(57)【要約】試験試料において病原体の標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸検出試薬を調整することと、標的核酸検出試薬をオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させることとを含んでなる方法である。また、試験試料中の病原体の標的核酸を検出するためのキットも記載される。本発明のキットは、少なくとも１つのプライマーペアと少なくとも１つのプローブとを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイを含んでなる。【選択図】図１Ａ
2009529857.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料又は試験試料中の１つ以上の病原体の標的核酸を検出するための方法であって、
１つ以上の病原体中の保存領域に結合する１つ以上のプライマーペアを利用して、試料中の標的核酸を増幅することと、
増幅標的核酸をオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させること、ここで前記マイクロアレイは異なった病原体に相補的なポリヌクレオチド配列を含む２つ以上のプローブあるいはプローブのセットを含む、と、
標的核酸のプローブへの結合を検出すること、ここで特定の病原体プローブへの結合が試料中の当該病原体の存在の指標となる、と、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記病原体が、レンサ球菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ、プロテウス、アナエロバクター、結核菌、腸球菌、ポリオウイルス１、エンテロウイルス７１、エンテロウイルス７０、エコーウイルス２、エコーウイルス４、エコーウイルス６、エコーウイルス９、エコーウイルス１１、エコーウイルス１２、エコーウイルス２６、コクサッキーウイルスＡ１３、コクサッキーウイルスＡ１５、コクサッキーウイルスＡ１８、コクサッキーウイルスＡ２０、コクサッキーウイルスＡ２１、コクサッキーウイルスＢ３−Ａ、コクサッキーウイルスＢ３−Ｃ、ＨＳＶ−１、及び、ＨＳＶ−２からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
プローブが配列番号１３〜５２からなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
前記標的核酸が大腸菌及びサルモネラ菌であり、そしてプローブが配列番号１４〜１７及び配列番号２２〜２６からなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
前記増幅工程が、配列番号１〜１２からなる群より選択される１つ以上のプライマーペアを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
プライマーが以下のペア：
配列番号１と２；配列番号１と４；配列番号１と６；配列番号３と２；配列番号３と４；配列番号３と６；配列番号５と２；配列番号５と４；配列番号５と６；配列番号５と６；配列番号７と８；配列番号９と１０並びに配列番号１１と１２、
から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーペアが配列番号１・２及び配列番号７・８である、請求項６の方法。
【請求項８】
プローブが配列番号１３〜５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の方法。
【請求項９】
マイクロアレイが少なくとも１つの病原体に由来する２つ以上のプローブを含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記生物学的試料が、組織、細胞、血液、血清、脳脊髄液、尿、細胞溶解液、血漿、排泄物、喀痰、血球、細針生検試料、腹水、及び胸水、あるいはそれらに由来する細胞からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１１】
マイクロアレイが、共通の症状に関連した病原体に対するプローブを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
マイクロアレイが、共通の感染経路に関連した病原体に対するプローブを含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
試料中の大腸菌とサルモネラ菌を区別する方法であって、
大腸菌及びサルモネラ菌中の保存領域に結合する１つ以上のプライマーペアを利用して、試料中の核酸を増幅することと、
増幅核酸をオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させること、ここで前記マイクロアレイは大腸菌及びサルモネラ菌中の可変領域に相補的なポリヌクレオチド配列を含む２以上のプローブを含む、と、
試料中の大腸菌及び／又はサルモネラ菌の存在の指標として核酸のプローブへの結合を検出することと、
を含む上記方法。
【請求項１４】
マイクロアレイが大腸菌に対する２つ以上のプローブセット及びサルモネラ菌に対する２つ以上のプローブセットを含み、各プローブセットが病原体に相補的な２つ以上の異なったプローブを含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
プライマーペアが配列番号１〜６からなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
プローブが配列番号１４〜１７及び配列番号２２〜２６からなる群より選択される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
試験試料中の少なくとも１つの病原体の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが配列番号１〜１２からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーペア、及び配列番号１３〜５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのプローブを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイを含み、ここでプローブは固体支持体上に固定化されている、上記キット。
【請求項１８】
プライマーペアが、以下のペア：
配列番号１と２；配列番号１と４；配列番号１と６；配列番号３と２；配列番号３と４；配列番号３と６；配列番号５と２；配列番号５と４；配列番号５と６；配列番号５と６；配列番号７と８；配列番号９と１０並びに配列番号１１と１２、
から選択される、請求項１７のキット。
【請求項１９】
プローブが配列番号１４〜１７及び配列番号２２〜２６からなる群より選択される、請求項１８のキット。
【請求項２０】
少なくとも１つのプローブが２つ以上の病原体に由来する２つ以上のプローブを含む、請求項１７のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景技術
