(57)【要約】  甘味調節剤のスクリーニングに機能的な新規なキメラタンパク質、対応する核酸配列、発現ベクター、トランスフェクトされた宿主細胞、ならびにそれらを採用する甘味応答の調節剤および増強剤のスクリーニング方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの甘味料または甘味増強剤と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、配列番号２または配列番号２０と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２ポリペプチド、配列番号４または配列番号２２と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ポリペプチドからなる群から選択される１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含む、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項２】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質、およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質からなる群から選択されるヘテロダイマータンパク質を形成する２つのポリペプチドサブユニットを含み、ヘテロダイマーのＴ１Ｒ２サブユニットが配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有する本質的に相同なポリペプチドを含有し、ヘテロダイマーのＴ１Ｒ３サブユニットが配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する本質的に相同なポリペプチドを含む、請求項１に記載のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項３】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマータンパク質またはそれらの実質的に相同なヘテロダイマータンパク質を限定することなく含むＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質を含む、請求項２に記載の２つのポリペプチドサブユニットを含むＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａが配列番号２に相当し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂが配列番号２０に相当し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａが配列番号４に相当しおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂが配列番号２２に相当する、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項４】
配列同一性によって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）、配列番号１９（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）、配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）および配列番号２１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）からなる群から選択される核酸配列と実質的に相同な核酸、ハイブリダイゼーションによって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）、配列番号１９（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）、配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）および配列番号２１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）からなる群から選択される核酸配列と実質的に相同な核酸、請求項１に定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸と実質的に相同な核酸を１種または２種以上含む、少なくとも１つの甘味料または甘味増強剤と結合することができるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸であって、配列同一性によって決定される実質的に相同な核酸が少なくとも９０％の配列同一性を有し、ハイブリダイゼーションによって決定される実質的に相同な核酸が、５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳからなる溶液中で４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中で６５℃で洗浄されるというストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、核酸が任意に配列番号６（ＨＳＶタグ）をその対応するタンパク質のＣ末端またはその付近に含む、前記核酸。
【請求項５】
請求項４で定義された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５で定義された発現ベクターを形質転換された、宿主細胞。
【請求項７】
安定的に請求項１で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質、任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なＧタンパク質を発現する、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
一時的に請求項１で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質、任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なＧタンパク質を発現する、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を産生する方法であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、発現に十分な条件下で培養し、それによってＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を形成し、任意にそれを細胞から回収するステップを含む、前記方法。
【請求項１０】
味覚細胞における甘味シグナルを調節する剤を同定する方法であって、
（ｉ）任意に他の剤の存在下で、剤の、甘味刺激およびカルシウム刺激から選択される刺激に応答して機能的応答を提供するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する細胞への接触、および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が、前記細胞中の少なくとも１つの機能応答によって、前記細胞中の前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の機能応答に影響するかどうかの決定、
を含み、
前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が請求項１〜３のいずれかに定義されたものである、前記方法。
【請求項１１】
細胞が、Ｇタンパク質もまた発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なキメラＧタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｇタンパク質が、キメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉ）が、細胞内メッセンジャーのまたはそれに起因する変化を計測することによって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
機能応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択された細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、哺乳類細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群より選択された哺乳類細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉ）が、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質と試験剤をカルシウムの存在下で接触させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
カルシウムが、塩化カルシウムの形態で提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する遺伝子組換え細胞、および
（ｉｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニスト
を、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節剤としての試験剤の同定のために組み合わせて利用することを含む、キット。
【請求項２２】
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する遺伝子組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）適切な濃度のアゴニストの存在下で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下における応答の比較により、細胞の機能的応答における変化を決定すること、ならびにその結果、試験剤が請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節剤であることが同定されること
を含む、請求項２１に記載のキットの利用方法。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を調節する剤の同定方法であって、
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質へのリガンド結合に応答して変化するパラメータを計測すること、および
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答して変化するパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定すること、およびそれによって調節剤またはリガンドを同定すること
を含む、前記方法。
【請求項２４】
リガンドが、カルシウム、カルシウムイオンおよび塩化カルシウムからなる群から選択されたリガンドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｉ）が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の特性を計測する、請求項２３または２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
甘味調節剤および特に甘味増強剤は、食品およびフレーバー業界にとって、例えば、糖や人工甘味料を含む甘味料を減らすことができる点で、強い興味がある。甘味増強剤の利用はカロリーの減少や、糖によるダメージから歯を防いだり、多くの人工甘味料に関連する苦味／金属味の異味および後味を回避するかまたは減少させることができる。
【背景技術】
【０００２】
甘味修飾剤または増強剤をスクリーニングするのに、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー甘味受容体を採用した知られたスクリーニング法を利用することができる。
甘味修飾剤／増強剤を同定または特性化するために、通常潜在的増強剤／修飾剤の存在下および非存在下で、両サンプルが甘味料をさらに含有する、サンプルの結果が比較される。しかし、甘味料および特に糖は、浸透圧、および／または粘度において大きな影響を有する。粘度および浸透圧のようなサンプルの特性の変化に起因して、標準的なスクリーニング法を利用したとき、不正確な結果の原因となるアーティファクトが起こり得る。
【０００３】
知られたスクリーニングの他の不利点は、野生型Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体は、特にスクロース、グルコース、フルクトースなどの炭水化物甘味料と同様に人工甘味料アスパルテームおよびスクラロースと結合するビーナスフライトラップ（「ＶＦＴ」）ドメインを含む細胞外アミノ末端ドメインなどいくつかの結合ドメインを含有することである。したがって、特定のリガンドの特定の調節剤のためのスクリーニングおよび特に、ＶＦＴリガンドを除外した、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメイン（「ＴＭＤ」）およびシステインリッチドメインのリガンドのためのものは、知られたスクリーニング法では不可能である。
【０００４】
Ｔ１Ｒ３のＴＭＤに結合するアゴニストはサイクラミン酸塩およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）である。スクロースおよびスクラロースはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３のＶＦＴに結合し、アスパルテームはＴ１Ｒ２のＶＦＴに結合する。
受容体への結合において糖と競合しうる剤の同定を防ぐため、ＶＦＴドメインと物理的に異なる位置、特にＴＭＤおよび／またはシステインリッチドメインに結合する甘味受容体調節剤の同定を可能にするスクリーニングが求められている。
【発明の概要】
【０００５】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を利用することで、上の問題点を回避し、改良された結果を可能にするスクリーニング法および結合アッセイが提供される。
最初の側面において、少なくとも１つの甘味料または甘味増強剤と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、配列番号２（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）または配列番号２０（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２ポリペプチド、配列番号４（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）または配列番号２２（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ポリペプチドからなる群から選択される１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含む、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
【０００６】
他の側面において、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質、およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質からなる群から選択されるヘテロダイマータンパク質を形成する２つのポリペプチドサブユニットを含む、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、ヘテロダイマーのＴ１Ｒ２サブユニットが配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有する本質的に相同なポリペプチドを含有し；ヘテロダイマーのＴ１Ｒ３サブユニットが配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する本質的に相同なポリペプチドを含む、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
【０００７】
他の側面において、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマータンパク質または本明細書で定義されるそれらの実質的に相同なヘテロダイマータンパク質を限定することなく含むＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質である、上記で定義される２つのポリペプチドサブユニットを含むＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａが配列番号２に相当し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂが配列番号２０に相当し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａが配列番号４に相当し、およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂが配列番号２２に相当する、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
【０００８】
他の側面において、配列同一性によって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）、配列番号１９（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）、配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）および配列番号２１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）からなる群から選択される核酸配列と実質的に相同な核酸、ハイブリダイゼーションによって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）、配列番号１９（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）、配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）および配列番号２１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）からなる群から選択される核酸配列と実質的に相同な核酸、上記に定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸と実質的に相同な核酸を１種または２種以上含む、少なくとも１つの甘味料または甘味増強剤と結合することができるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸であって、
【０００９】
配列同一性によって決定される実質的に相同な核酸が少なくとも９０％の配列同一性を有し；ハイブリダイゼーションによって決定される実質的に相同な核酸が、５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳからなる溶液中で４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中で６５℃で洗浄されるというストリンジェントな条件下でハイブリダイズし；核酸が任意に配列番号６（ＨＳＶタグ）をその対応するタンパク質のＣ末端またはその付近に含む、前記核酸が提供される。
【００１０】
他の側面において、上記で定義された核酸を含む発現ベクターが提供される。
他の側面において、上記で定義された発現ベクターを形質転換された宿主細胞が提供される。
他の側面において、上記のように安定的に上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質、Ｇタンパク質、任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なＧタンパク質を発現する宿主細胞が提供される。
他の側面において、上記のように一時的に上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質、Ｇタンパク質、任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なＧタンパク質を発現する宿主細胞が提供される。
【００１１】
他の側面において、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を産生する方法であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、発現に十分な条件下で培養し、それによってＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を形成し、任意にそれを細胞から回収するステップを含む、前記方法が提供される。
【００１２】
他の側面において、味覚細胞における甘味シグナルを調節する剤を同定する方法であって：
（ｉ）任意に他の剤の存在下で、剤の、甘味刺激およびカルシウム刺激から選択される刺激に応答して機能的応答を提供するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する細胞への接触；および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が、前記細胞中の少なくとも１つの機能応答によって、前記細胞中の前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の機能応答に影響するかどうかの決定；
を含み、
前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が上記で定義されたものである、前記方法が提供される。
【００１３】
他の側面において、細胞が、Ｇタンパク質もまた発現する、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、Ｇタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なキメラＧタンパク質である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、Ｇタンパク質が、キメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、ステップ（ｉｉ）が、細胞内メッセンジャーのまたはそれに起因する変化を計測することによって実施される、上記で定義された方法が提供される。
