(57)【要約】  治療を必要としている患者の血液循環に有効量の医薬を投与することによって、脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための医薬を製造するための赤血球生成分子の使用であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式  −ＣＯ−（ＣＨ２）Ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲの「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基に共有結合されている、赤血球生成分子の使用、ならびに本発明に従う赤血球生成分子を含むキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要としている患者の血液循環に有効量の医薬を投与することにより脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための医薬を製造するための赤血球生成分子の使用であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
【化１】
2009510008.tif 000008
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、
（ここで、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、
Ｒは、低級アルキルであり；
ｘは、２または３であり；
ｍは、約４５０〜約９００であり；
ｎは、１〜３であり、そして
ｎとｍは、得られる赤血球生成分子の分子量が、エリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）
に共有結合されている、赤血球生成分子の使用。
【請求項２】
式：
【化２】
2009510008.tif 000009
（式中、ｘ、ｍ、ｎおよびＲは、請求項１に定義されたとおりであり、そしてＰは、ポリ（エチレングリコール）基とアミド結合を形成するｎ個のアミノ基のないエリスロポエチン部分の残基である）
を有する、請求項１に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項３】
Ｒが、メチルである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項４】
ｍが、約６５０〜約７５０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項５】
ｎが、１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項６】
Ｒが、メチルであり、ｍが約６５０〜約７５０であり、そしてｎが１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項７】
式：
【化３】
2009510008.tif 000010
（式中、ｍは６５０〜７５０であり、ｎは１であり、そしてＰは請求項１に定義されたとおりである）
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項８】
エリスロポエチン部分が、ヒトエリスロポエチンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項９】
エリスロポエチン部分が、配列番号１の配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１０】
エリスロポエチン部分が、１〜６個のグリコシル化部位の付加により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１１】
脳および脊髄の神経変性障害が、卒中、外傷性脳損傷または脊髄損傷から選ばれる急性事象に関係する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１２】
脳の神経変性障害が、慢性処置に関係し、そして統合失調症、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症、脆弱Ｘ染色体関連振戦／運動失調症候群、パーキンソン病、スポンジ形エンセファロパシー、多発性硬化症およびバクテリアもしくはウイルス感染と関連した神経変性から選ばれる、前記請求項１〜１０のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１３】
血液循環への赤血球生成分子の投与が、注射、皮膚パッチ、皮下沈着または吸入により行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１４】
投与されるべき量が、エリスロポエチン部分の量により測定して、急性症例では約２週間までで約２５μg〜約５００μg／日であり、または慢性処置では約２５μg〜約１０００μg／週である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１５】
急性症例では１週間までで１６５μg／日を適用すること、または慢性処置では２００μg／週を適用することによる、請求項１４に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の有用な赤血球生成分子を含むキット。
【請求項１７】
赤血球生成分子および血液脳関門の透過性を改良する物質を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１６〜１７のいずれか一項に記載のキットの製造方法。
【請求項１９】
治療を必要としている患者の血液循環に治療有効量の赤血球生成分子を投与することを含む脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための方法であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
【化４】
2009510008.tif 000011
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、
（ここで、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、
Ｒは、低級アルキルであり；
ｘは、２または３であり；
ｍは、約４５０〜約９００であり；
ｎは、１〜３であり、そして
ｎとｍは、得られる赤血球生成分子の分子量が、エリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）
に共有結合されている、脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための方法。
【請求項２０】
治療を必要としている患者の血液循環に有効量の医薬を投与することにより脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための赤血球生成分子を含む医薬であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
【化５】
2009510008.tif 000012
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、
（ここで、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、
Ｒは、低級アルキルであり；
ｘは、２または３であり；
ｍは、約４５０〜約９００であり；
ｎは、１〜３であり、そして
ｎとｍは、得られる赤血球生成分子の分子量が、エリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）
に共有結合されている、医薬。
【請求項２１】
前記に定義した発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な赤血球生成剤（erythropoietic agent）（ＮＥＡ）を使用する脳および脊髄の神経変性障害を処置する方法に関する。
【０００２】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）などの市販のタンパク質治療剤のバイオアベイラビリティーは、それらの短い血漿半減期およびプロテアーゼ分解に対する感受性により制限される。これらの欠点は、それらが最大臨床効力を達成するのを妨害する。新規な赤血球生成剤は、ＥＰＯおよびそのアナログの化学的改変により開発された。これらの新規な作用物質は、腎臓疾患を有する患者、ＡＩＤＳおよび化学療法を受けている癌患者における最適な貧血の扱いを可能とする効力のある且つ長期の赤血球生成活性を与える。
【０００３】
本発明は、治療を必要としている患者に、治療有効量の新規な赤血球生成剤（ＮＥＡ）であって、化学的に改変されたヒトエリスロポエチンまたは特定の分子量およびリンカー構造を有する共有結合により組み込まれたポリ（エチレングリコール）基を含む化学的に改変されたヒトエリスロポエチンアナログである赤血球生成剤を投与することにより、脳及び脊髄の神経変性障害を処置する方法に関する。
【０００４】
