(57)【要約】提供されるものは、慢性的病的状態の根絶を促進するために、哺乳動物における免疫反応を強化する方法である。方法は、該哺乳動物の循環から、可溶性ＴＮＦ受容体などの免疫系抑制因子を除去し、病原体に対しより活発な免疫反応を可能にすることを含む。免疫系抑制因子の除去は、哺乳動物の生物学的流体を、標的とする免疫系抑制因子に結合し、したがって該因子を生物学的流体から除去することを可能とするＴＮＦαムテインなどの、一種以上の結合パートナーと接触させることによって実現される。特に有用なのは、可溶性ＴＮＦ受容体などの標的免疫系抑制因子に対し特異的に結合することが可能な、ＴＮＦαムテインなどの結合パートナーに対して共有的に結合体化される、不活性な、生体適合性物質から構成される吸収性基質である。
2009509965.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質に付着した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ムテインを含む結合体。
【請求項２】
前記ＴＮＦαムテインが、配列番号１として参照される保存配列を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記ＴＮＦαムテインが、共通配列・配列番号９を含み、前記配列において、
Ｘ１は、ＬｅｕおよびＶａｌから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２は、ＧｌｎＡｓｎＳｅｒ、ＡｒｇＡｌａＬｅｕ、ＡｒｇＴｈｒＰｒｏ、ＧｌｎＡｌａＳｅｒ、およびＧｌｎＴｈｒから選ばれる２または３アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ３は、ＡｓｐおよびＡｓｎから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＨｉｓＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｕ（配列番号２１）、ＨｉｓＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｕ（配列番号２２）、ＰｒｏＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｙ（配列番号２３）、ＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２４）、ＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２５）、ＩｌｅＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２６）、ＰｒｏＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２７）、ＩｌｅＡｓｎＳｅｒＰｒｏＧｌｙ（配列番号２８）、およびＶａｌＬｙｓＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２９）から選ばれる５アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇ（配列番号３０）、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｒｇ（配列番号３１）、ＧｌｙＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３２）、ＬｅｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇ（配列番号３３）、ＴｒｐＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３４）、ＧｌｎＳｅｒＧｌｙＴｙｒ（配列番号３５）、およびＬｅｕＡｓｎＡｒｇＡｒｇ（配列番号３６）から選ばれる４アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＬｙｓから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ８は、ＭｅｔＡｓｐ、ＭｅｔＬｙｓ、ＶａｌＧｌｕ、ＶａｌＬｙｓ、およびＶａｌＧｌｎから選ばれる２アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、およびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１１は、ＡｌａＡｓｐ、ＳｅｒＡｓｐ、ＴｈｒＡｓｐ、ＬｅｕＡｓｐ、ＡｌａＧｌｕ、およびＳｅｒＧｌｕから選ばれる２アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ１２は、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１４は、ＡｓｐＶａｌＶａｌＬｅｕ（配列番号３７）、ＡｓｐＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３８）、ＳｅｒＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３９）、ＰｒｏＰｒｏＰｒｏＶａｌ（配列番号４０）、ＳｅｒＴｈｒＨｉｓＶａｌＬｅｕ（配列番号４１）、ＳｅｒＴｈｒＰｒｏＬｅｕＰｈｅ（配列番号４２）、およびＳｅｒＴｈｒＡｓｎＶａｌＰｈｅ（配列番号４３）から選ばれる４または５アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ１５は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１７は、ＩｌｅおよびＶａｌから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１８は、ＧｌｎＧｌｕ、ＰｒｏＡｓｎ、ＧｌｎＴｈｒ、およびＰｒｏＳｅｒから選ばれる２アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ１９は、ＬｅｕおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２０は、ＰｒｏＬｙｓＡｓｐ、ＨｉｓＡｒｇＧｌｕ、ＧｌｎＡｒｇＧｌｕ、およびＨｉｓＴｈｒＧｌｕから選ばれる３アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ２１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＴｒｐから選ばれるアミノ酸であるか、または不在であり；
Ｘ２２は、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＡｌａから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２３は、ＬｅｕおよびＧｌｎから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２４は、ＧｌｙおよびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２５は、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２６は、ＡｌａおよびＴｈｒから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２７は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２８は、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２９は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、およびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ３０は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒから選ばれるアミノ酸であり；および
Ｘ３１は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸である、
請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記ＴＮＦαムテインが、ヒトのＴＮＦα（配列番号２）の、領域１、アミノ酸２９−３６、領域２、アミノ酸８４−９１、および領域３、アミノ酸１４３−１４９から選ばれるＴＮＦαの領域、または、別の種のＴＮＦαのアナログ位置にアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記ＴＮＦαムテインが、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、ムテイン３（配列番号５）、ムテイン４（配列番号６）、ムテイン５（配列番号７）、およびムテイン６（配列番号８）から選ばれる、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
前記ＴＮＦαムテインが、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、およびムテイン４（配列番号６）から選ばれる、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記ＴＮＦαムテインが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウサギ、およびラットから選ばれる種に由来する、請求項１に記載の結合体。
【請求項８】
前記ＴＮＦαムテインが、前記基質に共有結合される、請求項１に記載の結合体。
【請求項９】
前記基質が不活性媒体である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１０】
前記不活性媒体が中空線維である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１１】
前記不活性媒体がビーズの形態である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１２】
前記ビーズがマクロ多孔性ビーズである、請求項１１に記載の結合体。
【請求項１３】
前記マクロ多孔性ビーズが、アガロース、架橋結合アガロース、セルロース、調節孔ガラス、ポリアクリルアミド、アズラクトン、ポリメタクリレート、およびポリスチレンから選ばれる、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
前記ビーズが非多孔性ビーズである、請求項１１に記載の結合体。
【請求項１５】
前記非多孔性ビーズが、シリカ、ポリスチレン、およびラテックスから選ばれる、請求項１４に記載の結合体。
【請求項１６】
前記不活性媒体がセルロース製繊維である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１７】
前記不活性媒体が合成繊維である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１８】
前記不活性媒体がフラットまたはプリーツ状膜である、請求項９に記載の結合体。
【請求項１９】
前記不活性媒体がシリカ製粒子である、請求項９に記載の結合体。
【請求項２０】
前記不活性媒体がアガロース製粒子である、請求項９に記載の結合体。
【請求項２１】
前記ＴＮＦαムテインがダイマー状である、請求項１に記載の結合体。
【請求項２２】
前記ダイマー状ＴＮＦαムテインが、二つの同一のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の結合体。
【請求項２３】
前記ダイマー状ＴＮＦαムテインが、二つの非同一アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の結合体。
【請求項２４】
前記ＴＮＦαムテインがモノマーである、請求項１に記載の結合体。
【請求項２５】
前記ＴＮＦαムテインのＴＮＦ作用活性が、天然ＴＮＦαに比べて低下している、請求項１に記載の結合体。
【請求項２６】
前記ＴＮＦαムテインの膜受容体を介するシグナル伝達が、天然ＴＮＦαに比べて低下している、請求項１に記載の結合体。
【請求項２７】
前記ＴＮＦαムテインの細胞傷害活性が、天然ＴＮＦαに比べて低下している、請求項１に記載の結合体。
【請求項２８】
前記ＴＮＦαムテインのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性が、天然ＴＮＦαに比べて低下している、請求項１に記載の結合体。
【請求項２９】
前記ＴＮＦαムテインが、前記哺乳動物と同じ種のＴＮＦα由来のものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項３０】
前記ＴＮＦαムテインの、マルチマーＴＮＦα形成能力が、天然ＴＮＦαに比べて低下している、請求項１に記載の結合体。
【請求項３１】
病的状態を有する哺乳動物において免疫反応を刺激する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から生物学的流体を得ること；
（ｂ）前記生物学的流体を、可溶性腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）に対し特異的結合活性を有する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と接触させること；
（ｃ）前記生物学的流体から、前記可溶性ＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインを除去し、少量の可溶性ＴＮＦＲをもつ改変生物学的流体を生産すること；および、
（ｄ）前記改変生物学的流体を前記哺乳動物に投与すること、
を含む、方法。
【請求項３２】
前記生物学的流体が、血液、血漿、血清、およびリンパ液から選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記血液が全血である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記全血を、細胞成分と、無細胞成分または無細胞成分の分画とに分離する工程をさらに含み、前記無細胞成分または無細胞成分の分画が可溶性ＴＮＦＲを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞成分を、前記改変無細胞成分、または前記無細胞成分の改変分画と組み合わせて、改変全血を生産する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＴＮＦαムテインが、配列番号１として参照される保存配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＴＮＦαムテインが、共通配列・配列番号９を含み、
Ｘ１は、ＬｅｕおよびＶａｌから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２は、ＧｌｎＡｓｎＳｅｒ、ＡｒｇＡｌａＬｅｕ、ＡｒｇＴｈｒＰｒｏ、ＧｌｎＡｌａＳｅｒ、およびＧｌｎＴｈｒから選ばれる２または３アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ３は、ＡｓｐおよびＡｓｎから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ４は、ＨｉｓＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｕ（配列番号２１）、ＨｉｓＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｕ（配列番号２２）、ＰｒｏＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｙ（配列番号２３）、ＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２４）、ＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２５）、ＩｌｅＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２６）、ＰｒｏＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２７）、ＩｌｅＡｓｎＳｅｒＰｒｏＧｌｙ（配列番号２８）、およびＶａｌＬｙｓＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２９）から選ばれる５アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ６は、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇ（配列番号３０）、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｒｇ（配列番号３１）、ＧｌｙＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３２）、ＬｅｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇ（配列番号３３）、ＴｒｐＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３４）、ＧｌｎＳｅｒＧｌｙＴｙｒ（配列番号３５）、およびＬｅｕＡｓｎＡｒｇＡｒｇ（配列番号３６）から選ばれる４アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＬｙｓから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ８は、ＭｅｔＡｓｐ、ＭｅｔＬｙｓ、ＶａｌＧｌｕ、ＶａｌＬｙｓ、およびＶａｌＧｌｎから選ばれる２アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、およびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１１は、ＡｌａＡｓｐ、ＳｅｒＡｓｐ、ＴｈｒＡｓｐ、ＬｅｕＡｓｐ、ＡｌａＧｌｕ、およびＳｅｒＧｌｕから選ばれる２アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ１２は、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１４は、ＡｓｐＶａｌＶａｌＬｅｕ（配列番号３７）、ＡｓｐＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３８）、ＳｅｒＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３９）、ＰｒｏＰｒｏＰｒｏＶａｌ（配列番号４０）、ＳｅｒＴｈｒＨｉｓＶａｌＬｅｕ（配列番号４１）、ＳｅｒＴｈｒＰｒｏＬｅｕＰｈｅ（配列番号４２）、およびＳｅｒＴｈｒＡｓｎＶａｌＰｈｅ（配列番号４３）から選ばれる４または５アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ１５は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１７は、ＩｌｅおよびＶａｌから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ１８は、ＧｌｎＧｌｕ、ＰｒｏＡｓｎ、ＧｌｎＴｈｒ、およびＰｒｏＳｅｒから選ばれる２アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ１９は、ＬｅｕおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２０は、ＰｒｏＬｙｓＡｓｐ、ＨｉｓＡｒｇＧｌｕ、ＧｌｎＡｒｇＧｌｕ、およびＨｉｓＴｈｒＧｌｕから選ばれる３アミノ酸ペプチドであり；
Ｘ２１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＴｒｐから選ばれるアミノ酸であるか、または不在であり；
Ｘ２２は、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＡｌａから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２３は、ＬｅｕおよびＧｌｎから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２４は、ＧｌｙおよびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２５は、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２６は、ＡｌａおよびＴｈｒから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２７は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２８は、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ２９は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、およびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；
