(57)【要約】【課題】組織化された細孔構造を有する骨組を提供する。【解決手段】本発明の骨組は、インプラントするための固形の多孔性骨組であって、少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍの有機ポリマーと、前記骨組のエッジに対して垂直に配向した細孔とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラントするための固形の多孔性骨組であって、
少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍの有機ポリマーと、
前記骨組のエッジに対して垂直に配向した細孔とを含むことを特徴とする骨組。
【請求項２】
請求項１に記載の骨組であって、
前記細孔は、深さ及び直径に関して異なり、
前記深さ及び直径は、１〜１０００μｍの範囲であることを特徴とする骨組。
【請求項３】
請求項１に記載の骨組であって、
前記細孔は、延びており、前記骨組内でチャンネルを形成することを特徴とする骨組。
【請求項４】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の表面の付近に位置する細孔は、前記表面からより遠くに位置する細孔よりも大きな直径を有することを特徴とする骨組。
【請求項５】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の平均細孔直径、細孔寸法分布、及び架橋密度が一様ではないことを特徴とする骨組。
【請求項６】
請求項１に記載の骨組であって、
前記有機ポリマーは、細胞外マトリックスタンパク質又はその類似体を含むことを特徴とする骨組。
【請求項７】
請求項６に記載の骨組であって、
前記細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする骨組。
【請求項８】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組は、細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする骨組。
【請求項９】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の寸法及び形状は、前記骨組がインプラントされる組織に応じることを特徴とする骨組。
【請求項１０】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組の少なくとも１つの方向における幅は、５〜１０ｍｍの間であることを特徴とする骨組。
【請求項１１】
請求項１に記載の骨組であって、
前記骨組は、インプラントされると、前記骨組内又は前記骨組の付近で血管新生を促進することを特徴とする骨組。
【請求項１２】
請求項１に記載の骨組であって、
インプラント部位付近の組織による圧縮力に耐えられるほどの十分な剛性を有する材料から成ることを特徴とする骨組。
【請求項１３】
少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍであり、且つエッジに対して垂直に配向する細孔を含む、固形である多孔性及び生体適合性の骨組を作成するプロセスであって、
（ａ）少なくとも２つの構成要素を有し、伝導材料で構成された型にポリマー懸濁液を加えるステップと、
（ｂ）前記懸濁液が満たされたステップ（ａ）の前記型を、一定の温度の冷却材で、前記懸濁液が固化するまでの期間に過冷却し、それによって、固化した前記懸濁液の中に、且つ前記骨組のエッジに対して垂直に配向するように氷晶が形成されるステップと、
（ｃ）前記型の少なくとも１つの構成要素を取り除くことによって、固化した前記懸濁液の一部分を、前記一部分において昇華を引き起こす条件に晒し、それによって、細孔が前記骨組のエッジに対して垂直に形成されるステップと、
（ｄ）前記型の残りの要素を取り除き、固形である多孔性の前記骨組を晒すステップとを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記一部分を前記条件に晒すことによって、前記細孔が不均一な平均直径を有する状態で前記骨組内に形成されることを特徴とするプロセス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記細孔の平均直径は、０．１〜５００μｍの範囲であることを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記細孔は、延びており、前記骨組内でチャンネルを形成することを特徴とするプロセス。
【請求項１７】
請求項１３に記載のプロセスであって、
形成された前記細孔の前記骨組における分布は、一様ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項１８】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記骨組を、架橋剤に晒すステップをさらに含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプロセスであって、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、１エチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、紫外線、又はそれらの組み合わせであることを特徴とするプロセス。
【請求項２０】
請求項１８に記載のプロセスであって、
前記骨組の架橋密度は、一様ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項２１】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記ポリマー懸濁液は、少なくとも１つの有機ポリマーを有することを特徴とするプロセス。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプロセスであって、
前記有機ポリマーは、細胞外マトリックスタンパク質又はその類似体を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２３】
請求項２２に記載のプロセスであって、
前記細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２４】
請求項１３に記載のプロセスであって、
細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせを前記骨組に加えるステップをさらに含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２５】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記型の寸法及び形状は、前記骨組がインプラントされる組織の寸法及び形状に近似することを特徴とするプロセス。
【請求項２６】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記型は、２つ以上の伝導材料で構成されていることを特徴とするプロセス。
【請求項２７】
請求項２６に記載のプロセスであって、
ステップ（ｂ）で過冷却する際の前記伝導材料の凍結速度が領域によって異なることを特徴とするプロセス。
【請求項２８】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記型のそれぞれの構成要素は、異なる伝導材料で構成されていることを特徴とするプロセス。
【請求項２９】
請求項１３に記載のプロセスであって、
ステップ（ｂ）によって、前記型の表面は、温度勾配に晒されることを特徴とするプロセス。
【請求項３０】
請求項２９におけるプロセスであって、
前記温度勾配は、氷晶核の形成を誘発し、
前記氷晶核は前記型の表面に対して垂直に延びることを特徴とするプロセス。
【請求項３１】
請求項３０に記載のプロセスであって、
前記骨組内に、円柱状の氷晶が形成されることを特徴とするプロセス。
【請求項３２】
請求項１３に記載のプロセスであって、
前記骨組内の前記細孔が異なる特性を有するようにするために、前記伝導性材料、前記温度、浸漬時間、又はそれらの組み合わせは、一様ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項３３】
請求項１３に記載のプロセスであって、
インプラント部位付近の組織による圧縮力に耐えられるほどの十分な剛性を有する骨組を作成することを特徴とするプロセス。
【請求項３４】
骨組であって、
請求項１３乃至３３のいずれかにしたがって作成されたことを特徴とする骨組。
【請求項３５】
対象において器官又は組織を操作する方法であって、
前記対象に、請求項１乃至１２又は請求項３４のいずれかに記載の骨組をインプラントするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
前記骨組に細胞を加えるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、
