(57)【要約】  本発明は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、および、特にＢＰＨに誘導される膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）に起因する刺激性症状を含む泌尿器系障害の処置用の、ＰＤＥ−５およびＰＤＥ−４阻害剤を単独でまたは組み合わせて含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、該泌尿器系障害の処置用の医薬の製造において、単独でまたは組み合わせて使用するための、そのようなＰＤＥ−５およびＰＤＥ−４阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
2009509984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置における治療剤として有用なＰＤＥ５阻害剤のスクリーニング方法であって、ｉ）試験化合物をＰＤＥ５ポリペプチドと接触させる、ｉｉ）試験化合物の一定の濃度下で、または該試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｉｉ）該試験化合物の異なる濃度下で該ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｖ）ＰＤＥ−５ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の化合物を選択する、の各段階を含む方法。
【請求項２】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置における治療剤として有用なＰＤＥ４阻害剤のスクリーニング方法であって、ｉ）試験化合物をＰＤＥ４ポリペプチドと接触させる、ｉｉ）試験化合物の一定の濃度下で、または該試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｉｉｉ）該試験化合物の異なる濃度下で該ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｉｖ）ＰＤＥ−４ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の化合物を選択する、の各段階を含む方法。
【請求項３】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置における治療剤として有用なＰＤＥ５阻害剤およびＰＤＥ４阻害剤の組合せのスクリーニング方法であって、ｉ）第１の試験化合物をＰＤＥ５ポリペプチドと接触させる、ｉｉ）第１の試験化合物の一定の濃度下で、または該第１の試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｉｉ）該第１の試験化合物の異なる濃度下でＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｖ）ＰＤＥ−５ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の第１の化合物を選択する、ｖ）第２の試験化合物をＰＤＥ４ポリペプチドと接触させる、ｖｉ）第２の試験化合物の一定の濃度下で、または該第２の試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｖｉｉ）該第２の試験化合物の異なる濃度下でＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｖｉｉ）ＰＤＥ−４ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の第２の化合物を選択する、ｖｉｉ）ＰＤＥ５阻害活性を有する少なくとも１種の化合物を、ＰＤＥ４阻害活性を有する少なくとも１種の化合物と組み合わせる、の各段階を含む方法。
【請求項４】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、請求項４および請求項５に記載の治療剤の組合せである治療剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、バルデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、アバナフィル、ＳＬｘ２１０１およびＬＡＳ３４１７９からなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−５阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ＰＤＥ５阻害剤の使用。
【請求項９】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ＰＤＥ４阻害剤の使用。
【請求項１０】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、少なくとも１種のＰＤＥ４阻害剤および少なくとも１種のＰＤＥ５阻害剤の組合せの使用。
【請求項１１】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ＰＤＥ４ポリペプチドおよびＰＤＥ５ポリペプチドの阻害剤である物質の使用。
【請求項１２】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、バルデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、アバナフィル、ＳＬｘ２１０１およびＬＡＳ３４１７９からなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−５阻害剤の使用。
【請求項１３】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ロフルミラスト、シロミラストおよびピクラミラストからなるＰＤＥ−４阻害剤の群から選択される少なくとも１種のＰＤＥ−４阻害剤、並びに、バルデナフィル、シルデナフィルおよびタダラフィルからなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択される少なくとも１種のＰＤＥ−５阻害剤の組合せの使用。
【請求項１４】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症および閉塞性尿路疾患を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、バルデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、アバナフィル、ＳＬｘ２１０１およびＬＡＳ３４１７９の群から選択される少なくとも１種の化合物、または、その塩、水和物または塩の水和物を含有する医薬組成物。
【請求項１５】
神経因性膀胱、過活動膀胱および間質性膀胱炎の処置のための、バルデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、アバナフィル、ＳＬｘ２１０１およびＬＡＳ３４１７９の群から選択される少なくとも１種の化合物、または、その塩、水和物または塩の水和物を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
神経因性膀胱、過活動膀胱および間質性膀胱炎の処置のための、バルデナフィルまたはその塩、水和物または塩の水和物を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
神経因性膀胱、過活動膀胱および間質性膀胱炎の処置用の医薬組成物を製造するための、バルデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ダサンタフィル、アバナフィル、ＳＬｘ２１０１およびＬＡＳ３４１７９の群から選択される少なくとも１種の化合物、または、その塩、水和物または塩の水和物の使用。
【請求項１８】
神経因性膀胱、過活動膀胱および間質性膀胱炎の処置用の医薬組成物を製造するための、バルデナフィルまたはその塩、水和物または水和物の塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）およびＰＤＥ阻害剤の薬理に関する。より具体的には、本発明はＰＤＥ−５およびＰＤＥ−４阻害剤並びに泌尿器系障害の処置用医薬を製造するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）に至る良性前立腺肥大（ＢＰＨ）は、男性に非常に一般的な新生物である。５０歳以上の男性の約８０％が、遅い尿流および尿閉を伴う排尿頻度の増加、夜間尿および尿意切迫を含む中度ないし重度の症状を有すると推定される。従って、ＢＰＨは、西洋諸国において重大な健康管理問題としてますます認識されている (Guess 1995）。前立腺の外科手術（全ＢＰＨ患者の２０％）の他に、この疾患の一般的な処置は、５−アルファレダクターゼ阻害剤（フィナステリド）およびアルファ遮断薬（タムスロシン、ドキサゾシン、テラゾシン、アルフゾシン）を含む（Truss 2001）。５−アルファレダクターゼ阻害剤は、ＢＰＨの機械的成分に影響を及ぼし、前立腺組織の増殖を阻害する。アルファ遮断薬は、動的成分に影響を及ぼし、前立腺の平滑筋の弛緩を介してＢＰＨの刺激性症状を低減させ、それは、尿道の抵抗性を低減させる。さらに、アルファ−遮断薬は、膀胱の平滑筋細胞を直接弛緩させ、膀胱の非排尿性収縮を減少させ得る。しかしながら、これらの処置選択肢は、全て、限定された効力および／または好ましくない副作用プロフィールを有する（Carbone 2003）。従って、様々な試みが、前立腺間質の増殖を阻害するか、または、前立腺および膀胱の平滑筋の緊張を低下させる新しい治療選択肢に焦点を当ててきた。これには、即ち、アロマターゼ阻害剤（Sciarra 2000）、増殖因子のアンタゴニスト（Desgrandchamps 1997）、カリウムチャネル開口薬（Gopalakrishnan 2004）およびエンドセリンアンタゴニスト（Andersson 2002）が含まれる。
