(57)【要約】  １個若しくはそれ以上のアミノ基を含有する多糖若しくはアミノ機能性化多糖を還元糖および／若しくは還元糖誘導体で架橋することによる架橋多糖マトリックスの製造方法。生じるマトリックスは、多糖マトリックス、ならびにタンパク質および／若しくはポリペプチドとともに架橋された多糖を包含する混成架橋マトリックスを包含しうる。添加物および／若しくは細胞もまた該マトリックスに包含しうるか若しくはそれ内に埋め込まれうる。架橋を実施するための多様な異なる溶媒系および還元糖架橋剤が記述される。生じるマトリックスは多様な異なる物理、化学および生物学的特性を表す。
2009507103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ多糖、アミノ機能性化多糖、およびそれらの組合せから選択される最低１種の多糖を、最低１種の還元糖と反応させて架橋多糖を形成することを含んでなる、架橋多糖の製造方法。
【請求項２】
前記最低１種の多糖が、天然に存在するアミノ多糖、合成アミノ多糖、アミノヘテロ多糖、アミノホモ多糖、アミノ機能性化多糖ならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、アミノ機能性化ヒアルロン酸ならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、アミノ機能性化ヒアルロナンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、キトサンおよびそれらの誘導体化された形態ならびにそれらのエステルおよび塩、ヘパリンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、アミノ機能性化グリコサミノグリカンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記最低１種の還元糖が、アルドース、ケトース、アルドースの誘導体、ケトースの誘導体、およびそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記最低１種の還元糖が、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、八炭糖、九炭糖、十炭糖、およびそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記最低１種の還元糖が、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、フルクトース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記最低１種の還元糖が、還元単糖、還元二糖、還元三糖、還元オリゴ糖、誘導体化された形態のオリゴ糖、誘導体化された形態の単糖、単糖のエステル、オリゴ糖のエステル、単糖の塩、オリゴ糖の塩、およびそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記還元二糖が、マルトース、ラクトース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、ラミナリビオース、マンノビオースおよびキシロビオースよりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記最低１種の還元糖が、グリセルアルデヒド、リボース、エリトロース、アラビノース、ソルボース、フルクトース、グルコース、Ｄ−リボース−５−リン酸、グルコサミン、およびそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記最低１種の還元糖が、右旋性の形態の前記最低１種の還元糖、左旋性の形態の前記最低１種の還元糖、ならびに右旋性および左旋性の形態の前記最低１種の還元糖の混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応させることが、前記最低１種の多糖を、最低１種の溶媒および前記最低１種の還元糖を含んでなる溶液中でインキュベートして前記架橋多糖を形成させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液が最低１種の緩衝剤を包含する緩衝溶液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記最低１種の溶媒が、前記溶液のｐＨを制御するための最低１種の緩衝剤を包含する水性緩衝溶媒である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記最低１種の溶媒が、前記溶液のイオン強度を制御するための最低１種のイオン化可能な塩を包含する水性溶媒である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記最低１種の溶媒が、有機溶媒、無機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、親水性溶媒、疎水性溶媒、水に混合可能な溶媒、水に混合可能でない溶媒、およびそれらの組合せよりなる群から選択される最低１種の溶媒を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記最低１種の溶媒が、水、ならびに親水性溶媒、極性溶媒、水に混合可能な溶媒およびそれらの組合せから選択される最低１種の付加的な溶媒を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記最低１種の溶媒が、水、リン酸緩衝生理的食塩水、エタノール、２−プロパノール、１−ブタノール、１−ヘキサノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ヘキサン、トルエン、およびそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応させることが、架橋可能なアミノ基を有する最低１種のタンパク質若しくはポリペプチドを、前記最低１種の多糖および前記最低１種の還元糖に添加して、混成架橋マトリックスを形成させることもまた包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
架橋可能なアミノ基を有する前記最低１種のタンパク質若しくはポリペプチドが、コラーゲン、コラーゲンスーパーファミリー、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、構造タンパク質、血液由来タンパク質糖タンパク質、リポタンパク質、天然のタンパク質、合成タンパク質、ホルモン、成長因子、軟骨成長を促進するタンパク質、骨成長を促進するタンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜タンパク質、エラスチン、フィブリン、フィブリノーゲンから選択されるタンパク質、およびそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コラーゲンが、天然のコラーゲン、線維性コラーゲン、線維性アテロペプチドコラーゲン、テロペプチド含有コラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物供給源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、哺乳動物コラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、ウシアテロペプチドコラーゲン、ブタアテロペプチドコラーゲン、脊椎動物種から得られたコラーゲン、組換えコラーゲン、遺伝子的に工作若しくは改変されたコラーゲン、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩおよびＸＸＶＩ型線維付随性コラーゲン、ＶＩＩＩおよびＸ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＶ型コラーゲン、ＸＶおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲン、遺伝子的に改変された真核生物若しくは原核生物細胞または遺伝子的に改変された生物体により製造される人工的に製造したコラーゲン、精製されたコラーゲンおよび再構成された精製されたコラーゲン、線維性コラーゲンの粒子、線維性再構成アテロペプチドコラーゲン、細胞培地から精製されたコラーゲン、遺伝子的に工作された植物由来のコラーゲン、コラーゲンのフラグメント、プロトコラーゲン、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応させることが、最低１種の添加物を、前記最低１種の多糖および前記最低１種の還元糖に添加して、前記最低１種の添加物を含有する架橋マトリックスを形成することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記最低１種の添加物が、医薬品、薬物、タンパク質、ポリペプチド、麻酔薬、抗菌薬（ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗菌薬（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗ウイルス薬、抗真菌薬（ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗真菌薬（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗炎症薬、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、多様な細胞外マトリックス成分、ホルモン、成長因子、トランスフォーミング因子、受容体若しくは受容体複合体、天然のポリマー、合成ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオイチイド、薬物、治療薬、抗炎症薬、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質糖タンパク質、ムコタンパク質、ムコ多糖、マトリックスタンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症薬、タンパク質、ペプチド、ホルモン、遺伝子治療のための遺伝物質、核酸、化学修飾核酸、オリゴヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、遺伝子、遺伝子の一部、天然若しくは人工的に製造されたオリゴヌクレオチドを包含する組成物、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細胞取り込みおよび転写を促進するのに必要とされるウイルスおよびウイルス以外のベクター、グリコサミノグリカン、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、レシチン豊富な間質プロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、アグリカン、シンデカン、β−グリカン、バーシカン、セントログリカン、セルグリシン、フィブロネクチン、フィブログリカン、コンドロアドヘリン、ｆｉｂｕｌｉｎ、トロンボスポンジン−５、酵素、酵素阻害剤、抗体、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記架橋の前、間若しくは後に、前記最低１種の多糖および前記最低１種の還元糖に１種若しくはそれ以上の生存細胞を添加して、架橋マトリックス中に埋め込まれた最低１種の生存細胞を含有する架橋マトリックスを形成することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１種若しくはそれ以上の生存細胞が、脊椎動物軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脊椎動物幹細胞、胚性幹細胞、成体組織由来幹細胞、脊椎動物前駆細胞、脊椎動物線維芽細胞、マトリックスタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症剤、タンパク質、ホルモン、ペプチドの１種若しくはそれ以上を分泌するよう遺伝子的に工作された細胞、タンパク質、ペプチド、ホルモン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症薬、糖タンパク質、ムコタンパク質およびムコ多糖よりなる群から選択される１種若しくはそれ以上の分子に対する受容体を発現するよう工作された１種若しくはそれ以上の型の生存細胞、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記架橋多糖を、乾燥、凍結乾燥、脱水、臨界点乾燥、成型、滅菌、均質化、機械的剪断、電離放射線による照射、電磁放射線による照射、製薬学的に許容できるベヒクルとの混合、添加物での含浸、およびそれらの組合せから選択される処理にかけることをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法により製造された架橋多糖。
【請求項２６】
多糖を１種若しくはそれ以上の反応体と反応させて前記多糖の誘導体化された形態を形成する段階であって、前記誘導体化された形態は１個若しくはそれ以上のアミノ基を含有し；および
前記誘導体化された多糖を最低１種の還元糖で架橋して架橋多糖を形成する段階
を含んでなる、架橋多糖の製造方法。
【請求項２７】
前記アミノ基が一級アミノ基および二級アミノ基から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１種若しくはそれ以上の反応体がカルボジイミドを含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記１種若しくはそれ以上の反応体が、アジピン酸ジヒドラジドの存在下のカルボジイミドを含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記カルボジイミドが、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記最低１種の還元糖が、アルドース、ケトース、およびそれらの組合せから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記最低１種の還元糖が、グリセルアルデヒド、リボース、エリトロース、アラビノース、ソルボース、フルクトース、グルコース、Ｄ−リボース−５−リン酸、グルコサミン、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、八炭糖、九炭糖、十炭糖、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、フルクトース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、還元単糖、還元二糖、還元三糖、還元オリゴ糖、誘導体化された形態のオリゴ糖、誘導体化された形態の単糖、単糖のエステル、オリゴ糖のエステル、単糖の塩、オリゴ糖の塩、マルトース、ラクトース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、ラミナリビオース、マンノビオースおよびキシロビオース、ならびにそれらの組合せから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２４に記載の方法により製造された架橋多糖。
【請求項３４】
アミノ多糖、アミノ機能性化多糖およびそれらの組合せから選択される最低１種の多糖を、最低１種の架橋可能なタンパク質の存在下で、最低１種の還元糖で架橋して混成架橋マトリックスを形成することを含んでなる、混成架橋マトリックスの製造方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法により製造された架橋混成マトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２００５年９月２日出願の米国仮出願第６０／７１３３９０号（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）からの優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
本発明は、全般として、架橋多糖に基づくマトリックスおよび調製物、ならびに、より具体的には、還元糖およびそれらの誘導体を架橋剤として使用するアミノ多糖およびアミノ機能性化（ａｍｉｎｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）多糖の新規架橋方法、ならびに本方法を使用することにより形成される架橋された多糖マトリックスおよび調製物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸をベースとする若しくは他のアミノ糖をベースとする生成物の性能は、一方で宿主内でのそれらの機能の寿命を制御すること、および他方で天然のヒアルロン酸（ＨＡ）若しくは他の多糖成分の生物学的特性の保存に依存する。ＨＡ若しくは他の多糖成分の機能の寿命は、ヒアルロニダーゼ、若しくは宿主に存在するいずれかの他の多糖分解酵素による特異的酵素的分解に抵抗するその能力に依存する。この能力は、ＨＡ若しくは他の多糖に基づくポリマー内の分子内および分子間架橋の数に直接関係する。典型的に、より多数の架橋はこうした酵素的分解に対するより高い抵抗性をもたらす。
【０００４】
多糖および／若しくは多糖の誘導体および／若しくは人工的に機能性化された形態の多糖を架橋するための当該技術分野で既知の選択すべき例示的架橋剤は、例えば１，４ブナンジオールジグリシジルエーテルのような二官能性（若しくは多官能性）リンカー、多様な他の合成二官能性架橋剤、および他の関係する非生理学的剤であった。これらの架橋剤は、多糖分子のアミノ基若しくは他の官能基と反応して分子間架橋を形成する。しかしながら、これらの苛酷な剤は、多糖分子のコンホメーションの変化および架橋剤から溶脱することにより引き起こされうる、架橋多糖に基づく生物生成物の生物適合性および生物学的活性に対する負の影響を有しうる。従って、非生理学的剤により架橋された多糖生成物は何らかの程度の抗原性を表しうる、さらに、局所腫脹、そう痒、一過性若しくは長期の紅斑、浮腫、肉芽腫形成、表層性壊死蕁麻疹およびざ瘡状病変を包含する局所の炎症およびより複雑な全身反応は、商業的に存在する架橋多糖生成物で審美的に処置される患者の小さい割合で不利な副作用となりうる。
【０００５】
加えて、該生成物を注入のため懸濁液、ゲル若しくは乳液の形態で処方する場合に、当該技術分野で既知の人工的架橋剤の使用は、該注入可能な製剤の所望の流動学的特性とともに酵素的分解に対する満足すべき抵抗性を有する架橋生成物を得ることを常に可能にはしないとみられる。
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
従って、本発明の一態様により架橋多糖の製造方法が提供される。該方法は、アミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖ならびに／またはそれらの組合せから選択される最低１種の多糖を最低１種の還元糖と反応させて架橋多糖を形成することを包含する。
【０００７】
さらに、本発明の一態様により、最低１種の多糖は、天然に存在するアミノ多糖、合成アミノ多糖、アミノヘテロ多糖、アミノホモ多糖、アミノ機能性化多糖、ならびにそれら
の誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、アミノ機能性化ヒアルロン酸ならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、アミノ機能性化ヒアルロナンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、キトサンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにそれらのエステルおよび塩、ヘパリンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、アミノ機能性化グリコサミノグリカンならびにそれらの誘導体化された形態ならびにエステルおよび塩、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される。
【０００８】
さらに、本発明の一態様により、最低１種の還元糖は、アルドース、ケトース、アルドースの誘導体、ケトースの誘導体、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、八炭糖、九炭糖、十炭糖、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、フルクトース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロース、還元単糖、還元二糖、還元三糖、還元オリゴ糖、誘導体化された形態のオリゴ糖、誘導体化された形態の単糖、単糖のエステル、オリゴ糖のエステル、単糖の塩、オリゴ糖の塩、マルトース、ラクトース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、ラミナリビオース、マンノビオースおよびキシロビオース、グリセルアルデヒド、リボース、エリトロース、アラビノース、ソルボース、フルクトース、グルコース、Ｄ−リボース−５−リン酸、グルコサミン、ならびにそれらの組合せから選択される。
【０００９】
さらに、本発明の一態様により、最低１種の還元糖は、右旋性の形態の最低１種の還元糖、左旋性の形態の最低１種の還元糖、ならびに右旋性および左旋性の形態の最低１種の還元糖の混合物から選択しうる。
【００１０】
さらに、本発明の一態様により、反応させることは、最低１種の溶媒および最低１種の還元糖を包含する溶液中で最低１種の多糖をインキュベートして架橋多糖を形成することを含んでなる。
【００１１】
さらに、本発明の一態様により、溶液は最低１種の緩衝剤を包含する緩衝溶液である。
【００１２】
さらに、本発明の一態様により、溶媒は該溶液のｐＨを制御するための最低１種の緩衝剤を包含する水性緩衝溶媒である。
【００１３】
さらに、本発明の一態様により、溶媒は該溶液のイオン強度を制御するための最低１種のイオン化可能な塩を包含する水性溶媒である。
【００１４】
さらに、本発明の一態様により、溶媒（１種若しくは複数）は、有機溶媒、無機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、親水性溶媒、疎水性溶媒、水に混合可能な溶媒、水に混合可能でない溶媒、およびそれらの組合せよりなる群から選択される最低１種の溶媒を包含する。
【００１５】
さらに、本発明の一態様により、溶媒は、水、ならびに親水性溶媒、極性溶媒、水に混合可能な溶媒およびそれらの組合せから選択される最低１種の付加的な溶媒を包含する。
【００１６】
さらに、本発明の一態様により、溶媒は、水、リン酸緩衝生理的食塩水、エタノール、２−プロパノール、１−ブタノール、１−ヘキサノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ヘキサン、トルエン、およびそれらの組合せよりなる群から選択される。
【００１７】
さらに、本発明の一態様により、反応させることは、架橋可能なアミノ基を有する最低
１種のタンパク質および／若しくはポリペプチドを、最低１種の多糖および最低１種の還元糖に添加して、混成架橋マトリックスを形成することを包含する。
【００１８】
さらに、本発明の一態様により、架橋可能なアミノ基を有する最低１種のタンパク質および／若しくはポリペプチドは、コラーゲン、コラーゲンスーパーファミリー、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、構造タンパク質、血液由来タンパク質糖タンパク質、リポタンパク質、天然のタンパク質、合成タンパク質、ホルモン、成長因子、軟骨成長を促進するタンパク質、骨成長を促進するタンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜タンパク質、エラスチン、フィブリン、フィブリノーゲンから選択されるタンパク質、およびそれらのいずれかの組合せから選択される。
【００１９】
さらに、本発明の一態様により、コラーゲンは、天然のコラーゲン、線維性コラーゲン、線維性アテロペプチドコラーゲン、テロペプチド含有コラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物供給源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、哺乳動物コラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、ウシアテロペプチドコラーゲン、ブタアテロペプチドコラーゲン、脊椎動物種から得られたコラーゲン、組換えコラーゲン、遺伝子的に工作若しくは改変されたコラーゲン、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩおよびＸＸＶＩ型線維付随性コラーゲン、ＶＩＩＩおよびＸ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＶ型コラーゲン、ＸＶおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲン、遺伝子的に改変された真核生物若しくは原核生物細胞または遺伝子的に改変された生物体により製造される人工的に製造したコラーゲン、精製されたコラーゲンおよび再構成された精製されたコラーゲン、線維性コラーゲンの粒子、線維性再構成アテロペプチドコラーゲン、細胞培地から精製されたコラーゲン、遺伝子的に工作された植物由来のコラーゲン、コラーゲンのフラグメント、プロトコラーゲン、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される。
【００２０】
さらに、本発明の一態様により、反応させることは、最低１種の添加物を最低１種の多糖および最低１種の還元糖に添加して、最低１種の添加物を含有する架橋マトリックスを形成することを包含する。
【００２１】
さらに、本発明の一態様により、最低１種の添加物は、医薬品、薬物、タンパク質、ポリペプチド、麻酔薬、抗菌薬（ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗菌薬（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗ウイルス薬、抗真菌薬（ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗真菌薬（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗炎症薬、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、多様な細胞外マトリックス成分、ホルモン、成長因子、トランスフォーミング因子、受容体若しくは受容体複合体、天然のポリマー、合成ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオイチイド、薬物、治療薬、抗炎症薬、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質糖タンパク質、ムコタンパク質、ムコ多糖、マトリックスタンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症薬、タンパク質、ペプチド、ホルモン、遺伝子治療のための遺伝物質、核酸、化学修飾核酸、オリゴヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、遺伝子、遺伝子の一部、天然若しくは人工的に製造されたオリゴヌクレオチドを包含する組成物、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細胞取り込みおよび転写を促進するのに必要とされるウイルスおよびウイルス以外のベクター、グリコサミノグリカン、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、レシチン豊富な間質プロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、アグリカン、シンデカン、β−グリカン、バーシカン、セントログリカン、セルグリシン、フィブロネクチン、フィブログリカン、コンドロアドヘリン、ｆｉｂｕｌｉｎ、トロンボスポンジン−５、酵素、酵素阻害剤、抗体、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される。
