(57)【要約】遺伝子発現を阻害する、少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドを含む低分子干渉リボ核酸二重鎖（siRNA）を提供する。1つの態様において、本二重鎖はリボヌクレオチドを含み、少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドは、2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）である。2009513112.tif 000008
2009513112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖の二重鎖を含む、配列特異的な様式で標的遺伝子の発現を調節するための低分子干渉RNA（siRNA）であって、siRNAの少なくとも1つのリボ核酸ヌクレオチドがアラビノース修飾ヌクレオチドで置換される、siRNA。
【請求項２】
15〜30ヌクレオチド長である、請求項1記載のsiRNA。
【請求項３】
3’末端および5’末端に1〜3ヌクレオチドの突出部を有する、請求項2記載のsiRNA。
【請求項４】
アラビノース修飾ヌクレオチドが、フッ素基、ヒドロキシル基、アミノ基、アジド基、アルキル基、アルコキシ基、およびアルコキシアルキル基からなる群より選択される2’置換基を有する、請求項3記載のsiRNA。
【請求項５】
アルキル基が、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、および官能基化アルキル基からなる群より選択され、アルコキシ基が、メトキシ基、エトキシ基、プロプロキシ（proproxy）基、および官能基化アルコキシ基からなる群より選択され、かつ、アルコキシアルキル基が、メトキシエチルおよびエトキシエチルからなる群より選択される、請求項4記載のsiRNA。
【請求項６】
官能基化アルキル基が、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、およびブチルアミノ基からなる群より選択され、かつ、官能基化アルコキシ基が、q＝2〜4であり-Rが-NH2基、-OCH3基、または-OCH2CH3基である-O(CH2)q-Rからなる群より選択される、請求項5記載のsiRNA。
【請求項７】
少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドが2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）である、請求項3記載のsiRNA。
【請求項８】
少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドがsiRNAのセンス鎖上に存在する、請求項7記載のsiRNA。
【請求項９】
少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドがsiRNAのアンチセンス鎖上に存在する、請求項7記載のsiRNA。
【請求項１０】
センス鎖上の全てのヌクレオチドがFANAで置換される、請求項8記載のsiRNA。
【請求項１１】
少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドが、突出部の少なくとも1つのダングリング（dangling）ヌクレオチドである、請求項7記載のsiRNA。
【請求項１２】
ルシフェラーゼ発現を低下させるための、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項１３】
SEQ ID NO: 1および2の塩基配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項12記載のsiRNA。
【請求項１４】
SEQ ID NO: 3および4；SEQ ID NO: 5および6；SEQ ID NO: 7および8；SEQ ID NO: 9および10；SEQ ID NO: 11および12；SEQ ID NO: 13および14；SEQ ID NO: 15および16；SEQ ID NO: 17および18；SEQ ID NO: 19および20；SEQ ID NO: 21および22；SEQ ID NO: 23および24；SEQ ID NO: 25および26；SEQ ID NO: 27および28；ならびにSEQ ID NO: 29および30からなる群より選択される配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項1記載のsiRNA。
【請求項１５】
CCR3発現を低下させるための、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項１６】
SEQ ID NO: 31および32の塩基配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項12記載のsiRNA。
【請求項１７】
SEQ ID NO: 33および34；SEQ ID NO: 35および36；またはSEQ ID NO: 37および38からなる群より選択される配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項1記載のsiRNA。
【請求項１８】
RSウイルス（RSV）のウイルス複製を低下させるための、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項１９】
SEQ ID NO: 47および48の塩基配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項12記載のsiRNA。
【請求項２０】
SEQ ID NO: 49および50からなる配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項1記載のsiRNA。
【請求項２１】
PDE4D発現を低下させるための、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項２２】
SEQ ID NO: 39および40の塩基配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項12記載のsiRNA。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 41および42；SEQ ID NO: 43および44；ならびにSEQ ID NO: 45および46からなる群より選択される配列を有する二重鎖の鎖を有する、請求項1記載のsiRNA。
【請求項２４】
ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド間結合を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載のsiRNA。
【請求項２５】
siRNAのヌクレオチドの少なくとも1つをアラビノース修飾ヌクレオチドで置換する工程を含む、siRNAのヌクレアーゼ安定性および標的遺伝子阻害活性の少なくとも一方を増大させる方法。
【請求項２６】
アラビノース修飾ヌクレオチドが2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
siRNAが、二本鎖の二重鎖であり、3’末端および5’末端において1〜3ヌクレオチド突出部を有する15〜30ヌクレオチド長である、請求項25または26記載の方法。
【請求項２８】
置換される少なくとも1つのヌクレオチドがsiRNAのセンス鎖上に存在する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
置換される少なくとも1つのヌクレオチドがsiRNAのアンチセンス鎖上に存在する、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
センス鎖上の全てのヌクレオチドが置換される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
置換される少なくとも1つのヌクレオチドが突出部上に存在する、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
