(57)【要約】  本発明は線維芽細胞、とりわけ関節軟骨細胞を培養するために有用な、定義された無血清培地を提供し、かかる培地は血清含有培地の使用に付随する問題を回避する。定義された培地は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、化学的に定義された脂質、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、またはこれらの化合物の組み合わせを含む。別の側面において、本発明はまた、定義された無血清培地において軟骨細胞をインキュベートすることを含む、組織培養法を提供する。かかる方法は、低密度で播種された軟骨細胞の再分化能を維持しながら、それらの接着および増殖性増幅を促進する。
2009540826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）が補足された基礎培地を含む培養培地。
【請求項２】
基礎培地に実質的に純粋なインターロイキン６（ＩＬ−６）が追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
基礎培地に実質的に純粋な白血病抑制因子（ＬＩＦ）が追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項４】
基礎培地に実質的に純粋なＩＬ−６および実質的に純粋なＬＩＦが追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項５】
基礎培地がｃＤＲＦである、請求項１に記載の培養培地。
【請求項６】
基礎培地に実質的に純粋な血小板−由来成長因子（ＰＤＧＦ）が追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項７】
培養培地にステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸からなる群より選択される１つまたは複数の脂質が追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項８】
基礎培地がｃＤＲＦであり、ＰＤＧＦおよび化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）が追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項９】
基礎培地がｃＤＲＦｍであり、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭが追加的に補足された、請求項１に記載の培養培地。
【請求項１０】
基礎培地がｃＤＲＦｍであり、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭが追加的に補足された、請求項２に記載の培養培地。
【請求項１１】
基礎培地に実質的に純粋なｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）および／または実質的に純粋なインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）が補足されていない、請求項１に記載の培養培地。
【請求項１２】
培養培地中、ＯＳＭが０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項１に記載の培養培地。
【請求項１３】
培養培地中、ＯＳＭおよびＩＬ−６のそれぞれが、０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項２に記載の培養培地。
【請求項１４】
培養培地中、ＯＳＭおよびＬＩＦのそれぞれが、０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項３に記載の培養培地。
【請求項１５】
培養培地中、ＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦが、０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項４に記載の培養培地。
【請求項１６】
培養培地が無血清である、請求項１に記載の培養培地。
【請求項１７】
培養培地が血清をさらに含む、請求項１に記載の培養培地。
【請求項１８】
（ａ）ｃＤＲＦｍ；
（ｂ）０．１−１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ；
（ｃ）０．０５−５％  ＣＤＬＭ；
（ｄ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ；および
（ｅ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６
を含む培養培地。
【請求項１９】
実質的に純粋なＯＳＭが補足された基礎培地を含む培養培地とともに細胞をインキュベートする工程を含む、細胞培養の方法。
【請求項２０】
基礎培地に実質的に純粋なＩＬ−６が追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
基礎培地に実質的に純粋なＬＩＦが追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
基礎培地に実質的に純粋なＩＬ−６および実質的に純粋なＬＩＦが追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
基礎培地がｃＤＲＦである請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
基礎培地に実質的に純粋なＰＤＧＦが追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
基礎培地にステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸からなる群より選択される１つまたは複数の脂質が追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
基礎培地がｃＤＲＦであり、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭが追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
基礎培地がｃＤＲＦｍであり、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭが追加的に補足されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
基礎培地がｃＤＲＦｍであり、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭが追加的に補足されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
培養培地が実質的に純粋なＪＡＧ１および／または実質的に純粋なＩＬ−１３で補足されていない、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
ＯＳＭが培養培地中０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
培養培地中、ＯＳＭおよびＩＬ−６がそれぞれ０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
培養培地中、ＯＳＭおよびＬＩＦがそれぞれ０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
培養培地中、ＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦがそれぞれ０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
培養培地が無血清である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
培養培地が血清をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が軟骨細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
軟骨細胞が脱分化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
軟骨細胞が間葉系肝細胞に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
軟骨細胞がヒト軟骨細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
軟骨細胞がヒト関節軟骨細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
軟骨細胞が初代である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
細胞を継代する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項４３】
キレート剤を含む溶液で細胞をインキュベートすることによって細胞が継代される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＥＤＴＡが０．１ｍＭから１ｍＭまでの濃度で溶液中に存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
３２５ユニット／ｍｌ以下のトリプシンを含む溶液で細胞をインキュベートすることによって細胞が継代される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
溶液が０．１ｍＭから１ｍＭまでのＥＤＴＡを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞が２０，０００個／ｃｍ２以下の密度で播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項４９】
軟骨細胞を培養する方法であって、該軟骨細胞を培養培地でインキュベートする工程を含み、該培養培地が、
（ａ）ｃＤＲＦｍ；
（ｂ）０．１−１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ；
（ｃ）０．０５−５％ＣＤＬＭ；
（ｄ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ；および
（ｅ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６：
を含む、培養方法。
【請求項５０】
請求項１に記載の培養培地を用いて培養される軟骨細胞。
【請求項５１】
請求項１９に記載の方法を用いて培養される軟骨細胞。
【請求項５２】
請求項４９に記載の方法を用いて培養される軟骨細胞。
【請求項５３】
対象における軟骨欠損を治療する方法であって、その方法が、
（ａ）請求項１に記載の方法を用いて軟骨細胞を培養すること；および
（ｂ）対象に軟骨細胞を投与すること：
を含む治療方法。
【請求項５４】
対象における軟骨欠損を治療する方法であって、その方法が、
（ａ）請求項１９に記載の方法を用いて軟骨細胞を培養すること；および
