(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを起源とする少なくとも３つのNSポリペプチドを含んでなり、NSポリペプチドが天然型配置中で現れる順序とは異なる順序で配置されている、単離された融合タンパク質に関する。本発明はまた、前記の融合タンパク質をコードする核酸分子、及び該核酸分子を含んでなるベクターに関する。本発明はまた、前記核酸分子又は前記ベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子及び宿主細胞に関する。本発明はまた、前記融合タンパク質を組換え産生する方法に関する。最後に、本発明はまた、前記タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞を含んでなる医薬組成物、並びにHCV感染、HCV関連疾患及び病的状態を治療又は予防するためのその治療的使用、並びに宿主生物においてHCVに対する免疫応答を誘導又は刺激する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)を起源とする少なくとも３つのNSポリペプチドを含んでなり、NSポリペプチドが天然型配置中で現れる順序とは異なる順序で配置されている、単離された融合タンパク質。
【請求項２】
前記NSポリペプチドの各々の間の融合が直接であるか又はリンカーを介している、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３】
前記NSポリペプチドが全て同じHCV系統又は単離株を起源とする、請求項１又は２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項４】
前記NSポリペプチドの少なくとも２つが異なるHCV系統又は単離株を起源とする、請求項１又は２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項５】
NS4AポリペプチドとNS3ポリペプチドとNS5Bポリペプチドとを含んでなり、NS4AをＮ末端にNS5BをＣ末端に有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項６】
NS4AポリペプチドとNS3ポリペプチドとNS4BポリペプチドとNS5Bポリペプチドとを含んでなり、NS4AをＮ末端にNS5BをＣ末端に有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項７】
前記NS3ポリペプチドが、有意に減少したプロテアーゼ活性を示すように、天然型NS3ポリペプチドと比較して改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項８】
前記NS3ポリペプチドが、有意に減少したヘリカーゼ活性を示すように、天然型NS3ポリペプチドと比較して改変されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項９】
前記NS5Bポリペプチドが、有意に減少したRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を示すように、天然型NS5Bポリペプチドと比較して改変されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１０】
天然型HCVポリタンパク質前駆体のNS3/NS4A接合部、NS4A/NS4B接合部、NS4B/NS5A接合部及びNS5A/NS5B接合部に通常存在する１又はそれより多くのNS3認識切断部位を含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１１】
前記NS4A、NS4B及び/又はNS5Bポリペプチドが、天然型NS4A、NS4B及び/又はNS5Bポリペプチドの膜固定に通常関与する１又はそれより多い疎水性ドメインを欠失するように改変されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１２】
前記NS3ポリペプチドが、
12位から56位にわたる部分、70位から155位にわたる部分及び218位から248位にわたる部分を保持し；
Hisとは異なるアミノ酸残基、例えばAla残基による57位のHis残基の置換を含んでなり；
Thrとは異なるアミノ酸残基、例えばAla残基による269位のThr残基の置換を含んでなり；
Argとは異なるアミノ酸残基、例えばAla残基による464位のArg残基の置換を含んでなり；及び
631位のThr残基を含まない
様式で少なくとも改変されている配列番号１に示される天然型NS3タンパク質を起源とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１３】
前記NS3ポリペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１４】
前記NS4Aポリペプチドが、
配列番号２の21位〜33位の部分を含有し；
配列番号２の１位〜20位の部分を含有しない
様式で少なくとも改変されている配列番号２に示される天然型NS4Aタンパク質を起源とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１５】
前記NS4Aポリペプチドが、前に開始Met残基が付された配列番号６に示されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１４に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１６】
前記NS4Bポリペプチドが、
78位のSer残基から109位のLeu残基にわたる部分を含んでなり；
261位のCys残基を含まない
様式で少なくとも改変されている配列番号３に示される天然型NS4Bタンパク質を起源とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１７】
前記任意のNS4Bポリペプチドが、配列番号７に示されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１８】
前記NS5Bポリペプチドが、
155位のArg残基から182位のLeu残基にわたる部分を含んでなり；
Aspとは異なるアミノ酸残基、例えばAsn残基による220位のAsp残基の置換を含んでなり；
Aspとは異なるアミノ酸残基、例えばAsn残基による318位のAsp残基の置換を含んでなり；
571位のTrp残基から591位のArg残基にわたる部分を含まない
様式で少なくとも改変されている配列番号４に示される天然型NS5Bタンパク質を起源とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１９】
前記NS5Bポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１８に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号９又は１０に示されるアミノ酸配列と相同な又は同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２２】
哺乳動物宿主細胞における発現に最適化されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
配列番号１１又は１２に示されるヌクレオチド配列と相同な又は同一のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
酵母宿主細胞における発現に最適化されたヌクレオチド配列を有する、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
前記酵母宿主細胞がサッカロマイセス セレビシエ、サッカロマイセス ポンベ及びピキア パストリスからなる群より選択される、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号１３又は１４に示されるヌクレオチド配列と相同な又は同一のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２５に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
原核生物宿主細胞における発現に最適化されたヌクレオチド配列を有する、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
配列番号15又は１６に示されるヌクレオチド配列と相同な又は同一のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２７に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子の１又はそれより多いコピーを含んでなるベクター。
【請求項３０】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２９に記載のベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子。
【請求項３１】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２９に記載のベクター又は請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子を含んでなる宿主細胞。
【請求項３２】
(ａ)請求項２９に記載のベクター又は請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子を宿主細胞に導入して、請求項３１に記載のトランスフェクト宿主細胞又は感染宿主細胞を作製し；
(ｂ)前記トランスフェクト宿主細胞又は感染宿主細胞を該宿主細胞の増殖に適切な条件下でインビトロ培養し；
(ｃ)該細胞培養物から融合タンパク質を回収し；及び
(ｄ)任意に、回収した融合タンパク質を精製する
ことを含んでなる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を組換え的に製造する方法。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子、請求項３１に記載の宿主細胞又はそれらの任意の組合せを含んでなる組成物。
【請求項３４】
HCV感染、HCV関連の疾患及び病的状態の治療又は予防を意図する薬物の製造のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子、請求項３１に記載の宿主細胞又は請求項３３に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
請求項３３に記載の組成物が抗HCV免疫応答をプライムするか若しくはブーストするかのいずれか又はプライムしブーストするために使用される、プライムブースト治療様式に従って行われる、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
１又はそれより多いHCV薬での化学療法と組み合せて行われる請求項３４又は３５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
HCVはフラビウイルス科に属し、急性肝炎及び慢性肝疾患の主要な原因である。HCVウイルス感染は高率(54〜86％)の慢性化と関連し、５〜24％の症例で、20〜30年の期間にわたって肝硬変、続いて肝細胞ガン腫に進展することがある(McHutchinson, 2004, The American Journal of Managed Care 10, S21-29)。現在のところ、ヨーロッパや米国において、肝臓移植の20〜30％及び肝臓ガンの15〜33％がHCV感染によるものとされている。世界保健機関は、1999年に、世界中で約170百万人がHCVに慢性感染しており、毎年３〜４百万人が新たに感染していると推定した。
【０００２】
HCVは、エンベロープを持つウイルスであり、およそ9,600ヌクレオチドのプラス鎖の一本鎖リボ核酸(RNA)ゲノムを有し、この構成は全てのHCV系統及び単離株に共通である。０期におけるHCVゲノムの翻訳は、遺伝子型に従い3010〜3030アミノ酸の大きなポリタンパク質を生成する。このポリタンパク質は、ウイルス及び細胞のプロテアーゼによりタンパク質分解性に切断されて10のウイルスタンパク質を生じる。ポリタンパク質のアミノ末端側３分の１は、ビリオン構造タンパク質：コア(Ｃ)タンパク質及びエンベロープ糖タンパク質E1及びE2をコードする。構造領域の後には、小さな内在性膜タンパク質p7があり、これはイオンチャンネルとして機能しているようである。ゲノムの残りは、非構造(NS)タンパク質NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5Bをコードする。これらはウイルスのライフサイクルの細胞内プロセスを媒介している(Penin, 2004, Hepatology 39, 5-19)。HCVはまた、Ｆ(フレームシフト)又はARFP(オルターナティブリーディングフレームタンパク質：alternative reading frame protein)と呼ばれる小さなタンパク質をコードする。このタンパク質は、コア遺伝子内での代替の(alternative)＋１リーディングフレームへのリボソームフレームシフト又は内部開始により生じることがある(Branchら, 2005, Semin. Liver Dis. 25:105-117；及び国際公開第WO2004/069864号を参照)。このポリタンパク質をコードする配列の両末端には、２つの高度に保存された非翻訳領域(UTR)、それぞれ５'UTR及び３'UTRが隣接する。５'UTRに位置する内部リボソーム進入部位(internal ribosomal entry site)が翻訳開始のためのリボソーム固定を可能とし、一方３'UTRはウイルス複製の開始に重要な役割を演じると考えられる。
【０００３】
HCV慢性感染患者に対する現時点での標準的な治療法は、PEG化インターフェロン アルファ(PEG-INF-α)及びリバビリンの併用である(Friedら, 2002, N. Engl. J. Med. 347, 975-982)。しかしながら、この治療法は高価であり、10％の症例で治療の途中終了を招く相当の副作用を伴い、相当数の患者(例えば、非代償性肝硬変の患者、自己免疫疾患の患者、抑鬱の病歴の患者及び妊娠中の患者)には不適合である。更に重要なことに、治療された患者の僅かに50％が応答者(responder)であり(Falck-Ytterら, 2002, Ann. Intern. Med. 136, 288-292)、そして遺伝子型１の感染患者についての応答率は更に低い(27％〜35％)。
【０００４】
全体的にみて、HCV感染の制御においてＴ細胞免疫が演じる重大な役割、特に非構造(NS)タンパク質に向けられたCD4+及びCD8+Ｔ細胞媒介応答を強調する多くの実験的証拠が蓄積しつつある(例えば、Francavillaら, 2004, Eur. J. Immunol. 34, 427-37；Grakouiら, 2003, Science 302, 659-662；Shoukryら, 2003, J. Exp. Med. 197, 1645-1655；Thimmeら, 2001, J. Exp. Med. 194, 1395-1406；Lechnerら, 2000, J. Exp. Med. 191, 1499-1512；Gerlach, 1999, Gastroenterology 117, 933-941；Folgoriら, 2006, Nat Med. 12, 190-197)。実際、急性自己制限Ｃ型肝炎から自然に回復する患者で代表的に、活発なHCV特異的Ｔ細胞応答が観察される一方、持続感染患者では、Ｔ細胞応答は弱く、狭く集中している。他方、中和抗体(Ｂ細胞媒介免疫)が演じる役割は、更に明確ではない(Logvinoff, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 10149-54)。
【０００５】
15年以上前にHCVウイルスが発見されて以来、細胞培養でのウイルスの効率的な増殖を達成することが困難なため、及び容易に利用可能なウイルス感染の実験室モデルがないため、HCVに対するワクチンは未だ存在しない。しかしながら、現在、多くのワクチン候補が出現している(Barth及びBaumert, 2004, Novel vaccine strategies, p. 214-227, In State of the Art of Hepatology: Molecular and Cell Biology eds Kluwer Academic Publishers；Inchauspe and Feinstone, 2003, Clin. Liver Dis. 7, 243-259)。これらは、例えば、HCV由来ペプチド(Cernyら, 1995, J. Clin. Invest. 95, 521-30)、組換え産生HCV抗原、DNAベース及びウイルスベースのワクチン(Brinsterら, 2001, Hepatology 34, 1206-1217；Fornsら, 2000, Hepatology 32, 618-625)、及びHCVウイルス様粒子(Baumertら, 1999, Gastroenterology 117, 1397-1407；Jeongら, 2004, J. Virol. 78, 6995-7003)に基づいている。いくつかの候補は現在、前臨床モデルで評価されており、第一弾は臨床試験に入りつつある。現在フェーズIIにある最先端のワクチンは、アジュバント添加E1エンベロープタンパク質(Innogenetics)又はアジュバント添加CD4+及びCD8+Ｔ細胞エピトープ(Intercell)を利用している。
【０００６】
最近10年間に活発に展開されているアプローチは、種々の抗原ドメインに関連するポリタンパク質の免疫原としての使用に属している。先行技術のポリタンパク質の大多数は、単一のそして希望のもてる免疫原性ポリペプチドを形成するために、種々のNS HCVタンパク質由来の抗原性ポリペプチド、フラグメント又はエピトープの互いの融合体から得られている。例えば、国際公開第WO01/30812号及び同第WO03/031588号は、NS3からNS5BまでのHCVポリペプチドを融合して主要なNSタンパク質を包含する単一ポリペプチドを形成することを開示している。国際公開第WO03/097677号は、NS3、NS4B及びNS5Bポリペプチドに由来する30〜70アミノ酸の抗原性フラグメントの融合を記載している。国際公開第WO2004/046176号は、コア、NS3、NS4B及びNS5Bを含んでなるポリタンパク質を開示している。国際公開第WO2004/111082号は、NS3、NS4及びNS5Bを共発現するためのアデノウイルス及びMVAベクターを記載しており、ここでNS3とNS4は融合タンパク質として発現され、NS5Bは独立して発現される。
【０００７】
先行技術のポリタンパク質の配置は天然型のものと同様であり、種々の成分が天然型HCV前駆体において天然に生じる順序で現れることに留意すべきである。詳細には、NS3の後にNS4が続き、NS4の後にNS5が続いている。しかし、「天然型」配置は、得られるポリタンパク質の発現及び免疫原性に関して最適ではない。
【０００８】
HCVは、感染の慢性的かつ持続性の性質、高い有病率及び関連疾患の顕著な罹患率のために、今後何年もの間、世界的な健康に対する重大な脅威であり続けると予測され得る。したがって、HCV感染又はHCV関連疾患若しくは障害の予防及び治療を改善するための、より免疫原性の高いポリペプチド、その発現ベクター、製造方法及びそれらの使用の開発に対する重要な必要性が存在する。
【０００９】
本発明は、非天然型配置に配列された非構造(NS)ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。HCV NSポリペプチド(例えば、NS3、NS4A、NS5B及び任意にNS4B)の特定のフラグメントを選択し、得られた融合タンパク質の免疫原性及び/又は組換え産生プロセスを最適化するために特異的に配置した。天然型NSポリペプチドと比較して、本発明で提供される新規なHCV融合タンパク質又はそれらをコードするヌクレオチド配列は、抗HCV免疫応答の改善及び/又は宿主生物への導入に際しての全体的な細胞傷害性応答の改善及び/又は臨床ロット(clinical lots)の生産の改善を可能にし得る。したがって、本発明はHCV感染又はHCV関連疾患若しくは障害の現行の治療及び予防において顕著な進歩を表す。詳細には、本発明は、現存の治療法を強化するか又は慢性感染患者、特に従来の治療法に非応答性である患者に代替治療を提供するために使用され得る。
【００１０】
この技術的課題は、特許請求の範囲に規定された実施形態が提供されることによって解決する。
本発明の、他の観点、特徴及び利点並びに更なる観点、特徴及び利点は、本発明の現時点での好適な実施形態についての以下の説明から明らかになる。これらの実施形態は開示の目的で提供される。
【００１１】
したがって、第１の観点では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)に由来する少なくとも３つのNSポリペプチドを含んでなる単離された融合タンパク質を提供する。ここで、前記NSポリペプチドは、前記融合タンパク質中で、天然型配置において現れる順序とは異なる順序に配置されている。
【００１２】
本願全体を通して本明細書中で使用される場合、「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が別の意味を示していない限り、言及している化合物又は工程の「少なくとも１つ」、「少なくとも最初の」、「１又はそれより多い」又は「複数の」を意味するものとして使用される。例えば、用語「１つの細胞」は、細胞の混合物を含む複数の細胞を包含する。
用語「及び/又は」は、本明細書中で使用される場合、「及び」、「又は」及び「当該用語により繋げられた要素の全て又は任意の他の組合せ」の意味を包含する。
【００１３】
用語「約」又は「およそ」は、本明細書中で使用される場合、与えられた値又は範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
用語「アミノ酸」及び「残基」は同義語であり、天然アミノ酸及びアミノ酸アナログ(例えば、非天然アミノ酸、合成アミノ酸及び改変アミノ酸、Ｄ又はＬ光学異性体を含む)を包含する。
【００１４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書中で、ペプチド結合を介して結合した10又はそれより多いアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基のポリマーに言及するために互換的に使用される。このポリマーは直鎖状、分枝状又は環状であり得、天然に存在するアミノ酸及び/又はアミノ酸アナログを含んでなってもよい。このポリマーは非アミノ酸によって中断されていてもよい。一般的な指摘として、アミノ酸ポリマーは、長い(例えば、50より多いアミノ酸残基)場合、好ましくはポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる。
【００１５】