二重鎖の鎖がSEQ ID NO: 1および2の塩基配列を有し、siRNAの二本鎖の二重鎖がルシフェラーゼ発現を低下させる、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
二重鎖の鎖がSEQ ID NO: 31および32の配列を有し、siRNAがCCR3発現を低下させる、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
二重鎖の鎖がSEQ ID NO: 39および40の配列を有し、siRNAがPDE4D発現を低下させる、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
二重鎖の鎖がSEQ ID NO: 47および48の配列を有し、siRNAがRSウイルス（RSV）複製を低下させる、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
薬学的に許容される担体とともに、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNAを含む、薬学的組成物。
【請求項３７】
標的遺伝子の発現を調節するための医薬の製造のための、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNAの使用。
【請求項３８】
ルシフェラーゼの発現を低下させるための医薬の製造のための、請求項12〜14のいずれか一項記載のsiRNAの使用。
【請求項３９】
CCR3の発現を低下させるための医薬の製造のための、請求項15〜17のいずれか一項記載のsiRNAの使用。
【請求項４０】
RSウイルス（RSV）感染症を予防または治療するための医薬の製造のための、請求項18〜20のいずれか一項記載のsiRNAの使用。
【請求項４１】
PDE4Dの発現を低下させるための医薬の製造のための、請求項21〜23のいずれか一項記載のsiRNAの使用。
【請求項４２】
それを必要とする患者において標的遺伝子の発現を調節する方法であって、請求項36記載の薬学的組成物の治療的有効量を投与する工程を含む、方法。
【請求項４３】
標的遺伝子がCCR3であり、薬学的組成物が請求項15〜17のいずれか一項記載のsiRNAを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
標的遺伝子がRSウイルス（RSV）複製に関する遺伝子であり、薬学的組成物が請求項18〜20のいずれか一項記載のsiRNAを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
標的遺伝子がPDE4Dであり、薬学的組成物が請求項21〜23のいずれか一項記載のsiRNAを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
標的遺伝子の発現を調節するためのその使用に関する説明書とともに、請求項36記載の組成物を含む、市販用パッケージ。
【請求項４７】
標的遺伝子がCCR3であり、薬学的組成物が請求項15〜17のいずれか一項記載のsiRNAを含む、請求項46記載の市販用パッケージ。
【請求項４８】
標的遺伝子がRSウイルス（RSV）複製に関する遺伝子であり、薬学的組成物が請求項18〜20のいずれか一項記載のsiRNAを含む、請求項46記載の市販用パッケージ。
【請求項４９】
標的遺伝子がPDE4Dであり、薬学的組成物が請求項21〜23のいずれか一項記載のsiRNAを含む、請求項46記載の市販用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、少なくとも1つのアラビノース修飾ヌクレオチドを含む低分子干渉RNA二重鎖（siRNA）に関し、遺伝子発現のダウンレギュレーションのための低分子干渉2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノ核酸（2’-deoxy-2’-fluoroarabinonucleic acid）：RNAハイブリッドにも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸ベースの分子による遺伝子発現サイレンシングのための多数のストラテジーが開発中である［Stephenson, M.L. & Zamecnik, P.C. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4370-4373 (1977); Opalinska, J.B. & Gewirtz, A.M. Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nature Rev. 1 (July), 1-10 (2002)]。中でも、リボザイム、DNAザイム、および、キメラRNA-DNA（gapmer）またはホスホロチオエートDNAなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、ハイブリダイゼーション主導の「アンチセンス」ストラテジーが最も注目を集めており、数多くの調査の対象となっている［Stull, R.A. & Szoka, F.C. Antigene, ribozyme and aptamer nucleic acid drugs: progress and prospects.  Pharmaceutical Res. 12, 465-483 (1995); Uhlmann E. and Peyman, A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chem. Rev. 90, 544-584 (1990)]。より近年になって、これらのより伝統的なアプローチに対する、可能性のある面白い代替アプローチとして、転写後遺伝子サイレンシングまたはRNA干渉（RNAi）が登場してきた［Elbashir, S.M, Lendeckel, W. & Tuschl, T.  RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs.  Genes Dev. 15, 188-200 (2001); Caplen, N.J. et al. Specific inhibition of gene expression by small dsRNAs in invertebrate and vertebrate systems.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747 (2001); Nishikura, K. A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst.  Cell 107, 415-418 (2001); Tuschl, T. Expanding small RNA interference.  Nature Biotechnol. 20, 446-448 (2002); Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals.  Nature Rev. 5, 355-365 (2004); Nykanen A., Haley, B. & Zamore, P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.  Cell 107, 309-321 (2001)]。酵母から哺乳動物までの生きている生物において遺伝子をサイレンシングするためのこの方法の有用性を説明する報告が、数多く存在する［Yu, J.Y., S.L. DeRuiter, and D.L. Turner, RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 6047 (2002); Donze, O. and D. Picard, RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 30, e46 (2002); Sui, G., C. Soohoo, B. Affar el, et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515 (2002); Paddison, P.J., A.A. Caudy, E. Bernstein, et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948 (2002)]。
