(57)【要約】  本発明は種子処理用組成物並びにその使用、種子の処理方法、害虫からの植物保護の方法、及びさらには種子及び植物の処理方法を提供する。一つの態様では、種子を、種子処理用組成物で処理して、前記種子からの植物の生長において１種以上の害虫に対する耐性機構を誘導させる方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子を種子処理用組成物で処理し、前記種子から生長した植物に１種以上の害虫に対する植物の抵抗機構を誘導し、それにより、害虫による植物の被害を低減する方法であって、種子に前記処理用組成物を適用する工程を含む方法。
【請求項２】
前記種子が未発芽種子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理用組成物が種子浸漬を含み、前記方法が、処理組成物中に種子を浸漬することによって種子を処理する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記処理用組成物が、ジャスモン酸又はジャスモン酸塩類、例えば、ジャスモン酸カリウム又はジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）；ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合体（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体又はL-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファコイル-L-セリン及びコロナファコイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシンのメチルエステル類及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）；又は、これらの組み合わせ物を含めた、ジャスモン酸（ＪＡ）、又はオキシリピン類のジャスモネートファミリーの関連する化合物、あるいはＪＡ依存性の草食動物抵抗経路を活性化するその他の化合物から選択された処理剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記処理用組成物が、水、処理剤、及び非水溶媒を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記非水溶媒がエタノールを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記処理用組成物がジャスモン酸（ＪＡ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記処理用組成物がジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記処理用組成物が、処理剤を０．１ｍＭ〜１５ｍＭの濃度で含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
害虫に対する抵抗性が、オキシリピン経路（ジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路としても知られている）によって調節される防御機構によって引き起こされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
冷たい温度を用いることによって、処理の間、未発芽状態に種子を保つことを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１時間以上のあいだ種子を種子処理用組成物と接触させておくことを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
種子への処理用組成物の適用に続いて種子を乾燥させることを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
発芽の前１週間以上の間、植物抵抗機構の誘導を妨げることなく、処理した種子を貯蔵することができる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法にしたがって処理した種子から発芽した植物が、発芽後少なくとも７週間において害虫被害に対する抵抗性を示す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記害虫が草食性無脊椎動物を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
処理した種子から生長した植物における植物毒性が実質的に回避される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
害虫被害に対する植物の抵抗性が育ちうる種子であって、前記種子から生長した植物において一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導し、それによって害虫による植物被害を低減させるための種子処理用組成物で処理した種子を含む種子。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法によって処理した種子を含む、請求項１８に記載の種子。
【請求項２０】
種子を処理する種子処理用組成物であって、前記種子から生長した植物において一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導し、それによって害虫による植物被害を低減させるための種子処理用組成物。
【請求項２１】
ジャスモン酸又はそのジャスモネート塩、例えば、ジャスモン酸カリウムもしくはジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）、ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合物（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体、又は、L-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファソイル-L-セリン及びコロナファソイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシン及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）；又はそれらの組み合わせ物、を含めた、ジャスモン酸（ＪＡ）又はオキシリピン類のジャスモネートファミリーの関連するもの、又はＪＡ依存性の草食動物抵抗性経路を活性化するその他の化合物から選択される処理剤を含有する、請求項２０に記載の種子処理用組成物。
【請求項２２】
水、処理剤、及びアルコールを含有する、請求項２０又は２１に記載の種子処理用組成物。
【請求項２３】
ジャスモン酸（ＪＡ）又はジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）を含有する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の種子処理用組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか一項と関連づけて記載したいずれかの特徴を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の種子処理用組成物。
【請求項２５】
植物に害虫被害に対する抵抗性を付与する方法であって、種子処理用組成物を種子に適用し、次に前記種子から植物を生長させる工程を含み、前記処理用組成物が、前記種子から生長した前記植物において一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導し、それによって害虫による植物被害を低減させること、を含む方法。
【請求項２６】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法によって種子を処理する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
種子を種子処理用組成物で処理し、次に、発芽前に前記種子を洗浄及び／又は乾燥及び／又は貯蔵する工程を含む、請求項２５又は２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法によって提供される植物が、オキシリピン経路（これはジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路ともいわれる）によって調節される害虫防御機構によって引き起こされる害虫抵抗性を示す方法。
【請求項２９】
請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法及び／又は請求項１８又は１９に記載した種子から生長した及び／又は請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法によって処理した種子から生長した及び／又は請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物で処理した種子から生長した植物を含む、害虫被害に抵抗性のある植物。
【請求項３０】
植物への害虫被害を低減する方法であって、前記植物を、請求項２９に記載の植物の近くに配置することを含む方法。
【請求項３１】
種子から生長した植物に一種以上の害虫に対する植物の抵抗機構を誘導させ、それによって害虫による植物被害を低減させるために種子を処理するための種子処理用組成物の使用。
【請求項３２】
害虫の生存及び／又は害虫の数及び／又は害虫の成長及び／又は害虫の繁殖を制限するため、種子から生長した植物に一種以上の害虫に対する植物の抵抗機構を誘導するための、種子を処理するための種子処理用組成物の使用。