本発明は、試験試料において病原体の存在を検出するための試験キット及び方法に関する。試験試料は、患者から、あるいは病原体を含有するかもしれない食物又は飲料の発生源から得ることが可能である。
【０００２】
脳炎、頭髄膜炎（ｃｅｐｈａｌｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、髄膜炎、肺炎、胃腸炎、心内膜炎、尿路感染症のような疾患は、病原体による感染により引き起こされる。病原体としては、様々な細菌、ウイルス、真菌及び原虫が挙げられる。異なる病原体感染症であっても類似の症状を共に有するため、感染症又は疾患の原因の正確な診断を提供することが困難になる。例えば、脳炎患者と髄膜炎の患者は、一般に、発熱、頭痛及び痙攣を示す。これらの症状の原因である病原体の迅速で正確な同定は、どの処方薬を決定するかという点で重要である。病原体の同定のための現在の診断手段として、顕微鏡検査、微生物培養、免疫血清試験及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。これらの手段は高度に訓練されたスタッフを必要とし、そして非常に時間がかかる。
【０００３】
慣用のＰＣＲ法によれば、鋳型として機能する遺伝子を含有する試験試料を、特定の長さを有する少なくとも１つの遺伝子を増幅するために設計された少なくとも１対のＰＣＲプライマーと混合する。増幅ＰＣＲ産物をアガロースゲルを使用した電気泳動に供し、そして染色することにより、ＰＣＲ産物は可視化される。ＰＣＲ法によれば、試験試料に含有される遺伝子は、可視化ＰＣＲ産物の長さに基づき同定される。より効果的に複数の遺伝子をスクリーニングするために、複数のプライマーペアが同一の試料において増幅可能である。
【０００４】
しかしながら、プライマー試薬中に含有されるＰＣＲプライマーの数が増えるにつれて、電気泳動ゲル上の「ノイズ」が増加する。ＰＣＲ産物が非特異的アニーリングにより産生されたとき、「ノイズ」は起こる。このため、ＰＣＲ反応を使用するとき、たった数遺伝子以上の存在を決定することは困難である。
【０００５】
さらに、ＰＣＲ反応で増幅したＰＣＲ産物を電気泳動ゲル上で区別できるようにプライマーを設計する必要があるが、電気泳動ゲルでは分解能に制約があることが多い。少ないノイズで適した区別可能なＰＣＲ産物を産生するＰＣＲプライマーを設計することは困難であり、そして時間がかかる。したがって、ＰＣＲ／電気泳動に厳密に基づくアプローチは、多数の遺伝子の発現をスクリーニングするために効率的でない。
【０００６】
発明の概要
本発明は、生物学的試料又は試験試料において標的核酸を検出するための方法及び試験キットに関する。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、病原体の存在の高速かつハイスループットなスクリーニングのために使用される。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは既知の病原体のさまざまなオリゴヌクレオチド（プローブ）を含有し、そして１回のハイブリダイゼーションアッセイで病原体を識別する。
【０００７】
１つの側面において、本発明は、標的核酸を含有するポリヌクレオチドが生物学的試料又は試験試料中に存在するかどうかを決定する容易で且つ迅速な方法に関する。
別の側面において、本発明は、生物学的試料又は試験試料において病原体の標的核酸を検出するための方法であって、１つ以上の病原体中の保存領域に結合する１つ以上のプライマーペアを利用して試料中の標的核酸を増幅すること、増幅標的核酸をオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させること、そして、標的核酸のプローブへの結合を検出すること、を含む上記方法に関し、ここで、特定の病原体プローブへの結合が試料中の当該病原体の存在の指標となる。マイクロアレイは、異なった病原体に相補的なポリヌクレオチド配列を含む２つ以上のプローブあるいはプローブのセットを含む。
【０００８】
さらなる側面において、本発明は試料中の大腸菌及びサルモネラ菌を区別する方法に関する。該方法は、大腸菌及びサルモネラ菌中の保存領域に結合する１つ以上のプライマーペアを利用して試料中の核酸を増幅すること、増幅核酸をオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させること、そして、試料中の大腸菌及び／又はサルモネラ菌の存在の指標として核酸のプローブへの結合を検出することを含む。マイクロアレイは、大腸菌及びサルモネラ菌中の可変領域に相補的なポリヌクレオチド配列を含む２以上のプローブを含む。
【０００９】
別の側面において、本発明は、生物学的試料又は試験試料において病原体の標的核酸を検出するためのキットであって、該キットが少なくとも１つのプライマーペアを含み、そしてオリゴヌクレオチドマイクロアレイが固体支持体上に固定化される少なくとも１つのプローブを含む、上記キットに関する。
【００１０】
本発明の他の局面及び利点は、添付の図面と同様に、例として本発明の原理を説明する以下の記載から明らかとなるであろう。
発明の詳細な説明
Ｉ．病原体
「病原体」との用語は、疾患の要因となるものや疾患を生じるものを意味する。病原体との用語は、もっとも一般的には感染性生物を言うために使用される。これに限定されるわけではないが、これらは細菌、ウイルス、真菌及び原虫を含む。本発明の方法及びキットは、感染性疾患又は食中毒を引き起こした微生物及び病原体を同定するために有用である。限定されるわけではないが、病原体の例は、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、レンサ球菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ、プロテウス、アナエロバクター、結核菌、腸球菌、ポリオウイルス１、エンテロウイルス７１、エンテロウイルス７０、エコーウイルス２、エコーウイルス４、エコーウイルス６、エコーウイルス９、エコーウイルス１１、エコーウイルス１２、エコーウイルス２６、コクサッキーウイルスＡ１３、コクサッキーウイルスＡ１５、コクサッキーウイルスＡ１８、コクサッキーウイルスＡ２０、コクサッキーウイルスＡ２１、コクサッキーウイルスＢ３−Ａ、コクサッキーウイルスＢ３−Ｃ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２を含む。
【００１１】
ＩＩ生物学的試料及び試験試料
本明細書で使用する「生物学的試料」との用語は、生物から、又は生物の構成要素（例えば、細胞）から得られた試料を言う。１つの態様において、生物は哺乳動物である。別の態様において、生物はヒトである。試料はいかなる生物学的組織又は液体であってよい。しばしば、生物学的試料は患者に由来するであろう。限定されるわけではないが、そのような試料は、組織、細胞、血液、血清、脳脊髄液、尿、細胞溶解液、血漿、排泄物、喀痰、血球、細針生検試料、腹水、及び胸水、あるいはそれらに由来する細胞を含む。生物学的試料は、組織学的目的のために取られた凍結切片のような組織の切片を含んでいてもよい。
【００１２】
ある態様において、本発明は、生物学的試料が組織、細胞、血液、血清、脳脊髄液、尿、細胞溶解液、血漿、排泄物、喀痰、血球、細針生検試料、腹水、及び胸水、あるいはそれらに由来する細胞からなる群より選択される方法に関する。
【００１３】