（ｂ）対象に軟骨細胞を投与すること：
を含む治療方法。
【請求項５５】
対象における軟骨欠損を治療する方法であって、その方法が、
（ａ）請求項４９に記載の方法を用いて軟骨細胞を培養すること；および
（ｂ）対象に軟骨細胞を投与すること：
を含む治療方法。
【請求項５６】
軟骨細胞および請求項１に記載の培養培地を含む組成物。
【請求項５７】
軟骨細胞および
（ａ）ｃＤＲＦｍ；
（ｂ）０．１−１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ；
（ｃ）０．０５−５％ＣＤＬＭ；
（ｄ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ；および
（ｅ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６
を含む培養培地を含む組成物。
【請求項５８】
培養培地であって、
（ａ）実質的に純粋なＰＤＧＦおよびＣＤＬＭのいずれか一方または両方；および
（ｂ）実質的に純粋なＯＳＭ、実質的に純粋なＩＬ−６、および実質的に純粋なＬＩＦのいずれか一つまたは複数：
が補足された基礎培地を含む、培養培地。
【請求項５９】
基礎培地がｃＤＲＦである、請求項５８に記載の培養培地。
【請求項６０】
基礎培地がｃＤＲＦｍである、請求項５８に記載の培養培地。
【請求項６１】
基礎培地が実質的に純粋なＰＤＧＦおよびＣＤＬＭで補足された、請求項５８に記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００６年６月２０日に出願された米国特許出願第６０／８０５，３０７号に優先権を主張するものであって、この全内容は引用により本明細書の記載とする。
【０００２】
本発明は細胞および組織培養の分野に関する。より具体的には、本発明は軟骨欠損の治療または修復を意図した、軟骨組織を形成することができる細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節軟骨は、軟骨細胞によって産生された複合細胞外マトリクス内に包まれた軟骨細胞からなる。このマトリクス特有の生化学的組成は、関節の関節表面の滑らかで、ほとんど摩擦のない動きを提供する。加齢にしたがって、ヒト関節軟骨の引っ張り特性は生化学的変化の結果として変化する。３０歳以降、関節軟骨の引っ張り強度は著しく低下する。外傷または疾患、たとえばリウマチ性および変形性関節炎により生じた軟骨の損傷は、重大な身体的衰弱を引き起こす可能性がある。
【０００４】
軟骨が、それ自体を修復することは不可能であるため、軟骨損傷に伴う臨床的症状を緩和するいくつかの外科的方法が開発された。米国だけで、年間に５００，０００以上の関節形成法および関節交換が行なわれる。自己軟骨細胞移植は関節軟骨欠損の治療に認可されている方法である。その方法は、大腿顆の非荷重部分に由来する軟骨片を採取すること、および単離した軟骨細胞をその後同じ患者に戻して移植するためにｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることを含む。Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：８８９-８９５（１９９４）。
【０００５】
関節軟骨細胞は関節軟骨−特異的細胞外マトリクス成分を発現する。関節軟骨細胞はいったん採取され、酵素的消化により組織から分離されると、それらを増殖性増幅のために単層培養することができる。しかしながら、組織培養中にこれらの細胞は線維芽細胞的な形態をとり、そしてヒアリン様関節軟骨に特徴的なＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカン産生を中止する。そのような「脱分化」細胞は、速やかに増殖し、線維性組織に特徴的なＩ型コラーゲンを産生する。それにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの懸濁培養培地（Ａｕｌｔｈｏｕｓｅら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．＆  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：６５９-６６８（１９８９））のような適切な環境中、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨欠損（Ｓｈｏｒｔｋｒｏｆｆら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７：１４７-１５４（１９９６））環境中に置いた場合、細胞は再分化する、すなわち関節軟骨−特異的マトリクス分子を再び発現する。脱分化可逆性は、培養した自己軟骨細胞を使用して関節軟骨を上手く修復させるのに肝要である。
【０００６】
ヒト軟骨細胞は一般に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコの調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養する。Ａｕｌｔｈｏｕｓｅら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５：６５９-６６８（１９８９）；Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１２：９７-１０４（１９９４）。しかしながら、たとえ血清が哺乳動物細胞培養で広く使用されていても、その使用に関してはいくつかの問題がある：（１）血清には多くの未確認または非定量成分が含まれ、したがって「定義（ｄｅｆｉｎｅｄ）」されない；（２）血清成分はロット毎に異なり、実験または他の細胞培養への使用のために標準化することを困難にする；（３）血清成分の多くは細胞接着、増殖、および分化に影響を与え、これらのパラメータを制御することを困難にする；（４）血清のいくつかの成分は特定の細胞型の増殖に抑制性であり、ある程度その増殖作用を妨害し、結果として最適以下の増殖となる；（５）血清はウイルスおよび他の病原体を含むかもしれず、培養した細胞をヒトに移植しようとする場合、そのような血清は実験結果に影響を与えるか、または潜在的な健康被害を与えるかもしれない。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）無血清培地：動物細胞培養、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，９１-９９。
【０００７】
したがって、定義された無血清培地の使用は軟骨欠損の治療のための軟骨細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖にとりわけ好都合である。しかしながら、そのような定義された無血清培地は低密度で播かれた成人のヒト関節軟骨細胞の接着には十分であり、集密的な培養が得られるまで増殖を維持させ、そして関節軟骨表現型を再発現するための軟骨細胞の能力を維持するに違いない。
【０００８】
細胞培養のための生化学的に定義された培地（ＤＭ）を開発する努力が続けられてきた。ＤＭは一般に栄養分、成長因子、ホルモン、接着因子、および脂質を含む。的確な組成は、培地が考案される具体的な細胞型に対して適応しなければならない。線維芽細胞、ケラチン細胞、および上皮細胞を含む、いくつかの細胞型の首尾よい増殖が各種ＤＭ中で達成されてきた。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９４およびＢｕｔｌｅｒ  Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．バイオテクノロジー．６８：２８３−９１（２００５）。
【０００９】
自己軟骨細胞移植に利用可能な出発細胞材料の量は一般に限定されている。したがって、最小の集密下密度で関節軟骨細胞を播くことが好ましい。ＤＭにおける集密下密度での関節軟骨細胞を培養する試みは部分的にのみ成功した。低密度で播かれた軟骨細胞の増殖能力を持続させることができるＤＭは開発されているが、これらの培地の使用は播種後の組織培養容器への細胞の初期の接着のために依然として血清を必要とする。Ａｄｏｌｐｈｅら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５５：５２７-５３６（１９８４）、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１５０，１６３。
【００１０】
したがって、医学的適用、とりわけヒトにおける使用のために再分化可能な軟膏細胞の接着、増殖、および維持のための条件を最適化し、標準化し、そして制御するための必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：８８９-８９５（１９９４）
【非特許文献２】Ａｕｌｔｈｏｕｓｅら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．＆  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：６５９-６６８（１９８９）
【非特許文献３】Ｓｈｏｒｔｋｒｏｆｆら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７：１４７-１５４（１９９６）
【非特許文献４】Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）無血清培地：動物細胞培養、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，９１-９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の概要
この発明は化学的に定義された培養培地（ＤＭ）、該培地を作製する方法、および該培地の使用方法、たとえば細胞を培養すること、とりわけ、軟骨欠損の修復のためにヒト関節軟骨細胞を培養することを提供する。本発明のＤＭの特徴の一つは、１つまたは複数のＩＬ−６ファミリーのうちの実質的に純粋なサイトカイン、たとえばオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）などの存在である。
【００１３】
他にも好都合な点はあるが中でも、本発明は軟骨細胞培養において血清の使用を回避し、無血清条件下で細胞接着および増殖を促進し、および／または軟骨特異的表現型を再発現するための軟骨細胞の能力を維持することができる。一つの態様において、本発明は細胞の培養基材への初期接触に十分なＤＭを提供し、それによって細胞培養の初期段階における血清含有培地の必要性を除去する。本発明の別の態様は、細胞培養中のどの段階においても血清を使用せずに軟骨細胞などの細胞の増殖を促進する、定義された無血清細胞培養培地を提供する。本発明のさらに別の態様は、対象に移植する前に軟骨細胞を準備するために使用されるか、または軟骨欠損への移植を意図してマトリクス内に埋め込まれた軟骨細胞に対する再分化−維持培地として含まれることができる、細胞培養培地を提供する。本発明の別の態様は、軟骨欠損患者を治療するために適した状態の軟骨細胞の培養方法を提供する。本発明のさらなる好都合な点は以下の説明において部分的に示され、そして一部はその記載から明らかであるか、または本発明の実施により知ることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のＤＭは、ＩＬ−６ファミリーの１つまたは複数のサイトカイン、たとえばＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦなどを含む１つまたは複数の補足物が補足された基礎培地を含む。