【請求項３３】
前記種子処理用組成物が請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物を含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
害虫に対する抵抗性が、オキシリピン経路（これはまたジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路としても知られる）によって調節される防御機構によって引き起こされる、請求項３１〜３３のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
付属する図面のいずれかに関連して実質的に請求項１〜３４のいずれかに説明されている方法、種子、植物、処理用組成物、又は組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は植物の保護、特に、種子処理用組成物及びその使用、種子の処理方法、害虫から植物を保護する方法、並びに、種子及び植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の病気は、植物病原微生物（例えば、菌類、細菌、又はウイルス）によって引き起こされ、植物病原微生物は休眠状態の種子から成熟した植物までの生育の様々な段階で植物に感染しうる。様々な病原体による攻撃は、急性かつ大規模な組織の壊死から長期の慢性感染まで、広範囲な様々な病気をもたらす。農作物の害虫には広範囲の動物が包含されるが、多くは、線虫及び節足動物、例えば昆虫又はダニ類を含めた無脊椎動物である。これらの害虫は植物組織を餌にし、様々な害虫が様々な方法で様々な組織を攻撃する。例えば、過激な線虫は、個々の根の細胞の内容物を吸い取ることがある一方で、大きな昆虫害虫は、葉の大きな範囲をかじり取ることがある。
【０００３】
栽培実務、例えば、輪作及び衛生はひとまず別にして、多くの農作物保護は、害虫又は病害を引き起こす病原菌に直接毒性のある薬剤（農薬、これは害虫と病害の両方に対して用いる薬剤に用いる用語である）の適用に頼っている。例えば、害虫は、殺虫剤又は殺線虫剤を用いて処理し、病害は、抗微生物剤、例えば抗カビ剤又は抗菌剤で処理することができる。感染又は攻撃の部位に応じて、農薬を、葉への噴霧、土壌浸液、又は種子処理を含めた多くの方法で農作物に適用できる。適用方法に関わらず、従来の農薬は害虫又は病原体との直接の接触を通して作用するか、植物によって吸収されて植物組織が食べられたときにその機能を果たすことができる（例えば、浸透性農薬）。
【０００４】
公知の農薬を種子の処理に用いた場合は、種子は、病原体又は害虫を直接に阻害又は妨害するために設計された薬剤で被覆され、これらは種子の上で乾燥させる。そのような処理は、種子、苗、又は根を攻撃する土壌病原体又は害虫に対する直接の防御をもたらすことを多くの場合に目的としている。ほとんどの場合、観察される防御は、一時的であって、その保護剤が、成長の進行とともに、土壌及び根の中で分解、希釈、又は局限されることよって低下する。
【０００５】
公知の農薬の欠点は、その多くが非標的種に対しても毒性があり、生物学的多様性の低下をもたらし、有益種、例えば花粉媒介昆虫又は捕食性昆虫を害しさえすることである。加えて、いくつかの公知の農薬の潜在的な人への毒性に関する消費者の懸念がある。
【０００６】
遺伝子組み換えが、統合的害虫駆除(Integrated Pest Management, IPM)が用いられてきているのにしたがって、農薬の代替として用いられており、統合的害虫駆除は、栽培実務を、生物学的コントロールの手段としての害虫の寄生生物又は捕食者の使用と組み合わせるものである。しかし、それぞれが欠点をもっている。
【０００７】
害虫制御のさらなるアプローチは、植物の自然の防御システを使用することを意図している。植物は、非常に広範囲の環境からの刺激に応答する。応答には、害虫（例えば、草食性動物、例えば昆虫）及び病原体（例えば、菌類、バクテリア、ウイルスなど）に対する防御をもたらすものも含まれる。害虫又は病原体の攻撃に対する植物の応答は、刺激の最初の認識を、最終的には防御へと導く植物細胞中の変化へと結びつける一連の事象によって引き起こされる。したがって、傷に対する、及び害虫／病原体の攻撃に応えて、局所で起こるシグナル伝達経路、植物のまわりの局所的な事象と通じている全組織的シグナル、及びその全組織的シグナルに応答する離れたところの細胞中に生じるシグナル伝達経路を伴って、引き起こされる局所的及び全組織的事象がある。
【０００８】
植物のシグナル伝達分子は、環境刺激に対するこれら誘発された応答において中心的役割を演じており、なぜなら、それらの分子は、攻撃を植物内での内部的最終効果に結びつける中間分子シグナルとして作用するからである。例えば、様々な植物種において、ジャスモン酸は、傷害又は草食性動物の攻撃に続いて一時的に蓄積されることが知られており、かつ、傷害に反応する遺伝子の活性化と結びつけられている。別な例は、植物と病原体との相互作用の間に、サリチル酸は量が増加することが知られており、局所及び全組織的に獲得された抵抗性（systemic acquired resistance; SAR）と病気抵抗性にかかわる防御関連遺伝子の活性化の中心的調節因子であると考えられている。
【０００９】
ジャスモン酸（ＪＡ）は、農作物（例えばトマト（ソラナム・リコペルシカム Solanum lycopersicum）及びブドウのつる）に害虫抵抗性を誘導するために、外からの葉への噴霧として適用されている。しかし、ＪＡ又はその誘導体のそのような葉（及び根）への適用は、例えば、植物毒性を引き起こすことによって農作物に直接ダメージを引き起こす傾向があり、商業的に実施するためには費用がかかりすぎる。
【００１０】
米国特許第５９７７０６０号明細書は、アーウィニア・アミロボラ(Erwinia amylovora)のハーピンタンパク質(Harpin protein)を用いて、農作物中に敏感かつ全組織的に取得された抵抗性応答を誘発させ、ウイルスに対する病気抵抗性並びに初期の苗の生育を攻撃する土壌の菌類、線虫、及びいくらかの昆虫に対する防御をもたらすことを開示している。しかし、種子の浸漬によるもたらされる昆虫への抵抗性は、アブラムシ、すなわち、樹液を摂取する節足動物に制限されるように思われる。この浸漬は播種前に適用され、植物保護は種子の浸漬から苗へと持ち越されることによって、効果的にはそのタンパク質を苗に直接適用することによって、実際にもたらされると思われる。ハーピンは、多くの地域でその使用が大きな制限を受けうる遺伝子操作の結果であるという欠点も持っている。
【００１１】
発芽豆とメロン種子へ適用される種子浸漬剤としてのジャスモン酸の使用は、真菌病に対する防御を提供する目的のためだけにしか知られていない。植物にもたらされる防御は限定的なものであり、発芽した苗に直接移ったジャスモン酸から生じるようである。
【００１２】
国際公開ＷＯ０２０５５４８０号パンフレットは、昆虫を含めた病原体に対する耐性を誘導することにおけるコロナロン及び関連化合物の適用に関する。コロナロンはコロナチンの（化学的に合成された）人工的類似体であり、コロナチンはＪＡアミノ酸複合体の類縁体であり、同じではないが、ＪＡに類似した生物学的活性を有している。しかし、コロナロンは生育しつつある植物に適用されており、したがって、この開示はＪＡの葉への噴霧とは少し異なる。
【００１３】
国際公開ＷＯ０１４１５６８号パンフレットは、害虫を追い払い且つ有益な昆虫を誘引する植物揮発成分放出を誘発させるための、シスジャスモン噴霧の使用を開示している。ここでも、これは生長しつつある植物に直接適用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５９７７０６０号明細書
【特許文献２】国際公開ＷＯ０２／０５５４８０号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ０１／４１５６８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明は、本明細書で議論していようとそうでなかろうと、従来技術に伴う少なくとも１つの欠点を解決することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
〔本発明のまとめ〕
本発明の第一の面によれば、種子を種子処理用組成物で処理し、前記種子から生長した植物に１種以上の害虫に対する植物の抵抗機構を誘導し、それにより、害虫による植物の被害を低減する方法を提供し、本方法は、種子に上記処理用組成物を適用する工程を含む。
【００１７】
好ましくは、本方法は、発芽していない種子に上記処理用組成物を適用する工程を含む。適切には、本発明は上記処理用組成物を、次に発芽しうる未発芽種子に適用する工程を含む。あるいは、本方法は、上記処理用組成物を発芽種子に適用する工程を含んでもよい。
【００１８】
本明細書で用いるように、用語「害虫」は「病気」を含まない。特に、用語「害虫」からは、菌類、バクテリア、及びウイルスを含めた病原体は除かれる。用語「害虫」には、線虫、軟体動物、及び節足動物、例えば、昆虫及びダニ、を含めた無脊椎動物が含まれる。
【００１９】
適切には、害虫には草食性害虫が含まれる。適切には、害虫には草食性無脊椎動物が含まれる。害虫には線虫及び／又は軟体動物及び／又は草食性節足動物を含めることができる。あるいは、又は加えて、害虫には脊椎動物、例えばウサギを含めることも出来る。害虫には葉を餌にする害虫を含めることができる。害虫には樹液を餌にする害虫を含めることができる。したがって、誘発された植物抵抗機構は、樹液及び／又は葉を食べる害虫による植物の被害を低減するように作用しうる。あるいは、又は加えて、害虫にはその他の植物部位を餌にする害虫を含めることができ、誘発された植物抵抗機構はそのような害虫に対抗するように作用しうる。本方法／本処理用組成物は、病原体、例えば菌類、バクテリア、及びウイルスを含めた病気に対する、並びに害虫に対する防御をもたらしうる。
