(57)【要約】  試料中の抗体を検出する方法が開示され、この場合、抗体が赤血球又は赤血球ゴーストによって発現した抗原を標的にしている。（アッセイに基づいた従来の凝集反応におけるような）特定の抗原−抗体対の間の結合事象を検出するというよりはむしろ、ここでの方法は、血液型抗原に対する臨床上重要なアロ免疫抗体の多重検出を考慮している。特に、本方法は蛍光コード化した赤血球又は赤血球ゴーストを生成するステップと、蛍光サンドイッチ型イムノアッセイを用いて、血清／血漿中の抗体の存在を検出するためにそれらを使用するステップを含んでいる。このアッセイは、画像技術に基づいたフローサイトメトリ法又は蛍光顕微鏡を用いて読み取ることができる。【選択図】図１
2009529655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアロ抗体を検出する方法において：
別々にコード化された赤血球又は赤血球ゴーストセットを生成するステップであって、別々にコード化された細胞又はゴーストが、前記セット中のその他の細胞又はゴーストによって発現されない細胞膜表面上の少なくとも１の抗原を発現するステップと；
前記細胞膜表面上の前記抗原に対し、試料中に存在する抗体の結合を可能にする条件下で、前記セットを血清、血液又は血漿の試料へ曝露するステップと；
この結合した抗体を標的として標識された第２の抗体を用いて結合を検出するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
結合の後に過剰な未結合の試料を洗い落とすステップを更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コード化が蛍光染料を伴うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の抗体が蛍光染料で標識されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の抗体がモノクローナルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出ステップが、フローサイトメトリを用いて実行されるか、又は、前記コード化された細胞又はゴーストのアレイを画像化し、前記結合した第２の抗体を画像化し、前記結合した第２の抗体をこのアレイ画像と相関させて、前記セット内のどの細胞又はゴーストが前記試料中の抗体と反応したかを決定することによって実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
コード化したゴースト細胞を調製する方法が：
全血液から赤血球を分離するステップと；
染料溶液を用いて前記赤血球をインキュベートして、前記赤血球の表面上の抗原をコード化するステップと；
溶血溶液を用いて赤血球を溶血させるステップと；
再封入溶液を用いてこの溶血させた赤血球を再封入するステップと；
前記再封入溶液からこの再封入された赤血球ゴーストを分離するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項８】
分離が遠心分離によって行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶血溶液が、５００ｍｌの蒸留水に溶解させた０．６９ｇの一ナトリウムリン酸塩と、０．２０３ｇの塩化マグネシウム六水和物と、０．０４３５ｇのフェニルメチルスルホン酸クロリドとを具えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記再封入溶液が、５０ｍｌの蒸留水に溶解させた６ｇの塩化ナトリウムを具えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記染料溶液が、ｐＨがほぼ中性で、イオン強度がほぼ等浸透圧で、濃度０．１乃至２ｍＭのマグネシウムイオンとを有するバッファであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
この染料が蛍光性であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
５００ｍｌの蒸留水に溶解させた、４．３８３ｇの塩化ナトリウムと、０．３４５ｇの一ナトリウムリン酸塩と、０．２０３ｇの塩化マグネシウム六水和物と、０．０４３５ｇのフェニルメチルスルホン酸クロリドとを具える溶液中で、このゴーストを保存するステップを更に具えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
請求項７乃至１３のいずれかの方法により調製されるコード化したゴースト細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