前記細胞は、対象にインプラントする前に所定の期間に培養されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組の表面に加えられることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法であって、
前記細胞は、幹細胞又は前駆細胞であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法であって、
前記細胞は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせを発現するように操作されたことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法であって、
前記操作は、異種の細胞で構成された器官又は組織に対して行われることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３６に記載の方法であって、
前記方法は、創傷治癒に使用されることを特徴とする方法。
【請求項４３】
対象において器官又は組織を修復又は再生する方法であって、
前記対象に、請求項１乃至１２又は請求項３４のいずれかに記載の骨組をインプラントするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
前記骨組に細胞を加えるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組を対象にインプラントする前に所定の期間に培養されることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法であって、
前記細胞は、前記骨組の表面に加えられることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４４に記載の方法であって、
前記細胞は、幹細胞又は前駆細胞であることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４４に記載の方法であって、
前記細胞は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、炎症刺激物質、血管新生因子、又はそれらの組み合わせを発現するように操作されたことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４４に記載の方法であって、
前記操作は、異種の細胞で構成された器官又は組織に対して行われることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４４に記載の方法であって、
前記方法は、創傷治癒に使用されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細孔が組織化された構造体である様々な形状の大きな骨組（scaffold）を作成する方法に関連する。骨組の特定の巨視的形状に関わらず、一般的には、細孔が骨組のエッジに対して垂直に配向するように細孔構造体は組織化されている。
【背景技術】
【０００２】
損失及び損害した組織を再生するための骨組には、適切な細胞が骨組又は骨組の周囲に移動するのを可能にし、インプラント後のこれらの細胞への酸素及び栄養の適切な供給を可能にすることで細胞を短期的に支持し、且つ長期的には、変形して血管再生を可能にする（骨組が分解して脈構造及び組織構造が再形成する）骨組を使用する必要がある。新規の間質及び組織の形成のために、これらの機能が必要である。
【０００３】
作成された骨組には、細胞が播種される場合がある。細胞は骨組の最外部に容易に吸着することができるが、細胞運動の違いや栄養拡散の制限によって、細胞の分布は均一でない場合がある。その結果、組織が不均一に、且つ変形した状態で再生する可能性がある。このような組織が存続すると、他の疾患が発生しかねない。細胞が骨組中を均一に拡散している場合、一部の細胞は周囲の血管系が容易にアクセスできない骨組の内部に位置しているため、これらの細胞には細胞の長期的な安定性に必要な栄養及び酸素が供給されない。したがって、これらの細胞に栄養を施すために、血管が必要である。細胞が生存するためには、毛細血管の拡散距離内にある必要がある。血管は骨組の周囲の血管組織から骨組へ成長することができるが、血管再生は時間を要するので、適切な血管新生の前に細胞は死滅する可能性がある。
【０００４】
従来の組織再生における欠点の１つは、複雑な組織が形成される材料及び構造体、とりわけ、機能的な組織を形成するように適切な細胞が所望の特定の形状に整列するのを可能にする適切な材料及び構造体が欠如していることである。したがって、乳房又は他の器官の再生に使用できるほどの大きさを有する骨組が欠如している。
【０００５】
凍結乾燥によるコラーゲン系の骨組の作成（コラーゲン及び酸の懸濁液を鍋状又は管状の型で凍結し、その後に昇華させることで、多孔性のシート（１〜３ｍｍの厚さ）が形成される）、及びこれらの方法で得られる巨視的な形状（即ち、小さな管又は薄いシートの形状）は一般的である。しかし、現在までに、著しく長い多孔性の骨組、又は細胞移動、並びに細胞への栄養輸送に影響する、組織化された細孔構造を有する骨組を作成する方法が導入されることはなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある実施形態では、本発明は、インプラントするための固形の多孔性骨組であって、少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍである有機ポリマーと、前記骨組のエッジに対して垂直に配向する細孔とを含む骨組を提供する。ある実施形態では、骨組の表面の付近に位置する細孔は、表面からより遠くに位置する細孔よりも大きな直径を有する。
【０００７】
ある実施形態では、本発明は、少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍであり、且つエッジに対して垂直に配向する細孔を含む、固形である多孔性及び生体適合性の骨組を作成するプロセスであって、
（ａ）少なくとも２つの構成要素を有し、伝導材料で構成された型にポリマー懸濁液を加えるステップと、
（ｂ）前記懸濁液が満たされたステップ（ａ）の前記型を、一定の温度の冷却材で、前記懸濁液が固化するまでの期間に過冷却し、それによって、固化した前記懸濁液の中に、且つ前記骨組のエッジに対して垂直に配向するように氷晶が形成されるステップと、
（ｃ）前記型の少なくとも１つの構成要素を取り除くことによって、固化した前記懸濁液の一部分を、前記一部分において昇華を引き起こす条件に晒し、それによって、細孔が前記骨組のエッジに対して垂直に形成されるステップと、
（ｄ）前記型の残りの要素を取り除き、固形である多孔性の前記骨組を晒すステップとを含むプロセスを提供する。
【０００８】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係るプロセスにしたがって作成された骨組を提供する。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、対象において器官又は組織を操作する（engineering）方法であって、本発明に係る骨組をインプラントするステップを含む（ある実施形態では、創傷治療において）方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、対象において器官又は組織を修復又は再生する方法であって、本発明に係る骨組をインプラントするステップを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、固形であり、勾配を有する骨組、前記骨組の作成方法、及び前記骨組の治療への利用を対象とする。
【００１２】
骨組は、ある実施形態では、組織工学の様々な用途に使用される多孔性の材料である。多孔性の骨組の最も主要な用途は、損失した又は損害を受けた組織の再生を誘導するテンプレートとして使用することである。より大きな（特徴長が＞１ｍｍ）組織及び器官を治療するためには、特徴長が著しく長く、組織化された細孔構造を有し、且つインプラント部位に適合するために様々な巨視的な形状を有する骨組を作成する必要がある。
【００１３】
ある実施形態では、「多孔性」は、細孔及び孔隙を有し、それによって、透過性を有するマトリックスを意味する。他の実施形態では、骨組は不均一な多孔性である。ある実施形態では、不均一な多孔性により、骨組の一部の領域は透過性を有し、他の領域は透過性を有さない。一方、他の実施形態では、透過性の程度は、骨組の領域によって様々である。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、インプラントをするための固形である多孔性の骨組であって、少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍである有機ポリマーと、前記骨組のエッジに対して垂直に配向する細孔とを含む骨組を提供する。
【００１５】
ある実施形態では、「骨組」という用語は、細胞が付着、増殖、分化、及び細胞外マトリックスを分泌するための部位を提供し、最終的に組織の形成を引き起こすことによって、組織の再生を促進する三次元の構造体を意味する。
【００１６】
