(57)【要約】融合タンパク質は、（ｉ）前記融合タンパク質のアミノ末端に位置し、第１生理活性ペプチドもしくはタンパク質の配列を含有する第１セグメント；並びに、（ｉｉ）融合タンパク質のカルボキシル末端に位置し、第２生理活性ペプチドもしくはタンパク質の配列を含有する第２セグメントを含有する。前記第１及び第２のセグメントは、機能するように共有結合している。また、融合タンパク質をコードする核酸、ベクター及び核酸を有する宿主細胞、並びに、関連する合成物及び糖尿病もしくは／及び肥満の治療法についても開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質のアミノ末端に位置し、第１の生理活性ペプチドまたはタンパク質の配列を含有する第１のセグメント；及び、
融合タンパク質のカルボキシル末端に位置し、第２の生理活性タンパク質またはペプチドの配列を含有する第２のセグメントを含む融合タンパク質であって、
前記第１及び第２のセグメントが、機能するように共有結合してなる、融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１もしくは第２の生理活性ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質のホルモンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１の生理活性タンパク質は、グルカゴン様のペプチド１、アミリンもしくはペプチドＹＹ、またはその機能的等価物の配列を含有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１の生理活性タンパク質は、配列番号２の配列を含有する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記第２の生理活性タンパク質は、レプチンもしくは機能的等価物または減量関連タンパク質の配列を含有する融合タンパク質であり、ここで、前記第２の生理活性タンパク質は、ヘテロのペプチドまたはタンパク質のＣ−末端に共有結合的に融合する場合、その機能を維持する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２の生理活性タンパク質は、配列番号１の配列を含有する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質は、配列番号４、５、１０、１１、１６または１７の配列を含有する、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記第１の生理活性タンパク質は、配列番号１９のペプチドＹＹのうち、アミノ酸残基３〜３６の配列を含有する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質は、配列番号１２または１３の配列を含有する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記第１の生理活性タンパク質は、配列番号１８のアミリンのうち、アミノ酸残基１〜３６の配列を含有する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合タンパク質は、配列番号１４または１５の配列を含有する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記第１のセグメント及び前記第２のセグメントと結合するリンカーセグメントをさらに含み、ここで、前記リンカーセグメントはダイマー化することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記リンカーセグメントは、免疫グロブリンまたはその機能的等価物のＦｃ断片を含有する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧまたはＩｇＭである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンはＩｇＧである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｆｃ断片は、配列番号３を含有する、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質は、分泌前に、配列番号９またはその機能的等価物をさらに含有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項１９】
前記核酸は、配列番号６〜８のうち一の配列を含有する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を、前記核酸にコードされたポリペプチドを発現させる条件下で培地中にて培養し、及び前記培養細胞または前記細胞の培地から、前記ポリペプチドを精製することを含む、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、製薬用合成物；及び、医薬として許容される、キャリア。
【請求項２４】
請求項１に記載の融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、食品用合成物；及び、食事として許容される、キャリア。
【請求項２５】
請求項１に記載の融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸の有効量を、必要としている被検者に投与することを含む、体重の減量方法。
【請求項２６】
前記第１もしくは前記第２のペプチドまたはタンパク質を前記被検者に同時に投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸の有効量を、必要としている被検者に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
【請求項２８】
前記第１もしくは前記第２のペプチドまたはタンパク質を前記被検者に同時に投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被検者における、組換え治療用のペプチドまたはタンパク質の半減期を増大する方法であって、
配列番号１またはその機能的等価物を含有するセグメントに組換え治療用タンパク質を結合させて、融合タンパク質を形成すること；及び、被検者における前記融合タンパク質の半減期を決定することを含む、方法。
【請求項３０】
前記組換え治療用のペプチドまたはタンパク質は、糖尿病または肥満に関する治療効果を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号１またはその機能的等価物を含有するセグメントに前記治療用のペプチドまたは組換えタンパク質を結合させて、融合タンパク質のキメラを形成し；及び、
被検者における前記融合タンパク質の有効性を決定することを含む、治療用のペプチドまたはタンパク質の有効性を増大させる方法。
【請求項３２】
前記治療用のペプチドまたは組換えタンパク質は、糖尿病または肥満に関する治療効果を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ｉ）レプチンまたは機能的等価物；（ｉｉ）グルカゴン様ペプチド１、アミリン、ペプチドＹＹまたはそれらの機能的等価物のいずれか１つ；及び、（ｉｉｉ）医薬として許容されるキャリアを含む、製薬用合成物。
【請求項３４】
（ｉ）レプチンまたは機能的等価物；（ｉｉ）グルカゴン様ペプチド１、アミリン、ペプチドＹＹまたはそれらの機能的等価物のいずれか１つ；及び、（ｉｉｉ）食事として許容されるキャリアを含む、食品用合成物。
【請求項３５】
請求項３３に記載の製薬用合成物の有効量を、必要としている被検者に投与することを含む、糖尿病の治療方法または体重の減量方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の製薬用合成物の有効量を、必要としている被検者に投与することを含む、糖尿病の治療方法または体重の減量方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の融合タンパク質または機能的等価物を生産し、分泌する組換え乳酸菌；及び、食事として許容されるキャリアを含む、食品用合成物。
【請求項３８】
前記第１または前記第１の持続性型を、前記第２または前記第２の持続性型とともに生産し、分泌する組換え乳酸菌を含む、食品用合成物。
【請求項３９】
（ｉ）レプチンまたは機能的等価物を、（ｉｉ）グルカゴン様ペプチド１、アミリン、ペプチドＹＹまたはそれらの機能的等価物のいずれか１つとともに生産し、分泌する組換え乳酸菌を含む、食品用合成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年７月２９日に出願された米国仮出願番号ＵＳ６０／７０３，９５０；２００５年１０月１７日に出願された米国仮出願番号ＵＳ６０／７２７，６１２；２００６年１月２７日に出願された米国仮出願番号６０／７６２，８２０；及び、２００６年２月１４日に出願された米国仮出願番号６０／７７３，３８５に基づく優先権を主張し、それらの内容は全体として参照により本願に引用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は、通常、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）と呼ばれるが、複数の原因因子に由来する病気のプロセスを意味し、高血糖と呼ばれる血漿グルコースの濃度の上昇を特徴とする。例えば、ＬｅＲｏｉｔｈ，Ｄ．ら（ｅｄｓ．）、ＤＩＡＢＥＴＥＳ  ＭＥＬＬＩＴＵＳ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国、１９９６年）を参照せよ。米国糖尿病学会によると、糖尿病は世界の人口の約６％が罹患していると推定される。制御されない高血糖は、腎症、神経症、網膜症、高血圧、脳血管疾患及び冠状動脈心疾患を含む大血管及び小血管の病気にかかる危険性が高いことに起因して、死亡率の増加及び夭逝と相関性がある。それ故、グルコースのホメオスタシスを制御することが、糖尿病治療にとっての重要な方策である。
【０００３】
糖尿病には２つの主要な型がある。すなわち、１型糖尿病（かつて、インシュリン依存性糖尿病もしくはＩＤＤＭといわれた）；及び、２型糖尿病（かつて、インシュリン非依存性糖尿病もしくはＮＩＤＤＭといわれた）である。１型糖尿病は、インシュリン、すなわちグルコース利用を調節するホルモンが完全に欠乏した結果である。このインシュリンの欠乏は、通常膵臓のランゲルハンス島中でのβ細胞の破壊及びインシュリンの完全なる欠乏を特徴とする。２型糖尿病は、完全というよりはむしろ相対的なインシュリンの欠乏を伴うインシュリン抵抗性を特徴とする疾患である。２型糖尿病は、相対的なインシュリンの欠乏を伴う優性のインシュリン抵抗性から、何らかのインシュリン抵抗性を伴う優性のインシュリンの欠乏の範囲まで及びうる。インシュリン抵抗性は、幅広い濃度にわたって生理活性を発揮できるインシュリンの能力を減じる。インシュリン抵抗性の個体において、身体はこの欠陥を補うために、異常なほど大量のインシュリンを分泌する。インシュリン抵抗性を補うため、及びグルコースを適切に制御するために、適切とはいえない量のインシュリンが存在する場合、グルコース耐性が損われるという状態が促進される。糖尿病の臨床的状態の結果として、非常に多くの個体において、インシュリン分泌はさらに減少し、血漿グルコース濃度は上昇する。
