(57)【要約】本発明は、多成分核酸酵素（MNAzyme）およびそれらの使用方法に関する。MNAzymeは、一つまたは複数のMNAzyme組織化助長因子分子が存在する場合に自己組織化して触媒活性構造を形成する、二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を含む。MNAzymeを製造するための組成物、およびMNAzymeのコレクションを提供する。一つまたは複数のターゲットの検出、同定および/または定量のためのMNAzymeの使用方法も提供する。本方法は、溶液系アッセイにおいて、または一つまたは複数の反応成分が支持体構造に取り付けられているアッセイにおいて、実施することができる。本方法は、単一の反応で多数のターゲットを検出するためのMNAzyme検出の多重化に対処する。本組成物を製造するための、および本明細書において提供する方法を実施するためのキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を含む組成物であって、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分が、MNAzyme組織化助長因子（assembly facilitator）が存在する場合には自己組織化（self-assemble）して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成し；
該少なくとも第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；
自己組織化すると、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分が、MNAzymeのセンサーアームとして動作し、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分が、MNAzymeの基質アームとして動作し、ならびに該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、MNAzymeの触媒コアとして動作し；ならびに
該MNAzymeのセンサーアームが、該MNAzyme組織化助長因子と相互作用して、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分を、それらのそれぞれの触媒コア部分が会合してMNAzymeの触媒コア（該触媒コアは、少なくとも一つの基質を修飾することができる）を形成するように、近接した状態で維持し；ならびに
該MNAzymeの基質アームが、該MNAzymeの触媒コアが基質を修飾することができるように、基質に係合する組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つが、DNAまたはその類似体からなる、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
組織化助長因子が、同定、検出または定量されるターゲットである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
ターゲットが、核酸である、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
リボソームRNAが、16SリボソームRNAである、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
核酸の供給源が、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項4〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
核酸が、増幅される、請求項4〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
基質アーム部分またはセンサーアーム部分のうちの少なくとも一つを安定させるように作用する少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
組織化助長因子、オリゴヌクレオチド成分もしくは基質のうちの少なくとも一つまたはそれらの組み合わせが、1つより多くの分子からなる、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
第一のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、配列番号：149〜153、155〜157、159および161を含む群から選択され、ならびに第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、配列番号：166〜170および172を含む群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
MNAzymeの自己組織化の少なくとも一つの阻害剤をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチド成分もしくは組織化助長因子もしくは基質のうちの少なくとも一つまたはそれらの組み合わせが、少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
アプタマーまたはその一部分が、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの誘導体もしくは組み合わせのうちの少なくとも一つから構成される、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
MNAzymeの自己組織化の少なくとも一つの阻害剤をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分または組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つが、ヘアピン構造を形成することができる自己相補配列の少なくとも一部分をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
ヘアピン構造が、MNAzymeの自己組織化を阻害する、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
自己組織化の阻害が、ターゲットとアプタマーの接触により解消される、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
アプタマーまたはその一部分が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されるターゲットに結合する、請求項14〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
基質が、核酸またはタンパク質である、請求項1〜20のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
核酸が、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
タンパク質が、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質のうちの少なくとも一つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２４】
基質が、少なくとも一つのナノ粒子もしくはミクロ粒子またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２５】
基質アームが、相補的塩基対合によって基質に係合する、請求項1〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
基質が、不溶性支持体に取り付けられているか、溶液中で遊離している、請求項1〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
基質が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が、増加または減少される、請求項1〜26のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
MNAzymeによる基質の修飾が、検出可能な作用をもたらす、請求項1〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
基質の修飾が、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション(porphyrin metallation)、炭素-炭素結合、エステル結合もしくはアミド結合の形成、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項1〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
検出可能な作用が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項27、28または29記載の組成物。
【請求項３１】
検出可能な作用が測定され、該測定の大きさが、ターゲットの量を示す、請求項27〜30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つが、DNA、RNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1〜31のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
組織化助長因子および基質が、第一または第二のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一部に完全に相補的または部分的に相補的である核酸である、請求項1〜32のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つが、4-アセチルシチジン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、βD-ガラクトシルケオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-（（9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル）カルバモイル）トレオニン、N-（（9-β-リボフラノシルプリン-6-イル）N-メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-（（9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル）カルバモイル）トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウリジン、βD-アラビノシルウリジン、βD-アラビノシルチミジンを含む群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド置換または付加を含む、請求項1〜34のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも一つの追加の組織化助長因子が存在する場合に自己組織化して少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成する、少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分および第四オリゴヌクレオチド成分をさらに含む組成物であって、
該少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分の各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；
少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分および第四のオリゴヌクレオチド成分が自己組織化すると、該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分が、該少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeのセンサーアームを形成し、該少なくとも第三および該少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分が、該少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeの基質アームを形成し、ならびに該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、該少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeの触媒コアを形成し；ならびに
該少なくとも一つの追加のMNAzymeのセンサーアームが、該少なくとも一つの追加の組織化助長因子と相互作用して、該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分を、それらそれぞれの触媒コア部分が会合して少なくとも一つの追加のMNAzymeの触媒コア（該触媒コアは、少なくとも一つの追加の基質に対して作用することができる）を形成するように、近接した状態で維持し；ならびに
該少なくとも一つの追加のMNAzymeの基質アームが、該少なくとも一つの追加のMNAzymeの触媒コアが少なくとも一つの追加の基質に対して作用することができるように、少なくとも一つの追加の基質に係合する、
請求項1〜34のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３６】
追加の基質の各々が、同じである、異なる、またはそれらの組み合わせである、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）組織化助長因子を含有すると推定されるサンプルと該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）該少なくとも一つの触媒活性MNAzymeの自己組織化、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（c）該少なくとも一つのMNAzymeの触媒活性の存在を判定すること
（該触媒活性の存在が、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を示す）
を含む、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を検出するための方法。
【請求項３８】
MNAzymeの自己組織化が、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の一方または両方との組織化助長因子の接触を必要とする、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のいずれかまたは両方の少なくとも一部分に接触してMNAzymeを自己組織化する少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分を提供することをさらに含む、請求項37または38記載の方法。
【請求項４０】
第三のオリゴヌクレオチド成分が、1つより多くの分子から構成される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも第一の組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）該第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾が、検出可能な作用をもたらす）；
（c）該少なくとも第一の組織化助長因子を含有すると推定されるサンプルと該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）該少なくとも第一のMNAzymeの自己組織化、および
（2）該少なくとも第一のMNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該検出可能な作用を検出すること
を含む、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を検出するための方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つが、DNAまたはその類似体から構成される、請求項37〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
組織化助長因子が、同定、検出または定量されるターゲットである、請求項37〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
ターゲットが、核酸である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、その誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
リボソームRNAが、16SリボソームRNAである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
核酸の供給源が、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項44〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
核酸を増幅する段階をさらに含む、請求項37〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
増幅段階が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
組織化助長因子、第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分または基質のうちの少なくとも一つあるいはそれらの組み合わせが、1つより多くの分子から構成される、請求項37〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
増幅中または後に検出可能な作用を検出することをさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
検出可能な作用が、組織化助長因子の存在を示す、請求項37〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
検出可能な作用が、定量的または定性的に測定される、請求項37〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
基質が、核酸またはタンパク質である、請求項37〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
核酸が、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
タンパク質が、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質のうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
基質が、ナノ粒子もしくはミクロ粒子のうちの少なくとも一方またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項37〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
基質が、核酸であり、基質アームが、相補的塩基対合によって該基質に係合する、請求項54〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
基質が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が、増加または減少される、請求項37〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
基質が、不溶性支持体に取り付けられているか、溶液中で遊離している、請求項37〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
検出可能な作用が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項37〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
検出可能な作用の増幅カスケードの使用により検出可能な作用を増幅することをさらに含む、請求項37〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
検出可能な作用の増幅カスケードが、リボザイム/リガーゼカスケード、環状核酸酵素カスケード、タンパク質酵素カスケード、もしくは支持体に取り付けられた一つまたは複数の酵素のうちの一つまたは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
基質の修飾が、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択される、請求項37〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも一つの追加の組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成することができる、少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することをさらに含み、
少なくとも一つの追加の基質がサンプル中に存在する場合、該追加のMNAzymeによってのみ該追加の基質を修飾することができ、該修飾が、追加の検出可能な作用をもたらす、請求項37〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも一つの追加の検出可能な作用が、独自に検出可能である、請求項76記載の方法。
【請求項６７】
各追加の基質のうちの少なくとも一つが、該追加の基質が追加のMNAzymeによって修飾されたときにその追加の基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分のうちの一方だけが支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けられる、請求項65または66記載の方法。
【請求項６８】
一つの追加の基質が、その基質がそのそれぞれのMNAzymeによって修飾されたときに検出可能な作用を生じさせるように、少なくとも一つの不溶性支持体に取り付けられる、請求項65〜67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも第二のオリゴヌクレオチド成分は、ターゲットが存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができ、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一方は、少なくとも一つのアプタマー部分をさらに含む）；
（b）少なくとも一つのターゲットを含有すると推定されるサンプルと該オリゴヌクレオチド成分を、
（1）該アプタマー部分への該ターゲットの結合、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（c）該MNAzymeの触媒活性の存在を判定すること
（該触媒活性の存在が、ターゲットの存在を示す）、
を含む、少なくとも一つのターゲットの存在を検出するための方法。
【請求項７０】
ターゲットを同定、検出または定量することができる、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも一つのターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができ、ならびに該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一方、または該少なくとも一つの組織化助長因子は、少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分を含み、該ターゲットは、該少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分に結合することができる）；
（b）該MNAzymeの自己組織化の少なくとも一つの阻害剤を提供すること；
（c）少なくとも一つのターゲットを含有すると推定されるサンプルと、該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子および該阻害剤を、
（1）該少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分への該ターゲットの結合、および
（2）該少なくとも一つのMNAzymeの触媒活性、および
（3）該触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害の解消
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該MNAzymeの触媒活性の存在を判定すること
（該触媒活性の存在が、ターゲットの存在を示す）；
を含む、少なくとも一つのターゲットの存在を検出するための方法。
【請求項７２】
アプタマーまたはその一部分が、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの誘導体もしくは組み合わせのうちの少なくとも一つから構成される、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
検出可能な作用をもたらすためにMNAzymeによって修飾することができる基質を提供することをさらに含む、請求項69〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
修飾が、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択される、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
基質が、組織化助長因子およびターゲットが不在の場合には、個々に第一または第二のオリゴヌクレオチド成分によって、または該第一または第二のオリゴヌクレオチド成分の両方によって修飾されない、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも第一の組織化助長因子および少なくとも第一のターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができる）；
（b）該第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾が、検出可能な作用をもたらす）；
（c）該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分または該少なくとも第一の組織化助長因子または該少なくとも第一の基質のうちの少なくとも一つが、アプタマーをさらに含む場合、および該ターゲットが、該アプタマーの少なくとも一部分に結合することができる場合、該ターゲットが不在の場合に該触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害することができる少なくとも第一の阻害剤を提供すること；
（d）ターゲットを含有すると推定されるサンプルと、該オリゴヌクレオチド成分、該組織化助長因子、該基質および該阻害剤を、
（1）該アプタマーへの該ターゲットの結合、および
（2）該触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害の解消、
（3）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（e）該検出可能な作用の存在を判定し、それによって、該ターゲットの存在を検出すること；
を含む、少なくとも一つのターゲットの存在を検出するための方法。
【請求項７７】
オリゴヌクレオチド成分または組織化助長因子のうちの少なくとも一つが、DNAまたはその類似体から構成される、請求項69〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
アプタマーまたはその一部分が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されるターゲットに結合する、請求項69〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、基質または阻害剤のうちの少なくとも一つが、不溶性支持体に取り付けられる、請求項69〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、アプタマーまたはアプタマー部分のうちの少なくとも一つが、阻害剤をさらに含む、請求項71〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
アプタマーまたはその一部分が、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の少なくとも一つまたはそれらの誘導体もしくは組み合わせからなる、請求項69〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つが、ヘアピン構造を形成することができる自己相補配列の一部分をさらに含む、請求項71〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
ヘアピン構造が、触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害する、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害が、アプタマーまたはアプタマー部分とターゲットの接触に基づいて解消される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
阻害剤が、アプタマーまたはその一部分を含む群の少なくとも一つに結合することができる、請求項71〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
阻害剤が、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項71〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
基質が、核酸またはタンパク質である、請求項73〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
核酸が、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
タンパク質が、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質のうちの少なくとも一つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項87記載の方法。
【請求項９０】
基質が、少なくとも一つのナノ粒子もしくはミクロ粒子またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項73〜89のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
検出可能な作用が、定量的または定性的に測定される、請求項73〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
検出可能な作用が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項73〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
基質が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が、増加または減少される、請求項73〜92のいずれか一項記載の方法。
【請求項９４】
修飾が、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択される、請求項73〜93のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも一つの追加の組織化助長因子および少なくとも一つの追加のターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成することができる、少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することをさらに含む方法であって、
少なくとも一つの追加の基質がサンプル中に存在する場合には、該追加の基質を該追加のMNAzymeによって修飾することができ、該修飾が、追加の検出可能な作用をもたらし；ならびに
該第三もしくは第四のオリゴヌクレオチド成分または該追加の組織化助長因子または該追加の基質のうちの少なくとも一つが、該少なくとも一つの追加のターゲットに結合する少なくとも一つの追加のアプタマーをさらに含み；
少なくとも一つの追加の阻害剤分子が、該追加のアプタマーの一部分に接触し、その結果、該追加のターゲットが不在の場合には該追加の触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害し；ならびに
該少なくとも一つの追加の組織化助長因子が、該追加のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一部分に接触する、
請求項71〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
少なくとも一つの追加の検出可能な作用が、独自に検出可能である、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
追加の基質の各々が、同じである、異なる、またはそれらの組み合わせである、請求項95または96記載の方法。
【請求項９８】
各追加の基質のうちの少なくとも一つが、該追加の基質が追加のMNAzymeによって修飾されたときに該追加の基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分のうちの一方だけが支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けられる、請求項95〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、核酸の配列変異体が存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）該第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも一つの基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾は、検出可能な作用をもたらす）；
（c）配列変異体を含有すると推定されるサンプルと、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）該触媒活性MNAzymeの自己組織化、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該検出可能な作用の存在を判定し、それによって、少なくとも一つの配列変異体の存在を検出すること、
を含む、少なくとも一つの核酸配列変異体の存在を検出するための方法。
【請求項１００】
配列変異体が、一塩基多型、多ヌクレオチド多型、挿入、欠失、重複、転座、フレームシフト配列変異体、ナンセンス配列変異体、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
配列変異体が、DNAまたはRNA中に存在する、請求項99または100記載の方法。
【請求項１０２】
第一のオリゴヌクレオチド成分と第二のオリゴヌクレオチド成分のいずれかまたは両方が、1つより多くの分子から構成される、請求項99〜101のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
配列変異体を含有するサンプルが、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化DNA、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化RNA、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化DNAの少なくとも一つのアンプリコン、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化RNAの少なくとも一つのアンプリコン、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項99〜102のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
多成分核酸酵素の自己組織化が、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のいずれかまたは両方の少なくとも一部分と、配列変異体を含む核酸との接触を必要とする、請求項99〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
配列変異体を含有する核酸を増幅する段階をさらに含む、請求項99〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
増幅段階が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
増幅中または後の核酸配列変異体の存在の判定をさらに含む、請求項105または106記載の方法。
【請求項１０８】
検出可能な作用が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項99〜107のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０９】
基質が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が、増加または減少される、請求項99〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
基質が、不溶性支持体に取り付けられているか、溶液中で遊離している、請求項99〜109のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
修飾が、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択される、請求項99〜110のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
（a）少なくとも一つの追加の核酸配列変異体が存在する場合に自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する、少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）該少なくとも一つの追加のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも一つの追加の基質が存在する状態で、少なくとも一つの追加の核酸配列変異体を含有すると推定されるサンプルと該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分とを接触させること（該少なくとも一つの追加の基質の修飾は、
（1）少なくとも一つのMNAzymeの自己組織化、および
（2）少なくとも一つのMNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で、少なくとも一つの追加の検出可能な作用をもたらす）；ならびに
（c）該少なくとも一つの追加の検出可能な作用を検出し、それによって、該少なくとも一つの追加の配列変異体の存在を検出すること、
をさらに含む、請求項99〜111のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１３】
少なくとも一つの追加の検出可能な作用が、独自に検出可能である、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
追加の基質の各々が、同じである、異なる、またはそれらの組み合わせである、請求項112または113記載の方法。
【請求項１１５】
各追加の基質のうちの少なくとも一つが、該追加の基質が追加のMNAzymeによって修飾されたときに該追加の基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分のうちの一方だけが支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けられる、請求項112〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
（a）核酸が存在する場合に自己組織化して少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができる、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分を含む、二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）該少なくとも第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質が存在する状態で、核酸を含有すると推定されるサンプルと該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分とを接触させること（該基質は、
（1）MNAzymeの自己組織化、および
（2）MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で該少なくとも第一のMNAzymeによる基質の修飾に基づいて少なくとも第一の検出可能な作用をもたらすことができる検出可能な部分を含む）
を含み、
（c）触媒活性の不在が、該核酸における配列変異体の存在を示す、
核酸の配列変異体の存在を検出するための方法。
【請求項１１７】
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、メチル化核酸が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）該MNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾が、少なくとも第一の検出可能な作用をもたらす）；
（c）メチル化核酸を含有すると推定されるサンプルと、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）触媒活性MNAzymeの自己組織化、および
（2）そのMNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該少なくとも一つの検出可能な作用の存在を判定し、それによって、少なくとも一つのメチル化核酸の存在を検出すること
を含む、少なくとも一つのメチル化核酸の存在を検出するための方法。
【請求項１１８】
条件が、非メチル化核酸とではなく、メチル化核酸とのMNAzymeのハイブリダイゼーションを助長する温度をさらに含む、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
検出可能な作用の増幅カスケードの使用による検出可能な作用の増幅をさらに含む、請求項117または118記載の方法。
【請求項１２０】
検出可能な作用の増幅カスケードが、リボザイム/リガーゼカスケード、環状核酸酵素カスケード、タンパク質酵素カスケード、もしくは支持体に取り付けられた一つまたは複数の酵素のうちの一つまたは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項119記載の方法。
【請求項１２１】
メチル化核酸の供給源が、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物の酸、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項117〜120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
メチル化核酸が、メチル化RNAまたはメチル化DNAを含む群から選択される、請求項117〜121のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
多成分核酸酵素の自己組織化が、メチル化核酸と、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の一方または両方との接触を必要とする、請求項117〜122のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
基質または第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一つあるいはそれらの組み合わせが取り付けられた不溶性支持体の提供をさらに含む、請求項117〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
検出可能な作用が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項117〜124のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２６】
基質が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が、増加または減少される、請求項117〜125のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２７】
修飾が、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合もしくはアミド結合の形成を含む群から選択される、請求項117〜126のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
少なくとも一つの追加のメチル化核酸が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成することができる、少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することさらに含み、および
少なくとも一つの追加の基質がサンプル中に存在する場合には、該追加の基質を追加のMNAzymeによって修飾することができ、該修飾が、追加の検出可能な作用をもたらす、請求項117〜127のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
少なくとも一つの追加の検出可能な作用が、独自に検出可能である、請求項128記載の方法。
【請求項１３０】
追加の基質の各々が、同じである、異なる、またはそれらの組み合わせである、請求項128または129記載の方法。
【請求項１３１】
