(57)【要約】【課題】創傷処置、組織工学、組織再生及び細胞固定で使用するのに適した製品を供給する。【解決手段】細孔をもちそしてポリマー及びゲル形成のためのゲル形成イオンを含む発泡体を用意し、該イオンとの接触でゲルを形成できるゲル化サイトをもつ可溶性ポリサッカライドを含む液体成分を該発泡体と接触させ、それによって該イオンとの接触で、可溶性ポリサッカライドを含むゲルが該発泡体の細孔内に形成されることを特徴とする複合体の発泡方法及びこの方法でつくられた発泡体とその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔をもちそしてポリマー及びゲル形成のためのゲル形成イオンを含む発泡体を用意し、該イオンとの接触でゲルを形成できるゲル化サイトをもつ可溶性ポリサッカライドを含む液体成分を該発泡体と接触させ、それによって該イオンとの接触で、可溶性ポリサッカライドを含むゲルが該発泡体の細孔内に形成されることを特徴とする複合体の発泡方法。
【請求項２】
発泡体が殺菌されている請求項１記載の方法。
【請求項３】
ゲル形成イオンの少なくとも一部が、ゲル形成イオンを含む溶液中で発泡体を洗浄するか又は浸漬しそれから過剰の溶液を除去することによって取り込まれる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
発泡体がバイオポリマーからなる請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
発泡体が、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、キトサン及びそれらの混合物から選択されたポリサッカライドからなる請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発泡体が変性アルギン酸塩からなる請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発泡体が、少なくとも一つの細胞付着ペプチド配列をもった変性アルギン酸塩からなる請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発泡体中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩の平均分子量が約１０ｋＤａから約５００ｋＤａである請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
発泡体中のアルギネートの平均分子量が約５０ｋＤａから約３００ｋＤａである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
発泡体中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩が２０％以上のＧ含量をもつ請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ゲル形成イオンが、可溶性ポリサッカライドのゲル部分の少なくとも１０％に相当するモル量で存在する請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ゲル形成イオンが、可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの５％から２５０％に相当するモル量で存在する請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ゲル形成イオンがカルシウムイオンからなり、そしてゲル化イオンが可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの５％から２００％に相当するモル量で存在する請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ゲル形成イオンがストロンチウムイオンからなり、そしてゲル化イオンが可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの少なくとも５％から２００％に相当するモル量で存在する請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ゲル形成イオンがバリウムイオンからなり、そしてゲル化イオンが可溶性ポリサッカライドのゲル化サイトの少なくとも５％から２００％に相当するモル量で存在する請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
可溶性ポリサッカライドが可溶性ポリサッカライドを含む該液体の約０．２％から約１０％の重量濃度をもつ請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
可溶性ポリサッカライドが可溶性ポリサッカライドを含む該液体の約０．５％から約５％の重量濃度をもつ請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
液体成分中のポリサッカライドがアルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩及びペクチン及びそれらの混合物から選択されたものである請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ポリサッカライドがアルギン酸塩からなる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
もし人体内に移植される発泡体／ゲル複合体用に使用されるときは、アルギン酸塩が１００ＥＵ／ｇ以下のエンドトキシン含量をもつ請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
可溶性ポリサッカライドが、約４０００ダルトンから５０００００ダルトンの平均分子量をもったアルギン酸塩からなる請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
液体成分中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩が約２０％から約８０％のＧ含量をもつ請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
液体成分中のポリマーがアルギン酸塩からなりそしてアルギン酸塩が少なくとも２０％のＭ含量をもつ請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
該液体成分が約２ｍＰａｓから約５００ｍＰａｓの粘度をもつ請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
液体成分が約１０ｍＰａｓから約２００ｍＰａｓの粘度をもつ請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該液体成分がさらに機能性成分を含む請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
機能性成分が風味剤、芳香剤、粒子、細胞、多細胞集合体、治療剤、組織再生剤、成長因子、及び機能性食品からなる群から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該液体成分が機能性成分に対して不活性であるか機能性成分を安定化させる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ポリサッカライドが細胞付着ペプチド配列を含んでいる請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
発泡体の細孔内にゲルをもつ発泡体からなる複合体であって、該複合体が請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法によって得られることを特徴とする複合体。
【請求項３１】
ｉ）発泡体が細孔をもちそして発泡体の少なくとも一部に分布しているゲル形成イオンを含む発泡体；及びｉｉ）ポリサッカライドを含むゲルであって、ゲルが発泡体の細孔内に位置しそして発泡体と相互作用していることを特徴とする複合体。
【請求項３２】
細孔をもつ発泡体からなり、発泡体がゲル形成イオンをもち、ポリサッカライドゲルが細孔の少なくともいくつかに存在する複合体。
【請求項３３】
発泡体が、水、生理溶液、可溶性ポリサッカライド溶液からなる群から選択された液体を発泡体重量の１から３０倍の重量で吸収し、そしてポリサッカライド溶液が機能性成分を含む請求項３０から３２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３４】
複合体の弾性率が０．１ｋＰａから１０００ｋＰａである請求項３０から３３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３５】
発泡体及び／又はポリサッカライドが低含有量のエンドトキシンをもつ超高純度のポリサッカライドからなる請求項３０から３４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３６】
ポリサッカライドゲルがさらに機能性成分を含む請求項３０から３５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３７】
機能性成分が風味剤、芳香剤、粒子、細胞、多細胞集合体、治療剤、組織再生剤、成長因子、及び機能性食品からなる群から選択される請求項３６記載の複合体。
【請求項３８】
機能性成分が細胞からなる請求項３７記載の複合体。
【請求項３９】
ゲル形成イオンがバリウムイオン、ストロンチウムイオン、又はそれらの混合物を含む請求項３８記載の複合体からなる細胞増殖阻害用の複合体。
【請求項４０】
ゲル形成イオンがカルシウムイオンを含む請求項３７から３９のいずれか一項に記載の複合体からなる細胞増殖阻促進用の複合体。
【請求項４１】
発泡体がアルギン酸塩からなり、発泡体がさらに薬学活性剤及び／又は抗粘着剤から選択された機能性成分を含む請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法によって製造された複合体。
【請求項４２】
請求項３７から４０のいずれか一項に記載の複合体を、生体細胞に中性な浸透圧に調節したゲル形成イオンを含む溶液で洗浄することを特徴とする複合体中で細胞増殖を促進する方法。
【請求項４３】
洗浄工程が複合体の機械的性質を変性するように、ゲル形成イオンが選択される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
複合体を洗浄するために使用される溶液が、約５ｍＭから約２００ｍＭの濃度で、カルシウム塩、バリウム塩及びストロンチウム塩から選択された塩を含む請求項４２又は４３記載の方法。
【請求項４５】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法によって複合体を形成することからなると共に液体成分が細胞を含み、該ポリサッカライドが発泡体の細孔内でゲル化し、ゲル形成イオンがストロンチウムイオンを含むことを特徴とする細胞増殖を阻害する方法。
【請求項４６】
回収剤を含む水溶液を、可溶性サッカライドを含むゲルと接触させ、そこで該水溶液が生体細胞に中性な浸透圧を与えるように調節されていることを特徴とする請求項３８記載の複合体から細胞を回収する方法。
【請求項４７】
回収剤がクエン酸ナトリウム又はその他のクエン酸の可溶性塩、ＥＤＴＡナトリウム又はその他のＥＤＴＡ可溶性塩、又はヘキサメタフォスフェートを含む請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
インヴィトロの組織培養用途又はインヴィヴォの組織工学用途のための細胞固定及び／又は増殖のためのマトリックスとしての請求項３０から４１のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項４９】
複合体が、人や動物の身体に活性剤のインヴィヴォ徐放性を与えるための治療剤をさらに含む請求項３０から４１のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項５０】
複合体が、インヴィヴォの創傷処置を与えるための創傷処置に使用するための成分をさらに含む請求項３０から４１のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項５１】
組織に発泡体を固定し、該発泡体は連続細孔とゲル形成イオンをもち、可溶性ポリサッカライドを含む溶液を加えそしてポリサッカライドをゲル形成イオンと反応させることによって、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の複合体を該組織へ取り付けるための方法。
【請求項５２】
縫合によって複合体を組織に取り付けることからなる請求項３０から４１のいずれか一項に記載の複合体の該組織への取り付け方法。
【請求項５３】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法によって製造される複合体を移植しそして、発泡体が細胞成長を確立させる目的で人又は動物の身体内にアルギン酸塩を含むことを特徴とする細胞成長の促進方法。
【請求項５４】
可溶性アルギン酸塩と水を含む液体成分を、ゲル化した、ゲル形成イオンを取り込んだ、連続細孔のアルギン酸塩発泡体に添加し；そして発泡体が液体を吸収しそれによって細孔内でゲルを形成するときに可溶性アルギン酸塩を該ゲル形成イオンと反応させることからなるアルギン酸塩発泡体の細孔内のインシツゲル化を誘引させる方法。
【請求項５５】
組織と隣接した組織間に障壁を与えるように請求項３０から４１のいずれか一項に記載の複合体を組織に適用することからなる、隣接した組織への組織の付着を防止する方法。
【請求項５６】
ａ）ポリサッカライド、及び発泡剤及び所望による可塑剤、架橋剤及びｐＨ変性剤の一つ以上を含む水溶液分散物から湿潤発泡体を形成し；ｂ）所望により機械攪拌によって、水溶液分散物から発泡体を混合し；ｃ）ｉ）発泡体を成形し；そしてｉｉ）発泡体から架橋した発泡体を形成する工程の一つ以上を所望により実施し；ｄ）連続細孔を含む乾燥発泡体を形成するために発泡体を乾燥し；そして工程ａ）からｄ）の一つ以上に、又は工程ｄ）の後でゲル形成イオンを添加することを特徴とする、連続細孔ネットワークと細孔をもち引き続き添加されたポリサッカライド溶液をゲル化させるためのゲル形成イオンを含む乾燥吸収発泡体を形成する方法。
【請求項５７】
ポリサッカライドがヒアルロン酸塩を含む請求項５６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発泡体の細孔内でゲル化したポリサッカライドからなる複合体、その複合体の製造方法、及びその使用方法に関する。複合体は生物医学用途、例えば、細胞培養媒体及び移植、徐放伝達系、食品用途、工業用途、及び化粧品及び口腔衛生を含むパーソナルケア用途に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、引っ張り強度を増加させるために、紫外線照射によって架橋し、所望により殺菌緩衝液で、引き続き脱イオン水で洗滌し、そしてそれから未架橋のコラーゲンでコーティングしたバイオポリマーを含む被覆したバイオポリマー発泡体の製造方法を開示している。
【０００３】
特許文献２は、タンパク溶液又は変性したポリサッカライド及び、もし必要なら、架橋剤を含むゲル前駆体が、典型的には固体ゲル状態に転移する前にスポンジに添加されるようなゲルを注入したスポンジを開示している。ゲル化の開始は、酵素的に、熱的に、光化学的に、又は化学的に引き起こされる。ここでは、しかしながら、ゲル形成剤は発泡体マトリックス中に統合されずにマトリックスに添加されている。
