(57)【要約】  本発明は、生体系における標的細胞集団の増殖及び分化挙動を評価する方法であって、［ａ］前記細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を少なくとも１時点ｔにおいて測定するステップであって、前記増殖特性がクローンサイズ分布であるステップと、［ｂ］［ａ］において測定されたクローンサイズ分布を、方程式により予測又は記述される対応する時点ｔにおける標準クローンサイズ分布と比較するステップとを含み、［ａ］の測定されたクローンサイズ分布と［ｂ］の予測又は記述されるクローンサイズ分布間の差が前記細胞の改変された増殖又は分化挙動を示す、方法に関する。本発明はさらに、上の挙動、すなわちパラメータの値のスケーリング方式を評価すること、及びその細胞増殖及び／又は分化に対する効果を推測することを含む方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体系における標的細胞集団の増殖又は分化挙動を評価する方法であって、
［ａ］前記細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を少なくとも１時点ｔにおいて測定するステップであって、前記増殖特性がクローンサイズ分布であるステップと、
［ｂ］［ａ］において測定されたクローンサイズ分布を、方程式；
【数１】
2009529326.tif 000019
により予測又は記述される対応する時点ｔにおける標準クローンサイズ分布と比較するステップと
を含み、［ａ］の測定されたクローンサイズ分布と［ｂ］の予測又は記述されるクローンサイズ分布の差が前記細胞の改変された増殖又は分化挙動を示す、方法。
【請求項２】
測定及び比較のステップが２つ以上の時点について実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クローンサイズがクローン中の細胞数として決定される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
生体系が組織である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
組織が表皮である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的細胞集団が非ヒト試験動物中に存在する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
細胞集団が１つ又は複数のクローン細胞系列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的細胞が遺伝性マーカーで標識されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
系の２７細胞中１未満の細胞が標的細胞として標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞がマーカー遺伝子の発現により標識されている、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの増殖特性の値が、
（ｉ）マーカー遺伝子を含む試験動物を提供し、
（ii）前記試験動物の少なくとも１個の細胞において前記マーカーの遺伝性活性化を誘導し、遺伝性活性化が対象の組織の２７細胞中１未満の細胞において誘導され、
（iii）試験動物をインキュベートし、
（iv）遺伝性活性化の結果としてマーカー遺伝子を発現するクローン細胞を可視化し、
（ｖ）可視化されたクローン細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定する
ことにより測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
可視化が共焦点顕微鏡による、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞が、少なくとも１つの増殖特性を測定する前に試験化合物で処理される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞が試験動物の表皮に含まれ、試験化合物が試験動物の表皮に局所的に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標準細胞に対する処理された標的細胞の増殖又は分化特性（複数可）の差が、試験化合物が細胞増殖又は分化挙動に影響を及ぼすことを示す、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの増殖特性を測定する前に標的細胞において試験遺伝子を発現させることを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試験遺伝子を発現する標的細胞の増殖挙動の増加が、試験遺伝子が癌遺伝子であることを示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的細胞において成長挙動を変化させる遺伝子を発現させ、前記遺伝子を発現する標的細胞を、少なくとも１つの増殖特性を測定する前に試験化合物で処理することを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
処理された細胞における遺伝子の発現により誘導される成長挙動の変化の減少又は増強が、試験化合物が細胞成長挙動に影響を及ぼすことを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子の発現が標的細胞における増殖を増加させ、処理された細胞における前記増殖の減少又は抑止が、試験化合物が候補化粧品又は抗癌治療薬であることを示す、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的細胞がｐ５３を欠損している、請求項２９〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）の標準クローンサイズ分布が標的細胞集団の第２の時点ｔ２におけるクローンサイズ分布であり、
（ｃ）クローンサイズ分布を同時時間座標にリスケールすること、及び
（ｄ）（ｃ）の曲線形を比較すること
をさらに含み、前記曲線形が異なる場合は、細胞の増殖又は分化挙動が異常であると評価される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
細胞の増殖又は分化挙動がスケーリング方式：
【数２】
2009529326.tif 000020
（１）
に従うかどうかを判定すること
をさらに含み、前記増殖又は分化挙動が前記スケーリング方式に一致する場合は、細胞の増殖又は分化挙動は正常であると評価され、前記増殖又は分化挙動が前記スケーリング方式に一致しない場合は、細胞の増殖又は分化挙動は異常であると評価される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
方程式を標的細胞集団に適用することにより予測又は記述される少なくとも１つの追加のパラメータを、前記方程式を前記標準細胞集団に適用することにより予測又は記述される少なくとも１つの追加のパラメータと比較すること、及び
前記標的細胞集団において改変されるパラメータを同定し、それにより標的細胞の増殖又は分化挙動の変化を特徴付けること
をさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖及び分化などの細胞成長挙動を分析及び予測する方法、特に、細胞の成長挙動の変化を評価するための方法及び材料に関する。これは、例えば、成長挙動を変化させる薬剤を同定する、例えば、発癌性又は毒性スクリーニング及び癌治療法の開発に有用である可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、ケラチノサイトの層からなる毛包間表皮（ＩＦＥ）と共に散在する毛包に組織化されている（図１）。（Gambardella, L. & Barrandon, Y. The multifaceted adult epidermal stem cell. Curr Opin Cell Biol 15, 771-7 (2003)）ＩＦＥでは、増殖している細胞が基底細胞層に存在し、最終分化を果たすと、基底細胞は細胞周期から抜け出て、引き続いて基底上細胞層に移行する。表皮前駆細胞（ＥＰＣ）がどのように機能してＩＦＥを支持しているのかははっきりしないままである。成体哺乳動物上皮から失われた細胞は、短命のトランジット増幅（ＴＡ）細胞の中間集団を介して分化細胞を生み出す自己複製幹細胞（ＳＣ）の連続増殖により置き換えられると長い間考えられてきた。（Adami, J. G. The causation of cancerous and other new growths. British Medical Journal i, 621-628 (1901)、Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation 14, 23-34 (1979)、Alonso, L. & Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A 100 Suppl 1, 11830-5 (2003)、Braun, K. M. & Watt, F. M. Epidermal label-retaining cells: background and recent applications. J Investig Dermatol Symp Proc 9, 196-201 (2004)）表皮は、六角形の表皮増殖ユニット（ＥＰＵ）に組織化され、それぞれが単一幹細胞及びそのＴＡ細胞子孫により維持されると考えられている。（Potten, C. S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet 7, 77-88 (1974)）
【０００３】
毛包もＩＦＥも生み出すことができる前駆細胞は毛包バルジにあるが、これらの細胞は正常なＩＦＥを維持するのに何の役割も果たしてはいないように思われる。（Oshima, H., Rochat, A., Kedzia, C., Kobayashi, K. & Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell 104, 233-45 (2001)、Tumbar, T. et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-63 (2004)、Morris, R. J. et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 22, 411-7 (2004)、Levy, V., Lindon, C., Harfe, B. D. & Morgan, B. A. Distinct stem cell populations regenerate the follicle and interfollicular epidermis. Dev Cell 9, 855-61 (2005)、Ito, M. et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med 11, 1351-4 (2005)）標識保持細胞の研究により、ＩＦＥは、ＳＣ／ＴＡモデルに従って、上部ＥＰＵを支持しているＳＣを表す緩徐なサイクリング基底細胞を含有していることが明らかにされている。（Potten, C. S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet 7, 77-88 (1974)、Mackenzie, I. C. Relationship between mitosis and the ordered structure of the stratum corneum in mouse epidermis. Nature 226, 653-5 (1970)）
【非特許文献１】Gambardella, L. & Barrandon, Y. The multifaceted adult epidermal stem cell. Curr Opin Cell Biol 15, 771-7 (2003)
【非特許文献２】Adami, J. G. The causation of cancerous and other new growths. British Medical Journal i, 621-628 (1901)
【非特許文献３】Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation 14, 23-34 (1979)
【非特許文献４】Alonso, L. & Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A 100 Suppl 1, 11830-5 (2003)
【非特許文献５】Braun, K. M. & Watt, F. M. Epidermal label-retaining cells: background and recent applications. J Investig Dermatol Symp Proc 9, 196-201 (2004)
【非特許文献６】Potten, C. S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet 7, 77-88 (1974)
【非特許文献７】Oshima, H., Rochat, A., Kedzia, C., Kobayashi, K. & Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell 104, 233-45 (2001)
【非特許文献８】Tumbar, T. et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-63 (2004)
【非特許文献９】Morris, R. J. et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 22, 411-7 (2004)
【非特許文献１０】Levy, V., Lindon, C., Harfe, B. D. & Morgan, B. A. Distinct stem cell populations regenerate the follicle and interfollicular epidermis. Dev Cell 9, 855-61 (2005)
【非特許文献１１】Ito, M. et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med 11, 1351-4 (2005)
【非特許文献１２】Mackenzie, I. C. Relationship between mitosis and the ordered structure of the stratum corneum in mouse epidermis. Nature 226, 653-5 (1970)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞増殖及び分化挙動をモデル化するための先行技術は複雑な問題を被り、扱いにくく、種々の系に適用するのは困難である場合が多い。さらに、先行技術モデルでは、様々な挙動又は関与を、事態をさらに複雑にすることがある幹細胞を含む多細胞クラスに起因すると考えることが多い。本発明に最も近い先行技術は、おそらく組織を除去する又は損傷して、次にその再生又は修復を研究しようとする創傷治療ベースモデルであろう。明らかに、そのような研究は、創傷治療などの人工的系の研究に付随する問題を被る。さらに、定常状態挙動における幹細胞などの細胞の関与又は役割は当技術分野では理解が不完全であり、生体系をモデル化することは本質的に困難になっている。本発明は先行技術に付随する問題を克服しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ある種の生体系における細胞の増殖は、驚くべきことに、単一種の前駆細胞を伴い、簡単な数学モデルで記述できることを認識してきた。このモデルは、細胞の成長挙動の変化を初期段階で同定することを可能にし、例えば、発癌性又は毒性スクリーニング、癌治療法の開発、及び関連分野において一定範囲の用途を有する。
【０００６】
本発明者らは、組織恒常性の数学モデルを導き出した。先行技術モデルは必然的に非常に複雑であり、信頼するのは困難であった。これとは対照的に、観測及び実験を通じて、本発明者らは、組織恒常性の強固な予測的及び記述的モデルに到達するために、細胞増殖及び分化に関与する様々なパラメータを関連付ける驚くほど簡単な方法を導き出した。
【０００７】
本発明者らが行った最も顕著な観測の１つは、１つの律速過程が全体モデルを決定することができることである。特に、クローンサイズ分布は、予測可能な形で時間と共に変化することが明らかにされた。さらに、平均クローンサイズ対時間のプロットが直線になることがわかり、クローンサイズと時間の間の直線比例関係を再び支持している。
【０００８】
増殖及び分化挙動を支配している基礎となる「マスター方程式」に加えて、驚くべきことに、その結果と予測は異なる細胞集団及び異なる時点に確実にスケールすることができることが明らかにされた。実際に、この信頼できるスケーリングは、本明細書に記載するような細胞動力学の識別特性である。
【０００９】
要約すると、本発明は、単一の律速過程が組織恒常性のモデルを決定することができるという驚くべき知見、及び本発明者らが導き出した数学的関係の顕著な単純さに基づいている。実際に、本明細書に提出されているモデルは、観測結果に適合する唯一説得力のあるモデルである。本発明はこれらの驚くべき知見に基づいている。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、生体系における標的細胞集団の増殖又は分化挙動を評価する方法であって、
［ａ］前記細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を少なくとも１時点ｔにおいて測定するステップであって、前記増殖特性がクローンサイズ分布であるステップと、
［ｂ］［ａ］において測定されたクローンサイズ分布を、方程式；
【００１１】
【数１】
2009529326.tif 000003
【００１２】
により予測又は記述される対応する時点ｔにおける標準クローンサイズ分布と比較するステップと
を含み、［ａ］の測定されたクローンサイズ分布と［ｂ］の予測又は記述されるクローンサイズ分布の差が前記細胞の改変された増殖又は分化挙動を示す、方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、前記測定及び比較のステップが２つ以上の時点について実施される。
【００１４】
好ましくは、標的細胞の少なくとも１つの増殖特性が、前記標識化に続いて２つ以上の時点で測定される。ｔ＝０は典型的には標識化時間のことであるが、介入性の標識化が必要ではない実施形態においては、操作者の必要、例えば、研究の開始日に従って、ｔ＝０を選ぶことができる。明らかに、標的細胞のいかなる処理のタイミングも、別々にモニターされ、ｔ＝０と一致してもよいし一致しなくてもよい。実際に、確実にいかなる処理も、標識が確実に検出可能になる最初の過渡期後（典型的には、本明細書で取り上げる好ましい標識化技術を使った場合は２週間）にのみ行われるようにするのが有利である。なぜならば、より信頼できる標準又は対照集団はこのようにして確立してよく、細胞標識化に対する処理の考えうるいかなる効果も研究から排除することができるからである。
【００１５】
「標的細胞集団」とは、単一クローン分化系列のことだけではなく、標的細胞集団を一緒に構成する複数のクローンのことでもある。そのようなクローンは、同一生体系に存在してもよく、複数の対応する生体系に存在してもよい。例えば、標的細胞集団は、複数のクローンで構成されていてもよく、そのクローンは異なる試験動物中に存在してもよい。例えば、標的細胞集団は、３０クローンを含み、そのうちの１０クローンがそれぞれ３つの別々の動物中に存在していてもよい。クローン数の他のいかなる適切な分割も操作者が選択してよい。要点は、クローンサイズ分布を生み出す元の集団を構成するクローンは、等価な系、例えば、インビボで同一の遺伝的背景上、又は類似の条件の下にある培養下、又は優れた科学的実践を踏まえた他の点で比較可能な設定下由来でなければならない。原則では、異なった時点の細胞集団は異なった実在の細胞から構成されていてよい。なぜならば、当業者には明らかになるように、細胞／クローンの計数は、多くの場合、細胞を破壊しインキュベーションから除去されるので、それらの実在する個々の細胞は、培養に戻されて未来時点における数値の一部を形成することが通常はできないからである。したがって、いかなる時点において計数される細胞も他の時点で計数される細胞と等価であることが重要であるが、明らかに、それに続く時点で計数される細胞は、実際には以前の時点において計数された特定の個々の細胞ではない。なぜならば、分析されているのは集団／コホートであるからなのである。当然のことながら、クローンを非破壊的に計数することができれば、本発明は、個々に計数されそれに続く時点で再計数される細胞の単一コホート上で実施してよい。しかし、実際問題として、本発明の最も一般的な用途は上に設定された通りになるであろう（特定の時点における等価な集団又はクローンの集団／コホート計数）。
【００１６】
好ましくは、クローンサイズはクローン中の細胞数として決定される。
【００１７】
好ましくは、生体系は組織である。好ましくは、組織は表皮である。
【００１８】
標的細胞集団は動物、好ましくは非ヒト試験動物中に存在していてよい。
【００１９】
好ましくは、細胞集団は１つ又は複数のクローン細胞系列からなる。
【００２０】
好ましくは、前記標的細胞は遺伝性マーカーで標識されている。
【００２１】
