(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質を細胞内に容易に伝達できるヒト由来細胞膜透過伝達ペプチドとこれをコードする核酸を含む組換えベクターなどに関する。さらに詳しくは、ヒト由来Ｇタンパク質アルファ１２タンパク質のアミノ酸配列中の特定部位のアミノ酸１１個を含む配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する細胞膜透過伝達ペプチドとこれをコードする核酸を含む組換えベクター、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体等に関するものである。本発明の細胞膜透過伝達ペプチドは細胞内に効率的に伝達され得るので、タンパク質、核酸、薬物などを含む様々な物質を細胞内に伝達するのに有用に使用できる。
2009545312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する細胞膜透過伝達ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞膜透過伝達ペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
上記核酸は、配列番号２に記載される塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項５】
上記ベクター内に標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の組換えベクターの導入によって形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターの導入によって形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項５に記載の形質転換体を培地で培養するか、または上記形質転換体を動物に導入した後、生体内で培養することによって、請求項１に記載の細胞膜透過伝達ペプチドと融合された標的タンパク質を発現する方法。
【請求項９】
標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入された請求項５に記載の組換えベクターを、細胞を含む培養培地または生体内に処理することによって、標的タンパク質を細胞内に導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過伝達ペプチド（transmembrane delivery peptide；以下、‘ＴＤＰ’と略称する）に関する。さらに詳しくは、タンパク質、核酸、薬物などのような生体機能性物質の細胞内伝達に有用に使用できる、ヒトＧタンパク質（guanine nucleotide-binding protein）から由来した細胞膜透過伝達ペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＴＤ（protein transduction domain）と呼ばれるタンパク質伝達ドメインは、１９９０年代初期に、タンパク質の一部が生きている細胞で細胞膜を透過することによって細胞内に入ることができることが明らかになり、タンパク質の細胞内の作用機作の研究やタンパク質を臨床治療剤に応用するための効果的な技術に対する研究に用いることができると知られている（非特許文献１）。特に、このようなタンパク質伝達ドメインは、タンパク質のような巨大分子のほかにも核酸やリポソームなどの物質を細胞内に伝達することも可能である（非特許文献２、３）。
【０００３】
現在まで知らされた幾つかのタンパク質伝達ドメインとしては、ＨＩＶ−１由来ＴＡＴタンパク質の塩基性ドメイン由来ペプチド（ＴＡＴ）、ショウジョウバエ（Drosophila）由来アンテナペディア（Antennapedia）のホメオドメイン（Ａｎｔｐ）、ＨＳＶ由来転写因子（ＶＰ２２）と合成リシン／アルギニンペプチドなどがある（非特許文献４）。この中で、最も多く研究が進められたＴＡTペプチドは、ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列中４７番から５７番までの全１１個の塩基性アミノ酸ドメインからなっており（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号７）、上記ＴＡＴペプチドだけでも細胞膜を単独であるいは他のタンパク質と融合状態で伝達され得ることが明らかになった（非特許文献５）。 また、ＴＡＴ−ＰＴＤは、分子量１０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの大きさに関係なく様々なタンパク質を細胞内に伝達しうる（非特許文献６、７）。しかし、ＴＡＴ−ＰＴＤと融合されたタンパク質は、実際、真核細胞内に伝達できるだけでなく、細胞内でそれぞれのタンパク質本来の生物学的機能を有し、細胞内で機能するものと確認されており、マウスなどの動物モデルを用いた実験でも同じ結果が報告された（非特許文献８、９）。
【０００４】
タンパク質伝達ドメインによる細胞内にタンパク質を伝達することは、既に知らされたレセプター、トランスポータあるいはエンドソームを通した方法とは関係なく、行われる独立的なメカニズムであり、アルギニンあるいはリシンのようなアミノ酸による特定の構造モチーフやその配列がこのようなタンパク質伝達ドメインの伝達能力に影響があるものと推測されている（非特許文献１０）。また、正電荷を有するアミノ酸の中で、ヒスチジン、リシンなどとは対照的に、アルギニンのオリゴマーだけが效果的に細胞内に伝達される能力があることが分かり、アミノ酸が有している電荷だけが細胞内伝達能力に影響を与えるものではないことが知られている（非特許文献１１）。ＨＩＶ−１由来ＴＡＴ−ＰＴＤによる細胞内伝達の場合、α−ヘリックスのようなアミノ酸の第２次構造モチーフが重要な役割をしており、実際に、このようなα−ヘリックス構造はタンパク質伝達効率を極大化させると報告されている（非特許文献１０）。
