(57)【要約】本発明は、哺乳動物においてワクチンと相互作用する正常な組織を模倣するための適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞及び組織の構築物又はそれらの等価物を含む、組み込まれた人工免疫システムを構築する方法に関する。この人工免疫システムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでワクチン候補物の有効性を試験するために用いることができ、したがってワクチンの開発を加速すること、並びに薬物及び免疫システムとの化学的な相互作用を試験することに有用である。【選択図】なし
2009529870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工免疫システムであって、
第一のマトリクス及び該マトリクスに接着する複数の細胞を含むワクチン接種部位（複数の該ワクチン接種部位はマルチウェルフォーマットで組織化される）と、
膜、並びに複数のリンパ球及び白血球を含む三次元人工リンパ組織（複数の該三次元人工リンパ組織は第二のマルチウェルフォーマットで組織化される）と、
を含む、人工免疫システム。
【請求項２】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクス上に内皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクス上に内皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクス上に血管内皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項５】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクス上に血管内皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項６】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの両側上に内皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項７】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの両側上に内皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項８】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの両側上に血管内皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項９】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に内皮層を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側に上皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１０】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に内皮層を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側に上皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１１】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に内皮を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側に上皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１２】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に血管内皮を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側に上皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１３】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に内皮を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側に上皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１４】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に血管内皮を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側に上皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１５】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に血管内皮層を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側にリンパ管内皮層を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１６】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞がヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１７】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞がヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１８】
前記複数の細胞が前記第一のマトリクスの片側に血管内皮を、そして該第一のマトリクスのもう一方の側にリンパ管内皮を形成する、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項１９】
前記第一のマトリクスが天然の生体高分子を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項２０】
前記第一のマトリクスが異種移植片細胞外マトリクス（ＥＣＭ）シート、再構成されたコラーゲンマトリクス、及びキトサン／コラーゲン膜の足場から成る群から選択される天然の生体高分子を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項２１】
前記第一のマトリクスが、ナイロンメッシュ上に天然の生体高分子であるウシＩ型コラーゲンを含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項２２】
前記第一のマトリクスが、ポリカーボネートメッシュ上に天然の生体高分子であるウシＩ型コラーゲンを含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項２３】
前記膜が、透析膜、ポリカーボネート膜、及びポリ（エチレンテレフタレート）膜から成る群から選択される、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項２４】
前記複数のリンパ球及び白血球が前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項２５】
前記第二のマトリクスがヒドロゲル、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（エチレングリコールジメタクリレート）ヒドロゲル（ＰＥＧＤＡ又はＰＥＧＤＭＡ）、ポリ（エチレンオキシド）、及びポリ（フマル酸プロピレン−コ−エチレングリコール）（ＰＰＦ−ＰＥＧ）から成る群から選択される合成の細胞外マトリクス物質を含む、請求項２４に記載の人工免疫システム。
【請求項２６】
前記第二のマトリクスが天然のＥＣＭ物質を含む、請求項２４に記載の人工免疫システム。
【請求項２７】
前記第二のマトリクスがコラーゲン、ヒアルロン酸ヒドロゲル、仔ウシ皮ゼラチン、フィブリノゲン、トロンビン、及び脱細胞ＥＣＭから成る群から選択される天然ＥＣＭ物質を含む、請求項２４に記載の人工免疫システム。
【請求項２８】
前記脱細胞ＥＣＭが、腸粘膜下組織及び膀胱粘膜から成る群から選択される、請求項２７に記載の人工免疫システム。
【請求項２９】
前記第二のマトリクスが、合成のリンパ球ＥＣＭ由来ヒドロゲルを含む、請求項２４に記載の人工免疫システム。
【請求項３０】
前記第二のマトリクスが、天然のリンパ球ＥＣＭ由来足場を含む、請求項２４に記載の人工免疫システム。
【請求項３１】
前記第二のマトリクスが、天然のリンパ球ＥＣＭ由来ヒドロゲルを含む、請求項２４に記載の人工免疫システム。
【請求項３２】
前記第一のマトリクスに接着されている前記複数の細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３３】
前記第一のマトリクスに接着されている前記複数の細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３４】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞が線維芽細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３５】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞が肥満細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３６】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞がヒト細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３７】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞がヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３８】
前記ワクチン接種部位における前記複数の細胞が、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、単球、樹状細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球及び線維芽細胞から成る群から選択される細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項３９】
前記複数のリンパ球及び白血球がＴ細胞及びＢ細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４０】
前記複数のリンパ球及び白血球が自己Ｔ細胞及び自己Ｂ細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４１】
前記複数のリンパ球及び白血球が同種Ｔ細胞及び同種Ｂ細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４２】
前記複数のリンパ球及び白血球が樹状細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４３】
前記複数のリンパ球がナイーブＴ細胞及びナイーブＢ細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４４】
前記複数のリンパ球が記憶Ｔ細胞及び記憶Ｂ細胞を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４５】
抗原が前記第一のマトリクスに接着されてもいる、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４６】
抗原が前記第一のマトリクスに埋め込まれてもいる、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４７】
前記第一のマトリクスが抗原をさらに含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４８】
前記三次元人工リンパ組織が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項４９】
前記支持細胞が、間質細胞、上皮細胞、及び内皮細胞から成る群から選択される、請求項４６に記載の人工免疫システム。
【請求項５０】
前記ワクチン接種部位において前記第一のマトリクスに接着する前記細胞が組織足場内に含まれる、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項５１】
前記複数のリンパ球及び白血球が、前記人工リンパ組織において前記膜に接着し、組織足場内に含まれる、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項５２】
請求項１に記載の人工免疫システムのワクチン接種部位を作製する方法であって、
複数のコンセントリックリング（concentric rings）上に細胞外マトリクス（ＥＣＭ）膜を置くこと、
前記マルチウェルプレートの複数のウェルのそれぞれを前記複数のコンセントリックリングのそれぞれに配置すること、及び該複数のウェルを該コンセントリックリングに押し付け、それにより適所に前記ＥＣＭ膜を挟み込むこと（該マルチウェルプレートの複数のウェルは床構造を有さず、該コンセントリックリングの直径は、該マルチウェルプレートの複数のウェルの底部の直径よりもわずかに大きく、さらに該ＥＣＭ膜は該マルチウェルプレートの複数のウェルのそれぞれに対して強く伸ばした床構造を形成する）、並びに