【０００３】
環状ヌクレオチドｃＡＭＰおよびｃＧＭＰが平滑筋の緊張を低減できることも、十分に確立されている（Drescher 1994）。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、各々アデニル酸およびグアニル酸シクラーゼにより、それらの対応するヌクレオシド三リン酸から合成される。それらは、細胞内ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルを非常に効果的に調節する環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）により分解される。現在までに、１１種の異なるＰＤＥファミリーのメンバーが同定され、それらは構造、調節およびそれらの基質に対する特異性において異なる（Soderling 2000）。泌尿器系障害の処置に対するＰＤＥの役割は、不十分にしか理解されておらず、ＰＤＥアイソフォームの特徴解析は、他の系より遅れ、文献の多くは新しく同定されたＰＤＥの同定に先立ち公開された。ＰＤＥは、下部尿路、即ち、膀胱、尿道および前立腺組織で発現されるが、全ＰＤＥイソ遺伝子のｍＲＮＡ発現データおよび直接比較は、依然として欠けているか、または矛盾している。非特異的ＰＤＥ阻害が、ヒトの前立腺組織を弛緩させ得るといういくつかの証拠がある（Drescher 1994）。ＰＤＥ−５阻害の効果についてのデータは、非常に限られている。ＰＤＥ−６、−９および−１１も阻害するＰＤＥ−５阻害剤のザプリナストは、予め収縮したヒト前立腺組織をインビトロで弛緩させ得るが（Ueckert 2001）、この組織内の他のＰＤＥファミリーの役割は決定される必要があることが示された。膀胱内で、ＩＢＭＸ（ＰＤＥ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−１０および−１１の阻害）による様々なＰＤＥの非特異的遮断は、メスのモルモットの膀胱を弛緩させ得たが、ザプリナストは無効であった（Gillespie 2004）。これらの矛盾する知見にも拘わらず、海綿体の弛緩および勃起不全の処置におけるＰＤＥ−５の役割は周知であり、市場には既に非常に強力かつ選択的なＰＤＥ−５阻害剤がある。強力かつ選択的なＰＤＥ−４阻害剤は、主に喘息およびＣＯＰＤの処置に使用される（Spina 2003)。
【発明の開示】
【０００４】
発明の開示
本発明のある態様は、ｃＧＭＰ−依存性ＰＤＥ−５およびｃＡＭＰ−依存性ＰＤＥ−４が、前立腺のみならず、膀胱組織でも豊富であることを立証するＰＤＥｍＲＮＡ発現プロフィールにより提供される（図１、２）。従って、ＰＤＥ−５またはＰＤＥ−４の選択的阻害剤、および、特に両者の組合せは、前立腺の収縮力を低下させるのみならず、両者の組合せの付加的利益として、泌尿器系障害において頻発する、膀胱下尿道閉塞に起因する刺激性症状も改善する。ＰＤＥ−５の選択的阻害剤は、即ち、バルデナフィル、シルデナフィルおよびタダラフィルであり、ＰＤＥ−４の選択的阻害剤は、即ち、ロフルミラストである。
【０００５】
本発明の治療剤により対処される泌尿器系障害は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）および特にＢＰＨに誘導される膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）に起因する刺激性症状を含む。膀胱の症候的刺激のみならず、根底にあるＢＰＨに誘導される膀胱下尿道閉塞も特異的ＰＤＥ−５および／またはＰＤＥ−４阻害剤（および特にこれらの組合せ）での処置により対処されるので、この処置は、当分野で既知の処置方法を超える実質的な利益を提供する。
【０００６】
特に、そして実質的利益を伴って、上述の阻害剤または阻害剤の組合せにより処置できる他の泌尿器系障害は、神経因性膀胱症候群［過活動膀胱（ＯＡＢ）または間質性膀胱炎（ＩＣ）とも呼ばれる］、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害である。
【０００７】
本発明の他の態様は、ＰＤＥ−５阻害剤バルデナフィルが、ラットの尿道輪に対して０.９６μｍｏｌ／ｌのＥＣ５０値で、そして、ラットの前立腺および膀胱の細片に対して各々１.１および５.０μｍｏｌ／ｌのＥＣ５０値で、弛緩効果を有することの証明である（図３、表１）。
【０００８】
本発明の他の態様は、ＰＤＥ−４阻害剤ロフルミラストおよびＰＤＥ−５阻害剤バルデナフィルの両方が、ウサギの膀胱細片に対して各々２６０ｎｍｏｌ／ｌおよび１.７μｍｏｌ／ｌのＩＣ５０で弛緩効果を示すことの証明である（図４、表２）。
【０００９】
本発明の他の態様は、ＰＤＥ−５阻害剤バルデナフィルが、ラット膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）モデルにおいて、ＢＰＨの刺激性症状の指標としての非排尿性収縮の回数を有意に減少させることの証明により提供される（図５）。
【００１０】
本発明は、単独で、または、ＰＤＥ−４阻害剤と組み合わせて、泌尿器系障害の処置に有用であるＰＤＥ−５阻害剤を提供する。特に、本発明の化合物は、タダラフィル（（６Ｒ,１２ａＲ）−２,３,６,７,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３,４−メチレン−ジオキシフェニル）ピラジノ（１',２'：１,６）ピリド（３,４−ｂ）インドール−１,４−ジオン）、バルデナフィル（２−（２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル−１−スルホニル）フェニル）−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ（５,１−ｆ）（１,２,４）トリアジン−４−オン）、シルデナフィル（３−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−７−メチル−９−プロピル−２,４,７,８−テトラアザビシクロ［４.３.０］ノナ−３,８,１０−トリエン−５−オン）、ウデナフィル（Udenafil）５−［２−プロピルオキシ−５−（１−メチル−２−ピロリジニルエチルアミドスルホニル）フェニル］−メチル−３−プロピル−１,６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ（４,３−ｄ）ピリミジン−７−オン、ダサンタフィル（Dasantafil）７−（３−ブロモ−４−メトキシベンジル）−１−エチル−８−［［（１,２）−２−ヒドロキシシクロペンチル］アミノ］−３−（２−ヒドロキシエチル）−３,７−ジヒドロ−１−プリン−２,６−ジオン、アバナフィル（Avanafil）４−｛［（３−クロロ−４−メトキシフェニル）メチル］アミノ｝−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、Surface Logix のＳＬｘ２１０１、ＬＡＳ３４１７９トリアゾロ［１,２−］キサンチン,６−メチル−４−プロピル−２−［２−プロポキシ−５−（４−メチルピペラジノ）スルホニル］フェニル−、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）、シロミラスト（４−シアノ−４−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）およびピクラミラスト（Piclamilast）（３−シクロペントキシ−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−メトキシ−ベンズアミド）である。
【００１１】
本発明のまた他の態様は、単独または組合せで、上述の泌尿器系障害の処置用医薬の製造に使用するための、ＰＤＥ阻害剤、特にＰＤＥ−４−およびＰＤＥ−５の阻害剤のスクリーニング方法である。
【００１２】
本発明は、泌尿器系障害の処置に使用できるＰＤＥ阻害剤の同定方法（本明細書において、「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。これらの方法は、ホスホジエステラーゼに結合する、かつ／または、ＰＤＥ１Ａの生物学的活性またはその発現に対して刺激または阻害効果を有する候補または試験化合物または物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物（peptidomimetic）、低分子または他の分子）を同定し、次いで、これらの化合物のどれが泌尿器系障害に関する症状または疾患に対する効果を有するかをインビボアッセイで決定することを伴う。
【００１３】