マイナーな血液型抗原（例えば、Ｊｋ、Ｒｈ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ及びＤｕｆｆｙ）は、感作宿主に投与された場合、自己抗体及び／又はアロ抗体を誘起し、自己免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、新生児溶血性疾患、及び溶血性輸血反応を引き起こす。感作は過去の輸血又は抗体陽性の胎児の妊娠から生じる。これらのアロ抗体は通常、別々の凝集反応アッセイで経時的に、既知の表現型の赤血球（ＲＢＣ）パネルに対して、レシピエントの血清を検査することによって検出し同定される（例えば、抗Ｊｋａ抗体は、患者の血清がＪｋａ＋ＲＢＣと反応し、Ｊｋａ−ＲＢＣと反応しないかどうかを判定することによって同定されうる）。様々な抗原表現型のＲＢＣの複数の試料を選択することによって、臨床上重要なアロ抗体の存在又は不存在を検出することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
凝集反応アッセイは従来、溶液中、すなわち試験管内で行われている。特に反応が弱い場合、試験管の凝集反応用のデータ解釈は、熟練した、経験のある技術者を必要とする。しかしながら近年、ゲルフォーマットや被膜固相フォーマットのような新しい技法が、開発されてきた。ゲル技法はデキストラン−アクリルアミドゲルを通した赤血球凝集反応が制御されるという原理に基づいている［Ｊｕｄｄ  ＷＪ，Ｓｔｅｉｎｅｒ  ＥＡ，Ｋｎａｆｌ  ＰＣ，Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｃ．Ｔｈｅ  ｇｅｌ  ｔｅｓｔ：ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １９９８；１４：５９−６２］。マイクロチューブは、ゲル、バッファ及び試薬の混合物で充填される。ゲルの頂部で、患者の血清と様々な既知の赤血球との混合物が添加され、制御された条件下でのゲルを通した遠心分離がその後に続く。陰性反応では、細胞はゲルを通過し、マイクロチューブの底部で小球状になる。逆に陽性反応では、最も強い反応（最大の凝集反応塊）が最小ないし観察不能な移動を示し、ほとんどの赤血球が、ゲル微小カラムの頂部で、あるいはその近くで捕捉され、ゲル中の様々な準位で捕捉される。Ｉｍｍｕｃｏｒ社により開発された固相システムは、ヒト赤血球固定化用のマイクロウェルを提供し、対応する赤血球抗原に対するＩｇＧ赤血球抗体の検出用固相アッセイに用いられる［Ｐｌａｐｐ  ＦＶ，Ｓｉｎｏｒ  ＬＴ，Ｒａｃｈｅｌ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ  Ａ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｃｒｅｅｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９８４；８２：１７９］。ウェルは、マイクロウェル表面への、ユーザが選択した赤血球の固定化を可能にする化学カップリング剤で被膜される。被膜したウェルは、抗体抗原反応を促進する条件下で、血清、血漿又はその他の試薬を含む血液製剤と共にインキュベートされる。インキュベーションに続いて、未結合の残留免疫グロブリンが、ウェルと抗ＩｇＧ被膜された、添加した指示赤血球からすすがれる。遠心分離は、指示赤血球を固定化赤血球層に結合した抗体と接触させる。陽性試験の場合、ＩｇＧ−抗ＩｇＧは、指示赤血球と感作される固定化細胞との間の形態を複雑にする。架橋抗体の結果として、指示細胞は、第２の固定化層として固定化細胞と接着する。検出可能な抗体抗原相互作用がない場合（陰性試験）、指示赤血球は固定化細胞へ結合せず、すし詰め状態のボタンのように、ウェルの底で小球状になる。
【０００３】
細胞膜は、真核細胞内部と外部環境との間の界面を形成する。従って、この膜に埋め込まれたタンパク質の機能は多様であり、細胞外信号の細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリクス認識、感知、及び伝達と、細胞内外への溶質及び水分子の輸送とを含んでいる。細胞表面のタンパク質集合の不均一性は、抽出された膜タンパク質又は未精製の細胞可溶化物を用いたインビトロアッセイの開発の困難性につながっている。赤血球膜は、二重膜と、埋め込まれたタンパク質と糖タンパク質とのアレイと、細胞骨格タンパク質ネットワークの複合体層とからなる複雑な構成である［Ｓｔｅｃｋ，Ｔ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．６２（１９７４）１−１９；Ｂｙｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｄ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．８２（１９８５）６１５３−６１５７；Ｓｅｅｍａｎ，Ｐ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｉｌｅｓ，Ｇ．Ｈ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｏｌｅｓ  ｉｎ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｓａｐｏｎｉｎ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．５６（１９７３）５１９−５２７］。
【０００４】
プローブとしてコード化したインタクト細胞を用いることは、細胞表面レセプタに結合するリガンドを選別するための魅力的な代替方法を提供し、高スループット技術を受入可能な小型化され、多重化されたプラットフォームの開発を与える。
