(57)【要約】  本発明は、デングウイルスの血清型のカプシドタンパク質を得る方法に関し、該カプシドタンパク質は、抗体依存性の免疫増幅を誘導することなく、レシピエントにウイルス投与に対する防御免疫応答を誘導することができる。得られた組換えタンパク質は、デングワクチン調製物を得るために、医薬品産業で使用されることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容生物にデングウイルスに対する免疫応答を誘導することができるワクチンであり、且つ単独又は他の抗原と組み合わせて、１つ又はいくつかのデングウイルス血清型のカプシドタンパク質を含むことを特徴とする、医薬製剤。
【請求項２】
デングウイルス１、２、３、又は４型のカプシドタンパク質を単独、混合、又はそれらの組合せで含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
体液性応答及び／又は細胞性応答を誘導することが可能な抗原との混合又は組合せで、前記カプシドタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項４】
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３として配列表に特定される１つ又はいくつかのタンパク質と混合された、前記カプシドタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１及び３に記載の医薬品製剤。
【請求項５】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２４として配列表に特定される１つ又は複数の配列と化学的に又は遺伝的に融合された、前記カプシドタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１及び３に記載の医薬製剤。
【請求項６】
凝集形状又は微粒子形状の前記カプシドタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１、２、３、４、及び５に記載の医薬品製剤。
【請求項７】
薬理学的に許容される媒体及び油性又は非油性のアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、及び６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
経口、筋内、皮下、粘膜、又は静脈内使用のための、デングウイルスに対する予防薬又は治療薬であることを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６、及び７に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野及び医薬品産業に関し、特に、デングウイルス（以下、ＤＥＮと呼ぶ）に再感染した患者で認められる抗体依存性感染増強現象を回避しながら、デングウイルスの感染に対して免疫応答を誘導することのできるタンパク質を得ることに関する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱（ＤＦ）及びデング出血熱（ＤＨＦ）は、健康問題としてますます重要性を高め、地球の熱帯及び亜熱帯の様々な国に影響を及ぼしている。デングウイルスは、１００カ国以上で確認されており、危険地域には２５億の人々が住んでいると推定される。毎年、ＤＦは５，０００万から１億の間の症例数、及びＤＨＦは２５万から５０万の症例数が報告される。（Ｇｕｚｍａｎ  Ｍ．Ｇ．及びＫｏｕｒｉ  Ｇ．  ２００２．Ｄｅｎｇｕｅ：最新版Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２：３３〜４２）。
【０００３】
この疾患の病原体は、蚊のネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）によって伝搬されるフラビウイルス科フラビウイルス属のデングウイルスである（Ｌｅｙｓｓｅｎ  Ｐ．、Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｏ  Ｅ．、Ｎｅｙｔｓ  Ｊ．、２０００、「フラビウイルス科による感染症治療の展望（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）」、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：６７〜８２）。
【０００４】
現在までに、同じ領域で循環することができる４種の血清型が報告されている。デングウイルスは、ＲＮＡプラス鎖コートウイルスであり、そのゲノムは、１つの読み枠しか含まない。このＲＮＡは、３種の構造タンパク質及び７種の非構造タンパク質にプロセシングされるポリタンパク質に翻訳される（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ．Ｋ．、Ｂｒａｎｄｔ  Ｗ．Ｅ．、Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ  Ｊ．Ｍ．、１９８０、「フラビウイルスの化学構造及び抗原構造（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）」、Ｔｈｅ  ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｅｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｒ．Ｗ．（編集）、５０３〜５２９）。
【０００５】
最も重症な型のデング病を引き起こす危険因子を決定するために、複数の疫学的研究が行なわれてきた。これは、高熱、体液の排出、出血、及び最終的にデングショックによって特徴付けられる（Ｇｕｂｌｅｒ  Ｄ．Ｊ．、１９９８、「デング熱及びデング出血熱（Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ）」、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１：４８０〜４９６）。最も重要な危険因子のうちの１つは、異種血清型による二次感染である。異なる血清型の感染の間には交差防御は存在しない（Ｋｏｕｒｉ  Ｇ．、Ｇｕｚｍａｎ  Ｍ．Ｇ．、Ｂｒａｖｏ  Ｊ．、Ｔｒｉｎａ  Ｃ．、１９８９、「デング出血熱／デングショック症候群：キューバの流行からの教訓（Ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ／ｄｅｎｇｕｅ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｕｂａｎ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ）」、ＷＨＯ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＯＭＳ．６７：３７５〜３８０）。
【０００６】
この現象を説明するために、いくつかの仮説がある。最も重要なもののうちの１つは、抗体依存性感染増強である（Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｓ．Ｂ．、Ｓｃａｎｌｏｎ  Ｊ．Ｅ．、Ｕｍｐａｉｖｉｔ  Ｐ．、Ｕｄｏｍｓａｋｄｉ  Ｓ．、１９６９、「タイにおけるデング及びチクングンヤ熱ウイルスのヒトへの感染、１９６２〜１９６４、ＩＶ．バンコク都市圏における疫学研究（Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｎ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ、１９６２〜１９６４、ＩＶ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｎｇｋｏｋ  ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ  ａｒｅａ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１８：９９７〜１０２１）。
【０００７】
最初の研究により、ＤＥＮウイルスは、このウイルスに以前に感染したことのある患者の血液から得た末梢単核球でより大きな測定値で複製することが提示された（Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｓ．Ｂ．、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  Ｅ．Ｊ．、Ａｌｌｉｓｏｎ  Ａ．Ｃ．、１９７７、（「デングウイルス及び単核食細胞、ＩＩ．生体外感染を裏付ける血液及び組織白血球の同一性（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．  ＩＩ．Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：２１８〜２２９）。その後、残留抗体がこの効果の原因であることが実証された（Ｍｏｒｅｎｓ  ＤＭ、Ｈａｌｓｔｅａｄ  ＳＢ、Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ  ＮＪ、１９８７、「２型デングウイルス感染症の抗体依存性感染増強のプロファイル（Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ．Ｏｃｔ；３（４）：２３１〜７）。
【０００８】