ＰＤＥ−４またはＰＤＥ−５に結合する、かつ／または、ＰＤＥ−４またはＰＤＥ−５の活性または発現に対する刺激または阻害効果を有する候補または試験化合物または物質は、ＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５を発現する細胞を用いるアッセイ（細胞を基礎とするアッセイ）または単離したＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５を用いるアッセイ（細胞を含まないアッセイ）のいずれかで同定する。様々なアッセイが、ＰＤＥの様々な変異体（例えば、全長ＰＤＥ、ＰＤＥの生物学的に活性な断片、または、ＰＤＥの全部または一部を含む融合タンパク質）を用いることができる。さらに、ＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５は、任意の適する哺乳動物の種に由来することができる。アッセイは、試験化合物または既知のＰＤＥ−４もしくはＰＤＥ−５リガンドのＰＤＥ−４またはＰＤＥ−５への結合の直接または間接的測定を伴う結合アッセイであり得る。アッセイは、ＰＤＥ−４またはＰＤＥ−５の活性の直接的または間接的測定を伴う活性アッセイであることもできる。アッセイは、ＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５ｍＲＮＡまたはＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５タンパク質の発現の直接または間接的測定を伴う発現アッセイであることもできる。様々なスクリーニングアッセイを、試験化合物の泌尿器系障害の症状に対する効果の測定を伴うインビボアッセイと組み合わせる。
【００１４】
本発明は、薬学的薬物開発用のリード構造として適するＰＤＥの阻害剤およびアゴニストの同定を可能にする、生化学的な細胞を含まないアッセイを含む。そのようなアッセイは、ＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５を試験化合物と接触させること、および、試験化合物がＰＤＥ４および／またはＰＤＥ−５の酵素活性のアンタゴニスト（好ましい）またはアゴニストとして作用する能力を決定することを含む。ある実施態様では、アッセイは、ＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５を試験化合物と接触させた後、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのそのヌクレオシド一リン酸への変換を測定することにより、ＰＤＥ−４および／またはＰＤＥ−５のＰＤＥ活性をモニターすることを含む。
【００１５】
例えば、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルは、トリチウム含有化合物の３ＨｃＡＭＰおよび３ＨｃＧＭＰの使用により、[Hansen, R. S., and Beavo, J.A., PITAS USA1982,79: 2788-92］に記載の通りに測定できる。多数の化合物からなる化合物のプールをスクリーニングするために、［Bardelle, C. et al. (1999) Anal. Biochem. 275: 148-155］に記載のマイクロタイタープレートをベースとするシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を適用できる。
【００１６】
あるいは、購入できるＳＰＡキット（Amersham Pharmacia）を使用して、組換えタンパク質のホスホジエステラーゼ活性をアッセイできる。ＰＤＥ酵素は、環状ヌクレオチド、例えばｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを、それらの直鎖状対応物に加水分解する。ＳＰＡアッセイは、トリチウム標識された環状ヌクレオチド［３Ｈ］ｃＡＭＰまたは［３Ｈ］ｃＧＭＰを利用し、トリチウム標識された非環状生成物はＳＰＡビーズと選択的に相互作用するが、環状物質は効果的には結合しないことを基礎とする。
【００１７】
シンチレーションビーズに結合した放射性標識化生成物は、シンチレーションカウンターで分析できる光を発生させる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例には、非経腸（例えば、静脈内、動脈内、皮内、皮下、筋肉内、吸入、経皮、経粘膜、鼻腔および直腸投与）、経口（例えば、頬側、舌下、口内粘膜および経口投与）および局所（例えば、液剤または懸濁剤の局所的点滴注入および局所インプラント）が含まれる。
【００１９】
注射および点滴に適する医薬組成物には、滅菌水性液剤（有効成分が十分に水に可溶性であるならば）、懸濁剤、乳剤、および、滅菌注射可能液剤または分散剤の即時調製用の滅菌散剤が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、医薬的に許容し得るポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの適する混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、等張化剤または界面活性剤などの医薬的に許容し得る成分を添加し得る。デポー注射は、油性液剤または懸濁剤または生物分解性ポリマーの粒子などの既知の製剤原則をベースとする。
【００２０】
吸入による投与のために、エアゾルスプレーの形態で、加圧容器または適する噴霧剤を含有するディスペンサーから、噴霧器または乾燥粉末吸入器から、化合物を送達する。
【００２１】
全身的投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与のために、透過させようとする障壁に適切な浸透剤を製剤において使用する。そのような浸透剤は当分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー、舌下または頬側用製剤または坐剤の使用により達成できる。経皮投与のために、当分野で一般的に知られている通り、活性化合物を、軟膏、パッチ、ゲルまたはクリームに製剤化する。
【００２２】
これらの化合物は、直腸送達のために、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの常套の坐剤基剤を用いて）または停留浣腸の形態に調製することもできる。
【００２３】
経口用組成物は、一般的に、不活性希釈剤または増量剤および機能的補助剤を含む。それらは、カプセル剤に封入できるか、または、錠剤に打錠できる。他の適する投薬形は、発泡錠、チュアブル錠、口内崩壊錠（orodispersible tablet）、ソフトゼラチンカプセル剤、液体を満たしたハードゼラチンカプセル剤、サシェ中の散剤および経口用液剤である。
【００２４】
経口投薬形の製造に適する機能的補助剤は当分野で周知であり、例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの結合剤、クロスポビドンまたはクロスカルメロースナトリウムなどの崩壊剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動剤、ステアリン酸マグネシウム、マクロゴールまたはステアリン酸などの滑沢剤、アスパルテーム、スクロースまたはサッカリンナトリウムなどの甘味料、および、ペパーミントまたはオレンジ香料などの香味料が含まれる。
【００２５】
ある実施態様では、制御放出錠剤またはカプセルに満たした被覆ペレット剤またはインプラントおよびマイクロカプセル封入送達系を含む非経腸制御放出製剤などの、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体を用いて活性化合物を調製する。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸またはポリグリコール−ポリ乳酸−コポリマーなどの生物分解性または生物適合性ポリマーを使用できる。
【００２６】
本発明の他の実施態様は、ＰＤＥ−４およびＰＤＥ−５阻害剤の組合せ、および、泌尿器系障害の処置用の医薬組成物を製造するためのそれらの使用を提供し、ここで、これらの組合せは、以下のいずれかを含む；ｉ）ＰＤＥ−４およびＰＤＥ−５活性の両方に対する阻害作用を有する化合物を含む医薬組成物、または、ｉｉ）少なくとも１種のＰＤＥ−４阻害剤および少なくとも１種のＰＤＥ−５阻害剤を１つの投与ユニット中の固定された組合せとして含む医薬組成物、または、ｉｉｉ）少なくとも２セットの医薬組成物を含有し、各セットは、少なくとも１回の投与量のユニットでＰＤＥ−５阻害剤を含む少なくとも１個の医薬製剤、および、少なくとも１回の投与量のユニットでＰＤＥ−４阻害剤を含む少なくとも１個の医薬製剤からなり、ここで、該医薬組成物の各投与ユニットは、組み合わせて、連続的に、単回投与として、または複数回投与で投与される、複数製剤を組み合わせたキット。
【００２７】
本発明はさらに、以下を提供する：
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置における治療剤として有用なＰＤＥ５阻害剤のスクリーニング方法、それは、ｉ）試験化合物（ＰＤＥ−４阻害活性を有しても有さなくてもよい）をＰＤＥ５ポリペプチドと接触させる、ｉｉ）試験化合物の一定の濃度下で、または該試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｉｉ）該試験化合物の異なる濃度下で該ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｖ）ＰＤＥ−５ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の化合物を選択する、の各段階を含む。
