(57)【要約】  極限環境微生物から単離された酵素、およびその利用法が記載される。酵素は、約８０℃より高温かつ約２未満のｐＨで最適酵素活性を示す。さらに酵素はバイオマスの前処理を含む方法において最終生成物の生成を促進するように有用となり得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約８０℃より高温かつ約２未満のｐＨで最適酵素活性を示す、極限環境微生物から単離された酵素。
【請求項２】
前記酵素はアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来のヘミセルラーゼである、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
前記酵素はアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、ＡＴＣＣ２７００９由来のキシラナーゼである、請求項２に記載の酵素。
【請求項４】
前記酵素は水溶性である、請求項２に記載の酵素。
【請求項５】
前記酵素は、ｐＨ約１で顕著な酵素活性を示すキシラナーゼである、請求項１に記載の酵素。
【請求項６】
前記酵素は少なくとも約１２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の酵素。
【請求項７】
前記酵素は、配列番号５に記載されるとおりの酵素よりも少なくとも２０％大きい分子量を有する、請求項１に記載の酵素。
【請求項８】
多糖類の加水分解に有用である、請求項１に記載の酵素。
【請求項９】
バイオマス糖を最終生成物に変換する同時糖化発酵プロセスに有用である、請求項１に記載の酵素。
【請求項１０】
バイオマス糖を最終生成物に変換する順次加水分解発酵プロセスに有用である、請求項１に記載の酵素。
【請求項１１】
バイオマススラリーを前処理して該バイオマススラリー中に存在するオリゴマーおよび／または多糖類を分解して最終生成物を生成するのに有用である、請求項１に記載の酵素。
【請求項１２】
配列番号２を含む、極限環境微生物から単離された酵素。
【請求項１３】
配列番号１を含むＮ−末端配列をさらに有する、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１４】
配列番号３をさらに含む、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１５】
配列番号４をさらに含む、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１６】
配列番号３および配列番号４をさらに含む、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１７】
前記酵素は水溶性であり、少なくとも約８０℃の温度かつ約２未満のｐＨで最適酵素活性を示す、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１８】
以下、
バイオマス糖を含むバイオマス源を提供すること、
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来の水溶性ヘミセルラーゼで該バイオマスを前処理して最終生成物を生成すること、
を含む、バイオマスの処理法。
【請求項１９】
前記バイオマス糖は多糖類を含み、前記ヘミセルラーゼは該多糖類を加水分解する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヘミセルラーゼは、約２未満のｐＨかつ約８０℃より高温で酵素活性を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヘミセルラーゼは配列番号２、配列番号３および／または配列番号４、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヘミセルラーゼは約１２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオマスの前記前処理工程後、前記方法はさらに、以下、
順次加水分解発酵プロセスを提供して前記バイオマス糖を前記最終生成物に変換すること、および
前記ヘミセルラーゼを該順次加水分解発酵プロセスに供給して該バイオマス糖から該最終生成物への変換を促進すること、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマスの前記前処理工程後、前記方法はさらに、以下、
同時糖化発酵プロセスを提供して前記バイオマス糖を前記最終生成物に変換すること、および
前記ヘミセルラーゼを該同時糖化発酵プロセスに供給して該バイオマス糖から該最終生成物への変換を促進すること、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
以下、
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９源を提供すること、
該アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９を、上清を有する微生物栄養培地で培養すること、
該アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９の細胞を該栄養培地上清から分離すること、および
該アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来の該ヘミセルラーゼを該栄養培地上清から回収精製すること、
を含む、ヘミセルラーゼの調製法。
【請求項２６】
前記ヘミセルラーゼは水溶性であり、約２未満のｐＨかつ約８０℃より高温で顕著な酵素活性を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヘミセルラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号４に示されるとおりの配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
