(57)【要約】本発明は、システイン含有スカフォールドおよび／またはタンパク、および、そのようなシステイン含有産物を担持するか、および／または発現する発現ベクター、宿主細胞、および提示システムを提供する。本発明はさらに、そのような産物のライブラリーの設計法、そのようなライブラリーをスクリーニングして、標的分子に対し結合特異性を示す実体を生成する方法を提供する。さらに、本発明によって、本発明のシステイン含有産物を含む製薬組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３５以下のアミノ酸を有するポリペプチドを含む、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクであって、
前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１０％がシステインであり、
スカフォールド内のシステインを対合させることによって、少なくとも二つのジスルフィド結合が形成され、かつ前記対合は、３を超える複合指数を生成する、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項２】
約６０個以下のアミノ酸を有するポリペプチドを含む、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクであって、
前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１０％はシステインであり、
ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって、少なくとも四つのジスルフィド結合が形成され、かつ前記対合は、４を超える複合指数を生成する、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項３】
複合指数が６よりも大きい、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項４】
複合指数が１０よりも大きい、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項５】
標的分子に特異的に結合する、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項６】
約５０℃よりも高い温度で加熱された後も標的結合能を維持する、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項７】
約８０℃よりも高い温度で加熱された後も標的結合能を維持する、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項８】
約１００℃よりも高い温度で、かつ０．１秒を超える間、加熱された後も標的結合能を維持する、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項９】
標識類、エフェクター類、抗体類、および半減期延長成分から成る群から選ばれる成分に接合される、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１０】
モノマーである、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１１】
マルチマーである、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１２】
前記タンパクが一タイプのスカフォールドを含む、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１３】
前記タンパクが一を超えるタイプのスカフォールドを含む、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１４】
前記タンパクが、標的結合部位および半減期延長成分を含む、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１５】
前記タンパクが、標的に結合する反復単位を含む、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１６】
前記タンパクが、血清アルブミン、ＩｇＧ、赤血球、および血清に接触可能なタンパクから成る群から選ばれる半減期延長成分を含む、請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１７】
対応する天然システイン（Ｃ）−含有タンパクまたはスカフォールドの天然標的とは異なる標的に対して特異的結合性を示す、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク。
【請求項１８】
２０−６０個のアミノ酸から成る単一ドメインを含む非天然タンパクであって、３個以上のジスルフィドを有し、ヒトの血清暴露タンパクに結合し、かつ５％未満の脂肪族アミノ酸を有する、前記非天然タンパク。
【請求項１９】
２０−６０個のアミノ酸から成る単一ドメインを含む非天然タンパクであって、３個以上のジスルフィドを有し、ヒトの血清暴露タンパクに結合し、かつＴ−エピトーププログラムにおいてデータベースのタンパクの平均の９０％よりも低いスコアを有する、前記非天然タンパク。
【請求項２０】
請求項１、２、１８、または１９に記載の非天然タンパクから成るライブラリー。
【請求項２１】
請求項２０のライブラリーを提示する遺伝子パッケージ。
【請求項２２】
標的と、遺伝子パッケージの上に提示される外来ポリペプチドとの間の特異的相互作用の存在を検出する方法であって、
（ａ）請求項２０の遺伝子パッケージの提示を準備する工程、
（ｂ）安定なポリペプチド−標的複合体を生成するのに好適な条件下で遺伝子パッケージを標的と接触させる工程、および
（ｃ）遺伝子パッケージにおいて安定なポリペプチド−標的複合体の形成を検出し、それによって特異的相互作用の存在を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
所望の性質を有するポリペプチドを提示する遺伝子パッケージを単離する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパク、および、製薬学的に受容可能な担体を含む製薬組成物。
【請求項２５】
標的分子に対して結合特異性を示す非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドであって、Ｃ１−２，３−４、Ｃ１−３，２−４、およびＣ１−４，２−３から成る群から選ばれるパターンに従って、スカフォールド内システインを対合させることによって形成される二つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含み、前式において、ハイフンで結ばれる二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す、前記非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項２６】
標的分子に対して結合特異性を示す非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドであって、
【化１】
2009509535.tif 000210
から成る群から選ばれるパターンに従って、スカフォールド内システインを対合させることによって形成される三つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含み、前式において、ハイフンで結ばれる二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す、前記非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項２７】
標的分子に対して結合特異性を示す非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドであって、下記：
【化２】
2009509535.tif 000211
から選ばれるパターンに従って、スカフォールド内システインを対合させることによって形成される少なくとも四つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含み、
前式において、ハイフンで結ばれる二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す、前記非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項２８】
約５０℃よりも高い温度で加熱された後も標的結合能を維持する、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項２９】
約８０℃よりも高い温度で加熱された後も標的結合能を維持する、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３０】
約１００℃よりも高い温度で、かつ０．１秒を超える間、加熱された後も標的結合能を維持する、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３１】
標識類、エフェクター類、および抗体類から成る群から選ばれる成分に接合される、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３２】
モノマーである、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３３】
半減期延長成分を含む、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３４】
前記半減期延長成分が、血清アルブミン、ＩｇＧ、赤血球、および、血清に接触可能なタンパクから成る群から選ばれる、請求項３３に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３５】
対応する天然システイン（Ｃ）−含有タンパクまたはスカフォールドの天然標的とは異なる標的に対して特異的結合性を示す、請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド。
【請求項３６】
請求項２５、２６、または２７に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドから成るライブラリー。
【請求項３７】
請求項３６のライブラリーを提示する遺伝子パッケージ。
【請求項３８】
標的と、遺伝子パッケージの上に提示される外来ポリペプチドとの間の特異的相互作用の存在を検出する方法であって、
（ｄ）請求項３７の遺伝子パッケージの提示を準備する工程、
（ｅ）安定なポリペプチド−標的複合体を生成するのに好適な条件下で遺伝子パッケージを標的と接触させる工程、および
（ｆ）遺伝子パッケージにおいて安定なポリペプチド−標的複合体の形成を検出し、それによって特異的相互作用の存在を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
所望の性質を有するポリペプチドを提示する遺伝子パッケージを単離する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記遺伝子パッケージがファージである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ファージが繊維状ファージである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドを生産する方法であって、
請求項２５−２７のいずれか一項に記載の非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドをコードする核酸を含む宿主細胞を準備する工程、
前記核酸から、前記スカフォールドの発現を実現する条件下で、前記宿主細胞を適切な培養媒体において培養する工程、
を含む、前記方法。
【請求項４３】
前記媒体から前記スカフォールドを回収する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
請求項２５、２６、または２７に記載の前記非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールド、および製薬学的に受容可能な担体を含む製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は、双方とも２００５年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７２１，２７０号および米国仮特許出願第６０／７２１，１８８号、ならびに２００６年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／７４３，６２２号の利益を請求し、それらはその全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
分子生物学の基本概念の一つは、各天然タンパク質が、単一の「天然」構造またはフォールドを採用していることである。天然のフォールド以外の任意のフォールドの採用は、「ミスフォールド形成」と見なされる。多数の天然の、機能的フォールドを採用する天然タンパクの例はほとんど、または全く存在しない。ミスフォールド形成は、プリオンの感染性によって例示されるように重大な問題である。プリオンでは、その「誤った」フォールドが、触媒的に他のプリオンタンパクがミスフォールド形成する原因となり、脳の疾患およびある場合には死へと導く。ほとんど全てのタンパク質が、変性されると、ミスフォールドを生成し、繊維状ポリマーを形成するが、これらは、いくつかの変性疾患に関与しているようである。一例として、アルツハイマー病に関与するベータアミロイド繊維がある。タンパクのミスフォールド形成は、不溶の凝集体の非可逆的形成をもたらすが、変性タンパクは、溶融球状物としても出現することがある。多種多様な不安定構造を探る溶融球状状態から、タンパクは、漏斗型経路を辿り、次第にフォールド形成中間体の多様性を減らしていき、最終的に、単一の、安定的に折りたたまれた天然の構造が実現されるまで進むと考えられている。天然タンパクは、アロステリック調整、他のドメインに対する一ドメインの相対的なリッド／フラップ型移動、リガンドに対する結合による誘発的適合、または、結晶化力によって構造的な変更が可能であるが、これらの変更は一般に、基礎フォールドにおける基本的変化ではなくヒンジ様構造の移動を含む。従来観察された例は全て、天然タンパクは、その生物機能を実行するために、単一の安定なフォールドを採用するように進化してきており、この天然構造からの逸脱は有害であるとする考えを支持する。
【０００３】
同じタンパク配列でありながら（選択的スプライシング、糖化、またはタンパク分解酵素処理によって創出される変種を除く）天然に、一つを超える形として存在する例がこれまで二三見つかっているが、第２形は、通常単純にジスルフィド結合を失った不活性な副産物である（Ｓｃｈｕｌｚ  ら、，２００５；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ら、，２００３；Ｌａｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。高いジスルフィド密度を有する小型タンパクを含むミクロタンパク・ファミリーにおいて（多くは、毒素および受容体ドメインである）、完全に形成されてはいるものの（単純に欠陥的ではない）、別形のジスルフィド結合パターンを採用するために異なる構造を取る、互いに緊密に関連する配列が見いだされている。実例は、ソマトメジン（Ｋａｍｉｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ，２００４）およびマウロトキシン（Ｆａｊｌｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）である。
【０００４】
従来、タンパク提示ライブラリーは、非特許文献２に総覧されるように、単一の固定化されたタンパクフォールド、例えば、免疫グロブリンの各種ドメイン、インターフェロン、タンパクＡ、アンキリン、Ａ−ドメイン、Ｔ細胞受容体、フィブロネクチンＩＩＩ、ガンマ−クリスタリン、ユビキチン、その他諸々のフォールドを用いていた。ある場合、例えば、ヒトの免疫レパートリーから得られた免疫グロブリンライブラリーでは、ある単一ライブラリーは、多様なＶ−領域配列をスカフォールドとして用いるが、それらの配列は全て、基本的免疫グロブリンフォールドを共有する。別種ライブラリーとしてランダムペプチドまたは環状ペプチドライブラリーがあるが、これらは、定められたフォールドを持たず、かつ、単一の安定構造を取らないので、タンパクとは見なされない。
【０００５】
例えば、一つ以上の所望の性質を示す製薬を創出するための指向性進化による合理的選択を受け容れることが可能な新規タンパク構造の設計に対しては相当な需要が依然として存在する。上記の所望の性質として、免疫原性の低下、安定性の強化または半減期の延長、多重特異性、多価性、および標的に対する高い結合アフィニティーが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【非特許文献１】Ｂｉｎｚ．，Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３：１２５７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の一局面は、高いジスルフィド密度を示す新規タンパク構造の設計である。このタンパク構造は、例えば、一つ以上の所望の性質を示す製薬を創出するための指向性進化による合理的設計および選択に対し特に受容的である。そのような所望の性質としては、標的に対する高い結合アフィニティーおよび／またはアビディティー、分子量の低下および組織浸透性の向上、熱およびプロテアーゼ安定性の強化、半減期の延長、疎水性の向上、処方の強化（特に、高濃度）、および免疫原性の低下が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０００７】
一実施態様において、本発明は、例えば、スカフォールドの形を取る各種タンパク構造、および、そのようなタンパク構造から成るライブラリーを提供する。一局面では、スカフォールドは、多様なフォールド、または、他の非一次的構造を示す。別の局面では、スカフォールドは、生物機能を実行するために定義された空間配置を有する。別の実施態様では、本発明は、このようなタンパク構造から成るライブラリーを構築する方法、そのようなライブラリーを、遺伝学的ベヒクルまたはパッケージ（例えば、ファージなどのウィルスパッケージ、および非ウィルスパッケージ（例えば、酵母ディスプレイ、大腸菌表面ディスプレイ、リボソームディスプレイ、またはＣＩＳ（ＤＮＡ−連結）ディスプレイ）において提示する方法と共に、そのようなライブラリーをスクリーニングして製薬または製薬候補を生成する方法を提供する。本発明はさらに、主題のタンパク構造を発現するか、または利用するベクター、宿主細胞、および、その他のインビトロ系を提供する。
