(57)【要約】  本発明は植物における種子サイズ及び／又は種子数を増大させる方法及び組成物を提供する。特に、この方法及び組成物は植物成長及び／又は発生に関係又は関連する遺伝子を胚発生中に過剰発現させる。初期特異的胚プロモーターの制御下で、植物成長及び／又は発生関連遺伝子を有する遺伝子構築物を用いて形質転換されたトランスジェニック植物は、より大きく及び／又は数の多い種子を生産するフィールドにおいて成熟植物を提供する。高い収量表現型を有するトランスジェニック植物を提供する成長及び発生関連遺伝子を選択する方法も提供される。
2009519719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
初期胚発生中の種子において植物の生長と発生関連遺伝子を過剰発現させることを含む、植物において種子サイズを増大させる方法。
【請求項２】
前記種子における前記成長及び／又は発生関連遺伝子発現が、初期特異的胚プロモーターで制御される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記初期特異的胚プロモーターが、植物に対してヘテロ接合性である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記初期特異的胚プロモーターが植物に対してホモ接合性である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記初期特異的プロモーターが、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＡＰ１プロモーターがシロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼプロモーターがレスクェレラ・フェンドレリ（ＬＦＡＨ１２）由来の前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、前記２Ｓ２遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、前記脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、あるいは前記葉状子葉遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物成長及び／又は発生関連遺伝子が、ＲＥＶ遺伝子、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）遺伝子、イネヒストンデアセチラーゼ１遺伝子、Ｅ２Ｆｃ遺伝子、ＢＫＩ遺伝子、ＢＲＩｌ遺伝子、ＡＲＬ（Ａｒｇｏｓ−Ｌｉｋｅ）遺伝子、ｂｒｉｌ（ブラシノステロイドホルモン認識）遺伝子、ＦＡＴＢ遺伝子、ペピーノ遺伝子、ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナリングのレギュレータ）遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＢＢ（Ｂｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒ）遺伝子、ＲＨＤ２遺伝子、ＩＮＣＷ２遺伝子、ＭＮｌ遺伝子、ＷＡＫ２遺伝子、ＷＡＫ４遺伝子、又はＡＰ２遺伝子である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記成長及び／又は発生関連遺伝子がＲＥＶである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＥＶ遺伝子がシロイヌナズナ由来である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物がアブラナ科(Cruciferae)、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物がキャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、ムラサキウマゴヤシ、大豆、小麦、イネ、又はオオムギである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物がキャノーラ又は大豆であり、前記植物成長及び／又は発生関連遺伝子がＲＥＶであり、前記初期特異的プロモーターがアミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＡＰ１プロモーターが、シロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼプロモーターがレスクェレラ・フェンドレリ（ＬＦＡＨ１２）由来の前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、前記２Ｓ２遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、前記脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、あるいは前記葉状子葉遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
初期胚発生中の種子において植物の生長と発生関連遺伝子を過剰発現させることを含む、植物から入手可能な種子の数を増大させる方法。
【請求項１６】
前記種子における前記成長及び／又は発生関連遺伝子発現が、初期特異的胚プロモーターで制御される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記初期特異的胚プロモーターが植物に対してヘテロ接合性である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記初期特異的胚プロモーターが植物に対してホモ接合性である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記初期特異的プロモーターが、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターである請求項１６乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＡＰ１プロモーターがシロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼプロモーターがレスクェレラ・フェンドレリ（ＬＦＡＨ１２）由来の前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、前記２Ｓ２遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、前記脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、あるいは前記葉状子葉遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記植物成長及び／又は発生関連遺伝子が、ＲＥＶ遺伝子、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）遺伝子、イネヒストンデアセチラーゼ１遺伝子、Ｅ２Ｆｃ遺伝子、ＢＫＩ遺伝子、ＢＲＩｌ遺伝子、ＡＲＬ（Ａｒｇｏｓ−Ｌｉｋｅ）遺伝子、ｂｒｉｌ（ブラシノステロイドホルモン認識）遺伝子、ＦＡＴＢ遺伝子、ペピーノ遺伝子、ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナリングのレギュレータ）遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＢＢ（Ｂｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒ）遺伝子、ＲＨＤ２遺伝子、ＩＮＣＷ２遺伝子、ＭＮｌ遺伝子、ＷＡＫ２遺伝子、ＷＡＫ４遺伝子、又はＡＰ２遺伝子である請求項１５乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記成長及び／又は発生関連遺伝子がＲＥＶである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＥＶ遺伝子がシロイヌナズナ由来である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である請求項１５乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物がアブラナ科（Cruciferae）、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物がキャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、ムラサキウマゴヤシ、大豆、小麦、イネ、又はオオムギである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物がキャノーラ又は大豆であり、前記植物成長及び／又は発生関連遺伝子がＲＥＶであり、前記初期特異的プロモーターがアミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＡＰ１プロモーターが、シロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼプロモーターがレスクェレラ・フェンドレリ（ＬＦＡＨ１２）由来の前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、前記２Ｓ２遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、前記脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、あるいは前記葉状子葉遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上の制御配列に作用的に連結された植物成長及び／又は発生関連遺伝子をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物であって、前記１つ以上の制御配列が胚発生中に植物成長及び／又は発生関連遺伝子の発現を促進することができる、遺伝子構築物。
【請求項３０】
前記制御配列が初期特異的胚プロモーターである請求項２９に記載の遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記初期特異的胚プロモーターが、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターである請求項３０に記載の遺伝子構築物。
【請求項３２】
前記ＡＡＰ１プロモーターがシロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼプロモーターがレスクェレラ・フェンドレリ（ＬＦＡＨ１２）由来の前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、前記２Ｓ２遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、前記脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、あるいは前記葉状子葉遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来である請求項３１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３３】
前記植物成長及び／又は発生関連遺伝子が、ＲＥＶ遺伝子、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）遺伝子、イネヒストンデアセチラーゼ１遺伝子、Ｅ２Ｆｃ遺伝子、ＢＫＩ遺伝子、ＢＲＩｌ遺伝子、ＡＲＬ（Ａｒｇｏｓ−Ｌｉｋｅ）遺伝子、ｂｒｉｌ（ブラシノステロイドホルモン認識）遺伝子、ＦＡＴＢ遺伝子、ペピーノ遺伝子、ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナリングのレギュレータ）遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＢＢ（Ｂｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒ）遺伝子、ＲＨＤ２遺伝子、ＩＮＣＷ２遺伝子、ＭＮｌ遺伝子、ＷＡＫ２遺伝子、ＷＡＫ４遺伝子、又はＡＰ２遺伝子である請求項２９乃至３２のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項３４】
前記植物成長及び／又は発生遺伝子がＲＥＶ遺伝子である請求項３３に記載の遺伝子構築物。
【請求項３５】
前記ＲＥＶ遺伝子がシロイヌナズナＲＥＶ遺伝子である請求項３４に記載の遺伝子構築物。
【請求項３６】
前記構築物がポリＡ配列を更に含む請求項２９乃至３５のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項３７】
種子サイズが増大されたトランスジェニック植物を生産する方法であって、（ａ）請求項２９乃至３６のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を植物又は植物細胞に導入すること、及び（ｂ）再生及び成熟植物成長を促進する条件下で、前記遺伝子構築物を含んだ植物又は植物細胞を栽培することを含む、方法。
【請求項３８】
前記植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である植物由来である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物が、アブラナ科（Cruciferae）、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物がキャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、ムラサキウマゴヤシ、大豆、小麦、イネ、又はオオムギである請求項３９に記載の方法
【請求項４１】
前記植物がキャノーラ又は大豆である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
種子数が増大されたトランスジェニック植物を生産する方法であって、（ａ）請求項２９乃至３６のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を植物又は植物細胞に導入すること、及び（ｂ）再生及び成熟植物成長を促進する条件下で、前記遺伝子構築物を含んだ植物又は植物細胞を栽培することを含む、方法。
【請求項４３】
前記植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である植物由来である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記植物が、アブラナ科（Cruciferae）、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記植物がキャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、ムラサキウマゴヤシ、大豆、小麦、イネ、又はオオムギである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物がキャノーラ又は大豆である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
種子サイズ及び種子数が増大されたトランスジェニック植物を生産する方法であって、（ａ）請求項２９乃至３６のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を植物又は植物細胞に導入すること、及び（ｂ）再生及び成熟植物成長を促進する条件下で、前記遺伝子構築物を含んだ植物又は植物細胞を栽培することを含む、方法。
【請求項４８】
前記植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である植物由来である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記植物が、アブラナ科（Cruciferae）、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記植物がキャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、ムラサキウマゴヤシ、大豆、小麦、イネ、又はオオムギである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記植物がキャノーラ又は大豆である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
相当する野生型植物に比して増大された種子サイズを有するか、相当する野生型植物に比して増大された種子数を有するか、相当する野生型植物に比して増大された種子サイズ及び種子数を有する、トランスジェニック植物。
【請求項５３】
前記植物又は植物細胞が、単子葉植物又は双子葉植物である植物由来である請求項５２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
前記植物が、アブラナ科（Cruciferae）、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである請求項５３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５５】
前記植物がキャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、ムラサキウマゴヤシ、大豆、小麦、イネ、又はオオムギである請求項５４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５６】
前記植物がキャノーラ又は大豆である請求項５５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５７】
前記単子葉植物がイネ、オートムギ、トウモロコシ、又は小麦である請求項５３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５８】
前記植物がアブラナ科（Cruciferae）、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科のメンバーである請求項５７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５９】
前記双子葉植物が大豆、綿花、カメリナ、ムラサキウマゴヤシ、又はキャノーラである請求項５３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６０】
前記植物が、植物全体、植物の器官、種子、植物細胞、及びこれらの後代である請求項５２乃至５９のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６１】
前記植物器官が葉、茎、花、又は根である請求項６０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６２】
前記植物細胞が組織培養細胞である請求項６０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６３】
初期特異的胚プロモーターに機能的に関連させたときに植物収量を増大させる遺伝子を選択する方法であって、初期特異的胚プロモーターに機能的に関連させた遺伝子を含む発現ベクターを構築すること、前記発現ベクターを用いて植物細胞をトランスフェクトしてトランスジェニック植物を形成すること、前記トランスジェニック植物を成長させること、及び、野生型植物に比して収量が増大されたトランスジェニック植物において成長及び／又は発生関連遺伝子選択することを含む、方法。
【請求項６４】
前記成長及び／又は発生関連遺伝子が、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）遺伝子、イネヒストンデアセチラーゼ１遺伝子、Ｅ２Ｆｃ遺伝子、ＢＫＩ遺伝子、ＢＲＩｌ遺伝子、ＡＲＬ（Ａｒｇｏｓ−Ｌｉｋｅ）遺伝子、ｂｒｉｌ（ブラシノステロイドホルモン認識）遺伝子、ＦＡＴＢ遺伝子、ペピーノ遺伝子、ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナリングのレギュレータ）遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＢＢ（Ｂｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒ）遺伝子、ＲＨＤ２遺伝子、ＩＮＣＷ２遺伝子、ＭＮｌ遺伝子、ＷＡＫ２遺伝子、ＷＡＫ４遺伝子、又はＡＰ２遺伝子である請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記初期特異的胚プロモーターが、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターである請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＡＡＰ１プロモーターがシロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼプロモーターがレスクェレラ・フェンドレリ（ＬＦＡＨ１２）由来の前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター、前記２Ｓ２遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、前記脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来、あるいは前記葉状子葉遺伝子プロモーターがシロイヌナズナ由来である請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は２００５年１２月１５日出願の米国特許出願第６０／７５０，９９１号（この出願を本願に援用する）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
作物改良のためのターゲットとして最も重要な形質は収量である。新しい植物種を開発することによって収量を上げようとする努力は２つのアプローチに分類できる。１つには、旱魃、低温又は塩などの非生物的ストレス条件あるいは害虫又は病原体から生じる生物ストレス条件に対する抵抗性を増大させた作物品種を育種又は操作することによって収量損を低減させることである。この方法は価値があるが、ストレス条件が存在しないと収量を根本的には向上させることができない。
【０００３】
第２のアプローチは、基本的収量が増大された新しい作物品種を育種又は操作することである。従来の育種プログラムは、最初は、様々な作物における収量向上において相当な利益を生んだ。一般的に経験されるパターンは、最初は相当な収量の利益があったが、増加的な更なる改善は益々小さくなり、得ることが困難になる。
【０００４】
分子生物学的テクノロージーに基づく近年開発されたアプローチは、原理的には、植物成長及び／又は発生の役割を担う植物遺伝子の発現のタイミング、場所、又はレベルを変えることによって収量を大幅に改善することを実現するための可能性を提供した。植物成長及び／又は発生の役割を担う植物遺伝子を同定することには、過去２０年でかなりの進歩があった。植物成長調節及びそれが結局のところ収量形質に如何に関連しているかは複雑であるために、もしあるとしても、これら遺伝子のうちのどれが収量を改善するための明確な候補となるかは依然明らかとなっていない。
【０００５】
成長及び／又は発生機能を有する植物遺伝子を同定するためになされた研究の大半は、モデル植物系シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を用いて行われている。ＲＥＶＯＬＵＴＡ（ＲＥＶ）と呼ばれるそういった遺伝子の１つは、ｒｅｖ１と呼ばれるシロイヌナズナ(Arabidopsis)において機能欠損型突然変異体として初めは同定された（非特許文献１）。この突然変異は植物の成長及び形態に多面発現効果を及ぼした。関心のあったｒｅｖ１突然変異体の１つの表現型は非常に大きな種子であった。この表現型は農業的に好ましい可能性があったが、残念ながら、花と種子の数の低減、不育(infertility)及び葉の形態が変化することなど、望ましくない形質を伴った。このｒｅｖ１突然変異体は種子が大きいことに加えて、葉、茎、花が大きい。
【０００６】