【０００４】
特許文献３は、一つはコラーゲン移植そしてもう一つは膨潤圧力を発生する水和アルギン酸塩ゲルである、二つのマトリックス成分を含む生機械的移植を開示している。移植は細胞の個体群を含む。複合体の製造において、アルギン酸ナトリウム溶液は、アルギン酸塩とコラーゲンマトリックス間の引っ張り張力を作り出すために生理食塩溶液中に浸漬することによって膨潤を引き起こす。複合体は、二価カチオン塩を含む溶液中に浸漬させて、アルギン酸塩の架橋により水和ゲルを生成させることができる。
【０００５】
特許文献４は、可塑剤を内包するヒドロゲル前駆体の水溶液中にカチオンを含む繊維を調合してヒドロゲルを形成しそれからヒドロゲルを脱水することによって脱水した（多孔質の）ヒドロゲルの形成方法を開示している。
【０００６】
特許文献５は、カチオンをアニオン性ポリマーの架橋に寄与させるアニオン性ポリマー及び繊維又は他のポリマー粒子の固体架橋形態を含む吸収性発泡体材料を開示している。繊維は補強剤として作用するように最終の発泡体中に残る。最終の発泡体がさらなる生成物を製造するためにさらに反応することも、発泡体が、さらなる反応物への寄与に適したカチオンを含むことも暗示はされていない。
例えば、創傷処置、組織工学、組織再生及び細胞固定で使用するのに適した製品を供給するためのニーズが存在する。
【０００７】
【特許文献１】ＵＳＰ５，９４８，４２９（Ｂｅｌｌ）
【特許文献２】ＷＯ０１５４７３５  Ａ２（Ｂｅｎｔｚ）
【特許文献３】ＵＳＰ６，３０６，１６９（Ｌｅｅ）
【特許文献４】ＵＳＰ６，２０３，８４５（Ｑｉｎ）
【特許文献５】ＵＳＰ６，６５６，９７４（Ｒｅｎｎ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、創傷処置、組織工学、組織再生及び細胞固定で使用するのに適した製品を供給することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特性の優れた組み合わせをもった複合体が、細孔及び発泡体の細孔内で、インシツで形成されるゲルをもつ発泡体からなる複合体を形成することによって製造されることを見出した。
一観点においては、本発明は、発泡体及び発泡体の細孔内で、インシツで形成されるゲルを含む複合体を形成するための方法を提供するが、その方法は細孔をもち、ポリマー、好ましくは架橋可能なポリマー、及びゲルを形成するためのゲル形成イオンを含む発泡体を準備し、該イオンとの接触でゲルを形成できるゲル化サイトをもつ可溶性ポリサッカライドを含む液体成分を該発泡体と接触させ、それによって該イオンとの接触で、可溶性ポリサッカライドを含むゲルが該発泡体の細孔内に形成されることを特徴とする複合体の発泡方法である。
【００１０】
有利には、複合体中のゲルはその意図した使用のために良好な構造的完全さをもっており、例えば、ゲルは、望まない限り、発泡体から漏れない。その複合体は、公知のヒドロゲルに比較して物理的性質の優れた組み合わせをもっており、そして複合体は機能性成分、例えば、薬剤及び細胞個体群を運ぶために、そして好ましい運搬特性、例えば放出されるべき材料の放出を与えるために使用される。放出は如何なる好適な方法、例えば溶媒との接触によって、温度変化によって又は機械的操作によって引き起こされてもよい。複合体は有利には細胞固定のために使用される。
【００１１】
複合体はインシツ法によって製造され、その場合、発泡体はその意図した位置で使用されそしてそれから可溶性ポリサッカライドが、インシツで複合体を形成するように発泡体に添加される。発泡体は所望のときに使用前又は使用過程で形状化される。発泡体は固定具、例えば縫合によって基材に固定されそして可溶性ポリサッカライドがそれから発泡体に添加されゲルを生成しそして複合体を形成する。所望のときは、複合体を形成してそれから固定具、例えば縫合を使用して基材に固定してもよい。
【００１２】
複合体が室温又は室温付近でのプロセスで好適に製造されるときは、温度に敏感な材料を好適に内包させてもよい。本発明の方法は、もし所望なら含んでいてもよいが、高められた又は低下した温度での乾燥工程、例えばフリーズドライ工程を含む必要がない。特に高温での複合体の乾燥を避けるオプションは、有利なことに、複合体に内包された温度に敏感な材料が均一に分布しそして不活性化又は変質しない複合体の製造を可能にする。細孔をもち、ゲル形成イオンが内包されている発泡体中にポリサッカライドを含む液体成分を吸収させ、そしてポリサッカライドを発泡体の細孔内でゲル化させることを包含する。液体成分中のポリサッカライドは、好適には発泡体中のゲル形成イオンと反応性でゲルを形成する。
【００１３】
第三の観点では、本発明は本発明の方法でつくられた複合体に関する。
更なる観点においては、本発明は本発明の方法に従ってつくられた複合体の使用方法を提供する。
複合体は発泡体構造内で、インシツで生成したゲルを含みそしてゲルは発泡体内に分散する。複合体は特に医療用途、例えば創傷処置、組織工学及び組織再生及び細胞固定において使用するのに好適である。
【００１４】
好適には、複合体は、生理適合性のｐＨをもつ。発泡体又はゲルは分解性でそして両方とも好ましくは分解性である。発泡体及びゲルは人又は動物の身体内で同じ又は異なった条件下で又は異なった速度又は時間で分解する。
【００１５】
発泡体の細孔内でインシツに形成されたポリサッカライドゲルを含む複合体は、細孔をもちそして発泡体内に内包されたゲル形成イオンをもった発泡体にポリサッカライドを含む液体成分を添加しそれによってポリサッカライドのゲル化を引き起こすことによって作られる。
【００１６】
好適な発泡体は、好ましくは５から１０００ミクロン、より好ましくは２５から５００ミクロンの範囲の細孔サイズをもつ連続細孔ネットワークをもつ発泡体を包含し、その細孔内に添加されたポリサッカライドを含む液体成分を吸収することができる。本発明で使用するのに好適な発泡体は、少なくとも一つの面で連続した細孔をもちそして望ましくは、発泡体内で吸収されたポリサッカライドの輸送を可能にする及び／又は発泡体によって吸収できる液体成分の容積を効果的に増加させる内部結合した細孔の少なくとも一部をもつ。
【００１７】
発泡体は好適には膨潤性でそして好ましくは、液体、例えば生理水溶液又はポリサッカライド溶液を発泡体重量の好ましくは３０倍まで、より好ましくは１から２０倍吸収する。発泡体は細孔サイズの均一な又は不均一な分布をもつことができる。全ての細孔が液体成分を吸収する必要があるわけではない。
【００１８】
好適には、発泡体、複合体又は複合体を含む部材は、好ましくはγ線照射、Ｅ−ビーム、酸化エチレン、オートクレーブ加熱又はＮＯｘガスとの接触、水素ガスプラズマ殺菌によって殺菌される。殺菌は、複合体又は複合体に含まれる機能性成分に悪影響を与える場合には採用されるべきではない。
【００１９】
発泡体中のポリマーはイオン性又は共有結合架橋性であるが、可溶性ポリサッカライドが発泡体中のポリマー又は発泡体の成分、例えばゲル形成イオンと架橋可能である限り、架橋性である必要はない。
好ましい態様においては、発泡体は植物又は動物由来のバイオポリマーから形成される。そのような発泡体は、例えば特許文献６、特許文献７、特許文献４又は特許文献５に開示されているような先行技術のプロセスに従ってつくられる。
【００２０】
発泡体中のゲル形成イオンは、ポリサッカライドの少なくとも一部とゲルを形成するのに十分な量で存在する。
ポリサッカライドを含む液体成分と反応するためのゲル形成イオンは、発泡体の調製過程で取り込まれるか又は好ましくは液体成分の添加前に発泡体に添加される。ゲル形成イオンは、湿潤発泡体内で混合物の形成前に混合物、好ましくはバイオポリマー混合物内に分散させるか又は形成した発泡体に添加されることによって取り込まれる。所望により、追加のゲル形成イオンは、発泡体と添加されたポリサッカライドを含むゲルを含む複合体に添加される。ゲル形成イオンは、例えば発泡体を、発泡体を溶解させないゲル化イオン溶液で洗浄するか浸漬することによって取り込まれる。過剰の溶液は圧縮によって除去される。
【００２１】
ポリサッカライドを含む液体成分の添加前に発泡体中で十分なゲル形成イオンを与えることによって、複合体の体積の少なくとも一部を通して形成されたゲルをもつ複合体が確保される。
【００２２】
更なる態様においては、本発明は、発泡体、好ましくはバイオポリマーを含む発泡体を与えるが、ここで発泡体は細孔をもちそして発泡体中に分布した、好ましくは実質上均一に分布したゲル形成イオン及びポリサッカライドを含み、且つ発泡体の細孔内に位置して発泡体と相互作用するゲルを含む。
【００２３】
好ましくは、ゲル形成イオンは表面細孔のみよりはむしろ発泡体の内部細孔の少なくともいくつか中に存在する。ゲル形成イオンは、好ましくは発泡体中で実質上均一に分布している。ポリサッカライドを含む液体成分の導入前に発泡体中にゲル形成イオンを与えることによって、ポリサッカライドは、ポリサッカライドを含む液体成分の添加において、発泡体の内部体積の少なくとも一部でそして好ましくは実質上内部体積の全てを通してゲルが形成するように、イオンと相互作用する。
【００２４】
ゲルと発泡体の相互作用は、ゲル形成イオンが形成する“ブリッジ”によって、発泡体とポリサッカライド間の結合を介して化学的なものである。その相互作用は、ゲルと発泡体の物理的な内部結合によって発泡体の細孔内に保持されるゲルを介して物理的なものである。
【００２５】
発泡体はゲル形成イオンを含みそしてポリサッカライドを含む液体成分の添加で、ポリサッカライドは、発泡体中の細孔や通路によって発泡体の内部に好都合に浸透しそしてゲル形成イオンと反応して複合体を形成する。この場合、ゲルは、発泡体の内部体積の少なくとも一部を介して形成される。ゲル形成イオンを取り込む前に発泡体にポリサッカライドを添加すると、該イオンの添加において、発泡体の内部に該イオンの浸透を妨げるゲル層を形成する発泡体の表面上又は表面近くで反応が起こりやすくなる。
【００２６】
さらに、ゲル及び複合体は望ましくないことに不均一であるかもしれない。
好ましい態様においては、複合体は実質上均一なゲルを含む。
一態様においては、発泡体マトリックスのために使用されるポリマーはゲル形成イオンとゲル化するポリサッカライドを含む。好ましい態様においては、発泡体は、所望により、例えば特許文献７に記載されているような発泡剤を含む架橋したバイオポリマーを含む。
【００２７】
発泡体は好ましくは、ポリサッカライド及び／又は化学的に変性したポリサッカライドを含む。変性したポリサッカライド、例えばペプチドカップリングしたポリサッカライドが文献公知の手段で調製される。例えば、変性アルギン酸塩は特許文献８に開示されている。ペプチドカップリングしたポリサッカライドは、例えば細胞固定において細胞増殖及び細胞分化を促進するために使用するのに好ましい。ペプチドカップリングしたポリサッカライドは好ましくは変性していないポリサッカライドと組み合わせて使用される。
【００２８】
発泡体は好ましくは乾燥した吸収性発泡体である。
好ましい態様においては、本発明は、ａ）ポリサッカライド、及び発泡剤及び所望による可塑剤、架橋剤及びｐＨ変性剤の一つ以上を含む水溶液分散物から湿潤発泡体を形成し；ｂ）所望により機械攪拌によって、水溶液分散物から発泡体を混合し；ｃ）ｉ）発泡体を成形し；そしてｉｉ）発泡体から架橋した発泡体を形成する工程の一つ以上を所望により実施し；ｄ）連続細孔を含む乾燥発泡体を形成するために発泡体を乾燥し；そして工程ａ）からｄ）の一つ以上に、又は工程ｄ）の後でゲル形成イオンを添加することを特徴とする、連続細孔ネットワークと細孔をもち引き続き添加されたポリサッカライド溶液をゲル化させるためのゲル形成イオンを含む乾燥吸収発泡体を形成する方法を提供する。
【００２９】
特に好ましい態様においては、ゲル形成イオンが、発泡体全体を通して、該ゲル形成イオンの実質上均一な分布を与えるために、工程ａ）に添加される。ｐＨを減少させたり増加させたりするための公知のｐＨ変性剤及び可塑剤も使用でき、例えば特許文献７に記載されている。
【００３０】
発泡体は空気乾燥によって乾燥されそして所望なら成形、形状化又は圧縮に晒される。
本発明で使用される発泡体は、好ましくはポリサッカライドである。発泡体を製造するための好適なポリサッカライドの例としては、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、キトサン及びそれらの混合物を包含する。アルギン酸塩、キトサン及びヒアルロン酸塩が好ましいポリサッカライドである。
【００３１】
発泡体は好ましくは単一の発泡体を使用して調製されるか、又は代替としては、異なった密度又は細孔サイズ、及び発泡及び非−発泡領域の発泡体を含む不均一構造体から調製される。本発明で使用するのに好適なポリサッカライドとしては、水のような溶媒に可溶性のポリサッカライドを包含しそしてゲル形成イオンとの相互作用によってゲルに形成することができる。好適なポリサッカライドの例としては、ポリサッカライド単独又は別のポリサッカライドとの混合物でゲルを形成する限り、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、キトサン、ヒアルロン酸塩、及びそれらの混合物を包含する。
【００３２】
アルギネートはアルギン酸の塩である。海藻から単離される、アルギン酸は二つのウロン酸から作られるポリウロン酸：Ｄ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸である。Ｄ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸の比は、海藻の種類、植物の樹齢、及び海藻の部分（例えば、幹、葉）のような因子で変化する。アルギン酸は実質上水に不溶性である。それは、ナトリウム、カリウム、及びリチウム；マグネシウム；アンモニウム；及びメチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンのような低級アミンから導かれる、置換したアンモニウムカチオンのようなアルカリ金属と水溶性塩を形成する。その塩は、ｐＨ４以上で水溶液媒体に可溶性であるが、ｐＨが約４以下に下がるとアルギン酸に変換される。熱可逆性の水不溶性アルギネートゲルは、ゲル形成イオン、例えば、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、亜鉛、銅（＋２）、アルミニウム、及びそれらの混合物の適切な濃度の存在で形成される。アルギネートゲルは、ゲル形成イオンのための可溶性カチオン又はキレート剤、例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩等々の溶液に浸漬することによって溶解する。
【００３３】
主要なカチオンがカルシウムである水不溶性アルギネート塩は、クラス  ファエオフィシー、その例としてはフューカスベシキュロサス、フューカススピラリス、アスコフィリウムノドサム、マクロシスチスピリフェラ、アラリアエスキュレンタ、エクロニアマキシマ、レソニアニグレセンス、レソニアトラベキュラータ、ラミナリアジャポニカ、ダービリーアンタークチカ、ラミナリアハイパーボリー、ラミナリアロンギクルリス、ラミナリアディジタータ、ラミナリアサッカリーナ、ラミナリアクロウストニ、及びサラガッサムｓｐの海藻の葉状体及び幹中に見出される。アルギン酸及びその水溶性塩、特にアルギン酸ナトリウムの天然源からの回収方法は公知で、そして、例えば特許文献９及び特許文献１０に記載されている。
【００３４】