特に、本発明で使用されるＮＥＡｓは、好ましくは少なくとも１つの遊離アミノ基を有しそしてエリスロポエチン部分を含む化学的に改変された赤血球生成分子であって、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
−ＣＯ−（ＣＨ２）Ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、（ここで各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（即ち、カルボニル）は前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、Ｒは低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは約４５０〜約９００であり；ｎは１〜３であり、そしてｎとｍは、得られるＮＥＡの分子量が、改変されていないエリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaに等しくなるように選ばれる）に共有結合されている、化学的に改変された赤血球生成分子である。このようなＮＥＡｓは、例えばUS Pat.No.6,583,272に記載されており、これは、必要な程度に参照により本明細書に組みこまれる。
【０００５】
本発明で有用なＮＥＡｓは、生化学的におよび機能的にＥＰＯとは異なる。ｉｎ  ｖｉｖｏデータとｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、一緒になって、これらのＮＥＡｓが、ＥＰＯと比較して、ＥＰＯレセプターへの実質的により低い結合アフィニティーを示しそしてより急速に解離するということを示す。ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）と比較して、これらのＮＥＡｓは、増加した循環半減期および血漿滞留時間、減少したクリアランスおよび増加したｉｎ  ｖｉｖｏでの臨床的活性を含む、明確で、有利な臨床的性質を示す。
【０００６】
本発明のＮＥＡｓの目立った性質に関する上記観察のいくつかは、おそらく新規な作用様式により説明されうる。延長された血清半減期と共にエリスロポエチンレセプター（「ＥＰＯ−Ｒ」）からの急速な解離は、レセプターとの多重相互作用により増強され、そして持続した赤血球生成効果をもたらすことができる。立体的理由で、これらの多重相互作用は、ＥＰＯ−Ｒのシグナルカスケードを誘導するのに十分であるかもしれないが、レセプター／分子複合体がインターナリゼーションされ、そして分解されるような強い結合をもたらすほど十分に堅くない。統計的には、ある百分率の分子のみがこのような堅い結合をコミットすることができる。全体として、この作用様式は、１つの分子が分解される前に１つより多くのレセプターを活性化するという効果をもたらすであろう。
【０００７】
重要なことに、これらのＮＥＡｓの有利な性質は、減少した投与の頻度およびヘモグロビンのより安定なコントロールを可能とし、これは腎臓疾患を有する患者およびＡＩＤＳまたは化学療法を受けている癌を有する患者における貧血の最適な扱いを可能とする。これらの利点は、改良された処置結果および改良された患者のクオリティーオブライフをもたらすことが期待される。
【０００８】
天然に存在するヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）は、身体の種々の組織（例えば腎臓、脳等）において産生され、そして中でも赤血球産生を刺激する体液性血漿因子である（Carnot, P and Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953) Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W and  Plzak, LF (1957) Nature 179: 6331-4）。天然に存在するＥＰＯは、骨髄におけるコミットされた赤血球系前駆体（committed erythroid progenitors）の分裂および分化を刺激し、そしてレセプターへの結合により赤血球系前駆体に対してその生物学的活性を発揮する（Krantz, BS (1991) Blood 77:419）。
【０００９】
貧血を処置するためのＥＰＯの使用のほかに、最近、この分子は、神経保護効果および心筋保護効果を与えることも仮定されている。概説文献W. Jelkmann and K. Wagner. Ann. Hematol 83: 673-686 (2004)参照。
【００１０】
本発明は、ＮＥＡを血液循環に導入することにより脳および脊髄の神経変性障害を処置するための本発明のＮＥＡｓの使用を提供する。本発明は、本発明のＮＥＡｓが、その相対的に大きいサイズにもかかわらず、血液脳関門を横切って脳および脊髄に見出されるニューロンのための神経保護剤として役立つこともできるという発見に基づいている。これらのＮＥＡｓが上記した他の状況において示す著しく優れた臨床的性質は、ＥＰＯによる治療と比較して、神経変性障害を処置するために使用される場合に実質的な治療利点を与えることも予想される。
【００１１】
エリスロポエチンは、リコンビナントＤＮＡ技術を使用して生合成により製造され（Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224）、そしてチャイニーズハムスターの卵巣組織細胞（ＣＨＯ細胞）に挿入されそしてこの細胞で発現されたクローニングされたヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。完全にプロセッシングされた形態のｈＥＰＯの主要な一次構造は、配列番号１に示される。Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ１６１およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ３３の間に２つのジスルフィド架橋がある。糖部分なしのＥＰＯのポリペプチド鎖の分子量は、１８，２３６Ｄａである。インタクトなＥＰＯ分子では、分子量の約４０％は、タンパク質上のグリコシル化部位でタンパク質をグリコシル化する炭水化物基により占められる（Sasaki, H, Bothner, B,Dell, A and Fukuda,M(1987) J.Biol.Chem.262:12059）。
【００１２】
用語「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」は、（配列番号１）または（配列番号２）に記載されたアミノ酸配列またはそれに対して実質的に相同性のアミノ酸配列を有するグリコシル化タンパク質であって、その生物学的性質が赤血球産生の刺激および骨髄におけるコミットされた赤血球系前駆体の分裂および分化の刺激に関係することができるグリコシル化タンパク質である。更に、「エリスロポエチン」は、当技術分野の状態で知られている生物学的性質または結合アフィニティーの少なくとも１つを示すグリコシル化タンパク質を指す。従って、神経保護効果のみを示す分子が含まれる。本明細書で使用された、これらの用語は、例えば部位特異的突然変異誘発によるなどの如き故意に改変されたタンパク質または偶然突然変異により改変されたタンパク質を含む。これらの用語は、グリコシル化のための１〜６個の追加の部位を有するアナログ、糖タンパク質のカルボキシ末端端部に少なくとも１つの追加のアミノ酸を有するアナログであって、該追加のアミノ酸は少なくとも１つのグリコシル化部位を有するアナログ、およびグリコシル化のための少なくとも１つの部位の転位（rearrangement）を含むアミノ酸配列を有するアナログも含む。これらの用語は、天然のおよびリコンビナントに産生されたヒトエリスロポエチンの両方を含む。
【００１３】
ＥＰＯは、特異的膜貫通レセプター（ＥＰＯ−Ｒ）に結合する。機能的ヒトＥＰＯ−Ｒは、サイトカインクラスＩレセプタースーパーファミリーのメンバーであり、そして４８４アミノ酸の２つの同じ糖タンパク質鎖のホモダイマーとして現れる。各鎖は、細胞外ドメイン、疎水性膜貫通配列、およびタンパク質チロシンキナーゼＪＡＫ２が関係する細胞質ドメインを含む。改変されていないＥＰＯはレセプターサブユニットに結合し、その際２つの結合部位のための解離定数はきわめて異なる。ＥＰＯのレセプターとの結合は、２つのＥＰＯ−Ｒサブユニットのコンホメーション変化およびより堅い結合をもたらし、これは２つのＪＡＫ分子の自己リン酸化をもたらし、これは複雑なシグナリングカスケードをもたらす。ＥＰＯで誘導されたシグナリング経路は刺激の３０〜６０分後にほぼ基底レベルに戻ることが示された。ＥＰＯの効果は、ＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒの複合体のインターナリゼーションおよび分解を引き起こす造血細胞ホスファターゼ（ＨＣＰ）の作用により終結される。
【００１４】
