(57)【要約】  核酸の検出に有用な微小流体デバイスならびに微小流体デバイスを使用する方法を含む、多孔質ポリマ電極アセンブリを組み込む微小流体デバイス。
2009516173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流体デバイスであって、
多孔質モノリス、
材料表面が多孔質トポグラフィを画定するように、前記多孔質モノリスの少なくとも一部分に塗布される導電性ポリマ、および
前記導電性ポリマと電位源との間の電気接続部
を含む、多孔質電極アセンブリと、
前記導電性ポリマに印加される電位を制御するように構成されたコントローラとを備える微小流体デバイス。
【請求項２】
前記多孔質モノリスは導電性材料を含み、前記導電性ポリマと電位源との間の前記電気接続部は前記多孔質モノリスを含む請求項１に記載の微小流体デバイス。
【請求項３】
対象サンプルを前記多孔質ポリマ電極に／から搬送するように構成された流体システムをさらに備える請求項１に記載の微小流体デバイス。
【請求項４】
前記流体システムは、前記対象サンプルをフィルタリングするように構成された１つまたは複数のフィルタをさらに備える請求項３に記載の微小流体デバイス。
【請求項５】
前記多孔質ポリマ電極による分析のためのサンプル溶液を調製するのに適した１つまたは複数の構成品をさらに備える請求項３に記載の微小流体デバイス。
【請求項６】
対象サンプル溶液を調製するのに適した前記１つまたは複数の構成品は、１つまたは複数の試薬リザーバを含む請求項５に記載の微小流体デバイス。
【請求項７】
対象サンプル溶液を調製するのに適した前記１つまたは複数の構成品は、溶解反応用に構成されたチャンバを含む請求項５に記載の微小流体デバイス。
【請求項８】
対象サンプル溶液を調製するのに適した前記１つまたは複数の構成品は、変性反応用に構成されたチャンバを含む請求項５に記載の微小流体デバイス。
【請求項９】
対象サンプル溶液を調製するのに適した前記１つまたは複数の構成品は、ポリメラーゼチェイン反応用に構成されたチャンバを含む請求項５に記載の微小流体デバイス。
【請求項１０】
前記多孔質モノリスは、直径が約２μｍ〜約１００μｍである孔を含む請求項１に記載の微小流体デバイス。
【請求項１１】
前記多孔質ポリマ電極アセンブリは、
基材と、
前記基材上に配設された導電性層と、
前記導電性層上に配設された多孔質モノリスと、
導電性ポリマとを備え、前記導電性ポリマは、前記多孔質モノリスに塗布され、それにより、前記導電性ポリマが、前記多孔質モノリス内に存在する孔を少なくとも部分的に画定し、また、前記導電性層と前記導電性ポリマとの間に、電気接続部が形成される請求項１に記載の微小流体デバイス。
【請求項１２】
前記多孔質ポリマ電極アセンブリは、
多孔質非伝導性モノリスと、
前記多孔質モノリスの孔内の非多孔質でかつ非伝導性の充填材と、
前記モノリスの孔内に配設され、前記モノリスと前記充填材との間に介在する導電性ポリマとを備える請求項１に記載の微小流体デバイス。
【請求項１３】
前記多孔質電極アセンブリの表面は、非導電性充填材および非導電性モノリスによって少なくとも部分的に分離された複数の導電性ドメインを露出させる請求項１２に記載の微小流体デバイス。
【請求項１４】
前記導電性ドメインは、前記多孔質電極アセンブリの外部表面上に露出される請求項１３に記載の微小流体デバイス。
【請求項１５】
前記導電性ドメインは、前記多孔質電極アセンブリ内の流路の内部表面上に露出される請求項１３に記載の微小流体デバイス。
【請求項１６】
核酸を分析する微小流体デバイスであって、
複数の微小流体チャンバおよび流路が内部に作製されている基材と、
前記基材表面に固着されたカバーと、
生物学的サンプルを受け取るように構成された入口と、
前記生物学的サンプルを前処理するように構成された１つまたは複数のチャンバと、
前記生物学的サンプルをポリメラーゼチェイン反応にさらすように構成された１つまたは複数のチャンバと、
前記ポリメラーゼチェイン反応によって増幅された核酸ポリマを分離するように構成された１つまたは複数のチャンバと、
前記増幅された核酸ポリマを検出するように構成された多孔質ポリマ電極とを備える微小流体デバイス。
【請求項１７】
前記増幅された核酸ポリマを電気化学的に検出可能な標識に会合するように構成されたチャンバをさらに備える請求項１６に記載の微小流体デバイス。
【請求項１８】
前記増幅された核酸ポリマを分離するように構成された前記チャンバは、前記増幅された核酸ポリマを電気泳動的に分離するように構成される請求項１６に記載の微小流体デバイス。
【請求項１９】
サンプルを分析する方法であって、
請求項１から１８のいずれか一項に記載の微小流体デバイス内にサンプルを導入するステップと、
前記多孔質ポリマ電極による分析のために、前記サンプルを調製するステップと、
前記サンプルを前記多孔質ポリマ電極に搬送するステップと、
前記多孔質ポリマ電極に、電位を印加するステップとを含む方法。
【請求項２０】
前記サンプル内の対象分析物を検出するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象分析物を検出するステップは、帯電した生物分子を検出することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象分析物を検出するステップは、前記対象分析物に会合した電気化学的に活性なタグを検出することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象分析物を検出するステップは、負に帯電した生物分子を検出することを含み、電位を印加するステップは、前記多孔質ポリマ電極に正電位を印加することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記印加された電位によって、前記多孔質ポリマ電極内に前記対象分析物を保持するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記多孔質ポリマ電極に第２の電位を印加するステップをさらに含み、前記第２の印加電位は、前記対象分析物を前記多孔質ポリマ電極から放出する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸を検出する方法であって、
請求項１６から１８のいずれか一項に記載の微小流体デバイス内に、標的核酸を含むと考えられるサンプルを導入するステップと、
前記サンプルを前処理するステップと、
前記前処理されたサンプルを前記ポリメラーゼチェイン反応にさらすステップと、
前記ポリメラーゼチェイン反応混合物から増幅された核酸ポリマを分離するステップと、
前記多孔質ポリマ電極を使用して、前記増幅された核酸ポリマを検出するステップとを含む方法。
【請求項２７】
前記サンプルを前処理することは、前記サンプルを、蒸解すること、液化すること、希釈すること、溶解すること、および変性させることのうちの１つまたは複数を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅された核酸ポリマに電気化学的に活性な標識を付けるステップをさらに含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅された核酸ポリマに特異的な錯化たんぱく質を付けるステップをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅された核酸ポリマを分離することは、前記ポリメラーゼチェイン反応混合物から前記増幅された核酸ポリマを電気泳動的に分離することを含む請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
種々のアッセイが、微小流体システムなどの小規模分析システムを使用して実施されうる。
【背景技術】
【０００２】
こうしたシステムの感度、携帯性、耐久性は、システム構成品として多孔質ポリマ電極を組み込むことによって高められることができる。
【特許文献１】米国特許出願第１１／４７９，１７５号
【特許文献２】米国特許出願第１１／４４８，４３９号
【特許文献３】米国特許第５，２９６，３７５号
【特許文献４】米国特許第５，４９８，３９２号
【特許文献５】国際公開公報第ＷＯ９３／２２０５３号
【特許文献６】米国特許第５，３０４，４８７号
【特許文献７】米国特許第５，４５５，１７５号
【非特許文献１】「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ」  ９２，  １２１−１２６（１９９８）