【０００３】
インビボにおけるsiRNAの有用性および、その他のオリゴヌクレオチドベースの療法と同様に薬物療法における可能性のあるその用途は、いくつかの重要なハードル（例えば、オリゴヌクレオチドの送達、細胞取り込み、および生物学的安定性）に直面している。臨床的に有用な分子を生じる化学修飾を開発する必要がある。アンチセンスおよびsiRNAオリゴヌクレオチドを用いた最初の研究は、非修飾天然分子を用いて行われた。しかし、主に3’エキソヌクレアーゼの作用を通じてではあるが同じくエンドヌクレアーゼの攻撃の結果としても、天然オリゴヌクレオチドが比較的迅速な分解を受けることが、すぐに明らかになった。実際、オリゴリボヌクレオチド（RNA）は一般に、DNAと比較してヌクレアーゼ分解をより受けやすい。
【０００４】
アンチセンスおよびsiRNA分子は現在、その安定性およびRNAとのそのハイブリダイゼーション強度を増大するために日常的に修飾されているが、これは、その治療用途のためにこれらの物理的属性がしばしば必要であるためである［Mangos, M.M. & Damha, M.J. Flexible and frozen sugar-modified nucleic acids - modulation of biological activity through furanose ring dynamics in the antisense strand, Curr. Top. Med. Chem. 2, 1145-1169 (2002); Agrawal, S. and Q. Zhao. Mixed backbone oligonucleotides: improvement in oligonucleotide-induced toxicity in vivo. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135 (1998); Crooke, S.T. Molecular mechanisms of action of antisense drugs. Biochim. Biophys. Acta 1489, 31 (1999); Micklefield, J. Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications. Curr. Med. Chem. 8, 1157 (2001); Nielsen, P.E., Antisense peptide nucleic acids. Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 282 (2000); Braasch, D.A., S. Jensen, Y. Liu, et al., RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA. Biochemistry 42, 7967 (2003)]。送達ビヒクルの存在下で、どちらのタイプの分子も細胞膜と架橋でき、かつその後、それらの意図されるRNA標的とハイブリダイズすることができる。RNA三次構造は、アンチセンスオリゴヌクレオチド［Opalinska, J.B., A. Kalota, L.K. Gifford, et al. Oxetane modified, conformationally constrained, antisense oligodeoxyribonucleotides function efficiently as gene silencing molecules. Nucleic Acids Res. 32, 5791 (2004). Scherr, M., J.J. Rossi, G. Sczakiel, et al., RNA accessibility prediction: a theoretical approach is consistent with experimental studies in cell extracts. Nucleic Acids Res. 28, 2455 (2000). Sokol, D.L., X. Zhang, P. Lu, et al., Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11538 (1998)］およびsiRNA［Opalinska, J.B., A. Kalota, L.K. Gifford, et al. Oxetane modified, conformationally constrained, antisense oligodeoxyribonucleotides function efficiently as gene silencing molecules. Nucleic Acids Res. 32, 5791 (2004); Scherr, M., J.J. Rossi, G. Sczakiel, et al., RNA accessibility prediction: a theoretical approach is consistent with experimental studies in cell extracts. Nucleic Acids Res. 28, 2455 (2000); Sokol, D.L., X. Zhang, P. Lu, et al., Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11538 (1998)］がそれらの標的とハイブリダイズするための能力を決定する重要な要素である。非配列特異的結合を発揮することがどちらのタイプの分子にとっても望ましくないことは、言うまでもない。これらの要求全てを満たすのは難しい課題であることが判明した。
【０００５】
非修飾siRNA二重鎖を使用して遺伝子サイレンシングが成功しているが、しかし、生物学的安定性および薬物動態特性を改善するために、鎖の一方または両方の化学修飾が治療用途に必要である可能性が考えられる。siRNA活性に対する効果に関して数多くの化学修飾が試験されているが、これらの修飾のうちいずれが最も有利であるかは未だ明確になっていない。新規類似体の設計においては、mRNA標的の認識および切断を促進するために、伝統的なアンチセンスアプローチとは異なるsiRNAの以下の2つの重要な特徴を認識することが重要である：(i)二重鎖RNAが認識される；および(ii)遺伝子阻害は、RNase HではなくむしろRISC（RNA誘導型サイレンシング複合体）を必要とする［Elbashir, S.M, Lendeckel, W. & Tuschl, T.  RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs.  Genes Dev. 15, 188-200 (2001); Caplen, N.J. et al. Specific inhibition of gene expression by small dsRNAs in invertebrate and vertebrate systems.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747 (2001); Nishikura, K. A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst.  Cell 107, 415-418 (2001); Tuschl, T. Expanding small RNA interference.  Nature Biotechnol. 20, 446-448 (2002); Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals.  Nature Rev. 5, 355-365 (2004)]。