(57)【要約】本発明はＶＰＡＣ２受容体を選択的に活性化し、糖尿病の治療に有用であるペプチドを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストであって、
配列番号１７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＲＡｉｂＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＫＡｉｂＯｒｎ、
配列番号１８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｙ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＫ（Ｗ）Ｏｒｎ、
配列番号２０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＣＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＣＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＫ（Ｗ）ＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＫ（Ｗ）ＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＫ（Ｗ）ＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＫ（Ｗ）ＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＣＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＫ（Ｗ）ＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号４３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＣＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＣＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＣＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号９４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号９５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号９６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＣＯｒｎＯｒｎ、
配列番号９７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｏｒｎ、
配列番号９８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｏｒｎ、
配列番号９９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＫ（Ｗ）ＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１００：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号１０５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＣＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＣＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号１１０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡｂｕＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１１１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、及び
配列番号１１２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＫ（Ｗ）ＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
から選択される１つの配列と、Ｃ末端延長部分とを含んでなり、
当該Ｃ末端延長部分のＮ末端が上記ペプチド配列のＣ末端と結合し、当該Ｃ末端延長部分が
式３（配列番号３）：
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12
で表されるアミノ酸配列
（式中、
Ｘａａ1がＧｌｙ、Ｃｙｓ又は存在せず、
Ｘａａ2がＧｌｙ、Ａｒｇ又は存在せず、
Ｘａａ3がＰｒｏ、Ｔｈｒ又は存在せず、
Ｘａａ4がＳｅｒ又は存在せず、
Ｘａａ5がＳｅｒ又は存在せず、
Ｘａａ6がＧｌｙ又は存在せず、
Ｘａａ7がＡｌａ又は存在せず、
Ｘａａ8がＰｒｏ又は存在せず、
Ｘａａ9がＰｒｏ又は存在せず、
Ｘａａ10がＰｒｏ又は存在せず、
Ｘａａ11がＳｅｒ、Ｃｙｓ又は存在せず、及び
Ｘａａ12がＣｙｓ又は存在せず、
Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12の少なくとも５つが存在し、
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10又はＸａａ11が不在である場合、その下流にある次のアミノ酸はＣ末端延長部分の次のアミノ酸であり、
Ｃ末端のアミノ酸はアミド化されてもよい）
を含んでなり、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＣｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＬｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＫ（Ｗ）を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）を含んでなるか若しくは
当該ペプチドアゴニストのカルボキシ末端アミノ酸がＰＥＧ分子と共有結合するか、
又はそれらの組み合わせである、
前記ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項２】
前記Ｃ末端延長部分が以下から選択される、請求項１記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【表１】
2009519212.tif 000022
【請求項３】
前記Ｃ末端延長部分が配列番号１１又は配列番号１２で表される、請求項２記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項４】
少なくとも１分子のＰＥＧが前記Ｃ末端延長部分の残基に共有結合している、請求項１記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項５】
前記ＰＥＧが分岐状の分子である、請求項１から４のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項６】
前記ＰＥＧが直鎖状の分子である、請求項１から４のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項７】
各ＰＥＧ分子が２０，０００、３０，０００、４０，０００又は６０，０００Ｄａの分子量である、請求項１から６のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項８】
前記ペプチドアゴニストのＮ末端に更にＮ末端修飾を有してなる、請求項１から７のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストであって、当該Ｎ末端修飾が以下から選択される、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト：
（ａ）Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン又はノルロイシンの付加、
（ｂ）Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（配列番号９３）の配列を含んでなるペプチドの付加（式中、ＡｒｇがペプチドアゴニストのＮ末端と結合する）、
（ｃ）独立にアリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3基から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよいＣ1−Ｃ16アルキルの付加、
（ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ1の添加（式中、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ16アルキル（アリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン−ＳＨ及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、アリール（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、アリールＣ1−Ｃ4アルキル（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、−ＮＲ2Ｒ3（式中、Ｒ2及びＲ3は独立に水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アリール又はアリールＣ1−Ｃ4アルキルである）であるか、−ＯＲ4（Ｒ4はＣ1−Ｃ16アルキル（アリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリール（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）、又はアリールＣ1−Ｃ4アルキル（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、又は５−ピロリジン−２−オンである）、
（ｅ）−ＳＯ2Ｒ5の付加（式中、Ｒ5はアリール、アリールＣ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ16アルキルである）、
（ｆ）Ｃ1−Ｃ6アルキル又は−ＳＲ6で任意に置換されてもよいスクシンイミド基の形成（式中、Ｒ6は水素又はＣ1−Ｃ6アルキルである）、
（ｇ）メチオニンスルホキシドの付加、
（ｈ）ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）の付加及び
（ｉ）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加。
【請求項９】
前記Ｎ末端修飾がアセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2から選択される基の付加である、請求項８記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項１０】
前記Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加である、請求項９記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項１１】
以下から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニスト。
【表２】
2009519212.tif 000023
【表３】
2009519212.tif 000024
【表４】
2009519212.tif 000025
【表５】
2009519212.tif 000026
【表６】
2009519212.tif 000027
【請求項１２】
以下から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニスト。
【表７】
2009519212.tif 000028
【表８】
2009519212.tif 000029
【請求項１３】
以下の式で表される配列：
式４（配列番号４）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｔｈｒ−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｘａａ12−Ｘａａ13−Ｘａａ14−Ｘａａ15−Ｘａａ16−Ｘａａ17−Ｘａａ18−Ａｂｕ−Ｘａａ20−Ｘａａ21−Ｘａａ22−Ｘａａ23−Ｘａａ24−Ｘａａ25−Ｘａａ26−Ｘａａ27−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｘａａ30−Ｘａａ31−Ｘａａ32−Ｘａａ33−Ｘａａ34−Ｘａａ35−Ｘａａ36−Ｘａａ37−Ｘａａ38−Ｘａａ39−Ｘａａ40
［式中、
Ｘａａ1はＨｉｓ、ｄＨであるか又は存在せず、
Ｘａａ2はｄＡ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ｄＳ、Ｐｒｏ又はＡｉｂであり、
Ｘａａ3はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｘａａ4はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ｄＡ、Ａｉｂ又はＮＭｅＡであり、
Ｘａａ5はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ｄＶ、Ａｉｂ又はＮＭｅＶであり、
Ｘａａ6はＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、
Ｘａａ8はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり、
Ｘａａ9はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ10はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＬｙｓであり、
Ｘａａ12はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ａｉｂ、Ｃｉｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ又はＣｙｓであり、
Ｘａａ13はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ14はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＣｙｓであり、
Ｘａａ15はＬｙｓ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｋ（Ａｃ）Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ16はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ17はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ18はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｋ（Ｗ）、Ａｂｕ又はＮｌｅであり、
Ｘａａ20はＬｙｓ、Ｇｌｎ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｋ（Ａｃ）Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ21はＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｋ（Ａｃ）、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ22はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ23はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ24はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ25はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ26はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ27はＬｙｓ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｏｒｎ、ｄＫ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ28はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｃｉｔ、Ｐｒｏ、ｄＫ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ29はＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ｈＲ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ａｉｂ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ30はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ｈＲ、Ｃｉｔ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ31はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ32はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ33はＴｒｐであるか又は存在せず、
Ｘａａ34はＣｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ35はＧｌｕであるか又は存在せず、
Ｘａａ36はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ37はＧｌｙであるか又は存在せず、
Ｘａａ38はＴｒｐであるか又は存在せず、
Ｘａａ39はＣｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ40はＡｒｇであるか又は存在せず、
式中、Ｘａａ29、Ｘａａ30、Ｘａａ31、Ｘａａ32、Ｘａａ33、Ｘａａ34、Ｘａａ35、Ｘａａ36、Ｘａａ37、Ｘａａ38又はＸａａ39が不在である場合、その下流にある次のアミノ酸はペプチドアゴニスト配列における次のアミノ酸である］
と、
Ｃ末端延長部分とを含んでなり、当該Ｃ末端延長部分のＮ末端は式４のペプチドのＣ末端と結合し、当該Ｃ末端延長部分は以下の式のアミノ酸配列：
式３（配列番号３）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12
［式中、
Ｘａａ1はＧｌｙ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ2はＧｌｙ、Ａｒｇであるか又は存在せず、
Ｘａａ3はＰｒｏ、Ｔｈｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ5はＳｅｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ6はＧｌｙであるか又は存在せず、
Ｘａａ7はＡｌａであるか又は存在せず、
Ｘａａ8はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ9はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ10はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ11はＳｅｒ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ12はＣｙｓであるか又は存在せず、
Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの少なくとも５つは存在し、
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10又はＸａａ11が不在である場合、その下流にある次のアミノ酸はＣ末端延長部分における次のアミノ酸であり、
Ｃ末端のアミノ酸はアミド化されてもよい］
を含んでなり、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＣｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＬｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＫ（Ｗ）を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）を含んでなるか、もしくは
当該ペプチドアゴニストのカルボキシ末端アミノ酸がＰＥＧ分子に共有結合して付着するか、または
それらの組み合わせを含んでなる、
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト、並びに製薬的に許容し得る希釈剤、担体及び賦形剤のうちの１つ以上を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
医薬としての使用のための、請求項１から１３のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【請求項１６】
インスリン非依存性糖尿病の治療のための医薬の製造のための、請求項１から１３のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用。
【請求項１７】
インスリン依存性糖尿病の治療のための医薬の製造のための、請求項１から１３のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか１項記載のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを投与することを含んでなる、そのような処置を必要とする患者の糖尿病の治療方法。
【請求項１９】
前記糖尿病がインスリン非依存性糖尿病である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記糖尿病がインスリン依存性糖尿病である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
実施例において実質的に記載されたＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに関する。
【０００２】
具体的には本発明は、１分子以上のポリエチレングリコール分子又はその誘導体と共有結合している、選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
２型糖尿病又はインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は最も一般的な糖尿病であり、糖尿病に罹患する患者の９０％に影響を及ぼす。ＮＩＤＤＭにより、患者体内のβ細胞の機能が低下し、不十分なインスリン産生及び／又はインスリン感受性の減少に至る。ＮＩＤＤＭが制御されない場合、血液中グルコース量が過剰となり、高血糖をもたらす。時間の経過により更に深刻な合併症に至ることもあり、それにより腎臓機能不全、心血管障害、視覚の損失、下肢潰瘍化、神経障害及び虚血などが生じうる。ＮＩＤＤＭの治療法としては、様々な経口薬の使用のほかに、食事、運動及び体重管理の改善などが挙げられる。ＮＩＤＤＭに罹患する個人はまず、かかる経口薬を服用することにより、血糖値を制御できる。しかしながら、これらの処置では、ＮＩＤＤＭ患者において生じるβ細胞の機能の亢進歩的な損失は抑えられず、ゆえに疾患後の段階における血糖値を十分に制御することができない。また、現在利用可能な薬物治療は、ＮＩＤＤＭ患者を、例えば低血糖症、胃腸障害、体液貯留、浮腫及び／又は体重増加などの副作用の危険にさらすこととなる。