【非特許文献２】「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ」  １３，  １９３−２０５（１９８６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
多孔質ポリマ電極は、導電性材料の好ましい導電特性を多孔質構造と組み合わせる。得られる多孔質電極は、定性分析または定量分析のために、また、核酸などの帯電した材料を捕獲する、かつ／または、放出するために使用されうる。電極マトリクスの孔は、非導電性材料で充填されてもよく、複数の離散的な導電性表面を有する電極が得られる。微小流体システム内でのこうした多孔質電極の使用は、得られるデバイス上で電極の有利な特性を与えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
Ｉ．  多孔質ポリマ電極
図１は、断面で見られる、例示的な多孔質導電性ポリマ電極アセンブリ１０を示す。図１の特定の電極アセンブリは、円柱であるが、種々の幾何形状が、開示される電極アセンブリに適している。電極アセンブリは、得られる電極にマトリクスを提供する多孔質モノリス１２を含む。多孔質モノリスの表面には、導電性ポリマ１４が塗布されている。選択された多孔質ポリマ電極は、参照により組み込まれる、２００６年６月３０日に出願された「ＰＯＲＯＵＳ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ」についてのＬａｕ他の米国特許出願第１１／４７９，１７５号に記載された。
【０００５】
導電性ポリマ１４は、通常、電位源に電気接触している。１つの態様では、導電性ポリマ１４に接触する導電性層１６は、電気接触を提供する。電極アセンブリ１０の導電性層１６は、円柱電極アセンブリ自体を取り巻く。電気接触は、導電性層１６が、導電性ポリマ１４の少なくとも一部分に物理的に接触する場合、直接的であり、多孔質モノリス１２が、それ自体、適切に導電性があるなどの場合、間接的である。適切に頑強でかつ導電性がある任意の材料を使用して、導電性ポリマ１４と電位源との間の電気接続が提供されうる。導電性層１６は、通常、たとえば、金、プラチナ、アルミニウム、ニッケル、またはクロムなどの導電性金属である。電極アセンブリの特定の態様では、導電性層は、金を含む。電極アセンブリの代替の態様では、導電性層は、プラチナを含む。
【０００６】
電極アセンブリは、種々の幾何形状のうちの任意の幾何形状で作製されてもよい。通常、電極アセンブリは、極めて微細な多孔質である。すなわち、アセンブリは、孔、空洞、または流路１７を有するマトリクスを組み込む。通常、孔または流路のサイズは、約２μｍ〜約１００μｍの範囲であり、マトリクス表面の少なくとも一部分は、導電性である、かつ／または、帯電することが可能である。多孔質マトリクス内に存在する孔、空洞、または流路は、手作業で形成されてもよく、または、多孔質モノリス１２の形成の副産物として存在してもよい。これらの孔１７は、規則正しいまたは不規則な形状を有してもよく、また、アレイなどのように規則的に、あるいは、特定の短範囲規則度または長範囲規則度でない状態で配列されてもよい。通常、電極アセンブリが多孔質である場合、曲がりくねった経路をたどる場合がある微小流路１７は、マトリクスを通って流体が流れるのを可能にし、それにより、流体は、導電性ポリマのエリアに少なくとも断続的に接触した状態になる。電極アセンブリの特定の多孔度は、使用される調製方法に依存しており、また、使用される調製方法によって調節されてもよい。１つの態様では、電極アセンブリの多孔質の性質は、導電性ポリマが所望の多孔度を有する多孔質モノリス１２に塗布されることによって生じる。
【０００７】
電極アセンブリの構成品は、実際の使用のために十分な強度と完全性を持つように選択され、作製されてもよいが、得られる電極の耐久性は、図２のプレーナ電極アセンブリについて示すように、基材層１８の存在によって改善されてもよい。基材は、ポリマ１２に電位を伝導するのに関与する場合があるが、通常、基材は、電極アセンブリに機械的完全性を提供し、任意選択で、電極アセンブリの作製のためのベースまたは土台を提供する。
【０００８】
基材１８は、種々の材料から形成されうる。通常、基材は、実質的に化学的に不活性であり、また、容易に成形され、かつ／または、機械加工されてもよい材料から製造される。基材は、たとえば、金属、ガラス、ケイ素、あるいは他の天然または合成ポリマを含むことができる。基材は、種々の構成のうちの任意の構成に形成されうる。より詳細には、基材は、得られる電極アセンブリが、種々のタイプの分析システムと共に使用されるように、適切に成形され、大きさを決められうる。たとえば、電極アセンブリは、アーキテクチャの中でもとりわけ、毛管路、マイクロウェル、フローセル、または微小流路を使用する分析システムと共に使用されてもよい。
【０００９】
基材が存在する場合、導電性層１６は、通常、基材の表面上に堆積されて、電位源に対する１つまたは複数の電気接続部を含む、電極を動作させるのに必要な任意の電気回路が形成される。導電性層１６の塗布は、たとえば、無電解めっき、電解めっき、気相堆積、スパッタリング、または導電性材料を塗布する任意の他の適した方法によることができる。
【００１０】
導電性層１６と多孔質モノリス１２または導電性ポリマ１４との間の強い相互作用を容易にするために、導電性層１６は、ポリマとの相互作用を高めるために、物理的にまたは化学的に修飾されてもよい。たとえば、導電性層１６が金属層である場合、金属表面は、たとえば、化学的に活性化されるか、物理的に粗化されるか、または、その両方が行われうる。特に、導電性層１６が、金の金属層である場合、チオール化合物による金表面の化学的活性化は、後続のポリマ層を付着するのに有利でありうる。１つの態様では、金表面は、α−メルカプト−ＰＥＧ−ω−アルデヒドで修飾され、その後、３−アミノプロピルメタクリレートで処理され、ポリマ多孔質モノリス１２の塗布中に共重合を受けることができる活性表面部分をもたらす。金の導電性表面を修飾するために、種々の硫黄含有化合物およびその誘導体（たとえば、チオールまたは二硫化物）が使用されうる。
【００１１】
電極アセンブリ１０は、基礎にある多孔質モノリス１２に塗布された導電性表面ポリマ１４を含みうる。電極アセンブリ１０は、塗布される多孔質モノリスが、所望のトポグラフィ、すなわち、所望のサイズ、形状、多孔度、および配置構成を有する、空洞、孔、および／または凹凸を組み込むように、導電性層１６上で多孔質モノリスを調製することによって調製されうる。多孔質モノリスは、その後、所望の導電性ポリマ１４の塗布によって、その多孔質構造を通して修飾されうる。多孔質モノリスは、導電性材料または非導電性材料から調製されてもよい。ただし、導電性ポリマ１４と導電性層１６との間に電気接続部が設けられる場合に限る。多孔質モノリス１２が、実質的に非導電性である場合、多孔質モノリスは、導電性層１６の複数の部分が露出し、したがって、たとえば図１および２の２０で示すように、導電性ポリマ１４に電気的につながった状態で設置されるように、塗布されうる。
【００１２】
一部の実施形態では、多孔質モノリスは、導電性材料、たとえば、網状ガラス質炭素（すなわち、多孔質ガラス炭素）であることができる。多孔質モノリス１２が、それ自身で導電性である場合、多孔質モノリスは、導電性ポリマ１４と導電性層１６との間の、それにより、印加電位源に対する直接的な電気接続部として役立つことができる。
【００１３】
選択される多孔質モノリスは、現場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）重合され、導電性層１６の表面に共有結合することができる、ポリ（アクリル酸）またはポリ（アクリル酸）の共重合体の３次元的な多孔質膜から調製されうる。
【００１４】
例示的な多孔質ポリマモノリス膜は、選択されたモノマサブユニットのフリーラジカル重合によって調製されうる。単分子光開始剤および２分子光開始剤を使用して、重合反応が始動されうる。単分子重合開始剤と２分子重合開始剤の組合せを利用することが望ましい可能性がある。それは、こうした系が、酸素の存在下でも、ビニルモノマおよびエチニルモノマのフリーラジカル重合を可能にすることができるからである。
【００１５】