【０００４】
２型糖尿病患者の大部分は、β細胞からのインシュリンの放出を刺激することにより作用する血糖降下剤、もしくはインシュリンに対する患者の組織感受性を増進する薬剤のいずれか、またはインシュリンを用いた治療を受けている。しかし、この治療法はほとんどの症例で満足のいくものではない。
【０００５】
インシュリンは、主に細胞表面の細胞内貯蔵部位からグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の移動を通じて、骨格筋及び脂肪組織によるグルコースの摂取を刺激する（Ｓａｌｔｉｅｌ，Ａ．Ｒ．＆  Ｋａｈｎ，Ｃ．Ｒ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：７９９−８０６；Ｓａｌｔｉｅｌ，Ａ．＆  Ｐｅｓｓｉｎ，Ｊ．Ｅ．（２００２）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：６５−７１；Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｆ．（１９９８）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：３−１１）。インシュリンに対する応答において、細胞内膜に存在するＧＬＵＴ４の一部は、原形質膜に再分配され、結果として、細胞表面上のＧＬＵＴ４が増加し、これらの細胞によるグルコースの摂取が促進される。ＧＬＵＴ４の移動は、主にインシュリン受容体（ＩＲ）を通して伝達される。
【０００６】
グルコース輸送に加えて、インシュリンは脂質形成、すなわち前脂肪細胞（ｐｒｅ−ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ）の増殖、及び脂肪細胞における脂肪の蓄積を伴う、前脂肪細胞から脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ）への分化を含む方法に深く関わっている。脂肪細胞系である３Ｔ３−Ｌ１に関する研究は、脂質形成におけるインシュリンの果たす役割が主に有糸分裂であることを示唆している。分化前において、３Ｔ３−Ｌ１細胞はＩＲより多くのＩＧＦ−１受容体を含む線維芽細胞様の前脂肪細胞である。インビトロにおいて、前脂肪細胞の脂質形成は、通常用いられる分化誘発混合物、すなわちｃＡＭＰを上昇させる薬剤のメチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）；グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＸ）；及び、前脂肪細胞上のＩＧＦ−１受容体と結合するインシュリン（もしくはＩＧＦ−１）（Ｔｏｎｇ，Ｑ．，Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．（２００１）  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｅｎｄｏｃ．＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．２：３４９−３５５；Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．Ｄら（２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１２９３−１３０７）からなるＭＤＩが引き金となりうる。ＭＤＩを用いた治療をうける際、融合性の前脂肪細胞は再び細胞周期に入り、およそ二回の有糸分裂を経るものであり（Ｍｏｄａｎ−Ｍｏｓｅｓ，Ｄら（１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３３：８２５−８３１；Ｔｏｎｇ，Ｑ．，  Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．（２００１）  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｅｎｄｏｃ．＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．２：３４９−３５５；Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．Ｄら（２０００）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１２９３−１３０７）、この方法は通常クローン性増殖といわれる。下記のクローン性増殖において、前記前脂肪細胞は細胞周期から出て、脂肪細胞遺伝子を発現することにより脂肪細胞への分化を開始する。
【０００７】
その脂質生成の効果が原因となり、インシュリンは２型糖尿病患者の肥満促進という好ましくない効果を有する（Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：８２１−８２７）。不運なことに、２型糖尿病患者におけるグルコース輸送を刺激するために現在用いられている他の抗糖尿病治療薬は、脂質生成の活性も有している。このように現在の薬物治療では、血糖値の減少をもたらす一方で、肥満を促進することがある。
【０００８】
したがって、同時に脂質生成という副作用を生ずることなく高血糖を治す抗糖尿病治療薬を新たに作り出すことが非常に好ましい。糖尿病患者におけるグルコース摂取を、高血糖の原因となることなく誘発するような化合物もまた好ましい。多くの治療用タンパク質が糖尿病または肥満の治療のために開発されている。しかし、それらの多くは、乏しい有効性、副作用または不安定な性質のために満足のいくものではない。
【０００９】
一方、肥満は世界でも著しく進行の速いヒトの病気である。肥満患者は、耐糖能または「臨床的もしくは前臨床的」糖尿病を悪化させる場合がある。悪化した耐糖能を改善する抗肥満薬を作り出すことが非常に好ましい。理想を言えば、高血糖の原因とならずに肥満患者の減量を誘発し、悪化した糖耐性を改善する化合物もまた好ましい。
【発明の開示】
【００１０】
要約
本発明は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）もしくはそのアナログ、ペプチドＹＹ及びアミリンのような抗糖尿病もしくは抗肥満治療用ペプチドの生物学的有効期間を伸ばすための機能的な融合のパートナーとして、ヒトのレプチンを使用することに関する。前記レプチンの融合は、治療用ペプチドの生物学的有効期間を伸ばし、より多くの付加的な効果または治療用ペプチドとの相乗効果をもたらす。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、（ｉ）前記融合タンパク質のアミノ末端に位置し、第１の生理活性ペプチドまたはタンパク質の配列を含有する第１のセグメント；及び、（ｉｉ）前記融合タンパク質のカルボキシル末端に位置し、第２の生理活性タンパク質またはペプチドの配列を含有する第２のセグメントを含む融合タンパク質であって、前記第１及び第２のセグメントが機能するように共有結合してなる融合タンパク質を特徴とする。
【００１２】
単離されたタンパク質またはポリペプチドは、当然に関連した分子から実質的に遊離したタンパク質またはポリペプチドを意味する。すなわち、単離されたタンパク質またはポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７５％（すなわち、７５％から１００％の間の全ての値を含む）の純度を有する。いかなる適切で標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、またはＨＰＬＣによっても、純度を測定できる。本発明の単離されたポリペプチドは、（野生型のポリペプチドについては）天然物から精製することができ、組換えＤＮＡ技術または化学的方法により生産できる。
【００１３】
前記第１及び第２の生理活性ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質のホルモンである。前記第１の生理活性タンパク質は、グルカゴン様のペプチド１、アミリンもしくはペプチドＹＹ、またはその機能的等価物の配列を含有しうる。
【００１４】
一実施形態では、前記第１の生理活性タンパク質は、配列番号２の配列を含有する。前記第２の生理活性タンパク質は、レプチンもしくは機能的等価物または減量誘導タンパク質の配列を含有しうる。前記第２の生理活性タンパク質は、ヘテロのペプチドまたはタンパク質のＣ−末端に共有結合的に融合する場合、生理活性タンパク質の機能を維持する。前記第２の生理活性タンパク質は、配列番号１の配列を含有する。一例を挙げると、前記融合タンパク質は、配列番号４、５、１０、１１、１６または１７の配列を含有する。「ヘテロの」ポリペプチド、核酸または遺伝子は、異なるポリペプチド、核酸もしくは遺伝子に由来するものであるか、または、同種のポリペプチド、核酸もしくは遺伝子に由来する場合には、実質的にその元の形態から改変されている。
【００１５】
他の実施形態では、前記第１の生理活性タンパク質は、ペプチドＹＹのうちのアミノ酸残基３〜３６の配列を含有する（配列番号１９）。この場合、前記融合タンパク質は、配列番号１２または１３の配列を含有しうる。
【００１６】
さらに他の実施形態では、前記第１の生理活性タンパク質は、アミリンのうちのアミノ酸残基１〜３６の配列を含有する（配列番号１８）。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号１４または１５の配列を含有する。
【００１７】
上記した融合タンパク質は、前記第１のセグメント及び前記第２のセグメントと結合するリンカーセグメントをさらに含みうる。前記リンカーセグメントはダイマー化することができる。前記リンカーセグメントは、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのＦｃ断片またはその機能的等価物のＦｃ断片を含有しうる。好ましくは、前記免疫グロブリンはＩｇＧのＦｃ断片であり、例えば、配列番号３を含有する。
【００１８】
前記融合タンパク質は、分泌前に、配列番号９またはその機能的等価物をさらに含有しうる。配列番号９はｔＰＡ分泌シグナルペプチド配列である。成熟したタンパク質またはペプチドのＣ−末端と融合する場合、配列番号９は、前記タンパク質またはペプチドを分泌経路及び細胞外空間（例えば、タンパク質またはペプチドを発現する細胞の培地）へ導く。前記ｔＰＡシグナルペプチドは分泌後に成熟したタンパク質またはペプチドから開裂されうる。ＩｇＧの重鎖及び軽鎖に由来するペプチドのような類似のシグナルペプチドは同じ分泌目的に使用することもできる。
【００１９】
本発明の他の態様は、上記の融合タンパク質をコードする配列を含む単離された核酸であることを特徴とする。前記核酸は、配列番号６〜７のうち一の配列を含有しうる。
【００２０】