ＲＥＶ遺伝子はマップベースクローニング法（特許文献１、この特許を本願に援用する）によって同定され、転写因子群のホームドメイン−ロイシンイッパー（home domain-leucine zipper：ＨＤ−ＺＩＰ）ファミリーに属する転写因子であることが証明された。植物においては、ＨＤ−Ｚｉｐ遺伝子は、脈管組織発生、毛状突起及び根毛の発生、及び光調節応答(light-regulated response)などの多数の発生経路に関与している。ｒｅｖ１は機能欠損型突然変異体になり易かったので、逆方向反復ＲＥＶ（ＲＥＶ−ＩＲ）構築物を発現させることによって、又はＲＥＶ遺伝子の強力な過剰発現により惹起される共抑制を介して、トランスジェニックシロイヌナズナのＲＥＶ機能を不活化させる努力がなされた（特許文献１）。ＲＥＶ−ＩＲ構築物は弱いｒｅｖ１表現型を生じた。さらに大型で重い種子を含んだｒｅｖ１表現型も、ＲＥＶ過剰発現系に観察され、この系では植物全体にわたるＲＥＶトランス遺伝子の強力な構成的発現が構成的３５Ｓプロモーターによって引き起こされた。この作用はＲＥＶｍＲＮＡレベルの増大に相関しており、それが内因性ＲＥＶ遺伝子の共抑制に起因するものではないことを示していることは興味深い。抑制ではなくＲＥＶ過剰発現が種子サイズを増大させたという事実は重要であった。これはその事実がｒｅｖ１突然変異体に関する従来の研究に基づいて予期されなかったことによる。
【０００７】
植物全体にわたるＲＥＶトランス遺伝子の強力な構成的発現はｒｅｖ１突然変異体の大きな種子表現型を模倣したが、ｒｅｖ１突然変異体について見られる望ましくない表現型も複製した。ＲＥＶトランス遺伝子の構成的過剰発現の技術的に単純なアプローチにより大きな種子サイズ表現型を得る能力は有望であったが、望ましくない表現型はこのアプローチが商業的な農業用途には実行可能でないことを意味した。
【０００８】
多数の作物種に関してこの植物の農業的に関連する部分はその種子である。全般的な構成的ＲＥＶ過剰発現の副作用を生じずに大きな種子形質を得ることができれば、農業的に非常に有用なものとなる可能性がある。この問題を克服するために考えられる１つのアプローチは、ＲＥＶ過剰発現を特異的に種子に限定することである。ＲＥＶトランス遺伝子発現を引き起こすのに用いることのできる可能性のある多数の種子特異的プロモーターが既に周知であり、特徴付けされているが、種子に限定されたＲＥＶ過剰発現が、原理上、増大された種子サイズを実際に生じることを示唆する証拠はない。ある植物の種子における内因性ＲＥＶ遺伝子の自然な機能は、細胞成長又は細胞分割にあるのではなく、分裂開始及び向軸性の細胞運命決定（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）にあることが周知である。また、３５Ｓ／ＲＥＶ過剰発現植物における大きな種子サイズ表現型が、種子における又は胚発生中におけるＲＥＶの過剰発現に起因するか、あるいはそれに代わり、植物組織全体にわたるＲＥＶ過剰発現によって生じる植物の全体的な成長や発生に対する作用に起因するものかどうかは分かっていない。
【０００９】
種子サイズ決定に影響するであろう種子におけるＲＥＶの生物学的機能が知られていないことに加え、ＲＥＶトランス遺伝子を過剰発現させて種子サイズの増大を実現する試みにとって種子のどの部分又は種子発生中のどの段階が最良であるかを示す情報がない。
【特許文献１】ＷＯ０１／３３９４４
【特許文献２】ＷＯ２００４／０６３３７９
【特許文献３】米国特許第５，５１６，６６８号
【特許文献４】米国特許第５，８２４，８５７号
【特許文献５】米国特許第５，９５５，３６２号
【特許文献６】米国特許第５，９６９，２１３号
【特許文献７】米国特許第５，７８０，７９８号
【特許文献８】米国特許第５，９５９，１７９号
【特許文献９】米国特許第５，９１４，４５１号
【特許文献１０】米国特許第５，５９１，６１６号
【特許文献１１】米国特許第５，４６４，７６５号
【特許文献１２】米国特許第５，９６８，８３０号
【特許文献１３】米国特許第５，９６９，２１５号
【特許文献１４】米国特許第５，７３１，１７９号
【特許文献１５】米国特許第５，７１２，１３５号
【特許文献１６】ＷＯ０１／３３９４４Ａ１号
【非特許文献１】Ｔａｌｂｅｒｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：２７２３〜２７３５， １９９５
【非特許文献２】Ｏｔｓｕｇａら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２５：２２３〜２３６、２００１
【非特許文献３】ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ及びＢａｒｔｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：２９３５〜２９４２（１９９８）
【非特許文献４】ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：７０９〜７１３、２００１
【非特許文献５】Ｅｍｅｒｙら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ  １３：１７６８〜１７７４、２００３
【非特許文献６】Ｂａｒｒｅｒｏら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ９１：５９９〜６０３、２００３
【非特許文献７】Ｙｏｎｇ−Ｌｉｎｇ  Ｒｕａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：９５２〜９６４、２００３
【非特許文献８】Ｉｎ−Ｃｈｅｏｌ  Ｊａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３３：５３１ 〜５４１、２００３
【非特許文献９】ｄｅｌ  Ｐｏｚｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：２２２４〜２２３５、２００６
【非特許文献１０】Ｘｕｅｌｕ及びＣｈｏｒｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１１１８〜１１２２、２００６
【非特許文献１１】Ｗａｎｇら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ８：８５５〜８６５、２００５
【非特許文献１２】Ｈｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４７：１〜９、２００６
【非特許文献１３】Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：１０２０〜１０３３、２００３
【非特許文献１４】Ｈａｂｅｒｅｒら、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．２１２：５４２〜５５０、２００２
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１７２８〜１７３１，２００３
【非特許文献１６】Ｒｙａｎら、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．１３８：４９〜５８、１９９８
【非特許文献１７】Ｈｅｍｓｌｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：２５５４〜２５６３、２００５
【非特許文献１８】Ｄｉｓｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１６：２７２〜２７９、２００６
【非特許文献１９】Ｆｏｒｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：４４２〜４４６、２００３
【非特許文献２０】Ｖｉｌｈａｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：２３〜３０、２００２
【非特許文献２１】Ｗａｇｎｅｒ及びＫｏｈｏｒｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：３０３〜３１８、２００１，
【非特許文献２２】ＬａＩＩｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：１３１７〜１３３１、２００１
【非特許文献２３】Ｋｏｈｏｒｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４６：３０７〜３１６、２００６
【非特許文献２４】Ｍａｓａ−Ｏｈｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：３１２３〜３１２８、２００５
【非特許文献２５】Ｉｎａｇａｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：８７９〜８９２、２００６
【非特許文献２６】Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５〜１０９１９、１９９２
【非特許文献２７】Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、９９７
【非特許文献２８】Ｓｍｉｔｈら、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１
【非特許文献２９】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３、１９７０
【非特許文献３０】Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４〜２４４８、１９８８
【非特許文献３１】Ｆｅｎｇら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０、１９８７
【非特許文献３２】Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３、１９８９
【非特許文献３３】Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、１９９０
【非特許文献３４】Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５〜１０９１９、１９９２
【非特許文献３５】Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５８７７、１９９３
【非特許文献３６】Ｈｉｒｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４：５３５〜５４４、１９９８
【非特許文献３７】Ｂｒｏｕｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３：２０１〜２１０、１９９８
【非特許文献３８】Ｇｕｅｒｃｈｅら、Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ２：４６９〜４７８、１９９０
【非特許文献３９】Ｒｏｓｓａｋら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．４６：７１７〜７１５、２００１
【非特許文献４０】Ｋｒｏｊら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：６０６５〜６０７３、２００３
【非特許文献４１】Ｐｉｎｙｏｐｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：８５〜８８、２００３
【非特許文献４２】Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．９：７０３〜７１５、１９９７
【非特許文献４３】Ｄｅｖｉｃら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９：３８７〜３９８、１９９９
【非特許文献４４】Ｌｅｈｔｉ−Ｓｈｉｕら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．５８：８９〜１０７、２００５
【非特許文献４５】Ｋｏｈｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１７：１５４０〜１５５３、２００３
【非特許文献４６】Ｈａｓｌｅｋａｓら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．３６：８３３〜８４５、１９９８
【非特許文献４７】Ｈａｓｌｅｋａｓら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．５３：３１３〜３２６、２００３
【非特許文献４８】Ｃｕｓｈｉｎｇら、Ｐｌａｎｔａ  ２２１：４２４〜４３６、２００５
【非特許文献４９】Ｋｗｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５：５〜１８、２００３
【非特許文献５０】Ｌｏｔａｎら、Ｃｅｌｌ  ９３：１１９５〜１２０５、１９９８
【非特許文献５１】Ｄｅｂｅａｕｊｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：８５３〜８７１、２００１
【非特許文献５２】Ｎｅｓｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：２４６３〜２４７９、２００２
【非特許文献５３】Ｚｏｕ及びＴａｙｌｏｒ、Ｇｅｎｅ  １９６：２９１〜２９５、１９９７
【非特許文献５４】Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：１３３７〜１３５０、１９９９
【非特許文献５５】Ｔｓｕｃｈｉｙａら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３７：７３〜８１、２００４
【非特許文献５６】Ｓａｇａｓｓｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１３８〜１４９、２００２
【非特許文献５７】Ｎｅｓｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：１８６３〜１８７８、２０００
【非特許文献５８】Ｌｉｎ及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ  ５０：１１３９〜１１４７、１９９９
【非特許文献５９】Ｐｏｓｔｍａ−Ｈａａｒｓｍａら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３９：２５７〜２７１、１９９９
【非特許文献６０】Ｐｌａｎｔら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．２５：１９３〜２０５、１９９４
【非特許文献６１】Ｋｅｄｄｉｅら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．２４：３２７〜３４０、１９９４
【非特許文献６２】Ｎｇら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．５４：２５〜３８、２００４
【非特許文献６３】Ｐａｒｃｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：１５６７〜１５８２、１９９４
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【非特許文献６５】Ｂｕｓｔｏｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８３９〜８５４、１９８９
【非特許文献６６】Ｇｒｅｅｎら、ＥＭＢＯＪ．７：４０３５〜４０４４、１９８８
【非特許文献６７】Ｍｅｉｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ３：３０９〜３１６、１９９１
【非特許文献６８】Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：１０６９〜１０７９、１９９６
【非特許文献６９】Ｈｏｅｃｋｅｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９〜１８１、１９８３
【非特許文献７０】Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ８：２３８、１９８９
【非特許文献７１】Ａｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１：３０１〜３０５、１９８６
【非特許文献７２】Ｈｏｏｙｋａａｓ、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１３：３２７〜３３６、１９８９
【非特許文献７３】Ｇｒａｈａｍら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：５４６、１９７８）
【非特許文献７４】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）
【非特許文献７５】Ｋａｗａｉら、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２、１９８４
【非特許文献７６】Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１６３、１９８０
【非特許文献７７】Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１ ：８４１、１９８２
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【非特許文献８０】Ｖａｓｉｌ、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，２５：９２５〜９３７、１９９４
【非特許文献８１】Ｋｏｍａｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１：１６１〜１６５、１９９８（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）
【非特許文献８２】Ｌｏｏｐｓｔｒａら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１５：１〜９、１９９０
【非特許文献８３】Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１７：４４１〜４５２、１９９０
【非特許文献８４】Ｅｉｍｅｒｔら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１９：４８５〜４９０、１９９２
【非特許文献８５】Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１〜２８２、１９９４
【非特許文献８６】Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．３５：２０５〜２１８、１９９７
【非特許文献８７】Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．２２：４９１〜５０６、１９９３
【非特許文献８８】Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：２０４〜２０７、１９８８
【非特許文献８９】Ｂａｔｅｓ、Ｍｅｔｈ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．１１１：３５９〜３６６， １９９９
【非特許文献９０】Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、Ｍｅｔｈ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．１１１：３６７〜３７３， １９９９
【非特許文献９１】Ｌｙｚｎｉｋら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．１３：１５１〜１６１、１９８９
【非特許文献９２】Ｄａｔｔａら、Ｍｅｔｈ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．  １１１ ：３３５〜３３４、１９９９
【非特許文献９３】Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０〜４４４、１９８９
【非特許文献９４】Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１５３４〜１５３８、１９８８
【非特許文献９５】Ｒｅｇｉｓｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．２５：９５１〜９６１， １９９４
【非特許文献９６】Ｂａｒｃｅｌｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：５８３〜５９２、１９９４
【非特許文献９７】Ｖａｓｉｌら、Ｍｅｔｈ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．１１１：３４９〜３５８、１９９９
【非特許文献９８】Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．３５：１９７〜２０３、１９９７
【非特許文献９９】Ｆｉｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：５９〜８０、１９９９
【非特許文献１００】Ｂｉｒｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：２９７、１９９７
【非特許文献１０１】Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、Ｅｘｐ．Ａｇｒｉｃ．３３：１５〜３３、１９９７
【非特許文献１０２】Ｒｏｓｓａｋら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４６：７１７〜７２５，２００１
【非特許文献１０３】ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１４：２６９〜２７６、１９９０
【非特許文献１０４】Ｓｉｍｍｏｎｄｓ及びＤｏｎａｌｄｓｏｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：４８５〜４９０、２０００
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、当該遺伝子を過剰発現させない野生型植物に比して種子サイズの増大が得られる、胚発生の初期中に成長及び／又は発生関連遺伝子の胚特異的過剰発現を提供する。特定の実施態様では、ＲＥＶ遺伝子は初期胚特異的プロモーターを用いて過剰発現された。種子サイズの増大形質は、植物全体にわたるＲＥＶの構成的過剰発現について見られる有害な副作用を生じることなく達成された。また、ＲＥＶの胚特異的過剰発現は、野生型植物に比して植物１つ当たりの総種子数が増大するという予期しなかった結果を生じた。総種子数の増大は、鞘１つ当たりの種子数の増大、植物１つ当たりの総状花序数の増大、総状花序１つ当たりの鞘数の増大、種子不稔率の低減、あるいはこれら作用の組み合わせから生じた。これと共に、発生中の胚におけるＲＥＶの過剰発現から生じる増大された種子サイズ及び増大された種子数は、野生型植物に比して総収量を相当に増大させ、また植物成長及び／又は発生に関連する遺伝子を初期胚特異的プロモーターに関連して過剰発現させて植物収量を増大できることを実証するものである。
【００１１】
本発明はトランスジェニック植物における種子サイズ及び／又は種子数を増大させる方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、植物成長及び／又は発生に関連する遺伝子と作用的に関連する初期特異的胚プロモーターを用いて、トランスジェニック植物の発生中の種子において、その遺伝子及び／又はその遺伝子によってコードされたタンパク質を過剰発現させることに関連する。トランスジェニック植物において種子発生のこの初期中に遺伝子を過剰発現させることは、野生型植物に比して、トランスジェニック植物において種子生産量を増大させ及び／又は種子サイズを増大させる。
【００１２】
本発明の特定の実施態様では、ＲＥＶ遺伝子を初期特異的胚プロモーターと作用的に関連させて、トランスジェニック植物の発生中の種子においてＲＥＶタンパク質を過剰発現させた。種子発生のこの初期中にＲＥＶを過剰発現させることにより、驚くべきことに、ＲＥＶを植物全体にわたって過剰発現させたときに見られた有害な副作用を生じることなく、トランスジェニック植物において種子サイズ及び種子生産量が増大された。
【００１３】