ある実施形態では、骨組は、生体適合性の物質を含む。前記生体適合性の物質は、他の実施形態では、炭水化物を含み得る。他の実施形態では、前記生体適合性の物質は、タンパク質又は特定のアミノ酸を含み得る。他の実施形態では、前記生体適合性の物質は、本明細書に記載のポリマー又はモノマーを含み得る。他の実施形態では、前記生体適合性の物質は、これらの組み合わせを含み得る。
【００１７】
ある実施形態では、骨組は少なくとも１つのポリマーを有し、このポリマーは、天然ポリマー、有機ポリマー、細胞外マトリックスタンパク質、その類似体、又はそれらの組み合わせである。
【００１８】
ある実施形態では、ポリマーは、コポリマーである。他の実施形態では、ポリマーは、ホモポリマーである、又は他の実施形態では、ヘテロポリマーであり。他の実施形態では、本発明に係るポリマーは、天然ポリマーである。他の実施形態では、ポリマーは、フリーラジカル・ランダムコポリマーである、又は他の実施形態では、グラフトコポリマーである。ある実施形態では、ポリマーは、タンパク質、ペプチド、又は核酸を含み得る。
【００１９】
ある実施形態では、２つの異なる細胞外マトリックスの構成要素（例えば、Ｉ型コラーゲン及びＧＡＧなど）のグラフトコポリマーが形成される。コラーゲン／ＧＡＧの最終比は、同じになるように、又は他の実施形態では、８５／１５〜１００／０（ｗ／ｗ）になるように、当該技術分野で公知の方法（Yannas, et al. PNAS 1989, 86:933）で調整される。本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、全長のポリマーは、コラーゲナーゼの濃度勾配に、一定の時間に晒される。晒される時間は、他の実施形態では、領域によって様々である。それによって、他の実施形態では、そのように晒された骨組の一部分において、例えばコラーゲンが他の部分よりも多く分解される。他の実施形態では、コラーゲンの分解量は、酵素の濃度に依存する。他の実施形態では、コラーゲンの分解量は、ポリマーが所定の濃度のコラーゲナーゼに晒される時間に依存する。他の実施形態では、コラーゲンの分解量は、これらの組み合わせに依存する。
【００２０】
例えば、ある実施形態では、骨組はＩ型コラーゲンとＧＡＧとのグラフトコポリマーを含み、Ｉ型コラーゲンとＧＡＧとの比は、これらの高分子の質量を調整することで調節することができる。
【００２１】
他の実施形態では、ポリマーは、例えばコラーゲンなどのバイオポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、ポリ（Ｌ−ラクチド）（poly(L-lactide)：ＰＬＬＡ）及びポリグリコリド（polyglycolide：ＰＧＡ）などの［アルファ］−ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、米国特許第６，３３３，０２９号若しくは第６，３５５，６９９号に開示されたポリマー、又は、生体吸収可能な、且つ生体適合性のある、当該技術分野で公知の、若しくは将来発見される（公知のものと実質的に同様に機能する）任意のポリマー、コポリマー、又はポリマーとコポリマーとの混合物を含み得る。
【００２２】
ある実施形態では、生分解性ポリマーは、エステル、無水物、オルトエステル、及びアミドなどの官能基を含む。他の実施形態では、急速に生分解するポリマーの例として、例えば、ポリ［ラクチド−コ−グリコリド］、ポリ無水物、及びポリオルトエステルがある。ある実施形態では、生体内分解性ポリマーとして、ポリラクチド、ポリグルコシド、及びそれらのコポリマー、ポリ（エチレン−テレフタラート）、ポリ（ブチル酸）、ポリ（バレリアン酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリオルトエステル、並びにそれらの混合物又はコポリマーがある。アクリル酸及びメタクリル酸の生分解性及び生体適合性のポリマー又はエステルとして、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）などがある。本発明に使用できる他のポリマーとして、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリスチレンなどのポリアリルアルキレン、ポリ（エチレングリコール）などのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）などのポリ（アルキレンオキシド）、及びポリ（エチレンテレフタレート）などのポリ（アルキレンテレフタラート）がある。また、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、及びハロゲンポリビニルなどのポリビニルポリマーを使用することができる。ポリビニルポリマーの例として、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルフェノール、及びポリビニルピロリドンなどがある。本発明に係る骨組及び方法に、本明細書に記載のポリマーを組み合わせて使用することができ、その組み合わせは本発明の実施形態に相当することを理解されたい。
【００２３】
他の実施形態では、ポリマーは、ある実施形態では、細胞外マトリックス（extracellular matrix：ＥＣＭ）の構成要素を含む。他の実施形態では、ＥＣＭ構成要素は、当該技術分野で公知の方法によって、組織から精製される。例えば、コラーゲンが所望される場合は、ある実施形態では、コラーゲン以外の全ての物質を実施的に除去するように天然の細胞外マトリックスが処理される。精製は、グリコタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非コラーゲンタンパク質、又は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を実質的に除去又は濃縮するように行われる。
【００２４】
ある実施形態では、ポリマーは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、細胞収縮コラーゲン（プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、又はグリコタンパク質を含む）、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリン、ポリアシド（ポリ乳酸、ポリグルコール酸、ポリアミノ酸など）で作成された合成ポリマー繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらのコポリマー、及び／又はそれらの組み合わせを含み得る。
【００２５】
ある実施形態では、ポリマーは、他の所望の分子との結合を可能にする官能基を含み得る。この官能基の例は、下記に記載されている。ある実施形態では、前記官能基は、１つであり、水素結合に適している（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル結合、カルボキシル酸、及びエステルなど）。
【００２６】
他の実施形態では、官能基は有機酸基を含み得る。ある実施形態では、「有機酸基」という用語は、カルボキシル酸基及びスルホン酸基などの、有機酸のイオン化水素を含む任意の基を意味する。「有機酸官能基」という用語は、特定の反応条件下で有機酸基と同じように機能する任意の基を意味する。このようなものとして、例えば、前記有機酸基の金属塩（アルカリ金属塩（特にリチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩など）、アルカリ性土類金属塩（カルシウム塩又はマグネシウム塩など））、又は前記有機酸基の第４級アミン塩（特に第４級アンモニウム塩など）がある。
【００２７】
ある実施形態では、官能基は、オルト−エステル基又はアミド基などの酸加水分解が可能な結合を有し得る。他の実施形態では、官能基は、アルファ−エステル基又は無水物基などの塩基加水分解が可能な結合を有し得る。他の実施形態では、官能基は、炭酸基、エステル基、およびイミノ炭酸基などの酸加水分解及び塩基加水分解の両方が可能な結合を有し得る。他の実施形態では、官能基は、当該技術分野では公知である、かつ本明細書に記載されている方法／工程及び骨組に容易に用いることができる不安定結合を有し得る（例えば、Peterson et al., Biochem Biophys. Res. Comm. 200(3): 1586159 (1994) 及びFreel et al., J. Med. Chem. 43: 4319-4327 (2000)を参照)。
【００２８】
他の実施形態では、骨組は、ｐＨ改変化合物（pH-modifying compound）をさらに含む。ある実施形態では、「ｐＨ改変」は、水環境に配置又は溶解されたときにその水環境のｐＨを変化させる化合物の能力を意味する。他の実施形態では、ｐＨ改変化合物は、湿潤された、及び／又は熱に晒されたポリマーにおいて、加水分解可能な結合の加水分解を促進させることが可能である。ある実施形態では、ｐＨ改変化合物は、実質的に不水溶性である。適切な、実質的に不水溶性なｐＨ改変化合物には、実質的に不水溶性な酸及び塩基が含まれる場合がある。他の実施形態では、無機性及び有機性酸又は塩基が使用される場合がある。
【００２９】
他の実施形態では、本明細書に記載されているように、骨組内に他の分子が組み込まれている場合がある。これらの分子は、本明細書に記載されているように、官能基を介して結合している場合がある。他の実施形態では、分子は、骨組に直接結合している。
