(57)【要約】  本発明は、ＩｇＥ定常領域の断片を含む組換えペプチド、それをコードするヌクレオチド分子、それを含む組換えワクチンベクター、および、免疫応答を誘導し、アレルギー、喘息およびＩｇＥ依存性疾患を治療するための、それを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＥ定常領域の断片と、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、またはＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される非ＩｇＥアミノ酸配列を含む、組換えペプチド。
【請求項２】
前記組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を翻訳する段階を含む方法により作製された、請求項１に記載の組換えペプチド。
【請求項３】
前記ＩｇＥ定常領域の断片を含むポリペプチドと、前記非ＩｇＥアミノ酸配列を含むポリペプチドを化学的に共役させる段階を含む方法により作製された、請求項１に記載の組換えペプチド。
【請求項４】
前記ＩｇＥ定常領域が、Ｃε−１ドメイン、Ｃε−２ドメイン、Ｃε−３ドメイン、Ｃε−４ドメイン、Ｍ１ドメイン、Ｍ２ドメイン、およびＭ１／Ｍ２ドメインから選択される、請求項１に記載の組換えペプチド。
【請求項５】
前記ＩｇＥ定常領域の断片が、前記非ＩｇＥアミノ酸配列に融合している、請求項１に記載の組換えペプチド。
【請求項６】
前記ＩｇＥ定常領域の断片に前記非ＩｇＥアミノ酸配列が埋め込まれている、請求項１に記載の組換えペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載の組換えポリペプチドおよびアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の組換えポリペプチドをコードする、組換えワクチンベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の組換えポリペプチドを含む、組換えリステリア株。
【請求項１０】
前記組換えリステリア株が、組換えリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)株である、請求項８に記載の組換えリステリア株。
【請求項１１】
前記組換えリステリア株が、動物宿主を通じて継代されている、請求項８に記載の組換えリステリア株。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換えポリペプチドをコードする、ヌクレオチド分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のヌクレオチド分子およびアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項１４】
請求項１２に記載のヌクレオチド分子を含む、組換えワクチンベクター。
【請求項１５】
請求項１２に記載のヌクレオチド分子を含む、組換えリステリア株。
【請求項１６】
前記組換えリステリア株が、組換えリステリア・モノサイトゲネス株である、請求項１５に記載の組換えリステリア株。
【請求項１７】
前記組換えリステリア株が、動物宿主を通じて継代されている、請求項１５に記載の組換えリステリア株。
【請求項１８】
ＩｇＥ定常領域の断片を含むペプチドを発現している組換えリステリア株。
【請求項１９】
前記ペプチドが、非ＩｇＥアミノ酸配列をさらに含む、請求項１８に記載の組換えリステリア株。
【請求項２０】
前記非ＩｇＥアミノ酸配列が、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される、請求項１８に記載の組換えリステリア株。
【請求項２１】
前記ＩｇＥ定常領域が、Ｃε−１ドメイン、Ｃε−２ドメイン、Ｃε−３ドメイン、Ｃε−４ドメイン、Ｍ１ドメイン、Ｍ２ドメイン、およびＭ１／Ｍ２ドメインから選択される、請求項１８に記載の組換えリステリア株。
【請求項２２】
請求項１８に記載の組換えリステリア株およびアジュバントを含むワクチン。
【請求項２３】
被検体においてＩｇＥタンパク質に対する細胞性免疫応答を誘導するための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチドあるいは（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物の使用であって、前記ＩｇＥタンパク質が、前記被検体の細胞により内因的に発現され、前記免疫原性組成物が、主にＴｈ１型免疫応答を好むアジュバントを含む、使用。
【請求項２４】
前記免疫原性組成物が組換えワクチンベクターを含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記組換えペプチドが、非ＩｇＥアミノ酸配列をさらに含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記非ＩｇＥアミノ酸配列が、非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
被検体においてアレルギーを治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用であって、前記ＩｇＥタンパク質が、前記被検体の細胞により内因的に発現され、前記免疫原性組成物が、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する、使用。
【請求項２８】
前記免疫原性組成物が組換えワクチンベクターを含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記組換えペプチドが、非ＩｇＥアミノ酸配列をさらに含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
前記非ＩｇＥアミノ酸配列が、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項２７に記載の使用。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞がＴヘルパー細胞である、請求項２７に記載の使用。
【請求項３３】
前記Ｔ細胞が、前記被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させることのできる、請求項２７に記載の使用。
【請求項３４】
被検体においてアレルギー性喘息を治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチドあるいは（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用であって、前記ＩｇＥタンパク質が、前記被検体の細胞により内因的に発現され、前記免疫原性組成物が、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する、使用。
【請求項３５】
前記免疫原性組成物が、組換えワクチンベクターを含む、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記組換えペプチドが、非ＩｇＥアミノ酸配列をさらに含む、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
前記非ＩｇＥアミノ酸配列が、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３９】
前記Ｔ細胞がＴヘルパー細胞である、請求項３４に記載の使用。
【請求項４０】
前記Ｔ細胞が、前記被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させることのできる、請求項３４に記載の使用。
【請求項４１】
被検体において喘息エピソードの発生率を低下させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチドあるいは（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用であって、前記ＩｇＥタンパク質が、前記被検体の細胞により内因的に発現され、前記免疫原性組成物が、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する、使用。
【請求項４２】
前記免疫原性組成物が、組換えワクチンベクターを含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記組換えペプチドが、非ＩｇＥアミノ酸配列をさらに含む、請求項４１に記載の使用。
【請求項４４】
前記非ＩｇＥアミノ酸配列が、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項３４に記載の使用。
【請求項４６】
前記Ｔ細胞がＴヘルパー細胞である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４７】
前記Ｔ細胞が、前記被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させることのできる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４８】
前記喘息が、アレルギー性喘息である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４９】
被検体においてＩｇＥ依存性疾患または障害を治療する、阻害する、抑制する、または寛解させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチドあるいは（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用であって、前記ＩｇＥタンパク質が、前記被検体の細胞により内因的に発現され、前記免疫原性組成物が、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する、使用。
【請求項５０】
前記免疫原性組成物が、組換えワクチンベクターを含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記組換えペプチドが、非ＩｇＥアミノ酸配列をさらに含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記非ＩｇＥアミノ酸配列が、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）アミノ酸配列、ＡｃｔＡアミノ酸配列、およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列から選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５４】
前記Ｔ細胞がＴヘルパー細胞である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５５】
前記Ｔ細胞が、前記被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させることのできる、請求項４９に記載の使用。
【請求項５６】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害が喘息を含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５７】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害がアレルギー性喘息を含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５８】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害が枯草熱を含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５９】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害が薬物アレルギーを含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項６０】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害が尋常性天疱瘡を含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項６１】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害がアトピー性皮膚炎を含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項６２】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害が、蕁麻疹、湿疹結膜炎(eczema conjunctivitis)、鼻漏、鼻炎胃腸炎(rhinitis gastroenteritis)、またはその組合せを含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項６３】
前記ＩｇＥ依存性疾患または障害が、骨髄腫、ホジキン病、高ＩｇＥ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、またはその組合せを含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項６４】
ＩｇＥ依存性疾患または障害を寛解させる化合物を同定する方法であって、前記方法は、
Ａ．第１の動物を前記化合物に接触させる段階であって、前記第１の動物が請求項１に記載の組換えペプチドを投与されておらず、前記第１の動物が前記ＩｇＥ依存性疾患または障害を示す、段階と；
Ｂ．第２の動物を前記化合物に接触させる段階であって、前記第１の動物が請求項１に記載の組換えペプチドを投与されている、段階と；
Ｃ．前記第１の動物および前記第２の動物における前記ＩｇＥ依存性疾患または障害の臨床的相関を測定する段階とを含み；
それにより、前記化合物が前記第１の動物において前記臨床的相関に正に作用して前記第２の動物において前記臨床的相関に作用しないならば、前記化合物は前記ＩｇＥ依存性疾患または障害を寛解させることになる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥ定常領域の断片を含む組換えペプチド、それをコードするヌクレオチド分子、それを含む組換えワクチンベクター、および、免疫応答を誘導し、アレルギーおよび喘息を治療するための、それを含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は、一時的な気道閉塞、気道の炎症、および吸入された収縮刺激性の刺激に対する気管支反応の亢進（気道過敏症［ＡＨＲ］）の１またはそれ以上により臨床的に特徴づけられる。ＡＨＲの発症および空気の流れの減少の根底にある機構は、疾患の病因の中心的役割を果たすと考えられている。喘息の病因は複雑であるが、吸入したアレルゲンに対する不適切な免疫応答により誘発される気道の炎症が、この障害の臨床発現および病因に対する基本的な素因と考えられる。疾患の重篤度は、気道の進行性炎症ならびに気道閉塞およびＡＨＲのレベルに相関する場合が多い。
【０００３】
ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球（Ｔｈ２細胞）は、喘息における炎症性浸潤の支配的特徴である。これらの細胞は、この疾患の特徴であり得る免疫応答および病的応答（例えばＩｇＥ産生）を誘導するサイトカインを分泌することにより、疾患の進行およびＡＨＲを調節すると考えられる。喘息およびアレルギーを治療および寛解させるための方法は、当分野で至急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＩｇＥ定常領域の断片を含む組換えペプチド、それをコードするヌクレオチド分子、それを含む組換えワクチンベクター、および、免疫応答を誘導し、アレルギーおよび喘息を治療するための、それを含む方法を提供する。
【０００５】
一実施形態では、本発明は、ＩｇＥ定常領域の断片、および非ＩｇＥアミノ酸（ＡＡ）配列を含む組換えペプチドを提供する。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、リステリオリシン（ＬＬＯ）ＡＡ配列である。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列である。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、当分野で公知の任意のその他の非ＩｇＥＡＡ配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０００６】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンを提供する。
【０００７】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
【０００８】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。
【０００９】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む組換えリステリア株を提供する。
【００１０】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてＩｇＥタンパク質に対する細胞性免疫応答を誘導するための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチドあるいは（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物への使用を提供する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、被検体内で内因的に発現される。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、Ｔｈ１型免疫応答を主に好むアジュバントを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１１】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてアレルギーを治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させるための組成物の調製における（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、被検体により内因的に発現される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１２】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてアレルギー性喘息を治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させるための組成物の調製における（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、被検体により内因的に発現される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１３】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体において喘息エピソードの発生率を低下させるための組成物の調製における（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。もう１つの実施形態では、組換えペプチドは、非ＩｇＥＡＡ配列をさらに含む。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、本明細書に列挙される任意の非ＩｇＥＡＡ配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１４】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてＩｇＥ依存性疾患または障害を治療する、阻害する、抑制する、または寛解させるための組成物の調製における（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、前記被検体の細胞により内因的に発現される。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。一実施形態では、ＩｇＥ依存性疾患または障害は、喘息、アレルギー性喘息、枯草熱、薬物アレルギー、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、湿疹結膜炎(eczema conjunctivitis)、鼻漏、鼻炎胃腸炎(rhinitis gastroenteritis)、骨髄腫、ホジキン病、高ＩｇＥ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、またはその組合せを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１５】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＩｇＥ依存性疾患または障害を寛解させる化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）第１の動物を前記化合物に接触させ、この際前記第１の動物が請求項１に記載の組換えペプチドを投与されておらず、前記第１の動物が前記ＩｇＥ依存性疾患または障害を示す、段階；（ｂ）第２の動物を前記化合物に接触させ、この際前記第１の動物が請求項１に記載の組換えペプチドを投与されている段階；ならびに（ｃ）前記第１の動物および前記第２の動物における前記ＩｇＥ依存性疾患または障害の臨床的相関を測定する段階を含み；それにより、前記化合物が前記第１の動物において前記臨床的相関に正に作用し、前記第２の動物において前記臨床的相関に作用しないならば、前記化合物は前記ＩｇＥ依存性疾患または障害を寛解させることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｌｍ−Ｅ７とＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を対比する図である。Ｌｍ−Ｅ７を、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)（ＬＭ）ゲノム（Ａ）のｏｒｆＺドメインに遺伝子カセットを導入することにより作製した。ｈｌｙプロモーターは、ＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯのｈｌｙシグナル配列および最初の５アミノ酸（ＡＡ）の発現を駆動する。Ｂ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−菌株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することにより作製した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７とｐｒｆＡ遺伝子の非溶血性の融合物の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有し、そのプラスミドの保持について選択する。
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７のＥ７分泌を示す図である。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、ＬＢ培地中、３７℃にて一晩増殖させた。６００ｎｍの吸光度でのＯＤにより決定した同等数の細菌をペレット化し、各々の上清の１８ｍｌをＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウエスタンブロットにより解析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂ、それに続いてＨＲＰ結合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次にＥＣＬ検出試薬を用いて発色させた。
【図３】ｈｌｙプロモーター（ｐＨＬＹ）下、組換えリステリア株からＥ７を発現および分泌させるために用いたｐＡｃｔＡ−Ｅ７発現系の模式図である。ｐｒｆＡ遺伝子を用いてプラスミドの保持を選択した。
【図４Ａ】（Ａ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７（約６４ｋＤ）を分泌することを実証するウエスタンブロットを表す図である。ゲルをポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体で、次に１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧでプローブした。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７；レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１；レーン３；Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３；レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。
【図４Ｂ】（Ｂ）（Ａ）部分からのウエスタンブロットの一部分の拡大図である。
【図５】ＴＣ−１腫瘍細胞の皮下移植後７日および１４日の、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（黒色長方形）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（白色三角形）で免疫化したマウスおよび無処置マウス（非ワクチン接種；円）における腫瘍サイズを表す図である。
【図６Ａ】Ａ．ＴＣ−１腫瘍細胞を投与され、その後にＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７またはワクチン無し（無処置）を投与されたマウスの脾臓および腫瘍におけるＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を表す図である。
【図６Ｂ】Ｂ．ＴＣ−１細胞を投与され、その後に組換えリステリアワクチン（無処置、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７）を投与されたマウスの脾臓および腫瘍におけるＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および浸透を表す図である。
【図７】Ａ．Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７ワクチン接種によるＥ７特異的ＣＴＬの誘導を表す図である。Ｂ．Ｅ７を発現していないＥＬ４標的細胞を用いる対照実験を表す図である。
【図８】ＰＥＳＴ領域を含むリステリア構築物がより大きな腫瘍の退縮をもたらすことを表す図である。Ａ．１つの代表的実験からのデータ。Ｂ．３回の実験から得たデータの平均腫瘍サイズおよびＳＥ。
【図９】ＰＥＳＴ領域を含むリステリア構築物が脾臓においてより高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを表す図である。Ａ．１つの代表的実験からのデータ。Ｂ．３回の実験から得たデータの平均およびＳＥ。
【図１０】ＰＥＳＴ領域を含むリステリア構築物が腫瘍内でより高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導することを表す図である。Ａ．１つの代表的実験からのデータ。Ｂ．３回の実験から得たデータの平均およびＳＥ。
【図１１】異なる形態のＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質を発現するワクシニアウイルス構築物を表す図である。
【図１２】ＶａｃＬＬＯＥ７が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて２×１０５ＴＣ−１細胞より確立された腫瘍の長期の退縮を誘導することを表す図である。腫瘍投与後１１および１８日に、マウスに１匹あたり１０７ＰＦＵのＶａｃＬＬＯＥ７、ＶａｃＳｉｇＥ７ＬＡＭＰ−１、またはＶａｃＥ７を腹腔内に注射するか、または処理しないままにしておいた（無処置）。１つの処置群に８匹のマウスを用い、各腫瘍についての断面図（２回の測定の平均）を腫瘍接種後の示された日数について示す。