このように、RNA様オリゴヌクレオチドは、活性のために必要である全体的なA型へリックス構造を乱すことなく糖または骨格修飾を導入するための第一の候補である。有望な修飾はロックト核酸（Locked Nucleic Acid；LNA）であり、siRNA活性を有意に損なうことのない比較的少ない修飾によって重要な恩典が達成される（例えば、熱安定性および生物学的安定性の改善、ならびにオフターゲット（off target）作用の低減）［Elmen, J. et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucl. Acids Res. 33, 439-447 (2005)]。しかし、そのような化合物の活性および特異性は、LNA修飾の部位および程度に高度に依存することが認められた。アンチセンス鎖の5’末端における単一のLNA置換によって、活性が消失した。さらに、アンチセンス鎖を修飾すると活性が有意に損なわれたが、一方で、センス鎖LNA修飾は、非修飾siRNAと等しいまたはそれより低い活性を示す、軽度に修飾されたオリゴヌクレオチドによってのみ耐性を示した。修飾の程度の増加に伴って、毒性（ホスホロチオエート-RNA）および損なわれた活性（2’F-RNA、ボラノホスフェート-RNA）を含むその他の化学的性質の限界が存在するようである［Amarzguioui, M. et al. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA, Nucl. Acids. Res. 31, 589-595 (2003)]。これは基本的に、特定のオリゴヌクレオチドの化学的性質によって与えられるヌクレアーゼ安定性および/または特異性によって相殺されると考えられるが、有効なsiRNAの化学的性質の予測は、継続的研究の活発な焦点のままであり続けている。
【０００６】
ヌクレアーゼ安定性および/または遺伝子発現阻害能力を有する、化学修飾siRNAが必要である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明のある広範な局面によると、二本鎖の二重鎖を含む、配列特異的な様式で標的遺伝子の発現を調節するための低分子干渉RNA（siRNA）が提供され、該siRNAの少なくとも1つのリボ核酸ヌクレオチドがアラビノース修飾ヌクレオチドで置換されている。アラビノース修飾ヌクレオチドは2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）である。
【０００８】
好ましくは、siRNAは15〜30ヌクレオチド長であり、3’末端および5’末端において1〜3ヌクレオチドの突出部を有する。
【０００９】
特定の態様において、二重鎖は、例えば以下などのように、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいて任意の位置に任意の数のアラビノヌクレオチドを有し得る。
2009513112.tif 000003
ここで、Aはアラビノヌクレオチド、Rはリボヌクレオチドである。
【００１０】
本発明のその他の態様において、センス鎖は完全にアラビノヌクレオチドで置換されている。例えば
2009513112.tif 000004
であり、アンチセンス鎖は、例えば以下などの、完全なRNA鎖または部分的に置換されたRNA鎖である。
2009513112.tif 000005
【００１１】
本発明のその他の態様において、アラビノヌクレオチドは、フッ素基、ヒドロキシル基、アミノ基、アジド基、アルキル基、アルコキシ基、およびアルコキシアルキル基からなる群より選択される2’置換基を有する。本発明のさらなる態様において、アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ならびに、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、およびブチルアミノ基などの官能基化アルキル基からなる群より選択される。態様において、アルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロプロキシ（proproxy）基、および、-O(CH2)q-R基（式中、q＝2〜4であり、-Rは-NH2基、-OCH3基、または-OCH2CH3基である）などの官能基化アルコキシ基からなる群より選択される。態様において、アルコキシアルキル基は、メトキシエチルおよびエトキシエチルからなる群より選択される。態様において、2’置換基はフッ素であり、アラビノヌクレオチドは2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）である。好ましくは、FANAヌクレオチドはaraF-G、araF-T、araF-U、araF-A、araF-5-メチル-Cである。
【００１２】
本発明の一部の態様によると、siRNAは、ルシフェラーゼ発現、CCR3発現、またはPDE4D発現のいずれか一つを低下させることを目的とする。
【００１３】
本発明の別の態様によると、siRNAは、RSウイルス複製を低下させることを目的とする。
【００１４】
本発明のその他の態様において、二重鎖は、以下からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド間結合を含む：
(a) ホスホジエステル；
(b) ホスホトリエステル；
(c) ホスホロチオエート；
(d) メチルホスホネート；
(e) ボラノホスフェート；および
(f) (a)〜(e)の任意の組み合わせ。
【００１５】
本発明の別の広範な局面によると、siRNAのヌクレオチドの少なくとも1つをアラビノース修飾ヌクレオチドで、好ましくは2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）で置換する工程を含む、siRNAのヌクレアーゼ安定性および標的遺伝子活性の調節の少なくとも一方を増大させるための方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の広範な局面によると、薬学的に許容される担体とともに本発明のsiRNAを含む、薬学的組成物が提供される。
【００１７】
本発明の別の広範な局面によると、標的遺伝子、好ましくはCCR3およびPDE4Dの一方の発現を調節するための医薬の製造のための本発明のsiRNAの使用が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、RSウイルス複製を低下させるための医薬の製造のための本発明のsiRNAの使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の広範な局面によると、それを必要とする患者における遺伝子発現を調節する方法が提供される。本方法は、本発明の薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む。好ましくは、薬学的組成物は、CCR3発現の低下、PDE4D発現の低下、およびRSウイルス複製の低下のいずれか一つのためのsiRNAを含む。
【００２０】
本発明の別の広範な局面によると、市販用パッケージが提供される。市販用パッケージには、遺伝子発現を調節するためのその使用に関する説明書とともに、本発明の薬学的組成物が含まれる。好ましくは、薬学的組成物は、CCR3発現の低下、PDE4D発現の低下、およびRSウイルス複製の低下のいずれか一つのためのsiRNAを含む。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、mRNAを標的としかつRNAi機構を通してmRNA分解を促進するように設計された、修飾オリゴヌクレオチド二重鎖に関する。特に、修飾アラビノヌクレオチド（FANA）を含む低分子干渉RNA二重鎖を用いた、ルシフェラーゼ活性、ラットCCR3発現、およびRSVウイルス複製の選択的阻害を示す。本明細書に記載のRNAiの方法は、天然単位（すなわちDNA、RNA、2’-OMe-RNA、2’F-RNAヌクレオチド）由来の修飾ヌクレオチドの使用に的を絞った上述の一般的方法［Allerson, C.R. et al. Fully 2’-modified oligonucleotide duplexes with improved in vitro potency and stability compared to unmodified small interfering RNA. J. Med. Chem. 48, 901-904 (2005)］とは対照的である。