【００１４】
他の側面において、機能応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、前記細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択された細胞である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、細胞が、哺乳類細胞である、上記で定義された方法が提供される。
【００１５】
他の側面において、細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群より選択された哺乳類細胞である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、ステップ（ｉ）が、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質と試験剤をカルシウムの存在下で接触させることをさらに含む、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、カルシウムが、塩化カルシウムの形態で提供される、上記で定義された方法が提供される。
【００１６】
他の側面において、
（ｉ）上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する遺伝子組換え細胞、および
（ｉｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニスト
を、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節剤としての試験剤の同定のために組み合わせて利用することを含むキットが提供される。
【００１７】
他の側面において、
（ｉ）上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する遺伝子組換え細胞を成長させること；
（ｉｉ）適切な濃度のアゴニストの存在下で試験剤を添加すること；
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下における応答の比較により、細胞の機能的応答における変化を決定すること、ならびにその結果、試験剤が上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節剤であることが同定されること
を含む、上記で定義されたキットの利用方法が提供される。
【００１８】
他の側面において、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を調節する剤の同定方法であって；
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質へのリガンド結合に応答して変化するパラメータを計測すること、および
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答して変化するパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定すること、およびそれによって調節剤またはリガンドを同定すること
を含む、前記方法が提供される。
【００１９】
他の側面において、リガンドが、カルシウム、カルシウムイオンおよび塩化カルシウムからなる群から選択されたリガンドである、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、ステップ（ｉ）は、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の特性を計測する、上記で定義された方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、これに限定するものではないが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２モノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３モノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ２サブユニットと野生型Ｔ１Ｒ３）、およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ３サブユニットと野生型Ｔ１Ｒ２）を含む。
【００２１】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２は、これに限定するものではないが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂを含む。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３は、これに限定するものではないが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂを含む。各−ａ変異体は、異なる由来（ＣＳＲおよびＴ１Ｒ、それぞれ）の２つの部位が連結してキメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを与える正確な位置において、関連する−ｂ変異体とは異なる。それらの配列（配列番号１＋２：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ核酸＋タンパク質；配列番号３＋４：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ核酸＋タンパク質；配列番号１９＋２０：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ核酸＋タンパク質；配列番号２１＋２２：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ核酸＋タンパク質）から明らかなように、変異体−ａはシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の直前で連結し、変異体−ｂはＣＲＤの直後で連結する。
【００２２】
各キメラサブユニットは、キメラサブユニットまたは野生型サブユニットお互いと連結し得る。したがって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、特に、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａモノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａモノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ２−ａサブユニットと野生型Ｔ１Ｒ３）、Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ３−ａサブユニットと野生型Ｔ１Ｒ２）も、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂモノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂモノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ２−ｂサブユニットと野生型Ｔ１Ｒ３）、Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ３−ｂサブユニットと野生型Ｔ１Ｒ２）、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマー、およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーも含む。
【００２３】
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、またはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３のＶＦＴドメインを有しておらず、したがってＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３のＴＭＤドメインおよびシステインリッチドメインと結合する化合物を特異的に同定することが可能である。これらの同定された化合物は、インビボにおいて甘味受容体に結合するためにＶＦＴ部位と結合する炭水化物と競合しないことが期待される点で特に興味深く、したがって特に興味深い炭水化物の甘味増強剤の潜在的候補である。
【００２４】
キメラタンパク質は、時に求める特性を組み合わせたり、不要なものを排除したりできる、２または３以上のオリジナルタンパク質の連結された断片である。三次元空間におけるタンパク質のフォールディングが重大で、アミノ酸の位置がフォールディングに影響するので、どんな２断片でも連結することができるわけではない。重大なドメインおよびアミノ酸が知られていても、発現の成功、正しいフォールディングおよび求める特性に変化のない機能性は、まったく予測できない。
【００２５】
出願人らは、キメラモノマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３が機能的であり、機能的ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマーについての例参照；ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａもまた働き得る）を形成しうることを見出した。出願人らの実験は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２モノマーサブユニットもまた、ヘテロダイマーを形成せずに、機能的甘味受容体としての機能をそれ自身に有していることを示す。予備実験はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３が、あるＧタンパク質とかみ合いおよび／またはそれを活性化することに困難を有するだろうことを示したが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３は、Ｇタンパク質を活性化する能力を必要としない結合アッセイにおいて有用である。
【００２６】
したがって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３は、本明細書に記載されている方法において、そのモノマー形態においてもまた有用である。代替的に、それらの方法に利用することができるヘテロダイマーはキメラサブユニット／野生型サブユニットヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）である。
【００２７】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーにおいて、ヘテロダイマー複合体のそれぞれのＣＳＲ：：Ｔ１Ｒサブユニットは、２つのソースタンパク質からの連結された配列断片からなる。２つのソースタンパク質はヒトカルシウム感受性受容体（ｈＣａＳＲ）、およびＴ１Ｒタンパク質（Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３）である。両サブユニットに共通するｈＣａＳＲ由来断片（ＣＳＲ）は、ｈＣａＳＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有する。Ｔ１Ｒ由来断片は、Ｔ１Ｒ配列の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含有し、それらがそれぞれＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３由来であるので、異なっている。
【００２８】
キメラタンパク質は、甘味物質の代わりにカルシウムを受容体活性化のリガンド／アゴニストとして利用可能にし、甘味物質の存在に起因するあらゆる不都合な効果を回避することができる。
本明細書で利用される、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒという語は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２ホモマー；またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ホモマー；またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２とＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３もしくは野生型Ｔ１Ｒ３とのヘテロダイマー複合体（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）；またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３とＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２もしくは野生型Ｔ１Ｒ２とのヘテロダイマー複合体（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）を指す。
【００２９】
より一般的には、インビボおよび多くのインビトロの方法において、受容体がＧタンパク質と組み合わされているとき、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは「ＧＰＣＲ」とも言われる。
提供されるキメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ構築物（ＤＮＡ、ベクター、遺伝子組換え細胞、タンパク質）は、限定することなく、甘味応答の調節剤、例えば限定することなく甘味増強剤、をスクリーニングするときに有用である。慣習的なスクリーニング法および結合アッセイを調節剤および増強剤のスクリーニングに利用してもよい。かかるスクリーニングの方法論は、当該技術分野において周知であり、概略を下述する。
【００３０】
代替的に、キメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ構築物中のＣＳＲ（ｈＣａＳＲの一部）がカルシウムに応答性の成果物受容体を表し、Ｔ１Ｒ受容体のリガンド／アゴニストの存在／非存在下における調節剤のスクリーニングのとき、リガンドはカルシウムと置き換えられる（例えば、限定することなく、塩化カルシウムの形態で）。これは、現実のリガンド／アゴニストに存在するあらゆる否定的な効果を回避する付加的な利点を有する。例えば、糖リガンド／アゴニストの調節剤のスクリーニングのとき、糖の浸透圧などへの不都合な効果が回避される。
【００３１】
アッセイに利用される細胞
トランスフェクトされたまたは内在性のＴ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３のアゴニスト応答を決定する方法それぞれ、または他の調節剤に依存する前記応答の変化に、否定的に影響し得る。Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２の欠失は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３活性化の決定のためのヌルバックグラウンドを提供し、観察されたシグナルがＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３活性化に直接結びつく。これにより、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３を特異的に調節する剤の同定が可能となり、野生型Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を活性化する剤を除外し、ここで、Ｔ１Ｒ３の場合、Ｔ１Ｒ３は、甘味および旨味のヘテロダイマー両方の一部であるから、旨味物質もまた含む。
【００３２】
内在性の野生型Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の存在はいくつかのバックグラウンドシグナルの原因となり、それは望ましくない。内在性Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３を有する細胞は、十分に低いバックグラウンドの結果を獲得するのに依然として有用ではあるが、よりよい選択は内在性Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含有しない細胞である。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質を利用するときは、バックグラウンドに不都合な効果なしで野生型Ｔ１Ｒ３を含有することができ、またはＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質を利用するときは、バックグラウンドに不都合な効果なしで野生型Ｔ１Ｒ２を含有することができるという例外が発生する。
【００３３】
下に列挙した細胞は、内在性／野生型Ｔ１Ｒ３または内在性野生型Ｔ１Ｒ２を含有しない点で特に有用である。
しかし、代替的な細胞もまた本明細書に記載されている方法において有用である。
【００３４】
適切な真核細胞は、例えば、限定することなく、哺乳類細胞、酵母細胞、または昆虫細胞（Ｓｆ９を含む）、両生類細胞（メラニン保有細胞を含む）、またはシノラブディス（Caenorhabditis）（Caenorhabditis elegansを含む）細胞を含むぜん虫細胞などの真核細胞を含む。
適切な哺乳類細胞は、例えば、限定することなく、ＣＯＳ細胞（Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７を含む）、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞、または他のトランスフェクト可能な真核細胞セルラインを含む。
適切な細菌細胞は限定することなくE. coliを含む。
【００３５】
細胞は、当該技術分野において周知のように、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質（受容体をホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に連結する）を一過性にまたは安定的にトランスフェクトされてもよい。味覚ＧＰＣＲとの増強されたカップリングを提供するキメラＧタンパク質であるＧアルファ１６−ガストデューシン４４（Ｇ．ｓｕｂ．．ａｌｐｈａ．１６  ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇ．ｓｕｂ．ａｌｐｈａ．１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇａ１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６−ガストデューシン  ４４、または以下で使用されているように「Ｇα１６ｇｕｓｔ４４」としても知られている）を採用する優れた異種発現系は、ＷＯ２００４／０５５０４８に詳細に記載されている。代替的に、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているＧａｑ−ガストデューシンに基づいた他のキメラＧタンパク質、または、例えばＧ１６またはＧ１５などの、他のＧタンパク質もまた利用してよい。
【００３６】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは、受容体を、例えばホスホリパーゼＣシグナル伝達経路などの、シグナル伝達経路、または例えば後述のものを含むシグナル伝達経路に連結するＧタンパク質とともに、細胞内で発現させることが可能である：アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ＩＰ３、ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合、アラキドン酸、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、ＤＡＧ、プロテインキナーゼｃ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナーゼ、チロシンキナーゼ、またはＥＲＫキナーゼ。
【００３７】
代替的に、以下に詳述するように、いかなる適切なリポーター遺伝子もＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性化応答プロモーターに連結し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性の決定に利用することができる。
【００３８】
上述の細胞に利用されるベクター構築物
かかる細胞中でＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を発現するベクター構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用する、それ自体が周知なやり方によって産生され得る。配列の確認後、ｃＤＮＡ断片は、例えばｐｃＤＮＡ３．１哺乳類細胞用哺乳類発現ベクターなど、適切なベクター内へサブクローニングされてよく、正しい遺伝子の発現を可能にするために対応する宿主細胞に一過性にトランスフェクトされてよい。
【００３９】
例えば４８時間の、トランスフェクト後期間の後、タンパク質の正しい発現を確認するために細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって解析してもよい。一度正しいタンパク質の発現が確認されれば、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ  Ｔ−ＲｅｘＴＭを含む哺乳類細胞などの適切な細胞は、当該技術分野において周知の技術に従って、安定してタンパク質を発現する細胞を生成するためにトランスフェクトされてよい。
【００４０】
代替的に、様々な非哺乳類発現ベクター／宿主システムが、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒをコードする配列の含有および発現に利用可能である。これらは、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌を含む微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）、または細菌発現ベクター（例えばｐＢＲ３２２プラスミド）で感染させた昆虫細胞システムなどを含む。
【００４１】