前記ＥＣＭ膜に複数の細胞を充填すること(loading)、
を含む、請求項１に記載の人工免疫システムのワクチン接種部位を作製する方法。
【請求項５３】
前記ワクチン接種部位が、
ＥＣＭ膜と、
前記ＥＣＭ膜の第一の側面に接着する上皮細胞の層と、
前記ＥＣＭ膜の第二の側面に接着する内皮細胞の層と、
を含む、請求項１に記載の人工免疫システム。
【請求項５４】
バイオリアクターであって、
第一のマトリクス及び該マトリクスに接着する複数の細胞を含むワクチン接種部位（複数の該ワクチン接種部位はマルチウェルフォーマットで組織化される）と、
膜、並びに複数のリンパ球及び白血球を含む三次元人工リンパ組織（複数の該三次元人工リンパ組織は第二のマルチウェルフォーマットで組織化される）と、
を含む人工免疫システムを包含する、バイオリアクター。
【請求項５５】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項５４に記載のバイオリアクター。
【請求項５６】
前記三次元人工リンパ組織が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項５４に記載のバイオリアクター。
【請求項５７】
バイオリアクターを製造する方法であって、
２つのマルチウェルプレートを準備すること（第一のマルチウェルプレートの底部は第一のマトリクスから構成され、第二のマルチウェルプレートの底部は膜で構成される）、
血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を前記第一のマルチウェルプレートのウェルに充填し、前記ワクチン接種部位を調製すること、
前記血液単球及び前記非単球樹状細胞前駆体を試験薬で刺激すること及び該刺激された血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を成熟抗原提示細胞に変換させること、
複数のリンパ球を前記第二のマルチウェルプレートに充填し、前記三次元人工リンパ組織を調製すること、並びに
前記ワクチン部位を含む前記第一のマルチウェルプレートを、前記三次元人工リンパ組織を含む前記第二のマルチウェルプレートと整列させること及び１つのプレートの複数のウェルをもう１つのプレートの複数のウェルに挿入させ、複数のバイオリアクターを製造すること、
を含む、バイオリアクターを製造する方法。
【請求項５８】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記第二のマルチウェルプレートの底部にある前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第二のマルチウェルプレートの底部が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
薬剤の免疫原性を試験するのにバイオリアクターを用いる方法であって、
２つのマルチウェルプレートを準備すること（第一のマルチウェルプレートの底部は第一のマトリクスから構成され、第二のマルチウェルプレートの底部は膜から構成され）、
血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を前記第一のマルチウェルプレートに充填し、前記ワクチン接種部位を調製すること、
前記血液単球及び前記非単球樹状細胞前駆体を試験薬で刺激すること及び該刺激された血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を成熟抗原提示細胞に変換させること、
複数のリンパ球を前記第二のマルチウェルプレートに充填し、前記三次元人工リンパ組織を調製すること、
前記ワクチン部位を含む前記第一のマルチウェルプレートを、前記三次元人工リンパ組織を含む前記第二のマルチウェルプレートと整列させること及び１つのプレートの複数のウェルをもう１つのプレートの複数のウェルに挿入させ、複数のバイオリアクターを製造し、それによって該三次元人工リンパ組織において該複数のリンパ球を該成熟抗原提示細胞で刺激すること、並びに
前記複数のリンパ球による応答性を決定した後に、前記成熟抗原提示細胞で刺激すること、
を含む、薬剤の免疫原性を試験するのにバイオリアクターを用いる方法。
【請求項６１】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記第二のマルチウェルプレートの底部にある前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第二のマルチウェルプレートの底部が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
バイオリアクターを製造する方法であって、
２つのマルチウェルプレートを準備すること（第一のマルチウェルプレートの底部は第一のマトリクスから構成され、第二のマルチウェルプレートの底部は膜から構成される）、
試験薬を前記第一のマトリクスに組み入れること、
血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を前記第一のマルチウェルプレートに充填し、前記ワクチン接種部位を調製し、それにより該血液単球及び該非単球樹状細胞前駆体を前記試験薬で刺激すること、
該刺激された血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を成熟抗原提示細胞に変換させること、
複数のリンパ球を前記第二のマルチウェルプレートに充填し、前記三次元人工リンパ組織を調製すること、並びに
前記ワクチン部位を含む前記第一のマルチウェルプレートを、前記三次元人工リンパ組織を含む前記第二のマルチウェルプレートと整列させること及び１つのプレートの複数のウェルをもう１つのプレートの複数のウェルに挿入させ、複数のバイオリアクターを製造すること、
を含む、バイオリアクターを製造する方法。
【請求項６４】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記第二のマルチウェルプレートの底部にある前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第二のマルチウェルプレートの底部が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
薬剤の免疫原性を試験するのにバイオリアクターを用いる方法であって、
２つのマルチウェルプレートを準備すること（第一のマルチウェルプレートの底部は第一のマトリクスから構成され、第二のマルチウェルプレートの底部は膜から構成される）、
試験薬をそれぞれの前記第一のマトリクスに組み入れること、
血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を前記第一のマルチウェルプレートに充填し、前記ワクチン接種部位を調製し、それにより該血液単球及び該非単球樹状細胞前駆体を前記試験薬で刺激すること、
前記刺激された血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を成熟抗原提示細胞に変換させること、
複数のリンパ球を前記第二のマルチウェルプレートに充填し、前記三次元人工リンパ組織を調製すること、
前記ワクチン接種部位を含む前記第一のマルチウェルプレートを、前記三次元人工リンパ組織を含む前記第二のマルチウェルプレートと整列させること及び１つのプレートの複数のウェルをもう１つのプレートの複数のウェルに挿入させ、複数のバイオリアクターを製造し、それによって該三次元人工リンパ組織において該複数のリンパ球を該成熟抗原提示細胞で刺激すること、並びに
前記複数のリンパ球による応答性を決定した後に、前記成熟抗原提示細胞で刺激すること、
を含む、薬剤の免疫原性を試験するのにバイオリアクターを用いる方法。
【請求項６７】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記第二のマルチウェルプレートの底部にある前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第二のマルチウェルプレートの底部が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
足場バイオリアクターであって、
第一のマトリクスと、該マトリクスに接着する複数の細胞とを含むワクチン接種部位（該ワクチン接種部位は組織足場内に含まれる）及び
膜と、複数のリンパ球及び白血球とを含む三次元人工リンパ組織
を含む人工免疫システムを含む、足場バイオリアクター。
【請求項７０】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記三次元人工リンパ組織における前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項６９に記載の足場バイオリアクター。
【請求項７１】
前記三次元人工リンパ組織が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を単離及び不死化するのにバイオリアクターを用いる方法であって、
２つのマルチウェルプレートを準備すること（第一のマルチウェルプレートの底部が第一のマトリクスから構成され、第二のマルチウェルプレートの底部が膜から構成される）、
血液単球及び非単球樹上細胞前駆体を前記第一のマルチウェルプレートに充填し、前記ワクチン接種部位を調製すること、
前記血液単球及び前記非単球樹状細胞前駆体を抗原で刺激すること、及び該刺激された血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を成熟抗原提示細胞に変換させること、
複数のリンパ球を前記第二のマルチウェルプレートに充填し、前記三次元人工リンパ組織を調製すること、
前記ワクチン接種部位を含む前記第一のマルチウェルプレートを、前記三次元人工リンパ組織を含む前記第二のマルチウェルプレートと整列させること、及び１つのプレートの複数のウェルをもう１つのプレートの複数のウェルに挿入させ、複数のバイオリアクターを製造し、それによって該三次元人工リンパ組織において前記複数のリンパ球を前記成熟抗原提示細胞で刺激すること、並びに
前記抗原に特異的な抗体を産生するＢ細胞を単離、クローン化、及び不死化すること、
を含む、ヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を単離及び不死化するのにバイオリアクターを用いる方法。
【請求項７３】
前記リンパ球及び前記白血球が、前記第二のマルチウェルプレートの底部にある前記膜の最上部に位置する第二のマトリクスに接着される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第二のマルチウェルプレートの底部が、前記膜の下に位置する支持細胞をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み込まれた人工的なヒト組織構築システムを構築するための方法、そして詳細には、ワクチン、アジュバント、免疫療法候補物、化粧品、薬物、生物製剤及び他の化学物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために組み込まれたヒト免疫システムの構築に関する。この人工免疫システムは、物質と免疫システムとの相互作用を評価するために有用であり、したがってワクチン、薬物、生物製剤、免疫療法剤、化粧品、及び化学物質の開発を加速し、且つ正確性及び予測可能性を改善するために用いられ得る。人工免疫システムは、ヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を単離、クローン化及び不死化するのにも有用である。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００６年３月１５日に提出した米国出願第１１／３７５，０３３号の一部継続出願である。この出願の全体が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ヒトのワクチンの開発及び生物学的試験は伝統的に小動物モデル（例えば、マウス及びウサギのモデル）、ひいては非ヒト霊長類モデルに依拠してきた。しかし、このような小動物モデルは、高価であって、非ヒト霊長類モデルは高価且つ希少である。
【０００４】
哺乳動物の免疫システムは、環境病原体に対して身体を保護するために２つの一般的な適応機構を用いる。病原体由来分子に遭遇すると、免疫応答は、その病原生物に対する防御を確保するように活性化される。
【０００５】
第一の免疫システム機構は、非特異的（すなわち先天性の）炎症性応答である。先天性の免疫システムは、病原体には存在するが身体自体にはない特定の分子を認識すると考えられる。
【０００６】
第二の免疫システム機構は、特異的又は後天性の（すなわち適応的）免疫応答である。先天性の応答は基本的に各々の傷害又は感染に対して同じである。対照的に、後天性の応答は、対象の病原体に応じて発生する（custom-tailored）。この後天性免疫システムは、抗原と呼ばれる病原体に存在する多くの種々の分子に対する、特異的な免疫グロブリン（抗体）応答を包含する。さらに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の大きいレパートリーを、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ、ヒト白血球抗原、ＨＬＡとしても知られている）クラスＩ及びＩＩのタンパク質と結合した、プロセシング形態の抗原とのこれらのＴ細胞受容体の結合能についてサンプリングする。
【０００７】
免疫システムは、自己のタンパク質と非自己のタンパク質との間の構造的な相違を認識して応答する。免疫システムが非自己として認識するタンパク質は、抗原と呼ばれる。病原体は典型的には、多数の高度に複雑な抗原を発現する。
【０００８】
