(57)【要約】本発明は、血管内プロテーゼならびにその製造および使用方法を提供する。血管疾患もしくは障害を治療するための移植可能なデバイスには、平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子を含有する血管内プロテーゼが含まれる。本デバイスは、平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび前記成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングすることができる。本デバイスは、血管内インターベンション後の血管閉塞を阻害して同時に血管壁の回復を増強することによって、例えば再狭窄などの血管疾患もしくは障害を治療または予防するために有用である。
2009525110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管疾患もしくは障害を治療するための移植可能なデバイスであって、平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子を含有する血管内プロテーゼを含む移植可能なデバイス。
【請求項２】
前記血管内プロテーゼは、ステントである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記平滑筋細胞増殖のインヒビターは、ＵＰ５０である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記成長因子は、ＶＥＧＦである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記血管疾患は、再狭窄である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記デバイスは、前記平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび前記成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記デバイスは、代替的に、前記成長因子および平滑筋細胞増殖のインヒビターを発現もしくは過剰発現するように遺伝子操作されている内皮細胞を含む基質でコーティングされている、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
血管内インターベンション後に血管閉塞を阻害して、同時に血管壁の回復を増強する工程によって血管疾患もしくは障害を治療する方法であって：
ａ）平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子を含有する血管内デバイスを、それを必要とする対象の血管内に挿入する工程と；および
ｂ）前記インヒビターおよび成長因子を前記血管内に溶出させ、それにより平滑筋細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖を増強する工程とを含む方法。
【請求項９】
前記血管内デバイスは、ステントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記平滑筋細胞増殖のインヒビターは、ＵＰ５０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記成長因子は、ＶＥＧＦである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記血管疾患は、再狭窄である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
血管内インターベンション後に血管閉塞を阻害して同時に血管壁の回復を増強する工程によって血管疾患もしくは障害を治療する方法であって：
ａ）平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされた血管内デバイスを、それを必要とする対象の血管内に挿入する工程と；および
ｂ）前記インヒビターおよび前記成長因子を前記ポリマーから前記対象の血管内に溶出させ、それにより平滑筋細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖を増強する工程とを含む方法。
【請求項１４】
血管内インターベンション後の平滑筋細胞の新生内膜形成を予防する方法であって、平滑筋細胞増殖のインヒビターを血管障害部位へ送達する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記平滑筋細胞増殖のインヒビターは、ＵＰ５０である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記送達する工程は、注射によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の細胞増殖成長因子を送達する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞増殖成長因子は、ＶＥＧＦである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血管内インターベンション後に血管閉塞を阻害して、同時に血管壁の回復を増強する工程によって血管疾患もしくは障害を予防する方法であって：
ａ）それを必要とする対象の血管内に、平滑筋細胞増殖のインヒビターおよび成長因子が含浸させられている生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされた血管内デバイスを挿入する工程と；および
ｂ）前記インヒビターおよび前記成長因子を前記ポリマーから対象の血管内に溶出させ、それにより平滑筋細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖を増強する工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、化学、生化学、細胞生物学、遺伝子工学、医用デバイスおよび医学の分野に関する。詳細には、本発明は、プロテーゼの性能を改善し、内腔の狭小化を防止する因子を発現するように遺伝子操作された細胞でコーティングされた血管内プロテーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
世界中の極めて多くの人々が血管疾患に罹患している。それにより血管の罹患部分を回避するため、または閉塞もしくは損傷した血管の周囲の血流を回復させるために、人工もしくは自家いずれかの導管が既存血管内に移植されるバイパス手術は、そのような疾患のための最も一般的な治療法の１つである。毎年１００万例を越えるそのような手技が実施されていると推定されている。
【０００３】
アテローム硬化症は最も一般的な血管疾患の形態であり、枢要な身体器官への不十分な血液供給を導き、その結果として心臓発作、脳卒中、および腎不全を生じさせる。さらに、アテローム硬化症は、高血圧および糖尿病に罹患している患者、そして喫煙者において主要な合併症を誘発する。アテローム硬化症は、通常は血流量を調節する血管緊張を制御する動脈壁中の正常な血管平滑筋細胞（「ＶＳＭＣ」）の一部がそれらの性質を変化させ、「癌様」挙動を発生する慢性血管障害の１つの形態である。これらのＶＳＭＣは異常に増殖性になり、それらが内側の血管裏層内に侵入して広がることを可能にする物質（成長因子、組織分解酵素、およびその他のタンパク質）を分泌し、血流を遮断し、その血管を異常に局所血液凝固によって完全に閉塞され易くさせ、結果としてその動脈によって血液供給される組織の死を生じさせる。
【０００４】
矯正手術後の狭窄の再発または動脈狭窄である再狭窄は、アテローム硬化症の進行した形態である。近年の証拠は、冠動脈再狭窄が、冠静脈グラフトおよび心臓同種移植片アテローム硬化症と同様に、結果として突発性アテローム硬化症を生じさせる同一病原性プロセスの極めて進行した形態を表すと見なせるという血管傷害の統一的仮説を支持している。再狭窄は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む強力な成長調節分子を含む血管傷害に対する一連の複雑な線維増殖性応答に起因しており、これはさらにアテローム硬化症病変の後期と共通しており、結果として血管平滑筋細胞の増殖、移動および新生内膜蓄積を生じさせる。
【０００５】
再狭窄は、冠動脈バイパス手術（ＣＡＢ）、動脈内膜切除術、および心臓移植術後に、そして詳細には心臓バルーン血管形成術、アテレクトミー、レーザーアブレーションもしくは血管内ステント術（それらの各々で患者の３分の１は６カ月後までに動脈閉塞（再狭窄）を発生する）後に発生し、症状の再発（または死亡）の原因となり、反復血行再建術を必要とすることが多い。１０年間以上にわたる、血管形成術、バイパス移植術および動脈内膜切除術を含むアテローム硬化症疾患に対する様々な内科的および外科的治療の研究そして一次成功率における有意な向上にもかかわらず、後期再狭窄に起因する二次的傷害は、依然として患者の３０〜５０％において発生し続けている。
【０００６】
血管形成術、動脈内バルーンカテーテル拡張術およびステント留置術中には、結果として脱内皮化、内弾性板の崩壊、および内側平滑筋細胞の傷害が生じる。極めて多数の患者は、内腔狭小化を生じさせる平滑筋細胞増殖を特徴とする動脈壁の生物学的反応を有する。再狭窄はおそらく、術後に発生する炎症、血栓症、および平滑筋細胞蓄積の相互依存的作用から生じるが、一般的な最終経路は、収縮性表現型から分泌性表現型への内科的ＶＳＭＣ脱分化の結果として展開する。これは主として、周囲の基底膜を分解するマトリックス・メタロプロテイナーゼのＶＳＭＣ分泌、内膜内への増殖および走化性移動、および新生内膜線維増殖性病変を形成する大きな細胞外マトリックスの分泌を含んでいる。動脈傷害後のＶＳＭＣ表現型脱分化の多くは、新生腫瘍細胞（すなわち、異常な増殖、成長調節分子およびプロテアーゼ分泌、移動ならびに基底部浸潤）のＶＳＭＣ表現型脱分化を模倣する。
【０００７】
この現象を克服するために、そして再狭窄を予防することを試みて、いくつかの会社は、冠動脈もしくは末梢血管内に永続的に移植されて、細胞増殖を阻害もしくは防止する、そしてこのために平滑筋増殖によって作り出される狭小化を防止する薬物を放出（溶出）するステントを開発した。しかし、薬物溶出ステントは、一方では平滑筋細胞増殖および再狭窄を減少させるが、それらは極めて長期間にわたって内皮細胞単層の回復も妨害し、それによって長期間にわたり血管壁を血栓形成性にさせる。結果として生じる臨床的転帰は、薬物溶出ステントの後期凝固である。ステント血栓症を予防するために、患者は少なくとも１年間にわたり抗凝固剤および抗血小板薬（例、アスピリンおよびＰｌａｖｉｘ）を摂取するように推奨されるが、これは内皮細胞回復および血管治癒がこの１年という期間内に起こることを前提にしたものである。
【０００８】
血管グラフトは、透析患者における侵入部位としても使用される。グラフトは、患者の体内で動脈を静脈へ接続する。針はグラフト内に挿入され、血液が抜去され、血液透析装置内を通過させられ、グラフト内に挿入された第２の針を通して患者に戻される。
【０００９】
径の小さな合成人工血管は、長期的に見ると高い機能不全率を有する。バイパスグラフトの３０〜５０％は、５〜７年間以内に機能しなくなる。血液透析用グラフトの平均寿命はいっそう短く、２年間未満であることが多い。グラフトの機能不全の一次的原因は、組織内方成長および最終的には血栓形成に起因するグラフトの閉塞である。グラフトの径が小さいほど、機能不全の発生率は高くなる。血管グラフト性能を改善するための数多くのアプローチが提案されている。そのようなアプローチの１つは、人工グラフトにおけるより生体適合性で耐久性の合成材料の使用である。
【００１０】
血管グラフトにおいて使用されている合成材料の１つは、良好な生体適合性によって補完される高耐久性を有する、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））である。しかし、腔内ステントと同様に、ＰＴＦＥおよび類似の材料は、それでもまだそれらの有用性を限定する血栓形成に罹りやすい。これに対抗するために、ＰＴＦＥグラフトおよび腔内ステントの内壁には、移植前に自家内皮細胞（ＥＣ）が播種されている。ＥＣは卓越した生体適合性表面を提供するだけではなく、それらは実質的な血栓溶解活性も有している。さらに、ＥＣは、グラフト内での新生内膜増殖および炎症性反応を防止する。しかし、ＥＣを播種したグラフトおよびステントは、不完全な内皮形成および血流の剪断力に起因するグラフト表面からの内皮細胞の剥離に悩まされる。
【００１１】
内皮形成を改善するために、ＥＣは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、特許文献１）を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。ＶＥＧＦは細胞採取から播種までの時間を減少させられるだけではなく、迅速な増殖はより高速のグラフト被覆をもたらすので初期播種密度の低いグラフトの使用も許容する。
【００１２】
ＶＥＧＦは、他の血管細胞、詳細には平滑筋細胞（ＳＭＣ）に及ぼす衝撃の減少、したがって、有害な刺激作用を誘発する可能性の減少に起因して、血管内皮形成を増強できる他の低ＥＣ特異的成長因子に比した長所を有している。例えば、ＶＥＧＦは、吻合部からＥＣを動員するが、ＳＭＣを動員しない。
【００１３】
ＶＥＧＦを過剰発現するように遺伝子操作されたＥＣは、不完全な内皮形成という問題を大きく解決するが、血流の剪断応力下でのグラフトの内面からの細胞の剥離は依然として問題のままである。さらに、細胞増殖を阻害もしくは防止する薬物溶出ステントは、内皮細胞単層の回復もまた防止し、それによって血管壁を長期間にわたり血栓形成性にさせる。
【００１４】
剥離問題を取り扱うための１つのアプローチは、細胞を表面へよりしっかりと付着させるためにグラフトの内面を接着性マトリックスでプレコーティングすることであった。さらに、血流を模擬するために増殖中の持続的流動条件へグラフトの壁上に播種された細胞を曝露させることもまた報告されている。より遅い速度で発生するが、それでもＥＣはこれらの技術を用いて調製されたグラフトの壁から剥離し、したがってグラフトの有効寿命は依然として最適以下である。さらに、剥離した細胞は、剥離後のグラフト上に、高度に血栓形成性である細胞外マトリックスを残す。
【特許文献１】米国特許第５，７８５，９６５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そこで依然として、ＥＣがより長期間にわたって血流の剪断力に抵抗できる内皮化された血管グラフトに対する必要がある。さらに、インビボでのグラフト血栓および新生内膜形成を減少させる、改善された長期開存性を備える血管内プロテーゼに対する必要もある。本発明は、そのような血管内デバイスおよびそれらの調製方法およびそれらの使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
そこで、１つの態様では、本発明は、外面および内腔を説明する内面を有する合成チューブ状素子を含む人工血管グラフトに関する。このチューブは、その内面に播種および培養された複数の細胞を有する。細胞は、全部が内皮細胞または内皮細胞と平滑筋細胞の混合物のいずれかである。内皮細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分、平滑筋細胞の少なくとも一部分またはそれらの両方の少なくとも一部分が１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。
【００１７】
また別の態様では、本発明は、外面および内腔を説明する内面を含む合成チューブ状素子を含む人工血管グラフトに関する。複数の平滑筋細胞は、チューブの内面上で播種および培養される。平滑筋細胞の少なくとも一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００１８】
また別の態様では、本発明は、人工血管グラフトを製造する方法に関する。第１に、合成チューブ状素子が入手される。チューブは、外面および内腔を説明する内面を有する。複数の細胞が、チューブの内面上で播種され、そこで培養される。細胞は、全部が内皮細胞または内皮細胞と平滑筋細胞との混合物のいずれかである。さらに、内皮細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。同様に、内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分、平滑筋細胞の少なくとも一部分またはそれらの両方の少なくとも一部分が１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。
【００１９】
本発明の１つの態様では、上記の方法は、細胞の培養中にチューブ状素子の内面で流体剪断力を適用する工程をさらに含んでいる。
【００２０】
本発明の１つの態様は、患者における血管の一部分をバイパスする方法である。本方法は、第１端、第２端、外面、および内腔を説明する内面を有する合成チューブ状素子を使用する工程を含んでいる。複数の細胞は、チューブ状素子の内面上で播種および培養される。細胞は、内皮細胞のみ、または内皮細胞と平滑筋細胞の混合物を含んでいる。内皮細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分、平滑筋細胞の少なくとも一部分またはそれらの両方の少なくとも一部分が１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。チューブの第１端は、バイパスされる部分に近位の血管内に移植され、チューブの第２端はバイパスされる部分の遠位の血管内に移植される。結果として、流体連続性は、近位グラフトの部位からチューブ状素子の内腔を通して遠位グラフトの部位で血管内に戻るように血管内で確立される。
【００２１】
本発明の１つの態様は、患者に血液透析を実施する方法である。外面、内腔を説明する内面、第１端および第２端を含む合成チューブ状素子が使用される。チューブは、チューブ状素子の内腔を通して動脈から静脈内へ流体連続性が確立されるように、その第１端は動脈内に移植され、その第２端は静脈内に移植されて、患者の皮下へ移植される。チューブの内腔は、血液を患者から抜去し、そこで濾過される血液透析濾過装置に通して送り、次に内腔に通して患者に戻すことができるように、血液透析濾過装置に接続される。合成チューブ状素子は、その内面で播種および培養された複数の細胞を含んでおり、細胞は全部が内皮細胞または内皮細胞および平滑筋細胞の混合物を含んでいる。内皮細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分、平滑筋細胞の少なくとも一部分またはそれらの両方の少なくとも一部分が１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。
【００２２】
本発明の１つの態様では、複数の内皮細胞だけがチューブ状素子の内面上で播種および培養されている。
【００２３】
本発明の１つの態様では、内皮細胞および平滑筋細胞の両方がチューブ状素子の内面上で播種および培養されている。
【００２４】
本発明の１つの態様では、内皮細胞および平滑筋細胞の両方が上記方法で使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分は、細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００２５】
本発明の１つの態様では、内皮細胞および平滑筋細胞の両方が上記方法で使用される場合は、平滑筋細胞の少なくとも一部分は、細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。
【００２６】
本発明の１つの態様では、内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用され、平滑筋細胞の少なくとも一部分が細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている場合は、内皮細胞の少なくとも一部分は細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００２７】
本発明の１つの態様は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている内皮細胞または平滑筋細胞である。
【００２８】
本発明の１つの態様では、上記の細胞は、１つ以上の細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するようにさらに遺伝子操作されている。
【００２９】
本発明の１つの態様では、上記の細胞は、１つ以上のマーカーポリペプチドを発現または過剰発現するようにさらに遺伝子操作されている。
【００３０】
前記マーカーポリペプチドは、本発明の１つの態様では、選択マーカーまたはレポーターマーカーである。
【００３１】
本発明の１つの態様は、細胞増殖成長因子をコードする第１ポリヌクレオチド配列および細胞接着因子をコードする第２ポリヌクレオチド配列を含む核酸発現構築物である。
【００３２】
本発明の１つの態様では、上記の核酸発現構築物は、第１および第２ポリヌクレオチド配列の両方の発現を指令するプロモーター配列をさらに含んでいる。
【００３３】
本発明の１つの態様では、上記の核酸発現構築物は、２つのプロモーター配列を含んでおり、それらの１つが第１ポリヌクレオチド配列の発現を指令し、もう１つが第２ポリヌクレオチド配列の発現を指令する。
【００３４】
本発明の１つの態様では、上記の核酸発現構築物は、第１および第２ポリヌクレオチド区間の間に挿入されたリンカー配列をさらに含んでいる。
【００３５】
リンカー配列は、本発明の１つの態様では、ＩＲＥＳもしくはプロテアーゼ開裂認識部位を含んでいる。
【００３６】
本発明の１つの態様では、プロモーター配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーター配列からなる群から独立して選択される。
【００３７】
本発明の１つの態様では、第１および第２プロモーター配列は、どちらも誘導性プロモーター配列である。
【００３８】
第１および第２誘導性プロモーター配列は、本発明の１つの態様では、エフェクター分子によって調節される。
【００３９】
本発明の１つの態様では、第１および第２誘導性プロモーター配列は、同一エフェクター分子によって調節される。
【００４０】
本発明の１つの態様では、上記核酸発現構築物は、マーカーポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチド配列をさらに含んでいる。
【００４１】
マーカーポリペプチドは、本発明の１つの態様では、選択マーカーおよびレポーターマーカーからなる群から選択される。
【００４２】
本発明の１つの態様では、マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、第１または第２ポリヌクレオチド配列へ転写的に連結されている。
【００４３】
本発明の１つの態様では、転写連結は、ＩＲＥＳもしくはプロテアーゼ開裂認識部位を含んでいる。
【００４４】
本発明の１つの態様では、マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、第１または第２ポリヌクレオチド区間に翻訳的に融合されている。
【００４５】
本発明の１つの態様は、細胞増殖成長因子をコードする第１ポリヌクレオチド配列を含む第１核酸発現構築物と、細胞接着因子をコードする第２ポリヌクレオチド配列を含む第２核酸発現構築物とを含む核酸発現構築物系である。
【００４６】
本発明の１つの態様では、上記の構築物中において、第１または第２核酸発現構築物は、マーカーポリペプチドをコードする追加のポリヌクレオチド配列をさらに含んでいる。
【００４７】
本発明の１つの態様では、上記の構築物中においては、マーカーポリペプチドは、選択マーカーおよびレポーターマーカーからなる群から選択される。
【００４８】
本発明の１つの態様では、上記の構築物は、第１および第２ポリヌクレオチド配列の発現を指令するプロモーター配列をさらに含んでいる。
【００４９】
本発明の１つの態様では、上記の構築物は、２つのプロモーター配列を含んでおり、それらの１つは第１ポリヌクレオチド配列の発現を指令し、もう１つは第２ポリヌクレオチド配列の発現を指令する。
【００５０】
本発明の１つの態様では、上記の構築物中においては、プロモーター配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーター配列からなる群から独立して選択される。
【００５１】
本発明の１つの態様では、上記の構築物中においては、マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、第１または第２ポリヌクレオチド配列に転写的に連結されている。
【００５２】
本発明の１つの態様では、培養内皮細胞は、コンフルエントな単層を形成する。
【００５３】
本発明の１つの態様では、細胞接着因子は、ＵＰ５０、ビトロネクチン、アルブミン、エラスチン、トロポエラスチン、Ｅ−カドヘリン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、Ａｎｇ−１、フィブロネクチンおよびラミニンからなる群から選択される。
【００５４】
本発明の現在好ましい態様では、細胞接着因子は、ＵＰ５０である。
【００５５】
本発明の１つの態様では、チューブ状素子の内面は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ（商標））、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリエステル繊維、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（商標））、ポリウレタン、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質または処理されたヒトもしくは動物の血管を含んでいる。
【００５６】
本発明の１つの態様では、チューブ状素子の内面は、遺伝子操作された内皮細胞で播種する工程の前に接着マトリックスでコーティングされる。
【００５７】
本発明の１つの態様では、接着マトリックスは、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチントロポエラスチンおよび平滑筋細胞馴化増殖培地またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００５８】
本発明の１つの態様では、内皮細胞の少なくとも一部分は、１つ以上の細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００５９】
本発明の１つの態様では、細胞増殖成長因子は、ＶＥＧＦファミリーのタンパク質、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦおよびＨＧＦからなる群から選択される。本発明の現在好ましい態様では、細胞増殖成長因子は、ＶＥＧＦ−Ａである。
【００６０】
本発明の１つの態様では、細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている同一内皮細胞は、さらにまた細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００６１】
本発明の１つの態様では、内皮細胞の第１部分は細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されており、細胞の第２部分は細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００６２】
本発明の現在好ましい態様では、細胞接着因子および細胞増殖成長因子の両方が発現または過剰発現している場合は、細胞接着因子はＵＰ５０であり、細胞増殖成長因子はＶＥＧＦ−Ａである。
【００６３】
本発明の１つの態様では、平滑筋細胞は、チューブ状素子の外面上で播種および培養される。
【００６４】
本発明の１つの態様では、チューブの外面上で播種および培養されている平滑筋細胞の少なくとも一部分は、細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００６５】
本発明の１つの態様では、平滑筋細胞の少なくとも一部分は、細胞増殖因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００６６】
本発明の１つの態様では、細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている同一平滑筋細胞は、さらにまた細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００６７】
本発明の１つの態様では、平滑筋細胞の第１部分は細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されており、細胞の第２部分は細胞増殖成長因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。
【００６８】
本発明の１つの態様では、チューブ状素子の内腔は、それにチューブ状素子が移植される血管の内腔の断面積に実質的に等価である断面積を有している。
【００６９】
本発明の１つの態様では、内腔の断面積は、約７〜約７００ｍｍ２である。
【００７０】
本発明の１つの態様では、内皮細胞は、静脈、動脈および循環内皮細胞からなる群から選択されるソースから入手される、または骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞および胚幹細胞から選択されるソースに由来する。
【００７１】
本発明の１つの態様では、平滑筋細胞は、静脈もしくは動脈から、または骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞および胚幹細胞から入手される。
【００７２】
本発明の１つの態様では、内皮細胞および平滑筋細胞は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物から入手される。
【００７３】
本発明の１つの態様では、ヒトは、血管グラフトを受容する患者である。
【００７４】
本発明の１つの態様は、人工血管グラフトを製造する方法であって、第１端、第２端、外面および内腔を説明する内面を有する合成チューブ状素子を提供する工程を含む方法である。複数の細胞は、チューブ状素子の内面上で播種および培養される。複数の細胞は、複数の内皮細胞、複数の平滑筋細胞または複数の内皮細胞および複数の平滑筋細胞を含んでいる。内皮細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。平滑筋細胞だけが使用される場合は、少なくともそれらの一部分は、１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。内皮細胞および平滑筋細胞の両方が使用される場合は、内皮細胞の少なくとも一部分、平滑筋細胞の少なくとも一部分または内皮細胞および平滑筋細胞の両方の少なくとも一部分が１つ以上の細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作される。
【００７５】
本発明の１つの態様では、上記の方法では、細胞の培養中にチューブ状素子の内面で流体剪断力が適用される。
