｅ＝１０（１／−ａ）で与えられる。この効率は、プライマー対とＰＣＲの条件が有効であるとするためには、１．８と２．２の間に含まれなければならない。２という値が１００％の増幅に対応している。
【００７８】
さまざまな遺伝子の発現レベルの変動を比較できるようにするためには、これらのレベルを、サンプル間および実験条件間で恒常的に発現する遺伝子の発現レベルと比較することが必要である。行った実験の大半で選択した遺伝子はＲＳ１７遺伝子（Ｘ０７２５７）、すなわちリボソームタンパク質をコードする遺伝子である。実際、この遺伝子の発現レベルは、調べたさまざまな細胞の状態に応じてほとんど変化しないか、まったく変化しないことが明らかとなった。二つのＣｔ値の間で観察された差異は、対象となる遺伝子の発現レベルの変化を示したが、該差異は当初の物質の量における変動に由来するものではない。相対レベルの計算は、Ｄ＝２＾（（ＣｔＸ１−ＣｔＸ２）／（ＣｔＲ１−ＣｔＲ２））という式で与えられ、該式において、
ＣｔＸ１は細胞型１についての遺伝子ＸのＣｔを表し、
ＣｔＸ２は細胞型２についての遺伝子ＸのＣｔを表し、
ＣｔＲ１は細胞型１についての対照ＲＳ１７遺伝子のＣｔを表し、
ＣｔＲ２は細胞型２についての対照ＲＳ１７遺伝子のＣｔを表している。
【００７９】
胚線維芽細胞における発現レベルとの比較による遺伝子の相対的発現レベルは、発現の強さによって遺伝子の３つのカテゴリを明らかにした。非常に高いレベルで過剰発現した遺伝子を同定することができ、該遺伝子の、胚線維芽細胞に対する相対的発現レベルは１００倍を超える。これらの遺伝子はＣＥＳＣ細胞に「特異的」であると考えることができる。相対的発現レベルが１０と１００の間に含まれる遺伝子のクラスには、現状では１２の遺伝子が含まれる。最後に、胚線維芽細胞と比較して相対的発現レベルが２〜１０倍の間に含まれる遺伝子のクラスを区別することができる。
【実施例５】
【００８０】
実施例５：ＣＥＳＣ細胞の分化過程における遺伝子発現の追跡調査
スクリーニングの過程で同定された遺伝子の中には、ＣＥＳＣ細胞に特異的な発現を示すと考えられるものがある。胚線維芽細胞、ＣＥＳＣ細胞、およびＣＥＧＣ細胞の間における発現の差異は、遺伝子の発現レベルが細胞型によって変動することを示している。また、ＣＥＳＣ細胞の分化過程における発現レベルの変動を特徴付けることが不可欠であると考えられる。
【００８１】
誘導動態の実験を、とりわけ、１０−７Ｍのレチノイン酸のような誘導物質の存在下または不存在下で、成長因子もサイトカインも有さない分化培地に細胞を播種することで行った。刺激した細胞をさまざまな時間に採取し、遺伝子の発現レベルを前述のように（実施例４参照）ＱＲＴ−ＰＣＲによって分析した。特定の遺伝子の発現の変動を分析したところ、遺伝子によって異なる動態が明らかになった。
【００８２】
発現レベルの変動動態にしたがって、大きな３つのクラスの遺伝子を区別することができる。クラス１では、発現レベルが誘導前に最大となり、培地にレチノイン酸を添加すると急速に降下する遺伝子が見られる（図１１）。このクラスでは、ｓｏｘ−２、ｃｒｉｐｔｏ、ＡＰ、ｅｏｍｅｓ、ｏｃｔ−６、ｇｃｎｆ、ｓｏｘ−３、１Ｐ０６、ＧＴＴ３、ＲＡＲｇ２、ＢＭＰ−８、ｇａｔａ−４などの遺伝子が見られる。
【００８３】
クラス２では、ｆＦＧＦ−８、ｎａｎｏｇ、ｎｏｄａｌ、ｃｄｘ−２、ＲＡＲｂ１、ＲＡＲａ、ｐｉｗｉ、ＴＥＲＴ遺伝子などのような、分化誘導後４時間と８時間の間に最良の発現に達する遺伝子が見られる（図１２）。
【００８４】
クラス３では、分化誘導開始後２４時間から最良の誘導が得られる遺伝子、特に、ｐｉｗｉ、ｐ５３、ＴＥＲＴ、ＲＸＲａ、Ｏｃｔ−２、ＲＡＲｂ、ｇａｔａ−２、ｐａｘ−６遺伝子などの遺伝子が見られる（図１３）。
【００８５】
また、これらの連続的な変動と誘導において、変動が逆のｃｒｉｐｔｏ／ｎｏｄａｌ遺伝子とＦＧＦ−８／ＢＭＰ−８遺伝子のような、特定のこれらアクターの変動速度も注目すべきものである。
【実施例６】
【００８６】
実施例６：ステージＩＸ−ＸＩＩの胚盤葉細胞で発現する遺伝子の同定
ステージＸＩ−ＸＩＩの胚盤葉細胞を先行研究に記載されているように採取した（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、仏国特許第）。胚の調製と広範囲の洗浄の後でも残留卵黄があることを考え、これら胚盤葉細胞の沈渣物からのＲＮＡの二重調製法を行った。細胞の沈渣物を冷凍し、まず、およそ１×１０６個の細胞に対して５ｍｌの割合でＴｒｉｚｏｌ（Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ  １５５９６−０１８））を用いた方法によってＲＮＡを抽出した。ピペットによる均質化の後、混合物を４℃、４００ｇで１０分間遠心分離し、そして１ｍｌの溶液あたり２００μｌのクロロホルムを添加した。全体を乳化し、室温で上澄みを静かに移し取り、この操作を数回繰り返した。混合物を４℃、４００ｇで１５分間遠心分離し、水相を新たな試験管に移した。混合物ｍｌあたり５００μｌのイソプロパノールを添加した。それから、全体を、４℃、４００ｇで１５分間遠心分離することで沈殿させ、沈渣物を７０℃のエタノールで洗浄し、乾燥させ、そしてＱｕｉａｇｅｎキットのＲＮＡ抽出キットの、２００μｌ〜４００μｌの溶解緩衝液に回収した。このＲＮＡの調製／精製の第二の過程を製造者の指示にしたがって続けた。この二重の抽出によって、遺伝子の発現レベルのＱＲＴ−ＰＣＲによる分析における最も良好な再現性の結果が得られた。
【００８７】
ＱＲＴ−ＰＣＲによる検出条件は先述した条件と同じである（実施例４参照）。
【００８８】
ステージＸの胚盤葉細胞における遺伝子の相対的発現レベルは、特定の遺伝子も、胚線維芽細胞と比較してこの胚盤葉細胞で非常に強く発現することを示している。
【実施例７】
【００８９】
実施例７：鳥類の生殖細胞（ＣＧＳＣ）の生理に関与する遺伝子の同定
ニワトリの生殖細胞の出現および維持に関与する遺伝子を同定するために、ＣＥＳＣ細胞に対して用いたスクリーニング戦略を、ニワトリの胚の性腺細胞にも適用した。
【００９０】
ＣＥＳＣ細胞の遺伝子の研究に対して用いたアプローチと同様に、遺伝子の発現レベルを鳥類の生殖細胞で分析した。これらの細胞で発現した遺伝子のリストによって、これらの細胞で非常に強く発現した遺伝子（相対的な過剰発現の割合は１００を超える）と、相対的発現レベルが１００と１０の間に含まれる遺伝子を明らかにすることができた。ほとんどの遺伝子が、２と１０の間に含まれる比率の、より穏やかな発現を示した。
【実施例８】
【００９１】
実施例８：さまざまな細胞型の間における遺伝子発現の比較分析
ＣＥＳＣ細胞、ＣＥＧＣ細胞およびステージＩＸ−ＸＩＩの胚盤葉細胞の間における相対的発現レベルを比較することで、さまざまな細胞型の特徴的なマーカー遺伝子として現れる遺伝子のさまざまなリストが得られた（素点を添付書類に示している）。
【００９２】
８．１  ステージＩＸ−ＸＩＩの胚盤葉細胞
さまざまな発現プロファイルの先行結果を組み合わせることで、各細胞型に固有の発現の組み合わせを決定することができる。ステージＸの胚盤葉細胞とＣＥＳＣ細胞の発現レベルをインビトロで比較すると、ステージＸの胚盤葉細胞は、
−ｆｇｆ−８、ｆｇｆ−ｂ２、ｆｇｆ−４、ｗｎｔ−１４のような成長因子、
−ｓｍａｄ−９、ｃｉｓ−１、ｓｍａｄ−７、ｉｄ２、ｓｍａｄ−４のようなシグナル伝達アクター、
−ｓｆ−１、ｇａｔａ−５、ｓｏｘ−９、ｓｏｘ−２のような転写因子、
−ＷＤ４０、ＷＤＲＰ−３、ａｂｃｇ２輸送体のような構造遺伝子、
−Ｎ−ｍｙｃ２、ｐｏｚ−３、ａｔｍのような調節遺伝子、
−Ｔ細胞ＡＰＰ２Ｃホスファターゼ、ｓｓｂ−１、ｎｆ−２のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
−この発生段階で非常に特異的に現れるｚｐｃ遺伝子、
を過剰発現した（図１４）。
【００９３】
ステージＸの胚盤葉細胞と胚の性腺細胞ＣＥＧＣの同様の比較は、
−ｆｇｆ−８、ｆｇｆ−４、ｗｎｔ−３ａ、ｗｎｔ−１１、ｔｇｆ−ｂ２のような成長因子、
−ｉｄ２、ｓｍａｄ−９、ｓｏｃｓ−１、ｃｉｓ−１、ｓｍａｄ−７のようなシグナル伝達アクター、