【００１５】
基礎培地は適当な培地であってよい。好ましい実施態様において、基礎培地はｃＤＲＦ（表３）またはｃＤＲＦｍ（表４）である。ｃＤＲＦおよびｃＤＲＦｍはＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、およびＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を１：１：１の比で混合することによって調製されるか、または予混合培地を適切に合わせて表３および４のそれぞれに明記された基礎培地に達するように成長補足物を加えることによって調製される。
【００１６】
さらに好ましい実施態様において、基礎培地はさらに、血小板−由来成長因子（ＰＤＧＦ）および／または１つまたは複数の脂質が補足される。実施態様において、脂質は化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ；表５）であるか、あるいはＣＤＬＭ（たとえば、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸）から選択される１つまたは複数の脂質である。一実施態様において、本発明のＤＭは：
（ａ）実質的に純粋なＰＤＧＦおよびＣＤＬＭのうちの１つまたは両方；および
（ｂ）実質的に純粋なＯＳＭ、実質的に純粋なＩＬ−６、および実質的に純粋なＬ            ＩＦ；
が補足された基礎培地（たとえば、ｃＤＲＦまたはｃＤＲＦｍ）を含んでいてもよい。
たとえば、好ましい実施態様において、本発明のＤＭは含んでいてもよい：（ａ）基礎培地；（ｂ）０．１−１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ；（ｃ）０．０５−５％  ＣＤＬＭ；      （ｄ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ；および／または（ｅ）０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６。
【００１７】
先の大まかな説明および以下の詳細な説明は共に代表的で説明的なものだけであり、特許請求の範囲のように本発明を限定するものではないと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（１）ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳまたは（２）Ｅ９３培地（ＣＤＬＭ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−６、およびＯＳＭが補足された表４に明示するｃＤＲＦｍ）中で３回継代して、培養された初代ヒト軟骨細胞の増殖の比較を表す。
【図２】（１）ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳまたは（２）Ｅ９３培地（ＣＤＬＭ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−６ｍおよびＯＳＭが補足された表４に明示されたｃＤＲＦｍ）中で３回継代して、培養された初代ヒト軟骨細胞の細胞収率の比較を実証したものを表す。
【図３】Ｅ９３（２，３，４列）またはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（５，６，７列）中で増殖した軟骨細胞由来の細胞溶解物のＲＰＡを示す。軟骨マーカー、コラーゲン２およびアグリカンはすべての試料において発現される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細な説明
この発明は化学的に定義された培養培地（ＤＭ）、該培地を作製する方法、および該培地の使用方法、たとえば細胞を培養すること、とりわけ、軟骨欠損の修復のためにヒト関節軟骨細胞を培養することを提供する。本発明はＰＤＧＦおよびＣＤＬＭならびにＩＬ−６ファミリーの１つまたは複数のサイトカインが補足されたｃＤＲＦｍと言われる基礎培地が、培養中で再分化可能な軟骨細胞の接着、増殖および維持に十分であり、細胞培養のすべての段階において、血清含有培地と置き換えることができるという発見に少なくとも部分的に基づく。ＩＬ−６ファミリーのサイトカインは、たとえばＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦを含む。
【００２０】
したがって、一つの態様において、本発明は１つまたは複数の補足物が補足された基礎培地を含み、ＩＬ−６ファミリーの１つまたは複数のサイトカイン、たとえば、ＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦを含む培養培地を提供する。
【００２１】
「が補足される」という用語は、補足物が出発物質に加えられることによって最終物質を得ることを意味する。特に明示しない限り、１つまたは複数の補足物は特定の時間または特定の順序で加えられる必要はない。「が補足される」という用語は、現存の補足物で補足される前または後のいかなる時点においても、出発物質が他の補足物で追加的に補足されることを除外することはない。特に明示しない限り、補足物は実質的に「純粋な形態」で培地に追加される。「実質的に純粋な」という用語は、自然に発生する成分が実質的に取り除かれていることを示す。たとえば、実質的に純粋なサイトカインは精製されたサイトカインまたは組み換えによって生成されたサイトカインである。
【００２２】
Ｉ．基礎培地の作製（ｃＤＲＦ）
本発明の定義された無血清培地（ＤＭ）の作製の第一段階は基礎培地を得ることである。基礎培地はいかなる適当な培地であってもよい。実施態様において、基礎培地は表３に明示されたｃＤＲＦである。ｃＤＲＦは以下に記載の市販の出発成分から作製され得る。ｃＤＲＦは、Ａｄｏｌｐｈｅら、（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５５：５２７-５３６（１９８４））およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（米国特許第６，１５０，１６３号）によって開発されたＤＭの改変である。
【００２３】
ｃＤＲＦの３種の出発成分はＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ-１６４０、およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。出発成分は１：１：１の比で合わせる。３つすべての培地は一度に合わせることができ、あるいは培地のいずれか２つを予め混合しておき、その後適当な量の３つ目の培地と合わせることができる。出発成分の正確な組成は表１に明示される。得られた培地（表２に明示し、ＤＲＦという）は次にＩＴＳ（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、７ｎｇ／ｍｌ  セレニウム、および、場合により、２．０μｇ／ｍｌ  エタノールアミン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ヒトフィブロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｇｒｉｆｏｌｓ；Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ；またはＢａｘｔｅｒ；Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）、リノール酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），ヒト塩基性胎児成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、およびハイドロコーチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足し、ｃＤＲＦを作製する。すべての材料は取り扱い説明書にしたがって溶かし、希釈し、そして保存する。成分を合わせて最終的な培地を得るための正確な順序は重要ではない。完全な培地は標準的な手技により作製され、使用するまで好ましくは２−８℃で保存することができる。好ましい実施態様において、基礎培地は本質的に以上に記載したとおり、ヒト血清アルブミン、リノール酸、およびハイドロコーチゾンの量を調節して、表４に明示したように改変ｃＤＲＦ（ＣＤＲＦｍ）となるよう作製される。
【００２４】
実施態様において、基礎培地は表３に挙げられたｃＤＲＦのすべての必須成分を含む培地である。表３に記載の成分または成分のサブセットの濃度を下げるか、または成分を除去した場合に軟骨細胞の接着、増殖、および再分化に関連する培地の特性が実質的に同じならば、かかる成分または成分のサブセットは必須ではない。個々の成分について定められた濃度は具体的な細胞培養条件に合わせて調整することができる。当業者は、定法を使用してそのような調整を容易に行なうことができる。
【００２５】
付加的な成分が好ましく、軟骨細胞の接着、増殖、および再分化に悪い影響を与えない場合は、そのような成分を培地に添加することができる。そのような成分には、これに限定されないが、成長因子、脂質、血清タンパク質、ビタミン、ミネラル、および炭水化物が含まれる。たとえば、米国特許第６，１５０，１６３号に記載の、ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、−β２、−β３）、ＩＧＦ、およびインスリンのような軟骨細胞再分化を促進する成長因子またはホルモンを培地に補足することが好都合である。そのような成長因子およびホルモンは市販されている。補足物の別の例として骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれ、それらには少なくとも１５の構造および機能に関連するタンパク質が存在するが、それらに限定されない。ＢＭＰは各種細胞型の成長、分化、老化性、およびアポトーシスに関与することが示されている。たとえば、組換えＢＭＰ−４およびＢＭＰ−６は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入することができる。本発明のＤＭ中の各種補足物の濃度は最小限の実験で決定することができる。たとえば、本発明のＤＭ中のＢＭＰの濃度は０．０１〜０．１ｎｇ／ｍｌ、０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、および０．１−１μｇ／ｍｌから選択される。
【００２６】
当業者は本発明のＤＭが血清の使用を避けることに加えて好都合な点を有することを認識するであろう。しかしながら、記載されていない成分の使用が許容可能である場合において、本発明のＤＭを使用することが望ましいこともある。結果として、本発明のＤＭは血清、たとえばウシ胎仔血清、または他の化学的に不明確な成分、たとえば動物もしくは植物組織抽出物を補足することができる。したがって、ある態様において、本発明のＤＭは１０％またはそれ未満、たとえば８％またはそれ未満、６％またはそれ未満、４％またはそれ未満、２％またはそれ未満、１％またはそれ未満の血清を補足してもよい。