【００７６】
本発明の１つの態様は、本発明の人工血管グラフトを使用して患者における血管の一部分をバイパスする方法に関する。人工グラフトの１つの端はバイパスされる部分の近位の血管内に移植され、人工グラフトのもう１つの端はバイパスされる部分の遠位の血管内に移植され、それにより、近位グラフトの部位からチューブ状素子の内腔を通過して遠位グラフトの部位までの流体連続性が確立される。
【００７７】
本発明のまた別の態様は、本発明の人工血管グラフトを用いて患者に血液透析を実施する方法に関する。グラフトは、その１端を動脈内に移植し、また別の１端を静脈内に移植して、患者の皮下に移植され、それによって動脈からチューブ状素子の内腔を通して静脈内までの流体連続性が確立される。グラフトの内腔は、血液を内腔から血液透析濾過装置へ迂回させ、濾過し、次に内腔に戻すことができるように、血液透析濾過装置に接続される。
【００７８】
１つの実施形態では、本発明は、血管疾患もしくは障害を治療するための移植可能なデバイスであって、血管内デバイスおよびプロテーゼの上および／または中に配置された生分解性薬物溶出ポリマーを含む移植可能なデバイス提供する。ポリマーには、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターを含浸させることができ、そしてさらに成長因子を含浸させることもできる。１つの態様では、血管内プロテーゼは、ステント、血管グラフト、人工心臓、または人工弁である。また別の態様では、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターは、フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）−５（ＵＰ５０）であってよく、成長因子はＶＥＧＦであってよい。治療すべき血管疾患もしくは障害には、例えば、狭窄、再狭窄、アテローム硬化症、心拍停止、脳卒中、血栓症、もしくはアテレクトミー、またはこれらの疾患もしくは障害を治療するために使用された血管内インターベンションによって誘発された傷害が含まれる。
【００７９】
また別の態様では、移植可能なデバイスは、ＶＥＧＦを含む、または含まない、フィブリン−５を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている内皮細胞でコーティングされた基質を含むことができる。基質は、プロテーゼの上および／または中に配置することができる。
【００８０】
また別の実施形態では、本発明は、血管内インターベンション後の血管閉塞を阻害して同時に血管壁の回復を増強することにより血管疾患もしくは障害を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象の血管内に、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターおよび成長因子が含浸させられた生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされた血管内デバイスを挿入し、ポリマーからインヒビターおよび成長因子を血管内に溶出させ、それによって平滑筋細胞増殖を阻害して内皮細胞増殖を増強する工程による方法を提供する。
【００８１】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、血管内インターベンション後の平滑筋細胞の新生内膜形成を予防する方法であって、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターをコードするポリヌクレオチド配列を含有する複数のベクターを血管傷害の部位へ送達する工程による方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
（発明の詳細な説明）
毎年、夥しい数の人々が様々な器官および四肢へ十分な量の血液を送達する能力を失っている。これらの疾病の中で最もよく知られているのは、心臓に通じる１枝以上の動脈の閉塞である冠動脈閉塞症である。しかし、数十万人の人々はさらに四肢への血流の喪失にも苦しんでいる。血流の喪失が重大である場合は、先端の組織は虚血性になり、最終的には死亡する。そのような末梢血流の喪失は、傷害の結果として生じることがあるが、最も頻回には進行性アテローム硬化症を合併するアテローム硬化症または糖尿病などの疾患の結果である。これらの状態を救済するために、外科医はしばしば、血管の傷害もしくは罹患した部分を回避し、血流を回復させるために血管グラフトを使用しようとする。
【００８３】
血管グラフトは、一般には、生物学的または合成（または、同義語では人工）のいずれかであると分類される。生物学的グラフトの例には、自家グラフトおよび同種グラフトが含まれる。自家グラフトは、患者の身体における他の部位から採取される。例えば、末梢血管手術で、最も一般的なグラフトは長い伏在静脈を含んでいるが、このとき弁は切削用内腔内弁膜切開刀（ｖａｌｖｕｔｏｍｅ）を用いて外科的に切除される。
【００８４】
他方では、同種グラフトは、また別の動物または同一もしくは相違する種から採取された生物学的グラフトである。
【００８５】
合成もしくは人工グラフトは、例えば、制限なく、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））、延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））などの非生物学的材料から製造されている。Ｄａｃｒｏｎグラフトは、一般には大動脈および大動脈−腸骨動脈手術において使用される。現在は、鼠径靱帯の下方では、合成グラフトを用いた結果は生物学的（静脈）グラフトより劣ると考えられている。しかし、適切な静脈を入手できない場合は、ＰＴＦＥがほとんどの場合において最適なグラフト材料である。同様に、合成グラフトを使用すると、手術時間がより短縮され、後の手技のために静脈を使用せずに温存することができる。だが人工グラフトは、心臓バイパス手技ではまだ広範には使用されていない。これらのグラフト（ならびに一部の生物学的グラフト）の限界の１つは、長期開存性、すなわち長期間にわたり血流に開存したままでいる能力の欠如である。これは特に、鼠径部より下方の末梢血管および冠動脈に関連する血管などの小血管に関して問題となる。Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）またはＴｅｆｌｏｎ（登録商標）グラフトを用いた径の大きい、および中等度の血管の置換は１０年間以上の開存性を有する可能性があるが、小血管を用いた場合の結果はこれより顕著に不良である。問題は、これらのグラフトの内腔が組織内方成長および血栓症、すなわち血餅の形成に起因して閉塞する傾向を示すことである。内皮細胞（ＥＣ）は、ときどきは合成グラフトの内腔を内張りするために使用される。細胞は、それらの血栓溶解活性（Ｄｉｃｈｅｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９６，９３：３０１；Ｇｉｌｌｉｓ−Ｈａｅｇｅｒｓｔｒａｎｄら、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１９９６，２４：２２６）およびそれらが新生内膜増殖（組織および細胞外内方成長）およびグラフト内の炎症反応（Ｐａｓｉｃら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９５，９２：２６０５）を防止する能力に起因してグラフトの性能を増強する。あいにくなことに、細胞は、流動している血液の剪断力に抵抗できないことが多く、最終的にはグラフトの表面から引き離されるので、したがってそれらの有用性が無効になる。本発明の合成血管グラフトは、この状況に対応する。
【００８６】
本発明のグラフトは、制限なく、ＰＴＦＥ（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））、ｅＰＴＦＥ、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、ポリエステルもしくはポリウレタンなどの完全に合成の材料から製造されたチューブ状素子を含んでいる。循環系中で剛性の壁を備えるグラフトを使用することはできるが、それらは血液波動伝搬および局所電場速度に有害な作用を及ぼす、したがってより高い高調波を減衰させて位相ひずみを導入する「低域フィルター」として主として機能する傾向があるために好ましくない。そこで、人工グラフトは繊維モチーフで製造されることが最も多く、つまりそれらは通常はウーブン、またはニットの繊維材料であるが、ポリウレタン製グラフトを押出成形することもできる。本発明の「合成」グラフトは、処理された動物もしくはヒト血管もまた含んでいる。
【００８７】
本発明の典型的な合成グラフトは、図１に示した。グラフト１０は、外面１５および内腔１３を説明する内面１４を有する合成チューブ状素子１２から構成される。合成チューブ状素子１２は、それに移植される血管の内断面積と実質的に等価である内断面積を有する。本発明の現在好ましい実施形態では、内断面積は約７〜７００ｍｍ２である。内面１４は、制限なく、例えばＰＴＦＥ、ｅＰＴＦＥ、ポリエステル繊維、コラーゲン繊維、エラスチン繊維、ポリウレタン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）、または動物もしくはヒトから入手した処理血管などの材料から構築される。内面１４は、好ましくは、制限なく、穴および／または突起部などの細胞播種を促進する構造を有している。
【００８８】
本発明の現在好ましい実施形態では、内面１４はＥＣおよび／またはＳＭＣ１６でコーティングされるが、それらの少なくとも一部分は１つ以上の細胞増殖因子を発現するように遺伝子操作されており、それらの一部分は１つ以上の細胞接着因子を発現するように遺伝子操作されている。
【００８９】
細胞増殖成長因子には、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、Ｅｐｏ（エリスロポイエチン）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＩＬ（インターロイキン）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）および血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。これらのいずれも本発明のデバイスおよび方法において使用できるが、ＰＤＧＦファミリーの１メンバーであるＶＥＧＦは、血管内皮の極めて特異的な刺激因子であるので、現在好ましい。
【００９０】
ＶＥＧＦファミリーは、現時点ではＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよび最も近年に発見されたＶＥＧＦ−Ｅから構成される。ＰＩＧＦ（胎盤成長因子）はＶＥＧＦ−Ａと密接に関連しており、擬ＶＥＧＦファミリー因子と見なされることが多い。これらはいずれも、実際上、本発明のグラフトおよび方法において使用されるために好ましい。
【００９１】
本発明のグラフトおよび方法において有用な細胞接着因子には、制限なく、細胞膜をＥＣＭへ結合させる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一部であると考えられる因子が含まれる。
【００９２】
本発明の現在好ましい実施形態では、内面１４はＥＣおよび／またはＳＭＣでコーティングされており、このとき同一細胞が細胞増殖成長因子および細胞接着因子の両方を発現するように遺伝子操作されている。
【００９３】
さらに、チューブ状素子１２の外面１５は、グラフト受容を向上させ、ならびにグラフト耐久性に役立つように遺伝子操作された、または遺伝子操作されていない平滑筋細胞でコーティングすることができる。
【００９４】
内皮細胞（ＥＣ）は、血管の内面もしくは内腔面を被覆する細胞である。それらは多数の目的に役立つが、本発明に関連して最も重要な目的の１つは、血栓症、すなわち血管内での血餅形成の予防ならびに組織内方成長の予防および望ましくない細胞外マトリックスの産生の予防である。本発明の合成グラフトにおいて有用なＥＣには、制限なく、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＡＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、皮膚微小血管内皮細胞（ＤＭＥＣ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）、ヒト頸静脈内皮細胞（ＨＪＶＥＣ）、ヒト橈骨動脈内皮細胞（ＨＲＡＥＣ）、およびヒト内胸動脈内皮細胞（ＨＩＭＡＥＣ）などの動脈および静脈ＥＣが含まれる。有用なＥＣは、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞および胚幹細胞などの循環内皮細胞および内皮細胞前駆体から入手することもできる。
【００９５】
平滑筋細胞は血管内で内皮細胞を取り囲んでおり、拡張および収縮することによって血管の径を調節する。本発明のために最も重要なことに、平滑筋細胞は、大多数の細胞外マトリックスの分泌の原因となる。本発明のグラフトにおいて有用な平滑筋細胞には、制限なく、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＭＣ）、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞（ＨＵＡＳＭＣ）、ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）、ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）、ヒト気管支平滑筋細胞（ＨＢＳＭＣ）、ヒト橈骨動脈平滑筋細胞（ＨＲＡＳＭＣ）、およびヒト伏在静脈もしくは頸静脈平滑筋細胞が含まれる。
【００９６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、哺乳動物組織中の細胞を取り囲んで支持する複合材料である。細胞外マトリックスは、一般には結合組織と呼ばれている。ＥＣＭは、構造タンパク質（コラーゲン、エラスチン）、分化したタンパク質（フィブリリン、フィブロネクチン、ラミニン）およびプロテオグリカン（それに付着しているタンパク質コアはグリコサミノグリカンと呼ばれる繰り返し二糖である）の生体分子の３つの主要クラスから構成される。
【００９７】
コラーゲンは、ＥＣＭの主要タンパク質を含んでいる。実際に、それらは動物界において見いだされる最も豊富なタンパク質である。少なくとも２０種のタイプのコラーゲンが存在する。コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型は最も豊富であり、類似構造の原線維を形成する。ＩＶ型は二次元細網であり、基底膜の主要成分である。コラーゲンは自然状態では主として線維芽細胞によって合成されるが、上皮細胞もまた一部のコラーゲンを合成する。
【００９８】
ＥＣＭにおいてフィブロネクチンが果たす役割は、細胞を様々な細胞外マトリックスへ付着させることである。例えば、フィブロネクチンは、細胞をコラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ含有ＥＣＭに付着させることが証明されている。
【００９９】
フィブロネクチンは、細胞をコラーゲンＩＶ含有ＥＣＭには付着させない。この場合には、ラミニンが接着分子である。
【０１００】
その他の細胞接着因子には、エラスチンおよびその前駆体であるトロポエラスチンが含まれる。エラスチンは、架橋結合の前には極めて可溶性であるトロポエラスチンの広範な架橋結合に起因して極めて不溶性である。エラスチンおよびトロポエラスチンは、平滑筋細胞および内皮細胞の両方によって自然に合成される。
【０１０１】
内皮細胞カドヘリン（Ｅ−カドヘリン）は、カルシウム依存性接着分子である。それらは同種親和性方法で結合する傾向がある。すなわち、１つのカドヘリンは細胞外空間内の他のカドヘリンに結合する。この結合は特定接合部で発生する。
【０１０２】
Ｓ−タンパク質、血清拡散因子およびエピボリン（ｅｐｉｂｏｌｉｎ）としても知られるビトロネクチンは、多数の組織の細胞外マトリックス中に存在する。フィブロネクチンとともに、ビトロネクチンは血漿および血清中の主要接着タンパク質である。ビトロネクチンと他のＥＣＭ成分との相互作用は、主としてそのコラーゲン結合ドメインによって媒介される。表面上のプレコーティングとして使用されると、ビトロネクチンは、多数の様々なタイプの細胞の付着、拡散、増殖および分化を促進する。
【０１０３】
近年発見されたタンパク質、フィブリン−５もしくはＤＡＮＣＥ（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｒｅｓｔ，ＥＦＧ−ｌｉｋｅ（発生中の動脈および神経堤、ＥＦＧ様））としても知られているＵＰ５０もまたＥＣＭ中で見いだされている。ＵＰ５０は、例えば肺、大動脈および皮膚などの弾性を必要とする種々の器官にとって不可欠である弾性線維の生成および組織化に関係している。このタンパク質は、細胞表面インテグリンと相互作用するＲＧＤモチーフを有しており、細胞−マトリックス接着を促進する。
【０１０４】
上記の因子の多くは、ＥＣおよびＳＭＣによって自然に発現する。これらの細胞は、特に剪断応力に対する抵抗性に関して、人工グラフトの内面上のコーティングとして、細胞の性能を向上させるために因子を過剰発現するように遺伝子操作することができる。他方、所望の因子が自然には発現しない場合は、細胞はそれを発現するように同様に遺伝子操作することができる。
【０１０５】
播種された細胞自体による細胞接着因子の発現は、実質的に向上した細胞−細胞および細胞−グラフトの接着を生じさせるが、遺伝子操作されたＥＣもしくはＳＭＣを用いて播種して接着をいっそう増強させる前に、例えば制限なく、フィブロネクチンなどの１つ以上のＥＣＭタンパク質を用いてグラフトの内面をプレコーティングすることもまた本発明の１つの態様である。タンパク質は、最初にＥＣおよびＳＭＣを増殖させるために使用した細胞培養から収穫することができる、または血液から単離することができる。さらに細胞を培養した後の細胞培養培地自体を使用することもまた本発明の１つの態様であり、この場合には培地は「馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」と呼ばれる。現在好ましい馴化培地は、遺伝子操作された、もしくは遺伝子操作されていないＳＭＣの培養から入手される馴化培地である。
【０１０６】
上記の細胞は、それらの一部分が１つ以上の細胞増殖成長因子を発現し、それらの一部分が１つ以上の上記のＥＣＭ細胞接着因子を発現するように遺伝子操作されている。しかし、本発明の現在好ましい実施形態では、同一細胞が細胞増殖因子および細胞接着因子の両方を発現するように遺伝子操作されている。
【０１０７】
本発明の現在好ましい実施形態では、上記の細胞は、グラフトの内面上に播種されてコンフルエンスまで培養される。
【０１０８】
細胞接着因子の発現によって与えられる向上した接着が細胞増殖を犠牲にせずに成り立ち、細胞増殖は正常に進行することが見いだされていることは注目に値する。
【０１０９】
図２は、本発明の人工グラフトを調製して評価するために使用される実験デザインを提示しているフローチャートである。
【０１１０】
第１に、増殖成長因子、接着因子、またはその両方を発現するように細胞を確実に形質移入するベクターが開発されなければならない。今回の場合には、遺伝子を血管細胞内に転移させるために２種のタイプのウイルスベクターのいずれか１つを使用した。第１は、高レベルの導入遺伝子の発現をもたらす組換えアデノウイルスベクターであった。そのようなベクターは、アデノ関連ベクター（ＡＡＶ）およびレンチウイルスに基づくベクターより容易に調製できるという長所を有している。さらに、他のウイルスベクター系とは相違して、アデノウイルスベクターは、導入遺伝子の発現のために細胞分裂が必須ではないために、グラフトへの細胞播種後に使用できる。これとは対照的に、レトロウイルスベクターは細胞分裂を必要とするが、これは本発明においては概して、組織培養プレート上では高度に、そしてグラフト上ではそれより少ない程度で実施される。
【０１１１】
第２ベクターは、ＧＡＬＶ（ギボン関連白血病ウイルス）糖タンパク質を備える偽型レトロウイルスベクターであった。偽型ベクターはヒトＥＣおよびＳＭＣに対して高親和性を有しており（Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ．−Ｌ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９６，３：９４６−５６）、そしてアデノウイルスベクターとは相違して、レトロウイルスベクターによる形質移入は安定性の形質移入発現および娘細胞内への遺伝子発現の伝達そしてインビボでの低免疫原性反応をもたらす。
【０１１２】
ＵＰ５０およびＶＥＧＦ１６５遺伝子をＥＣおよびＳＭＣ内に転移させるためには、表１に列挙したベクターを使用した。図３ａ、４ａおよび４ｂはアデノウイルスＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ、ＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰ発現ベクターを示しており、図３ｂ、４ｃおよび４ｄは、使用したレトロウイルスＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ、ＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰベクターを示している。
【０１１３】
【表１−１】
2009525110.tif 000003
【０１１４】
【表１−２】
2009525110.tif 000004
Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入されたヒトＥＣが播種されたｅＰＴＦＥグラフトは、蛍光顕微鏡によって観察されたように、ＧＦＰを発現することが見いだされた（図５Ａ）。Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰによって形質移入されたヒトＥＣが播種されたｅＰＴＦＥグラフトも同様に導入遺伝子を発現することが見いだされた（図５ｂ）。導入遺伝子の発現は、感染の２４時間後に分析した。
【０１１５】
ＵＰ５０−ＧＦＰを過剰発現するレトロウイルスによって形質導入されたヒトＥＣが播種されたｅＰＴＦＥグラフトは、さらにＧＦＰを発現する細胞（図６ａ）の蛍光顕微鏡検出によっても導入遺伝子を発現することが見いだされたが、それはＵＰ５０が発現カセット内の上流に位置する（ＧＦＰが発現する場合は、ＵＰ５０が発現させられなければならない）からである。ＶＥＧＦ−ＧＦＰを過剰発現するレトロウイルスによって形質導入されたヒトＥＣが播種されたグラフトは、導入遺伝子を発現することが同様に見いだされた（図６ｂ）。導入遺伝子の発現は、播種の４８時間後に分析した。
【０１１６】
ヒトＥＣ同一性は、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）についての免疫組織化学的染色によって検証した（図３３）。
【０１１７】
ＵＰ５０−ＧＦＰをコードする組換えアデノウイルスによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入は、さらに導入遺伝子の発現もまた生じさせた（図７ｂおよび７ｄ）。ＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入は、同様にＧＦＰの産生を生じさせた（図８ｂおよび８ｄ）。
【０１１８】
ＵＰ５０  ｍＲＮＡの転写は、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣおよびＳＭＣ（図９ａおよび９ｂ）ならびにＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターを用いて遺伝子操作されたＥＣおよびＳＭＣにおいてＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出された（図１０ａおよび１０ｂ）。
【０１１９】
ＵＰ５０（６０ｋＤ）発現は、アデノウイルスを用いたＥＣおよびＳＭＣの形質移入（図１１）およびＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターによる形質導入（図１２）後のＵＰ５０ウェスタンブロット分析によって検出した。
【０１２０】
ＵＰ５０は、Ａｄ．ＵＰ５０形質移入ＥＣおよびＳＭＣ中で、免疫組織化学的分析によって検出された（図１３ｂおよび１３ｄ）。細胞質染色は、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入細胞中では発生したが、Ａｄ．ＧＦＰ形質移入細胞中では発生しなかったが、これはＵＰ５０の細胞質での高レベル発現を示していた。
【０１２１】
共焦点顕微鏡検査を使用して、形質移入ＥＣ内でのＵＰ５０の細胞内部位を決定した。ＵＰ５０は、細胞質および細胞膜の両方においてＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入内皮細胞中で検出された（図１４ｂおよび１４ｃ）。これはコンフルエント細胞内のフィラメント様構造としても検出された（図１４ｂ）。
【０１２２】
ＥＣＭ中のＵＰ５０の存在は、ＵＰ５０−ＧＦＰをコードするアデノウイルスベクターによって形質移入されたＥＣの免疫組織化学的分析によって検出された（図１５）。
【０１２３】
その一部分はＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰによって形質移入され、その一部分はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入されたＥＣおよび／またはＳＭＣの共培養は、有意なレベルのＶＥＧＦおよびＵＰ５０を発現することが見いだされた（図１６ａおよび１６ｂ）。同様に、その一部分はＵＰ５０を発現するようにレトロウイルスによって形質導入され、その一部分はＶＥＧＦを発現するようにレトロウイルスによって形質導入されたＳＭＣおよびＥＣの共培養の分析は、ウェスタンブロット分析によって有意なレベルの因子を共発現することが見いだされた（図１７ａおよび１７ｂ）。
【０１２４】
上記の感染−形質導入は、細胞質ＧＦＰ発現によって検出されるように、ほぼ１００％の導入遺伝子の発現細胞を産生した。ＵＰ５０の導入遺伝子過剰発現は、細胞増殖および増殖に阻害作用を及ぼさなかった（図１８）。アデノウイルス形質移入細胞（Ａｄ．ＧＦＰ、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ）中で測定された数値は非感染コントロール群よりわずかに高かったが、ＵＰ５０発現の作用は有意ではなかった。Ａｄ．ＧＦＰによって形質移入されたＥＣとＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入されたＥＣとの間に有意な差は見られなかった。ＡｄＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰを用いた形質移入は、他の因子に比較して有意な増殖を誘導した。
【０１２５】
上記は、その一部は増殖成長因子を発現し、その一部は細胞接着因子を発現する細胞の共培養を用いる実行可能性を証明している。しかし、両方の因子を発現する同一細胞を有することは本発明の現在好ましい実施形態である。このため、ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターによって形質導入されたＥＣを４８時間にわたりインキュベートし、その後にＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰもしくはＡｄ．ＧＦＰを用いて感染させた。細胞は、ウイルス含有培地中でさらに２４時間にわたりインキュベートした。その後、ウイルス培地を血清無含有培地と交換し、細胞をさらに２４時間にわたりインキュベートした。増殖培地（３０μＬ）のサンプルを１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上で電気ブロッティングし、抗ＶＥＧＦまたは抗ＵＰ５０抗体のいずれかと一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ抱合二次抗体へ曝露させた後、ＥＣＬ試薬を用いてブロットを展開させ、Ｘ線フィルムに曝露させた。ＵＰ５０−ＧＦＰを発現するようにレトロウイルスによって形質導入され、引き続いてＶＥＧＦ−ＧＦＰをコードするアデノウイルスベクターによって形質移入されたＥＣは、蛍光顕微鏡検査によって決定されたように、ＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターを用いて感染させただけの細胞より高レベルのＧＦＰ発現を提示した（図１９ａおよび１９ｂ）。ウェスタンブロット分析は、細胞がＶＥＧＦおよびＵＰ５０タンパク質を共発現することをさらに確証した（図２０ａおよび２０ｂ）。次に、長期生体適合性および開存性を有する合成血管グラフトを生成するマイトジェン因子および接着因子の両方を発現するように遺伝子操作されたＥＣの使用について調査した。
【０１２６】
ヒト伏在静脈ＥＣは、２種の別個のウイルスベクターであるＶＥＧＦ−ＧＦＰおよびＵＰ５０−ＧＦＰを用いてレトロウイルスによって形質導入した。形質導入後、細胞はｅＰＴＦＥグラフト上に播種した。図３２Ａは、最初にＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターによって、そして７２〜９６時間後にＶＥＧＦ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターによって形質導入された後の細胞培養皿内の内皮細胞の蛍光顕微鏡写真を示している。この図は、細胞が二重遺伝子形質導入を生残り、正常な形態を維持できることを示している。図３２Ｂは、二重形質導入細胞が実際に両方の遺伝子を発現することを示しているウェスタンブロットである。右側のパネルでは、上方部分における密なバンドはＵＰ５０が過剰発現していることを示しており、下方領域における密なバンドはＶＥＧＦが過剰発現していることを示している。
【０１２７】
ＥＣ内での導入遺伝子の発現を調節するためには、エフェクター調節発現系を使用できる。例えば、テトラサイクリンによってそれら自体がアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるプロモーターを用いることによって、ＶＥＧＦ発現はアップレギュレートすることができ、ＵＰ５０発現はダウンレギュレートすることができる。この方法で、細胞接着が優先である場合には、バイパス手術後第１週において、細胞接着因子、例えばＵＰ５０を発現または過剰発現する細胞を作製できる。次に、テトラサイクリンを投与すると、グラフトの強化された被覆を実行するために細胞増殖成長因子、例えばＶＥＧＦの発現を同時にアップレギュレートしながら細胞接着因子発現をダウンレギュレートすることができる。または、細胞を、ＵＰ５０を安定性で発現または過剰発現するようにレトロウイルスによって形質導入し、その後にＶＥＧＦの発現が一過性であるような方法でＡｄ．ＶＥＧＦによって形質移入することができる（実施例１２）。
【０１２８】