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、標的分子に対し結合特異性を示す、非天然のシステイン（Ｃ）−含有スカフォールドを提供する。この実施態様において、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドは、式：Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．によって表される組み合わせの群から選ばれるパターンによるスカフォールド内システインを含む。式中、ｎは、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数に等しく、かつ、Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．は、（２ｉ−１）の積を表し、この式においてｉは、１からｎまでの範囲の正の整数である。
【０００９】
別の実施態様では、本発明は、３５以下のアミノ酸を有するポリペプチドを含む、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクを提供する。前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１０％はシステインであり、スカフォールド内のシステインを対合させることによって、少なくとも二つのジスルフィド結合が形成され、前記対合は、３を超える複合指数を生成する。
【００１０】
一局面では、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、約６０個以下のアミノ酸を有するポリペプチドを含んでもよく、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１０％はシステインであり、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって、少なくとも四つのジスルフィド結合が形成され、前記対合は、４、６、または１０を超える複合指数を生成する。
【００１１】
別の局面では、本発明の非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、約５０℃よりも高い温度、好ましくは約８０℃よりも高い温度、さらに好ましくは１００℃よりも高い温度で、０．００１秒から１０分の範囲における任意の期間加熱された後、標的結合能を発揮する。
【００１２】
ある局面では、本明細書に記載される非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、標識（すなわち、ＧＦＰ、ＨＡ−タグ、フラグ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ）、エフェクター（すなわち、酵素、細胞傷害剤、キレート剤）、抗体（すなわち、全体抗体、Ｆｃ領域、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体）、腫瘍など所望の組織または区画へ分子を集中させる標的狙撃分子（ＶＥＧＦヘパリン結合エキソンなどのペプチドまたはドメイン、）、組織の障壁（経皮、経口、腸内、頬内、膣内、直腸内、鼻腔内、肺内、血液脳関門、経強膜）を横断する輸送を強化する障壁輸送接合体、例えば、アルギニン富裕ペプチド、アルキルサッカリド、界面活性剤を模倣するか、またはタンパクを含むか、または表示するミセルを形成する、（イオン性、または非イオン性）両親媒性ペプチド、および、小型分子（例えば、アルブミンに結合するか、または細胞膜に挿入されるもの）を含む半減期延長成分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化学的ポリマー、または各種ペプチドおよびタンパク配列（膜に挿入されるか、または非特異的に結合する疎水性ペプチドを含む）、（ヒト）血清アルブミン、トランスフェリン、ポリ（ＧＧＧＳ）リンカーなどのポリマー系グリシン富裕配列、から成る群から選ばれる成分に接合される。これらの接合体を形成する連結部は、遺伝学的に形成されてもよいし、あるいは化学的に形成されてもよい。このシステイン含有タンパクはまた、ホモまたはヘテロのマルチマーを生成して、２−マー、３−マー、４−マー、５−マー、６−マー、７−マー、８−マー、９−マー、１０−マー、１１−マー、１２−マー、１４−マー、１６−マー、１８−マー、２０−マー、またはそれよりもさらに高次のマルチマーを形成してもよく、これらのマルチマーは、タンパクの半減期を延長し、結合部位の濃度を増し、したがって見かけの解離定数を向上させ、標的に応じて、結合アビディティを増す場合もある。この高次マルチマーは、単一の大型遺伝子への融合、または、タンパクに対し遺伝学的にコードされるペプチド結合性ペプチド（「連結ペプチド」）を加え、それによって別々に発現されるタンパクが、Ｎ−および／またはＣ−末端において連結ペプチドを介して、あるいは、各種の化学的連結を通じて互いに結合してタンパクマルチマーを形成することによって創製することが可能である。好適な半減期延長成分としては、血清アルブミン、ＩｇＧ、赤血球、および血清に接触可能なタンパクに結合する成分が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。各標的および各製薬使用は、多数のこれらの要素の組み合わせの内それぞれ異なる組み合わせを好む。
【００１３】
本発明はさらに、２０−６０個のアミノ酸から成る単一ドメインを含む非天然タンパクで、３個以上のジスルフィドを有し、ヒトの血清暴露タンパクに結合し、かつ、５％未満の脂肪族アミノ酸を有するタンパクを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、２０−６０個のアミノ酸から成る単一ドメインを含む非天然タンパクで、３個以上のジスルフィドを有し、ヒトの血清暴露タンパクに結合し、かつ、Ｔ−エピトーププログラムにおいてデータベースのタンパクの平均の９０％よりも低い、好ましくはデータベースのタンパクの平均の９９％よりも低いスコアを持つタンパクを提供する。さらに本発明に含まれるものは、主題の非天然タンパクのライブラリー、該タンパクをコードする遺伝子パッケージを含む発現ベクター、および、該タンパクを発現または提示する他の宿主細胞である。
【００１５】
さらに本発明に含まれるものは、本明細書に開示されるシステイン含有ミクロタンパクを生産する方法である。
【００１６】
さらに本発明に含まれるものは、標的と、遺伝子パッケージの上に提示される外来ポリペプチドとの間の特異的相互作用の存在を検出する方法である。この方法は、（ａ）本発明の遺伝子パッケージ提示を準備する工程；（ｂ）安定なポリペプチド−標的複合体を生成するのに好適な条件下で遺伝子パッケージを標的と接触させる工程；および（ｃ）遺伝子パッケージにおいて安定なポリペプチド−標的複合体の形成を検出し、それによって特異的相互作用の存在を検出する工程を含む。方法はさらに、所望の性質を有するポリペプチドを提示する遺伝子パッケージを単離するか、または、遺伝子パッケージによって担持される、所望のポリペプチドをコードする配列部分の配列を決定する工程を含んでもよい。例示の遺伝子パッケージとしては、ウィルス（例えば、ファージ）、細胞、および胞子が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００１７】
（参照としての援用）
本明細書に言及される公刊物および特許出願は全て、各個別の公刊物または特許出願が、特異的および個別的に、参照により取り込まれると表示されるのと同程度に、全ての目的のために参照により本明細書に取り込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本明細書に言及される公刊物および特許出願は全て、各個別の公刊物または特許出願が、特異的および個別的に、参照により取り込まれると表示されるのと同程度に、全ての目的のために参照により本明細書に取り込まれる。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様が図示され、説明されるが、これらの実施態様は、ただ例として提供されるに過ぎないことは当業者には明白であろう。これから数多くの変種、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かぶことであろう。本発明を実行する際、本明細書に記載される、本発明の実施態様に対する様々な代替も採用が可能であることを理解しなければならない。
【００２０】
（一般技術）
本発明の実施は、別様に指示しないかぎり、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組み換えＤＮＡに関する、当業者の能力範囲内にある、通例技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，ら、，ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
【００２１】
（定義）
「タンパク」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは直鎖でも分枝鎖でもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、糖化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、他の任意の操作、例えば、標識化合物と接合されたアミノ酸ポリマーを含む。本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然および／または、非天然すなわち合成アミノ酸、例えば、グリシン、およびＤまたはＬの光学異性体、およびアミノ酸類縁体、およびペプチド様物質を含むアミノ酸を指す。タンパクは一つ以上のドメインを含んでもよい。
【００２２】
「ドメイン」という用語は、サイズにはよらず、単一の、安定な三次元構造体を指す。典型的ドメインの三次元構造体は、溶液において安定で、そのメンバードメインが単離されるか、他のドメインに共有的に融合されるかとは無関係に同じ状態を持続する。本明細書に定義されるドメインは、ベータ−シート、アルファヘリックス、および未構造化ループなどの二次構造要素によって形成される、特定の三次元構造体を有する。ミクロタンパク・ファミリーのドメインでは、ジスルフィド架橋が、一般に、三次構造を決定する一次要素である。ある例では、ドメインは、アビディティ（同じ標的に対する複数の結合部位）、多重特異性（異なる標的に対する複数の結合部位）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＩｇＧ（ｈＩｇＧ１、２、３、または４）、または赤血球に結合する（ドメイン、環状ペプチド、または直線状ペプチドによる）半減期などの、特定の機能的活性を付与することが可能なモジュールである。
【００２３】
「ループ」は、標的との相互作用のアフィニティーおよび特異性に寄与するシステイン間配列であり、そのアミノ酸組成もまた、タンパクの可溶性に影響を及ぼす。可溶性は、高濃度処方、例えば、経口、腸内、経皮、鼻腔内、肺内、血液脳関門、在宅注射で使用される処方、およびその他の投与ルートおよび方式にとって重要である。
【００２４】
「ミクロタンパク」という用語は、ＳＣＯＰデータベースにおける、ある分類を指す。ミクロタンパクは通常、一定の構造を持つ最小タンパクであり、通常、２個のジスルフィド持つ１５個ほどの小さなアミノ酸、または１０個を超えるジスルフィドを持つ最大２００個のアミノ酸を有するタンパクであるが、ただしそれらに限定されない。ミクロタンパクは、一つ以上のミクロタンパク・ドメインを含んでもよい。いくつかのミクロタンパク・ドメイン、またはドメイン・ファミリーは、様々なジスルフィド結合パターンによって与えられる、複数の幾分安定で、複数の幾分類似の構造を持つことが可能であり、そのため安定という用語は、ペプチド、および非ミクロタンパク・ドメインからミクロタンパクを区別するために相対的な意味で使用される。多くのミクロタンパク毒素は、単一ドメインから構成されるが、細胞表面の受容体ミクロタンパクは、多くの場合複数ドメインを有する。ミクロタンパクがそのように小型であることが可能なのは、それらのフォールド形成が、典型的な疎水性コアによって安定化されるのではなく、ジスルフィド結合および／またはイオン、例えば、カルシウム、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛、鉄、または様々な他の多価イオンによって安定化されるからである。
【００２５】
「スカフォールド」という用語は、タンパクライブラリーの構築において、保存された共通配列として使用される、最小のポリペプチド「枠組み」または「配列モチーフ」を指す。スカフォールドの固定された、または保存された残基／位置の間には、可変性および超可変性位置が存在する。固定されたスカフールド残基の間の可変領域には、きわめて多様なアミノ酸が供給され、標的分子に対する特異的結合を実現する。スカフォールドは、通常、１群の配列近縁タンパクを整列させたときに観察される保存残基によって定義される。固定された残基は、特に、その整列された複数のタンパクの機能がそれぞれ異なる場合、フォールド形成または構造にとって必要とされると考えられる。ミクロタンパク・スカフォールドの完全な記述には、システインの数、位置または間隔、および結合パターンの外、カルシウムなどのイオンに対する結合部位を含む、ループにおける任意の固定残基の位置およびその名称を含んでもよい。
【００２６】
「ミクロタンパク」のフォールドは、大抵ジスルフィド結合の連結パターン（すなわち、１−４、２−６、３−５）によって定義される。このパターンは、空間配置定数であり、一般に、例えば、還元・酸化（レドックス剤）によってジスルフィド連結の解除および回復することなしに別パターンに変換することはできない。一般に、近縁配列を有する天然タンパク同士は、同じジスルフィド結合パターンを取る。主要決定因子は、システイン距離パターン（ＣＤＰ）、および、いくつかの固定された非ｃｙｓ残基の外、もしあれば金属結合部位である。少数例では、タンパクのフォールド形成はまた、周囲の配列（すなわち、ペプチド前駆体）、および、ある場合には、該タンパクが、そのフォールド形成を助ける２価の金属イオン（すなわち、Ｃａ＋＋）に結合することを可能とする残基の誘導体の化学的形成（すなわち、ガンマ・カルボキシル化）によっても影響を受ける。大多数のミクロタンパクでは、そのようなフォールド形成支援は必要とされない。
【００２７】
しかしながら、同じ結合パターンを持つタンパクにおいて、ループの長さおよび組成における差が、そのタンパクにむしろ異なる構造を与えるほど十分に大きいために、複数のフォールドを含む場合がやはりある。一例が、コノトキシン、シクロトキシン、およびアナトドメイン・ファミリーである。これらは、同じＤＢＰを持つが、きわめて異なるＣＤＰを有するために、別々のフォールドと見なされる。タンパクフォールドの決定因子は、異なるフォールドに対し構造を大きく変える任意の属性であり、例えば、システインの数および結合パターン、システインの間隔、システイン間ループ（特に、フォールド形成に、または、カルシウム（または他の金属、または補因子）結合部位の位置または組成に必要と思われる固定されたループ残基）の配列モチーフの差である。
【００２８】
「ジルスルフィド結合パターン」または‘ＤＢＰ’という用語は、システインの連結パターンを指し、タンパクのＮ末端からＣ末端に向けて１−ｎという数字で表される。ジスルフド結合パターンは、空間配置的に一定であり、これは、このパターンが、１個以上のジスルフィドを、例えば、レドックス条件を用いて連結解除することによってのみ変えることが可能であることを意味する。可能な２−、３−、および４−ジスルフィド結合パターンを、下記の００４８−００７５パラグラフに掲げる。
【００２９】
「システイン距離パターン」または‘ＣＤＰ’という用語は、タンパク直鎖においてシステインを隔てる、非システインアミノ酸の数を指す。いくつかの表示法が使用される：Ｃ５Ｃ０Ｃ３Ｃは、Ｃ５ＣＣ３Ｃに等しく、ＣｘｘｘｘｘＣＣｘｘｘＣに等しい。
【００３０】
「位置ｎ６」または‘ｎ７＝４’という用語は、システイン間ループを指し、‘ｎ６’は、Ｃ６およびＣ７の間のループと定義され、‘ｎ７＝４’は、Ｃ７およびＣ８の間のループが、システインを勘定に入れずに４アミノ酸長であることを意味する。
【００３１】
「還元性フォールド解除」という用語は、還元剤（例えば、ジチオスレイトール）の存在下に、フォールドされていたタンパクのフォールドが解けることを含む。「酸化性フォールド再形成」という用語は、酸化剤の存在下に、完全にフォールドが解除された還元状態から、フォールド形成経路への再進入を含む。
【００３２】
「複合体」という用語は、平均して、直線状α鎖バックボーンにおいて多数のアミノ酸によって隔てられる複数のシステインに対し、複数のシステインがジスルフド結合される、システイン結合パターンを指す。「複合性」は、両ジスルフィド間の長さの、合計（累積）の、バックボーン直線距離として定量される。例えば、３−ジスルフィド空間配置における最大値は９（１−４  ２−５  ３−６＝３＋３＋３）であり、最小値は３（すなわち、１−２  ３−４  ５−６）である。複合性パターンは、より低い複合性パターンと比べると、長さの多様性のためにより多くの異なるフォールドを提供するが、出現頻度はより低くなるようである。例えば、天然配列ファミリーで、もっとも剛性の高い構造体の最大数は、パターン１−４  ２−５  ３−６、１−６  ２−４  ３−５、１−５  ２−４  ３−６、および１−４  ２−６  ３−５において観察される。これらは全て、複合性最大のパターンであり（３ＳＳタンパクの３−９スケールにおいて複合性スコア９）、これは、より複合性の高い空間配置の方が、より多くの異なるシステイン間隔を、すなわち、より多くのフォールドを形成することが可能であるようであることを示す。したがって、単純なジスルフィド結合パターン（例えば、１−２  ３−４  ５−６）の頻度を除去または低減することによって、各ジスルフィド結合パターンにおいて形成される平均フォールド数が増す（すなわち、コノトキシン対シクロチド対アナトのように、大きく異なるｃｙｓ−間隔となる）ことが期待される。単純結合パターンの大部分を除去する簡単な方法は、約９アミノ酸長未満のループ長を用いることである。なぜなら、天然タンパクでは、ジスルフィド連結される、ｃｙｓ残基間の最小距離（「スパン」と呼ばれる）は、一般に約９アミノ酸長だからである。２ＳＳタンパクの複合性は、２−４、４ＳＳタンパクでは４−１６、５ＳＳタンパクでは、５−２５の範囲を有する。
【００３３】