【００２７】
当業者はまた、ｃＤＲＦの等価物がさまざまな公知の培地、たとえば、イーグルの基礎培地（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：５０１（１９５５））、最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８：３９６（１９５９））、Ｈａｍ’ｓ培地（Ｈａｍ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２９：５１５（１９６３）），Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｖｉｔｚ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．７８：１７３（１９６３）），ＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙら、Ｐｒｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１００：１１５（１９５９））、ＲＰＭＩ培地（Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．１９９：５１９（１９６７））、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．６９：１０６−１１２（１９７１）），ＮＣＴＣ  １３５培地（Ｅｖａｎｓら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３６：４３９（１９６８））、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ培地  ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２２：１００３（１９５９））などから作製することができると認識するであろう。これらの培地は単独または適切な割合の混合物として使用して、ｃＤＲＦに等価な基礎培地を作製することができる。あるいは、ｃＤＲＦまたはその等価物は個々の化合物または他の培地および増殖補足物から作製することができる。本発明はいずれか具体的な粘稠度の培地に限定されず、液体から半固体までの範囲の培地の使用を包含し、溶解に適した固化培地および固体組成物を含む。
【００２８】
【表１−１】
2009540826.tif 000003
【００２９】
【表１−２】
2009540826.tif 000004
【００３０】
【表２−１】
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【００３１】
【表２−２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
【表４】
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【００３４】
ＩＩ．基礎培地の補足物
Ａ．血小板−由来成長因子（ＰＤＧＦ）
一実施態様において、基礎培地は実質的に純粋なＰＤＧＦが補足される。
【００３５】
ＰＤＧＦは血清には存在するが、血漿には存在しない主要な分裂促進因子である。ＰＤＧＦはＡおよびＢと表される２種の構造的に関連した鎖からなる二量体分子である。二量体イソ型のＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢおよびＢＢは各種細胞型において異なって発現される。一般にすべてのＰＤＧＦイソ型は、皮膚線維芽細胞、グリア細胞、動脈平滑筋細胞、およびいくつかの上皮および内皮細胞を含む、結合組織細胞に対する強力な分裂促進因子である。
【００３６】
組換えＰＤＧＦは各種供与源から市販されている。以下の実施例で使用されるヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（ｈｒＰＤＧＦ−ＢＢ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２２０−ＢＢ）から購入し、溶かし、取り扱い説明書に従って使用した。ｈｒＰＤＧＦ−ＢＢの大腸菌による発現および１０９アミノ酸残基の成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂ鎖タンパク質をコードするＤＮＡ配列（前駆体配列においてトレオニン残基１９０を有する末端からＣ末端へプロセッシングされる）はＪｏｈｎｓｏｎら．（ＥＭＢＯ  Ｊ．３：９２１（１９８４））により記載される。ジスルフィド結合したホモダイマーのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、２つのアミノ酸残基Ｂ鎖からなり、約２５ｋＤａの分子量を有する。ＰＤＧＦの活性は、Ｒａｉｎｅｓら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０９：７４９−７７３（１９８５））に記載のように、静止ＮＲ６Ｒ−３Ｔ３線維芽細胞の３Ｈ−チミジン取り込みを刺激する能力により測定する。このアッセイにおけるＰＤＧＦのＥＤ５０は一般に１−３ｎｇ／ｍｌである。
【００３７】
ＰＤＧＦの濃度は、０．１−１ｎｇ／ｍｌ、１−５ｎｇ／ｍｌ、５−１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０−１５ｎｇ／ｍｌ、１５−５０ｎｇ／ｍｌ、および５０−１００ｎｇ／ｍｌより選択される。ある態様において、ｃＤＲＦに１−２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５−１５ｎｇ／ｍｌ、そしてもっとも好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを補足する。好ましい実施態様において、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。あるいは、ＰＤＧＦは別の型、たとえば、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、またはいずれかのＰＤＧＦ型の混合物であってもよい。関連した態様において、本発明のＤＭはさらにまたは別の方法として以下に記載の付加的な補足物をさらに含む。
【００３８】
Ｂ．脂質
一実施態様において、基礎培地はＣＤＬＭ（表５）または、別の方法として、ＣＤＬＭから選択される１つまたは複数の脂質が補足される。
【００３９】
脂質は構造成分ならびに生細胞において潜在的なエネルギー源として重要である。インビトロにおいて、多くの細胞は培養培地中に存在するグルコースおよびアミノ酸から脂質を合成することができる。しかしながら、細胞外脂質が利用可能であれば、脂質生合成は阻害され、細胞は培地中の遊離脂肪酸、脂質エステル、およびコレステロールを利用する。血清は脂質に富み、培養細胞にとっての主な細胞外脂質源となってきた。いくつかの系において無血清培地における細胞の増殖促進に、魚油に基づいた化学的に定義されない脂質調製物が有効であることが見出されている。たとえば、Ｗｅｉｓｓら、インビトロ２６：３０Ａ（１９９０）；Ｇｏｒｆｉｅｎら、インビトロ２６：３７Ａ（１９９０）；Ｆｉｋｅら、インビトロ２６：５４Ａ（１９９０）を参照のこと。したがって、通常は血清により供給される各種脂質の代わりにそのような脂質を無血清培地に補足することが望ましいかもしれない。
【００４０】
本発明のＤＭに使用する適切な脂質はステアリン酸、マレイン酸、オレイン酸、リノール酸パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸を含む。一実施態様において、基礎培地は表５に示す化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）が補足される。ＣＤＬＭはｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから利用可能である。ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるように、脂質成分に加えて、ＣＤＬＭはエタノール（１００ｇ／Ｌ）および乳化剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（登録商標）（１００ｇ／Ｌ）およびＴｗｅｅｎ８０（登録商標）（２．２ｇ／Ｌ）を含む。
【００４１】
本発明の方法を実施する場合、表５に示すＣＤＬＭの個々の脂質成分の濃度は、具体的な細胞培養条件に対して調製することができる。当業者により定法を使用してそのような調製を容易に行なうことができる。さらに、ＣＤＬＭのすべての成分が必須でなくてもよい。成分の組成または成分のサブセットの濃度を下げるか、または成分を除去した場合に、軟骨細胞の接着、増殖、および再分化に関連する培地の性質が実質的に同じのままであれば、かかる成分または成分のサブセットは必須ではない。
【００４２】
一実施態様において、本発明のＤＭは少なくとも１，２，４，６，８、またはすべてのＣＤＬＭの脂質成分を含む。一実施態様において、ＤＭは表５に記載のＰＤＧＦおよびＣＤＬＭを含む。他の限定的でない実施態様において、ＤＭはＰＤＧＦおよび表６に示す脂質の組み合わせを含む。
【００４３】
【表５】
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【００４４】
【表６−１】
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【００４５】
【表６−２】
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【００４６】
ある実施態様において、培地の脂質濃度（ｖ／ｖ）は０．０５〜０．１％、０．１〜０．５％、０．５％、０．５〜１％、１〜２％、および２〜５％から選択される。ある別の態様において、ＤＭは付加的に１〜２５ｎｇ・ｍｌ、より好ましくは、２〜１５ｎｇ／ｍｌ、そしてもっとも好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦが補足される。具体的な態様において、ＤＭは約０．５％（ｖ／ｖ）ＣＤＬＭ、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを含む。
【００４７】
Ｃ．ＩＬ−６ファミリーサイトカイン
サイトカインの各ＩＬ−６は、広範囲の細胞型で見出される、共有シグナル伝達受容体サブユニットを利用することができる。たとえば、Ｈｉｒａｎｏら、（２００１）ＩＬ−６リガンドおよび受容体ファミリー：サイトカイン関連、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、５２３−５３５。ＩＬ−６−ファミリーサイトカインの例は、これに限定されないが、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、およびニューロトロフィン１／Ｂ細胞刺激因子３（ＮＮＴ−１／ＢＳＦ−３）を含む。ＩＬ−６ファミリーのサイトカインは造血発生、神経発生、および骨形成を含むさまざまな生体系における細胞増殖および分化を抑制することがわかっている。Ｂｒｕｃｅら、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．４：１５７−１７０（１９９２）。
【００４８】