【０００４】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）は、セクレチン及びグルカゴンと同じペプチドファミリーに属する。ＰＡＣＡＰ及びＶＩＰは、ｃＡＭＰの媒介及び他のＣａ2+の媒介によるシグナル伝達経路を経て、３つのＧタンパク質共役受容体によって活性化する。これらの受容体は、ＰＡＣＡＰ嗜好性のタイプ１（ＰＡＣ１）受容体（非特許文献１及び２）及び２つのＶＩＰ共有型のタイプ２受容体（ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２）（非特許文献３から８）として公知である。一連のＰＡＣＡＰのアナログは特許文献１及び２に開示される。
【０００５】
ＰＡＣＡＰは３つの受容体全てに対する顕著な活性化能を有する一方で、ＶＩＰは選択的に２つのＶＰＡＣ受容体を活性化する（非特許文献９）。両方のＶＩＰ及びＰＡＣＡＰは、それらを静脈注射で提供したとき、ヒトのインスリン分泌を刺激するのみならず、グルカゴン分泌及び肝臓からのグルコース放出を増加させることが知られている（非特許文献１０及び１１）。但し、ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰ刺激は結果的には、全体的には血糖症を改善させない。ＰＡＣＡＰ又はＶＩＰによる多くの受容体の活性化は、神経、内分泌腺、心血管、再生機構、筋肉及び免疫系に幅広い生理的影響を及ぼす（非特許文献１２）。またＶＩＰにより誘導されたラットの下痢は、ＶＰＡＣ受容体のうちの１つ（ＶＰＡＣ１）のみにより媒介されることが示唆されている（非特許文献１３および９）。ＶＰＡＣ１及びＰＡＣ１受容体はα細胞及び肝細胞において発現し、すなわち肝臓からのグルコース放出をもたらす効果に関与するものと考えられる。
【０００６】
エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ、学名：Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  Ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に含まれる物質である（非特許文献１４）。３９のアミノ酸からなるペプチドであり、グルコース依存性のインスリン分泌を促進する活性を有する。具体的なＰＥＧ化エキセンディン及びエキセンジンアゴニストペプチドは、特許文献３中に記載されている。
【０００７】
最近の研究では、ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチドが、胃腸（ＧＩ）における副作用をもたらさず、グルカゴン放出及び肝臓グルコース放出を増加させずに、膵臓からのインスリン分泌を促進できることが示されている（非特許文献９）。ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチドは最初は、ＶＩＰ及び／又はＰＡＣＡＰの修飾により同定された（例えば非特許文献１５及び９、並びに特許文献４及び５、を参照）。
【０００８】
しかしながら現在までに報告されているＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの多くは効果、選択性及び安定性プロフィールに関して問題があり、それらの臨床的な使用可能性が限られている。更に、これらのペプチドの多くは、製剤中における当該ポリペプチドの安定性、並びにｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらのポリペプチドの半減期が短いこと、などの問題から、商業的に利用するための候補としては不適当である。更に、幾つかのＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストがジペプチジル−ペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）の作用により不活性となることが確認されている。すなわち短い血清中半減期は、治療薬としてのこれらのアゴニストの使用の妨げとなりうる。したがって、ＮＩＤＤＭ薬剤に関連する現在直面する課題を解決する、新規な治療方法に対するニーズが存在する。
【非特許文献１】Ｉｓｏｂｅ，ら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，１１０：２１３−２１７（２００３）、
【非特許文献２】Ｏｇｉ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９６：１５１１−１５２１（１９９３）
【非特許文献３】Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，２１：６１９−６７０（２０００）、
【非特許文献４】Ｈａｍｍａｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ，５０：２６５−２７０（１９９８）、
【非特許文献５】Ｃｏｕｖｉｎｅａｕ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：２４７５９−２４７６６（２００３）、
【非特許文献６】Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９３：５４６−５５３（１９９３）、
【非特許文献７】Ｌｕｔｚ，ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４５８：１９７−２０３（１９９９）、
【非特許文献８】Ａｄａｍｏｕ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０９：３８５−３９２（１９９５）
【非特許文献９】Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２）
【非特許文献１０】Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１０：４８１−４８４（１９８９）
【非特許文献１１】Ｆｉｌｉｐｓｓｏｎら、ＪＣＥＭ，８２：３０９３−３０９８（１９９７）
【非特許文献１２】Ｇｏｚｅｓら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６：１０１９−１０３４（１９９９）
【非特許文献１３】Ｉｔｏら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２２：１１３９−１１５１（２００１）、Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：１４５３−１４６０（２００２）
【非特許文献１４】Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１）：７４０２−７４０５（１９９２）
【非特許文献１５】Ｘｉａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１：６２９−６３３（１９９７）、
【特許文献１】米国特許第６２４２５６３号
【特許文献２】国際公開第２０００／０５２６０号
【特許文献３】国際公開第２０００／６６６２９号
【特許文献４】国際公開第０１／２３４２０号
【特許文献５】国際公開第２００４／０６８３９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＶＰＡＣ２受容体に選択的であり、高い血糖値が示される場合には膵臓からのインスリン分泌を誘導する、改良された化合物の提供に関する。本発明の化合物は、β細胞の機能を向上させると考えられるペプチドである。これらのペプチドは、ＧＩ副作用又はそれに対応する肝臓からのグルコース放出の増加を伴わずに、インスリン分泌を誘導する生理的効果を有し、更に公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、ペプチドの選択性、効力及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が全体的に向上している。
【００１０】
本発明はまた、クリアランスが低く、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が改善された、選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。本発明のアゴニストは、長い期間内に最小限の回数で投与されることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様では、
配列番号１７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＲＡｉｂＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＫＡｉｂＯｒｎ、
配列番号１８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｙ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＫ（Ｗ）Ｏｒｎ、
配列番号２０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＣＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＣＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号２９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＫ（Ｗ）ＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＫ（Ｗ）ＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＫ（Ｗ）ＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＫ（Ｗ）ＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号３９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＣＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＫ（Ｗ）ＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号４３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＣＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＣＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号４５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＣＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号９４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号９５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号９６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＣＯｒｎＯｒｎ、
配列番号９７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｏｒｎ、
配列番号９８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｏｒｎ、
配列番号９９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＫ（Ｗ）ＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１００：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＶＡＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０３：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０４：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号１０５：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＣＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０６：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎＣ、
配列番号１０７：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０８：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＣＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１０９：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＳＩＯｒｎＣＯｒｎ、
配列番号１１０：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡｂｕＡＡｉｂＯｒｎＹＬＱＳＩＯｒｎＯｒｎ、
配列番号１１１：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）ＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、及び
配列番号１１２：ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＫ（Ｗ）ＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎ、
から選択される１つの配列と、Ｃ末端延長部分とを含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。当該Ｃ末端延長部分のＮ末端は上記ペプチド配列のＣ末端と結合し、当該Ｃ末端延長部分は
式３（配列番号３）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12
で表されるアミノ酸配列である。
式中、Ｘａａ1はＧｌｙ、Ｃｙｓ又は存在せず、
Ｘａａ2はＧｌｙ、Ａｒｇ又は存在せず、
Ｘａａ3はＰｒｏ、Ｔｈｒ又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒ又は存在せず、
Ｘａａ5はＳｅｒ又は存在せず、
Ｘａａ6はＧｌｙ又は存在せず、
Ｘａａ7はＡｌａ又は存在せず、
Ｘａａ8はＰｒｏ又は存在せず、
Ｘａａ9はＰｒｏ又は存在せず、
Ｘａａ10はＰｒｏ又は存在せず、
Ｘａａ11はＳｅｒ、Ｃｙｓ又は存在せず、及び
Ｘａａ12はＣｙｓ又は存在せず、
Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12の少なくとも５つは存在し、
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10又はＸａａ11が不在である場合、その下流にある次のアミノ酸はＣ末端延長部分の次のアミノ酸であり、Ｃ末端のアミノ酸はアミド化されてもよく、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＣｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＬｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＫ（Ｗ）を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子と共有結合する少なくとも１つのＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）を含んでなるか若しくは
当該ペプチドアゴニストのカルボキシ末端アミノ酸がＰＥＧ分子と共有結合するか、
又はそれらの組み合わせである。
【００１２】
好ましくは、式３のＣ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの少なくとも６個は存在する。好ましくは、当該Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの少なくとも７、８、９、１０、１１又は全てが存在する。
【００１３】
好ましくは、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分は、以下から選択される。
【表１】
2009519212.tif 000002
【００１４】
更に好ましくは、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分は、配列番号１１又は配列番号１２の配列を有する。
【００１５】
本発明の第１の態様に従ってＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのいかなる位置のいかなるＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）残基に、１つ以上のＰＥＧ分子を共有結合させてもよい。
【００１６】
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが配列番号２２、２３、３９、４２、４３、４４、４５、９５、９６、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８及び１０９から選択される配列を有する場合、システイン残基がＰＥＧ化されているのが好ましい。
【００１７】
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが配列番号１９、３４、３５、３６、３８、４１、９９及び１１２から選択される配列を有する場合、Ｋ（Ｗ）残基がＰＥＧ化されているのが好ましい。
【００１８】
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが配列番号１８、２０、２１、３７、９４、９７、９８及び１１１から選択される配列を有する場合、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）残基がＰＥＧ化されているのが好ましい。
【００１９】
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストがＣ末端延長部分を有する場合、１つ以上のＰＥＧ分子が前記Ｃ末端延長部分の１つ以上のＣｙｓ残基に共有結合してもよい。配列番号１７〜４５及び９４〜１１２から選択される配列は、１つ以上のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）残基と、１つ以上のＣｙｓ残基を含むＣ末端延長部分を含んでなる場合、片方又は両方の配列中に１つ以上のＰＥＧ化された残基が存在してもよい。
【００２０】
好ましくは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分の残基に少なくとも１つのＰＥＧ分子が共有結合して存在する。
【００２１】
１を超えるＰＥＧ分子が存在する場合、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）、Ｋ（Ｗ）及びカルボキシ末端におけるＰＥＧ化アミノ酸の組合せが存在してもよい。例えば、２つのＰＥＧ分子が存在する場合、１つがＬｙｓ残基に結合し、もう１つがＣｙｓ残基に結合してもよい。
【００２２】
好ましくは、ＰＥＧ分子は分岐状である。あるいは、ＰＥＧ分子は直鎖状であってもよい。
【００２３】
好ましくは、ＰＥＧ分子は１，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量である。好ましくは、ＰＥＧ分子は１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００及び６０，０００Ｄａから選択される。更に好ましくは、２０，０００、３０，０００、４０，０００又は６０，０００Ｄａから選択される。本発明のペプチドアゴニストに共有結合するＰＥＧ分子が２つ存在する場合、各々は１，０００〜４０，０００Ｄａであり、好ましくは２０，０００及び２０，０００Ｄａ、１０，０００及び３０，０００Ｄａ、３０，０００及び３０，０００Ｄａ又は２０，０００及び４０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００２４】
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト配列は更に、当該ペプチドのＸａａ1の上流のＮ末端にヒスチジン残基を更に含んでなってもよい。
【００２５】
好ましくは、本発明の第１の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、ペプチドアゴニストのＮ末端においてＮ末端修飾を更に有し、当該Ｎ末端修飾は以下のものから選択される。
（ａ）Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン又はノルロイシンの付加、
（ｂ）Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（配列番号９３）の配列を含んでなるペプチドの付加（式中、ＡｒｇがペプチドアゴニストのＮ末端と結合する）、
（ｃ）独立にアリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3基から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよいＣ1−Ｃ16アルキルの付加、
（ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ1の添加（式中、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ16アルキル（アリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン−ＳＨ及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、アリール（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、アリールＣ1−Ｃ4アルキル（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、−ＮＲ2Ｒ3（式中、Ｒ2及びＲ3は独立に水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アリール又はアリールＣ1−Ｃ4アルキルである）であるか、−ＯＲ4（Ｒ4はＣ1−Ｃ16アルキル（アリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリール（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）、又はアリールＣ1−Ｃ4アルキル（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、又は５−ピロリジン−２−オンである）、
（ｅ）−ＳＯ2Ｒ5の付加（式中、Ｒ5がアリール、アリールＣ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ16アルキルである）、
（ｆ）Ｃ1−Ｃ6アルキル又は−ＳＲ6で任意に置換されてもよいスクシンイミド基の形成（式中、Ｒ6が水素又はＣ1−Ｃ6アルキルである）、
（ｇ）メチオニンスルホキシドの付加、
（ｈ）ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）の付加及び
（ｉ）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加。
【００２６】
好ましくは、当該Ｎ末端修飾は、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2から選択される基の付加である。当該Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加であるのが、特に好適である。
【００２７】
当業者であれば、配列番号１７〜４５及び９４〜１１２から選択される様々な組合せのペプチド配列を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト（本願明細書に記載のＣ末端延長部分及びＮ末端修飾）を、上記の開示に基づいて作製できることを認識するであろう。
【００２８】
本発明の第１の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、以下から選択されるアミノ酸配列を含んでなるのが好ましい。
【表２】
2009519212.tif 000003
【表３】
2009519212.tif 000004
【表４】