後天性の免疫は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球（又は単にＢ細胞及びＴ細胞）と呼ばれる特殊な免疫細胞によって媒介される。後天性の免疫は、抗原構造を特異的に記憶し、同じ抗原への反復曝露によって応答が増大し、この特定の病原体に対して誘導された保護レベルが増大する。
【０００９】
Ｂ細胞は、抗体の作用によってそれらの機能を生じて、媒介する。Ｂ細胞依存性免疫応答は、抗体が体液中で検出されるので、「体液性免疫」と呼ばれる。
【００１０】
Ｔ細胞依存性免疫応答は、エフェクターの活性が、エフェクターＴ細胞の局所作用によって直接媒介されるので、「細胞性免疫」と呼ばれる。エフェクターＴ細胞の局所作用は、Ｔ細胞と二次エフェクター細胞、例えば活性化されたマクロファージとの間の相乗的な相互作用によって増幅される。この結果として、病原体が破壊され、疾患の発生が防がれる。
【００１１】
病原体と同様に、先天性の免疫応答をワクチン接種部位で開始すること、並びに二次リンパ組織において長期記憶細胞を発生し得る抗原特異的なＴ細胞及びＢ細胞を活性化することによって、ワクチンは機能する。ワクチン接種部位の細胞、並びにリンパ組織のＴ細胞及びＢ細胞とのワクチンの正確な相互作用は、このワクチンの最終的な成功にとって重要である。
【００１２】
感染性生物体に対するほとんど全てのワクチンは、ワクチン自体として弱毒化又は不活性化された病原体を生成するという古典的なアプローチによって開発され続けてきた。しかし、このアプローチは、我々の免疫機構における近年の飛躍的な理解を活用できていない。それどころか、依然としてこのアプローチは、病原体の変異体を作製すること、及び非ヒト動物モデルにおける有効性についてそれらを試験することから成る経験的なアプローチのままである。
【００１３】
さらに洗練されたワクチンの設計、作製及び試験における進歩は、幾つかの理由のために失速している。第一に、明らかに、実験的なワクチンに曝された健常な人々、特に小児における有害な副作用について社会的な容認がほとんどないために、ヒトで試験できるワクチンはごく少数しかない。癌ワクチン臨床試験を除いて、このせいで、ヒトの臨床試験の現実の世界で可能な革新は極めて限定される。第二に、免疫優勢なＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導に、そしてＢ細胞応答を中和するのに、どのエピトープが最適であるかを予測することは未だに困難である。第三に、小動物の試験と、その後の霊長類での臨床試験は、ワクチン開発の頼みの綱であり、このようなアプローチは、ヒトと非ヒト種との間の本質的な相違、並びに非ヒト霊長類の使用を制限する倫理上及び費用の懸念によって制限される。結果として、臨床に対する基本的な知識の解釈は遅く、また等しく重要な、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト免疫の理解の進展が遅い。
【００１４】
ヒト臨床試験において代わりにｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト組織及び細胞を用いても多くの新規のワクチンを試験することができないことに対処するのに、本発明の人工免疫システム（ＡＩＳ）が用いられ得る。このＡＩＳによって、ヒト免疫のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて迅速なワクチン評価が可能になる。このＡＩＳによって、現在用いられている動物モデルに加えて、ワクチンを試験するためのさらなるモデルが提供される。
【００１５】
免疫システムを調節する試みが行われている。例えば、米国特許第６，８３５，５５０号Ｂ１、米国特許第５，００８，１１６号、Suematsu他（Nat. Biotechnol．，22,1539-1545,（2004））、国際公開第２００４／１０１７７３号及び米国特許公開第２００３／０１０９０４２号を参照されたい。それにもかかわらず、これらの刊行物では、ワクチン部位（ＶＳ）、リンパ組織等価物（lymphoid tissue equivalent）（ＬＴＥ）を含む人工免疫システム、及び物質と免疫システムとの相互作用を評価するためのＡＩＳの使用については記載も示唆もされていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでワクチン、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品及び他の化学物質を試験するための、機能的に等価なヒト組織の組み込まれたシステムを提供する。本発明の一態様は、形態的に等価な構築物を製造するのではなく設計する青写真を用いて、機能的に等価な組織を構築するための方法に関する。ヒト免疫システムに対する機能的な等価性は、モジュールの免疫バイオリアクターシステムに収容された、培養組織構築物（engineered tissue constructs）（ＥＴＣ）を構築することによって達成される。
【００１７】
本発明の別の態様は、人工免疫システム（ＡＩＳ）を構築する方法に関する。この方法は、（１）ヒト免疫システムについての基礎を形成する機能的に等価な免疫学的な培養組織（ワクチン接種部位（ＶＳ）、リンパ組織等価物（ＬＴＥ））を設計して青写真を描くこと、（２）培養組織と免疫学的構築物との間に伝達経路を提供すること、（３）モジュールの免疫バイオリアクターに、培養組織及び免疫学的構築物を組み込んで、例えば迅速なワクチン評価に用いることができる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＩＳの基礎を形成することを包含する。
【００１８】
人工免疫システムの構築のためのアプローチは、樹状細胞（ＤＣ）に特に焦点を当てて、再生可能な細胞供給源が密集した、培養免疫学的組織の構築を包含する。直接的な自己集合プロセスを介した細胞と、生体分子と、足場との間の空間的な並置及び一時的な関係を最適化する能力は、既存の二次元（２Ｄ）ペトリ皿細胞培養物よりもはるかにｉｎ  ｖｉｖｏの状況に非常に類似した再生可能な三次元（３Ｄ）の異種の生物学的に生存可能な構築物にある。
【００１９】
本発明はさらに、例えば（１）種々の感染性疾患及び病原体を排除するために被験体において免疫システムを調節する能力を評価すること、（２）ワクチン又は免疫療法処方物の迅速な比較、（３）さらなる開発に焦点を当てるために律速段階（rate limiting steps）を特定するためのワクチン又は免疫療法作用の合理的な解析、そして（４）さらに迅速且つ長期にわたる防御を促進する、より良好なワクチンを作製するための最適な処方物の体系的な測定のためにＡＩＳを用いる方法に関する。このような培養組織構築物の等価な免疫システムの予測的価値は、現在のヒト免疫のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルよりも優れている。
【００２０】
本発明は、モノクローナル抗体産生Ｂ細胞を単離、クローン化及び不死化するのにＡＩＳを用いる方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の主な目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ワクチン、免疫療法剤、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品及び他の化学物質を試験するために、組み込まれたヒト組織、特に組み込まれたヒト免疫システムを提供することである。本発明の一態様は、ヒトにおいてワクチンと相互作用する正常な組織を模倣するのに、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞構築物及び組織構築物又はそれらの等価物を用いることを包含する、組み込まれたヒト免疫システムモデルを構築する方法に関する。ヒト組織のこのような組み込まれたプラットフォームによって、ワクチン開発戦略が加速し、免疫システムと相互作用する薬物の試験が可能になる。さらに、動物試験の減少を可能にし、動物研究及びヒトの臨床試験の費用の一部で、候補ワクチンを再培養して再試験することが可能になる。
【００２２】
組織培養（Tissue engineering）には、細胞及び組織と特異的に相互作用し得る合成若しくは天然の物質又はデバイスの開発が包含される。この構築物は、これらの物質と生きている細胞とを組合せて機能的な組織等価物を生じる。組織培養は、多数の種々の分野、例えば、生体材料工学、薬物送達、組換えＤＮＡ技法、生分解性ポリマー、バイオリアクター、幹細胞単離、細胞カプセル化及び固定、並びに細胞の２Ｄ及び３Ｄの足場の生成に関与する。多孔性の生分解性生体材料足場が、組織培養構築物を形成するための細胞の３Ｄの増殖に必要である。足場で多孔性を得るための、線維結合、溶媒流延／粒子浸出（particulate leaching）、気体発泡／粒子浸出及び液相間分離を含む、幾つかの技法が存在する。これらは大きい内部接続された細孔を生じて、細胞の播種及び遊走を促進する。本明細書において用いる場合、「組織培養構築物（tissue-engineered construct）」又は「培養組織構築物（engineered tissue construct）」（「ＥＴＣ」）という用語は、構築物に対して構造的な完全性を与える天然又は合成の足場とともに、天然由来の又は合成的に増殖された組織又は細胞の任意の組合せを包含する。
【００２３】
３Ｄ生物学は、適切な機能の免疫学的ＥＴＣを誘導するのに重要であることが知られている（例えば、Edelman & Keefer, Exp. Neurol. 192:1-6（2005）を参照されたい）。細胞の過程を研究するための主なアプローチは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞を培養することである。歴史的には、これは、プラスチック又はガラスの支持体上で細胞をプレート培養することを包含している。固体又はフィルターの支持体上で増殖された細胞は、２次元（２Ｄ）培養物と呼ばれる。多孔性の支持体上のこのような２Ｄ培養物は、生物学の多くの局面を研究するために極めて有用であった。しかし、かなりの多くのｉｎ  ｖｉｖｏ様条件が現在、３Ｄ培養物で実現できる。例えば、多くの上皮細胞、初代培養物及び樹立された株の両方ともが、３ＤのＥＣＭにおいて増殖された場合複雑な上皮構造を形成する。
【００２４】
近年では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリンパ節モデルでは、３Ｄの腸組織マトリクスはＡＰＣに向かうＴ細胞遊走を容易にするだけでなく、細胞間の相互作用に対する運動性も支持するということが示されている。３Ｄのコラーゲンマトリクス環境は、その空間的な構築のおかげで、リンパ球のクローリング（crawling）の牽引となり、リンパ節皮質の幾つかの構造的な特徴を模倣する。これによってｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫システムを含む構築物中の３Ｄ環境の重要性についての実験的正当性が与えられる。
【００２５】
２Ｄ微小環境と３Ｄ微小環境との間の相違としては、
（１）２Ｄ培養物においては、細胞は、人工支持体から天然ではない異方性の外部刺激を受けるが、３Ｄ培養物では、細胞は全ての次元のＥＣＭ上で遊走できること、
（２）２Ｄ培養物においては、支持体（例えば、プラスチック、ガラス）は、天然に存在するＥＣＭよりもはるかに剛直であること、
（３）３Ｄ培養で増殖した細胞は、アポトーシスに対してより耐性であること、及び
（４）細胞によって分泌されたタンパク質は、ＥＣＭ周囲の３Ｄ培養物とより良好に相互作用し、且つそれによって組織化され、細胞の挙動に影響し得ること、
が挙げられる。
【００２６】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏの人工免疫システム（ＡＩＳ）の設計は、
１．基本的で、機能的な免疫学的組織：
ａ．皮膚及び／又は粘膜の等価物（ワクチン接種部位）、
ｂ．リンパ組織等価物（ＬＴＥ（リンパ節））、及び
ｃ．他の２つの組織を接続するための血管の網目状構造等価物、
２．再生可能且つ反復可能な試験のための細胞供給源、並びに
３．免疫学的組織を収容し且つ組み込み、そしてワクチンの有効性を迅速に評価及び試験するためのバイオリアクター、
を含む。
【００２７】
本発明のＡＩＳはさらに、
（ａ）血中単球及び非単球樹状細胞（ＤＣ）前駆体の輸送を容易にして、人工的な皮膚３Ｄ組織培養構築物内の成熟抗原提示樹状細胞への自然状態での変換を支持するｉｎ  ｖｉｔｒｏの皮膚及び／又は粘膜等価足場（ワクチン接種部位、ＶＳ）と、
（ｂ）成熟ＤＣ遊走のためのワクチン接種部位からリンパ組織等価物（ＬＴＥ）への管様経路、及びワクチン接種部位（ＶＳ）への単球遊走のための血管様経路と、
（ｃ）リンパ節の形状を模倣し、且つ適切なリンパ節の細胞型を含有する構造を有する組織培養足場におけるリンパ組織等価物と、
（ｄ）内因性の組織と同等の特性を示す機能的に等価な組織構築物である上記の構築物と、
（ｅ）バイオリアクターシステムにおけるこれらの免疫学的組織構築物の組み込みと、
をさらに含む。
【００２８】
４．リンパ節の形状を模倣し、且つ適切なリンパ節細胞型、サイトカイン及びケモカインを含有する構造を有する３Ｄ足場におけるリンパ節様構造（ＬＴＥ）の設計及び構築、
５．リンパ球と、二次リンパ組織におけるリンパ球によって予測される生化学的刺激（例えば、接着モチーフ及びケモカイン勾配）とを含む、リンパ節の「開かれた（open）」細網の網目状構造を模倣する物理的構造を提供する３Ｄ構造を達成するための、ＬＴＥの設計におけるリンパ節のＴゾーンのモデルを介する免疫応答の開始を研究するために調節可能な微小環境を作製するアプローチの促進、並びに合成及び天然の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）物質の使用、