【００３０】
ある実施形態では、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、本発明など）、グリコサミノグリカン（デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸及び／又はケラタン硫酸など）、ムチングリコタンパク質（例えば、ルブリシン（Lubricin））、ビトロネクチン、トリボネクチン、界面活性リン脂質、鶏冠製ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス成分を含み得る。幾つかの実施形態では、細胞外マトリックス成分は、ARIHREASE（登録商標）高分子量ヒアルロン酸ナトリウム、SYNVISC（登録商標） Hylan G-F 20、HYLAGAN（登録商標）ヒアルロン酸ナトリウム、HEALON（登録商標）ヒアルロン酸ナトリウム及びSIGMA（登録商標）コンドロイチン６−硫酸などのように市販されている。
【００３１】
他の実施形態では、１つ以上の生体分子が骨組に組み込まれている場合がある。他の実施形態では、前記生体分子には、薬剤、ホルモン、抗生物質、抗菌物質、染料、放射性物質、蛍光物質、シリコン・エラストマ、アセタール、ポリウレタン、放射線不透過性フィラメント又は物質、抗菌性物質、化学物質若しくは薬剤、それらの組み合わせなどが含まれる。これらの物質は、治療効果の促進、骨組の劣化又は体による拒絶の可能性の縮小、視覚化の促進、適切な方向づけ、感染への抵抗性の増大、治療の促進、柔軟性又は他の任意の望ましい効果の増加のために使用され得る。
【００３２】
ある実施形態では、骨組の重合体濃度、又は骨組の生体分子及び／若しくは骨組に組み込まれている細胞などの成分の濃度は一様ではない。
【００３３】
ある実施形態では、生体分子には、走化性物質、抗生物質、ステロイド性若しくは非ステロイド性鎮痛剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、様々なタンパク質（例えば、短鎖ペプチド、骨形態形成タンパク質、グリコタンパク質及びリポタンパク質）、細胞接着剤（生物活性リガンド、インテグリン結合配列、リガンド）、様々な成長（増殖）及び／若しくは分化剤（例えば、上皮細胞増殖因子,ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−β  Ｉ〜ＩＩＩ、増殖及び分化因子、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インシュリン由来増殖因子、形質転換成長因子、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ｂＥＧＦ、ＴＧＦβスーパーファミリー（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−１２、ソニック・ヘッジホッグ、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＰＤＧＦ）、特定の成長因子の上方調節を行う小さな分子（テナシン―Ｃ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、デコリン、トロンボエラスチン、トロンビン由来ペプチド、ヘパリン結合領域、ヘパリン、ヘパリン硫酸）、ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。
【００３４】
ある実施形態では、成長（増殖）因子には、ヘパリン結合性増殖因子（heparin binding growth factor：ｈｂｇｆ）、形質転換成長因子アルファ（transforming growth factor alpha：ＴＧＦアルファ）若しくは形質転換成長因子ベータ（transforming growth factor beta：ＴＧＦベータ）、アルファ線維芽成長因子（fibroblastic growth factor：ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（epidermal growth factor：ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（vascular endothelium growth factor：ＶＥＧＦ）（その一部は血管新生因子でもある）が含まれる。他の実施形態では、因子には、インシュリン、グルカゴン、及びエストロゲンなどのホルモンが含まれる。幾つかの実施形態では、神経成長因子（nerve growth factor：ＮＧＦ）又は筋肉形成因子（muscle morphogenic factor：ＭＭＦ）を組み込むことが所望される。ある実施形態では、ＴＮＦアルファ／ベータ、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ（Matrix metalloproteinase：ＭＭＰ）が組み込まれる。
【００３５】
他の実施形態では、骨組は、任意の組織の自家移植片、同種移植片、及び異種移植片（対象に対して）のうちの１つ以上を含み得る。ある実施形態では、組織は、ホモジネートであり、ある実施形態では、同じ組織を修復又は再生するのに（例えば、ある実施形態では、骨組織を成長させるのに）使用される骨組を含む。
【００３６】
他の実施形態では、インプラントされる骨組は、細胞をさらに含み得る。ある実施形態では、細胞は、前記骨組上に播種される。他の実施形態では、細胞は、骨組の周囲に播種される。他の実施形態では、細胞は、幹細胞又は前駆細胞である。他の実施形態では、本発明に係る方法は、サイトカイン、成長（増殖）因子、ホルモン、又はそれらの組み合わせを投与するステップをさらに含む。
【００３７】
他の実施形態では、骨組は細胞を含み得る。ある実施形態では、細胞には次に記載のものの１つ以上が含まれ得る。軟骨細胞、繊維軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、滑膜細胞、骨髄細胞、間葉細胞、間質細胞、幹細胞、胚幹細胞、脂肪組織由来の前駆細胞、末梢血液前駆細胞、成体組織由来の幹細胞、遺伝子組み替え細胞、軟骨細胞と他の細胞の組み合わせ、骨細胞と他の細胞の組み合わせ、骨髄細胞と他の細胞の組み合わせ、骨髄細胞と他の細胞の組み合わせ、間葉細胞と他の細胞の組み合わせ、間質細胞と他の細胞の組み合わせ、幹細胞と他の細胞の組み合わせ、胚幹細胞と他の細胞の組み合わせ、成体組織由来の前駆細胞、末梢血液前駆細胞と他の細胞の組み合わせ、成体組織由来の幹細胞と他の細胞の組み合わせ、及び遺伝子組み替え細胞と他の細胞の組み合わせ。他の実施形態では、本発明に係る骨組及び方法に使用されるこれらの細胞の任意のものは、所望の分子を発現するように操作される場合がある。所望の分子の例として、例えば、ヘパリン結合性増殖因子（ｈｂｇｆ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦアルファ）若しくはベータ（ＴＧＦベータ）、アルファ線維芽成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（その一部は血管新生因子でもある）がある。他の実施形態では、発現される因子として、インスリン、グルカゴン、及びエストロゲンなどのホルモンがある。他の実施形態では、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは筋肉形成因子（ＭＭＦ）などの因子が発現される。他の実施形態では、ＴＮＦアルファ／ベータが発現される。
【００３８】
ある実施形態では、本発明に係る骨組は、細孔を含む。前記骨組においては、ある実施形態では、細孔の深さは様々であり（約１〜３５０００μｍの範囲）、他の実施系形態では、細孔の直径は様々であり（約０．７５〜１５００μｍの範囲）、又は他の実施形態では、細孔の深さ及び直径は様々である。ある実施形態では、骨組の長さと骨組の高さとの比は、１０よりも大きい。
【００３９】
ある実施形態では、「約」という用語は、１〜２０％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、１〜１０％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、１〜５％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、５〜１０％の範囲のずれを意味する。他の実施形態では、「約」という用語は、１０〜２０％の範囲のずれを意味する。
【００４０】