ジスルフィド結合の「スパン」という用語は、システイン自身を排除した、連結システイン間のアミノ酸距離を指す。平均スパンは、下記の表１に示すように、１０−１４ＡＡであるが、約１２であることが好ましい。１１−１４ａａの倍数が最大となるようにシステイン間隔を設けると、それは、近接ジスルフィド（隣接システイン間に形成される）を除去し、約１２アミノ酸（その他１８、２４など）のスパンを有するシステイン残基の、多数の組み合わせを実現することになるので、構造的多様性を強化するために使用することが可能である。一例は、ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６Ｃ（‘３Ｘ６’）、ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６ＣＸ６Ｃ（‘４Ｘ６’）、ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５Ｃ（‘３Ｘ５’）、ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５ＣＸ５Ｃ（‘４Ｘ５’）、または５−６、４−７、または３−８アミノ酸の範囲を持つループの組み合わせを有する類似のモチーフと考えられる。ＣＸ６ＣおよびＣＸ５Ｃは、一般に、この二つの隣接システイン同士を結合させるには短すぎ（最小スパンは通常約９アミノ酸である）、時に「サブドメイン」または「ミクロ・ドメイン」と呼ばれることもあるが、一般に完全なドメインとは見なされない、環状ペプチド構造の形成を阻止する。いくつかの例示のジスルフィドスパンを下表に示す。
【００３４】
表１．ジスルフィドスパン
【００３５】
【化３】
2009509535.tif 000002
「システイン富裕反復タンパク（‘ＣＲＲＰ’）」という用語は、通常、ただしそれに限定されないが、単一ポリペプチド鎖を有し、約１％を超える、好ましくは約５％、あるいは場合によっては１０％を超えるシステイン含量を持つ、ある特定の保存アミノ酸配列（「反復パターン」または「反復モチーフ」）から成る「反復単位」（また、「モジュール」、「反復列」、または「建設ブロック」とも呼ばれる）を含むタンパクを指す。このファミリーは、アンキリン・ファミリーを含むロイシン富裕反復タンパクとは配列上無関係である。ＣＲＲＰ単位は互いに相互作用を持ち、他のドメインとは独立して折りたたまる一つの大きなドメインを形成する。反復単位を加える、または欠失することによってＣＲＲＰのサイズを調整することが可能である。好ましい反復タンパクとしては、無関係配列によって隔てられる単一反復列とは一般に区別が可能な、同じモチーフからなる頭−尾反復列が挙げられるが、ただしこれに限定されない。
【００３６】
本明細書で用いる「製薬学的に受容可能な担体」という用語は、標準的製薬学的担体の内の任意のもの、例えば、リン酸バッファー生食液、水、乳剤、例えば、油／水、または水／油乳剤、および各種の湿潤剤が挙げられる。組成物はさらに、安定剤および防腐剤を含むことも可能である。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照されたい。
【００３７】
「製薬組成物」とは、活性剤と、不活性であるか活性であるかを問わない、担体との組み合わせを含み、それによって、インビトロ、インビボ、または体外での診断または治療用途に好適な組成物が形成されることが意図される。
【００３８】
核酸またはタンパクに適用される場合の、「非天然性」という用語は、天然には認められない核酸またはタンパクを指す。非天然性核酸およびタンパクの例としては、組み換えによって修飾されるものが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００３９】
（システイン含有タンパクおよびタンパクライブラリーの設計）
以下に詳述するように、本発明の一局面は、広範な構造的多様性を有するタンパクライブラリーであって、それから、治療、予防、獣医学、診断、試薬、または材料用途を含む多様な用途、ただしこれらに限定されないが、のために所望の性質を有する結合タンパクを選択し、進化させることが可能なタンパクライブラリーを創製することである。
【００４０】
一実施態様では、本発明は、好ましくは空間配置的に異なる、少なくとも２、３、４、５、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００以上の異なる構造を有する、システイン含有タンパクライブラリーを提供する。ある実施態様では、システイン含有タンパクライブラリーは、高ジスルフィド密度（ＨＤＤ）タンパクを含む。ＨＤＤファミリーのタンパクは、通常、５−５０％（５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％）のシステイン残基を有し、各ドメインは、通常、少なくとも二つのジスルフィド、および、任意に、補因子、例えば、カルシウムまたは別のイオンを含む。
【００４１】
ＨＤＤスカフォールドの存在によって、これらのタンパクは、小型ではあるが、比較的剛強な構造を取ることが可能となる。剛性は、高い結合アフィニティー、抗原処理に関与するプロテアーゼ（プロテアーゼの分類については下記参照）を含むプロテアーゼおよび熱に対する耐性の実現に重要であり、したがって、そのタンパクの低い、または非免疫原性に寄与する。ジスルフィド枠組みによって、タンパクは、疎水性コアと呼ばれる、多くのタンパク内部における多数の疎水性側鎖の相互作用を要することなく、折りたたまれる。非ＨＤＤスカフォールドは全て、特異性またはフォールド形成においてしばしば問題の原因となる疎水性コアを有する。ＨＤＤタンパクは、非ＨＤＤタンパクよりも親水性であり、このため結合特異性が改善される。小さいサイズも、速やかな組織浸透には有利であり、かつ、経口、鼻腔内、腸内、肺内、血液脳関門などの代替輸送においても有利である。さらに、小さなサイズは、免疫原性を下げるのにも役立つ。ジスルフィドの数を増すか、または、同数のジスルフィドを持つが、少ない数のアミノ酸を有するドメインを用いることによって、より高いジスルフィド密度を実現することが可能である。さらに、非システイン固定残基の数を減らし、より高いパーセンテージのアミノ酸を、標的結合に利用可能となるようにすることが望ましい。
【００４２】
ジスルフィド枠組みによって、システイン間ループにおける各ファミリーの極端な配列多様性が可能になる。ファミリー間には、ループ長およびシステイン間隔において膨大なばらつきが存在する。ジスルフィド結合形成の組み合わせの性質により、ジスルフィド枠組みにより、多数の異なる結合パターンおよび異なる構造の形成が可能となり、かつ、フォールド形成は異種的であってもよいため、指向的進化によって構造および配列を最適化するための、ゆっくりと進行する進化経路が存在する。特に、ＨＤＤタンパクは、単一配列が、複数の異なる安定フォールドを取ることを可能とする独特の能力を有することが予想される。
【００４３】
広範なジスルフィド結合パターンを生成するために、種々のジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）を有する種々の異性形に有利に作用する、ある一定範囲の異なる条件下に、ライブラリーを置くことも可能である。例えば、種々のＤＢＰの形成を実現するために、還元剤と酸化剤の相対的濃度および強度によって決定される、溶媒のレドックス電位を利用することも可能である。還元性溶媒を創製するために、各種の還元剤、例えば、２−メルカプトエタノール（ベータ−メルカプトエタノール、ＢＭＥ）、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィン）、水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、還元形）、グルタチオンの還元形（ＧＳＨ）、およびシステインの還元形を含む還元剤を、ただしこれらに限定されないが、使用することが可能である。酸化性溶媒を創製するには、各種の酸化剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、酸化形）、過酸化水素、グルタチオン（酸化形、ＧＳＳＧ）、銅フェナントロリン（酸化形）、酸素（空気）、微量金属、およびシステインの酸化形（シスチン）を含む酸化剤を、ただしこれらに限定されないが、使用することが可能である。
【００４４】
特に有用なのは、多様なジスルフィド結合パターンの探索を可能とし、時間と共に安定形の集積を可能とするほど十分急速に、タンパクがジスルフィドを繰り返し形成・破壊することを可能とするレドックス試薬の混合物および勾配である。安定性ではなく、ＤＢＰの最大多様性を望む場合、混合物が平衡に達するのを阻止してもよい。多様な構造（完全に還元された、高温）に好都合な条件は、突然、高度に酸化性の、低温条件に変えて、構造体が、もっとも安定なＤＢＰを見出すことができないほどの時間で形成されるようにする。構造多様性を創出するもう一つの方法は、多様な条件、例えば、種々の薬品（すなわち、遠くに位置するシステインとの遅い／困難なジスルフィド結合を加速する、ポリエチレングリコールのような容積排除剤）、種々の溶媒（極性、非極性、アルコール）、種々の金属イオン（Ｃａ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、その他）、または様々のｐＨ（ｐＨ１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２）などの条件下でゆっくりとジスルフィドを形成することである。この各種条件は、同じタンパク配列に多様な別形フォールドを取らせるために、単独で、または任意の組み合わせで使用することが可能である。
【００４５】
ジスルフィドの形成、および／または、補因子の存在は、還元剤または酸化剤の供給、または補因子の添加によって簡単に調節することが可能である。
【００４６】
あるタンパクが、折りたたまれて複数の別形の安定構造に変わることができる能力は、通常、該タンパク内部の結合相互作用の数と強度の外に、利用可能なフォールド形成経路（単数または複数）の性質に依存する。ジスルフィドの不在下では、安定な折りたたみタンパクを得るためには、通常、多数の弱い側鎖接触（塩橋、ファンデルワールス接触、疎水性相互作用など）が要求される。したがって、異なる、別様の安定フォールドの形成、または、標的への結合を指令するためには、多くの残基の修飾が必要とされる。一方、タンパクに安定構造を与えるには、僅かに数個の（例えば、２または３個）ジスルフィド結合で十分であり、他のアミノ酸の位置（通常、約６５−８０％）は全て、所望の標的（コノトキシンでは８０％を超え、このもっとも極端な例である）のための結合表面の創出のために利用することが可能である。したがって、ジスルフィドは、構造に対する低い情報含量対処法（すなわち、ランダム配列では、高い出現頻度を持つ）であり、アミノ酸の最大分画を、結合およびその他の各種機能のために利用可能とする。
【００４７】
大型の、非ジスルフィド含有タンパクのフォールド形成経路および安定性は、大きな割合の残基部分が多少なりとも固定されるように、多数のアミノ酸側鎖相互作用を必要とする。そのため、タンパクが配列を適応させる能力が大きく低下する。この状況は、通常、比較的大型のスカフォールド・タンパク、例えば、免疫グロブリン、フィブロネクチン、およびリポカリンなどのタンパクに起こるが、これらのタンパクでは、通常、ミスフォールド形成を起こさないようにすると、少数のＣＤＲ様ループのみがランダム化されるだけにすぎない。しかも、疎水性コアを含む、これらのタンパクでは、ミスフォールド形成は、一般に非可逆的なタンパク凝集を意味する。数回の突然変異によって導入される単一ジスルフィド架橋は、多数のアミノ酸残基の構造的機能を引き受け、それらの配列を解放して、異なる目的、例えば、所望のタンパク標的に対する結合に向かって進化するように仕向ける。非ＨＤＤタンパクの場合でも、ジスルフィドを徐々に付加することは、そのタンパクが、複合性の増大に向かって進化し続けるためのもっとも重要な鍵となる場合がある。システイン（Ｃ）は、２０種の生物学的アミノ酸レパートリーに、後から付け加えられたように見えるが、システインの頻度は、タンパク進化中に徐々に上昇することが示された。
【００４８】
さらに、ジスルフィド介在性フォールド形成によって、タンパクはより親水性になる（なぜなら、ジスルフィドは、疎水性コアを置換する）ので、このようなタンパクのミスフォールド形成は、一般に非可逆的凝集をもたらすことはなく、タンパクは可溶状態を持続し、最終的に再生が可能となる。
【００４９】
ジスルフィド固有の特徴は、同じ一組のシステインが、原理的には、様々の別形のジスルフィド結合パターンとして連結することが可能であることである。なぜなら、ジスルフィドは組み合わせだからである。例えば、二つのジスルフィドタンパクは、３通りの異なるジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）を有し、三つのジスルフィドタンパクは、１５通りの異なるＤＢＰを有し、かつ、四つのジスルフィドタンパクは、最大１０５通りの異なるＤＢＰを有することが可能である。２ＳＳ  ＤＢＰの全て、３ＳＳ  ＤＢＰの大部分、および４ＳＳ  ＤＢＰの半分未満において天然例が存在する。一局面において、ジスルフィド結合パターンの全数は、式：Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．に従って計算することが可能である。式中、ｎ＝システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数であり、かつ、式中、Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．は、（２ｉ−１）の積を表す。この式においてｉは、１からｎまでの範囲の正の整数である。
【００５０】
したがって、一実施態様では、標的分子に対して結合特異性を示す、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドを提供する。この実施態様において、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドは、式：Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．によって表される組み合わせの群から選ばれるパターンによるスカフォールド内システインを含む。式中、ｎは、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数に等しく、かつ、式中、Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．は、（２ｉ−１）の積を表し、この式においてｉは、１からｎまでの範囲の正の整数である。一局面において、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−２，３−４、Ｃ１−３，２−４、およびＣ１−４，２−３から成る群から選ばれるパターンに従って、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成される二つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。別の局面では、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−２，３−４，５−６、Ｃ１−２，３−５、４−６、Ｃ１−２，３−６，４−５、Ｃ１−３，２−４、５−６、Ｃ１−３，２−５，４−６、Ｃ１−３，２−６、４−５、Ｃ１−４，２−３，５−６、Ｃ１−４，２−６、３−５、Ｃ１−５，２−３，４−６、Ｃ１−５，２−４、３−６、Ｃ１−５，２−６，３−４、Ｃ１−６，２−３、４−５、およびＣ１−６，２−５、３−４から成る群から選ばれるパターンに従って、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成される三つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。別の局面において、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、前述の式によって定義される組み合わせの群から選ばれるパターンに従って、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成される、少なくとも四つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む、標的分子に対して結合特異性を示すポリペプチド、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクを含む。さらに別の局面では、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−９、Ｃ１−１０、Ｃ２−９、Ｃ２−１０、Ｃ３−９、Ｃ３−１０、Ｃ４−９、Ｃ４−１０、Ｃ５−９、Ｃ５−１０、Ｃ６−９、Ｃ６−１０、Ｃ７−９、Ｃ７−１０、Ｃ８−９、Ｃ８−１０、およびＣ９−１０から成る群から選ばれるパターンに従って、タンパク内のシステインを対合させることによって形成される、少なくとも五つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。さらに別の局面では、標���分子に対し結合特異性を示す、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−１１、Ｃ１−１２、Ｃ２−１１、Ｃ２−１２、Ｃ３−１１、Ｃ３−１２、Ｃ４−１１、Ｃ４−１２、Ｃ５−１１、Ｃ５−１２、Ｃ６−１１、Ｃ６−１２、Ｃ７−１１、Ｃ７−１２、Ｃ８−１１、Ｃ８−１２、およびＣ９−１１、Ｃ９−１２、Ｃ１０−１１、Ｃ１０−１２、およびＣ１１−１２から成る群から選ばれるパターンに従って、タンパク内のシステインを対合させることによって形成される、少なくとも六つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。
【００５１】
通常、全てのシステインが、同じドメイン中の他のシステインに対するジスルフィド結合に与る。二つのジスルフィド（２ＳＳ）を有するミクロタンパクは、空間配置的に異なる（すなわち、単純な回転によっては相互変換されない）三つのジスルフィド結合パターン：１−２  ３−４、１−３  ２−４、または１−４  ２−３、これらはそれぞれ異なるアルファ鎖バックボーン構造を有する、を取ることが可能である。
【００５２】
同様に、三つのジスルフィドを有するミクロタンパクは、最大１５通りの異なるジスルフィド結合パターンを持つことが可能であり、四つのジスルフィドを有するミクロタンパクは、最大１０５通りのジスルフィド結合パターンを持つことが可能であり、五つのジスルフィドを有するミクロタンパクは、最大９４５通りの結合パターンを持つことが可能であり、六つのジスルフィドを有するミクロタンパクは、最大１０，３９５通りのジスルフィド結合パターンを持つことが可能であり、七つのジスルフィドを有するタンパクは、最大１３５，１３５通りの異なる結合パターンを持つことが可能であり、さらに大きなジスルフィド数についても以下同様である（掛け数は、３、５、７、９、１１、１３倍）。下記は、二つ、三つ、または四つのジスルフィド結合を有するタンパクにおけるジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）を掲げる。
【００５３】