更なる態様においては、ポリマーはキトサンを含む。キトサンは、β−（１→４）−結合した２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノーズ（ＧｌｃＮＡｃ）及び２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノーズ（ＧｌｃＮ）からなる線状ポリサッカライドである。キトサンはキチンのＮ−脱アセチル化した誘導体で、それは全体がほとんどβ−（１→４）−結合した２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノーズ（ＧｌｃＮＡｃ）から構成されている。市販のキトサンは、キチンのアルカリＮ−脱アセチル化によってつくられる。不溶性化合物の除去と結びつけた不均一系脱アセチル化プロセスは、ポリマー鎖に沿って、ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮ−単位のランダム分布をもったキトサン生成物を生じさせる。キトサン中のアミノ基は、約６．５のｐＫａ値をもちそしてこの値以下のｐＨで、遊離のアミノ基はプロトン化して溶液中に溶解したキトサン塩は正電荷を運ぶことになる。従って、キトサンは負に帯電した成分と反応し、キトサンの正電荷密度の直接関数となる。
【００３５】
有利なことに、キトサンのカチオン的性質は、生理粘着的性質を与える。さらに、キトサンは、血の固まりの形成においてそして治癒過程のフィブリンレベルを減少させて傷跡組織の形成を減少させる、それらの負電荷を与える効果によって赤血球組織を沈殿させる。キトサンは、リゾチーム及び哺乳類の身体、例えば人体中で生ずる他の関連する酵素によって分解する。使用する場合、本発明の発泡体中のキトサンは、哺乳類の唾液、涙、血清及び腸液内のリゾチームによって分解する。酵素的分解は、発泡体を生成物がその機能を果たしそしてそれから分解によって身体から排泄されるように設計することを可能にする。
【００３６】
ペクチンは、種々の植物の根、幹、葉、及び果実、特にライム、レモン、グレープフルーツ、及びオレンジのような柑橘類の果実の皮中に見出される天然生成ポリサッカライドである。ペクチンは、Ｄ−ガラクトロン酸由来のポリマー単位を含む。市販製品は、Ｄ−ガラクトロン酸由来の単位の２０−６０％が、ペクチン源にも依るが、メチル基でエステル化されている高メトキシペクチン及び低メトキシペクチン（及びアミド化したペクチンのような誘導体）を包含する。ペクテート（ぺクチネート）は、Ｄ−ガラクトロン酸由来の単位の２０％までと一緒に完全に脱エステル化されたペクチンである。
【００３７】
カラギーナンは、赤い海藻から抽出された硫酸化されたガラクタンの群を意味する。カラギーナンは、交互の（１→３）α−Ｄ及び（１→４）β−Ｄ−グルコシジン結合と結合したＤ−ガラクトピラノシル単位の直鎖である。カラギーナンは、部分的には、硫酸化の程度及び位置によって区別される。多くの砂糖単位は、炭素数Ｃ−２又はＣ−６のヒドロキシル基にエステル化した一つ又は二つの硫酸基をもっている。好適なカラギーナンとしては、カッパーカラギーナン、イオーターカラギーナン、及びカッパーＩＩカラギーナン及びそれらのブレンド物を包含する。ナトリウムカラギーナンは室温で可溶性である。カラギーナンは、公知の技術によってゲル形成イオンの低含量で調製される。カラギーナンゲルは熱可逆性である。ゲル形成イオンの高レベルはゲルが溶融する温度を増大させる。カッパーカラギーナンは強く堅いゲルを生成するが、イオーターカラギーナンは弾性的で従順である。カッパーとイオーターのコポリマーであるカッパーＩＩカラギーナンは弱いゲルである。特定のカラギーナンのためのゲル形成イオンは文献公知でそしてカリウム及びカルシウムを含む。ラムダーカラギーナンは水中でゲルを形成しないが、ブレンド、例えば得られるゲルの機械的性質を変性するために有用である。好ましいカラギーナンはイオーターカラギーナンである。イオーターカラギーナンは、Ｄ−ガラクトース−４−流酸塩−３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース−２−流酸塩の繰り返し単位をもち、約２５から３４％の硫酸エステル含量を与える。
【００３８】
さらに好ましいバイオポリマーは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、それらの塩及び変性したヒアルロン酸からなる。ヒアルロン酸ナトリウムは、全ての高級動物の皮膚、関節、眼及び多くの器官及び組織の外部細胞マトリックス中に見出される豊富なグリコサアミノグリカンである。動物由来でないＨＡは、ステレプトコカスズーエピデミカスから発酵する。非−動物源からのヒアルロン酸は本発明の使用に好ましい。ヒアルロン酸は、（β−１，４）−結合したグルクロネート（Ｄ）と（β−１，３）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ）から構成される直鎖のコポリマーである。ヒアルロン酸塩のコイル状の構造はその重量のほぼ１０００倍の水を捕捉することができる。これらの特性は分子に有利な生化学的性質及び明白な生物学的機能を与え、そして薬剤運搬、組織工学及び粘性サプリメントにおける生体適合性で生体活性な材料のための建設ブロックとして使用するのに望ましい。
【００３９】
ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩は、哺乳類器官中の天然成分でヒアルロニダーゼによって酵素的に分解可能である。内皮組織中のヒアルロン酸塩の半減期は一日以下であり、そして成人中のポリマーの自然回転率はほぼ７ｇ／日である。ヒアルロナンのマイルドから中庸な共有結合変性は、インヴィヴォの安定性と滞留時間を数日から数ヶ月又は一年まで増加させる。
【００４０】
好適に変性されたヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸塩に共有結合した基を含むものを包含しそして例えばペプチド結合したヒアルロン酸塩を包含する。好ましい変性したヒアルロン酸塩は、好適には共有結合的に変性したカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基をＤ及びＮモノマー単位上にそれぞれもっている。変性したヒアルロン酸塩は、変性したヒアルロン酸塩の基及び濃度の選択によって、架橋可能性、溶解度、例えば、特定の細胞、薬剤又はペプチドと結合する能力の生分解速度のようなヒアルロン酸塩の性質又は機能性を加え、変性又は変更するために誂えられる。
【００４１】
ヒアルロン酸は、接続的組織治癒及び傷のない胎児の創傷治癒の初期段階で重要な役割を演じそして細胞移動、細胞粘着、及び細胞増殖を調節しそして組織工学及び組織再生用途において特に有用であると考えられる。
【００４２】
変性したポリサッカライドは、またポリサッカライド誘導体として知られているが、それらがゲル形成イオンと反応性である限り、本発明の用途で使用される。例えば、アルギネートは、酸化エチレン又は酸化プロピレンのようなアルキレンオキサイドと反応してグリコールアルギネートを生成する。グリコールはカルボキシル基を介してアルギネートに結合する。典型的には、アルギネートは酸化プロピレンと反応してプロピレングリコールアルギネート（ＰＧＡ）を生成する。プロピレングリコールアルギネートは特許文献１１、１２、及び１３に開示されている。好ましくは、プロピレングリコールアルギネートは、約４０％から約９５％、より好ましくは約７０％から９５％のエステル化率をもっている。異なった分子量のプロピレングリコールアルギネートの混合物も又使用される。アルミニウムイオンはグリコールアルギネートをゲル化させるのに好適である。
【００４３】
好ましくは、発泡体は、混合機、例えばワイヤーブラシを備えたキチンエイドミキサーを使用して、可塑剤、例えば、グリセリン及びソルビトールのようなその他の成分と一緒に発泡体を製造するためにポリマー水溶液を泡立てて製造される。
【００４４】
発泡剤が、発泡助剤として水溶液分散物中に含まれる。存在するときは、発泡剤は好適には発泡体の崩壊抵抗のある湿潤発泡体を製造する。発泡剤は単一材料でもよいし、又は発泡を助ける材料の混合物であってもよい。発泡剤は、ポリマー状発泡剤、界面活性剤、又はそれらの混合物であってもよい。
【００４５】
表面活性ヒドロコロイドのようなポリマー状発泡剤は、それらが界面活性剤よりも得られるゲル化した発泡体から浸出させるのが難しいので、一般的には多くの生物学的用途に好ましい。表面活性ヒドロコロイドの例としては、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、アルブミン及びプロピレングリコールアルギネートのようなグルコールアルギネートを包含する。いくつかの用途の場合、発泡剤に加えて、追加のポリサッカライド、例えばカルボキシメチルセルロースのようなセルロース誘導体を添加することが有利である。ポリマー状発泡剤は、好ましくは水に可溶性で、均一なゲル化発泡体が製造される。好ましい水溶性発泡剤としては、発泡体中で細かな細孔を生じさせる小さな泡を発生させる、アルブミン及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを包含する。
【００４６】
高レベルのカルシウムを含む乾燥した架橋発泡体を水に浸漬すると、発泡体構造は、典型的には、発泡体の高レベルの架橋によって破壊しない。しかしながら、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのような水溶性発泡剤を含む、発泡体中の可溶性成分は発泡体から拡散して出て行く。この発泡剤ロスは、使用条件下で溶解しない発泡剤の使用によって、例えば創傷治療用途において防止できる。いくつかの発泡剤は体温でゲルを形成し、例えば、メチルセルロースは３５℃以上で、ゲルを形成する。メチルセルロースを含む発泡体を、発泡体が体温で存在するような用途での発泡剤として使用するときは、メチルセルロースはゲル状態で存在しそして発泡体中に残りそして発泡体の湿潤強度に寄与する。
【００４７】
ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなポリマー状発泡剤が使用されるときは、水溶液分散物中のポリマー状発泡剤の濃度は典型的には約０．５ｗｔ％から約６ｗｔ％、好ましくは約１ｗｔ％から約４ｗｔ％、より好ましくは約１．５ｗｔ％から約２ｗｔ％である。これは、発泡体中に存在する添加剤を除いて、ポリマー状発泡剤を約３ｗｔ％から約３７ｗｔ％、好ましくは約６ｗｔ％から約２５ｗｔ％、より好ましくは約６％から約１２．５ｗｔ％を含む発泡体を生成する。
【００４８】
或る用途の場合、界面活性剤が、ポリマー状発泡剤の添加と一緒に又は添加無しで発泡剤として使用される。界面活性剤は、熟練した当業者に公知で、そして例えば、ここでは参照として取り込まれている特許文献１４に記載されている。非イオン性界面活性剤は、典型的には、疎水性の有機脂肪族又はアルキル芳香族化合物と親水性の酸化エチレン及び／又は酸化プロピレンとの縮合生成物である。得られたポリエーテル鎖の長さは疎水性と親水性の性質間の所望のバランスを達成するように調節できる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、約５から３０モルの酸化エチレンをもつｔ−オクチルフェノール及びｔ−ノニルフェノール、例えば約９．５モルの酸化エチレンと縮合したノニルフェノール、約１２モルの酸化エチレンと縮合したジノニルフェノールのような直鎖又は側鎖アルキル基中に８から１８の炭素原子を含むアルキルフェノールのエトキシレート；エトキシ化した及びプロポキシ化したアルコール、特にアルコールのモル当たり２から１００モルの酸化エチレン及び／又は酸化プロピレンをもつＣ１０−２０アルコール、特に約５から３０モルの酸化エチレンをもつ直鎖又は側鎖に約８から１８の炭素原子を含む一級アルコールのエトキシ化物、例えば、デシルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、又はミリスチルアルコールのエトキシ化物；約５から３０モルの酸化エチレンをもつ直鎖又は側鎖に約８から１８の炭素原子を含む二級脂肪族アルコールのエトキシ化物；酸化エチレン及び酸化プロピレンをもつ約８から２０の炭素原子を含む脂肪族アルコールの縮合物；ポリエチレングリコールとポリエチレンオキサイド；エトキシ化したキャスターオイル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（商標）ＣＯ４０）；エトキシ化した水素化キャスターオイル；エトキシ化したココナッツオイル；エトキシ化したラノリン；エトキシ化したトールオイル；エトキシ化したタローアルコール；及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（ＴＷＥＥＮ（商標）８５）のようなソルビタンエステルのエトキシ化物を包含する。傷薬のような物理的用途に対しては、界面活性剤が乾燥したゲル化発泡体に含まれるときは、ソルビタンエステルのエトキシ化物のような非−イオン性界面活性剤が好ましい。アニオン性界面活性剤の例としては、ステアリン酸ナトリウム、ナトリウムセチルサルフェート、ナトリウムラウリルサルフェート、アンモニウムラウリルサルフェート、トリエタノールアミンラウリルサルフェート、ナトリウムミリスチルサルフェート、及びナトリウムステアリルサルフェート、トリエタノールアミンドデシルベンゼンスルフォネート、ナトリウムドデシルベンゼンスルフォネート、ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテルサルフェート、及びアンモニウムポリオキシエチレンラウリルエーテルサルフェートである。好ましいアニオン性界面活性剤はナトリウムラウリルサルフェート（ナトリウムドデシルサルフェート）である。カチオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルベンジルメチルアンモニウムクロライド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムブロマイドのような四級アンモニウム塩、セチルピリジニウムブロマイド、及び四級化したポリオキシエチルアルキルアミンのハロゲン塩を包含する。両性イオン界面活性剤もまた使用できる。
【００４９】
界面活性剤がポリマー状発泡剤と一緒に使用されるときは、有用な界面活性剤はＴＷＥＥＮ（商標）２０界面活性剤のようなソルビタンエステルである。ＴＷＥＥＮ（商標）２０界面活性剤のような界面活性剤がポリマー状発泡剤と一緒に使用されるときは、乾燥したゲル化発泡体は、約０．０５ｗｔ％から１．０ｗｔ％、典型的には０．１ｗｔ％から０．５ｗｔ％の界面活性剤を含む。しかしながら、例えば、ナトリウムラウリルサルフェートのような界面活性剤がポリマー状発泡体無しで使用される口腔ケア用途のような或る用途に対しては、乾燥したゲル化発泡体は、発泡体中に存在する水及びシリカ又は他の研磨剤のような添加剤を除外して、約０．５ｗｔ％から５．０ｗｔ％、典型的には１．５ｗｔ％から３．０ｗｔ％の界面活性剤を含む。
【００５０】
人又は動物の身体の治療のための本発明に従った複合体成分は望ましくは生体適合性でそして所望により生分解性である。
発泡体はそれ自身本発明の複合体として同じ用途の製品として使用されてもよい。
【００５１】
本発明で使用するのに好適なゲル形成イオンとしては、一価又は多価イオン、好ましくは二価及び／又は三価イオン、又はポリサッカライドとゲルを形成できるイオン又はポリサッカライドと可溶性塩を形成しないイオンの混合物を包含する。特定のポリサッカライド用のゲル形成イオンは文献公知である。アルギネートの場合、好適な多価カチオンとしては、例えば、カルシウム（２＋）、バリウム（２＋）、ストロンチウム（２＋）、鉄（２＋）、亜鉛（２＋）、銅（２＋）、及びアルミニウム（３＋）を包含する。好ましいカチオンは二価カチオンであり、より好ましくはカルシウム（２＋）カチオンである。カリウムのような一価カチオンは、アルギン酸カリウムが可溶性アルギネート塩であるため、アルギネートに対するゲル化イオンとして考慮されない；しかしながら、カリウムカチオンは、カッパーカラギーナン又はカッパーＩＩカラギーナンに対しては好適なゲル化イオンである。ポリサッカライド塩が正電荷である例えば、キトサン、負電荷であるゲル形成イオン、例えばリン酸塩が使用できる。