【００２２】
本発明は、ヒト細胞系において遺伝子発現を阻害する一連の糖修飾二重鎖の特徴決定を包含する。これらの低分子干渉二重鎖には、体液中に存在するヌクレアーゼに対する改善された安定性などの改善された特徴を該二重鎖に付与するアラビノース修飾ヌクレオチドが含まれる。好ましくは、糖修飾ヌクレオチドは2’-デオキシ-2’-フルオロアラビノヌクレオチド（FANA）である。FANA修飾二重鎖を作製するための方法は、RNAヌクレオチドとFANA残基との置換を必要とする。
【００２３】
修飾siRNAの活性は、ルシフェラーゼを過剰発現するよう操作された改変HeLa細胞系を用いて評価された。ルシフェラーゼmRNA発現レベルおよびルシフェラーゼ活性レベルは、それぞれリアルタイムPCRおよびルシフェラーゼ分析技術を用いて決定した。実際のsiRNA塩基配列の設計および選択は、Mittalら［Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals.  Nature Rev. 5, 355-365 (2004)］にしたがって、AmbionおよびQiagenアルゴリズムならびにNCBI Blast検索を用いて行った。少なくとも3つのsiRNA二重鎖候補を選択し、上述のように試験した。最も活性の高いsiRNA二重鎖が同定されたら（EC50が約0.5 nM）、予備実験を実施し、アラビノース修飾がsiRNA活性に与える影響を評価した。そのようなFANA修飾二重鎖のルシフェラーゼ活性の選択的、特異的かつ効果的な阻害を示す（図1）。siRNA二重鎖における一方のRNA鎖（センス鎖）がFANA鎖で完全に置換されていることによって、mRNA標的の選択的、特異的かつ効果的なダウンレギュレーションを同様に与えるFANA：RNAハイブリッドが作製される（図1A）。
【００２４】
本明細書に開示された化合物は、RNAi機構を通して選択的に遺伝子発現を阻害することができる、FANA修飾二重鎖の第一の例（FANA修飾siRNAおよびFANA：RNAハイブリッド）に相当する。
【００２５】
具体的には、本発明は、siRNA二重鎖の活性に対して適合性のあるFANAヌクレオチドを提供する。さらに、FANAセンス鎖全体が相補的な非修飾RNAアンチセンス鎖に結合でき、それによって、RNAi経路に入って選択的かつ効果的にmRNAを標的としてその分解を促進する二重鎖が作製されることが示されている（図1Aおよび2A）。これらの修飾二重鎖は、（固相化学法によって）成分である鎖を合成すること、および、その後それらをアニーリングさせて二重鎖を形成することによって得られる。予想外なことに、センス鎖の部分的または完全な修飾を伴う全ての場合において、遺伝子サイレンシング活性は、非修飾未変性siRNA二重鎖を用いて観察される場合と同様である（図1Aおよび2A）。FANA修飾二重鎖による処置は、濃度依存的な様式でルシフェラーゼ活性の低下をもたらし、推定EC50は0.06〜3.6 nMの範囲であった。センス修飾二重鎖について観察された作用強度は未変性siRNAのそれに匹敵し（図2A〜2C）、本システムにおいて推定EC50は0.20 nMであった（表1）。
【００２６】
本発明はまた、活性に影響することなくダングリング（dangling）dN末端残基（3’末端または5’末端）がFANAで置換されたアンチセンス鎖に非修飾センス鎖がアニーリングした、RNA二重鎖を提供する（表1Bおよび2B）。驚いたことに、2つの3’-デオキシヌクレオチドをFANA残基で置換することによって、非修飾siRNAよりも作用強度が増大するが、これは、対応する変化によって活性の有意な低下または完全な消失がもたらされる、LNA修飾を有するsiRNAとは著しく対照的である［Elmen, J. et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucl. Acids Res. 33, 439-447 (2005)]。
【００２７】
本発明はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が修飾残基を含む一方でRNAi活性を維持しているRNA二重鎖も提供する（図1C）。2本の鎖の一方にFANAを含むRNA二重鎖と同様に、これらの二重鎖は、非修飾siRNAの作用強度と等しいまたはそれを上回る作用強度で特異的標的分解を示した（図2C）。
【００２８】
非修飾siRNAと同様、トランスフェクション後最大4日間、アラビノース修飾二重鎖を細胞にトランスフェクションした場合に、ルシフェラーゼ活性の阻害の持続が認められた（図3）。しかし、この時点で、修飾siRNAが非修飾siRNAよりも大きな阻害活性を有することが見出された。
【００２９】
本明細書において、FANA含有siRNA二重鎖のヌクレアーゼ安定性は非修飾siRNA二重鎖よりも改善されるという証拠が提示されている（図4）。非修飾siRNAは15分間以内に完全に分解されるが、完全に修飾されたセンス鎖と3’末端突出部が修飾されたアンチセンス鎖とを含むsiRNA二重鎖は5時間後にも容易に検出可能である。したがって、単独のまたはリボヌクレオチド（RNA）ユニットと組み合わせた2’-デオキシ-2’-フルオロ-b-D-アラビノ-(オリゴヌクレオチド)は、相補的（アンチセンス）RNA鎖とハイブリダイズして、作用強度が改善されヌクレアーゼ耐性が増大したsiRNA二重鎖を作製することができる。これらの化合物のインビボ投与を意図する際に、これらの特性は大いに望ましい。
【００３０】
「治療的有効量」とは、必要な投与量および期間において所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。本発明の修飾核酸の治療的有効量は、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに、修飾核酸が個体において所望の応答を誘発する能力などの要素によって変動しうる。投与レジメンは、最適な治療的応答を提供するように調整されうる。また、治療的有効量とは、治療的に有利な効果により化合物の任意の毒性作用または有害作用を補って余りある量でもある。任意の特定の対象について、個体の需要、および組成物の投与を行うまたは投与を管理する者の専門的判断によって、具体的な投与レジメンが経時的に調整されうる。
【００３１】
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」には、生理学的に適合できる、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。ある態様において、担体は非経口投与に適している。あるいは、担体は静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、舌下投与、または経口投与に適していてもよい。薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散体、ならびに滅菌注射液または分散体の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を用いることは、当技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるその使用が意図される。追加の活性化合物を本組成物に組み入れることもできる。
【００３２】