最近、ＥＰＯは最初に考えられたよりも多く多様な生存成長因子であることが示された。ＥＰＯは、神経栄養性および神経保護機能（Cerami A et al. (2002) Nephrol. Dial.  Transplant. 17: 8-12; Chong, ZZ et al. (2003) Curr. Drug Targets Cardiovasc.  Haematol. Disord. 3: 141-154; Jumbe, NL (2002) Oncology 16: 91-107; Marti, HH et al. (2000) News Physiol. Sci. 15: 225-229）、血管機能（Masuda, S et al. (1999) Int. J. Hematol. 70: 1-6; Smith, KJ et al. (2003) Cardiovasc, Res. 59: 538-548）、および心臓保護機能（Smith, KJ et al. (2003) Cardiovasc, Res. 59: 538-548; Parsa, CJ et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 999-1007）を有すると考えられている。ＥＰＯ−Ｒは、げっ歯類および哺乳動物の脳の異なる区域に存在することが示された（Digicaylioglu, M et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3717-3720; Li, Y et al. (1996) Pediatr. Res. 40: 376-380; Marti, HH et al. (1996) Eur. J. Neurosci. 8: 666-676）。ＥＰＯ結合部位は、主としてマウスの海馬、内包（capsula interna）、皮層（cortex）および中脳に位置していた（Digicaylioglu, M et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3717-3720）。更に、ＥＰＯは神経幹（neuronal stem）及び前駆体細胞の増殖および分化を刺激することが知られている（Shingo, T et al. (2001) J. Neurosci. 21: 9733-9743; Studer, L et al. (2000) J. Neurosci. 20: 7377-7383）。
【００１５】
ＥＰＯの神経保護効果は、無酸素初代海馬神経細胞培養物（anoxic primary hippocampal neuronal cell cultures）におけるミトコンドリア膜電位を維持することによりＥＰＯの神経保護作用におけるＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ経路の第一位の重要性（primary importance）にさかのぼることができる（Chong, ZZ et al. (2003) Circulation 106: 2973-2979）。ミトコンドリア膜電位の脱安定化は、シトクロームＣの放出をもたらし、これはＤＮＡフラグメント化を促進するカスパーゼ８、１および３を活性化する。
【００１６】
脳におけるＥＰＯのｉｎ  ｖｉｖｏ神経保護効果は、スナネズミ（Mongolian gerbils）で行われた１９９８年のＳａｓａｋｉのグループにより最初に提唱された（Sadamoto, Y et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 26-32; Sakanak, M et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4635-4640）。ＥＰＯの側脳室への注入は、虚血で誘導された学習不能を防止し、そして海馬ＣＡ１ニューロンを死から救出することが示された。ラットに関する同様な実験は、虚血で誘導された位置ナビゲーション不能（place navigation disability）、皮質梗塞および視床変性の減少を示した（Sadamoto, Y et al.(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 26-32）。更に、低酸素プレコンディショニングの既知の保護効果は、ＥＰＯシグナリングが可溶性ＥＰＯ−Ｒの脳室への注入により局所的にブロックされる場合には、マウスでは有意に減少させられる（Prass. K et al.(2003) Stroke 34:1981-1986）。
【００１７】
全身投与されたＥＰＯは血液脳関門の故に脳に入らないであろうということが以前に推測されていた（Junk, AK et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 10659-10664; Juul, SE et al. (1999) Pediatr. Res. 46: 543-547）。血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳および脳脊髄液（ＣＳＦ，髄液）を血液から分離し、そして血液と脳との間の物質の交換を調節する。本明細書で使用される用語「ＢＢＢ」は、血液脳関門および血液−ＣＳＦ関門を含む。それは、主として脳毛細管（brain capillaries）、脈絡叢立方上皮（choroids plexus cuboidal epithelium）およびくも膜よりなる。すべてのＢＢＢ部位は、連続した細胞間の密着接合の存在、内皮ポアの不存在および少数の飲作用小胞により特徴付けられる。更に、脳毛細管は、身体の他の領域からの毛細管と比較して、内皮ミトコンドリアの数密度の数倍の増加を含む。ＢＢＢを構成する細胞は、主として経細胞経路のみにより溶質交換を可能とする、連続した細胞層として有効に機能する。従って、脂質可溶性溶質はＢＢＢを容易に透過するが、電解質、脂質不溶性非電解質およびタンパク質は、それらが非神経組織に入るよりもゆっくりと血液から脳に入る。この関門機能は脳を有害な物質から保護するのを助ける。
【００１８】
溶質分子が膜を横切って移動する４つの基本的機構がある。（１）単純拡散、（２）促進された拡散、（３）水性チャンネルを通る単純拡散および（４）タンパク質担体を通る活性化された輸送。傍細胞拡散（paracellular diffusion）は、密着接合によりＢＢＢでなんら顕著な程度に起こらない。経細胞拡散の場合に、一般的規則では、物質の親油性が高ければ高いほど、脳への拡散はより大きい。グルコース、アルコールおよび他の小分子は丁度拡散により脳に入る。大部分のタンパク質は、通常活性化された輸送を使用することを必要とする。
【００１９】
血液脳関門は、高張マンニトールの動脈内注射などの特定の液剤により開かせることができる。マンニトールは、内皮細胞を収縮させることにより浸透圧によって血液脳関門を開かせると考えられる。
【００２０】
ＣＳＦは、脳室、脊椎管およびくも膜下空間内に位置している。ＣＳＦの主要なソースは、側脳室、第３および第４脳室の脈絡叢であり、そして容積は脳重量の１０〜２０％の間で変わる。ヒトでのＣＳＦの容積は、ヒトでは５時間の代謝回転（ラットでは１時間）で１４０〜１５０mlである。ＣＳＦは、その産生により発生した流体静力学的圧力の影響下に脳室およびくも膜下空間内で移動する。ＣＳＦは、脳をクッションで守り、脳細胞外流体を調節し、神経活性物質の分布を可能とし、そして脳により産生された廃棄産物を集めるシンクである。
【００２１】
Ｊｕｍｂｅ（Jumbe NL (2002) Oncology 16: 91-107）は、静脈内にリコンビナントヒトＥＰＯを投与された（５００Ｕ／kg）ラットの脳脊髄液対血清濃度比は、約１×１０−３であることを示した。２５μg／kgでのダルベポエチンαの投与について同様なことがいえる。ノンコンパートメント解析（noncompartmental analysis）による濃度−時間曲線下の計算された平均面積（ＡＵＣ０−８）は、それぞれ、脳脊髄液中でリコンビナントヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）について３４０mUh／mlおよびダルベポエチンα（darbepoetin α）について３．６ngh／ml対血清中で３７０，０００mUh／mlおよび４５００ngh／mlであった。
【００２２】
卒中実験に関して、試験動物への高い用量のｒｈＥＰＯの全身投与は、中脳動脈閉塞の２４時間後の梗塞の容積を減少させ（Siren, AL et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 4044-4049）、死亡率を減少させ（Buemi, M et al. (2000) Eur. J. Pharmacol. 392:31-34）、ニューロン損傷を防止し（Alafaci, C et al. (2000) Eur. J. Pharmacol. 406: 219-225）、脳血流を増加させ（Grasso, G (2001) J. Neurosurg. Sci. 45: 7-14）、そして神経学的欠落（neurologic deficits）を減少させる（Grasso, G et al. (2002) J. Neurosurg. 96: 565-570）ことが示された。ＥＰＯは、更に、運動ニューロンアポトーシスおよび神経学的不能を防止し（Cerami, A et al. (2002) Nephrol. Dial. Transplant 17: 8-12）、運動機能の回復を改良し（Gorio, A et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9450-9455）、そして低酸素脳における炎症性反応を減少させる（Villa, P et al. (2003) J.Exp. Med. 198:971-975）。