１．オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）
ヒトのＯＳＭは、分泌過程で取り除かれるＮ末端の２５残基疎水性シグナル配列を伴った２５２アミノ酸ポリペプチドとして最初に翻訳される分泌性糖タンパク質である。さらに翻訳後の分裂により３１個のＣ末端残基が取り除かれ、１９２アミノ酸のジスルフィド結合された成熟タンパク質が残る。Ｒｏｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６４１ ８６４５（１９９１）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ７７：１１０１−１１１６（１９９４）。ヒトにおいて、ＯＳＭは２つの異なる受容体複合体−ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）／ｇｐ１３０二量体およびＯＳＭ受容体（ＯＳＭＲ）／ｇｐ１３０二量体を介して結合し、情報を伝える。各受容体複合体に結合することにより、ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達物質および転写活性化因子（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）情報伝達系の活性を導く。Ｈｅｉｎｒｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４：１−２０（２００３）．
【００４９】
ＯＳＭは、ヒト腫瘍細胞株のすべてではないが、一部の増殖を阻害することが報告されている。その一方で、ＯＳＭは、ヒトの包皮線維芽細胞またはＷＩ−３８細胞などの、いくつかの正常な線維芽細胞の増殖を刺激することが報告されている。Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９７３９−９７４３（１９８６）。したがって、ＯＳＭは、インビトロのある細胞の成長を刺激するのに役立つかもしれない。さらに詳しいＯＳＭの記載は米国特許第５，２０２，１１６号および第５，８１４，３０７号にある。
【００５０】
ＯＳＭは、商業的供給源から容易に利用可能である。以下の例において、大腸菌により産生される１９６−アミノ酸組換えＯＳＭは、Ｒ＆Ｄシステム（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（カタログ番号２９５−ＯＭ，Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１８８２−１８９０（１９９０）も参照）から得られた。ＯＳＭの生物活性は、たとえば、Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３−３３４（１９８９）に記載されているように、ヒト赤白血病細胞株の増殖アッセイで試験することにより測定されてもよい。好ましい実施態様において、ヒトのＯＳＭは本発明の培地を作製するために用いられる。しかしながら、当業者は、他の種、自然に発生する突然変異体、および工学的な突然変異体から得られるＯＳＭが効果的であることを認識するであろう。
【００５１】
２．インターロイキン−６（ＩＬ−６）
ＩＬ−６は多くの別の名称：インターフェロンベータ２；Ｂ細胞分化因子；Ｂ細胞刺激因子２；肝細胞刺激因子；ハイブリドーマ増殖因子；およびＣＴＬ分化因子を含む：を有する。ヒトＩＬ−６は、１８６個のアミノ酸の分泌糖タンパク質であり、２１２−アミノ酸前駆タンパク質として合成される。Ｍａｔｓｕｄａら、（２００１）ＩＬ−６：サイトカイン関連，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，５３８−５６３。ヒトにおいて、ＩＬ−６は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）およびｇｐ１３０ホモ二量体のフック剛体を介して結合し、情報を伝える。ＩＬ−６がＩＬ−６Ｒ受容体に結合することによって、ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達物質および転写活性化因子（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）情報伝達系の活性を導く。Ｈｅｉｎｒｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４：１−２０（２００３）。
【００５２】
ＩＬ−６が、ＰＣ１２神経細胞の分化を誘発すること、細胞増殖性の骨髄前駆細胞の成熟を誘発すること、およびＴ細胞の増殖を誘発することが報告されている。その一方で、ＩＬ−６は、骨髄性白血病細胞および乳癌細胞の増殖を阻害することもまた示されている。したがって、ＩＬ−６はインビトロにおいて、ある細胞の増殖を刺激するために役立つかもしれない。ＩＬ−６のさらに詳細な記載は、米国特許第５，１８８，８２８号にある。
【００５３】
ＩＬ−６は商業的供給源から利用可能である。以下の例において、大腸菌により産生される１８４−アミノ酸組換えＩＬ−６は、Ｒ＆Ｄシステム（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（カタログ番号．２０６−ＩＬ，Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ３２４：７３−７６（１９８６）も参照）から得られた。ＩＬ−６の生物活性は、たとえば、Ｎｏｒｄａｎ  ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：８１３（１９８７）に記載されているように、形質細胞腫増殖アッセイで試験することにより測定される。好ましい実施態様において、ヒトＩＬ−６は本発明の培地を作製するために用いられる。しかしながら、当業者は、他の種、自然発生する突然変異体、および工学的な突然変異体から得られるＩＬ−６が効果を有することを認識するであろう。
【００５４】
３．白血病抑制因子（ＬＩＦ）
ＬＩＦはいくつかの別の名称：コリン作動性分化因子；ＤＡ細胞におけるヒトインターロイキン；分化刺激因子；ＭＬＰＬＩ；およびエンフィラミン（Ｅｍｆｉｌｅｒｍｉｎ）を有する。ヒトＬＩＦは、糖タンパク質を分泌する１８０個のアミノ酸である。Ｋｏｎｄｅｒａ−Ａｎａｓｚら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５２：９７−１０５（２００４）。ヒトにおいて、ＬＩＦはＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）／ｇｐ１３０二量体を介して結合し、信号を送る。ＬＩＦがＬＩＦ受容体に結合することにより、ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達物質および転写活性化因子（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）およびマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）情報伝達系の活性を引き起こす。Ｈｅｉｎｒｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４：１−２０（２００３）。
【００５５】
ＬＩＦはＭ１骨髄性白血病細胞の増殖を阻害することが報告されている。たとえば、米国特許第５，４４３，８２５号参照。対照的に、ＬＩＦはニューロンの増殖を刺激し、ならびに副腎髄質表現型からアセチルコリン作動性表現型までニューロンの分化を促進することが報告されている。たとえば、米国特許第５，９６８，９０５号を参照。ＬＩＦを切断された神経に加えると神経の再分化を増強することができる。米国特許第６，１５６，７２９号参照。したがって、ＬＩＦはインビトロにおいてある細胞の増殖を促進するために有効であるかもしれない。
【００５６】
ＬＩＦは商業的供給源から利用可能である。以下の例において、大腸菌で産生される１８１個のアミノ酸の組換えヒトＬＩＦはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（カタログ番号．Ｌ５２８３，Ｇｅａｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９９５（１９８７）も参照）から得られる。ＬＩＦの生物活性は、たとえばＧｅａｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９９５（１９８７）に記載のように、Ｍ１マウス脊髄性白血病細胞の分化を刺激する能力を試験することによって評価される。好ましい実施態様において、ヒトＬＩＦは本発明の培地を作製するために用いられる。しかしながら、当業者は他の種、自然発生する突然変異体、および工学的な突然変異体から得られるＬＩＦが有効であることを認識するであろう。
【００５７】
ある実施態様において、本発明のＤＭは、ＰＤＧＦと、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸からなる群より選択される１つまたは複数の脂質と、ならびに１つまたは複数のサイトカインを補足したｃＤＲＦである。さらなる実施態様において、本発明のＤＭは、ＰＤＧＦと、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ−トコフェロール酢酸からなる群より選択される１つまたは複数の脂質と、ならびにＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦからなる群の１つまたは複数を補足したｃＤＲＦである。サイトカインの濃度は、０．０１−０．１ｎｇ／ｍｌ、０．１−１ｎｇ／ｍｌ、１−５ｎｇ／ｍｌ、５−１０ｎｇ／ｍｌ、１０−１５ｎｇ／ｍｌ、１５−５０ｎｇ／ｍｌ、および５０−１００ｎｇ／ｍｌから選択される。ある実施態様において、ｃＤＲＦは、ＯＳＭ、ＩＬ−６、および／またはＬＩＦが０．０１−１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．１−２ｎｇ／ｍｌおよび、もっとも好ましくは、０．５−１ｎｇ／ｍｌ補足される。より好ましい実施態様において、ｃＤＲＦは、およそ１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ、０．５％  ＣＤＬＭ、１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、および０．５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭにて補足される。関連する実施態様において、本発明のＤＭはさらに以下に記載のような付加的な補足物を含む。
【００５８】
ある実施態様において、本発明のＤＭはＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦを少なくとも１つ、２つ、または３つすべて含む。他の限定されない実施態様において、ＤＭは表７に記載のＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦの組み合わせを含む。限定されないがさらに追加的な実施態様において、ＤＭは表７に記載のＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦと、ＰＤＧＦと、表５に示されたＣＤＬＭとのいずれの組み合わせを含む。より好ましい実施態様において、ＤＭは表５に示されたＯＳＭ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭを含む。さらに好ましい実施態様において、ＤＭは表４に示されたｃＤＲＦｍである。たとえば、培地はｃＤＲＦｍ、ＯＳＭ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦおよびＣＤＬＭを含む。
【００５９】
【表７】
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【００６０】
Ｄ．付加的な補足物
本発明のＤＭは培地中における細胞の増殖を促進するのに必要な付加的な補足物のいずれかが補足されてもよい。そのような補足物は、以下に限定されないが、ＢＭＰファミリーのもの、ＴＧＦ−ベータファミリーのもの、ＩＧＦ、およびインスリンを含む。
【００６１】
本発明の培地は、血清を使用しない培地で、分化可能な軟骨細胞を播種、増殖、維持するために用いることができる。ＰＤＧＦ、脂質、ＯＳＭ、ＩＬ−６、およびＬＩＦの濃度の規定範囲は具体的な細胞培養条件によって調節される必要がある。そのような調節は当業者が通常の技術を用いることによって容易に為され得る。
【００６２】
ある実施態様において、本発明の培養培地は実質的に純粋なｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）および／または実質的に純粋なインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）が補足されない。
【００６３】
ある実施態様において、本発明の培養培地は米国特許出願公開番号第ＵＳ２００５／０２６５９８０号Ａ１（たとえば、５９から６８段落）および第ＵＳ２００５／００９０００２号Ａ１（たとえば、１０から１４段落）に記載の補足物の具体的な組み合わせのどれも補足されていない、ただし、培地がそれらの組み合わせから少なくとも１つまたは複数の補足物を除く限り、それらに記載のいずれの組み合わせの集合を補足してもよい。たとえば、ある実施態様において、本発明の培養培地は、実質的に純粋な上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、実質的に純粋な肝細胞因子（ＳＣＦ）、実質的に純粋なインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、実質的に純粋な脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、実質的に純粋なエリスロポエチン（ＥＰＯ）、実質的に純粋なＦＭＳ関連チロシンキナーゼ−３（Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２）リガンド、および／または実質的に純粋なウィングレス型ＭＭＴＶ組込み部位（ＷＮＴ）ファミリーのものからなる群より選択される特定の１つ、２つ、３つ４つまたは複数の補足物で補足されない。ある実施態様において、本発明の培地はデキサメタゾンを含有しない。
【００６４】
ＩＩＩ．軟骨細胞および他の適切な細胞
本発明の方法はいずれの適当な細胞に使用され得る。この方法は軟骨性組織を産生することができる細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖に特に適している。
【００６５】
軟骨細胞は種々の軟骨型、たとえばヒアリン軟骨、弾性軟骨、および線維軟骨に見出される細胞である。軟骨細胞はそれらが産生する細胞外マトリクスに主に基づいた特徴的な表現型を有する間葉系細胞である。前駆体細胞はＩ型コラーゲンを産生するが、軟骨細胞系譜にコミットされる場合、それらはＩ型コラーゲン産生を停止し、細胞外マトリクスの実質的な部分を構成するＩＩ型コラーゲン産生を始める。さらにコミット軟骨細胞は、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンを有する、アグレカンと呼ばれるプロテオグリカン凝集体を産生する。
【００６６】
本明細書に使われるように、「軟骨細胞」という語は、軟骨から得られる分化した細胞をいい、培養中で増殖しながら軟骨細胞に分化する能力を保有する、脱分化した軟骨細胞を含む。「軟骨細胞」という語は、初代の、継代された、自家性、異種性、ゼネロガス（ｘｅｎｏｌｏｇｕｏｓ）などの如何に関わらない軟骨細胞をいう。
【００６７】
本発明で使用する軟骨細胞はいずれか適切な方法により単離することができる。軟骨細胞単離のための各種出発物質および方法は当該技術分野で公知である。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，動物細胞の培養：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版．Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３７−１６８（１９８７）；Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：５６０−５６４（１９７９）；Ｒ．ＴｕｂｏおよびＬ．Ｂｒｏｗｎ，関節軟骨：ヒト細胞培養；Ｖｏｌｕｍｅ  Ｖ，Ｋｏｌｌｅｒら．（ｅｄｓ．）（２００１）；およびＫａｎｄｅｌら．，Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓ．，およびＩｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（５），５６５−５７７（１９９５）。例としては、関節軟骨はヒトドナーの大腿顆から採取することができ、軟骨細胞は０．１％コラゲナーゼ／ＤＭＥＭ中で一晩消化することにより軟骨から剥離することができる。剥離された細胞は、本発明のＤＭまたは１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭのような適切な培地中で初代細胞として増殖する。
【００６８】
ある状況においては、すでに軟骨細胞に分化している、軟骨生検由来の細胞より、むしろ間葉系肝細胞のような軟骨前駆幹細胞を増殖することが望ましいことがある。軟骨細胞はそのような細胞の軟骨細胞への分化を誘導することによって得ることができる。そのような肝細胞を単離することができる組織の例は、骨液、胎盤、臍帯、骨髄、脂肪、皮膚、筋肉、骨膜、または軟骨膜を含む。
【００６９】
軟骨細胞および軟骨前駆細胞の他に、ある状況において、軟骨細胞に分化転換することが可能な間葉系細胞など、軟骨細胞への潜在能力を伴う他の細胞を使用することが好ましいこともある。軟骨細胞はインビトロにおいてそのような細胞の軟骨細胞への分化を誘導することによって得ることができる。軟骨細胞への潜在能力を伴う他の細胞の例は骨芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、上皮細胞、ケラチン細胞、および神経細胞を含む。
【００７０】
軟骨細胞への潜在能力を伴う軟骨細胞、軟骨前駆細胞、および他の細胞は、軟骨欠損患者の治療に適した状態まで培養されてもよい。そのような治療上有用な軟骨細胞は、いかに限定されないが、ＩＩ型コラーゲンおよびヒアリン様関節軟骨に特徴的なプロテオグリカンを含む関節軟骨に特異的な細胞外基質成分を発現するはずである。軟骨細胞の分化状況を決定するアッセイは当該分野で公知であり、たとえば、Ｒ．ＴｕｂｏおよびＬ．Ｂｒｏｗｎ，関節軟骨：ヒト細胞培養；第５版，Ｋｏｌｌｅｒら、ｅｄｓ．（２００１）および実施例中に記載されている。
【００７１】
本発明のＤＭのために使われる他の細胞は、ＤＭ中で増殖する可能性のある、初代または継代細胞、または培養された組織の一部としての細胞を含む。他の細胞の例は肝細胞、ベータ細胞、および島細胞を含む。
【００７２】
軟骨細胞および他の細胞はヒト、オランウータン、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ゾウなどを含むが、それらに限定されないどんな哺乳類動物からも単離することができる。本発明のＤＭに使用可能な細胞は、ＤＭ中で増殖することができる初代または継代細胞あるいは培養組織の一部としての細胞を含む。
【００７３】
ＩＶ．細胞培養法
細胞は特定の細胞型および施用に適したあらゆる細胞培養法を用いて培養することができる。細胞培養法は当該分野において公知であり、たとえばＪ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，第２版．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，２００２に記載されている。
【００７４】
たとえば、軟骨細胞は０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡを使用して８０〜９０％コンフルエントに継代し、継代培養のために希釈し、２回目およびそれに続く継代のために再播種し、さらに増幅を行なう。トリプシンおよびＥＤＴＡの両者ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手することができる。あるいは、細胞はＥＤＴＡなどのキレート剤を含む溶液とともにインキュベートすることによって継代してもよい。非酵素的な細胞分離のためのキレート剤のそのような使用は当該分野で広く知られている。具体的な実施態様において、本発明のＤＭ中で増殖する細胞は０．１ｍＭから１ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して継代される。好ましい実施態様において、本発明のＤＭ中で増殖する細胞は、０．１ｍＭから１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、０．００２５％（または３２５ユニット／ｍｌ）未満、好ましくは０．０００２５％（または３２．５ユニット／ｍｌ）組換えトリプシンを使用して継代される。いずれの時点でも細胞は、１０％ＤＭＳＯおよび４０％ＨＳＡを含むＤＭＳＯ中、または、たとえば米国特許第６，３６５，４０５号に記載のような当該分野で知られる他の組成物中で収集され、凍結することができる。
【００７５】
ある実施態様において、細胞は低密度で最初に培養することができる。「低密度」という用語は２０，０００細胞／ｃｍ２未満の播種密度を表す。
【００７６】
本発明の方法は、単層、多層、固体支持体上、懸濁液中、および３Ｄ培養物中を含むがそれらに限定されない、各種条件下の培養物中で増殖する細胞に適切である。
【００７７】
Ｖ．培地の評価方法
ある実施態様において、本発明の培地は、細胞を寛容な環境に置いた際に、分化−受容状態における細胞を維持する能力について、特に、軟骨細胞に分化する／再分化するかについて試験することができる。プロテオグリカン、アグリカンおよびコラーゲンＩＩは、インビボにおいて軟骨細胞によって通常分泌される細胞外マトリックスの成分の例であり、軟骨細胞の機能のマーカーとして扱ってもよい。軟骨細胞の分化能力を維持する培地の能力はアガロースおよび／またはアルギン酸アッセイによって決定されてもよい。アガロースアッセイは３Ｄアガロースマトリックスで増殖する細胞で、プロテオグリカンの形成を確認し、たとえばＢｅｎｙａら、Ｃｅｌｌ３０：２１５−２２４（１９８２）に記載されている。アルギン酸アッセイはアルギン酸懸濁液中で培養された細胞のアグリカンおよびコラーゲンＩＩ遺伝子の発現を測定するもので、たとえばＹａｅｇｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３７（２）：３１８−２５（１９９７）；およびＧａｇｎｅら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．１８（６）：８８２−８９０（２０００）に記載されている。