中和化されていない抗体の特異性又は濃度の条件において、抗体−ウイルス複合体は、単球及びマクロファージのような、膜にＦｃγレセプターを提示する細胞によって、内部化され得る。抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）として知られているこの機序は、二次感染の間に起こる（Ｍｏｒｅｎｓ  ＤＭ、Ｈａｌｓｔｅａｄ  ＳＢ、Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ  ＮＪ、１９８７、「２型デングウイルス感染症の抗体依存性感染増強のプロファイル（Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ、Ｏｃｔ；３（４）：２３１〜７；Ｋｌｉｋｓ  Ｓ．Ｃ．、Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ  Ｓ．、Ｎｉｓａｌａｋ  Ａ．、Ｂｕｒｋｅ  Ｄ．Ｓ．、１９８８、「母性デング抗体は、乳児のデング出血熱の発症において重要であるという証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３８：４１１〜４１９）。
【０００９】
Ｈａｌｓｔｅａｄら（Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｓ．Ｂ．、Ｓｃａｎｌｏｎ  Ｊ．Ｅ．、Ｕｍｐａｉｖｉｔ  Ｐ．、Ｕｄｏｍｓａｋｄｉ  Ｓ．、１９６９、「タイにおけるデング及びチクングンヤ熱ウイルスのヒトへの感染、１９６２〜１９６４、ＩＶ．バンコク都市圏における疫学研究（Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｎ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ、１９６２〜１９６４、ＩＶ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｎｇｋｏｋ  ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ  ａｒｅａ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１８：９９７〜１０２１）は、タイ、バンコクでの３年間の研究で、小児のＤＥＮ感染症による入院指数が、７ヵ月から８ヵ月の小児で最大に達したと報告した。これらの指数は、１ヵ月から３ヵ月の乳児で観察された指数よりは、４倍から８倍高く、３歳児の指数よりは２倍高かった。Ｋｌｉｋｓら（Ｋｌｉｋｓ  Ｓ．Ｃ．、Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ  Ｓ．、Ｎｉｓａｌａｋ  Ａ．、Ｂｕｒｋｅ  Ｄ．Ｓ．、１９８８、「母性デング抗体は、乳児のデング出血熱の発症において重要であるという証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３８：４１１〜４１９）は、ＤＥＮ−２に対する移行中和抗体価（ｍａｔｅｒｎａｌ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒｓ）と、同種ウイルス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ）による感染によって引き起こされたＦＨＤを有する１３人の子供の年齢との間の関係を決定した。この結果は、移行抗体のレベルが中和レベル以下（ｓｕｂｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ）まで低下したときに、ウイルスによる重篤な感染の症例が生じたことを示した。これらのデータは、移行抗体がまず防御しその後ＤＨＦの発症を促す２つの役割を担うという仮説と一致する。
【００１０】
この免疫現象にもかかわらず、今日の世界の最先端のワクチン候補株は、エンベロープタンパク質を含む、異なる４種の血清型の弱毒ウイルスに基づく。これらの候補株は、ヒトボランティアにおいて、露出したタンパク質（ＰｒＭ／Ｍ及びエンベロープ）に対する抗体の潜在的な増幅と４種のウイルス血清型に対する抗体を中和するプロテクターとを誘導することができる（Ｋａｎｅｓａ−ｔｈａｓａｎ  Ｎ．、Ｓｕｎ  Ｗ．、Ｋｉｍ−Ａｈｎ  Ｇ．、Ｖａｎ  Ａｌｂｅｒｔ  Ｓ．、Ｐｕｔｎａｋ  Ｊ．Ｒ．、Ｋｉｎｇ  Ａ．、Ｒａｅｎｇｓａｋｕｌｓｒａｃｈ  Ｂ．、Ｃｈｒｉｓｔ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｈ．、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｋ．、Ｚａｈｒａｄｎｉｋ  Ｊ．Ｍ．、Ｖａｕｇｈｎ  Ｄ．Ｗ．、Ｉｎｎｉｓ  Ｂ．Ｌ．、Ｓａｌｕｚｚｏ  Ｊ．Ｆ．、及びＨｏｋｅ  Ｃ．Ｈ．、２００１、「ヒトボランティアでの弱毒デングウイルスワクチン（アベンティスパスツール社）の安全性及び免疫原性（Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ．１９：３１７９〜３１８８）。
【００１１】
免疫化後、高レベルの中和抗体は、抗体促進の誘導にもかかわらず、ウイルス複製を阻止することができた。ワクチン接種を受けた人において、中和抗体に関して４種の血清型への全体的な血清型の変換が、血液中で得られない又は低レベルまで減少するとき、問題が起こる可能性があり、個体は、次いで防御抗体が存在しないウイルス血清型による重い二次感染に罹患しやすくなる。実際に、サル及びヒトでのいくつかの試験が、ワクチン製剤でのウイルス量を定義するために行なわれた（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  Ｆ．、Ａｒｒｏｙｏ  Ｊ．、Ｐｕｇａｃｈｅｖ  Ｋ．Ｖ．、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｃ．、Ｚｈａｎｇ  Ｚ．Ｘ．、Ｗｅｌｔｚｉｎ  Ｒ．、Ｇｅｏｒｇａｋｏｐｏｕｌｏｓ  Ｋ．、Ｃａｔａｌａｎ  Ｊ．、Ｏｃｒａｎ  Ｓ．、Ｓｏｉｋｅ  Ｋ．、Ｒａｔｅｒｒｅｅ  Ｍ．、Ｍｏｎａｔｈ  Ｔ．Ｐ．、２００１、「非ヒト霊長類での４価黄熱−デングキメラウイルスワクチンの構造、安全性、及び免疫原性（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ−ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７２９０〜７３０４）。
【００１２】
一部の症例では、血清型変換のバランスは、４種の血清型に対して得られなかった（Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ  Ａ、Ｌａｎｇ  Ｊ、Ｃｈａｎｔｈａｖａｎｉｃｈ  Ｐ、Ｙｏｋｓａｎ  Ｓ、Ｆｏｒｒａｔ  Ｒ、Ａｔｔａｎａｔｈ  Ｐ、Ｓｉｒｉｖｉｃｈａｙａｋｕｌ  Ｃ、Ｐｅｎｇｓａａ  Ｋ、Ｐｏｊｊａｒｏｅｎ−Ａｎａｎｔ  Ｃ、Ｃｈｏｋｅｊｉｎｄａｃｈａｉ  Ｗ、Ｊａｇｓｕｄｅｅ  Ａ、Ｓａｌｕｚｚｏ  ＪＦ、Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ  Ｎ、２００２、「タイ成人ボランティアにおける４価の弱毒デング生ワクチンの安全性及び免疫原性：血清型濃度、比率、及び反復投与の役割（Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｔｈａｉ  ａｄｕｌｔ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｒａｔｉｏ，ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅｓ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．６６（３）：２６４〜７２）。さらに、中和抗体に関して、全体的な血清型の変換のために小児に弱毒ワクチンを３用量まで投与することが必要であったが、これらの抗体が時間内に持続するかどうか依然として不明であった（Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ  Ａ、Ｌａｎｇ  Ｊ、Ｃｈａｎｔｈａｖａｎｉｃｈ  Ｐ、Ｙｏｋｓａｎ  Ｓ、Ｆｏｒｒａｔ  Ｒ、Ａｔｔａｎａｔｈ  Ｐ、Ｓｉｒｉｖｉｃｈａｙａｋｕｌ  Ｃ、Ｐｅｎｇｓａａ  Ｋ、Ｐｏｊｊａｒｏｅｎ−Ａｎａｎｔ  Ｃ、Ｃｈａｍｂｏｎｎｅａｕ  Ｌ、Ｓａｌｕｚｚｏ  ＪＦ、Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ  Ｎ、２００４、「５歳から１２歳のタイの小児における２種類の４価デング弱毒生ワクチンの３投与量までの安全性及び免疫原性（Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｔｈｒｅｅ  ｄｏｓｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｆｉｖｅ−  ｔｏ  ｔｗｅｌｖｅ−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  Ｔｈａｉ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ．；２３（２）：９９〜１０９）。これは、デングウイルスのエンベロープタンパク質を含むワクチン製剤、即ち開発中のワクチン候補で最も問題となる関心事のうちの１つである。
【００１３】