【００２３】
更に、多発性硬化症（ＭＳ）におけるエリスロポエチンの使用は、最近考慮下にある。ＭＳは、脳および脊髄である中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患である。ＭＳに罹病した人において、プラークまたは病変（lesions）と呼ばれる損傷のパッチが、ＣＮＳ白質の外見上ランダムな区域に現れる。病変の部位では、ミエリンと呼ばれる神経絶縁物質が、おそらく自己免疫炎症期間中に失われる。ミエリン鞘は、脱髄として知られたプロセスにおいて軸索からはがれる。ミエリン鞘はオリゴデンドロサイトのある部分によりＣＮＳにおいて形成される。これまで、何がＭＳを引き起こすかは明らかでない。種々の理論、例えば、自己免疫、病原体媒介、遺伝子成分、子宮内の生化学的事象、血液脳関門の損傷、食餌およびビタミン不足、アレルギー反応その他が提唱された。更に、炎症は軸索膜も害することが論議される。これまでＭＳのために利用可能な治効のある処置はない。しかしながら、多数の医薬がこの疾患を対症的に処置するのに使用されうる。例えば、コルチコステロイド、多数の免疫抑制薬物およびインターフェロンβを投与することができる。
【００２４】
Diem et al. (Brain (2005), 128: 375-85)は、炎症性および神経変性の面をターゲティングするためのＥＰＯの適用と組み合わされたステロイド処置を記載している。従って、メチルプレドニゾロンおよびエリスロポエチンが、ＭＳのモデルにおいて組み合わせた治療として使用されて成功している。
【００２５】
卒中患者でEhrenreich et al. (Ehrenreich, H et al. (2002) Mol. Med. 8: 495-505)によりなされたヒトにおける実験は、卒中の１ヶ月後の顕著な神経学的回復および臨床的結果に関連してｒｈＥＰＯ処置された患者では梗塞サイズの減少の強い傾向があることを示した。患者は、卒中後の最初の日には１日１回ｒｈＥＰＯを静脈内に受け取った（３．３×１０４Ｕ）。患者の脳脊髄液中のＥＰＯの平均濃度は、１７Ｕ／ｌに増加した（正常な値は約１Ｕ／ｌである）。患者における血清レベルは、注入の３時間後にほぼ５，０００Ｕ／ｌとなった（正常な血清レベルは約１５Ｕ／ｌである）。更に、ＥＰＯを使用しては、急性卒中の取り囲んでいる領域の再かん流損傷を減少させるのにも成功することができた。
【００２６】
ＥＰＯおよびＥＰＯ−Ｒは、ヒトおよびげっ歯類の脳組織において発現され（Siren AL et al. (2001) Acta Neuropathologica 101:271-276）、低酸素症誘導性であり（Jelkmann. W (1994) Clin. Investig. 72: 3-10）、そして顕著な神経保護潜在力を証明した（Bernaudin, M et al. (1999) J. Cereb. Blood Flow Metab. 19: 643-651; Genc, S et al. (2001) Neurosci. Lett. 298: 139-141）ことが知られている。成人ヒト脳では、ＥＰＯおよびそのレセプターの弱い発現のみがニューロンおよびアストロサイトにおいて報告されている（Siren AL et al. (2001) Acta Neuropathologica 101: 271-276）。いずれにせよ、虚血および／または低酸素症後のヒト脳において、ＥＰＯが血管組織および炎症性細胞において見られ、血管および神経突起およびアストロサイト突起のＥＰＯ−Ｒは、梗塞および梗塞周囲のゾーンにおいて処理される。より古い虚血梗塞では、ＥＰＯおよびＥＰＯ−Ｒは、反応性グリアにおいて最も強かった。ターゲット細胞におけるＥＰＯ−Ｒ刺激の正味の効果は、増殖、アポトーシスの抑制、および赤芽球の場合には、分化である。
【００２７】
ＢＢＢは、ＥＰＯなどの大きなグリコシル化分子を有効に排除するということが推測されていた。古典的見地ではＢＢＢは大きな分子を透過させることはできないと考えられるけれども、研究は、いくらかの大きな分子が、毛細管内皮を横切って脳に特異的に輸送されて、脳機能に影響を与えうることを示した。これは、内皮細胞の内腔表面に存在するレセプターへの結合を介して起こる。これは、エンドサイトーシスを開始し、次いでＢＢＢを横切るトランスロケーションが起こる。ＥＰＯ−Ｒは脳毛細管で発現されるので、ＢＢＢを通るＥＰＯの輸送はレセプター媒介輸送を介して機能するということが推測される。
【００２８】
注目すべきことに、組織保護のために必要なＥＰＯの血清濃度は、赤血球生成のために必要な濃度よりも高い。これに対する１つの理由は、組織保護のためのレセプターは赤血球系前駆体と比較してより低いアフィニティー（約１０００倍）を示すということである（Masuda, S et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 11208-11216）。他の理由は、ＢＢＢの存在であることができる。予備臨床的データは、組織損傷に対する保護のために必要なＥＰＯの最小治療レベルは、３００〜５００mlU／kg体重のオーダーにあると思われることを示唆している。ＥＰＯの単位は、１５μモルＣｏＣｌ２（塩化コバルト）のようにラットにおける同じ赤血球生成反応を誘導するＥＰＯの量として定義される。従って、簡単に言えば、ＥＰＯは脳および脊髄のニューロンに対する神経保護効果を有することが知られている。しかしながら、このような治療のためのＥＰＯの潜在的使用は、このよう効果を達成するために必要な実質的に高い治療レベルの必要により限定される。改良された半減期を有し、そしてＢＢＢを横切る新規な赤血球生成刺激因子（ＥＳＡ）は、特にそのようなＥＳＡが血液循環に相対的に低い開始濃度で投与されてネガティブな副作用を回避することができるならば、好ましいであろう。
【００２９】
当技術分野の状態の問題は、特許請求の範囲に記載の特定の分子量およびリンカー構造を有する共有結合により組み込まれたポリ（エチレングリコール）基を含む本発明のＮＥＡの使用により解決される。特に、このＮＥＡは、血液循環に医薬を導入することによる脳および脊髄の神経変性障害の処置のための医薬の製造のために使用される。好ましい態様では、該ＮＥＡは、少なくとも１つの遊離アミノ基を有し、そしてエリスロポエチン部分を含む化学的に改変された赤血球生成分子であって、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１つのグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
−ＣＯ−（ＣＨ２）Ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、（ここで各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（即ち、カルボニル）は前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、Ｒは低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは約４５０〜約９００であり；ｎは１〜３であり、そしてｎとｍは、得られるＮＥＡの分子量が、改変されていないエリスロポエチン糖タンパク質の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）に共有結合されている、化学的に改変された赤血球生成分子である。
【００３０】
好ましくは、ＮＥＡは、式：
【化６】
2009510008.tif 000002
（式中、ｘ、ｍ、ｎおよびＲは請求項１に定義されたとおりであり、そしてＰは、ポリ（エチレングリコール）基（１つまたは複数）とアミド結合（１つまたは複数）を形成するｎ個のアミノ基（１つまたは複数）のないエリスロポエチン部分の残基である）
で示される。上記した形態の範囲内で、Ｒは最も好ましくはメチルであり、ｍは約６５０〜約７５０であり、そしてｎは１である。
【００３１】
最も好ましくは、本発明の方法で使用されるＮＥＡは、式：
【化７】
2009510008.tif 000003
（式中、ｍは６５０〜７５０であり、ｎは１であり、そしてＰはエリスロポエチン部分の残基である）
を有する。
【００３２】
好ましくは、エリスロポエチン部分は、内在性遺伝子活性化により発現されうるヒトエリスロポエチン糖タンパク質であり、そして配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００３３】
または、エリスロポエチン部分は、１〜６個のグリコシル化部位の付加により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有する。
【００３４】
他の好ましい態様では、本発明の方法により処置することができる脳および脊髄の神経変性障害は、卒中、ＴＢＩ（外傷性脳損傷）、または脊髄損傷から選ばれる急性事象に関係する。更に、脳および脊髄の神経変性障害は、卒中、統合失調症、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ染色体関連振戦／運動失調症候群）、パーキンソン病、スポンジ形エンセファロパシー、多発性硬化症およびバクテリアもしくはウイルス感染と関連した神経変性を含む慢性処置に関係することができる。
