(57)【要約】【課題】成長した（出来上がった）バイオフィルムに対して、ＫＳＬが大きな効果を奏し、副作用の少ない口腔衛生を促進するための処置剤および方法を提供する。【解決手段】成長したバイオフィルムを処置する、口腔衛生を促進するための方法は、バイオフィルムの機械的な分断の後にＫＳＬを適用する口腔環境に、抗菌ペプチドＫＳＬおよび界面活性剤を適用する工程を含む。ＫＳＬを含む歯垢予防チューインガムは、持続的な放出の口腔衛生処置を提供する。【選択図】図１１
2009516645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌ペプチドと、界面活性剤とを含む口腔衛生処置剤。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）またはその誘導体を含む請求項１に記載の処置剤。
【請求項３】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）である請求項２に記載の処置剤。
【請求項４】
前記界面活性剤が、カチオン剤である請求項１に記載の処置剤。
【請求項５】
前記界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムである請求項４に記載の処置剤。
【請求項６】
前記界面活性剤が、塩化ベンジルおよび塩化ピリジンからなる群から選択される請求項１に記載の処置剤。
【請求項７】
前記抗菌ペプチドおよび前記界面活性剤が、水性の口内洗浄液中で混合される請求項１に記載の処置剤。
【請求項８】
成長したバイオフィルムを、抗菌デカペプチドおよび界面活性剤に接触させることを含む、成長した口腔バイオフィルムを処置する方法。
【請求項９】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤がカチオン剤である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムである請求項１０に記載の処置。
【請求項１２】
前記成長したバイオフィルムを接触させる前記工程が、成長したバイオフィルムを有する使用者の口内をＫＳＬとベンザルコニウムと、を含有する溶液ですすぐことを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
成長したバイオフィルムを機械的に分断させることと、
前記分断されたバイオフィルムを抗菌デカペプチドに接触させることとを含む成長したバイオフィルムを処置する方法。
【請求項１４】
前記抗菌デカペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ガム基材と有効な量の抗菌デカペプチドとを含む、歯垢予防のチューインガム。
【請求項１６】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）を含む請求項１５に記載のチューインガム。
【請求項１７】
さらに界面活性剤を含む請求項１６に記載のチューインガム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、界面活性剤または機械的分断と併せた抗菌デカペプチドの使用による、出来上がったバイオフィルム（生物膜）の処置剤に関する。本発明はまた、持続的歯垢（プラーク）防止剤としての抗菌デカペプチドを含有するチューインガムの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、出来上がった口腔バイオフィルムの処理における界面活性剤または機械的分断を伴うＫＳＬの使用、および口腔衛生処置に使用するためのＫＳＬを含有するチューインガムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの口腔バイオフィルムは、コロニー形成可能な表面に形成された多様なかつ複数種の微生物群落から成る複雑な三次元構造物である（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｏｌｅｎｂｒａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９３；Ｋｏｌｅｎｂｒａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｊｒ．，２００４；Ｍａｒｓｈ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｓｈａｗ，１９９５）。細菌の堆積に大きな影響を有する基層の物理的なおよび化学的な表面特性は別として（Ｑｕｉｒｙｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．， ２０００）、口腔バイオフィルムの形成には一連の事象が含まれる。これには、コロニー形成可能な表面上での条件付けの唾液由来の膜（後天性の唾液薄膜（ペリクル））の初期形成、後天性の薄膜に存在する宿主由来の受容体分子への一次付着菌の付着、付着した初期の付着菌に対する二次付着菌のそれに続く相互作用、付着した細菌の続く増殖（コロニー形成）、および成長した微生物群落の発達が挙げられる（Ｋｏｌｅｎｂｒａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９３；Ｍａｒｓｈ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｓｈａｗ，１９９５；Ｑｕｉｒｙｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの群落における特定の常住菌の増殖が制御されなければ、口腔疾患の発症の一因となる可能性がある（Ｌｏｅｓｃｈｅ，１９９９）。
【０００３】
虫歯および歯周病の発症は歯垢に密接に関連しており、歯垢は、歯の表面に形成された唾液薄膜への細菌の吸着またはそれらの凝集の結果として形成される。歯垢に関連した口腔疾患を予防および治療するために、殺菌および／または静菌のメカニズムによって作用する抗菌剤の使用に対する関心が高まっている。これらの作用剤の中には、クロルヘキシジン、トリクロサン、金属イオン、第四級アンモニウム化合物および精油がある。
【０００４】
唾液薄膜は、唾液タンパク質の選択的吸着によって形成される。唾液タンパク質における荷電基がエナメルの中の反対の符号の電荷と相互作用し、薄膜では負に帯電した酸性の唾液タンパク質が優勢である。したがって、歯の表面または酸性の唾液タンパク質に対する薬剤の親和性は、歯垢の形成を阻害する重要な要因である。クロルヘキシジンは、強いカチオン活性を持つビスビグアニドである。細菌成分または酸性の唾液成分へのクロルヘキシジンの結合およびそれに続く口腔表面での保持には、クロルヘキシジンが歯垢の増殖を阻害できる度合が直接関係することが以前から示唆されている。現在の用途ではクロルヘキシジンは最も有効な歯垢防止剤とみなされているが、これは、苦味、味覚の認知障害、歯および舌の可逆的な汚れならびに歯磨き剤中の界面活性剤との相互作用のような幾つかの短所を有する。