追加の基質のうちの少なくとも一つが、該追加の基質が追加のMNAzymeによって修飾されたときに該追加の基質の追加の検出可能な部分および追加のクエンチャー部分のうちの一方だけが支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けられる、請求項128〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３２】
（a）少なくとも第一の組織化助長因子が存在する場合に自己組織化して少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも第二のオリゴヌクレオチド成分を含む、二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）少なくとも第一の基質が取り付けられている不溶性支持体を提供すること（該第一の基質は、該MNAzymeによって修飾することができ、該第一の基質は、少なくとも第三の分子を含み、該第三の分子は、該第一の基質が該第一MNAzymeによって修飾されると放出される少なくとも第一の触媒活性酵素を含む）；
（c）組織化助長因子を含有すると推定されるサンプルと、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、該第一の基質が取り付けられている不溶性支持体が存在する状態で、
（1）該MNAzymeの自己組織化、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）少なくとも第二の基質が取り付けられている不溶性支持体を提供すること（該第二の基質は、該第一の触媒活性酵素によって切断することができ、該第二の基質は、少なくとも第四の分子を含み、該第四の分子は、該第二の基質が該第一の酵素によって修飾されると放出される少なくとも検出可能な部分を含む）
を含み、
（e）該第一の触媒活性酵素が、多数の該第二の基質を修飾し、それによって多数の検出可能な部分を放出し；および
（f）該第一の触媒活性酵素による該第二の基質の修飾後、該検出可能な部分を検出することができ；および
（g）該検出可能な部分の検出が、組織化助長因子の存在を示す、
増幅カスケードを使用して少なくとも一つの組織化助長因子を検出するための方法。
【請求項１３３】
検出可能な部分が、第一の基質を修飾し、それによって追加の触媒活性酵素を放出することができる、追加の第二の触媒活性酵素をさらに含む、請求項132記載の方法。
【請求項１３４】
第一または第二の触媒活性酵素のうちの少なくとも一つが、MNAzyme、DNAzyme、リボザイム、加水分解酵素、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ヒドロラーゼ、リティカーゼ、ペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、エステラーゼ、カスパーゼ、カテプシン、デスルフヒドラーゼ、アミダーゼ、グルコシダーゼを含む群から選択される、請求項133記載の方法。
【請求項１３５】
組織化助長因子が、同定、検出または定量されるターゲットである、請求項132〜134のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３６】
（a）ターゲットが存在する場合に自己組織化して第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する、第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）第一および第二の基質が取り付けられている不溶性支持体を提供すること（該第一および第二の基質を該第一MNAzymeによって修飾することができ、該第一および第二基質は、第二の触媒活性MNAzymeを形成することができる少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分をそれぞれ含み、該第三および第四のオリゴヌクレオチド成分は、該第一および第二の基質が該第一MNAzymeによって修飾されると放出される）；
（c）第三および第四の基質が取り付けられている該不溶性支持体を提供すること（該第三および第四の基質を該第二MNAzymeによって修飾することができ、該第三および第四の基質は、第三の触媒活性MNAzymeを形成することができる少なくとも第五および第六のオリゴヌクレオチド成分をそれぞれ含み、該第五および第六のオリゴヌクレオチド成分は、該第三および第四の基質が該第二MNAzymeによって修飾されると放出される）；および
（d）該第二および該第三MNAzymeの組織化を助長することができる組織化助長因子を提供すること；および
（e）検出可能な作用をもたらすように該第二MNAzymeによって修飾することができる第五の基質を提供すること； 
（f）ターゲットを含有すると推定されるサンプルと該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分とを、該組織化助長因子が存在する状態で、および該第一、第二、第三および第四の基質が取り付けられている該不溶性支持体が存在する状態で、
（1）該第一、第二および第三MNAzymeの自己組織化、および
（2）該第一、第二および第三MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；
を含み、
（g）該第三のMNAzymeが、該第一および第二の基質を修飾し、それによって該第二のMNAzymeをさらに提供し、該第二MNAzymeが、該第三、第四および第五の基質のうちの少なくとも一つをさらに修飾し、それによって該第三のMNAzymeをさらに提供し、それによって該検出可能な作用をさらにもたらし；ならびに
（h）該検出可能な作用の検出が、そのターゲットの存在を示す、
MNAzyme媒介シグナル増幅カスケードを使用してターゲットを検出するための方法。
【請求項１３７】
ターゲットを同定、検出または定量することができる、請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
第五の基質が、第一、第二、第三または第四の基質のうちのいずれか一つと同じである、または異なる、請求項136または137記載の方法。
【請求項１３９】
ターゲットが、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択される、請求項132〜138のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４０】
核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項139記載の方法。
【請求項１４１】
第一、第二、第三または第四の基質の各々が、同じ固体支持体上に存在する、もしくは異なる固体支持体上に存在する、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項136〜140のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４２】
第一、第二、第三または第四の基質の少なくとも一つについての修飾が、検出可能な作用をさらにもたらす、請求項136〜141のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４３】
（a）同定、検出または定量すべき多数の組織化助長因子を提供すること；
（b）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を設計すること（
少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成し、
該少なくとも第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；
自己組織化すると、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分が、該MNAzymeのセンサーアームを形成し、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分が、該MNAzymeの基質アームを形成し、ならびに該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、該MNAzymeの触媒コアを形成し；
該MNAzymeのセンサーアームが組織化助長因子と相互作用して、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分を、それらのそれぞれの触媒コア部分が会合してMNAzymeの触媒コアを形成（該触媒コアは、少なくとも一つの基質を作用することができる）するように、近接した状態で維持し；ならびに
該MNAzymeの基質アームが、該MNAzymeの触媒コアが基質を修飾することができるように、基質に係合する）；
（c）該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分および触媒コア部分は不変であり、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一方のセンサーアーム部分は別の多数の組織化助長因子を認識することに適するように、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を改変すること；ならびに
（d）それらの多数の組織化助長因子の各々について該改変段階を繰り返すこと；
を含む、各々が少なくとも一つの組織化助長因子を認識し、基質を修飾する、多数の多成分核酸酵素（MNAzyme）を製造するための方法。
【請求項１４４】
多数のターゲットの少なくとも一つに各々が対応する多数のMNAzymeを組織化するように設計された多数のオリゴヌクレオチド成分と少なくとも一つの基質とを含む、多数のターゲットの存在を検出するためのキット。
【請求項１４５】
多数の組織化助長因子と、多数の組織化助長因子の各々に各々が対応する多数のMNAzymeを組織化するように設計された多数のオリゴヌクレオチド成分と、少なくとも一つの基質とを含む、多数のMNAzymeを組織化するためのキット。
【請求項１４６】
ターゲットに対応するMNAzymeを組織化するように設計された多数のオリゴヌクレオチド成分と基質とを含む、ターゲットを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、多成分触媒核酸およびそれらの使用方法に関する。さらに詳細には、本発明は、自己組織化性（self-assembling）多成分核酸酵素を含む組成物、そのような組成物の製造方法、およびそのような組成物の使用方法に関し、該使用としては、該多成分核酸酵素による基質の触媒的修飾を検出することによるターゲット、例えば組織化助長因子（assembly facilitators）および他の単位の検出、同定および/または定量が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年10月13日出願の米国特許仮出願第60/726,291号および2005年10月7日出願の米国特許仮出願第60/724,567号、それぞれの恩典を主張し、該仮出願は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の背景
特許、公開出願、技術論文および学術論文を含み得る様々な出版物が、本明細書内のいたるところで括弧に入れて引用されており、各々の書誌情報は、本明細書の最後に見つけることができる。これらの各引用出版物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００４】
核酸分子は、酵素活性または触媒活性を付与することができる二次構造配置をとることができる。インビトロ発生技術は、核酸の切断（Carmi et al., 1996; Raillard and Joyce, .1996; Breaker, 1997; Santoro and Joyce, 1998）、核酸のライゲーション（Cuenoud and Szostak, 1995）、ポルフィリンメタレーション（Li and Sen, 1996）、および炭素-炭素結合（Tarasow et al., 1997）、エステル結合（Illangasekare et al., 1995）またはアミド結合（Lohse and Szostak, 1996）の形成を含む広範な反応を触媒することができる、多くの場合、「DNAzyme」または「リボザイム」と呼ばれるそのような触媒核酸の発見および開発を助長した。
【０００５】
詳細には、ワトソン・クリック塩基対合によるハイブリダイゼーション後に異なる核酸配列を特異的に切断するDNAzymeおよびリボザイムが、特性付けされている。DNAzymeは、RNA（Breaker and Joyce, 1994; Santoro and Joyce, 1997）またはDNA（Carmi et a.l, 1996）分子のいずれかを切断することができる。触媒RNA分子（リボザイム）も、RNA（Haseloff and Gerlach, 1988）配列とDNA (Raillard and Joyce, 1996）配列の両方を切断することができる。大部分の核酸酵素の触媒的切断の速度は、二価金属イオン、例えば、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、およびPb2+の存在および濃度に依存する（Santoro and Joyce, 1998; Brown et al., 2003）。
【０００６】
触媒核酸、例えばハンマーヘッド型リボザイムならびに10：23および8：17 DNAzymeは、多数のドメインを有する。それらは、基質に特異的に結合する配列の領域である二つの非保存基質結合ドメイン（「ハイブリダイジングアーム」）に隣接する、保存触媒ドメイン（触媒コア）を有する。HaseloffおよびGerlachは、ハンマーヘッド型リボザイムを設計作製し、これは、二つの保存ドメインを一緒にして触媒コアを形成するそのステムループ構造のため、そう名づけられた（Haseloff and Gerlach, 1988）。「10：23」および「8：17」DNAzymeは、特定のRNAホスホジエステル結合で核酸基質を切断することができる（Santoro and Joyce, 1997）。10：23 DNAzymeは、二つの基質認識アームに隣接する15デオキシヌクレオチドの触媒ドメインを有する。8：17 DNAzymeは、同様に二つの基質認識アームに隣接する14デオキシヌクレオチドの触媒ドメインを有する。
【０００７】
触媒核酸は、最低限の要件を満たすターゲット配列を有する核酸基質を切断することができる。この基質配列は、その触媒核酸のハイブリダイジングアームに実質的に相補的でなければならず、ならびにその基質は、切断部位に特定の配列を含有しなければならない。その切断部位における特定の配列の要件としては、例えば、10：23 DNAzymeによる切断についてのプリン：ピリミジンリボヌクレオチド配列（Santoro and Joyce, 1997）およびハンマーヘッド型リボザイムについての配列ウリジン：X（Perriman et al., 1992）が含まれ、Xは、A、CまたはUに等しいが、Gには等しくない。
【０００８】
触媒核酸は、触媒コアを形成する領域内でのみ一定の修飾を許容することが証明された（Perreault et al., 1990; Perreault et al., 1991; Zaborowska et al., 2002; Cruz et al., 2004; Silverman, 2004）。DNAzymeの触媒活性の原因となる配列の例を表1に列挙する。
【０００９】
(表1) 幾つかの活性DNAzymeおよびそれらの基質についての例示的配列
2009509551.tif 000002
【００１０】
公知リボザイムにおける一定のリボヌクレオチドの一定のデオキシリボヌクレオチドでの置換が、一定の条件下で試みられた（McCall et al., 1992）。DNAに完全に変換されたリボザイムは、RNAとDNAの配座の違いのため活性を有さない（Perreault et al., 1990）。これらの研究は、デオキシリボヌクレオチドでのリボヌクレオチドの単なる置換によってRNA酵素を役立つDNA酵素に変えることはできないことを明示している。
【００１１】
治療用途のための一定のホモ二量体またはヘテロ二量体リボザイムの開発を試みた幾つかの研究がある（Kuwabara et al., 1999; Kuwabara et al., 2000; Oshima et al., 2003）。これらの研究におけるリボザイムの触媒コアは、リボヌクレオチドのみを含むものであった。さらに、DNAzymeが二量体または多量体形式で機能する能力は考究されておらず、二量体リボザイムから二量体DNAzymeを可能な二量体DNAzyme構造および結果として生じる活性に関して推定する方法についての情報も、一切与えられていない。
【００１２】
触媒核酸は、検出可能なシグナルを生じさせる、従って、増幅された核酸ターゲット配列の実時間モニタリングを可能にする手段として、インビトロ増幅プロトコルと併用されている（Todd et al., 2000）（米国特許第6,140,055号；同第6,201,113号；WO 99/45146；PCT/IB99/00848；WO 99/50452）。当技術分野においてDzyNA検出（Todd et al., 2000）としても知られている、チモーゲン検出（米国特許第6,140,055号；同第6,201,113号；WO 99/45146；PCT/IB99/00848；WO 99/50452）は、ターゲットとシグナルの同時増幅を生じさせる。これは、触媒DNAzymeまたはリボザイムがターゲット配列と共に共増幅して、多数のターンオーバーが可能な真の酵素として機能するアンプリコンを生じさせるため、発生する。従って、各触媒核酸アンプリコンが多数のレポーター基質を切断する。DNAzymeおよびリボザイムは、触媒核酸の不活性アンチセンス配列である、5’タグを有するプライマーを使用することにより、アンプリコンに導入される。これらの配列が、インビトロ増幅中にコピーされると、それらの触媒活性センス配列が、ターゲット配列と共に共増幅される。このチモーゲン/DzyNAアプローチは、非常に融通がきく。DNAzymeアンプリコンを生じさせるPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、鎖置換増幅（「SDA」）またはローリングサークル増幅（RCA）；およびリボザイムアンプリコンを生じさせる核酸配列に基づく増幅（NASBA）、自己支持配列複製（3SR）または転写媒介増幅（TMA）増幅法を含むターゲット増幅法に触媒的シグナル増幅を結びつけることができるからである。さらに、広範な触媒活性を有する非常に多数の触媒核酸分子が、発見または開発されたので、このチモーゲンアプローチは、そのアッセイの読み取りが核酸基質の切断以外の化学的修飾に依存する場合には、核酸以外のレポーター基質を使用することもある。チモーゲン/DzyNA（Todd et al., 2000）またはNASBA/リボザイム（WO 00/58505）アプローチは、高感度であり有用であると考えてよいが、プライマー配列の増幅のためにノイズの可能性がある。
【００１３】
NASBAを使用して、ターゲット核酸とハンマーヘッド型リボザイムの触媒コアの一セクション（GAArA）とを含有するRNAアンプリコンが生成され、プライマーにタグ付けされたアンチセンス配列として導入され、その後、複製された（WO 00/58505）。蛍光体およびクエンチャーで標識されおり、レポーター基質としての役割も果す第二の分子を用いて、触媒活性に必要な追加の配列（CUrGANrGrA）がセンス配列として導入された。一定のリボヌクレオチド塩基（上記rN）は、リボヌクレオチドとして残らなければならず、すなわち触媒性リボザイム活性は喪失される。すべてがDNAからなる二つの分子は、触媒活性へテロ二量体酵素を形成することができないと考えられた（WO 00/58505）。
【００１４】
触媒核酸は、一塩基多型（「SNP」）の検出にも利用されている。触媒核酸結合アームと基質の間のワトソン・クリック塩基対合のための厳格な要件が、密接に関連した短い配列を識別することができる方法の開発を可能にした。DNAzymeおよびリボザイムは、たった一つの塩基ほどの小さな二配列間の相違を識別することが明らかになった（Cairns et al., 2000）（WO 99/50452）。
【００１５】
DNAzymeは、一定のインビトロ用途のリボザイムに勝る利点を提供する特性を有する。DNAは、RNAより本質的に安定であり、従って、より丈夫であり、より長い貯蔵寿命を有する。DNAは、溶解または凍結乾燥形態のいずれかで、室温で長期間保管することができる。DNAzymeも、例えば、増幅中の高温への暴露により不可逆的に変性しないため、一定の用途では大多数のタンパク質酵素より好適である。
【００１６】
このようにして、DNAzymeおよび/またはリボザイムに基づく触媒核酸を好ましくは提供する、核酸配列および他の単位を検出、同定および定量するための単純で迅速で原価効率のよい方法が、当技術分野において必要とされ続けている。
【発明の開示】
【００１７】
発明の概要
本発明の第一の局面に従って、少なくとも二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を含む組成物を提供し、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、MNAzyme組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成し、
該少なくとも第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；
自己組織化すると、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分は、MNAzymeのセンサーアームとして動作し、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分は、MNAzymeの基質アームとして動作し、ならびに該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分は、MNAzymeの触媒コアとして動作し；
該MNAzymeのセンサーアームは、該MNAzyme組織化助長因子と相互作用して、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分を、それらのそれぞれの触媒コア部分が会合してMNAzymeの触媒コア（該触媒コアは、少なくとも一つの基質を修飾することができる）を形成するように、近接した状態で維持し；ならびに
該MNAzymeの基質アームは、該MNAzymeの触媒コアが基質を修飾することができるように、基質に係合する。
【００１８】
該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つは、DNAまたはその類似体を含むことがある。
【００１９】
該組織化助長因子は、同定、検出または定量されるターゲットであり得る。該ターゲットは、核酸を含むことがある。該核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。該リボソームRNAは、16SリボソームRNAであってもよい。
【００２０】
該核酸の供給源は、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【００２１】
該核酸を増幅することができる。この増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む場合がある。
【００２２】
該組成物は、該基質アーム部分またはセンサーアーム部分のうちの少なくとも一つを安定させるように作用する少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分をさらに含むことがある。
【００２３】
該組織化助長因子、該オリゴヌクレオチド成分もしくは基質のうちの少なくとも一つまたはそれらの組み合わせは、1つより多くの分子からなる場合がある。
【００２４】
該第一のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分は、配列番号：149〜153、155〜157、159および161を含む群から選択することができ、ならびに該第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分は、配列番号：166〜170および172を含む群から選択することができる。
【００２５】
該組成物は、該MNAzymeの自己組織化の少なくとも一つの阻害剤をさらに含む場合がある。
【００２６】
該オリゴヌクレオチド成分もしくは組織化助長因子もしくは基質のうちの少なくとも一つまたはそれらの組み合わせは、少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分をさらに含むことがある。該アプタマーまたはその一部分は、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの誘導体もしくは組み合わせのうちの少なくとも一つからなり得る。
【００２７】
該組成物は、該MNAzymeの自己組織化の少なくとも一つの阻害剤をさらに含む場合がある。
【００２８】
該第一もしくは該第二のオリゴヌクレオチド成分または該組織化助長因子または該基質のうちの少なくとも一つは、ヘアピン構造を形成することができる自己相補配列の少なくとも一部分をさらに含む場合がある。該ヘアピン構造は、該MNAzymeの自己組織化を阻害することができる。該自己組織化の阻害は、ターゲットとアプタマーの接触により解消することができる。該アプタマーまたはその一部分は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されるターゲットに結合することができる。
【００２９】
該基質は、核酸またはタンパク質を含むことがある。該核酸は、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該タンパク質は、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該基質は、少なくとも一つのナノ粒子もしくはミクロ粒子またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。該基質は、不溶性支持体に取り付けられている場合もあり、または溶液中で遊離している場合もある。該基質は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含むことがあり、該MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が増加または減少される。
【００３０】
該基質アームは、相補的塩基対合によって該基質に係合することができる。
【００３１】
該MNAzymeによる基質の修飾は、検出可能な作用をもたらすことができる。この基質の修飾は、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合もしくはアミド結合の形成、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。該検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。該検出可能な作用を測定することができ、その測定の大きさが、ターゲットの量を示す。
【００３２】
該オリゴヌクレオチド成分、該組織化助長因子または該基質のうちの少なくとも一つは、DNA、RNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。該組織化助長因子および該基質は、該第一または第二のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一部に完全に相補的または部分的に相補的である核酸を含むことができる。該オリゴヌクレオチド成分、該組織化助長因子または該基質のうちの少なくとも一つは、4-アセチルシチジン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、βD-ガラクトシルケオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-（（9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル）カルバモイル）トレオニン、N-（（9-β-リボフラノシルプリン-6-イル）N-メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-（（9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル）カルバモイル）トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウリジン、βD-アラビノシルウリジン、βD-アラビノシルチミジンを含む群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド置換または付加を含む場合がある。
【００３３】
該組成物は、少なくとも一つの追加の組織化助長因子が存在する場合に自己組織化して少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成する、少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分および第四オリゴヌクレオチド成分をさらに含むことがあり、
該少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分の各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；
少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分および第四のオリゴヌクレオチド成分が自己組織化すると、該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分は、該少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeのセンサーアームを形成し、該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分は、該少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeの基質アームを形成し、ならびに該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分は、該少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeの触媒コアを形成し；ならびに
該少なくとも一つの追加のMNAzymeのセンサーアームは、該少なくとも一つの追加の組織化助長因子と相互作用して、該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分を、それらそれぞれの触媒コア部分が会合して少なくとも一つの追加のMNAzymeの触媒コア（該触媒コアは、少なくとも一つの追加の基質に対して作用することができる）を形成するように、近接した状態で維持し；ならびに
該少なくとも一つの追加のMNAzymeの基質アームは、該少なくとも一つの追加のMNAzymeの触媒コアが少なくとも一つの追加の基質に対して作用することができるように、少なくとも一つの追加の基質に係合する。
【００３４】
各々のそれら追加の基質は、同じである場合もあり、異なる場合もあり、またはそれらの組み合わせである場合もある。
【００３５】
本発明の第二の局面に従って、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）組織化助長因子を含有すると推定されるサンプルと該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）少なくとも一つの触媒活性MNAzymeの自己組織化、および
（2）MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（c）その少なくとも一つのMNAzymeの触媒活性の存在を判定すること
を含み、その触媒活性の存在が、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を示す。
【００３６】
該オリゴヌクレオチド成分または組織化助長因子のうちの少なくとも一つは、DNAまたはその類似体からなり得る。
【００３７】
該組織化助長因子は、同定、検出または定量されるターゲットであり得る。該ターゲットは、核酸を含むことがある。該核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、その誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。該リボソームRNAは、16SリボソームRNAであってもよい。
【００３８】
該核酸の供給源は、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【００３９】
該方法は、該組織化助長因子を増幅する段階をさらに含む場合がある。該増幅段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む場合がある。
【００４０】
該組織化助長因子、該オリゴヌクレオチド成分もしくは基質のうちの少なくとも一つまたはそれらの組み合わせは、1つより多くの分子からなる場合がある。
【００４１】
該方法は、該増幅中または後に該触媒活性の存在の判定をさらに含む場合がある。
【００４２】
該MNAzymeの自己組織化は、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の一方または両方と該組織化助長因子の接触を必要し得る。
【００４３】
該方法は、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のいずれかまたは両方の少なくとも一部分に接触してMNAzymeを自己組織化する少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分をさらに含む場合がある。該第三のオリゴヌクレオチド成分は、1つより多くの分子からなる場合がある。
【００４４】
本発明の第三の局面に従って、少なくとも一つの組織化助長因子の存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも第一の組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）該第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾が、検出可能な作用をもたらす）；
（c）該少なくとも第一の組織化助長因子を含有すると推定されるサンプルと該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）該少なくとも第一のMNAzymeの自己組織化、および
（2）該少なくとも第一のMNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該検出可能な作用を検出すること
を含む。
【００４５】
該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つは、DNAまたはその類似体からなり得る。
【００４６】
該組織化助長因子は、同定、検出または定量されるターゲットであり得る。該ターゲットは、核酸を含むことがある。該核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、その誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。該リボソームRNAは、16SリボソームRNAであってもよい。
【００４７】
該核酸の供給源は、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【００４８】
該方法は、該核酸を増幅する段階をさらに含む場合がある。この増幅段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む場合がある。
【００４９】
該組織化助長因子または該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分または基質のうちの少なくとも一つあるいはそれらの組み合わせは、1つより多くの分子からなる場合がある。
【００５０】
該方法は、該増幅中または後に該検出可能な作用を検出することをさらに含む場合がある。該検出可能な作用は、該組織化助長因子の存在を示すことができる。該検出可能な作用は、定量的または定性的に測定することができる。
【００５１】
該基質は、核酸である場合もあり、またはタンパク質である場合もある。該核酸は、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該タンパク質は、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質のうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含む。該基質は、ナノ粒子もしくはミクロ粒子のうちの少なくとも一方またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。該基質は、不溶性支持体に取り付けられている場合もあり、または溶液中で遊離している場合もある。
【００５２】
該基質は、核酸を含む場合があり、該基質アームは、相補的塩基対合によって該基質に係合することができる。
【００５３】
該基質は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含むことがあり、該MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が増加または減少される。該検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。
【００５４】
該方法は、検出可能な作用の増幅カスケードの使用による検出可能な作用の増幅をさらに含む場合がある。該検出可能な作用の増幅カスケードは、リボザイム/リガーゼカスケード、環状核酸酵素カスケード、タンパク質酵素カスケード、もしくは支持体に取り付けられた一つまたは複数の酵素のうちの一つまたは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００５５】
該基質の修飾は、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択することができる。
【００５６】
該方法は、少なくとも一つの追加の組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成ことができる少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することをさらに含む場合があり、および
少なくとも一つの追加の基質がサンプル中に存在する場合には、該追加の基質を該追加のMNAzymeによって修飾することができ、該修飾が、該追加の検出可能な作用をもたらす。
【００５７】
該少なくとも一つの追加の検出可能な作用は、独自に検出することができる。
【００５８】
各追加の基質のうちの少なくとも一つを、該追加の基質が該追加のMNAzymeによって修飾されたときにその追加の基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分のうちの一方だけがその支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けることができる。
【００５９】
一つの追加の基質を、その基質がそのそれぞれのMNAzymeによって修飾されたときに検出可能な作用を生じさせるように、少なくとも一つの不溶性支持体に取り付けることができる。
【００６０】
本発明の第四の局面に従って、少なくとも一つのターゲットの存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも第二のオリゴヌクレオチド成分は、ターゲットが存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができ、該第一および該第二のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一方は、少なくとも一つのアプタマー部分をさらに含む）；
（b）該少なくとも一つのターゲットを含有すると推定されるサンプルと該オリゴヌクレオチド成分を、
（1）該アプタマー部分への該ターゲットの結合、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（c）該MNAzymeの触媒活性の存在を検出すること
（該触媒活性の存在が、該ターゲットの存在を示す）、
を含む。
【００６１】
該オリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一つを固体支持体に取り付けることができる。
【００６２】
該オリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一つは、DNAまたはその類似体からなる場合がある。
【００６３】
該ターゲットを同定、検出または定量することができる。
【００６４】
該方法は、少なくとも一つの追加のターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成することができる、少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することをさらに含む場合があり、
該第三または第四のオリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一方は、該少なくとも一つの追加のターゲットに結合する少なくとも一つの追加のアプタマー部分を含む。
【００６５】
本発明の第五の局面に従って、少なくとも一つのターゲットの存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも一つの組織化助長因子および少なくとも一つのターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができ、ならびに該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一方、または該少なくとも一つの組織化助長因子は、少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分を含み、該ターゲットは、該少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分に結合することができる）；
（b）該MNAzymeの自己組織化の少なくとも一つの阻害剤を提供すること；
（c）該少なくとも一つのターゲットを含有すると推定されるサンプルと、該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子および該阻害剤を、
（1）該少なくとも一つのアプタマーまたはその一部分への該ターゲットの結合、および
（2）該少なくとも一つのMNAzymeの触媒活性、および
（3）該触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害の解消
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該MNAzymeの触媒活性の存在を判定すること
（該触媒活性の存在が、該ターゲットの存在を示す）；
を含む。
【００６６】
該少なくとも一つのターゲットは、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択することができる。
【００６７】
該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または阻害剤のうちの少なくとも一つを不溶性支持体に取り付けることができる。
【００６８】
該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、アプタマーまたはアプタマー部分のうちの少なくとも一つは、該阻害剤をさらに含むことができる。
【００６９】
該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分または組織化助長因子のうちの少なくとも一つは、ヘアピン構造を形成することができる自己相補配列の一部分をさらに含む場合がある。該ヘアピン構造は、該触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害することができる。
【００７０】
該アプタマーまたはその一部分は、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの誘導体もしくは組み合わせのうちの少なくとも一つからなり得る。
【００７１】
該触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害は、該アプタマーまたはアプタマー部分とターゲットを接触させることにより解消することができる。
【００７２】
該阻害剤は、該アプタマーまたはその一部分を含む群の少なくとも一つに結合可能な場合もある。
【００７３】
該阻害剤は、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
【００７４】
該方法は、検出可能な作用をもたらすために該MNAzymeによって修飾することができる基質を提供することをさらに含む場合がある。該修飾は、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択することができる。該組織化助長因子および該ターゲットが不在の場合には、個々に該第一または第二のオリゴヌクレオチド成分によって、または該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の両方によって該基質を修飾することができない。
【００７５】
該基質は、核酸またはタンパク質を含むことがある。該核酸は、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含む。該タンパク質は、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質のうちの少なくとも一つ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００７６】
該基質は、少なくとも一つのナノ粒子もしくはミクロ粒子またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００７７】
該検出可能な作用の検出は、該触媒活性MNAzymeの触媒活性を示すことができ、該触媒活性は、該ターゲットを示す。該検出可能な作用は、定量的または定性的に測定することができる。該検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。
【００７８】
該基質は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含むことがあり、該MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が増加または減少される。
【００７９】
本発明の第六の局面に従って、少なくとも一つのターゲットの存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、少なくとも第一の組織化助長因子および少なくとも第一のターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができる）；
（b）該少なくとも第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾が、検出可能な作用をもたらす）；