ある実施形態では、細孔の直径は様々であり、約１〜１００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、１００〜約２００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、２００〜約３００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、３００〜約４００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、４００〜約５００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、５００〜約７５０μｍである。他の実施形態では、前記直径は、７５０〜約１０００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、１０００〜約１５００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、１５００〜約２０００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、２０００〜約２５００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、２５００〜約３０００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、３０００〜約３５００μｍである。
【００４１】
ある実施形態では、細孔の直径は様々であり、約１〜１００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、１００〜約２００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、２００〜約３００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、３００〜約４００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、４００〜約５００μｍである。他の実施形態では、前記直径は、５００〜約７５０μｍである。他の実施形態では、前記直径は、７５０〜約１０００μｍである。
【００４２】
他の実施形態では、本発明は、チャンネルを形成する細孔を有する固形の多孔性骨組を提供する。他の実施形態では、チャンネルは、骨組の表面に分散している。他の実施形態では、チャンネルは軸に沿って位置しており、他の実施形態では、前記チャンネルの骨組表面付近における幅は骨組コアにおける幅よりも大きい。ある実施形態では、骨組の表面から中心に行くほど、チャンネルは狭くなる。幾つかの実施形態では、前記骨組の表面付近に位置する細孔は、前記表面からより離れた部分に位置する細孔よりも大きな直径を有する。
【００４３】
ある実施形態では、細孔又は細孔によって形成されたチャンネルは、特定の組織形成（ある実施形態では、腸組織の再生、他の実施形態では、腎臓の再生、他の実施形態では、骨の再生、他の実施形態では、乳房の再生、又は他の実施形態では、神経組織など）のために設計されている。
【００４４】
ある実施形態では、チャンネルの幅は、約１μｍ〜５ｃｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約１〜２００μｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約２００〜４００μｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約４００〜６００μｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約６００〜８００μｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約８００μｍ〜１ｍｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約１〜５ｍｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約５ｍｍ〜１ｃｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約１〜２ｃｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約２〜３ｃｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約３〜４ｃｍの範囲内で様々である。他の実施形態では、チャンネルの幅は、約４〜５ｃｍの範囲内で様々である。
【００４５】
ある実施形態では、不均一な多孔性を有する骨組は、特に組織の操作、修復、又は再生に適切である。その場合、組織は連結組織である、又はその骨組は、互いに近接している２つ以上の組織の操作、修復若しくは再生に使用される。ある実施形態では、多孔性の相違によって、異なった種類の細胞が骨組内の適切な領域へ移動するのが容易になり得る。他の実施形態では、多孔性の相違により、骨組にある様々な細胞の間での適切な細胞間結合の発達が容易になる場合があり、これは組織の発達／修復／再生のための適切な構成に必要である。例えば、樹上突起又は細胞突起は、骨組材料の異なった細孔率により、より適切に伸長し得る。他の実施形態では、骨組における透過性の相違によって、タンパク質の透過が促進及び防止される場合があり、その場合、透過性は分子の大きさによるので、不均一な細孔率を有する骨組は分子のふるいとして働く。本発明に係る勾配骨組は、不均一な細孔率が望ましい任意の目的のために用いられる場合があり、本発明の一部であることを理解されたい。
【００４６】
他の実施形態では、骨組の平均細孔直径及び／又はその分布は一様ではない。他の実施形態では、平均細孔直径は、前記骨組におけるそれらの空間的構成に応じて異なる。他の実施形態では、平均細孔直径は、骨組の任意軸に沿った細孔直径分布に応じて異なる。他の実施形態では、骨組は、細孔の無い領域を有する。他の実施形態では、前記領域では、大きさが１０００Ｄａ以上の分子は透過できない。
【００４７】
ある実施形態では、「平均細孔直径」は、面積平均直径（Ｄ３，２）を意味する。他の実施形態では、Ｄ３，２は、平均細孔直径の値であり、他の実施形態では、対数正規分布に従う。ある実施形態では、「Ｄ３，２」は、細孔の平均直径を意味し、細孔を球形と仮定し、且つ測定装置に晒される表面積における平均直径を推定することで計算される。
【００４８】
ある実施形態では、対数正規分布は、度数分布計算用の下記の式にしたがって算出される。
2009513247.tif 000002
但し、
ｄｐは、細孔直径（μＭ）であり、
ｄＡは、平均細孔直径であり、
σは、細孔直径の標準偏差（μＭ）である。
【００４９】
ある実施形態では、「細孔直径分布」は、細孔直径の標準偏差であるσを意味し、単位はμＭである。
【００５０】
本発明のこの態様、及びある実施形態では、本発明に係る骨組の架橋密度は一様ではない。他の実施形態では、架橋密度は、当該技術分野で公知の任意の架橋方法によって変えられる。ある実施形態では、「架橋密度」という用語は、それぞれの架橋間にあるモノマーの平均の数である。他の実施形態では、架橋間にあるモノマーの数が小さければ小さいほど、架橋密度は大きくなり、これは、他の実施形態では、骨組の物理化学的な特性に影響する。細胞の移動を可能にするほど大きな細孔が得られるように、架橋密度を調整する必要がある。他の実施形態では、細孔の寸法は、走査電子顕微鏡によって、又は他の実施形態では、高分子プローブ（macromolecular probe）を使用することで求められる。ポリマーの網目には、細胞（例えば、ある実施形態では、ケラチノサイト、軟骨細胞、及び骨芽細胞など）が含まれた懸濁液が適切な成長因子と共に注入される。その後、細胞は網目内で増殖する。細胞が増殖するにつれて、周囲の網目は分解する。網目の分解時期は、細胞が細胞間コンタクトを介してネットワーク（器官／組織）を形成する時期と一致する必要がある。
【００５１】
ある実施形態では、本発明は、固形の骨組を作成するプロセスであって、伝導物質から成り、少なくとも２つの構成要素を有する型にポリマー懸濁液に入れた後に、前記骨組を架橋剤に晒すステップをさらに含むプロセスを提供する。他の実施形態では、前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、１エチル３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジミド（ＥＤＡＣ）、紫外線又はそれらの組み合わせである。ある実施形態では、上記に記載したように架橋密度を調節するために、架橋剤に晒す時間は様々である。ある実施形態では、本明細書に記載されているように勾配を誘起する条件下でポリマー懸濁液を超冷却すると、架橋密度が領域によって異なる骨組が形成される。
【００５２】
ある実施形態では、前記骨組の寸法及び形状は、骨組がインプラントされる組織に応じる。
【００５３】
他の実施形態では、骨組は、インプラントされる際に、骨組内又は骨組付近で血管が形成されるのを促進する。
【００５４】
ある実施形態では、骨組は、インプラント部位付近の組織による圧縮力に耐えられるほど十分な剛性を有する材料から成る。他の実施形態では、骨組材料の架橋の程度は、周囲の組織の圧縮力を相殺するように調整される。ある実施形態では、最初のポリマー・スラリーの濃度は、標的組織の圧縮力に応じる。ある実施形態では、骨組は、骨組にある程度の弾力性を与え、同時に骨組の破壊を防止する可塑剤を含む。骨組が弾力性を有し、且つ周囲の標的細胞の圧縮力に対する耐性を有するようにするために、ある実施形態では、可塑剤が骨組の表面に集中するように、又は他の実施形態では、可塑剤の濃度が深さ及び分布領域によって異なるように骨組は構築されている。
【００５５】