２ＳＳタンパクにおける３通りのＤＢＰパターンは：
１−２  ３−４、１−３  ２−４、１−４  ２−３
３ＳＳタンパクにおける１５通りのＤＢＰパターンは：
【００５４】
【化４】
2009509535.tif 000003
４ＳＳタンパクにおける１０５通りのＤＢＰは：
【００５５】
【化５】
2009509535.tif 000004
【００５６】
【化６】
2009509535.tif 000005
大型で、システイン少数タンパクは、広範な二次、三次構造、または場合によっては四次構造を必要とし、別形ジスルフィド結合パターンによって仲介される別形フォールドの形成を阻止する。ミクロタンパクでは、ジスルフィド誘発構造以外の二次または三次構造は、ほとんど、または全く無く、システイン間のループ配列（一次構造）は、アミノ酸組成において例外的に変動性が高い。したがって、他のタンパクに比べ、ミクロタンパクは、様々の異なる結合パターンを取ることが可能な配列弾力性を持つ可能性がはるかに高い。
【００５７】
少数のシステインは、多様な、完全に異なる空間配置構造を提供することが可能であるが、これは、ジスルフィドを破ることなしには相互変換が不可能であることを意味する。これらの構造は、通常、ループに対しては全く、またはごく僅かしか要求を課すことなく実現されるので、結合特異性、および特異的標的に対するアフィニティーの創出について、ループ配列を思いのままに利用することが可能である。ある特異的タンパク配列は、あるフォールドに対しては、別のフォールドよりもはっきりした好みを示すようであり、あるフォールドを全く取ることができない場合がある。天然のミクロタンパクのファミリーの配列モチーフから、システイン間隔はＤＢＰに寄与するが、非−ｃｙｓのループ残基からの寄与はごく僅かであるようである。高ジスルフィド密度タンパクにおけるシステイン間ループの平均長は、多くの好ましいスカフォールドでは約０から約１０の範囲であり、大部分のスカフォールドでは約３から約１５アミノ酸である。これは、あるスカフォールドでは約５０％、２５％−２０％（もっとも好ましい）、１５％−１０％（少し好ましくない）、または場合によって５％の範囲の、高密度のシステインを提供する。これらはいずれも、僅か０．８％という平均的タンパクにおけるシステインの密度よりもはるかに高い。要すれば、システイン同士をごく緊密に近づくように加工して、ジスルフィドを効率的、適正に形成することも可能である。効率的結合形成によって、もっとも弱い結合の破壊および新規結合の再生を多数サイクル繰り返すことが可能となり、それによって、もっとも安定に結合されるタンパクが次第に得られる。大型タンパクではシステインが低密度であることが、ジスルフィドの非効率的で、したがって不適正となり易い形成に寄与するようである。
【００５８】
種々のジスルフィド結合パターンは、温度およびプロテアーゼに対するその安定性において異なることが予想される。したがって、本発明は、（ａ）標的分子に結合することが可能であり、（ｂ）スカフォールド内システインを対合させることによって形成される少なくとも二つのジスルフィド結合を有し、（ｃ）約５０℃よりも高い温度、好ましくは約８０℃よりも高い温度、場合によっては約１００℃よりも高い温度で、０．０１秒から１０秒までの範囲の任意の期間加熱された後も標的結合性を発揮する、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドを提供する。要すれば、この非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドは、スカフォールド内システインを対合させることによって形成される、少なくとも、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十、十一、十二、またはそれ以上のジスルフィド結合を含むように設計されてもよい。
【００５９】
より高度に架橋される（例えば、高い複合数を有する）タンパクの方が、「サブドメイン」を形成し、一つ以上のジスルフィドを含むが、タンパクの他の部分に対して自由に回転することが可能なタンパクよりも安定であることが予想される。より高い安定性は、直線状ペプチドの上に引かれたジスルフィドの（累積）長さ、および、直線状ペプチド配列を用いたＤＢＰダイアグラムにおいてジスルフィドが互いに交わる回数と相関する。しかしながら、種々のジスルフィド結合パターンは、様々な収率で形成され、架橋数の最大ものの抽出が最小となることが予想される。システイン同士の近傍性がジスルフィド形成の駆動実体である限り、近接システイン同士の間に形成されるジスルフィドは、出現する確率がもっとも高いが、同時に安定性の視点からはもっとも好ましくない、なぜなら、そのようなジスルフィドは、ミクロ、またはサブドメインを形成するからである。
【００６０】
したがって、ある実施態様では、本発明は、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクを有するライブラリーを提供する。これらのタンパクにおいては、それぞれが、３５未満のアミノ酸を含み、そのポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも１０％がシステインであり、少なくとも二つのジスルフィド結合が、スカフォールド内システインを対合させることによって形成され、かつ、この対合が、３を超える複合指数を生成する。他の、いくつかの実施態様では、本発明は、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクを有するライブラリーを提供する。これらのタンパクにおいては、それぞれが、約６０未満のアミノ酸を含み、そのポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも１０％がシステインであり、少なくとも四つのジスルフィド結合が、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成され、かつ、前記対合が、４、６、または１０を超える複合指数を生成する。
【００６１】
ある局面では、主題のミクロタンパクは、任意の標的に対しピコモル活性を発揮し、加熱（場合によっては沸騰）およびプロテアーゼに対し高い耐性を持っていてもよい。別の局面では、主題のミクロタンパクは、高度の親水性傾向を持ち、ドメイン当たり二つの異なる結合面（二面性）を持つ傾向を有していてもよい。
【００６２】
各ジスルフィド結合パターンは、理論上は、システインの、広範な各種間隔と適合するが、あるシステイン間隔パターンは、ある特異的結合パターンに対し、別のシステイン間隔パターンよりも適合する。天然配列では、各ジスルフィド結合パターンと関連して、複数の優勢システイン間隔パターンがある。例えば、コノトキシン、シクロチド、およびアナト・ファミリー（異なるフォールドと考えられる）は、大きく異なるシステイン間隔を有するが、ジスルフィド結合パターンは同じである。したがって、ジスルフィド結合パターンの頻度分布を主に決定するものはシステインの間隔であり、ＣＤＰの設計が、ＤＢＰおよび構造を調節し、その進化を方向づける実際的方法である。システインの間隔は、システイン間ループの長さを決定し、かつ、そのタンパクの「フォールド」を大きく決定する。同じ配列ファミリーに属するタンパク同士は、高度に保存されるアミノ酸位置、およびそれらの優勢間隔の全てから構成される、同じスカフォールド配列、またはスカフォールドモチーフを共有するので、これらは、通常、同じ「フォールド」を持つと考えられる。
【００６３】
主題ミクロタンパクは、モノマー、ダイマー、トリマー、またはより高次のマルチマーであってもよい。複数ドメイン・ミクロタンパクは、ホモマルチマーであってもよいし、あるいは、ヘテロマルチマーであってもよい。すなわち、ドメイン同士が、ジスルフィド数、ジスルフィド結合パターン、構造、フォールド、配列、またはスカフォールドにおいて異なるマルチマーであってもよい。主題ミクロタンパクは、種々の異なる構造体、例えば、種々の異なる長さ、アミノ酸組成および機能を持つペプチド（直線状、または環状）を含む構造体に融合させることも可能である。各ドメインは、天然の毒素と同じ、または異なる、種々の標的に対し、一つ以上の結合面（二面性）を持つことが可能である。
【００６４】
本発明はさらに、一つ以上のドメイン、および任意に一つ以上の（環状または直線状）ペプチドを含む単一タンパク鎖を有する非天然ミクロタンパクを提供する。一般に、各ドメインは、別々に折たたまり、機能する。ミクロタンパク・ドメインは、該ドメインのサイズ、その温度に対する安定性、および、大腸菌におけるその発現レベル（したがって、商品のコスト）の大部分を決定する高ジスルフィド密度「スカフォールド」を有する。このスカフォールドはさらに、該タンパクの免疫原性の決定に重要な役割を果たすことが予想される。スカフォールドは、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、またはそれ以上のシステインを含み、これらのシステインは、同じドメイン内に２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のジスルフィド結合を形成する。
【００６５】
複数の性質において改善を示す、好ましい特異的３−ジスルフィドスカフォールドの内のいくつかは、コノトキシン（２９ａａ合計、７ａａ固定化、Ｃａ−部位無し、１−４  ２−５  ３−６ジスルフィド結合パターンによる剛性構造）、シクロチド（２４ａａ合計、１０ａａ固定、Ｃａ−部位無し、剛強な１−４  ２−５  ３−６構造）、アナト・スカフォールド（３７ａａ合計、１０ａａ固定、Ｃａ−部位無し、剛強な１−４  ２−５  ３−６ジスルフィド結合パターン）、デフェンシンＩスカフォールド（２９ａａ、１０ａａ固定、Ｃａ−部位無し、剛強な１−６  ２−４  ３−５結合パターン）、トキシン２スカフォールド（２９ａａ合計、１０ａａ固定、Ｃａ−部位無し、剛強な１−４  ２−６  ３−５ジスルフィド結合スカフォールド）であるが、他にも、既存、および新規の、広範なスカフォールドが特異的利点を提供する。他の好ましいスカフォールドとして、１７３メンバーを擁するＰｆａｍファミリーＰＦ００７３４で、１−３  ２−４連結の４システイン、Ｃ１０Ｃ５Ｃ９ＣのＣＤＰを有する２６ＡＡ長（第１から最終Ｃｙｓまで）である、セルロース結合ドメイン（ＣＢ，ＣＥＢ）；２５メンバーを擁するＰＦ００４５１ファミリーで、１５ＡＡ長、１−３  ２−４連結の４システイン、Ｃ０Ｃ４ＣＣのＣＤＰを有する、アルファ−コノトキシン（ＡＣ）；６８メンバーを擁するＰＦ００４５１ファミリーで、１−３  ２−５  ３−６連結の６システイン、Ｃ５Ｃ３Ｃ１０Ｃ４Ｃ１ＣのＣＤＰを有する２８ＡＡ長、オメガ−トキシン様（ＯＴ）；３９メンバーを擁するＰＦ０５３７５ファミリーで、２９ＡＡ長、１−４  ２−６  ３−５連結の６システイン、Ｃ９Ｃ２Ｃ１Ｃ８Ｃ４ＣのＣＤＰを有する、パシファスチン（ＰＣ）；３５メンバーを擁するＰＦ００２９９ファミリーで、２６ＡＡ長、１−４  ２−５  ３−６連結の６システイン、Ｃ６Ｃ５Ｃ３Ｃ１Ｃ６ＣのＣＤＰを有する、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＰ）；１７５メンバーを擁するＰＦ０００６６ファミリーで、３３ＡＡ長、１−５  ２−４  ３−６連結の６システイン、Ｃ７Ｃ８Ｃ３Ｃ４Ｃ６ＣのＣＤＰを有する、ノッチ（ＮＯ）；１２６メンバーを擁するＰＦ０００８８ファミリーで、３９ＡＡ長、１−５  ２−４  ３−６連結の６システイン、Ｃ１０Ｃ１０Ｃ４Ｃ０Ｃ１０ＣのＣＤＰを有する、トレフォイル（ＴＲ）；１２３メンバーを擁するＰＦ０１８２１ファミリーで、４２ＡＡ長、１−２  ３−５  ４−６連結の６システイン、Ｃ１４Ｃ２Ｃ２Ｃ１１Ｃ７ＣのＣＤＰを有する、ＴＮＦ−受容体様（ＴＮ）；１２３メンバーを擁するＰＦ０１８２１ファミリーで、４２ＡＡ長、１−２  ３−５  ４−６連結の６システイン、Ｃ１４Ｃ２Ｃ２Ｃ１１Ｃ７ＣのＣＤＰを有する、ＴＮＦ−受容体様（ＴＮ）；１２３メンバーを擁するＰＦ０１８２１ファミリーで、３７ＡＡ長、１−４  ２−５  ３−６連結の６システイン、Ｃ５Ｃ２Ｃ８Ｃ２Ｃ５Ｃ１ＣのＣＤＰを有する、アナフィロトキシン様（ＡＴ）；４１０メンバーを擁するＰＦ０１４３７ファミリーで、６１ＡＡ長、１−４  ２−８  ３−６  ４−７連結の８システイン、Ｃ５Ｃ２Ｃ８Ｃ２Ｃ５Ｃ１２Ｃ１９ＣのＣＤＰを有する、プレキシン（ＰＬ）がある。他の好ましいスカフォールドとして、５���ＡＡ長（第１から最終Ｃｙｓまで）で、１−３  ２−４  ５−６  ７−８連結の８システイン、Ｃ１３Ｃ６Ｃ１６Ｃ１Ｃ１０Ｃ０Ｃ４ＣのＣＤＰを有する、三指トキシン（ＰＬ）；３５ＡＡ長で、１−２  ３−４  ５−６  ７−８連結（交互連結ＤＢＰは既知であることに注意）の８システイン、Ｃ３Ｃ９Ｃ１Ｃ３Ｃ５Ｃ０Ｃ６ＣのＣＤＰを有する、ソマトメジン；４７ＡＡ長で、８システイン、Ｃ３Ｃ８Ｃ１１Ｃ２Ｃ０Ｃ５Ｃ１０ＣのＣＤＰを有する、じゃがいもプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）；３７ＡＡ長で、１−４  ２−５  ３−６  ７−８連結の８システイン、Ｃ５Ｃ２Ｃ８Ｃ２Ｃ５Ｃ１２Ｃ１９ＣのＣＤＰを有する、キチンビンジンドメイン（ＣＨＢ）；３４ＡＡ長で、６システイン、Ｃ６Ｃ６Ｃ０Ｃ４Ｃ６ＣのＣＤＰを有する、蜘蛛トキシン（ＳＴ）；３４ＡＡ長で、６システイン、Ｃ６Ｃ５Ｃ０Ｃ３Ｃ８ＣのＣＤＰを有する、トキシンＢ（ＴＢ）；２６ＡＡ長で、１−３  ２−４連結の４システイン、Ｃ１０Ｃ５Ｃ９ＣのＣＤＰを有する、セルロース結合ドメイン（ＣＥＢ）；１５ＡＡ長で、１−３  ２−４連結の４システイン、Ｃ０Ｃ４Ｃ８ＣのＣＤＰを有する、アルファ−コノトキシン（ＡＣ）がある。
【００６６】
主題の非天然ミクロタンパクは、天然のタンパク配列に基づいて設計されてもよい。例えば、本明細書に含まれる多くの天然タンパクまたはドメインは、スカフォールドタンパクとして使用するのに魅力的な特徴を有する。
【００６７】
【化７】
2009509535.tif 000006
【００６８】
【化８】
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【００６９】
【化９】
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【００７０】
【化１０】
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プロテアーゼ耐性ミクロタンパクの設計は、免疫原性を最小化するという観点から重要である。天然の、多くのミクロタンパクは、プロテアーゼ阻害剤である。Ｒａｏ，Ｍ．Ｂ．ら、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６２（３）：５９７−６３５を参照されたい。生化学および分子生物学国際単位命名委員会によれば、プロテアーゼは、グループ３のサブグループ４（ヒドロラーゼ）に分類される。しかしながら、プロテアーゼは、その作用および構造の巨大な多様性のために、酵素命名の一般的システムには簡単に馴染まない。現在、プロテアーゼは、下記の三つの主要基準に基づいて分類される。（ｉ）触媒される反応のタイプ、（ｉｉ）触媒部位の化学的性質、および（ｉｉｉ）構造を基準とする進化的関係である。
【００７１】
プロテアーゼは、その作用部位に応じて、大きく二つの主要グループ、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼに分割される。エキソペプチダーゼは、基質のアミノまたはカルボキシ末端に近いペプチド結合を切断するが、一方、エンドペプチダーゼは、基質の末端から遠いペプチド結合を切断する。活性部位に存在する官能基に基づいて、プロテアーゼはさらに、四つの主要グループに分類される。すなわち、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼである。この標準的分類に正確に合致しない雑多なプロテアーゼが少数ある。例えば、活性にＡＴＰを必要とするＡＴＰ依存性プロテアーゼがそれである。プロテアーゼは、そのアミノ酸配列に基づいて、種々のファミリーに分類され、さらに、共通の祖先から別れた、数組のペプチドを入れるために「クラン」に分類される。ペプチダーゼの各ファミリーには、触媒タイプを示すコード文字が割り当てられる。すなわち、セリン、システイン、アスパラギン酸、メタロ、または未知のタイプには、それぞれ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｍ、またはＵが割り当てられる。
【００７２】
エキソペプチダーゼ：エキソペプチダーゼは、ポリペプチド鎖の末端近くにおいてのみ作用する。それらの、ＮまたはＣ末端における作用部位に基づいて、それぞれ、アミノ−、およびカルボキシペプチダーゼに分類される。
【００７３】
アミノペプチダーゼ：アミノペプチダーゼは、ポリペプチドの遊離Ｎ末端に作用し、単一アミノ酸残基、ジペプチド、またはトリペプチドを開放する。
【００７４】
カルボキシペプチダーゼ：カルボキシペプチダーゼは、ポリペプチドのＣ末端に作用し、単一アミノ酸、またはジペプチドを開放する。カルボキシペプチダーゼは、酵素の活性部位におけるアミノ酸残基の性質に基づいて、三つの主要グループ、セリン・カルボキシペプチダーゼ、メタロ・カルボキシペプチダーゼ、およびシステイン・カルボキシペプチダーゼに分けられる。
【００７５】
エンドペプチダーゼ：エンドペプチダーゼは、ＮおよびＣ末端から離れた、ポリペプチド鎖の内部領域のペプチド結合に対し好んで作用を及ぼすという特徴を持つ。アミノ基またはカルボキシル基の存在は、酵素活性に対し否定的影響を及ぼす。エンドペプチダーゼは、その触媒機序に基づいて四つのサブグループに分けられる。すなわち、（ｉ）セリンプロテアーゼ、（ｉｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、（ｉｉｉ）システインプロテアーゼ、（ｉｖ）メタロプロテアーゼである。
【００７６】
ヒトのプロテアーゼ：カテプシンＢ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｘ／Ｚ／Ｐ、および１は、パパイン・ファミリーのシステインプロテアーゼである。カテプシンＬおよびカテプシンＳは、抗原提示細胞において抗原処理に関与することが知られている。カテプシンＣは、別にＤＰＰＩ（ジペプチジル−ペプチダーゼＩ）とも呼ばれる。カテプシンＡは、セリンカルボキシペプチダーゼであり、カテプシンＤおよびＥは、アスパラギン酸プロテアーゼである。カテプシンは、リソソーム・プロテアーゼとして、タンパク分解において重要な役割を演じる。カテプシンは、ヒトおよび動物の腫瘍において再分布が行われるか、あるいはレベルの上昇があるので、侵入および転移においても役割を演じている可能性がある。カテプシンは、不活性な酵素前駆体として合成され、処理されて、成熟した、活性を有する酵素となる。シスタチン、およびいくつかのセルピンなどの内因性タンパク阻害剤は、活性酵素を抑制する。他のカテプシンは、カテプシンＧ、Ｄ、およびＥである。
【００７７】