（c）該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分または該少なくとも第一の組織化助長因子または該少なくとも第一の基質のうちの少なくとも一つが、アプタマーをさらに含む場合、および該ターゲットが、該アプタマーの少なくとも一部分に結合することができる場合、該ターゲットが不在の場合に該触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害することができる少なくとも第一の阻害剤を提供すること；
（d）該ターゲットを含有すると推定されるサンプルと、該オリゴヌクレオチド成分、該組織化助長因子、該基質および該阻害剤を、
（1）該アプタマーへの該ターゲットの結合、および
（2）該触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害の解消、
（3）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（e）該検出可能な作用の存在を判定し、それによって、該ターゲットの存在を検出すること；
を含む。
【００８０】
該オリゴヌクレオチド成分または組織化助長因子のうちの少なくとも一つは、DNAまたはその類似体からなり得る。
【００８１】
該アプタマーまたはその一部分は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されるターゲットに結合することができる。
【００８２】
該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、基質または阻害剤のうちの少なくとも一つを不溶性支持体に取り付けることができる。
【００８３】
該オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子、アプタマーまたはアプタマー部分のうちの少なくとも一つは、該阻害剤をさらに含むことができる。
【００８４】
該アプタマーまたはその一部分は、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの誘導体もしくは組み合わせからなり得る。
【００８５】
該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つは、ヘアピン構造を形成することができる自己相補配列の一部分をさらに含む場合がある。該ヘアピン構造は、該触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害することができる。該触媒活性MNAzymeの自己組織化の阻害は、該アプタマーまたはアプタマー部分とターゲットを接触させることにより解消することができる。
【００８６】
該阻害剤は、該アプタマーまたはその一部分を含む群の少なくとも一つに結合可能な場合もある。該阻害剤は、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
【００８７】
該基質は、核酸またはタンパク質を含むことができる。該核酸は、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラのうちの少なくとも一つまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該タンパク質は、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質のうちの少なくとも一つ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００８８】
該基質は、少なくとも一つのナノ粒子もしくはミクロ粒子またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００８９】
該検出可能な作用の検出は、該ターゲットの存在を検出することができる。該検出可能な作用は、定量的または定性的に測定することができる。該検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。
【００９０】
該基質は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含むことがあり、該MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が増加または減少される。該修飾は、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択することができる。
【００９１】
該方法は、少なくとも一つの追加の組織化助長因子および少なくとも一つの追加のターゲットが存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成することができる、少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することをさらに含み得、
少なくとも一つの追加の基質がサンプル中に存在する場合、該追加の基質を該追加のMNAzymeによって修飾することができ、該修飾が、追加の検出可能な作用をもたらし；
該第三もしくは第四のオリゴヌクレオチド成分または該追加の組織化助長因子または該追加の基質のうちの少なくとも一つは、該少なくとも一つの追加のターゲットに結合する少なくとも一つの追加のアプタマーをさらに含み；
少なくとも一つの追加の阻害剤分子が、該追加のアプタマーの一部分に接触し、それによって、該追加のターゲットの不在下では該追加の触媒活性MNAzymeの自己組織化を阻害し；ならびに
該少なくとも一つの追加の組織化助長因子は、該追加のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一部分に接触する。
【００９２】
該少なくとも一つの追加の検出可能な作用は、独自に検出することができる。
【００９３】
各々の追加の基質は、同じである場合もあり、異なる場合もあり、またはそれらの組み合わせである場合もある。
【００９４】
各追加の基質のうちの少なくとも一つを、該追加の基質が該追加のMNAzymeによって修飾されたときに該追加の基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分のうちの一方だけがその支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けることができる。
【００９５】
本発明の第七の局面に従って、少なくとも一つの核酸配列変異体の存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、核酸の配列変異体が存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）該第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも一つの基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾は、検出可能な作用をもたらす）；
（c）該配列変異体を含有すると推定されるサンプルと、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）該触媒活性MNAzymeの自己組織化、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該検出可能な作用の存在を判定し、それによって、該少なくとも一つの配列変異体の存在を検出すること、
を含む。
【００９６】
該配列変異体は、一塩基多型、多ヌクレオチド多型、挿入、欠失、重複、転座、フレームシフト配列変異体、ナンセンス配列変異体、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。該配列変異体は、DNAまたはRNA中に存在する場合がある。
【００９７】
該第一のオリゴヌクレオチド成分と該第二のオリゴヌクレオチド成分のいずれかまたは両方が、1つより多くの分子からなる場合もある。
【００９８】
該配列変異体を含有するサンプルは、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化DNA、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化RNA、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化DNAの少なくとも一つのアンプリコン、亜硫酸水素塩修飾メチル化もしくは非メチル化RNAの少なくとも一つのアンプリコン、またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
【００９９】
該多成分核酸酵素の自己組織化は、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のいずれかまたは両方の少なくとも一部分と、該配列変異体を含む核酸との接触を必要とする場合がある。
【０１００】
該方法は、該配列変異体を含有する核酸を増幅する段階をさらに含む場合がある。該増幅段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含む場合がある。該方法は、該増幅中または後に該核酸配列の存在の判定をさらに含む場合がある。
【０１０１】
該検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。
【０１０２】
該基質は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含むことがあり、該MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が増加または減少される。
【０１０３】
該基質は、不溶性支持体に取り付けられている場合もあり、または溶液中で遊離している場合もある。
【０１０４】
該修飾は、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を含む群から選択することができる。
【０１０５】
該方法は、
（a）少なくとも一つの追加の核酸配列変異体が存在する場合に自己組織化して少なくとも一つの追加の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する、少なくとも第三のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）該少なくとも一つの追加のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも一つの追加の基質が存在する状態で、少なくとも一つの追加の核酸配列変異体を含有すると推定されるサンプルと該少なくとも第三および少なくとも第四のオリゴヌクレオチド成分とを接触させること（該少なくとも一つの追加の基質の修飾は、
（1）少なくとも一つのMNAzymeの自己組織化、および
（2）少なくとも一つのMNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で、少なくとも一つの追加の検出可能な作用をもたらす）；ならびに
（c）該少なくとも一つの追加の検出可能な作用を検出し、それによって、該少なくとも一つの追加の配列変異体の存在を検出すること、
をさらに含む場合がある。
【０１０６】
該少なくとも一つの追加の検出可能な作用は、独自に検出することができる。
【０１０７】
各々の追加の基質は、同じである場合もあり、異なる場合もあり、またはそれらの組み合わせである場合もある。
【０１０８】
該方法は、該基質が取り付けられた不溶性支持体の提供をさらに含む場合がある。
【０１０９】
各追加の基質のうちの少なくとも一つを、該追加の基質が該追加のMNAzymeによって修飾されたときに該追加の基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分のうちの一方だけがその支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けることができる。
【０１１０】
本発明の第八の局面に従って、核酸の配列変異体の存在を検出するための方法を提供し、
（a）核酸が存在する場合に自己組織化して少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成することができる少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分を含む、二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）該少なくとも第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質が存在する状態で、核酸を含有すると推定されるサンプルと、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を接触させること（該基質は、
（1）MNAzymeの自己組織化、および
（2）MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で該少なくとも第一のMNAzymeによる基質の修飾に基づいて少なくとも第一の検出可能な作用をもたらすことができる検出可能な部分を含む）
を含み、
（c）触媒活性の不在が、該核酸における配列変異体の存在を示す。
【０１１１】
本発明の第九の局面に従って、少なくとも一つのメチル化核酸の存在を検出するための方法を提供し、
（a）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、メチル化核酸が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する）；
（b）該第一のMNAzymeによって修飾することができる少なくとも第一の基質を提供すること（該MNAzymeによる該基質の修飾が、少なくとも第一の検出可能な作用をもたらす）；
（c）メチル化核酸を含有すると推定されるサンプルと、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、
（1）触媒活性MNAzymeの自己組織化、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）該少なくとも一つの検出可能な作用の存在を判定し、それによって、少なくとも一つのメチル化核酸の存在を検出すること
を含む。
【０１１２】
該条件は、非メチル化核酸とではなく、該メチル化核酸との該MNAzymeのハイブリダイゼーションを助長する温度をさらに含む場合がある。
【０１１３】
該方法は、検出可能な作用の増幅カスケードの使用による検出可能な作用の増幅をさらに含む場合がある。該検出可能な作用の増幅カスケードは、リボザイム/リガーゼカスケード、環状核酸酵素カスケード、タンパク質酵素カスケード、もしくは支持体に取り付けられた一つまたは複数の酵素のうちの一つまたは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１１４】
該メチル化核酸の供給源は、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物の酸、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【０１１５】
該メチル化核酸は、メチル化RNAまたはメチル化DNAを含む群から選択することができる。
【０１１６】
該多成分核酸酵素の自己組織化は、該メチル化核酸と、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の一方または両方との接触を必要とする場合がある。
【０１１７】
該方法は、該基質または該第一もしくは第二のオリゴヌクレオチド成分のうちの少なくとも一つ、あるいはそれらの組み合わせが取り付けられた不溶性支持体の提供をさらに含む場合がある。
【０１１８】
該検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。
【０１１９】
該基質は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含むことがあり、該MNAzymeによる該基質の修飾に基づいて、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な作用が増加または減少される。
【０１２０】
該修飾は、切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合もしくはアミド結合の形成を含む群から選択することができる。
【０１２１】
該方法は、少なくとも一つの追加のメチル化核酸が存在する場合には自己組織化して、少なくとも一つの追加の触媒活性MNAzymeを形成することができる、少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分を提供することさらに含む場合があり、および
少なくとも一つの追加の基質がサンプル中に存在する場合には、該追加の基質を該追加のMNAzymeによって修飾することができ、その修飾が、該追加の検出可能な作用をもたらす。
【０１２２】
該少なくとも一つの追加の検出可能な作用は、独自に検出することができる。
【０１２３】
各々の追加の基質は、同じである場合もあり、異なる場合もあり、またはそれらの組み合わせである場合もある。
【０１２４】
該追加の基質のうちの少なくとも一つを、該追加の基質が該追加のMNAzymeによって修飾されたときに該追加の基質の追加の検出可能な部分および追加のクエンチャー部分のうちの一方だけがその支持体に取り付けられた状態でとどまるように、不溶性支持体に取り付けることができる。
【０１２５】
本発明の第十の局面に従って、増幅カスケードを使用して少なくとも一つの組織化助長因子を検出するための方法を提供し、
（a）少なくとも第一の組織化助長因子が存在する場合に自己組織化して少なくとも第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および少なくとも第二のオリゴヌクレオチド成分を含む、二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）少なくとも第一の基質が取り付けられている不溶性支持体を提供すること（該第一の基質は、該MNAzymeによって修飾することができ、該第一の基質は、少なくとも第三の分子を含み、該分子は、該第一の基質が該第一MNAzymeによって修飾されると放出される少なくとも第一の触媒活性酵素を含む）；
（c）組織化助長因子を含有すると推定されるサンプルと該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を、該第一の基質が取り付けられている不溶性支持体が存在する状態で、
（1）該MNAzymeの自己組織化、および
（2）該MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；ならびに
（d）少なくとも第二の基質が取り付けられている不溶性支持体を提供すること（該第二の基質は、該第一の触媒活性酵素によって切断することができ、該第二の基質は、少なくとも第四の分子を含み、該第四の分子は、該第二の基質が該第一の酵素によって修飾されると放出される少なくとも検出可能な部分を含む）
を含み、
（e）該第一の触媒活性酵素が、多数の該第二の基質を修飾し、それによって多数の検出可能な部分を放出し；
（f）該第一の触媒活性酵素による該第二の基質の修飾後、該検出可能な部分を検出することができ；および
（g）該検出可能な部分の検出が、該組織化助長因子の存在を示す。
【０１２６】
該検出可能な部分は、該第一の基質を修飾し、それによって追加の触媒活性酵素を放出することができる、追加の第二の触媒活性酵素をさらに含む場合がある。該第一または該第二の触媒活性酵素のうちの少なくとも一つは、MNAzyme、DNAzyme、リボザイム、加水分解酵素、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ヒドロラーゼ、リティカーゼ、ペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、エステラーゼ、カスパーゼ、カテプシン、デスルフヒドラーゼ、アミダーゼ、グルコシダーゼを含む群から選択することができる。
【０１２７】
該組織化助長因子は、同定、検出または定量されるターゲットを含むことができる。該ターゲットは、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択することができる。該核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【０１２８】
本発明の第十一の局面に従って、MNAzyme媒介シグナル増幅カスケードを使用してターゲットを検出するための方法を提供し、
（a）ターゲットが存在する場合に自己組織化して第一の触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成する、第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分を提供すること；
（b）第一および第二の基質が取り付けられている不溶性支持体を提供すること（該第一および第二の基質を該第一MNAzymeによって修飾することができ、該第一および第二基質は、第二の触媒活性MNAzymeを形成することができる少なくとも第三および第四のオリゴヌクレオチド成分をそれぞれ含み、該第三および第四のオリゴヌクレオチド成分は、該第一および第二の基質が該第一MNAzymeによって修飾されると放出される）；
（c）第三および第四の基質が取り付けられている該不溶性支持体を提供すること（該第三および第四の基質を該第二MNAzymeによって修飾することができ、該第三および第四の基質は、第三の触媒活性MNAzymeを形成することができる少なくとも第五および第六のオリゴヌクレオチド成分をそれぞれ含み、該第五および第六のオリゴヌクレオチド成分は、該第三および第四の基質が該第二MNAzymeによって修飾されると放出される）；および
（d）該第二および該第三MNAzymeの組織化を助長することができる組織化助長因子を提供すること；
（e）検出可能な作用をもたらすように該第二MNAzymeによって修飾することができる第五の基質を提供すること； 
（f）ターゲットを含有すると推定されるサンプルと該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分を、該組織化助長因子が存在する状態で、および該第一、第二、第三および第四の基質が取り付けられている該不溶性支持体が存在する状態で、
（1）該第一、第二および第三MNAzymeの自己組織化、および
（2）該第一、第二および第三MNAzymeの触媒活性
を可能にする条件下で接触させること；
を含み、
（g）該第三のMNAzymeは、該第一および第二の基質を修飾し、それによって該第二のMNAzymeをさらに提供し、該第二MNAzymeは、該第三、第四および第五の基質のうちの少なくとも一つをさらに修飾し、それによって該第三のMNAzymeをさらに提供し、それによって該検出可能な作用をさらにもたらし；ならびに
（h）該検出可能な作用の検出は、そのターゲットの存在を示す。
【０１２９】
該ターゲットを同定、検出または定量することができる。該ターゲットは、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択することができる。該核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【０１３０】
該第五の基質は、該第一、第二、第三または第四の基質のうちのいずれか一つと同じである場合もあり、または異なる場合もある。
【０１３１】
該第一、第二、第三または第四の基質の各々は、同じ固体支持体上に存在する場合もあり、異なる固体支持体上に存在する場合もあり、またはそれらの任意の組み合わせである場合もある。
【０１３２】
該第一、第二、第三または第四の基質の少なくとも一つについての修飾は、検出可能な作用をさらにもたらすことができる。
【０１３３】
本発明の第十二の局面に従って、各々が少なくとも一つの組織化助長因子を認識し、基質を修飾する、多数の多成分核酸酵素（MNAzyme）を製造するための方法を提供し、本方法は、
（a）同定、検出または定量すべき多数の組織化助長因子を提供すること；
（b）二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を設計すること（少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分は、組織化助長因子が存在する場合には自己組織化して、触媒活性多成分核酸酵素（MNAzyme）を形成し、
該少なくとも第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；
自己組織化すると、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分が、該MNAzymeのセンサーアームを形成し、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分が、該MNAzymeの基質アームを形成し、ならびに該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が、該MNAzymeの触媒コアを形成し；
該MNAzymeのセンサーアームが組織化助長因子と相互作用して、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分を、それらのそれぞれの触媒コア部分が会合してMNAzymeの触媒コア（該触媒コアは、少なくとも一つの基質を作用することができる）を形成するように、近接した状態で維持し；ならびに
該MNAzymeの基質アームが、該MNAzymeの触媒コアが基質を修飾することができるように、基質に係合する）；
（c）該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分および触媒コア部分は不変であり、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一方のセンサーアーム部分は別の多数の組織化助長因子を認識することに適するように、該二つ以上のオリゴヌクレオチド成分を改変すること；ならびに
（d）多数の組織化助長因子の各々について該改変段階を繰り返すこと；
を含む。
【０１３４】
本発明の第十三の局面に従って、多数のターゲットの存在を検出するためのキットを提供し、このキットは、多数のターゲットの少なくとも一つに各々が対応する多数のMNAzymeを組織化するように設計された多数のオリゴヌクレオチド成分と少なくとも一つの基質とを含む。
【０１３５】
本発明の第十四の局面に従って、多数のMNAzymeを組織化するためのキットを提供し、このキットは、多数の組織化助長因子と、多数の組織化助長因子の各々に各々が対応する多数のMNAzymeを組織化するように設計された多数のオリゴヌクレオチド成分と、少なくとも一つの基質とを含む。
【０１３６】
本発明の第十五の局面に従って、ターゲットを検出するためのキットを提供し、このキットは、ターゲットに対応するMNAzymeを組織化するように設計された多数のオリゴヌクレオチド成分と基質とを含む。
【０１３７】
定義
一定の用語を本明細書において使用し、それらは、以下のとおり示す意味を有するものとする。
【０１３８】
用語「含む（comprising）」は、「本質的に、しかし必ずしも唯一ではなく含むこと（including）」を意味する。さらに、「含む」という語の変形、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」は、相応じて変わる意味を有する。
【０１３９】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、同義で用いることができ、この用語は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアプリコンまたはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されるわけでなない、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖ポリマー、またはそれらの類似体、誘導体、変異体、フラグメントもしくは組み合わせを指す。非限定的例として、核酸の供給源は、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
【０１４０】
用語「オリゴヌクレオチド」および「プライマー」は、一般に、DNAもしくはDNA含有核酸分子、またはRNAもしくはRNA含有分子、またはそれらの組み合わせのセグメントを示す。オリゴヌクレオチドの例としては、核酸ターゲット；基質、例えば、MNAzymeによって修飾することができるもの；プライマー、例えば、PCRなどの方法によるインビトロターゲット増幅のために使用されるもの；およびMNAzymeの成分が含まれる。一定の態様において、MNAzyme組織化助長因子は、本明細書において定義するようなオリゴヌクレオチドを含むことができる。本明細書において用いる場合のパートザイム（partzyme）もオリゴヌクレオチドを含むことがある。
【０１４１】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、別の指示がなければ、明記されている任意の配列ならびにそれに相補的な配列への言及を含む。オリゴヌクレオチドは、4-アセチルシチジン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、βD-ガラクトシルケオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、βD-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-（（9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル）カルバモイル）トレオニン、N-（（9-β-リボフラノシルプリン-6-イル）N-メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-（（9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル）カルバモイル）トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウリジン、βD-アラビノシルウリジン、βD-アラビノシルチミジンを含む群を含むがこれらに限定されるわけでなない、少なくとも一つの付加または置換を含む場合がある。
【０１４２】
用語「触媒核酸分子」、「触媒核酸」、「核酸酵素」および「触媒核酸配列」は、本明細書においては同義で用いており、基質を認識することができ、基質の修飾を触媒することができる、DNA分子もしくはDNA含有分子（当技術分野において「DNA酵素」、「デオキシリボザイム」または「DNAzyme」としても知られている）またはRNAもしくはRNA含有分子（当技術分野において「RNA酵素」または「リボザイム」としても知られている）、またはDNA-RNAハイブリッド分子であるこれらの組み合わせを意味するものとする。触媒核酸中のヌクレオチド残基としては、塩基A、C、G、TおよびU、ならびにそれらの誘導体および類似体を含むことができる。
【０１４３】
用語「誘導体」は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関して用いる場合、（例えば組み換え手段により）一体生産されるまたは（例えば、キメラ手段により）合成後付加される任意の融合分子を含めて、任意の機能的に等価の核酸またはヌクレオチドを含む。このような融合は、付加されたRNAもしくはDNAを有する、またはポリペプチド（例えば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）もしくは抗体にコンジュゲートした、本発明のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０１４４】
核酸またはヌクレオチドに関係して用いる場合の用語「類似体」は、DNAまたはRNA分子または残基に関する物理構造であって、DNAもしくはRNA残基またはそれらの類似体と水素結合を形成することができる（すなわち、DNAもしくはRNA残基またはそれらの類似体をアニールして塩基対を形成することができる）物理構造を有する化合物を包含するが、そのような結合は、この用語「類似体」に包含される該化合物にはあまり必要とされない。このような類似体は、構造的に関係があるリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドと異なる化学的および生物学的特性を有する場合がある。メチル化、ヨウ素化、臭素化またはビオチン化残基が、類似体の例である。デオキシイノシン、C-5-イミダゾールデオキシウリジン、3-（アミノプロピニル）-7-デアザ-dATP、2’-O-メチルRNA、2’O-メチルキャップを含むヌクレオチド類似体を含有する活性DNAzymeが記載されている（Warashina et al., 1999; Cairns et al., 2003; Schubert et al., 2004; Sidorov et al., 2004）。他の類似体は、DNAzymeの触媒活性と適合性である。例えば、ある塩基での別の塩基の置換による、ある塩基の類似体での置換による触媒核酸配列の改変、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変は、当業者には簡単であり得る。例えば、改変は、合成中に行うことができ、または合成後に特定の塩基の修飾によって行うことができる。塩基変更または塩基類似体などの改変が組み込まれた触媒核酸の経験的試験により、触媒活性に対する改変配列または特定の類似体の影響を評定することができる。塩基A、C、G、TおよびUの類似体は、当技術分野において公知であり、サブセットを表2に列挙する。
【０１４５】
（表2）本明細書において有用なヌクレオチド類似体の例
2009509551.tif 000003
2009509551.tif 000004
【０１４６】
用語「フラグメント」は、核酸に関して用いる場合、その核酸の構成要素を指す。一般に、フラグメントは、核酸と共通の質的生物活性を有するが、必ずしもその状態である必要はない。核酸のフラグメントは、生物活性を保持するポリペプチドを必ずしもコードする必要はない。むしろ、核酸フラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRオリゴヌクレオチドとして有用であり得る。該フラグメントは、本発明の核酸から誘導される場合もあり、あるいは何らかの他の手段、例えばキメラ合成によって合成される場合もある。
【０１４７】
用語「変異体」は、本明細書において用いる場合、実質的に同様の核酸またはポリペプチド配列を指す。一般に、配列変異体は、共通の質的生物活性を有する。さらに、このような配列変異体は、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％配列同一性を共有し得る。一般に、異なる種からのポリペプチドまたは核酸であるが、本明細書において開示する対応するポリペプチドまたは核酸と同じ生物学的機能または生物活性を共有する相同体も、用語「変異体」の意味に含まれる。
【０１４８】
用語「高ストリンジェンシー」は、本明細書において用いる場合、二つの核酸をハイブリダイズすることができる条件を指し、例えば、溶液中の塩および/または界面活性剤の濃度、二つの核酸のハイブリダイゼーション中に用いられる溶液の温度、ならびにそのハイブリダイゼーションの期間を含み得る。従って、本明細書において用いる用語「高ストリンジェンシー」は、二つの核酸のハイブリダイゼーションが、そのような核酸が高い相補性度を共有する場合にのみ導びかれる、溶液中での条件を指す。該相補性度としては、約50％から99％の範囲を含むことができるがそれらに限定されるわけではない。従って、「高ストリンジェンシー」条件は、様々な温度、ならびに様々な濃度の界面活性剤、塩および二価カチオンを含むバッファーの使用を含むことができるがそれらに限定されるわけではない。
【０１４９】
用語「組織化助長因子分子」、「組織化助長因子」、「MNAzyme組織化助長因子分子」、「助長因子」および「MNAzyme組織化助長因子」は、本明細書において用いる場合、触媒活性MNAzymeを形成する成分パートザイムの自己組織化を助長することができる単位を指す。好ましい態様において、組織化助長因子は、MNAzymeの自己組織化のために必要とされる。一部の態様において、組織化助長因子は、核酸または非核酸分析物などのターゲットを含む。組織化助長因子分子は、「MNAzyme」の成分または部分を構成する一つまたは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」と対合または結合することができる、一つまたは複数の領域または分子を含む場合がある。組織化助長因子は、MNAzymeの成分パートザイムの少なくとも一つと相互作用する、対合するまたは結合するのであれば、各成分パートザイムまたはオリゴヌクレオチドと相互作用する、対合するまたは結合する必要はない。本明細書において用いる場合、組織化助長因子分子は、MNAzymeの自己組織化を助長することができる構成要素の最も広い範囲を包含すると意図する。一部の態様において、組織化助長因子は、核酸を含むことができる。他の態様において、組織化助長因子は、任意の細胞またはその任意の部分、例えば、任意の真核もしくは原核細胞、ウイルス、プリオン、酵母もしくは真菌、または任意の他の分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸を含むがそれらに限定されるわけではない）を含むことができる。他の態様において、組織化助長因子は、ウイルス、プリオン、酵母もしくは真菌、または任意の他の分子（例えば、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、全生物、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはこれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含むがそれらに限定されるわけではない）を含むことができる。
【０１５０】
用語「ターゲット」は、本明細書において用いる場合、特定のMNAzymeによって検出、同定または定量しようとする任意の天然または合成単位、構成要素または分析物を含む。従って、ターゲットは、高感度検出法、同定法および/または定量法が望ましい検出可能な単位、構成要素または分析物の最も広い範囲を包含する。一部の態様において、ターゲットは、組織化助長因子を含む。一部の例示的ターゲットとしては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、全生物、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、酵母、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはこれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせが含まれるがそれらに限定されるわけではない。他のターゲットも本明細書において使用するために意図される。
【０１５１】
用語「基質」、「基質分子」および「キメラ基質」は、本明細書において用いる場合、触媒分子によって認識され得る、触媒分子による作用を受け得る、または触媒分子により化学的に修飾され得る任意の分子を含む。特定の態様において、基質は、酵素によって認識され、修飾され得る。他の態様において、基質は、触媒核酸分子によって認識され、修飾され得る。基質の化学的修飾は、修飾反応の産物の出現もしくは増加によって、または修飾反応の基質の消失もしくは減少によって測定することができる。特定の触媒分子は、各基質分子が、その触媒分子による触媒活性について認識できる少なくとも最小限の構造を有するならば、一つまたは複数の異なる基質分子を認識することができる。
【０１５２】
「レポーター基質」、「レポータープローブ」または「レポータープローブ基質」は、本明細書において用いる場合、触媒反応に関連しての基質の消失または産物の出現いずれかの測定を助長することに特に適合する基質である。レポーター基質は、溶液中で遊離している場合もあり、または例えば、表面にもしくは別の分子に、結合（もしくは「係留」）されている場合もある。レポーター基質は、例えば、蛍光体（一つまたは複数の追加の成分、例えばクエンチャーを伴うもしくは伴わない）、放射性標識、ビオチンでの標識（例えば、ビオチン化）または化学発光標識を含む多様な手段のいずれによっても標識することができる。触媒核酸についてのレポーター基質は、例えばそれらの末端に共有結合で取り付けられた、タンパク質または核酸酵素も含むことができる。
【０１５３】
本明細書において用いる場合、「ジェネリック」または「ユニバーサル」基質は、各々が異なるターゲットを認識できる多数のMNAzymeによって認識され、それらによる触媒作用を受ける基質、例えば、レポーター基質である。このような基質の使用は、構造的に関連したMNAzyme（これらのすべてが、ユニバーサル基質を認識する）を使用する多種多様なターゲットの検出、同定または定量のための独立したアッセイの開発を助長する。これらのユニバーサル基質は、各々、独自に、一つまたは複数の標識で標識することができる。好ましい態様において、独自に検出することができる標識を使用して一つまたは複数のジェネリック基質を標識して、MNAzymeを使用する様々なターゲットの独自または同時検出に適便な系を作ることができる。
【０１５４】
本明細書において用いる場合、用語「パートザイム」、「成分パートザイム」および「成分オリゴヌクレオチド」は、MNAzyme組織化助長因子分子が存在する場合にのみ、それらの二つ以上が一緒に「MNAzyme」を形成することができるDNA含有、RNA含有またはDNA-RNA含有オリゴヌクレオチドを指す。一定の好ましい態様において、一つまたは複数の成分パートザイム、好ましくは少なくとも二つの成分パートザイムが、次の三つの領域またはドメインを含むことができる。化学的修飾を触媒するMNAzyme触媒コアの一部を形成する「触媒」ドメイン；組織化助長因子（例えば、ターゲット）と会合および/または結合することができる「センサーアーム」ドメイン；ならびに基質と会合および/または結合することができる「基質アーム」ドメイン。これらの領域またはドメインの描写は、例えば、図1で見ることができる。パートザイムは、一つまたは複数の分子を含む場合がある。パートザイムは、アプタマーを含む（しかし、これに限定されない）少なくとも一つの追加の成分を含む場合があり、本明細書においてこれを「アプタ-パートザイム」と呼ぶ。パートザイムは、例えば図25において見られるように、基質を含む場合もある。
【０１５５】
用語「MNAzyme」は、本明細書において用いる場合、MNAzyme組織化助長因子分子（例えば、ターゲット）が存在する場合にのみ、基質を触媒的に修飾することができる活性核酸酵素を形成する二つ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）を指す。パートザイムAおよびパートザイムBを含む例示的MNAzymeを図1に示す。図1を参照すると、DNAパートザイムAおよびBは、各々、（例えば、核酸ターゲットとのワトソン・クリック塩基対合により）ターゲットに結合する。MNAzymeは、ターゲット上で互いに隣接しているパートザイムAおよびBのセンサーアームがハイブリダイズするときにのみ形成する。MNAzymeの基質アームは、レポーター基質に係合し、その切断は、パートザイムAおよびBの触媒ドメインの相互作用によって形成されるMNAzymeの触媒コアによって触媒される。MNAzymeは、蛍光体とクエンチャー色素のペアの間で基質を切断し、そのようにしてシグナルを生じさせる。DNA/RNAキメラ（レポーター基質）の切断は、その図の中に例示されている。用語「多成分核酸酵素」および「MNAzyme」は、本明細書において同義で用いており、二つの分子からなる二部構成の構造、または三つの核酸分子からなる三部構成の構造、または他の多部構成の構造、例えば、四つ以上の核酸分子によって形成されたものを含む。MNAzymeは、組織化助長因子または基質との相互作用によってMNAzymeの安定をもたらす安定化オリゴヌクレオチドも含む場合がある。MNAzymeの形成が、組織化助長因子での少なくともそのパートザイム成分の組織化、および触媒活性が検出可能となるために基質の結合を必要とすること、ならびにこれらの成分のいずれの不在も触媒活性の欠如をもたらすことは、明らかである。
【０１５６】
本明細書において用いる場合、「アプタマー」は、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する構造を含むことができる。例えば、この認識は、そのアプタマーのより高レベルの構造、例えば、三次元結合ドメインまたはポケットのため、高い特異度を有する場合がある。従って、アプタマーは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、全生物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、あるいは任意の他の単位に結合することができる。本明細書において好ましいアプタマーは、吸収、回収および再増幅の反復プロセスにより合成核酸の複合ライブラリーから単離することができる短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーを含むことができる。従って、アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼあらゆるターゲットに対して生じさせることができる。
【０１５７】
本明細書において用いる場合、用語「カスケード」は、逐次段階的に発生するプロセスまたは動作のあらゆる継続を指し、各段階の発生は、前の段階の発生に一般に依存する。従って、カスケードとしては、酵素的カスケードまたは任意の他のシグナル伝達カスケードが含まれるがそれらに限定されるわけではない。一部の態様において、カスケードは、MNAzymeの触媒活性の結果として生じるシグナルの増幅を含む場合がある。好ましい態様において、そのような増幅カスケードは、シグナルの反復増幅、従って周期的増幅を必要とし得、第一のMNAzymeの触媒活性は、第二のMNAzymeの触媒活性に必要な分子を利用できるようにし、その第二のMNAzymeがまた、第一のMNAzymeの触媒活性に必要な分子を利用できるようにする。一部の態様において、該必要な分子は、パートザイム、酵素、組織化助長因子、基質、ターゲット、これらの一部分もしくはフラグメント、またはそれらの組み合わせを含むことができる。従って、一部の態様におけるカスケードは、蓄積作用の産出を含む場合があり、従って、検出することができるレベルにシグナルを生じさせることによって低存在度のターゲットを検出することができる。他の態様では、2つより多くの触媒的段階を利用する場合がある。このカスケードは直線的であり得る。好ましい態様において、このカスケードは、指数形であり得る。
【０１５８】
本明細書において用いる場合、用語「阻害剤」または「組織化阻害剤」は、本明細書において定義するとおりのMNAzymeの一つまたは複数の成分と相互作用して、または基質もしくは組織化助長因子と相互作用して、MNAzymeの組織化を防止する任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、全生物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、または任意の他の単位もしく分子を含むがそれらに限定されるわけではない。「阻害剤」または「組織化阻害剤」は、MNAzymeに物理的に近接している必要はないが、非限定的な例として、MNAzyme、基質または組織化助長因子の成分部分に競合的に結合し、その結果、そのような成分がMNAzyme組織化に利用され得ることを防止することができる。そのような結合としては、例えば、MNAzymeの成分部分を含むオリゴヌクレオチドに相補的である阻害性核酸を含むことができる。