【０００５】
このように、細胞内で機能する標的タンパク質を細胞または組織内に伝達させるタンパク質伝達ペプチドは、タンパク質、核酸あるいは薬物を伝達するための非常に効率的な方法であり、最初に発見されたＴＡＴ−ＰＴＤ以外にも、様々なタンパク質伝達ドメインが発見または合成されてきた。しかし、従来知られていたタンパク質伝達ドメインは、いずれもウイルスなどに由来するか、または合成されたペプチドであり、実際、人体内に適用時には、免疫反応などの問題が発生する虞がある。従って、今まで知らされたタンパク質伝達ドメインに代替できるヒト由来タンパク質伝達ドメインを見出すことは非常に重要である。
【０００６】
そこで、本発明者らは、ヒト由来Ｇタンパク質α−１２の全体アミノ酸配列の一部が、細胞膜透過伝達ペプチド機能を有していることを見出し、上記ペプチドをコードする組換えベクターを製造している。そこに標的タンパク質が融合されるように、標的タンパク質の組換え遺伝子をベクターに挿入して、大腸菌菌株でタンパク質を発現、精製した後、動物細胞内に伝達し、これを生物学的方法で確認することによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 10444-10450
【非特許文献２】Lewin et al., 2000, Nature Biotech., 18, 410-414
【非特許文献３】Torchilin, 2002, Cell. Mol. Biol. Lett., 7, 265-267
【非特許文献４】Wadia and Dowdy, 2003, Curr. Protein Pept. Sci., 4, 97-104
【非特許文献５】Vives et al., 1997, J. Biol. Chem., 272, 16010-16017
【非特許文献６】Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 664-668
【非特許文献７】Nagahara et al., 1998, Nature Med., 4, 1449-1452
【非特許文献８】Asoh et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 17107-17112
【非特許文献９】Cao et al., 2002, J. Neurosci., 22, 5423-5431
【非特許文献１０】Ho et al., 2001, Cancer Res., 61, 474-477
【非特許文献１１】Wender et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 13003-13008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞内に標的タンパク質を伝達する能力を有する新しいヒト由来細胞膜透過伝達ペプチド、上記ペプチドをコードする核酸、上記核酸と標的タンパク質をコードする遺伝子が融合されている組換えベクター、及び上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明はヒトＧタンパク質アルファ１２から由来された配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する細胞膜透過伝達ペプチドを提供する。
【００１０】
また、本発明は上記ペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１１】
また、本発明は上記核酸を含む組換えベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は上記組換えベクターに標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入された組換えベクターを提供する。
【００１３】
また、本発明は上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００１４】
また、本発明は上記組換えベクターで質転換された形質転換体から融合タンパク質を発現及び大量生産する方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入された上記組換えベクターを、細胞を含む培養培地または生体内に処理することによって標的タンパク質を細胞内に導入する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＧＮＰ−ＴＤＰペプチドをコードする塩基配列を含む５７ｂｐ長さの相補的ＤＮＡ配列をアニーリングし、これを増幅して得られたＤＮＡ断片を示す電気泳動写真である。
【図２】ｐＥＴ２８ａベクターにＧＮＰ−ＴＤＰをコードする断片を挿入して、ｐＧＮＰベクターを製造する過程を示す模式図である。
【図３】ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）をコードするＤＮＡをｐＧＮＰベクターに挿入して、ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰベクターを製造する過程を示す模式図である。
【図４】ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰプラスミドを大腸菌菌株に形質転換し、培養してＩＰＴＧ処理後、時間単位でサンプリングした後、過発現ＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を含む細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した結果を示す写真である。