【００２２】
さらに、本発明の一態様により、反応することは、前記架橋の前、間若しくは後に、最低１種の多糖および最低１種の還元糖に１種若しくはそれ以上の生存細胞を添加して、該マトリックス中に埋め込まれた最低１種の生存細胞を含有する架橋マトリックスを形成することもまたに包含する。
【００２３】
さらに、本発明の一態様により、生存細胞は、脊椎動物軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脊椎動物幹細胞、胚性幹細胞、成体組織由来幹細胞、脊椎動物前駆細胞、脊椎動物線維芽細胞、マトリックスタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症剤、タンパク質、ホルモン、ペプチドの１種若しくはそれ以上を分泌するよう遺伝子的に工作された細胞、タンパク質、ペプチド、ホルモン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症薬、糖タンパク質、ムコタンパク質およびムコ多糖よりなる群から選択される１種若しくはそれ以上の分子に対する受容体を発現するよう工作された１種若しくはそれ以上の型の生存細胞、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される。
【００２４】
さらに、本発明の一態様により、該方法は、架橋多糖を、乾燥、凍結乾燥、脱水、臨界点乾燥、成型、滅菌、均質化、機械的剪断、電離放射線による照射、電磁放射線による照射、製薬学的に許容できるベヒクルとの混合、添加物での含浸、およびそれらの組合せから選択される処理にかけることをさらに包含する。
【００２５】
本発明により、架橋多糖の製造方法もまた提供される、該方法は、多糖を１種若しくはそれ以上の反応体と反応させて誘導体化された形態の該多糖を形成する段階を包含する。該誘導体化された形態は１個若しくはそれ以上のアミノ基を含有し、そして誘導体化された多糖を最低１種の還元糖で架橋して架橋多糖を形成すること。
【００２６】
さらに、本発明の一態様により、アミノ基は一級アミノ基および二級アミノ基から選択される。
【００２７】
さらに、本発明の一態様により、１種若しくはそれ以上の反応体はカルボジイミドを包含する。
【００２８】
さらに、本発明の一態様により、１種若しくはそれ以上の反応体は、アジピン酸ジヒドラジドの存在下にカルボジイミドを包含する。
【００２９】
さらに、本発明の一態様により、カルボジイミドは１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である。
【００３０】
さらに、本発明の一態様により、最低１種の還元糖は、アルドース、ケトース、およびそれらの組合せから選択される。
【００３１】
さらに、本発明の一態様により、最低１種の還元糖は、グリセルアルデヒド、リボース、エリトロース、アラビノース、ソルボース、フルクトース、グルコース、Ｄ−リボース−５−リン酸、グルコサミン、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、八炭糖、九炭糖、十炭糖、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、フルクトース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、還元単糖、還元二糖、還元三糖、還元オリゴ糖、誘導体化された形態のオリゴ糖、誘導体化された形態の単糖、単糖のエステル、オリゴ糖のエステル、単糖の塩、オリゴ糖の塩、マルトース、ラクトース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、ラミナリビオース、マンノビオースおよびキシロビオース、ならびにそれらの組合せから選択される。
【００３２】
本発明の一態様により、混成架橋マトリックスの製造方法もまた提供される。該方法は、アミノ多糖、アミノ機能性化多糖およびそれらの組合せから選択される最低１種の多糖を、最低１種の架橋可能なタンパク質の存在下で最低１種の還元糖で架橋して混成架橋マトリックスを形成することを包含する。
【００３３】
最後に、本発明の態様により、上述された方法により製造された、架橋多糖、ならびに多糖および１種若しくはそれ以上のタンパク質を包含する混成マトリックスもまた提供される。
【００３４】
［発明の詳細な記述］
全体で使用される表記法
以下の表記法を本出願を通じて使用する。
【００３５】
【表１】
2009507103.tif 000003
【００３６】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的分解に対する優れた抵抗性ならびに他の有用な流動学的および／若しくは生物学的特性を有する、新規の架橋多糖に基づく生物適合性マトリックスおよび調製物の新規製造方法を開示する。該方法は、とりわけ、アミノ多糖（限定されるものでないがキトサンを挙げることができる）および／若しくはアミノ機能性化多糖（限定されるものでないがアミノ機能性化ヒアルロン酸を挙げることができる）を、Ｄ（−）−リボース、ＤＬ−グリセルアルデヒド、Ｄ（−）−エ
リトロース、Ｄ（−）−アラビノース、および当該技術分野で既知の多くの他の型の還元糖のような還元糖で架橋することに基づく。こうした新規架橋マトリックスの例も開示する。
【００３７】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的分解に対する優れた特性ならびに他の有用な流動学的および／若しくは生物学的特性を有する、１種若しくはそれ以上のアミノ多糖および／または１種若しくはそれ以上のアミノ機能性化多糖ならびに／または１種若しくはそれ以上のタンパク質（および／若しくはポリペプチド）の混合物を（架橋剤としての）１種若しくはそれ以上の還元糖（１種若しくは複数）で架橋して新規の混成の多糖／タンパク質に基づくマトリックスおよび調製物を形成することにより製造される混成架橋マトリックスの新規製造方法もまた開示する。
【００３８】
「多糖」（１種および複数）という用語ならびにそれらの複合形態は、こうした多糖（１種若しくは複数）のいかなる化学修飾された形態および／若しくは誘導体も包含し、ならびに限定されるものでないがこうした多糖若しくはそれらの誘導体化された形態のエステルおよび塩を挙げることができる、いかなる天然に存在するおよび／または人工的に製造（かつ／若しくは人工的に合成）された多糖（１種若しくは複数）も定義するために本明細書で使用する。
【００３９】
「アミノ多糖」（１種および複数）という用語ならびにそれらの複合形態は、還元糖により架橋されることが可能な１種若しくはそれ以上のアミノ基を含有するいかなる形態の多糖（１種若しくは複数）も定義するために本明細書で使用する。
【００４０】
「アミノ機能性化多糖」（１種および複数）という用語ならびにそれらの複合形態は、とりわけ、還元糖により架橋されることが可能である１個若しくはそれ以上のアミノ基を包含する１個若しくはそれ以上の化学的部分をそれに結合するように化学修飾されているいかなる多糖も定義するのに本明細書で使用する。
【００４１】
従って、本明細書に記述される架橋方法は、とりわけ、天然に存在するアミノ多糖、合成アミノ多糖、アミノヘテロ多糖、アミノホモ多糖、アミノ機能性化多糖、ヒアルロン酸およびその誘導体化された形態、ヒアルロナンおよびその誘導体化された形態、キトサンおよびその誘導体化された形態、ヘパリンおよびその誘導体化された形態、ならびにそれらの多様な組合せを架橋するのに使用しうる。開示される方法は、こうしたアミノ多糖およびアミノ機能性化多糖のいずれかの適するエステルおよび塩の架橋を包含する。
【００４２】
炭水化物化学の当業者により認識されるであろうとおり、下の特定の実施例および実験に記述されない他の型のアミノ基含有多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖もまた、多様な架橋生成物を提供するために、本明細書に開示される方法により架橋しうる。還元糖（若しくは還元糖誘導体）を使用するこうしたアミノ多糖若しくはアミノ機能性化多糖の架橋は、本発明の方法および生成物の範囲内に包含されることが指摘される。
【００４３】
いかなる適する還元糖も本発明の方法で架橋剤として使用しうる。該糖は、単糖、還元端を有する二糖、還元端を有する三糖などでありうる。適する糖はアルドースおよびケトースを包含しうる。単糖を架橋剤として使用する場合、それは三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖でありうるが、しかし７個以上の炭素原子をもつ単糖もまた使用しうる。従って、本発明の新規架橋方法で使用しうる糖は、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、アロース、アルトロース、グルコース、マノース、グロース、イドース、ガラクトース、フルクトース、タロースまたはいずれかの他の二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、八炭糖、九炭糖若しくは十炭糖、およびそれらの多様な適する誘導体化された形態などである。
【００４４】
活性のアルデヒド若しくはケト基を有する上述された単糖若しくはオリゴ糖の還元誘導体もまた、本発明で架橋剤として使用しうる。
【００４５】
架橋反応の速度は、当該技術分野で既知であるとおり、使用される特定の糖の開環形態に存在するアルデヒド若しくはケト基の平衡濃度に依存しうる。しかしながら、当該技術分野で既知であるとおり、反応時間を単純に延長することにより、ある種の特定の糖の遅い反応速度について補償することが可能でありうる。
【００４６】
下述される実験は、こうしたアミノ多糖およびアミノ基で合成で機能性化された多糖の選択された例示的還元糖との典型的な反応を示し、かつ、生じるマトリックスの改良された分解抵抗性および流動学的特性を記述する、制限しない一例である。以下の実験は例としてのみ示されかつ本発明の範囲を制限するために意図していないことが指摘される。従って、当業者に明らかであろうとおり、多糖、機能性化多糖、（架橋剤として使用される）還元糖、反応条件、反応混合物の組成、反応温度、反応時間、ならびに生じる架橋マトリックスの化学、物理、流動学的および生物耐久性（ｂｉｏｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ）の特性は、下に開示される実験にとりわけ記述されるものと異なることがある。
【００４７】
ヒアルロン酸（ＨＡ）という用語は、ヒアルロン酸それ自身およびその塩若しくは塩の混合物、ならびにとりわけヒアルロネートの塩の双方を示すための包括的名称として以下の本文で使用する。
【００４８】
アミノ機能性化ヒアルロン酸という用語は、遊離アミノ基をもつ部分を含有するよう誘導体化された、ヒアルロン酸およびその塩若しくは塩の混合物を示すための包括的名称として以下の本文で使用する。該アミノ基は一級アミノ基および／若しくは二級アミノ基でありうる。アミノ基を含有する部分を導入するための好ましい部位は多糖のカルボキシル基であるが、しかし、こうしたアミノ基を含有する部分を糖環（１個若しくは複数）の他の部位に導入することが可能でありうる。アミノ機能性化は完全である必要はなく、そして、いくつかのカルボキシル基（若しくは、使用される場合は他の誘導体化部位）が誘導体化されないままでありうる。
【００４９】
アミノ機能性化多糖という用語は、架橋する還元糖のアルデヒド若しくはケト基と反応しうるアミノ基を含有するいかなる多糖も示す包括的用語として以下の本文で使用する。アミノ基は一級および／若しくは二級アミノ基でありうる。アミノ基は（キトサンでのように）糖環構造に直接配置されうるが、しかし、多糖鎖の糖環の１個若しくはそれ以上の部位すなわち化学基に共有結合される部分の一部でもまたありうる。
【００５０】
従って、アミノ基は、機能性化される必要がなくかつ環バックボーンのアミノ基を通じて還元糖で直接架橋されうる、（下で詳細に開示されるところの）キトサンの場合でのように糖環に直接配置されることができる。部分的に脱アセチル化されたキチンに基づくポリマーもまた、遊離アミノ基（一級若しくは二級）を有するいずれの多糖もそうでありうるように、本発明の糖架橋方法を使用して架橋されうることが指摘される。
【００５１】
本明細書に開示される実験の結果に従って、限定されるものでないがエタノールを挙げることができる極性の水と混合可能な溶媒の架橋反応混合物への添加が、いかなる極性溶媒も含まない緩衝水性溶液の存在下での架橋と比較して、架橋効率を有意に増大することができかつ反応生成物の改良された分解抵抗性をもたらすことが指摘される。
【００５２】
架橋の正確な反応機序および生じる架橋多糖の化学的性質は現在完全には理解されていない一方、該反応は、例えばタンパク質鎖中に存在するリシン若しくはアルギニンまたは
他のアミノ酸の遊離アミノ基とのような、タンパク質のアミノ酸のアミノ基との糖のアルデヒド若しくはケト基の反応に基づき、還元糖を使用してタンパク質分子を架橋する古典的糖化反応に（必ずしも同一でないとは言え）いくぶん類似でありうることが想定される。
【００５３】
還元糖のこれらのタンパク質架橋反応は当該技術分野で公知である。こうしたタンパク質架橋反応は、少なくとも部分的に初期反応生成物のアマドリ転位により進行し、黄色若しくは茶褐色の終末糖化産物の形成に至ると考えられる。
【００５４】
本発明の発明者は、本出願に開示される実験で得られる架橋多糖の構造を完全には特徴付けしていない一方、生じる架橋多糖の２２５〜２３５および２８５〜３５５ナノメートルの範囲の特徴的吸光度ピークが、タンパク質糖化生成物および終末タンパク質糖化産物（ＡＧＥ）にいくぶん類似の（しかし必ずしも同一でない）性質の糖化生成物の存在の指標でありうる。
【実施例】
【００５５】
実験で使用する物質
ヘパリンナトリウムＥＰ（バッチ番号９８１８０３０）はＪＵＫ  Ｋｒａｅｂｅｒ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．、独国ハンブルグから得た。
【００５６】
Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）（ロット番号７３４９）およびＲｅｓｔｙｌａｎｅ−Ｐｅｒｌａｎｅ（ロット番号７０６４）は、Ｑ−Ｍｅｄ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラから商業的に入手可能である。Ｈｙｌａｆｏｒｍ（Ｒ）Ｐｌｕｓ（ロット番号Ｒ０４０９は、それらの供給業者ＩＮＡＭＥＤ  ＡＥＳＴＨＥＴＩＣＳ、アイルランドを通じてＧｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの一部門）から商業的に入手可能である。
【００５７】
ｔｕｒｒａｘ均質化は、別の方法で述べられない限り、ＩＫＡ（Ｒ）−ＷＥＲＫＥ、独国から商業的に入手可能なモデルＵＬＴＲＡ  ＴＵＲＲＡＸ（Ｒ）Ｔ−２５（ベーシック）を使用して実施した。
【００５８】
全部の凍結乾燥処置は、Ｈｅｔｏ  Ｌａｂｏ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、デンマークから商業的に入手可能なモデルＦＤ  ８凍結乾燥機を使用して実施した。冷却器温度は−８０℃であった。前凍結の間の棚温度は−４０℃であった。凍結乾燥のための棚温度は＋３０℃であった。前凍結時間は８時間であり、また、凍結乾燥時間は２４時間であった。凍結乾燥の間の真空はおよそ０．０１ｂａｒであった。
【００５９】
下の表１は、本出願に記述される実験で使用する物質の商業的供給源を列挙する。
【００６０】
【表２】
2009507103.tif 000004
【００６１】
ＨＡアミノ機能性化手順Ｉ
１．４〜１．８ＭＤａの範囲の分子量を有するＨＡ  １５０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウェー・オスロから製品番号２２２２００３、ヒアルロン酸ナトリウム医薬等級（Ｐｈａｒｍａ  Ｇｒａｄｅ）１５０として商業的に入手可能）、若しくは０．６２〜１．１５ＭＤａの範囲の分子量を有するＨＡ  ８０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウェー・オスロから製品番号２２２
２００２、ヒアルロン酸ナトリウム医薬等級１５０として商業的に入手可能）４００ｍｇを３５０ｍＬのＤＩ水に溶解し、７グラムのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を該混合物に添加した。生じる溶液のｐＨを４．７５に調節し、そして該溶液を２時間攪拌した。７６４ｍｇの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を２．０ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして該混合物に添加し、そしてｐＨを室温で再度４．７５に調節した。ｐＨの変化により反応をモニターし、そして４．７５に継続して調節した。ｐＨの変化を検出し得なくなった後に、反応混合物を追加の１時間若しくは一夜放置した。その後該溶液を透析チューブに移し、そしてＡＤＨが透析物中で検出されなくなるまでＤＩ水に対し透析した。透析した溶液を３．５リットルの１００％エタノール中に移し、２グラムのＮａＣｌを添加し、そして該混合物を１時間攪拌した。沈殿された改変されたＨＡを分離するために、該溶液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した。得られたアミノ機能性化ＨＡ（ＡＦＨＡ）は使用するまで４℃で保存した。
【００６２】
下述されるＡＦＨＡを使用する全部の架橋実験において、ＨＡ８０を機能性化することから生じるアミノ機能性化ＨＡを下で一貫してＡＦＨＡ８０と称し、また、ＨＡ１５０を機能性化することから生じるアミノ機能性化ＨＡは下で一貫してＡＦＨＡ  Ｉ  １５０と称することが指摘される。この２種のアミノ機能性化ＨＡ物質（ＡＦＨＡ８０およびＡＦＨＡ  Ｉ  １５０）を、下で開示される全部のＨＡ架橋実験に使用した）。
【００６３】
ＨＡ架橋手順
下述される全部の実験で、ボルテックス攪拌はｖｏｒｔｅｘＴＭ回転混合機を使用して実施した。全部の遠心分離（別の方法でとりわけ述べられない限り）は、ＳＯＲＶＡＬＬ（Ｒ）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＤＵ  ＰＵＮＴ、米国から商業的に入手可能なＳＯＲＶＡＬＬ  ＳＳ−３４ローターを伴うモデルＲＣ５Ｃ遠心機を使用して行った。
【００６４】
第一の数字（実験シリーズ番号を指す）の後にスラッシュ（／）記号、そしてその後該シリーズ内で実施された実際の実験の範囲が続くような、下述される以下の実験のそれぞれを実施した。例えば、下の実験シリーズ３２／１−３は、以下の３実験、すなわち実験３２／１、実験３２／２および実験３２／３を包含する。この表記法は本明細を通じて一貫して使用する。
【００６５】
実験シリーズ３２／１−３
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ８０を１ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして５ｍＬの１００％エタノールを添加しかつ１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量のグリセルアルデヒドを、後に続くとおり該ＡＦＨＡ８０混合物に添加した：
ａ）１００μＬのＤＩ水に溶解した２ｍｇのグリセルアルデヒド（実験３２／１）
ｂ）２００μＬのＤＩ水に溶解した４ｍｇのグリセルアルデヒド（実験３２／２）
ｃ）３００μＬのＤＩ水に溶解した６ｍｇのグリセルアルデヒド（実験３２／３）
生じる反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、そしてインキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。その後該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ１ｍＬのＤＩ水を残存するペレットに添加した。室温で３０分後に該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる架橋生成物は以下の特徴を有した：
ａ）（実験３２／１）：５００μＬの硬質ゲル。
ｂ）（実験３２／２）：架橋ＨＡと水の間の相分離を伴わない軟質の不透明ゲル（３時間の再遠心分離後に５００μＬの澄明なゲルをもたらした）。
ｃ）（実験３２／２）：８００μＬのゲル。
【００６６】
実験３３／１
およそ２５ｍｇのＡＦＨＡ８０を５ｍＬのＤＩ水に溶解し、２５ｍＬの１００％エタノールに添加しかつ１分間ボルテックス攪拌した。５００μＬのＤＩ水に溶解した１０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドの溶液を該混合物に添加し、そして生じる混合物を１分間ボルテックス攪拌し、インキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。インキュベーター中で６時間の回転後に、２５０μＬのＤＩ水に溶解した追加の５ｍｇのグリセルアルデヒドを反応混合物に添加し、そして該混合物をインキュベーターに戻してインキュベーション期間を完了させた。２４時間のインキュベーションの終了後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ４０ｍＬのＤＩ水および２ｍＬのＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ）をペレットに添加し、そして室温で６時間放置した。該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる生成物は５００μＬの硬質の不透明ゲルであった。
【００６７】
実験シリーズ３５／１−４
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ８０を１ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして１２ｍＬの１００％エタノールに添加しかつ１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量のＤＬ−グリセルアルデヒドを後に続くとおり添加した：
ａ）７５μＬのＤＩ水に溶解した１．５ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／１）。
ｂ）１５０μＬのＤＩ水に溶解した３．０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／２）。
ｃ）２２５μＬのＤＩ水に溶解した４．５ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／３）。
ｄ）３００μＬのＤＩ水に溶解した６．０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／４）。
生じる反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、インキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。２４時間後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ５ｍＬのＤＩ水を各ペレットに添加した。室温で３０分後に該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる架橋生成物は以下の特徴を有した：
ａ）（実験３５／１）３．４ｍＬの透明ゲル。
ｂ）（実験３５／２）３．５ｍＬの透明ゲル。
ｃ）（実験３５／３）４．０ｍＬの透明ゲル。
ｄ）（実験３５／４）４．０ｍＬの透明ゲル。
【００６８】
実験シリーズ３７／４−６
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ８０を１ｍＬのＤＩ水に溶解しかつ１０ｍＬの１００％エタノールに添加した。該混合物を１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量のＤＬ−グリセルアルデヒドを後に続くとおり該混合物に添加した：
ａ）４００μＬのＤＩ水に溶解した８ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３７／４）。
ｂ）５００μＬのＤＩ水に溶解した１０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３７／５）。
ｃ）６００μＬのＤＩ水に溶解した１２ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３７／６）。
生じる反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、そしてインキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。インキュベーション期間の終了後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ５ｍＬのＤＩ水を各ペレットに添加した。室温で３０分後に該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる架橋生成物は以下の特徴を有した：
ａ）（実験３７／４）２．５ｍＬの透明ゲル。
ｂ）（実験３７／５）１．９ｍＬの透明ゲル。
ｃ）（実験３７／６）１．５ｍＬの透明ゲル。
【００６９】
実験シリーズ３８／１−３
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ８０を１ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして１０ｍＬの１００％エタノールに添加しかつ１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量のＤＬ−グリセルアルデヒドを、後に続くとおり該混合物に添加した：
ａ）７００μＬのＤＩ水に溶解した１４ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３８／１）。
ｂ）８００μＬのＤＩ水に溶解した１６ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３８／２）。
ｃ）９００μＬのＤＩ水に溶解した１８ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３８／３）。
生じる反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、インキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。２４時間後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ５ｍＬのＤＩ水をペレットのそれぞれに添加した。３７℃で３０分後に該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる架橋生成物は以下の特徴を有した：