【０００５】
その内容を全体として引用によって本明細書に組み入れる、出願者の同時係属出願である米国特許出願第１０／７９５，５１４号では、本発明者は、抗菌デカペプチドＫＳＬおよびその類縁体をバイオフィルムの形成を防ぐのに使用でき、かつ口腔微生物の増殖を抑えるのに使用可能であるという発見を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＫＳＬは口腔バイオフィルムの形成を妨げることにおいて有用性を示したが、ＫＳＬは出来上がったバイオフィルムには大きな効果を有さなかった。さらに、ＫＳＬは口腔微生物の増殖を抑えるのに効果的であったが、ＫＳＬを用いた口腔衛生用の確実な投与方法および治療は明確には示されていない。理解されるように、流水や歯ブラシが利用できない状況では、歯垢および口腔バイオフィルムを制御する方法が必要である。例えば、戦場の兵士は歯磨きをせずに数日から数週間過ごすことを求められる可能性がある。さらに、クロルヘキシジンの短所を考えると、処置が実際に使用されるのを確実にするために、よりはっきりした味を有し、副作用の少ない歯垢防止処置が必要とされる。
【０００７】
上記のことは、出来上がったバイオフィルムの処置および歯垢防止剤として抗菌剤を用いた処置に関連する問題のいくつかを強調している。さらに、上記のことは、出来上がったバイオフィルムを処置するための信頼できる処方および方法に関する、長い間の、しかし未解決の、当該技術におけるニーズを強調している。上記のことはまた、歯磨きが現実的ではない場合の、歯垢を処置する明瞭な組成および方法に関する、長い間の、しかし未解決の、当該技術におけるニーズを強調している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記の現実的な問題を克服し、同時に新しい利点を提供する。
最近、種々の天然資源から分離された抗菌ペプチドが、その原核生物に対する選択性および微生物耐性をできるだけ抑えるという期待から、注目を集めている。その抗菌活性を改善することを目標に、これら天然ペプチドの類縁体が合成されている。合成組み合わせライブラリー技術を用いて新規の抗菌デカペプチド（ＫＳＬ）が開発された。このペプチドおよびその類縁体のいくつかは、広い範囲の抗菌活性を持つとともに、虫歯の発症および歯垢の形成に関連する口腔細菌株の増殖を抑えることが本発明者によって示されている。一次構造は以下のとおりである。
【０００９】
［Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2］  （配列番号１）
歯垢防止剤用の媒体としてのチューインガムの使用は、実際的な観点およびコンプライアンスの観点から魅力的である。ガムの利点は、それが普通、すすぎ剤や歯磨き剤よりも長く口中に保持されることである。したがって、チューインガムに含まれる活性剤は、唾液中に上手く放出されれば、種々の受容部位に結合する十分な時間を有するであろう。ＫＳＬもまた５つのリシン残基を含有するカチオン性分子なので、歯の表面との、および唾液における酸性の糖タンパク質との静電気的相互作用の可能性を有すると考えられる。
【００１０】
ＫＳＬはバイオフィルムの形成を効果的に阻止することが以前より示されているが、成長したバイオフィルムに対しては相対的に効果がないままである。本発明者は、界面活性剤の存在下で、またはバイオフィルムを機械的に分断した後にＫＳＬを使用すると、ＫＳＬは成長したバイオフィルムの生存率に有意な影響を及ぼすという予期しない結果を発見した。したがって、本発明は、ＫＳＬは、歯垢が介在する口腔疾患を防ぐための従来の口腔衛生にとって、有用な添加剤になる可能性を示している。
【００１１】
本発明者はまた、チューインガム組成におけるＫＳＬの使用が、味の悪さ、歯の汚れまたは持続的な放出を保証できないことを含む従来技術の歯垢予防ガムの欠点を持たないことも発見した。
以下の実施の説明および実施例によって、本発明の新規な方法、手段および化合物が当業者に明らかにされる。
【００１２】
図面と併せて本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】咀嚼（チューイング）装置およびサーモスタット試験セルを示す。上面と下面との間にガムを置く。咀嚼手順は、上面の剪断（ねじり）運動と組み合わせた下面の上下のストローク（往復運動）から成る。
【図２】水中で（ａ）、および０．１Ｍのホウ酸緩衝液（バッファ）（ｐＨ９）中（ｂ）で５５℃で３日間インキュベート（培養）したＫＳＬ標準のＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図３】５５℃で異なったｐＨ条件におけるＫＳＬの分解動態を示す。
【図４】異なったｐＨの緩衝液におけるＫＳＬの分解に関するアレニウスプロットを示す。
【図５】３７℃での人工唾液におけるＨＡディスクに対するＫＳＬの吸着を示し、（ａ）は、８個の未処理のＨＡディスクに対するＫＳＬ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の吸着の概要であり、（ｂ）は未処理および２０分間予備処理したＨＡディスクに対するＫＳＬの吸着である。予備処理したＨＡディスクはヒト唾液に３７℃で２時間浸し、次いで人工唾液で洗浄し、乾燥してＫＳＬ溶液に加えた。
【図６】３７℃の人工唾液におけるガム組成からのＫＳＬの試験管内放出を示す。咀嚼装置を用いて、異なるＫＳＬ添加（５、１０、２０ｍｇ）を含有するチューインガムを調べた。
【図７】噛み終え試験によるガム組成からのＫＳＬの生体内放出を示す。それぞれ５、１０または２０ｍｇのＫＳＬを含有するガムを被験（志願）者が所定の時間噛み、残った量を抽出し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。