【図５】大腸菌菌株で過発現ＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィーとＱ−セファローズカラムクロマトグラフィーを介した純粋精製過程で、それぞれの試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した結果を示す写真である。レーンＭ；タンパク質マーカーレーン１；ＩＰＴＧ誘導前試料レーン２；ＩＰＴＧ誘導４時間後の試料レーン３；細胞破砕物の上清試料,レーン４；Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー試料レーン５；Ｑ−セファローズカラムクロマトグラフィー試料レーン６；ＰＤ−１０脱塩カラム試料
【図６】精製された組換えタンパク質ＧＮＰ−ＥＧＦＰを動物細胞株Ｈ９ｃ２にタンパク質濃度単位（Ａ）または時間単位（Ｂ）で処理した後、細胞内に伝達されたタンパク質を確認するために細胞を破砕し、ウェスタンブロットで分析した結果を示す電気泳動写真である。
【図７】精製された組換えタンパク質ＧＮＰ−ＥＧＦＰを動物細胞株Ｈ９ｃ２に処理し、細胞内に伝達されたタンパク質をフローサイトメトリーで分析した結果を示すグラフである。
【図８】精製された組換えタンパク質ＧＮＰ−ＥＧＦＰを動物細胞株Ｈ９ｃ２に処理し、細胞内に伝達されたタンパク質を蛍光顕微鏡で分析した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、ヒトＧタンパク質アルファ１２から由来された配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する細胞膜透過伝達ペプチドを提供する。
【００１９】
本発明者らは、ヒト遺伝子の中からタンパク質伝達ドメインを有する可能性がある候補配列を検索し、その中で、Ｇタンパク質アルファ１２タンパク質の全３８１個アミノ酸配列の中で、２９番目のアラニンから３９番目のアルギニンまで１１個アミノ酸配列からなるペプチドが、融合タンパク質を細胞内に伝達する機能を有していることを見いだした。上記ペプチドは、細胞内に標的タンパク質を效果的に伝達することができるので、様々なタンパク質、核酸及び薬物を細胞内に伝達するのに有用に使用することができる。本発明者らは、上記ペプチドを“ＧＮＰ−ＴＤＰ（guanine nucleotide-binding protein transmembrane delivery peptide）”と命名した。
【００２０】
また、本発明は上記ペプチドをコードする核酸を提供する。
【００２１】
本発明の核酸は、配列番号１に記載される細胞膜透過伝達ペプチドをコードすることができる塩基配列を含み、その中で、配列番号２に記載される塩基配列を有することが好ましい。
【００２２】
また、本発明は、上記核酸を含む組換えベクターを提供する。
【００２３】
本発明において、“組換えベクター”とは適当な宿主細胞で標的タンパク質を発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物を意味する。
【００２４】
本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミッドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。好適な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダ配列を含み、目的に応じて、多様に製造することができる。ベクターのプロモーターは構成的または誘導性であってもよい。また、ベクターはベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能なベクターの場合、複製起源を含む。
【００２５】
本発明の組換えベクターは、好ましくは一般的な大腸菌菌株発現用ベクターに、上記配列番号１に記載されるペプチドをコードする核酸を挿入することによって製造することができる。本発明の好ましい実施例では、大腸菌発現用ベクターとしてｐＥＴ２８ａを用いたが、必ずしもこれに限定されるものではない。一般的に使用することができる全ての大腸菌株発現用ベクターが制限なく用いられる。本発明の好ましい実施例では、大腸菌菌株発現用ベクターであるｐＥＴ２８ａベクターを用いて、配列番号２に記載されるＧＮＰ−ＴＤＰ塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入し、組換えベクターを製造し、これを“ｐＧＮＰ”と命名した（図２参照）。
【００２６】
また、本発明は、上記組換えベクターに標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入された組換えベクターを提供する。
【００２７】
組換えベクターを用いて標的タンパク質を融合タンパク質形態に製造した後、細胞内の伝達効率を直接確認するために、本発明の好ましい実施例では、ＥＧＦＰ遺伝子をｐＧＮＰに挿入した組換えベクターを製造し、これを“ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰ”と命名した（図３参照）。上記で、標的タンパク質は特定のタンパク質、例えば、本発明の好ましい実施例で使われたＥＧＦＰなどに限定されなく、全ての種類のタンパク質が制限なく使用することができる。
【００２８】
また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２９】