【０００５】
赤血球内溶質の封入は、薬剤輸送及びターゲティングの手段として広く研究されてきた［Ｉｈｌｅｒ  Ｇ．Ｍ．，Ｇｌｅｗ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ  Ｓｃｈｎｕｒｅ，Ｆ．Ｗ．Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．７０（１９７３）２６６３−２６６６；ＤｅＬｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ  Ｈｉｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ  ｄｉａｌｙｚｅｒ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔｓ  ａｎｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．１０２（１９８０）２２０−２２７；Ｂａｋｅｒ，Ｒ．Ｆ．Ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．２１５（１９６７）４２４−４２５；Ｍａｒｓｄｅｎ，Ｎ．Ｖ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｏｓｔｌｉｎｇ，Ｓ．Ｇ．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．１８４（１９５９）７２３−７２４］。このアプローチにおいて、軽度の浸透圧溶血が、赤血球の膜有孔性の変化を誘発し、タンパク質及び小さな溶質とほぼ同一サイズのプローブが、赤血球内部に分配することを可能にする。溶血後のイオン強度（等浸透圧条件の復元）を適宜操作することによってこの孔は再封入でき、赤血球に分配された溶質を永久に捕捉する（赤血球ゴーストとしても知られている）。再封入されたゴーストを洗浄することによって、外部媒質から過剰な溶質を除去する。このアプローチを用いて、蛍光性赤血球ゴーストを与えるための蛍光標識されたデキストランを負荷することは、文献に報告されている［Ｄｏｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔｓ  ａｓｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｖｏｌ．２０（１９９５）１４−１８］。
【０００６】
しなしながら、アッセイでの最封入されたゴーストの使用は、細胞表面タンパク質とその配向性が、ゴーストの調製と溶質負荷処理によって影響を及ぼされないことを必要とする。特に低イオン強度バッファの使用、又はバッファ中にマグネシウムイオンがないことは、分子構成の脱凝集反応と、膜のインサイドアウトのフォールディングを導き、本目的のために使用不可能な生成物を与える。
【０００７】
細胞を蛍光コード化する代替的な方法は、膜透過性の脂溶性染料の使用［Ｔａｎａｋａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｓｃｈｒｏｉｔ，Ａ．Ｊ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５８（１９８３）１１３３５−１１３４３；Ｔｏｋｕｍａｓｕ，Ｆ．ａｎｄ  Ｄｖｏｒａｋ，Ｊ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｖｏｌ．２１１（２００３）２５６−２６１］と細胞表面に対する反応性染料の不可逆性共有結合［Ｄｏｎａｌｄ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＲＢＣｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ａｔ  ｔｗｏ  ｂｉｏｔｉｎ  ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ  ｐｅｒｍｉｔ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＲＢＣ  ｖｏｌｕｍｅ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，ｖｏｌ  ４４（２００４）４３１−４３７；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｄａｌｅ，Ｇ．Ｌ．Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ：Ｉｎ−ｖｉｖｏ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．７０（１９８７）７９１−７９５］を含んでいる。あるとしてもわずかなデータしか、リガンド−レセプタ相互作用上の共有結合の効果については存在しない［Ｃｏｗｌｅｙ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，ｖｏｌ．３９（１９９９）１６３−１６８］。更に、いくつかの染料が多数の異なる色を生成するのに用いられる場合にコード化反応が厳密に制御されないのであれば、多数の別個のコードは表面コード化アプローチを用いて構成することには難しく、異なるスペクトルフィンガプリントを有する多数の染料ライブラリが用いられる。従って、反応を精密にモニタリングせずに、数個の染料の色を用いることができるコード化方法が所望されている。