本発明に関しては、用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、ポリデオキシリボヌクレオチド(DNA)(例えば、cDNA、ゲノムDNA、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離DNA、プローブ、プライマー及びこれらの任意の混合物)又はポリリボヌクレオチド(RNA)分子(例えば、mRNA、アンチセンスRNA)又はポリリボヌクレオチド-ポリデオキシリボヌクレオチド混合物の任意の長さのポリマーを定義する。これらは、一本鎖若しくは二本鎖、直鎖状又は環状の、天然又は合成のポリヌクレオチドを包含する。更に、ポリヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ(改変の例としては米国特許第5,525,711号、同第4,711,955号又は欧州特許公開第302175号を参照)を含んでなってもよく、非ヌクレオチド成分で中断されていてもよい。存在する場合、ヌクレオチドへの改変は重合の前又は後に付与され得る。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、生成物、組成物及び方法を定義するために使用するときは、用語「を含んでなる」は、当該生成物、組成物、及び方法が、言及している要素又は工程を含むが、他の要素又は工程を排除しないことを意味すると意図される。用語「から本質的になる」は、何らかの本質的な重要性を有する他の要素又は工程を除外することを意味する。よって、言及の成分から本質的になる組成物は、痕跡量の混入物及び医薬的に許容可能なキャリアを除外するものではない。「からなる」は、痕跡量より多い他の成分又は工程を排除することを意味する。例えば、ポリペプチドが言及のアミノ酸配列以外には如何なるアミノ酸も含有しない場合、該ポリペプチドは、該アミノ酸配列「からなる」。アミノ酸配列が僅かに少数(a few)の追加アミノ酸残基、代表的には約１〜約50程度の追加残基、と共に存在する場合、ポリペプチドは該アミノ酸配列「から本質的になる」。アミノ酸配列がポリペプチドの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部であるとき、該ポリペプチドは該アミノ酸配列「を含んでなる」。このポリペプチドは、少数〜数百までの追加アミノ酸残基を有することができる。この追加アミノ酸残基は、ポリペプチド輸送(trafficking)においてある役割を演じてもよいし、ポリペプチド産生又は精製を容易にしてもよいし、又はとりわけ、半減期を延長してもよい。同じことがポリヌクレオチド配列にも当てはまる。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「単離した(された)」は、天然の環境から精製又は取り出されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は核酸をいう。用語「精製した(された)」は、天然で関連している少なくとも１つの他の成分から分離されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は核酸をいう。
【００１８】
「HCV」は「Ｃ型肝炎ウイルス」を意味する。広範な系統発生学的分析により、HCV単離株は、異なるサブタイプ(ａ、ｂ、ｃ、・・等)を含む６つの主要な遺伝子型(１〜６)に分類された(Simmonsら, 2005, Hepatology 42, 962-973)。遺伝子型1aの代表的なHCV単離株としては、HCV-1(Chooら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455)、HCV-J1(Okamotoら, 1992, Nucleic Acids Res. 20, 6410-6410)及びHCV-H(Inchauspeら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10292-10296)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型1bの代表的なHCV単離株としては、HCV-JA(Katoら, 1990, Proc. Natl. Acad., Sci. 87, 9524-9528)及びHCV-BK(Takamizawaら, 1991, J. Virol. 65, 1105-1113)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型1cの代表的なHCV単離株としては、HCV-G9(Okamotoら, 1994, J. Gen. Virol. 45, 629-635)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型2aの代表的なHCV単離株としては、HCV-J6(Okamotoら, 1991, J. Gen. Virol. 72, 2697-2704)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型2bの代表的なHCV単離株としては、HCV-J8(Okamotoら, 1992, Virology 188, 331-341)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型2cの代表的なHCV単離株としては、HCV-BEBE1(Nakoら, 1996, J. Gen. Virol. 141, 701-704)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型3aの代表的なHCV単離株としては、HCV-NZL1(Sakamotoら, 1994, J. Gen. Virol. 75, 1761- 1768)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型3bの代表的なHCV単離株としては、HCV-Tr(Chayamaら, 1994, J. Gen. Virol. 75, 3623-3628)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型4aの代表的なHCV単離株としては、HCV-ED43(Chamberlainら, 1997, J. Gen. Virol. 78, 1341-1347)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型5aの代表的なHCV単離株としては、HCV-EUH1480(Chamberlainら, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 44-49)が挙げられる(これらに限定されない)。遺伝子型6aの代表的なHCV単離株としては、HCV-EUHK2(Adamsら, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 393-396)が挙げられる(これらに限定されない)。
【００１９】
用語「融合」又は「融合タンパク質」は、本明細書中で使用する場合、１つのポリペプチド鎖における、少なくとも３つのNSポリペプチド(又はそれらのフラグメント若しくは変形体)の相互の組合せをいう。好ましくは、種々のNSポリペプチド間の融合は遺伝子的手段により、すなわち、各々のNSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をインフレームで融合することにより実施される。「インフレームで融合する(される)」とは、当該融合されたコーディング配列の発現が、各々のNSポリペプチドの間に翻訳ターミネーターを有しない単一タンパク質を生じることを意味する。
【００２０】
各々のNSポリペプチド間の融合は、直接的であることも又はリンカーによることもできる。本明細書中で使用する場合「直接」とは、その間に追加のアミノ酸残基を有さない２つのNSポリペプチド間の融合(例えば、或るNSポリペプチドをコードするコドンはその次のNSポリペプチドをコードするコドンに連続している)をいう。或いは、少なくとも２つのNSポリペプチドの接合部にリンカーペプチドを使用してもよい。リンカーの存在は、融合タンパク質の正しい形成、フォールディング及び/又は機能化を容易にし得る。本発明は、用いられるリンカー配列の形態、サイズ又は数により制限されず、２つのNSポリペプチド間の接合部にリンカー配列の複数コピーが挿入されてもよい。本発明による適当なリンカーは、３〜30アミノ酸長であり、アミノ酸(例えば、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アラニン及び/又はプロリン)の繰り返しから構成される(例えば、Wiederrechtら, 1988, Cell 54, 841；Aumaillyら, 1990 FEBS Lett. 262, 82；及び Dekkerら, 1993, Nature 362, 852を参照)。適当なリンカーの代表例としては、Ｎ末端NSポリペプチドを２番目のNSポリペプチドに接続するSer-Gly-Serリンカー及び２番目のNSポリペプチドを３番目のNSポリペプチドに接続するGly-Ser-Gly-Ser-Glyリンカーが挙げられる。或いは、HCV由来の配列を使用して２つのNSポリペプチドを互いに接続してもよい(例えば、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1691位〜およそ1711位に伸びる天然型NS4AポリペプチドのＣ末端部分)。
【００２１】
「少なくとも３」は、３又は３より大きい数字を意味し、３又は４が特に好ましい。
本明細書中で使用される場合、用語「NSポリペプチド」は、当該分野で認識されている非構造タンパク質をいい、好ましくは、NS2、NS3、NS4A、NS4B及びNS5Bポリペプチドからなる群から選択される非構造タンパク質をいう。にもかかわらず、融合タンパク質はNS5Aポリペプチドを含有しないことが好ましい。本発明に関して、本発明の融合タンパク質に含まれるNSポリペプチドは、独立して、現時点で同定されている任意のHCV系統又は単離株(例えば、用語「HCV」に関連して上記したもの)に由来してもよい。用語「由来する」は、単離されていること、クローン化されていること、誘導されたこと又は関連することを意味する。よって、本発明により、融合タンパク質に含まれる各々のNSポリペプチドは、下記に更に定義するように、天然型NSポリペプチドに由来してもよいし又は改変NSポリペプチドに由来してもよい。
【００２２】
「天然型」NSポリペプチドとは、実験室で人により人工的に改変又は変更されたものを除き、天然の供給源から見出すか又は単離することができるNSタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをいう。よって、用語「天然型NSポリペプチド」は、天然に存在するNSポリペプチド及びそのフラグメントを包含する。天然の供給源としては、生物学的なサンプル(例えば、HCV感染患者又は過去にHCVに感染したことのある患者の血液、血漿又は血清)、培養細胞及び組換え物質(例えば、HCVウイルス又はゲノム、ゲノム又はcDNAライブラリー、HCVゲノムのフラグメントを含むプラスミド、プロセシングを受ける前の組換えNSポリペプチド又はプロセシングを受けた成熟組換えNSポリペプチドなど)が挙げられる。多くの天然型NSポリペプチド/遺伝子のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が文献に記載されており、特別なデータバンクで入手可能である。天然型NSポリペプチドの代表例は、配列番号１〜４に示される(配列番号１〜４は、遺伝子型1b HCV JA株の天然型NS3、NS4A、NS4B及びNS5Bポリペプチドのアミノ酸配列を提供する)。しかし、天然型NSポリペプチドは、これら例示配列に限定されない。実際、アミノ酸配列は、異なるHCV遺伝子型、サブタイプ及び単離株間で変化することがあり、この天然の遺伝子変動の範囲は、本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
本発明の融合タンパク質に含まれるNSポリペプチドの１つ又はそれより多くは、互いに独立して、例示配列又は他の天然型NSポリペプチドからの１又はそれより多いアミノ酸改変を含むことができる。改変は変異及び/又は化学成分の付加(例えば、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化など)若しくは標識成分の付加によって生じさせることができる。変異としては、１若しくはそれより多いアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加又はこれらの可能性の種々の組み合わせが挙げられる。いくつかの改変を企図する場合、それらは連続残基及び/又は非連続残基に関することがある。改変は当業者に公知である多くの方法で行うことができる。例えば、NSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ルーチンの組換え技法、例えば、規定のフラグメントの酵素的切断に続く改変及びライゲーション、部位特異的変異誘発(例えば、Amersham(Les Ullis，フランス)のSculptorTMインビトロ変異誘発システムを使用)、PCR変異誘発又はDNAシャフリングを用いて改変する。
【００２４】
好ましい改変NSポリペプチドは、対応する天然型NSポリペプチドと高度なアミノ酸配列同一性を保持し、例えば、完全長アミノ酸配列の全長又はそのより短いフラグメント(例えば、少なくとも10、15、20、25、30、40、50、100アミノ酸長)に対して少なくとも75％の同一アミノ酸残基を保持する。より具体的には、本発明に関しては、本発明で用いる改変NSポリペプチドは、対応する天然型NSポリペプチドと、75％より大きい、有利には80％より大きい、望ましくは85％より大きい、好ましくは90％より大きい、より好ましくは95％より大きい、更により好ましくは97％より大きい同一性の程度を共有する。２つのポリペプチド間のパーセント同一性は、最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各々のギャップ長を考慮して、それら配列により共有される同一位置の数の関数である。アミノ酸配列間のパーセンテージ同一性を決定するための種々のコンピュータープログラム及び数学アルゴリズムが当該分野で入手可能であり、例えばBlastプログラム(例えば、Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402；Altschulら, 2005, FEBS J. 272, 5101-5109)は、NCBI(National Center for Biotechnology Information)で入手可能である。
【００２５】
例えば、本発明の融合タンパク質に含まれるNSポリペプチドの何れか又は全てが、特定の遺伝子型又はサブタイプに代表的であるように改変することができ、よってコンセンサス又は近コンセンサス(near-consensus)配列に対応するアミノ酸配列を含んでなる。コンセンサス又は近コンセンサス配列は、代表的には、特定の遺伝子型又はサブタイプの種々のNSの配列アラインメントの後に決定される。NSポリペプチドの何れか又は全ては、以下に記載されるように、改変された機能的特性、例えば減少した酵素機能及び/又は減少した細胞膜固定能力及び/又は減少した翻訳後プロセシング能力、を有するNSポリペプチドを提供するように改変することもできる。そのような機能的特性に決定的に重要であるアミノ酸は、ルーチンの方法、例えば構造的及び機能的分析により同定され得る。当業者は、所与の酵素活性を減少させ又は阻害することができる改変タイプを容易に決定することができる。例えば、(例えば、触媒部位中の)酵素活性の活性領域内の１又はそれより多いアミノ酸を欠失又は置換させ、その結果、天然型の酵素活性が顕著に減少又は消失するように部位特異的変異誘発又はPCR技法を行い得る。生物学的活性の減少又は欠落は、当業者に公知の方法を用いて、試験されるべき酵素活性に応じて適切なアッセイで容易に決定することができる。膜固定ドメインは、通常、疎水性に基づいて予測される。
【００２６】
本発明によれば、本発明の融合タンパク質に含まれる少なくとも３つのNSポリペプチドは、天然型配置において現れる順序とは異なる順序で配置される。天然型配置は当該分野で公知であり(本願の導入の章に記載された概説を参照)、NSポリペプチドが現れる順序はHCVポリタンパク質前駆体に見出されるものと同様、すなわち、Ｎ末端からＣ末端へ、NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5Bである。天然型配置によると：
【００２７】
・NS2ポリペプチドは、常に、NS3ポリペプチド又はNS4Aポリペプチド又はNS4Bポリペプチド又はNS5Aポリペプチド又はNS5Bポリペプチドの前にあり；
・NS3ポリペプチドは、常に、NS4Aポリペプチド又はNS4Bポリペプチド又はNS5Aポリペプチド又はNS5Bポリペプチドの前にあり；
・NS4Aポリペプチドは、常に、NS4Bポリペプチド又はNS5Aポリペプチド又はNS5Bポリペプチドの前にあり；
・NS4Bポリペプチドは、常に、NS5Aポリペプチド又はNS5Bポリペプチドの前にあり；
・NS5Aポリペプチドは、常に、NS5Bポリペプチドの前にある。
【００２８】
本発明の融合タンパク質においては、該配置は、NSポリペプチドの少なくとも１つが天然型配置とは異なる順序で現れるという意味で天然型ではない。よって、融合タンパク質がNS3ポリペプチド、NS4Aポリペプチド及びNS5Bポリペプチドを含んでなる場合、天然型配置は、NS3をＮ末端にNS5BをＣ末端に有するNS3-NS4A-NS5Bである。これに対して、非天然型配置は、NS5B-NS3-NS4A、NS5B-NS4A-NS3、NS4A-NS3-NS5B、NS4A-NS5B-NS3又はNS3-NS5B-NS4Aであり得る。
【００２９】
詳細には、本発明の融合タンパク質は、以下の少なくとも１つを含んでなる：
・NS3ポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS4Aポリペプチド；
・NS5BポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS3ポリペプチド；
・NS5BポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS4Bポリペプチド；
・NS4BポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS3ポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS4Aポリペプチド；及び/又は
・NS5BポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS4BポリペプチドのＮ末端に直接又はリンカーを介して融合したNS3ポリペプチド。
【００３０】
本発明の融合タンパク質のこのような特定の部分において、各々のNSポリペプチドは、独立して、天然型であることも改変されていることもできる。例えば、NS4A-NS3部分に含まれるNS4Aポリペプチドは天然型である一方で、NS3ポリペプチドは下記の改変の少なくとも１つを含んでなることができる。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質に含まれる全てのNSポリペプチドは、同じHCV系統又は単離株に由来する。或いは、より広い範囲のHCV遺伝子型に対する保護を提供するために、NSポリペプチドの少なくとも２つは、異なるHCV系統又は単離株に由来する。融合タンパク質を特定の地理的領域に適合させることも興味深くあり得る。ここで、融合タンパク質は、この領域に固有のHCV単離株に由来する少なくとも１つのNSポリペプチドを含ませることによって使用される(例えば、遺伝子型1a、1b、２及び３は、北アメリカ、ヨーロッパ及びアジアで優勢であり；遺伝子型４は北アフリカ及び中央アフリカで優勢であり；遺伝子型５はこれまでは大部分が南アフリカで確認されており；遺伝子型６の単離株はベトナム及び香港で主に見出されている)。例えば、融合タンパク質が、NS3ポリペプチド、NS4Aポリペプチド及びNS5Bポリペプチドを含んでなる場合、NS3ポリペプチドはHCVの第１の株に由来し、NS4A及びNS5BポリペプチドはHCVの第２の株に由来することができる。或いは、NS4AポリペプチドがHCVの第１の株に由来し、NS3及びNS5BポリペプチドはHCVの第２の株に由来することができる。或いは、NS5BポリペプチドがHCVの第１の株に由来し、NS3及びNS4AポリペプチドはHCVの第２の株い由来することができる。或いは、NS3、NS4A及びNS5Bポリペプチドは各々異なるHCV系統に由来する。本発明の融合タンパク質がNS4Bポリペプチドも含んでなる場合、NS4Bポリペプチドは、その他のポリペプチドと同じHCV系統に由来してもよいし、異なるHCV系統に由来してもよい。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態は、NS4AをＮ末端にNS5BをＣ末端に有してNS4Aポリペプチド、NS3ポリペプチド及びNS5Bポリペプチド(NS4A-3-5B融合体)を含んでなるか、これらから本質的になるか又はこれらからなる融合体に関する。任意に、融合体はまた、得られる融合タンパク質の免疫原活性を更に改善するように、NS4Bポリペプチド(又はそのフラグメント若しくは変形体)を含んでもよい。NS4Bポリペプチドは、好ましくは、NS3ポリペプチドとNS5Bポリペプチドの間に含まれる。したがって、本発明はまた、NS4AをＮ末端にNS5BをＣ末端に有してNS4Aポリペプチド、NS3ポリペプチド、NS4Bポリペプチド及びNS5Bポリペプチド(NS4A-3-4B-5B融合体)を含んでなるか、これらから本質的になるか又はこれらからなる融合体に関する。にもかかわらず、NS3ポリペプチド、NS4Aポリペプチド、NS5Bポリペプチド及び任意選択肢のNS4Bポリペプチドは別として、本発明の融合タンパク質は、他のHCVポリペプチド、特にコア、NSポリペプチドとの関連で上記したようにNS5Aポリペプチドを含まないことが好ましい。
【００３３】
より具体的には、用語「NS3ポリペプチド」とは、任意のHCV系統から得た天然型NS3タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又は上記で定義したような改変NS3タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドをいう。本発明で使用するNS3ポリペプチドは、少なくとも200アミノ酸、有利には少なくとも300アミノ酸、好ましくは少なくとも400アミノ酸、より好ましくは少なくとも500アミノ酸、更により好ましくは少なくとも600アミノ酸の長さを有する。説明として、天然型HCV-1 NS3タンパク質は631アミノ酸長であり、ポリタンパク質前駆体中でおよそ1027位〜1657位に位置している。天然型NS3ポリペプチドは、２つの区別される活性ドメイン、Ｎ末端のセリンプロテアーゼドメイン及びＣ末端のヘリカーゼドメインを含んでなる。NS3プロテアーゼは、HCVポリタンパク質前駆体のNS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A及びNS5A/NS5B接合部でのプロセシングを担っており、タンパク質分解活性(Tomeiら, 1993, J. Virol. 67, 4017-4026)及び適切なフォールディング(Yaoら, 1999, Structure(London)7 pp 1353)にはコファクターとしてのNS4Aを必要とする。切断部位から上流の６位のアスパラギン酸又はグルタミン酸及び１位のシステイン又はスレオニン並びに切断部位から下流の１位のセリン又はアラニンからなるモチーフがHCV NS3プロテアーゼにより特異的に認識される。NS3ヘリカーゼは、ウイルス複製の間の二本鎖RNA中間体を巻き戻すために重要であると考えられている(Taiら, 1996, J. Virol. 70, 8477-8484)。