初期胚発生中の種子において植物成長及び／又は発生に関連する遺伝子を過剰発現させることを含む、植物において種子サイズを増大させる方法も提供される。特に、この方法は初期特異的胚プロモーターの制御下で成長及び／又は発生関連遺伝子を種子に過剰発現させることを含む。初期特異的胚プロモーターは植物に対してヘテロ接合性又はホモ接合性である。本発明のある種の実施態様では、プロモーターは、ＡＡＰ１などのアミノ酸パーミアーゼ遺伝子(amino acid permease gen)、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子、ＦＡＥ１などの脂肪酸伸長酵素遺伝子、又は葉状子葉遺伝子に関連する初期特異的プロモーターである。本発明において有用な特定のプロモーターには、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のＡＡＰ１プロモーター、レスクェレラ・フェンドレリ(Lesquerella fendleri)由来のオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター（ＬＦＡＨ１２）、２Ｓ２遺伝子プロモーター、又はシロイヌナズナ由来の葉状子葉遺伝子ＬＥＣ２プロモーターを挙げることができる。
【００１４】
本発明の特定の実施態様では、ＲＥＶ遺伝子を初期特異的胚プロモーターと作用的に関連させた。この方法では、ＲＥＶ遺伝子が種子の初期発生中に過剰発現され、野生型植物に比して種子サイズ及び種子数が増大される。
【００１５】
本発明の方法を用いて、単子葉植物又は双子葉植物として特徴付けされる植物において種子サイズ及び／又は種子数を増大させることができる。特に、この方法を用いて、アブラナ科(Brassicacea)(Cruciferae)、イネ科(Gramineae)、アオイ科(Malvaceae)、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅのメンバーである植物において種子サイズ及び／又は種子数を増大させることができる。本発明の方法に使用するのに関心のある特定の植物には、キャノーラ(canola)、トウモロコシ(corn)、カメリナ(camelina)、綿花(cotton)、ムラサキウマゴヤシ(alfalfa)、大豆(soybean)、小麦(wheat)、イネ(rice)、又はオオムギ(barley)が挙げられる。
【００１６】
また、本発明は、１つ以上の制御配列に作用的に連結された植物成長及び／又は発生に関連する遺伝子核酸配列を含む遺伝子構築物を提供する。１つ以上の制御配列は胚発生中の遺伝子の発現を促進できる。特に、本発明の遺伝子構築物は初期特異的胚プロモーターを含んだ制御配列を含む。この初期特異的胚プロモーターは、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子、２Ｓ２アルブミン遺伝子（２Ｓ２）、脂肪酸伸長酵素遺伝子（ＦＡＥ１）、又は葉状子葉遺伝子（ＬＥＣ２）に関連するプロモーターを含む。本発明の典型的な遺伝子構築物は、シロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター、レスクェレラ・フェンドレリ由来のオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーター（ＬＦＡＨ１２）、シロイヌナズナ由来の２Ｓ２遺伝子プロモーター、シロイヌナズナ由来の脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーター、又はシロイヌナズナ由来の葉状子葉遺伝子２プロモーターを含む。 本発明の特定の遺伝子構築物はシロイヌナズナ由来のＲＥＶ遺伝子に作用的に関連する初期特異的胚プロモーターを含む。この遺伝子構築物はまた作用的に関連するポリＡ配列を含む。
【００１７】
本発明はまた種子サイズ及び／又は種子数が増大されたトランスジェニック植物を生産する方法を提供する。この方法は（ａ）植物又は植物細胞に上記遺伝子構築物を導入し、再生及び成熟移植物成長を促進する条件下で、該遺伝子構築物を含む植物又は植物細胞を栽培することを含む。典型的には、この方法は相当する野生型植物に比して種子サイズ及び／又は種子数が増大されたトランスジェニック植物を生産する。上記遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物は単子葉植物又は双子葉植物であり、ここでは特に、単子葉植物はイネ科のメンバーである。特に関心のあるイネ科由来の植物には、イネ、オート麦（ｏａｔ）、トウモロコシ、又は小麦が挙げられる。更に、本発明のトランスジェニック植物はアブラナ科(Brassicacea(Cruciferae)、アオイ科(Malvaceae)、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科の植物である。特に、その場合において、トランスジェニック植物は大豆、綿花、カメリナ、ムラサキウマゴヤシ、又はキャノーラである。
【００１８】
本発明はまた初期特異的胚プロモーターと機能的に関連されたときに植物収量を増大させる遺伝子を選択する方法を提供する。この方法は、初期特異的胚プロモーターと機能的に関連する植物成長及び／又は発生に関連する遺伝子を含んだ発現ベクターを構築すること、発現ベクターを用いて植物細胞をトランスフェクトしてトランスジェニック植物を形成すること、トランスジェニック植物を成長させること、増大された収量を有するトランスジェニック植物を選択することを含む。収量が増大されたトランスジェニック植物を産生する遺伝子が、トランスジェニック植物を更に発生させるために選択される。本発明に用いることができる遺伝子には、限定するものではないが、例えば、ＣＡＰ（シクラーゼ関連タンパク質）遺伝子、イネヒストンデアセチラーゼ１遺伝子、Ｅ２Ｆｃ遺伝子、ＢＫＩ遺伝子、ＢＲＩｌ遺伝子、ＡＲＬ(Argos-Like)遺伝子、ｂｒｉｌ（ブラシノステロイドホルモン認識＝brassinosteroid hormone perception）遺伝子、ＦＡＴＢ遺伝子、ペピーノ(Pepino)遺伝子、ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナリング調節因子）遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＢＢ(Big Brother)遺伝子、ＲＨＤ２遺伝子、ＩＮＣＷ２遺伝子、ＭＮｌ遺伝子、ＷＡＫ２遺伝子、ＷＡＫ４遺伝子、ＡＰ２遺伝子、等が上げられる。
【００１９】
図１は初期胚発生中の胚特異的プロモーターの発現プロフィールを示す図である。シロイヌナズナ胚発生中の大まかな段階：初期球状＝授粉後（ＤＡＰ）２日目、心臓＝授粉後４日目、トルペド（ｔｏｒｐｅｄｏ）＝授粉後６日目、ｗａｌｋｉｎｇ  ｓｔｉｃｋ＝授粉後７日目、初期成熟胚＝授粉後８日目
【００２０】
図２は、ＲＥＶＯＬＵＴＡ及び非ＲＥＶＯＬＵＴＡのＨＤ−ＺＩＰＩＩＩクラス転写因子のある領域のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列のこの領域はＨＤ−ＺＩＰＩＩＩタンパク質をタンパク質のＲＥＶＯＬＵＴＡ又は非ＲＥＶＯＬＵＴＡクラスに属するものと定めるアミノ酸配列の特徴的な差を含む。配列の四角で囲んだ部分は、非ＲＥＶＯＬＵＴＡ  ＨＤ−ＺＩＰＩＩＩタンパク質を画定するアミノ酸配列挿入の部位を示す。ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質はアミノ酸配列挿入が無いことによって画定される。
Ａｔｈｂ−９（シロイヌナズナ；配列番号：２）；Ａｔｈｂ−１４（シロイヌナズナ；配列番号：３）；ＲＥＶ（シロイヌナズナ；配列番号：４）；ＢｎＬｆＲＥＶ（セイヨウアブラナ；配列番号：５）； ＯｓＲＥＶｌ（イネ；配列番号：６）；ＺｍＲＬＤｌ（トウモロコシ；配列番号：７）；ＯｓＲＥＶ２（イネ；配列番号：８）；Ａｔｈｂ−１５（シロイヌナズナ；配列番号：９）；及びＡｔｈｂ−８（シロイヌナズナ；配列番号：１０）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は野生型植物に比して種子サイズ及び／又は種子数が増大された植物を生産するのに有用な方法及び組成物を提供する。特に、この方法は植物の胚において、植物成長及び／又は発生に関与する遺伝子を過剰発現させることを含む。トランス遺伝子の過剰発現の結果、植物において、種子サイズが増大され及び／又は種子数が増大する。特定の実施態様では、ＲＥＶＯＬＵＴＡ（ＲＥＶ）遺伝子を過剰発現させた。本発明の各方法におけるＲＥＶトランス遺伝子は、胚発生中に発現を開始する、特に初期特異的胚発生中に発現を開始するプロモーターに調節される。予期せぬことに、初期胚発生中のＲＥＶトランス遺伝子の過剰発現は、種子を大きく及び／又は多くした。
【００２２】
植物成長及び／又は発生に関与する遺伝子の過剰発現により種子サイズが増大されるかどうかを決定するための最初の試みとして、ＲＥＶ遺伝子を種子にターゲッティングし、ＲＥＶ発現を惹起するために胚特異的プロモーターを含むＲＥＶトランス遺伝子構築物を試験した。シロイヌナズナ胚発生中に発現プロフィールが十分に特徴付けされた多数の胚特異的プロモーターの利用可能性により、幾つかの異なるが、重なり合う胚発生相にＲＥＶ過剰発現をターゲッティングしたトランスジェニック植物を作製することが可能となった。シロイヌナズナＲＥＶトランス遺伝子構築物をキャノーラに導入して試験に供した。直接キャノーラに導入することの論拠は、シロイヌナズナゲノムがキャノーラに非常に関連しているので、シロイヌナズナにおいて決定されたようなプロモーターに特徴的な既知の発現をキャノーラに持ち込み易く、またキャノーラが作物種であることにある。キャノーラの種子サイズへの作用を実証することは、直接的な農業的関連を有するであろう。第２の例では、シロイヌナズナＲＥＶである。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、植物成長及び／又は発生関連遺伝子とは、植物の成長速度、全体サイズ、組織サイズ、又は組織数を決定する役割を担うか、あるいは、組織同一性及び形態の決定に至る植物発生プログラムの役割を担う遺伝子のことである。そういった成長及び発生関連遺伝子は、突然変位、過剰発現、又は発現の抑制によるその機能の改変が、変えられた植物成長速度、全体的な植物サイズ、組織サイズ又は数を変えるか、又は発生を変えたときに同定される。植物及び成長関連遺伝子は数多くの機構にその作用を及ぼし得る。この機構の一部には、細胞周期の調節、植物ホルモン合成／分解経路、植物ホルモンに対する感受性、細胞壁生合成、細胞同一性決定、等を含む。
【００２４】
過剰発現又は抑制分析により、多数の植物遺伝子が成長及び／又は発生の役割を担うことが明らかとなっている。成長及び／又は発生に関与することが知られており、本発明の方法において使用又は試験することのできる遺伝子の幾つかの例を以下で考察するが、限定するものではない。シロイヌナズナＣＡＰ遺伝子はＲａｓ−ｃＡＭＰシグナリング及びアクチン細胞骨格アクチン細胞骨格の調節に関与するシクラーゼ関連タンパク質をコードする。グルココルチコイド誘導プロモーターの下でＣＡＰを過剰発現させれば、表皮細胞と葉肉細胞の伸長が低減されることに起因して、アクチンフィラメントが失われ、葉のサイズが縮小する（非特許文献６）。綿花においてショ糖合成酵素遺伝子の発現を抑制すれば、細胞線維長は低減され、繊維細胞は小さく、少なくなる（非特許文献７）。トランスジェニックイネにおいてＡＢＡ誘導プロモーターを用いてイネヒストンデアセチラーゼ１遺伝子を過剰発現させれば、その結果、野生型に比して、成長速度及び異常なシュート及び根組織が増大した植物が得られた（非特許文献８）。ＲＮＡｉによりシロイヌナズナにおいてＥ２Ｆｃを抑制すれば、葉、分裂組織、及び内鞘細胞の増殖活性が増大される。器官内の細胞は小さくなったものの、野生型よりも数が多くなり、葉においては倍数性レベルが低減された（非特許文献９）。ＲＮＡｉによるＢＫＩ遺伝子の抑制により胚軸長が増大された幼苗が得られ、ＢＫＩの過剰発現により矮性植物が得られた（非特許文献１０）。部分的に構成的なステロイド受容体ＢＲＩｌを発現するトランスジェニック植物は長い胚軸を有する（非特許文献１１）。シロイヌナズナにおいてＡｒｇｏｓ−Ｌｉｋｅ（ＡＲＬ）を抑制すると、子葉、葉、他の側方器官は小さくなったが、過剰発現させたところ、反対の作用が生じた。器官サイズの変化は、細胞数によるものではなく、細胞サイズに起因する可能性がある（非特許文献１２）。
【００２５】
成長及び／又は発生表現型を改変させる突然変異体を有する植物を分析したところ、植物の生長と発生の役割を担う多数の遺伝子が同定された。ブラシノステロイドホルモン知覚、ｂｒｉｌ−５に影響を及ぼす突然変異体は、矮性植物を生じる（非特許文献１１）。アシル−アシルキャリアタンパク質チオエステラーゼをコードするシロイヌナズナＦＡＴＢ遺伝子においてＴ−ＤＮＡ挿入（ノックアウト）したところ、成長速度、生体重及び発芽率が低減された（非特許文献１３）。推定上の抗ホスファターゼであるペピーノにおける機能欠損型突然変異が、茎頂分裂組織に腫瘍様細胞増殖を示し、異常な葉を過剰に生じた（非特許文献１４）。シロイヌナズナＲＧＳ遺伝子（Ｇタンパク質シグナリングの調節因子）は Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の構造を有しており、ＲＧＳボックスを含む。ＲＧＳタンパク質はＧａサブユニットの不活化を加速し、ひいてはＧＰＣＲシグナリングを低減させる。ヌルｒｇｓ突然変異体は、暗所で成長させた胚軸において細胞伸長を増大させ、明所で成長させた根において細胞産生を増大した（非特許文献１５）。シロイヌナズナＴＩＰｌ遺伝子は根毛発生の役割を担い、細胞成長の役割も行う。ｔｉｐ１−２突然変異体はより小さなロゼット、縮小された高さ、及びより短い節間を有する（非特許文献１６、非特許文献１７）。非常に小さなＢｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒ  ｍＲＮＡを生じるか、又はそれを全く生じないＢｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒ（ＢＢ）遺伝子の突然変異体（染色体再配置又はＴ−ＤＮＡ挿入）は、花器は大きくなり、花の生体量(flower biomass)は多くなり、茎は厚くなる。逆に、Ｂｉｇ  Ｂｒｏｔｈｅｒを過剰発現させると、花器は小さく、花の生体量は少なく、茎は薄くなり、葉のサイズは縮小する。ＢＢは細胞数を変えることもある（非特許文献１８）。ＲＨＤ２遺伝子は反応性酸素種の根毛中への蓄積及びこれに続くカルシウムチャネルの活性化にとって重要なＮＡＤＰＨオキシダーゼをコードする。ｒｈｄ２突然変異体は根の先端成長細胞(tip growing cell)の細胞増殖に障害がある（非特許文献１９）。トウモロコシにおける小さな突然変異は、ＩＮＣＷ２遺伝子から発現される細胞壁型インベルターゼの欠損を生じさせる。ｍｎ１突然変異体の細胞は野生型よりも小さく、ｍｎ１種子突然変異体は、野生型種子の内胚乳重量の２０％しかない。細胞増殖はｍｎ１内胚乳の周辺層の細胞内で弱められることがあり、これら細胞の有糸分裂活性を低下させることがある（非特許文献２０）。ＷＡＫ２、ｗａｋ２−１のＴ−ＤＮＡ挿入突然変異体は根において細胞伸長を低減させた。ＷＡＫ２は液胞型インベルターゼ活性の調節により細胞増殖を制御し得る。植物においてＷＡＫ２又はＷＡＫ４の誘発性アンチセンスの発現が、細胞伸長を妨げ、矮性植物を産む（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。シロイヌナズナ遺伝子ＡＰ２は、花器の同定及び花芽分裂組織同定の確立の役割を担う。ＡＰ２の機能欠損突然変異は、野生型に比して種子質量の増大を生じた（非特許文献２４）。ｔｅｂ突然変異体は根が短く、葉が鋸歯状で、帯化がある。ｔｅｂ突然変異体は、Ｇ２／Ｍ細胞周期進行の異常によって生じ得る細胞分割の異常を示す（非特許文献２５）。
【００２６】
用語「成長及び／又は発生遺伝子」又は「成長及び／又は発生トランス遺伝子」は本明細書で用いられる場合、遺伝子によってコードされたヌクレオチド又はタンパク質の発現及び／又は産生をコード又は促進する任意のポリヌクレオチド配列を意味する。したがって、用語「成長及び／又は発生遺伝子」又は「成長及び／又は発生トランス遺伝子」は、ヌクレオチド及び／又はタンパク質コード配列に隣接(flank)する配列を含み得る。例えば、この配列はタンパク質コード配列（エクソン）、介在配列（イントロン）、遺伝子の正常な発現に必要な配列を含む隣接する５’及び３’ＤＮＡ領域（すなわち、それぞれプロモーター領域とポリＡ追加領域、及び任意のエンハンサー配列）であるヌクレオチド配列を含み得る。
【００２７】
本明細書では、用語「成長及び／又は発生タンパク質」、「成長及び／又は発生ホモログ」又は「成長及び／又は発生関連オルソログ」は、植物の成長速度、全体的サイズ、組織サイズ、又は組織数を調節するか、又は組織の同一性及び形態（本発明の方法を実施する際に利用される場合）の決定に繋がる発生プログラムを調節する能力を有し、かつ、遺伝子のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一、更に典型的には少なくとも約７５ ％同一、より典型的には少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、タンパク質を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「胚特異的遺伝子」とは、植物において胚発生中に優先的に発現される遺伝子である。この開示のために、胚発生は、接合子における最初の細胞分裂から始まり、（成熟、乾燥、休眠を特徴とする）胚発生後期まで続き、成熟及び乾燥した種子の生成で終了する。胚特異的遺伝子は、「初期特異的」及び「後期特異的」としてさらに分類することができる。初期特異的遺伝子は、胚形態形成の終了まで胚において発現される遺伝子である。後期特異的遺伝子は、成熟から、成熟し乾燥した種子の生成まで発現される遺伝子である。初期胚発生中に発現を開始し、初期特異的である胚特異的遺伝子の例を図１に示す。
【００２９】
「異種配列」とは、異なる種から始まるか、あるいは同じ種から始まる場合には、その元の形態から実質的に改変されたオリゴヌクレオチド配列である。例えば、構造遺伝子に作用的に連結されたヘテロ接合プロモーターは、構造遺伝子が由来する種とは異なる種からのもであるか、同じ種からのものである場合には、その元の形態から実質的に改変されたものである。
【００３０】
用語「ベクター」とは典型的には二本鎖のＤＮＡ断片を指し、外来ＤＮＡの断片に挿入され得る。ベクター又はレプリコンは例えば、プラスミド性又はウイルス性のものであり得る。ベクターはベクターの自己複製を宿主細胞において促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。この開示の文脈において用語「レプリコン」はまた、ベクター配列の宿主染色体へ再結合をターゲッティングするか、あるいは促進するポリヌクレオチド配列領域を含む。また、外来ＤＮＡはまず、例えばＤＮＡウイルスベクターに挿入され得るが、このウイルスベクターＤＮＡの宿主細胞への形質転換は、ウイルスＤＮＡのウイルスＲＮＡベクター分子への転換を生じ得る。外来ＤＮＡはヘテロ接合ＤＮＡであるとして定義され、宿主細胞には天然には見出されないＤＮＡであり、例えば、ベクター分子を複製し、選択可能又はスクリーニング可能なマーカー又はトランス遺伝子をコードする。ベクターは外来又はヘテロ接合ＤＮＡを適した宿主細胞に輸送するのに用いられる。宿主細胞に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立して、又はそれと同時に複製することができ、ベクターの幾つかのコピー及びその挿入されたＤＮＡが生成され得る。あるいは、ベクターは外来又はヘテロ接合ＤＮＡの宿主染色体への挿入をターゲティングすることができる。また、ベクターは挿入されたＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又は挿入されたＤＮＡのＲＮＡの複数のコピーへの複製を生じさせる必要な要素を含み得る。幾つかの発現ベクターは追加で、ｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素を含む。挿入されたＤＮＡによってコードされたｍＲＮＡ及びポリペプチドの多数の分子は、このようにして迅速に合成され得る。
【００３１】
用語「トランス遺伝子ベクター」とは挿入されたＤＮＡ断片を含んだベクターを指し、「トランス遺伝子」はｍＲＮＡに転写されるか、宿主細胞内でＲＮＡとして複製される。用語「トランス遺伝子」とは、ＲＮＡに転換された挿入されたＤＮＡの部分を指すだけでなく、ＲＮＡの転写又は複製に必要なベクターの部分も指す、また、トランス遺伝子はタンパク質を産生することができるオープン・リーディング・フレームを含んだポリヌクレオチド配列を必ずしも含む必要はない。
【００３２】
用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」、「形質転換」は、胞へのＤＮＡの導入を意味する。この細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、原核細胞又は真核細胞であってよい。典型的な原核宿主細胞には種々のＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。典型的な真核宿主細胞は、植物細胞（例えば、キャノーラ細胞、綿花細胞、カメリナ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、大豆細胞、イネ細胞、オートムギ細胞、小麦細胞、オオムギ細胞、又はトウモロコシ細胞、等）、酵母細胞、昆虫細胞、又は動物である。導入されたＤＮＡは通常、挿入されたＤＮＡ片を含んだベクターの形態である。導入されるＤＮＡ配列は宿主細胞と同じ種から、又は宿主細胞とは異なる種から得てよいか、又は、一部の外来ＤＮＡと一部の宿主種由来のＤＮＡを含んだハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。
【００３３】
用語「植物」は植物全体、植物の器官（例えば、葉、幹、花、根など）、種子及び植物細胞（組織培養細胞を含む）並びにこれらの後代を含む。本発明の方法において使用可能なクラスの植物は、一般に、形質転換技術を受けやすい高等植物のクラスと同じ程度広く、単子葉植物や双子葉植物のほか、藻類などの下等植物を含む。これには多倍数体、二倍体、半数体、半接合体を含む種々のレベルの倍数性植物が挙げられる。
【００３４】
「異種配列」は外来種からの配列であるか、同種からの場合は、その元の形態から実質的に改変された配列である。例えば、構造遺伝子に作用的に結合されたヘテロ接合プロモーターは、構造遺伝子が由来する種とは異なる種からのもであるか、同じ種からのものである場合には、その元の形態から実質的に改変されたものである。
【００３５】
本明細書では、用語「ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子」又は「ＲＥＶＯＬＵＴＡトランス遺伝子」とは、ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質の発現及び／又は産生をコード又は促進する任意のポリヌクレオチド配列を意味するのに用いられる。したがって、用語「ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子」「ＲＥＶＯＬＵＴＡトランス遺伝子」は、ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質コード配列に隣接する配列を含み得る。例えば、この配列は、タンパク質コード配列（エクソン）、介在配列（イントロン）、ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子の正常な発現に必要な配列を含んだ５’ ＤＮＡ領域及び３’ＤＮＡ領域（すなわち、それぞれプロモーター領域及びポリＡ追加領域、並びに任意のエンハンサー配列）であるヌクレオチド配列を含み得る。
【００３６】
本明細書では、用語「ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質」、「ＲＥＶＯＬＵＴＡホモログ」又は「ＲＥＶＯＬＵＴＡオルソログ」とは、植物細胞分割（本発明の方法を実施する際に利用される場合）調節する能力を有し、かつ、（本願に援用した）特許文献１に記載のＲＥＶＯＬＵＴＡに関するアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一、更に典型的には少なくとも約７５ ％同一、より典型的には少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、タンパク質を意味するのに用いられる。
【００３７】