現在、第Ｉ相／第ＩＩ相臨床試験中の弱毒ワクチンの別の不利な点は、安全性である。最初の投与後の、熱、筋肉痛、点状出血、及び頭痛等の成人及び小児における副作用の存在が、いくつかの研究で実証されている（Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ  Ａ、Ｌａｎｇ  Ｊ、Ｃｈａｎｔｈａｖａｎｉｃｈ  Ｐ、Ｙｏｋｓａｎ  Ｓ、Ｆｏｒｒａｔ  Ｒ、Ａｔｔａｎａｔｈ  Ｐ、Ｓｉｒｉｖｉｃｈａｙａｋｕｌ  Ｃ、Ｐｅｎｇｓａａ  Ｋ、Ｐｏｊｊａｒｏｅｎ−Ａｎａｎｔ  Ｃ、Ｃｈａｍｂｏｎｎｅａｕ  Ｌ、Ｓａｌｕｚｚｏ  ＪＦ、Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ  Ｎ、２００４、「５歳から１２歳のタイの小児における２種類の４価デング弱毒生ワクチンの３投与量までの安全性及び免疫原性（Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｔｈｒｅｅ  ｄｏｓｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｆｉｖｅ−  ｔｏ  ｔｗｅｌｖｅ−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  Ｔｈａｉ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ．；２３（２）：９９〜１０９）。一般に、生ワクチンに潜在的に関連する病原性復帰の現象が起こり得る。
【００１４】
新規の代替物の探索では、組換え方法を介して得られる、エンベロープタンパク質又はこのタンパクの断片に基づく様々な変異種のワクチン候補が開発されてきた。これらの組換えによる候補は、生ウイルスの接種に関連する安全問題を回避し、且つ４種の血清型に対する均衡のとれた応答が誘導されない場合、個体を感作することができる（Ｖｅｌｚｉｎｇ  Ｊ、Ｇｒｏｅｎ  Ｊ、Ｄｒｏｕｅｔ  ＭＴ、ｖａｎ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ  Ｇ、Ｃｏｐｒａ  Ｃ、Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  ＡＤ、Ｄｅｕｂｅｌ  Ｖ、１９９９、「２型デングウイルスに対する防御免疫の誘導：候補の弱毒生ワクチン及び組換えワクチンの比較（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｍａｒ  １７；１７（１１〜１２）：１３１２〜２０）。一方で、これらの候補株は、血清型に特異的で適切な防御免疫応答を刺激するために、ヒトではその使用がまだ承認されていない強力なアジュバントを必要とする（Ｈｅｒｍｉｄａ  Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ、Ｌａｚｏ  Ｌ、Ｓｉｌｖａ  Ｒ、Ｚｕｌｕｅｔａ  Ａ、Ｃｈｉｎｅａ  Ｇ、Ｌｏｐｅｚ  Ｃ、Ｇｕｚｍａｎ  ＭＧ、Ｇｕｉｌｌｅｎ  Ｇ、２００４、「Ｐ６４ｋの髄膜炎菌タンパク質担体の構造内に挿入された２型デングエンベロープ断片は、マウス内のウイルスに対して機能的免疫応答を可能にする。（Ａ  ｄｅｎｇｕｅ−２  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐ６４ｋ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎａｂｌｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４、Ｊａｎ；１１５（１）：４１〜９）。
【００１５】
中和抗体の液性応答は、動物で広範囲にわたって研究され、そのプロテクター効果が実証された。デング熱のプロテクター機序としての細胞傷害性の細胞性免疫応答は、詳しく研究されていない。それどころか、細胞性応答の誘導と疾患の最も重症な型の間の相互関係を実証するいくつかの報告がある（Ｒｏｔｈｍａｎ  Ａ．Ｌ．及びＥｎｎｉｓ  Ｆ．Ａ．、１９９９、「デング出血熱の免疫病原性（Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２５７：１〜６）。これらの研究は、ＤＨＦを示す個体における活性化Ｔ細胞の高レベルの存在に基づいている（Ｇｒｅｅｎ  Ｓ、Ｐｉｃｈｙａｎｇｋｕｌ  Ｓ、Ｖａｕｇｈｎ  ＤＷ、Ｋａｌａｙａｎａｒｏｏｊ  Ｓ、Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ  Ｓ、Ｎｉｓａｌａｋ  Ａ、Ｋｕｒａｎｅ  Ｉ、Ｒｏｔｈｍａｎ  ＡＬ、Ｅｎｎｉｓ  ＦＡ、１９９９、「デング出血熱を有する小児由来の末梢血リンパ球上のＣＤ６９初期発現（Ｅａｒｌｙ  ＣＤ６９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）」、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１８０（５）：１４２９〜３５）。
【００１６】
Ｔ細胞エピトープは、主に非構造性タンパク質で報告されている（Ｋｕｒａｎｅ  Ｉ、Ｚｅｎｇ  Ｌ、Ｂｒｉｎｔｏｎ  ＭＡ、Ｅｎｎｉｓ  ＦＡ、１９９８、「デングウイルス２、３、及び４型に対して交差反応を示すヒトＣＤ４＋  細胞傷害性Ｔリンパ球クローンによって認識されるＮＳ３上のエピトープの定義（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ＮＳ３  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅｓ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅｓ  ２、３、ａｎｄ  ４）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８  Ｊａｎ  ２０；２４０（２）：１６９〜７４）が、エンベロープ及びカプシドタンパク質にも存在する（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．、Ｉ．Ｋｕｒａｎｅ、Ｃ．Ｊ．Ｌａｉ、Ｍ．Ｂｒａｙ、Ｂ．Ｆａｌｇｏｕｔ、及びＦ．Ａ．Ｅｎｎｉｓ、１９８９、「デングウイルス特異的交差反応性ＣＤ８ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＣＤ８  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：５０８６〜５０９１；Ｇａｇｎｏｎ  Ｓ．Ｊ．、Ｚｅｎｇ  Ｗ．、Ｋｕｒａｎｅ  Ｉ．、Ｅｎｎｉｓ  Ｆ．Ａ．、１９９６、「血清型特異的及び血清型交差反応性パネルのヒトＣＤ４＋  細胞傷害性Ｔリンパ球クローンによって認識される４型デングウイルスのカプシドタンパク質上の２つのエピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ４  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅｓ）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：１４１〜１４７）。それにもかかわらず、細胞性免疫応答の誘導のみに基づくこれら一部のタンパク質の防御特性は、実証されていない。
【００１７】
免疫増強現象を回避するワクチンの候補株の探索では、非構造的タンパク質ＮＳ１及びＮＳ３を用いる研究が行なわれた。ＮＳ１の場合、組換えタンパク質を用いて免疫したマウスにおける予防は、あるレベルに達した。同様の結果が、ＮＳ１遺伝子を含む裸のＤＮＡを用いて抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機序を通して得られた（Ｗｕ  ＳＦ、Ｌｉａｏ  ＣＬ、Ｌｉｎ  ＹＬ、Ｙｅｈ  ＣＴ、Ｃｈｅｎ  ＬＫ、Ｈｕａｎｇ  ＹＦ、Ｃｈｏｕ  ＨＹ、Ｈｕａｎｇ  ＪＬ、Ｓｈａｉｏ  ＭＦ、Ｓｙｔｗｕ  ＨＫ、２００３、「マウスでの２型デングウイルスに対するＤＮＡワクチンにおける非構造的タンパク質ＮＳ１を用いての予防効果及び免疫機構の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＳ１  ｉｎ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ２  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｓｅｐ  ８；２１（２５〜２６）：３９１９〜２９）。それにもかかわらず、ヒト内皮細胞を認識する抗体の誘導による自己免疫の現象においてそれらが役割を任う可能性について報告がある（Ｃｈｉｏｕ−Ｆｅｎｇ  Ｌｉｎ、Ｈｕａｎ−Ｙａｏ  Ｌｅｉ、Ａｉ−Ｌｉ  Ｓｈｉａｕ、Ｈｓｉａｏ−Ｓｈｅｎｇ  Ｌｉｕ、Ｔｒａｉ−Ｍｉｎｇ  Ｙｅｈ、Ｓｈｕｎ−Ｈｕａ  Ｃｈｅｎ、Ｃｈｉｎｇ−Ｃｈｕａｎ  Ｌｉｕ、Ｓｈｕ−Ｃｈｅｎ  Ｃｈｉｕ、及びＹｅｅ−Ｓｈｉｎ  Ｌｉｎ、２００２、「一酸化窒素の生成を介してデングウイルスの非構造的タンパク質１に対する抗体によって誘導される内皮細胞のアポトーシス（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｖｉａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５７〜６６４）。さらに、ＮＳ３遺伝子を含む裸のＤＮＡ製剤を用いる防御についての報告がある。しかしながら、受身免疫を用いて同じ予防が得られたために、この予防は産生された抗体によって媒介されたことが実証された（Ｔａｎ  ＣＨ、Ｙａｐ  ＥＨ、Ｓｉｎｇｈ  Ｍ、Ｄｅｕｂｅｌ  Ｖ、Ｃｈａｎ  ＹＣ、１９９０、「デング１型ウイルスの非構造的タンパク質ＮＳ３に向けられるモノクローナル抗体を用いるマウスにおける受身防御の研究（Ｐａｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＳ３  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  １  ｖｉｒｕｓ）」、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１９９０  Ｍａｒ；７１（Ｐｔ３）：７４５〜９）。さらに、ＮＳ３タンパク質エピトープの研究に基づき、異種ウイルスによる感染に直面している細胞性応答は潜在的に有害であり得るという、仮説は注目に値する（Ｚｉｖｎｙ  Ｊ、ＤｅＦｒｏｎｚｏ  Ｍ、Ｊａｒｒｙ  Ｗ、Ｊａｍｅｓｏｎ  Ｊ、Ｃｒｕｚ  Ｊ、Ｅｎｎｉｓ  ＦＡ、Ｒｏｔｈｍａｎ  ＡＬ、１９９９、「部分的な作用薬効果は、異種デングウ��ルス血清型への細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答に影響を及ぼす。（Ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ．）」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｅｐ１；１６３（５）：２７５４〜６０）。