核酸とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログを意味する。ＤＮＡまたはＲＮＡのアナログは、核酸アナログから合成することができる。前記核酸分子は一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。「単離された核酸」とは、いかなる自然発生した核酸の構造、または自然発生した核酸のいかなる断片の構造とも一致しない構造を有する核酸を意味する。このように、かかる用語は、例えば、（ａ）自然発生したゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、自然発生した生物のゲノムにおいて、分子の一部と並んだコーディング配列の双方と並ぶことのないＤＮＡ；（ｂ）結果的に得られる分子がいかなる自然発生したベクターまたはゲノムＤＮＡとも一致しないような方法で、ベクター、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成された断片、または制限断片のような分離した分子；及び、（ｄ）雑種遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子をカバーしている。上述の核酸は、本発明の融合タンパク質を発現するために用いられうる。かかる目的のために、前記核酸を、発現ベクターを生み出す上で適切な制御配列と、機能できるように結合させることができる。
【００２１】
ベクターとは、連結される他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。前記ベクターは自己複製することができ、または宿主ＤＮＡに組み込むことができる。前記べクターの例として、プラスミド、コスミドまたはウィルスベクターが含まれる。前記ベクターは、宿主細胞内で前記核酸の発現に適切な形態の核酸を含有する。好ましくは、前記ベクターは、発現されるべき核酸配列と、機能できるように結合される一以上の制御配列を含有する。「調節塩基配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。組織特異的及び／または誘導可能な配列だけでなく、制御配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を命令する配列を含む。前記発現ベクターの構成は、形質転換されるべき宿主細胞の選択や、所望のタンパク質またはＲＮＡのレベルなどのような因子に依存しうる。前記発現ベクターは、本発明のポリペプチドを生産する宿主細胞に取り込まれうる。上記核酸を含有する宿主細胞は、本発明の範囲内である。例として、大腸菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウィルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞が含まれる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州を参照せよ。本発明のポリペプチドを生産することで、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることのできる条件を備えた培地において、宿主細胞を培養することができ、前記培養細胞または前記細胞の培地から前記ポリペプチドを精製することができる。他の方法として、本発明の前記核酸は、インビトロで、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて転写及び翻訳されうる。
【００２２】
タンパク質の因子についての「機能的等価物」とは、タンパク質、例えば、一以上の点変異、挿入、欠失、切断、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質のポリペプチド誘導体を意味する。それは前記因子と、少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、９５％もしくは１００％、または７０％から１００％の間の他のいかなる数字全てを含む）一致し、前記因子の活性、例えば、その受容体との結合能、及び対応するシグナル変換経路の誘発能を実質的に維持する。
【００２３】
二つのアミノ酸配列または二つの核酸についての「一致の確率」とは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３で修正されている、のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０に記載されたＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴのプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長−１２を用いて実行し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実行し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。ギャップが２つの配列の間に存在する場合、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，１９９７に記載されているようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが利用できる。
【００２４】
前記融合タンパク質をコードする前述の融合タンパク質もしくは核酸を含む合成物は本発明の範囲内に含まれる。前記合成物は、医薬として許容されるキャリアを含有する製薬用合成物、または食事として許容されるキャリアを含有する食品用合成物である。前記合成物は、前記融合タンパク質をコードする前記融合タンパク質または核酸の有効量を、必要としている被験者の体重の維持または減量のために投与することができる。この目的のために、前記被検者は同時に、非融合形態における上述の第１または前記第２のペプチドもしくはタンパク質の投与を受けることができる。
【００２５】
本発明は（ｉ）レプチンまたは機能的等価物；（ｉｉ）グルカゴン様ペプチド１、アミリン、ペプチドＹＹ、またはそれらの機能的等価物のいずれか一つ；及び、（ｉｉｉ）医薬として許容されるキャリアを含有する別の製薬用合成物であることを特徴とする。
【００２６】
本発明はまた、前記融合タンパク質、または前記第２のペプチドもしくはタンパク質とともに前記第１のペプチドもしくはタンパク質を生産し、分泌する組換え乳酸菌を含む食品用合成物であることを特徴とする。
【００２７】
上記合成物は、糖尿病または肥満の治療に用いることができる。このように、糖尿病もしくは肥満の治療の方法は本発明の範囲に含まれる。前記方法は、上記融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸の有効量を、必要としている被検者に投与することを含む。前記方法は、互いに融合していない前記第１（特に、持続性型）または前記第２のペプチドもしくはタンパク質を被検者に同時に投与することを含んでいてもよい。
【００２８】
他の態様では、本発明は、被検者における、組換え治療用ペプチドまたはタンパク質の半減期を増大する方法を特徴とする。前記方法は、配列番号１またはその機能的等価物を含有するセグメントに組換え治療用タンパク質を結合させて、融合タンパク質を形成すること；及び、被検者における前記融合タンパク質の半減期を決定することを含む。前記治療用ペプチドまたは組換えタンパク質は、糖尿病または肥満に関する治療効果を有する。
【００２９】
本発明はまた、被検者における組換え治療用ペプチドまたはタンパク質の前記有効性を増大させる方法を特徴とする。前記方法は、配列番号１またはその機能的等価物を含有するセグメントに前記組換えタンパク質を結合させて、融合タンパク質のキメラを形成し;及び、被検者における前記融合タンパク質の有効性を決定することを含む。前記治療用ペプチドまたは組換えタンパク質は、糖尿病もしくは肥満またはその両方に関する治療効果を有する。配列番号１の融合は、前記組換え治療用ペプチドまたはタンパク質の有効性を付加的もしくは付加的以上もしくは相乗効果によって増大させうる。前記融合のパートナーは互いの生物学的機能を干渉しない。
【００３０】
本発明の一以上の実施形態の詳細は以下の記述において説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、前記記載及び請求項から明らかであろう。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、抗糖尿病または抗肥満の治療用ペプチドまたはポリペプチドの生物学寿命または有効性を延ばすための機能的な融合パートナーとしての、レプチンの新たな用途の発見に基づく。レプチンまたはその機能的等価物は、多くの生理活性ペプチド、例えば、抗糖尿病ペプチドのＣ末端に結合する際、より多くの付加的作用または相乗効果とともに、生物学的寿命及び生理活性ペプチドの有効性を伸ばすことは予想外であった。例えば、これらのタンパク質は、グルカゴン様ペプチド１、アミリンもしくはペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、またはそれらの機能的等価物を含む。
【００３２】
本分野において公知であるが、生理活性タンパク質に対するＮ末端タンパク質の融合は、特に、大きなサイズのタンパク質融合パートナーに対して完全に活性を喪失する場合がある。例えば、プロ酵素及びプロホルモンは、Ｎ末端におけるプロペプチド融合が原因となって活性化しない。これらのプロ消化酵素及びプロホルモンは、それらのプロペプチドが開裂される後まで生物学的に活性化している。さらに、大きなサイズのタンパク質融合は、発現する量を減少させることがある。予想外なことに、タンパク質に結合したレプチンは、哺乳類の宿主細胞中で量産することができる。前記融合はレプチンまたは結合された生理活性タンパク質の活動を妨げない。また、予想外なことに、レプチンまたはその機能的等価物は、前記生理活性ペプチドの生物学的寿命を伸ばすだけでなく、互いの活動を増進する。
【００３３】
さらに、ＧＬＰ−１またはそのアナログを使用する際、ＰＹＹまたはアミリンは、（融合タンパク質中であるか、またはそうでない）レプチンとともに使われ、それらは食欲または食物摂取を減らすこと等を通して、体重に対してより付加的な効果または相乗効果を有する。市販のＧＬＰ−１または組換えレプチンの使用のみでは、我々の動物モデル（我々のパイロット実験）において著しい減量を誘発しなかったので、これは予想外のことであった。このようなレプチン及びＧＬＰ−１またはそのアナログ、ＰＹＹ、あるいはアミリンの併用投与は、肥満または糖尿病の治療に用いることができる。
【００３４】
例えば、下記の例に示すように、融合タンパク質であるＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンは、ＧＬＰ−１のグルコース低下活性を維持するだけでなく、レプチンの減量活性も保つ。さらに、それは、ＧＬＰ−１のアナログであるＥ４  Ｂｙｅｔｔａよりも生物学的寿命をよりいっそう長くし、または治療効果をより長く持続させる。
【００３５】
レプチン
レプチン、例えば、 ジーンバンク登録番号ＮＰ＿０００２２１は、脂肪由来ホルモンであって、食物摂取及び体重を調節する鍵となる栄養センサーである。組換えレプチンは、小動物においては効果的な減量薬である。しかし、肥満体の人間に対するレプチン治療は、先天的なレプチン欠乏に苦しむ被検者に限定されない。明らかなことであるが、レプチンそれ自体は、素晴らしいヒト治療用薬とはいえない。一方、前記ヒトの食欲、食物摂取及び減量の調節は、一以上の因子によって調節されうる。本願で開示するように、生物学的寿命を延ばすための、他の糖尿病関連治療薬または減量治療薬の機能的な融合パートナーとしてレプチンを使用することは、さらなる治療上の価値を有する。
【００３６】