栄養培地はさらに、以下
約１ｇ／ｌのキシラン、約１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、約５．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、約０．８ｍＭのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、約１．７４ｍＭのＮａ２ＳＯ４、約２５ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ２、約６．６ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２、約２．０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４、約０．５ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４、約０．５ｍｇ／ｌのホウ酸、約５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ３、約０．１５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４、約０．０２５ｍｇ／ｌのＮａＭｏＯ４、約０．０５ｍｇ／ｌのＣｏＮＯ３、約０．０２ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２、約０．０８ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、約０．０１ｍｇ／ｌの葉酸、約０．１ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、約０．０４ｍｇ／ｌのリボフラビン、約０．０８ｍｇ／ｌのニコチンアミド、約０．０８ｍｇ／ｌのｐ-アミノ安息香酸、約０．０１ｍｇ／ｌのビオチン、約０．０００４ｍｇ／ｌのシアノコバラミン、約０．０８ｍｇ／ｌのＤ-パントテン酸-Ｃａ、約０．０２ｍｇ／ｌのミオイノシトール、約０．０５ｍｇ／ｌのコリンブロミド、約０．０２ｍｇ／ｌのオロト酸一ナトリウム、および約０．１ｍｇ／ｌのスペルミジンを含み、
該得られる栄養培地はｐＨ約３．５に調整される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、以下
前記回収精製したヘミセルラーゼを順次加水分解発酵プロセスに供給してバイオマス糖から最終生成物への前記変換を促進すること、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、以下
前記回収精製したヘミセルラーゼを同時糖化発酵プロセスに供給して、バイオマス糖から最終生成物への前記変換を促進すること、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、以下
バイオマススラリーを前記回収精製したヘミセルラーゼで前処理して該バイオマススラリー中に存在するオリゴマーおよび／または多糖類を分解して最終生成物を生成すること、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
以下
極限環境微生物由来の水溶性ヘミセルラーゼを提供すること、および
約２未満のｐＨで、該水溶性ヘミセルラーゼで該多糖類の加水分解を行うこと、を含む、多糖類の加水分解法。
【請求項３３】
前記水溶性ヘミセルラーゼはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９から単離される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記水溶性ヘミセルラーゼは約８０℃より高温で最適酵素活性を示す、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス処理の酵素および方法に関する。より詳細には、水溶性であり、さらに少なくとも約８０℃の温度かつ約２未満のｐＨで最適酵素活性を示す酵素に関する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２００５年１１月２日提出の米国非仮出願第１１／２６６，０６３号、「バイオマス処理の酵素および方法」の権益を主張する。この米国非仮出願はその全体が参照することにより援用される。
【０００３】
（政府の権利）
米国政府は、米国エネルギー省とＢａｔｔｅｌｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｌｌｉａｎｃｅ，ＬＬＣとの間の契約第ＤＥ-ＡＣ０７-０５ＩＤ１４５１７号に従って以下の発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
生物精製所関連での燃料および付加価値化学物質の生産にリグノセルロース系残渣のセルロースおよびヘミセルロースに含まれる糖類を利用できれば望ましいことは長い間知られていた。リグノセルロース系残渣として、主にセルロース、ヘミセルロース、およびリグニンで構成される不均一三次元マトリクスからなるトウモロコシ茎葉などの材料が挙げられる。リグノセルロースの不均一性のため、セルラーゼ酵素などの比較的大きい分子はセルロースとヘミセルロースに直接接触できないことが長い間知られている。
【０００５】
これまでは、酸前処理プロセスを開発することでヘミセルロースを加水分解して除去し、それにより、マトリクス中のセルロースのセルラーゼ酵素によるセルロース分解への感受性を増加していた。このアプローチは一定の成功をおさめたものの、こうした酸前処理プロセスは高温高圧が必要なために資本も操作コストもかかり、そのうえプロセスによりもたらされる前処理の過酷さに応じて相当量の毒性分解産物を産出することが長い間知られている。このアプローチに付随する別の欠点は、これらの熱分解産物が同時にその後の発酵に利用可能な潜在的糖類の損失を示していることである。
【０００６】
