(57)【要約】本発明は、親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとし、ここで機能性タンパク質またはペプチド断片が、ナノ粒子に、ポリエチレングリコール−α−マレイン酸イミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合している、活性剤負荷ナノ粒子に関する。また開示されているのは、前記ナノ粒子の製造方法およびこの使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとする活性剤負荷ナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、親水性タンパク質（１種）または親水性タンパク質（２種以上）に、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合した少なくとも１種の機能性タンパク質またはペプチド断片を含むことを特徴とする、前記ナノ粒子。
【請求項２】
親水性タンパク質または親水性タンパク質の少なくとも１種が、血清アルブミン、ゼラチンＡ、ゼラチンＢおよびカゼインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
親水性タンパク質または親水性タンパク質の少なくとも１種が、ヒト起源のものであることを特徴とする、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
機能性タンパク質またはペプチド断片が、アポリポタンパク質、抗体、酵素、ホルモン類、細胞増殖抑制剤、抗生物質およびこれらの断片からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項５】
機能性タンパク質が、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂおよびアポリポタンパク質Ｅからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルが、３４００Ｄａまたは５０００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含むポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類の群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項７】
ナノ粒子に、活性剤が、吸着、取り込みにより、または反応性基を介しての共有結合もしくは複合体形成結合により負荷されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項８】
活性剤が、細胞増殖抑制剤、抗生物質、抗ウイルス薬、鎮痛剤、向知性薬、抗てんかん薬、鎮静薬、向精神薬、下垂体ホルモン類、視床下部ホルモン類、他の調節ペプチドおよびこれらの阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
活性剤が、ダラルジン、ロペラミド、ツボクラリンおよびドキソルビシンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１０】
親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとし、機能性タンパク質またはペプチド断片で修飾されている活性剤負荷ナノ粒子の製造方法であって、該方法が、以下の段階：
−親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせの水溶液を脱溶媒和する段階、
−架橋による脱溶媒和により形成したナノ粒子を安定化する段階、
−安定化されたナノ粒子の表面上のアミノ基を、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルで変換する段階、
−機能性タンパク質またはペプチド断片にチオール基を導入する段階、および
−チオール基を導入したタンパク質またはペプチド断片を、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルで変換されたナノ粒子に共有結合させる段階
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項１１】
チオール基を導入したタンパク質またはペプチド断片の結合に続いて、ナノ粒子に活性剤を吸着的に負荷することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
親水性タンパク質が、血清アルブミン、ゼラチンＡ、ゼラチンＢ、カゼインおよび類似のタンパク質、またはこれらのタンパク質の組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
親水性タンパク質が、ヒト起源のものであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
脱溶媒和が、親水性タンパク質に対する水混和性非溶媒を撹拌し、加えることにより、または塩析により行われることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