本発明で用いられるレプチンは、米国特許出願第２００３０２０３８３７号、及びＺｈａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７２：４２５−４３２；参照により本願に引用される）で説明されているような組換えマウスまたは組換えヒトタンパク質、あるいは２８番目のグルタミル残基を欠いたタンパク質（Ｚｈａｎｇら、上記文献、４２８頁）から選択されうる。米国特許出願２００３０２０３８３７号（そこでは配列番号:４）で説明されているような組換えヒトレプチンタンパク質アナログも使用することができ、（１）３５番目に位置するリジンの代わりにアルギニン、及び（２）７４番目に位置するイソロイシンの代わりにロイシンを含有する。
【００３７】
マウスのレプチンタンパク質は、特に成熟タンパク質のような前記ヒトレプチン、さらにいえば、特にＮ末端で、実質的に相同性を有する。前記組換えヒト配列において、前記マウスの配列から分化したアミノ酸を替えることにより（例えば、アミノ酸残基の代替）、前記組換えヒトタンパク質のアナログを調製できる。なぜなら、前記組換えヒトタンパク質は、マウスにおいて生理活性を有し、このようなアナログはヒトにおいて活性化している可能性があるからである。例えば、配列番号１とナンバリングされたものの、３５番目に位置する残基にリジン、及び７４番目に位置する残基にイソロイシンを有するヒトタンパク質を用いると、３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２、及び１４５番目に位置する一つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸に置き換わりうる。前記マウスのタンパク質の対応する位置にあるアミノ酸を選択してもよい。
【００３８】
ラットレプチンタンパク質（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９５；２０９：９４４−９５２）または赤毛猿レプチンタンパク質（米国特許出願第２００３０２０３８３７号）も使うことができる。これらレプチンタンパク質は、多くの位置においてヒトレプチンタンパク質とは異なっている。これらの多様な位置にある一つ以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置換してレプチンアナログを生産できる。他のアナログは、前記タンパク質のアミノ酸配列の一部を欠失させることにより調製できる。例えば、参照により本願に引用される、米国特許出願２００３０２０３８３７号を参照せよ。
【００３９】
グルカゴン様ペプチド−１
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、例えば、ジーンバンク登録番号Ｐ０１２７５のものは、ＧＬＰ−１（７−３６）及びＧＬＰ−１（７−３７）のような２つの原理分子形態における腸内分泌細胞中で合成される。前記ペプチドは、以下のプログルカゴンのためのＤＮＡ及び遺伝子のクローン作成で初めて確認された。ＧＬＰ−１の生物学的活性の初期の研究は、ＧＬＰ−１（アミノ酸１−３７及び１−３６）のうちＮ末端の全長を伸ばした形態を利用した。大きなＧＬＰ−１分子は、一般的に生理活性を欠いている。後に、１９８７年に、前記第１の６アミノ酸を除去することにより、生理活性が大幅に増進したＧＬＰ−１分子がより短くなることが見出された。
【００４０】
循環している生物学的に活性のあるＧＬＰ−１の大部分は、前記ＧＬＰ−１（６−３６）であり、生理活性のあるＧＬＰ−１（７−３７）の形態もより少量ではあるが検出可能である。ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、２番目に位置するアラニンがペプチドの分解を導くので、Ｎ末端はＧＬＰ−１の生理活性を調節する上で重要な遺伝子座である。２番目に位置するアラニンがグルタミンまたはバリンに置換されたＧＬＰ−１アナログはＤＰＰ−ＩＶに抵抗する。
【００４１】
ＧＬＰ−１は潜在的に抗糖尿病及び抗肥満に有益な効果を有する。例えば、ＧＬＰ−１は、胃の内容物の排出を遅らせ、食後の血統上昇を鈍らせ；食欲を抑制し；食物摂取を抑制し；及び、β細胞の成長を引き起こす。これらの効果は、製薬会社にとって大変興味深い。アミリン  ファーマスーティカル社は、糖尿病及び肥満に関係した兆候に対して求められているＧＬＰ−１のアナログを市販している。ノボ  ノルディスク社は、別の長時間作用型のＧＬＰ−１を開発した。現在少なくとも５社が、ＧＬＰ−１の結合したヒューマンゲノムサイエンス社のアルブミン融合ＧＬＰ−１アナログを開発中である。
【００４２】
ペプチドＹＹ及びアミリン
ＧＬＰ−１アナログのほかに、ペプチドＹＹ（例えば、ジーンバンク登録番号Ｐ１００８２）、アミリン（例えば、ジーンバンク登録番号Ｐ１０９９７）、及び多くの他のポリペプチドもしくはタンパク質もまた潜在的「抗肥満」もしくは「抗糖尿病」薬であり、それらの生物学的寿命を伸ばすためにレプチンに結合し、付加的なもしくはそれ以上の作用あるいはキメラ分子のような相乗効果を有する。実際のところ、アミリンファーマスーティカル社は現在糖尿病及び肥満を適応症とするアミリン（商号Ｓｍｙｌｉｎ）を市販している。
【００４３】
本願で開示するように、レプチン及び抗肥満タンパク質についての多くの融合タンパク質が作り出されている。それらの例として、ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−レプチンの単量体形（配列番号:４）、ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチンの二量体型（配列番号:５）、（Ｇ８−またはＶ８−ＧＬＰ−）−リンカー−レプチン（配列番号:１０）、ＧＬＰ−１アナログ（Ｇ８−またはＶ８−ＧＬＰ−１）−リンカー−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン二量体型（配列番号:１１）を含有する。さらに、ペプチドＹＹ（３−３６）−リンカー−レプチン（配列番号:１２）、ペプチドＹＹ（３−３６）−リンカー−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチンの二量体型（配列番号:１３）、アミリン−リンカー−レプチン （配列番号:１４）、アミリン−リンカー−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチンの二量体型（配列番号:１５）もまた作られた。
【００４４】
これらのキメラ治療用薬は、ＧＬＰ−１及びレプチン単独と比較して付加的利益を持つ。例えば、前記キメラ薬は、レプチンまたはＧＬＰ−１よりもインビボでより安定である。キメラ分子のファーマキネティック（Ｐｈａｍａｒｋｉｎｅｔｉｃｓ）  プロファイル、組織分布、副作用、及び有効性は、二つの個別分子、すなわち天然またはアナログのレプチンまたはＧＬＰ−１を同時使用した場合とは異なっている。
【００４５】
レプチンのアナログ、ＧＬＰ−１、ペプチドＹＹ、またはアミリン（またはそれらの生物学的に活性な断片）を本発明において使用することができる。各アナログの配列は、一つ以上の保存アミノ酸置換または一つ以上の非保存アミノ酸の生理活性を失わない置換、欠失もしくは挿入により、野生型配列とは異なる。以下に示す表は、適したアミノ酸置換を示している：
【００４６】
【表１】
2009510999.tif 000002
【００４７】
本願で開示される融合タンパク質は、一つ以上の化学的な部分が前記タンパク質の部分に結合することによって誘導体化されうる。化学的に改良した誘導体は、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、口腔、鼻腔、肺、局所もしくは他の経路を用いた投与のために、さらに改良されてもよい。生理活性タンパク質の化学的改良は、何らかの環境下、例えば、治療用タンパク質の安定性及び循環時間を増加させ、並びに免疫原性を減少させるような環境下で、付加的利益をもたらすことが分かった。米国特許第４，１７９，３３７号、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ中（Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ及びＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．ｐｐ．３６７−３８３（１９８１）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２年５月）（出版社：Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，  Ｍｏｕｎｔｖｉｅｗ  Ｃｏｕｒｔ，Ｆｒｉｅｒｎ  Ｂａｒｎｅｔ  Ｌａｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎ２０，ＯＬＤ，英国）を参照せよ。
【００４８】
誘導体化に適切な化学部分はさまざまな水溶性ポリマーから選択される。結合した前記タンパク質は水性の環境で沈殿しないように選択された前記ポリマーは水溶性であるべきである。好ましくは、前記最終生成物生成の治療用使用のために、前記ポリマーは医薬的に許容できる。前記ポリマー／タンパク質 複合体が治療用に用いられるといった配慮、そしてもしそうなら、望ましい投与量、循環時間、タンパク質分解への抵抗力、及び他の配慮に基づいた望ましいポリマーを当業者は選択できるであろう。現在のタンパク質及びペプチドにとって、誘導体化の有効性は望ましい形（すなわち、浸透圧ポンプによる、あるいはさらに好ましくは、注射もしくは輸液、あるいはさらに経口投与、肺送達、もしくは経鼻投与用に考案された形、例えば）での前記誘導体の投与及びここに説明するような生物学的効果を観察することによって解明されうる。
【００４９】
水溶性ポリマーは例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸のコポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムもしくは非ランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールのホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリスチレンマレイン酸エステル、及びポリビニルアルコールからなる群から選択されうる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定のため製造において有利である。
【００５０】
融合タンパク質は、前記タンパク質の循環半減期を増加させるために、ポリアミノ酸にさらに結合できる。現在の治療用または美容用の目的のために、このようなポリアミノ酸は、中和抗原反応、または他の副作用を作り出さないものであるべきである。このようなポリアミノ酸は、（ヒト血清アルブミンのような）血清アルブミン、抗体またはそれらの一部（例えば、抗体のコンスタント領域、すなわちＦｃ領域）、あるいは他のポリアミノ酸からなる群から選択することができる。
【００５１】
前記ポリマーは、いかなる分子量でもよく、分枝または非分枝でありうる。ポリエチレングリコールについて、取り扱い及び製造を容易にするために好ましい分子量は約２ｋＤａから約１００ｋＤａの間である（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、定められた分子量よりも大きな分子もあり、小さな分子もあるということを示す）。所望の治療用プロファイル（例えば、所望の徐放期間、場合により生物学的活性に関する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度もしくは欠如、及び治療用タンパク質もしくはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）によっては、他のサイズのものも使うことができる。