−ｅｏｍｅｓ、ｓｏｘ−３、ｓｏｘ−２、１Ｐ０６、ｇａｔａ−２、ｇａｔａ−５、ｐａｘ−６、ｆｂｘ−１５ｂ、ｓｏｘ−９のような転写因子、
−ＷＤ４０、ｃｌａｕｄｉｎ−１、アスタシン、ＷＤＲＰ−３、ａｂｃｇ２のような構造遺伝子、
−ａｔｍ、Ｎ−ｍｙｃ−２、ｐｏｚ−２、ｐｏｚ−３のような調節遺伝子、
−ｅｎｓ−１、Ｔ細胞ＡＰＰ２Ｃホスファターゼ、ＴＣ８９３、ｎｆ−２、ｓｓｂ−１、ＴＣ８２３のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
−この発生段階で非常に特異的に現れるｚｐｃ遺伝子、
の過剰発現を示した（図１４）。
【００９４】
このように、ステージＸを最も良く定義できる組み合わせは、二つの状況の間で最もよく発現する、
−＿ｆｇｆ−４、ｔｇｆ−ｂ２、
−ｉｄ−２、ｓｍａｄ−７、ｓｍａｄ−９、ｓｎｏＮ、ＳＯＣＳ１３、
−Ｃｘｃｒ−４、
−ｇａｔａ−５、Ｎ−Ｃｏｒ１、
−ａｔｍ、ブルーム症候群、ｅｎｘ−１、ｒａｄ５４ｂ、ｒｂｍ６、ｓｓｂ−１、
−ｎｆ−２、Ｎ−ｍｙｃ２、ｐｍｌ、Ｔ細胞ＡＰＰ２Ｃ、ＷＤＲＰ−３、
−ｃｐｅ１７３８、ｃｗｆ１６、ＴＣ８２３２５、ＴＣ８７、ｚａｎ７５、
−Ｚｐｃ、
という遺伝子を含んでいる。
【００９５】
ステージＸの胚盤葉細胞については、ｆｇｆ−４因子とｆｇｆ−８因子、ｉｄ−２遺伝子、ＳＯＣＳ１３遺伝子、細胞内シグナル伝達に作用するｓｎｏＮを含むｓｍａｄファミリーのさまざまなメンバーのような、多くのシグナル伝達アクターが存在することに注目することができる。強いものであっても、これらのアクターの存在は完全には特異的ではない。
【００９６】
８．２  ＣＥＳＣ細胞
同様に、ステージＸの胚盤葉細胞と比べて、ＣＥＳＣ細胞は、
−ｗｎｔ−１０、ｂｍｐ−５、ｄａｐｐｅｒ−１のような成長因子、
−ｂｒａｐ、ＴＧＦ−ＲＩＩのようなシグナル伝達アクター、
−ｇｃｎｆ、ＴＲ−ａ、ｐａｘ−６、１Ｐ０６、ｉｒｘ−４のような転写因子、
−エメリン、アスタシン、ｃｌａｕｄｉｎ−３、ＬＡＭＰレクチン、ｓｖａｐ−１、ｄｏｒｆｉｎのような構造遺伝子、
−ｔｒａ−１、ｃｈ−ｔｏｇ、ｍｕｓａｓｈｉのようなマーカー遺伝子、
−ＦＴＴシンターゼ、ＣＧ１８２、ｍａｔｕｒａｓｅ  Ｋ、ＲＮＡシクラーゼ、ＦＭＲＰＩ１８２のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
を過剰発現する（図１５）。
【００９７】
また、胚の性腺細胞ＣＥＧＣと比べて、ＣＥＳＣ細胞は
−ｗｎｔ−３ａ、ｗｎｔ−１０、ｆｇｆ−８、ｂｍｐ−８、ｗｎｔ−１１、ｆｇｆ−４、ｄａｐｐｅｒ−２のような成長因子、
−ＲＩＩアクチビン、ｂｒａｐのようなシグナル伝達アクター、
−ｎａｎｏｇ、ｅｏｍｅｓ、ｓｏｘ−３、１Ｐ０６、ｐａｘ−６、ｇｃｎｆ、ｓｏｘ−２、ｇａｔａ−２、ｆｂｘ−１５ｂ、ｉｒｘ−４のような転写因子、
−アスタシン、ｃｌａｕｄｉｎ−３、ｃｌａｕｄｉｎ−１のような構造遺伝子、
−ｔｒａ−１、ｅｎｓ−１のようなマーカー遺伝子、
−ＴＣ８９６、ｍａｔｕｒａｓｅ  Ｋ、ＲＮＡシクラーゼ、ＦＭＲＰＩ１８２のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
を過剰発現する（図１５）。
【００９８】
このように、増殖中のＣＥＳＣ細胞を最も良く定義できる組み合わせは、
−ｗｎｔ−１０ａ、ｗｎｔ−１１、ｄａｐｐｅｒ−１、
−１Ｐ０６、ｐａｘ−６、ｇｃｎｆ、ｉｒｘ−４、ｓｏｘ−３、
−アスタシン、ｃｌａｕｄｉｎ−３、
−ｔｒａ−１、
−１Ｐ０８−Ａ０９、ｓｌｃ３８ａ、ＦＭＲＰＩ１８２、
という遺伝子を含む。
【００９９】
増殖中のＣＥＳＣ細胞については、これらの細胞に特徴的なリストのうち、転写因子の割合が多いことに言及することができる。とりわけ、この研究の過程ではじめて、ニワトリにおいて、ｎａｎｏｇ、１Ｐ０６（ｏｃｔ−３／４、下記参照）およびｇｃｎｆという遺伝子が単離され、クローニングされ、そして研究された。
【０１００】
また、ｍａｔｕｒａｓｅ、発現が増殖に関連しており機能の分からないＦＭＲＰＩ１８２遺伝子、ｓｌｃ３８−２遺伝子（おそらく溶質輸送体ファミリーのメンバーである）、１Ｐ０８−Ａ０９遺伝子のような新たな遺伝子も同定された。
【０１０１】
８．３  ＣＥＧＣ細胞
胚の性腺細胞は、全組織の利用ストック（上記参照）を用いたところ、ステージＸの胚盤葉細胞と比べて、
−ｂｍｐ−５、ｄｋｋ−３のような成長因子、
−エンドグリン受容体、ＴＧＦ−ＲＩＩ、ＦＧＦ−Ｒ、ｐｔｅｎ、ｗｉｓｐ−１、ｓｍａｄ−３、ＦＧＦ−Ｒ、ｓｍａｒｃｄ−３のようなシグナル伝達アクター、
−ｐａｘ−２のような転写因子、
−エメリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＨＳＰｂ７のような構造遺伝子、
−ｔｉｅ−２、ｐｉｗｉ、ｍｕｓａｓｈｉのようなマーカー遺伝子、
−ＣＧＩ１８２、ｓａｍｓｎ−１、ｆｌｊ００１８８のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
という遺伝子を過剰発現した（図１６）。
【０１０２】
また、増殖中のＣＥＳＣ細胞と比べると、胚の性腺細胞は
−ｗｎｔ−１４、ｂｍｐ−５、ｄｋｋ−３のような成長因子、
−エンドグリン受容体、ＲＰＬ−Ｒｂｏｘ１、ｗｉｓｐ−１、ｐｔｅｎ、ｃｉｓ−１、ｓｍａｄ−７、ｓｍａｄ−９、ｓｍａｄ−４、ＴＧＦ−ＲＩＩ、ｃ−ｓｋｉ、ｓｍａｒｃｄ−３のようなシグナル伝達アクター、
−Ｉｈｘ−９、ｓｆ−１、ｇａｔａ−４、ｐａｘ−２、ｄａｘ−１、ｓｏｘ−９のような転写因子、
−ａｂｃｇ−２、ＶＥ−カドヘリン−２のような構造遺伝子
−ｔｉｅ−２、ｄｍｒｔ−１、ｐｉｗｉのようなマーカー遺伝子、
−ＴＣ９５、ＫＨＫｏｃ−１、ｆｌｊ００１８８、ｔｅｐ１２、ｓａｍｓｎ−１のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
−ｖａｓａ、ｐｉｗｉのような生殖細胞のマーカー遺伝子、
という遺伝子を過剰発現した（図１６）。
【０１０３】
このように、胚の性腺のＣＥＧＣ細胞を最も良く定義できる組み合わせは、
−ＢＭＰ−２ＩＫ、ＢＭＰ−５、ｄｋｋ３、
−エンドグリン、ＦＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−ＲＩＩ、Ｗｉｓｐ−１、
−Ｇａｔａ−４、Ｉｈｘ−９、
−Ｒａｂ４０Ｂ、ｓｍａｄ３、ｓｍａｒｃｄ３、
−ＴＣ９５４０８、ＴＣ９７６９４、ＦＬＪ００１８８、
−ｔｉｅ２、ｔｏｂ、
という遺伝子を含む。
【０１０４】
これらの組み合わせは単なる指標でしかなく、単一の細胞型に非常に特異的に現れる遺伝子はほとんどない。
【０１０５】
同定された遺伝子の中には、ｄｅａｄｅｎｄ、ｖａｓａ、ｗｉｓｐ−１、ｔｅｐ１２などのような、発現プロファイルが生殖組織に限定される、その他の種における相同体を有するものがある。ステージＸの胚盤葉細胞とＣＥＧＣ細胞（生殖能力を有する二つの細胞型）の間で共通する発現プロファイルを比較すると、発現が弱く、さらにはＣＥＳＣ細胞ではほとんどない遺伝子の組み合わせを同定することができる。生殖細胞マーカーのこの消失またはこの大きな減少は、ステージＸの胚盤葉細胞を培養した結果と考えることができる。しかし、生殖能力の必要条件および／または十分条件でのこれらの遺伝子の発現に関しては、いかなる指摘もできない。遺伝子は、
−ｗｎｔ−１４、
−Ｂｒｉｎｐ、ｃｉｓ−１、ｃ−ｓｋｉ、ｐｒｌ−Ｒｂｏｘ１ｌ、ｐｔｅｎ、ｓｅｆ、ｓｍａｄ−４、ｓｍａｄ−５、
−Ａｂｃｇ２、ｃｌｏｃｋ、ｄｍｒｔ−１、ｌｆｎｇ、ｍｏｒｆ、
−Ｄａｘ−１、ｐａｘ−２、ｓｆ−１、ｓｏｘ−９、
−Ｄｅａｄｅｎｄ、ｐｏｚ−３、ｓｌｕｇ、Ｖｅ−カドヘリン−２、
−Ｅｍｘ−２、ｆｒａｇｉｌｉｓ４、ＴＣ１３６、ｔｅｐ１２、ｔｓｃ−２２、
−Ｔｕｄｏｒ、ｖａｓａ、
である。
【０１０６】
同様に、発現レベルで変動があっても、ステージＸの胚盤葉細胞に関するものを除き、ＣＥＳＣ細胞とＣＥＧＣ細胞に共通する遺伝子がある。これらの遺伝子とは、
−ｃｒｉｐｔｏ、ＢＲＡＰ、ＴＧＦ  ＲＩＩＩ、
−ＣＧＩ８２、ｃｈ−ｔｏｇ、ｄｄｘ−２５、Ｄｏｒｆｉｎ、エメリン、