ａ）（実験３８／１）１．０ｍＬの透明ゲル。
ｂ）（実験３８／１）０．７５ｍＬの透明ゲル。
ｃ）（実験３８／１）０．５０ｍＬの透明ゲル。
【００７０】
実験シリーズ４１／１−４
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を５ｍＬのＤＩ水に溶解し、１０ｍＬの１００％エタノールに添加し、そして１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量のＤＬ−グリセルアルデヒドを、後に続くとおり該混合物に添加した：
ａ）３００μＬのＤＩ水に溶解した６ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４１／１）。
ｂ）４００μＬのＤＩ水に溶解した８ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４１／２）。
ｃ）５００μＬのＤＩ水に溶解した１０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４１／３）。
ｄ）６００μＬのＤＩ水に溶解した１２ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４１／４）。
生じる反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、インキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。２４時間後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ２０ｍＬのＤＩ水をペレットのそれぞれに添加した。３７℃で３０分後に該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。ａ（実験４１／１）、ｂ（実験４１／２）およびｃ（実験４１／３）の場合に相分離は観察されず；ｄ（実験４１／４）の場合に５ｍＬの上清を除去し得た。５０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨ溶液をその後全サンプルに添加し、そしてサンプルを再度遠心分離しかつ４０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）で２回洗浄した。希釈した架橋生成物を各段階後に６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した。結果は後に続くとおりであった。すなわち、サンプルａ（実験４１／１）、ｂ（実験４１／２）およびｃ（実験４１／３）にゲルは残存しなかった。サンプルｄ（実験４１／４）で５ｍＬの透明ゲルが得られた。
【００７１】
実験シリーズ４２／１−３
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を５ｍＬのＤＩ水に溶解し、４０ｍＬの１００％エタノールに添加しかつ１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量のＤＬ−グリセルアルデヒドを、後に続くとおり該混合物に添加した：
ａ）８００μＬのＤＩ水に溶解した１６ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４２／１）。
ｂ）１０００μＬのＤＩ水に溶解した２０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４２／
２）。
ｃ）２０００μＬのＤＩ水に溶解した４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４２／３）。
生じる反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、そしてインキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。２４時間後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ生じるペレットのそれぞれに４０ｍＬのＤＩ水を添加した。室温で３０分後に、該混合物のそれぞれを６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。生じる架橋ゲルは、ａ）からｂ）を介しｃ）まで、増大するゲル粘度を表した（すなわち、実験４２／１で生じるゲルは該三者の最低の粘度を有し、実験４２／３で生じるゲルは該三者の最高粘度を有し、そして実験４２／２で生じるものは該３サンプルの最高および最低の値の間の粘度値を有した）。
【００７２】
実験シリーズ４４／１−２
およそ５ｍｇのＡＦＨＡ８０を５ｍＬのＤＩ水に溶解し、４０ｍＬの１００％エタノールに添加しかつ１分間ボルテックス攪拌し、その後、以下の異なる量の多様な還元糖架橋剤を、後に続くとおり該混合物に添加した：
ａ）２ｍＬのＤＩ水に溶解した４４ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験４４／１）。ｂ）２ｍＬのＤＩ水に溶解した４４ｍｇのＤ（−）−リボース（実験４４／１）。
反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、インキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間（実験４４／１）および３７℃で１１日間（実験４４／２）回転した。インキュベーション期間の終了時に、反応混合物のそれぞれを６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして生じるペレットのそれぞれに４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を添加した。該混合物を室温で３０分間放置し、そして６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。結果は後に続くとおりであった。すなわちａ）（実験４４／１）軟質の透明ゲルが得られたｂ）（実験４４／２）灰白色ないし帯黄色ゲルが得られた。
【００７３】
実験シリーズ５３／１−３
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を２ｍＬのＤＩ水に溶解した。１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを２ｍＬのＤＩ水に溶解した。該２溶液を混合し、そして針を伴わないシリンジを通して５回および１８Ｇ針を通して２回押出した。該混合物は、最後に１８Ｇ針を通して以下の量のエタノール中に押出した：
ａ）２０ｍＬの１００％エタノール（実験５３／１）。
ｂ）３０ｍＬの１００％エタノール（実験５３／２）。
ｃ）４０ｍＬの１００％エタノール（実験５３／３）。
生じる架橋反応混合物のそれぞれをインキュベーターに入れかつ３７℃で２４時間回転した。インキュベーション期間の終了時に、溶液のそれぞれを６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、そして生じるペレットのそれぞれに２０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を添加した。該混合物をその後３７℃で３時間放置し、そして６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００７４】
実験５４／１
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、１５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解した。該混合物を、２２Ｇ針を通して繰り返し押出し（６回）、およびその後１８Ｇ針を通して４０ｍＬの１００％エタノール中に押出し、インキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。インキュベーション後に該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ２０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットに添加した。生じる混合物を３７℃で２時間放置し、そして該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００７５】
実験５５／１
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、１５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解した。該混合物を、２２Ｇ針を通して繰り返し押出し（６回）、そしてその後、１８Ｇ針を通して３５ｍＬの１００％エタノールおよび５ｍＬのＤＩ水の混合物中に押出した。該反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。インキュベーション期間の後に、該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去しかつ２０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットに添加した。３７℃で２時間後に、該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。生じる白色物質は水の取り込みを示さなかった。
【００７６】
実施例６０／１
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして５０℃で３０分間振とうした。該反応混合物をその後、シリンジ（針を伴わない）を通して４０ｍＬの１００％エタノール中に押出し、そして生じる混合物を水浴に入れかつ５０℃で６時間振とうした。該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットに添加した。該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。生じる反応生成物は２．８ｍＬのゲルであった。
【００７７】
実験６１／１
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして該混合物を５０℃で６０分振とうした。該混合物をその後、シリンジ（針を伴わない）を通して４０ｍＬの１００％エタノール中に押出し、そして生じる混合物を水浴に入れかつ５０℃で５時間振とうした。インキュベーション後に該混合物を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットに添加した。該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００７８】
実験６２／１
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして室温で１０分間振とうした。該混合物を、シリンジを通して４０ｍＬの１００％エタノール中に放出し、水浴に入れかつ５０℃で２４時間振とうした。その後、該溶液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットに添加した。該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。生じる生成物は１ｍＬの不透明ゲルであった。
【００７９】
実験シリーズ６５／３−５
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を：
ａ）１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験６５／３）。
ｂ）２００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験６５／４）。
ｃ）３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験６５／５）
を含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解した。生じる反応混合物を、２０Ｇ針を通して４回押出し、そして反応混合物のそれぞれを、針を伴わないシリンジを通して４０ｍＬの１００％エタノール中に押出し、そして加熱浴に入れかつ５０℃で３時間振とうし、そしてその後インキュベーターに入れかつ３７℃で１６時間回転した。生じる反応混合物のそれぞれをその後６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、生じるペレットのそれぞれに添加した。該混合物をその後６０００ｒｐｍで２０分間
再度遠心分離した。生じる反応生成物は、以下の外見：
ａ）（実験６５／３）３．５ｍＬの不透明ゲル。
ｂ）（実験６５／３）２．５ｍＬの不透明ゲル。
ｃ）（実験６５／３）２．０ｍＬの不透明ゲル。
を有した。
【００８０】
実験シリーズ６７／１−２
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解した。該物質をシリンジ中で混合し、そして４０ｍＬの１００％エタノール中に放出した。該混合物をインキュベーターに入れ、そして以下の期間回転した：
ａ）３７℃で２日。（実験６７／１）。
ｂ）３７℃で３日。（実験６７／２）。
インキュベーション期間の後に該溶液を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットのそれぞれに添加した。該混合物をその後９０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる反応生成物は：ａ）２ｍＬの不透明ゲル（実験６７／１）およびｂ）１．６ｍＬの不透明ゲル（実験６７／２）であった。
【００８１】
実験シリーズ６７／４−６
およそ５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を：
ａ）３００ｍｇのＤ（−）−リボース（実験６７／４）。
ｂ）３００ｍｇのＤ（−）−アラビノース（実験６７／５）。
ｃ）およそ１５０ｍｇのＤ（−）−エリトロース（実験６７／６）。
を含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解した。該３混合物をそれぞれ、シリンジ中で２０Ｇ針を何回も通して押出すことにより混合し、そしてその後、それぞれを２０Ｇ針を通して４０ｍＬの１００％エタノール中に押出した。該混合物をその後インキュベーターに入れかつ３７℃で１５日間回転した。インキュベーション後に該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）をペレットに添加し、そして該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。生じる反応生成物は後に続くところの特性を示した：
ａ）（実験６７／４）水の取り込みなし−帯黄色繊維
ｂ）（実験６７／５）透明ゲル。
ｃ）（実験６７／６）水の取り込みなし−白色繊維
【００８２】
実験７２／１
およそ１００ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を、１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する４ｍＬのＤＩ水に溶解した。生じる反応混合物を、１８Ｇ針を通して４回押出し、そしてその後２１Ｇ針を通して２回押出した。該混合物を２個の等しい部分に分割した。該２部分のそれぞれを、２１Ｇ針を通して４０ｍＬの１００％エタノール中に押出した。生じる混合物をインキュベーターに入れかつ３７℃で３日間回転した。インキュベーション期間の後に、５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を２混合物のそれぞれに添加し、そして該溶液を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、生じるペレットのそれぞれに添加した。該混合物をその後９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、そして生じるペレットを合わせた。該実験は、合計（合わせた）容量２．１ｍＬの不透明ゲルをもたらした。
【００８３】
実験シリーズ７５／１、２
１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを７ｍＬのＤＩ水に溶解した。１．５ｍＬの１００％エタノール中の１００ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを、調製したＤＬ−グリセルアルデヒド溶液に添加した。生じる混合物を、１８針を通す押出（３回）により均質化し、そして２個の等しい部分に分割した。該２部分のそれぞれを４０ｍＬの１００％エタノール中に押出した。該混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で３日間回転した。その後、５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を該２混合物のそれぞれに添加し、そして該溶液を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、生じるペレットのそれぞれに添加した。該２混合物をその後９０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離し、そして該２ペレットを合わせた。
【００８４】
実験シリーズ７５／３、４
８０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを７ｍＬのＤＩ水に溶解した。２ｍＬの１００％エタノール中の１００ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを、調製したＤＬ−グリセルアルデヒド溶液に添加した。生じる混合物を、１８Ｇ針を通す押出（３回）により均質化し、そして２個の等しい部分に分割した。該２部分のそれぞれを４０ｍＬの１００％エタノール中に個別に押出した。該混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で３日間回転した。その後、５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、該２反応混合物のそれぞれに添加し、そして該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、生じるペレットのそれぞれに添加した。該ペレットをその後９０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離し、そして生じるペレットを合わせた。
【００８５】
実験７７／１
９０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを１４ｍＬのＤＩ水に溶解した。５ｍＬの１００％エタノール中の１００ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを、調製したＤＬ−グリセルアルデヒド溶液に添加した。生じる反応混合物を、１８Ｇ針を通す押出（３回）により均質化し、そして２個の等しい部分に分割した。該部分のそれぞれを４０ｍＬの１００％エタノールに添加した。生じる混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で３日間回転した。その後、５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を該混合物のそれぞれに添加し、そして該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、生じるペレットのそれぞれに添加しかつ混合した。該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離し、そして生じるペレットを合わせた。
【００８６】
キトサン架橋手順：
該実験で使用した原線維化（ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）緩衝液は後に続くとおり調製した。すなわち、６．５リットルのＤＩ水を１０リットルガラス製容器に入れた。１１．３グラムのＮａＯＨ（０．０４Ｍの最終濃度のため）および２５２グラムのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２Ｍの最終濃度のため）を該ＤＩ水に溶解した。ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで１１．２に調節した。該溶液の容量をＤＩ水で７リットルに仕上げた。最終のｐＨをｐＨ１１．２０〜１１．３０の範囲に（ＮａＯＨで）調節した。
【００８７】
実験９／１
およそ１８１．５ｍｇのキトサンを９．６ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌに溶解した。１４ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを２．５ｍＬのＤＩ水に溶解し、そしてキトサン溶液と混合した。該混合物を１分間ボルテックス攪拌し、そして１ｍＬの原線維化緩衝液および９．６ｍＬの１００％エタノールを、恒常的攪拌下にキトサン／ＤＬ−グリセルアルデヒド混合物にゆっくりと添加した。該反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。インキュベーションの終了時に、１．４ｍＬのＤＩ水に溶解した２８ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する溶液を該混合物に添加し、そして生じる混合物をインキュベーター中に残しかつ３７℃で追加の２４時間回転した。該混合物をその後７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、そして、生じるペレットを３０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌおよびその後３０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。各洗浄段階は、過剰の液体を除去するためのサンプルの遠心分離を包含した。生じるペレットは堅固なゲルの粘度のものであった。
【００８８】
実験１２／１
グリセルアルデヒドの６種の異なる溶液を、後に続くとおり調製した：
ａ）２．５ｍＬのＤＩ水中の２０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド。
ｂ）２．５ｍＬのＤＩ水中の４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド。
ｃ）２．５ｍＬのＤＩ水中の６０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド。
ｄ）２．５ｍＬのＤＩ水中の８０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド。
ｅ）２．５ｍＬのＤＩ水中の１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド。
生じるＤＬ−グリセルアルデヒド溶液ａ〜ｅのそれぞれを、１９６ｍｇのキトサン１０ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを溶解することにより調製した溶液と個別に混合した。生じる６種の反応混合物のそれぞれを１分間ボルテックス攪拌した。該６混合物のそれぞれに、１ｍＬの原線維化緩衝液を恒常的攪拌下にゆっくりと添加し、次いで１５ｍＬの７０％エタノール／ＤＩ水混合物（ｖ／ｖ）をまた恒常的攪拌下にゆっくりと添加した。該反応混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。２４時間のインキュベーション後に、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液および２．５ｍＬの原線維化緩衝液を反応混合物にゆっくりと添加し、次いでボルテックス攪拌した。該混合物をその後３７℃で再インキュベートした。第二のインキュベーションの間に混合物をインキュベーターから２回取り出し、ボルテックス攪拌しかつその後インキュベーターに戻した（ＰＢＳおよび原線維化緩衝液を添加した１および２時間後）。該混合物をその後インキュベーター中に残しかつ回転した。３７℃での総インキュベーション時間は４８時間であった。インキュベーションの完了後に該６サンプル（ａ〜ｅ）を７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除去しかつ生成物を３０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌ、次いで３０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。各洗浄段階は、過剰の溶媒を除去するためのサンプルの遠心分離を包含した。全５種の生じるサンプルは、おそらく糖化生成物の形成による帯黄色（未反応キトサン溶液の初期の帯黄色より濃かった）を表した。観察されたゲル相をもたらす明瞭な相分離はサンプルａおよびｂで見出されたのみであった。
【００８９】
実験シリーズ３５／１−４
以下の４種の異なるＤＬ−グリセルアルデヒド溶液を調製した：
ａ）７５μＬのＰＢＳに溶解した１５ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／１）。
ｂ）１５０μＬのＰＢＳに溶解した３０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／２）。
ｃ）２２５μＬのＰＢＳに溶解した４５ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／３）。
ｄ）３００μＬのＰＢＳに溶解した６０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド（実験３５／４）。
上の４種のＤＬ−グリセルアルデヒド溶液ａ〜ｄのそれぞれを、１ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌに溶解したおよそ２０ｍｇのキトサンの溶液と個別に混合し、そして０．１Ｎ  ＨＣｌを使用して（ｐＨ７．０に）中和した。生じる４種の反応混合物のそれぞれを１分間ボルテックス攪拌し、そして１２ｍＬの１００％エタノールを各ボルテックス攪拌した反応混合物に恒常的攪拌下に添加した。生じる反応混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。インキュベーション期間の完了後に反応混合物を７００
０ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除去し、そして生じるペレットを１０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌでそれぞれ洗浄し、次いで５ｍＬのＤＩ水で洗浄した。各洗浄段階は、過剰の溶媒を除去するためのサンプルの遠心分離を包含した。水とキトサンゲルの間の相分離は、（それぞれ実験３７／１、３７／２、３７／３および３７／４の）４サンプルａ〜ｄのいずれでも観察し得なかった。
【００９０】
実験シリーズ３８／１−６および３９／１−４