【００５２】
所望のゲル形成イオン又はゲル形成イオンの混合物を与える塩又は塩の組み合わせはゲル形成イオンとして使用される。ゲル形成イオンは、調製過程又はポリサッカライドと液体の添加前に発泡体に添加される過程で発泡体中に取り込まれる。ポリサッカライド発泡体の典型的な洗浄溶液は、塩化カルシウム、塩化バリウム、又は塩化ストロンチウムのような水溶性ゲル化塩を約３０ｍＭから約２００ｍＭ、より好ましくは５０から１００ｍＭ含む。好適には、ゲル化速度は、それらがゆっくりと溶解するｐＨ条件下でわずかに溶解する塩を使用することによって、又は金属イオン封鎖剤と組み合わせた可溶性ゲル形成イオンを使用することによってゲル化を遅延するためにコントロールされる。洗浄又は浸漬は複合体の性質を変性するために使用でき、そこでは追加のゲル形成イオンは複合体を強くするか又は硬くするためにそしてまた細胞増殖をコントロールするために添加され、一方、金属イオン封鎖剤又は非−ゲル形成イオンのような他の処理は複合体を弱くするか又は溶解させるために使用される。アルギネートゲルは、クエン酸水溶液、ＥＤＴＡ又はヘキサメタフォスフェートの添加によって溶解する。生体細胞で使用するための洗浄処理は等浸透圧でなければならない。複合体の性質はそれに応じて所望のように誂えられる。
【００５３】
ゲル形成イオンは、発泡体及び／又はポリサッカライドのポリマーとゲルを形成することができる。ゲル形成イオンは、発泡体と可溶性ポリサッカライド間の結合を形成する。好ましくは、発泡体中の“ゲル形成イオン”は、ポリサッカライドに寄与可能でそして、ポリサッカライドのゲル化サイトの少なくともいくつかにおいて発泡体に液体成分を接触させることによって占有されているようなレベルで発泡体中に存在する。好適には、ゲル形成イオンは、添加されるポリサッカライド中のゲル化サイトの少なくともいくつかで占有するために十分なゲル形成イオンが存在する限り、ゲル形成イオンを結合するための発泡体中のサイトに対して化学量論レベルで発泡体中に存在する。
【００５４】
一態様においては、ゲル形成イオンは発泡体ポリマーとゲルを形成できない。
別の態様においては、発泡体は可溶性ポリサッカライド中のゲル化サイトに比較してゲル形成イオンの過剰を含む。ゲル形成イオンの少なくともいくつかは、発泡体構造内のゲル形成イオンとの相互作用によってゲル化する可溶性ポリサッカライドの添加前に発泡体中に取り込まれる。
【００５５】
ゲル形成イオンの濃度は、得られたゲルが、ゲル形成イオンと完全に反応しないゲル化サイトをもつポリサッカライドを含むようにコントロールされる；即ち、ゲル形成イオン又はゲル形成イオンの混合物は、ポリサッカライドのゲル化サイトの１００％を飽和させるのに必要な量より少ないモル量で存在する。例えば、カルシウムイオンのような、十分なゲル形成イオンが、利用出来る全てのゲル化サイト（例えば、アルギネートの場合のＬ−グルロン酸単位、ペクチン物質の場合のＤ−ガラクトロン酸）と反応するために存在するとき、ゲル形成ポリマーは１００％飽和する。アルギネートのゲル化サイトを完全に飽和させるのに必要なカチオン量は、二価カチオンのみ、又は三価カチオンのみがゲル化で使用されるときは、例えば、アルギネート中のＬ−グルロン酸２モル当たり１モルの二価カチオン、又はアルギネート中のＬ−グルロン酸３モル当たり１モルの三価カチオンであると考慮される。二価カチオン及び三価カチオンの混合物が使用されるときは、二価カチオンは二つのゲル化サイトと結合しそして三価カチオンは三つのゲル化サイトと結合するので、アルギネートを飽和させるのに必要な量が決定できる。このように、これより少ない量は、アルギネートのゲル化サイトを完全に飽和させるのに必要な量より少ない量であると考慮される。好適には、発泡体中に存在するゲル形成イオンは、ポリサッカライドのゲル化サイトの約５％から２５０％、より好適には５％から２００％、好ましくは約３５％から１５０％、よりさらに好ましくは約５０％から１００％飽和させるのに十分である。
【００５６】
発泡体それ自身はポリサッカライドを使用して調製されそしてまたゲル形成イオンを必要とする。発泡体及びポリサッカライドの両者が同じゲル形成イオンに依存する場合には、発泡体単独では、調製されるときに、例えば、１５０％の初期飽和をもつが、しかしながら、追加のポリサッカライドが液体として添加されそして発泡体の細孔に吸収されるときは、ゲル形成イオンのいくつかは添加されたポリサッカライドをゲル化するために使用される。この場合、添加されたポリサッカライドの飽和は、ゲル形成イオンの合計量及び細孔内でゲルを形成する発泡体中のポリサッカライド及び添加されたポリサッカライド発泡体の両者に対するゲル化サイトの合計量基準で計算される。
【００５７】
アルギネートの場合、アルギネートと多価カチオンとの反応で生成したゲルの強度はアルギネートの分子量、アルギネートのグルロン酸含量（“Ｇ含量”）及びポリマー鎖上のグルロン酸及びマンヌロン酸の配列に関係する。さらに、細孔サイズ、発泡体の厚み、アルギネート濃度、はゲル形成イオンのレベル及び使用されるイオンの種類もまた強度に寄与する。アルギネートのＧ含量は好適には少なくとも約３０％、好ましくは約４０％から約９０％、そしてより好ましくは約５０％から約８０％である。例えば、レッソニアトラベキュラータ由来の及びラミナリアハイパーボリーの幹からのアルギネートは、高いＧ含量をもちそして好ましいものとして本発明のゲル化発泡体を形成するために使用される。高Ｇ含量をもつ完全に飽和したアルギネートは、最も高い機械的強度をもったゲルを与える。
【００５８】
これらのＧブロックと化学量論的に反応するのに必要な、カルシウムのような二価カチオンの量が、二つのグルロン酸単位プラス一つの二価カチオンが一つのイオン架橋を作るのに必要であることを考慮することによってそれぞれのアルギネートタイプに対して計算できる。１％のアルギン酸ナトリウム溶液の化学量論的飽和に必要なカルシウムの量は下記の表に与えられる：
【００５９】
海藻源                              ％Ｇ        ｍＭ  Ｃａ
ラミナリアハイパーボリー（幹）      ７０        １４−１６
ラミナリアハイパーボリー（葉）      ５４        １１−１３
レッソニアトラベキュラータ          ６６        １３−１５
マクロシスチスピリフェーラ          ３９          ８−  ９
【００６０】
種々の商業的に利用出来るアルギネート、その性質、及びその製造源は、特許文献１５の表１、１６欄、４９行から１７欄、１８行に見出すことができる。アルギネートの混合物又はブレンド物、例えば、異なった分子量及び／又はＧ含量のアルギネートがゲル形成ポリマーとして使用される。
【００６１】
ゲル化サイトの完全な飽和（１００％飽和）は、組成物がＬ−グルロン酸単位の２モル当たり１モルの二価カチオンを含むときに起こる。例えば、ラミナリアハイパーボリーの幹から抽出されたアルギン酸ナトリウム１％溶液では約１５ｍＭのカルシウムイオン溶液が１００％飽和に必要で、ラミナリアハイパーボリーの葉から抽出されたアルギン酸ナトリウム１％溶液では約１２ｍＭのカルシウムイオン溶液が１００％飽和に必要で、そしてレッソニアトラベキュラータから抽出されたアルギン酸ナトリウム１％溶液では約１４ｍＭのカルシウムイオン溶液が１００％飽和に必要である。このように、アルギネートがゲル形成ポリマーとして使用されるときは、ゲル形成組成物は、アルギネート中に存在するＬ−グルロン酸単位２ｍＭ当たり、好ましくは０．２から０．９ｍＭの二価カチオン、好ましくは２０％から９０％のカルシウム（２＋）イオンを含む。わずかに溶解する塩をゲル形成イオンとして使用するときは、架橋の程度は、ゲル生成の過程で存在するゲル化剤、例えば炭酸カルシウムの量、及び／又は溶解剤、例えば、グルコノデルタラクトンのようなｐＨ変性剤の量をコントロールすることによってコントロールできる。好ましくは、ｐＨ変性剤とゲル化剤間には、実質上全てのゲル形成イオンが利用出来るように、化学量論関係があるべきである。
【００６２】
ポリサッカライド上の全てのゲル化サイトがゲル形成イオンで飽和していないときは、残りのサイトは非−架橋イオンによって占有される。所望なら、Ａｇ（１＋）カチオンのような活性イオンが残りのサイトのいくつか又は全てを占有するために使用される。特許文献１６はアルギン酸銀が、火傷、創傷、潰瘍損傷、及び関連する病的状態を治療するために使用されることを開示している。
【００６３】
発泡体に添加するのに好適な液体成分は、溶媒、典型的には水中に溶解しているポリサッカライドを含む。
可溶性ポリサッカライドからゲルを製造するために好適な可溶性ポリサッカライドの例としては、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、キトサン及びそれらの混合物を包含する。アルギン酸塩、キトサン及びヒアルロン酸塩が好ましい可溶性ポリサッカライドである。
【００６４】
液体成分の吸収速度及びポリサッカライドのゲル化速度は複合体の構造にインパクトを与える。液体成分の吸収速度及び吸着能力は、細孔サイズ及び体積のような発泡体特性、組成及び分子量のようなポリサッカライドの特性；及び固体濃度、及び粘度のような吸収に関係する液体成分の性質に依存する。液体成分の粘度が、発泡体に急速に吸収されるその能力にインパクトを与えるときは、低濃度のアルギネートを使用すること又は低分子量のアルギネートを使用することが好適である。
【００６５】
ゲルの機械的強度に影響する因子としては、ポリサッカライドの濃度、ポリサッカライドの分子量、異なったポリサッカライド成分のブレンド物を、適切な、例えばＭ−リッチな及びＧ−リッチなアルギネートの比、ゲル形成イオン及びゲルのその他の成分の種類とレベルとして包含する。ゲルの強度はこれらのパラメーターを意図した用途に従って操作することによって誂えられる。
【００６６】
好適には、液体成分の粘度は約５ｍＰａｓから約１０００ｍＰａｓ、より典型的には約８ｍＰａｓから６００ｍＰａｓ、より好ましくは約１０ｍＰａｓから２００ｍＰａｓである。発泡体の一部、例えば発泡体の表面にのみゲル層をつくることが望まれるのでなければ、液体成分は好ましくは発泡体の細孔内に完全に吸収される。細孔を被覆することのみを望むのでなければ、液体は十分にゲル化されるべきでそして未ゲル化または部分的ゲル化した材料が発泡体から漏れ出すことを避けるためにそれは細孔内に留まる。
【００６７】
ゲル形成は、ゲル形成イオンの量及び種類、組成及び分子量のようなポリサッカライド特性；及び固体濃度、及び粘度のような吸収に関係する液体成分の性質、及び利用出来る細孔体積に対する液体の相対割合に依存する。或る態様においては、液体が吸収され、ポリサッカライドがゲル化し始め、そしてゲルは細孔を満たす。他の態様、例えば、ポリサッカライドの実質部分は、液体が吸収されるときに細孔壁の被覆としてゲル化する。
【００６８】
好ましいポリサッカライドはアルギネート（アルギン酸塩）である。アルギネートが使用されるとき、液体は典型的には約０．５ｗｔ％から約１０ｗｔ％、好ましくは約１ｗｔ％から約６ｗｔ％を含む。好適な重量平均分子量は、約４，０００ダルトンから５００，０００ダルトン、好ましくは４０００から３０００００ダルトンである。全体で使用されるとき、重量平均分子量は、多角レーザー光散乱検知器を備えたサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を使用して決定される。
【００６９】
ポリサッカライドを含む液体は、ポリサッカライドゲル中に好適に配置され、例えば捕捉された機能性成分をさらに含む。液体成分が発泡体に吸収されるのを又はポリサッカライドがゲルを形成するのを妨げない限り、如何なる機能性成分も添加できる。機能性成分は液体又は固体であり、もし不溶性なら、液体中に微粒子として分散する。ゲル中に配置される望ましい成分は、風味剤、芳香剤、薬剤及び獣医薬剤、酵素、成長変性剤、及び抗菌剤、植物細胞、動物細胞、及び人体細胞を含む生体細胞、イースト、バクテリア、等々を包含する。薬剤、粒子、細胞、多細胞集合体、組織、及びその類似物の取り込みは、ポリサッカライド、好ましくはアルギネート、溶液中でゆっくりした混合を必要とする。その成分は、もし所望なら、ゲルから遅れて放出される細胞、薬剤、風味剤、芳香剤のような熱感応性物質を含むことができる。
【００７０】
存在する場合、機能性成分は複合体の意図した使用に従って選択される。その複合体は、好適には、使用時にその成分を放出する機能性成分のための担体として作用する。特に機能性成分が薬剤である場合、その複合体は特定の方法でその成分を放出するように誂えられる。成分の“放出プロフィール”は所望により、即放性、速い放出性、徐放性又はパルス的な放出性である。
【００７１】
或る態様においては、ゲルから捕捉された成分を放出することが望ましい。放出は、ゲルの物理的すり潰し、ゲルからの抽出、ゲルの溶解、又はゲルからの単純拡散又は漏れによって達成される。成分を放出させるために選択される方法は、用途及び放出されるべき成分の性質に依存し、そして機械的又は超音波エネルギー、温度又はｐＨ変化の適用、又はキレート剤のような“脱ゲル化”剤の添加を包含する。
【００７２】
本発明の複合体は、細胞培養マトリックス、組織工学移植、及び薬剤、生物学的製剤、抗菌剤及び殺菌剤の徐放性運搬系のような生物医学用途、及び食品用途、工業用途、及び化粧品及び口腔衛生のようなパーソナルケア用途において有用である。
【００７３】
一態様においては、本発明は、一つ又は二つの簡単な工程で殺菌した乾燥アルギネート発泡体内のゲル中に固定された細胞、薬剤又は粒子をもつ殺菌した複合体を製造する方法を提供する。
【００７４】
殺菌したアルギネート複合体の用途は、インヴィトロ又はインヴィヴォ組織培養用途に対する細胞固定及び／又は細胞増殖、創傷治療のための、又はインヴィヴォの抗−粘着層としての細胞治療及び人工器官、徐放性のためにインヴィヴォで使用される運搬系を包含する。
【００７５】
人に移植する為の部材は、好適には、部材当たり３５０ＥＵ以下のエンドトキシン含量をもつ。低いエンドトキシン含量、例えば３５０ＥＵ／ｇ以下、好ましくは１００ＥＵ／ｇ以下をもつ超純粋ポリサッカライドが、発泡体のために、或いは可溶性ポリサッカライドとして、又は両方が適切なものとして、生きている動物及び人に移植することが意図されている構造が何かによって、使用される。例えば、アルギネートが、人体への移植用に使用されるときは、アルギネートは好適に１００ＥＵ／ｇ以下のエンドトキシン含量をもつ。
【００７６】
好ましい態様においては、複合体は１０ＥＵ／ｇ以下のエンドトキシン含量をもつ。
本発明の複合体は、新しい組織の成長を導く鋳型を与えそして栄養分を細胞に到達させそして排泄物を取り除くことを確保する三次元の足場上に播種された細胞を使用して、機能的な組織が作り出される、組織成長及び組織工学において有用である。本発明の複合体は所望の内部成長を容易にしそして調節可能なそして予測可能な方法で分解を経験するように製作することができる。例えば、新しく発達した組織が複合体に広がるとき、複合体は好適に分解しそして新しい組織形成のためのスペースを与える。複合物はまた、複合体が、例えば細胞相互作用分子及び成長因子の放出、例えば骨、神経、皮膚及び軟骨の再生によって移植される領域中で固定された細胞との特定の相互作用を刺激するようにつくられる。その複合体は、所望の幾何形状に基づく細胞の内部成長を助長する成長因子を放出しそして移植のコントロールされた分解は再生された骨組織が加重に耐えることを可能にする。本発明の複合体は、カルシウムイオン又はストロンチウムイオンを、それぞれゲル形成イオンとして使用することによって、細胞増殖を促進するか又は阻害するように設計することができる。
【００７７】