本明細書で使用する「試験試料」との用語は、生きていない供給源から得られた試料を言う。限定されるわけではないが、試験試料の供給源は、食物、飲料、土壌、地下水、海水、及び湖沼水を含む。病原体及び病原体に感染した細胞は、通常はこれら試験試料に含有される。
【００１４】
生物学的試料及び試験試料の病原体は、特定の病原体の標的核酸の存在又は非存在により同定される。ある態様において、標的核酸はゲノム物質、ミトコンドリアＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び病原体のこれらの断片を含む。
【００１５】
病原体は、症状及び感染経路に依存して多数の群に分類される。多数の種類の標的核酸検出試薬及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイが、多数の群に対応するために調製される。症状に依存して選択される標的核酸検出試薬及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイが使用される。したがって、症状及び感染経路から予測される病原体の中から、真の病原体を高い精度で同定可能である。
【００１６】
ＩＩＩ．標的核酸
標的核酸は、検出しようとする病原体に固有のポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡを含む遺伝物質である。病原体に独特の標的核酸の存在を検出することにより、病原体自体の存在が推察される。同様に、病原体の属に特異的な標的核酸の存在は、その属のメンバーの存在を示す。
【００１７】
「ヌクレオチド配列」又は「核酸」又は「ポリヌクレオチド」との用語は交換可能に使用され、そしてヌクレオチドのヘテロポリマー又はこれらヌクレオチドの配列を言う。「オリゴヌクレオチド」は、約５０ヌクレオチド又はそれ以下のポリヌクレオチドを言う。これらの用語はまた、一本鎖又は二本鎖であってよく、そしてｃＤＮＡに対してセンス鎖又はアンチセンス鎖を表すＤＮＡ又はＲＮＡを言う。本明細書の配列において、Ａはアデニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、そしてＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ（Ｕ）である。ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、本明細書中で与えられる配列のＴ（チミン）はＵ（ウラシル）で置換されると考えられる。
【００１８】
「相補的」又は「相補性」との用語は、塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合を言う。例えば、配列５’−ＡＧＴ−３’は相補的配列３’−ＴＣＡ−５’に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のいくつかのみが結合するような「部分的」であってもよく、又は全面的な相補性が一本鎖分子間に存在するような「完全的」であってもよい。核酸分子鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率性及び強度に重要な影響を有する。
【００１９】
本明細書で使用する「精製された」又は「実質的に精製された」との用語は、示された核酸又はポリペプチドが、例えばポリヌクレオチド、タンパク質などのような他の生物学的巨大分子の実質的非存在中に存在することを意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「単離された」との用語は、その天然の供給源中の核酸と共に存在する少なくとも１つの他の構成要素から分離された核酸を言う。１つの態様において、核酸は、（もしあるとしても）溶媒、緩衝液、イオン又は核酸の溶液中に通常存在する他の構成要素のみの存在下に発見される。「単離された」及び「精製された」との用語は、それらの天然の供給源中に存在する核酸を包含しない。
【００２１】
本明細書で使用する「実質的に等価」又は「実質的に類似」とは、１つ以上の置換、欠失または付加により参照配列から変化した核酸配列を言い、その正味の効果は参照配列と対象配列間に反対の機能的相違をもたらさない。典型的には、そのような実質的等価配列は約３５％以下まで変化する（即ち、対応する参照配列と比較して、実質的等価配列における個々のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失の数を、実質的等価配列におけるヌクレオチドの総数で割ると、約０．３５以下である）。そのような配列は、記載配列に６５％配列同一性を有すると言う。１つの態様において、本発明の実質的等価配列は３０％以下まで参照配列から変化する（７０％配列同一）；本態様の変化において、２５％以下までであり（７５％配列同一）；そして、本態様のさらなる変化において、２０％以下までであり（８０％配列同一）；そして、本態様のさらなる変化において、１０％以下までであり（９０％配列同一）；そして、本態様のさらなる変化において、５％以下までである（９５％配列同一）。１つの態様において、ヌクレオチド配列は少なくとも約６５％同一性を有する。他の態様において、ヌクレオチド配列は少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一性を有する。
【００２２】
ある側面において、本発明は「標的核酸検出試薬」を調製することに関する。標的核酸検出試薬は、標的核酸自体か増幅標的核酸のいずれかであることが可能である。
標的核酸は、標準技術を使用して生物学的試料及び試験試料から単離される。使用される技術は、単離しようとするポリヌクレオチドのタイプにより、即ちＤＮＡかＲＮＡかにより決定されるであろう。単離技術はまた、調査する病原体のタイプ及び生物学的／試験試料の量に依存して修飾可能でもある。
【００２３】
ＩＶ．検出試薬
ある態様において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション前に、標的核酸を増幅して「標的核酸検出試薬」を生成する。他の態様において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション前に標的核酸を増幅せず、「標的核酸検出試薬」と標的核酸は同一である。１つの態様において、標的核酸又は増幅標的核酸は１つ以上のマーカー分子で標識される。マーカー分子の付着は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション時に、標的核酸又は増幅標的核酸の検出を容易にする。マーカー分子は当業者に周知の多くの手段のいずれかにより取り込まれてよい。１つの態様において、マーカー分子は、試料の標的核酸の調製における増幅工程の間に同時に取り込まれる。したがって、例えば、マーカー分子を含むプライマー又はヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、マーカー分子を含有する増幅産物を提供するであろう。ある態様において、マーカー分子はビオチン、磁気ビーズ、蛍光色素、放射線標識、酵素、比色分析標識、着色ガラス、又はプラスチックビーズを含む。１つの態様において、マーカー分子（例えば、蛍光標識ＵＴＰ及び／又はＣＴＰ）を含むヌクレオチドを使用した上記のような転写増幅は、転写された核酸中に標識を取り込む。