【０００８】
試料中の抗体がゴーストに結合したことを示すべく、コード化したゴースト細胞と第２の抗体を用いた多重アッセイフォーマットにおいて、例えば、フローサイトメトリを用いて、ゴースト細胞アレイの解読がなされる［Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．Ｆ．ａｎｄ  Ｆｌｅｇｅｌ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．２５（１９９８）；Ｒｏｂａｃｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｌｌｙｅｒ，Ｃ．Ｄ．Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｖｏｌ．４３（２００３）９１８；Ｒｏｂａｃｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｌｌｙｅｒ，Ｃ．Ｄ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｖｏｌ．４４（２００４）１８７；Ｓｈａｒｏｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｆｉｂａｃｈ，Ｅ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＢＯ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｖｏｌ．１２（１９９１）５４５−５４９；Ａｒｎｄｔ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｇａｒｒａｔｔｙ，Ｇ．Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．３１（２００４）］。高スループットに付随する利点を用いてインサイツでの解読を可能にする、その他の解読方法が所望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＢＣアロ抗体の検出及び評価方法が開示され、既知の抗原が存在すれば、蛍光コード化した赤血球又は赤血球ゴーストを生成し、血液／血清／血漿試料中の抗体の存在を検出するためにそれらの赤血球又は赤血球ゴーストを用い、好ましくは蛍光サンドイッチ型のイムノアッセイを用いることに基づいている。蛍光ＲＢＣ又はＲＢＣゴーストの多重集合がまず生成され、特定の表現型を表わす各々の集合が、蛍光サイン又はコードとユニークに連結する。陽性反応の場合においては、試料中のアロ抗体が、抗原−抗体複合体を形成するコード化細胞上の同族の抗原に結合する。未結合の免疫グロブリンを除去するための洗浄後に、（コード化染料より、異なるスベクトルサインを有する）蛍光第２試薬が導入され、細胞上に捕捉されたアロ抗体に結合する。蛍光第２試薬によって生成されたこのアッセイ信号は、コード化蛍光を有する結合と相関することによって、特定の細胞／ゴーストと相関し、従って、細胞及び同族のアロ抗体上に存在する抗原を同定することができる。コード化した細胞の解読は、蛍光顕微鏡検査法及び２次元画像分析法を用いてインサイツで為すことができ、解読画像がアッセイ画像と比較され相関される（特許された米国特許出願第０９／４４８，２４０号参照）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下の例は、コード化したゴースト細胞を用いてアッセイを行うと同時に、コード化したゴースト細胞の調製処理を概説している。この処理は、反応の厳密なモニタリングを要求することなく、数個の染料を用いたコード化を可能にし、結果として生ずるゴーストは、蛍光型イムノアッセイで用いられる場合、試料中の抗体を検出するために正確な配向性で抗原を示す。アッセイ結果のインサイツ解読例も含まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
コード化したゴースト細胞を調整する際に、好ましいバッファ条件（ｐＨがほぼ中性、の濃度０．１乃至２ｍＭのバッファと、イオン強度がほぼ等浸透圧のマグネシウムイオン）は、細胞表面タンパク質の反応性と元の配向性を保護するのを手助けし、それらのタンパク質が接近できないように転化されることを防いでいる。例示的な方法は、以下の例１で示されている。
【実施例】
【００１２】
例１：赤血球の分離と標識されたゴーストの調製
赤血球洗浄保管バッファ：
５００ｍｌの蒸留水に溶解された
塩化ナトリウム                  ＝４．３８３ｇ
一ナトリウムリン酸塩            ＝０．３４５ｇ
塩化マグネシウム六水和物        ＝０．２０３ｇ
フェニルメチルスルホン酸クロリド＝０．０４３５ｇ
赤血球溶血バッファ：
５００ｍｌの蒸留水に溶解された
一ナトリウムリン酸塩            ＝０．６９ｇ