好ましくは、系内の２７細胞中１未満の細胞が標的細胞として標識される。これは、個々のクローンは十分離されている可能性があり、したがって独立したクローンとして追跡するのがいっそう容易になるという利点を有し、クローンが拡大する際に合併する、又は隣接する細胞がマークされ、単一クローンとして現れる混合クローンを生じてしまうという問題を回避する。以下に取り上げるこれらの理由から、通常、マーキング比は低い方が好ましい。
【００２２】
好ましくは、標的細胞はマーカー遺伝子の発現により標識される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの増殖特性の値が、
（ｉ）マーカー遺伝子を含む試験動物を提供し、
（ii）前記試験動物の少なくとも１個の細胞において前記マーカーの遺伝性活性化を誘導し、遺伝性活性化が対象の組織の２７細胞中１未満の細胞において誘導され、
（iii）試験動物をインキュベートし、
（iv）遺伝性活性化の結果としてマーカー遺伝子を発現するクローン細胞を可視化し、
（ｖ）可視化されたクローン細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定する
ことにより測定される上記の方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、可視化は共焦点顕微鏡による。
【００２５】
標的細胞は、少なくとも１つの増殖特性を測定する前に試験化合物で処理してよい。好ましくは、標的細胞は試験動物の表皮に含まれ、試験化合物は試験動物の表皮に局所的に投与される。局所投与は、組織に材料を「塗布する」などのあらゆる適切な方法によるものでよいし、注射、スプレー、クリーム、軟膏、パーティクルガン、浸漬、又は化合物を含有するパッチ若しくは持続放出装置の適用でも、他のいかなる適切な手段でもよい。
【００２６】
好ましくは、標準細胞に対する処理された標的細胞の増殖又は分化特性（複数可）の差は、試験化合物が細胞増殖又は分化挙動に影響を及ぼすことを示す。
【００２７】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの増殖特性を測定する前に標的細胞において試験遺伝子を発現させることを含む上記の方法を提供する。試験遺伝子を発現する標的細胞の増殖挙動の増加は、試験遺伝子が癌遺伝子であることを示す。
【００２８】
別の態様では、本発明は、標的細胞において成長挙動を変化させる遺伝子を発現させること、及び少なくとも１つの増殖特性を測定する前に、前記遺伝子を発現する標的細胞を試験化合物で処理することを含む上記の方法を提供する。処理された細胞における前記遺伝子の発現により誘導される成長挙動の変化の減少又は増強は、試験化合物が細胞成長挙動に影響を及ぼすことを示す。前記遺伝子の発現が標的細胞における増殖を増加させる場合、処理された細胞における前記増殖の減少又は抑止は、試験化合物が候補化粧品又は抗癌治療薬であることを示す。
【００２９】
好ましくは、標的細胞は、ｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子を欠損している。
【００３０】
別の態様では、本発明は、（ｂ）の標準クローンサイズ分布が前記標的細胞集団の第２の時点ｔ２におけるクローンサイズ分布であり、
（ｃ）クローンサイズ分布を同時時間座標にリスケールすること、及び
（ｄ）（ｃ）の曲線形を比較すること
をさらに含み、前記曲線形が異なる場合は、細胞の増殖又は分化挙動が異常であると評価される、上記の方法を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、細胞の増殖又は分化挙動がスケーリング方式：
【００３２】
【数２】
2009529326.tif 000004
（１）
【００３３】
に従うかどうかを判定すること
をさらに含み、前記増殖又は分化挙動が前記スケーリング方式に一致する場合は、細胞の増殖又は分化挙動は正常であると評価され、前記増殖又は分化挙動が前記スケーリング方式に一致しない場合は、細胞の増殖又は分化挙動は異常であると評価される、上記の方法を提供する。好ましくは、前記方法は、前記方程式を前記標的細胞集団に適用することにより予測又は記述される少なくとも１つの追加のパラメータを、前記方程式を前記標準細胞集団に適用することにより予測又は記述される少なくとも１つの追加のパラメータと比較すること、及び前記標的細胞集団において改変されるパラメータを同定し、それにより標的細胞の増殖又は分化挙動の変化を特徴付けることをさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
上記のように、本発明者らは、ある種の生体系における細胞の増殖は幹細胞を伴わず、簡単な数学モデルにより記述することができると認識してきた。実際に、幹細胞の関与に関して、現在まで調査されたある種の系では、増殖は１つの前駆細胞区画を伴っているように思われる。
【００３５】
クローンサイズ
クローンサイズは研究中の特定のクローンの大きさを評価することにより決定される。これはいかなる適切な手段によって測定してもよい。例えば、クローンの全体の物理的大きさを測定してもよい。これは、研究中のクローンの質量又は体積などの特性を評価することによるものでよい。別の態様では、クローンサイズは、研究中の特定のクローンの直径として評価してよく、これはクローンが背中の皮膚に位置している場合は特に好ましい。この実施形態では、好ましくは、直径は平均直径と解釈される。これは、クローンが円形以外の場合は特に重要になる。代わりに、クローンサイズは、クローンが占める二次元面積を測定することにより評価してよい。好ましい実施形態では、クローンサイズは、クローン中の細胞の総数を意味する。好ましくは、クローンサイズは、クローン中の有核細胞の総数である。
【００３６】
有意義なクローンサイズ分布を作り出すためには、いくつかのクローンは、所与の時点のいくつかのクローンサイズデータ点を生み出すように測定しなければならない。好ましくは、分布は少なくとも３０の個々のクローンサイズ、好ましくは、少なくとも１００の個々のクローンサイズを含む。さらに多数のクローンサイズのもつ利点は、クローンサイズ分布の正確さが改善されることである。
【００３７】
生体系
本発明は、扁平表皮などの扁平組織、特に、重層扁平表皮などの重層扁平組織に特定の用途を見出している。
【００３８】
生体系は組織でよい。組織は、基底層及び１つ又は複数の基底上層を含む重層組織でよい。組織は表皮でよい。
【００３９】
標的細胞が、サイクリング及び非サイクリング細胞を含む場合、サイクリング細胞は基底層で維持してよく、非サイクリング細胞は基底層の外に移動する。
【００４０】
好ましくは、少なくとも１つの増殖特性の値は組織試料で測定される。好ましくは、この測定はインビトロである。
【００４１】
好ましくは、標的細胞集団は、非ヒト試験動物に存在している、又は存在していた。
【００４２】
本発明の一態様は、集団における標的細胞の成長挙動の変化、例えば、増殖及び／又は分化の変化を評価する方法であって、
ａ）前記細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定するステップと、
ｂ）測定値を、細胞成長挙動のモデルにより集団内の正常な細胞の前記特性について予測値と比較するステップであって、
前記細胞成長挙動のモデルが、親サイクリング細胞が、１）２個のサイクリング娘細胞、２）１個のサイクリング及び１個の非サイクリング娘細胞、又は３）２個の非サイクリング娘細胞のいずれかに分裂することを必要とし、前記集団内の細胞がどれも幹細胞ではないステップと、
ｃ）前記細胞の成長挙動の変化の可能性を、前記測定値と予測値の差から判定するステップと
を含む方法を提供する。
【００４３】
標的細胞の成長挙動の変化は、例えば、対照（すなわち、正常細胞）と比較して増殖及び／又は分化の変化若しくは改変を含んでいてよい。成長挙動が改変された細胞は、例えば、異常な増殖及び／又は分化を有していてよい。
【００４４】
標的細胞を含有する細胞集団は、組織内に存在してよい。好ましくは、組織は、複数の領域又は層を含んでおり、例えば、基底層及び１つ又は複数の基底上層を含む重層組織でよい。重層組織には、上皮組織、食道組織又は頚部組織などの重層扁平組織がある。いくつかの好ましい実施形態では、重層扁平組織は表皮であり、これは共焦点画像解析を受け入れることができ、３−Ｄ画像解析に単一クローン由来の細胞を都合よく追跡させる。組織は、背中の皮膚などの背面皮膚などの皮膚若しくは尾部皮膚などの末梢皮膚、又は食道組織若しくは耳組織でもよい。好ましくは、組織は、皮膚などの扁平上皮であり、好ましくは尾部皮膚などの末梢皮膚である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、標的細胞を含む組織は、動物中に、又はさらに好ましくは、動物から得られる試料、例えば、組織生検中に存在してよい。適切な動物には、ヒト及び非ヒト動物、特に哺乳動物、例えばマウスなどのげっ歯類がある。本明細書に記載する方法では、細胞成長挙動に対する効果を認識するのに必要な動物の数を減らすことができる。これは、少なくとも一部は、対象の生体系内で（平均して）空間的に十分離れているマーク細胞へのマーキングシステムの滴定による。この方法で、クローンが動物中に存在する場合は、動物当たり複数のクローンを研究することができる。これは、特定の処理又は遺伝子構造についてのロバスト研究用に十分なクローンを得るために必要な動物の数を減少させるという利点を有する。実際に、局所的に適用される処理では、動物当たり複数の処理を研究し、各処理が複数のクローンを含み、それにより各条件ごとに必要な動物の数をさらに減少させることもできる可能性がある。
【００４６】
他の実施形態では、重層組織は、器官型ケラチノサイト培養物などの人工的組織モデルシステムでもよい。
【００４７】
サイクリング細胞は、組織内の特定の領域又は層、例えば、基底層で維持してよく、非サイクリング細胞は、サイクリング細胞を含有する領域又は層から、例えば、１つ又は複数の基底上層に移動してもよい。上皮などの重層扁平組織では、細胞は最終的に組織表面から脱落してよい。
【００４８】
サイクリング細胞は、本明細書では、「Ａ細胞」、非サイクリング基底細胞は「Ｂ細胞」、及び基底上層中の非サイクリング細胞は「Ｃ細胞」と呼んでよい。Ａ細胞は速度λＡＡで２個の娘Ａ細胞に分裂してよく、速度λＢＢで２個の娘Ｂ細胞に分裂してよく、λＡＢと名付けられた速度で非対称的に１個のＡ細胞と１個のＢ細胞に分裂してもよい。基底上層への移動速度はλＢＣと名付けてよい。
【００４９】
サイクリング細胞（Ａ細胞）は、活発に増殖しており、有糸分裂及び細胞分裂ができる細胞である。サイクリング細胞は、分化経路を進行する２個の非サイクリング細胞に分裂することができるので、不死ではなく、したがって幹細胞とは異なる。
【００５０】
非サイクリング細胞（Ｂ及びＣ細胞）は、活発に増殖してはおらず、さらに有糸分裂及び細胞分裂ができない細胞である。非サイクリング細胞は、部分的に又は末期的に分化してよい。
【００５１】
サイクリング細胞と非サイクリング細胞は、例えば、Ｋｉ６７、ＣＤＣ６、及びブロモデオキシウリジン染色を含む一定範囲の既知の細胞マーカーを使って同定し、識別してよい。これらのマーカーに特異的に結合する抗体は市販されている。
【００５２】
正常細胞は、その細胞周期機構が完全に機能的であり、例えば、組織恒常性を調節する細胞シグナル伝達経路に応答して最終分化及びアポトーシスが可能な非形質転換（すなわち、非癌）細胞である。
【００５３】
正常細胞の集団は通常、定常状態にあり、細胞分裂による細胞の発生速度が、例えば、移動による細胞の消失速度に等しい。単位面積当たりの細胞数及び経時的なサイクリング細胞の割合は、定常状態集団では一定のままである可能性がある。したがって、正常細胞増殖では、２個のサイクリング娘細胞への分裂速度（λＡＡ）は、２個の非サイクリング娘細胞への分裂速度（λＢＢ）に等しいと仮定してよい。したがって、好ましくは、正常細胞増殖では、２個のサイクリング娘細胞への分裂速度は、２個の非サイクリング娘細胞への分裂速度に等しいと仮定される。成長挙動が改変された細胞、例えば、増殖及び／又は分化が異常な細胞は、定常状態でない可能性があり、これらの速度は等しくない可能性がある。
【００５４】
集団中の適切な標的細胞は、１つ又は複数のクローン株化細胞、好ましくは、１つ又は複数の分離した又は識別可能なクローン系統からなっていてよい。クローン株化細胞は、単一で共通の祖先細胞にすべて由来する細胞のグループ又はファミリーである。分裂及び／又は分化に続いて、通常、最初の単細胞由来の多数の細胞が存在することになる。分化により、これらの細胞の一部又は全部は、同一でなくてもよく、（例えば、形態学的に又は遺伝子発現のプロファイリングによって）互いに識別可能でよい。実際に、細胞は、標識され空間的にクラスター化されこれと一致していれば、共通の祖先由来であると見なせる。標識された細胞は、例えば、その活性化が親細胞内で誘導された遺伝性マーカーを発現してよい。その場合、親細胞の子孫はすべて、遺伝性マーカーの発現により標識されることになる。
【００５５】
細胞集団内の、例えば、組織中のクローン系統は、好ましくは、例えば、標識され、好ましくは空間的に離されていることにより、前記集団内の他のクローン系統から区別することが可能である。
【００５６】
クローン株化細胞の運命は経時的に決定してよい、例えば、クローン株化細胞中の細胞の数又は種類の変化は経時的に決定してよい。いくつかの実施形態では、単一集団内の複数のクローン株化細胞の運命は経時的に決定してよい。
【００５７】
以前記載された幹細胞ベースモデルに反して、本明細書に記載の細胞成長挙動モデルは、１つ又は複数のクローン株化細胞のサイズ分布は時間と共に増加すると予測している。これは、以下に提示する実験データで確証されている。
【００５８】
標的細胞の成長挙動の変化の可能性を上記のモデルを使って決定するために標的細胞において測定してもよい適切な増殖特性には、クローン株化細胞における細胞の総数、クローン株化細胞における基底細胞の数、クローンサイズ分布、クローン株化細胞におけるサイクリング細胞と非サイクリング細胞の割合、クローン株化細胞におけるサイクリング基底細胞の割合、異なる種類の細胞の比（例えば、サイクリング細胞対非サイクリング細胞）、異なる種類の細胞の数、１つ又は複数種類の細胞のクラスターサイズ分布、非対称分裂速度及び／又は対称分裂速度があってよい。
【００５９】
標的細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞などのげっ歯類細胞、又はヒト細胞などの霊長類細胞でよい。
【００６０】
マウス表皮、特に尾部表皮では、本明細書に提示するデータは、非対称細胞分裂の確率（ｐＡＤ）は約０．８４であることを示している。言い換えると、マウス表皮の細胞分裂の８４％は非対称であり、１６％は対称である（すなわち、８％は２個のサイクリング（Ａ）娘細胞を生み出し、８％は２個の非サイクリング（Ｂ）娘細胞を生み出す）。これらの数字は、マウス尾部表皮に関連して適用され図示される。本明細書に提示されるモデルは、特に定常状態の場合には、他の哺乳動物組織でも同じであることに注目すべきである。当然のことながら、これらの定数の正確な値は他の組織では異なっていてもよく、これは参照により又は観察により操作者によって容易に点検される。
【００６１】
少なくとも１つの増殖特性の値は、１つ又は複数の時点で決定してよい。いくつかの実施形態では、増殖特性を表す値を出すために、２つ以上の時点で標的細胞の読取りを行ってよい。
【００６２】
数学モデル
組織成長又は細胞死などの要因によるクローンサイズ拡大は、モデルに影響を及ぼすことから排除されてきたのが本発明のモデルの特徴である。例えば、クローン増殖に関する１つの仮説は、対象のクローンに隣接する細胞が死亡すると、その死んだ隣接する細胞に取って代わるために対象のクローンのマークされた細胞が分裂する可能性があることである。本発明の数学モデルは、この種の影響は行われる分析又は予測に悪影響を及ぼさないとわかっているという事実から恩恵を受けている。
【００６３】
正常細胞の増殖特性の値を予測するために使われる細胞成長挙動のモデルは、サイクリング細胞の全体の分裂速度（λ）、分裂が非対称である確率（ＰＡＤ）、及び非サイクリング細胞の基底層から基底上層への移動速度（Γ）というパラメータによって定義してよい。
【００６４】
サイクリング及び非サイクリング娘細胞への対称的細胞分裂速度は正常細胞では同一であると仮定すると、これらのパラメータは方程式：
【００６５】
【数３】
2009529326.tif 000005
【００６６】
により関連付けてよく、
Ｐｍｎ（ｔ）は、誘導後の時間ｔ後に細胞がｍ個のサイクリング細胞とｎ個の非サイクリング細胞からなる確率であり、Ｐｍｎ（０）＝ｎδｍｌδｎ０＋（１−ｎ）δｍ０δｎ１である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、細胞成長挙動の変化には、λＡＡ：λＢＢの比の変化があってよい。例えば、正常細胞増殖及び分化では、λＡＡ：λＢＢは１に等しくてよいが、標的細胞においては、λＡＡ：λＢＢは１より大きくても１より小さくてもよい。これは、例えば、癌を示している可能性のある過剰な増殖、又は組織恒常性には不十分な可能性のある増殖のいずれかを示しているのであろう。
【００６８】
同一方程式は次の形で都合よく書いてもよい。すなわち、
【００６９】
【数４】
2009529326.tif 000006
【００７０】
を、標識されたクローンが誘導後の時間ｔでｎＡ個のＡ−型のＥＰＣとｎＢ個のＢ−型のＥＰＣを含む確率と定義し、その時間発展はマスター方程式：
【００７１】
【数５】
2009529326.tif 000007
【００７２】
により支配され、初期条件
【００７３】
【数６】
2009529326.tif 000008
【００７４】
に従う。
【００７５】
これは、明らかに上に提示する方程式と同じであり、（１−２ｒ）＝ＰＡＤ、ｎＡ＝ｍ及びｎＢ＝ｎ、したがってｎＡ，ｎＢ＝ｍ，ｎである。便宜上、本発明の方法とは、好ましくはこの「マスター方程式」のことである。
【００７６】
これらの又は他の代わりのパラメータの値は、モデルを正常細胞成長挙動（すなわち、正常に増殖し分化する細胞）で引き出されたデータにフィットさせることにより決定してよい。例えば、方法は、正常細胞の１つ又は複数の増殖特性、好ましくは２つ以上の増殖特性の値を測定し、パラメータを測定値にフィットさせることを含んでいてよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、正常細胞の１つ又は複数の増殖特性の値は、異なる時点に及び前記値の経時的な発展にフィットさせたパラメータで測定してよい。
【００７８】
方法は、細胞の複数の増殖特性の値を測定することを含んでいてよい。
【００７９】
正常細胞成長挙動のモデルに関するエラー範囲を決定してよい。これらは、正常細胞の増殖特性の測定値のエラー範囲から導き出してよい。これらは、パラメータのフィットさせた値のエラー範囲により表してよい。
【００８０】
標的細胞の細胞成長挙動、例えば、増殖及び／若しくは分化の変化は同定され、又は標的細胞の成長挙動が正常細胞成長挙動に対して変化する若しくは改変される可能性は、増殖特性の測定値と正常細胞成長挙動の増殖特性に対しモデルにより予測される値間の差、並びにその測定値とモデルのエラー範囲間の関係に基づいて決定してよい。
【００８１】
細胞成長挙動の変化、例えば、増殖及び／又は分化の変化は、標的細胞の改変された成長挙動を記述するのに必要な細胞成長挙動モデルのパラメータの値を決定することにより特徴付けてよい。方法は、正常細胞の成長挙動を特徴付けるのに使われるパラメータ及び／又は仮定を調整することにより、上記の細胞増殖モデルを標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の測定値にフィットさせることにより、改変された成長挙動を記述するモデルを作成し、それによって、改変された成長挙動を記述するパラメータ及び／又は仮定が調整された細胞成長挙動モデルを得ることを含んでいてよい。
【００８２】
「フィッティング」とは、自動的又は半自動的手段により、モデルに特性の測定値に対応する増殖特性の値を予測させる細胞成長挙動モデルのパラメータの値を決定することを意味する。フィッティングのための種々のコンピュータを使った方法は当技術分野では公知である。
【００８３】
改変された細胞成長挙動を記述するモデルのパラメータは、正常細胞成長挙動を記述するモデルのパラメータと比較し、改変された成長モデルにおけるパラメータ改変の量又は程度を同定してよい。これにより、細胞成長挙動の変化は同定される及び／又は特徴付けられる。
【００８４】
スケーリング
上記のように、モデルが異なる時点又は細胞の異なる集団に容易に拡張可能であることが、本明細書に提示するモデルの重要な特徴である。異常な増殖をする／分化する細胞（前癌又は癌細胞など）は正常細胞と異なるスケーリング／識別特性を見せることがスケーリング実施形態の核心の利点である。できる限り簡単に言うと、スケーリングモデルが侵害されたら、細胞は異常な増殖又は分化特性を示していることになる。
【００８５】
さらに詳細には、スケーリングは、確率分布関数がスケーリング方式を有することを意味する。本発明によれば、特定時間における特定サイズのクローンの分布（「曲線」）は、クローンサイズｎの関数である。異なる時間（ｔ）では、曲線は異なるであろう。スケーリングに従うことは、特定の時点（ｔ１）で曲線が与えられると、他のいかなる時点（ｔ２、ｔ３、等）の曲線も根本的に同一、すなわち、同一形／曲線になることを意味する。これは、特定の系がスケーリングに従うかどうかを判定するために簡単に検証又は試験することができる。すなわち、これを試験するため、初回時（ｔ）からのデータを取り、時間座標を異なる時間（ｔ１）にリスケールする。次に、異なる時点からの曲線が同形の曲線に「崩壊する」又は「リスケールする」のかどうかを比較により判定する。そうであれば、系はスケーリングに従う、又は拡張可能である／スケーリング方式を有する（すなわち、スケーリングモデルに一致する）と言われる。この図解は、図１７ａが参照され、このさらに詳細は実施例に記載している。
【００８６】
さらに詳細には、スケーリング挙動を同定するために、標識された前駆細胞が、誘導後に時間ｔで総数ｎ個の基底層細胞のあるクローンに成長する確率を記述するクローンサイズ分布Ｐｎ（ｔ）を定義する。これから、「持続する」クローンの分布、すなわち、少なくとも１個の基底層細胞を含有する標識クローンの分布を定義することができる。