したがって、バイオマスの処理法、および処理プロセスに用いた場合に酸前処理の過酷さを低減してエネルギーおよび資本コストを下げてヘミセルロース由来の糖類の収量を増加させて毒性副生成物の形成を最小限にする酵素が、本出願の対象である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の第一の態様は、極限環境微生物から単離された８０℃より高温かつ約２未満のｐＨで最適酵素活性を示す酵素に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ２７００９に由来するヘミセルラーゼに関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、多糖類の加水分解に有用な酵素に関する。
【００１０】
さらになお、本発明の別の態様は、バイオマス糖を最終生成物に変換する同時糖化発酵プロセスに有用となり得る酵素に関する。
【００１１】
本発明のなお別の態様は、バイオマス処理法に関し、これは、バイオマス糖を含むバイオマス源を提供する工程、このバイオマスをアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来の水溶性ヘミセルラーゼで前処理して最終生成物を生成する工程を含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、ヘミセルラーゼの調製法に関し、これは、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９源を提供する工程、上清を有する微生物栄養培地でアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９を培養する工程、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの細胞を栄養培地上清から分離する工程、および栄養培地上清からアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来のヘミセルラーゼを回収精製する工程を含む。
【００１３】
そのうえ、本発明の別の態様は、多糖類の加水分解法に関し、これは、微生物由来の水溶性ヘミセルラーゼを提供する工程、および約２未満のｐＨで、水溶性ヘミセルラーゼを用いて多糖類の加水分解を行う工程を含む。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の態様を、以下により詳細に説明する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、本明細書中以下に記載されるとおり、極限環境微生物から単離された、約８０℃より高温かつ約２未満の最適ｐＨで最適酵素活性を示す酵素に関する。本発明において、酵素は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスに由来するヘミセルラーゼおよび／またはキシラナーゼであり、ここでこの微生物はさらにＡＴＣＣ２７００９として同定される。酵素は、本明細書中以下に記載されるとおり、ｐＨ約１で酵素活性を示すようである。なおさらに、この酵素は少なくとも約１２０ｋＤａの分子量を有する。本発明において、酵素は、開示されるとおり、同時糖化発酵プロセスおよび／または順次加水分解発酵プロセスに有用でありバイオマス糖を最終生成物に変換することができる。さらになお、本明細書中記載されるとおりの酵素は、バイオマススラリーを前処理してバイオマススラリー中に存在し最終生成物をもたらす水溶性または水不溶性オリゴマーおよび／または多糖類を分解するのに有用である可能性がある。
【００１６】
本明細書中以下に用いられるとおり、「極限環境微生物」という用語は、沸騰水、氷、バッテリー酸などヒトが極限と判断する条件下で、または海底で生存繁栄することが可能な生物を意味する。そのような微生物の例として、上限２３５°Ｆの温度で増殖するパイロロバス・フマリー（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉ）、-２０℃（-４０°Ｆ）の温度で生存するサイクロバクター・クライオペジェラ（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｏｐｅｇｅｌｌａ）、原子炉で生存可能なデイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、海面の大気圧の３００倍の圧力で繁栄するフォトバクテリウム・プロフンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、およびバッテリー酸と同じｐＨ０で生存するピクロフィラス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。こうした微生物を見いだすことができる環境として、沸騰泉、熱水噴出口、氷河、塩類平原、および原子炉が挙げられる。本発明で用いる微生物は、天然源および人工源から入手、または培養寄託機関から購入することができる。本発明において、培養は、好ましくは４０℃より高温かつｐＨ約５未満で、より好ましくは５０℃より高温かつｐＨ４未満で、さらに好ましくは５５℃より高温かつｐＨ３．５未満で、しかも好気性条件下で行われる。培養期間は、ｐＨ、温度、および用いる栄養培地に依存して変化するものの、１２時間〜数日という期間が一般に好ましい結果となるだろう。本明細書中使用される場合、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能で、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９として同定される微生物と定義される。
【００１７】
本明細書中使用される場合、「酵素活性」という用語は、酵素が引き起こす反応を意味する。酵素は、全ての生物により産生されるタンパク質であり、これはそれ自身が変化または破壊されることなくある化学種を別の種類の化学種に変化させる反応を、媒介し、引き起こし、および／または促進する。本出願の文脈において、「最適」という単語は、「酵素活性」という用語と組み合わせて用いる場合、酵素が所定の結果をもたらすのに最適かつ最速で働くことを可能にする最も好ましい条件を意味する。最適酵素活性は、温度、ｐＨ、および塩濃度をはじめとする条件により影響を受け得る。