それに対して耐性を持つようにタンパク剤を加工することが可能な、他のヒト・プロテアーゼとしては、トリプターゼ、キマーゼ、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、アジプシン／因子Ｄ、カリクライン、ヒトタンパク分解酵素３（Ｓｉｇｍａ）、トロンビンがある。
【００７８】
さらに、主題のミクロタンパクの設計に天然のＨＤＤタンパクを用いてもよい。天然のＨＤＤタンパクとしては、動物細胞表面受容体タンパクの数多くのファミリーの外に、防衛的（すなわち、嚥下吸収された）および攻撃的（注入可能な）動物トキシン、例えば、蛇、蜘蛛、さそり、腹足類、およびアネモネの有毒タンパクが挙げられる。これらのタンパククラスの共通項は、それらが、宿主−環境／病原体境界面に存在することである。上記、および、本明細書に記載される、他の、任意のタンパクは、本発明の、非天然システインスカフォールドを生成するのに使用することが可能な例示のスカフォールドとして役立つ。
【００７９】
特に興味あるのは、この境界部（宿主および病原体の両方）には、その配列を急速に適応させることを可能とする特殊な分子支援システムを有する傾向のあるタンパクが存在することである。例としては、ナイセリアおよび他の細菌のピリン、脊椎動物の抗体システム、トリパノソームの可変表面糖タンパク、プラスモジウムの表面タンパク（実際はミクロタンパク）、および他の多くの例がある。ＡＡ配列の急速な適応は、ミクロタンパクで明瞭に観察される。すなわち、ミクロタンパクの配列は、ゲノム配列の近似性から予想するよりもはるかにまちまちとなる傾向を持つ。プロテアーゼによる攻撃を防ぐ剛強構造（しかしながら、必ずしも同じ構造というわけではない）を保持しながら、急速に配列を適応させる能力が多分、このクラスのタンパクが、トキシンの開始物質として使用されるために、動物の進化とは独立に複数（７）回招集された理由であろう。このように繰り返し招集されたことは、このクラスのタンパクが、トキシン構築に特に有用な特性を提供することを示している。その他の、定常な特性としては、小さなサイズ（これらは最小のフォールド形成タンパクである）、および、プロテアーゼおよび温度に対する極端な安定性がある。
【００８０】
受容体タンパクおよびトキシンは、急速な配列変動率を示し、このため、ごく近縁の腹足類トキシン同士が完全に無関係に見えるほどである。急速な進化は、トキシンの必須の特性であると考えられる。なぜなら、毒物は、多様で、常に変化する犠牲動物種における広範な受容体タンパクの変化（トキシンに対する耐性を実現するための進化速度の上昇を示す）に追随しなければならないからである。このグループの一つのきわめて有用な特性は、複数の公刊物に記載されるように、高いジスルフィド密度のスカフォールドのプロテアーゼ安定性によって付与される低い免疫原性である。これは、噛まれたが、逃げおおせた犠牲動物においてトキシンに対する耐性の創出を免れるのに重要と考えられる。受容体とトキシンの両方が、急速に配列を適応させる必要があるのであるから、ある場合には、両方が、ＨＤＤミクロタンパク・ドメインから構成されるということになっても驚くべきことではない。例えば、蛇毒様タンパクの構造準拠クラス（タンパク構造分類（ＳＣＯＰ）データベースによって定義される）は、蛇毒トキシンの外、そのいくつかは同じ構造のリガンドと相互作用を持つ（すなわち、ＴＧＦベータ−ＴＧＦベータ−受容体）、ヒトの細胞表面受容体の細胞外ドメインを含む。例示のタンパクとしては、蛇毒様タンパク、例えば、蛇毒トキシン、およびヒトの細胞表面受容体の細胞外ドメインが挙げられる。蛇毒トキシンの非限定的例としては、エラブトキシンＢ、ガンマ−カルジオトキシン、ファシクリン、ムスカリニントキシン、エラブトキシンＡ、ニューロトキシンＩ、カルジオトキシンＶ４ＩＩ（トキシンＩＩＩ）、カルジオトキシンＶ、アルファ−コブラトキシン、長ニューロトキシン１、ＦＳ２トキシン、ブンガロトキシン、ブカンジン、カルジオトキシンＣＴＸＩ、カルジオトキシンＣＴＸ  ＩＩＢ、カルジオトキシンＩＩ、カルジオトキシンＩＩＩ、カルジオトキシンＩＶ、コブラトキシン２、アルファ−トキシン、ニューロキシンＩＩ（コブロトキシンＢ）、トキシンＢ（長ニューロトキシン）、カンドトキシン、ブカインがある。（ヒト）細胞表面受容体の細胞外ドメインの、非限定的例としては、ＣＤ５９、ＩＩ型アクチビン受容体、ＢＭＰ受容体Ｉａエクトドメイン、ＴＧＦ−ベータＩＩ型受容体細胞外ドメインが挙げられる。
【００８１】
大抵の天然ＨＤＤタンパクファミリーでは、ジスルフィド・スカフォールド単独で高度の剛性を与えることが可能である。これは、誘発適合性、およびそれと関連するエントロピー・ペナルティーを回避することによって高いアフィニティーの獲得にとって有利である。多くのミクロタンパク・ファミリーにおいて、単に４、６、８、または１０個のシステイン残基のみで、そのタンパクの構造、耐熱性、およびプロテアーゼ耐性などの主要な性質を完全に決定することを可能とし、一方、ループの他の残基の全て（例えば、コノトキシンの場合のように）、またはほとんど全ては、結合特異性のために望ましい任意の配列を自由に採用可能とするようにしているようである。システインは、最小の配列定義（「低情報含量」）によって最重要機能を実現するが、これは、より多くの固定アミノ酸を含み、したがってより高い情報含量を有する別形スカフォールドよりも、このスカフォールドの方が統計的に優先的に独立して招集される理由となる。例えば、２個の余分な固定アミノ酸は、情報含量を増し、複数の配列から成るランダムプールから招集される、または該プールにおいて出現する予想頻度を２０ｘ２０＝４００倍下げる。非―ｃｙｓアミノ酸に基づくタンパク安定性の同様レベルは、はるかに多くの残基を必要とし、その結果、より大型で、および／または、進化的にはより適応性の低いタンパクしか得られない。
【００８２】
天然トキシンの構造的多様性の一つの起源は、ＨＤＤ（高ジスルフィド密度）タンパクが、進化的時間スケールにおいて発揮することが示されている長さ変動によってもたらされる。このことは、蛇のジスインテグリンについて詳細に記載されている（Ｃｌａｖｅｔｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍｕｒｃａｎｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，Ｒ．Ｄ．Ｇ．，Ｋｉｓｉｅｌ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｃ．（２００３）Ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３７２：７２５−７３４．Ｃｌａｖｅｔｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｃｚ，Ｃ．，Ｍｏｎｌｅｏｎ，Ｄ．，Ｅｓｔｅｖｅ，Ｖ．，Ｃｅｌｄａ，Ｂ．，Ｊｕａｒｅｚ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｎｚ，Ｌ．（２００５）Ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４５：１０６３−１０７４）。
【００８３】
大型ＨＤＤタンパクをコードする遺伝子の一部の欠失（または挿入／添加）は、元の配列と相同ではあるが、異なる構造と見なしてもよい、多数の、より小さい（またはより大きい）変動をもたらすことが可能である。公刊された例では、ジスルフィドの多くは保存されるが、少数のシステインは、新しい結合パターンを形成する。これに関する天然の機序は、ＤＮＡレベルにおける修飾、ｍＲＮＡ選択的スプライシング、分解、タンパクの（トランス−）スプライシング、または、いずれかの末端における、別形の短縮または付加、選択的翻訳の外、分解、または別形の短縮を含むことが考えられる。その天然の機序が何であれ、この原理は、最適能力および安定性、および最小サイズを有するタンパクを進化させるために、分子生物学および（ファージ）ディスプレイライブラリを用いて実地に実行することが可能である。
【００８４】
さらに、下記の好ましいファミリー：Ａ−ドメイン、ＥＧＦ、Ｃａ−ＥＧＦ、ＴＮＦ−Ｒ、ノッチ、ＤＳＬ、トレフォイル、ＰＤ、ＴＳＰ１、ＴＳＰ２、ＴＳＰ３、アナト、インテグリンベータ、サイログロブリン、デフェンシン１に加え、本明細書に開示されるさらに別のファミリー、を含む天然のタンパク配列から、新規の、修飾スカフォールドを生成することが可能である。動物トキシンとして機能する、二つ以上のジスルフィドを有する、既存のタンパクドメイン・ファミリーとしては、下記の好ましいファミリー：トキシン１、２、３、４、５、６、７、９、１１、１２、デフェンシン１、デフェンシン２、シクロチド、ＳＨＫＴ、ジスインテグリン、ミオトキシン、ガンマ−チオネイン、コノトキシン、Ｍｕ−コノトキシン、オメガ−アトラコトキシン、デルタ−アトラコトキシンの外、本明細書に掲載されるさらに別のファミリーが挙げられる。修飾スカフォールドは、システイン数、ジスルフィド結合パターン、間隔、第１から最終システインまでのサイズ／長さ、ループ構造（種々の固定残基またはサイズを持つ）、イオン結合部位（異なる位置、アミノ酸組成、およびイオン特異性）、性能関連特性（安全性、非免疫原性、ヒトのものにより似ていること、ヒトのものにより似ていないこと、温度安定性、プロテアーゼ安定性、疎水性指数、親水性アミノ酸のパーセンテージ、共融点、高濃度、特異的残基の不在などの処方性質、剛性、ジスルフィド密度、ライブラリー残基のパーセンテージ、ジスルフィド結合パターンの複合性などを含む）において、天然のものと異なっていてもよい。
【００８５】
ある場合には、天然の多様性において出現するサブファミリーを反映することが有用であるが、これは、それぞれが異なるサブファミリーに属し、サブファミリー間の長さおよび配列差を反映する、特異的ループ設計の複数の長さ変動を、同じスカフォールドライブラリーに含めることによって（通常、別々のオリゴヌクレオチドを用いて）実行することが可能である。
【００８６】
ある応用では、既存のスカフォールドの改良変種を生成することが有用である場合がある。例えば、ＬＤＬ受容体Ａ型ドメイン（「Ａ−ドメイン」）、またはＥＧＦドメインの新規変種は、元のものに比べて改良されたスカフォールドをもたらすと考えられる、様々の比較的保存性の高い方法によって生成することが可能である。変種を修飾するには種々の方法が、例えば、Ｎ−末端をＣ−末端に切り替えることによって、Ａドメインのシステインモチーフ（間隔を含む）だけを、または、Ａドメインの保存残基（非−ｃｙｓを含む）のモチーフを反転させることを含む方法が存在する。いくつかの小型ペプチドでは反転の実行が可能であることが示されているが、この場合、少数のアミノ酸だけが反転される。他の修飾としては、タンパクの長さを変えて（より短く、またはより長く）、公刊されたライブラリーの、または天然の配列の長さ範囲から逸脱させること、カルシウム結合部位を別組のループに移動すること、および、ループの固定非−ｃｙｓ残基の一つ以上を変えることを含めてもよい。固定残基がＤである場合、目的は、この位置に非Ｄ残基を置くことになる。これを実行し、特異的アミノ酸位置について新規の、多数の組成物を試験する良い方法は、天然のアミノ酸の、または、公刊ライブラリーで使用されるミックスの反対（すなわち、相補的）となるアミノ酸ミックスを与えるコドンを使用することである。公刊ライブラリーが、ある位置にＩ、Ｌ、Ｖを含む場合、新規モチーフは、その位置にＩ、Ｌ、Ｖ以外の２０ＡＡ全てを与えることによって実現することが可能と考えられる。各位置は、構造に関し、機能に関してはさらに、アミノ酸要求において差を示す。
【００８７】
スカフォールドのライブラリーはさらに、既存のスカフォールド配列モチーフについてより良い変種を探すために使用することも可能である。下記の局面：異なるジスルフィド結合パターン、および／またはジスルフィドの異なる間隔、および／またはループの異なる配列モチーフ、および／または固定ループ残基における違い、および／または、カルシウム結合部位の異なる位置、不在、またはＡＡ組成、またはイオン特異性の内の一つ以上において、既知のスカフォールドよりも優れるスカフォールドを探し求めることが可能である。
【００８８】
Ａ−ドメイン以外のスカフォールド、例えば、ドメインファミリーＥＧＦ、Ｃａ−ＥＧＦ、ＴＮＦ−Ｒ、クニッツ、ノッチ／ＬＮＲ／ＤＳＬ、トレフォイル／ＰＤ／Ｐ−型、ＴＳＰ１、ＴＳＰ２、ＴＳＰ３、アナト、インテグリンベータ、サイログロブリン、トキシン１、２、３、４、５、６、７、９、１１、１２、デフェンシン１、デフェンシン２、シクロチド、ＳＨＫＴ、ジスインテグリン、ミオトキシン、ガンマ−チオネイン、コノトキシン、Ｍｕ−コノトキシン、オメガ−アトラコトキシン、デルタ−アトラコトキシンの外、表に掲載されるさらに別のファミリーを含むスカフォールドに対し、これらの原理をどのようにして適用したらよいかを、当業者であれば知っている。
【００８９】
Ａドメインから得られた、例示の、修飾および新規スカフォールドとしては、下記の配列：
Ｃ１（ｘｘ）ＥＤｓｘＤｘＣ２ＤｘｘＧＤＣ３ｘＷｘｘ［ｐｓ］ｘＣ４（ｘｘ）ｘｘｘＣ５ｘＦｘｘｘ（ｘｘ）Ｃ６  プラスさらに一つのジスルフィド
を含む非天然配列（５０ａａ未満）を有するタンパクドメインが挙げられる。例えば、３−ジスルフィドＡ−ドメインと類似するが、比較的屈曲性の大きいＡ−ドメイン構造を安定化する位置に余分のシステインを持つために、剛性がより大きい、いくつかの４ジスルフィドドメインがある。一例は、Ａ−ドメインの３ＳＳフォールド（１−３  ２−５  ４−６）を含むが、そのＡ−ドメインのどちらかの側面にある１ジスフフィドによって該フォールドを安定化する１−８  ２−４  ３−６  ５−７結合パターンである。Ａ−ドメインの、別の、高品質４−ジスルフィド版（「Ａ＋ドメイン」と呼ばれる）としては、１−５  ２−４  ３−７  ６−８、１−３  ２−６  ４−８  ５−７、１−４  ２−７  ３−６  ５−８、１−４  ２−７  ３−６  ５−８を始め、外にも多くのものがある。サイズは、ほんの数ＡＡだけより長い（２−１２、好ましくは８ＡＡ未満）だけで、Ａ−ドメインとほぼ同じでなければならない。この同じ分析法および解決法は、他の、全ての３−ジスルフィドファミリーに対し、さらに、下記の一般構造を持つ２−および４−ジスルフィドファミリーに対しても使用することが可能である。
【００９０】
（非天然配列および５０ａａ未満の）タンパクドメインで、Ｃ１およびＣ６の間に、
Ｃ１ｘ（ｘｘｘ）ｘＦｘＣ２ｘｘｘ（ｘｘｘ）Ｃ３ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘＣ４ＤＧｘｘＤＣ５ｘＤｘＳＤＥ（ｘｘｘｘ）ｘＣ６、および３６を超えるａａ
を含むドメイン。
【００９１】
（非天然配列および５０ａａ未満の）タンパクドメインで、Ｃ１およびＣ６の間に、
Ｃ１ｘ（ｘｘｘ）ｘＦｘＣ２ｘｘｘ（ｘｘｘ）Ｃ３ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘＣ４ＤＧｘｘＤＣ５ｘＤｘＳＤＥ（ｘｘｘｘ）ｘＣ６、および３２未満のａａ
を含むドメイン。
【００９２】
非天然配列および５０未満のａａを有するタンパクドメインで、１−３  ２−５  ４−６連結の３ジスルフィド、およびＣ１とＣ６の間に３６を超えるａａを有するドメイン。
【００９３】
（非天然配列および５０ａａ未満の）タンパクドメインで、Ｃ１およびＣ６の間に、
Ｃ１ｘ（ｘｘｘ）ｘＦｘＣ２ｘｘｘ（ｘｘｘ）Ｃ３ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘＣ４ＤＧｘｘＤＣ５ｘＤｘＳＤＥ（ｘｘｘｘ）ｘＣ６、および３２未満のａａ
を有するドメイン。
【００９４】
非天然配列（５０ａａ未満）のタンパクドメインで、
Ｃ１（ｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘｘＣ２ｘｘｘｘｘＣ３ｘｘｘｘｘｘＣ４（ｘｘ）ｘｘｘＣ５ｘｘｘｘｘ（ｘｘ）Ｃ６（反転Ａ−ドメイン）
を含むドメイン。
【００９５】
下線アミノ酸の内の一つが存在しないタンパクドメイン（非天然配列および５０ａａ未満）：
Ｃ１ｘ［ａｐｓ］（ｘ）［ｅｋｑ］ＦｘＣ２ｘｘｘｘ（ｘ）Ｃ３［ｉｌｖ］［ｐｓ］ｘｘ［ｌｗ］［ｌｒｖ］Ｃ４ＤＧ［ｄｅｖ］［ｐｎｄ］ＤＣ５ｘＤ［ｄｇｎｓ］ＳＤＥ（ａｐｓ）（ｌｐｓ）ｘｘＣ６
同じ方法による異なる表示法は（三つの異なるモチーフレベルが示され；所望の変化には下線を施す）である。
【００９６】
Ｃ１ｘ（ｘｘ）ｘｘｘ非ＦｘＣ２ｘｘｘｘ（ｘｘ）Ｃ３ｘｘｘｘｘＣ４ｘｘｘｘ非ＤＣ５ｘ（ｘ）ｘｘｘ非Ｄ非Ｆ（ｘ）ｘｘｘＣ６、または
Ｃ１ｘ（ｘｘ）ｘｘｘ非ＦｘＣ２ｘｘｘｘ（ｘｘ）Ｃ３［非ＩＬＶ］［非ＰＳ］ｘｘｘｘＣ４非Ｄ非Ｇｘｘ非ＤＣ５ｘ（ｘ）非Ｄｘ非Ｓ非Ｄ非Ｅ（ｘ）ｘｘｘＣ６
（非天然配列、および）、Ａ−ドメインフォールドと同じ結合パターンを有するが、システインについてはきわめて異なる間隔、および完全に無関係のタンパク配列を持つＨｕｗｅｎトキシンＩＩフォールドを有するタンパクドメイン。
【００９７】
二重配列を含まないドメイン・ファミリー：このクラスは、大抵の動物トキシンスカフォールド、および細胞表面受容体由来のスカフォールドを含む。蛇、蜘蛛、さそり、腹足類、およびいそぎんちゃく毒のタンパクトキシンは、天然の、注入可能な生体製剤と考えることが可能である。これらの毒は、通常、一定範囲の受容体および生物種特異性を有する、関連および無関連の、１００を超える異なるトキシンを含む。これらのトキシンの大部分は、高密度のジスルフィドを有する小型タンパクである。典型的サイズは、２ジスルフィドでは１５−２２ａａ、３ジスルフィドでは２５−４５ａａ、４ジスルフィドでは３５−５０ａａであるが、５、６、７、８、またはそれ以上のジスルフィドについても多くの例がある。例は、デルタ−アトラコトキシン（１−４  ２−６  ３−７  ５−８）、さそりトキシン（１−８  ２−５  ３−６  ４−７）、オメガ−アガトキシン（１−４  ２−５  ３−４  ７−８）、マウロトキシン（１−５  ２−６  ３−４  ７−８）、およびＪ−アトラコトキシン（１−４  ２−７  ３−４  ５−８）である。
【００９８】
系統発生学的分析から、これらのタンパクは、無関係の動物群が、無関係の開始点から独立に類似のトキシン構造を生成する、集約的進化の例であることが示されている。同じ設計原理が、少なくとも七つの独立の場合（それぞれ、無関係の分類学的群に属する）において支配的であることを考えると、この設計は、他のタイプのトキシン（すなわち、微生物タンパクトキシン）を構築するために用いられる他のスカフォールドよりも重要な利点を有することが期待される。
【００９９】
これらのタンパクによって共有される唯一の特性は、高密度のジスルフィド結合である。これらのタンパクの（ｃｙｓ以外の）アミノ酸配列は、きわめて変動性が高く（コノトキシンの整列を参照）、広範囲の、種々の構造体（タンパクフォールド）が創製されている。
【０１００】