以上に記載された系とともに利用することができる特定のベクターの例は、「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」、編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein、第１版、CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に記載されている。
【００４２】
細菌系において、多くのクローニングおよび発現ベクターが、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列について意図する利用に応じて選択し得る。例えば、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列のルーチンのクローニング、サブクローニング、および増殖が、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene, La Jolla Calif.）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Life Technologies）などの多機能性大腸菌ベクターを利用して行える。ＧＰＣＲをコードする配列の、ベクターのマルチクローニングサイトへのライゲーションはｌａｃＺ遺伝子を妨害し、組換え分子を含有する形質転換細菌の同定のための比色スクリーニング手法を利用可能にする。加えて、これらベクターはインビトロ転写、ジデオキシシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、およびクローニングされた配列内のネストされた欠失の作出にも有用であり得る。例えば抗体の産生など、多量のＧＰＣＲが必要なとき、ＧＰＣＲの高発現を導くベクターが利用し得る。例えば強い、誘導可能なＳＰ６またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターなどが利用し得る。
【００４３】
酵母発現系はＧＰＣＲの産生に利用されてよい。アルファファクター、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨプロモーターなどの構成的または誘導プロモーターを含む多数のベクターが酵母Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastorisに利用し得る。加えて、かかるベクターは、発現タンパク質の分泌または細胞内の保持を導き、安定的増殖のための外来性配列の宿主遺伝子への統合を可能にする。
【００４４】
異種タンパク質を昆虫細胞セルラインで発現するために、例えば、鱗翅目昆虫のバキュロウィルスであるAutographia californicaマルチカプシドヌクレオウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の誘導体が利用可能である。このシステムにおいて、外来性遺伝子発現は、ポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターのいずれかの、非常に強い後期ウィルスプロモーターに導かれ、多様なベクターが、組換えタンパク質の発現および回収の最適化に利用可能である。これらのベクターは膜結合型および分泌型タンパク質の両方を高度に発現することが可能であり、また哺乳類システム中で起こることが知られる、Ｎ−およびＯ−連結糖鎖付加、リン酸化、アシル化、タンパク質分解および分泌ワクチン成分を含む多くの翻訳後修飾も可能である。例えばInvitrogenのInsectSelectＴＭなどの多くのベクターが商業的に入手可能である。
【００４５】
発現系
求めるタンパク質（ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）およびＧタンパク質）をコードするｃＤＮＡを発現するために、典型的には、適切なｃＤＮＡを、転写を導く強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合領域を含む発現ベクターにサブクローニングする。例えばE.coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaなど、適切な細菌プロモーターは当該技術分野において周知であり、かかる発現系のためのキットが商業的に入手可能である。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現系も商業的に入手可能である。真核細胞発現ベクターは、例えばアデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウィルスベクターなどであってよい。
【００４６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的に、宿主細胞においてタンパク質をコードする核酸を発現するのに必要な付加的要素の全てを含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットはしたがって、タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターおよび、転写の効率的なポリアデニレーションに必要なシグナル、リボソーム結合領域、および翻訳ターミネーションを含む。タンパク質をコードする核酸配列は典型的に、組換えタンパク質の効率的な細胞表面発現を推進するために、ラットソマトスタチン−３受容体配列のＮ末端４５アミノ酸などの、細胞表面受容体に有用な膜標的化シグナルに連結していてよい。付加的なベクター要素は、例えばエンハンサーなどを含んでもよい。
【００４７】
発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に、効果的なターミネーションを提供するための転写終止領域も含むべきである。終止領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、また異なる遺伝子から得てもよい。
タンパク質の発現のために、真核細胞または原核細胞における発現のために当該技術分野において周知の、慣用のベクターを利用してよい。ベクターの例は、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、およびｐＥＴ２３Ｄを含むプラスミドなどの細菌発現ベクター、および例えばＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系を含む。
【００４８】
真核ウィルス由来の制御要素を含む発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、サイトメガロウィルスベクター、パピローマウィルスベクター、およびエプスタイン・バーウィルス由来のベクターなどは、典型的に真核発現ベクターとして利用される。他の真核ベクターの例には、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ、およびＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内での発現に効果を示す他のプロモーターの指揮下でタンパク質を発現させられる他のいかなるベクターも含む。
【００４９】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸リダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。
【００５０】
典型的に発現ベクターに含まれる要素には、E. coli中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを取り込んだ細菌の選別を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの本質的でない領域のユニークな制限部位なども含んでよい。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重大ではなく、当該技術分野で知られたあらゆる多くの薬剤耐性遺伝子が適している。必要ならば、原核配列は、真核細胞内でのＤＮＡの複製を妨害しないように任意に選択される。
【００５１】
細菌系において、ＧＰＣＲのｃＤＮＡ断片は、単独で、または、対象となるＧＰＣＲが、E. coliペリプラズムマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であって、そのシグナルペプチドを含むＭＢＰがＧＰＣＲのアミノ末端に連結しているものに融合した融合タンパク質として発現されてよい。野生型ＧＰＣＲのｃＤＮＡまたはＭＢＰ：ＧＰＣＲ融合ｃＤＮＡは、例えばE. coli中でＧＰＣＲの発現がｌａｃ野生型プロモーターによって駆動されるｐＢＲ３２２など、適切なプラスミドへサブクローニングされる。E. coliにおけるＧＰＣＲの発現方法は、例えば「G-protein coupled receptors（Signal Transduction Series）」, 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 第１版, pp. 265〜280, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999などに記載されている。
【００５２】
内在性ＧＰＣＲを欠損した遺伝子操作酵母システムおよび昆虫細胞システムは、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性化スクリーニングに対してヌルバックグラウンドであるという利点を提供する。
遺伝子操作酵母システムはヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を、対応する内在性酵母フェロモン受容体経路の成分と代替するものである。下流シグナル経路はまた、通常の酵母シグナル応答が選択培地上でのプラス成長またはレポーター遺伝子発現に転換するように、改変される（Broach, J. R. and J. Thorner, 1996, Nature, 384 (supp.):14〜16に記載）。
【００５３】
遺伝子操作昆虫システムは、受容体をホスホリパーゼＣシグナル経路に連結できるヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を組み込んでいる（例えばKnight and Grigliatti, (2004) J. Receptors and Signal Transduction, 24: 241〜256参照）。
両生類細胞システム、特にメラニン含有細胞は、例えばＧＰＣＲ発現系について記載したＷＯ９２／０１８１０などに記載されている。
【００５４】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒの過剰発現
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは、例えばＣＭＶ早期プロモーターなどの強力な構成的プロモーターの制御下に置くことにより過剰発現することができる。代替的に、保存的なＧＰＣＲアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある変異を導入し、利用するＧＰＣＲを構成的に活性化させることが可能である。
【００５５】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ発現ベクター構築物の細胞内へのトランスフェクション
タンパク質を大量に発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫の細胞系を作出するために、標準的なトランスフェクション法が利用可能である。
【００５６】
核酸配列を宿主細胞に導入するために知られたいかなる方法も利用してよい。用いる特定の遺伝子操作手順は、対象となるタンパク質を発現できる宿主細胞中に関係する遺伝子を首尾良く導入できさえすればそれでよい。これらの方法は、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性の遺伝物質を宿主細胞中に導入することを伴ってもよく、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクターなどを含む。
【００５７】
例えば、限定することなく、Ｔ−ＲｅｘＴＭ発現系（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を用いることができる。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステムは、E. coli Ｔｎ１０にコードされたテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性オペロン由来の調節エレメントを利用したテトラサイクリン制御哺乳類発現系である。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステム中のテトラサイクリン調節は、テトラサイクリンのＴｅｔリプレッサーへの結合および対象となる遺伝子の発現を制御するプロモーターの抑制解除に基づいている。
【００５８】
細胞培養
トランスフェクト後、トランスフェクトされた細胞は、当該技術分野において周知の標準的な培養条件で培養することができる。異なる細胞は、適切な温度および細胞培養培地を含む、異なる培養状態を要求することは、当業者に明らかである。
【００５９】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体タンパク質回収
所望の場合、タンパク質を標準的な技術を利用して細胞培養から回収することができる。例えば、沈殿およびクロマトグラフィ工程に供する前に細胞を機械的にまたは浸透圧ショックによって破裂させてよく、その種類と順序は回収される特定の組換え物質次第である。あるいは、組換えタンパク質を、組換え細胞が培養された培養培地から回収することもできる。
【００６０】
本明細書のアッセイによって同定され得る味覚調節物質
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体活性の調節物質（リガンド、アゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、増強剤を含む様々なタイプ）は、下述のように同定可能である。
調節物質のタイプは同時に１以上のタイプを含んでもよく、濃度に依存し得る。例えば、剤がある濃度範囲においてアゴニストとして作用するが、別の濃度範囲においては他のアゴニスト（例えば甘味料または糖）の調節剤または増強剤として作用することもある。したがって、剤はその調節活性の決定のために異なる濃度で試験されるべきである。
これから本明細書に記載された方法において同定可能な剤の定義について述べる。
【００６１】
調節剤は、１または２以上の後述のものの増大または減少を引き起こす剤である：受容体の細胞表面発現、リガンドの受容体への結合、または受容体の活性化形態によって開始される細胞内応答（アゴニストの存在下または非存在下における）。調節剤はそれ自身が受容体に結合し、それを活性化し、それによって細胞内応答の増大を調節するアゴニストであり得る。
【００６２】
調節剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体またはその断片を含む様々なタイプの化合物を含む。それらは、合成または天然物質、天然材料の抽出物を含む様々な給源、例えば動物、哺乳類、昆虫、植物、細菌または真菌細胞材料または培養細胞、あるいはかかる細胞の馴化培地などに由来し得る。
リガンドは受容体と結合する剤であり、アゴニスト、部分的アゴニスト、増強剤、アンタゴニスト、または逆アゴニストであってもよい。
【００６３】
アゴニストは、受容体に結合したときに、アゴニストの非存在下での細胞内応答と比較して、受容体を活性化し、細胞内応答を増大させるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質受容体のリガンドである。付加的にまたは代替的に、アゴニストは、アゴニストの非存在下で細胞表面に存在する細胞表面受容体の数と比較して、受容体の細胞表面発現を増大させるように、細胞表面受容体の内在化を減少させ得る。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒのアゴニストは、例えばカルシウム、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ＮＤＨＣ、およびシンナモニトリルなどを含む。
【００６４】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のリガンドは、キメラタンパク質のＣＳＲ部分に結合するＣＳＲドメインリガンド（カルシウム）、またはキメラタンパク質のＴ１Ｒ部分に結合するＴＳＲドメインリガンド（甘味応答の調節剤）の２つのタイプに分類することができる。
部分的アゴニストは、受容体を最大限活性化する他のアゴニストと比べて、部分的にしか作用しないアゴニストである。
【００６５】
アンタゴニストは、アゴニストと同じ（競合的アンタゴニスト）または異なる（アロステリックアンタゴニスト）受容体の部位に結合するが、受容体の活性化形態によって起こる細胞内応答を活性化せず、それゆえアゴニストの存在下およびアンタゴニストの非存在下と比較して、アゴニストによって誘導される細胞内応答を阻害するリガンドである。
受容体と結合する逆アゴニストは、受容体によって媒介される構成的細胞内応答を、逆アゴニストの非存在下における細胞内応答と比較して減少させる。
【００６６】
阻害剤は、阻害剤の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して、アゴニストと受容体との結合を減少させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を減少させる。
増強剤は、アゴニストの受容体への結合を、増強剤の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して増大させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を増大させる。
【００６７】
リガンドを結合し、例えばＧタンパク質（すなわち調節剤との種々の相互作用に起因して）などによりシグナルを伝達する受容体の活性または活性の変化は、以下に記載されるアッセイによって決定可能である。
【００６８】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体の調節剤同定のためのアッセイ
調節剤は、機能的効果／パラメータを決定および比較するための、多種多様なインビトロおよびインビボアッセイを利用して、または代替的に結合アッセイによって、同定可能である。受容体の機能上の試験剤の効果は適切な機能的パラメータを分析することで計測可能である。受容体活性に影響するあらゆる生理学的変化は、調節剤の同定のために利用可能である。
【００６９】
かかる機能的アッセイは、例えば動物から単離された無傷の細胞または組織を利用した、濃度、活性またはそれらの二次メッセンジャーの変化（例えば細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イノシトールリン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール／ＤＡＧ、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼなどを含む）、イオンフラックス、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルの計測に基づいたアッセイ、およびＧＴＰ結合性、ＧＴＰ分解酵素、アデニル酸シクラーゼ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、ＰＫＣ、キナーゼおよび転写レポーターに基づいたアッセイなど、当該技術分野において周知である。いくつかの適切なアッセイが、例えばＷＯ  ０１／１８０５０に記載されている。
【００７０】
受容体活性化は、典型的には例えば、例えば細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンを放出するＩＰ３などの二次メッセンジャーの増大など、後続する細胞内イベントの起点となる。いくつかのＧタンパク質共役受容体活性化は、ホスホリパーゼＣ媒介ホスファチジルイノシトール加水分解を通したイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する。ＩＰ３は次に細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンの放出を刺激する。したがって、細胞内カルシウムイオンレベルの変化、またはＩＰ３などの二次メッセンジャーレベルの変化は、Ｇタンパク質共役受容体活性の決定に利用可能である。
【００７１】
全ての機能的アッセイは、例えば受容体をその表面または単離細胞膜画分上に発現する細胞を含有するサンプルで行うことができる。有用な細胞は上述されている。また、分離細胞または細胞膜を有するサンプルの代わりに、遺伝子組換え動物からの組織を利用してもよい。
本明細書に記載されたスクリーニング方法は、甘味応答の調節剤、例えば甘味増強剤、を同定するのに特に有用である。
【００７２】
それ自身がアゴニストではない調節剤（例えば、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、または増強剤）を同定するため、いずれもアゴニストを含有する、試験剤を含むサンプルおよび含まないサンプルを比較する。アゴニストとして、例えばカルシウムを用いることができる。カルシウムの使用は、両方のＴＭＤがアクセス可能となる利点を有する。他の知られたまたは同定されたアゴニスト、例えば、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、およびシンナモニトリルなどもまた利用可能であるが、同定される調節剤の調節剤結合部位と一致し得るリガンド／アゴニスト結合部位を部分的にふさぎ、低シグナルの原因となり得る。
【００７３】
例えば、コントロール（アゴニストを含むが調節剤は含まない）の相対的受容体活性値を１００とする。コントロールに対する活性の減少により阻害剤、アンタゴニストまたは逆アゴニストが同定され、一方、増大により増強剤が同定される。通常、試験剤を含まないサンプルと比べて、または試験剤を含むが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づいたサンプルと比べて、試験剤を含むサンプルにおいて計測された活性における、１０％またはそれ以上の増大または減少は、有意であると考えられる。
【００７４】
甘味増強剤を同定するため、試験剤を含むサンプルおよび含まないサンプルを比較する。例えば、コントロール（例えば塩化カルシウムなどのアゴニストを含むが、調節剤は含まない）の相対的受容体活性値を１００とする。増大により増強剤が同定される。通常、試験剤を含まないサンプルと比べて、または試験剤を含むが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づいたサンプルと比べて、試験剤を含むサンプルにおいて計測された活性における、１０％またはそれ以上の増大または減少は、有意であると考えられる。