６．ＬＴＥにおいて、Ｂ細胞抗体産生のために、ヘルパーＴ細胞のリンパ節様機能を提供すること（例えば、ＬＴＥ内の別個のＴ細胞及びＢ細胞の領域）が、デジタル印刷の複合作用（別個のゾーン内のＴ細胞及びＢ細胞の集合化に関する）によって、及び制御放出技術（例えば、それぞれ、Ｔ細胞及びＢ細胞の領域を維持するためにＴ細胞及びＢ細胞の誘引物質を放出するマイクロスフェアを用いる）によって設計され得ること、
７．ＬＴＥ、ＢＬＣ（Ｂリンパ球化学誘引物質、ＭＶ１０ｋＤａ）、ＭＩＰ−３β（マクロファージ炎症性タンパク質−３β、ＣＣＬ１９）及びＳＬＣ（二次リンパ組織ケモカイン）、ＬＴＥマトリクスでの制御放出のためのケモカインマイクロスフェアの自己組織化を補助することであって、さらに、マイクロスフェアは、ＬＴＥ足場にＴ細胞及びＢ細胞で同時に印刷されてもよい（代替的な実施形態では、マイクロスフェアは、「リンカーンログ」に酷似した十字パターンで重合化の間にヒドロゲルマトリクスの「支柱（struts）」内（例えば、ポリカプロラクトンを用いて）に直接カプセル化され得る）（さらに別の実施形態では、間質細胞が足場内へのＴ細胞局在化を誘導すると仮定すれば、ＦＲＣ移植Ｔ細胞領域が用いられ得る）、
８．複数の免疫学的ＥＴＣを維持し、且つヒト免疫システムを模倣するのに用いられ得る、培養された、細胞の微小流体の環境バイオリアクターの使用、
９．幾つかの実施形態において、栄養富化液が免疫学的細胞を「給餌する（feed）」ために送り出される内部チャネルを備える小型の３Ｄハウジングの使用。これらのチャネルの壁は、内皮細胞が接着し、人工内皮を作製するように改変することができるか、又は細胞の挙動を変えない生物学的に適合する物質から製造される。栄養液は、種々の細胞が（初めにシリンジによって）注入される前にこのシステムをプライムする（prime）。いくつかの実施形態において、次いで完全なＡＩＳは、栄養／酸素溶液について血流をシミュレーションするポンプに機能的に接続することができる。或る実施形態では、脈動ポンプ機構を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでの状況をさらに良好に模倣する。小型サイズで透明な構造の実施形態で、顕微鏡下でｉｎ  ｓｉｔｕにおける成分の検査が可能になる。
【００２９】
ＬＴＥの別の実施形態では、隣接するＴ細胞及びＢ細胞のゾーンを作製し、これによってｉｎ  ｖｉｖｏでのリンパ節におけるＢゾーン及びＴゾーンの自然な分離を模倣する。この実施形態では、ＬＴＥのＴゾーン及びＢゾーンは、マイクロキャリアを用いて作製することができる。マイクロキャリア上での細胞の培養に関して、現在多くのことが知られている。これらは典型的には、直径が約１００μｍ〜約５０００μｍで、表面が粗いか多孔性の、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の成分でコーティングされることが多い粒子であり、その上には種々のアンカー依存性細胞が成長及び増殖し得る。このモデルシステムは箱の中の粒子に類似している。マイクロキャリアに好適なマトリクス物質としては、リンパ組織粒子ＥＣＭ物質、プロタサン、コラーゲン、プロタサン／コラーゲン混合物、ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド））、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３０】
このようなＬＴＥを作製するための一般的アプローチは、
１．Ｔ細胞及びＢ細胞の接着のための適切な接着リガンド、例えばケモカインをマイクロキャリアに充填すること（このマイクロキャリアは、天然であっても合成であっても、高密度であっても多孔性であっても、そして所望の充填密度次第で種々のサイズであってもよい）、
２．マイクロキャリア上でＴ細胞及びＢ細胞を培養すること（Ｔ細胞及びＢ細胞は、一緒に培養されてもよく（図１Ａ）、又はそれぞれのマイクロキャリア上で別々に培養されてもよい（図１Ｂ、図１Ｃ））、
３．Ｔ細胞及びＢ細胞の集合化したマイクロキャリアを多孔性容器中で一緒に接触させること（「テニスボールのかご（tennis ball basket）」に類似）、そして
４．このマイクロキャリアを、充填密度によって細胞浸透するように「知的に（intelligently）」充填させること、
を包含する。
【００３１】
哺乳動物におけるワクチンに対する免疫応答の発生には連続的な工程が存在する。第一にワクチンは、細胞を活性化するためにワクチン接種の皮膚、腸又は粘膜部位で免疫細胞に作用する。第二に、ワクチンでの免疫後、樹状細胞（ＤＣ）は、この部位から、リンパハイウェイを介して流入領域リンパ節へと遊走する。第三に、流入領域リンパ節における樹状細胞（又は他の二次リンパ組織）は、Ｔ細胞及びＢ細胞と相互作用して、さらなる免疫応答を活性化し、複合エフェクター機構によって病原体を排出し、そして抗原の長期記憶を有する記憶細胞に変換することができる抗原特異的なリンパ球を活性化する。
【００３２】
この３工程プロセスは、本発明のＡＩＳにおいて機能的に模倣される。第一に、抗原／病原体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのワクチン接種部位（ＶＳ、例えば皮膚等価物又は粘膜組織等価物）で免疫細胞に作用し、抗原提示細胞を活性化して、成熟プロセスを開始する。第二に、サイトカイン、ケモカイン及び化学物質がワクチン接種部位で生成されるので、樹状細胞は、この部位から血管内皮を介してリンパ組織等価物（ＬＴＥ）へと遊走して、それらの成熟プロセスを完了させる。第三にＬＴＥ中の樹状細胞は、Ｔ細胞及びＢ細胞と相互作用して、さらなる免疫応答を活性化し、複合エフェクター機構によって病原体を排出し、そして抗原の長期記憶を有する記憶細胞に変換することができる抗原特異的なリンパ球を活性化する。
【００３３】
このＡＩＳは、ワクチン又は免疫療法作用における基本的な工程に対応する免疫学的組織構築物を含む。これらの工程を機能的に再現するために、ＡＩＳは、以下の組織培養構築物を含む：
血液単球及び非単球性樹状細胞前駆体の輸送を促進し、それらの人工ＶＳ構築物内の成熟抗原提示樹状細胞への自然状態の変換を支持する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＶＳ足場と、
樹状細胞（ＤＣ）遊走のための、ワクチン接種部位（ＶＳ）からリンパ組織等価物（ＬＴＥ）への経路と、
リンパ節の機能性を模倣し、適切なリンパ節の細胞型を含有する構造を有する足場におけるリンパ組織等価物（ＬＴＥ）。
【００３４】
これらの機能的に等価な組織構築物は、内因性の組織と同様の特性を示す。これらの機能的に等価な組織構築物は、モジュールのバイオリアクターに組み込まれる。ＡＩＳは、バイオリアクターシステム内で適切なレパートリーのＴ細胞及びＢ細胞を提供するｅｘ  ｖｉｖｏ免疫システムにおいて、ハイスループットなワクチン及び免疫調節物質のスクリーニングを行うように設計される。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのリンパ組織等価物（ＬＴＥ）
ワクチンの最終的な放出（output）はリンパ組織で生じ、ここで抗原特異的なＴ細胞及びＢ細胞は、活性化されて、部分的にｉｎ  ｖｉｔｒｏでは検出することが困難であることが分かっている記憶細胞に変換される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで天然の免疫応答を模倣するために、本発明は、ワクチン接種部位（ＶＳ）と接続することができるリンパ組織等価物（ＬＴＥ）、本質的には人工リンパ節を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ワクチン由来抗原は、リンパ管に沿ったリンパ節細胞への拡散によって、又は抗原を内在している成熟ＤＣの流入領域リンパ節への遊走によって、リンパ節に輸送される。リンパ節では、ＤＣは抗原特異的Ｔ細胞を活性化し、ヘルパーＴ細胞と組合されて、抗原特異的Ｂ細胞を活性化し、免疫応答を誘発するのを助ける。
【００３５】
Ｔ細胞及びＢ細胞の応答の強度及び質は、送達される抗原の量に、並びにワクチン由来の抗原を担持するＤＣ（ＡＰＣ）のサブタイプ及び成熟状態に依存する。鍵となる細胞（樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞）の間の２方向性及び３方向性の相互作用は、リンパ節の空間的に分離された領域において続いて順を追って生じる。このプロセスをシミュレーションするために、人工的なリンパ組織又はリンパ組織等価物は、組織培養、材料科学及び生物学的研究の組合せを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリンパ節様の特徴及び空間的組織化で構築されてもよい。例えば、免疫細胞はケモカインの勾配に対して高度に反応性であり、したがって、これらのシグナル伝達分子の組織化された勾配を包含する足場の設計によって、合成のリンパ節組織が、天然の組織と同様の様式で自己組織化される。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織化された組織中での形成を助けるさらなる分子を発見するために天然組織の形成を並行して研究してもよい。このような複雑な合成構造はまた、例えばデジタル印刷バイオアセンブリツール（ＢＡＴ）を用いて製造されてもよい。
【００３６】
本発明の或る実施形態では、一旦ＬＴＥが集合化されれば、これを、種々の所望の生体分子（例えば、サイトカイン、タンパク質、抗体）を生合成する「バイオファクトリー（biofactory）」として使用することも可能になる。例えば、抗原がＢ細胞に提示される場合、それらはＬＴＥにおいて抗体を作製し得る。潜在的に、この作製された抗体は、Ｂ細胞のレパートリー、及びどのようにしてペプチドがこのＢ細胞に提示されるかに依存して、モノクローナル抗体でもあり得る。
【００３７】
代替的には、ヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞は、単離、クローン化及び不死化することができる。本発明の或る実施形態では、ＬＴＥは同種Ｔ細胞を含む。別の実施の形態では、ＬＴＥは自己Ｔ細胞を含む。
【００３８】
この人工免疫システムは、天然の免疫システムとは機構的に異なるが、機能性に関しては同様である、一般的なバイオリアクター設計を有し得る。
【００３９】
或る実施形態では、免疫学的ＥＴＣが、小型の培養細胞環境バイオリアクターに組み込まれる。この設計は、２つの機能的に等価な膜を連続的な順序で使用し、ＬＴＥとして機能するために、機能的なＶＳを作製し、粒子上又は周囲のＴ細胞及びＢ細胞を局所的に集積させる。
【００４０】
重要な設計の考察は、生物学的機能を模倣すること、ゾーン間の培地量を最小にして細胞輸送の効率を増大させること、そして抗原性応答を評価する手段を提供することである。培地量を組み込んで最小にすることによって、免疫学的ＥＴＣ内及び間の細胞遊走についての可能性は劇的に高まり、増大された免疫学的応答が提供され得る。
【００４１】
しかし、組み込まれたバイオリアクターにＶＳ及びＬＴＥを有する必要はない。代替的な実施形態では、ＶＳ由来の成熟ＤＣは、ＬＴＥに物理的に位置されてもよい。これらの成熟ＤＣは、Ｔ細胞ゾーン内のＴ細胞、及びＬＴＥのＢ細胞ゾーン内のＢ細胞を活性化することができる。したがって、ＶＳ及びＬＴＥの両方、並びにＶＳ由来の成熟ＤＣとＬＴＥにおけるＴ細胞との間の相互作用を非組み込み様式で試験して特徴付けることが可能になる。
【００４２】
ＡＩＳの働きにおける一般的で基本的なカスケード事象は以下の通りである：
単球及び他の血液由来細胞（ＰＢＭＣ）が血管ハイウェイへ注入され、
ケモカイン（ＶＳに対して天然であるか又は意図的に加えられるか）が単球を引き付け、ＶＳに入り、
単球が未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）に分化し、
ｉＤＣがＶＳにおける「ワクチン接種」（抗原の導入を含む）に応じて成熟し、
ケモカインは成熟ＤＣを引き付け、
ケモカイン（ＬＴＥに対して天然であるか又は意図的に加えられるか）が、成熟ＤＣをＬＴＥに引き付け、
ＬＴＥ中の成熟ＤＣが、Ｔ細胞及びＢ細胞を活性化する。
【００４３】
単球及び樹状細胞は自然状態で相互作用して、血管内皮を通って遊走する。他の実施形態ではケモカインは、磁気マイクロビーズで可能なように、細胞の遊走を方向付けるのに用いられ得る。小型化された電磁石と一緒になった磁気ビーズは、バイオリアクター中の細胞の操作に便利な機構である。例えば、適切な表面マーカー（受容体、エピトープ）を有する細胞は、ビーズを用いて選択されてもよいし、そして選択された細胞は、或る局所的な環境から別の環境へ輸送されてもよく、これによって細胞が、例えば、所望の表面、環境、又は他の細胞と接触させられる（実施例を参照されたい）。
バイオリアクター
組み込まれたＡＩＳバイオリアクターを使用する本発明の実施形態では、免疫学的細胞を「給餌する」ために、３Ｄハウジング中の内部チャネルによって栄養富化液が送り出される。これらのチャネルの壁は、内皮細胞が接着し、内皮を形成するように改変できるか、又は細胞挙動を変えない生物学的に適合する物質から製造される。
【００４４】
或る実施形態では、超短パルスレーザーによるレーザー微小加工を用いて、液体がよく流れるようにチャネルを設計して製造してもよい。他の実施形態では、マイクロスタンピング、積層又は標準的なＣＮＣ及び他の粉砕プロセスを用いてもよい。
【００４５】
このような構築物内の細胞は培養培地（栄養物）に曝される。
【００４６】
次いで完全な人工免疫システムを、栄養／酸素溶液について血流をシミュレーションするポンプに接続することができる。或る実施形態では、ポンプ機構を脈動させて、血管をさらによく模倣してもよい。次いで、温度、湿度並びに酸素及び二酸化炭素の濃度を調節して自然状態のｉｎ  ｖｉｖｏ環境を最もよくシミュレーションするインキュベーターに、集合体全体を挿入してもよい。
【００４７】