【図８】二重（デュアル）フローセルモデルの模式図である。（Ａ）フローシステム。矢印は流れ（フロー）の方向を示す。このシステムは、１４ゲージのマスターフレックス（Master flex）チューブ（イリノイ州、バーノンヒルズのCole-Palmer社）によって接続される。ＫＳＬによるバイオフィルムのパルス処理については、それぞれ処理溶液および制御溶液を含有する２つの注入可能なシリンジを有するシリンジポンプ（マサチューセッツ州、ホリストンのKD Scientific社）を直接、三方弁を介して各フローチャンバーに接続する。（Ｂ）二重フローセルを示す。このフローセルは、Ｇｅディスクを保持するための３つの凹部をそれぞれ有する２つの平行なフローチャンバーから成る。各凹部の内径および内部の深さはそれぞれ１０．２５ｍｍおよび２．０ｍｍである。流入口用および流出口用に直径２．０ｍｍの穴がフローチャンバーの各端に穿孔されている。フローチャンバーは、一方の側においてポリカーボネートの底板によって受けられ、他方の側において２つの平行する６０ｍｍ×２４ｍｍのＮｏ．２カバーガラスを含むアルミニウムの蓋（カバー）板で止められる。（Ｃ）流路（深さ０．４ｍｍ、幅１３ｍｍ、長さ２５ｍｍ）の寸法を示すフローチャンバーの横断面である。
【図９】ＤＩＣ顕微鏡によって示されるように、二重フローセルにおける口腔バイオフィルムの発達に対するＫＳＬの効果を示す。（Ａ）ＫＳＬ含有（５０□ｇ／ｍＬ）培地によるバイオフィルムフローセルの連続的な潅流はバイオフィルムの形成を妨げる。ＫＳＬを含まない培地で潅流したフローチャンバーにおいて、唾液で調整されたＧｅ表面に付着した唾液細菌からのバイオフィルムの発達を示す未処理のバイオフィルム細胞（ａ〜ｃ：陰性対照）の画像。ＫＳＬ（５０□ｇ／ｍＬ）で処理したバイオフィルム細胞（ｄ〜ｆ）の画像。処理対未処理の並んだ画像は、二重フローセルの平行したチャンバーでの接種に続いて、２時間（ａ、ｄ）、５時間（ｂ、ｅ）および８時間（ｃ、ｆ）の間隔で得た。（Ｂ）さらに低い濃度のＫＳＬ含有培地（１０□ｇ／ｍＬ）によるチャンバーの潅流は、バイオフィルムの形成を防ぐのにあまり有効ではなかった。未処理（ａ〜ｂ）および処理（ｃ〜ｄ）。画像は、接種に続いて２時間（ａ、ｃ）および８時間（ｂ、ｄ）の間隔で得た。結果は３回の実験の１つを表す。倍率は２００倍。棒は５０□ｍを示す。
【図１０】ＫＳＬを含まない培地（ａ〜ｃ）およびＫＳＬを含有する（５０□ｇ／ｍＬ）培地（ｄ〜ｆ）によってパルス処理したＧｅ表面における口腔バイオフィルム細胞のＤＩＣ画像を示す。パルス処理（２時間間隔で０．２ｍＬ／分で３０分間）は、接種後４時間（Ａ）または６時間（Ｂ）で開始した。バイオフィルムの増殖は、接種後６時間ではなく４時間、ＫＳＬでパルス処理されたフローチャンバーにおいて大きく阻害された。処理対未処理の画像は、二重フローセルの平行チャンバーに唾液細菌を接種した後、２時間（ａ、ｄ）、６時間（ｂ、ｅ）および１０時間（ｃ、ｆ）の間隔で得た。データは、３回の別個の実験の１つを示す。倍率は２００倍。棒は５０□ｍを示す。
【図１１】無傷のバイオフィルムおよび分断したバイオフィルムに対するＫＳＬの効果および界面活性剤を有するＫＳＬのバイオフィルムに対する効果を示す。（Ａ）試験管内プラークアッセイ（分析物）を用いた、無傷のバイオフィルム、および唾液細菌により唾液に被覆されたＨＡディスク上に形成された４５時間の分断されたバイオフィルムに対するＫＳＬの効果。マンホイットニー検定を用いて、実験群（ＫＳＬ処理した、無傷の、または分断したバイオフィルム）間のＣＦＵの対数低下を対照群（ｄＨ2Ｏ処理の、無傷の、または分断したバイオフィルム）と比較した。１つのアスタリスクは、ＫＳＬ処理された無傷のバイオフィルムとｄＨ2Ｏ処理された無傷のバイオフィルムとの間に統計的に有意な差があることを表す（ｐ＜０．０５）。同様に、２つのアスタリスクは、ＫＳＬ処理された分断されたバイオフィルムとｄＨ2Ｏ処理された分断されたバイオフィルムとの間に統計的に有意な差があることを表す（ｐ＜０．０１）。ＫＳＬは、処理された無傷のバイオフィルムのＣＦＵをやや低下させたが、クロルヘキシジン（ＣＨＸ）は無傷のバイオフィルムの生存率をさらに大きく低下させた。（Ｂ）試験管内プラークシステムを用いた、唾液で被覆したＨＡディスク上に形成された無傷の６６時間の口腔バイオフィルムに対するＫＳＬの殺菌活性を促進する塩化ベンザルコニウムの効果。クラスカル・ワリス検定を用いて、対照群（ｄＨ2Ｏ処理）を含む種々の処理群の間でＣＦＵの対数低下を比較した。１つのアスタリスクは、ＫＳＬおよび塩化ベンザルコニウム（Ｂｚｌ）の併用処理と、ｄＨ2Ｏ（ｐ＜０．００１）、ＫＳＬ（ｐ＜０．０１）またはＢｚｌ（ｐ＜０．０１）処理された無傷のバイオフィルムとの間に統計的に有意な差があることを表す。２つのアスタリスクは、ＣＨＸとｄＨ2Ｏ（ｐ＜０．００１）またはＢｚｌ（ｐ＜０．０５）処理された無傷のバイオフィルムとの間に統計的に有意な差があることを表す。ＫＳＬまたはＢｚｌ単独では、ｄＨ2Ｏ処理された群と比べて無傷のバイオフィルムの生存率に有意な低下は生じないが、ＫＳＬとＢｚｌとの併用は、これら６６時間の口腔バイオフィルムの生存率に有意な効果を有した（生菌数で１対数の低下を超える）。ＣＨＸ処理された群とＫＳＬおよびＢｚｌの併用との間には、生菌数で有意差は認められなかった。（Ａ）および（Ｂ）について、データは、それぞれ４つ一組で行われた３回の別個の実験の１つの判定を表す。バーは標準偏差を表す。（Ｃ）唾液を被覆したＨＡ表面で増殖した対照のバイオフィルムおよび処理したバイオフィルムの共焦点画像。Live/ Dead BacLight（商標）生存率キット（オレゴン州、ユージーンのMolecular Probes社）を用いて様々な処理に晒されたバイオフィルム細胞の生存率を評価した。製造元によって記載されたようにBacLightアッセイ溶液を製造元の示す通りに調製し、暗所にて室温で１５分間、検体を染色した。水で３回洗浄した後、Ａｒ−Ｋｒレーザー（ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０メタ）および液浸（長い作動距離）対物レンズを取り付けたアキシオプラン光学顕微鏡で試料を観察した。４８８ｎｍの励起波長を使用し、２つの別個の放射フィルター、５００〜５３０ｎｍ（ＳＹＴＯ、生細胞）および６５０〜７１０���ｍ（ヨウ化プロピジウム、死細胞）によって放射される蛍光を集めた。ほとんど緑色に染まるバイオフィルム細胞（生細胞を示す）を示した対照（１ａおよび１ｂ）に比べると、ＣＨＸ（２ａおよび２ｂ）またはＫＳＬとＢｚｌとの併用（５ａおよび５ｂ）は、ほとんど赤色に染まるバイオフィルム細胞（死細胞を示す）の存在によって示されるように、バイオフィルム細胞の生存率を有意に低下させた。示された濃度でのＫＳＬ（３ａおよび３ｂ）またはＢｚｌ（４ａおよび４ｂ）単独では、バイオフィルム細胞の生存率にさほど影響を有さなかった。パネル１ａ〜５ａはバイオフィルムの水平（ｘｙ）の断面を表すが、パネル１ｂ〜５ｂは、種々の作用剤で処理したバイオフィルムの矢状（ｘｚ）の画像（水平のｘｙ断面上の線で示される）である。棒は５０μｍを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は部分的には、ＫＳＬおよびその類縁体が、界面活性剤と組み合わせると、成長したバイオフィルムの処置に相乗効果を有するという発見に基づく。これらの予期しない、かつ驚くべき結果を以下の実施例で述べる。本発明のこの局面によれば、界面活性剤と組み合わせたＫＳＬは、口腔微生物の増殖、成長したバイオフィルム、ならびに特に、虫歯および歯垢を予防および処置する方法の一部であってもよい。本発明のこの局面は、歯磨きが実行可能な選択肢ではない環境における口腔衛生および処置のための口腔衛生組成に有用であることが明らかになるであろう。