親水性タンパク質に対する水混和性非溶媒が、エタノール、メタノール、イソプロパノールおよびアセトンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
熱プロセスまたは二官能性アルデヒド類もしくはホルムアルデヒドを用いて、ナノ粒子を安定化することを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
グルタルアルデヒドを、二官能性アルデヒドとして用いることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルが、３４００Ｄａまたは５０００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含むポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルの群から選択されることを特徴とする、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
２−イミノチオランを、チオール基を修飾する剤として用いることを特徴とする、請求項１０〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
活性剤が、細胞増殖抑制剤、抗生物質、抗ウイルス薬、鎮痛剤、向知性薬、抗てんかん薬、鎮静薬、向精神薬、下垂体ホルモン類、視床下部ホルモン類、他の調節ペプチドおよびこれらの阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
活性剤が、ダラルジン、ロペラミド、ツボクラリンおよびドキソルビシンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１０〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
親水性タンパク質にポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合したアポリポタンパク質を含む活性剤負荷ナノ粒子の、血液脳関門を横断して、薬学的または生物学的に活性な剤を輸送するための使用。
【請求項２３】
親水性タンパク質が、血清アルブミン、ゼラチンＡ、ゼラチンＢ、カゼインおよび類似のタンパク質、またはこれらのタンパク質の組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
親水性タンパク質の少なくとも１種が、ヒト起源のものであることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
活性剤が、細胞増殖抑制剤、抗生物質、抗ウイルス薬、鎮痛剤、向知性薬、抗てんかん薬、鎮静薬、向精神薬、下垂体ホルモン類、視床下部ホルモン類、他の調節ペプチドおよびこれらの阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
活性剤が、ダラルジン、ロペラミド、ツボクラリンおよびドキソルビシンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
ナノ粒子を、脳の情動を処置するために用いることを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜９のいずれかに記載のナノ粒子の、医薬を製造するための使用。
【請求項２９】
機能性タンパク質がアポリポタンパク質である、請求項１〜９のいずれかに記載のナノ粒子の、脳情動を処置するための医薬を製造するための使用。
【請求項３０】
機能性タンパク質がアポリポタンパク質である、請求項１〜９のいずれかに記載のナノ粒子の、脳情動を処置するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとし、ここで機能性タンパク質またはペプチド断片が、ナノ粒子に、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合している、活性剤負荷ナノ粒子に関する。さらに特に、本発明は、少なくとも１種の親水性タンパク質をベースとし、ここで機能性タンパク質またはペプチド断片、好ましくはアポリポタンパク質が、ナノ粒子に、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合して、血液脳関門を横断して、薬学的または生物学的に活性な剤を輸送する、活性剤負荷ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「ナノ粒子」は、１０ｎｍ〜１０００ｎｍの大きさを有し、薬剤または他の生物学的活性物質を共有結合、イオン結合もしくは吸着的結合により結合させることができるか、またはこれらの物質を導入することができる人工的な、または天然の高分子物質で構成されている粒子を意味するものと理解される。
【０００３】
特定のナノ粒子により、それら自体は血液脳関門を横断することができない親水性薬剤を、これら親水性薬剤が中枢神経系（ＣＮＳ）において治療的に活性になり得るように、血液脳関門を横断して輸送することが可能となる。
【０００４】