【００８７】
【数７】
2009529326.tif 000009
【００８８】
この定義で、初期過渡的挙動後、観察されたクローンサイズ分布は簡単なスケーリング方式：
【００８９】
【数８】
2009529326.tif 000010
（１）
【００９０】
に適合することが示されており（図１７ａ及び以下）、τはある一定時間スケールを示している。
【００９１】
このスケーリング試験は、モデルの基礎をなす動力学は著しく単純であるという本発明者らの重要な驚くべき知見を強調している。さらに、このスケーリングは、異常細胞挙動を正常細胞挙動と区別する方法を可能にしており、例えば、このスケーリングによれば、自然細胞動力学の加速だけでも（例えば、ＡＴＲＡ処理）、癌性増殖又は前癌性増殖などの異常挙動と区別することができる。さらに、このスケーリング挙動は定常状態系に特徴的であり、観測データがスケールしなければ、それは、その系が定常状態にはなく、例えば、細胞消失又は細胞獲得又はスケーリングに従わせない他の不均衡への歪みが存在する可能性があることを示している。
【００９２】
細胞の増殖又は分化挙動がスケーリングモデルと一致しなければ、これにより潰瘍が生じる可能性がある（例えば、細胞消失又は減少した増殖又は不適切な分化の場合）。これとは対照的に、スケーリングモデルと一致できなければ、代わりに、細胞が前癌性又は癌性であることを示している可能性がある（例えば、過剰蓄積又は不適切な指数関数的増殖の場合）。スケーリングモデルに従わないことから生じるこれら２つの考えうる推論を識別することは、マスター方程式を使って異常細胞挙動のパラメータを推測する、例えば、定常状態又は基準集団と比較して細胞が消失している（潰瘍性）のか獲得されている（癌性／前癌性）のかを判定することによって簡単に実現される可能性がある。マスター方程式を使ったパラメータの誘導は本明細書に記載されている。
【００９３】
試験化合物の研究に関しては、それらの化合物が良性ならば、細胞増殖又は分化挙動は、マスター方程式における上記の通常モデルに従うはずである。この場合には、そのモデルを使って、細胞分裂速度の変化、又は対称／非対称分裂の割合などのその増殖若しくは分化挙動の他の特性を直接推測することができる。しかし、その動力学がそのモデルと適合せずスケーリング方式を有さなければ、その挙動は、その結果が癌性であれ潰瘍性であれ、異常として示される。
【００９４】
したがって、細胞動力学が確かにスケーリングに従うことが確証された場合、本発明の追加の利点は、その他のパラメータを方程式から導くことができ、それにより、その系の細胞動態の特性の記述を有用に提供することである。系が拡張可能であることが確証された後にマスター方程式から導かれるパラメータの例は、細胞分裂の速度、及び／又は細胞分裂のチャネリング（すなわち、非対称分裂の速度対対称分裂の速度）である。
【００９５】
例えば、非常に若いマウスを使った、ある種の試験系の場合、マウスの皮膚表皮が生体系であれば、スケーリング又は識別特性研究が可能になる前に最初の増殖期が存在する可能性があることに注目すべきである。にもかかわらず、ほぼ１０又は１１週間後、クローンサイズ分布はスケーリング方式に従うはずである。これは、定常状態に到達する必要がある系、及び「ノイズ」を与える小クローンサイズ（例えば、１つ又は２つの細胞クローン）に対する揺らぎの効果により引き起こすことができる。この最初の過渡期でも、細胞動力学はマスター方程式に従うはずである。誘導時に単細胞クローンで始まって、有利なことに、スケーリング挙動が始まる前に、開始細胞挙動でさえマスター方程式により暗黙のうちに略さずに記述される。スケーリング挙動に到達する時間は、系の物理的パラメータに従って変化し、数学的には１／ｒ＼ラムダにより設定される。いずれにせよ、マスター方程式を通じて完全な記述が提供される。スケーリングの適用は本明細書においてさらに詳細に取り上げられる。
【００９６】
実用的な面から言って唯一有意義な「過渡」期は、使用するマーキングシステムに依存している。これに関して、マーキングシステムが好ましいＡｈｃｒｅＥＲＴ／Ｒ２６ＥＹＦＰ／ｗｔシステムの場合、「過渡期」はほぼ２週間である。この２週間は、ロバストで信頼できる検出のために閾値レベルまでマーカーを発現する誘導された細胞ごとにかかる時間である。マーカー発現がこの閾値を通過してしまう前に実施される研究は、細胞が可視化されていないことにより初期時点で誘導された細胞を見逃す危険をおかす。明らかに、マーカー発現を必要なレベルにまで到達させるこの過渡時間枠の特定の持続期間は系によって、又は検出装置若しくは他の要因に従って変わる可能性がある。いつマーカーが確実に検出可能になったかを観察し、この要因に関して本発明を働かせるのは当業者の能力の十分範囲内である。
【００９７】
スケーリング方程式に従っている定常状態系から導くことができる上の利点にもかかわらず、本発明の主要な利点は、細胞動力学が提供されるモデルに従っても従わなくても、決定を下せることである。手短に言えば、動態が本発明のモデルに従わなければ、これは、典型的に、研究している特定の処理、化合物、又は遺伝子に対し否定的であることを示している。従うことができないのは、その系がもはや簡単な細胞動態に従っていないことを強く示すものである。その系が本明細書に記載する細胞動態にもはや従っていない時点で、２つの主要な推論、すなわち、
１．処理の化合物は非発癌性化合物又は処理であるが、分化の促進又は抗増殖効果などの他の効果を有する可能性がある。これは、おそらく最終的に潰瘍を引き起こす。元にある機序は変わる可能性がある。例えば、生存クローンが異常なほど急速に消失する可能性がある。さらに、おそらく平均クローンサイズが異常なほど小さくなる。元にある理由が何であれ、典型的にこのような所見は、細胞消失、したがって潰瘍に向かう全体傾向があることを示している。
２．化合物又は処理は発癌物質又は発癌性である。このために最終的に腫瘍又は非腫瘍癌を生じることになる。これらの条件の下での細胞の特性は、典型的にクローンの指数増殖の出現である（例えば、クローンサイズの指数関数的増加）。これは、発癌物質又は発癌性処理の典型的な識別特性である。
【００９８】
単一時点
本明細書に提示する方程式を使って細胞動力学を研究する場合、操作者の特定の必要次第で、１つの時点だけで情報を提供するのに十分である可能性がある。しかし、当然のことながら、スケーリング／識別特性分析のためには、２つ以上の時点があることが不可欠であることを念頭に置かなければならない。明らかに、スケーリング／識別特性分析は、２つ以上の時点データが与えられなければ、実施することはできない。
【００９９】
単一時点実施形態では、入力は好ましくはクローンサイズ分布である。例えば、これはクローン中の細胞数でよく、又は例えば、増殖している細胞数でもよい。にもかかわらず、その場合、動力学はマスター方程式と比較される。動力学がマスター方程式の予測に適合すれば、結論では、その処理又は化合物は良性であるということになる可能性がある。これは必ずしも、例えば、細胞分裂速度に対して何の効果もないということではない。実際に、ＡＴＲＡ適用は良性である。しかし、ＡＴＲＡ適用は実際、効果があったのであり、その効果は全過程の速度を上げることであった。しかし、全過程はそれでも主方程式により記述される動力学に適合していたのであり、ＡＴＲＡはただ動力学を加速しただけであった。機序の点では、ＡＴＲＡは実際に分化を増加させ、それにより補償として増殖が対応して増加した。しかし、要点は、ＡＴＲＡ処理に続く細胞増殖及び分化の動力学は、それでも本明細書に提示する方程式に適合していたことである。その点から、次に、その方程式を使って、細胞増殖（細胞分裂）速度などのその他のパラメータを導き出し、したがって、良性ＡＴＲＡ処理の性質をよりよく理解することが可能であった。
【０１００】
ＡＴＲＡ処理は、その全体的効果が、特定の時間にわたる細胞分裂数が大幅に増加し、それにより、実際に実験が行われる時間よりもはるかに長い時間恒常的組織の維持をシミュレートするものなので、本発明に従って実施される研究を加速するのに特に有用である。
【０１０１】
多点分析
別の態様では、本発明は、生体系の標的細胞集団の増殖又は分化挙動を評価する方法であって、
（ａ）前記標的細胞集団に対し初回時（ｔ１）にクローンサイズ分布を収集すること、
（ｂ）前記標的細胞集団に対し２回時（ｔ２）にクローンサイズ分布を収集すること、
（ｃ）そのクローンサイズ分布を同時時間座標にリスケールすること、及び
（ｄ）（ｃ）の曲線形を比較すること
を含み、前記曲線が異なっていれば（例えば、似ていない、又は実質的に同じではない）、その細胞の増殖又は分化挙動は異常であると評価される、方法を提供する。
【０１０２】
さらに詳細には、前記曲線が実質的に同じであれば、その細胞の増殖又は分化挙動は正常であると評価され、前記曲線が似ていなければ、その細胞の増殖又は分化挙動は異常であると評価される。当然のことながら、ある種の実施形態では、増殖又は分化挙動の動態はおそらく正常である、すなわち、平衡である又は定常状態であろう。しかし例えば、動態及び定常状態は正常であるが、加速された増殖／分化が、前記パラメータの推測によって、本明細書で教えるマスター方程式から識別することができるＡＴＲＡ処理に応答して観測されるように、基礎にある細胞分裂速度はおそらく変化するであろう。したがって、好ましい実施形態では、先ずスケーリングを試験し、次にマスター方程式により記述又は予測されるパラメータも比較されて、細胞増殖又は分化挙動の多点分析を提供する。
【０１０３】
好ましくは、前記方法は、細胞の増殖又は分化挙動がスケーリング方式：
【０１０４】
【数９】
2009529326.tif 000011
（１）
【０１０５】
に従うかどうかを判定すること
をさらに含み、前記増殖又は分化挙動が前記スケーリング方式に一致する場合は、細胞の増殖又は分化挙動は正常であると評価され、前記増殖又は分化挙動が前記スケーリング方式に一致しない場合は、細胞の増殖又は分化挙動は異常であると評価される。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、生体系における標的細胞集団の増殖又は分化挙動を評価する方法であって、マスター方程式を前記標的細胞集団に適用することにより予測又は記述される少なくとも１つの追加のパラメータを、マスター方程式を基準細胞集団に適用することにより予測又は記述される少なくとも１つの追加のパラメータと比較すること、及び前記標的細胞集団において改変されるパラメータを同定し、それにより標的細胞の増殖又は分化挙動の変化を特徴付けることをさらに含む方法を提供する。
【０１０７】
好ましくは、マスター方程式を基準にして決定されるパラメータに対して行われる比較は、前記方程式により予測又は記述される、好ましくは前記方程式により予測されるパラメータに対して行われる。
【０１０８】
標識化
標的細胞は、集団内の他の細胞と区別するために、標識してよい。好ましくは、個々の細胞とそれに由来するクローン系統が集団内で、例えば表皮などの組織内で識別されるように、集団内のわずかな割合の細胞、例えば、２７細胞中１未満の細胞のみが標識される。
【０１０９】
標的細胞の少なくとも１つの増殖特性を、前記標識化に続いて１つ又は複数の時点で測定してよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、例えば、細胞表面抗原若しくは類似の部分などの検出可能細胞マーカーをすでに発現している細胞の亜集団を追跡するのが望ましければ、又は代わりに、おそらく特定のウイルス、トランスポゾン若しくは類似の検出可能な部分に感染した細胞のクローンを追跡するのが望ましければ、細胞の介入マーキングは必要としなくてもよい。必要条件は、単に、細胞の増殖及び／又は分化についての情報を本発明に従って収集することができるように、特定の細胞又は細胞群由来の細胞が後の時点で検出することができることである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、細胞は、マーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼなどの発光タンパク質をコードする遺伝子の発現によって標識してもよい。マーカー遺伝子の発現は、増殖特性の測定に先立って遺伝的に活性化してよい。
【０１１２】
遺伝的活性化とは、最初の活性化が誘導された親細胞から細胞分裂により生み出される子孫細胞に受け継がれる活性化、すなわち、活性化の誘導に続いて細胞分裂中にマーカー遺伝子の発現が親細胞から娘細胞に伝えられることである。
【０１１３】
いくつかの好ましい実施形態では、マーカー遺伝子は、上記の集団内のわずかな割合の細胞において遺伝的に活性化されてよい。これにより、個々のクローン系統は集団内で区別可能であり、１つの、又は好ましくは２つ以上のクローン系統の増殖特性を、集団内で、例えば、単一試験動物由来の組織において測定することができる。
【０１１４】
例えば、少なくとも１つの増殖特性の値は、
（ｉ）マーカー遺伝子を含む試験動物を提供し、
（ii）前記試験動物の少なくとも１つの標的細胞において前記マーカーの遺伝性活性化を誘導し、遺伝性活性化が組織、例えば表皮中の２７細胞中１未満の細胞において誘導され、
（iii）試験動物をインキュベートし、
（iv）遺伝的活性化の結果として、マーカー遺伝子を発現するクローン細胞を可視化し、
（ｖ）可視化されたクローン細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定する
ことにより測定してよい。
【０１１５】
好ましくは、マーカー遺伝子の遺伝性活性化は、２７細胞中１未満の細胞に、好ましくは３０細胞中１未満の細胞に、好ましくは４０細胞中１未満の細胞に、好ましくは６０細胞中１未満の細胞に、好ましくは１００細胞中１未満の細胞に、好ましくは１５０細胞中１未満の細胞に、好ましくは２００細胞中１未満の細胞に、好ましくは３００細胞中１未満の細胞に、好ましくは４００細胞中１未満の細胞に、好ましくは５００細胞中１未満の細胞に、好ましくは６００細胞中１未満の細胞に、好ましくは６３５細胞中１未満の細胞に、好ましくは６５３細胞中１未満の細胞に、好ましくは７００細胞中１未満の細胞に、好ましくは８００細胞中１未満の細胞に、好ましくは９００細胞中１未満の細胞に、好ましくは１０００細胞中１未満の細胞に、又はさらに少ない割合の細胞に遺伝性活性化をもたらすレベルで誘導される。
【０１１６】
これにより、空間的に分離されているマーカー遺伝子を細胞が発現する確率が最大になり、それによって可視化が促進される。最適組換え速度は、組織によって異なる細胞構成及び細胞間隔次第で、組織によって異なるであろう。
【０１１７】
マーカー遺伝子などの遺伝子構築物を、試験動物ゲノムの特定の遺伝子座、好ましくはｈｐｒｔ又はローザ（Rosa）遺伝子座などの偏在的に発現される遺伝子座、好ましくはローザ遺伝子座に向けてよい。構築物に含有される癌遺伝子などの対象の遺伝子の発現は、発現を表皮の基底層に向けるケラチン５などの組織特異的プロモーターを使うことによって制限してよい。
【０１１８】
遺伝的活性化は、前記マーカー遺伝子の発現を生じる少なくとも１個の細胞に組換えを誘導することにより、誘導してよい。
【０１１９】
これは、背景組換え事象、又は重大な背景組換え事象が観測されないように厳重に調節されている遺伝性体細胞組換えシステムを使って達成してよい。個々にマークされた集団の合併又は切り離しを引き起こすクローンの物理的拡大なしで、個々の細胞それぞれ由来の娘細胞を追跡することができるほど空間的に離された細胞において平均的に個々の組換え事象が起こる程度に、組換え誘導は低頻度で起きてよい。
【０１２０】
適切な組換え法には、ｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ又はｆｌｐリコンビナーゼシステムがある。誘導性のｆｌｐシステムを使ってよい。特に、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムは好ましく、好ましくは誘導性ｃｒｅ−ｌｏｘシステムがよい。特に好ましいのは、ＡｈｃｒｅＥＲＴシステムである（Kemp et al., 2004 NAR vol 32 No.11）。Ｂ−ナフトフラボン及びtamoxifenの投与によって、ＡｈｃｒｅＥＲＴマウスにおいて、組換えを誘導してよく、マーカーは活性化してよい。
【０１２１】
試験動物は、１つ又は複数の、好ましくは２つ以上の個々に標識されたクローン株化細胞を含んでいてよい。動物をインキュベートすることにより、個々のクローン系統もインキュベートされている、すなわち、クローン系統はそれが生み出されたマウスの組織においてインビボでインキュベートされる。しかし、明らかに、インキュベーション全体（すなわち、動物）は、適切な実験室環境においてインビトロで行われる。
【０１２２】
インキュベーションにより、細胞分裂、移動又は分化の正常な過程が起こることができる。したがって、インキュベーションステップでは、試験動物には、正常レベルの世話を施し、正常な餌を与え、できる限り正常な状態が与えられる。次に、細胞は、通常、試験動物内において細胞が存在する特定の微環境で増殖する（又は増殖しない）と考えられるように、増殖する（又は増殖しない）可能性がある。これにより、生物学的に関連のあるインビボ過程を研究することができる。
【０１２３】
可視化はいかなる適切な手段によってもよい。例えば、後に可視化を媒介する抗体により検出されるマーカーを使ってもよい。代わりに、マーカーはそれ自体が発光する、例えば、蛍光性であってよい。最も好ましいのは、増強黄色蛍光タンパク質などのそれ自体が蛍光性のマーカーである。
【０１２４】
他の可視化法には、蛍光タンパク質、抗タグ免疫蛍光法を使って可視化を可能にするエピトープタグを発現しているタンパク質、それ自体が免疫原性であり免疫蛍光法によって可視化することができるタンパク質、例えば、変異ｐ５３がある。
【０１２５】
蛍光及び／又はタグ付きタンパク質は、ＩＲＥＳ配列を使うことにより、又は対象の遺伝子を有する融合タンパク質として、対象の遺伝子と同じＲＮＡから発現することができる。代わりに、蛍光及び／又はタグ付きタンパク質は、クローンが蛍光又はタグ付きタンパク質の消失により同定されるように、ｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセットに含むことができる。有利には、これらの相補的アプローチは、例えば、ＳＴＯＰカセットに青色蛍光タンパク質を、及び対象の遺伝子と一緒にＩＲＥＳから発現される黄色蛍光タンパク質を含むことにより、組み合わせることが可能である。この実施形態では、組換えに続いて、細胞は青色から黄色に変換すると考えられる。
【０１２６】
標的細胞及びそれ由来のクローン細胞は、例えば、共焦点顕微鏡、好ましくは全載共焦点顕微鏡により可視化してよい（Braun et al., 2003 Development 130 5241-5255）。
【０１２７】
本明細書に記載の方法は、細胞成長挙動、例えば、細胞増殖及び／又は分化に対する試験化合物の効果を判定するのに、例えば、毒性若しくは発癌性研究に、又は、治療若しくは化粧品で使用するために抗増殖薬を求めてスクリーニングするのに有用である可能性がある。例えば、本明細書に記載の標的細胞は、少なくとも１つの増殖特性を測定し、細胞増殖に対する効果を判定する前に、試験化合物で処理してよい。対照と比較して処理した標的細胞の増殖及び／又は分化に変化があれば、試験化合物は細胞増殖を改変する又は影響を及ぼすことを示している可能性がある。変化は、例えば、試験化合物は毒性がある若しくは発癌性であることを示している可能性がある、又は、有益な化粧品としての特性があることを示している可能性がある。
【０１２８】
標的細胞が試験動物の組織内にある実施形態では、細胞は、試験化合物を標的細胞を含む試験動物に投与することにより、例えば、注射により若しくは経口投与などの試験動物への全身性導入という他の手段により、又は局所的適用により、例えば、物質若しくは組成物を「塗布する」若しくは他の方法で局所的に投与することにより、試験化合物で処理してよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的細胞は試験動物の表皮内にあり、試験化合物は表皮に局所的に適用される。例えば、試験動物はマウスでよく、投与は尾部皮膚への、好ましくは前記皮膚の外面への局所的適用によるものでよい。組織試料は、試験化合物の適用に続いて１つ又は複数の時点で、処理した標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定するために、動物から取り除いてよい。
【０１２９】
多くの個々の物理的に離された細胞クローンは、単一試験動物の表皮で作ることができ、１つ又は複数の増殖特性の値は個々のクローンごとに別々に測定することができる。
【０１３０】
細胞成長挙動に対する試験化合物の効果を評価する方法は、
（ａ）集団内の標的細胞を試験組成物又は物質で処理すること、
（ｂ）前記処理した標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定すること、
（ｃ）測定値を、細胞成長挙動のモデルによって集団内の正常哺乳動物細胞の前記特性に対して予測された値と比較することであって、
細胞成長挙動の前記モデルは親サイクリング細胞が、１）２個のサイクリング娘細胞、２）１個のサイクリング及び１個の非サイクリング娘細胞、又は３）２個の非サイクリング娘細胞のいずれかに分裂することを必要とし、前記集団内の細胞はどれも幹細胞ではないこと、
（ｄ）前記処理された標的細胞の成長挙動、例えば、増殖及び／又は分化の変化の可能性を、前記測定値と予測値の差から判定すること
を含むことができ、試験化合物の不在と比較して試験化合物の存在における変化の可能性が増加している場合、試験化合物は細胞成長挙動に影響を及ぼすことを示す。
【０１３１】
試験動物、例えば、マウスなどのげっ歯類の表皮内の標的細胞は、試験化合物、例えば、候補化粧品で、試験化合物を動物の皮膚に局所的に投与することにより処理してよい。
【０１３２】
表皮組織の試料は、標的細胞の増殖特性を測定するために、投与に続いて入手し分析してよい。
【０１３３】
適切な試験動物は、上記のように、その活性化を表皮組織内の２７細胞中１未満の細胞に誘導することができる遺伝的に活性化可能なマーカー遺伝子を含んでいてよい。
【０１３４】