Ｘ３０は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒから選ばれるアミノ酸であり；および
Ｘ３１は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸である、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴＮＦαムテインが、ヒトのＴＮＦα（配列番号２）の、領域１、アミノ酸２９−３６、領域２、アミノ酸８４−９１、および領域３、アミノ酸１４３−１４９から選ばれるＴＮＦαの領域、または、別の種のＴＮＦαのアナログ位置にアミノ酸置換を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＮＦαムテインが、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、ムテイン３（配列番号５）、ムテイン４（配列番号６）、ムテイン５（配列番号７）、およびムテイン６（配列番号８）から選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＮＦαムテインが、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、およびムテイン４（配列番号６）から選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＮＦαムテインが、単一型の可溶性ＴＮＦＲに対して特異的結合活性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記可溶性ＴＮＦＲがｓＴＮＦＲＩである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記可溶性ＴＮＦＲがｓＴＮＦＲＩＩである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物学的流体が、２つ以上の型の可溶性ＴＮＦＲに対し特異的結合活性を有するＴＮＦαムテインに接触させられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＴＮＦαムテインが、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩに対して特異的結合活性を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＴＮＦαムテインが、不活性媒体に付着されて吸着基質を形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＴＮＦαムテインが不活性媒体に共有結合される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記不活性媒体が中空線維である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記不活性媒体がマクロ多孔性ビーズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記不活性媒体がセルロース製繊維である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記不活性媒体が合成繊維である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記不活性媒体がフラットまたはプリーツ状膜である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記不活性媒体がシリカ製粒子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＮＦαムテインが組み換え的に生産される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５５】
前記生物学的流体が、複数のＴＮＦαムテインに接触させられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数のＴＮＦαムテインが、単一型の可溶性ＴＮＦＲに対して特異的結合活性を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記可溶性ＴＮＦＲがｓＴＮＦＲＩである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
可溶性ＴＮＦＲがｓＴＮＦＲＩＩである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記生物学的流体が、２つ以上の型の可溶性ＴＮＦＲに対し特異的結合活性を有する、複数のＴＮＦαムテインに接触させられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数のＴＮＦαムテインが、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩに対して特異的結合活性を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＴＮＦαムテインが担体に結合体化される、請求項３１に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数のＴＮＦαムテインが担体に結合体化される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
工程（ａ）から工程（ｄ）までが繰り返される、請求項３１に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項６５】
前記哺乳動物が、非ヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項６６】
前記可溶性ＴＮＦＲに結合した前記ＴＮＦαムテインが、機械的方法によって除去される、請求項３１に記載の方法。
【請求項６７】
前記可溶性ＴＮＦＲに結合した前記ＴＮＦαムテインが、化学的または生物学的方法によって除去される、請求項３１に記載の方法。
【請求項６８】
前記可溶性ＴＮＦＲに結合した前記ＴＮＦαムテインが、前記ＴＮＦαムテインから生物学的流体を分離することによって除去される、請求項３１に記載の方法。
【請求項６９】
病的状態を有する哺乳動物において免疫系反応を刺激する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から生物学的流体を得ること；
（ｂ）可溶性腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）に対して特異的結合活性を有し、不活性媒体に付着されて吸着基質を形成する、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ムテインに、前記生物学的流体を接触させること；
（ｃ）前記可溶性ＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインを含む吸着基質を生物学的流体から除去し、改変生物学的流体を生産すること；および、
（ｄ）前記哺乳動物に、前記改変生物学的流体を投与すること、
を含む、方法。
【請求項７０】
前記生物学的流体が、血液、血漿、血清、およびリンパ液から選ばれる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記血液が全血である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記全血を、細胞成分と、無細胞成分または無細胞成分の分画とに分離する工程をさらに含み、前記無細胞成分、または無細胞成分の前記分画が可溶性ＴＮＦＲを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
細胞成分を、前記改変無細胞成分または無細胞成分の改変分画と組み合わせて、改変全血を生産する工程をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
病的状態を有する哺乳動物において免疫反応を刺激する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から生物学的流体を得ること；
（ｂ）可溶性腫瘍壊死因子受容体に対して特異的結合活性を有する、二つ以上のＴＮＦαムテインに、前記生物学的流体を接触させること；
（ｃ）前記可溶性ＴＮＦＲに結合した前記ＴＮＦαムテインを前記生物学的流体から分離し、改変生物学的流体を生産すること；
（ｆ）前記哺乳動物に、前記改変生物学的流体を投与すること、
を含む、方法。
【請求項７５】
前記二つ以上のＴＮＦαムテインが、不活性媒体に付着して吸着基質を形成する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記二つ以上のＴＮＦαムテインが不活性媒体に共有的に結合体化される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記生物学的流体が、血液、血漿、血清、およびリンパ液から選ばれる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記血液が全血である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
全血を、細胞成分と、無細胞成分または前記無細胞成分の分画とに分離する工程をさらに含み、前記無細胞成分または無細胞成分の分画が可溶性ＴＮＦＲを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞成分を、前記改変無細胞成分、または前記無細胞成分の改変分画と組み合わせて、改変全血を生産する工程をさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
生物学的流体から可溶性腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）を除去する方法であって、
（ａ）生物学的流体を得ること；
（ｂ）前記生物学的流体を、可溶性ＴＮＦＲに対し特異的結合活性を有する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ムテインと接触させること；
（ｃ）前記生物学的流体から、前記可溶性ＴＮＦＲに結合した前記ＴＮＦαムテインを除去し、可溶性ＴＮＦＲ量の低下した改変生物学的流体を生産すること；
を含む、方法。
【請求項８２】
前記ＴＮＦαムテインが、不活性媒体に付着されて吸着基質を形成し、前記生物学的流体から、前記可溶性ＴＮＦＲに結合した前記ＴＮＦαムテインを含む前記吸着基質を除去することによって、前記可溶性ＴＮＦＲに結合している前記ＴＮＦαムテインが、前記生物学的流体から除去される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
工程（ｂ）において、生物学的流体が、可溶性ＴＮＦＲに対して特異的結合活性を有する、一つ以上の追加のＴＮＦαムテインにさらに接触させられ、かつ、工程（ｃ）において、前記可溶性ＴＮＦＲに結合している、前記一つ以上の追加のＴＮＦαムテインが、前記生物学的流体からさらに除去される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記生物学的流体が、複数のＴＮＦαムテインと接触させられる、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年９月２２日に出願された、米国特許出願第１１／２３４，０５７号の一部継続出願であり、これに対して優先権を主張する。米国特許出願第１１／２３４，０５７号は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、一般に、免疫療法の分野に関し、より詳細には、宿主の免疫反応を強化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
哺乳類の免疫系は、有害となる可能性のある介在因子の成長および増殖に対し宿主を保護するように進化してきた。これらの介在因子としては、環境中に存在し、宿主の体内に導入されると様々の病的状態を誘発することが可能な、感染性微生物、例えば、細菌、ウィルス、真菌、および寄生虫などが挙げられる。他にも、病的状態は、環境から得られる因子ではなく、むしろ宿主の体内で自発的に発生した因子に由来する場合もある。そのもっとも良い例が、哺乳類で起こることが知られる多くの悪性疾患である。理想的には、宿主におけるこれらの有害因子の存在が、免疫系の動員を誘発し、該因子の破壊を実行し、それによって宿主の環境の清純性が回復されることである。
【０００４】
免疫系による病原体の破壊は、様々のエフェクター機構を巻きこんで行われるが、それらは、一般に、二つのカテゴリー分類される。先天性免疫と特異的免疫である。防衛の第一線は、先天性免疫機構によって仲介される。先天性免疫は、宿主の体内に侵入する無数の因子を区別しない。そうではなく、先天性免疫は、炎症反応、食作用、補体およびインターフェロンなどの原形質包含成分を用いる一般的方法によって対応する。一方、特異的免疫は、病原体をそれぞれ区別する。特異的免疫は、ＢおよびＴリンパ球によって仲介され、大部分は、先天性免疫のエフェクター機構を増幅し、それらの重点的作用を補佐する。
【０００５】
効果的免疫反応の微細な調整は、先天性および特異的の両免疫機構からの寄与を必要とする。免疫系のこの両腕それぞれの機能、およびそれらの相互作用は、時間的／空間的に、かつ、関与する特定の細胞タイプの点からも注意深く互いに調和的に調節されている。この調和的調節は、いくつかの、可溶性免疫刺激性介在因子、すなわち「免疫系刺激因子」の活動によってもたらされる（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３０１−３０８（１９９３）において総覧される）。これらの免疫系刺激因子の内のあるものは、炎症反応、および付属の、一連の全身反応を起動し、それらを恒久的に維持する。そのような因子の例としては、炎症性介在因子腫瘍壊死因子αおよびβ、インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターフェロン−γ、およびケモカインＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性タンパク１−αおよび１−β、およびマクロファージの走化性および活性化因子が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。その他の免疫系刺激因子は、特異的免疫のＢおよびＴリンパ球の間の相互作用を促進する。そのような因子の例としては、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、およびインターフェロン−γが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。さらに別の免疫系刺激因子は、特異的免疫と先天性免疫との間の双方向性コニュニケーションを仲介する。そのような因子の例としては、インターフェロン−７、インターロイキン−１、腫瘍壊死因子αおよびβ、およびインターロイキン−１２が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらの免疫系刺激因子は全て、宿主細胞表面の特定の受容体に結合し、標的細胞の機能を変える細胞内シグナルの輸送をもたらすことによって、その作用を及ぼす。それと協調して、これらの介在因子は、免疫細胞の活性化および増殖を刺激し、該細胞を、特定の解剖学的部位に招集し、攻撃因子の根絶におけるこれらの細胞同士の協力を可能とする。ある個人において誘発される免疫反応は、生産される免疫系刺激因子の特定の補体、および各刺激因子の相対的量によって決められる。
【０００６】
前述の免疫系刺激因子とは対照的に、免疫系は、免疫反応の抑制を補佐する、別の、可溶性介在因子を進化させている（Ａｒｅｎｄ，Ａｄｖ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．４０：３６５−３９４（１９９５）に総覧される）。これらの「免疫系抑制因子」は、宿主の組織を損傷する可能性のある慢性的免疫状態の確立を阻止するため、反応を抑える能力を免疫系に付与する。免疫系抑制因子による宿主の免疫機能の調節は、後述の各種機構を通じて実現される。
【０００７】
第一に、ある免疫系抑制因子は、免疫系刺激因子に直接結合し、それら刺激因子が、宿主細胞の原形質膜受容体に結合するのを阻止する。この種の免疫系抑制因子の例としては、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロン−γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、およびインターロイキン−７に対する可溶性受容体が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０００８】
第二に、ある免疫系抑制因子は、免疫系刺激因子の、その受容体に対する結合に拮抗する。例を挙げると、インターロイキン−１受容体拮抗因子は、インターロイキン−１の膜受容体に結合することが知られる。該拮抗因子は、標的細胞に活性化シグナルを輸送することはしないが、インターロイキン−１の膜受容体を占拠することによって、インターロイキン−１の作用をブロックする。
【０００９】
第三に、特定の免疫系抑制因子は、宿主細胞の受容体に結合し、免疫系刺激因子の生産低下をシグナル伝達することによってその作用を及ぼす。例としては、二つの、最重要の、前炎症介在因子である、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン−１の生産を下げるインターフェロン−β（Ｃｏｃｌｅｔ−Ｎｉｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ８：３４５−３４９（１９９７））、および、免疫系刺激因子、インターロイキン１２の生産を抑制することによって細胞性免疫反応の発達を抑えるインターロイキン−１０（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０４１−１０４８（１９９３））が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。免疫系刺激因子の生産の低下に加えて、ある免疫系抑制因子はさらに、他の免疫系抑制因子の生産を強化する。例として挙げると、インターフェロン−α２ｂは、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子αの生産を抑制し、かつ、対応する免疫系抑制因子、インターロイキン−１受容体拮抗因子、および、腫瘍壊死因子αおよびβに対する可溶性受容体の生産は増大させる（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｓｔｅｍ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２４（３  Ｓｕｐｐｌ．９）：８１−９３（１９９７））。
【００１０】
第四に、ある免疫系抑制因子は、免疫細胞に直接作用し、その増殖および機能を抑制し、そうすることによって免疫系の活力を低下させる。例として挙げると、トランスフォーミング増殖因子βは、各種免疫細胞を抑制し、炎症および細胞性免疫反応を著明に抑える（Ｌｅｔｔｅｒｉｏ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１３７−１６１（１９９８）に総覧される）。以上まとめると、これら様々の免疫抑制機構は、免疫反応を量的にも質的にも制御し、それによって宿主自身の組織に対する並行的損傷の可能性を最小化することが意図される。
【００１１】
自己調節のために宿主の免疫系によって生産される抑制因子に加え、別の免疫系抑制因子が、感染性微生物によって生産される。例えば、多くのウィルスは、宿主の免疫系抑制因子の、ウィルス相同体である分子を生産する（Ｓｐｒｉｇｇｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１０１−１３０（１９９６）に総覧される）。そのようなものとして、宿主の補体抑制因子、インターロイキン−１０、および、インターロイキン−１、腫瘍壊死因子αおよびβ、およびインターフェロンα、βおよびγに対する可溶性受容体に対する相同体が挙げられる。同様に、ぜん虫などの寄生生物も、宿主の免疫系抑制因子の相同体を生産し（Ｒｉｆｆｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４：５６４−５７４（１９９６）に総覧される）、かつ、いくつかの細菌属も、免疫抑制性産物を生産することが知られる（Ｒｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：５４３−５４６（１９９０）に総覧される）。これらの免疫系抑制因子は全て、感染の初期段階において免疫反応の抑制を助け、微生物に有利な立場を与え、感染の有害性および慢性を強調する。