例えば、多種の薬剤を、ポリソルベート８０（Tween（登録商標）８０）または他の界面活性剤を塗布された、中枢神経系においてこれらの作用により顕著な薬理学的効果を奏するポリブチルシアノアクリレートナノ粒子により、血液脳関門を横断して輸送することが、可能であった。このようなポリブチルシアノアクリレートナノ粒子と共に投与される薬剤の例には、ダラルジン(dalargin)、エンドルフィンヘキサペプチド、ロペラミドおよびツボクラリン、それぞれMerz社、Frankfurtの２種のＮＭＤＡレセプターアンタゴニストであるＭＲＺ２／５７６およびＭＲＺ２／５９６、ならびに抗悪性腫瘍活性剤であるドキソルビシンが含まれる。
【０００５】
血液脳関門を横断してこれらのナノ粒子を輸送する機構は、場合によっては、ポリソルベート８０被膜を介してナノ粒子により吸着されるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）に基づく。おそらく、これらの粒子は、これによりリポタンパク質粒子を模倣し、これは、脳内皮細胞のレセプターにより認識および結合され、これにより脂質の脳への供給が確実になる。
【０００６】
しかし、血液脳関門を横断すると知られているポリブチルシアノアクリレートナノ粒子は、ポリソルベート８０が生理学的起源のものではない点、および血液脳関門を横断してのナノ粒子の輸送が、場合によってはポリソルベート８０の毒性効果によるものであり得る点の欠点を有する。さらに、既知のポリブチルシアノアクリレートナノ粒子はまた、ＡｐｏＥの結合が吸着によってのみ起こるという欠点を有する。これにより、ナノ粒子結合ＡｐｏＥは、遊離のＡｐｏＥと平衡状態で存在し、身体中への注射の後に、粒子からのＡｐｏＥの迅速な脱着が起こり得る。さらに、多くの薬剤は、ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子に十分な程度で結合せず、したがってこの担体系で血液脳関門を横断して輸送することができない。
【０００７】
これらの欠点を克服するために、WO 02/089776 A1は、ビオチニル化アポリポタンパク質Ｅがアビジン−ビオチン系またはアビジン誘導体を介して結合するヒト血清アルブミンのナノ粒子（ＨＳＡナノ粒子）を提案している。静脈内注射の後、これらのＨＳＡナノ粒子は、吸着的に、または共有結合した薬剤ならびに粒子マトリックス中に導入された薬剤を、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断して輸送することができる。このようにして、生化学的、化学的または物理化学的理由により他の方法では当該関門を横断することができない活性剤を、ＣＮＳにおける薬理学的および治療的用途のために用いることができる。
【０００８】
しかし、アビジン−ビオチン系は、種々の欠点を有する。例えば、この使用は、ナノ粒子の製造に関して複雑であり、さらに免疫学的または他の副作用をもたらし得る。さらに、アビジン−ビオチン系を含む粒子系は、長期間貯蔵すると凝集する傾向があり、これにより、平均粒度の増大がもたらされ、粒子の効率性に対して悪影響を有する。
【発明の開示】
【０００９】
したがって、本発明の根底にある課題は、生化学的、化学的または物理化学的理由により血液脳関門を横断することができない薬剤を、これらのナノ粒子が従来技術から知られているポリブチルシアノアクリレートナノ粒子の、およびアビジン−ビオチン系を含むＨＳＡナノ粒子の欠点を有せずにＣＮＳに供給することができる、ナノ粒子を提供することにあった。
【００１０】
この課題は、親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとするナノ粒子であって、少なくとも１種の薬理学的に許容し得る、および／または生物学的に活性な剤を含み、機能性タンパク質として作用するアポリポタンパク質が、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合している前記ナノ粒子により、解決される。
【００１１】
本発明のナノ粒子がベースとする親水性タンパク質または親水性タンパク質の少なくとも１種は、好ましくは血清アルブミン、ゼラチンＡ、ゼラチンＢおよびカゼインを含むタンパク質の群に属する。ヒト起源の親水性タンパク質が、より好ましい。最も好ましくは、ナノ粒子は、ヒト血清アルブミンをベースとする。
【００１２】
二官能性ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類は、マレイミド基およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含み、この間に、所定の長さのポリエチレングリコール鎖が存在する。好ましくは、機能性タンパク質またはペプチド断片は、親水性タンパク質に、３４００Ｄａまたは５０００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含むポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合している。
【００１３】
ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルを介して親水性タンパク質に結合しているアポリポタンパク質は、好ましくは、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）およびアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）からなる群から選択される。