あるいは、本明細書では用語「ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質」「ＲＥＶＯＬＵＴＡホモログ」、又は「ＲＥＶＯＬＵＴＡオルソログ」とは、植物転写因子のＨＤ−ＺＩＰＩＩＩクラスの非ＲＥＶＯＬＵＴＡメンバーとは異なるものとして同定されるＲＥＶＯＬＴＡタンパク質を意味するのに用いられる。タンパク質のＨＤ−ＺＩＰＩＩＩクラスのＲＥＶＯＬＵＴＡメンバーは、特許文献１に記載され、図２に示したＲＥＶＯＬＵＴＡアミノ酸配列のアミノ酸残基１４６と１４７との間の非ＲＥＶＯＬＵＴＡ  ＨＤ−ＺＩＰＩＩＩタンパク質に存在する特徴的なアミノ酸配列挿入が欠損しているか、又は存在しないことによって特徴付けられる。図２では、ａｔｈｂ−８、ａｔｈｂ−９、ａｔｈｂ−１４、ａｔｈｂ−１５で示したシロイヌナズナ由来のホメオボックス転写因子は、非ＲＥＶＯＬＵＴＡ  ＨＤ−ＺＩＰＩＩＩタンパク質であり、いずれもＲＥＶＯＬＵＴＡアミノ酸配列のアミノ酸１４６と１４７との間に特徴的なアミノ酸配列挿入を有する。図２の５つのＲＥＶＯＬＵＴＡ配列はすべて、ＲＥＶＯＬＵＴＡアミノ酸配列のこの場所においてアミノ酸挿入を欠損している。このアミノ酸配列挿入が無いことは、ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質の特徴的かつ決定的な特徴である。
【００３８】
用語「パーセント同一性(percent identity)」とは、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列が以下に示すようなコンピュータプログラムを用いて並んで整列されたときに同じ相対位置を占めるアミノ酸又はヌクレオチドのパーセントを意味する。用語「パーセント類似性(percent similarity)」とは比較された２つのタンパク質配列の関連性の程度の統計的尺度である。パーセント類似性は、化学的類似性（例えば、比較されたアミノ酸が酸性、塩基性、親水性、芳香性、等であるかどうか）に基づいて、比較されたアミノ酸の各対に数値を割り当てるコンピュータプログラム及び／又は１対の比較されたアミノ酸の一方のメンバーをコードするコドンをその対の他方のメンバーをコードするコドンに変換するのに必要となる塩基対の変化の最小数 によって測定される進化距離によって算出される。計算は２つの配列の最良のフィットの整列を可能性のあるすべての整列の反復的比較によって実験的に行った後で行われる。（非特許文献２６を参照のこと）。
【００３９】
ポリヌクレオチド配列の用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを用いた以下の記載のプログラムを用いた基準配列に比して少なくとも６０％の配列同一性、典型的には少なくとも７０％、更に典型的には、少なくとも８０％、及び最も典型的には少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者であれは、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付け等を考慮することによって、これらの値を適切に調節できることを理解できよう。
【００４０】
アミノ酸配列同一性は、例えば、以下のように決定することができる。成長及び／又は発生関連遺伝子、例えば、ＲＥＶＯＬＵＴＡによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列の部分を用い、プログラムＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．９（非特許文献２７）を用いて核酸配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース）を検索することができる。２つの（又は２以上の）ポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列比較は典型的には、２つの配列の配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性のある局所領域を同定し比較することによって実行される。本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ(comparison window)」は少なくとも約２０の連続する位置、一般的に約５０〜約２００、更に一般的には約１００〜約１５０のセグメントを指し、ここでは、配列は、２つの配列が最適に整列された後に、同じ数の連続する基準配列と比較可能である。
【００４１】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、非特許文献２８に記載のような局所的同一性又は類似性アルゴリズムによって、非特許文献２９の相同性整列アルゴリズムによって、非特許文献３０の類似性検索の方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン、サイエンスドライブ５７５所在）のコンピュータによる実施によって、又は視覚的検査によって、実施される。
【００４２】
有用なアルゴリズムの１例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、１群の関連する配列から複数の配列整列を漸進的対合整列を用いて作製し、関連性とパーセント配列同一性を示す。これはまた、この整列を作製するために使用されるクラスター化関連性を示すツリー又は系統樹をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは非特許文献３１の漸進的整列法の簡略形を使用する。使用される方法は非特許文献３２により記載された方法と類似する。このプログラムは、３００個までの配列、各々最大長５、０００ヌクレオチド又は５，０００アミノ酸を整列し得る。マルチ整列手順は、２つの最も類似する配列の対合整列で始まる。次いで、このクラスターは、その次に最も関連する配列、又は整列された配列クラスターに対して整列される。２つの配列のクラスターが、２つの個々の配列の対合整列の単純な拡張により整列される。最終的整列は、一連の漸進的対合整列により実現される。このプログラムは、特定の配列、及び配列比較領域に関するそれらのアミノ酸等価物又はヌクレオチド等価物を指定し、そしてプログラムパラメーターを指定することにより実行される。例えば、基準配列が、その配列同一性パーセント関連性を決定するために、以下のパラメーターを使用して、他の試験配列と比較され得る：デフォルトギャップウェイト（３．００）、デフォルトギャップ長ウェイト（０．１０）、重み付けエンドギャップ。
【００４３】
パーセント配列同一性とパーセント配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの他の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは非特許文献３３に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより高スコアリング配列対合（ＨＳＰ）を同定することを含み、このワードは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくつかの正の値のしきい値スコアＴと一致するか又はこの値を満足させるかのいずれかである。Ｔは隣接ワードスコアしきい値と呼ばれる（上記の非特許文献３３）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、これらのワードヒットは、累積整列スコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向でのワードヒットの拡張は、以下の場合に止められる：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘ離れる場合；累積スコアがゼロ以下になる場合（１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因して）；又はいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、Ｘは、その整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（非特許文献３４を参照のこと）整列（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【００４４】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実行する（例えば、非特許文献３５を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の表示を提供する。例えば、比較試験における最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は参照配列に類似であると見なされる。配列整列と配列類似性の分析のための追加の方法及びアルゴリズムは、当業者には周知である。
【００４５】
挿入されたポリヌクレオチド配列が転写され翻訳されて機能的ポリペプチドを産生する場合、当業者は、コドン縮重性が理由で、多くのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることを認識する。これらの変形例は用語「成長及び／又は発生遺伝子」及び「成長及び／又は発生トランス遺伝子」、並びに特定的に「ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子」及び「ＲＥＶＯＬＵＴＡトランス遺伝子」によって特定的に包含される。また、これらの用語は特定的には、遺伝子産生の機能を保持するタンパク質をコードする遺伝子配列、例えば、ＲＥＶＯＬＵＴＡに対して実質的に同一である完全長配列を含む。２つの核酸配列又はポリヌクレオチドは、２つの配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基それぞれの配列が、上記のような最大の一致に対して整列されたときに同じである場合に、「同一である」と言われる。用語「に相補的」とは、相補的配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部又は一部と同一であることを意味するのに用いられる。
【００４６】
成長及び／又は発生関連遺伝子並びに成長及び／又は発生関連タンパク質のアミノ酸配列、例えば、ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子配列及びＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質配列の変形例や改変例は、特許文献１に記載されており、これを本願に援用する。ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子などの関心のある遺伝子、ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチド配列は、任意の植物種から単離又は取得され得る。本発明の特定の実施形態では、使用されるＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子配列はシロイヌナズナからのものであるが、関心のある他の種からのＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子を用いてもよい。例えば、トウモロコシ(Zea mays)からのＲＥＶＯＬＵＴＡのためのヌクレオチド配列とアミノ酸配列が特許文献２（本願に援用する）に記載されている。
【００４７】
用語「生物学的活性、「生物学的活性のある」、「活性」、「活性のある」、「生物学的機能」、「ＲＥＶ生物学的活性」、「機能的活性のある」とは、ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質などの関心のあるタンパク質が二量化する（又はタンパク質オリゴマーに組み込まれる）能力、あるいはネイティブな野生型（例えば内因性）ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質を調節又は二量化する能力を指す。しかし、この用語はまた、ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質などの関心のあるタンパク質が、例えば、限定するものではないが、タンパク質、例えばＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質によって認識されるプロモーター領域に特異的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む他の分子と結合する及び／又は相互作用する能力（この結合及び／又は相互作用イベントは植物細胞分割を媒介し、最終的にはある表現型を与える）、あるいは、他の分子のネイティブな野生型タンパク質との結合及び／又は相互作用を調節又はもたらす能力（この結合及び／又は相互作用イベントは植物細胞分割を媒介し、最終的には関心のある遺伝子と関連する表現型を与える）も包含することを意図する。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、ＲＥＶ表現型とはＲＥＶ核酸又はタンパク質によって与えられる表現型を指すものとし、特に、種子サイズ又は種子数が示される特徴を包含する。典型的には、ＲＥＶ表現型は初期特異的胚発生中にＲＥＶを過剰発現する植物を検証することによって決定され、ここで、この植物からの種子の数とサイズは対応する親又は野生型植物の組織の種子の数とサイズと比較できる。このＲＥＶ表現型を有する植物は、ある植物集団の代表数内で種子の数及び／又はサイズの統計医学的に有意な変化を有する。
【００４９】
植物成長及び／又は発生関連遺伝子に作用的に結合され、かつ記載した本発明の方法を用いて発現されるのに適したプロモーターは典型的には、胚において著しく発現し、その他の植物組織においては発現が低いか、又は全く発現しない。特に関心があるのは、初期特異的胚発生において発現を開始するプロモーター配列である。初期特異的プロモーターとは、シロイヌナズナにおける受粉(walking stick)後７日目あるいは別の植物種における相当する段階より以前にタンパク質の発現を開始するプロモーターである。特に関心のあるプロモーター配列の例には、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＡＡＰ１）のためのプロモーター（例えば、シロイヌナズナ由来のＡＡＰ１プロモーター）（非特許文献３６）、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子のためのプロモーター（例えば、レスクェレラ・フェンドレリ由来の、ＬＦＡＨ１２で指定したプロモーター）（非特許文献３７）、２Ｓ２アルブミン遺伝子のためのプロモーター（例えば、シロイヌナズナ由来の２Ｓ２プロモーター）（非特許文献３８）、脂肪酸伸長酵素遺伝子プロモーター（ＦＡＥ１）（例えば、シロイヌナズナ由来のＦＡＥ１プロモーター）（非特許文献３９）、葉状子葉遺伝子プロモーター（ＬＥＣ２）（例えば、シロイヌナズナ由来のＬＥＣ２プロモーター）（非特許文献４０）が挙げられる。関心のある他の初期胚特異的プロモーターには、限定するものではないが、Ｓｅｅｄｓｔｉｃｋ（非特許文献４１）、Ｆｂｐ７とＦｂｐｌ１(Petunia Seedstick)（非特許文献４２）、Ｂａｎｙｕｌｓ（非特許文献４３）、ａｇｌ−１５とａｇｌ−１８（非特許文献４４）、Ｐｈｅｌ（非特許文献４５）、Ｐｅｒｌ（非特許文献４６；非特許文献４７）、ｅｍｂｌ７５（非特許文献４８）、ＬＩｌ（非特許文献４９）、Ｌｅｃｌ（非特許文献５０）、Ｆｕｓｃａ３（非特許文献４０）、ｔｔ１２（非特許文献５１）、ｔｔ１６（非特許文献５２）、Ａ−ＲＺｆ（非特許文献５３）、ＴｔＧ１（非特許文献５４；非特許文献５５）、Ｔｔ１（非特許文献５６）、ＴＴ８（非特許文献５７）、Ｇｅａ−８（ニンジン）（非特許文献５８）、Ｋｎｏｘ（イネ）（非特許文献５９）、Ｏｌｅｏｓｉｎ（非特許文献６０；非特許文献６１）、ＡＢＩ３（非特許文献６２；非特許文献６３）、等が挙げられる。
【００５０】
本発明に適したプロモーターは、形質転換されるべき同種から、又は異種から用いることができる。また、プロモーターは使用されるべきＲＥＶトランス遺伝子についてと同種から、あるいは異種からとすることができる。本発明の方法に用いられるプロモーターはまた、上記プロモーターの１又は複数と共通の発現プロフィールを有するプロモーターの組み合わせを含み得るキメラプロモーターを含むことも可能である。本発明の１実施形態では、シロイヌナズナ由来のＡＡＰ１遺伝子プロモーターをシロイヌナズナＲＥＶ遺伝子と組み合わせ、これを用いてトランスジェニックキャノーラ（セイヨウアブラナ）を構築した。また、本発明の追加の実施形態においては、レスクェレラ・フェンドレリ由来のオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子プロモーターＬＦＡＨ１２をシロイヌナズナＲＥＶ遺伝子と作用的に結合させ、これを用いてトランスジェニックキャノーラ（セイヨウアブラナ）を構築した。上記トランスジェニック植物の各々は、ＲＥＶを初期胚発生中に過剰発現させて種子サイズ及び／又は種子数を増大させる本発明の方法に特徴的なＲＥＶ表現型を示した。
【００５１】
上記の初期特異的プロモーターは本発明の方法に使用し得る代表的プロモーターであるに過ぎないことに留意されたい。植物のゲノムＤＮＡのプロモーター領域を同定し、特徴を決定する方法が当業者には公知であり、例えば、非特許文献６４；非特許文献６５；非特許文献６６；非特許文献６７；非特許文献６８により記載されたものが挙げられる。
【００５２】
初期胚においてＲＥＶを過剰発現するトランスジェニック植物は、例えば、ＲＥＶＯＬＵＴＡをコードする遺伝子に作用的に結合された初期特異的胚プロモーターをコードするトランスジェニックベクター（例えば、プラスミド、ウイルス、等）を植物に移植することによって得ることができる。典型的には、ベクターがプラスミドである場合、ベクターは選択可能マーカー遺伝子、例えば、カナマイシン抵抗性をコードするカナマイシン遺伝子も含む。植物形質転換の最も一般的な方法は、標的トランス遺伝子を植物形質転換ベクターにクローニングし、次いでそれを（非特許文献６９）に記載のようなヘルパーＴｉプラスミドを含んだアグロバクテリウム・テュミファシエンス(Agrobacterium tumifaciens)に形質転換することによって実施される。追加の方法は、例えば非特許文献７０に記載されている。このトランス遺伝子ベクターを含んだアグロバクテリウム細胞は、（非特許文献７１；非特許文献７２）により記載されているように、形質転換されるべき植物の葉の薄片を用いて培養できる。培養植物宿主細胞の形質転換は典型的には、上記のようにアグロバクテリウム・テュミファシエンスを用いて実現される。硬い細胞膜障壁を有さない宿主細胞の培地は通常、元は非特許文献７３により記載され、非特許文献７４において改変されたリン酸カルシウム法 を用いて形質転換される。しかし、ポリブレン法（非特許文献７５）、原形質融合法（非特許文献７６）、エレクトロポーション法（非特許文献７７）、核への直接マイクロインジェクション法（非特許文献７８）など、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法を用いてもよい。形質転換された植物カルスは、例えば、カルス及びシュート誘発のためにカナマイシンや適した量の植物ホルモン、例えばナフタリン酢酸とベンジルアデニンを含んだ培地で細胞を成長させることによって、選択可能マーカーを通して選択することができる。次いで、植物細胞を再生することができ、当業者には周知の技法を用いて、得られた植物を土壌に移すことができる。
【００５３】
上記方法に加えて、クローニングされたＤＮＡを裸子植物、被子植物、単子葉植物、双子葉植物を含む多様な植物種に移植する非常に多くの方法が当該分野では周知である（例えば、非特許文献７９；非特許文献８０；非特許文献８１；非特許文献８２；非特許文献８３（樹木の形質転換）；非特許文献８４（アブラナ科の形質転換）；非特許文献８５；非特許文献８６；非特許文献８７；特許文献３；特許文献４（イネ科の形質転換）；特許文献５（小麦形質転換）；特許文献６（単子葉植物形質転換）；特許文献７（トウモロコシ形質転換）；特許文献８；特許文献９（大豆形質転換）を参照されたい）。代表例には、プロトプラストによるエレクトロポーション促進ＤＮＡ取り込み（非特許文献８８；非特許文献８９；非特許文献９０；特許文献９）；ポリエチレングリコールを用いたプロトプラスト処理（非特許文献９１；非特許文献９２）；ＤＮＡ装填微粒子銃を用いた細胞の打ち込み（非特許文献９３；非特許文献９４；非特許文献９５；非特許文献９６；非特許文献９７；非特許文献９８；非特許文献９９）が挙げられる。また、植物形質転換の戦略と技法が非特許文献１００；非特許文献１０１にレビューされている。少し変形すれば、これらの技法は幅広い植物種に適用可能なものとなる。
【００５４】
単子葉植物形質転換の場合、粒子打ち込みが典型的には選択される方法である。しかし、トウモロコシなどの単子葉植物もまた、特許文献１０に記載のようなアグロバクテリウム形質転換法を用いて形質転換可能である。単子葉植物、例えばトウモロコシの形質転換をもたらす別の方法は、胚形成懸濁培養物からの細胞を繊維（５％ｗ／ｖ、Ｓｉｌａｒ  ＳＣ−９ウィスカー）とプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌ）との懸濁液と混合し、次いでこれをＶｏｒｔｅｘ  ＧＥＮＩＥ  ＩＩボルテックスミキサー（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、米国ニューヨーク州ボヘミア所在）のマルチプルサンプルヘッドに直立して設置するか、あるいはＭＩＸＯＭＡＴ歯科用アマルガムミキサー（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃａｎａｄａ社、カナダ国オンタリオ州バーリントン所在）のホルダ内に水平に設置する。次いで、形質転換は（例えばＶｏｒｔｅｘ  ＧＥＮＩＥ  ＩＩを用いて）約６０秒間全速で混合するか、又は固定速度で１秒間振盪させる（ＭＩＸＯＭＡＴ）ことによって実行できる。この工程により細胞集団が産生され、該細胞集団から安定した形質転換体を選択することができる。安定して形質転換されたカルスから植物を再生し、サザンハイブリダイゼーション分析法によって、これら植物とその産物がトランスジェニックであることを示すことができる。この方法の主要な利点は、その簡便さと低いコストにある。粒子打ち込みとは異なり、高価な機器や補給品は必要ない。植物細胞、特にトウモロコシの形質転換のためのウィスカーの使用が、例えば、特許文献１１に記載されている。
【００５５】
特許文献１２は大豆を形質転換し、再生する方法を記載している。特許文献１３は形質転換されたサトウダイコン(Beta vulgaris)植物、例えばテンサイ(sugar beet)を生産する形質転換法を記載している。
【００５６】
上記形質転換法の各々には利点と不利がある。各々の方法では、プラスミドからのＤＮＡは遺伝子操作されるので、関心のある遺伝子だけでなく、選択可能なマーカー遺伝子及びスクリーニング可能マーカー遺伝子も含む。選択可能マーカー遺伝子はプラスミドのコピーを組み込んだ細胞のみを選択するのに用いられる（この構築物は関心のある遺伝子と選択可能かつスクリーニング可能な遺伝子がユニットとして移植されるようなものである）。このスクリーニング可能遺伝子は、関心のある遺伝子を運ぶ細胞のみを上手く培養するための別のチェックを行う。
【００５７】
抗生物質抵抗性選択可能マーカー(antibiotic resistance selectable markers)を用いる従来のアグロバクテリウム形質転換は、そのような植物が抗生物質への耐性を動物やヒトへ広げるという過度なリスクを引き起こすという一般市民の反対があるために、問題がある。そのような抗生物質マーカーは特許文献１４に記載のものに類似するアグロバクテリウム法を用いて植物を形質転換することによって、植物から除去することが可能である。抗生物質抵抗性の問題はまた、特許文献１５に記載されているようなバー又はパットコーディング配列(pat coding sequences)を用いることにより効果的に回避することもできる。これらの好適なマーカーＤＮＡはグルタミンシンセターゼ阻害物質ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ（グルホシネート）及びグルホシネートアンモニウム塩(Basta、Ignite)の作用を阻害又は中和する第２のタンパク質又はポリペプチドをコードする。
【００５８】
これら遺伝子の１つ以上を含むプラスミドを前述の技法のいずれかによって植物プロトプラスト又はカルス細胞に導入した。マーカー遺伝子が選択可能遺伝子である場合、ＤＮＡパッケージを組み込んだ細胞のみが、適した植物毒素性物質を用いた選択に基づいて生き残る。適した細胞が同定され、伝播されると、植物が再生される。ＤＮＡパッケージが植物ゲノムに上手く組み込まれたことを保証するために、形質転換された植物からの子孫を試験しなければならない。
【００５９】
形質転換の成功に影響を及ぼす多数の因子が存在する。外因性遺伝子構築物及びその調節要素のデザインと構築は、植物核の染色体ＤＮＡへの外因性配列の組み込み及び細胞によって発現されるべきトランス遺伝子の能力に影響を及ぼす。外因性遺伝子構築物を非致死的に植物細胞核へ導入する適切な方法が不可欠である。重要なことは、植物全体を回復する場合、適した再生プロトコルを考慮すると、構築物が導入される細胞のタイプは再生に従順なタイプでなければならない。