治療的組成物は典型的に、製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本組成物は、高い薬物濃度に適した、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、またはその他の規則正しい構造として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合液を含む溶媒または分散媒体であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散体の場合は必要な粒度を維持することによって、および、界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、注射用組成物の持続的吸収を引き起こすことができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド二重鎖を、時間放出製剤中に、例えば遅延放出ポリマーを含む組成物中に投与することができる。修飾オリゴヌクレオチドを、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤などの迅速な放出に対して修飾オリゴヌクレオチド二重鎖を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ酪酸ポリグリコール酸コポリマー（PLG）などの生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製に関する多くの方法が特許出願されており、または一般的に当業者に公知である。
【００３３】
必要に応じて上記で列挙された成分の1つまたは組み合わせと共に、本発明のオリゴヌクレオチド二重鎖などの活性化合物の必要量を適切な溶媒中に組み込み、その後ろ過滅菌を行うことによって、滅菌注射液を調製することができる。一般に、基礎分散媒体および上記で列挙されたもの由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって、分散体が調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、先に濾過滅菌したその溶液から活性成分および任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。本発明の代替的局面によると、本発明のオリゴヌクレオチド二重鎖は、その溶解度を増大させる1つまたは複数の追加の化合物と共に製剤化されうる。
【００３４】
本明細書において本発明の様々な態様を開示しているが、当業者の共通した一般的知識に従い、本発明の範囲内で多くの適合化および改変が行われうる。実質的に同じ方法で同じ結果を達成するために、本発明の任意の局面に関して、そのような改変には公知の同等物の置換が含まれる。数値範囲は、範囲を定義している数値を含む。添付の特許請求の範囲において、「含む」という用語はオープンエンドな用語として用いられており、「含むが、それに限定されるわけではない」という語句と実質的に同等である。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の様々な局面の例示であるが、本明細書に開示された本発明の広範な局面を制限するものではない。
【００３６】
実施例1：siRNA二重鎖およびアラビノース修飾二重鎖の化学合成
本調査において調製したオリゴマーの配列および組成を表1に示す。オリゴリボヌクレオチド、FANA修飾オリゴリボヌクレオチド、および全FANAオリゴヌクレオチドの合成は、公知のプロトコールに従い標準的なβ-シアノエチルホスホアミダイト化学を用いて、Applied Biosystems（ABI）合成器上で、1μmolスケールで行った［E. Viazovkina, M.M. Mangos, M.I. Elzagheid, and M.J. Damha (2002) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Unit 4.15); M.J. Damha and K.K. Ogilvie (1993) Oligoribonucleotide synthesis - the silyl-phosphoramidite method in “Protocols for Oligonucleotide and Analogs: Synthesis and Properties” S. Agrawal (ed.), Methods in Molecular Biology pp.81-114, The Humana Press Inc., Totowa, New Jersey]。FANA修飾オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを、脱保護し、精製し、全く同様に管理した。アニオン交換HPLCまたはゲル電気泳動によって全てのオリゴヌクレオチドを精製し、Sephadex G-25ビーズを用いるサイズ排除クロマトグラフィーを介して脱塩した。センス鎖と対応するアンチセンス鎖とを（化学量論比1:1）混合し、試料を凍結乾燥し、20μM溶液を作製するのに十分な再懸濁/アニーリング緩衝液を加えることによって、二重鎖の保存液を調製した。siRNA再懸濁/アニーリング緩衝液の組成は、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES-KOH、2mM酢酸マグネシウム、pH7.4である。
【００３７】
実施例2：FANA含有siRNAの有効性
本実施例は、HeLa X1/5細胞における、標的mRNAの特異的ノックダウンおよびルシフェラーゼ活性の低減についてのFANA含有siRNAの有効性に関する。HeLa X1/5細胞系は、ECACC（ECACC No. 95051229）より得られ、10%ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン、1%非必須アミノ酸、1%ビタミン、500μg/ml G418および300μg/mlハイグロマイシンを添加したEMEM培地（Invitrogen, Burlington ON）で維持された。トランスフェクション用に、トランスフェクションの24時間前に1.0×105個/ウェルの細胞を24ウェルプレート上に播種した。トランスフェクション当日、製造業者の推奨に従い、Lipofectamine 2000（Invitrogen, Burlington ON）をsiRNA：Lipofectamine 2000＝1：2の比率で用いて、細胞を0.21μgのsiRNAでトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収した。siRNAトランスフェクションに起因する細胞毒性の指標としての細胞の代謝活性を、製造業者の推奨に従いalamar Blue（商標）蛍光定量アッセイ法（Medicorp, Montreal QC）を用いて評価した。
【００３８】
製造業者のプロトコールに従いルシフェラーゼアッセイシステム（BD Bioscience, Mississauga, ON）を用いて、ルシフェラーゼ活性分析を実施した。手短にいうと、siRNAへの曝露後に細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Invitrogen, Burlington, ON）で洗浄し、溶解させた。細胞溶解物を遠心分離して細胞片を除去し、20μlのアリコートを96ウェルlumitracプレート（Ultident; Greiner Bio-one）に移動させた。ルシフェリン基質溶液を添加したらすぐに、マイクロプレートルミノメーター（Luminoskan Ascent, Thermo LabSystem）を用いて発光を測定した。その後、細胞代謝活性値（alamar Blue(商標)）に対して発光値を標準化し、トランスフェクションに起因する毒性を補償した。
【００３９】
リアルタイムPCR分析用に、製造業者のプロトコールに従いRNeasy mini kit（Qiagen, Mississauga, ON）を使用して、総RNAを抽出した。SuperScript(商標)II Reverse Transcriptaseおよびランダムプライマー（Invitrogen, Burlington, ON）を用いて、1μgの総RNAからcDNAを調製した。以前に最適化された条件およびLightCycler（Roche, Laval, QC）を使用し、ルシフェラーゼ遺伝子（LUC5013 F1: 5’-acgctgggcgttaatcagag-3’；LUC5013 R1: 5’-gtcgaagatgttggggtgttg-3’；TIB MOLBIOL）およびハウスキーピング遺伝子GAPDH（huGAPD for: 5’-ggtggtctcctctgacttc-3’；huGAPD rev: 5’-ctcttcctcttgtgctcttg-3’；TIB MOLBIOL）に対する遺伝子特異的なプライマーおよびプローブを用いて、定量的リアルタイムPCRを実施した。