【００５２】
このように結合するポリマー分子の数は変化しうるものであり、当業者であれば機能への影響を解明できるであろう。モノ誘導体化されうる、あるいは同一のもしくは異なる化学的部分（例えば、ポリマー、例えば、異なる分子量のポリエチレングリコール）とジ、トリ、テトラ、または何らかの組み合わせによる誘導体が提供されうる。タンパク質（またはペプチド）分子に対するポリマー分子の割合は、反応混合物におけるそれらの濃度が変化するにつれて、変化するであろう。一般に、（過剰な非反応タンパク質またはポリマーの存在しない反応効率に関する）最適割合は、所望の誘導体化度合（例えば、モノ、ジ−、トリ−、など）、選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分枝であるか非分枝であるか、及び反応条件のような因子によって決定される。
【００５３】
化学的部分は、タンパク質の機能性または抗原性ドメインにおける効果を考慮してタンパク質と結合されるべきである。当業者にとって利用可能な多くの結合方法がある。例えば、本願に参照により引用される、ＥＰ０４０１３８４（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリング）。Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１２３５（１９９２）（塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化を報告）。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノまたはカルボキシル基のような反応基を介して、アミノ酸残基に共有結合されうる。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合されうる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基及びＮ末端アミノ酸残基を含有し、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、及びＣ末端アミノ酸残基を含有する。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応基として用いられうる。治療目的のため、好ましくは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。レセプター結合にとって重要な残基での結合は、レセプター結合が所望である場合には避けるべきである。
【００５４】
特に、Ｎ末端の化学修飾タンパク質が好ましい。本合成物の例示として、ポリエチレングリコールを用いる場合、（分子量、分枝などによる）種々のポリエチレングリコール分子、反応混合物中のタンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実施されるＰＥＧ化反応のタイプ、及び選択されたＮ末端ＰＥＧ化タンパク質を得る方法から選択されうる。Ｎ末端ＰＥＧ化タンパク質を得る（すなわち、必要であれば他のモノＰＥＧ化部分からこの部分を分離する）方法は、ＰＥＧ化タンパク質分子の集団からＮ末端ＰＥＧ化物質を精製することにより行われうる。選択的なＮ末端の化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なるタイプの元のアミノ基（Ｎ末端に対してのリジン）についての異なる反応性を用いた還元アルキル化により、行うことができる。適切な反応条件下で、ポリマーを含有するカルボニル基によるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、タンパク質のリジン残基のイプシロンアミノ基とＮ末端残基のアルファアミノ基との間のｐＫａ差を利用可能なｐＨで反応を行うことにより、タンパク質を選択的にＮ末端でＰＥＧ化することができる。このような選択的誘導体化により、水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される：ポリマーとの複合体化は、タンパク質のＮ末端で優性的に生じ、リジン側鎖のアミノ基のような他の反応基の有意な修飾は生じない。還元アルキル化を用いる場合、水溶性ポリマーは上記のタイプであり得り、タンパク質にカップリングするための一つの反応性アルデヒドを有するべきである。一つの反応性アルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであれば使用可能である。
【００５５】
Ｎ末端のモノＰＥＧ化誘導体は、治療用品の製造を容易にする上で好適である。Ｎ末端のＰＥＧ化は、ジ、トリ、または他の複数のＰＥＧ化した製品に比して、製品の特徴が単純化されるので、同一の製品を保証する。上記の還元アルキル化方法をＮ−末端合成に利用することは、工業的な製造を容易にするため、好まれる。
【００５６】
さらに本発明の別の形態において、本発明のタンパク質の製薬用合成物及び誘導体を使用する方法を提供する。このような製薬用合成物は、注入による投与、または経口、肺、経鼻、経皮もしくは他の形態の投与に対して用いられうる。一般的に、本発明は医薬として許容される希釈剤、防腐剤、溶解補助剤、乳化剤、アジュバント及び／またはキャリアとともに、本発明のタンパク質または誘導体産物の有効量を含む製薬用合成物を含む。このような合成物は、様々な緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び溶解補助剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、並びに充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のようなポリマー化合物からなる粒子製剤、またはリポソームへの物質の取り込みを含む。ヒアルロン酸も使用でき、これは、循環中における持続時間の延長を促進する効果を有すると考えられる。このような合成物は、物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、並びに本タンパク質及び本誘導体のインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼしうる。例えば、レミントンズファーマスーティカルサイエンス、１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）  １４３５−１７１２頁が、参照により本願に引用される。前記合成物は、液体形態、または乾燥粉末のような凍結乾燥形態に調製することができる。経皮製剤と同様に、移植可能な徐放性製剤も考慮される。
【００５７】
本願に参照により引用されるレミントンズファーマスーティカルサイエンス，１８ｔｈ  Ｅｄ．１９９０（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．  １８０４２）Ｃｈａｐｔｅｒ  ８９において概説されている経口固形投与形態が本願での使用のために考慮される。固形投与形態は、錠剤、カプセル、丸剤、トローチまたはロゼンジ、カシェまたはペレット剤を含有する。また、リポソームまたはプロテノイドのカプセル化も本合成物（米国特許第４，９２５，６７３）を製剤するために使用しうる。リポソームのカプセル化も使用でき、さまざまなポリマー（例えば、米国特許第５，０１３，５５６）でリポソームを誘導体化することができる。本願に参照により引用されるＭａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，１９７９において、治療用に可能な固形投与形態の説明が述べられている。一般的に、製剤はタンパク質（またはアナログもしくは誘導体）、及び胃環境に対する防御と腸における生理活性物質の放出を可能にする不活性成分を含有する。
【００５８】
また、特に、上記の誘導体化されたタンパク質の経口投与形態も考慮される。必要に応じて誘導体の経口送達は有効であるようにタンパク質を化学的に修飾することができる。一般的に、考慮される前記化学修飾は、（ａ）タンパク質分解の抑制、及び（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを可能にする少なくとも１つ以上の成分をタンパク質（またはペプチド）分子そのものに結合することである。また、タンパク質の全体安定性の上昇及び体内での循環時間の上昇も望ましい。このような成分の例として：ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンを含有する。例えば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉとＤａｖｉｓ、可溶性ポリマー−酵素付加化合物、「薬剤としての酵素」、ＨｏｃｅｎｂｅｒｇとＲｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９８１），ｐｐ  ３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９（１９８２）参照。使用できる他のポリマーはポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。
【００５９】
前記タンパク質（もしくは誘導体）が放出される場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）または大腸である。当業者は、胃で溶解されないが、十二指腸の中または小腸の中の他の部位で、物質を放出する製剤を利用できる。好ましくは、タンパク質（もしくは誘導体）の保護か、胃内環境、例えば腸を超えて生理活性物質を放出するかのいずれか一方によって、前記放出は胃内環境の悪影響を避けるであろう。
【００６０】
充分な胃の抵抗性を確保するために、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性の被覆剤が不可欠である。腸の被覆剤に使われている、より一般的な不活性成分の例としては、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニル酢酸フタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロース酢酸フタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ及びＳｈｅｌｌａｃがある。これらのコーティングは混合膜として使われうる。
【００６１】
被覆剤または被覆剤の混合物は、胃に対する保護を意図していない錠剤として使うこともできる。これは、シュガーコーティング剤、または嚥下をより簡単にさせる被覆剤を含みうる。カプセルは、治療用乾燥物、すなわち粉末の運搬用の（ゼラチンのような）固いシェルからなり；液状用には、やわらかいゼラチンシェルが用いられうる。カプセルのシェル材料は、濃いスターチ（ｔｈｉｃｋ  ｓｔａｒｃｈ）もしくは他の食用紙である。丸剤、薬用キャンディー、成形の錠剤または粉薬錠剤用には、湿式塊化法を用いることができる。
【００６２】
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態の微細多粒子として、製剤中に含めることができる。カプセル投与用物質の製剤は、粉末、軽度圧縮プラグまたは錠剤であってもよい。治療薬は圧縮によって調製することができる。