【図１３】：図１３．Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスが甲状腺に腫瘍を生じ、その場所でＥ７遺伝子が発現されることを表す図である。６ヶ月でマウスを犠牲にし、甲状腺を取り出し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。（ａ）外側から見える甲状腺腫大をもつ１８月齢のＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの全写真。（ｂ）６月齢のＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの甲状腺の顕微鏡写真。甲状腺の濾胞はコロイドで充血し、それらの形状は不規則である。（ｃ）６月齢のマウスの甲状腺のより高い倍率での顕微鏡写真。腺全体にわたる、コロイドの充満した濾胞の代わりに、濾胞性の組織化(follicular organization)のほとんどまたは全くない細胞の固体塊が存在する。乳頭癌が明白である。６月齢Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの、低い（ｄ）および高い（ｅ）倍率での通常の甲状腺を比較のために示す。
【図１４Ａ】ＬＬＯおよびＡｃｔＡ融合物が、無処置マウスまたはＬＭ−ＮＰ（対照）で処理されたマウスと比較して、野生型マウスおよびＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ａ）で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいて、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの固形腫瘍の退縮を誘導することを表す図である。
【図１４Ｂ】ＬＬＯおよびＡｃｔＡ融合物が、無処置マウスまたはＬＭ−ＮＰ（対照）で処理されたマウスと比較して、野生型マウスおよびＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（Ｂ）で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいて、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの固形腫瘍の退縮を誘導することを表す図である。
【図１４Ｃ】ＬＬＯおよびＡｃｔＡ融合物が、無処置マウスまたはＬＭ−ＮＰ（対照）で処理されたマウスと比較して、野生型マウスおよびＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｃ）で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいて、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの固形腫瘍の退縮を誘導することを表す図である。これは４回の免疫化により行った。
【図１４Ｄ】ＬＬＯおよびＡｃｔＡ融合物が、無処置マウスまたはＬＭ−ＮＰ（対照）で処理されたマウスと比較して、野生型マウスおよびＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（Ｄ）で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいて、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの固形腫瘍の退縮を誘導することを表す図である。これは４回の免疫化により行った。
【図１５】ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７ワクチンがマウス甲状腺重量を減少させたことを表す図である。６〜８週齢のマウスを、１×１０８Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７または２．５×１０８Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で毎月１回８ヶ月間免疫化した。最後の免疫化から２０日後にマウスを犠牲にし、その甲状腺を取り出して秤量した。
【図１６】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンが、ラットＨｅｒ２が自己抗原として発現されるラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて、確立されたラットＨｅｒ２発現腫瘍の成長を遅くすることを示す図である。
【図１７】ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍成長を制御することを示す図である。
【図１８】ＬＭ組換え体に感染させた宿主細胞によるインビトロ提示を表す図である。Ｊ７７４細胞を細菌に感染させ、５１Ｃｒ放出アッセイの標的として用いた。エフェクターは、Ｋｄ拘束性ＮＰエピトープで刺激したインフルエンザ免疫マウスの脾細胞であった。白色円：非感染Ｊ７７４細胞；黒色円：Ｋｄ拘束性ＮＰペプチドでパルスしたもの；白色正方形：１０４０３株で感染させたもの；白色三角形：ＤＰ−Ｌ２８４０で感染させたもの；黒色三角形：ＤＰ−Ｌ２８５１で感染させたもの；黒色正方形：ＤＰ−Ｌ２０２８で感染させたもの。
【図１９】組換えＬＭ株で免疫化した後のＮＰ特異的ＣＴＬの誘導を示す図である。ＤＰ−Ｌ２０２８（Ａ）またはＤＰ２８５１（Ｂ）で免疫化したマウスの脾細胞を、インビトロで５日間、Ｋｄ拘束性ＮＰペプチドで刺激し、５１Ｃｒ放出アッセイのエフェクターとして用いた。標的は、未処理のＰ８１５細胞（白色正方形）、Ｋｄ拘束性ＮＰペプチドでパルスしたもの（黒色正方形）、Ｋｄ拘束性ＬＬＯペプチドでパルスしたもの（黒色三角形）またはＤｂ拘束性ＮＰペプチドでパルスしたもの（黒色円）であった。
【図２０】示されたワクチンで免疫化されたマウスの肺抽出物および無処置マウスの肺抽出物の肺インフルエンザウイルスの力価を表す図である。各パネルは別々の機会に行われた実験を表す。実験１および２に関してＮは３であり、実験３および４に関して６である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＩｇＥ定常領域の断片を含む組換えペプチド、それをコードするヌクレオチド分子、それを含む組換えワクチンベクター、ならびに、免疫応答を誘導し、アレルギーおよび喘息を治療するための、それを含む方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、ＩｇＥ定常領域の断片（「ＩｇＥ断片」）、および非ＩｇＥアミノ酸（ＡＡ）配列を含む組換えペプチドを提供する。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、リステリオリシン（ＬＬＯ）ＡＡ配列である。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列である。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。本明細書に記載されるように、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列およびその断片との融合は、抗原の細胞性免疫原性を増強する。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、当分野で公知の任意のその他の免疫原性非ＩｇＥＡＡ配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１９】
一実施形態では、断片は、核酸、ペプチドまたはタンパク質の一部であり、それは、一実施形態では、全核酸、ペプチドまたはタンパク質の所望の機能および／または特性を保持する。
【００２０】
本発明の方法および組成物のＬＬＯＡＡ配列は、もう１つの実施形態では、非溶血性のＬＬＯＡＡ配列である。もう１つの実施形態では、配列はＬＬＯ断片である。もう１つの実施形態では、配列は完全なＬＬＯタンパク質である。もう１つの実施形態では、配列は、当分野で公知の任意のＬＬＯタンパク質またはその断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２１】
本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、もう１つの実施形態では、次の配列：
【化１】
2009545330.tif 000002
を有する；その核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７に示される:
【化２】
2009545330.tif 000003
この配列に相当するプロタンパク質の最初の２５ＡＡはシグナル配列であり、細菌により分泌されるとＬＬＯから切断される。従って、この実施形態では、全長活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。もう１つの実施形態では、上記配列は、本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として用いられる。もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯＡＡ配列は、配列番号１の相同体である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号１の変異体である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号１の断片である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号１のイソ型である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２２】
一実施形態では、イソ型は、別のペプチドまたはタンパク質と同じ機能および類似の（または同一の）配列を有するペプチドまたはタンパク質であるが、異なる遺伝子の生成物である。一実施形態では、変異体は軽微な点で別のものとは異なるものである。
【００２３】
もう１つの実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片が本発明の組成物および方法に利用される。もう１つの実施形態では、Ｎ末端のＬＬＯ断片は、Ｎ末端断片である。もう１つの実施形態では、Ｎ末端のＬＬＯ断片は次の配列を有する：
【化３】
2009545330.tif 000004
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯＡＡ配列は、配列番号２に示される配列を含む。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号２の相同体である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号２の変異体である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号２の断片である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号２のイソ型である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２４】
もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は次の配列を有する：
【化４】
2009545330.tif 000005
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯＡＡ配列は、配列番号３に示される配列を含む。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号３の相同体である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号３の変異体である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号３の断片である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯＡＡ配列は、配列番号３のイソ型である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２５】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様ドメインを含む。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片が利用される。
【００２６】
もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片はカルボキシ末端に活性化ドメインを含まない。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含まない。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、非溶血性の断片である。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または変異により非溶血性となる。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または変異により非溶血性となる。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の位置での欠失または変異により非溶血性となる。
【００２７】
もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の約４４１ＡＡからなる。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、５２９ＡＡ全長ＬＬＯタンパク質の最初の約４００〜４４１ＡＡを含む。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質の１〜４４１ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの最初の約４２０ＡＡからなる。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質の１〜４２０ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの約２０〜４４２ＡＡからなる。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質の２０〜４４２ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、システイン４８４を含む活性化ドメインを含まない任意のΔＬＬＯ、および特にシステイン４８４を含まないΔＬＬＯが、本発明の方法および組成物に適している。
【００２８】
もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４００ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の３００ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の２００ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の１００ＡＡに相当する。もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の５０ＡＡに相当し、それは、一実施形態では、１またはそれ以上のＰＥＳＴ様配列を含む。
【００２９】
もう１つの実施形態では、ＬＬＯ断片は、上記のＡＡ範囲の１つに相当する、相同ＬＬＯタンパク質の残基を含む。残基数は、もう１つの実施形態では、上に列挙される残基数に正確に一致する必要はない；例えば、相同のＬＬＯタンパク質が、本明細書で用いられるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合。
【００３０】
各ＬＬＯタンパク質およびＬＬＯ断片は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００３１】
本発明の方法および組成物のもう１つの実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、ＩｇＥ断片に融合される。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は次の配列を有する。
【化５】
2009545330.tif 000006
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号４に示される配列を含む。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号４の相同体である。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号４の変異体である。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号４の断片である。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号４のイソ型である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３２】
もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、次の配列を含む組換えヌクレオチドにコードされる：
【化６】
2009545330.tif 000007
もう１つの実施形態では、組換えヌクレオチドは、配列番号５に示される配列を有する。もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号５に示される配列を含む。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号５の相同体である。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号５の変異体である。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号５の断片である。もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号５のイソ型である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３３】
もう１つの実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当分野で公知の任意のその他のＡｃｔＡ断片である。もう１つの実施形態では、本発明の組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意のその他の配列を含む。もう１つの実施形態では、組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質全体をコードする任意のその他の配列を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３４】
本発明の方法および組成物のもう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、ＩｇＥ断片に融合される。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号６）である。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号７）である。もう１つの実施形態では、抗原と任意のＬＬＯ配列（一実施形態では、本明細書に列挙されるＰＥＳＴ様ＡＡ配列の１つである）の融合は、ＩｇＥに対する細胞性免疫を増強することができる。
【００３５】
もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、リステリアＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ様配列である。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、次の配列である。
【化７】
2009545330.tif 000008
もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ｌｓｏ遺伝子にコードされる、リステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)細胞溶解素に由来する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号１２）である。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、連鎖球菌属の種(Streptococcus sp)のストレプトリジンＯタンパク質に由来する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)ストレプトリジンＯ、例えば３５〜５１ＡＡのＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１３）に由来する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)ストレプトリジンＯ、例えば３８〜５４ＡＡのＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１４）に由来する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、配列番号８〜１４から選択される配列を有する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、配列番号６〜１４から選択される配列を有する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。
【００３６】
「ＰＥＳＴ様配列」とは、もう１つの実施形態では、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）残基に富む領域をさす。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１２ＡＡ長の、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、および／またはトレオニン（Ｔ）残基の局所濃度の高い親水性のストレッチと定義される。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、正に帯電したＡＡ、すなわちアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）を含まない。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、いくつかの正に帯電したアミノ酸を含有する１またはそれ以上のクラスターに隣接されている。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、それを含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は１またはそれ以上の内部リン酸化部位を含み、これらの部位でのリン酸化がタンパク質分解に先行する。
【００３７】
一実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ様配列は、方法、例えばＬＭに関してＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ(1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271)により、およびＲｏｇｅｒｓら(Science 1986; 234(4774): 364-8）に記載されるものに従って同定される。あるいは、その他の原核生物に由来するＰＥＳＴ様ＡＡ配列を、この方法に基づいて同定することもできる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が含まれると予測されるその他の原核生物としては、限定されるものではないが、その他のリステリア種が挙げられる。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓらに開示されるアルゴリズムに適合する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらに開示されるアルゴリズムに適合する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列はＰＥＳＴ検出プログラムを用いて同定される。
【００３８】
もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特定されたタンパク質配列内の正に帯電したＡＡ  Ｒ、Ｈ、およびＫについての初期スキャンにより達成される。正に帯電したフランク(flanks)間の全てのＡＡを計数し、ウィンドウサイズのパラメータに等しいかまたはそれより多いＡＡ数を含むモチーフだけをさらに考慮する。もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含まなければならない。
【００３９】
もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質は、決定的なＡＡが局所的に豊富であることならびにモチーフの疎水性に基づくパラメータをスコア化することにより洗練される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴが豊富であることは質量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰおよび１当量のＳまたはＴについて補正される。もう１つの実施形態では、疎水性の計算は、原則としてＪ．ＫｙｔｅおよびＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法に従う（Kyte, Ｊ and Dootlittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982)。簡略化した計算のためには、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指標（通常−４．５（アルギニン）から＋４．５（イソロイシン）までである）を、次の一次変換を用いて正の整数に変換し、０（アルギニン）から９０（イソロイシン）までの値を生じる。
ハイドロパシー指標＝１０＊Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指標＋４５
【００４０】
もう１つの実施形態では、可能性のあるＰＥＳＴモチーフの疎水性を、各ＡＡ種に関してモルパーセントと疎水性指標の積の合計として計算する。次の方程式により表されるように、局所的に豊富であるというタームと疎水性であるというタームの組合せとして所望のＰＥＳＴスコアを得る。
【００４１】
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指標。
【００４２】
もう１つの実施形態では、「ＰＥＳＴ様配列」または「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」とは、上記アルゴリズムを用いて少なくとも＋５のスコアを有するペプチドをさす。もう１つの実施形態では、この用語は、少なくとも６のスコアを有するペプチドをさす。もう１つの実施形態では、このペプチドは少なくとも７のスコアを有する。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも８である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも９である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１０である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１１である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１２である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１３である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１４である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１５である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１６である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１７である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１８である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも１９である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２０である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２１である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２２である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２２である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２４である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２４である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２５である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２６である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２７である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２８である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも２９である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも３０である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも３２である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも３５である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも３８である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも４０である。もう１つの実施形態では、このスコアは少なくとも４５である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４３】
もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当分野で公知の任意のその他の方法またはアルゴリズム、例えばＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. 2005 Jun; 21 Suppl 1:i169-76）を用いて同定される。もう１つの実施形態では、次の方法が使用される。
【００４４】
ＰＥＳＴ指標は、１の値をＡＡＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることにより、適当な長さのそれぞれのストレッチ（例えば３０〜３５ＡＡのストレッチ）について計算される。ＰＥＳＴ残基のそれぞれに対する係数値（ＣＶ）は１であり、その他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）のそれぞれに対する係数値は０である。
【００４５】
ＰＥＳＴ様配列を同定するための各方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４６】
もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当分野で公知の任意のその他のＰＥＳＴ様配列である。それぞれのＰＥＳＴ様配列およびその種類は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４７】
「ＰＥＳＴ様配列との融合」とは、もう１つの実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むタンパク質断片と融合することをさす。もう１つの実施形態では、この用語には、タンパク質断片がＰＥＳＴ様配列以外の周囲の配列を含む場合が含まれる。もう１つの実施形態では、このタンパク質断片はＰＥＳＴ様配列からなる。従って、もう１つの実施形態では、「融合」とは、そのそれぞれの末端で連結されているか、または一方が他方の中に埋め込まれている２つのペプチドまたはタンパク質断片をさす。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４８】
もう１つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、適当な配列をサブクローニングし、それに続いて得られるヌクレオチドを発現させることを含むプロセスにより調製される。もう１つの実施形態では、部分配列をクローニングし、適当な制限酵素を用いて適当な部分配列を切断する。この断片は次に連結され、もう１つの実施形態では、所望のＤＮＡ配列が作製される。もう１つの実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて作製される。最初に、ネイティブＤＮＡのセグメントを新しい末端のいずれかの側で別々に増幅する。一方の増幅配列の５’末端はペプチドリンカーをコードし、さらにもう一方の増幅配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。最初の断片の５’末端は第２の断片の３’末端と相補的であるので、この２つの断片を（例えばＬＭＰアガロースでの部分的精製後に）第３のＰＣＲ反応において重複する鋳型として用いることができる。増幅配列は、コドン、開口部位のカルボキシ側のセグメント（これからアミノ配列を形成する）、リンカー、および開口部位のアミノ側の配列（これからカルボキシル配列を形成する）を含む。次に、この挿入断片をプラスミドの中に連結する。もう１つの実施形態では、同様の戦略を用いてＩｇＥタンパク質断片が非相同ペプチドの中に埋め込まれているタンパク質が作製される。
【００４９】
一実施形態では、ペプチド、例えばＨＰＶ  Ｅ７と融合したＡｃｔＡ、ＬＬＯおよび／またはＰＥＳＴ様配列は、たとえ融合ペプチドが非リステリアベクターにおいて発現したとしても（実施例４）、前記ペプチドに対する免疫応答を増大させ（実施例２）、抗腫瘍免疫を付与し（実施例１および３）、ペプチド特異的ＣＤ８＋細胞を生成した（実施例２および３）。一実施形態では、自己抗原（一実施形態では、その生物により内因的に産生される抗原である）であるペプチドと融合したＬＬＯおよび／またはＰＥＳＴ様配列は、前記自己抗原に対する免疫応答を増大させた（実施例５〜７）。
【００５０】
もう１つの実施形態では、本発明の組換えポリペプチドは、ＩｇＥ断片を含む第１のポリペプチドと非ＩｇＥＡＡ配列を含む第２のポリペプチドを化学的に結合する段階を含むプロセスにより作成される。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片を、非ＩｇＥＡＡ配列を含む第２のポリペプチドに結合させる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片を含むペプチドを、非ＩｇＥＡＡ配列に結合させる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片を、非ＩｇＥＡＡ配列に結合させる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５１】
本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、もう１つの実施形態では、Ｃε−１ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片はＣε−２ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片はＣε−３ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片はＣε−４ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片はＭ１ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片はＭ２ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片はＭ１／Ｍ２ドメインである。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片には１よりも多くの上記ドメインが含まれる（例えばＣε−１およびＣε−２）。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、上記のドメインの中の１つの断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、上記のドメインの中の１つと重複するが完全には含まない（例えばＣε−３ドメインの一部分を含む領域）。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、上記のドメインの中の１つより多くと重複する（例えばＭ１ドメインの一部分およびＭ２ドメインの一部分）。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、当分野で公知の任意のその他のＩｇＥの領域または断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５２】
「Ｍ１ドメイン」、「Ｍ２ドメイン」、および「Ｍ１／Ｍ２ドメイン」とは、もう１つの実施形態では、それぞれ、Ｍ１、Ｍ２、およびＭ１＋Ｍ２エキソンによりコードされるドメインをさす。もう１つの実施形態では、この用語は、上記ドメインの中の１つと重複するＩｇＥ断片をさす。
【００５３】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥタンパク質は、ヒトＩｇＥタンパク質である。もう１つの実施形態では、このタンパク質は、マウスＩｇＥタンパク質である。もう１つの実施形態では、このタンパク質は、当分野で公知の任意のその他の種に由来する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５４】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、次の配列の断片である。
【化８】
2009545330.tif 000009
もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１５の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１５の相同体の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１５の変異体の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１５のイソ型の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５５】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、配列番号１６に示したヌクレオチド配列によりコードされるＡＡ配列の断片である（実施例９）。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１６のヒト相同体の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１６の変異体の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１６のイソ型の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１６のヒト相同体の変異体の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１６のヒト相同体のイソ型の断片によりコードされる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５６】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、次のＡＡ配列を有する。
【化９】
2009545330.tif 000010
もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１７の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１７の相同体の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１７の変異体の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１７のイソ型の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５７】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、次の配列を有するヌクレオチド分子によりコードされる。
【化１０】
2009545330.tif 000011
【００５８】
もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１８の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１８のヒト相同体の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１８の変異体の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１８のイソ型の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１８のヒト相同体の変異体の断片によりコードされる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１８のヒト相同体のイソ型の断片によりコードされる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５９】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、次のＡＡ配列を有する。
【化１１】
2009545330.tif 000012
【００６０】
もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１９の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１９の相同体の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１９の変異体の断片である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、配列番号１９のイソ型の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６１】
もう１つの実施形態では、本発明のワクチン中の選択的にスプライシングされたＩｇＥイソ型のｃＤＮＡが投与される。もう１つの実施形態では、選択的にスプライシングされたＩｇＥイソ型のｃＤＮＡの断片が投与される。選択的にスプライシングされたＩｇＥイソ型は当分野で周知であり、例えば、Ｂａｔｉｓｔａ  ＦＤら（Characterization of a second secreted IgE isoform and identification of an asymmetric pathway of IgE assembly． Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Apr 16; 93(8): 3399-404)およびＬｙｃｚａｋ  ＪＢら（Expression of novel secreted isoforms of human immunoglobulin E proteins. J Biol Chem. 1996 Feb 16; 271(7): 3428-36）に記載されている。それぞれのイソ型およびそのそれぞれの断片は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６２】
もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、当分野で公知の任意のその他のＩｇＥタンパク質の任意のその他の断片である。
【００６３】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、非ＩｇＥＡＡ配列と融合されている。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ断片は、非ＩｇＥＡＡ配列の中に埋め込まれている。もう１つの実施形態では、本明細書において例証されるように（ＤＰ−Ｌ２８５１、実施例８）、ＩｇＥ由来ペプチドは、ＬＬＯ断片、ＡｃｔＡタンパク質もしくは断片、またはＰＥＳＴ様配列の中に組み込まれる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６４】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、約４００残基よりも小さい。もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、約１４ｋＤａよりも小さい。もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、約６０ｋＤよりも小さいが、一方、もう１つの実施形態では、それは約５０ｋＤよりも小さく、一方、もう１つの実施形態では、それは約２５ｋＤよりも小さい。もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物のＩｇＥ断片は、組換えリステリア株により容易に分泌されることのできるサイズである。
【００６５】
もう１つの実施形態では、本発明のＩｇＥ断片の長さは、少なくとも８アミノ酸（ＡＡ）である。もう１つの実施形態では、この長さは８ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも９ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは９ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも１０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも１１ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１１ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも１２ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１２ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約１４ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１４ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約１６ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１６ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約１８ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１８ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約２０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは２０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約２５ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは２５ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約３０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは３０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約４０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは４０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは５０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは７０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１００ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは１５０ＡＡを超える。もう１つの実施形態では、この長さは少なくとも約２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは２００ＡＡを超える。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６６】
もう１つの実施形態では、この長さは約８〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約９〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１０〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１１〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１２〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１５〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約８〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約２０〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約３０〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約４０〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜７０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約５０〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜１００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約７０〜５００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１００〜１５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１００〜２００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１００〜２５０ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１００〜３００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１００〜４００ＡＡである。もう１つの実施形態では、この長さは約１００〜５００ＡＡである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６７】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えポリペプチドは、シグナル配列を含む。もう１つの実施形態では、シグナル配列は、ワクチンベクターを構築するために用いた生物に由来する。もう１つの実施形態では、シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列である。もう１つの実施形態では、シグナル配列は、ＡｃｔＡシグナル配列である。もう１つの実施形態では、シグナル配列は、リステリアのシグナル配列である。もう１つの実施形態では、シグナル配列は、当分野で公知の任意のその他のシグナル配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６８】
用語「ペプチド」および「組換えペプチド」とは、もう１つの実施形態において、任意の長さのペプチドまたはポリペプチドをさす。もう１つの実施形態では、本発明のペプチドまたは組換えペプチドは、ＩｇＥ断片について上に列挙される長さの中の１つを有する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６９】
一実施形態では、用語「ペプチド」とは、ネイティブペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）および／またはペプチドミメティクス（典型的に、合成的に合成されたペプチド）、例えば、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドなどをさし、それらは、例えば、一団となっている間にそれらのペプチドをより安定にするか、または細胞への浸透をより可能にする修飾を有してよい。かかる修飾としては、限定されるものではないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾が挙げられ、それには、限定されるものではないが、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨ、骨格修飾、および残基修飾が含まれる。ペプチドミメティック化合物を調製するための方法は当分野で周知であり、例えば、本明細書において完全に説明されるように参照により援用される、Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)に明記されている。この点に関するさらなる詳細は本明細書の下文に記載されている。
【００７０】
ペプチド内部のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、＊Ｒが任意のアルキル、例えばメチルである−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、逆アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、Ｒが天然に炭素原子上に提示される「通常の」側鎖である、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）により置換されてよい。
【００７１】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のいずれかで生じてもよく、さらに同時に数箇所（２〜３）で生じてもよい。天然の芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅを、合成非天然酸、例えば、ＴＩＣ、ナフチルアラニン(naphthylelanine)（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどに対して置換してもよい。
【００７２】
上記の内容に加えて、本発明のペプチドはまた、１またはそれ以上の修飾されたアミノ酸あるいは１またはそれ以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合糖質など）も含んでよい。
【００７３】
一実施形態では、用語「アミノ酸（単数）」または「アミノ酸（複数）」は、２０種類の天然に存在するアミノ酸（それらのアミノ酸はしばしば翻訳後にインビボで修飾され、それには、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンが挙げられる）、ならびにその他の異常アミノ酸（限定されるものではないが、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが挙げられる）を含むものと理解される。さらに、用語「アミノ酸（単数）」にはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の両方が含まれうる。
【００７４】
本発明のペプチドまたはタンパク質は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当分野で公知の様々な技法により調製することができる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)）。
【００７５】
一実施形態では、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「核酸」と互いに交換可能であり、限定されるものではないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列も含みうる分子をさしうる。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列もさす。
【００７６】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドおよびアジュバントを含むワクチンを提供する。
【００７７】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、本発明の組換えペプチドをコードする組換えワクチンベクターを含む。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、本発明の組換えペプチドをコードするプラスミドを含む。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００７８】