これらのタンパクの望ましい性質の一つは、それらの並外れて小さいサイズである。ミクロタンパクは、もっとも小さい剛強タンパクで、急速な組織浸透に必要とされる。第２の共通性質は、同じサイズの他のタンパクよりも高い、その剛性であり、これによって、これらのタンパクは、標的に結合したときに誘発適合を回避することができ、より高度な結合アフィニティーが可能となる。第３の特性は、これらのタンパクの並外れた安定性で、熱安定性（多くのミクロプロテインは、変性されることなく煮沸することが可能である）、および広範囲のプロテアーゼに対する耐性の両方を備える。安定性は、静脈内（ＩＶ）、または皮下（ＳＣ）に注入される生物製剤にとって重要であり、経皮的、鼻腔内、経口、腸内、血液脳関門を介して輸送されるタンパクにとってはさらに重要である。安定性はまた、長い半減期、好適な搬出・保存にとっても重要である。大いに興味をそそるもう一つの性質は、これらのタンパクの非免疫原性である。これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるタンパク分解に対し、これらのタンパクの示す抵抗性によって仲介されることが報告されている。この抵抗性は、高ジスルフィド密度構造によって付与されることが公表されている。免疫原性を低く抑える他の因子としては、タンパクの小さなサイズおよび親水性がある。
【０１０１】
二重配列を含むドメインのファミリーはまた、主題のミクロタンパクおよびそのライブラリーの生成にも用いられる。多数の例が、下記の実施例に記載される。
【０１０２】
反復列を含むドメインのファミリー：システイン富裕反復列タンパク。システイン富裕反復列タンパクの高いシステイン含量によって、その反復列内において、および／または二つの反復単位間において、複数のジスルフィド結合の形成を可能とする。このために、ジスルフィド結合の反復パターンが得られる。このパターンは固定された空間配置を与える。ただし、稀な場合であるが、同じ配列が、別形のジスルフィド結合パターンを取ることもある（または、取るように進化することも可能である）。反復タンパクにおけるジスルフィド結合は、ＣＲＲＰモチーフ（ＸＡ１，ＸＡ２）／（ＸＢ１，ＸＢ２）／（ＸＣ）によって特徴づけられる。前式においてＸＡは、連結システイン間のシステイン距離であり、これは、同じジスルフィド結合における第１システインと第２システインの間のシステイン数である。このシステイン距離は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。ＣＲＲＰモチーフにおける２（またはそれ以上）の数は、二つ（またはそれ以上）の異なるタイプの結合を示し、ＸＡ１はそのような第１結合を表し、ＸＡ２はそのような第２ジスルフィド結合を表す。例えば、１−４  ２−３空間配置を有するＣｘＣｘＣｘＣｘＣｘＣｘＣｘＣは、第１ジスルフィド結合タイプについては＋３のシステイン距離、第２ジスルフィド結合タイプについては＋１のシステイン距離を有する（「３、１」）。
【０１０３】
ＸＢは、一ジスルフィド結合の第１システインから、次のジスルフィド結合の第１システインまでのシステイン距離（システイン数）を表す（例えば、１−４  ２−３の空間配置を有するＣｘＣｘＣｘＣｘＣｘＣの場合、ＸＢは＋１である。二つの異なるタイプのジスルフィドボンドＸＢ１は、一タイプのジスルフィド結合の第１システインから、隣接ジスルフィド結合の第１システインまでのシステイン距離を表し、一方、ＸＢ２は、この場合では、次の反復列に配される第２タイプのジスルフィド結合の第１システインから次のジスルフィド結合の第１システインまでのシステイン距離を表す。この例では、ＸＢ２は＋３である（Ｃ２からＣ５まで）が、ＸＢ２は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０となることも可能である。ＸＣは、螺旋反復タンパクにおいて螺旋転回当たりのジスルフィド結合数を表し、１の分数か、または、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のような整数となることも可能である。
【０１０４】
各ドメインは通常（必ずしもそうとは限らないが）、Ｎ−および／またはＣ−末端に末端キャップを有する。末端キャップは、通常、正規の反復列よりも一つまたは二つ少ないシステインを持つ。なぜなら、末端キャップは、二つの反復列ではなく、一反復列のみに接続しなければならないからである。
【０１０５】
反復列に関するさらに詳細な記載は、タンパク中の、各タイプのジスルフィド結合の「スパン」（二つの連結システイン間の非−ｃｙｓアミノ酸数）を含むと考えられる。反復タンパクを表すもう一つの方法は、反復単位の配列を、例えば、（ＣｘｘｘＣｘＣｘｘｘｘＣｘｘＣＣｘｘ）ｎと表すことである。どのシステイン同士が連結されるかを表示するのにＣａおよびＣｂ表記を、例えば、（ＣａｘｘｘＣａｘＣｂｘｘｘｘＣｃｘｘＣｂＣｃｘｘ）ｎに見られるように使用することが可能である。
【０１０６】
システイン富裕反復タンパクの重要な特性は、どちらの末端でも、Ｎ−末端またはＣ−末端のいずれにおいても延長が可能であるということである。ライブラリー設計のための二つの方法として、１）天然の反復タンパクのランダム化、および２）通常、天然の反復タンパクからの抽出によって得られるが、天然の反復列とは幾分異なる間隔（より理想化された）を有する合成反復列がある。天然のＣＲＲＰとしては、グラニュリン（ＰＦ００３９６）、昆虫抗凍結タンパク（ＰＦ０２４２０）、フリン様ドメイン（ＰＦ００７５７）、ＣｘＣｘＣｘ反復列（ＰＦ０３１２８）、パラメシウム表面抗原（ＰＦ０１５０８）、および機能が未知のショウジョウバエドメイン（ＰＦ０５４４４）が挙げられる。
【０１０７】
要すれば、主題のシステイン含有タンパクおよび／またはスカフォールドは、生体反応修飾因子と融合されてもよい。生体反応修飾因子の例としては、蛍光タンパク、例えば、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）、サイトカインまたはリンフォカイン、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびγ−インターフェロンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。その他の有用な融合配列として、精製をやり易くするものがある。そのような配列の例は、従来技術で既知であるが、例えば、Ｍｙｃ、ＨＡ（インフルエンザウィルス血球凝集素由来）、Ｈｉｓ−ｏ、またはＦＬＡＧなどのエピトープをコードするものが挙げられる。精製をやり易くする他の融合配列が、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、または、免疫グロブリンのＦｃ部分などのタンパクから得られる。
【０１０８】
ライブラリーの構築：本発明は、主題のシステイン含有スカフォールドのライブラリーを提供する。天然の選択を受けるタンパクは、均一に折りたたまれる必要があるが、新規の、進化していない配列を有するタンパクは、折りたたまれて複数の安定構造を形成することが可能であるか、または、条件を変えることによって少なくともそのように誘起することが可能である。同じタンパク配列の異なるコピーを折りたたんで異なる安定構造を形成させることは、ライブラリーの構造的多様性を、ライブラリー中の独立クローンを超えてさらに拡大する。ライブラリー中の独立クローンの数は、一般に、異なる配列の数に等しく、「ライブラリーサイズ」と呼ばれ、ファージディスプレイ・ライブラリーでは約１０１０である。しかしながら、ファージライブラリーのパンニング選択時に使用されるファージ粒子の実際の数は、通常、ライブラリーサイズよりも１０−１０，０００倍大きい。過剰倍数は、「ライブラリー当量数」と呼ばれるが、より大きなライブラリー性能を獲得するためにこの差を利用する方法がある。もしもクローンの１０−１０，０００コピーのそれぞれが（すなわち、同じアミノ酸配列を有する全てが）、異なる、安定なＤＢＰおよび構造を取ると仮定すると、一過性に異なる構造を取る不安定構造を用いて、構造多様性をさらに増すことが可能である。一方、もしも各ファージ粒子が、その利点および欠点も含めて、ランダムペプチドと同様に、広く多様な構造を取ることが可能な不安定タンパクも表示するとするならば、多様性はさらに増加する可能性がある。多数の不安定構造を取ることが可能なタンパクは、ファージ粒子の数（１０１２−１０１５）を超えて多様性を拡大する。低アフィニティークローンの回収は、大きな数のライブラリー当量を必要とするが（すなわち、１％回収効率においてクローンを回収するためには約１００ライブラリー当量が必要である）、高アフィニティークローンの回収は、１００％効率に近く起こるので（アフィニティークロマトグラフィーによって実証されるように）、構造的多様性の増加は、高アフィニティークローンの割合を大きく増すことが期待される。不安定構造を伴う構造的多様性の増加には妥協点がある。なぜなら、標的結合の際、表示タンパクにおける構造誘発の必要（標的ではなく、結合するタンパクの方の誘発適合）は、これらのクローンの結合アフィニティーを下げることが予想されるからである。
【０１０９】
一つの方法は、４システイン（最大２ジスルフィド、および最大３通りの結合パターン）、６システイン（最大３ジスルフィド、および最大１５通りの異なるジスルフィド結合パターン）、８システイン（最大４ジスルフィド、および最大１０５通りの結合パターン）、または１０システイン（最大５ジスルフィド、および最大９４５通りの結合パターン）、あるいは１２、１４、１６、１８、２０、またはそれ以上のシステインを有するライブラリーを構築することである。
【０１１０】
一局面では、ジスルフィド結合パターンの全数は、下記の式によって一般化することが可能である。
【０１１１】
式：Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．式中、ｎ＝システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数であり、かつ、Ｅｒｒｏｒ！  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｃｏｄｅｓ．は、（２ｉ−１）の積を表し、この式においてｉは、１からｎまでの正の整数である。
【０１１２】
要すれば、大きいが、変動する数（すなわち、１０−３０）のシステインをコードする、はるかに大きな構築体を生成することも可能である。得られたシステイン含有産物は、広く多様なやり方でフォールド形成し、それぞれが２、３、４、または５ジスルフィドを含む構造要素が、それぞれの間に交差性架橋の可能性のある、異なる組み合わせを創出する。これら比較的大型の構築体の指向性進化過程の際、以前に選択された構築体を、例えば、ランダム断片化、ＰＣＲ（例えば、ランダムプライマーによる）、または（例えば、４ｂｐ）制限消化によってより小型の断片に破断することも可能である。長いタンパクのライブラリー多様性が低下した場合、各大型構築体から種々の断片を創製し、その後、組み換え、または他の指向性進化法によって再度多様性を増すことが可能である。
【０１１３】
ＨＤＤタンパクから成るこのようなライブラリーに関する、一つの予想される不安は、ジスルフィドの多くが形成された後の、対合されない複数のシステインの存在である。遊離チオールは、互いに相互作用を持ち、凝集体を創成するが、この凝集体は、標的に対する多価性結合のために、ブロッキングアッセイにおいてはっきりと高いスコアを呈する傾向を持つ。しかしながら、これらの遊離チオールは、例えば、イオドアセタミド、すなわち、スルフヒドリルに対する周知の遮断剤によって遮断され、凝集体を形成することがないよう、または適正に形成されたジスルフィドを攻撃することがないよう阻止することが可能である。
【０１１４】
同数のジスルフィドを有する（すなわち、三つのジスルフィドは、１５通りの可能な連結パターンを与える）、ミクロタンパクの複数のファミリーの共通配列を整列することによって、システイン間の間隔は、０から約１２アミノ酸のほぼ均等な分布を形成することが明らかにされる。簡単のためと、平均ループ長を小さく保持するために、我々は、システイン間ループ当たり０−１０アミノ酸を有するファミリーを好む。
【０１１５】
合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡが、６個のシステインと、システイン間ループの０−１０ＮＮＫ（または類似のあいまいコドン）残基をコードするようにライブラリーを構築することが可能である。ＮＮＫコドンは、２０ａａ全てをコードするが、１／６４コドンだけは終止コドンとなる（ＮＮＮコドンを用いた場合よりも３倍少ない）。これは、早すぎる終止コドンを含むタンパクの割合を下げる。５個のシステイン間ループを仮定すると、これらのタンパクは、平均２５ＮＮＫコドンを含むことになり（ループ当たり０から１０ａａ、平均５を仮定する）、これは、早すぎる終止コドンを含むクローンの割合を下げる。終止コドンを除く、１０よりも少ない数のコドン、またはあいまい（混合塩基組成）コドンを用いることによって、完全タンパクの割合を増すことが可能である。図に示すように、各オリゴヌクレオチドは、システイン・コドンから開始し、かつシステイン・コドンで停止し（一端ではセンス方向、他端ではアンチセンス方向）、これらのシステイン・コドン間には０−１０ＮＮＫ（または逆方向）コドンがある。この合成ライブラリー作製法では、ループ配列の全てが、任意のループ位置において使用することが可能であり、したがって、システインは全て、通常、同じコドンによってコードされる。これらのオリゴは全て混ぜ合わされ、合成遺伝子プールが、前述のように（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ら、１９９５．Ｇｅｎｅ）重複ＰＣＲによって創製される。
【０１１６】
ファージライブラリーを創成するための、別の、強力な方法は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異法のＳｃｈｏｌｌｅの変法である（Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｍ．ら、（２００５）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．＆  ＨＴＰ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ８：５４５−５５１）。この方法では、ライブラリーコード・オリゴヌクレオチドによって、プラスミド中の終止コドンが、非終止コドンに変換される。この方法の新規バージョンとして、任意の二つの終止コドン（通常、アンバーコドンとオークルコドン）の間の往復サイクルが挙げられる。これによって、突然変異発生の各サイクル毎に終止コドンを再挿入する手間を要することなく、進化するクローンプールに対しＳｃｈｏｌｌｅ法を反復帰納的に適用することが可能となる。
【０１１７】
３ＳＳ（３−ジスルフィド；１５通りの可能な構造）、および４ＳＳ（１０５通りの可能な構造）混合のスカフォールドライブラリーは特に有用である。ジスルフィド結合パターンに関して我々が所有する主な調節手段は、システインの間隔である。タンパクがどの構造（ジスルフィド結合パターン、‘ＤＢＰ’）を取るかは、例えば、フォールド再形成のために、ある一定範囲の環境を提供することによってある程度調節することが可能である。ＤＢＰは、トリプシン消化および／またはＭＳ／ＭＳ分析によって分析することが可能である。
【０１１８】
構造的多様性の問題点は、複数スカフォールドライブラリーでも、単一スカフォールドライブラーでも同じであり、大きさの差は連続的に調整することが可能である。既存の天然ファミリーから多少変動し（ループ当たり平均０から１５アミノ酸）、かつ、多少類似するが、システイン間隔に基づくライブラリー設計には連続性がある。通常、単一スカフォールドライブラリーも、相当の長さ変動（天然の変動を模倣する）を含む。配列類似性によって複数のファミリーが創製されること、および、通常、僅かな少数のメンバーについてのみ、構造（結合パターン）が実験的に決定されることに注意されたい。したがって、かなりの数の天然配列が、配列から予想されるものとは別の構造を持つ可能性がある。天然の、高度に進化し、微細に調整された（すなわち、高い情報含量の）配列は、一般に、高い信頼度で一定のやり方でフォールド形成するが、しかし、低い情報含量の、調整度のより低いタンパク（例えば、初期のファージディスプレイ・ライブラリーのもの、および／または、１サイクルのパンニング後で、指向性進化前の構造的に多様なライブラリーから得られたもの）は、しばしば、いくつかの異なるフォールド形成をすることが予想される。
【０１１９】
タンパクの、ある特異的な、天然ファミリーの保存スカフォールドに基づくライブラリーは、ＩｇドメインまたはフィブロネクチンＩＩＩのように、通常、各種の問題点（すなわち、ヘテロのフォールド形成、フォールド未形成、凝集、または低レベルの発現）を抱える約５−１０％のクローンを含む。長さ多様性を増すこと、より大きな配列および構造多様性を許容することは、より振る舞いの低劣なクローンを生成する可能性がある。突然変異発生の新たなサイクルを適用する前に、不要なモノマーを選択排除し、ダイマーおよびより高次のマルチマーを作製するのが一般的である。しかしながら、指向性進化は、非適正クローンの振る舞いを向上させる点できわめて有効である傾向を持つので、指向性進化によって、クローン排除によって、および／または、配列変更および／または構造変更によって、クローンプールの平均品質を徐々に改善することが可能である。指向性進化は、改良活性を選択するようにスクリーニングするが、改良フォールド形成は、活性を改善するための簡便な方法であるので、活性の指向性進化は、タンパクフォールド形成効率の向上（Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１６３−１１６８；Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．ら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５−３１９）、および温度安定性の向上（多くの報告例）を実現するための、実証済みの、効率的方法である。理由は、活性構造をより効率的に採用するクローンは、より活性が高く、したがって、選択過程においてより好まれるからである。我々の目指す過程は、パンニングの初期ラウンドは、種々のフォールドを有するたくさんのクローンを生成し、一方、高レベルの様々な問題点（不完全なフォールド形成、ヘテロのフォールド形成、低レベル発現、凝集など）が見られる可能性の高いものであるが、（ファージ）パンニングによる強力な機能的選択と組み合わせて、指向性進化（誤作動性ＰＣＲ、相同組み換え、カセットによる組み換え、または場合によっては単純に複数回のスクリーニングを含む、多くの可能な方式）を用いることによって、均一なフォールド形成を持つクローンを積極的に選び出すことが予想される過程である。均一なフォールド形成をするクローンの頻度を高めるために、同じライブラリーを、複数回（ファージ増幅付きで、または無しで）、改めて還元、フォールド形成、およびパンニングを行うことも可能である。不完全なフォールド形成のタンパクを除去するために、各サイクル毎に、遊離チオール・アフィニティーカラムを用いることが可能であり、あるいは、遊離チオールを、各種キャップ剤（ＦＩＴＣ−マレイミド、イオドアセタミド、ヨード酢酸、ＤＴＮＢなど）と反応させることが可能である。さらに、遊離チオールの頻度を下げるために、全体ライブラリーを再度フォールド形成することも可能であるし、あるいは、部分的に還元、および再度酸化することも可能である。ファージディスプレイおよび可溶性タンパク結合アッセイは、しばしば、多価の溶液を積極的に選ぶ。タンパク間ジスルフィドを有するタンパクは、多価性の一般的供給源であるが、これらは製造不能なので除去する必要がある。ファージディスプレイを複数回行う（その間に可溶性タンパクのアッセイを行うことなく）ことは、ファージ上においてのみ作動する溶液を進化させる傾向がある。したがって、これらのクローンが支配的になることを阻止するために、一般に、可溶性タンパクのスクリーニングは望ましい。タンパク構造の多様性は、初期には望ましいが、タンパク間ジスルフィド結合を形成するクローンは、その除去を次第に増やすことが望ましい。構造の多様性は、不定のフォールド形成、およびタンパク間ジスルフィドと相関し、かつ、構造進化は、不均一フォールド形成と切り離すことができないので、ある程度の不均一性を許容する方法を開発する必要がある。