2009519212.tif 000005
【表５】
2009519212.tif 000006
【表６】
2009519212.tif 000007
【００２９】
より好ましい本発明の第１の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、配列番号４７、６４、６６、１１５、１１９、１２２、１２６、１３０及び１４４から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００３０】
本発明の第２態様は、以下から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。
【表７】
2009519212.tif 000008
【００３１】
より好ましい本発明の第２態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、配列番号８０又は配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなる。
【００３２】
本発明の第３の態様は、以下の式のアミノ酸配列：
式４（配列番号４）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｔｈｒ−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｘａａ12−Ｘａａ13−Ｘａａ14−Ｘａａ15−Ｘａａ16−Ｘａａ17−Ｘａａ18−Ａｂｕ−Ｘａａ20−Ｘａａ21−Ｘａａ22−Ｘａａ23−Ｘａａ24−Ｘａａ25−Ｘａａ26−Ｘａａ27−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｘａａ30−Ｘａａ31−Ｘａａ32−Ｘａａ33−Ｘａａ34−Ｘａａ35−Ｘａａ36−Ｘａａ37−Ｘａａ38−Ｘａａ39−Ｘａａ40
（式中、
Ｘａａ1はＨｉｓ、ｄＨであるか又は存在せず、
Ｘａａ2はｄＡ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ｄＳ、Ｐｒｏ又はＡｉｂであり、
Ｘａａ3はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｘａａ4はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ｄＡ、Ａｉｂ又はＮＭｅＡであり、
Ｘａａ5はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ｄＶ、Ａｉｂ又はＮＭｅＶであり、
Ｘａａ6はＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、
Ｘａａ8はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり、
Ｘａａ9はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ10はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＬｙｓであり、
Ｘａａ12はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ａｉｂ、Ｃｉｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ又はＣｙｓであり、
Ｘａａ13はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ14はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＣｙｓであり、
Ｘａａ15はＬｙｓ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、Ｋ（Ａｃ）Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ16はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ17はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ18はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｋ（Ｗ）、Ａｂｕ又はＮｌｅであり、
Ｘａａ20はＬｙｓ、Ｇｌｎ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｋ（Ａｃ）Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ21はＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｋ（Ａｃ）Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ22はＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ23はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ24はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ25はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ26はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｉｂ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ27はＬｙｓ、ｈＲ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ（イソプロピル）、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｏｒｎ、ｄＫ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であり、
Ｘａａ28はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、ｈＲ、Ｃｉｔ、Ｐｒｏ、ｄＫ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であり、
Ｘａａ29はＬｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ｈＲ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ａｉｂ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ30はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ｈＲ、Ｃｉｔ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ31はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ32はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ33はＴｒｐであるか又は存在せず、
Ｘａａ34はＣｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ35はＧｌｕであるか又は存在せず、
Ｘａａ36はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ37はＧｌｙであるか又は存在せず、
Ｘａａ38はＴｒｐであるか又は存在せず、
Ｘａａ39はＣｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ40はＡｒｇであるか又は存在せず、
式中、Ｘａａ29、Ｘａａ30、Ｘａａ31、Ｘａａ32、Ｘａａ33、Ｘａａ34、Ｘａａ35、Ｘａａ36、Ｘａａ37、Ｘａａ38又はＸａａ39が不在である場合、その下流にある次のアミノ酸はペプチドアゴニスト配列における次のアミノ酸である）
と、Ｃ末端延長部分とを含んでなり、当該Ｃ末端延長部分のＮ末端は式４のペプチドのＣ末端と結合し、当該Ｃ末端延長部分は以下の式のアミノ酸配列：
式３（配列番号３）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12
（式中、Ｘａａ1はＧｌｙ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ2はＧｌｙ、Ａｒｇであるか又は存在せず、
Ｘａａ3はＰｒｏ、Ｔｈｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ5はＳｅｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ6はＧｌｙであるか又は存在せず、
Ｘａａ7はＡｌａであるか又は存在せず、
Ｘａａ8はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ9はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ10はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ11はＳｅｒ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ12はＣｙｓであるか又は存在せず、
Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの少なくとも５つは存在し、
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10又はＸａａ11が不在である場合、その下流にある次のアミノ酸はＣ末端延長部分における次のアミノ酸であり、
Ｃ末端アミノ酸はアミド化されてもよい）
を含んでなり、
当該ペプチドアゴニストがＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＣｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストがＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＬｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストがＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＫ（Ｗ）を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストがＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）を含んでなるか、
若しくは当該ペプチドアゴニストのカルボキシ末端アミノ酸がＰＥＧ分子に共有結合して付着するか、又は、
それらの組み合わせを含んでなる、
ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。
【００３３】
好ましくは、第３の本発明の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式４（配列番号４）の配列を含んでなる。
ここで、
Ｘａａ3はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｘａａ8はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｘａａ9はＡｓｎ又はＧｌｎであり、
Ｘａａ10はＴｙｒ又はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり、
Ｘａａ12はＡｒｇ、ｈＲ、Ｌｙｓ又はＯｒｎであり、
Ｘａａ14はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｉｂ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｙｓ、Ａｌａ又はＬｅｕであり、
Ｘａａ15はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ又はＡｒｇであり、
Ｘａａ16はＧｌｎ又はＬｙｓであり、
Ｘａａ17はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ又はＮｌｅであり、
Ｘａａ20はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、
Ｘａａ21はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、
Ｘａａ23はＬｅｕ又はＡｉｂであり、Ｘａａ25はＳｅｒ又はＡｉｂであり、
Ｘａａ27はＬｙｓ、Ｏｒｎ、ｈＲ又はＡｒｇであり、
Ｘａａ28はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ｈＲ、Ａｉｂ、Ｏｒｎ又はＰｒｏであり、
Ｘａａ29はＬｙｓ、Ｏｒｎ、ｈＲであるか又は存在しない。
【００３４】
好ましくは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、式４（配列番号４）の配列を含んでなり、式中、Ｘａａ23又はＸａａ25はＡｉｂである。更に好ましくは、Ｘａａ23及びＸａａ25の両方がＡｉｂである。
【００３５】
好ましくは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｘａａ14又はＸａａ15がＡｉｂである式４の配列を含んでなる。
【００３６】
あるいは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｘａａ20又はＸａａ21がＡｉｂである式４の配列を含んでなる。
【００３７】
より好ましくは、Ｘａａ14又はＸａａ15がＡｉｂであり、Ｘａａ20又はＸａａ21がＡｉｂである。Ｘａａ15がＡｉｂで、Ｘａａ20がＡｉｂであるのが特に好ましい。
【００３８】
好ましくは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、Ｘａａ15がＡｉｂであり、Ｘａａ20がＡｉｂであり、Ｘａａ12、Ｘａａ21、Ｘａａ27及びＸａａ28が全てＯｒｎである式４の配列を含んでなる。好ましくは、Ｘａａ15はＡｉｂであり、Ｘａａ20はＡｉｂであり、Ｘａａ12、Ｘａａ21、Ｘａａ27及びＸａａ28は全てＯｒｎであり、Ｘａａ8はＧｌｕであり、Ｘａａ9はＧｌｎであり、Ｘａａ10はＴｙｒ（ＯＭｅ）である。更に好ましくは、Ｘａａ15はＡｉｂであり、Ｘａａ20はＡｉｂであり、Ｘａａ12、Ｘａａ21、Ｘａａ27及びＸａａ28は全てＯｒｎであり、Ｘａａ8はＧｌｕであり、Ｘａａ9はＧｌｎであり、Ｘａａ10はＴｙｒ（ＯＭｅ）であり、Ｘａａ23及び／又はＸａａ25はＡｉｂである。Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、Ｘａａ12、Ｘａａ15、Ｘａａ20、Ｘａａ21、Ｘａａ23、Ｘａａ25、Ｘａａ27及びＸａａ28のうちの１つ以上が、ＰＥＧ化されたＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ、ＣＨ2）2ＳＨ）又はＫ（Ｗ）であってもよく、その他の全ての位置において上記したような適切なアミノ酸置換がなされてもよい。
【００３９】
好ましくは、式３のＣ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの少なくとも６つが存在する。好ましくは、Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの７、８、９、１０、１１個又は全てが存在する。
【００４０】
好ましくは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択される配列で表される。
【００４１】
好ましくは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分は、配列番号１１又は配列番号１２で表される。
【００４２】
１つ以上のＰＥＧ分子を、本発明の第３の態様に係るＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの任意に位置において、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）のいずれの残基に共有結合させてもよい。Ｃ末端延長部分は、ＰＥＧ化してもよい１つ以上のＣｙｓ残基を含んでなっていてもよい。式４による配列が１つ以上のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）残基を含み、Ｃ末端延長部分が１つ以上のＣｙｓ残基を含む場合、１つ以上のＰＥＧ化残基を片方又は両方の配列中に存在させてもよい。
【００４３】
好ましくは、少なくとも１つのＰＥＧ分子が式４の残基に共有結合して存在する。好ましくは、１つ以上のＰＥＧ分子が、式４の９、１３、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２４、２５、２６及び２８の位置の残基と共有結合して存在する。
【００４４】
好ましくは、少なくとも１つのＰＥＧ分子が、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分の残基に共有結合して存在する。
【００４５】
１を超えるＰＥＧ分子を存在させる場合、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）Ｋ（Ｗ）及びカルボキシ末端アミノ酸におけるＰＥＧ化を組合せてもよい。２つのＰＥＧ分子を存在させる場合、例えば１つをＬｙｓ残基に結合させ、もう１つをＣｙｓ残基に結合させてもよい。
【００４６】
好ましくは、当該ＰＥＧ分子は分岐状である。あるいは、当該ＰＥＧ分子は直鎖状であってもよい。
【００４７】
好ましくは、当該ＰＥＧ分子は１，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの分子量である。好ましくは、当該ＰＥＧ分子は１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００及び６０，０００Ｄａのものから選択される。更に好ましくは、２０，０００、３０，０００、４０，０００又は６０，０００Ｄａのものから選択される。本発明のペプチドアゴニストに共有結合するＰＥＧ分子が２つ存在する場合、各々１，０００〜４０，０００Ｄａであってもよく、好ましくは２０，０００及び２０，０００Ｄａ、１０，０００及び３０，０００Ｄａ、３０，０００及び３０，０００Ｄａ又は２０，０００及び４０，０００Ｄａの分子量である。
【００４８】
好ましくは、本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはペプチドアゴニストのＮ末端においてＮ末端修飾を更に含んでなり、当該Ｎ末端修飾は以下から選択される。
（ａ）Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン又はノルロイシンの付加、
（ｂ）Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（配列番号９３）の配列を含んでなるペプチドの付加（式中、ＡｒｇがペプチドアゴニストのＮ末端と結合する）、
（ｃ）独立にアリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよいＣ1−Ｃ16アルキルの付加、
（ｄ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ1の添加（式中、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ16アルキル（アリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン−ＳＨ及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、アリール（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、アリールＣ1−Ｃ4アルキル（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、−ＮＲ2Ｒ3（式中、Ｒ2及びＲ3は独立に水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アリール又はアリールＣ1−Ｃ4アルキルである）であるか、−ＯＲ4（Ｒ4はＣ1−Ｃ16アルキル（アリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）、アリール（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）、又はアリールＣ1−Ｃ4アルキル（Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン及び−ＣＦ3から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい）であるか、又は５−ピロリジン−２−オンである）、
（ｅ）−ＳＯ2Ｒ5の付加（式中、Ｒ5がアリール、アリールＣ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ16アルキルである）、
（ｆ）Ｃ1−Ｃ6アルキル又は−ＳＲ6で任意に置換されてもよいスクシンイミド基の形成（式中、Ｒ6が水素又はＣ1−Ｃ6アルキルである）、
（ｇ）メチオニンスルホキシドの付加、
（ｈ）ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）の付加及び
（ｉ）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加。
【００４９】
好ましくは、当該Ｎ末端修飾は、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2から選択される基の付加である。当該Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加であるのが、特に好適である。
【００５０】
当業者であれば、本願明細書に記載したような式４のペプチド配列、Ｃ末端延長部分及びＮ末端修飾を様々な組合せで含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを、上記の開示に基づいて作製できると認識するであろう。
【００５１】
本発明の第３の態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、配列番号５９、６２、６４、６５、６６、７１、７２、７３、７４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１４１、１４４、１４６及び１４８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるのが好ましい。
【００５２】
本発明の第４の態様にしたがい、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト及び１つ以上の製薬的に許容し得る希釈剤、担体及び／又は賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明の第５の態様にしたがい、医薬としての使用のための、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを提供する。
【００５４】
本発明の第６の態様にしたがい、インスリン非依存性糖尿病の治療のための医薬の製造のための、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用を提供する。
【００５５】
本発明の更に別の態様では、インスリン依存性糖尿病の治療のための医薬の製造のための、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの使用を提供する。
【００５６】
本発明は、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト投与することを含んでなる、そのような処置を必要とする患者における糖尿病の治療方法を提供し、該糖尿病はインスリン非依存性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病であってよい。
【００５７】
