(57)【要約】液相の解離速度を決定する分析形式を使用して、高親和性分子間相互作用の速度定数を測定する方法が提供される。本発明は、結合リガンド対遊離リガンドの比率を推定するために、選択された時間間隔でサンプル溶液に接触するバイオセンサを使用する。本発明の方法に従って決定される解離速度定数は、インビボ結合定数を非常によく模倣し、固相装置を使用して行なわれる測定に伴って起こる拡散障壁のアーチファクトを回避する。本発明の方法は、バイオセンサ機器での連続測定を必要としないので、かかる機器を他のサンプルの処理に利用可能にしておくというさらなる長所を提供する。本方法は、解離が数時間から数日またはそれ以上の間隔にわたって徐々に起こる反応の解離速度の正確な測定を可能にする。
2009529656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応の特性を評価する方法であって、
総濃度での受容体［Ｒ］と、総濃度でのリガンドの第１型［Ｌ＊］とを含む、実質的に平衡化された溶液を提供するステップと、
前記溶液に総濃度での前記リガンドの第２型［Ｌ］を追加するステップと、
固相結合分析において、前記リガンドの前記第２型を追加したステップ後の第１の時間での、前記リガンドの前記第１型の前記固相への結合から生じるシグナルを決定するステップと
を備え、前記リガンドの前記第１型は特異的に前記固相に結合し、前記リガンドの前記第２型は特異的に前記固相に結合しないことを特徴とする方法。
【請求項２】
［Ｌ＊］＜［Ｒ］＜［Ｌ］である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドの前記第２型の前記追加ステップに先立って、前記リガンドの実質的にすべての前記第１型が前記受容体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の固相結合分析において、前記リガンドの前記第１型の、前記固相への前記結合から生じる複数のシグナルを決定するステップをさらに含み、前記シグナルは、前記リガンドの前記第２型の追加ステップ後に複数の時間で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナルのうちの少なくとも２つのシグナルが互いに異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも５時間だけ互いに異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも１０時間だけ互いに異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも２０時間だけ互いに異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも１００時間だけ互いに異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の固相結合分析が、前記溶液を収容する単一容器中で行なわれる、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の固相結合分析において決定された前記複数のシグナルから、解離速度定数を計算するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の固相結合分析において決定された前記複数のシグナルから、遊離Ｌ＊に結合した比率または前記比率の逆数を計算するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相結合分析が非破壊である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固相結合分析がファイバーに基づく分析である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ファイバーに基づく分析が干渉法シグナルを生成するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固相結合分析が表面プラズモン共鳴に基づく分析である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高親和性分子反応の特性評価にとって有用な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用モノクローナル抗体を製造する多くのバイオテクノロジー企業の目標は、生物学的標的に対する高親和性結合を備えた抗体を作製することである。大部分の治療抗体は、ナノモルレンジの結合定数を有しており、多くの研究は、ピコモルレンジに近づくように親和性の改善に取り組んでいる。結合反応の反応速度測定またはリアルタイム測定を行なうことができる機器（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．