【００２０】
本明細書で用いるとおり、「種子処理用組成物」の用語には、種子被覆（種子コーティング）及び種子浸漬用組成物が含まれる。
【００２１】
適切には、種子処理用組成物は、種子浸漬を含む。したがって、本方法は、種子を、種子処理用組成物に浸漬することによって種子を処理する方法を含むことができる。
【００２２】
適切には、本処理用組成物は、ジャスモン酸（ＪＡ）、又はオキシリピン類のジャスモネートファミリーの関連するもの、あるいはＪＡ依存性の草食動物抵抗経路を活性化するその他の化合物から選択された処理剤（適切には植物のシグナル伝達化学物質）を含み、それには、ジャスモン酸又はそのジャスモン酸塩類、例えば、ジャスモン酸カリウム又はジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）；ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合体（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体又はL-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸(12-oxo-phytodienoic acid)；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファコイル-L-セリン及びコロナファコイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシンのメチルエステル類(esters)及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類(esters)；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）；又は、これらの組み合わせ物が含まれる。
【００２３】
適切には、本処理用組成物は、ジャスモン酸又はそのジャスモネート塩類、例えば、ジャスモン酸カリウム又はジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）；ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合物（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体又はL-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸(12-oxo-phytodienoic acid)；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファコイル-L-セリン及びコロナファコイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシンのメチルエステル類及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）；又は、これらの組み合わせ物からなる群から選択される処理剤を含む。
【００２４】
適切には、本処理用組成物は、ジャスモン酸又はそのジャスモネート塩類、例えば、ジャスモン酸カリウム又はジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）；ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合物（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体又はL-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸(12-oxo-phytodienoic acid)；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファコイル-L-セリン及びコロナファコイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシンのメチルエステル類及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）からなる群から選択される単一の処理剤を含む。
【００２５】
適切には、本処理用組成物は、処理剤としてジャスモン酸（ＪＡ）を含む。好適には、本処理用組成物は、単一の処理剤としてジャスモン酸（ＪＡ）を含む。
【００２６】
適切には、本処理用組成物は、処理剤としてジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）を含む。本処理組成物は、単一の処理剤としてジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）を含むことができる。
【００２７】
ジャスモン酸（ＪＡ）は、植物における、草食動物の攻撃に対する応答の普遍的な調節因子であると考えられる。それは長距離の植物防御シグナル伝達経路の一部を形成し、外部から（葉の組織又は根に）適用した場合には、攻撃の時に生じる被害及び将来の攻撃の可能性を低下させる目的のために、節足動物及びその他の害虫に対する防御関連応答を誘導しうる。ＪＡの生合成へと導くオクタデカノイド経路は、植物防御応答の活性化に関連づけられることが理解されている。
【００２８】
しかし、害虫の攻撃に対して誘導された植物防御の現在の理解を前提とすれば、防御システムを誘導する化合物を種子に適用することが、長期にわたって害虫から、生長しつつある植物を防御することは予想されない。種子から生長しつつある植物への遷移には、大きな代謝の再プログラム化と、種子には存在しない組織の生成を、生長点形態においてすら必要とする。これにも関わらず、草食昆虫に対するジャスモン酸介在防御応答（これは本発明によって誘導されうる）は、驚くほど有効でありうる。さらに意外なことに、処理した種子の続く発芽は、この処理方法によって実質的に抑制されないであろう。
【００２９】
驚くべきことに、本発明者は、種子に処理用組成物を適用することが、処理した種子から発芽した植物において害虫を標的とする自然防御構成因子を誘導しうることを発見した。これは、発芽後のかなりの時間その状態に保つことができ、これは全く予期しないことである。これは、処理剤を低濃度で種子に適応した後でさえ、そうであり、活性化合物が自然に分解した後長く、何週間にもわたって持続する害虫制御をもたらしうる。予期せぬことに、未発芽種子に適用した場合、防御は、続いて生長する植物に誘導されうることを発見した。
【００３０】
適切には、害虫に対する抵抗性は、オキシリピン経路（ジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路としても知られている）によって調節される防御機構によって引き起こされる。
【００３１】
好適には、上記種子処理用組成物は、水性組成物を含む。この処理用組成物は、非水溶媒、適切にはアルコール、例えばエタノールを含有しうる。
【００３２】
適切には、処理用組成物は、処理剤、例えばジャスモン酸を、少なくとも１０μＭ、例えば１ｍＭ以上の濃度で含む。この処理用組成物は、処理剤、例えばジャスモン酸を、１０μＭ〜５０ｍＭ、適切には０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、例えば１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で含みうる。この処理用組成物は、処理剤を１０ｍＭ以下の量で含みうる。
【００３３】
本処理用組成物は、処理剤を、少なくとも０．１ｍＭ、例えば、少なくとも、０．５ｍＭ；１．０ｍＭ；１．５ｍＭ；２．０ｍＭ；２．５ｍＭ；３．０ｍＭ；３．５ｍＭ；４．０ｍＭ；４．５ｍＭ；５．０ｍＭ；６．０ｍＭ；７．０ｍＭ；８．０ｍＭ；９．０ｍＭ；又は１０ｍＭの量で含みうる。
【００３４】
本処理用組成物は、処理剤を、１５ｍＭ以下、例えば、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２．５ｍＭ、１２．０ｍＭ、１１．５ｍＭ、１１．０ｍＭ、１０．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、９．５ｍＭ、９．０ｍＭ、８．０ｍＭ、７．０ｍＭ、又は６．０ｍＭ以下の量で含みうる。
【００３５】
本処理用組成物は、非水溶媒、好適にはアルコールを、少なくとも１ｍＭの濃度で含みうる。本処理用組成物は、非水溶媒、好適にはアルコールを、１ｍＭ〜１００ｍＭ、好適には１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で含みうる。
【００３６】
好適には、本処理用組成物は、水と処理剤と好適にはさらに非水溶媒、好適にはアルコール、をさらに含む。好適には、処理用組成物の少なくとも９５質量％、例えば少なくとも９９質量％が、水、処理剤、及びアルコールからなっていてよい。好適には、この処理用組成物は、水、処理剤、及びアルコールのみからなる。本処理用組成物は、水、エタノール、及びジャスモン酸のみからなることができる。
【００３７】
好適には、本方法は、種子処理用組成物を、休眠種子であってよい未発芽種子に適用することを含む。
【００３８】
好適には、本方法は、発芽を妨げる条件下で、種子処理用組成物を種子に適用することを含む。この種子処理用組成物は、低温及び／又は暗闇の条件下で、種子に適用されうる。
【００３９】
好適には、種子処理用組成物は、種子に、１０℃以下、例えば、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、又は４℃、又はそれ未満の温度にて適用される。好適には、種子は処理工程の間を通して、そのような温度に保たれる。
【００４０】