【００２８】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置における治療剤として有用なＰＤＥ４阻害剤のスクリーニング方法、それは、ｉ）試験化合物（ＰＤＥ−５阻害活性を有しても有さなくてもよい）をＰＤＥ４ポリペプチドと接触させる、ｉｉ）試験化合物の一定の濃度下で、または該試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｉｉｉ）該試験化合物の異なる濃度下で該ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｉｖ）ＰＤＥ−４ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の化合物を選択する、の各段階を含む。
【００２９】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置における治療剤として有用なＰＤＥ５阻害剤およびＰＤＥ４阻害剤の組合せのスクリーニング方法、それは、ｉ）第１の試験化合物をＰＤＥ５ポリペプチドと接触させる、ｉｉ）第１の試験化合物の一定の濃度下で、または該第１の試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｉｉ）該第１の試験化合物の異なる濃度下でＰＤＥ５ポリペプチドの活性を決定する、ｉｖ）ＰＤＥ−５ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の第１の化合物を選択する、ｖ）第２の試験化合物をＰＤＥ４ポリペプチドと接触させる、ｖｉ）第２の試験化合物の一定の濃度下で、または該第２の試験化合物の非存在下で、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｖｉｉ）該第２の試験化合物の異なる濃度下でＰＤＥ４ポリペプチドの活性を決定する、ｖｉｉ）ＰＤＥ−４ポリペプチドに対する阻害効果を有する少なくとも１種の第２の化合物を選択する、ｖｉｉ）ＰＤＥ５阻害活性を有する少なくとも１種の第１の化合物を、ＰＤＥ４阻害活性を有する少なくとも１種の第２の化合物と組み合わせる、の各段階を含む。
【００３０】
試験化合物を細胞内または細胞表面上で接触させることを含み、その細胞はインビトロである、スクリーニング方法。
試験化合物をＰＤＥ−４またはＰＤＥ−５ポリペプチドと、細胞のない系で接触させることを含む、スクリーニング方法。
スクリーニング方法は、検出可能な標識と結合した試験化合物を含み得る。
【００３１】
特に、本発明は以下を提供する：
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症および閉塞性尿路疾患を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ＰＤＥ５ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む医薬組成物。
【００３２】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ＰＤＥ４ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む医薬組成物。
【００３３】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、上述の選択的治療剤の組合せである治療剤を含む医薬組成物。
【００３４】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ＰＤＥ５ポリペプチドおよびＰＤＥ４ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む医薬組成物。
【００３５】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−（ジフルオロ−メトキシ）ベンズアミド）、シロミラスト（４−シアノ−４−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）およびピクラミラスト（３−シクロペントキシ−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−メトキシ−ベンズアミド）からなるＰＤＥ−４阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−４阻害剤を含む医薬組成物。
【００３６】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症および閉塞性尿路疾患を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、タダラフィル（（６Ｒ,１２ａＲ）−２,３,６,７,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３,４−メチレン−ジオキシフェニル）ピラジノ（１',２'：１,６）ピリド（３,４−ｂ）インドール−１,４−ジオン）、バルデナフィル（２−（２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル−１−スルホニル）フェニル）−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ（５,１−ｆ）（１,２,４）トリアジン−４−オン）、シルデナフィル（３−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−７−メチル−９−プロピル−２,４,７,８−テトラアザビシクロ［４.３.０］ノナ−３,８,１０−トリエン−５−オン）、ウデナフィル５−［２−プロピルオキシ−５−（１−メチル−２−ピロリジニル−エチル−アミドスルホニル）フェニル］−メチル−３−プロピル−１,６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ（４,３−ｄ）ピリミジン−７−オン、ダサンタフィル７−（３−ブロモ−４−メトキシベンジル）−１−エチル−８−［［（１,２）−２−ヒドロキシシクロペンチル］アミノ］−３−（２−ヒドロキシエチル）−３,７−ジヒドロ−１−プリン−２,６−ジオン、アバナフィル４−｛［（３−クロロ−４−メトキシフェニル）メチル］アミノ｝−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、Surface Logix のＳＬｘ２１０１、ＬＡＳ３４１７９トリアゾロ［１,２−］キサンチン,６−メチル−４−プロピル−２−［２−プロポキシ−５−（４−メチルピペラジノ）−スルホニル］フェニルまたはこれらの塩、水和物または塩の水和物の群から選択されるＰＤＥ−５阻害剤を含む医薬組成物。
【００３７】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）、シロミラスト（４−シアノ−４−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）およびピクラミラスト（３−シクロペントキシ−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−メトキシ−ベンズアミド）からなるＰＤＥ−４阻害剤の群から選択される少なくとも１種のＰＤＥ−４阻害剤、並びに、バルデナフィル（２−（２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル−１−スルホニル）フェニル）−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ（５,１−ｆ）（１,２,４）トリアジン−４−オン）、シルデナフィル（３−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−７−メチル−９−プロピル−２,４,７,８−テトラアザビシクロ［４.３.０］ノナ−３,８,１０−トリエン−５−オン）およびタダラフィル（（６Ｒ,１２ａＲ）−２,３,６,７,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３,４−メチレン−ジオキシフェニル）からなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択される少なくとも１種のＰＤＥ−５阻害剤の組合せを含む医薬組成物。
【００３８】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症および閉塞性尿路疾患を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ＰＤＥ５阻害剤の使用。
【００３９】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ＰＤＥ４阻害剤の使用。
【００４０】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、少なくとも１種のＰＤＥ４阻害剤および少なくとも１種のＰＤＥ５阻害剤の組合せの使用。