【０１５９】
以下の略記を本明細書においておよび本明細書全体を通して用いる。
MNAzyme：多成分核酸酵素または多部構成核酸酵素；
DNAzyme：デオキシリボ核酸酵素；
RNAzyme：リボ核酸酵素、またはリボザイム；
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；
SDA：鎖置換増幅；
LAMP：ループ媒介等温増幅；
RCA：ローリングサークル増幅；
TMA：転写媒介増幅；
3SR：自己支持配列複製；
NASBA：核酸配列に基づく増幅；
dH2O：脱イオン蒸留水；
LNA：ロックされた核酸；
PNA：ペプチド核酸；
bDNA：分岐DNAアッセイ；
FCS：蛍光相関分光法；
TSA：チラミドシグナル増幅；
An：分析物またはターゲット；
F：蛍光体；
Q：クエンチャー；
miR：ミクロRNA；
N＝A、C、T、Gまたはそれらの任意の類似体；
N’＝Nに相補的な、またはNと塩基対合することができる任意の核酸；
（N）x：任意の数のN；
（N’）x：任意の数のN’；
W：AまたはT；
K：A、GまたはAA；
rN：任意のリボヌクレオチド塩基；
（rN）x：任意の数のrN；
rR：AまたはG；
rY：CまたはU；
M：AまたはC；
H：A、CまたはT；
D：G、AまたはT；
JOEまたは6-JOE：6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン；
FAMまたは6-FAM：6-カルボキシフルオレセイン；
BHQ1：ブラックホールクエンチャー1；
BHQ2：ブラックホールクエンチャー2；
M-MLV RT（H-）：モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、RNアーゼHマイナス；
shRNA：短いヘアピンRNA；
siRNA：短い干渉RNA；
mRNA：メッセンジャーRNA；
tRNA：トランスファーRNA；
snoRNA：小分子RNA；
stRNA：一過性低分子RNA；
smRNA：修飾性低分子RNA；
プレ-ミクロRNA：ミクロRNA前駆体；
プリ-ミクロRNA：始原ミクロRNA。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６０】
実施形態の詳細な説明
本明細書において提供する図および実施例が、本発明およびその様々な態様を例示するためのものであり、限定するためのものではないことを最初に理解しなければならない。
【０１６１】
本発明に従って、ターゲットの検出、同定および/または定量のための組成物、方法およびキットを提供する。本方法は、一般に、組織化助長因子が存在する場合に自己組織化して活性核酸酵素を形成する多数の核酸成分により好ましくは形成される多成分または多部構成核酸酵素を含む組成物の使用を含む。好ましい態様において、該組織化助長因子は、ターゲットであり、従って、該多成分核酸酵素は、ターゲットが存在する場合にのみ形成する。
【０１６２】
1.組成物-MNAzyme
多成分核酸酵素（Multi-component Nucleic Acid enzyme）（本明細書において、同様に、多部構成核酸酵素（multipartite nucleic acid enzyme）または「MNAzyme」とも呼ばれる）は、本明細書においてパートザイムとも呼ばれる二つ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化することができる。該パートザイムオリゴヌクレオチドは、MNAzyme自己組織化助長因子が存在する場合には自己組織化してMNAzymeを形成する。従って、MNAzymeは、触媒活性核酸酵素である。一部の態様において、MNAzymeの存在は、検出することができ、ターゲットの存在を示す。ターゲットが組織化助長因子を含む場合、そのターゲットが存在する場合にしかMNAzymeは形成しないからである。上で略述した基本原理に基づく多種多様なアッセイを本明細書において提供する。MNAzymeを形成することができるオリゴヌクレオチド、および様々な配列のMNAzymeを含む組成物も、本明細書において提供する。一部の態様において、オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つは、ターゲットに結合することができるアプタマーも含む/含むことができる。
【０１６３】
好ましい態様において、MNAzyme構造は、一つまたは複数のDNAzymeおよび/またはリボザイムに基づく。特定のDNAzyme構造に基づくMNAzyme構造は、さらに好ましい。現在好ましい構造は、10：23および8：17 DNAzymeを含むDNAzymeに基づく。様々な態様において、MNAzymeは、リボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基のいずれかまたは両方を含む。さらに好ましい態様において、MNAzyme構造は、DNAzymeの構造に少なくとも一部は基づく。他の好ましい態様において、MNAzymeは、少なくとも幾つかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはそれらの類似体を含む。さらに好ましい態様において、MNAzymeの触媒コアは、一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。さらにいっそう好ましい態様において、一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、基質の触媒作用に関与する。他の態様において、該触媒コア中の少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、触媒活性を向上させる。さらに他の態様において、デオキシリボヌクレオチド塩基が存在しない比較対象となるMNAzymeを基準して測定可能な率で触媒作用が発生するために、MNAzymeの触媒コア中の少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体に対する厳格な要件がある。
【０１６４】
本明細書において提供するMNAzymeは、当業者には周知の一つまたは複数の置換、例えば類似体、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の改変、様々な欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせを含有する場合がある。本明細書において証明するように、このような修飾、置換、欠失、挿入などをセンサーおよび/もしくは基質アームにおいて、ならびに/または触媒コア部分において行うことができるので、その分子は触媒活性を保持する。基質または組織化助長因子に結合するアームに対する置換および修飾は、十分に許容され得るものであり、実際、異なる基質/組織化助長因子に合わせてそれらの分子を作ることができる基礎となる。例えば、センサーアームの修飾により、異なる組織化助長因子に合わせて作ることができ、一方、基質アームの修飾により、異なる基質に合わせて作ることができる。
【０１６５】
従って、一定の好ましい態様において、本発明は、デオキシリボヌクレオチドからなる、または一定の修飾/置換などによりそのような分子から誘導される、触媒活性を有するMNAzymeを考えている。原則として、例えばリボヌクレオチドでの分子全体の置換は、その活性が一定の重要なデオキシリボヌクレオチドに依存するため、その分子を不活性にする。相応じて、リボザイムにおける一部のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することはできるが、例えばデオキシリボヌクレオチドでの分子全体の置換は、その分子を不活性にする。
【０１６６】
MNAzymeが、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、または両方までも含むことは、当業者には分かる。少なくとも一つの、さらに好ましくはすべての、デオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含むMNAzymeが、現在好ましい。MNAzymeの触媒コアの中に少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含むMNAzymeも好ましい。そのような塩基が触媒活性に必要とされる態様は、なおさらに好ましい。
【０１６７】
多部構成DNAzymeが、例えば安定性および使用の容易さに関して、多部構成リボザイムより有利であることも、当業者には分かる。従って、本明細書において提供する多成分MNAzymeは、多成分リボザイムの現在好ましい代替となり得、これらも様々な態様に従って提供する。一定の態様において、単一のMNAzymeは、二つの分子、すなわち組織化助長因子（例えば、ターゲット）および基質を認識することができるので、一つの基質しか認識することができない単一分子核酸酵素、例えばDNAzymeに勝る利点をMNAzymeが提供することも、分かる。例えば、MNAzymeのこれらの特性が、それらをインサイチュー、インビボまたはインビトロ検出を含むターゲットの検出に適応可能にする。
【０１６８】
2.ターゲットを検出、同定または定量するためにMNAzymeを使用する方法
本発明は、少なくとも一つのターゲットの検出、同定または定量のための一つまたは複数のMNAzymeの使用を利用する様々な方法を提供する。一つの態様において、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分は、組織化助長因子を含有するサンプルと接触したときにのみ自己組織化し、該触媒活性MNAzymeの自己組織化は、それによってその組織化助長因子の存在を示し、組織化助長因子がターゲットである。例えばアプタマーを伴うものなどの他の態様において、組織化助長因子は、ターゲットではない場合があり、従って、MNAzymeの自己組織化に必要な要素しか含まない場合がある。
【０１６９】
本発明の様々な態様のうちの幾つかは、実体図によってより良好に理解することができる。従って、図を参照して、ならびに本明細書における組成物および方法に従って、ポリメラーゼなどのタンパク質酵素を一切必要とせずに核酸酵素のみを使用して少なくとも一つのターゲットを検出することができるMNAzymeに基づく方法を一般に提供する（例えば、図1、3、4、7〜13、20、21、24、25）。MNAzymeとタンパク質酵素の併用は、本明細書において除外されず、本明細書において一定の態様ではタンパク質酵素の包含が許容され、または好ましいことさえあるが、（例えば、MNAzyme切断効率について）タンパク質酵素を必要としない方法の反応条件のほうが、一般に、制限が少なく、容易に最適化される。タンパク質酵素についての要件がないことは、一般に、試薬の費用も減少させる。
【０１７０】
本明細書においてさらに提供するような、ターゲットの検出にMNAzymeを利用する一部の方法は、ターゲットの熱サイクリングおよび/または変性を必要としない。等温法は、熱サイクリングを必要とする方法より融通がきき、ならびに一本鎖核酸と二本鎖核酸を含むターゲットとの区別を可能にすることもできる。さらに、熱サイクリングの必要がないことにより、このような方法は、より容易およびより安価になり得る。合成のものである場合もあり天然のものである場合もあるサンプル中の対象となるターゲットの単純で、迅速で、費用効率がよく、等温で、手順に融通がきく検出方法を本明細書における方法に従って提供する。
【０１７１】
本明細書に提供する一定の実施例は、例えば蛍光レポーター基質のMNAzyme媒介切断をもたらすMNAzymeのターゲット特異的組織化による核酸ターゲットの検出を証明する。さらに、MNAzyme分子の性質のため、反応は、MNAzymeの組織化および利用される基質の触媒的修飾（例えば、切断）のための要件のみを条件として、広範な温度にわたって行うことができる。
【０１７２】
MNAzyme構造の基本例を図1に示す。示されている構造は、ここには単にターゲットと示されているMNAzyme組織化助長因子分子と塩基対合したパートザイムAおよびパートザイムBを含む。ターゲットと相互作用することによりパートザイムAおよびBは、触媒コアを極めて近接させ、それによって形成することができた。MNAzymeの基質アームは、基質、ここではレポーター基質と相互作用し塩基対合した。このようにして、MNAzymeは自己組織化し、このプロセスは、MNAzyme組織化助長因子分子ターゲットの存在により助長される。ターゲットが不在の場合、MNAzymeは形成しない。基質の修飾（この場合は切断）は、縦矢印が指している基質内のMNAzyme切断部位でMNAzymeの触媒コアにより触媒される。本発明のこの特定の態様における基質は、検出可能なシグナル、例えば蛍光体Fと、クエンチャーQの作用によりその検出可能なシグナルFに対してクエンチ効果を及ぼすクエンチャー部分とを含む。そのMNAzyme切断部位で切断されると、容易に検出または定量される検出可能なシグナル、ここでは蛍光が実質的に増加する。
【０１７３】
さらに、図1は、一部の態様では組織化助長因子を含むターゲットを検出するための基本的なMNAzyme使用方法の一例を示すものであると理解することができる。戦略1（図2参照）は、DNA、RNAおよびタンパク質を含むターゲットの検出に適合したMNAzymeを使用する。このレポーター基質は、溶液中で遊離している場合もあり（図1）または支持体に結合している場合もある（図3）。様々な手段、例えば、蛍光体FとクエンチャーQ色素のペアの分離によってシグナルを生じさせることができる（図1および3）。
【０１７４】
さらに具体的に、パートザイムAおよびパートザイムB（各々が、基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含む）を図1に示す。ターゲットが存在する場合、パートザイムAおよびパートザイムBのセンサーアーム部分は、ターゲット、例えばDNAまたはRNA配列の相補的部分とハイブリダイズし始め、塩基対合することができる。この様式でターゲットと接触すると、MNAzymeは自己組織化して触媒コアを形成し、これは、基質アームによって結合される基質を修飾することができる。好ましくは、MNAzymeの存在は、その触媒活性の検出または測定により検出される。このようにして組織化したMNAzymeの基質アームは、それらの基質アーム上の相補的配列と基質の相互作用により、基質、例えば、図1に示されているレポーター基質に係合することができる。基質が、基質アームとそのように係合すると、触媒コアは、基質の修飾（例えば、切断）を促進することができ、そしてまた、その基質を直接または間接的に測定または検出することができる。
【０１７５】
さらに図を参照して、図2は、MNAzymeアッセイの幾つかの適用例の様式化された外観を提供するものである。戦略1は、上で説明したようなMNAzymeアッセイの基本適用を例示する。オリゴヌクレオチドがターゲットを認識し結合すると、ターゲットと基質の両方についての認識配列を有する二つの別のオリゴヌクレオチドからなるMNAzymeが形成する。この基質、例えばレポーター基質は、直接（戦略1）、ターゲット増幅中もしくは後（戦略2）またはシグナルカスケードにより（戦略3）MNAzymeの触媒作用によって修飾され、検出可能なシグナルを生じさせる。一部の態様では、ターゲットとシグナル増幅の両方が同時に行われる。
【０１７６】
広範な用途範囲にわたる組織化助長因子の検出、同定または定量のための戦略にMNAzymeを使用できることは、当業者には認識される。これらの範囲としては、医療用途、獣医学的用途、農業用途、食品技術用途、画像形成用途および生物テロリズム用途が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１７７】
MNAzymeを使用して、溶液中のターゲットを検出、同定および/または定量できることも、当業者には容易に理解できる。例えば、単一の基質を使用する単一のターゲットの検出、同定および/または定量を伴う戦略をこのような検出に適用することができる。一部の態様において、これは、ジェネリック基質の使用を伴う場合がある。一連のジェネリック基質を修飾する多数のMNAzymeを使用して、溶液中の多数のターゲットを検出することもでき、各基質の修飾により、明確に検出可能なシグナル、例えば異なる蛍光が生じる。
【０１７８】
3.多数のMNAzymeを使用する方法
一般に、本明細書において提供する様々なアッセイを使用して、一反応もしくはアッセイにつきただ一つのターゲットを検出できること、または単一の反応またはアッセイにおいて多数のターゲットを検出できることは、当業者には理解される。多数のターゲットを検出するとき、そのアッセイおよび検出すべきものに依存して、一つまたは複数のMNAzymeを使用することができる。例えば、多数の関連構造、例えば、（MNAzymeによって認識される）重要な配列を共有し、例えば長さまたはその重要な配列以外の配列のみが異なる一群の配列を検出する場合には、単一のMNAzymeで十分なこともある。その重要な配列を有する任意の配列を検出することができる。多数のMNAzymeは、たった一つのヌクレオチドほどの小さな差の関連配列を検出する場合、または大きく異なるターゲットを検出することとなる場合でさえ有用となり、各々の存在または不在を知ることが望ましい。同様に、一部の態様では、単一の基質で十分である一方で、他方では、幾つかのターゲットの各々を検出するために固有の基質が必要である。場合により、多重化するために、本方法には、各基質について別個のまたは固有の検出可能なシグナルの使用して本方法の設計を助長する必要がある。基質を支持体に付け、その支持体上のそれらの局在定位により基質を区別できるときには、各基質ついて別個のまたは固有の検出可能なシグナルを必要としない場合もある。これらの設計の特徴は、当業者には容易に理解される。一部の態様において、該方法は、一反応における様々な異なるタイプのターゲット、例えば、核酸ターゲットおよびタンパク質の検出を可能にする。
【０１７９】
4.ターゲット増幅を使用する方法
本明細書に記載する方法が、MNAzyme触媒活性前、中または後のターゲットの増幅を含む場合があることは、当業者には容易に理解される。このようなターゲット増幅は、検出、同定または定量しようとするターゲットの量が、そうでなければ検出可能にできないシグナルをもたらすような量のものである本発明の態様に、特に適用することができる。そのような増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、転写媒介増幅（TMA）、自己支持配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のうちの一つまたは複数を含むことができる。
【０１８０】
戦略2（図2）は、核酸ターゲットのインビトロ増幅中または後のアンプリコンの蓄積のモニタリングに適合したMNAzymeの使用を例示する。核酸配列のインビトロ増幅のための技法は、当技術分野において公知である。これらとしては、DNAポリメラーゼによって媒介される技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）例えば、米国特許第4,683,202号；米国特許第4,683,195号；米国特許第4,000,159号；米国特許第4,965,188号；米国特許第5,176,995）（Saiki et al., 1985；Chehab et al., 1987）、鎖置換増幅（「SDA」）（Walker et al., 1992）、ローリングサークル増幅（「RCA」）（Lizardi et al., 1998）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）およびループ媒介等温増幅（「LAMP」）（Notomi et al., 2000；Nagamine et al., 2002）が含まれる。他のターゲット増幅技術は、RNAポリメラーゼによって媒介され、例えば、転写媒介増幅（「TMA」）（Jonas et al., 1993）、自己支持配列複製（「3SR」）（Fahy et al., 1991）および核酸配列複製に基づく増幅（「NASBA」）（Compton, 1991）である。
【０１８１】
PCR、RT-PCR、SDA、RCAおよびLAMPによって生産される増幅産物（「アンプリコン」）は、DNAからなり、これに対してRNAアンプリコンは、TMA、3SRおよびNASBAによって生産される。
【０１８２】
さらに、図2に例示されているような戦略2を参照して、その幾つかの局面のうちの一つにおいて、本発明は、例えば上述のPCR、RT-PCR、SDA、RCA、LAMP、TMA、3SRおよびNASBAを含むターゲット増幅法とMNAzymeを併用する方法を提供する。実施例4、5、6および9は、PCRアンプリコンの検出を実証する。実施例4、5、6および9において、PCR後の終点分析は、ターゲット核酸の存在または不在の迅速な判定を助長した。実施例8、10、11、13、14、15、16、19および20は、PCR増幅の実時間モニタリングを例示するものであり、そのようにしてターゲット核酸の定量を可能にする。非対称プライマー比または対照プライマー比のいずれかを用いてPCRにより生産されるアンプリコンの蓄積は、MNAzymeを使用してモニターすることができる。
【０１８３】
図2（戦略2）において見られるように、ターゲット核酸は、その核酸（すなわち、DNAまたはRNA）を増幅するための手順に従って増幅する。好ましくは、標準的なインビトロ増幅方法を使用する。増幅中に産生されるアンプリコンは、MNAzymeのターゲットとしての役割を果し、従って、MNAzyme活性は、そのターゲットの存在を示す。増幅とMNAzyme組織化および触媒活性の両方を可能にする条件下で単一容器においてそのようなモニタリングを行うことができること、または増幅反応の最後にもしくは過程でサンプルを除去することにより、増幅後にもしくは増幅中の複数の時点でMNAzymeアッセイを行うことができることは、当業者には分かる。
【０１８４】
ターゲット増幅を触媒核酸活性と併用する方法またはプロトコルが、特定の反応条件を必要とし得ることも分かる。好ましくは、反応条件は、ポリメラーゼ活性（例えば増幅）および（検出のための）基質の触媒核酸増幅と適合性である。PCR中などの高温で同時に発生する触媒活性とポリメラーゼ活性のための条件を決定するプロトコルがDNAzymeについて説明されている（Impey et al., 2000）。DNAzymeアーム長、バッファー、温度、二価イオン濃度を含む因子の影響および添加剤の作用が、この学術論文の中で証明されている。DNA酵素は、インビトロ増幅戦略との併用に適する。例えば、それらは、増幅中の高温への暴露によって不可逆的に変性しない。
【０１８５】
5.不溶性および固体支持体を使用する方法
一般に、本方法が、多重化されようとされまいと、溶液で適用できること、あるいは一つまたは複数の基質、酵素もしくそれらの部分、MNAzyme組織化助長因子および/またはターゲットを結合させる、取り付けるまたは係留させる不溶性支持体または固体支持体と併用されることも理解される。重ねて、このようなアッセイ系の特徴は、本明細書において例示する方法および変形ならびに研究例の提供を受けた当業者には、一般に、理解される。従って、本発明を本明細書における文字通りの教示に限定されるとみなすべきではなく、本発明は、本明細書において提供する教示の原理および範囲ならびに当技術分野において知識に矛盾することなく修正および変更することができる。
【０１８６】
図3、パネル（i）を参照して、MNAzymeと支持体に係留された基質とを使用してターゲットを検出するための例示的方法を示す。本態様において、基質は、好ましくは、示されているように、検出可能なシグナル、例えば蛍光体を含む検出可能な部分とその検出可能なシグナルを減少または消去するクエンチャー部分とを伴う基質であり、そして基質の検出可能な部分およびクエンチャー部分は、例えば、その基質が例えば切断によって修飾されるまで、極めて近接したままである。この基質は、支持体に取り付けられている。好ましくは、この支持体は、不溶性材料であるか、その基質を保持し、大部分の反応混合物における自由な移動からそれを締め出すマトリックスである。核酸ターゲットを含む基質を固定または配置するためのこのような支持体は、当技術分野において公知である。マイクロアッセイでの使用に適便なビーズを含む様々な形態の多種多様なマトリックス、ポリマーなど、ならびに反応条件に適合した他の材料から、該支持体を選択できることは、当業者には分かる。一定の好ましい態様において、該支持体は、プラスチック材料、例えばプラスチックビーズもしくはウェーハである場合もあり、または特定のアッセイを行うウエルもしくはチューブのものである場合もある。
【０１８７】
支持体への基質の取り付けは、MNAzymeによってその基質が例えば切断により修飾されたとき、検出可能な部分またはクエンチャー部分のいずれか（しかし、両方ではない）は、支持体に取り付けられた状態でとどまるが、他方は、遊離して大部分の反応混合物中に移動し、その取り付けられた状態でとどまっている部分から離れるように、計画される。従って、切断例では、クエンチャー部分および検出可能な部分が、切断に基づいて分離されるにつれて、検出可能なシグナルが非常に大きく増加する。図3、パネル（i）に示されている態様では、蛍光体を含有する検出可能な部分が、切断後取り付けられた状態でとどまる。これは、その支持体上のシグナルの局在定位を可能にする恩典を有するが、場合によっては、蛍光体が溶液中に放出されることがある。例えば、ライゲーションを行うさらなる態様では、クエンチャーを蛍光体にライゲートし、そのようにして検出可能なシグナルを減少させることができる。
【０１８８】
図3、パネル（ii）を参照して、異なるターゲットに特異的な多数のMNAzyme（二つ示されている）を作製するための多数のMNAzyme成分を含む多重化された方法を示す。この態様は、特定の判っている場所、例えば「チップ」の中に基質を含む構造を包含し、非常に多数の基質、例えば基質1、基質2への結合に多数の場所を利用することができる。各基質の検出可能な部分をその場所にトレースすることができ、その位置に係留する。各MNAzyme、例えば、MNAzyme 1、MNAzyme 2について、ターゲット、例えばターゲット1、ターゲット2が、例えば試験溶液中に存在する場合、そのターゲットに対応するおよび特異的なMNAzymeは、自己組織化することとなり、その対応する基質の切断を触媒し、結果として、その位置でシグナルを生成することができる。従って、その検出可能なシグナルの場所により、どのMNAzymeが、その基質を切断したか、および従って、どのターゲットが、その試験溶液中に存在するかが同定される。本態様において、基質の修飾は、その位置により同定可能なシグナルを生じさせる。この基質は、独自に同定可能な検出メカニズム、例えば異なる蛍光体を必要としないが、そのような考慮が本発明の範囲内であることは、当業者には理解される。
【０１８９】
別様にはアレイまたはマイクロアレイとして知られている「チップ」の形態の不溶性支持体を包含する本発明の態様は、一般に、そのチップに連結された、係留された、または別様に取り付けられた多数の基質を含む。特定の形態において、それらの基質は、核酸を含む。多数の核酸を、当技術分野において公知の任意の適する方法により、例えばピペット、インクジェット印刷、コンタクトプリンティングまたはフォトリソグラフィーにより、そのチップ上に配置することができる。このチップは、少なくとも一つの素子からなることができ、各素子が少なくとも一つの核酸を含む。この少なくとも一つの素子は、同じ配列の多数の核酸からなる場合もある。チップを構成する素子の数は、いずれの数であってもよく、多数の素子が一つのチップ上に配置される場合、それらの素子に、均一な距離もしくは可変的な距離またはそれらの組み合わせで間隔をあけることができる。一部の態様では、それらの素子をランダムに配置し、その後、各素子のそれぞれの位置を決めることができる。それらの素子のサイズおよび形状は、本発明の特定の用途に依存し、異なるサイズおよび形状の素子を組み合わせて一つのチップにすることもできる。このチップの表面は、実質的に平面である場合もあり、または陥没部もしくは突起部などの特徴を有する場合もあり、それらの素子が、それらの陥没部または突起部に配置される場合もある。そのような陥没部は、素子を浸漬させる溶液のレザバーとなることができ、またはそのような突起部は、素子の乾燥を助長することができる。例えば、素子を96ウエルプレートの各ウエルに配置することができる。一部の態様において、チップは、各々の素子を同定するために、固有識別子、例えば表示、無線周波タグ、集積装置、例えばマイクロプロセッサ、バーコードまたは他のマーキングを含む場合がある。これらの固有識別子は、追加でまたは代替として、そのアレイの表面の陥没部または突起部を含む場合がある。さらに、これらの固有識別子は、そのチップの正しい配向または同定のために提供することができる。これらの固有識別子は、データ取り込み装置により、または光学スキャナもしくは光学検出装置により直接読み取ることができる。
【０１９０】
6.上記方法において使用されるレポーター基質系
本発明に従って、異なるターゲットを認識する新たなMNAzymeを作り出すために設計を容易に変更できることで迅速なアッセイの開発を可能にするジェネリックレポーター基質系も提供する。本明細書において論じているように、パートザイムの基質アーム部分および触媒コア部分は、変わらずとどまることができ、新たなターゲットに必要な一つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみが変わる。ジェネリック基質配列が提供され、従って、同基質を多数の異なるターゲットのためのアッセイに組み込むことができる。さらに、同基質は、基質が溶液中で遊離している、または支持体に係留されているもしくは取り付けられている場合のアッセイを含む本明細書において様々な態様における方法に組み込むことができる。一連のジェネリック基質を多重反応において使用して、多数のターゲットの同時検出を可能にすることができる。
【０１９１】
ジェネリック基質を使用するMNAzyme戦略は、各々の新たなターゲットに特異的なプローブの設計および使用を必要とする技法、例えば、TaqMan（登録商標）またはBeaconsに勝る重要な利点をもたらす。
【０１９２】
7.上記方法において使用される基質
以下でさらに詳細に説明するようにMNAzymeは、ユニバーサルまたはジェネリック基質を利用することができる一定の態様において有利な特性を有する。そのような基質を、基質が検出可能な部分とクエンチャー部分の両方を含む現在好ましい構成で図1に示す。このクエンチャー部分は、基質がMNAzymeによって切断されるまで、その基質の検出可能な部分からの検出可能なシグナルの減少または消去に適応している。例えばこのクエンチャー部分は、「ブラックホールクエンチャー1」（BHQ1）または「ブラックホールクエンチャー2」（BHQ2）を含むことができる。
【０１９３】
従ってMNAzymeは、検出可能な部分とクエンチャー部分の間で基質を切断してそれら二つの部分を溶液中で分離させ、その結果クエンチャー部分を検出可能な部分の局所的環境から遠ざけ、または有効に除去するので、検出可能なシグナルを出現または増加させることができる。
【０１９４】
ジェネリックまたはユニバーサル基質の使用は、MNAzymeの成分パートザイムの設計によって可能となる。それらのパートザイムのセンサーアームのみを改変することにより、しかし基質アームは変えずに残すことにより、多数のターゲットの各々に特異的な非常に多様なMNAzymeを設計することができ、これらのすべてが検出にユニバーサル基質を利用する。各ターゲットのためのカスタマイズされたまたは固有の基質の必要性を無くすという点でこれがもたらす利点は、当業者には分かる。各々の新たなターゲットは、一つまたは複数のセンサーアーム部分の一つまたは複数の変化しか必要とせず、基質アーム部分および触媒コア部分は不変のままとどまることができる。従って単一のレポーター基質が、MNAzymeを使用する単一のターゲットのために使用される場合もあり、改変されたMNAzymeを使用する一連のアッセイで多数のターゲットのために使用される場合もある。多数のレポーター基質が、多数のMNAzymeを各ターゲットについて一つ使用して単一のアッセイにおいて多数のターゲットを検出する多重化を可能にする。MNAzymeを使用するこのような多重化方法は、溶液中で（図18）または支持体システムに取り付けて（図3）容易に遂行される。このようにして、本明細書において説明するような支持体への基質またはMNAzymeパートザイムまたは組織化助長因子または追加の酵素活性のうちの一つまたは複数の取り付けを伴うシステムで多重化アッセイを遂行できることは、本明細書において考慮されている。
【０１９５】
さらに、基質を追加の単位、例えば標識された核酸、ナノ粒子、ミクロ粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックされた核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはこれらの任意の組み合わせに組み込むことができる。例えばナノ粒子は金ナノ粒子であり得、これらの金ナノ粒子は多数のターゲット、例えば核酸と会合している。
【０１９６】
MNAzymeによって基質を修飾し、それによって検出可能な作用をもたらすことができる。この検出プロセスにおけるMNAzymeによる基質の修飾は、例えば切断、ライゲーション、ポルフィリンメタレーション、炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を伴う場合がある。MNAzymeによる基質修飾の結果として検出可能な作用が生みだされ、従ってその作用の大きさは、測定しようとするターゲットの量を示す。この検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む様々な方法によって検出することができる。
【０１９７】
幾つかのグループが、比色読み出しでの核酸ターゲットおよび他の分析物の検出を報告している（Elghanian et al, 1997、Mirkin et al, 1996、およびLiu and Lu, 2004）。この戦略は金ナノ粒子（これらの各々が、その表面に取り付けられた別個のDNAオリゴヌクレオチド配列を有する）のバッチの作製を伴う。その後、それらの金ナノ粒子に取り付けられている配列との相補性を有する「架橋性オリゴヌクレオチド」の添加により、金ナノ粒子を凝集させることができる。粒子凝集は結果として、赤色から青色への付随的な色の変化を生じさせる（Mirkin et al, 1996）。さらに最近の研究により、それらの架橋性オリゴヌクレオチド内にDNAzyme基質配列を含めることによって、金粒子の凝集を逆転させるメカニズムを生じさせることができることが証明された（Liu and Lu, 2004）。DNAzymeの活性化、および基質/架橋性オリゴヌクレオチドのその後の切断は結果として、金粒子の解離および青色から赤色への色の変化を生じさせた。
【０１９８】
その触媒活性のリードへの特定のDNAzymeの依存性を利用することによって機能する、上の概念に基づく単純なリード検出装置が考案された。金粒子を凝集させるために使用される架橋性オリゴヌクレオチドを切断するDNAzymeが設計された（Liu and Lu, 2004）。同様に、アデノシンに特異的なアプタマーを含有するアプタザイム、およびアデノシンが存在する場合にのみ架橋性オリゴヌクレオチドを切断することができるDNAzymeにより、比色形式でのアデノシンの検出が可能になった。
【０１９９】
8.上記方法の最適化
本明細書に記載する方法を、様々な実験パラメータを使用して最適化して、ターゲットの検出、同定および/または定量を最適化できることは、当業者には容易に理解される。最適化される特定の実験パラメータおよびそのような最適化のレベルは、利用される特定の方法、ならびに検出、同定および/または定量しようとする特定のターゲットに依存する。そのようなパラメータとしては、時間、温度、塩、界面活性剤、カチオンおよび他の試薬（ジメチルスルホキシド（DMSO）が含まれるが、これに限定されない）の濃度、長さ、相補性、GC含量、ならびに核酸の融点（Tm）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２００】
一部の態様、例えば、配列変異の検出および/またはメチル化DNAの検出を伴う方法において、実験パラメータ、好ましくは、その方法を行う温度を含む実験パラメータは、配列変異またはメチル化ヌクレオチドを含むまたは含まないターゲット核酸、それぞれへのMNAzyme成分核酸の結合間を区別するように最適化することができる。そのような方法を行うことができる温度は、約20℃から約96℃、約20℃から約75℃、20℃から約60℃、または約20℃から約55℃の範囲内であり得る。
【０２０１】
一つの好ましい態様において、MNAzymeを使用する方法を実施するための最適化反応を本明細書において提供する。このような最適化反応では、触媒活性が非最適化反応の10、20、または30％上まで増大される。さらに好ましい反応条件は、触媒活性を少なくとも35％または40％、および好ましくは50％以上にまで向上させる。さらにいっそう好ましい態様において、最適化反応は50％より多くの、および66％までの、75％までのまたは100％までもの触媒活性の増加を有する。さらにいっそう好ましい態様において、完全最適化反応法は100％以上、200％以上または300％以上もの触媒活性の増加をもたらす。他の好ましい反応条件は、非最適化反応条件で実施される方法より1000％以上まで触媒活性を向上させることができる。本明細書において提供する方法を最適化するための非常に好ましい反応条件は、一定の二価カチオンを含めることである。殆どの核酸酵素の触媒活性は、二価カチオンの濃度による影響を濃度依存的様式で受け得る。好ましい最適化反応は、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、およびPb2+のうちの一つまたは複数について最適化される。
【０２０２】
9.アプタマーを使用する方法
核酸以外のターゲットを含むターゲットの検出、同定および/または定量を助長することができるアプタマーを用いて本明細書記載の方法を行うことができることは、当業者には容易に分かる。
【０２０３】
図4および20を参照して、非核酸単位を含むターゲットを検出するためにMNAzymeを使用する方法を例示する。本方法は、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する核酸またはタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたはこれらの組み合わせを含むことができるアプタマーを使用する。アプタマーは例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、全生物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、または任意の他の単位に結合することができる（Lee et al., 2004）。
【０２０４】
本明細書において好ましいアプタマーは、吸収、回収および再増幅の反復プロセスにより合成核酸またはペプチドの複合ライブラリーから単離することができる短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーまたはペプチドを含むことができる。従ってアプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼあらゆるターゲットに対して生じさせることができる。好ましい態様において、アプタマーとしては例えば、好ましくは発生および選択技術により生成される核酸結合分子が含まれる。好ましくはアプタマーは、例えば上の表2のとおりのヌクレオチド類似体を含む（しかし、それらに限定されない）DNAもしくはRNA分子、または両方の組み合わせを含むことができる。
【０２０５】
MNAzymeとアプタマーの使用を組み合わせるための戦略を図4および20に図示する。図4、パネル（i）を参照して、このMNAzyme検出戦略に必要な核酸オリゴヌクレオチドは、（a）標準的なパートザイム；（b）アプタマー（太線の配列）と、ヘアピンを形成することができ、従ってMNAzyme組織化を阻害することができる相補配列とが組み込まれているパートザイムである、アプタ-パートザイム；（c）アプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合することができ、従って活性MNAzymeの組織化を可能にする、組織化助長因子；および（d）基質を含むことができる。ターゲット分析物（An）が不在の場合、アプタ-パートザイムは活性MNAzymeの組織化を阻害するヘアピン構造をとる。ターゲット分析物が存在する場合そのターゲット分析物は、アプタ-パートザイムのアプタマードメインに結合し、そのようにしてヘアピン構造を破壊し、そのアプタ-パートザイムが活性MNAzymeの組織化に参加できるようにする。その後、その活性MNAzymeが基質を修飾して、例えば蛍光シグナルを生じさせることができる。
【０２０６】
図4、パネル（ii）を参照して、このMNAzyme検出戦略に必要な核酸オリゴヌクレオチドは、（a）二つの標準的なパートザイム；（b）アプタマー（太線の配列）と、ヘアピン構造を形成することができる相補性阻害配列とが組み込まれている、組織化助長因子；および（c）基質を含むことができる。ターゲット分析物が不在の場合組織化助長因子は、活性MNAzymeの組織化を命令するこの成分の能力を阻害するヘアピン構造をとる。ターゲット分析物が存在する場合そのターゲット分析物は、組織化助長因子のアプタマードメインに結合し、そのようにしてヘアピン構造を破壊し、その成分が活性MNAzymeの組織化を導くことができるようにする。その後、その活性MNAzymeが基質を修飾して、例えば蛍光シグナルを生じさせることができる。
【０２０７】
単数または複数の組織化助長因子分子のいずれかの末端にアプタマーを組み込むことができることは、当業者には分かる。さらにパートザイムオリゴヌクレオチド成分の一つまたは複数に多数のアプタマーを組み込むことができることは、分かる。図4、パネル（i）および（ii）に図示されている戦略における組織化助長因子は、DNA、RNA、LNA、PNA、または一つまたは複数のヌクレオチド塩基類似体を含有する配列を含むことができる。他の態様において、ターゲットAnは核酸である。このような態様では、ターゲット核酸に相補的な配列が図4中の太線アプタマー配列の代わりになる。
【０２０８】
図4パネル（iii）を参照して、このMNAzyme検出戦略に必要な核酸オリゴヌクレオチドは二つのアプタ-パートザイムを含むことができ、それらの各々がアプタマーの一部分を含有する。ターゲット分析物が不在の場合、活性MNAzymeは組織化できない。ターゲット分析物が存在する場合そのターゲット分析物は、オリゴヌクレオチド成分を互いに架橋させ、そのようにして活性MNAzymeの組織化を導く組織化助長因子としての役割を果す。その後、その活性MNAzymeが基質を修飾して、例えば蛍光シグナルを生じさせることができる。
【０２０９】
アプタマー結合とMNAzyme組織化を併用する関連戦略を図20に図示する。この戦略においてアプタマー配列は、ターゲット分析物が存在する場合にのみ活性MNAzymeが形成される配座で、パートザイムの末端に組み込まれている（アプタ-パートザイム）。図示されているMNAzyme検出戦略に必要なオリゴヌクレオチド成分は、（a）標準的なパートザイム；（b）アプタマーがその末端の一方に組み込まれているパートザイムである、アプタ-パートザイム；（c）アプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合して、（ターゲットが存在する場合に）活性MNAzymeの組織化を可能にする、組織化助長因子；（d）レポータープローブ基質；および（e）少なくともそのアプタマー配列の一部およびそのパートザイム配列の基質結合アームの一部にわたる領域内のアプタ-パートザイムにハイブリダイズする、組織化阻害剤を含む。ターゲットが不在の場合（左手のパネル）組織化阻害剤はアプタ-パートザイムに結合し、そのようにしてレポータープローブ基質の結合（および切断）を遮断する。ターゲットが存在する場合（右手のパネル）そのターゲットはアプタ-パートザイムのアプタマー配列に結合して、組織化阻害剤の結合を防止し、レポータープローブ基質の結合および切断を可能にする。従って活性MNAzymeは、ターゲットが存在する場合にのみ形成し、蛍光シグナルを生じさせることができる。
【０２１０】
さらに活性MNAzymeの形成を防止する相補的阻害配列が、オリゴヌクレオチドパートザイム成分に組み込まれている（図4、パネル（i））か、別の分子に組み込まれている（図20）という違いはあるが、図20に図示されているような戦略が図4のパネル（i）に図示されているものに類似していることは、当業者には分かる。従って阻害配列は、別の分子である場合もあり、またはMNAzyme複合体に参加している成分のうちの一つに組み込まれている場合もある。
【０２１１】
一つまたは複数のアプタマーが、パートザイム、組織化助長因子または基質を含むオリゴヌクレオチド成分のいずれにも組み込むことができることも、当業者には分かる。さらにアプタマーは、これらのオリゴヌクレオチドのうちのいずれか一つのいずれかの末端に組み込むことができる。
【０２１２】
アプタマー/MNAzyme戦略を使用して、それぞれ小分子（ATP）およびタンパク質（Taqポリメラーゼ）を検出する実施例18および21を参照することによって、本発明をより良好に理解することができる。
【０２１３】
10.ミクロRNAの検出、同定および定量のための方法
ミクロRNAの検出、同定および/または定量が、本明細書に記載する方法の特定の態様を代表することは、当業者には理解される。図5を参照して、短い核酸配列（例えば、ミクロRNA（miR））の増幅およびMNAzymeを使用するアンプリコン検出のための戦略を例示する。
【０２１４】
ミクロRNA（miR）などの短い核酸配列の検出は、主としてこれらのターゲットの小さいサイズのために追加の戦略を必要とする。MiRは、約22ヌクレオチドの長さの非コーディングRNA分子である。クローニングまたはノーザンブロット分析によってそれらを検出できるが、これらの方法は骨が折れ、またRT-PCRなどの技法より大量の全RNAを必要とする。miRの小さなサイズは、標準的な設計の二つのPCRプライマーを収容するには不十分な配列をもたらす。さらに、miR増幅を遂行した場合でさえサイズ（電気泳動によって確かめる）を用いて、またはSybr Greenもしくはエチジウムブロミドなどの非特異的染料の挿入から蛍光を用いて、プライマー-二量体と本物のアンプリコンを区別することは難しい。この限界は、TaqMan（登録商標）またはBeaconプローブなどの内部ハイブリダイゼーションプローブでmiRアンプリコンをプロービングすることによって克服できたが、重ねてこれらのアンプリコンの小さなサイズは、標準設計のプローブの使用を妨げる。
【０２１５】
miR分析のための修飾TaqMan（登録商標）RT-PCR法（Chen et al., 2005）は、miR特異的3’末端と、ステムループを形成することができるそれらの5’末端における追加の非関連配列とを有する3’プライマーを使用して逆転写を開始させる。生成されたcDNAを、これらの3’プライマーおよび5’プライマー（これらも、miR特異的3’末端と、それらの5’末端における追加の非関連配列とを有する）を使用して増幅させる。それらのプライマーによって導入されるmiR配列と非関連配列の両方に結合するTaqMan（登録商標）プローブを使用して、その増幅を実時間でモニターする。しかし、そのプライマー設計、ならびにTaqMan（登録商標）プローブのサイズおよび位置決めのため、特異的miRを密接に関連した配列と区別できない可能性はまだ存在する。
【０２１６】