好適には、本方法は、冷たい温度、適切には１０℃未満であるが処理用組成物の凝固点よりは高い温度を用いて、処理の間、未発芽状態に種子を保つことを含む。
【００４１】
適切には、本方法は、１時間以上のあいだ、適切には少なくとも６時間、例えば少なくとも１２時間、種子を処理用組成物と接触させておくことを含む。好適には、本方法は、１時間〜７２時間、好適には６時間〜４８時間、例えば約２４時間、種子を種子処理用組成物に接触させておくことを含む。
【００４２】
好適には、処理用組成物は、種子に適用される液体、例えば、種子浸漬液を含む。好適には、この処理用組成物は、液体として適用されるジャスモン酸を含む。
【００４３】
あるいは、処理用組成物は、ダスト状、粉末、スラリー、又は蒸気として適用されうる。処理剤には、例えば、蒸気として適用されるジャスモン酸メチルが含まれる。
【００４４】
粉末として適用する場合は、処理用組成物は展着剤を含むことができる。スラリーとして適用する場合は、スラリーは、水和性粉末、水分散性粉末、又はマイクロカプセル封入剤／カプセル懸濁液のいずれかを含んでよい。液体として適用する場合は、濃縮物は、種子への適用の前に希釈を必要としうる。ジャスモン酸又はジャスモネートに由来する種子コーティング剤は、例えば、液体として容易に適用されうるが、適用しすぎを避けるためにクレーなどのフィラーで充分に希釈した場合には、ダスト状又はスラリーとして適用することもできる。
【００４５】
種子を処理用組成物でコーティングするためには、その組成物は種子と機械的にブレンドされて均一な被覆を確実にし、いかなる水分も、時期尚早の発芽を引き起こすことを避けるために蒸発することが推奨されうる。コーティング法の変形には、いくつかの異なる処理（これらの処理がそれらの適用手段に関して適合性がある場合）を、配合物を介して同時に種子に適用すること、又はいくつかの異なる処理を順次適用して、ペレット化として公知の方法で一連の処理層を構築することを含みうる。粉が取り払われることに抗して種子をシールするために、また必要な場合には、識別のために種子を着色するために、いくつかの周知のポリマー又はその他のコーティングのうちの一つが適用されてもよい。
【００４６】
好適には、本方法は、部分的に又は完全に、最も好適には完全に種子を処理用組成物中に浸すことによって、種子を浸漬することを含む。好適には、本方法は、処理用組成物に種子を浸し、そうして、上に詳述したように、種子を少なくとも１時間のあいだ、組成物と接触させておく。
【００４７】
好適には、本方法は、種子への処理用組成物の適用に続いて種子を乾燥させることを含む。この方法は、種子を自然に乾燥させておくことを含みうる。あるいは、本方法は、種子を乾燥させるために熱をかけることを含みうる。好適には、処理用組成物の適用に続いて種子を乾燥させることは、植物抵抗機構の誘導を妨げない。
【００４８】
本方法は、種子への処理用組成物の適用に続いて種子を洗浄することを含むことができる。本方法は種子を水で洗うことを含みうる。本方法は、部分的又は完全に、最も好適には完全に、種子を水中に浸漬することを含みうる。本方法は、種子に処理用組成物を適用する工程と、種子を乾燥させる工程との間で、種子を洗浄することを含みうる。好適には、処理用組成物の適用に続いて且つ発芽の前に種子を洗浄することは、植物抵抗機構の誘導を妨げない。
【００４９】
好適には、本方法で処理した種子は、播種する前に少なくとも２４時間貯蔵しうる。好適には本方法で処理した種子は、使用前に、未処理の種子と実質的に同じ方法で貯蔵することができる。処理した種子は、発芽が開始される前に少なくとも２４時間、好適には少なくとも７２時間、例えば、１週間以上、貯蔵しうる。処理した種子は、例えば、播種される前、且つ発芽が始まる前１ヶ月以上、貯蔵しうる。好適には、処理用組成物の適用に続いて且つ発芽の前に種子を貯蔵することは、植物抵抗機構の誘導を妨げない。したがって、処理した種子は、発芽の前１週間以上の間、植物抵抗機構の誘導を妨げることなく、貯蔵されることができる。
【００５０】
好適には、本方法で処理された種子は、単子葉植物又は双子葉植物のものである。好適には、本方法で処理された種子は、園芸又は農作物のものである。農作物は商業目的のために育成される農作物であってよい。
【００５１】
好適には、本方法は、処理用組成物を適用し、それにより、処理した種子から生長した植物における害虫抵抗性が、オキシリピン経路（ジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路としても知られる）によって調節される防御機構によって引き起こされる。
【００５２】
好適には、この防御機構は、種子の処理によって生じる。好適には、害虫に対する耐性は、処理した種子から発芽する植物への本組成物の残留だけによって生じるのではない。この防御機構は、種子から発芽しつつある植物への処理用組成物の持ち越しによるのではなく、むしろ種子の処理によって誘導されうる。
【００５３】
好適には、本発明によって処理した種子から発芽した植物は、発芽後少なくとも１週間において、好適には少なくとも２週間、例えば、発芽後３、４、５、６、７、又は８週間もしくはそれより後において、害虫被害に対する抵抗性を示しうる。
【００５４】
好適には、本方法によって処理した種子から発芽した植物は、未処理の種子から発芽した、それ以外は同等の植物よりも、害虫被害に対するさらに大きな抵抗性を、発芽後少なくとも１週間において、好適には発芽後少なくとも２週間、例えば３、４、５、６、７、又は８週間あるいはそれより後において示しうる。
【００５５】
好適には、本方法によって処理した種子から発芽した植物における害虫防御機構は、害虫の生存の低下及び／又は害虫による植物被害の低減及び／又は害虫の繁殖の減少によって作用しうる。
【００５６】
本種子処理用組成物は、種子から生長した植物における、一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導でき、これが害虫の生存及び／又は害虫数及び／又は害虫の成長及び／又は害虫の繁殖を制限する。
【００５７】
好適には、本方法にしたがって処理した種子から発芽した植物の近傍内にある植物も、害虫による植物被害の危険が低下しうる。好適には、本発明によって処理した種子からの植物によって生産される植物揮発性シグナル伝達化合物の生産が、近くの未処理植物における害虫被害に対する抵抗性をもたらしうる。
【００５８】
好適には、処理した種子から発芽した植物における植物毒性に伴う問題は全くない。
【００５９】
好適には、この処理方法は、実質的に、処理した種子から生長した植物、又はその植物が生長して作り出す農作物の収量もしくは品質、への悪影響を引き起こすことを回避する。好適には、本方法は、処理した種子から生長した植物における植物毒性を実質的に回避するような方法である。
【００６０】
本方法は、これ以後に記載するとおり、第三の側面による組成物で種子を処理することを含みうる。
【００６１】
本発明の第二の側面によれば、害虫被害に対する植物の抵抗性が育ちうる種子を提供し、その種子は、その種子から生長した植物において一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導し、それによって害虫による植物被害を低減させるための種子処理用組成物で処理した種子を含む。
【００６２】
好ましくは、種子は、未発芽種子を含む。好適には、この種子は、引き続き発芽しうる未発芽種子を含む。
【００６３】
好適には、種子は、第一の側面の方法にしたがって処理した種子を含む。この種子は、以下に記載するとおりの第三の側面にしたがう組成物で処理した種子を含みうる。
【００６４】
好適には、種子は、第一の側面に関連して記載したいずれかの特徴を含む。
【００６５】
植物は、第一の側面に関連して記載したいずれかの特徴を含みうる。害虫は、第一の側面に関連して記載したいずれかの特徴を含みうる。種子処理用組成物は、第一の側面に関連して記載したいずれかの特徴を含みうる。植物防御機構は、第一の側面に関連して記載したいずれかの特徴を含みうる。
【００６６】
本発明の第三の側面によれば、処理した種子から生長した植物に、一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導させるために種子を処理し、それにより、害虫による植物被害を制限するための種子処理用組成物を提供する。
【００６７】
好適には、この処理用組成物は、上記第一の側面による方法で用いられるように準備される。
【００６８】
好適には、この処理用組成物は、ジャスモン酸（ＪＡ）又はオキシリピン類のジャスモネートファミリーの関連するもの、又はＪＡ依存性の、草食動物への抵抗経路を活性化するその他の化合物から選択され、それには以下が含まれる：ジャスモン酸又はそのジャスモネート塩、例えば、ジャスモン酸カリウムもしくはジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）、ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合物（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体、又は、L-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファソイル-L-セリン及びコロナファソイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシン及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）；又はそれらの組み合わせ物。
【００６９】