【００１５】
本発明はまた部分的には、ＫＳＬおよびその類縁体が、バイオフィルムの機械的分断と併せて使用される場合、成長したバイオフィルムを処理するのに使用されてもよいという発見に基づく。これらの予期しない、かつ驚くべき結果についても以下の実施例で述べられる。本発明のこの局面によれば、歯磨きのような機械的分断と組み合わせたＫＳＬは、口腔微生物の増殖、成長したバイオフィルム、ならびに特に、虫歯および歯垢を予防および処理する方法の一部であってもよい。本発明のこの局面により、普遍的な口腔衛生処置プログラムの一部として有用であることが分かるであろう。
【００１６】
本発明はまた部分的には、ＫＳＬおよびその類縁体が、チューインガム組成に使用されて、持続的な歯垢予防剤を提供してもよいという発見に基づく。ＫＳＬチューインガム組成の予期しない、かつ優れた結果を以下の実施例で述べる。本発明のこの局面によれば、ＫＳＬおよびその誘導体は、歯垢形成を防止し、予防し、より良い口腔衛生を促進するチューインガム組成の一部であってもよい。本発明のこの特徴は、例えば、戦場の兵士のような、歯を磨くことができない、または歯を磨かない個人にとってより良い口腔衛生を促進するのに特に有利である。
【００１７】
以下の実施例は、本発明の種々の有利な特徴および予期しない結果をさらに明らかにするであろう。
Ａ．抗菌デカペプチド（ＫＳＬ）のチューインガム
１．材料および方法
１．１  材料
自動ペプチド合成機（モデル９０、ケンタッキー州、ルイスビレのAdvanced Chem Tech社）により、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応を用いた標準の固相法によってＫＳＬ（ＭＷ＝１２５０Ｄａ）を合成し、上述のようにその純度を決定した［７］。ガム基材（ＳＭＩＬＹ２Ａ）は、Gum Base社（イタリア、ミラノ）から得た。ｄ−ソルビトールおよびｄ−マンニトールはSigma社（ミズーリ州、セントルイス）から入手した。アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Fisher Scientific（ニュージャージー州、フェアローン）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はピアース（イリノイ州、ロックフォード）から入手した。そのほかの化学物質はすべて分析等級であり、市販品を入手して使用した。
１．２  ＫＳＬの高速液体クロマトグラフィによる分析
プロスフェアＣ−１８ガードカラム（４．６×７．５ｍｍ、イリノイ州、ディアフィールドのAlltech社）を有するプロスフェアＣ−１８分析用カラム（４．６×２５０ｍｍ、イリノイ州、ディアフィールドのAlltech社）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによってＫＳＬを分析した。移動相Ａ（水中の０．１％ＴＦＡ水溶液）および移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）による勾配溶出を行った。ＫＳＬは、流速１．０ｍＬ／分にて８０：２０〜７０：３０（移動相Ａ：Ｂ）の線形勾配により８分間で溶出された。総稼動時間は１６分で、注入容量は４０μＬだった。２１５ｎｍでのＵＶ検出によってクロマトグラムを記録した。
１．３  安定性試験
脱イオン水における１０ｍｇ／ｍＬのペプチド原液を用いてＫＳＬの試験溶液を調製した。０．１Ｍの緩衝液濃度で、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）およびホウ酸ナトリウム緩衝（ｐＨ９）液中でＫＳＬペプチドの分解を調査した。２００μｇ／ｍＬのＫＳＬを含有する各緩衝溶液を温度制御したオーブンにて、それぞれ２５℃、３７℃および５５℃でインキュベートした。所定の時間で試料を取り出し、前記のＨＰＬＣ条件下で分析した。人工唾液中で３７℃で３日間にわたってＫＳＬの安定性を調査した。実際の使用条件を模倣する試みとして、試験管内の放出試験に人工唾液を使用した。人工唾液の成分は、以下のとおりである：塩化ナトリウム：０．８４４ｇ、塩化カリウム：１．２００ｇ、塩化カルシウム２水和物：０．１９３ｇ、塩化マグネシウム６水和物：０．１１１ｇ、リン酸水素二カリウム：０．３４２ｇを水で１０００ｍＬにする。塩酸溶液によってｐＨをｐＨ５．７±０．１に調整した［２６］。
１．４  ヒドロキシアパタイトディスクとの相互作用
３７℃の人工唾液中のＨＡディスク（サイズ：直径０．３８インチ×厚さ０．０６〜０．０８インチ）とＫＳＬとを相互作用させることによって、歯のような素材に対するＫＳＬの親和性を評価した。歯の表面を模倣するために、ろ過したヒト唾液中で２時間ＨＡディスクを予備処理した（ＨＡディスク４個／ヒト唾液４ｍＬ）。朝、朝食の前に３人の健常な男性提供者からヒト全唾液を採取した。採取後、直ちに唾液を１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、０．４５μｍの膜フィルターにより浮遊物をろ過した。ＨＡディスクは、ヒト唾液で調整した後、人口唾液ですすぎ、３７℃のＫＳＬ溶液（人工唾液中、０．５ｍｇ／ｍＬ）４ｍＬに加えた。対照として、未処理のＨＡディスクを直接３７℃のＫＳＬ溶液に加えた。１８サイクル／分の速度で垂直回転する回転ホイールに試料バイアルを搭載した。所定の時間に試料を取り出し、遠心分離し、浮遊物をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
１．５  チューインガムの調製
上述した手順［８］に従ってチューインガム組成を調製した。融解するために、ガム基材を５０〜６０℃の間の温度で加熱した。ガム基材が適当な流体粘度になったら、そのほかの成分とともにＫＳＬを微粉末として加えた。温度を一定に保持する一方で、乳鉢にてガム基材と成分を混合した。混合後、均質なチューインガムを押し出し、類似の形状およびサイズの四角形に切断し、室温にて一晩置いて固くした。ガムの組成は以下のとおりであった。５５０ｍｇのガム基材、４２０ｍｇのソルビトール、１０ｍｇのマンニトール、１０ｍｇのサッカリン、および１０ｍｇ、２０ｍｇまたは３０ｍｇのＫＳＬ（全重量：約１ｇ）。
１．６  試験管内の放出試験