複合体中で固定された細胞は動物に移植され、そこではゲルは免疫障壁として作用しそして免疫系によって検知を妨げ、それによって異種移植を可能にさせる。動物細胞に移植（異種移植）が望まれるとき、この種の人工器官を使用するとき、細胞が移植された細胞から成長してはみ出しそして免疫系に晒されるようにならないことが重要なので、好適にはストロンチウムがゲル生成イオンとして使用できる。その複合体はまた例えば、癌研究のための細胞、腫瘍及び組織の異種移植を確立するために使用できる。小鳥のランガーハンのような多細胞集合体の複合体中での固定は、該多細胞集合体を動物又は人間に免疫拒否無しで移植することを可能にしそしてそのような移植した多細胞集合体は、それから例えば、インシュリンを生成する人工器官として機能する。
【００７８】
細胞培養は多くの生体物質、例えば、酵素、ホルモン、免疫生体（モノクロナル抗体、インターロイキン、リンフォカインのような）を作り出すのに使用できる。細胞は、合計細胞数を増加させるために、本発明に従った複合体中で培養できる。例えば、患者から単離された細胞は、合計細胞数を増加させるために、本発明の複合体中で培養でき、細胞はそれから複合体から取り戻すことができそして組織工学用途で使用することができる。本発明に従った複合体中の細胞培養はまた組織のような構造体を生み出すための細胞分離及び成長を探求し、特徴づけ、特定するために使用することができる。例えば、細胞は外部ストレスによって影響を受けそして複合体（ゲル／発泡体）材料の弾性の変性は遺伝子表現に影響する。
【００７９】
複合体中でインヴィトロに生成する細胞は、回収剤を使用して培養液から好適に回収される。好適な回収剤としては、クエン酸ナトリウム又はクエン酸のその他の可溶性塩、ＥＤＴＡナトリウム又はＥＤＴＡのその他の可溶性塩、及びヘキサメタフォスフェートを包含する。
【００８０】
如何なる理論によっても拘束されることは望まないが、細胞が固定されている複合体及びゲルの堅さは、ゲルの機械的性質が増殖を調節し、そして分化は細胞のタイプに基づいて観察されるので、細胞成長のための重要な因子であると考えられる。細胞が付着しているゲルの堅さ（例えば、弾性率によって測定されるとき）は、外部骨格から生ずる力の大きさを確保できる細胞拡張の程度を決定する。アルギネートゲルの性質はアルギネート濃度、ゲル形成イオンの飽和度、及びゲル形成イオンのタイプによって変化する。さらに、アルギネートは、ＲＧＤトリペプチドのような細胞付着ペプチド配列のような、細胞付着のためのペプチド配列を添加するために化学的に変性することができる。
【００８１】
本発明に従った複合体は、組織間の癒着を防止するために人及び動物の身体の治療に使用される。外科的干渉は、組織、例えば筋肉間、筋肉と腱又は神経又はその他の組織間の癒着又は共成長を引き起こす。この望ましくない組織成長を防止するために、抗−癒着層が筋肉間、筋肉と腱又は神経間に挿入され創傷をカバーしそして治癒過程の手術後の癒着形成を防止する。本発明の複合体は、細胞成長及び抗−癒着層への浸入を遅らせるか防止し、治癒過程の組織間癒着を避ける、例えば複合体中のヒアルロン酸塩及びゲル化イオン材料の選択によって、抗−癒着層として使用するためにつくることができる。その複合体は、架橋イオンの量、ポリマーのタイプ、ポリマー濃度を適切に変えることによって、創傷治療剤として溶解しそして分解するか身体から排出される生分解性材料からつくることができる。
【００８２】
処方特性にも依るが、複合体は種々の時間をかけて分解するように処方することができそしてそれによって薬剤や組織再生剤のような固定された物質を放出することができる。本発明の好ましい使用は、有機又は無機物質が複合体中に固定できそして組織再生のための足場として作用することができる組織修復である。そのような一つの例は、発泡体内のゲル中にヒドロキシアパタイトを内包させることで、そしてそれから発泡体／ゲル複合体中に骨再生を生じさせるために骨欠陥中に移植される。別のそのような例は、複合体内に細胞を引き付ける物質を内包させることで、引き続き組織再生を促進するために組織の傷部分に複合体を移植するものである。
【００８３】
複合体が徐放性運搬用途、例えば、薬剤、成長因子、栄養剤、風味剤又は芳香剤として使用されるときは、その機械的及び化学的性質は、所望の環境において適切な放出に変性することができる。
【００８４】
用  語  解
アルブミン
牛のアルブミン、フラクションＶ、約９９％（Ａ−３０５９）（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
抗生物質−抗真菌剤
抗生物質−抗真菌剤溶液（０７１０）ＧＩＢＣＯ（商標）（インビトロゲン社、グランドアイランド、ＮＹ，ＵＳＡ）
Ｃ２Ｃ１２
マウスミオブラストセルライン（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７７２）
ＣａＣｌ２
塩化カルシウム二水和物、Ｐｈ．Ｅｕｒ．リーデル−デハーエン、ドイツ）
ＣａＣｌ２
塩化カルシウム二水和物（１．０２３８２．１０００）（メルク  ＫｇａＡ，ダームスタット、ドイツ）
ＣａＣＯ３
エスカール５００、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜５．２μｍ（ＫＳＬシュタウブテクニーク、ドイツ）
ＣａＣＯ３
ヒューバーカル５００エリート、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜４．２μｍ（ヒューバーエンジニアードマテリアルズ、フィンランド）
【００８５】
ＣａＣＯ３
ヒューバーカル２５０エリート、炭酸カルシウム、粒子サイズ〜８．７μｍ（ヒューバーエンジニアードマテリアルズ、フィンランド）
カルセイン
カルセイン、ＡＭ、１ｍｇ／ｍｌ（Ｃ３０９９）（インビトロゲン、モレキュラープローブズ、ＵＳＡ）
クエン酸塩
クエン酸ナトリウム二水和物、Ａ．Ｃ．Ｓ試薬（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
ＦＢＳ
胎児の子牛血清、ＧＩＢＣＯ（商標）（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
蛍光デキストラン１０ｋＤＡ
デキストラン、フルオレッセイン、１００００  Ｍｗ、アニオン性（Ｄ−１８２１）（モレキュラープローブス、オレゴン、ＵＳＡ）
蛍光デキストラン７０ｋＤＡ
デキストラン、フルオレッセイン、７００００  Ｍｗ、アニオン性（Ｄ−１８２２）（モレキュラープローブス、オレゴン、ＵＳＡ）
【００８６】
ＧＤＬ
グルコノδ−ラクトーン（ロケッテ、イタリー）
グリセリン
グリセリン、Ｐｈ．Ｅｕｒ．（ＶＷＲプロラボ、ローベン、ベルギー）
成長媒体
コンドロサイトのために変性されたダルベッコーズイーグル媒体（Ｄ−ＭＥＭ）
コンドロサイト
（６１６９５−０２６）ＧＩＢＣＯ（商標）（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）１０％熱不活性化したＦＢＳ（５６℃で２０分）、１％抗生物質−抗真菌剤及び１％ピルビン酸ナトリウム添加。
成長媒体
Ｃ２Ｃ１２細胞のために変性されたダルベッコーズイーグル媒体（Ｄ−ＭＥＭ）
Ｃ２Ｃ１２細胞
（Ｄ−７７７７）（シグマケミカルＣｏ．セントルイス、ＵＳＡ）。１０％の熱不活性化したＦＢＳ（５６℃で２０分）、３．７ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１０ｍｌ／ｌの非−必須アミノ酸、１０ｍｌ／ｌのペニシリン−ストレプトマイシン溶液、１．４ｍｇ／ｌのプロマイシン及びＭＱ−水を添加した。
【００８７】
成長媒体
ＭＤＣＫ細胞（Ｍ０６４３）のための最小必須媒体イーグル（ＭＥＭ）
ＭＤＣＫ細胞
（シグマケミカルＣｏ．セントルイス、ＵＳＡ）。１０％の熱不活性化したＦＢＳ（５６℃で２０分）、１０ｍｌ／ｌのペニシリン−ストレプトマイシン溶液、２．２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３及びＭＱ−水を添加した。
ＧＤＬ
グルコノδ−ラクトーン（ロケッテ、イタリー）
グリセリン
グリセリン、Ｐｈ．Ｅｕｒ．（ＶＷＲプロラボ、ローベン、ベルギー）
ハンクス
ハンクのバランス塩溶液；ＮａＨＣＯ３で変性；フェノールレッド、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムなし（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
【００８８】
ＨＰＭＣ
ファーマコート６０３、置換タイプ２９１０、ハイプロメローズ  ＵＳＰ、（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）（信越化学株式会社、日本）
イソトンＩＩ
ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）ＩＳＯＴＯＮ（商標）ＩＩ希釈液（ベックマンコウルター、ドイツ）
生／死テストキット
動物細胞の成育可能性／細胞毒性キット（インビトロゲン、モレキュラープローブス、オレゴン、ＵＳＡ）
マンニトール
Ｄ−マンニトール９８％（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
ＭＤＣＫ
マディンダービーカリーンキドニーセルライン（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−３４）
ＭＱ−水
ミリＱ水
【００８９】
ＮａＣｌ
塩化ナトリウム、ｐ．ａ．，（メルク、ドイツ）
ＮａＨＣＯ３
炭酸水素ナトリウム（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
Ｎａ２ＨＰＯ４
燐酸水素二ナトリウム：３０４２７（リーデル−デハーエン、ドイツ）
Ｎａ−トリフォスフェート
Ｎａ−トリフォスフェートペンタベーシック（Ｔ５８８３−５００Ｇ）（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＲＧＤ
ペプチド結合したプロノーバアップＭＶＧアルギネート、バッチ：ＣＢＩＦＭＣ０１Ａ０２１２２００５，殺菌ろ過し凍結乾燥した。ペプチド配列：ＧＲＧＤＳＰ．ペプチド：アルギネート比＝９．１１：１
ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＶＡＰＧ
ペプチド結合したプロノーバアップＭＶＧアルギネート、バッチ：ＣＢＩＦＭＣ０２Ａ０２１２２６０５，殺菌ろ過し凍結乾燥した。ペプチド配列：ＶＡＰＧ．ペプチド：アルギネート比＝１３．５：１
【００９０】
ペニシリン−ストレプトマイシン
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ０７８１）（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
プロタナール（商標）ＬＦ２００Ｓ
アルギン酸ナトリウム、薬用グレード、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝３０２ｍＰａｓ（ＦＭＣ、フィラデルフィア、ＵＳＡ）
プロノーバアップＭＶＧ
アルギン酸ナトリウム、バッチ：７０１−２５６−１１、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝３８５ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＬＶＧ
アルギン酸ナトリウム、バッチ：ＦＰ−５０２−０４、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝５０ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバＳＬＧ１００
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝１６６ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバＳＬＧ２０
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝３７．５ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
【００９１】
プロノーバＳＬＭ２０
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝９．０ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバＳＬＭ２０
殺菌アルギン酸ナトリウム、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝９２ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＬＶＧ
アルギン酸ナトリウム、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝２５ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＬＶＧ
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ：２２１１０５、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝３５ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＬＶＧ
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ：ＦＰ−５０２−０４、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝５０ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＬＶＧ
アルギン酸ナトリウム、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝９２ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
【００９２】
プロノーバアップＭＶＧ
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ：ＦＰ−３１０−０１、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝２９６ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＭＶＧ
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ：ＦＰ−３１２−０３、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝２４８ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロノーバアップＭＶＧ
超高純度アルギン酸ナトリウム、バッチ：７０１−２５６−１１、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝３８５ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロタサンＣＬ２１０（２１４）
塩化キトサン、バッチ：７０８−７８３−０１、脱アセチル化：９４．５％、ｐＨ＝５．３、粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝７７ｍＰａｓ（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロタサンアップＣＬ２１３