【００３４】
「NS4Aポリペプチド」とは、任意のHCV系統から得た天然型NS4Aタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又は上記で定義した改変NS4Aタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを意味する。本発明で使用するNS4Aポリペプチドは、少なくとも10アミノ酸、有利には少なくとも11アミノ酸、好ましくは少なくとも12アミノ酸、より好ましくは少なくとも13アミノ酸の長さを有する。「NS4Bポリペプチド」とは、任意のHCV系統から得た天然型NS4Bタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又は上記で定義した改変NS4Bタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを意味する。本発明で使用するNS4Bポリペプチドは、少なくとも20アミノ酸、有利には少なくとも25アミノ酸、好ましくは少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも31アミノ酸、更により好ましくは少なくとも32アミノ酸の長さを有する。説明として、天然型HCV NS4(A〜B)タンパク質は315アミノ酸長であり、ポリタンパク質前駆体中でおよそ1658位〜1972位に位置する。NS4Aポリペプチド(1658位〜1711位)は、NS3プロテアーゼのコファクターであるが、NS3の安定性及び小胞体(ER)膜における局在のためにも必要とされる(Faillaら, 1994, J. Virol. 68, 3753-3760)。NS4Bポリペプチド(1712位〜1972位)は内在性膜タンパク質であるがその機能は未だ知られていない。予測アルゴリズムにより、４〜６の膜貫通セグメントの存在が示唆されている。しかし、その発現は、一見ERに由来する膜様のクモの巣(seemingly ER-derived membranous web)の形成を引き起こす(Eggerら, 2002, J. Virol. 76, 5974-5984)。
【００３５】
「NS5Bポリペプチド」とは、任意のHCV系統から得た天然型NS5Bタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド又は上記で定義した改変NS5Bタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを意味する。本発明で使用するNS5Bポリペプチドは、少なくとも200アミノ酸、有利には少なくとも300アミノ酸、好ましくは少なくとも400アミノ酸、より好ましくは少なくとも500アミノ酸、更により好ましくは少なくとも550アミノ酸の長さを有する。説明として、天然型HCV-1 NS5Bタンパク質は591アミノ酸長であり、ポリタンパク質前駆体中でおよそ2421位〜3011位に位置している。天然型NS5Bタンパク質はRNA依存性RNAポリメラーゼとして作用する。このポリメラーゼは、おそらく、マイナス鎖のRNA中間体及びプラス鎖の子孫コピーの合成を可能にする(Lohmanら, 1997, J. Virol. 71, 8416-8428)。このポリメラーゼは、Ｃ末端21アミノ酸配列により小胞体膜と結合することが見出された(Schmidt-Mendeら, 2001, J. Biol. Chem. 276, 44052-44063)。
【００３６】
明確さのために、NS3、NS4A、NS4B及びNS5Bポリペプチドに関連して本明細書中で言及するアミノ酸ストレッチは、HCV-1ポリタンパク質前駆体(Chooら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455により又はGenBankアクセッションM62321に記載される)中での位置に関して与えられる。しかし、上記のように、本発明はまた、他のHCV系統又は単離株のNSポリペプチド及び改変NSポリペプチドも包含する。したがって、文脈が明確に別のことを示していない限り、本明細書中でHCV-1ポリタンパク質前駆体を参照してNSポリペプチド又はそのペプチドに言及するときは、HCV-1のNSポリペプチド若しくはそのペプチド、他の任意のHCV系統若しくは単離株のNSポリペプチド若しくはそのペプチド又は改変NSポリペプチド若しくはそのペプチドを意味する。本発明の好ましい実施形態は、遺伝子型1b HCV JA株(Katoら, 1990, Proc. Natl. Acad., Sci. 87, 9524-9528)に由来するNS3ポリペプチド、NS4Aポリペプチド、NS5Bポリペプチド及び任意選択肢のNS4Bポリペプチドを含んでなる融合タンパク質に関する。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質に含まれるNS3ポリペプチドは、著しく減少したプロテアーゼ活性を示し、個々のポリペプチドへの融合タンパク質の切断を媒介することはできないように、対応する天然型NS3ポリペプチドに比して改変されている。プロテアーゼ活性は、NS3ポリペプチドのＮ末端部分、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで約1027位〜約1207位(配列番号１に示される天然型HCV-JA NS3ポリペプチドの約１位〜約181位)に位置決めされている。より具体的には、NS3プロテアーゼ活性は、触媒性の３組の残基(catalytic triad residues)、1083位のHis(Ｈ)、1107位のAsp(Ｄ)及び1165位のSer(Ｓ)(配列番号１のそれぞれ57位、81位及び139位)に帰せられている。適切なプロテアーゼ欠損NS3ポリペプチドの代表例は、Bartenshlagerら, 1993, J. Virol. 67, 3835-3844及びTomeiら, 1993, J. Virol. 67, 4017-4026に記載されている。好ましくは、触媒性のAsp及びSer残基は予測された抗原性ドメイン内に存在するので、本発明で用いるNS3ポリペプチドは、1083位(配列番号１の57位に対応)のHis残基又は別のHCV血清型の天然型NS3ポリペプチドの等価位置に位置するアミノ酸残基のHis以外の任意のアミノ酸残基への置換、特に好ましくはAla残基への置換(H1083A)を含んでなる。プロテアーゼ活性の破壊は当該分野で周知のアッセイを用いて決定することができる(Takeshitaら, 1997, Anal. Biochem. 247, 242-246；Kakiuchiら, 1997 J. Biochem 122, 749-755；Saliら, 1998, Biochemistry 37, 3392-3401；Kakiuchiら, 1999, J. Virol. Meth. 80, 77-84)。
【００３８】
或いは又は併せて、本発明の融合タンパク質に含まれるNS3ポリペプチドは、著しく減少したヘリカーゼ活性を示すように、対応する天然型NS3ポリペプチドに比して改変されている。４つの残基がNS3関連ヘリカーゼ活性に関与し、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号でそれぞれ1295位のThr、1437位のThr、1490位のArg及び1493位のArg(配列番号１で示される天然型HCV-JA NS3ポリペプチドの269位及び411位のThr残基並びに464位及び467位のArg残基に対応する)である。適切なヘリカーゼ欠損NS3ポリペプチドの代表例は、Kimら(1997, J. Virol. 71, 9400)並びにLin及びKim(1999, J. Virol. 73, 8798-8807)に記載されている。好ましくは、本発明で用いるNS3ポリペプチドは、1490位(配列番号１の464位に対応)のArg残基又は別のHCV血清型の天然型NS3ポリペプチドの等価位置に位置するアミノ酸残基のArg以外の任意のアミノ酸残基への置換、1295位(配列番号１の269位に対応)のThr残基又は別のHCV血清型の天然型NS3ポリペプチドの等価位置に位置するアミノ酸残基のThr以外の任意のアミノ酸残基への置換を含んでなり、両方の場合でAla残基への置換(T1295A及びR1490A)が特に好ましい。ヘリカーゼ活性の破壊は、当該分野で周知のアッセイを用いて、例えば巻き戻し活性を評価することによって決定することができる。
【００３９】
最も好ましくは、本発明で用いるNS3ポリペプチドは、天然型NS3ポリペプチドのプロテアーゼ活性及びヘリカーゼ活性の両方を減少させ又は破壊するように変異され、これら酵素機能と関連して上記した改変を含んでなる。変異はH1083A、T1295A及びR1490Aが特に好ましい。
【００４０】
或いは又はNS3ポリペプチドに関連して上記で提案した改変と併せて、本発明の融合タンパク質に含まれるNS5Bポリペプチドは、著しく減少したRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を示すように、対応する天然型NS5Bポリペプチドと比して改変されている。２つのAsp残基がこの酵素機能に関与し、それぞれ全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで2640位及び2738位である(配列番号４で示される天然型HCV-JA NS5Bポリペプチドの220位及び318位のAsp残基に対応する)。適切なポリメラーゼ欠損NS5Bポリペプチドの代表例は、Lohmannら(1997, J. Virol. 71, 8416-8428)に記載されている。好ましくは、本発明で用いるNS5Bポリペプチドは、2640位(配列番号４の220位に対応)のAsp残基若しくは別のHCV血清型の天然型NS5Bポリペプチドの等価位置に位置するアミノ酸残基のAsp以外の任意のアミノ酸残基への置換及び/又は2738位(配列番号４の318位に対応)のAsp残基若しくは別のHCV血清型の天然型NS5Bポリペプチドの等価位置に位置するアミノ酸残基のAsp以外の任意のアミノ酸残基への置換を含んでなる。両方の場合、Asn残基への置換が特に好ましい。RNAポリメラーゼ活性の破壊は、当該分野で周知のアッセイ、例えば、初期のRNA生成物中への放射性ヌクレオチド基質の取り込みに基づく従来のレプリカーゼアッセイを用いて決定することができる(例えば、Behrensら, 1996, EMBO J. 15, 12-22；Ferrariら, 1999, J. Virol. 73, 1649-1654を参照)。
【００４１】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質に含まれるNSポリペプチドは、対応する天然型NSポリペプチドに比して追加の改変を更に含んでなる。適切な改変は、得られた融合タンパク質のプロセシング、安定性及び溶解性に有益な改変、例えば、下記に記載するような潜在的切断部位、膜固定及び/又は糖付加の不活性化を目的とする改変である。
【００４２】
有利には、本発明の融合タンパク質は、個々のNSポリペプチドへのプロセシングを避けるために、天然型HCVポリタンパク質前駆体中にNS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A及びNS5A/NS5B接合部で通常存在するNS3認識切断部位の１つ又はそれより多くを含んで成らない。本発明で用いる好ましいNS3ポリペプチドは、著しく減少したプロテアーゼ活性を示すが、NS3認識切断部位の不活性化は更なる程度の安全性を導入する。切断部位のコンセンサス配列は、Asp/Glu-X4-Cys/Thr-Ser/Ala(ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である)である。天然型NS3ポリペプチドによる切断は、Cys/Thr残基の後ろで起こることが示された。好ましくは、本発明で用いるNS3ポリペプチドは、天然型NS3ポリペプチドのＣ末端に通常存在するThr又はCys残基(配列番号１の361位に対応する、HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで1657位又は別のHCV血清型の天然型NS3ポリペプチドの等価位置)を含んで成らない。或いは又は併せて、NS4Aポリペプチドは、天然型NS4AポリペプチドのＣ末端に通常存在するCys残基(配列番号２の54位に対応する、HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで1711位又は別のHCV血清型の天然型NS4Aポリペプチドの等価位置)を含んで成らない。或いは又は併せて、任意選択肢のNS4Bポリペプチドは、天然型NS4BポリペプチドのＣ末端に通常存在するCys残基(配列番号３の261位に対応する、HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで1972位又は別のHCV血清型の天然型NS4Bポリペプチドの等価位置)を含んで成らない。
【００４３】
更に別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、天然型NS4A、NS4B及び/又はNS5Bポリペプチドの膜固定に通常関与する１又はそれより多い疎水性ドメインを欠失するように更に改変されていてもよい。６つの膜固定疎水性ドメインが、天然型NS4Bポリペプチド中で同定されていおり、１つは天然型NS4AポリペプチドのＮ末端部分に存在し、１つはNS5B天然型ポリペプチドのＣ末端部分に存在する。それらの少なくとも部分的な欠失により、融合タンパク質の溶解性の改善が可能となり、よって組換え手段による生産を容易にし得る。このことにより、所与の宿主生物において個々のHCVポリペプチドを投与した際と比べて、融合タンパク質の全体的な細胞傷害性の制限もまた可能となり得る。
【００４４】
この観点では、NS4Aポリペプチドは、有利には、天然型NS4AポリペプチドのＮ末端部分内に通常存在する１又はそれより多い疎水性アミノ酸残基の欠失又は置換により改変される。好ましいNS4Aポリペプチドは、Ｎ末端で最初の20アミノ酸残基までを欠失している(例えば、配列番号２で示される天然型HCV-JA NS4Aポリペプチドのおよそ１位〜およそ20位の除去に対応する、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1658位〜およそ1677位の欠失が好ましい)一方で、にもかかわらず、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1678位〜およそ1690位(配列番号２で示される天然型HCV-JA NS4Aポリペプチドのおよそ21位〜およそ33位)に伸びる天然型NS4Aポリペプチドの部分を保持している。好ましいNS4Aポリペプチドは、天然型NS4AポリペプチドのＣ末端部分、例えば、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1691位〜およそ1711位(配列番号２で示される天然型HCV-JA NS4Aポリペプチドのおよそ34位〜およそ54位に相当する)に伸びる部分を保持していても、保持していなくてもよい。最も好ましくは、本発明の融合タンパク質に含まれるNS4Aポリペプチドは、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1678位〜およそ1690位(配列番号２で示される天然型HCV-JA NS4Aポリペプチドのおよそ21位〜およそ33位に対応する)に伸びる天然型NS4Aポリペプチドの部分からなる。
【００４５】
或いは又は併せて、好ましいNS5Bポリペプチドは、天然型NS5BポリペプチドのＣ末端に通常存在する10〜30アミノ酸残基を欠失している、特に好ましくは、Ｃ末端の最後の21アミノ酸残基(例えば、配列番号４の571位〜591位に対応する、HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで2991位〜3011位)が欠失されている。
【００４６】
或いは又は併せて、好ましい任意選択肢のNS4Bポリペプチドは、６つの膜固定疎水性ドメインの少なくとも１つを欠失している。より好ましくは、任意選択肢のNS4Bポリペプチドは、内部抗原性ドメインを本質的に保持するように、対応する天然型NS4BポリペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方で１又はそれより多いアミノ酸残基が切り取られている。好ましくは、本発明で用いる任意選択肢のNS4Bポリペプチドは、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1789位〜およそ1820位(配列番号３で示される天然型HCV-JA NS4Bポリペプチドのおよそ78位〜およそ109位に対応)に伸びるアミノ酸ストレッチを含んでなるか、或いは該アミノ酸ストレッチから本質的になる。
【００４７】
更に別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、所与の宿主生物における発現に際し潜在的なＮ-糖付加を抑制するように更に改変されている。このことに関し、コンセンサス糖付加部位Asn-Val-Ser-Valは、天然型NS5Bポリペプチドにおいて、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで2789位〜2792位(配列番号４で示される天然型HCV-JA NS5Bタンパク質の369位〜372位に対応)に同定されている。これに関する例示の変異は、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けで2791位(配列番号４の371位)のSer残基のSer残基とは異なる残基(例えば、Gly残基)による置換からなる。
【００４８】
望ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主生物への導入に際し、体液性若しくは細胞性又はその両方であるかにかかわらず、抗原特異的免疫応答を誘導又は刺激することができるという意味で免疫原性である。本発明はまた、(例えば、ジスルフィド結合の酸化により)免疫原性を強化するように操作された融合タンパク質を包含する。望ましくは、本発明の融合タンパク質に含まれる種々のNSポリペプチドのフォールディングは、天然型NSポリペプチドのフォールディングと同様である。本発明に関して、融合タンパク質は、Ｔ細胞レセプターにより認識される１又はそれより多い抗原性ドメインを保持することが好ましい。融合タンパク質中で適切に保持され得る多くのHCV抗原性ドメインが文献に記載されている(例えば、Chienら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10011-10015；Chienら, 1993, J. Gastroent. Hepatol. 8, S33-39及び国際公開第WO03/097677号を参照)。
【００４９】
好ましくは、本発明の融合タンパク質に含まれるNS3ポリペプチドは、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1038位〜およそ1082位、およそ1096位〜およそ1181位及びおよそ1244位〜およそ1274位(例えば、配列番号１で示される天然型HCV-JA NS3ポリペプチドのおよそ12位〜およそ56位、およそ70位〜およそ155位及び/又はおよそ218位〜およそ248位)に伸びる天然型NS3ポリペプチドの部分を保持する。好ましくは、本発明の融合タンパク質に含まれるNS5Bポリペプチドは、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ2573位〜およそ2601位(例えば、配列番号４で示される天然型HCV-J NS5Bポリペプチドのおよそ155位〜およそ182位)に伸びる天然型NS5Bポリペプチドの部分を保持する。本発明の融合タンパク質は、NS4Bポリペプチドを含んでなる場合、好ましくは、完全長HCV-1ポリタンパク質に関する番号付けでおよそ1789位〜およそ1820位(例えば、配列番号３で示される天然型HCV-J NS4Bタンパク質のおよそ78位〜およそ109位)に伸びる天然型NS4Bポリペプチドの部分を保持する。
【００５０】
本発明の融合タンパク質の免疫原性活性は、当該分野で慣用の多くの技法(例えば、本発明の方法に関連して下記に記載される技法又は実施例に例示されている技法)により評価することができる。本発明に関して、融合タンパク質の免疫原性活性は、天然型NSポリペプチドにより提供される通常の免疫原性活性より程度及び/又は性質が大きいことが好ましい。例えば、宿主生物への融合タンパク質の導入に際して、天然型NSポリペプチドの導入の際に比して、その免疫応答はより強力で、より広い性質(例えば、CD4+及びCD8+細胞のようなより多くの免疫細胞が関与する)のものであり得るし、又はその範囲が異なり得る(例えば、非支配的な潜在エピトープを指向する)。このことは、強化された医療効果を提供し、よって投薬レジメンを低減させ、クオリティオブライフを改善させる。
【００５１】
好ましいNS3ポリペプチドは、配列番号１で示される天然型HCV-JA NS3タンパク質に由来し、少なくとも以下のように改変されている：
・12位〜56位、70位〜155位及び218位〜248位に伸びる部分を保持する；
・57位のHis残基のHisとは異なるアミノ酸残基(例えばAla残基)による置換を含んでなる；
・269位のThr残基のThrとは異なるアミノ酸残基(例えばAla残基)による置換を含んでなる；
・464位のArg残基のArgとは異なるアミノ酸残基(例えばAla残基)による置換を含んでなる；及び
・631位にThr残基を含んで成らない。
【００５２】
更により好ましくは、本発明で用いるNS3ポリペプチドは、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含んでなるか、該アミノ酸配列から本質的になるか或いは該アミノ酸配列からなる。
【００５３】
好ましいNS4Aポリペプチドは、配列番号２で示される天然型HCV-JA NS4Aタンパク質に由来し、少なくとも以下のように改変されている：
・配列番号２の21位〜33位の部分を含有する；
・配列番号２の１位〜20位の部分を含有しない。
【００５４】
更により好ましくは、NS4Aポリペプチドは、配列番号２の21位〜33位の部分から本質的になり、イニシエーターであるMet残基がその前にあるアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、NS4Aポリペプチドは、イニシエーターであるMet残基が前にある、配列番号６で示されるアミノ酸配列から本質的になる。
【００５５】
好ましい任意選択肢のNS4Bポリペプチドは、配列番号３で示される天然型HCV-JA NS4Bタンパク質に由来し、少なくとも以下のように改変されている：
・78位のSer残基〜109位のLeu残基に伸びる部分を含んでなる；
・261位のCys残基を含んで成らない。
更により好ましくは、任意選択肢のNS4Bポリペプチドは、配列番号７で示されるアミノ酸配列から本質的になるか或いは該アミノ酸配列からなる。
【００５６】