およそ２０ｍｇのキトサンを１ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌに溶解し、そして０．１Ｎ  ＮａＣｌを使用して中和した。ＤＬ−グリセルアルデヒドの１０種の異なる溶液を後に続くとおり調製した：
ａ）８０ｍｇのグリセルアルデヒドを４００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３８／１）。ｂ）１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを５００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３８／２）。
ｃ）１２０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを６００μＬのＰＢＳに溶解した。（実験３８／３）。
ｄ）１６０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを８００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３８／４）。
ｅ）２００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを１０００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３８／５）。
ｆ）２４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを１２００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３８／６）。
ｇ）３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを１５００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３９／１）。
ｈ）３５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを１７５０μＬのＰＢＳに溶解した（実験３９／２）。
ｉ）４００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを２０００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３９／３）。
ｊ）５００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを２５００μＬのＰＢＳに溶解した（実験３９／４）。
ＤＬ−グリセルアルデヒド溶液ａ〜ｊのそれぞれをその後、１ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌに溶解したおよそ２０ｍｇのキトサンを含有する１ｍＬのキトサン溶液と個別に混合し、そして、０．１Ｎ  ＨＣｌを使用して（ｐＨ７．０に）中和した。各反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、そして１０ｍＬの１００％エタノールを恒常的攪拌下に反応混合物のそれぞれに添加した。該反応混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。インキュベーション期間の完了後に反応混合物を７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、そして生じるペレットを１０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌでそれぞれ洗浄し、次いで５ｍＬのＤＩ水（上の実験３８／１−６について）若しくは１０ｍＬのＤＩ水（上の実験３９／１−４について）で洗浄した。各洗浄段階は、過剰の溶媒を除去するためのサンプルの遠心分離を包含した。実験３８／１−６の最終反応生成物では、水と架橋キトサンゲルの間の相分離を観察し得なかった。３９／１−４の最終反応生成物では、上清およびキトサンゲルへの相分離が遠心分離後に観察された。実験３８／１−６および３９／１−４の反応生成物の色は、増大する架橋剤（ＤＬ−グリセルアルデヒド）濃度について生じる架橋キトサンゲルの付随する減少する水の取り込みを伴い、灰白色から帯黄色まで変動することが観察された。
【００９１】
実験シリーズ４０／１−３
本実験では、部分ｇ、ｉおよびｊのみを、後に続くところのＤＬ−グリセルアルデヒド濃度、すなわち
ｇ）３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを１５００μＬのＰＢＳに溶解した（実験４０／１）。
ｉ）４００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを２０００μＬのＰＢＳに溶解した（実験４０／２）。
ｊ）５００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを２５００μＬのＰＢＳに溶解した（実験４０／３）。
で実施したことを除き、上述された実験３９の正確な反復であった。
【００９２】
反応条件の残部は、上に詳細に記述されたところの実験シリーズ３９／１−４でのとおり正確に実施した。
【００９３】
生じるペレットを、生成物の膨潤挙動を測定するのに使用した（該結果は図９に具体的に説明する）。
実験シリーズ４４／３−４
ａ）５６ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを５００μＬのＤＩ水に溶解した（実験４４／３）。
ｂ）５６ｍｇのＤ（−）−リボースを５００μＬのＤＩ水に溶解した（実験４４／４）。
【００９４】
上のａおよびｂの溶液のそれぞれを、５ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣｌにおよそ１００ｍｇのキトサンを溶解すること、および０．１Ｎ  ＮａＣｌを使用して該溶液を中和することにより調製したキトサン溶液と個別に混合した。２種の生じる反応混合物のそれぞれを１分間ボルテックス攪拌し、そして４０ｍＬの１００％エタノールと混合した。該反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間（実験４４／３）若しくは３７℃で１２日間（実験４４／４）回転した。２種の異なるインキュベーション期間が完了した後に、反応混合物を７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを４０ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌで洗浄し、次いで１０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。各洗浄段階は、過剰の溶媒を除去するためのサンプルの遠心分離を包含した。双方の実験は軟質ゲルをもたらした。実験４４／３から生じるゲルでは、ＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したゲルは、実験４４／４から生じるＤ（−）−リボースで架橋したゲルのものより鮮やかな帯黄色を有した。
【００９５】
架橋多糖の分光学的特徴付け
今や図１〜４に参照がなされる。図１〜３に具体的に説明されるグラフで、縦軸はサンプルの吸光度を表し、そして横軸は波長をｎｍで表す。図４に具体的に説明されるグラフでは、縦軸はサンプルの吸光度を表し、そして横軸は（ｃｍ−１の単位の）波長を表す。
【００９６】
アミノ機能性化ヒアルロン酸（ＡＦＨＡ）（破線曲線１０により表される）およびＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したＡＦＨＡ（実線曲線２０により表される）のＵＶ−可視スペクトルを表す図解のグラフである図１は、本発明の方法の一態様に従って得た。破線曲線は、アミノ機能性化ＨＡ（上で詳細に開示されたとおり製造したＡＦＨＡ  Ｉ  １５０）のサンプルのスペクトルを表し、そして、実線曲線は、上述されたところの実験７２／１で得られたＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋した生成物のスペクトルを表す。ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０サンプルと対照的に、架橋多糖サンプルは、架橋反応での糖化生成物の形成を示しうる２２５〜２３５ｎｍおよび２８５〜３５５の範囲の強い吸光度を表す。
【００９７】
図２は、本発明の方法の態様に従って得た、Ｄ（−）−リボースで架橋したＡＦＨＡ（破線曲線３０により表される）、Ｄ（−）−エリトロースで架橋したＡＦＨＡ（実線曲線３２により表される）およびＤ（−）−アラビノースで架橋したＡＦＨＡ（点線曲線３４により表される）のＵＶ−可視スペクトルを表す図解のグラフである。Ｄ（−）−リボースで架橋したＨＡのサンプルは実験６７／１のサンプルから得た。Ｄ（−）−エリトロースで架橋したＨＡのサンプルは実験６７／６のサンプルから得た。Ｄ（−）−アラビノースで架橋したＨＡのサンプルは実験６７／２のサンプルから得た。
【００９８】
ピークの移動は、おそらく、ＨＡを架橋するのに使用した異なる還元糖の結果である。各糖はそれ自身の特定の鎖長およびコンホメーション（該反応で形成される最終的な終末糖化産物（ＡＧＥ）に対する影響を有する）を有する。
【００９９】
図３は、本発明の方法の態様に従って得た、架橋されていないキトサン（実線曲線４０により表される）、Ｄ（−）−リボースで架橋したキトサン（破線曲線４２により表される）、およびＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサン（点線曲線４４により表される）のＵＶ−可視スペクトルを表す図解のグラフである。架橋されていないキトサン（曲線４０）のサンプルは上の表１に示されるとおりＡｌｄｒｉｃｈから得た。Ｄ（−）−リボースで架橋したキトサン（曲線４２）のサンプルは実験４４／４のサンプルから得た。ＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサン（曲線４４）のサンプルは実験４４／３のサンプルから得た。
【０１００】
未修飾（架橋されない）キトサンを含むサンプルと対照的に、Ｄ（−）−リボースおよびＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサンの２サンプルは、２９０ｎｍ付近で高められた吸光度を表した（おそらく、想定される糖化生成物およびおそらくＡＧＥの典型的な吸光度を示す。
【０１０１】
図４は、本発明の方法の態様によるヒアルロン酸（点線曲線４６により表される）、破線曲線４８により表されるＡＦＨＡ、および実線曲線５０により表されるＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したＡＦＨＡのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを表す図解のグラフである。
【０１０２】
該点線曲線はヒアルロン酸（ＨＡ１５０）のＩＲスペクトルを表す。破線曲線はアミノ機能性化ＨＡ（ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０）のＩＲスペクトルを具体的に説明する。実線曲線は、実験３３／１で得られたＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したＨＡのサンプルのスペクトルを表す。図４のＩＲスペクトルは、カルボキシル（ＣＯＯ−）基の吸光度の範囲、ならびに、範囲１６１０〜１５５０ｃｍ−１および１４２０〜１３００ｃｍ−１のこれらの吸光度と重なり、それらの環境に依存してより高若しくは低波数に移動しうるアミドおよびアミン基の吸光度（それぞれ１６５０ｃｍ−１および１５６０ｃｍ−１）を示す。加えて、１７４０〜１７００ｃｍ−１の範囲の吸光度が架橋後に出現する。典型的には、カルボン酸の吸光度ならびにアミドおよびアミノ酸の吸光度は（１７４０〜１７００ｃｍ−１の）この波長範囲に見出される。これらの官能基の全部が最終的な架橋ＨＡ中に存在するため、それらを識別することは困難である。一般に、大きな吸光度スペクトル変化が、本明細書に開示される架橋反応生成物で観察されることがあり、これは、アミノ機能性化の間の修飾および化学反応、ならびに使用される架橋手順および糖化生成物の形成を強く示唆する。
【０１０３】
架橋多糖の物理的特徴付け
上述された実験で得られた架橋多糖の全部の特徴付けを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＧｍｂＨ、独国から商業的に入手可能なモデルＨＡＡＫＥ  ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ  ６００回転式レオメーターで標準的方法を使用して実施した。全部の測定で、モデルＰＰ  ２０  Ｔｉ  ＰＲローターをモデルＭＰＣ２０／Ｓ  ＱＦ測定プレートカバーとともに使用した。測定は２３℃の温度で実施した。
【０１０４】
全部の流動学的試験は振動測定法を使用して実施した。４００μＬの試験される物質をレオメーターの２枚の縞板間に置いた。正弦応力を０．０１と１０Ｈｚの間の周波数範囲で全サンプルに適用した。複素粘度｜η＊｜の生じる値を下の表２に示す。選択した流動学の測定結果は図５〜７にもまたより詳細に具体的に説明する。
【０１０５】
【表３】
2009507103.tif 000005
【０１０６】
【表４】
2009507103.tif 000006
【０１０７】
｜η＊｜の複数の測定値を表２の右側の列に提示する場合、第一の示される値は、最終ペレットから直接採取されるところの（若しくは、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）、Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）およびＨｙｌａｆｏｒｍ（Ｒ）サンプルについては商業的製品シリンジから直接採取されるところの）最終反応生成物サンプルの測定の結果を表すことが指摘される。同一実験の同一サンプルについて（同じ列内に）示される他の測定された｜η＊｜値は、（数値の後のカッコ内に詳細に示されるところの）針を通してサンプルを押出すこと若しくは３７℃で指定される時間サンプルをさらにインキュベートすること（インキュベーションの正確な時間は数値の後のカッコ内に明記される）のいずれかによりさらに加工した同一サンプルから得られる結果を示す。
【０１０８】
数種の商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づくマトリックスの流動学的特性と比較し
た、多様なＤＬ−グリセルアルデヒド濃度で多様な時間架橋した多様な組成物のＡＦＨＡに基づく多糖の流動学的特性の測定の結果を具体的に説明する図解のグラフである図５〜７に今や参照がなされる。図５〜７で、縦軸は複素粘度（｜η＊｜）をパスカルで表し、そして横軸は振動周波数をＨｚで表す。
【０１０９】
図５で、黒丸は、（１００ｍｇのグリセルアルデヒドで３７℃で２４時間架橋した）実験５３／３の架橋マトリックスについて得られた実験データ点を表す。黒四角は、（１５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドで３７℃で２４時間架橋した）実験５４／１の架橋マトリックスについて得られた実験データ点を表す。黒三角は、（３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドで３７℃で２４時間架橋した）実験６２／１の架橋マトリックスについて得られた実験データ点を表す。白丸は、商業的に得られるＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット：７０６４）について得られた実験データ点を表す（正確な数値については表２を参照されたい）。
【０１１０】
図５のグラフで見られうるとおり、類似の反応条件下でＤＬ−グリセルアルデヒド濃度を増大させることは、生じる架橋多糖の粘度を有意に増大する。さらに、（３００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを架橋混合物中で使用した）実験６２／１から生じる架橋多糖は、０．１Ｈｚより下の周波数値について、商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づくＲｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）−Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）のものより有意により高い複素粘度値を有する。
【０１１１】
図６中で、黒丸は、（５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドで３７℃で４８時間架橋した）実験６７／１の架橋マトリックスについて得られた実験データ点を表す。黒四角は、（５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドで３７℃で７２時間架橋した）実験６７／２の架橋マトリックスについて得られた実験データ点を表す。白丸は、商業的に得られるＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット：７０６４）について得られた実験データ点を表す（正確な数値については表２を参照されたい）。
【０１１２】
図６から見られうるとおり、ＡＦＨＡの架橋反応のインキュベーション時間を４８時間から７２時間まで延長する場合、生じるＨＡに基づく架橋多糖の複素粘度値は、架橋反応時間を延長することに伴い有意に増大する。さらに、（架橋混合物中で使用される５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを用いて７２時間の架橋反応を実施した）実験６７／２から生じる架橋多糖は、０．１Ｈｚより下の周波数値について、商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づくＲｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）−Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）のものより有意により高い複素粘度値を有する。
【０１１３】
図７中で、黒菱形の記号は、（４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドで３７℃で３日間架橋した）実験７７／１の架橋マトリックスについて得られた実験データ点を表す。白丸は、商業的に得られるＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット：７０６４）について得られた実験データ点を表す。白四角は、商業的に得られるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）（ロット：７３４９）について得られた実験データ点を表す。白三角は、商業的に得られるＨｙｌａｆｏｒｍ（Ｒ）Ｐｌｕｓ  ロット番号Ｒ０４０９について得られた実験データ点を表す（正確な数値については表２を参照されたい）。
【０１１４】
図７から見られうるとおり、３種の商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づく注入可能なゲルおよび実験７７／１のＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したＨＡに基づく多糖の複素粘度値を比較する場合、測定される複素粘度値は、０．１〜０．０１Ｈｚの振動周波数範囲にわたり、実験７７／１で得られる架橋物質について一貫してかつ有意により高い。例えば、０．０１Ｈｚで、実験７７／１で得られた架橋物質の複素粘度は、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）−Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）ロット番号７０６４について測定された複素粘度の
２倍以上、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（Ｒ）−ロット番号７３４９について測定された複素粘度の３倍以上、およびＨｙｌａｆｏｒｍ（Ｒ）−Ｐｌｕｓ  ロット番号Ｒ０４０９について測定された複素粘度の８倍以上である。
【０１１５】
粘度値のこうした増大は、美容整形外科および美容目的上使用される物質でとりわけ望ましいことができる増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）の持ち上げ（ｌｉｆｔｉｎｇ）および形成能力の改良と有利に相関しうることが、当業者により認識されるであろう。本明細書で開示される改良されたゲルはこうした優れた粘度値を有する一方、それらは、にもかかわらず、３０Ｇ針くらい細い針を通してなお容易に注入可能である。
【０１１６】
酵素的分解抵抗性アッセイ
分解抵抗性アッセイは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版：Ｍ．Ｆ．ＣｈａｐｌｉｎとＪ．Ｆ．Ｋｅｎｎｅｄｙ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、英国、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３４４９−１Ｐ）ｐｐ．３２４（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところのヒアルロニダーゼ消化およびウロン酸／カルバゾールアッセイ法を使用して実施した。
【０１１７】
上で開示された実験のいくつかのヒアルロニダーゼ消化実験の結果を下の図１０に示す。２実験を実施した：
【０１１８】
第一の消化実験
１ａ）架橋ＨＡの消化
実験７５／３から生じる架橋アミノ機能性化ＨＡの２００μＬの５サンプルを、２５０μＬのＮａＣｌ（０．９％）溶液、および５０μＬのＤＩ水に溶解した６０．８単位のヒアルロニダーゼとそれぞれ混合した。全サンプルを３７℃でインキュベートした。消化を開始した後、連続する１時間間隔でサンプルを採取し、物質を１分間ボルテックス攪拌することにより均質化し、そして１３０００ｒｐｍで５分間、Ｈｅｒａｅｕｓ  ＃３３２５Ｂローターを使用するＨｅｒａｅｕｓ“ｂｉｏｆｕｇｅ  ｐｉｃｏ”遠心機  カタログ番号７５００３２８０を遠心分離した（該遠心機およびローターはＫｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、独国から商業的に入手可能である）。２５０μＬの生じる上清を使用してカルバゾールアッセイを実施した。
【０１１９】
１ｂ）Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）ロット番号７０６４の消化
２００μＬのＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット番号７０６４）の５サンプルを、２５０μＬのＮａＣｌ（０．９％）溶液、および５０μＬのＤＩ水に溶解した６０．８単位のヒアルロニダーゼとそれぞれ混合し、そしてサンプルを３７℃でインキュベートした。消化を開始した後、連続する１時間間隔でサンプルを採取した。取り出したサンプルは、該物質を１分間ボルテックス攪拌することにより均質化し、そして同一のＨｅｒａｅｕｓ“ｂｉｏｆｕｇｅ  ｐｉｃｏ”遠心機で１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。２５０μＬの生じる上清を使用してカルバゾールアッセイを実施した。
【０１２０】
カルバゾールアッセイ手順に従い、各サンプルについて吸光度を５２５ｎｍで測定した。Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）の場合の強すぎる色反応により、該サンプルはホウ酸硫酸を使用して１０倍希釈する必要があった。インキュベーション２時間のサンプルは、カルバゾール処置の間の過度に高い温度により双方の場合（７５／３実験の生成物およびＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ））で拒絶され）、そして従って図１０のグラフに提示されない。
【０１２１】
ＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したアミノ機能性化ＨＡおよび商業的に得られるＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）のヒアルロニダーゼによる消化のカルバゾールアッセイ結果を具体的に
説明する図解のグラフである図１０に、参照が今やなされる。
【０１２２】
図１０のグラフの縦軸は５２５ｎｍの波長での試験されたサンプルの吸光度を表し、そして横軸は消化試験の開始からの時間を時間で表す。Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）サンプル（そのデータ点は図１０で黒四角により表される）が、（未希釈サンプルの読取り不可能に高い吸光度により）吸光度を読取る前に１０倍希釈しなければならなかった一方、実験７５／３から生じるアミノ機能性化ＨＡの他のサンプル（そのデータ点は図１０で黒丸により表される）の吸光度が、それらがあったまま（希釈することなく）読取られたという事実を考慮に入れた後、実験７５／３から得られた架橋したアミノ機能性化ＨＡのサンプルが、Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）により表される抵抗性よりもヒアルロニダーゼによる分解に対するはるかにより高い（最低７倍より高い）抵抗性を有したことが明らかである。
【０１２３】
Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）試験サンプルの１０倍希釈について補償するためにＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）の吸光度値（図１１中で黒四角により図解で表される）を１０により乗算した図１０のカルバゾールアッセイ結果を具体的に説明する図解のグラフである図１１に、今や言及がなされる。実験７５／３から生じるアミノ機能性化ＨＡのサンプルの吸光度値を図１１で黒丸により図解で表す。実験７５／３から生じるＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）サンプルの吸光度値は図１１で黒丸により表す。
【０１２４】
希釈サンプルから得られる吸光度値を単純に乗算することにより吸光度の正確な値を得ることが常に可能ではないことは公知である一方、これを、実験７５／３から得られる架橋アミノ機能性化ＨＡの吸光度値とＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）のものの間の差違の近似の印象を示すために単に行った。従って、図１１に表される値は、具体的説明の目的上のみの非常に粗い近似にすぎず、そして該２物質間の吸光度の真の差違の正確な表示でないかも知れない。
【０１２５】
第二の消化実験