超高純度塩化キトサン、バッチ：ＦＰ−１０４−０２，粘度（２０℃で１ｗｔ％水溶液）＝７４ｍＰａｓ、脱アセチル化率＝８６％（ノバマトリックス、オスロ、ノルウエー）
プロピジウムイオダイド
（Ｐ４１７０）（シグマケミカルＣｏ．セントルイス、ＵＳＡ）
【００９３】
プロマイシン
プロマイシンジヒドロクロライド（Ｐ７２５５）（シグマケミカルＣｏ．セントルイス、ＵＳＡ）
ヒアルロン酸ナトリウム
薬品グレード８０、バッチ：１７０５３Ｐ、分子量：１．０８＊１０６ｇ／モル（紀文フードケミファ社用のノバマトリックス、日本）
ピルビン酸ナトリウム
ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ溶液（Ｓ−８６３６）（シグマケミカルＣｏ．セントルイス、ＵＳＡ）
ソルビトール
生化学用のＤ（−）ソルビトール、乾燥、１００％（メルク、ＫＧａＡ、ドイツ）
ソルビトールスペシャル
７０％ソルビトール溶液（ＳＰＩポリオールズ、ＵＳＡ）
ＳｒＣＬ２
塩化ストロンチウム六水和物９９％Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
ＳｒＣＯ３
炭酸ストロンチウム９９．９＋％（シグマ−アルドリッチケミーＧｍｂＨ、ドイツ）
【００９４】
【特許文献６】ＵＳＰ５，８８８，９８７（Ｈａｙｅｓ）
【特許文献７】ＷＯ２００５０２３３２３（Ｇａｓｅｒｏｄ）
【特許文献８】ＵＳＰ６，６４２，３６３（Ｍｏｏｎｅｙ）
【特許文献９】ＵＳＰ２，０３６，９３４（Ｇｒｅｅｎ）
【特許文献１０】ＵＳＰ２，１２８，５５１（Ｌｅ  Ｇｌｏａｈｅｃ）
【特許文献１１】ＵＳＰ３，９４８，８８１（Ｓｔｒｏｎｇ）
【特許文献１２】ＵＳＰ３，７７２，２６６（Ｐｅｔｔｉｔｔ）
【特許文献１３】ＵＳＰ２，４２６，１２５（Ｓｔｅｉｎｅｒ）
【特許文献１４】ＵＳＰ３，９２９，６７８（Ｌａｕｇｈｌｉｎ）
【特許文献１５】ＵＳＰ６，３３４，９６８（Ｓｈａｐｉｒｏ）
【特許文献１６】ＵＳ２００３／００２１８３２  Ａ１（Ｓｃｈｅｒｒ）
【発明の効果】
【００９５】
本発明の複合体は医療用途、例えば創傷処置、組織工学及び組織再生及び細胞固定において使用するのに特に好適である。複合体中のゲルはその意図した使用のために良好な構造的完全さをもっており、例えば、ゲルは、望まない限り、発泡体から漏れない。その複合体は、公知のヒドロゲルに比較して物理的性質の優れた組み合わせをもっており、そして複合体は機能性成分、例えば、薬剤及び細胞個体群を運ぶために、そして好ましい運搬特性、例えば放出されるべき材料の放出を与えるために使用される。
【実施例１】
【００９６】
この実施例は発泡体の堅さと弾性がゲル形成イオンと温度の関数としてどのように変化するかを示す。
テストされた三つの異なった発泡体用の湿式発泡体処方を表１に示す。その処方は、カルシウムイオンがアルギネートのゲル化サイトを飽和させるのに十分なように、炭酸カルシウムを、それぞれ６６％、１１１％及び１５５％で変化させた。
【００９７】
【表１】
2009529926.tif 000002
【００９８】
アルギネートの水溶液を調製して脇に置いた。炭酸カルシウムを混合ボウル中で水（表１で示される量より少ない２５ｇ）に溶解させた。グリセリン、ソルビトールスペシャル、アルギネート水溶液、及びＨＰＭＣを同じボウル中に添加しそして分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、均一性を確保するために中速度で１分間ブレンドした。新しく混合したＧＤＬ溶液（即ちＧＤＬプラス２５ｇの水）を添加する前に混合を高速度でさらに７分間続けそしてさらに高速度で１分間混合すると（１００ｍｌ容器を満たすのに必要な湿潤発泡体の重量から測定したとき）０．２５ｇ／ｍｌの密度の発泡体を与えた。発泡体を、バーシドライベンチプロテクターを使用して発泡体側のポリエチレンで被覆した２ｍｍの高さの成形型中に投入しそして乾燥オーブン中で、８０℃で３０分間乾燥する前にカバーをしないで保存した。発泡体の乾燥シートは、細孔サイズと厚みを変更したときに若干異なって見えた。湿潤発泡体のゲル化速度はゲル形成イオンの飽和と相関しているので、細孔の合体は最も低い飽和の発泡体で多く起こる。
【００９９】
２．１ｃｍ径の円形パッチを乾燥発泡体シートに貼り付けた。１１１％飽和の発泡体からの発泡体パッチのいくつかを１２１℃で２０分間オートクレーブ中で加熱した。
発泡体パッチを直径３．５ｃｍのペトリ皿中に置きそしてモデル生理溶液（２．５ｍＭのＣａＣｌ２  と９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ）４ｍｌを添加した。発泡体を、ボーリンＣＶＯ１２０高解像度レオメーターに移す前にこの溶液中に５分間保存した。発泡体を、振動測定の前に、５００μｍの隙間をもつ鋸歯状プレート間に置いた。０．５Ｐａから５０Ｐａのせん断応力を適用して、応力掃引を行った。周波数は１Ｈｚにセットした。それぞれの発泡体パッチに対して掃引を３回行った。線形粘弾性領域で読み取られる弾性率、Ｇ’，（Ｇ’ｌｉｎ）を表２に示す。テストは二つの異なった温度で行った。添加された生理溶液の温度、掃引過程及び測定過程の温度は２０℃か３７℃であった。
【０１００】
【表２】
2009529926.tif 000003
【０１０１】
データは、増加したゲル形成イオン量の関数として弾性率の増加を示す。オートクレーブ条件は１１１％飽和で発泡体の弾性に影響を与えないようであった。
【実施例２】
【０１０２】
この実施例は、ゲル形成イオンが発泡体から添加したアルギネート溶液にどのように拡散しそれによってどのようにゲル化を引き起こすかを示す。ゲル動力学及び材料の弾性の増加を記載するために、弾性率が、アルギネート溶液が添加された後の時間の関数として測定された。複合体を実施例１で調製した同じ６６％及び１１１％飽和した発泡体からの乾燥発泡体ディスク（２．１ｃｍ直径）及び２５０μｌの１％プロノーバアップＬＶＧ（９９ｍＰａ）から、発泡体の表面頂部上にピペットから滴下することによって溶液を均一に分配することによって調製した。添加したアルギネート溶液の全てが吸収されそしてそれは発泡体全体の細孔を満たした。６６％及び１１１％飽和した発泡体中に存在するカルシウムイオンは、複合体中のアルギネート合計量の４３％及び７１％を飽和させる。アルギネート溶液の添加５分後に複合体をレオメーターに移した。隙間を３００μｍにセットしそして周波数と歪をそれぞれ１Ｈｚと０．００１に保った。時間の関数としての複合体の弾性率、Ｇを表３に示す。
【０１０３】
【表３】
2009529926.tif 000004
【０１０４】
結果は、両者の発泡体の時間の関数としての弾性率を示し、それはアルギネート発泡体から添加されたアルギネート溶液へのゲル形成イオンの拡散と得られたゲル化を示している。１１１％発泡体の場合、Ｇの値は急速に増加し６０分後に一定の高みに達する。６６％飽和発泡体の場合、Ｇ値はより低く、よりゆっくり増加しそしてその結果は拡散がテストの１０５分内では完結しないことを示している。
【実施例３】
【０１０５】
この実施例は、生体材料複合体の弾性が、変化するゲル形成イオン量を含む発泡体の使用によってそして異なったＧ−含量と分子量をもったアルギネート溶液を添加することによって、どのように変性できるかを示す。
【０１０６】
テストされた発泡体は１１１％飽和発泡体及び実施例１からオートクレーブに入れられた１１１％飽和発泡体であり、そして炭酸カルシウムの半分を大きな粒子直径（ヒューバーカル２５０エリート、８．７μｍ）をもった炭酸カルシウムで置き換えた炭酸カルシウムのブレンド物を使用する以外は実施例１で調製された新しい１５５％飽和発泡体であった。この発泡体は、実施例１からの１５５％飽和発泡体よりも幾分大きな細孔をもっておりそしてより高い粘度でより多くのアルギネート溶液を吸収できた。１５５％飽和発泡体の湿潤密度は０．２４ｇ／ｍｌであった。実施例１のように、発泡体ディスク（直径２．１ｃｍ）をペトリ皿中に置き、そしてピペットを使用して、その頂部表面に２５０μｌのアルギネート溶液を添加した。添加したアルギネート溶液の全てが吸収されそしてそれは発泡体全体の細孔を満たした。添加したアルギネート溶液をもつ発泡体を含む皿を室温で６０分間保ち、そしてそれからモデル生体溶液の４ｍｌを添加した。５分後、皿をレオメーターに移し、そして応力掃引を、隙間を３００μｍにセットしたことを除けば実施例１に記載したのと同様に実施した。これらのサンプルの測定されたＧ’ｌｉｎを表４に示す。プロノーバアップＬＶＧのＧ含量は約６７％（高い−Ｇ）で、一方プロノーバＳＬＭ２０は約４３％Ｇ（高い−Ｍ）を含んでいる。より低い粘度をもったアルギネートサンプルを、プロノーバＳＬＭ２０及びプロノーバアップＬＶＧのそれぞれ１％と２％溶液をオートクレーブに１２１℃で２０分間入れることによってアルギネートの分子量を分解させて調製した。
【０１０７】
【表４】
2009529926.tif 000005
【０１０８】
【表５】
2009529926.tif 000006
【０１０９】
データは、１．０％及び０．５％添加したアルギネートの両者で最も高い弾性率をもつ複合体は添加された高−Ｇアルギネートをもつ１５５％飽和した発泡体であったことを示している。アルギネートの分子量は、０．７５％のアルギネート濃度で同じ結果が得られる高−Ｇアルギネートの場合０．７５％以下であることを除いて、弾性率Ｇ’ｌｉｎが粘度減少と共に低下するとき、高−Ｇ及び高−Ｍアルギネート両者にとって重要である。一般的に、弾性率Ｇ’ｌｉｎは、添加されたアルギネートの濃度が１５５％及び１１１％飽和発泡体の両者で、そして四つの異なったアルギネートで減少するときに減少する。例外は、最も低い濃度での低粘度アルギネートの場合に観察される。複合体の弾性率Ｇ’ｌｉｎは、発泡体をオートクレーブに入れたことによって変化しなかった。
【実施例４】
【０１１０】
この実施例は、複合体材料の弾性が、追加のゲル形成イオンを含む溶液で複合体を洗浄することによってどのように影響されるかを示す。
実施例１の１１１％飽和発泡体からの乾燥発泡体ディスク（直径約２．１ｃｍ）をペトリ皿中に置きそして２５０μｌの１％プロノーバアップＬＶＧ（９９ｍＰａｓ）を発泡体の頂部表面に室温で６０分間添加した。それから、ＣａＣｌ２の５０ｍＭ溶液又はＳｒＣｌ２の５０ｍＭ溶液のいずれかの４ｍｌ中で培養した。５分後は、モデル生体溶液で置き換えた余分なゲル形成イオンを含む溶液であったそして別の５分後は、実施例１で記載されたように測定されたＧ’ｌｉｎであった。添加された余分のゲル形成イオンを受け取らなかった別のサンプルはアルギネートが添加された６０分後に添加されたモデル生体溶液を含んでおり、そしてＧ’ｌｉｎは膨潤の５分後に測定された。結果を表６に示す。
【０１１１】
【表６】
2009529926.tif 000007
【０１１２】
データは、カルシウム又はストロンチウムイオンを含む溶液でそれぞれ複合体を洗浄することによって、弾性率Ｇ’ｌｉｎは４から６倍近く増加することを示す。カルシウムイオンで洗浄した複合体よりも堅いゲルネットワークを作り出すストロンチウムイオンを含む溶液で洗浄した複合体の場合はより高い値が観察された。
【実施例５】
【０１１３】
この実施例は、アルギネート中で固定されたＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞の増殖及び生育可能性が、アルギネート発泡体のカルシウム飽和を変化させることによってどのような影響を受けるか、及び細胞固定後の複合体に追加のゲル形成イオンを添加する効果を示す。
【０１１４】
アルギネートのゲル化サイトの１００％及び２００％飽和に十分なカルシウムイオンを用いて、二つの異なったアルギネート発泡体を調製した。湿式発泡体処方を表７に示す。
【０１１５】
【表７】
2009529926.tif 000008
【０１１６】
アルギネートの水溶液を調製した。それから、炭酸カルシウムを混合ボウル中で水中に２５ｇであること以外は、上表にリスト化したように分散させた。
グリセリン、ソルビトールスペシャル、アルギネート水溶液、及びＨＰＭＣを同じボウル中に添加しそして分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、均一性を確保するために中速度で１分間ブレンドした。１００％飽和発泡体の場合は、混合を高速で３分間続けた。ＧＤＬを残りの２５ｇの水中に溶解させそして湿潤発泡体中に添加した。分散物は高速でさらに３０秒間混合した。１００％発泡体の得られた湿潤密度は０．２３ｇ／ｍｌであった。２００％発泡体の場合は、高速混合時間は、ＧＤＬ添加前で３．５分で、それからさらに高速混合を１５秒間行った。２００％発泡体は０．２６ｇ／ｍｌの湿潤密度をもっていた。両方の発泡体を、１ｍｍ高さでテフロン被覆した成形型中に投入しそして乾燥オーブン中で、８０℃で３０分間乾燥する前に室温でカバーをしないで保存した。
【０１１７】
乾燥した発泡体シートから小刀を使用してディスク（直径＝３．６ｃｍ）を切断しそして別々に充填した。発泡体ディスクを１２１℃で２０分間オートクレーブに入れた。
殺菌したアルギネート（プロノーバＳＬＧ１００）を細胞成長媒体（ＭＥＭ）中に溶解させ１％アルギネート溶液とした。このアルギネート溶液とＭＤＣＫ細胞の懸濁物を成長媒体中でブレンドして、アルギネートの最終濃度０．８％及び２０００００細胞／ｍｌとした。アルギネート発泡体ディスクを、ウエル（ｗｅｌｌ）サイズにぴったり適合する６個のウエルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）内のウエルに移した。アルギネート細胞懸濁物の１．０ｍｌを発泡体のそれぞれに、ピペットで滴下して分配しそしてアルギネート複合体を３７℃で２０分間培養した。１００％及び２００％飽和した発泡体中に存在するカルシウムイオンはアルギネート合計量のゲル化サイトの、それぞれ６７％及び１３３％を飽和させるのに十分であった。サンプルの半分はそれから、５０ｍＭの塩化カルシウム及び１０４ｍＭのＮａＣｌを含む水溶液約５ｍｌ中にそれらを添加することによって、洗浄後処理を与えられた。１０分後に、塩溶液を細胞成長媒体で置き換えた。培養２０分後に、残ったサンプルに細胞成長媒体を添加した。固定された細胞をもつアルギネート複合体を３７℃で保存しそして成長媒体を一週間に３回交換した。増殖及び生育可能性の定量化は固定後の異なった時間後に測定された。固定された細胞は、約８ｍｌの等浸透圧のコハク酸塩溶液（５０ｍＭのコハク酸三ナトリウム二水和物と１０４ｍＭのＮａＣｌ）を含む遠心分離管にアルギネート複合体を移すことによって単離した。その管を、複合体が２−１０分以内で溶解するまで静かに回転し、そしてそれから１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上澄み液を取り去りそして細胞を含むペレットを２５０ｍＭのマンニトール１．０ｍｌ中に再懸濁させた。再懸濁させたペレットの１００μｌ、８０μｌ、及び５０μｌのそれぞれのサンプルを９６個のウエルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）内のウエルに移した。それから、マンニトールの０、２０μｌ、及び５０μｌをそれぞれ添加して（即ち、それぞれのウエルを合計１００μｌに満たすために）それから生／死試薬のさらに１００μｌを添加した。生／死試薬は、５ｍｌのマンニトール溶液（２５０ｍＭ）、２０μｌのエチジウム溶液（２ｍＭ）及び５μｌのカルセイン溶液（４ｍＭ）からつくられた。０−１０６個の細胞の範囲内で成育しうるそしてエタノール固定した細胞から標準曲線を調製した。
【０１１８】
細胞増殖及び生育可能性は、シトフルオールマイクロプレートリーダーを使用して測定した。カルセインのために使用したフィルターは４８５ｎｍ（励起）及び５３０ｎｍ（放射）で、そしてエチジウムのためには５３０ｎｍ（励起）及び６２０ｎｍ（放射）であった。
【０１１９】
【表８】
2009529926.tif 000009
【０１２０】