好ましいNS5Bポリペプチドは、配列番号４で示される天然型HCV-JA NS5Bタンパク質に由来し、少なくとも以下のように改変されている：
・154位のArg残基〜182位のLeu残基に伸びる部分を含んでなる；
・220位のAsp残基のAspとは異なるアミノ酸残基(例えばAsn残基)による置換を含んでなる；
・318位のAsp残基のAspとは異なるアミノ酸残基(例えばAsn残基)による置換を含んでなる；及び
・571位のTrp残基〜591位のArg残基に伸びる部分を含んで成らない。
【００５７】
更により好ましくは、NS5Bポリペプチドは、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含んでなるか、該アミノ酸配列から本質的になるか或いは該アミノ酸配列からなる。
【００５８】
本発明の最も好ましい融合タンパク質は、配列番号９又は10に記載されるアミノ酸配列と相同又は同一であるアミノ酸配列を含んでなり、或いは該アミノ酸配列から本質的になり、或いは該アミノ酸配列からなる。配列番号９(図１)に記載される配列は、上記の好ましいNS4A、NS3及びNS5Bポリペプチドの融合体に相当し、Ｎ末端イニシエーターであるMetを１位に有し、NS4Aポリペプチドはアミノ酸残基２〜アミノ酸残基14に伸び、リンカーがアミノ酸残基15〜アミノ酸残基17に伸び、NS3ポリペプチドはアミノ酸残基18〜アミノ酸残基647に伸び、リンカーがアミノ酸残基648〜アミノ酸残基652に伸び、NS5Bポリペプチドはアミノ酸残基653〜アミノ酸残基1222に伸びている。配列番号10(図２)に記載される配列は、上記の最も好ましいNS4A、NS3、NS4B及びNS5Bポリペプチドの融合体に相当し、Ｎ末端イニシエーターであるMetを１位に有し、NS4Aポリペプチドはアミノ酸残基２〜アミノ酸残基14に伸び、リンカーがアミノ酸残基14〜アミノ酸残基17に伸び、NS3ポリペプチドはアミノ酸残基18〜アミノ酸残基647に伸び、NS4Bポリペプチドはアミノ酸残基648〜アミノ酸残基679に伸び、NS5Bポリペプチドはアミノ酸残基680〜アミノ酸残基1249に伸びている。
【００５９】
本発明の範囲には、本発明の融合タンパク質の新規なペプチドフラグメント、特に配列番号９又は配列番号10に記載のペプチドフラグメントが更に含まれる。本明細書において使用する場合、フラグメントは、本明細書中に開示される融合タンパク質からの少なくとも10、15、20、50又はそれより多くの連続アミノ酸残基を含んでなる。そのようなフラグメントは、機能を遂行する能力、例えば、基質に結合し又は免疫原として作用する能力に基づいて選択することができる。適切なペプチドフラグメントは、代表的には、新規な免疫原性構造を含有する融合タンパク質のドメイン又はモチーフを含んでなるものである。予測免疫原性ドメインは、当業者に周知であり容易に利用可能なコンピュータープログラムによって容易に同定される。本発明のペプチドフラグメントは、公知のタンパク質合成法を用いて合成することができる。
【００６０】
本発明の融合タンパク質及びそのペプチドフラグメントは、任意の適当な方法により、例えば標準的な直接ペプチド合成技術(例えば、Bodanszky, 1984 in Principles of peptide synthesis, Springer-Verlag)及び本発明のベクターに関連して下記に記載されるような組換えDNA技術によって製造することができる。
【００６１】
よって、本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。特に好ましくは、配列番号９又は配列番号10で示されるアミノ酸配列又は配列番号９又は配列番号10に相同なアミノ酸配列を含んでなるか或いはそのような配列から本質的になるか或いはそのような配列からなる融合タンパク質をコードする核酸分子である。
【００６２】
望ましくは、本発明の核酸分子は、特定の宿主細胞、例えば、哺乳動物、酵母(例えば、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス ポンベ(Saccharomyces pombe)又はピキア パストリス(Pichia pastoris)又は原核生物(例えば、E. coli)の宿主細胞において高レベル発現を提供するために最適化される。実際に、所与のアミノ酸をコードするに利用可能な１より多いコドンがあるとき、生物のコドン使用頻度パターンは高度に非ランダムであり(例えば、Wadaら, 1992, Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118を参照)、コドンの利用は異なる宿主間で顕著に異なり得る(例えば、Nakamuraら, 1996, Nucleic Acids Res. 24, 214-215を参照)。本発明で用いられるNSをコードするヌクレオチド配列は、ウイルス(HCV)起源であるので、宿主細胞(例えば、細菌又は下等な真核細胞)における効率的な発現には不適切なコドン使用頻度パターンを有し得る。
【００６３】
代表的には、コドン最適化は、この特定の宿主細胞で頻繁には使用されないコドンに対応する１又はそれより多い「天然型」(例えば、HCV)コドンを、より頻繁に用いられ同じアミノ酸をコードする１又はそれより多いコドンにより置換することによって実行される。このことは、従来の変異誘発によるか又は化学合成技法(例えば、合成核酸分子が得られる)によって達成することができる。頻繁には使用されないコドンに対応する全ての天然型コドンを置換する必要はない。なぜなら、発現の増大は部分的置換でさえも達成することができるからである。更に、得られる核酸分子中への制限部位の導入に対応するために、最適コドン利用頻度から幾分逸脱してもよい。
【００６４】
宿主細胞における発現は、コドン利用頻度の最適化に加えて、ヌクレオチド配列の更なる改変によって更に改善することができる。例えば、本発明の核酸分子は、稀な非最適コドンの一群が集中した領域に存在することを防ぐように及び/又は発現レベルにネガティブに影響すると予測される少なくとも部分的にネガティブな配列エレメントを抑制若しくは改変するように改変することができる。そのようなネガティブな配列エレメントとしては、非常に高い(＞80％)又は非常に低い(＜30％)GC含量を有する領域；ATリッチ又はGCリッチな配列ストレッチ；不安定な順方向反復(direct repeat)配列又は逆方向反復(inverted repeat)配列；RNA二次構造；及び/又は内部の潜在的調節エレメント(例えば、内部TATAボックス、chi部位、リボソーム侵入部位及び/又はスプライシングドナー/アクセプター部位)が挙げられる(これらに限定されない)。
【００６５】
本発明の最適化核酸分子は、好ましくは、同一条件(例えば、同じ細胞タイプ、同じ培養条件、同じ発現ベクターなど)下、ある宿主細胞において、より高いレベル、すなわち、対応する天然型HCV遺伝子を含む核酸分子により発現されるレベルに比して少なくとも110％、有利には少なくとも150％、好ましくは少なくとも200％のレベルで、本発明の融合タンパク質を発現することができる。発現レベルは、従来の技法、例えば本発明の融合タンパク質に含まれるHCVポリペプチドの１つに特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティングにより評価することができる。
【００６６】
好ましい実施形態によれば、本発明は、配列番号11〜16に示されるヌクレオチド配列のいずれかと相同(より好ましくは同一)であるヌクレオチド配列を含んでなるか或いはそのようなヌクレオチド配列から本質的になるか或いはそのようなヌクレオチド配列からなる、核酸分子を提供する。配列番号11の核酸分子は、ヌクレオチド配列が哺乳動物(例えば、ヒト)細胞における発現に最適化されているNS4A-3-5B融合タンパク質をコードする。配列番号12の核酸分子は、ヌクレオチド配列が哺乳動物(例えば、ヒト細胞)における発現に最適化されているNS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードする。配列番号13の核酸分子は、ヌクレオチド配列が酵母(例えば、P pastoris)における発現に最適化されているNS4A-3-5B融合タンパク質をコードする。配列番号14の核酸分子は、ヌクレオチド配列が酵母(例えば、P pastoris)における発現に最適化されているNS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードする。配列番号15の核酸分子は、ヌクレオチド配列が原核生物(例えば、E. coli)における発現に最適化されているNS4A-3-5B融合タンパク質をコードする。配列番号16の核酸分子は、ヌクレオチド配列が原核生物(例えば、E. coli)における発現に最適化されているNS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードする。当然のことながら、配列は、5'及び3'非コード配列、必要ならば5'末端のイニシエーターMet、3'末端の１又はそれより多いSTOPコドン、及び両末端にクローン化工程を容易にするための適切な制限部位が備えられていてもよい。例示の核酸分子が図３〜８にも提供される。
【００６７】
本発明はまた、上記で定義するような核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子に関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に公知である。代表的には、ハイブリダイゼーションは、約45℃の６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中で実施され、続いて50〜６５℃の0.2×SSC、0.1％SDS中での１又はそれより多い洗浄が行われる。好ましくは、そのようなハイブリダイズする核酸は、上記で定義した核酸分子と、完全長ヌクレオチド配列又はそのより短いフラグメント(例えば、少なくとも30、45、50、60、80、100、150、200ヌクレオチド長)にわたって70％より大きい配列同一性の程度を共有する。より好ましくは、それらの間の同一性の程度は70％より大きく、有利には80％より大きく、望ましくは85％より大きく、好ましくは90％より大きく、より好ましくは95％より大きく、更により好ましくは97％より大きい。
【００６８】
そのようなハイブリダイズする核酸分子の代表例としては、配列番号11〜16の何れかに含まれる少なくとも約20、30、40、50、100又は150の連続ヌクレオチドに相補的である核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子)が挙げられる(これらに限定されない)。例示の配列の変形(例えば縮重コドン)又はHCVの異なる単離株/系統間の多形又はDNAシャッフリングのような技法により得られる変形もまた本発明に包含される。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸分子のフラグメント、例えば、制限エンドヌクレアーゼ及びPCR生成フラグメントに関する。そのようなフラグメントは、プローブ、プライマー又は融合タンパク質の免疫原性部分をコードするフラグメントとして使用することができる。
【００７０】
本発明の核酸分子は、当該分野でアクセス可能な配列データ及び本明細書中で提供される配列情報を用いて生成することができる。本発明の融合タンパク質に含まれるHCVポリペプチドの各々をコードするDNA配列は、従来の分子生物学又はPCR技術により、HCV含有細胞、cDNA及びゲノムライブラリー、ウイルスゲノム又はそれを含むことが知られている先行技術のベクターから直接単離することができ、必要ならば、ルーチンの変異誘発技術により(例えば、上記のように、特定の宿主細胞における発現を最適化するように、遺伝子型若しくはサブタイプ特異的配列に適合するように)更に改変することができる。各々のHCVポリペプチドをコードする配列の融合は、例えば、直接又はペプチドリンカーをコードする配列を通介してのいずれかで、インフレームでのライゲーションにより達成し得る。或いは、本発明の核酸分子はまた、自動化プロセスでの化学合成により生成することができる(例えば、Edge, 1981, Nature 292, 756；Nambairら, 1984, Science 223, 1299；Jayら, 1984, J. Biol. Chem. 259, 6311に記載されるように、オーバーラップしている合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができる)。
【００７１】
本発明はまた、本発明の核酸分子の１又はそれより多いコピーを含んでなるベクターを提供する。例えば、異なる遺伝子型又はサブタイプに由来する融合タンパク質をコードする核酸分子を同じベクターに含ませることが有利であり得る。
【００７２】
用語「ベクター」とは、本明細書中で使用する場合、発現ベクター及び非発現ベクターの両方をいい、この用語には、ウイルスベクター及び非ウイルスベクター(染色体外ベクター(例えば多コピープラスミド)を含む)並びに宿主の染色体中に組み込まれるように設計された組み込みベクターが包含される。本発明に関して特に重要なのは、遺伝子療法で用いるベクター(すなわち、これは宿主生物に核酸分子を送達することができるベクター)及び種々の発現系において用いるための発現ベクターである。
【００７３】
本発明の融合タンパク質を発現するために、種々の宿主-ベクターシステムを使用し得る。そのような宿主-ベクターシステムとしては、融合体をコードする核酸分子を含有するバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドベクターで形質転換した細菌のような原核生物(例えば、E. coli又はBacillus subtilis)；融合体をコードする核酸分子を含有する酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pombe、Pichia pastoris)；融合体をコードする核酸分子を含有するウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染した昆虫細胞システム(例えば、Sf9細胞)；融合体をコードする核酸分子を含有する、ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV；タバコモザイクウイルスTMV)で感染したか又はプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞システム；又は融合体をコードする核酸分子を含有するプラスミド又はウイルス発現ベクターでトランスフェクト又は感染した哺乳動物細胞システム(例えば、培養細胞)が挙げられる。
【００７４】
原核システムにおける使用に適切なベクターとしては、pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBleuscript(Stratagene)、pPoly(Latheら, 1987, Gene 57, 193-201)、pTrc(Amannら, 1988, Gene 69, 301-315)；pET 11d(Studierら, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 60-89)；pIN(Inouyeら, 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109；Van Heekeら, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509)；及びpGEXベクター(本発明の核酸分子がグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(GST)との融合体で発現することができる)が挙げられる(これらに限定されない)。プラスミドpGEX-2T(Amersham Biosciences Product code: 27-4801-01, Genbankアクセッション番号U13850)が、本発明に関して特に適切である。
【００７５】
酵母(例えば、S. cerevisiae)における発現に適切なベクターとしては、pYepSec1(Baldariら, 1987, EMBO J. 6, 229-234)、pMFa(Kujanら, 1982, Cell 30, 933-943)、pJRY88(Schultzら, 1987, Gene 54, 113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)及びpTEF-MF(Dualsystems Biotech製品コード：P03303)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
哺乳動物宿主細胞における発現に適切したベクターは、ウイルス起源又は非ウイルス起源(例えば、プラスミドDNA)であることができる。適切なプラスミド ベクターとしては、pREP4、pCEP4(Invitrogene)、pCI(Promega)、pCDM8(Seed, 1987, Nature 329, 840)及びpMT2PC(Kaufmanら, 1987, EMBO J. 6, 187-195)、pVAX及びpgWiz(Gene Therapy System Inc；Himoudiら, 2002, J. Virol. 76, 12735-12746)が挙げられる(限定されない)。
【００７７】
更に、本発明に関して用いられる宿主ベクターシステムはまた、維持、増殖又は宿主細胞における本発明の核酸分子の発現を可能にする１又はそれより多い追加のエレメントを含んでなってもよい。そのような追加のエレメントとしては、(例えば、細胞栄養要求性の補完又は抗生物質耐性による)組換え宿主細胞の同定及び単離を容易にするためのマーカー遺伝子、安定化エレメント(例えば、Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103 に記載されるようなcer配列及び米国特許第5,198,343号に記載されるDAPシステム)及び組込みエレメント(例えば、LTRウイルス配列及びトランスポゾン)が挙げられる(限定されない)。
【００７８】
原核宿主細胞における発現に適切なマーカー遺伝子としては、テトラサイクリン及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)(Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567；O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1527)；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072)；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150, 1)；ゼオマイシン(zeomycin)に対する耐性を付与するzeo；カナマイシンに対する耐性を付与するkana及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroのような耐性遺伝子は、哺乳動物宿主細胞における発現に使用することができる。ura3又はLeu２酵母変異体の補完を提供するURA3又はLEU２遺伝子は、酵母システムにおける発現に使用することができる。特に、プロモーターを欠失させたURA3遺伝子は、有利に利用され得る。
【００７９】
種々の異なるウイルス(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルスなど)に由来する多くのウイルスベースの発現システムもまた本発明に関して利用することができる。本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスベクター」は、ベクターDNA及びそれから生成されたウイルス粒子を包含する。ウイルスベクターは、複製コンピテントであることも又は複製欠損若しくは複製障害であるように遺伝子的に無能にすることもできる。用語「複製コンピテント」は、本明細書中で使用する場合、特定の宿主細胞(例えば、腫瘍細胞)においてより良好に又は選択的に複製するように操作されている複製選択性及び条件付きで複製可能なウイルスベクターを包含する。
【００８０】
このようなベクターとしては、例えば、遺伝子導入又は組換え産生について多数の裏付けのある利点を有するアデノウイルスベクターが挙げられる(概説として「Adenoviral vectors for gene therapy」, 2002, D. Curiel and J. Douglas編, Academic Pressを参照)。本発明による使用のためのアデノウイルスベクターは、種々のヒト又は動物供給源から得ることができる。アデノウイルス血清型１から51までの任意の血清型を用いることができる。特に好ましいのは、ヒトアデノウイルス２(Ad2)、５(Ad5)、６(Ad6)、11(Ad11)、24(Ad24)及び35(Ad35)である。記載されたアデノウイルスは、アメリカンタイプカルチュアコレクション(ATCC, Rockville, Md.)から入手可能であり、それらの配列、構造及び生産方法を記載し、そのことにより当業者がそれらを適用することを可能にしている多数の出版物の主題となっている(例えば、米国特許第6,133,028号；同第6,110,735号；国際公開第WO 02/40665号；同第WO 00/50573号；欧州特許第1016711号；Vogelsら, 2003, J. Virol. 77, 8263-8271を参照)。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、複製コンピテントである。そのような複製コンピテントなアデノウイルスベクターの例は、当該分野で周知であり、当業者に容易に利用可能である(例えば、Hernandez-Alcocebaら, 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024；Nemunaitisら, 2001, Gene Ther. 8, 746-759；Alemanyら, 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727を参照)。本発明における使用に適切な複製コンピテントなアデノウイルスベクターは、野生型アデノウイルスゲノムから、Rbに対する結合を失効するようにE1A CR2ドメインで欠失させること(例えば、国際公開第WO00/24408号を参照)及び/又は天然型E1及び/又はE4プロモーターを組織、腫瘍又は細胞状態特異的プロモーターで置換すること(例えば米国特許第5,998,205号、国際公開第WO99/25860号、米国特許第5,698,443号、国際公開第WO00/46355号、同第WO00/15820号及び同第WO01/36650号を参照)により操作することができる。
【００８２】
別の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、複製欠損である(例えば、国際公開第WO94/28152号；Luskyら, 1998, J. Virol 72, 2022-2032を参照)。好ましい複製欠損アデノウイルスベクターは、(アクセッション番号M73260でGeneBankに及びChroboczekら, 1992, Virol. 186, 280-285に開示されているヒトアデノウイルスタイプ５の配列を参照して)およそ459位〜3328位又は459位〜3510位に伸びるE1欠失を伴うE1欠損である(例えば、米国特許第6,136,594号及び同第6,013,638号を参照)。クローニング能力は、アデノウイルスゲノムの更なる部分(非必須のE3領域又は他の必須のE2、E4領域の全部又は一部)を欠失させることにより更に改善する。