好適には、処理用組成物は、下記の群から選択される処理剤を含む：ジャスモン酸又はそのジャスモネート塩類、例えば、ジャスモン酸カリウム又はジャスモン酸ナトリウム；ジャスモン酸メチルエステル（「メチルジャスモネート」）；ジャスモン酸-L-アミノ酸（アミド結合した）複合物（コンジュゲート）、例えば、L-イソロイシンとの複合体、又は、L-バリン、L-ロイシン、及びL-フェニルアラニンとの複合体；12-オキソ-フィトジエン酸；コロナチン（コロナファシン酸と2-エチル-1-アミノシクロプロパンカルボン酸とのアミド）；コロナファソイル-L-セリン及びコロナファソイル-L-トレオニン；1-オキソ-インダノイル-イソロイシン及び1-オキソ-インダノイル-ロイシンのメチルエステル類；コロナロン（2-[(6-エチル-1-オキソ-インダン-4-カルボニル)-アミノ]-3-メチルペンタン酸メチルエステル）；又はそれらの組み合わせ物。
【００７０】
好適には、本処理用組成物は、ジャスモン酸（ＪＡ）を処理剤として含む。
【００７１】
好適には、本処理用組成物は水性組成物を含む。本処理用組成物は非水溶媒、好適にはアルコール、例えば、エタノール、を含んでもよい。
【００７２】
好適には、本処理用組成物は、水と、処理剤と、好適にはさらに非水溶媒、好適にはアルコールとを含む。好適には、本処理用組成物は、実質的に、水、処理剤、及び非水溶媒のみからなる。好適には、本処理用組成物は、実質的に、水、処理剤、及びアルコールのみからなる。
【００７３】
好適には、本処理用組成物は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含む。
【００７４】
種子は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含みうる。種子は未発芽種子であってよい。植物は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含みうる。害虫は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含みうる。植物防御機構は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含みうる。
【００７５】
本発明の第四の側面によれば、害虫被害に対する抵抗性を植物にもたらす方法を提供し、この方法は、種子処理用組成物を種子に適用し、続いてその種子から植物を生長させ、ここで上記処理用組成物が、その処理した種子から生長した植物において、一種以上の害虫に対する植物防御機構を誘導させ、それによって害虫による植物被害を制限（低減）する。
【００７６】
好適には、上記植物は、未処理の種子から生長した以外は同等の植物よりも、害虫に対する、より大きな抵抗力を含む。
【００７７】
好ましくは、本方法は、処理用組成物を未発芽種子に適用することを含む。好適には、本方法は、続いて発芽しうる未発芽種子に処理用組成物を適用することを含む。あるいは、本方法は、発芽しつつある種子に処理用組成物を適用することを含みうる。
【００７８】
好適には、本方法は、第一の側面の方法にしたがって種子を処理することを含む。本方法は、上記第二の側面にしたがう種子を用いることができる。本方法は、上記第三の側面にしたがう処理用組成物を用いることができる。
【００７９】
本方法は、処理用組成物で種子を処理し、次に発芽前にその種子を洗浄及び／又は乾燥及び／又は貯蔵することを含むことができる。
【００８０】
処理（これには、洗浄及び／乾燥を含めることができる）に続いて、本方法は、公知の未処理の種子と実質的に同様の方法で、処理した種子を取り扱うこと（これには貯蔵を含めることができる）を含むことができる。
【００８１】
好適には、植物は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含む。
【００８２】
好適には、本方法によって作った植物は、オキシリピン経路（これはジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路ともいわれる）によって調節される防御機構によって生じた対昆虫抵抗性を示す。
【００８３】
種子は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含むことができる。害虫は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含むことができる。上記種子処理用組成物は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含むことができる。植物防御機構は、上記第一の側面に関連して説明したいずれかの特徴を含むことができる。
【００８４】
本発明の第五の側面によれば、害虫被害に抵抗性の植物を提供し、植物には上記第四の側面による方法によって準備した、及び／又は上記第二の側面による種子から生長した、及び／又は上記第一の側面の方法にしたがって処理した種子から生長した、及び／又は上記第三の側面にしたがう組成物で処理した種子から生長した植物が含まれる。
【００８５】
第五の側面は、第一、第二、第三、又は第四の側面と関連して説明したいずれかの特徴を用いることができる。
【００８６】
本発明の第六の側面によれば、植物への害虫被害の制限方法を提供し、この方法は、前記植物を第五の側面による植物の近くに配置することを含む。
【００８７】
上記第六の側面は、上記第一、第二、第三、又は第四の側面と関連して説明したいずれかの特徴を用いることができる。
【００８８】
本発明の第七の側面によれば、種子を処理するための種子処理用組成物の使用を提供し、それはその種子から生長した植物に一種以上の害虫に対する植物の抵抗機構を誘導させるためであり、それによって害虫による植物被害を制限（低減）させる。
【００８９】
好適には、本種子処理用組成物は、上記第三の側面による組成物を含む。
【００９０】
好適には、害虫に対する抵抗性は、オキシリピン経路（これはまたジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路としても知られる）によって調節される防御機構によって引き起こされる。
【００９１】
第七の側面は、上記第一、第二、第三、又は第四の側面との関連で説明したいずれかの特徴を用いることができる。
【００９２】
本発明の第八の側面によれば、種子を処理するための種子処理用組成物の使用を提供し、これは、害虫の生存及び／又は害虫の数及び／又は害虫の成長及び／又は害虫の繁殖を制限（低減）するために、その種子から生長した植物に一種以上の害虫に対する植物の抵抗機構を誘導するためである。
【００９３】
好適には、本処理用組成物は、上記第三の側面による組成物を含む。
【００９４】
好適には、害虫に対する抵抗性は、オキシリピン経路（ジャスモネート経路又はオクタデカノイド経路としても知られる）によって調節される防御機構によって引き起こされる。
【００９５】
第八の側面は、第一、第二、第三、又は第四の側面との関連で説明したいずれかの特性を用いることができるが、そのような特性が相互に排他的である場合を除く。
【００９６】
〔図面の簡単な説明〕
本発明は、付属する図面を参照して、例を使って説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、トマトの苗へのハダニの被害に対する、ＪＡ種子処理の効果を示している。
【図２】図２は、ハダニの個体数に対するＪＡ種子処理の効果を示している。
【図３】図３は、ハダニ集団による産卵数へのＪＡ種子処理の影響を示している。
【図４】図４は、マンドゥカ・セクスタ（Munduca sexta）の芋虫による草食へのＪＡ種子処理の影響を示す。
【図５】図５は、甘唐辛子におけるミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）へのＪＡ種子処理の影響を示す。
【図６】図６は、すぐ近くの未処理の植物におけるハダニの個体数への、ＪＡ種子処理の影響を示す。
【図７】図７は、すぐ近くの未処理の植物におけるハダニの繁殖への、ＪＡ種子処理の影響を示す。
【図８】図８は、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」）におけるミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）の個体数への、ＪＡ種子処理の影響を示している。
【図９】図９は、トウモロコシでのスポドプテラ・エクゼンプタ（Spodoptera exempta）の芋虫による草食への、ＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１０】図１０は、小麦でのスポドプテラ・エクゼンプタ（Spodoptera exempta）の芋虫による草食への、ＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１１】図１１は、処理した種子を、２ヶ月の貯蔵の後で播種した場合の、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」）におけるミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）の個体数へＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１２】図１２は、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」）の種子発芽へのＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１３】図１３は、週毎の収穫におけるトマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」）の植物の草丈への、ＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１４】図１４は、週毎の収穫におけるトマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」）の植物当たりの実の数への、ＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１５】図１５は、毎週の収穫におけるトマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”)）の果実乾燥質量に対する、ＭｅＪＡ種子処理の影響を示す。