表８のデータは、余分のカルシウムイオン（より堅いゲルネットワークを与える）を添加する洗浄工程は細胞増殖を促進することを示す。細胞の数が時間と共に増加するにつれ、減少した細胞生育可能性が観察された。
複合体を生／死試薬内に浸漬した後で、蛍光顕微鏡でそれを調べると、洗浄した複合物サンプルはより多い細胞漏れ出しがあることを示した。
【実施例６】
【０１２１】
この実施例は、マウス（Ｃ２Ｃ１２細胞）からの速く成長する筋芽細胞の増殖及び生育可能性が細胞固定後の洗浄工程によってどのように影響を受けるか及び洗浄溶液中のゲル形成イオンタイプの影響を示す。
【０１２２】
アルギネート発泡体はゲル形成イオンとしてのカルシウムイオンでつくられ、アルギネートを１５５％飽和させるのに十分である。湿式発泡体処方を表９に示す。
【０１２３】
【表９】
2009529926.tif 000010
【０１２４】
湿潤発泡体は、合計３０ｇの水に溶解したＧＤＬの添加前に高速で７分間混合し、引き続きさらに３０秒間高速で混合することを除けば、実施例５に記載されたように調製された。得られた発泡体の密度は０．２９ｇ／ｍｌでそして発泡体は、バーシドライベンチプロテクターを用いて発泡体側のポリエチレンで２ｍｍ深さで被覆された成形型に投入された。発泡体はそれから乾燥オーブン中で、８０℃で３０分間乾燥する前に室温で１時間カバーをしないで保存した。
【０１２５】
ディスク（直径＝２．１ｃｍ）を乾燥発泡体シートから打ち抜きそして別々に充填した。発泡体ディスクを１２１℃で２０分間オートクレーブに入れた。
殺菌したアルギネート発泡体を、ウエル（ｗｅｌｌ）サイズにぴったり適合する１２個のウエルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）内のウエルに移した。１％アルギネート溶液（プロノーバＳＬＧ２０）の３００μｌを発泡体にピペットで滴下して分配した。発泡体をそれから３７℃で２０分間培養した。発泡体中に存在するカルシウムイオンは複合体中のアルギネートの合計量を９７％飽和させるのに十分であった。成長媒体（Ｄ−ＭＥＭ）を発泡体の三分の一に添加した。等浸透圧のカルシウム溶液（５０ｍＭの塩化カルシウム及び２５０ｍＭのマンニトール）の約２ｍｌを残りの発泡体の半分に添加し、一方残りの発泡体の他の半分は等浸透圧のストロンチウム溶液（５０ｍＭの塩化ストロンチウム及び２５０ｍＭのマンニトール）を受け取った。ゲル化溶液を約２−５分後に成長媒体で置き換えた。固定化された細胞をもつ発泡体を３７℃に保ちそして成長媒体を週に３回交換した。
【０１２６】
細胞増殖と生育可能性の定量化を固定後１０週間で、１日に二回測定した（図２）固定化した細胞を、１日及び１０週間テストのために異なった脱ゲル化溶液を使用したことを除き、実施例５に記載されたように単離した。細胞固定化の後で１日テストされた発泡体を５０ｍＭのコハク酸塩及び２５０ｍＭのマンニトールを含む１０ｍｌの溶液に溶解させた。細胞固定化の後で１０週テストされた発泡体を添加された５０ｍＭのコハク酸塩を含む１０ｍｌのハンク溶液に溶解させた。回収された細胞ペレットを１ｍｌの生／死試薬（４ｍｌのイソトンＩＩ、１ｍｌのプロピジウムイオダイド（８５μｇ／ｍｌ）及び２０μｌのカルセイン（１ｍｇ／ｍｌ）からつくられた）に分散させた。蛍光顕微鏡中で細胞カウントのためのビュルカー測定室に二滴添加し、一方細胞分散物の残りは６０μｍのナイロンメッシュを通してろ過しそしてそれから再懸濁の５分後に、細胞をコウルターエピックスエリートフローシトメーターを使用して分析した。
【０１２７】
【表１０】
2009529926.tif 000011
【０１２８】
表１０の結果は三つの全ての複合体で合計細胞数の増加を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞の増殖は、細胞固定化後に追加のカルシウムイオンを含む溶液で洗浄された複合体中で固定化された細胞の場合に最も高度に促進された。最も遅い成長細胞は、細胞固定化後にストロンチウムイオンを含む溶液で洗浄された複合体中で固定された細胞であった。
【０１２９】
蛍光顕微鏡で複合体を調べると、カルシウムイオンで洗浄された複合体中で固定化された細胞は構造体から引っ張り出されそして共に成長したことが示された。ストロンチウムイオンで洗浄された複合体中で固定化された細胞は単一細胞又は小さな群れとして見えた。
【実施例７】
【０１３０】
この実施例は、人の軟骨細胞の増殖及び生育可能性が、アルギネート発泡体中のゲル成長イオン源、細胞固定後の洗浄工程を変えることによってどのように影響されるか及び洗浄溶液中の異なったゲル形成イオンの影響を示す。
【０１３１】
アルギネート発泡体を、アルギネートをそれぞれ１５５％及び１０５％飽和させるのに十分なゲル化イオンとして、カルシウム或いはストロンチウムを用いて作った。湿式発泡体処方を表１１に示す。
【０１３２】
【表１１】
2009529926.tif 000012
【０１３３】
湿潤発泡体は、合計水の３０ｇの水中に溶解したＧＤＬの添加前に８分間の高速混合を使用しそして４５秒の最終高速混合を使用したことを除き、実施例６に記載されたように調製された。得られた湿潤発泡体の密度は０．３０ｇ／ｍｌであり、そして発泡体を、バーシードライベンチプロテクターで被覆された２ｍｍ深さの成形型中に投入した。発泡体はそれから乾燥オーブン中で８０℃で３０分間乾燥する前に室温で１時間カバーをしないで保存した。
【０１３４】
殺菌したアルギネート発泡体ディスクの調製及び発泡体への細胞の添加が、１９５，０００細胞／ｍｌをもつ３００μｌの１％アルギネート溶液（プロノーバＳＬＧ２０）が発泡体に添加されたことを除けば、実施例７に記載されたようにして、行われた。存在するゲル形成イオンは、カルシウムイオンでゲル化した発泡体及びストロンチウムイオンでゲル化した発泡体の場合、アルギネート中のＧモノマーの合計をそれぞれ９７％及び６３％飽和させるのに十分であった。
【０１３５】
細胞増殖及び生育可能性の定量化は、カルシウムイオンでゲル化したアルギネート発泡体（Ｃａ−発泡体）中で細胞固定化の２週間及び１１週間後で２回、そしてストロンチウムイオンでゲル化されたアルギネート発泡体（Ｓｒ−発泡体）の場合は１３週間後に１回測定しそしてそのデータを表１２に示す。固定化された細胞は、１５ｍｌの脱ゲル化溶液（５０ｍＭのクエン酸塩を含んだハンクス）をＳｒ−発泡体に使用したことを除き、実施例６に記載されたようにして単離した。細胞定量化のためのサンプル調製及びフローシトメーターの使用は実施例６に記載されたとおりであった。
【０１３６】
【表１２】
2009529926.tif 000013
【０１３７】
表１２に記載された結果は、カルシウムイオン溶液で洗浄された複合体中のアルギネートマトリックスは、１１週間後では他の複合体の少なくとも２倍の細胞量をもっていたことを示している。これは、追加のカルシウムイオンによる促進された細胞増殖及び／又はより堅いゲルマトリックスを与えることを示している。その結果はまた、ストロンチウムイオン溶液で洗浄された複合体のマトリックス中で固定された細胞の阻害された細胞増殖を示している。同じ傾向は、ストロンチウム発泡体でも観察された。カルシウムイオンで洗浄されたストロンチウム発泡体はストロンチウム発泡体シリーズの最大の細胞成長を示した。ストロンチウムを含む溶液で洗浄なし又は洗浄ありのストロンチウム発泡体は合計細胞数の増加が少ないか又は増加がなかった。増加した細胞死は細胞が増殖されたとき時間が過ぎると観察された。生育可能な細胞の最大パーセントは、最も遅い成長細胞を含む複合体で観察された。蛍光顕微鏡で複合体を調べると、カルシウム洗浄された複合体中で固定された細胞は構造体から引っ張り出されそして共に成長していることが示された。ストロンチウムイオンで洗浄された複合体中で固定化された細胞は単一細胞又は小さな群れとして見えた。
【実施例８】
【０１３８】
この実施例は、複合体バイオ材料が固定化された物質の徐放性を与えるマトリックスとしてどのように使用できるかそして放出プロフィールが固定化した材料のサイズの関数としてどのように変性できるかを示す。
【０１３９】
テストされたアルギネート発泡体は実施例１に示されたものと同じでそしてアルギネートのゲル化サイトの１１１％を飽和させるのに十分なカルシウムを取り込んでいた。直径１．０ｃｍの発泡体ディスをクコルクボーラーで打ち抜いた。１．１％アルギネート水溶液がプロノーバアップＬＶＧ（ＦＰ−５０２−０４）からつくられた。このアルギネート溶液を、ＭＱ−水及び表１３に示されるようなアルギネート濃度及び蛍光デキストランのタイプを変える四つの異なった溶液を与えるための蛍光デキストラン（６．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液で希釈した。アルギネートと蛍光デキストランを含む溶液１３．８０μｌを、ピペットでアルギネート発泡体ディスク上に滴下しそして１０分後に溶液は完全に発泡体に吸収された。アルギネート発泡体中に存在するカルシウムは、溶液及び発泡体中の合計アルギネート量の６２％のゲル化サイトを飽和させるのに十分なものであった。それぞれの発泡体ディスクに添加された蛍光デキストランの量は４５．６３μｇであった。発泡体ディスクを、アルミナフォイルでカバーして光を遮るのみで室温で保持した。発泡体ディスクのそれぞれを、それから別々に１０ｍｌのハンクスを含むチューブに移した。そのチューブをほぼ２０ｒｐｍで水平に攪拌しそして１００μｌのサンプルを複合体から漏れ出したと思われる蛍光デキストランの定量化のために回収した。回収したサンプル及び標準溶液（蛍光デキストラン１０ｋＤａ及び−ハンクスで希釈した７０ｋＤａ）中の蛍光デキストラン濃度を、シトフルオルミクロプレートリーダーを使用して分析した。使用したフィルターは４８５ｎｍ（励起、バンド幅２０ｎｍ）及び５３０ｎｍ（放射、バンド幅２５ｎｍ）であった。０ｍｇ／ｍｌから０．０１ｍｇ／ｍｌの範囲で５本の平行線で両タイプの蛍光デキストランから標準曲線を作成した。適合曲線は、１０ｋＤａ及び７０ｋＤａに対して、それぞれ相関係数Ｒ２＝０．９９８及びＲ２＝０．９７９を与えた。
【０１４０】
ディスクをハンクス溶液に移した後、５分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分及び１５０分でサンプルを回収した。１５０分後で測定値は一定の高みに達した。ｆ（ｔ）＝１００−１００−ｋｔ（ｋ：速度定数、ｔ：時間）によって記載される非−線形フィットカーブ、及びグラフィットワークスペースの計算プログラムを使用して、半減期を決定した。結果を表１３に示す。
【０１４１】
【表１３】
2009529926.tif 000014
【０１４２】
結果は、蛍光デキストランの二つの分子量間の放出速度に有意な差異を示している。結果はまた、アルギネートの低濃度で固定化された両方のデキストランのより速い放出を示している。
【実施例９】
【０１４３】
この実施例は、アルギネート発泡体中への細胞の固定化及び細胞増殖を促進するためのペプチド結合したアルギネートの使用を示す。
この実施例で使用されたアルギネート発泡体はアルギネートの１２５％を飽和させるのに十分なカルシウムを添加したものであった。湿式発泡体処方を表１４に示す。
【０１４４】
【表１４】
2009529926.tif 000015
【０１４５】
湿潤密度が０．２４ｇ／ｍｌであり、発泡体がテフロンで被覆された２ｍｍ高さの成形型に投入されたことを除き、実施例１に記載されたようにして、発泡体を作成した。使用された装置は、２５０℃で４時間熱処理によって処理するか、１ＭのＮａＯＨで洗浄した。乾燥した発泡体をガンマー線照射（照射量：２９．５ｋＧｙ）によって殺菌した。
【０１４６】
殺菌した発泡体ディスク（直径＝２．１ｃｍ）をコルクボーラーを使用して打ち抜きそして１２個のウエルプレート内のウエルに移した。表１５は、調製された細胞（Ｃ２Ｃ１２）及びアルギネートの三つの異なったブレンド物を示す。細胞を成長媒体（ＤＭＥＭ）中に懸濁させそしてビュルカーセル計数チェンバーを使用して定量した。レギュラーアルギネート（プロノーバＳＬＧ２０、バッチ：２２１１０５）をＤＭＥＭに溶解させ、そしてペプチド結合させたアルギネート（ノバタッチＶＡＰＧ及びノバタッチＲＧＤ）を２５０ｍＭのマンニトール中に溶解させた。アルギネートに結合したペプチドの密度は、ノバタッチＶＡＰＧ及びノバタッチＲＧＤに対してそれぞれ０．０４５μモル／ｍｇ固体及び０．０３１μモル／ｍｇ固体と測定された（アミノ酸法によって測定された）。
【０１４７】
【表１５】
2009529926.tif 000016
【０１４８】
それぞれの懸濁物は１．０％濃度の合計アルギネートを含んでいた。表１５に示される懸濁物の２５０μｌを各発泡体ディスクに添加し、異なった懸濁物を異なったディスクに添加した。発泡体中のカルシウムは、アルギネート合計量の７７％のＧモノマーを飽和させるのに十分であった。各ディスク中のペプチド濃度は０．０２５μモルで細胞の量はディスク当たり２５０００であった。懸濁物をピペットを使用して発泡体上に滴下した。発泡体は添加した全ての溶液を吸収しそして水和後の厚みは１．２ｍｍであった。発泡体は、細胞懸濁物の添加後に培養器に移しそして３７℃で２０分間保持した。それから、発泡体ディスクの半分に約２．５ｍｌのＤＭＥＭを添加し、一方他の半分に塩化カルシウム５０ｍＭとマンニトール２５０ｍＭの等浸透圧溶液約２．５ｍｌを添加した。約５分後に、カルシウムを含む溶液を添加した発泡体はこの溶液をＤＭＥＭで置き換えた。
【０１４９】
二日後に、発泡体ディスクを５０ｍＭのクエン酸三ナトリウムと２５０ｍＭのマンニトールを含む溶液中に溶解させたことを除き、実施例５に記載されたようにして、細胞を単離した。遠心分離にかけた後の細胞ペレットを２５０ｍＭのマンニトールに再懸濁させた。再懸濁させたペレットの１００μｌ及び８０μｌのそれぞれの三つのサンプルをそれから９６個のウエルプレート内のウエル中に移した。それから、マンニトールの０及び２０μｌをそれぞれ添加し（即ち、各ウエルを合計１００μｌに満たすために）それからさらに生／死試薬１００μｌを添加した。生／死試薬は、５ｍｌのマンニトール溶液（２５０ｍＭ）、２０μｌのエチジウム溶液（２ｍＭ）及び５μｌのカルセイン溶液（４ｍＭ）からつくられた。０−１０６個の細胞の範囲内で成育しうるそしてエタノール固定した細胞から標準曲線を調製した。適合曲線は、生育しうる及び死んでいる細胞に対して、それぞれ相関係数Ｒ２＝０．９８８及びＲ２＝０．９８４を与えた。
【０１５０】
それぞれの発泡体ディスクから単離された生育しうる細胞の定量化は、実施例５に記載したようにシトフルオルミクロプレートリーダーを使用して実施された。結果を表１６に示す。死んだ細胞のシグナルは全てのサンプルのブランク値についてであり、これらのデータは示されていない。
【０１５１】
【表１６】
2009529926.tif 000017
【０１５２】
表１６のデータはノバタッチＲＧＤが細胞増殖を最も促進することを示している。
【実施例１０】
【０１５３】
この実施例は、キトサン発泡体の製造方法及び密度及び吸収に関するそれらの性質を示す。
４％のキトサン塩を含む水溶液をプロタサンＣＬ２０（２１４）を使用して調製した。７７．０ｇのＭＱ−水及び１４．０ｇのソルビトール（乾燥）を混合ボウルに添加しそしてボウルをゆっくり混合しながらソルビトールを溶解させた。１００ｇのキトサン溶液、６．０ｇのグリセリン及び３．０ｇのＨＰＭＣを、同じ混合ボウルに添加した。分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、中速度で１分間均一性を確保するためにブレンドした。混合を高速で２．５分間続けた。湿潤密度は０．２３ｇ／ｍｌと測定された（１００ｍｌ容器を満たすのに必要な湿潤発泡体の重量から決定した）。湿潤発泡体をテフロンで被覆した２ｍｍ及び４ｍｍ高さの成形型中に投入しそれから乾燥オーブン中に８０℃で、それぞれ３０分及び６０分置いた。
【０１５４】