本明細書に記載の方法は、毒性又は発癌性を求めて化合物をスクリーニングするのに有用である。物質又は化合物の毒性及び／若しくは発癌性を評価する方法は、
（ａ）集団内の標的細胞を試験化合物又は物質で処理すること、
（ｂ）前記処理した標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定すること、
（ｃ）測定値を、細胞成長挙動のモデルによって集団内の正常哺乳動物細胞の前記特性に対して予測された値と比較することであって、
細胞成長挙動の前記モデルは親サイクリング細胞が、１）２個のサイクリング娘細胞、２）１個のサイクリング及び１個の非サイクリング娘細胞、又は３）２個の非サイクリング娘細胞のいずれかに分裂することを必要とし、前記集団内の細胞はどれも幹細胞ではないこと、
（ｄ）前記処理された標的細胞の成長挙動、例えば、増殖及び／又は分化の変化の可能性を、前記測定値と予測値の差から判定すること
を含むことができ、試験化合物又は物質の不在と比較して試験化合物又は物質の存在における変化の可能性が増加している場合、試験化合物又は物質は毒性がある及び／若しくは発癌性であることを示す。
【０１３５】
適切な物質又は化合物は、あらゆる潜在的な若しくは候補発癌物質又は毒素を含んでいてよく、ヒトを含む動物が曝露されることがあるあらゆる化合物、例えば、治療薬、化粧品、工業製品、又は環境でよい。
【０１３６】
毒性又は発癌性の特性を求めてスクリーニングすることに加えて、本明細書に記載の方法は、有益な美容特性を求めて化合物をスクリーニングするのにも有用である可能性がある。物質又は化合物の美容特性を評価する方法は、
（ａ）集団内の標的細胞を試験化合物又は物質で処理すること、
（ｂ）前記処理した標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定すること、
（ｃ）測定値を、細胞成長挙動のモデルによって集団内の正常哺乳動物細胞の前記特性に対して予測された値と比較することであって、
細胞成長挙動の前記モデルは親サイクリング細胞が、１）２個のサイクリング娘細胞、２）１個のサイクリング及び１個の非サイクリング娘細胞、又は３）２個の非サイクリング娘細胞のいずれかに分裂することを必要とし、前記集団内の細胞はどれも幹細胞ではないこと、
（ｄ）前記処理された標的細胞の成長挙動、例えば、増殖及び／又は分化の変化の可能性を、前記測定値と予測値の差から判定すること
を含むことができ、試験化合物又は物質の不在と比較して試験化合物又は物質の存在における変化の可能性が増加している場合、試験化合物又は物質は有益な美容特性を有する可能性があることを示す。
【０１３７】
有益な美容特性は、細胞増殖及び／若しくは分化の阻害又は減少を含んでよい。本方法を使って、細胞増殖及び／若しくは分化を阻害する又は減少させると同定された試験化合物又は物質は、化粧品として有用である可能性がある。
【０１３８】
処理した標的細胞の増殖及び分化を記述する細胞成長挙動モデルにおけるパラメータの値は、本明細書に記載の方法において決定してよい。方法は、未処理の標的細胞の増殖及び分化を特徴付けるのに使われるパラメータ及び／又は仮定を調整することにより、上記の細胞成長挙動モデルを、処理した標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の測定値にフィットさせることにより、処理した標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルを作成し、それによって処理した標的細胞の増殖及び分化を記述するパラメータ及び／又は仮定が調整された細胞成長挙動モデルを得ることを含んでよい。
【０１３９】
処理した標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルのパラメータは、未処理の標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルのパラメータ、並びに同定された試験化合物による処理によって改変されるパラメータと比較してよい。
【０１４０】
上記のように、標的細胞は、表皮などの試験動物の組織内に存在してよい。
【０１４１】
いくつかの好ましい実施形態では、標的細胞は活性ｐ５３を含有していない、すなわち、ｐ５３は標的細胞では不活化又は抑制されてきた。ｐ５３を不活化する又は抑制するための適切な方法は当技術分野では公知である。
【０１４２】
本明細書に記載の方法は、改変された、例えば、異常な成長挙動を有する標的細胞上で正常な成長挙動を回復させる化合物を求めてスクリーニングするのにも有用である可能性がある。異常な成長挙動を有する標的細胞には、癌細胞又は癌遺伝子を発現している細胞などの過剰な増殖の細胞があってよい。
【０１４３】
方法は、例えば、改変された又は異常な成長挙動、例えば、改変された又は異常な増殖及び／若しくは分化を有する標的細胞を、試験化合物で処理し、次に上記の標的細胞の少なくとも１つの増殖特性を測定することを含んでよい。
【０１４４】
試験化合物の効果は、処理された標的細胞における増殖特性の測定値と未処理の細胞におけるその増殖特性に対してモデルにより予測された値間の差に基づいて判定してよい。
【０１４５】
例えば、処理された標的細胞における改変された成長挙動が減少する若しくは抑制される可能性、又は正常な成長挙動が増加する若しくは促進される可能性は、前記測定値と予測値の差から判定してよい。試験化合物で処理された細胞において、改変された成長挙動の可能性が減少していれば、又は正常な成長挙動の可能性が増加していれば、試験化合物は、癌治療薬又は化粧品として有用である可能性がある抗増殖薬であることを示している可能性がある。
【０１４６】
試験化合物は、候補発癌物質又は毒素でよい。この実施形態では、対照と比較して処理した標的細胞の成長挙動の変化は、試験化合物が発癌物質又は毒素であることを示している。
【０１４７】
試験化合物は、候補化粧品でよい。この実施形態では、対照と比較して処理した標的細胞の成長挙動の変化は、試験化合物が候補化粧品であることを示している。
【０１４８】
上記のように、処理した標的細胞の増殖及び／又は分化を記述する細胞成長挙動モデルのパラメータの値を決定してよい。方法は、未処理の標的細胞の成長挙動を特徴付けるのに使われるパラメータ及び／又は仮定を調整することにより、上記の細胞成長挙動モデルを、処理した標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の測定値にフィットさせることにより、処理した標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルを作成し、それによって処理した標的細胞の増殖及び分化を記述するパラメータ及び／又は仮定が調整された細胞成長挙動モデルを得ることを含んでよい。処理した標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルのパラメータは、未処理の標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルのパラメータ、並びに同定された試験化合物による処理によって改変されるパラメータと比較してよい。
【０１４９】
改変された成長挙動を有する標的細胞であって、上記の方法において使用するのに適した標的細胞には、癌遺伝子を発現する細胞又は細胞増殖を改変する他の遺伝子がある。方法は、例えば、上記の少なくとも１つの増殖特性を測定する前に標的細胞において細胞増殖及び／又は分化を改変する遺伝子、例えば、Ｇｌｉ−１などの癌遺伝子を発現させ、その遺伝子を発現する標的細胞を試験化合物で処理することを含んでよい。
【０１５０】
対照（すなわち、未処理の細胞）と比較して処理された細胞における改変された増殖及び／若しくは分化が減少又は抑制されていれば、試験化合物が、異常に増殖している細胞上で正常な増殖及び／又は分化を回復させることができ、癌の治療に有用である可能性があることを示している。
【０１５１】
さらに、細胞増殖及び／又は分化を改変する遺伝子の発現を、発現を表皮の基底層に向けるケラチン５などの組織特異的プロモーターを使うことにより制限してよい。
【０１５２】
本明細書に記載の方法は、細胞増殖及び／又は分化に対する遺伝子の効果を判定するのにも有用である可能性がある。これは、例えば、癌遺伝子の同定に有用である可能性がある。方法は、標的細胞において試験遺伝子を発現させ、次に上記標的細胞の少なくとも１つの増殖特性を測定することを含んでいてよい。
【０１５３】
試験遺伝子の効果は、試験遺伝子を発現している標的細胞における増殖特性の測定値と、試験遺伝子を発現していない標的細胞（例えば、正常な増殖及び分化を起こしている細胞）の細胞成長挙動モデルによりその増殖特性に対して予測される値間の差に基づいて判定してよい。
【０１５４】
例えば、試験遺伝子の発現が細胞増殖及び／又は分化を改変する可能性は、前記測定値と予測値の差から判定してよい。試験遺伝子を発現している細胞における改変された増殖及び／又は分化の可能性が増加していれば、試験遺伝子は癌遺伝子又は細胞増殖及び／若しくは分化を改変する他の遺伝子であることを示している可能性がある。
【０１５５】
上記のように、試験遺伝子を発現している標的細胞の増殖及び／又は分化を記述する細胞成長挙動モデルにおけるパラメータの値を決定してよい。方法は、試験遺伝子の発現が不在の下で標的細胞の増殖及び分化を特徴付けるのに使われるパラメータ及び／又は仮定を調整することにより、上記細胞成長挙動モデルを試験遺伝子を発現している標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の測定値にフィットさせることにより、試験遺伝子を発現している標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルを作成し、それによって試験遺伝子を発現している標的細胞の増殖及び分化を記述するパラメータ及び／又は仮定が調整された細胞成長挙動モデルを得ることを含んでよい。試験遺伝子を発現している標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルのパラメータは、試験遺伝子を発現していない標的細胞の増殖及び分化を記述するモデルのパラメータ、並びに同定された試験遺伝子の発現により改変されるパラメータと比較してよい。
【０１５６】
試験遺伝子は、候補癌遺伝子、細胞周期調節因子、非対称細胞分裂若しくは最終分化を制御している遺伝子、細胞シグナル伝達経路若しくは細胞間接着を調節する、又は細胞増殖及び／若しくは分化に影響を及ぼすと思われる他の遺伝子でよい。
【０１５７】
本発明の別の態様は、それでプログラムされるプロセッサに、
ａ）上記の細胞成長挙動のモデルを使って集団内の正常細胞の増殖特性の値を予測することであって、
細胞成長挙動の前記モデルが、親サイクリング細胞が、１）２個のサイクリング娘細胞、２）１個のサイクリング及び１個の非サイクリング娘細胞、又は３）２個の非サイクリング娘細胞に分裂することを必要とし、前記集団中の細胞はどれも幹細胞ではないこと、
ｂ）標的細胞で測定される前記増殖特性の値を、正常細胞での前記予測値と比較すること、及び
ｃ）前記標的細胞の改変された細胞成長挙動、例えば、改変された増殖又は分化の可能性を、前記測定値と予測値の差から判定すること
を可能にするコンピュータ可読コードを有するコンピュータプログラム製品を提供する。
【０１５８】
コンピュータ可読コードは、それでプログラムされたプロセッサが、正常な細胞増殖及び分化から得られるデータ、例えば、正常細胞の増殖特性を表す１つ又は複数の測定値に細胞成長挙動モデルをフィットさせ、正常細胞に対して増殖特性の値を予測することをさらに可能にしてよい。
【０１５９】
コンピュータ可読コードは、それでプログラムされたプロセッサが、標的細胞の改変された増殖及び／又は分化を記述する細胞成長挙動モデルのパラメータの値を決定することをさらに可能にしてよい。例えば、プロセッサは、正常細胞増殖及び分化を特徴付けるのに使われるパラメータ並びに／又は仮定を調整することにより、上記の細胞成長挙動モデルを、標的細胞の少なくとも１つの増殖特性の測定値にフィットさせ、それによって、改変された増殖及び／又は分化を記述するパラメータ並びに／又は仮定が調整された細胞成長挙動モデルを得てよい。
【０１６０】
そのようにプログラムされたプロセッサは、改変された増殖及び／又は分化を記述するモデルのパラメータを、正常な増殖及び分化を記述するモデルのパラメータと比較し、それによって、改変されたモデルのパラメータの改変の量又は程度を同定してよい。これにより、増殖及び／又は分化の変化を特徴付けることができる。
【０１６１】
したがって、本発明は、それでプログラムされたプロセッサに本明細書に記載の方法を実施させるようなコンピュータ可読コードを有するコンピュータプログラム製品を提供する。明らかに、測定ステップは、分析ステップを実行するのに使われるコンピュータとは別のコンピュータにより実行してよい、又は前記測定ステップは技術者が実行してよい。したがって、好ましくはコンピュータプログラム製品は、それでプログラムされたプロセッサに本明細書に記載の方法の非測定ステップ、すなわち増殖特性（例えば、クローンサイズ）の測定以外のステップを実施させるようなコンピュータ可読コードを有する。
【０１６２】
上記のように、標的細胞は試験化合物で処理してよく、試験物質が増殖及び／又は分化を改変し、例えば、候補化粧品又は候補発癌物質若しくは毒素である確率は、測定される増殖特性に基づいて決定してよい。
【０１６３】
本発明の追加の態様は、（ｉ）例えば、上記の集団における標的細胞の細胞成長挙動、例えば、増殖及び／又は分化の変化を評価するためのプロセッサをプログラムするためのコンピュータ可読コード、（ii）そのようなコンピュータ可読コードを有するコンピュータプログラム製品、及び（iii）上記のように、前記細胞の増殖特性の測定から、集団における標的細胞の成長挙動、例えば、増殖及び／又は分化の変化を評価するように設定されたコンピュータシステムを提供する。
【０１６４】
用語「コンピュータプログラム製品」は、直接コンピュータにより読み取りアクセスすることができるあらゆるコンピュータ可読媒体を含む。典型的な媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；光ディスク又はＣＤ−ＲＯＭなどの光学式記憶媒体；ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電子記憶媒体；並びに磁気／光学式記憶媒体などのこれらの範疇のハイブリッドがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１６５】
化合物試験
本発明は、予測薬物試験などの用途の改良を可能にする。例えば、モデル系における細胞分裂速度を加速することができるが、細胞挙動を記述する基礎的数学モデルはそれでも有効である。したがって、系の細胞分裂速度を加速するが、系はそれでも本明細書に記載のモデルに制約されていることがわかっていることにより、細胞挙動に対する種々の化合物又は処理の効果を、有利に短い時間枠にわたって調査することができる。この適用の一例は、レチノイド処理を使うことである。例えば、生体系としてマウス尾部表皮を使って、マウスにＡＴＲＡなどのほぼ２週間のレチノイド処理を施すことができる。クローンサイズを本明細書で教示する通りに測定する。次に、これらの値は本明細書に提示するモデルを使って分析する。ほぼ１２週間目段階で細胞増殖挙動について予測を行う。驚くことに、それらの予測は観測結果と一致していることがわかる。本発明のこの種の適用の商業的利点は、レチノイド処理に続いて、ほぼ１２週間目のマウス表皮系は、５年分の細胞分裂事象に相当することを受けていることである。したがって、本発明のモデルを使って、予測化合物試験はほぼ１２〜１４週間という劇的に加速された（減少させた）期間で行うことができるが、先行技術ではこの種の研究は典型的にほぼ５年かかっていたと考えられる。この系の追加の利点は、この系が、この種の化合物試験を実施するために必要とするマウスなどの試験動物の数を大幅に減少させることである。この利点は、加速された時間枠から生じ、動物当たり複数のクローンを本明細書に記載する技法を使って独立して分析できるという事実からも生じる。
【０１６６】
本発明のさらなる適用は、潜在的発癌性の遺伝変種の研究分野にある。例えば、ＧＬＩ１では、変異体をマウスに導入し、マーカー（ＥＹＦＰなど）と同時に活性化することができる。ＧＬＩ１の過剰発現は腫瘍を促進することが知られている。実際に、これらの腫瘍は基底細胞癌腫瘍としてよく特徴付けられている。ＧＬＩ１はヒトにおけるヘッジホグ／パッチドに相当する。ＧＬＩ１を発現しているクローンを追跡するためのマーキングシステムに結合させたＧＬＩ１過剰発現を含む、マウスなどの試験動物での研究を行うことにより、予測抗癌研究を実施することができる。例えば、Tazoratine（商標）（Allergan社製）はＧＬＩ１阻害剤である。本発明のシステムを使って、ＧＬＩ１の阻害が癌の予防又は治療において有用な道具であるかどうかという生物学的に関連のある問題に取り組むことができる。
【０１６７】
これは、好ましくは、同時ＧＬＩ１過剰発現と増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）による細胞マーキングを誘導することにより、上の概略のように実施される。次に、対照マウスは未処理のままにするか、又は媒体で処理することができる。次に、試験マウスは、Tazoratine（商標）処理、又は癌性細胞成長に対して有益な効果がある可能性があると考えられる他のあらゆる候補化合物による処理を受けることができる。次に、それらのマウスにおける標的細胞の増殖又は分化挙動は、本発明に従って分析することができる。これにより、非常に短い時間枠で細胞挙動／恒常性に対する効果を有利に分析することができる。さらに、このシステムを使うことには、必要な試験動物の数の著しい減少などの実際的で倫理的な利点がある。例えば、以前必要であった動物の４分の１、又はさらに少ない数だけで同じ研究を行うことができる。さらに、試験動物の年齢コホートの必要性は本発明の教示に従うことにより取り除かれる。なぜならば、本明細書に提示する数学的手法を使えば初期段階の観測結果を外挿することができるからである。これにより、処理のずっと後の時間枠における細胞増殖及び分化挙動の予測が可能になる。したがって、これは、試験動物を先行技術が要求するほど長い時間処理条件の下に維持しておく必要がないことを有利に意味しており、それによりそれらの試験動物の苦痛又は不快は有利に減少する。
【０１６８】
したがって、本発明が提供する重要な利点の１つは、クローンの挙動が、（例えば）癌性表現型を示しているかどうか（例えば、特定の処理が発癌性の結果を得るかどうか）が非常に短い実験（例えば、試験動物としてマウスの場合２〜２０週間）からわかることである。これは、試験動物の長期間維持を必要とする先行技術研究と際立って対照的である。
【０１６９】
ＧＬＩ１を使う研究を実施することに加えて、明らかに他の潜在的癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子を研究してよい。これの好ましい例には、ｐ５３、Ｒａｓなどがある。
【０１７０】
本明細書に記載のシステムの追加の適用は、対象の細胞又はクローンを、試験動物から取り除いてインビトロでクローン化することにより追跡することである。これを実現する１つの簡単な方法は、マウス表皮細胞を取り出し、それを当業者には公知であるマウスケラチノサイト成長のための通常の条件の下でインキュベートするだけである。
【０１７１】
本発明の種々の追加の態様及び実施形態は、本開示に照らして当業者には明らかであろう。
【０１７２】
本明細書で言及するすべての文献は、その全体を参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０１７３】
本発明は、上に記載されている特徴のそれぞれ並びにすべての組合せ及び小組合せを包含するものとする。
【０１７４】
本発明のある種の態様及び実施形態は、ここで以下に記載する実施例により及び図を参照して説明することにする。
［実施例］
【０１７５】
方法
動物及び試料調製
動物実験はすべてHome Office Project Licenceに指示された通りに行った。ＡｈｃｒｅＥＲＴ及びＲ２６ＥＹＦＰ／ＥＹＦＰマウスの作製は以前に記載されている。（Srinivas, S. et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol 1, 4 (2001)、Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res 32, e92 (2004)）ＡｈｃｒｅＥＲＴ  Ｒ２６ＥＹＦＰ／ｗｔマウスをβＮＦ及びtamoxifenの複数回投与で処理すると、上部毛包及びＩＦＥに高レベルの組換えが見られた（データは示されていない）。薬剤投与量を滴下して低頻度標識化をし、コーン油に溶解した８０ｍｇ／ｋｇ  β−ナフトフラボン（Sigma-Aldrich社製）及び１ｍｇ tamoxifen遊離塩基（MP Biomedicals社製）を１回腹腔内注射すると、誘導後２週間目で、尾部ＩＦＥの６００基底細胞中ほぼ１細胞に、及び背中のＩＦＥの４０基底細胞中１細胞にＥＹＦＰ発現が生じた（Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res 32, e92 (2004)）。生後１５カ月でも、毛包のバルジ領域には標識化は検出されず、未処理ＡｈｃｒｅＥＲＴ  Ｒ２６ＥＹＦＰ／ｗｔ動物には背景標識化は存在しなかった。表皮ホールマウントは記載の通りに調製した（Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-55 (2003)）。背中表皮の分析では、６０μｍ凍結切片を使った。
【０１７６】
免疫染色及び画像化
ホールマウントの免疫染色は記載の通りに実施した。（Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-55 (2003)）以下の一次抗体、すなわち、Alexa Fluor488又は555にコンジュゲートした抗ＧＦＰ（Molecular Probes社製）、抗Ｋｉ６７（Abcam社製）、抗ｎｕｍｂ（Abcam社製）及び抗開裂カスパーゼ３（Cell Signalling Technology社製）を使用した。二次抗体はMolecular Probes社製であった。共焦点画像は、０．２〜２μｍインクリメント中３０〜１２０光学的断面がImprovision Velocityソフトウェアを使ってレンダーリングされたＺ−ｓｔａｃｋ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎとして提示される。