本発明は更に、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを含んでなる、インスリン非依存性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病の治療用の医薬組成物を提供する。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、配列番号１７〜４５及び９４〜１１２から選択される１つの配列と、Ｃ末端延長部分であって、そのＣ末端延長部分のＮ末端が上記ペプチド配列のＣ末端と結合するＣ末端延長部分を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを提供する。当該Ｃ末端延長部分は、以下の式のアミノ酸配列を含んでなる。
式１（配列番号１）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12−Ｘａａ13
（式中、
Ｘａａ1はＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ2はＧｌｙ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ3はＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ5はＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ6はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ7はＡｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ8はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ9はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ10はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ11はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ12はＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ13はＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）又は存在せず、
Ｘａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、Ｘａａ11又はＸａａ12が存在しない場合、その下流に存在する次のアミノ酸は当該Ｃ末端延長部分における次のアミノ酸であり、
Ｃ末端のアミノ酸はアミド化されていてもよく、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＣｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＬｙｓ残基を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＫ（Ｗ）を含んでなるか、
当該ペプチドアゴニストはＰＥＧ分子に共有結合する少なくとも１つのＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）を含んでなるか、若しくは
当該ペプチドアゴニストのカルボキシ末端アミノ酸はＰＥＧ分子に共有結合するか、又は、
それらの組み合わせである。）
【００５９】
式１のＣ末端延長部分が、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）のいずれをも、３つ以下で含有するのが好ましい。Ｃ末端延長部分が、これらの残基のいずれをも２つ以下で含有するのがより好ましい。２つのＣｙｓ残基がＣ末端延長部分に存在する場合、Ｃｙｓ残基がＣ末端に存在するのが好ましい。Ｃ末端延長部分が、これらの残基のいずれをも１つ以下で含有するのが更に好ましい。Ｃ末端延長部分に１つのＣｙｓ残基だけが存在する場合、Ｃｙｓ残基がＣ末端に存在するのが好ましい。
【００６０】
好ましくは、上記の他の実施態様に関するＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分は、以下の式のアミノ酸配列を含んでなる。
式２（配列番号２）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12−Ｘａａ13
（式中、
Ｘａａ1はＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ2はＧｌｙ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ3はＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ5はＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ6はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ7はＡｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ8はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ9はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ10はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ11はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇであるか又は存在せず、
Ｘａａ12はＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ13はＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
但しＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10、Ｘａａ11又はＸａａ12が存在しない場合、次の下流側のアミノ酸はＣ末端延長部分における次のアミノ酸であり、
Ｃ末端のアミノ酸はアミド化されていてもよい）。
【００６１】
好ましくは、式１又は２のＣ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ13のうち少なくとも１つが存在する。好ましくは、Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ13のうち、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又は全てが存在する。
【００６２】
好ましくは、上記の別の実施態様に係るＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＣ末端延長部分は、以下の式のアミノ酸配列を含んでなる。
式３（配列番号３）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10−Ｘａａ11−Ｘａａ12
（式中、
Ｘａａ1はＧｌｙ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、
Ｘａａ2はＧｌｙ、Ａｒｇであるか又は存在せず、
Ｘａａ3はＰｒｏ、Ｔｈｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ5はＳｅｒであるか又は存在せず、
Ｘａａ6はＧｌｙであるか又は存在せず、
Ｘａａ7はＡｌａであるか又は存在せず、
Ｘａａ8はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ9はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ10はＰｒｏであるか又は存在せず、
Ｘａａ11はＳｅｒ、Ｃｙｓであるか又は存在せず、及び
Ｘａａ12はＣｙｓであるか又は存在せず、
但しＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8、Ｘａａ9、Ｘａａ10又はＸａａ11が存在しない場合、次の下流側のアミノ酸はＣ末端延長部分における次のアミノ酸となり、
Ｃ末端のアミノ酸はアミド化されていてもよい）。
【００６３】
好ましくは、式３のＣ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの少なくとも１つは存在する。好ましくは、当該Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ12のうちの最低２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個又は全てが存在する。
【００６４】
本発明の任意の態様及び実施態様においても使用できる、他のＣ末端延長部分は、以下の式のアミノ酸配列を有する。
式１３（配列番号１３）：Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｘａａ9−Ｘａａ10
（式中、
Ｘａａ1はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ2はＡｒｇ、Ｓｅｒ、ｈＲ、Ｏｒｎ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ3はＴｈｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ4はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ5はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ6はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ7はＰｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ8はＬｙｓ、Ｋ（Ｗ）Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、
Ｘａａ9はＫ（ＥＣ16）Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在せず、及び
Ｘａａ10はＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）であるか又は存在しない。）
【００６５】
式１３のＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4、Ｘａａ5、Ｘａａ6、Ｘａａ7、Ｘａａ8又はＸａａ9が存在しない場合、その次の下流側のアミノ酸がＣ末端延長部分における次のアミノ酸であるのが好ましい。Ｃ末端アミノ酸はアミド化されていてもよい。
【００６６】
好ましくは、式１３のＣ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ10のうちの少なくとも１つが存在する。好ましくは、当該Ｃ末端延長部分のＸａａ1からＸａａ10のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９個又は全てが存在する。
【００６７】
更に好ましくは、本発明の任意の態様及び実施態様においても使用できる、他のＣ末端延長部分は、以下から選択される。
【表８】
2009519212.tif 000009
【００６８】
本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストよりも選択性、効果及び／又は安定性が強化されている。特に、Ｃキャッピング配列としての、エキセンディン−４のＣ末端配列又はこのＣ末端配列の変異型の付加により、意外なことにＶＰＡＣ２受容体選択性が増加し、またタンパク質分解に対する安定性が増加した。
【００６９】
ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト上の特定の残基への１分子以上のＰＥＧの共有結合により、非ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、半減期が長く、クリアランスの減少した、生物学的に活性を有するＰＥＧ化されたＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。
【００７０】
用語「ＶＰＡＣ２」は、本発明のアゴニストが活性化する具体的な受容体（Ｌｕｔｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４５８：１９７−２０３（１９９９）；Ａｄａｍｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０９：３８５−３９２（１９９５））を指す用語として用いる。この用語はまた、本発明のアゴニストを指す用語としても用いる。
【００７１】
本発明の「選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」は、選択的にＶＰＡＣ２受容体を活性化し、インスリン分泌を誘導するペプチドのことを指す。好ましくは、本発明の選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列は、２８〜４０の天然及び／又は非天然のアミノ酸を有し、更にＣ末端延長部分を含んでもよく、又は含まなくともよい。
【００７２】
「選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」又は「ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」とは、１分子以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が共有結合している選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト又はその誘導体を指し、各ＰＥＧは、アミノ酸（システイン若しくはリジン）、Ｋ（Ｗ）若しくはＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）、又はペプチドのカルボキシ末端に結合する。
【００７３】
選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはＣ末端延長部分を有してもよい。本発明の「Ｃ端末延長部分」とは１〜１３の天然若しくは非天然のアミノ酸配列を含んでなり、ペプチド結合を介してＣ末端延長部分のＮ末端が上記配列のＣ末端と結合している。Ｃ末端延長部分のいかなるＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｋ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）残基もＰＥＧ分子と共有結合してもよく、及び／又は、Ｃ末端延長部分のカルボキシ末端アミノ酸にＰＥＧ分子が共有結合していてもよい。
【００７４】
Ｃ末端延長部分に関する、本発明で用いられる「結合する」の用語には、ペプチド配列のＣ末端にアミノ酸若しくは化学基が直接付加若しくは結合することが包含される。
【００７５】
所望により、選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはＮ末端修飾を有してもよい。本明細書で用いられる「Ｎ端末修飾」の用語には、ペプチドのＮ末端にアミノ酸若しくは化学基が直接付加若しくは結合して化学基を形成することが包含され、それによりペプチドのＮ末端に窒素原子が導入される。
【００７６】
Ｎ末端修飾には、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列への１つ以上の天然又は非天然アミノ酸の付加が包含されてもよく、好ましくは１０アミノ酸以下であり、最も好ましくは１アミノ酸の付加である。Ｎ末端に付加させることができる天然アミノ酸としては、メチオニン及びイソロイシンが挙げられる。Ｎ末端に付加する修飾アミノ酸としてＤ−ヒスチジンを用いてもよい。あるいは、以下のアミノ酸をＮ末端に付加してもよい。
配列番号９３：ＳｅｒＴｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ＰｒｏＧｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ（ここで、ＡｒｇがペプチドアゴニストのＮ末端と結合する）。好ましくは、当該Ｎ末端に付加させるいずれのアミノ酸も、ペプチド結合で当該Ｎ末端と結合する。
【００７７】
本発明の用語「結合する」には、Ｎ末端修飾に関して用いる場合、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストのＮ末端に直接アミノ酸若しくは化学基を付加若しくは結合させることが包含される。上記のＮ末端修飾の付加は、ペプチド結合を形成させる通常の結合条件下で実施できる。
【００７８】
ペプチドアゴニストのＮ末端にアルキル基（Ｒ）（好ましくはＣ1−Ｃ16アルキル基）を付加して修飾し、（Ｒ）ＮＨ−を形成させてもよい。
【００７９】
あるいは、ペプチドアゴニストのＮ末端に式−Ｃ（Ｏ）Ｒ1の基を付加して修飾し、式Ｒ1Ｃ（Ｏ）ＮＨ−のアミドを形成させてもよい。式Ｒ1ＣＯＯＨの有機酸と反応させて式−Ｃ（Ｏ）Ｒ1基を付加してもよい。アシル化反応を使用したアミノ酸配列のＮ末端への修飾は、従来技術において公知である（例えばＧｏｚｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２７３：１６１−１６７（１９９５）を参照）。式−Ｃ（Ｏ）Ｒ1の基の添加によりＮ末端において尿素基又はカルバメート基が形成される（国際公開第２００４／０６８３９号、国際公開第０１／２３２４０号パンフレットを参照）。また、ピログルタミン酸又は６−アミノヘキサン酸を付加することによりＮ末端を修飾してもよい。
【００８０】
ペプチドアゴニストのＮ末端に式−ＳＯ2Ｒ5の基を付加して修飾し、Ｎ末端でスルフォンアミド基を形成させてもよい。
【００８１】
ペプチドアゴニストのＮ末端をコハク無水物と反応させて修飾し、Ｎ末端でスクシンイミド基を形成させてもよい。スクシンイミド基によりペプチドのＮ末端に窒素原子が組み込まれる。
【００８２】
あるいは、メチオニンスルホキシド（ビオチニル−６−アミノヘキサン酸）又は−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加によりＮ末端を修飾してもよい。−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加はグアニド化修飾であり、それによりＮ末端アミノ酸の末端ＮＨ2が−ＮＨＣ（＝ＮＨ）−ＮＨ2となる。
【００８３】
Ｎ末端修飾及びＣ末端延長部分を含む本発明の大部分の配列中には、標準的な１文字又は３文字表記で表される２０の天然アミノ酸が含まれる。使用する他の表記は、以下の通り定義する。
Ｃ６＝ヘキサノイル基、
ｄ＝各アミノ酸のＤ型アイソフォーム（非天然）（例えば、ｄＡ＝Ｄ−アラニン、ｄＳ＝Ｄ−セリン、ｄＫ＝Ｄ−リジン）、
ｈＲ＝ホモアルギニン、
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸、
ＯＭｅ＝メトキシ基、
Ｎｌｅ＝Ｎｏｒ−ロイシン、
ＮＭｅ＝アミノ酸のαアミノ基に結合するＮメチル基（例えば、ＮＭｅＡ＝Ｎ−メチルアラニン、ＮＭｅＶ＝Ｎ−メチルバリン）、
Ｏｒｎ＝オルニチン、
Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）＝ε−（３’−メルカプトプロピオニル）−リジン、
Ｋ（Ｗ）＝ε−（Ｌ−トリプトフィル）−リジン、
Ａｂｕ＝α−アミノ−ｎ−酪酸又は２−アミノブタン酸、
Ｃｉｔ＝シトルリン、
Ｋ（Ａｃ）＝ε−アセチルリジン、
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール、
ＰＥＧ４０Ｋ＝４０，０００ダルトンのＰＥＧ分子、
ＰＥＧ３０Ｋ＝３０，０００ダルトンのＰＥＧ分子、
ＰＥＧ２０Ｋ＝２０，０００ダルトンのＰＥＧ分子。
【００８４】
ＶＩＰは、２８のアミノ酸を有する単一配列として天然に存在する。しかしながら、ＰＡＣＡＰは、アミド化されたカルボキシル基を有する、３８アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）又は２７アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−２７）のいずれかとして存在する（Ｍｉｙａｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、１７０：６４３−６４８（１９９０））。ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ−２７及びＰＡＣＡＰ−３８の配列は以下の通りである。
【表９】
2009519212.tif 000010
【００８５】
本明細書の用語「天然アミノ酸」とは、ヒト遺伝暗号によってコードされる２０のアミノ酸（すなわち２０の標準的なアミノ酸）を意味する。これらの２０のアミノ酸とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンである。
【００８６】
「非天然アミノ酸」の例としては、合成アミノ酸及び体内で修飾されたそれらが挙げられる。これらには、Ｄ−アミノ酸、アルギニン様アミノ酸（例えばホモアルギニン）、及び側鎖に余分のメチレン基を有する他のアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、修飾アミノ酸（例えばノルロイシン、（イソプロピル）リジン（リジンの側鎖アミンはイソプロピル基で修飾））などが挙げられる。またオルニチン、アミノイソ酪酸及び２−アミノブタン酸などのアミノ酸も包含される。
【００８７】
本発明の用語「選択的」とは、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが、他の公知の受容体よりもＶＰＡＣ２受容体との高い選択性を有することを指す。選択性の程度は、ＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＶＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率、又は、ＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率により算出される。なお、結合アフィニティは実施例４にて後述するとおりに算出される。
【００８８】
「インスリン分泌活性」とは、高いグルコース濃度に応答してインスリン分泌を促進する能力のことを指し、これにより細胞によるグルコース取り込みが開始され、血漿中グルコース濃度が減少する。インスリン分泌性活性は公知の方法で評価することができ、例えばＶＰＡＣ２受容体結合活性又は受容体活性化（例えばインスリノーマ細胞系又は小島によるインスリン分泌）を測定する試験、静脈グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、腹膜内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）、並びに経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）などが挙げられる。インスリン分泌性活性は、ヒトの場合はインスリン濃度又はＣ−ペプチド濃度を測定することによって日常的に測定する。本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはインスリン分泌性活性を有する。
【００８９】
本発明の「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果」とは、細胞ベースのアッセイにおいてＶＰＡＣ２受容体を活性化するペプチドの能力の基準のことを指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果は「ＥＣ50」として表し、それは単一の用量反応実験において、活性上昇の最大に対して５０％の結果を生じさせる化合物の有効濃度を意味する。本発明の場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ及びＡｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎの２つの異なるアッセイを使用して算出する。これらのアッセイの詳細は実施例３及び５を参照。これらのアッセイは異なる方法で実施されるものの、得られる結果は通常２つのアッセイ間における相関関係を示す。
【００９０】
「血漿中半減期」という用語は、循環する当該分子の半分が血漿中でクリアランスされるまでにかかる時間のことを指す。あるいは「半減時間」の用語を用いることもある。血漿中半減期又は半減時間に関して「延長された」又は「長期化された」というときは、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの半減期が、同じ条件下における参照分子（例えば非ＰＥＧ化形態のペプチド又は天然ペプチド）のそれと比較して統計学的に有意に増加していることを意味する。本願明細書に記載する半減期は除去の半減期であり、すなわち対数直線で表される除去速度を指す。当業者であれば、半減期は派生パラメータであり、クリアランス及び分布体積の関数であることを認識する。