本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、もう１つの実施形態では、主にＴｈ１型免疫応答を好むアジュバントを含む。もう１つの実施形態では、このアジュバントは主にＴｈ１依存性免疫応答を好む。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答を好む。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、Ｔｈ１依存性免疫応答を好む。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、抗体依存性応答よりも細胞性免疫応答を好む。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、当分野で公知の任意のその他の種類のアジュバントである。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、標的ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘導する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００７９】
もう１つの実施形態では、前記アジュバントはＭＰＬである。もう１つの実施形態では、このアジュバントはＱＳ２１である。もう１つの実施形態では、このアジュバントはＴＬＲアゴニストである。もう１つの実施形態では、このアジュバントはＴＬＲ４アゴニストである。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、ＴＬＲ９アゴニストである。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）である。もう１つの実施形態では、このアジュバントはイミキモドである。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、サイトカインまたはそれをコードするヌクレオチド分子である。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、ケモカインまたはそれをコードするヌクレオチド分子である。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、ＩＬ−１２またはそれをコードするヌクレオチド分子である。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、ＩＬ−６またはそれをコードするヌクレオチド分子である。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、リポ多糖類である。もう１つの実施形態では、このアジュバントは、当分野で公知の任意のその他のアジュバントである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８０】
「主にＴｈ１型免疫応答」とは、もう１つの実施形態では、標準法により検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の６０％より多くがＴｈ１型Ｔ細胞である免疫応答をさす。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の７０％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の８０％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の８５％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の９０％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の９５％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の９７％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の９９％より多くがＴｈ１型である。もう１つの実施形態では、検出可能な抗原特異的Ｔｈ２型ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在しない。もう１つの実施形態では、バックグラウンドレベルの抗原特異的Ｔｈ２型ＣＤ４＋Ｔ細胞しか検出されない。
【００８１】
もう１つの実施形態では、「主にＴｈ１型免疫応答」とは、ＩＦＮ−γが分泌される免疫応答をさす。もう１つの実施形態では、それは腫瘍壊死因子−βが分泌される免疫応答をさす。もう１つの実施形態では、それはＩＬ−２が分泌される免疫応答をさす。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８２】
主にＴｈ１型免疫応答を「好む」とは、もう１つの実施形態では、試験された大多数の被検体において主にＴｈ１型免疫応答を誘導することをさす。もう１つの実施形態では、この用語は、６０％を超える試験された被検体における、主にＴｈ１型免疫応答の誘導をさす。もう１つの実施形態では、この数は７０％を超える。もう１つの実施形態では、この数は８０％を超える。もう１つの実施形態では、この数は８５％を超える。もう１つの実施形態では、この数は９０％を超える。もう１つの実施形態では、この数は９５％を超える。もう１つの実施形態では、この数は９８％を超える。もう１つの実施形態では、この数は１００％である。もう１つの実施形態では、この数は６０％である。もう１つの実施形態では、この数は７０％である。もう１つの実施形態では、この数は８０％である。もう１つの実施形態では、この数は８５％である。もう１つの実施形態では、この数は９０％である。もう１つの実施形態では、この数は９５％である。もう１つの実施形態では、この数は９８％である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８３】
Ｔｈ１型およびＴｈ２型Ｔ細胞のレベルを測定するために用いる方法は、もう１つの実施形態では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。もう１つの実施形態では、この方法は、当分野で公知の任意のその他の方法である。免疫応答ならびにＴｈ１細胞とＴｈ２Ｔ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のレベルを測定する方法は当分野で周知であり、例えば、フローサイトメトリー、標的細胞溶解アッセイ（もう１つの実施形態では、クロム放出アッセイ）四量体の使用などが挙げられる；これらには細胞表現型、遺伝子拘束、および応答認識の微細な特異性を決定するための方法が含まれる。これらの方法は、例えば、Current Protocols in Immunology (John E. Coligan et al, (C)2006 by John Wiley & Sons, Inc)に記載されている。もう１つの実施形態では、免疫応答を測定する方法は、Ｔ細胞に対するインビトロ抗原提示および／または抗原特異的ＣＴＬの増殖を含む。インビトロ抗原提示および／またはＣＴＬ増殖のための方法は当分野で周知であり、例えば、Ｓｈｅｉｌら(Identification of an autologous insulin B chain peptide as a target antigen for H-2Kb-restricted cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med. 1992 Feb 1;175(2):545-52)およびＣａｒｂｏｎｅら(Induction of cytotoxic T lymphocytes by primary in vitro stimulation with peptides. J Exp Med. 1988 Jun 1;167(6):1767-79)に記載されている。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８４】
本発明の方法および組成物で利用される免疫原性組成物は、もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターを含む。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターは、本発明の組換えペプチドを含む。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターは、本発明のヌクレオチド分子を含む。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターは、本発明の組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８５】
もう１つの実施形態では、本発明は、ペプチドを発現している組換えリステリア株を提供し、前記ペプチドはＩｇＥ定常領域の断片を含む。
【００８６】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む組換えワクチンベクターを提供する。もう１つの実施形態では、この発現ベクターはプラスミドである。組換えベクターを構築および利用するための方法は当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、およびＢｒｅｎｔら(2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されている。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８７】
もう１つの実施形態では、ベクターは細胞内病原体である。もう１つの実施形態では、ベクターはサイトゾル病原体に由来する。もう１つの実施形態では、ベクターは細胞内病原体に由来する。もう１つの実施形態では、細胞内病原体は主に細胞性免疫応答を誘導する。もう１つの実施形態では、ベクターはサルモネラ菌株である。もう１つの実施形態では、ベクターはＢＣＧ株である。もう１つの実施形態では、ベクターは細菌ベクターである。もう１つの実施形態では、細胞内病原体を用いても抗原特異的Ｔｈ２型細胞は誘導されないので、ＩｇＥ産生Ｂ細胞がポリクローナル増殖（例えばＴｈ２ＣＤ４＋細胞によるＩＬ−４分泌により誘導される増殖）を受ける可能性は低下する。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターは著しい抗体応答を誘導しない。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターは主にＴｈ１型免疫応答を誘導する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８８】
もう１つの実施形態では、ベクターは、サルモネラ菌属の種、赤痢菌属の種、ＢＣＧ、リステリア・モノサイトゲネス(L. monocytogeges)、大腸菌(E. coli)およびストレプトコッカス・ゴルドニ(S.gordonii)から選択される。もう１つの実施形態では、融合タンパク質は、ファゴリソソーム融合を回避して細胞の細胞質に存在するよう修飾された組換え細菌ベクターにより送達される。もう１つの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。その他の実施形態では、ベクターは、ワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、修飾ワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、疱疹ウイルス、およびレトロウイルスから選択される。もう１つの実施形態では、ベクターはネイキッドＤＮＡベクターである。もう１つの実施形態では、ベクターは当分野で公知の任意のその他のベクターである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８９】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。
【００９０】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えヌクレオチド分子およびアジュバントを含むワクチンを提供する。
【００９１】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えヌクレオチド分子を含む組換えワクチンベクターを提供する。
【００９２】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えヌクレオチド分子を含む組換えリステリア株を提供する。
【００９３】
本発明の方法および組成物の組換えリステリア株は、もう１つの実施形態では、組換えリステリア・モノサイトゲネス株である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)株である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・グレイ(Listeria grayi)株である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)株である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・ムライ(Listeria murrayi)株である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・ウェルシメリ(Listeria welshimeri)株である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、当分野で公知の任意のその他のリステリア種の組換え株である。
【００９４】
もう１つの実施形態では、リステリア株は遺伝子の欠失により弱毒化される。もう１つの実施形態では、リステリア株は１より多くの遺伝子の欠失により弱毒化される。もう１つの実施形態では、リステリア株は遺伝子の欠失または不活性化により弱毒化される。もう１つの実施形態では、リステリア株は１より多くの遺伝子の欠失または不活性化により弱毒化される。
【００９５】
もう１つの実施形態では、変異される遺伝子はｈｌｙである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ａｃｔＡである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ｐｌｃＡである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ｐｌｃＢである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ｍｐlである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ｉｎｌＡである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ｉｎｌＢである。もう１つの実施形態では、変異される遺伝子は、ｂｓｈである。
【００９６】
もう１つの実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。もう１つの実施形態では、リステリア株は、ビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子を欠損している。もう１つの実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子を欠損している。
【００９７】
もう１つの実施形態では、リステリア株は、ＡＡ代謝酵素を欠損している。もう１つの実施形態では、リステリア株は、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子を欠損している。もう１つの実施形態では、リステリア株は、ｄａｔ遺伝子を欠損している。もう１つの実施形態では、リステリア株は、ｄａｌ遺伝子を欠損している。もう１つの実施形態では、リステリア株は、ｄｇａ遺伝子を欠損している。もう１つの実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子ＣｙｓＫを欠損している。もう１つの実施形態では、この遺伝子はビタミン−Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｒｐＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｒｐＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｒｐＥである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｓｎＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｇｌｔＤである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｇｌｔＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｌｅｕＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｒｇＧである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｈｒＣである。もう１つの実施形態では、リステリア株は、本明細書の上文に記載される遺伝子の１またはそれ以上を欠損している。
【００９８】
もう１つの実施形態では、リステリア株は、シンターゼ遺伝子を欠損している。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｆｏｌＰである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｉｓｐＤである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｉｓｐＦである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｈｉｓＦである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｈｉｓＨである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｆｌｉＩである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、リボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｉｓｐＤである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｃｏｂＳである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｃｏｂＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｃｂｉＤである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｃｏｂＱである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｕｐｐＳである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｒｕＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｄｘｓである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｍｖａＳである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｄａｐＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｉｓｐＧである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｆｏｌＣである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、クエン酸シンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｒｇＪである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ成分である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｍｅｎＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、メナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｃａｒＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｃａｒＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｈｙＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｍｇｓＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｒｏＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｈｅｐＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｒｌｕＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｉｌｖＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｉｌｖＮである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｌｓＳである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｆａｂＦである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｆａｂＨである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、シュードウリジンシンターゼである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｐｙｒＧである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｔｒｕＡである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｐａｂＢである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｔｐシンターゼ遺伝子（例えばａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）である。
【００９９】
もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｐｈｏＰである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｒｏＡおよび／またはａｒｏＣである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ａｒｏＤである。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ｐｌｃＢである。
【０１００】
もう１つの実施形態では、リステリア株は、ペプチド輸送体を欠損している。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、糖ＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、リン酸輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ＺＩＰ亜鉛輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、硫酸輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、プロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、マグネシウム輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、蟻酸塩／亜硝酸輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、スペルミジン／プトレッシンＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、Ｎａ／Ｐｉ共輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、糖リン酸輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、グルタミンＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、主要なファシリケーター(major facilitator)ファミリーの輸送体．である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、モリブデンＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、タイコ酸(techoic acid)ＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、コバルトＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、アンモニウム輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、アミノ酸ＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、マンガンＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。もう１つの実施形態では、この遺伝子は、上記のタンパク質の中の１つのサブユニットである。
【０１０１】
もう１つの実施形態では、本発明の組換えリステリア株は、動物宿主を通じて継代されている。もう１つの実施形態では、継代はワクチンベクターとしての株の効力を最大にする。もう１つの実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を安定化させる。もう１つの実施形態では、継代はリステリア株の毒性を安定化させる。もう１つの実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を増大させる。もう１つの実施形態では、継代はリステリア株の毒性を増大させる。もう１つの実施形態では、継代は、不安定なリステリア株の亜株を取り除く。もう１つの実施形態では、継代は、不安定なリステリア株の亜株の蔓延を低減する。動物宿主を通じて組換えリステリア株を継代するための方法は当分野で周知であり、例えば、米国特許出願第１０／５４１，６１４号に記載されている。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。それぞれのリステリア株およびその種類は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０２】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えリステリアは、抗原またはＬＬＯ−抗原融合物をコードする構築物で安定に形質転換される。一実施形態では、この構築物は、さらなるサブクローニングを促進するためにポリリンカーを含む。組換えリステリアを作製するためのいくつかの技法が公知である；各技法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０３】