【００１２】
慢性疾患における、宿主由来免疫系抑制因子の役割は既に定まっている。大多数の症例において、これは、初期の感染における二極化Ｔ細胞反応を反映する。この反応では、免疫抑制介在因子（すなわち、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、および／またはトランスフォーミング増殖因子−β）の生産の方が、免疫刺激介在因子（すなわち、インターロイキン−２、インターフェロンγ、および／または腫瘍壊死因子β）の生産に対し優勢になる（Ｌｕｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｖ．９：５３２−５６２（１９９６）に総覧される）。この種の免疫抑制介在因子の過剰生産は、いくつかの、医学的に重要な疾患において、慢性の、非治癒性病的状態を生成することが示されている。そのようなものとしては、１）寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｓａｒｔｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３２７１−３２７６（１９９７））、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（Ｌａｕｃｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｉｓｔａ  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｉａ  ２８：９９−１０９（１９９６）に総覧される）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（Ｅｔｇｅｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７６：３７２−３９０（１９９８）に総覧される）、およびある種のぜん虫（Ｒｉｆｆｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記）；２）細胞内細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  （Ｂａｌｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏ．２２：１９９−２０４（１９９８））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ（Ｂｅｒｍｕｄｅｚ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｐｓｉ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：３０９３−３０９７（１９９３））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ（Ｓｉｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５５０１−５５１０（１９９３））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  （Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｂａ  Ｆｄｎ．Ｓｙｍｐ．１９５：１２３−１３２（１９９５））、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１１３０−１１３３（１９９５））、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｂｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１５：１０５−１１４（１９９５））、および、３）細胞内真菌、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１４：１４８−１６２（１９９５）に総覧される）による感染によってもたらされる疾患が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。自発的に感染を解除することができない無能力性は、他の、宿主由来の免疫系抑制因子によっても影響を受ける。例を挙げると、インターロイキン−１受容体拮抗因子、および、腫瘍壊死因子αおよびβに対する可溶性受容体は、多くの感染性介在因子の存在によって駆動される、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子αおよび／またはβに対する反応として生産される。例として、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｊａｋｏｂｓｅｎ  ｅ��  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１６５４−１６５９（１９９８）；Ｓａｒｔｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｂａｌｃｅｗｉｔｃｚ−Ｓａｂｌｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２６３６−２６４１（１９９８））、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  （Ｅｒｉｃｋｓ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２１００−２１０６（１９９７））による感染が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。前述の免疫系抑制因子の内のいずれかが、個別に、または組み合わさって、病原体の根絶前に、免疫反応性を抑える、または他のやり方で変えた場合、慢性的感染がもたらされる場合がある。
【００１３】
宿主由来免疫系抑制因子は、感染性疾患における上記の役割の外に、悪性の慢性疾患にも寄与する。癌患者における可溶性腫瘍壊死因子Ｉ型（ｓＴＮＦＲＩ）に関する研究によって説得的証拠が提示されている。ナノモル濃度のｓＴＮＦＲＩが、癌患者の各種活性化免疫細胞によって、多くの場合、腫瘍組織そのものによって合成される（Ａｄｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５６０２−５６０７（１９９１）；Ａｄｏｌｆ  ａｎｄ  Ａｐｆｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４３：１２７−１３６（１９９１））。さらに、ｓＴＮＦＲＩの循環レベルは、しばしば、癌患者において著明に上昇し（Ａｄｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｋａｌｍａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５７：１４７−１５２（１９９３）；Ｅｌｓａｓｓｅｒ−Ｂｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．１５：１７−２４（１９９４）；Ｇａｄｄｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：３１２５−３１２８（１９９６）；Ｄｉｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６９０−１６９３（１９９２））、寛解時には低下し、かつ、腫瘍発達の進行段階では増加し（Ａｄｅｒｋａ，ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｋａｌｍａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｅｌａｓｓｅｒ−Ｂｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｇａｄｄｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．上記）、および、高レベルで存在する場合は、比較的劣悪な治療結果と相関する（Ａｄｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。これらの所見は、ｓＴＮＦＲＩが、腫瘍壊死因子αおよび／またはβ（ＴＮＦ）を用いる抗腫瘍免疫機構を抑制することによって腫瘍の生存を助けることを示唆し、かつ、癌の治療的戦略として、ｓＴＮＦＲＩレベルの臨床的操作を積極的に支持する。
【００１４】
免疫系抑制因子の除去は臨床的利点を提供するという直接的証拠が、癌の有望な実験的治療法であるウルトラフェレーシスの評価から得られている（Ｌｅｎｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆ．８：５１１−５２７（１９８９）；Ｌｅｎｔｚ，Ｔｈｅｒ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ３：４０−４９（１９９９）；Ｌｅｎｔｚ，Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １６：１０７−１１４（１９９７））。ウルトラフェレーシスは、限外ろ過による血漿成分の体外分画を含む。ウルトラフェレーシスは、ある定められた分子サイズ範囲内の血漿成分を選択的に除去するが、各種腫瘍タイプを提示する患者に対し、著明な臨床的利点を提供することが示されている。ウルトラフェレーシスによって、腫瘍部位に、多くの場合処置開始の１時間以内に著明な炎症が誘発される。このように速やかであることは、この炎症反応の発達には、あらかじめ形成された化学的および／または細胞介在因子が関与することを示唆し、その反応に対する天然の血漿抑制因子が除去されることを反映する。実際、ＴＮＦαおよびβ、インターロイキン−１、およびインターロイキン−６などの免疫系抑制因子は、ウルトラフェレーシスによって取り除かれる（非特許文献１）。注目すべきことは、ｓＴＮＦＲＩの除去は、観察された臨床反応と相関することである（非特許文献１；非特許文献２）。
【００１５】
ウルトラフェレーシスは、免疫系刺激因子の添加によって免疫を急激に立ち上げようとする、比較的伝統的な方法とは真っ向から対立する。これらの中でももっとも著明なものは、超生理的レベルのＴＮＦ（非特許文献３）、および、ＴＮＦの生産を間接的に刺激する、インターロイキン−２（非特許文献４）の輸液である。これらの治療の成果は、下記によって限りあるものであった。１）用いたレベルでは、それらは極めて有害であり、かつ、２）それぞれ、免疫系抑制因子であるｓＴＮＦＲＩの血漿レベルを増加させる（非特許文献５；非特許文献６）。以上まとめると、これらの所見は、免疫系刺激因子の添加よりはむしろ、癌に対する生物学的治療法−免疫系抑制因子の除去を含む方法としてのウルトラフェレーシスの有用性を支持する。
【００１６】
ウルトラフェレーシスは、従来の治療法に優る利点を提供するとはいうものの、その臨床的有効性を制限する欠点をいくつか有する。ウルトラフェレーシスによって除去されるのは、免疫系抑制因子だけではなく、有効なものまで含めて、他の血漿成分も除去される。なぜなら、除去される血漿成分と保持される血漿成分の間の区別は、単に分子サイズに基づくだけだからである。ウルトラフェレーシスの、さらにもう一つの欠点は、処置の間の、循環血容量の著明な低下であり、これは、交換液の輸液によって補わなければならない。もっとも効果的な交換液は、非腫瘍保持のドナーの血漿から同一の方法で生産された限外ろ過物である。典型的治療スケジュール（それぞれ、約７リットルの限外ろ過液の除去を伴う、１５回処置）は、交換液生産のために、２００リットルを超えるドナー血漿を必要とする。ドナー血漿の慢性的不足は、ヒト免疫不全ウィルス、Ａ、Ｂ、およびＣ型肝炎、またはその他の病原性介在因子による感染の危険と組み合わされて、ウルトラフェレーシスの広範な導入にたいする重大な障害となっている。
【００１７】
免疫系抑制因子の除去に伴って有利な作用が得られるという理由で、これらの抑制因子を循環から特異的に除去するために使用することが可能な方法が求められている。そのような方法は、理想的には、特異的であって、他の循環成分を除かず、かつ、循環容量の著明な低下をもたらすものであってはならない。本発明は、これらの要求を満たし、同時に関連利点を提供する。
【非特許文献１】Ｌｅｎｔｚ，Ｔｈｅｒ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ３：４０−４９（１９９９）
【非特許文献２】Ｌｅｎｔｚ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １６：１０７−１１４（１９９７）
【非特許文献３】Ｓｉｄｈｕ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５７：７９−１２８（１９９３）
【非特許文献４】Ｍａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６：１４１−１４８（１９９３）
【非特許文献５】Ｌａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２：４０２−４０６（１９９０）
【非特許文献６】Ｍｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：１１９５−１１９９（１９９２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
提供されるのは、哺乳動物の循環中に存在する可溶性ＴＮＦ受容体などの免疫系抑制因子の除去を通じて、哺乳動物における免疫反応を刺激する方法である。可溶性ＴＮＦ受容体などの免疫系抑制因子の除去は、哺乳動物から生物学的流体を除去し、これらの流体を、標的免疫系抑制因子と選択的に結合することが可能な結合パートナー、例えば、ＴＮＦαムテインと接触させることによって実行することが可能である。
【００１９】
これらの方法において有用な結合パートナーとしては、可溶性ＴＮＦ受容体に対して特異性を持つＴＮＦαが挙げられる。さらに、１種以上のＴＮＦ受容体に対して特異性を持つＴＮＦαの混合物の使用も可能である。
【００２０】
一例として、ＴＮＦαムテインなどの結合パートナーは、あらかじめ固相支持体の上に固定して、「吸収性基質」を創製することが可能である（図１）。この吸収性基質に対し生物学的流体を暴露することによって、可溶性ＴＮＦ受容体などの免疫系抑制因子による結合が可能とされ、したがって、生物学的流体の量の低下が実現される。この処置された生物学的流体は、患者に戻すことも可能である。処置される生物学的流体の量、および処置速度は、毒性を最小化しながらも、活発な免疫反応を誘発する結果をガイドとして、各患者について個別化されるパラメータである。固相支持体（すなわち、不活性媒体）は、このような目的のために有用なものであれば、どのような材料から構成されてもよく、例えば、中空線維、セルロース製繊維、合成繊維、フラットまたはプリーツ状膜、シリカ製粒子、粗大な多孔性ビーズなどを含む材料によって構成されてもよい。
【００２１】
別の例として、ＴＮＦαムテインなどの結合パートナーは、「攪拌リアクター」において生物学的流体と混ぜ合わせることも可能である。次に、この結合パートナー−免疫系抑制因子複合体は、機械的、または化学的または生物学的手段または方法によって除去することが可能であり、この改変生物学的流体は患者に戻すことが可能である。
【００２２】
さらに提供されるのは、基質に付着された、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ムテインを含む結合体である。
【００２３】
さらに提供されるのは、吸収性基質、または攪拌リアクターのいずれかを含む装置である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の好ましい局面に関する、下記の詳細な説明、および該説明に含まれる実施例、および図面、および、それ以前およびそれに続く説明を参照することによってより容易に理解することが可能となろう。
【００２５】
本発明の化合物、組成物、物品、装置、および／または方法が開示され、記載される前に、本発明は、特定の合成法、特定の核酸分子、または特定のレーザー波長に限定されるものではないと理解しなければならない。なぜなら、当然のことながら、それらものは変動するからである。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の局面を記載するためのものであって、限定的であることを意図するものではないことを理解しなければならない。
【００２６】
本明細書および付属の特許請求項において用いられる、「ある」および「当該」という単数形は、文脈から明らかに別様に指定されない限り、複数への言及を含む。したがって、あるリボ核酸に対する言及は、複数のリボ核酸分子から成る複数の混合物を含み、あるプローブに対する言及は、２種以上の、そのようなプローブなどから成る、複数の混合物を含む。
【００２７】
範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から、および／または、「約」別のある特定の値までとして表わされる。このような範囲が表される場合、別の局面は、一方の特定の値から、および／または、他方の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」によって近似値として表される場合、特定の数値は、別局面を形成するものであることが理解される。さらに、範囲のそれぞれの端点は、他方の端点との関係において、および他方の端点とは独立に重要であることが理解される。
【００２８】
本明細書および後述の特許請求項では、下記の意味を持つと定義されるいくつかの用語に対して言及がなされる。
【００２９】
「任意の」または「任意に」とは、後述の事象または状況は起こってもよいし、起こらなくともよいこと、記述は、前記事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。例えば、「サンプルは、一つを超えるＴＮＦαムテインを任意に含んでもよい」という語句は、サンプルは、一つを超えるＴＮＦαを含んでもよいし、または含まなくてもよいこと、および、該記述は、一つのＴＮＦαムテインを含むサンプルと、一つを超えるＴＮＦαムテインを含むサンプルの両方を含むことを意味する。
【００３０】
提供されるものは、宿主哺乳動物における可溶性ＴＮＦ受容体などの免疫系抑制因子のレベルを下げ、それによって病的状態を寛解するか、または、病的状態の重度を下げることが可能な免疫反応を強化する方法である。開示の方法は、宿主の免疫反応の大きさを強調することによって、多くの場合有害な副作用をもたらす化学療法剤、例えば、癌治療に使用される化学療法剤の反復投与と関連する問題点を回避する。
【００３１】
開示の方法は、一般に、（ａ）病的状態を有する哺乳動物から生物学的流体を得ること；（ｂ）該生物学的流体を、可溶性ＴＮＦ受容体などの標的免疫系抑制因子に選択的に結合することが可能なＴＮＦαムテイン結合パートナーに接触させ、標的免疫系抑制因子の量が低減された改変生物学的流体を生成すること；および、その後、（ｃ）改変生物学的流体を前記哺乳動物に投与すること、によって実現される。
【００３２】
本明細書で用いる「免疫系刺激因子」という用語は、免疫反応の大きさを増すか、あるいは、ある特定の病的状態の寛解においてより効果的な特定の免疫機構の発達を促進する、可溶性介在因子を指す。免疫系刺激因子の例としては、前述の、炎症性介在因子腫瘍壊死因子αおよびβ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターフェロン−γ、インターフェロン−７、およびケモカインＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性タンパク１−αおよび１−β、およびマクロファージの走化性および活性化因子が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００３３】
本明細書で用いる「免疫系抑制因子」という用語は、免疫反応の大きさを下げるか、あるいは、ある特定の病的状態の寛解においてより効果的な特定の免疫機構の発達を抑えるか、または、ある特定の病的状態の寛解において効果のより低い、特定の免疫機構の発達を促進する、可溶性介在因子を指す。宿主由来の免疫系抑制因子の例としては、インターロイキン−１受容体拮抗因子、トランスフォーミング増殖因子−β、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、あるいは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターフェロン−γ、および、腫瘍壊死因子αおよびβに対する受容体が挙げられる。開示の組成物、結合体、および方法の特定局面では、免疫系抑制因子は、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ型（ｓＴＮＦＲＩ）、またはＩＩ型（ｓＴＮＦＲＩＩ）であってもよい。微生物によって生産される免疫系抑制因子はまた、標的となり得るもの、例えば、腫瘍壊死因子αおよびβに対する、可溶性受容体を含む可能標的である。本明細書で用いる「標的」免疫系抑制因子という用語は、開示の方法によって生物学的流体から除去されるべき抑制因子、または抑制因子の集合体、例えば、ｓＴＮＦＲＩおよび／またはｓＴＮＲＦＩＩを指す。