或る実施形態では、このバイオリアクターシステムは、全体の大きさが数インチ程度であるように構築することができ、これによって潜在的にｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫システムバイオリアクター装置は、他の固定された及び携行可能な分析装置に構築される。小型化したサイズで且つ光学的に透明な実施形態によって、顕微鏡を用いてｉｎ  ｓｉｔｕにおける成分の可視化が可能になる。
【００４８】
ＬＴＥ構築物の設計及びサイズには、物理的及び実用的制限がある。構築物の物理的容量は、二次免疫応答及び一次免疫応答のそれぞれに対する所望の細胞集団の概算に基づく。その数によって、例えば具体的に構築物内の細胞の充填密度も推測される（例えば６８％）。
【００４９】
参照用：
スケールボリューム
１×１×１ｍｍ＝０．００１ｃｍ３又は１μＬ
１０００万個の細胞（約６μｍの細胞径）＝０．００２１ｃｍ３又は２μＬ
直径×高さ＝シリンダー容量
２．３ｍｍ×１ｍｍ＝０．００４ｃｍ３又は４μＬ
５．７ｍｍ×３ｍｍ＝０．０７７ｃｍ３又は８４μＬ
６．６ｍｍ×３ｍｍ＝０．１０３ｃｍ３又は１０３μＬ
図２Ａ及び図２Ｂは、ＡＩＳの設計及び機能（例えば、細胞培養時間並びにどれだけのＴ細胞及びＢ細胞を血液単位から得て、ＡＩＳに投入することができるか（この例では細胞源としてＰＢＭＣを用いる））に対する他の実用的な考察（practical considerations）を示す。本発明の或る実施形態では、Ｔ細胞集団とＢ細胞集団との比は、１つのＢ細胞当たりＴ細胞はおよそ１．６個であり、これはリンパ節で見られるものを模倣している。本発明の或る実施形態では、一次免疫応答を調べるために、このシステムは、およそ１０００万個のＴ細胞及び６３０万個のＢ細胞を含む。
【００５０】
本発明のＡＩＳの他の実施形態では自動化及びハイスループット試験が容易である。本発明の実施形態は、固定ＡＩＳモデル及び下記の組み込まれたモデルを含む。他の実施形態では、コラーゲン及び他のＥＣＭ膜をウェルベースのバイオリアクターに収容することができる。提示された例における様々な特徴としては、以下を含む：
単純性（例えば９６ウェルフォーマットに組み入れることができる）、
安価、
幾つかのＬＴＥモデルに対する適合性、
例えば膜及びクッションＶＳモデルに対する適合性、
ＶＳ及びＬＴＥ調製配列を別々に維持することができ、構築物を後で組み入れることができること、
低いデッドボリューム、
様々なＶＳモデルを用いる単一及び逆ＤＣ経内皮遊走スキームに対する適合性、
培地の交換を減少させ又は変え、微小環境において重要なサイトカインを維持するための微小透析濾過の組み入れ。
【００５１】
マルチウェルベースのシステムを用いる実施形態に関する多くの例では９６ウェルマイクロアレイプレートが用いられるが、任意のマルチウェルフォーマットを用いることができる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆａｓｔ（登録商標）２４及び２８ウェルプレートを用いることができ、Abgene製の８及び１２サーモストリップを用いることができ、Ｎｕｎｃ（登録商標）１６ウェルスライドを用いることができ、スタンダード３８４ウェル及び１５３６ウェルマイクロアレイプレートを用いることができる。マイクロアレイプレートには、組織又は細胞培養を対象とするプレート、すなわち組織培養プレートが含まれる。本発明の方法は、マルチウェルフォーマットのサイズ又はマルチウェルフォーマットの製造業者のいずれによっても限定されることを意図しない。
【００５２】
ＡＩＳを用いて、ワクチン及び他の物質に対する免疫応答を迅速に試験して評価することが可能である。この組織を組織化して、ワクチン、抗原、又は対象の他の化学物質を受けるのに適切に活性化させるのに、幾つかの概念がある。一実施形態では、組み込まれた培養組織構築物は、走化性及び培養的放出（engineered-release）微小粒子を組み入れ、組織及び細胞の集合及びプログラミングのための様々な生体分子の時間、空間及び用量のパラメーターを制御する。別の実施形態では、間質及び実質が、細胞間、細胞−マトリクス、細胞自体が作製する構造的且つ内因性の増殖因子刺激によって得られた連絡を介する天然様組織へと自己集合化することを可能にする環境が構築物によって得られる。外因性の増殖因子は、所定の表現型を誘導する必要はない。
【００５３】
特に示されていない限り、本発明の実施には、免疫学、組織学、微生物学、細胞及び組織培養及び分子生物学の当業者に慣用の方法が利用される。このような技法は、文献内で完全に説明される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は全体が参照により援用される。
［実施例］
【実施例１】
【００５４】
デザイナー（designer）足場構造
デザイナー足場構造を、細胞の生存度、細胞の運動性及びバイオリアクターに関する栄養流を試験するように構築し、コラーゲンゲルに対する構築物安定性の関数として細胞の運動性を研究している。図３は、ナイロンメッシュ上のプロタサン／コラーゲンマトリクスで増殖するＨＵＶＥＣ細胞を示す。ナイロン膜の高倍率のＳＥＭ及び分散されたプロタサン／コラーゲンマトリクス物質は上の画像に示される。ＨＵＶＥＣ細胞の第一の層の播種は、反転した膜上で行われ（左側、側面１）、次いで２４時間後に、正立位置にして（右側、側面２）、ここに第二の層を適用した。ＨＵＶＥＣ細胞の各々の面の位相差画像は、下の真ん中２つの画像に示され、ここでは左が第一の層であって、右が適用された第二の層である。
【実施例２】
【００５５】
デジタル印刷技術
予備的なハードウェア及びソフトウェアのＥＴＣ異種デジタル印刷の原型が開発されている。図４は、デジタル印刷されたリンパ節のモックアップ及び血管の細網画像を示す。このモックアップのリンパ節は、６つの生体適合性ヒドロゲル層、４つの種々のパターン及び３つの物質を含む。脈管画像は、約１００μｍ〜約３０００μｍの範囲の特徴的なサイズを有する生分解性構築物質の複数の層で構築されている。この物体は各々３つの分注ノズルで製造された。
【実施例３】
【００５６】
ＬＴＥ構造
ＬＴＥは、ナイーブＴ細胞及びナイーブＢ細胞の活性化の重要な場所として機能する。本発明は、ＬＴＥの設計において、リンパ節細胞外マトリクスのモデルの製造及び種々の微小環境刺激（例えば、ケモカイン、サイトカイン、細胞（例えば、線維芽細胞性細網細胞））を提供するための複数のアプローチを包含する。ＬＴＥの特定の設計の検討材料としては、ＬＴＥ内でのＴ細胞活性化及びＤＣ生存／機能、並びにＴゾーン及びＢゾーンの両方を含むＬＴＥ構造の製造が挙げられる。これらは幾つかの相補的な戦略を用いて組み立てることができる。
【００５７】
ａ．分離されたＴ細胞及びＢ細胞領域の直接の物理的な集合化。
【００５８】
ｂ．マトリクス内の別個の位置内で培養された局所ケモカイン供給源の作製を介する、Ｔ細胞及びＢ細胞領域の自己組織化及び維持。
【００５９】
以下の説明は、本発明のこれらの特徴の各々について実験的な論理及びアプローチを詳細に示す。
【実施例４】
【００６０】
リンパの細胞外マトリクスから製造されたマイクロビーズ
マイクロビーズは、ピッツバーグ大学のStephen Badylak博士によって提供されたプロトコルを用いて調製されたブタのリンパ細胞外マトリクスから製造された。
【００６１】
２ｍｇ／ｍｌのプロタサンに約１０ｍｇ／ｍｌのリンパ節（ＬＮ）ＥＣＭの微小断片を含有する懸濁物（ｐＨ３．５）を液体窒素の表面上に、層流中で、１滴ずつ噴霧して、約１．５ｍｍのサイズの液滴を作製した。次いで、凍結されたビーズを一晩凍結乾燥させて、その後１時間、１０％トリポリリン酸塩（ＴＰＰ）（ｐＨ６．０）中でインキュベートし、次いで１００μｍ容の細胞ストレイナーにおいて脱イオン水で３回洗浄し、次いで再度凍結乾燥した（図５）。
【実施例５】
【００６２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組織切片鋳型
機能的なＬＴＥを構築するさらなるアプローチ。上記実施形態は、哺乳動物、好ましくはヒトの二次的なリンパ組織の最小の機能的模倣物を製造するアプローチを記載する。本発明の範囲内で考慮される他の実施形態がこれより記載される。
【００６３】
別の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの人工胸腺の開発を試みている研究者等によって報告されたのと同様に、天然のヒト間質細胞を用いてＬＴＥを「鋳型にすること（templating）」を包含する（図６）（Poznansky他、Nat. Biotechnol. 18: 729-734（2000））。彼等のアプローチは、以下の工程を包含していた：
１．マウス由来の小さい胸腺断片を、１２ウェルのプレート中のセルフォームディスク（多孔性マトリクス）の表面上で培養し、間質のコンフルエンス層がマトリクス全体にわたって形成されるまで、増殖培地中で１４日間カバーした。
【００６４】
２．コンフルエンスに達した際、ヒトリンパ球前駆細胞を共培養物に加えた。
【００６５】
３．４〜２１日間の共培養の間、接着しない細胞を定期的に回収し、細胞表面マーカーを分析してＴリンパ球産生を測定した。
【００６６】
本発明の或る実施形態における同様のスキームに従って、天然の間質細胞を有する構築物を播種して、添加されたＴ細胞、Ｂ細胞及びＤＣに前もって準備された微小環境を提供するために、リンパ節断片若しくはリンパ節、脾臓、又は扁桃腺「切片」由来の間質細胞を用いてＬＴＥマトリクスを「鋳型にすること」ができる。このような共培養物は、この鋳型工程の間に標準的な器官培養方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持することができ、鋳型にされたＬＴＥは引き続いて、継続的な維持のためにＡＩＳバイオリアクターに充填され得る。このアプローチは、正確なリンパ微小環境を生成するための代替を提供するだけでなく、リンパ節形成及び組織化原理の分析の相補的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチも提供する。
【実施例６】
【００６７】
バイオリアクターの設計及び構築物：ＡＩＳ成分の組み込み
ハイスループット薬物スクリーニング技術との類似性を記載すれば、迅速なワクチン又は化学物質のスクリーニングに適切なＡＩＳには、単回使用のために設計された、複数の低コストの使い捨て可能なバイオリアクターを用いることができる。各々のバイオリアクターは種々の抗原でチャレンジされ、免疫応答の活性化の際に、抗体、Ｂ細胞及びＴ細胞について回収される。
【００６８】
本発明の或る実施形態において、微小流体バイオリアクターは、この目的を達成するために用いることができる。この微小流体バイオリアクターは、組織構築物を播種するにはほんのわずかな細胞しか要しないというさらなる利点をもたらす。
【００６９】
図７に示されるように、本発明の或る実施形態では、ＡＩＳバイオリアクターは、顕微鏡検査のための透明なポリマーシート又はカバーガラスを備える２区画の顕微鏡スライドとして製造され得る。好ましい実施形態では、各々の免疫バイオリアクターの物理的な寸法は、約７．５ｃｍ長で且つ約２．５ｃｍ幅程度であり、全体的な厚みは約２ｍｍ以下である。第一のチャンバは、後に下部の構造的な層に挿入されるモジュール単位として、又は最初から完全な組み込まれたシステムとして増殖され得る、ＶＳ膜及びＬＴＥ膜を含有する。第二のチャンバは、Ｔ細胞及びＢ細胞の集団を含むＬＴＥを含有する。必要に応じて、リンパ器官輸送又は他の組織への輸送を可能にするようにさらなるＬＴＥ構築物が添加されてもよい。上部の層に配置されるシリンジチューブポートによって、脈管経路に沿って、ＥＴＣ内の戦略的な位置での因子及び／又は細胞の注入が可能になる。図８は、ＶＳ及びＬＴＥのＥＴＣの下の高い接触領域を有する微小加工された経路を示す例示的な組み込まれたバイオリアクターの平面図を示す。
【００７０】
経路に沿って遊走する細胞と、ＶＳ及びＬＴＥ組織構築物における細胞との間の相互作用を促進させるために、各々の組織膜間の接触空間は、例えば、小型の組み込まれたマイクロチャネルを有する加工された挿入物又は薄い積層を用いて調整され得る。適切な構築物質としては、生物学的に適合性のポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレン及びアクリリックが挙げられる。積層ベースの挿入物は、より大きい圧延された管状設計が図７に図示される設計に組み入れられるような、実施例（図９）に示された通りのものである。或る意味では、これらの設計は、末梢血から二次リンパ器官へのリンパ球の遊走を支持する細い細静脈経路を模倣する。
【００７１】
栄養富化培地を、チャネルを介して外部培地リザーバから送り出すことができ、ＶＳ及びＬＴＥ構築物を通って接線方向に流し、このリザーバに戻す。再循環する培地と組織構築物との間の栄養物及び老廃物の輸送は、拡散性及び対流性（水切りフロー（Starling flow））プロセスの両方によって生じる。
【００７２】
他の栄養物とは対照的に、酸素は細胞培養培地にはごくわずかしか溶けない。結果として、十分な酸素供給を維持し、且つ壊死ゾーンの進行を回避するためには高い還流速度が必要になり得る。必要な還流速度が物理的な能力を超える（例えば、異常な高圧の液滴がバイオリアクターの封止の完全性を損ない得る）か、又は過剰な液体剪断を生じる場合、代替的な実施形態では、培地中の酸素分圧は、例えば、循環している血液培地と直列であるＯ２マイクロエクスチェンジャーを用いることによって増大され得る。反対側で高い酸素濃度に曝されたガス透過性のポリマーに血液培地を循環させることによって、Ｏ２環境は、Ｏ２の消費及び損失を補償するように調整され得る。バイオリアクター中のＯ２濃度に対するモニタリング及び調整は、酸素空気供給に対するフィードバックを提供するための市販の非接触蛍光プローブを用いて行なうことができる。ポリマーの界面の酸素ガスと組織構築物との間に高濃度勾配を作り出すことによって、拡散性の輸送及びより厚い構築物の培養が促進され得る。光学的検査／蛍光画像のための透明なカバーを有する組み立てられた構築物の例は図１０に示される。
【実施例７】