【００１８】
本明細書中使用される場合、「キシラナーゼ」という単語は、ヘミセルロース分子の骨格を作るキシロース糖間の化学結合を切ることにより、またはヘミセルロース側鎖のキシロース糖間の結合を切ることによりヘミセルロースをばらばらにする酵素を意味する。
【００１９】
本明細書中使用される場合、「多糖類」という単語は、化学結合で一緒につながった糖類の鎖（同じ糖類でも異なる糖類でも可能）を意味する。多糖類は、側鎖を持つまたは持たないこうした糖類の直鎖からなるものであり得る。多糖類の例として、デンプン、ペクチン、セルロース、およびヘミセルロースが挙げられる。
【００２０】
本出願の文脈において、「加水分解」という単語は、水がある分子と反応してこれを少なくとも２つに分ける化学反応を意味する。
【００２１】
本明細書中使用される場合、「バイオマス糖」という語句は、セルロースおよびヘミセルロースなどのバイオマス構成要素の分解に由来する糖を意味する。バイオマス糖の例として、グルコース、キシロース、ガラクトース、マンノース、およびアラビノースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
「同時糖化発酵プロセス」という語句は、本明細書中以下、バイオマスからエタノールなどの燃料または化学種を作るプロセスを意味し、バイオマスは化学的手段で前処理されていてもいなくてもよい。プロセスではセルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼ酵素（単数または複数）を用いてバイオマス多糖類を糖類に分解し（糖化）、そして糖類を微生物（単数または複数）源で発酵させて燃料または化学種生成物にする（発酵）。これらの２つのプロセスは同一反応容器中同時に起こる（同時）。
【００２３】
本出願中使用される場合、「最終生成物」という語句は、本明細書中以下、化学反応または酵素反応により生成する化学種（単数または複数）を意味する。本発明で意図される最終生成物の例として、処理時間および反応条件に依存して、キシロースおよび／または１個〜複数個のキシロース分子が挙げられる。
【００２４】
本発明の文脈において、「バイオマス」という単語は、植物および他のセルロース系材料（トウモロコシ葉茎、麦わら、およびおがくずなどの木製副産物など）を意味する。
【００２５】
「バイオマススラリーの前処理」という語句は、本出願の文脈において、バイオマスを続けてエタノールなどの燃料に変換するための準備を意味する。この前処理は、バイオマスを粉砕して粉末または小粒子にする工程、および水を加える（これがスラリーを構成する）工程を含む。次いでこのスラリーを、バイオマスからリグニンを一部または完全に除去するように設計された多数の方法で処理して、セルラーゼおよびヘミセルラーゼなどの酵素を用いてヘミセルロースおよびセルロースがそれらを構成する糖により容易に分解され得る形に変換する。前処理によっては、セルロースを固体残渣で残したまま、ヘミセルロースをそれを構成する糖に分解する。この処理工程は、酵素分解工程の前かつ糖をエタノールに変換する発酵工程の前に行われるため、「前処理」と称する。
【００２６】
本発明の文脈において、「水溶性」という語句は、どのような固体残渣も残すことなく水に完全に溶解し得る化学種または他の物質を意味する。
【００２７】
本発明の文脈において、「ヘミセルロース」という単語は、植物の構成要素の１つを意味し（その他の２つは、セルロースおよびリグニンである）、これはキシロースおよびマンノースなどの糖類の直鎖でできていて、これらは化学結合でつながっている。この直鎖は、鎖にそって糖類および他の化学種からなる分岐鎖も持つ。
【００２８】
本発明の文脈において、「ヘミセルラーゼ」という単語は、ヘミセルロースをそれを構成する糖類に分解し得る酵素のクラスを意味する。ヘミセルラーゼの例として、キシラナーゼ、マンナナーゼ、グルクロニダーゼ、およびアラビノフラノシダーゼが挙げられる。
【００２９】
「順次加水分解発酵プロセス」という語句は、本発明の文脈において、バイオマスから燃料または化学種（エタノールなど）を作るプロセスを意味し、ここでバイオマスは高温下、酸で処理（加水分解）されて、リグニンが除去され、かつバイオマス中に存在するセルロースおよびヘミセルロースがそれらを構成する糖類に変換されるかもしくはセルラーゼおよびヘミセルラーゼなどの酵素を用いてより容易にそれらを構成する糖類に分解され得る形に変換される。これらの糖類は、水に溶解させて、それから冷却し、ｐＨを中性にして、続いて様々な種類の微生物で発酵されて燃料（単数または複数）または化学種（単数または複数）生成物になる（発酵）。これらの２つのプロセスは、最初に加水分解工程が行われる反応容器と次に発酵工程が行われる反応容器と別々の反応容器で行われる（順次）。
【００３０】
「アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの培養」という語句は、本発明の文脈において、上記微生物に食料源（溶解性または不溶性ヘミセルロース）、様々なビタミンおよびミネラルを水に溶解させて（これは栄養培地を構成する）提供し、微生物が増殖することを可能にする適した条件（温度１４０°Ｆ、ｐＨ３．５、および酸素）を微生物に与えることを意味する。
【００３１】
「アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの細胞を分離する」という語句は、本発明の文脈において、遠心分離と呼ばれるプロセスにより細菌細胞を栄養培地から取り出す手段を含む。遠心分離では、細胞と栄養培地を管に入れて円形に回転させる。これは、メリーゴーラウンドで外側に押される感じを受けるのと同じ効果である。同様に、細胞も管の下部に押されて栄養培地から取り出すことができる。
【００３２】