もう１つの実施形態では、前記構築物または非相同遺伝子は、相同組換えを用いてリステリア染色体に統合される。相同組換えのための技法は当分野で周知であり、例えば、Frankel, FR, Hegde, S, Lieberman, J, and Y Paterson. Induction of a cell-mediated immune response to HIV gag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155: 4766-4774. 1995; Mata, M, Yao, Z, Zubair, A, Syres, K and Y Paterson, Evaluation of a recombinant Listeria monocytogenes expressing an HIV protein that protects mice against viral challenge. Vaccine 19: 1435-45, 2001 ; Boyer, JD, Robinson, TM, Maciag, PC, Peng, X, Johnson, RS, Pavlakis, G, Lewis, MG, Shen, A, Siliciano, R, Brown, CR, Weiner, D, and Y Paterson. DNA prime Listeria boost induces a cellular immune response to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable of limited suppression of S1V239 viral replication. Virology. 333: 88-101, 2005.に記載されている。もう１つの実施形態では、相同組換えは、米国特許第６，８５５，３２０号に記載されるように行われる。もう１つの実施形態では、温度感受性プラスミドを用いて組換え体を選択する。各々の技法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０４】
もう１つの実施形態では、前記構築物または非相同遺伝子は、トランスポゾン挿入を用いてリステリア染色体に統合される。トランスポゾン挿入のための技法は当分野で周知であり、とりわけ、Ｓｕｎら(Infection and Immunity 1990, 58:3770-3778）によりＤＰ−Ｌ９６７の構築において記載されている。トランスポゾン変異は、安定なゲノム挿入変異株を形成することのできるもう１つの実施形態において、利点を有する。もう１つの実施形態では、外来遺伝子がトランスポゾン変異により挿入されているゲノムの位置は不明である。
【０１０５】
もう１つの実施形態では、前記構築物または非相同遺伝子は、ファージ組込み部位を用いてリステリア染色体に統合される(Lauer P, Chow MY et al, Construction, characterization, and use of two LM site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002;184(15): 4177-86)。もう１つの実施形態では、インテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージの結合部位（例えばＵ１５３またはＰＳＡリステリオファージ(listeriophage)）を用いて、ゲノム中の任意の適当な部位であってよい（例えばｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）、対応する結合部位に非相同遺伝子を挿入する。もう１つの実施形態では、内在性プロファージは、構築物または非相同遺伝子の組込みの前に利用される結合部位から救済される(cured)。もう１つの実施形態では、この方法は、単一コピーの組込み体をもたらす。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０６】
もう１つの実施形態では、前記構築物は、リステリア株によりプラスミド上に保有される。抗原融合タンパク質を発現するＬＭベクターは、この技法によって構築されている。Ｌｍ−ＧＧ／Ｅ７は、ｐｒｆＡ−欠失変異株を、１コピーのｐｒｆＡ遺伝子と、本明細書に記載されるように、酵素の溶血作用を除去するために切断されたＬＬＯ（ｈｌｙ）遺伝子の１形態と融合させた１コピーのＥ７遺伝子とを含有するプラスミドで補完することにより作成された。機能性ＬＬＯは、ｈｌｙの内在性染色体のコピーによって生物により維持された。もう１つの実施形態では、このプラスミドは抗生物質抵抗性遺伝子を含む。もう１つの実施形態では、このプラスミドは、形質転換リステリア株のゲノムに欠けている毒性因子をコードする遺伝子を含む。もう１つの実施形態では、この毒性因子はｐｒｆＡである。もう１つの実施形態では、この毒性因子は、ＬＬＯである。もう１つの実施形態では、この毒性因子は、ＡｃｔＡである。もう１つの実施形態では、この毒性因子は、弱毒化の標的として上に列挙される遺伝子のうちのいずれかである。もう１つの実施形態では、この毒性因子は、当分野で公知の任意のその他の毒性因子である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０７】
もう１つの実施形態では、本発明の組換えペプチドは、リステリアタンパク質、例えば、ＰＩ−ＰＬＣ、またはそれをコードする構築物などに融合されている。もう１つの実施形態では、分泌されたリステリアタンパク質のシグナル配列、例えば、溶血素、ＡｃｔＡ、またはホスホリパーゼなどが抗原コード遺伝子に融合されている。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターのシグナル配列が使用される。もう１つの実施形態では、組換えワクチンベクターにおいて機能性であるシグナル配列が使用される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０８】
もう１つの実施形態では、前記構築物は、エピソームの様式でリステリア株に含まれる。もう１つの実施形態では、外来抗原は組換えリステリア株に擁されるベクターから発現される。リステリアにおける発現の各方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０９】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてＩｇＥタンパク質に対する細胞性免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、被検体を（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物と接触させる段階を含み、それにより被検体においてＩｇＥタンパク質に対する細胞性免疫応答を誘導する。もう１つの実施形態では、細胞性免疫応答はＴ細胞応答である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は被検体内で内因的に発現される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１０】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてＩｇＥ発現細胞に対する細胞性免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、被検体を（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物と接触させる段階を含み、それにより被検体においてＩｇＥ発現細胞に対する細胞性免疫応答を誘導する。もう１つの実施形態では、細胞性免疫応答はＴ細胞応答である。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は被検体内で内因的に発現される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１１】
本明細書に提供されるように、本発明のワクチンは抗原特異的ＣＴＬを誘導する。従って、これらのワクチンは、ワクチン、例えば、ＩｇＥおよびＩｇＥ断片（例えば本明細書に列挙されるものの断片）などに存在する抗原を含有する細胞を除去する際に有効である。さらに、本発明のワクチンにより誘導されるＣＴＬは、肺の粘膜面でのウイルス感染に対する防御から明らかなように、粘膜免疫を誘導する（実施例８）。
【０１１２】
本明細書に提供されるように、抗ＩｇＥワクチン接種のための方法は、血清ＩｇＥおよびＩｇＧ力価を決定することにより容易に試験することができる。血清ＩｇＥおよびＩｇＧ１力価を決定するための方法は当分野で周知であり、抗体分泌細胞の別個のアイソタイプを同時に検出することのできる２色ＥＬＩＳＰＯＴアッセイが挙げられる(Czerkinsky et al., 1988)。もう１つの実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプ応答の測定は、ＩｇＥ組換えワクチンを用いる治療がこのアイソタイプを分泌するＢ細胞のみに影響するかどうかを決定するための特異性対照として役立つ。
【０１１３】
本発明の方法のもう１つの実施形態では、被検体は、免疫原性組成物、ベクター、または本発明の組換えペプチドで免疫化される。もう１つの実施形態では、被検体に免疫原性組成物、ベクター、または組換えペプチドが投与される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体を（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物と接触させる段階を含み、それにより、被検体においてアレルギー性喘息を治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させる、被検体においてアレルギー性喘息を治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させる方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてアレルギー性喘息を治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、被検体により内因的に発現される。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１５】
本明細書に提供されるように、本発明のワクチンは、新しく合成されたＩｇＥタンパク質を含む細胞を除去する際に効果的である。従って、本発明のワクチンは全身のＩｇＥレベルを低下させ、それにより、アレルギーおよび喘息の重篤度を有意に低下させ、一部の例では除去する。
【０１１６】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体を（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物と接触させる段階を含み、それにより、被検体においてアレルギーを治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させる、被検体においてアレルギーを治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させる方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてアレルギーを治療する、阻害する、抑制するまたは寛解させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、被検体により内因的に発現される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１７】
もう１つの実施形態では、本発明の方法は、アレルギーまたは喘息に関連する突発性気道閉塞を寛解させる。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、アレルギーまたは喘息に関連する気道の炎症を寛解させる。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、アレルギーまたは喘息に関連する、吸入された収縮刺激性の刺激に対する気管支反応の亢進（気道過敏症［ＡＨＲ］）を寛解させる。
【０１１８】
もう１つの実施形態では、本発明の方法は、肺におけるＴｈ２細胞を含む炎症性浸潤の蓄積に応答するＩｇＥ産生を寛解させる。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、Ｔｈ２サイトカインに応答するＩｇＥ産生を寛解させる。もう１つの実施形態では、このサイトカインはＩＬ−４である。もう１つの実施形態では、このサイトカインはＩＬ−１３である。もう１つの実施形態では、このサイトカインはＩＬ−５である。もう１つの実施形態では、このサイトカインは当分野で公知の任意のその他のＴｈ２サイトカインである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１９】
もう１つの実施形態では、本発明の方法は、可溶性ＩｇＥと結合する細胞または細胞種の活性化を低下させる。もう１つの実施形態では、この細胞種は肥満細胞である。もう１つの実施形態では、この細胞種は当分野で公知の任意のその他のＩｇＥ結合細胞である。もう１つの実施形態では、循環ＩｇＥレベルの低下により効果がもたらされる。もう１つの実施形態では、肺ＩｇＥレベルの低下により効果がもたらされる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２０】
もう１つの実施形態では、本発明の方法は、ＡＨＲを治療するために用いられる。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、全ての種類のアレルギー性疾患を治療するために用いられる。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、治療的に用いられる。もう１つの実施形態では、本発明の方法は、予防的に用いられる。もう１つの実施形態では、アレルギー性疾患は、好酸球増加症、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、肺のＴｈ２サイトカイン応答、および／またはＡＨＲを含む。その他の実施形態では、本発明は、アレルギーまたは喘息に関連するあらゆる疾患、障害、症状、または副作用を治療する方法を提供する。それぞれの疾患、障害、および症状は、本発明の別個の実施形態を表す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
一実施形態では、本発明の方法は、上記のアレルギーまたは喘息に関連する疾患、障害、症状、または副作用のいずれかを治療、抑制、阻害、または予防するために用いられる。一実施形態では、「治療すること」とは、治療的処置および予防または防止的手段の両方をさし、この際、その目的は、本明細書の上文に記載される標的にされた病的状態または障害を予防または軽減することである。従って、一実施形態では、治療することには、疾患、障害または状態、またはその組合せに関連する症状に直接影響を及ぼすまたはそれらを治癒させること、抑制すること、阻害すること、予防すること、その重篤度を低下させること、その発症を遅延させること、減少させることが含まれうる。従って、一実施形態では、「治療すること」とは、とりわけ、進行を遅延させること、緩解を促進すること、緩解を誘導すること、緩解を増大すること、回復を速めること、代替治療法の有効性を高めることまたは代替治療法に対する耐性を低下させること、あるいはその組合せをさす。一実施形態では、「予防すること」とは、とりわけ、症状の発症を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの数または頻度を低下させること、症候性のエピソード間の潜伏期を増やすこと、またはその組合せをさす。一実施形態では、「抑制すること」または「阻害すること」とは、とりわけ、症状の重篤度を低下させること、急性エピソードの重篤度を低下させること、症状の数を低下させること、疾患関連症状の発生率を低下させること、症状の潜伏期を低下させること、症状を寛解させること、二次的症状を低下させること、二次感染を低下させること、患者の生存を延長すること、またはその組合せをさす。
【０１２２】
一実施形態では、症状は原発性であるが、一方、もう１つの実施形態では、症状は二次的である。一実施形態では、「原発性」とは、特定の疾患または障害の直接的結果である症状をさし、一方、一実施形態では、「二次的」とは、原発性の原因から生じるかまたはその結果として起こる症状をさす。一実施形態では、本発明における使用のための化合物は、アレルギーまたは喘息に関連する原発症状または二次的症状または二次的合併症を治療する。もう１つの実施形態では、「症状」は、疾患または病状のどのような徴候であってもよい。
【０１２３】
従って、一実施形態では、本発明は、被検体においてアレルギーを治療する、予防する、阻害する、および／または抑制する方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてアレルギー性喘息を治療する、予防する、阻害する、および／または抑制する方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、被検体において喘息エピソードを治療する、予防する、阻害する、および／または抑制する方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、ＩｇＥ依存性疾患または障害を治療する、予防する、阻害する、および／または抑制する方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、喘息、アレルギー性喘息、喘息エピソード、ＩｇＥ依存性疾患または障害、またはその組合せからの被検体の保護を提供する。
【０１２４】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体において喘息エピソードの発生率を低下させるための組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチドまたは（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。もう１つの実施形態では、組換えペプチドは、非ＩｇＥＡＡ配列をさらに含む。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、本明細書に列挙される任意の非ＩｇＥＡＡ配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２５】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体においてＩｇＥ依存性疾患または障害を治療する、阻害する、抑制する、または寛解させる組成物の調製における、（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）前記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物の使用を提供する。もう１つの実施形態では、ＩｇＥタンパク質は、前記被検体の細胞により内因的に発現される。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、前記ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導する。
【０１２６】
一実施形態では、ＩｇＥ依存性疾患または障害は、アレルギー性疾患、アレルギー性喘息、枯草熱、薬物アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、またはその組合せを含みうる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ依存性疾患または障害は、蕁麻疹、湿疹結膜炎、鼻漏、鼻炎胃腸炎、またはその組合せを含む。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ依存性疾患または障害は、骨髄腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、高ＩｇＥ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、またはその組合せを含む。
【０１２７】
もう１つの実施形態では、ＡＨＲ、アレルギー性肺疾患［ＡＬＤ］およびアレルギー性疾患は、本明細書に記載されるように測定される。もう１つの実施形態では、当分野で公知の別の方法が利用される。ＡＨＲ、ＡＬＤ、およびアレルギー性疾患を評価するための方法は当分野で周知であり、例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＡＭら(Induction of pulmonary allergen-specific IgA responses or airway hyperresponsiveness in the absence of allergic lung disease following sensitization with limiting doses of ovalbumin-alum. Cell Immunol 2001 Sep 15;212(2): 101-9)およびＭａｔｔｅｓ  Ｊら(IL-13 induces airways hyper-reactivity independently of the IL-4R alpha chain in the allergic lung. J Immunol 2001 Aug 1;167(3): 1683-92)に記載されている。それぞれの方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２８】
もう１つの実施形態では、本発明は、被検体を（ａ）ＩｇＥタンパク質またはその断片を含む組換えペプチド；または（ｂ）組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子のいずれかを含む免疫原性組成物と接触させる段階を含み、この際、ＩｇＥタンパク質は被検体の細胞により内因的に発現され、かつ、免疫原性組成物は、ＩｇＥタンパク質に対するＴ細胞性免疫応答の形成を誘導し、それにより被検体において喘息エピソードの発生率を低下させる、被検体において喘息エピソードの発生率を低下させる方法を提供する。もう１つの実施形態では、組換えペプチドは、非ＩｇＥＡＡ配列をさらに含む。もう１つの実施形態では、非ＩｇＥＡＡ配列は、本明細書に列挙される任意の非ＩｇＥＡＡ配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２９】
本発明の方法および組成物に誘導されるＴ細胞性免疫応答は、もう１つの実施形態では、ＣＴＬ媒介性応答を含む。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞性免疫応答に関与するＴ細胞はＣＴＬである。もう１つの実施形態では、この免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。もう１つの実施形態では、この免疫応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３０】
もう１つの実施形態では、Ｔ細胞性免疫応答は、Ｔヘルパー細胞を含む。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞性免疫応答に関与するＴ細胞は、Ｔヘルパー細胞である。もう１つの実施形態では、この免疫応答は、Ｔｈ１型応答である。もう１つの実施形態では、この免疫応答は、主にＴｈ１型応答である。もう１つの実施形態では、この免疫応答は、抗体依存性と反対に、主に細胞性の応答である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３１】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物により誘導されるＩｇＥ特異的Ｔ細胞は、被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させることができる。もう１つの実施形態では、ＩｇＥ特異的Ｔ細胞は、被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を認識することができる。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞性免疫応答に関与するＴ細胞は、被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させることができる。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞は、被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を認識することができる。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞は、被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を溶解させる。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞は、被検体においてＩｇＥ産生Ｂ細胞を認識する。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬ溶解よりも機構によりその標的を死滅させる。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞は、アポトーシスを誘導することによりその標的を死滅させる。もう１つの実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＡＳ−ＦＡＳ−リガンド相互作用を介してその標的を死滅させる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３２】
本発明の方法および組成物により誘導されるＴ細胞により認識または溶解されるＩｇＥ産生Ｂ細胞は、もう１つの実施形態では、表面のＩｇＥ受容体を産生する。もう１つの実施形態では、このＩｇＥ産生Ｂ細胞はＩｇＥ抗体を産生する。もう１つの実施形態では、このＩｇＥ産生Ｂ細胞は可溶性ＩｇＥ抗体を産生する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３３】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物により誘導されるＩｇＥ特異的Ｔ細胞は、ＩｇＥ分子を有するが産生しない非標的細胞を溶解させない。もう１つの実施形態では、非標的細胞は、肥満細胞である。もう１つの実施形態では、非標的細胞は、好塩基球である。もう１つの実施形態では、非標的細胞は、循環好塩基球である。もう１つの実施形態では、非標的細胞は、活性化好酸球である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３４】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物の方法または免疫原性組成物は、細胞性免疫応答を誘導する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、主に細胞性免疫応答を誘導する。もう１つの実施形態では、免疫原性組成物は、主にＴｈ１型免疫応答を誘導する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３５】
本発明の方法および組成物により治療される喘息は、もう１つの実施形態では、アレルギー性喘息である。もう１つの実施形態では、この喘息はＩｇＥ依存性喘息である。もう１つの実施形態では、この喘息は、当分野で公知の任意のその他の種類の喘息である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３６】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＩｇＥ依存性疾患または障害を寛解させる化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、（Ａ）第１の動物を前記化合物に接触させる段階（この際、第１の動物が請求項１の組換えペプチドを投与されておらず、第１の動物が前記ＩｇＥ依存性疾患または障害を示す）；（Ｂ）第２の動物を前記化合物に接触させる段階（この際、第２の動物が請求項１の組換えペプチドを投与されている）；ならびに（Ｃ）第１の動物および第２の動物におけるＩｇＥ依存性疾患または障害の臨床的相関を測定する段階を含む。もう１つの実施形態では、前記化合物が第１の動物において前記臨床的相関に正に作用し、第２の動物において前記臨床的相関に作用しないならば、前記化合物は、ＩｇＥ依存性疾患または障害を寛解させるために使用されうる。
【０１３７】
もう１つの実施形態では、本発明の方法および組成物により誘導される免疫応答は、標的細胞の細胞質で新しく合成されるＩｇＥ断片を認識する抗原特異的ＣＴＬを選択的に生じる。もう１つの実施形態では、これらの細胞は、細胞親和性のＩｇＥを有する細胞、例えば、肥満細胞または好塩基球などを認識しない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３８】
もう１つの実施形態では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、単独で被検体に投与される。もう１つの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、別のアレルギーまたは喘息療法とともに投与される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３９】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の方法を行う段階を含み、それにより、ＩｇＥ発現腫瘍、新生物、または悪性腫瘍に対して被検体をワクチン接種する、ＩｇＥ発現腫瘍、新生物、または悪性腫瘍に対して被検体をワクチン接種する方法を提供する。