【００７８】
ＶＩ．細胞使用方法
本発明は、さらに本発明の方法および、たとえば治療において、たとえば対象にそのような細胞を投与することによって対象を治療するためのそのような細胞の使用方法を用いて培養された細胞を提供する。たとえば、軟骨欠損（たとえば外傷または変形性関節症による）の、本発明の方法にしたがって培養された軟骨細胞（たとえば、自己軟骨細胞）を投与することによって修復することを含む。
【００７９】
実施例
本発明の各種態様は以下に提示された実施例においてさらに詳しく表現され、説明される。
【実施例１】
【００８０】
実施例１：ＩＬ−６は初代ヒト軟骨細胞の細胞収率および増殖を増加させる
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
３）０．２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６で補足された、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
４）１．０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６で補足された、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ。
【００８１】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＩＬ−６で増殖した細胞の細胞収率は、試験したすべての継代でもっとも高かった（表９）。ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＩＬ−６で増殖した細胞の増殖指数は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞の増殖指数とほぼ同程度であり、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌのみで増殖した細胞の増殖指数を上回った（表１０）。これらの結果はＩＬ−６を補足したｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌが血清含有培地の有効な代替物となることを示している。
【００８２】
【表８】
2009540826.tif 000013
【００８３】
【表９】
2009540826.tif 000014
【００８４】
【表１０】
2009540826.tif 000015
【実施例２】
【００８５】
実施例２：ＯＳＭは初代ヒト軟骨細胞の細胞収率および増殖を増加させる
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ８
３）０．１ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
４）０．５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
５）１．０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ。
【００８６】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。表１１のデータは、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＯＳＭで増殖した細胞の細胞収率が試験したすべての継代でもっとも高かったことを示している。ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＯＳＭでの細胞の増殖指数はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでの細胞の増殖指数とほぼ同程度であり、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌのみでの細胞の増殖指数を上回った（表１２）。これらの結果はＯＳＭを補足したｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌが血清含有培地の有効な代替物となることを示している。
【００８７】
【表１１】
2009540826.tif 000016
【００８８】
【表１２】
2009540826.tif 000017
【実施例３】
【００８９】
実施例３：ＬＩＦは初代ヒト軟骨細胞の細胞収率および増殖を増加させる
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
３）０．１ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
４）０．５ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
５）２．０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ。
【００９０】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。表１３のデータは、第１継代の後、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＬＩＦで増殖した細胞の細胞収率がもっとも高かったことを示している。ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＬＩＦでの細胞の増殖指数はｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌのみでの細胞の増殖指数より高かった（表１４）。これらの結果は、ＬＩＦを補足したｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌが血清含有培地の有効な代替物となることを示している。
【００９１】
【表１３】
2009540826.tif 000018
【００９２】
【表１４】
2009540826.tif 000019
【実施例４】
【００９３】
実施例４：ＩＬ−６およびＯＳＭの両者は初代ヒト軟骨細胞の細胞収率を向上する
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
３）１．０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
４）０．５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
５）１．０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６＋０．５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ。
【００９４】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。表１５のデータは、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＩＬ−６、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＯＳＭ、またはｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ＋ＩＬ−６＋ＯＳＭで増殖した細胞の細胞収率がもっとも高かったことを示している。これらの結果は、ＩＬ−６およびＯＳＭを補足したｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌが血清含有培地の有効な代替物となることを示している。
【００９５】
【表１５】
2009540826.tif 000020
【実施例５】
【００９６】
実施例５：ＪＡＧ−１は無血清培地における軟骨細胞の増殖を阻害する
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
３）２．０μｇ／ｍｌ  ＪＡＧ−１を補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ。
【００９７】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。表１６のデータは、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌにおける細胞収率はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでの細胞収率のおよそ２倍であったことを示している。しかしながら、ＪＡＧ−１をｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌに加えた場合、細胞収率はｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌのみと比較して１６倍減少した。同様に、ＪＡＧ−１を入れないｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌでの細胞増殖指数が０．２４であったのに対して、ＪＡＧ−１が存在する場合の細胞増殖に関する増殖指数は、わずか０．００４であった。これらの結果は、試験された状況下で、ＪＡＧ−１を補足したｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌが血清含有培地の有効な代替物でないことを示している。
【００９８】
【表１６】
2009540826.tif 000021
【実施例６】
【００９９】
実施例６：ＩＬ−１３は無血清培地における軟骨細胞の増殖を阻害する
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
３）３．０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３を補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ
４）１０．０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３を補足した、表８に示すｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ。