他の実施形態では、可塑剤は、生体適合分子の分子量よりも小さく、自由体積を増大させる任意の物質であり得る。ある実施形態では、可塑剤は、有機化合物（ある実施形態では、様々な鎖長を有するトリグリセリド）である。他の実施形態では、可塑剤は、水である。
【００５６】
ある実施形態では、生体適合ポリマーを含む骨組は、不定形なガラス状態の固体を形成するプロセスで作成される。ある実施形態では、「ガラス状態の固体」は、可塑剤を迅速に除去する際にバイオポリマーの並進運動（translational mobility）が阻害され、且つポリマー固有の断熱膨張係数（adiabatic expansion coefficient）に対応する分子の配列性向（alignment）が絶たれる程度までにポリマーの粘度が増加する不定形の準安定固体を意味する。
【００５７】
ある実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、空気が混入した生体適合性ポリマー液を迅速に冷却することで作成される。他の実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、真空下で溶媒を迅速に除去することで作成される。他の実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、凍結乾燥で作成される。ある実施形態では、不定形なガラス状態の固体は、６５℃よりも高い温度で又は約４〜４０℃の間の温度で押し出し成形を行うことによって作成される。ある実施形態では、骨組の幅、長さ、深さ、又はそれらの組み合わせは、押し出し成形の条件を設定し、押し出し成形に使用されるダイを設計することで調整される。当業者ならば、互いに連結した細孔を多く有する（スポンジのように）不定形のガラスを作成でき、且つ製造条件を変えることで細孔の寸法を調整できる任意のプロセスが、本発明に係る骨組を作成するのに適しており、したがって、本発明の範囲内に組み込まれることを理解できるであろう。
【００５８】
ある実施形態では、骨組は、本発明の方法にしたがって材料を凍結乾燥及び昇華させることにより、多孔状に作成される。これは、例えば、Dagalakisに付与された米国特許第４，５２２，７５３号に記載されているような、当業者に公知の方法を用いれば実施可能である。例えば、多孔性の勾配骨組は、凍結乾燥によって作成可能である。ある実施形態では、細胞外マトリックス成分が液体に懸濁される場合がある。そこで、その懸濁液は凍結され、次に凍結乾燥される。懸濁液が凍結することによって、液体から氷晶が形成される。そこで、これらの氷晶は、凍結乾燥の工程の真空状態下で昇華することにより、氷晶が材料中に占めていた場所に空隙が残る。他の実施形態では、作成される骨組の成分密度及び細孔の寸法は、凍結工程の始まりに、懸濁液の凍結速度及び／又は細胞外マトリックス成分が懸濁される水の量を調節することにより異なってくる場合がある。
【００５９】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、比較的大きく、均一的な細孔及び低い成分密度を有する骨組を作成するためには、制御された遅い速度（例えば、−１℃／分又はその以下）で温度を約−２０℃まで下げて細胞外マトリックス成分を凍結し、次に、凍結乾燥を行う場合がある。比較的小さく、均一的な細孔及び高い成分密度を有する骨組を作成するためには、凍結前に、液体部分（例えば、水）を均一的に取り除くために遠心分離を行い、細胞外マトリックス成分を圧縮する場合がある。その後、得られる細胞外マトリックス成分の塊を液体窒素で瞬間冷凍し、凍結乾燥を行う。中程度の寸法の細孔及び中程度の成分密度を有する骨組を作成するためには、比較的速い速度（例えば＞−１℃／分）で温度を−２０〜−４０℃まで下げて細胞外マトリックス成分を凍結し、その後、その塊を凍結乾燥する。
【００６０】
他の実施形態では、本発明は、固形であり、多孔性及び生体適合性を有し、
少なくとも１つの方向における幅が少なくとも３．５ｍｍであり、且つエッジに対して垂直に配向している細孔を有する骨組を作成するプロセスであって、伝導材料から成り、少なくとも２つの構成要素を有する型にポリマー懸濁液を入れるステップと、前ステップで前記懸濁液が満たされた多構成要素の前記型を、前記懸濁液が固化するまでの期間に一定温度の冷却材で超冷却し、それによって、固化した前記懸濁液に、前記骨組のエッジに対して垂直に配向するように氷晶が配向するステップと、少なくとも１つの構成要素を取り除くことで固化した前記ポリマー懸濁液の一部分を、前記一部分に昇華を引き起こす条件に晒し、それによって、細孔が前記骨組のエッジに対して垂直に形成されるステップと、前記型の残りの構成要素を取り除いて多孔性の前記骨組を晒すステップとを含むプロセスを提供する。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の任意の骨組を作成するプロセスを提供する。
【００６２】
ある実施形態では、「ポリマー懸濁液」又は「懸濁液」は、１つの成分を除去する際に固形の骨組を形成する任意の懸濁系を意味する。ある実施形態では、懸濁系は、懸濁液である。他の実施形態では、懸濁系は、エマルジョンである。他の実施形態では、懸濁系は、ゲルである。他の実施形態では、懸濁系は、泡である。ある実施形態では、ポリマー懸濁液は、モノマー、又は他の実施形態では、単一の生体適合性分子を含む。
【００６３】
ある実施形態では、固形の骨組を作成するプロセスであって、多構成要素の型にポリマー懸濁液を注入し後に、前記懸濁液が満たされた前記型を、前記懸濁液が固化するまでの期間に一定温度の冷却材で超冷却し、それによって、固化した前記懸濁液に、前記骨組のエッジに対して垂直に配向するように氷晶が形成されるステップをさらに含むプロセスを提供する。他の実施形態では、前記懸濁液又はその一部分を、昇華を引き起こす条件に晒し、それによって、細孔が前記骨組のエッジに対して垂直に形成される。他の実施形態では、前記条件に晒された領域に形成された前記細孔は、前記条件に晒されなかった領域に比の細孔に比べて、異なる直径を有する。
【００６４】
ある実施形態では、多孔性の骨組は、骨組の表面からコアに配向している「トンネル」を有する。ある実施形態では、トンネルの直径は、表面から離れるのにしたがって小さくなる。他の実施形態では、トンネルは、型の構成要素を取り除くことで形成され、その場合、骨組の表面から骨組の中心に配向した開トンネルが形成される。ある実施形態では、型の取り除かれる特定の構成要素は、ある実施形態では、骨組の表面上に存在する、又は他の実施形態では、骨組の内部に存在する。また、懸濁液を固化する条件は、トンネルを形成するように設定される場合がある。
【００６５】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、本発明に係る勾配骨組を作成するためには、凍結速度は、骨組の形成時に骨組内に温度勾配を生じさせるべく、制御される。例えば、本明細書に記述及び／又は例示されているような、ポリマーを含む関心のあるスラリは、「Loree et al., 1989 Proc. 15th Annual Northeast Bioeng Conf, pp. 53-54」に示されているように、過冷却シリコン油に挿入される場合がある。この態様によれば、且つある実施形態では、容器の長さに沿って伝わる凍結フロントが形成されることでスラリ内に温度勾配が形成されるべく、容器は完全に浸っているのではなく、部分的に浸っている。
【００６６】
他の実施形態では、型における氷晶の形成速度及びその大きさを制御するために、ソーラー浴の効果（solar bath）が使用される。それによって、凍結した骨組における細孔の寸法を容易に制御することができる。ある実施形態では、スラリには溶質が付加され、温度勾配は、スラリを含む容器を冷却したプレート（ある実施形態では、凍結乾燥機であり得る）に設置することで、又は他の実施形態では、容器上に加熱ランプを設置することで形成される。溶解度は、温度に応じて変化するので、溶質濃度勾配が形成される。他の実施形態では、溶質濃度は、凍結温度に影響するので、一定の凍結時間には異なる大きさの氷晶が生じる。これにより、溶質濃度に関して勾配がある部分では、溶質濃度の増加に対しては、細孔の大きさは反比例するようになる。
【００６７】
ある実施形態では、勾配は、熱力学的平行前の凍結プロセスを停止することで維持される。所定の形状を有する容器にこのように浸漬したスラリにおける熱力学的平衡を達成する時間を求める方法は、当業者には、容易に判明するであろう。所望の温度勾配を達成した後は、スラリは、ある実施形態では、容器から取り出され、凍結乾燥される。昇華した後に残存する物質は、ポリマーを含み、平均細孔径に関して勾配を有する骨組である。
【００６８】
他の実施形態では、骨組の凍結速度の勾配は、骨組の成分を含む容器と容器が置かれている凍結機の棚との間に勾配断熱層（graded thermal insulation layer）を使用することで形成される。ある実施形態では、断熱層の勾配は、例えば、層内の特定の方向に沿って厚みが増す領域を作成する、又は他の実施形態では、層の熱伝導性を変化させるなどの当該技術分野では公知の様々な方法を使用することで作成される。後者は、例えば、アルミニウム及び銅、又はプレキシガラス及びアルミニウムなどを使用することで実施可能であり、これらは全て本発明に係る実施形態を表す。