０．１４３９ｍｇの架橋ＨＡ若しくは０．１５０７ｍｇのＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット番号７０６４）を、２５０μＬのＮａＣｌ（０．９％）溶液、および５０μＬのＤＩ水に溶解した６０．８単位のヒアルロニダーゼとそれぞれ個別に混合した。２種の生じる消化反応混合物を３７℃でインキュベートした。インキュベーション４時間後に、物質を１分間ボルテックス攪拌することにより該２サンプルを均質化し、そしてＨｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅ  ｐｉｃｏ遠心機で１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を双方のサンプルから除去し、そして残存する（消化されない）サンプル重量を消化サンプルのそれぞれについて測定した。実験７５／３から生じる架橋アミノ機能性化ＨＡの９９．５％、およびＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット番号７０６４）の９．３％が、遠心分離および上清の除去後に沈降物として残存した。これらの結果は、Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）の商業的サンプルと比較して実験７５／３から生じるアミノ機能性化ＨＡのヒアルロニダーゼ消化に対するはるかにより高い（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抵抗性を強く確証する。
【０１２６】
本明細書に開示される架橋方法に従って製造した糖で架橋した多糖物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒアルロニダーゼ消化に対する高い抵抗性は、一般におよびとりわけ審美的処置で組織増強のための増量剤すなわち嵩増し剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として使用されるマトリックス中で高度に有利である、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物分解に対する同様に高い抵抗性を該物質が表しうることを示す。それは、埋植物の寿命を延長することができ、かつ、必要とされる審美的処置の頻度を低下させることができ、従って必要とされる処置の総費用ならびに処置若しくは注入の回数および／若しくは頻度を低下させて、改良された患者の快適さをもたらしうるからである。
【０１２７】
サンプル膨潤試験
架橋過程の間の過剰量のエタノールの存在により、糖で架橋したアミノ機能性化ＨＡはその脱水された形態で出現する。その水和された形態と比較して、脱水された形態の架橋ＨＡの容量は無視できる。記述される洗浄手順（反応生成物が（例えば実験３５で５ｍＬのＤＩ水中の）最終洗浄により再水和された）後に、結果として生じるゲルを標準的試験管に移し、そしてゲルの容量（ｍＬで）を測定した。
【０１２８】
参照が今や図８〜９になされる。図８は、本発明の一態様による、多様な異なる濃度のＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したアミノ機能性化ＨＡの膨潤挙動を測定することの結果を具体的に説明する図解の棒グラフである。
【０１２９】
図８の図解の棒グラフは、実験３５／２、３５／４、３７／４、３７／５、３７／６、３８／１、３８／２および３８／３（それぞれ図８の棒５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および６６により表される）で得られたＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したアミノ機能性化ヒアルロン酸サンプルの水取り込み（膨潤）の結果を示す。図８のグラフの最も左の棒５０は、架橋実験で使用した量に類似の量での、しかしＤＬ−グリセルアルデヒドを使用することを伴わないＡＦＨＡ８０を水和することの結果を表す（この結果は架橋されないＡＦＨＡ８０サンプルを表す）。図８のグラフの各棒について、該サンプルのそれぞれの架橋で使用したＤＬ−グリセルアルデヒドの量（ｍｇで）をグラフの横軸に示す。（洗浄による）水和および遠心分離後の試験されたサンプルの容量（ｍＬで）は、洗浄による反応混合物からのエタノールの除去後のサンプルの水で誘導される膨潤の量の表示として縦軸に表す。図８の結果は、架橋されないＡＦＨＡ８０サンプル中で最大でありかつ反応混合物中の架橋剤（ＤＬ−グリセルアルデヒド）の量が増大する際にほぼ一貫して減少する、一貫してより高いサンプル膨潤を示す。
【０１３０】
図９は、本発明の一態様による、多様な異なる濃度のＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサンの膨潤挙動を測定することの結果を具体的に説明する図解のグラフである。図９の図解の棒グラフは、実験４０／１、４０／２および４０／３（それぞれ図９の棒６２、６４および６６により表される）で得られたＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサンサンプルの水取り込み（膨潤）の結果を示す。図９の棒グラフの最も左の棒６０は、架橋実験シリーズ４０／１−３で使用した量と類似の量での、しかしＤＬ−グリセルアルデヒドを使用することを伴わない架橋されないキトサン（架橋されないキトサンサンプル）を水和することの結果を表す。該キトサンサンプルの架橋で使用したＤＬ−グリセルアルデヒドの量（ｍｇで）はグラフの横軸に示す。（洗浄による）水和および遠心分離後のサンプルの容量（ｍＬで）は、洗浄による反応混合物からのエタノールの除去後のサンプルの水で誘導される膨潤の量の表示として縦軸に表す。図９の結果は、反応混合物中の架橋剤（ＤＬ−グリセルアルデヒド）の量が（図９で具体的に説明される例で３００ｍｇから４００ｍｇを介し５００ｍｇまで）増大する際にほぼ一貫して減少する、架橋されないキトサンサンプル中で最大である、一貫してより高いサンプルの膨潤を示す。
【０１３１】
キトサンおよびコラーゲンを架橋することにより作成される混成マトリックス
線維性コラーゲンは米国特許第６，６８２，７６０号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記述されるとおり製造した。原線維状（ｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ）コラーゲンは遠心分離（４５００ｒｐｍ）により濃縮した。
【０１３２】
実験１
１４．５ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．３６）、５ｍＬの原線維化緩衝液（上で詳細に開示されたとおり調製した）、３５ｍＬの１００％エタノール、および５００μＬのＰＢＳ緩衝液に溶解した１００ｍｇのＤ（−）−リボースの混合物に添加した１４０ｍｇの原線維状コラーゲンをそれぞれ含有する３本の異なる試験管を調製した。該反応混合物をボルテックス攪拌した。
【０１３３】
３種の異なるキトサン溶液ａ、ｂおよびｃは後に続くとおり調製した：
ａ）１３．５ｍｇのキトサンを２．５ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
ｂ）２７ｍｇのキトサンを５．０ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
ｃ）５４ｍｇのキトサンを１０．０ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
【０１３４】
溶液ａ、ｂおよびｃのそれぞれを、恒常的攪拌を伴い、試験管中のコラーゲン／Ｄ（−）−リボース混合物の１種に一滴ずつゆっくりと添加した。該反応混合物を１分間ボルテックス攪拌し、そしてインキュベーター中３７℃で１２日間回転した。インキュベーション期間の終了時に、該混合物を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。全部の生じる反応生成物はペースト様粘度を有した。キトサンの濃度を増大させることの間、該生成物の帯黄色もまた灰白色から濃黄色に徐々に変化した。ｃ）の場合、架橋したキトサンの集合体がペーストの内側に見出された。
【０１３５】
実験２
１７．５ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液、５ｍＬの原線維化緩衝液、１７．５ｍＬの１００％エタノール、および３００μＬの１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液に溶解した３３ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドの混合物に添加した１４０ｍｇの原線維状コラーゲンをそれぞれ含有する３本の異なる試験管を調製した。該反応混合物をボルテックス攪拌した。
【０１３６】
３種の異なるキトサン溶液ａ、ｂおよびｃは後に続くとおり調製した：
ａ）１３．５ｍｇのキトサンを２．５ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
ｂ）２７ｍｇのキトサンを５．０ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
ｃ）５４ｍｇのキトサンを１０．０ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
【０１３７】
上のキトサン溶液ａ、ｂおよびｃのそれぞれを、恒常的攪拌を伴い、試験管中のコラーゲン／ＤＬ−グリセルアルデヒド反応混合物の１種に一滴ずつゆっくりと添加した。１分間の追加のボルテックス攪拌後に該反応混合物をインキュベーター中３７℃で２４時間回転した。インキュベーション期間の終了時に、該混合物を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。全部の生じる反応生成物はペースト様粘度を有した。キトサンの濃度を増大させた際に、該生成物の帯黄色が灰白色から鮮黄色に徐々に増大した。ｃ）の場合、架橋したキトサンの集合体がペーストの内側に見出された。
【０１３８】
実験７／１
９．８ｍＬの１００％エタノール、および７００μＬの原線維化緩衝液に溶解した１４ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドの混合物に添加した１０８ｍｇの原線維状コラーゲンをそれぞれ含有する５本の異なる試験管を調製し、そしてボルテックス攪拌した。該５種のコラーゲン／ＤＬ−グリセルアルデヒド混合物をインキュベーター中３７℃で６時間回転した。
【０１３９】
以下の５種のキトサン溶液もまた調製した。すなわち
ａ）５３ｍｇのキトサンを３．２ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
ｂ）７５．６ｍｇのキトサンを４．５ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
ｃ）１０７．５ｍｇのキトサンを６．４ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
ｄ）１４１ｍｇのキトサンを８．４ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
ｅ）１６１．３ｍｇのキトサンを９．６ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した
溶液ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅのそれぞれを、上述されたコラーゲン／ＤＬ−グリセルアルデヒド混合物を含有する５本の試験管の１本にゆっくりと一滴ずつ添加した。１分間の追加のボルテックス攪拌後に混合物を再度インキュベーターに入れ、そして３７℃で２４時間回転した。第二のインキュベーション時間が終了した後、混合物を５０００ｒｐｍで
１５分間遠心分離した。
【０１４０】
全部の生じる架橋生成物はペースト様粘度を有した。キトサンの濃度を増大させることの間、生成物の帯黄色が灰白色から鮮黄色まで徐々に増大する。サンプルｃ）は、架橋しされないコラーゲンを溶解するため、過剰量の６Ｎ  ＮａＯＨ中５０℃で６時間インキュベートした。（ＤＩ水で）３回の洗浄および遠心分離段階後に、サンプルをＨＣｌ加水分解にかけ、そして、キトサンに共有結合したヒドロキシプロリン（コラーゲンを表す）を検出するために（商業的実験室で）アミノ酸分析計により分析した。ヒドロキシプロリンが該サンプル中で検出された。
【０１４１】
実験７／２
９．８ｍＬの１００％エタノール、および７００μＬの原線維化緩衝液に溶解した１４ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドの混合物に添加した１０８ｍｇの原線維状コラーゲンをそれぞれ含有する３本の異なる試験管を調製し、そしてボルテックス攪拌した。
【０１４２】
以下の３種のキトサン溶液ａ、ｂおよびｃもまた調製した。すなわち
ａ）５３ｍｇのキトサンを３．２ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
ｂ）１０７．５ｍｇのキトサンを６．４ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
ｃ）１６１．３ｍｇのキトサンを９．６ｍＬの０．１Ｎ  ＨＣＬに溶解した。
【０１４３】
溶液ａ、ｂおよびｃのそれぞれを、恒常的攪拌を伴い、コラーゲン／ＤＬ−グリセルアルデヒド混合物を含有する該３本の試験管の１本にゆっくりと一滴ずつ添加した。１分間の追加のボルテックス攪拌後に、該混合物を３７℃のインキュベーター中で２４時間回転した。インキュベーション期間の終了後に混合物を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。全部の生じる反応生成物はペースト様粘度を有した。キトサンの濃度を増大させることの間、生成物の帯黄色は灰白色から鮮黄色に徐々に増大した。
【０１４４】
ヘパリンアミノ機能性化
５００ｍｇのヘパリンナトリウムＥＰ（バッチ番号９８１８０３０）を３００ｍＬのＤＩ水に溶解した。３．０ｇのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を該混合物に添加した。生じる溶液のｐＨを４．７５に調節し、そして均質な溶液が得られるまで該溶液を攪拌した。４００ｍｇの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を２．０ｍＬのＤＩ水に溶解しかつ該混合物に添加し、そしてｐＨを室温で再度４．７５に調節した。ｐＨをモニターすることにより該反応をモニターし、ｐＨは継続的に４．７５に調節した。該反応混合物を攪拌しながら一夜放置した。該溶液をその後透析チューブに移し、そしてＡＤＨが透析物中で検出されなくなるまで、ＤＩ水およびＤＩ水／エタノール混合物（４：１  ｖ／ｖ）に対する交互透析にかけた。生じるアミノ機能性化ヘパリンナトリウムＥＰ（ヘパリン−Ｍ）は使用するまで４℃で保存した。
【０１４５】
ＨＡアミノ機能性化手順ＩＩ
２．４ｇの１．４〜１．８ＭＤａの範囲の分子量を有するＨＡ  １５０（ヒアルロン酸ナトリウム医薬等級１５０、ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウェー・オスロから製品番号２２２２００３として商業的に入手可能）を２．０ＬのＤＩ水に溶解し、そして７．０ｇのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を該混合物に添加した。生じる溶液のｐＨをｐＨ４．７５に調節し、そして均質な溶液が得られるまで該溶液を攪拌した。７６０ｍｇの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を１０．０ｍＬのＤＩ水に溶解しかつ該混合物に添加し、そしてｐＨを室温で再度４．７５に調節した。ｐＨの変化をモニターすることにより反応をモニターし、ｐＨは継続的にｐＨ４．７５に調節した。ｐＨの変化を検出し得なくなった場合に反応混合物を追加の１時間若しくは一夜放置した。該溶液をその後透析チューブに移し、そしてＡＤＨが
透析物中で検出されなくなるまで、ＤＩ水およびＤＩ水／エタノール混合物（４：１  ｖ／ｖ）に対する交互透析にかけた。透析した溶液を３．５リットルの１００％エタノール中に移し、５ｇのＮａＣｌを添加し、そして該混合物を１時間攪拌した。沈殿した改変されたＨＡを分離するため、該溶液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した。生じるアミノ機能性化ＨＡ（ＡＦＨＡ  ＩＩ）は使用するまで４℃で保存した。
【０１４６】
ＨＡアミノ機能性化手順ＩＩＩ
２．５ｇの１．４〜１．８ＭＤａの範囲の分子量を有するＨＡ  １５０（ヒアルロン酸ナトリウム医薬等級１５０、ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウェー・オスロから製品番号２２２２００３として商業的に入手可能）を２．０ＬのＤＩ水に溶解し、そして３．４ｇのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を該混合物に添加した。生じる溶液のｐＨを４．７５に調節し、そして均質な溶液が得られるまで該溶液を攪拌した。４００ｍｇの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を１０．０ｍＬのＤＩ水に溶解しかつ該混合物に添加し、そしてｐＨを室温で再度４．７５に調節した。ｐＨの変化をモニターすることにより反応をモニターし、ｐＨは継続的にｐＨ４．７５に調節した。ｐＨの変化を検出し得なくなった場合に反応混合物を追加の１時間若しくは一夜放置した。該溶液をその後透析チューブに移し、そしてＡＤＨが透析物中で検出されなくなるまで、ＤＩ水およびＤＩ水／エタノール混合物（４：１  ｖ／ｖ）に対する交互透析にかけた。透析した溶液を３．５リットルの１００％エタノール中に移し、５ｇのＮａＣｌを添加し、そして該混合物を１時間攪拌した。沈殿した改変されたＨＡを分離するため、該溶液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した、生じるアミノ機能性化ＨＡ（ＡＦＨＡ  ＩＩＩ）は使用するまで４℃で保存した。
【０１４７】
ＨＡアミノ機能性化手順ＩＶ
２．４ｇの１．４〜１．８ＭＤａの範囲の分子量を有するＨＡ  １５０（ヒアルロン酸ナトリウム医薬等級１５０、ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウェー・オスロから製品番号２２２２００３として商業的に入手可能）を３５０ｍＬのＤＩ水に溶解し、５．０ｇのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を該混合物に添加した。生じる溶液のｐＨをｐＨ４．７５に調節し、そして均質な溶液まで該溶液を攪拌した。５００ｍｇの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を１０．０ｍＬのＤＩ水に溶解しかつ該混合物に添加し、そしてｐＨを室温で再度４．７５に調節した。ｐＨの変化により反応をモニターし、そして４．７５に継続的に調節した。ｐＨの変化を検出し得なくなった後に、反応混合物を追加の１時間若しくは一夜放置した。その後、該溶液を透析チューブに移し、そして、ＡＤＨが透析物中で検出されなくなるまで、ＤＩ水およびＤＩ水／エタノール混合物（４：１  ｖ／ｖ）に対する交互透析にかけた。透析した溶液を３．５リットルの１００％エタノール中に移し、５ｇのＮａＣｌを添加し、そして該混合物を１時間攪拌した。沈殿した改変されたＨＡを分離するため、該溶液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した。生じるアミノ機能性化ＨＡ（ＡＦＨＡ  ＩＶ）は使用するまで４℃で保存した。
【０１４８】
実験シリーズ０３／１０５／１−６
６ｍＬの１００％エタノール中に１５２ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０をそれぞれ含有する２個の別個の同一のスラリーを調製した。
【０１４９】
９ｍＬのＤＩ水に溶解した９００ｍｇのＤ（−）−ソルボースを含有する溶液を、架橋剤（Ｄ（−）−ソルボース）溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、第一のＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーに添加した。生じる反応混合物を３個の等しい部分１、２および３に分割し、そして生じる部分のそれぞれをインキュベーターに入れかつ３７℃で後に続くとおり回転した。すなわち
実験０３／１０５／１では、部分１を６日間インキュベートした。
実験０３／１０５／２では、部分２を１２日間インキュベートした。
実験０３／１０５／３では、部分３を１８日間インキュベートした。
９ｍＬのＤＩ水に溶解した９００ｍｇのＤ（−）−フルクトースを含有する溶液を、架橋剤（Ｄ（−）−フルクトース）溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、第二のＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーに添加した。生じる反応混合物を３個の等しい部分４、５および６に分割し、そして生じる部分のそれぞれをインキュベーターに入れかつ３７℃で後に続くとおり回転した。すなわち
実験０３／１０５／４では、部分４を６日間インキュベートした。
実験０３／１０５／５では、部分５を１２日間インキュベートした。
実験０３／１０５／６では、部分６を１８日間インキュベートした。
【０１５０】
上の反応混合物１〜６のインキュベーションが完了した後、４０ｍＬのＤＩ水を反応混合物１〜６のそれぞれに添加し、そして該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、そして２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を、生じるペレットのそれぞれに添加しかつ混合した。該混合物を９０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離した。実験０３／１０５／１、０３／１０５／１、０３／１０５／２、０３／１０５／３、０３／１０５／４、０３／１０５／５および０３／１０５／６の生じるペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１５１】
実験シリーズ０３／１１４／１−４
実験０３／１１４／１
２ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。１．５ｍＬのＤＩ水中の５０ｍｇのＤ（−）−フルクトースの溶液を、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、該スラリーに添加した。生じる混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに注いだ。該反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で２日間回転した。インキュベーションの完了後に４０ｍＬのＤＩ水を該反応混合物に添加し、そして該混合物を９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０１５２】
実験０３／１１４／２
該実験は、反応混合物を４日間の回転を伴いインキュベートしたことを除き、上の実験０３／１１４／１について記述されたとおり実施した。
【０１５３】
実験０３／１１４／３
該実験は、５０ｍｇのＤ（−）−ソルボースをＤ（−）−フルクトースの代わりに使用したことを除き、上の実験０３／１１４／１について記述されたとおり実施した。
【０１５４】
実験０３／１１４／４
該実験は、反応混合物を２日の代わりに４日間の回転を伴いインキュベートしたことを除き、上の実験０３／１１４／３について記述されたとおり実施した。
【０１５５】
実験０３／１１４／１、０３／１１４／２、０３／１１４／３および０３／１１４／４の生じるペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１５６】
実験シリーズ０３／１４０／１−４
実験０３／１４０／１
１ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。架橋剤溶液は、２．０ｍＬのＤＩ水に３００ｍｇのＤ（−）−リボースを溶解することにより調製した。該架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れ、そして試験管をボルテックス攪拌して均質な混合物を得た。該混合物をその後４０ｍＬの１００％エタノールに注いだ。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で５日間回転した。インキュベーション期間の終了時に４０ｍＬのＤＩ水を反応混合物に添加し、そして生じる混合物を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。生じるペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）で洗浄し、そして７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットをその後、１８Ｇ針を通して１回およびその後２１Ｇ針を通して１回の押出により均質化し、そして４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）中に６時間保ち、そしてその後７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットを、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｒ）濾紙Ｎｏ．４（Ｗｈａｔｍａｎ、米国からカタログ番号１００４  ３２０として商業的に入手可能）を使用して濾過し、そして３７℃で３日間インキュベートした。
【０１５７】
実験０３／１４０／２
該実験は、架橋剤溶液が２．０ｍＬのＤＩ水に溶解した５０ｍｇのＤ（＋）−ソルボースを包含したことを除き、上の実験０３／１４０／１について記述されたとおり実施した。
【０１５８】
実験０３／１４０／３
該実験は、架橋剤溶液が２．０ｍＬのＤＩ水に溶解した５０ｍｇのＬ（＋）−フルクトースを包含したことを除き、上述された実験０３／１４０／１について記述されたとおり実施した。
【０１５９】
実験０３／１４０／４
該実験は、架橋剤溶液が２．０ｍＬのＤＩ水に溶解した３００ｍｇのＤ（＋）グルコースを包含し、そしてペレットを濾紙を使用して濾過しなかったことを除き、上の実験０３／１４０／１について記述されたとおり実施した。
【０１６０】
実験０３／１４０／１、０３／１４０／２、０３／１４０／３および０３／１４０／４の生じるペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を、下の表５に要約する。
【０１６１】
実験０３／１４０／６
１ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。架橋剤溶液は、３００ｍｇのＤ−リボース−５−リン酸二ナトリウム塩脱水物を２．０ｍＬのＤＩ水に溶解することにより調製した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーは、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリー層の下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な溶液を得ることにより、架橋剤溶液と混合した。生じる混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに注いだ。該反応混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で５日間回転した。インキュベーション期間の終了時に４０ｍＬのＤＩ水を該反応混合物に添加し、そして生じる混合物を振とうしかつ７０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、そして、ペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）で２回洗浄し、そして７０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。生じるペレットについて測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１６２】