−ＥＲＣＣ−２、ＫＨＫｏｃ１、ＬＡＭＰレクチン、
−ｍａｔｕｒａｓｅ、ｍｕｓａｓｈｉ、ｐｉｗｉ、ＳＡＭＳＮ−１、ＳＶＡＰ−１、ＴＣ８６９９０、
−ＴＲ−ａｌｐｈａ、
である。
【０１０７】
また、ＣＥＧＣ細胞に関するものを除き、ＣＥＳＣ細胞とステージＸの胚盤葉細胞の間で共通して発現する遺伝子について同一の分析を行った。これらの遺伝子とは、
−ｎｏｄａｌ、ｗｎｔ−３ａ、ｗｎｔ−１１、
−Ｒａｓ  ｌｉｋｅ、
−ｄｒｇ−１、ｅｎｓ−１、ｅｗｓ−１、
−Ｅｏｍｅｓ、Ｆｂｘ１５ｂ、ｇａｔａ−２、ｊｓｄ３、ｐａｘ−６、ｓｏｘ−２、ｓｏｘ−３、
−Ｄｄｘ−２８、Ｍａｇｏ、ネスチン、ＰＯＺ２、
−Ａｒｇ  ＮｍｅｔｈｙｌＡＳＥ、ＰＰ２４４７、ＲＮＡシクラーゼ、
−Ａ１４ＴＳ、ＣＥＳ−ｃ３２、ＴＣ８９３、トランスリン、
−Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ｓｙｎｔａｘｉｎ  １６、ＷＤ４０、ＷＤＦＹＰ−２、である。
【０１０８】
一つまたはその他の状況で過剰発現したさまざまな遺伝子を分析することによって、インビトロでの多能性の維持、インビボおよびインビトロでの生殖能力の制御、そして特定の遺伝子の発現レベルに対する培養条件の影響についてさまざまなモデルを提案することが可能となる。
【０１０９】
細胞骨格
ＣＥＳＣ細胞の形態形成の維持を保証する細胞骨格の遺伝子のレベルでは、限られた数の遺伝子のみが、有用で重要な発現の差異を示した。とりわけ、ＷＤモチーフを有する遺伝子、すなわち細胞骨格レベルでのタンパク質間の相互作用に関与するモチーフがＣＥＧＣよりもＣＥＳＣ細胞でより多く発現するＷＤＲＰ−２遺伝子（ＴＣ１９０１９８）である。ＷＤ−４０遺伝子（ＴＣ１８９５３７）はステージＩＸ−ＸＩＩの胚盤葉細胞にかなり特異的であると考えられる。ベータ・カテニン遺伝子が二つの系で強く発現することに注目すべきであり、このことは、該遺伝子の調節がタンパク質レベルで実際に行われることを示唆している。逆に、「ギャップ結合」と細胞間の強力な関連の維持に関与するＣｌａｕｄｉｎ−１遺伝子（ＴＣ１８９９７４）はＣＥＳＣ細胞で強く発現した。この観察結果は、電子顕微鏡によって行った、細胞内結合が特に重要でありうまく構造化されていたＣＥＳＣ細胞の分析と合致するものである。また、細胞の移動と、周囲との潜在的な相互作用を可能にする、細胞の細胞外基質の制御に介入するメタロプロテアーゼという酵素であるアスタシン（ＴＣ２２１９５２）も検出された。
【０１１０】
成長因子
ＣＥＳＣ細胞とＧＥＳＣ細胞は、さまざまなレベルで、成長因子とサイトカインの大きなファミリーのさまざまなメンバーを発現した。また、ＴＧＦ／ＢＭＰファミリー、ＦＧＦファミリー、チロシンキナーゼ受容体因子のファミリー、シグナルがｇｐ１３０という経路によって伝達されるサイトカインのファミリー、およびｗｎｔファミリーの多くの成長因子が、ＣＥＳＣ細胞あるいはＧＥＳＣ細胞で特異的に発現した。
【０１１１】
試験したさまざまなアクターのうち、ＣＥＳＣ細胞はＣＥＧＣ細胞よりもかなり強くｎｏｄａｌ、ＦＧＦ−８、ｗｎｔ−３ａ、ｗｎｔ−１０ａ、ＢＭＰ−８およびＦＧＦ−４といった因子を発現した。該ＣＥＧＣ細胞はとりわけ、ｗｎｔ−１４、ＴＧＦ−ｂ２およびＢＭＰ−５因子の過剰発現を特徴としている。
【０１１２】
マウスとヒトのＥＳ細胞について言及されているように（Ｂｅｓｓｅｒ，２００４、Ｖａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ｎｏｄａｌの発現が多能性の複雑な調節全体に関与していることに注目すべきである。
【０１１３】
ｃｒｉｐｔｏ遺伝子はＧＥＳＣ細胞とＣＥＳＣ細胞で同時に発見されたものであるが、不可欠なエレメントかつヒトのＥＳ細胞の「痕跡」として言及されている（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１１４】
マウスにおいては、ＦＧＦ−８の発現は、ＰＧＣが移動後に性腺に達しているとき、ＰＧＣの増殖に関与した（Ｋａｗａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＣＥＳＣ細胞でのＦＧＦ−８の強い発現は、これらの細胞のＰＧＣの「性質」を表す良好な指標となりうるものだが、ＧＥＳＣ細胞よりもずっと高いレベルの発現は、この因子の活性化経路が脱制御された兆候であると考えられる。同様に、ＦＧＦ−４は、ＧＥＳＣ細胞よりもＣＥＳＣ細胞でおよそ５倍発現した。ＦＧＦ−４がマウスにおいてＯｃｔ−３／４転写因子の最適な標的として同定されており（Ｄａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、インビトロおよびインビボの両方で、ＭＥＳＣ細胞において不可欠なアクターである（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｗｉｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）ことに注目すべきである。
【０１１５】
また、二つのＢＭＰ因子の状況も、とりわけＭＥＳＣ細胞の多能性の制御（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）と、インビトロ（Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｇｅｉｊｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）およびインビボでの（Ｓａｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）マウスの生殖細胞の出現と維持に、ＢＭＰ−４因子とＢＭＰ−８因子が強く関与していることを特徴としている。マウスにおける機能の消失によってＢＭＰ−４の発現が消滅することにより、中胚葉の派生物が形成されなくなるため胚が早期（発生の８〜９日目）に死亡する（Ｗｉｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。これらの胚では、いかなるＰＧＣも検出されない（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。この不在はＢＭＰ−８で補うことができる。ＢＭＰ−４自身は胚盤葉上層からの早期の誘導に必要である。ＢＭＰ−８ｂ遺伝子の発現を消滅させると、生殖細胞の増殖の減少と、減数分裂を開始する細胞の減少という結果になる（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１１６】
ｓｄｆ−１遺伝子については、この因子のメッセンジャーの発現はその受容体であるＣＸＣＲ４の発現と相関があり、該受容体もまた、組織全体において陽性細胞が同定されていなくとも、性腺で特異的に検出される。ＣＥＳＣ細胞は生殖細胞の誘導を保証する因子または受容体を発現するこの特性は有していなかった。なぜなら、ゼブラフィッシュ（Ｄｏｉｔｓｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｋｎａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、マウス（Ａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、より近年ではニワトリ（Ｓｔｅｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）において示されているように、これら二つのアクターは、生殖細胞の移動の制御に強く関与するからである。したがって、ＣＥＳＣ細胞でたとえばＣＸＣＲ４受容体を発現させてＣＥＳＣ細胞の向性を変更することで、より効果的に性腺をコロニー形成させることが可能である。ステージＩＸ−ＸＩＩの胚盤葉細胞におけるＣＸＣＲ−４の強い発現は、早期胚内での細胞移動の制御における重要な要素である。
【０１１７】