【００３４】
本明細書で用いる「可溶性ＴＮＦ受容体」という用語は、ＴＮＦαおよびＴＮＦβに対する受容体の可溶形を指す。これまで二つの型のＴＮＦ受容体が特定されている。別にＴＮＦ−Ｒ５５とも呼ばれる、Ｉ型受容体（ＴＮＦＲＩ）、および別名ＴＮＦ−Ｒ７５とも呼ばれる、ＩＩ型受容体（ＴＮＦＲＩＩ）である。いずれも、ＴＮＦαおよびＴＮＦβに結合する膜タンパクであり、細胞内シグナル伝達を仲介する。これらの受容体のいずれも、可溶形としても出現する。ＴＮＦ受容体の可溶形は、前述のように、免疫系抑制因子として機能する。本明細書で用いる可溶形ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩ、または他の、任意のＴＮＦ受容体の可溶形の内の少なくとも一つを含む。開示の方法では、方法は、方法において使用されるＴＮＦαムテイン、または複数のムテインの結合するＴＮＦ受容体が、一型であるのか、または両型であるのかに依存して、一型の、または両型のＴＮＦ受容体を除去するのに使用することが可能である。
【００３５】
本明細書で用いる「哺乳動物」という用語は、ヒト、または、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはその他の哺乳類を含む動物であってもよい。「患者」という用語は、開示の組成物、結合体、および方法の記載においては、「哺乳動物」という用語と同義的に使用される。
【００３６】
本明細書で用いる「病的状態」という用語は、宿主における、宿主とは免疫学的に異なる介在因子の持続的存在が、病態の成分であるか、または病態の原因となっている、任意の状態を指す。このような病的状態の例としては、ウィルス、細菌、寄生虫、および真菌による持続性の感染、および癌が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。このような慢性疾患を示す個人の中でも、免疫系抑制因子のレベルが上昇している人々は、本開示の治療に特に好適である。免疫系抑制因子の血漿レベルは、従来技術で周知の方法を用いて定量することが可能である（例えば、Ａｄｏｌｆ  ａｎｄ  Ａｐｆｌｅｒ，上記、１９９１を参照されたい）。当業者であれば、本発明の方法に従って免疫系抑制因子を除去することによって利益を得られると考えられる病的状態は簡単に決めることが可能である。
【００３７】
本明細書で用いる「生物学的流体」という用語は、哺乳動物から得られる体液、例えば、血液、例えば、全血、血漿、血清を含む血液、リンパ液、または、他のタイプの体液を指す。要すれば、生物学的流体は、処理されるか、または、例えば、無細胞成分を得るために分画されてもよい。開示の組成物、結合体、および方法に関連して使用される場合、「無細胞生物学的流体」という用語は、循環系の無細胞成分、例えば、血漿、血清、リンパ液、またはそれらの分画を含む成分を指す。生物学的流体は、哺乳動物から、当業者には既知の任意の手段または方法、例えば、従来のアフェレーシス法（Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＭｃＬｅｏｄ，Ｐｒｉｃｅ，ａｎｄ  Ｄｒｅｗ，ｅｄｓ．，ＡＡＢＢ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｓｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９７）を参照）を含む方法によって取り出すことが可能である。ある任意の時間において、哺乳動物から抽出される生物学的流体の量は、いくつかの要因、例えば、宿主哺乳動物の年齢および体重、および、治療効果を実現するのに必要な容量を含む要因に依存する。初期のガイドラインとして、一血漿容量（ヒトの成人では約３−５リットル）を取り出し、その後、本発明の方法に従って、標的とする免疫系抑制因子を除去することが可能である。
【００３８】
本明細書で用いる「選択的に結合する」という用語は、ある分子が、一つのタイプの標的分子には結合するが、他のタイプの分子にはほとんど結合しないことを意味する。本明細書では、「特異的に結合する」という用語は、「選択的に結合する」と相互交換的に使用される。
【００３９】
本明細書で用いる「結合パートナー」という用語は、標的免疫系抑制因子に対し選択的に結合することが可能な能力に関して選ばれた任意の分子を含めることが意図される。結合パートナーは、標的免疫系抑制因子と天然状態で結合するものであってもよい。例えば、ｓＴＮＦＲＩに対する結合パートナーとして、腫瘍壊死因子αまたはβを使用することも可能である。それとは別に、標的免疫系抑制因子に選択的に結合することが可能な能力に関して選ばれた、他の結合パートナーを使用することも可能である。そのようなものとして、天然結合パートナーの断片、その、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体標本または断片、または合成ペプチドが挙げられる。さらに別の局面では、結合パートナーは、ＴＮＦαムテインであってもよく、このＴＮＦαムテインは、トリマー、ダイマー、またはモノマーであってもよい。
【００４０】
本明細書で用いる「ＴＮＦαムテイン」という用語は、親配列に対し一つ以上の置換を有し、かつ、可溶性および／または膜性ＴＮＦＲを問わず、ＴＮＦ受容体に対する特異的結合活性を保持するＴＮＦα変異種を指す。一般に、本発明のムテインは、親配列に対し単一アミノ酸置換を有する。例示のＴＮＦαムテインとして、ムテイン１、２、３、４、５、および６と表示されるヒトのＴＮＦαムテインが挙げられる（図３Ｂ参照）。これらは、ヒトのＴＮＦαから得られたものであるが、後述するように、野生型配列に比べ単一のアミノ酸置換を有する。ヒト以外の種の類似ムテイン、例えば、図３Ａに示される他の哺乳類種、またはその他の哺乳類種における、ムテイン１、２、３、４、５、または６と類似のムテインも同様に含められることが理解される。さらに下に詳述するように、上記およびその他のムテインも、本発明のＴＮＦαムテインの意味の中に含まれる。さらに、ＴＮＦαムテインは、ＴＮＦαの突然変異形または改変形、例えば、マルチマーを形成するか、または結合してダイマーを形成して活性を低下させた変異形または改変形を含んでもよい。天然のＴＮＦαの開示の改変形は、別々に、または、任意の組み合わせで一緒に使用することが可能である。さらに、ムテイン１、２、３、４、５、および６の改変形は、共に、または別々に使用することが可能であり、かつ、それぞれ、または全て、モノマーまたはダイマー状成から得られる改変形と共に使用することが可能である。例えば、野生型ＴＮＦαの改変モノマーは、野生型ＴＮＦαの、第二改変モノマーと結合させてダイマーを形成してもよい。さらに別の局面では、野生型ＴＮＦαの改変モノマーは、アミノ酸配列、例えば、ムテイン１と結合してダイマーを形成してもよい。したがって、「ＴＮＦαムテイン」は、ＴＮＦαの改変モノマー、野生型ＴＮＦαにおける単一突然変異を含むモノマー、例えば、ムテイン１、ムテイン２、ムテイン３、ムテイン４、ムテイン５、ムテイン６、または、本明細書に記載される、他の、任意の突然変異アミノ酸配列を含むモノマー；二つの同一アミノ酸配列を含むダイマー；および、二つの、非同一アミノ酸配列を含むダイマーを含んでもよい。例えば、ＴＮＦαムテインは、野生型ＴＮＦαの、二つの、同一の、改変モノマーを含むダイマー、あるいは、野生型ＴＮＦαの、二つの、非同一の、改変モノマーを含むダイマーを含んでもよい。さらに別の局面では、ＴＮＦαムテインは、同一のアミノ酸突然変異を含む、二つのアミノ酸配列を含むダイマーを含んでもよい。さらに別の局面では、ＴＮＦαは、非同一アミノ酸突然変異を持つ、二つのアミノ酸配列を含むダイマーを含んでもよい。さらに、ＴＮＦαムテインは、野生型ＴＮＦαの改変形と、単一アミノ酸突然変異を含むアミノ酸配列、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８によって特定されるアミノ酸配列、あるいは、本明細書に開示される、他の、任意の突然変異アミノ酸配列とを含むダイマーを含んでもよい。
【００４１】
ＴＮＦαムテインは、モノマー、ダイマー、またはトリマーであってもよい。すなわち、ＴＮＦαムテインは、モノマー形、ダイマー状、またはトリマー形を取ってもよい。天然のＴＮＦαは、本明細書において例示されるＴＮＦαムテインと同様、三つの１７ｋＤａサブユニットから成るホモトリマーである。本明細書に記載される方法を用いて生産される他のＴＮＦαムテインも、トリマーとして存在してもよい。ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインの、一価の可溶性ＴＮＦＲに対する結合は、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテイン・トリマーに存在する、三つのモノマーの内の二つしか含まない。ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテイン・トリマーは、三つの、可溶性ＴＮＦＲ分子に対して結合することが可能であるが、それぞれに対する結合は、単にアフィニティーのみに支配される独立事象であって、アビディティによる寄与を容れない。したがって、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインのダイマー状による結合の強度は、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインのトリマー形に比べて減少しない。
【００４２】
提供されるものは、哺乳動物における免疫反応を刺激するか、または強化するための組成物および方法である。本発明は、そうすると有利であるので、免疫反応に対する免疫系抑制因子の抑制効果に対抗するか、または該効果を下げるために、免疫系抑制因子に結合するリガンドを使用する。このようなリガンドは、本明細書では「結合パートナー」とも呼ばれるが、生物学的流体から免疫系抑制因子の除去を可能とするために固相支持体に付着されてもよい。
【００４３】
本発明において特に有用な結合パートナーは、免疫系抑制因子、例えば、可溶性ＴＮＦ受容体、特に、ｓＴＮＦＲＩおよび／またはｓＴＮＦＲＩＩに、高度のアフィニティーの下に結合するリガンドである。結合パートナーの、もう一つの有用な特徴は、直接的毒性の欠如である。例えば、ＴＮＦ作用因子の活性化を持たない、または抑えられた結合パートナーは特に有用である。一般に、結合パートナーなどのリガンドが、固相支持体に共有的に結合された場合でも、結合リガンドのあるパーセンテージは、例えば、共有的連結を破壊する化学的反応、あるいは、生物学的流体中に存在するプロテアーゼ活性によって、支持体から漉し出される。そのような場合、リガンドは、処理される生物学的流体の中に浸透し、したがって患者に戻される。したがって、免疫系抑制因子に対してはアフィニティーを持つが、生物学的反応を刺激する能力は抑えられている、すなわち、作用活性が抑えられているか、または低いリガンドを使用するのが有利である。この場合、リガンドのあるものは、処理される生物学的流体中に漉し出されても、そのリガンドは、患者の体内に再度導入された場合、膜受容体のシグナル伝達に関して依然として低い生物活性を発揮すると考えられる。
【００４４】
結合パートナーの、もう一つの有用な特徴は、間接的毒性、例えば、免疫原性の欠如である。前述のように、結合リガンドが、基質から漉し出され、リガンドが、処理される生物学的流体中に存在するようになることはごく普通のことである。この生物学的流体が患者に戻されると、これによって、患者には、低レベルのリガンドが導入されることになる。もしもそのリガンドが免疫原性であるとすると、リガンドに対する免疫反応が刺激され、特に、処理プロセスが繰り返される患者において有害な免疫反応が引き起こされる可能性がある。したがって、低度の免疫原性を持つリガンドであれば、該リガンドに対する、有害な全ての免疫反応を最小化すると考えられる。本明細書の開示では、本発明の結合パートナーとして使用するのに特に有用なリガンドは、治療される患者と同じ種から得られる。例えば、ヒトを治療する場合、結合パートナーとしてヒトのＴＮＦαムテインを使用することが可能である。これは、内因性ＴＮＦαに対して相同であるために、免疫原性が低いことが期待されるからである。同様に、他の、哺乳類種から得られたムテインを、それぞれの動物において使用することが可能である。
【００４５】
本明細書で開示されるように、ＴＮＦαムテインが、本発明の方法では特に有用な結合パートナーである。従来、いくつかのＴＮＦαムテインが記載されている（例えば、Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７：５−２２（１９９４）；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：８２７−８３６（１９９１）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４０６９−２４０７５（１９９２）；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．３：７１３−７１９（１９９０）を参照、なお、これらのそれぞれを引用により本明細書に含める）。特定の例示のムテインとしては、図３Ｂに示す、ヒトのＴＮＦαムテインが挙げられる。
【００４６】
本発明において結合パートナーとしてＴＮＦαムテインを使用するのにはいくつかの利点がある。ＴＮＦαムテインは、ＴＮＦα受容体に対し、比較的低い結合活性を示すが、いくつかのＴＮＦαムテインの結合度は、天然ＴＮＦαよりも僅かに５−から１７−倍低いだけにすぎない。このような結合アフィニティーは、天然のＴＮＦαに比べると低下してはいるが、それでもなお、本発明では効果的な結合パートナーであることが可能である（実施例３を参照）。ＴＮＦαムテイン使用のもう一つの利点は、いくつかのＴＮＦαムテインが、天然のＴＮＦαに比べ、膜受容体を介するシグナル伝達の低下、例えば、細胞傷害活性またはインビボ毒性の低下を示すことである。特に、ムテイン１、２、３、４、５、および６では、２００倍から１０，０００倍の細胞傷害性の低下が示される（下記、およびＶａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，上記、１９９４；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２を参照）。したがって、結合アフィニティーが１０から１７倍低下しても、膜受容体を介するシグナル伝達において２００倍から１０，０００倍の低下が、例えば、細胞傷害活性またはインビボ毒性の低下があり得る。前述のように、膜受容体を介するシグナル伝達の、このような低下、例えば、細胞傷害性またはインビボ毒性の低下は、基質からのリガンドの漏出の可能性、および、改変生物学的流体を患者に戻す場合、患者の体内へ低レベルが導入されるという観点から有利である。さらに、ＴＮＦαのダイマー融合タンパク、または、ＴＮＦαムテインのダイマー状を、本開示の方法に使用することも可能である。このようなダイマー融合は、下記の理由で有用である、（１）該融合体は、生物学的流体から可溶性ＴＮＦＲを除去するのに十分なアフィニティーの下に可溶性ＴＮＦＲ受容体に結合する、および、（２）該融合体は、野生型ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合、または膜ＴＮＦＲを介するシグナル伝達の低下を示す。
【００４７】
ＴＮＦαムテイン使用のさらに別の利点は、ＴＮＦαムテインが天然の構造を持つことである。これらのムテイン類は、天然のＴＮＦα配列に対して高度の相同性を有するために、これらのムテインはフォールド形成して、ＴＮＦ受容体結合活性を保持する天然構造を取ることが可能である。この天然構造は、恐らく、突然変異アミノ酸残基を除き、同じアミノ酸残基が、天然ＴＮＦαの場合と同様に分子の表面に暴露されることを意味する。このような天然のフォールド形成は、ＴＮＦαムテインが、哺乳類のそれぞれの種において、ほとんど、または全く免疫原性を持つはずがないことを意味する。
【００４８】
本明細書に開示されるように、特に有用なムテインは、ヒトのムテイン１、２、３、４、５、および６（図３Ｂ）、および、他の哺乳類種における類似のムテインである。ムテイン１は、野生型のヒトＴＮＦαに対し、Ａｒｇ３１がＰｒｏで置換された単一アミノ酸置換である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２）。このムテインは、天然ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合活性が約１０倍低く、細胞傷害性が約１０，０００倍低い。ムテイン２は、野生型のヒトＴＮＦαに対し、Ａｓｎ３４がＴｙｒで置換された単一アミノ酸置換である（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０；Ｙａｍａｇｉｓｈｉらの記数システムではＡｓｎ３２である）。このムテインは、天然ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合活性が約５倍低く、細胞傷害性が約１２，５００倍低い。ムテイン３は、野生型のヒトＴＮＦαに対し、Ｐｒｏ１１７がＬｅｕで置換された単一アミノ酸置換である（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０；Ｙａｍａｇｉｓｈｉらの記数システムではＰｒｏ１１５である）。このムテインは、天然ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合活性が約１２倍低く、細胞傷害性が約１４００倍低い。ムテイン４は、野生型のヒトＴＮＦαに対し、Ｓｅｒ１４７がＴｙｒで置換された単一アミノ酸置換である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２）。このムテインは、天然ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合活性が約１４倍低く、細胞傷害性が約１０，０００倍低い。ムテイン５は、野生型のヒトＴＮＦαに対し、Ｓｅｒ９５がＴｙｒで置換された単一アミノ酸置換である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２）。このムテインは、天然ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合活性が約１７倍低く、細胞傷害性が約２００倍低い。ムテイン６は、野生型のヒトＴＮＦαに対し、Ｔｙｒ１１５がＰｈｅで置換された単一アミノ酸置換である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２）。このムテインは、天然ＴＮＦαに比べ、膜ＴＮＦＲに対する結合活性が約１７倍低く、細胞傷害性が約３，３００倍低い。本明細書に開示されるように、それぞれの種のアナログ位置において同じアミノ酸置換を作製することによって、他の哺乳種にも類似のムテインを生成することが可能であることが理解される。
【００４９】
ムテイン１、２、および４は、他のＴＮＦαムテインと同様、従来から知られており、多価の膜受容体に対する結合に関してもその特徴が解明されているけれども、これらのＴＮＦαムテインが、一価の、可溶性ＴＮＦ受容体に結合するかどうかに関しては従来未知であった。本明細書に開示される通り、ＴＮＦαムテインは、可溶性ＴＮＦ受容体に対し、血漿からそれを除去するのに十分なアフィニティーの下に結合する（実施例３および６を参照）。これらの結果は、ＴＮＦαムテインが、生物学的流体から可溶性ＴＮＦ受容体を除去するための、効果的結合パートナーとなり得ることを示す。
【００５０】
本明細書に例示される特異的ムテインに対して付加的に加えられるＴＮＦαムテインも本発明の方法において使用が可能であることが理解される。各種種から得られるＴＮＦαは、高度のアミノ酸特異性を示す（図３Ａおよび３Ｂ、保存配列・配列番号１；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９４を参照）。Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記、１９９４）によって記載されるように、ＴＮＦα保存アミノ酸配列が、１１の哺乳種全体に特定された。この保存アミノ酸配列は、図示した１１種全ての種で保存されるが、ただ単一種のみが、図示の位置で変異を示す（図３Ａ、およびＶａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９４参照）。したがって、提供されるものは、配列番号１として参照される保存配列を含むＴＮＦαムテインである。
【００５１】