【００１８】
デングウイルスのカプシドタンパク質の場合、致死的デングウイルスの攻撃に対する防御の証拠は報告されていない。関連するフラビウイルスに関して、著者が日本脳炎（ＪＥ）カプシドタンパク質の遺伝子を含む裸のＤＮＡ製剤をマウスに接種した報告書が発表された。この製剤は、細胞傷害性応答の実証にもかかわらず、マウスにおいて致死的ＪＥウイルスの攻撃に対する防御反応を誘導しなかった（Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｅ、Ａｊｉｒｏ  Ｎ、Ｎｕｋｕｚｕｍａ  Ｃ、Ｍａｓｏｎ  ＰＷ、Ｋｕｒａｎｅ  Ｉ、２００３、「マウスにおいて中和抗体又は細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する日本脳炎ウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの予防効果の比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｓｅｐ  ８；２１（２５〜２６）：３６７５〜８３）。
【００１９】
組換えタンパク質カプシドを用いる防御は、ヒトパピローマウイルスの症例でのみ実証された。しかしながら、Ｃ型肝炎ウイルスのような他のウイルスによるそのプロテクターの役割が示唆された。それにもかかわらず、すべての症例では、それらは、ウイルス感染を除去するために細胞傷害性応答が免疫系の唯一の手段である慢性感染症又は腫瘍である（Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  Ｓ、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  Ｌ、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｏｂｒｅｇｏｎ  ＪＣ、Ｈｅｒｒｅｒａ  Ａ、Ｌｏｒｅｎｚｏ  ＬＪ、Ｐｉｃｈａｒｄｏ  Ｄ、Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｊ、２０００、「Ｃ型肝炎ウイルスコアの切断型変異体は、ＤＮＡ免疫化の後、マウスにおいて遅いが強力な免疫応答を誘導する。（Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｓｌｏｗ  ｂｕｔ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．）」、Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｎｏｖ  ２２；１９（７〜８）：９９２〜７；Ｓｕｚｉｃｈ  ＪＡ、Ｇｈｉｎ  ＳＪ、Ｐａｌｍｅｒ−Ｈｉｌｌ  ＦＪら、１９９５、「パピローマウイルスＬ１タンパク質による全身免疫化は、ウイルス性の粘膜乳頭腫パピローマの発症を完全に阻止する。（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｌ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｓ．）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；９２：１１５５３〜５７）。これらの疾患は、ヒトにおけるデング熱による感染症で示される急性プロファイルと一致しない（Ｖａｕｇｈｎ  Ｄ．Ｗ．、Ｇｒｅｅｎ  Ｓ．、Ｋａｌａｙａｎａｒｏｏｊ  Ｓ．、Ｉｎｎｉｓ  Ｂ．Ｌ．、Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ  Ｓ．、Ｓｕｎｔａｙａｋｏｒｎ  Ｓ．、Ｅｎｄｙ  Ｔ．Ｐ．、Ｒａｅｎｇｓａｋｕｌｒａｃｈ  Ｂ．、Ｒｏｔｈｍａｎ  Ａ．Ｌ．、Ｅｎｎｉｓ  Ｆ．Ａ．及びＮｉｓａｌａｋ  Ａ．、２０００、「デングウイルス血症の力価、抗体応答パターン、及びウイルス血清型は、疾患の重症度と相関する。（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｅｍｉａ  ｔｉｔｅｒ，ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ．）」、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１８１：２〜９）。
【００２０】
デングウイルスのカプシドタンパク質は、９〜１２ｋＤａ（１１２〜１２７個のアミノ酸）の分子量を有し、且つそのアミノ酸の２５％がアルギニンとリシンであるために顕著な塩基特性を有する。これらのアミノ酸の存在は、ポリカチオン性ペプチド自体の能力のために、免疫系に抗原提示を支持することが可能である（Ｌｉｎｇｎａｕ  Ｋ．、Ｅｇｙｅｄ  Ａ．、Ｓｃｈｅｌｌａｃｋ  Ｃ．、Ｍａｔｔｎｅｒ  Ｆ、Ｂｕｓｃｈｌｅ  Ｍ．、Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｗ．、２００２、「ポリ−ｌ−アルギニンは、増強され且つ持続する免疫応答のためにＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）と共力して、ＣｐＧ−ＯＤＮに誘導される炎症促進性サイトカインの全身放出を阻止する。（Ｐｏｌｙ−ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣｐＧ−ｍｏｔｉｆｓ  （ＣｐＧ−ＯＤＮ）  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ＣｐＧ−ＯＤＮ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．）」、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０：３４９８〜３５０８）。タンパク質は、何ら露出する領域もなくビリオン構造内に完全に位置する（Ｋｕｈｎ  ＲＪ、Ｚｈａｎｇ  Ｗ、Ｒｏｓｓｍａｎｎ  ＭＧ、Ｐｌｅｔｎｅｖ  ＳＶ、Ｃｏｒｖｅｒ  Ｊ、Ｌｅｎｃｈｅｓ  Ｅ、Ｊｏｎｅｓ  ＣＴ、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  Ｓ、Ｃｈｉｐｍａｎ  ＰＲ、Ｓｔｒａｕｓｓ  ＥＧ、Ｂａｋｅｒ  ＴＳ、Ｓｔｒａｕｓｓ  ＪＨ、２００２、「デングウイルスの構造：フラビウイルス組織、成熟、及び融合に対する影響（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ）」、Ｃｅｌｌ．Ｍａｒ  ８；１０８（５）：７１７〜２５）。
【００２１】
Ｊｏｎｅｓ及び同僚（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｔ．Ｊｏｎｅｓ、Ｌｉｘｉｎ  Ｍａ、Ｊｏｈｎ  Ｗ．Ｂｕｒｇｎｅｒ、Ｔｅｒｅｓａ  Ｄ．Ｇｒｏｅｓｃｈ、Ｃａｒｏｌ  Ｂ．Ｐｏｓｔ、及びＲｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｋｕｈｎ、２００３、「フラビウイルスカプシドは、二量体アルファヘリックスのタンパク質である。（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｉｓ  ａ  Ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐ７１４３〜７１４９、Ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．１２）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え方法によって得たＶＤ２カプシドタンパク質を精製して、このタンパク質が核酸なしで溶液中で二量体のような挙動を示すことを実証した。その二次構造は、主にアルファヘリックスの形状であり、且つこれらのヘリックスの４つによって構成され、Ｃ末端の終端でより大きな長さのうちの１つがある。Ｎ末端の終端は、定義される構造を示さず、その欠失は、タンパク質の構造的完全性に影響を及ぼさない。
【００２２】