【００８３】
本発明の核酸分子は、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができる。好ましくは、E1領域と置き換えて挿入される。問題の領域の天然の転写方向に対してセンス又はアンチセンス配位に配置され得る。
【００８４】
他の適切なウイルスベクターは、ポックスウイルスから導かれる(例えば、Coxら，「Viruses in Human Gene Therapy」，J. M. Hos編, Carolina Academic Pressを参照)。本発明に関して、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科のいずれのメンバー(特に、カナリア痘、鶏痘及びワクシニアウイルス；後者が好ましい)から得てもよい。適切なワクシニアウイルスとしては、コペンハーゲン系統(Goebelら, 1990, Virol. 179, 247-266及び517-563；Johnsonら, 1993, Virol. 196, 381-401)、Wyeth系統及び改変アンカラ(MVA)系統(Antoineら, 1998, Virol. 244, 365-396)が挙げられる(限定されない)。組換えポックスウイルスを構築する一般的条件は当該分野で周知である(例えば、欧州特許公開第206920号；Mayrら, 1975, Infection 3, 6-14；Sutter及びMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851；米国特許第6,440,422号を参照)。本発明の核酸分子は、好ましくは、ポックスウイルスゲノム内の非必須遺伝子座に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子が、コペンハーゲンワクシニアベクターへの挿入(Hrubyら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415；Weirら, 1983, J. Virol. 46, 530-537)に特に適切であり、MVAベクターへの挿入には欠失II又はIIIが特に適切である(Meyerら, 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038；Sutterら, 1994, Vaccine 12, 1032-1040)。
【００８５】
好ましい実施形態によれば、本発明のベクターは、本発明の核酸分子を宿主細胞又は生物における発現に適切な形態で含んでなる。このことは、核酸分子が、ベクター及び/又は宿主細胞にとって適切な１又はそれより多い調節配列の制御下に配置されることを意味する。用語「調節配列」とは、本明細書中で使用する場合、或る宿主細胞における核酸分子の発現を可能にし、該発現に寄与し又は該発現を変調させる(核酸又はその誘導体の１つ(すなわち、mRNA)の複製、重複化(duplication)、転写、スプライシング、翻訳、安定性及び/又は宿主細胞中の輸送を含む)任意の配列をいう。調節配列の選択が、宿主細胞、所望の発現レベルなどのような要因に依存することは、当業者に理解される。
【００８６】
プロモーターは特に重要であり、本発明に関して有用な適切なプロモーターとしては、多くのタイプの宿主細胞において核酸分子の発現を導く構成性プロモーター及び或る宿主細胞においてのみ(例えば、肝臓特異的調節配列)又は特定の事象若しくは外因性の要因に応答して(例えば、温度、栄養素添加物、ホルモン又は他のリガンドにより)ヌクレオチド配列の発現を導くものが挙げられる。
【００８７】
E. coli宿主細胞における発現に適切なプロモーターとしては、バクテリオファージλpLプロモーター、lac、TRP及びIPTG誘導性pTACプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。酵母における発現に適切なプロモーターとしては、TEF(Mumbergら, 1995, Gene 156, 119-122)、PGK(Hitzemanら, 1983, Science 219, 620-625)、MFα(Inokuchiら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 3185-3193)、CYC-1(Guarenteら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2199)、GAL-1、GAL4、GAL10、PHO5、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP又はGAPDH)及びアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(Denisら, 1983, J. Biol. Chem. 25, 1165)プロモーターが挙げられる。ポックスウイルスベクターにおける発現のために、ワクシニア7.5K、H5R、TK、p28、p11又はK1Lプロモーター、Chakrabartiら(1997, Biotechniques 23, 1094-1097)、Hammondら(1997, J. Virological Methods 66, 135-138)及びKumar及びBoyle(1990, Virology 179, 151-158)に記載された合成プロモーター並びに早期/後期キメラプロモーターを使用してもよい。哺乳動物細胞における構成性発現に適切なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター(Boshartら, 1985, Cell 41, 521-530)、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーター(Adraら, 1987, Gene 60, 65-74)及び単純ヘルペスウイルス(HSV)-１のチミジンキナーゼ(TK)プロモーターが挙げられる。外因性に供給された化合物によって調節される誘導性真核プロモーターとしては、亜鉛誘導性メタロチオネイン(MT)プロモーター(Mc Ivorら, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、デキサメタゾン(Dex)誘導性マウス乳腺がんウイルス(MMTV)プロモーター、T7ポリメラーゼプロモーターシステム(国際公開第WO 98/10088号)、エクジソン昆虫プロモーター(Noら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)、テトラサイクリン抑制性プロモーター(Gossenら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551)、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Kimら, 1995, J. Virol. 69, 2565-2573)、RU486誘導性プロモーター(Wangら, 1997, Nat. Biotech. 15, 239-243及びWangら, 1997, Gene Ther. 4, 432-441)及びラパマイシン誘導性プロモーター(Magariら, 1997, J. Clin. Invest. 100, 2865-2872)が挙げられる(限定されない)。
【００８８】
組織特異的プロモーター、特に治療的利益が所望されるHCV感染細胞を標的することを可能とするプロモーターが使用されてもよい。適切なプロモーターとしては、肝臓特異的プロモーター、例えばHMG-CoAレダクターゼ(Luskey, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1881-1893)；ステロール調節エレメント１(SRE-1；Smithら, 1990, J. Biol. Chem. 265, 2306-2310)；アルブミン(Pinkertら, 1987, Genes Dev. 1, 268-277)；ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ(PEPCK)(Eisenbergerら, 1992, Mol. Cell Biol. 12, 1396-1403)；ヒトＣ反応性タンパク質(CRP)(Liら, 1990, J. Biol. Chem. 265, 4136-4142)；ヒトグルコキナーゼ(Tanizawaら, 1992, Mol. Endocrinology 6, 1070-1081)；コレステロール７-αヒドロキシラーゼ(CYP-7)(Leeら, 1994, J. Biol. Chem. 269, 14681-14689)；α-１アンチトリプシン(Cilibertoら, 1985, Cell 41, 531-540)；インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-1)(Babajkoら, 1993, Biochem Biophys. Res. Comm. 196, 480-486)；ヒトトランスフェリン(Mendelzonら, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 5717-5721)；コラーゲンタイプＩ(Houglumら, 1994, J. Clin. Invest. 94, 808-814)及びFIX(US 5,814,716)遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００８９】
本発明での使用に適切な更なるプロモーターは、増殖性腫瘍細胞において優先的に発現する遺伝子から得ることができ、例えば、肝臓ガンにおいて過剰発現するα-フェトプロテイン遺伝子(Kanaiら, 1997, Cancer Res. 57, 461-465)、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)(国際公開第WO99/27113号、同第WO 02/053760号及び Horikawaら, 1999, Cancer Res. 59, 826)及び低酸素応答性エレメント(HRE)のプロモーターである。
【００９０】
当業者は、本発明の核酸分子の発現を制御する調節エレメントが、宿主細胞又は生物における、転写の適切な開始、調節及び/又は終結(例えば、ポリＡ転写終結配列)、mRNA輸送(例えば、核局在化シグナル配列)、プロセシング(例えば、スプライシングシグナル)及び安定性(例えば、イントロン及び非コーディング5'及び3'配列)、翻訳(例えば、ペプチドシグナル、プロペプチド、３成分リーダー配列、リボソーム結合部位、Shine-Dalgamo配列など)及び精製工程(例えば、タグ)のための追加のエレメントを更に含んでなってもよいことを理解する。
【００９１】
例えば、シグナルペプチドを、最終的にはプロペプチドとの組合せで、培養培地への融合タンパク質の分泌を容易にするために使用してもよい。シグナルペプチドは、代表的には、Metイニシエーターの直後で融合タンパク質のＮ末端に挿入され、必要であれば、プロペプチドがシグナルペプチドの下流に挿入される。シグナル及び/又はプロペプチドの選択は、幅広く、当業者に利用しやすい。本発明に適切なシグナル/プロペプチドの例としては、接合因子(MF)αのシグナルペプチド配列(Kurjan及びHerskowitz, 1982, Cell 30, 933-934、及び米国特許第5,879,926号)；インベルターゼ(国際公開第WO84/01153号)；PHO5(ドイツ特許公開第3614/83号)；YAP3(酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３；国際公開第WO95/02059号)；及びBAR1(国際公開第WO87/02670号)が挙げられるが、これらに限定されない。ERへの進入の間に、シグナルペプチドは前駆体ポリペプチドからプロセシング部位で切断される。プロセシング部位は、宿主細胞のタンパク質分解酵素により認識される任意のペプチド配列を含んでなることができる。好ましいプロセシング部位の例としては、２つの塩基性残基Lys及びArgの任意の組合せ(特に好ましくはLys-Arg)(これは、Saccharomyces cerevisiaeのKEX2遺伝子によりコードされるエンドペプチダーゼ(Fullerら, 1986, Microbiology, 273-278を参照)又は他の酵母種の等価プロテアーゼ(Juliusら, 1983, Cell 32, 839-852を参照)によって切断される)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
ペプチドタグ(例えば、利用可能な抗血清が認識することができる短いペプチド配列)を、宿主細胞又は培養上清からの組換え融合タンパク質の精製を容易にするために使用してもよい。好ましくは、タグは、融合タンパク質のＣ末端に挿入する。例示的なタグとしては、Hisタグ(例えば、６又はそれより多いヒスチジン残基から構成される)、S mansoniのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)からのペプチド配列、E. coliからのマルトース結合タンパク質(MPB)、ヒトアルカリホスファターゼ、FLAGオクタペプチド及びe-タグ(米国特許第6,686,152号)が挙げられる(限定されない)。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態は、TEFプロモーターの制御下に配置された本発明の核酸分子(例えば、配列番号13及び14のヌクレオチド配列)及び適切な転写終結配列(例えば、チトクロームcycターミネーター)を含んでなる、酵母における発現用のシャトルプラスミドに関する。このプラスミドは、E. coli及び酵母宿主細胞用の複製起点(例えば、それぞれORI及び２μ)、E. coli(例えば、アンピシリン抵抗遺伝子)及び酵母(例えば、栄養要求性URA3及びLeu2-3)における発現に適切な選択マーカーを更に含んでなる。
【００９４】
本発明の別の好ましい実施形態は、IPTG誘導性pTACプロモーターの制御下に配置された本発明の核酸分子(例えば、配列番号15及び16のヌクレオチド配列)及び適切な転写終結配列を含んでなる、E. coliにおける発現に適切なpGEXプラスミドに関する。このプラスミドは、E. coli用の適切な複製起点(例えば、ORI)及び適切な選択マーカー(例えば、アンピシリン抵抗遺伝子)を更に含んでなる。
【００９５】
本発明の更に別の好ましい実施形態は、適切な調節エレメント下に配置された本発明の核酸分子(例えば、配列番号11及び12のヌクレオチド配列)を含んでなる哺乳動物細胞における発現用の複製欠損アデノウイルスベクターに関する。好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、E1及びE3が欠失しAd5ゲノムであり、E1欠失は、およそヌクレオチド459〜およそヌクレオチド3511に伸び、E3欠失は、およそヌクレオチド28592〜およそヌクレオチド30470に伸びる。好ましいアデノウイルスベクターは、およそヌクレオチド１〜およそヌクレオチド458のAd5配列と、5'側から3'側へ、CMV前初期エンハンサー/プロモーター、キメラヒトβ-グロビン/IgGイントロン(Promegaから入手可能なpCIベクター中に見出されるようなもの)、２つのポリタンパク質形態(配列番号11又は12)のいずれかをコードする配列及びSV40後期ポリアデニル化シグナルを含有する発現カセットと、続いておよそヌクレオチド3512〜およそヌクレオチド28592及びヌクレオチド30470〜およそヌクレオチド35935のAd5配列とを含んでなる。
【００９６】
必要ならば、本発明のベクターは、１又はそれより多い導入遺伝子(例えば、宿主細胞又は生物において本発明の核酸分子と共に発現されるべき関心の遺伝子)を更に含んでなることができる。望ましくは、導入遺伝子の発現は、HCV関連疾患又は病的状態に対し治療的又は保護的活性を有する。適切な導入遺伝子としては、サイトカインをコードする遺伝子(例えば、IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、IFNg)、トキシンをコードする遺伝子(例えば、リシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン)、自殺遺伝子及び特にはアシクロビル又はガンシクロビルプロドラッグとの組合せで使用されるべきであるTK HSV-1をコードする遺伝子(Carusoら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028)、プロドラッグたる５-フルオロシトシン(5-FC)との組合せで使用されるべきであるシトシンデアミナーゼ(CDase)とウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(UPRTase)が挙げられる(限定されない)。この点に関して、FCU-1遺伝子産物(国際公開第WO 99/54481号に記載)は、特に有用である。導入遺伝子は、使用される場合、適切な調節エレメントの制御下に配置され、本発明のベクターの任意の位置に又は本発明のベクターとの組合せで使用される独立のベクターに挿入することができる。
【００９７】
本発明の核酸分子のベクター骨格への挿入は、ルーチンの分子生物学により、例えばSambrookら(2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されたように実施することができる。アデノウイルスベクター又はポックスウイルスベクターへの挿入は、Chartierら(1996, J. Virol. 70, 4805-4810)及びPaulら(2002, Cancer gene Ther. 9, 470-477)にそれぞれ記載されるような相同組換えにより実施することができる。
【００９８】
本発明はまた、脂質又はポリマーと複合化されて微粒子構造(リポソーム、リポプレックス(lipoplex)又はナノ粒子)を形成しているベクター(例えば、プラスミドDNA)を包含する。そのような技術は当該分野で利用可能である(例えば、Arangoaら, 2003, Gene Ther. 10: 5-14；Eliazら, 2002, Gene Ther. 9, 1230-1237及びBetageriら, 1993, 「Liposome drug delivery systems」, Technomic Publishing Company, Incを参照)。
【００９９】
別の実施形態において、本発明は、上記の本発明の核酸分子又はベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子を提供する。
代表的には、そのようなウイルス粒子は次の工程を含んでなる方法により産生される：
(ａ)本発明のウイルスベクターを適切な細胞株に導入し；
(ｂ)感染性ウイルス粒子の産生を可能にするように、細胞株を適切な条件下で培養し；
(ｃ)産生された感染性ウイルス粒子を細胞株の培養物から回収し；
(ｄ)任意に、回収した感染性ウイルス粒子を精製する。
【０１００】
ウイルスベクターが欠損性である場合、感染性粒子は、通常、補完細胞株において又はヘルパーウイルス(これは非機能性ウイルス遺伝子をトランスで提供する)の使用により産生する。例えば、E1欠失アデノウイルスベクターを補完するに適切な細胞株としては、293細胞(Grahamら, 1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72)及びPER-C6細胞(Fallauxら, 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917)が挙げられる。ポックスウイルスベクターを増殖させるに適した細胞は、トリ細胞、最も好ましくは精卵から得られるニワトリ胚から調製される初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)である。
【０１０１】
感染性ウイルス粒子は、培養上清から又は溶菌後の細胞から回収し得る。それらは、標準技術(例えば国際公開第WO96/27677号、同第WO98/00524号、同第WO98/22588号、同第WO98/26048号、同第WO00/40702号、欧州特許公開第1016700号及び国際公開第WO00/50573号に記載されている、塩化セシウムグラジエント中でのクロマトグラフィ、超遠心分離)で更に精製することができる。
【０１０２】
本発明はまた、特定の標的細胞への優先的な標的付け(targetting)を可能にするように改変されたベクター又はウイルス粒子を包含する(例えば、Wickamら, 1997, J. Virol. 71, 8221-8229；Arnbergら, 1997, Virol. 227, 239-244；Michaelら, 1995, Gene Therapy 2, 660-668；国際公開第WO94/10323号；同第WO02/96939号及び欧州特許公開第1146125号を参照)。本発明の標的付けられたベクター又はウイルス粒子の特性は、その表面に、細胞成分又は表面露出成分を認識してこれらに結合することができるリガンド、例えば細胞特異的マーカー(例えば、HCV感染細胞)、組織特異的マーカー(例えば、肝臓特異的マーカー)及びウイルス(例えば、HCV)抗原が存在することである。適切なリガンドの例としては、HCV抗原ドメインに対する抗体又はそのフラグメントが挙げられる。細胞標的付けは、ウイルスの表面に存在するポリペプチド(例えば、アデノウイルス線維、ペントン、pIX又はワクシニアp14遺伝子産物)中へリガンドを遺伝学的に挿入することにより行う。
【０１０３】
本発明はまた、本明細書中に記載される本発明の核酸分子、ベクター又は感染性ウイルス粒子を含んでなる宿主細胞に関する。本発明に関して、用語「宿主細胞」は、組織、器官又は単離細胞における特定構造に関して何らの限定もなく広く理解されなければならない。そのような細胞は、独特な細胞タイプであっても、異なる細胞タイプの一群であってもよく、培養細胞株、初代細胞及び増殖細胞を包含する。
【０１０４】
本発明に関して、宿主細胞としては、原核細胞、下等真核細胞(例えば、酵母)及び他の真核細胞(例えば、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物(例えば、ヒト又は非ヒト)細胞)が挙げられる。好ましいE. coli宿主細胞として、E. coli BL21(Amersham Biosciencesから入手可能)が挙げられる(限定されない)。好ましい酵母宿主細胞としては、S. cerevisiae、S. pombe、Pichia pastorisが挙げられ(限定されない)、特に好ましいのはKEX-2発現酵母細胞、例えば欧州特許公開第607 080号に記載されているTGY47.1(又はその同系のLeu+変換体TGY73.4)系統及び米国特許第5,879,926号、同第5,162,208号及び同第6,103,515号に記載されているものである。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、BHK(ベイビーハムスター腎臓)、CV-1(アフリカサル腎臓細胞株)、COS(例えば、COS-7)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、マウスNIH/3T3細胞、HeLa細胞及びVero細胞が挙げられる(限定されない)。宿主細胞はまた、本発明の複製欠損ベクター(例えば、アデノウイルスベクター)の少なくとも１つの欠損機能を補完することができる補完細胞(例えば、293及びPERC.6細胞)を包含する。