【００６０】
本発明の最初のクローニング段階のための宿主細胞として、原核生物を用いることもできる。これらの最初のクローニング段階と増殖段階に使用可能である方法、ベクター、プラスミド、宿主細胞系は、当業者には周知であり、本明細書には記載しない。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、当業者に周知の方法を用いて形質転換されるべき植物において、植物成長及び／又は発生関連遺伝子をコードする遺伝子、例えばＲＥＶに作用的に結合されるように、初期特異的胚プロモーターを挿入することができる。このプロモーターを挿入すれば、トランスジェニック植物の発生中の種子において、遺伝子、例えばＲＥＶの初期胚発現が可能となる。
【００６２】
本発明の方法において特に関心のあるトランスジェニック植物には、限定するものではないが、特に、アブラナ(Cruciferae)科、イネ科、アオイ科、又はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ−Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ科からの単子葉植物及び双子葉植物が挙げられる。これらの科のうちで特に関心のある植物には、限定するものではないが、農業的に関心のある、キャノーラ、トウモロコシ、カメリナ、綿花、小麦、イネ、大豆、オオムギ、その他の種子生成植物、さらに、限定するものではないが、ムラサキウマゴヤシ等を含むその他の植物が挙げられ、これら植物は本発明の特定の実施形態において、初期特異的胚プロモーターの制御下でＲＥＶトランス遺伝子を含む。トランス遺伝子はトランスジェニック植物と同じ種からのものとすることができるか、あるいはトランス遺伝子は異種植物からのものとすることができる。特に関心があるのは、シロイヌナズナ由来のＲＥＶトランス遺伝子を含むトランスジェニック植物である。初期特異的胚プロモーターはまた、トランスジェニック植物と同じ種からのものとすることができるか、あるいは異種植物からのものとすることができる。例えば、初期特異的胚プロモーターはＲＥＶトランス遺伝子と同じ植物種からのものとすることができるか、更には、別の植物種からのものとすることができる。特に関心があるのは、シロイヌナズナ又はレスクェレラ・フェンドレリ由来の初期特異的胚プロモータであるが、初期特異的プロモーターは別種の植物から得ることが可能である。本発明の方法に適していると見い出された初期特異的プロモーター及びＲＥＶトランス遺伝子の具体的な組み合わせには、限定するものではないが、（ａ）レスクェレラ・フェンドレリＬＦＡＨ１２プロモーター／シロイヌナズナＲＥＶ；（ｂ）シロイヌナズナＡＡＰ１プロモーター／シロイヌナズナＲＥＶ；（ｃ）シロイヌナズナＬＥＣ２プロモーター／シロイヌナズナＲＥＶ；（ｄ）シロイヌナズナ２Ｓ２プロモーター／シロイヌナズナＲＥＶが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、キャノーラを形質転換させるためにこれらのトランス遺伝子構築物を用いたが、他の植物種を形質転換させるのに用いることもできる。特に、それらを用いて、種子サイズ及び／又は種子数が増大されたトランスジェニック植物を大豆、トウモロコシ、綿花、カメリナ、イネ、小麦、オオムギ、ムラサキウマゴヤシ、及び農業的に関心のある他の作物において生成することができる。
【００６３】
本発明はまた、植物収量を増大させる成長及び／又は発生関連遺伝子を選択する方法も提供する。この方法では、関心のある遺伝子を発現プラスミド又はベクターの初期特異的胚プロモーターと機能的に関連させる。トランスジェニック細胞を形成する分野では周知の方法を用いて、関心のある遺伝子を含んだ発現プラスミド又はベクターを植物細胞に形質移入させる。トランスジェニック植物が得られるまで、上記に開示の方法を含む周知の方法によって、トランス遺伝子を含んだ細胞をトランスジェニック植物へと成長させ再生させる。野生型植物に比して収量が増大されるかについてトランスジェニック植物を観察し、収量が増大されたトランスジェニック植物を得るために用いたそれらの成長及び／又は発生関連遺伝子を更なる発展のために選択した。選択された成長及び／又は発生関連遺伝子を含むトランスジェニック植物を更に発展させれば、野生型植物よりも高収量の農業的に重要な植物を得ることができる。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例は本発明の種々の態様の単なる例示として提供したものであって、本発明を限定するものとして解釈してはならない。
【００６５】
以下の実施例は初期特異的胚プロモーターと植物成長及び／又は発生の役割を担う遺伝子とを含む種々の発現ベクターの構築法を説明するものである。特に、胚特異的プロモーターである（ａ）レスクェレラ・フェンドレリＬＦＡＨ１２；（ｂ）シロイヌナズナＡＡＰ１；（ｃ）シロイヌナズナＬＥＣ２；（ｄ）シロイヌナズナ２Ｓ２、（ｅ）シロイヌナズナＦＡＥ１をシロイヌナズナＲＥＶＯＬＵＴＡ（ＲＥＶ）遺伝子と作用的に関連させ、これを用いてトランスジェニックキャノーラ植物を生成した。
【００６６】
実施例１。ＲＥＶＯＬＵＴＡの胚特異的発現を発現を与えるように設計されたトランス遺伝子構築物を発現するトランスジェニックキャノーラ植物
トランスジェニックシロイヌナズナ植物においてシロイヌナズナＲＥＶ遺伝子を構成的過剰発現させたところ、非トランスジェニック野生型シロイヌナズナ植物に比して種子サイズが増大されたが、この形質は悪い多面的影響を伴った。これらの影響には、葉の形態が変えられたこと及びシロイヌナズナにおいて腋芽形成が低減されたことを含む。葉の形態が変化すること及び植物が全体的に発育不良であることは、植物全体にわたって高い構成的レベルでＲＥＶ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックキャノーラに観察された悪い作用である。種子以外の組織において望ましくない作用を回避しながら増大された種子サイズ形質を得るために、ＲＥＶトランス遺伝子の過剰発現を種子の発生中の胚に特異的にターゲッティングする戦略を取ることができる。これは胚特異的プロモーターがＲＥＶ遺伝子の発現を惹起するトランス遺伝子発現構築物を用いて達成可能である。植物の発生や成長過程に関与するＲＥＶのような他の植物遺伝子の構成的過剰発現もまた、トランスジェニック植物に悪い多面的作用を及ぼすものと合理的に想定可能である。発生や成長の役割を担う植物遺伝子を収量を増強する可能性のある遺伝子として評価するために胚特異的プロモーターを用いることにより、収量を増大する効果についてそのような植物遺伝子を評価するための一般的アプローチが得られる。
【００６７】
初期胚発生中のキャノーラ胚（セイヨウアブラナ）においてＲＥＶのトランスジェニック発現を生じるように設計された発現構築物に使用するために、胚特異的発現を与える５つのプロモーターを選択した。これらのプロモーターは、ＡＡＰ１（シロイヌナズナ由来のアミノ酸パーミアーゼ遺伝子）（非特許文献３６）、
【００６８】
ＧＧＴＴＧＣＡＴＣＴ  ＴＴＧＡＡＴＡＣＣＴ  ＴＴＴＴＣＴＣＡＴＴ  ＴＡＧＧＣＡＴＡＡＣ  ＡＡＴＡＴＡＡＴＡＡ  ＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴ  ＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴ  ＴＣＴＴＴＴＧＧＴＧ  ＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡ  ＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡ  ＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴ  ＴＴＧＴＡＴＡＡＣＴ  ＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡ  ＧＡＴＡＴＴＴＴＴＡ  ＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＧＡＣ  ＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡ  ＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧ  ＴＧＴＴＴＴＡＴＧＡ  ＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧ  ＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴ  ＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡ  ＣＡＣＴＡＴＡＡＡＴ  ＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡ  ＡＧＴＴＣＴＴＡＧＡ  ＡＡＴＧＴＡＴＣＴＧ  ＴＡＡＡＴＴＴＣＡＡ  ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡ  ＴＡＴＡＧＣＡＴＴＴ  ＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧ  ＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴ  ＡＣＡＴＴＡＴＡＴＡ  ＴＡＴＧＡＴＡＡＡＡ  ＡＴＡＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＴＧＴＡＣＴＴＴＧ  ＴＡＧＴＴＡＣＡＡＡ  ＡＡＧＴＣＡＴＴＡＴ  ＡＴＣＡＡＣＡＡＡＴ  ＣＴＡＡＡＴＡＴＡＡ  ＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣ  ＴＡＴＡＴＡＴＴＡＣ  ＴＣＣＡＡＡＴＴＡＡ  ＣＴＧＴＣＡＧＡＡＴ  ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧ  ＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴ  ＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧ  ＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡ  ＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣ  ＡＴＡＴＧＴＧＧＴＣ  ＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴ  ＣＣＡＡＡＡＧＣＡＡ  ＴＴＴＡＣＡＣＡＴＣ  ＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡ  ＡＣＴＡＴＡＴＴＡＡ  ＡＴＡＡＡＣＡＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴ  ＡＡＣＴＡＡＡＡＣＡ  ＴＴＴＡＴＡＡＣＡＴ  ＴＴＡＡＣＡＡＴＡＡ  ＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡ  ＴＣＧＡＡＣＡＣＧＴ  ＡＴＡＡＣＧＴＡＴＴ  ＴＴＴＴＴＡＣＧＴＡ  ＴＡＣＧＴＣＴＴＧＴ  ＴＧＧＣＡＴＡＴＡＴ  ＧＣＴＴＡＡＡＡＡＣ  ＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴ  ＡＣＡＴＡＴＡＣＡＡ  ＧＴＡＴＧＴＣＴＡＴ  ＡＴＡＴＡＴＧＡＴＡ  ＴＴＡＴＧＣＡＡＡＣ  ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴ  ＴＧＡＣＴＡＴＡＡＴ  ＴＡＧＡＣＴＴＣＴＴ  ＣＡＴＴＴＡＣＴＣＴ  ＣＴＣＴＣＴＧＡＣＴ  ＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴ  ＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴ  ＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣ  ＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣ  ＴＴＴＣＴＣＴＣＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）；
【００６９】
ＬＦＡＨ１２（スクェレラ・フェンドレリ由来のオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ：デサチュラーゼ遺伝子）（非特許文献３７）、
【００７０】
ＴＣＡＧＧＡＡＧＡＴ  ＴＡＡＧＴＣＴＴＴＧ  ＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴ  ＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴ  ＡＡＡＴＡＣＡＴＴＡ  ＡＧＡＡＡＴＣＧＧＴ  ＴＡＴＧＡＡＧＣＴＴ  ＣＧＴＴＴＴＴＴＧＴ  ＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴ  ＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧ  ＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡ  ＴＴＡＧＴＴＧＣＧＧ  ＴＴＡＴＴＡＧＣＡＴ  ＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴ  ＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧ  ＧＧＡＴＧＡＴＧＡＡ  ＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣ  ＴＣＴＡＴＧＴＡＡＴ  ＧＣＡＴＴＴＴＧＴＴ  ＴＧＡＡＡＡＣＴＣＡ  ＧＣＴＡＡＴＧＣＴＡ  ＡＴＧＣＡＡＴＴＴＣ  ＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣ  ＴＴＴＧＴＴＡＴＧＴ  ＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴ  ＡＴＴＧＡＡＴＡＧＧ  ＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧ  ＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧ  ＣＡＡＡＡＧＣＣＡＴ  ＴＧＡＴＴＡＡＡＴＣ  ＡＡＡＣＣＡＴＴＡＣ  ＡＴＡＡＧＡＡＣＡＡ  ＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴ  ＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡ  ＧＡＧＡＴＧＣＡＡＡ  ＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴ  ＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡ  ＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡ  ＡＴＴＡＴＴＧＡＧＡ  ＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡ  ＴＣＡＣＡＧＡＣＡＣ  ＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴ  ＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣ  ＡＣＴＴＡＧＡＧＡＧ  ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧ  ＣＡＡＣＣＡＡＡＣＡ  ＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣ  ＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡ  ＡＴＴＡＧＣＴＴＣＡ  ＴＡＣＧＴＴＴＴＧＣ  ＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣ  ＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡ  ＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ  ＡＣＡＧＣＣＡＣＧＡ  ＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴ  ＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡ  ＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡ  ＴＣＧＴＧＡＣＡＣＴ  ＴＣＴＣＡＣＧＧＴＴ  ＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡ  ＧＣＣＴＴＴＡＴＧＴ  ＣＣＴＣＴＡＣＴＴＣ  ＴＴＣＴＡＣＴＡＡＡ  ＧＡＣＡＣＡＴＣＧＧ  ＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡ  ＧＧＴＧＴＧＧＡＡＴ  ＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴ  ＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴ  ＣＴＣＡＣＡＧＧＴＡ  ＴＧＧＡＡＴＡＡＴＣ  ＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴ  ＴＴＴＴＧＧＡＧＴＴ  ＣＴＴＧＡＧＧＴＴＣ  ＴＧＡＴＣＡＣＡＡＣ  ＡＣＧＧＣＡＴＣＣＡ  ＣＡＴＣＧＡＣＡＧＧ  ＴＣＴＴＡＧＧＡＡＡ  ＡＣＣＡＣＧＡＡＧＧ  ＴＴＡＴＧＡＴＣＴＴ  ＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴ  ＧＴＣＡＡＡＡＧＡＴ  ＡＡＡＡＡＣＧＡＧＴ  ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡ  ＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴ  ＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡ  ＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧ  ＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧ  ＡＧＡＧＡＴＴＧＡＧ  ＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡ  ＴＡＡＧＡＡＣＣＣＴ  ＡＡＴＣＣＣＣＡＡＴ  ＴＴＡＴＧＡＧＡＴＴ  ＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴ  ＣＣＧＴＴＡＧＡＧＡ  ＡＧＡＡＡＣＡＴＡＡ  ＴＧＴＴＧＴＧＣＧＴ  ＴＴＴＡＡＴＴＡＧＡ  ＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧ  ＡＴＧＧＧＣＴＴＴＡ  ＴＣＴＴＴＴＧＴＴＡ  ＡＧＡＧＴＴＴＴＧＧ  ＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴ  ＧＧＧＴＴＴＴＴＧＡ  ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴ  ＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡ  ＡＡＡＣＧＡＣＧＴＣ  ＧＴＴＴＧＧＴＴＴＡ  ＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴ  ＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡ  ＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧ  ＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴ  ＡＴＴＡＡＣＧＧＣＣ  ＴＴＡＡＡＡＣＧＧＡ  ＴＴＡＡＡＴＣＣＡＴ  ＡＡＴＣＣＧＴＣＡＧ  ＴＣＡＡＣＴＡＧＧＧ  ＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧ  ＴＣＡＡＣＧＧＣＧＴ  ＴＴＴＴＧＣＡＴＡＡ  ＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡ  ＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴ  ＡＡＣＧＧＡＧＴＧＧ  ＡＣＧＧＡＡＴＧＧＣ  ＴＴＴＴＴＡＧＧＡＡ  ＧＴＴＴＧＴＡＡＣＣ  ＧＧＧＧＴＣＴＴＴＴ  ＧＴＴＴＡＴＧＡＴＧ  ＴＡＴＴＴＧＴＣＣＣ  ＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴ  ＴＧＴＴＣＡＧＧＣＣ  ＧＴＴＴＡＧＧＣＣＴ  ＴＴＴＴＣＣＴＡＴＡ  ＴＡＣＴＧＧＡＡＡＴ  ＡＡＣＴＡＴＴＧＴＣ  ＣＡＧＡＣＧＡＧＴＴ  ＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡ  ＣＡＴＡＴＣＡＡＧＡ  ＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡ  ＡＧＡＴＧＴＧＴＴＡ  ＣＧＡＡＧＣＣＡＴＡ  ＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡ  ＣＣＣＴＡＡＧＣＣＴ  ＡＡＡＣＣＣＴＡＧＡ  ＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣ  ＡＣＧＴＴＴＡＴＡＣ  ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ  ＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＡＡＡＧＧＣ  ＣＴＴＣＧＴＡＴＣＡ  ＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴ  ＴＴＴＴＧＣＴＴＡＡ  ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴ  ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣ  ＡＡＴＡＡＴＣＡＡＣ  ＡＴＡＡＡＣＴＡＧＧ  ＴＴＡＡＧＴＣＧＴＧ  ＧＡＴＣＴＡＡＴＴＴ  ＴＡＴＴＧＴＧＡＡＡ  ＡＴＧＴＡＡＴＴＧＣ  ＴＴＣＴＣＴＴＡＡＧ  ＡＡＡＡＧＡＴＴＣＡ  ＴＡＧＣＡＡＡＡＴＡ  ＴＴＣＧＣＡＴＣＴＴ  ＴＣＴＴＧＴＧＡＡＴ  ＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴ  ＴＴＴＴＧＧＧＧＣＴ  ＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡ  ＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣ  ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＴ  ＧＡＣＡＡＣＴＴＴＡ  ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴ  ＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡ  ＡＡＡＴＡＴＡＧＧＡ  ＡＣＡＡＣＡＣＧＴＧ  ＴＴＧＴＴＣＡＴＡＡ  ＡＣＴＡＣＡＣＧＴＡ  ＴＡＡＴＡＣＴＣＡＡ  ＧＡＡＧＡＴＧＡＡＴ  ＣＴＴＴＡＴＡＡＧＡ  ＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴ  ＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡ  ＣＡＴＡＡＡＡＡＧＴ  ＴＴＴＧＴＣＡＡＴＴ  ＧＡＡＡＧＴＧＡＣＡ  ＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡ  ＡＧＧＡＡＣＡＡＡＡ  ＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧ  ＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴ  ＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡ  ＴＧＴＧＴＣＡＴＴＣ  ＡＴＣＡＡＡＴＡＣＴ  ＡＡＡＴＡＣＴＡＣＡ  ＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡ  ＣＴＧＣＣＴＡＣＴＴ  ＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣ  ＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣ  ＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣ  ＣＣＡＣＧＡＧＣＣＴ  ＴＣＣＡＴＴＴＡＡＡ  ＣＣＣＴＣＴＣＴＣＧ  ＴＧＣＴＡＴＴＣＡＣ  ＣＡＧＡＡＴＡＧＡＡ  ＧＣＣＡＡＧＡＧＡＧ  ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴ  ＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧ  ＡＴＣＡＴＴＧＴＣＴ  ＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴ  ＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡ  ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＧＡＣＣＡＣＴＴＡ  ＴＡＴＣＴＡＡＡＡＴ  ＣＴＡＧＴＡＣＡＴＧ  ＣＡＡＴＡＧＡＴＴＡ  ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＣ  ＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡ  ＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）；