本発明は、大腸菌での組換えによりわずか４０％の純度で得たＤＥＮ−２ウイルスのカプシドが、マウスにおいて致死的ＤＥＮ−２ウイルスによる曝露に対して防御免疫応答を誘導できることを初めて記述する。この高度に精製したタンパク質はその防御能を維持することが実証された。この防御能は、分子の微粒子化形状によるマウスの免疫化において優れていた。さらに、達成した防御は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって媒介されたことが実証された。今まで報告されたカプシドのＴ細胞のエピトープが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞によって認識されることを考えると、新規の要素である（Ｇａｇｎｏｎ  ＳＪ、Ｚｅｎｇ  Ｗ、Ｋｕｒａｎｅ  Ｉ、Ｅｎｎｉｓ  ＦＡ、１９９６、「血清型特異的及び血清型交差反応性パネルのヒトＣＤ４＋細胞傷害性Ｔリンパ球クローンによって認識される４型デングウイルスのカプシドタンパク質上の２つのエピトープの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ４  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ−ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｌｏｎｅｓ）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０（１）：１４１〜７；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＣＰ、Ｄｏｎｇ  Ｔ、Ｃｈａｕ  ＮＶ、Ｄｕｎｇ  ＮＴ、Ｃｈａｕ  ＴＮ、Ｔｈａｏ  Ｉｅ  ＴＴ、Ｄｕｎｇ  ＮＴ、Ｈｉｅｎ  ＴＴ、Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ、Ｆａｒｒａｒ  Ｊ、２００５、「デングウイルスによる二次感染したベトナム人成人におけるデングウイルスエピトープに対する初期のＴ細胞応答（Ｅａｒｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｅｔｎａｍｅｓｅ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９（９）：５６６５〜７５）。さらに、この組換え分子を、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４ｋタンパク質及び２型デングウイルスのエンベロープタンパク質のＩＩＩドメインによって形成されるＰＤ５タンパク質と混合した。この融合タンパク質は、高度に血清型特異的で、防御的な、中和免疫応答を生じることが可能であり、抗体依存性感染増強現象が生じる確率が低い（Ｈｅｒｍｉｄａ  Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ、Ｌａｚｏ  Ｌ、Ｓｉｌｖａ  Ｒ、Ｚｕｌｕｅｔａ  Ａ、Ｃｈｉｎｅａ  Ｇ、Ｌｏｐｅｚ  Ｃ、Ｇｕｚｍａｎ  ＭＧ、Ｇｕｉｌｌｅｎ  Ｇ、２００４、「Ｐ６４ｋの髄膜炎菌タンパク質担体の構造内に挿入された２型デングエンベロープ断片は、マウス内のウイルスに対して機能的免疫応答を可能にする。（Ａ  ｄｅｎｇｕｅ−２  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐ６４ｋ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎａｂｌｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４  Ｊａｎ；１１５（１）：４１〜９）。
【００２３】
カプシドタンパク質及びエンベロープタンパク質のＩＩＩドメインの融合により形成される遺伝子構築物を得ることも、同様の目的を達成するために説明される。結果として、カプシドをＤＥＮ−２のＩＩＩドメインと組み合わせた２つの製剤は、マウスにおいて、カプシドのみで生じる反応よりも高いリンパ球増殖反応を生じ、さらにＰＤ５だけで生じるよりも高い血清型特異的抗体応答を生じた。この最後の結果は、異種抗原による抗体の産生におけるデングウイルスのカプシドタンパク質の免疫増強能力や、Ｂ型肝炎ウイルス等の他のウイルス由来の他の組換えカプシドについて記載される現象を実証する（Ａｌｖａｒｅｚ  ＪＣ、Ｇｕｉｌｌｅｎ  Ｇ、「粘膜経路による免疫促進物質としてのウイルス様粒子を含む製剤（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｂｙ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｒｏｕｔｅ）」、Ｃｕｂａｎ  ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ、ＣＵ  １９９８／１８３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、マウスに接種すると致死的ウイルスによる感染に対する防御反応を生じるデングウイルスのカプシドタンパク質に対応する組換えタンパク質を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
デングウイルスのカプシドタンパク質を体系化する遺伝子を、ファージＴ５プロモーターを含むプラスミドに挿入した。組換えプラスミドによって形質転換させた細胞ＸＬ−１Ｂｌｕｅは、結果として生じるタンパク質を高レベルで発現した。
【００２６】
このタンパク質を約４０％の純度まで精製し、水酸化アルミニウムをアジュバントとして、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。最後の投与から１ヵ月後、抗ウイルス抗体応答を測定した。同時に、デングウイルスを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した脾臓でのリンパ球増殖反応を決定した。その結果、顕著なリンパ球増殖反応を検出したが、抗ウイルス抗体は誘導されなかった。同時に、出血していないマウスで、防御アッセイを行なった。デングウイルスの１００ＬＤ５０値に対応する致死量を接種し、２１日間、疾患の症状と死亡を観察した。結果として、陰性対照群のすべてのマウスは死亡したが、免疫したマウスでは４４％の生存率を得た。これは、カプシドタンパク質のみでの免疫によるデングウイルスに対する防御反応の最初の証拠である。
【００２７】
その後、高分解能精製プロセスを実施し、純度９５％の組換えタンパク質を得た。
【００２８】
半精製及び精製の両方の調製物をＨＰＬＣで分析して、各検体のタンパク質の凝集状態を調べた。半精製調製物では保持時間の短い画分が検出され、一方、精製調製物の検体では分子の二量体形に対応する保持時間が検出された。
【００２９】
精製変形形態で凝集状態を得るために、少量のオリゴヌクレオチドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの微粒子化プロセスを実施した。このプロセスの結果、直径２１ｎｍの粒子が得られた。
【００３０】
９５％を超える純度を有する二量体及び微粒子の両調製物をマウスに接種した。二量体調製物にフロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムをアジュバントとして用い、一方、微粒子化変形形態は水酸化アルミニウムだけをアジュバントとして用いた。
【００３１】
半精製調製物と同様に、高レベルのリンパ球増殖が検出された。防御アッセイでは、フロイント及びアルミニウムをアジュバントして用いた二量体調製物でそれぞれ４０％及び２０％の生存率を得た。しかしながら、アルミニウムをアジュバントとして用いた微粒子化タンパク質は、より高い防御率を誘導した。
【００３２】
半精製タンパク質で得た結果と共にこれらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて防御反応を誘導するカプシドタンパク質の能力を示し、且つタンパク質の微粒子化形状の優位性を実証し、将来、アジュバントとしての水酸化アルミニウムと共にヒトで使用することを可能にする。さらに、抗ウイルス反応を誘導しないことは、疾患「デング出血熱」の最も重症型の発生の危険因子としての抗体依存性感染増強現象を排除するであろう。
【００３３】
その不在が実証されたために抗体の誘導に関連しない可能な防御機序を決定する目的で、ＣＤ８＋細胞枯渇の研究を行なった。その結果、このマーカーを提示する細胞を除去すると誘導される防御効果が消失するために、各変形形態の純粋なタンパク質で達成される防御は、このマーカーを示す細胞の存在に依存した。
【００３４】
同様に、微粒子化組換えカプシドと体液性応答を誘導する抗原の組合せがリンパ球増殖反応の発生に影響を及ぼさないかどうかを調べるために、且つ免疫応答の双方の分岐に寄与することが可能な免疫原の混合物を考察するために研究を行なった。そのために、カプシドの精製微粒子化変形形態及び２型デングウイルスのエンベロープタンパク質のＩＩＩドメインを含む融合タンパク質をマウスに接種した。これは、ＡＤＥ現象を減少させる血清型特異的免疫応答を発生させることができる（Ｈｅｒｍｉｄａ  Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ、Ｌａｚｏ  Ｌ、Ｓｉｌｖａ  Ｒ、Ｚｕｌｕｅｔａ  Ａ、Ｃｈｉｎｅａ  Ｇ、Ｌｏｐｅｚ  Ｃ、Ｇｕｚｍａｎ  ＭＧ、Ｇｕｉｌｌｅｎ  Ｇ、２００４、「マウスにおいて、Ｐ６４ｋの髄膜炎菌タンパク質担体の構造内に挿入された２型デングエンベロープ断片は、ウイルスに対して機能的免疫応答を可能にする。（Ａ  ｄｅｎｇｕｅ−２  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐ６４ｋ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎａｂｌｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４  Ｊａｎ；１１５（１）：４１〜９）。３用量を投与して産生された抗体を分析すると、抗ウイルス血清型特異的抗体のより高い誘導が実証された。その上、カプシドだけで誘導されるよりも高く、且つ融合タンパク質で誘導されるよりも著しく高いリンパ球増殖反応が検出された。
【００３５】
同時に、両抗原の遺伝子融合を使用して組合せ効果を得ることが可能かどうかを調べるために、カプシドタンパク質遺伝子のＮ末端に融合したＤＥＮ−２ウイルスのエンベロープタンパク質のＩＩＩドメインを含むプラスミドを構築した。結果として生じる純度４０％のタンパク質は、ＢＡＬＢ／ｃマウスで、カプシド単独によって誘導されるよりも高いリンパ球増殖反応と、ＰＤ５によって誘導されるよりも高い血清型特異的抗体応答を生じさせた。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）ＰＤＣ−２のクローニング及び発現