【００２４】
あるいは、マーカー分子を元の標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接添加してよい。核酸へマーカー分子を付着させる手段は当業者に周知であり、そして例えば、ニックトランスレーション又はキナーゼ反応を介した標的核酸のリン酸化による末端標識、及びそれに続く試料核酸をマーカー分子に連結する核酸リンカーの付着（ライゲーション）を含む。
【００２５】
本発明の使用に適した検出可能なマーカー分子は、分光的手段、光化学手段、生化学手段、免疫化学手段、電気的手段、光学手段又は化学手段により検出可能な任意の組成物を含む。本発明において有用なマーカー分子は、標識ストレプトアビジンコンジュゲートと共に染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射線標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、並びに金コロイドのような比色分析標識、又は着色ガラス又はプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）を含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；３，８５０，７５２号；３，９３９，３５０号；３，９９６，３４５号、４，２７７，４３７号；４，２７５，１４９号；及び４，３６６，２４１号を含む。１つの態様において、マーカー分子は増幅標的核酸中に取り込まれたマーカー分子を含むヌクレオチドである。
【００２６】
高い検出感受性を有しそして容易に操作されるので、マーカー分子を含むヌクレオチドは蛍光物質（Ｃｙ３、Ｃｙ５など）又はビオチンで標識されたヌクレオチド（モノマー）であることが可能である。マーカー分子を含むヌクレオチドはＰＣＲ反応により増幅しようとするポリヌクレオチド中に取り込まれ、そして増幅ポリヌクレオチドを標識する。ビオチンで標識されたヌクレオチドの場合、標識ポリヌクレオチドは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により可視化される。
【００２７】
ある態様において、本発明はＰＣＲ反応により標的核酸を増幅する増幅工程、及び標的核酸を含むポリヌクレオチドが増幅ＰＣＲ反応産物中に存在するかどうかを検出する遺伝子検出工程を含む。例えば、遺伝子検出工程において、ポリヌクレオチドの存在はオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して検出される。
【００２８】
Ｖ．標的核酸増幅工程
ある態様において、標的核酸検出試薬は標的核酸の増幅により産生される。１つの態様において、標的核酸検出試薬はＰＣＲを使用して増幅される。標的核酸増幅工程において、ＰＣＲ反応は、試料抽出物、標的核酸を含むポリヌクレオチドを増幅するための遺伝子検出プライマー試薬、及び標識ヌクレオチドを使用して実行される。試料抽出物は、ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出しそして精製するための既知のポリヌクレオチド抽出方法に従って、試験試料中に含有されるポリヌクレオチドを抽出しそして精製することにより得られる抽出物であり、そしてＰＣＲ反応において鋳型として利用される。
【００２９】
核酸と第二核酸がストリンジェントな条件下で同じプローブ核酸にハイブリダイズする場合、核酸は第二核酸と実質的に同一である。実質的に同一な核酸の間の相同性は、８０％、９０％、９５％あるいはそれ以上であることが可能である。
【００３０】
遺伝子増幅工程を実行するために、試料抽出物、病原体同定プライマー試薬、標識ヌクレオチド及び他の試薬、並びにＰＣＲ反応に必要な酵素は１つの反応チューブ中でＰＣＲ反応される。ＰＣＲ反応によって、ポリヌクレオチドは増幅される。
【００３１】
しばしば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーション前に核酸試料を増幅することが望ましい。限定されるわけではないが、適した増幅方法として、以下が挙げられる：
・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．サンディエゴ（１９９０））
・リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕとＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４；５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１；１０７７（１９８８）、及びＢａｒｒｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）
・転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）を参照されたい）
・自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０））
１つの態様において、標的核酸はＰＣＲを使用して増幅される。別の態様において、標的核酸は逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲを使用することにより増幅される。さらなる態様において、ＲＴ−ＰＣＲはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｒｏｍｅｇａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ２１０Ａ）から入手可能）を使用することにより実行される。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性真正細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ−８から得られた酵素の組み換え型であり、そして７４℃でＤＮＡを複製し９５℃で２０分の半減期を示す熱安定性酵素である。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、マグネシウムの存在下で５’→３’方向にヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡへのポリマー化を触媒し、マグネシウムの存在下で５’→３’方向にＲＮＡ鋳型を使用してヌクレオチドのＤＮＡへのポリマー化を触媒する。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼはしばしば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写及び高温でのプライマー伸張反応に使用される。
【００３２】
本発明の増幅方法は、以下の酵素の働きを用いる。つまり、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。本発明の方法及び組成物に使用するためのＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従ってプライマーの伸張をもたらすことが可能である。したがって、選択されたポリメラーゼは、少なくとも大部分はデオキシリボヌクレオチドが含まれる標的核酸鋳型に沿って核酸プライマーを伸張可能なものである。ポリメラーゼは、核酸鎖をその核酸鎖が結合しているポリヌクレオチドから移動させることが可能である。