図5に示されているようにここで利用される方法は、好ましくはその3’末端のmiRに結合する3’プライマーを利用し、ならびに5’末端でステムループを形成することができるまたはできない、miRと関連のない、伸長配列を有する。図5が示しているようにそのプライマーの非関連配列は、ループ構造を作る場合もあり（図5、左手側）、または単にタグ構造を作る場合もある（図5、右手側）。いずれの例においても3’ miRプライマーを、逆転写酵素が存在する状態で伸長し、その後3’末端にmiR特異的配列を有し、5’末端に非関連伸長配列を有する5’および3’プライマーを使用してPCR増幅する。それらのアンプリコンは、5’プライマーと3’プライマーの間の領域を含むアンプリコンを認識し、そのアンプリコンにハイブリダイズするMNAzymeによって、容易に検出される。MNAzymeセンサーアームとターゲット核酸との相補性のための厳格な要件により、密接に関連した配列であっても識別することができる。下の実施例の中の実施例5および実施例10は、短い核酸配列の増幅によって生成されたアプリコンを検出するためのMNAzymeの使用の結果を明示している（上の図2における戦略2も参照）。さらに実施例5は、ただ一つのヌクレオチドの違いしか有さない二つの配列間を区別する、MNAzymeを使用する方法の能力を実証する。これは、その増幅プロセスによって密接に関連した配列間の識別ができないときでさえ、MNAzymeにより結果として生じるアンプリコンの小さな配列変異間の識別が可能になるという点で重要な利点をもたらす。
【０２１７】
11.カスケードを使用する方法
本明細書に記載する方法を使用して、本明細書において定義するようなカスケードを行うことができることは、当業者には分かる。本明細書において開示するようなそのような方法を行う特定の態様は、以下を含むがそれらに限定されるわけではない：（1）ターゲットが存在する場合にのみ基質を切断するようなMNAzymeの使用。その後、該基質が第二の事象、例えば検出可能なシグナルの生成への関与のために利用可能になる。例えば、基質の切断により酵素が利用可能になり、その後それがアンカーを切断し、その結果クエンチャーからの蛍光タグの解離が生じる図6に示されている使用；または（2）例えば低存在度のターゲットが、検出可能なシグナルを別な方法では準備できない用途における、ターゲットが存在する場合にのみ基質を切断するようなMNAzymeの使用。その後該基質が、第二の事象への関与のために利用可能になり、そしてまた該第二の事象の動作が、任意の数の後続の事象に関与するためにさらなる基質を利用可能にするので、後続の事象により、基質が先行の事象の動作への関与に利用可能となり、その結果循環型カスケードが生じる。例えば、シグナルを増幅するためにそのような循環型カスケードを利用する図7および25に示されている使用。
【０２１８】
検出可能な作用の増幅カスケードは、リボザイム/リガーゼカスケード、環状核酸酵素カスケード、タンパク質酵素カスケード、もしくは支持体に取り付けられた一つまたは複数の酵素のうちの一つまたは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２１９】
図2を参照して戦略3は、シグナルカスケードの使用によりシグナルを増幅するためにMNAzymeを使用する方法の概要を示すものである。これは図6、7および25を参照して、さらに詳細に論じる。
【０２２０】
図6は、酵素媒介シグナル増幅に連結させたターゲットのMNAzyme検出の例示的方法を示すものである。上で論じたように本発明は、ターゲットを増幅するMNAzyme検出を使用する方法、ならびに生成されたシグナルを増幅する方法に備えている。一部の態様においてシグナル増幅戦略とMNAzyme技術の併用は、ターゲット増幅と併用されるMNAzymeアッセイの代替となるが、一部の事例ではターゲット増幅とシグナル増幅の両方を一緒に使用する場合もある。シグナルの好ましい増幅方法は、当業者には分かるように、生体系におけるシグナル増幅に、多くの場合関与するカスケードメカニズムを伴う。
【０２２１】
触媒核酸を使用する増幅カスケードの幾つかの例は、当技術分野において公知であり、本明細書において使用するために考慮されている。ライゲーションカスケード（Paul and Joyce, 2004）は、オリゴヌクレオチドを含有する二つのRNAをライゲートする第一のリボザイム（A）を使用して、第二のリボザイム（B）を形成する。その後リボザイム（B）は、オリゴヌクレオチドを含有する他の二つのRNAをライゲートして、新たな第一リボザイム（A）を形成し、このようにしてカスケード反応を誘発する。
【０２２２】
本明細書における使用に適する第二の増幅カスケードは、環状化DNAzyme/基質分子（Levy and Ellington, 2003）を使用する。DNAzyme（A）は環状であるときには不活性であるが、その環状DNAzyme（A）を切断する第二のDNAzyme（B）による線形化によって活性化された状態になる。その後、活性線状DNAzyme（A）は、環状DNAzyme（B）分子を切断し、従ってそれらを線形化し、活性化する。互いに切断/線形化することができるこれら二つのDNAzymeが、触媒核酸活性のカスケードを生じさせる。
【０２２３】
他のアプローチ、例えば、DNAzymeの使用をアプタマーの融通性とおよび/または伝統的なタンパク質酵素の触媒力と組み合わせるアプローチ（例えば、Zhang et al., 2005）、を利用できることは、当業者には理解される。Zhangの方法はタンパク質酵素の放出を生じさせ、そして今度はその酵素が検出可能な分子の形成を触媒し、その結果シグナルが生成および増幅される。Zhangのアプローチは高感度検出を可能にするが、各アッセイのために高度にカスタマイズされた分子を必要とするので費用がかかる。ペプチドと核酸のカップリング方法は、当技術分野において公知であり（例えば、Cheng et al., 1993参照）、支持体構造にDNAを取り付けるための方法も公知である。例えばAsher（PCT/US96/02380）は、不溶性支持体への酵素（リボザイム）の係留を記載しており、これは放出されると、二つの空間的に離れたリボザイムを使用して基質を切断し、その結果シグナルの増幅を開始させる。
【０２２４】
インビトロ法のためのシグナル増幅の他の例は当技術分野において公知であり、証明に成功したものに類似の技術を使用して、さらに他のシグナル増幅戦略を作ることができる。例えば、分岐DNAアッセイ（bDNA）（Urdea, 1993）は、反応を媒介する標識プローブに取り付けられた第二レポーター分子（例えば、アルカリホスファターゼ）を利用することによりシグナルを増幅する。蛍光相関分光法（FCS）は、シグナルの電子的増幅を利用する（Eigen and Rigler, 1994）。チラミドシグナル増幅（TSA）（Bobrow et al., 1989；Adams, 1992；Raap et al., 1995；van Gijlswijk et al., 1997）は、ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して、チアミシドをタンパク質中のチロシン残基に結合するその活性形に変換する。TSAは細胞免疫化学の様々な用途に使用される。インベーダーアッセイ（Hall et al., 2000）は、ヌクレアーゼ切断がある期間にわたってターゲット分子当たり1000より多くの切断事象をもたらすことができる様式で、ターゲット配列に結合する二つのオリゴヌクレオチドを利用し、その切断反応を蛍光プローブに連結させることができる。しかし、公知シグナル増幅法には限界がある。例えばbDNAアッセイは、ターゲット増幅法ほど高感度ではない。
【０２２５】
従って図6にさらに注目して、シグナル増幅戦略の一部としてMNAzymeにより放出される酵素を利用する方法の一例を示す。例えば、蛍光体部分とクエンチャー部分の間で基質を酵素的切断し、そのようにしてシグナルを生じさせることによって、そのシグナルを生じさせることができる。本明細書において使用するために考慮される酵素としては、DNAzyme、MNAzyme、リボザイム、ならびに測定可能な活性を有するタンパク質酵素、例えば、プロテアーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよび他の加水分解酵素が含まれるがそれらに限定されるわけではない。好ましいターゲットは、ヒト、動物、植物、ウイルス、細菌のDNAまたはRNAを含むがこれらに限定されるわけでなない核酸配列である。他の好ましいターゲットとしては、プリオン、酵母もしくは真菌、または任意の他の分子（例えば、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、全生物、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはこれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせが含まれるがそれらに限定されるわけではない）を含むことができる。
【０２２６】
図6において見られるように、本明細書においては「エンザイム」と示されている例示的酵素を切断可能な分子、好ましくは核酸によって、第一の不溶性支持体に取り付ける。図6における例に示されているように、酵素「エンザイム」のための取り付け具としての機能を果すその切断可能な分子は、ジェネリックまたはユニバーサルMNAzyme基質である。また、第一不溶性支持体と接触していない不溶性支持体に、酵素「エンザイム」のための「切断可能なアンカー」基質を取り付ける。「エンザイム」は、検出可能な活性を有する任意の酵素、例えば、MNAzyme、DNAzyme、リボザイム、または上で説明したようなタンパク質酵素である。好ましい態様では、MNAzymeまたはDNAzymeが特に有用である。自己組織化してユニバーサルもしくはジェネリック基質を切断することができるMNAzymeを形成するオリゴヌクレオチド成分またはパートザイムが存在する場合、およびMNAzymeのためのターゲットが存在する場合、MNAzymeが形成し、支持体から「エンザイム」を触媒的に切断し、その結果それが遊離され、「切断可能なアンカー」基質に接近できるようになり、それを切断する。「切断可能なアンカー」の切断により、取り付けられた基質から蛍光体が放出される。その蛍光体は容易に検出および測定される。
【０２２７】
固定されているまたは取り付けられている酵素のその基質（これも、好ましくは支持体に固定されているまたは取り付けられている）からの物理的分離を、本明細書では時として「空間的分離」と呼ぶ。一つまたは複数の酵素をそれらそれぞれの基質から、および互いに「空間的に分離」させることができる。特に、第一酵素のための基質の切断により第二酵素が放出され、そしてまたその第二酵素のための基質が切断されると、それによりさらなる第一酵素が放出されるシグナル増幅カスケードが結果として生じる（図7参照）。
【０２２８】
好ましい態様において、酵素「エンザイム」のための基質は、クエンチャー部分と検出可能な部分の両方を含む、示されているような二官能性基質である。酵素「エンザイム」が、未切断基質中にある間は検出可能なシグナルを有さない分子であり、切断されると、その検出可能なシグナルが一桁から何桁も大きさが増加する態様が、特に好ましい。
【０２２９】
図7を参照して、MNAzymeおよび二つの「空間的に分離した」酵素を使用するシグナル増幅を用いるアッセイの一例を示す。シグナル増幅カスケードは、上で説明したような「空間的に分離した」DNAzymeを使用して生じさせることもできる。最初のMNAzyme切断事象により、固定され係留された基質が切断され、その結果DNAzyme Aが放出される。その後、DNAzyme Aは、第二のDNAzyme Bが係留されている第二の配列に移動する。DNAzyme Aは、DNAzyme Bを放出し、そして今度はそれがさらなるDNAzyme Aを放出させる。シグナル増幅を生じさせるカスケードが開始される。様々な態様においてそのターゲットは、ヒト、ウイルス、細菌のDNAもしくはRNAを含むがこれらに限定されるわけでなない核酸配列である場合もあり；またはそのターゲットは、タンパク質、ウイルス、プリオン、抗体、全細胞もしくは小分子である場合もある。
【０２３０】
詳細には、DNAzyme Bによっても切断される第一ユニバーサルMNAzyme基質またはジェネリック基質によってDNAzyme Aが支持体に取り付けられていることは、図7における例からわかる。DNAzyme Bは、DNAzyme Aのための基質である第二のジェネリック基質によって不溶性支持体に取り付けられている。両方のDNAzymeは、それらのそれぞれの基質がそれらに近づけないように保持されている。自己組織化して、ユニバーサル基質を切断するMNAzymeを形成するパートザイムが存在する場合、およびターゲットがさらに存在する場合、MNAzymeが形成され、DNAzyme Aを保持するユニバーサルMNAzyme基質を切断し、その結果DNAzyme Aが放出される。このとき、DNAzyme Aは、第二のジェネリック基質に移動することができる。DNAzyme Aにより第二のジェネリック基質が切断されると、DNAzyme Bがここでは蛍光体Fと示されているその付属の検出可能なシグナルとともに放出される。このとき蛍光体Fは、保持されていたクエンチャー部分Qから分離されるので、検出可能となる。このときその基質に近づくことができる遊離DNAzyme Bは、そうすることでそれ（第一ジェネリック基質）を切断し、その結果追加のDNAzyme Aが放出され、そしてまたそれがさらなるDNAzyme Bおよび検出可能なシグナルFを放出させる。このようにして、検出可能なシグナルFの量の指数的増加を伴う強力なシグナル増幅カスケードが確立される。
【０２３１】
係留パートザイムを使用するMNAzymeカスケードの例は、図25への参照により、より良く理解することができる。このダイヤグラムに図示されているように、MNAzymeを使用してシグナル増幅カスケードを開始させることができる。この反応は次の要素を含有する。（i）溶液中で遊離しているMNAzyme 1についてのパートザイム；（ii）溶液中で遊離している（図示されているとおり）または基質、Sub 1によって不溶性支持体に係留されている、MNAzyme 2または3（これらは、同じセンサーアームを有する）のための組織化助長因子；（iii）基質、Sub 1によって不溶性支持体に係留されているMNAzyme 2についてのパートザイム。Sub 1は、MNAzyme 1（ターゲット分析物が存在する場合）またはMNAzyme 3（組織化助長因子が存在する場合）のいずれかによって切断することができ、切断の結果、MNAzyme 2についてのパートザイムが溶液中に放出される；（iv）基質、Sub 2によって不溶性支持体に係留されているMNAzyme 3についてのパートザイム。Sub 2は、MNAzyme 2によって切断することができ（組織化助長因子が存在する場合）、切断の結果、MNAzyme 3についてのパートザイムが溶液中に放出される；（v）Sub 2と同じ配列を有するが、溶液中で遊離しており、ならびに蛍光体（F）とクエンチャー（Q）とで二重標識されている、Sub 2-FQ。Sub 2-FQをMNAzyme 2によって切断して、蛍光シグナルを生じさせることができる。
【０２３２】
ターゲット分析物が存在する場合、溶液中で遊離しているパートザイムから活性MNAzyme 1が形成する。MNAzyme 1はそのSub 1を切断し、そのようにしてMNAzyme 2についてのパートザイムを放出する。一旦遊離すると、これらのパートザイムは、組織化助長因子とハイブリダイズし、MNAzyme 2を形成し、これが遊離Sub 2-FQを切断する（蛍光シグナルを生じさせる）か、係留されたSub 2を切断する（MNAzyme 3についてのパートザイムを放出する）。MNAzyme 3はMNAzyme 1と同じ基質アームを共有するので、これも係留Sub 1を切断することができ、そのようにしてMNAzyme 2のためのさらなるパートザイムを放出する。この結果さらなる酵素（MNAzyme）についての成分（パートザイム）の酵素的生成のカスケードおよび付随するシグナル増幅カスケードが生じる。
【０２３３】
12.メチル化核酸の検出、同定および定量のための方法
MNAzyme媒介シグナル生成は、完全にマッチする核酸配列とミスマッチを含有するものとの識別を可能にする。この能力により、MNAzymeをメチル化核酸の検出、同定および定量に使用することができる。
【０２３４】
メチル化パターンの改変は、癌、糖尿病、自己免疫疾患および精神障害などの疾病に随伴してしばしば発生する。メチル化分析のために現在使用されている膨大な大多数のプロトコルは、ゲノムDNAの亜硫酸水素塩修飾で始まる。亜硫酸水素塩修飾は、非メチル化、メチル化されていない、シチジンをウリジンに変換する。その後、例えばPCRによってその亜硫酸水素塩修飾核酸を増幅すると、それらのウリジンはチミジンで置換され、そのメチル化シチジンはシチジンによって置換される。これらの修飾アンプリコンは、（非メチル化Cを本来含有する場所に）Tを含有する配列と（メチル化Cを本来含有する場所に）Cを含有する配列とを識別することができる様々な方法によって分析することができる。
【０２３５】
密接に関連した配列変異体間を識別するMNAzymeの能力が、この技術を本来メチル化されていたまたはメチル化されていなかった亜硫酸水素塩修飾配列間の識別に十分に適するものにする。このアプローチは実施例11への参照により、より良く理解することができる。
【０２３６】
さらに、MNAzymeは、亜硫酸水素塩修飾を必要としないメチル化および非メチル化DNAの直接分析を可能にする新規アプローチを提供することができる。亜硫酸水素塩修飾は骨が折れ、時間が掛かり、分析すべき核酸に対して破壊的であるため、これは有意な利点をもたらす。
【０２３７】
トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムを伴うスタビライザーアームの使用は、組織化助長因子中に存在する単一のヌクレオチド多型を検出するMNAzymeの能力を実証するために用いた（実施例22）。本実施例において使用した実験条件下、トランケートされた（五塩基）センサーアームを有するパートザイムは、その予想融解温度より十分に高い温度で機能した。スタビライザーアームを有する系、およびトランケートされたセンサーアームを有するパートザイムは、ターゲットの小さな変化に対して非常に敏感であり、非常にストリンジェントな温度での使用に適用できる。この検出戦略をさらに拡大して、事前の亜硫酸水素塩修飾を必要とせずに、特定のシトシン残基がメチル化されているまたはメチル化されていないターゲット間を直接識別することができた。
【０２３８】
5-メチルシトシンの存在は、非メチル化シトシンに対して、DNAの融解温度をメチル化塩基当たり1.3℃上昇させる。パートザイム、スタビライザーアームおよび基質を、メチル化ターゲットが存在する場合のハイブリダイゼーションおよび活性MNAzyme組織化に適するが、非メチル化ターゲットが存在する場合のMNAzyme組織化には高すぎる温度でインキュベートすると、シグナルはメチル化ターゲットが存在する場合にのみ生成される。これは、癌および他の疾病のマーカーとしてのメチル化塩基の検出方法を提供することができる、メチル化パターンの直接分析のための新規戦略を提供する。
【０２３９】
従って、本明細書において開示するような温度を含む実験パラメータの最適化が本発明の方法の範囲内であると考えられること、ならびにそのような最適化が、直接的または亜硫酸水素塩修飾後、いずれかのメチル化DNAの検出に関する方法の実施の際に特に適用できることは当業者には分かり、理解される。
【０２４０】
13.核酸配列変異体の検出および同定のための方法
さらに本発明は、MNAzyme媒介シグナル生成により完全にマッチした核酸配列とミスマッチを含有するものとを識別することができることに基づいて、配列変異体を検出および同定するための方法を提供する。
【０２４１】
本発明の方法によって検出することができる配列変異としては、付加、欠失、置換、変換、重複、転座、フレームシフト配列変異体、ナンセンス配列変異体、またはこれらの任意の組み合わせが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２４２】
これらの方法は、疾病もしくはその素因の診断、多型の同定、または核酸複製忠実度の評価を含む（しかし、これらに限定されない）、核酸配列変異を検出および/または同定することが望ましい任意の状況で適用することができる。加えて、より大きな改変、例えば融合転写産物を生じさせる、様々な癌タイプに随伴する転座も、検出することができる。これらは白血病に随伴して発生することが多い。例えばPML/RARα融合転写産物は、急性前骨髄球性白血病に随伴し、およびbcr/abl融合転写産物は、慢性顆粒球性白血病に随伴する。
【０２４３】
MNAzyme媒介ターゲット検出は、パートザイムセンサーアームおよび組織化助長因子のワトソン・クリック塩基認識によって行うことができる。相補性のための要件を利用して、パートザイムセンサーアームと組織化助長因子との間の単一塩基ミスマッチを含む（しかし、これに限定されない）小さな配列変異を検出することができる。配列変異体を識別する能力は、実施例5、19および22への参照により、より良く理解することができる。
【０２４４】
これらの実施例は、すべてセンサーアームと組織化助長因子が完全にマッチしている状況と少なくとも単一の塩基ミスマッチまたは多型が存在する状況との間を識別するMNAzymeの能力を実証するものである。
【０２４５】
単一塩基ミスマッチを識別する能力は、（a）温度、塩濃度、カチオンの濃度を含む多数の因子による影響を受け得る、反応条件のストリンジェンシー、（b）ミスマッチのタイプ、（c）パートザイムアーム内のミスマッチの場所、および（d）パートザイムアームの長さを含む幾つかの因子に依存する。用途に依存して反応のストリンジェンシーは、センサーアームと組織化助長因子の間の何らかのミスマッチ度に対して不寛容または寛容であるように調整することができる。ストリンジェントな条件により、たった一つのヌクレオチドの違いなどの密接に関連した配列変異体の識別が可能となる。より低いストリンジェンシー条件は、組織化助長因子と密接に関連した配列との間を識別できない。従ってこれを利用して、単一のMNAzymeで単一の反応において密接に関連した配列の一群を同時に検出することができる。
【０２４６】
単一のヌクレオチド多型の識別は、トランケートされたセンサーアームを伴うパートザイムの使用によって拡大することができる（図23および実施例22）。別の分子だが、隣接結合しているトランケートされたパートザイムの第二成分とみなすことができるスタビライザーオリゴヌクレオチド成分によって、トランケートされたセンサーアームを安定させることができる。
【０２４７】
14.細菌およびウイルスの検出、同定および/または定量のためのMNAzyme
本発明は、例えば、検出、同定および/または定量しようとする微生物に固有の核酸などの任意の分子へのハイブリダイゼーションに適応したMNAzymeセンサーアームを設計することによる細菌、ウイルスまたは任意の他の微生物の検出方法を包含する。加えてまたは代替的に、例えばグラム陽性またはグラム陰性菌を含むがこれらに限定されるわけでなない微生物の一類を検出することができる。当業者の予期の範囲内であるさらなる方法の変法としては、検出、同定および/または定量しようとする微生物に固有のタンパク質、小分子、細胞、細胞成分または細胞産物、例えば毒素への結合に適応したアプタマーの使用が含まれるが、これに限定されない。
【０２４８】
細菌およびウイルスは、MNAyzme技術を使用するそれらの迅速で高感度な同定、検出および/または定量のためのテンプレートを提供することができるDNAおよび/またはRNAを含有する。細菌およびウイルス種ならびに株の間の配列変異を利用して、個々の種および株間の高感度識別を可能にすることができる。多重MNAzymeアプローチは、多数の細菌またはウイルス種、株または単離物の同時検出および/または識別に特に好ましい。
【０２４９】
あるいは、細菌またはウイルス種および株全体にわたる配列類似性領域を使用して、単一のMNAzymeアッセイで、個々の種および株の任意の群の存在または不在を同定することができる。この後者のアプローチは、無菌性および/またはマイコプラズマ汚染についての急速放出試験の代わりにグラム染色法の細菌試験を使用するアッセイの基礎として、細菌性リボソーム16S配列において見出される保存領域を使用する、実施例15に例示されている。
【０２５０】
HIV-1ウイルスのRNAの検出および定量のためのMNAzymeの使用を例証する実施例16は、ウイルスの検出および定量のための高感度ツールとしてのMNAzymeの使用を実証するものである。
【０２５１】
15.キット
本発明は、本明細書において開示する方法を実施するためのキットも提供する。一般に、本発明の方法を実施するためのキットは、本方法を実施するために必要な試薬すべてを収容している。例えば、一つの態様において、キットは第一および第二パートザイムを含む少なくとも第一および第二のオリゴヌクレオチド成分を収容する第一の容器と、基質を含む第二の容器を含むことができ、それらの第一および第二パートザイムならびに基質のMNAzymeへの自己組織化は、試験サンプル中に存在する組織化助長因子の会合を必要とする。従ってこのような態様では、第一および第二パートザイムならびに基質を試験サンプルに適用して、組織化助長因子（この組織化助長因子が、ターゲットを含む）の存在を判定する。
【０２５２】
一般に本発明のキットは、例えば洗浄用試薬および/または本発明の方法の実施の際に必要とされる他の試薬を収容する、一つまたは複数の他の容器も含む。
【０２５３】
本発明に関連して区画化キットは、試薬が別々の容器に収容されており、且つ、小さなガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックもしくは紙のストリップを含むことができる任意のキットを含む。このような容器は、サンプルおよび試薬の交差汚染を回避しながらの一つの区画から別の区画への試薬の効率的な移送、ならびに定量的様式での一つの区画から別の区画への各容器の薬剤または試薬の添加を可能にすることができる。このようなキットは、試験サンプルを受け入れる容器、アッセイにおいて使用される試薬を収容する容器、洗浄用試薬を収容する容器、および検出試薬を収容する容器も含むことができる。一般に、本発明のキットは、キットの成分を使用して、適切な方法を実行するための使用説明書も含む。本発明のキットおよび方法は、例えば実時間PCR機を含む（しかし、これに限定されない）自動分析装置およびシステムと共に使用することができる。
【０２５４】
異なるターゲットの検出、同定または定量への適用に、本発明の単一のキットを適用できる場合もあり、または代替的に、例えば各ターゲットに特異的な試薬を含有する異なるキットを必要とする場合もある。本発明の方法およびキットは、任意の単位の検出、同定または定量が望ましい任意の状況で適用することができる。
【０２５５】
如何なる点においても本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない以下の特定の実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。
【０２５６】
実施例
以下の実施例において、10：23または8：17DNAzymeのいずれかの触媒コアの分解に基づく幾つかのMNAzyme設計を様々なターゲット核酸および基質に適応させた（表3）。これらのターゲット基質系を様々な反応条件下で試験し、頑丈であると証明した。
【０２５７】
以下の実施例において使用したMNAzyme設計および特定のパートザイムの例を表3に列挙する。パートザイムは、ターゲットドメイン（例えば、RPLPOエキソン4についてはRO4）、MNAzyme触媒活性に必要なドメイン（例えば、A1）および基質ドメイン（例えば、SubBi-1については1）への参照がその名前に組み込まれるように名づけた（例えば、RO4A1/1）。
【０２５８】
(表3) 例示的MNAzymeおよび基質。研究例において使用した特定のパートザイム
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【０２５９】
実施例1：ターゲット核酸（ヒトRPLPO配列）の直接検出へのMNAzymeの適用
1.1パートザイムオリゴヌクレオチド
8：17 DNAzymeに基づくMNAzymeの四つの設計（図8〜10）を試験した。「N」によって示すセンサーアーム（ターゲット結合）配列を任意の公知核酸ターゲットのターゲット特異的配列によって置換できることは、当業者には分かる（図8〜10）。レポーター基質に結合する基質アーム配列は、ジェネリックであり、多数のターゲットに使用できる。図8〜10において「N」によって示す基質配列を、DNA、RNAまたはDNA/RNAキメラ配列によって置換することができ、「r」によって示すものを、他のおよび/または異なる数のリボヌクレオチド配列によって置換することができることは、当業者には分かる。
【０２６０】
図8〜10に記載するRPLPO MNAzymeの触媒活性を測定するために行う実験では、AおよびBオリゴヌクレオチドパートザイムを、RPLPO遺伝子のエキソン4をターゲットにするように設計した。それらのAおよびBパートザイムの配列、5’から3’を下に列挙する（下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする）。
2009509551.tif 000009
【０２６１】
1.2.レポーター基質
二重標識核酸レポーター基質の切断により、MNAzyme活性をモニターした。これらの基質配列は、8：17 DNAzyme基質として以前に使用された、RNA塩基とDNA塩基の両方を含有するキメラ配列である（Li et al., 2000）。本実施例では、レポーター基質をSubBi-1-FBと呼び、これは、内部ラベル、すなわち、RNA塩基のヌクレオチド5’に取り付けた6-カルボキシフルオロセイン（「6-FAM」）およびRNA塩基のヌクレオチド3’に取り付けたブラックホールクエンチャー1（「BHQ1」）部分を有する。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でMNAzymeによるSubBi-1-FBの切断をモニターした。SubBi-1-FBの標識配列、5’から3’は次のとおりであり、下線を付けた塩基は、6-FAMおよびBHQ1部分の位置を示す。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
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【０２６２】
1.3.対照MNAzyme配列
触媒コアの形成に欠くことのできないA1オリゴヌクレオチドにおける単一の塩基を突然変異させることにより、ハイブリダイゼーション対照（不活性MNAzyme）を不活性化した。レポーター基質とターゲット配列は、両方とも、依然としてMNAzymeに結合できるが、MNAzymeの触媒コアにおける修飾のため、その基質を切断することはできない。パートザイム分子へのレポーター基質の結合は、ハイブリダイゼーションに基づくそのレポーター基質の配座変化のため、本質的に、ある程度の蛍光を生じさせることができた。突然変異A1パートザイム分子（RO4A1mut）を使用する対照を含め、ハイブリダイゼーション対照を設計した。その突然変異MNAzyme配列を下に示す。Tに変えたG塩基の位置に下線を引く。
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【０２６３】
1.4.ターゲット
この実施例のターゲット配列は、ヒトRPLPO遺伝子のエキソン4の一セクションと同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、RO4/1ターゲットであった。このRO4/1ターゲットの配列は次のとおりである（5’から3’へと記載）。
2009509551.tif 000012
【０２６４】
正しくないターゲット配列が存在するときにシグナルを検出できないことを保証するために、3μgのラムダDNA（PROMEGA）または非関連配列の合成陰性対照オリゴヌクレオチド（RO4/1mutターゲット）を使用することにより、「オフターゲット」効果を判定した。
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【０２６５】
1.5.反応成分
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、7秒ごとに読み取った。表4におけるすべての反応は、Tris HCl（25℃でpH 9.0）中1μMのSubBi-1-FBと25mM MgCl2のバルクミックスを含有した。
【０２６６】
（表4）核酸の検出のための反応成分
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【０２６７】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。これは、ウエル間で変わることが知られているからである。これは、バルクミックスのみの蛍光を読み取ることによって測定した。その後、ウエル間での比較ができるように、そのウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０２６８】
1.6.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の切断の検出
設計1および2のMNAzymeは、この実験条件下でレポーター基質のターゲット依存性決断の形跡をほとんど示さなかった（図8）。ターゲットRPLPOオリゴヌクレオチドターゲット伴う反応と伴わない反応について、蛍光は同様であった。ターゲットRPLPOオリゴヌクレオチドの添加は、設計3（図9および10）および設計4（図10）についての蛍光を増加させた。これは、蛍光の増加の原因となる蛍光体とクエンチャー色素のペアの間でのレポーター基質の切断を生じさせる、ターゲット核酸が存在する場合の活性MNAzymeの形成と一致する。無ターゲット対照の蛍光は、ターゲット含有反応におけるものより低く、いずれの対照反応も経時的な蛍光の増加を示さなかった（図8〜10）。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因することを明示している。設計4の切断効率は、RPLPO系の設計3より大きかった（図10）。
【０２６９】
設計3についてのオフターゲット、ハイブリダイゼーション、パートザイムAのみおよびパートザイムBのみの対照反応を示す（図9）。これらの対照の蛍光レベルは、無ターゲット反応のものより低いか、それらと同様であった。いずれの対照反応も、経時的な蛍光の増加を示さなかった。これらの結果は、レポーター基質の切断が、活性MNAzymeの組織化に必要なパートザイムAおよびパートザイムBオリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列の両方の存在に依存することを、さらに明示している。
【０２７０】
実施例2：miR-20またはmiR-20に相同な短いDNA配列の検出のためのMNAzyme
2.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeを使用する検出を、miRの分析に利用することもできる。この実施例において、MNAzymeは、正しいmiR配列が存在するときにのみ形成する。このMNAzymeは、関連miR配列、例えばhsa-miR-20とhsa-miR-93とを区別することができる。
【０２７１】
図11に記載するMNAzymeの触媒活性を測定するために行った実験では、AおよびBパートザイムオリゴヌクレオチドを、hsa-miR-20をターゲットにするように設計した。これらのパートザイムAおよびBオリゴヌクレオチドの配列、5’から3’を、下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000015
【０２７２】
2.2.レポーター基質
二重標識核酸レポーター基質の切断により、MNAzyme活性をモニターする。この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を引いた塩基は、5’末端の6-FAM部分および3’末端のBHQ1部分の位置を示す。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）で、FAMとBHQ1の間のリボヌクレオチドでのSubBi-1-FBの切断に起因する蛍光の変化をモニターした。
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【０２７３】
2.3.ターゲット
この実施例のためのターゲットは、RNA hsa-miR-20種に相同である配列を有するDNAオリゴヌクレオチド、D-20であった（図11（i））。D-20ターゲットの配列は次のとおりである（5’から3’へと記載）。
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【０２７４】
2.4.対照配列
ミクロRNAを検出するために開発したいかなるアッセイも、所望のmiR配列、例えばhsa-miR-20と、一つまたは複数の塩基がターゲットmiRと異なり得る関連配列、例えばhsa-miR-17-5p、とを特異的に区別しなければならない（図11（i））。hsa-miR-20関連「オフターゲット」17-5p、93、106aおよび106b miRオリゴヌクレオチドもDNAとして合成した。それらを下に5’から3’へと記載する。
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【０２７５】
2.5.反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計4分間、7秒ごとに読み取った。表5におけるすべての反応は、1μM SubBi-1-FB、Tris HCl（25℃でpH 9.0）および25mM MgCl2からなるバルクミックスを含有した。
【０２７６】
(表5) 図11に示すような核酸ターゲットの検出のための反応の成分
2009509551.tif 000019
【０２７７】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。これは、ウエル間で変わることが知られているからである。これは、バルクミックスのみの蛍光を読み取ることによって測定した。その後、ウエル間比較ができるように、各ウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０２７８】
ターゲット含有、「無ターゲット」および「オフターゲット」反応を、5mMおよび100mM MgCl2濃度が存在する状態でも行い、25mM MgCl2と比較した（図12）。
【０２７９】
2.6.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の切断の検出
MNAzymeのパートザイムAおよびBオリゴヌクレオチドは、ターゲット配列が存在する場合にのみ触媒活性MNAzymeに組織化して、レポーター基質を切断する。この実施例において、オフターゲット対照は、センサーアーム（miR-20ターゲット結合配列）とのミスマッチ塩基を二つほどしか有さない。「オフターゲット」D-17-5pは、二つのミスマッチ塩基を有し、そのうちの一つだけが、miR-20配列の中央に位置する最も差別的な領域において発生する。ターゲット配列D-20を含有する切断反応は、無ターゲット対照と比較して26倍のシグナル増加をもたらした（図11（iii））。これは、オフターゲット対照、D-17-5pおよびD-106a（これらは、無ターゲット対照と比較して3.5倍のシグナル増加をもたらす）ならびにD-93およびD-106b（これらは、無ターゲット対照と比較してシグナルの増加を全くもたらさない）に匹敵する（図11（iii））。このように、D-20と関連配列の違いは、ほんの少数の塩基しか異ならない配列を識別するMNAzyme系の能力を明示している。単分子DNAzymeを使用した以前の研究は、DNAzymeが単一塩基の突然変異を区別する能力を有することを証明した（Impey et al., 2000）。MNAzymeも単一塩基の変化を識別することができる（下の実施例5参照）。
【０２８０】
「パートザイムAのみ」および「パートザイムBのみ」対照は、バックグラウンド蛍光のものと同様の蛍光を有した（データは示さない）。
【０２８１】
タンパク質酵素の使用は、反応中にタンパク質酵素活性に最適な濃度で存在する他の試薬を必要とする。例えば、ポリメラーゼのような酵素を利用するプロトコルでは、レポーター基質の切断の点でDNAzymeを助ける金属イオン補因子の濃度が最低限に保たれる。MNAzymeを使用する直接検出は、タンパク質酵素を一切必要とせず、従って、迅速な基質切断のために反応条件を最適化することができる。これらの反応では、金属イオン補因子、例えば、Mg2+を増加させて、MNAzyme触媒反応速度を最適化することができる。図12は、ターゲット検出プロトコルにおいて通常は許容できないレベルにMgCl2の濃度を増加させることができる方法を示す。高MgCl2（100mM）でのほうが、MNAzymeの触媒効率は高い。さらに、D-20ターゲットを検出するとき、MgCl2の増加は、その反応の特異性に影響を及ぼさなかった。関連配列D-17-5p、ターゲットD-106aターゲット、D-93ターゲットおよびD-106bターゲットとD-20ターゲットを、尚、明瞭に区別できるからである。
【０２８２】
実施例3：核酸ターゲットの直接検出のためのMNAzyme（設計5および6）
3.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
10：23 DNAzymeに基づくMNAzymeの設計5および6を触媒活性について試験した（図13）。「N」によって示すセンサーアーム（ターゲット結合）配列を任意の公知核酸ターゲットのターゲット特異的配列によって置換できることは、当業者には分かる。レポーター基質に結合する基質アーム配列は、ジェネリックであり、多数のターゲットに使用できる。図13において「N」によって示す基質配列を、DNA、RNAまたはDNA/RNAキメラ配列によって置換できることは、当業者には分かる。
【０２８３】
図13に記載するRPLPO MNAzymeの触媒活性を測定するために行った実験では、AおよびBオリゴヌクレオチドパートザイムを、RPLPO遺伝子のエキソン5をターゲットにするように設計した。それらのAおよびBパートザイムの配列、5’から3’を下に列挙する（下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする）。好ましくは配列番号：17および配列番号：18において、下線が引かれておらず、太字でもなく、イタリック体でもない配列が、図13に示すような幹構造を形成する（例えば、設計5参照）。
2009509551.tif 000020
【０２８４】
3.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2である。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000021
【０２８５】
3.3.ターゲット配列
この実施例のターゲット配列は、下のとおりの配列、5’から3’を有する合成オリゴヌクレオチドRO5/1ターゲットであった。このターゲット配列は、RPLPO遺伝子の一セクション、エキソン5と同じ配列を有する。
2009509551.tif 000022
【０２８６】
3.4.反応成分
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において55℃で行った。各反応の蛍光を、合計5分間、7秒ごとに読み取った。表6におけるすべての反応は、1μM SubBi-2-FB、Tris HCl（25℃でpH 9.0）および25mM MgCl2を含有した。
【０２８７】
(表6)  図13に示すような核酸ターゲットの検出のための反応の成分
2009509551.tif 000023
【０２８８】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。これは、ウエル間で変わることが知られているからである。これは、バルクミックスのみの蛍光を読み取ることによって測定した。その後、ウエル間比較ができるように、そのウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０２８９】
3.5.結果：基質の検出および切断
設計5および6のMNAzymeでのターゲット含有反応は、無ターゲット対照と比較して経時的な蛍光の増加を示した（図13（ii）、それぞれ、上および下のパネル）。これは、パートザイムオリゴヌクレオチドが、ターゲット配列が存在する場合にのみ触媒活性MNAzymeに組織化し、レポーター基質を切断することを明示している。無ターゲット対照は、蛍光の増加を示さなかった。これは、発生している切断がなかったことを示している。設計6についての切断速度は、設計5よりかなり速かった。
【０２９０】
実施例4：MNAzymeを使用する核酸配列のインビトロPCR増幅からの増幅の検出
4.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeを使用して、インビトロ増幅核酸配列からのアンプリコンを検出するのに使用することもできる。この実施例についてのアンプリコンの検出は、二段階プロセスとして行うが、単一の反応で行うこともできる。この例において、アンプリコンを検出するために使用するオリゴヌクレオチドは、ヒトRPLPO遺伝子を検出する、オリゴヌクレオチドRO4A2/1およびRO4B3/1を使用する設計4（図10）に基づくものであった。AおよびBパートザイムオリゴヌクレオチドを下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000024
【０２９１】
4.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を引いた塩基は、5’末端の6-FAM部分および3’末端のBHQ1部分の位置を示す。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-1-FBの切断をモニターした。
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【０２９２】
4.3.PCRによるヒトRPLPO遺伝子の増幅のためのプライマー
この実施例のためのターゲット配列は、下に列挙するPCRプライマーを使用する、K562（PROMEGA）細胞系統から抽出したヒトゲノムDNAからのRPLPO遺伝子のエキソン4からの配列のインビトロPCR増幅によって生成した。
2009509551.tif 000026
【０２９３】
4.4.対照ターゲットオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドを合成し、RPLPO配列の陽性対照として使用した。この対照オリゴヌクレオチドは、これらの実験ではPCRによって増幅しなかった。
2009509551.tif 000027
【０２９４】
4.5.反応成分：RPLPO遺伝子のPCR増幅
RPLPOのPCR増幅を25μLの総反応容量で行った。すべての増幅反応は、GeneAmp（登録商標）PCR System 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems）で行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で5秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で5秒間および55℃で30秒間であった。すべての反応は、500ngのK562ヒトゲノムDNA（PROMEGA）と共に、またはなしで、40nMの5RO4/3および200nMの3RO4/2、3mMのMgCl2、200μMの各dNTP、1x Immobuffer（Bioline)および1単位のImmolase（Bioline）を含有した。
【０２９５】