【００４０】
siRNAに組み込まれた場合にFANAが十分な耐性を示すことが、図1に示した結果によって示されている。実際に、非修飾siRNAと比較した場合に、全FANA修飾センス鎖を有するsiRNA（F3/O）はその活性（mRNAおよびルシフェラーゼ活性）を保持していた（図1A）。また、アンチセンス鎖に導入された場合にFANA修飾が十分な耐性を示すことも、本発明者らのデータによって示されている。2つの3’突出デオキシヌクレオチドを2つのFANA残基で置換したこと（O/F4およびF3/F4）によって、非修飾siRNA二重鎖（55%）と比較した場合に、二重鎖の阻害活性の増大（65%）が得られた（図1Bおよび1C）。これらの結果は、化学修飾が、修飾の種類に応じて一方の端においてしか十分な耐性を示さないことが示された公開データとは対照的である。しかし、アンチセンス鎖の5’末端および中央部をまとめて包含する6個のFANAの導入によって、センス鎖に導入された修飾にかかわらず、siRNA二重鎖の活性が消失した（図1Bおよび1C）。siRNAのアンチセンス鎖の中央部はRNAi細胞機構との二重鎖相互作用に重要であり、かつ化学修飾に対して大変感受性が高いことが知られている。したがって、好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖両方における修飾が、上述したパラメータの範囲に含まれる（図1C）。
【００４１】
実施例3：FANA含有siRNAの作用強度
本実施例は、HeLa X1/5細胞におけるルシフェラーゼ活性の特異的ノックダウンについてのFANA含有siRNAの作用強度に関する。総量0.21μgのsiRNAを用いて用量応答調査を実施し、それによって、有効なsiRNAを対照siRNAで段階希釈し、活性オリゴヌクレオチドの有効量を減少させる一方で、siRNAの最終量を一定に維持した。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４２】
アンチセンス鎖の3’突出部の2つのデオキシヌクレオチドがFANAで置換され、かつ非修飾（O/F4）または完全修飾（F3/F4）センス鎖を有するsiRNAが、濃度依存的様式でルシフェラーゼ活性を阻害し、対応する非修飾siRNAよりも増大した作用強度を有することが、結果により示されている（図2Bおよび2C）。推定EC50値を表1に示す。
【００４３】
実施例4：FANA含有siRNAの作用の持続
本実施例は、FANA含有siRNAが阻害活性を最大96時間維持したことを示す。様々な修飾siRNAおよび非修飾siRNAに対する曝露の後に、ルシフェラーゼ活性を様々な時点で測定した（図3）。FANA残基含有siRNAは最大4日間活性を延長したことが、結果により示されている。さらに、FANA含有siRNAは、非修飾siRNAと比較した場合に96時間の時点において、増大した阻害活性を有することが、データによって実証されている（それぞれ65%対45%のルシフェラーゼ活性阻害）。
【００４４】
実施例5：FANA含有siRNAの安定性の増大
本実施例は、ウシ胎仔血清の存在下でのsiRNA二重鎖の安定性に関する。実験の結果を図4に示す。siRNAを、10%ウシ胎仔血清を含むDMEMで希釈し、37℃でインキュベーションした。0.25時間、0.5時間、0.45時間、1時間、2時間、6時間、および24時間後に12μlのアリコートを採取し、50% Ficollを含む1.5×TBEローディングバッファー36μl中で凍結させ、分析まで維持した。非変性条件下、20%ポリアクリルアミドゲル上で試料を分離し、SYBR gold（Invitrogen, Burlington, ON）で染色した。完全なsiRNAに相当するバンドを、デンシトメトリー分析によって定量した。
【００４５】
センス鎖へのFANAの導入によって血清媒介性siRNA分解に対する有意な耐性が与えられることが、結果により示されている。FANAの導入によって、siRNAの血清耐性が有意に増強される。代表的なゲルを図4Aに示す。配列にかかわらず、全ての非修飾型のsiRNA（O/O）の半減期が15分を下回る（図4B、4C、および4D）。アンチセンス鎖において2つの3’突出デオキシヌクレオチドを2つのFANAで置換すること（O/F4）は、siRNA二重鎖の血清安定性特性への影響を与えなかった（図4B、4C、および4D）。しかし、全FANA修飾センス鎖を有すること（F3/O）は、最大4時間のsiRNA二重鎖半減期として、血清媒介性分解に対する有意な耐性を付与したことが観察された（図4B）。最後に、約5時間のsiRNA半減期が測定されたので、センス鎖およびアンチセンス鎖両方のFANA修飾（F3/F4）はヌクレアーゼに対するずっと大きな耐性をもたらした（図4Bおよび4C）。
【００４６】
実施例6：CCR3 mRNA発現レベルの阻害におけるFANA含有siRNAの有効性
本実施例は、NIH-3T3細胞中での、CCR3 mRNAの発現レベルの特異的ノックダウンにおけるFANA含有siRNAの有効性に関する。NIH-3T3細胞系はATCC（ATCC CRL-1658）から得られ、10%仔ウシ血清（calf bovine serum）、4mM L-グルタミン、3.7g/L炭酸水素ナトリウム、4.5g/lグルコース、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM培地（Invitrogen, Burlington, ON）中で維持される。トランスフェクションの1日前に1.0×105個/ウェルの細胞を24ウェルプレート上に播種した。製造業者の推奨に従い、Lipofectamine 2000（Invitrogen, Burlington, ON）をDNA/siRNA：Lipofectamine 2000＝1：2の比率で用いて、ラットCCR3遺伝子を発現するプラスミド0.2μg、ルシフェラーゼ（参照遺伝子）を発現するプラスミド0.2μg、およびsiRNA 0.01μg、0.1μg、または0.2μgで、細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収した。Quantigene法（Panomics, Fremont, CA）を用いて、CCR3およびルシフェラーゼの発現レベルを定量した。その後、ルシフェラーゼに関して測定されたレベルに対してCCR3発現レベルを標準化した。
【００４７】
FANA残基のsiRNAへの導入によって、ラットCCR3 mRNAを標的とするsiRNAの阻害活性の用量依存的増大がもたらされたことを、図5に示された結果は示している。実際、アンチセンス鎖における2つの3’突出デオキシヌクレオチドを2つのFANAで置換したこと（O/F4）によって、二重鎖の阻害活性の増大がもたらされた（非修飾CCR3 siRNA（35%）と比較した場合に、最大49%）（図5）。さらに、非修飾siRNAと比較した場合に、全FANA修飾センス鎖を有するCCR3 siRNA（F3/O）はより活性であった（CCR3 mRNAレベルの75%阻害）（図5）。最後に、siRNA二重鎖の両鎖の修飾は十分な耐性を示し、阻害活性は75%に達した。これらのデータは、FANAが (1) siRNA二重鎖に導入された場合に十分な耐性を示し、かつ (2) siRNA二重鎖の阻害活性を増強する、という知見を支持するものである。
【００４８】
実施例7：ウイルス複製の阻害におけるFANA含有siRNAの有効性の増大