【００６３】
着色剤及び着香剤は、どれもが含まれうる。例えば、前記タンパク質（もしくは誘導体）を製剤し、（リポソームもしくはミクロスフィア被包などによって）それからさらに着色剤及び着香剤を含有する冷却飲料のような食品の中に配合することができる。
【００６４】
不活性物質を伴う治療薬を希釈するか、その容量を増加させてもよい。これらの希釈剤は炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、変性デキストラン及びデンプンを含有しうる。一部の無機塩もまた、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含有して、フィラーとして使用しうる。市販の希釈剤の一部として、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、ＥｍＤＥＸ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌがある。
【００６５】
崩壊剤も、固形投与形態の治療製剤中に含まれうる。崩壊剤として使用される物質は、デンプンをベースとする市販の崩壊剤であるエキスプロータブを含有するデンプンを含んでもよいが、これに限定されることはない。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジ及びベントナイトは全て使用しうる。崩壊剤の別の形態は不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ゴムは崩壊剤及び結合剤として使うことができる。そして、これらは寒天、カラヤゴムもしくはトラガカントのような粉末ゴムを含有しうる。アルギン酸及びそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
【００６６】
結合剤は、硬錠剤を形成するために、治療用薬剤と結合して用いることができ、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンのような天然産物からの材料を含有しうる。その他のものはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はいずれも、治療薬を顆粒化するためのアルコール溶液中で使用できる。
【００６７】
減摩剤は治療製剤の中に製造工程中の粘着を防ぐために含まれうる。潤滑剤は治療薬及び鋳型壁の間の層として使うことができ、これらはマグネシウム塩及びカルシウム塩を含有したステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及び蝋を含みうるが、それだけに限られない。ラウリル硫酸ナトリウム及びラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００及び６０００のような可溶性潤滑剤も使用できる。
【００６８】
製剤中の薬剤の流動特性を高めることができ、また、圧縮の際の再配列を助けるすべり剤を添加してもよい。すべり剤は、デンプン、滑石、発熱性シリカ及び水和ケイアルミネートを含有しうる。
【００６９】
水性環境中での治療用薬剤の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。界面活性剤として、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムのような陰イオン界面活性剤がありうる。陽イオン界面活性剤も使用でき、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含みうる。界面活性剤として製剤中に含有されることができる潜在的な非イオン性の界面活性剤の一覧として、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤はいずれか一方単独、または種々の比率での混合物として、タンパク質または誘導体の製剤中に存在しうる。
【００７０】
前記タンパク質（もしくは誘導体）の吸収を潜在的に高める添加物として、例えばオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸のような脂肪酸が挙げられる。
【００７１】
放出制御製剤は好ましいものでありうる。前記製剤は、拡散または浸出機序による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムに配合することができる。緩やかに変性するマトリックスもまた製剤中に組み込むこともできる。本治療薬の制御放出のもう一つの形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ社）に基づく方法によるものであり、すなわち、浸透圧作用によって１個の小さな開口部を通して水が侵入し、薬剤を押し出す半透過性膜中に薬剤が納められている。一部の腸溶剤皮も緩徐放出作用を有する。
【００７２】
他の被覆剤は製剤用に使用しうる。これらはコーティングパンに適用可能な多様な糖類を含む。治療用薬剤は、薄膜被覆錠剤中に含めることもでき、この場合に用いられる材料は２つの群に分けられる。第１の群は非腸溶物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールを含む。第２の群は一般にはフタル酸のエステルである腸溶物質からなる。
【００７３】
最適な薄膜状の被覆を提供するために、材料の混合物を用いてもよい。薄膜状の被覆はパンコーターもしくは流動床において、または圧縮被覆によって実施できる。
【００７４】
また、本タンパク質またはその誘導体に関する、食品用の乳酸菌発現システムを通じた、今までにない経口送達システムが本願で考慮される。融合タンパク質をコードする遺伝子は、ｕｓｐ４５のような有効な分泌のリーダー配列がＮ末端に組み込まれた食品用の発現プラスミドｐＬＥＢ５９０及びｐＬＥＢ６００（Ｔｉｍｏ  Ｔａｋａｌａ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，ＩＳＢＮ  ９５２−１０−２２６０−４；ｈｔｔｐ：／／ｅｔｈｅｓｉｓ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉで利用可能）中で再構築されうる。前記再構築されたプラスミドは、さらに発現及び増殖のための食品用乳酸菌に移行されうる。ＧＬＰ１−レプチンのような分泌された融合タンパク質を発現する形質転換された乳酸菌は、経口送達用にフリーズドライされうる。前記乳酸菌は耐酸性であり、簡単に低いｐＨのバリアを通過しうり、数日間、腸にとどまりうる。分泌された融合タンパク質は、有効性のために直接腸に吸収されうる。
【００７５】
本発明のタンパク質（またはその誘導体）の肺送達も考慮される。タンパク質（またはその誘導体）は吸入の際に哺乳類の肺に送達され、肺上皮内層を通って血流に入る。これについての報告は、例えば、Ａｄｊｅｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９０，７：５６５−５６９；Ａｄｊｅｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １９９０，６３：１３５−１４４；Ｂｒａｑｕｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９８９，１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６；Ｈｕｂｂａｒｄら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９８９，３：２０６−２１２；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９，８４：１１４５−１１４６；Ｏｓｗｅｉｎら「タンパク質のエーロゾル化」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏ．，１９９０，Ｍａｒｃｈ；Ｄｅｂｓら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１４０：３４８２−３４８８、及び米国特許第５，２８４，６５６号を参照せよ。
【００７６】
その全てが当業者には熟知のものである、ネブライザ、定量吸入器、及び粉末吸入器を含むがこれらに限定されない、治療薬剤の肺送達用に設計された広い範囲の機械的装置が、本発明を実施する際の使用に関して考慮される。
【００７７】
本発明の実施に適した市販の装置のいくつかの具体例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．が製造しているＵｌｔｒａｖｅｎｔ  ネブライザ、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏが製造しているＡｃｏｒｎ  ＩＩ  ネブライザ、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．が製造しているｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器、及びＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．が製造しているＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【００７８】
このような装置は全て、タンパク質（またはアナログもしくは誘導体）を投薬するのに適した製剤を使用する必要がある。典型的には、各々の製剤は、用いる装置の種類に特異的であり、治療において有用な希釈剤、アジュバント及び／またはキャリアに加えて適切な促進物質の使用を含む。
【００７９】
前記タンパク質（または誘導体）は、遠位肺への最も有効な送達のために、平均粒径１０μｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５μｍの微粒子形態として最も好適に製剤されるはずである。
【００８０】
医薬として許容されるキャリアは、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトールのような炭水化物を含む。製剤において使用するためのほかの成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、及びＤＯＰＣを含有する。天然または合成界面活性剤も使用できる。（前記タンパク質またはアナログを誘導体化することへの使用とは別にしても）ポリエチレングリコールも使用できる。シクロデキストランのようなデキストランも使用できる。胆汁酸塩及び他の関連増強剤も使用できる。セルロース及びセルロース誘導体も使用できる。アミノ酸も、例えば緩衝剤製剤中で使用することができる。
【００８１】
また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接複合体、あるいは他のキャリアの使用も考慮される。
【００８２】
ネブライザ、ジェット噴霧器または超音波噴霧器による使用に適した製剤は、典型的には溶液１ｍＬ当たり、生理活性タンパク質を約０．１から２５ｍｇの濃度で水に溶解したタンパク質（または誘導体）を含む。前記製剤はまた、（例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節のため、）緩衝剤及び単糖も含有しうる。また、前記ネブライザ製剤は、エーロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって生じるタンパク質の表面誘導凝集を低減または予防するために、界面活性剤を含有しうる。