【図１６】図１６は、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”)）におけるアブラムシ（ミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)）の個体数へのＭｅＪＡ種子処理の影響を示す。
【００９８】
〔本発明の詳細な説明〕
［ジャスモン酸（ＪＡ）及びジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）の溶液の調製］
ジャスモン酸（ＪＡ）及びジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）の溶液は、種子の処理の直前に調製した。
【００９９】
ジャスモン酸溶液を調製するために、２５０ｍｇのＪＡを１ｍＬのエタノールに溶かし、脱イオン水で４００ｍＬの体積に増やして、４２．８ｍＭのエタノール中の３ｍＭのＪＡの溶液を得た。それは以下の通りである：
１．  ＪＡ（シグマ-アルドリッチ社）の２５０ｍｇ試薬瓶中のジャスモン酸の塊を、試薬瓶のラベルから記録をとった。
２．  そのラベルを除去し、その試薬瓶の外側から全ての接着剤をアセトンを用いて除去した。
３．  ５分間その試薬瓶を乾燥させておいた後、最寄りのｍｇに秤量した。
４．  ５００ｍＬのメスフラスコをその標線まで脱イオン水で満たした。
５．  そのメスフラスコから１０００μＬのギルソン(Gilson)ピペットを使用して５ｍＬの水を取り除き、次に分析用１００ｍＬピペットを使用してさらに１００ｍＬを取り除いた。
６．  ＪＡの試薬瓶に、１０００μＬのギルソン(Gilson)ピペットを使用して１ｍＬのエタノールを添加し、試薬瓶の蓋をし、さらに、試薬瓶を振盪してＪＡを溶かした。ＪＡが水に直接溶けないので、エタノールの使用が必要である。
７．  次に、試薬瓶の内容物を、１０００μＬのギルソン(Gilson)ピペットを使用して５００ｍＬのメスフラスコに移した。
８．  １ｍＬの脱イオン水を、１０００μＬのギルソン(Gilson)ピペットを使用して空の試薬瓶に添加し、試薬瓶の蓋をして、試薬瓶を再度激しく振盪した。
９．  次に、試薬瓶の内容物を１０００μＬのギルソン(Gilson)ピペットを使用して上記の５００ｍＬのメスフラスコに移した。
１０．  ステップ８及び９をさらに３回繰り返した。
１１．  メスフラスコ（この時点で４００ｍＬの液体と２５０ｍｇのＪＡが入っている）に栓をして、激しく振盪した。
１２．  上記試薬瓶を１５０℃のオーブン中で一定質量になるまで乾燥させて、その質量を記録した。
１３．  メスフラスコ中のＪＡの濃度を、上記試薬瓶の２つの質量測定の質量差から計算した。
【０１００】
１．５ｍＭのＪＡ溶液は、上記の３ｍＭのＪＡ溶液を、４２．８ｍＭのエタノールを含む脱イオン水で２倍に希釈することによって調製した。様々なその他の濃度を、例９のために、適切に加減した量を用いて上記方法にしたがって調製した。
【０１０１】
３．０ｍＭのＭｅＪＡ溶液を、上述したものと実質的に同じ方法によって調製したが、ＪＡに変えてＭｅＪＡを用いた。ＭｅＪＡ溶液を調製するために、２６９ｍｇのＭｅＪＡを１ｍＬのエタノールに溶かし、脱イオン水で４００ｍＬの体積にし、４２．８ｍＭのエタノール中の３ｍＭのＭｅＪＡの溶液を得た。
【０１０２】
〔種子処理−概説〕
トマト、ペッパー(pepper)、トウモロコシ(maize)、及び小麦の種子を、３ｍＭのＪＡ又は１．５ｍＭのＪＡの溶液、あるいは３ｍＭのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）、あるいは４２．８ｍＭのエタノールを含む脱イオン水（対照）で処理したが、これはホイルで覆ったペトリ皿の溶液中で、２４時間、冷蔵庫中４℃で、４０までの種子を完全に浸漬させることによって行った。４℃の温度は、ジャスモン酸溶液の分解の防止と、種子の発芽防止の両方のために採用した。
次に、処理溶液から種子を取り出して、１リットルの脱イオン水で５分間洗浄して、種子の外側をコーティングしたＪＡ又はＭｅＪＡを除去した。
【０１０３】
〔トマト、ペッパー、トウモロコシ、及び小麦の生長と試験〕
トマトの種子を石綿ブロック中に播き、泥炭（ピート）系コンポスト上で、温室中、１２℃〜２８℃で、１６時間の光と８時間の暗闇のサイクルの人工照明下で、４８日、５６日、又は７０日、生育した。
【０１０４】
ペッパーの種子は泥炭系コンポストに播き、夏の環境条件下で、加温していない温室中で生育した。
【０１０５】
小麦とトウモロコシの種子は泥炭系コンポストに播き、秋に、補助照明（６００ＷのＳＯＮ−Ｔランプ、１日当たり１６時間）を用いて、加温していない温室中で生育した。
【０１０６】
次に、トマト植物体を、テトラニカス・ウルチカエ(Tetranychus urticae)（ナミハダニ、two-spotted spider mite）（これは９日間、飼っておいた）、マンドゥカ・セクスタ(Manduca sexta)（タバコ・ホーンワーム）（これは４日間、飼っておいた）、又はミズス・ペルシカエ(Myzus persicae))（アブラムシ）（これは１０又は１２日間、飼っておいた）を用いて試験を行った。それぞれの場合に、これらの生物はそれらが最初にその上に置かれた植物に制限した。ペッパー植物体は、ミズス・ペルシカエ(Myzus persicae) (アブラムシ)（これは２週間、飼っておいた）を用いた試験した。トウモロコシと小麦の植物体は、スポドプテラ・エグゼンプタ（Spodoptera exempta）の芋虫（これは２日（トウモロコシ）又は３日（小麦）、飼っておいた）を用いた試験した。
【０１０７】
植物体へのテトラニカス・ウルチカエ(Tetranychus urticae)の影響は、各植物上の生きたハダニ及び死んだハダニの数と、解剖顕微鏡を使用してハダニの卵の数とを数えることによって評価した。
【０１０８】
植物体へのミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)の影響は、各植物上のアブラムシの個体数を解剖顕微鏡下、１０倍の倍率で数えることによって評価した。
【０１０９】
植物体へのマンドゥカ・セクスタ(Manduca sexta)又はスポドプテラ・エクゼンプタ（Spodoptera exempta）の影響は、食べられた葉の面積の測定によって評価し、これは、葉面積計を使用して測定した。
【実施例１】
【０１１０】
［実施例１］
ＵＫ市販Ｆ１ハイブリッドトマト品種（cv. カルーセル）を、脱イオンＨ２Ｏ中の１．５ｍＭ又は３．０ｍＭのいずれかのジャスモン酸（ＪＡ）と４２．８ｍＭのエタノールで、２４時間、４℃で、暗所にて処理した。次にそれらの種子を溶液から取り出し、種子の外側を被覆しているＪＡを除去するためだけに、脱イオンＨ２Ｏ中で洗った。次に、それらの種子を、ロックウォールブロックを用いる商業的方法で播種し、この農作物に適切な温室条件下で生育した。植物を、普通の農作物害虫であって、ここでは「モデル草食動物」として働くナミハダニ（テトラニクス・ウルチカエ、Tetranychus urticae）に、処理の後の７週間後に曝した。
【０１１１】
アカハダニ(red spider mite)の攻撃によって引き起こされた肉眼で分かる被害（この害虫による摂食活動による葉の表面の特徴的な淡色の剥離）は、大幅に低減された（図１−対照及び３．０ｍＭのＪＡのみ）。誘導され、観察された抵抗性は、種子へのＪＡの適用後８週間でさえ顕著だった。
【０１１２】
対照植物上の個体数と比較して、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の葉の上のナミハダニ（テトラニクス・ウルチカエ、tetranychus urticae）の個体数の顕著な低下も観察された（図２）。対照植物は、全てのＪＡ処理した植物から少なくとも１０ｍ離して配置し、図示したデータは１０回の繰り返しの平均±標準誤差である。
【０１１３】
対照植物と比較して、産卵によって測定したそのハダニの繁殖速度に顕著な低下があることがさらに観察された（図３）。対照植物は、全てのＪＡ処理した植物から１０ｍ離して配置し、図示したデータは１０回の繰り返しの平均±標準誤差である。
【０１１４】
図２は、ハダニ個体数に対するＪＡ種子処理の効果を示しており、図中の説明は以下の通りである。
Ｘ２＝種子処理のＪＡ濃度（ｍＭ）；及び
Ｙ２＝生存しているハダニの数。
【０１１５】
図３は、ハダニ集団による産卵に対する、ＪＡ種子処理の効果を示し、図中の説明は以下のとおりである。
Ｘ３＝種子処理のＪＡ濃度（ｍＭ）；及び
Ｙ３＝成虫の雌１頭当たりが産んだ卵。
【実施例２】
【０１１６】
［実施例２］
ＵＫ市販Ｆ１ハイブリッドトマト品種（cv. カルーセル(cv.Carousel)）を、１．５ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）で処理し、この農作物に適した条件下で植物を生長させた（実施例１のもとでの記載どおり）。種子処理後８週間で、処理した種子から生長させた植物を、２頭の３令のガ（マンドゥカ・セクスタ、Manduca sexta）の芋虫（タバコイモムシ）を第５番目の葉の上に置くことによって、葉を咀嚼する草食動物に曝した。芋虫はその植物の上で、４日間、摂食させておき、次に食べられた葉の面積を測定した。草食後に残った葉の面積は、対照と比較して、ＪＡで処理した種子から生長させた植物で顕著に高かった（図４）。加えて、ＪＡで処理した種子から生長させた植物の葉を食べた芋虫は、対照を餌にしたものよりも２０％低くしか生長していなかった。対照の種子は、適切なエタノール溶液で処理したが、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保っておいた。図示したデータは、１０回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１１７】