２つのモジュール（ＡＢ  ＦＩＡ社、スウェーデン、ルンド）（図１）からなる試験管内咀嚼放出装置を用いて、チューインガムからのＫＳＬの試験管内放出試験を行った。各モジュールは温度自動調節された（サーモスタットの）ガラスセルからなり、その中には、上下の咀嚼板を保持する鉛直方向を向いた２つのピストンが取り付けられている。４０ｍＬの人工唾液でセルを満たし、チューインガムを下側の咀嚼板上に置いた。咀嚼処理は、上面のねじりの動きと組み合わせた下面の上下のストロークからなり、この運動が、チューインガムの咀嚼および試験培地の撹拌を提供する。試験培地の温度は３７℃に制御され、咀嚼頻度は、１分当たり５０±２ストロークだった。所定の時間間隔で４００μＬの浮遊物を取り出した。各試料採取の後、溶解培地を新鮮な人工唾液に取り換えた。ＫＳＬの放出量はＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した。
１．７  生体内の放出試験
３人の被験者によって噛み終え試験を行った。各被験者は、所定の時間（５分、１０分および２０分間）１分当たり３０回〜４０回の咀嚼回数にて各種ガムの一片を咀嚼した。所定の時間、ガムを咀嚼した後、ガムの中に残っているＫＳＬの量を分析した。ＫＳＬを抽出するために、ガムを５０〜６０℃で５分間加熱し、次いでアセトニトリルとＤＭＳＯ（１：１）との混合物５ｍＬを加えた。５分間十分に混合した後、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を加え、室温で混合物を３０分間活発に撹拌した。試料を遠心分離し、０．４５μｍの膜フィルターにより浮遊物をＨＰＬＣバイアルの中にろ過した。
２．結果および考察
２．１  ＫＳＬのＨＰＬＣ分析
ＫＳＬの分析方法として、勾配溶出を用いた逆相のＨＰＬＣ法が開発されている。ＨＰＬＣ条件下で、脱イオン水中のＫＳＬのスタンダードは、保持時間７．０分で単一ピークとして検出された（図２ａ）。ＫＳＬの検出に関する線形性の相関係数は、ペプチド濃度２０〜４００μｇ／ｍＬの範囲で０．９９９を上回り、係数変動＜５％のこれらの濃度でアッセイは再現可能であった（ｎ＝３、アッセイ内およびアッセイ間）。ＨＰＬＣ法により、５５℃で３日間、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中で生成された分解化合物から無傷のＫＳＬを分離することができた（図２ｂ）。上述した［２７］ようなペプチド結合の切断および酸化が関与する可能性が高い、分解生成物を同定し、または分解経路を決定する試みは行わなかった。
２．２  水溶液中での化学的安定性
図３は、５５℃の種々のｐＨの溶液中での時間に対するＫＳＬの残量比率の半対数プロットを示す。ｐＨは、一次速度式に近似的に従う、観察された分解反応速度によって、ＫＳＬの分解率に影響を及ぼした。ＫＳＬの分解は２５〜５５℃の緩衝溶液中でも調査した。回帰分析による、時間データに対する濃度の半対数プロットの傾きから、分解率定数を得た。ＫＳＬの観察された反応一次速度定数を表１に記載する。ＫＳＬの安定性に関する最適ｐＨは規定できなかったが、最も好ましい安定性は、ｐＨ４の酢酸緩衝液で現れた。５５℃でのＫＳＬ分解の半減期は、ｐＨ４で１６５．０日、ｐＨ７．４で１３．８日、ｐＨ９で４．７日であった。温度と速度定数との関係は、アレニウスプロットによって図４に示す。傾きに由来する活性化エネルギー（Ｅa）は、ｐＨ４で６．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、ｐＨ７．４で１３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、およびｐＨ９で１７．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであった（表１）。ＫＳＬは人工唾液中でも安定であった（データは示さず）。３７℃にて３日間インキュベートした後、ＨＰＬＣで検出される分解ピークはなかった。
２．３  ＨＡディスクとの相互作用
歯のような素材および唾液タンパク質に対するＨＡディスクを用いたＫＳＬの親和性を図５に示す。図５ａは、吸着の平衡が５分以内に生じ、およそ２０％のＫＳＬが８個のディスクに吸着したことを示す。ＫＳＬの吸着は、ＨＡディスクの量およびディスク上のタンパク質被覆（コーティング）に依存した（図５ｂ）。未処理のＨＡディスクと、ヒト唾液に浸すことによってタンパク質を被覆されたＨＡディスクとを比較すると、４個のＨＡディスクを使用した場合、結合に識別可能な差異があった。これは、限られた数の結合部位および被覆されたＨＡディスクに対する大きな吸着のためかもしれない。このことは、ＫＳＬが５つのリジン残基を含有するカチオン性分子なので唾液中の酸性糖タンパク質との静電気的相互作用に大きな潜在力を有するため、酸性の唾液タンパク質が働いたことを示唆している。口腔におけるクロルヘキシジンの保持は歯垢形成の抑制に直接関係することが強く示唆されている［１７〜１９］。ＢａｒｎｅｔｔらはＨＡに対するクロルヘキシジンの結合の生体内での歯垢予防効果との相関を報告した［２８］。この研究に示されるように、ＨＡに対するＫＳＬの親和性は、歯垢形成に関連する口腔細菌株に対する抗菌活性を伴う歯垢予防剤としての可能性を示唆している［７］。
２．４  チューインガムからの試験管内での放出
試験管内での溶解および薬剤放出試験のための装置および方法については、固形投与形態が記載されている［２３］。しかしながら、薬剤の放出には連続的な咀嚼が必要とされるので、これらの方法はチューインガムからの薬剤の放出を調査するのに容易に適合させられない。Ｋｖｉｓｔ外によって開発された装置は、チューインガム組成の試験管内の薬剤放出試験に有用性を示した［２４，２５］。
【００１８】
図６は、様々な量のペプチド（ガム１個当たり５ｍｇ、１０ｍｇおよび２０ｍｇ）を含有するチューインガム組成からのＫＳＬの試験管内放出の特徴を示す。３つのガム組成からのＫＳＬの放出は、１０分で４８〜５５％、２０分で６５〜７２％および３０分で７１〜８２％だった。２０ｍｇのＫＳＬを含有するガム組成は、５ｍｇおよび１０ｍｇのＫＳＬを含有するガム組成よりもやや高い％の放出を示した。全体として７８〜８８％のＫＳＬが６０分間に放出された。放出されたＫＳＬの量は、ガム組成の負荷レベルに比例した。
【００１９】
試験管内の放出試験は、５０〜６０℃で製造されたガム組成におけるＫＳＬの安定性を評価するのに有効であった。ガムから放出されたＫＳＬのＨＰＬＣ分析は、無傷のＫＳＬのピークのみを示したが、これは、製造工程の間、ペプチドが安定のままであることを示している（データは示さず）。
２．５  チューインガムからの生体内での放出