【００７３】
層状のＡＩＳの製造及び組み立て
このような微小流体バイオリアクターの製造には、最適の処理条件（例えば、レーザー流量及び変換速度）を決定するために、生体適合性物質を用いた超短パルス加工試験が必要であり得る。本発明の設計は、デバイスが組み立てられた後に、ビア又はポートの追加のために、層状デバイス（例えば、ガス透過性のポリマーの最上部層、ＢＡＴ堆積された中間層、及びＰＤＭＳの底部層）をレーザー加工するのに十分に可塑性である。
【００７４】
図１１は、ＡＩＳデバイスの実施形態における直接沈着の断面図を示す。種々の生体材料構造が、人工免疫システム（例えば、バイオコンクリート、逆ヒドロゲルオパール、コロイド粒子、ＥＣＭゲル、コラーゲンゲル、マイクロキャリア）の構成要素として組み入れられ得る。例えば、ポリマーメッシュのレバー（rebar）は、ＶＳ及びＬＴＥ領域のくぼみに層ごとに直接沈着され得る。このような設計では、メッシュレバーをプレートに接着させるために、ポリアクリレート、ポリスチレン又はＤＭに鋭敏な別の透明なプラスチックから作製されたＡＩＳユニットの下部のプレートを有することが好ましい。この実施形態では、この表面はＥＳＣ足場と同様にＫＯＨを用いてマイクロパターン化される。全ての必要な栄養物及びサイトカインを保有するフィブリンゲルマトリクスを用いて、薄膜としてメッシュのスレッドをコーティングして、細胞の適応及び動きのために十分な空間を残す。
【００７５】
図１２及び図１３に示されるように、本発明の設計は、層状化されたデバイス（例えば、ガス透過性のポリマーの最上部層、ＢＡＴ沈着された中間層、及びＰＤＭＳの底部層）のレーザー加工するのに十分に可塑性である。図１４は、リンパ管及び血管のループ及び外部培地リザーバのための接続された外部ポンプを備える灌流バイオリアクターシステムの模式図を示す。ＡＩＳバイオリアクターは、半回分式又は連続式のいずれで操作されてもよい。
【００７６】
本発明の或る実施形態では、バイオリアクター中の膜の組み込みは、図１５に例示されるように、薄い金属（例えば、ステンレス鋼）リングの間に膜を圧着する（crimping）ことによって達成される。このような圧着方法を用いて、生物学的な膜は、接着剤を使用せずに支持されてもよく、そして約４００μｍ以下の厚みプロファイルを有するディスク状にプレスされてもよい。
【００７７】
図１６は、３層の平坦な導波管の製造を示す。図１７は、灌流バイオリアクターと、組み込まれた光導波管を備えるＥＬＩＳＡチップと、デバイスを接続してスワッピングさせるための微小流体バックプレーンと、外部ポンプ及びリザーバのための微小流体コネクターとを備える例示的なデバイスを示す。
【００７８】
チャネルを直接加工することに加えて、モールドを適切な物質で加工して、ＰＤＭＳデバイスが形成され得る再利用可能な母型を作製してもよい。これによって、連続したレーザー加工よりも高容積のデバイスを製造することが可能になる。漏れのない構築物を得るためにチャネル封入方法が評価される。デバイスを含む物質は、高温で損傷される可能性が高く、そのため頑強な低温結合方法が必要である。
【００７９】
デバイスの試験には、外部接続を取り付けること及び提供するために付属品を必要とする。レーザー加工はまた、外部ポンプ又はリザーバの接続を断つ必要なしにデバイスの素早いスワッピングを支持するこれらの試験付属品にマニホールドを提供するためにも用いられ得る。圧力、流動抵抗及び流量を測定するための装置も、このマニホールドを介してデバイスに接続されてもよい。チャネルの形状を最適化するための修正は、このデータ及びＥＴＣの能力に基づいて為され得る。
【００８０】
ＡＩＳ微小流体バイオリアクターシステムは、一定の温度、湿度及び二酸化炭素の制御を維持するインキュベーターに入れられてもよい。フェノールレッドは、培地中で比色的なｐＨ指示薬として機能し、その結果ｐＨは、例えば、対数増殖能による視覚検査又は光度定量によって定期的にモニタリングされ得る。別の実施形態では、ｐＨは、ｐＨプローブ及びレコーダーを備える外部培地リザーバ中で連続的且つ正確にモニタリングされてもよい。
【００８１】
合成膜及び天然の膜の両方に挿入支持体を作製することは、積層物、圧着されたリング及び接着剤を用いることによって達成されている（図１８）。積層物及び接着剤は主にポリマーメッシュを支持するために用いられており、ポリマーメッシュが次に、合成的に形成された生物学的な膜に対する機械的な強度を与える。積層物を用いる製造は、次に熱的に一緒に封止されるポリマー積層物の２つの小片の間に伸展されたメッシュを挟み込むことを包含する。この接着方法は、メッシュ支持体を伸展させること、及び生体適合性の接着剤を用いてステンレス鋼リングを接着させることを包含する。前に考察されたこの圧着方法は、２つのステンレス鋼リングで膜を圧縮することを包含する。一般には、この積層及び接着の方法は、合成のメッシュで支持された膜に限定されるが、この圧着方法は、天然の生物学的膜及び合成のメッシュの両方に適合し得る。
【実施例８】
【００８２】
光学的診断ＡＩＳ微小流体バイオリアクター
免疫学は、現時点でいずれのヒトの系でも観察できない事象の多くのカスケードを有する。詳細には、ワクチンが免疫学的組織内に入ること及び免疫学的組織内での相互作用に関連する律速段階の結果、失敗する場合、ヒトでこのプロセスを測定する方法も改善する方法も現在は存在しない。この問題に取り組むため、本発明の或る実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫学的／ワクチン接種プロセスのｉｎ  ｓｉｔｕの工程において光学的にモニターできるような方法でＡＩＳを構築することを包含する。
【００８３】
一実施形態では、組み込まれた光導波管は、単独の微小流体バイオリアクターシステム上での光学的励起、吸収、蛍光及び画像化を含む多くの異なる機能を備える、ＡＩＳのマイクロ−トータル分析システム（μＴＡＳ）の一部になる。ｉｎ  ｓｉｔｕの診断システムによって、さらに迅速に免疫学的構築物を最適化し、診断評価が行われる。二光子蛍光は、人工的組織及び生きている組織の両方において３次元の全てで免疫学的事象の可視化を可能にし得る。この技法は、種々のアジュバント、ワクチン候補物、薬物、生物製剤、生体分子及び抗原提示ビヒクルの効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、そしてｉｎ  ｓｉｔｕの診断で理解し最適化するのを助けることができる。
【００８４】
プロセスを単純化し、分析時間を減らすため、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて免疫学的分析工程を行うために用いられ得るμＴＡＳの製造に関して、原型の結果が提示される。一実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕの光学診断のための組み込まれた光導波管を加えたＡＩＳデバイスを提供する。これらの導波管は、比色分析（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、吸収及び蛍光分析）のために光学的励起及び検出経路を提供する。
【００８５】
本実施例では、単層の平坦なポリマー導波管を、ポリマー基板の選択的なフェムト秒のレーザーアブレーションを用いて製造した。ガラススライドを、８０μｍ厚の層の単一部分、屈折率が１．５６の紫外線硬化ポリマーでコーティングした。紫外（ＵＶ）ランプ（４Ｗ）での３０分間の硬化後、平坦な光導波管及び微小流体チャネルを、Ｔｉ：サファイアフェムト秒レジーム（regime）レーザーを用いてポリマーに加工した。光導波管及び微小流体チャネルは各々約１００μｍ幅で８０μｍの深さであった。ＣＷ  Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザーからの光は、左側に示されるようなテーパー状の配列の溝に挿入された５０μｍのコア直径の光ファイバーによって平坦な導波管にカップリングされた。平坦な導波管を通って導かれた光は、交差する微小流体チャネルを通過する。この導波管／チャネル交差は、レーザー源オフで真ん中に、そしてレーザー源オンで右側に示される。右からのチャネルに入る光は、チャネルの反対側で導波管に収束される。次いでこの光は、別の５０μｍのコアの光ファイバーにカップリングされて、測定のためのシリコン検出器に送られる。
【実施例９】
【００８６】
ｉｎ  ｓｉｔｕ診断バイオリアクターの開発
ｉｎ  ｖｉｖｏのシステムを模倣する微小流体デバイスは、細胞の相互作用及び生物学的プロセスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究における価値を提供している。このようなデバイスは、小さいサンプル及び試薬量、小さい廃棄量、増大した表面積対容積比、低いレイノルド数（層流）、粒子分離のための速い沈降、反応時間の短縮及び携行性を含む、伝統的な大規模の流体集成装置を上回る幾つかの利点を提供する。幾つかの微小流体デバイスはまた、ポンプ、バルブ、フィルター、ミキサー、電極及び検出器を組み込む。整列の容易さ及びさらに短い反応時間によって、このアプローチを用いて可能なほぼリアルタイムの検出が行われる。
【００８７】
微小流体デバイスの製造は主に、シリコン又はガラスのフォトリソグラフィー及び引き続くエッチングのような、微小電子工学産業において開発された技術に依拠している。これらの技術はしばしば、複数の処理工程及びクリーンルーム施設を要し、そして作業デバイスを作製するためには数日又は数週間を要し得る。それらはラピッドプロトタイピング（rapid prototyping）よりもデバイスの大量生産によりよく適している。製造の比較的新しい方法は極短パルスレーザー微小加工（ultra-short pulse laser micromachining）（ＵＳＰＬＭ）である。ＵＳＰＬＭは、マスクもフォトレジスト現像の必要性もなしに物質が直接製造され得るという利点を有する。したがってデバイスは、さらに迅速に、しばしば１日以内で、製造することができ、これによってラピッドプロトタイピングが可能になる。さらに、極端に短いパルス幅（＜１５０ｆｓ）及び高強度に起因して、ほとんどの任意の物質が、多光子吸収及びイオン化のおかげで、それがレーザー波長で透明であっても、容易にアブレーションされ得る。これは光学的に透明なバイオリアクターのために物質を加工するには特に有用である。図１９は、微小流体チャネルに組み込まれた超短パルスレーザー微小加工された平坦な光導波管を示す。左側のパネル：光ファイバーのカップリングのためのテーパー状のポート。真ん中のパネル：平坦な導波路の微小流体チャネル交差点（電源オフ）。右側のパネル：平坦な導波路の微小流体チャネル交差点（電源オン、右側から入る）。
【００８８】
本発明の或る実施形態では、ＵＳＰＬＭを用いて、バイオリアクター中の微小流体チャネル、ビア、リザーバ、及び組み込まれた光導波管を加工した。高価でなく広範に用いられる生体適合性のシリコンエラストマーである、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、この構造の本体を構成する。ＰＤＭＳのシートは、ＵＳＰＬＭによってパターン化され、次いで３Ｄ構築物を形成するように組み立てられ得る（印刷した足場を備えるレーザー加工微小流体バイオリアクター及び組み込まれた光導波管（Laser-machined microfluidic bioreactors with printed scaffolds and integrated optical waveguides），Nguyen他, Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng., 5591）。この層は、酸素プラズマで処理することによって永続的に結合されてもよいし、又は機械的な圧力を加えることによって一時的に結合されてもよい。したがって、使い捨て可能又は再使用可能なデバイスの製造が容易に達成される。
【００８９】
一実施形態では、組み込まれた光導波管は、図２０に図示されるように製造される。この導波管は、真ん中のポリマー層が高い屈折率を有する複数の交互の屈折率のポリマー層を含む。好ましい実施形態では、このポリマーは、ＵＶ若しくは熱で硬化されるか又はその両方の組合せで硬化されてもよい（例えば、ＰＤＭＳ被覆加工及びＵＶ硬化コア）。導波管は超短パルスレーザーを用いていずれかの側で物質を取り除くことによって規定される。このレーザーはまた、導波管に対する光ファイバーのカップリングのためのテーパーを組み込むように用いられ得る。微小流体チャネルは、導波管に対して平行又は垂直に加工される。光は微小流体チャネルの片側で導波管に進行され、チャネルを通過して、ここでチャネル中の液体と相互作用し、次いでチャネルの反対側で導波管によって収束されて、検出器に送られる。別の実施形態では、光ファイバーはＰＤＭＳ、次いでファイバーに垂直に加工された微小流体チャネルに包埋され、このチャネル内のファイバーの小断面が取り除かれる。これによって平坦なポリマー導波管の必要性、並びにスプリッター及びコンバイナのような複雑な導波管形状によるファイバー対導波管カップリングの損失が省かれる（図２１）。
【００９０】
図２２は、リング及び支持マトリクス上にコラーゲン膜を有する例示的なバイオリアクター構造を示す。３７℃で１時間凝固させたコラーゲンクッションは、３週間より長くコラーゲン分解せずに極めて安定した状態を維持した。パネルＡは、バイオリアクターの設計を示す。パネルＢは、バイオリアクター全体からメッシュ内のコラーゲンマトリクスクッションのレベルへの進行を示す。コラーゲンクッション上でＨＵＶＥＣ細胞がコンフルエンスに達した後、滅菌条件下でバイオリアクターは組み立てられる（パネルＣ）。一旦組み立てられれば、培地の流れが始まる。
【実施例１０】
【００９１】
ＡＩＳデバイスの設計