実験０３／１４０／６の結果は、アミノ機能性化多糖を架橋するための還元糖の使用が単純な還元糖を使用することに制限されないこと、ならびに、多様な異なる還元糖誘導体
もまた、本発明の架橋多糖マトリックスおよび混成マトリックスを得るために成功裏に使用しうることを示す。
【０１６３】
実験シリーズ０３／１１０／１−４
実験０３／１１０／１
５ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。該スラリーを、架橋剤溶液を該スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、８ｍＬのＤＩ水に溶解した１６０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する架橋剤溶液と混合した。６．５ｍＬの生じる混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに注ぎかつボルテックス攪拌した。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で１日間回転した。インキュベーション期間の終了時に４０ｍＬのＤＩ水および２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）を該混合物に混合しながら添加し、そして生じる混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してペレットを得た。
【０１６４】
実験０３／１１０／２
該実験は、４０ｍＬの１−ヘキサノールを４０ｍＬの１００％エタノールの代わりに使用したことを除き、上の実験０３／１１０／１について記述されたとおり実施した。
【０１６５】
実験０３／１１０／３
該実験は、４０ｍＬの１−ブタノールを４０ｍＬの１００％エタノールの代わりに使用したことを除き、上の実験０３／１１０／１について記述されたとおり実施した。
実験０３／１１０／４
該実験は、４０ｍＬの２−プロパノールを４０ｍＬの１００％エタノールの代わりに使用したことを除き、上の実験０３／１１０／１について記述されたとおり実施した。
【０１６６】
実験０３／１１０／４、０３／１１０／４、０３／１１０／４および０３／１１０／４の生じるペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１６７】
実験シリーズ０３／１３１／２−５
実験０３／１３１／２
２ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。該スラリーは、架橋剤溶液を該スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、６ｍＬのＤＩ水に溶解した１４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する架橋剤溶液と混合した。３．５ｍＬの生じる混合物を４０ｍＬの酢酸エチルに注ぎ、そして生じる反応混合物をインキュベーターに入れかつ３７℃で１日間回転した。インキュベーション期間の終了時に４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）を混合しながら該混合物に添加し、そして生じる混合物を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去してペレットを得た。
【０１６８】
実験０３／１３１／３
該実験は、４０ｍＬのアセトン（ジメチルケトン）を４０ｍＬの酢酸エチルの代わりに使用したことを除き、上の実験０３／１３１／２について記述されたとおり実施した。
【０１６９】
実験０３／１３１／４
該実験は、４０ｍＬの１−ヘキサノールを４０ｍＬの酢酸エチルの代わりに使用したことを除き、上述された実験０３／１３１／２について記述されたとおり実施した。
【０１７０】
実験０３／１３１／５
２ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。該スラリーは、架橋剤溶液を該スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、６ｍＬのＤＩ水に溶解した１４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含有する架橋剤溶液と混合した。８．０ｍＬの生じる混合物を４０ｍＬのトルエンに注ぎ、そして生じる反応混合物をインキュベーターに入れかつ３７℃で６日間回転した。インキュベーション期間の終了時に、反応混合物に３０ｍＬの１００％エタノールを添加すること、混合することおよび７０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、トルエンを洗い流した。エタノール洗浄および遠心分離をもう２回反復した。生じるペレットを、２５ｍＬのＤＩ水および２０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）の混合物で３回洗浄し、そして７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。最終洗浄段階は、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）に該ペレットを再懸濁すること、および７０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により実施した。上清を除去しかつペレットを試験のため保管した。
【０１７１】
実験０３／１３１０／２、０３／１３１／３、０３／１３１／４および０３／１３１／５の生じるペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１７２】
実験０３／１４６／２
２ｍＬの１００％エタノール中の１００ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを調製した。１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを４０．０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）に溶解した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、架橋剤溶液と混合した。生じる混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で１日間回転した。インキュベーション期間の終了時に該混合物を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを４０ｍＬのＤＩ水に再懸濁し、そして生じる懸濁液を室温で１２時間放置した。該混合物をその後７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、ペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）への再懸濁混合および７０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により２回洗浄した。結果として生じるペレットを３７℃の温度で３日間インキュベーターに入れた。生じるペレットについて測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１７３】
実験シリーズ０５／０８／２−４
実験０５／０８／２
２ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを３ｍＬのＤＩ水に溶解した。ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーは、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、架橋剤溶液と混合した。５．０ｍＬの生じる混合物を４０ｍＬのジクロロメタンに注ぎ、そして生じる反応混合物をインキュベーターに入れかつ３７℃で１日間回転した。インキュベーション期間の終了時に３５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）を物質に添加しかつ混合し、そして生じる懸濁液を７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離しかつ上清を除去した。ペレットを試験のため取っておいた。
【０１７４】
実験０５／０８／３
該実験は、４０ｍＬのヘキサンを４０ｍＬのジクロロメタンの代わりに使用したことを除き、上の実験０５／０９８／２について記述されたとおり実施した。
【０１７５】
実験０５／０８／４
２ｍＬの１００％エタノール中に５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。１００ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを３ｍＬのＤＩ水に溶解した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、架橋剤溶液と混合した。５．０ｍＬの生じる混合物を４０ｍＬのジエチルエーテルに注ぎ、そして生じる反応混合物を水浴中に入れ、そして３０℃で２日間振とうした。水浴インキュベーション期間の終了時に、３５ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）を生じる物質に添加しかつ混合して、物質を懸濁させた。生じる懸濁液を７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を除去した。最終洗浄段階は４０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）で行った。該混合物をその後２００００ｒｐｍで４５分間遠心分離しかつ上清を除去した。
【０１７６】
実験０５／０８／２、０５／０８／３および０５／０８／４で得られたペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴を下の表５に要約する。
【０１７７】
ＨＡを包含する混成マトリックスの付加的な例
ブタ線維性コラーゲンを米国特許第６，６８２，７６０号明細書に詳述されるとおり調製した。
【０１７８】
実験０３／９４／２
５ｍＬの１００％エタノール中の８０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを調製した。架橋剤溶液は、２．５ｍＬのＤＩ水に溶解した４０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを包含した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れることにより架橋剤溶液と混合した。加えて、０．４ｍＬの原線維状コラーゲンストック溶液（３５ｍｇ／ｍＬ原線維化緩衝液の濃度を有する）を該混合物に添加し、そして生じる混合物をボルテックス攪拌して均質な混合物を得た。生じる混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに添加した。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で３日間回転した。インキュベーション期間の終了時に混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した。残存するペレットを４０ｍＬのＤＩ水で洗浄し、そして２００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。結果として生じるペレットを、２５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％ＮａＣｌ）と合わせ、そして２４０００ＲＰＭで１分間ｔｕｒｒａｘ均質化した。均質化した混合物を９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しかつ上清を除去した。生じるペレットを試験のため取っておいた。生じるペレットについて測定した複素粘度値、および生じる混成マトリックスのペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１７９】
実験シリーズ０４／３７／２３−２９
１００％エタノール中のＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを表３に従って調製した。ＤＬ−グリセルアルデヒドを、下の表３に開示されるところの量で１．０ｍＬのＤＩ水に溶解した。ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、２．０ｍＬの原線維状ブタコラーゲンの溶液（原線維化緩衝液１ｍＬあたり３５ｍｇのコラーゲンの濃度を有する）に継続的ボルテックス攪拌を伴いゆっくりと添加し、各実験のコラーゲンの総量を表３に示す。その後、１ｍＬの架橋剤溶液をコラーゲン／ＡＨＦＡ混合物に添加し、そして合わせた混合物を２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化して均質な混合物を得た。均質化した混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに添加した。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で一夜回転した。インキュベーション期間の終了時に上清を除去した。物質を４０ｍＬのＤＩ水で１回洗浄しかつ６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして６０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を伴い４０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）で２回洗浄した。実験０４／３７／２３、０４／３７／２４、０４／３７／２５、０４／３７／２６、０４／３７／２７、０４／３７／２８および０４／３７／２９の多様な反応混合物の調製において使用した物質の正確な量、ならびに複素粘度の実験的測定値を下の表３に要約する。
【０１８０】
実験０４／３９／３０、０４／４１／３１、０４／４４／３２、０４／４８／３４、０４／５２／３５および０４／５２／３６
１００％エタノール中のＡＦＨＡ  Ｉ  １５０のスラリーを調製した。各実験のスラリーの組成は下の表３に詳述する。ＤＬ−グリセルアルデヒド（架橋剤として使用する）を、表３に指定される量で１．０ｍＬのＤＩ水に溶解した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、ＡＦＨＡ溶液へのコラーゲン溶液のボルテックス攪拌を伴うゆっくりの添加することにより、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）に懸濁したある量の原線維状ブタコラーゲンと混合した。各実験で使用する原線維状コラーゲンの量は表３に示す。架橋剤（ＤＬ−グリセルアルデヒド）溶液をその後、攪拌しながらコラーゲン／ＡＦＨＡ混合物に添加した。全実験の生じる反応混合物を２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化して均質な混合物を得た。４０ｍＬの１００％エタノールを、生じる反応混合物のそれぞれに添加した。生じる混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で一夜回転した。インキュベーション期間の終了後に上清を除去した。
【０１８１】
生じるペレットのそれぞれを４０ｍＬのＤＩ水で１回洗浄しかつ６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そしてその後４０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）で２回洗浄しかつ６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。洗浄したペレットのそれぞれをその後２５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液と混合し、そして２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化した。ｔｕｒｒａｘ均質化後に、均質化した混合物のそれぞれを６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離しかつ上清を除去した。生じるペレットを試験した。生じるペレットの各１種の複素粘度を上に詳細に開示されるとおり測定した。多様な反応混合物の調製において使用する物質の量、および複素粘度の実験的測定値を表３に要約する。
【０１８２】
【表５】
2009507103.tif 000007
【０１８３】
実験０４／５５／１
２ｍＬの１００％エタノール中の１５０ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＶ  １５０のスラリーを調製した。１５０ｍｇのＤ（−）−フルクトースを５．０ｍＬの原線維状ブタコラーゲン（原線維化緩衝溶液１ｍＬあたりおよそ３ｍｇのコラーゲンの濃度を有する）に溶解した。ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、継続的ボルテックス攪拌を伴い原線維状コラーゲン／Ｄ（−）−フルクトース懸濁液と混合した。生じる混合物を２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化して均質な混合物を得た。均質化した混合物を３５ｍＬの１００％エタノールおよび０．５ｍＬの酢酸（１０％  ｖ／ｖ）に添加した。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で６時間回転した。インキュベーション期間の終了時に上清を除去した。残存するペレットを２５ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液と混合し、そして２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化した。均質化した混合物を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離しかつ上清を除去した。結果として生じるペレットを４０ｍＬのＤＩ水で１回洗浄しかつ６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そしてその後、４０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）で２回洗浄しかつ６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。該ペレットを３７℃で３日間インキュベートした。
【０１８４】
生じるペレットについて実験的に測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１８５】
実験０３／１４５／２
２ｍＬの１００％エタノール中に１５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。１０５ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒド、および５．０ｍｇのウシ心からのチトクロームＣを３．０ｍＬのＤＩ水に溶解した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、架橋剤溶液を該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、架橋剤およびタンパク質溶液と混合した。ボルテックス攪拌した混合物を４０ｍＬのエタノールに添加した。生じる混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で２日間回転した。インキュベーション期間の終了時に上清を除去し、そして、生じる物質を、４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液に再懸濁すること、振とうすること、および７０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により３回洗浄した。結果として生じるペレットを、１８Ｇ、２２Ｇおよび２５Ｇ針を通す連続押出（針あたり１回）により均質化した。押出後に物質を４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）で洗浄しかつ７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じるペレットについて測定した複素粘度値、および生じるペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１８６】
実験０３／１４５／２の結果は、コラーゲン以外のタンパク質が糖化によりアミノ機能性化多糖に成功裏に架橋されうることを示す。それはまた、コラーゲンと実質的に異なるタンパク質を本発明の混成架橋マトリックスの形成において使用しうることも示す。
【０１８７】
こうしたタンパク質／アミノ多糖糖化マトリックスの形成は、異なるタンパク質を選択することにより生じる混成マトリックスの流動学的特性を改変するために有利でありうるのみならず、しかしまた（限定されるものでないが、酵素、成長を促進する若しくは成長を阻害するタンパク質、多様なシグナル伝達タンパク質およびペプチドなどを挙げることができる）生物学的に活性のタンパク質をマトリックス中に有利に組み込むためにも有用でありうる。
【０１８８】
実験０３／１４６／１
２ｍＬの１００％エタノール中に１５０ｍｇのＡＦＨＡ  Ｉ  １５０を含有するスラリーを調製した。１０５ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドおよび３ｍＬのヘパリン−Ｍ（およそ４０ｍｇ）を３．０ｍＬのＤＩ水に溶解した。該ＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーを、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  Ｉ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、ヘパリンを含有する架橋剤溶液と混合した。
【０１８９】
該混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに添加した。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で２日間回転した。インキュベーション期間の終了時に上清を除去し、そして、生じる物質を、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と合わせた４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液（０．９％）と混合すること、振とうすることおよび７０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により２回洗浄した。結果として生じるペレットを、１８Ｇ、２２Ｇおよび２５Ｇ針を通す連続押出（針あたり１回）により均質化し、そして３７℃のインキュベーターに３日間入れた。生じる物質はクリーム状しかし堅固な不透明ゲルであった。
【０１９０】
生じるペレットについて測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１９１】
実験０３／１４６／１の結果は、還元糖での架橋を、異なるアミノ多糖およびアミノ機能性化多糖（還元糖により架橋されることが可能なアミノ基を含有する）ならびにそれらの誘導体の多様な混合物に適用しうることを示す。架橋されたマトリックス内の多様な多糖の特定の型および／若しくは比を制御することにより、こうした混合膜の物理、化学および生物学的特性を制御かつ改変することが可能でありうるため、こうした混合架橋マトリックスは有利でありうる。
【０１９２】
実験シリーズ０５／０２／１−２
実験０５／０２／１
２ｍＬの１００％エタノール中に１５０ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０を含有するスラリーを調製した。１０ｍＬのＤＩ水に溶解した５０ｍｇのＤＬ−グリセルアルデヒドを含
有する溶液を、架橋剤溶液をスラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、ＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０溶液と混合した。生じる混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに注いだ。生じる反応混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で５時間回転した。インキュベーション期間の終了時に上清を除去し、そして残存するペレットを３５ｍＬのＤＩ水で洗浄しかつ７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じるペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、再懸濁しかつ７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。該結果は約３０ｍＬの軟質の透明ゲルであった。このゲルを、１５ｍＬの１００％エタノールに再懸濁すること、および１００００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により４回洗浄した。生じるペレットを、０．５ｍＬの酢酸溶液（ＤＩ水中１０％）と混合した３５ｍＬの１００％エタノール中に移し、そして該混合物を３７℃のインキュベーターに入れかつ２４時間回転した。インキュベーションの終了時に上清を除去した。残存する物質をＤＩ水で洗浄しかつ３７℃で１時間放置した。該サンプルをその後１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。生じるペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、振とうしかつ１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。該ペレットを、１８Ｇ、２０Ｇ、２２Ｇ、２５Ｇ、２７Ｇおよび３０Ｇ針を連続的に通過させることにより均質化し、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、振とうしかつ１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。該ペレットをシリンジに入れそして３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後に、該物質を複素粘度の測定のため試験した。
【０１９３】
実験０５／０２／２
該実験は、使用した架橋剤溶液が１０ｍＬのＤＩ水に溶解した１００ｍｇのＤ（−）−フルクトースを包含したことを除き、上の実験０５／０２／１で記述されたとおり実施した。第一のインキュベーション段階は４０ｍＬの軟質の透明ゲルを生じた。
【０１９４】
実験０５／０２／１および０５／０２／２で得られた最終的ペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１９５】