【００３３】
いかなる逆転写酵素も本発明の実施に使用可能であり、限定されるわけではないが、Ｓｕｐｃｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴＩＩ、「標準の（ｒｅｇｕｌａｒ）」ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ、又はその組換え体を含む。
【００３４】
予想された病原体が試料抽出物中に存在せず、ポリヌクレオチドが試料抽出物中に存在しない場合、増幅ポリヌクレオチドはＰＣＲ反応産物中に存在せず、そしてポリヌクレオチドは続く遺伝子検出工程において検出されない。
【００３５】
予想された病原体が試料抽出物中に存在する場合、その病原体に由来するポリヌクレオチドはＰＣＲ反応における鋳型として機能する。病原体同定プライマー試薬中の対応する増殖プライマーの鋳型への結合によりＰＣＲ反応は進行し、これにより病原体に固有の標的核酸を含むポリヌクレオチドが増幅される。標識ヌクレオチドが増幅ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、即ちＰＣＲ産物に取り込まれる。したがって、ＰＣＲ反応産物は標識される。
【００３６】
標的核酸を増幅するために使用するプライマーは、細菌、ウイルス、真菌及び原虫からなる群より選択される病原体から単離されたポリヌクレオチドに基づき設計される。他の態様において、標的核酸を増幅するために使用するプライマーは以下のものから単離されたポリヌクレオチドに基づき設計される：リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、レンサ球菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ、プロテウス、アナエロバクター、結核菌、腸球菌、ポリオウイルス１、エンテロウイルス７１、エンテロウイルス７０、エコーウイルス２、エコーウイルス４、エコーウイルス６、エコーウイルス９、エコーウイルス１１、エコーウイルス１２、エコーウイルス２６、コクサッキーウイルスＡ１３、コクサッキーウイルスＡ１５、コクサッキーウイルスＡ１８、コクサッキーウイルスＡ２０、コクサッキーウイルスＡ２１、コクサッキーウイルスＢ３−Ａ、コクサッキーウイルスＢ３−Ｃ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２。いくつかの態様において、ＰＣＲは上記の病原体の少なくとも１つから単離されたポリヌクレオチド配列を含むプライマーを利用する。
【００３７】
ある態様において、特定のプライマーペアは１つより多くの病原体のポリヌクレオチドにアニーリング可能である。そのようなプライマーペアは、ある病原体中の保存された領域にアニーリング可能である。しかしながら、プライマーペアが隣接するヌクレオチド配列は可変領域である。そのようなプライマーペアの使用は多数の病原体の核酸配列の増幅を可能にするが、それでもなお、オリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズする時にこれらの病原体を識別することを可能にする。多くの細菌及び真菌の１６Ｓ／１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子由来の２つの同一領域をプライマーとして使用した場合、ＰＣＲ増幅により１９７塩基対（細菌）又は２４８塩基対（真菌）のＤＮＡ部分が与えられる。多数の低保存領域がプライマー領域間のＤＮＡ部分中に見出され、これがそれらに特異的な配列にしたがってハイブリダイゼーションにより病原体を選別するプローブを与える。細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡのＤＮＡ配列を示す図１Ａ及び１Ｂを参照されたい。保存領域間の可変プローブ領域と共に、２つの保存プライマー領域が示される。図２Ａ及び２Ｂは、真菌ＤＮＡ配列の１８Ｓ  ｒＤＮＡ部分中のプライマー及びプローブ領域を示す。
【００３８】
１つの態様において、ＰＣＲは配列番号１〜１２（表１）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むプライマーを利用する。プライマーペアのいくつかの組み合わせは、配列番号１と２；配列番号１と４；配列番号１と６；配列番号３と２；配列番号３と４；配列番号３と６；配列番号５と２；配列番号５と４；配列番号５と６；配列番号５と６；配列番号７と８；配列番号９と１０および／または配列番号１１と１２を含む。
【００３９】
【表１】
2009529857.tif 000003
【００４０】
配列の後の数字は、プライマーが様々な鋳型上にアニーリングするヌクレオチドの位置を示す。
ＶＩ．マイクロアレイ
「マイクロアレイ」は分離領域の直線又は２次元のマイクロアレイであり、それぞれが明確な区域を有し、固体支持体の表面上に形成される。標的核酸配列又はその続きの配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブマイクロアレイは、以下に記載するディスプレイ戦略の１つを使用して固体支持体上に固定化される。本発明の方法は、１つ以上の標的核酸配列に相補性を示すプローブを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイを採用する。典型的には、これらのプローブはＤＮＡであり、そして固体表面上の高密度マイクロアレイ（即ち、「ＤＮＡチップ」）中に固定化される。本質的に、いかなる考えられる基材が本発明に採用されて良い。基材は、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物学的、非生物学的、有機的、無機的、あるいはこれらの任意の組み合わせであってよい。基材は、ディスク、四角、球、円などのようないかなる都合の良い形を有してよい。基材は一般に平面であるが、様々な代替の表面配置を採用してよい。例えば、基材には、合成が行われる盛り上がった領域やくぼんだ領域を有していてよい。基材及びその表面は、本明細書に記載する反応を実行する硬い支持体を形成可能である。基材及びその表面はまた、適切な光吸収特性を与えるよう選択される。例えば、基材はポリマー化ラングミュアーブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）フィルム、機能性ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾シリコン、あるいは非常に様々なゲルまたはポリマー（（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）二フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はその組み合わせなど）のいずれか１つであってよい。他の基材材料は、本明細書の開示に接する当業者には容易に理解されるであろう。１つの態様において、基材は平面ガラスである。
【００４１】