生体内の噛み終え試験を行って、試験管内の結果と生体内の性能との間で薬剤放出パターンを相関させた。訓練を受けた被験者がそれぞれ５分間、１０分間、２０分間ガムを噛み、次いで残留するＫＳＬをチューインガムから抽出した。抽出方法を有効にするために、それぞれ１０ｍｇ、２０ｍｇおよび３０ｍｇのＫＳＬを含有するガムを調べた。３種のガムの抽出収率は、負荷量に対して８４．３〜８８．６％の範囲内であった。抽出したＫＳＬのＨＰＬＣによる分析は、標準ＫＳＬと同一の保持時間で単一ピークを示した。
【００２０】
図７は、試験管内での放出試験で使用したのと同じチューインガム組成からの、ＫＳＬの生体内での放出の特徴を示す。３種のガム組成物からのＫＳＬの％放出は、各時点で有意に異なることはなく、５分では３９〜５２％の放出、１０分では５９〜６９％の放出および２０分では７７〜８３％の放出を示した。試験管内の放出と同様に、放出されたＫＳＬの量は負荷レベルに比例した。生体内試験におけるＫＳＬの放出量が試験管内での放出よりもやや高かったが、放出パターンは本質的に同一だった。試験管内放出と生体内放出との相関係数は＞０．９９であった。先に、Ｋｖｉｓｔらは、同じ装置を用いて得た試験管内の放出の特徴は、生体内の放出の特徴に極めて類似していることも報告した［２５］。結果として、ＫＳＬを含有するチューインガム組成は、好ましい試験管内／生体内の放出の特徴を示したが、それは２０分間でほぼ８０％の放出に達した。２０分という咀嚼時間は、ガムを噛むアメリカ人の８０％超にとって通常の時間であることが報告されている［２９］。
３．結論
ＫＳＬは、ヒト唾液で予備処理されたＨＡディスクに高い親和性を示し、チューインガムに上手く調合された。咀嚼装置を用いて試験管内で、および噛み終え法によって生体内で有望な放出特性が得られた。この試験は、ＫＳＬが制御された仕方でチューインガムから放出され、口腔に効果的に保持されて歯垢の形成を抑制することを示唆している。
Ｂ．口腔バイオフィルムの制御
１．材料および方法
抗菌デカペプチド、ＫＳＬの合成
自動ペプチド合成機（モデル９０、Advanced Chem Tech社、ケンタッキー州、ルイスビレ）で、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応を用いた標準の固相法によってＫＳＬ（ＫＫＶＶＦＫＶＫＦＫ−ＮＨ2）を合成し、以前記載された（Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）ようにその純度を決定した。
１．２  緩衝液および培地
以前記載された（Ｓｈｅｌｌｉｓ，１９７８）ように人工唾液を調製した。Ｗｉｌｌｉａｍｓによって記載された唾液系培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９８）を試験管内プラークアッセイシステムに使用した。
唾液の採取および唾液細菌の分離
ヒトの唾液を採取する方法および唾液細菌を単離する方法は以前記載された（Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。試験は、ウォルター・リード陸軍研究所の治験審査委員会によって認可され、被験者すべてからインフォームドコンセントを得た。
二重フローセルシステム
この試験で使用された二重フローセルシステムは、Ｈｅｒｌｅｓ外（Ｈｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）によるケモスタットフローセルを改変し、我々の設計およびBioSurface Technologies社（モンタナ州、ボーズマン）の仕様に従って構成された（図１）。フローセルは２つの区画からなり、それぞれ、その上にバイオフィルムが形成されるＧｅディスク（直径１０ｍｍ、厚さ１．８ｍｍ）を保持するための３つの凹部を持つポリカーボネートのフローチャンバーを有している。Ｇｅディスクには、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて未染色のバイオフィルムの視覚化を可能にする反射面を設けた。
【００２１】
バイオフィルムを形成するために、二重フローセルにおけるＧｅディスク（Ｍｉｎｄｒｕｍ社、カリフォルニア州、ランチョ・クカモンガ）を無菌の５０％ヒト全唾液で１時間調整した。５０％唾液（総量１．５ｍＬ）中で約１．０×１０7個の細胞／ｍＬに調整された分離した唾液細菌をフローチャンバーに注入した。ディスク表面に細菌が最初に付着してから２時間後、培養培地（２０％トッド・ヒューイットブロス（培地））のフローを流速０．２ｍＬ／分で開始した（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。採用された流速は、基板表面でおよそ９．６５ｓ-1のずり速度を生成したが、それは口腔における流体の流れに一致している（Ｂａｋｋｅｒ  ａｔ  ａｌ．，２００３）。
【００２２】
口腔バイオフィルムの発生および成長を制御することにおけるＫＳＬの効果を評価するために、ＫＳＬを含まない培地またはＫＳＬを含有する培地（１０〜５０□ｇ／ｍＬのＫＳＬ）によって、表面に付着した細胞（最初のコロニー形成後）を連続して潅流した。あるいは、２０％ＴＨＢ中のＫＳＬ５０□ｇ／ｍＬまたは対照の培地を０．２ｍＬ／分で注入ポンプを用いて２時間間隔で３０分間、様々な成長段階のバイオフィルム（例えば、接種後４時間または６時間）をパルス処理した。ＤＩＣ顕微鏡によってリアルタイムで、未処理のバイオフィルムの増殖と処理されたバイオフィルムの増殖とに対する抗菌剤の効果を直接比較した。
口腔バイオフィルムに対するＫＳＬの殺菌活性
二重フローセルシステムと併せて、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍら（Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によって記載されたバイオフィルム形成の試験管内歯垢モデルの変形例を用いて、発達した口腔バイオフィルムに対する、試験された抗菌剤およびそのほかの作用剤の効果を判定した（詳細は付録１を参照のこと）。唾液細菌がバイオフィルムを形成するための基板としてＨＡディスク（Ｃｌａｒｋｓｏｎ社、ペンシルベニア州、サウスウイリアムズポート）を採用した。
【００２３】
発達した口腔バイオフィルムに対するＫＳＬの阻害活性を判定するために、発生後４５時間のバイオフィルムを有するディスクを、ＫＳＬ水溶液の入ったウエル（２００□ｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウエル）に移した。３７℃で３０分間晒した後、１ｍＬの生理食塩水でディスクを３回すすぎ、１ｍＬのＰＢＳの入った無菌の１５ｍＬのポリプロピレン試験管に移した。カップホーン付きMicroson超音波細胞破砕装置（ニューヨーク州、ファーミングデールのMisonix社）によって、５ワットで２分間超音波処理することにより、表面に付着したバイオフィルム細胞（処置後）を回収した。超音波処理で使用される、時間間隔も含む設定は、経験的に事前に決定され、付着したバイオフィルム細胞の最大の回収を得た。