【００６９】
ある実施形態では、本発明は、固形であり、多孔性及び生体適合性を有する本発明に係る骨組を作成するプロセスであって、少なくとも２つの構成要素を有する型を使用するプロセスを提供する。ある実施形態では、骨組がインプラントされる組織と近似する大きさ及び形状を有し、且つ複数の構成要素を有する型が使用される。ある実施形態では、型は２つ以上の伝導材料で構成されている。他の実施形態では、伝導材料の熱伝達率は異なり、それによって、ポリマー懸濁液を超冷却する際に凍結速度が部位によって異なるようになる。ある実施形態では、複数の構成要素を有する型の各構成要素は、異なる伝導材料から構成されている。
【００７０】
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載したプロセスにしたがって作成される骨組を提供する。他の実施形態では、このプロセスは、骨組を、少なくとも１つの細胞外マトリックス成分を分解又は溶解する酵素の濃度が増加する溶液群の勾配に晒すステップをさらに含む。本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、少なくとも１つの細胞外マトリックス成分の分解は、酵素濃度が増加すると、増大する。
【００７１】
ある実施形態では、局所的にＴｇ（ガラス転移温度）を保存温度よりも低下させるステップの後に骨組のＴｇを保存温度より高くするように環境条件を変える。他の実施形態では、マトリックスを脱水することで、Ｔｇを保存温度よりも高くすることができる。この脱水は、ある実施形態では、マトリックスを所望のＴｇよりも低い温度に晒す、又は他の実施形態では、マトリックスを飽和塩溶液に晒すことによって行うことができる。ある実施形態では、使用される飽和塩溶液は、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）溶液又は酢酸カリウム（Ｋ＋ＣＨ３ＣＯＯ−）溶液である。他の実施形態では、マトリックスの脱水には、五酸リン（Ｐ２Ｏ５）が使用される。他の実施形態では、マトリックスの脱水には、湿潤度を０．３５よりも低くするほどの濃度の硫酸が使用される。ある実施形態では、Ｔｇを越えるように骨組を局所的に加熱したとき、発熱体を取り除くと、骨組材料を局所的にＴｇよりも低い温度に冷却することになり、それによって、細孔がさらに崩壊するのが防止される。ある実施形態では、Ｔｇを上昇させるために、骨組材料を架橋する場合がある。それによって、臨海断片長（critical segment length）（ｘ）が大きくなる。
【００７２】
ある実施形態では、骨組の軸に沿って、細孔を制御しなら崩壊させる。ある実施形態では、当該技術分野では公知の適切な気圧下（例えば、関心領域に直接温風を当てるなど）で、関心領域から水分を蒸発させる場合がある。本発明のこの態様では、乾燥された領域においては、表面張力でこれらの細孔は崩壊し、それによって、細孔は無くなる、又は多孔性の程度が低下する。
【００７３】
ある実施形態では、分解又は溶解という用語は、部分分解又は部分溶解の意味を含む。他の実施形態では、分解又は溶解という用語は、完全分解又は完全溶解という意味を含む。
【００７４】
ある実施形態では、本発明は、対象において器官又は組織を操作する方法であって、本発明に係る骨組をインプラントするステップを含む。
【００７５】
他の実施形態では、本発明は、患者の器官若しくは組織の修復又は再生の方法であって、本発明に係る骨組を患者にインプラントするステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００７６】
本発明のこれらの態様によれば、且つある実施形態では、骨組は、本発明に係るプロセスで作成され得る。
【００７７】
ある実施形態では、本発明は、インプラント型の勾配骨組を提供する。この勾配骨組は、用途、並びに所望のインプラント部位に適合すべく、領域によって異なる物理的な特性を有する。例えば、細孔の寸法及び材料の密度は、望ましい物理的構造を有する骨組を形成すべく、領域によって異なることがある。このような、骨組の細孔の寸法及び材料の密度の相違は、とりわけ、望ましい量の細胞を受け取り、維持すると同時に望ましい程度の構造的硬直性を示す骨組を設計するのに有用である。また、本開示によれば、インプラント型の骨組は、インプラントされる際に望ましい細胞活性を可能にする適切な物理的な微細構造を有するようにだけではなく、例えば組織の修復又は再生などの用途のために、組織にインプラントされる際にその組織に本来ある生化学的構成（コラーゲン、成長因子、グリコサミノグリカンなど）を有するように作成されることが可能である。
【００７８】
ある実施形態では、本発明に係る方法は、創傷治癒に使用される。
【００７９】
ある実施形態では、「創傷」という用語は、最も一般的な意味では、損傷を受けた生体組織を意味する。他の実施形態では、創傷は、皮膚裂傷である。ある実施形態では、創傷は、皮膚のある部分が２つに分離した擦過傷を意味する。ある実施形態では、創傷は、外科的切開を意味する。他の実施形態では、創傷には、肺組織、動脈壁、又は弾性繊維を有する他の器官の損傷が含まれ得る。ある実施形態では、創傷には、膿瘍が含まれ得る。他の実施形態では、創傷は、糖尿病によって悪化し得る。ある実施形態では、本発明に係る方法及び骨組は、創傷治癒を速めるために使用される。
【００８０】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、創傷治癒には、血栓形成、炎症性細胞の動員、上皮化、並びにマトリックスの形成及び再構築などが伴われる。したがって、ある実施形態では、本発明に係る骨組には、これらの段階に関わる分子が組み込まれる場合がある。他の実施形態では、組織の損傷直後、血管の破壊によって、溢血、付属の血小板の凝集、及び血液凝固が発生し、フィブリン血栓が形成される。ある実施形態では、本発明に係る骨組には、これらの段階に関わる又はこれらの段階を促進する分子が組み込まれる場合がある。フィブリン血栓に閉じこまれた活性化血小板は、脱顆粒し、様々なサイトカイン及び成長ホルモンを放出する。これらのサイトカイン及び成長ホルモンは、創傷部位への炎症細胞の動員及び血管形成を促進し、再上皮化及び結合組織の収縮に関わる組織の挙動を開始させる。ある実施形態では、本発明に係る骨組は、陥入した表面の形状を有し、破壊された血管の成長を可能にする。他の実施形態では、骨組は、サイトカインと成長ホルモンとをさらに含む。
【００８１】
ある実施形態では、脱顆粒した血小板によって放出される成長ホルモン及びサイトカイン、バクテリアのタンパク質から切断されるホルミルメチオニルペプチド、並びにフィブリン及び他のマトリックスタンパク質のタンパク質分解産物などの様々な走化シグナルによって、好中球及び単球は、損傷部位に動員される。好中球の浸潤は、ある実施形態では、数日後に停止するが、創傷部位に単球が動員され続けることによって、マクロファージは蓄積し続ける。活性化したマクロファージは、成長因子及びサイトカインを放出し続け、それによって、脱顆粒した血小板からの初期シグナルが増大する。
【００８２】
他の実施形態では、肉芽組織形成及び創傷の再上皮化が開始する。再上皮化のプロセスにおいては、ある実施形態では、ケラチノサイトが基底膜から脱離し、フィブリン及びフィブロネクチンの一時的なマトリックス及び下層のマトリックスを遊走し、その後に、上皮細胞が増殖し、それによって、置換に必要な細胞ができる。ケラチノサイトの増殖は、ケラチノサイトの成長因子及び上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリのメンバー（他の実施形態では、骨組に、又はある実施形態では、本発明に係る方法に組み込まれる）によって制御される。フィブリン血栓の間を移動するためには、ケラチノサイトは、自身の前方にあるフィブリンの障害物を溶解する必要がある。このプロセスでは、プラスミンという主要な線維素溶解酵素が使用される。したがって、ある実施形態では、プラスミンは、本発明に係る骨組に組み込まれる、又は他の実施形態では、本発明に係る方法に使用される。再上皮化は、下層の収縮性結合組織によってさらに促進される。この収縮性結合組織は、収縮することで創縁を互いに接近させる。創傷の表面が細胞の単層に被覆されると、上皮細胞の移動が停止する。
【００８３】
ある実施形態では、新規の上皮の細胞は、損傷していない上皮の外層にある細胞の標準的分化プログラムを経る。したがって、上皮の新しい層は、創縁から内部に向かって再構築される。マトリックスの形成及び再構築は、再上皮化と同時に開始する。その後の数ヶ月間にわたって、マトリックスからフィブロネクチンが除去され、残存する瘢痕の伸張強度を増大させるコラーゲンが蓄積されることでマトリックスは頻繁に変化する。したがって、過剰な瘢痕形成を防止する分子、又はフィブロネクチンの除去を促進する酵素（例えば、ＭＭＰ）が、本発明に係る骨組に組み込まれ、また、本発明に係る方法に使用され得る。損傷の数年後、ヒトの瘢痕において組織の弾性の原因である弾力繊維が検出されるようになる。ある実施形態では、本発明に係る骨組の表面に上皮細胞が播種され、次に、この骨組は、創傷部位にインプラントされる。したがって、創傷治癒が促進されるようになる。
【００８４】