別の発泡体を、上述の手順に従ってつくったが、湿潤発泡体は８ｍｍ深さの成形型中で成形された。発泡体を８０℃で１時間そしてそれから４０℃で３時間乾燥した。
得られた発泡体は、連続細孔ネットワークをもった柔軟でソフトなものであった。水を発泡体に添加すると、それは直ちに吸収されそして発泡体はかなり膨張した。水和された発泡体はその形状を維持したが、比較的弱くてその湿潤発泡体はひと隅からもちあげて一個を移すことができなかった。水和前の乾燥発泡体を圧縮しても発泡体の吸収速度又は吸収能力にあまり影響を与えなかった。
【０１５５】
吸収能力を測定するために、発泡体を小刀を使用して３．５ｃｍｘ３．５ｃｍ片に切断した。発泡体片を秤量しそしてメッシュ（直径０．７１ｍｍ）上に置き、そしてハンクのバランス塩溶液を、モデル生理溶液としてピペットを使用して滴下した。過剰の液体を添加すると、発泡体は透明になった。発泡体片からの滴りガ認められなくなったら、湿潤発泡体の重量を測定した。三つの異なった発泡体の乾燥密度と吸収能力を測定し、そして結果を表１７に示す。
【０１５６】
【表１７】
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【実施例１１】
【０１５７】
この実施例は、アルギネート発泡体を第一層として、そしてキトサン発泡体を、アルギネート発泡体に付着した第二層として含むようにつくられた二層発泡体材料を示す。複合体のこのタイプは、キトサン発泡体の堅固さ、強度、生分解性及び吸収能力を変性するために使用される。
【０１５８】
アルギネート発泡体を最初に、４％のアルギネート（プロノーバアップＭＶＧ）を含む水溶液を調製することによってつくった。１１１．２ｇのアルギネート溶液を混合ボウルに移した。同じボウルに、６．０ｇのグリセリン、１８．０ｇのソルビトールスペシャル、３．０ｇのＨＰＭＣ、０．８５ｇの炭酸カルシウム（アルギネート中のグルロン酸残基を１２５％飽和させるのに十分な）及び３３．３ｇのＭＱ−水を添加した。分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、中速度で１分間均一性を確保するためにブレンドした。２．６９ｇのＧＤＬ及び２５．０ｇのＭＱ−水の新しく混合したＧＤＬ溶液を添加する前に、混合を高速で７分間続けた。混合を高速で１分間続けると、湿潤密度０．２３ｇ／ｍｌをもつ発泡体を得た。湿潤発泡体をバーシドライベンチプロテクター（ナルゲンナンクインターナショナル、ＵＳＡ）を使用して発泡体側のポリエチレンで被覆した４ｍｍ及び２ｍｍの高さの成形型中に投入しそして室温で６０分間カバーをしないで保存した。
【０１５９】
それから、湿潤キトサン発泡体を、ゲル化した発泡体の頂部に２ｍｍ及び４ｍｍ（型高さの増加によって）の層として、ゲル化したアルギネート発泡体の２ｍｍ及び４ｍｍ厚みの頂部に、それぞれ加えた。１８．０ｇのソルビトールスペシャルを乾燥ソルビトールの代わりに使用し、７３．０ｇのＭＱ−水をこの発泡体に添加したこと以外は、実施例１０に記載されたようにして、キトサン発泡体をつくった。中速で２分それから高速で３分混合すると、湿潤密度０．２２ｇ／ｍｌの発泡体が生じた。二層発泡体をもつ成形体をそれから３７℃でオーブンに移す前に、８０℃で１．５時間乾燥オーブン中に置きそして一昼夜乾燥を続けた。
【０１６０】
得られた乾燥発泡体は連続細孔ネットワークをもつソフトで柔軟なものであった。アルギネート部分の細孔はキトサンから作られた発泡体より小さかった。乾燥後は二つの発泡体タイプを分離することは困難であった。各発泡体層は水を直ちに吸収し（キトサン発泡体の場合、第一添加の吸収時間は１秒以下そしてアルギネート発泡体の場合は約３秒であった）そしてそれらは水和後も付着したまま残った。水和した発泡体の水和したアルギネート部分は、高い引っ張り強度をもち、一方キトサン部分は非常に弱かった。水和したキトサン発泡体片は、キトサン発泡体側面を指で押すと壊れるか又はキトサン発泡体は反対（アルギネート）側に押すことによって引き延ばされた。破壊は剥離ではなかった。
【実施例１２】
【０１６１】
この実施例は、生分解性に関してより安定性にしそしてより高い湿潤堅固さを与えるためのキトサン発泡体の架橋方法を記載する。
キトサン発泡体を、中速及び高速での混合時間をそれぞれ１．５分及び４．５分にしたこと以外は、実施例１１に記載されたようにして作った。得られた湿潤発泡体密度は０．２０ｇ／ｍｌであった。湿潤発泡体を２ｍｍ及び４ｍｍ深さの型に投入した。それから、Ｎａ−トリフォスフェートの１００ｍＭ溶液を、細かな液滴を与えるように調節されたノズルをもつスプレーボトルに満たした。Ｎａ−トリフォスフェート溶液を湿潤発泡体上に、２ｍｍ及び４ｍｍに対してそれぞれ約５０ｍｌ及び１００ｍｌをスプレーした。湿潤発泡体はスプレーされた溶液を幾分か吸収したので、添加は、各添加間を１秒以内で数回行った。湿潤発泡体をそれから、乾燥オーブン中で８０℃で、２ｍｍ及び４ｍｍ型に投入された発泡体に対して、それぞれ１時間及び２時間乾燥した。
【０１６２】
乾燥発泡体はソフトで柔軟でそして連続細孔ネットワークをもっていた。その発泡体は水を直ちに吸収しそしてそれらは、実施例１０の未−架橋のキトサン発泡体よりも水和しても変形が少なくそしてより強いものであった。
【実施例１３】
【０１６３】
この実施例は、ゲル化イオンを含むキトサン発泡体がインシツで外部から添加されたキトサン溶液のゲル化を引き起こす能力をもっていることを示す。
発泡体ディスク（直径＝２．１ｃｍ）を、実施例１２で示した４ｍｍ高さの型に投入された発泡体からコルクボーラーを使用して打ち抜いた。発泡体ディスクをそれから、前の実施例で使用したのと同じレオメーターの鋸歯状プレート上に置いた。ディスクにそれからＭＱ−水又は１．０％のキトサン溶液（プロタサンアップＣＬ２１３）の過剰水溶液を添加した。上方のプレート（ＰＰ２５）を５００μｍの隙間に下げそしてせん断応力を０．５Ｐａから５０Ｐａかけて応力掃引を行った。振動測定を、溶液添加後約３分で開始した。振動数は１Ｈｚに設定した。掃引は各発泡体パッチに対して２回行った。線形粘弾性領域で読まれる弾性率、Ｇ’（Ｇ’ｌｉｎ）及び位相角を表１８に示す。
【０１６４】
【表１８】
2009529926.tif 000019
【０１６５】
弾性率及び位相角の両方に基づいて、表中の結果は、キトサン溶液添加後では、よりゲル的な発泡体の性質を示している。
【実施例１４】
【０１６６】
この実施例は、混合時間及びキトサン発泡体に取り込まれた空気の量が異なった発泡体の性質にどのような影響を与えるかを示す。
キトサン発泡体を、異なった発泡体密度を得るために異なった混合時間を使用したこと以外は、実施例１０に記載されたようにして調製した。湿潤発泡体を作るための全ての発泡体成分を中速度で１．５分混合した。高速混合を１分間続けると、得られた湿潤密度は０．４５ｇ／ｍｌであった。約半分の発泡体を４ｍｍ及び２ｍｍ高さの型に投入した。それから残りの発泡体をさらに１分間高速で混合した。得られた湿潤密度は０．２９ｇ／ｍｌであり、そして発泡体の残りを上述のように投入した。高速での混合時間が第一が４５秒で第二が４分４５秒であったこと以外は、上記の同じ手順を繰り返した。湿潤密度はそれぞれ０．５２ｇ／ｍｌ及び０．１８ｇ／ｍｌであった。最も高い湿潤密度をもった二つの発泡体は、成形型側の表面で作られた薄いフィルムを得た。これは、発泡体が底部近くで、よりゆっくりと乾燥するときの細孔の合体による。乾燥発泡体密度は４ｍｍ高さの型に投入された発泡体から、コルクボーラーを使用して１ｃｍの直径でディスクを打ち抜くことによって決定された。異なった発泡体の密度及びノギスによって測定された厚みを表１９に示す。発泡体は、適用応力範囲が０．５Ｐａから１８Ｐａであり、そしてそれぞれの発泡体片のために三つの掃引が実施されたこと以外は、実施例１０に記載されたのと同じレオメーター設定をもつその弾性率Ｇ’ｌｉｎによって特徴付けられた。結果は表１９に含まれ、直径１ｃｍをもつ三つの異なった発泡体の最後の二つの掃引の平均値を示している。発泡体片を、レオメーターに移す前に、約５分間２ｍｌのハンク溶液中に保持した。乾燥した発泡体の引っ張り張力は、ＳＭＳテキスチャー解析器及びＡ／ＴＧ引っ張りグリップを使用して測定した。破壊するまでに、０．５ｍｍ／ｓで発泡体を引き延ばすのに必要な力が読み取られ、そしてそれが破壊したときの最大力と伸びの距離を表１９に示す。発泡体片を、３．１５ｃｍ長さ、端部で１．７５ｃｍ幅そして中心で１．２５ｃｍ幅、狭いところが端部から１ｃｍの寸法となるように小刀を使用して骨形状に切断した。発泡体を、発泡体の中央で破壊を起こさせそしてグリップに付着しているところではないようにしてこの形状に切断した。発泡体の各端部のほぼ０．３ｃｍがそれをグリップに固定するために使用された。
【０１６７】
【表１９】
2009529926.tif 000020
【０１６８】
表は、最も高い湿潤密度をもった発泡体が合体によって最も多く崩壊したことを示す。また、発泡体は湿潤密度を増加させることによって細孔サイズを増加させることが観察された。引っ張り強度と弾性率は空気量の増加によって低下した。材料が破壊する前に引き延ばすことができる長さとして表される材料の弾性は湿潤密度の低下によって低下した。三つの濃密でない材料はほぼ同じ弾性をもっていた。
【実施例１５】
【０１６９】
この実施例は、カルシウムイオンを取り込んだヒアルロン酸（ＨＡ）の調製を記載する。外部から添加されたアルギネート溶液のゲル化を引き起こすためのこれらのイオンを与える発泡体能力も又示される。
【０１７０】
２．５％ＨＡを含む水溶液を調製しそして脇に置いた。４９．６５ｇのＭＱ−水、２．３５ｇの塩化カルシウム二水和物及び１０．５ｇのソルビトール（乾燥）を混合ボウルに添加しそしてボウルをゆっくり回転させながら乾燥成分を溶解させた。１３０ｇのＨＡ溶液、４．５ｇのグリセリン及び３．０ｇのＨＰＭＣを同じ混合ボウルに添加した。分散物を、ワイヤーブラシを備えたホバートキッチンエイドミキサーで、均一性を確保するために中速度で２分間ブレンドした。高速で３分５０秒混合を続けた。湿潤密度は０．２１ｇ／ｍｌと測定された（１００ｍｌ容器を満たすのに必要な湿潤発泡体の重量から決定された）。湿潤発泡体を、テフロンで被覆された２ｍｍ及び４ｍｍ高さの成形型に投入しそれから乾燥オーブン中で８０℃で５０分間置いた。
【０１７１】
４ｍｍ高さの型に投入された発泡体から、コルクボーラーを使用して、発泡体ディスク（直径＝２．１ｃｍ）を打ち抜いた。１．０％及び０．５％のアルギネート溶液を、プロノーバＳＬＧ２０（バッチ：２２１１０５）からＭＱ−水を添加することによって調製した。乾燥発泡体ディスクを、ボーリンＣＶＯ１２０高解像度レオメーター上の鋸歯状プレート（ＰＰ２５）間に置いた。それから、アルギネート溶液の３５０μｌをピペットを使用して添加した。発泡体ディスク中のカルシウム含量は、１．０％及び０．５％溶液に対して、添加したアルギネートのゲル化残基をそれぞれ１２４％及び２４８％飽和させるのに十分である。１分後、アルギネート溶液は吸収されそして発泡体は完全に水和されたものに近くなっている。上方のプレートをそれから５００μｍの隙間に下げそして弾性率、Ｇ’の測定を開始した。振動数、歪及び温度は、それぞれ１Ｈｚ、０．００１及び２０℃に設定された。結果を表２０に示す。
【０１７２】
【表２０】
2009529926.tif 000021
【０１７３】
アルギネート溶液添加後の数秒の過程のＧ’の増加は、ゲル化イオンを与えること及びゲル化反応が開始されたことを確証する。三つの溶液間のＧ’値の差異は、ゲルが作り出されること及び最も強いゲルは最も濃縮されたアルギネート溶液から作り出されることを確証する。
【実施例１６】
【０１７４】
この実施例は、フォスフェートイオンを取り込んだヒアルロン酸（ＨＡ）の調製を記載する。外部から添加されたキトサン溶液のゲル化を引き起こすためのこれらのイオンを与える発泡体能力も又示される。
【０１７５】
ＨＡ発泡体は、カルシウム源が２．２７ｇのＮａ２ＨＰＯ４で置き換えられそして使用した水の量が４９．７ｇであったこと以外は、実施例１５に記載されたようにしてつくった。高速での混合時間は３分で０．１７ｇ／ｍｌの湿潤密度を与えた。２ｍｍ及び４ｍｍ型に投入された発泡体を、乾燥オーブン中に８０℃で、それぞれ４５分及び７５分保持した。
【０１７６】
実施例Ａに記載されたようなレオロジー測定用の同じパラメーターが使用された。水及び１％キトサン溶液が過剰量で添加された。弾性率、Ｇ’、及び位相角を記載する値は、表２１に示される値を平準化した。
【０１７７】
【表２１】
2009529926.tif 000022
【０１７８】
結果は、キトサン溶液を添加された発泡体は、ＭＱ−水を添加された発泡体よりゲル状挙動を示し堅いことを示している。
【実施例１７】
【０１７９】
この実施例は、カルシウムイオンを含むキトサン発泡体の調製について記載する。キトサン発泡体中で固定されたカルシウムは、それが乾燥キトサン発泡体によって吸収されたときに、アルギネート溶液のインシツゲル化を引き起こす。そのような構造物は、細胞固定化又は固定化された薬剤、酵素、ホルモン、等々の徐放性を与えるために生化学的用途において有用である。
【０１８０】
２．３５ｇのＭＱ−水を２．３５ｇの塩化カルシウム二水和物（８０ｍＭ）で置き換えたことを除けば、実施例１１と同じ量及び成分を含むキトサン発泡体をつくった。湿潤密度０．２０ｇ／ｍｌをもつ湿潤発泡体を中速度及び高速度で、それぞれ１．５分及び６分混合することによって作成した。湿潤発泡体を前に記載したように２ｍｍ及び４ｍｍ高さの型に投入した。それから、それらを乾燥オーブン中に８０℃で、１．５時間置いた。乾燥発泡体はソフトで柔軟で連続細孔ネットワークをもっており、乾燥密度は０．０３９±０．００１ｇ／ｃｍ３であった。発泡体は水を直ちに吸収しそして実施例１０と同じ厚みの発泡体と類似な湿潤堅固さをもっていた。この発泡体は、ハンクの溶液を発泡体に添加したとき、実施例１０からの発泡体と比較して膨張が少なかった。この発泡体に対するハンク溶液の吸収能力は１６．８±１．９ｇ／ｇ発泡体と測定された（三つのサンプルの平均値±ＳＤ）。この発泡体の細孔は、実施例１０からの４ｍｍ厚みの発泡体よりも幾分大きかったが、これは、溶液のイオン強度のために、低下したキトサン粘度による、より多い合体によると思われる。
【０１８１】
４ｍｍ高さのトレー中で成形された発泡体からの、発泡体ディスクをコルクボーラーを使用して、直径２．１ｃｍで打ち抜いた。乾燥発泡体ディスクを、ボーリンＣＶＯ１２０高解像度レオメーター上の鋸歯状プレート（ＰＰ２５）間に置いた。それから、１％アルギネート（プロノーバアップＬＶＧ）溶液の５００μｌをピペットを使用して添加した。発泡体ディスク中のカルシウム含量は、添加したアルギネートのゲル化残基を９６％飽和させるのに十分である。１分後に、アルギネート溶液は吸収されそして発泡体はほとんど完全に水和していた。上方のプレートを１．０００ｍｍの隙間に下げ、そして弾性率、Ｇ’の測定を開始した。振動数、歪及び温度は、それぞれ１Ｈｚ、０．００１及び２０℃に設定された。結果を表２２に示す。
【０１８２】
【表２２】
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【０１８３】
アルギネート溶液を添加した発泡体ディスクの高いＧ’値及び添加後まもなくのＧ’の増加は、キトサン発泡体からの添加されたアルギネート溶液にゲル形成イオンを与えることを確証している。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明の複合体は生物医学用途、例えば、細胞培養媒体及び移植、徐放伝達系、食品用途、工業用途、及び化粧品及び口腔衛生を含むパーソナルケア用途に有用である。また、本発明の複合体は医療用途、例えば創傷処置、組織工学及び組織再生及び細胞固定において使用するのに特に好適である。
【国際調査報告】
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