【００７１】
２Ｓ２（シロイヌナズナ由来の２Ｓ２アルブミン遺伝子）（非特許文献３８）、ＦＡＥ１（シロイヌナズナ由来の脂肪酸伸長酵素遺伝子）（非特許文献１０２）、及びＬＥＣ２（シロイヌナズナ由来の葉状子葉遺伝子）（非特許文献４０）を含む。
【００７２】
ＣＴＴＴＧＴＴＴＴＧ  ＴＡＧＡＧＴＧＴＴＣ  ＴＡＴＧＧＧＴＴＡＴ  ＧＡＴＴＴＣＧＡＡＡ  ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡ  ＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡ  ＴＴＡＴＴＴＣＧＡＣ  ＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡ  ＧＣＴＴＧＴＡＴＡＡ  ＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡ  ＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡ  ＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡ  ＡＡＴＴＣＣＡＡＴＡ  ＴＣＣＡＡＴＡＧＴＴ  ＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴ  ＡＴＴＴＧＴＴＣＣＧ  ＡＴＴＡＡＴＣＧＡＧ  ＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡ  ＴＡＴＧＣＡＣＡＡＡ  ＡＴＣＴＡＴＣＡＴ  ＧＴＡＣＣＡＴＴＴＣ  ＴＡＡＧＡＣＴＡＴＡ  ＴＡＴＴＴＧＧＴＴＡ  ＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴ  ＧＣＣＧＴＧＴＧＴＴ  ＣＴＧＡＴＴＣＣＡＡ  ＴＡＡＡＴＴＴＴＡＧ  ＣＧＣＡＴＡＧＴＡＡ  ＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡ  ＡＡＧＣＡＡＡＡＴＴ  ＴＴＣＴＣＡＡＡＡＧ  ＴＧＴＡＣＴＡＡＴＧ  ＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴ  ＧＡＧＴＴＴＣＴＡＣ  ＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡ  ＴＡＡＣＴＡＴＴＧＡ  ＣＴＣＧＡＴＴＴＴＣ  ＡＣＡＡＡＡＣＴＡＧ  ＴＡＴＧＣＴＡＡＡＴ  ＡＴＣＡＣＡＴＴＡＣ  ＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴ  ＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴ  ＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡ  ＡＴＡＴＴＧＧＡＴＡ  ＣＧＡＡＴＡＡＴＴＴ  ＴＴＡＣＡＣＴＡＡＡ  ＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡ  ＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣ  ＧＴＴＴＡＴＴＣＡＡ  ＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡ  ＧＡＣＧＡＣＡＡＡＡ  ＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡ  ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡ  ＣＧＡＣＴＡＡＣＴＴ  ＡＧＴＴＴＴＴＧＣＡ  ＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧ  ＧＡＴＴＴＧＴＣＣＴ  ＴＴＴＣＡＡＴＧＴＴ  ＴＧＡＡＴＡＣＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡ  ＴＡＡＴＡＡＧＴＴＴ  ＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡ  ＡＡＴＡＡＣＣＣＧＴ  ＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡ  ＴＡＣＧＣＡＡＡＡＡ  ＣＧＡＣＡＡＡＡＡＡ  ＡＴＡＴＴＡＡＴＴＡ  ＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴ  ＴＡＧＴＴＴＡＴＡ  ＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ  ＡＡＴＧＧＣＴＡＴＴ  ＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴ  ＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴ  ＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴ  ＧＣＡＴＴＴＡＴＧＣ  ＴＡＡＡＴＣＴＴＴＣ  ＴＡＡＡＧＧＴＡＣＡ  ＡＡＧＡＴＴＣＧＴＴ  ＴＴＴＴＣＡＡＴＧ  ＴＴＴＧＡＡＣＴＧＣ  ＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴ  ＡＴＡＧＡＴＴＴＧＧ  ＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧ  ＡＧＴＴＡＡＴＡＴＡ  ＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡ  ＣＴＣＣＡＡＡＡＴＡ  ＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧ  ＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴ  ＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡ  ＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣ  ＡＴＡＴＡＧＣＣＡＡ  ＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣ  ＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴ  ＧＴＧＣＣＡＴＡＡＡ  ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡ  ＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡ  ＣＡＣＡＡＴＣＴＧＧ  ＣＧＣＣＡＣＡＴＡＴ  ＡＣＡＣＡＴＧＴＡＣ  ＴＡＧＴＧＴＡＴＧＴ  ＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡ  ＡＣＣＴＣＴＧＴＡＴ  ＴＣＡＴＡＴＣＴＣＴ  ＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴ  ＧＡＧＴＧＧＴＧＣＧ  ＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣ  ＣＣＡＴＡＡＧＣＴＧ  ＣＡＡＡＣＡＴＴＧＡ  ＡＣＣＡＴＣＴＧＣＡ  ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＣ  ＴＣＧＴＴＴＴＣＴＴ  ＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧ  ＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣ  ＡＣＴＣＧＣＴＣＴＣ  ＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡ  ＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣ  ＧＡＣＣＴＣＴＣＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴ  ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡ  ＧＡＴＣＴＣＴＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣ  ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ  ＣＧＧＧＡＡＡＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）
【００７３】
５つのプロモーターすべてがシロイヌナズナにおいて初期胚発現を生じた。初期胚発生中の５つのプロモーターの発現プロフィールを図１に概略的に示す。ＡＡＰ１、ＬＦＡＨ１２、２Ｓ２、ＦＡＥ１の各プロモーターは胚発生の最も初期においては機能しない。これらのプロモーターはまずＡＡＰ１、次にＬＦＡＨ１２、２Ｓ２、次いでＦＡＥ１の順序で徐々に後の段階において転写的に活性になる。次いで、４つのプロモーターはすべて、後期の胚発生段階を通して活性が維持される。ＬＥＣ２プロモーターは逆の発現プロフィールを有し、極めて初期の胚発生中に活性になり、更に後期の段階を通して次第に活性を低下する。
【００７４】
ＡＡＰ１、ＬＦＡＨ１２、２Ｓ２、ＦＡＥ１、ＬＥＣ２の各プロモーターはＲＥＶトランス遺伝子発現構築物のＲＥＶコード領域配列の２つの構成の１つと結合された。プロモーターＡＡＰ１、ＬＦＡＨ１２、２Ｓ２，ＦＡＥ１、ＬＥＣ２はＲＥＶ遺伝子中に存在するようなすべてのイントロンを含むＲＥＶ遺伝子コード配列と結合された。ＡＡＰ１プロモーターとＬＦＡＨ１２プロモーターも、イントロン欠損ＲＥＶｃＤＮＡ由来のＲＥＶコード領域配列と結合された。
シロイヌナズナＲＥＶ（ＡｔＲｅｖ）ｃＤＮＡ
【００７５】
ＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧ  ＣＧＧＴＧＧＣＴＡＡ  ＣＣＡＣＣＧＴＧＡＧ  ＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧ  ＡＣＡＧＴＡＴＧＡＡ  ＴＡＧＡＣＡＴＴＴＡ  ＧＡＴＡＧＴＡＧＣＧ  ＧＴＡＡＧＴＡＣＧＴ  ＴＡＧＧＴＡＣＡＣＡ  ＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ  ＴＣＧＡＧＧＣＴＣＴ  ＴＧＡＧＣＧＴＧＴＣ  ＴＡＣＧＣＴＧＡＧＴ  ＧＴＣＣＴＡＡＧＣＣ  ＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣ  ＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ  ＡＡＴＴＧＡＴＣＣＧ  ＴＧＡＡＴＧＴＴＣＣ  ＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡ  ＡＴＡＴＴＧＡＧＣＣ  ＴＡＡＧＣＡＧＡＴＣ  ＡＡＡＧＴＣＴＧＧＴ  ＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧ  ＣＡＧＧＴＧＴＣＧＡ  ＧＡＴＡＡＧＣＡＧＡ  ＧＧＡＡＡＧＡＧＧＣ  ＧＴＣＧＡＧＧＣＴＣ  ＣＡＧＡＧＣＧＴＡＡ  ＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴ  ＣＴＣＴＧＣＧＡＴＧ  ＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴ  ＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡ  ＧＡＡＴＧＡＴＡＧＧ  ＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣ  ＡＧＧＴＴＴＣＴＣＡ  ＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣ  ＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴ  ＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡ  ＧＣＡＧＣＴＡＡＣＴ  ＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡ  ＡＣＧＡＴＣＣＡＡＧ  ＣＴＧＴＧＡＡＴＣＴ  ＧＴＧＧＴＣＡＣＡＡ  ＣＴＣＣＴＣＡＧＣＡ  ＴＴＣＧＣＴＴＡＧＡ  ＧＡＴＧＣＧＡＡＴＡ  ＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧ  ＡＴＴＧＣＴＣＴＣＡ  ＡＴＣＧＣＡＧＡＧＧ  ＡＧＡＣＴＴＴＧＧＣ  ＡＧＡＧＴＴＣＣＴＡ  ＴＣＣＡＡＧＧＣＴＡ  ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣ  ＴＧＴＴＧＡＴＴＧ  ＧＧＴＴＣＡＧＡＴＧ  ＣＣＴＧＧＧＡＴＧＡ  ＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣ  ＧＧＡＴＴＣＧＧＴＴ  ＧＧＣＡＴＣＴＴＴＧ  ＣＣＡＴＴＴＣＧＣＡ  ＡＡＧＡＴＧＣＡＡＴ  ＧＧＡＧＴＧＧＣＡＧ  ＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧ  ＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴ  ＡＧＣＴＴＡＧＡＡＣ  ＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴ  ＴＧＣＡＧＡＧＡＴＣ  ＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣ  ＧＧＣＣＡＴＣＴＴＧ  ＧＴＴＣＣＧＴＧＡＣ  ＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣ  ＴＴＧＡＡＧＴＴＴＴ  ＣＡＣＴＡＴＧＴＴＣ  ＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡ  ＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣ  ＡＡＴＣＧＡＧＣＴＴ  ＧＴＴＴＡＴＡＴＧＣ  ＡＧＡＣＧＴＡＴＧＣ  ＡＣＣＡＡＣＧＡＣＴ  ＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧ  ＣＣＣＧＣＧＡＴＴＴ  ＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧ  ＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡ  ＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡ  ＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴ  ＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴ  ＧＴＧＡＧＡＧＧＴＣ  ＧＣＴＡＴＣＴＧＧＣ  ＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧ  ＧＧＣＣＴＡＡＴＧＣ  ＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴ  ＴＣＴＣＡＧＴＴＴＧ  ＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡ  ＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴ  ＡＧＴＧＧＧＴＡＴＴ  ＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣ  ＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴ  ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡ  ＴＴＡＴＴＣＡＣＡＴ  ＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣ  ＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧ  ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＧ  ＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴ  ＧＴＧＣＴＴＣＧＡＣ  ＣＣＣＴＴＴＡＴＧＡ  ＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡ  ＧＴＣＧＴＴＧＣＡＣ  ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ  ＣＡＴＴＴＣＣＧＣＧ  ＴＴＧＣＧＧＴＡＴＡ  ＴＣＡＧＧＣＡＡＴＴ  ＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧ  ＴＣＴＡＡＴＧＧＴＧ  ＡＡＧＴＡＧＴＧＴＡ  ＴＧＧＡＴＴＡＧＧＡ  ＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧ  ＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧ  ＡＡＣＣＴＴＴＡＧＣ  ＣＡＡＡＧＡＴＴＡＡ  ＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴ  ＣＡＡＴＧＡＴＧＣＧ  ＧＴＴＡＡＴＧＧＧＴ  ＴＴＧＧＴＧＡＣＧＡ  ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴ  ＡＣＧＡＴＧＣＡＴＴ  ＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣ  ＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴ  ＡＴＣＧＴＴＧＣＴＡ  ��ＴＡＡＣＴＣＴＡＣ  ＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧ  ＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴ  ＣＴＡＡＴＴＣＴＣＴ  ＴＴＣＧＴＴＣＣＴＴ  ＧＧＡＧＧＣＧＴＧＣ  ＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡ  ＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧ  ＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡ  ＡＴＧＴＴＣＣＴＣＣ  ＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧ  ＡＴＣＣＧＧＴＴＣＣ  ＴＴＡＧＡＧＡＧＣＡ  ＴＣＧＡＴＣＴＧＡＧ  ＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴ  ＴＣＡＡＴＧＴＴＧＡ  ＴＧＣＡＴＡＴＴＣＣ  ＧＣＴＧＣＴＡＣＡＣ  ＴＴＡＡＡＧＣＴＧＧ  ＴＡＧＣＴＴＴＧＣＴ  ＴＡＴＣＣＧＧＧＡＡ  ＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣ  ＡＡＧＡＴＴＣＡＣＴ  ＧＧＧＡＧＴＣＡＧＡ  ＴＣＡＴＡＡＴＧＣＣ  ＡＣＴＡＧＧＡＣＡＴ  ＡＣＡＡＴＴＧＡＡＣ  ＡＣＧＡＡＧＡＡＡＴ  ＧＣＴＡＧＡＡＧＴＴ  ＧＴＴＡＧＡＣＴＧＧ  ＡＡＧＧＴＣＡＴＴＣ  ＴＣＴＴＧＣＴＣＡＡ  ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＴ  ＴＴＡＴＧＴＣＡＣＧ  ＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴ  ＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡ  ＴＴＴＧＴＡＣＣＧＧ  ＧＡＴＴＧＡＣＧＡＧ  ＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧ  ＧＡＧＣＴＴＧＴＴＣ  ＴＧＡＡＣＴＧＡＴＡ  ＴＴＴＧＣＴＣＣＧＡ  ＴＴＡＡＴＧＡＧＡＴ  ＧＴＴＣＣＣＧＧＡＴ  ＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣ  ＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣ  ＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡ  ＧＴＣＡＴＡＣＣＣＧ  ＴＴＧＡＴＧＣＴＡＡ  ＡＡＣＧＧＧＡＧＡＴ  ＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣ  ＴＧＴＴＡＡＣＣＧＣ  ＴＡＡＴＣＡＣＣＧＴ  ＡＣＡＣＴＡＧＡＣＴ  ＴＡＡＣＴＴＣＴＡＧ  ＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＧ  ＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣ  ＴＧＡＧＡＡＴＧＣＴ  ＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴ  ＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧ  ＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧ  ＡＧＡＴＧＴＡＴＴＣ  ＴＣＡＣＴＡＴＣＧＣ  ＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣ  ＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡ  ＡＣＡＡＣＴＴＧＣＡ  ＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴ  ＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧ  ＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡ  ＴＧＴＧＡＧＧＡＧＣ  ＧＴＧＡＴＣＴＣＡＴ  ＣＡＧＴＴＣＡＡＣＧ  ＴＧＴＴＧＣＡＡＴＧ  ＧＣＧＡＴＣＴＣＡＣ  ＣＧＴＣＴＧＧＧＡＴ  ＡＡＧＣＣＣＧＡＧＴ  ＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡ  ＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣ  ＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴ  ＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡ  ＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡ  ＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴ  ＣＡＡＡＧＴＴＡＣ  ＡＧＴＣＡＴＣＡＣＴ  ＴＡＧＧＣＴＣＧＧＡ  ＧＴＴＧＣＴＧＡＣＧ  ＡＴＴＧＡＴＴＣＡＣ  ＴＴＧＧＡＡＧＣＧＡ  ＣＧＡＣＴＣＧＧＴＡ  ＣＴＡＡＡＡＣＴＴＣ  ＴＡＴＧＧＧＡＴＣＡ  ＣＣＡＡＧＡＴＧＣＣ  ＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴ  ＧＣＴＣＡＴＴＡＡＡ  ＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡ  ＧＴＧＴＴＣＡＴＧＴ  ＴＴＧＣＧＡＡＣＣＡ  ＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡ  ＧＡＣＡＴＧＣＴＡＧ  ＡＧＡＣＡＡＣＡＣＴ  ＴＧＴＡＧＣＣＴＴＡ  ＣＡＡＧＡＴＡＴＡＡ  ＣＡＣＴＣＧＡＡＡＡ  ＧＡＴＡＴＴＣＧＡＴ  ＧＡＡＴＣＧＧＧＴＣ  ＧＴＡＡＧＧＣＴＡＴ  ＣＴＧＴＴＣＧＧＡＣ  ＴＴＣＧＣＣＡＡＧＣ  ＴＡＡＴＧＣＡＡＣＡ  ＧＧＧＡＴＴＴＧＣＴ  ＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴ  ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧ  ＴＧＴＧＴＣＡＡＣＧ  ＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣ  ＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡ  ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴ  ＧＴＴＧＣＴＴＧＧＡ  ＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣ  ＴＧＣＡＴＣＴＧＡＡ  ＧＡＡＡＡＣＡＡＣ  ＡＡＣＡＡＴＣＴＧＣ  ＡＴＴＧＴＣＴＴＧＣ  ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴ  ＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴ  ＣＴＴＴＴＧＴＧＴＧ  Ａ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）．