【０１２０】
構造の多様性とフォールドの均一性に関する所望のバランスについて種々のライブラリー設計を評価するために、ライブラリー設計の多様性を手早く評価する目的で、小型のライブラリーを作製し、少数のクローン（３０−１０００）をスクリーニングすることが可能である。
【０１２１】
同じタンパクの中の種々のジスルフィドは、別様に反応するので、ある程度の調節を可能とする。タンパク間ジスルフィドを有するクローンをファージライブラリーから除去する方法の内の一つは、そのファージライブラリーを、低濃度の還元剤に暴露することである。この還元剤は、もっとも弱いジスルフィド、例えば、きわめて弱いので、クローンから除去したいと思う、タンパク間ジスルフィドおよびタンパク内ジスルフィドのみを還元するので、次に、この部分的に還元されたライブラリーを遊離チオールカラムの上に通過させると、これらのクローンは除去される。
【０１２２】
（ＨＤＤタンパクの構造進化）
上述したように、ＨＤＤタンパクは、各レベル、例えば、一次（配列）、二次（アルファヘリックス、ベータ・シートなど）、三次（フォールド、ジスルフィド結合パターン）、および四次（他のタンパクとの連結）を含むレベルにおけるタンパクの構造進化を受容することが可能である。三次構造を完全に変えることができれば、それは、ＨＤＤタンパクを、治療薬または製薬組成物に関する原理的設計にもっとも適応するものとすることになる。既存の指向性進化法でも、限られたものではあるが、二次的構造進化（アルファヘリックス、ベータ・シート）が起こる場合があるが、三次構造において高品質の修飾を創出することは、指向性および原理設計では実行が困難であった。
【０１２３】
２ＳＳから、ジスルフィド付加によって３ＳＳからさらに４ＳＳへと進化させること、および、欠失による逆転は、頻繁に起こるようであり、蛇ジスインテグリンに関しては報告されてもいる（Ｃａｌｖｅｔｅ，Ｊ．Ｊ．  ら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７２：７２５−７３４）。天然のファミリーのＤＢＰ同士の近縁性は、天然でもＤＢＰの再構成が起こる可能性のあることを示唆しており、特異的ファミリー、例えば、ソマトメジンについては公刊物によって支持されている。
【０１２４】
１５種の異なる３ＳＳ構造、１０５種の４ＳＳ、または９４５種の４ＳＳ構造は、空間配置的に異なるが、これは、これらの構造は、相互変換が可能となるためには、破壊して、ジスルフィド結合を再形成しなければならないことを意味する。各３ＳＳタンパクは、「最近接」変種である、６種の（完全）ジスルフィド結合異性形（変更結合パターンを有する２ジスルフィド、保存された結合パターンを有する１ジスルフィド）を有し、各４ＳＳタンパクは、それぞれ２個の保存ジスルフィド、および２個の変更ジスルフィドを有する１２種の最近接異性形を有する。このようにして、徐々に、構造進化のための経路が創出される。
【０１２５】
構造の指向性進化過程は、先ず、多様な構造（必ずしも全てが可能とは限らず、かつ、頻度も異なる）を奨励し、次いで、徐々に構造を締めつけるばかりでなく、構造を部分的に修飾し（緩慢なＤＢＰ変化によって）、一方では、だんだんより優れた結合因子を選択する。構造の、最初の大きな多様性は、異なるＡＡ配列数を超えて、ライブラリーの実効サイズを拡大するのに役立つ。しかしながら、構造が多様になればなるほど、それらのフォールド形成は不均一となり、そのため、これらのタンパクは、有用となるほどの均一なフォールドを形成するためには相当の進化を必要とする。最適ループ長を持つ構造は、より均一なフォールドを形成し、プロテアーゼ耐性がより高く、免疫原性がより低い。場合によって見られる特定位置を除き、ループの配列は、三次構造に影響を及ぼすようには見えず、かつ、ループは概して二次構造を持たない。
【０１２６】
ループ長を最適化する好ましい方法は、比較的長いループ（すなわち、６、７、８アミノ酸）から始め、それから徐々にその長さを短縮し、各ループを、ある範囲の、異なるサイズ（低い平均サイズ）の他のループによって置換することである。この過程は、結び目の締めつけに似ている。ループの位置は、通常一定とされるが（すなわち、Ｃ２−Ｃ３）、それらの位置は、特に、タンパクにおける、複数の小さい結合部位が有用な解決策である場合には、変動させることも可能である。
【０１２７】
一つの好ましい方法は、選ばれたクローンのプールにおけるループ（すなわち、ループＣ１−Ｃ２、Ｃ２−Ｃ３、Ｃ３−Ｃ４、Ｃ４−Ｃ５、Ｃ５−Ｃ６、Ｃ６−Ｃ７、またはＣ７−Ｃ８、Ｃ８−Ｃ９、Ｃ９−Ｃ１０）を、多くはランダム配列からなる、これまで一度も選択されたことのない新しい１組のループで置換することである。異なるシステインに対し、また、要すれば、それらのシステインに側接する二三の固定塩基に対し別のコドンを用いることによって、ＰＣＲ重複反応（好ましい）においてループ交換を実行するためのＰＣＲ部位を創出することが可能であり、あるいは、制限部位法を用いることも可能である。
【０１２８】
あるタンパク標的に結合するように選ばれた、プール中の異なるクローンは、そのタンパクの異なる部位に結合する可能性が高い。同じ部位に結合するために近似配列を用いる場合でも、それらのクローンは関与部分が異なる可能性が高い。例えば、あるクローンは、ループ１に活性配列を持ち、別のクローンはループ５に持つことがある。より多くの固定アミノ酸を持つことは、同じ関与部分を有するクローンがより多いことになり、これは、相同組み換えによる指向性進化のためには有利と考えられる。
【０１２９】
選ばれたクローンプールに対し組み換えを実行するにはたくさんの方法がある。大抵の方式では、ループはそのまま手をつけず、相互に組み合わされるだけであるが、相同組み換えを駆動するのに、ループ間の相同性が用いられる方式もある。一般に、各ループは、同じ位置に留まるが（すなわち、Ｃ４−Ｃ５）、これも変動させてよい。ある方式では、選ばれたクローンプールのループが全て連結されておらず、次に改めて連結されるが、もっと保存的な方法は、一つの特定のループ（すなわち、Ｃ４−Ｃ５）のみを未連結とし、他のループは連結状態に保持し、たくさんの交差ではなく、僅かに１−２個の交差を有するクローンライブラリーを創製することである。この目的は、たくさんの保存的変化の組み合わせを必要とする、たくさんの、異なる、緩慢な経路を創製することである。
【０１３０】
たくさんのフォールドを有するライブラリー、または、ただ一つのフォールドを有するライブラリーを作製するのではなく、比較的少数の構造体（すなわち、最低限界が２、５、１０、３０、１００、３００、最高限界が１０、３０、１００、３００、１０００、３０００）で、その結合パターンは剛強構造を生ずるか、または天然ファミリーに出現するもので、最良のシステイン間隔に関する詳細な情報を提供する構造体を可能とするように設計された、間隔に僅かな変動性を有するライブラリーを作製できることが望ましい。一例は、ｃｘｘｘ（ｘ）ｃｘｘｃｘｘｘｘ（ｘｘ）ｃｘｘｘｃｘｘｘ（ｘ）ｘｘｃｘｘｘｘ（ｘ）ｃｘｘｘｃである。
【０１３１】
ライブラリーの実効的多様性および品質は、共にきわめて重要であるが、正反対の設計要求を持つ傾向がある。品質は、主に、適正にフォールド形成するクローンの割合によって決定される。ライブラリーの理論的多様性（よりランダム化されたＡＡ位置）の展開は、非フォールド形成クローンの割合を増やす傾向を持つ。フォールド形成を増す工程は、各ＡＡ位置において天然ＡＡを使用すること、および天然の保存残基を保存することを含む。これは、単一スカフォールドライブラリーでは簡単に実行されるが、複数スカフォールドライブラリーではそうではない。したがって、複数スカフォールドライブラリーでは、非フォールド形成クローンの割合がより高くなる。フォールド形成のために固定化される必要のある２ＡＡだけをランダム化すると、フォールド形成クローンの割合は、４００倍低下し、実効ライブラリーサイズを下げる。
【０１３２】
種々のライブラリーを創製し、ＦＩＴＣ−マレイミドを用いて残存する遊離チオールの割合を測定（反応、洗浄、結合ＦＩＴＣの測定）することによって、フォールド形成クローンの割合を測定することは有用である。さらに、遊離チオールを含む固相支持体を用いてフォールド未形成クローンを除去すること、および／または、全体ライブラリーまたはフォールド未形成クローンのフォールドを再形成することも有用である場合がある。一つの方法は、部分的にフォールド形成した、または劣悪なフォールド形成したタンパクは還元するが、安定にフォールド形成したタンパクは還元しないと期待される濃度の還元剤にライブラリーを暴露することである。
【０１３３】
しかしながら、劣悪なライブラリー設計でも、はるかに低いが、あるレベルのフォールド形成クローンを有することがある。一つの方法は、たくさんの、単一スカフォールドライブラリーを別々に構築し、パンニングの前にそれらを混ぜ合わせることである。これによって、高品質の、多様なライブラリーが得られるはずである。
【０１３４】
ヘテロ性フォールド形成は、適切に処理すれば利点となるべきものである。通例のライブラリーはサイズが１０−ｅ８−１０ｅ９であり、また、約１０ｅ１３個のファージ粒子を創出するから、各配列は、１０ｅ４−１０ｅ５個の粒子によって提示される。もしもパンニングが１００％の効率で実行される（すなわち、各１ｎＭ以上のクローンが全て捕捉される）とすると、各配列を、１０ｅ３個の異なる構造として所有することは、有効な多様性、的中率、および品質にとって莫大な利点となるはずである。効率的パンニングは、高濃度のファージ、高濃度の標的、高温（より速やかな平衡）、１０−１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの容積排除剤、可溶性標的・対・固定標的などを必要とする。
【０１３５】
タンパクの適正なフォールド形成を促進するための、一つの方法は、ＰＥＧなどの容積排除剤の存在下にフォールド形成（最初に）をすることであってもよい。容積排除剤は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度、さらにはシャッフリング反応（複合断片重複ＰＣＲ）の効率を急激に増す。ＰＥＧは単にチオールの実効濃度を増し、これによってより多くの鎖間、および鎖内ジスルフィドが増す。
【０１３６】
一般に、フォールド未形成クローンは不要であるが、ヘテロ性フォールド形成は望ましい。未フォールド形成およびヘテロ・フォールド形成は明らかに相伴っている。他の場合は未フォールド形成のクローンが標的誘発性にフォールド形成するのは特に有用であるが、めったに起こらない出来事である。混合スカフォールドライブラリーの実効ライブラリーサイズに予想通りの減少が見られるため、効果的な突然変異発生策が一般に好まれる。組み換えを選んでもよいし、あるいは、長さ変動と点突然変異の両方を選んでもよい。ランダムライブラリーから得られた配列の組み換えは困難である場合がある。このような短いクローンに対しては、誤作動性ＰＣＲの誤作動率はやや低く（０．７％）、再クローニングを必要とする。再合成は、選ばれたクローンの配列決定、ライブラリーの再合成、および再クローニングを必要とする。別法として、大腸菌の、主題の突然変異株に対し、適正にフォールド形成されたクローンを選択的に採取するために、多数サイクルのパンニングおよび増幅を行うことも可能である。さらに、Ｅｖｏｇｅｎｉｘの方法を応用することも可能である。
【０１３７】
２−３−４法の魅力は、ＰＣＲによる各ステップでランダム配列を付加するが、他の形の突然変異発生を必要としないことである。ミクロタンパクは、新規または既存のペプチドリガンドまたはタンパク断片から建設することが可能である。この方法は、あらかじめ結合性を有する、または有しない、短いアミノ酸配列を利用する。結合性アミノ酸配列は、その一端または両端において、単一システインをコードするランダムまたは固定アミノ酸によって側接されてもよい。オリゴヌクレオチドが、この結合配列および側接システインコードＤＮＡをコードするように設計される。新たに導入されたシステインは、任意に、ランダムまたは非ランダム配列によって側接されてもよい。システイン含有側接配列の変動は全て、混合され、集められ、２本鎖ＤＮＡに変換される。これらの集合配列は、任意に、制限酵素認識部位をコードするか、または、あらかじめ存在するＤＮＡ配列にアニールするＤＮＡによって側接されてもよい。この方法は、新規または既存のシステイン距離パターンを生成することが可能である。
【０１３８】
（システイン富裕反復タンパク（ＣＲＲＰ））
甲虫Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ由来のシステイン富裕反復抗凍結タンパクは、Ｃ−末端において延長が可能であることが示された（Ｃ．Ｂ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：１１６３７−４６）。この延長は、ＣＲＲＰモチーフ１／２／１を含む。螺旋状であるが、ベータ・シートを含む（「ベータ−ヘリックス」）抗凍結タンパクの極端な規則性は、抗凍結活性と、氷結合部位の面積との関係を調べるために系統的に探索された。ベータ・ヘリックスの、ジスルフィド結合の中心コイルである、１２−アミノ酸のそれぞれが、Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｔｈｒ氷結合モチーフを含んでいる。７コイルの親抗凍結タンパクにコイルを付加し、かつ、該タンパクからコイルを取り去ることによって、６−１１コイルを持つ、一連の構築体が作製される。これらの抗凍結体のミスフォールド形は、氷アフィニティー精製によって除去し、各構築体の比活性を正確に比較した。比較される濃度に応じて、６から９コイルに進むと、抗凍結活性に１０−１００倍の増加が見られた。
【０１３９】
我々の関心は、保存性のもっとも低いアミノ酸位置においてランダム化され、選ばれたヒトの治療標的に対する結合剤（作用剤または拮抗剤）の選択に使用される、複数の反復列を有する抗凍結タンパクを作製することである。
【０１４０】
グラニュリン（図１０２および１０３）は、３／２／２なるＣＲＲＰモチーフを持つ天然のＣＲＲＰである（ヘリックス、図１３０−１３２参照）。各反復単位は、高いモジュール性を持ち、したがって、Ｃ−末端に複数の反復列を付加することによってコア単位を延長するのに有用であることを示す証拠が提出されている（Ｄ．Ｔｏｌｋａｔｃｈｅｖ  ら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：２８７８−８６；Ｗ．Ｆ．Ｖｒａｎｋｅｎ，ら、（１９９９）Ｊ  Ｒｅｐｔ  Ｒｅｓ，５３：５９０−７）。空気酸化されると、鯉グラニュリン１の、３０残基のＮ−末端サブドメインに対応するペプチドは、天然タンパクに観察されるジスルフィド対合を自発的に形成した。ＮＭＲによる構造解明から、このペプチド中には、定められた二次構造の存在が示された。このペプチドの構造計算から、ペプチド断片が、天然ペプチド内に形成されるものと同じ立体配置を取ることが示された。鯉グラニュリン−１の、３０残基の、Ｎ−末端ペプチドは、二つのヘアピン間ジスルフィド結合によって補強された、二つのベータ・ヘアピンが独立にフォールド形成した積層体の最初の例である。
【０１４１】
我々の関心は、保存性のもっとも低いアミノ酸位置においてランダム化され、選ばれたヒトの治療標的に対する結合剤（作用剤または拮抗剤）の選択に使用される、複数の反復列を有するグラニュリン由来タンパクを作製することである（図１０２）。
【０１４２】
反復性タンパク構造およびアフィニティー熟成：ＣＲＲＰの利点は、それらが、他の多くのドメインと違って、特定の用途に必要なだけ長くも、短くも作製することが可能であることである。したがって、これらには、同じ、または異なる標的のために、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の結合部位を付与することが可能である。
【０１４３】
ロイシン富裕タンパクおよび、他の、非システイン含有反復タンパクに対し、ＣＲＲＰの有利な点は、ライブラリーにおいて、より多くのアミノ酸のランダム化が可能であることである。これは、ＣＲＲＰのフォールド形成が、たくさんの、より多くの固定残基を必要とする疎水性コアの存在ではなく、むしろジスルフィド結合の存在に依存するためである。したがって、ＣＲＲＰのライブラリーは、より多くの変動性位置を持つ（＞５０、６０、７０、または８０％）クローンを含み、これは、可能な表面接触面積を増し、かつ、標的に対する高いアフィニティーの可能性を増す。ロイシン富裕反復性タンパク、例えば、アンキリンは、通常、末端キャップがランダム化されないために、各３３ＡＡ反復列の内の僅かに６ＡＡ、あるいは、６−反復列ドメイン当たり２４ＡＡにおいて変動するだけである。
【０１４４】
各種アフィニティー熟成法が、図１４０、１４、１４２、および１６０に示される。これらのアフィニティー熟成原理は、反復性タンパクについて説明するのがもっともよいが、本出願に記載される他の、全てのスカフォールドにも同様に適用が可能である。
【０１４５】
ＣＲＲＰのアフィニティー熟成は、異なる二つの方策：モジュール付加およびモジュール置換によって実行することが可能である。
【０１４６】
「モジュール付加法」は、比較的少数（例えば、１−３）の反復単位から始め、アフィニティー熟成の各工程でランダム化反復単位を加え、次いで、結合因子に関にして選択する。各進化サイクルにおいて、ランダム化モジュールを加え、次いでもっとも活性の高いクローンを選択する。この過程は、各サイクルにおいてタンパクのサイズを増し、一方、各延長ラウンド後、所望の結合活性について選択する。この方法は、ランダム化配列を、選択配列に変換する。
【０１４７】
「モジュール置換法」は、比較的多数（例えば、４−１０；「最終数」）の反復列から始め、各ライブラリー生成ラウンド毎に、新しい反復列（通常１−３）群をランダム化し、次いで標的結合性について選択する。この方法では、タンパクのサイズは一定である。選択されない配列（通常、固定）は、徐々にランダム化配列に変換され、これが次に選択配列に変換される。
【０１４８】