【００７５】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を採用するスクリーニングのために、カルシウムがアゴニストとして利用可能である。代替的に、ＣＳＲ：：Ｔ１ＲのＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３断片の関連部分に結合するアゴニストを利用してもよい。これらのアゴニストは、例えばペリラルチン、サイクラミン酸塩、ＮＤＨＣ、およびシンナモニトリルを含む。
【００７６】
アゴニストまたは部分的アゴニストの同定
ＶＦＴドメインに結合しないアゴニストまたは部分的アゴニストを同定するために、試験剤を有するサンプルを、アゴニスト（例えば塩化カルシウム、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、シンナモニトリル、または他の同定されたリガンド／アゴニスト）を有するポジティブコントロールと比較する。代替的に／付加的に、試験剤を有するおよび有さないサンプルが、そのＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の活性について比較される。
【００７７】
例えば、アゴニストまたは部分的アゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストが１００ｍＭまたはそれ以下で存在しているとき、ポジティブコントロール甘味アゴニストの最大生物学的活性の少なくとも１０％に相当する生物学的活性を有しており、例えばアゴニストの最大生物学的活性に匹敵するまたはそれ以上の最大生物学的活性を有し得る。最大生物学的活性は、与えられた受容体アッセイフォーマット内で達成可能なアゴニスト、例えば塩化カルシウム、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、シンナモニトリルなどアッセイに対する最大達成可能な受容体応答であって、その応答が、同じアゴニストの濃度を増大させて適用してもさらに増大できないものと定義される。
【００７８】
上述のアゴニストは、異なる濃度において、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニストの増強剤としても働き得る。これは、アゴニスト−試験剤を甘味増強効果を示すシグナルについて試験するために、カルシウムまたは他のアゴニストを利用したスクリーニング法で試験することができる。
代替的に、試験剤を有するサンプルにおける、例えば１０％またはそれ以上の計測活性の増大が、試験剤を有さないサンプルまたは試験剤を有するがＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づくサンプルと比較される。
【００７９】
アンタゴニストを同定するために、知られたアゴニストの存在下における、試験剤の存在下および非存在下での受容体活性が比較される。アンタゴニストは、例えば少なくとも１０％の、アゴニスト刺激性受容体活性の減少を示す。
逆アゴニストを同定するために、試験剤の存在下および非存在下での受容体活性が、上述のように、受容体を過剰発現する動物／細胞／膜を含有するサンプルで比較される。逆アゴニストは、例えば少なくとも１０％の、受容体の構成的活性の減少を示す。
【００８０】
上述のアッセイにおけるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体活性を計測する適切な検出法の様々な例を以下に記載する。
多くのスクリーニングはカルシウム活性に頼っており、これらについては、細胞、受容体、酵素またはリポーター遺伝子を非特異的に刺激することを回避するために、カルシウムの少ない緩衝系を利用すべきである。
【００８１】
細胞質イオン濃度または膜電位の変化の決定：
「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」, CRC Press 1999; 第１版, Haga and Berstein編に詳述されているように、受容体活性を報告するために、細胞にイオン感受性色素を負荷することができる。細胞質または膜電位におけるイオン濃度の変化は、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指標を利用して計測される。
【００８２】
カルシウムフラックス
ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出は、カルシウムに結合する細胞持続性（cell-permanent）色素を利用して決定される。カルシウム結合性色素は、細胞内のカルシウム上昇に比例する蛍光シグナルを発生する。この方法は、受容体活性の迅速かつ定量的な計測を可能にする。
【００８３】
用いる細胞は、上述のようにホスホリパーゼＣ経路に連結できるようにするために、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ  ＧＰＣＲとＧタンパク質とを共発現するトランスフェクト細胞である。ネガティブコントロールは、候補化合物の可能な非特異的効果を排除するために、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞またはその膜（モックトランスフェクションしたもの）を含む。
カルシウムフラックス検出手順は、「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」; 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 第１版, 424pp.CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に詳述されており、適合させたバージョンの概略を以下に記載する。
【００８４】
０日目：９６ウェルプレートに、１ウェルあたり８．５K個の細胞を播種し、栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
１日目：１ウェルあたり１５０ｎｇのＧＰＣＲ  ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用して、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
【００８５】
２日目：成長培地を捨て、細胞を、１．５μＭのFluo-4 AM（Molecular Probes）および２．５μＭのプロベニシドを、３７℃で１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのグルコースを含有する、低カルシウムＣ１緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かしたものからなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液で１時間（室温にて暗所で）インキュベートする。１２５μｌの低カルシウムＣ１緩衝溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートをさらに３０分室温にて暗所でインキュベートする。
緩衝溶液を捨て、プレートを１００μｌの低カルシウムＣ１緩衝溶液を洗浄緩衝液として５回洗浄し、細胞を２００μｌの低カルシウムＣ１緩衝液中で再構成する。
【００８６】
プレートを、例えばFlexstation（Molecular Devices）またはFLIPR（Molecular Devices）などの蛍光マイクロプレートリーダーに設置し、２０μｌの１０倍濃縮リガンドストック溶液を加えて受容体活性化を開始する。蛍光は、リガンドを加える１５秒前からリガンドを加えた後４５〜１１０秒後まで継続的に監視する。受容体活性化レベルは以下の２つの方程式で定義される：活性化の％＝（最大蛍光−基準蛍光／基準蛍光）×１００、または蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光、式中基準蛍光はリガンド添加前の平均蛍光レベルを表す。
【００８７】
有用な細胞は、これに限定するものではないが、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞などの上述した哺乳類細胞である。細胞は、当該技術分野で周知のとおりに、ＧＰＣＲとＧタンパク質で一過性にまたは安定的にトランスフェクトすることができる。優れた異種発現系は、ＷＯ２００４／０５５０４８に詳述されている。
カルシウムフラックスアッセイは、例えば後述の例１に記載されているように行うことができる。
【００８８】
調節剤の同定は、上述の方法を以下のように変更して行われる。シグナルは、アゴニストの存在下だが試験剤の非存在下でＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現する遺伝子組換え細胞から得られた、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性の基準レベルと比較される。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性の増大または減少、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、またはそれ以上など、により調節剤を同定する。
【００８９】
代替的に、同定は、調節剤が存在しないサンプルと比較したとき、または調節剤は存在するがＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現しない細胞（モックトランスフェクションした細胞）のサンプルと比較したとき、例えば１０％またはそれ以上の、蛍光強度の増大または減少を伴う。
【００９０】
アデニル酸シクラーゼ活性
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、例えばKenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585〜591に詳述されているように行われる。反応混合物は通常３７℃で１０分より短くインキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は０．９ｍｌの冷６％トリクロロ酢酸を添加して除タンパクする。チューブを遠心し、それぞれの上清をＤｏｗｅｘ  ＡＧ５０ｗ−Ｘ４カラムに加える。カラムからのｃＡＭＰ画分を、アゴニストによる受容体活性化を受けて発生したｃＡＭＰレベルを計測するために、４ｍｌの０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で計数バイアル中に溶出する。コントロール反応もまた、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを利用して行うべきである。
【００９１】
ＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル
Ｇタンパク質を発現している細胞中で、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）／Ｃａ２＋およびその結果としての受容体活性に相当するシグナルを、蛍光を利用して決定可能である。ＧＰＣＲを発現している細胞は、細胞内貯蔵およびイオンチャネルの活性化経由の寄与の結果、細胞質カルシウムレベルの増大を見せ得、必須ではないが、カルシウムフリー緩衝液中でかかるアッセイを実施し、内在ストアからのカルシウム放出の結果による蛍光応答と区別するために、随意にＥＤＴＡなどのキレート剤を補完することが望ましいだろう。
【００９２】
ホスホリパーゼＣ／細胞内Ｃａ２＋シグナル
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは、受容体とホスホリパーゼＣシグナル伝達経路を連結するＧタンパク質を有する細胞で発現される。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば蛍光Ｃａ２＋指示色素および／または蛍光イメージングなどを利用して、計測する。
【００９３】
ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含むＧＰＣＲにとって、受容体活性の指標はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。本方法は、標識ＧＴＰの結合を決定することで膜と連結するＧタンパク質を計測する。
受容体を発現する細胞から単離された膜は、３５Ｓ−ＧＴＰγＳおよび未標識ＧＤＰを含有する緩衝液中でインキュベートされる。活性を有するＧＴＰａｓｅは無機リン酸塩として標識を放出し、これは２０ｍＭのＨ３ＰＯ４中の活性炭５％懸濁液中で遊離無機リン酸塩を分離した後にシンチレーションカウンティングによって決定される。混合物をインキュベートし、未結合標識ＧＴＰをＧＦ／Ｂフィルターでろ過して取り除く。結合した標識ＧＴＰを液体シンチレーションカウンティングで計測する。コントロールは、試験剤の非特異的効果の可能性を排除するために、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクションしたもの）から単離した膜を利用するアッセイを含む。方法はTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol., 47: 848〜854に詳述されている。
【００９４】
調節剤を同定するために、上述の、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性などの、１０％またはそれ以上の変化（増大または減少）は通常十分である。しかしながら、アゴニストを同定するためには、上述のアッセイは以下のように変更して実施する。剤は、化合物が１００ｍＭまたはそれ以下、例えば１０μＭから５００μＭの範囲など、例えば約１００μＭで存在したときに、活性が、知られたアゴニスト（例えばペリラルチン）のそれの少なくとも５０％であった場合、または知られたアゴニストによって誘導されるレベルと同じまたはそれ以上のレベルを誘導する場合、通常アゴニストとして同定される。
【００９５】
マイクロフィジオメーターまたはバイオセンサー
かかるアッセイはHafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149〜158に詳述されているように行うことができる。
アラキドン酸
アラキドン酸の細胞内レベルは受容体活性の指標として採用される。かかる方法はGijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146-20156に詳述されている。
【００９６】
ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ
細胞内または細胞外ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または、例えばHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91〜105に記載されているような、ｃＡＭＰ結合タンパク質を利用して計測可能である。代替的に、例えばLJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsの高効率蛍光偏光ベースホモジニアスアッセイなど、複数のｃＡＭＰ計測のためのキットもまた商業的に入手可能である。代替的に、ｃＧＭＰの細胞内または細胞外レベルもまた、イムノアッセイを利用して計測可能である。例えば、Felly-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159-164(1994)に記載の方法などが、ｃＧＭＰレベルを決定するのに利用され得る。代替的に、米国特許第４，１１５，５３８号に記載されているｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを計測するアッセイキットもまた利用可能である。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【００９７】
ＤＡＧ／ＩＰ３
例えばPhospholipid Signaling Protocols, Ian M. Bird, Totowa, N.J.編, Humana Press, 1998に記載のように、受容体活性に起因するリン脂質分解によって放出される、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）をＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性の指標として検出しおよび利用することが可能である。例えばPerkin Elmer and CisBio Internationalから商業的に入手可能な、イノシトール三リン酸の計測のためのキットもまた利用可能である。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【００９８】
ＰＫＣ活性
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウム活性化タンパク質キナーゼファミリーの、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を伴う経路を通してシグナリング可能である。
ＰＫＣに誘導される遺伝子産物の増大は、ＰＫＣの活性化およびその結果としての受容体の活性化を示す。これらの遺伝子産物は、例えばガン原遺伝子転写因子コード遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎを含む）、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤（コラーゲナーゼタイプＩおよびプラズミノーゲン活性化因子阻害剤を含む）、および接着分子（細胞内接着因子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）を含む）などを含む。
【００９９】
ＰＫＣ活性はKikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 13341に記載されているように、その後ホスホセルロースペーパーに結合することによって分離されるＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を計測することで、直接計測し得る。これは精製キナーゼまたは粗細胞抽出物中の活性の計測に利用可能である。タンパク質キナーゼＣサンプルは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＴＴでアッセイ直前に希釈可能である。
代替的なアッセイは、PanVeraから商業的に入手可能なタンパク質キナーゼＣアッセイキットを利用して行うことも可能である。
【０１００】
上述のＰＫＣアッセイは、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）を発現する細胞からの抽出物に対して行う。
活性はまた、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の制御配列によって駆動するリポーター遺伝子構築物の利用を通して計測可能である。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０１】
ＭＡＰキナーゼ活性
ＭＡＰキナーゼ活性は、例えばNew England Biolabsのｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキット、またはPerkin-Elmer Life ScienceのFlashPlateＴＭ ＭＡＰキナーゼアッセイなど、商業的に入手可能なキットを利用して計測可能である。ｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼまたはＥＲＫ１／２は、ＧｑおよびＧｉ結合ＧＰＣＲを発現する細胞を利用しているとき、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性を示すために計測可能であり、ＧＰＣＲ活性化に続く内在性ＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化を計測するＥＲＫ１／２アッセイキットはTGR Biosciencesから商業的に入手可能である。
【０１０２】
知られた合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸塩を通したチロシンキナーゼ活性の直接計測は周知であり、他のタイプのキナーゼ（例えばセリン／スレオニンキナーゼ）の活性も同様に計測可能である。
【０１０３】
全てのキナーゼアッセイは、精製キナーゼまたは１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞から調製した粗抽出物で行うことができる。利用するキナーゼの基質は、全長タンパク質または基質の代わりとなる合成ペプチドであり得る。Pinna & Ruzzene（1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191-225）は、キナーゼ活性の検出に有用な複数のリン酸化基質部位を列挙している。複数のキナーゼ基質ペプチドが商業的に入手可能である。特に有用なものは、多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である、「Ｓｒｃ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（Sigmaから商業的に入手可能）である。いくつかの方法は、ペプチド基質のフィルターへの結合を必要とし、そこでペプチド基質は、結合を促進するために、正味で正に荷電しているべきである。一般的に、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有しているべきである。反応は一般的に、０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を利用する。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０４】
転写レポーター／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ応答性プロモーター／レポーター遺伝子