導入遺伝子の発現は検証されたので、次に細胞生理学に発現が及ぼす作用を調査した。これを遂行するために、アデノウイルス感染ＥＣスフェロイドを用いて、コラーゲンゲル内でのインビトロ血管形成について試験した。スフェロイドの生成については、実施例のセクションに記載した。Ａｄ．ＧＦＰ（図２１ｂ）またはＡｄＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣ（図２１Ｆ）のスフェロイドは、低いベースライン時催芽活性を有することが見いだされた。催芽は、いずれかへの外因性ＶＥＧＦの添加によって強度に刺激された（図２１ｄおよび２１ｈ）。同様に、Ａｄ．ＧＦＰもしくはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣ（図２２ｂおよび２２ｆ）のスフェロイドは、低いベースライン時催芽活性を示した。催芽活性は、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣとの５０％共培養において刺激された（図２２ｈ）。最高催芽レベルは、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰおよびＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣの共培養において観察された（図２２ｈ）。
【０１２９】
細胞接着（＝保持）について試験した相違するセットの実験では、組換えアデノウイルス形質移入後のＵＰ５０の発現は、Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞（４０％）もしくはコントロールの非形質移入細胞（２０％）と比較して細胞保持を有意に増加させる（６０％）ことが証明された（図２３）。このため、ＵＰ５０とＶＥＧＦとの共発現または過剰発現は、ＶＥＧＦ単独によって媒介される場合に比較してＥＣの催芽を増加させると結論付けることができる。これらの結果は、そのような因子の組み合わせを発現するＥＣが増強された増殖性および接着性能力を示すことを証明している。
【０１３０】
本発明の現在好ましい実施形態では、増殖成長因子は、ＶＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２１２２１）、酸性もしくは塩基性ＦＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ６７２９１およびＭ２７９６８）またはＨＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１４０１２）である。本発明の現在好ましい実施形態では、細胞接着因子は、ＵＰ５０（配列番号１）、フィブリン−５／ＤＡＮＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１１２１５２）、ビトロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００６３８）、アルブミン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００４７７）、コラーゲンＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００１１４）、コラーゲンＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１５５２４）、フィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０２７６１）、ラミニン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００５５６０）、トロポエラスチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ０６５７５９、またはＶＥカドヘリン（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１７９５）である。
【０１３１】
ＥＣもしくはＳＭＣを発現または過剰発現するように遺伝子組み換えできるその他の細胞接着因子は、本明細書の開示に基づくと当業者には明白になるであろう。すべてのそのような接着因子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
好ましくは、ＥＣおよびＳＭＣの両方が使用される場合は、細胞増殖成長因子は、ＳＭＣの望ましくない増殖を回避できるように特にＥＣの増殖を促進する。すなわち、ＳＭＣは、それらが本発明において使用される方法である、それらが内皮細胞の接着のためのより良好な表面を提供することに役立つ場合に望ましい。そこで、本発明のグラフトの外面（内腔上）上でのＳＭＣの使用は、ＳＭＣによって産生する細胞外マトリックスのグラフトを通しての内面上への移動を生じさせることができ、そこでマトリックスはＥＣのための改善された表面を提供するであろう。同様に、グラフトの内面上でのＳＭＣの使用は、ＥＣの層の下方でそのような層が自然に発生する血管の構造を模倣するために内面上でＳＭＣの単層を生成することが企図されている。
【０１３３】
グラフト１０を生成するために、細胞１６が播種される。すなわち内皮細胞の多数の細胞もしくはコロニーは素子１２の内面１４上に置かれ、次に細胞は、それらが接着して、必要な場合は十分な程度の内面１４のコーティングが達成されるまで成長して増殖するように培養される。好ましくは、細胞１６は、内面１４上でのコンフルエントな細胞単層を生じさせる条件下で培養される。「コンフルエントな単層」は、内皮細胞の増殖における、表面上の連続する一様なコーティングを形成するためにそれらが全部が相互に接触する段階を意味する。この時点で、正常細胞は、接触阻害の現象に起因して増殖を停止する。
【０１３４】
播種前に、内面は、内皮細胞の接着、成長および増殖に役立つ物質でコーティングすることができる。これらの物質は、制限なく、アミノ酸、ヌクレオチド、血清タンパク質、塩、ビタミン、例えばヒト血清などの補充血清（ＦＣＳ）を含むことができる。細胞と表面との接着を増強するためには、外因性ＥＣＭ物質もまた含めることができる。
【０１３５】
グラフト１０の内面１４をコーティングするためには、数種の播種アプローチを使用できる。ＥＣおよびＳＭＣの両方が使用された場合は、細胞は、内面１４上へ同時に、または連続的に播種することができる。最初にＳＭＣ、次にＥＣの連続的播種が、現在は好ましい。すなわち、遺伝子操作された、もしくは遺伝子操作されていないＳＭＣが好ましくは最初に播種され、その後に遺伝子操作されたＥＣが播種される。これは細胞にそれらの正常位置、すなわちＳＭＣの下方ならびにグラフトのＥＣと内面との間についての素因を与える。同時の播種が使用される場合は、細胞はそれらの所望の位置へ移動することができる、すなわちＳＭＣはグラフトの表面に向かって移動し、ＥＣはＳＭＣの上部に存在できるように移動する。連続播種が使用される場合は、播種間の時間は変動してよいが、ＳＭＣを用いた播種とＥＣを用いた播種間の現在好ましい時間経過は２４〜９６時間である。ＥＣがＳＭＣに対する天然親和性を有することは知られているので、好ましくは作用をいっそう増強するために接着因子を過剰発現し、さらに播種された内皮細胞もしくは循環内皮細胞がＳＭＣへ接着することを可能にするように遺伝子操作されたＳＭＣでグラフトを播種することが可能である。
【０１３６】
細胞１６は、同一細胞が細胞増殖成長因子および細胞接着因子の両方を発現するように遺伝子操作することができる。代替法では、細胞の一部分は細胞増殖成長因子を発現するように遺伝子操作し、また別の部分は細胞接着因子を発現するように遺伝子操作することができる。一般に、相違する細胞が細胞増殖成長因子および接着因子を発現または過剰発現するように使用される場合は、細胞接着因子を発現または過剰発現するより大きな比率の細胞が使用されることが好ましい。約６０％〜約９０％の細胞が細胞接着因子を発現または過剰発現することが現在好ましい。最も好ましいのは、細胞増殖成長因子および細胞接着因子の両方を発現または過剰発現する細胞であるが、この場合は、当然ながら比率は１：１である。そのような細胞は、天然細胞またはＶＥＧＦもしくはＵＰ５０単独を発現または過剰発現する細胞より良好にグラフトに接着することが見いだされた。
【０１３７】
ＥＣおよびＳＭＣは、様々な哺乳動物組織ソースから入手できる。例えば、ＥＣは、制限なく、静脈の区間、動脈の区間、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞、胚幹細胞または循環内皮細胞から入手できる。平滑筋細胞は、制限なく、ヒト伏在静脈、左内胸動脈、橈骨動脈、骨髄前駆細胞、胚幹細胞、および末梢血幹細胞から入手できる。
【０１３８】
本発明の現在好ましい実施形態では、ＥＣおよびＳＭＣは、グラフトの予定レシピエントまたは同系ドナーの組織から入手される。
【０１３９】
当然ながら、本発明のデバイスおよび方法において使用できるＥＣおよびＳＭＣは、細胞拒絶の回避が講じられる場合は、手段を提供する異種組織から入手することができる。これらの手段には、制限なく、ヒト崩壊促進因子を発現する、またはａ−Ｇａｌエピトープを発現しないトランスジェニック動物組織の使用が含まれる。同様に、よく知られている免疫抑制薬が使用されることが多い。拒絶のリスクを減少させるためのこれらやの他の多数の方法は、当技術分野においてよく知られている。当業者であれば、これらの技術のうちのいずれが所定の状況において最善に使用されるのかを知っているであろう。すべてのそのような手段は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４０】
増殖因子および接着因子は、配列によって発現する因子がＥＣおよびＳＭＣ中で機能的であることを前提に、ヒトまたはその他の哺乳動物細胞に由来するポリヌクレオチド配列によってコードすることができる。
【０１４１】
増殖および接着因子は、使用されるＥＣもしくはＳＭＣ細胞に対して内因性もしくは異種性であってよい。それらが内因性である場合は、すなわちそれらの一部もしくは全部が細胞によって発現されている場合、細胞はそれらの１つ以上を過剰発現するように遺伝子操作することができる。細胞は、所望の異種因子を発現するように遺伝子操作することもできる。
【０１４２】
本明細書で使用する用語「過剰発現する」、「過剰発現した」、または「過剰発現」は、細胞によって通常産生されるレベルを超える発現レベルを意味する。過剰発現は、その因子のより高いレベルの発現を生じさせる、細胞内への内因性遺伝子の追加のコピーを導入する工程によって誘導できる。過剰発現は、さらにまた内因性遺伝子の転写または翻訳をアップレギュレートする細胞遺伝子材料内へエンハンサー配列を導入する工程によって誘導することもできる。後者は、例えば、当技術分野においてよく知られている遺伝子「ノックイン」技術によって遂行できる。これは、ＲＮＡ分解のレベルを低下させる、または関連遺伝子のＲＮＡを安定化させる因子を導入する工程によって達成することもできる。遺伝子の過剰発現を生じさせる、そして本発明に関連して有用であろうこれらやその他の方法は、本明細書の開示に基づくと当業者には明白になるであろう。すべてのそのような技術は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４３】
本明細書で使用する語句「遺伝子操作する」は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチド配列を細胞内へ導入することを意味する。これらの配列は、過剰発現が目的である場合と同様に、細胞の遺伝子材料内に既に存在する配列の複製物であってよい。または、配列は、細胞がその配列によってコードされる因子を正常には発現しない場合におけるように、完全に外因性であってよい。配列は、それらの永続的一部分になるように細胞のゲノム内に統合することができる、またはそれらは細胞の核もしくは細胞質内の別個の一過性実体として残留していてもよい。本明細書の他の場所で記載するように、因子の安定性かつ一過性両方の発現は、所定の状況下では、本発明の方法を実行する際に有用なことがある。
【０１４４】
本発明のまた別の態様は、本明細書に記載の方法において使用するためにＥＣおよびＳＭＣを遺伝子操作するための核酸発現構築物である。本明細書で使用する用語「核酸構築物」は、１つ以上の増殖および／または接着因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を意味する。現在好ましい実施形態では、本構築物は、１つは細胞増殖成長因子をコードし、１つは細胞接着因子をコードする２つの配列を含んでいる。「ポリヌクレオチド配列」は、特定の因子の発現をコードする線形配列のヌクレオチド残基を意味する。現在好ましい実施形態では、本構築物は、ポリヌクレオチド配列の発現を指令するために１つ以上のプロモーター配列もまた含んでいる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートへの結合を促進し、複製を開始するＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＤＮＡの同一伸長鎖上でそれに物理的に接続した１つ以上の遺伝子だけの転写を開始する。すなわち本プロモーターは、それが影響を及ぼす遺伝子と「シス形」になければならない。プロモーターは構成的であってよい、すなわち常に「オン」であり、あらゆる時点に転写を開始することができる。プロモーターは、組織特異的であってよく、所定の組織環境内でのみ転写を開始することができる。または誘導性であってもよいが、その場合にはプロモーターが機能することを「誘導する」ためには、エフェクターとして知られる他の分子、または例えば制限なく、温度、光線、剪断応力、ｐＨ、圧力などの他の外部の影響が必要とされる。本発明の構築物においてはこれらのタイプのプロモーターのいずれも使用することができ、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４５】
実施例のセクションにおいて詳細に記載するように、細胞増殖成長因子および細胞接着因子は、様々な時間的パターンで発現させることができる。すなわち、所望であれば、遺伝子の発現は、細胞接着因子の発現または過剰発現を最初に発生させ、そして後の時点に、細胞増殖成長因子の発現または過剰発現をアップレギュレートさせるように制御することができる。所望であれば、細胞接着因子の発現は、細胞増殖成長因子の発現がアップレギュレートされる場合はダウンレギュレートすることができる。しかし現在は、細胞接着因子の発現または過剰発現は、細胞増殖成長因子の発現または過剰発現がアップレギュレートされる場合には単純に維持されることが好ましい。
【０１４６】
現在好ましい実施形態では、核酸発現構築物は、各々がポリヌクレオチド配列の１つの発現を指令する、２つのプロモーター配列を含んでいる。現在はさらに、プロモーターが誘導性であり、それらが同一エフェクター分子によって調節されることが好ましい。さらにまた、プロモーター配列は、エフェクターによって１つのプロモーターがアップレギュレートされ、同時に、もう１つのプロモーター配列がダウンレギュレートされるように選択されることが現在好ましい。
【０１４７】
適切な誘導性プロモーターには、制限なく、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているＴｅｔ−Ｏｎ（商標）およびＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）遺伝子発現系において使用されるプロモーターなどの、化学的に誘導されたプロモーター（エフェクター）が含まれる。また別の例は、剪断応力誘導性プロモーターである。
【０１４８】
代替法では、それらが転写的に連結されている、そして多シストロン性メッセージの第２配列の翻訳を指令するために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が含まれていることを前提に、両方のポリヌクレオチド配列を調節するための単一プロモーター配列を使用できる。
【０１４９】
これら２つのポリヌクレオチド配列は、２つのポリヌクレオチドの開裂および分離が発現している細胞中で発生できるようにプロテアーゼ開裂部位が配列間に挿入されていることを前提に、翻訳的に融合させることができる。
【０１５０】
所望であれば、これら２つのポリヌクレオチド配列は、細胞内に共導入される個別核酸構築物として提供することができる。
【０１５１】
本発明のまた別の態様は、本発明の細胞を遺伝子操作するための核酸発現構築物系である。本明細書で使用する「構築物系」は、上述した２つの核酸発現構築物を含んでいる。１つは細胞増殖成長因子をコードし、もう１つは細胞接着因子をコードするであろう。
【０１５２】
現在好ましい実施形態では、発現構築物もしくは構築物系は、レポーターマーカー、選択マーカーなどをコードする追加のポリヌクレオチド配列を含んでいる。選択マーカーはどの細胞が遺伝子操作された細胞であるかを決定し、そしてそれらの細胞を単離することに役立つように使用される。一般的選択マーカーは、抗生物質耐性である。つまり、耐性遺伝子は、所望の因子遺伝子と一緒に細胞内に挿入される。細胞がベクターによって処理された後に、首尾よく感染させた細胞は抗生物質への曝露を生残り、単離することはできるが、感染していない細胞は死滅するであろう。レポーターマーカーは、細胞増殖成長因子および細胞接着因子の発現を監視するために使用される。レポーターマーカーの例には、制限なく、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。本明細書の遺伝子操作された細胞の産生において有用であろうその他の選択マーカーおよびレポーターマーカーは、本明細書の開示に基づくと当業者には明白になり、本発明の範囲内に含まれる。
【０１５３】
細胞増殖成長因子および細胞接着因子の発現を監視するためには、レポーターマーカー遺伝子は、因子をコードするポリヌクレオチド配列に転写的に連結または翻訳的に融合させることができる。または、レポーターマーカー遺伝子は、因子の転写を指令する配列と同一のプロモーター配列の転写制御下に置くことができる。
【０１５４】
細胞増殖成長因子および細胞接着因子をコードするポリヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞を形質転換させるため、そして細胞内の因子の発現を指令するために適切な市販されている発現ベクター系内にライゲートすることができる。そのような市販のベクター系は、現行のプロモーターもしくはエンハンサー配列を置換する、複製する、もしくは突然変異させるため、または追加のポリヌクレオチド配列を導入するために当技術分野においてよく知られている組み換え技術によって容易に遺伝子操作することができる。
【０１５５】
適切な哺乳動物発現ベクターには、制限なく、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）；ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）；ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ならびにそれらの誘導体が含まれる。
【０１５６】
因子をアップレギュレートするために本明細書で有用な核酸発現構築物もしくは構築物系は、細胞増殖成長因子もしくは細胞接着因子をコードする内因性配列に対してシス形の転写調節配列を含むことができる。「シス形」は、調節配列が、それが調節する配列と同一ＤＮＡ分子上に存在することを意味している。または、因子をアップレギュレートするために有用な核酸発現構築物もしくは構築物系は、細胞増殖成長因子もしくは細胞接着因子をコードする内因性配列に対してトランス形で翻訳調節配列を含むことができる。「トランス形」は、調節配列が、それが調節する配列とは相違するＤＮＡ分子上に存在することを意味している。
【０１５７】
当技術分野においてよく知られている遺伝子「ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）」技術は、ＥＣもしくはＳＭＣのゲノム内にシス作用性転写調節配列を導入するために使用できる（すべての図面を含めてそれらの各々は、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように参照して組み込まれる、米国特許第５，４８７，９９２号、第５，４６４，７６４号、第５，３８７，７４２号、第５，３６０，７３５号、第５，３４７，０７５号、第５，２９８，４２２号、第５，２８８，８４６号、第５，２２１，７７８号、第５，１７５，３８５号、第５，１７５，３８４号、第５，１７５，３８３号および第４，７３６，８６６号を参照されたい）。さらに例えば、国際特許公開のＷＯ９４／２３０４９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８およびＷＯ９４／２８１２３も参照されたい。この技術についての追加の一般的情報については、Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２５１−２７０，１９９１；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，１９８９；Ｄａｖｉｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１）２６９３−２６９８，１９９２；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２（８）：１２９９−１３０２，１９９３；Ｄｕｆｆ  ａｎｄ  Ｌｉｎｃｏｌｎ，“Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＰＰ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ”，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，１９９５；Ｈｕｘｌｅｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：７４２−７５０  １９９１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２６１  １９９３；Ｌａｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５：２２−２９，１９９３；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：１０５７８−８２；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２８１−３０１，１９９１；Ｓｃｈｅｄｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５８−２６１，１９９３およびＳｔｒａｕｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１９０４−１９０７，１９９３を参照されたい。
【０１５８】
本発明の核酸発現構築物は、ＤＮＡの直接マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、ジエチルアミノエチルデキストランおよびリン酸カルシウム媒介性形質移入、エレクトロポレーション、リポフェクション、アデノウイルス形質移入、レトロウイルス形質導入およびその他を含むがそれらに限定されない多数の方法のいずれかを用いてＥＣおよびＥＭＣ中に導入することができる。そのような方法は当技術分野においてよく知られており、それらのいずれも本発明の範囲内に含まれている。
【０１５９】
インビボでのｅＰＴＦＥグラフトへの血管ＥＣおよびＳＭＣの安定性および接着を評価するために、インビボ条件に似ている様々な機械的および血流力をシミュレートできる人工脈動流装置を開発した。本装置は、生合成製品を移植する前の品質保証のためにも使用できる。
【０１６０】
本装置（図２６）は、拍動性血液ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ装置、＃１４２１、米国）、硬質ステンレススチール（３１６Ｌ）チューブ（外径：１２ｍｍおよび６ｍｍ）、柔軟性Ｔｅｆｌｏｎ製チューブ（外径：１２ｍｍおよび６ｍｍ）、ステンレススチール（３１６Ｌ）コネクターおよび弁（Ｈａｍｌｅｔ社、イスラエル国）、およびガラス製補正タンクを含んでいる。本装置は、インキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２）内で組み立て、圧力モニター（＃７４２、Ｍｅｒｎｎｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、米国）およびフローモニター（＃Ｔ１０６、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）の両方によって監視する。入手したデータは、グラフト内で生成した剪断力の計算値をオンラインで提示する、データ収集システムによって分析する。
【０１６１】
装置が組み立てられると（各実験前には清潔で無菌である）、圧力およびフローコネクターがシステムおよび較正されているモニターに接続される。データ収集ソフトウエアが始動させられ、システムには暖かい（３７℃）増殖培地（Ｍ１９９、ペニシリン（２００単位／ｍＬ）−ストレプトマイシン（０．２ｍｇ／ｍＬ）、アムホテリシン（０．５μｇ／ｍＬ）および胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、２０％）が充填される。次に２枝のＰＴＦＥグラフトがステンレススチール製コネクターに装着され（図３１ａ）、シリコン糸を用いて正位置に固定される。システム内の培地の脈動流は、ポンプの１回ストローク量および流量の調整を通して緩徐に増加させられる。流体は、システム内のステンレススチール製チュービングおよびＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製チュービング内を流れる。生理学的パルス波は、タンクＡを用いて生成される。流体波の制御は、弁Ａを用いて達成される。弁ＢおよびＣは、グラフトを通る流量の制御を提供する。システム内の圧力は、弁Ｄによって制御される。本システムとインキュベーター内の雰囲気との平衡は、流体リザーバーとしても機能する補正タンクＢによって達成される。
【０１６２】
ｅＰＴＦＥグラフト上の内皮細胞の保持は、ＵＰ５０、ＶＥＧＦ−ＧＦＰ遺伝子および天然ＥＣをコードするレトロウイルスを用いるＥＣ形質導入後に試験した。ＵＰ５０を過剰発現するＥＣが播種されたグラフトを、ＧＦＰを発現するＥＣが播種されたグラフトに比較して試験した。これらの結果は、動脈様流動および剪断応力に曝露させた場合に、ＵＰ５０を過剰発現するＥＣの方がＧＦＰを発現する細胞よりはるかに良好に保持されることを示している。無作為に選択された区域の例は、図３５に示した。ＧＦＰによって形質導入されたＥＣ播種グラフトを天然ＥＣが播種されたグラフトと比較した場合に、差は観察されなかった。ＵＰ５０を過剰発現するＥＣが播種されたグラフトの保持についても、ＶＥＧＦを過剰発現するＥＣが播種されたグラフトと比較した。ＵＰ５０を過剰発現するＥＣは、ＶＥＧＦを過剰発現するＥＣに比して優れた保持を示した。無作為に選択された区域の例は、図３６に示した。ＵＰ５０およびＶＥＧＦを過剰発現するＥＣが播種されたグラフト上の細胞の保持は、ＶＥＧＦだけを過剰発現するＥＣが播種されたグラフト上の細胞の保持と比較した（図３７）。両方の因子を過剰発現する細胞は、ＶＥＧＦ単独を過剰発現する細胞より実質的に良好な保持を示した（図３８）。
【０１６３】
上記のインビトロ結果がインビボで複製されるかどうかを試験するために、細胞増殖成長因子および細胞接着因子を過剰発現するヒツジ自家ＥＣが播種されたグラフトをドナーヒツジ動脈内に移植した（実施例２６）。その結果は、ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＶＥＧＦ−ＧＦＰのいずれかを過剰発現する細胞が播種されたグラフトは、ＧＦＰ単独を過剰発現する細胞と比較して、インビボ血流への曝露後にグラフトに接着しているより多数の細胞を有することを示した（図３０）。さらに、ＵＰ５０を過剰発現する細胞が播種されたグラフトは、ＧＦＰもしくはＶＥＧＦを過剰発現する細胞が播種されたグラフトより多数の接着性細胞を提示した。
【０１６４】
本発明の人工血管グラフトは、任意の用途において、天然もしくは人工のいずれかで、任意の現行バイパスもしくはシャント用グラフトの代りに使用することができる。そこで、それらは、制限なく、種々の心臓動脈バイパス術、そして末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を治療するために使用される動脈バイパス術の両方のために使用できる。本発明の人工グラフトは、血液透析に使用するために作製される瘻孔の代用品もしくは置換物として使用することもできる。さらに本発明の合成人工血管グラフトは、例えば外傷によって損傷した四肢動脈などの損傷した血管を代用するために使用することもできる。
【０１６５】
本発明のグラフトのための現在好ましい用途は、透析患者が使用するための人工動静脈シャントである。
【０１６６】
血液透析では、患者の血液は、薄い膜によって分離された２つのチャンバーから構成される透析装置を通過させることによって「浄化」される。血液は膜の片側のチャンバーを通過し、透析液は他方のチャンバーを循環する。血液中の廃棄物は膜を通って透析液中に通過し、廃棄され、「清潔な」血液は血流内に再循環させられる。血流へのアクセスは、外部からであっても内部からであってもよい。外部からのアクセスは、１本は動脈内、１本は静脈内に配置される２本のカテーテルを含んでいる。より頻回には、そして好ましくは、内部アクセスが提供される。これは、動静脈瘻またはＡＶグラフトのいずれかによって遂行される。ＡＶ瘻は、皮下での動脈および静脈の外科的接合を含んでいる。血液量の増加が弾性の静脈を引き延ばして、より大量の血流量を可能にする。針は、透析のために血液が抜去され、その後血液が拡張した静脈を通して戻されるように瘻内に配置される。
【０１６７】
ＡＶグラフトは、１つの理由、または他の理由から静脈がＡＶ瘻のために不適合である人々のために使用できる。ＡＶグラフトは、患者自身の伏在静脈由来のドナー静脈、ウシ由来の頸動脈または動脈由来の合成グラフトを患者の静脈へ外科的に移植する工程を含んでいる。合成ＡＶグラフトを用いた場合の主要合併症の１つは、グラフトの閉塞を惹起する血栓症および新生内膜細胞増殖である。
【０１６８】
血栓症および新生内膜増殖に対抗するために、グラフトには患者自身の内皮細胞が播種されている。しかし、細胞層を通過する針の侵入によって惹起される損傷とともに、これらのグラフトを通過する高速の血流は、グラフトの壁からのＥＣの剥離を生じさせることが多い。本発明のグラフトは、この欠陥を克服する。
【０１６９】
第一に、ＵＰ５０およびＶＥＧＦを過剰発現する本発明の遺伝子操作されたＥＣは、穿刺部位でよりグラフトに付着したままでいることができる、したがって針によって惹起される損傷を最小限に抑えることができる。さらに、遺伝子操作された細胞は、天然ＥＣよりはるかに迅速に増殖し、したがって穿刺部位をより高速かつ完全に被覆する。これは、ＥＣＭ、グラフトの性能を増強するために使用される他の物質およびグラフト材料自体の血液への曝露を減少させ、これは穿刺部位での血栓症の発生を減少させると予測されるであろう。ＥＣ層の迅速な再生は、さらに吻合部位でのＳＭＣ増殖も減少させるはずであり、したがってシャント内のグラフトの開存性を向上させるであろう。これは、実施例２７で証明されている。
【０１７０】