たとえば、適した多孔質ポリマモノリスは、単分子開始剤と２分子開始剤の組合せを使用して実施されうる、アクリル酸とメチレンビスアクリルアミドの混合物の重合によって調製されうる。適した単分子開始剤は、ベンゾインエステル、ベンジルケタール、アルファ−ジアルコキシアセトフェノン、アルファ−ヒドロキシアルキルフェノン、アルファ−アミノアルキル−ホスフィン、およびアシルホスフィン酸化物を含むが、それに限定されない。適した２分子開始剤は、通常、フリーラジカルを生成するために、アミンなどの共開始剤を必要とする。２分子開始剤は、ベンゾフェノン、チオキサントン、およびチタノセンを含むが、それに限定されない。
【００１６】
電極アセンブリの１つの態様では、多孔質ポリマモノリスは、相分離／沈降技法を使用して調製されて、所望のモノリス多孔度、したがって、得られる電極表面の多孔度および／またはトポグラフィが生成される。多孔質のポリ（アクリル酸）モノリスは、ポロゲン（有機溶媒）、たとえば、ジオキサン、ヘプタン、エチルエーテル、およびメチルエチルケトンの存在下でフリーラジカル重合によって沈降されうる。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）内にアクリル酸、メチレンビスアクリルアミド、および単分子／２分子光開始剤を含む溶液の薄膜は、ＵＶ光源を使用して光重合化されうる。重合が進むにつれて、ＭＥＫ内に溶解できない架橋ポリマが沈降し、（相分離をもたらす）多孔質膜を形成する。重合およびその後の相分離を使用して、多孔度の所望の程度を有するポリマモノリスが形成されうる。得られるポリマモノリスの多孔度および孔サイズは、ポロゲン（溶媒）、反応に使用される特定のモノマ（複数可）、および利用される重合パラメータの選択によって調節されうる。多孔質ポリマモノリスの機械的特性はまた、適切な架橋剤の添加および／または所望のコモノマの選択によって調節されうる。
【００１７】
通常、多孔質モノリスの機械的完全性は、多孔質ポリマ膜が基材に共有結合するときに高められる。たとえば、基材がガラスである場合、ガラス表面は、反応性シラン試薬を使用して修飾されうる。ガラス表面、たとえば、重合可能表面上のシラノール基を（３−メタクリルオキシプロピル）メチルジメトキシシランと反応させることによって、アクリル酸などのビニルモノマとの共重合にさらされうるメタクリルオキシ基が形成され、多孔質ポリマモノリスをガラス基材に共有結合させる。
【００１８】
別の態様では、適した多孔質ポリマモノリスは、ポリマ微小粒子を焼結することによって調製されうる。適した微小粒子は、市販されていてもよく、または、前もって調製される可能性がある。たとえば、微小粒子が架橋ポリ（アクリル酸）を含む場合、適した微小粒子は、アクリル酸の逆エマルジョン重合によって合成されうる。重合プロセスは、熱開始剤、たとえば、過硫酸カリウムによって始動されうる。重合は、さらに、適した重合触媒、たとえば、とりわけ、テトラメチルエチレンジアミンの存在下で起こりうる。重合はまた、所望の架橋剤、たとえば、とりわけ、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドの存在下で実施されてもよい。架橋ポリ（アクリル酸）微小粒子は、たとえば、透析によって清浄され、簡単なろ過によって収集されうる。
【００１９】
所望の多孔質モノリスを調製するために、ポリマ微小粒子を含む組成物が、所望の基材の表面上にコーティングされうる。通常、ポリマ微小粒子は、十分な程度の架橋によって調製され、微小粒子は、高温で、焼結するか、または、コヒーレントな固体になって、所望の多孔度を有する多孔質モノリスをもたらす。所望のモノリスの性質を得るために、微小粒子調合剤は、モノリス厚を制御するための増粘剤を含みうる。増粘剤は、たとえば、シリカチキソトロープ剤、あるいは、非架橋ポリ（ビニルアルコール）または非架橋ポリ（アクリル酸）などの水溶性ポリマでありうる。
【００２０】
微小粒子組成物を塗布し、微小粒子を焼結させる任意の適したプロセスが使用されうる。たとえば、微小粒子組成物は、スピンキャスティング、ディップコーティング、スプレーコーティング、ローラコーティング、または他の塗布方法によって塗布されうる。得られる皮膜は、通常、高温で外部圧を加えることによって乾燥される。たとえば、油圧ホットプレスを使用して、微小粒子を焼結し、それにより、多孔質モノリスが形成されうる。焼結プロセス後、存在する水溶性増粘剤は、通常、多孔質モノリスを水ですすぐことによって除去されうる。
【００２１】
プライマを使用して、所望の基材上の、焼結したモノリスの付着力（ａｄｈｅｓｉｏｎ）が改善されうる。たとえば、基材がガラスである場合、プライマは、シラン誘導体化表面剤でありうる。プライマはまた、上述したように、重合され、基材表面に化学結合される、架橋または非架橋ポリ（アクリル酸）の層でありうる。
【００２２】
通常、たとえば、サンプル溶液が電極アセンブリを通して流れる用途において、多孔質ポリマ電極が、開口の広い孔構造を示すことが有利である場合、相分離／沈降法によって得られる開口の広い孔構造が好ましい可能性がある。
【００２３】
上述したポリマ多孔質モノリス処方は、加水分解安定性、多孔質モノリスの表面特性にわたる程度の高い制御、および対費用効果を提供する可能性がある。しかし、種々の他の多孔質モノリス組成物を使用して、所望の程度の多孔度を有するモノリスが調製されてもよく、それは、適切に多孔性のある電極アセンブリの用途に適する。
【００２４】
たとえば、多孔質モノリスは、炭素から形成されてもよい。特に、多孔質モノリスは、炭素布、炭素マット、網状ガラス質炭素、炭素フェルト、または他の炭素材料から形成されてもよい。導電性接着剤（ａｄｈｅｓｉｖｅ）を使用して、炭素多孔質モノリスを導電性層に接合しうる。たとえば、Ｎ−メチルピロリジノン内のフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）の濃厚溶液内で分散したカーボンブラック粉末を含むペーストを含む任意の適切な導電性接着剤が使用されうる。導電性層は、たとえば、金属性ステンレス鋼または金を含みうる。導電性表面ポリマは、その後、多孔質モノリスに塗布されて、所望の電極アセンブリを形成しうる。
【００２５】
導電性ポリマ１４の塗布は、塗布される皮膜と相互作用することになる表面を有する多孔質モノリス組成物を選択することによって容易にされうる。たとえば、多孔質モノリスは、とりわけ、カルボン酸基などの適切な官能基を含むことができ、それにより、塗布された導電性ポリマは、多孔質モノリスと、イオン的に、かつ／または、共有結合的に相互作用して、結合が高められうる。
【００２６】
導電性ポリマは、化学酸化を利用して多孔質モノリスに塗布されうる。たとえば、塩化鉄は、前駆体ピロールおよびビチオフェン用の酸化体として使用されることができ、多孔質ポリマモノリスが、表面カルボン酸基を示す場合、塩化鉄による多孔質モノリスの処理は、通常、カルボキシラート基とＦｅ（ＩＩＩ）イオンの会合をもたらす。結果得られる、鉄を添加した多孔質ポリマモノリスが、ピロールまたはビチオフェンなどの適切なモノマ溶液にさらされると、酸化され、かつ、導電性のあるポリマが、多孔質モノリス表面に堆積されうる。種々の類似の化学酸化体の任意の酸化体が、こうして使用されてもよいことが理解されるべきである。たとえば、多孔質モノリス表面が、アンモニウム部分によって官能基化される場合、過硫酸ナトリウムは、アンモニム基を介して表面に結合し、その後、塗布されるポリマ前駆体を酸化するのに使用されうる。
【００２７】
あるいは、導電性ポリマ層は、化学酸化体が存在しない状態か、存在する状態のいずれかで、電気化学的に調製されうる。特に、多孔質ポリマモノリス内に存在する孔が、基礎になる導電性層を暴露する場合、導電性ポリマは、導電性層自体の表面から成長することができ、導電性層１６と導電性ポリマ１４との間に有利な電気接続部を生成する。種々の対アニオン（ドーパント）が、この手法で使用される可能性があり、Ｌｉ他によって述べられた「ドーピング−デドーピング−リドーピング（ｄｏｐｉｎｇ−ｄｅｄｏｐｉｎｇ−ｒｅｄｏｐｉｎｇ）」技法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ，  ９２，  １２１−１２６（１９９８））を使用して、得られる導電性ポリマの導電率が改善されうる。多孔質モノリスが、それ自体導電性がある場合、導電性ポリマは、電気化学的に酸化され、多孔質モノリス自体の表面上に堆積されうる。
【００２８】