レポーター遺伝子アッセイで調節剤を同定するためには、シグナルにおける、少なくとも２倍の増大または１０％の減少が有意である。アゴニストは、試験剤の存在下および非存在下における活性を比較したとき、例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍またはそれ以上刺激する。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒへのアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナルは、細胞内事象のカスケードを作動させ、最終結果として１または２以上の遺伝子の転写または翻訳における迅速かつ検出可能な変化をもたらす。
受容体の活性はしたがって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性化に応答するプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現の計測によって決定される。
【０１０５】
本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子発現の受容体媒介制御に必要な１または２以上の転写制御エレメントまたは配列であり、これは受容体調節発現に必要な１または２以上の基本プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合部位を含む。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒへのアゴニストの結合の結果もたらされる細胞内シグナルに応答するプロモーターは、選択され、発現または遺伝子産物活性が容易に検出および計測可能な、対応するプロモーター制御レポーター遺伝子に作動可能に連結される。
【０１０６】
レポーター遺伝子は、例えばルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびいわゆる「前初期」遺伝子、ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子、転写因子ＣＲＥＢ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、プロエンケファリン遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子、ＮＦ−κＢに応答する遺伝子、およびＡＰ−１応答遺伝子（ＦｏｓおよびＪｕｎ、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む）から選択されてよい。
【０１０７】
プロモーターは、当業者には明らかなように、選択されたレポーター遺伝子に応じて選択される。
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその産物の検出のためのアッセイは当該技術分野で周知である。さらなるレポーター遺伝子の例は以下に記載されている。
【０１０８】
「前初期」遺伝子は好適であり、速やかに誘導される（例えば受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触から数分以内）。レポーター遺伝子の好ましい特性には、次の１または２以上のものが含まれる：リガンド結合に対する速やかな応答性、休眠細胞における低発現または検出できない発現、新たなタンパク質合成の一過性かつ独立した誘導、後続する転写の遮断に新たなタンパク質合成が必要であること、およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが数分から数時間の短い半減期を有すること。同様に、プロモーターも好ましくは、これらの特性を１つ、数個、または全て有している。
【０１０９】
ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子は、複数の異なる刺激に応答し、速やかな誘導を有する遺伝子の例である。ｃ−ｆｏｓ調節エレメントは、転写開始に必要なＴＡＴＡボックス、基本転写のための２つの上流エレメント、および、二回対称性を有するエレメントを含み、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ，およびＰＭＡによる誘導に必要なエンハンサーを含む。ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡキャップ部位の上流−３１７〜−２９８ｂｐの間に位置する２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清枯渇ＮＩＨ３Ｔ３細胞の血清誘導に不可欠である。２つの上流エレメントのうちの１つは−６３〜−５７に位置し、ｃＡＭＰ調節のためのコンセンサス配列に類似する。
【０１１０】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）は細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。したがって、ｃＡＭＰレベルの調節を通してシグナルする受容体の活性化は、転写因子の結合か、またはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥ、またはｃＡＭＰ応答エレメントと称する）に連結されたレポーター遺伝子の発現を検出することで決定可能である。ＣＲＥのＤＮＡ配列はＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーター構築物は米国特許第５，９１９，６４９号に記載されている。
【０１１１】
他の好適なレポーター遺伝子およびそのプロモーターは、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、ソマトスタチン遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、プロエンケファリンおよびｃＡＭＰ、ニコチンアゴニスト、およびホルボールエステルに応答性のそのプロモーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーターを含む。
【０１１２】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答するレポーター遺伝子およびそのプロモーターのさらなる例は、ＡＰ−１転写因子およびＮＦ−κＢを含む。ＡＰ−１プロモーターは、回文配列ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡであるコンセンサスＡＰ−１結合部位により特徴付けられる。ＡＰ−１はまた、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）を含む腫瘍プロモーターによる誘導の媒介に関与しており、したがって、ＴＰＡ応答性エレメントとして、ＴＲＥと呼ばれることもある。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の早期の応答に関与する複数の遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答性遺伝子の例は、ＦｏｓおよびＪｕｎ（タンパク質それ自体がＡＰ−１活性を組成する）、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む。
【０１１３】
ＮＦ−κＢプロモーター／結合エレメントはコンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣを有する。多くの遺伝子がＮＦ−κＢ応答性であると同定されていて、その制御エレメントをリポーター遺伝子と連結し、ＧＰＣＲ活性を監視することが可能である。ＮＦ−κＢに応答する遺伝子は、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＣＣＲ５、Ｐ−セレクチン、Ｆａｓリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩκＢαをコードするものを含む。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは当該技術分野で知られているか、または当該技術分野の通常の技術、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを用いて、またはＮＦ−κＢ制御に従うことが知られる遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて容易に形成可能である。さらに、ＮＦ−κＢ応答性レポーター構築物は、例えばCLONTECHから商業的に入手可能である。
【０１１４】
与えられたプロモーター構築物は、構築物をトランスフェクトしたＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）発現細胞を、アゴニスト（例えばペリラルチン）に曝露することで簡単に試験することができる。アゴニストに応答するレポーター遺伝子の発現における、少なくとも２倍の増大は、レポーターがＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性を計測するのに適していることを示す。
転写アッセイのためのコントロールは、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）を発現しないがレポーター構築物を保持している細胞、およびプロモーターのないレポーター構築物を有する細胞の両方を含む。
【０１１５】
レポーター遺伝子の活性化によって示されるＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性を調節する剤は、他のプロモーターおよび／または他の受容体を用いて、シグナルのＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）特異性を立証し、およびその活性範囲を決定することによって立証可能であり、これにより、あらゆる非特異的シグナル、例えばレポーター遺伝子経路経由の非特異的シグナルなどを排除する。
【０１１６】
イノシトールリン酸（ＩＰ）計測
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は、少なくとも４８時間またはそれ以上の３Ｈ−ミオイノシトールによる細胞標識を伴う、米国特許第５，４３６，１２８号に記載されているように決定されてよい。標識細胞は試験剤に１時間接触させ、次いでそれらの細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水に抽出する。その後、イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィで分離し、シンチレーションカウンティングで定量する。アゴニストに関して、刺激比（fold stimulation）は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロールの存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。同じように、阻害剤、アンタゴニストおよび逆アゴニストに関して、阻害比は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロール（アゴニストを含有してもしなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。
【０１１７】
結合アッセイ
リガンド結合に対する機能的応答に起因するパラメータ変化を計測する上述の機能的アッセイに代えて、リガンド結合を、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体へのリガンドの結合を計測する結合アッセイで決定してもよい。
結合アッセイは当該技術分野で周知であり、溶液中、任意に固相に付着した二重膜中、脂質単層中、または小胞中で試験可能である。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドへの調節剤の結合は、例えば分光特性（例えば蛍光、吸収、または屈折率）の変化の計測、水力学的手法（例えば外見の採用）、およびクロマトグラフィ、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドの可溶特性の計測等によって決定可能である。１つの態様において、結合アッセイは生物化学的であり、組換えＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞／組織からの膜抽出物を利用する。結合アッセイは、例えば、Ｔ１ＲについてAdler et al.によってＵＳ２００５００３２１５８の段落［０１６９］から［０１９８］に記載されているように実施することができる。
【０１１８】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体ポリペプチドおよび核酸、ならびに実質的に相同なポリペプチドおよび核酸
本明細書に記載されている方法に有用なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、配列番号２（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）、配列番号４（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）、配列番号２０（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）、配列番号２２（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）、配列番号２および配列番号４のキメラヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）、配列番号２０および配列番号２２のキメラヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）、配列番号２および配列番号２２のキメラヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）、配列番号２０および配列番号４のキメラヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）、配列番号２または２０と野生型Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／Ｔ１Ｒ３またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／Ｔ１Ｒ３）、および配列番号４または２２と野生型Ｔ１Ｒ２のヘテロダイマー（Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａまたはＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）から選択されるポリペプチドからなる群から選択されてよい。
【０１１９】
あるいは、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質（またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒをコードする核酸配列）は、上記ポリペプチドと実質的に相同であって、依然として機能的である（すなわちリガンドと結合するおよび／またはリガンドによって活性化される、またはかかる受容体をコードしている）レセプター（またはかかるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体をコードする核酸配列）であってよい。
【０１２０】
実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３のＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３部分が、対立遺伝子変異体またはマウス、ラット、ハムスター、サル、およびイヌ由来のＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３を含む、異なる種の関連する部分に置き変えられているかかるタンパク質を含む。
さらに、実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ核酸またはポリペプチド配列は、保存的変異および／または点変異により形成されてもよく、下記のあらゆる保存的に改変された変異体を含む。
【０１２１】
核酸配列について、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列（保存的に置換されたアミノ酸、すなわちアルギニンに差し替えられたリシンおよび下記に説明されているさらなる例など）をコードする核酸を意味する。
【０１２２】
遺伝コードの縮重によって、配列は異なるが機能的に同一な複数の核酸が任意の与えられたポリペプチド／タンパク質をコードする。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の１種である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列はまた、全ての可能な核酸のサイレント変異を記載している。したがって、それぞれの核酸中のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、同一のポリペプチドを産生する機能的に同一の核酸配列を得るために改変し得る。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの与えられた核酸配列に内在する。
【０１２３】
アミノ酸配列について、アミノ酸置換は、かかる変化をＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ配列に導入するのに利用することができる、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法、宿主細胞のトランスフェクション、およびインビトロ転写を含む、遺伝子組換え技術の知られた手順を利用して導入することができる。次いで、変異体を、味覚細胞特異的ＧＰＣＲ機能活性についてスクリーニングすることができる。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択する１つの典型的な指針は（オリジナルの残基の後に典型的な置換が続く）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ、ａｒｇ／ｌｙｓ、ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ、ａｓｐ／ｇｌｕ、ｃｙｓ／ｓｅｒ、ｇｌｎ／ａｓｎ、ｇｌｙ／ａｓｐ、ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ、ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ、ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ、ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ、ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ、ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ、ｓｅｒ／ｔｈｒ、ｔｈｒ／ｓｅｒ、ｔｒｐ／ｔｙｒ、ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ、ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。
【０１２４】
代替的な典型的な指針は、お互いが保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する後続の６群：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を利用する。
他の代替的な指針は、全ての荷電アミノ酸を、正であるか負であるかで、相互の保存的置換を認めるものである。加えて、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さい割合（例えば２６％まで、２０％まで、１０％まで、または５％まで）のアミノ酸を変化させ、追加し、または削除する個別の置換、欠失または付加もまた保存的に改変された変異とみなされる。
【０１２５】
実質的に相同なヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に示す配列同一性の度合いを有するか、または以下に示すある一定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【０１２６】
％配列同一性
実質的に相同なヌクレオチド配列は、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
実質的に相同なポリペプチド配列は、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
【０１２７】
配列同一性の計算は、後述のように決定される。
ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Serch Tool）は、http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能なプログラムｂｌａｓｔｎに使用されているヒューリスティックな検索アルゴリズムである。他のヌクレオチド配列に対するヌクレオチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ（データベース配列に対する一致を報告するための統計学的に有意な閾値）、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いて、Ｂｌａｓｔｎが利用される。他のポリペプチド配列に対するポリペプチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いて、Ｂｌａｓｔｐが利用される。
【０１２８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
ヌクレオチド配列は、本明細書で提示するヌクレオチド配列、またはその相補体と、以下に詳述するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズできた場合、実質的に相同であると考えられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）からなる溶液中での６５℃での洗浄である。
【０１２９】
バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が、例えばスクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ中に存在するために起こり得る。