4.6.反応成分：ターゲット配列の検出
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、7秒ごとに読み取った。表7におけるすべての反応は、1μM SubBi-1-FB、Tris HCl（25℃でpH 9.0）および25mM MgCl2のバルクミックスを含有した。オリゴヌクレオチドパートザイムAおよびBの濃度は、1μMであった。
【０２９６】
(表7) インビトロPCR後のRPLPO DNA増幅の検出のための反応成分。設計4を使用したMNAzyme系（RO4A2/1：RO4B3/1）
2009509551.tif 000028
【０２９７】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。これは、ウエル間で変わることが知られているからである。これは、バルクミックスのみの蛍光を読み取ることによって測定した。その後、ウエル間比較ができるように、そのウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０２９８】
4.7.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の切断の検出
RPLPO、エキソン4の検出のためのMNAzyme設計4は、PCRによりヒトゲノムDNAからターゲットRPLPO配列を増幅したとき、経時的な蛍光の増加を示した（図14）。RPLPOアンプリコンについて見られた蛍光の増加は、1012コピーの陽性対照RO4/1ターゲットオリゴヌクレオチドについて見られたものに類似していた。無ターゲット対照の蛍光は、ターゲット含有反応におけるものより低く、陰性対照反応は、経時的な蛍光の増加を示した。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因することを明示している。
【０２９９】
実施例5：短い核酸配列のインビトロPCR増幅によって生成されたアンプリコンを検出するためのMNAzymeの使用
5.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeを使用して、インビトロ増幅核酸配列からのアンプリコンを検出することができる。この実施例では、増幅および検出を三段階プロセスで行う（図5）が、逆転写、PCR増幅および検出を単一反応チューブで同時に行うこともできる。この実施例について、アンプリコンを検出するために使用したオリゴヌクレオチドは、hsa-miR-20を検出するために設計される設計4、miRパートザイムAおよびBオリゴヌクレオチド（図11）を使用した。下線を引いた塩基が組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基がターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基が基質にハイブリダイズするような、それらのMNAzymeパートザイムオリゴヌクレオチドを下に列挙する。
2009509551.tif 000029
【０３００】
5.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を引いた塩基は、5’末端の6-FAM部分および3’末端のBHQ1部分の位置を示す。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-1-FBの切断をモニターした。
2009509551.tif 000030
【０３０１】
5.3.22mer D-20オリゴヌクレオチドターゲット配列の増幅のためのPCRプライマー
この実施例のためのターゲット配列は、下に列挙するオリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用する、D-20オリゴヌクレオチドのインビトロPCR増幅によって生成した。
2009509551.tif 000031
【０３０２】
5.4.ターゲット配列および対照
PCRおよびMNAzymeを使用する短い配列の増幅および検出を実証するためのテンプレートとして、miR-20に相同なDNA配列（D-20ターゲット）使用した。
2009509551.tif 000032
【０３０３】
さらに、誤増幅されたいかなる密接に関連した「オフターゲット」配列もmiR-20系で検出できないことを保証するために、対照ターゲットDNAオリゴヌクレオチドD-17-5pターゲットも、miR-20パートザイムAおよびBオリゴヌクレオチド系で試験した。
2009509551.tif 000033
【０３０４】
5.5.反応成分：ターゲット配列の増幅
ターゲット配列の増幅を25μLの総反応容量で行った。すべての増幅反応は、GeneAmp（登録商標）PCR System 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems）で行った。段階1および2（逆転写およびPCR）についてのサイクリングパラメータは、42℃で30分間、95℃で7分間、10サイクルの95℃で5秒間および30℃で30秒間（1サイクルにつきプラス2℃）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で5秒間および50℃で30秒間であった。反応は、最初、10nMの3miR20/L1のみを含有し、42℃で30分間の後、反応を一時停止させ、30nMの3miR20/P1および200nMの5miR20/1を添加した。列挙した以外の全試薬は、初期反応混合物中、3mMのMgCl2、200μMの各dNTP、1x Immobuffer（Bioline)および1単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のうちのいずれか、a）108コピーのD-20ターゲット、b）無ターゲット（dH2O）またはc）108コピーのオフターゲットDNA（D-17-5pターゲット）であった。
【０３０５】
5.6.反応成分：ターゲット配列の検出
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、7秒ごとに読み取った。表8におけるすべての反応は、1μM SubBi-1-FB、Tris HCl（25℃でpH 9.0）および25mM MgCl2のバルクミックスを含有した。パートザイムAおよびBの濃度は、1μMであった。
【０３０６】
(表8)  インビトロ増幅した短い（20〜25mer）核酸配列の検出のための反応成分。設計4を使用したMNAzyme系（miR20A2/1：miR20B3/1）。
2009509551.tif 000034
【０３０７】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。その後、ウエル間比較ができるように、そのウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０３０８】
5.7.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の切断の検出
D-20の検出のためのMNAzyme設計4は、使用したターゲット配列が、PCRによって増幅されたmiR-20ターゲットであったとき、経時的な蛍光の増加を示した（図15（i））。
【０３０９】
無ターゲット対照の蛍光は、ターゲット含有反応におけるものより低く、陰性対照反応は、経時的な蛍光の増加を示した。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因することを明示している。
【０３１０】
この実施例におけるオフターゲット対照（D-17-5p）は、miR-20プライマーとハイブリダイズする領域内の末端位置における一つのミスマッチしか有さないので、miR-20プライマーでも増幅した。D-20ターゲットとD-17-5pターゲットの両方の増幅を電気泳動法によって確認した。両方のアンプリコンにはそれらの末端にプライマー配列が組み込まれているので、今や、これらは、それらのアンプリコンの中央のたった一つの塩基の違いしかない。MNAzymeは、このD-20アンプリコンとD-17-5pアンプリコンとの識別に成功した。この識別は、図15（ii）に図示するようなそれらのプライマー間にある領域内のD-20およびD-17-5pアンプリコンのたった一つのヌクレオチドの違いの結果である。このMNAzymeは、プライマー間に存在する（従って、プライマー二量体と真のアンプリコンとの識別を可能にする）四つの塩基を必要とし、これらの四つの塩基は、正確でなければならず、いかなる置換も許容しない。この実施例は、たった一つのヌクレオチド多型の違いしかないもの含む密接に関連した配列を識別するMNAzymeの能力を例証するものである。
【０３１１】
実施例6：全RNAのインビトロPCR増幅により生成されたミクロRNAアンプリコンの検出のためのMNAzymeの使用
6.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeを使用して、インビトロ増幅核酸配列からのアンプリコンを検出することができる。この実施例では、逆転写およびPCR増幅を第一のチューブで行い、その後、第二のチューブでMNAzyme媒介検出を行う二段階プロセス（図5）で増幅および検出を行う。この実施例について、アンプリコンを検出するために使用したオリゴヌクレオチドは、hsa-miR-20を検出するために設計される設計4、miRパートザイムAおよびBオリゴヌクレオチド（図11）であった。下線を引いた塩基が組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基がターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基が基質にハイブリダイズするような、それらのMNAzymeパートザイムオリゴヌクレオチドを下に列挙する。
2009509551.tif 000035
【０３１２】
6.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を引いた塩基は、5’末端の6-FAM部分および3’末端のBHQ1部分の位置を示す。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-1-FBの切断をモニターした。
2009509551.tif 000036
【０３１３】
6.3.hsa-miR-20の増幅のためのPCRプライマー
この実施例のためのターゲット配列は、下に列挙するオリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用する、ヒト胸腺全RNA（Ambion）のインビトロ増幅によって生成した。
2009509551.tif 000037
【０３１４】
6.4.ターゲット配列および対照
ヒト胸腺全RNA（Ambion）をmiR-20の増幅のためのテンプレートとして使用し、その後、MNAzymeを使用してアンプリコンを検出した（セクション6.6）。
【０３１５】
miR-20に相同なRNA配列（R-20ターゲット）を、短い配列の増幅を実証するための陽性対照として使用し、その後、MNAzymeを使用して、結果として生じたアンプリコンの検出を行った。
2009509551.tif 000038
【０３１６】
6.5.反応成分：ターゲット配列の増幅
ターゲット配列の逆転写およびPCR増幅を25μLの総反応容量で行った。すべての増幅反応は、GeneAmp（登録商標）PCR System 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems）で行った。サイクリングパラメータは、40℃で30分間、95℃で7分間、10サイクルの95℃で5秒間および30℃で30秒間（1サイクルにつき温度が2℃上昇する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で5秒間および50℃で30秒間であった。反応は、40nMの3miR20/L1および200nMの5miR20/1、3mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、30単位のMMLV(-H）逆転写酵素（Promega）、1x Immobuffer（Bioline)および0.5単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のうちのいずれか、a）1μgの全RNA、b）無ターゲット（dH2O）またはc）1014コピー（5μM）のR-20ターゲットオリゴヌクレオチドを含有した。
【０３１７】
6.6.反応成分：ターゲット配列の検出
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計5分間、30秒ごとに読み取った。表9におけるすべての反応は、1μM SubBi-1-FB、1μM パートザイムA、1μM パートザイムB、50mM Tris HCl（25℃でpH 9.0）、25mM MgCl2およびターゲット（表9に示すとおり）のバルクミックスを含有した。
【０３１８】
(表9)インビトロ増幅全RNAの検出のための反応成分。設計4を使用したMNAzyme系（miR20A2/1：miR20B3/1）。
2009509551.tif 000039
【０３１９】
SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）で各反応についてのバックグラウンド蛍光レベルを測定した。その後、ウエル間比較ができるように、そのウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０３２０】
6.7.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の切断の検出
miR-20の検出のためのMNAzyme設計4は、使用したターゲット配列が、PCRによって増幅された全RNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した（図16）。
【０３２１】
無RNAターゲット対照の蛍光は、RNAターゲット含有反応におけるものより低く、いかなる陰性対照反応も経時的な蛍光の増加を示さなかった。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのPCR増幅ターゲット依存的組織化に起因することを明示している。この実験は二段階（逆転写/PCR、その後、MNAzyme終点検出）で行ったが、すべての段階を単一反応チューブで同時に行って、反応を実時間でモニターすることもできる。
【０３２２】
実施例7：核酸シグナルカスケードに連結させたMNAzymeによるターゲット検出
7.1.MNAzymeによって開始されるシグナル増幅カスケード
図7に図示するように、シグナル増幅カスケード反応にMNAzyme検出を連結させることにより、核酸の検出限界を下げることができる。MNAzymeは、カスケード開始のための非常に特異的な誘発メカニズムも可能にする。
【０３２３】
7.2.空間的に分離したDNAzymeカスケード
ビオチン標識DNAzymeの取り付けを可能にする、ストレプタビジンで被覆されたプラスチックウェーハへの取り付けを含む様々な方法を使用して、DNAzymeを支持体に係留させることができる。取り付けに使用される配列は、ジェネリックMNAzyme/DNAzyme基質としての役割を果すこともできる。ターゲット（例えば、核酸配列）は、活性MNAzymeの形成を可能にするパートザイム配列へのハイブリダイゼーション後、検出できる。その後、そのMNAzymeは、係留されているジェネリック基質を切断し、そのようにしてDNAzyme Aを放出させることができる。その後、DNAzyme Aは、DNAzyme Bが係留されている第二の固体表面上の第二のジェネリック配列に移動することができる。DNAzyme Aは、その第二のジェネリック配列を切断し、そのようにしてDNAzyme Bを放出させることができる。この基質の蛍光体/クエンチャー色素ペア間の切断は、蛍光増加を生じさせることができる。そして次に、その放出されたDNAzyme Bが、さらなる第一基質を切断し、そのようにしてさらなるDNAzyme Aを放出させ、シグナルカスケードを開始させることができ、その結果、シグナル増幅が生じる（図7）。
【０３２４】
この実施例は、空間的に分離したDNAzymeを使用する一つのシグナルカスケード生成メカニズムを説明するものであるが、他の方法も存在し、それらも触媒核酸を使用してシグナルを増幅させることができる。いかなるそのような方法もここで十分に機能するが、但し、取り付けまたは物理的分離の幾つかの手段により、基質を、それに対して作用する酵素に「接近不能」な状態に保つことを条件とする。MNAzymeにより開始される反応に連結させることができる核酸シグナル増幅の他の例としては、ライゲーションカスケード（Paul and Joyce, 2004）および環状DNAzymeカスケード（Levy and Ellington, 2003）が含まれるがこれらに限定されるわけではない、これらの各々が、酵素とその基質の「分離」を維持し、その後、その酵素と基質が、結果として触媒活性が生じ得るように接触すると、直接または間接的に増幅シグナル、またはシグナルカスケードが生じるという基本原理を含む。
【０３２５】
実施例8：核酸ターゲットの定量のためのMNAzymeの使用
8.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeは、PCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間でターゲット核酸の増幅をモニターするために使用することができる。さらに、実時間のモニタリングにより、その反応に最初に存在するターゲットの量を定量することができる。この実施例では、PCR増幅およびMNAzyme媒介検出を単一チューブで同時に行う一段階プロセスで、増幅および検出を行う。パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBは、ヒトRPLPO遺伝子のエキソン5に相補的なセンサーアームを有する設計6を使用した（図17（i））。それらのパートザイムオリゴヌクレオチドを下に列挙するが、「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。
2009509551.tif 000040
【０３２６】
8.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-3である。本実施例において、SubBi-3-FBは、その5’末端を6-FAMでおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識した。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-3-FBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000041
【０３２７】
8.3.RPLPOエキソン5の増幅のためのPCRプライマー
この実施例のためのターゲット配列は、下に列挙するオリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用するヒトゲノムDNAのインビトロ増幅によって生成した。
2009509551.tif 000042
【０３２８】
8.4.ターゲット配列
K562細胞系統から抽出されたヒトゲノムDNA（Promega）をRPLPO遺伝子の増幅のためのテンプレートとして使用した。
【０３２９】
8.5.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
ターゲット配列の実時間増幅および定量を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、ABI7700サーモサイクラー（Applied Biosystems）で行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で5秒間および60℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で5秒間および50℃で30秒間であった。反応は、40nMの5RO5/1および200nMの3RO5/1、200nMのRO5A4/3-Pおよび200nMのRO5B5/3-P、200nMのSubBi-3-FB、10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、1x ROXリファレンス（Invitrogen）、1x Immobuffer（Bioline)、0.25単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のうちのいずれか、ゲノムDNAテンプレート（20,000pg、4000 pg、800 pg、160 pg、32 pgおよび6.4 pg）または無ターゲット（dH2O）を含有した。
【０３３０】
8.6.結果：ターゲットの増幅およびSubBi-3-FBレポーター基質の切断
RPLPOエキソン5の実時間検出および増幅のためのMNAzyme設計6は、使用したターゲット配列が、PCRによって増幅されたヒトゲノムDNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した（図17（ii））。
【０３３１】
無DNAターゲット対照の蛍光は、DNAターゲット含有反応におけるものより低く、その反応中に増加しなかった。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因することを明示している。サイクル閾値に対してDNA濃度の対数をプロットすることにより、標準曲線を作成して、0.995の相関係数を有する線形プロットを得た。6.4pgのゲノムDNAを含有する反応には、約10コピーのターゲットが存在することとなる。この実施例は、このアプローチの高い感度を実証する。
【０３３２】
この実験は、非対称プライマー比を使用したが、実時間PCRを使用するその後の実験（データは示さない）により、そのMNAzyme検出が、対照プライマー比を使用するPCRとの適合性もあることが実証された。
【０３３３】
実施例9：同時に多数のターゲットをターゲットにする多数のMNAzymeを使用する多重反応
9.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
多数の固有MNAzymeを含む1回の多重化反応で多数のターゲットを同時に検出することができる。各MNAzymeは、一つのターゲットに特異的なセンサーアームと、一連のジェネリック基質の固有メンバーに特異的な基質アームとを有し、これらの各々が異なる蛍光体で標識されている（図18）。以下の実施例では、二つの異なるターゲット、すなわち、RPLPOおよびD-20配列を検出するように、MNAzymeを設計した。任意の数のターゲットをこの方法に従って使用できることは、分かる。それらのパートザイムAおよびBの配列、5’から3’を下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000043
【０３３４】
9.2.レポーター基質
この実施例において使用した二つのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2およびSubBi-3であった。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。SubBi-3は、その5’末端を6-JOE部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-3-JBと呼んだ。
【０３３５】
485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターし、520nm（JOE励起波長）での励起と共に、548nm（JOE放射波長）でSubBi-3-JBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000044
【０３３６】
9.3.ターゲット配列
この実施例のためのターゲット配列は、下のとおりの配列、5’から3’を有する合成オリゴヌクレオチドRO5/1ターゲットおよびD-20ターゲットであった。RO5/1ターゲット配列は、RPLPO遺伝子の一セクション、エキソン5と同じ配列を有し、D-20ターゲット配列は、RNA hsa-miR-20のDNA相同体である。
2009509551.tif 000045
【０３３７】
9.4.反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加をモニターすることにより、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において55℃で行った。各反応の蛍光を、合計5分間、7秒ごとに読み取った。表10におけるすべての反応は、PCRIIバッファー（Applied Biosystems）および25mM MgCl2を含有した。
【０３３８】
(表10) 二つの異なる核酸ターゲットの同時検出のための反応の成分
2009509551.tif 000046
【０３３９】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。これは、ウエル間で変わることが知られているからである。これは、バルクミックスのみの蛍光を読み取ることによって測定した。その後、ウエル間比較ができるように、そのウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０３４０】
9.5.結果：基質の検出および切断
ターゲットD-20またはRPLPOを含有するシングルプレックス（Singleplex）反応は、無ターゲット対照と比較して、経時的な蛍光の増加を示した（図19（i））。これは、パートザイムが、ターゲット配列が存在する場合にのみ、触媒活性MNAzymeに組織化し、レポーター基質を切断することを明示している。「無ターゲット」（dH2O）対照は、蛍光を増加させなかった。これは、ターゲットが不在の場合には切断が発生しないことを示している。RPLPOおよびD-20の同時検出のための多重（multiplex）反応（図19（ii））は、各ターゲットについて、シングルプレックス反応において各ターゲットについて観察されるものと同様の結果を生じさせた。「無ターゲット」対照反応では蛍光の増加が観察されなかった。これらの結果により、特異性の喪失を伴わない、単一の反応で多数のターゲットの同時検出が実証される。
【０３４１】
実施例10：ミクロRNAのインビトロ増幅によって生成されたアンプリコンの定量のためのMNAzymeの使用
10.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeは、RTPCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間でターゲット核酸の増幅をモニターするために使用することができる。さらに、実時間モニタリングにより、その反応に最初に存在するターゲットの量を定量することができる。この実施例では、第一段階が、逆転写によるcDNAの生成を含み、その後、第二段階でそのcDNAのPCR増幅とMNAzyme媒介検出を同時に行う二段階プロセスで、増幅および検出を行う。パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBは、ヒトミクロRNA hsa-let-7aに相補的なセンサーアームを有する設計6を使用した。それらのパートザイムオリゴヌクレオチドを下に列挙するが、「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000047
【０３４２】
10.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2である。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。492nm（FAM励起波長）での励起と共に、516nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。以下の配列において、下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000048
【０３４３】
10.3.ターゲット配列
RNA hsa-let-7a種に相同な配列を有する合成RNAオリゴヌクレオチドR-let7aの二段階RTPCRにより、この実施例のための標準曲線を作成した。R-let7aの配列（5’から3’へと記載）は次のとおりである。
2009509551.tif 000049
【０３４４】
結腸細胞（Ambion）、K562白血病細胞、HeLa子宮頚癌細胞（Ambion）および脾臓細胞（Clontech）からのヒト全RNAのサンプルを増幅し、hsa-let-7aの存在度について分析した。
【０３４５】
10.4.hsa-let-7aの増幅のためのPCRプライマー
以下のプライマーをhsa-let-7aの増幅のために使用した。逆転写のためにプライマー3let7aを使用し、PCR増幅のためにプライマー5let7aおよび3PCR7aを使用した。
2009509551.tif 000050
【０３４６】
10.5.反応成分：ターゲット配列の逆転写
25μLの総反応容量で、ターゲット配列の逆転写を行った。2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems）を用いて、20分間、20℃で、続いて、20分間、30℃で、その後、20分間、40℃で反応物をインキュベートした。それらの反応は、10nM 3let7a、5mM MgCl2、300μMの各dNTP、20単位のRnasin（Promega）、1x Immobuffer（Bioline）、100単位のM-MLV RT（H-）、および5μLの次のもののいずれか、R-let7a（6×1011コピー）またはヒト全RNA（正常小腸からのもの（0.1μg）、K562からのもの（0.1μg）、HeLaからのもの（0.2μg）、もしくは脾臓からのもの（0.2μg））を含有した。対照反応は、上記のすべての試薬を含有したが、RNAターゲットを欠き、その代わりに5μLのdH2Oのみを含有した。
【０３４７】
10.6.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
25μLの総反応容量で、ターゲット配列の実時間増幅および定量を行った。すべての反応は、Mx3005P（商標）QPCR System（Stratagene）で行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および40℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃上昇する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で15秒間および50℃で30秒間であった。これらの反応は、200nMの3PCR7aおよび40nMの5let7a、400nMのPCR7aA4/2-Pおよび400nMのPCR7aB5/2-P、200nMのSubBi-2-FB、10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、20単位のRnasin（Promega）、1x Immobuffer（Bioline)、1単位のImmolase（Bioline）、ならびに5μLの次のもののいずれか、R-let7a cDNA（5×108、5×107、5×106、5×105、5×104コピーを含有）またはヒト全RNAテンプレート（正常結腸、0.5μg；K562、0.5μg；HeLa、1μg；脾臓、1μg）または無ターゲット（dH2O）を含有した。
【０３４８】
10.7.結果：ターゲットの増幅およびSubBi-2-FBレポーター基質の切断
hsa-let-7aの実時間検出および定量のためのMNAzymeは、使用したターゲット配列が、合成オリゴヌクレオチドRNAまたはヒト全RNAから生成したcDNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した。無ターゲット対照反応についてはシグナルが検出されなかった（表11）。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因するものであったことを明示している。サイクル閾値に対して初期RNA濃度の対数をプロットすることにより標準曲線を作成して、0.999の相関係数を有する線形プロットを得た。四つのヒト全RNAサンプルも増幅し、その標準曲線からの外挿により、各々におけるhsa-let-7aの量を概算した（表11）。
【０３４９】
(表11) 増幅のための反応およびhsa-let-7aアンプリコンの検出の結果。
2009509551.tif 000051
【０３５０】
この実施例は、MNAzymeによって、ヒトミクロRNA種のRTPCR増幅により生成されたアンプリコンを検出および定量することができることを実証する。ミクロRNAは、約22塩基というそれらの小さなサイズのため、増幅および検出が難しい。MNAzymeは、この用途に適する。
【０３５１】
実施例11：DNAメチル化を検出するためのMNAzymeの使用
11.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
実時間PCRおよびMNAzyme媒介シグナル生成により、完全にマッチした核酸配列とCの反対側にCを有するミスマッチを含有するものとを識別することができることは、実施例19において証明する。この能力により、細胞のメチル化状態の分析にMNAzymeを使用することができる。多くの場合、癌に随伴してメチル化パターンの改変が発生する。メチル化分析のための大多数のプロトコルは、メチル化形ではなく非メチル化形のシチジンをウリジンに変換する、ゲノムDNAの亜硫酸水素塩修飾で始まる。その後、その修飾DNAのPCR増幅により、そのウリジンがチミジンで置換され、そして様々な方法を使用して、T（本来、非メチル化C）を含有する配列とC（本来、メチル化C）を含有する配列とを区別することができる。後続の実施例では、MNAzymeを使用して、亜硫酸水素塩修飾DNAのp16遺伝子のプロモーター領域における特異的CpG二重項のメチル化状態を判定した。
【０３５２】
この実施例において、パートザイムは、メチル化p16遺伝子の亜硫酸水素塩修飾に従って生成された配列にマッチするように設計した。それらのパートザイムの配列（5’から3’）を下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、亜硫酸水素塩修飾ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。
2009509551.tif 000052
【０３５３】
11.2.レポーター基質
この実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-3であった。本実施例においてSubBi-3は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-3-FBと呼んだ。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-3-FBの切断をモニターした。SubBi-3-FBの配列（5’から3’）を下に示す。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000053
【０３５４】
11.3.亜硫酸水素塩修飾p16の増幅ためのPCRプライマー
この実施例において、PCRプライマーは、本来メチル化されている亜硫酸水素塩修飾ターゲットにマッチするように設計した。この実施例のためのターゲット配列は、下に列挙するオリゴヌクレオチドPCRプライマー（5’から3’）を使用する亜硫酸水素塩修飾ヒトゲノムDNAのインビトロ増幅によって生成した。
2009509551.tif 000054
【０３５５】
11.4.ターゲット配列および対照。
K562細胞系統から抽出したヒトゲノムDNAを、非メチル化p16遺伝子プロモーターを含有する陰性対照ゲノムDNAとして使用した。ユニバーサルCpGメチル化ゲノムDNA（Chemicon）を、メチル化p16遺伝子プロモーターの対照として使用した。MethylEasyキット（Human Genetic Signatures）をその製造業者の使用説明書に従って使用して、一晩、ゲノムDNAを亜硫酸水素塩修飾した。その後、メチル化DNAおよび非メチル化DNAを系列希釈して、p16遺伝子プロモーターがメチル化されているDNAをさまざまな比率、すなわち、100％、20％、4％、0.8％、0.16％および0.032％、で含有するサンプルを生じさせた。ゲノムDNAの代わりにヌクレアーゼ不含dH2Oを無ターゲット対照として使用した。
【０３５６】
11.5.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
ターゲット配列の実時間増幅および定量を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、Stratagene MX3005p QPCR Systemで行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および56℃で30秒間、ならびに最後に、50サイクルの95℃で15秒間および52℃で30秒間であった。反応は、200nMの5p16および40nMの3p16、200nMのp16A5/3-Pおよび200nMのp16B6/3-P、200nMのSubBi-3-FB、7.5mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、1x Immobuffer（Bioline)、1単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のうちのいずれか、150ngの亜硫酸水素塩修飾ゲノムDNA（100％、20％、4％、0.8％、0.16％もしくは0.032％メチル化DNAを含有）またはdH2Oのみ（無ターゲット対照反応）を含有した。すべての反応は、二重反復で行った。
【０３５７】
11.6.結果：MNAzymeによるメチル化の検出
メチル化特異的MNAzymeは、そのターゲットサンプルが、上は100％から下は0.16％に至るメチル化DNAを含有するとき、経時的な蛍光の増加を示した（表12）。対照的に、ターゲットサンプルが、0.032％および0％メチル化DNAを含有するとき、反応は、無ターゲット対照において見られるものに類似した低い蛍光レベルを示し、その蛍光は、経時的に増加しなかった。メチル化ターゲットのパーセンテージが減少するにつれて、反応のCtは増加し、0.996のR2値を有する標準曲線をプロットした。実験結果を下の表12にまとめる。
【０３５８】
表12.亜硫酸水素塩修飾ゲノムDNAサンプル中のDNAメチル化を検出するためのMNAzymeの使用。
2009509551.tif 000055
【０３５９】
メチル化p16特異的プライマーおよびMNAzymeは、この実施例において使用した条件下でメチル化ターゲットと非メチル化ターゲットとを識別することができた。さらに、この系により、非メチル化ターゲットのバックグラウンド中、0.16％のメチル化ターゲットの検出が可能であった。PCR反応の100％の効率は、各サイクルのダブリングを意味する。この実験における133％の実測効率は、（PCRによる）ターゲット増幅と、MNAzymeの触媒活性により増幅されたアンプリコン検出の両方が存在することを示す。
【０３６０】
実施例12：ヘアピン構造を形成するセンサーアームを有するパートザイムから組織化するMNAzyme
活性MNAzymeに組織化することができるパートザイムの構造は、柔軟である。この実施例により、MNAzyme活性と適合性のある追加の構造を実証する。
【０３６１】
12.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
MNAzymeを使用する検出は、パートザイムAもしくはパートザイムBのまたはパートザイムAとBの両方のセンサーアーム領域の後に任意のヘアピン配列が続くときにも行うことができる。以下の実験において、パートザイムAおよびBは、ヒトミクロRNA、hsa-miR-143の配列をターゲットにするように設計した。パートザイムAおよびパートザイムBオリゴヌクレオチドの配列、5’から3’を下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズし、ならびに普通の活字の塩基は、ヘアピンを形成する。
2009509551.tif 000056
【０３６２】
12.2.レポーター基質
二重標識核酸レポーター基質の切断により、MNAzyme活性をモニターした。この実施例のためのレポーター基質は、下に記載するとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBであった。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を引いた塩基は、その5’末端の6-FAM部分およびその3’末端のBHQ1部分の位置を示す。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）で、FAMとBHQ1の間のデオキシリボヌクレオチドでのSubBi-1-FBの切断に起因する蛍光の変化をモニターした。
2009509551.tif 000057
【０３６３】
12.3.ターゲット
この実施例のためのターゲット配列は、ヒトミクロRNAに相同な配列、hsa-miR-143を有する、DNAオリゴヌクレオチド、D-143ターゲットであった。そのD-143ターゲットの配列は次のとおりであった（5’から3’へと記載）。
2009509551.tif 000058
【０３６４】
12.4.反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。すべての反応は、SmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、7秒ごとに読み取った。表13におけるすべての反応は、1μM SubBi-1-FB、10mM Tris HCl（25℃でpH 9.0）および25mM MgCl2からなるバルクミックスを含有した。
【０３６５】
(表13) 核酸ターゲットの検出のための反応の成分
2009509551.tif 000059
【０３６６】
実験中に使用したSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）の各反応ウエルは、先ず、そのバックグラウンド蛍光レベルについて試験した。これは、ウエル間で変わることが知られているからである。これは、バルクミックスのみの蛍光を読み取ることによって測定した。その後、ウエル間比較ができるように、各ウエルで行ったすべての他の反応からこの値を引いた。
【０３６７】
12.5.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の切断の検出
パートザイムAおよびBの設計の様々な組み合わせは、すべて、活性MNAzymeに組織化することができた。蛍光の増加によって証明されるように、これらは、ターゲット配列が存在する場合にのみレポーター基質を切断した。この実施例において、パートザイムのセンサーアームは、ヘアピンを形成する配列で伸長されていた。ヘアピンを有する一方のパートザイム（パートザイムAもしくはパートザイムB）を含有する反応は、または両方のパートザイム（AおよびB）がヘアピンを含有する場合は、ヘアピンがないパートザイムを使用したときに見られるものと同様の蛍光シグナルをもたらした。ターゲットを欠くいかなる対照反応においても、シグナルの増加は観察されなかった。
【０３６８】
ヘアピンを含有するパートザイムの設計は、ミクロRNAなどの短い配列の検出に適する戦略を提供する。この実験で検出されたDNAオリゴヌクレオチドは、わずか22の塩基であった。この配列を、ヘアピンを含有するまたはしないパートザイムを使用して、検出した。ヘアピン設計は、より安定な構造をもたらし、ならびにさらに、MNAzyme組織化および触媒活性と適合性のあることがわかっているパートザイムの設計に柔軟性をもたらす。
【０３６９】
実施例13：実時間RTPCRによる四つの核酸配列の同時定量のためのMNAzymeの使用
13.1.四重RTPCRアッセイのためのパートザイムオリゴヌクレオチド
RTPCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間で同時に多数のターゲットを増幅することができる。さらに、それらのターゲットの増幅を、多数の固有MNAzymeを含む一つの多重化反応において、実時間で同時にモニターすることができる。各MNAzymeは、一つのターゲットに対して特異的なセンサーアームと、各々が異なる蛍光体で標識されている一連のジェネリック基質の単独のメンバーに対して特異的な基質アームとを有する（図18）。この実施例において、MNAzymeは、四つの異なるターゲット、すなわち、ヒトBCR、RPLPO、β-アクチンおよびHPRT転写産物を検出するように設計した。任意の数のターゲットをこの方法に従って使用できることは、分かる。各ターゲットについてのパートザイムAおよびBの配列、5’から3’を下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000060
【０３７０】
13.2.レポーター基質
この実施例については、各々を異なる蛍光体で標識した四つの異なるレポーター基質を使用した。それらの基質の配列を下に5’から3’へと記載する。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-JOE部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-JBと呼んだ。535nmでの励起と共に、555nmでSubBi-2-JBの切断をモニターした。SubBi-3は、その5’末端をQuasar 670部分でおよびその3’末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-3-Q6B2と呼んだ。635nmでの励起と共に、665nmでSubBi-3-Q6B2の切断をモニターした。SubBi-6は、その5’末端をTexas Red部分でおよびその3’末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-6-TRB2と呼んだ。585nmでの励起と共に、610nmでSubBi-6-TRB2の切断をモニターした。第四の基質、SubBi-7は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-7-FBと呼んだ。492nmでの励起と共に、516nmでSubBi-7-FBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000061
【０３７１】
13.3.ターゲット配列およびそれらの四つのアンプリコンの増幅のためのPCRプライマー
K562白血病細胞から抽出したヒト全RNAを、ターゲット転写産物の四つすべてのインビトロ増幅のためのテンプレートとして使用した。それらのアンプリコンは、下に列挙するオリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用するRTPCRによって生成した。
2009509551.tif 000062
【０３７２】
13.4.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