【００４１】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ＰＤＥ４ポリペプチドおよびＰＤＥ５ポリペプチドの阻害剤である物質の使用。
【００４２】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症および閉塞性尿路疾患を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、タダラフィル（（６Ｒ,１２ａＲ）−２,３,６,７,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３,４−メチレン−ジオキシフェニル）ピラジノ（１',２'：１,６）ピリド（３,４−ｂ）インドール−１,４−ジオン）、バルデナフィル（２−（２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル−１−スルホニル）フェニル）−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ（５,１−ｆ）（１,２,４）トリアジン−４−オン）、シルデナフィル（３−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−７−メチル−９−プロピル−２,４,７,８−テトラアザビシクロ［４.３.０］ノナ−３,８,１０−トリエン−５−オン）、ウデナフィル５−［２−プロピルオキシ−５−（１−メチル−２−ピロリジニル−エチル−アミドスルホニル）フェニル］−メチル−３−プロピル−１,６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ（４,３−ｄ）ピリミジン−７−オン、ダサンタフィル７−（３−ブロモ−４−メトキシベンジル）−１−エチル−８−［［（１,２）−２−ヒドロキシシクロペンチル］アミノ］−３−（２−ヒドロキシエチル）−３,７−ジヒドロ−１−プリン−２,６−ジオン、アバナフィル４−｛［（３−クロロ−４−メトキシフェニル）メチル］アミノ｝−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、Surface Logix のＳＬｘ２１０１、ＬＡＳ３４１７９トリアゾロ［１,２−］キサンチン,６−メチル−４−プロピル−２−［２−プロポキシ−５−（４−メチルピペラジノ）−スルホニル］フェニルからなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−５阻害剤、またはこれらの塩、水和物または塩の水和物の使用。
【００４３】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）、シロミラスト（４−シアノ−４−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）およびピクラミラスト（３−シクロペントキシ−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−メトキシ−ベンズアミド）からなるＰＤＥ−４阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−４阻害剤の使用。
【００４４】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置用の医薬組成物を製造するための、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）、シロミラスト（４−シアノ−４−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）およびピクラミラスト（３−シクロペントキシ−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−メトキシ−ベンズアミド）からなるＰＤＥ−４阻害剤の群から選択される少なくとも１種のＰＤＥ−４阻害剤、並びに、バルデナフィル（２−（２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル−１−スルホニル）フェニル）−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ（５,１−ｆ）（１,２,４）トリアジン−４−オン）、シルデナフィル（３−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−７−メチル−９−プロピル−２,４,７,８−テトラアザビシクロ［４.３.０］ノナ−３,８,１０−トリエン−５−オン）およびタダラフィル（（６Ｒ,１２ａＲ）−２,３,６,７,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３,４−メチレン−ジオキシフェニル）からなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択される少なくとも１種のＰＤＥ−５阻害剤の組合せの使用。
【００４５】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置に有用な医薬組成物の製造方法であって、ｉ）上記のスクリーニング方法に従いＰＤＥ５の阻害剤を同定する、ｉｉ）上記のスクリーニング方法に従いＰＤＥ４の阻害剤を同定する、）該阻害剤が、哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の症状を改善するか否かを決定する；およびｉｉｉ）少なくとも１種の該阻害剤を許容し得る医薬担体と組み合わせる、の各段階を含む方法。
【００４６】
ＰＤＥ５の阻害剤が、バルデナフィル（２−（２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル−１−スルホニル）フェニル）−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ（５,１−ｆ）（１,２,４）トリアジン−４−オン）、シルデナフィル（３−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−７−メチル−９−プロピル−２,４,７,８−テトラアザビシクロ［４.３.０］ノナ−３,８,１０−トリエン−５−オン）、タダラフィル（（６Ｒ,１２ａＲ）−２,３,６,７,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３,４−メチレンジオキシフェニル）、ウデナフィル５−［２−プロピルオキシ−５−（１−メチル−２−ピロリジニル−エチル−アミドスルホニル）フェニル］−メチル−３−プロピル−１,６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ（４,３−ｄ）ピリミジン−７−オン、ダサンタフィル７−（３−ブロモ−４−メトキシベンジル）−１−エチル−８−［［（１,２）−２−ヒドロキシシクロペンチル］アミノ］−３−（２−ヒドロキシエチル）−３,７−ジヒドロ−１−プリン−２,６−ジオン、アバナフィル４−｛［（３−クロロ−４−メトキシフェニル）メチル］アミノ｝−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、Surface Logix のＳＬｘ２１０１およびＬＡＳ３４１７９トリアゾロ［１,２−］キサンチン,６−メチル−４−プロピル−２−［２−プロポキシ−５−（４−メチルピペラジノ）−スルホニル］フェニルからなるＰＤＥ−５阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−５阻害剤である、医薬組成物の製造方法。
【００４７】
ＰＤＥ４の阻害剤が、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）、シロミラスト（４−シアノ−４−（３−シクロペントキシ−４−メトキシ−フェニル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸）およびピクラミラスト（３−シクロペントキシ−Ｎ−（３,５−ジクロロピリジン−４−イル）−４−メトキシ−ベンズアミド）からなるＰＤＥ−４阻害剤の群から選択されるＰＤＥ−４阻害剤である、医薬組成物の製造方法。
【００４８】
良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症、閉塞性尿路疾患および勃起不全を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患を有する哺乳動物においてＰＤＥ活性を調節するための、上述の医薬組成物の使用。
【００４９】
バルデナフィル、シルデナフィルおよびタダラフィルからなる医薬組成物の群から選択される少なくとも１種の医薬組成物、並びに、ロフルミラスト、シロミラストおよびピクラミラストからなる医薬組成物の群から選択される少なくとも１種の医薬組成物の組合せを含有する、ヒトを含む哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患を処置するための複数製剤を組み合わせたキット。
【００５０】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置に有用な複数製剤を組み合わせたキットの製造方法であって、ｉ）バルデナフィル、シルデナフィルおよびタダラフィルからなる医薬組成物の群から少なくとも１種の医薬組成物を選択する、ｉｉ）ロフルミラスト、シロミラストおよびピクラミラストからなる医薬組成物の群から少なくとも１種の医薬組成物を選択する、ｉｉｉ）該医薬組成物の少なくとも２種を組み合わせ、それにより該複数製剤を組み合わせたキットを創成する、の各段階を含む方法。