当業者であれば、開示の組成物、結合体、および方法において使用するのに好適な、付加的ムテインは簡単に決めることが可能である。前述のように、天然のＴＮＦαに比べて、ＴＮＦ受容体に対し比較的高いアフィニティーを持つが、膜受容体を介するシグナル伝達の低下、例えば、細胞傷害性またはインビボ毒性の低下を示すＴＮＦαムテインは、本開示の組成物、結合体、および方法において特に有用である。当業者であれば、従来技術で周知の方法に基づいて使用される、好適な、付加的ＴＮＦαムテインは簡単に決めることが可能である。配列にアミノ酸置換を導入する方法は従来技術において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５６），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）；米国特許第５，２６４，５６３および５，５２３，３８８号）。ＴＮＦαの生成は既に記載されている（Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９４；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０）。さらに、当業者であれば、本開示の方法に使用する場合の適性を確認するために、候補ムテインの結合、および細胞傷害性および／またはインビボ毒性を簡単に定量することが可能である（Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９４；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０）。
【００５２】
本開示の組成物、結合体、および方法において使用する場合、特に興味深いＴＮＦαムテインは、ＴＮＦ受容体に対し比較的高いアフィニティーを持ち、かつ、膜受容体を介するシグナル伝達の低下、例えば、細胞傷害性またはインビボ毒性の低下を示すことの外に、ＴＮＦαの三つの領域：領域１、アミノ酸２９−３６；領域２、アミノ酸８４−９１；および領域３、アミノ酸１４３−１４９（図３Ａに示す番号順）にアミノ酸置換を持つものである。ムテイン１、２、および４が、これらの領域に単一アミノ酸置換を有するムテインの例である。領域１は、ヒトのＴＮＦαの、アミノ酸２９−３６、残基ＬＮＲＲＡＮＡＬ（配列番号２のアミノ酸２９−３６）に対応する。領域２は、ヒトのＴＮＦαの、アミノ酸８４−９１、残基ＡＶＳＹＱＴＫＶ（配列番号２のアミノ酸８４−９１）に対応する。領域３は、ヒトのＴＮＦαの、アミノ酸１４３−１４９、残基ＤＦＡＥＳＧ（配列番号２０）に対応する。本明細書に開示されるＴＮＦαの外に、他のＴＮＦαムテインも、本明細書に開示される通り、例えば、領域１、２、または３に単一アミノ酸置換を導入し、かつ、結合活性、および細胞傷害活性および／またはインビボ毒性に関してスクリーニングを行うことによって生成することが可能である（さらに、Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０を参照）。ある特定のアミノ酸残基または領域にアミノ酸置換を導入するための方法は、当業者にはよく知られる（例えば、Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９２；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９０；米国特許第５，２６４，５６３および５，５２３，３８８号を参照されたい）。例えば、天然配列に対し、他の１９のアミノ酸のそれぞれを、領域１、２、および３の位置のそれぞれに導入し、可溶性および／または膜結合ＴＮＦ受容体に対する結合活性および／または、シグナル伝達活性、例えば、細胞傷害活性またはインビボ毒性に関してスクリーニングすることが可能である。このためには、約４２０の突然変異の生成（領域１、２、および３における２２位置のそれぞれにおける１９種のアミノ酸置換）を要するにすぎず、これは、周知の方法で簡単に生成およびスクリーニングすることが可能な数字である。本明細書に開示される所望の特徴、例えば、ＴＮＦ受容体に対する特異的結合活性、および膜ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の低下を有するものは、本開示の組成物、結合体、および方法において有用なＴＮＦαムテインとして選択することが可能である。
【００５３】
さらに提供されるのは、配列番号９の共通配列を有するＴＮＦαムテインである（図３Ｃ）。一局面では、ＴＮＦαムテインは、配列番号９の共通配列を含む。該配列において、Ｘ１は、ＬｅｕおよびＶａｌから選ばれるアミノサンであり；Ｘ２は、位置１においてＧｌｎまたはＡｒｇ、位置２においてＡｓｎ、Ａｌａ、またはＴｈｒ、および位置３においてＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、または不在を有する、２または３個のアミノ酸ペプチド、例えば、ＧｌｎＡｓｎＳｅｒ、ＡｒｇＡｌａＬｅｕ、ＡｒｇＴｈｒＰｒｏ、ＧｌｎＡｌａＳｅｒ、およびＧｌｎＴｈｒから選ばれるペプチドであり；Ｘ３は、ＡｓｐおよびＡｓｎから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ４は、位置１においてＨｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ、位置２においてＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、またはＬｙｓ、位置３においてＶａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒ、位置４においてＧｌｕまたはＰｒｏ、および位置５においてＧｌｕまたはＧｌｙを有する５アミノ酸ペプチド、例えば、ＨｉｓＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｕ（配列番号２１）、ＨｉｓＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｕ（配列番号２２）、ＰｒｏＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｙ（配列番号２３）、ＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２４）、ＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２５）、ＩｌｅＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２６）、ＰｒｏＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２７）、ＩｌｅＡｓｎＳｅｒＰｒｏＧｌｙ（配列番号２８）、およびＶａｌＬｙｓＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２９）から選ばれるペプチドであり；Ｘ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ６は、位置１においてＬｅｕ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、またはＧｌｎ、位置２においてＳｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｓｎ、位置３においてＧｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙ、および位置４においてＡｒｇまたはＴｙｒを有する４アミノ酸ペプチド、例えば、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇ（配列番号３０）、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｒｇ（配列番号３１）、ＧｌｙＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３２）、ＬｅｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇ（配列番号３３）、ＴｒｐＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３４）、ＧｌｎＳｅｒＧｌｙＴｙｒ（配列番号３５）、およびＬｅｕＡｓｎＡｒｇＡｒｇ（配列番号３６）から選ばれるペプチドであり；Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＬｙｓから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ８は、位置１においてＭｅｔまたはＶａｌ、位置２においてＧｌｕまたはＧｌｎを有する２アミノ酸ペプチド、例えば、ＭｅｔＡｓｐ、ＭｅｔＬｙｓ、ＶａｌＧｌｕ、ＶａｌＬｙｓ、およびＶａｌＧｌｎから選ばれるペプチドであり；Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１０は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、およびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１１は、位置１においてＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕ、位置２においてＡｓｐまたはＧｌｕを有する２アミノ酸ペプチド、例えば、ＡｌａＡｓｐ、ＳｅｒＡｓｐ、ＴｈｒＡｓｐ、ＬｅｕＡｓｐ、ＡｌａＧｌｕ、およびＳｅｒＧｌｕから選ばれるペプチドであり；Ｘ１２は、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選ばれるアミノ��であり；Ｘ１４は、位置１においてＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ、位置２においてＶａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、またはＴｈｒ、位置３においてＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＡｓｎ、位置４においてＬｅｕまたはＶａｌ、および、位置５においてＬｅｕ、Ｐｈｅ、または不在を有する４または５アミノ酸ペプチド、例えば、ＡｓｐＶａｌＶａｌＬｅｕ（配列番号３７）、ＡｓｐＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３８）、ＳｅｒＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３９）、ＰｒｏＰｒｏＰｒｏＶａｌ（配列番号４０）、ＳｅｒＴｈｒＨｉｓＶａｌＬｅｕ（配列番号４１）、ＳｅｒＴｈｒＰｒｏＬｅｕＰｈｅ（配列番号４２）、およびＳｅｒＴｈｒＡｓｎＶａｌＰｈｅ（配列番号４３）から選ばれるペプチドであり；Ｘ１５は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１７は、ＩｌｅおよびＶａｌから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１８は、位置１においてＧｌｎまたはＰｒｏ、位置２においてＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒを有する２アミノ酸ペプチド、例えば、ＧｌｎＧｌｕ、ＰｒｏＡｓｎ、ＧｌｎＴｈｒ、およびＰｒｏＳｅｒから選ばれるペプチドであり；Ｘ１９は、ＬｅｕおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２０は、位置１においてＰｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｎ、位置２においてＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｈｒ、および位置３においてＡｓｐ、またはＧｌｕを有する３アミノ酸ペプチド、例えば、ＰｒｏＬｙｓＡｓｐ、ＨｉｓＡｒｇＧｌｕ、ＧｌｎＡｒｇＧｌｕ、およびＨｉｓＴｈｒＧｌｕから選ばれるペプチドであり；Ｘ２１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＴｒｐから選ばれるアミノ酸であるか、または不在であり；Ｘ２２は、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＡｌａから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２３は、ＬｅｕおよびＧｌｎから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２４は、ＧｌｙおよびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２５は、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２６は、ＡｌａおよびＴｈｒから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２７は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノサンであり；Ｘ２８は、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２９は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、およびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ３０は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒから選ばれるアミノ酸であり；およびＸ３１は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸である（図３Ａ；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９４を参照されたい）。このような共通ＴＮＦαムテインは、ＴＮＦ受容体に対し結合活性を示すことが期待されるが、このような活性は、本明細書に開示される通り、当業者によって周知方法の用い簡単に定量することが可能である。
【００５４】
前述の変異位置の外に、ＴＮＦαムテインは、配列番号１として参照される保存配列の中にさらに変異アミノ酸を含むことも可能であることが理解される。図３Ａに示すように、かつ前述したように、ＴＮＦα保存配列は、図示の哺乳種の内の一つが、他の１０種とは異なる、いくつかの位置を含む。例えば、位置２における保存アミノ酸Ａｒｇは、イヌではＬｅｕである（図３Ａ）。したがって、ＴＮＦαムテインは、残余は配列番号１として参照される保存配列を有しながら、位置２においてＬｅｕから成る置換を含むことが可能である。同様に、種の内の少なくとも１種が、保存配列に対してアミノ酸置換を有する、他の「保存」位置の置換は、ＴＮＦαムテインとして含まれる。例えば、ＴＮＦαムテインは、ムテイン１の対応置換、すなわち、Ａｒｇ３１Ｐｒｏ、および、前述のようにＸで表される可変位置における保存配列の置換、および／または、単一種において変動する、保存位置における置換を有することが可能である。さらに、ＴＮＦαムテインは、ＴＮＦαの、保存配列または特定種の配列に対する、保存的アミノ酸置換を含むことが可能である。このようなＴＮＦαムテインは、当業者であれば、本明細書に開示される通り、ＴＮＦαムテインの所望の特徴にもとづいて簡単に認識することが可能である。
【００５５】
本明細書に開示されるＴＮＦαムテインのいずれについても、修飾してＮ−末端欠失を含めるようにすることも可能である。Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ（上記、１９９４）に論じられているように、ＴＮＦαのＮ−末端における短い欠失は活性を保持するが、一方、Ｎ−末端の１７個のアミノ酸の欠失は活性消失をもたらす。したがって、開示のＴＮＦαムテインはさらに、活性を保持する、Ｎ−末端欠失を有するＴＮＦαムテインを含むことが理解される。このようなＴＮＦαムテインは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸から成るＮ−末端欠失を含んでもよい。さらに、当業者であれば、本明細書に開示される通り、ＴＮＦαムテインの中にさらにＮ−末端欠失を組み込むことが可能かどうかを、欠失突然変異を作製し、所望の特徴についてスクリーニングすることによって簡単に決定することが可能である。
【００５６】
提供されるのは、本発明において開示される、各種ＴＮＦαムテインである。一般に、特に有用なＴＮＦαムテインは、天然／野生型ＴＮＦαに比べ、ＴＮＦ受容体、特に膜結合ＴＮＦ受容体に対する結合活性が、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、または場合によってはそれ以上の倍数の低下を示す。このような結合活性の低下は、ｓＴＮＦＲに向けて発揮されてもよいが、必ずしもそうである必要はない。さらに、特定の有用なＴＮＦαムテインは、天然／野生型ＴＮＦαに比べ、膜受容体を介するシグナル伝達が、例えば、細胞傷害性またはインビボ毒性が、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約３００倍、約５００倍、約１０００倍、約２０００倍、約３０００倍、約４０００倍、約５０００倍、約６０００倍、約７０００倍、約８０００倍、約９０００倍、約１０，０００倍、約２０，０００倍、約３０，０００倍、約５０，０００倍、または場合によってはそれ以上の倍数の低下を示す。ＴＮＦαムテインは、前述され、本明細書に開示されるように、結合アフィニティーの低下および／または細胞傷害性の低下を有してもよいことが理解される。
【００５７】
提供されるのは、基質に付着した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ムテインを含む結合体である。さらに別の局面では、結合体のＴＮＦαムテインは、配列番号１として参照される保存配列を含む。
【００５８】
さらに提供されるのは、ＴＮＦαムテインが、共通配列・配列番号９を有する結合体である。該配列において、Ｘ１は、ＬｅｕおよびＶａｌから選ばれるアミノサンであり；Ｘ２は、位置１においてＧｌｎまたはＡｒｇ、位置２においてＡｓｎ、Ａｌａ、またはＴｈｒ、および位置３においてＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、または不在を有する、２または３個のアミノ酸ペプチド、例えば、ＧｌｎＡｓｎＳｅｒ、ＡｒｇＡｌａＬｅｕ、ＡｒｇＴｈｒＰｒｏ、ＧｌｎＡｌａＳｅｒ、およびＧｌｎＴｈｒから選ばれるペプチドであり；Ｘ３は、ＡｓｐおよびＡｓｎから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ４は、位置１においてＨｉｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ、位置２においてＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、またはＬｙｓ、位置３においてＶａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒ、位置４においてＧｌｕまたはＰｒｏ、および位置５においてＧｌｕまたはＧｌｙを有する５アミノ酸ペプチド、例えば、ＨｉｓＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｕ（配列番号２１）、ＨｉｓＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｕ（配列番号２２）、ＰｒｏＧｌｎＶａｌＧｌｕＧｌｙ（配列番号２３）、ＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２４）、ＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２５）、ＩｌｅＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙ（配列番号２６）、ＰｒｏＧｌｎＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２７）、ＩｌｅＡｓｎＳｅｒＰｒｏＧｌｙ（配列番号２８）、およびＶａｌＬｙｓＡｌａＧｌｕＧｌｙ（配列番号２９）から選ばれるペプチドであり；Ｘ５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ６は、位置１においてＬｅｕ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、またはＧｌｎ、位置２においてＳｅｒ、Ａｓｐ、またはＡｓｎ、位置３においてＧｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙ、および位置４においてＡｒｇまたはＴｙｒを有するアミノ酸ペプチド、例えば、ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇ（配列番号３０）、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇＡｒｇ（配列番号３１）、ＧｌｙＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３２）、ＬｅｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇ（配列番号３３）、ＴｒｐＡｓｐＳｅｒＴｙｒ（配列番号３４）、ＧｌｎＳｅｒＧｌｙＴｙｒ（配列番号３５）、およびＬｅｕＡｓｎＡｒｇＡｒｇ（配列番号３６）から選ばれるペプチドであり；Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＬｙｓから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ８は、位置１においてＭｅｔまたはＶａｌ、位置２においてＧｌｕまたはＧｌｎを有する２アミノ酸ペプチド、例えば、ＭｅｔＡｓｐ、ＭｅｔＬｙｓ、ＶａｌＧｌｕ、ＶａｌＬｙｓ、およびＶａｌＧｌｎから選ばれるペプチドであり；Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１０は、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、およびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１１は、位置１においてＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕ、位置２においてＡｓｐまたはＧｌｕを有する２アミノ酸ペプチド、例えば、ＡｌａＡｓｐ、ＳｅｒＡｓｐ、ＴｈｒＡｓｐ、ＬｅｕＡｓｐ、ＡｌａＧｌｕ、およびＳｅｒＧｌｕから選ばれるペプチドであり；Ｘ１２は、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１３は、ＧｌｎおよびＨｉｓから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１４は、位置１においてＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ���位置２においてＶａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、またはＴｈｒ、位置３においてＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＡｓｎ、位置４においてＬｅｕまたはＶａｌ、および、位置５においてＬｅｕ、Ｐｈｅ、または不在を有する４または５アミノ酸ペプチド、例えば、ＡｓｐＶａｌＶａｌＬｅｕ（配列番号３７）、ＡｓｐＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３８）、ＳｅｒＴｙｒＶａｌＬｅｕ（配列番号３９）、ＰｒｏＰｒｏＰｒｏＶａｌ（配列番号４０）、ＳｅｒＴｈｒＨｉｓＶａｌＬｅｕ（配列番号４１）、ＳｅｒＴｈｒＰｒｏＬｅｕＰｈｅ（配列番号４２）、およびＳｅｒＴｈｒＡｓｎＶａｌＰｈｅ（配列番号４３）から選ばれ；Ｘ１５は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１６は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１７は、ＩｌｅおよびＶａｌから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ１８は、位置１においてＧｌｎまたはＰｒｏ、位置２においてＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒを有する２アミノ酸ペプチド、例えば、ＧｌｎＧｌｕ、ＰｒｏＡｓｎ、ＧｌｎＴｈｒ、およびＰｒｏＳｅｒから選ばれ；Ｘ１９は、ＬｅｕおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２０は、位置１においてＰｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｎ、位置２においてＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｈｒ、および位置３においてＡｓｐ、またはＧｌｕを有する３アミノ酸ペプチド、例えば、ＰｒｏＬｙｓＡｓｐ、ＨｉｓＡｒｇＧｌｕ、ＧｌｎＡｒｇＧｌｕ、およびＨｉｓＴｈｒＧｌｕから選ばれ；Ｘ２１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、およびＴｒｐから選ばれるアミノ酸であるか、または不在であり；Ｘ２２は、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＡｌａから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２３は、ＬｅｕおよびＧｌｎから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２４は、ＧｌｙおよびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２５は、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２６は、ＡｌａおよびＴｈｒから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２７は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２８は、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＡｒｇから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ２９は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、およびＡｓｐから選ばれるアミノ酸であり；Ｘ３０は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒから選ばれるアミノ酸であり；およびＸ３１は、ＶａｌおよびＩｌｅから選ばれるアミノ酸である。
【００５９】
さらに別の局面では、提供されるのは、ＴＮＦαムテインが、ヒトのＴＮＦα（配列番号２）の、領域１アミノ酸２９−３６、領域２アミノ酸８４−９１、および領域３アミノ酸１４３−１４９から選ばれるＴＮＦαの領域において、または別の種のＴＮＦαのアナログ位置においてアミノ酸置換を有する、結合体である。
【００６０】
さらに提供されるのは、ＴＮＦαムテインが、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、ムテイン３（配列番号５）、ムテイン４（配列番号６）、ムテイン５（配列番号７）、およびムテイン６（配列番号８）から選ばれる、結合体である。ある特定局面では、提供されるのは、ＴＮＦαムテインが、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、およびムテイン４（配列番号６）から選ばれる、結合体である。ダイマー状では、ＴＮＦαムテインは、二つの同一のアミノ酸配列を含んでもよいし、あるいは、二つの非同一アミノ酸配列を含んでもよい。結合体のＴＮＦαムテインは、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウサギ、およびラットから選ばれた種から得られてもよい。
【００６１】
さらに提供されるのは、病的状態を持つ哺乳動物において免疫反応を刺激する方法である。方法は、該哺乳動物から生物学的流体を得る工程；可溶性腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）に対して特異的結合活性を有する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ムテインに該生物学的流体を接触させる工程；可溶性ＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインを、生物学的流体から除去し、可溶性ＴＮＦＲ量が低下した改変生物学的流体を生産する工程；および、該哺乳動物に、この改変生物学的流体を投与する工程を含んでもよい。生物学的流体は、例えば、全血を含む血液、血漿、血清、またはリンパ液であってもよい。さらに別の局面では、生物学的流体として全血を用いる方法は、全血を、細胞成分、および、可溶性ＴＮＦＲを含む、無細胞成分、または無細胞成分の分画に分離する工程をさらに含んでもよい。方法は、細胞成分を、改変無細胞成分、または無細胞成分の改変分画と組み合わせて、改変生物学的流体として該哺乳動物に投与することが可能な改変全血を生産する工程をさらに含んでもよい。したがって、細胞成分、および、改変無細胞成分、または無細胞成分の改変分画は、別々に該哺乳動物に投与されてもよい。
【００６２】
ＴＮＦαムテインは、単一型の可溶性ＴＮＦＲに対し、例えば、ｓＴＮＦＲＩ、またはｓＴＮＦＲＩＩに対して特異的結合活性を持つことが可能である。それとは別に、ＴＮＦαムテインは、１型を超える可溶性ＴＮＦＲに対し、例えば、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの両方に対し特異的結合活性を持つことが可能である。
【００６３】
結合パートナーの各種混合物も使用することが可能である。例えば、一混合物は、単一標的免疫系抑制因子に対して選択的に結合する、複数の結合パートナーから構成されてもよい。別の混合物は、それぞれが異なる標的免疫系抑制因子に対して選択的に結合する、複数の結合パートナーから構成されてもよい。それとは別に、混合物は、異なる標的免疫システム抑制因子に対し選択的に結合する、複数の結合パートナーから構成されてもよい。例えば、混合物は、１種を超えるＴＮＦαムテインを含んでもよい。さらに、この複数のＴＮＦαムテインは、単一型の可溶性ＴＮＦ受容体に対し特異的に結合するか、または、１種を超えるＴＮＦ受容体に対し、例えば、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩに対して結合してもよい。
【００６４】
さらに別の局面では、生物学的流体は、複数のＴＮＦαムテインと接触させてもよい。したがって、この複数のＴＮＦαムテインは、単一型の可溶性ＴＮＦＲに対し、例えば、ｓＴＮＦＲＩまたはｓＴＮＦＲＩＩに対して特異的結合活性を持ってもよい。それとは別に、ＴＮＦαムテインは、１型を超える可溶性ＴＮＦＲに対し、すなわち、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩに対し特異的結合活性を持ってもよい。
【００６５】
結合パートナー／免疫系抑制因子複合体の分子量を増したい場合には、結合パートナーを担体に結合体化させてもよい。このような担体の例としては、タンパク、炭水化物複合体、およびポリエチレングリコールなどの合成ポリマーが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００６６】
本明細書で用いる、結合パートナーの「機能的に活性な結合部位」とは、１種以上の標的免疫系抑制因子に対して結合することが可能な部位を指す。
【００６７】
ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインのダイマー状を生成するための一法は、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインモノマーを、抗体の重鎖定常域に共有的に連結する融合タンパクを生産することである。ダイマーＴＮＦαを生成するための特に有用な方法は、抗体のダイマー状Ｆｃ部分の形成に関与する、２本の重鎖定常域のそれぞれにＴＮＦαを融合することである。これらの重鎖定常域は集合して安定なＦｃ構造を形成するので、該定常域は、連結するＴＮＦαまたはＴＮＦαムテイン分子に対しても同様にダイマーを形成させる。一局面では、ダイマー型の二つのアミノ酸配列は同一である。別の局面では、ダイマー型の二つのアミノ酸配列は、非同一である。さらに別の局面では、ＴＮＦαムテインのアミノ末端が、天然そのままの重鎖定常域のカルボキシ末端に融合される、融合タンパクが生産されてもよい。ＴＮＦαはこれまでも、その生物活性を大きく失うことなく、そのアミノ末端において、様々の融合タンパクで融合されている。このような重鎖−ＴＮＦα融合タンパクは、天然の抗体軽鎖と組み合わされて、可溶性ＴＮＦＲを中和し、かつ、その抗体およびＴＮＦα配列が得られた哺乳動物において免疫原性が抑えられた分子を形成することが可能である。別の局面では、重鎖定常域は、ヒンジ領域の短縮されたアミノ末端であり、そのため、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインモノマーが、そのカルボキシ末端において融合することが可能な、二つの部位が得られるようになっていてもよい。従来、ＴＮＦαのカルボキシ末端を含む融合タンパクが生産されているが、通常、その融合タンパクのＴＮＦα成分の生物活性には著明な低下がもたらされる。この、観察される活性の著明な低下は、ＴＮＦαのカルボキシ末端アミノ酸（Ｌｅｕ１５７）のカルボキシル基が、隣接モノマー中のＬｙｓ１１とイオンペアを形成することによって、トリマー形成を安定化することによる（Ｅｃｋ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２９）：１７５９５−１７６０５（１９８９）、なお、この文献を引用により本明細書に含める）。Ｌｅｕ１５７のカルボキシル基を利用するペプチド結合の形成が、可溶性ＴＮＦＲに対する、この融合タンパクの結合性の低下を招くものであるならば、重鎖定常域のアミノ末端と、ＴＮＦαムテインのカルボキシ末端の間の接合部に、一つ以上の、カルボキシル官能基を含むＲ−基を有するアミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を挿入することも可能である。さらに別の局面では、前述のように、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを含む、他のダイマー状血漿タンパクを、ＴＮＦαムテインのアミノまたはカルボキシ末端に融合させてもよい。
【００６８】
それとは別に、ＴＮＦαモノマーは、周知の化学的架橋連結法を用いて、血漿タンパク、例えば、抗体または血清アルブミンに架橋結合してもよい。このような方法は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）に教示されるように、よく知られる。
【００６９】
さらに提供されるのは、膜ＴＮＦＲに対する結合、および膜ＴＮＦＲを介するシグナル伝達がさらに低下されるように調製されたＴＮＦαおよびＴＮＦαムテインのモノマー形である。ＴＮＦαのモノマー形は、アビディテイの寄与が全くないので、ＴＮＦα異性形の内で、膜ＴＮＦＲに対する結合強度が最低となることが予想される。さらに、モノマー形ＴＮＦαは、トリマー形ＴＮＦαよりも、膜ＴＮＦＲを介するシグナル伝達が著明に低下することが予想される。なぜなら、モノマー形ＴＮＦαの、膜ＴＮＦＲに対する架橋結合能力は低下しているからである。前述のように、一価の可溶性ＴＮＦＲに対する、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインの結合には、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテイン・トリマー中に存在する三つのモノマーの二つが与るだけである。したがって、可溶性ＴＮＦＲに結合するためには、ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテインは、少なくともダイマー状態となるようにマルチマー形成されなければならない。モノマー形ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインのマルチマー形成は、本明細書に開示される吸着性基質の創製の際、それらを、固相支持体に共有的に結合体化することによって簡単に実現が可能である。したがって、モノマー形ＴＮＦαまたはＴＮＦムテインの二つの分子は、一旦固相支持体の上で互いに近接して固定されたならば、可溶性ＴＮＦＲに結合することが可能である。一方、固相支持体から解離されると、これらのリガンドは、モノマー状態に戻るので、膜ＴＮＦＲに対する結合、および膜ＴＮＦＲを介するシグナル伝達は衰える。
【００７０】
モノマー形のＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインを生成する一方法は、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインが、そのカルボキシ末端において、野生型ＴＮＦには存在しないアミノ酸に融合される、融合タンパクを生産することである。前述のように、ＴＮＦαのカルボキシ末端融合は従来から生産されているが、通常、これらの融合では、融合タンパクのＴＮＦα成分の生物学的活性に著明な低下がもたらされる。この、観察される活性の著明な低下は、ＴＮＦαのカルボキシ末端アミノ酸（Ｌｅｕ１５７）のカルボキシル基が、隣接モノマー中のＬｙｓ１１とイオンペアを形成することによって、トリマー形成を安定化することによる（Ｅｃｋ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２９）：１７５９５−１７６０５（１９８９）、なお、この文献を引用により本明細書に含める）。隣接モノマー中のＬｙｓ１１とのイオン形成を阻止するのに十分な距離、該分子のカルボキシ末端を延長するように、さらにいくつかのアミノ酸を組み込むことができれば、それは、トリマー形成を低減するはずである。ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインに対して融合されてもよいアミノ酸としては、精製タグ（例えば、ポリヒスチジンまたはＧＳＴ），または、モノマーの適正なフォールド形成を可能とするが、好ましくは免疫原性を持たない、任意のアミノ酸のランダム配列が挙げられる。
【００７１】
もう一つの局面では、ダイマー状融合タンパクの、ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテイン部分に、該ダイマー状ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインの、野生型ＴＮＦαのモノマーに対する連結する能力を下げるように設計された突然変異を導入してもよい。ダイマー状ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインの、野生型ＴＮＦαのモノマーに対する連結は、トリマー構造を回復させ、融合タンパクの、膜ＴＮＦＲに対する結合能力を高める可能性があり、したがって、もしもこの融合タンパクが吸着性基質から放出されて患者に戻された場合、毒性をもたらすことが考えられる。通常であれば、トリマー形ＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインの集合に与るイオンペア（例えば、Ｌｙｓ９８とＧｌｕ１１６、またはＬｙｓ１１とＬｅｕ１５７、Ｅｃｋ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｎｇ，上記、１９８９）を形成する残基において突然変異を導入した場合、これらのムテインの、野生型ＴＮＦαモノマーと連結する能力は、低下または欠失されることが考えられる。前述のように、免疫グロブチンの重鎖、またはその他の融合パートナーに対し、カルボキシ末端Ｌｅｕ１５７においてＴＮＦαまたはＴＮＦαムテインが融合することは、隣接サブユニットにおけるＬｙｓ１１とのイオンペア形成を阻止するために、野生型ＴＮＦαモノマーとの連結を防ぐのに役立つ。
【００７２】
開示の組成物、結合体、および方法において有用な各種結合パートナーを生産するための方法は、当業者にはよく知られている。そのような方法としては、組み換えＤＮＡおよび合成技術、またはそれらの組み合わせが挙げられる。ＴＮＦαムテインなどの結合パートナーは、前核細胞、または真核細胞、例えば、哺乳類、昆虫、酵母などの細胞において発現させることが可能である。要すれば、発現に使用される宿主種に何らかのコドンバイアスがあれば、それを反映するようにコドンを改変してもよい。
【００７３】