基材上にオリゴヌクレオチドプローブマイクロアレイを順序付けてディスプレイするために様々な方法が利用可能であり、それにより標的核酸について引き出しうるハイブリダイゼーションパターン及び配列情報を最大限にする。例示的なディスプレイ及び順序付け法は、本明細書により参照により援用されるＰＣＴ特許公報ＷＯ９４／１２３０５号に記載される。
【００４２】
プローブはオリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド、あるいは相補的塩基対合により標的核酸配列とハイブリダイズ可能なこれらヌクレオチドポリマーのいかなる修飾型であることが可能である。修飾型は２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド及びいわゆるＰＮＡを含み、ＰＮＡはオリゴデオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合ではなくぺプチドを介して結合する。プローブは支持体に任意の連結により付着する（例えば、３’、５’又は塩基を介して）。３’方向はオリゴヌクレオチドの固相合成の化学に適合するので、３’での結合がより一般的である。標的核酸検出試薬の各タイプのプローブへのハイブリダイゼーションを識別するために、単一プローブの多数は基材上の分離された部位に固定化される。各分離された多数の単一プローブの多数を「スポット」と言う。スポットサイズは直径およそ０．７ｍｍから１ｍｍであることが可能で、各スポットは０．３５μＭから０．４０μＭ  ＤＮＡを有する。例えば、２つの病原体（レンサ球菌とサルモネラ菌）の存在するポリヌクレオチドを試験するＤＮＡマイクロアレイは２つのスポットを有する。つまり、１つはレンサ球菌のプローブからなり、他方はサルモネラ菌のプローブからなる。ある態様において、６、１２、２４、３６、５６、６４、９６、１０８、又は３８４のプローブの異なるスポットが基材上に固定される。１つの態様において、マイクロアレイは１．５ｃｍ２であることが可能である。
【００４３】
いくつかのマイクロアレイにおいて、全てのプローブは同じ長さである。他のマイクロアレイは異なる長さのプローブを採用する。特定のハイブリダイゼーション条件を最適化するために、プローブの長さは変化可能である。ハイブリダイゼーション条件を最適化して「ノイズ」を低減する。ハイブリダイゼーション反応のｐＨ、温度、及びイオン条件を変更することにより、ハイブリダイゼーション条件を修飾する。用語「ストリンジェント」は、ハイブリダイゼーションを起こすために核酸配列間に高い相補性を必要とするような当該技術分野で共通して理解される条件を言うために使用される。ストリンジェントな条件は高度にストリンジェントな条件を含み、即ち６５℃で０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのハイブリダイゼーションを含む。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合において、追加の例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３７℃で６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。４８℃、５５℃、６０℃及び６４℃のようなより高い温度は、より長いオリゴヌクレオチドに使用可能である。
【００４４】
別の態様において、本発明はオリゴヌクレオチドの洗浄及びマーカー分子の存在の検出をさらに含む方法に関する。例えば、洗浄は６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、そして中程度にストリンジェントな条件（即ち、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄）で実行可能である。
【００４５】
いくつかの態様において、プローブは、細菌、ウイルス、真菌、原虫からなる群より選択される病原体から単離されたポリヌクレオチドに相補的であるように設計される。他の態様において、プローブは、以下：
リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、レンサ球菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ、プロテウス、アナエロバクター、結核菌、腸球菌、ポリオウイルス１、エンテロウイルス７１、エンテロウイルス７０、エコーウイルス２、エコーウイルス４、エコーウイルス６、エコーウイルス９、エコーウイルス１１、エコーウイルス１２、エコーウイルス２６、コクサッキーウイルスＡ１３、コクサッキーウイルスＡ１５、コクサッキーウイルスＡ１８、コクサッキーウイルスＡ２０、コクサッキーウイルスＡ２１、コクサッキーウイルスＢ３−Ａ、コクサッキーウイルスＢ３−Ｃ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２
から単離されたポリヌクレオチドに相補的であるように設計される。別の態様において、プローブは配列番号１３〜５２（表２）からなる群より選択される。
【００４６】
【表２−１】
2009529857.tif 000004
【００４７】
【表２−２】
2009529857.tif 000005
【００４８】
いくつかの技術が上記の型の高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを設計し、合成し、ハイブリダイズし、そして解釈するために開発されてきた。
光方向性合成（ｌｉｇｈｔ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が、基材の表面上にオリゴヌクレオチドプローブを形成するために使用可能である（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７３（１９９１））。この光方向性合成は、半導体に基づく光リソグラフィーと固層化学合成を組み合わせる。光化学的に除去可能な保護基で修飾されたリンカーが固層基材、即ち基材表面に付着した場合、このプロセスは開始する。光解離性保護基を有するリンカーおよびホスホラミダイトが合成されており、これは、Ｐｅａｓｅらによる、ＰＮＡＳ、９１：１１２４１−１１２４５（１９９４）に記載されている。光は、光リソグラフマスクを介して合成表面の特定区域に向けられ、続く化学カップリングのためにこれらの区域を活性化する。一連の光解離性保護基を保持するヌクレオチドの初めは基材とインキュベートすることであり、そして先行する工程で光を照射した部位で化学カップリングが起こる。次いで、光はマスクの異なる部分を介して次の合成部位に向けられ、そして化学的工程では、オリゴヌクレオチドプローブの明確なコレクションが構築可能であり、それぞれが基材の表面上にその独特の住所を有する。増幅生成蛍光標識ＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ及びハイブリダイゼーションは、落射蛍光共焦点顕微鏡により検出される（Ｆｏｄｅｒら、１９９３）。
【００４９】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、試験しようとする各病原体に固有な全てのプローブを含有するスポットを有する。