【００９１】
クリアランスとは、薬を除去する生体の能力の基準のことを指す。例えば薬剤の修飾によりクリアランスが低下した場合、半減期は長期化すると考えられる。しかしながらこの相互関係は、分布量に変化がない場合にのみ正確なものとなる。対数直線における最終相の半減期（ｔ1／2）、クリアランス（Ｃ）及び分布（Ｖ）体積における、利用可能な近似関係は、ｔ1／2〜０．６９３（Ｖ／Ｃ）の方程式で表される。クリアランスとはどれくらいの薬剤が除去されたかを指し示すものではなく、むしろ当該除去によって薬剤が完全に除去されるべき生体液（例えば血液かプラズマ）の量のことを指す。クリアランスは単位時間あたりの体積として表される。
【００９２】
本発明で用いる「配列同一性（％）」とは、配列のアラインメントを取ったとき、それらが同様の位置又は領域において同様のアミノ酸である（同一か若しくは保存的に置換されている場合）ことを示す場合に用い、その場合、同一若しくは保存的に置換されているアミノ酸とは、元となるタンパク質と比較して、当該タンパク質の活性又は機能を変えないそれらのことを指す。例えば、各々少なくとも８５％の相同性を有する２つのアミノ酸配列とは、最適なアラインメントで最高３つのギャップを許容した場合、同様の位置において少なくとも８５％同様（同一若しくは保存的に置換された残基）であることを指すが、但しギャップに関しては、合計１５以下のアミノ酸残基が影響を受けない。
【００９３】
本発明の配列同一性（％）の算出に使用する参照ペプチドを以下に示す。
【表１０】
2009519212.tif 000011
【００９４】
配列同一性（％）は、本発明に包含されるペプチドとＰ４８７（配列番号８４）などの参照ペプチドとの間における異なる残基の数を決定し、その数を、参照ペプチドのアミノ酸数（例えばＰ４８７では３９アミノ酸）で除算し、その結果に１００を乗算し、更に１００からその結果の数を減算することにより算出できる。例えば、Ｐ４８７と異なる４つのアミノ酸を有する３９アミノ酸を有する配列は、９０％（例えば１００−（４／３９）×１００）の配列同一性を有する。３９のアミノ酸より長い配列の場合、Ｐ４８７配列と異なる残基の数は、上記の算出に供される３９アミノ酸を超える分のアミノ酸を含む。例えば、４０アミノ酸を有し、Ｐ４８７配列の３９アミノ酸とは４つのアミノ酸が異なり、Ｐ４８７配列に存在しないアミノ酸がカルボキシ末端に１つ添加されている場合、Ｐ４８７と異なるアミノ酸は合計５つとなる。すなわち、この配列は８７％（例えば１００−（５／３９）×１００）の配列同一性（％）を有する。配列同一性の程度は公知の方法を使用して算出してもよい（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０（１９８３）及びＭｙｅｒｓ  Ｅ．及びＭｉｌｌｅｒ  Ｗ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）を参照）。相同性の程度を算出する際に使用できる１つのプログラムとしてはＭｅｇＡｌｉｇｎリップマン−ピアソンの１ペア方法（デフォルトパラメータを使用する）が挙げられ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｙｓｔｅｍの一部としてＤＮＡｓｔａｒ  Ｉｎｃ社，１１２８，Ｓｅｌｆｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，５３７１５，ＵＳＡから入手できる。使用できる他のプログラムとしてはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗが挙げられる。これはＴｈｏｍｐｓｏｎらが開発した、ＤＮＡ又はタンパク質配列の多数配列アラインメントパッケージである（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））。このツールは関連する配列の異種間比較を実行し、配列の保存性を解析するのに有用である。Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷはＤＮＡ又はタンパク質のための多目的用の多数配列アラインメントプログラムである。これは異なる配列における、生物学的に有意義な多数の配列のアラインメントを生じさせる。選択された配列中に存在する、最高にマッチする部分を算出し、相同性、類似性及び相違が視覚可能となるようにそれらを整列させる。進化上の関係は、Ｃｌａｄｏｇｒａｍｓ又はＰｈｙｌｏｇｒａｍｓを観察することにより解析できる。
【００９５】
本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの配列はＶＰＡＣ２受容体に対して選択的であり、好ましくはＰ４８７（配列番号８４）と６０％〜７０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜８０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜９０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９７％、９０％〜９５％又は９５％〜９７％の配列同一性を有する。好ましくは、当該配列はＰ４８７（配列番号８４）と８２％超の配列同一性を有する。好ましくは、当該配列はＰ４８７（配列番号８４）と９０％超の配列同一性を有する。更に好ましくは、当該配列はＰ４８７（配列番号８４）と９２％超の配列同一性を有する。より更に好ましくは、当該配列はＰ４８７（配列番号８４）と９５％又は９７％超の配列同一性を有する。
【００９６】
本明細書で用いられる用語「Ｃ1−Ｃ16アルキル」とは、１〜１６個の炭素原子を有する一価の飽和した直鎖状、分岐状若しくは環状の基であり、環状であるときは３〜１６個の炭素原子を有する炭化水素を意味する。すなわち、用語「Ｃ1−Ｃ16アルキル」には例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが包含される。Ｃ1−Ｃ16アルキル基は、例えばアリール、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ基、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＦ3及び−ＳＨなどの１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい。
【００９７】
本発明の用語「Ｃ1−Ｃ6アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する一価の飽和した直鎖状、分岐状若しくは環状の基であり、環状であるときは３〜６個の炭素原子を有する炭化水素を意味する。すなわち、用語「Ｃ1−Ｃ6アルキル」には、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが包含される。Ｃ1−Ｃ6アルキル基は１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい。
【００９８】
本発明の用語「Ｃ2−Ｃ6アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合を有し、２〜６個の炭素原子を有する一価の飽和した直鎖状、分岐状若しくは環状の基であり、環状であるときは３〜６個の炭素原子を有する炭化水素を意味する。すなわち、用語「Ｃ2−Ｃ6アルケニル」にはビニル、プロプ−２−エニル、ブト−３−エニル、ペント−４−エニル及びイソプロペニルが包含される。Ｃ2−Ｃ6アルケニル基は１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい。
【００９９】
本発明の用語「Ｃ2−Ｃ6アルキニル」とは、少なくとも１つの三重結合を有し、２〜６個の炭素原子を有する一価の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味する。すなわち、用語「Ｃ2−Ｃ6アルキニル」には、プロプ−２−イニル、ブト−３−イニル及びペント−４−イニルが包含される。Ｃ2−Ｃ6アルキニルは１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい。
【０１００】
本発明の用語「Ｃ1−Ｃ6アルコキシ」とは、１〜６個の炭素原子を有し、二価のＯを介して置換部位と結合している、一価の非置換の飽和した直鎖状若しくは分岐鎖状の炭化水素を意味する。すなわち、用語「Ｃ1−Ｃ6アルコキシ」には例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ及びｔｅｒｔ−ブトキシが包含される。Ｃ1−Ｃ6アルコキシ基は１つ以上の置換基で任意に置換されてもよい。
【０１０１】
「ハロ」又は「ハロゲン」の用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【０１０２】
用語「アリール」とは、それのみ又は基の一部として使用する場合、フェニル基などの５〜１０員からなる芳香族若しくは複素環式芳香族基、５又は６員からなる単環の複素環式芳香族基（その各員は利用できる置換部位の数によって１、２、３、４又は５個の置換基で任意に置換されてもよい）、ナフチル基、又は８−、９−又は１０員からなる二環式複素環式芳香族基（によって、任意に置換されてもよいことがありえる）（その各員は利用できる置換部位の数によって１、２、３、４、５又は６個の置換基で任意に置換されてもよい）のことを指す。このアリールの定義において、適切な置換基としてはＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、−ＮＨ2、−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ及びＣＦ3が挙げられる。
【０１０３】
本発明の用語「アリールＣ1−Ｃ4アルキル」とは、アリールで置換されたＣ1−Ｃ4アルキルを意味する。すなわち、用語「アリールＣ1−Ｃ4アルキル」には、ベンジル、１−フェニルエチル（α−メチルベンジル）、２−フェニルエチル、１−ナフタレンメチル又は２−ナフタレンメチルが包含される。
【０１０４】
「ナフチル」という用語には、１−ナフチル及び２−ナフチルが包含される。１−ナフチルが好ましい。
【０１０５】
本発明の用語「ベンジル」とは、−ＣＨ2−基を介して置換部位と結合する一価の非置換フェニル基を意味する。
【０１０６】
本発明の用語「５又は６員環の単環式複素環式芳香族基」とは、環中に合計５又は６個の原子を有する単環式芳香族基であって、それらの１〜４個の原子がＮ、Ｏ及びＳから各々独立に選択されるものを意味する。好ましい基は、Ｎ、Ｏ及びＳから各々独立に選択される１又は２個の原子を環中に有してなる。５員の単環式複素環式芳香族基の例としては、ピロリル（またアゾリルとも呼ばれる）、フラニル、チエニル、ピラゾリル（また１Ｈ−ピラゾリル及び１，２−ジアゾリルと呼ばれる）、イミダゾリル、オキサゾリル（また１，３−オキサゾリルと呼ばれる）、イソキサゾリル（また１，２−オキサゾリルと呼ばれる）、チアゾリル（また１，３−チアゾリルと呼ばれる）、イソチアゾリル（また１，２−チアゾリルと呼ばれる）、トリアゾリル、オキサゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、オキサトリアゾリル及びチアトリアゾリルが挙げられる。６員の単環式複素環式芳香族の例としては、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル及びトリアジニルが挙げられる。
【０１０７】
本発明の用語「８、９又は１０員の二環式複素環式芳香族基」とは、環中に合計８、９又は１０個の原子を有する融合した二環式芳香族基であって、それらの１〜４個の原子がＮ、Ｏ及びＳから各々独立に選択されるものを意味する。好ましい基は、環中に１〜３個の、Ｎ、Ｏ及びＳから各々独立に選択される原子を有する。好適な８員の二環式複素環式芳香族基としては、イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾリル、チエノ［３，２−ｂ］チエニル、チエノ［２，３−ｄ］［１，３］チアゾリル及びチエノ［２，３−ｄ］イミダゾリルが挙げられる。好適な９員の二環式複素環式芳香族基としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル（またベンゾ［ｂ］フラニルと呼ばれる）、イソベンゾフラニル（またベンゾ［ｃ］フラニルと呼ばれる）、ベンゾチエニル（またベンゾ［ｂ］チエニルと呼ばれる）、イソベンゾチエニル（またベンゾ［ｃ］チエニルと呼ばれる）、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、１，３−ベンゾキサゾリル、１，２−ベンズイソキサゾリル、２，１−ベンズイソキサゾリル、１，３−ベンゾチアゾリル、１，２−ベンゾイソチアゾリル、２，１−ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、１，２，３−ベンゾキサジアゾリル、２，１，３−ベンゾキサジアゾリル、１，２，３−ベンゾチアジアゾリル、２，１，３−ベンゾチアジアゾリル、チエノピリジニル、プリニル及びイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンが挙げられる。好適な１０−会員を有する二環式複素環式芳香族基としては、キノリニル、イソキノリニル、シノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，５−ナフチリジル、１，６−ナフチリジル、１，７−ナフチリジル及び１，８−ナフチリジル。
【０１０８】
本発明の用語「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコール分子を意味する。その典型的な形態においては、ＰＥＧは末端にヒドロキシル基を有する直鎖状ポリマーであり、式ＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ（式中、ｎは約８〜約４０００）で表される。末端の水素原子は保護基（例えばアルキル又はアルカノール基）で置換されてもよい。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基、好ましくは末端ヒドロキシ基を有する。好ましくはこのヒドロキシ基を活性化し、ペプチドと反応させる。本発明にとり有用な多くの形態のＰＥＧが存在する。多数のＰＥＧ誘導体が従来技術において公知であり、本発明への使用にも適している（米国特許第５４４５０９０号、第５９００４６１号、第５９３２４６２号、第６４３６３８６号、第６４４８３６９号、第６４３７０２５号、第６４４８３６９号、第６４９５６５９号、第６５１５１００号及び第６５１４４９１号、並びにＺａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６）：１５０−１６５、１９９５を参照）。本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに共有結合するＰＥＧ分子は、特定のタイプに限定されない。ＰＥＧ分子は好ましくは５００〜１００，０００Ｄａの分子量である。ＰＥＧは直鎖状であってもよく、又は分岐状であってもよい。本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、１、２又は３個のＰＥＧ分子がペプチドに結合していてもよい。１、２個のＰＥＧ分子がＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト１分子当たりに存在するのがより好ましいが、複数のＰＥＧ分子がペプチド１分子に存在する場合は、３個以下で存在するのが好ましい。ＰＥＧ分子の両端をホモ若しくはヘテロ官能化し、２つ以上のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを架橋してもよいことが更に考察される。２つのＰＥＧ分子が存在する場合、当該ＰＥＧ分子は好ましくは各々２０，０００ＤａのＰＥＧ分子であるか、又は各々３０，０００ＤａのＰＥＧ分子である。しかしながら、異なる分子量を有するＰＥＧ分子を用いてもよく、例えば１つが１０，０００ＤａのＰＥＧ分子でもう１つが３０，０００ＤａのＰＥＧ分子であってもよく、又は１つが２０，０００ＤａのＰＥＧ分子でもう１つが４０，０００ＤａのＰＥＧ分子であってもよい。
【０１０９】
本発明では、ＰＥＧ分子はＣｙｓ又はＬｙｓ残基、又はＣ末端残基に共有結合してもよい。ＰＥＧ分子はＬｙｓ残基（Ｋ（Ｗ））の側鎖に結合するＴｒｐ残基に共有結合してもよい。あるいは、Ｋ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）基をＰＥＧ化してＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2Ｓ−ＰＥＧ）を形成させてもよい。ペプチドアゴニスト中のいかなるＬｙｓ残基もＫ（Ｗ）又はＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）で置換してもよく、それらを更にＰＥＧ化してもよい。更に、ペプチドアゴニストのいかなるＣｙｓ残基も修飾システイン残基（例えばｈＣ）で置換してもよい。修飾Ｃｙｓ残基はＰＥＧ分子に共有結合してもよい。
【０１１０】
本発明の用語「ＰＥＧ化」とは、本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに、上記の通りに１つ以上のＰＥＧ分子が共有結合することを意味する。
【０１１１】
本発明の好ましい実施態様は、配列番号１７〜４５及び９４〜１１２から選択されるペプチド配列、及び配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択されるＣ末端延長部分を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関する。Ｃ末端延長部分が配列番号１１又は配列番号１２であるのが特に好適である。
【０１１２】
本発明のより好ましい実施態様は、配列番号１７〜４５及び９４〜１１２から選択されるペプチド配列、及び配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択されるＣ末端延長部分を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関し、当該ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは更にＮ末端修飾を含んでなり、当該修飾がアセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加である。本実施態様では、Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加であるのがより好ましい。
【０１１３】
更なる本発明の好ましい実施態様は、式４（配列番号４）のアミノ酸配列、及び配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択されるＣ末端延長部分を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関し、当該ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは更にＮ末端修飾を含んでなり、当該修飾がアセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加である。本実施態様では、Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加であるのがより好ましい。
【０１１４】
本発明のより好ましい実施態様は、式４（配列番号４）のアミノ酸配列を含んでなるＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの提供に関し、式中、Ｘａａ15はＡｉｂであり、Ｘａａ20はＡｉｂであり、Ｘａａ12、Ｘａａ21、Ｘａａ27及びＸａａ28は全てＯｒｎであり、Ｃ末端延長部分は配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２から選択され、当該ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは更にＮ末端修飾を含んでなり、当該修飾がアセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加である。本実施態様では、より好ましくは、Ｘａａ15がＡｉｂであり、Ｘａａ20がＡｉｂであり、Ｘａａ12、Ｘａａ21、Ｘａａ27及びＸａａ28が全てＯｒｎであり、Ｘａａ8がＧｌｕであり、Ｘａａ9がＧｌｎであり、Ｘａａ10がＴｙｒ（ＯＭｅ）である。特に好ましくは、Ｘａａ15がＡｉｂであり、Ｘａａ20がＡｉｂであり、Ｘａａ12、Ｘａａ21、Ｘａａ27及びＸａａ28が全てのＯｒｎであり、Ｘａａ8がＧｌｕであり、Ｘａａ9がＧｌｎであり、Ｘａａ10がＴｙｒ（ＯＭｅ）であり、Ｘａａ23及び／又はＸａａ25がＡｉｂである。
【０１１５】
タンパク質のＰＥＧ化により、治療用にペプチド又はタンパク質を使用することに付随する、多数の薬理学的、及び毒物的／免疫学的な課題が解決できる。しかしながら、個々のペプチドによっては、ＰＥＧ化されたペプチドの形態が、非ＰＥＧ化されたペプチドの形態と比較して生物活性が顕著に損なわれる場合もありうる。
【０１１６】
ＰＥＧ化タンパク質の生物活性は、例えば以下のような要因の影響を受ける。
ｉ）ＰＥＧ分子のサイズ、
ｉｉ）結合の具体的な部位、
ｉｉｉ）修飾の程度、
ｉｖ）有害なカップリング条件、
ｖ）結合にリンカーが用いられるか、あるいはポリマーが直接結合するか、
ｖｉ）有害な副生成物の生成、
ｖｉｉ）活性化ポリマーによるダメージ、又は、
ｖｉｉｉ）電荷の保持。
例えば、サイトカインのＰＥＧ化により、ＰＥＧ化が有しうる効果が示される。採用するカップリング反応によっては、サイトカインのポリマー修飾により生物活性の劇的な減少につながりうる（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｅ．，ら、（１９９８）、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ及びｏｔｈｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｈｅｍ．６８：１−１８）。ＰＥＧ化ペプチドの生物活性の維持は、タンパク質の場合よりも多くの課題を含む。ペプチドはタンパク質より小分子であるため、ＰＥＧ化による修飾は生物活性により大きな影響を及ぼすことが考えられる。
【０１１７】
本発明のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを１分子以上のＰＥＧと共有結合させて修飾することにより、タンパク質分解及び腎クリアランスが遅延され、薬物動態プロフィールが全体的に改善された。ＰＥＧ化によりＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの見かけのサイズが増加し、そのため腎臓濾過が減少し、下生体内における分布が変化する。ＰＥＧ化により、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の抗原性エピトープが保護され、それにより網内系クリアランス及び免疫系による認識が低減し、更にタンパク質分解酵素（例えばＤＰＰ−ＩＶ）による分解が低減する。
【０１１８】
通常であれば、小分子の、生物学的に活性を有するＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストに対する１分子以上のＰＥＧの共有結合により、例えば、固有の二次構造及び生理活性形態が不安定になることや、生物活性の減少によるアゴニストへの悪影響の危険性が生じ、当該アゴニストの治療的使用にとり不適切なものとなることが予想されるしかしながら、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの特定の残基への１分子以上のＰＥＧの共有結合により、驚くべきことに、非ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストと比較して、高い生物学的活性を有し、長期の半減期を有し、及びクリアランスの低下したＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られることを見出し、その発見に基づき本発明を完成させるに至った。本発明の化合物には、選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが包含される。
【０１１９】
ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の潜在的なＰＥＧ化部位を決定するため、セリンのスキャニングを実施した。Ｓｅｒ残基をペプチドの特定の部位で置換し、Ｓｅｒ修飾されたペプチドに関し、それによる効果及び選択性を試験する。あるＳｅｒ置換による薬剤の効果に対する影響が最小であり、当該Ｓｅｒ修飾ペプチドがＶＰＡＣ２受容体に選択的である場合、そのＳｅｒ残基を更にＣｙｓ又はＬｙｓ残基で置換し、その部分を直接的又は間接的なＰＥＧ化部位として用いる。間接的な残基のＰＥＧ化とは、ＰＥＧ化部位の残基と結合する化学基又は残基をＰＥＧ化することを指す。Ｌｙｓの間接的なＰＥＧ化としては、Ｋ（Ｗ）及びＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）のＰＥＧ化が挙げられる。
【０１２０】
本明細書に記載した発明は、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを提供する。ＰＥＧ化により選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの半減期が長期化され、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０又は２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の除去半減期を有するＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストが得られる。本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、好ましくは２００ｍＬ／ｈ／ｋｇ以下、より好ましくは１８０、１５０、１２０、１００、８０、６０ｍＬ／ｈ／ｋｇ以下、最も好ましくは５０、４０又は２０ｍＬ／ｈ／ｋｇ未満のクリアランス値を示す。
【０１２１】
本発明にはまた、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのペプチド配列のＣ末端にある特定のアミノ酸を添加することによりペプチドが保護され、また活性、選択性及び／又は薬理的効果を強化できるという発見が包含される。例えば、これらのＣ末端延長部分はペプチドの螺旋構造を安定させ、酵素による開裂を受け易いＣ末端付近の部位を安定化させることができる。更にまた、本願明細書に開示されるＣ末端延長部分のペプチドの多くが、ＶＰＡＣ２受容体に対して選択的であり、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ及び他の公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストより強力である。好ましいＣ末端延長部分の例としては、Ｃキャッピング配列としてのエキセンディン４の延長部分ペプチドである。エキセンディン４は、Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  Ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に含まれる物質である（Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１）：７４０２−７４０５（１９９２）。Ｃ末端延長部分の他の例としては、ヘロデルミン（ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ）及びヘロスペクチン（ｈｅｌｏｓｐｅｃｔｉｎ）のＣ末端配列である。ヘロデルミン及びヘロスペクチンはＧｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒの唾液中にもみられる。
【０１２２】
更に、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＮ末端修飾により、薬理効果の強化及び／又はＤＰＰ−ＩＶ開裂に対する安定性の強化が得られることを見出した。
【０１２３】
ＶＩＰ及び幾つかの公知のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは様々な酵素による開裂を受け易いため、短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示す。ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの様々な酵素切断部位は後述する。切断部位はＶＩＰ（配列番号１４）のアミノ酸部位との関連において記載し、本願明細書に記載の配列にも適用できる。
【０１２４】
酵素ジペプチジル−ペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によるペプチドアゴニストの開裂は、位置２（ＶＩＰのＳｅｒ）及び位置３（ＶＩＰのアスパラギン酸）との間で起きる。本発明のアゴニストへのＮ末端修飾の付加によって、この領域がＤＰＰ−ＩＶによる切断に対してより安定になる。ＤＰＰ−ＩＶによる切断に対する安定性を改善できるＮ末端修飾の例としては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、メチオニン、メチオニンスルホキシド、３−フェニルプロピオニル、フェニルアセチル、ベンゾイル、ノルロイシン、Ｄ−ヒスチジン、イソロイシン、３−メルカプトプロピオニル、ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（６−アミノカプロン酸）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2の付加が挙げられる。Ｎ末端修飾がアセチル又はヘキサノイルの付加であるのがより好ましい。
【０１２５】
野生型ＶＩＰ中のキモトリプシン切断部位は、アミノ酸１０と１１（チロシン及びトレオニン）の間、及びアミノ酸２２と２３（チロシン及びロイシン）の間に存在する。位置１０及び／又は１１及び位置２２及び／又は２３における置換により、これらの部位でのペプチドの安定性が改善されうる。例えば、位置１０及び／又は位置２２のチロシンのＴｙｒ（ＯＭｅ）による置換により安定性が向上しうる。
【０１２６】
野生型ＶＩＰ中のトリプシン切断部位は、アミノ酸位置１２と１３の間に存在する。特定のアミノ酸置換（例えば位置１２におけるオルニチン、及び位置１３におけるアミノイソ酪酸）は、この部位でのペプチド切断に対する感受性を減少させる。
【０１２７】
野生型ＶＩＰ、及び公知の多数のＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストにおいては、塩基性アミノ酸である位置１４と１５の間、及び位置２０と２１の間に切断部位が存在する。本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、これらの部位が置換されているため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解に対する安定性が改善されている。これらの部位の好ましい置換により、トリプシン様酵素（トリプシンを含む）によるペプチド切断に対する感受性が減少する。例えば、位置１５のアミノイソ酪酸、位置２０のアミノイソ酪酸及び位置２１のオルニチンによる置換は、安定性の向上につながりうるため全て好ましい。ペプチダーゼ切断に対する抵抗を有する、本発明の数種の代表的な選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストにおける改良された安定性を実施例７において示す。
【０１２８】
切断部位はまた、野生型ＶＩＰのアミノ酸位置２５と２６の間にも存在する。
【０１２９】
ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中の、アミノ酸位置２７、２８、２９、３０及び３１を含む領域もまた酵素分解を受け易い。Ｃ末端延長部分の付加によってペプチドアゴニストが神経エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）に対してより安定になることもありえ、ＶＰＡＣ２受容体に対する選択性が向上することもありえる。この領域はまたトリプシン様の酵素による攻撃を受け易い。それが生じる場合には、ペプチドアゴニストは更なるカルボキシプチダーゼ活性によりそのＣ末端延長部分を喪失し、当該ペプチドが不活性な形態となりうる。この領域の分解に対する抵抗性を向上させる好ましい置換としては、位置２７におけるオルニチン、位置２８におけるオルニチン又はアミノイソ酪酸、及び位置２９におけるオルニチンによる置換が挙げられる。
【０１３０】
選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは様々なペプチダーゼによる分解抵抗性を有するが、それ以外にも、本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストは、公知の幾つかのペプチドと比較して、ＶＰＡＣ２受容体に対する選択性を有し、薬理効果が強化され、及び／又は安定性が向上したペプチドであるという側面を有する。本発明の様々なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストにおける強化された効果及び選択性を実施例３、４及び５に示す。
【０１３１】
実施例３の表１は選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのリスト、及びそれらの対応するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果に関する試験結果を示す。好ましくは、本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは２００ｎＭ未満のＥＣ50値を示す。好ましくは、ＥＣ50値は１００ｎＭ未満である。更に好ましくは、ＥＣ50値は５０ｎＭ未満である。最も好ましくは、ＥＣ50値は３０ｎＭ未満である。
【０１３２】
実施例４の表２は、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト、並びにそれらのヒトＶＰＡＣ２、ＶＰＡＣ１及びＰＡＣ１への受容体結合試験の結果のリストを示す。これらのアッセイの詳細は実施例４を参照。選択性の程度は、ＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＶＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率、及びＶＰＡＣ２受容体結合アフィニティ：ＰＡＣ１受容体結合アフィニティの比率により算出される。好ましくは、本発明のアゴニストは、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１受容体の場合と比較して、ＶＰＡＣ２受容体に対する親和性が少なくとも５０倍高い選択性比率として表される。好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも１００倍高い。更に好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも２００倍高い。より更に好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも５００倍高い。より更に好ましくは、このＶＰＡＣ２に対する親和性は、ＶＰＡＣ１及び／又はＰＡＣ１より少なくとも１０００倍高い。
【０１３３】
本発明で用いられる「選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト」にはまた、本願明細書に記載の当該アゴニストの製薬的に許容し得る塩が包含される。本発明の選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは多くの酸性基、塩基性基及びそれらの両方の官能基を有するため、多くの無機塩基、並びに無機及び有機酸のいずれとも反応して塩を形成する。酸性付加塩の形成に通常使用される酸としては、塩酸、臭化水素、ヨウ素化水素、硫酸、リン酸などの無機酸、並びにｐ−トルエンスルホン酸、メタン硫酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸が挙げられる。かかる塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、モノリン酸水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸、フマル酸エステル、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、キシレンスルホン酸塩などが挙げられる。
【０１３４】
塩基付加塩としては、無機塩基（例えばアンモニウム、又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩など）に由来するものが挙げられる。本発明の塩の調製に有用なそのような塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。
【０１３５】
本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、好ましくは医薬組成物として製剤化される。標準的な製剤技術として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載の方法を採用してもよい。本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、頬側、局所、経口、経真皮、鼻腔内、肺内投与用に製剤化してもよく、又は非経口投与用に製剤化してもよい。
【０１３６】
非経口投与としては、例えば筋肉内、静脈内、皮下、皮内、腹膜内投与などの全身投与が挙げられる。選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを、医薬組成物の一部として、製薬的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤との組み合わせで患者に投与し、ＮＩＤＤＭ又は以下に記載するような障害を治療することができる。当該医薬組成物は溶液状であってもよく、又は、非経口投与する場合には、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの懸濁液、又は二価の金属陽イオン（例えば亜鉛）と錯体を形成したＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの懸濁液としてもよい。適切な薬剤担体は、ペプチド又はペプチド誘導体と相互作用しない不活性成分を含有してもよい。非経口投与用の適切な薬剤担体としては、例えば滅菌した水、生理的食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍＬでベンジルアルコールを含有する食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ハンクス溶液）、乳酸リンガー液などが挙げられる。適切な賦形剤の若干の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。
【０１３７】
本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、その血漿中濃度が長期間有効な濃度範囲内に維持されるように製剤化してもよい。ペプチド薬の有効な経口輸送を妨げる主な障害としては、酸及び酵素によるペプチドの分解による弱い生物学的利用能、上皮膜による弱い吸収、及び消化管の酸性ｐＨ環境への暴露後のペプチドの不溶性化が挙げられる。本発明に包含される当該ペプチドを経口送達する様々なシステムが公知である。例えば、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストをマイクロカプセル中に封入し、更に経口送達することが可能である。例えば、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、充填材として市販されている、生物学的適合性を有する、生物分解性ポリマー、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−ＣＯＯＨ及びオリーブ油から構成されるマイクロカプセルに封入することができる（Ｊｏｓｅｐｈら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４３：１３１９−１３２８（２０００）を参照）。他のタイプのマイクロカプセル技術はまた、ＡｌｋｅｒｍｅｓからＭｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）及びＰｒｏｌｅａｓｅ（登録商標）などの市販の生分解性ポリマーを利用して実施できる。Ｍｅｄｉｓｏｒｂ（登録商標）ポリマーは、いずれかのラクチド異性体から調製できる。ラクチド：グリコリド比率は０：１００〜１００：０の間で変化させることができ、幅広い範囲のポリマー特性とすることができる。これにより、数週から数か月にわたる吸収時間を有する送達システム及びインプラント可能手段の設計が可能となる。またＥｍｉｓｐｈｅｒｅが、ペプチド及びタンパク質の経口送達技術に関する記事として多数報告されている。例えば、Ｌｅｏｎｅ−ｂａｙらの国際公開第９５／２８８３８号が挙げられ、そこでは修飾アミノ酸を含有する特異的な担体により吸収を促進する技術に関して開示している。
【０１３８】
本願明細書に記載のＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、多種の疾患及び症状に罹患する患者の治療に使用できる。本発明に包含されるアゴニストは、ＶＰＡＣ２受容体と呼ばれる受容体においてそれらの生物学的効果を及ぼす。ゆえに、ＶＰＡＣ２受容体刺激に、又は、ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの投与に有利に反応する疾患及び／又は症状に罹患する患者は、本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２アゴニストにより治療されることができる。これらの患者は、「ＶＰＡＣ２  アゴニストを用いた当該治療を必要とする」或いは「ＶＰＡＣ２受容体の活性化を必要とする」などと称される。
【０１３９】
本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは糖尿病（１型及び２型糖尿病（インスリン非依存性真性糖尿病又はＮＩＤＤＭ））の治療に使用できる。例えばＮＩＤＤＭが進行する危険性を有する患者に対して、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストを用いて予防的処置を行ってもよい。かかる処置により、糖尿病及び糖尿病による合併症の発症を遅延させことも可能となる。本発明のアゴニストで処置することができる更なる患者としては、耐糖能の異常（ＩＧＴ）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５，１９９９）、又は空腹時血糖異常（ＩＦＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：７９６，１９９１）を有する患者であって、体重が、患者の身長及び体格における標準体重より約２５％高い患者、ＮＩＤＤＭに罹患する親を１人でも有する患者、妊娠糖尿病に罹患した患者及び例えば内因性インスリン分泌の減少から生じる代謝性障害を有する患者が挙げられる。選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを用いて、耐糖能異常を有する患者の症状のＮＩＤＤＭへの発展の防止、膵臓β−細胞の悪化の防止、β−細胞増殖の誘導、β−細胞機能の改善、休止中のβ−細胞の活性化、β−細胞への細胞分化、β−細胞複製の刺激及びβ−細胞アポトーシスの阻害などが可能となる。本発明の方法において、本発明のアゴニストを使用して治療若しくは予防できる疾患及び症状としては：若年性糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：４０，１９９４）、成人の潜在性自己免疫疾患（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｄ．１１：２９９，１９９４）、妊娠糖尿病（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４０：１９７，１９９１）、代謝性エックス症候群、異脂肪血症、高血糖、高インスリン血症、高トリグリセリド血症及びインスリン抵抗などが挙げられる。
【０１４０】
本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、糖尿病の第２の原因の治療にも使用できる（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．ｌ）：Ｓ５，１９９９）。かかる第２の原因としては、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、クロム親和性細胞腫及び薬物性糖尿病が挙げられる。糖尿病を誘導しうる薬剤としては、限定されないがピリミニル、ニコチン酸、グルココルチコイド、フェニトイン、甲状腺ホルモン、β−アドレナリン作動薬、α−インターフェロン及びＨＩＶ感染治療薬などが挙げられる。
【０１４１】
本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、食物摂取の抑制及び肥満の治療に効果的である。
【０１４２】
本発明の選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはまた、アテローム硬化型疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ濃度、高血圧、原発性肺高血圧症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病及び冠状動脈疾患を含む）、脳血管疾患及び末梢性血管疾患などの障害の予防若しくは治療、並びに、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌及び過形成の治療、男性及び女性の生殖障害、性的障害、潰瘍、睡眠障害、脂質及び炭水化物の代謝障害、体内時計の機能不全、成長障害、エネルギーホメオスタシスの障害、自己免疫疾患などの免疫疾患（例えば全身エリテマトーデス）、並びに急性及び慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び感染性ショックなどの治療に効果的である。
【０１４３】
本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストはまた、例えば脂質蓄積細胞への細胞分化、インスリン感受性及び血糖値の調節に関連する生理的障害の治療に有用である。それらは例えば膵臓β細胞の不全、インスリン分泌腫瘍の形成及び／又は自己免疫低血糖症（インスリンに対する自己抗体、インスリン受容体に対する自己抗体若しくは膵臓β細胞を活性化する自己抗体による）、アテローム動脈硬化性斑、炎症性反応、発癌、過形成、脂肪細胞遺伝子発現、脂肪細胞分化、膵臓β細胞質量の減少、インスリン分泌、インスリンに対する組織感度、脂肪肉腫細胞増殖、多嚢胞性卵巣の疾患、慢性無排卵、高アンドロゲン症、プロゲステロン産生、ステロイド合成、細胞内の酸化還元ポテンシャル及び酸化ストレスの形成をもたらすマクロファージの分化、ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）産生、γグルタミルペプチド転移酵素、カタラーゼ、血漿中トリグリセリド、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール濃度の上昇などが関与する。
【０１４４】
更に、本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは喘息の治療（Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ３７：５７−６６（１９９５）、米国特許第５６７７４１９号、ポリペプチドＲ３ＰＯがモルモット気管平滑筋を弛緩させる活性を有することを示す）、低血圧誘導（ＶＩＰは喘息の患者における低血圧、心搏急速及びほてりを誘導する（Ｍｏｒｉｃｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７：２７９−２８０（１９８６）、Ｍｏｒｉｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ  ２：１２２５−１２２７（１９８３））、男性の生殖器障害の治療（Ｓｉｏｗら、Ａｒｃｈ．Ａｎｄｒｏｌ．４３（１）：６７−７１（１９９９））、抗アポトーシス／神経保護薬としての使用（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２０７−１２（１９９８））、虚血の間の心臓保護（Ｋａｌｆｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１２６８（２）：９５２−８（１９９４）、Ｄａｓ，ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２９７−３０８（１９９８））、体内時計及びそれに関連する障害の調節（Ｈａｍａｒら、Ｃｅｌｌ  １０９：４９７−５０８（２００２）、Ｓｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１１５７５−８０，（２０００））、及び抗潰瘍薬としての使用（Ｔｕｎｃｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：３０９−２２，（１９９８））に供することができる。