【０１０５】
本発明の具体的実施形態によれば、宿主細胞は更にカプセル化することができる。細胞カプセル化技術は以前に記載されている(Trescoら, 1992, ASAIO J. 38, 17-23；Aebischerら, 1996, Human Gene Ther. 7, 851-860)。
【０１０６】
本発明の更なる観点は、本発明のベクター、感染性ウイルス粒子及び/又は宿主細胞を用いて融合タンパク質を組換え産生する方法である。融合タンパク質を産生する方法は、(ａ)本発明のベクター又は感染性ウイルス粒子を適切な宿主細胞に導入して、トランスフェクト又は感染した宿主細胞を産生し、(ｂ)トランスフェクト又は感染した宿主細胞を宿主細胞の増殖に適切な条件下でインビトロ培養し、(ｃ)細胞培養物から融合タンパク質を回収し、そして(ｄ)任意に、回収した融合タンパク質を精製することを含んでなる。
【０１０７】
当業者は、本発明の融合タンパク質を適切な宿主細胞において産生するために利用可能な多数の発現システム及びベクター又は感染性ウイルス粒子を宿主細胞中へ導入する方法についての知識を有していると予期される。そのような方法としては、マイクロインジェクション(Capechiら, 1980, Cell 22, 479-488)、CaPO4媒介トランスフェクション(Chen及びOkayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752)、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション(Chuら, 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326)、リポフェクション/リポソーム融合(Felgnerら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417)、粒子衝突(Yangら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572)、遺伝子銃、形質導入、ウイルス感染及び種々の手段による宿主生物への直接投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明のベクターは、宿主細胞へのベクターの導入を容易にするために、トランスフェクション試薬、例えば、ポリカチオン性ポリマー(例えば、キトサン、ポリメタクリレート、PEIなど)及びカチオン性脂質(例えば、DC-Chol/DOPE、現在Promegaから入手可能なトランスフェクタムリポフェクチン)との組合せで使用することができる。更に、上記のように、組換えDNA技術を使用して、例えば、高コピー数ベクターの使用、１又はそれより多い転写調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)の置換又は改変、融合体をコードする核酸分子のコドン使用頻度の宿主細胞への最適化及び転写物を脱安定化し得るネガティブ配列の抑制により、宿主細胞における核酸分子の発現を改善することができる。
【０１０９】
本発明の宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコ及びペトリ皿で培養することができる。培養は、所与の宿主細胞に適切な温度、pH及び酸素含量で行うことができる。本明細書では、原核生物及び真核生物細胞におけるタンパク質の産生について公知の種々の方法を詳細に記載するつもりはない。融合タンパク質の産生は、ペリプラズムであるか、細胞内であるか又は宿主細胞の外側(例えば、培養培地中)へ分泌させることができる。
【０１１０】
融合タンパク質が産生宿主細胞の外に分泌されない場合又は完全には分泌されない場合、凍結融解、超音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用などを含む標準的な溶解手順によって回収することができる。分泌される場合、培養培地から直接回収することができる。
【０１１１】
融合タンパク質は、次いで、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、ゲル電気泳動、濾過及びクロマトグラフ法(例えば、逆相、サイズ排除、イオン交換、アフィニティー、ホスホセルロース、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト又は高速液体クロマトグラフィー)を含む周知の精製法により精製することができる。特定の本発明の融合タンパク質を精製するために使用する条件及び技術は、正味電荷、分子量、疎水性、親水性のような因子に依存し、当業者に明らかである。更に、精製のレベルは意図する用途に依存する。産生宿主細胞に依存して、融合タンパク質は種々の糖付加パターンを有することができ、又は糖付加されないことがあり得ることもまた理解される。
【０１１２】
別の観点では、本発明は、本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞(本明細書中では「活性物質」と呼ぶ)又はそれらの任意の組合せ(例えば、異なる遺伝子型又はサブタイプの融合タンパク質の組合せ又はそのような融合タンパク質をコードするベクター/ウイルス粒子の組合せ)を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、組成物は、治療有効量の活性物質に加えて更に、医薬的に許容され得るビヒクルを含んでなる医薬組成物である。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、治療が望まれる疾患又は病的状態に通常伴う１又はそれより多い症状の緩和に十分な用量である。予防的使用に関する場合、この用語は、疾患又は病的状態の確立を予防し又は遅延させるに十分な用量を意味する。例えば、免疫応答を誘導するための治療有効量は、免疫系の活性化(例えば、抗HCV応答の発現を生じる)を引き起こすために必要な量であり得る。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、「医薬的に許容され得るビヒクル」は、医薬投与に適合性の任意の又は全てのキャリア、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤並びに吸収遅延剤などを含むと意図される。
【０１１４】
適切には、本発明の医薬組成物は、ヒト又は動物への使用に適した希釈剤を含んでなる。好ましくは、等張性、低張性又は弱高張性であり、比較的低いイオン強度を有する。代表例としては、滅菌水、生理食塩水(例えば、塩化ナトリウム)、リンゲル液、グルコース、トレハロース又はショ糖溶液、Hank液及び他の生理学的に平衡化された水性の塩溶液が挙げられる(例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkinsの最新版を参照)。本発明の組成物は、生理学的なpH又はわずかに塩基性のpH(例えば、約pH７〜約pH９の間)で、ヒトへの使用に適当であるように、適切に緩衝化される。適切な緩衝剤としては、リン酸緩衝液(例えば、PBS)、重炭酸緩衝液及び/又はトリス緩衝液を含む(限定されない)。
【０１１５】
組成物はまた、望ましい薬学的又は薬力学的性質を提供するための他の医薬的に許容され得る賦形剤を含有することができ、そのような性質としては、例えば、pH、浸透圧、粘度、清澄性、色、無菌性、安定性、製剤溶解速度の改変又は維持、ヒト又は動物生物の中への放出又は吸収の改変又は維持、血液障壁を横切る輸送の促進、或いは特定の臓器(例えば、肝臓)における浸透が挙げられる。適切な賦形剤はアミノ酸を含む。
【０１１６】
本発明の組成物に含まれる医薬的に許容され得るビヒクルは、製造及び長期貯蔵(すなわち、少なくとも一ヶ月)条件下で、凍結温度(例えば、−70℃、−20℃)、冷蔵温度(例えば、４℃)又は周囲温度にて、その安定性を保存することも可能にしなければならない。この点に関して、本発明の組成物に特に適合する製剤は以下のものを含む：
・１Ｍショ糖、150mM NaCl、１mM MgCl2、54mg/l Tween 80、10mMトリス(pH8.5)(特に活性物質がアデノウイルスベクターのとき)、及び
・10mg/mlマンニトール、１mg/ml HSA、20mMトリス(pH7.2)及び150mM NaCl
・生理食塩水。
【０１１７】
加えて、本発明の組成物は、ヒトにおける全身適用又は粘膜適用に適した１又はそれより多いアジュバントを含んでなってもよい。好ましくは、アジュバントは、本発明の組成物に対する免疫、特にＴ細胞媒介免疫(例えば、TLR-7、TLR-8及びTLR-9のようなトール様レセプター(TLR)を通じて)を刺激することが可能である。有用なアジュバントの代表例としては、ミョウバン、フロイントの完全又は不完全(IFA)のような鉱油エマルジョン、リポ多糖又はその誘導体(Ribiら, 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)、QS21のようなサポニン(Suminoら, 1998, J.Virol. 72, 4931-4939；WO 98/56415)、イミキモド(Imiquimod)(Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43, S6-S11)及び関連化合物S-27609(Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12, 1324-1332)のようなイミダゾ-キノリン化合物、CpG(Chuら, 1997, J. Exp. Med. 186: 1623；Tritelら, 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547)のようなシトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド並びにIC-31(Kritschら, 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-270)のようなカチオン性ペプチドが挙げられる(限定されない)。
【０１１８】
本発明の組成物は、全身、経皮及び局所投与を含む種々の投与態様により投与することができる。注射は、任意の手段、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、血管内、動脈内注射又は動脈(例えば、肝動脈注入)若しくは肝臓供給静脈(例えば、門脈への注射)への直接注射により実行することができる。注射は、従来のシリンジ及び針又は当該分野で利用可能な任意の他の適当なデバイスを用いて行うことができる。或いは、本発明の組成物は、粘膜経由で、例えば口腔/消化管(alimentary)、鼻腔、気管内、肺内、膣内又は直腸内ルートで投与してもよい。気道への投与は、液滴の噴霧若しくはエアロゾル化、スプレー又は加圧容器(例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの適切な噴射剤を用いる)を用いるか若しくは非加圧ディスペンサー中の乾燥粉末組成物によって実行することができる。局所投与もまた経皮手段(例えば、パッチなど)を用いて実行することができる。本発明に関して、筋肉内及び皮下投与は好ましい経路を構成する。
【０１１９】
本発明の組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体又は凍結物であることができる。固体(例えば、乾燥粉末又は凍結乾燥物)組成物は、真空乾燥及び凍結乾燥を含む方法によって得ることができる。粘膜投与のために、組成物は、経口投与用には耐消化性(gastroresistant)カプセル及び顆粒として、直腸又は膣投与用には坐剤として、最終的には粘膜の孔サイズを増大させるに有用な吸収増強剤との組合せで製剤化することができる。そのような吸収増強剤は、代表的には、粘膜のリン脂質ドメインに対して構造的類似性を有する物質、例えばデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル-β-シクロデキストリン、ラウロイル-1-リゾホスファチジルコリンである。
【０１２０】
適切な投薬量は、種々のパラメーターの関数、特に、投与態様；用いる組成物；宿主生物の年齢、健康及び体重；症状の性質と程度；同時に行う治療の種類；治療の頻度；及び/又は予防若しくは治療の必要性の関数として適合させることができる。治療に適切な投薬量を決定するために必要な更に精密な計算は、該当する事情を考慮して、医師がルーチンで行う。一般的なガイダンスとして、ウイルスを含んでなる組成物(例えば、アデノウイルス粒子)に適切な投薬量は、約105から1013iu(感染単位)まで、望ましくは約107から1012iuまで変化する。ベクタープラスミドに基づく組成物は、10μg〜20mgの間、有利には100μgから２mgの間の用量で投与し得る。タンパク質組成物は、10ng〜20mgの間の１又はそれより多い用量で投与してもよく、体重１kg当たり約0.1μg〜約２mgの治療タンパク質という投薬量が特に好ましい。投与は、単回投薬でか又は或る時間間隔の後に１又は数回繰り返す投薬で行ってもよい。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、種々の疾患及び病的状態、特にHCV感染に伴うものを治療する方法において用い得る。本明細書で使用する場合、用語「治療」又は「治療する」は、予防及び/又は治療法を包含する。本発明の医薬組成物は、HCV持続感染及びHCV感染患者における肝臓ガンの治療に特に有用である。用語「ガン」は、散在性又は局所性の腫瘍、転移ガン、ガン性ポリープ並びに前ガン性の病変(例えば、肝硬変)を含む任意のガン性の病的状態を包含する。好ましくは、本明細書に記載した様式に従って宿主生物中に導入する際に、本発明の組成物は、治療した宿主に治療上の利益を提供する。用語「宿主生物」は、任意の動物、特に哺乳動物、例えば、任意のネズミ、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、サル又はヒト対象(例えば、HCVに感染したヒト)を包含すると意図される。治療上の利益は、多くの方法により、例えば、感染個体の血液、血漿又は血清中に検出されるHCVウイルス血症の治療前と比較した減少、及び/又は抗HCV免疫応答(例えば、抗HCV抗体の産生及び/又はＴ細胞媒介免疫)の検出、又はHCV感染に伴う症状の遅延(例えば、肝硬変又は肝ガンの発症の遅延)、又はHCV感染に典型的に関連する肝臓の炎症/脂肪症/線維症状態の減少、又は当該個体の従来の治療法に対する応答の改善により証明することができる。
【０１２２】
したがって、本発明はまた、上記の様式に従ってHCV感染、HCV関連疾患及び病的状態を治療又は予防することを意図する薬物の製造のための、本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞又は組成物の使用を包含する。上記の方法による使用をも包含する。
本発明はまた、ヒト又は動物生物に、治療有効量の本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞又は組成物を投与することを含んでなる、ヒト又は動物生物の治療又は予防の方法を提供する。
【０１２３】
所望であれば、本発明の方法は、１又はそれより多い従来の治療様式(例えば、放射線照射、化学療法及び/又は手術)と組み合せて施行することができる。複数の治療アプローチの使用は、より幅広い介入を患者に提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、手術介入の前又は後に実行することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、放射線療法(例えば、γ線照射)の前又は後に実行することができる。当業者は、使用することができる適切な放射線療法プロトコール及びパラメーターを容易に処方することができる(例えば、Perez及びBrady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 第２版 JB Lippincott Coを参照；当業者に容易に理解されるような適切な適応及び改変を使用)。
【０１２４】
更に別の実施形態において、本発明の方法又は使用は、HCV感染、HCV関連疾患又は病的状態の治療又は予防に従来使用されている１又はそれより多いHCV薬による化学療法と組み合わされる。HCV薬の代表例としては、プロテアーゼ阻害剤(例えば、VertexのVX950のようなセリンプロテアーゼ阻害剤)、ポリメラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、抗線維化剤(antifibrotics)、ヌクレオシドアナログ、TLRアゴニスト、Ｎ-糖付加阻害剤、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗HCV抗体、免疫モジュレーター、治療ワクチン及びHCV関連肝細胞ガンの治療に通常使用する抗腫瘍剤(例えば、肝動脈における化学塞栓術により通常投与されるアドリアマイシン又はアドリアマイシンリピオドールとスポンゼルとの混合物)が挙げられる(限定されない)。例えば、治療ワクチンは、組換え抗原、VLP、ベクター又は抗HCV体液性応答の誘引に特に適するHCV構造タンパク質(例えば、コア、エンベロープE1及び/又はE2)に基づくか若しくはこれをコードする合成ペプチドを包含する。。このようなHCV薬は、単回投与で或いは標準のプロトコール、投薬量及び数時間、数日及び/又は数週間にわたるレジメンに従う複数回投与で提供される。投与は、本発明の組成物の投与の前、投与と同時又は投与の後であり得る。特に適切な組合せは、本発明の方法の前の、該方法と並行する又は該方法に引き続く、PEG化INF-α2a(例えば、10μg/週の用量で)及び/又はリバビリン(例えば、800〜1200mg/日で)による24〜48週間の治療を包含する。
【０１２５】
別の実施形態において、本発明の方法又は使用は、１又はそれより多いプライマー組成物と１又はそれより多いブースター組成物の逐次投与を含んでなるプライムブースト(prime boost)治療様式に従って実行する。代表的には、プライミング組成物及びブースティング組成物は、少なくとも抗原性ドメインを共通して含んでなるか又はコードする異なるビヒクルを用いる。プライミング組成物を宿主生物に最初に投与し、続いて１日から12ヶ月まで変化する期間の後にブースティング組成物を同じ宿主生物に投与する。本発明の方法は、プライミング組成物の１〜10回の逐次投与に続くブースター組成物の１〜10回の逐次投与を含んでなってもよい。望ましくは、注射間隔は、ほぼ１週間〜６ヶ月である。更に、プライミング組成物及びブースティング組成物は、同じ部位に又は同じ投与経路若しくは異なる投与経路で代わりの部位に投与することができる。例えば、ポリペプチドに基づく組成物は粘膜経路で投与することができる一方、ベクターに基づく組成物は好ましくは注射し、例えば、MVAベクターについては皮下注射、DNAプラスミド及びアデノウイルスベクターについては筋肉内注射による。
【０１２６】
本発明に関して、本発明の組成物は、抗HCV免疫応答をプライムするか又はブーストするか又はプライム及びブーストの両方のいずれかをするために使用する。本発明の好ましいプライミング組成物は、好ましくは、融合体をコードするアデノウイルスベクター/ウイルスと融合体をコードするプラスミドDNAとを含んでなるものである。融合体をコードするMVAベクター/ウイルスは、好ましくはブースト用に使用する。一方、組換え産生融合タンパク質は、独立してプライム用又はブースト用に使用する。例えば、配列番号９又は配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する組換え産生融合タンパク質でプライムし、その融合タンパク質をコードするアデノウイルスベクターでブーストしてもよい。別の例として、配列番号９又は配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするDNAプラスミドでプライムし、その融合タンパク質をコードするMVAウイルス粒子でブーストしてもよい。
【０１２７】
本発明の組成物はまた、本発明の組成物と共通の抗原性ドメイン(例えば、NS3、NS4B及び/又はNS5Bポリペプチドの抗原性ドメイン)をコードするか又は含んでなる先行技術の物質と組み合せて使用することもできる。そのような物質の供給源は幅広く、そのような供給源としては、ペプチド、タンパク質、種々のウイルスからのウイルスベクター、プラスミドDNA、ウイルス様粒子のようなタンパク質性粒子(Burnsら, 1994, Mol. Biol. Techno. 1, 137-145)、放射線照射細胞のような細胞性物質、ウイルス粒子などが挙げられる(限定されない)。例えば、本発明に関して有用な特に適切なベクターは、国際公開第WO2004/111082号に記載され、NS3、NS4B及びNS5Bをコードするアデノウイルスベクター及びMVAベクターである。別の例として、国際公開第WO03/097677号に記載され、NS3、NS4B及びNS5Bの抗原性ドメインを含んでなるペプチドも、本発明に関して有用である。例示を目的として、国際公開第WO2004/111082号のアデノウイルス粒子でプライムし、続いて、上記のように配列番号９若しくは配列番号10の組換え産生融合タンパク質又は配列番号９若しくは配列番号10の融合タンパク質をコードするMVAベクター/ウイルスでブースとしてもよい。別の例として、配列番号９又は配列番号10の融合タンパク質をコードするDNAプラスミドでプライムし、国際公開第WO2004/111082号のMVAベクターでブーストしてもよい。
しかしながら、他のプライムブーストの組合せも本発明に関して可能である。
【０１２８】
本発明はまた、宿主生物においてHCVに対する免疫応答を誘導又は刺激する方法を提供し、この方法は、該免疫応答を誘導又は刺激するために、該生物に、本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞又は組成物を投与することを含んでなる。免疫応答は、特異的及び/又は非特異的、体液性及び/又は細胞媒介性の応答であり得る。免疫応答は、好ましくは、HCV抗原を指向するＴ細胞応答である。
【０１２９】
本発明の方法が動物又はヒト生物において投与に際して抗HCV免疫応答の誘導又は刺激する能力は、当該分野で標準的な種々のアッセイを用いてインビトロ又はインビボで評価することができる。免疫応答の開始及び活性化を評価するために利用可能な技術の一般的記載については、例えば、Coliganら(1992 and 1994, Current Protocols in Immunology ；ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health)を参照。細胞性免疫の測定は、活性化されたエフェクター細胞により分泌されるサイトカインプロフィール(CD4+及びCD8+Ｔ細胞に由来するものを含む)の測定(例えば、IL-10又はIFNg産生細胞のELIspotによる定量)によって、免疫エフェクター細胞の活性化状態の決定(例えば、古典的［3H］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ)によって、感作された対象における抗原特異的Ｔリンパ球についてのアッセイ(例えば、細胞傷害性アッセイにおけるペプチド特異的溶解)によって実行する。体液性応答を刺激する能力は、抗体結合及び/又は結合における競合によって決定する(例えば、Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Pressを参照)。本発明の方法はまた、適当な感染性又は腫瘍誘導性物質(例えば、NS遺伝子を発現するワクシニアウイルス)で攻撃した動物モデルにおいて更に有効性を確認して、該感染性又は腫瘍誘導性物質の中和及び最終的には関連する症状に対する部分的な抵抗性(これは抗HCV免疫応答の誘導又は強化を反映する)を決定することができる。本発明の組成物の試験及び検証は、後記の実施例の章でも説明する。