【００１４】
本発明のナノ粒子の他の好ましい態様において、機能性タンパク質は、アポリポタンパク質ではなく、抗体、酵素およびペプチドホルモン類からなるタンパク質の群から選択される。しかし、ほとんどすべての所望のペプチド断片、好ましくは前述の機能性タンパク質の機能的に活性な断片の群からのペプチド断片を、ナノ粒子に、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合させることも、可能である。
【００１５】
したがって、本発明の主題は、親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとし、前記ナノ粒子が、親水性タンパク質（１種）または親水性タンパク質（２種以上）に、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介して結合した少なくとも１種の機能性タンパク質またはペプチド断片を含むことを特徴とする、活性剤負荷ナノ粒子である。
【００１６】
輸送するべき活性剤をナノ粒子に負荷させることを、活性剤をナノ粒子に吸着させること、活性剤をナノ粒子中に取り込むことにより、または反応性基を介しての共有結合もしくは複合体形成結合により行ってもよい。
【００１７】
原則として、本発明のナノ粒子には、ほとんどすべての所望の活性剤／薬剤を負荷することができる。しかし、好ましくは、ナノ粒子に、それ自体は血液脳関門を横断することができない活性剤を負荷する。一層好ましくは、活性剤は、細胞増殖抑制剤、抗生物質、抗ウイルス物質、ならびに神経系の疾患に対して活性である薬剤の群、例えば鎮痛剤、向知性薬、抗てんかん薬、鎮静薬、向精神薬、下垂体ホルモン類、視床下部ホルモン類、他の調節ペプチドおよびこれらの阻害剤を含む群からのものに属し、このリストは、いかなる方法によっても限定的ではない。最も好ましくは、活性剤は、ダラルジン、ロペラミド、ツボクラリンおよびドキソルビシンを含む群から選択される。
【００１８】
本発明のナノ粒子は、おそらく副作用を生じるアビジン−ビオチン系を用いて、機能性タンパク質またはこのペプチド断片を粒子の親水性タンパク質に結合させることが必要ではないという利点を有する。
【００１９】
好ましくは、本発明のナノ粒子を、最初に親水性タンパク質（１種）または親水性タンパク質（２種以上）の水溶液をナノ粒子に、脱溶媒和プロセスにより変換し、その後架橋により上記ナノ粒子を安定化させることにより、製造する。
【００２０】
水溶液からの脱溶媒和を、好ましくはエタノールを加えることにより行う。原則として、脱溶媒和を、親水性タンパク質に対する他の水混和性非溶媒、例えばアセトン、イソプロパノールまたはメタノールを加えることにより行うことも、可能である。したがって、ゼラチンを、出発タンパク質として、アセトンを加えることにより首尾よく脱溶媒和した。水性相に溶解したタンパク質の脱溶媒は、構造形成塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸アンモニウムを加えることにより、同様に可能である。これを、塩析と呼ぶ。
【００２１】
ナノ粒子を安定化するのに適する架橋剤は、二官能性アルデヒド類、好ましくはグルタルアルデヒド、ならびにホルムアルデヒドである。さらに、ナノ粒子マトリックスを、熱的プロセスにより架橋させることが、可能である。安定なナノ粒子系は、２５時間を超える期間にわたり６０℃で、または２時間を超える期間にわたり７０℃で得られた。
【００２２】
安定化されたナノ粒子の表面上に位置する官能基（アミノ基、カルボキシル基、水酸基）を、アポリポタンパク質の直接的な共有結合のために用いることができる。これらの官能基を、アミノ基と遊離のチオール基との両方に対して反応性であるヘテロ二官能性(heterobifunctional)「スペーサー」を介して、遊離のチオール基が前に導入されているアポリポタンパク質に結合させることができる。
【００２３】
本発明のナノ粒子を製造するために、粒子表面のアミノ基を、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとする架橋剤であるポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルで変換する。このプロセスにおいて、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルのスクシンイミジル基は、粒子表面のアミノ基と反応し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する。この反応により、ＰＥＧ基を粒子表面上に導入することが可能であり、これは次に、チオール基を導入された物質と反応することができる鎖の他方の末端においてマレイミド基を含み、これによりチオエーテルを形成する。
【００２４】