【００８３】
定量吸入装置に関して使用するための製剤は、一般に界面活性剤の助けを借りて、推進剤に懸濁した前記タンパク質（または誘導体）を含有する、微細に分かれた粉末を含む。前記推進剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、もしくはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含有する炭化水素、またはそれらの組み合わせのような、かかる目的に使用される物質であれば、従来のいかなるものでもよい。適当な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン及びダイズレシチンを含有する。オレイン酸も界面活性剤として有用であると考えられる。
【００８４】
粉末吸入装置から投薬するための製剤は、タンパク質（または誘導体）を含有する微細分割乾燥粉末を含み、同時に、装置からの粉末の散布を促進する量、例えば５０から９０重量％の、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールのような充填剤も含みうる。
【００８５】
前記タンパク質（またはアナログもしくは誘導体）の経鼻送達も考慮される。経鼻送達は、薬剤を肺に沈着させることを必要とせず、治療薬剤を鼻に投与した後に直接、タンパク質が血流へ通過することを可能にする。経鼻送達のための製剤は、デキストランまたはシクロデキストランを含むものを含有する。他の粘膜を通しての輸送による送達も考慮される。
【００８６】
本発明の融合タンパク質の有効量を、それを必要としている被検者に投与することによって糖尿病または肥満を治療する方法は、本発明の範囲に含まれる。治療を受ける被検者は、糖尿病または肥満に特徴的な状態を有しているか、そのような状態になる危険性がある。この方法は単独で、または他の薬剤もしくは治療法とともに行うことができる。「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、療養（ｃｕｒｅ）、緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、軽減（ｒｅｌｉｅｖｅ）、治療（ｒｅｍｅｄｙ）、予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）、または疾患、疾患の兆候、病状の二次状態もしくは疾患の素因の改善といった目的を伴う、合成物の被検者への投与を意味する。「有効量」とは、治療される被検者に対して、医学的に好ましい結果を生み出すことのできる合成物の量である。前記医学的に好ましい結果とは、客観的（すなわち、いくつかのテストもしくはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち、被検者が効果の兆候を示すか効果を感じる）なものでありうる。
【００８７】
治療される被検者は一つ以上の上記の疾患の治療を必要としているといっていい。このような治療を必要としている被検者と特定することは被検者または専門医療機関の評価においてでき、そして主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、テストもしくは診断方法により測定可能）でありうる。
【００８８】
あるインビボのアプローチにおいては、治療用合成物（例えば、本発明の融合タンパク質を含有する合成物）が被検者に投与される。一般的に、前記タンパク質は医薬として許容されるキャリア（例えば、生理食塩水）中に懸濁され、経口的にまたは静脈内輸液によって、投与、あるいは皮下、筋肉内、髄腔内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内もしくは肺内に注射または注入される。
【００８９】
必要とされる投与量は、投与の経路の選択、製剤の性質、被検者の疾患の性質；被検者のサイズ、体重、表面積、年齢及び性別；他に投与されている薬剤；並びに主治医の判断に依存する。適切な投与量は、０．０１−１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる投与量のバリエーションは、利用できる合成物の多様性及び各種の投与経路の異なる効果を考慮して予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射よりも投与量が多くなることが予想される。これらの投与量のレベルのバリエーションは、当該技術分野で周知のように、最適化のための標準的な経験上のルーティンを用いて調節できる。適切な輸送手段（例えば、高分子微粒子もしくは移植可能な装置）での合成物のカプセル化は特に、経口送達で輸送の効率を増大しうる。
【００９０】
本発明の合成物の有効性は、インビトロ及びインビボ両方において評価される。例えば、以下に示す例を参照せよ。簡潔にいえば、前記合成物は、インビトロでその有効性の検査を受けることができる。インビボでの研究のために、前記合成物を動物（例えば、マウスモデル）に注射することができ、その治療効果はその後アクセスされる。その結果に基づき、適切な投与量の範囲及び投与経路が決定できる。
【００９１】
本方法は、糖尿病治療薬（例えば、インシュリン、及び場合によってはアミリン）、コレステロールや血圧を下げる薬剤（例えば、血中脂質濃度を下げる薬剤、または心臓血管の薬剤）、及び活性を増大する薬剤（例えば、アンフェタミン）のような、治療に有用な他の薬剤とともに使用されうる。食欲抑制剤もまた使用されうる。このような投与は、同時にまたは順次、行われうる。
【００９２】
さらに、本方法は、身体全体の外観を変えるためにデザインされる美容整形（例えば、体重を減らすためにデザインされる脂肪吸引術もしくはレーザー手術、または見た目の体重を増やすためにデザインされる移植手術）のような外科的治療とともに用いられうる。バイパス手術または動脈プラークのような脂肪性沈着物による血管の閉塞が原因となる、有害な状態を緩和するためにデザインされる他の手術のような心臓手術の健康上の利益は、本合成物及び本方法の併用により増大しうる。超音波もしくはレーザーのように胆石を除去する方法は、治療方法を行う前、最中または治療後に用いることができる。
【００９３】
下記の例は、単に例示として説明されるものであり、ここでの開示の内容に限定されることはないものと解釈されなければならない。更なる労作なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づき、本発明の最大限の範囲を利用することができると考えられる。本願で引用された全ての刊行物は、それらの全体が参照により本願に引用される。
【００９４】
例１：
融合タンパク質であるＧＬＰ−１−Ｆｃ−レプチン及びＧＬＰ−１−３Ｇ−レプチンをコードする構成物を調製した。
【００９５】
具体的にいうと、ＥｃｏｒＲＩ−ｔＰＡ−ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−レプチン−Ｎｏｔ  Ｉ  ｃＤＮＡは、まず、市販のサービスプロバイダー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって合成され、ＥｃｏＲＩ  ａｄ  Ｎｏｔ  Ｉを用いて消化した。結果として生じた融合配列（配列番号：６）は、続いて、哺乳類発現用の、ＣＭＶベースの哺乳類の発現ベクターであるｐＣＡ、ｐＣＡｐｕｒｏ及びｐＣＡｄｈｆｒ中でクローニングした。
【００９６】
ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン（配列番号:５）をコードする発現ベクターを構築するために、標準的な多段階ＰＣＲ法を用いて、コーディング配列（配列番号: ７）を生成した。簡潔に説明すると、上記融合配列（配列番号:６）及びＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡ（配列番号:８）は、ＰＣＲの鋳型として用いられた。ＧＬＰ−１、ＩｇＧ１  Ｆｃ、及びレプチンの３つのオーバーラッピング断片を合成するためにプライマーはデザインされた。これらの断片を、２段階ＰＣＲ反応によって最終配列（配列番号: ７）を作るために結合した。結果として生じた融合配列は、コザック配列、すなわちｔＰＡシグナル配列を、そのＮ末端ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン  ｃＤＮＡに含んでいた。この配列を、哺乳類発現用の、ＣＭＶベースの哺乳類発現ベクターであるｐＣＡｐｕｒｏ及びｐＣＡｄｈｆｒ中にライゲーションした。
【００９７】
例２：
融合タンパク質であるＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチン及びＧＬＰ−１−３Ｇ−レプチンを、無血清の懸濁液中で培養されたＣＨＯ細胞中で発現させた。上述の二つの構造物は、標準的な方法を用いてＣＨＯ細胞系中で発現させた。前記ｔＰＡの分泌シグナル（配列番号:９）により、上記の培地中で融合タンパク質を発現させた。各細胞クローンの培地を集めて、ウサギの抗ヒトＦｃ断片抗体（ＰＩＥＲＣＥ、製品番号００３１４２３）を用いたドットブロット解析を行った。高レベルの融合タンパク質を発現する多数の細胞クローンが見つかった。
【００９８】
例３：
ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチンを、無血清の懸濁液培地中でスケールアップした。ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチン（配列番号:５）を発現するクローンについての発現タイター及びロバストを、９６穴プレート中でのアニマルコンポーネントフリー無血清培地中で行い、その後、１２５ｍｌ容の攪拌フラスコでのフェドバッチ研究を行った。高い発現レベルを有するクローンは、アニマルコンポーネントフリー無血清培地を含有する４リットルの懸濁液培養容器中でスケールアップした。条件付き培地中での発現タイターは、上記のようにドットブロットによって研究した。スケールアップは成功したことが分かった。
【００９９】
前記融合タンパク質を生産するために、培地を集めてろ過した。前記タンパク質を、タンパク質−Ａの親和性樹脂（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を用いて精製し、０．５Ｍのアルギニン  ＨＣｌのｐＨ３．３バッファーにより溶出した。その精製したバルクを、１％のアルギニン  ＨＣｌ、５ｍＭのヒスチジン、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０及び１％のマンニトールを含有するｐＨ５．０のバッファー中で形成し、−８０℃で保存した。
【０１００】