【０１３０】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質又はそのペプチドフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用する場合、抗体は、標的ペプチドに結合し、無関係のタンパク質に有意には結合しないとき、標的ペプチドに選択的に結合する。或る場合には、ペプチドに結合する抗体は、ある程度の交差反応性にもかかわらず依然として選択的であると理解される。そうであっても、本発明の抗体は、個々の天然型NSポリペプチド及び天然型配置で配置されたNSポリペプチドの融合体には、高親和性又は高い選択性で結合しないことが好ましい。
【０１３１】
本明細書中で使用する場合、抗体は、当該分野で認識されている抗体と一致すると明確に定義される。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにそれら抗体のフラグメント(Fab又はF(ab')2及びFvフラグメントを含むがこれらに限定されない)を包含する。本発明の抗体は、当該分野で慣用の技術を用いて、例えば有効量の本発明の融合タンパク質及び/又はそのペプチドフラグメントを動物に投与した後に作製することができる。抗体は、好ましくは、独特な配列(例えば、NS4AポリペプチドとNS3ポリペプチドの融合部位に重なる配列及びNS3ポリペプチドとNS5Bポリペプチドの融合部位に重なる配列)を含んでなる本発明の融合タンパク質の領域又は別個のフラグメントから作製する。
【０１３２】
本発明の抗体は、本発明の範囲内の種々の潜在的用途を有している。例えば、そのような抗体は、(ａ)本発明の融合タンパク質を検出するアッセイにおける試薬として、(ｂ)生物学的サンプル中のHCVウイルスの存在を検出するアッセイにおける試薬として、及び/又は(ｃ)本発明の組換え産生融合タンパク質を、タンパク質及び他の夾雑物の混合物から回収するツールとして(例えば、培養宿主細胞からのアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降による精製を可能にすることによって)使用することができる。
【０１３３】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物又は抗体を用いる、HCVウイルスによる感染に感受性の個体から採取した生物学的サンプル(例えば、血漿、血清、組織)中のHCVウイルス又は抗HCV抗体の検出及び/又は定量の方法に関する。
【０１３４】
１つの実施形態において、本発明の方法は、生物学的サンプル中のHCVウイルスの検出及び/又は定量により特に適切であり、該方法は、生物学的サンプルを少なくとも１つの本発明の抗体と、ウイルスと抗体との間で複合体の形成を可能にする条件下に接触させる工程及び複合体の形成を適切な手段により検出及び/又は定量する工程を少なくとも含んでなる。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明の方法は、生物学的サンプル中の抗HCV抗体の検出及び/又は定量により特に適切であり、該方法は、生物学的サンプルを本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物と、抗HCV抗体と本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物との間で複合体の形成を可能にする条件下に接触させる工程及び複合体の形成を適切な手段により検出及び/又は定量する工程を少なくとも含んでなる。
【０１３６】
当業者は、本発明の方法で使用すべき抗体、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物の量を容易に決定する。ウイルスの検出及び/又は定量の手段はルーチンであり、当業者に周知である。例示を目的として、ブロット、ELISA、いわゆるサンドウィッチ技術、競合技術及びPCR技術(特に、いわゆる「リアルタイム」技術)を挙げてもよい。本発明の抗体、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞又は組成物の試薬としての使用は、検出可能な物質とのカップリング(すなわち、物理的連結)により容易になることがある。検出可能な物質の例としては、種々の酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ)、補欠分子団(例えば、ストレプトアビジン/ビオチン又はアビジン/ビオチン)、蛍光物質(例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体)、発光物質、生物発光物質(例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン又はエクオリン)及び放射性物質(例えば、125I、131I、35S又は3H)が挙げられる。
【０１３７】
最後に、本発明は、本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞、組成物又は抗体の、生物学的サンプルにおけるHCV感染のインビトロ診断のための使用に関する。
【０１３８】
本発明を例示様式で記載してきた。用いた用語法は、限定的文言の性質を有しているというよりはむしろ説明的文言の性質を有すると意図されていると理解すべきである。自明のこととして、上記の教示に照らして本発明の多くの改変及び変形が可能である。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本明細書中に具体的に記載したものとは異なる様式で実施してもよいと理解すべきである。
【０１３９】
上記で引用した特許、刊行物及びデータベース記載事項の開示の全てが、それら特許、刊行物及び記載事項の各々が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されている場合と同程度に、具体的にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
図面の説明
図１は、NS4A-3-5B融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。付加又は改変したアミノ酸残基には下線を付する一方、置換した天然型残基を配列の下に示す。
図２は、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。付加又は改変したアミノ酸残基には下線を付する一方、置換した天然型残基を配列の下に示す。
【０１４１】
図３は、哺乳動物細胞における発現に最適化された、NS4A-3-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
図４は、哺乳動物細胞における発現に最適化された、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【０１４２】
図５は、酵母細胞における発現に最適化された、NS4A-3-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
図６は、酵母細胞における発現に最適化された、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【０１４３】
図７は、原核細胞における発現に最適化された、NS4A-3-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
図８は、原核細胞における発現に最適化された、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【０１４４】
図９は、後記する実施例に示される融合タンパク質NS4A-3-5B及びNS4A-3-4B-5Bの概略設計図を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、NS3、NS4B及びNS5Bポリペプチドで予測できる抗原性ドメインを表す(国際公開第WO03/097677号を参照)。
図10は、gWiz NS4A-3-5B Hs及びgWiz NS4A-3-4B-5B Hs発現ベクターの概略構造を示す。
【０１４５】
図11は、gWiz NS4A-3-5B(Ａ  レーン１及びＣ  レーン３)、gWiz NS4A-3-4B-5B(Ｂ  レーン１及びＣ  レーン２)及びgWiz(Ａ  レーン２、Ｂ  レーン２及びＣ  レーン１)プラスミドによるHuh-7細胞のトランスフェクション後の、ウェスタンブロットによるインビトロ発現を示す。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクトHuh-7細胞を溶菌し、融合タンパク質をマウスモノクローナル抗NS3抗体(Ａ及びＢ)又はマウスモノクローナル抗NS5B抗体(Ｃ)を用いるウェスタンブロット分析により検出した。
【０１４６】
図12は、gWiz NS4A-3-5B Hsの筋肉内注射後の、IFNγELISPOTアッセイによるNS3に特異的なCD8+Ｔ細胞応答の評価を示す。個々のマウスの脾細胞をNS3特異的ペプチドGLL又は無関係のペプチドの存在下にて40時間培養した。結果は、三つ組ウェル(triplicate well)で得られた106脾細胞について検出したスポット数の平均値として示す。M1、M2、M3及びM4は、gWiz NS4A-3-5B Hsで免疫した４匹のマウスを表す。Mcはコントロールのマウスである。
【０１４７】
図13は、アデノウイルス感染細胞からの融合タンパク質の発現を示す。A549細胞(1.5×106細胞)に、異なるアデノウイルス、それぞれ、融合体発現アデノウイルスAdTG17476及びAdTG17477並びにネガティブコントロールとしての空のアデノウイルス及び無関係の組換えアデノウイルスを、10のMOIで感染させた。細胞を10％血清と48時間培養した後、Laemmli緩衝液で溶菌した。タンパク質サンプル(１/20容量)をSDS PAGE電気泳動ゲル上に負荷した。タンパク質をクーマシーブルーで検出した。レーン１：分子量マーカー；レーン２：非感染A549細胞；レーン３：空のアデノウイルスに感染したA549細胞；レーン４：無関係のアデノウイルスに感染したA549細胞；レーン５：AdTG17476に感染したA549細胞；及びレーン６：AdTG17477に感染したA549細胞。
【０１４８】
図14は、HLA-A2.1トランスジェニックマウスにおいてAd HCV融合タンパク質により誘導されたIFNγ Elispot応答を示す。AdTG17476、AdTG17477又は空のAdを、前脛骨筋に109 IU/マウスの用量で１回筋肉内注射した。各動物群(試験用は４匹のマウス、コントロール群用は２匹のマウスを含む)について、注射の２週間後にIFNγ ELISPOTにより細胞性免疫応答を評価した。NS3特異的HLA-A2制限エピトープGLL(図14A)及びKLT(図14B)並びにNS5B特異的HLA-A2制限エピトープKLQ(図14C)に対する個々のマウス(M1〜M4)の応答が示す。無関係のペプチドDLMをネガティブコントロールとして使用する。106脾細胞についてのスポット数が50(カットオフライン)よりも大きい場合、ELISPOT応答を陽性と見なす。
【０１４９】
以下の実施例は、本発明の例示のために提供される。
【実施例】
【０１５０】
実施例
材料及び方法
以下に記載する構築物を、Sambrookら(2001, Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)に詳細に記載されているような遺伝子工学及び分子クローニングの一般的技術に従って又は市販キットを用いる場合には製造者の推奨に従って製造する。PCR増幅技術は当業者に公知である(例えば、PCR Protocols-A guide to Methods and applications, 1990；Innis, Gelfand, Sninsky and White編, Academic Press Incを参照)。ヒトHu-7肝ガン細胞株を使用して、以下の実施例に記載された構築物からの融合タンパク質の正確な発現を評価した。培養条件は当該分野で慣用されている。例示を目的として、細胞を、10％ウシ胎仔血清、２mM L-グルタミン及び100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)を補充したダルベッコ改変イーグル培地を含有する完全DMEM培地において、37℃にて５％CO2雰囲気中で増殖させる。細胞を、Lipofectamine Plus試薬(Invitrogen)を用い、製造者の指示に従ってトランスフェクトする。NS3及びNS5Bを指向するネズミモノクローナル抗体は、市販品として購入することができるか又は当該分野で慣用の技術に従って製造することができる。
【０１５１】
プラスミドの構築
オーバーラップするオリゴヌクレオチドを使用して、それぞれNS4A-NS3-NS5B(3666ヌクレオチド)及びNS4A-NS3-NS4B-NS5B(3747ヌクレオチド)融合タンパク質をコードする合成遺伝子を作製した(GeneART, Regensburg, Germany)。融合体の設計を図９に示す。ヌクレオチド配列を、ホモサピエンス(配列番号11及び12並びに図３及び４)、Pichia(配列番号13及び14並びに図５及び６)、及びE. coli(配列番号15及び16並びに図７及び８)における高度発現に最適化した。得られた融合体のアミノ酸配列を、NS4A-NS3-NS5Bについては配列番号９に、NS4A-NS3-NS4B-NS5Bについては配列番号10に示す。合成ヌクレオチド配列の各々を、pPCR-Scriptプラスミド(Stratagene)のSacI及びKpnI制限部位にクローニングした。
【０１５２】
哺乳動物細胞における一過性発現には、ホモサピエンスにおける発現に最適化した融合体をコードする合成遺伝子(配列番号11〜12並びに図３及び４)を、gWiz発現ベクター(Gene Therapy Systems)のSacI及びNotI制限部位に、サイトメガロウイルスプロモーターの転写制御下に挿入して、gWiz NS4A-3-5B Hs及びgWiz NS4A-3-4B-5B Hsベクター(図10)を作製した。次いで、配列番号17に示すオリゴヌクレオチド(5'-ATG TAC GTC GAC CACC ATG GGC AGC GTG GTG ATT GTG GGC CGG ATC 3')を用いてコザックコンセンサス配列(下線)を改善し、配列番号18に示すオリゴヌクレオチド(5'-CAT GTA GC GGC CGC TCA TCA TCT AGG CCT GGC CCT GGA CAG-3')を用いて停止コドン(下線)を作製して、配列を改変した。全てのプラスミドを配列決定により検証した。
【０１５３】
インビトロ発現研究
ウェスタンブロット分析
トランスフェクションの１日前に、Huh-7(５×105/ウェル)を６ウェルプレート中に播種した。細胞を、gWiz NS4A-3-5B Hs、gWiz NS4A-3-4B-5B Hsベクター又はネガティブコントロールとしてのgWizプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後48時間で、細胞を50mMトリス-HCl、150mM NaCl、0.1％ SDS、１％ NP40及び0.5％デオキシコール酸Na中で溶菌した。溶菌サンプルを95℃で５分間加熱し、タンパク質をSDS-８％ポリアクリルアミド上での電気泳動により分離した。免疫ブロッティングを、NS3特異的マウスモノクローナル抗体(例えば、8G4C3、bioMerieux)又はNS5B特異的マウスモノクローナル抗体(例えば、11F6C8、bioMerieux)を一次抗体として、ヤギ抗マウスIgG-ペルオキシダーゼ抗体(Sigma)を二次抗体として使用して実施した。市販のECLキット(Amersham Biosciences)を使用してシグナルを明らかにした。
【０１５４】
免疫蛍光分析
トランスフェクションの１日前に、ガラスカバースリップを６ウェルプレート中に配置し、0.2％ゼラチンで10分間処理し、次いで各ウェル中に５×105のHuh-7細胞を播種した。細胞単層を、gWiz NS4A-3-5B Hs、gWiz NS4A-3-4B-5B Hsベクター又はネガティブコントロールとしてのgWizプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後48時間で、カバースリップをPBS中で２回洗浄し、細胞を４％PFAで10分間固定し、次いで洗浄し、PBS中0.1％ Triton X-100で10分間透過化処理した。カバースリップを洗浄し、一次抗体としてのNS3特異的マウスモノクローナル抗体(例えば、8D8E1、bioMerieux)又はNS5B特異的マウスモノクローナル抗体(例えば、5B-12B7、D. Moradpourによる提供)で室温にて１時間処理した。洗浄後、TRITC抗マウスIgG(Dako)を30分間加えた。洗浄後、カバースリップを80％グリセロール中にマウントした。ラメ(lame)をCarl Zeiss Axioplan顕微鏡で観察し、AxioCamカラーデジタルカメラで撮影した。
【０１５５】
インビボ発現研究
Pascoloら(1997, J. of Experimental Medicine 185, 2043-2051)により記載されたように作製したHLA-A2.1トランスジェニックマウスを飼育した。これらマウスは、H-2Db及びマウスβ2-ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされており、ヒトβ2mのＣ末端がキメラ重鎖(HLA-A2.1 α1-α2、H-2Dbα3膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメイン)のＮ末端に共有結合したトランスジェニック単鎖組織適合性クラスＩ分子を発現する。
【０１５６】
免疫プロトコール
プラスミド注射の５日前に、HLA-A2トランスジェニックマウスに10μＭ心臓毒(Latoxan)での前処置をした。gWiz NS4A-3-5B、gWIZNS4A-3-4B-5B及びgWiz(ネガティブコントロール)プラスミドを、100μg(100μlの１× PBS中)の用量にて２週間間隔で２回筋肉内に注射した。２回目の免疫の２週間後に、例えばHimoudiら(2002, J. Virol. 76, 12735-46)に記載されたように、HLA-A2制限CD8+Ｔ細胞応答を調べた。
【０１５７】
ELISPOTアッセイによる免疫応答のモニタリング
脾細胞(２×105)を、抗マウスIFNγモノクローナル抗体(Pharmingen；10μg/ml)で被覆したMultiscreenプレート(Millipore)において三つ組ウェルで、完全αMEM培養培地(Invitrogen)中、ネガティブコントロールとしての10ユニット/mlの組換えIL-2(PeproTech Inc, England)単独又はポジティブコントロールとしての５μg/mlのコンカバリン(Concavalin)Ａ又は10μMのペプチド(DLM無関係ペプチド、Martinら, 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405及びHimoudiら, 2002, J. Virol. 76, 12735-46により記載されたNS3タンパク質中に位置するGLLペプチド)の存在下で40時間培養した。IFNγ産生細胞を、以前に記載されたようなサイトカイン特異的酵素結合免疫スポットアッセイ(ELISPOT)(Himoudiら, 2002, J. Virol. 76, 12735-46)により定量した。ネガティブコントロールウェル中のスポット数(個々のIFNγ産生細胞を表す)を、ペプチドを含有する試験ウェル中の数から減算した。結果を三つ組ウェルについて得た平均値として示す。
【０１５８】
実施例１：NS4A-3-5B及びNS4A-3-4B-5Bポリタンパク質のインビトロ発現
融合タンパク質NS4A-3-5B及びNS4A-3-4B-5Bをコードする配列を、図９に概説したように構築した。配列を、以下に列挙するように、３つの異なる宿主(GeneART, Regensburg, Germany)ヒト(Hs)、Pichia pastoris(Pp)及びE. coli(Ec)のそれぞれにおける発現に最適化した：
【０１５９】
ホモサピエンスにおける発現に最適化したNS4A-3-5B Hs(配列番号11及び図３)
Pichiaにおける発現に最適化したNS4A-3-5B Pp(配列番号13及び図５)
E. coliにおける発現に最適化したNS4A-3-5B Ec(配列番号15及び図７)
ホモサピエンスにおける発現に最適化したNS4A-3-4B-5B Hs(配列番号12及び図４)
Pichiaにおける発現に最適化したNS4A-3-4B-5B Pp(配列番号14及び図６) 
E. coliにおける発現に最適化したNS4A-3-4B-5B Ec(配列番号16及び図８)。
【０１６０】
NS4A-NS3-NS4B-NS5B及びNS4A-NS3-NS5B融合体をコードしホモサピエンスにおける発現に最適化した配列を、gWiz発現ベクター(GeneTherapy Systems)中に、サイトメガロウイルスプロモーターの転写制御下にクローニングした(図10)。NS融合タンパク質の発現を、gWiz NS4A-3-5B Hsベクター、gWiz NS4A-3-4B-5B Hsベクター又はネガティブコントロールとしてのgWizプラスミドでトランスフェクトしたHuh-7細胞において、ウェスタンブロット及び免疫蛍光により評価した。
【０１６１】
図11に示されるように、ウェスタンブロット分析により、抗NS3特異的抗体(図11A及び7B)又は抗NS5B特異的抗体(図11C)による検出後に、約135kDaの予測した分子量を有するユニークなバンドが個々の融合体の各々について明らかになった(短いNS4A-3-5B融合体については図11Aレーン１及び図11Cレーン３、長いNS4A-3-4B-5B融合体については図11Bレーン１及び図11Cレーン２)。予想されたように、gWizプラスミドでトランスフェクトしたHuh-7細胞から得たサンプル中には、タンパク質は検出されなかった(図11Aレーン２、図11Bレーン２及び図11Cレーン１)。これら結果は、短い融合体NS4A-NS3-NS5B及び追加的にNS4Bが組み込まれた長い融合体がHuh-7細胞で発現することを確証する。
【０１６２】
免疫蛍光分析により、Huh-7トランスフェクト細胞における２つの融合タンパク質の発現が確証された。興味深いことに、両タンパク質は細胞質内局在を示した。このことは、疎水性膜固定ドメインの大部分の欠失の結果としての適切なプロセシングを示唆する。gWizプラスミドでトランスフェクトした細胞はシグナルを示さなかった。
【０１６３】