ＤＥＮ−２ウイルス由来のカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を、ＤＥＮ−２ウイルス株（ジャマイカ遺伝子型）由来の配列番号１及び配列番号２として配列表に特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した（Ｄｅｕｂｅｌ  Ｖ．、Ｋｉｎｎｅｙ  Ｒ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｔ  Ｄ．Ｗ．、「２型デングウイルス（ジャマイカ遺伝子型）の非構造タンパク質の推定ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列：全長ゲノムの比較解析（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅ  ２  ｖｉｒｕｓ，Ｊａｍａｉｃａ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８８、１６５：２３４〜２４４）。
【００３７】
ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＱＥ−３０を消化して、ベクターを作成した。このベクターは、ファージＴ５プロモーター及びＮ末端の領域に６−ヒスチジン尾部を含む（配列番号６）。ライゲーション後、潜在的な組換え体を制限酵素による消化で解析し、陽性クローンを配列決定して、接合部を調べた。
【００３８】
コンピテント細胞ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．、１９８３、「プラスミドによる大腸菌の形質転換に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７〜５８０）を、ｐＤＣ−２（図１及び配列番号４）と呼ぶ選択クローンによって形質転換させた。形質転換させた大腸菌株を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを追加したＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地で１０時間３７℃で培養した。プロモーターの誘導のために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで使用した。コロニーを増殖させた後、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。その結果、１５−ｋＤＡのバンドが得られた。タンパク質は、抗ＤＥＮ−２の過免疫腹水（ＨＭＡＦ）によって認識された。このタンパク質をＰＤＣ−２（配列番号５）と命名した。
【００３９】
（実施例２）ＰＤＣ−２の半精製及び特徴付け
ｐＰＤＣ−２によって形質転換させ、３７℃で増殖させた大腸菌株から採取したバイオマスをフレンチプレスで破壊した。可溶性画分と不溶性画分の間に均一に分布した組換えタンパク質を採取した。可溶性画分を、ＱセファロースＦＦカラム及び１０ｍＭ、ｐＨ８のトリス緩衝液を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。非吸収画分のタンパク質を、４０％の純度で採取し、免疫学的研究（図２）のために使用した。
【００４０】
（実施例３）半精製ＰＤＣ−２の免疫学的評価
ＢＡＬＢ／ｃマウス３０匹を含む３群を使用した。そのうち２群に、１群にはフロイントアジュバント（ＦＡ）を他の１群には水酸化アルミニウムを用いて、組換えタンパク質１０μｇを腹腔内経路で免疫した。ｐＱＥ−３０形質転換細胞の破壊の結果生じた可溶性画分を、ＦＡをアジュバントとして用いた陰性対照として使用した。３回目の投与の１５日後にマウス１０匹から採血し、ＤＥＮ−２に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって決定した。いずれかのアジュバントを配合した組換えタンパク質による免疫後、抗体価は得られなかった。
【００４１】
表１．半精製ＰＤＣ−２によるマウスの免疫後、採取した血清由来のＤＥＮ−２に対する抗体価
【表１】
2009507864.tif 000002
【００４２】
（実施例４）防御アッセイ
上記の変形形態での免疫により致死的な同種ＤＥＮウイルス曝露に対してマウスに付与された防護を評価するために、水酸化アルミニウムに吸着させた組換えタンパク質及び対照調製物によって免疫した各群からの１０匹のマウスを使用した。ウイルス性脳炎による死亡に関して死亡率を得るために、頭蓋内接種により致死的ＤＥＮ−２ウイルスの１００ＬＤ５０値の用量を各マウスに投与し、２１日間観察した。陽性対照として、感染性ＤＥＮ−２ウイルス（１０４ｐｆｕ）によって免疫したマウス１０匹を含む群を使用した。陰性対照群のすべてのマウスは、投与後７〜１１日目までに罹患し、２１日目までに１００％の死亡率を得たが、一方、陽性対照群のすべてのマウスは生存した。最終的に、組換えタンパク質ＰＤＣ−２によって免疫した群は、４４．４％の防護を示した（表２）。
【００４３】
表２．致死的な同じデングウイルスに曝露した後のＰＤＣ−２免疫したマウスにおける生存率
【表２】
2009507864.tif 000003
＊算出法：（生存マウスの数）／（マウスの総数）。生存マウスのデータは、曝露後２１日目に得た。
【００４４】
（実施例５）リンパ球増殖反応
水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用したカプシドタンパク質によって免疫した群からの残りのマウスを最後の投与から３０日後に屠殺した。次いで、それらの脾臓を摘出し、ＤＥＮ−２に対するリンパ球増殖反応を調べた。表３の結果は、得られた刺激指数を示す。
【００４５】
表３．免疫したマウス由来のリンパ球の同種血清型に対する刺激指数
【表３】
2009507864.tif 000004
＊刺激指数：ＡＤＮの自然合成制御の計数／分と検体の計数／分との指数平均。
＊＊ＤＥＮ−２に感染させたマウス脳の調製物。
＊＊＊感染させなかったマウス脳の調製物。
＊＊＊＊フィトヘマグルチニンマイトジェン（陽性対照）。
【００４６】
（実施例６）ＰＤＣ−２の精製
ＰＤＣ−２によって形質転換させ、３７℃で増殖させた大腸菌株から採取したバイオマスをフレンチプレスで破壊した。可溶性画分と不溶性画分の間に均一に分布した組換えタンパク質が得られた。可溶性画分を、ＳＰセファロースＦＦカラム及びトリス緩衝液１０ｍＭ、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）０．５％、尿素７Ｍ、ｐＨ８を使用して、陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた。カラムをジエタノールアミン緩衝液３０ｍＭ、ＮａＣｌ３５０ｍＭ、ｐＨ１０．３で洗浄した。対象のタンパク質の溶出を、ジエタノールアミン緩衝液３０ｍＭ、ＮａＣｌ７５０ｍＭ、ｐＨ１０．３を用いて行なった。タンパク質を溶出した後、Ｇ−２５カラムを使用して緩衝液を交換した。最終的に、トリス緩衝液１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ中で純度９６％のタンパク質を得た（図３）。
【００４７】
（実施例７）半精製及び精製変形形態の特徴付け
半精製及び精製調製物の凝集状態を特徴付ける目的で、ＴＳＫ−５０００カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。半精製検体を適用した後、１５分から２０分の保持時間で、均一で主要なピークが検出され、高分子量種の存在を立証した（図４Ａ）。これに反して、カプシドタンパク質の高精製画分からの検体では、３０分の保持時間を検出し、分子の二量体形状に対応した（図４Ｂ）。
【００４８】
（実施例８）「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」での再微粒子化の研究
二量体形状の純粋カプシドタンパク質を再微粒子化するために、緩衝液をＨｅｐｅｓ２５ｍＭ、ＫＡｃ１００ｍＭ、ＭｇＡｃ２  １．７ｍＭ、ｐＨ７．４に交換した。タンパク質及びオリゴヌクレオチドの混合物を３７℃で１分間加熱した後、それらを同量で３０℃で３０分間インキュベートした。実験の陰性対照として、タンパク質をオリゴヌクレオチドなしでインキュベートした。両調製物を電子顕微鏡で観察すると、対照検体には粒子は観察されなかったが、オリゴヌクレオチドの混合物とあらかじめインキュベートしたタンパク質の検体では直径約２１ｎｍの粒子が多量に観察された（図５）。
【００４９】
（実施例９）マウスにおける精製カプシドの免疫学的評価
ＢＡＬＢ／ｃマウス２０匹を含む５群を使用した。そのうち２群を、水酸化アルミニウム及びフロイントアジュバントを用いて、二量体精製組換えタンパク質１０μｇを腹腔内経路で免疫させた。別の群を、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いた精製微粒子化カプシドタンパク質１０μｇで免疫した。プラスミドｐＱＥ−３０で形質転換させ、且つＰＤＣ−２と同一の精製ステップで処理したＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞の破壊物からの可溶性画分を、フロイントアジュバントをアジュバントとして使用して、陰性対照として用いた。第５の群を陽性対照としてＤＥＮ−２ウイルスによって免疫させた。最後の投与から１ヵ月後、生存のパーセンテージを得るために、各群からのマウス１０匹に頭蓋内接種によって致死的ＤＥＮ−２の１００ＬＤ５０値の用量を投与し、２１日間観察した。陰性対照群のすべてのマウスは、投与後７〜１１日までに罹患し、０％の死亡率が得られ、陽性対照群のすべてのマウスは生存した。最終的に、組換えタンパク質で免疫した群のうち、純粋な二量体ＰＤＣ−２で免疫した群は、水酸化アルミニウムによって免疫したときに２０％の防護を示し、フロイントアジュバントを使用したときに、４０％の防護を示した。さらに、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いた再微粒子化純粋タンパク質を投与した群では、９０％のマウスで防護された（表４）。