導電性ポリマ層は、任意の適切なモノマまたはその組合せについての、化学的酸化および／または電気化学的酸化によって調製されうる。本明細書で使用されるように、適切なモノマは、酸化によって、電極表面層として有用であるために十分な導電率を示すポリマを生成するモノマである。通常、得られるポリマは、制御可能でかつ可逆的な方法で酸化／還元され、ポリマが示す表面電荷の制御を可能にする。適切なモノマは、アセチレン、アニリン、カルバゾル、フェロセニレン、ビニレン、インドール、イソチアナフテン、フェニレン、フェニレンビニレン、硫化フェニレン、フタロシアニン、ピロール、キノキサリン、セレノフェン、窒化硫黄、チアゾール、チオナフテン、チオフェン、およびビニルカルバゾル、ならびにそれらの誘導体、それらの組合せおよび下位組合せを含むが、それに限定されない。
【００２９】
特定の例では、非伝導性ポリアニリンは、ＣｈｉａｎｇおよびＭａｃＤｉａｒｍｉｄによって報告されたプロトコル（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ，  １３，  １９３−２０５（１９８６））に従って合成される。Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）に溶解可能な非導電性ポリアニリンは、多孔質モノリスに塗布されうる。コーティングされたポリアニリンは、その後、電気化学的かまたは化学的に酸化されて、導電性ポリマ層が生成されうる。導電性ポリアニリンと負に帯電した多孔質ポリマモノリスとの間のイオン相互作用ならびに物理的インターロッキングは、導電性ポリマを多孔質モノリス表面に固定する。多孔質モノリスが、カルボン酸基によって官能基化される場合、カルボン酸基は、導電性ポリマの対アニオンとして役立ちうる。導電性ポリマ表面の外部表面上の正電荷は、その後、負に帯電した分析物を引き付ける、かつ／または、不動態化するのに使用され、その後、捕獲した分析物を放出するように、電気化学的に中和されうる。
【００３０】
本明細書で述べる多孔質ポリマ電極は、通常、大きな電極表面積を提供する。この増大した表面積は、以下で説明されるように、選択される用途において利点を提供する可能性がある。しかし、表面積はまた、電極が、有意のバックグラウンド二重層静電容量を示すようにさせる可能性がある。このバックグラウンド信号が望ましくない場合、電極が、複数の離散的な導電性ドメインを含み、ドメインが、非導電性マトリクスによって、部分的にまたは完全に分離されうるように、多孔質電極の表面を修飾することによって、バックグラウンド信号は減衰されうる。こうした構成は、導電性ドメインを分離することができ、それにより、それぞれの導電性ドメインの拡散ゾーンの重なりを依然として可能にしながら、電極の幾何学的面積を減少させる。これは、溶液相分析物（複数可）の最大サンプリングを依然として可能にしながら、充電電流を低減しうる。得られる電極は、捕獲および誘導信号のために効果的に大きな表面積を提供するが、静電容量が低減され、したがって、バックグラウンド信号が減少する。たとえば、一部の態様では、バックグラウンド信号は、３桁程度低減されうるであろう。
【００３１】
一部の実施形態では、複数の離散的な導電性ドメインを有する電極は、上述したように、最初に多孔質ポリマを調製し、その後、多孔質電極アセンブリ内の孔を非多孔質でかつ非導電性材料で充填することによって調製されてもよい。１つの態様では、孔は、他の調合剤の中でもとりわけ、粘度が低い２部分エポキシ樹脂または潜在性硬化剤を充填されうる。複数の導電性ドメインは、その後、たとえば、ポリシング、研磨、穿孔、または他の成形によって、機械的に開放されて、非導電性マトリクス内に導電性ポリマ島が現れうる。こうした導電性島は、ナノメートル〜ミリメートル程度の直径を有しうる。
【００３２】
電極の１つの態様では、図３に示すように、充填された電極マトリクスの表面は、露出され、プレーナ電極アセンブリ２０をもたらす。露出した電極面２２は、非導電性材料、非伝導性多孔質モノリス２６または非導電性充填材料２８によって分離された導電性ドメイン２４を含む。図３は、要素２４、２６、および２８についてのいくつかの相対的な寸法および分布を示すが、これらの寸法および分布は、例示的であり、ユーザのニーズに応じて変わる可能性がある。
【００３３】
あるいは、分離された導電性ドメインおよび多孔質電極マトリクスを有する利点は、図４に示す多孔質電極アセンブリ３０をもたらすために、充填された電極マトリクス内に流路を穿孔するか、または、その他の方法で機械加工することによって達成されてもよい。得られる流路３２は、非導電性充填材料３６および多孔質モノリス３７内の導電性ポリマ３４の分離ドメインを露出させる。流路は、ランダムに分布されうるか、または、規則的なアレイで設置されうる。得られる電極アセンブリは、バックグラウンド信号の低減という付加的な利点がある状態で、上述した多孔質電極アセンブリと同様な電極を貫通してまたは通り過ぎて、対象サンプルが流れることを可能にする。
【００３４】
別の例では、図１の多孔質ポリマ電極１０の空隙１７が、先に説明したように、非導電性充填材料を充填され、電極の上部および下部面が、同様に覆われる場合、多孔質電極マトリクスは、図５の断面図に示すように、円柱マトリクスを貫通して流路を機械加工することによって調製されうるであろう。電極マトリクス４０は、導電性ポリマ４２でコーティングされた非導電性多孔質モノリス４１を含み、得られる空隙は、非導電性充填剤４３を充填される。導電性ポリマ４２の少なくとも一部分は、導電性層４４と電気接触した状態にある。流路４６は、電極アセンブリの円柱軸に沿って延び、導電性ポリマ４２の少なくとも一部分を流路の内部表面上に露出させ、電極アセンブリを通って溶液が流れることを可能にする。電極マトリクスは、任意の適した形状、流路の数、およびアレイ幾何形状を有する流路のアレイを含みうる。
【００３５】
機械加工の代替法として、非導電性充填材料は、ネガフォトレジスト材料を含んでもよい。この態様では、選択されたエリア内でのネガレジストの照射および現像は、分離した導電性島も露光しうる。
【００３６】
代替の態様では、図６に示すように、電極アセンブリ４７は、非導電性基材４９内で形成された開口または空洞内に調製された、導電性多孔質ポリマ電極プラグ４８のアレイを含みうる。このタイプの電極アセンブリは、非導電性基材内の適切な空洞または穴内で、上述したように、多孔質電極マトリクスを重合することによって調製されてもよい。電極アセンブリ４７はまた、多孔質ポリマ電極プラグ（図示せず）に電気接続状態で、たとえば、銅、金、または他の十分に不活性でかつ導電性がある材料を含む導電性材料を組み込みうる。
【００３７】
ＩＩ．  多孔質ポリマ電極の例示的な用途
本明細書に述べる多孔質ポリマ電極アセンブリは、限定はしないが、電位測定、ボルタンメトリ、ポーラログラフィおよび伝導度滴定の用途を含む電気化学用途において種々の有利な特性を所有しうる。特に、電極表面の不規則でかつカスタマイズ可能なトポグラフィは、研究者が、種々の生物電子現象を調査することを可能にする。さらに、多孔質ポリマ電極の表面は、当技術分野で容易に理解されるように、適切なモノマ前駆体の選択か、表面の化学的修飾か、または、その両方によって、容易にカスタマイズされうる。
【００３８】
多孔質ポリマ電極は、分析物の検出、定量化、不動態化、キャラクタリゼーション、および／または精製を容易にしうる。多孔質ポリマ電極は、インビボおよびインビトロで利用されうる。通常、多孔質ポリマ電極は、電極を対象分析物に接触させること、電極に電位を印加することを含む方法において有用である。
【００３９】
多孔質ポリマ電極が、選択された分析物と組合せて利用される場合、分析物は、通常、帯電した種であるか、または、帯電した種を生成するために、酸化または還元されうる。多孔質ポリマ電極の電位を変動させることによって、帯電した分析物種は、捕獲される、かつ／または、濃縮される、かつ／または、放出されてもよい。通常、電極マトリクスの多孔度は、所望の帯電した分析物を補足し、分析物と空間的に相互作用するように選択される。すなわち、電極表面上に存在する空洞は、帯電した分析物を収容するように適切な大きさに作られる。好ましくは、電極トポグラフィは、帯電した分析物が、ある程度の選択性を持って、電極と相互作用するように選択される。したがって、多孔質ポリマ電極は、拡散方向と無関係に、所望の分析物の補足を容易にし、検出感度の改善を提供する可能性がある。
【００４０】
適切な電荷、サイズ、および形状を持つどの分析物も、共有結合的にまたは非共有結合的に分析物に会合した電気化学的に活性なタグを含むように修飾される分析物を含む、開示された電極用の適切な分析物でありうる。通常、分析物は生物分子である。生物分子は、正にまたは負に帯電してもよく、たとえば、ポリペプチド、炭水化物、および核酸ポリマを含みうる。
【００４１】