【０１４０】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の方法を行う段階を含み、それにより、ＩｇＥ発現腫瘍、新生物、または悪性腫瘍を治療する、ＩｇＥ発現腫瘍、新生物、または悪性腫瘍を治療する方法を提供する。
【０１４１】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の方法を行う段階を含み、それによりＩｇＥ発現腫瘍、新生物、または悪性腫瘍の形成を抑制する、ＩｇＥ発現腫瘍、新生物、または悪性腫瘍の形成を抑制する方法を提供する。
【０１４２】
その他の実施形態では、上記のあらゆる方法の組換えペプチド、組換え核酸、ＩｇＥ断片、ワクチンベクター、または組換えリステリア株は、本発明の組成物の組換えペプチド、組換え核酸、ＩｇＥ断片、ワクチンベクター、または組換えリステリア株のいずれかの特徴を有する。それぞれの特徴は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４３】
もう１つの実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書に列挙されるペプチドと相同である。用語「相同性」、「相同の」などは、タンパク質またはペプチドに関する場合に、一実施形態では、最大パーセントの相同性を達成するため、そして配列同一性の一部としての保存的置換を何ら考慮せずに、必要に応じて、配列をアラインし、ギャップを導入した後の、対応するネイティブポリペプチドの残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の割合をさす。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当分野で周知である。
【０１４４】
相同性は、もう１つの実施形態では、当分野で十分説明されている方法による、配列アラインメントのためのコンピュータアルゴリズムにより決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム分析は、利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ(BLAST Enhanced Alignment Utility)）、ＧＥＮＰＥＰＴおよびＴＲＥＭＢＬなどの利用を含んでよい。
【０１４５】
もう１つの実施形態では、「相同性」または「相同の」とは、配列番号１〜１４から選択される非ＩｇＥ配列に対して７０％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４から選択される配列に対して７２％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して７５％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４から選択される配列に対して７８％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して８０％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して８２％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４から選択される配列に対して８３％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して８５％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して８７％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４から選択される配列に対して８８％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して９０％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して９２％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４から選択される配列に対して９３％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して９５％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４から選択される配列に対して９６％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して９７％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して９８％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して９９％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１〜１４の中の１つに対して１００％の同一性をさす。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４６】
もう１つの実施形態では、「相同性」または「相同の」とは、配列番号１５〜１９から選択されるＩｇＥ配列に対して７０％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９から選択される配列に対して７２％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して７５％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９から選択される配列に対して７８％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して８０％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して８２％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９から選択される配列に対して８３％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して８５％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して８７％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９から選択される配列に対して８８％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して９０％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して９２％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９から選択される配列に対して９３％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して９５％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９から選択される配列に対して９６％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して９７％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して９８％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して９９％を超える同一性をさす。もう１つの実施形態では、「相同性」とは、配列番号１５〜１９の中の１つに対して１００％の同一性をさす。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４７】
もう１つの実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定により決定され、その方法は当分野で十分説明されている（例えば、"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook et al., 2001 , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.参照）。その他の実施形態では、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して、中程度からストリンジェントな条件下で行われる。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む、溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【０１４８】
本明細書に列挙される任意のＡＡ配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、もう１つの実施形態では、免疫ブロット解析を含む、当分野で十分説明されている方法により、または確立された方法により利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを用いるＡＡ配列のコンピュータアルゴリズム解析により決定される。これらのパッケージの一部には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈまたはＳｃａｎｐｓパッケージが含まれ、もう１つの実施形態では、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、および／または分析のための広範囲／局所的またはＢＬＯＣＫＳアラインメントを用いている。それぞれの相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４９】
本発明のもう１つの実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」とは、一連の少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組合せをさす。一実施形態では、この用語には、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」とは、一実施形態では、核酸ポリマーのモノマー単位をさす。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核内ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびリボザイムの形態である。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記載されている（Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96およびその中で引用される参照文献）。ＤＮＡは、その他の実施形態では、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡあるいはこれらの群の誘導体の形態であってよい。その上、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であってよい。また、この用語には、もう１つの実施形態では、その他の種類の主鎖を含むが同じ塩基である人工核酸も含まれる。一実施形態では、この人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチド主鎖およびヌクレオチド塩基を含み、一実施形態では、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両方と結合することができる。もう１つの実施形態では、ヌクレオチドは、修飾されたオキセタンである。もう１つの実施形態では、ヌクレオチドは、１またはそれ以上のリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換することにより修飾される。もう１つの実施形態では、人工核酸は、当分野で公知のネイティブ核酸のリン酸塩主鎖からなる任意のその他の変異体を含む。ホスホチオラート(posphothiorate)核酸およびＰＮＡの使用は当業者に公知であり、例えば、Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; および Raz NK et al Biochern Biophys Res Commun. 297:1075-84に記載されている。核酸の作製および使用は当業者に公知であり、例えば、Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. および Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareed に記載されている。それぞれの核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５０】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の方法を行う際に利用される化合物または組成物を含むキットを提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５１】
医薬組成物および投与の方法
「医薬組成物」とは、もう１つの実施形態では、治療上有効な量の有効成分、すなわち組換えペプチドあるいはそれを含むかまたはコードするベクターを、製薬上許容される担体または希釈剤とともにさす。「治療上有効な量」とは、もう１つの実施形態では、所与条件および投与計画に対して治療効果をもたらす量をさす。
【０１５２】
有効成分を含有する医薬組成物は、もう１つの実施形態では、当業者に公知の任意の方法、例えば、非経口的に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、膣内に、または腫瘍内に、などにより被検体に投与されてよい。
【０１５３】
本発明の方法および組成物のもう１つの実施形態では、医薬組成物は経口的に投与され、従って経口投与に適した形態に、すなわち固体または液体の調製物として処方される。適した固体経口製剤としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレットなどが挙げられる。適した液体経口製剤としては、溶液、懸濁液、分散体、乳濁液、オイルなどが挙げられる。本発明のもう１つの実施形態では、有効成分はカプセル剤に処方される。この実施態様に従って、本発明の組成物は、活性化合物および不活性担体もしくは希釈剤に加えて、硬ゲル化(gelating)カプセル剤を含む。
【０１５４】
もう１つの実施形態では、医薬組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、もしくは筋肉内注射により投与される。適した液体製剤としては、溶液、懸濁液、分散体、乳濁液、オイルなどが挙げられる。もう１つの実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、従って静脈内投与に適した形態に処方される。もう１つの実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、従って動脈内投与に適した形態で処方される。もう１つの実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、従って筋肉内投与に適した形態で処方される。
【０１５５】
もう１つの実施形態では、医薬組成物は局所的に体表面に投与され、従って局所投与に適した形態で処方される。適した局所処方物としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、滴剤などが挙げられる。局所投与には、組換えペプチドまたはベクターが調製され、医薬担体を含むまたは含まない生理学的に許容される希釈剤中の溶液、懸濁液、または乳濁液として適用される。
【０１５６】
もう１つの実施形態では、有効成分は、小胞、例えばリポソーム中で送達される。
【０１５７】
その他の実施形態では、本発明の方法で用いられる担体または希釈剤としては、限定されるものではないが、ガム、デンプン（例えばトウモロコシデンプン、アルファ化(pregeletanized)デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば微晶質セルロース）、アクリレート（例えばポリメチルアクリレート）、カルシウムカルボナート、マグネシウムオキシド、タルク、またはそれらの混合物が挙げられる。
【０１５８】
その他の実施形態では、液体製剤のための製薬上許容される担体は、水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、乳濁液またはオイルである。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用有機エステル、例えば、エチルオレエートなどである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。オイルの例は、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、あるいは乳または卵由来の脂質である。
【０１５９】
もう１つの実施形態では、非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用の）としては、ナトリウムクロライド溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースとナトリウムクロライド、乳酸リンゲル液および硬化油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充物、電解質補充物、例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの、などが挙げられる。例は、界面活性剤およびその他の製薬上許容されるアジュバントを添加したまたは添加しない、滅菌液、例えば、水およびオイルなどである。一般に、水、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連糖液、ならびにグリコール類、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどが、特に注射液にとって好ましい液体担体である。オイルの例は、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、あるいは乳または卵由来の脂質である。
【０１６０】
もう１つの実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、制御放出組成物、すなわち、投与後一定期間にわたって有効成分が放出される組成物である。制御または持続放出組成物には、親油性デポー（例えば脂肪酸、蝋、オイル）中の処方物が含まれる。もう１つの実施形態では、組成物は、即時放出組成物、すなわち、投与後直ちに有効成分の全てが放出される組成物である。
【実施例１】
【０１６１】
実験的詳細の項
実施例１：ＡｃｔＡ−Ｅ７とＬＬＯ−Ｅ７の融合物は抗腫瘍免疫を付与する
材料および実験方法
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７の構築
【０１６２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７プラスミドを、ｐＤＰ２０２８（ＬＬＯ−ＮＰをコードする）から作出した、ｐＤＰ２０２８は順番に、ｐＤＰ１６５９から次のように作出した：
【０１６３】
グラム陰性およびグラム陽性菌の両方で複製可能なシャトルベクターである、プラスミドｐＡＭ４０１は、グラム陽性のクロラムフェニコール耐性遺伝子とグラム陰性のテトラサイクリン耐性決定基を含む。プラスミドｐＤＰ１６５９を構築するため、ＬＬＯの最初の４２０ＡＡをコードするＤＮＡ断片およびそのプロモーターおよび上流の調節配列を、ＬＭゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅し、ｐＵＣ１９の中に連結させた。用いたＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番号２０）および５'−ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣ−３'（配列番号２１）であった。ＮＰをコードするＤＮＡ断片を、同様に、線状化プラスミドｐＡＰＲ５０１（ニューヨーク、シナイ山医学大学院のピーター・パレス博士より入手）を鋳型として用いてＰＣＲ増幅し、その後、インフレーム翻訳融合物として溶血素遺伝子断片の下流のｐＵＣ１９の中に連結させた。用いたＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号２２）および５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴ−３’（配列番号２３）であった。次に、この融合物をｐＡＭ４０１のＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩ部位にサブクローニングした。
【０１６４】
プラスミドｐＤＰ２０２８は、ｐｒｆＡ遺伝子をｐＤＰ１６５９のＳａｌＩ部位にサブクローニングすることにより構築した。
【０１６５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系中のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子；図１Ｂ）を、次のように作出した。Ｅ７を、プライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２４；ＸｈｏＩ部位に下線が引かれている）および５'−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号２５；Ｓｐｅｌ部位に下線が引かれている）を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の中に連結させた。Ｅ７を、ＸｈｏＩ／Ｓｐｅｌ消化によりｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５の中に連結させた。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ｐｒｆＡを、マルチコピーシャトルプラスミド（Wirth R et al, J Bacteriol, 165:831, 1986）であるｐＡＭ４０１にクローニングし、ｐＧＧ−５５を生成する。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物（配列番号２中に示される配列を有し、溶血性のＣ末端を欠く）の最初の４４１ＡＡの発現を駆動し、それはＸｈｏＩ部位によりＥ７遺伝子に連結されてｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じ、それは転写されてＬＬＯ−Ｅ７として分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のハオ・シェン博士より提供されたもの）の、ｐＧＧ−５５での形質転換を、インビボでのプラスミドの保持について選択した。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー５’−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２６；Ｎｈｅｌ部位に下線が引かれている）および５’−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２７；ＸｈｏＩ部位に下線が引かれている）を用いて作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（配列番号２８；Ｘｂａｌ部位に下線が引かれている）および５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２９；ＳａｌＩ部位に下線が引かれている）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１６６】
Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムに組み込まれた単一コピーＥ７遺伝子カセット；図１Ａ）を、ｈｌｙプロモーターと、Ｅ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列を含む発現カセットをＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインに導入することにより作成した。Ｅ７を、プライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３'（配列番号３０；ＢａｍＨＩ部位に下線が引かれている）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号３１；Ｘｂａｌ部位に下線が引かれている）を用いてＰＣＲ増幅した。次に、Ｅ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターの中に連結させた。ＬＭ株１０４０３Ｓを、ＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに相当する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む、得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７で形質転換した。相同性ドメインは、相同組換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。クローンをＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてスクリーニングした。
【０１６７】
細菌を、（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）を含む、または（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含まないブレインハートインフュージョン培地中で増殖させ、一定量を−８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法により発現を検証した（図２）。
【０１６８】
Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７を、ｐＤＰ−２０２８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）から次のように作出した。
【０１６９】
ｐＤＰ−２０２８は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同質遺伝子であるが、インフルエンザ抗原を発現する。Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ａｃｔＡタンパク質の末端切断型と融合させたＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含む。Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を改変することにより構築したプラスミドベクターｐＤＤ−１をＬＭに導入することにより作成した。ｐＤＤ−１は、ａｃｔＡ−Ｅ７の発現および分泌を駆動する、１コピーの３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）を発現する発現カセット；４つのＰＥＳＴ配列（配列番号５）を含む１１７０ｂｐのａｃｔＡ遺伝子（前記分子の最初の３９０ＡＡからなる末端切断型ＡｃｔＡポリペプチド、配列番号４）；３００ｂｐのＨＰＶ  Ｅ７遺伝子；１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（毒性遺伝子の発現を制御）；および形質転換された細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）を含む。（図３）(Sewell et al. (2004), Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 130: 92-97)。
【０１７０】