したがって、本発明は、生物学的試料又は試験試料において病原体の標的核酸を検出するための方法に関する。本発明の方法は、標的核酸検出試薬を調製する工程と、標的核酸検出試薬をオリゴヌクレオチドマイクロアレイに接触させる工程とを含んでなる。いくつかの態様において、病原体は、レンサ球菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ、プロテウス、アナエロバクター、結核菌、腸球菌、ポリオウイルス１、エンテロウイルス７１、エンテロウイルス７０、エコーウイルス２、エコーウイルス４、エコーウイルス６、エコーウイルス９、エコーウイルス１１、エコーウイルス１２、エコーウイルス２６、コクサッキーウイルスＡ１３、コクサッキーウイルスＡ１５、コクサッキーウイルスＡ１８、コクサッキーウイルスＡ２０、コクサッキーウイルスＡ２１、コクサッキーウイルスＢ３−Ａ、コクサッキーウイルスＢ３−Ｃ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２からなる群より選択される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイはこれら列挙された病原体の少なくとも１つから単離されたポリヌクレオチド配列を含むプローブを含む。別の態様において、プローブは配列番号１３〜５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
ＶＩＩ．キット
ある局面において、本発明は試験試料において病原体の標的核酸を検出するためのキットに関する。キットは少なくとも１つのプライマーペアを含み、そしてオリゴヌクレオチドマイクロアレイは少なくとも１つのプローブを含む。１つの態様において、プライマーペアは配列番号１〜１２からなる群より選択されるプライマーを含む。別の態様において、プローブは配列番号１３〜５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本発明は以下の実施例によってより詳細に説明されるであろう。本例示及び態様は、説明のためのものであって限定的なものではないと考えるべきであり、本発明は本明細書に記載の詳細に限定されないが、添付する特許請求の範囲の範囲内及びその均等の範囲内で修飾してもよい。
【実施例】
【００５２】
ＶＩＩＩ．実施例
［実施例１］
ＤＮＡマイクロアレイ製造工程
１．ガラス表面洗浄
きれいなスライドをＨ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２（２：１）中に３０分間浸漬した。Ｈ２Ｏで３回洗浄し、次いで、メタノールで２回洗浄する。加圧空気の気流の下で乾燥し、次いで、８０℃で１０分間乾燥した。
【００５３】
２．ガラスシラン化
１ｍＭ  ＨＡｃ中の２％Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＥＤＡ）中で、３０分間室温（ＲＴ）で超音波処理した。Ｈ２Ｏで３回洗浄し、次いで、メタノールで２回洗浄する。Ｎ２の気流の下で乾燥し、次いで、１１０℃で１５分間乾燥した。
【００５４】
３．シラン化スライドをヘテロ二官能性架橋剤で修飾する
架橋剤溶液（ＤＭＦ中の１０％無水ピリジン８０ｍｌ中の３８４ｍｇ  ＰＤＩＴＣ（２ｍｍｏｌ））に２時間室温で浸漬した。ＤＭＦで３回すすぎ、次いで、ジクロロエタンで２回すすいだ。Ｎ２下で乾燥する。
【００５５】
４．マイクロアレイプリント及びＤＮＡ固定化
０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中の４０μＭ  ＮＨ２−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を活性化ガラススライド上に６０％の湿度でスポットする。１時間以上３７℃の飽和湿度下で反応する。水ですすぎ、そしてＨ２Ｏ中の６−アミノヘキサノール（１００ｍＭ）含有溶液中に沈めた。Ｈ２Ｏで１００℃で２〜３分間洗浄し、次いで加圧空気下で乾燥する。
【００５６】
【化１】
2009529857.tif 000006
【００５７】
［実施例２］
ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション工程
１．ＰＣＲ増幅及び標識
１μｌのＤＮＡ試料を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ（各）、及び０．２μＭ  Ｃｙ５標識プライマー（各）を含有する１００μｌのＰＣＲ反応緩衝液に添加する。次いで、５ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、そして以下の温度条件でＰＣＲ増幅した：
ｉ）    ９６℃  ２分
ｉｉ）  ９５℃  ２０秒
ｉｉｉ）６０℃  ２０秒
ｉｖ）  ７２℃  ３０秒
→工程ｉｉへ、２８サイクル
ｖ）    ７２℃  ２分
反応は全体で約１時間２０分かかる。
【００５８】
２．ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション
ＰＣＲ溶液を０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ  ｐＨ７．２を含有する５容量のハイブリダイゼーション緩衝液で希釈する。６１℃で１時間、ハイブリダイゼーションする。
【００５９】
３．ＤＮＡマイクロアレイ洗浄
ハイブリダイズしたスライドを０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳで１５分間３度にわたって５０℃で洗浄し、次いで０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウムで１５分間５０℃で洗浄する。Ｈ２Ｏですすぎ、次いで加圧空気下で乾燥する。
【００６０】
４．マイクロアレイ読み出し
ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション結果を、ＦｕｊｉＦｉｌｍＴＭ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ＦＬＡ３０００により読み出し、Ｃｙ５をＨｅＮｅ  Ｌａｓｅｒ（６３３ｎｍ）で励起する。そして、シグナル密度をパック（ｐａｃｋｅｄ）ソフトウエアＡｒｒａｙＧｕａｇｅＴＭで解析する。
【００６１】
［実施例３］
細胞を患者から単離した組織の切片から直接採取する。ＤＮＡを任意の公知のプロトコルを使用してこれらの細胞から抽出する。約２〜１０ｎｇのＤＮＡを２つのプライマーペア、すなわち、配列番号１・２及び配列番号７・８を使用してＰＣＲにより増幅する。増幅ＤＮＡを標識するためにＰＣＲ反応に［３２Ｐ］−ｄＣＴＰを含ませて、マーカー分子を有する標的核酸検出試薬を生成させた。
【００６２】
過剰の［３２Ｐ］−ｄＣＴＰを除去するためにスピンカラムによりマーカー分子を有する標的核酸検出試薬を精製し、そして９５℃でのインキュベーションにより変性させ、その後、直ちに氷上で冷却する。次いで、配列番号１３〜５２を含むプローブを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイの存在下で、高度にストリンジェントな条件下でマーカー分子を有する変性標的核酸検出試薬をインキュベートする。ハイブリダイゼーションは、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃で２時間おこない、その後０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃にて３回洗浄する。マイクロアレイをＸ線フィルムに暴露し、そしてオートラジオグラムを現像する。