【００５１】
ＰＤＥ−５ポリペプチドの活性を調節する少なくとも１種の治療剤、および、タダラフィル、および、ＰＤＥ−４ポリペプチドの活性を調節する少なくとも１種の治療剤の組合せを含有する、哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患を処置するための複数製剤を組み合わせたキット。
【００５２】
哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）および下部尿路症状（ＬＵＴＳ）からなる疾患の群に含まれる疾患の処置に有用な複数製剤を組み合わせたキットの製造方法であって、ｉ）ＰＤＥ−５ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む少なくとも１種の医薬組成物を選択する、ｉｉ）ＰＤＥ−４ポリペプチドの活性を調節する治療剤を含む少なくとも１種の医薬組成物を選択する、ｉｉｉ）該医薬組成物の少なくとも２種を組み合わせ、それにより該複数製剤を組み合わせたキットを創成する、の各段階を含む方法。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様は、哺乳動物の良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）、下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、神経因性膀胱症候群（ＯＡＢ）および（ＩＣ）、混合型、切迫性、腹圧性または溢流性失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）などの尿失禁（ＵＩ）、骨盤痛、雌性および雄性の生殖器系を構成する器官の良性および悪性障害、急性または慢性腎不全などの腎臓病、腎移植拒絶などの免疫学的に媒介される腎臓病、ループス腎炎、免疫複合体腎臓病、糸球体症、腎炎、中毒性腎症および閉塞性尿路疾患を含む泌尿生殖器系障害からなる疾患の群に含まれる疾患の処置のための、バルデナフィル、その塩、水和物または塩の水和物を含有する医薬組成物である。
【００５４】
驚くべきことに、特に、バルデナフィル、その塩、水和物または塩の水和物が、他のＰＤＥ−５阻害剤と比較して、高い活性を示し、神経因性膀胱（過活動膀胱または間質性膀胱炎とも呼ばれる）の処置において良好な結果を示すことが見出された。
【００５５】
図面の説明
図１：Sprague Dawley Rats の腎臓（Ｋ）、膀胱（Ｂ）、前立腺（Ｐ）、尿道（Ｕ）および海綿体（Ｃ）におけるＰＤＥ−５の相対的ｍＲＮＡ発現。データは、平均＋ＳＥＭ、ｎ＝１０である。
【００５６】
図２：Sprague Dawley Rats の膀胱および前立腺における、ＰＤＥ−４ａ、−４ｂ、−４ｃ、−４ｄおよびＰＤＥ−５の相対的ｍＲＮＡ発現。データは平均＋ＳＥＭ、ｎ＝１０である。
【００５７】
図３：単離されたラット尿道の輪（黒色三角形）、および膀胱−（黒色菱形）および前立腺の細片（灰色四角形）の収縮に対するバルデナフィルの効果。膀胱の細片を、Ｋ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液を使用して予め収縮させた。前立腺および尿道の組織を、１０μｍｏｌ／ｌフェニレフリンを使用して予め収縮させた。弛緩を事前収縮の百分率として表した。各点は、平均値±ＳＥＭを表す。ｎ＝９。
【００５８】
図４：単離したウサギ膀胱の細片の収縮に対するロフルミラスト（黒色菱形）およびバルデナフィル（灰色四角形）の効果。膀胱の細片を、Ｋ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液を使用して予め収縮させた。弛緩を事前収縮の百分率として表した。各点は、平均値±ＳＥＭを表す。ｎ＝９。
【００５９】
図５：媒体（Ｖ）およびバルデナフィルＨＣｌ（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）によるボーラスｉ.ｖ.処置後の非排尿性収縮の回数（％）。データは、平均＋ＳＥＭ、＊＝ｐ＜０.０５で有意（対応のあるスチューデントのｔ検定）である。
【００６０】
図６：基底排尿間隔（Ｃ）と比較した、媒体（Ｖ）およびバルデナフィルＨＣｌ（１,３ｍｇ／ｋｇ）のボーラスｉ.ｖ.処置後の排尿間隔（％）。データは、平均＋ＳＥＭ、＊＝ｐ＜０.０５で有意（対応のあるスチューデントのｔ検定）である。
【００６１】
実施例１
組織のサンプル採取およびＲＮＡの調製：体重２００−２５０ｇのオスの Sprague Dawley ラットを、組織収集に使用した。７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２からなるキャリアガス中に５％イソフルラン（Baxter S.A.）を混合してラットを手早く麻酔し、次いで、断頭により安楽死させた。腹部を正中切開により開き、腎髄質、尿管、膀胱、前立腺および尿道として腎臓および下部尿路組織を露出させ、迅速に取り出した。組織を液体Ｎ２中で冷凍し、ＲＮＡ調製まで保存した。RNeasy ミニカラム (Qiagen Inc.) を使用して総ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅ消化によりさらに精製した。
【００６２】
ＰＤＥｍＲＮＡの定量：リアルタイム定量ＰＣＲ（TaqMan-PCR, Heid 1996）により、ラットの下部尿路組織における様々なＰＤＥイソ遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定した。従って、供給業者のマニュアルに沿って、Superscript II RT cDNA 合成キット (Gibco, Inc）で総ＲＮＡ１μｇをｃＤＮＡに転写した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより ABI Prism 7700 配列検出装置 (Applied Biosystems, Inc.）でＰＤＥのｍＲＮＡを測定した。各ＰＤＥイソ遺伝子ｍＲＮＡのフォワードおよびリバースプライマー並びに蛍光発生プローブの特異的配列を、Primer Express 1.5 Software (Applied Biosystems, Inc.）で設計した。ＰＣＲ増幅の間に、Ｔａｑポリメラーゼの５'核酸分解活性がプローブを切断し、５'レポーター蛍光染料を３'のクエンチャー染料から分離する。標的ｍＲＮＡレベルと逆に相間する閾サイクルＣｔを、レポーター蛍光の発光がバックグラウンドレベルより１０倍標準偏差以上に増加させたサイクル数として測定した。ハウスキーピング遺伝子として、フォワードプライマー５'−ａｃｃｔｔｃａａｃａｃｃｃｃａｇｃｃａ−３'、リバースプライマー５'−ｃａｇｔｇｇｔａｃｇａｃｃａｇａｇｇｃａ−３'および蛍光プローブ５'−６ＡＦＭ−ａｃｇｔａｇｃｃａｔｃｃａｇｇｃｔｇｔｇｔｔｇｔｃｃ−ＴＡＭＡＲＡ−３'を使用して、ベータ−アクチンを上記の通りに定量した。ベータ−アクチンｍＲＮＡレベルでＰＤＥｍＲＮＡレベルを補正し、比較Ｃｔ−方法を使用して相対的発現として算出した。
【００６３】
下部尿路におけるＰＤＥ−５およびＰＤＥ−４Ａ、−４Ｂ、−４Ｃ、−４ＤｍＲＮＡの発現：ＰＤＥ−５の下部尿路組織における発現プロフィールについて不完全なデータしかないので、オスの Sprague Dawley ラットにおいて、TaqMan RT-PCR によりＰＤＥｍＲＮＡを定量した。最も顕著なＰＤＥ−５の発現は、膀胱で見られた（図１）。低い発現レベルが、尿道、海綿体および前立腺で見られた（図１）。これらの結果は、下部尿路組織、特に膀胱に、実質的なＰＤＥ−５ｍＲＮＡ発現があることを示した。
【００６４】
さらに、全４種のＰＤＥ−４イソ遺伝子（ＰＤＥ−４Ａ、−４Ｂ、−４Ｃおよび−４Ｄ）のＰＤＥ−４ｍＲＮＡ発現を、TaqMan RT-PCR により膀胱および前立腺において決定した（図２）。我々は、検出能の境界線上にある非常に低いＰＤＥ−４ｃの発現を見出したが、ＰＤＥ−４Ａ、−４Ｂおよび４ＤｍＲＮＡは、実質的に両方の組織で発現された。膀胱では、ＰＤＥ−４Ｄが最も豊富なＰＤＥ−４イソ遺伝子ｍＲＮＡであり、一方、前立腺では、ＰＤＥ−４ａおよび−４Ｄはほぼ等しく分布し、ＰＤＥ−５ｍＲＮＡより２.５倍高く発現された（図２）。
【００６５】
この発現プロフィールは、ＰＤＥ−５およびＰＤＥ−４ＤｍＲＮＡが膀胱で、また前立腺組織で豊富であることを立証する。従って、ＰＤＥ−５またはＰＤＥ−４の阻害剤は、しかし、特に、ロフルミラストと組み合わせたバルデナフィルなどのＰＤＥ−５およびＰＤＥ−４阻害剤の両者の組合せは、膀胱のみならず前立腺の収縮性を低下させ、かくして当分野の現状で既に存在する泌尿器系障害の処置方法を超える利益を提供し、該障害は、即ち、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）および特にＢＰＨに誘導される膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）に起因する刺激性症状（下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を含むがこれらに限定されない）を含む。
【００６６】
実施例２