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片（４４１ＡＡ）は、プライマー５’−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（ＸｂａＩ部位に下線が引かれている；配列番号３２）およびプライマー５’−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−３’（ＮｏｔＩ部位に下線が引かれている。最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子のオーバーラップである；配列番号３３）。ａｃｔＡ遺伝子は、プライマー５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３’（ＮｏｔＩ部位に下線が引かれている；配列番号３４）およびプライマー５’−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３’（ＸｈｏＩ部位に下線が引かれている；配列番号３５）を用いてＬＭ１０４０３野生型ゲノムからＰＣＲ増幅した。Ｅ７遺伝子は、プライマー５’−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’（ＸｈｏＩ部位に下線が引かれている；配列番号３６）およびプライマー５’−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（Ｘｍａｌ部位に下線が引かれている；配列番号３７）を用いてｐＧＧ５５からＰＣＲ増幅した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５’−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（Ｘｍａｌ部位に下線が引かれている；配列番号３８）およびプライマー５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（ＳａｌＩ部位に下線が引かれている；配列番号３９）を用いてＬＭ１０４０３野生型ゲノムからＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーター−ａｃｔＡ遺伝子融合物（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）をＰＣＲ生成し、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号３５）を用いて精製ｐＨｌｙおよびａｃｔＡ  ＤＮＡから増幅した。
【０１７１】
ｐｒｆＡ遺伝子に融合したＥ７遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）をＰＣＲ生成し、上流Ｅ７プライマー（配列番号３６）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を用いて精製したＥ７およびｐｒｆＡ  ＤＮＡから増幅した。
【０１７２】
Ｅ７−ｐｒｆＡ融合産物に融合したｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合産物をＰＣＲ生成し、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を用いて精製した融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡおよびＥ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ産物から増幅し、ｐＣＲＩＩ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．)の中に連結させた。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を、ｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７を用いて形質転換した。溶解および単離の後、このプラスミドをＢａｍＨＩ（予測断片サイズ７７０および６４００ｂｐ）およびＢｓｔＸＩ（予測断片サイズ２８００および３９００）を用いる制限分析によりスクリーニングし、上記の上流ｐＨｌｙプライマーおよび下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマーを用いるＰＣＲによりスクリーニングした。
【０１７３】
ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ＰｒｆＡ  ＤＮＡ挿入断片を、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化によりｐＣＲＩＩから切り出し、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化したｐＤＰ−２０２８の中に連結させた。ＴＯＰ１０’Ｆコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｊａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を発現系ｐＡｃｔＡＥ７で形質転換した後、クロラムフェニコール耐性クローンを、上記の上流ｐＨｌｙプライマーおよび下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマーを用いるＰＣＲ解析によりスクリーニングした。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンを増幅し、ミディプレップＤＮＡ精製系キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）を用いてｐＡｃｔＡＥ７を細菌細胞から単離した。ペニシリン処理したリステリアのｐｒｆＡ陰性株（ＸＦＬ−７株）を、Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓら(1994, J. Exp. Med. 180: 2209-2218)に記載されるように、発現系ｐＡｃｔＡＥ７で形質転換し、インビボでのプラスミドの保持についてクローンを選択した。クローンを、２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル） クロラムフェニコールを含むブレインハートインフュージョン培地（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ）中で３７℃にて増殖させた。一定量の細菌を−８０℃にて凍結させた。
【０１７４】
抗原発現の免疫ブロット検査
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７（約６４ｋＤ）を分泌することを検証するため、リステリア株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて増殖させた。タンパク質を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を含む培養上清から沈殿させ、０．１Ｎナトリウムヒドロキシドを含む１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一量の各ＴＣＡ沈殿上清を、４％〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）に負荷した。ゲルをフッ化ポニビリデン膜に移し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ）で、次に１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）でプローブした。Ａｍｅｒｓｈａｍ強化化学発光検出試薬でブロットを顕色し、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を感光させた（図４）。
【０１７５】
腫瘍退縮実験
６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に２×１０５ＴＣ−１細胞を左側腹部の皮下に投与した。腫瘍接種の１週間後に、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知できる大きさに達した。次に、７日目と１４日目にマウスをＬｍ株の０．１のＬＤ５０で処理した。
【０１７６】
腫瘍成長の測定
腫瘍を、最短および最長の表面径を計るキャリパーで１日おきに測定した。これらの２つの測定値の平均、ミリメートルの単位の平均腫瘍直径として様々な時点に対してプロットした。腫瘍直径が２０ｍｍに達した時にマウスを犠牲にした。各時点についての腫瘍測定値は生存しているマウスについてのみ示される。
【０１７７】
結果
ＡｃｔＡまたはＬＬＯ断片に融合させたＥ７抗原を発現するリステリア株（それぞれ「Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７」および「Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７」）により誘導される抗腫瘍免疫を決定するため、ＴＣ−１腫瘍細胞をマウスの皮下に移植し、触知できる大きさ（およそ５ミリメートル（ｍｍ））まで増殖させた。７日目および１４日目に、マウスを、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ ＣＦＵ）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（さらなる陰性対照）またはＬｍ−Ｅ７（１０６ ＣＦＵ）のいずれかのＬＤ５０で腹腔内に免疫化した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の全ての動物が腫瘍を含まず、そのままであったが、それに対して無処置の動物およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰまたはＬｍ−Ｅ７で免疫化した動物は全て腫瘍を大きく増殖させた（図５）。
【０１７８】
従って、ＡｃｔＡ、ＬＬＯ、またはそれらの断片への融合は、抗原に対して増大した免疫原性；具体的に言えば、細胞性免疫原性を付与する。
【実施例２】
【０１７９】
実施例２：Ｅ７のＬＬＯまたはＡｃｔＡへの融合はＥ７特異的免疫性を増強し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を生成する
材料および実験方法
【０１８０】
２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を含む１００ｍｃｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する、５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）に、４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を加えたものを、１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左側腹の皮下に移植した（ｎ＝３）。マウスを、７、１４および２１日目に腹膜内に免疫化し、２８日目に脾臓および腫瘍を回収した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で２ｍｌのＲＰ１０培地を含有する管の中で４℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子で刻み、２ｍｍの塊に切断し、３ｍｌの酵素混合物（ＰＢＳ中、０．２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ−Ｐ、１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ−１）とともに３７℃にて１時間インキュベートした。組織懸濁液をナイロンメッシュに通して濾過し、四量体およびＩＦＮ−γ染色のためにＰＢＳ中５％ウシ胎児血清＋０．０５％のＮaＮ３で洗浄した。
【０１８１】
脾細胞および腫瘍細胞を、１０７細胞／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下、１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドとともに５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４Ｇ２）中で４℃にて１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、透過処理し、透過処理キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて固定し、ＩＦＮ−γについて染色した。２レーザーフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて５００,０００イベントを得、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）を用いて解析した。活性化した（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＩＦＮ−γ分泌細胞の割合を算出した（図６Ａ）。
【０１８２】
四量体染色のため、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリトリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号４０）を負荷し、室温にて１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合ＣＤ８βで４℃にて３０分間染色した。脾臓中、および腫瘍中の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して細胞を分析した（図６Ｂ）。
【０１８３】
結果
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の抗原特異的免疫性を増強する能力を分析するため、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ ＣＦＵ）で免疫化するか、あるいは処理しなかった（無処理）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群のマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７を投与されたマウスまたは無処置マウスにおけるよりも、より高い割合のＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ａ）および四量体特異的ＣＤ８＋細胞（図６Ｂ）を含んでいた。その上、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７免疫化はＥ７特異的ＣＴＬ活性を誘導した（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１８４】
従って、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、両方とも腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞および腫瘍退縮の誘導に効果的である。従って、ＬＬＯおよびＡｃｔＡ融合物は本発明の方法および組成物において効果的である。
【実施例３】
【０１８５】
実施例３：ＰＥＳＴ様配列への融合はＥ７特異的免疫性を増強する
材料および実験方法
構築物
【０１８６】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７がプロモーターとＬＬＯの最初の５０ＡＡしか含まないことを除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一なリステリア株である、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を次のように構築した。
【０１８７】
ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を、オーバーラップ伸張（ＳＯＥ）ＰＣＲによるスプライシングにより全長Ｅ７遺伝子に融合させた。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片を、ＬＬＯの最初の４４１アミノ酸を含むプラスミドｐＧＧ−５５から増幅させ、従来のＰＣＲ技法により一緒にスプライスした。ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片であるｐＶＳ１６．５およびＬＭ転写因子ｐｒｆＡをプラスミドｐＡＭ４０１の中にサブクローニングした。得られるプラスミドを用いて、リステリアのｐｒｆＡ陰性株であるＸＦＬ−７（ロサンゼルス市カリフォルニア大学のジェフリー・ミラー博士より提供されたもの）を形質転換して、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を作出した。
【０１８８】
Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯ断片を含まずにＥ７を分泌する組換え株である。この株を形質転換するために用いたプラスミドは、ｈｌｙプロモーターの遺伝子断片およびＥ７遺伝子と融合したシグナル配列を含む。この構築物は、染色体に組み込まれた単一コピーのＥ７遺伝子を発現する本来のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されるＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、と完全に同質遺伝子である。
【０１８９】
組換え株を、クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）を含むブレインハートインフュージョン培地で増殖させた。一定量の細菌を−８０℃にて凍結させた。
【０１９０】
結果
ＰＥＳＴ様配列との融合物の抗原性への効果を試験するため、ＬＬＯ  ＰＥＳＴ様配列をＥ７に融合させた。実施例１に記載されるように、ＬＬＯ−Ｅ７およびＥ７単独を発現しているリステリア株と並行して腫瘍退縮調査を行った。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ定着腫瘍の５／８および３／８の退縮をもたらした（図８Ａ）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは１／８のマウスにしか腫瘍退縮をもたらさなかった。ＰＥＳＴ含有構築物（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７）で処理した腫瘍と、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉで処理した腫瘍間には腫瘍サイズにおける統計上の有意差が観察された（スチューデントｔ検定）（図８Ｂ）。
【０１９１】
脾臓中のワクチンにより生成されたＥ７特異的リンパ球のレベルを比較するため、２１日目に脾臓を回収し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体、およびＥ７／Ｄｂ四量体で染色した。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、低レベルのＥ７四量体陽性の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を脾臓において誘導したが、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、それぞれ５倍および１５倍多い細胞を誘導した（図９Ａ）、これは３回の別々の実験で再現可能な結果である。従って、ＰＥＳＴ様配列への融合は、四量体陽性の脾細胞の誘導を増大させた。３回の実験から得たデータの平均値およびＳＥ（図９Ｂ）は、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉよりもＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７による四量体陽性のＣＤ８＋細胞の有意な増加を実証する（スチューデントｔ検定により、Ｐ＜０．０５）。同様に、腫瘍浸潤抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、再現可能な３回の実験で、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７をワクチン接種されたマウスにおいて多かった（図１０Ａ〜Ｂ）。四量体陽性のＣＤ８＋ＴＩＬの平均値は、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉよりもＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に関して有意に高かった（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定）。
【０１９２】
従って、ＰＥＳＴ様配列は、抗原に増大した免疫原性を付与する。
【実施例４】
【０１９３】
実施例４：抗原のＬＬＯへの融合による免疫原性の増強は、リステリアベクターを必要としない
材料および実験方法
Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７の構築
【０１９４】
ワクシニアのＷＲ株をレシピエントとして用いて、融合遺伝子をリステリアプラスミドから切り出し、ｐ７５プロモーターの制御下、ｐＳＣ１１に挿入した。このベクターは、ワクシニア構築物Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７ＬａｍｐおよびＶａｃ−Ｅ７に用いられるトランスファーベクターであり、そのため、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７との直接比較が可能であったため、このベクターを選択した。このようにして、同じ初期／後期化合物プロモーターｐ７．５の制御下で３つ全てのワクシニア組換え体が発現された。その上、ＳＣ１１は、ＴＫ選択およびβ−ガラクトシダーゼスクリーニングに対する組換えウイルスプラークの選択を可能にする。図１１は、これらの実験で用いられる様々なワクシニア構築物を表す。Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐは、リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）シグナル配列とＬＡＭＰ−１の細胞質側末端由来の配列の間に融合されたＥ７タンパク質を発現した組換えワクシニアウイルスである。
【０１９５】
以下の改変は、ワクシニアによる遺伝子産物の発現を可能にするように行われた：（ａ）ワクシニアによる初期転写を妨げるＴ５ＸＴ配列を、ＰＣＲによりＬＬＯ−Ｅ７配列の５’位から取り除き；および（ｂ）さらなるＸｍａＩ制限部位をＰＣＲにより導入してＬＬＯ−Ｅ７のＳＣ１１への最終的な挿入を可能にした。これらの変化の首尾よい導入（ＬＬＯ−Ｅ７をコードする最初の配列を失うことのない）を、配列決定により検証した。得られるｐＳＣｌ１−Ｅ７構築物を用いて、野生型ワクシニア株、ＷＲに感染させたＴＫ−ｖｅ細胞系統ＣＶ１に形質移入した。この同時感染／トランスフェクション段階から得た細胞可溶化物は、３回プラーク精製したワクシニア組換え体を含む。プラーク精製されたワクシニアによるＬＬＯ−Ｅ７融合産物の発現を、ＬＬＯタンパク質配列に対して作られた抗体を用いてウエスタンブロットにより検証した。その上、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７のＬＬＯおよびＥ７に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を産生する能力を、それぞれ、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６マウスのＬＬＯ（９１〜９９）およびＥ７（４９〜５７）エピトープを用いて決定した。クロム放出アッセイで結果を確認した。
【０１９６】
結果
抗原のＬＬＯとの融合による免疫原性の増強がリステリアベクターを必要とするかどうかを決定するため、ＬＬＯの非溶血性の末端切断型を含む融合タンパク質としてＥ７を発現しているワクシニアベクターを構築した。腫瘍が直径３ｍｍのときに治療を開始することを除いて、実施例１に記載されるようにＴＣ−１を用いて腫瘍拒絶調査を行った（図１２）。７６日までに、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７処置マウスでは５０％のマウスに腫瘍がなかったが、Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐマウスでは２５％のマウスのみ腫瘍がなかった。他の実験では、ＬＬＯ−抗原融合物は、ＳＢＡＳ２または非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合したＥ７ペプチドよりも免疫原性が高いことが左右比較において示された。
【０１９７】
これらの結果は、（ａ）ＬＬＯ−抗原融合物は、リステリアの状況においてだけでなく、その他の状況においても免疫原性であること；および（ｂ）ＬＬＯ−抗原融合物の免疫原性は、好都合にも、効果的であることがわかっている他のワクチンアプローチに匹敵することを示す。
【実施例５】
【０１９８】
実施例５：ＬＬＯおよびＡｃｔＡ融合物は、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスのＥ７発現腫瘍に対する免疫寛容を克服する
免疫寛容のモデルとして、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスを作成し、それらの表現型を評価した。マウスは８週目に甲状腺過形成を発症し始め、６ヶ月で触知できる甲状腺腫となった。６〜８ヶ月までに、大部分のマウスが甲状腺癌を示した。６ヶ月齢で犠牲にしたトランスジェニックマウスは、癌の初期段階を示す、正常な甲状腺構造の脱分化を示した。肥大した脱分化細胞にはコロイドが充満し、そこに甲状腺ホルモンが集積する（図１３）。Ｅ７はこれらのマウスにおいて自己抗原であるので、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスはＥ７に対する免疫寛容を示した。
【０１９９】
本発明のワクチンがＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスのＥ７発現腫瘍に対する免疫寛容を克服する能力を調査するため、６〜８週齢の野生型およびトランスジェニックマウスにおいて１０５ＴＣ−１細胞を皮下に（ｓ．ｃ．）移植し、固形腫瘍を形成させた。マウスは免疫化させずにおくか（無処理）、または７および１４日後に腹腔内にＬＭ−ＮＰ（対照）、１×１０８ｃｆｕ ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７（図１４Ａ）または２．５×１０８ｃｆｕ  ＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（図１４Ｂ）で免疫化させる。無処理マウスは、予期した通り大きな腫瘍量を有し、２ｃｍを超える腫瘍のために２８日または３５日までに犠牲にした。それに反して、３５日までにＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７かまたはＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７のいずれかを投与した結果、野生型マウスのそれぞれ７／８または６／８、およびトランスジェニックマウスの３／８が完全な腫瘍退縮をもたらした。完全な腫瘍退縮を示さなかったトランスジェニックマウスにおいて、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７−ワクチン接種およびＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ワクチン接種マウスにおいて腫瘍成長の顕著な低下が観察された。
【０２００】
他の実験では、２１日および２８日にさらなるワクチン接種を投与した。ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７（図１４Ｃ）またはＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（図１４Ｄ）は、それぞれ４／８および３／８のトランスジェニックマウスにおいて完全な腫瘍退縮を誘導し、残りのマウスにおいて腫瘍成長の低下を誘導した。
【０２０１】
ワクチンが自発性の腫瘍成長に影響を及ぼす能力を調査するため、６〜８週齢マウスを１×１０８Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７または２．５×１０８Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で毎月１回８ヶ月間免疫化した。最後の免疫化から２０日後にマウスを犠牲にし、その甲状腺を取り出して秤量した。結果は各ワクチン群に対する甲状腺の重量として示される（図１５）。
【０２０２】
トランスジェニックマウスにおいて完全な腫瘍退縮および／または腫瘍成長の低下を誘導する際の本発明のワクチンの有効性は、ペプチドに基づくワクチンの無効力性と大いに異なっていた。従って、本発明のワクチンは、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスのＥ７発現腫瘍に対する免疫寛容を克服することができた。
【実施例６】
【０２０３】
実施例６；ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２は自己抗原に対する免疫寛容を克服する
材料および実験方法
【０２０４】