そこで、内皮細胞増殖成長因子および細胞接着因子を発現または過剰発現するように遺伝子操作された細胞は、血流の剪断力に対して実質的により抵抗性であり、機械的損傷または剪断応力誘発性剥離後でさえグラフトを完全に被覆するより高度の能力を有している。さらに、ＶＥＧＦおよびＵＰ５０を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている細胞は、これらの因子を発現しない細胞よりはるかに迅速に、穿刺によって惹起される損傷を被覆および修復すると思われる。そこで、本発明のグラフトは、グラフト内への針の侵襲部位またはグラフトの露出面でのより低い血栓症の発生率も有するはずである。これらの因子は、実施例２７〜２９で証明されたように、現行グラフトより実質的に大きな開存性および患者におけるより長い有用な寿命を生じさせるはずである。
【０１７１】
また別の実施形態では、血管障害に関連する、そして詳細には血管形成術およびステント留置術、またはアテレクトミーに関連する病変を治療するためのデバイスおよび方法が提供される。例えば、実施例２９を参照されたい。特に興味深いのは、血管の内膜内への血管平滑筋細胞の移動および増殖、ならびにアテローム硬化症に関連する癒着の結果として生じる再狭窄と呼ばれる傷害である。フィブリン−５（ＵＰ５０）でコーティングされた血管プロテーゼを使用する追加の長所は、フィブリン−５が平滑筋細胞の移動および増殖を部分的に阻害することである。ステントなどの血管プロテーゼに使用される一部の薬物とは相違して、フィブリン−５は、平滑筋細胞増殖を完全には抑制しない。インターベンション後の血管壁治癒のためには一部の平滑筋細胞増殖が必要とされるので、フィブリン−５は、有益な内皮細胞を含む全細胞増殖を完全に阻害するという、ステント上で使用される現行薬物より優れた長所を有する。フィブリン−５単独の使用は平滑筋細胞および内皮細胞の移動および増殖の両方を部分的に阻害するが、ＶＥＧＦなどの成長因子の添加は、フィブリン−５の存在に起因して部分的に阻害されたままになる平滑筋細胞の増殖よりも内皮細胞の迅速な増殖を促進する。したがって、ＶＥＧＦ単独を用いた場合に見られるよりも、フィブリン−５およびＶＥＧＦを使用すると内皮細胞の増殖および移動への相乗作用が生じる。
【０１７２】
例えば、冠動脈バルーン血管形成術およびアテレクトミーなどの様々な心血管症候群の治療に起因する血管内インターベンションの長期的有益性は、手技３〜６カ月後の相当に高い症候性再狭窄発生率（４０〜５０％）によって制限される。再狭窄は一部には、血管内腔を狭小化し、血管平滑筋細胞の移動および増殖を特徴とするプロセスである、筋内膜過形成に起因する。再狭窄を予防するための内科的療法は、一様に成功が得られていない。血管内ステントは最適な内腔獲得を達成するため、そして重大なリモデリングを予防するために使用され、成功が得られている。しかし、内腔肥厚化は、依然としてステント再狭窄において重要な役割を果たしている。そこで、フィブリン−５を単独で、またはＶＥＧＦと組み合わせて溶出する血管内プロテーゼは、平滑筋細胞の増殖および移動を部分的に阻害し、それによって結果として生じる再狭窄を防止するであろう。ＶＥＧＦと一緒にフィブリン−５を溶出するプロテーゼは、内皮細胞の増殖、移動、および接着を増強する工程によって内皮細胞層の修復を同時に強化し、したがってプロテーゼの血液凝固を防止するであろう。
【０１７３】
本方法は、血管形成術もしくはアテレクトミーによって惹起される、血管傷害に苦しんでいる宿主に使用される。治療用混合物を投与するための時間は、傷害の時間に関連して相対的に短期間にわたる単回の投与または複数回の投与を提供して、広範囲に変動してよい。したがって、１つの実施形態では、本発明は、傷害部位での内皮細胞の増殖および移動の強化を生じさせるフィブリン−５およびＶＥＧＦの治療用混合物を傷害部位の血管壁に、または血管壁内に導入する工程を提供する。これら２種のタンパク質は、血管傷害部位へ直接的に（注射などによって）投与できる、またはタンパク質としてプロテーゼ内に組み込むことができる、またはプロテーゼを被覆し、そのポリマーの分解によって緩徐に放出されるであろうポリマー内に組み込むことができる。血管壁内に注入して、内皮細胞および平滑筋細胞が利用できる治療用混合物を生じさせる様々な送達系を使用できる。使用できるデバイスには、参照して本明細書に組み込まれるＷＯ９２／１１８９５、ＷＯ９５／０５８６６およびＷＯ９６／０８２８６に記載されたデバイスによって例示される、薬物送達バルーン、例えば、多孔性、超音波泳動性、およびイオン泳動性バルーンが含まれる。さらに、ステントが治療用混合物を運ぶステントも使用できる。好ましくは、ステントは便宜的にもカテーテルを用いて導入されるので、閉塞に対する増加した保護のためにフィブリン−５およびＶＥＧＦタンパク質の短期的および長期的両方の送達を提供できる。
【０１７４】
カテーテルによる治療用混合物の内腔内または壁内送達と結び付けて、ステントは、血管傷害部位で導入することができる。ステントは、生分解性または非生分解性であってよく、例えば金属、セラミック、プラスチックもしくはそれらの組み合わせなどの様々な材料から調製することができる。ヒドロキシカルボン酸のポリエステルなどの生分解性プラスチックが、特に重要である。文献では極めて多数のステントが報告されており、商業的受容が見いだされている。フィブリン−５およびＶＥＧＦタイプの混合物を送達するために修飾できるステントタイプの例は、それらの各々が参照して全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，２２７号；第５，７３３，３２７号；第５，８９９，９３５号；第６，３６４，８５６号；第６，４０３，６３５号；第６，４２５，８８１号；第６，７１６，２４２号；および第６，９１８，９２９号に開示されている。
【０１７５】
任意の適切な生分解性薬物−ポリマーコーティング、または当業者に知られている、それによってＶＥＧＦを含む、または含まない、フィブリン−５の治療用混合物を放出するための他の手段を使用できる。そのようなポリマーまたは送達系を使用する代表的な方法もまた、それらの各々が参照して全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，２２７号；第５，７３３，３２７号；第５，８９９，９３５号；第６，３６４，８５６号；第６，４０３，６３５号；第６，４２５，８８１号；第６，７１６，２４２号；第６，９１８，９２９号；および第６，９３９，３７６号によっても提供される。ステントの性質に依存して、ステントは、ステント本体内に組み込まれる、またはその上にコーティングされる治療用混合物を有していてよい。組み込むために、血管を支持して再狭窄から保護しながら治療用混合物を放出するであろう生分解性プラスチックステントが通常は使用されるであろう。ステントの作製では、生分解性マトリックスは、当技術分野において知られている任意の便宜的手段によって形成することができる。または、ステントは、ＶＥＧＦを含む、または含まないフィブリン−５の治療用混合物の制御放出を許容するであろう接着剤もしくはコーティングを用いて、治療用混合物でコーティングすることができる。ステントは、さらにまたＶＥＧＦの同時もしくは連続的投与または別の適切な成長因子を含むフィブリン−５から構成されてよい。ステントは、例えば、上述した生分解性ポリマー、生理学的に許容される接着剤、タンパク質、多糖などの治療用混合物およびマトリックスを含有する組成物で浸漬する、スプレーする、さもなければコーティングすることができる。ステントのための材料および／または治療用混合物を含むコーティングを適切に選択することによってＶＥＧＦまたはその他の適切な因子を含む、または含まないフィブリン−５の生理学的に活性な量の治療用混合物は、通常は少なくとも１日から１週間以上までにわたり、血管傷害の部位で維持することができる。
【０１７６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、血管内デバイスおよびプロテーゼの上および／または中に配置された生分解性薬物溶出ポリマーを含む、血管疾患もしくは障害を治療するための移植可能なデバイスを提供する。ポリマーには、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターを含浸させることができ、そしてさらに成長因子を含浸させることもできる。１つの態様では、血管内プロテーゼは、ステント、血管グラフト、人工心臓、または人工弁である。また別の態様では、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターは、フィブリン−５（ＵＰ５０）であってよく、成長因子はＶＥＧＦであってよい。治療すべき血管疾患もしくは障害には、例えば、狭窄、再狭窄、アテローム硬化症、心拍停止、脳卒中、血栓症、もしくはアテレクトミー、またはこれらの疾患もしくは障害を治療するために使用された血管内インターベンションによって誘発された傷害が含まれる。
【０１７７】
また別の態様では、移植可能なデバイスは、ＶＥＧＦを含む、または含まない、フィブリン−５を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている内皮細胞でコーティングされた基質を含むことができる。基質は、プロテーゼの上および／または中に配置することができる。
【０１７８】
また別の実施形態では、本発明は、血管内インターベンション後の血管閉塞を阻害して同時に血管壁の回復を増強することにより、血管疾患もしくは障害を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象の血管内に、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターおよび成長因子が含浸させられた生分解性薬物溶出ポリマーでコーティングされた血管内デバイスを挿入し、ポリマーからインヒビターおよび成長因子を血管内に溶出させ、それによって平滑筋細胞増殖を阻害して内皮細胞増殖を増強する工程による方法を提供する。
【０１７９】
１つの態様では、血管内デバイスは、ステントであってよい。また別の態様では、本デバイスは、（任意の口径の）血管グラフトであってよい。また別の態様では、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターは、フィブリン−５であり、成長因子はＶＥＧＦである。血管疾患もしくは傷害は、例えば、再狭窄、血栓症、アテローム硬化症、アテレクトミー、または様々な心血管状態の治療に関連する血管内傷害を含むことができる。さらにまた別の態様では、本デバイスは、平滑筋細胞の増殖因子および成長因子のインヒビターを発現または過剰発現するように遺伝子操作されている内皮細胞でコーティングされた基質を含むことができる。
【０１８０】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、血管内インターベンション後の平滑筋細胞の新生内膜形成を予防する方法であって、平滑筋細胞増殖／移動のインヒビターをコードするポリヌクレオチド配列を含有する複数のベクターを血管傷害の部位へ送達する工程による方法を提供する。また別の態様では、ベクターは、例えばＶＥＧＦなどの１つ以上の成長因子をコードするポリヌクレオチド配列を追加して含むことができる。
【０１８１】
１つの態様では、平滑筋細胞の増殖／移動のインヒビターは、フィブリン−５（ＵＰ５０）である。送達工程は、ステント送達、または例えば注射によるなどの局所送達によって実施することができる（例えば、実施例２８〜２９を参照されたい）。
【実施例】
【０１８２】
以下の実施例は、単に本発明の様々な態様を例示するために提供する。それらは、何であれ決して本発明の範囲を限定することは企図しておらず、企図すると見なすべきではない。
【０１８３】
以下に記載する実施例は、分子学、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ分野において一般に使用される術語および方法を使用する。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ，  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら、（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら、（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，  ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐ���ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号；第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号を参照されたい。上記の米国特許は、すべての図面を含めて、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように、参照して組み込まれる。
【０１８４】
実施例１：ＬａｃＺ遺伝子をコードする組換えアデノウイルスベクターの生成
細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子ＬａｃＺを含有する３，７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州）をＣＭＶ前初期プロモーターの制御下での構成的発現のためにプラスミドｐＣＡ３内に挿入した。生じたプラスミドは、プラスミドｐＪＭ１７によって、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現する「２９３」細胞内へ共形質移入した。プラスミドｐＪＭ１７は、Ｅ３領域を排除して、ウイルスのＥ１領域内のインサート（ｐＢＲＸ）を含んでいるアデノウイルスゲノムを含有している。形質移入後のβ−ガラクトシダーゼをコードするｐＣＡ３とｐＪＭ１７との間の同種組換えは、ｐＪＭ１７のＥ１領域をｐＣＡ３からのＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ発現カセットと置換した。プラーク形成は、共形質移入の２〜４週間後に発生し、その後に個別プラークを単離し、それらから「２９３」細胞の感染によってウイルス抽出物を増幅させた。各ウイルスストックの力価は、「２９３」細胞におけるプラークアッセイによって決定した。約１０１０ｐｆｕ／ｍＬのウイルス力価が得られた。感染細胞によるβ−ガラクトシダーゼの発現は、Ｘ−ｇａｌ染色によって確証された。
【０１８５】
実施例２：ＶＥＧＦおよびＧＦＰ遺伝子をコードする組換え２シストロン性アデノウイルスベクターの生成
分泌のシグナル配列（カリフォルニア州マウンテンビューに所在するＳｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ社のＪ．Ａｂｒａｈａｍ博士よりの寄贈）を含むヒトＶＥＧＦ１６５  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２１２２１）を含有する６００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをシャトルベクターｐＱＢＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰ（ＱＢＩ社、カナダ国）のＢｇｌＩＩ部位内に挿入すると、それによりシャトルベクターＣＭＶ５−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰが産生した（図３ａ）。発現プラスミドｐＱＢＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰは、ｈＣＭＶ５インサートを含有するＥ１領域内に欠失を備えるＡｄ５ゲノムの左腕（１６％）を含有している。シャトルベクターＣＭＶ５−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、プラスミドｐＪＭ１７によってＥ１遺伝子を構成的に発現する「２９３」細胞内へ共形質移入した。ｐＪＭ１７プラスミドは、Ｅ３領域を排除して、ウイルスのＥ１領域内のインサート（ｐＢＲＸ）を含んでいるアデノウイルスゲノムを含有している。形質移入後のＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰとｐＪＭ１７との間の同種組換えは、Ｅ１領域およびｐＢＲＸインサートをＣＭＶ５−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ由来の発現カセットと置換した。プラーク形成は、共形質移入の２〜４週間後に発生し、その後に個別プラークを単離し、「２９３」細胞の感染によってウイルス抽出物を増幅させた。各ウイルスストックの力価は、「２９３」細胞におけるプラークアッセイによって決定した。約１０１０ｐｆｕ／ｍＬの力価が得られた。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって確証した。
【０１８６】
実施例３：ヒトＶＥＧＦおよびＧＦＰをコードする偽型レトロウイルスベクターの生成
ＧＦＰおよびヒトＶＥＧＦ１６５遺伝子をコードする組換えレトロウイルスベクターは、２工程でプラスミドｐＬＸＳＮ（＃Ｋ１０６０−Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）内にクローニングする工程によって構築した。第１に、ＶＥＧＦ１６５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２１２２１）をコードする６００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントは、プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（＃６０２９−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＢａｍＨＩ部位内に挿入した。次に、ＶＥＧＦ１６５、ＩＲＥＳおよびＥＧＦＰコーディング配列を含有する２．０ｋＢのＥｃｏＲＩ−ＭｕｎＩフラグメントは、ベクターＬＸＳＮ−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（図３ｂ）を生じさせるｐＬＸＳＮ内のＥｃｏＲＩ制限部位内にクローニングした。レトロウイルスベクター産生のために、２９３Ｅ３環境栄養性パッケージング細胞は、ＬＸＳＮ−ＶＥＧＦ１６５−ＥＧＦＰを用いて一過性で形質移入した。４８時間後、Ｇ４１８耐性プロデューサー細胞のコンフルエントな培養からの上清を採取し、濾過し（０．４５μｍ）、ＰＡ３１７両種性パッケージング細胞を形質導入するために使用した。形質導入ＰＡ３１７細胞はＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）選択（３００ｍｇ／ｍＬ）下で増殖させ、４８時間後に上清を採取し、高効率でＥＣおよびＳＭＣを形質導入することのできる偽型ウイルスを生成するためにＧＡＬＶエンベロープ糖タンパク質を発現するＴＥＦＬＹＧＡパッケージング細胞を形質導入するために使用した。形質導入ＴＥＦＬＹＧＡ細胞のＧ４１８選択（４００μｇ／ｍＬ）後に、個々のコロニーを採取し、ＥＧＦＰおよびＶＥＧＦ１６５発現についてスクリーニングした。各コロニーのウイルス力価はＴＥ６７１細胞形質導入によって決定し、１０５〜１０６ｐｆｕ／ｍＬの範囲内にあることが見いだされた。最高力価産生コロニーを選択し、新しく採取した上清を形質導入のために使用した。
【０１８７】
実施例４：ＵＰ５０遺伝子をコードする組換えアデノウイルスベクターの生成
ヒトＵＰ５０遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクター（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＹ．  Ｓｈａｕｌから入手した）は、上述したように構築した。ヒトＵＰ５０  ｃＤＮＡを含有する１，３６１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメント（配列番号１）をプラスミドｐＣＡ３内に挿入した。導入遺伝子含有プラスミドのｐＣＡ３は、「２９３」細胞内にプラスミドｐＪＭ１７によって共形質移入した。形質移入後の発現プラスミドとｐＪＭ１７との間の同種組換えは、Ｅ１領域をｐＣＡ３プラスミド由来の発現カセットと置換し、それによりシャトルベクターＣＭＶ５−ＵＰ５０を生成した（図４ａ）。プラーク形成は、共形質移入の２〜４週間後に発生した。個々のプラークを単離し、ウイルス抽出物は２９３細胞の感染によって増幅させた。約１０１１ｐｆｕ／ｍＬのウイルスストックの力価が得られた。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって確証した。
【０１８８】
実施例５：ＵＰ５０およびＧＦＰ遺伝子の両方をコードする組換えアデノウイルスベクターの生成
ヒトＵＰ５０およびＧＦＰ遺伝子を共発現する組換えアデノウイルスベクターは、修正ＡｄＥａｓｙプロトコール（２８）によって構築した。ＵＰ５０  ｃＤＮＡの１，３６１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントは、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶシャトルベクター内のＢｇｌＩＩ部位内へ挿入した。このシャトルベクターは、導入遺伝子の下流で追加のＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰをコードする。インサート含有シャトルベクターは、ＰｍｅＩ消化によって線形化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国）を用いて精製した。コンピテントＢＪ５１８３細胞は、エレクトロポレーションによってインサートを含有するシャトルベクターおよびｐＡｄＥａｓｙ−１によって共形質移入され、ＵＰ５０−ＧＦＰをコードする組換えアデノウイルスベクターを含有する陽性クローン（図４ｂ）は、ＰＣＲおよび制限マップ分析によって選択した。組換えアデノウイルスプラスミドは、ＰａｃＩ消化によって線形化し、精製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）を用いて「２９３」細胞内に形質移入した。形質移入の７日後、細胞変性効果が発生し、１００％の細胞がＧＦＰを発現することが見いだされた。細胞を収穫し、ウイルス抽出物は、「２９３」細胞内でさらに増幅させた。各ウイルスストックの力価は「２９３」細胞内での連続希釈アッセイによって決定し、約１０１１ｐｆｕ／ｍＬの力価が得られた。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって確証した。
【０１８９】
実施例６：ＵＰ５０の発現またはＵＰ５０およびＥＧＦＰの共発現のためのレトロウイルスベクターの構築
ヒトＵＰ５０遺伝子をコードする組換えレトロウイルスベクターＬＸＳＮ−ＵＰ５０（図４ｃ）は、ヒトＵＰ５０  ｃＤＮＡの１，３６１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントをプラスミドｐＬＸＳＮ（＃Ｋ１０６０−Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）のＢａｍＨＩ部位内へＭｏ−ＭＵＬＶ  ５’長い末端反復（ＬＴＲ）の制御下で挿入する工程によって構築した。
【０１９０】
ＵＰ５０およびＥＧＦＰ遺伝子の両方をコードする２シストロン性組換えレトロウイルスベクターは２工程でプラスミドｐＬＸＳＮ内へクローニングした。第１に、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、＃６０２９−１）から切り取った１，４００ｂｐのＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ  ＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩフラグメントを、コントロールのプラスミドｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを構築するためにＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ消化ｐＬＸＳＮ内に挿入した。次に、ｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（図４ｄ）は、ヒトＵＰ５０  ＥｃｏＲＩフラグメント（１，３６１ｂｐ）をｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＥｃｏＲＩ部位内にクローニングする工程によって構築した。これらの構築物中の遺伝子発現は、Ｍｏ−ＭＵＬＶ  ５’長い末端反復（ＬＴＲ）によって調節される。
【０１９１】
実施例７：ＵＰ５０をコードする偽型組換えレトロウイルスベクターの生成
レトロウイルスベクター産生のためには、ベクターｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０−ＥＧＦＰもしくはｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）を用いて２９３ＦＬＹＡパッケージング細胞内へ形質移入した。４８時間後、ウイルスプロデューサー細胞のコンフルエントな培養からの上清を採取し、濾過し（０．４５μｍ）、２９３ＦＬＹ１０Ａもしくは２９３ＦＬＹＧＡＬＶパッケージング細胞へ添加した。形質導入細胞はＧ４１８選択（４００μｇ／ｍＬ）下で増殖させ、個々のコロニーを採取し、倒立蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰ発現についてスクリーニングした。それらは、形質導入細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によってＵＰ５０の発現についてもまたスクリーニングした。各コロニーのウイルス力価は、ＴＥ６７１細胞の形質導入によって決定し、約１０６ｆｆｕ／ｍＬの力価が得られた。最高力価を備えるコロニーからの上清は、ＥＣおよびＳＭＣの形質導入のために新しく採取した。
【０１９２】
実施例８：初代血管細胞の組織培養
ヒト伏在静脈ＥＣ（ＨＳＶＥＣ）、ヒト橈骨動脈ＥＣ（ＨＲＡＥＣ）およびヒト左内胸動脈ＥＣ（ＨＬＡＥＣ）は、以前に記載されたように（２９）、コラゲナーゼ消化によって長さ５ｃｍの血管区間から採取した。単離したＥＣは、２０％ウシ胎児血清（ｈｙＣｌｏｎｅ社、米国）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、および０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、１００μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ社、米国）および２ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｎｅｕｆｅｌｄ教授から入手）が補給されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）を含有するゼラチン被覆培養皿上で培養した。細胞形態ならびにｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびＣＤ３１についての免疫組織化学的染色に基づいて監視した表現型安定性を保証するために、第３〜９継代からの細胞を採取した（図３９）。ヒトＳＭＣは、ヒト伏在静脈、ヒト橈骨動脈（ＨＲＡＳＭＣ）および左内胸動脈（ＨＬＳＭＣ）由来の移植片外植によって培養した。細胞は、１０％のプールヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補給したＤｕｌｂｅｃｃｏの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）中で培養した。ＳＭＣは、平滑筋α−アクチンについての免疫組織化学的染色によって同定した（Ｄａｋｏ社、米国、図４０）。細胞は、ルーチン的に無菌性、エンドトキシンおよびマイコプラズマ感染について試験した。動物の静脈は、ヒト血管区間の場合と同一手技を用いて、ミニブタおよびヒツジから切除した。ブタおよびヒツジ両方由来のＥＣおよびＳＭＣは、ヒトＥＣおよびＳＭＣと同一方法で同様に採取した。
【０１９３】
実施例９：細胞系の組織培養
パッケージング細胞系２９３−ＦＬＹＡ、２９３−ＦＬＹ１０Ａ、２９３−ＦＬＹＧＡＬＶおよびＴＥＦＬＹＧＡ（フランス国のＤｒ．ＦＬ．Ｃｏｓｓｅｔ−Ｌｉｏｎから入手した）は、１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、６μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｓｉｇｍａ社、米国）および６μｇ／ｍＬのフレオミシン（ｐｈｌｅｏｍｉｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ社、米国）を補給したＤＭＥＭ中で増殖させた。
【０１９４】
パッケージング細胞系ＰＡ３１７、２９３Ｅ３（エルサレムのＨａｄｄａｓａ大学のＤｒ．Ｊ．Ｅｘｅｌｒｏｄから入手した）は、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞は、ルーチン的に無菌性、エンドトキシンおよびマイコプラズマ汚染について試験した。
【０１９５】
実施例１０：組換えアデノウイルスベクターによるＥＣおよび血管ＳＭＣの感染
細胞は、感染させる２０時間前にフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ社、米国）をプレコートしたプレート（４．５μｇ／ｍＬ）上で７０％コンフルエンスに播種し、完全培地（Ｍ２０）中で増殖させた。感染当日、培養培地は新鮮血清無含有Ｍ１９９培地と交換し、組換えウイルスを３，０００の感染多重度（ＭＯＩ）（すなわち、ウイルス粒子３，０００個／細胞）で加えた。細胞は２０分毎に穏やかに上下に動かしながら９０分間にわたりインキュベートし、その後にウイルス含有培地を完全培地（Ｍ２０）と交換した。感染率は、蛍光ＧＦＰフィルター（ＧＦＰ−ＬＰ、Ｎｉｋｏｎ社）を装備した倒立蛍光顕微鏡（ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ社、日本国）を用いてＧＦＰ発現の視認によって監視した。
【０１９６】
実施例１１：組換えレトロウイルスベクターによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入
ＥＣもしくはＳＭＣ（第４〜９継代）は、４．５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコーティングされたプレート中において１０５個（細胞）／ウエル（３５ｍｍ）で播種し、２４時間にわたり完全培地中で増殖させた。細胞は、形質導入の１時間前に０．１ｍｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ社、米国）を含有する血清無含有Ｍ１９９培地で培養培地を交換することによって予備馴化した。予備馴化後に、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。形質導入は、新しく採取した上清を用いた細胞の４時間にわたるインキュベーションによって実施し、ウイルス産生パッケージング細胞から濾過した（０．４５μＬ）。インキュベーションの終了時に、ウイルス含有培地をＭ２０培地と交換した。