特に、核酸ポリマである分析物に関して、核酸ポリマは、核酸断片、オリゴヌクレオチド、あるいは、第２または第３構造を示すポリマを含むより大きな核酸ポリマとして存在しうる。核酸断片は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、および／または４本鎖構造を含みうる。核酸は、小断片であってよく、または、任意選択で、少なくとも８つの塩基または塩基対を含みうる。分析物は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはそれらの混合物またはハイブリッドである核酸ポリマでありうる。任意のＤＮＡは、任意選択で、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖ＤＮＡであり、任意のＲＮＡは、任意選択で、１本鎖（「ｓｓ」）または２本鎖（「ｄｓ」）である。核酸ポリマは、天然ポリマ（元々、生物学的である）または合成ポリマ（人工的に修飾されるか、または、調製される）でありうる。
【００４２】
核酸ポリマが、修飾されたヌクレオチド塩基を含む場合、塩基は、限定はしないが、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−ベータ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キューオシン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオシチジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−ベータ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン、および、（ａｃｐ３）ｕを含みうる。
【００４３】
核酸ポリマ分析物は、任意選択で、染色体などの凝縮相で存在する。核酸ポリマは、任意選択で、１つまたは複数の修飾塩基またはリンクを含むか、または、非共有結合的にまたは共有結合的に付着される標識を含む。たとえば、修飾塩基は、自然に発生する修飾塩基または人工的に改変された塩基でありうる。核酸ポリマは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットなどのペプチド核酸であることもできる、または、それを含むことができる。核酸ポリマは、反応性官能基によって修飾されるか、または、共役物質で置換されうる。１つの態様では、核酸ポリマは、電気化学的検出のための電気化学的に活性なタグの会合によって修飾される。
【００４４】
分析物溶液は、とりわけ、血液サンプル、尿サンプル、スワイプ、スミアから調製される生物学的サンプルであることができ、または、それらから生成されうる。あるいは、サンプルは、とりわけ、空気サンプル、水サンプル、または土壌サンプルから調製される環境サンプルであってよい。分析物溶液は、生物学的構造から（たとえば、溶解した細胞、組織、有機体または小器官）の抽出によって得られうる。サンプルは、通常、水性であるが、生物学的に適合性がある有機溶媒、緩衝剤、無機塩、および／または、アッセイ溶液として当技術分野で知られている、他の成分を含みうる。
【００４５】
対象分析物は、通常、当技術分野で一般的に知られている方法に従って調製された、水性の、ほぼ水性の、または、水性で混和性の溶液内に存在する。分析物溶液を多孔質ポリマ電極に接触させるどんな方法も、一般に、分析物を電極に接触させる許容可能な方法である。１つの態様では、電極は、分析物溶液内に浸漬される。別の態様では、分析物溶液は、電極に塗布される。電極が、装置またはデバイス内に組み込まれる場合、装置またはデバイスは、分析物溶液を調製し、かつ／または、分析物溶液を電極に接触させるための適したフルイディクスを含みうる。クロマトグラフカラムは、多孔質ポリマ電極から上流に設置され、クロマトグラフカラムは、生物分子または細胞のろ過、分離、単離、および事前捕獲／放出のうちの１つまたは複数を実施するように構成されうる。
【００４６】
分析物を検出するステップは、電極において、分析物の存在を電気化学的に検出するいずれの方法も含む。通常、電位が電極表面に印加されるか、または、印加電位が変えられ、得られる電流が決定される。あるいは、電位は、選択された値に保持されることができ、電流の変化が経時的に決定される、または、一定電流が印加され、得られる電圧が決定されうる。通常、同じ分析物または同様な分析物の既知の量などの標準と比較することによって、分析物の存在が、定性的に検出されてもよく、または、分析物の量が、定量的に決定されうる。共有結合的にまたは非共有結合的に分析物に会合する電気化学的標識の存在によって、検出および定量化は高められうる。
【００４７】
相関は、一般に、電気化学的反応の存在および／または大きさを、（たとえば、異なる時刻における同じサンプル、および／または、任意の時刻における別のサンプルの同様な測定から生じる）別の反応および／または（たとえば、較正曲線、予想される反応の計算、および／または電気化学的に活性な参照材料から得られる）較正標準と比較することによって実施されうる。
【００４８】
開示される多孔質ポリマ電極の大きな表面積は、分析物検出感度を改善する場合がある。特に、分析物が帯電した分析物である場合、分析物を捕獲するために、適切な電位が電極に印加される。１つの態様では、多孔質ポリマ電極は、分析物を電極表面に静電的に引き付けることによって帯電した分析物を捕獲する、かつ／または、濃縮するのに使用されうる。たとえば、流れるサンプルから分析物を捕獲することによって、サンプルが、分析物から激減する可能性がある。印加電位を取り除くことによって、または、印加電位の極性を逆にすることによって、捕獲された分析物は、収集またはさらなる特性付けのために、溶液内に放出されてもよい。これは、分析物が、核酸または核酸断片である場合、特に有利な用途である。
【００４９】
たとえば、帯電した分析物は、全体が負の帯電を示す核酸ポリマであってよい。正電荷を多孔質ポリマ電極に加え、かつ、対象核酸ポリマと相補的な孔および表面フィーチャを有する電極を選択することによって、核酸ポリマは、電極表面において、捕獲され、濃縮されうる。１つの態様では、多孔質ポリマ電極は、正に酸化された状態と中性の還元状態との間で切換えられることができ、この可逆性を使用して、負に帯電した核酸断片が捕獲され、放出される。一部の実施形態では、多孔質ポリマ電極を使用して、ＰＣＲ増幅から生じる核酸断片を検出し、かつ／または、定量化しうる。
【００５０】
核酸増幅を検出する種々のアッセイは、２００６年６月３０日に出願され、参照により組み込まれる、「ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」という名称のＡｉｖａｚａｃｈｖｉｌｉに対する米国特許出願第１１／４４８，４３９号に記載される。仮出願に開示される選択されたアッセイは、有利には、本明細書で開示される多孔質ポリマ電極を使用して実施されてもよく、特に、有利には、上述した多孔質ポリマ電極を組み込む微小流体デバイスを使用して実施されてもよい。
【００５１】
電気化学的システムのバックグラウンドノイズは、測定システムの固有のバックグラウンド電流および容量性充電電流に由来する。これらの電流は小さい可能性があるため、他の検出方法を利用するデバイスの場合に比べて、電気化学的デバイスの場合、よりよいシグナルノイズ比および感度が達成されうる。さらに、電気化学的方法は、通常、小さな電流および電圧を使用するため、多孔質ポリマ電極を組み込むデバイスは、通常、大きく、高価で、重い電源を必要としない。電気化学ベースのデバイスは、通常、光源、ミラー、フィルタ、検出器、支持メカニクス、または移動メカニクスなどの光学構成品を必要としないため、これは、光学的検出方法のために光源を必要とするデバイスに勝る利点である。したがって、電気化学ベースのデバイスは、携帯型デバイスおよび／または可搬型デバイスで使用するのに適している。
【００５２】
ＩＩＩ．  多孔質ポリマ電極を組み込む装置
上述したポリマ電極は、種々の装置、システム、またはデバイスに組み込まれてもよい。電極は、たとえば、マイクロプレート、ＰＣＲプレート、またはシリコンチップの一部分として組み込まれてもよい。１つの態様では、ポリマ電極は、分析物溶液が、多孔質ポリマ電極のマトリクスを通り過ぎてまたは貫通して流れるように、デバイスに組み込まれる。１つの例では、分析物溶液は、たとえば、図１に示す円柱電極アセンブリのように、３次元多孔質マトリクスを貫通して流れる。あるいは、多孔質ポリマ電極は、分析物溶液内に浸漬するようになっている（すなわち、「ディップスティック」）か、または、たとえば、図２に示すプレーナ電極アセンブリのように、分析物溶液が多孔質ポリマ電極を通り過ぎて流れるようになっている。本明細書で述べる多孔質ポリマ電極は、微小流体デバイスに組み込むのに特に適する。