【０１７７】
クローンサイズ、数及び増殖の分析
提示するデータは、時点当たり少なくとも３マウスを使った少なくとも２実験の典型例である。
【０１７８】
尾部表皮
尾部表皮のパターン化組織により、２８２，０００±２３００μｍ２あり、４８７０±４００（平均値±ＳＤ）基底層細胞を含有する毛包の隣接列間の尾部ＩＦＥの単位面積を定義することができる。
【０１７９】
単位面積の尾部ＩＦＥ当たりの標識クローンの平均数は、１００面積を計数した６カ月及び１２カ月を除いて、各時点での３マウスそれぞれの５０単位面積の共焦点画像化により検出されるすべてのクローンを計数することにより評価した。
【０１８０】
クローンサイズは、各時点の各マウスの少なくとも１個の基底細胞を含有する少なくとも５０クローンのＺ  ｓｔａｃｋ共焦点画像化により決定した。６週間後、無核角化層細胞が標識クローン中に現れ、総細胞数を計数することが不可能になり、したがって、クローン当たりの総細胞数は６週間まで計数したが、その後の時点では基底細胞のみを点数化したことに注目されたい。Ｋｉ６７陽性細胞の割合は、少なくとも３マウスから複数の領域の少なくとも１５００基底細胞を画像化することにより決定した。
【０１８１】
背中の皮膚表皮
６０μｍ凍結切片を光学切片法により分析した。クローン数を決定するために、３つの１０ｍｍ長の表皮中のクローンすべてを、３カ月までの時点のマウスごとに分析し、６カ月及び１２カ月時点で少なくとも５ｃｍの表皮をマウスごとに点数化した。基底細胞数として表される最大クローン直径を、各時点で３マウスそれぞれで少なくとも５０クローンに対して点数化した（図１１）。
【０１８２】
アポトーシス
誘導後２日、１週間、２週間、３週間、４週間及び６週間目の尾部表皮のホールマウントを抗開裂カスパーゼ３／Alexa Fluor488コンジュゲートで染色し、陽性カスパーゼ３染色は退行期毛包に限定した。
【０１８３】
有糸分裂紡錘体配向の分析
ＤＡＰＩ染色尾部ＩＦＥのホールマウントを、均一強ＤＡＰＩ染色により明らかにされるように、凝縮した染色体を含有するすべての核のＺ  ｓｔａｃｋを獲得することにより分析した。画像は、上のように、３次元でレンダーリングし、中期からまで終期のすべての有糸分裂像の紡錘体配向を記載の通りに点数化した（Das, T., Payer, B., Cayouette, M. & Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron 37, 597-609 (2003)）。
【０１８４】
レチノイン酸処理
エタノール、プロパンジオール７０：３０中全トランスレチノイン酸（Sigma社製）を、３カ月間週５日０．３３ｍＭで、又は２週間毎日１ｍＭで、尾部皮膚及び剃った背中の皮膚（それぞれ０．５ｍｌ）に局所的に塗布した。
【実施例１】
【０１８５】
誘導性遺伝子マーキングを使って、成体マウス中の細胞及びその子孫の試料に標識した。誘導性ＣＹＰ１Ａ１プロモーターから発現されるｃｒｅリコンビナーゼ（ＡｈｃｒｅＥＲＴ）のtamoxifen調節変異体導入のトランスジェニック動物を、Ｒ２６ＥＹＦＰ／ＥＹＦＰレポーター株上に交雑させ、そこでは増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）の条件的対立遺伝子がＲｏｓａ２６遺伝子座に標的されている（図８（Srinivas, S. et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol 1, 4 (2001)、Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res 32, e92 (2004)））。こうして得られるＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔヘテロ接合体では、生後６〜９週間目でのβＮＦ及びtamoxifenの１回投与に続いてＥＹＦＰが発現される。誘導後時折、マウスのコホートは分析のために選別した。ＥＹＦＰを発現している細胞及びその標識された子孫は、ホールマウント表皮の共焦点顕微鏡により検出した（Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-55 (2003)）。
【０１８６】
誘導後２日目に、単一標識細胞だけがホールマウント調製物中のクローンで見られた。それに続くマウスのコホートの分析により、粘着性のままでサイズが進行的に拡大するクローンが実証された。ＥＹＦＰ標識が検出可能なレベルにまで蓄積するにしたがって、尾部ＩＦＥの単位面積当たりの標識クローンの数は増加し、誘導後２週間でピークに達し、次に３カ月までにピーク値の６．８％、１年で３．２％にまで低下した。類似の結果は背中の皮膚ＩＦＥで見られた（図２及び１０）。
【０１８７】
単細胞が実験の開始時に標識され、ＩＦＥにおいて検出可能なアポトーシスが存在しなかったとき、各クローン中の細胞の総数は誘導以降の増殖の直接測定を提供する。１つ又は複数の基底細胞を含有するクローンを点数化して、標識後６週間までのクローン当たりの細胞の総数（図３）、及び１年までのクローン当たりの基底細胞の数を測定した。Ｋｉ６７免疫染色により評価される尾部ＩＦＥ中の増殖している基底細胞の割合は、１５±１％（平均値±標準誤差）であることがわかった（Birner, P. et al. Immunohistochemical detection of cell growth fraction in formalin-fixed and paraffin-embedded murine tissue. Am J Pathol 158, 1991-6 (2001)）。決定的には、１年後のこの数字には有意差はなく、サイクリング基底細胞の割合は標識クローン及び隣接する非標識表皮において同じであったので、（ａ）実験の間、ＩＦＥは定常状態系と見なすことができる、及び（ｂ）標識クローン内に含有される細胞は全ＥＰＣを代表していると推測することができる。さらに、ＩＦＥ中のクローン分布の分析により、標識クローンは毛包から移動してくる非標識クローンに置き換わってはいないことが示されている（図１２及び１３）。毛包のバルジに標識していないので、バルジＳＣから派生することができる標識クローンはない。
【０１８８】
ＳＣ／ＴＡ細胞仮説に基づくモデルは、ＥＰＵモデルを含むすべてが、長時点では、ＳＣ支持クローンの集団のサイズ分布は必ず定常状態に収束するが、その祖先をＴＡ又は分化細胞に遡るクローンは分化を通じて失われると予測している。ＴＡ細胞区画の特性は、クローンサイズ分布のモーメント（すなわち、平均、分散、等）が必ず一定値に収束するように、ＳＣ支持クローンにおける基底細胞の数に上限を課す。そのような挙動は、クローンサイズにおける強力な増加を明らかにする観測された分布（図３）と著しく対照的である。したがって、ＳＣ区画に頼っていない表皮の維持には異なったパラダイムを考慮せざるを得なくなる。観測された挙動は、非幹細胞ＥＰＣのみを伴う恒常性モデルと両立することを以下で実証する。
【０１８９】
多数のクローン運命データのおかげで、以下の追加の観測結果を使って、ＥＰＣ集団の特徴を判定することができる。先ず、ホールマウント表皮の三次元再構築により、有糸分裂紡錘体の３％のみが基底層に対し垂直であることが明らかにされ、胚性表皮とは対照的に（Lechler, T. & Fuchs, E. Asymmetric cell divisions promote stratification and differentiation of mammalian skin. Nature 437, 275-80 (2005)、Smart, I. H. Variation in the plane of cell cleavage during the process of stratification in the mouse epidermis. Br J Dermatol 82, 276-82 (1970)）、大部分のＥＰＣ分裂が２個の基底細胞を生み出すことを示している。第２に、誘導後３週間目の２つの細胞クローンの試験により、細胞分裂は、１個のサイクリング細胞（Ｋｉ６７陽性）と１個の非サイクリング細胞、又は２個のサイクリング細胞、又は２個の非サイクリング細胞のうちいずれかを生み出す可能性があることが明らかにされている。神経及び筋原前駆体における非対称分裂を特徴付ける、約２つの細胞クローンにおけるｎｕｍｂタンパク質の非対称分割の観測結果と合わせると（図４）（Zhong, W., Feder, J. N., Jiang, M. M., Jan, L. Y. & Jan, Y. N. Asymmetric localization of a mammalian numb homolog during mouse cortical neurogenesis. Neuron 17, 43-53 (1996)、Conboy, I. M. & Rando, T. A. The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis. Dev Cell 3, 397-409 (2002)）、ＥＰＣ産物の平面配向分裂は対称又は非対称のいずれかであるという結論に導かれる（ゼブラフィッシュ網膜前駆体でも見られる現象（Das, T., Payer, B., Cayouette, M. & Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron 37, 597-609 (2003)））。
【０１９０】
これらの観測結果は、わずか３パラメータ、すなわち、増殖している（Ａ−型）ＥＰＣの全体分裂速度λ、分裂が非対称である確率ＰＡＤ、及び非増殖（Ｂ−型）ＥＰＣの基底層から基底上層への移行速度Γを含むクローン運命のモデルに具体化される。さらに、定常状態ＥＰＣ集団を維持するために、対称細胞分裂（Ａ→Ａ＋Ａ及びＢ→Ｂ＋Ｂ）速度は等しくなければならないことに注目してよい。最後に、基底層細胞数／単位面積は一定のままである（データは示されていない）という観測結果により、追加の制約Γ＝λｎ／（１−ｎ）が生じ、ｎは基底層中のＥＰＣの体積分率を示しており、調節可能なパラメータ数をわずか２まで減少させる。
【０１９１】
形式上、Ｐｍｎ（ｔ）を標識クローンが、誘導後時間ｔ後にｍ個のＡ−型ＥＰＣ及びｎ個のＢ型ＥＰＣを含む確率と定義すると、対応する枝分かれ対消滅（branching-annihilation）過程に関連する時間発展はマスター方程式、
【０１９２】
【数１０】
2009529326.tif 000012
【０１９３】
により指定され、
この方程式は、初期条件Ｐｍｎ（０）＝ｎδｍ１δｎ０＋（１−ｎ）δｍ０δｎ１に従って解かなければならない。対応する動力学は積分可能であるが、完全分布関数に対する分析表現の回復は実行不可能に思われる。それに反して、マスター方程式の解は数値積分法により直接得ることができる。
【０１９４】
実験値ｎ＝０．１５を取ると、基底層集団へのフィット（図７）は、λ＝１／週（Γ＝０．２／週を意味する）、及びＰＡＤ＝０．８４で実験データと良好な量的一致を示しており、すなわち、ＥＰＣ分裂の８％が２個の前駆細胞を生み出し、８％が２個の分裂終了細胞を生み出すが、残りの８４％は非対称であり、これは胚性マウス表皮で見られる数字に匹敵する数字である。（Lechler, T. & Fuchs, E. Asymmetric cell divisions promote stratification and differentiation of mammalian skin. Nature 437, 275-80 (2005)）重大なことに、全クローン細胞集団（６週間まで入手可能である）に適用すると、同一パラメータはデータへの良好な量的フィットを提供する（図６）。さらに、２個の基底層細胞を有する２つの細胞クローンの割合の測定は、異なる細胞型（基底対基底上）を区別する手段を提供する（図５）。いずれの場合も（実験と理論）、数字６３％を得る。
【０１９５】
モデルの基盤をさらに批判的に評価し、その予測能力を実証するために、レチノイドで処理することにより表皮の増殖及び分化速度を増加させる効果を試験した。２つのプロトコル、すなわち、（１）マウスを誘導し、３カ月の間隔をあけた後、０．３３ｍＭの全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）又は媒体のみのどちらかでさらに３カ月間処理する、（２）マウスは、誘導後直ちに始めて、２週間１ｍＭの全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）又は媒体のみで処理するを使った。どちらの場合も、クローンサイズは、ＡＴＲＡ処理マウスにおいてＫｉ６７染色により評価される増殖速度の増加と調和して、ＡＴＲＡ処理動物において実質的に増加するのが見られた（対照の１６．５±２．２％（平均値±標準誤差）と比べて５７．０±３．７％）。ＡＴＲＡ処理は有糸分裂紡錘体の配向を改変しなかった（図１１及び１２）。重大なことに、２週間目に、モデルを観測された２つの細胞クローン分布にフィットさせる際に、どちらのプロトコルでも、データは、野生型から変化していないＡＤ速度８４％と適合しているが、ＥＰＣ分裂速度は、媒体で因数１．４で、ＡＴＲＡ処理系では２２で増加していることが見出されている（図８）。６カ月分布に適用すると、モデル予測と実験データの比較により、顕著な量的一致が示されている（図８）。したがって、非標識サイクリングＳＣの重大な寄与は、正常及びＡＴＲＡ処理表皮のいずれでも観測されるクローン挙動とは不適合である。
【０１９６】
長期間組織で持続する細胞のみが癌を生じる複数の変異体を獲得するポテンシャルを有することが示唆されてきた。本明細書のこれらの結果は、サイクリングＥＰＣはすべて発癌性変異体に感受性の長命のクローンを生み出す等しい確率を有することを示している。
【実施例２】
【０１９７】
方法
この実施例では、生体系における標的細胞集団の増殖又は分化挙動を評価する方法を実証する。
【０１９８】
この実施例では、標的細胞は試験マウスの表皮細胞である。その一部は、時間ｔ＝０で遺伝性マーカーで標識される。この実施例では、細胞は実施例１と同じように標識される。
【０１９９】
次に、少なくとも１時点ｔでの前記細胞の少なくとも１つの増殖特性の値を測定し、前記増殖特性はクローンサイズ分布である。この実施例では、ｔは４週間（標識化から４週間）である。
【０２００】
次に、上で測定されたクローンサイズ分布は、方程式；
【０２０１】
【数１１】
2009529326.tif 000013
【０２０２】
により予測又は記述される対応する時点ｔにおける標準クローンサイズ分布と比較される。
【０２０３】
この実施例では、標準クローンサイズ分布は、上の方程式を対応する時間ｔでの正常マウス表皮由来のクローンサイズに適用することにより作成される。
【０２０４】
試験マウスの測定されたクローンサイズ分布と基準細胞の予測又は記述されるクローンサイズ分布間の差は、前記細胞の増殖又は分化挙動が改変されたことを示す。この実施例では、差は見つからず、したがって試験マウスにおける細胞の挙動が改変されたとは推測されなかった。
【実施例３】
【０２０５】
偏差、適用及びスケーリング研究
概要
成体表皮恒常性の現在のモデルに従って、皮膚組織を前駆細胞の２つの別々の集団、すなわち自己複製幹細胞、及び数回の細胞分裂の後に分化するトランジット増幅期細胞として知られるその子孫によって維持する（Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation 14, 23-34 (1979)、Alonso, L. & Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100 (suppl. 1), 11830-11835 (2003)、Braun, K. M. & Watt, F. M. Epidermal label-retaining cells: background and recent applications. J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 9, 196-201 (2004)。誘導性遺伝子標識化を利用することにより、インビボでの単細胞分割で１年まで時間間隔をおいてマウス尾部表皮において前駆細胞の代表的試料の運命を追跡した。本明細書では、クローンサイズ分布は１種類の前駆細胞のみを含む恒常性の新モデルと一致していることを示している。これらの細胞は、表皮恒常性を確保する速度で対称的分裂も非対称的分裂も受けることが見出されている。結果により、インビボでの組織維持に関する幹細胞の役割を洞察することができる。
【０２０６】
実施例３の方法
動物及び試料調製
動物実験はすべてHome Office Project Licenceに指示された通りに行った。ＡｈｃｒｅＥＲＴ及びＲ２６ＥＹＦＰ／ＥＹＦＰマウスの作製は以前に記載されている（Srinivas, S. et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4 (2001)、Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32, e92 (2004)）。ＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔマウスをβＮＦ及びtamoxifenの複数回投与で処理すると、上部毛包及びＩＦＥに高レベルの組換えが見られた（図１８）。薬剤投与量を滴下して低頻度標識化をし、コーン油に溶解したｋｇ当たり８０ｍｇのβ−ナフトフラボン（Sigma-Aldrich社製）及び１ｍｇのtamoxifen遊離塩基（MP Biomedicals社製）を１回腹腔内注射すると、誘導の２週間目に、尾部ＩＦＥの６００基底細胞中ほぼ１細胞に、及び背中のＩＦＥの４０基底細胞中１細胞にＥＹＦＰ発現が生じた（Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32, e92 (2004)）。生後１５カ月でも、毛包のバルジ領域には標識化は検出されず、未処理ＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔ動物には背景標識化は存在しなかった（図１８ｃ、ｄ）。表皮ホールマウントは記載の通りに調製した（Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-5255 (2003)）。背中表皮の分析では、６０μｍ凍結切片を使った。
【０２０７】
免疫染色及び画像化
ホールマウントの免疫染色は記載の通りに実施した（Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-5255 (2003)）。以下の一次抗体、すなわち、Alexa Fluor488又は555にコンジュゲートした抗ＧＦＰ（Molecular Probes社製）、抗Ｋｉ６７（Abcam社製）、抗ｎｕｍｂ（Abcam社製）、抗開裂カスパーゼ３（Cell Signalling Technology社製）、及びFITCにコンジュゲートした抗−α−チューブリン（Sigma社製）を使用した。二次抗体はMolecular Probes社製であった。共焦点画像はＺ−ｓｔａｃｋ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎとして示され、０．２〜２μｍインクリメント中３０〜１２０光学的断面がImprovision Velocityソフトウェアを使ってレンダーリングされた。
【０２０８】
クローンサイズ、数及び増殖の分析
提示するデータは、時点当たり少なくとも３マウスを使った少なくとも２実験の典型例である。
【０２０９】
尾部表皮
尾部表皮のパターン化組織により、２８２，０００±２３００μｍ２あり、４８７０±４００（平均値±標準偏差）基底層細胞を含有する毛包の隣接列間の尾部ＩＦＥの単位面積を定義することができる（図２２ａ）。単位面積の尾部ＩＦＥ当たりの標識クローンの平均数は、１００面積を計数した６カ月及び１２カ月目を除いて、各時点での３マウスそれぞれの５０単位面積の共焦点画像化により検出されるすべてのクローンを計数することにより評価した。クローンサイズは、各時点の各マウスの少なくとも１個の基底細胞を含有する少なくとも５０クローンのＺ−ｓｔａｃｋ共焦点画像化により決定した。６週間後、無核角化層細胞が標識クローン中に現れ、総細胞数を計数することが不可能になり、したがって、クローン当たりの総細胞数は６週間まで計数したが、基底細胞の総数は１年まで点数化することができた。Ｋｉ６７陽性細胞の割合は、少なくとも３マウスから複数の領域の少なくとも１５００基底細胞を画像化することにより決定した。
【０２１０】
背中の皮膚表皮
６０μｍ凍結切片を光学切片法により分析した。クローン数を決定するために、３つの１０ｍｍ長の表皮中のクローンすべてを、３カ月まで時点のマウスごとに分析し、６カ月及び１２カ月時点で少なくとも５ｃｍの表皮をマウスごとに点数化した。基底細胞数として表される最大クローン直径を、各時点で３マウスそれぞれで少なくとも５０クローンに対して点数化した。
【０２１１】
アポトーシス
誘導後２日、１週間、２週間、３週間、４週間及び６週間目の尾部表皮のホールマウントを抗開裂カスパーゼ３／Alexa Fluor488コンジュゲートで染色し、陽性カスパーゼ３染色は退行期毛包に限定した。追加実験では、ＤＡＰＩにより可視化される開裂カスパーゼ３及びアポトーシス小体の染色は、誘導後３週間及び６カ月目のマウス由来のホールマウントの基底層で試験した。陽性対照として、表皮ホールマウントに１６０ｍＪｃｍ−２ＵＶＣを照射し、３７℃で１６時間インキュベーション後に分析した。
【０２１２】
有糸分裂紡錘体配向の分析