【０１００】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。表１７のデータは、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌにおける細胞収率がＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでの細胞収率のおよそ２倍であったことを示している。しかしながら、ＩＬ−１３をｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌに加えた場合、細胞収率は用量依存的に減少した。ＩＬ−１３の濃度３ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌは、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌと比較して、細胞収率をそれぞれ３２％および４６％まで減らした。加えて、５０％ないし８０％のコンフルエントに達するまでに必要な培養時間は、ＩＬ−１３の存在で増加し、その結果、増殖指数はわずか０．０７または０．０６であった。これらの結果は、試験された状況下で、ＩＬ−１３を補足したｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌが血清含有培地の有効な代替物でないことを示している。
【０１０１】
【表１７】
2009540826.tif 000022
【実施例７】
【０１０２】
実施例７：Ｅ９３倍値は軟骨細胞の細胞収率および増殖を増加させる
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）表５に示される５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および０．５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足した、表４に示すｃＤＲＦｍ（本明細書中、Ｅ９３として示される）
【０１０３】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。Ｅ９３培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。細胞収率を決定し、集団倍加率を各継代の最後に計算した。Ｅ９３での細胞増殖指数はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでの細胞増殖指数と比較して同等であるかまたは高くなった（表１８、図１）。Ｅ９３で増殖した細胞の細胞収率はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでの細胞増殖にくらべて大きく向上した（表１９、図２）。これらの結果は、ＣＤＬＭ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−６およびＯＳＭを補足したｃＤＲＦｍが血清含有培地の有効な代替物となることを示している。
【０１０４】
【表１８】
2009540826.tif 000023
【０１０５】
【表１９】
2009540826.tif 000024
【実施例８】
【０１０６】
実施例８：ＩＬ−６およびＯＳＭを補足した培地は三次元培養における軟骨細胞の再分化能力を維持する
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）実施例７に記載の無血清Ｅ９３培地。
【０１０７】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。
【０１０８】
三代継代後、細胞の再分化能力をアガロース上でのコロニーの形成およびプロテオグリカンの生成を測定することによって評価した（Ｂｅｎｙａら、Ｃｅｌｌ３０：２１５−２２４（１９８２））。細胞５万個を２％アガロースに再懸濁し、６０ｍｍシャーレに播種した。アガロース上での細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで、３７℃にて培養し、播種から２４時間、およびそれから２から３日ごとに再供給した。培養して２１日後、１０％ホルマリンで固定し、すすぎ、０．２％サフラニンで染色し、全体をすすいで、背景染色をジ取り除いた。陽性のプロテオグリカンを染色したコロニーの数、および大きさが５０ミクロンと同等またはより大きいコロニーの数を決定した。６．８％以上の細胞がプロテオグリカン陽性コロニーを形成し、最小規模基準を満たすシャーレを「通過」と評価した。すべての株を三重に試験した。６つの生検由来の細胞株を試験した。表１７に示すとおり、６つすべての株は、血清含有または無血清培地で増殖するかどうかのアガロースアッセイを通過した。これらの結果は、ＤＬＭ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−６およびＯＳＭを補足したｃＤＲＦｍが血清含有培地の有効な代替物となることをさらに示している。
【０１０９】
【表２０】
2009540826.tif 000025
【実施例９】
【０１１０】
実施例９：１０株の軟骨細胞の平均細胞収率はＩＬ６およびＯＳＭを補足した培地のほうが血清を補足したＤＭＥＭより高い
初代ヒト軟骨細胞を関節軟骨生検から単離し、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２（Ｅ９３高）または３，０００細胞／ｃｍ２（Ｅ９３低）の密度でそれぞれ播種した。すべての実験にＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ；
２）実施例７に示すＥ９３培地。
【０１１１】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌトリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。無血清培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。フラスコあたりの細胞収率を各継代の終わりに決定し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭにおけるＰ１細胞収率として正規化した。Ｅ９３での高または低播種密度で増殖した細胞の平均細胞収率は、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭで増殖した細胞と比較して、大きく増えた（表２１）。これらの結果は、Ｅ９３が血清含有培地の有効な代替物となることを示している。
【０１１２】
【表２１】
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【実施例１０】
【０１１３】
実施例１０：ＩＬ６およびＯＳＭを補足した培地はアルギン酸懸濁液培養における２型コラーゲンおよびアグリカンを再発現する軟骨細胞の能力を維持する
］初代ヒト軟骨細胞を実施例９に記載のごとく準備した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳまたはＥ９３で増殖した細胞をアルギン酸培養のために第３代の継代で採取した。アルギン酸培養は細胞１×１０６個を１．２％アルギン酸溶液に播種することによって行なった。アルギン酸培養は、３−５日ごとに、ＥＧＨＩＣ（ＤＭＥＭ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＧＦ−１、２５μｇ／ｍＬアスコルビン酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウム）が供給された。培養２１日後、軟骨細胞をアルギン酸ビーズから抽出し、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンのｍＲＮＡをリボヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ（ＲＰＡ）を用いて検出した。このアッセイにおいて、ＩＩ型コラーゲンはゲル上３１０塩基対（ｂｐ）バンドとして検出され、Ｉ型コラーゲンは２６０ｂｐバンド、およびアグリカンは２１０ｂｐバンドであった。図３はＥ９３（２、３および４レーン）またはＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンのｍＲＮＡを含む１０％血清を補足したＤＭＥＭ（５、６および７レーン）で増殖した細胞由来の細胞溶解物の量の増加を示す。これは、Ｅ９３培地で増殖したヒト軟骨細胞がこれらの重要な軟骨マーカーを再発現させる能力があることを示す。
【実施例１１】
【０１１４】
実施例１１：ＩＬ６およびＯＳＭを補足した培地で増殖した軟骨細胞の核型および老化
たとえば、細胞がヒトの治療に用いられる場合、細胞が通常の核型を維持し、培養中老化に入ることは重要であるかもしれない。Ｅ９３で増殖した軟骨細胞は少なくとも第１０代継代を通して通常の核型を示し、およそ３０集団倍加の後老化した。
【０１１５】
実施例１２：低濃度のサイトカインは軟骨細胞の増殖を刺激する
初代ヒト軟骨細胞は関節軟骨の生検から単離され、その試料を細分し、０．２５％  ＸＩＶ型プロテアーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス）を用いて１時間酵素的消化を行い、その後０．１％コラゲナーゼで、３７℃にて一晩酵素的消化を行なった。細胞を５分間、１，０００×ｇで遠心分離して回収し、適切な試験培地に再懸濁した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞を３，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。無血清培地で増殖した細胞を５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。すべての実験でＴ７５フラスコを使用した。以下の培地を試験した：
１）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
２）実施例７に記載のＥ９３培地
３）０．５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および０．２５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足したＥ９３培地
４）０．１ｎｇ／ｎｌ  ＩＬ６および０．０５ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補足したＥ９３培地。
【０１１６】
５０％ないし８０％のコンフルエントに達してから細胞を継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、ＥＤＴＡ中３２５ユニット／ｍｌ  トリプシンに曝して採取し、数を計測して、再播種した。Ｅ９３培地で増殖した細胞をＰＢＳですすぎ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中０．０００２５％  Ｔｒｙｐｚｅａｎ（登録商標）（０．１×組換えトリプシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に曝して採取し、数を計測して、再播種した。１日あたりの集団倍加率として表される増殖率は各継代の終わりに算出された（表２２）。これらの結果は、Ｅ９３における低濃度ＩＬ−６およびＯＳＭが初代ヒト軟骨細胞の増殖を支持することを示す。
【０１１７】
【表２２】
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【０１１８】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、その全体における参考文献によって組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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