本発明のナノ粒子を製造するために好ましいポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルのポリエチレングリコール鎖は、３４００Ｄａの平均分子量を有する（ＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌ）。しかし、原則として、比較的短い、または比較的長いポリエチレングリコール鎖、例えば５０００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含むポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を用いることも、可能である。
【００２５】
本発明のナノ粒子を製造するために、結合させるべきアポリポタンパク質、機能性タンパク質またはペプチド断片に、２−イミノチオランでの変換によりチオール基を導入する。当該タンパク質またはペプチド断片の遊離のアミノ基を、この変換のために用いる。
【００２６】
各々の反応段階の後、粒子系を、水溶液中で繰り返し遠心分離し、再分散させることにより精製する。変換に続いて、それぞれの溶解したタンパク質を、原則として、分子ふるいクロマトグラフィーにより低分子量反応生成物から分離する。
【００２７】
親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせをベースとし、機能性タンパク質またはペプチド断片で修飾されている活性剤負荷ナノ粒子を製造するための好ましい方法は、以下の段階：
−親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせの水溶液を脱溶媒和する段階、
−架橋による脱溶媒和により形成したナノ粒子を安定化する段階、
−安定化されたナノ粒子の表面上のアミノ基を、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルで変換する段階、
−機能性タンパク質またはペプチド断片にチオール基を導入する段階；および
−チオール基を導入したタンパク質またはペプチド断片を、ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステルで変換されたナノ粒子に共有結合させる段階
を含むことを特徴とする。
【００２８】
薬理学的効果を媒介するために、薬学的に、または生物学的に活性な物質（活性剤）を、粒子中に導入することができる。この場合において、活性剤の結合を、共有結合、複合体形成結合により、ならびに吸着的結合により行ってもよい。
【００２９】
チオール基を導入されたアポリポタンパク質または他のチオール基を導入された機能性タンパク質もしくはペプチド断片の共有結合に続いて、ＰＥＧで修飾されたナノ粒子に、好ましくは活性剤を吸着的に負荷する。
【００３０】
特に好ましい方法において、親水性タンパク質または親水性タンパク質の少なくとも１種は、血清アルブミン、ゼラチンＡ、ゼラチンＢおよびカゼインならびに類似のタンパク質、またはこれらのタンパク質の組み合わせを含むタンパク質の群から選択される。最も好ましくは、ヒト起源の親水性タンパク質を、製造のために用いる。
【００３１】
アポリポタンパク質Ｅが結合した親水性タンパク質または親水性タンパク質の組み合わせの本発明のナノ粒子は、他の方法では血液脳関門を横断しない、薬学的または生物学的に活性な剤、特に親水性活性剤を、血液脳関門を横断して輸送して、薬理学的効果を誘発するのに適する。好ましい活性剤は、細胞増殖抑制剤、抗生物質、ならびに神経系の疾患に対して活性である薬剤、例えば鎮痛剤、向知性薬、抗てんかん薬、鎮静薬、向精神薬、下垂体ホルモン類、視床下部ホルモン類、他の調節ペプチドおよびこれらの阻害剤の群に属する。このような活性剤の例は、ダラルジン、ロペラミド、ツボクラリン、ドキソルビシンなどである。
【００３２】
このように、活性剤が負荷されており、アポリポタンパク質で修飾した、本明細書中に記載したナノ粒子は、多数の脳疾患を処置するのに適する。このために、担体系に結合した活性剤を、それぞれの治療的目的に従って選択する。担体系は、これ自体、とりわけ血液脳関門を横断しての通過を示さないか、または不十分な通過を示す当該活性物質について示唆する。活性剤として適すると考慮される物質は、２〜３の適用領域以外を述べると、脳腫瘍の療法のための細胞増殖抑制剤、脳領域におけるウイルス感染症、例えばＨＩＶ感染症の療法のための活性剤、しかしまた認知症情動の療法のための活性剤である。
【００３３】
したがって、本発明の他の主題は、本発明のナノ粒子の、医薬を製造するための使用；より具体的には、機能性タンパク質がアポリポタンパク質である本発明のナノ粒子の、脳疾患を処置するための医薬を製造するための使用およびそれぞれ、このようなタンパク質の脳疾患を処置するための使用である。その理由は、これらのナノ粒子を、血液脳関門を横断して、薬学的または生物学的に活性な剤を輸送するために用いることができるからである。
【００３４】
例：
ＨＳＡナノ粒子を脱溶媒和により製造するために、２００ｍｇのヒト血清アルブミンを、２．０ｍｌの１０ｍＭのＮａＣｌ溶液に溶解し、この溶液のｐＨを、８．０の値に調整した。撹拌下で、８．０ｍｌのエタノールを、１．０ｍｌ／分の速度で、この溶液に、滴加により加えた。この脱溶媒和段階により、２００ｎｍの平均粒度を有するＨＳＡナノ粒子の形成がもたらされる。
【００３５】
ナノ粒子を、２３５μｌの８％グルタルアルデヒド溶液を加えることにより、安定化した。１２時間のインキュベーション期間に続いて、ナノ粒子を、最初に精製水中で、その後ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中で３回遠心分離し、再分散させることにより精製した。