【００７６】
ＲＥＶトランス遺伝子構築物
ＬＦＡＨ１２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
ＬＦＡＨ１２プロモーターの２１７０塩基対（ｂｐ）領域をＥｃｏＲＩ−ＬＦＡＨ１２プライマー
（ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）
及びＳａｃＩ−ＬＦＡＨ１２プライマー
（ＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）
を用いてレスクェレラ・フェンドレリゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは、公開されたＬＦＡＨ１２配列（（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号ＡＦ０１６１０３．１又はＧＬ３４５２１２８）（非特許文献３７）のそれぞれ５’末端及び３’末端から２４ヌクレオオチド及び１５ヌクレオチドを開始した。 幾つかの別個のＰＣＲ反応物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社）にクローニングし、配列決定した。すべての配列（配列番号：１２）は相互に同一であり、公開されたＬＦＡＨ１２配列とは９７％同一であった。この差はプロモーターの検索に用いたＬ．ｆｅｎｄｌｅｒｉのアクセッション(accession)が特異的であることに起因するものと考えられる。ＥｃｏＲＩを用いてＬＦＡＨ１２をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに移動し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のプロモーターの配向はプロモーターの５’側のＫｐｎＩ及びプロモーターの３’側のＳｐｅＩであると決定された（ｐＴＧ１４３）。ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをｐＴＧ９５（ｐＣＧＮ１５４７の３５Ｓ−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ、特許文献１６）から、ＬＦＡＨ１２プロモーター（ｐＴＧ１４３からのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と一緒にＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、３方向連結（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）のＫｐｎＩを用いて切断されたｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクター（非特許文献１０３）に連結させて、植物ＮＰＴＩＩ発現カセットに対して尾尾（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）配向のＬＦＡＨ１２プロモーター−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。
【００７７】
ＡＡＰ１−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
ＡＡＰ１プロモーターの８０９塩基対（ｂｐ）領域を、ＥｃｏＲＩ−ＡＡＰ１プライマー
（ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）
及びＳａｃＩ−ＡＡＰ１プライマー
（ＧＡＧＣＴＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）
を用いてシロイヌナズナ （エコタイプコロンビア）ゲノムＤＮＡから増幅した。ＳａｃＩ−ＡＡＰ１プライマーは公開されたＡＡＰ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｘ９５６２２．１；ＧＬ１５６６６８７）（非特許文献３６）の３’末端から６ヌクレオチドを開始した。全ＰＣＲ産物の配列は相互に同一になり、 公開されたＣ２４エコタイプＡＡＰ１配列とは９８％同一になり、アノテートされたＣｏｌエコタイプＡＡＰ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号ＡＣ００８０５１．３；ＧＬ７４６２０１９）（配列番号：１１）とは１００％同一であった。ＥｃｏＲｌを用いてＡＡＰ１をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに移動させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のプロモーターの配向はプロモーターの５’側のＫｐｎＩ及びプロモーターの３’側のＳｐｅＩであると決定された（ｐＴＧ１４５）。ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをｐＴＧ９５（ｐＣＧＮ１５４７の３５Ｓ−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ、特許文献１６を参照のこと）から、ＡＡＰ１プロモーター（ｐＴＧ１４５からのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と一緒にＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、３方向連結（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）のＫｐｎＩを用いて切断されたｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクター（非特許文献１０３）に連結させて、植物ＮＰＴＩＩ発現カセットに対して頭尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）配向のＡＡＰ１プロモーター−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。
【００７８】
ＬＦＡＨ１２−Ａｔ  ＲＥＶｃＤＮＡ−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
コロンビア・エコタイプ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｅｃｏｔｙｐｅ）のシロイヌナズナ葉から単離した全ＲＮＡから合成したｃＤＮＡから、Ａｔ  ＲＥＶｃＤＮＡを増幅した。使用したプライマーはＡＴＧにＮｃｏＩ部位を組み込み、停止コドン後にＢａｍＨＩ部位を組み込んだ：ＮｃｏＩ−ＡＴＧ  ｒｅｖ
ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣ  ＴＡＡＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）
及びＢａｍＭ−ＴＧＡ  ｒｅｖ
ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＣＣＡＧＴＴＴＡＣ  ＡＡＡＧＧＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）
得られたＡｔＲＥＶｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、配列決定した（ｐＴＧ２３０）。ｐＴＧ９５をテンプレートとして使用し、５’末端にＥｃｏＲＶを組み込み、３’末端にＮｏＴＩ／ＫｐｎＩを組み込んだプライマーを用いてＲｅｖ３’ＵＴＲを増幅した：ＥｃｏＲＶｒｅｖＵＴＲ
ＧＡＴＡＴＣＴＴＣＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
及びＮｏｔ／Ｋｐｎ  ｒｅｖＵＴＲ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
得られたＡｔＲｅｖ３’ＵＴＲをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、配列決定した。ＥｃｏＲＮ部位及びＮｏｔＩ部位を用いてＲｅｖ３’ＵＴＲをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに移動した（ｐＴＧ２３４）。次いで、Ｒｅｖ３’ＵＴＲをｐＴＧ２３４から取り出し、ＥｃｏＲＮ部位及びＮｏｔＩ部位を用いてｐＴＧ２３０に連結した（ｐＴＧ２３９）。ＡｔＲＥＶｃＤＮＡ−Ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをｐＴＧ２３９から、ＬＦＡＨ１２プロモーター（ｐＴＧ１４３からのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と一緒にＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、３方向連結(three-way ligation)でｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクターに連結して、植物ＮＰＴＩＩ発現カセット（ｐＴＧ２４１）に対して頭尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）配向のＬＦＡＨ１２−Ａｔ  ＲＥＶｃＤＮＡ−ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。
【００７９】
ＡＡＰ１−ＡｔＲＥＶｃＤＮＡ−Ｒｅｖ３’ＵＴＲ
ＡｔＲＥＶｃＤＮＡ−ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをｐＴＧ２３９から、ＡＡＰ１プロモーター（ｐＴＧ１４５からのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と一緒にＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、３方向連結(three-way ligation)でｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクターに連結し、植物ＮＰＴＩＩ発現カセット（ｐＴＧ２４２）に対して頭尾(head-to-tail)配向のＡＡＰ１−ＡｔＲＥＶｃＤＮＡ−ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。
【００８０】
ＦＡＥ１−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
ＫｐｎＩ部位及びＳｐｅＩ部位を用いてＣＤベクターから９３３ｂｐＦＡＥ１プロモーターを増幅し、プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、配列決定した（ｐＴＧ２３８）。次いで、ＥｃｏＲＩ（ｐＴＧ２４３）を用いてＦＡＥ１プロモーターをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに移動した。ＡｔＲＥＶ遺伝子−Ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットを、ｐＴＧ９５から、ＦＡＥ１プロモーター（ｐＴＧ２４３からのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と一緒にＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、ＫｐｎＩを用いて３方向連結に切断されたｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクター（非特許文献１０３）に連結し、植物ＮＰＴＩＩ発現カセット（ｐＴＧ２４８）に対して頭尾配向のＦＡＥ１プロモーター−ＡｔＲＥＶ遺伝子−Ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。
【００８１】
２Ｓ２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
１３７９ｂｐ２Ｓ２プロモーターをＣＤプラスミドｐ４１６３（２Ｓ２−ＡｔＲＥＶＳｗａｌフラグメントから切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位に連結した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのプロモーターの配向は、プロモーターの５’側のＫｐｎＩ及びプロモーターの３’側のＢａｍＨＩにあると決定された（ｐＴＧ２５１）。ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをｐＴＧ１３８（ＴＯＰＯの３５Ｓ−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ）から、２Ｓ２プロモーター（ｐＴＧ２５１からのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）と一緒にＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、ＫｐｎＩを用いて３方向連結に切断されたｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクター（非特許文献１０３）に連結し、植物ＮＰＴＩＩ発現カセットに対して頭尾配向の２Ｓ２プロモーター−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。
【００８２】
ＬＥＣ２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
１２５６ｂｐＬＥＣ２プロモーターをＡｐａＩ及びＰｓｔＩを用いてＣＤプラスミドｐ５２１７から切断し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの同じ部位（ｐＴＧ２５２）にクローニングした。次いで、このプロモーターを、同じ部位上で線形化されたｐＴＧ１１２（プラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔのＡｔＲＥＶ遺伝子）にＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして取り込んで、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔプラスミドのＬＥＣ２−ＡｔＲＥＶ遺伝子であるｐＴＧ２８０を得た。テンプレートとしてｐＴＧ２３４を用いて、Ｒｅｖ３’ＵＴＲを５’末端にＮｏｔＩ部位を組み込み込んだプライマー及び３’末端にＮｏｔＩ／ＫｐｎＩを組み込んだプライマーを用いて増幅した：Ｎｏｔ  ＲＥＶ  ＵＴＲは、
ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
を開始し、ＮｏｔＫｐｎＲｅｖ  ＵＴＲは
ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
を開始する。得られたＡｔＲＥＶ３’ＵＴＲをプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、配列決定した（ｐＴＧ２８１）。次いで、Ｒｅｖ３’ＵＴＲをＮｏｔＩ部位を用いてｐＴＧ２８０に移動し、スクリーニングして適した配向にした。得られたプラスミドはプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔにおいてＬＥＣ２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−Ｒｅｖ３’ＵＴＲであった（ｐＴＧ２８３）。ＬＥＣ２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−Ｒｅｖ３’ＵＴＲを、ＫｐｎＩを用いて線形化されたｐＣＧＮ１５４７プラスミドにＫｐｎＩフラグメントとして移動し、植物ＮＰＴＩＩ発現カセット（ｐＴＧ２８８）を用いてスクリーニングして頭尾配向にした。
【００８３】
キャノーラ（セイヨウナタネ(Brassica napus)）形質転換
非特許文献７０の方法に基づくアグロバクテリウム媒介形質転換法を用いて、倍加半数体キャノーラ種ＤＨ１２０７５をＲＥＶトランス遺伝子発現構築物を用いて形質転換した。
【００８４】
滅菌した種子を、１プレート当たり約４０〜約６０個の種子を入れた、１％スクロースを１５×６０ｍｍのペトリ皿に入れた１／２ＭＳ（ムラシゲ・スクーグ(Murashige & Skoog)）培地で５日間発芽させた。合計約１５００個の種子が各形質転換構築物について発芽した。種子は発芽培地中に完全には沈めなかった。発芽した種子を組織培養室で２５℃で、１６時間の明／８時間の暗周期で成長させた。
【００８５】
分裂組織を得ずに、子葉を頂端分裂組織の真上で切断した。これは頂端分裂組織領域の真上で２つの葉柄を鉗子を用いて優しく把持することにより行った。鉗子で葉柄を潰さないように注意した。鉗子の先端部をガイドとして用い、鋭い１２番ブレードを備えたメスを使用して葉柄を切断した。子葉を共培養培地の１５ｍｍ×１００ｍｍプレート上に置いた。適切に切断された子葉は簡単に分離するが、分離しなかった場合、分裂組織が得られた非常に良いチャンスであり、そのような子葉は使用しなかった。各プレートには約２０枚の子葉を入れた。プロトコルの次の段階でマイナスの影響を及ぼすであろうしおれ(wilting)を回避するように調整した数プレート毎に、アグロバクテリウムを用いて子葉外植片を播種した。
【００８６】
エレクトロポーションによりＲＥＶ系異質転換構築物をアグロバクテリウム・テュミファシエンスに導入した。ＲＥＶ形質転換構築物を保持するアグロバクテリウムをＡＢ培地で適した抗生物質を用いて２日間２８℃で振とう成長させた。子葉外植片を播種するために、少量のアグロバクテリウム培養液を１０ｍｍ×３５ｍｍのペトリ皿に加えた。各外植片の葉柄をアグロバクテリウム培養液に浸漬し、切断した端部をペトリ皿の共培養培地に入れた。このプレートを密閉し、２５℃、１６時間の明／８時間の暗サイクルで３日間組織培養室に置いた。
【００８７】
３日後、子葉外植片を１０のセットでシュート誘発培地を入れた新鮮な２５ｍｍ×１００ｍｍのペトリ皿に移した。この培地には選別物質（２０ｍｇ／ｌカナマイシン）及びホルモン（４．５ｍｇ／ｌブラシノステロイド（ＢＡ））を入れた。健康に見える子葉外植片のみを移した。子葉外植片をシュート誘発培地上に１４乃至２１日間保持した。この時点では、緑色のカルス及び恐らくは幾つかのシュート発生、並びにいくつかの形質転換されていないシュートが観察されると考えられる。形質転換されなかったシュートは、その色が白紫色であることにより容易に見分けられた。カナマイシン感受性シュートを切断することにより除去し、健康に見えるカルスすべてをシュート誘発媒体の新鮮なプレートに移した。子葉外植片を更に１４乃至２１日間これらのプレートに置いた。
【００８８】
２乃至３週間後、暗緑色となったシュートをシュート伸長培地を入れたプレートに移した。この培地には選別物質（２０ｍｇ／ｌカナマイシン）を入れたが、ホルモンは入れなかった。５つのシュートを各プレートに移した。このプレートを密閉し、組織培養室に戻した。ガラス質のように見える移したシュートをフロログルシノール（１５０ｍｇ／１）を含んだシュート伸長培地に移した。健康で緑になったシュートをシュート伸長培地プレートに戻した。場合によっては、正常に見えるシュートを得るために、ガラス質のシュートを同じ培地の新鮮なプレートに繰り返し移すことが必要であった。
【００８９】
正常な形態のシュートを０．５ｍｇ／ｌインドール酪酸を含んだ発根培地を入れた４オンスのベビーフード用広口瓶に移した。過剰なカルスがあれば、広口瓶に移す際に切断した。約６週毎に０．２ｍｇ／ｌインドール酪酸を入れた新鮮な広口瓶に移すことによって、シュートは広口瓶の中で無限に維持することが可能である。
【００９０】
良好な根系が形成されたら、Ｔ0世代シュートを広口瓶から取り出し、根から寒天を除去し、その培養植物を鉢植え用の土に移した。各々独立したＴ0世代培養植物はキャノーラゲノムへのトランス遺伝子の挿入が独立して発生したことを表し、イベントと呼ぶことにした。透明なカップを培養植物上に数日間置き、植物を新しい環境に順化させた。植物が硬くなると、カップを取り外した。次いで、Ｔ0トランスジェニックイベントを成熟するまで温室で成長させ、Ｔ1種子を採取した。
【００９１】
Ｔ0イベントの特徴付け
サザン分析によりトランス遺伝子挿入遺伝子座の数を各イベントで決定した。Ｔ0イベントにおけるＲＥＶトランス遺伝子発現をノーザン分析又はエンドポイントＲＴ−ＰＣＲにより検証した。授粉１９日後（days after pollination：ＤＡＰ）の胚発生における単一の時間ポイントについてＲＥＶ発現データを取得した。これらのデータから、この発生時間ポイントでは、ＬＦＡＨ１２プロモーター及び２Ｓ２アルブミンプロモーターがＡＡＰ１プロモーターよりも高いレベルのＲＥＶ  ＲＮＡ産生を惹起していることが明らかであった。２Ｓ２／ＲＥＶ構築物は多くのイベントにおいて中程度のレベルから高いレベルの発現を生じた。この発現データは５つのプロモーターすべてがトランスジェニックキャノーラ植物においてＲＥＶトランス遺伝子発現を惹起する機能を持っていたことを証明する。
【００９２】
７つのＲＥＶトランス遺伝子構築物すべてについてＴ0植物の発生は成功した。試験した構築物には、（ａ）ＡＡＰ１／ＲＥＶ遺伝子；（ｂ）ＡＡＰ１／ＲＥＶｃＤＮＡ；（ｃ）ＬＦＡＨ１２/ＲＥＶ遺伝子；（ｄ）ＬＦＡＨ１２/ＲＥＶｃＤＮＡ；（ｅ）２Ｓ２／ＲＥＶ遺伝子；（ｆ）ＦＡＥ１/ＲＥＶ遺伝子；及び（ｇ）ＬＥＣ２／ＲＥＶ遺伝子を含んだ。