ＤＡＰＩ染色尾部ＩＦＥのホールマウントを、均一強ＤＡＰＩ染色により明らかにされるように、凝縮した染色体を含有するすべての核のＺ−ｓｔａｃｋを獲得することにより分析した。画像は、上のように、三次元でレンダーリングし、中期から終期までのすべての有糸分裂像の紡錘体配向を記載の通りに点数化した（Das, T., Payer, B., Cayouette, M. & Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron 37, 597-609 (2003)）。
【０２１３】
ｃｒｅ発現の分析
誘導後のｃｒｅＥＲｔメッセンジャーＲＮＡレベルは、Trizol（Sigma社製）を使って尾部表皮から調製したＲＮＡの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）を使って定量ポリメラーゼ連鎖反応により分析した。使用したプライマーは、5'-CGTACTGACGGTGGGAGAAT及び5'-CCCGGCAAAACAGGTAGTTAであり、その産物はSyBr Greenを使って検出した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡは、Taqman probe（Applied Biosystems社製）で測定した。
【０２１４】
フローサイトメトリー
単細胞浮遊液は、DispaseII（Roche社製）での３０分インキュベーションを使い、それに続くトリプシンＥＤＴＡでの消化により尾部表皮から調製した。この方法は、毛包間表皮を真皮及び下部毛包から分離する。ビオチンコンジュゲート抗β１インテグリン抗体（BD Biosciences/Pharmingen社製）及びAlexa488-streptavidin（Molecular Probes社製）で染色後、試料はパラホルムアルデヒドで固定し、１００μｇｍｌ−１のリボヌクレアーゼＡ及び５０μｇｍｌ−１のヨウ化プロピジウムを含む０．１％サポニンで透過処理し、細胞ダブレットを排除するためにヨウ化プロピジウムチャネルパルス面積／幅ゲーティングを使って、BD Facscaliburフローサイトメーターで分析した。
【０２１５】
背景
哺乳動物表皮は、ケラチノサイト層からなる毛包間表皮（ＩＦＥ）で分散した毛包に組織化されている（図１４ａ）（Gambardella, L. & Barrandon, Y. The multifaceted adult epidermal stem cell. Curr. Opin. Cell Biol. 15, 771-777 (2003)）。ＩＦＥでは、増殖している表皮前駆細胞（ＥＰＣ）が基底細胞層に存在する。最終分化に傾倒すると、基底細胞は細胞周期を出て、続いて基底上細胞層に移動する。毛包もＩＦＥも生み出すことができる前駆体は毛包バルジにあるが、これらの細胞は正常な毛包間表皮の維持には何の役割も果たしていないように思われる（Tumbar, T. et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-363 (2004)、Morris, R. J. et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnol. 22, 411-417 (2004)、Levy, V., Lindon, C., Harfe, B. D. & Morgan, B. A. Distinct stem cell populations regenerate the follicle and interfollicular epidermis. Dev. Cell 9, 855-861 (2005)、Ito, M. et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nature Med. 11, 1351-1354 (2005)、Claudinot, S., Nicolas, M., Oshima, H., Rochat, A. & Barrandon, Y. Long-term renewal of hair follicles from clonogenic multipotent stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 14677-14682 (2005)）。標識保持研究によれば、ＩＦＥは、幹／ＴＡ細胞仮説に従って、トランジット増幅（ＴＡ）及び分化細胞のクローン単位を支持する幹細胞を表すと解釈されてきた緩徐サイクリング基底細胞を含有することが明らかにされている（Mackenzie, I. C. Relationship between mitosis and the ordered structure of the stratum corneum in mouse epidermis. Nature 226, 653-655 (1970)、Potten, C. S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet. 7, 77-88 (1974)）。しかし、これらの研究は、表皮恒常性中のＥＰＣ挙動の動力学を明らかにすることができない。増殖している細胞の運命を追跡する以前の遺伝子標識化研究では、表皮損傷を必要とするか、又は生じる標識クローンが少なすぎて量的分析ができない、のどちらかであった（Ghazizadeh, S. & Taichman, L. B. Multiple classes of stem cells in cutaneous epithelium: a lineage analysis of adult mouse skin. EMBO J. 20, 1215-1222 (2001)、Kameda, T. et al. Analysis of the cellular heterogeneity in the basal layer of mouse ear epidermis: an approach from partial decomposition in vitro and retroviral cell marking in vivo. Exp. Cell Res. 283, 167-183 (2003)、Ro, S. & Rannala, B. A stop-EGFP transgenic mouse to detect clonal cell lineages generated by mutation. EMBO Rep. 5, 914-920 (2004)、Ro, S. & Rannala, B. Evidence from the stop-EGFP mouse supports a niche-sharing model of epidermal proliferative units. Exp. Dermatol. 14, 838-843 (2005)）。
【０２１６】
表皮への適用
正常表皮でのＥＰＣ運命を追跡するために、誘導性遺伝子マーキングを使って、成体マウス中の細胞及びその子孫の試料を標識した。誘導性ＣＹＰ１Ａ１プロモーターから発現されるｃｒｅリコンビナーゼのtamoxifen調節変異体（ＡｈｃｒｅＥＲＴ）のトランスジェニック動物を、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）の条件付き対立遺伝子がＲｏｓａ２６遺伝子座に標的されているＲ２６ＥＹＦＰ／ＥＹＦＰレポーター株上に交雑させた（図１８ａ、（Srinivas, S. et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4 (2001)、Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32, e92 (2004)））。こうして得られたＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔヘテロ接合体では、ＥＹＦＰは、生後６〜９週間目にβＮＦ及びtamoxifenでの処理により誘導されるｃｒｅの一過性発現に続いて用量依存の形で発現される（図１８）。マウスのコホートは、誘導剤の１回投与後間隔をおいて分析用に選別した。ＥＹＦＰを発現している細胞及びその標識された子孫は、ホールマウント表皮の共焦点顕微鏡により検出した（Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-5255 (2003)）。誘導後２日目に、単独で標識された細胞のみが、基底層の６００細胞中１細胞の頻度で見られ、後の時点で遭遇する細胞のクラスターはクローンであり、それぞれが単一子孫細胞由来であることを示している（図１４ｂ）。それに続くマウスコホートの分析により、粘着性のままであり、サイズが進行的に拡大するクローンが実証された（図１４ｂ、図１９）。１つ又は複数の基底細胞を含有するクローンを点数化し、標識化後６週間までの観測されるクローンサイズ分布（すなわち、クローン当たりの有核細胞の総数）及び１年までの基底層クローンサイズ分布（方法を参照されたい）は図１５に示している。
【０２１７】
尾部表皮に少なくとも１個の基底層細胞を含有する標識クローンの密度は、ＥＹＦＰレベルがすべての標識細胞中で検出可能なレベルにまで蓄積するに従って、誘導後２日目から増加し、２週間目でピークに達した。次に、クローン数は３カ月までにピーク値の７±２％（平均値±標準偏差）まで、１年で３±２％まで低下し、類似の結果は背中の皮膚で見られた。この減少に伴って、基底上細胞のみを含有する多細胞クローンが出現し、分化を通じたクローン消失と一致していた（図２１）。ＩＦＥクローンの空間的分布の分析により、標識クローンは毛包から移動してくる非標識クローンで置き換えられていないことが示されている（図２２）。さらに、標識クローンはどれもバルジ幹細胞に由来することはできない、なぜならばこの領域は標識化されていないからである（図１８及び下）。
【０２１８】
クローン運命データを解釈しようと試みる前に、このデータが組織成長又はアポトーシスに影響を受けている程度を評価する必要がある。先ず、成長による表皮表面積の増加速度は低く（実験の時間経過にわたり月当たり３．５％未満と評価された）、アポトーシスは基底層細胞では検出不可能であった（下及び図２３を参照されたい）。さらに、単位面積当たりの基底層細胞の数、及び（Ｋｉ６７とｃｄｃ６免疫染色の両方で評価される）サイクリング細胞の割合は、２週間目と１年目の試料間に有意差をまったく示さなかった。サイクリング細胞の割合を評価する両技法は、フローサイトメトリー同様に、類似する結果を与え、すなわち、Ｋｉ６７で２２±３％（平均値±標準偏差）；ｃｄｃ６で２４±４％；及びフローサイトメトリーで２２±１％であった（図２４を参照されたい）（Williams, G. H. et al. Improved cervical smear assessment using antibodies against proteins that regulate DNA replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 14932-14937 (1998)、Birner, P. et al. Immunohistochemical detection of cell growth fraction in formalin-fixed and paraffin-embedded murine tissue. Am. J. Pathol. 158, 1991-1996 (2001)）。最後に、誘導後５日目でも１年目でも、標識細胞集団と非標識細胞集団間のサイクリング細胞の割合に有意差はなかった（下及び図１９を参照されたい）。したがって、誘導時に標識された基底層細胞は全基底細胞集団の典型であり、観測されたクローン進化は表皮恒常性における成体系を代表していると結論付けられる。
【０２１９】
幹／ＴＡ細胞仮説によれば、ＴＡ細胞は限定された回数の細胞分裂と、その後の分化を受ける（Potten, C. S. Cell replacement in epidermis (keratopoiesis) via discrete units of proliferation. Int. Rev. Cytol. 69, 271-318 (1981)）。この予測を試験するために、３週間目のクローンを試験し、そのうちの９０％を超えるクローンが誘導後１２週間までに消失する。重大なことに、３個以上の細胞を含むクローンが基底細胞も基底上細胞も含有しており、非同期の最終分化を示していた（図１６ａ）。さらに、２個の基底細胞からなるクローンの免疫染色により、１回の細胞分裂で１個のサイクリングと１個の非サイクリング娘細胞、又は２個のサイクリング娘細胞、又は２個の非サイクリング娘細胞のいずれかが生み出される可能性があることが明らかになっている（図１６ｂ）。これにより、ショウジョウバエ（Drosophila）末梢神経系及びゼブラフィッシュ網膜前駆体において記載されているような、基底面内には非対称細胞分裂が存在するかどうかという疑問が生じる（Das, T., Payer, B., Cayouette, M. & Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron 37, 597-609 (2003)、Gho, M. & Schweisguth, F. Frizzled signalling controls orientation of asymmetric sense organ precursor cell divisions in Drosophila. Nature 393, 178-181 (1998)）。ホールマウント表皮の三次元画像化によれば、有糸分裂紡錘体の３％のみが基底層に対して垂直になっていることが明らかにされ、胚性表皮とは対照的に、大多数のＥＰＣ分裂が２個の基底層細胞を生み出すことを示している（図２５、（Lechler, T. & Fuchs, E. Asymmetric cell divisions promote stratification and differentiation of mammalian skin. Nature 437, 275-280 (2005)、Smart, I. H. Variation in the plane of cell cleavage during the process of stratification in the mouse epidermis. Br. J. Dermatol. 82, 276-282 (1970)））。２個の基底細胞［ＥＤ：すなわち、２個の基底細胞＋基底上細胞ではなく、２個の基底細胞のみからなるクローン］からなるクローン中でのｎｕｍｂタンパク質の非対称分配（神経及び筋原前駆体における非対称分裂を特徴付ける）の観測により、平面配向非対称分裂も表皮では起きていることが示唆されている（図１６ｃ）（Zhong, W., Feder, J. N., Jiang, M. M., Jan, L. Y. & Jan, Y. N. Asymmetric localization of a mammalian numb homolog during mouse cortical neurogenesis. Neuron 17, 43-53 (1996)、Conboy, I. M. & Rando, T. A. The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis. Dev. Cell 3, 397-409 (2002)）。したがって、ＥＰＣ挙動は、他の系において関係する前駆体で観測される挙動とは大幅に異なっている（Smart, F. M. & Venkitaraman, A. R. Inhibition of interleukin 7 receptor signaling by antigen receptor assembly. J. Exp. Med. 191, 737-742 (2000)、Temple, S. & Raff, M. C. Clonal analysis of oligodendrocyte development in culture: evidence for a developmental clock that counts cell divisions. Cell 44, 773-779 (1986)）。
【０２２０】
次に、３カ月を超えて持続する長命細胞の挙動を検討した。幹／ＴＡ細胞仮説内で、表皮は単一自己複製幹細胞に支持された約１０個の基底細胞を含む表皮増殖単位に組織化されている（Potten, C. S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet. 7, 77-88 (1974)）。個々の幹細胞がその自己複製能力を保持していれば、幹／ＴＡ細胞モデルは、基底層クローンサイズ分布は必ず時間非依存になり、単一表皮増殖単位の特徴を示すことを予測する。そのような挙動は、表皮で観測される平均クローンサイズの進行的増加とは著しく対照的である（図１５）。
【０２２１】
この明らかな矛盾に直面しても、一般的パラダイム内にとどまりつつ、幹細胞／ＴＡ細胞モデルの修正を試みることができるであろう。これには、おそらく、幹細胞の加齢及び／又は移動の能力を導入することが含まれるであろう（Ro, S. & Rannala, B. Evidence from the stop-EGFP mouse supports a niche-sharing model of epidermal proliferative units. Exp. Dermatol. 14, 838-843 (2005)）。代わりに、実験データの範囲を有効に使って、表皮恒常性の新たなパラダイムの証拠を探求してみることができるであろう。興味深いことに、そのような証拠は、観測されるクローンサイズ分布のスケーリング特性に見出される。本明細書では、クローン運命データは、ｉｆｅが増殖細胞の１区画のみにより維持されるモデルに適合すると主張している。このモデルが幹／ＴＡ細胞仮説の極端な改良型であると見なすべきであるのか、新たな概念と見なすべきなのかは、ほぼ間違いなく意味論の問題であり、この点は後に取り上げることになる。
【０２２２】
スケーリング挙動を同定するために、標識前駆体細胞が、誘導後時間ｔでｎ個の基底層細胞を有するクローンに成長する確率を記述するクローンサイズ分布Ｐｎ（ｔ）を定義する。これから、「持続する」クローンの分布、すなわち、少なくとも１個の基底層細胞を含有する標識クローンの分布：
【０２２３】
【数１２】
2009529326.tif 000014
【０２２４】
を定義することができる。この定義で、開始トランジェント挙動後、観測されるクローンサイズ分布は、簡単なスケーリング方式：
【０２２５】
【数１３】
2009529326.tif 000015
（１）
【０２２６】
に適合することを明らかにしており、τはある一定の時間尺度を示している。この人目を引く観測から、長時間において、持続しているクローン中の基底層細胞の平均数は時間に対し直線的に増加すると推定され、これは長命サイクリング幹細胞の存在と一致しない挙動である。さらに重大なことに、スケーリングは、クローン進化の長時間特性は１つの特徴的時間スケールτのみにより決定付けられることを示しており、幹細胞エイジング又は皮膚損傷などの外的要因が重大な影響を及ぼさないクローン運命の単純なモデルに一致している。
【０２２７】
総合すると、実験観測結果のすべて及びスケーリング挙動は、１種類のみのＥＰＣ及びわずか３つの調節可能なパラメータ：すなわち増殖（標識Ａ−型）ＥＰＣの全体分裂速度λ；非対称な細胞分裂の割合（１−２ｒ）；並びに非増殖（Ｂ−型）細胞の基底層から基底上層への移行速度Γを含むクローン運命モデルと一致している（図１７ｂの模式図を参照されたい）。定常状態ＥＰＣ集団を維持するためには、対称的細胞分裂（Ａ→Ａ＋Ａ及びＡ→Ｂ＋Ｂ）速度はｒと同一であり等しくなければならない。最後に、基底層細胞密度は一定のままであるという観測結果は、追加の制約Γ＝λρ／（１−ρ）をもたらし、ρは基底層での増殖細胞の割合を示しており、調節可能なパラメータの数をわずか２つにまで減らしている。
【０２２８】
ＰｎＡ，ｎＢ（ｔ）を標識クローンが誘導後の時間ｔにｎＡ個のＡ−型及びｎＢ個のＢ−型ＥＰＣを含む確率と定義すると、その時間発展はマスター方程式：
【０２２９】
【数１４】
2009529326.tif 000016
【０２３０】
に支配され、初期条件
【０２３１】
【数１５】
2009529326.tif 000017
【０２３２】
に従う。この方程式の正確な分析的解は得られないが、時間ｔ＞１／ｒλにおいて系は漸近型に入り、そこでは、ｎ＝ｎＡ＋ｎＢと定義すると、持続するクローンの基底層クローンサイズ分布が、ｆ（ｘ）＝ｅ−ｘ及びτ＝ρ／ｒλを有する方程式（１）の観測されたスケーリング方式を獲得する、すなわち、クローン進化の長時間特性は対称的分裂速度ｒλにより決定されることを示してよい。増殖基底層細胞の区画に対する実験的に推測される値ρ＝０．２２と組み合わせると、データの漸近分布へのフィット（図１７a、挿入図）により週当たりｒλ＝０．０８８±０．００４が同定される。
【０２３３】
時間ｔ＜１／ｒλ≒１１週間において、基底層クローンサイズ分布の過渡的挙動が優勢になる。この型では、基底層クローンサイズ分布も全クローンサイズ分布も、対応するマスター方程式の数値積分法から決定することができる。漸近データ依存性からｒλを取ると、基底層クローンサイズ分布の実験データへの１パラメータフィットにより、ｒ＝０．０８で全１年時間経過にわたり良好な量的一致が得られる（図１５ｄ）、すなわち、ＥＰＣ分裂はλ＝週当たり１．１（以前の評価と一致する数字（Potten, C. S. Cell replacement in epidermis (keratopoiesis) via discrete units of proliferation. Int. Rev. Cytol. 69, 271-318 (1981)））の速度で起こり、分裂の８４％は非対称運命を生じるが、基底層からの細胞移行速度はΓ＝週当たり０．３１の速度で起こる。パラメータの同じ選択により、全クローンサイズ分布も実験との著しい量的一致を示している（図１５ｂ）。誘導に続く２週間にわたる標識クローンの緩徐な蓄積はモデルのフィットに対し重大な効果をもたらさないことは注目すべきである。
【０２３４】
結論として、本明細書に報告する全範囲のクローン運命データが、マウス尾部皮膚表皮の単一増殖細胞区画を含むモデルに適合していることを明らかにしてきた。
【０２３５】