【００５０】
表４．致死的な同じデングウイルスに曝露した後に、アッセイしたタンパク質変形形態で免疫したマウスにおける生存率
【表４】
2009507864.tif 000005
＊算出法：（生存マウスの数）／（マウスの総数）。生存マウスのデータは、曝露後２１日目に得た。
【００５１】
（実施例１０）リンパ球増殖反応
水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いた、二量体又は再微粒子化のいずれかのカプシドタンパク質によって免疫した群からの残りのマウス（マウス１０匹）を、最後の投与から１５日後に屠殺した。次いで、それらの脾臓を摘出し、ＤＥＮ−２に対するリンパ球増殖反応を調べた。表５の結果は、得られた刺激指数を示す。
【００５２】
表５．免疫したマウス由来のリンパ球の同じ血清型に対する刺激指数
【表５】
2009507864.tif 000006
＊刺激指数：ＡＤＮの自然合成制御の計数／分と検体の計数／分との指数平均。
＊＊ＤＥＮ−２に感染させたマウス脳の調製物。
＊＊＊感染させなかったマウス脳の調製物。
＊＊＊＊フィトヘマグルチニンマイトジェン（陽性対照）。
【００５３】
（実施例１１）ＰＤ５及びＰＤＣ−２によって形成される混合物の免疫学的評価
微粒子化した純粋なカプシドタンパク質１０μｇ及びタンパク質ＰＤ５（配列番号２３）２０μｇの混合物を１５日間隔で３投与によってマウス２０匹に接種した。純粋なカプシドタンパク質１０μｇによって免疫した群、陰性対照群から採取して同量のＰＤＣ−２と混合した２０μｇのタンパク質ＰＤ５によって免疫した群、及びＰＤ５構築体に存在する担体タンパク質であるタンパク質Ｐ６４ｋによって免疫した群を対照群として使用した。すべての症例では、水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用した。
【００５４】
最後の投与から１５日後、マウスから採血して、血清を抗ウイルス抗体についてＥＬＩＳＡによってテストした。表６及び７に示すように、混合物によって免疫した群は、タンパク質ＰＤ５だけによって免疫した群のそれよりも高い力価で血清型特異的抗体を発生させ、同時にこれら２つの群の力価は、ＤＥＮ−２ウイルスに対する抗体が検出されなかったタンパク質ＰＤＣ−２によって免疫した群における力価よりも高かった。その一方で、さらにマウス１０匹をリンパ球増殖アッセイのために各群から選んだ。これらのマウスの脾臓から細胞を抽出し、感染性ＤＥＮ−２ウイルスによって刺激した。表８に示すように、混合物によって免疫した群の刺激指数は、カプシドタンパク質だけによって免疫した群の刺激指数よりも高かった。最も低い刺激指数は、タンパク質ＰＤ５によって免疫した群で得られた。
【００５５】
表６．免疫化後、採取した血清中のＤＥＮ−２ウイルスに対する抗体価
【表６】
2009507864.tif 000007
【００５６】
表７．各群から採取した血清の混合物中に含まれる抗体の血清型特異性の決定
【表７】
2009507864.tif 000008
【００５７】
表８．免疫したマウス由来のリンパ球の同じ血清型に対する刺激指数
【表８】
2009507864.tif 000009
＊刺激指数：ＡＤＮの自然合成制御の総数／分と検体の総数／分との指数平均。
＊＊ＤＥＮ−２に感染させたマウス脳の調製物。
＊＊＊感染させなかったマウス脳の調製物。
＊＊＊＊フィトヘマグルチニンマイトジェン（陽性対照）。
【００５８】
（実施例１２）ＣＤ８枯渇の研究
細胞性免疫応答の誘導の何らかの証拠を得るために、再微粒子化及び二量体カプシドタンパク質をＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。ＰＤＣ−２を産生するために使用したプラスミドで形質転換した細胞から採取し、且つタンパク質ＰＤＣ−２のために使用したものと同様の精製プロセスによる調製物を陰性対照として用いた。
【００５９】
タンパク質（２０μｇ）の３用量を、水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用して、マウス２０匹を含む複数群に投与した。最後の投与から１ヵ月後、このマーカーを含むマウス免疫系の細胞を枯渇させることが可能なラット抗マウスＣＤ８ｍＡｂ１ｍｇを各群の半数のマウスに投与した。翌日、すべてのマウスにＤＥＮ−２ウイルスの１００ＬＤ５０（半数致死量）値を投与した。マウスを疾患の徴候の開始について観察し、死亡を記録した。
【００６０】
免疫した非処置群の場合、二量体及び再微粒子化カプシドによって免疫した群ではそれぞれ２０％及び８０％の予防を得た。同様に、処置群における防護率は、非処置群よりも低く、二量体ＰＤＣ−２に対しては、０％の防護であり、再微粒子化タンパク質に対しては１０％の防護であった。陰性対照群の場合、処置又は非処置いずれのマウスにおいても防護は得られなかった。
【００６１】
表９．組換えカプシドの変異体によって免疫したマウスにおけるＤＥＮ−２致死ウイルスを用いた誘発アッセイ
【表９】
2009507864.tif 000010
＊算出法：（生存マウスの数）／（マウスの総数）。生存マウスのデータは、曝露後２１日目に得た。
【００６２】
（実施例１３）ＤＥＮ−１タンパク質の採取及び半精製
ＤＥＮ−１ウイルス（配列番号７）のカプシドタンパク質のアミノ酸１〜１００をコードするヌクレオチド配列を、ＤＥＮ−１ウイルス株由来の配列番号８及び配列番号１０として配列リストに同定したオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。Ｎ末端の領域（配列番号６）にファージＴ５プロモーター及び６−ヒスチジン尾部を含むプラスミドｐＱＥ−３０のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの消化によってベクターを作成した。ライゲーション後、組換え体を制限酵素による消化で解析し、且つ接合部を調べるために陽性クローンを配列決定した。コンピテント細胞ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．、１９８３、「プラスミドによる大腸菌の形質転換に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７〜５８０）を、ｐＤＣ−１（図６及び配列番号１０）と呼ぶ選択クローンによって形質転換させた。形質転換させた大腸菌株を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを追加したＬＢ培地で１０時間３７℃で培養した。プロモーターの誘導のために、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで使用した。コロニーを増殖させた後、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。その結果、１５−ｋＤＡのバンドを採取した。タンパク質を、抗ＤＥＮ−１のＨＭＡＦによって認識した。このタンパク質をＰＤＣ−１（配列番号１１）と命名した。
【００６３】
（実施例１４）ＰＤＣ−１の半精製及び特徴付け
ＰＤＣ−１によって形質転換させ、３７℃で増殖させた大腸菌株から採取したバイオマスをフレンチプレスで破壊した。可溶性画分と不溶性画分の間に均一に分布した組換えタンパク質を採取した。可溶性画分から、ＱセファロースＦＦカラム及び、トリス緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ８）を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。非吸収画分のタンパク質を、４５％の純度で採取し、免疫学的研究のために使用した。
【００６４】
（実施例１５）半精製ＰＤＣ−１の免疫学的評価
ＢＡＬＢ／ｃマウス３０匹を含む２群を使用した。そのうちの１群を、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いて、組換えタンパク質１０μｇを腹腔内経路で免疫させた。ｐＱＥ−３０形質転換細胞の破壊の結果生じた可溶性画分を、水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用し、陰性対照として使用した。３回目の投与後の１５日後にマウスの一部（１０匹）から採血し、ＤＥＮ−１に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって決定した。組換えタンパク質による免疫化後、抗ウイルス抗体価は採取されなかった。
【００６５】
表１０．半精製ＰＤＣ−１による免疫化後、採取した血清由来のＤＥＮ−１ウイルスに対する抗体価
【表１０】
2009507864.tif 000011
【００６６】
（実施例１６）防御アッセイ
記述した変異体での免疫化による致死的な同じＤＥＮウイルスの投与に対するマウスに付与した予防の評価のために、水酸化アルミニウムに吸着させた組換えタンパク質及び対照調製物によって免疫した群それぞれからの１０匹のマウスを使用した。ウイルス性脳炎による死亡に関して死亡率のパーセンテージを得るために、頭蓋内接種によって致死的ＤＥＮ−１ウイルスの１００ＬＤ５０値の用量を各マウスに投与し、２１日間観察した。陽性対照として、感染性ＤＥＮ−１ウイルス（１０４ｐｆｕ）によって免疫したマウス１０匹を含む群を使用した。陰性対照群のすべてのマウスは、投与後７〜１１日までに罹患し、２１日までに１００％の死亡率を得たが、一方、陽性対照群のすべてのマウスは生存した。最終的に、組換えタンパク質ＰＤＣ−１によって免疫した群は、５０％の予防を示した（表１１）。
【００６７】
表１１．致死的な同じＤＥＮウイルスの接種後、アッセイされたタンパク質変異体によって免疫したマウスにおける生存率
【表１１】
2009507864.tif 000012
＊算出法：（生存マウスの数）／（マウスの総数）。生存マウスのデータは、曝露後２１日目に得た。