組織の調製：オスの Wistar ラット（２００−３００ｇ）を、二酸化炭素を使用して安楽死させた。組織を取り出し、以下の組成（ｍｍｏｌ／ｌ）：ＮａＣｌ１１２、ＫＣｌ５.９、ＣａＣｌ２２.０、ＭｇＣｌ２１.２、ＮａＨ２ＰＯ４１.２、ＮａＨＣＯ３２５、グルコース１１.５の氷冷 Krebs-Henseleit バッファーに入れた。４つの等しい大きさの約２ｍｍｘ１０ｍｍの縦方向の細片を膀胱体から切り出した。前立腺の細片は、尿道と平行に前立腺の両葉を横断して切り出すことにより得た。動物１匹につき１つの輪を尿道の近位部から切り出した。
【００６７】
White New Zealand ウサギを、チオペンタールを使用して麻酔した。膀胱を取り出し、以下の組成（ｍｍｏｌ／ｌ）：ＮａＣｌ１１２、ＫＣｌ５.９、ＣａＣｌ２２.０、ＭｇＣｌ２１.２、ＮａＨ２ＰＯ４１.２、ＮａＨＣＯ３２５およびグルコース１１.５の氷冷 Krebs-Henseleit バッファーに入れた。等しい大きさの約２ｍｍｘ１０ｍｍの縦方向の細片を膀胱体から切り出した。
【００６８】
機械的活性の記録：調製物を、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃で平衡化した Krebs-Henseleit 溶液を含む２０ｍｌの器官浴に移した。細片を２つのフックの間に２つのクリップで据え付けた。等尺性張力を記録するために、フックの一方を力変換器に連結し、次いでそれを増幅器およびチャート式記録計に繋いだ。他方のフックを移動可能ユニットに取り付け、負荷前の張力の正確な調整を可能にした。次いで、全ての組織に６０分間の平衡期間を与え、その間にそれらを洗浄し、２０分毎に静止張力を１ｇに調節した。
【００６９】
平衡期間後、調製物をＫ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液に曝すことにより、各実験を開始した。この方法を３回繰り返し、各収縮の間に組織を少なくとも３回洗浄した。
【００７０】
次いで、膀胱の細片を、Ｋ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液を使用して予め収縮させた。収縮が安定したら、試験化合物の累積用量応答曲線を構築した。Ｋ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液により誘導される安定した収縮を１００％の張力と定義した。弛緩を張力の百分率として表した。
【００７１】
前立腺の細片および尿道の輪を、１０−６ｍｏｌ／ｌフェニレフリンで予め収縮させた。前立腺組織に対する化合物の効果を、各収縮の間に洗浄段階を設けて非累積的に試験した。
【００７２】
器官浴アッセイ：単離されたラット泌尿生殖器官に対するバルデナフィルの効果：ＰＤＥ５阻害剤バルデナフィルの平滑筋の弛緩に対する効果を、器官浴システムで試験した。化合物を１０−８ｍｏｌ／ｌないし１０−５ｍｏｌ／ｌの濃度範囲でアプライした（図３、表１）。バルデナフィルは、尿道の輪を０.９６μｍｏｌ／ｌのＥＣ５０値で、前立腺および膀胱の細片を各々１.１および５.０μｍｏｌ／ｌのＥＣ５０値で弛緩させた。
【００７３】
【表１】
2009509984.tif 000003
表１：単離されたラット泌尿生殖組織の収縮に対するバルデナフィルの効果。弛緩を事前収縮の百分率として表す。各点は、平均値±ＳＥＭを表す。ｎ＝９。
【００７４】
実施例３
組織の調製：オスの Wistar ラット（２００−３００ｇ）を、二酸化炭素を使用して安楽死させた。組織を取り出し、以下の組成（ｍｍｏｌ／ｌ）：ＮａＣｌ１１２、ＫＣｌ５.９、ＣａＣｌ２２.０、ＭｇＣｌ２１.２、ＮａＨ２ＰＯ４１.２、ＮａＨＣＯ３２５、グルコース１１.５の氷冷 Krebs-Henseleit バッファーに入れた。４つの等しい大きさの約２ｍｍｘ１０ｍｍの縦方向の細片を膀胱体から切り出した。前立腺の細片は、尿道と平行に前立腺の両葉を横断して切り出すことにより得た。動物１匹につき１つの輪を尿道の近位部から切り出した。
【００７５】
White New Zealand ウサギを、チオペンタールを使用して麻酔した。膀胱を取り出し、以下の組成（ｍｍｏｌ／ｌ）：ＮａＣｌ１１２、ＫＣｌ５.９、ＣａＣｌ２２.０、ＭｇＣｌ２１.２、ＮａＨ２ＰＯ４１.２、ＮａＨＣＯ３２５およびグルコース１１.５の氷冷 Krebs-Henseleit バッファーに入れた。等しい大きさの約２ｍｍｘ１０ｍｍの縦方向の細片を膀胱体から切り出した。
【００７６】
機械的活動の記録：調製物を、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃で平衡化した Krebs-Henseleit 溶液を含む２０ｍｌの器官浴に移した。細片を２つのフックの間に２つのクリップで据え付けた。等尺性張力を記録するために、フックの一方を力変換器に連結し、次いでそれを増幅器およびチャート式記録計に繋いだ。他方のフックを移動可能ユニットに取り付け、負荷前の張力の正確な調整を可能にした。次いで、全ての組織に６０分間の平衡期間を与え、その間にそれらを洗浄し、２０分毎に静止張力を１ｇに調節した。
【００７７】
平衡期間後、調製物をＫ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液に曝すことにより、各実験を開始した。この方法を３回繰り返し、各収縮の間に組織を少なくとも３回洗浄した。
【００７８】
次いで、膀胱の細片を、Ｋ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液を使用して予め収縮させた。収縮が安定したら、試験化合物の累積用量応答曲線を構築した。Ｋ＋（５０ｍｍｏｌ／ｌ）Krebs-Henseleit 溶液により誘導される安定した収縮を１００％の張力と定義した。弛緩を張力の百分率として表した。
【００７９】
前立腺の細片および尿道の輪を、１０−６ｍｏｌ／ｌフェニレフリンを使用して予め収縮させた。前立腺組織に対する化合物の効果を、各収縮の間に洗浄段階を設けて非累積的に試験した。
【００８０】
ＰＤＥ５およびＰＤＥ４阻害剤の単離されたウサギ膀胱細片に対する効果：ＰＤＥ５阻害剤バルデナフィルおよびＰＤＥ４阻害剤ロフルミラストの膀胱の平滑筋の弛緩に対する効果を、ウサギ膀胱細片を使用する器官浴で試験した。両方の化合物を１０−９ｍｏｌ／ｌないし１０−５ｍｏｌ／ｌの濃度で試験した（図４、表２）。ロフルミラストおよびバルデナフィルの両方は、膀胱細片を各々２６０ｎｍｏｌ／ｌおよび１.７μｍｏｌ／ｌのＩＣ５０で弛緩させた（表２）。
【００８１】
【表２】
2009509984.tif 000004
表２：単離されたウサギ膀胱細片の収縮に対するロフルミラストおよびバルデナフィルの効果。弛緩を事前収縮の百分率として表す。各点は、平均値±ＳＥＭを表す。ｎ＝９。
【００８２】
実施例４
全ての動物実験は、「German Law for the Protection of Laboratory animals」によって実施し、認可「Tierversuchsvorhaben No 401/A01 M010/M011 vom 09.07.2004」の承認されたガイドラインによって実行した。実験は、体重２００−２５０ｇのメスの Sprague Dawley ラットで実施した。
【００８３】
膀胱下尿道閉塞：膀胱下尿道閉塞のために、６６％Ｎ２Ｏ３３％Ｏ２の担体中の１.５−２％イソフルランの混合物でラットを麻酔した。腹部を除毛し、下部正中切開により開き、膀胱および尿道を確認し、尿道膀胱接合点（urethravesical junction）を露出させた。１.０ｍｍの金属棒を近位尿道に沿って置き、６−０ナイロン結紮糸を尿道および棒の周りにきつく結んだ。引き続き棒を取り除き、腹部を絹の結紮糸で閉じ、７０％エタノールで清浄化した。１０ｍｇ／ｋｇ Rimadyl（登録商標）(Pfizer）で、術後の疼痛に対する処置を行った。次いで、ラットを２週間維持し、水道水および標準的なラットの餌を与えた。膀胱内圧測定の２４時間前に、上記の通りにイソフルランでラットを麻酔した。上記の通りに開腹を実施し、膀胱を露出させ、ポリエチレンカテーテル（ＰＥ５０）を膀胱円蓋に植え込んだ。カニューレを使用して、皮下を通してカテーテルを動物の後首に到達させた。さらに静脈内投与のためのカテーテル（ＰＥ１０）を頸静脈に設置し、皮下で動物の後首まで通した。両方のカテーテルを縫合およびテープにより固定した。
【００８４】
意識のある膀胱内圧測定：膀胱内圧測定のために、上記の通りに動物をイソフルランで短く麻酔し、ボールマンケージに入れ、固定した。次いで、実験開始前に動物を少なくとも１時間回復させた。次いで、膀胱内圧測定用の圧力トランスデューサー（MLT0698, ADInstruments）および生理食塩水を流速１０ｍｌ／ｈで継続的に注入するための輸液ポンプ（Perfusor Compact（登録商標）, Braun Melsungen）に連結するために、膀胱カテーテルをｔ型管に連結した。ＢＯＯ動物は、対照動物と比較して、膀胱容積の増加（膀胱の拡大に起因する）および非排尿性収縮（ＢＰＨの刺激性症状を模倣する）を示した。処置前後の排尿間隔当たりの非排尿性収縮の算出により、処置効力を定量した。正の対照のために、アルファ受容体アンタゴニストのタムスロシン（１０μｇ／ｋｇ）を使用した。値は、非排尿性収縮の％減少で与えられた。
【００８５】
結果の統計的分析：データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表し、ｎは実験回数を示す。平均間の差異の有意さを、対応のある、および対応のない、スチューデントのｔ検定により決定した。０.０５より低い確率水準を有意であると見なした。