クローンサイズの尺度としてのクローン直径の変化を使って、背中の皮膚における類似の分析を実施した。この部位で観測される細胞挙動は単一区画モデルと量的に一致している。幹細胞の小静止集団は、存在しても、我々の分析では検出不能と考えられるが、創傷治癒などの過程では高度に活性に富むと予測されると考えられることに注目してよい（Ito, M. et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nature Med. 11, 1351-1354 (2005)）。表皮恒常性の以前のモデルでは、限定数の分裂を受けるＴＡ細胞区画の存在が仮定されている。尾部表皮は、無制限数の分裂を受ける可能性がある前駆細胞の単一集団により維持されていることを我々は明らかにしている。
【０２３６】
実施例３の参考文献：
1. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation 14, 23-34 (1979).
2. Alonso, L. & Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100 (suppl. 1), 11830-11835 (2003).
3. Braun, K. M. & Watt, F. M. Epidermal label-retaining cells: background and recent applications. J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 9, 196-201 (2004).
4. Gambardella, L. & Barrandon, Y. The multifaceted adult epidermal stem cell. Curr. Opin. Cell Biol. 15, 771-777 (2003).
5. Tumbar, T. et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-363 (2004).
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7. Levy, V., Lindon, C., Harfe, B. D. & Morgan, B. A. Distinct stem cell populations regenerate the follicle and interfollicular epidermis. Dev. Cell 9, 855-861 (2005).
8. Ito, M. et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nature Med. 11, 1351-1354 (2005).
9. Claudinot, S., Nicolas, M., Oshima, H., Rochat, A. & Barrandon, Y. Long-term renewal of hair follicles from clonogenic multipotent stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 14677-14682 (2005).
10. Mackenzie, I. C. Relationship between mitosis and the ordered structure of the stratum corneum in mouse epidermis. Nature 226, 653-655 (1970).
11. Potten, C. S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet. 7, 77-88 (1974).
12. Ghazizadeh, S. & Taichman, L. B. Multiple classes of stem cells in cutaneous epithelium: a lineage analysis of adult mouse skin. EMBO J. 20, 1215-1222 (2001).
13. Kameda, T. et al. Analysis of the cellular heterogeneity in the basal layer of mouse ear epidermis: an approach from partial decomposition in vitro and retroviral cell marking in vivo. Exp. Cell Res. 283, 167-183 (2003).
14. Ro, S. & Rannala, B. A stop-EGFP transgenic mouse to detect clonal cell lineages generated by mutation. EMBO Rep. 5, 914-920 (2004).
15. Ro, S. & Rannala, B. Evidence from the stop-EGFP mouse supports a niche-sharing model of epidermal proliferative units. Exp. Dermatol. 14, 838-843 (2005).
16. Srinivas, S. et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4 (2001).
17. Kemp, R. et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32, e92 (2004).
18. Braun, K. M. et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development 130, 5241-5255 (2003).
19. Williams, G. H. et al. Improved cervical smear assessment using antibodies against proteins that regulate DNA replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 14932-14937 (1998).
20. Birner, P. et al. Immunohistochemical detection of cell growth fraction in formalin-fixed and paraffin-embedded murine tissue. Am. J. Pathol. 158, 1991-1996 (2001).
21. Potten, C. S. Cell replacement in epidermis (keratopoiesis) via discrete units of proliferation. Int. Rev. Cytol. 69, 271-318 (1981).
22. Das, T., Payer, B., Cayouette, M. & Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron 37, 597-609 (2003).
23. Gho, M. & Schweisguth, F. Frizzled signalling controls orientation of asymmetric sense organ precursor cell divisions in Drosophila. Nature 393, 178-181 (1998).
24. Lechler, T. & Fuchs, E. Asymmetric cell divisions promote stratification and differentiation of mammalian skin. Nature 437, 275-280 (2005).
25. Smart, I. H. Variation in the plane of cell cleavage during the process of stratification in the mouse epidermis. Br. J. Dermatol. 82, 276-282 (1970).
26. Zhong, W., Feder, J. N., Jiang, M. M., Jan, L. Y. & Jan, Y. N. Asymmetric localization of a mammalian numb homolog during mouse cortical neurogenesis. Neuron 17, 43-53 (1996).
27. Conboy, I.M. & Rando, T. A. The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis. Dev. Cell 3, 397-409 (2002).
28. Smart, F. M. & Venkitaraman, A. R. Inhibition of interleukin 7 receptor signaling by antigen receptor assembly. J. Exp. Med. 191, 737-742 (2000).
29. Temple, S. & Raff, M. C. Clonal analysis of oligodendrocyte development in culture: evidence for a developmental clock that counts cell divisions. Cell 44, 773-779 (1986).
【実施例４】
【０２３７】
異なる組織への適用及び追加の技法
表皮ホールマウント及び切片の分析：
尾部表皮。尾部表皮のパターン化組織により、２８２，０００±２３００μｍ２あり、４８７０±４００（平均値±標準偏差）基底層細胞を含有する毛包の隣接する列間に尾部ＩＦＥの単位面積を定義することができる（図２２ａ）。尾部ＩＦＥの単位面積当たりの標識クローンの平均数を、１００面積を計測した６カ月及び１２カ月目を除き、各時点で３マウスそれぞれで５０単位面積の共焦点画像化により検出するクローンすべてを計測することによって評価した。クローンサイズは、各時点で各マウスにおいて少なくとも１つの基底細胞を含有する少なくとも５０クローンのＺ  ｓｔａｃｋ共焦点画像化により決定した。６週間後、無核角化膜層細胞が標識クローンに現れ、全細胞数を計測することは不可能になり、したがって、クローン当たりの細胞の総数は６週間目まで計測したが、基底細胞の総数は１年目まで点数化することができたことに注目されたい。Ｋｉ６７陽性細胞の割合は、少なくとも３マウス由来の複数の分野で少なくとも１５００基底細胞を画像化することにより決定した。背中の皮膚表皮。６０μｍ凍結切片を光学切片法により分析した。クローン数を決定するために、３つの１０ｍｍ長の表皮中のクローンすべてを、３カ月まで時点のマウスごとに分析し、６カ月及び１２カ月時点で少なくとも５ｃｍの表皮をマウスごとに点数化した。基底細胞数として表される最大クローン直径を、各時点で３マウスそれぞれで少なくとも５０クローンに対して点数化した。
【０２３８】
アポトーシス。誘導後２日から、１週間、２週間、３週間、４週間及び６週間目の尾部表皮のホールマウントを抗開裂カスパーゼ３／Alexa Fluor488コンジュゲートで染色し、陽性カスパーゼ３染色は退行期毛包に限定した。追加実験では、ＤＡＰＩにより可視化される開裂カスパーゼ３及びアポトーシス小体の染色は、誘導後３週間及び６カ月目のマウス由来のホールマウントの基底層で試験した。陽性対照として、表皮ホールマウントに１６０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＣを照射し、３７℃で１６時間インキュベーション後に分析した。
【０２３９】
有糸分裂紡錘体配向の分析。ＤＡＰＩ染色尾部ＩＦＥのホールマウントを、均一強ＤＡＰＩ染色により明らかにされるように、凝縮した染色体を含有するすべての核のＺ  ｓｔａｃｋを獲得することにより分析した。画像は、上のように、三次元でレンダーリングし、中期から終期までのすべての有糸分裂像の紡錘体配向を記載の通りに点数化した（Das, T., Payer, B., Cayouette, M. & Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron 37, 597-609 (2003)）。
【０２４０】
ｃｒｅ発現の分析。誘導に続くｃｒｅＥＲｔｍＲＮＡレベルは、Trizol（Sigma社製）を使って尾部表皮から調製したＲＮＡの量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。使用したプライマーは、5'-CGTACTGACGGTGGGAGAAT及び5'-CCCGGCAAAACAGGTAGTTAであり、その産物はSyBr Greenを使って検出した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡは、Taqman probe（Applied Biosystems社製）で測定した。
【０２４１】
フローサイトメトリー。単細胞浮遊液は、DispaseII（Roche社製）での３０分インキュベーションを使い、それに続くトリプシンＥＤＴＡでの消化により尾部表皮から調製した。この方法は、毛包間表皮を真皮及び下部毛包から分離する。ビオチンコンジュゲート抗β１インテグリン抗体（BD Biosciences/Pharmingen社製）及びAlexa488-streptavidin（Molecular Probes社製）で染色後、試料はパラホルムアルデヒドで固定し、１００μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ及び５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む０．１％サポニンで透過処理し、細胞ダブレットを排除するためにＰＩチャネルパルス面積／幅ゲーティングを使って、BD Facscaliburフローサイトメーター上で分析した。
【０２４２】
ＡｈｃｒｅＥＲｔ誘導ＥＹＦＰ発現の特徴付け
標識化が起こると考えられる間隔を決定するために、誘導に続くｃｒｅＥＲｔ発現の持続時間を決定することが重要であった。マウスをβＮＦ及びtamoxifenの１回注射で誘導し、尾部皮膚表皮におけるｃｒｅＥＲｔｍＲＮＡのレベルを、ベースラインで並びに誘導後２４時間及び４８時間目でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。ｃｒｅＥＲｔ転写物は２４時間で増加するが、４８時間までに背景レベルに戻る（図１８ｂ）。
【０２４３】
次に、標識細胞の位置を評価した。誘導後、標識化は毛包間表皮、皮脂腺及び上部毛包において単細胞で検出した。１年目に標識クローンを含有する２８７０の毛包のうち、すべてのクローンが上部毛包に限定されており、バルジ又は下部毛包では決してＥＹＦＰは検出されなかった（図１８ｄ、ｅ及びデータは示していない）。毛包バルジにおける多分化能幹細胞の局在化を考慮するとこれは重大である（Morris, R. J. et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 22, 411-7 (2004)、Tumbar, T. et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-63 (2004)）。
【０２４４】
ＥＹＦＰプロモーターの用量反応性も分析した。マウスは、βＮＦ及びtamoxifenの最大耐量まで誘導した。５日後に分析した表皮における標識化レベルは、１回誘導注射と比較すると劇的に増加していたが、低用量での標識と同じ表皮及び毛包の領域に限定されていた（図１８ｅ）。さらに、サイズが３０細胞を超える基底細胞のパッチの集密標識化が検出された（図１８ｆ）。
【０２４５】
誘導剤の不在の下では組換え背景速度が存在するかどうかも調査した。共焦点顕微鏡でもフローサイトメトリーでも、生後１５カ月の非誘導動物の尾部ホールマウントではＥＹＦＰ発現はまったく検出することができなかった。
【０２４６】
標識及び非標識細胞における増殖
標識クローンが全基底細胞を代表するかという問題にさらに取り組むために、５日間毎日βＮＦ及びtamoxifen注射を施し、最初の注射後１０日目に分析した最大誘導マウスにおける増殖細胞の割合を決定した（図１８ｅ、ｆ及びデータは示していない）。標識及び非標識細胞集団におけるＫｉ６７陽性細胞の割合は、それぞれ２２±２．５％（平均値±標準偏差）及び２２±１％であった。
【０２４７】
Ｋｉ６７陽性基底細胞の割合は、βＮＦ及びtamoxifenの１回投与による誘導後１年目の、標識クローン（２０±４％、平均値±標準偏差）及び隣接非標識表皮（２０±５％）でも同じであった（図１９）。
【０２４８】
総合すると、このデータは、標識クローン内に含有される細胞は初期時点でも後期時点でも全ＥＰＣを代表していることを示している（データは示していない）。
【０２４９】
クローンを含有する基底細胞の分化
実験の最初の１２週間にわたり基底細胞を含有するクローンの急速消失は、クローン中の全基底細胞の分化による可能性があり、完全に基底上細胞からなる多細胞クローンが生じると推測された。これが事実であるかどうかを調査するために、誘導後２日目、並びに２、３、６及び１２週間目に表皮ホールマウントを試験し、多細胞クローンを計測した。基底上細胞のみからなるクローンの割合は３週間目にピークまで増加し、１２週間までに低レベルに低下した（図２１）。これは、分化し基底層を離れる基底細胞を含有するクローンと一致しており、続いて基底上細胞のみを含有するクローンが脱落により消失する。
【０２５０】
表皮表面積の加齢に伴う拡大
尾部表皮における年齢と表皮表面積の関係を決定するために、尾部長及び直径（その底部から２ｃｍで）を、ＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔマウス又は生後６週間から８．５カ月の動物中の同一ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ６背景のマウスで測定した（図２３）。どちらの場合も、実験の時間経過にわたり、加齢に伴う尾部長に重大な変化はなかった。オスのマウスでもメスのマウスでも、尾部直径ｄは、
オスで、ｄ（ｔ）＝２９ｍｍ＋（ｔ／月）×１．０ｍｍ（Ｒ２＝０．９１、ｎ＝２９）
及び
メスで、ｄ（ｔ）＝３０ｍｍ＋（ｔ／月）×０．５ｍｍ（Ｒ２＝０．９０、ｎ＝３２）
のように加齢と共に直線的に変化した。
【０２５１】
尾部長は一定なので、尾部の表面積は、オスで３％／月及びメスで２％／月で増加している直径に比例して変化しているに違いない。そのような成長速度は、観測されるクローンサイズ分布に重大な影響を及ぼすことはないと考えられる。
【０２５２】
加齢に伴う体表面の増加を評価するために、同一グループの動物で体重を測定した（図２３）。成体マウスでは、体重Ｍは、データを、
オスで、Ｍ＝１４．７ｇ＋ｌｎ（ｔ／月）×７．８ｇ（Ｒ２＝０．９８、ｎ＝２９）
及び
メスで、Ｍ＝１３．２ｇ＋ｌｎ（ｔ／月）×１４．６ｇ（Ｒ２＝０．９１、ｎ＝３２）
にフィットさせると年齢と共に対数的にスケールすることがわかった。
【０２５３】
体重はマウスの体積と比例すると仮定すると、表面積は必ずＭ２／３に比例してスケールする。したがって、６週間から１年まで（すなわち、実験の全時間経過にわたって）、マウスの身体の表面積は、オスでほぼ５０％及びメスでほぼ８８％増加する。そのような効果は標識背中の皮膚クローンの質的挙動に重大な影響を及ぼすことはないと考えられるが、背中の皮膚におけるクローンサイズ分布の長時間特性の詳細な量的分析に影響を及ぼす可能性があると考えられる。背中の皮膚データに量的モデル化を適用する場合には、これらの要因を念頭に置いておく方がよい。
【０２５４】
毛包間表皮におけるアポトーシスの頻度
毛包間表皮の基底層におけるアポトーシスの頻度を決定するために、ＤＡＰＩ染色及びカスパーゼ３の発現により、アポトーシス小体に対して導入後３週間及び６カ月目に表皮を試験した。それぞれが４８７０±４００（平均値±標準偏差）細胞を含有する１０単位面積における基底層（図２３を参照されたい）を開裂カスパーゼ３染色に対して試験し、陽性細胞は見つからなかった。１３，０００を超えるＤＡＰＩ染色細胞を、アポトーシス小体の証拠を求めて試験し、まったく見つからなかった（図２３及び表Ｓ１）。これとは対照的に、開裂 カスパーゼ ３染色及びアポトーシス小体は、１２０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＣ照射後１６時間で試験した陽性対照ホールマウントに広範囲に存在していた。
【０２５５】
これらの結果は、Ｃ５７Ｂ１６マウスの表皮におけるアポトーシス細胞の頻度は０．０２％であるという以前の報告と一致しているが、この数字には基底及び基底上層細胞を含んでいる（Lu, Y. P., Lou, Y. R., Peng, Q. Y., Xie, J. G. & Conney, A. H. Stimulatory effect of topical application of caffeine on UVB-induced apoptosis in the epidermis of p53 and Bax knockout mice. Cancer Res 64, 5020-7 (2004)）。アポトーシス細胞のクリアランス速度は、ＵＶＢ照射に続く６〜８時間の間である。基底層のアポトーシス細胞は同一速度で取り除かれると仮定したら、正常表皮の基底層でのアポトーシス速度は、開裂カスパーゼ３陽性細胞で百万／日当たり６０細胞未満、及びアポトーシス小体で百万／日当たり２００細胞未満であると結論付けてよい。１年の時間経過にわたって、これは、開裂 カスパーゼ ３陽性細胞では基底層細胞の３％未満、及びアポトーシス小体では１０％のアポトーシスによる予測される磨滅と翻訳される。そのような効果は、観測されるクローンサイズ分布に重大な影響を及ぼすことはないと考えられ、尾部皮膚データで観測される平均クローンサイズの強力な増加の規模を説明することができないと考えられる。