【００６３】
［実施例４］
飲料水試料を、例えば貯水池から又は蛇口からのような典型的な飲料水源から単離する。試料を濃縮し、そして／またはろ過し、任意の病原体を単離する。任意の公知のプロトコルを使用して、ＤＮＡをこれらの細胞から抽出する。２つのプライマーペア、すなわち、配列番号１・２及び配列番号７・８を使用してＰＣＲにより、約２〜１０ｎｇのＤＮＡを増幅する。増幅ＤＮＡを標識するためにＰＣＲ反応に［３２Ｐ］−ｄＣＴＰを含ませ、これによりマーカー分子を有する標的核酸検出試薬を生成させる。
【００６４】
過剰の［３２Ｐ］−ｄＣＴＰを除去するためにスピンカラムによりマーカー分子を有する標的核酸検出試薬を精製し、そして９５℃でのインキュベーションにより変性し、その後直ちに氷上で冷却する。次いで、配列番号１３〜５２を含むプローブを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイの存在下で、高度にストリンジェントな条件下でマーカー分子を有する変性標的核酸検出試薬をインキュベートする。ハイブリダイゼーションは、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃で２時間おこない、その後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃にて３回洗浄する。マイクロアレイをＸ線フィルムに暴露し、そしてオートラジオグラムを現像する。
【００６５】
本発明を少なくとも１つの例示的な実施例に関して記載したが、本明細書を読んだとき多くの変化及び修飾が当業者には明らかになるであろう。したがって、そのようなすべての変化及び修飾を含むために、先行技術を考慮して付属の請求の範囲が出来るだけ広く解釈されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】図１Ａは、１６Ｓ  ｒＤＮＡの細菌ＤＮＡ配列の保存プライマー領域及び可変プローブ領域を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１６Ｓ  ｒＤＮＡの細菌ＤＮＡ配列の保存プライマー領域及び可変プローブ領域を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、１８Ｓ  ｒＤＮＡの細菌ＤＮＡ配列の保存プライマー領域及び可変プローブ領域を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１８Ｓ  ｒＤＮＡの細菌ＤＮＡ配列の保存プライマー領域及び可変プローブ領域を示す。
【図３】図３は、本発明の態様の概略図である。
【図１Ａ】
2009529857.tif 000007
【図１Ｂ】
2009529857.tif 000008
【図２Ａ】
2009529857.tif 000009
【図２Ｂ】
2009529857.tif 000010
【図３】
2009529857.tif 000011
【配列表】
2009529857000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月3日(2008.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料又は試験試料中の１つ以上の病原体の標的核酸を検出するための方法であって、
１つ以上の病原体中の保存領域に結合する１つ以上のプライマーペアを利用して、試料中の標的核酸を増幅することと、
増幅標的核酸をオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させること、ここで前記マイクロアレイは異なった病原体に相補的なポリヌクレオチド配列を含む２つ以上のプローブあるいはプローブのセットを含む、と、
標的核酸のプローブへの結合を検出すること、ここで特定の病原体プローブへの結合が試料中の当該病原体の存在の指標となる、と、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記病原体が、レンサ球菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、マイコプラズマ、リステリア・モノサイトゲネス、髄膜炎菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ、プロテウス、アナエロバクター、結核菌、腸球菌、ポリオウイルス１、エンテロウイルス７１、エンテロウイルス７０、エコーウイルス２、エコーウイルス４、エコーウイルス６、エコーウイルス９、エコーウイルス１１、エコーウイルス１２、エコーウイルス２６、コクサッキーウイルスＡ１３、コクサッキーウイルスＡ１５、コクサッキーウイルスＡ１８、コクサッキーウイルスＡ２０、コクサッキーウイルスＡ２１、コクサッキーウイルスＢ３−Ａ、コクサッキーウイルスＢ３−Ｃ、ＨＳＶ−１、及び、ＨＳＶ−２からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
プローブが配列番号１３〜５２からなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
前記標的核酸が大腸菌及びサルモネラ菌であり、そしてプローブが配列番号１４〜１７及び配列番号２２〜２６からなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
前記増幅工程が、配列番号１〜１２からなる群より選択される１つ以上のプライマーペアを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
プライマーペアが配列番号１〜２及び配列番号７〜８である、請求項１の方法。
【請求項７】
プローブが配列番号１３〜５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が、組織、細胞、血液、血清、脳脊髄液、尿、細胞溶解液、血漿、排泄物、喀痰、血球、細針生検試料、腹水、及び胸水、あるいはそれらに由来する細胞からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
試験試料中の少なくとも１つの病原体の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが配列番号１〜１２からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーペア、及び配列番号１３〜５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのプローブを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイを含み、ここでプローブは固体支持体上に固定化されている、上記キット。
【請求項１０】
プローブが配列番号１４〜１７及び配列番号２２〜２６からなる群より選択される、請求項９のキット。
【国際調査報告】
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