【０１４５】
選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」とは、ＶＰＡＣ２受容体刺激を必要とする患者に投与したときの、許容できない副作用を引き起こすことなく、所望の治療的及び／又は予防的効果をもたらす量のことを指す。「所望の治療的効果」には、以下の１つ以上が含まれる。１）疾患又は症状に関連する徴候の改善、２）疾患又は症状に関連する徴候の発症の遅延、３）治療を行わない場合と比較した寿命の長期化、及び４）治療を行わない場合と比較した生活の質の改善。例えば、ＮＩＤＤＭの治療用のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２アゴニストの「有効量」とは、治療を行わない場合よりも血液グルコース濃度がより顕著に制御される量のことを指し、それにより、結果的に糖尿病による合併症（例えば網膜症、神経障害又は腎臓病）の発症が遅延される。ＮＩＤＤＭの予防用の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」とは、処置を行わない場合と比較して、抗血糖剤（例えばスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリン及び／又はビスグアニジン）による治療が必要となる高血糖の発症を遅延させる量のことを指す。
【０１４６】
患者に投与される選択的なＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの「有効量」はまた、疾患のタイプ及び重症度、並びに患者の特徴（例えば健康状態、年齢、性別、体重及び薬剤に対する許容度）に依存する。患者の血液グルコースの正常化に効果的な選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２ペプチド受容体アゴニストの投与量は、限定されないが、患者の性別、体重及び年齢、血糖値の制御不能の重症度、投与経路及び生物学的利用能、ペプチドの薬物動態プロフィール、薬効及び製剤化のタイプなどの多くの要因に依存する。
【０１４７】
本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの典型的な投与量範囲は、約１μｇ／日〜約５０００μｇ／日にわたる。好ましくは、投与量は約１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、より好ましくは約１μｇ／日〜約２５００μｇ／日にわたる。更に好ましくは、投与量は約５μｇ／日〜約１００μｇ／日にわたる。更に好ましい投与量範囲は、約１０μｇ／日〜約５０μｇ／日である。最も好ましくは、投与量は約２０μｇ／日である。
【０１４８】
「患者」とは哺乳類であり、好ましくはヒトであるが、それ以外の動物、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
【０１４９】
本発明の選択的ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、固相ペプチド合成などの標準的な方法を用いて調製できる。例えば、ペプチド合成装置としてＲａｉｎｉｎ−ＰＴＩ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ｔｕｃｓｏｎ社製，ＡＺ）などが市販されている。固相合成用の試薬は、例えばＧｌｙｃｏｐｅｐ社（シカゴ、ＩＬ）から市販されている。固相ペプチド合成装置を製造業者の指示に従って使用し、干渉基を保護し、反応させるアミノ酸を保護し、カップリングさせ、デカップリングさせ、未反応アミノ酸をキャッピングすることができる。
【０１５０】
典型的には、α−Ｎ保護されたアミノ酸と、樹脂上で伸長するペプチド鎖上のＮ末端アミノ酸を、室温で、不活性溶媒（ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン又はメチレンクロライド）中で、カップリング剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び塩基（例えばジイソプロピルエチルアミン））の存在下でカップリングさせる。α−Ｎ保護基を、トリフルオロ酢酸又はピペリジンなどの試薬を使用して、得られるペプチド樹脂から除去し、更にペプチド鎖に付加させる次の所望のＮ保護アミノ酸を用いてカップリング反応を反復する。適切なアミン保護基は公知であり、例えばＧｒｅｅｎ及びＷｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１に記載されている。例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）基及びフルオロエニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基が挙げられる。
【０１５１】
選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは、適切な側鎖保護基を有するｔ−ブトキシカルボニル−又はフルオロエニルメトキシカルボニル−α−アミノ酸を使用する標準的な自動固相合成プロトコルを使用して合成できる。合成終了後、例えばα−アミノ基を以下のものと反応させることによりＮ末端修飾を行ってもよい。
（ｉ）活性エステル（α−Ｎ保護アミノ酸の導入に関する上記と同様のプロトコルを使用）、
（ｉｉ）アルデヒド（還元剤の存在下（還元的アミノ化方法））、及び
（ｉｉｉ）グアニド化（ｇｕａｎｉｄａｔｉｏｎ）試薬。
更に、標準的なフッ化水素又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた側鎖の同時脱保護方法を用いて固相担体からペプチドを分離させる。更に粗ペプチドを、ＶＹＤＡＣ  Ｃ１８カラムによる逆相クロマトグラフィを使用して、０．１％  ＴＦＡ中のアセトニトリル勾配により精製する。アセトニトリルを除去するため、０．１％のＴＦＡ、アセトニトリル及び水を含有する溶液からペプチドを凍結乾燥させる。分析用逆相クロマトグラフィにより純度を検定できる。質量分析によりペプチドのアイデンティティを解析できる。中性ｐＨの水性バッファ中にペプチドを溶解させることができる。
【０１５２】
また本発明のペプチドアゴニストは、真核生物及び原核細胞宿主を使用し、公知の組換え方法により調製してもよい。
【０１５３】
ペプチドを調製、精製した後、少なくとも１分子のＰＥＧを、Ｃｙｓ若しくはＬｙｓ残基、Ｋ（Ｗ）若しくはＫ（ＣＯ（ＣＨ2）2ＳＨ）、又はカルボキシ末端アミノ酸に共有結合させて修飾する。ＰＥＧと共有結合したペプチドの調製方法として、多様な手法が従来技術において公知であり、本発明に使用する方法は特に限定されない（ＲｏｂｅｒｔｓＭ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４：４５９−４７６，２００２）の報告などを参照）。
【０１５４】
使用可能なＰＥＧ分子の例としては、メトキシ−ＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（２つに分かれたＰＥＧマレイミド（Ｎｅｋｔａｒ社製、ハンツヴィル、アラバマ）が挙げられる。他の例としては、バルクｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社製）、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ−４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社製）及びメトキシ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−３０Ｋ（Ｄｏｗ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
ＰＥＧのカルボキシ末端への結合は、組換えＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを前駆体として使用して酵素的にカップリングさせるか、あるいは例えば米国特許４３４３８９８号又はＩｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．＆Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．４３：１２７−３８（１９９４）に記載のような代替法で行ってもよい。
【０１５６】
本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを調製するための１つの方法として、ＰＥＧ−マレイミドを使用してＰＥＧを直接ペプチドのチオール基に結合させる方法が挙げられる。チオール官能基の導入は、上記の位置でペプチド上若しくはペプチド内にＣｙｓ又はｈＣ残基を付加若しくは挿入することにより実施できる。また、チオール含有酸（例えばメルカプトプロピオン酸）を用いたリジンε−アミノ基のアシル化により、ペプチドの側鎖上へチオール官能基を導入することもできる。本発明のＰＥＧ化方法では、マイケル付加を利用して安定なチオエーテルリンカーを形成させる。反応は非常に特異的であり、他の官能基の存在下で、穏やかな条件下で生じる。ＰＥＧマレイミドが、良く知られた、生理活性なＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートの調製用の反応性ポリマーとして用いられている。好ましくは、当該方法では、チオール含有ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの過剰量（好ましくはＰＥＧマレイミドに対して１〜１０モルの過剰）を用いて反応を完了させる。好ましくは１０分〜４０時間、室温で、ｐＨ４．０〜９．０において反応を実施する。過剰の非ＰＥＧ化チオール含有ペプチドは、従来技術の分離方法によってＰＥＧ化生成物から容易に分離できる。ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストは好ましくは逆相ＨＰＬＣ又は限外除外クロマトグラフィを使用して単離する。ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＰＥＧ化に必要な特異的な条件を実施例８に示す。システインのＰＥＧ化は、ＰＥＧマレイミド又は２つに分かれたＰＥＧマレイミドを使用して実施できる。
【０１５７】
本発明のＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを調製するための別法は、ＰＥＧ−スクシニミジル誘導体を使用したリジン残基のＰＥＧ化に基づく方法である。部位特異的なＰＥＧ化のため、ＰＥＧ化に使用されないＬｙｓ残基をＡｒｇ残基で置換する。
【０１５８】
他のＰＥＧ化方法は、Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応を経由する方法である。この方法では、ＶＰＡＣ２受容体に選択的なペプチド上にＰＥＧ分子を導入するために、遊離アミンを有するＴｒｐ残基が必要となる。これを実施するための１つのアプローチとしては、固相合成の間に、Ｌｙｓ側鎖のアミンに対してアミド結合を介して部位特異的にＴｒｐ残基を導入する方法が挙げられる（実施例１０を参照）。
【０１５９】
本発明の様々な好ましい特徴及び実施態様を、図を参照しながら記載する。図１は、グルコース注入２４時間前にＰ５０５又はＰ５２５で処置した動物における、ｉ．ｖ．グルコース投与に対するインスリン応答の増大を示す。参考として、ビヒクルで処理した動物のインスリン応答を示す。
【実施例】
【０１６０】
＜実施例１＞固相ｔ−Ｂｏｃによる、選択的なＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの調製：
約０．５〜０．６ｇ（０．３８〜０．４５ｍｍｏｌｅ）のＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）−ＰＡＭ樹脂を、標準的な６０ｍＬ反応容器中に添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置を用いてダブルカップリングを実施した。
【０１６１】
以下の側鎖被保護アミノ酸（Ｂｏｃアミノ酸の２ｍｍｏｌｅカートリッジ）をＭｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）から購入し、合成に用いた。
Ａｒｇ−トシル（ＴＯＳ）、Ａｓｐ−δ−シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｘ）、Ｇｌｕ−δ−シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｘ）、Ｈｉｓ−ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ−２−クロロベンジルオキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）、ＳｅｒＯ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ−ホルミル（ＣＨＯ）及びＴｙｒ−２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２Ｂｒ−Ｚ）。
【０１６２】
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＤＭＦ中の０．５Ｍのヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びジクロロメタン中の０．５Ｍのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）をＭａｙｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。
【０１６３】
対称無水物若しくはＨＯＢｔエステルを使用して標準的なダブルカップリングを実施し、両方ともＤＣＣを使用して形成させた。合成終了後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を除去し、Ｔｒｐが配列中に存在する場合にはペプチジル樹脂を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理し、Ｔｒｐ側鎖を脱ホルミル化した。Ｎ末端アシル化のため、４倍過剰の対応する酸の対称無水物をペプチド樹脂に添加した。ＤＣＭ中でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を活性化させ、対称無水物を調製した。４時間反応させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。ＤＣＭで洗浄した後、樹脂をＴＥＦＬＯＮ製の反応容器へ移し、真空乾燥させた。
【０１６４】
反応容器をＨＦ（フッ化水素）装置（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に取り付け、開裂反応を実施させた。ｇ／樹脂当たり１ｍＬのｍ−クレゾールを添加し、１０ｍＬのＨＦ（ＡＧＡ社製、インディアナポリス、ＩＮ）を予め冷却された容器中で凝縮させた。メチオニンが存在する場合は、樹脂ｇ当たり１ｍＬのＤＭＳを添加した。アイスバス中で１時間反応液を撹拌した。真空内でＨＦを除去した。エチルエーテル中に残余物を懸濁させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを酢酸水溶液で抽出し、凍結乾燥又は逆相カラム上へ直接ロードした。
【０１６５】
バッファＡ（水中０．１％ＴＦＡ）を用い、２．２×２５ｃｍのＶＹＤＡＣ  Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣ（Waters）で、１０ｍＬ／分で１２０分、Ａの２０％〜９０％のＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の勾配とし、２８０ｎｍ（４．０Ａ）でＵＶをモニターしながら、１分間ずつに分けてフラクションを回収した。適当なフラクションを混合し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ  ＡＱ  Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ質量分析により、乾燥生成物を分析した。
【０１６６】
＜実施例２＞固相ＦＭｏｃを用いた、選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの調製
約１１４ｍｇ（５０ｍｍｏｌｅ）のＦＭＯＣＳｅｒ（ｔＢｕ）ＷＡＮＧ樹脂（ＧｌｙｃｏＰｅｐ社製、シカゴ、ＩＬ）を各反応容器に添加した。Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて合成を実施した。７５ｍｇ（５０μｍｏｌｅ）のＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ．Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用してＣ末端アミドを有するアナログを調製した。
【０１６７】
以下のＦＭＯＣアミノ酸を、ＧｌｙｃｏＰｅｐ社（シカゴ、ＩＬ）及びＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入した。Ａｒｇ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ−β−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ−δ−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）。
【０１６８】
溶媒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｎメチルピロリドン（ＮＭＰ−Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）は、Ｍａｙｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。
【０１６９】
ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及びピペリジン（Ｐｉｐ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミルウォーキー、ＷＩ）から購入した。
【０１７０】
全てのアミノ酸を、ＤＭＦで０．３Ｍとなるように溶解させた。２０％のＰｉｐ／ＤＭＦを使用して２０分間脱保護した後、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで活性化させてカップリングを３時間実施した。脱保護及びカップリングの後、各樹脂をＤＭＦで洗浄した。最後のカップリング及び脱保護の後、ペプチジル樹脂をＤＣＭで洗浄し、反応容器中で真空乾燥させた。Ｎ末端アシル化のため、４倍過剰の対応する酸の対称無水物をペプチド樹脂に添加した。ＤＣＭ中でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を活性化させ、対称無水物を調製した。４時間反応させ、ニンヒドリン試験によりモニターした。ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄した後、真空乾燥させた。
【０１７１】
開裂反応液を、１０ｍＬのＴＦＡ中に０．２ｍＬのチオアニソール、０．２ｍＬのメタノール、０．４ｍＬのトリイソプロピルシランを含有する開裂カクテル（全てＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミルウォーキー、ＷＩから購入）と２時間混合させた。Ｃｙｓが配列中に存在する場合、２％のエタンジチオールを添加した。ＴＦＡ濾過液を４０ｍＬのエチルエーテルに添加した。沈殿物を２０００回転／分で２分遠心分離した。上澄みをデカントした。ペレットを４０ｍＬのエーテル中に再懸濁し、再度遠心分離し、再度デカントし、窒素下更に真空下において乾燥させた。
【０１７２】
各生成物０．３〜０．６ｍｇを、１ｍＬの０．１％のＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）に溶解させ、２０μＬをＨＰＬＣ［０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ  ＡＱ  Ｃ１８、１ｍＬ／分、４５℃、２１４ｎＭ（０．２Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝５０％  Ｂ〜９０％  Ｂ、３０分］により分析した。
【０１７３】
バッファＡ（水中０．１％ＴＦＡ）を用い、２．２×２５ｃｍのＶＹＤＡＣ  Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣ（Waters）で、１０ｍＬ／分で１２０分、Ａの２０％〜９０％のＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の勾配とし、２８０ｎｍ（４．０Ａ）でＵＶをモニターしながら、１分間ずつに分けてフラクションを回収した。適当なフラクションを混合し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（０．４６×１５ｃｍのＭＥＴＡＳＩＬ  ＡＱ  Ｃ１８）及びＭＡＬＤＩ質量分析により、乾燥生成物を分析した。
【０１７４】
Ｐ５２１の前駆体（Ｃ６−ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＳＩＯｒｎＯｒｎＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＣＣ−ＮＨ2）：上記のＦＭｏｃプロトコルを使用して合成を実施した。分析用ＨＰＬＣによってペプチドを解析した（ｔR＝１０．９分、ＨＰＬＣ条件は上記の通り、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：ｍ／ｚ計算値＝４２９０．０、ｍ／ｚ実測値＝４２９０．８［Ｍ＋Ｈ+］）。調製用の逆相ＨＰＬＣを使用した精製の後、純粋なフラクションを混合し、凍結乾燥し、最終的な凍結乾燥粉末として１４．８ｍｇを得た。
【０１７５】
Ｐ５２５の前駆体（Ｃ６−ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹＡｉｂＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＣＣ−ＮＨ2）：Ｐ５２１前駆体の記載と同様に操作した。分析用ＨＰＬＣ：ｔR＝１１．０分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：ｍ／ｚ計算値＝４２８８．０、ｍ／ｚ実測値＝４２８８．８［Ｍ＋Ｈ+］）。最終生成物を凍結乾燥し、粉末１８．７ｍｇを得た。
【０１７６】
Ｐ５７４の前駆体（Ｃ６−ＨＳＤＡＶＦＴＥＱＹ（ＯＭｅ）ＴＯｒｎＬＲＡｉｂＱＬＡＡｂｕＡｉｂＯｒｎＹ（ＯＭｅ）ＬＱＡｉｂＩＯｒｎＯｒｎＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＣＣ−ＮＨ2）：Ｐ５２１前駆体の記載と同様に操作した。分析用ＨＰＬＣ：ｔR＝１１．７分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：ｍ／ｚ計算値＝４３３０．１、ｍ／ｚ実測値＝４３３０．７［Ｍ＋Ｈ+］）。最終生成物を凍結乾燥し、粉末４６．２ｍｇを得た。
【０１７７】
＜実施例３＞ヒトＶＰＡＣ２受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果：ＡｉｐｈａＳｃｒｅｅｎ：