標的ＤＮＡで観察された特異的相互作用の１０倍以下の強度のシグナルは、バックグラウンドであると考えられる。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐによって放射性標識して計測することができる。
【０１３０】
調節剤を同定するためのキット
キットは、例えば、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ、もしくはそれと実質的に相同な配列を発現する組換え細胞を含み、かつ、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒのアゴニスト、例えば、限定することなく、塩化カルシウム、ペリラルチン、ＮＤＨＣ、サイクラミン酸塩、およびシンナモニトリルなどを含む、スクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットである。
カルシウムを含むキットの利用は、野生型受容体またはキメラタンパク質のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３部分ではなく、キメラタンパク質のみに結合し、それを活性化するという利点を有する。
【０１３１】
任意に、細胞はさらに例えばカルシウムシグナリングのためのＧタンパク質を含む。好適なＧタンパク質は既知であり、上述されており、当業者は必要な場合にそれをどのように細胞に導入すればよいかを承知している。非常に有用なキメラＧタンパク質はＧアルファ１６−ガストデューシン４４である。
アゴニストは、例えば１ｎＭ〜１０ｍＭ、または０．１マイクロＭ〜１ミリＭ、例えば０．１マイクロＭ〜１００マイクロＭなどの好適な濃度で提供される。
好適な濃度は、例えば、塩化カルシウムについては０．２〜２０ｍＭ、ペリラルチンについては５〜５００μＭ、シンナモニトリルについては１０〜１０００μＭ、サイクラミン酸塩については０．０１〜５ｍＭ、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）については０．０３３〜３．３ｍＭである。
【０１３２】
キットの任意構成要素は、提供される組換え細胞を培養するための好適な培地、および、細胞をその上で成長させるための固体支持体、例えば細胞培養皿またはマイクロタイタープレートなどを含んでよく、これらの任意構成要素は当業者が容易に入手できる。
キットは以下のように利用されてよい：
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭから１００ｍＭまたはそれ以上までの濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のアゴニストの存在下で加える。
（ｉｉｉ）細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が調節剤であり得るかどうかが決定される。
【０１３３】
例えば、（ｉｉｉ）は上述のアッセイのいずれかに従い、上述の受容体活性を報告する検出方法のいずれかと組合せて行うことができる。これは、同じく上述された、特別に選択したまたは適応させた組換え細胞を必要とすることがある。好適なアッセイは、例えば、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒの活性化および試験剤に応答したその変化を決定するためのカルシウムフラックスアッセイである。
【０１３４】
キットは増強剤を同定するために以下のように利用することができる：
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭから１００ｍＭまたはそれ以上の濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のカルシウムアゴニスト（例えば、限定することなく、塩化カルシウムの形態のもの）の存在下で加える。
（ｉｉｉ）カルシウムに対する細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が増強剤であると決定される。
好適な塩化カルシウムの濃度は、例えば、約０．２〜２０ｍＭ、または０．５〜１０ｍＭ、または約１ｍＭである。
【０１３５】
同定された増強剤の確認
上述の方法によって同定された増強剤は、フレーバリストのパネルまたは試験者に同定された調節剤をテイスティングさせる単純な官能試験によって簡単に確認し得る。化合物は、例えば、甘味を確認するために水中で、または甘味を増強する調節剤であることを確認するために甘味料と一緒に、調節剤のないネガティブコントロールと比較してテイスティングする。
【０１３６】
大規模スクリーニングアッセイ
上述の転写レポーターアッセイおよびほとんどの細胞ベースのアッセイは、ライブラリーをＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性を調節する剤についてスクリーニングするのに適している。
アッセイは、アッセイ工程の自動化および、典型的には平行して実行される（例えばロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式など）、任意の好都合な給源からの化合物のアッセイへの供給によって、巨大な化学的ライブラリをスクリーニングするように設計され得る。
【０１３７】
アッセイは、多くの潜在的調節剤を含むコンビナトリアルケミカルまたはペプチドライブラリーの提供を伴う、ハイスループットスクリーニング法で実行されてもよい。かかるライブラリーは、次いで、上述の活性を呈するライブラリー剤（特に化学種またはサブクラス）を同定するために、上述の１またはそれ以上のアッセイでスクリーニングされる。こうして同定された調節剤は直接利用でき、または、誘導体を製造および試験することでさらなる調節剤を同定するためのリードとして利用することができる。
合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trecillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, N.J.）、Brandon Associates（Merrimack, N.H.）、およびMicrosource（New Milford, Conn.）を含む多くの企業から商業的に入手可能である。
【０１３８】
試験剤のライブラリ
コンビナトリアルケミカルライブラリは、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」の組合せることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された様々な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリなどのリニアコンビナトリアルケミカルライブラリは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、化学的ビルディングブロック（アミノ酸）のセットをあらゆる可能な方法で組合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、かかる化学的ビルディングブロックの組合せ混合を通して合成可能である。
レアケミカルライブラリはAldrich（Milwaukee, Wis.）から入手可能である。
【０１３９】
細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは、例えばPan Laboratories（Bothell, Wash.）またはMycoSearch（NC）から商業的に入手可能であり、あるいは、当該技術分野で周知の方法で容易に生成可能である。さらに、天然および合成的に産生されたライブラリおよび化合物は、慣用の化学的、物理的および生化学的手法で容易に改変される。
他のライブラリとしては、タンパク質／発現ライブラリ、例えば食物、植物、動物、細菌を含む天然給源からのｃＤＮＡライブラリ、１または２以上のポリペプチドをランダムにまたは体系的に変異させた変異体を発現するライブラリ、および１つの細胞または組織のｍＲＮＡ内容を発現させるのに利用されるウィルスベクターでのゲノムライブラリを含む。
【０１４０】
ハイスループットアッセイでは、数千の異なる調節剤またはリガンドを１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的調節剤に対する別個のアッセイの実施に利用でき、または、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合、各５〜１０ウェルで１つの調節剤を試験可能である。したがって、1つの標準的なマイクロタイタープレートは約１００の調節剤をアッセイ可能である。１５３６ウェルプレートを利用した場合、１つのプレートは、約１００から約１５００の異なる化合物を、簡単にアッセイ可能である。１日にいくつかの異なるプレートをアッセイ可能なので、約６，０００〜２０，０００の異なる化合物のためのアッセイスクリーニングが可能である。
【０１４１】
本アッセイ方法でＣＳＲ：：Ｔ１Ｒの調節効果を試験し得る試験剤のタイプ
試験剤は、小化学化合物、化学ポリマー、生物ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、核酸および脂質を含む任意の剤であってもよい。剤は、合成化合物、化合物の混合物、天然産物または天然サンプル、例えば植物抽出物、培養上清、または組織サンプルなどであり得る。
【０１４２】
甘味を改変し得る化合物の例として、メチルカビコール、テアサポニンＥ１、アセスルファムＫ、アリテーム、アスパルテーム、ＣＨ４０１、ズルチン、ネオテーム、サイクラミン酸ナトリウム、スクラロース、スーパーアスパルテーム、シナリン、グリシフィリン、レバウジオシドＣ、アブルソシドＡ（Abrusoside A）、アブルソシドＢ、アブルソシドＣ、アブルソシドＤ、アブルソシドＥ、アピオグリチルリチン、アラボグリチルリチン、バイユノシド、ブラゼイン、ブリオズルコシド、カルノシフルオシドＶ（Carnosifloside V）、カルノシフルオシドＶＩ、D. cumminsii、シクロカリオシドＡ、シクロカリオシドＩ、ズルコシドＡ、グリチルリチン酸、ヘルナンズルチン、ヘルナンズルチン、４ベータ−ヒドロキシ−ヘスペリチン−７−グルコシドジヒドロカルコン、ハンキオシドＥ（Huangqioside E）、ハンキオシドＥ、３−ヒドロキシフロリジン、
【０１４３】
２，３−ジヒドロ−６−メトキシ３−Ｏ−アセテート、マビンリンマルトシル−アルファ−（１，６）−ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソモグロシドＶ、モナチン、グリチルリチン酸モノアンモニウム（Ｍａｇ）、ムクロジオシドＩｉｂ（Mukurozioside Iib）、ナリンジンジヒドロカルコン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＨＣ）、ネオモグロシド、オスラジン、ペリアンドリンＩ、ペリアンドリンＩＩ、ペリアンドリンＩＩＩ、ペリアンドリンＩＶ、ペリアンドリンＶ、フロミソシドＩ（Phlomisoside I）、フロリジン、フィロズルチン、ポリポドシドＡ、グリチルリチンカリウムマグネシウムカルシウム、プテロカリオシドＡ（Pterocaryoside A）、プテロカリオシドＢ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、ルブソシド、
【０１４４】
スカンデノシドＲ６（Scandenoside R6）、シアメノシドＩ、グリチルリチン酸ナトリウム、ステビオールビオシド、ステビオシド、ステビオシド、アルファ−グリコシルスアビオシドＡ、スアビオシドＢ、スアビオシドＧ、スアビオシドＨ、スアビオシドＩ、スアビオシドＪ、タウマチン、グリチルリチン酸トリアンモニウム（ＴＡＧ）、トリロバチンクルクリン、ストロジン１、ストロジン２、ストロジン４、ミラクリン、ホダルシン、ジュジュバサポニンＩＩ、ジュジュバサポニンＩＩＩ、アブルソシドＥ、ペリアンドリン酸Ｉ、モノグルクロニド、ペリアンドリン酸ＩＩ、モノグリクロニド、クロロゲン酸、ベータ−（１，３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジル）−ヘスペルチンジヒドロカルコン、３’−カルボキシ−ヘスペルチンジヒドロカルコン、３’−ステビオシドアナログを挙げることができる。
同定された甘味料の調節剤は、例えば、甘味知覚を誘発することが可能な人工甘味料の調節剤を含んでもよい。
【０１４５】
消費材は食料製品、飲料、口腔ケア製品、およびかかる製品に混合するための組成物、特にフレーバー組成物を含む。フレーバー組成物は、加工食品または飲料にその加工の最中に添加することができ、またはそれら自身が、例えばソースなどの調味料などの消費材となり得る。甘味料は、菓子類ならびにデザートおよび風味のあるおよび甘酸っぱい消費材を含む他の甘味消費材に特に有用である。消費材の例は、菓子製品、ケーキ、シリアル製品、パン屋製品、パン製品、ガム、チューインガム、ソース（調味料）、スープ、加工食品、調理果物および野菜製品、肉および肉製品、卵製品、ミルクおよび乳製品、チーズ製品、バターおよび代替バター製品、代替乳製品、大豆製品、食用油および油脂製品、薬剤、飲料、アルコール飲料、ビール、ソフトドリンク、食品抽出物、植物抽出物、肉抽出物、調味料、甘味料、栄養補助食品、薬用および非薬用ガム、錠剤、トローチ、ドロップ、乳剤、エリキシル剤、シロップおよび飲料を製造するための他の調製物、インスタント飲料および発泡錠を含む。
【０１４６】
核酸およびタンパク質の配列
本明細書に記載の構築物および方法に用いた配列は、後述の配列表に見出すことができる。
配列番号１および１９はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２キメラタンパク質（−ａ／−ｂ）をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号２および２０はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２キメラタンパク質（−ａおよび−ｂ）のポリペプチド／アミノ酸配列に対応している。
配列番号３および２１はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質（−ａおよび−ｂ）をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号４および２２はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質（−ａおよび−ｂ）のポリペプチド／アミノ酸配列に対応している。
【０１４７】
２つのサブユニットを含む複合体として一緒になって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２キメラタンパク質およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質は機能的キメラ甘味受容体を形成する。得られる複合体は２つの−ａ変異体、２つの−ｂ変異体、または組み合わせ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａとＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂまたはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂとＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）、または本明細書に記載されているようにその機能を残した相同的変異体を含み得る。
【０１４８】
トランスフェクトされた構築物において、新規なキメラタンパク質をコードする核酸（変異体−ａについての配列番号１または３、および変異体−ｂについての配列番号１９または２１）のＣ末端に、ＨＳＶタグを後続させる（配列番号５）。
得られるタンパク質はしたがって次のアミノ酸を含有する：配列番号５が後続する配列番号１、配列番号５が後続する配列番号１９、配列番号５が後続する配列番号３、または配列番号５が後続する配列番号２１のアミノ酸。
【０１４９】
Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体複合体の、既知のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニットの既知の全長核酸及びタンパク質配列は、Ｔ１Ｒ２については配列番号７＋８に、Ｔ１Ｒ３については配列番号９＋１０に与えられている。
既知の全長ｈＣａＳＲ受容体核酸およびタンパク質配列は配列番号１１＋１２に与えられている。
【０１５０】
配列番号１＋２：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ核酸＋タンパク質
配列番号３＋４：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ核酸＋タンパク質
配列番号５＋６：Ｃ末端のＨＳＶタグ核酸＋タンパク質
配列番号７＋８：Ｔ１Ｒ２（全長コード配列）核酸＋タンパク質
配列番号９＋１０：Ｔ１Ｒ３（全長コード配列）核酸＋タンパク質
配列番号１１＋１２：ｈＣａＳＲ核酸＋タンパク質
配列番号１３〜１８：プライマー配列、例２ａ＆ｂおよび例３ａ＆ｂを比較
配列番号１９＋２０：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ核酸＋タンパク質
配列番号２１＋２２：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ核酸＋タンパク質
配列番号２３〜２５：プライマー配列、例２ｂおよび３ｂを比較
【０１５１】
これより以下に、上述の方法を例証する一連の例が続く。以下の例は単なる例示であって、いかようにも本方法またはキットを限定すると解すべきではない。
【０１５２】
実施例
全ての実施例において、ヒトＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３およびｈＣａＳＲ由来のＤＮＡ配列を利用している。
実施例の概要
１：Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイ
２ａ：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａベクター構築物の調製
２ｂ：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂベクター構築物の調製
３ａ：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａベクター構築物の調製
３ｂ：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａベクター構築物の調製
４：Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ベクター構築物の調製（比較のための野生型受容体）
５：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３、およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３異種発現系のトランスフェクション
５．２：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを発現する安定細胞株の調製
６ａ：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａの活性化
６ｂ：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂの活性化
【０１５３】
例１
Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイ
Ｆｌｕｏ−４は、細胞内カルシウムの蛍光指示薬であり、カルシウム濃度の変化、特にリガンド添加後に起こる受容体活性化に応答した増加の決定を可能にする。
Ｇα１６−ガストデューシン４４を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を宿主細胞として利用し、例５に記載のとおりに様々な構築物でトランスフェクトした。
【０１５４】
黒く、底が透明な９６ウェルプレートを全てのアッセイで利用した。アッセイの前日、プレートに、ウェル毎に８５００個のトランスフェクト細胞を播種し、用いた細胞に適した成長培地中、３７℃で一晩維持した。ＨＥＫ２９３については、高グルコース、Ｌ−グルタミン、塩酸ピロキシジンを含有し、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地をＨＥＫ２９３細胞の成長および維持に利用した。
【０１５５】
アッセイの際に成長培地を廃棄し、細胞を１時間（３７℃にて暗所で）、低カルシウムＣ１緩衝溶液に溶解した１．５μＭのＦｌｕｏ−４ＡＭ（Molecular ProbesTM, Invitrogen, US）および２．５μＭのプロベニシド（Sigma-Aldrich）からなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液でインキュベートした。低カルシウムＣ１緩衝溶液は１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２（２ｍＭから減じてある）および１０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）を含有する。
【０１５６】
最初の１時間の負荷期間の後、プレートをウェルあたり１００μｌの低カルシウムＣ１緩衝液で５回、自動プレート洗浄機（BioTek）を利用して洗浄し、洗浄の後、Ｆｌｕｏ−４−ＡＭの完全な脱エステル化をもたらすために、プレートを室温にて３０分間暗所でさらにインキュベートした。緩衝溶液を廃棄し、プレートを１００μｌの低カルシウムＣ１洗浄緩衝液で洗浄し、最終的に細胞を１８０μｌの低カルシウムＣ１洗浄緩衝液中に入れた。
【０１５７】
アッセイの読み取りのため、プレートをＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices））中に置き、受容体活性化を、低カルシウムＣ１緩衝液中で調製した２０μｌの１０×濃縮リガンドストック溶液の添加後に開始させた。
蛍光は、リガンド添加前１５秒間およびリガンド添加後１０５秒間で継続的に監視した（４５〜１０５秒で十分であろう）。
受容体活性化は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で与えられ、次の等式で定義される：
蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光
式中、基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０〜１５秒について計算した平均蛍光を表す。
【０１５８】
ネガティブコントロールとして、モックトランスフェクションした細胞を同濃度のリガンドに曝露し、シグナルに対応しない微量のカルシウム濃度を決定した。活性化された受容体を有する細胞は、ネガティブコントロールを有意に上回るシグナル（ＲＦＵ）によって同定した。