【００３５】
最近の方法では、ＮＥＡは、神経変性障害を処置もしくは軽減するのに十分な量（「治療有効量」）で投与される。ＮＥＡは、ＥＰＯ治療に使用される慣用の方法により患者に投与されうる。ＮＥＡの正確な量は、処置されるべき状態の正確な型、処置されるべき患者の状態、および組成物中の他の成分に依存する。μgで示される量は、それぞれのエリスロポエチン（即ち、タンパク質）部分のみに関係する。好ましくは、患者は、本発明のＥＳＡ約０．１〜約１００μg／kg体重、好ましくは、約１〜約１０μg／kg体重を週に１回投与される。
【００３６】
必要ならば、ＮＥＡは、より頻繁に投与されてもよい。しかしながら、本発明に従って使用されるＮＥＡは、処置される疾患および投与の種類に依存して、２週間毎に、３週間毎にまたは月１回もしくはより長い時間間隔においてすら投与されることもできる。コンジュゲートを含有する医薬組成物は、ニューロンの死により特徴付けられる神経変性障害を経験しているヒト患者に種々の手段により投与するための有効な強度で処方されうる。コンジュゲートの平均治療有効量は、変わることができ、そして特に免許のある医師の推奨および処方箋に基づくべきである。
【００３７】
本発明に従うＮＥＡｓの特異的活性は、当技術分野で知られている種々のアッセイにより決定されうる。本発明の精製されたＮＥＡの生物学的活性は、例えば、ヒト患者への注射によるＮＥＡの投与が脳および脊髄のニューロンの保護をもたらすようなものである。
【００３８】
本発明の医薬製剤は、薬学的に許容できる担体またはビヒクルと共に処方される注射に適当な医薬組成物を含む。このような医薬組成物の調製は、当技術分野で知られている。例えば、US2002/0037841 A1（WO 01/87329に対応する）参照。このＵＳ公報は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の物を処方するための薬学的に許容できる担体は、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質等を含む。
【００３９】
更に、任意の安定剤または充填剤を添加しまたは添加しないで、組成物の噴霧乾燥された調製物の使用は望ましいことがありうる。
【００４０】
本発明で使用されるＥＳＡｓは、張力剤、例えば、１３２mM塩化ナトリウムを含有するｐＨ７の１０mMリン酸ナトリウム／カリウムバッファー中に処方されうる。場合により、医薬組成物は、保存剤を含有することができる。医薬組成物は、種々の量のエリスロポエチンタンパク質、例えば１０〜１０００μg／ml、好ましくは５０μgまたは４００μgを含有することができる。
【００４１】
ＮＥＡは、好ましくは、注射、皮膚パッチ、皮下沈着または吸入により血液循環に導入されるであろう。
【００４２】
好ましくは、ＮＥＡは、神経変性の急性症例の場合には２週間までの間約２５μg〜約５００μg／日の用量で、または神経変性疾患の慢性処置の場合には約２５μg〜約１０００μg／週を適用することにより個体に投与されるであろう。後者の症例における投与は、適用の型および疾患の型に依存して毎月１回の適用までまたはより長い時間枠においてさえ１回までに拡大することもできる。好ましい態様では、ＮＥＡは急性症例では１週間まで約１６５μg／日でまたは慢性症例では約２００μg／週で適用されるであろう。
【００４３】
更に、本発明は、前記した使用に従い有用なＮＥＡおよび血液脳関門の透過性を改良する物質を含むキットに関するものであり、そして血液脳関門の透過性を改良する物質はマンニトールである。
【００４４】
上記したヒトエリスロポエチンおよび類似したタンパク質は、内在性遺伝子活性化により発現されうる。好ましいヒトエリスロポエチン糖タンパク質は、配列番号１および配列番号２のこれら、最も好ましくは配列番号１のこれらである。
【００４５】
更に、Ｐは、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個の追加のグリコシル化のための部位を有するそのアナログの残基からなる群より選ばれうる。下記に詳細に記載のとおり、ＥＰＯの調製および精製は、当技術分野で周知されている。ＥＰＯとは、任意の慣用のソース、例えば、組織、タンパク質合成、天然もしくはリコンビナント細胞による細胞培養物から得られる、天然もしくはリコンビナントタンパク質、好ましくはヒト、を意味する。ＥＰＯの活性を有する任意のタンパク質、例えばムテインまたは他の改変されたタンパク質が包含される。この点で「任意の活性」は、ニューロン細胞のみに提示されたＥＰＯレセプターへの結合特異性も含む。従って、赤血球生成活性を示さない本発明に従うＮＥＡ誘導体が含まれる。
【００４６】
リコンビナントＥＰＯは、リコンビナントＤＮＡ技術によりまたは内在性遺伝子活性化によるＣＨＯ−、ＢＨＫ−またはＨｅｌａ細胞系における発現により調製されうる。内在性遺伝子活性化によるＥＰＯを含むタンパク質の発現は、当技術分野で周知であり、そして例えば、U.S.Patents Nos. 5,733,761, 5,641,670,および5,733,746ならびにinternational patent publication Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667およびWO 91/09955に開示されており、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。エリスロポエチン糖タンパク質産物の調製のための好ましいＥＰＯ種は、ヒトＥＰＯ種である。更に好ましくは、ＥＰＯ種は、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＥＰＯ、更に好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列である。
【００４７】
更に、Ｐは、１〜６個の追加のグリコシル化のための部位を有する糖タンパク質アナログの残基であることができる。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチドバックボーンに沿った特異的位置で起こり、そしてタンパク質安定性、分泌、細胞レベル以下の局在化（subcellular localization）および生物学的活性などのタンパク質の物理的性質に顕著に影響を与える。グリコシル化には通常２つの型がある。Ｏ−連結されたオリゴ糖はセリンまたはトレオニン残基に結合され、そしてＮ−連結されたオリゴ糖は、アスパラギン残基に結合されている。Ｎ−連結されたオリゴ糖およびＯ−連結されたオリゴ糖の両方に見出される１つの型のオリゴ糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）であり、これは９個以上の炭素原子を含有するアミノ糖のファミリーである。シアル酸は、通常Ｎ−連結されたオリゴ糖およびＯ−連結されたオリゴ糖の両方における末端残基であり、そしてそれは負の電荷を有するので、糖タンパク質に酸性の性質を与える。１６５アミノ酸を有するヒトエリスロポエチンは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を含む３個のＮ−連結されたオリゴ糖鎖および１個のＯ−連結されたオリゴ糖鎖を含有する。Ｎ−連結されたグリコシル化は、位置２４、３８および８３に位置したアスパラギン残基で起こり、そしてＯ−連結されたグリコシル化は、位置１２６に位置したセリン残基で起こる。オリゴ糖鎖は、末端シアル酸残基で改変される。グリコシル化エリスロポエチンからのすべてのシアル酸残基の酵素による除去は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の損失をもたらすが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の損失をもたらさない。何故ならば、エリスロポエチンのシアリル化は、肝臓結合タンパク質により、その結合およびその後のクリアランスを阻止するからである。
【００４８】
本発明のＮＥＡｓの化学合成で使用される糖タンパク質は、シアル酸結合のための部位の数の増加をもたらすヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列の１つ以上の変化を有するヒトエリスロポエチンのアナログを含む。グリコシル化のために利用できる部位を増加または変更するアミノ酸残基の付加、欠失または置換を有するこれらの糖タンパク質アナログは、部位特異的突然変異誘発により発生させることができる。ヒトエリスロポエチンにおいて見出されるレベルよりも高いシアル酸のレベルを有する糖タンパク質アナログは、生物学的活性のために必要な第二級または第三級コンホメーションを乱さないグリコシル化部位を付加することにより発生させられる。本発明のＮＥＡｓの化学的合成で使用される糖タンパク質は、通常Ｎ−連結された部位もしくはＯ−連結された部位に極めて近接したところに１つ以上のアミノ酸の置換を含むグリコシル化部位において増加したレベルの炭水化物結合を有するアナログも含む。本発明のＮＥＡｓの化学合成で使用される糖タンパク質は、エリスロポエチンのカルボキシ末端端部から延びておりそして少なくとも１つの追加の炭水化物部位を与える１つ以上のアミノ酸を有するアナログも含む。本発明のＮＥＡｓの化学合成で使用される糖タンパク質は、少なくとも１つのグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有するアナログも含む。グリコシル化部位のこのような転位は、ヒトエリスロポエチンにおける１つ以上のグリコシル化部位の欠失および１つ以上の非天然に存在するグリコシル化部位の付加を包含する。追加のグリコシル化部位を有するエリスロポエチンアナログは、１９９５年３月１日に公開されたElliotへのEuropean Patent Application 640619に更に詳細に開示されている。