ＴＮＦαムテインなどの結合パートナーは、不活性媒体に付着させて、吸着基質を形成させてもよい（図１）。ＴＮＦαムテインは、例えば、不活性媒体などの基質に共有結合させてもよい。本明細書で用いる「不活性媒体」という用語は、結合パートナー（単複）を付着することが可能な固相支持体を含むことが意図される。特に有用な支持体は、このような目的にために使用される材料、例えば、セルロース製中空線維、合成中空線維、シリカ製粒子、フラットまたはプリーツ状膜、粗大な多孔性ビーズ、アガロース製粒子などを含む材料である。この不活性媒体は、ビーズ形状、例えば、粗大な多孔性ビーズ、または非多孔性ビーズであってもよい。例示の、マクロ多孔性ビーズとしては、アガロース、セルロース、調節孔ガラスなどの天然材料、または、ポリアクリルアミド、架橋結合アガロース（例えば、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ａｃｔｉｇｅｌ（登録商標）、およびＵｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標））、アズラクトン、ポリメタクリレート、ポリスチレン／ジビニールベンゼンなどの合成材料が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。一局面では、マクロ多孔性ビーズはＡｃｔｉｇｅｌ（登録商標）を含む。例示の、非多孔性ビーズとしては、シリカ、ポリスチレン、ラテックスなどを含むが、ただしこれらに限定されない。中空線維および膜も、天然または合成材料から構成されていてよい。例示の天然材料としては、セルロース、および修飾セルロース、例えば、セルロースジアセテートまたはトリアセテートが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。例示の合成材料としては、ポリスルフォン、ポリビニール、ポリアセテートなどが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。このような不活性媒体は、購入することも可能であり、あるいは、当業者であれば簡単に作製することが可能である。結合パートナーは、当業者には周知の、例えば、共有接合を含む任意の手段または方法によって、不活性媒体に付着させることが可能である。それとは別に、結合パートナーは、不活性媒体に共有結合させた添加分子との、高アフィニティー、非共有的相互作用を通じて、不活性基質と連結させることも可能である。例えば、ビオチニル化結合パートナーは、不活性媒体にあらかじめ結合体化させたアビジンまたはストレプトアビジンと相互作用を持つことが可能である。
【００７４】
このようにして生産された吸着基質は、体外回路の使用を通じて、生物学的流体、またはその分画と接触させてもよい。体外性、吸着基質の開発および使用については広範に論じられている（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １１：１５０−１５７（１９９３）を参照）。
【００７５】
本発明では「攪拌リアクター」と呼ばれる、さらに別の局面では（図２）、生物学的流体を、混合チェンバーにおいてＴＮＦαムテインなどの結合パートナーに暴露し、その後、結合パートナー／免疫系抑制因子複合体を、当業者に既知の手段または方法、例えば、機械的、または化学的または生物学的分離法によって取り除くことが可能である。例えば、結合パートナー、したがって、結合パートナー／免疫系抑制因子複合体が、処理される生物学的流体の最大成分である場合には、機械的分離法を使用することが可能である。そのような場合、結合パートナー、およびそれと連結する免疫系抑制因子を保持するためにろ過が用いられ、その間、生物学的流体の他の全ての成分は、フィルターを浸透通過し、したがって患者の体に戻ることが可能とされる。化学的または生物学的分離法の例では、結合パートナー、およびそれと連結する免疫系抑制因子は、その結合パートナーに特異的に付着することが可能な吸着基質に暴露することを通じて、該処置生物学的流体から取り除くことが可能である。例えば、ＴＮＦαムテインに対して反応性を有する抗体によって構築される基質は、この目的のために使用することが可能である。同様に、ビオチンが、生物学的流体に添加される前にＴＮＦαムテインなどの結合パートナーに結合体化された場合、その処置流体から、結合パートナーおよびそれと連結する免疫系抑制因子を除去するために、アビジンまたはストレプトアビジンによって構築された基質を使用することが可能であろう。生物学的流体からの、ＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインなどの、結合パートナー／免疫系抑制因子複合体の除去は、何らかの好適なやり方で、生物学的流体と、結合パートナー／免疫系抑制因子複合体とを分離することによって実現することが可能である。結合パートナー／免疫系抑制因子複合体、および生物学的流体の内のどちらか、または両方を、他方から受動的、または能動的に分離することが可能である。したがって、例えば、ＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインの、生物学的流体からの除去は、例えば、生物学的流体からＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインを能動的に除去することによって、あるいは、ＴＮＦＲに結合したＴＮＦαムテインから生物学的流体を能動的に除去することによって実現される。
【００７６】
本発明の最終工程では、可溶性ＴＮＦ受容体などの標的免疫系抑制因子の量を低減させた、処置または改変生物学的流体は、生物学的流体の未処置分画と、処置の際にもしもそのような分画が生産された場合には、共に、処置を受ける患者に戻される。この改変生物学的流体は、当業者に既知の任意の手段または方法、例えば、循環系への直接的注入を含む方法によって、該哺乳動物に投与することが可能である。改変生物学的流体は、同時的、体外回路における結合パートナーとの接触直後に投与してもよい。この回路では、生物学的流体は、（ａ）収集され、（ｂ）望むなら、細胞成分と無細胞成分に分離され、（ｃ）結合パートナーに暴露され、要すれば、標的免疫系抑制因子に結合した結合パートナーから分離され、（ｄ）要すれば、細胞成分と合わされ、かつ、（ｅ）改変生物学的流体として患者に再投与される。さらに別の局面では、改変無細胞性生物学的流体は、生物学的流体の細胞成分が患者に投与されるのとは別の注入部位において患者に投与することが可能である。患者に対する改変無細胞性生物学的流体の投与は、患者に対する細胞成分の投与と同時であっても、先行しても、あるいは、追加されてもよい。それとは別に、改変生物学的流体の投与は、当業者によって簡単に決められる適切な保存条件下で遅延させることも可能である。
【００７７】
望ましければ、全体プロセスは繰り返されてもよい。当業者であれば、患者の臨床状態を監視し、その状態を、処置前、最中、および後の循環における、可溶性ＴＮＦα受容体などの標的免疫系抑制因子（単複）の濃度（単複）と相関させることによって、反復処置の利益を簡単に判断することが可能である。
【００７８】
さらに提供されるのは、生物学的流体における可溶性ＴＮＦ受容体などの、標的免疫系抑制因子の量を下げるための装置である。装置は、（ａ）生物学的流体を、細胞性成分、および無細胞成分、またはその分画に分離するための手段；（ｂ）改変無細胞成分、またはその分画を生産するための、前述の通りの、ＴＮＦα成分を付着させた吸着基質、または攪拌リアクター；および（ｃ）改変無細胞成分、またはその分画と細胞分画を合わせるための手段から構成されてもよい。装置は、細胞成分が、全体血漿、またはその分画から分離される、生物学的流体としての全血に対し特に有用である。
【００７９】
最初に、生物学的流体を、細胞成分、および無細胞成分、またはその分画に分画するための手段、および、処置後、その細胞成分を、無細胞成分、またはその分画と合わせるための手段は、従来技術において既知である（Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，上記参照）。
【００８０】
標的とされる免疫系抑制因子は、ｓＴＮＦＲＩ（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１９６６−１１９７３（１９８９）；Ｇａｔａｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８７８１−８７８４（１９９０））、多能性免疫系刺激因子の天然抑制因子、ＴＮＦであってもよい。ｓＴＮＦＲＩは、膜性腫瘍壊死因子受容体Ｉ型の細胞外ドメインを、その膜および細胞ドメインから解放する、タンパク分解性切断によって生産される（Ｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：３６１−３７０（１９９０）；Ｈｉｍｍｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：７０５−７１５（１９９０））。ｓＴＮＦＲＩは、高いアフィニティーの下でＴＮＦに結合し、そうすることによって、ＴＮＦが、細胞表面の膜受容体に対して結合するのを抑制する能力を保持する。
【００８１】
生物学的流体中のｓＴＮＦＲＩレベルは、先行するＴＮＦの増加によって特徴づけられる様々の条件下において上昇する。そのような条件として、前述の細菌、ウィルス、および寄生虫感染、および癌が挙げられる。これらの病態のそれぞれにおいて、攻撃的因子の存在が、ＴＮＦ生産を刺激し、これが、ＴＮＦＲＩ生産における対応する増加を刺激する。ｓＴＮＦＲＩ生産は、局所の毒性ばかりでなく、ＴＮＦレベルの上昇と関連する全身毒性を下げ、かつ、免疫原ホメオスターシスを回復することが意図される。
【００８２】
腫瘍を抱える宿主の場合、ｓＴＮＦＲＩの過剰生産は、様々な抗腫瘍免疫反応におけるＴＮＦの決定的役割を考えると、病気の進行に深刻な影響を及ぼす可能性がある（Ｂｅｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６２５−６５５（１９８９）に総覧されている）。ＴＮＦは、Ｉ型膜連結ＴＮＦ受容体に結合することによって腫瘍細胞死を直接誘発する。さらに、血管内皮細胞の死がＴＮＦ結合によって誘発され、これは、腫瘍を助ける循環ネットワークを破壊し、さらに腫瘍細胞の死に寄与する。ナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球介在細胞分解におけるＴＮＦの重要な役割も記録されている。ｓＴＮＦＲＩによるこれらのエフェクター機構のいずれか、または全てに対する抑制は、腫瘍の生存を劇的に強調する可能性がある。
【００８３】
ｓＴＮＦＲＩは、腫瘍の生存を増進すること、および、その除去は、抗腫瘍免疫を強化することが明らかにされている。マウス腫瘍の実験モデルにおいて、ｓＴＮＦＲＩ生産は、インビトロにおいて、ＴＮＦの細胞傷害作用、および、ナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球によって仲介される細胞分解から、形質転換細胞を保護することが認められた（Ｓｅｌｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：８８−９３（１９９８））。さらに、形質転換細胞によるｓＴＮＦＲＩの分泌は、インビボにおいて、その発癌性および持続性を著明に強化することが示されている（Ｓｅｌｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｈｏｗｅｌｌ，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００：８１−８７（２０００））。さらに、前述のウルトラフェレーシスに関するヒトの臨床治験（Ｌｅｎｔｚ，上記）によって明らかにされたように、循環するｓＴＮＦＲＩの除去は、癌患者に対し臨床的利点を提供することが認められた。これらの所見は、腫瘍の生存におけるこの分子の重要性を確認し、かつ、ｓＴＮＦＲＩをより特異的に除去するための方法の開発は、癌の免疫療法のための有望な新しい道程となることを示唆する。
【００８４】
下記の実施例は、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、装置、および／または方法がどのようにして製造され、評価されるかに関する、完全な開示および記述を当業者に提供するために記載されるものであり、本発明の純粋に例示のためであることを意図するものであり、本発明人らが、自らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。数（例えば、量、温度など）に関しては正確性を確保するように努めたけれども、ある程度の誤差および偏倚は斟酌しなければならない。別様に指示しない限り、部分は、重量部であり、温度は摂氏で表されるか、室温であり、圧は、大気圧であるか、その近傍である。
【実施例】
【００８５】
実施例１
免疫系抑制因子、ヒトのｓＴＮＦＲＩの生産、精製、および特徴解明
本実験で使用されるｓＴＮＦＲＩは、大腸菌（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネアポリス、ミネソタ州）、または、ほぼ記載される通りの真核細胞培養体（米国特許第６，３７９，７０８号を参照されたい、なお、この特許を引用により本明細書に含める）のいずれかにおいて組み換え的に生産された。真核細胞性発現プラスミドの構築、培養細胞の形質転換および選択法、および、形質転換細胞によるｓＴＮＦＲＩ生産の定量は、既に記載されている（Ｓｅｌｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記、１９９８）。
【００８６】
ｓＴＮＦＲＩは、本実験では、捕捉性ＥＬＩＳＡ（Ｓｅｌｉｎｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，上記）によって検出し、定量した。さらに、組み換えｓＴＮＦＲＩの生物活性、すなわち、ＴＮＦに対する結合能力は、ＥＬＩＳＡによって確認した。アッセイプレートを、ヒトのＴＮＦα（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）でコートし、ウシ血清アルブミンによってブロックし、これに、前述のように培養上清に含ませたｓＴＮＦＲＩを加えた。ビオチニル化ヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩ、アルカリフォスファターゼ結合体化ストレプトアビジン、およびｐ−ニトロフェニルフォスフェートを順次加えることによって、結合ｓＴＮＦＲＩを検出した。
【００８７】
実施例２
ＴＮＦαムテインの生産、精製、および特徴解明
簡単に言うと、ＴＮＦαムテイン１、２、３、および４は、大腸菌においてそれぞれのｃＤＮＡを発現させることによって生産した。ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテイン１、２、３、および４をコードする遺伝子は、細菌発現のために最適化されたコドンを有する、重複オリゴヌクレオチドを用いて調製した。各コード配列を、ｏｍｐ  Ａリーダーをコードする配列に読み枠が一致するように融合し、組み換えポリペプチドのペリプラズムへの輸出を可能とした。合成断片を、ｌａｃ  Ｚプロモーター直近の下流においてｐＵＣ１９誘導体にクローンし、得られた組み換えプラスミドを大腸菌に導入した。組み換え細菌を、後期ｌｏｇまで培養し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって３時間誘発し、遠心によって収集した。ペリプラズム分画を調製し、ヤギ抗ヒトＴＮＦα捕捉ポリクロナール抗体使用のＥＬＩＳＡによって試験した。希釈ペリプラズムの添加後、結合ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテイン１、２、３、および４を、ビオチニル化ポリクロナールヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩ、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびｐ−ニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）を順次加えることによって検出した。ＴＮＦαおよび各ＴＮＦαムテインは、それぞれのペリプラズムにおいて検出可能であった。ただし、ＴＮＦαムテイン３のレベルは、アッセイの検出限界を僅かに超える程度であった（図４）。
【００８８】
ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテインポリペプチド１、２、および４は、ほぼ記載される通りに（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１１：４９３−５０１（１９９０））、それぞれ、ＱおよびＳ陰イオンおよび陽イオン交換カラム使用の連続クロマトグラフィーによって、ペリプラズム分画より精製した。ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテインポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において＞９５％均一となるまで精製した。ゲルから、ＴＮＦαまたはムテインに相当する１７ｋＤａのバンド、および、３４ｋＤａバンドが明らかになった。後者は、ウェスタンブロットによって、ダイマー状ＴＮＦαムテインであることが確認された。
【００８９】
ＴＮＦαムテインを、ｓＴＮＦＲＩに対する結合能力について調べた。マイクロタイタープレートのウェルをＴＮＦαでコートし、ブロックし、抑制因子、ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテイン１、２、および４の存在下、または不在下においてインキュベートした。図５に示すように、ＴＮＦαムテイン１、２、および４はそれぞれｓＴＮＦＲＩに結合する。
【００９０】
実施例３
ＴＮＦαムテイン吸着基質によるヒト血漿からの、免疫系抑制因子ｓＴＮＦＲＩの除去
ＴＮＦαムテイン吸着基質を調製し、ヒト血漿からｓＴＮＦＲＩを除去する能力について調べた。簡単に言うと、精製ＴＮＦαムテイン１、２、および４を、それぞれ、臭化シアノゲン（ＣＮＢｒ）セファローズ（登録商標）４Ｂに、ビーズ１ｍＬ当たり０．５ｍｇの密度において結合体化し、残余のＣＮＢｒは、エタノールアミンによって反応停止させた。得られた基質を、個別のカラム筐体にパックし、使用前にリン酸バッファー生食液にて十分に洗浄した。
【００９１】
正常のヒト血漿に、組み換えヒトｓＴＮＦＲＩ（実施例１を参照）を含む培養上清を、ミリリットル当たり８ナノグラムの最終濃度となるように加え、分当たり樹脂ミリリットル当たり血漿１ミリリットルの流速で、それぞれのカラムを通過させた。非特異的除去について調整するために、固定タンパクを含まず、エタノールアミンで反応停止させた追加カラムを含めた。１ｍＬ分画を収集し、開始試料および分画に含まれるｓＴＮＦＲＩの相対濃度を、捕捉ＥＬＩＳＡによって定量した。捕捉ＥＬＩＳＡを実行するために、ウェルを、ヤギ抗ｓＴＮＦＲＩポリクロナール抗体でコートし、２％ＢＳＡでブロックした。血漿サンプルを、１：２で希釈し、ウェルに加え、ウェル中のｓＴＮＦＲＩを捕捉した。ビオチニル化ポリクロナールヤギ抗ｓＴＮＦＲＩを加え、次いで、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびｐ−ニトロフェニルフォスフェートを加えた。４０５ｎｍにおける相対的吸光度を用いて除去を評価した。
【００９２】
図６に示すように、固定された３種類のＴＮＦαムテイン全てが、ヒトの血漿からｓＴＮＦＲＩを効果的に除去し、図５で観察された等級がここでも明らかになった。コントロール基質は、ｓＴＮＦＲＩレベルに全く低下をもたらさず、ＴＮＦαムテイン基質において観察される除去の特異性を裏づけた。重要なことは、臨床背景において使用が予想される流速と近似の流速において、ほぼ定量的な除去が、ＴＮＦαムテイン１および４によって実現されたことである。
【００９３】
実施例４
ヒトのＴＮＦαムテイン４の高レベル生産および精製
ヒトのＴＮＦαムテイン４を生産するための、高レベル発現システムが開発された。ヒトのＴＮＦαムテイン４をコードする合成遺伝子が、一連の重複オリゴヌクレオチドからＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ワシントン州）によって生産された。この遺伝子の５′末端は、６ヌクレオチド認識配列の中にメチオニンコドンを含む、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩのための部位を含む。このメチオニンコドンを、６個のヒスチジン残基（６Ｈｉｓ）のコドンと、読み枠が一致するように融合させ、これらの後に、煙草エッチウィルス（ＴＥＶ）プロテアーゼによって切断される７個のアミノ酸認識配列を指定する追加コドンを付加する。この認識配列の後には、位置１４７においてセリンをチロシンで置換することを除いては、天然のＴＮＦαポリペプチドの細胞外部分全体を表す１５７個のアミノ酸をコードする配列が続く。ＴＮＦαムテインコード配列の後には、読み枠一致の終止コドンが続き、終止コドンの後には、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ  ＨＩの部位が続く。制限エンドヌクレアーゼ部位を除いては、構築体は、大腸菌のコドンバイアスを反映するように、かつ、ｍＲＮＡ転写物の二次構造を最小化するように最適化される。合成遺伝子は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ社特製のｐＵＣ１９誘導体の中にクローンされ、コード領域のヌクレオチド配列が、ジデオキシ・チェーンターミネーション法を用いて両端において確認された。
【００９４】