本発明のこの態様によれば、且つある実施形態では、固形であり、多孔性及び生体適合性を有し、上皮細胞が播種され、且つ１つ以上の細胞外マトリックス及びその類似体をさらに含む勾配骨組は、開放創傷にインプラントすることで創傷を治癒するのに使用される。尚、骨組は、エラスチンと、好中球と、単球と、ＥＧＦとを含む。他の実施形態では、骨組には、幹細胞が播種される。幹細胞は、ある実施形態では、成長因子を発現するように操作されている。
【００８５】
ある実施形態では、本発明に係る方法及び固形の勾配骨組は、豊胸手術後の乳房組織を再生するのに使用される。他の実施形態では、切開部位から本発明に係る勾配骨組を挿入してインプラントした後の数時間内に、骨組の表面に存在する開放した大きな細孔チャンネルに炎症性滲出液が流入するようになる。フィブリノゲンから形成されたフィブリンは、凝縮し、血管が成長できる網目を形成する。炎症性滲出液に存在するほかの因子及び細胞が、骨組内での間質の再構築及び血管形成を促進する。周囲の組織の収縮及びインプラントが占める空間からの圧力の増加により、組織にすでに存在する血管系は骨組に接近するようになる。他の血管もまた、被膜状（capsule form）に骨組を囲むように形成される。炎症性滲出液及び移動した細胞／播種された細胞からの高濃度の血管新生因子によって、血管が骨組までに成長し、永久に周囲の細胞を支持するようになる。
【００８６】
下記の実施例は、本発明の最良の実施形態をさらに詳細に説明するものであって、本発明の範囲を制限するものとして見なされるべきではない。
【実施例】
【００８７】
≪実施例１：大きな三次元容量を有する乳房組織の再生≫
【００８８】
使用される骨組は、球形であり、その直径は５０ｍｍである。骨組の表面又は表面付近には、骨組の中心へ延びる開放したチャンネルを有する。これらのチャンネルの直径は、骨組の中心から表面に行くほど大きくなる。表面付近の直径は数ミリメートルほど大きい。チャンネルは、骨組の中心に行くほど分離して骨組内で網目を形成し得る（組織において血管が徐々に分離するのと同様に）。骨組の表面には、適切な細胞が播種されている。細胞は、骨組の外表面から深さが１０ｍｍの内部までに拡散する。また、骨組は、コラーゲン繊維に結合しているＶＲＧＦをも有する。細孔チャンネルの直径は、骨組の表面では、１ｍｍである。
【００８９】
このデバイスをインプラントする方法は、生理食塩水で満たされた乳房インプラントをインプラントする方法と類似している。生理食塩水で満たされた乳房インプラントは、完全にコーティングされたインプラントであり、一定容量のものが市販されている。この乳房インプラントは、厚いシェルと、表面の継ぎ目と、インプラントを区画に分離する内部隔壁（ある部分が圧縮されている際に他の部分が膨張するのを最小限にするため）とを有する。インプラントのシェルのテキスチャリングは、被膜拘縮を減少するように設計されている。切開は、患者の身体及び所望に応じて、乳頭／乳輪の下、乳房の下の溝、又は腋窩部のいずれかで行われる。インプラントは、一般的には、胸筋の下部に設置される。なぜならば、この部位にインプラントを設置すると、違和感が減少し、外観がより自然になる。インプラントされた乳房をマンモグラムで観察すると、ほとんど全ての場合において、筋肉の下にインプラントを確認することできる（筋肉上にインプラントを確認できる場合は、より少ない）。
【００９０】
骨組は、腋窩切除で挿入される。このデバイスは、大胸筋上に設置される。大胸筋上に骨組を設置することで、被膜拘縮が増大し、血管床が骨組表面にさらに容易に接近するようになると予想される。患者には、全身麻酔が施される。次に、腋窩切除を行った後に、外科医は、骨組を挿入するために、乳腺組織と大胸筋との間に空間を形成する。骨組は形成された空間に挿入され、切開部分は縫合される。手術後、患者は、デバイスの離脱を防止し、且つ圧縮力からデバイスを保護するように設計された特別な下着を着用する。手術後は、必要に応じて、鎮痛剤が使用される。デバイスが一旦設置されると、周囲の組織からの圧力によって既存の血管系がデバイスの外表面に接するようになり、組織が骨組と接触するようになる。インプラントの周囲では、自然発生的に被膜が形成され、様々な量の収縮性細胞を有する繊維組織の多層膜が形成される。最も内側に位置する膜は、骨組に近接する血管系を含む。インプラントの周囲に形成される被膜の量は、インプラントを構成している物質による。合成ポリマーの周囲では、より多くに被膜が形成される。
【００９１】
毛細血管からは炎症性滲出液が放出され、それによって、切開によって形成された創傷が血漿タンパク質に浸される。損傷した組織を除去し、新たな組織の形成を誘導し、損傷したマトリックス、基底膜、及び結合組織を再構築し、且つ血液による供給を確立するために、様々な細胞が動員される。損傷後の３つの段階で滲出液が放出される。第１の段階は、損傷直後に開始し、ヒスタミンの刺激による液体の放出を伴い、約８〜３０分続く。次の段階は、第１段階に類似しているが、さらに長く（最大数日間）続く。最終段階は、損傷の数時間後に開始し、その効果は２〜３日目で最大となり、数週間で徐々に無くなる。細胞性滲出液は、第２段階及び第３段階で生じる。マトリックスの一般的な成分は、より液体状になり、それによって、滲出液の含有物は、さらに拡散するようになる。しかし、組織圧の急激な上昇はまだ起きない。これによって、滲出液は、急激な圧力で骨組に損傷を与えることなく、骨組の細孔及びチャンネルの中を流れることができる。滲出液の構成要素（細胞性及び分子性）は、血管形成及び組織の再生を促進する。
【００９２】
炎症性滲出液は、インプラント後の数時間以内に骨組の開放した大きな細孔チャンネルに流入し始める。フィブリノーゲンが凝縮して形成されたフィブリンは、血管が成長できる網目を形成する。滲出液に存在する他の因子及び細胞は、骨組内での間質の再構築、及び血管新生を促進する。既存の組織にある血管は、骨組の周囲の組織の収縮及びインプラントが占める空間からの圧力の増加によって骨組に接近するようになる。新たな血管が形成され、この血管は、骨組を被膜状に囲むようになる。滲出液及び移動した細胞／播種された細胞からの高濃度の血管新生因子によって、血管が骨組へ成長し、周囲の細胞に永久に供給するようになる。
【００９３】
血管の成長を配向できる方向づけられたチャンネルによって、血管が骨組の中心に到達するための成長距離及びランダムな血管新生が減少する。またこれらのチャンネルにより、骨組の外領域にて血管が発達するのに必要な血管の成長量が減少し、それによって、骨組の大部分において血管が急速に発達するようになる（なぜならば、血管が骨組の表面に向かってｘｍｍ成長した場合、骨組の中心付近で同じ長さで成長する場合よりも、骨組のより大きな部分を満たすことになるため）。
【００９４】
細胞増殖段階は、約２４〜４８時間で開始し、２〜３週間で最大限に達する。組織の再構築は、約１〜２週間で開始する。４週間以内に、ほとんどの骨組が分解され、組織の再生が完了する。
【００９５】
≪実施例２：異なる細孔直径を有する勾配骨組を構築するための凍結−昇華の方法≫
【００９６】
＜スラリの作成＞
【００９７】
例えば、牛の腱から単離された微小繊維、Ｉ型コラーゲン（Integra LifeSceinces）などの細胞外マトリックス成分、及びサメの軟骨から単離されたコンドロイチン６硫酸（Sigma Aldrich）を、０．０５Ｍ酢酸に入れ、ｐＨ３．２、１５０００ｒｐｍ、４℃で混合し、次に、真空装置を用いて５０ｍＴｏｒｒで脱気する。
【００９８】
＜異なる細孔直径＞
【００９９】
懸濁液を容器に入れ、その容器の一部のみ（高さの１０％まで）を過冷却したシリコン浴（Loree et al., 1989）に浸す。スラリの凍結の平衡時間を測定し、熱平衡に達する前に凍結工程を停止する。容器を浴槽から取り、次にスラリを凍結乾燥（例えば、VirIis Genesis凍結乾燥機（Gardiner, NY）で）で昇華する。したがって、スラリ内で温度勾配が生じ、凍結面が形成され、この凍結面は熱平衡前に停止される。次に凍結乾燥を行うことで、昇華が起き、細孔の平均直径に関して勾配を有する領域を有するマトリックスのコポリマーが形成される。
【０１００】
他の方法では、懸濁液を容器に入れ、その容器を冷凍庫の棚に置く。勾配を有する断熱材が容器と棚との間に設置されており、それにより、上記のような凍結面の勾配が形成される。勾配を有する断熱材は、アルミニウム及び銅、又はアルミニウム及びプレキシガラスなどの熱伝導率が異なる材料の使用などの様々な方法で構築することができる。
【０１０１】
ある実施形態では、容器は、取り外し可能な要素を含む多構成要素の容器である。ある実施形態では、ポリマー懸濁液の固化後にこれらの要素を除去することによって、凍結したスラリ内でトンネルが形成され、それらの配向が最適化される。他の実施形態では、取り外し可能な要素は、例えば、トンネルの直径が骨組から離れれば離れるほど小さくなるように、円錐形の形状を有している。
【０１０２】
ある実施形態では、型の表面の形状によって、凍結したスラリにおいてへこみやチャンネルが形成され、所望の形状及び分布を有する表面が形成される。
【０１０３】
以上、本発明の最良の実施形態を説明したが、これらの説明は、本発明を制限するものではない、当業者ならば、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な変更及び改変を加えることが可能であると理解するであろう。
【国際調査報告】
2009513247.tif 000003