【００４９】
更に、本発明のＮＥＡｓの化学合成で使用される糖タンパク質は、下記のもの：
【化８】
2009510008.tif 000004
2009510008.tif 000005
から選ばれる改変により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を含むエリスロポエチンなどの（しかしこれに限定されない）少なくとも１つの追加のグリコシル化のための部位を含むアミノ酸配列を含む。
【００５０】
アミノ酸配列の改変について本明細書で使用された表示法は、上付の数（１つまたは複数）により示された対応する改変されていないタンパク質（例えば、配列番号１もしくは配列番号２のｈＥＰＯ）の位置（１つまたは複数）が、それぞれの上付の数（１つまたは複数）のすぐ前のアミノ酸（１つまたは複数）に変えられることを意味する。
【００５１】
糖タンパク質は、糖タンパク質のカルボキシ末端端部に少なくとも１つの追加のアミノ酸を有するアナログであって、該追加のアミノ酸は少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアナログであることもでき、即ち、上記したコンジュゲートは、糖タンパク質が、ヒトエリスロポエチンの配列を含む配列およびヒトエリスロポエチン配列のカルボキシ末端における第２配列を含み、ここで第２配列は少なくとも１つのグリコシル化部位を含有する化合物も指す。追加のアミノ酸は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端端部に由来するペプチドフラグメントを含むことができる。好ましくは、糖タンパク質は、（ａ）カルボキシ末端から延びているアミノ酸配列、Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ（配列番号３）を有するヒトエリスロポエチン；（ｂ）更にＳｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯ  を含む（ａ）のアナログ；および（ｃ）更にＡｓｎ３０  Ｔｈｒ３２  Ｖａｌ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯを含む（ａ）のアナログからなる群より選ばれるアナログである。
【００５２】
糖タンパク質は、少なくとも１つのグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有するアナログであることもできる。転位は、ヒトエリスロポエチンにおけるＮ−連結された炭水化物部位のいずれかの欠失およびヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列の位置８８におけるＮ−連結された炭水化物部位の付加を含むことができる。好ましくは、糖タンパク質は、Ｇｌｎ２４  Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯ；Ｇｌｎ３８  Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯ；およびＧｌｎ８３  Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯからなる群より選ばれるアナログである。
【００５３】
本明細書で使用された「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する線状もしくは分岐状アルキル基を意味する。低級アルキル基の例は、メチル、エチルおよびイソプロピルを含む。本発明に従えば、Ｒは任意の低級アルキルである。Ｒがメチルであるコンジュゲートが好ましい。
【００５４】
記号「ｍ」は、ポリ（エチレンオキシド）基におけるエチレンオキシド残基（ＯＣＨ２ＣＨ２）の数を表す。エチレンオキシドの単一ＰＥＧサブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。従って、コンジュゲートの分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、数「ｍ」に依存する。本発明のコンジュゲートにおいて、「ｍ」は、約４５０〜約９００（約２０kDa〜約４０kDaの分子量に相当する）、好ましくは、約６５０〜約７５０（約３０kDaの分子量に相当する）である。数ｍは、本発明の得られるコンジュゲートが改変されていないＥＰＯに匹敵する生理学的活性を有するように選ばれ、該活性は、改変されていないＥＰＯの対応する活性と同じであるか、またはより高い活性、またはその一部（fraction）を表すことができる。「約」のある数の分子量は、それが慣用の分析技術により決定されるその数の合理的な範囲内にあることを意味する。数「ｍ」は、エリスロポエチン糖タンパク質に共有結合された各ポリ（エチレングリコール）基の分子量が約２０kDa〜約４０kDaであり、そして好ましくは約３０kDaであるように選ばれる。
【００５５】
本発明のコンジュゲートにおいて、数「ｎ」は、アミド連結（１つまたは複数）を介してエリスロポエチンタンパク質の遊離アミノ基（リシンアミノ酸のε−アミノ基および／またはアミノ末端アミノ基を含む）に共有結合したポリエチレングリコール基の数である。本発明のコンジュゲートは、ＥＰＯの分子あたり１つ、２つまたは３つのＰＥＧ基を有することができる。「ｎ」は、１〜３の範囲の整数であり、好ましくは、「ｎ」は１または２であり、更に好ましくは「ｎ」は１である。
【００５６】
式Ｉの化合物は、既知のポリマー物質：
【化９】
2009510008.tif 000006
（式中、Ｒおよびｍは上記のとおりである）
から、式ＩＩの化合物をエリスロポエチン糖タンパク質と縮合させることにより調製することができる。ｘが３である式ＩＩの化合物は、α−低級アルコキシ−ポリ（エチレングリコール）−酪酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ）である。ｘが２である式ＩＩの化合物は、α−低級アルコキシ−ポリ（エチレングリコール）−プロピオン酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）である。活性化されたエステルをアミンと反応させてアミドを形成するための任意の慣用の方法を利用することができる。上記した反応において、例示されたスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす離脱基である。タンパク質とのコンジュゲートを製造するための式ＩＩの化合物などのスクシンイミジルエステルの使用は、１９９７年９月３０日に発行されたU.S.Patent No. 5,672,662 (Harris, et al.)に開示されている。
【００５７】
ヒトＥＰＯは、９つの遊離アミノ基、アミノ末端アミノ基＋８つのリシン残基のε−アミノ基を含有する。ペグ化試薬を式ＩＩのＳＢＡ化合物と組み合わせると、ｐＨ７．５、１：３のタンパク質：ＰＥＧ比および２０〜２５℃の反応温度で、モノ−ペグ化種、ジ−ペグ化種および痕跡量のトリ−ペグ化種の混合物が生成することが見出された。ペグ化試薬が式ＩＩのＳＰＡ化合物ある場合は、タンパク質：ＰＥＧ比が１：２であることを除いて同様な条件で、主としてモノ−ペグ化種が生成する。ペグ化ＥＰＯは、混合物としてまたはカチオン交換クロマトグラフィーで分離された種々のペグ化種として投与することができる。反応条件（例えば、試薬の比、ｐＨ、温度、タンパク質濃度、反応の時間等）を操作することにより、異なるペグ化種の相対的量を変えることができる。
【００５８】
本発明は、上記したコンジュゲートを含む組成物の使用を提供する。少なくとも９０％のモノ−ＰＥＧコンジュゲート、即ち、ｎが１である、を含有する組成物を実施例５に示されたとおりに製造することができる。通常、エリスロポエチン糖タンパク質のモノ−ＰＥＧコンジュゲートが望ましい。何故ならば、それらはジ−ＰＥＧコンジュゲートよりも高い活性を有する傾向があるからである。モノ−ＰＥＧコンジュゲートの百分率およびモノ−ＰＥＧ種とジ−ＰＥＧ種との比は、組成物において溶離ピーク付近のより広い画分をプールして組成物におけるモノ−ＰＥＧの百分率を減少させるか、またはより狭い画分をプールして組成物におけるモノ−ＰＥＧの百分率を増加させることによりコントロールすることができる。約９０％のモノ−ＰＥＧコンジュゲートは、収率および活性の良好なバランスである。時には、例えば、少なくとも９２％または少なくとも９６％のコンジュゲートがモノ−ＰＥＧ種（ｎは１に等しい）である組成物が所望されうる。本発明の態様において、ｎが１であるコンジュゲートの百分率は、９０％〜９６％である。