「ヘミセルラーゼの回収および精製」という語句は、本発明の文脈において、ヘミセルラーゼ酵素を栄養培地から分離することを意味する。本発明では、栄養培地からヘミセルラーゼを分離するのにカチオン交換と呼ばれるプロセスが用いられた。これについては、栄養培地（ヘミセルラーゼを含む）をポンプでカチオン交換材料に通した。カチオン交換材料と接触すると、ヘミセルラーゼはカチオン交換材料にくっつくが、栄養培地は通過する。それから、ヘミセルラーゼ酵素をカチオン交換材料から取り出して精製する。
【００３３】
「微生物栄養培地」という語句は、本出願の文脈において、微生物（アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス）用食料源およびビタミンおよびミネラルを意味し、これらは全て水に溶解させて微生物が増殖するのに必要なｐＨに調整してある。より詳細には、微生物栄養培地は、約１ｇ／ｌのキシラン、約１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、約５．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、約０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１．７４ｍＭのＮａ２ＳＯ４、約２５ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ２、約６．６ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２、約２．０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４、約０．５ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４、約０．５ｍｇ／ｌのホウ酸、約５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ３、約０．１５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４、約０．０２５ｍｇ／ｌのＮａＭｏＯ４、約０．０５ｍｇ／ｌのＣｏＮＯ３、約０．０２ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２、約０．０８ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、約０．０１ｍｇ／ｌの葉酸、約０．１ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、約０．０４ｍｇ／ｌのリボフラビン、約０．０８ｍｇ／ｌのニコチンアミド、約０．０８ｍｇ／ｌのｐ-アミノ安息香酸、約０．０１ｍｇ／ｌのビオチン、約０．０００４ｍｇ／ｌのシアノコバラミン、約０．０８ｍｇ／ｌのＤ-パントテン酸-Ｃａ、約０．０２ｍｇ／ｌのミオイノシトール、約０．０５ｍｇ／ｌのコリンブロミド、約０．０２ｍｇ／ｌのオロト酸一ナトリウム、および約０．１ｍｇ／ｌのスペルミジンを含み、そしてここで得られる栄養培地はｐＨ約３．５に調整される。
【００３４】
「上清」という単語は、本出願の文脈において、細菌細胞を栄養培地から実質的に除去した後の残り物である栄養培地を意味する。
【００３５】
本発明者らは、高温低ｐＨで活性を示し、こうした条件下でインキュベートした場合に長期間安定性を示す、温度および酸安定キシラナーゼを単離および特性決定した。本発明者らは、熱および酸安定ヘミセルラーゼおよびセルラーゼは、本明細書中以下に記載されるとおり、一方では先に記載された前処理プロセスの過酷さを減少させ、および／または様々なプロセスでのこうした制限を取り除く、プロセスに特定の価値を有するかプロセスの付属品として特定の価値を有すると認識している。これについて、本発明者らは、莫大な数の、Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｒｋおよび様々な微生物菌株保存機関からの、高温低ｐＨ下で安定な酵素を産生する能力がある生物をスクリーニングした。これについて、Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＰａｒｋのＮｏｒｒｉｓ  Ｇｅｙｓｅｒ  Ｂａｓｉｎにある６カ所の泉から水および堆積物試料を収集した。これらの試料を、ｐＨ３．５で０．５ｇ／ｌのオーツ麦スペルト麦キシラン、または０．５ｇ／ｌの粉砕トウモロコシ穂軸のいずれかを含有するミネラル塩培養液に播種した。続く培養は８０℃でインキュベートし、目視および顕微鏡で増殖について毎日観測した。そのうえ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｅｎ  Ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）を検索して、増殖の最適温度およびｐＨが約６０℃より高温で約４未満のｐＨである、可能性のある従属栄養生物を４種見つけた。これらの複数種の生物は、ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺに推奨される培地で、上記に記載されるとおり、オーツ麦スペルト麦キシラン、または粉砕トウモロコシ穂軸で置き換えた炭素源で増殖した。次いでこれらの培養物をその後それらの最適増殖温度およびｐＨ３．５でインキュベートした。続く微生物増殖を濁りの様子で目視で評価した。
【００３６】