【００２４】
上記のような超音波処理によりＨＡディスク（発生後４５時間のバイオフィルム）からバイオフィルム細胞を回収することによって、分断されたバイオフィルムに対するＫＳＬの効果を評価した。分離したバイオフィルム細胞（無菌のｄＨ2Ｏ中）を等量のＫＳＬ水溶液と混合して最終ペプチド濃度２００□ｇ／ｍＬを得、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＫＳＬと懸濁したバイオフィルム細胞との相互作用をＰＢＳで洗浄することによって終了させた。
【００２５】
ＫＳＬによる無傷のバイオフィルムの殺傷を促進することにおける界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、Sigma社、ミズーリ州、セントルイス）の効果を判定するために、ＫＳＬ（２００□ｇ／ｍＬ）、塩化ベンザルコニウム（０．００１％）またはその２つの作用剤の組み合わせにより、発生後６６時間の口腔バイオフィルムを処理し、次いで、処理された試料の生菌数の測定および共焦点レーザー走査顕微鏡検査を行った。塩化ベンザルコニウムの投与量は経験的に事前に決定して、最小の殺菌活性を示す作用剤の濃度を選択した。
【００２６】
処理されたディスクまたは分断されたバイオフィルムに由来するバイオフィルム細胞の生菌数は、血液寒天プレート上に連続して希釈した試料をらせん状に播くことによって測定した。蒸留水または０．１２％のジグルコン酸クロルヘキシジン水溶液（Sigma社）をそれぞれ陰性対照または陽性対照として用いた。発生後、４５時間のバイオフィルムを、クロルヘキシジンに１分間、および３７℃で水に３０分間晒した。
３．結果
二重フローセルで形成された口腔バイオフィルムとＫＳＬとの相互作用
ＫＳＬが抗バイオフィルム活性を有するかどうかを判定するために、我々は、口腔バイオフィルムの発達に対する種々の濃度のＫＳＬの効果を調べた。ＤＩＣ顕微鏡を用いて、我々は、フローセルの接種後２時間で、フローチャンバーにおいて唾液で調整したＧｅ表面への唾液細菌の付着を認めた（図２Ａ、ａおよびｄ；図２Ｂ、ａおよびｃ）。細菌が表面に付着した後、ＫＳＬを含むまたは含まない培養培地でフローチャンバーを連続して潅流した。ＫＳＬを欠く培地で潅流したフローチャンバーでは、接種後５時間で微細コロニーが形成され（図２Ａ、ｂ）、発達し続けて８時間後にはフィルム状の構造になった（図２Ａ、ｃ）。対照的に、５０□ｇ／ｍＬのＫＳＬは、バイオフィルムの発達を中断させた。細菌は付着したままだったが、微細コロニーやフィルム状の構造を形成することはできなかった（図２Ａ、ｄ〜ｆ）。さらに、１０□ｇ／ｍＬのＫＳＬは、バイオフィルム形成の抑制に部分的に有効だった。接種後８時間で微細コロニーが形成されたが（図２Ｂ、ｃ〜ｄ）、未処理の付着した唾液細菌はフィルム状の構造を形成した（図２Ｂ、ａ〜ｂ）。
【００２７】
ＫＳＬを含有する培地のフローチャンバーへの連続的な潅流は、付着した唾液細菌が調整されたＧｅ表面上でバイオフィルムに分化するのを妨げたが、我々はまた、接種後様々な時点でバイオフィルム細胞をパルス処理することによって、ＫＳＬが発達過程を中断させることができるかどうかを判定することに関心を持った。図３Ａ（ａ〜ｃ）に示されるように、接種後４時間のバイオフィルム細胞の、ＫＳＬを含まない培地によるパルス処理（２時間ごとに０．２ｍＬ／分で３０分）は、付着した唾液細菌がバイオフィルムに発達するのを妨げなかった。対照的に、接種後４時間のバイオフィルム細胞の、ＫＳＬを含有する培地（５０□ｇ／ｍＬ）によるパルス処理は、バイオフィルムの形成を抑制した（図３Ａ、ｄ〜ｆ）。しかしながら、対照（図３Ａ、ａ〜ｃ）に比べて、接種後６時間のバイオフィルムの、ＫＳＬを含有する培地によるパルス処理は、バイオフィルム構造の発達を抑制することができないか、またはその構造を変えることができなかった（図３Ｂ、ｄ〜ｆ）。
無傷の口腔バイオフィルムおよび分断された口腔バイオフィルムとＫＳＬとの相互作用
我々のフローセル実験は、成長した口腔バイオフィルムはＫＳＬの影響を受けにくいことを示した。対照的に、発達の早い段階で付着した唾液細菌またはバイオフィルム細胞をＫＳＬに晒すと、成長した増殖性のバイオフィルムへのさらなる発達が抑制された。この背景において我々は、試験管内プラークアッセイを用いて、発達した口腔バイオフィルムの組織化された構造が成長した口腔バイオフィルムのＫＳＬへの耐性に寄与するかどうかを判定することに関心を持った。図４Ａに示されるように、唾液で調整したＨＡディスク上に形成された無傷の発生後４５時間の口腔バイオフィルムをＫＳＬに晒すことによって生菌数が少し低下した（ｐ＜０．０５）。生菌数の大きな低下は０．１２％のクロルヘキシジンによって処理された無傷のバイオフィルムで認められた。これらのバイオフィルムをＫＳＬ処理の前に超音波処理によって機械的に分断した場合、ｄＨ2Ｏで処理した対照に比べて、ＫＳＬで処理した細胞の生存率が非常に大きく低下（１．８対数）した。同じ濃度のＫＳＬで処理した無傷のバイオフィルムに比べて、分断したバイオフィルムの生存率に、同様に有意な低下があった。
界面活性剤の存在下での無傷の口腔バイオフィルムとＫＳＬとの相互作用
バイオフィルムの組織化された構造が抗菌剤へのバイオフィルムの感受性に影響を与える場合があるので、我々は、試験管内のプラークアッセイを用いて、ＫＳＬによるバイオフィルム細胞の殺傷を促進することにおける界面活性剤、塩化ベンザルコニウムの効果を判定することに関心を持った。図４Ｂに示されるように、水による処理に比べて、塩化ベンザルコニウム（０．００１％）存在下でのＫＳＬは、クロルヘキシジンによって生じるのと同様の程度まで、発生後６６時間の口腔バイオフィルムの生存率を有意に低下させた（１対数の低下を超えて）。ＫＳＬ（２００□ｇ／ｍＬ）または塩化ベンザルコニウム（０．００１％）単独では、これらバイオフィルムの生存率にあまり効果を有さなかった。これらの結果は、共焦点顕微鏡によって示される（図４Ｃ）ような処理された試料の生細胞／死細胞の染色によって確認された。
４．考察
分離された唾液細菌と一緒に取り外し可能でコロニー形成可能な表面を有する二重フローセルの使用によって、口腔バイオフィルムの形成に対する抗菌剤の効果を調べるための代替の方法が提供される。歯垢の元としてのヒト唾液細菌の使用は、これらの細菌が口腔における硬質組織および軟質組織に形成されるバイオフィルムに由来するので（Ｈｅｌｍｅｒｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、特に関係がある。システムによって処理群と陰性対照群との間で、非破壊的で直接的なバイオフィルムの発達の比較が可能である。