もう一つの重要なアクターはｄｅａｄｅｎｄ遺伝子であり、該遺伝子は生殖性のこのコロニー形成プロセスに関与し（Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、該遺伝子のｔｅｒ突然変異は生殖細胞の発生を危険にさらすものである（Ｙｏｕｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。この遺伝子はＣＥＳＣ細胞よりも性腺細胞で多く発現する。
【０１１８】
試験したその他の因子および受容体の発現レベルは、ＣＥＳＣ細胞あるいはＧＥＳＣ細胞にはそれほど特異的ではない。
【０１１９】
膜受容体
ＴＧＦｂ／ＢＭＰおよびＦＧＦに対する受容体のメッセンジャーが、ＣＥＦを含む、試験した細胞型の全体で検出された。これらの変動の生理学的重要性が知られていないとき、検出されたＲＮＡのレベルがタンパク質レベルの良好な指標であれば、第一にシグナル伝達の実際の欠如がこれらの受容体レベルで観察されるとは考えられない。しかし、ＣＥＳＣ細胞におけるアクチビンＩＩＢ（Ｕ３１２２３）受容体の強い発現が観察され、該発現はおそらく、これらの細胞におけるｎｏｄａｌとｃｒｉｐｔｏの強い発現と関係している。
【０１２０】
ＣＥＧＣ細胞では、ＣＥＳＣ細胞と比べて高い割合で、ＦＧＦ−Ｒ（Ｕ４８３９５）、ＴＧＦ−ＲＩＩ（ＡＦ２０２９９１）およびＴＧＦ−ＲＩＩＩ（Ｌ０１１２１）という受容体が発現した。チロシンキナーゼ受容体ファミリーのさまざまな遺伝子の発現プロファイルは、分析した遺伝子の数が網羅的でなくても、あまり変化するとは考えられない。
【０１２１】
注目すべきことに、ＳＣＦに対する受容体であるｃ−ｋｉｔの発現レベルはＣＥＳＣ細胞では非常に弱く、このことは胚の性腺細胞で観察された発現と対照的である。しかし、生殖系の維持におけるＳＣＦの重要性も証明されている。このｃ−ｋｉｔのレベルは、ｃ−ｋｉｔ受容体がその他の多くの組織（造血組織、神経細胞など）で発現しても、細胞の生殖性の性質の良好な指標であると考えられる。
【０１２２】
ＬＩＦのシグナル伝達経路においては、ＬＩＦ−Ｒ受容体とｇｐ１３０タンパク質の発現が見つかり、これらはまた、線維芽細胞でも検出された（Ｄｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｇｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。鳥類のＬＩＦ因子は近年クローニングされたものであるが（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、この因子は線維芽細胞でのみ検出され、このことは、他の種におけるこのサイトカインの産生に合致しており、また、ＣＥＳＣ細胞が、用いた培養条件ではオートクリン産生しないことを示唆している。
【０１２３】
シグナル伝達
シグナル伝達経路においては、チロシンキナーゼ受容体とＴＧＦｂ／ＢＭＰ受容体の活性化経路およびｇｐ１３０ｊａｋ／ＳＴＡＴの経路の大半のアクターは、概して偏在的に、さまざまな細胞型の間で大差なく発現した。しかし、いくつかの観察を行う必要がある。ＰＴＥＮ遺伝子（ＢＭ４８６８１９）ならびにＰＯＺ３（ＴＣ２１６１３７）のようなＰＯＺドメインにあるファミリーの遺伝子がＣＥＧＣ細胞で強く発現した。ＣＩＳ−１（ＴＣ２１６０００）、ＳＳＢ−１（ＴＣ２１０３５８）、ＳＯＣＳ１３（ＴＣ２１７５８８）などのような遺伝子は、さまざまな受容体によるシグナル伝達に関与し、また多くの遺伝子がＧＴＰａｓｅｓの経路に関与する。ＴＧＦ／ＢＭＰの作用を調節する作用で知られる、Ｓｍａｄ−３（ＴＣ１８７８３５）、Ｓｍａｄ−６およびＳｍａｄ−７（ＴＣ１９４１３６）遺伝子もまた、ＣＥＦでの強い発現が見られても、ＣＥＳＣ細胞よりもＣＥＧＣ細胞で多く発現した。マウスにおける生殖細胞の決定論に強く関与することで知られるＳｍａｄ−１遺伝子（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）とＳｍａｄ−５遺伝子（ＴＣ２０９７７０）（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）はそれぞれ、ＣＥＳＣ細胞とＣＥＧＣ細胞でより多く発現した。線維芽細胞での発現も検出された。Ｓｍａｄ−４遺伝子（ＴＣ２０７２１３）は、ＣＥＧＣで好適に発現したが、ＣＥＳＣとＣＥＦでは検出されないか、あるいはほとんど検出されなかった。このＳｍａｄ−４遺伝子は多くの状況で、ＴＧＦｂ／ＢＭＰファミリーのメンバーのシグナル伝達の鍵遺伝子として現れる。なぜなら、該遺伝子は、これらの因子に依存する遺伝子の転写制御に不可欠だからである。マウスにおけるｓｍａｄ−４遺伝子の不活性化に関連する多くの欠点のうち、ＢＭＰ−４突然変異体（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）およびＭＢＰ−８ｂ突然変異体（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｌｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）で観察されるものに非常に類似したＰＧＣの形成の不在が観察された（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｃ−ｓｋｉ遺伝子（ＴＣ２１９２４７）およびＳＮｏＮ遺伝子（ＴＣ２１５０６９）も特異的な発現の差異を有しており、生殖経路におけるこれらの細胞の増殖と分化の制御に参与している。ＴＧＦ／ＢＭＰファミリーのシグナルの伝達のこれらさまざまなアクターの発現レベルは、研究した細胞の「幹細胞」または「生殖細胞」としての性質の主要な指標に相当すると考えることができる。発現レベルのあらゆる変動は、候補遺伝子のさまざまな操作によって誘導される変化をより良く画定するために利用することができる。これらのさまざまな遺伝子自体、とりわけＳｍａｄ−４も、ＣＥＳ細胞の生殖能力の制御において非常に重要な候補である。したがって、これらのさまざまな遺伝子の効果または破壊をインビトロとインビボの両方でテストすることが特に適切だと考えられる。
【０１２４】
ｒａｓ−ｌｉｋｅ遺伝子（ＴＣ２０１１７７）もまた、ＣＥＧＣ細胞よりもＣＥＳＣ細胞において、またステージＩＸ−ＸＩＩの胚盤葉細胞において、より特異的な発現を示した。マウスのオーソログ遺伝子は近年、ＭＥＳＣ細胞の増殖の主要なアクターとして同定され（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＰＩ３キナーゼ経路による特定の細胞系の「腫瘍形成」という特徴の原因である可能性がある。しかし、この遺伝子についてのＭＥＳＣ細胞の突然変異体は、生殖系をコロニー形成させる能力があるが、子孫に対するいかなる結果も今日まで現れていない。生殖細胞での発現レベルについては記載がなく、ＭＥＳＣ細胞での発現の阻害は増殖速度に対してマイナスの効果を有している。増殖速度の必要な低下（この遺伝子の阻害を介する）はＰＧＣの分化の前提条件であるという仮説が考えられる。
【０１２５】
テストしたその他の遺伝子は発現レベルでは大きな不均衡は示さなかったと考えられる。Ｓｔａｔ、ＭＡＰキナーゼ、ｅｒｋなどのタンパク質のような、シグナル伝達のその他のアクターの活性の調節は、おそらくタンパク質のレベルで、とりわけ、リン酸化／脱リン酸化に関連した活性化メカニズムによって行われる。このことは、ＭＥＳＣ細胞におけるＳＴＡＴ−３タンパク質については証明されている。
【０１２６】
核タンパク質の因子のレベルにおいては、候補遺伝子の数の多さを考えると状況は複雑である。概略的に、転写因子については、ホルモン核受容体（ＨＮＲ）ファミリー、ｓｏｘ遺伝子ファミリーおよびｇａｔａ遺伝子ファミリーなどのさまざまな遺伝子ファミリーが特に関与すると考えられる。
【０１２７】