ターゲット配列の実時間増幅および定量を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、Mx3005P（商標）QPCR System（Stratagene）で行った。サイクリングパラメータは、50℃で30分間、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、40サイクルの95℃で15秒間および54℃で30秒間であった。これらの反応は、40nMの各5’プライマーおよび200nMの各3’プライマー、200nMの各Aパートザイムおよび200nMの各Bパートザイム、200nMの各基質、10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、20単位のM-MLV RT（H-）、1x Immobuffer（Bioline)、1.5単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のうちのいずれか、全RNAテンプレート（100ng、20ng、4ng、800 pg、160 pgもしくは32 pg）または無ターゲット（dH2O）を含有した。
【０３７３】
(表14) 四つの異なる核酸ターゲットの同時検出のための反応の成分
2009509551.tif 000063
【０３７４】
13.5.結果：四つの異なるターゲット配列の同時増幅および四つの異なるレポーター基質の切断による検出
β-アクチン、RPLPO、BCRおよびHPRT転写産物の実時間検出および定量のために使用した四つのMNAzymeは、使用したターゲット配列が、RTPCRによって増幅されたヒト全RNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した（表15）。四つすべての反応についての無RNAターゲット対照の蛍光は、RNAターゲット含有反応におけるものより低く、反応中に増加しなかった（表15）。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因したことを明示している。
【０３７５】
サイクル閾値に対してRNA濃度の対数をプロットすることにより、四つすべてのターゲットについての標準曲線を作成して、線形プロットを得た。各標準物質の閾値（Ct）を表15に示す。この表に示すCt値は、二重反復試験の結果の平均値である。各ターゲットについての相関係数（R2）、傾きおよび反応効率も表15に示す。
【０３７６】
(表15) 四つの異なる核酸ターゲットの同時増幅および検出のための反応の結果
2009509551.tif 000064
【０３７７】
この実施例におけるMNAzyme RTPCR反応は、四つのジェネリック基質を含む単一の多重反応での四つのターゲットの同時検出および定量のための標準曲線の作成を可能にした。これらのジェネリック基質は、単一の反応で四つのターゲットの他の組み合わせをモニターすることにも適する。
【０３７８】
実施例14：実時間多重RTPCRにおける五つの核酸配列の同時定量のためのMNAzymeの使用
14.1.五重RTPCRアッセイのためのパートザイムオリゴヌクレオチド
RTPCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間で同時に多数のターゲットを増幅することができる。さらに、それらのターゲットの増幅を、多数の固有MNAzymeを含む一つの多重化反応において、実時間で同時にモニターすることができる。各MNAzymeは、一つのターゲットに対して特異的なセンサーアームと、各々が異なる蛍光体で標識されている一連のジェネリック基質の単独のメンバーに対して特異的な基質アームとを有する（図18）。この実施例において、MNAzymeは、五つの異なるターゲット、すなわち、BCR、RPLPOエキソン4、β-アクチン、RPLPOエキソン5およびHPRT mRNA配列を検出するように設計した。任意の数のターゲットをこの方法に従って使用できることは、分かる。それらのパートザイムAおよびBの配列、5’から3’を下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000065
【０３７９】
14.2.レポーター基質
この実施例については、各々が五つの異なる蛍光体のうちの一つで標識されている五つの異なるレポーター基質を使用した。基質配列を5’から3’へと記載する。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端をAlexa 350部分でおよびその3’末端をBHQ1で末端標識し、SubBi-2-A350Bと呼んだ。350nmでの励起と共に、440nmでSubBi-2-A350Bの切断をモニターした。SubBi-3は、その5’末端をQuasar 670部分でおよびその3’末端をBHQ2で末端標識し、SubBi-3-Q6B2と呼んだ。635nmでの励起と共に、665nmでSubBi-3-Q6B2の切断をモニターした。SubBi-6は、その5’末端をTexas Red部分でおよびその3’末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-6-TRB2と呼んだ。585nmでの励起と共に、610nmでSubBi-6-TRB2の切断をモニターした。SubBi-7は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-7-FBと呼んだ。492nmでの励起と共に、516nmでSubBi-7-FBの切断をモニターした。SubBi-4は、その5’末端を6-JOE部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-4-JBと呼んだ。535nmでの励起と共に、555nmでSubBi-4-JBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000066
【０３８０】
14.3.ターゲット配列および五つのmRNAターゲット配列の増幅のためのPCRプライマー。
K562細胞から抽出したヒト全RNAを、五つすべてのターゲットのインビトロ増幅のためのテンプレートとして使用した。それらのアンプリコンは、下に列挙するオリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用するインビトロ増幅によって生成した。
2009509551.tif 000067
【０３８１】
14.4.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
ターゲット配列の実時間増幅および定量を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、Mx3005P（商標）QPCR System（Stratagene）で行った。サイクリングパラメータは、50℃で30分間、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、40サイクルの95℃で15秒間および54℃で30秒間であった。これらの反応は、40nMの5Bアクチン、5BCR14、5HPRT/5、および80nMの5RO4/3、5RO5/1、および200nMの3Bアクチン、3BCR15/6、3HPRT/8、ならびに400nMの3RO4/2および3RO5/1を含有した。βアクチン、BCR、RPLPOエキソン4およびHPRTについては各200nMのAパートザイムおよびBパートザイム、ならびにRPLPOエキソン5については各400nMのAパートザイムおよびBパートザイムが存在した。200nMのSubBi-2-A350B、SubBi-3-Q6B2、SubBi-6-TRB2およびSubBi-7-FB、ならびに400nMのSubBi-4-JBが存在した。10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、20単位のM-MLV RT（H-）（Promega）、1x Immobuffer（Bioline)、2単位のImmolase（Bioline）、ならびに5μLの次のうちのいずれか、全RNAテンプレート（100ng、20ng、4ng、800 pg、もしくは160 pg）または無ターゲット（dH2O）も存在した。
【０３８２】
(表16) 五つの異なる核酸ターゲットの同時検出のための反応の成分
2009509551.tif 000068
【０３８３】
14.5.結果：五つの異なるターゲット配列の同時増幅および五つの異なるレポーター基質の切断による検出
RPLPOエキソン4、BCR、β-アクチン、RPLPOエキソン5およびHPRT内のRNA配列の実時間検出および定量のために使用した五つのMNAzymeは、使用したターゲット配列が、RTPCRによって増幅されたヒト全RNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した（表17）。五つすべての反応についての無RNAターゲット対照の蛍光は、RNAターゲット含有反応におけるものより低く、反応中に増加しなかった（表17）。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因したことを明示している。
【０３８４】
サイクル閾値に対してRNA濃度の対数をプロットすることにより、五つすべてのターゲットについての標準曲線を作成して、線形プロットを得た。各標準物質の閾値（Ct）を表17に示す。これらのCt値は、二重反復での反応の結果の平均値である。各ターゲットについての相関係数（R2）、傾きおよび反応効率も表17に示す。
【０３８５】
(表17) 五つの異なる核酸ターゲットの同時増幅および検出のための反応の結果
2009509551.tif 000069
【０３８６】
この実施例におけるMNAzyme RTPCR反応は、五つのジェネリック基質を含む単一の多重反応での五つのターゲットの同時検出および定量のための標準曲線の作成を可能にした。これらのジェネリック基質は、単一の反応において五つのターゲットの他の組み合わせをモニターすることにも適する。
【０３８７】
実施例15：細菌におけるリボソーム16Sの定量のためのMNAzymeの使用
グラム染色の細菌検査を置換すべく、MNAzymeを、細菌種において見出される保存核酸配列に基づく無菌性および/またはマイコプラズマ汚染についての急速放出試験に使用することができる。MNAzymeは、RTPCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間でターゲット細菌核酸の増幅をモニターするために使用することができる。逆転写、PCR増幅およびMNAzyme媒介検出を一本のチューブで同時に行うこの実施例では、細菌リボソーム16S配列において見出される保存配列を使用する。
【０３８８】
スタフィロコッカス・カピティス（Staphylococcus capitis）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Staphylococcus warneri）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter woffii）、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Propionibacterium acnes）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）およびシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）を含む幾つかの細菌種に共通であるリボソーム16S配列の領域をターゲットにするように、系を設計した。
【０３８９】
15.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBは、細菌種の間の保存領域に相補的なセンサーアームを有する設計7を使用した。それらのパートザイムオリゴヌクレオチドを下に列挙するが、「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000070
【０３９０】
15.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2である。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。492nm（FAM励起波長）での励起と共に、516nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す
2009509551.tif 000071
【０３９１】
15.3.細菌におけるリボソーム16Sの増幅のためのPCRプライマー
この実施例のためのターゲット配列は、下に挙げるオリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用する枯草菌のインビトロ増幅によって生成した。
2009509551.tif 000072
【０３９２】
15.4.ターゲット配列および対照
細菌リボソームRNAを枯草菌細胞から抽出し、16S領域の増幅のためのテンプレートとして使用した。RNAの代わりにヌクレアーゼ不含dH2Oを無ターゲットとして使用した。
【０３９３】
15.5.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
ターゲット配列の実時間増幅および定量を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、Mx3005P（商標）QPCR system（Stratagene）で行った。サイクリングパラメータは、50℃で30分間、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、40サイクルの95℃で5秒間および55℃で30秒間であった。これらの反応は、40nMの516S1-1および200nMの316S1-1、200nMの16S1A5/2-Pおよび200nMの16S1B6/2-P、200nMのSubBi-2-FB、7.5mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、1x Immobuffer（Bioline)、1単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のうちのいずれか、RNAテンプレート（500ng、50ng、5ngもしくは500 pg）または無ターゲット（dH2O）を含有した。
【０３９４】
15.6.結果：ターゲットの増幅およびSubBi-2-FBレポーター基質の切断
細菌リボソーム16Sの実時間検出および定量のためのMNAzymeは、使用したターゲット配列が、RTPCRによって増幅された細菌RNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した。無テンプレート対照の蛍光は、RNA含有反応におけるものより低く、反応中に増加しなかった。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因することを明示している。サイクル閾値に対してRNA濃度の対数をプロットすることにより標準曲線を生成して、0.992の相関係数を有する線形プロットを得た。
【０３９５】
(表18) 細菌リボソーム16Sアンプリコンの増幅および検出のための反応の結果
2009509551.tif 000073
【０３９６】
この実施例は、MNAzymeによって、細菌リボソーム16S RNAのRTPCR増幅により生成されたアンプリコンを検出および定量することができることを実証する。この実施例において使用したMNAzymeは、スタフィロコッカス・カピティス、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ワーネリ、黄色ブドウ球菌、枯草菌、化膿連鎖球菌、クロストリジウム・スポロゲネス、アシネトバクター・ルオフィイ、ざ瘡プロピオンバクテリウム、緑膿菌およびシュードモナス・フルオレッセンスの間で100％保存されている細菌16Sの領域をターゲットにする。故に、単一のMNAzymeおよびレポーター基質を使用して、上の細菌のいずれかの存在についてサンプルをスクリーニングすることができる。シグナル（例えば、FAM）の検出が、そのサンプル中のこれらの細菌種のうちの一つまたは複数の存在を示すこととなる。
【０３９７】
実施例16：単一チューブRT-PCRによるウイルスRNAの検出および定量のためのMNAzymeの使用
MNAzymeは、RTPCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間でターゲット核酸の増幅をモニターするために使用することができる。さらに、実時間モニタリングにより、その反応に最初に存在するターゲットの量を定量することができる。この実施例では、HIVウイルスRNAの検出および定量のためのMNAzymeの使用を例証する。逆転写、PCR増幅およびMNAzyme検出をワン・チューブ反応で行った。
【０３９８】
16.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
HIV-1のNef遺伝子を特異的にターゲットにするようにパートザイムを設計した。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。
2009509551.tif 000074
【０３９９】
16.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-6である。本実施例において、SubBi-6は、その5’末端をTexas Red部分でおよびその3’末端をBHQ2部分で末端標識し、SubBi-6-TRB2と呼んだ。585nm（Texas Red励起波長）での励起と共に、610nm（Texas Red放射波長）でSubBi-6-TRB2の切断をモニターした。以下の配列において、下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000075
【０４００】
16.3.ターゲット配列
HIV-1ウイルスRNAのRTPCR増幅によって、この実験における標準曲線を作成した。QIAGEN Ultrasens Virus Kit HIV-1を使用して、HIV-1に感染したヒトCEMT4細胞から回収した培地からウイルスRNAを単離した。ウイルスRNAの代わりにヌクレアーゼ不含（NF）水を無ターゲット対照として使用した。
【０４０１】
16.4.HIV-1 Nef転写産物の増幅のためのPCRプライマー。
以下のプライマーをHIV-1 Nef転写産物の増幅に使用した。逆転写に3’プライマー、Nef/3PCRを使用し、その後、このプライマーおよび5’プライマーNef/5PCRによりPCR増幅を助長した。
2009509551.tif 000076
【０４０２】
16.5.反応成分：ターゲット配列の増幅および定量
ターゲット配列の実時間増幅および定量を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、Mx3005pQPCR System（Stratagene）で行った。サイクリングパラメータは、50℃で30分間、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で15秒間および55℃で30秒間であった。これらの反応は、200nMの3’プライマーNef/3PCRおよび40nMの5’プライマーNef/5PCR、200nMのパートザイムNefA4/6-Pおよび200nMのパートザイムNefB5/6-P、200nMのSubBi-6-TRB2、10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、1x Immobuffer（Bioline)、0.5単位のImmolase（Bioline）、10単位のMMLV RT（H-）、ならびに5μLの次のうちのいずれか、RNAテンプレート（45,000pg、4,500pg、450pg、45pg、4.5pgもしくは0.45pgを含有）または無ターゲット（水のみ）を含有した。
【０４０３】
16.6.結果：ターゲット増幅およびSubBi-6-TRB2レポーター基質の切断
HIV-1 Nef転写産物の実時間検出および定量のためのMNAzymeは、使用したターゲット配列が、RTPCRによって増幅されたHIV-1ウイルスRNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した。ターゲットを欠く（水のみの）対照について、シグナルの増加はなかった。これは、ターゲット含有反応において生じる蛍光の増加が、後にレポーター基質を切断する触媒活性MNAzymeのターゲット依存的組織化に起因したことを明示している。
【０４０４】
サイクル閾値（Ct）に対して各反応におけるRNAテンプレートの量の対数をプロットすることにより標準曲線を作成して、線形プロットを得た。各標準物質のCtを、相関係数（R2）、傾きおよび反応効率と共に表19に示す。
【０４０５】
(表19) HIV Nef転写産物の増幅および検出の結果
2009509551.tif 000077
【０４０６】
この実施例は、HIV-1をはじとするウイルス配列の検出および定量にMNAzymeを使用できることを実証する。
【０４０７】
実施例17：MNAzymeの触媒活性の配列要件
17.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
最初に発見された10：23 DNAzymeの触媒コアは、15のヌクレオチドを含む（Santor & Joyce, 1997）。触媒コア内の重要な塩基に関する後の研究により、ある特定の塩基置換が触媒活性を有意に低下させるが、他は十分に許容されることが証明された（Zaborowska et al）。
【０４０８】
この実施例では、二つのパートザイムの部分コア内の配列変異に対するMNAzyme触媒コアの許容度を調査するために一連のパートザイムを設計し、試験した。ヒトRPLPO遺伝子を検出するMNAzymeについての非修飾パートザイムAおよびBを、対照として使用し、その部分触媒コア領域内のただ一つの塩基が置換された様々な突然変異パートザイム配列と比較した。ターゲットを検出するために使用したパートザイムオリゴヌクレオチドは、設計7（実施例20参照）に基づくものであり、それらを下に列挙する（5’から3’）。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、下線を引いた塩基、イタリック体の塩基および太字の塩基は、対照（非突然変異）部分コア配列と比較して突然変異しており、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。
2009509551.tif 000078
【０４０９】
17.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2である。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。以下の配列において、下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000079
【０４１０】
17.3.ターゲット配列
この実験におけるターゲットテンプレートとして、合成DNAオリゴヌクレオチドを使用した。そのターゲットの配列を下に5’から3’へと示す。
2009509551.tif 000080
【０４１１】
17.4.反応条件
SmartCycler Systemサーモサイクラー（Cepheid）を使用して、様々なパートザイムの触媒活性の分析を行った。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、25μLであった。各反応は、1 x PCR Buffer II（Applied Biosystems）、10mMのMgCl2、0.2μMのSubBi-2FB、2μMのRO4/2ターゲット、ならびに各2μMでのAおよびBパートザイムのペアを含有した。各反応におけるパートザイムペアは、下の表20のとおりであった。
【０４１２】
(表20) 核酸ターゲットの検出のための反応の成分
2009509551.tif 000081
【０４１３】
反応物を54℃で20分間、インキュベートし、12秒間隔で蛍光データを収集した。出発蛍光は、SmartCycler Systemサーモサイクラーの個々のウエルごとに変わることがあるので、異なるウエルでの反応を比較できるように、各反応の各時点での蛍光から初期蛍光値を引いた。その後、突然変異パートザイムAまたは突然変異パートザイムBのいずれかを含有する複製反応の平均を、対照複製に対する蛍光のパーセンテージとして表示した。
【０４１４】
17.5.結果：SubBi-2-FBレポーター基質の切断の検出。
様々なパートザイムペアによる基質の切断を、経時的な蛍光の変化により判断した。その後、各反応についての正規化した蛍光値を、同じ時点での対照反応において観察された蛍光に対するパーセンテージとして表示した（表21）。
【０４１５】
(表21) 様々なパートザイム配列変異体（＊この実施例）の切断活性および変異体10：23 DNAzymeの活性（＊＊Zaborowska）との比較。
2009509551.tif 000082
【０４１６】
この実験は、パートザイムAまたはBのいずれかの部分触媒コア内の様々な置換が、活性MNAzyme形成と両立できることを示している。対照的に、他の置換は、あまり許容されず、触媒活性が殆どまたは全くない構造を生じさせた。MNAzymeを使用して得られた結果を、10：23 DNAzyme触媒コア内での等価の置換について報告されたもの（Zaborowska et al）と比較したところ、上（表21）と類似したパターンが観察された。例えば、パートザイムA内または10：23コア内の位置14におけるGのAでの置換（G14A）は、90％より大きな切断活性の喪失を生じさせた。対照的に、パートザイムA内または10：23コア内の位置12におけるAのTでの置換（A12T）は、対照配列と比較して約80％の切断活性を保持する分子を生じさせた。
【０４１７】
従って、DNAzyme活性と適合性のある他の配列置換（例えば、10：23 DNAzymeまたは8：17 DNAzyme）についての文献での情報により、同じ配列変異を一方のパートザイムに導入したときに期待される触媒活性を予測することができる。さらに、当業者は、経験的な試験を用いて、活性MNAzyme形成と適合性のある追加のパートザイム部分触媒コア配列変異体を同定することができる。
【０４１８】
実施例18：アデノシン5’-三リン酸などの小分子を含むターゲットの検出へのMNAzymeの適用
アプタマーは、高い親和性および特異性でターゲットに結合するそれらの能力のため、ランダム配列オリゴヌクレオチドの大きなプールからインビトロで発生させた一本鎖DNAまたはRNA分子である。アプタマーは、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、全細胞およびウイルスを含む多くのタイプのターゲットに特異的結合するそれらの能力のため、選択した。この実施例では、ターゲットが存在する場合にのみ活性MNAzymeを形成する配座でパートザイムの末端にアプタマー配列(アプタ-パートザイム)を組み込んだ。この目的を達成する方法は、図4に概要を示す戦略および後続の実施例において使用する戦略（図20に図示する）を含めて、幾つかある。
【０４１９】
図20に図示するMNAzyme検出戦略に必要な核酸オリゴヌクレオチドとしては、次のものが含まれる；標準的なパートザイム；
a）その一方の末端にアプタマーが組み込まれているパートザイムである、アプタ-パートザイム；
b）アプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合して活性MNAzymeの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである、組織化助長因子；
c）レポータープローブ基質；および
d）少なくともアプタマー配列の一部およびパートザイム配列の基質結合アームの一部にわたる領域においてアプタ-パートザイムにハイブリダイズする、阻害剤オリゴヌクレオチド。
【０４２０】
アプタマーに結合するターゲットが不在の場合（図20の左手のパネル）、阻害剤オリゴヌクレオチドは、アプタ-パートザイムに結合し、そのようにしてレポータープローブ基質の結合（および切断）を遮断する。アプタマーに結合するターゲットが存在する場合（図20の右手のパネル）、ターゲットはアプタ-パートザイムのアプタマー配列に結合して、阻害剤オリゴヌクレオチドの結合を防止し、レポータープローブ基質の結合および切断を可能にする。従って、MNAzymeは、ターゲットが存在する場合にのみ形成し、蛍光シグナルを生じさせることができる。
【０４２１】
小分子、ATPの検出を用いる戦略を実証した。この実施例において使用した27ヌクレオチド長アプタマー配列は、ATPおよびdATPの結合に非常に特異的であると以前に報告されている（Achenbach, 2005; Huizenga and Szostak, 1995）。
【０４２２】
18.1.パートザイムオリゴヌクレオチド、組織化および阻害性オリゴヌクレオチド
この実施例では、ATPアプタマー配列をアプタ-パートザイムAの基質アームに隣接して配置した（図20）。アプタ-パートザイムAおよびパートザイムBのセンサーアームは、組織化助長因子に結合するように設計した。アプタ-パートザイムAtpA2/1およびパートザイムAtp B3/1の配列（図21）を下に示す（5’から3’）。以下の配列において、太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。加えて、パートザイムAtpA2/1中の普通の活字の塩基は、ATPまたはdATPに結合するDNAアプタマー配列を示す。
2009509551.tif 000083
【０４２３】
その組織化助長因子の配列を下に示す（5’から3’）。
2009509551.tif 000084
【０４２４】
その阻害剤オリゴヌクレオチドの配列を下に示す（5’から3’）。
2009509551.tif 000085
【０４２５】
18.2.レポーター基質
二重標識核酸レポーター基質の切断により、MNAzyme活性をモニターした。この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を付けた塩基は、その5’末端の6-FAM部分およびその3’末端のBHQ1部分の位置を示す。490nm（FAM励起波長）での励起と共に、520nm（FAM放射波長）でFAMとBHQ1の間のリボヌクレオチドでのSubBi-1-FBの切断に起因する蛍光の変化をモニターした。
2009509551.tif 000086
【０４２６】
18.3.ターゲット
この実施例のためのターゲット分子は、5’-三リン酸（ATP）およびデオキシアデノシン5’-三リン酸（dATP）であった。グアノシン5’-三リン酸（GTP）およびシトシン5’-三リン酸（CTP）を陰性対照として使用した。すべての分子をBiolineから購入した。ヌクレアーゼ不含水を無ターゲット対照として使用した。
【０４２７】
18.4.反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲットの検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、50μLであった。基質を注入する前に、（二次構造を減少させるために）すべての反応物を60℃で5分間プレインキュベートした。反応は、FLUOstar OPTIMA（BMG Biotech）において47℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、3秒ごとに読み取った。各反応は、200nM AtpA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nM AtpR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、50mM Tris HCl pH7.5、ならびにATP、dATP、GTP、CTPのいずれかの2mMまたは無ターゲット（水）の最終濃度を含有した。
【０４２８】
18.5.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の検出および切断
ATPまたはdATPが不在の場合、低い蛍光レベルが観察され、それは経時的に増加しなかった。これは、阻害剤オリゴヌクレオチドが活性MNAzymeの組織化を防止できることを明示している（図21）。ATPまたはdATPが存在する場合、蛍光シグナルは、より高く、それが経時的に増加した。これは、阻害剤オリゴヌクレオチドがdATPおよびATPによって置換され、活性MNAzymeが形成されたことを示している。GTPおよびCTPが存在する場合の蛍光シグナルが、ATPまたはdATPが不在の場合、すなわち無分析物の水対照の場合と同じであったので、このMNAzymeの組織化は、ターゲット依存的であった。この実施例は、ターゲットに非常に特異的なアプローチで、核酸ターゲットと非核酸ターゲットの両方を含むターゲットの検出のために、アプタマーにMNAzymeを連結させることができることを実証する。
【０４２９】
この戦略の設計が柔軟であり得ることは、当業者には理解される。部分触媒コア配列を含有する二つのパートザイムのいずれかについてのいずれかの末端（5’または3’）にアプタマーを組み込むことができる。従って、阻害剤オリゴヌクレオチドは、そのアプタマー領域に、および（レポーター基質に結合する）基質アームまたは（組織化助長因子に結合する）センサーアームのいずれかに、結合することができる。前の設計（図20；この実施例）での阻害剤は、レポーター基質の結合を遮断する。後の設計での阻害剤は、パートザイムと組織化助長因子の結合を防止し、従って、活性MNAzymeの形成を防止する。
【０４３０】
本文献は、多くのタイプのターゲットを検出することができる非常に多数のアプタマーについての配列を含む。これらとしては、タンパク質、炭水化物、脂質、プリオン、ヌクレオチド、全細胞およびウイルスが含まれる。これらすべてのタイプのターゲットに対するアプタマーをパートザイムに連結させて、非常に多岐にわたる範囲の分子を検出することができた。アプタマー（またはアプタ-パートザイム）へのターゲットの結合とMNAzymeによるレポーター基質の切断の両方に適合した反応条件（バッファー、温度、二価カチオン濃度など）は、経験的試験によって決定することができる。さらに、研究者により選択される反応条件下、インビトロでアプタマーを発生させるので、MNAzymeの切断に適合した条件下で結合する任意の所望のターゲットにアプタマーを発展させることができるように分子発生を調整することができる。MNAzymeは、非常に広範な条件にわたって活性であるので、当業者は、MNAzyme切断に適合した条件を容易に決定できる。
【０４３１】
実施例19：単一の塩基ミスマッチの検出のためのMNAzymeの使用
MNAzymeは、PCRなどのインビトロターゲット増幅法を使用して実時間でターゲット核酸を検出および定量するために使用することができる。MNAzymeを使用して、例えば、核酸配列の変化を検出することにより、定量的な結果を生じさせることもできる。MNAzyme媒介がーゲット検出は、センサーアームおよびターゲット配列のワトソン・クリック塩基認識によって行うことができる。この実施例では、パートザイムセンサーアームとターゲット核酸配列の間の相補性に関するこの要件を利用することにより、単一の塩基ミスマッチを検出するために、MNAzymeを使用する。
【０４３２】
19.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムオリゴヌクレオチドは、ターゲット配列に完全に相補的であるように、またはターゲット配列を基準にしてミスマッチがあるように設計した（図22（i））。完全マッチパートザイムA（RO5A5/2（22）-P）、完全マッチパートザイムB（RO5B6/2（11G）-P）およびミスマッチパートザイムB（RO5B6/2（11C）-P）の配列を下に列挙する（5’から3’）。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。パートザイムRO5B6/2（11C）-Pにおけるミスマッチ塩基は、太字であると共に、下線が引かれている。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。
2009509551.tif 000087
【０４３３】
19.2.レポーター基質
この実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列を下に列挙する（5’から3’）。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000088
【０４３４】
19.3.RPLPOエキソン5の増幅のためのPCRプライマー
この実施例のためのターゲット配列は、下に列挙する（5’から3’）オリゴヌクレオチドPCRプライマーを使用する、ヒトゲノムDNAのインビトロ増幅によって生成した。
2009509551.tif 000089
19.4.ターゲット配列および対照
ヒトK562細胞系統から抽出したヒトゲノムDNAを、RPLPO遺伝子の増幅のためのテンプレートとして使用した。ゲノムDNAの代わりにヌクレアーゼ不含（NF）水を無ターゲット対照として使用した。
【０４３５】
19.5.反応成分：ターゲット配列の増幅および検出
ターゲット配列の実時間増幅および検出を25μLの総反応容量で行った。すべての反応は、ABI 7700サーモサイクラー（Applied Biosystems）で行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で15秒間および47℃で30秒間であった。これらの反応は、40nMの5RO5/1、200nMの3RO5/2、200nMのRO5A5/2（22）-Pおよび200nMのRO5B6/2（11G）-Pまたは200nMのRO5B6/2（11C）-P、200nMのSubBi-2-FB、10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin（Promega）、1 x ROXリファレンス（Invitrogen）、1x Immobuffer（Bioline)、1単位のImmolase（Bioline）、ならびに次のいずれか、100ngのゲノムDNAテンプレートまたはNF-水を含有した。
【０４３６】
19.6.結果：MNAzymeを使用する単一塩基ミスマッチ検出
完全マッチセンサーアームBを含むMNAzymeは、使用したターゲット配列が、PCRによって増幅されたヒトゲノムDNAであったとき、経時的な蛍光の増加を示した（図22（ii））。対照的に、ミスマッチセンサーアームBを含有するMNAzymeは、無ターゲット対照において見られるものに類似した、ゲノムターゲットに関する低い蛍光レベルを示し、その蛍光は、経時的に増加しなかった。従って、パートザイムAおよびB接合部からの単一ミスマッチの三つの塩基は、活性MNAzymeの形成を防止するために十分であった。
【０４３７】
この実施例は、MNAzymeを使用して、ターゲットとセンサーアームの間の単一の塩基ミスマッチを検出できることを実証する。MNAzymeは、単一の塩基変化ほどのわずかな改変を検出することができるので、MNAzymeを使用して、わずかな欠失またはわずかな挿入による配列の違いを識別することもできることは、当業者には明らか。加えて、融合転写産物を生じさせる、様々な癌タイプに随伴する転座などの、より大きな改変も、検出することができる。これらは、多くの場合、白血病に随伴して発生し、例えば、PML/RARα融合転写産物は、急性前骨髄球性白血病に随伴し、bcr/abl融合転写産物は、慢性顆粒球性白血病に随伴する。
【０４３８】
この実施例は、活性MNAzymeの組織化を防止するためには単一のミスマッチで十分であり得ることを示すものであるが、追加の実験は、すべての単一塩基ミスマッチが、すべての条件下でMNAzyme組織化を完全に破壊するとはかぎらないことを明示した。単一塩基ミスマッチを識別する能力は、a）温度、塩濃度、カチオン濃度を含む多くの因子による影響を受け得る、反応条件のストリンジェンシー、b）ミスマッチのタイプ、例えば、C/Cに対するG/Tミスマッチ、c）パートザイムアーム内のミスマッチの位置、およびd）パートザイムアームの長さを含む幾つかの因子に依存する。
【０４３９】
単一塩基多型を検出できるMNAzymeの能力を増大させるために、追加の戦略を利用してもよい。これらとしては、例えば、実施例22において実証するような、トランケートされたパートザイムセンサーアームの使用が含まれる。
【０４４０】
実施例20：10：23触媒コアに由来する変異体部分触媒コア配列を含有する一連のパートザイムペアからのMNAzyme活性の試験
インビトロで発生させた様々なDNAzymeからの部分配列が組み込まれた多成分核酸酵素（MNAzyme）を作ることができる。8：17および10：23 DNAzymeからの部分配列に基づく活性MNAzymeを実証した。さらに、8：17および10：23 DNAzymeに基づく幾つかの代替パートザイム設計が、活性を有する（実施例1、3、図9、10および13）または欠く（実施例1、図8）ことを証明した。この実施例は、さらに、これらの研究を拡大し、10：23 DNAzymeからの部分触媒コア配列に基づく活性パートザイム配列と不活性パートザイム配列の両方を同定する。さらに、本実施例は、それらの部分触媒コア配列がパートザイムに組み込まれると機能的活性MNAzymeが生成されるように触媒コア配列を分割するための最適な場所を特定するために必要な段階のための一般プロトコルを提供する。
【０４４１】
20.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
この実施例における方法は、パートザイムに組み込まれると機能的活性MNAzymeを生じさせる部分触媒配列に分割するために、10：23触媒コア配列の中のどの位置が適するかを調査するために使用した。10：23配列を様々なポイントで分割し、その後、それらの二つの部分配列を、ターゲット（ヒトRPLPO遺伝子）が存在する場合に基質を切断するように設計された一連のパートザイムペアに組み込んだ。試験した各パートザイムペアについての部分触媒コアを、その10：23 DNAzymeの完全触媒コア配列（Santoro and Joyce, 1997）への参照と共に、表22に示す。
【０４４２】
(表22) 10：23 DNAzymeにおける、ならびにそのコアの位置1から15の塩基を二つのパートザイムAおよびB間で異なるように配置した一連の変異体パートザイムペアにおける、塩基および位置
2009509551.tif 000090
すべての配列は、5’から3’へと記載されている。MNAzyme設計およびパートザイムの学名は、表3における系列からの延長であり、この表では、それをコア内の分割位置の特定に拡大した。例えば、設計6は、位置8のTと位置9のAの間（T8-T9）でコアを分割した、パートザイムA4およびパートザイムB5設計（A4：B5）を有する10：23由来のMNAzymeである。
【０４４３】
この実験では、一連のパートザイムペアは、すべて、ヒトRPLPO遺伝子のエキソン5にハイブリダイズするように設計したセンサーアーム、および基質、SubBi-2に向けた基質アームと共に合成された。この実験において使用したパートザイムペアは、Sigma-Proligoによって合成されたものであり、それらの配列を下に列挙する（5’から3’）。下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、核酸ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。
RPLPOパートザイムペアA4：B5
2009509551.tif 000091
RPLPOパートザイムペアA5：B6
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RPLPOパートザイムペアA6：B7
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RPLPOパートザイムペアA7：B8
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RPLPOパートザイムペアA8：B9
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RPLPOパートザイムペアA9：B10
2009509551.tif 000096
【０４４４】
20.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2である。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000097
【０４４５】
20.3.ヒトRPLPO遺伝子のエキソン5の増幅のためのPCRプライマー
これらのプライマーの配列を下に5’から3’へと示す。
2009509551.tif 000098
【０４４６】
20.4.ターゲット配列
K562細胞から抽出したヒトゲノムDNAをPCR反応のテンプレートとして使用した。
【０４４７】
20.5.反応条件
ターゲット配列の実時間増幅およびパートザイムペアの触媒活性の検出を、ABI 7700サーモサイクラー（Applied Biosystems）を用いてサイクリングさせる25μLの反応で行った。サイクリングパラメータは、95℃で7分間、10サイクルの95℃で15秒間および65℃で30秒間（1サイクルにつき温度が1℃低下する）、ならびに最後に、50サイクルの95℃で15秒間および50℃で30秒間であった。各反応は、0.04μMの5RO5/1、0.2μMの3RO5/2、10mMのMgCl2、50μMの各dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、1x Immobuffer（Bioline)、0.2μMのSubBi-2-FB、1 x ROXリファレンス色素（Invitrogen）、10単位のRnasin（Promega）、1単位のImmolase Polymerase（Bioline）、および100ngのゲノムDNAを含有した。加えて、各反応は、パートザイムのペア：0.2μMのパートザイムAおよび0.2μMのパートザイムB（RPLPOパートザイムペアA4：B5またはA5：B6またはA6：B7またはA7：B8またはA8：B9またはA9：B10）を含有した。
【０４４８】
20.6.結果
実時間MNAzyme-PCR法を使用して、六つのRPLPOパートザイムペアのうちの三つから触媒活性を検出した。パートザイムペアA4：B5およびA5：B6は、高い触媒活性レベルを示し、その結果、22サイクル以下でターゲットを検出することができた（表23）。A7：B8パートザイムペアも活性を有したが、A4：B5およびA5：B6より低い活性であった。この実験の条件下でパートザイムペアA6：B7、A8：B9またはA9：B10から触媒活性は検出されなかった。
【０４４９】
(表23) 様々なパートザイムペアを使用して得たサイクル閾値（Ct）
2009509551.tif 000099
Ct値は、三重反復の反応からの平均であり、このとき、蛍光レベル閾値を0.2に設定し、サイクル1および14の間、ベースラインバックグラウンド蛍光を引いた。
【０４５０】
実施例21：タンパク質ターゲットの検出のためのMNAzymeの適用
実施例18において実証したように、パートザイムの末端にアプタマー配列を組み込むこと（アプタ-パートザイム）によってターゲットを検出するために、MNAzymeを使用することができる。この実施例では、Taqポリメラーゼに高い特異性で結合することが報告されている（Yakimovich, 2003）46ヌクレオチド長アプタマー配列を使用してタンパク質Taqポリメラーゼを検出するために、同MNAzyme検出戦略（図20）を使用した。組織化助長因子およびパートザイムBオリゴヌクレオチドは、MNAzymeを使用してATPを検出した実施例18において使用したものと同じであった。
【０４５１】
21.1.パートザイムオリゴヌクレオチド、組織化および阻害性オリゴヌクレオチド
この実施例では、Taqポリメラーゼアプタマー配列を、アプタ-パートザイムAの基質アームに隣接するように配置した（図20）。アプタ-パートザイムAおよびパートザイムBのセンサーアームは、組織化助長因子に結合するように設計した。アプタ-パートザイムTaqA2/1およびパートザイムAptB3/1の配列を下に示す（5’から3’）。以下の配列において太字の塩基は、組織化助長因子とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。加えて、アプタ-パートザイムA2 TaqA2/1における普通の活字の塩基は、Taqポリメラーゼに結合するDNAアプタマー配列を示す。