【００５３】
微小流体デバイスは、小容積の流体を利用するデバイスである。一部の事例では、微小流体デバイスは、ナノリットル以下の程度の流体容積を利用しうる。１つの例では、微小流体デバイスは、ピコリットル程度の流体容積を利用しうる。微小流体デバイスは、サンプルを調製し、搬送し、かつ／または、分析するために、種々の幾何形状で配置された種々の微小流路、ウェル、および／または、弁を利用しうる。これらの微小流路、ウェル、および／または、弁は、ミリメートル（ｍｍ）〜マイクロメートル（μｍ）またはさらにナノメートル（ｎｍ）の範囲の寸法を有しうる。微小流体デバイスは、限定されることなく、「メソスケールデバイス（ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｅｖｉｃｅｓ）」または「マイクロマシンデバイス（ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ）」と呼ばれてもよい。微小流体デバイスは、デバイスを貫通して流体を搬送するために、とりわけ、注入、ポンピング、加えられる吸引、毛管作用、浸透作用、および、熱膨張および収縮を含む種々の力に依存しうる。１つの例では、微小流体デバイスは、水性サンプル、試薬、および緩衝剤の搬送を補助するために、能動的な電気浸透に依存しうる。
【００５４】
例示的な微小流体デバイス５０は、図７に概略的に示され、多孔質ポリマ電極アセンブリ５２、電極アセンブリ５２に印加する電位を制御するように構成されたコントローラ５４、対象サンプル溶液５８を調製するのに適した１つまたは複数の構成品５６、および対象サンプル溶液５８を電極アセンブリ５２へ／から搬送するのに適した流体システム６０を含む。
【００５５】
こうした微小流体デバイスの流れ通路は、約０．１μｍ〜５００μｍの程度の断面寸法を示す可能性があるが、代表的な幅は、２．０〜３００μｍ、より好ましくは、１０〜１００μｍの程度である。多くの用途について、５〜５０μｍの流路幅が使用されうる。基材上にまたは基材内に作製される反応または混合チャンバは、たとえば、最大数ミリメートルの長い寸法を有しうる。一般に、微小流路およびチャンバの深さは、０．１〜１００μｍ、通常、２〜５０μｍの程度である。
【００５６】
通常、微小流体デバイスは、対象分析に所望される、種々の流路、混合チャンバおよび／または反応チャンバ、ならびに入口を画定するために微細作製される基材を含む。デバイスの流路、チャンバ、および他のフィーチャは、固体または半固体基材から設計され、作製されうる。通常、基材はシリコンであり、微小流体流路およびチャンバは、確立されたマイクロマシン法を使用して微細作製される。
【００５７】
微小流体デバイスの流路および要素は、基材の表面上に作製され、その後、カバーが、基材表面にわたって固着されてもよい。基材表面をシールし、微小流体流路およびチャンバを画定するために、任意の適したカバーが使用されてもよいが、透明カバーは、微小流体デバイスの動作が監視されることを可能にする。通常、ガラスカバーが、基材に固着される。本明細書で述べる微小流体デバイスは、通常、約１０μＬ以下のサンプル容積を分析するように構成される。
【００５８】
微小流体デバイスにわたる流体の搬送は、特に、透明カバーまたは透明基材が使用される場合、視覚的観察によって、または、光学検出および解析によって判定されうる。
【００５９】
種々の微小流体デバイスは、共に参照により組み込まれる、Ｋｒｉｃｋａ他に対する米国特許第５，２９６，３７５号（１９９４）およびＷｉｌｄｉｎｇ他に対する米国特許第５，４９８，３９２号（１９９６）に記載される。
【００６０】
対象サンプルは、微小流体デバイスに添加される前に、より大きな程度、またはより小さな程度で精製されてもよい。あるいは、微小流体デバイスは、多孔質ポリマ電極アセンブリによる暴露または分析のためにサンプルを調製するように構成された１つまたは複数の構成品を組み込みうる。
【００６１】
サンプル調製ステップは、たとえば、細胞溶解、たんぱく質変性化、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、電位泳動、アフィニティクロマトグラフィ、および電気化学分析を含みうる。対象サンプルが、生物学的材料を含む場合、サンプルの前処理は、とりわけ、液化、蒸解、および希釈などの１つまたは複数の手順を含みうる。
【００６２】
微小流体デバイスが、たとえば、分析物を捕獲し、その後、分析物を放出することによって、分析物を精製することを意図される場合、分析物は、通常、帯電しているか、または、電荷を取得することが可能であるため、分析物は、多孔質ポリマ電極の表面と静電的に相互作用しうる。分析物が、それ自体帯電しない場合、分析物は、分析物と錯体を作ることになる、分析物用の捕獲プローブと結合して、帯電した種を提供しうる。
【００６３】
微小流体デバイスが、分析物を検出するか、または、定量化することを意図される場合、分析物は、任意選択で、分析物との特異的な相互作用が可能で、検出試薬を含む捕獲プローブと結合する。検出が、多孔質ポリマ電極によって達成される場合、検出試薬は、一般に、電気化学的に活性な種である。
【００６４】
分析物の分析は、分析物の光学的特性付けを含む付加的な機器分析と組合されうる。微小流体デバイスが、光学分析も実施する場合、分析物は、直接検出されうる、または、検出可能な光学特性を分析物に与える捕獲プローブと組合されうる。たとえば、比色標識または発光標識が、電気化学的に活性な標識に加えて、分析物と組合されてもよい。
【００６５】
多孔質ポリマ電極を組み込む微小流体デバイスを使用して、上述した多孔質ポリマ電極の有利な特性を利用する種々のアッセイのいずれもが実施されうる。一部の実施形態では、主題の微小流体デバイスは、特に、その分析物が生物分子である場合、最も特別には、生物分子が核酸ポリマである場合、分析物の検出、定量化、不動態化、特性付け、および／または、精製に有用である。
【００６６】
核酸ポリマの増幅、その後の検出に適する代表的な微小流体デバイスは、図８に示される。微小流体デバイス６２は、概略的に示され、簡潔にするために、こうした微小流体システム内に存在する場合がある微小流路およびウェルの全てを示すことを意図されない。核酸ポリマの増幅および検出に適する微小流体デバイスを含む選択された微小流体デバイスは、それぞれが参照により組み込まれる、Ｗｉｌｄｉｎｇ他による国際公開公報第ＷＯ９３／２２０５３号（１９９３）、Ｗｉｌｄｉｎｇ他に対する米国特許第５，３０４，４８７号（１９９４）、およびＫｒｉｃｋａに対する米国特許第５，２９６，３７５号（１９９４）に記載される。
【００６７】
微小流体デバイス６２は、多孔質ポリマ電極アセンブリ６４および電極アセンブリ６４に印加する電位を制御するように構成されたコントローラ６６を含む。コントローラは、通常、電源と電流測定または電位測定を実施する機器の両方として役立つ。
【００６８】
多孔質ポリマ電極アセンブリ６４から上流には、対象サンプル溶液を調製するように構成された微小流体デバイスのサンプル調製領域６８がある。サンプル調製領域６８は、サンプル調製プロセスにとって有用な試薬を供給するように構成された試薬リザーバ７０を含む。微小流体デバイスの種々のチャンバは、デバイスを通して試薬、サンプル溶液、および反応生成物を搬送するのに適した微小流体流路システム７２によって相互接続され、特に、こうした種を電極アセンブリ６４へ／から搬送する。
【００６９】
サンプル、通常、生物学的サンプルは、入口７４を介して微小流体デバイス内に導入されうる。サンプルは、注入か、電気浸透か、毛管作用か、または、任意の他の適した導入方法によって導入されうる。微小流体デバイスは、任意選択で、前処理ウェルまたはチャンバ７６を含む。前処理チャンバ７６は、生物学的サンプルが、所望である場合、サンプルの蒸解、液化、または希釈のために、試薬と混合することを可能にする。こうした前処理は、生物学的サンプル流体を下流プロセスの有効性を高めるのに十分にさせるために使用しうる。
【００７０】
この前処理後に、サンプルは、任意選択でろ過される。たとえば、サンプルは、電気浸透ポンピングによって、フィルタ７８を通って反応チャンバ８０に搬送されうる。フィルタ７８は、下流の反応に干渉する可能性がある大きな粒子を除去するのに使用されうる。フィルタは、調査下の生物学的サンプルに適合する任意の適切なろ過剤であることができる。たとえば、フィルタ７８は、比較的大きな、たとえば、約１００μｍの孔サイズを有する膜フィルタまたはフリットガラスフィルタを含みうる。