【０１９７】
実施例１２：ＥＣを用いたＰＴＦＥグラフトの播種
ＰＴＦＥグラフト（Ｇｏｒｅ社、米国）を必要な長さへ無菌的に切断し、ＰＢＳ中で３回洗浄し（室温で３０分間）、フィブロネクチン中でインキュベートした（ＰＢＳ中で２０μｇ／ｍＬ、一晩、３７℃）。２つのコネクター（Ｔｅｆｌｏｎもしくはステンレススチール）は、１本ずつをグラフトの片側に入れて挿入した。これらのコネクターは、３回の二重結びで結んだシリコン糸で固定した。各グラフトの端部は、ゴム製キャップを用いて栓をした（図３１Ａ）。
【０１９８】
細胞をトリプシン化し、１，２００ｒｐｍで５分間にわたり遠心した。ペレットは、４００，０００個（細胞）／ｃｍ２（グラフト）に等価の細胞密度で増殖培地中に細懸濁させた。この細胞懸濁液にＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）を加えた。
【０１９９】
グラフトを播種用試験管の中心軸上へ無菌的に取り付け（図３１Ｂ）、Ｐａｓｔｅｕｒピペットを用いて細胞懸濁液を充填した。グラフトを漏れについて試験し、次に中心軸を取り囲んでいるチューブ内に挿入し、これにＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ）を含有する増殖培地を充填した。チューブを密封し、インキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）内に配置し、そこでこれを２時間にわたり１／６ｒｐｍで回転させた。次に、ゴム栓を無菌的に取り除き、さらに２時間回転を継続した。グラフトは、播種装置から、ｂＦＧＦ  ２ｎｇ／ｍＬが補給された増殖培地を含有する培養プレートへ移し、４８時間にわたりインキュベートした（５％  ＣＯ２、３７℃）。グラフトの播種効率は、播種した細胞のＧＦＰ産生の蛍光顕微鏡検出によって、または組織化学的ヘマトキシリン−エオシン染色によって評価した。
【０２００】
実施例１３：内皮細胞の定量的形態計測
インキュベーション期間の終了時に、グラフトは１時間にわたり４％のパラホルムアルデヒド中で固定した。固定後、グラフトを長手方向で切片作製し、蛍光顕微鏡下で試験し、写真撮影し、さらに画像は画像分析システム（Ｉｍａｇｅ  ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、米国）によって加工処理した。内皮細胞播種グラフトの形態計測評価は、内皮細胞によるグラフトの表面被覆を評価するためのコンピュータ援用画像分析によって実施した。画像分析システムは、倒立蛍光顕微鏡（ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ社、日本国）上に据え付けられたデジタルビデオカメラ（ＤＸＭ  １２００、Ｎｉｋｏｎ社、日本国）から構成される。データはデジタル化し、画像分析システム（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４画像分析用ソフトウエア）へ移した。分析したグラフト表面の顕微鏡検査（×１００の倍率）下でグラフトの無作為の運動によって、少なくとも１０の区域を選択した。本分析は、画像分析ソフトウエアを使用して、内皮細胞被覆面積対全区域面積（Ｐｅｒ−ａｒｅａ）の比率の決定を含んでいた。各区域は１２の等四分円に分割され、各四分円について同一比率が決定された。さらに、主観的評価は、被覆について観察された均質性（１〜３の尺度）および密度（１〜５の尺度）をスコア付けすることによって実施した。
【０２０１】
実施例１４：遺伝子操作された血管細胞における導入遺伝子の発現の検出
全ＲＮＡは、ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ  ＲＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を用いてＵＰ５０をコードするアデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターによる形質変換の４８時間後にＥＣおよびＳＭＣから単離した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍの吸光度から計算した。
【０２０２】
ｃＤＮＡ分析のために、１μｇのＲＮＡを５００ｎｇのランダムヘキサマーと混合し、この混合物を１０分間にわたり７０℃で加熱し、次に氷上で冷却した。０．４ｍＭのｄＮＴＰ、５単位のＡＭＶ−逆転写酵素（ＲＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、５ｍＭのＤＴＴ、３２単位のＲＮＡｓｅｏｕｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）およびＲＴバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の混合液をＲＮＡに加えた。この反応混合液を３８℃で２時間にわたりインキュベートし、さらに９５℃で１５分間インキュベートした。ＰＣＲは、７μＬの逆転写酵素（ＲＴ）反応ミックス、２０ｐｍｏｌのセンスプライマー：
【０２０３】
【化１】
2009525110.tif 000005
（配列番号２）、
２０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー：
【０２０４】
【化２】
2009525110.tif 000006
（配列番号３）、
２４０ｍｍｏｌのｄＮＴＰ、１ＵのＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社、日本国）および反応バッファー（Ｔａｋａｒａ社）を含む５０μＬの容量中で実施した。ＰＣＲサイクリングプロトコルは：９４℃で２分間、その後に１０サイクルの９４℃／３０秒間−＞５０℃／３０秒間−＞７２℃／６０秒間であった。この後に９４℃／３０秒間−＞６０℃／３０秒間−＞７２℃／６０秒間＋５秒間／サイクル−＞７２℃／１０分間の２１サイクルが続いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上での電気泳動法によって分析した。
【０２０５】
実施例１５：ＵＰ５０およびＶＥＧＦタンパク質発現についてのウェスタンイムノブロット分析
アデノウイルスまたはレトロウイルスによって遺伝子操作されたＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０もしくはＶＥＧＦタンパク質の発現を、遺伝子操作された細胞馴化培地のウェスタンブロット分析によって検出した。培養培地は遺伝子操作２４時間後に血清無含有培地と交換し、細胞をさらに２４時間にわたり培養した。遺伝子操作された細胞−馴化培地（ＣＭ）（３０μＬ）のサンプルは、還元条件下で１０％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中での電気泳動法によって分離した。分離したタンパク質は、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社）上に電気ブロッティングした。これらのブロットは、室温で１時間にわたり緩徐に攪拌しながらインキュベーションブロック溶液（０．１％スキムミルクおよび０．３％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ））を用いてブロックした。その後、ブロットは、室温で２時間にわたりブロック溶液中に希釈した一次抗体と一緒にインキュベートした。ＵＰ５０検出のためには親和性精製ウサギポリクローナル抗ＵＰ５０抗体（＃９８５５、特注、Ｓｉｇｍａ社、イスラエル国）（１：５０００）を使用し、ＶＥＧＦ検出のためにはウサギポリクローナル抗ＶＥＧＦ１６５抗体（＃ＳＣ１５２、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ社、米国）（１：７００）を使用した。
【０２０６】
一次抗体を用いたインキュベーション後に、ブロットはＴＢＳＴを用いて３回洗浄し、室温で１時間にわたりＴＢＳＴで希釈した抗ウサギペルオキシダーゼ抱合二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、米国）と一緒にインキュベートした。ＴＢＳＴを用いた３回の洗浄後に、特異的タンパク質はＥＣＬ試薬（Ｓｉｇｍａ社、米国）を用いたブロットの発生およびＸ線フィルムへの曝露によって視認した。
【０２０７】
実施例１６：ＵＰ５０の発現についての免疫組織化学的分析
アデノウイルスによって感染させたＥＣおよびＳＭＣは、フィブロネクチン（４．５μｇ／ｍＬ）がプレコーティングされたチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ社、米国）上に播種し、２４時間にわたり培養した。細胞は、室温の４％パラホルムアルデヒド中での２０分間にわたるインキュベーションおよびその後のＰＢＳを用いた２回の洗浄によるアデノウイルス感染の４８時間後に固定した。細胞は、５分間にわたり電子レンジ中で１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）とともにスライドを加熱することによって変性させた。サンプルは、製造業者の取扱説明書にしたがって、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｅｄ社、米国）とともに供給されたブロック溶液を用いてブロックした。ブロッキング後、細胞は室温で１時間にわたり親和性精製抗ＵＰ５０（１：５０）と一緒にインキュベートした。サンプルはＰＢＳ−Ｔ（０．３％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、１時間にわたりＰＢＳ−Ｔ中で１：４００に希釈したローダミン抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（＃ＳＣ２０９１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、米国）と一緒にインキュベートした。細胞はＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、封入剤（Ｈ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）で被覆した。サンプルは次に、走査型蛍光共焦点（ＭＲＣ−１０２４、ＢｉｏＲａｄ社）顕微鏡を用いて細胞中のＧＦＰおよびローダミンの検出によって視認した。
【０２０８】
ＥＣＭ中のＵＰ５０の免疫組織化学的分析のために、ＵＰ５０遺伝子をコードする組換えアデノウイルスベクターで感染させたＥＣは、増殖培地へのデキストランの添加によってＥＣＭを生成するように誘導した。２０ｍＭのＮＨ４ＯＨ溶液を用いたＥＣ層の露出後、ＥＣＭは、抗ＵＰ５０抗体を用いたローダミンに基づく免疫染色を受けさせた。
【０２０９】
実施例１７：アデノウイルスによって感染させたＥＣおよびＳＭＣの共培養によるＵＰ５０およびＶＥＧＦタンパク質の発現
アデノウイルスによって感染させたＥＣもしくはアデノウイルスによって感染させたＥＣおよびＳＭＣの混合物は、血清を補給した培地中での感染後に２４時間培養し、さらに２４時間にわたり血清無含有培地中で培養した。上清タンパク質は１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法により分離し、分離したタンパク質はニトロセルロース膜上で電気ブロッティングした。ブロットは、抗ＶＥＧＦもしくは抗ＵＰ５０抗体と一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ抱合二次抗体へ曝露させた後、ＥＣＬ試薬を用いてブロットを展開させ、Ｘ線フィルムに曝露させた。
【０２１０】
実施例１８：レトロウイルスによって感染させたＥＣおよびＳＭＣの共培養によるＶＥＧＦおよびＵＰ５０タンパク質発現についてのウェスタンブロット分析
様々なレトロウイルスで感染させたＥＣまたは感染させたＥＣおよびＳＭＣの混合物は、感染後に２４時間にわたり血清補給培地中で培養し、その後に細胞はさらに２４時間にわたり血清無含有培地中で培養した。増殖培地のサンプル（３０μＬ）は、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に電気ブロッティングした。ブロットは、抗ＶＥＧＦもしくは抗ＵＰ５０抗体のいずれかと一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ抱合二次抗体へ曝露させた後、ＥＣＬ試薬を用いてブロットを展開させ、Ｘ線フィルムに曝露させた。
【０２１１】
実施例１９：血管細胞中で過剰発現した組換えＶＥＧＦおよびＵＰ５０の機能的分析
内皮細胞（第５〜１１継代）は、アデノウイルス感染ＥＣの２４時間前に４．５μｇ／ｍＬフィブロネクチンでプレコーティングされた２４ウエルプレート中において３０％コンフルエンス（１０４個（細胞）／ウエル）で播種した。細胞は、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ、Ａｄ．ＧＦＰもしくはＡｄ．ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰを用いて感染させた。３７℃でのアデノウイルスベクターへの９０分間の曝露後、血清含有培地を加え、１６〜１８時間後に培地は２％ヒト血清および２ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭ１９９培地と置換した。アッセイは３回ずつ実施し、増殖は感染後第７日にＸＴＴ比色アッセイによって測定した。
【０２１２】
実施例２０：ＵＰ５０を過剰発現するＥＣによって生成したＥＣＭへのＥＣの接着
ＥＣは、感染前２４時間にわたりフィブロネクチンでプレコーティングされた４８ウエルプレート上に播種した（１０４個（細胞）／ウエル）。細胞は、以前に記載されたように、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＡｄ．ＧＦＰを用いて感染させた。感染後、細胞は、４％デキストラン４２０００（Ｓｉｇｍａ社、米国）を補給したＭ２０培地中で７日間にわたり増殖させた。この感染期間後、培地は感染した細胞から吸引し、マトリックス産生細胞は約５分間にわたり２０ｍＭのＮＨ４ＯＨとの接触によって露出させた。細胞溶解後、ＥＣＭでコーティングされたウエルはＰＢＳで３回洗浄し、４℃でＰＢＳ中に保管した。
【０２１３】
ＥＣは、１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液中でのインキュベーションによって剥離させ、マトリックスはＭ１９９培地を用いて洗浄し、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染、Ａｄ．ＧＦＰ感染、または非感染ＥＣ由来の培養培地（ＣＭ）中で１５分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ＥＣはＥＣＭでコーティングされたウエル上に播種した（２×１０４個（細胞）／ウエル）。Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣによって生成したＥＣＭ上に播種した細胞は、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染細胞由来のＣＭ中でインキュベートした。Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞によって生成したＥＣＭ上に播種した細胞は、Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞から収集したＣＭと一緒にインキュベートし、非感染細胞によって生成したＥＣＭ上に播種した細胞のコントロール群は、非感染細胞馴化培地と一緒にインキュベートした。細胞は、細胞接着を許容するようにさらに３０分間にわたりインキュベートし、次にＰＢＳを用いて洗浄した。残留していた接着細胞の定量は、ＸＴＴ比色アッセイによって実施した。
【０２１４】
ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣから生成したＥＣＭを利用して、類似の実験を実施した。
【０２１５】
実施例２１：ＵＰ５０が三次元コラーゲン培養中のＥＣ増殖に及ぼす作用−インビトロ血管形成
コラーゲンゲル内でのインビトロ血管形成は、アデノウイルス感染ＥＣスフェロイドを用いて定量した。ＥＣスフェロイドの生成は、以前に記載されたように実施した（３３）。内皮細胞は、０．２５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースを含有する培養培地中に懸濁させ、３７℃、５％のＣＯ２での２４時間にわたる非組織培養処理丸底９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社、デンマーク国）中で培養したが、その期間内に懸濁させた細胞は１ウエルに付き規定サイズおよび細胞数（約７５０個／スフェロイド）の単一スフェロイドを形成した。スフェロイドは、次にコラーゲンゲル中に包埋した。コラーゲンストック液は、８容量の酸性ラット尾コラーゲン抽出物（４℃で２ｍｇ／ｍＬへ平衡化させた）、１容量の１０×Ｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）を混合する工程によって、使用前に調製した。ｐＨは、０．３４ＮのＮａＯＨの添加によって７．４へ調整した。コラーゲンゲル上での重合前のスフェロイドの沈降を予防するために、１容量のコラーゲンストック液は、４０％ヒト血清および０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースを含有する１容量の室温のＭ１９９培地と混合した。スフェロイド含有ゲル（２０〜３０個のスフェロイド／ゲル）は事前に加温した２４ウエルプレート中へ迅速に移し、重合させた。ゲルは３７℃で５％のＣＯ２と一緒にインキュベートし、ゲル中でのＥＣの増殖は、デジタルビデオカメラ（ＤＸＭ１２００、Ｎｉｋｏｎ社、日本国）を用いた顕微鏡写真によって証明した。各群から少なくとも４０個のスフェロイドの催芽について分析した。
【０２１６】
実施例２２：ＵＰ５０過剰発現がトリプシン化後のインビトロ培養ＥＣの接着に及ぼす作用
内皮細胞は、アデノウイルス感染の２４時間前に、１２ウエルプレート内で７０〜８０％のコンフルエンス（６〜７．５×１０４個（細胞）／ウエル）で播種した。細胞は、以前に記載されたように、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＡｄ．ＧＦＰを用いて感染させた（３×１０３ｐｆｕ／細胞）。非感染細胞は、コントロールとして機能した。感染後に、細胞は４日間にわたりＭ２０培地中で増殖させた。細胞はＰＢＳを用いて洗浄し、接着アッセイは、０．００１％のＥＤＴＡを含有する０．００２５％トリプシンを用いる細胞のトリプシン化によって実施した。室温での３分間のインキュベーション後、トリプシンは、完全培地（Ｍ２０）の添加によって中和した。細胞はＰＢＳを用いて３回洗浄し、次にＭ２０（３００μＬ）培地を細胞へ加えた。コントロールの非トリプシン化細胞に対するパーセントとしての、残留していた接着細胞の定量は、比色ＸＴＴアッセイによって決定した。
【０２１７】
実施例２３：ＵＰ５０過剰発現がＥＣＭへの細胞接着に及ぼす作用
ＥＣは、１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液によって剥離させ、０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社、米国）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液を含有するＭ１９９培地で洗浄し、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＡｄ．ＧＦＰ感染ＥＣ由来または非感染ＥＣ由来の培養培地（ＣＭ）と１５分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞はＥＣＭでコーティングされたウエル中に播種した（２×１０４個（細胞）／ウエル）。Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣによって生成したＥＣＭ上に播種した細胞は、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染細胞由来のＣＭ中でインキュベートした。Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞によって生成したＥＣＭ上に播種した細胞は、Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞から収集したＣＭと一緒にインキュベートし、非感染細胞によって生成したＥＣＭ上に播種した細胞のコントロール群は、非感染細胞馴化培地と一緒にインキュベートした。細胞は、細胞接着を許容するようにさらに３０分間にわたりインキュベートし、次にＰＢＳを用いて洗浄した。残留していた接着細胞の定量は、比色ＸＴＴアッセイによって実施した。
【０２１８】
以前に示した、分泌されたＵＰ５０およびＥＣＭ結合ＵＰ５０への曝露（図１５）は、コントロール群に比較してＥＣの＞３０％の接着増加を生じさせた（図２４）。
【０２１９】
実施例２４：ＵＰ５０過剰発現が持続的剪断応力下でのＥＣの保持に及ぼす作用
ヒト伏在静脈ＥＣ（第８〜１１継代）を播種し（１０５個（細胞）／ウエル（３５ｍｍ））、Ｍ２０中で６０〜８０％のコンフルエンスまで増殖させた。細胞は、以前に記載されたように、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＡｄ．ＧＦＰを用いて感染させた（ＭＯＩ  ３０００）。非感染細胞は、コントロールとして機能した。細胞は、剪断応力へ曝露する前の導入遺伝子の発現を保証するために３０時間にわたり増殖させた。実験前に、各群（Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ、Ａｄ．ＧＦＰ、コントロール）からの２つのウエルをトリプシン−ＥＤＴＡを用いて採取し、細胞を計数した。揺動中に細胞を完全に被覆するために、５ｍＬのＭ２０培地を各ウエルに加えた。プレートはＣＯ２インキュベーター内の揺動台上に配置し、強度に揺動させながら（約１４０サイクル／分）２０〜２４時間にわたりインキュベートした。揺動後、細胞はＰＢＳを用いて５回洗浄した。細胞はトリプシン−ＥＤＴＡを用いて採取し、血球計数器によって計数した。本アッセイは、さらに各々レトロウイルスベクターによって形質導入した細胞を用いて実施した。
【０２２０】
図２５ａ〜ｇ（形態計測）および２５ｈ（細胞計数）に提示した結果は、レトロウイルス形質導入によるＵＰ５０過剰発現が持続的剪断応力に曝露させたＥＣの接着増加を生じさせることを証明している。ＵＰ５０を発現する細胞の９８％は、ＧＦＰ発現（７２％±１％）および非形質導入ＥＣ（６９±２％）とは対照的に、プレートに接着したままであった。ＵＰ５０を発現するようにアデノウイルスによって感染させたＥＣを用いた場合も類似の結果が得られた。
【０２２１】
実施例２５：脈動流下でのｅＰＴＦＥグラフト上のヒトＥＣの保持
グラフトは、上述したように播種した。
【０２２２】
各グラフトには、２時間にわたり１２０／８０ｍｍＨｇの定常圧力および３００ｍＬ／分の流動を受けさせた。次にグラフトを装置から取り出し、細胞安定性およびグラフトへの接着を上述したように評価した。
【０２２３】
播種したグラフトは、層流条件に曝露させた。流量は、ポンプを１分当たり６０ストロークで用いて３００ｍＬ／分の流速で２時間にわたり１２０／７５（平均９０ｍｍＨｇ）の生理的血圧に到達するように調整した。グラフトは、顕微鏡検査および形態計測分析によって評価した。流動条件に曝露させた後、グラフト内面上の細胞密度および均質性の評価を実施した。グラフトは、１時間にわたり室温で、新しく調製したＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で固定した。グラフトは、以前に記載されたように、切り開き、２枚のスライドガラス間で平らにし、蛍光顕微鏡下で視認し、そして形態計測分析を用いて分析した。図２７ａ〜ｄを参照されたい。補足的に、以前に言及したように、ヘマトキシリン−エオシンを用いてグラフトを染色して分析した。
【０２２４】
実施例２６：インビボ流動条件下で人工血管グラフト上に播種した遺伝子操作されたＥＣの保持；ヒツジ動脈における遺伝子操作されたヒツジＥＣがコーティングされたｅＰＴＦＥグラフトの短期移植
移植の３６時間前に、ＧＦＰ、ＵＰ５０−ＧＦＰもしくはＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰを過剰発現するためにレトロウイルス形質導入により遺伝子操作されたヒツジＥＣを径の小さなｅＰＴＦＥグラフト（６ｍｍ）に播種した。
【０２２５】
絶食（１２時間）させた成体ヒツジには、筋肉内注射による１０ｍｇのジアゼパムおよび静脈内投与する５００〜６００ｍｇのフェントバルビタールナトリウムで前投薬した。ヒツジには気管内挿管し、１％〜２％吸入イソフルランを用いて麻酔を維持した。アスピリン（６００ｍｇ）は術前に投与した。実験中の監視システムは、血圧測定、パルスオキシメトリー、およびＥＣＧを含んでいた。ヘパリン（３００Ｕ／ｋｇ）は、グラフト移植のための曝露および動脈の調製後の全身性抗凝固のために静脈内注射した。血液サンプルは、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を測定することによってヘパリン化の効率を評価するために、手技中に３０分毎に採取した。
【０２２６】
播種したグラフトは、次に専門心臓外科医によって、ヒツジ頸動脈および大腿動脈の両側の端側へ移植した（図２８）。大腿動脈の一方の側で、移植されたグラフトにｒｅｔｒｏＧＦＰ形質導入ＥＣを、そして他方の側では移植されたグラフトにｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣを播種した（大腿動脈）。大腿動脈内の一方の側で移植されたグラフトにｒｅｔｒｏＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ形質導入ＥＣを、そして他方の側では移植されたグラフトにｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣを播種した。移植されたグラフトの開存性は、移植されたグラフトの血流への曝露の３０分前およびグラフト採取の前に直接触診、ドップラー流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ、米国ニューヨーク州）を用いた流量測定値および選択的血管造影の実施により評価した（図２９）。
【０２２７】
大腿動脈グラフトを通過する流量は、両側で類似であった（約５０ｍＬ／分、大腿動脈血流量の３８％）。実験開始時にはより高かった頸動脈グラフトを通る流量は、吻合部位での局所的血栓症（手術合併症に続発性）に起因して、２時間の終了時には両側で減少した。移植の２時間後に大腿動脈および頸動脈グラフトを採取した。両方のグラフトを採取し、グラフトの内面上の細胞保持を蛍光顕微鏡検査によって分析した。グラフトの抜去後、ヒツジは静脈内塩化カリウム投与によって犠死させた。全実験は、イスラエル国ハイファに所在するＴｅｃｈｎｉｏｎ  ＩＴＴの実験動物の飼育管理および規則にしたがって実施した。
【０２２８】
実施例２７：透析用針穿刺を受けた、人工血管グラフト上に播種したＵＰ５０およびＶＥＧＦを過剰発現する遺伝子操作されたＥＣの回収
ｅＰＴＦＥグラフトに、ＵＰ５０およびＶＥＧＦを過剰発現する遺伝子操作されたＥＣおよびＧＦＰを過剰発現するＥＣを播種した。播種の２４時間後、グラフトをＭａｔｒｉｇｅｌ（２ｍｇ／ｍＬ）を用いて外面上に載せ、透析に使用する１４Ｇの針で穿刺した。グラフトを２４時間にわたりインキュベートし、その後で蛍光顕微鏡を用いて視認した。ＵＰ５０およびＶＥＧＦが播種されたグラフトは、増強された増殖および針の軌跡内の間隙を閉鎖する内皮細胞の穿刺傷を越える架橋を示した（図３４Ａ）。ＧＦＰを過剰発現するＥＣで播種したグラフトは、この作用を示さなかった（図３４Ｂ）。針によって生じた間隙の閉鎖は、グラフトに生体適合性表面を提供し、したがって局所的血栓症を減少させる。
【０２２９】
実施例２８：フィブリン−５は単独で平滑筋細胞および内皮細胞増殖／移動の両方を阻害する
インビトロ試験は、フィブリン−５が単独で平滑筋細胞および内皮細胞増殖／移動の両方を部分的に阻害することを証明している。例えばＶＥＧＦなどの成長因子を添加すると、内皮細胞は迅速に増殖するが、他方平滑筋細胞は部分的に損害されたままとなる。そこで、成長因子の存在下では、フィブリン−５は、内皮細胞増殖／移動に対して平滑筋細胞増殖／移動とは相違する作用を及ぼす。図４１ＡおよびＢにはその結果を要約した。
【０２３０】
ＵＰ５０が内皮細胞増殖に及ぼす作用およびＶＥＧＦの添加によるその作用の逆転：
一次内皮細胞はヒト伏在静脈から単離した。細胞は、ＬＸＳＮをベースとするＵＰ５０をコードするウイルスベクターを用いてレトロウイルスによって形質導入した。追加の試験群は以下を含んでいた：ナイーブＥＣ、ＶＥＧＦ１６５（内皮細胞の特異的マイトジェン）を発現するＥＣ、ＧＦＰを発現するＥＣ、ＵＰ５０およびＶＥＧＦ１６５を発現するＥＣ、外因性ＶＥＧＦ１６５が補給されたＵＰ５０を発現するＥＣ。増殖アッセイのために、ゼラチンでプレコーティングされた２４ウエルプレート中に２０，０００個（細胞）／ウエルを播種した。細胞は、第０日、第２日、第４日、および第５日にコールター・カウンターを用いて計数した。（図４１Ａ）。
【０２３１】
ＵＰ５０が平滑筋細胞増殖に及ぼす作用およびｂＦＧＦを添加してもその作用は逆転されない：
一次平滑筋細胞をヒト伏在静脈から単離した。細胞は、ＬＸＳＮをベースとするＵＰ５０をコードするウイルスベクターを用いてレトロウイルスによって形質導入した。コントロールのために、ＧＦＰによって形質導入した細胞を使用した。アッセイのために、ゼラチンでプレコーティングされた２４ウエルプレート中に２０，０００個（細胞）／ウエルを播種した。細胞は、ベースライン時、第２日、第６日、および第９日にコールター・カウンターを用いて計数した。細胞は、ｂＦＧＦ（平滑筋細胞の強力なマイトジェン）とともに増殖させた。（図４１Ｂ）。
【０２３２】
実施例２９：合成グラフト上に播種した内皮細胞によるフィブリン−５およびＶＥＧＦの共発現は、ヒツジモデルにおいて長期開存性を改善し、そしてラット頸動脈傷害モデルでの血管傷害後の新生内膜形成を減少させる
フィブリン−５およびＶＥＧＦがインビトロでの内皮細胞および平滑筋細胞の増殖、ならびにラット頸動脈傷害モデルにおける新生内膜形成に及ぼす作用について、これら２つの遺伝子がグラフト開存性を改善できる機序を探索するために試験した。フィブリン−５およびＶＥＧＦを過剰発現する自家ＥＣが播種された、端側に移植した長さ１５〜１８ｃｍ、６ｍｍ径のｅＰＴＦＥグラフトの３および６カ月後の長期開存性についてもまた試験した。
【０２３３】
短い静脈区間からの自家ＥＣを単離し、内皮細胞（ＥＣ）はフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５を発現するレトロウイルスベクターによって形質導入した。細胞は次に６ｍｍのｅＰＴＦＥグラフト（処置グラフト）上に播種した。グラフトは、ヒツジ頸動脈モデル内に移植した（１５〜１８ｃｍのグラフト）（以下で説明する）。コントロールのために、ベアｅＰＴＦＥグラフトおよびナイーブＥＣを播種したグラフトを使用した。選択的血管造影を用いると、３カ月後には、全処置グラフト（６／６）は開存性であったが、コントロール群で開存性であったのは３３％（ベアグラフトの２／６およびナイーブＥＣが播種されたグラフトでは２／６）だけであった。６カ月後には、処置グラフト６本中５本は開存性であったが、これに比較してベアグラフトでは６本中１本、そしてナイーブＥＣが播種されたグラフトでは６本中２本が開存性であった。