特定の遺伝子の関与は、遺伝子発現のエピジェネティックな制御に直接関連している。ニワトリの発生過程または鳥類モデルにおけるエピジェネティックなメカニズムの知識は、インシュレーター配列の同定を含む、グロビン遺伝子の発現メカニズムの先駆的な発見（Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，１９９３）と、リゾチーム遺伝子の転写制御に関する研究に限定される（Ｋｏｎｔａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。その他の哺乳動物系または下等真核生物系との類推によって、遺伝子発現のエピジェネティックな制御に関与するニワトリのさまざまな遺伝子が同定された。発現の大きな差異が観察される遺伝子のうち、胚の性腺でより強く発現するｄｍｒｔ−１遺伝子と、胚盤葉細胞でより多く発現するＤＣＳＭ遺伝子およびｅｎｘ−１遺伝子が見つかっている。ｄｍｒｔ−１遺伝子の発現は、マウスモデルにおけるようにセルトリ細胞に特異的であると考えられるが（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、生殖細胞画分におけるこれらの遺伝子の検出は、説明を変更することになる。その他の遺伝子は興味深い発現プロファイルを有するが、線維芽細胞でも発現した。
【０１２８】
テロメラーゼ遺伝子
幹細胞および胚性幹細胞、特にＣＥＳＣ細胞は固有のテロメラーゼ活性を有する（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ニワトリのテロメラーゼ遺伝子はクローニングされたばかりであり（Ｄｅｌａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｓｗａｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＣＥＳＣ細胞での発現レベルは高いと考えられる。
【０１２９】
ｓｏｘファミリーの遺伝子
ｓｏｘ遺伝子については、ｓｏｘ−９遺伝子（Ｕ１２５３３）の発現がＣＥＧＣ細胞に、より特異的であり、このことは、マウスの精巣形成におけるこの遺伝子の役割の重要性に合致していると考えられるが（Ｃｈａｂｏｉｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、該遺伝子は好適には支持細胞で発現すると考えられる。哺乳類と鳥類の間でのこの遺伝子の役割の保存が考えられ（Ｍｏｒａｉｓ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、この遺伝子は、Ｄａｘ−１（ＡＦ２０２９９１）の存在下でＣＥＧＣ細胞においてもまた強い発現が見られるアクターである、核受容体ｓｆ−１（Ｓｅｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）（ＮＭ２０５０７７）の直接的な標的である。
【０１３０】
ＣＥＳＣ細胞に最も特異的な遺伝子のうち、二つの遺伝子ｓｏｘ−２（Ｕ１２５３２）とｓｏｘ−３（Ｕ１２４６７）を挙げることができる。マウスにおけるある特定のプロモーターのレベル（Ｍｉｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、とりわけＦＧＦ−４のプロモーターレベル（Ｄａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）で、ＳＯＸ−２タンパク質とＯＣＴ−３／４タンパク質の強い関連が証明された。１Ｐ０６遺伝子は、哺乳類のＯｃｔ−３／４遺伝子に対する鳥類の相同体であり（下記実施例９参照）、ＣＥＳＣ細胞で非常に強く発現し、これらの細胞の最も良いマーカーの一つであると考えられる。
【０１３１】
ｇａｔａファミリーの遺伝子
また、ｇａｔａ遺伝子も特徴的な発現プロファイルを示した。ｇａｔａ−４遺伝子（Ｕ１１８８７）は、胚の性腺細胞で好適に発現し、発現はセルトリ細胞の存在に関連していると考えられる（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｌａｖｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｇａｔａ−２遺伝子（Ｘ５６９３０）とｇａｔａ−５遺伝子（Ｕ１１８８８）は、ＣＥＳＣ細胞でより多く発現し、とりわけ、胚盤葉細胞ではｇａｔａ−５遺伝子が強く過剰発現する。ｇａｔａ−２遺伝子のメッセンジャーは、生殖細胞（Ｓｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）およびニワトリの早期胚（Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）で検出されている。ｇａｔａ遺伝子の多面的な作用は、標的遺伝子のプロモーターにおける類似のおよび／または共通の応答エレメントのレベルでさまざまなパートナーと関連することで変調、制御される。したがって、造血系に優先的なパートナーの一つがｅｔｓファミリーの遺伝子の一つであれば、その他の系における増殖および分化の組み合わせは異なる。ｇａｔａ遺伝子に対する応答エレメントは、ｓｍａｄ−７遺伝子のプロモーターにおけるＢＭＰに対する応答エレメント（ＢＲＥエレメント）を用いて同定される（Ｂｅｎｃｈａｂａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このｓｍａｄ−７遺伝子はまた、ＣＥＳＣ細胞よりも胚の性腺細胞でより多く発現した。
【０１３２】
Ｉｄファミリーの遺伝子はＢＭＰの作用を制御する、無視できないアクターであると考えられる。Ｉｄ２遺伝子は胚の性腺細胞でより発現し、とりわけ、ＣＥＳＣ細胞よりも胚盤葉細胞で発現すると考えられる。この遺伝子は、マウスモデルと同様のアプローチにおいて（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｋｏｗａｎｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＣＥＳＣ細胞の増殖／分化の調節の中心にあると考えられる。
【０１３３】
文献に記載されているこれらのさまざまなプロセスでは、ＹＹ１パートナー（Ｋｕｒｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）（ＣＥＳＣ細胞での強い発現も見られるが、その発現レベルは比較的、偏在的である）と、心臓分化のケースとしてはＮＫｘファミリーのアクター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）が頻繁に見られる。ところが、現状では哺乳類でのみ同定されているｎａｎｏｇ遺伝子がこのＮｋｘ遺伝子ファミリーに属する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ニワトリのゲノムに関する公開されている配列レベルでの相同性分析によって、ニワトリのｎａｎｏｇ遺伝子を同定した（図１７）。このアクターの機能はさらに、マウス系ではほとんど知られていない。ＥＮＳ−１タンパク質は遺伝子のトラッピングアプローチで同定されているが（Ａｃｌｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、細胞が分化するように誘導されると、ＣＥＳＣ細胞での非常に強い過剰発現とメッセンジャーの急速な消失を伴う、特に興味深い発現プロファイルも示した（Ａｃｌｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１３４】
Ｏｃｔ−３／４／ｓｏｘ−２複合体の標的となることで知られているｕｔｆ−１遺伝子の相同体（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）はニワトリにおいて未だに同定されていないが、トランスフェクション実験では、マウスのｏｃｔ−３／４遺伝子、ｓｏｘ−２遺伝子およびｕｔｆ−１遺伝子のプロモーターがＣＥＳＣ細胞で特異的に活性化されることを指摘することができ、このことは、これらさまざまなアクターの発現調節メカニズムが鳥類のＣＥＳＣ細胞で保存され、機能的であることを示している（実施例１２参照）。このトランス活性化はニワトリの胚線維芽細胞では検出されなかった。
【０１３５】
ホルモンの核受容体