実験０５／１５／１
２ｍＬの１００％エタノール中の１５０ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩＩ  １５０のスラリーを調製した。架橋剤溶液は１０ｍＬのＤＩ水に溶解した１５０ｍｇのＤ（−）−フルクトースを包含した。
【０１９６】
ＡＦＨＡ  ＩＩＩ  １５０スラリーを、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  ＩＩＩ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより架橋剤溶液と混合した。生じる混合物を４０ｍＬの１００％エタノールに注いだ。該反応混合物をその後インキュベーターに入れ、そして３７℃で１２時間、およびその後室温で追加の２日間回転した。インキュベーションの終了時に上清を除去した。残存する物質を、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬのＤＩ水で洗浄しかつ８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。生じるペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した３０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、振とうしかつ１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。該サンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｒ）濾紙Ｎｏ．１１３（カタログ番号１１１３  ３２０）を使用して濾過した。濾過後、該サンプルを３７℃で３日間インキュベートしかつ試験した。該実験は約４．０ｍＬのわずかに不透明のゲルを生じた。実験０５／１５／１で得られた最終的ペレットについて測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１９７】
実験０５／１８／１
２ｍＬの１００％エタノール中の１５０ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩＩ  １５０のスラリーを調製した。架橋剤は７ｍＬのＤＩ水に溶解した１５０ｍｇのＤ（−）−フルクトースであった。該ＡＦＨＡ  ＩＩＩ  １５０スラリーを、架橋剤溶液をＡＦＨＡ  ＩＩＩ  １５０スラリーの下に入れること、およびボルテックス攪拌して均質な混合物を得ることにより、架橋剤溶液と混合した。該混合物を、０．５ｍＬの酢酸（ＤＩ水中１０％）と混合した４０ｍＬの１００％エタノールに注いだ。生じる混合物をインキュベーターに入れ、そして３７℃で１２時間、およびその後室温で追加の２日間回転した。インキュベーション後に上清を除去した。残存する物質を、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬのＤＩ水で洗浄しかつ８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。生じるペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した３０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、振とうしかつ１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。該サンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｒ）濾紙Ｎｏ．１１３を使用して濾過し、そして１８ゲージ針を通して押出すことにより均質化した。均質化後にサンプルを３７℃で３日間インキュベートした。生じるペレットについて測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０１９８】
実験シリーズ０５／２２／１−４
それぞれ２ｍＬの１００％エタノール中に７５ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＶ  １５０を含有する４種のスラリー（スラリー１〜４）を調製した。２種の異なる架橋剤溶液を、その後、後に続くとおり調製した。すなわち
Ａ．２２０ｍｇのＤ（−）−フルクトースを７ｍＬのＤＩ水に溶解した。
Ｂ．７ｍＬのＤＩ水中の１４０ｍｇのＤ（−）−フルクトース。
（それぞれ実験０５／２２／１および０５／２２／３の）サンプル１および３のＡＦＨＡ
ＩＶ  １５０スラリーをそれぞれ３．５ｍＬの架橋剤溶液Ａ．と混合し、また、（それぞれ実験０５／２２／２および０５／２２／４の）サンプル２および４のＡＦＨＡ  ＩＶ
１５０スラリーを３．５ｍＬの架橋剤溶液Ｂ．と混合した。
【０１９９】
全４サンプル中の混合は、均質な混合物を得るための継続的ボルテックス攪拌を伴いＡＦＨＡ  ＩＶ  １５０スラリーに架橋剤溶液を添加することにより実施した。
【０２００】
（それぞれ実験０５／２２／１および０５／２２／２の）サンプル番号１および２を２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化した。該４混合物のそれぞれを４０ｍＬの１００％エタノールに個別に注いだ。生じる４種の反応混合物をインキュベーターに入れかつ３７℃で２日間回転した。インキュベーション後に上清を除去した。生じるペレットをそれぞれ、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、そして３０００ｒｐｍ（遠心機：Ｋｕｂｏｔａ  ＫＳ−８０００、スイングバケットローターＲＳ  ３０００／６、ステンレス鋼製バケット５３５９２）で５分間遠心分離した。生じる４種のペレットをそれぞれ、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と混合した４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、振とうしかつ３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。生じる４種のペレットを３７℃で３日間インキュベートした。実験０５／２２／１、０５／２２／２、０５／２２／１および０５／２２／２の生じるペレットについて測定した複素粘度値、ならびに該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０２０１】
実験シリーズ０５／２３／１、２
２ｍＬの１００％エタノール中の７５ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＶ  １５０のスラリーを調製した。７０ｍｇのＤ（−）−フルクトースを５ｍＬのＤＩ水に溶解した。
【０２０２】
各ＡＦＨＡ  ＩＶ  １５０スラリーを、均質な混合物に達せさせるためのＡＦＨＡ  ＩＶ  １５０スラリーのボルテックス攪拌の間に架橋剤溶液を添加することにより、２．５ｍＬの架橋剤溶液と一体化した。
【０２０３】
サンプル番号２を２４０００ＲＰＭで０．５分間ｔｕｒｒａｘ均質化した。各混合物を４０ｍＬのエタノールに添加した。生じる混合物をインキュベーターに移しかつ３７℃で２日間回転した。その後上清を除去した。残存物を、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄しかつ３０００ｒｐｍ（遠心機：Ｋｕｂｏｔａ  ＫＳ−８０００、スイングバケットローターＲＳ  ３０００／６、ステンレス鋼製バケット５３５９２）で５分間遠心分離した。結果として生じるペレットを、２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）と一緒の４０ｍＬの生理学的ＮａＣｌ溶液で洗浄し、振とうしかつ３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。該サンプルをその後３７℃で３日間インキュベートした。生じるペレットについて測定した複素粘度値、および該ペレットのいくつかの観察された特徴の簡単な記述を下の表５に要約する。
【０２０４】
酵素的分解抵抗性アッセイ
分解抵抗性アッセイは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版：Ｍ．Ｆ．ＣｈａｐｌｉｎとＪ．Ｆ．Ｋｅｎｎｅｄｙ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、英国、１９９４、（ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３４４９−１Ｐ）ｐｐ．３２４（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところのヒアルロニダーゼ消化およびウロン酸／カルバゾールアッセイ法を使用して実施した。
【０２０５】
いくつかの上で開示された実験のヒアルロニダーゼ消化実験の結果を図１０に示す。２種の消化実験を実施した：
【０２０６】
１ａ）架橋ＨＡの消化
実験０５／０２／０２から生じる架橋アミノ機能性化ＨＡ（１ｍＬあたり２５．６ｍｇのＤ（−）−フルクトースで架橋したＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０の濃度を有する）のおよそ１００μＬの５サンプルを、それぞれ５００μＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）、および１０μＬのＤＩ水に溶解した１０単位のヒアルロニダーゼと混合した。全サンプルを３７℃でインキュベートした。正確なサンプル容量は下の表４Ａの第二列に示す。該サンプルを、消化を開始した後連続する１時間間隔でインキュベーションから取り出し、各取り出したサンプルを、物質を１分間ボルテックス攪拌すること、およびＨｅｒａｅｕｓ“ｂｉｏｆｕｇｅ  ｐｉｃｏ”遠心機（カタログ番号７５００３２８０、Ｈｅｒａｅｕｓ  ＃３３２５Ｂローターを使用する、遠心機およびローターはＫｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、独国から商業的に入手可能である）中１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより均質化した。２５μＬの生じる上清および２２５μＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）を使用してカルバゾールアッセイを実施した。架橋ＨＡ消化試験の結果を表４Ａに要約する。
【０２０７】
１ｂ）Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）ロット番号７５７６の消化
２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するおよそ１００μＬのＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット番号７５７６）の５サンプルを、それぞれ、５００μＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）、および１０μＬのＤＩ水に溶解した１０単位のヒアルロニダーゼと混合し、そして該サンプルを３７℃でインキュベートした。サンプルの正確な容量は下の表４Ｂの第二列に示す。該サンプルを、消化を開始した後連続する１時間間隔でインキュベーションから取り出した。取り出したサンプルのそれぞれを、該物質を１分間ボルテックス攪拌すること、および同一のＨｅｒａｅｕｓ“ｂｉｏｆｕｇｅ  ｐｉｃｏ”遠心機での１３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により均質化した。２５μＬの生じる上清および２２５μＬのＰＢＳ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３６）を使用してカルバゾールアッセイを実施した。カルバゾールアッセイ手順に従って、吸光度を各サンプルについて５２５ｎｍで測定した。
【０２０８】
実験０５／０２／０２からのＤ（−）−フルクトースで架橋したアミノ機能性化ＨＡマトリックスの例示的一サンプル、およびＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）の商業的に得られるサンプルのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒアルロニダーゼ分解に対する抵抗性％を消化時間（時間で）の関数として具体的に説明する図解のグラフである図１２に、今や参照がなされる。図１２のグラフの縦軸は、ヒアルロニダーゼ分解に対する抵抗性（開始ＨＡ量のパーセントで表す、時間０のＨＡの開始量からの指定された消化時間後に残存するＨＡの量）を表し、また、横軸は分解時間を時間で表す。図１２で、曲線７０は実験０５／０２／０２で得られるマトリックスの消化結果を表し、また、７２と標識された曲線はＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）（ロット番号７５７６）の消化結果を表す。図１２のグラフから、実験０５／０２／０２で製造したマトリックスは、Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）の試験した商業的サンプルの抵抗性よりはるかに優れているヒアルロニダーゼ分解に対する抵抗性を有することが見られうる。
【０２０９】
例えば、５時間の消化後に実際上全部のＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）が消化された一方、実験０５／０２／０２で製造したマトリックスのサンプルのおよそ６８％が未消化のままであった。Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）消化試験の結果もまた表４Ｂに要約する。
【０２１０】
【表６】
2009507103.tif 000008
【０２１１】
【表７】
2009507103.tif 000009
【０２１２】
【表８】
2009507103.tif 000010
【０２１３】
【表９】
2009507103.tif 000011
【０２１４】
【表１０】
2009507103.tif 000012
【０２１５】
実験０５／８２／１
１５０ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０を４４０ｍＬのＤＩ水に溶解し、そして該溶液を丸底フラスコに移した。１０ｍｇのＤ（−）−フルクトースを１０ｍＬの生理的食塩水に溶解した。生じる溶液を該ＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０溶液と混合し、そして生じる混合物を真空下でのフラスコの回転によりゆっくりと蒸発させた。濃縮した混合物（およそ２ｍＬ）を軽度真空下に３７℃で２日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に３０ｍＬの生理的食塩水をフラスコの内容物に添加し、そして真空なしで１時間回転した。生じるゲルを取り出し、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙（Ｎｏ．１１３）を通して濾過し、そして該ゲルを生理的食塩水で希釈することにより６ｍＬの最終容量にもたらした。該物質をその後１６Ｇ、１８Ｇ、２０Ｇ、２１Ｇおよび２２Ｇ針を通して連続して押出した。各押出段階を３回反復した。生じる粒子は帯黄色でありかつ堅固な粘度を有した。
【０２１６】
実験シリーズ０９／９５／１−４
実験０９／９５／１
合計量２００ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０を含有するＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の水性サンプルを調製した。１．２ｍＬの原線維状ブタコラーゲンの溶液（１６．５ｍｇ／ｍＬ）を該サンプルに添加した。１０ｍＬの生理的食塩水に溶解した１００ｍｇのＤ（−）−フルクトースをその後コラーゲン／ＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０混合物に添加した。生じる混合物を、タービンスターラー（ＩＫＡ（Ｒ）−Ｗｅｒｋｅ，ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．、独国から商業的に入手可能なモデルＲ  １３１２タービンスターラー）で８００ｒｐｍで１分間攪拌し、ステンレス鋼製トレイに移しかつ凍結乾燥した。凍結乾燥後にサンプルをエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ／ｖ）で覆いかつ３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後に該物質をエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ／ｖ）で３回洗浄し、サンプルを排出することにより溶媒を除去し、そして該サンプルを凍結乾燥により乾燥した。２ｍＬの生理的食塩水を凍結乾燥した物質に添加し、そして該混合物を３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、該サンプルを１６Ｇ針を通して押出し、４ｍＬの生理的食塩水を添加し、そして該物質を再度１８Ｇおよび２０Ｇ針を通して押出した。
【０２１７】
実験０９／９５／２
該実験は、使用したＤ（−）−フルクトースの量が１３０ｍｇであったことを除き、上の実験０９／９５／１について記述されたとおり実施した。
【０２１８】
実験０９／９５／３
該実験は、使用したＤ（−）−フルクトースの量が１６０ｍｇであったことを除き、上の実験０９／９５／１について記述されたとおり実施した。
【０２１９】
実験０９／９５／４
該実験は、使用したＤ（−）−フルクトースの量が１００ｍｇであり、かつ、コラーゲンを添加しなかったことを除き、上の実験０９／９５／１について記述されたとおり実施した（本実験は、コラーゲンを伴わず架橋したＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０の対照であった）。
【０２２０】
実験シリーズ０９／１０２／１−６
（２．８５ｍｇ／ｍＬ  ＤＩ水の濃度の）ＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０の水性溶液を、合計量３００ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０を含有するサンプルを調製するのに使用した。１．８ｍＬの原線維状コラーゲンの溶液（１６．５ｍｇコラーゲン／ｍＬ原線維化緩衝液の濃度を有する）を（それぞれ実験０９／１０２／２−５の）サンプル２〜５に添加した。１．８ｍＬの原線維化緩衝液を、コラーゲン溶液の代わりにサンプル１に添加した（コラーゲンを含まない対照−実験０９／１０２／１）。５．０ｍＬの生理的食塩水中のＤ（−）−フルクトースの溶液（生理的食塩水１ｍｌあたり４０ｍｇのＤ（−）−フルクトースの濃度を有する）を該６サンプルのそれぞれに添加し、そして該サンプルを混合した。全部の生じる反応混合物をタービンスターラーで８００ｒｐｍで１分間攪拌し；個別のステンレス鋼製トレイに移しかつ凍結乾燥した。凍結乾燥後に（それぞれ実験０９／１０２／１、０９／１０２／２および０９／１０２／３の）サンプル１、２および３をエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ：ｖ）で覆い、そして３７℃で６時間インキュベートした。（それぞれ実験０９／１０２／１、０９／１０２／２および０９／１０２／３の）サンプル１、２および３のそれぞれをエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ：ｖ）で３回洗浄し、サンプルを排出することにより溶媒を除去し、そして該サンプルを凍結乾燥により乾燥した。（それぞれ実験０９／１０２／４、０９／１０２／５および０９／１０２／６の）サンプル４、５および６は洗浄しなかった。
【０２２１】
２ｍＬの生理的食塩水をサンプル１〜６のそれぞれに添加し、そしてサンプルの全部を３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後に全サンプルを１６Ｇ針を通して１回押出した。４ｍＬの生理的食塩水を、押出したサンプルのそれぞれに添加し、そしてサンプルのそれぞれを、１８Ｇ針を通して１回および２０Ｇ針を通して１回連続して押出した。
【０２２２】
実験シリーズ０９／１０２／１−６の実験のそれぞれで使用した物質の詳細な量および反応条件を下の表６に示す。
【０２２３】
【表１１】
2009507103.tif 000013
【０２２４】
実験０９／１０２／１−６から生じるゲルのいくつかの特性を上の表５に示す。
実験シリーズ１１／４０／１、２
下述される実験１１／４０／１および１１／４０／２で使用されるキトサン基剤（ｂａｓｅ）は、ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、ノルウェー・オスロからＰｒｏｔａｓａｎ  ＵＰ  Ｂ  ８０／２００として商業的に入手可能である。
【０２２５】
実験１１／４０／１
３００ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０を含有するＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０の水性溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。０．１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ５−原線維化緩衝液を添加することにより調節した）に溶解した３０ｍｇのキトサンを含有する溶液、および１０ｍＬの生理的食塩水に溶解した３３０ｍｇのＤ（−）−フルクトースを、混合しながらＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０溶液に添加した。該混合物を、タービンスターラーを用いて８００ｒｐｍで１分間攪拌し、ステンレス鋼製トレイに移しかつ凍結乾燥した。凍結乾燥後にサンプルをエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ：ｖ）で覆いかつ３７℃で６時間インキュベートした。生じる物質をエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ：ｖ）で３回洗浄し、排出することにより溶媒を除去し、そして凍結乾燥によりサンプルを乾燥した。４ｍＬの生理的食塩水を凍結乾燥した物質に添加し、そして該物質を３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、サンプルを１６Ｇ針を通して押出し、８ｍＬの生理的食塩水を添加し、そして該混合物を再度１８Ｇ針および２０Ｇ針を通して連続して押出した。
【０２２６】
実験１１／４０／２
該実験は、ＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０溶液を、０．１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ５−原線維化緩衝液を添加することにより調節した）に溶解した６０ｍｇのキトサン、および１０ｍＬの生理的食塩水に溶解した３６０ｍｇのＤ（−）−フルクトースと混合したことを除き、上の実験１１／４０／１について記述されたとおり実施した。生じる物質は堅固な粘度および灰白色／黄色を有するゲルであった。
【０２２７】
実験シリーズ１１／４０／３−５
実験１１／４０／３
３００ｍｇのＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０を含有するＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０の水性溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。１．１ミリモル（２３７ｍｇ）のＤ（＋）−グルコサミン塩酸塩の溶液を１０ｍＬの生理的食塩水に溶解したを該水性ＡＦＨＡ  ＩＩ  １５０溶液と混合した。該混合物をタービンスターラーを用いて８００ｒｐｍで１分間攪拌し、ステンレス鋼製トレイに移しかつ凍結乾燥した。凍結乾燥後に、該サンプルをエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ：ｖ）で覆いかつ３７℃で６時間インキュベートした。生じる物質をエタノール／ＤＩ水混合物（９０：１０  ｖ：ｖ）で３回洗浄し、排出することにより溶媒を除去しかつサンプルを凍結乾燥により乾燥した。４ｍＬの生理的食塩水を凍結乾燥した物質に添加し、そして該物質を３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、サンプルを１６Ｇ針を通して押出し、８ｍＬの生理的食塩水を添加し、そして、該混合物を再度１８Ｇ針および２０Ｇ針を通して連続して押出した。生じる物質は堅固な粘度および灰白色／黄色を有するゲルであった。
【０２２８】
実験１１／４０／４
該実験は、使用した還元糖が（グルコサミン塩酸塩の代わりに）３９６ｍｇ（１．１ミリモル）のマルトース一水和物であったことを除き、上の実験１１／４０／３について記述されたとおり実施した。生じる物質は、堅固な粘度および灰白色／黄色を有するゲルであった。
【０２２９】
実験１１／４０／５
該実験は、使用した還元糖が（Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩の代わりに）３９６ｍｇ（１．１ミリモル）のＤ（＋）−ラクトース一水和物であったことを除き、上の実験１１／４０／３について記述されたとおり実施した。生じる物質は、堅固な粘度および灰白色／黄色を有するゲルであった。
【０２３０】
制限された数の還元糖の型を上で開示される例示的実験で使用した一方、多くの他の型の還元糖および／若しくは還元糖の誘導体を、本発明の架橋マトリックスを製造するための架橋剤として使用しうることが指摘される。こうした還元糖は、限定されるものでないが、アルドース、ケトース、二炭糖、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖、八炭糖、九炭糖、十炭糖、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、フルクトース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、還元単糖、還元二糖、還元三糖、還元オリゴ糖、マルトース、ラクトース、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ツラノース、トレハロース、イソマルトース、ラミナリビオース、マンノビオースおよびキシロビオース。グリセルアルデヒド、リボース、エリトロース、アラビノース、ソルボース、フルクトース、グルコース、およびそれらの組合せを挙げることができる。
【０２３１】
本発明の架橋マトリックスを作成するのに使用しうる他の型の還元糖は、とりわけ、米国特許第５，９５５，４３８号、同第６，３４６，５１５号および同第６，６８２，７６０号明細書、ならびに公開国際特許出願第ＷＯ  ２００３／０４９６６９号明細書（全部のものは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に全部組み込まれる）に開示される還元糖および還元糖誘導体である。
【０２３２】