【０２３４】
これらの所見の機序を証明するために、フィブリン−５が平滑筋増殖および血管傷害のラット頸動脈モデルにおける新生内膜形成を阻害するかどうかを決定した。フィブリン−５は、ラット頸動脈の血管傷害の誘導後の動脈壁の細胞へ移した。傷害１４日後の新生内膜形成について試験した。１４日後に、フィブリン−５を発現するアデノウイルスベクターによって処置したラットにおいて、新生内膜形成ならびにＳＭＣ増殖は完全に抑制された。フィブリン−５の発現は、免疫組織化学によって検証された。
【０２３５】
フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＥＣのＰＴＦＥ血管グラフトの播種は、径の小さなｅＰＴＦＥグラフトの長期開存性を向上させた。この現象は、フィブリン−５による新生内膜形成の阻害に起因する。これらの方法および結果について以下で詳細に説明する。
【０２３６】
方法
ＥＣの単離および培養
インビトロ実験のために、自家内皮細胞を、大動脈−冠動脈バイパス術のために使用されたヒト静脈の残余物からの短い区間のコラゲナーゼ消化によって単離した。静脈残余物の使用は、Ｃａｒｍｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＩＲＢによる承認を受けた。ヒツジ内皮細胞は、類似方法を用いて後肢外側伏在静脈から単離した。実験動物使用プロトコルは、イスラエル国ハイファに所在するＴｅｃｈｎｉｏｎ大学の「実験動物の飼育管理委員会」によって精査され、承認された。
【０２３７】
ＥＣは、２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、米国）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、２ｍＭのＬ−グルタミン酸塩（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）、１００μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ社、米国）、および２ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｇ．Ｎｅｕｆｅｌｄのご厚意による寄贈）を補給した、ゼラチンでコーティングされた培養皿上のＭ−１９９培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）中で培養した。ヒトＥＣは、それらの典型的な敷石状形態および抗ＣＤ３１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、米国）を用いる免疫組織化学（ＩＨＣ）によって同定した。ヒツジＥＣは、それらの典型的な敷石状形態および抗ｅＮＯＳ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、米国）を用いるＩＨＣによって同定した。
【０２３８】
レトロウイルスベクターの産生
これらのベクターは、インビトロ実験およびヒツジ実験のために使用した。
【０２３９】
フィブリン−５をコードする偽型組換えレトロウイルスベクターの生成
フィブリン−５をコードする組換えレトロウイルスベクターは、Ｍｏ−ＭＵＬＶ  ５’−長い末端反復（ＬＴＲ）およびＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａシグナルの制御下で、１３６１ｂｐのフィブリン−５  ｃＤＮＡフラグメント（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ００６３２９）をｐＬＸＳＮプラスミド（＃Ｋ１０６０−Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）のＢａｍＨＩ部位内へ挿入する工程によって構築した。レトロウイルスベクター産生のためには、１０μｇのｐＬＸＳＮ−フィブリン−５プラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）を用いて２９３ＦＬＹＡパッケージング細胞内へ形質移入した。４８時間後、ウイルスプロデューサー細胞のコンフルエントな培養からの上清を採取し、濾過し（０．４５μｍ）、２９３ＦＬＹ１０Ａもしくは２９３ＦＬＹＧＡＬＶパッケージング細胞へ添加した。形質導入細胞はＧ４１８選択（４００μｇ／ｍＬ）下で増殖させ、個々のコロニーを採取し、馴化培地サンプルのウエスタンブロット分析によってフィブリン−５発現についてスクリーニングした。各コロニーのウイルス力価はＴＥ６７１細胞形質導入によって決定したが、力価は約１０６ｐｆｕ／ｍＬの範囲内にあった。
【０２４０】
ＶＥＧＦ１６５およびＧＦＰをコードする偽型レトロウイルスベクターの生成
６００ｂｐのＶＥＧＦ１６５  ＢａｍＨＩ  ｃＤＮＡフラグメントは、ｐＣＤＮＡ−ＶＥＧＦ１６５（カリフォルニア州マウンテンビューに所在するＳｃｉｏｎｓ  Ｎｏｖａ社のＤｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍのご厚意による寄贈）から切断した。ヒトＶＥＧＦ１６５遺伝子をコードする組換えレトロウイルスベクターは、６００ｂｐのＶＥＧＦ１６５  ＢａｍＨＩフラグメントをｐＬＸＳＮプラスミドのＢａｍＨＩ部位内に挿入する工程によって構築した。
【０２４１】
組換えレトロウイルスベクターのｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、上述した方法と類似プロセスでｐＬＸＳＮプラスミド内にクローニングした。１，４００ｂｐのＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ  ＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩフラグメントは、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、＃６０２９−１）から切り取り、ｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰプラスミドを構築するためにＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ消化ｐＬＸＳＮ内に挿入した。ＧＦＰ、およびＶＥＧＦ１６５のレトロウイルスベクターストック液産生のためには、上述したフィブリン−５ウイルスストック生成法に類似する方法を使用した。
【０２４２】
アデノウイルスベクターの調製
これらのベクターは、血管傷害のラット頸動脈モデルのために使用した。
【０２４３】
ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰおよびＧＦＰ遺伝子をコードする組換え２シストロン性アデノウイルスベクターの生成
ヒトＶＥＧＦ１６５およびＧＦＰ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターは、シャトルベクター内へのルーチンの原核生物のクローニングおよび２９３細胞系における同種組換え手技からなる、いくつかの工程で構築した。分泌のためのシグナル配列を含むヒトＶＥＧＦ１６５  ｃＤＮＡを含有する６００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメント（カリフォルニア州マウンテンビューに所在するＳｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ社のＤｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍのご厚意による寄贈）をｐＱＢＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰシャトルベクター（ＱＢＩ社、カナダ国）内のＢｇｌＩＩ部位へ挿入した。発現プラスミドｐＱＢＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰは、その中にｈＣＭＶ５が挿入されたＥ１領域内に欠失を備えるＡｄ５ゲノムの左腕（１６％）もまた含有していた。シャトルベクターｐＱＢＩ−ＶＥＧＦ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、Ｅ１遺伝子を構成的に発現する２９３細胞内へｐＪＭ１７プラスミドによって共形質移入した。ｐＪＭ１７プラスミドは、Ｅ３領域を排除して、ウイルスのＥ１領域内のインサート（ｐＢＲＸ）を含んでいるアデノウイルスゲノムを含有していた。形質移入後の発現プラスミドとｐＪＭ１７との間の同種組換えは、Ｅ１領域およびｐＢＲＸインサートをｐＣＡ３プラスミド由来の発現カセットと置換した。プラーク形成は、共形質移入後の２〜４週間の間に発生した。個々のプラークを単離し、ウイルス抽出物は２９３細胞の感染によって増幅させた。各ウイルスストックの力価は２９３細胞内でのプラークアッセイによって決定し、力価は約１０１０〜１０１１ｐｆｕ／ｍＬの範囲に及んだ。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタン分析によって確証した。ＧＦＰウイルスストック生成は、類似方法で実施した。
【０２４４】
フィブリン−５−ＧＦＰ遺伝子をコードする組換えアデノウイルスベクターの生成。
【０２４５】
ヒトフィブリン−５およびＧＦＰ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターは、変法ＡｄＥａｓｙプロトコル（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．ＰＮＡＳ  １９９８）によって構築した。フィブリン−５  ｃＤＮＡの１，３６１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントは、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶシャトルベクター内のＢｇｌＩＩ部位内へ個別に挿入した。このシャトルベクターは、導入遺伝子の下流で追加のＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＰＦを含有している。これらのシャトルベクターは、ＰｍｅＩ消化によって線形化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットによって精製した。シャトルベクターおよびｐＡｄＥａｓｙ−１は、コンピテントＢＪ５１８３細胞内へ電気泳動法によって共形質変換させた。組換えアデノウイルスベクターを含有する陽性クローンは、ＰＣＲおよび制限マップ分析にしたがって選択した。組換えアデノウイルスプラスミドは、ＰａｃＩ消化によって線形化し、精製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、米国）を用いて２９３細胞内に形質移入した。形質移入の７日後、細胞変性効果が発生し、１００％の細胞がＧＦＰを発現した。細胞を収穫し、ウイルス抽出物は、２９３細胞内でさらに増幅させた。各ウイルスストックの力価は２９３細胞内での連続希釈アッセイによって決定し、力価は１０１０〜１０１１ｐｆｕ／ｍＬの範囲に及んだ。導入遺伝子の発現は、感染細胞馴化培地のウェスタン分析によって確証した。
【０２４６】
内皮細胞の形質導入
４×１０５個のＥＣは、形質導入の２４時間前にフィブロネクチンでコーティングされた６０ｍｍ径のプレート（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル国）上に播種した。細胞は、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ社、米国）と一緒に１時間にわたりインキュベートし、３７℃で４時間にわたりレトロウイルスベクターに曝露させた。ウイルスベクターストックは、細胞１個に付きウイルス粒子５〜８個の比率を達成するようにＭ１９９培地中に希釈させた。
【０２４７】
ＥＣの二重形質導入は、２工程プロセスによって達成した：（１）フィブリン−５をコードするレトロウイルスベクターによる初回形質導入、その後に＞８０％のＥＣ集団がフィブリン−５を発現するまでのＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いた選択；（２）ＶＥＧＦ１６５をコードするレトロウイルスベクターによるこのフィブリン−５を発現するＥＣ集団の形質導入。ＥＣはＧ４１８の存在下で培養し、導入遺伝子の発現は、関連導入遺伝子についてのウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＩＨＣによって監視した。結果として生じる二重形質導入されたＥＣ集団は、フィブリン−５を発現する細胞（＞８０％）および追加してＶＥＧＦ１６５を発現するこれらの細胞のサブ集団（１５〜３０％の細胞）を含んでいた。
【０２４８】
ｅＰＴＦＥグラフトへの内皮細胞の播種
ｅＰＴＦＥグラフト（６ｍｍ、Ｇｏｒｅ社、米国）は、播種前にフィブロネクチン（４５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社、米国）を用いてプレインキュベートした。ＥＣ播種は、同種の重力非依存性グラフト播種を許容するために回転式装置を用いて実施した。血管グラフトにはＥＣ培地中に４．５×１０５個（細胞）／ｃｍ２（グラフト表面積）を含有していたＥＣ懸濁液を充填した。グラフトの播種は、５％のＣＯ２、３７℃の環境において実施した。この方法は、コンフルエントなＥＣ単層でコーティングされたＰＴＦＥグラフトを産生した。
【０２４９】
播種の４８時間後である播種方法の終了時に、グラフト先端を切断し、播種品質を評価するために２．５％グルタルアルデヒド中に固定した。ＶＥＣＴＡ−ＳＨＩＥＬＤ封入液（ＶＥＣＴＯＲ社、米国）を含有するＤＡＰＩを用いる核染色を実施した。グラフト切片は、倒立蛍光顕微鏡を２００倍の倍率で用いて、５カ所の無作為領域における播種細胞による被覆について試験した。
【０２５０】
ウエスタンブロット
形質導入細胞における導入遺伝子の発現を検証するためにウエスタンブロットを実施した。形質導入細胞由来の馴化培地を採取し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロース紙へ電気的に移動させ、これを１０％低脂肪乳でブロックし、ヒトフィブリン−５配列由来の合成ペプチドに対して立てられたウサギポリクローナル抗体とともに１：５００の希釈率でインキュベートした（特注、Ｓｉｇｍａ社、イスラエル国）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（１：７０００）を使用して、ＥＣＬ検出システムを用いて結合抗体を視認した。ＶＥＧＦ１６５の検出は、１：５００の希釈率でヤギ抗ヒトＶＥＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ社、米国）を用いて実施した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヤギ抗体（１：１００００）を使用して、ＥＣＬ検出システムを用いて結合抗体を視認した。
【０２５１】
導入遺伝子の発現についての免疫組織化学
組織培養：免疫組織化学を使用して、形質導入細胞における導入遺伝子の発現の同定を実施した。細胞は４ウエル組織培養スライド（Ｎｕｎｃ社）上で２４時間にわたり播種し、次に４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を用いて固定した。抗原を回収するために、スライドは１ｍＭ  ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）中で１５分間にわたりマイクロ波処置した。
【０２５２】
ｅｃＮＯＳ染色スライドについては、ＣＡＳブロック（Ｚｙｍｅｄ社、米国）と一緒にインキュベートし、次にＣＡＳブロック内のウサギ抗ヒトＮＯＳ３抗体を用いて免疫染色した（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、米国）。二次抗体は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ−ウサギペルオキシダーゼ抱合体（１：１、Ｄａｋｏ社、デンマーク）であった。結合抗体の検出は、ＡＥＣ基質を用いて実施した（Ｄａｋｏ社、デンマーク）。
【０２５３】
αＳＭＣ−アクチンの染色のためには、スライドをＣＡＳブロック（Ｚｙｍｅｄ社、米国）とインキュベートし、次にマウス抗ヒトＳＭＣアクチン抗体（１：５０、ＤＡＫＯ社、デンマーク）を用いて免疫染色した。二次ビオチン抱合ヤギ抗マウス（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）。結合抗体の検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）を用いて実施した。
【０２５４】
ＶＥＧＦ１６５染色については、スライドをＣＡＳブロック（Ｚｙｍｅｄ社、米国）と一緒にインキュベートし、次にヤギ抗ヒトＶＥＧＦ抗体を用いて免疫染色した（１：５０、Ｒ＆Ｄ社、米国）。二次ビオチン抱合ロバ抗ヤギ（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）。結合抗体の検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）を用いて実施した。
【０２５５】
フィブリン−５の染色のためには、スライドを７０％のＣＡＳブロック（Ｚｙｍｅｄ社、米国）および３０％ヤギ血清（Ｚｙｍｅｄ社、米国）と一緒にインキュベートし、次に２％のＴｗｅｅｎ  ２０を補給したブロック溶液中のウサギ抗ヒト抗体（１：２００、特注、Ｓｉｇｍａ社、イスラエル国）を用いて免疫染色した。二次抗体は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ−ウサギペルオキシダーゼ抱合体（１：２、Ｄａｋｏ社、デンマーク）であった。結合抗体の検出は、ＡＥＣ基質を用いて実施した（Ｄａｋｏ社、デンマーク）。
【０２５６】
グラフト：グラフトは２４時間にわたり４％ホルマリンを用いて固定し、次にパラフィン中に包埋した。脱パラフィン化連続切片は、１ｍＭのＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）中で２０分間にわたりマイクロ波処置した。
【０２５７】
ｖＷＦおよびαＳＭＣアクチンの染色のためには、グラフト切片をウサギ抗ヒトｖＷＦ抗体（１：１００、Ｄａｋｏ社、デンマーク）およびマウス抗ヒトαＳＭＣアクチン（１：５０、Ｄａｋｏ社、デンマーク）と一緒にインキュベートした。ｖＷＦ抗体については、二次抗体はＦＩＴＣヤギ抗ウサギ抱合体（１：５０、Ｚｙｍｅｄ社、米国）であった。αＳＭＣ抗体については、二次抗体は、ローダミンヤギ抗マウス（１：５０、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、米国）であった。
【０２５８】
組織：組織は４８時間にわたり４％ホルマリンを用いて固定し、次にパラフィン中に包埋した。
【０２５９】
フィブリン−５の染色のためには：脱パラフィン化連続切片を内因性ペルオキシダーゼ不活性化溶液中でインキュベートした。スライドは、次に１ｍＭ  ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）中で２０分間にわたりマイクロ波処置した。スライドを次に７０％のＣＡＳブロックおよび３０％ヤギ血清（Ｚｙｍｅｄ社、米国）と一緒にインキュベートし、次に２％のＴｗｅｅｎ  ２０を補給したブロック溶液中のウサギ抗ヒト抗体（１：５０、特注、Ｓｉｇｍａ社、イスラエル国）を用いて免疫染色した。二次抗体は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ−ウサギペルオキシダーゼ抱合体（１：２、Ｄａｋｏ社、デンマーク）であった。結合抗体の検出は、ＡＥＣ基質を用いて実施した（Ｄａｋｏ社、デンマーク）。
【０２６０】
Ｋｉ−６７染色のためには、スライドを内因性ペルオキシダーゼ不活性化溶液中でインキュベートした。スライドは、次に１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中でマイクロ波処置した。スライドを次に０．３％のＴｒｉｔｏｎを補給した２０％ウサギ血清と一緒にインキュベートした。組織は、０．１％のＴｒｉｔｏｎを補給した３％のウサギ抗ヒトＫｉ−６７抗体（１：５０、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）を用いて免疫染色した。二次抗体は、ウサギ抗ラット（Ｖｅｃｔｒａｓｈｉｅｌｄ社）であった。結合抗体の検出は、ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｒａｓｈｉｅｌｄ社）およびＤＡＢ基質を用いて実施した。
【０２６１】
導入遺伝子の発現についてのＥＬＩＳＡ
５×１０５個の細胞の血清無含有馴化培地を２４〜４８時間後に採取し、細胞遠心分離のために２分間にわたり２，０００ｒｐｍで遠心し、使用時まで−８０℃で冷凍した。
【０２６２】
ＶＥＧＦ１６５のためには市販のキットであるヒトＶＥＧＦイムノアッセイキットを製造業者（Ｒ＆Ｄ、米国）の取扱説明書にしたがって使用した。
【０２６３】
フィブリン−５のためには、本発明者らの研究室で開発したＥＬＩＳＡを用いてタンパク質レベルを測定した。標準物質およびサンプルは非抗体被覆９６ウエルプレート内に分布させた。ウサギ抗ヒトフィブリン−５特注特異的抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ社、イスラエル国）を加え、ウエル内に存在するフィブリン−５に結合させた。二次抗体は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ−ウサギペルオキシダーゼ抱合体（１：５０、Ｄａｋｏ社、デンマーク）であった。ＴＭＢ／Ｅ溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）を呈色反応のための基質として使用した。反応は、０．２５ＭのＨＣｌ停止液を用いて停止させた。プレートは、４５０／５４０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー内で読み取った。
【０２６４】
ウサギおよびヒツジ毒性モデルにおける生体内分布
一般的説明
ＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔ播種のために使用した遺伝子操作内皮細胞の生体内分布をウサギ／ヒツジ毒性モデルにおいて試験した。生体内分布試験は、それらがグラフト表面から剥離したＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔ細胞の分布を試験するために実施した。ウサギにはＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔのために調製した治療用量もしくは高用量の二重形質導入内皮細胞を注射し、３もしくは２４週間後に犠死させた。
【０２６５】
ヒツジにはベア、ナイーブＥＣ播種、またはＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔバイパス導管を移植し、２４週間後に犠死させた。８匹のヒツジを、ベクター特異的配列の生体内分布について分析した。生体内分布は、以下のようにＰＣＲを用いて精巣および卵巣を含む主要器官および組織において試験した：
ＤＮＡサンプルの調製
ウサギ／ヒツジ組織由来の２つずつのサンプルを新しく犠死させた動物から入手し、ＤＮＡ単離時まで−８０℃で保管した。組織サンプルから５０〜７０ｍｇのアリコートを調製した。さらに、各々５ｍＬの新鮮全血サンプルから白血球（ＷＢＣ）サンプルを調製した。ＲＢＣを溶解させ、ＷＢＣは遠心分離後に採取し、食塩水中で洗浄し、ＤＮＡ単離時まで−７０℃で冷凍した。
【０２６６】
組織およびＷＢＣからのゲノムＤＮＡの抽出は、プロトコルにしたがってＱＩＡｍｐ  ＤＮｅａｓｙを用いて実施した。ＲＮＡの共抽出を排除するために、ＲＮａｓｅ  Ａをサンプルに加えた。
【０２６７】
ヒツジ組織中のベクター特異的配列の存在を同定するために、ＤＮＡサンプルを以下の組織から抽出した：末梢血球、眼、腎臓、脾臓、肺、精巣／卵巣、肝臓、心臓、骨髄、骨格筋［咀嚼筋−ＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔおよびＲＴ四頭筋によって供給される筋肉−コントロール筋肉］および脳、ならびに移植されたグラフトの遠位、中央および近位部分から入手されたグラフトサンプル。
【０２６８】
次のウサギ組織を試験した：ＷＢＣ、眼、肝臓、脾臓、肺、骨髄、精巣／卵巣、腎臓、心臓、非虚血性骨格筋［ＬＴ四頭筋］、虚血性骨格筋［ＲＴ四頭筋］、虚血性骨格筋［ＲＴ腓腹筋］、および脳。
【０２６９】
ＰＣＲ反応の調製：
ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０）領域からのベクター特異的配列およびレトロウイルスベクター（ｐＬＸＳＮ、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２８２４８）において見出されたネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）領域からの配列を検出するために、ネステッドＰＣＲアッセイを実施した。選択したプライマーは、１４０ｂｐの単一ＰＣＲ増幅産物の増幅をもたらした。各々が約１μｇの組織中ＤＮＡを含有する各組織について、３回ずつのＰＣＲを実施した。３回のうちの１回は、５０コピーのベクターＤＮＡを用いてスパイクした。
【０２７０】
ＰＣＲアッセイコントロール
陰性試薬コントロール（ＮＲＣ）−核酸を含まないＰＣＲ反応ミックスから構成される。
【０２７１】
前哨コントロール（ＳＣ）−鋳型核酸を含まない反応ミックスから構成される。これらのチューブは、第１は組織採取中（解剖後）および第２は組織サンプルの調製中の特定の時間に開放したままにした。
【０２７２】
陽性特異性コントロール（ＰＳＣ）−組換えベクタープラスミド（ｐＬＸＳＮ−ＶＥＧＦ）から調製したＤＮＡから構成される。陽性特異性コントロールは、５００、５０および１０の３種の濃度のベクタープラスミドＤＮＡコピーを含んでいた。
【０２７３】
陽性組織コントロール（ＰＴＣ）−ベクター無含有組織から抽出した１μｇのＤＮＡの３つのサンプルから構成される。各サンプルは、３種の別個の濃度（５００、５０、および１０コピー）のベクターＤＮＡを用いてスパイクした。
【０２７４】
ＰＣＲは、プロトコール（ＭＧＶＳ社、申請中）にしたがって実施した。ＰＣＲの結果は、１４０ｂｐの特異的な単一増幅バンドが観察され、コントロールが予想通りである場合に陽性と見なした。
【０２７５】
ＤＮＡ完全性の評価
組織サンプル中で抽出したＤＮＡの完全性は、ハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して特異的な追加のＰＣＲによって評価した（ウサギβ−アクチンに対して特異的なプライマーおよびヒツジβ−アクチンに対して特異的なプライマーを用いて）。１０６ｂｐの単一特異的ＰＣＲ増幅産物を産生するウサギサンプルＤＮＡ（０．１μｇ）は陽性と見なし、１８２ｂｐのＰＣＲ増幅産物はヒツジサンプルＤＮＡに対して陽性と見なした。
【０２７６】
ウサギにおける生体内分布試験の結果
治療用量−２４週間後犠死群の１匹のウサギについての代表的結果を図４２に示した。現在までに試験した他のウサギのＰＣＲの結果は表２に要約した。組織サンプルから抽出したＤＮＡの完全性は、ウサギハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して特異的なＰＣＲ反応によって評価した。７匹のウサギを試験したが、試験した組織のいずれにおいてもベクター特異的配列は検出されなかった（表２を参照）。
【０２７７】
【表２】
2009525110.tif 000007
１４０ｂｐの単一陽性ＰＣＲ産物は、全スパイク組織および陽性コントロールで観察された。前哨コントロールおよび陰性コントロールについては、増幅シグナルは観察されなかった。全組織は、ベクター配列については陰性であることが見いだされた。このＰＣＲアッセイの感受性は、１μｇのＤＮＡ中の１０コピーのベクターＤＮＡである。
【０２７８】
全組織サンプルから抽出したＤＮＡの完全性は、ウサギハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して特異的なＰＣＲによって評価した。全サンプルについての１６０ｂｐ増幅産物の存在および陰性コントロールについての生成物なし（図４３）は、ＤＮＡ完全性の指標であった。
【０２７９】
ウサギ生体内分布試験についての結論
生体内分布試験は、それらがグラフト表面から剥離したＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔ細胞の分布を試験するために実施した。ベクター特異的配列の証拠は、ＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔ細胞の直接動脈内注射のウサギモデルについて試験したいずれの組織中でも検出されなかった。
【０２８０】
ヒツジにおける生体内分布試験の結果
これまでに試験したヒツジのＰＣＲの結果の要約は、表３に提示した。ＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔが移植された３匹の試験ヒツジ中１匹は、試験した全組織中でベクター特異的配列の存在について陰性であることが見いだされたことに注目することは重要である。２４週間後犠死群のＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔが移植された１匹のヒツジについて同様に試験した。現在までに試験した他のヒツジのＰＣＲの結果は表３に要約した。
【０２８１】
【表３−１】
2009525110.tif 000008
【０２８２】
【表３−２】
2009525110.tif 000009
ヒツジ生体内分布試験についての考察および結論
１．移植２４週間後の、剖検時の移植グラフト中で検出されたベクター配列
・ベクター特異的配列は、ＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔにおいては検出されたが、ナイーブＥＣ播種、またはベアｅＰＴＦＥグラフトにおいては検出されず、これは本発明者らのＰＣＲに基づく生体内分布アッセイシステムの妥当性を支持している。
【０２８３】
・ベクター特異的配列は、移植２４週間後に試験したヒツジ３匹中２匹におけるＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔ内で検出された。そこで、遺伝子操作された細胞は、少なくとも２４週間にわたりグラフト表面に接着し続けるであろう。
【０２８４】
・ベクター特異的配列は、試験したＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔの３例中２例の近位、中央および遠位グラフト切片で検出された。これは、少なくとも２４週間にわたるグラフト表面全体での細胞接着および保持の同種パターンを意味している。