【００２８】
この試験システムでは、対照に比べてＫＳＬはバイオフィルムの発達を顕著に妨害した。我々は、観察された抑制はおそらくＫＳＬの抗菌活性のためであると結論付けた。我々は、ＫＳＬが標的細菌の膜を不安定化させることによってその抗菌活性を発揮することを示している（Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。対照的に、出来上がった口腔バイオフィルム（発生後４５時間のバイオフィルム）をＫＳＬに晒したところ、その構造を分断せず、バイオフィルム細胞の生存率を大きく低下させなかった。その結果は、いったん発達するとバイオフィルムはＫＳＬに、より耐性を持つことを示している。興味深いことに、類似する特性が、表面分泌物に豊富に存在する天然の抗菌成分であるラクトフェリンで認められた。低抑制濃度のラクトフェリンの連続的潅流は、緑膿菌によるバイオフィルムの発達を妨害した。しかしながら、ＫＳＬと同様にラクトフェリンは、成長したバイオフィルムの構造を変えることはできなかった（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００２９】
幾つかの要因が抗菌剤へのバイオフィルムの感受性に影響を及ぼす（Ｃａｍｐａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。我々は、発達した口腔バイオフィルムのＫＳＬに対する感受性が低下するのは、三次元バイオフィルム構造および／または外部高分子物質の存在によって、我々の抗菌剤の拡散に遅延が生じること、または我々の抗菌剤が排除されることによるという仮説を立てた。これを調べるために、我々は、唾液細菌によって形成され、唾液で被覆したＨＡ表面で増殖した口腔バイオフィルムを分断し、無傷のバイオフィルムと比べた、これら分断したバイオフィルムの細胞のＫＳＬに対する感受性を判定した。我々は、バイオフィルム構造の分断は、標的とされたバイオフィルム細胞の我々の抗菌剤に対する感受性を改善すると推論した。実際、分断処理によって、無傷の口腔バイオフィルムに比べて、分断されたものに由来するバイオフィルム細胞の感受性が大きく向上し、バイオフィルムの組織化された構造が、無傷のバイオフィルムの抗菌剤に対する感受性に影響を及ぼす働きをしていることが示唆された。しかしながら、我々は、無傷のバイオフィルムで観察された感受性の低下が、バイオフィルム細胞に関連するであろう外部高分子にも起因するのかどうかは確信がない。さらに、公知のカチオン系界面活性剤（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６）である塩化ベンザルコニウムが低殺菌濃度で、ＫＳＬに対するバイオフィルムの感受性を有意に促進した。内在するメカニズムについては不明であるが、考えられる説明の１つは、低抑制濃度の塩化ベンザルコニウムが、バイオフィルムの構造に影響を与えることによって、無傷の口腔バイオフィルムに存在するバイオフィルム細胞のＫＳＬへの接近能を高めるかもしれないということである。あるいは、カチオン剤である塩化ベンザルコニウムが、唾液細菌の殺傷においてＫＳＬの殺菌活性に相乗効果を提供することが考えられる。
５．結論
ＫＳＬが口腔バイオフィルムの発達を妨害したという発見は、ＫＳＬが、歯垢が介在する歯科疾患を予防するための歯磨き剤に対する有益な添加剤となり得る可能性を生じる。ＫＳＬは分断された口腔バイオフィルム細胞を殺傷するのに有効だったので、これは特に関係がある。この分断は、口腔衛生処置の間の機械的な歯磨きおよび／または歯間磨き（フロス）によって生じさせることができるであろう。
【００３０】
当業者は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上記の好ましい実施形態の種々の改変および修正を設計することができることを十分に理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本明細書に具体的に記載された以外で本発明を実施してもよいことが理解されるべきである。
【図３】
2009516645.tif 000003
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月26日(2008.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌ペプチドと、界面活性剤とを含む口腔衛生処置剤。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）またはその誘導体を含む請求項１に記載の処置剤。
【請求項３】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）である請求項２に記載の処置剤。
【請求項４】
前記界面活性剤が、カチオン剤である請求項１に記載の処置剤。
【請求項５】
前記界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムである請求項４に記載の処置剤。
【請求項６】
前記界面活性剤が、塩化ベンジルおよび塩化ピリジンからなる群から選択される請求項１に記載の処置剤。
【請求項７】
前記抗菌ペプチドおよび前記界面活性剤が、水性の口内洗浄液中で混合される請求項１に記載の処置剤。
【請求項８】
成長したバイオフィルムを、抗菌デカペプチドおよび界面活性剤に接触させることを含む、成長した口腔バイオフィルムを処置する方法。
【請求項９】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤がカチオン剤である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムである請求項１０に記載の処置。
【請求項１２】
前記成長したバイオフィルムを接触させる前記工程が、成長したバイオフィルムを有する使用者の口内をＫＳＬとベンザルコニウムと、を含有する溶液ですすぐことを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
成長したバイオフィルムを機械的に分断させることと、
前記分断されたバイオフィルムを抗菌デカペプチドに接触させることとを含む成長したバイオフィルムを処置する方法。
【請求項１４】
前記抗菌デカペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ガム基材と界面活性剤と有効な量の抗菌デカペプチドとを含む、歯垢予防のチューインガム。
【請求項１６】
前記抗菌ペプチドが、ＫＳＬ（配列番号１）を含む請求項１５に記載のチューインガム。