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスをジャクソン研究所より購入し、ペンシルバニア大学生態動物園で飼育した。自発的に腫瘍を生じなかった、若い未交尾のＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに５×１０４ＮＴ−２細胞を注射した。このトランスジェニックマウスはＨＥＲ−２／ｎｅｕに大いに寛容であるため、１００％の動物において腫瘍成長に必要とされる最小の用量は、野生型マウスの用量よりもはるかに少ない(Reilly RT, Gottlieb MB et al, Cancer Res.2000 Jul 1;60(13): 3569-76)。ＮＴ−２細胞を、側腹の皮下空間に注射した。マウスは０．１のＬＤ５０のリステリアワクチンを腫瘍移植後７日目（４〜５ｍｍの触知できる腫瘍が検出された時点）およびその後毎週、さらに４週間受けた。
【０２０５】
結果
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子は、マウスｎｅｕとは５〜６％のＡＡ残基が異なり、従ってマウスにおいて免疫原性である（Nagata Y, Furugen R et al, J Immunol. 159: 1336-43）。マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターおよびエンハンサーの転写制御下でラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現するトランスジェニックマウスは、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕに対して免疫学的に寛容である。これらのマウスは自発的に乳癌を発症する。ＭＭＴＶプロモーターはまた、造血細胞でも機能し、マウスをＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して大いに寛容にする。従って、このマウスは、ヒト乳癌および一般に抗原、例えば、正常組織において低いレベルで発現されるＨｅｒ−２／ｎｅｕなどを発現する腫瘍のストリンジェントなモデルである（Muller W. J. (1991) Expression of activated oncogenes in the murine mammary gland: transgenic models for human breast cancer. Cane Metastasis Rev 10: 217-27）。
【０２０６】
６〜８週齢ＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにＮＴ−２細胞を注射し、次にＬＭ−ΔＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々、あるいはＰＢＳまたはΔＬＬＯ−Ｅ７（陰性対照）で免疫化した。大部分の対照マウスは、それらの腫瘍量のために４２日までに犠牲にしなければならなかったが、全てのワクチン接種したマウスにおいて腫瘍成長が制御された（図１６）。
【０２０７】
従って、ΔＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、確立されたＮＴ−２腫瘍の退縮を誘導するそれらの能力から明らかなように、腫瘍細胞上で発現される自己抗原に対する寛容性を破ることができる。従って、ＬＬＯ−抗原およびＡｃｔＡ−抗原融合物を含むワクチンは、Ｈｅｒ−２かまたはＥ７のいずれかを含む自己抗原に対する寛容性を破ることに効果的であり、本発明の知見が一般化でき、特定の抗原に特異的でないことが示される。
【実施例７】
【０２０８】
実施例７：ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンはＨｅｒ−２／Ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける自発的腫瘍成長を制御する
材料および実験方法
【０２０９】
ΔＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンを、次の量（ｃｆｕ）で投与した：Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ１：１×１０７；Ｌｍ−Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ２：５×１０７；ＬＬＯ−ＥＣ３：１×１０８；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ２：１×１０７；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ１：１×１０７。
【０２１０】
結果
ΔＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンを、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍成長を妨げる能力についても評価した。トランスジェニックマウス（１ワクチン群あたりｎ＝１２）を、６週齢に開始し、３週間に１回継続して、ワクチン株の１種類の０．１のＬＤ５０で５回免疫化した。マウスを、乳腺での腫瘍形成についてモニターした。３５週までに、全ての対照マウス（ＰＢＳまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１−免疫化）が腫瘍を発症した。それに反して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ１群の９２％に腫瘍がなく、マウスＬｍ−ＬＬＯ−ＥＣ２、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ１、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＩＣ２で免疫化したマウスの５０％、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ３で免疫化したマウスの２５％に腫瘍がなかった（図１７）。
【０２１１】
これらの知見は、前の実施例の結果を裏付け、本発明のワクチンが自己抗原に対する寛容性を破り、自発的腫瘍成長を妨げることを示す。
【実施例８】
【０２１２】
実施例８；リステリアおよびＬＬＯ融合ベクターにより粘膜免疫応答が誘導される
材料および実験方法
ウイルス
【０２１３】
Ａ型インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４は、Ｈ１Ｎ１サブタイプに属する。再集合ウイルスＸ３１（ＰＲ８×Ａ／Ａｉｃｈｉ／６８）は、Ｈ１Ｎ１の代わりにＨ３およびＮ２をコードする遺伝子を発現する点がＰＲ８とは異なり、それらは親Ａ／Ａｉｃｈｉに由来する。感染性ウイルスストックを１０日齢の孵化鶏卵の尿膜腔で増殖させ、少量の一定量の感染性尿膜腔液を−７０℃で保存した。
【０２１４】
細菌株および成長条件
プラスミドｐＤＰ２０２８を、実施例１に記載されるように構築した。ｐｒｆＡ（−）株ＤＰＬ１０７５のｐＤＰ２０２８での形質転換により、ＤＰ−Ｌ２０２８株が生じ、それはインビトロおよびインビボで安定に融合タンパク質を分泌した。
【０２１５】
ＤＰ−Ｌ２８４０株の構築。オーバーラップ伸張（ＳＯＥ）ＰＣＲ法によるスプライシングを用いてＫｄ拘束ＬＬＯエピトープ（９１〜９９残基）を、１４７〜１５５残基のＫｄ拘束ＮＰエピトープで置き換え、修飾されたｈｌｙ遺伝子をＰＫＳＶ７温度感受性ベクターに挿入してプラスミドｐＤＰ２７３４を生じた。このプラスミドを引き続いて用いて変更された領域を細菌染色体に組み込んだ。
【０２１６】
ＤＰ−Ｌ２８５１株の構築。プラスミドｐＤＰ９０６は、ＬＭ染色体のＳａｕ９６断片をｐＡＭ４０１にクローニングすることにより得られた。この染色体断片はＬＬＯをコードし、また、ＬＬＯプロモーターおよび上流の調節配列を含む。この染色体断片には他に完全なオープンリーディングフレームは存在しなかった。プラスミドｐＤＰ９０６をエレクトロポレーションによりＤＰ−Ｌ２８４０に導入して、ＤＰ−Ｌ２８５１を生じた。全ての段階で、配列決定および制限分析により操作を検証した。
【０２１７】
５１Ｃｒ放出アッセイ
非感染５７７４細胞は陰性対照としての役割を果たし、１４７−１５８／Ｒ１５６  ＮＰペプチドでパルスした５７７４細胞は陽性対照としての役割を果たした。Ｐ８１５細胞を標識し、ＮＰエピトープペプチドまたは対照ペプチドでパルスし、１ウェルあたり１０４細胞の密度で標的として用いた（丸底９６ウェルプレート、Ｃｏｓｔａｒ）。あるいは、Ｐ８１５細胞にインフルエンザウイルスを次のように感染させた：１０６細胞をペレット化し、１００ｍｃＬの血清フリー培地に再懸濁した。１０００血球凝集単位（ＨＡＵ）のＡ／ＰＲ／８ウイルスを含有する１００ｍｃＬの感染性尿膜腔液を添加し、細胞を３７℃にて１時間穏やかに揺らした。その後、血清を含有する培地を添加し、５％のＣＯ２下で細胞を３２℃にて一晩インキュベートした。翌日、感染細胞を５１Ｃｒで標識し、標的として用いた。放出された５１Ｃｒを１００ｍｃＬの上清について測定した。特異的溶解を１００×［（Ｘ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ）］として計算し、この場合、Ｘ＝１分当たりの実験カウント数（ｃ．ｐ．ｍ．）、Ｓ＝自発的ｃ．ｐ．ｍ．、およびＴ＝合計（１％Ｔｒｉｔｏｎに誘導される）ｃ．ｐ．ｍ．である。示されるデータは類似結果をもつ数回の実験の代表である。
【０２１８】
免疫化マウスの肺におけるウイルス力価の決定
マウスを、０．１〜０．２ＬＤ５０のＬＭ株、１０７ｐｆｕのワクシニア株（ＮＩＡＩＤ、ウイルス性疾患研究所(Laboratory of Viral Diseases)、ジャック・ベンニンク博士より提供されたもの）または１００ｍｃｌのＸ３１ウイルスの感染性尿膜腔液のいずれかで静脈内に免疫化した。３週間後、マウスにＰＢＳ中５０ｍｃＬのインフルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスを鼻腔内に（ｉ．ｎ．）接種した。投与されたウイルスの量は、０．２５のＬＤ５０に相当した。鼻腔内投与はメトファンによる麻酔下で行った。５日後にマウスを犠牲にし、その肺を取り出して、血清フリー（０．１％ＢＳＡ）イスコフ培地中でホモジナイズした。肺抽出物の１０倍希釈物中のウイルス力価を、記載されるように決定した。
【０２１９】
結果
いくつかのＮＰ発現Ｌｍ株（全て上に記載されている）を作出した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰの場合、ＮＰを上記のその他の構築物と同じ方法でＬＬＯ断片に融合させた。ＤＰ−Ｌ２８４０の場合、ＮＰ３３の１４７〜１５５ＡＡに及ぶＫｄ拘束ＮＰエピトープを、分泌されたＬＬＯ分子に組み込んだ（すなわちその中に埋め込んだ）。フランキング配列はエピトーププロセシングの効率に影響を及ぼすことが示されているので、Ｋｄ拘束ＬＬＯエピトープ内のＡＡ残基ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ（残基９１〜９９；配列番号４１）をＫｄ拘束エピトープの残基で置換して正確なプロセシングを確実にした。得られるＤＰ−Ｌ２８４０株は、ヒツジ赤血球の溶解を測定するインビトロアッセイで測定して、溶血作用を有さなかったが、ウエスタンブロット法により測定すると変異株ＬＬＯ分子を分泌していた。ＤＰ−Ｌ２８４０により分泌されたＬＬＯの量は、野生型細菌上清から沈殿したものよりも少なかった。溶血作用の差異の効果を決定するため、ＤＰ−Ｌ２８４０を、１コピーのネイティブｈｌｙ遺伝子を有するプラスミドでトランスに補完し、その結果ＤＰ−Ｌ２８５１株が得られた。ＤＰ−Ｌ２８５１は、血小板に野生型溶血作用を示し、５７７４細胞単層でＤＰ−Ｌ２８４０よりも一層効率的に成長した。
【０２２０】
ＤＰ−Ｌ２０２８に感染させた細胞は、効率的にＮＰエピトープを提示することができたが、ＤＰ−Ｌ２８４０に感染させた細胞はできなかった（図１８）。ＤＰ−Ｌ２８５１に感染させた細胞は、ＮＰエピトープを提示することができ、ＤＰ−Ｌ２８４０が、効率の悪い空胞からのエスケープに起因しうる実験条件下ではＮＰエピトープを提示することができないことが示される。用いた条件下でＤＰ−Ｌ２０２８の効率がＤＰ−Ｌ２８５１よりも増加したことは、ＤＰ−Ｌ２０２８にマルチコピープラスミドが存在することが原因である可能性があり、それに対してＤＰ−Ｌ２８５１は、染色体中の単一コピー遺伝子からＮＰエピトープを発現する。もう１つの考えられる解釈は、ＤＰ−Ｌ２０２８にＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが存在しないことであり、ＤＰ−Ｌ２０２８はＮＰの優位なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープだけを含む。
【０２２１】
ＤＰ−Ｌ２０２８およびＤＰ−Ｌ２８５１のインビボでの免疫原性を決定するため、脾細胞を免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離し、インビトロでＫｄ拘束ＮＰペプチドで刺激した。ＬＭの両方の組換え株は、ペプチドをパルスした標的およびインフルエンザに感染させた標的の細胞溶解により明らかなように、ＮＰ特異的ＣＴＬを誘導することができた（図１９）。
【０２２２】
ワクチン接種後３週間、致死量以下の用量のＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（構築物のＮＰ遺伝子がそれに由来する）をマウスに投与することにより、ワクチンの保護効果を調査した。ＤＰ−Ｌ２０２８とＤＰ−Ｌ２８５１の両方が、無処置マウスまたは野生型ＬＭで免疫化したマウスと比較して、肺のウイルス力価の統計上有意な低下（０．５〜０．７ｌｏｇ）をもたらした（図２０および表１）。
【０２２３】
表１．無処置マウスと比較した、示された薬剤で免疫化したマウスにおける肺ウイルス力価（単位：ｌｏｇ）の低下。図２０に示される４回の実験に関する低下。この実験には合計１８匹のマウスを１０４０３、ＤＰ−Ｌ２０２８、ＤＰ−Ｌ２８５１、およびＸ３１に用い、１２匹のマウスをワクシニア−ＮＰおよびワクシニアに用いた。
＊−低下は、１０４０３と有意差がある（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【表１】
2009545330.tif 000013
＊低下は、１０４０３Ｓによりもたらされるものと有意差がある（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ＮＤ＝実施せず
【０２２４】
従って、本発明のワクチンは、多様な抗原に対して細胞性免疫応答を誘導する。さらに、この免疫応答は、抗原ペプチドがＬＬＯ配列、ＡｃｔＡ配列、またはＰＥＳＴ様配列と融合されていようと、または埋め込まれていようと誘導される。さらに、この免疫応答は全身性におよび粘膜への両方に感染防御免疫を付与する。
【実施例９】
【０２２５】
実施例９；ＬＭ−ＩｇＥベクターの構築
【０２２６】
組換えＬＭワクチンベクターを作出し、宿主細胞ＬＬＯまたはεＣＨの断片と融合したその断片（具体的には、Ｃε１ドメイン（残基１３４〜２２４）および完全Ｃε２（残基２２５〜３３０）、Ｃε３（残基３３１〜４３７）、およびＣε４［残基４３８〜５４７］およびＭ１／Ｍ２）の中に発現させ、分泌させる。ＩｇＥＣＨおよびＭ１／Ｍ２ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、以下のネズミｃＤＮＡ配列に基づくプライマーで作成する。
【化１２】
2009545330.tif 000014
【０２２７】
それぞれの融合タンパク質の細菌成長培地中への分泌を、ＬＬＯアミノ末端に対する抗体を用いるウエスタンブロットにより検証する（Singh et al, Fusion to Listeriolysin O and delivery by Listeria monocytogenes enhances the immunogenicity of HER-2/neu and reveals subdominant epitopes in the FVB/N mouse. J Immunol 2OO5;175(6):3663-73）。
【０２２８】
組換え抗原を、次の遺伝子をｐＧＧ−５５にサブクローニングすることにより作成する。ｐＧＧ−５５は、インビトロで約１０マイクログラム／ｍｌの分泌産物を生じるために必要な要素を含む：
【０２２９】
１）ＣＨεドメイン１〜４に関して、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５７７２およびＸ６５７７４；配列番号１９）に由来する、２，４，６ＴＮＰ特異的マウスハイブリドーマＩＧＥＬａ２を利用する。
【０２３０】
２）ＩｇＥの膜エキソンに関して、Ｂ細胞ハイブリドーマＩｇＥ−５３−５６９（Bottcher et al, Production of monoclonal mouse IgE antibodies with DNP specificity by hybrid cell lines）を利用する。
【実施例１０】
【０２３１】
実施例１０：ＩｇＥ定常領域に対する特異的免疫応答の生成
【０２３２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、下の実験の全てに細菌ベクターから生じる非抗原特異的効果の程度を決定する対照として含まれる。５つのＬｍ−ＬＬＯ−ＣＨε構築物のＩｇＥ定常領域に対してインビボで細胞性免疫を生成する能力を試験するため、ＢＡＬＢ／ｃは、ＩｇＥ断片に融合したＬＬＯを発現するＬＭベクターで非経口的に(parentally)免疫化されたマウスである。その他の実験では、経口経路が用いられる。
【０２３３】
ワクチンに対する抗ＩｇＥ液性免疫応答は、経口的に接種したマウスにおいて、ＥＬＩＳＡアイソタイピングアッセイによる血清抗体の産生および粘膜抗体応答を測定することにより決定される。最小から検出感度以下の液性抗体応答が検出され、ＬＭベクターを含む以前の経験およびＬＭの細胞内生活環に一致する。
【０２３４】
抗ＩｇＥ細胞性免疫応答のため、免疫化マウスのリンパ球系細胞について次のパラメータを測定する：１）ＩｇＥでの刺激によるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖；２）ＩｇＥ刺激に応答するサイトカイン、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌、ならびにＣＤ８陽性またはＣＤ４陽性細胞のいずれかを奪うことによるこれらの細胞の表現型の検証；３）ＩｇＥを発現する標的（例えばＩＧＥＬａ２）またはＩｇＥ由来ペプチドでインキュベートした腫瘍標的細胞を特異的に認識および溶解させるＣＴＬの生成。さらなる実験において、細胞表現型、遺伝的拘束、および応答の認識の微細特異性が決定される。
【０２３５】
１またはそれ以上の次の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、ＩｇＥ特異的ＣＴＬのインビトロ増殖に利用される：ネズミ腫瘍細胞、例えば、Ｐ８１５細胞（Ｈ−２ｄ肥満細胞腫）および個々のＨ−２ｄ  ＭＨＣハプロタイプを形質移入されたＬ細胞など、これらはクローン化されたＣＴＬ細胞のＭＨＣ拘束を評価するために用いられる。ＩｇＥ重鎖は、前記系統に抗原ｃＤＮＡを形質移入することにより標的細胞に導入され、それによりサイトゾルで抗原を合成する。他の実験では、浸透圧性の飲作用(osmotic pinocytosis)または化学的に均質な合成ペプチドの形態の抗原ペプチドまたはタンパク質消化により組換え抗原が細胞質に導入される。さらなる実験では、ＣＨε２ドメイン中の、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２つのＣＴＬエピトープに対応するペプチド（１０９位〜１１７位（ＬＹＣＦＩＹＧＨＩ；配列番号４２；番号は最初の定常領域のＡＡ１から開始）および１１３位〜１２１位（ＩＹＧＨＩＬＮＤＶ；配列番号４３）を合成し、それに対する免疫応答を評価する。公知のＣＴＬエピトープに対して、およびさらなるエピトープに対しての両方ともに有意な細胞性抗ＩｇＥ免疫応答が観察される。
【０２３６】
その他の実験では、単回免疫を多重ワクチンと比較して有効性を最適化する。さらなる実験において、免疫化の後ＣＴＬ細胞が出現する時間を決定する。さらなる実験では、ＬＬＯ配列、ＡｃｔＡ配列、またはＰＥＳＴ様配列の抗原との融合物が非ＬＭ系で試験される。
【実施例１１】
【０２３７】
実施例１１：アレルギー性喘息の調節および抑制におけるワクチンの有効性
材料および実験方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアレルギー性喘息の誘導
【０２３８】
マウスにＯＶＡ−ａｌｕｍ（２００ｍｃＬ生理食塩水中、ミョウバン１ｍｇあたり２ｍｃｇのＯＶＡ）の２回の腹腔内注射を０日および１４日に行い、それに続いて生理食塩水エアロゾル中１％のＯＶＡを３０、３２、および３４日に行った（２０分／日）。３５日までに、マウスは有意な気道好酸球増加症、および、末梢のリンパ器官および肺における強いＴｈ２応答に媒介される、高レベルの循環ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体を示す。３５日にマウスをＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体力価の決定のために出血させ、疾患の拡大の程度の等しい実験群に割り当てる。
【０２３９】
アレルギー性ＡＨＲの測定
アレルギー性ＡＨＲを、次の技法を用いて測定する：
【０２４０】
肺炎症：気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液の細胞およびサイトカインプロフィール:
気道の濾液中の好酸球炎症は、喘息の主な病理学的特徴である。細胞の変化を定量化するため、気管チューブを通じて５ｍｌ滅菌生理食塩水で肺を洗浄し、回収したサンプルあたりの気管支肺胞の（ＢＡＬ）洗浄液の量を測定し、白血球を計数する（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）。細胞遠心分離調製物に関して少なくとも３００細胞を計数することにより示差（differential）細胞計数を行う（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ２；Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）。スライドをＬｅｕｋｏｓｔａｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で染色し、標準的な血液学的手順により区別する。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびエオタキシンレベルを、ＥＬＩＳＡによるＢＡＬの無細胞上清から決定し、ブラッドフォードの標準的な方法により総タンパク質を決定する。
【０２４１】
サイトカインＥＬＩＳＡ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の標準的なプロトコールに従って、サンドイッチＥＬＩＳＡによりサイトカインを測定する。
【０２４２】
病理組織診断を、気管支周囲および血管周囲の粘膜下組織の周囲の炎症の変化の集中を示すために行う。洗浄後、０．５ｍｌのパラホルムアルデヒド（４％のｗ／ナトリウムカコジレート、０．１Ｍ、ｐＨ７．３）で肺を膨らませ、組織学的解析のために同じ溶液で固定する。膨張圧を制御して、サーファクタントプロテインＤ（ＳＰ−Ｄ）−／−マウスにおける気腫の程度を定量化する。気道炎症を評価するため、主要気管支の周囲の肺組織のブロックを切り取り、パラフィンブロックに包埋する。５ｍｃｍの組織切片をスライドガラスに貼り、スライドを脱パラフィンし、正常ウサギ血清中で３７℃にて２時間インキュベートし、ウサギ抗マウスＭＢＰまたは正常ウサギ免疫前対照血清のいずれかで染色し、４８℃にて一晩インキュベートする。洗浄および１％のクロモトロープ２Ｒ（ＨＡＲＬＥＣＯ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で３０分間のインキュベーションの後、スライドを３７℃にて３０分間フルオレセイン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧに入れ、次いでフルオレセインフィルターシステムを備えたツァイス顕微鏡を用いて調べた。主要気道周囲の粘膜下組織または末梢の（非気道）組織からの０．０６−ｍｍ２切片中の好酸球の数を、ＩＰＬａｂ２ソフトウェアで分析する（Ｓｉｇｎａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡ）
【０２４３】
アレルゲン負荷、および非特異性刺激、例えば、メタコリン（ＭＣｈ）などに対する気道過敏症も評価される。肺抵抗（ＲＬ）および動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）を、ＭＣｈの静脈内投与に続いて、次のように測定する：麻酔下（全ての外科的処置の前および最中、２０分ごとに、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン＋２０ｍｇ／ｋｇのキシラジン）、マウスに１．０ｍｇ／ｋｇのパンクロニウムブロミドを投与し、カニューレ処置し、人工呼吸させる（１４０呼吸／分；１回呼吸量０．２ｍｌ）。形質導入された肺胞圧および気流速度（Ｖａｌｉｄｙｎｅ  ＤＰ４５およびＤＰ１０３、ＵＳＡ）を用いて肺抵抗（ＲＬ）および動的コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）をコンピュータにより計算する（Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ）。
【０２４４】
結果
抗ＩgＤ抗血清を注射したマウスは、８日後に大量のＩｇＥおよびＩｇＧ１ポリクローナル抗体を産生する。アレルギー性喘息の調節および抑制における本発明のワクチンの有効性を判定するため、マウスを前の実施例からのＬｍ−ＬＬＯ−ＣＨεワクチンまたは対照Ｌｍベクターで免疫化する。注射の８日後に、２００〜３００ｍｃｇの抗ＩgＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ１の血清力価をＥＬＩＳＡにより決定し、脾臓のＩｇＥ分泌細胞およびＩｇＧ１分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴで定量化する。この実験は、長期の免疫記憶の誘導を判定するために、ワクチン投与後の間隔を変えて繰り返される。他の実験では、二次的ＩｇＥ抗体応答への抗ＩｇＥワクチンの効果をＡＨＲのマウスモデルにおいて評価する。
【０２４５】
本発明のワクチンのアレルギー性喘息への効果を判定するため、喘息を誘導し、マウスにその後Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＨεまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（抗原対照）をワクチン接種する。抗−ＯＶＡ  ＩｇＥ抗体およびそれを分泌するがＩｇＧ抗体は分泌しない細胞を、実験群において抑制する。ワクチン接種１週間後およびそれより後の時点で、さらなるマウスを犠牲にし、１Ｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３ならびにＩＦＮ−γのレベルを測定することによりＴｈ２応答を評価するため、肺および脾臓を取り出す。
【０２４６】
気道過敏症への本発明のワクチンの影響を判定するため、喘息のマウスに抗ＩｇＥまたは対照ワクチンをワクチン接種する。２週間後（喘息を衰退させるための休息期間）、マウスに漸増用量のメタコリンを負荷し、そのＡＨＲを上記のように測定する。
【０２４７】
上記の効果におけるＣＴＬの役割を判定するため、抗ＩｇＥおよび対照ワクチンで免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を調製する。細胞を、３０日以降のＯＶＡエアロゾルへの曝露の前に様々な期間で同系マウスに養子移入し、免疫パラメータを上記のように検定する。
【図１】
2009545330.tif 000015
【図２】
2009545330.tif 000016
【図３】
2009545330.tif 000017
【図４Ａ】
2009545330.tif 000018
【図４Ｂ】
2009545330.tif 000019
【図５】
2009545330.tif 000020
【図６Ａ】
2009545330.tif 000021
【図６Ｂ】
2009545330.tif 000022
【図７】
2009545330.tif 000023
【図８】
2009545330.tif 000024
【図９】
2009545330.tif 000025
【図１０】
2009545330.tif 000026
【図１１】
2009545330.tif 000027
【図１２】
2009545330.tif 000028
【図１３】
2009545330.tif 000029
【図１４Ａ】
2009545330.tif 000030
【図１４Ｂ】
2009545330.tif 000031
【図１４Ｃ】
2009545330.tif 000032
【図１４Ｄ】
2009545330.tif 000033
【図１５】
2009545330.tif 000034
【図１６】
2009545330.tif 000035
【図１７】
2009545330.tif 000036
【図１８】
2009545330.tif 000037
【図１９】
2009545330.tif 000038
【図２０】
2009545330.tif 000039
【配列表】
2009545330000001.xml
【国際調査報告】
2009545330.tif 000062
2009545330.tif 000063