例示的なＡＩＳデバイスを図２３に図示する。このデバイスは、微小流体バイオリアクターと、組み込まれた光導波管を備えるＥＬＩＳＡチップと、デバイスを接続しスワッピングさせるための微小流体バックプレーンと、外部ポンプ及びリザーバのための微小流体コネクターとを備える。このバイオリアクターは４つの外部ポートを有し、２つが各々組織構築物の上と下にある。３セットの２つのチャネルを有するＥＬＩＳＡチップが図示されるが、他の実施形態ではより多いチャネルが同じフットプリントに組み込まれる。各々のセットでは、１つのチャネルがサンプルアッセイのためであり、もう１つがサンプルなしの対照である。各々のセットを同じＥＬＩＳＡインプットポートに接続し、これによって両方のチャネルを同時に調製することが可能になる。しかし、セット中の１つのチャネルのみがサンプルの液体に接続される。この液体は、微小流体バックプレーン中のチャネルを通ってバイオリアクターからＥＬＩＳＡチップに送り出される。バルブは、各々のチャネルへのサンプル液体の添加を制御する。光ファイバーによってＥＬＩＳＡチャネルに光をカップリングして、この伝達された光を検出器に接続された別のファイバーにカップリングさせる。この好ましい実施形態では、バイオリアクター及びＥＬＩＳＡチップは両方とも、２光子及び共焦点顕微鏡検査のために光学的に透明である。この好ましい実施形態では、本実施例における集合体全体のフットプリントは約５０×７５ｍｍである。
【実施例１１】
【００９２】
バイオファクトリーとしてのＡＩＳの利用
本発明の或る実施形態では、集合化されたＬＴＥを、種々の所望の生体分子（例えば、サイトカイン、タンパク質、抗体）を生合成する「バイオファクトリー」として用いる。例えば、抗原がＢ細胞に提示される場合、それらのＢ細胞はＬＴＥ中で抗体を生成し得る。潜在的に、生成された抗体はまた、Ｂ細胞のレパートリー及びこのペプチドがＢ細胞にどのように提示されるかに依存してモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、基本的な生物医学研究において、疾患の診断において、そして感染及びガンのような疾病の処置において広く用いられる。抗体は、多くの研究者等によって、彼らの研究において用いられる重要なツールであり、多くの医学上の進歩をもたらしている。
【００９３】
代替的な実施形態において、集合化ＡＩＳを用い、ヒト抗体産生Ｂ細胞（当然ながらそのそれぞれ１つ１つが特定抗原に対してモノクローナルである）を単離／クローン化した後、不死化することができる。これらの抗体産生Ｂ細胞はヒト抗体を産生し、これはマウス抗体又はヒト化抗体よりも治療的に有益である。
【実施例１２】
【００９４】
固定ＡＩＳ
ハイスループット薬物スクリーニング技術との類似性を記載すれば、迅速なワクチン、ワクチン処方物又は化学物質のスクリーニングに適切なＡＩＳには、単回使用のために設計された、複数の低コストの使い捨て可能なバイオリアクターを用いることができる。各々のバイオリアクターは例えば種々の抗原又は抗原／アジュバントの組合せでチャレンジされ、免疫応答の活性化の際に、抗体、Ｂ細胞及びＴ細胞について回収される。本発明の或る実施形態は図２４に図示される。本実施例では、固定９６ウェルプレートフォーマットが用いられる。このシステムには２つの部分が含まれる：ＶＳ及びＬＴＥ。
【００９５】
ＶＳには、マトリクス及びマトリクスに接着した複数の細胞が含まれる。ＶＳに用いられる細胞は、マトリクスの片側又は両側で内皮層、内皮、血管内皮層、又は血管内皮を形成することができる。代替的に、ＶＳに用いられる細胞は、マトリクスの一方の側で内皮層及びもう一方の側で上皮層、又はマトリクスの一方の側で内皮層及びもう一方の側で上皮、又はマトリクスの一方の側で内皮及びもう一方の側で上皮、又はマトリクスの一方の側で血管内皮及びもう一方の側で上皮層、又はマトリクスの一方の側で内皮及びもう一方の側で上皮層、又はマトリクスの一方の側で血管内皮及びもう一方の側で上皮、又はマトリクスの一方の側で血管内皮層及びもう一方の側でリンパ内皮層、又はマトリクスの一方の側で血管内皮層及びもう一方の側でリンパ内皮を形成することができる。
【００９６】
ＶＳでマトリクスに接着した複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み得るか、又はこれらに由来し得る。代替的に、ＶＳのマトリクスに接着した複数の細胞は、線維芽細胞、肥満細胞、ヒト細胞、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、血管内皮細胞、リンパ内皮細胞、単球、樹状細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球、及び線維芽細胞を含み得る。好ましくは、血管内皮層又は血管内皮がＶＳで形成される場合、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）又はヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を用いるのが好ましい。
【００９７】
ＶＳで用いられるマトリクスは、天然の生体高分子を含み得る。天然の生体高分子は、異種移植細胞外マトリクス（ＥＣＭ）シート、再構築コラーゲンマトリクス、及びキトサン／コラーゲン膜足場から成る群から選択され得る。一実施形態では、天然の生体高分子は、ナイロンメッシュ又はポリカーボネートメッシュ上のウシＩ型コラーゲンである。
【００９８】
ＬＴＥは膜と膜に接着した複数のリンパ球又は白血球とを含む。複数のリンパ球又は白血球はＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブＢ細胞、記憶Ｔ細胞及び／又は記憶Ｂ細胞を含み得る。この膜は、透析膜、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）膜、若しくはポリカーボネート（ＰＣ）膜、又は膜を通して培地を交換することができる任意の多孔性膜であり得る。ＬＴＥで用いることができるポリカーボネート膜の例は、コーニング（登録商標）トランスウェル（登録商標）浸透性細胞培養支持体であるが、多くの他のこのような膜が当業者に既知であり、本発明に用いることができる。
【００９９】
ＬＴＥにおいて透析膜を用いることによって（ＬＴＥのマトリクスは透析膜に位置する）、小分子が自由に膜を通過する一方で、細胞及びより大きな分子、例えばタンパク質、抗体及びサイトカインが保持され得るように、インキュベーションウェルを設計することができる。小分子に対する浸透性によって、細胞の老廃物を取り除き、それによってより長期間、細胞を生存させる手段が与えられる一方で、局在しているそれぞれのウェルにおけるより大きな分子の保持によって、サイトカイン又は抗体を検出する確率を増大させることができる。
【０１００】
代替的な実施形態において、複数のリンパ球及び白血球が、膜の最上部に位置するマトリクスに接着される。ＬＴＥに用いられるマトリクスは合成の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）物質、天然ＥＣＭ物質、合成リンパ球ＥＣＭ由来のヒドロゲル、天然リンパ球ＥＣＭ由来の足場、天然リンパ球ＥＣＭ由来のヒドロゲルを含み得る。合成の細胞外マトリクス物質はヒドロゲル、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（エチレングリコールジメタクリレート）ヒドロゲル（ＰＥＧＤＡ又はＰＥＧＤＭＡ）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（フマル酸プロピレン−コ−エチレングリコール）（ＰＰＦ−ＰＥＧ）から成る群から選択され得る。天然細胞外マトリクス（ＥＣＭ）物質はコラーゲン、ヒアルロン酸ヒドロゲル、仔ウシ皮ゼラチン、フィブリノゲン、トロンビン、及び脱細胞化ＥＣＭ（例えば、小腸粘膜下組織及び膀胱粘膜）から成る群から選択され得る。
【０１０１】
別の代替的な実施形態において、ＬＴＥは、透析膜又はポリカーボネート膜又は他の膜の下に（すなわち、培地の下部チャンバ中に）位置する、支持細胞、例えば間質細胞（例えばＨＳ５骨髄由来間質細胞）、上皮細胞、及び内皮細胞（例えばＥＡ．ｈｙ９２６形質転換細胞株）をさらに含み得る。これらの支持細胞は、膜の最上部で増殖する複数のリンパ球及び白血球の生存率を増大させる。本発明の例示的な実施形態では、支持細胞と同時の膜の使用の組合せによって、標準的な９６ウェルサイズのプレートで少なくとも約５００万個のリンパ球を生存させることができる。本発明の例示的な実施形態では、ウェルの限定空間における約５００万個の細胞によって、ナイーブ免疫反応が観察される。代替的な実施形態では、条件培地を、単独又は支持細胞と組合せて、培地の下部チャンバ（膜の下にある）で用いることができる。
【０１０２】
このシステムのそれぞれの部分は別々に処理することができ、次いで組合せた後、バイオリアクターが形成される。一実施形態では、２つのマルチウェルプレート（１つがウェルの底部に第一のマトリクス（ＶＳに用いられる）を含み、１つがウェルの底部に必要に応じた第二のマトリクス（ＬＴＥに用いられる）を含む）を調製することによってバイオリアクターが形成される。次に、第一のマルチウェルプレートのウェル（ＶＳに用いられる）に、血液単球及び非単球樹状細胞前駆体（又は上記の他の細胞型のいずれか）を充填する。次いで、血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を試験薬又は抗原で刺激し、刺激された血液単球及び非単球樹状細胞前駆体を成熟抗原提示細胞に変換させる。第二のマルチウェルプレートのウェル（ＬＴＥに用いられる）に、複数のリンパ球及び白血球を充填し、三次元人工リンパ組織を調製する。次いで、第一のマルチウェルプレート（ワクチン接種部位を含む）を第二のマルチウェルプレート（三次元人工リンパ組織を含む）と共に整列させ、１つのマルチウェルプレートのウェルをもう１つのマルチウェルプレートのウェルに挿入し、複合バイオリアクターを製造する。９６ウェルフォーマットは、例えば、羊膜及びコラーゲンＶＳモデル、並びに種々のＬＴＥ設計（例えば、テニスボールモデル及び逆オパール足場）に適合させることができる。
【実施例１３】
【０１０３】
組み込まれたＡＩＳ
ハイスループット薬物スクリーニング技術との類似性を記載すれば、迅速なワクチン又は化学物質のスクリーニングに適切なＡＩＳには、単回使用のために設計された、複数の低コストの使い捨て可能なバイオリアクターを用いることができる。各々のバイオリアクターは種々の抗原でチャレンジされ、免疫応答の活性化の際に、抗体、Ｂ細胞及びＴ細胞について回収される。本発明の別の実施形態では、組み込まれたＡＩＳは、ＰＢＭＣが添加される構築物を含む（図２４Ｂ）。このバイオリアクターの調製は、固定モデルについて記載されたものに類似しているが、ＶＳでは、ＰＢＭＣが添加される前で、且つＨＵＶＥＣがコンフルエンスになった後に、抗原は膜と結合するか、又は膜内に包埋される。
【実施例１４】
【０１０４】
細胞生存度
細胞生存度。細胞生存度を増大させる透析膜の能力の評価は、透析膜の有無で細胞培養物を調製することによって行なわれた。約１００万個のＰＢＭＣの培養物を培地５００μｌに添加し、ＰＭＡ及びＰＨＡで刺激した。次いで、それぞれの培養物を通常の９６ウェルプレート又はさらに培地５ｍＬで懸濁した透析膜ホルダー（約３．５ｋＤａのカットオフセルロース膜を備える）のいずれかに入れた。約１００万個のＰＢＭＣを有する比較ウェル５．５ｍＬを標準として調製した。次いで、細胞を３日間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、培養物を取り除き、ｐＨ変化を（視覚的に）調べた。「正常な」ウェル中の培地は、酸性化を示す黄色に変化し、この条件は細胞増殖の継続を促さなかった。透析膜含有培養容器中の培地は、細胞増殖の継続に最適な弱塩基性のｐＨを示すピンク色のままであった。
【０１０５】
大きい分子の保持。大きい分子を保持させる透析膜の能力の評価は、５０ｋＤａのアルブミン分子が、１０ｋＤａのカットオフ透析膜を通って浸透するか否かをモニタリングすることによって行われた。アルブミン（５ｍｇ／ｍＬ）及び１％ＮａＣｌのストック溶液を調製し、開かれたウェルプレートに入れた。次いで、１０ｋＤａの透析膜「バケット（bucket）」をプレート中で懸濁し、１％ＮａＣｌ  ５００μｌを添加した。次いで、ウェルプレートを３７℃で２４時間、インキュベートした。それから、プレートを取り除き、ＵＶ可視分光光度計を用いて２７８ｎｍの波長で透析ウェル溶液を分析した。スペクトル結果及び検量線によって、透析膜を通って浸透したアルブミンは検出されなかったことが示された。
【実施例１５】
【０１０６】
微小流体バイオリアクター
本発明の或る実施形態において、「薄いシート状膜バイオリアクター」が調製された。この実施形態は、例えば、ワクチン接種部位（ＶＳ）に対する支持足場としてＥＣＭ由来膜を収容するための微小流体バイオリアクターを含む。本発明の或る実施形態では、ＥＣＭバイオリアクターのＥＣＭ膜は、２つのコンセントリックリングによって適所に保持されている：内側（例えば、ＰＴＦＥ、テフロン（登録商標））リング及びより大きな（例えば、ポリカーボネート）外側リング。ＥＣＭ由来膜が、内側リングを外側リングに押し付けることによって２つのリング間の狭いギャップ（約１００μｍ）に挟み込み、それにより内側リングの中の開口部全体に、ＥＣＭ由来膜が強く伸びる。次いで、曝されたＥＣＭ膜の片側又は両側でコンフルエンスな内皮を増殖することができる。このアプローチは、ウェルベースのフォーマットで容易に適合可能である。他の実施形態では、ポーテッド蓋（ported lids）及び／又は固定リングは、ＥＣＭ／リング構造のいずれか片側に独立して接着させることができ、幾つかの異なる実験配置を可能にさせる。例えば、最上側のポーテッド蓋によって内皮を剪断することができる一方で、底部の固定リングでは、固定条件で内皮が維持される。蓋は透明であってもよく、ワクチン接種部位の顕微鏡検査が可能になる。
【０１０７】