【０２５６】
実施例４の参考文献：
1. Morris, R. J. et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 22, 411-7 (2004).
2. Tumbar, T. et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-63 (2004).
3. Lu, Y. P., Lou, Y. R., Peng, Q. Y., Xie, J. G. & Conney, A. H. Stimulatory effect of topical application of caffeine on UVB-induced apoptosis in the epidermis of p53 and Bax knockout mice. Cancer Res 64, 5020-7 (2004).
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】表皮の組織を示している。毛包は、下部毛包（ｌｆ）、脂腺（ｓｇ）上部毛包（ｕｆ）及び毛包間表皮（ＩＦＥ）を生じるポテンシャルのあるバルジ（ｂ）に位置する幹細胞を含有している。挿入図は、幹細胞（Ｓ）、トランジット増幅（ＴＡ）細胞、及び分化するにしたがって基底層から移動する（矢印）分裂終了基底細胞を含む以前のモデルでのＩＦＥの推定される組織を示している。
【図２】誘導後２日目から５０週間目までのＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔマウスにおける単位面積当たりの標識クローンの数を示している。
【図３】誘導後２日目から６週間目までの標識クローンにおけるクローン当たりの細胞（基底細胞と基底上細胞の両方）の総数を示している。エラーバーは、表皮前駆細胞のインビボクローン標識化により決定される平均値の標準誤差を示している。
【図４】誘導後２日目から１年目までの標識クローンにおけるクローン当たりの基底細胞の数を示している。レジェンドに示される細胞数を含有するクローンの割合が示されており、エラーバーは平均値の標準誤差を示している。
【図５】誘導後１年にわたり２個以上の細胞を含有する標識クローンに対してクローン当たりの基底細胞の分布を示している。エラーバー（平均値の標準誤差）の付いたポイントは観測結果であり、曲線はＥＰＣ挙動の予測である。
【図６】誘導に続く６週間にわたるクローンサイズの分布（クローン当たりの全細胞）を示している。エラーバー（平均値の標準誤差）の付いたポイントは観測結果であり、曲線は示されているサイズのクローンの割合を生じるＥＰＣの予測値である。
【図７】ＥＰＣ運命の概略を示している。ＥＰＣ細胞分裂は２個のサイクリング細胞（明）、分裂終了基底細胞（暗）及びサイクリング細胞、又は２個の分裂終了細胞のいずれかを、示される頻度で及び１回／週の平均細胞分裂速度で生み出す。
【図８】レチノイド処理の効果を示している。対照及びＡＴＲＡ処理動物における６カ月目のクローンサイズ分布はプロトコル１に従って誘導し処理し、エラーバーは平均値の標準誤差を示している。暗及び明ポイントは、それぞれ対照及びＡＴＲＡ処理マウスのモデル予測を示している。
【図９】遍在性Ｒｏｓａ２６プロモーターに標的されたＬｏｘＰ配列（三角形）が隣接する「停止」カセット（暗部）を含有する条件的ＥＹＦＰ（黄色）発現構築物を有するＲ２６ＥＹＦＰ／ＥＹＦＰマウスを、Ａｈプロモーターを誘導するβナフトフラボン（βＮＦ）での処理に続いて変異エストロゲンレセプター（ｃｒｅＥＲＴ）に融合したｃｒｅリコンビナーゼを発現するＡｈｃｒｅＥＲＴトランスジェニック系統と交雑させる様子を示す。Tamoxifenの存在の下で、ｃｒｅＥＲＴは、組換え細胞及びその子孫においてＥＹＦＰ発現をもたらす停止カセットの切除を媒介する。
【図１０】凍結切片の共焦点分析により決定される背中の皮膚クローンにおけるクローン密度を示している。クローン直径は基底細胞の数として表される。エラーバーは平均値の標準誤差を示している。
【図１１】凍結切片の共焦点分析により決定される背中の皮膚クローンにおけるクローンサイズを示している。クローン直径は基底細胞の数として表される。エラーバーは平均値の標準誤差を示している。
【図１２】ＤＡＰＩ染色表皮ホールマウントの共焦点顕微鏡により決定される、正常表皮における基底層に対する有糸分裂の配向を示している。左端のパネルは平面有糸分裂、中央パネルは傾斜有糸分裂、及び右端パネルは垂直有糸分裂。
【図１３】ＤＡＰＩ染色表皮ホールマウントの共焦点顕微鏡により決定される、３カ月のＡＴＲＡ処理後の基底層に対する有糸分裂の配向を示している。左端のパネルは平面有糸分裂、中央パネルは傾斜有糸分裂、及び右端パネルは垂直有糸分裂。
【図１４】表皮前駆細胞のインビボクローン標識化を示している。ａ、表皮の組織。毛包は、下部毛包（ｌｆ）、脂腺（ｓｇ、オレンジ色）上部毛包（ｕｆ）及び毛包間表皮（ＩＦＥ、ベージュ色）を生じるポテンシャルのあるバルジ（ｂ、緑色）に位置する幹細胞を含有している。模式図は、ＩＦＥにおけるケラチノサイトの組織である（幹／ＴＡ細胞仮説により提唱される）。基底層は、幹細胞（Ｓ、青色）、トランジット増幅細胞（ＴＡ、暗緑色）、及び分化するにしたがって基底層から移動する（矢印）分裂終了基底細胞（赤色）を含む。ｂ、誘導に続いて示されている時点での基底表面から見たＡｈｃｒｅＥＲＴＲ２６ＥＹＦＰ／ｗｔマウス由来のＩＦＥホールマウントの投影されたＺ−ｓｔａｃｋ共焦点画像。黄色、ＥＹＦＰ；青色、ＤＡＰＩ核染色。スケールバー、２０μｍ。
【図１５】クローン運命データを示している。ａ、誘導後２日目、１、２、３、４及び６週間目に測定された、細胞数の関数としてのクローンサイズの分布（クローン当たりの全細胞）（エラーバーは平均値の標準誤差を示している）。ｂ、ｄ、細胞数の異なる値に対する時間の関数としてのクローンサイズの分布（クローン当たりの全細胞）（ｂ）及びクローン当たりの基底細胞（ｄ）（エラーバーは平均値の標準誤差を示している）。本明細書では、凝集クローンサイズは２の羃乗でサイズが増加する範囲である（図内のレジェンドを参照されたい）。好ましい実施形態では、標識化効率により起こりうる多義性を有利に除去するために、単細胞クローンは分布から除去し、それによって誘導時に標識された分裂終了細胞の集団を取り除く。我々は、ＥＹＦＰレベルが安定化している、すなわち標識化後の開始過渡期の後の誘導後２週間又はそれ以降の時点に集中している。連続曲線は、細胞分裂速度がλ＝週当たり１．１及び対称分裂率がｒ＝０．０８である提唱されている１前駆体細胞モデルの挙動を示している（詳細は本文を参照されたい）。ｃ、誘導後の２日目、１、２、３、４及び６週間目、３、６、１２カ月目に測定した、基底細胞数の関数としてのクローン当たりの基底細胞の分布（エラーバーは平均値の標準誤差を示している）。
【図１６】表皮前駆体における非対称細胞運命を示している。ａ、非同期的最終分化を示す３細胞クローンの可視化。投影されたＺ−ｓｔａｃｋ画像は、１基底細胞（ｂ）、及び２基底上細胞；角膜化層細胞（ｃ）、及び矢じりによって示される第２の基底上細胞を示している。略画は視野角度を示している。上パネル：ＥＹＦＰ、黄色及びＤＡＰＩ、青色；下パネルは示されるＥＹＦＰのみでの対応する画像である。スケールバー、２０μｍ。ｂ、単回分裂の娘細胞の異なる増殖運命を示す２細胞クローン（両方とも基底細胞、組換え後３週間目）の可視化で、対称及び非対称細胞運命の証拠を提供している。基底表皮表面から、増殖マーカーＫｉ６７（赤色）、ＤＡＰＩ（青色）、及びＥＹＦＰ（黄色）を染色されているクローンを見ている。矢じりはＥＹＦＰ標識細胞の位置を示している。Ｋｉ６７陽性細胞が２個、１個、及び０個の３種類のクローンが示されている。スケールバー、１０μｍ。ｃ、増殖マーカーＫｉ６７（青色）、ｎｕｍｂ（赤色）及びＥＹＦＰ（黄色）を染色された２細胞クローン（両方とも基底細胞、組換え後３週間目、基底表皮表面から見ている）であり、ｎｕｍｂの非対称分布を示しており、平面分裂から生じる非対称細胞運命の証拠を提供している。スケールバー、５μｍ。
【図１７】表皮前駆細胞運命のスケーリング及びモデルを示している。ａ、基底層クローンサイズ分布（キーは図１５ｄレジェンドを参照されたい）を、リスケールした時間座標ｔ／ｎ（ｎは各分布の上限として取られ、例えば、レンジ３から４ではｎ＝４、など）に対して再プロットする。長時点（＞６週間）では、ｎの異なる値に対するデータセットは単一曲線（破線）に収束する、すなわち、誘導後の時間ｔにおいてレンジｎ／２からｎまでの基底細胞数を有する標識クローンを見出す確率は、時間２ｔにおいてレンジｎから２ｎまでのサイズを有するクローンを見出す確率に等しいことに我々は注目している。より短い時間スケールでは、過渡的挙動が単一スケーリングからの逸脱をもたらす分布を支配している。この過渡的挙動は１前駆細胞区画モデルにより非常によく記述される（図１２の説明文及び主文を参照されたい）。方程式（１）を利用すれば、グループ別データに対する普遍的スケーリング曲線を、
【数１６】
2009529326.tif 000018
として同定することができ、τ＝ρ／ｒλ、すなわち、Ｇｎ（ｔ／ｎ）はｎとは独立している。したがって、長時間（＞１３週間）及び大ｎ（＞４）でｔ／ｎ（挿入図）に対してＺｎ（ｔ）＝１／（２ｌｎ［１−（１−Ｇｎ（ｔ）１／２）／２］）をプロットすることにより、得られる斜線を使って−１／τを推測してよい。ｂ、表皮恒常性の単一前駆体区画モデル。無制限の自己複製ポテンシャル（中黒矢印）を有する単一集団のＥＰＣ（緑色三角形）が表皮を維持している。基底層の分裂終了細胞（明赤色）は定常速度で基底上区画（暗赤色）に移行する。モデルは、定常状態では幹細胞（青色）に対する役割を何も提唱していないが、静止状態集団は損傷に続く再生における成長では役割を果たしている可能性がある（中白矢印）。左手四角形はＥＰＣの増殖特性を示している。右手四角形は基底分裂終了細胞の基底上層への移行を示している（暗赤色）。総合すると、それぞれの速度を有するこれらの過程は、本文で取り上げた恒常性の１区画モデルを要約している。
【図１８】実験的設計及びプロモーター特徴付けを示している。（ａ）Ｒ２６  ＥＹＦＰ／ＥＹＦＰマウス；tamoxifenの存在の下では、ｃｒｅＥＲＴはｓｔｏｐカセットの切除を媒介し、ＥＹＦＰは組換え細胞及びその子孫において発現される。（ｂ）表皮におけるｃｒｅＥＲＴの調節；ベータＮＦの１回投与後；バーは標準偏差。（ｃ）（ｄ）（ｅ）尾部表皮のホールマウント、バーは２０μｍ。
【図１９】後期時点でのクローンの構造を示している。（ａ）Ｚ−ｓｔａｃｋの再構築、６カ月目のクローン、青色ＤＡＰＩ、黄色ＥＹＦＰ、バー２０μｍ；（ｂ）１２カ月目のクローン、赤色Ｋｉ６７、バー２０μｍ。
【図２０】背中皮膚表皮の分析を示している；（ａ）共焦点分析による基底細胞数としてのクローン直径；バーは標準誤差；（ｂ）誘導後１年目の１０基底細胞の直径の典型的クローン、バー１０μｍ；黄色ＥＹＦＰ；青色ＤＡＰＩ。
【図２１】完全に基底上細胞からなる多細胞クローンの分析を示しており；（ａ）２細胞クローン；上と同じ色；バー１０μｍ（ｂ）誘導後の所与の時点での多細胞クローンの総数の割合としての基底上細胞のみの多細胞クローンの割合；バーは標準誤差。
【図２２】誘導に続く１年間にわたる尾部ＩＦＥにおける標識クローンの分布を示している；（ａ）クローン分布の分析のために尾部ＩＦＥの単位面積を定義する。クローン分布の分析のために、示すようにそれぞれが３領域に分割された、バー２００μｍ。（ｂ）各時点での３領域における標識ＩＦＥクローンの平均割合；バーは標準誤差。
【図２３】ＩＦＥの基底層におけるアポトーシスの頻度を示しており、表Ｓ１も示している。（ａ）〜（ｃ）表皮成長（尾部の基底から２ｃｍでの尾部直径の変化）；（ａ）尾部長（ｂ）体重（ｃ）年齢、バーは標準偏差。（ｄ）及び（ｅ）；アポトーシスの頻度；（ｄ）誘導後３週間目からの基底層ＩＦＥの画像；（ｅ）対照；１２０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＣでの照射後１６時間固定した。青色ＤＡＰＩ、緑色開裂カスパーゼ３；矢印はアポトーシス小体。表Ｓ１は、誘導後３週間目及び６カ月目での、ＩＦＥにおける基底細胞当たりアポトーシス小体又は開裂カスパーゼ３の存在によるアポトーシスの頻度を示している。
【図２４】ＩＦＥにおけるサイクリング細胞の割合を示している；（ａ）及び（ｂ）フローサイトメトリーにより評価されるベータ１インテグリン陽性ケラチノサイトのＤＮＡ含有量；バーは陽性細胞のゲートである；（ｂ）ベータ１インテグリン発現細胞のヨウ化プロピジウムを示している。バーは、＞２ｎ  ＤＮＡの細胞を定義するゲートである（この実験では２１％）。
【図２５】（ａ）〜（ｂ）ＤＡＰＩ染色表皮ホールマウントの共焦点顕微鏡により決定される、基底層に対する有糸分裂の配向を示している；（ｃ）ＤＡＰＩ（青色）及び抗チューブリン（緑色）での二重染色を示している；密接に関連するＤＡＰＩとチューブリンにより評価される配向；バーは２μｍ。
【０２５８】
（参考文献）
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配列表
プライマー
5'-CGTACTGACGGTGGGAGAAT
5'-CCCGGCAAAACAGGTAGTTA
【図１】
2009529326.tif 000021
【図２】
2009529326.tif 000022
【図３】
2009529326.tif 000023
【図４】
2009529326.tif 000024
【図５】
2009529326.tif 000025
【図６】
2009529326.tif 000026
【図７】
2009529326.tif 000027
【図８】
2009529326.tif 000028
【図９】
2009529326.tif 000029
【図１０】
2009529326.tif 000030
【図１１】
2009529326.tif 000031
【図１２】
2009529326.tif 000032
【図１３】
2009529326.tif 000033
【図１４】
2009529326.tif 000034
【図１５】
2009529326.tif 000035
【図１６】
2009529326.tif 000036
【図１７】
2009529326.tif 000037
【図１８】
2009529326.tif 000038
【図１９】
2009529326.tif 000039
【図２０】
2009529326.tif 000040
【図２１】
2009529326.tif 000041
【図２２】
2009529326.tif 000042
【図２３】
2009529326.tif 000043
【図２４】
2009529326.tif 000044
【図２５】
2009529326.tif 000045
【国際調査報告】
2009529326.tif 000046
2009529326.tif 000047
2009529326.tif 000048
2009529326.tif 000049