から入手可能なエタロンファイバーに基づくシステム、およびＢｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．. から入手可能な表面プラズモン共鳴に基づく機器）は、結合の会合相および解離相の両方の速度定数を確立するために使用できることから、平衡状態に基づく結合測定を上回る利点を提供するので、二分子相互作用の測定に有利である。したがって、速度論に基づく特性評価は、抗体および受容体の結合反応のような生体反応についての親和性を決定する好ましい代表的な方法である。しかし、高親和性抗体に関する反応のような高親和性反応は、これらの方法にとって障害となる。結合の解離相は、（ナノモル解離定数（ＫD）での）数時間から（ピコモル解離定数（ＫD）での）数日にわたることがある。解離速度測定のために、結合複合体は通常、成分の１つが固定され、他の成分が、固定された成分に結合することにより、センシング表面上に形成される。考察を容易にするために、本発明者は抗体結合反応に焦点を合わせるが、ここで説明を行って請求する方法の原理および実施は、他の生体分子に関する結合反応を含む任意の結合反応に関連する。抗体結合親和性測定では、通常、抗原はセンシング表面上に固定される。次に、その表面は、対象となる抗体を含む溶液にさらされ、結合が進行する。一旦結合が起こると、センシング表面は緩衝液（すなわち最初は遊離抗体がない緩衝液）にさらされ、解離速度はリアルタイムで継続的にモニターされる。高親和性抗体に必要とされる数時間から数日間にわたる解離の継続的なモニターは、結果的に機器を占領し、サンプル処理量を制限することになる。
【０００３】
速度測定を妨げ、誤った結果へ導くベースライン変動を最小限に抑えるため、長期間の解離速度測定では、機器類に追加の性能が必要になる。ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．およびＢｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ. が販売するような固相機器において、固相は、見かけ上の解離速度に潜在的に影響を与える拡散障壁を提供する。抗体が抗原から解離するにつれて、固相では抗体を抗原に接近させたまま保持し、抗体の拡散を制限するので、表面上で抗体が抗原に再結合する可能性が増加する。センシング表面上での抗体の再結合は、誤って見かけ上の遅い解離速度定数を導く可能性がある。したがって、結合反応特性の評価方法に対する改善が、当技術分野において必要である。本発明は、従来技術のこれらの欠点および他の欠点に対する解決法を提供する。
【発明の開示】
【０００４】
結合反応の特性評価のための方法および組成物を、本明細書において開示する。本方法は、ナノモルレンジからピコモルレンジでの解離定数により特性評価される反応に対する独特な用途がある。一態様において、本発明の方法は、溶液中の受容体、およびリガンドの第１型を提供すること、受容体およびリガンドが実質的に結合平衡状態に達するまで待機すること、溶液にリガンドの第２型を追加すること、固相結合分析においてリガンドの第１型の固相に対する結合から生じるシグナルを決定することを含む。別の態様において、リガンドの第１型は固相に対して特異的に結合し、リガンドの第２型は特異的に結合しない。さらに別の態様において、リガンドの第１型は実質的にすべて、リガンドの第２型の追加に先立って受容体に結合される。なお別の態様では複数の固相結合分析が行なわれ、リガンドの第２型を追加した後に、シグナルは複数の回数で決定される。別の態様において、少なくとも２つの時間は、少なくとも５時間、または少なくとも１０時間、または少なくとも２０時間、または少なくとも１００時間で互いに異なる。別の態様において、少なくとも２つの決定されたシグナルは互いに異なる。なお別の態様において、本方法は解離速度定数の計算を含む。さらに別の態様において、本方法は、決定されたシグナルからの、遊離したリガンドの第１型に対して結合したリガンドの第１型の比率またはその比率の逆数の計算を含む。なお別の態様において、複数の固相結合分析は同一の容器において行なわれる。さらに別の態様において、固相結合分析はサンプル非破壊である。別の態様において、固相結合分析はファイバーに基づく分析である。なお別の態様において、ファイバーに基づく分析は干渉法シグナルを生成することを含む。別の態様において、固相結合分析は表面プラズモン共鳴に基づく分析である。
【０００５】
例示の実施形態は、エタロンファイバーに基づく機器または表面プラズモン共鳴に基づく機器を使用して実行される分析を含む。
【０００６】
本発明の変形において、反応は抗体および抗原を伴う。別の変形において、リガンドの２つの型は、固相に対して特異的に結合するタグを含むか否かにより異なる。好ましい実施形態において、タグはビオチンであり、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを含む。
【０００７】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、以下の説明および添付図面に関連して一層よく理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
利点および有用性
簡潔に言えば、本明細書で以下詳細に説明するのは結合反応の特性を評価する方法である。
【０００９】