本発明の一態様により、適する還元糖誘導体もまた本発明のマトリックスの架橋に使用しうることがさらに指摘され、こうした誘導体は、限定されるものでないがＤ−リボース−５−リン酸、グルコサミン、および当該技術分野で既知のいずれかの他の型の他の還元糖誘導体を挙げることができる。上の還元糖およびそれらの誘導体のいずれかのエステルおよび塩もまた、単独で若しくは上に開示される還元糖型とのいずれかの適する組合せで
使用しうる。
【０２３３】
本発明の付加的な態様により、使用される還元糖（１種若しくは複数）は右旋性、左旋性、ならびに右旋性および左旋性の形態の混合物でありうることがなおさらに指摘される。１種若しくはそれ以上の還元糖のラセミ混合物もまた使用しうる。加えて、多様な光学活性の異性体の形態（鏡像異性体）ならびに／若しくはそれらのいずれかの混合物および組合せを包含する、１個若しくはそれ以上の非対称（キラル）炭素原子を含有するいかなる還元糖もまた、本発明の方法およびマトリックスで使用しうる。
【０２３４】
本発明の付加的な一態様により、アミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖、ならびに／または多様なアミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖のいずれかの混合物、ならびに／あるいはアミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖の１種若しくはそれ以上のタンパク質（ならびにまたはいずれかの所望の添加物）とのいずれかの混合物を架橋するのに１種以上の還元糖を使用しうることが当業者により認識されるであろう。例えば、制限しない一例により、ＡＨＦＡ  Ｉ  １５０はＤ（−）−リボースおよびＤ（＋）−ソルボースの混合物として架橋しうる。同様に、本発明の別の態様により、キトサンおよびＡＨＦＡ  Ｉ  １５０の混合物は、マルトース、グルコースおよびフルクトースを含有する混合物中で架橋しうる。なお別の例示的態様において、ＡＨＦＡ、コラーゲンおよびヘパリンの混合物を、リボース、グルコサミンおよびＤ−リボース−５−リン酸を包含する架橋剤の混合物で架橋しうる。これらの態様は例としてのみ示され、そして、使用される多糖の数および型、ならびに架橋反応混合物に包含される還元糖の数および型を変化させることにより、多くの他の変形および改変が可能である。
【０２３５】
上に開示される特定の架橋反応は制限された例示的範囲の溶媒および溶媒混合物を利用する一方で、本発明の架橋反応で使用される溶媒系で多くの改変および変形がなされうることが当業者により認識されるであろう。従って、本発明のマトリックスを形成するのに使用される架橋反応は、水性溶液、緩衝水性溶液、水および／若しくは水性緩衝溶液ならびに１種若しくはそれ以上の有機溶媒を包含する溶液、１種若しくはそれ以上の非水性溶媒を包含する非水性溶液などで実施しうる。上に開示される実際の実験から見られうるとおり、使用される非水性溶媒は極性および／若しくは親水性および／若しくは水と混合可能な溶媒でありうるが、しかし、多様な異なる非極性、非疎水性および水と実質的に混合可能でない溶媒（１種若しくは複数）もまた包含しうる。原則として、いずれかの溶媒若しくは溶媒の組合せを包含するいずれの型の溶媒系も本発明の架橋反応を実施するのに使用しうるが、但し、合理的な注意を溶媒の選択で使用する。
【０２３６】
例えば、溶媒は、好ましくは（しかし義務的にでなく）、（いかなる妨害する副反応も有害でないか、または実際に耐えられ得る若しくはなお望ましい場合を除き）架橋反応に悪影響を及ぼしうる若しくはそれらを妨害しうる過度に化学反応性の基若しくは部分を含有すべきでない。同様に、アミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖と一緒に架橋されているいかなるタンパク質および／若しくはポリペプチドの望ましくない変性も回避するのに使用する溶媒（１種若しくは複数）の型の選択に注意を払うべきである。こうした予防措置を念頭に置けば、ほぼいかなる型の溶媒若しくは溶媒混合物若しくは溶媒系も、本発明の架橋反応を実施するのに使用しうる。
【０２３７】
従って、本発明のマトリックスは、アミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖、ならびに／または多様なアミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖のいずれかの混合物、ならびに／またはアミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖の１種若しくはそれ以上のタンパク質とのいずれかの混合物のいずれかの適する組合せを、還元糖および／若しくは還元糖誘導体のいずれかの所望の組合せで架橋することにより形成しうる。全部のこうした組合せおよび変更は本発明の範囲内にあると考えられる。こうした多様な組
合せの使用は、いずれかの所望の応用にマトリックスを適合させるために、生じる架橋マトリックスの化学および／若しくは物理および／若しくは流動学的および／若しくは生物学的特性の微調整に有利に使用しうる。生じるマトリックスの特性は、従って、とりわけ、使用されるアミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖の数および特性、使用されるタンパク質の数および型（使用される場合）、架橋する還元糖の数および型、ならびに該マトリックスに包含されるいずれかの他の添加物の特性に依存しうる。マトリックスの特性は、とりわけ、反応条件、反応温度、ｐＨ、使用される溶媒（１種若しくは複数）の型、および反応混合物中に存在しかつ／若しくは架橋後に該マトリックスに添加されるいずれかの添加物の存在若しくは非存在によってもまた影響されうることもまた指摘される。
【０２３８】
架橋反応混合物中で使用される溶媒（１種若しくは複数）は、（限定されるものでないが、実験０９／９５／１および実験０９／１０２／１−６の生理的食塩水溶液中で使用されるＮａＣｌ、若しくは実験２、１２／１および３７／１−３ならびに上で詳細に開示されたところの他の実験で使用されるＰＢＳを挙げることができる）最低１種のイオン化可能な塩を包含しうることが指摘される。イオン化可能な塩（１種若しくは複数）は前記溶液のイオン強度を制御するために有用であることができ、そして、タンパク質が反応溶液のイオン強度に感受性である場合にタンパク質を包含する混成マトリックス形成方法の実施において有利でありうる。当該技術分野で既知のいずれかの適するイオン化可能な塩（１種若しくは複数）を使用して、当該技術分野で公知であるとおり反応溶液のイオン強度を制御しうることが指摘される。使用しうるイオン化可能な塩のいくつかの制限しない例は、当該技術分野で既知であるところの、多様なアルカリ金属塩、アルカリ金属ハロゲン化物、多様な異なる金属硫酸塩および／若しくはリン酸塩、多様な異なるアンモニウム塩などを包含する。しかしながら、当該技術分野で既知のいずれかの他の適する型のイオン化可能な塩（１種若しくは複数）もまた、本発明の架橋反応で使用しうる。
【０２３９】
上述された新規架橋反応の生成物を、多様な異なる架橋多糖に基づくマトリックスおよび多糖／タンパク質に基づく混成マトリックスを得るのに使用しうることが指摘される。こうしたマトリックスは、いずれかの所望の形状の固体の形態のマトリックス、ならびに／若しくは限定されるものでないが、いずれかの所望の大きさおよび形状のマトリックス粒子、マイクロスフェア、ミクロ粒子の注入可能なおよび注入可能でない懸濁液を挙げることができるいずれかの形態の注入可能な製剤として得ることができるか、あるいはそれらを提供するように（こうしたマトリックスから固形若しくは半固形物品を形成するための型および／若しくは圧縮ならびに／または乾燥および／若しくは凍結乾燥の適する使用、ならびに／あるいは当該技術分野で既知のいずれかの他の方法により）適して加工しうる。固体の形態のマトリックスは、限定されるものでないが、シート、チューブ、膜、スポンジ、フレーク、ゲル、ビーズ、ミクロスフェア、ミクロ粒子、ならびに、本発明の糖化方法を使用して架橋することにより得られうる（限定されるものでないが多糖／タンパク質混成マトリックスを挙げることができる）上で開示された多糖に基づくマトリックス型のいずれかから作成される他の関係する幾何学的形態を挙げることができる。
【０２４０】
（糖で架橋された多糖および糖で架橋された混成タンパク質／多糖マトリックス双方を包含する）上述された新規架橋反応の生成物は、該架橋マトリックスをさらなる処理および／または１種若しくはそれ以上の加工段階にかけることにより、さらに加工かつ／若しくは処理かつ／若しくは改変しうることが指摘される。こうした処理および／若しくは改変は、限定されるものでないが、乾燥、凍結乾燥、脱水、臨界点乾燥、（造形された物品を形成するための）型での成型、滅菌、（マトリックスの流動特性および注入可能性を改変若しくは改良するための）均質化、（流動学的特性および注入の容易さを改変するための）機械的剪断、（滅菌の目的上および／若しくは付加的な架橋を実施するためおよび／若しくは他の目的上の）電離放射線による照射、（滅菌の目的上および／若しくは付加的
な架橋を実施するためおよび／若しくは他の目的上の）電磁放射線による照射、（例えば組織の嵩増しおよび／若しくは組織増強ならびに／または他の目的上注入可能な製剤を形成するためのような）製薬学的に許容できるベヒクルとの混合、熱的手段（オートクレーブ処理など）による滅菌、（限定されるものでないが過酸化水素、オゾン、エチレンオキサイドなどを使用する滅菌を挙げることができる）化学的手段による滅菌、添加物での含浸、ならびに／あるいはこうした加工段階のいずれかの組合せを挙げることができる。
【０２４１】
さらに、上で開示される付加的な処理若しくは加工段階のいずれかの適する組合せを、本明細書に開示される新規の糖で架橋されたマトリックスのいずれかの所望の改変かつ／若しくは乾燥かつ若しくは造形された物品および／若しくは製剤を提供するために、いずれかの適する順序で使用しうる。全部の上述された処理方法は当該技術分野で公知であり、そして従って下で詳述されない。
【０２４２】
本発明の混成マトリックスはいずれかの特定の型のコラーゲンの使用に制限されないことがさらに指摘される。むしろ、限定されるものでないが、天然のコラーゲン、線維性コラーゲン、線維性アテロペプチドコラーゲン、テロペプチド含有コラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、動物供給源から得られたコラーゲン、ヒトコラーゲン、哺乳動物コラーゲン、組換えコラーゲン、ペプシン処理コラーゲン、再構成コラーゲン、ウシアテロペプチドコラーゲン、ブタアテロペプチドコラーゲン、脊椎動物種から得られたコラーゲン、組換えコラーゲン、遺伝子的に工作若しくは改変されたコラーゲン、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩおよびＸＸＶＩ型線維付随性コラーゲン、ＶＩＩＩおよびＸ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＶ型コラーゲン、ＸＶおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲン、遺伝子的に改変された真核生物若しくは原核生物細胞または遺伝子的に改変された生物体により製造される人工的に製造したコラーゲン、精製されたコラーゲンおよび再構成された精製されたコラーゲン、線維性コラーゲンの粒子、線維性再構成アテロペプチドコラーゲン、遺伝子的に改変された真核生物若しくは原核生物細胞または遺伝子的に改変された生物体により製造される人工的に製造したコラーゲン、精製されたコラーゲンおよび再構成された精製されたコラーゲン、線維性コラーゲンの粒子、線維性再構成アテロペプチドコラーゲン、細胞培地から精製されたコラーゲン、遺伝子的に工作された植物由来のコラーゲン、コラーゲンのフラグメント、プロトコラーゲン、ならびに上で列挙されたコラーゲン型のいずれかの組合せを挙げることができる、いかなる所望の型のコラーゲンも、上で開示されるところの本発明の混成マトリックスの形成において使用しうる。
【０２４３】
本出願で開示される混成マトリックスが、上で実験的に示されたところのコラーゲンおよびチトクロームＣの使用に制限されないことが、当業者により認識されるであろう。むしろ、本発明の混成マトリックスは、アミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖に加え、１種若しくはそれ以上の還元糖架橋剤および／若しくは還元糖誘導体架橋剤によりアミノ多糖および／若しくはアミノ機能性化多糖に架橋可能であるいずれかの適する型のタンパク質（１種若しくは複数）および／またはポリペプチド（天然若しくは合成の）を包含するマトリックスを包含しうる。こうした架橋可能なタンパク質若しくはポリペプチドは、限定されるものでないが、コラーゲン、コラーゲンスーパーファミリー、細胞外マトリックスタンパク質、酵素、構造タンパク質、血液由来タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、天然のタンパク質、合成タンパク質、ホルモン、成長因子、軟骨成長を促進するタンパク質、骨成長を促進するタンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜タンパク質、エラスチン、フィブリン、フィブリノーゲンから選択されるタンパク質、およびそれらの多様な異なる組合せを挙げることができる。
【０２４４】
本発明の一局面により、本発明の架橋多糖マトリックスは、適する製薬学的添加物およ
び／若しくは製薬学的に許容できるベヒクル（１種若しくは複数）を含む若しくは含まない、適する注入可能な製剤に処方しうる。こうした注入可能な製剤は（適する針を伴う若しくは伴わない）適するシリンジ中に包装しうる。こうした充填済の滅菌済シリンジは、限定されるものでないが皺襞平滑化の応用、組織増強、組織の嵩増しなどを挙げることができる多様な美顔的および医学的応用で有用でありうる。
【０２４５】
本発明の付加的な一態様により、本発明のマトリックスは、限定されるものでないが、医薬品、薬物、タンパク質、ポリペプチド、麻酔薬、抗菌薬（ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗菌薬（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗ウイルス薬、抗真菌薬（ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗真菌薬（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗炎症薬、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、多様な細胞外マトリックス成分、ホルモン、成長因子、トランスフォーミング因子、受容体若しくは受容体複合体、天然のポリマー、合成ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、薬物、治療薬、抗炎症薬、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質糖タンパク質、ムコタンパク質、ムコ多糖、マトリックスタンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症剤、タンパク質、ペプチド、ホルモン、遺伝子治療のための遺伝物質、核酸、化学修飾核酸、オリゴヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、遺伝子、遺伝子の一部、天然若しくは人工的に製造されるオリゴヌクレオチドを包含する組成物、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細胞取り込みおよび転写を促進するのに必要とされるウイルスおよびウイルス以外のベクター、グリコサミノグリカン、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、レシチン豊富な間質プロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、アグリカン、シンデカン、β−グリカン、バーシカン、セントログリカン、セルグリシン、フィブロネクチン、フィブログリカン、コンドロアドヘリン、ｆｉｂｕｌｉｎ、トロンボスポンジン−５、酵素、酵素阻害剤、抗体を挙げることができる剤および物質で、ならびに、上の物質および／または当該技術分野で既知のいずれかの他の型の特性を改変する剤若しくは物質のいずれかの組合せにより、化学的かつ／若しくは物理的かつ／若しくは生物学的に改変しうる。加えて、若しくは、あるいは、剤（１種若しくは複数）または物質（１種若しくは複数）は架橋前に反応混合物に添加することができ、そして、該架橋反応をその後、該剤（１種若しくは複数）または物質（１種若しくは複数）を形成された架橋マトリックス内に組み込みかつ／若しくは架橋して該マトリックスの特性を変えるように、該剤（１種若しくは複数）または物質（１種若しくは複数）の存在下で実施しうる。
【０２４６】
こうした添加された物質は、当該技術分野で公知であるところのいずれかの適する架橋剤により多糖マトリックスに共有結合しうる。あるいは、若しくは加えて、こうした改変物質は、本明細書に記述される架橋過程の間に反応混合物中に包含されることができ、そして従って、架橋多糖に基づくマトリックス若しくは混成マトリックス内に捕捉されうるか若しくはそれらに組み込まれうる。
【０２４７】
本明細書に記述される架橋マトリックスは、当該技術分野で既知のいずれかの化学的若しくは生物学的修飾剤に該マトリックスをさらすことによりさらに改変されうることが、当業者により認識されるであろう。例えば、限定されるものでないが、架橋後に架橋されたマトリックス成分上に残存するアミノ基および若しくは／カルボキシ基、ならびに／またはヒドロキシル基を挙げることができる遊離官能基のいくつか若しくは全部を、マトリックス特性をさらに制御するために、（限定されるものでないがアミノ基および／若しくはカルボキシ基、ならびに／またはヒドロキシ基および／若しくはニトロ基、ならびに／またはクロロおよび／若しくはブロモおよび／若しくはヨード基、ならびに／またはペルオキソ基および／若しくはペリオド基および／若しくはペルクロロ基、ならびに／または同様のいずれかの他の化学基および／若しくは化学的部分を挙げることができる）他の化学基若しくは部分を化学的に導入してこうした基をさらに改変するように、化学的に若しくは酵素で処理しうる。こうした可能な架橋後修飾の例は、限定されるものでないが、架橋マトリックスの多糖バックボーンまたは混成マトリックスのいずれかの包含される架橋されたタンパク質若しくはポリペプチドのタンパク質バックボーン上に存在する遊離ヒドロキシル若しくはカルボキシ基のエステル化、多糖若しくはポリペプチドバックボーン上のいずれかの遊離アミノ基のアセチル化、あるいは当該技術分野で既知のいずれかの他の型の官能基の化学若しくは酵素的修飾反応を挙げることができる。こうした修飾の化学は当該技術分野で公知であり、そして従って下で詳細に開示されない。
【０２４８】
こうした官能基修飾は、マトリックスを特定の所望の応用に適合させるために（限定されるものでないが疎水性、親水性、多様な選択されたｐＨレベルでの正味電荷、マトリックスの多孔性、マトリックスの水吸収能力、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的分解に対する抵抗性などを挙げることができる）マトリックスの特性をさらに改変かつ微調整するのに有用でありうる。修飾されているマトリックスを、生物適合性を必要とする用途に意図している場合は、十分な程度の生物適合性を確保するために、修飾されている化学基の選択、および該マトリックスの構造に導入されているいずれかの化学基の性質に注意を払うべきであることを念頭に置くべきである。しかしながら、高い程度の生物適合性を必要としないマトリックスの他の応用においては、上に列挙された基および（限定されるものでないがアゾ基、アジド基ニトロソ基などを挙げることができる）当該技術分野で既知のいずれかの他の化学基の多くを、該マトリックスの構造および特性のさらなる改変を提供するために該マトリックスの構造に導入しうる。
【０２４９】
本発明のマトリックスの付加的な一態様により、上述された若しくは本明細書に開示される方法を使用して製造した架橋マトリックスのいずれにも生存細胞を添加しうる。生存細胞は、該マトリックス中に包含された若しくは埋め込まれた１個若しくはそれ以上の生存細胞を含有する架橋マトリックスを形成するために、架橋の間若しくは後に添加しうる。
【０２５０】
本発明のマトリックスの付加的な一態様により、マトリックスに包含される生存細胞は、脊椎動物軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脊椎動物幹細胞、胚性幹細胞、成体組織由来幹細胞、脊椎動物前駆細胞、脊椎動物線維芽細胞、マトリックスタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症剤、タンパク質、ホルモン、ペプチドの１種若しくはそれ以上を分泌するよう遺伝子的に工作された細胞、タンパク質、ペプチド、ホルモン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、成長因子、転写因子、抗炎症剤、糖タンパク質、ムコタンパク質およびムコ多糖よりなる群から選択される１種若しくはそれ以上の分子に対する受容体を発現するよう工作された１種若しくはそれ以上の型の生存細胞でありうる。数種の型の異なる細胞の組合せもまた本発明のマトリックスに包含しうる。
【０２５１】
本発明の多様な態様により、本出願の方法により得られる架橋多糖に基づくマトリックスは、限定されるものでないが、（ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの応用のための）組織工学で使用可能なマトリックス足場構造、医薬品および生物製剤（生物学的に活性のタンパク質、遺伝子、遺伝子ベクターなど）のための制御送達系、誘導される組織および骨再生のための膜、（限定されるものでないが皺襞充填ならびに他の美顔的および審美的目的上の注入可能な製剤を挙げることができる）組織増強および／若しくは美顔的使用のための注入可能かつ／若しくは埋植可能な嵩増し剤および／若しくはプロテーゼ装置、天然のおよび／若しくは再構成および／若しくは人工臓器を固定するための包被、限定されるものでないが人工乳房を挙げることができる人工組織若しくは臓器の製造のための増量材料を挙げることができる多様な応用での、ならびに、他の天然若しくは人工ポリ
マー構造、材料および／若しくはマトリックス、あるいは他の天然の若しくは合成の有機および無機化合物ならびに／若しくはポリマー、ならびに／または上の物質の全部の組合せと組合せた本発明の架橋多糖を含んでなる混成材料の成分としての使用に適しうる。
【０２５２】
上で開示された反応およびサンプル調製の多くで使用される緩衝液はリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）であった一方、これは本発明を実施するための義務では決してないことが、当業者により認識されるであろう。従って、多くの異なる型の緩衝液ならびに若しくは緩衝溶液および緩衝溶媒を、本発明の多糖に基づくマトリックスおよび／若しくは多糖／タンパク質に基づく混成マトリックスを製造するための材料製造手順および／若しくは架橋反応を実施するのに使用しうる。例えば、本発明の製造法および架橋反応で使用しうる他の例示的緩衝剤は、限定されるものでないが、クエン酸／クエン酸緩衝剤、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および当該技術分野で既知の多くの他の型の緩衝剤を挙げることができる。しかしながら、上述される架橋反応を妨害しうる活性化学基若しくは部分を該緩衝剤が包含しないことを確実にするために、緩衝剤の組成の選択（使用する場合）に注意を払うべきである。こうした緩衝剤、および使用のためのそれらの選択の考慮は当該技術分野で公知であり、そして文献に広範囲に記述され、そして従って本明細書で詳細に開示されない。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
本発明を理解しかつそれが実務においてどのように実施されうるかを理解するために、いくつかの好ましい態様を、制限しない例としてのみ、付随する図面を参照して今や記述することができる。
【図１】本発明の方法の一態様により得られた、破線曲線により表されるアミノ機能性化ヒアルロン酸（ＡＦＨＡ）および実線曲線により表されるＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したＡＦＨＡのＵＶ−可視スペクトルを表す図解のグラフである。
【図２】本発明の方法の態様により得られた、破線曲線により表されるＤ（−）−リボースで架橋したＡＦＨＡ、実線曲線により表されるＤ（−）−エリトロースで架橋したＡＦＨＡ、および点線曲線により表されるＤ（−）−アラビノースで架橋したＡＦＨＡのＵＶ−可視スペクトルを表す図解のグラフである。
【図３】本発明の方法の態様により得られた、実線曲線により表される架橋されていないキトサン、破線曲線により表されるＤ（−）−リボースで架橋したキトサン、および点線曲線により表されるＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサンのＵＶ−可視スペクトルを表す図解のグラフである。
【図４】本発明の方法の態様による、点線曲線により表されるヒアルロン酸、破線曲線により表されるＡＦＨＡ、および実線曲線により表されるＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したＡＦＨＡのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを表す図解のグラフである。
【図５−７】数種の商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づくマトリックスの流動学的特性と比較した、本発明の方法の態様による、多様な異なるＤＬ−グリセルアルデヒド濃度で多様な時間架橋したＡＦＨＡに基づく多糖の６種の異なる組成物の流動学的特性の測定の結果を具体的に説明する図解のグラフである。
【図８】本発明の一態様による、多様な異なる濃度のＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したアミノ機能性化ＨＡの膨潤挙動を測定することの結果を具体的に説明する図解のグラフである。
【図９】本発明の一態様よる、多様な異なる濃度のＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したキトサンの膨潤挙動を測定することの結果を具体的に説明する図解のグラフである。
【図１０】ＤＬ−グリセルアルデヒドで架橋したアミノ機能性化ＨＡおよび商業的に得られるＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）のヒアルロニダーゼによる消化のカルバゾールアッセイの結果を具体的に説明する図解のグラフである。
【図１１】Ｐｅｒｌａｎｅ（Ｒ）試験サンプルの１０倍希釈について補償するためにＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）の吸光度値を１０により乗算した、図１０のカルバゾールアッセイの結果を具体的に説明する図解のグラフである。
【図１２】Ｄ（−）−フルクトースで架橋したアミノ機能性化ＨＡマトリックスの例示的一サンプルおよびＰｅｒｌａｎｅ（Ｒ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒアルロニダーゼ消化に対する抵抗性％を消化時間の関数として具体的に説明する図解のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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