形質転換は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入する方法が含まれる。当分野で公知された宿主細胞に準じて適した標準技術を選択して遂行することができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（electroporation）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストランスルフェート、リポフェクタミンなどが含まれるが、これに制限されない。
【００３０】
宿主細胞によってタンパク質の発現量と修飾が多様であるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用する。宿主細胞は、エセリシア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、プロテウス・ミラビルリース（Proteus mirabilis）またはスタヒロコッカス（Staphylococcus）のような原核宿主細胞が挙げられるが、これに制限されない。また、真菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus））、酵母（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミケス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、アカパンカビ（Neurospora crassa））などのような下等真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞が挙げられる。
【００３１】
上記形質転換体は、上記組換えベクターを任意の宿主細胞に導入させることによって容易に製造することができる。本発明の好ましい実施例では、ｐＧＮＰベクター及び上記ｐＧＮＰベクターに標的タンパク質であるＥＧＦＰを挿入させた発現用組換えベクターｐＧＮＰ−ＥＧＦＰを大腸菌菌株ＤＨ５αに導入して形質転換体を製造した。
【００３２】
また、本発明は、上記形質転換細胞を用いて細胞膜透過伝達ペプチドと融合された標的タンパク質を発現する方法を提供する。
【００３３】
上記標的タンパク質は、上記形質転換細胞を適切な培地で培養するか、または上記形質転換細胞を任意の動物に導入した後、生体内で培養することによって容易に発現及び大量生産できる。本発明の好ましい実施例では、ｐＧＮＰベクターにＥＧＦＰ遺伝子を挿入させた組換え発現ベクターｐＧＮＰ−ＥＧＦＰを大腸菌菌株ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）に導入して形質転換体を作り、これを適切な培地で培養することで、細胞膜透過伝達ペプチドとＥＧＦＰとが融合された組換えタンパク質を発現及び精製した（図４及び図５参照）。本発明の好ましい実施例によれば、上記組換え融合タンパク質を動物細胞株に処理した場合、ＧＮＰが融合されない天然型ＥＧＦＰを処理した場合と比較する時、非常に高い割合でタンパク質が細胞内に伝達された（図７及び図８参照）。従って、本発明の方法を用いると、目的とする物質、例えばタンパク質、核酸、薬物などを、ヒトを含む動物細胞内に効率的に伝達することができるので、薬物などを伝達するための用途で有用に使用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００３５】
しかし、下記実施例は、本発明を例示するためだけであり、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
＜実施例１＞ＧＮＰ−ＴＤＰペプチドをコードする二重鎖ＤＮＡの製作
ヒトＧタンパク質アルファ１２（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号、ＡＡＨ８７５３７、ＢＣ０８７５３７）の全３８１アミノ酸配列の中で、２９番目アラニンから３９番目アルギニンまでの１１個アミノ酸配列（ＧＮＰ−ＴＤＰペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含む配列番号３に記載される一本鎖のオリゴマーと、それと相補的な配列を有する配列番号４に記載されるオリゴマーとを結合させることによって、ＧＮＰ−ＴＤＰペプチドをコードする塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡを製造した。具体的に、上記ＤＮＡオリゴマーは、ＧＮＰ−ＴＤＰをコードする３３個塩基を有する配列番号２に記載されるＤＮＡ配列と、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩの認識部位を含む全５７ｂｐのＤＮＡと、これに相補的な配列のＤＮＡである。上記オリゴマーを８０℃で１５分間処理した後、室温に放置し、２オリゴマーを結合させることによって、５７ｂｐの二重鎖ＤＮＡを製造した。上記反応から増幅された増幅産物について、２％アガロースゲル電気泳動で確認した。その結果、５７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した（図１）。
【００３７】
＜実施例２＞ｐＧＮＰベクターの製作
上記実施例１で製造された５７ｂｐＤＮＡ断片を用いて、大腸菌株発現用ｐＧＮＰ組換えベクターを製作した。具体的に、上記５７ｂｐＤＮＡ断片を２％アガロースゲルで電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Germany）を使用してＤＮＡを分離した。分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩに消化し、ｐＥＴ２８ａベクター（Novagen, USA）ベクターも同じ制限酵素で消化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Promega, USA）で反応させて、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ断片が挿入された新しいプラスミドベクターを製造し、これを“ｐＧＮＰ”と命名した（図２）。