2009509551.tif 000100
【０４５２】
組織化助長因子の配列を下に示す（5’から3’）。
2009509551.tif 000101
【０４５３】
阻害剤オリゴヌクレオチドの配列を下に示す（5’から3’）。
2009509551.tif 000102
【０４５４】
21.2.レポーター基質
二重標識核酸レポーター基質の切断により、MNAzyme活性をモニターする。この実施例のためのレポーター基質は、下に示すような配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を引いた塩基は、5’末端の6-FAM部分および3’末端のBHQ1部分の位置を示す。490nm（FAM励起波長）での励起と共に、520nm（FAM放射波長）で、FAMとBHQ1の間のリボヌクレオチドでのSubBi-1-FBの切断に起因する蛍光の変化をモニターした。
2009509551.tif 000103
【０４５５】
21.3.ターゲット
この実施例におけるターゲット分子は、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）であり、クレノウポリメラーゼ（Amersham Biosciences）を陰性対照として使用した。ヌクレアーゼ不含水を「無ターゲット」対照として使用した。
【０４５６】
21.4.反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、50μLであった。反応は、FLUOstar OPTIMA（BMG Biotech）において40℃で行った。各反応の蛍光を、合計15分間、6秒ごとに読み取った。各反応は、200nM TaqA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nM TaqR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、25mM Tris HCl pH6.8、ならびに次のいずれか、Taq DNAポリメラーゼの5単位もしくはクレノウポリメラーゼの5単位、または無タンパク質（水のみ）の最終濃度を含有した。
【０４５７】
21.5.結果：SubBi-1-FBレポーター基質の検出および切断
Taqポリメラーゼが不在である場合、低い蛍光レベルが見られ、それは経時的にもほんのわずかにしか増加しなかった。これは、阻害剤オリゴヌクレオチドが活性MNAzymeの組織化を防止できたことを明示している。Taqポリメラーゼが存在する場合、蛍光シグナルは、より高く、経時的に増加した。これは、阻害剤オリゴヌクレオチドが、Taqポリメラーゼによって置換され、活性MNAzymeが形成されたことを示す。クレノウポリメラーゼが存在する場合の蛍光シグナルは、Taqポリメラーゼが不在の場合、すなわち「無ターゲット」水対照の場合のシグナルに類似していたので、MNAzymeの組織化は、ターゲット依存的であった。これは、Taqポリメラーゼゼアプタマー配列が、Taqポリメラーゼに特異的であり、クレノウには結合しないことを証明したYakimovich et al（2003）の観察と一致する。上記の本MNAzyme実施例は、特定のタンパク質の検出のためのアプタマーにMNAzymeを連結させることができることを明示している。
【０４５８】
実施例22：トランケートされたパートザイムおよびスタビライザーオリゴヌクレオチドを使用する単一オリゴヌクレオチド多型（SNP）の検出
パートザイムセンサーアームおよびターゲット配列のワトソン・クリック塩基認識により、MNAzyme媒介ターゲット検出を行うことができる。実施例19では、相補性についてのこの要件を使用して、パートザイムセンサーアームとターゲット核酸配列との単一塩基ミスマッチを検出した。以下の実施例では、スタビライザーオリゴヌクレオチドによって安定させることができるトランケートされたセンサーアームを有するパートザイムを使用する戦略を用いて一塩基多型（SNP）を検出するために、その相補性についての要件を再び利用した。この実施例において使用したMNAzyme検出戦略を図23に図示し、必要なオリゴヌクレオチドを下に記載する。
a）標準的なパートザイム；
b）ある形のSNPに完全にマッチするが、他にはしないように設計されている、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイム（例えば、5塩基）；
c）そのパートザイムのトランケートされたセンサーアームに隣接するターゲットにハイブリダイズする、スタビライザーオリゴヌクレオチド（例えば、15塩基）。
このスタビライザーは、その5ヌクレオチドセンサーアームがターゲットにハイブリダイズされるとMNAzyme組織化を助長するように設計される；および
d）レポータープローブ基質。
【０４５９】
22.1.パートザイムオリゴヌクレオチドおよびスタビライザーオリゴヌクレオチド
この実施例において、パートザイムBのセンサーアームは、わずか5ヌクレオチド長であるように、およびターゲットオリゴヌクレオチドにおいて発生するSNPを識別するように設計した。パートザイムBのセンサーアームは、「T」形のSNPにはハイブリダイズするが、「C」形のSNPにはしないように設計した。パートザイムAおよびBならびにスタビライザーオリゴヌクレオチドの配列を下に示す（5’から3’）。以下の配列において、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドの3’リン酸化を示す。
2009509551.tif 000104
【０４６０】
22.2.レポーター基質
この実施例において使用したレポーター基質は、SubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。490nm（FAM励起波長）での励起と共に、520nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列を下に列挙する（5’から3’）。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000105
【０４６１】
22.3.ターゲット
この実施例のためのターゲット基質は、Xd遺伝子由来の合成オリゴヌクレオチドであった。ターゲットのうちの一つは、「T」形のSNP（XdC/2（52））に対応し、パートザイムBセンサーアームと完全にマッチした。他のターゲットは、「C」形のSNPに対応し、パートザイムBセンサーアームとはミスマッチがあった。合成オリゴヌクレオチドは、Sigma-Proligoに注文したものであり、ターゲットの代わりに「無ターゲット」対照としてヌクレアーゼ不含水を使用した。両方のターゲットの配列を、下線を引いたSNPとともに、下に列挙する（5’から3’）。
2009509551.tif 000106
【０４６２】
22.4.反応条件
触媒活性MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、ターゲット配列の検出を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、50μLであった。反応は、FLUOstar OPTIMA（BMG Biotech）において55℃で行った。各反応の蛍光を、合計5分間、2秒ごとに読み取った。すべての反応は、200nMのXdA4/2-P、200nMのXdB5/2-P、1 x PCR Buffer II（Applied Biosystem）および25mMのMgCl2を含有した。加えて、この反応は、表24に列挙するオリゴヌクレオチドを含有した。
【０４６３】
（表24）MNAzyme反応における追加の試薬
2009509551.tif 000107
【０４６４】
22.5.結果：SubBi-2-FBレポーター基質の検出および切断
MNAzymeは、完全マッチSNPテンプレートを使用したとき、経時的な蛍光の増加を示した（反応A：図23）。対照的に、テンプレートがミスマッチであった（SNPを含有した）とき、蛍光シグナルは、経時的に増加しなかった（反応B：図23）。同様に、ターゲットオリゴヌクレオチドが不在の場合には蛍光の増加はなかった（反応D：図23）。スタビライザーオリゴヌクレオチドの存在は、MNAzyme複合体を安定させるために不可欠であることが明らかになった。完全マッチターゲットを含めてすべての反応成分を含有するが、スタビライザーオリゴヌクレオチドを欠く反応は、経時的な蛍光の増加をもたらさなかった（反応C：図23）。従って、安定なMNAzyme複合体を形成するには5塩基のセンサーアームでは不十分であったが、スタビライザーオリゴヌクレオチドの存在が、パートザイムセンサーアーム（5塩基）の短い長さを補い、ストリンジェントな温度条件（この実施例では55℃）のもとで安定なMNAzymeの形成を可能にした。このスタビライザーオリゴヌクレオチドは、安定なMNAzymeの形成に必要であるので、この系における第三のパートザイムと考えることができる。
【０４６５】
この実施例は、SNPほどのわずかな違いしかない二つのターゲットを識別するためにMNAzymeを使用できることを実証する。さらに、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムの適用およびスタビライザーオリゴヌクレオチドとのそれらの併用を実証する。
【０４６６】
実施例23：リボヌクレオチド置換を有するMNAzymeの触媒活性
リボザイムとは異なり、自然に発生するDNAzymeは、発見されていない。DNAzymeは、大きなオリゴヌクレオチドライブラリーからインビトロで発生させる。公知のリボザイムにおける一定のリボヌクレオチドの一定のデオキシリボヌクレオチドでの置換が、一定の条件下で試みられた（McCall et al., 1992）。DNAに完全に変換されたリボザイムは、RNAとDNAの配座の違いのため、活性を有さない（Perreault et al., 1990）。これらの研究は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの単なる交換によってRNA酵素を役立つDNA酵素に変更できないことを明示している。デオキシリボヌクレオチドのリボヌクレオチドでの置換に対するMNAzymeの許容度を調査する実験を行った。
【０４６７】
23.1.パートザイムオリゴヌクレオチド
この実施例では、部分触媒コアを構成する領域内の一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドと交換した様々なパートザイムを合成した。単一のリボオリゴヌクレオチド置換を有する、または部分触媒コア領域全体をリボヌクレオチドと交換した、パートザイムを合成した。パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBは、ヒトRPLPO遺伝子のエキソン4の領域に相補的なセンサーアームを有した。これらのパートザイムオリゴヌクレオチド、5’から3’を下に列挙する。以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000108
【０４６８】
23.2.レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-2-FBと呼んだ。485nm（FAM励起波長）での励起と共に、530nm（FAM放射波長）でSubBi-2-FBの切断をモニターした。以下の配列において、下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000109
【０４６９】
23.3.ターゲット配列
この実験では合成DNAオリゴヌクレオチドをターゲットテンプレートとして使用した。そのターゲットの配列を下に5’から3’へと示す。
2009509551.tif 000110
【０４７０】
23.4.反応条件
SmartCycler Systemサーモサイクラー（Cepheid）を使用して、様々なパートザイムペアの触媒活性の分析を行った。総反応容量は、25μLであり、各反応は、1 x PCR Buffer II（Applied Biosystems）、10 mMのMgCl2、0.2μMのSubBi-2-FB、2μMのRO4/1ターゲット、および各2μMでのAおよびBパートザイムのペアを含有した。各反応におけるパートザイムペアは、表24にあるとおりであった。
【０４７１】
(表24) 様々な反応におけるパートザイム。
2009509551.tif 000111
【０４７２】
反応物を54℃で20分間、インキュベートし、12秒間隔で蛍光データを収集した。出発蛍光は、SmartCycler Systemサーモサイクラーの個々のウエルごとに変わることがあるので、異なるウエルでの反応を比較できるように、各反応の各時点での蛍光から初期蛍光値を引いた。
【０４７３】
23.5.結果：パートザイム部分触媒コア配列内のリボヌクレオチド置換を有するMNAzymeの触媒活性。
様々なパートザイムペアからなるMNAzymeによる基質の触媒的切断を、蛍光の変化として経時的にモニターした（表25）。
【０４７４】
(表25) 様々なパートザイムの組み合わせを使用して得た結果。
2009509551.tif 000112
【０４７５】
この実験は、パートザイムの部分触媒コア内の幾つかのリボヌクレオチド置換が、活性MNAzyme形成と適合性のあることを示す。単一の置換（パートザイムA（リボ-14g））は、これらの条件下ですべてのDNAパートザイムと同様の活性を有したが、別の単一置換（パートザイムA（リボ9a））は、活性MNAzyme形成とやはり適合性ではあるが、対照より遅い速度で基質を切断した。MNAzymeは、パートザイムAおよび/またはパートザイムBの部分的触媒コアにおける全ヌクレオチドの置換を許容しなかった。
【０４７６】
実施例24：シグナル増幅カスケードを開始させるメカニズムとしての係留パートザイムの放出によるMNAzymeの活性化
24.1.MNAzyme媒介シグナル増幅カスケード
MNAzymeを使用して、シグナル増幅カスケードを開始させることができる。このようなシグナル増幅カスケードの一つの戦略を図25に図示する。ターゲットが存在する場合、活性MNAzyme 1は、溶液中で遊離しているパートザイムから形成する。MNAzyme 1は、その係留基質、Sub1を切断し、そのようにしてMNAzyme 2についてのパートザイム成分を放出させる。一旦遊離すると、これらのパートザイムは、組織化助長因子とハイブリダイズし、MNAzyme 2を形成し、それが基質Sub2を切断する。溶液中で遊離している二重標識Sub2がMNAzyme 2によって切断され、蛍光シグナルが生成される。加えて、MNAzyme 2は、係留されているSub2を切断して、パートザイムを放出させ、これらのパートザイムは、MNAzyme 2と同じセンサーアームを有し、組織化助長因子にハイブリダイズすると、MNAzyme 3を形成する（この組織化助長因子は、係留されている場合もあり、または溶液中で遊離している場合もある）。MNAzyme 3は、MNAzyme 1と同じ基質アームを共有するので、これも、係留Sub1を切断することができ、そのようにしてMNAzyme 2についてのさらなるパートザイム成分を放出させる。これが、結果として、さらなる酵素（MNAzyme）についての成分（パートザイム）の酵素的生成のカスケードおよび付随的シグナル増幅を生じさせる。
【０４７７】
24.2.蛍光標識基質を切断することができる係留MNAzymeの活性化
この実施例は、図25に図示するようなシグナル増幅カスケードの第一段階を実証するものである。この開始段階において、ターゲットは、溶液中で遊離しているパートザイムに結合し、活性MNAzyme 1を形成する。MNAzyme 1は、その係留基質、Sub1を切断し、そのようにしてMNAzyme 2についてのパートザイム成分を放出させる。一旦遊離すると、これらのパートザイムは、組織化助長因子とハイブリダイズし、MNAzyme 2を形成する。溶液中で遊離している二重標識Sub2-FQ（具体的には、この実施例におけるSubBi-3-FB）がMNAzyme 2によって切断され、蛍光シグナルが生成される。
【０４７８】
24.3.パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、下線を引いた塩基は、組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、太字の塩基は、ターゲットとハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、基質にハイブリダイズする。イタリック体でもあり、下線も引かれている塩基は、パートザイムに連結されて係留される基質配列を表す。「-P」は、そのオリゴヌクレオチドのリン酸化を示し、「（ビオチン）」は、そのオリゴヌクレオチドのビオチン化を示す。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下に列挙するすべての配列は、5’から3’へと記載されている。
【０４７９】
溶液中で遊離しているMNAzyme 1パートザイムは、ヒトRPLPO遺伝子のエキソン5に特異的に結合するように設計し、係留されているMNAzyme 2パートザイムは、組織化助長因子にハイブリダイズするように設計した。
2009509551.tif 000113
【０４８０】
24.4.レポーター基質
この実施例におけるレポーター基質（Sub 2；図25）は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-3である。本実施例において、SubBi-3は、その5’末端を6-FAM部分でおよびその3’末端をBHQ1部分で末端標識し、SubBi-3-FBと呼んだ。492nm（FAM励起波長）での励起と共に、516nm（FAM放射波長）でSubBi-3-FBの切断をモニターした。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。
2009509551.tif 000114
【０４８１】
24.5.合成ターゲットおよび助長因子配列
以下の配列において「（ビオチン）」は、そのオリゴヌクレオチドのビオチン化を示す。
2009509551.tif 000115
【０４８２】
24.6.ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートへのビオチン化パートザイムの係留
ビオチン化パートザイムおよび組織化助長因子の係留は、室温で、100μLの総反応容量で行った。この結合ミックスは、Amressco PBS溶液（Ca+およびMg+を伴わない）中、200nMのパートザイムRO4A4/3-5b、200nMのパートザイムRO4B5/3-3bおよび200nMの組織化助長因子RO4/2-3bを含有した。結合ミックス（100μL）を、ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレート（Roche Diagnostics）の各ウエルに等分した。結合時間は30分であり、その後、PBSを使用して3回洗浄し、洗浄除去前に、各々15分、インキュベートした。
【０４８３】
24.7.係留MNAzymeの切断および切断された蛍光標識基質の検出
FluoStarOptima蛍光計（BMG LabTech）を用いて、55℃で等温的に、4分間、100μLの総反応容量で、蛍光標識基質、SubBi-3-FBの切断をモニターした。反応は、200nMのパートザイムRO5A4/2-P、200nMのパートザイムRO5B5/2-P、200nMの基質SubBi-3-FB、25mMのMgCl2、1 x PCR Buffer II（Applied Biosystems）、および200nMの合成RO5ターゲットを含有した。「無ターゲット」対照については、合成RO5ターゲットの代わりにヌクレアーゼ不含水を使用した。基質SubBi-3-FBの添加で反応を開始させた。
【０４８４】
24.8.結果：「無ターゲット」対照に対するRO5ターゲットが存在する場合の蛍光レベルの変化
ターゲットを欠く反応（水対照）と比較して、RO5ターゲットが存在する場合には蛍光が増加する。4分後の蛍光の変化は、無ターゲット対照についての＜1,000単位と比較して、ターゲットが存在する場合には約36,000単位であった。これは、（パートザイムRO5A4/2-PおよびRO5B5/2-Pで構成された）MNAzyme 1が、係留されている基質を切断して、MNAzyme 2を構成するパートザイムを放出させることができることを明示している。さらに、一旦放出されると、それらのパートザイムは、基質を切断してシグナル生成をもたらすことができる組織化助長因子との活性MNAzyme複合体を形成できることを明示している。
【０４８５】
実施例25：DNA中のメチル化シトシンとシトシンの直接識別
トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムとスタビライザーアームの使用を、ターゲット組織化助長因子中に存在する一塩基多型（SNP）を検出するMNAzymeの能力（実施例22）を実証するために用いた。その実施例において使用した実験条件下、五塩基センサーアームを、その期待融解温度より十分に高い55℃で、SNPのためのプローブとして使用した。スタビライザーアームと、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムとを有する系は、ターゲットにおける小さな変化に対して非常に高感度である。この検出戦略は、事前の亜硫酸水素塩修飾の必要がない、特定のシトシン残基がメチル化されているまたはメチル化されていないターゲット間の直接識別（実施例11参照）に、さらに拡大することができる。
【０４８６】
5-メチルシトシンの存在は、非メチル化シトシンを基準にして、DNAの融解温度をメチル化塩基1つにつき1.3℃上昇させる。従って、例えば、五ヌクレオチド長のセンサーアームを有するパートザイムは、三つの5-メチルシトシンを含有するターゲットに、同じ配列の非メチル化ターゲットに結合することができる温度よりほぼ4℃高い温度で結合することができる。
【０４８７】
メチル化ターゲットが存在する場合のハイブリダイゼーションおよびMNAzymeに適するが、非メチル化ターゲットが存在する場合のMNAzyme形成には高すぎる温度で、パートザイム、スタビライザーアームおよび基質をインキュベートすると、シグナルは、メチル化ターゲットが存在する場合にのみ生成される。
【０４８８】
これは、癌および他の疾病のマーカーとしてのメチル化塩基の検出方法をもたらすことができる、メチル化パターンの分析のための新たな戦略をもたらす。
【０４８９】
実施例26：ターゲットに応じて色の変化を誘導するためのMNAzymeの使用
比色形式でMNAzymeを使用するための戦略を図24に図示する。このアプローチでは、MNAzyme基質を架橋性オリゴヌクレオチドに組み込むこととなる。この架橋性オリゴヌクレオチドは、金粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する。組織化助長因子が存在しない場合、この架橋性オリゴヌクレオチドは無傷のままであり、金粒子は、凝集して、反応を青色に変えることとなる。組織化助長因子、例えばターゲット核酸が存在する場合には、溶液中に存在するパートザイムから活性MNAzymeが組織化し、基質（および従って、架橋性オリゴヌクレオチド）を切断することとなる。これは、金粒子凝集体の分散を招き、その結果として、青色から赤色への色の変化が生じることとなる。
【０４９０】
このMNAzyme戦略は、幾つかのジェネリック成分が組み込まれた系を提供し、従って、任意の新たなターゲットに迅速に適応させることができる方法を提供する。これは、より複雑な分子を必要とする、DNAzymeおよび金粒子を使用する他のシステムに勝る利点を提供する。このMNAzyme戦略において、MNAzyme基質、およびオリゴヌクレオチドを取り付けた金粒子は、ジェネリックであり、任意の核酸ターゲットの分析に使用することができた。新たな分析システムは、新たなターゲットに相補的なセンサーアームを有する新たなパートザイムの合成しか必要としない。さらに、この比色反応を、核酸、タンパク質または他のターゲットによる活性化に対して高感度のMNAzyme系と併用することもできる。
【０４９１】
参照
特許および特許公報：
PCT国際公開公報第WO 99/45146
PCT国際公開公報第IB99/00848
PCT国際公開公報第WO 99/50452
PCT国際公開公報第WO 00/58505
PCT出願PCT/US96/02380（「Asher」）
米国特許第4,683,202号
米国特許第4,683,195号
米国特許第4,000,159号
米国特許第5,176,995号
米国特許第4,965,188号
米国特許第6,140,055号
米国特許第6,201,113号
【０４９２】
他の参照：
2009509551.tif 000116
2009509551.tif 000117
2009509551.tif 000118
2009509551.tif 000119
2009509551.tif 000120
【０４９３】
ここで、添付の図面を参照しながら、単なる例として本発明の好ましい態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０４９４】
【図１】MNAzymeの設計：MNAzymeの例示的設計の描写を示す図である。この図において、パートザイムAおよびBの基質アーム部分（A）は、蛍光タグが取り付けられているレポーター基質（左）およびクエンチャーが取り付けられているレポーター基質（右）に結合する。触媒コア部分（C）は、基質アーム部分（A）とセンサーアーム部分（B）の間に位置する。ターゲットにセンサーアーム部分（B）が結合すると、そのレポーター基質がMNAzyme切断部位で切断され、それによって蛍光が増加する。
【図２】MNAzyme媒介ターゲット検出のための戦略：MNAzymeを使用してターゲットを検出する方法の例示的適用を示すフローチャートを示す図である。MNAzymeは、（1）直接検出；（2）増幅中または増幅後、いずれかの、例えばPCR、SDA、LAMP、RCA、TMA、3SRまたはNASBAによって生成されたアプリコンの検出；および（3）シグナル増幅カスケードの開始のための使用することができる。
【図３】MNAzymeおよびアンカーされたジェネリック基質を使用するターゲットの検出方法：例示的MNAzymeと支持体に係留された基質を切断するMNAzymeを使用するターゲット検出法との描写を示す図である。この態様において、MNAzymeは、組織化助長因子（ターゲット）が存在する場合にのみ形成する。MNAzymeが、その係留された基質を蛍光体とクエンチャーの間で切断すると、シグナルが生じる。ここに示すように、蛍光体FとクエンチャーQの間で切断すると、結果として蛍光の増加が生じる。一般に、この方法は、切断が発生したときに蛍光体FまたはクエンチャーQのいずれかは支持体に取り付けられたままとどまることができるように設計することができる。パネル（i）：示されている支持体は、それに係留された基質を一つだけ有する。パネル（ii）：異なる場所に多数の基質を係留することができる。各基質は、特定のMNAzyme組織化助長因子分子が存在する場合に形成されるMNAzyme分子によってのみ切断することができる。ここで、ターゲット1および2は、それぞれ、MNAzyme 1および2の自己組織化を助長する。従って、この例において、MNAzyme 1は、ターゲット1が存在する場合にのみ自己組織化し、基質1のみを切断する。同様に、MNAzyme 2は、ターゲット2が存在する場合にのみ自己組織化し、基質2のみを切断する。その表面の基質の位置を決めることによってシグナルを定位することができ、従って、異なる組織化助長因子を特異的に検出することができる。
【図４】例示的ターゲット検出方法：例えば、タンパク質または小分子を含むるがこれらに限定されるわけではないターゲット分析物（An）を検出するためにMNAzymeを使用する方法の例を示す図である。この例は、蛍光体（F）およびクエンチャー（Q）で標識された基質のMNAzyme切断によるシグナルの生成を示すものである。この一般設計は、そのシグナルが切断以外の修飾によって生成される、および/またはその読み取りが蛍光的ではなく、例えば比色的、放射性などである、他の形式で使用できる。三つの一般戦略をこの図に図解する。（i）ターゲット分析物に結合させるためのアプタマーを一つのパートザイムに連結させる（アプタ-パートザイム）。この分子は、自己相補性を有し、ならびにターゲット分析物が不在の場合には活性MNAzyme組織化に寄与することができない。第二のパートザイム、基質および組織化助長因子も規定する。特定のターゲット分析物がそのアプタマードメインに結合すると、そのアプタ-パートザイム内の相補的塩基は分離し、その結果、そのアプト-パートザイムは、活性MNAzyme組織化に寄与することができる配座をとることができるようになる。その活性MNAzymeは、その基質を切断し、蛍光を生じさせることができる。（ii）ターゲット分析物に結合させるためのアプタマーを組織化助長因子に連結させる。この分子は、自己相補性を有し、ならびにターゲット分析物が不在の場合には活性MNAzymeをアラインし、組織化するようにパートザイムを導くことができない。二つのパートザイムおよび基質も規定する。特定のターゲット分析物がそのアプタマードメインに結合すると、その組織化助長因子内の相補的塩基は分離し、その結果、その組織化助長因子は、活性MNAzymeの組織化を導くことができる配座をとることができるようになる。その活性MNAzymeは、その基質を切断し、蛍光を生じさせることができる。（iii）二つのアプト-パートザイム（これらの各々が、アプタマーの一部を含有する）を基質が存在する状態でインキュベートする。ターゲット分析物が不在の場合、それら二つのアプタ-パートザイムは、組織化して活性MNAzymeを形成することができない。特定のターゲット分析物が存在し、そのアプタマーの一部分を含有する両方のドメインに結合するとき、それら二つのアプタ-パートザイムは、極めて近接するようになり、活性MNAzymeに組織化することができる。その活性MNAzymeは、その基質を切断し、蛍光を生じさせることができる。
【図５】MNAzymeを使用するミクロRNAのPCR増幅および検出：ミクロ-RNA（miR）種などの短い配列の増幅および検出のためのMNAzyme戦略の描写を示す図である。この方法は、miRの3’末端に結合する3’プライマーを使用し、このプライマーは、その5’末端で幹-ループ構造を形成することができる（パート（i）および（ii）、ループプライマー、左）またはできない（パート（iii）および（iv）、タグプライマー、右）、非関連伸長配列（破線の四角の中に示す）を有する。この3’ miRプライマーを逆転写酵素が存在する状態で伸長し（パート（i）および（iii））、その後、3’末端にmiR特異的配列および5’末端に非関連伸長配列を有する5’および3’プライマーを使用してPCRにより増幅させる（パート（ii）および（iv））。これらのアンプリコンは、その5’プライマーと3’プライマーの間の領域を含むアンプリコンにハイブリダイズするMNAzymeによって、検出することができる。そのMNAzymeセンサーアームとターゲット核酸の厳格な相補性についての要件が、密接に関連した配列の識別を可能にする。F：蛍光体；Q：クエンチャー。
【図６】酵素媒介シグナル増幅に連結させたMNAzyme検出：シグナル増幅カスケードを開始させるためのMNAzymeの描写を示す図である。この態様において、MNAzymeは、シグナル生成の下流カスケードを誘発し、（左から右、上のパネル）MNAzymeは、ターゲットが存在する場合にのみ形成し、その後、支持体上の係留位置から酵素を放出する。下のパネルに示すように、その後、それらの遊離酵素が蛍光基質分子を切断する。この蛍光基質は、容易に検出される。F：蛍光体；Q：クエンチャー。
【図７】MNAzymeおよびシグナル増幅を使用する分析物の検出：MNAzymeは、部分的に分離したDNAzymeを使用して生成されるカスケードを誘発することができる。順に番号付けした段階で示すように、ターゲットが存在する場合にのみ発生する最初のMNAzyme切断事象は、固定された基質を切断することができ、その結果、第一の係留DNAzyme A（「A」）が放出される（段階1〜3）。DNAzyme Aは、一旦遊離すると、次に、第二の係留DNAzyme B（「B」）（蛍光体で標識）を切断し、放出させ（段階4〜6）、そしてまたそれが、追加のDNAzyme Aを切断し、放出させ（段階7〜8）、結果として、カスケードを開始させる。指数的シグナル増幅は、蛍光体を有するDNAzyme Bを後続のカスケードで放出させるので、測定を容易にする。F：蛍光体；Q：クエンチャー。
【図８】RPLPOターゲットのためのMNAzyme設計：パネル（i）：MNAzymeの設計1（上のパネル）および2（下のパネル）のための例示的配列；パネル（ii）：MNAzyme設計1（上のパネル）および2（下のパネル）によるレポーター基質のターゲット依存性切断の結果。N＝A、G、C、Tまたは任意の類似体；N’＝Nに相補的な任意のヌクレオチド；（NまたはN’）x＝任意の数のヌクレオチドまたは類似体；K＝A、GまたはAA；W＝AまたはT；rN＝任意のリボヌクレオチドおよび/または任意の数のリボヌクレオチド；＊＝ウォッブル塩基。
【図９】RPLPOターゲットのためのMNAzyme設計：パネル（i）：MNAzymeの設計3のための例示的配列；パネル（ii）：レポーター基質のターゲット依存性切断の結果。示されている対照反応は、無ターゲット、ハイブリダイゼーション対照、二つのオフターゲット対照、ならびにパートザイムAまたはパートザイムBオリゴヌクレオチドのいずれか（両方ではない）を含有する反応を含む。N＝A、G、C、Tまたは任意の類似体；N’＝Nに相補的な任意のヌクレオチド；（NまたはN’）x＝任意の数のヌクレオチドまたは類似体；K＝A、GまたはAA；W＝AまたはT；rN＝任意のリボヌクレオチドおよび/または任意の数のリボヌクレオチド；＊＝ウォッブル塩基。
【図１０】RPLPOターゲットのためのMNAzyme設計：パネル（i）：MNAzymeの設計4のための例示的配列；パネル（ii）：設計3および4についてのターゲット依存性切断の効率。ターゲットRPLPOオリゴヌクレオチドを含有する反応、およびターゲットを欠く対照についての結果を示す。N＝A、G、C、Tまたは任意の類似体；N’＝Nに相補的な任意のヌクレオチド；（NまたはN’）x＝任意の数のヌクレオチドまたは類似体；K＝A、GまたはAA；W＝AまたはT；rN＝任意のリボヌクレオチドおよび/または任意の数のリボヌクレオチド；＊＝ウォッブル塩基。
【図１１】密接に関連した配列間の識別のためのMNAzymeの使用：パネル（i）：図11および12における実験でターゲット配列として使用した、hsa-miR-20および関連miR配列に相同なDNA配列。D-20と関連D-miRとの配列に関する相違に、下線を引く。縦の太い破線が、二つのセンサーアームによって認識されるオリゴヌクレオチドの領域を隔てている。パネル（ii）：miR-20の検出のための設計4のMNAzymeについての例示的配列を描写する。パネル（iii）：レポーター基質のD-20 MNAzymeターゲット依存性切断についての結果。示されている対照反応：「オフターゲット」オリゴヌクレオチド（D-17-5p、D-106a、D-106b、D-93）および「無ターゲット」（dH2O）対照反応。
【図１２】MiR-20 MNAzyme系のMgCl2最適化：miR-20検出のために例示的設計4 MNAzyme系を使用して得られた結果。レポーター基質のターゲット（D-20）依存性切断。「オフターゲット」配列（D-17-5p、D-106a、D-106b、D-93）または「無ターゲット」（dH2O）を含有する対照反応を、それぞれ、（i）5 mM、（ii）25 mMまたは（iii）100 mM MgCl2を含有する反応について示す。
【図１３】RPLPOターゲットのためのMNAzyme設計：パネル（i）：MNAzymeの設計5および6のための例示的配列。パネル（ii）：設計5および6ならびにそれらの「無ターゲット」対照を使用する、レポーター基質のターゲット依存性切断の結果。N＝A、G、C、Tまたは任意の類似体；N’＝Nに相補的な任意のヌクレオチド；（NまたはN’）x＝任意の数のヌクレオチドまたは類似体；R＝AまたはG；Y＝CまたはU；rN＝リボヌクレオチド塩基。
【図１４】PCR増幅RPLPOの検出：ヒトRPLPO遺伝子をターゲットにする設計4のMNAzyme系によるレポーター基質および様々な対照反応物のターゲット依存性切断についての結果。RPLPO MNAzyme反応は、（i）対照RPLPOオリゴヌクレオチド、（ii）RPLPO遺伝子に相補的なプライマーを使用してヒトゲノムDNA（100 ng）の増幅によって生成されたRPLPO PCRアンプリコン（5μL）、（iii）ゲノムDNAを欠く「無ターゲット」RPLPO PCR反応物または（iv）非増幅ヒトゲノムDNA（500 ng）のいずれかを含有するものであった。
【図１５】増幅された短い（22 mer）配列の検出。パネル（i）：ヒトmiR-20配列をターゲットにする設計4のMNAzyme系によるレポーター基質のターゲット依存性切断についての結果。miR-20 MNAzyme反応は、（i）対照D-20ターゲットオリゴヌクレオチド（増幅させていないもの）の1012（1E＋12）のコピー、（ii）そのmiR-20配列に相補的なプライマーを使用してD-20ターゲットオリゴヌクレオチドの2×107（2E＋7）のコピーの増幅によって生成されたPCRアンプリコン（5μL）、（iii）D-20ターゲットオリゴヌクレオチドを欠く「無ターゲット」PCR反応物、（iv）D-20ターゲットオリゴヌクレオチド（増幅させていないもの）の108（1E＋8）のコピー、および（v）「オフターゲット」対照D-17-5pターゲット（PCRによって増幅された2×107（2E＋7）のコピー）のいずれかによって行われるものであった。パネル（ii）：D-20ターゲット配列とオフターゲット配列、D-17-5pの比較。このD-17-5pオリゴヌクレオチドは、D-20ターゲット配列を基準にして、そのPCRプライマー結合領域内に一つのミスマッチを有し、（それらのプライマー間に位置する）その領域内の一つのミスマッチは、MNAzymeのセンサーアームによる問い合わせを受ける。
【図１６】増幅されたmiR-20アンプリコンの検出：PCR増幅後のMNAzymeを使用するアンプリコンの終点検出の例。PCRを使用して、ヒト胸腺細胞からの全RNA中に存在するmir-20ミクロRNAを増幅し、MNAzyme方法論を使用して検出した。増幅させたサンプルおよび対照は、示されているとおりである。
【図１７】MNAzyme設計6によるRPLPOエキソン5の定量的実時間PCR分析：MNAzymeを使用してRPLPO遺伝子を検出してRPLPOのエキソン5の蓄積をモニターするMNAzyme方法論を使用する、実時間検出および定量の例。パネル（i）：MNAzyme設計6；パネル（ii）：示されているような異なるテンプレート量についての実時間PCRを示す蛍光シグナル；パネル（iii）：標準曲線および増幅された材料の定量。結果は、PCRによって増幅されたヒトゲノムDNAのMNAzyme検出についての蛍光の時間依存的増加を示している。R2＝0.995；傾き＝-3.698
【図１８】多数のターゲットの例示的多重分析の略図：各々が一つのMNAzymeに特異的である二つ以上の基質を使用して、二つ以上のターゲットを同時に検出することができる。基質は、好ましくは、異なる蛍光体で標識する。この例において、ターゲット1は、FAM蛍光の増加をモニターすることによって検出することができ、ターゲット2は、JOE蛍光の増加をモニターすることによって検出することができる。Q：クエンチャー；FAM、JOE：蛍光体。
【図１９】RPLPOおよびD-20配列の単一および多重検出： JOE標識基質を使用してRPLPOの検出をモニターし、FAM標識基質を使用してD-20ターゲット配列の検出をモニターした。パネル（i）：MNAzyme設計6は、一つだけのMNAzyme系、RPLPO（上のパネル）またはD-20（下のパネル）のいずれかについてのパートザイムを含む；パネル（ii）：MNAzyme設計6は、RPLPOとD-20の両方をターゲットにするMNAzymeについてのパートザイムを含有する。
【図２０】アプタマーを使用するターゲットのMNAzyme検出：ターゲット検出のための一つの例示的戦略を示す図である。この戦略において、アプタマー配列は、ターゲットが存在する場合にのみ活性MNAzymeが形成される配座でパートザイムの末端に組み込まれる（アプタ-パートザイム）。図示されているMNAzyme検出戦略に必要なオリゴヌクレオチド成分は、（a）標準的なパートザイム；（b）アプタマーがその末端の一方に組み込まれたパートザイムである、アプタ-パートザイム；（c）（ターゲットが存在する場合）活性MNAzymeの組織化を可能にする、アプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合する、組織化助長因子；（d）レポータープローブ基質；および（e）アプタ-パートザイムの、そのアプタマー配列の少なくとも一部およびそのパートザイム配列の基質結合アームの一部にわたる領域にハイブリダイズする組織化阻害剤を含む。ターゲット分析物が不在の場合（パネル（i））には、組織化阻害剤がアプタ-パートザイムに結合し、そのようにしてレポータープローブ基質の結合（および切断）を遮断する。ターゲット分析物が存在する場合（パネル（ii））には、ターゲットがアプト-パートザイムのアプタマー配列に結合して、組織化阻害剤の結合を防止し、レポータープローブ基質の結合および切断を可能にする。従って、MNAzymeは、ターゲットが存在する場合にのみ形成し、蛍光シグナルを生じさせることができる。
【図２１】アプタマーを使用する小分子のMNAzyme検出：ターゲット、具体的にはAPTの検出のためのMNAzymeの使用の一例を示す図である。小分子、ATPの検出の例を用いて、図20に図示する戦略を証明した。パネル（i）は、ATPの検出に使用したオリゴヌクレオチド成分の配列を図示するものである。これらは、パートザイム、アプタパートザイム（これには、ATPに結合するためにアプタマーが組み込まれている）、アプタマー/MNAzyme組織化阻害剤、レポーター基質および組織化助長因子を含む。パネル（ii）SubBi-1-FB切断分析は、ATPおよび他のヌクレオチドが存在するまたは不在の状態でオリゴヌクレオチド成分をインキュベートした後に得られた結果を示す。ATPおよびdATPは存在するが、GTPまたはCTPは存在しない状態で、経時的に蛍光の増加が観察された。さらに、いかなるターゲットも存在しない状態（水だけの対照）では、蛍光の増加は観察されなかった。
【図２２】MNAzymeを使用する単一塩基ミスマッチの検出：単一塩基ミスマッチの検出のためのMNAzymeの使用の一例を示す図である。パネル（i）は、RPLPOエキソン5ターゲット配列における単一塩基ミスマッチの検出に使用したオリゴヌクレオチド成分の配列を図示するものである。図示されているオリゴヌクレオチドは、MNAzyme設計7（例えば、実施例20）に基づく二つのパートザイム（A5およびB6）とレポーター基質とを含むものであった。パートザイムBセンサーアーム内の第三塩基（X）は、ターゲット配列とマッチしているまたはミスマッチである。X＝Gの場合、パートザイムとターゲットは、完全にマッチしている。X＝Cである場合、センサーアームとターゲットRPLPOとがミスマッチである。パネル（ii）は、RPLPOターゲットに関して完全にマッチしているまたはミスマッチであるパートザイムBを含む反応におけるPCR増幅および実時間検出後に得られた結果を示すものである。
【図２３】SNP検出のためのMNAzyme戦略および結果：この方法は、SNPの一つのバージョンに完全にマッチしているトランケートされたパートザイムBセンサーアームと、その完全にマッチしたターゲットが存在する場合にMNAzymeの組織化を助長するスタビライザーオリゴヌクレオチドとを使用する。そのパートザイムBセンサーアームとターゲット核酸の厳格な相補性のための要件が、密接に関連した配列の識別を可能にする。パネル（i）：完全にマッチした5-塩基センサーアームと、スタビライザーオリゴヌクレオチド；パネル（ii）：ミスマッチの5-塩基センサーアームと、スタビライザーオリゴヌクレオチド；パネル（iii）：無スタビライザー対照；パネル（iv）：無ターゲット対照；パネル（v）：完全にマッチしたターゲット、ミスマッチのターゲット、無スタビライザー対照および無ターゲット対照でのMNAzyme SNP検出の結果。
【図２４】変色反応を生じさせるためのMNAzyme検出の改造：この方法は、架橋性オリゴヌクレオチドによって連結されたときに青色の凝集体を形成する、オリゴヌクレオチドが取り付けられたナノスケールの金粒子を使用する（パネルi）。これらの架橋性オリゴヌクレオチドには、基質配列が組み込まれている。ターゲットが存在する場合（パネルii）、MNAzymeが組織化し、その基質配列を切断して、個々の金粒子を放出し、裸眼で見ることができる青色から赤色への色の変化を生じさせる。
【図２５】係留パートザイムを使用するMNAzymeカスケードの例：このダイアグラムに図示されているように、MNAzymeを使用して、シグナル増幅カスケードを開始させることができる。この反応は、次の要素を含む：（i）溶液中で遊離しているMNAzyme 1についてのパートザイム；（ii）溶液中で遊離している（図示のとおり）か、基質、Sub 1、により不溶性支持体に係留されている、MNAzyme 2および3（これらは、同じセンサーアームを有する）のための組織化助長因子；（iii）基質Sub 1により不溶性支持体に係留されているMNAzyme 2についてのパートザイム。Sub 1は、MNAzyme 1（ターゲットが存在する場合）またはMNAzyme 3（組織化助長因子が存在する場合）によって切断することができ、切断の結果、MNAzyme 2についてのパートザイムが溶液中に放出される；（iv）基質、Sub 2、により不溶性支持体に係留されているMNAzyme 3についてのパートザイム。Sub 2は、MNAzyme 2（組織化助長因子が存在する場合）によって切断することができ、切断の結果、MNAzyme 3についてのパートザイムが溶液中に放出される；（v）Sub 2と同じ配列を有するが、溶液中で遊離しており、蛍光体（F）およびクエンチャー（Q）で二重標識されている、Sub 2-FQ。Sub 2-FQをMNAzyme 2によって切断して、蛍光シグナルを生じさせることができる。ターゲットが存在する場合、活性MNAzyme 1が、溶液中で遊離しているパートザイムから形成する。MNAzyme 1は、そのSub 1を切断し、そのようにしてMNAzyme 2についてのパートザイムを放出する。一旦遊離すると、これらのパートザイムは、組織化助長因子とハイブリダイズし、MNAzyme 2を形成し、これが、遊離Sub 2-FQを切断する（蛍光シグナルを生じさせる）または係留Sub 2を切断する（MNAzyme 3についてのパートザイムを放出する）。MNAzyme 3は、MNAzyme 1と同じ基質アームを共有するので、これも係留Sub 1を切断し、そのようにしてMNAzyme 2についてのさらなるパートザイムを放出することができる。これが、より多くの酵素（MNAzyme）についての成分（パートザイム）の酵素的生成のカスケードおよび随伴するシグナル増幅カスケードを生じさせる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2009509551.tif 000139
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月19日(2008.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009509551000001.app
【国際調査報告】
2009509551.tif 000176
2009509551.tif 000177
2009509551.tif 000178