図４は、マンドゥカ・セクスタ(Manduca sexta)のイモムシによる摂食に対する、ＪＡ種子処理の影響を示し、図中、説明は以下の通りである：
Ｘ４＝種子処理（Ｃ＝対照での処理、及びＪＡ＝ジャスモン酸での処理）；及び
Ｙ４＝摂食後の葉の面積（ｃｍ２）。
【実施例３】
【０１１８】
［実施例３］
この試験では、甘唐辛子の種子（カプシカム・アンナウム、cv ビスケイン；Capsicum annuum, cv Biscayne）を１．５ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）で処理し、この農作物に適した条件下で植物を生長させた（概説で説明したとおりである）。種子処理後８週間で、処理した種子から生長させた植物を、ミズス・ペルシカエ、Myzus persicaeに曝した。アブラムシは、その植物の上で２週間、摂食させておき、この期間にわたるアブラムシ個体数の増大を次に測定した。ＪＡで処理した種子から生長させた植物上でのアブラムシ個体数の増大の速度に顕著な低下があった（ｐ＜０．００１）（図５）。対照の種子は、適切なエタノール溶液で処理したが、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保った。図示したデータは１０回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差であり、線はフィッティングした生長曲線であり、これは対照に対して０．１９±０．０１１、ＪＡ処理したものに対して０．１１±０．０１６の個体数増加速度を与える。
【０１１９】
図５は、甘唐辛子（カプシカム・アンナウム、Capsicum annum）におけるミズス・ペルシカエ、Myzus persicaeへの、ＪＡ種子処理の影響を示しており、図５において、説明は以下のとおりである：
Ｘ５＝アブラムシを導入後の日数；及び
Ｙ５＝アブラムシ数（Ｃ＝対照処理、ＪＡ＝ジャスモン酸処理）。
【実施例４】
【０１２０】
［実施例４］
トマト（cv. カルーセル（cv. Carousel））の植物を同じ条件下で生長させ、実施例１のもとで説明したとおりに、ナミハダニ（テトラニクス・ウルチカエ、tetranychus urticae）に曝した試験では、ＪＡ処理は受けていないが、１．５ｍＭ又は３．０ｍＭのいずれかのジャスモン酸（ＪＡ）で処理した種子から生長させた植物に隣接して生長させた植物上で、T. urticaeの個体数の顕著な低下があった。この効果は、少なくとも１０メートル離れて配置した対照と比較して観測された（図６）。図示したデータは１０回の繰り返し試験の平均±その平均の標準誤差である。
【０１２１】
ＪＡ処理を受けていないが、１．５ｍＭ又は３．０ｍＭのいずれかのジャスモン酸（ＪＡ）で処理した種子から生長させた植物に隣接して生長した植物で、ハダニの（産卵によって測定した）増殖速度の顕著な低下も観察された。ここでもこの効果は、少なくとも１０メートル離れて配置した対照と比較して観察された（図７）。図示したデータは、１０回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１２２】
図６は、近くの未処理の植物における、ハダニ個体数へのＪＡ種子処理の影響を示しており、その説明は以下のとおりである：
Ｘ６＝処理（ＶＣ=何もしていない対照、Ｎ１．５=１．５ｍＭ種子処理の近隣、及びＮ３．０= ３．０ｍＭの種子処理の近隣）；及び
Ｙ６＝生きているハダニの数。
【０１２３】
図７は、未処理植物近くにおける、ハダニの増殖に対するＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下のとおりである：
Ｘ７＝処理（ＶＣ=何もしていない対照、Ｎ１．５=１．５ｍＭ種子処理の近隣、及びＮ３．０= ３．０ｍＭの種子処理の近隣）；及び
Ｙ７＝成虫の雌１頭当たりの産卵。
【実施例５】
【０１２４】
［実施例５］
ＵＫ市販Ｆ１ハイブリッドトマト品種（cv.カルーセル(cv. Carousel)）を、脱イオンしたＨ２Ｏ中の３．０ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）と４２．８ｍＭのエタノールで２４時間、４℃で暗所にて処理をした。次に、これらの種子を溶液から取り出して、種子の外側を被覆しているＪＡを除去するためだけに、脱イオンＨ２Ｏ中で洗浄し、この農作物に適した条件下で植物を生長させた（概説のもとに記載したとおり）。播種後１０週で、植物をアブラムシ（ミズス・ペルシカエ、Myzus persicae）に曝した。アブラムシは、その植物の上で１２日間、摂食させておき、アブラムシ個体数を対照植物と比較した。ＪＡで処理した種子から生長させた植物上での、アブラムシ個体数の有意な（ｐ＜０．０５）低下があった（図８）。対照の種子は、適切なエタノール溶液で処理したが、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保った。図示したデータは１５回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１２５】
図８は、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”）におけるミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）の個体数へのＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下のとおである；
Ｘ８＝最初のアブラムシの攻撃後の日数；及び
Ｙ８＝アブラムシの数（対照の％として処理した）。
【実施例６】
【０１２６】
［実施例６］
トウモロコシ（maize）cv アーリゴールド（Earligold）の種子を、１．５ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）で処理し、（実施例１のもとに説明したとおりである）温室中で植物を生長させた。穂を出す時期（種子処理後約１０週）に、完全に開いた葉の上に蛾（スポドプテラ・エグゼンプタ, Spodoptera exempta）の２頭の芋虫を置くことによって葉を咀嚼する草食動物に曝した。芋虫は植物上で２日間、摂食させておき、次に食べられた葉の面積を測定した。芋虫によって消費された葉の面積は、対照よりも、ＪＡで処理した種子から生長させた植物で３８％低かった（ｐ＜０．０５の有意性）。芋虫の単位質量当たり消費された葉の面積として表した場合は、ＪＡで処理した種子から生長させた植物における低下は、なおさらに明言できる（４０％、ｐ＜０．００１、図９）。対照の種子は適切なエタノール溶液で処理したが、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保った。図示したデータは、１２の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１２７】
図９は、トウモロコシ（メイズ、maize）上のスポドプテラ・エクゼンプタ(Spodoptera exempta)の芋虫による草食への、ＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下の通りである：
Ｘ９＝処理（Ｃ＝対照、ＪＡ＝ジャスモン酸処理）；及び
Ｙ９＝芋虫の初期体重１ｇ当たりの消費された葉の面積。
【実施例７】
【０１２８】
［実施例７］
市販の小麦の品種（cv. アインシュタイン、cv. Einstein）の種子を、１．５ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）で処理し、植物を温室中で生育させた（実施例１で説明したとおり）。種子処理の後７週間で、各植物上に蛾（スポドプテラ・エクゼンプタ、Spodoptera exempta）の２頭の芋虫を置くことによって、葉を咀嚼する草食動物に曝した。芋虫は植物上で３日間摂食させておき、次に、食べられた葉の面積を測定した。芋虫によって消費された葉の面積は、対照よりもＪＡで処理した種子から生長させた植物で６０％低かった（ｐ＜０．０１の有意性、図１０）。対照の種子は適切なエタノール溶液で処理したが、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保った。図示したデータは、１０回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１２９】
図１０は、小麦上のスポドプテラ・エクゼンプタ(Spodoptera exempta)の芋虫による草食への、ＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下のとおりである：
Ｘ１０＝処理（Ｃ＝対照、ＪＡ＝ジャスモン酸処理）；及び
Ｙ１０＝食べられた葉の面積（ｃｍ２）。
【実施例８】
【０１３０】
［実施例８］
ＵＫ市販Ｆ１ハイブリッドトマト品種（cv.カルーセル、cv. Carousel）の種子を、脱イオン化したＨ２Ｏ中の３．０ｍＭのジャスモン酸（ＪＡ）と４２．８ｍＭのエタノールで２４時間、４℃で暗所にて処理をした。前の実施例におけるとおり、次に、これらの種子を溶液から取り出して、種子の外側を被覆しているＪＡを除去するためだけに、脱イオンＨ２Ｏ中で洗浄し、次に乾燥させ、播種前２ヶ月間、４℃で、冷蔵庫中で乾燥貯蔵した。播種後、この農作物に適した条件下で植物を生長させた（概説のもとに記載したとおり）。播種後１０週で、アブラムシであるミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）に曝した。アブラムシは、その植物の上で１０日間、摂食させておき、アブラムシ個体数を対照植物と比較した。ＪＡで処理した種子から生長させた植物上での、アブラムシ個体数の有意な（ｐ＜０．０５）低下があった（図１１）。対照の種子は、適切なエタノール溶液で処理したが、ＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保った。図示したデータは１５回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１３１】