【００７１】
反応チャンバ８０は、サンプルの溶解および変性化のために使用されうる。図７に示すように、溶解プロセスおよび／または変性化プロセスに有用な試薬は、弁８４を介して試薬リザーバ８２から添加されうる。溶解プロセスおよび／または変性化プロセスは、加熱ユニット８６によって加熱することによって加速されうる。加熱ユニット８６は、１つまたは複数の暖気ランプ、加熱コイル、流体熱交換器、または、任意の他の適した加熱装置、ならびに、ファン、ブロワ、熱交換器、または反応チャンバ８０を冷却するための他の適した冷却機構を含みうる。
【００７２】
溶解および／または変性化後、サンプルは、任意選択で、途中で付加的なフィルタ９０を通過して、ＰＣＲチャンバ８８に搬送される。フィルタ９０（存在するとき）は、通常、フィルタ７８（存在するとき）より微細である。たとえば、約１００μｍの孔サイズを有する比較的粗いフィルタ７８と違って、フィルタ９０は、約５〜１０μｍの孔サイズについて選択されうる。こうした微細フィルタを使用して、溶解／変性化プロセスの好ましくない副産物が除去されうる。サンプルが、ＰＣＲチャンバ８８に達すると、ＰＣＲプロセスにとって有用な試薬が、弁９４を介してＰＣＲ試薬リザーバ９２からＰＣＲチャンバ８８に添加されうる。ＰＣＲチャンバ８８は、加熱ユニット９６により加熱されることが可能である。加熱ユニット８６と同様の、加熱ユニット９６は、ＰＣＲプロセスを容易にする任意の適切な加熱機構であることができ、通常、加熱サイクリングが、ＰＣＲチャンバ８８内で達成されるように、冷却機構を含む。選択された、適した熱サイクリング機構は、参照により組み込まれる、Ｗｉｔｔｗｅｒ他に対する米国特許第５，４５５，１７５号（１９９５）に記載される。
【００７３】
ＰＣＲが終了した後、サンプルは、約５〜１０μｍの孔サイズを有する別のフィルタ９８を通って電解チャンバ９７に搬送されうる。電解チャンバ９７は、コントローラによって制御される電極１００を含む。図８のコントローラ６６に電気接続されているものとして示されるが、電極１００用のコントローラは、多孔質ポリマ電極６４用のコントローラと同じか、または、異なる可能性がある。適切な試薬が、弁１０４を介して試薬リザーバ１０２から電解チャンバ９７に添加されうる。電解チャンバ９７に添加される試薬は、たとえば、検出試薬を組み込む増幅された核酸ポリマ用の捕獲プローブを含みうる。
【００７４】
存在するとき、捕獲プローブは、通常、増幅された核酸ポリマ用の選択性のある結合パートナである。捕獲プローブは、任意の適した供給源から得られ、任意の適した構造を有しうる。捕獲プローブは、天然供給源および／または人工供給源から得られうる。相応して、捕獲プローブは、とりわけ、細胞（複数可）、細胞溶解物（複数可）、合成酵素（複数可）、化学合成、酵素的分解、化学的分解、および／または結さつによって、合成されるか、または、形成されうる。そのため、捕獲プローブは、ＲＮＡか、ＤＮＡか、または、その任意の適した類似物でありうる。さらに、捕獲プローブは、分析物と同じ構造クラスの分子に属しうる（たとえば、それぞれがＤＮＡであるか、または、それぞれがＲＮＡである）か、または、異なるクラスの分子に属しうる（たとえば、捕獲プローブは核酸類似物であり、分析物は、とりわけＲＮＡまたはＤＮＡである）。
【００７５】
捕獲プローブは、増幅された核酸ポリマに対して任意の適したバックボーン構造を有しうる。一部の例では、捕獲プローブは、捕獲プローブではバックボーンが少なく帯電し、分析物ではバックボーンが多く帯電する（または、その逆）など、分析物と異なるバックボーンを有しうる。こうした構成によって、増幅された核酸ポリマは、多孔質ポリマ電極について捕獲プローブより大きなアフィニティを有しうる（または、その逆である）。捕獲プローブの類似のバックボーンは、リン酸塩部分、リボース部分、または、その両方を欠く可能性がある。一部の例では、捕獲プローブの類似のバックボーンは、複数のアミド部分を含みうる。一部の例では、類似のバックボーンは、類似物がペプチド核酸であるように、ペプチドバックボーンでありうる。本明細書で使用されるように、ペプチドバックボーンは、加水分解されて、複数のアミノカルボン酸、特に、アルファ−アミノカルボン酸を放出しうる任意のバックボーンである。例示的な実施形態では、ペプチド核酸は、バックボーンのメチレンカルボニル部分を通してヌクレオチド塩基のアレイを配置する、連鎖Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンサブユニットで形成されるバックボーンを有する。
【００７６】
捕獲プローブは、捕獲プローブと分析物が少なくとも部分的に２本鎖の核酸を形成するように、塩基対の相互作用によって、増幅された核酸に関するデュープレックスを形成するように構成されうる。相応して、分析物のセクション（または全て）は、分析物のセクション（または全て）に相補的でありうる。別法として、または、付加的に、たとえば、捕獲プローブを光学要素のマトリクスに結合するために、捕獲プローブは、分析物に無関係に、２本鎖領域を含みうる。捕獲プローブは、分析物の任意の領域に（塩基対を）ハイブリダイズするように構成されることができ、たとえば、捕獲プローブは、分析物の末端に隣接して、または、分析物の末端から離間してハイブリダイズしうる。
【００７７】
１つの例では、適した捕獲プローブは、共有結合的か非共有結合的のいずれかで捕獲プローブに会合する１つまたは複数の検出可能な電気化学標識を含む。捕獲プローブは、さらに、限定することなく、発光標識（蛍光標識、発光標識、および化学発光標識を含む）か、比色標識か、または、その組合せを含みうる。あるいは、選択される標識は、たとえば、標識と付加的な検出試薬との相互作用によって、間接的に検出されうる。
【００７８】
標識が付加的な検出試薬と相互作用する場合、標識は、通常、標識抗体用のハプテンなどの特異的な結合対のメンバ、または、相補的配列によって標識付けられる核酸配列である。標識は、たとえば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出またはアルカリンフォスファターゼ検出と、それに続く、化学発光検出または比色検出のための標的として使用されうるジゴキシゲニン部分を含んでもよい。付加的な検出試薬は、付加的な検出試薬に対する標識の会合が、捕獲プローブの電気化学的検出を容易にするように、電気化学的媒介物質を含みうる。
【００７９】
特定の例では、増幅の検出は、任意選択で、電気化学的媒介物質の存在による、多孔質ポリマ電極６４における電気化学的検出による。
【００８０】
特定の例では、増幅の検出は、電気化学標識で修飾されたプライマおよび特異的な錯化たんぱく質を含む捕獲プローブを利用する。こうした捕獲プローブは、電解チャンバ９７に添加されるため、増幅された対象核酸ポリマは、標識付けされたプライマと錯体化たんぱく質の両方に会合して、錯体が形成される。非共有結合錯体が形成された後、電解ウェル９７内の電極１００と電解ウェル１０８内の電極１０６との間に電位が印加される。通常、電極１００は陰極電位に保持され、電極１０６は陽極電位に保持されるため、架橋ポリアクリルアミドゲル１１０の薄膜と共に、ゲル１１０にわたって電気泳動が起こる。電気泳動が起こっている間、多孔質ポリマ電極は、通常、電気的に中性であるか、または、非導電性状態に保持される。
【００８１】
ポリアクリルアミドゲルは、通常、程度の低い架橋によって調製される。これらの電気泳動的状況下で、錯体化され、たんぱく質および標識付けされたプライマにハイブリダイズした標的ＤＮＡを除いて、全ての核酸断片は、電解チャンバ１０８に移動することになる。比較的大きな核酸−たんぱく質錯体は、サイズが大きく、架橋ポリアクリルアミドゲルの薄膜に貫入することが比較的できないため、あとに残る。
【００８２】
電気泳動的分離が述べられたが、標的核酸ポリマを分離するために、たとえば、機械的分離、サイズ排除クロマトグラフィ、誘導ビードまたはマトリクスを使用した分離を含む、任意の適した分離プロセスが使用されるであろう。マトリクスは、たとえば、磁気ビードまたはストレプトアビジン修飾マトリクスを含み、分析物核酸配列を、他の核酸断片および未結合標識から分離するのにも使用されうる。
【００８３】
任意の過剰でかつ未結合の、電気化学的に活性な捕獲プローブおよび非標的ＤＮＡ断片が、多孔質ポリマ電極アセンブリ６４の近傍から除去されると、電解チャンバ９７内の電極１００が陰極電位に保持されながら、陽極電位が、電極アセンブリ６４に印加されうる。まだ導電性でない場合、多孔質ポリマ電極は、導電性状態に変換され、正に帯電する。