本研究において、ヘミセルラーゼおよび／またはセルラーゼ活性は、キシランの存在下で増殖が起こるなら存在すると、仮定された。増殖が起こった培養物は、約３日間インキュベーションした後収穫された。遠心分離により、培養物から細胞を取り出した。１０，０００ＭＷＣＯ膜の付いたＡｍｉｃｏｎTM限外濾過セルを用いて培養上清を約１０００〜２０００倍に濃縮する。続く上清濃縮物を、次いでコムギアラビノキシラン（これはＭｅｇａｚｙｍｅから市販されている）、またはカルボキシメチルセルロース、（これはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから確保した）を用いてヒモリブデン酸還元糖酸アッセイ（これは、Ｓｏｍｏｇｙｉ  （１９５２），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９５：１９−２３にすでに記載されている）でヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性について試験した。コムギアラビノキシランおよびカルボキシメチルセルロースは、それぞれヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性の基質として用いた。アッセイの標準条件は、６０℃およびｐＨ約３．５に設定した。図面を参照してわかるとおり、ヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性は、上限約９０℃の温度まで測定して酵素活性の最適温度を求めた。上記で参照される還元糖アッセイは、基質を加えた上清濃縮物のインキュベーション温度を変更して修正した。同様に、酵素活性を１〜約８の範囲のｐＨで測定して酵素活性の最適ｐＨを求めた。研究のため、還元糖アッセイは、アッセイ構成要素を適切なｐＨ緩衝液（ｐＨ１〜２は５０ｍＭのマレイン酸ナトリウムまたは５０ｍＭのグリシン、ｐＨ２〜６は５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６〜８は５０ｍＭのリン酸ナトリウム、およびｐＨ８〜９は５０ｍＭのＴｒｉｓ）で調製して修飾した。
【００３７】
上記のほかに、上清濃縮物を約７０℃かつｐＨ２．０でインキュベートすることで温度およびｐＨの関数としてのヘミセルラーゼおよびセルラーゼ安定性を試験した。これについては、鉱物油の層で濃縮物を覆ってこの試験の間蒸発を制限した。試料を周期的に収集して、先に述べた標準アッセイ条件でヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性について評価した。ヘミセルラーゼおよびセルラーゼ反応速度に関しては、様々な量のコムギアラビノキシランまたはカルボキシメチルセルロースを用いて還元糖アッセイで求めた。反応速度は、６０℃かつｐＨ３．５で求めた。Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ＰｒｏTM（これはＳｙｎｅｘＣｈｅｍから入手可能）を用いて非線形分析でＭｉｃｈａｅｌｉｓ−ＭｅｎｔｅｎパラメーターvＭＡＸおよびＫＭを計算した。上記のプロセス後、本発明者らはさらなる試験用にアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ２７００９）を同定した。
【００３８】
続いて、無細胞培養材料を濃縮して粗酵素調製物を作った。続くＳＤＳ-pageゲルでは、５本の主要なバンドと複数の薄いバンドが見られた。続いて計算されたこれらのバンドの質量は、他の報告されたキシラナーゼおよびセルラーゼと一致した。図１、図２、図３、および図４からわかるとおり、本発明者らは、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離された酵素（これは本明細書中ＡＴＣＣ２７００９として同定される）の酵素活性（キシラナーゼおよびセルラーゼ）の最適温度が約８０℃であることを発見した。図１からわかるとおり、相対酵素活性は、別の同様な微生物Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）から単離された同様な酵素が提供する酵素活性と対照的である。さらに、単離されたキシラナーゼの最適ｐＨは２であるもののｐＨ１という低さでも酵素活性を示すのに対して、セルラーゼ活性の最適ｐＨは約４であり、もっともこれはｐＨ２という低さでもいくらか活性を示したことがわかった。図４は、上記で記載されるようなｐＨの関数としてのキシラナーゼ活性を示す。本発明者らの知る限りでは、すでに報告されている最適ヘミセルラーゼｐＨの最低値は、Ｃｏｌｌｉｎｓ  （２００５，  ＦＥＭＳ，  Ｍｉｃｒｏ．  Ｒｅｖｉｅｗ，  ２９  （１）：３−２３）に参照があった。単離された本発明の水溶性キシラナーゼ酵素がおそらく１未満のｐＨで活性を有することは考えられるが、現在、還元糖アッセイ試薬はｐＨ１未満では不安定であった。さらなる研究は、新たに単離されたヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性が７０℃かつｐＨ２でインキュベートされても活性の減少を示さなかったことを明らかにした。上記の研究から、本発明者らはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ２７００９）がキシラン基質上で増殖することができ、さらに細胞外ヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性を産生すると結論づけた。細胞外ヘミセルラーゼおよびセルラーゼは、ともに水溶性で、ｐＨ約２で顕著なヘミセルラーゼ活性を示し、少なくとも約１２０ｋＤａの分子量を有する。もう一度図４を参照のこと。
【００３９】
先行技術は、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）から酸安定キシラナーゼが精製かつ特性決定されて、これは最適ｐＨが２．０かつ最適温度が５０〜６０℃であることを開示している。（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｘｙｌａｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ，  Ｉｔｏ，  Ｋ．，  Ｏｇａｓａｗａｒａ，  Ｈ．，  Ｓｕｇｏｍｏｔｏ  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ．，  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６  （４）：５４７−５５０，  Ａｐｒｉｌ  １９９２）。さらに、４〜５の範囲に最適ｐＨがある複数のキシラナーゼが報告されているが、多数のキシラナーゼは最適温度が上限１００℃までと報告されている。