高レベル発現ベクターを構築するために、前核細胞発現プラスミドｐＥＴ−１１ａ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた。６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＴＮＦαムテイン４をコードする合成遺伝子が、前述のｐＣＵ１９−系組み換えプラスミドから、Ｎｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩによる消化によって放出された。得られた断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、ｐＥＴ−１１ａにおいて一意のＮｄｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位に連結した。この連結反応産物を、電気穿孔によって大腸菌宿主株λＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に導入した。λＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｔ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを細菌ゲノム中に転換により取り込んだ、溶原性λファージ組み込み体を含む、大腸菌Ｋ１２の誘導体である。Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の誘発性発現によって、ｐＥＴ−１１ａにおいてＴＮＦαムテイン遺伝子の直近の上流に存在するＴ７プロモーターによる高レベル転写が可能となる。１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉプレートにおいて安定な形質転換細菌が選択された。発現プラスミドの忠実度に基づいて、個々のコロニーを選択した。忠実度の評価は、組み換えプラスミドの単離、および、ＮｄｅＩおよびＢａｍ  ＨＩの組み合わせ消化による、６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＴＮＦαムテイン４遺伝子の放出によって行った。
【００９５】
ＴＮＦαムテイン４発現構築体によって形質転換したλＢＬ２１（ＤＥ３）の培養体は、３７℃で育成し、ＩＰＴＧで誘発し、遠心によって収集した。細菌ペレットを、溶菌バッファーに再縣濁し、ＤＮアーゼおよびリゾチームと３０分インキュベートした。この分解産物をホモジェネートし、遠心によって澄明とした。この分解産物に含まれるＴＮＦα４を、Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄカラム（ＢＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いメーカーの指示に従って精製した。精製したＴＮＦαムテイン４を、ＴＥＶプロテアーゼで消化し、再びＨｉｓ  Ｂｉｎｄカラム上でクロマトグラフィー処理し、解離ポリヒスチジンタグ、および、これもポリヒスチジンタグを含むＴＥＶプロテアーゼを除去した。精製ＴＮＦαムテイン４を、Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄカラム通流によって収集し、リン酸バッファー生食液に対して透析し、−２０℃で保存した。標本の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による評価では、＞９５％であった。
【００９６】
実施例５
ＴＮＦαムテイン４によって構築した体外性吸着装置による、血漿からの、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩのインビトロ除去
精製ＴＮＦαムテイン４を、Ａｃｔｉｇｅｌ  ＡＬＤ  Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ  ４（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に化学的に結合体化することによって、体外性吸着装置を無菌的に製造した。リガンド結合体化のために用いられるアルデヒド化学の優れた安定性、および、血液および血漿における架橋結合アガロースの、実証済みの生体適合性および安定性のために、吸着装置の構築には、Ａｃｔｉｇｅｌ  ＡＬＤ  Ｕｌｔｒａｆｌｏｗが好ましい。ＴＮＦαムテイン４は、メーカーの指示に従って、ビーズ１ｍＬ当たり１ｍｇのムテイン濃度でビーズに結合体化させた。６２．５ｍＬの基質を、重力流によって、両端に３６ミクロンのポリプロピレン・フィルターを含む、ポリカーボネート筐体（５ｃｍ長×４ｃｍ直径）にパックした。得られた装置を、カラムの１０倍容量の０．５Ｍ  ＮａＣｌ、カラムの１０倍容量の０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８、およびカラムの１０倍容量の、０．１％アジ化ナトリウム含有正常生食液で順次洗浄した。
【００９７】
ＴＮＦαムテイン４吸着装置は、血漿からヒトのｓＴＮＦＲを除去する能力に関してインビトロで評価した。正常ヒト血漿を、０．４５ミクロンフィルターでろ過し、ポンプによって１分当たり血漿３０ミリリットルの流速で装置を還流させた。３０個の２５ｍＬ分画が収集され、初期の血漿サンプル、および分画の中に含まれる、ヒトのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩのレベルを、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩ捕捉ＥＬＩＳＡを用いて定量した。捕捉ＥＬＩＳＡを実行するために、ウェルを、ヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩポリクロナール抗体、またはヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩＩポリクロナール抗体でコート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）し、次に、２％ＢＳＡでブロックした。血漿サンプルを、１：２で希釈し、ウェルに加え、ウェル中のｓＴＮＦＲＩまたはｓＴＮＦＲＩＩを捕捉した。ビオチニル化ポリクロナールヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩ、またはビオチニル化ポリクロナールヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、次いで、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびｐ−ニトロフェニルフォスフェートを加えた。４０５ｎｍにおける吸光度を用いて、精製ヒトｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて得られた標準曲線に対するｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの濃度を計算した。初期の血漿サンプルにおけるヒトのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの濃度は、それぞれ、１．１７ｎｇ／ｍＬおよび０．５５ｎｇ／ｍＬであった。ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩは、装置通過後に収集した分画のいずれからも検出されなかった。これは、装置が、これら低量の溶質のどちらも血漿から除去する能力を持つことを裏づける。
【００９８】
このＴＮＦαムテイン４吸着装置を、同様のやり方で、血漿からイヌのｓＴＮＦＲを除去する能力について評価した。ＴＮＦαムテイン４吸着装置を通過させて、内因性ヒトｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩをあらかじめ除去した正常ヒト血漿に、イヌｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩを、それぞれ、２ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬ加えた。この分析に用いたイヌｓＴＮＦＲは、下記の実施例７に記載するように細胞培養体において組み換え的に生産した。この添加血漿を、０．４５ミクロンフィルターでろ過し、ポンプによって１分当たり血漿３０ミリリットルの流速で装置を還流させた。２５個の１０ｍＬ分画が収集され、初期の血漿サンプル、および分画の中に含まれる、イヌのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩのレベルを、ｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩ捕捉ＥＬＩＳＡを用いて定量した。捕捉ＥＬＩＳＡを実行するために、前述のように、ウェルを、ヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩポリクロナール抗体、またはヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩＩポリクロナール抗体でコートした。２％ＢＳＡでブロックした後、血漿サンプルを、１：２で希釈し、ウェルに加え、ウェル中の、それぞれのｓＴＮＦＲを捕捉した。組み換えイヌｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの、カルボキシ末端ポリヒスチジン・タグと反応することが可能な、ウサギ・ポリクロナールＩｇＧを加え、次いで、ビオチニル化抗ウサギＩｇＧ、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびｐ−ニトロフェニルフォスフェートを加えた。各サンプルにおいて４０５ｎｍにおける吸光度を用いて、精製組み換えイヌｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩを用いて得られた標準曲線に対するｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの濃度を計算した。ＥＬＩＳＡで評価した場合の、添加血漿サンプル中のイヌのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの濃度は、それぞれ、２，８ｎｇ／ｍＬおよび４．０ｎｇ／ｍＬであると定量された。吸着装置の通過後、血漿分画におけるｓＴＮＦＲＩの濃度は、５７％から８２％に低下し、ｓＴＮＦＲＩＩは、血漿分画のいずれにおいても検出不能であった。これらの所見は、ヒトのＴＮＦαムテイン４の吸着装置が、イヌのｓＴＮＦＲに対しても同様に除去する能力を持つことを裏づける。
【００９９】
実施例６
ＴＮＦαムテイン４によって構築された体外性吸着装置による、血漿からの、イヌのｓＴＮＦＲＩのエクスビボ除去
血漿からｓＴＮＦＲＩを除去する、ＴＮＦαムテイン４吸着装置の能力を、治療的血漿交換のために用いられるものとほとんど同様の体外回路で使用された場合について評価した。簡単に言うと、外頸静脈に埋め込んだ二腔カテーテルを通じて、４７ｋｇのイヌから血液を抽出した。この血液を、ＣｙｔｏＬｏｇｉｃによってあらかじめ無菌的に修正した、Ｃｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｘｃｈａｎｇｅディスポーザブルチューブを用い、遠心性血漿分離機Ｃｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａへ輸送した。分離されると、血球および血漿は、それぞれ独立にルートを辿り、システムの残余部分を還流する。血漿成分は、本明細書の図１に示すように、ＴＮＦαムテイン４吸着装置を通過させられる。処置ずみ血漿は、再び血球と合わせられてカテーテルを通じて動物に戻される。血漿の０．５から１容量が処置されるいくつかの工程が実行されたが、それぞれ、１時間未満で完了した。
【０１００】
このプロセスによるイヌのＴＮＦＲＩの除去を評価した。血漿サンプルは、体外回路から、吸着装置への進入直前、および吸着装置からの脱出直後において入手した。これらの血漿サンプルにおけるイヌのｓＴＮＦＲＩのレベルを、捕捉ＥＬＩＳＡを用いて定量した。捕捉ＥＬＩＳＡを実行するために、
除去を評価した。ウェルを、あらかじめイヌのｓＴＮＦＲＩと交差反応することが明らかにされている、マウス抗ヒトｓＴＮＦＲＩモノクロナール抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）でコートした。２％ＢＳＡでブロックした後、装置前および装置後の血漿サンプルを、１：２で希釈し、ウェルに加え、ウェル中の、イヌのｓＴＮＦＲＩを捕捉した。ビオチニル化ヤギ抗ヒトｓＴＮＦＲＩポリクロナール抗体を加え、次いで、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびｐ−ニトロフェニルフォスフェートを加えた。各サンプルにおいて４０５ｎｍにおける吸光度を用いて、精製組み換えイヌｓＴＮＦＲＩを用いて得られた標準曲線に対するｓＴＮＦＲＩの濃度を計算した。この被験体に対する５回の別々の処置時に得られた、装置前および装置後血漿サンプルペアについて、このアッセイを用いて評価した（下表参照）。各サンプルペアにおいて、ｓＴＮＦＲＩの著明な除去が観察された（範囲＝６９．７０％から８１．０３パーセント）。これらの５回の処置におけるｓＴＮＦＲＩの平均除去パーセントは７４．９０±５．６６であった。
【０１０１】
【化１】
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実施例７
イヌのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩの生産および精製
本実験において使用されるイヌのｓＴＮＦＲは、真核細胞培養体において生産された。イヌのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩをコードする合成遺伝子は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって、一連の重複オリゴヌクレオチドから生産された。イヌのｓＴＮＦＲＩ  ｃＤＮＡの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＸＭ＿８４９３８１に含まれるものに基づいた。イヌのｓＴＮＦＲＩＩ  ｃＤＮＡの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＸＭ＿５４４５６２に含まれるものに基づいた。各ｃＤＮＡは、３′末端において、６個のヒスチジン残基（６Ｈｉｓ）のコドンと読み枠が一致するように融合させ、これらの後に、読み枠一致終止コドンを付加した。各遺伝子の５′および３′末端には、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏ  Ｉの認識配列を側接させた。制限エンドヌクレアーゼ部位を除いては、各構築体は、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓのコドンバイアスを反映するように、かつ、ｍＲＮＡ転写物の二次構造を最小化するように最適化される。各合成遺伝子は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ社特製のｐＵＣ１９誘導体の中にクローンされ、各コード領域のヌクレオチド配列が、ジデオキシ・チェーンターミネーション法を用いて両端において確認された。
【０１０２】
イヌのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩをコードする合成遺伝子を、前述のｐＵＣ１９系組み換えプラスミドから、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏ  Ｉによる消化によって放出させた。得られた断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、真核細胞発現ベクター、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，カリフォルニア州）において一意のＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位に連結した。この連結反応産物を、電気穿孔によって大腸菌宿主株λＢＬ２１（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に導入した。１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉプレートにおいて安定な形質転換細菌が選択された。発現プラスミドの忠実度に基づいて、個々のコロニーを選択した。忠実度の評価は、組み換えプラスミドの単離、および、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏ  Ｉの組み合わせ消化による、それぞれのｓＴＮＦＲ遺伝子の放出によって行った。
【０１０３】
イヌのｓＴＮＦＲ発現プラスミドを、リポフェクタミンを用いてＣｆ２Ｔｈ細胞の培養体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州）に導入した。ｓＴＮＦＲＩ（クローンＥ）およびｓＴＮＦＲＩＩ（クローンＦ）を生産する、形質転換クローン細胞系統を、ヒグロマイシン（０．１ｍｇの活性剤／ｍｌ）の存在下に限界希釈によって単離した。クローンＥおよびＦの培養体は、スピナーフラスコで育成し、イヌのｓＴＮＦＲＩおよびｓＴＮＦＲＩＩ組み換え体は、それぞれ、臭化シアノゲンセファロースの上に固定されたヒトのＴＮＦαまたはヒトのＴＮＦαムテイン４のカラム使用のアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｓＴＮＦＲはＰＢＳに対して透析し、−２０℃で保存した。
【０１０４】
本発明が、現在好ましい局面を参照しながら説明されたわけであるが、本発明の精神から逸脱することなく、各種の改変の実行が可能であることを理解しなければならない。したがって、本発明は、下記の特許請求項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付属の図面は、本発明のいくつかの局面を描き、説明と相俟って、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、開示される組成物、結合体、および方法の一局面の「吸着基質」構成を示す。この例では、患者から血液が取り出され、細胞成分、および無細胞成分またはその分画に分離される。無細胞成分、またはその分画は、吸着基質に暴露され、結合が、したがって、可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体などの標的免疫系抑制因子の除去が実現される。次に、改変無細胞成分またはその分画は、同時に、患者に戻される。
【図２】図２は、開示される組成物、結合体、および方法の一局面の「攪拌リアクター」構成を示す。この例では、患者から血液が取り出され、細胞成分、および無細胞成分またはその分画に分離される。ＴＮＦαムテインなどの結合パートナーが、この無細胞成分、またはその分画に加えられる。続いて、結合パートナー（ＴＮＦαムテイン）／免疫系抑制因子（可溶性ＴＮＦ受容体）複合体が、機械的、または化学的または生物学的手段または方法によって、無細胞成分またはその分画から取り除かれ、次に、この改変無細胞成分またはその分画は、同時に患者に戻される。
【図３Ａ】図３Ａは、様々な種から得られたＴＮＦα配列（マウス、配列番号１０；ラット、配列番号１１；ウサギ、配列番号１２；ネコ、配列番号１３；イヌ、配列番号１４；ヒツジ、配列番号１５：ヤギ、配列番号１６；ウマ、配列番号１７；ウシ、配列番号１８；ブタ、配列番号１９；ヒト、配列番号２）の整列を示す。最上段配列は、上に示した種全体に亘って保存されるアミノ酸（配列番号１）（完全保存、または一例外を含む）を示す。非保存アミノ酸は、「．」によって示される（Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：５−２２（１９９４）から引用、なお、これを引用により本明細書に含める）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、保存ＴＮＦα配列と、ヒトのＴＮＦα、および、ムテイン１（配列番号３）、ムテイン２（配列番号４）、ムテイン３（配列番号５）、ムテイン４（配列番号６）、ムテイン５（配列番号７）、およびムテイン６（配列番号８）と表示される、六つの代表的ＴＮＦαムテインとの整列を示す。４種のムテインは、ボールドおよび下線で示される単一アミノ酸置換において、ヒトの配列と異なる。
【図３Ｃ】図３Ｃは、代表的なＴＮＦαの共通配列（配列番号９）を示す。
【図４】図４は、ヒトのＴＮＦαおよびＴＮＦαムテイン１、２、３、および４の発現構築体によって形質転換した大腸菌のペリプラズムにおける、それらの結合パートナーの存在を示す。
【図５】図５は、ＴＮＦαムテインがｓＴＮＦＲＩに結合することを示す。マイクロタイタープレートのウェルをＴＮＦαでコートし、ブロックし、抑制因子、ＴＮＦαおよびＴＮＦαムテイン１、２、および４の存在下、または不在下においてインキュベートした。
【図６】図６は、固定されたＴＮＦムテインによる、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ（ｓＴＮＦＲＩ）の除去を示す。ムテイン１、２、および４を、セファローズ（登録商標）４Ｂ上に固定し、組み換えヒトｓＴＮＦＲＩを加えた正常ヒト血漿をムテインを固定させたカラムを通過させた。血漿からのｓＴＮＦＲＩの除去を、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009509965.tif 000012
2009509965.tif 000013