【００５９】
本発明で提供された化学的に改変された赤血球生成タンパク質が単純拡散によりＢＢＢを通過することができるであろうということは直感に反する。何故ならば、本発明のＮＥＡは高度に親水性であり、そして大きい分子量を有するからである。これは、小さなＰＥＧ分子（２０００ダルトン分子量）によるペグ化は脳由来の神経栄養因子などのペプチドの受動的脳取り込みを減少させることを、Partridge et al.(Pharmaceutical Research,Vol.15,No.4,1998)が示したからである。それにもかかわらず、我々の下記の実施例は、ＣＳＦ中のＮＥＡｓの存在を明らかに示す。これらの発見は、分子の構造に組み込まれたポリ（エチレングリコール）部分を含む本発明のＮＥＡｓが促進されたか、あるいは能動輸送プロセスによりＢＢＢを通過することと合致しており、したがって我々はそのことを仮定する。
【００６０】
卒中に罹患している患者は、できるかぎり早く本発明のＮＥＡで処置されるべきである。慢性神経学的疾患に関して、ＮＥＡは血液循環におけるその改良された滞留時間（即ち、より長い半減期）により周期的に投与されるであろう。ＮＥＡは長い滞留時間を有し、そしてＥＰＯレセプターに対する減少したアフィニティーを示すので、ヘモグロビンレベルはかなり狭い範囲においてコントロールされうる。ＥＰＯで通常見出されるヘモグロビンレベルのピークおよび谷は、ＮＥＡを投与することにより減少されるので、血栓症および血液の望まない濃厚化（thickening）の増加した危険のようなネガティブな副作用が減少する。
【００６１】
本発明を、更に、例示的実施例により以下に説明する。これらの実施例は、本発明の種々の態様を表現するが、適用を限定することを意図しない。
【００６２】
実施例
実施例１：ＥＰＯのｍＰＥＧ−ＳＢＡによるペグ化
ヒトＥＰＯの醗酵および精製は、例えばＵＳ６，５８３，２７２、実施例１に記載されている。
【００６３】
ＵＳ６，５８３，２７２の実施例１の血清なしの技法に従って精製されたＥＰＯ（ＥＰＯｓｆ）は、分析方法により決定して均一であり、そして８つのアイソフォームからなる典型的なアイソフォームパターンを示した。それは、正赤血球マウスアッセイ（normocythaemic mouse assay）により決定して１９０，０００IU／mgの特異的生物学的活性を有していた。使用されたペグ化試薬は、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡであり、これはＲがメチルであり、ｘが３であり、そしてｍが６５０〜７５０である（平均約６８０、約３０kDaの平均分子量に相当する）、式ＩＩの化合物である。
【００６４】
ペグ化反応
ＥＰＯｓｆ１００ミリグラム（１０．３mg／mlＥＰＯｓｆストツク９．７１ml、５．４８μモル）に、３０kDaメトキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ５０６mg（１６．５μモル）（Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabamaから得られた）を含有する０．１Ｍリン酸カリウムバッファー１０ml、ｐＨ７．５、を加え、そして室温（２０〜２３℃）で２時間混合した。最終タンパク質濃度は５mg／mlであり、そしてタンパク質：ＰＥＧ試薬比は１：３であった。２時間後、氷酢酸でｐＨを４．５に調節することにより、反応を停止させ、そして精製の準備ができるまで２０℃で保存した。
【００６５】
精製
１．コンジュゲート混合物：ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ（スルホ−プロピルカチオン交換樹脂）約２８mlをＡＭＩＣＯＮガラスカラム（２．２×７．５cm）に詰め込み、そして１５０ml／時間の流速で２０mMアセテートバッファーｐＨ４．５で平衡化した。３０mgタンパク質を含有する反応混合物６mlを平衡化バッファーで５倍に希釈し、そしてカラムに適用した。吸着されなかった物質をバッファーで洗い落とし、そして吸着されたＰＥＧコンジュゲート混合物を平衡化バッファー中の０．１７５Ｍ  Ｎａｃｌでカラムから溶出した。カラムにまだ残っている改変されなかったＥＰＯｓｆを７５０mM  ＮａＣｌで溶出した。カラムを出発バッファー中で再平衡化した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてそれらのペグ化の程度を決定した。０．１７５Ｍ  ＮａＣｌ溶出液は、モノペグ化種、ジペグ化種および痕跡量のトリペグ化種を含有しており、これに対して７５０mM  ＮａＣｌ溶出液は改変されていないＥＰＯｓｆを含有していることが見出された。
【００６６】
２．ジ−ＰＥＧおよびモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ：先の工程でカラムから溶出された精製されたコンジュゲート混合物をバッファーで４倍希釈し、そしてカラムに再適用し、そして記載されたとおりに洗浄した。ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆおよびモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆは、それぞれ、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１７５Ｍ  ＮａＣｌでカラムから別々に溶出された。溶出は、７５０mM  ＮａＣｌでも行って、いかなる残っている改変されなかったＥＰＯｓｆも溶出した。
【００６７】
代替的には、反応混合物をアセテートバッファーで５倍希釈し、そしてＳＰ−セファロースカラムに適用した（〜０．５mgタンパク質／mlゲル）。カラムを洗浄し、そしてモノＰＥＧ−ＥＰＯｓｆを吸着させ、ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆおよび改変されていないＥＰＯｓｆは、前節に記載のとおりに溶出した。
【００６８】
結果
３０kDaの数平均分子量を有する線状ＰＥＧ分子を化学的にコンジュゲーションさせることにより、ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆを合成した。ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆは、ＥＰＯｓｆの第一級アミノ基と３０kDa  ＰＥＧ−酪酸のスクシンイミジルエステル誘導体との反応から誘導され、この反応はアミド結合をもたらした。
【００６９】
結果を表１に要約する。精製されたコンジュゲート混合物はモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆおよびジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆを含んでおり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定して改変されていないＥＰＯｓｆを含んでいなかった。コンジュゲート混合物は、２３．４mgまたは出発物質の７８％に相当した。モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆとジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆのカチオン交換クロマトグラフィー分離は、コンジュゲート混合物におけるモノ−ＰＥＧ対ジ−ＰＥＧ比が殆ど１：１であることを示した。反応完了の後に、モノ：ジ：改変されていない、の個々の成分の割合は、４０：３８：２０（％）であった。全体の収率は殆んど定量的であった。
【００７０】
【表１】
2009510008.tif 000007
【００７１】
実施例２：ｍＰＥＧ−ＳＰＡによるＥＰＯのペグ化
実施例２で使用されたＥＰＯｓｆの異なるアリコートを３０kDaメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama）と反応させた。反応は、１：２のタンパク質：試薬比で行われ、そして精製技術は実施例２に従った。主としてモノ−ペグ化種が生成した。
【００７２】
上記したＥＰＯコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、US 6,583,272の実施例４に記載されている。
【００７３】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を、Charles River RCC, Fuellinsdorf,Switzerlandからの雄のＷｉｓｔｅｒラットで行った。ＥＰＯおよびＥＰＯコンジュゲート（実施例１に従って発生させた）を両方ともラットの尾部静脈への２５μg／kg体重の単一用量として静脈内に投与した。指示された時点（注射の２および６時間後）で、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを採取し、次いで血漿を集めた（舌下または末端）。ＣＳＦは、小脳延髄槽（大槽）への採集針（０．７×１９mm）の挿入により得られた。ＣＳＦは、毛細管力によってシリコンチューブ（内径０．５mm）により排液された。この技術を使用して、ラットから〜０．１mlのＣＳＦを得ることが可能である。