【００８４】
ハイブリダイズされた核酸錯体が、架橋ポリアクリルアミドゲル１１０の薄膜から移動するため、錯体は、正に帯電した多孔質ポリマ電極において静電的に捕獲され、内部電極表面上に濃縮する。使用するために選択された電気化学的標識が、ポリマ電極の材料に適合する場合、標的核酸ポリマは、電気化学的に検出されうる。標的核酸配列の電気化学的検出は、プライマ、使用された錯体化たんぱく質、および標的核酸ポリマと会合したときの、電気化学的に活性な標識の酸化還元電位に依存する。
【００８５】
核酸錯体を形成するのに使用される特異的な錯体化たんぱく質は、リコンビナーゼ、１本鎖結合たんぱく質、抗体、転写因子、または任意の他の核酸結合たんぱく質の群の中の任意のものから選択されうる。結合は、とりわけ、ジゴキシゲニンまたはビオチンを含む１つまたは複数の付加的な試薬によって媒介されてもよい。
【００８６】
（実施例）
以下の実施例は、多孔質ポリマ電極を含む微小流体システムの選択された態様および実施形態を述べる。これらの実施例は、例証のために含まれ、本開示の全体の範囲を制限するか、または、規定することを意図されない。特に、本明細書で開示され、示される特定の態様および実施形態は、多くの変形が可能であるため、制限的な意味で考えられるべきでない。
【００８７】
（実施例１）
サイズがほぼ３ｍｍ×５ｍｍ×１５ｍｍの網状ガラス質炭素（ＲＶＣ）発泡体（平均孔サイズが約６０μｍ、１２〜１５％密度、ＤＵＯＣＥＬ）の一部分は、アセトンで洗い流すことによって洗浄され、窒素下で乾燥される。発泡体に対する電気接触は、ワニ口クリップを使用して達成される。ＲＶＣ電極は、１：３アセトニトリルの攪拌溶液内に浸され、脱イオン化水は、３５ｍＭの３−メトキシチフェンと１０ｍＭの過塩素酸ナトリウムを含有する。溶液にさらされるＲＶＣのエリアは、ほぼ３ｍｍ×５ｍｍ×８ｍｍである。メトキシチフェンの電解重合は、プラチナ箔対電極を使用して、３００秒間で、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して１．４Ｖで進行した。この活性化プロセスは、図９に示される。重合した後、電極は、溶液から取り除かれ、水で洗い流され、１０ｍＭの過塩素酸ナトリウムの溶液内に戻された。その後、図１０に示すように、導電性ポリマ皮膜の帯電状態を、正と中性との間で切換えるサイクリックボルタンメトリ（２０ｍＶ／ｓ）が実施された。
【００８８】
（実施例２）
多孔質ポリマ電極アセンブリは、実施例１に述べるように、網状ガラス質炭素のモノリスの表面上に、正に帯電したポリ（３−メトキシオフェン）を、酸化状態で、電気化学的に堆積させることによって調製される。得られる電極アセンブリの核酸を捕獲する能力は、蛍光核酸染料ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）））で予め染めたヒトゲノムＤＮＡに対して電極アセンブリを暴露することによって確認される。図１１に示すように、正に帯電した電極アセンブリの蛍光顕微鏡写真は、電極アセンブリの表面上のヒトＤＮＡの存在を示す。照合確認として、ポリ（３−メトキシオフェン）ポリマが、その中性状態に電気化学的に還元される実験が繰り返される。図１２に示すように、中性電極アセンブリは、電極アセンブリの表面上でＹＯＹＯ−１蛍光をほとんど、または、全く示さず、電極マトリクス内で少量の蛍光だけを示す。
【００８９】
上述した開示は、独立した有用性を有する複数の全く異なる発明を包含してもよい。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態（複数可）で開示されたが、本明細書で開示され、示された本発明の特定の実施形態は、多数の変形が可能であるため、制限的な意味で考えられるべきでない。本発明の主題は、本明細書で開示される、種々の要素、特徴、機能、および／または、特性の、新規でかつ自明でない全ての組合せおよび下位組合せを含む。添付特許請求の範囲は、新規でかつ自明でないとみなされる、いくつかの組合せおよび下位組合せを特に指摘する。特徴、機能、および／または、特性の、他の組合せおよび下位組合せで具現化される発明は、本出願または関連出願から優先権を主張する出願において請求されてもよい。異なる発明を対象としようと、同じ発明を対象としようと、また、元の特許請求の範囲に対して、範囲が、広くても、狭くても、同じでも、異なるものでも、こうした特許請求の範囲は、本開示の発明の主題内に含まれるものとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】例示的な多孔質ポリマ電極アセンブリの断面図である。
【図２】代替の多孔質ポリマ電極アセンブリの部分断面図である。
【図３】別の例示的な電極アセンブリの面の斜視図である。
【図４】なお別の例示的な電極アセンブリの面の部分断面図である。
【図５】なお別の例示的な電極アセンブリの断面図である。
【図６】なお別の電極アセンブリの斜視図である。
【図７】例示的な微小流体システムの略図である。
【図８】代替の選択された微小流体システムの略図である。
【図９】実施例１に示す、網状ガラス質炭素上のメトキシチオフェンの電解重合を示すプロットである。
【図１０】実施例１に示す、正の帯電と中性の帯電との間の多孔質ポリマ電極のサイクリングを示すサイクリックボルタモグラムである。
【図１１】実施例２に述べるように、正電位に保持された例示的な電極アセンブリの蛍光顕微鏡写真であり、電極表面上の吸収されたＤＮＡの存在が、ＹＯＹＯ−１核酸染料でＤＮＡを蛍光染色することによって立証される。
【図１２】実施例２に述べるように、中性電位に保持された例示的な電極アセンブリの蛍光顕微鏡写真であり、電極表面上にＤＮＡがほとんど、または、全く存在せず、電極マトリクス内に少量だけが存在することが、ＹＯＹＯ−１核酸染料でＤＮＡを蛍光染色することによって立証される。
【符号の説明】
【００９１】
１０  多孔質導電性ポリマ電極アセンブリ
１２  多孔質モノリス
１４  導電性ポリマ
１６  導電性層
１７  流路（孔）
１８  基材層
２０  プレーナ電極アセンブリ
２２  電極面
２４  導電性ドメイン
２６  非伝導性多孔質モノリス
２８  非導電性充填材料
３０  多孔質電極アセンブリ
３２  流路
３４  導電性ポリマ
３６  非導電性充填材料
３７  多孔質モノリス
４０  電極マトリクス
４１  非導電性多孔質モノリス
４２  導電性ポリマ
４３  非導電性充填剤
４４  導電性層
４６  流路
４７  電極アセンブリ
４８  導電性多孔質ポリマ電極プラグ
４９  非導電性基材
５０  微小流体デバイス
５２  多孔質ポリマ電極アセンブリ
５４  コントローラ
５６  構成品
５８  対象サンプル溶液
６０  流体システム
６２  微小流体デバイス
６４  多孔質ポリマ電極アセンブリ
６６  コントローラ
６８  サンプル調製領域
７０  試薬リザーバ
７２  微小流体流路システム
７４  入口
７６  前処理チャンバ
７８  フィルタ
８０  反応チャンバ
８２  試薬リザーバ
８４  弁
８６  加熱ユニット
８８  ＰＣＲチャンバ
９０  フィルタ
９２  ＰＣＲ試薬リザーバ
９４  弁
９６  加熱ユニット
９７  電解チャンバ
９８  フィルタ
１００  電極１
１０２  試薬リザーバ
１０４  弁
【図１】
2009516173.tif 000003
【図２】
2009516173.tif 000004
【図３】
2009516173.tif 000005
【図４】
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【図５】
2009516173.tif 000007
【図６】
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【図７】
2009516173.tif 000009
【図８】
2009516173.tif 000010
【図９】
2009516173.tif 000011
【図１０】
2009516173.tif 000012
【図１１】
2009516173.tif 000013
【図１２】
2009516173.tif 000014
【国際調査報告】
2009516173.tif 000015
2009516173.tif 000016
2009516173.tif 000017
2009516173.tif 000018
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