【００６８】
（実施例１７）リンパ球増殖反応
タンパク質ＰＤＣ−１によって免疫した群からの残りのマウスを、最後の投与から１５日後に屠殺した。次いで、それらの脾臓を摘出し、ＤＥＮ−１に対するリンパ球増殖反応を調べた。表１２の結果は、得られた刺激指数を示す。
【００６９】
表１２．免疫したマウス由来のリンパ球の同じ血清型に対する刺激指数
【表１２】
2009507864.tif 000013
＊刺激指数：ＡＤＮの自然合成制御の計数／分と検体の計数／分との指数平均。
＊＊ＤＥＮ−２に感染させたマウス脳の調製物。
＊＊＊感染させなかったマウス脳の調製物。
＊＊＊＊フィトヘマグルチニンマイトジェン（陽性対照）。
【００７０】
（実施例１８）ＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩのクローニング及び発現
タンパク質のドメインＩＩＩ領域に対応する、ＤＥＮ−２ウイルス由来のエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株（ジャマイカ遺伝子型）由来の配列番号１３及び配列番号１４として配列リストに同定したオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた（Ｄｅｕｂｅｌ  Ｖ．、Ｋｉｎｎｅｙ  Ｒ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｔ  Ｄ．Ｗ．、「２型デングウイルス（ジャマイカ遺伝子型）の非構造タンパク質のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列：全長ゲノムの比較解析（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅ  ２  ｖｉｒｕｓ，Ｊａｍａｉｃａ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８８、１６５：２３４〜２４４）。
【００７１】
ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩでプラスミドＰＤＣ−２を消化してベクターを作成し、これは、ファージＴ５プロモーター、Ｎ末端の領域の６−ヒスチジン尾部及びＤＥＮ−２ウイルスのカプシドタンパク質の１００個のアミノ酸に対応する領域を含む。ライゲーション後、潜在的な組換え体を制限酵素による消化で解析し、且つ接合部を調べるために陽性クローンを配列決定した。最終的に、選択したクローンを、ｐＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩ（配列番号１５）と命名した。
【００７２】
コンピテント細胞ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．、１９８３、「プラスミドによる大腸菌の形質転換に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７〜５８０）を、ＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩと呼ぶ選択クローンによって形質転換させた。形質転換させた大腸菌株を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを追加したＬＢ培地で１０時間３７℃で培養した。プロモーターの誘導のために、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで使用した。コロニーを増殖させた後、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。その結果、３０−ｋＤＡのバンドを採取した。タンパク質を、抗ＤＥＮ−２のＨＭＡＦによって認識した。このタンパク質をＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩ（配列番号１６）と命名した。
【００７３】
（実施例１９）ＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩの半精製及び特徴付け
ＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩによって形質転換させ、３７℃で増殖させた大腸菌株から採取したバイオマスをフレンチプレスで破壊した。可溶性画分と不溶性画分の間に均一に分布した組換えタンパク質を採取した。可溶性画分から、ＱセファロースＦＦカラム及びトリス緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ８）を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。非吸収画分のタンパク質を、４０％の純度で採取し、免疫学的研究（図２）のために使用した。
【００７４】
（実施例２０）半精製ＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩのマウスにおける免疫学的評価
ＢＡＬＢ／ｃマウス３０匹を含む５群を使用した。そのうちの１群を、アジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて、組換えタンパク質１０μｇを腹腔内経路で免疫させた。プラスミドｐＱＥ−３０によって形質転換させたＸＬ−１ブルー細胞の破壊の結果生じた可溶性画分を、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いた陰性対照として使用した。別の２つの群を対照として加えた。そのうちの１群を、タンパク質ＰＤＣ−２によって、及び他の群をタンパク質ＰＤ５（このタンパク質は、ＤＥＮ−２ウイルスのエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩ領域を含む）によって、免疫した。３回目の投与の１５日後に各群からの１０匹のマウスから採血し、ＤＥＮ−２に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって決定した。表１３及び１４に示すように、ＰＤＣ−２ＤｏｍＩＩＩによって免疫した群は、ＤＥＮ−２に対する高い血清型特異的抗体価を発現し、タンパク質ＰＤ５によって誘導された抗体価よりも高かった。これらの結果は、カプシドタンパク質との遺伝子の組合せが、エンベロープタンパク質のドメインＩＩＩによって誘導される抗ウイルス性免疫応答を増強することを証明する。
【００７５】
表１３．ＤｏｍＩＩＩカプシドタンパク質による免疫化後、採取した血清由来のＤＥＮ−２に対する抗体価
【表１３】
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【００７６】
表１４．各群から採取した血清の混合物に含まれる抗体の血清型特異性の決定
【表１４】
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【００７７】
その一方で、さらにマウス１０匹をリンパ球増殖アッセイのために各群から選んだ。これらのマウスの脾臓から細胞を抽出し、感染性ＤＥＮ−２ウイルスによって刺激した。表１５は、組合せによって免疫した群の刺激指数が、カプシドタンパク質だけによって免疫した群の刺激指数よりも高かったことを示す。タンパク質ＰＤ５によって免疫した群の刺激指数は、最も低かった。
【００７８】
表１５．免疫したマウス由来のリンパ球の同じ血清型に対する刺激指数
【表１５】
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＊刺激指数：ＡＤＮの自然合成制御の計数／分と検体の計数／分との指数平均。
＊＊ＤＥＮ−２に感染させたマウス脳の調製物。
＊＊＊感染させなかったマウス脳の調製物。
＊＊＊＊フィトヘマグルチニンマイトジェン（陽性対照）。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＰＤＣ−２を産生するためのＤＥＮ−２ウイルスのカプシドタンパク質のクローニング戦略を示す図である。ＤＥＮ２Ｃ：ＤＥＮ−２のカプシドタンパク質の断片。
【図２】ＰＤＣ−２半精製プロセスの１５％でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を示す図である。１．破壊上清、２及び３．ＱセファロースＦＦに吸着されない画分、４．１ＭのＮａＣｌで溶出させた画分。
【図３】ＰＤＣ−２精製プロセスの１５％でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を示す図である。１．破壊上清、２．ゲルに吸収されない画分、３．洗浄画分（ＮａＣｌ３５０ｍＭ）、４．溶出画分（ＮａＣｌ７５０ｍＭ）、５．トリス１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ中の画分。
【図４】ＰＤＣ−２調製物の半精製（Ａ）及び純粋（Ｂ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００でのクロマトグラフィープロファイルを示す図である。
【図５】純粋ＰＤＣ−２調製物のオリゴヌクレオチドを用いる処置前（Ａ）及び処置後（Ｂ）の電子顕微鏡検査写真である。
【図６】ＰＤＣ−１を産生するためのＤＥＮ−１ウイルスのカプシドタンパク質のクローニング戦略を示す図である。ＤＥＮ１Ｃ：ＤＥＮ−１のカプシドタンパク質の断片。
【図７】ＰＤＣ−１半精製プロセスの１５％でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を示す図である。１．分子量マーカー、２．破壊上清、３．ＱセファロースＦＦに吸着されない画分。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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