ホルモンの核受容体については、ｄａｘ−１遺伝子が胚盤葉細胞で非常に強く過剰発現すると考えられる。この遺伝子は、とりわけｓｆ−１遺伝子の作用に対する拮抗作用による（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、生殖性の分化に対してマイナスではあるが（Ｓｗａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）不可欠の役割を持つこと（Ｍｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）で知られている。このｄａｘ−１遺伝子はそれ自身がｓｆ−１によってプラスに制御され、ＣＯＵＰ−ＴＦによってマイナスに制御されうる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。また、ｄａｘ−１の発現はｗｎｔ−４による特定の活性化系に依存している（Ｍｉｚｕｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ところが、ｗｎｔ−４はＣＥＳＣ細胞よりも性腺でより多く発現が観察される因子の一つである。また、Ｎ−Ｃｏｒｌ遺伝子（ＴＣ２０１１５７）のような、ＨＮＲと関連するタンパク質をコードする遺伝子も存在し、特徴的な差異を示した。
【０１３６】
本発明者が配列の全部を決定したｇｃｎｆ遺伝子（図１８）は、ＣＥＳＣ細胞で非常に強く特異的な発現が見られ、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のプロモーターレベルでのｓｆ−１に対する該遺伝子の拮抗作用は、マウスにおける記載がある（Ｆｕｒｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１３７】
ｓｆ−１遺伝子はほとんど胚の性腺細胞のみで発現が見られた。ところが、ｓｆ−１とｌｒｈはＦＴＺ−Ｆ１の二つの相同体であり、該相同体の性腺の決定論と早期の発生における役割については記載がある（Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｆａｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。補助的な調節レベルと、ホルモンの核受容体の作用とその他のパートナー（たとえばｓｏｘ−９など）の間で起こりうる結合は、ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎを介して行われうる。転写制御におけるこの翻訳後修飾と、ゲノムの完全性の重要性は高まり続けている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｓｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎは細胞の配分と因子間の相互作用を同時に修飾する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｋｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＥＲＲのような（Ｍｉｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）マウスの生殖細胞の決定論に関与することで知られるその他の受容体は、発現レベルの変動が大きい研究した系では存在しないと思われる。
【０１３８】
受容体ＲＡＲ、ＲＸＲ、ＴＲは細胞の分化の過程に、より特徴的に関与している。該受容体の発現速度と発現レベルの変動は実施例５で分析した。
【０１３９】
ＲＮＡ結合タンパク質
生殖細胞での遺伝子の転写制御に関与するタンパク質のうち、ＲＮＡを固定するタンパク質、すなわち「ＲＮＡ結合タンパク質」が見られた。これらのタンパク質はとりわけショウジョウバエで同定されており、胚の極性の制御（Ｈｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ａ）と生殖細胞の決定論の制御に介入するものである。もう一つのモデル種、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは、生殖細胞の前成説は、同様に、また概略的には、これらのタンパク質の存在と役割に基づいている。しかし、これら二つのモデルにおいて、転写に必要な活性化であるＲＮＡポリメラーゼＩＩのリン酸化による活性化の制御は、これら「ＲＮＡ結合タンパク質」によっては行われない（Ｓｅｙｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。哺乳類においては、これらの遺伝子のうちいくつかがマウスにおける生殖系の維持にも不可欠であることが示されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかし、マウスの生殖細胞の由来は、三次元的な細胞環境と、ＢＭＰ−４やＢＭＰ−８のような因子の作用とに関連した、さまざまなアクターによる誘導現象に、より関連していると考えられる。これらの誘導全体が最終的に、Ｏｃｔ−３／４のようなさまざまな主要なアクターの発現レベルを制御する（Ｓａｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。この誘導の由来は、マウスのＭＥＳＣ細胞の分化から生殖細胞をインビトロで得ることによって強化されると考えられる（Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｇｅｉｊｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｔｏｙｏｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１４０】
ニワトリにおいては、ニワトリの胚の早期段階ですぐに、ｖａｓａ陽性細胞が特定されたことで、前成説が再び説かれている（Ｅｘｔａｖｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｔｓｕｋｅｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この仮説では、ある特定の「ＲＮＡ結合タンパク質」の役割が必要不可欠であると考えられる。
【０１４１】
発現レベルをテストしたこのファミリーの約６０の遺伝子では、ＣＥＳＣ細胞よりもＣＥＧＣ細胞において、しかしまた胚盤葉細胞においてもずっと強く発現する遺伝子として、ｂｒｕｎｏ遺伝子（ＡＢ０５０４９７）、ｔｕｄｏｒ遺伝子（ＴＣ２１３３７８）、ｎａｎｏｓ遺伝子（ＴＣ２２３６２９）、ｖａｓａ遺伝子（ＡＢ００４８３６）が検出されたが、これは、おそらくこれらの細胞における生殖レベルでのコンピテント細胞の存在に対応している。ＣＥＳＣ細胞はｖａｓａ遺伝子に対して陽性であるが、該細胞が培養に維持されるとすぐに、生殖系をほとんど導かなくなる。また、相対的な発現レベルはこの生殖能力に不可欠な要素だと考えられる。ｎａｎｏｓ遺伝子のようなある特定の遺伝子は、ほぼＣＥＧＣ細胞に対してのみ発現の特異性を有する。ｍａｇｏ遺伝子は、ＣＥＳＣおよびＣＥＧＣの二つの細胞型と比べて、胚盤葉細胞でより強い発現を示した。また、ＲＮＡを結合させる能力を有するＲＮＡヘリカーゼタンパク質の特徴的なモチーフである「Ｄｅａｄ  ｂｏｘ」により特徴付けられる遺伝子についても指摘することができる（Ｒｏｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｄｄｘ  ２８遺伝子（ＴＣ２１１７４８）ならびにＲＮＡシクラーゼの相同体（ＴＣ２１４８８８）はＣＥＳＣ細胞で良好に発現した。ショウジョウバエおよび／またはＣ．ｅｌｅｇａｎｓのタンパク質と相同的な新規な分子は、さらに同定すべきものであり、該分子とはとりわけ、ｏｓｋａｒ、ｐｕｍｉｌｉｏ、ａｕｂｅｒｇｉｎｅ、ｍａｅｌｓｔｒｏｍ相同体などである。哺乳類においては、生殖細胞の性質の制御におけるこれら「ＲＮＡ結合」タンパク質の役割は知られていないが、ショウジョウバエで得られた結果によると、これらの遺伝子の活性のあらゆる乱れが生殖系の消失につながると考えられる。タンパク質は、該タンパク質が認識するメッセンジャーの細胞質／核局在化の制御に、ひいてはこれらの標的メッセンジャーの翻訳の効率に作用すると考えられる（Ｈｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｈａｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐａｌａｃｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらのタンパク質と該タンパク質のＲＮＡの作用メカニズムは、とりわけｉＲＮＡと「ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体」であるＲＩＳＣ複合体による、これらのメッセンジャーの発現レベルの潜在的な調節によって、複雑化し続ける（Ｔｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１４２】