【０２８５】
・グラフトは、近位、中央および遠位グラフト切片の形態測定分析を用いて内腔開存性グラフトの内腔表面のＥＣ被覆について評価した。連続する厚さ６μｍのスライドをヘマトキシリン−エオシンによって染色した。この染色は、グラフトの内腔の被覆が生体内分布については陰性であることを明らかにした。
【０２８６】
２．移植２４週間後の、他の組織もしくは器官において検出されたベクター配列
表３に要約したように、ＭｕｌｔｉＧｅｎｅＧｒａｆｔが移植された３匹のヒツジにおいて、移植２４週間後にベクター特異的配列の生体内分布について試験した。ベクター特異的配列は、１匹のヒツジの眼組織および他のヒツジの骨髄において検出された。他の組織もしくは器官では、ベクター含有細胞の証拠は見いだされなかった。
【０２８７】
眼への血液供給は、移植グラフト（頸動脈）に対して下流である。このため、グラフト表面からの細胞剥離は眼に達することがある。提案された臨床状況では、グラフトは四肢に移植されるので、このシナリオでは剥離した細胞は眼に到達しないであろう。さらに、ベクター特異的配列は、動物３匹中１匹で、ＤＮＡ抽出とは無関係の５例中２例で検出された。これらの結果は、眼における遺伝子操作された細胞の量は小さいことを示しており、提案された下肢バイパス術の適応とはおそらく関連しない「モデル関連性結果」を表す可能性がある。
【０２８８】
骨髄からの陽性シグナルは、動物３匹中１匹で、ＤＮＡ抽出とは無関係の３例中１例で検出された。これは骨髄中の少量の遺伝子操作ＤＮＡの存在の指標、または組織採取手技中の汚染の結果として生じる「擬陽性」の可能性がある。
【０２８９】
ベクター特異的配列の増幅は、スパイクされた組織および陽性コントロール中で観察されたが、陰性コントロール中では観察されなかった。全組織中のβ−アクチン遺伝子配列の増幅は、抽出したＤＮＡの完全性を証明した。
【０２９０】
生物学的活性アッセイ
導入遺伝子の活性：
レトロウイルスベクターによる内皮細胞へのフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の高効率遺伝子導入は、実行可能であることが証明された。ＥＣは導入遺伝子を発現することが証明されており、本セクションでは導入タンパク質が毒性試験のために使用されたヒトおよびウサギ細胞上で生物学的活性であるというインビトロ証拠を提供する。
【０２９１】
細胞内シグナル形質導入に導入遺伝子が及ぼす作用
フィブリン−５は、細胞の接着、増殖および運動性の調節において重要な役割を有する細胞外マトリックスタンパク質である。これらの経路におけるフィブリン−５の関係は、未だ十分には理解されていない。以前の試験では、フィブリン−５は、ＭＡＰキナーゼＥＲＫおよび上皮細胞中のｐ３８の活性化を増強することが見いだされた。同様に数種の成長因子およびサイトカイン、特にＶＥＧＦ１６５によってアップレギュレートされるこれらのキナーゼの活性化は、単一上流ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）によるトレオニンおよびチロシンのリン酸化を通して発生する。ここで本発明者らは、フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５が単離したヒト伏在静脈由来内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）および平滑筋細胞（ＨＳＶＳＭＣ）中でＥＲＫおよびｐ３８リン酸化を活性できるかどうかを試験した。手短には、ナイーブＥＣおよびＳＭＣは２４時間にわたり６ウエルプレート内で培養した。培地は、フィブリン−５、ＶＥＧＦ１６５もしくはその両方の遺伝子を過剰発現するＨＳＶＥＣの馴化培地と交換した。外因性ＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍＬ）もまた一部の実験において培養に加えた。その後、細胞は低温ＰＢＳを用いて１回洗浄し、溶解バッファーを用いて溶解させた。全細胞抽出物中のＥＲＫおよびｐ３８活性化は、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫまたは抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰＫモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析によって評価した。タンパク質負荷の相違は、抗ＥＲＫもしくは抗β−アクチン抗体のいずれかを用いた剥離膜の再プロービングによって監視した。
【０２９２】
結果：
１．フィブリン−５を発現する細胞由来の予備馴化培地へのナイーブＨＳＶＥＣの曝露は、ＥＲＫリン酸化の有意な増強を生じさせたが、不活性形へは作用をほとんど、もしくは全く生じさせなかった。この上昇は、フィブリン−５に加えてＶＥＧＦ１６５を用いた細胞のナイーブＨＳＶＳＭＣ形質導入においてさえいっそう顕著であり、これはさらにＥＲＫリン酸化のわずかな増加をもたらしたが、ＨＳＶＳＭＣにおける活性化には影響を及ぼさなかった（図４４）。
【０２９３】
２．図４５では、ＶＥＧＦ１６５を発現する細胞由来の予備馴化培地のナイーブＨＳＶＥＣへの添加が３０分間の曝露後に最高値に達するｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８の時間依存性アップレギュレーションをもたらした。
【０２９４】
３．ｐ３８のリン酸化はフィブリン−５の過剰発現によっては誘導されず、そのリン酸化の上昇は、細胞がＶＥＧＦ１６５と一緒にフィブリン−５をまさに過剰発現した時点に検出された。（図４６）。
【０２９５】
概要
フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５両方の導入遺伝子の発現は、ヒトＥＣに生物学的作用を及ぼすことが見いだされた。フィブリン−５過剰発現はＥＲＫ活性化をもたらしたが、他方ＶＥＧＦ１６５はＥＲＫおよびｐ３８両方のリン酸化を増強した。例えば細胞の増殖、分化、移動および生存などの生物学的プロセスにおけるＥＲＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫの機能的関与に関しては矛盾するデータが存在する。フィブリン−５がＨＳＶＥＣの増殖を減少させる能力は、ＥＲＫ活性化の増強を通して媒介されることが考えられる。さらに、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＳＶＥＣ増殖についての本発明者らの観察もまた、このプロセスにおいてＥＲＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫが役割を果たすことを意味するであろう。
【０２９６】
毒性試験に使用されたウサギ内皮細胞への導入遺伝子の活性
ウサギ静脈に由来するＥＣにヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質が及ぼす生物学的作用を増殖アッセイによって評価し、ヒト静脈由来ＥＣと比較した。ＥＣ（１×１０４個（細胞）／ウエル）は、フィブロネクチンがプレコーティングされた１２ウエルプレート上に播種した。ＥＣは、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した増殖培地中で培養した。翌日、培地は、７２時間にわたり２種の濃度の組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ｒｈＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補給した２％のＦＢＳを含有する増殖培地と交換した。細胞増殖にＶＥＧＦが及ぼす作用は、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞計数器を用いて細胞を計数することによって評価した（図４７）。
【０２９７】
結果：
本アッセイは、ヒトＶＥＧＦがウサギ内皮細胞に及ぼす生物学的作用を有することを証明した。２例のドナー由来のウサギＥＣへのヒトＶＥＧＦ補給は、７２時間後に細胞増殖における２０〜３０％の増加を生じさせた。
【０２９８】
細胞増殖アッセイ
内皮細胞−ヒト伏在静脈由来内皮細胞（２×１０４個（細胞）／ウエル）は、フィブロネクチン（２０μｇ／ｍＬ）でプレコーティングされた２４ウエル培養皿内に播種した。ＥＣはトリプシンを用いて採取し、播種４時間後、第２日（４８時間後）、第４日（９６時間後）、第５日（１２０時間後）に細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国）を用いて計数した。各実験は３回ずつ実施し、３例の相違する静脈ドナーにおいて繰り返した（一次細胞系）。増殖率は、非形質導入ＥＣ（ナイーブ）、ＧＦＰを過剰発現するレトロウイルス形質導入ＥＣ（緑色蛍光タンパク質）、フィブリン−５を過剰発現するレトロウイルス形質導入ＥＣ、ならびにＶＥＧＦ１６５およびフィブリン−５を共発現するレトロウイルス形質導入ＥＣ中で試験した。本アッセイは、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍＬ）の補給を行って、および行わずに実施した。
【０２９９】
平滑筋細胞−ヒト伏在静脈由来平滑筋細胞（２×１０４個（細胞）／ウエル）は、ＰＢＳ−ゼラチンでプレコーティングされた２４ウエル培養皿内に播種した。ＳＭＣはトリプシンを用いて採取し、播種４時間後、および３つの時点に細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国）を用いて計数した。各実験は３回ずつ実施し、３例の相違する静脈ドナーにおいて２回繰り返した（一次細胞系）。増殖率は、非形質導入ＳＭＣ（ナイーブ）、ＧＦＰを過剰発現するレトロウイルス形質導入ＳＭＣおよびフィブリン−５を過剰発現するレトロウイルス形質導入ＳＭＣ中で試験した。本アッセイは、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍＬ）の補給を行って、および行わずに実施した。
【０３００】
ラット頸動脈傷害モデル
それにより内皮細胞が過剰に拡張させたＦｏｇａｒｔｙバルーンによって内頸動脈から露出させられるラット頸動脈傷害モデルは、再狭窄の現象を試験するための最も一般的な動物モデルである。本方法は、バルーン拡張およびステント留置後のヒト動脈内で惹起される傷害に類似する血管傷害を誘発する。傷害に反応して、平滑筋細胞は増殖して内膜層に移動し、動脈内腔に突出する新生内膜層を作り出す。
【０３０１】
動物モデル−実験動物使用プロトコルは、イスラエル国ハイファに所在するＴｅｃｈｎｉｏｎ大学の「実験動物の飼育管理委員会」によって精査され、承認された。体重が４００〜４５０ｇの２５匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙ系ラットは、筋肉内注射されたケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン０．２５ｍｇ／ｋｇで麻酔をかけた。この段階でヘパリン（１００Ｕ）を皮下注射し、５０Ｕを筋肉内注射した。右外頸動脈の遠位区間を結紮し、動脈切開術を実施した。動脈切開部に通して２ＦのＦｏｇａｒｔｙバルーンカテーテルを導入し、右総頸動脈の起始部へ前進させた。バルーンは、わずかな抵抗を生成するために十分に拡張し（０．３ｍＬ）、右総頸動脈の全長にわたる内皮露出を生成するために、充填したバルーンを３回抜去した。
【０３０２】
傷害の誘導後、動脈切開部に通して傷害区間へ２４Ｇカテーテルを誘導し、０．１５ｍＬの以下の溶液を５匹のラットに注射した：フィブリン−５−ＧＦＰをコードするアデノウイルスベクター懸濁液（感染粒子が１０１０個）、ＧＦＰをコードするアデノウイルスベクター、ＶＥＧＦ−ＧＦＰをコードするアデノウイルスベクターまたはフィブリン−５およびＶＥＧＦをコードするベクターのアデノウイルス混合物（総量０．１５ｍＬ中の各ベクターから５×１０９個の感染粒子）。５匹のラットに正常食塩水を注射した。２本の結紮糸を用いて、注射した溶液が分離された区間内に維持されることを許容しながら、２０分間にわたり総頸動脈を大動脈および遠位動脈から分離した。カテーテルを抜去した後、右外頸動脈を動脈切開部の近位で結紮し、右内頸動脈を通る大動脈からの血流を許容しながら傷害区間内の血流を回復させた。深部体温は、動物を乾燥した電気毛布で維持して、３６〜３７℃で維持した。
【０３０３】
ラットは、第１４日に記載したように麻酔した。頸動脈のためには、圧力−灌流固定を実施した。胸郭を開き、１８Ｇ静脈内カテーテルを上行大動脈内に導入した。ラットは、致死量のフェントバルビタールナトリウム（７５ｍｇ／ｋｇ）を用いて犠死させた。出血は２本の頸動脈に通して誘導し、１２０ｍｍＨｇで１０分間をかけて１００ｍＬの４％ホルムアルデヒド溶液を注入した。圧力灌流固定後、全右総頸動脈を回収し、２４時間にわたりホルマリン中に浸漬し、最後にパラフィンブロック内に包埋した。左総頸動脈もまた切除し、コントロールとして使用した。
【０３０４】
評価−傷害動脈区間は、中央遠位部分からの２つの断面についての形態計測分析を用いて、新生内膜形成の存在および内腔開存性について評価した。スライドは、形態計測分析のためにヘマトキシリン−エオシンによって染色した。ＥＣ被覆、内腔内血栓領域および血栓領域対グラフト内腔面積の比率は、デジタル画像分析（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、米国）を用いて計算した。外弾性板（ＥＥＬＭ）の内側、内弾性板（ＩＥＬＭ）の内側、および動脈内腔の断面積を測定した。中膜および内膜の面積は、ＥＥＬＭ面積からＩＥＬＭの面積を減算し、そしてＩＥＬＭ面積から内腔面積を減算することによって計算した。動脈狭窄の程度は、新生内膜面積対内腔面積の比率（Ｉ／Ｌ）および新生内膜面積対中膜面積の比率（Ｉ／Ｍ）によって決定した。スライドは、組織内のフィブリン−５の存在についてもまた免疫染色した。さらに、スライドは、増殖細胞の存在についてＫｉ−６７で染色した。
【０３０５】
インビボヒツジモデル
本実験方法は、以下の工程から構成した：外側伏在静脈は１８匹の成体ヒツジから切除した。それらの静脈各々由来の内皮細胞（ＥＣ）を単離し、２０〜２４日間の期間にわたり５０×１０６個（細胞）へ拡大させた。ＥＣは、ＣＤ３１についての免疫組織化学的染色を用いて同定し、他方では線維芽細胞および平滑筋細胞汚染を平滑筋α−アクチンについての免疫染色を用いて除外した。ＥＣは、フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５をコードする遺伝子を用いてレトロウイルスによって形質導入した。遺伝子導入および選択後のフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の発現は、免疫組織化学的染色およびＥＬＩＳＡによって検証した。遺伝子導入および細胞拡大後に、形質導入ＥＣは長さ２５ｃｍで６ｍｍ径のｅＰＴＦＥグラフト上に播種した。６本のグラフトにフィブリン−５（＞９０％の細胞）およびＶＥＧＦ１６５（１５〜２５％の細胞）を過剰発現する自家ＥＣを播種し、６本のグラフトには自家非形質導入ＥＣ（ナイーブ）を播種し、６本のベアグラフトはコントロールとして移植した。播種したグラフトは、ＥＣドナーヒツジの右頸動脈内に移植した。グラフトは頸動脈の端側に移植し、吻合部間の頸動脈はグラフトを通る血流量を最大限にするために閉塞させた。手術終了時に、グラフト開存性は選択的血管造影法によって検証し、頸動脈血流量を測定した（Ｄｏｐｐｌｅｒフロープローブ、＃Ｔ−１０６；Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ社、ニューヨーク）。移植の３カ月後、ヒツジに麻酔を掛け、グラフト開存性を試験するために選択的血管造影法を実施した。６カ月後、選択的血管造影法および頸動脈を通る血流量の測定を繰り返し、ヒツジはＫＣｌ注射によって犠死させた。移植したグラフトは、１００ｍｍＨｇで１Ｌの通常の生理食塩水を用いて選択的に灌流した。次にグラフトを含む頸動脈を切り裂き、近位および遠位吻合部、ならびにグラフトの中央区間からの連続区間をさらに２４時間にわたり４％ホルマリン中で固定し、次にパラフィン包埋した。スライドは、内腔内血栓症および内皮細胞被覆を評価するためにＨ＆Ｅ染色によって選択した。開存性グラフトは、全３種の横断面、つまり、近位および遠位吻合部、ならびに中央グラフト切片の形態計測分析を用いて腔内血栓の存在について評価した。連続する厚さ６μｍのスライドをヘマトキシリン−エオシンによって染色した。ＥＣ被覆、内腔内血栓領域および血栓領域対グラフト内腔面積の比率は、デジタル画像分析（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ４，Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、米国）を用いて計算した。
【０３０６】
グラフト切片は、内腔細胞の性質を評価するために、さらにｖＷＦおよびαＳＭＣアクチンについても免疫染色した。
【０３０７】
グラフト切片は、さらに形質導入細胞の存在についてＮｅｏ＋耐性遺伝子についてＰＣＲによって評価した。
【０３０８】
統計的方法
全データは、平均値±ＳＤとして計算した。複数のノンパラメトリック群間の増殖指数の比較は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ、その後のＤｕｎｎの事後試験を用いて実施した。２つのノンパラメトリック群は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｈｎｅｙ  Ｕ試験を用いて比較した。２つの群間の血流量および形態計測的変量の比較は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて実施した。０．０５以下の両側Ｐ値は、統計的有意と見なした。
【０３０９】
Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して、インビトロフロー装置における２時間の流動に曝露させた後のｅＰＴＦＥグラフトのＥＣ保持を比較した。グラフト切片における血栓面積を比較するためにはχ二乗検定を使用した。ＥＣコーティングにおける差を評価するためには、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用した（Ｓｔａｔｉｓｔｉｘ  ８、米国）。
【０３１０】
結果：
ＥＣおよびＳＭＣのインビトロ増殖：
実施例２８に記載の考察を参照されたい。
【０３１１】
新生内膜形成：ラット頸動脈傷害モデル：内皮細胞中でのフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の過剰発現
フィブリン−５をコードするレトロウイルスベクターによる形質導入後に、形質導入細胞の５０〜７０％は導入遺伝子を発現した。導入遺伝子の発現は、Ｇ４１８選択下での５〜７日間の培養後には細胞の８５〜１００％へ改善された。ＶＥＧＦ１６５をコードするベクターによる二次形質導入後、フィブリン−５を過剰発現するＥＣの２０〜３０％は、追加してＶＥＧＦ１６５を過剰発現した。フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の過剰発現は、ウエスタンブロット分析によって検証した（図４８Ａ、Ｂ）これらの細胞の免疫組織化学的染色は、二重遺伝子発現を証明した（図４７Ｃ、Ｄ）。二重遺伝子の発現は安定性であり、第１６継代まで維持された。
【０３１２】
本実験では、ｉ）フィブリン−５、ｉｉ）フィブリン−５およびＶＥＧＦ、ｉｉｉ）ＧＦＰをコードするアデノウイルスベクターまたは食塩水（コントロール）を血管傷害部位へ送達した。傷害後の第１４日に新生内膜形成の量を観察した。結果は、フィブリン−５単独の発現は新生内膜形成を防止するが、ＶＥＧＦの添加は、一部の、しかし統計的には有意ではない新生内膜形成を許容したことを示している。図４９Ａは、食塩水（コントロール）およびフィブリン−５を用いた場合の新生内膜形成を示している。免疫染色を用いると、フィブリン−５は、フィブリン−５を発現するアデノウイルスベクターに曝露させた動脈内での遺伝子導入後に排他的に発現することがさらに証明されている。増殖中の平滑筋細胞の数を検出するためのＫＩ−６７の染色は、増殖がフィブリン−５導入後に減少すること、そして食塩水導入後には存在することを証明した。図４９Ｂは、インジケーターとして内膜中膜比を用いた新生内膜の量をまとめている。フィブリン−５の導入がラット頸動脈内での新生内膜形成を減少させることは明白である。
【０３１３】
ＥＣ増殖アッセイ
ＥＣによるフィブリン−５の過剰発現は、ＥＣ増殖に阻害作用を及ぼした（図４１Ａ、Ｂ）。この阻害作用は繰り返しのヒト伏在静脈ＥＣ増殖アッセイにおいて観察された。ｂＦＧＦなどの外因性成長因子の存在は、この作用を阻害した。同一細胞内でのＶＥＧＦ１６５の過剰発現はこの阻害作用を無効にし、そしてｂＦＧＦの存在下では非形質導入ＥＣもしくはフィブリン−５形質導入ＥＣに比した増殖の利点を有していた。
【０３１４】
ＥＣ播種ｅＰＴＦＥグラフト
ＥＣは、方法のセクションに記載したｅＰＴＦＥグラフト上に播種した。グラフトには、緑色蛍光タンパク質発現、および走査型電子顕微鏡検査によって証明されるように、ＥＣのコンフルエントな単層でコーティングした（図５０Ａ、Ｂ）。播種されたＥＣは、ヘマトキシリン＆エオシン染色によって証明されるように、グラフト表面上に単一単層を形成した（図５０Ｃ）。播種した細胞をＣＤ−３１についての免疫組織化学的染色によっても染色した（図５０Ｄ）。
【０３１５】
フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５を発現するＥＣで播種したｅＰＴＦＥグラフトの改善された開存性
グラフトはヒツジ頸動脈の両側に移植し、２週間にわたり動物を観察した。両方の遺伝子を過剰発現するＥＣを播種したグラフト（ｎ＝８）は、ベアｅＰＴＦＥグラフト（ｎ＝４）、ナイーブＥＣ播種グラフト（ｎ＝２）、およびＧＦＰを過剰発現するＥＣを播種したグラフト（ｎ＝４）を含むコントロール群と比較した。フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の発現は、ＧＦＰ発現、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学によって関連する導入遺伝子について検証した。二重遺伝子形質導入ＥＣ播種グラフト２つにおいて、ＶＥＧＦ１６５発現レベルは、ウエスタンブロット分析において検出されなかった。
【０３１６】
全動物が実験プロトコルを完了した；１匹の動物は手術部位での創傷感染に罹患した。流量測定および血管造影評価は、移植した全グラフトが移植手術の完了時に開存性であることを明らかにした。
【０３１７】
２週間後、血管造影を繰り返し、動物を安楽死させ、再建された動脈を試験のために切除した。移植されたコントロールグラフトの３０％は、完全に閉塞していた（図５１Ａ、Ｂ）。これとは対照的に、二重遺伝子形質導入ＥＣが播種された移植グラフトの全部は、開存性であり、良好な流動を証明した。
【０３１８】
全グラフト切片（近位、中央および遠位区間）の形態計測分析は、グラフト閉塞が血栓症に関連することを明らかにした。形態計測によるグラフト切片の血栓についての分析から得られたデータは、表４に示した。フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＥＣを播種したグラフトの区間は、コントロール群からのグラフトと比較して、積層状の血栓形成の有意な減少を示した：コントロール群のグラフト切片の５５％（１６／２９）は、二重遺伝子グラフト切片では４％に過ぎなかったのとは対照的に、３％を超える血栓面積を示した（ｐ値＜０．００８）。
【０３１９】
【表４】
2009525110.tif 000010
フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の過剰発現はｅＰＴＦＥグラフトのＥＣ保持を改善する
グラフトのＥＣ被覆は、細胞に被覆されたままである全グラフト面積のパーセンテージとして評価した。全グラフト切片（近位、中央および遠位）をＥＣコーティングについて評価した。グラフトのＥＣコーティング試験の結果の要約は表４に示した。結果は、フィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の二重発現がコントロール群のＥＣコーティンググラフトと比較して、ｅＰＴＦＥグラフトへのＥＣ接着を有意に改善することを証明した（７３．４±２２．４％対２９．６±２４．８％；ｐ値＜０．００４）。
【０３２０】
考察
実施例２９は、合成グラフト上に播種された内皮細胞によるフィブリン−５およびＶＥＧＦの共発現がヒツジモデルにおいて径の小さな合成グラフトの長期開存性を改善することを証明している。これら２種の遺伝子の共発現がラット頸動脈傷害モデルにおける血管傷害後の新生内膜形成を減少させたという証拠もまた提供されている。
【０３２１】
ナイーブ内皮細胞、またはフィブリン−５およびＶＥＧＦを共発現するように形質導入された細胞のいずれかが播種された径の小さな合成グラフト、およびベアグラフトを使用して、合成グラフト上に播種された内皮細胞によるフィブリン−５およびＶＥＧＦの共発現がグラフトの長期開存性を改善するという仮説を試験した。ヒツジ頸動脈モデルを使用し、端側吻合部を使用して長さ１５〜２０ｃｍのグラフトを移植したが、これは成体ヒツジの頸動脈のサイズがヒトにおける大腿動脈のサイズと類似であり、大腿−膝窩動脈バイパス術における手術野に類似する手術野を提供するからである。手術終了時にカテーテル検査を使用して、手術の失敗を除外した。選択的血管造影のための３および６カ月後の時点は、吻合部の新生内膜形成が６カ月後には完了するであろうという前提に基づいて使用した。
【０３２２】
表４に示したように、グラフト開存性は、２種の遺伝子を発現するＥＣで播種されたグラフトを用いた場合は有意に高かった。播種されたグラフトの開存率は、ヒツジ頸動脈において報告された開存率と比較して高度に改善される（Ｏｒｔｅｎｗａｌｌら、（１９８８）Ｓｕｒｇｅｒｙ，１０３：１９９−２０５）。自家ＥＰＣが事前に播種された脱細胞化ブタ回腸動脈の短い（４〜５ｃｍ）のグラフトを使用したヒツジ頸動脈挿入術では、長期（＞１３０日間）開存性が報告された。そのモデルでは、研究者らはグラフトへの細胞接着を改善するために、本明細書に記載したアプローチとは相違するアプローチを使用した。本明細書に記載したように、播種された細胞の接着を改善するためにフィブリン−５の接着能力が使用されているが、Ｋａｕｓｈａｌらは、グラフトをグラフト移植前の４日間にわたり剪断応力に曝露させた。隣接動脈区間由来の循環ＥＰＣもしくはＥＣによるグラフト被覆は、若年動物および短いグラフトにおいて発生することが多い。播種されたグラフトによるグラフト内腔面の７０％被覆が観察されているが、２週間後には播種されたナイーブＥＣの３０％しか見いだされなかった。
【０３２３】
吻合部位での新生内膜形成はグラフトを通る血流量を減少させ、最終的にはグラフト機能不全を生じさせる。血管傷害の結果としての新生内膜形成は、平滑筋細胞増殖および細胞外マトリックス産生に由来する炎症性および血栓性プロセスの結果である。薬物溶出ステントは、平滑筋細胞増殖を効率的に阻害し、冠動脈内の新生内膜形成を防止する。フィブリン−５はＥＣおよびＳＭＣの両方の増殖を阻害したが、ＥＣ増殖の阻害はＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦの添加によって逆転された。フィブリン−５がＳＭＣに及ぼす阻害作用は、ＦＧＦの補給によっては逆転されなかった。さらに、本発明者らは、血管傷害後のフィブリン−５の局所的発現が新生内膜の形成を完全に無効にすることを証明した。フィブリン−５およびＶＥＧＦの共発現は、最小サイズの新生内膜の形成を生じさせた。インビトロ増殖アッセイおよびインビボ実験での頸動脈によって確証された概念は、フィブリン−５およびＶＥＧＦをの組み合わせを使用することによって、ＳＭＣ増殖を選択的に阻害し、同時にＥＣ増殖を刺激できるというものである。レトロウイルスをベースとするベクターによる遺伝子導入は、インビボでの少なくとも数週間にわたる導入遺伝子の発現を保証する。明らかに、これは、傷害関連性の細胞および分子事象を阻害するために必要な期間である。これら２種の遺伝子を共発現する細胞が播種されたグラフト６本中１本での３カ月後の限局性狭小化および６カ月後のほぼ閉塞は、問題の多い動物モデル、または非播種表面の限局性領域に関連する可能性がある。さらにまた、手術用ブルドッグ鉗子の使用などの手術中のグラフトの取扱いおよび播種細胞の機械的除去を行うグラフト操作に関連する可能性もある。３カ月後の狭小化は二重遺伝子発現細胞が播種されたグラフト６本中１本の区間でのみ観察されたという事実は、フィブリン−５およびＶＥＧＦを共発現するＥＣの播種が局所的血栓症および新生内膜形成を防止するという本発明者らの仮説を支持している。
【０３２４】
臨床的に適合する時点内でのグラフト播種の実効可能性に関して、静脈剥離からグラフト移植までの平均時間は２２日間であった。使用したウイルスベクターは、ヒトおよびヒツジ血管細胞における形質導入率を改善するために偽型であった（ステントの論文を参照）。２種のレトロウイルスをベースとするベクターによる細胞の形質導入は、骨髄由来細胞において報告されたように、悪性形質変換に対する細胞性状を増加させる可能性がある（参考文献参照）。この問題に対処するために、これら２種の遺伝子を共発現するＥＣのテロメラーゼ活性について試験した。この活性は極めて低く、同一継代のコントロールナイーブ細胞に匹敵することが見いだされた。２種の相違するレトロウイルスベクター（フィブリン−５およびＶＥＧＦをコードする）によって形質導入された細胞内のウイルスゲノムのコピー数についてもまた試験した。３種の一次ＥＣ系における平均コピー数は、二重形質導入細胞において＜１０コピーであった。形質導入細胞における１０未満のウイルスゲノムコピー数は、低率の悪性細胞形質変換と結び付いていると報告された。
【０３２５】
これらをまとめると、本実施例は、フィブリン−５およびＶＥＧＦを発現するＥＣを用いた径の小さなｅＰＴＦＥグラフトの播種が長期グラフト開存性を改善したことを証明している。このデータに基づく開存率が改善される機序は、フィブリン−５およびＶＥＧＦが血管細胞に及ぼす相乗作用に帰することができる。
【０３２６】
その他の実施形態
本発明の特定の実施形態についての上記の詳細な説明から、様々な心血管状態を治療するための独創的なデバイスおよび方法が記載されていることは明白である。本明細書では特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは例示する目的でのみ例として開示されており、そして添付の特許請求項の範囲に関して限定することは企図されていない。詳細には、本明細書に記載した実施形態に関する知識を用いれば、当業者であれば様々な代用、変更、および変形は日常的作業であること、そして請求項によって規定された本発明の精神および範囲から逸脱せずに行えることは本発明者らによって企図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
本明細書に記載の図面は、本発明を理解するための視覚資料としてのみ提供されている。それらは、何であれ決して本発明の範囲を限定することを意図しておらず、意図すると見なしてはならない。
【図１】本発明の血管グラフトを示した図である。
【図２】本発明のハイブリッド生物学的合成血管グラフトを構築するための戦略のフローチャートである。
【図３】ＶＥＧＦ−ＧＦＰを発現するアデノウイルス（３ａ）およびレトロウイルス（３ｂ）構築物を示した図である。