現行アプローチのいくつかの特徴を示す。第１に、本発明の方法は、計測変動、サンプルの蒸発、および拡散のアーチファクトを含め、誤差源を減らすことにより、解離速度定数推定の正確性を改善する。本発明の方法は、単一サンプルに対する多数回の測定を可能にする。ファイバーに基づく分析を使用する好ましい実施形態では、多数回の測定は非常に小さい体積を用いて行われるので、サンプル材料を節約できる。
【００１０】
本アプローチの利点は多数あるが、それには、サンプル保存、パラメータ推定の正確性の改善、および単一機器を使用した測定処理量の劇的な増加が含まれる。
【００１１】
本発明は、化学反応の解離速度の推定に有用であり、（例えば、ナノモルレンジからピコモルレンジまたはそれ以下のレンジの解離定数を有する）高い親和性によって化学反応が特性評価されるとき、および解離が数時間から数日またはそれ以上の間隔にわたるような、解離速度が十分に遅い場合に、特定の有用性を与える。
定  義
【００１２】
特に定めのない限り、請求項および明細書で使用する用語を、以下の通り定義する。
【００１３】
「固相結合分析」は、反応物の少なくとも１つの成分が支持基板に貼り付けられる結合反応である。例示の固相結合分析としては、カリフォルニア州メンロパーク市のＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｃｔｅｔ（商標）を使用して行うエタロンファイバーを使用した分析、または、スウェーデン・ウプサラのＢｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ. から入手可能な表面プラズモン共鳴機器を使用した分析がある。
【００１４】
「特異的結合反応」は、飽和可能であることを示す反応、および標識成分の結合がその成分の未標識型の過剰量と競合する反応である。
【００１５】
「非破壊分析」は、サンプルを実質的に消費せずにサンプルからの測定が可能な分析である。したがって非破壊分析は、単一サンプルから反復測定値を得られる方法である。
【００１６】
「ファイバーに基づく分析」は、グラスファイバーのようなファイバーに起こる反応から測定値が得られる分析である。
【００１７】
「干渉法シグナル」は、電磁放射線中の干渉から生じるシグナルである。
【００１８】
「抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する全長免疫グロブリン分子として定義され、重鎖および軽鎖の可変領域の接触面で抗原結合部を形成する。さらに用語「抗体」は、全長免疫グロブリン分子に加えて、ＦａｂフラグメントあるいはｓｃＦｖｓのような組換型の単一鎖分子等、全長免疫グロブリン分子の断片も包含するように意図される。
【００１９】
本願で使用される略語は以下を含む。
「ＦＩＴＣ」は、フルオレセインイソチオシアネートである。
「Ｌ＊」はリガンドの第１型であり、固相結合分析における固相に特異的に結合する。
「Ｌ」は、固相結合分析における固相に特異的に結合しないリガンドの第２型である。
「Ｒ」は、Ｌ＊およびＬの両方に特異的に結合する結合パートナ（または受容体）である。
【００２０】
本明細書および付帯する請求項で使用されるように、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味を指す場合を除き、複数の指示物を含むことに留意する。
本発明の方法
【００２１】
本発明は、解離が数時間から数日、またはそれ以上にわたる長い期間で非常にゆっくり起こる結合反応の正確な特性評価の課題に関する。本方法は、リガンドの第１型が固相と特異的に結合し、第２型がその固相と特異的に結合しないように、リガンドの２つの型を調製できる任意の結合反応を使用して実行できるが、例示の反応は抗体および抗原間に生じ、特にナノモルからピコモルレンジでの解離定数によってその特性が評価される。通常、リガンドの第１型および第２型は、固相へ特異的に結合し、かつ受容体に対するリガンドの結合を実質的に妨害しない親和性タグの有無によってのみ異なる。一般的な親和性タグには、ビオチン、オリゴマーヒスチジン、オリゴヌクレオチド、レクチンなどが含まれる。
【００２２】
説明を容易にするために、抗体結合反応を参照して本発明を説明するが、本発明の範囲はその実施例ではなく、付帯する請求項によって限定される。好ましい実施形態において、本発明は、カリフォルニア州メンロパーク市のＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．から入手可能なエタロンファイバーに基づくＯｃｔｅｔ（商標）などのバイオセンサ、またはスウェーデン・ウプサラのＢｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ. から入手可能な表面プラズモン共鳴に基づくビアコアなどのバイオセンサを使用する、高親和性抗体の速度定数の測定における問題を解決するために使用できる。本発明の実施形態では、解離速度は液相中に解離を生じさせる分析形式を使用して決定され、その解離の進行中に固相分析を使用してモニターされる。固相分析は、結合リガンド対遊離リガンドの画分の推定値を決定することができる、固相および液相の相互作用から生じるシグナルを得るため、１つ以上の時間間隔で固相を液相と接触することにより行われる。