非対称的な分裂および多くの種の生殖系の維持に関与するｐｉｗｉ遺伝子（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｋｕｒｏｍｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、ＣＥＳＣ細胞よりもＣＥＧＣ細胞でより多く発現した。胚盤葉細胞では、ＣＥＳＣ細胞およびＣＥＧＣ細胞におけるよりもｐｉｗｉは発現しないと考えられる。このｐｉｗｉ遺伝子はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のファミリーに属し、ＲＩＳＣ複合体の必須の構成要素の一つである。該遺伝子はＰＡＺドメインを含み、該ドメインは、ＲＮＡを結合し、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡの分解の二本鎖ｍＲＮＡレベルでのエンドヌクレアーゼとして作用することができるものである（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｔａｈｂａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。また、ｄｉｃｅｒ遺伝子の発現レベルは、ｓｉＲＮＡの産生を保証し、またニワトリにおいても同定されているものであり（Ｆｕｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＣＥＳＣ細胞とＣＥＧＣ細胞において同等であると考えられる。
【０１４３】
その他の遺伝子
比較した細胞型によって発現で大きな差異を示すその他の遺伝子のうち、ＣＥＳＣ細胞と胚盤葉細胞に特異的なｔｒａ−１（ＮＭ２０４２８９）、先行研究でＣＥＳＣ細胞のマーカーとして記載されている（Ａｃｌｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）ｅｎｓ−１遺伝子、ＭＥＳＣ細胞の生理に関与するＴ−ｂｏｘというボックス遺伝子であるがその役割は分かっていないｆｂｘ１５遺伝子とｆｂｘ１５ｂ遺伝子（Ｔｏｋｕｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、Ｎｋｘ転写因子ファミリーのｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックス遺伝子ＩＲＸ４（Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）の存在を挙げることができる。その他の多くの遺伝子が発現の差異を示した。
【０１４４】
未知の遺伝子
機能が現状では完全に未知である遺伝子は、試験したさまざまな細胞型の間で発現の差異を示した。たとえば、ＣＥＧＣ細胞で過剰発現した遺伝子ＴＣ９７６（ＴＣ２２７３６９）、ＴＣ９５４（ＴＣ２０３４１０）およびＦＬＪ００１８８（ＴＣ１９６６９７）と、ＣＥＳＣ細胞で過発現した遺伝子ＴＣ８６９（ＴＣ１９２９２７）、１Ｐ０８−Ａ０９（ＴＣ１８９６３９）、ＴＣ８２３（ＴＣ２０９０８４）、ｓｌｃ３８ａ２（ＴＣ１８７３６０）、ＴＣ８９６（ＴＣ１９６３９９）、ＦＰＰシンターゼ（ＴＣ２１１２３５）、ＴＣ８７４（ＴＣ１９３５９０）およびＣＥＳ−ｃ３２（ＴＣ８３６９４）とを挙げることができる。胚盤葉細胞でより多く発現した遺伝子ＣＰＥ１７３８（ＴＣ２１４７４１）を指摘することができる。ＴＣ９７６遺伝子は、アンキリン・モチーフとＳＯＣＳボックス（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、サイトカインシグナル伝達の抑制遺伝子）を含んだ、マウスのＡＳＢ−６タンパク質との部分的な相同性を有している（Ｗｉｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらのＡＳＢ遺伝子は生殖細胞で発現することが多く、ＡＳＢ１４遺伝子は、ＣＥＳＣ細胞とＣＥＧＣ細胞で好適な発現が見られたが、胚盤葉細胞ではほとんど見られなかった。これらの遺伝子の機能の仮説の一つは、ＳＯＣＳドメインが特定のメッセンジャーに特異的な生殖細胞の区画化に介入し、体細胞でのそれらの分解を促進させるというものである（ＤｅＲｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。このメカニズムは同時に存在し、「ＲＮＡ結合タンパク質」によって行われるメカニズムに相補的であると考えられる。
【０１４５】
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−Ｓｏｏｄｅｅｎ−Ｋａｒａｍａｔｈ  Ｓ，Ｇｉｂｂｉｎｓ  ＡＭ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．５８：１３７−４８．
−Ｓｔｅｂｌｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２７２：３５１−６１．
−Ｓｕｍｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：８６１−７２．
−Ｓｗａｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７６１−７．
−Ｓｗａｎｂｅｒｇ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２３１：１４−２１．
−Ｔａｄａ  Ｔｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．２０７：５５１−６１．
−Ｔａｈｂａｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．５：１８９−９４．
−Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：５４１−５．
−Ｔａｎａｋａ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：８４１−５３．
−Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２：７８４４−８．
−Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−７．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１８２７．
−Ｔｈｏｒａｖａｌ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．７３：１８９７−９０５．
−Ｔｈｏｒａｖａｌ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．７３：１８９７−９０５．
−Ｔｏｋｕｚａｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：２６９９−２７０８．
−Ｔｏｍａｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６：８３１−４１．
−Ｔｏｙｏｏｋａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００：１１４５７−６２．
−Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：３６０９−２１．
−Ｔｓｕｄａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２３９−４１．
−Ｔｓｕｎｅｋａｗａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：２７４１−５０．
−Ｖａｌｌｉｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２７５：４０３−２１．
−Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ＶＥ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−７．
−Ｖｉｄａｌ  ＶＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２８：２１６−７．
−Ｗａｇｅｒｓ  ＡＪ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６：６３９−６４８．
−Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｌｉｎ  Ｈ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：２０１６−９．
Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１３：１４２９−３４．
−Ｗｉｌｃｏｘ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９：３８８８１−８．
−Ｗｉｌｄｅｒ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９２：６１４−２９．
−Ｗｉｎｎｉｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２１０５−１６．
−Ｗｕｒｍｓｅｒ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１２５３−５．
−Ｘｉｅ  Ｔ，Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ  ＡＣ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：３２８−３０．
−Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ＹＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１５４７−５０．
−Ｙａｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．６：６３７−４８．
−Ｙｅｏｍ  ＹＩ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：８８１−９４．
−Ｙｉｎｇ  ＱＬ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  １１５：２８１−９２．
−Ｙｉｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：１０５３−６３．
−Ｙｉｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９８：７８５８−６２．
−Ｙｏｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：３１５７−６５．
−Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．１９９４  Ｆｅｂ；４５（２）：１６３−７１．
−Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｅｖ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４１：６７５−８４．
−Ｙｏｕｎｇｒｅｎ  ＫＫｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：３６０−４．
−Ｙｕ  ＲＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１０１０−２２．
−Ｙｕａｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２６３５−４５．
−Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：８３６−４１．
−Ｚｈａｏ  ＧＱ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：１６５７−６９．
−Ｚｈａｏ  ＧＱ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５；１１０３−１２
−Ｚｈｏｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７：１０２８−３４．
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ＳｔＸ細胞で発現する遺伝子の表である。
【図２】幹細胞で発現する遺伝子の表である。
【図３】生殖細胞で発現する遺伝子の表である。
【図４】ＳｔＸ細胞および幹細胞で発現する遺伝子の表である。
【図５】幹細胞および生殖細胞で発現する遺伝子の表である。
【図６】生殖細胞およびステージＸの細胞で発現する遺伝子の表である。
【図７】ＧＦ５８細胞の成長曲線を示す図である。
【図８】ＧＦ５８細胞におけるいくつかの遺伝子の発現レベル（ｐ７）を示す図である。
【図９】性腺で観察されたレベル（＝１）と比較した、ｐ３ｇ画分とｐ４ｇ画分における遺伝子発現の分析を示す図である。
【図１０】試験した遺伝子クラスの分類を示す図である。
【図１１】分化誘導過程における、クラス１遺伝子の発現レベルの変動を示す図である。
【図１２】分化誘導過程における、クラス２遺伝子の発現レベルの変動を示す図である。
【図１３】分化誘導過程における、クラス３遺伝子の発現レベルの変動を示す図である。
【図１４】ステージＸの胚盤葉細胞、ＣＥＳＣ細胞およびＣＥＧＣ細胞間の、発現プロファイルの比較を示す図である。
【図１５】ＣＥＳＣ細胞、ステージＸの胚盤葉細胞およびＣＥＧＣ細胞間の発現プロファイルの比較を示す図である。
【図１６】ＣＥＧＣ細胞、ステージＸの胚盤葉細胞およびＣＥＳＣ細胞間の発現プロファイルの比較を示す図である。
【図１７】ニワトリのｎａｎｏｇ遺伝子のタンパク質配列とｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図１８】ニワトリのｇｃｎｆ遺伝子のタンパク質配列とｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図１】
2009529900.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009529900.tif 000014
【図１４】
2009529900.tif 000015
【図１５】
2009529900.tif 000016
【図１６】
2009529900.tif 000017
【図１７】
2009529900.tif 000018
【図１８】
2009529900.tif 000019
【配列表】
2009529900000001.app
【国際調査報告】
2009529900.tif 000020
2009529900.tif 000021
2009529900.tif 000022
2009529900.tif 000023
2009529900.tif 000024
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