【００３８】
上記ｐＧＮＰベクターを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株に形質転換させた後、抗生剤カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ（Luria Botani）平板培地に塗抹して培養した。コロニーを形成する形質転換大腸菌菌株からプラスミドＤＮＡを分離し、Ｔ７  プロモーター配列（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）をプライマーとして用いて、ＤＮＡ塩基配列分析器（ABI system, USA）を用いたＤＮＡ塩基配列分析を実施した結果、上記ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片は配列番号２に記載されるＧＮＰ−ＴＤＰのＤＮＡ配列であることが確認された。
【００３９】
＜実施例３＞ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰプラスミドの製作
上記実施例２で製造されたｐＧＮＰベクターでＧＮＰ−ＴＤＰの細胞内への伝達効率を直接確認するために、標的タンパク質として選択したＥＧＦＰ遺伝子をｐＧＮＰベクター内に挿入させた。上記ＥＧＦＰ遺伝子は、全体ＤＮＡ配列が含まれているｐＥＧＦＰ−Ｎ１（BD  Biosciences, USA）ベクターを鋳型としてＰＣＲ反応を遂行して得た。この時、使われたＰＣＲ反応のためのプライマーとして配列番号５に記載される上流プライマー及び配列番号６に記載される下流プライマーを使用しており、これらはそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ認識部位が含まれた配列である。ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間鋳型を熱変性し、５８℃で１分間鋳型とプライマーの結合し、７２℃で１分間延長反応することを１周期とし、３５周期を、ＰＣＲ反応器を利用して遂行した。上記反応から増幅された約７２０ｂｐのＤＮＡ断片に対して、１％アガロースゲル電気泳動を遂行して確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して分離した。分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＧＮＰベクターにＴ４  ＤＮＡリガーゼで反応させて挿入することによって、標的タンパク質をコードするＥＧＦＰ遺伝子が挿入された新しいプラスミド“ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰ”を製造した。
【００４０】
上記ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰベクターを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株に形質転換させた後、抗生剤カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が含まれたＬＢ平板培地に培養し、コロニーを形成する形質転換大腸菌を選別した。選別された大腸菌コロニーからｐＧＮＰ−ＥＧＦＰを分離し、これをＰＣＲ反応分析とＤＮＡ塩基配列分析を遂行した結果、ＥＧＦＰ遺伝子が含まれていることを確認した。上記ｐＧＮＰ−ＥＧＦＰを大腸菌菌株ＤＨ５αに導入して形質転換体を製造して保存した。
【００４１】
＜実施例４＞大腸菌でＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の発現及び精製
上記実施例３で製造されたベクターｐＧＮＰ−ＥＧＦＰを用いて大腸菌菌株で融合タンパク質ＧＮＰ−ＥＧＦＰを製造した。組換えベクターｐＧＮＰ−ＥＧＦＰをタンパク質過発現用大腸菌菌株ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）に導入し、形質転換させた後、抗生剤であるカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ平板培地で形成されたコロニーをＬＢ液状培地に接種した後、３７℃で１６時間培養し、十分な培養液を得て、これを新しいＬＢ液状培地に接種した。同温度で振盪培養した後、６００ｎｍ波長で吸光度が０．６になれば、タンパク質の過発現のために最終濃度が０．５ｍＭになるように、ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加した後、４時間さらに培養した。時間単位に、サンプリングした培養液を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を遂行した結果、組換えタンパク質ＧＮＰ−ＥＧＦＰが発現されたことを確認した（図４）。
【００４２】