しかしながら、本発明者らの知る限り、本明細書中記載されるとおりの酵素は、本明細書中請求されるとおりのような低ｐＨかつ高温で活性を示すことが知られた初めての酵素である。上述に加えて、本発明者らは、エンドグルカナーゼが、同じ生物、すなわちアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９から精製されていることを知っているが、これはそれに加えてキシラナーゼ活性を有することが報告されている。この酵素は最適ｐＨ４．０かつ最適温度約８０℃を有したことが報告されている。これについては、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来の好熱好酸性エンドグルカナーゼ（ｃｅｌＢ）は、グリコシド加水分解酵素のファミリー５１に属するアラビノフラノシダーゼと高い配列類似性を示した（Ｅｃｋｅｒｔ  Ｋ．，  Ｓｎｙｄｅｒ  Ｅ．，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７０  （１７）：３５９３−３６０２，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，  ２００３）。この先行技術参照文献に記載されるとおりの前述のセルラーゼ前駆体は、以下に示す配列番号５の研究により最も理解される：
2009519005.tif 000003
【００４０】
本発明に関しては、極限環境微生物から単離された新規酵素は、以下に示すとおりの配列番号１を含むＮ−末端配列を有する：
ＤＶＶＳＴＰＩＳＭＥＩＱＶ
【００４１】
本発明の酵素のこのＮ−末端配列が配列番号５の４４位〜５６位に配列／相当することが注記される。
【００４２】
本発明において、本発明により意図されるとおりの極限環境微生物から単離された酵素は、以下に示す配列番号２に示されるとおりのものを含む：
ＱＡＳＳＳＩＶＧＮＡＬＡＱＡＡＳＬＳＰＴＩＳＡＹＬＲＱＮＧＬＳＰＳＤＬＡＲＴＷＳＳＹＹＣＴＱＦＤＤＰＱＧＡＡＱＴＡＬＡＴＲＩＣＮＤＱＡＬＧＧＧＡＰＴＡＳＡＴＩＴＶＮＴＡＡＲ
【００４３】
理解のことと思うが、この配列番号２は配列番号５に示されるとおりのｃｅｌＢ配列の１６６位〜２４８位に配列／相当する。配列番号２では２０７位、２０８位、２１２位、２２９位、および２３１位でアミノ酸が代わっていること、ならびに２０９位、２１３位、および２３０位でそれぞれアミノ酸が加わっていることが注記される
本発明において、本発明の酵素はさらに特性決定することができ、以下の配列番号３の研究により最も理解される：
ＧＬＮＡＡＶＷＤＳＧＬＮＳＱＴＶＩＳＥＶＱＡＬＨＰＡＬＩＲＷＰＧＧＳＩＳＤＭＤＹＮＷＥＴＮＴＲ
【００４４】
理解のことと思うが、配列番号３は、配列番号５の２５８位〜３０４位に配列／相当する。配列番号３では、位置番号２９５でアミノ酸が代わっており、２９６位にアミノ酸が加わっていることが注記される。
【００４５】
本発明において、本発明により意図されるとおりの酵素は、以下に示すとおりの配列番号４をさらに含む：
ＥＡＤＤＨＡＶＰＮＱＰＱＫＧＮＰＧＬＳＰＱＡＹＡＱＮＡＬＱＦＭＱＳＰＶＶＹＹＲ
【００４６】
配列番号４は、配列番号５の３７９位〜４１５位に配列／相当する。先の配列番号５に関して、本発明の配列番号４では４０９位、４１１位、および４１３位でそれぞれアミノ酸が代わっていることが理解される。なおそのうえ、さらなるアミノ酸が４１２位および４１４位〜４１５位にそれぞれ位置する。
【００４７】
上記された先行技術のＥｃｋｅｒｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒの参照では、多糖類分解活性を持つ細胞外好熱好酸性酵素の存在を決定する目的でアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９で研究を行ったことが、同じ論文の３５９６ページに見られる。著者らは、生物がキシランを含む様々な多糖類を唯一の炭素源およびエネルギー源として利用することがわかったと記した。しかしながら、著者らは、培養上清のキシラナーゼ活性を検出するにいたらなかった。著者らは、酵素が細胞に伴うと仮定して無処置の細胞からＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００でキシラン分解活性を伴うセルロース分解活性を抽出することに成功した。著者らは、培養が増殖の定常期に達した後でさえセルロース分解活性およびそれに付随するキシラナーゼ活性が細胞に束縛されたままであることを観測した。対照的に、本発明の極限環境微生物から単離された８０℃以上の温度かつ２未満のｐＨで最適酵素活性を示す酵素は、水溶性と判断され、さらに細胞上清から単離されている。
【００４８】
本発明はまた、ヘミセルラーゼの調製法にも関し、これはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９源を提供する工程、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９を上清がある微生物栄養培地で培養する工程、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの細胞を栄養培地上清から分離する工程、ならびに栄養培地上清からのアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９に由来するヘミセルラーゼを回収精製する工程を含む。本方法は、記載されるとおり、ヘミセルラーゼを製造し、これは水溶性でｐＨ約２未満かつ約８０℃より高い温度で顕著な酵素活性を示す。記載されるとおりの本方法において、ヘミセルラーゼは配列番号：１、２、３、および／または４に示されるとおりの配列を含む。なおさらに、記載されるとおりの本方法において、用いる栄養培地はさらに、約１ｇ／ｌのキシラン、約１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、約５．