塩化マグネシウム六水和物        ＝０．２０３ｇ
フェニルメチルスルホン酸クロリド＝０．０４３５ｇ
赤血球封入溶液：
５０ｍｌの蒸留水に溶解された
塩化ナトリウム＝６ｇ
手順：
ｉ）      １ｍｌの保管バッファを、２ｍｌの遠心管に入れる
ｉｉ）    刺した指の鮮血を１滴加え（〜２５ｕＬ）、緩やかに逆位にして混ぜ合わせる
ｉｉｉ）  〜６００乃至１０００ｇで２分間遠心分離し、上澄みを除去する。１．５ｍｌの保管バッファを加え、緩やかにＲＢＣペレットを再懸濁し、遠心分離を繰り返す。上澄みを捨て、２回繰り返す。
ｉｖ）    保管バッファ中の蛍光溶質（又は溶質混合物）を所望の濃度に調整し、２００ｍｌの溶液を赤血球ペレットに加える。ＲＴで５分間インキュベートする。
ｖ）      １．５ｍｌのＲＢＣ溶血バッファを（ｉｖ）中の溶液に加え、逆位によって素早く混合し、ＲＴで３０秒間インキュベートする
ｖｉ）    ２５０ｕｌのＲＢＣ封入溶液を（ｖ）に加え、逆位で混合する
ｖｉｉ）  〜１６，０００乃至２０，０００ｇで３分間遠心分離し、上澄みを捨てる。１．５ｍｌの保管バッファ中でゴーストペレットを再懸濁し、遠心分離−再分散サイクルを３回繰り返す。
ｖｉｉｉ）０．１３ｇ／Ｌのアジ化ナトリウムを伴う１ｍｌの最終保管バッファ中でペレットを再懸濁し、使用するまで２乃至４℃で保管する。１月以上の間保管すると、ゴーストは安定する。
図１（ａ）は処理のフローチャートを示す。図１（ｂ）はサイズ分布を示し、図１（ｃ）は上述の処理を用いてコード化したゴースト細胞の蛍光画像を示す。
【００１３】
例２：コード化したゴースト細胞のライブラリの生成
分子量３０００（標識密度１ｍｏｌ／ｍｏｌ）のＴＡＭＲＡ標識デキストランは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社から取得し、分子量４０００（標識密度０．０５ｍｏｌ／ｍｏｌ−０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ）のＦＩＴＣ標識デキストランは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から取得した。５つの濃度の異なる保存液１０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ及び０．０１６ｍｇ／ｍｌが、それぞれ保管バッファを用いて調製された。コード化したゴーストの１０個の異なる集合は、例１に述べた処方箋を用いて調製した。ゴーストは、その蛍光性についてフローサイトメトリを用いて評価された。ＴＡＭＲＡ及びＦＩＴＣデキストランの別個の１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて、２つのコード化した染料を所有するコード化したゴーストを生成した。
【００１４】
例３：磁気反応性のコード化されたゴースト細胞のライブラリ生成
コード化したゴースト細胞は、当該技術分野で既知の磁気細胞表面標識法によって与えられうる。いくつかの会社が対象の細胞を磁気標識して分離するキットを販売している（ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ、ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ．ｃｏｍ、ｗｗｗ．ｄｖｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。磁力標識された全血液細胞は、商業上の製品（ｗｗｗ．ｄｉａｇａｓｔ．ｃｏｍ）としても利用可能である。図２に概説したように、特定の所望のアプローチは、試料からの抗体の結合の後に続いて加えられる、抗ヒトＩｇＧで被膜された磁性ナノビーズを用いた標識を利用している。
【００１５】
例４：コード化されたゴーストを解読する方法
上に概説した方法は、明るい、光安定性の、容易に多重化される、蛍光コード化したゴーストを生成している。従って、好結果の解読ストラテジは、フローサイトメトリのような従来の連続照合技術を含め、赤血球を評価するのに従来使用されてきた混合したものの内部から単一の細胞集合の識別を果たすことができるいずれのプラットフォームも含んでいる。代替的に、２次元画像分析法と連結した蛍光顕微鏡検査法［名称ＲＥＡＤＴＭ 、米国特許第６，７９７，５２４号参照；“Ａｒｒａｙ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”米国特許第６，３８７，７０７号参照、双方が引用として取り込まれる］は、解読に用いることができる。機能化した基質上に配置すること［Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｏｔｏ−ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｒｒａｙｓ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ｖｏｌ．