【図４】ＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰを発現するアデノウイルスベクター（４ａおよび４ｂ）およびレトロウイルスベクター（４ｃおよび４ｄ）を示した図である。
【図５】ＵＰ５０−ＧＦＰ（５ａ）またはＶＥＧＦ−ＧＦＰ（５ｂ）をコードする組換えアデノウイルスベクターによって形質移入されたヒトＥＣが播種されたＰＴＦＥグラフトの顕微鏡写真である。
【図６】ＵＰ５０−ＧＦＰ（６ａ）またはＶＥＧＦ−ＧＦＰ（６ｂ）をコードする組換えレトロウイルスベクターによって形質移入されたヒトＥＣが播種されたＰＴＦＥグラフトの顕微鏡写真である。
【図７】Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入されたＥＣ（７ａ〜ｂ）およびＳＭＣ（７ｃ〜ｄ）の顕微鏡写真である。細胞は、光線顕微鏡（７ａおよび７ｃ）または蛍光顕微鏡（７ｂおよび７ｄ）を用いて観察された。
【図８】ＵＰ５０−ＧＦＰを発現するようにレトロウイルスによって形質移入されたＥＣ（８ａおよび８ｂ）およびＳＭＣ（８ｃおよび８ｄ）の顕微鏡写真である。細胞は、光線顕微鏡（８ａおよび８ｃ）または蛍光顕微鏡（８ｂおよび８ｄ）を用いて観察された。
【図９】ＵＰ５０を発現するようにアデノウイルスによって形質移入されたＥＣ（９ａ）およびＳＭＣ（９ｂ）中でのＵＰ５０  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の写真である。図９ａでは、レーン１はプラスミドＵＰ５０  ＤＮＡからなる陽性コントロールである；レーン２は陰性コントロールの逆転写酵素反応である；レーン３は陰性コントロールのＰＣＲ反応である；レーン４はＡｄ．ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン５はＡｄ．ＵＰ−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；およびレーン６は非形質移入ＥＣである。図９ｂでは、レーン１は陽性コントロールのプラスミドＵＰ５０  ｃＤＮＡである；レーン２は陰性コントロールの逆転写酵素反応である；レーン３はＡｄ．ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン４はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣであり、レーン５は非形質移入ＳＭＣである。
【図１０】レトロウイルスによって形質移入されたＥＣ（１０ａ）およびＳＭＣ（１０ｂ）中でのＵＰ５０  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の写真である。図１０ａでは、レーン１はｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン２はＵＰ５０を発現するようにレトロウイルスによって形質移入されたＥＣであり、レーン３はプラスミドＵＰ５０  ＤＮＡからなる陽性コントロールである。図１０ｂでは、レーン１はマーカーである；レーン２は非形質移入ＳＭＣである；レーン３はｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；および、レーン４はｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである。
【図１１】アデノウイルスによって形質移入されたＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０タンパク質発現のウェスタンブロット分析の写真である。レーン１は非形質移入ＥＣからなるコントロールである；レーン２はＡｄ．ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン３はＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン４はＡｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン５は非形質移入ＳＭＣからなるコントロールである；レーン６はＡｄ．ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン７はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン８はＡｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；およびレーン９はＵＰ５０−ＧＦＰを発現する陽性コントロールの２９３−ＦＬＹＡ安定性形質転換細胞である。
【図１２】レトロウイルスによって形質移入されたＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０タンパク質発現のウェスタンブロット分析の写真である。レーン１は非形質移入ＥＣからなるコントロールである；レーン２はｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン３はｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン４は非形質移入ＳＭＣからなるコントロールである；レーン５はｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン６はｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；およびレーン７はＵＰ５０−ＧＦＰを発現する陽性コントロールの２９３−ＦＬＹＡ安定性形質転換細胞である。
【図１３】Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（１３ｂおよび１３ｄ）またはコントロールのプラスミド（１３ａおよび１３ｃ）を用いて感染させたＥＣ（１３ａおよび１３ｂ）およびＳＭＣ（１３ｃおよび１３ｄ）中でのＵＰ５０表面発現の免疫組織化学的分析の蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】Ａｄ．ＵＰ５０（１４ａ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（１４ｂおよび１４ｃ）によって形質移入されたＥＣの走査型蛍光共焦点顕微鏡写真である。図１４ｂおよび１４ｃは、細胞−細胞接触を用いて、および用いずにＥＣ増殖における蛍光標識ウサギ抗ＵＰ５０抗体を用いたＵＰ５０についての免疫組織化学を示した図である。緑色蛍光はＧＦＰに起因し、赤色はＵＰ５０に対するローダミン標識抗体に各々起因する。
【図１５】Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣによって生成されたＥＣＭ中のＵＰ５０タンパク質についての免疫組織化学的分析の蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】アデノウイルスによって形質移入されたＥＣおよびＳＭＣの共培養によるＶＥＧＦ（１６ａ）およびＵＰ５０（１６ｂ）の発現についてのウェスタンブロット分析を示した図である。レーン１は、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン２は、Ａｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ形質移入ＥＣ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン３は、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン４は、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣ＋Ａｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン５は、陽性コントロールのＵＰ５０を発現する２９３−ＦＬＹＡ安定性形質転換体である。
【図１７】レトロウイルスによって形質移入されたＥＣおよびＳＭＣの共培養によるＶＥＧＦ（１７ａ）およびＵＰ５０（１７ｂ）の発現についてのウェスタンブロット分析を示した図である。図１７ａでは、レーン１は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣ＋ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン２はｒｅｔｒｏＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣ＋ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン３は、ｒｅｔｒｏＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン４は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン５は、ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン６は、ＥＣコントロールである；レーン７は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣ＋ｒｅｔｒｏＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン８は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣ＋ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン９は、ＳＭＣコントロールである；およびレーン１０は、組換えＶＥＧＦ陽性コントロールである。図１７ｂでは、レーン１は、ＳＭＣコントロールである；レーン２は、ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＳＭＣである；レーン３は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣ＋ｒｅｔｒｏＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン４は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＳＭＣ＋ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質導入ＥＣである；レーン５は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣである；レーン６は、ＶＥＧＦコントロールである；およびレーン７は、ＵＰ５０コントロールである。
【図１８】ＵＰ５０−ＧＦＰ、ＶＥＧＦ−ＧＦＰもしくはＧＦＰをコードするアデノウイルスベクターによって形質移入されたＥＣの増殖を示したヒストグラムである。
【図１９】ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入ＥＣ（１９ａ）内およびｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入され、引き続いてＡｄ．ＧＦＰまたはＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ（１９ｂおよび１９ｃ）のいずれかで感染させたＥＣ内でのＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】引き続いてアデノウイルスベクターで感染させたｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰ形質移入ＥＣ内でのＶＥＧＦ（２０ａ）およびＵＰ５０（２０ｂ）タンパク質発現のウェスタンブロット分析の写真である。レーン１は、ＵＰ５０を発現する陽性コントロールの２９３−ＦＬＹＡである；レーン２は、非形質移入ＥＣのコントロールである；レーン３は、３−Ａｄ．ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン４は、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣである；レーン５は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入したＥＣである；レーン６は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入され、Ａｄ．ＧＦＰで感染させたＥＣである；レーン７は、ｒｅｔｒｏＵＰ５０−ＧＦＰによって形質移入され、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰで感染させたＥＣである；およびレーン８は、陽性コントロールの組換えＶＥＧＦである。
【図２１】１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを添加していない（２１ａ、２１ｂ、２１ｅおよび２１ｆ）、もしくは添加した（２１ｃ、２１ｄ、２１ｇおよび２１ｈ）、Ａｄ．ＧＦＰ（２１ａ〜ｄ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（２１ｅ〜ｈ）形質移入ＥＣの三次元インビトロ血管形成の光線顕微鏡（２１ａ、２１ｃ、２１ｅおよび２１ｇ）または蛍光顕微鏡（２１ｂ、２１ｄ、２１ｆおよび２１ｈ）写真である。
【図２２】Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質移入ＥＣとの５０％共培養を行っていない（２２ａ、２２ｂ、２２ｅおよび２２ｆ）、または行った（２２ｃ、２２ｄ、２２ｇおよび２２ｈ）、Ａｄ．ＧＦＰ（２２ａ〜ｄ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（２２ｅ〜ｈ）形質移入ＥＣの三次元インビトロ血管形成の光線顕微鏡（２２ａ、２２ｃ、２２ｅおよび２２ｇ）または蛍光顕微鏡（２２ｂ、２２ｄ、２２ｆおよび２２ｈ）写真である。
【図２３】Ａｄ．ＵＰ５０形質移入（赤ワイン色の棒）、Ａｄ．ＧＦＰ形質移入（青色の棒）または非形質移入（黄色の棒）ＥＣの接着アッセイに由来するヒストグラムである。３回ずつ実施された２種の実験を提示した。
【図２４】ＵＰ５０含有細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へのＥＣの接着アッセイに由来するヒストグラムである。結果は、バックグラウンドの減算後の補正ＯＤ値として提示した。
【図２５】連続剪断応力に曝露させたＵＰ５０を過剰発現するＥＣの接着を示した図である。２４時間にわたる揺動の前（２５ａ、２５ｃおよび２５ｅ）および後（２５ｂ、２５ｄおよび２５ｆ）の、非形質移入（２５ａおよび２５ｂ）、ｒｅｔｒｏＧＦＰ形質移入（２５ｃおよび２５ｄ）およびｒｅｔｒｏＵＰ５０形質移入（２５ｅおよび２５ｆ）ＥＣの無作為に選択した区域を示した。図２５ｇは、揺動後に残留していた細胞のパーセンテージのヒストグラムである。結果は、揺動前に存在した細胞の数に対する揺動後に残留していた細胞数の比率に基づいたパーセンテージとして示した。
【図２６ａ】インビトロの層流条件下での細胞保持を試験するために使用したシステムを示した。図２６ａはシステムの略図であり、２６ｂはフローシステムの写真である。
【図２６ｂ】インビトロの層流条件下での細胞保持を試験するために使用したシステムを示した。図２６ａはシステムの略図であり、２６ｂはフローシステムの写真である。
【図２７】層流システム内での脈動性層流条件下に曝露させたＧＦＰ（２７ａおよび２７ｂ）またはＵＰ５０−ＧＦＰ（２７ｃおよび２７ｄ）を発現するようにレトロウイルスによって形質移入されたＥＣが播種されたｅＰＴＦＥ合成血管グラフトの蛍光顕微鏡写真である。
【図２８】遺伝子操作されたヒトＥＣが播種されたｅＰＴＦＥ合成血管グラフトが移植されている露出させたヒツジ大腿動脈の写真である。
【図２９】ＰＴＦＥグラフト動脈吻合部の手術野の血管造影図ならびに左（２９ａ）および右（２９ｂ）大腿動脈内に移植されたグラフトの開存性を示した図である。
【図３０】ＧＦＰ（３０ａおよび３０ｂ）、ＶＥＧＦ−ＧＦＰ（３０ｃおよび３０ｄ）またはＵＰ５０−ＧＦＰ（３０ｅおよび３０ｆ）を発現するようにレトロウイルスによって形質移入されたＥＣが播種されたインビボ移植グラフトの内面上の細胞保持の蛍光顕微鏡写真である。各アッセイのために２つの代表的な区域を示した。
【図３１】内皮細胞播種装置を示している。図３１ａは、そのコルク栓を備えるｅＰＴＦＥグラフトを示した図である。図３１ｂは、播種装置の写真である。
【図３２】レトロウイルスベクターによる遺伝子導入後のＵＰ５０およびＶＥＧＦ細胞の両方を過剰発現する培養内皮細胞の蛍光顕微鏡写真（ａ）およびウェスタンブロット（ｂ）を示した図である。
【図３３】ＥＣ播種グラフト上のＣＤ−３１の免疫組織化学的染色を示した図である。図３３ａは染色したグラフトの長手方向切片であり、図３３ｂは左右方向切片である。
【図３４】ＥＣが事前に播種された穿刺ｅＰＴＦＥグラフトを示した図である。図３４ａは、穿刺部位でＶＥＧＦおよびＵＰ５０を過剰発現するＥＣが播種されたグラフトを示した図である。図３４ｂは、穿刺部位でＧＦＰを過剰発現するＥＣが播種されたグラフトを示した図である。
【図３５ａ】流動誘導性剪断応力への曝露後のｅＰＴＦＥグラフト上のＥＣ保持の無作為に選択された区域を示した図である。ＥＣは、ＧＦＰおよびＵＰ５０−ＧＦＰを過剰発現するように遺伝子操作されている。
【図３５ｂ】流動誘導性剪断応力への曝露後のｅＰＴＦＥグラフト上のＥＣ保持の無作為に選択された区域を示した図である。ＥＣは、ＧＦＰおよびＵＰ５０−ＧＦＰを過剰発現するように遺伝子操作されている。
【図３６】流動誘導性剪断応力への曝露後のｅＰＴＦＥグラフト上のＥＣ保持の無作為に選択された区域を示した図である。ＥＣは、ＵＰ５０−ＧＦＰおよびＶＥＧＦ−ＧＦＰを過剰発現するように遺伝子操作されている。
【図３７】流動誘導性剪断応力への曝露後のｅＰＴＦＥグラフト上のＥＣ保持の無作為に選択された区域を示した図である。ＥＣは、ＵＰ５０−ＧＦＰおよびＶＥＧＦ−ＧＦＰ（一部には同一細胞によって）およびＶＥＧＦ−ＧＦＰを過剰発現するように遺伝子操作されている。
【図３８】フィブリン−５を過剰発現する、またはフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５を共発現する内皮細胞のｅＰＴＦＥグラフト上での改善された保持を示した図である。内皮細胞（ＥＣ）はｅＰＴＦＥグラフト上に播種し、インビトロ流動装置内での脈動性流動条件に曝露させた。非形質導入、ナイーブＥＣ、ＧＦＰ形質導入ＥＣ、ＶＥＧＦ１６５形質導入ＥＣ、フィブリン−５形質導入ＥＣ、ならびにフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５で二重形質導入されたＥＣをｅＰＴＦＥグラフト上に播種した。結果は、細胞保持率±標準偏差の平均値（％）として提示した。ＶＥＧＦを発現するＥＣの保持は、ＧＦＰを発現する細胞もしくはナイーブ細胞の保持に類似したが、ＶＥＧＦおよびフィブリン−５を発現するＥＣは改善された接着を示した。
【図３９】ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子およびＣＤ３１についての免疫組織化学的染色によるＥＣの同定を示した図である。
【図４０】ＳＭＣ  α−アクチンについての免疫組織化学的染色によるＳＭＣの同定を示した図である。
【図４１ａ】フィブリン−５の存在下での内皮細胞および平滑筋細胞増殖についてのインビトロ試験：（Ａ）内皮細胞はフィブリン−５単独（−ｂＦＧＦ）の存在下で阻害され、そして次に増殖因子を添加した場合に迅速に増殖する；（Ｂ）平滑筋細胞増殖は、内皮細胞と比較して、フィブリン−５および増殖因子の存在下では遅延または阻害される。
【図４１ｂ】フィブリン−５の存在下での内皮細胞および平滑筋細胞増殖についてのインビトロ試験：（Ａ）内皮細胞はフィブリン−５単独（−ｂＦＧＦ）の存在下で阻害され、そして次に増殖因子を添加した場合に迅速に増殖する；（Ｂ）平滑筋細胞増殖は、内皮細胞と比較して、フィブリン−５および増殖因子の存在下では遅延または阻害される。
【図４２】２４週間後に犠死させた、１匹のウサギの治療用量の投与後の生体内分布ＰＣＲ結果である。選択した組織および器官由来のＤＮＡサンプル、および適切なコントロールをＰＣＲによるベクター配列の存在について分析した（Ａ、ＢおよびＣ）。陽性の結果は、単一の１４０ｂｐ  ＰＣＲ産物の存在によって示された。（＊）は、サンプルが５０コピーのベクタープラスミドを用いてスパイクされていたことを示している。Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカーを示している。
【図４３】β−アクチンによるＤＮＡ完全性を示した図である。ベクター配列の存在について分析した組織サンプルを、無傷ウサギβ−アクチン遺伝子を示す１０６ｂｐバンドの存在によってＤＮＡ完全性について同時に試験した。
【図４４】ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）および平滑筋細胞中のＥＲＫ活性化にフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５が及ぼす作用を示した図である。４×１０５個のナイーブＨＳＶＥＣもしくはＨＳＶＳＭＣを６ウエルプレート内の１０％血清中で２４時間にわたり播種した。次に培地は、ＶＥＧＦ１６５を添加していない、もしくは添加したナイーブまたはフィブリン−５を過剰発現するＨＳＶＥＣの１ｍＬの馴化培地（ＣＭ）と９０分間にわたり交換した。以前にＥＲＫリン酸化の活性化を誘導することが証明された外因性ＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍＬ）の３０分間にわたる添加は、本アッセイの陽性コントロールとして機能した。細胞溶解液からの１０μｇの全タンパク質中でのＥＲＫおよびｐＥＲＫタンパク質のウェスタンブロット分析を実施した。少なくとも１回は繰り返して同一結果が得られた代表的実験を示した。
【図４５】ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）中でのｐ３８活性化にＶＥＧＦ１６５が及ぼす時間依存性作用を示した図である。４×１０５個のナイーブＨＳＶＥＣを２４時間にわたり６ウエルプレート内の１０％血清中で播種した。次に培地をナイーブもしくはＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＨＳＶＥＣの１ｍＬの馴化培地（ＣＭ）と３〜３０分間にわたり交換した。細胞溶解液からの１０μｇの全タンパク質中でのｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８およびβ−アクチンタンパク質のウェスタンブロット分析を実施した。少なくとも１回は繰り返して同一結果が得られた代表的実験を示した。
【図４６】ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）中でのｐ３８活性化にフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５が及ぼす作用を示した図である。４×１０５個のナイーブＨＳＶＥＣを６ウエルプレート内の１０％血清中で２４時間にわたり播種した。次に培地は、ＶＥＧＦ１６５を添加していない、もしくは添加した、ナイーブもしくはフィブリン−５を過剰発現するＨＳＶＥＣの１ｍＬの馴化培地（ＣＭ）と３０分間にわたり交換した。細胞溶解液からの１０μｇの全タンパク質中でのｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８およびβ−アクチンタンパク質のウェスタンブロット分析を実施した。少なくとも１回は繰り返して同一結果が得られた代表的実験を示した。
【図４７】ＶＥＧＦがウサギＥＣ増殖に及ぼす作用を示した図である。１×１０４個のヒトおよびウサギナイーブＥＣ（各々、ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ））およびウサギＥＣ（Ｒｂ．ＥＣ））をフィブロネクチンがコーティングされた１２ウエルプレート上に播種した。次に培地は、２０および５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを添加した、もしくは添加していない２％のＦＢＳを含有する培地と７２時間にわたり交換した。細胞は、次にＣｏｕｌｔｅｒ細胞計数器において計数した。本アッセイは２回ずつ実施した。
【図４８】ヒツジ内皮細胞中でのフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の過剰発現を示した図である。ヒツジ内皮細胞は、フィブリン−５をコードするレトロウイルスベクターによって形質導入しその後にレトロウイルスベクターをコードするＶＥＧＦ１６５による形質導入を実施した。形質導入細胞は、４８時間にわたり血清無含有増殖培地を用いてインキュベートし、馴化培地サンプルを収集し、ウェスタンブロットによってフィブリン−５（Ａ）およびＶＥＧＦ１６５（Ｂ）発現について分析した。同一細胞を抗フィブリン−５抗体（Ｃ）および抗ＶＥＧＦ１６５抗体（Ｄ）で染色した。図示したのは同一細胞（Ｃ）のＤＡＰＩ核染色画像上へのフィブリン−５についてのＦＩＴＣ抱合二次抗体を用いた免疫染色のスーパーインポーズ（Ｃ）、およびＤＡＰＩ核染色上へのＶＥＧＦ１６５についてのローダミン抱合化二次抗体を用いた免疫染色のスーパーインポーズ（Ｄ）である。図示したように、８５％を超える細胞が、フィブリン−５を発現し、多数の細胞がＶＥＧＦ１６５を共発現する（倍率：１００倍）。
【図４９ａ】平滑筋細胞による新生内膜形成のインビボモデル−ラット頸動脈モデル：（Ａ）食塩水（コントロール）およびフィブリン−５単独を用いた新生内膜形成：免疫染色は、フィブリン−５は、フィブリン−５を発現するアデノウイルスベクターに曝露させた動脈内での遺伝子導入後に排他的に発現することを示している。増殖細胞の数を検出するためのＫＩ−６７を用いた染色は、増殖がフィブリン−５の導入後には減少するが、食塩水導入後には存在していたことを示している；（Ｂ）インジケーターとして内膜培地比を使用した、平滑筋細胞の新生内膜量のまとめ。
【図４９ｂ】平滑筋細胞による新生内膜形成のインビボモデル−ラット頸動脈モデル：（Ａ）食塩水（コントロール）およびフィブリン−５単独を用いた新生内膜形成：免疫染色は、フィブリン−５は、フィブリン−５を発現するアデノウイルスベクターに曝露させた動脈内での遺伝子導入後に排他的に発現することを示している。増殖細胞の数を検出するためのＫＩ−６７を用いた染色は、増殖がフィブリン−５の導入後には減少するが、食塩水導入後には存在していたことを示している；（Ｂ）インジケーターとして内膜培地比を使用した、平滑筋細胞の新生内膜量のまとめ。
【図５０】内皮細胞は、ｅＰＴＦＥグラフト上に単層として播種されている。ｅＰＴＦＥグラフトには、上述したようにヒツジ伏在静脈内皮細胞を播種した。播種の４８時間後に、グラフトは２．５％グルタルアルデヒドを用いて固定した。グラフト切片を長手方向に切断し、ＧＦＰを発現する細胞について蛍光顕微鏡下で試験し（Ａ）、走査型電子顕微鏡を用いて評価した（Ｂ）。固定したグラフトサンプルは、次にパラフィン包埋した。連続切片に対して、ヘマトキシリン−エオシン染色（矢印は被覆細胞の単層（Ｃ）を示している）、またはＣＤ３１について免疫染色（Ｄ）のいずれかを実施した。
【図５１】ナイーブＥＣならびにフィブリン−５およびＶＥＧＦ１６５の両方を過剰発現するＥＣが播種された、移植されたグラフトの血管造影写真である。選択的血管造影法によって証明されるように、図５１Ａにおけるナイーブグラフトは血餅で充填されており、ベアグラフトは完全に閉塞していることに注目されたい。二重遺伝子発現を備えるグラフトは開存性であり、良好な流動を証明している。５１Ｂにおける表は、開存性データを要約している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２１ｆ】
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【図２１ｇ】
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【図２１ｈ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【図２２ｅ】
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【図２２ｆ】
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【図２２ｇ】
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【図２２ｈ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２７ｄ】
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【図２８】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３０ｃ】
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【図３０ｄ】
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【図３０ｅ】
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【図３０ｆ】
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【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３２】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３５ａ】
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【図３５ｂ】
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【図３６ａ】
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【図３６ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９ａ】
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【図４９ｂ】
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【図５０ａ】
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【図５０ｂ】
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【図５０ｃ】
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【図５０ｄ】
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【図５１】
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【国際調査報告】
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