【００７４】
化合物
ＥＰＯ、濃度：１．８４  mg／ml
投与容積：２  ml／kg体重
組成：水性バッファー
ＥＰＯコンジュゲート、濃度：６．２  mg／ml
投与容積：２  ml／kg体重
組成：水性バッファー
【００７５】
採集されたサンプル中の化合物濃度は、酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定された。
【００７６】
結果
図１〜３は、本発明に従うＮＥＡが血液脳関門を横切ることができることを示す。２〜６時間の期間の範囲内で、髄液中のコンジュゲートの濃度は増加する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】注射の２および６時間後のラットの血清中のＥＰＯおよび本発明のＮＥＡの濃度を示す。
【図２】注射の２および６時間後のラットの髄液中のＥＰＯおよび本発明のＮＥＡの濃度を示す。
【図３】注射の２および６時間後のラットの髄液および血清中のＥＰＯおよび本発明のＮＥＡの濃度を示す。
【図１】
2009510008.tif 000013
【図２】
2009510008.tif 000014
【図３】
2009510008.tif 000015
【配列表】
2009510008000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月19日(2008.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要としている患者の血液循環に有効量の医薬を投与することにより脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための医薬を製造するための赤血球生成分子の使用であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
【化１】
2009510008.tif 000016
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、
（ここで、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、
Ｒは、低級アルキルであり；
ｘは、２または３であり；
ｍは、約４５０〜約９００であり；
ｎは、１〜３であり、そして
ｎとｍは、得られる赤血球生成分子の分子量が、エリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）
に共有結合されている、赤血球生成分子の使用。
【請求項２】
式：
【化２】
2009510008.tif 000017
（式中、ｘ、ｍ、ｎおよびＲは、請求項１に定義されたとおりであり、そしてＰは、ポリ（エチレングリコール）基とアミド結合を形成するｎ個のアミノ基のないエリスロポエチン部分の残基である）
を有する、請求項１に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項３】
Ｒが、メチルである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項４】
ｍが、約６５０〜約７５０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項５】
ｎが、１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項６】
Ｒが、メチルであり、ｍが約６５０〜約７５０であり、そしてｎが１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項７】
式：
【化３】
2009510008.tif 000018
（式中、ｍは６５０〜７５０であり、ｎは１であり、そしてＰは請求項１に定義されたとおりである）
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項８】
エリスロポエチン部分が、ヒトエリスロポエチンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項９】
エリスロポエチン部分が、配列番号１の配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１０】
エリスロポエチン部分が、１〜６個のグリコシル化部位の付加により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１１】
脳および脊髄の神経変性障害が、卒中、外傷性脳損傷または脊髄損傷から選ばれる急性事象に関係する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１２】
脳の神経変性障害が、慢性処置に関係し、そして統合失調症、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症、脆弱Ｘ染色体関連振戦／運動失調症候群、パーキンソン病、スポンジ形エンセファロパシー、多発性硬化症およびバクテリアもしくはウイルス感染と関連した神経変性から選ばれる、前記請求項１〜１０のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１３】
血液循環への赤血球生成分子の投与が、注射、皮膚パッチ、皮下沈着または吸入により行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１４】
投与されるべき量が、エリスロポエチン部分の量により測定して、急性症例では約２週間までで約２５μg〜約５００μg／日であり、または慢性処置では約２５μg〜約１０００μg／週である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１５】
急性症例では１週間までで１６５μg／日を適用すること、または慢性処置では２００μg／週を適用することによる、請求項１４に記載の赤血球生成分子の使用。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の有用な赤血球生成分子を含むキット。
【請求項１７】
赤血球生成分子および血液脳関門の透過性を改良する物質を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１６〜１７のいずれか一項に記載のキットの製造方法。
【請求項１９】
治療を必要としている患者の血液循環に治療有効量の赤血球生成分子を投与することを含む脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための方法であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
【化４】
2009510008.tif 000019
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、
（ここで、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、
Ｒは、低級アルキルであり；
ｘは、２または３であり；
ｍは、約４５０〜約９００であり；
ｎは、１〜３であり、そして
ｎとｍは、得られる赤血球生成分子の分子量が、エリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）
に共有結合されている、脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための方法。
【請求項２０】
治療を必要としている患者の血液循環に有効量の医薬を投与することにより脳及び脊髄の神経変性障害を処置するための赤血球生成分子を含む医薬であって、該赤血球生成分子が少なくとも１つの遊離アミノ基を有するエリスロポエチン部分を含み、該エリスロポエチン部分は、ヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加または少なくとも１個のグリコシル化部位の転位により改変されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンのアナログからなる群より選ばれ；該エリスロポエチン部分は、式：
【化５】
2009510008.tif 000020
の「ｎ」ポリ（エチレングリコール）基、
（ここで、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、式中、
Ｒは、低級アルキルであり；
ｘは、２または３であり；
ｍは、約４５０〜約９００であり；
ｎは、１〜３であり、そして
ｎとｍは、得られる赤血球生成分子の分子量が、エリスロポエチン部分の分子量を差し引いて、約２０kDa〜約１００kDaであるように選ばれる）
に共有結合されている、医薬。
【国際調査報告】
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2009510008.tif 000023
2009510008.tif 000024
2009510008.tif 000025