【００３６】
ナノ粒子を活性化するために、５００μｌの架橋剤ＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌの溶液（ＰＢＳ緩衝液８．０中６０ｍｇ／ｍｌ）を、２．０ｍｌのナノ粒子懸濁液（ＰＢＳ緩衝液中２０ｍｇ／ｍｌ）に加え、室温で１時間撹拌下でインキュベートした。インキュベーション期間の後、ＰＥＧ修飾ナノ粒子を、上記のように精製水で精製した。これらの段階により、ペグ化されたＨＳＡナノ粒子が得られ、これは、表面に適用されたＰＥＧ誘導体のマレイミド基を介して、遊離チオール基に対する反応性を有していた。
【００３７】
アポリポタンパク質の共有結合のために、最初に遊離のチオール基を、この構造中に導入した。このために、５００μｇのアポリポタンパク質を、１．０ｍｌのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、２−イミノチオラン（トラウトの試薬）を、５０倍モル過剰で加えた。室温での１２時間の反応期間に続いて、チオール基を導入したアポリポタンパク質を、デキストラン脱塩カラム(D-Salt（登録商標）Column)を介しての分子ふるいクロマトグラフィーにより精製し、低分子量反応生成物を、当該プロセスにおいて分離した。
【００３８】
チオール基を導入したアポリポタンパク質のＨＳＡナノ粒子への共有結合のために、５００μｇのチオール基を導入したアポリポタンパク質を、２５ｍｇのＰＥＧ修飾ＨＳＡナノ粒子に加え、この混合物を、室温で１２時間インキュベートした。当該反応期間の後、未反応のアポリポタンパク質を、遠心分離により除去し、当該ナノ粒子を再分散させた。最終的な精製段階において、アポリポタンパク質で修飾したＨＳＡナノ粒子を、２．６容量％のエタノール中に吸収させた。
【００３９】
別個の試料において、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｂおよびアポリポタンパク質Ａ１に、チオール基を導入し、これをＨＳＡナノ粒子に結合させた。
【００４０】
ナノ粒子にモデル薬剤であるロペラミドを負荷するために、２．６容量％のエタノール中の６．６ｍｇのロペラミドを、２０ｍｇのＡｐｏＥ修飾ナノ粒子に加え、２時間インキュベートした。当該時間の後、未結合の薬剤を、遠心分離および再分散により分離し、得られたロペラミドが負荷されたアポリポタンパク質修飾ＨＳＡナノ粒子を、注射目的のために水中に吸収させ、粒子含量を、水で１０ｍｇ／ｍｌに希釈することにより調整した。ナノ粒子を、動物実験において用いて、これらが血液脳関門を横断して活性剤を輸送するのに適していることを試験した。
【００４１】
溶解した形態で血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができないオピオイドとしてのロペラミドは、ＢＢＢを横断するための相当する担体系のための特に好適なモデル薬剤である。ロペラミド含有製剤の適用後に生じる鎮痛効果により、物質が、中枢神経系中に蓄積し、したがってＢＢＢが克服されたという直接の論証が得られる。
【００４２】
動物実験において用いた典型的なナノ粒子状製剤は、１０．０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子、０．７ｍｇ／ｍｌのロペラミドおよび１９０μｇ／ｍｌのＡｐｏＥを含んでいた。
【００４３】
動物実験用の適用準備済みのナノ粒子状製剤（合計容量２．０ｍｌ）の組成は、以下の通りであった：
１．１０．０ｍｇ／ｍｌのアポリポタンパク質修飾ＨＳＡナノ粒子
２．１９０．０μｇ／ｍｌの共有結合したアポリポタンパク質
３．０．７ｍｇ／ｍｌのロペラミド（ナノ粒子に吸着的に結合している）
４．注射目的のための水。
【００４４】
製剤を、７．０ｍｇ／ｋｇのロペラミドの投与量でマウスに静脈内に適用した。２０ｇのマウスの平均体重に基づいて、動物に、２００μｌの適用量の前述の製剤を施与した。
【００４５】
この系の補助により、図１に示す鎮痛効果が、前述の活性剤であるロペラミドを用いた静脈内注射の後に、達成された。高温の光線をマウスの尾上に投射し、マウスがその尾を振り払うまでに経過する時間を測定するテールフリック試験により、鎮痛（侵害受容応答）を検出する。１０秒後（＝１００％ＭＰＥ）、マウスへの損傷を生じないように、実験を中止する。負のＭＰＥ値は、製剤の投与の後に、マウスがその尾を、処置の前よりも早期に振り払う場合に生じる。
【００４６】
比較として、２．６容量％のエタノール中の０．７ｍｇ／ｍｌのロペラミド溶液を用いた。遊離物質であるロペラミド自体は、血液脳関門を横断しての輸送の欠如により、鎮痛効果を示さない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ポリエチレングリコール−α−マレイミド−ω−ＮＨＳエステル類を介してアポリポタンパク質で修飾させたロペラミド負荷ＨＳＡナノ粒子の静脈内適用後の、鎮痛効果（最大可能効果、ＭＰＥ）のグラフである。
【図１】
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【国際調査報告】
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