実施例２：gWIZ NS4A-3-5B Hs及びNS4A-3-4B-5B Hsの免疫原性のインビボ評価
プラスミドgWiz NS4A-3-5B Hs及びNS4A-3-4B-5B HsがHLA-A2トランスジェニックマウスにおいてCD8+Ｔ細胞応答を誘導する能力を評価するために、免疫原性研究を、「材料及び方法」に記載したように従って実施した。２回目の免疫の２週間後に、IFNγELISPOTアッセイによりHLA-A2制限CD8+Ｔ細胞応答を調べた。図12に示されるように、pgWiz NS4A-3-5Bは、HLA-A2制限性であり周知の免疫優性GLLペプチド(NS3タンパク質、Martinら, 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405)に特異的なIFNγ産生Ｔ細胞を誘導することができた。このことは、このエピトープの正確な提示を示唆する。
【０１６４】
融合タンパク質を保護免疫について評価するために、前臨床マウス攻撃アッセイを使用することも可能である。マウスにHCVウイルスを直接感染させることはできないので、これらアッセイは、組換えワクシニアウイルス(WR系統)又はHCV NS抗原を発現するリステリア(Listeria)のいずれかを利用する。ワクシニアウイルス又はリステリアの注射後、マウスは、注射後２〜６日をピークとする感染を発症し、ウイルス又は細菌が注射されたマウスの卵巣(ワクシニアモデル)又は肝臓(リステリアモデル)に検出されるようになる。前臨床評価には、候補ワクチン(組換え融合タンパク質又は融合タンパク質を発現するアデノウイルス粒子の投与)、コントロール(例えば、天然型配置のNSポリペプチド融合体の投与)及びネガティブ構築物(例えば、非HCV抗原又は空のアデノウイルス)のマウスへのワクチン接種を含ませる。その後、動物を、HCV NS抗原(NS2〜NS5)の全てを発現する組換えワクシニアウイルス又はワクチン候補に含まれるNS抗原の１つを発現するリステリアで攻撃する。ワクチンが特異的Ｔ細胞のプライムに成功する場合、攻撃されたマウスは、ワクシニア又はリステリアベクター及びNS抗原に対する免疫応答を発現する。候補ワクチンの保護活性は、非ワクチン接種マウスの卵巣又は肝臓で測定したワクシニア又はリステリアの力価と比較して、ワクチン接種マウスの卵巣又は肝臓で測定したワクシニア又はリステリアの力価の減少を生じる。
【０１６５】
実施例３：哺乳動物細胞におけるNS4A-3-5B及びNS4A-3-4B-5B融合タンパク質の発現
NS4A-NS3-NS5B(3666ヌクレオチド)及びNS4A-NS3-NS4B-NS5B(3747ヌクレオチド)に対応する、ホモサピエンスにおける発現に最適化された融合体をコードする合成遺伝子(配列番号11〜12)を、次のプライマーOTG18033(GGGGGGCTAGCGCCACCATGGGCAGCGTGGTGATTG；配列番号19)及びOTG18036(GGGGGGGTACCCTCATCATCTAGGCCTGGCCCTG；配列番号20)を用いて、対応するpPCR-ScriptプラスミドからPCRにより増幅した。両フラグメントを、アデノウイルス配列(それぞれ、アデノウイルスヌクレオチド１〜458及びヌクレオチド3328〜5788)に囲まれたCMV駆動発現カセットを含有するアデノウイルスシャトルプラスミドのNheI及びKpnI制限部位に挿入して、相同組換えによるベクターゲノムの作製を可能にした(Chartierら, 1996, J. Virol. 70, 4805-4810)。得られたアデノウイルスベクターは、E3(ヌクレオチド28592〜30470)及びE1(ヌクレオチド459〜3511)を欠失しており、E1領域が、CMV前初期エンハンサー/プロモーターと、キメラヒトβ-グロビン/IgGイントロン(Promegaから入手可能なpCIベクター中に見出されるようなもの)と、２つのポリタンパク質形態のいずれかをコードする配列と、SV40後期ポリアデニル化シグナルとを(5'から3'に)含有する発現カセットにより置換されている。得られたアデノウイルスベクターを、pTG17476(NS4A-3-4B-5B)及びpTG17477(NS4A-3-5B)と命名した。慣用のE1補完細胞株にPacI線状化ウイルスゲノムをトランスフェクトすることにより、組換えアデノウイルスAdTG17476及びAdTG17477を作製した。ウイルスの増殖、精製及び力価決定を以前に記載されているように行った(Erbs, 2000, Cancer Res. 60, 3813-3822)。
【０１６６】
融合タンパク質の発現を、アデノウイルス感染細胞において、SDS PAGE電気泳動により評価した。A549細胞(1.5×106細胞)(ATCC CCL-185)に、10又は100のMOIで、融合体発現アデノウイルスAdTG17476及びAdTG17477並びにネガティブコントロールとしての空のアデノウイルス及び無関係の組換えアデノウイルスを感染させた。細胞を、10％血清と共に48時間培養した後、Laemmli緩衝液で溶菌した。タンパク質サンプル(１/20容量)をSDS PAGE電気泳動ゲル上に負荷し、タンパク質をクーマシーブルーにより染色した。図13に示されるように、AdTG17476及びAdTG17477に感染した細胞(レーン５及び６)において、およそ135kDaの予測した分子量を有するユニークなバンドが明確に観察された。このことは、融合体をコードするアデノウイルスベクターに感染した細胞における高発現レベルを反映する。他方、このバンドは、ネガティブコントロールに感染した細胞(レーン３及び４)並びに非感染A549細胞(レーン２)から回収したサンプルにおいて欠落している。
【０１６７】
発現レベルを、10のMOIでウイルス構築物に48時間感染されたA549細胞におけるウェスタンブロットにより分析した。細胞ペレットを回収し、抗NS3マウスモノクローナル抗体(例えば、1B6，bioMerieux)及び抗NS4ウサギポリクローナル抗体(例えば、RB、bioMerieux)を用いてプローブした。抗NS3又は抗NS4特異的抗体での検出後、予測した分子量を有する主要なバンドが、AdTG17476及びAdTG17477に感染した細胞から回収したサンプルにおいて明らかになった。このことは、クーマシーブルー染色後に検出される高発現レベルを確認する。
【０１６８】
実施例４：HLA-A2トランスジェニックマウスにおけるHCVポリタンパク質発現アデノウイルスの免疫原性
動物モデル
HLA-A2.1トランスジェニックマウスを、Pascoloら(1997, J Ex Med)により記載されたように作製した。これらマウスは、H-2Db及びマウスβ2-ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされ、ヒトβ2mのＣ末端がキメラ重鎖(HLA-A2.1 α1-α2、H-2Dbα3膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメイン)のＮ末端に共有結合したトランスジェニック単鎖組織適合性クラスＩ分子を発現する。
【０１６９】
免疫プロトコール
３群のマウスがこのプロトコールに含まれ、それぞれ、AdTG17476(Ad NS4A-3-4B-5B)を注射した４匹のマウス、AdTG17477(Ad NS4A-3-5B)を注射した４匹のマウス、空のAd(Ad1514)を注射した２匹のマウスであった。アデノウイルスは、前脛骨筋に、100μlの１×PBS中109IUの用量で１回筋肉内注射した。細胞性免疫応答を注射の２週間後に調べた。
【０１７０】
免疫応答のモニタリング
ELISPOTアッセイ
各群のマウスからの脾細胞を回収し、赤血球を溶解した。２.105細胞を、抗マウスIFNγモノクローナル抗体(Pharmingen；10μg/ml)で被覆したMultiscreenプレート(Millipore)において三つ組ウェルで、完全αMEM培養培地(GIBCO BRL)中、ネガティブコントロールとしての10ユニット/mlの組換えマウスIL-2(PeproTech Inc, England)単独又は10μMのペプチド(DLM無関係ペプチド、NS3タンパク質に位置するGLL及びKLTペプチド、NS5Bタンパク質に位置するKLQペプチド(Martinら, 2004, J Med Virol. 74, 397-405及びHimoudiら, 2002, J Virol., 76, 12735-12746)又はポジティブコントロールとしての５μg/mlのコンカバリンＡの存在下で40時間培養した。IFNγ産生細胞を、以前に記載されたようなサイトカイン特異的酵素結合免疫スポットアッセイ(ELISPOT)(Himoudiら, J Virol 2002)により定量した。ネガティブコントロールウェル中のスポット数(個々のIFNγ産生細胞を表す)を、ペプチドを含有する試験ウェル中の数から減算した。結果を三つ組ウェルについて得た平均値として示す。
【０１７１】
結果
アデノウイルス免疫の２週間後に、HLA-A2制限Ｔ細胞応答をIFNγELISPOTアッセイにより調べた。図14に示されるように、AdTG17476及びAdTG17477の両方が、全てのワクチン接種動物において、HLA-A2制限GLLエピトープに特異的なIFNγ産生Ｔ細胞を高頻度で誘導することができた(図14A、中央値：それぞれ1210及び868スポット)。AdTG17476の方が統計学的に有意に高効率であった(Mann-Whitney検定、p=0.0209)。両ウイルスとも、より低い頻度(中央値：187及び90スポット)で、亜優性(subdominant)のKLTエピトープに特異的なIFNγ産生Ｔ細胞もまた誘導した(図14B)。加えて、AdTG17476をワクチン接種したマウスの２:４、AdTG17477をワクチン接種したマウスの１:４がNS5Bタンパク質のKLQエピトープを標的する応答を発現した(図14C)。
【０１７２】
このことは、本発明による融合タンパク質が、真核系において高レベルで産生されことが可能であること及び得られたタンパク質が慣用のモデル動物において免疫原性であることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１−１】NS4A-3-5B融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２−１】NS4A-3-4B-5B融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【０１７４】
【図３−１】哺乳動物細胞における発現に最適化された、NS4A-3-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図３−４】図３−３の続きである。
【図３−５】図３−４の続きである。
【図３−６】図３−５の続きである。
【０１７５】
【図４−１】哺乳動物細胞における発現に最適化された、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図４−４】図４−３の続きである。
【図４−５】図４−４の続きである。
【図４−６】図４−５の続きである。
【０１７６】
【図５−１】酵母細胞における発現に最適化された、NS4A-3-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図５−３】図５−２の続きである。
【図５−４】図５−３の続きである。
【図５−５】図５−４の続きである。
【０１７７】
【図６−１】酵母細胞における発現に最適化された、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図６−４】図６−３の続きである。
【図６−５】図６−４の続きである。
【図６−６】図６−５の続きである。
【０１７８】
【図７−１】原核細胞における発現に最適化された、NS4A-3-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図７−４】図７−３の続きである。
【図７−５】図７−４の続きである。
【図７−６】図７−５の続きである。
【０１７９】
【図８−１】原核細胞における発現に最適化された、NS4A-3-4B-5B融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図８−３】図８−２の続きである。
【図８−４】図８−３の続きである。
【図８−５】図８−４の続きである。
【図８−６】図８−５の続きである。
【０１８０】
【図９】実施例に示される融合タンパク質NS4A-3-5B及びNS4A-3-4B-5Bの概略設計図を示す。
【図１０】gWiz NS4A-3-5B Hs及びgWiz NS4A-3-4B-5B Hs発現ベクターの概略構造を示す。
【図１１】gWiz NS4A-3-5B(Ａ  レーン１及びＣ  レーン３)、gWiz NS4A-3-4B-5B(Ｂ  レーン１及びＣ  レーン２)及びgWiz(Ａ  レーン２、Ｂ  レーン２及びＣ  レーン１)プラスミドによるHuh-7細胞のトランスフェクション後の、ウェスタンブロットによるインビトロ発現を示す。
【０１８１】
【図１２】gWiz NS4A-3-5B Hsの筋肉内注射後の、IFNγELISPOTアッセイによるNS3に特異的なCD8+Ｔ細胞応答の評価を示す。
【図１３】アデノウイルス感染細胞からの融合タンパク質の発現を示す。
【図１４】HLA-A2.1トランスジェニックマウスにおいてAd HCV融合タンパク質により誘導されたIFNγ Elispot応答を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)を起源とするNS4Aポリペプチドを含む少なくとも３つのNSポリペプチドを含んでなり、NSポリペプチドが天然型配置中で現れる順序とは異なる順序で配置され、NS4AポリペプチドはＮ末端に位置している、単離された融合タンパク質。
【請求項２】
前記NSポリペプチドの各々の間の融合が直接であるか又はリンカーを介している、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３】
前記NSポリペプチドが全て同じHCV系統又は単離株を起源とする、請求項１又は２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項４】
前記NSポリペプチドの少なくとも２つが異なるHCV系統又は単離株を起源とする、請求項１又は２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項５】
NS4AポリペプチドとNS3ポリペプチドとNS5Bポリペプチドとを含んでなり、NS5BをＣ末端に有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項６】
NS4AポリペプチドとNS3ポリペプチドとNS4BポリペプチドとNS5Bポリペプチドとを含んでなり、NS5BをＣ末端に有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項７】
前記NS3ポリペプチドが、有意に減少したプロテアーゼ活性を示すように、天然型NS3ポリペプチドと比較して改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項８】
前記NS3ポリペプチドが、有意に減少したヘリカーゼ活性を示すように、天然型NS3ポリペプチドと比較して改変されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項９】
前記NS5Bポリペプチドが、有意に減少したRNA依存性RNAポリメラーゼ活性を示すように、天然型NS5Bポリペプチドと比較して改変されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１０】
天然型HCVポリタンパク質前駆体のNS3/NS4A接合部、NS4A/NS4B接合部、NS4B/NS5A接合部及びNS5A/NS5B接合部に通常存在する１又はそれより多くのNS3認識切断部位を含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１１】
前記NS4A、NS4B及び/又はNS5Bポリペプチドが、天然型NS4A、NS4B及び/又はNS5Bポリペプチドの膜固定に通常関与する１又はそれより多い疎水性ドメインを欠失するように改変されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１２】
前記NS3ポリペプチドが、
12位から56位にわたる部分、70位から155位にわたる部分及び218位から248位にわたる部分を保持し；
Hisとは異なるアミノ酸残基、例えばAla残基による57位のHis残基の置換を含んでなり；
Thrとは異なるアミノ酸残基、例えばAla残基による269位のThr残基の置換を含んでなり；
Argとは異なるアミノ酸残基、例えばAla残基による464位のArg残基の置換を含んでなり；及び
631位のThr残基を含まない
様式で少なくとも改変されている配列番号１に示される天然型NS3タンパク質を起源とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１３】
前記NS3ポリペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１４】
前記NS4Aポリペプチドが、
配列番号２の21位〜33位の部分を含有し；
配列番号２の１位〜20位の部分を含有しない
様式で少なくとも改変されている配列番号２に示される天然型NS4Aタンパク質を起源とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１５】
前記NS4Aポリペプチドが、前に開始Met残基が付された配列番号６に示されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１４に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１６】
前記NS4Bポリペプチドが、
78位のSer残基から109位のLeu残基にわたる部分を含んでなり；
261位のCys残基を含まない
様式で少なくとも改変されている配列番号３に示される天然型NS4Bタンパク質を起源とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１７】
前記任意のNS4Bポリペプチドが、配列番号７に示されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１８】
前記NS5Bポリペプチドが、
155位のArg残基から182位のLeu残基にわたる部分を含んでなり；
Aspとは異なるアミノ酸残基、例えばAsn残基による220位のAsp残基の置換を含んでなり；
Aspとは異なるアミノ酸残基、例えばAsn残基による318位のAsp残基の置換を含んでなり；
571位のTrp残基から591位のArg残基にわたる部分を含まない
様式で少なくとも改変されている配列番号４に示される天然型NS5Bタンパク質を起源とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１９】
前記NS5Bポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１８に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号９又は１０に示されるアミノ酸配列と相同な又は同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２２】
哺乳動物宿主細胞における発現に最適化されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
配列番号１１又は１２に示されるヌクレオチド配列と相同な又は同一のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
酵母宿主細胞における発現に最適化されたヌクレオチド配列を有する、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
前記酵母宿主細胞がサッカロマイセス セレビシエ、サッカロマイセス ポンベ及びピキア パストリスからなる群より選択される、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号１３又は１４に示されるヌクレオチド配列と相同な又は同一のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２５に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
原核生物宿主細胞における発現に最適化されたヌクレオチド配列を有する、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
配列番号15又は１６に示されるヌクレオチド配列と相同な又は同一のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２７に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子の１又はそれより多いコピーを含んでなるベクター。
【請求項３０】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２９に記載のベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子。
【請求項３１】
請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２９に記載のベクター又は請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子を含んでなる宿主細胞。
【請求項３２】
(ａ)請求項２９に記載のベクター又は請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子を宿主細胞に導入して、請求項３１に記載のトランスフェクト宿主細胞又は感染宿主細胞を作製し；
(ｂ)前記トランスフェクト宿主細胞又は感染宿主細胞を該宿主細胞の増殖に適切な条件下でインビトロ培養し；
(ｃ)該細胞培養物から融合タンパク質を回収し；及び
(ｄ)任意に、回収した融合タンパク質を精製する
ことを含んでなる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を組換え的に製造する方法。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子、請求項３１に記載の宿主細胞又はそれらの任意の組合せを含んでなる組成物。
【請求項３４】
HCV感染、HCV関連の疾患及び病的状態の治療又は予防を意図する薬物の製造のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の感染性ウイルス粒子、請求項３１に記載の宿主細胞又は請求項３３に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
請求項３３に記載の組成物が抗HCV免疫応答をプライムするか若しくはブーストするかのいずれか又はプライムしブーストするために使用される、プライムブースト治療様式に従って行われる、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
１又はそれより多いHCV薬での化学療法と組み合せて行われる請求項３４又は３５に記載の使用。
【国際調査報告】
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