培養フラスコ中で、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄した。次に酵素フリーの分散バッファを用いて細胞をリンスした。分散させた細胞を回収した。次に細胞をスピンダウンし、刺激バッファで洗浄した。データポイントごとに、刺激バッファ中に懸濁させた５０，０００細胞を用いた。このバッファに、Ａｌｐｈａスクリーンアクセプタビーズを、当該刺激と共に添加した。この混合物を６０分間インキュベートした。溶解バッファ及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズを添加し、６０〜１２０分間インキュベートした。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎのシグナル（細胞内ｃＡＭＰ濃度を表す）を、適切な計測装置（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ）で測定した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎのドナー及びアクセプタビーズを扱う処理は減光下で実施した。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ50は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線によって定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。
【０１７８】
各アゴニストの結果は、１度のランにおいて行った最低限２つの分析値から算出した。若干のアゴニストの場合、１つ以上のランにおける結果の平均として算出した。試験したペプチド濃度は、１００００、１０００、１００、１０、３、１、０．１、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００１及び０．００００１ｎＭである。
【０１７９】
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ：
９６ウェルマイクロタイタープレート中で安定にヒトＶＰＡＣ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞系を、アッセイ前日に５０，０００細胞／ウェルで播種した。２００μＬの培地中で２４時間細胞をインキュベートした。実験日に培地を除去した。更に細胞を２度洗浄した。室温で、１５分間、アッセイバッファ＋ＩＢＭＸ中で細胞をインキュベートした。その後、刺激を添加し、アッセイバッファ中に溶解させた。３０分間にわたり刺激した。次にアッセイバッファを穏やかに除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ｃＡＭＰキット中の細胞溶解試薬を添加した。その後、製造業者の指示に従い、ｃＡＭＰシグナルの検出に関する標準的なプロトコルを実施した（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社、米国）。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ50は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線によって定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。
【０１８０】
各アゴニストの結果は、独立に行った２つのランの結果の平均である。試験したペプチド濃度は、１００００、１０００、１００、１０、３、１、０．１、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００１及び０．００００１ｎＭである。
【０１８１】
それぞれのアッセイフォーマットによる、ヒトＶＰＡＣ２受容体の活性（ＥＣ50（ｎＭ））をTable 1に示す。
【表１１】
2009519212.tif 000012
【表１２】
2009519212.tif 000013
【０１８２】
＜実施例４＞選択性
結合試験：
安定なＶＰＡＣ２細胞系（実施例３を参照）、又はヒトＶＰＡＣ１又はＰＡＣ１でトランジェントにトランスフェクションした細胞から調製した細胞膜を用いた。トレーサーとしてＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２の場合は125ＩラベルしたＶＩＰ、並びにＰＡＣ１の場合は125ＩラベルしたＰＡＣＡＰ−２７を使用して、フィルタ結合試験を実施した。
【０１８３】
このアッセイに用いる溶液及び装置は以下の通りである。
前浸漬溶液：Ａｑｕａ  ｄｅｓｔ中の０．５％のポリエチレンアミン、
フィルタプレートのフラッシュバッファ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、
ブロッキングバッファ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．２％のプロテアーゼフリーのＢＳＡ、
アッセイバッファ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のプロテアーゼフリーのＢＳＡ、
希釈及びアッセイプレート：ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、Ｕ型、
濾過プレート：Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＦＢ  Ｏｐａｑｕｅ  Ｐｌａｔｅ、１．０μＭ  Ｂタイプのグラスファイバーフィルタ。
【０１８４】
フィルタプレートを調製するため、減圧濾過によって前浸漬溶液を吸引除去した。２００μＬのフラッシュバッファを用いてプレートを２度洗浄した。２００μＬのブロッキングバッファをフィルタプレートに添加した。次にフィルタプレートを、室温で１時間、２００μＬの前浸漬溶液でインキュベートした。
【０１８５】
アッセイプレートを２５μＬのアッセイバッファ、アッセイバッファの中に懸濁した２５μＬ（２．５μｇ）の膜、アッセイバッファ中のアゴニスト２５μＬ、及びアッセイバッファ中のトレーサー（約４００００ｃｐｍ）２５μＬで満たした。満たされたプレートを振とうしながら１時間インキュベートした。
【０１８６】
アッセイプレートからフィルタプレートへの移動を行わせた。ブロッキングバッファを減圧濾過によって吸引除去し、フラッシュバッファで２回洗浄した。アッセイプレートからフィルタプレートへ９０μＬを移した。アッセイプレートから移した９０μＬを吸引し、２００μＬのフラッシュバッファで３回洗浄した。プラスチック製の支持体を除去した。６０℃で１時間乾燥させた。３０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを添加した。カウントを実施した。
【０１８７】
ヒトＶＰＡＣ２、ＶＰＡＣ１及びＰＡＣ１の受容体への結合（ＩＣ50）をTable 2に示す。
【表１３】
2009519212.tif 000014
【表１４】
2009519212.tif 000015
【０１８８】
＜実施例５＞ラットＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２受容体におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ：
市販のトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用して、ラットＶＰＡＣ１又はＶＰＡＣ２受容体ＤＮＡにより、ＣＨＯ−ＰＯ細胞をトランジェントにトランスフェクションした。９６ウェルプレートに１０，０００／ウェルの密度で細胞を播種し、２００ｍＬの培地で３日間インキュベートし、３日目にアッセイを実施した。
【０１８９】
実験日に培地を除去した。更に細胞を２度洗浄した。室温で、１５分間、アッセイバッファ＋ＩＢＭＸ中で細胞をインキュベートした。その後、刺激を添加し、アッセイバッファ中に溶解させた。３０分間にわたり刺激した。次にアッセイバッファを穏やかに除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ｃＡＭＰキット中の細胞溶解試薬を添加した。その後、製造業者の説明書に従い、ｃＡＭＰシグナルの検出に関する標準的なプロトコルを実施した（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社、米国）。ｃＡＭＰ生成におけるＥＣ50は、シグナルから直接算出したか、又は各プレートで作成した標準曲線によって定義される絶対的なｃＡＭＰ濃度に基づいて算出した。
【０１９０】
各アゴニストの結果は、独立に行った２つのランの結果の平均である。ラットＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２の結果は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘアッセイのみを使用して得た。試験したペプチド濃度は、１００００、１０００、１００、１０、３、１、０．１、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００１及び０．００００１ｎＭである。
【０１９１】
ラットＶＰＡＣ２及びＶＰＡＣ１受容体の活性（ＥＣ50（ｎＭ））をTable 3に示す。
【表１５】
2009519212.tif 000016
【表１６】
2009519212.tif 000017
【０１９２】
＜実施例６＞ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
静脈ブドウ糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）：
通常のウィスターラットを一晩絶食させ、実験前に麻酔した。血液サンプリング用カテーテルをラットに挿入した。アゴニストを皮下投与し、通常グルコース投与の２４時間前に曝露した。血液サンプルを頸動脈から採取した。血液サンプルは、アゴニスト投与後のグルコース注入の直前に採血した。最初の採血の後、グルコース混合液を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。ｋｇ体重当たりグルコース＋アゴニストを有する担体を合計１．５ｍＬ注入した（０．５ｇ／ｋｇ体重によるグルコース投与となる）。望ましい投与量を決定するため、ペプチド濃度をμｇ／ｋｇ単位で変化させた。グルコース投与の２、４、６及び１０分後に血液サンプルを採血した。アゴニストを含まない、グルコースのみを含む同じ担体を投与する群を対照動物群とした。幾つかの場合、グルコース投与後２０及び３０分における血液サンプルを採血した。アプロチニンを血液サンプルに添加（２５０〜５００ｋＩＵ／ｍＬ血液）した。次に標準的な方法を使用して血漿中のグルコース及びインスリンレベルを分析した。
【０１９３】
アッセイでは、ＰＢＳ中の調製及び補正されたペプチドストックを使用した。通常、このストックは１００μＭストックとして希釈する。しかしながら、約１ｍｇ／ｍＬでアゴニストを含有する、更に濃縮されたストックを用いた。それぞれの濃度を常時測定した。最大応答の変動性は、担体投与量の変動性に大部分起因する。プロトコルの詳細を以下に示す。
【表１７】
2009519212.tif 000018
【表１８】
2009519212.tif 000019
【０１９４】
ＰＥＧ化ペプチドの薬物動態的側面：健康なフィッシャー３４４ラット（群当たり３匹）を用い、１００μｇアゴニスト／ｋｇ（ペプチド含量ベースにおけるアゴニスト量、ＰＢＳバッファ中に溶解）を注射した。投与後３、１２、２４、４８、７２、９６及び１６８時間において血液サンプルを採血し、血清中のペプチド含量を、ペプチドのＮ末端を認識する標識免疫検定法（ＲＩＡ）によって分析した。次にＰＫパラメータを、モデル非依存的な方法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏ、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して算出した。
【表１９】
2009519212.tif 000020
【０１９５】
＜実施例７＞ラット血清における安定性試験：
ラット血清中におけるＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストペプチドの安定性を解析するため、ＣＨＯ−ＶＰＡＣ２細胞クローン＃６（９６ウェルプレート／５０，０００細胞／ウェル、１日インキュベート）、ＰＢＳ  １×（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００μＭの分析用ストック液（上記）、と殺した通常のウィスターラットから採取したラット血清、アプロチニン及びＤｉｓｃｏｖｅＲｘアッセイキットを準備した。ラット血清を使用前まで４℃で保存し、２週以内に用いた。
【０１９６】
０日目に、９０μＬのラット血清及び１０μＬのペプチドストック液を混合し、１０μＭペプチド／ラット血清の１００μＬアリコートを２本調製した。２５０ｋＩＵ  アプロチニン／ｍＬを、これらのアリコートのうちの１つに添加した。アプロチニンを含有するアリコートを４℃で保存した。アプロチニンを含有しないアリコートを３７℃で保存した。アリコートを２４又は７２時間インキュベートした。
【０１９７】
１日目に、０日目に調製したアリコートの２４又は７２時間のインキュベーション後、インキュベートバッファ（ＰＢＳ＋１．３ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのグルコース及び０．２５ｍＭのＩＢＭＸを含有）を調製した。４℃及び３７℃アリコートにおいて、ペプチドを１１回の５倍連続希釈のプレートを作製し、ペプチドごとに試験した。最初のスクリーニング（実施例３を参照）において、ペプチドが１ｎＭを上回るＥＣ50を有する場合、１０００ｎＭを最大濃度とし、一方ペプチドが１ｎＭ以下のＥＣ50を有する場合、２０００ｎＭを最大濃度とした。プレートを細胞と共に２回インキュベートバッファで洗浄した。プレートに、ウェル当たり５０μＬのインキュベート培地を添加し、１５分間インキュベートした。最初のスクリーニングにより示された最大濃度を用いて、試験されるペプチドごとの４℃及び３７℃アリコートにおける、ペプチドの１１回の５倍連続希釈により調製したプレートの細胞へ、ウェル当たり５０μＬで溶液を移した（２回試験を実施）。この処理によりペプチド濃度が２倍に希釈される。室温で３０分間細胞をインキュベートした。上澄みを除去した。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ抗体／抽出バッファを４０μＬ／ウェルで添加した。シェーカ（３００回転／分）で１時間、細胞をインキュベートした。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘキットを用いて通常の操作を行った。ｃＡＭＰスタンダードをカラム１２に添加した。ｃＡＭＰアッセイデータからＥＣ50値を測定した。残留している活性化ペプチドの量を、各条件ごとに式ＥＣ50,4℃／ＥＣ50,37℃により推定した。
【表２０】
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【０１９８】
＜実施例８＞チオールベースの反応による、選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストのＰＥＧ化：
ＰＥＧ化反応は通常、チオエーテル結合が形成されうる条件下で実施する。具体的には、溶液のｐＨは約４〜９、チオール含有ペプチド濃度はＰＥＧマレイミド濃度の０．７〜１０モル過剰である。ＰＥＧ化反応は通常室温で行う。次にＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを逆相ＨＰＬＣ又は限外除外クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して単離する。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はＭＡＬＤＩ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙを使用して、ＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析する。
【０１９９】
通常、チオール官能基を選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト中又は上に導入する場合、片方又は両方の末端に、システイン若しくはホモシステイン若しくはチオール含有部分を添加することにより、又は、システイン若しくはホモシステイン若しくはチオール含有部分を配列中に挿入することによって実施する。チオール含有ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを４０ｋＤａ、３０ｋＤａ又は２０ｋＤａのＰＥＧ−マレイミドと反応させ、チオエーテル結合により共有結合したＰＥＧ含有誘導体を調製する。
【０２００】
Ｐ５０５の合成
２０，０００Ｄａの平均分子量を有する１９ｍｇのペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ５０５）、及び１６２ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＮＯＦ、日本）を２ｍＬの１００ｍＭのＮＨ4Ａｃバッファ（１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）を含有）中に溶解させ、４時間反応させた。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後、凍結乾燥し、粉末として生成物９７ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験した。
【０２０１】
Ｐ５２５の合成
２０，０００Ｄａの平均分子量を有する１８．７ｍｇのペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ５２５）、及び１５７ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＮＯＦ、日本）を２ｍＬの１００ｍＭのＮＨ4Ａｃバッファ（１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）を含有）中に溶解させ、４時間反応させた。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後、凍結乾燥し、粉末として生成物１１４ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験した。
【０２０２】
Ｐ５７２の合成
２０，０００Ｄａの平均分子量を有する２２．３ｍｇのペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ５７２）、及び１７７ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＮＯＦ、日本）を２ｍＬの１００ｍＭのＮＨ4Ａｃバッファ（１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）を含有）中に溶解させ、４時間反応させた。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後、凍結乾燥し、粉末として生成物１３７ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験した。
【０２０３】
Ｐ５７４の合成
２０，０００Ｄａの平均分子量を有する３１．９ｍｇのペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ５７４）、及び２８３ｍｇのメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＮＯＦ、日本）を３ｍＬの１００ｍＭのＮＨ4Ａｃバッファ（１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）を含有）中に溶解させ、４時間反応させた。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後、凍結乾燥し、粉末として生成物１７１ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験した。
【０２０４】
Ｐ６０２の合成
ペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ６０２）２０ｍｇと、３０，０００Ｄａの平均分子量を有するメトキシ−ポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド（Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国）２２３ｍｇを、２ｍＬの１００ｍＭのＮＨ4Ａｃバッファ（１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）を含有）中に溶解させ、４時間反応させた。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後、凍結乾燥し、粉末として生成物１３２ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験した。
【０２０５】
＜実施例９＞アシル化によるリシンの側鎖のＰＥＧ化：
選択的ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストの部位特異的なＰＥＧ化を実施するため、ＰＥＧ化しようとするＬｙｓ残基以外の全てのＬｙｓ残基をＡｒｇ残基に置換する。使用できるＰＥＧ分子はｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社製、Ｌｏｔ＃：ＰＴ−０４Ｅ−１１）である。好ましくは室温で２〜３時間ＰＥＧ化反応を実施する。調製用ＨＰＬＣによりペプチドを精製する。
【０２０６】
実施例１０：ピクテ−シュペングラー反応によるＰＥＧ化：
ピクテ−シュペングラー反応によるＰＥＧ化を実施するには、遊離アミン基を有するＴｒｐを用いて、残基選択的にＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニスト上にＰＥＧ分子を導入する必要がある。Ｔｒｐ残基をＬｙｓ残基の側鎖上へカップリングさせる。広いＳＡＲは、この修飾によっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果及び選択性に関して親ペプチドの特性を変化させないことを示す。
【０２０７】
官能性アルデヒド（例えばｍＰＥＧ２−ＢＵＴＹＲＡＬＤ−４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、米国）を有するＰＥＧを反応に使用した。部位特異的なＰＥＧ化により、ＰＥＧとペプチドとの間のテトラカルボリン環の形成がなされた。室温で１〜４８時間、氷酢酸中でＰＥＧ化を実施した。１〜１０モル過剰のＰＥＧアルデヒドを反応に用いた。酢酸の除去後、ＰＥＧ化ＶＰＡＣ２受容体ペプチドアゴニストを調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。
【０２０８】
Ｐ５３５の合成
２７．７ｍｇのペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ５３５）、及び５９０ｍｇのｍＰＥＧ２−ＢＵＴＹＲＡＬＤ−４０Ｋを３ｍＬの酢酸に溶解させ、２日間反応させた。分離用ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離し、凍結乾燥し、粉末状態のＰＥＧ化ペプチドアゴニストの生成物９４ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【０２０９】
Ｐ５５７の合成
２３ｍｇのペプチド前駆体（非ＰＥＧ化Ｐ５５７）、及び４６０ｍｇのｍＰＥＧ２−ＢＵＴＹＲＡＬＤ−４０Ｋを３ｍＬの酢酸に溶解させ、２日間反応させた。準備のＲＰ−ＨＰＬＣにより単離し、凍結乾燥し、粉末状態のＰＥＧ化ペプチドアゴニストの生成物５０ｍｇを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び限外除去ＨＰＬＣでＰＥＧ化ペプチドアゴニストを解析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【０２１０】
本発明の他の態様は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に自明である。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】グルコース注入２４時間前にＰ５０５又はＰ５２５で処置した動物における、ｉ．ｖ．グルコース投与に対するインスリン応答の増大を示す。参考として、ビヒクルで処理した動物のインスリン応答を示す。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月25日(2008.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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