【０１５９】
例２ａ
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａベクター構築物の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａキメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）（１〜Ｐｈｅ５３９）を表すＰＣＲ産物およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＳｅｒ４９３から始まるＣ末端を含むＴ１Ｒ２の「−ａ」断片（Ｔ１Ｒ２−ａ、配列番号１（核酸）および２（タンパク質））を表すＰＣＲ産物、にある共通の制限酵素部位を介して連結することによって作出した。
【０１６０】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａキメラＤＮＡの作製を容易にするために、ＳａｃＩＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。これらの導入部位および適した制限酵素を当該技術分野で周知のバッファーおよび条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１６１】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＳａｃＩＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ２−ａ断片のＮ末端にそれぞれ位置し、キメラＤＮＡの２つのＰＣＲ産物／断片のライゲーションを可能にする。このＳａｃＩＩ部位の組み込みは、ｈＣａＳＲ中のＰｈｅ５３９をアルギニン残基に変換する。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａキメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に与えられる配列番号１３〜１６の特異的プライマーを用いて、Platinum Taq High Fidelity Polymeraseを用いたＰＣＲを利用して増幅した。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。
下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１６２】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＦ（配列番号１３）
ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＣ
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＲ（配列番号１４）
ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣ
Ｔ１Ｒ２−断片プライマーＦ（配列番号１５）
ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＧ
Ｔ１Ｒ２−断片プライマーＲ（配列番号１６）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＴ
【０１６３】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ヒトＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから商業的に入手可能）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したヒトＴ１Ｒ２をコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応パラメータは、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１６４】
得られた核酸断片はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ベクター構築物においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａキメラｃＤＮＡ断片のアッセンブリを可能にした。
【０１６５】
得られた挿入物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ａ  ｃＤＮＡを有する得られたＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ａベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号２（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ａ）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ａ：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１６６】
例２ｂ
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂベクター構築物の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂキメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）（１〜Ｉｌｅ６０３）を表すＰＣＲ産物ならびに膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＶａｌ５５７から始まるＣ末端を含むＴ１Ｒ２の「−ｂ」断片（Ｔ１Ｒ２−ｂ、配列番号１９（核酸）および２０（タンパク質））を表すＰＣＲ産物、にある共通の制限酵素部位を介して連結することによって作出した。
【０１６７】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂキメラＤＮＡの作製を容易にするために、ＢｓｉＷＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。これらの導入部位および適した制限酵素を当該技術分野で周知のバッファーおよび条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１６８】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＢｓｉＷＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ２−ｂ断片のＮ末端にそれぞれ位置し、キメラＤＮＡの２つのＰＣＲ産物／断片のライゲーションを可能にする。このＢｓｉＷＩ部位の組み込みは、ｈＣａＳＲ中のＧｌｕ６０２／Ｉｌｅ６０３をＡｒｇ／Ｔｈｒ残基に変換する。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ｂキメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に与えられる配列番号１３、１６、２３および２４の特異的プライマーを用いて、Platinum Taq High Fidelity Polymeraseを用いたＰＣＲを利用して増幅した。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。
下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１６９】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＦ（配列番号１３）
ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＣ
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＲ（配列番号２３）
ＡＴＡＴＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴ
Ｔ１Ｒ２−断片プライマーＦ（配列番号２４）
ＡＴＡＴＣＧＴＡＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＴ
Ｔ１Ｒ２−断片プライマーＲ（配列番号１６）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＴ
【０１７０】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ヒトＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから商業的に入手可能）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したヒトＴ１Ｒ２をコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応パラメータは、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１７１】
得られた核酸断片はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ベクター構築物においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂキメラｃＤＮＡ断片のアッセンブリを可能にした。
【０１７２】
得られた挿入物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ｂ  ｃＤＮＡを有する得られたＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ｂベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号２０（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ｂ）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ｂ：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１７３】
例３ａ
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａベクター構築物の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａキメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物にある共通の制限酵素部位を介して連結、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）（１〜Ｐｈｅ５３９）を表すＰＣＲ産物およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＳｅｒ４９３から始まるＣ末端を含むＴ１Ｒ３の断片を連結することによって作出した。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａキメラＤＮＡの作製を容易にするために、ＳａｃＩＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。
【０１７４】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＳａｃＩＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ３−ａ断片のＮ末端にそれぞれ位置し、２つの断片のライゲーションを可能にする。このＳａｃＩＩ部位の組み込みは、前のｈＣａＳＲのＰｈｅ５３９をアルギニン残基に変換する配列を含むベクター構築物をもたらす。これらの導入ライゲーション部位および適した制限酵素を当該技術分野で周知のバッファーおよび条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１７５】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａキメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に列挙した配列番号１７および配列番号１８の特異的プライマーを用いて、Platinum Taq High Fidelity Polymeraseを用いたＰＣＲを利用して増幅した。その後、Ｔ１Ｒ３−ａの増幅ＰＣＲ産物およびｈＣａＳＲの増幅ＰＣＲ産物（後者は上記例２に記載されているように形成）を、以下に列挙されているプライマー内に導入された制限酵素部位を介してライゲーションした。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１７６】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＦおよびｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＲ
上記例２ａに示されている配列番号１３および配列番号１４
Ｔ１Ｒ３−断片プライマーＦ（配列番号１７）
ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＡＧ
Ｔ１Ｒ３−断片プライマーＲ（配列番号１８）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴ
【０１７７】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ｈＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから購入）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したｈＴ１Ｒ３をコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応パラメータは、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１７８】
得られた核酸断片（ライゲーションは断片が確認された後に行われる）はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen,USA）にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１７９】
シークエンシングの後、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａベクター構築物を形成した。形成されたベクター構築物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。得られたベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号４（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ：：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１８０】
例３ｂ
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂベクター構築物の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂキメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物にある共通の制限酵素部位を介して連結、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）（１〜Ｉｌｅ６０３）を表すＰＣＲ産物ならびに膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＡｒｇ５６０から始まるＣ末端を含むＴ１Ｒ３の断片を表すＰＣＲ産物を連結することによって作出した。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂキメラＤＮＡの作製を容易にするために、ＢｓｉＷＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。
【０１８１】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＢｓｉＷＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ３−ｂ断片のＮ末端にそれぞれ位置し、２つの断片のライゲーションを可能にする。このＢｓｉＷＩ部位の組み込みは、前のｈＣａＳＲのＰｈｅ５３９をアルギニン残基に変換する配列を含むベクター構築物をもたらす。これらの導入部位および適した制限酵素を当該技術分野で周知のバッファーおよび条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１８２】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂキメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に列挙した配列番号２５および配列番号１８の特異的プライマーを用いて、Platinum Taq High Fidelity Polymeraseを用いたＰＣＲを利用して増幅した。その後、Ｔ１Ｒ３−ｂの増幅ＰＣＲ産物およびｈＣａＳＲの増幅ＰＣＲ産物（後者は上記例２ｂに記載されているように形成）を、以下に列挙されているプライマー内に導入された制限酵素部位を介してライゲーションした。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１８３】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＦおよびｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＲ
上記例２ｂに示されている配列番号１３および配列番号２３
Ｔ１Ｒ３−断片プライマーＦ（配列番号２５）
ＡＴＡＴＣＧＴＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＧＣ
Ｔ１Ｒ３−断片プライマーＲ（配列番号１８）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴ
【０１８４】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ｈＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから購入）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したｈＴ１Ｒ３−ｂをコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応パラメータは、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１８５】
得られた核酸断片（ライゲーションは断片が確認された後に行われる）はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen,USA）にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１８６】
シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂベクター構築物を形成した。形成されたベクター構築物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。得られたベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号２２（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ：：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１８７】
例４
Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ベクター構築物（比較のための野生型受容体）の調製
Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３ベクター構築物の形成のため、ヒトＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の全タンパク質コード配列を含むｃＤＮＡ断片をヒト茸状乳頭ｃＤＮＡライブラリから単離し、完全にシークエンスし、そしてｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen）にサブクローニングした。
【０１８８】
例５
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３のトランスフェクション、およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の異種発現
トランスフェクトされたベクター構築物は、上記のとおりに形成した例２ａおよび３ａ、または２ｂおよび３ｂ、ならびに４に記載されているものを利用した。ｈＣａＳＲについては、全長ｃＤＮＡに基づく、商業的に入手可能なｐＣＭＶベースのベクター構築物を利用した（TRUECLONE collection, Origene Inc., USA）。
【０１８９】
安定的にＧα１６−ガストデューシン４４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成した）に、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物、またはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３、またはｈＣａＳＲを次のようにトランスフェクトした：
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６−ガストデューシン４４細胞を９６ウェルの黒い、透明底のプレートに、ウェルあたり８５００細胞の密度で播種し、選択的成長培地で一晩成長させた。１日目に、培地を抗生物質不含かつ血清不含の成長培地に変更し、細胞をそれぞれ７５ｎｇのＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２（−ａまたは−ｂ）およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３（合計１５０ｎｇ）（−ａまたは−ｂ）、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３（合計１５０ｎｇ）、または７５ｎｇのｈＣａＳＲベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用してトランスフェクトした。