下記の分子を、上記の場合と類似した手法で構築し、発現させた。これらの分子は、（１）改変ＧＬＰ−１（Ｇ８−ＧＬＰ−）−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）−レプチン（配列番号：１０）;（２）改変ＧＬＰ−１（Ｇ８−ＧＬＰ−１）−リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン（配列番号：１１）のダイマー形態；（３）ペプチドＹＹ（３−３６）−リンカー−レプチン（配列番号：１２）;（４）ペプチドＹＹ（３−３６）−リンカー−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン（配列番号：１３）のダイマー形態；（５）アミリン−リンカー−レプチン（配列番号：１４）；（６）アミリン−リンカー−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン（配列番号：１５）のダイマー形態；（７）Ｇ８−ＧＬＰ１−３Ｇｌｙ−レプチン（配列番号：１６）のモノマー形態；及び、（８）Ｇ８−ＧＬＰ１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ１  Ｆｃ−レプチン（配列番号：１７）のダイマー形態である。
【０１０１】
例４：
ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチンを精製した。上述の培地を、タンパク質−Ａの結合用親和性カラム（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）及び溶出用のｐＨ３．５の０．５Ｍ  アルギニン−ＨＣｌを用いて、ろ過し、精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ｐａｇｅゲルにより研究した。
【０１０２】
例５：
発現したＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチンの分類を行った。ＨＲＰが複合体化したウサギの抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ＰＩＥＲＣＥ、製品番号００３１４２３）、ヤギの抗ヒトレプチン抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ３９８）、及びＨＲＰが複合体化したウシの抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、カタログ番号ｓｃ−２３５０）、ウサギの抗ＧＬＰ−１抗体（Ａｌｐｈａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号ＧＬＰ１５−Ｐ）、及びＨＲＰが複合体化したヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、カタログ番号ｓｃ−２００４）を用いて、タンパク質についての分子の全体性を、還元及び非還元のウエスタンブロットにより決定した。発現したＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチンは、すべての一次抗体によって認識されることが分かった。この結果は、如才なくＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチンが発現したことを示している。
【０１０３】
例６
ＧＬＰ−１−３ｘＧｌｙ−ＩｇＧ  Ｆｃ−レプチンの治療活性を研究した。
【０１０４】
まず、腹腔内グルコースの耐性テスト（ｉｐ  ＧＴＴ）を行い、グルコース依存性のインシュリン分泌に関するＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンの活性をテストした。手短に言うと、マウスの血糖を、ｏｎｅ−ｔｏｕｃｈ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｔｒｉｐｓを用いて測定した。尾の採血を通してマウスから血液サンプルを得た。続いて、０．０４、０．１または０．２ｍｇの、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンまたは調節タンパク質であるヒトのＩｇＧ１  Ｆｃ断片を腹腔内から注入した。注射後直ちに飽和グルコース水溶液０．２ｍｌをマウスの中へ腹腔内からｉｐ注入した。１及び２時間後、別の血液サンプルをグルコース測定のために同じような方法で集めた。Ｂｙｅｔｔａ（０．０２５ｍｇ；ＧＬＰ−１  アナログＥ４という商号、Ａｍｉｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）は陽性対照として用いた。この結果を下記の表１−４に要約した：
【０１０５】
【表２】
2009510999.tif 000003
【０１０６】
【表３】
2009510999.tif 000004
【０１０７】
【表４】
2009510999.tif 000005
【０１０８】
【表５】
2009510999.tif 000006
【０１０９】
表１に示されたように、Ｂｙｅｔｔａ、０．１ｍｇ  ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチン、及び０．２ｍｇのＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンの注入は、血液グルコースレベル（それぞれ、Ｐ＜０．０１、０．０５及び０．０５）を有意に抑制した。上記の結果は、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンが用量依存性に血液グルコースレベルを下げるのに用いることができることを示す。
【０１１０】
グルコース耐性テストの前に、上記の実験をＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチン（０．２ｍｇ）のｄａｙ−１で繰り返した。ＩＰグルコース耐性テストは、ｄａｙ−１及びｄａｙ−２で各々２回行われた。この結果を下記の表５に要約した：
【０１１１】
【表６】
2009510999.tif 000007
【０１１２】
表５に示されたように、０．２ｍｇのＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンを一回注入することで、血液グルコースレベルは抑制され、少なくとも二日間続いた。
【０１１３】
ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンの体重に対する効果を研究した。０．１ｍｇのＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンまたはヒトのＩｇＧ１  Ｆｃ断片を、上記と同じような方法で７日間マウスに注入した。１日目と７日目に、各々のラットの体重を量り、記録した。この結果を下記の表６に要約した。
【０１１４】
【表７】
2009510999.tif 000008
【０１１５】
７日目にＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンを注入されたマウスは、１１．３％体重が減少したことが分かった（ｐ＜０．０５）。一方、ヒトのＩｇＧ１  Ｆｃ断片を注入されたマウスでは、体重減少がまったく見られなかった。これらの結果は、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンが体重を減らすのに有用であることを示している。
【０１１６】
次に、Ｂｙｅｔｔａ（ＧＬＰ−１  アナログＥ４）の体重に対する効果を、同じような方法で研究した。５マイクログラムのＢｙｅｔｔａを、各マウスに１日２回、７日間注入した。体重を、１、４及び７日目に測定した。この結果を下記の表７に要約した。
【０１１７】
【表８】
2009510999.tif 000009
【０１１８】
Ｂｙｅｔｔａの投与は、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片と比較して、体重に対する統計学的に有意な効果は有していないことが分かった。
【０１１９】
上記の実験において、７日間、各マウスの血液グルコースレベルを、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチン（０．１ｍｇ）もしくはＩｇＧ１  Ｆｃ断片を注入後１時間の時点で、毎朝測定し、記録した。同じテストを、Ｂｙｅｔｔａ（ＧＬＰ−１  アナログ  ５ｕｇ；１日に２回）を用いて行った。この結果を下記の表８及び９に要約した。
【０１２０】
【表９】
2009510999.tif 000010
【０１２１】
【表１０】
2009510999.tif 000011
【０１２２】
下記の表８及び９に示すように、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンもしくはＢｙｅｔｔａを注入したマウスは、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片を注入したマウスよりも低い血液グルコースレベルを有していた。
【０１２３】
レプチンの体重に対する効果を上記と同じような方法で研究した。より具体的にいうと、０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅのヒトの組換えレプチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９８−ＬＰ）もしくはヒトのＩｇＧ  Ｆｃを、１日２回（午前９時及び午後５時）を７日間、腹腔内からマウスに注入した。この結果は下記の表１０に要約した。
【０１２４】
【表１１】
2009510999.tif 000012
【０１２５】
表１０に示すように、レプチンにより、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンが誘発する体重減少が半分未満となった。
【０１２６】
ＧＴＴアッセイも同様に、少数のラット及びウサギに対して行った。全ての結果は、血液グルコースレベルをＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンが抑制することを裏付けるものである。
【０１２７】
要約すれば、市販のＧＬＰ−１のアナログＥ４  Ｂｙｅｔｔａと比較して、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンは、ＧＬＰ−１がグルコースの活性を低くするのを維持するだけでなく、レプチンの減量効果も維持する。さらに、ＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンは、ＧＬＰ−１アナログＥ４  Ｂｙｅｔｔａよりも長く持続する治療効果を有する。このように、臨床的利用のために、注入頻度をもっと少なくする必要がある。また、市販のＧＬＰ−１のアナログＥ４  Ｂｙｅｔｔａ（表７）もしくは組換えレプチン（表１０）の単独でのｉｐ注入またはそれらを組み合わせた効果は、結果としてＧＬＰ１−Ｆｃ−レプチンが誘発するのと同程度の減量には到らなかった。結論として、（例えば、融合タンパク質として）レプチンと一緒にＧＬＰ−１を用いることは、減量に対して、付加的以上の効果または相乗効果を有する。
【０１２８】
他の実施形態
本明細書に記載のすべての特徴はいかなる組み合わせにおいても実施できる。本明細書に記載の各特徴は、同一、均等または類似の目的をもたらす代替的な特徴によって置換されうる。このように、もし明確に述べていないのであれば、開示された各特徴は、一般的な一連の均等または類似の特徴に関するほんの一例にすぎない。
【０１２９】
上記説明から、当業者は容易に本発明の不可欠の特徴を解明することができる、そして本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な用法及び環境に適応するために本発明を変形及び修正することができる。このように、他の実施形態も、以下の請求項の範囲に含まれる。
【配列表】
2009510999000001.app