【００２３】
分析形式の原理は、特異的に固相に結合する能力において異なる２つの型のリガンド（Ｌ＊およびＬ）の条件に基づくが、両者は、液相中に存在する結合パートナ（Ｒ）に結合する能力において実質的に異ならない。特に好ましい実施形態では、固相分析において特異的に結合できるリガンド型（Ｌ＊）の濃度は、液相結合パートナ（Ｒ）の濃度未満であり、Ｒの濃度は固相分析において特異的に結合することができないリガンド型（Ｌ）の濃度未満である。固相は、Ｌ＊からＬを識別する部分の結合パートナを含む。例示の固相の結合パートナは、抗体、アビジンまたはストレプトアビジン、ニッケル、（アプタマーを含む）オリゴヌクレオチド、レクチン、炭水化物などを含み、それらは抗原、タンパク質、ペプチド、ビオチン、オリゴマーヒスチジン、相補的なオリゴヌクレオチド、炭水化物、およびレクチンのような部分を認識する。ガラスまたはプラスチックのような相に固体を誘導体化し、本発明の方法で使用されるリガンドを誘導体化する例示の化学作用は当業者に周知であり、例示のプロトコルは、以下に示すような既刊文献および教科書から広く入手可能であり、それら全体の開示は参照することにより本明細書に組み込まれる：「タンパク質精製のための親和性タグの比較 (Comparison of Affinity Tags for Protein Purification)」 2005, 41, 98-105, Lichty 他；「構造生物学のためのタンパク質産生の高スループット方法の設計（Design of High-Throughput Methods of Protein Production for Structural Biology）」Structure, 2000, v8, 9, R177-R185, Stevens；「タンパク質マイクロアレイ：挑戦および展望（Protein Microarrays: Challenges and Promises）」Pharmacogenomics, 2002, 3(4), 1-10, Talapatra 他；「アプタマー：ＲＮＡおよびリボヌクレオタンパク質の研究のための親和性タグ（Aptamers: Affinity Tags for the Study of RNA and Ribonuceoproteins）」RNA 2001, v7(4), 632-641, Srisawat and Engelke；「表面プラズモン共鳴における二重特異性相互作用分析のためのカルボキシメチルデキストラン修飾金表面に対するタンパク質の固定化（Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran  -  Modified Gold Surface for Bispecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance）」Analytical Biochem. 1991, 198, 268-277, Johnsson 他；「タンパク質結合および架橋の化学作用（Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking）」Shan Wong編，CRC Press, Boca Raton, FL, 1993；「固相免疫測定法の免疫化学（Immunochemistry of Solid Phase Immunoassay）」John Butler編，CRC Press, Boca Raton, FL, 1991。
【００２４】
いくつかの実施形態において、Ｌを液相へ追加する前に、Ｌ＊およびＲの間の結合反応を平衡状態に進行させる。いくつかの実施形態において、Ｌを液相へ追加する前に、本質的にすべてのＬ＊はＲへ結合される。一旦、Ｌを液相へ追加すると、１つまたは複数の固相結合分析が実行され、Ｌ＊がＲへ結合した状態の程度の特性を評価するのに有用なシグナルを得る。多数のこれらのシグナルを得ることにより、溶液中のＲからのＬ＊の解離速度は、当業者に周知の技術を使用して推定できる。
【００２５】
本発明の方法によって導出される解離速度定数は、解離の直接的な測定によって固相から得られるものよりも正確である。通常、それらの測定は、例えば固相に対してＲおよびＬを結合させること、および遊離Ｌをほとんどまたは全く持たない液相にその固相を露出することにより行なわれる。固相は、例えばＲに対するＬの再結合を促進する拡散障壁を提供するので、固相からのかかる直接測定は誤差を生じやすい。対照的に、本発明の方法を用いて導出される解離速度定数は、液相中で起こる過程を反映し、そのためインビボ結合を非常によく模倣し、固相装置で行なわれた速度定数測定による拡散障壁のアーチファクトを回避する。本発明の方法は、バイオセンサ機器による連続測定を必要とせず、他のサンプルを処理できるようにするという付加的な利点を提供する。本発明の方法は、反応の解離相の結合親和性および時間的経過に依存して、解離相の間に選択された間隔でのみ測定する。したがって本発明の方法は、一旦Ｌが提供されたならば、数時間から数日にわたる時間間隔でＬ＊がＲから解離するような遅い解離速度を有する非常に高い親和性反応（例えば、ナノモルからピコモルまたはより低い平衡解離定数）の特性評価を可能にする。