図１１は、処理した種子を２ヶ月貯蔵後に播種した場合の、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”）におけるミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)個体数に対するＪＡ種子処理の影響を示し、図中、説明は以下の通りである：
Ｘ１１＝最初にアブラムシに曝した後の日数；及び
Ｙ１１＝アブラムシの数（対照の％として処理した）。
【実施例９】
【０１３２】
［実施例９］
脱イオンＨ２Ｏ中の１．５ｍＭ又は３．０ｍＭのいずれかのジャスモン酸（ＪＡ）と４２．８ｍＭのエタノールで、２４時間、４℃にて、暗所で種子を処理した場合は、ＵＫ市販Ｆ１ハイブリッドトマト品種（cv カルーセル、cv. Carousel）の種子の発芽がほぼ１日遅くなった。これらの処理は、最終的な発芽の％割合に有意な影響を全く示さなかった。種子を、同じ条件下で０．００１〜５０ｍＭの広い範囲の濃度のジャスモン酸（ＪＡ）で処理した場合は、最終的な発芽の％割合は、１０ｍＭを超える濃度によってのみ、有意に低下した（図１２）。図示したデータは１０回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差であり、線はフィッティングした用量応答である。
【０１３３】
図１２は、播種後７日のトマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”）の種子発芽に対するＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下の通りである：
Ｘ１２＝ＪＡ濃度（ｍＭ  ｌｏｇ単位）；及び
Ｙ１２＝７日後の種子発芽（％）。
【実施例１０】
【０１３４】
［実施例１０］
植物を１週間間隔で収穫した場合の生育と収量の長期試験において、１．５又は３．０ｍＭのＪＡでの種子処理では、実施例９におけるように、トマト、キュウリ、又はペッパーの栄養増殖及び生殖生長への、あるいは商業的収量へのいかなる有意な影響もなかった。例えば、トマト（cv. カルーセル、cv. Carousel）に対する図示したデータは、各週毎の収穫における植物の草高（図１３）、果実の数（図１４）、又は果実の乾燥重量（図１５）にいかなる有意な影響も示していない。データは８回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差であり、線はフィッティングした生長応答である。そのフィッティングした生長応答と、二元分散解析（処理x収穫）のいずれも、対照植物と、ＪＡ処理した種子から生長した植物との間のいかなる有意な差も示していない。
【０１３５】
図１３は、各週の収穫におけるトマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”）の草高への、ＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下の通りである：
Ｘ１３＝収穫（週数）；及び
Ｙ１３＝草高（ｃｍ）（Ｃ＝対照、ＪＡ＝ジャスモン酸処理）。
【０１３６】
図１４は、各週の収穫におけるトマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”）の一植物体あたりの実の数に対するＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下のとおりである：
Ｘ１４＝収穫（週数）；及び
Ｙ１４＝実の数（Ｃ＝対照、ＪＡ＝ジャスモン酸処理）。
【０１３７】
図１５は、各週の収穫での、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”）からの果実乾燥重量に対するＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下のとおりである：
Ｘ１５＝収穫（週数）；及び
Ｙ１５＝果実乾燥重量（ｇ）（Ｃ＝対照、ＪＡ＝ジャスモン酸処理）。
【実施例１１】
【０１３８】
［実施例１１］
ＵＫ市販Ｆ１ハイブリッドトマト品種（cv. カルーセル、cv. Carousel）の種子を、脱イオン化したＨ２Ｏ中の３．０ｍＭのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）と４２．８ｍＭのエタノールで２４時間、４℃で暗所にて処理をした。次に、これらの種子を溶液から取り出して、種子の外側を被覆しているＭｅＪＡを除去するためだけに、脱イオンＨ２Ｏ中で洗浄し、そしてこの農作物に適した条件下で植物を生長させた（概説のもとに記載したとおり）。播種後１０週で、処理した種子から生長した植物を、アブラムシであるミズス・ペルシカエ（Myzus persicae）に曝した。アブラムシは、その植物の上で１２日間、摂食させておき、この期間にわたって間隔をおいて、アブラムシ個体数を測定した。対照植物と比較して、ＭｅＪＡで処理した種子から生長させた植物上で、アブラムシ個体数の有意な（ｐ＜０．０５）低下があった（図１６）。対照の種子は、適切なエタノール溶液で処理したが、ＭｅＪＡ処理した種子から生長させた植物の近くに保った。図示したデータは１２回の繰り返しの平均±その平均の標準誤差である。
【０１３９】
図１６は、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」（Solanum lycopersicum cv “Carousel”））におけるミズス・ペルシカエ(Myzus persicae)の個体数への、ＭｅＪＡ種子処理の影響を示しており、図中、説明は以下のとおりである：
Ｘ１６＝アブラムシに曝した後の日数；及び
Ｙ１６＝アブラムシ数（対照の％として処理した）。
【０１４０】
［実施例のまとめ］
実施例１〜１１まで、処理した種子から生長させたトマト、甘唐辛子、トウモロコシ（maize）、及び小麦の植物が、播種後の最大で１０週間までに曝した場合に、昆虫及びその他の害虫に対して防御されることが観察された（表１）。
【０１４１】
【表１】
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【０１４２】
表１は、ジャスモン酸又はジャスモン酸メチルで処理した種子から生長させた、トマト（ソラナム・リコペルシカム cv 「カルーセル」(Solanum lycopersicum cv “Carousel”)、甘唐辛子（カプシカム・アンナム，cv ビスケイン(Capsicum annuum, cv Biscayne)、トウモロコシ（cv. アーリゴールド(cv. Earligold)）、及び小麦（cv. アインシュタイン(cv. Einstein)）の植物をその試験期間後に様々な害虫に曝して、害虫抵抗性を示すことを発見した試験期間を示している。
【０１４３】
本発明の方法、種子、植物、及び組成物の好ましい態様は、顕著な利点を持ちうることが理解されよう。植物の天然の防御機構、例えば、害虫に対して作用してその生存、摂食、又は害虫の増殖を抑制する防御機構を誘導するために、種子に植物シグナル伝達化学物質（処理剤）を含む処理組成物を適用することによって、農作物の被害を低減することができる。発芽前にそのような組成物を適用することによって、続く苗及び成熟した植物に驚くほど好都合かつ有効なやり方で害虫の攻撃に対抗する準備をさせることができる。この処理組成物の作用様式に鑑みれば、好ましい態様はＩＰＭアプローチにおける主要な役割及び／又は殺虫剤の使用量の低減に主な役割をもつことができると考えられる。
【０１４４】
種子を処理するための方法及び組成物の好ましい態様は、草食性の節足動物及びその他の害虫に対抗して、続く植物に有効な防護をもたらしうる。そのような防御は、長期にわたって有効でありうる。驚くべきことに、未発芽種子の処理が有効であり、このことはその種子を処理と播種との間にかなりの期間貯蔵することを許容することができる。有利なことには、植物毒性の問題は回避できる。
【０１４５】
本出願に関連してこの明細書とともに又はこれに先だって共に提出した全ての論文及び文献に注意が向けられ、これらは本明細書とともに公衆の閲覧に対して公開されており、全てのそのような論文及び文献の内容は、参照により本願に援用する。
【０１４６】
本明細書中に開示した全ての特徴（任意の付属する請求項、要約書、及び図面を含める）、及び／又はそうして開示された任意の方法又は工程の全ての段階は、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくらかが相互に排他的である組み合わせを除いて、いかなる組み合わせで結合してもよい。
【０１４７】
本明細書に開示された各特徴物（任意の付属する請求項、要約書、及び図面を含める）は、他に明示の記載がない限り、同一の、等価な又は類似した目的を果たす代替のものによって置き換えることができる。したがって、他に明示の記載がない限り、開示した各特徴物は、等価又は類似した特徴物の一般的な系統の一例にすぎない。
【０１４８】
本発明は上述した態様の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（任意の付属する請求項、要約書、及び図面を含める）中に開示した特徴の任意の新規な一つ、又は任意の新規な組み合わせに、あるいは、そのようにして開示された任意の方法又は工程の段階の任意の新規な一つ又は任意の新規な組み合わせに拡張される。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【国際調査報告】
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