【０１９０】
ｈＣａＳＲベクターは、カルシウムに感受性であり、カルシウム結合部位が、キメラのＶＦＴが由来するこの受容体のＶＦＴに存在するため、カルシウムに感受性のＧＰＣＲのポジティブコントロールとして利用した。
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３−ａまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３−ｂ）またはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのトランスフェクションのため、それぞれ７５ｎｇのベクター構築物を、ペア毎に合計１５０ｎｇになるように組み合わせ、０．３μｌのリポフェクタミン２０００と一緒に利用した。７５ｎｇのｈＣａＳＲベクターＤＮＡは、このカルシウム感知モノマーＧＰＣＲに利用した。
【０１９１】
上述のリポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に交換した。細胞は一晩成長させ、Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイを例１に記載したように行った。
上記ベクター構築物のうちの１つを一過性にトランスフェクトした細胞を、例１に記載したように蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices）を利用して同定した。
【０１９２】
例５．２
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーを発現する安定細胞株の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａが、テトラサイクリン調節ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａの存在下において、両タンパク質の構成的過剰発現の細胞毒性効果の可能性を回避するために構成的に過剰発現するように、安定細胞系を作出した。ヘテロダイマー（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）の１つのサブユニットをテトラサイクリン調節ベクター内に置くことにより、その発現レベルを調節し、その結果、安定クローン株の生存率および機能性を最適化することが可能となる。
【０１９３】
キメラヒトＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーを安定的に発現するヒト細胞系は、まずヒトＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａを含む線状化ｐｃＤＮＡ４−ＴＯベクター（Invitrogen）を、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成したＧα１６ｇｕｓｔ４４発現細胞系にトランスフェクトすることで作出する。Ｇα１６ｇｕｓｔ４４発現細胞系は、味覚受容体への増強された結合を示し、テトラサイクリンによって誘導され、非特異的Ｇタンパク質Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現し、ＨＥＫ−２９３−Ｔ−Ｒｅｘ細胞系（Invitrogen, USAから商業的に入手可能）に基づいている。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａを発現するクローン細胞系を同定し、ヒトＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ  ｃＤＮＡを含む線状化ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏベクター（Invitrogen）をトランスフェクトして、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａを両方発現する二重安定クローン細胞系を得た。
【０１９４】
４マイクログラムの線状化ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２−ａ／ｐｃＤＮＡ４ＴＯ構築物および０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）のトランスフェクションの２４時間後、細胞を、１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、および０．２ｍｇ／ｍｌのゼオシンを添加したＤＭＥＭ（Invitrogen）を含有する選択培地に、１：１５０，０００までの１０×希釈で３７℃にて再播種した。２〜３週間後、ゼオシン耐性コロニーを、個々に拡大し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ  ｃＤＮＡの発現を可能にする１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンによる４時間の誘導後に、５０マイクロモーラーのペリラルチンに対する機能的応答に基づいて安定クローンを選択した。我々はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ  ｃＤＮＡの最小の基底発現を呈する個別クローン（＃１７）を同定し、ヘテロダイマー受容体複合体の安定細胞系を作出するために、これをＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３−ａ構築物のレシピエントとして利用した。
【０１９５】
誘導可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａを含むクローン１７に、４μｇの線状化ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）をトランスフェクトした。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に移した。２４時間後、細胞を１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、および０．２ｍｇ／ｍｌのゼオシン（Invitrogen）、および０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加したＤＭＥＭを含有する選択培地に３７℃で再播種した。
【０１９６】
耐性コロニーを拡大し、例１に記載されている方法を利用してＦＬＩＰＲ−Ｔｅｔｒａ装置（Molecular Devices）上での自動化蛍光イメージングにより決定される、ペリラルチン（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａの結合／活性化が寄与する）およびサイクラミン酸ナトリウム（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３−ａの結合／活性化が寄与する）の両方に対する応答に基づいて、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーを含むものとして同定した。全ての潜在的なクローンを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンによる誘導（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａの過剰発現を誘導するため）の後、甘味物質に対する機能応答について評価した。
【０１９７】
潜在的クローンはまた、Ｔ１Ｒ２−ａを低レベルで基底的に発現するが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａと合わさり機能的ヘテロダイマー複合体をもたらすことができるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ受容体の十分な発現を有しているあらゆるクローンを同定するために、テトラサイクリン誘導無しでも試験した（Ｔ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ−２９３（Invitrogen）などのテトラサイクリン調節システムは、システム固有の漏れやすさに起因して、導入遺伝子が基底的に低レベルで発現していることが知られている）。誘導性の機能的ＣＳＲ：：
Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーを発現する安定クローンは、５０マイクロＭのペリラルチンおよび５ｍＭ（ミリＭ）のサイクラミン酸ナトリウムの両方に対する応答に基づいて同定した。複数の甘味物質に対して最も大きなテトラサイクリン誘導性の応答を呈した１つのクローン細胞系を増殖させ、続く比較に利用した。様々なリガンド／甘味物質による試験の結果を下表に示す。
【０１９８】
【表１】
2009540804.tif 000002
【０１９９】
データは、次の方程式を利用した、刺激後における基準値以上の蛍光の標準化された増大（ΔＦ／Ｆ）を示す：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０、式中Ｆはピーク蛍光シグナル、およびＦ０はリガンドの添加前に計測された蛍光シグナルの平均から決定した基準値蛍光シグナルである。得られたΔＦ／Ｆ値は、トランスフェクトされた受容体との直接的または間接的な相互作用に応答した細胞カルシウムの増加（「シグナル」）に対応する（３回の反復実験の平均値（ＡＶＧ）および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）が与えられている）。
【０２００】
リガンドの化学構造を下記に示す。
ｐ−ＥＴＢＺ＝ｐ−エトキシベンズアルデヒド
【化１】
2009540804.tif 000003
ＮＤＨＣ
【化２】
2009540804.tif 000004
【０２０１】
【化３】
2009540804.tif 000005
サイクラミン酸ナトリウム（サイクラミン酸は甘味物質である。ナトリウムイオンの付加的な存在は、水への可溶性を上昇させるが、甘味にさらなる貢献はしない。）
【０２０２】
例６ａ
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａの活性化
様々なリガンドによる刺激後の細胞内カルシウム応答は、Ｇα１６−ガストデューシン４４を安定して発現し、かつＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａキメラヘテロダイマーをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において決定した。結果は、（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーを形成するために）例４に記載のＴ１Ｒ２ベクター構築物およびＴ１Ｒ３ベクター構築物の両方、または（モノマーｈＣａＳＲを形成するために）例５に記載のｈＣａＳＲベクター構築物をトランスフェクトした細胞から得られた結果と比較した。
【０２０３】
トランスフェクトは例４に記載されているように実施した。結果は例１に記載されているように計算した（データは刺激後の蛍光の基準値以上の正味の増大（相対蛍光単位またはＲＦＵ）を示し、６回の反復実験の平均（ＡＶＧ）および±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）が与えられている）。次のリガンドを、括弧内に示されている濃度でトランスフェクト細胞を刺激するのに利用した：塩化カルシウム（２ｍＭ）、スクラロース（０．５ｍＭ）、アスパルテーム（０．８５ｍＭ）、ペリラルチン（５０μＭ）、シンナモニトリル（１００μＭ）、サイクラミン酸塩（１ｍＭ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）（０．３３ｍＭ）。
得られたシグナルは、トランスフェクトされた受容体との直接的または間接的な相互作用に応答した細胞のカルシウム増大（「シグナル」）に対応するＲＦＵ表示の蛍光である。
【０２０４】
甘味受容体を発現しない、構築物なしでトランスフェクトされた、モックトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６−ガストデューシン４４細胞は、単にバックグラウンドに対応するシグナルを決定するためにネガティブコントロールとして利用した。
トランスフェクト細胞は、示された甘味料およびカルシウム感知ドメインを含むタンパク質のポジティブコントロール（カルシウム）、およびネガティブコントロール（Ｃ１緩衝液）に曝露した。
【０２０５】
結果は下表に示されている。
ＡＶＧ欄は平均蛍光を与え、ＳＴＤ欄は標準偏差を与える。下表は、試験した様々なベクター構築物の各々における、６回の反復実験におけるＲＦＵ＋／−ＳＴＤの平均変化を示す。
【表２】
2009540804.tif 000006
【０２０６】
ネガティブコントロール／モックトランスフェクションはバックグラウンドシグナルに対応するシグナルレベルを示す。
ポジティブコントロール（カルシウム）が示すように、カルシウム感知ドメインを有する全てのトランスフェクト細胞はカルシウムに反応した（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーおよびｈＣａＳＲ）。
キメラヘテロダイマーのカルシウムに対する応答は、甘味ヘテロダイマーから得られたそれと比較できない。カルシウムはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーのアゴニストではないので、Ｇα１６ガストデューシン４４ｇタンパク質のみを発現するモックトランスフェクションした細胞よりも大きなシグナルを与えない。
【０２０７】
アスパルテームおよびスクラロースについて、シグナルはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーをトランスフェクトした細胞でのみ検出された。スクラロースおよびアスパルテームはＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラには欠損しているＴ１Ｒ２のＶＦＴに結合すると考えられており、そのことはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーにおけるシグナルの欠如を説明する。
ｈＣａＳＲは塩化カルシウムのみに応答し、試験したどの甘味物質によっても活性化されなかった。
【０２０８】
塩化カルシウム、ペリラルチン、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩およびＮＤＨＣについては、シグナルの顕著な増大が、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａキメラヘテロダイマーを発現する細胞で観察された。
ペリラルチン、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩およびＮＤＨＣについて、これらのシグナルはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーで検出されたシグナルの強度に匹敵するものであった。
【０２０９】
キメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーをトランスフェクトされた細胞で検出されたこれらのシグナルは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのシグナルおよびネガティブコントロール（モックトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６ガストデューシン４４細胞）から得られたバックグラウンドの両方よりも顕著に高く、ｈＣａＳＲ受容体をトランスフェクトした細胞から得られたシグナルの約５０％の規模であった。
結果は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａが、カルシウム、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、シンナモニトリル、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）によって活性化されるが、スクラロースまたはアスパルテームでは活性化されないことを明示している。
【０２１０】
例６ｂ
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂの活性化
様々なリガンドによる刺激後の細胞内カルシウム応答は、Ｇα１６−ガストデューシン４４を安定して発現し、かつＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂキメラヘテロダイマーをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において決定した。結果は、（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーを形成するために）例４に記載のＴ１Ｒ２ベクター構築物およびＴ１Ｒ３ベクター構築物の両方、または（モノマーｈＣａＳＲを形成するために）例５に記載のｈＣａＳＲベクター構築物をトランスフェクトした細胞から得られた結果と比較した。
【０２１１】
トランスフェクトは例４に記載されているように実施した。結果は例１に記載されているように計算した（データは刺激後の蛍光における基準値以上の標準化された増大（ΔＦ／Ｆ）を示し、６回の反復実験の平均（ＡＶＧ）および±標準偏差（ＳＴＤ）が与えられている）。塩化カルシウム（２ｍＭ）、スクラロース（０．５ｍＭ）、ペリラルチン（５０μＭ）を試験リガンドとして利用した。
得られたカルシウム可動化シグナルは、基準蛍光（Ｆ０）によって標準化されたピーク蛍光（Ｆ）における増大である。データは次の方程式を用いて標準化される：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０、式中Ｆはピーク蛍光シグナルおよびＦ０はリガンド添加の前に計測される平均蛍光シグナルによって決定される基準蛍光シグナルである。得られたΔＦ／Ｆ値は、トランスフェクトされた受容体との直接的または間接的な相互作用に応答した細胞のカルシウム増大（「シグナル」）に対応する。
【０２１２】
甘味受容体を発現しない、構築物なしでトランスフェクトされた、モックトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６−ガストデューシン４４細胞は、単にバックグラウンドに対応するシグナルを決定するためにネガティブコントロールとして利用した。
トランスフェクト細胞は、示された甘味料およびカルシウム感知ドメインを含むタンパク質のポジティブコントロール（カルシウム）、およびネガティブコントロール（Ｃ１緩衝液）に曝露した。
【０２１３】
結果は下表に示されている。
ＡＶＧ欄は平均ΔＦ／Ｆを与え、ＳＴＤ欄は標準偏差を与える。下表は、試験した様々なベクター構築物の各々における、６回の反復実験におけるΔＦ／Ｆ＋／−ＳＴＤの平均変化を示す。
【表３】
2009540804.tif 000007
【０２１４】
ネガティブコントロール／モックトランスフェクションはバックグラウンドシグナルに対応するシグナルレベルを示す。
ポジティブコントロール（カルシウム）が示すように、カルシウム感知ドメインを有する全てのトランスフェクト細胞はカルシウムに反応した（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマーおよびｈＣａＳＲ）。
キメラヘテロダイマーのカルシウムに対する応答は、甘味ヘテロダイマーから得られたそれと比較することができない。カルシウムはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーのアゴニストではないので、Ｇα１６ガストデューシン４４ｇタンパク質のみを発現するモックトランスフェクションした細胞よりも大きなシグナルを与えなかった。
【０２１５】
スクラロースについて、シグナルはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーをトランスフェクトした細胞（野生型）でのみ検出された。スクラロースはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラには欠損しているＴ１Ｒ２のＶＦＴに結合すると考えられており、そのことはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマーにおけるシグナルの欠如を説明する。
ｈＣａＳＲは塩化カルシウムのみに応答し、試験したどの甘味物質によっても活性化されなかった。
【０２１６】
塩化カルシウム、ペリラルチンについては、シグナルの顕著な増大が、あらゆるＴ１Ｒ３構築物またはその変異体の非存在下でＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂホモマーを発現する細胞と同様にＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂキメラヘテロダイマーを発現する細胞で観察された。
【０２１７】
キメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマーをトランスフェクトされた細胞で検出されたこれらのシグナルは、ネガティブコントロール（モックトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６ガストデューシン４４細胞）から得られたバックグラウンドよりも顕著に高かった。
結果は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂが、カルシウム、ペリラルチンによって活性化されるが、スクラロースでは活性化されないことを明示している。
【０２１８】
受容体、核酸、ポリペプチド、方法およびキットは、上記においてある例示的な態様に関して記載されているが、同様の機能を実施するために、他の同様の態様が利用されてよく、または記載の態様に改変および付加が加えられてもよいと理解されるべきである。さらに、全ての開示された態様は必ずしも互いに排他的ではなく、様々な態様は必要な特性を提供するために組み合わせてもよい。当業者は、本開示の精神と範囲から離れることなく変更を加えることができる。したがって、本方法およびキットはいかなる単一の態様に限定されるべきではなく、むしろ請求項の記載にしたがった幅および範囲をもって解釈されるべきである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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