実施例
【００２６】
下記は、本発明を実行する具体的な実施形態の実施例である。本実施例は説明のみを目的に提示され、多少なりとも本発明の範囲を限定するようには意図されない。使用する数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する努力を行なったが、いくつかの実験誤差および実験偏差は当然考慮に入れられるべきである。
【００２７】
本発明の実行は、特別の指示の無い限り、当分野の技術内の、タンパク質化学、生化学、組換型ＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を利用してもよい。かかる技術は、文献において十分に説明されている。例えば、T.E. Creightonの「タンパク質：構造および分子特性（Proteins: Structures and Molecular Properties）」（W.H. Freeman and Company, 1993年）；A.L. Lehningerの「生化学（Biochemistry）」（Worth Publishers, Inc.，現行版）；Sambrook  他の「分子クローニング：実験手引き書（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」（第２版、1989年）；「酵素学における方法（Methods In Enzymology）」（S. Colowick and N. Kaplan 編、Academic Press, Inc.）；「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第１８版（Easton, Pennsylvania:Mack Publishing Company. 1990年）；Carey and Sundbergの「先端有機化学（Advanced Organic Chemistry）」第３版（Plenum Press）Ａ巻およびＢ巻（1992年）を参照。
実施例１；抗体抗原反応の特性を評価する方法の概説
【００２８】
抗原−抗体反応の特性を評価する本発明の方法を実行する手順を図１に示す。ステップ１において、サンプルは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の適切な結合緩衝液もしくは溶液のような標準的な生理的緩衝液中で、親和性タグの付いた（例えば、ビオチン化された）抗原（Ｌ＊）と解離速度定数が推定される抗体（Ｒ）との間の免疫複合体を形成することによって調製される。タグの付いた抗原および抗体濃度は好ましくは平衡であるように選択され、本質的に、タグの付いた抗原はすべて抗体によって結合される。ステップ２において、大量のモル過剰量のタグの付いていない抗原（Ｌ）を加えて、ビオチン−抗原による抗体結合部位についての競合反応を設定する。本形式において、ビオチン−抗原が抗体により予め結合されるので、免疫複合体は、タグの付いていない抗原を結合するために解離しなくてはならない。解離に際して、モル過剰量のタグの付いていない抗原は、抗体に対して結合しやすい。経時的に遊離ビオチン−抗原がサンプル中に出現し始め、出現速度は抗体解離速度に依存する。ステップ３は、解離速度定数を導出するために続いて使用される、遊離ビオチン−抗原量対結合ビオチン−抗原量を測定する、ストレプトアビジンで被覆されたバイオセンサの選択された時間間隔でのサンプル混合物中における浸漬を示す。
実施例２：グラスファイバーバイオレイヤ干渉法センサを使用する抗ＦＩＴＣ／ＦＩＴＣ反応の特性評価。
【００２９】
図２は抗フルオレセイン／フルオレセイン−デキストラン結合ペアについての（図１に図解する）ステップ３の解離結果を示す。本実施例において、グラスファイバーバイオレイヤ干渉計センサが固相結合分析を行なうために使用される。センサならびにセンサの製造および使用方法は、本願と同一所有者の米国公開特許第２００５０２５４０６２号で詳細に記載されており、その内容は目的を問わず全体を参照することにより本明細書に組み入れられる。本実施例において、前記ファイバーは、ＦＩＴＣ−デキストランリガンド上のビオチンタグに結合するストレプトアビジンにより誘導体化される。本方法の実施でこのタイプのセンサを使用した場合、意外な利点がある。治療抗体の開発の初期段階では、抗体供給量が限られる場合がある。解離速度推定の精度は、同一のサンプル混合物の反復測定センサ測定を行なうことにより改善される。グラスファイバーバイオセンサは（マイクロタイタープレートウェルのような）通常のサンプル反応チャンバに適合性があるので、かかる抗体サンプルの消費を最小限にし、１００μＬ以下を必要とする。かかるグラスファイバーセンサは、直径約０．５ｍｍの小さな感知領域を有する。反復測定がサンプル中のビオチン−抗原の総量に対してごくわずかな影響しか及ぼさないので、同一サンプルの反復測定は比較的限られた結合能力を有する小さな感知領域で促進される。
【００３０】
材料および方法
【００３１】
試薬は以下の供給元から得た。