【００８６】
ＢＯＯラットにおける非排尿性収縮に対するバルデナフィルの効果：ＢＯＯモデルのために、尿道の部分的結紮を麻酔下のラットで実施した。この方法に起因する膀胱下尿道閉塞（ＢＯＯ）は、有意な膀胱重量の増加を引き起こし（データは開示せず）、明白な膀胱肥厚を示した。それは、意識のある動物における膀胱内圧測定により検出される膀胱の非排尿性収縮（ＮＶＣ）も引き起こした。これらのＮＶＣは、ＢＰＨの刺激性症状の測定であり、３ｍｇ／ｋｇバルデナフィルｉ.ｖ.のＭＥＤにより有意に減少した。
【００８７】
実施例５
全ての動物実験は、「German Law for the Protection of Laboratory animals」によって実施し、認可「Tierversuchsvorhaben No 401/A01 M010/M011 vom 09.07.2004」の承認されたガイドラインによって実行した。実験は、体重２００−２５０ｇのメスの Sprague Dawley ラットで実施した。
【００８８】
麻酔下の膀胱内圧測定：膀胱内圧測定のために、メスのＳＤラットをウレタンで麻酔した（１.２ｇ／ｋｇ、ｉｐ）。開腹後、膀胱を露出させ、両方の尿管を結紮し、切断した。ポリエチレンカニューレ（ＰＥ５０）を膀胱円蓋に植え込み、腹部を閉じた。生理食塩水の継続的注入のための輸液ポンプ（Perfusor（登録商標）compact; Braun Melsungen）に連結するために、そして、膀胱内圧測定用の圧力トランスデューサー（Combitrans; Braun Melsungen）に連結するために、膀胱カテーテルをｔ型管に連結した。膀胱内圧のシグナルを Powerlab System (MLT0698, ADInstrument）で記録した。外科手術から１時間の平衡期間後に、膀胱内圧測定を実施した。ｉ.ｖ.薬物処置のために、左大腿静脈をポリエチレンカテーテルでカニューレ挿入した。排尿間隔（膀胱容積に対応する）に対する処置の効果を算出した。
【００８９】
過活動膀胱の誘導を、生理食塩水の代わりに０.２％酢酸溶液（塩水で希釈）の膀胱への注入により、または、膀胱内圧測定の１８時間前のシクロホスファミド１５０ｍｇ／ｋｇのｉ.ｐ.注射により、実施した。
【００９０】
結果の統計的分析：データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表し、ｎは実験回数を示す。平均間の差異の有意さを、対応のある、および対応のない、スチューデントのｔ検定により決定した。０.０５より低い確率水準を有意であると見なした。
【００９１】
ＣＹＰ処置ラットの排尿間隔に対するバルデナフィルの効果：排尿間隔は、３ｍｇ／ｋｇバルデナフィルｉ.ｖ.のＭＥＤにより有意に増加した。
【００９２】
参考文献
Andersson KE, Chapple CR, Hofner K. Future drugs for the treatment of benign prostatic hyperplasia. World J Urol 2002;19:436-42. 
Bardelle, C. et al. (1999) Anal. Biochem. 275: 148-155
Carbone DJ Jr, Hodges S: Medical therapy for benign prostatic hyperplasia: sexual dysfunction and impact on quality of life. Int J Impot Res 2003;15:299-306.
Desgrandchamps F. Clinical relevance of growth factor antagonists in the treatment of benign prostatic hyperplasia. Eur Urol. 1997; 32:28-31.
Drescher P, Eckert RE, Madsen PO. Smooth muscle contractility in prostatic hyperplasia: role of cyclic adenosine monophosphate. Prostate 1994;25:76.
Gopalakrishnan M, Shieh CC. Potassium channel subtypes as molecular targets for overactive bladder and other urological disorders. Expert Opin Ther Targets 2004; 8:437-58.
Gillespie JI, Drake MJ. Phosphodiesterase-linked inhibiton of nonmicturition activity in the isolated bladder. BJU International 2004;93:1325-1332
Guess HA, Epidemiology and natural history of benign prostatic hyperplasia. Urol Clin North Am 1995;22:247.
Hansen, R. S., and Beavo, J.A., PITAS USA1982,79: 2788-92
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM, Real time quantitative PCR. Genome Res 1996;6:986-994.
Sciarra F, Toscano V. Role of estrogens in human benign prostatic hyperplasia. Arch Androl 2000;44:213-20.
Soderling SH, Beavo JA, Regulation of cAMP and cGMP signaling: new phosphodiesterases and new functions. Curr Opin Cell Biol. 2000;12:174-179.
Spina D, Phosphodiesterase-4 Inhibitors in the treatment of inflammatory lung disease, Drugs 2003;63:2575-2594
Truss M.C, Stief C, Machtens S, Wagner T, Jonas U (Eds) Pharmakotherapie in der Urologie, Springer 2001
Uckert S, Kuthe A, Jonas U, Stief CG, Characterization and functional relevance of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoenzymes of the human prostate. J Urol 2001; 166:2484-2490.
Ying J, Yao D, Jiang Y, Ren X, Xu M, The positive effect of sildenafil on LUTS from BPH while treating ED  Zhonghua Nan Ke Xue 2004 10:681-683.
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、Sprague Dawley Rats の腎臓（Ｋ）、膀胱（Ｂ）、前立腺（Ｐ）、尿道（Ｕ）および海綿体（Ｃ）におけるＰＤＥ−５の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
【図２】図２は、Sprague Dawley Rats の膀胱および前立腺における、ＰＤＥ−４ａ、−４ｂ、−４ｃ、−４ｄおよびＰＤＥ−５の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。
【図３】図３は、単離されたラット尿道の輪（黒色三角形）、および膀胱−（黒色菱形）および前立腺の細片（灰色四角形）の収縮に対するバルデナフィルの効果を示す。
【図４】図４は、単離したウサギ膀胱の細片の収縮に対するロフルミラスト（黒色菱形）およびバルデナフィル（灰色四角形）の効果を示す。
【図５】図５は、媒体（Ｖ）およびバルデナフィルＨＣｌ（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）によるボーラスｉ.ｖ.処置後の非排尿性収縮の回数（％）を示す。
【図６】図６は、基底排尿間隔（Ｃ）と比較した、媒体（Ｖ）およびバルデナフィルＨＣｌ（１,３ｍｇ／ｋｇ）のボーラスｉ.ｖ.処置後の排尿間隔（％）を示す。
【図１】
2009509984.tif 000005
【図２】
2009509984.tif 000006
【図３】
2009509984.tif 000007
【図４】
2009509984.tif 000008
【図５】
2009509984.tif 000009
【図６】
2009509984.tif 000010
【国際調査報告】
2009509984.tif 000011
2009509984.tif 000012
2009509984.tif 000013
2009509984.tif 000014
2009509984.tif 000015