組換えタンパク質ＧＮＰ−ＥＧＦＰを分離精製するために、培養液を遠心分離で合わせた後、緩衝溶液（６Ｍ  ウレア、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０)で溶解した。大腸菌の細胞壁がよく破れるように−８０℃温度に凍結及び解凍する過程を３回繰返した後、ウルトラソニックプロセッサー（ultrasonic processor）ＶＣＸ−５００（Sonics & Materials, USA）を使用して細胞を粉砕し、遠心分離して上清を分離した。分離された試料をＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen, Germany）とQ−セファローズカラム（Amersham Bioscience, Sweden）に適用してＧＮＰ−ＥＧＦＰタンパク質を純粋分離精製した（図５）。上記組換えタンパク質をＰＤ−１０脱塩カラム（Amersham Biosciences, Sweden）を使用して脱塩させた後、グリセロールの濃度が１０％になるように添加し、−８０℃で保管した。
【００４３】
＜実施例５＞動物細胞株内へのＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質の伝達
上記実施例４で分離精製された組換えタンパク質をラットの筋芽細胞Ｈ９ｃ２細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４６）内に伝達し、その効率を確認した。Ｈ９ｃ２細胞をＤＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco, USA）を使用して培養し、６−ウェルプレート（Nalge Nunc, USA）に細胞数を６×１０５で分注した後、プレート面積の７０％程成長した時、１０％ＦＢＳが含まれた新しい培地に交替した。そこに、ＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を濃度単位（０〜２．０μＭ）で２時間、または０．５μＭの濃度で２時間、細胞に処理した。対照群としてはＧＮＰペプチドが融合されていない天然型ＥＧＦＰタンパク質を使用した。決まった時間後に、細胞をＰＢＳ緩衝溶液（phosphate-buffered saline）で２回洗浄した後、ＥＤＴＡが入っていないトリプシン（Gibco-BRL, USA）を１０分間処理することによって、細胞表面に付着され得るタンパク質を除去し、再びＰＢＳで洗浄した。
【００４４】
上記細胞株に処理された組換えタンパク質の伝達効率を確認するために、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー（fluorescence activated cell sorting）及び蛍光顕微鏡を用いた分析を遂行した。まず、ウェスタンブロット分析のために細胞溶解緩衝溶液（２０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  トリトン、２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍｇ／ｍＬ  ロイペプチン、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いて細胞を破壊し、遠心分離して細胞内の全体タンパク質を得た。タンパク質２０μｇを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、電気泳動ゲルに含まれたタンパク質をポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）用紙（Gelman, USA）に吸着させた後、ＥＧＦＰに対する抗体（Santa Cruz, USA）を使用して通常的な方法でウェスタンブロットを遂行し、細胞内に伝達されたＥＧＦＰを検出した。その結果、タンパク質の処理濃度と時間に依存的に動物細胞株内に伝達されたことを確認した（図６）。
【００４５】
このような結果を検証するために、フローサイトメトリーを利用して実験した。動物細胞株Ｈ９ｃ２を６−ウェルプレートに細胞数２×１０５で分注した後、細胞がプレート面積の８０〜９０％程成長した時、ＥＧＦＰあるいはＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を０．５μＭの濃度で処理した。１時間後、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシンを処理して細胞膜に付着され得る組換えタンパク質を除去した。再びＰＢＳで洗浄した後、細胞を書き取り、０．５ｍＬ  ＰＢＳを入れて混合した後、フローサイトメトリーを利用して蛍光を分析した。その結果、ＧＮＰが融合されていないＥＧＦＰは、動物細胞内に伝達されていなく、ＧＮＰ−ＥＧＦＰが動物細胞内に効率的に伝達されたことを確認した（図７）
【００４６】
最後に、実際動物細胞内に伝達されているタンパク質を直接確認するために、蛍光顕微鏡（Olympus BX51, USA）を使用して実験した。４−ウェルプレート（LAB-TEK II CHAMBER, Nalge Nunc, USA）に細胞を分注した後、ＥＧＦＰあるいはＧＮＰ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を０．５μＭ濃度で処理し、トリプシン処理した後、ＰＢＳで洗浄した。これを室温で、３．７％ホルムアルデヒド溶液で５分間放置した後、再びＰＢＳで洗浄し、マウントして蛍光顕微鏡で観察した。その結果、組換えタンパク質が効率的に動物細胞株内に伝達されたことを確認した（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
上記説明のように、本発明の細胞膜透過伝達ペプチドは動物細胞株内に効率的に伝達され得るので、タンパク質、核酸,薬物などを含む様々な目的物質を細胞内に伝達するための目的で有用に使用することができる。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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