遊離非ビオチン化検体（カタログ番号  Ｄ３３０６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、デキストラン−フルオレセイン、３０００ＭＷ）
ビオチン−検体（カタログ番号Ｄ７１５６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、デキストラン−フルオレセインおよびビオチン、３０００ＭＷ）。
抗体（カタログ番号Ａ−６４１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、抗フルオレセイン抗体、ウサギポリクローナル、Ｆａｂフラグメント）。
Ｋ−センサ（カタログ番号１８−０００２、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．  ）。
サンプル希釈剤（カタログ番号１８−１０００、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．  ）。
【００３２】
実験サンプル：
ビオチン−検体（陰性対照；最低シグナル）
ビオチン−検体＋抗体（陽性対照；最高シグナル）
ビオチン−検体＋抗体＋遊離非ビオチン化検体  
競合のための異なる濃度の遊離非ビオチン化検体を追加する。
【００３３】
１．ビオチン−検体＋抗体の平衡結合：
【００３４】
１．１．サンプル希釈剤中に２×ビオチン−抗原溶液を調製する。この実施例のために、ビオチン−デキストラン−フルオレセイン（０．２５μｇ／ｍｌ）の溶液を調製した。このストックを、ビオチン＋抗体溶液と同様に陰性対照の調製のために使用した。
【００３５】
１．２．ビオチン−抗原ストックおよび抗体（抗フルオレセイン）ストックを、４１．６７ｎＭのビオチン−抗原および１２５ｎＭの抗体（Ｌ＊に対して３倍のモル過剰量のＲ）の最終濃度を得るように混合した。
【００３６】
１．３．陰性対照（ビオチン−抗原のみ）を、４１．６７ｎＭの濃度になるように調製した。
【００３７】
１．４．すべてのサンプルを、平衡に達するように緩やかな撹拌により室温で一晩インキュベートした。
【００３８】
２．オフレート（解離速度）測定のための競合分析：
【００３９】
２．１．以下に記載するように、重複サンプルセットを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，  Ｉｎｃ．  から入手可能なＯｃｔｅｔ機器を使用する分析のための２枚の分析プレートを得るために調製した。
【００４０】
２．２．１００倍モル過剰量および１０００倍モル過剰量（上記の抗体、Ｒ）の遊離非ビオチン化抗原（デキストラン−フルオレセイン、Ｌ）を、１．２からの溶液の２つの分割物に追加した。２つのサンプル中の遊離非ビオチン化抗原（Ｌ）の最終濃度は、それぞれ１２．５μＭおよび１２５μＭであった。
【００４１】
２．３．各反応に追加する総容量を、ＰＢＳにより総容量を調整することによって、すべてのサンプルにおいて等しく保った。
【００４２】
２．４．２．１におけるサンプルと同一の総容量にするために、遊離非ビオチン化抗原（Ｌ）の代わりに、ＰＢＳを陰性対照に追加した。
【００４３】
２．５．分析プレート：ＧｒｅｉｎｅｒのＢｌａｃｋ  Ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ９６−ｗｅｌｌ  ＰＰ  ｐｌａｔｅ（Ｅ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  番号ＥＫ−２５２０９）
【００４４】
２．５．１．カラム１中のウェルを、ベースライン測定のためのサンプル希釈剤で満たした（各２００μｌ）。
【００４５】
２．５．２．カラム２中のウェルを、サンプル溶液で満たした（各２００μｌ）。
【００４６】
３．ＦｏｒｔｅＢｉｏ  のＯｃｔｅｔ での分析：
【００４７】
３．１．インキュベーションを開始した後、第１タイムポイントを直接とった。
【００４８】
３．２．ＯｃｔｅｔおよびＫセンサを使用する分析手順：
【００４９】
３．２．１．サンプルプレートを５分間Ｏｃｔｅｔで３０℃に暖めた（プレートにカバーはしない）。
【００５０】
３．２．２．分析手順を以下のように設定した：
【００５１】
３．２．２．１．２００ｒｐｍでプレートを撹拌し、温度を３０℃に保持して、カラム１のサンプル希釈剤におけるベースラインを６０秒間採取した。
【００５２】
３．２．２．２．２００ｒｐｍでプレートを撹拌し、温度を３０℃に保持して、結合データをカラム２のウェルから１２００秒間採取した。
【００５３】
３．２．３．初期の結合データを得た後、サンプルプレートをＯｃｔｅｔから取り出し、プレートシーラにより密閉し、実験台上にて周囲温度でインキュベートした。１枚のプレートを後の全タイムポイントのために使用した。
【００５４】
３．３．各タイムポイントで、３．２のステップを反復した。示された実施例データのために、データは、プレート１については１４、３８、１３２、２２６、３６１、４５５、１４６７、１７８３分で、および重複プレート２については９、３２、１１６、２６３、３２５、４３０、１４３７、１７２５分で採取した。例示のデータを、両実験からのデータを提供する図４に示す。固相に対する結合を進行させる時間の量を表わすパラグラフ中に提供される値から、図４に凡例中の時間が２０分で相殺されることに留意すること。