５（２００５）１１１−１１８；Ｓｏｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｒａｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１（２００３）４２９−４３８；Ｋａｔｏ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ａｎ  ｏｌｅｙｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｅｔｈｅｒ−ｍｏｄｉｆｙｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｖｏｌ．３５（２００３）１０１４−１０２１］、及び画像ファイバ上への捕捉［Ｂｉｒａｎ，Ｉ．  Ａｎｄ  Ｗａｌｔ，Ｄ．Ｒ．Ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ａｒｒａｙｓ：Ａ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．７４（２００２）３０４６−３０５４］のような事前形成を可能にする方法を含む、細胞の２次元アレイについての多様な方法が報告されている。更に、磁気細胞の選択［Ｔｉｂｂｅ，Ａ．Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｉｓｋ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｖｏｌ．４３（２００１）３１−３７］、マイクロ流体チャネル［Ｓｈｅｌｂｙ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ．１００（２００３）１４６１８−１４６２２］、交流電気泳動［米国特許第６，３８７，７０７号；Ｍｉｎｅｒｉｃｋ，Ａ．Ｒ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅ��ｎａｔｉｎｇ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｖｏｌ．２４（２００３）３７０３−３７１７］のような、動的又はリアルタイムアレイ組立法がある。
【００１６】
例５：全赤血球を用いたイムノアッセイ
図３は、全血液又はＲＢＣゴーストを用いてイムノアッセイを行うための処理フローを示している。この例において、洗浄した全ＲＢＣ（表現型Ｆｙ（ａ＋，ｂ−），（Ｋ−，ｋ＋））は、モノクローナルマウス抗Ｆｙとモノクローナルマウス抗Ｋ（双方がニューヨーク血液センタのＭａｒｉｏｎ  Ｒｅｅｄ博士からの研究室から贈り物である）と別個に反応させた。双方の場合において、Ｃｙ５標識ヤギ抗マウスポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）は、第２の蛍光検出抗体として用いられた。予想通り、特異的な信号は抗Ｆｙａの場合に見られ、抗Ｋ抗体の場合には見られなかった（結果は示さず）。
【００１７】
例６：コード化したゴーストを用いたイムノアッセイ
イムノアッセイは例５に概説したように、洗浄された全ＲＢＣ（表現型（Ｍ＋，Ｎ−））と、モノクローナルラット抗Ｍ及び抗Ｎ抗体（米国Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、マサチューセッツ州スワンプスコット）とから調製されるゴースト細胞を用いて行われた。抗Ｍを伴う反応は、予期される蛍光信号を生成したが、予想通り、抗Ｎはバックグラウンドにわたり、どんな検出可能な信号も生成しなかった。図７は抗Ｍ抗体を用いたイムノアッセイ完成後のＲＢＣゴーストの画像を示す。
【００１８】
例７：全赤血球とアロ血清を用いたイムノアッセイ
一連のイムノアッセイは、表現型試薬ＲＢＣ（０．８％サージスクリーン、Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ニュージャージー州）及び試薬血清（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ニュージャージー州）を用いて実行された。全ケースで、ＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）（１：１００希釈）が、第２の検出抗体として用いられた。抗体陰性ＡＢ血液型血清は、負のコントロールとして用いられた。結果は以下の表１に示した。蛍光イムノアッセイと報告された表現型（抗グラム）との結果は一致している。
【表１】
2009529655.tif 000003
【００１９】
用語、表現及び例示はここでは具体例であり制限はされないこと、及び本発明の範囲は請求項によってのみ制限され、請求される主題の総ての等価物を含んでいることは、理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、赤血球分離及びゴースト細胞調製用のフローチャートである。
【図２】図２は、結合後に続く例示的な手順用のフローチャートであり、第２の抗体を展示する磁性ビーズを用いて解読用アレイ内の反応性ゴーストを捕捉している。
【図３】図３は、ゴーストを用いた血清中で反応性抗体を、かつ、サンドウィッチアッセイフォーマット中で第２の検出抗体を検出する手順のフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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