ウェルベースのフォーマットにおけるＶＳに対するＥＣＭ膜。本発明のこの実施形態では、これまでに記載されたコンセントリックリングを用いてＥＣＭ膜を取り付ける方法は、図２５に示されるようなウェルベースのフォーマットで用いることができる。ここでは、内部のテフロン（登録商標）リングを底のない従来のウェルバケットに代える。バケットと、外側の固定リングとの間にＥＣＭを置き、バケットを固定リング（直径がバケットの底部よりもわずかに大きい）に押し付け、それにより適所でＥＣＭ膜を挟み込む。次いで、余分なＥＣＭ膜を取り除くことができ、ＶＳの細胞が増殖するバケットの底部全体に膜を強く伸ばしたままにする。バケットは、細胞培養物の培地を含有するウェルプレートに置くことができる。
【０１０８】
足場バイオリアクター。本発明の別の実施形態において、足場を収容するように、記載の微小流体バイオリアクターが変化する。本発明の或る実施形態であるＩＣＣバイオリアクターが図２６に図示される。この設計が、集合化を容易にし、堅固な封止が可能になる。例として、このバイオリアクターは、直径９ｍｍ厚さ１／１６インチのＩＣＣ足場を収容する。ポーテッドウィンドウを通って足場の片側に流れを適用し、薄い（２５０μｍ）チャンバに封じ込めることができる。足場のもう一方の側に薄いカバーガラスを取り付け、高解像度の顕微鏡試験を可能にする。顕微鏡アダプタプレート（右下の図）も作製した。
【実施例１６】
【０１０９】
９６ウェルフォーマットにおける足場の組み込み
この実施形態において、ＬＴＥ又はＶＳに対する組織足場を９６ウェルフォーマットに組み込んでいる。
【０１１０】
図２７Ａ、１番目の画像、倍率約２０倍。ＩＣＣ足場が、９６ウェルプレートのウェル中の水５００μｌに入れられる。底面図（ｉｎｖｅｒｔｏｓｃｏｐｅ）であるが、コラーゲン及びマイクロキャリアを含む他の足場を用いることができる。
【０１１１】
図２７Ｂ、２番目の画像。上面図：ウェル「Ｂ」は水５００μｌを含有し、ウェル「Ｃ」は水５００μｌ中にＩＣＣ足場を含有する。本実施例では、足場は幅約７ｍｍ、厚さ約２００μｍである。キャビティは約４０μｍである。
【実施例１７】
【０１１２】
ＶＳ及びＬＴＥ組み込みのウェルベースのフォーマット
この実施形態において、ウェルベースのＡＩＳが、例えばトキシン、病原体、ワクチン及び薬物の評価のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングモデルとして用いられるように設計される。図２８は、どのようにして、ＶＳ及びＬＴＥ構築物は、ＶＳがフィルタープレートで用いられ、ＬＴＥがアクセプタウェルに入れられるウェルベースのフォーマットに組み込むことができるかを示す。ＶＳは、図示された設計でＬＴＥに適合される。
【実施例１８】
【０１１３】
ハイスループット試験
固定又は組み込まれたＡＩＳ（実施例１２及び実施例１３を参照されたい）を用いるハイスループット試験は、図２９で図示されるマルチウェルフォーマットを用いて達成することができる。この実施形態のＡＩＳは２つの部分、ＶＳ及びＬＴＥを含む。それぞれの部分が別々に調製され、実施例１２及び実施例１３のように試験の最終工程で組合される。成熟抗原提示細胞による刺激の後に、上記の複数のリンパ球による反応性が求められる。このシステムの単純性によって自動化が可能になる。さらに、９６ウェルフォーマット又は実験室自動化で典型的に用いられる他のウェルベースのフォーマットが、ＡＩＳのこれらの実施形態に適合することができる。
【実施例１９】
【０１１４】
組織構築物の調製
内皮及び上皮を作製するための組織構築物の最上部及び底部における細胞を付加した異種移植組織構築物の調製。皮膚等価物として用いられるＶＳモデルの開発及びどのようにしてこれをアレルゲンで試験することができるかの説明が図３０に示される。この実施形態では、ポリカーボネート膜支持構造を用いて、コラーゲン、他の天然ポリマー、若しくはヒドロゲル等の合成物質、又はこれらの組合せを含む３Ｄ  ＥＣＭ膜を調製する。
【０１１５】
一度、構造的に２つの細胞層を支持することができるＥＣＭが確立されると、上皮細胞、例えばヒトケラチノサイトの層をマトリクスの片側で増殖させることができる。ケラチノサイトが確立し、重層の形成が始まった後に、連続的な層状化及びタイトな細胞間結合のために、細胞を空気界面に曝す。一度、角化した細胞層が形成されると、構築物は反転し、内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣの層がもう１つの側で増殖され得る。
【０１１６】
一度、内皮細胞層が確立されると、構築物が再び反転し、ケラチノサイトに対する空気界面を元に戻すことができる。一度、内皮細胞がコンフルエンスな単層を形成すると、組織構築物が完全になり、例えば化学物質、化粧品、アジュバント、抗原及び／又は炎症シグナルの特徴付け及び試験が容易になる。
【実施例２０】
【０１１７】
他の細胞の導入
３Ｄ構築物内の補助細胞の導入（図３１）。本発明の実施形態では、線維芽細胞又は他の補助細胞を添加することができる。線維芽細胞は、膜支持体に添加する前、及びマトリクス上の上皮及び／又は内皮細胞の増殖前に、ＥＣＭ物質と混合することができる。ＶＳの実施形態では、精製単球を内皮に添加することができ、次いで細胞を構築物に移行させることができる。単球が、ＤＣに分化し、構築物から逆移行された後、又はマクロファージに分化し、構築物に保持した後、保持細胞を内皮の表面から取り除くことができ、残存マクロファージが構築物内に保持する。
【０１１８】
上記の説明及び実施例は、本発明を実施する方法を当業者に教示する目的であり、本説明を読めば当業者に明らかとなるその明白な変更及び変形を全て詳述するような意図はない。しかし、このような明白な変更及び変形の全てが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれることが意図される。この特許請求の範囲は、文脈が特に逆を示すものでない限り、意図される目的を満たすのに有効である任意の順序で、特許請求された成分及び工程を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１Ａ】ＬＴＥの模式図であり、ここではＴ細胞及びＢ細胞が、マイクロキャリア上で一緒に培養され、次いで多孔性の容器に移される。
【図１Ｂ】ＬＴＥの模式図であり、ここではＴ細胞及びＢ細胞が、別々のマイクロキャリア上で培養され、次いで多孔性の容器で一緒にされる。
【図１Ｃ】ＬＴＥの模式図であり、ここでは別々のＴ細胞及びＢ細胞マイクロキャリアが、別々のマイクロキャリア上で培養され、次いで別々の区画を備える多孔性の容器で一緒にされる。
【図２Ａ】ＡＩＳデザインの実用的な考察を示す図である。
【図２Ｂ】ＡＩＳデザインの実用的な考察を示す図である。
【図３】ナイロンメッシュ上のプロタサン／コラーゲンマトリクス上で増殖するＨＵＶＥＣ細胞を示す図である。ナイロン膜及び分散されたプロタサン／コラーゲンマトリクス物質の高倍率ＳＥＭは、上の画像に示す。ＨＵＶＥＣ細胞の第一の層の播種は、反転した膜上で行われ（左側、側面１）、次いで、２４時間後に正立の位置にして（右側、側面２）、ここで第二の層が適用される。ＨＵＶＥＣ細胞の各々の面の位相差画像は、下の真ん中２つの画像に示され、ここでは左側が第一の層であり、右側が適用された第二の層である。
【図４】デジタル印刷されたリンパ節の実物大模型（左側パネル）及び脈管の網状画像（右側パネル）を示す図である。
【図５】急速冷凍、凍結乾燥及びトリポリリン酸塩でのゲル化によってリンパのＥＣＭ（８０％（ｗ／ｗ））及びプロタサン（２０％（ｗ／ｗ））から製造されたマイクロビーズの画像を示す図である。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏの人工胸腺の作製を試みている研究者等によって報告されたのと同様に、天然のヒト間質細胞を用いてＬＴＥを「鋳型にすること」に関するさらなる実施形態を示す図である（Poznansky他、Nat. Biotechnol. 18:729-734,（2000））。
【図７】バイオリアクターの模式図である。
【図８】ＶＳ及びＬＴＥのＥＴＣ（右側パネル）の真下に高い接触領域（左側パネル）を備える、微小加工された内皮経路を示す例示的な組み込まれたバイオリアクターの平面図である。
【図９】積層に基づく挿入物を示す図であるが、より大型の圧延された管状設計が、図１３に図示された設計に組み入れられている。
【図１０】微小流体のバックプレーン上の光診断での例示的な微小流体バイオリアクターを示す図である。
【図１１】ＡＩＳデバイスにおける直接の沈着の断面図である。種々の生体材料の構造が、人工免疫システムの構成要素として組み入れられてもよい（例えば、バイオコンクリート、コロイド粒子、ＥＣＭゲル、コラーゲンゲル、マイクロキャリア）。例えば、ポリマーのメッシュレバーは、ＶＳ及びＬＴＥ領域の後退において直接、層ごとに沈着され得る。このような設計では、ポリアクリレート、ポリスチレン又はＤＭに鋭敏な別の透明なプラスチックから成るＡＩＳ単位の下のプレートを備え、メッシュレバーをプレートに結合させることが好ましい。この実施形態では、ＥＳＣ足場と同様にＫＯＨを用いて表面をマイクロパターン化する。細胞の適応及び動きのために十分な空間を残して、薄膜としてメッシュのスレッドをコーティングするために、全ての必要な栄養素及びサイトカインを保有するフィブリンゲルマトリクスを用い得る。
【図１２】別々の層における例示的な微小流体バイオリアクターを示す図である。
【図１３】組み立てられた微小流体バイオリアクターを示す図である。
【図１４】血管のループ及び外部の培地リザーバのための結合された外部ポンプを備える灌流バイオリアクターシステムの模式図である。ＡＩＳバイオリアクターは、半バッチ式又は連続式のいずれで操作され得る。
【図１５】薄い金属（例えば、ステンレス鋼）リングの間の膜を示す図である。このような圧着方法を用いて、生物学的な膜は接着剤の使用なしに支持することができ、約４００μｍ以下の厚みプロファイルでディスク状に圧縮され得る。
【図１６】３層の平坦な導波管の製造を示す模式図である。
【図１７】灌流バイオリアクターと、組み込まれた光導波管を備えるＥＬＩＳＡチップと、デバイスを接続してスワッピングを可能にする微小流体バックプレーンと、外部ポンプ及びリザーバのための微小流体コネクターとを備える例示的なデバイスを示す図である。
【図１８】ステンレス鋼リングによって支持された合成及び天然の膜の写真である。
【図１９】微小流体チャネルに組み込まれた、超短パルスレーザーで微小加工された平坦な光導波路の画像を示す図である。左側のパネル：光ファイバーのカップリングのためのテーパー状ポート。真ん中のパネル：平坦な導波路の微小流体チャネル交差点（電源オフ）。右側のパネル：平坦な導波路の微小流体チャネル交差点（電源オン、右側から入る）。
【図２０】ＭａＡＩＳの実施形態を示す図である。
【図２１】レーザー加工された、組み込まれた光導波路を示す図である。ｎ１は導波路のコアの屈折率を示し、ｎ２は被覆加工係数である。
【図２２】リング及び支持マトリクス上にコラーゲン膜を備える例示的なバイオリアクター構造を示す図である。パネルＡは、バイオリアクターの設計を示す。パネルＢは、バイオリアクター全体からメッシュ内のコラーゲンマトリクスクッションのレベルへの進行を示す。パネルＣは、コラーゲンクッション上でＨＵＶＥＣ細胞がコンフルエンスに達した後の、滅菌条件下のバイオリアクターの組み立てを示す。一旦組み立てられれば、培地の流れが始まる。
【図２３】微小流体のバックプレーン上の光診断での例示的な微小流体バイオリアクターを示す図である。
【図２４Ａ】自動化に適した本発明のウェルベースの実施形態を示す図である。
【図２４Ｂ】自動化に適した本発明のウェルベースの実施形態を示す図である。
【図２５】ウェルベースのフォーマットで用いることができるコンセントリックリングを使用してＥＣＭ膜を取り付ける方法を示す図である。
【図２６】バイオリアクターを示す図である。
【図２７Ａ】９６ウェルフォーマットにおける足場の組み込みを示す図である。
【図２７Ｂ】９６ウェルフォーマットにおける足場の組み込みを示す図である。
【図２８】どのようにして、ＶＳ及びＬＴＥ構築物をウェルベースフォーマットに組み込むことができるかを示す図であり、ＶＳがフィルタープレートで用いられ、ＬＴＥがアクセプタウェルに置かれる。ＶＳは、図示された設計でＬＴＥに適合される。
【図２９】組み込まれたＡＩＳを用いたハイスループット試験は、固定９６ウェルフォーマットを用いて達成することができることを示す図である。本実施形態のＡＩＳは、ＶＳ及びＬＴＥの２つの部分を含む。それぞれの部分が別々に調製され、試験の最終工程で結合される。このシステムの単純性が自動化を容易にする。さらに、実験室自動化で典型的に用いられる、９６ウェルフォーマット又は他のウェルベースフォーマットは、ＡＩＳのこれらの実施形態に適合させることができる。
【図３０】皮膚等価物として用いることができるＶＳモデルと、アレルゲンを用いて試験する方法とを示す図である。
【図３１】補助細胞の３Ｄ構築物への導入を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2009529870.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2009529870.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
2009529870.tif 000010
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
2009529870.tif 000031
【図２６】
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【図２７Ａ】
2009529870.tif 000033
【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2009529870.tif 000037
【図３１】
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【国際調査報告】
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