【００５５】
図２は、上記手順を使用して得られた代表的な正規化されたデータ（左側）、および解離速度定数を推定する以下に記載の第１分析方法に従う分析（右側）を示す。図３は、Ｌの追加後のタイムポイントで得られた代表的データに加えて、ＲＬ＊の最大結合（陽性対照）およびＬ＊の最小結合（陰性対照）を示す。
【００５６】
４．データ分析：
【００５７】
４．１．各測定についての総ｎｍシフトを分析の最後に決定した。この実施例において、ｎｍシフトは、センサ先端に対する２０分の結合期間の後に、タイムポイント毎に決定された。２０分の期間が選択されたのは、着実な読み出しを可能にし、経験的に固相バイオセンサに対する溶液相成分の結合の終点を効果的に記録するタイムポイントであると決定されたからである。もちろん、他の出願において、結合期間は、例えばＲＬ＊およびＬ＊成分についての温度、イオン強度、および拡散定数のようなパラメータの関数として異なってもよく、適切な結合期間はこの開示の恩恵を被る当業者によって容易に決定することができる。
【００５８】
この実施例において、各タイムポイントの結合データは、２０分間にわたり発生したｎｍシフトの形式で記録されたが、本方法は、例えば、１からＦｏｒｔｅ数分のようなより短い期間にわたり発生する初期シフト、または初期の結合期間にわたり採取される結合の一次導関数（例えば速度）の使用によっても実行できる。初期シフトまたは初期速度を使用する利点は、それがＲＪＬ＊複合体のさらなる解離が分析の過程で起こる可能性を最小限に抑えることである。
【００５９】
４．２．解離速度定数、ｋdis定量法１：
【００６０】
４．２．１．各サンプルのために、時間対ｎｍシフト（Ｘ対Ｙ）についてグラフを作成した。ビオチン抗原＋抗体の陽性対照の平均値を、０時間におけるｎｍシフトのデータポイントとして使用した。
【００６１】
４．２．２．ｙ＝ｙ０＋Ａ＊ｅｘｐ（Ｒ０＊ｘ）である場合、これらのデータの指数関数フィッティングを、ｋdisの決定のために使用した。ｋdis＝−Ｒ０。これらの測定例を図２の右側および図５に示す。
【００６２】
４．３．ｋdis定量法２：
【００６３】
４．３．１．各サンプルのために、ｌｎ（時間）対ｎｍシフト（Ｘ対Ｙ）のグラフを作成し、片対数を用いて描画されたデータを直線にフィッティングした。
【００６４】
４．３．２．直線フィッティングから、シグナルの半分（ｎｍシフト）が失われた時間を決定した。これはｔ１／２である。
【００６５】
４．３．３．ｋdisは等式ｋdis＝（ｌｎ２／ｔ１／２）によって近似され、１００倍のモル過剰および１０００倍のモル過剰の競合について図６の上部において示される。図６の下部は、標準的なＯｃｔｅｔのリアルタイム分析を使用して得られた速度に加えて、両方の推定方法を用いる推定解離速度定数（ここではｋdisの代わりにｋｄとして表示される）も作表する。
実施例３：ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）装置での本発明の方法の実施
【００６６】
多量（例えば１０から２０ｍＬ）のサンプルが調製されることを除けば、サンプルのセットアップは、実施例２での記載と同じ様式で実行される。各分析につき１分割量（例えば約１から２ｍＬ）を消費する。さらに、タンパク質濃度に起因する任意の屈折率変化を補正するために、溶液の対照を使用する。この実動実施例のために、サンプルとして同様の総タンパク質濃度を与える理想的な溶液対照は、非ビオチン化検体と抗体から成る。
【００６７】
２．ストレプトアビジンビアコアチップを使用する（センサーチップＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ.カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）。代替物として、アミン反応性ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ. カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）は標準的手順を介して固定化ストレプトアビジンに対して使用可能である。
【００６８】
３．各タイムポイントについて、新しいビアコアチップを使用する。各チップは、実施例２に記載され３つのサンプルと溶液対照を分析するために使用される４つのフローセルを含む。
【００６９】
４．各タイムポイントで、各溶液の１分割量を、個々のフローセルに注入する。
【００７０】
５．次のタイムポイントで、新しいチップを機器と挿入し、各サンプルおよび各溶液対照の新しい分割量を注入する。
【００７１】
９．一旦すべてのタイムポイントが取得されると、ビアコアＲＵ値（ビアコアシグナル単位）がＯｃｔｅｔ  ｎｍシフトの代わりに使用される以外は、実施例２に記載されているようにデータ分析を続行する。
【００７２】
本発明は特に、好ましい実施形態および様々な代替の実施形態に関連して示し、説明してきたが、当業者にとっては言うまでもなく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく形式および細部を種々変更可能である。