本実施例は、A549細胞におけるRSウイルス（RSV）の複製を阻害するためのFANA残基含有siRNA二重鎖の有効性に関する。A549細胞系（ATCC, # CCL-185）は、10%非不活性化（non-inactivated）FBS（HyClone）を添加したHam F12培地（HyClone, Logan, UT）中で維持した。トランスフェクションの1日前に1.0×105細胞を24ウェルプレートの個々のウェル中に播種した。トランスフェクション当日に、製造業者の推奨に従って、siRNA対トランスフェクション試薬（Lipofectamine 2000（Invitrogen, Burlington, ON)）＝1：3の比率で、0.05μg、0.2μg、または0.4μgのsiRNAで細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に、感染多重度（MOI）＝1で細胞をRSVに感染させ、ウイルス感染を1日間続けた。ウイルスへの曝露から24時間後に、細胞上清を回収し、RSVタンパク質を検出するためのELISA法を用いてRSVレベルを評価した。
【００４９】
アンチセンス鎖の3’突出部の2つのデオキシヌクレオチドがFANAで置換されセンス鎖が非修飾のままであるsiRNA二重鎖（O/F4）は、濃度依存的様式でRSV複製を阻害し、低用量において非修飾siRNAと比較して増大した阻害活性を有することが、結果により示されている（図6）。これらの結果は、FANAがsiRNAの阻害活性を増大させるという知見を支持するものである。
【００５０】
引用された全ての参考文献は、本明細書において参照により本明細書に組み入れられる。本発明の好ましい態様を本明細書において記載したが、本発明の趣旨や添付の特許請求の範囲の範疇から逸脱することなくこれらを変更できることを、当業者は認識するであろう。
【００５１】
（表１）本調査において合成されたオリゴヌクレオチドおよび二重鎖
2009513112.tif 000006
2009513112.tif 000007
a大文字＝RNA；小文字＝DNA；太大文字＝FANA
例えば、O/Oは非修飾siRNAを表し、O/F1は、非修飾センス鎖およびアンチセンス鎖中のF1修飾を含むsiRNAを表す。n.d.＝測定せず。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
ここで本発明を、添付の図面を考慮してさらに詳細に説明する。
【図１】HeLa X1/5細胞中でのルシフェラーゼの阻害における、様々なsiRNAの有効性を示す。センス鎖のみ（A）、アンチセンス鎖のみ（B）、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方（C）に修飾を有するsiRNA 0.21μgで、細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼ活性レベルを測定し、代謝活性に対して標準化した。次に、標準化したルシフェラーゼ活性を、100%に設定した対照siRNAと比較して、ルシフェラーゼ活性のパーセンテージとして決定した。データは、標準化ルシフェラーゼ活性平均値 +/- SEMを表す。トランスフェクションの24時間後に、リアルタイムPCR分析によってルシフェラーゼmRNAレベルを（ハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現に対して）定量した。バーは、ルシフェラーゼ/GAPDH比の平均値 +/- SEMを示す。
【図２】ルシフェラーゼ活性の阻害におけるFANA含有siRNAの作用強度を示す。様々な量の活性siRNAによる24時間の細胞のトランスフェクションによって、各siRNAに関して用量応答が得られた。センス鎖のみ（A）、アンチセンス鎖のみ（B）、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方（C）に修飾を有するsiRNAに関する用量応答を示す。ルシフェラーゼ活性を測定し、値を代謝活性に対して標準化して、100%に設定した対照siRNAと比較した。データは、標準化ルシフェラーゼ活性平均値 +/- SEMを表す。
【図３】HeLa X1/5細胞における、ルシフェラーゼmRNAを標的とする様々なsiRNAの経時的な有効性を示す。細胞を0.21μgのsiRNAでトランスフェクションした。トランスフェクションの4、8、24、48、72、および96時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。データは、100%に設定した対照siRNAと比較した、標準化ルシフェラーゼ活性平均値 +/- SEMを表す。
【図４】FANA含有siRNAの血清安定性を示す。様々なsiRNAを10%ウシ胎仔血清中で37℃でインキュベーションし、示された時点においてアリコートを採取した。PAGEによってsiRNAを分離し、SYBR goldを用いて可視化した。デンシトメトリーによってバンドを定量し、100%に設定した当初量からの、完全なsiRNAのパーセンテージを求めた。(A) ルシフェラーゼを標的とするsiRNAの血清安定性を示す。「ds」は二本鎖siRNAマーカーを示し、「ss」は一本鎖siRNAマーカーを表す。(B) グラフは、ルシフェラーゼを標的とする様々なsiRNAの血清安定性を表す。(C) グラフは、CCR3を標的とする様々なsiRNAの血清安定性を表す。(D) グラフは、PDE4Dを標的とする様々なsiRNAの血清安定性を表す。データは、2〜3回の独立した実験からの平均値±SEMを表す。
【図５】NIH-3T3細胞中でのラットCCR3発現の阻害におけるFANA含有siRNAの有効性を示す。ラットCCR3を標的とする増大量のsiRNAを、ラットCCR3遺伝子を発現するプラスミドと共に、NIH-3T3細胞中に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に、Quantigene（Panomics）法を用いてCCR3 mRNA発現レベルを測定し、参照遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現レベルに対して標準化した。100%に設定した対照siRNAと比較したパーセンテージ阻害としてsiRNAの活性を測定した。データは平均値 +/- SEMを表す（n＝6）。
【図６】A549細胞中でのRSV産生に対するRSVウイルスPタンパク質を標的とするFANA含有siRNAの有効性を示す。A549細胞を培養し、24ウェルプレート中に0.1×105細胞/ウェルで播種して、37℃、5%CO2で一晩培養した。翌日、Lipofectamine2000トランスフェクション試薬をsiRNA：Lipofectamine 2000＝1：3の比率で用いて、0.05μg、0.2μg、または0.4μgのsiRSV-P2（RSVウイルスPタンパク質に対するsiRNA）、siRSV-P2-Mi（RSVウイルスPタンパク質に対するsiRNAミスマッチ）、siRSV-P2-O/F4、および陰性対照のsiRNA-P2-Mi-O/F4で、細胞培養物をトランスフェクションした。各トランスフェクション実験を三つ組で実施した。トランスフェクションの1日後、細胞をM.O.I.＝1でhRSVに感染させ、37℃、5%CO2で一晩インキュベーションした。感染の24時間後に上清を回収し、ELISAを用いて、RSVタンパク質の定量によりウイルスレベルを評価した。データは、そのそれぞれのミスマッチsiRNAによるRSV阻害のレベルに対する、siRNAによる%RSV阻害として表す。
【図１Ａ】
2009513112.tif 000009
【図１Ｂ】
2009513112.tif 000010
【図１Ｃ】
2009513112.tif 000011
【図２Ａ】
2009513112.tif 000012
【図２Ｂ】
2009513112.tif 000013
【図２Ｃ】
2009513112.tif 000014
【図３】
2009513112.tif 000015
【図４Ａ】
2009513112.tif 000016
【図４Ｂ】
2009513112.tif 000017
【図４Ｃ】
2009513112.tif 000018
【図４Ｄ】
2009513112.tif 000019
【図５】
2009513112.tif 000020
【図６】
2009513112.tif 000021
【配列表】
2009513112000001.app
【国際調査報告】
2009513112.tif 000022
2009513112.tif 000023
2009513112.tif 000024
2009513112.tif 000025
2009513112.tif 000026
2009513112.tif 000027