【００９３】
実施例２。複製されたフィールド試験における、キャノーラ収量に関する胚発生中のＲＥＶトランス遺伝子発現の効果の評価
この実施例では、種々の胚特異的プロモーターの制御下でシロイヌナズナＲＥＶトランス遺伝子を含むトランスジェニックキャノーラ植物をフィールド試験で試験した。
【００９４】
フィールド試験へのトランスジェニックＲＥＶイベントの応用
トランス遺伝子発現及びトランス遺伝子挿入遺伝子座数の組み合わせに基づくフィールド試験に応用するためにＴ0イベントを選択した。トランス遺伝子発現及び単一のトランス遺伝子挿入遺伝子座が確認されたイベントにはフィールド試験に進めるべき最高の優先度を割り当てた。場合によっては、複数の遺伝子の存在が遺伝子量に起因して、全体的に高いトランス遺伝子発現レベルを生じた場合、複数の挿入遺伝子座を有するイベントを選択した。
【００９５】
選択されたイベントからのＴ1種子を分離Ｔ1集団としてフィールドプロットで成長させた。各イベントは２列の２４の植物プロットとして植え付けた。単一のトランス遺伝子挿入遺伝子座を有するイベントについて、２４のＴ1植物間でのトランス遺伝子の分離は、トランス遺伝子を欠損する約６つのヌル植物、１２のヘテロ接合性植物、６つのホモ接合性植物の分布を生じた。開花前に各Ｔ1植物を個々に袋に入れて異系交配を回避した。２４のＴ1植物の各々からＴ2種子を別個に収穫した。
【００９６】
Ｔ2種子ストックを用いて２４の親Ｔ1植物のどれがヌル、ヘテロ接合性、又はホモ接合性であるのかを同定した。各Ｔ1植物からの約３０個のＴ2種子をカナマイシンの類似体である抗生物質Ｇ４１８を含んだ溶液を用いてペトリ皿のフィルタ紙上で発芽させた。植物を選択可能マーカーであるｎｐｔＩＩ抵抗性遺伝子と共形質転換させたので、トランス遺伝子を有する種子のみが発芽し、成長し続けるであろう。プレート上の種子すべてがＧ４１８に対して感受性があることが分かった場合、Ｔ1親をヌル系として同定した。プレート上の種子すべてがＧ４１８に対して抵抗性であると分かった場合、Ｔ1親をホモ接合系として同定した。プレート上の種子の約１／４が感受性があり、その残りが抵抗性である場合、Ｔ1親をヘテロ接合系として同定した。同じ形質転換イベントからのホモ接合Ｔ1親からのＴ2種子をバルク化して、ホモ接合種子ストックを生成しフィールド試験に供した。同じ形質転換イベントからのヌルＴ1親からのＴ2種子をバルク化して、ヌル同胞種子ストックを生成し、フィールド試験に供した。
【００９７】
フィールド試験デザイン
大規模な複製された試験のフィールドにおいて各トランスジェニック系をそのヌル同胞と直接比較することによって、胚特異的プロモーターを用いたＲＥＶトランス遺伝子の収量増強遺伝子としての可能性の評価をトランスジェニックキャノーラ系で試験した。ヌル同胞はＴ1世代のトランス遺伝子の分離から生じるので、ヌル同胞及びホモ接合同胞は遺伝的にほぼ同一である。唯一の大きな違いはＲＥＶトランス遺伝子の有無である。このほぼ遺伝的同一性により、ヌル同胞がＲＥＶトランス遺伝子の作用を評価するための最適な対照となる。この試験の主な目的はあるイベントからのトランスジェニック系をそのヌル分離と比較することであったので、分割法を選択した。この方法により、トランスジェニックサブエントリーと非トランスジェニックサブエントリーとの間の相互作用並びにイベント（サブプロット及び主プロットの相互作用）間のトランスジェニックサブプロット間の違いに対しては高いレベルの評価になり、イベント全体又は主プロット間の違いに対しては低いレベルの評価になる。
【００９８】
キャノーラが一般に生育される環境条件の範囲下で収量表現型を評価するために、フィールド試験は草原環境の複数の場所で実施した。すべての場所において、各トランスジェニックイベントを隣接するプロットのそのヌル同胞と物理的に対にした。ホモ接合同胞及びヌル同胞の各プロット対を各試験場所で４回複製した。各試験における４つの複製プロット対の場所は各試験場所において無作為に分布させた。プロットは１．６ｍ×６ｍとし、１平方メートル当たり約１４２個の種子の密度で植え付けた。キャノーラの商用生産には典型的である標準的な農耕法を用いて、植物を成熟するまで成長させた。
【００９９】
実施例３。トランスジェニックキャノーラにおける種子収量を増大させるための胚特異的プロモーターからのＲＥＶトランス遺伝子の発現
各収量フィールド試験場所における全プロットはコンバインを用いて個々に収穫した。各プロットから、含水量を調節した総種子重量として総種子収量データを収集した。各試験のトランスジェニックイベント毎に、各ホモ接合系の４つの複製プロットからの総収量の平均を関連するヌル同胞系の４つの複製プロットからの総収量の平均と比較した。この比較を用いて総種子収量に対するＲＥＶトランス遺伝子の作用を評価した。複数の試験場所各々からの結果を合わせて、総種子収量に対するＲＥＶトランス遺伝子の作用のａｃｒｏｓｓ  ｔｒｉａｌｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ法を行った。各試験場所の分散の統計学的に分析は、ホモ接合トランスジェニック系とそのヌル同胞系との間の総種子収量の差についての有意性のしきい値（Ｐ＝０．０５）の割り当てを可能にした。
【０１００】
統計学的に有意な総種子収量の増大を示したトランスジェニックＲＥＶキャノーラ系を表１にまとめた。統計学的に有意な総収量の増大を示すトランスジェニック系を７つのプロモーター／ＲＥＶトランス遺伝子構築物すべてについて同定した。これらの結果は、胚特異的プロモーターを用いたＲＥＶの過剰発現は種子収量を増大させることを実証するものである。収量に対する最大の影響はＬＥＣ２プロモーターを用いて得られ、ＲＥＶの過剰発現が胚発生の最も初期に最も有効であり得ることを示唆している。これはＬＥＣ２プロモーターが発生の非常に早くに最大の活性があり、胚発生の後期を通しては転写活性が低下するためである。ＡＡＰ１、ＬＦＡＨ１２、２Ｓ２の各プロモーターは胚発生の徐々に後の段階で転写活性を開始するが、収量を増大させるのにも有効であった。ＬＦＡＨ１２プロモーターは、回収されて有意に増大された収量を示した独立したイベントの数について著明であり、これは、このプロモーターを用いた形質について浸透度が高いことを示すものである。収量の増大が中程度である唯一のイベントはＦＡＥ１プロモーターについて回収され、これは恐らくは、胚発生の初期において転写活性を開始するプロモーターが収量増大のための最良の手段を提供することを示唆し、ある遺伝子の初期胚過剰発現を用いて、植物成長及び／又は発生に関与する遺伝子がトランスジェニック植物において収量を増大させる可能性を有するかどうかを評価することができることを示す。
【０１０１】
【表１】
2009519719.tif 000003
【０１０２】
実施例４。胚特異的プロモーターを用いた、胚発生中にＲｅｖを発現するトランスジェニックキャノーラにおける種子サイズの増大
フィールド試験の個々のプロットから収穫した種子はすべてオーブンで低温乾燥させて含水量を均一にした。フィールド試験の各プロットの種子サンプル各々について、Ａｇｒｉｃｕｌｅｘ（Ｇｕｅｌｐｈ社、カナダ国オンタリオ州）種子計数器を用いて１０００個の種子を数えた。次いで１０００個の種子サンプル各々の重量を測定した。各ホモ接合系の４つの複製プロットからの１０００個の種子重量の（ＴＳＷ）の平均を関連するヌル同胞系の４つの複製プロットからのＴＳＷの平均と比較した。ホモ接合トランスジェニックＲＥＶ系とそのヌル同胞系との間のＴＳＷ値の差をＲＥＶトランス遺伝子に起因すると考えられる種子サイズの差の尺度として用いた。各試験場所の分散の統計学的分析は、ホモ接合トランスジェニック系とそのヌル同胞系との間のＴＳＷの差についての有意性のしきい値（Ｐ＝０．０５）の割り当てを可能にした。
【０１０３】
ＴＳＷで示される統計学的に有意な種子サイズの増大を示したトランスジェニックＲＥＶキャノーラ系を表２にまとめた。統計学的に有意なＴＳＷの増大を示すトランスジェニック系を７つのプロモーター／ＲＥＶトランス遺伝子構築物の６つについて同定した。ＲＥＶ発現を惹起するＬＥＣ２プロモーターとＬＦＡＨ１２プロモーターの種子サイズに対する作用はこれらのプロモーターを用いた総収量について観察された作用と一致する。ＬＥＣ２／ＲＥＶ構築物は種子サイズの強力な正の増大を生じ、これは非常に初期の胚発生におけるＲＥＶの過剰発現が有効であることを示唆している。ＬＦＡＨ１２プロモーターもまた形質の強力な浸透を示し、６つの独立したイベントは統計学的に有意な種子サイズの増大を示している。ＲＥＶ過剰発現を惹起するＡＡＰ１プロモーターと２Ｓ２プロモーターもまた、統計学的に優位な種子サイズの増大を生じた。ＦＡＥ１／ＲＥＶトランス遺伝子構築物を有するイベントは、ＴＳＷの優位な増大を全く示さなかった。ＦＡＥ１プロモーターの活性が試験した５つのプロモーターの胚発生の最後を開始するので、ある作用の欠損は胚発生の早期に転写活性を開始するプロモーターが、植物の生長と発生に影響を及ぼす遺伝子、例えばＲＥＶと関連させたときに収量を増大させる手段を提供する。また、これらのプロモーターを用いて、トランスジェニック植物における成長及び／又は発生に関連する他の植物遺伝子の収量、例えば種子サイズ及び／又は数を増大させる可能性について評価することもできる。
【０１０４】
【表２】
2009519719.tif 000004
【０１０５】
実施例５。胚特異的プロモーターを用いた、胚発生中にＲｅｖを発現するトランスジェニックキャノーラにおいて増大された種子サイズと収量
増大された種子サイズ表現型について考えられる１つの結果は、種子産生に対してリソースの一定の純量(net)の割り当てを維持するために種子数の低減を生じる植物による補償的応答(compensating response)であると考えられる。表３は統計学的に有意な増大された種子サイズと総収量の増大をフィールド試験において実証した６つの独立したトランスジェニックＲＥＶイベントをまとめたものである。種子サイズと総収量が同時に増大することが、ＡＡＰ１／ＲＥＶ、ＬＦＡＨ１２／ＲＥＶ、２Ｓ２／ＲＥＶ、ＬＥＣ２／ＲＥＶトランス遺伝子構築物を有するイベントにおいて観察され、これは４つのプロモーターすべてが植物による補償的応答としての種子数の低減を誘発することなく種子サイズを増大させるのに有効であったことを示している。
【０１０６】
表３のＴＳＷ値と総収量値との比較から、種子サイズの増大は観察された収量の全体的増大を説明しないことが明らかとなった。種子サイズの増大は総収量に寄与する１つの要素である。増大された収量の残りは増大された種子数に起因するものであった。殆どの場合、増大された種子数は増大された総収量の主要な要素であった。増大された種子数は鞘１つ当たりの種子数の増大、総状花序数の増大、総状花序１つ当たりの鞘数の増大、種子不稔率(seed abortion rate)の低減、又はこれら作用の組み合わせから生じたものと考えられる。
【０１０７】
種子サイズと総収量の増大を示すイベントのリストからＦＡＥ１／ＲＥＶトランス遺伝子構築物を有するイベントが欠けていることは、胚発生の初期において転写活性を開始するプロモーターが発生や成長に関与する植物遺伝子のトランスジェニック植物において種子サイズと収量を増大させる可能性について評価するための最良の手段を提供することを示すものである。また、収量増大のための最大の効果は胚発生の初期において転写活性を開始するプロモーターを用いて実現されるとも考えられる。
【０１０８】
【表３】
2009519719.tif 000005
【０１０９】
実施例６。ＲＥＶＯＬＵＴＡの胚特異的発現を与えるように設計されたトランス遺伝子構築物を発現するトランスジェニック大豆植物
収量と種子サイズの増大を実現するためにＬＦＡＨ１２胚特異的プロモーターを用いてトランスジェニックキャノーラ植物においてＲＥＶＯＬＵＴＡトランス遺伝子発現を惹起することに成功した（表１、２、３）ことに基づいて、大豆を形質転換させるためにＬＦＡＨ１２−ＡｔＲＥＶ遺伝子構築物を構築した。大豆はキャノーラのように双子葉植物であり、ＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子は植物種にわたって高度に保存されることが、シロイヌナズナＲＥＶＯＬＵＴＡ遺伝子がトランスジェニック大豆植物に導入されるときに機能することを可能にした。
【０１１０】
ＲＥＶトランス遺伝子構築
ＬＦＡＨ１２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ
ＬＦＡＨ１２プロモーターの２１７０ｂｐ領域を、ＥｃｏＲＩ−ＬＦＡＨ１２プライマー
（ＧＡＡＴＴＣＴＣ  ＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）
及びＳａｃＩ−ＬＦＡＨ１２プライマー
（ＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）
を用いてレスクェレラ・フェンドレリゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは公開されたＬＦＡＨ１２配列（（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）番号ＡＦ０１６１０３．１又はＧＬ３４５２１２８）（非特許文献３７）の５’末端及び３’末端それぞれから２４ヌクレオチド及び１５ヌクレオチドを開始した。幾つかの独立したＰＣＲ反応物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社）にクローニングし、配列決定した。すべての配列は相互に同一になり、公開されたＬＦＡＨ１２配列とは９７％同一であった。この差はプロモーターの検索に用いたＬ．ｆｅｎｄｌｅｒｉのアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）が特異的であることに起因するものと考えられる。ＥｃｏＲＩを用いてＬＦＡＨ１２をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩプラスミドに移動し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のプロモーターの配向はプロモーターの５’側のＫｐｎＩ及びプロモーターの３’側のＳｐｅＩであると決定された（ｐＴＧ１４３）。ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをｐＴＧ９５（ｐＣＧＮ１５４７の３５Ｓ−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ、特許文献１６）から、ＬＦＡＨ１２プロモーター（ｐＴＧ１４３からのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメント）と一緒にＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして取り出し、３方向連結（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）のＫｐｎＩを用いて切断されたｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクター（非特許文献１０３）に連結させて、植物ＮＰＴＩＩ発現カセット（ｐＴＧ１７１）に対して頭尾配向のＬＦＡＨ１２プロモーター−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲを作製した。ＬＦＡＨ１２ｐｒ−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲカセットをＫｐｎＩを用いてｐＴＧ１７１から切り出し、Ｔ４ポリメラーゼを用いて平滑末端化し、ＳｍａＩを用いて切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにクローニングしてｐＴＧ４６４（ＴＧ−ＧＭ６）を得た。
【０１１１】
大豆形質転換
懸濁培地で成長させた大豆細胞に金粒子上のＤＮＡを導入するｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法を用い、大豆種Ｘ５をＲＥＶトランス遺伝子発現構築物を用いて形質転換した。ＲＥＶトランス遺伝子発現構築物を含んだ線状ＤＮＡを、ハイグロマイシン選択可能マーカー遺伝子を用いて別個の線状ＤＮＡフラグメント上で共形質転換した。
【０１１２】
大豆細胞に挿入するＤＮＡを調整するために、ＲＥＶ遺伝子２．５μｌ及びｐＨＹＧＲＤＮＡ２．５μｌを金粒子に添加した。ＣａＣｌ２５０μｌを加え、５秒間ボルテックスした。次いで、スペルミジン２０μｌを添加し、５秒間ボルテックスした。沈殿物をチューブの底に沈殿させた。上清を除去し、１００％エタノール２００μｌでペレットを２回洗浄した。上清を除去し、１００％エタノール１２０μｌ中にペレットを懸濁させた。ディスク１つ当たり８μｌに等分して挿入した。
【０１１３】
バイオリスティクス挿入後、細胞をフラスコの懸濁培地で１２日間成長させた。次いで、２．４％シュガー３０ｍｌ＋Ｆｉｎｅｒ’ｓ  Ｌｉｇｈｔ（Ｆ．Ｌ．）＋１０μｇ／μｌハイグロマイシン（ｈｙｇ）１７０μｌを入れた新しいフラスコに培養物を移した。次の４週間、２．４％シュガー＋Ｆ．Ｌ．＋ｈｙｇを入れた新しいフラスコに移すことによって、毎週培地を変えた。
【０１１４】
形質転換された緑色のカルスが第１５週〜第２０週の間にフラスコに発生した。緑色のカルスの入ったフラスコの内容物を滅菌した１００×１５ｍｍの皿又は蓋に注いだ。滅菌した鉗子を用いて、緑色のカルスを茶色の細胞から裂き、２．４％シュガー１〜２ｍｌ＋Ｆ．Ｌ．＋Ｈｙｇ／ウェルを充填した２６ウェルプレートに移した。１緑色のカルス（クローン）／ウェル  ２０〜３０クローン／フラスコを得ることを目標とした。
【０１１５】
滅菌した１０ｍＬピペット及び自動ピペッターを用いて全ウェルから全培地を吸引することによって、２週毎に培地をプレート内で変えた。培地を新鮮な２．４％シュガー＋Ｈｙｇと交換した。適したｐｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ培地を得るためにプレートを監視した。これらは幾つかのｐｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ突起物を有する緑色で、迅速な分割と成長を示した。顕微鏡観察により適した細胞集団が確認されると、滅菌した皿又は蓋に移し、死細胞物を可能な限り多く取り除いた。残りの組織片を２．４％シュガー＋Ｈｙｇの一般的な３０ｍｌフラスコに移した。培地交換の間の約３〜５週間、クローンを成長させた。
【０１１６】
クローンが十分成長したら、分割した。クローン１つ当たり裁量の５片のみを維持した。これらは幾つかのｐｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ突起物を有する緑色であった。滑らかな緑色のコロニーは望ましくない。十分に大きくなるまでクローンを３〜５週毎に継代培養した。この時点で、再生の第１段階としてクローンを２，４−Ｄを除去するための活性炭を有する大豆再生培地に移した（ＯＭＳＭ６ＡＣ、本願に援用した非特許文献１０４）。
【０１１７】
組織から２，４−Ｄを除去するための活性炭（ＡＣ）を入れたＯＭＳＭ６ＡＣで６日以下の期間クローンを成長させた。次いで、クローンを大豆胚発芽培地（ＯＭＳＭ６Ｇ、上記非特許文献１０４）に３週間移した。この培地は胚の発生を可能にする。３週間後、最良の２０個の胚を選択し、大豆成熟培地（ＯＭＳＭ６ＰＨ、上記非特許文献１０４）に移した。最良の胚は１乃至２枚の子葉を有し、分裂組織が見える（融合胚とは反対に）単一の胚であった。分裂組織が寒天表面に平行になるように胚を移した。胚が黄色に変色する４週間、クローンをＯＭＳＭ６ＰＨ上で維持した。黄色になると、すぐに乾燥して、植物に再生された。
【０１１８】
３層のＨ２Ｏ−飽和ワットマン(Whatman)フィルタで底を３０分滅菌したマゼンタボックス内で胚を乾燥させた。胚を１０日間乾燥し、次いで、プレートの大豆発根培地（Ｂ５／２培地、上記非特許文献１０４）上で約１０乃至１２日間移した。シュートが蓋まで成長するか、葉が開いたら、小植物をすぐにＳｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ（園芸用木箱(flat)）に入れた。最初の三出葉が出現するまでトランスジェニック小植物を園芸用木箱で成長させ、６インチに鉢に移して種子まで成長させた。
【０１１９】
実施例７。トランスジェニック大豆において増大された種子サイズを決定するための、胚特異的プロモーターからのＲＥＶトランス遺伝子の発現
トランス遺伝子発現及びトランス遺伝子挿入遺伝子座数の組み合わせに基づく表現型評価に応用するために、ＬＦＡＨ１２−ＡｔＲＥＶ遺伝子−ｒｅｖ３’ＵＴＲ（ＴＧ  ＧＭ６）トランス遺伝子構築物を有するＴ0イベントを選択した。トランス遺伝子発現及び単一のトランス遺伝子挿入遺伝子座が確認されたイベントには種子増大及びフィールド試験に進めるべき最高の優先度を割り当てた。場合によっては、複数の遺伝子の存在が遺伝子量に起因して、全体的に高いトランス遺伝子発現レベルを生じた場合、複数の挿入遺伝子座を有するイベントを選択した。選択されたＴ0イベントからのＴ1種子を分離Ｔ1集団として温室で成長させた。種子はすべてのＴ1植物から個々に収穫した。各イベントのＴ2世代植物を成長させ、ＰＣＲによりタイピングして、どのＴ2系がＲＥＶトランス遺伝子にとってホモ接合、ヘテロ接合、又はヌル分離固体であるのかを決定した。各Ｔ2系からの種子を収穫し、計数し、計量した。Ｔ2系についての総種子重量及び種子数に基づいて、１０００個の種子重量（ＴＳＷ）値を各系について算出した。次いで、各イベントのホモ接合クラス、ヘテロ接合クラス、ヌル分離固体クラスのために平均的なＴＳＷを算出した。
【０１２０】
ＲＥＶ発現がＬＦＡＨ１２胚特異的プロモーターによって惹起された２つの独立した形質転換イベントは、ヌル分離体系に対してホモ接合系とヘテロ接合系両方で種子サイズが統計学的に有意に増大したことを示す。表４にまとめた結果から、初期胚発生中にＲＥＶトランス遺伝子が過剰発現したことは明らかである。
【０１２１】
【表４】
2009519719.tif 000006
【０１２２】
実施例８。トランスジェニック大豆における増大された総種子収量を決定するために、胚特異的プロモーターからのＲＥＶトランス遺伝子の発現
胚特異的プロモーターによって惹起されるＲＥＶトランス遺伝子発現の総種子収量に対する効果を試験するために、ホモ接合体系とヌル分離体系からのＴ3種子種子を貯留し、夏の成長期の間にフィールドに植え付けた。フィールドの個々の植物から収穫した全種子をオーブンで低温乾燥して種子重量を測定する前に含水率を均一にした。ＲＥＶ発現がＬＦＡＨ１２胚特異的プロモーターにより惹起された１つのトランスジェニックイベントは、そのヌル同胞に対して、総種子収量が２２．７％増大されたこと及び種子サイズが８．０％増大されたことを示す（表５）。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
上記実施例は例示のためのものであって、主張される本発明の範囲を限定するものではない。本発明の他の変形例が当業者にはすぐに明白となろうし、それらは添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書に引用した刊行物、特許、特許出願、及びその他の参照物も本願に援用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】初期胚発生中の胚特異的プロモーターの発現プロフィールを示す図である。シロイヌナズナ胚発生中の大まかな段階：初期球状＝授粉後（ＤＡＰ）２日目、心臓＝授粉後４日目、トルペド（ｔｏｒｐｅｄｏ）＝授粉後６日目、ｗａｌｋｉｎｇ  ｓｔｉｃｋ＝授粉後７日目、初期成熟胚＝授粉後８日目
【図２】ＲＥＶＯＬＵＴＡ及び非ＲＥＶＯＬＵＴＡのＨＤ−ＺＩＰＩＩＩクラス転写因子のある領域のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列のこの領域はＨＤ−ＺＩＰＩＩＩタンパク質をタンパク質のＲＥＶＯＬＵＴＡ又は非ＲＥＶＯＬＵＴＡクラスに属するものと定めるアミノ酸配列の特徴的な差を含む。配列の四角で囲んだ部分は、非ＲＥＶＯＬＵＴＡ  ＨＤ−ＺＩＰＩＩＩタンパク質を画定するアミノ酸配列挿入の部位を示す。ＲＥＶＯＬＵＴＡタンパク質はアミノ酸配列挿入が無いことによって画定される。Ａｔｈｂ−９（シロイヌナズナ；配列番号：２）；Ａｔｈｂ−１４（シロイヌナズナ；配列番号：３）；ＲＥＶ（シロイヌナズナ；配列番号：４）；ＢｎＬｆＲＥＶ（セイヨウアブラナ；配列番号：５）； ＯｓＲＥＶｌ（イネ；配列番号：６）；ＺｍＲＬＤｌ（トウモロコシ；配列番号：７）；ＯｓＲＥＶ２（イネ；配列番号：８）；Ａｔｈｂ−１５（シロイヌナズナ；配列番号：９）；及びＡｔｈｂ−８（シロイヌナズナ；配列番号：１０）
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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