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、約０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１．７４ｍＭのＮａ２ＳＯ４、約２５ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ２、約６．６ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２、約２．０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４、約０．５ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４、約０．５ｍｇ／ｌのホウ酸、約５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ３、約０．１５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４、約０．０２５ｍｇ／ｌのＮａＭｏＯ４、約０．０５ｍｇ／ｌのＣｏＮＯ３、約０．０２ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２、約０．０８ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、約０．０１ｍｇ／ｌの葉酸、約０．１ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、約０．０４ｍｇ／ｌのリボフラビン、約０．０８ｍｇ／ｌのニコチンアミド、約０．０８ｍｇ／ｌのｐ-アミノ安息香酸、約０．０１ｍｇ／ｌのビオチン、約０．０００４ｍｇ／ｌのシアノコバラミン、約０．０８ｍｇ／ｌのＤ-パントテン酸-Ｃａ、約０．０２ｍｇ／ｌのミオイノシトール、約０．０５ｍｇ／ｌのコリンブロミド、約０．０２ｍｇ／ｌのオロト酸一ナトリウム、および約０．１ｍｇ／ｌのスペルミジンを含み、ここで得られる栄養培地はｐＨ約３．５に調整される。本出願で先に記載したとおり、本発明の酵素は様々なプロセスに用いることができる。したがって、上記の方法は、回収精製したヘミセルラーゼを同時糖化発酵プロセスに供給してバイオマス多糖類の最終生成物への変換を促進する工程を含む。上記のとおりの酵素を用いるプロセスの１つは、回収精製したヘミセルラーゼまたはタンパク質の大部分がヘミセルラーゼからなる生物から調製した粗酵素調製物とともにバイオマススラリーを前処理してバイオマススラリー中に存在するオリゴマーおよび／または多糖類を分解して最終生成物を産生する工程を含む。
【００４９】
上記の酵素を用いる方法として他に考えられるものを用いてもよい。例えば、極限環境微生物から単離された酵素は、多糖類を加水分解する方法に用いてもよく、この方法は、極限環境微生物由来の水溶性ヘミセルラーゼを提供する工程、およびｐＨ約２未満で水溶性ヘミセルラーゼを用いて多糖類を加水分解する工程を含む。上記に記載されたとおり、水溶性ヘミセルラーゼは約８０℃の温度で最適酵素活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
操作
本発明の記載される実施形態の操作は容易に明らかになると信じてここで簡単に要約する。
【００５１】
記載されるとおり、極限環境微生物から単離された約８０℃かつ約２未満のｐＨで最適酵素活性を示す酵素は、配列番号：２〜４、それぞれの研究により最も理解される。単離された酵素は、バイオマスの処理法において有用であり、この方法は、バイオマス糖を含むバイオマス源を提供する工程、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ２７００９由来の水溶性ヘミセルラーゼとともにバイオマスを前処理して最終生成物を産生する工程を含む。本発明の方法において、バイオマス糖は多糖類を含み、ヘミセルラーゼがこの多糖類を加水分解する。上記に記載のとおり、ヘミセルラーゼは約２未満のｐＨかつ約８０℃より高温で酵素活性を示す。
【００５２】
本発明により意図されるとおりのヘミセルラーゼは、約１２０ｋＤａの分子量を有する。上記に記載されるとおりの方法において、この方法は、ヘミセルラーゼの存在下または不在下でバイオマスを前処理する工程、順次加水分解発酵プロセスを提供してバイオマス糖を最終生成物に変換する工程、およびヘミセルラーゼを順次加水分解発酵プロセスに供給してバイオマス糖から最終生成物への変換を促進する工程をさらに含む。上記で記載のとおりのバイオマスを前処理する工程（これはヘミセルラーゼの存在下または不在下で過酷さを減らして行うことが出来る）後に、この方法は、同時糖化発酵プロセスを提供してバイオマス糖を最終生成物に変換する工程、およびヘミセルラーゼを同時糖化発酵プロセスに噴射してバイオマス糖から最終生成物への変換を促進する工程をさらに含む。
【００５３】
したがって、上記で記載のとおりの本発明の酵素および方法が、先行技術の酵素およびこれまで用いられてきた慣行に付随する欠点の多くを回避し、そして様々な有害廃棄物を生み出し高い前処理の過酷さを達成するために高温高圧および大量の酸を必要とするため全プロセスのコストが増加する傾向があった前処理工程の過酷さを減少させながら同時に様々な所望の最終生成物を生成する簡便な手段を提供することがわかるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
本発明の好適な実施形態を、以下の添付の図面を参照して以下に記載する。
【図１】本発明により提供されるセルラーゼ活性への温度の影響を示す図である。
【図２】ｐＨ４．０での、本発明により提供されるセルラーゼ活性への温度の影響を示す図である。
【図３】６０℃での、本発明のセルラーゼ活性へのｐＨの影響を示す図である。
【図４】６０℃での、本発明のキシラナーゼ活性へのｐＨの影響を示す図である。
【図１】
2009519005.tif 000004
【図２】
2009519005.tif 000005
【図３】
2009519005.tif 000006
【図４】
2009519005.tif 000007
【配列表】
2009519005000001.app