【００７３】
本明細書の主体部分で引用されたすべての参照文献、発行済特許、および特許出願は、目的を問わず、いずれも全体を参照して本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明のステップと、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．製 Ｏｃｔｅｔ（商標）バイオセンサを使って本発明を実行して得た結果とを図解する模式図である。
【図２】モデル系によりＯｃｔｅｔ（商標）バイオセンサを使用して得られた、時間０から９時間にわたる５つのタイムポイントで正規化されたデータを図示し、ここで、抗体は抗ＦＩＴＣであり、リガンドの第１型はＦＩＴＣ−デキストラン−ビオチンであり、リガンドの第２型はＦＩＴＣ−デキストランであり、解離速度定数を得るためにそれらのデータをフィッティングし（あてはめ）、本発明および従来技術分析の方法を使用して得られる解離速度を比較する。
【図３】１０分から９時間にわたる４つの異なるタイムポイントでの、図２と同一の機器類およびモデル系を使用した生データを図示する。
【図４】２９分から１７６３分にわたる１６の異なるタイムポイントで得られた、図２および３と同一の機器類およびモデル系を使用した生データを図示する。
【図５】図４のデータを単一指数関数にフィッティングさせる方法を図示する。
【図６】図２および３と同一の機器類およびモデル系を使用して（しかしリガンドの第２型の２つの異なる濃度で）得られたデータ、および片対数目盛上にプロットして得られたデータの直線フィッティングを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月21日(2008.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応の特性を評価する方法であって、
総濃度での受容体［Ｒ］と、総濃度でのリガンドの第１型［Ｌ＊］とを含む、実質的に平衡化された溶液を提供するステップと、
前記溶液に総濃度での前記リガンドの第２型［Ｌ］を追加するステップと、
固相結合分析において、前記リガンドの前記第２型を追加したステップ後の第１の時間での、前記リガンドの前記第１型の前記固相への結合から生じるシグナルを決定するステップと
を備え、前記リガンドの前記第１型は特異的に前記固相に結合し、前記リガンドの前記第２型は特異的に前記固相に結合せず、前記固相結合分析がファイバーに基づく分析であることを特徴とする方法。
【請求項２】
［Ｌ＊］＜［Ｒ］＜［Ｌ］である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドの前記第２型の前記追加ステップに先立って、前記リガンドの実質的にすべての前記第１型が前記受容体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の固相結合分析において、前記リガンドの前記第１型の、前記固相への前記結合から生じる複数のシグナルを決定するステップをさらに含み、前記シグナルは、前記リガンドの前記第２型の追加ステップ後に複数の時間で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナルのうちの少なくとも２つのシグナルが互いに異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも５時間だけ互いに異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも１０時間だけ互いに異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも２０時間だけ互いに異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の時間のうちの少なくとも２つの時間が少なくとも１００時間だけ互いに異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の固相結合分析が、前記溶液を収容する単一容器中で行なわれる、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の固相結合分析において決定された前記複数のシグナルから、解離速度定数を計算するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の固相結合分析において決定された前記複数のシグナルから、遊離Ｌ＊に結合した比率または前記比率の逆数を計算するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相結合分析が非破壊である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ファイバーに基づく分析が干渉法シグナルを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2009529656.tif 000009