両方法とも、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の標的に対する結合アフィニティーの向上について選ばれた、大きな単一結合部位、または、複数の別々の結合部位を持つ反復性タンパクを生成する。反復列の付加は、結合部位（単複）の延長を可能とし、これは、その標的に対し単一部位で結合するドメインと比べ、より高い結合アフィニティーをもたらす。反復性タンパクドメインは、反復列を含まない短いリンカー配列を介して、他の反復性タンパクドメインに連結させることが可能である。これは、天然の反復性タンパクに観察されるものと同様の反復性タンパク組織である。天然の反復性タンパクは、短いアミノ酸配列によって縦列に連結され、かつ、その間に非反復性タンパクが点在することがしばしば起こる（Ｈ．Ｋ．Ｂｉｎｚ  ら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１４９】
しかしながら、反復性タンパクはまた、二つの結合部位の間に剛強な接続部を形成するのに用い、これらの部位が同時に標的に結合するできるようにしてもよい。別々のドメインの間に通常存在する、屈曲性のペプチドリンカーと違って、反復性タンパクによる剛強なコネクターは、より高い結合アフィニティーを生成することが期待される。結合部位の間に剛強なコネクターを創製するためのもう一つの方法は、それ自身コイル形成するプロリン富裕配列、またはコラーゲン様配列を用いることである。
【０１５０】
アフィニティー熟成は、単一の連続配列、または複数の不連続配列を標的として、ＤＮＡレベルにおける（部分的）ランダム化によって実行される。ＤＮＡランダム化の順序工程も、ＤＮＡレベルにおいて不連続的か、連続的（すなわち、順序的）であってもよい。タンパクレベルでは、突然変異発生も、用途に応じて、不連続的、または連続的であってもよい。例えば、螺旋状反復タンパクでは、タンパクの同じ側に連続的結合表面を実現するために、ＤＮＡおよびタンパク鎖レベルにおいて不連続的熟成を使用するのが典型的と考えられる。これは、タンパクの表面ではランダム化区域は連続的であるにも拘わらず、ランダム化アミノ酸が、アルファ鎖バックボーンおよびＤＮＡレベルにおいて不連続的であるために不連続的と呼ばれる。他方、順序的熟成は、ＤＮＡレベルおよびタンパク・バックボーンレベルにおいて連続的な、一組のアミノ酸について、螺旋の全ての側面がランダム化され、標的に対する結合部位となり、この反復性タンパクと標的タンパクの間に、より複雑な三次元相互作用を可能とするように、ランダム化することを含む。不連続（ＤＮＡレベル）アフィニティー熟成の場合は、ランダム化配列の間に挟まる、一般的固定配列が、一ライブラリー内において、または、複数のライブラリー間において、制限酵素または重複ＰＣＲによる組み換えを実行するのに利用され、これによって、結合アフィニティーの向上についてスクリーニングされるクローンの数を増す、さらに新たな工程が提供される。
【０１５１】
アフィニティー熟成にとって好ましい方法は、配列のランダム化であり、これは、スカフォールドタンパクの一区域を第１（部分的）ランダム化すること、最良クローンのプールを選択すること、この選択されたプールのクローンにおける第２区域をランダム化すること、最良クローンの（第２）プールを選択すること、この第２プールのクローンの第３区域をランダム化すること、および、向上クローンの（第３）プールを選択することを含む。これは、例えば、図１３６に示される。好ましい方法は、三つの突然変異発生区域（ｎ−項、中間、およびｃ−項）を非重複性とすることである。任意の順序の突然変異発生を使用することが可能であるが、ｎ−項／中間／ｃ−項、およびｎ−項／ｃ−項／中間が、好ましい選択である。突然変異発生区域の間の、１５−２０ｂｐの、突然変異非発生スカフォールド配列はそのまま放置しておくのが有用である。その配列が、Ｋｕｎｋｅｌ型突然変異発生においてオリゴヌクレオチドのためのアニール区域として役立つからである。この方法は、以前に突然変異発生した配列の、合成的な、突然変異の再発生、これは、通常、クローンの配列決定、配列同士の整列、ファミリーモチーフの抽出、およびこれらのモチーフをコードするオリゴの再合成、および新規合成ライブラリーの創製を含む手間のかかるプロセスである、を回避する。好ましい方式は、ランダム化が、各位置において、多くは天然に見られるアミノ酸を生成するようにコドン選択を用いることである。
合成ＣＲＲＰ
合成ＣＲＲＰは、モチーフＣａＸ０−ｎＣｂＸ０−ｎＣｃＸ０−ｎＣｄＸ０−ｎＣｅＸ０−ｎＣｆＸ０−ｎＣｇＸ０−ｎＣｉＸ０−ｎｎＣｊＸ０−ｊから成る。式中、Ｃは、定められた位置におけるシステイン残基であり、ｘは、各個別のシステイン間における０と１２の間の、任意の数のアミノ酸である。これらの設計は、ＣＲＲＰモチーフによって、例えば、個別のジスルフィド結合間のシステイン距離、ジスルフィド結合の第１システインから、次のジスルフィド結合の第１システインまでのシステイン距離によって定義される。ライブラリー設計には下記のモチーフが有用である。３／４／１、ＣａＸ０−ｎＣｂＸ０−ｎＣｃＸ０−ｎＣｄＸ０−ｎＣｅＸ０−ｎＣｆＸ０−ｎＣｇＸ０−ｎで、ＣａがＣｄとジスルフィド結合を形成する；（３，４）（１，４）／２、ＣａＸ０−ｎＣｂＸ０−ｎＣｃＸ０−ｎＣｄＸ０−ｎＣｅＸ０−ｎＣｆＸ０−ｎＣｇＸ０−ｎで、ＣａがＣｄとジスルフィド結合を形成し、ＣｃがＣｇとジスルフィド結合を形成する；（４／２），（３／１）、ＣａＸ０−ｎＣｂＸ０−ｎＣｃＸ０−ｎＣｄＸ０−ｎＣｅＸ０−ｎＣｆＸ０−ｎＣｇＸ０−ｎで、ＣａがＣｅとジスルフィド結合を形成する；（３，５）／（１，２）／２、ＣａＸ０−ｎＣｂＸ０−ｎＣｃＸ０−ｎＣｄＸ０−ｎＣｅＸ０−ｎＣｆＸ０−ｎＣｇＸ０−ｎで、ＣａがＣｆとジスルフィド結合を形成し、ＣｂがＣｅとジスルフィド結合を形成し、ＣｄがＣｉとジスルフィド結合を形成する；（３，５，７）／（１，２，３）／３で、ＣａがＣｆとジスルフィド結合を形成し、ＣｂがＣｅとジスルフィド結合を形成し、ＣｃがＣｊとジスルフィド結合を形成する；（４，５）／（１，４）／２で、ＣｄがＣｉとジスルフィド結合を形成し、ＣｆがＣｊとジスルフィド結合を形成する（図１２５−１３３を参照）。
【０１５２】
既知の空間配置を持つジスルフィド結合を含む単一ドメインファミリーから始め、Ｎ−、またはＣ−末端においてこのモチーフを延長することによって新規ＣＲＲＰを設計することが可能である。二つの反復単位の間にジスルフィド接続性を実現するには、新たに二つのシステイン残基を、部位特異的突然変異発生によって導入する必要があるかもしれない。１−４  ２−５  ３−６の空間配置は、小型のシステイン富裕ミクロタンパクにおいてもっとも一般的に観察されるジスルフィドの空間配置である。この空間配置を持つドメインは、関連空間配置を持つ反復列を加えることによって延長することが可能である。システン残基は、システイン１およびシステイン２の間の位置、およびシステイン６の後に導入される。さらに２個のシステインの存在下においても、１−４  ２−５  ３−６の空間配置を形成しようとする強い傾向がある。なぜなら、構造スカフォールドはこの空間配置しか許容しないからである。
【０１５３】
異なる構造体の接続：図１４６、１４７、１４８を参照されたい。ミクロタンパク分子は、様々の異なるやり方で互いに連結することが可能である。例えば、１−４  ２−５  ３−６の空間配置を持つＣ５Ｃ５Ｃ５Ｃ５Ｃ５Ｃは、別の同様のモジュールに対してリンカー無しに連結されて、Ｃ５Ｃ５Ｃ５Ｃ５Ｃ５ＣＣ５Ｃ５Ｃ５Ｃ５Ｃ５Ｃモジュールを生成することが可能である。モジュールは、構造的ＰＰＰＰリンカーによって連結されてもよい。さらに、二つのモジュールを連結するために、システイン富裕反復性モジュールを用いることも可能である。グラニュリン様反復単位は、一般的反復性モチーフ（ＣＣ５）ｎとのリンカーとして役立つ。さらに、１３  ２４の空間配置を持つ二つのジスルフィド含有リンカー、およびモチーフ（Ｃｘ０−ｎＣｘ０−ｎＣｘ０−ｎＣ）ｎによって融合を実現することも可能である。式中、ｘは、０からｎ＝１２までの、任意の数のアミノ酸である。抗凍結タンパク反復列（２ＣＡ５ＣＢ３）ｎであって、ＣＡおよびＣＢの間にジスルフィド結合が形成されるタンパクを、異なるモジュール間のコネクターとして、または、ミクロタンパクを他のタンパクに接続するために使用する。
【０１５４】
典型的合成反復性タンパクの設計：反復性タンパクの天然の設計は、コアモチーフに付加される、単一の建設ブロックの反復である。この過程は、インビトロ進化において模倣することが可能である。抗凍結タンパクは、Ｎ−末端におけるキャップとして、典型的３−ジスルフィドミクロタンパクを含む（ＣａｘｘｘｘＣｂｘｘＣｃｘｘｘＣｄｘｘＣｅｘｘＣｆｘｘｘｘ）。この構造体の一部を、分子生物学を用いて、この配列のＣ−末端に付加することが可能である。反復単位を選ぶには二つの可能性がある：ｘＣｂｘｘＣｃｘｘｘＣｄｘｘＣｅｘ、またはｘｘＣｂｘｘＣｃｘｘｘＣｄｘｘＣｅｘｘＣｆｘのいずれかを、Ｃ−末端に連続的に付加して、新規反復性タンパクを設計することが可能である。図１０４を参照されたい。
【０１５５】
ＣＸＣＸＣＣＸＣＸＣモチーフによる合成スカフォールドの設計：多くのミクロタンパク・ファミリーが、ジスルフィド空間配置１−４  ２−５  ３−６を持つ、下式：
Ｃｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘ）Ｃｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘ）ＣＣｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘ）Ｃｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘ）Ｃから成るモチーフを含む。この一般的共通配列がライブラリー設計に使用される。間隔は、さらに別のシステインおよびジスルフィド結合を含んでもよい。各ジスルフィド結合間の間隔は、平均１３−１５である。基本的モチーフの外に加わる余分なシステイン・ペアは、青または緑のイタリック体で示され、連結されるシステインは同じ色を共有する。
【０１５６】
【化１２】
2009509535.tif 000010
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔは、間隔６、５、０、３を持つ４４メンバー、および間隔６、５、０、４を持つ５７メンバー、および間隔６、６、０３を持つ３４メンバー、および間隔６、６、０、４を持つ２７メンバーを含む。最後の間隔（Ｃｙｓ５とＣｙｓ６の間の）は、４から６アミノ酸まで変動してもよい。
【０１５７】
システイン距離パターン（ＣＤＰ）：天然のタンパクをファミリーに分類するためにもっとも一般的に使用される方法は、タンパク配列の相同性に基づく。これらのアルゴリスムの目的は、多くの場合、進化距離を反映する近縁性に基づいてタンパク配列をグループ分けすることである。これらのアルゴリスムは、各位置について、同一マッチするか、または化学的に近縁なアミノ酸の数を最大とするように配列を整列させる。しばしば、整列を向上させるためにギャップが導入される。有意な配列変動を可能とし、したがって、新規結合タンパクのための基礎となるタンパクスカフォールドを特定するために、一般に、このような相同性に基づく配列ファミリーが用いられる。しかしながら、相同性に基づくファミリーは、近縁ミクロタンパク間には配列保存性の程度が低いために、ミクロタンパク系ライブラリーの設計には限られた有用性しか持たない。ごく近縁なミクロタンパクの配列は、そのシステイン残基の保存を除いては、ほとんど配列相同性を持たない場合が多い。相同性に基づく探索アルゴリスムによるギャップの導入は、突然変異残基、および、タンパク構造および／または安定性に重要な残基の特定において決定的な、ミクロタンパク配列の整列を複雑にする。ミクロタンパクは、極端に高密度のシステイン残基を有することで、他の多くのタンパクとは異なるので、この群は、システイン間隔をキー・パラメータと位置づけ、同じシステイン距離パターン（ＣＤＰ）を共有するミクロタンパクをまとめてクラスターとすることを可能とする整列法を必要とする。したがって、システイン距離クラスターとは、同じ数のアミノ酸によって隔てられるいくつかのシステイン残基を有するタンパク配列群である。あるシステイン距離クラスターの全メンバーの配列は、全てのクラスターメンバーは同じ合計長を持つので、整列される。さっらに、配列内の各位置の平均アミノ酸組成を簡単に計算することができる。これは、ミクロタンパク・ライブラリーを構築する際、変動する可能性のある残基の特定ばかりでなく、変動の程度の特定までごく簡単なものとする。同じＣＤＰを持つミクロタンパクの大型クラスターは、ミクロタンパク・ライブラリーを設計するために特に有用である。なぜなら、該クラスターは、各位置における天然の変動について詳細な情報を提供するからである。
【０１５８】
ＣＤＰクラスターは、通常、近縁ミクロタンパク配列のサブセットである。多くの場合、ＣＤＰクラスターのメンバーは全て、相同タンパクから成る同じファミリーの出自である。しかしながら、複数のタンパクファミリー由来のメンバーを含むＣＤＰクラスターもある。一例は、５１メンバーを含む、ＣＤＰクラスター３＿５＿４＿１＿８（場合によってＣ３Ｃ５Ｃ４Ｃ１Ｃ８、またはＣｘｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘＣｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘＣとも表示される）である。このクラスターでは、あるものはファミリーＰＦ００００８から、別のあるものはＰＦ０７９７４から得られる。このＣＤＰを持つ配列は、（原理的には）、両方の構造を取ることが可能である。これらの構造的に異なるＣＤＰは、構造進化を実現するために好ましい。
【０１５９】
ＤＢＰは直接調節することが難しいが、ＣＤＰは遺伝子合成によって簡単に調節されるので、ＣＤＰは、ＤＢＰおよび構造を調節するのにもっとも好ましい方法となっている。
【０１６０】
有用ＣＤＰの特定：有用ＣＤＰは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔまたは翻訳ＥＭＢＬ（Ｔｒｅｍｂｌ）などのタンパク配列データベースを分析することによって見つけ出すことが可能である。Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰｆａｍからの情報を組み合わせ、システイン結合パターンを注記するデータベースが、Ｇｕｐｔａによって記載されている（Ｇｕｐｔａ，Ａ．，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，１３：２０４５−５８）。このデータベースは、ミクロタンパクに典型的な、高いパーセンテージのシステイン残基を含むタンパク配列を求めて探索することが可能である。連続または隣接システイン残基間の距離を計算し、ＣＤＰを得、次いで多数回出現するＣＤＰを探索することが可能である。多くの天然配列が同じＣＤＰを共有する場合、ＣＤＰは特に興味深い。なぜなら、これは、ＣＤＰが多様な配列を許容することを示すからである。有用なＣＤＰは、隣接システイン残基間の距離が長い（「長いループ」）のを避ける。なぜなら、長距離ループは、プロテアーゼによる攻撃を受け易く、かつ、ＭＨＣ分子の裂け目に結合するほど長いペプチドを生成する可能性がより高くなるからである。特に興味深いのは、距離がどれも１５、１４、１３、１２、または１１アミノ酸を超えないＣＤＰである。より好ましいのは、隣接システイン間の距離がどれも１０、９、または８残基を超えないＣＤＰである。特に興味深いのは、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、バリン、メチオニン、イソロイシンなどの疎水性アミノ酸を少量しか含まないファミリー由来のＣＤＰである。これらの疎水性残基は、典型的タンパクでは約３４％の頻度で起こり、非特異的疎水性結合と関連する。特に興味深いＣＤＰは、疎水性残基を３０、２８、２６、２４、または２２％未満しか持たないメンバーをたくさん含む。好ましいＣＤＰおよび個別メンバーは、疎水性残基を、２０、１８、１６、１４、１２、１０％未満、場合によっては８または６％しか含まない。特に興味深いのは、個別メンバーが大きな配列多様性を示すＣＤＰである。表２は、ミクロタンパク・ライブラリーのきわめて有用なスカフォールドとして役立つことが可能なＣＤＰの例である。［表３］は、もっとも好ましいＣＤＰを示す。
【０１６１】
【化１３】
2009509535.tif 000011
【０１６２】
【化１４】
2009509535.tif 000012
「メンバー」と表示されるコラムは、Ｇｕｐｔａ（Ｇｕｐｔａ，Ａ．，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，１３：２０４５−５８）によって記載されたデータベースにおいて特定された、特定ＣＤＰを持つ天然配列の番号を示す。‘ｎ’は、そのクラスターにおけるジスルフィド数である。「ドメイン長」は、ＣＤＰのアミノ酸残基数（第１ｃｙｓから最終ｃｙｓまで）である。コラムｎ１からｎ７は、クラスターのシステイン残基を隔てる、非システイン残基の数を掲げる。ｎ２＝６は、Ｃ２およびＣ３の間のループが、両システインを除いて、６ＡＡ長であることを意味する。
【０１６３】
【化１５】
2009509535.tif 000013
【０１６４】
【化１６】
2009509535.tif 000014
「メンバー」は、Ｇｕｐｔａ（Ｇｕｐｔａ，Ａ．，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，１３：２０４５−５８）によって記載されたデータベースにおいて特定された、特定ＣＤＰを持つ天然配列の番号を示す。‘ｎ’は、そのクラスターにおけるジスルフィド数を示す。「ドメイン長」は、ＣＤＰのアミノ酸残基数（第１ｃｙｓから最終ｃｙｓまで）を示す。コラムｎ１からｎ７は、クラスターのシステイン残基を隔てる、非システイン残基の数（「ループ長」）を掲げる。
【０１６５】
システイン間ループの内のあるものは、サイズを固定させる必要があるが、一方、別のループは、ある程度の長さの変動性を受容することが可能である。天然配列のファミリーに見られる長さの多様性は、特定のループにおいてどの程度の長さ変動が受容可能であるのかを評価する一つの目安となる。このように許容される長さ変動は、マイナス１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸からプラス１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の範囲に亘る。
【０１６６】
ＤＢＰの指向性進化、およびクローンプールのタンパクフォールド：多数のジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）は、非ＨＤＤタンパクには、たとえそれが多くのジスルフィドを持つものであっても利用不可能であるが、ＨＤＤ（「高ジスルフィド密度」）タンパクの最適化のためには使用することが可能な、さらにもう一つの自由度である。一つの要因は、大型のタンパクでは、ジスルフィドは互いに遠くに隔てられるので、他の固定配列がタンパクを折りたたみ、それによって、システイン同士が互いに局所的に高濃度となるように、かつ適切な方向性をもって近づけられる場合を除いては、反応する可能性がまず無いということである。したがって、システインは、大型のタンパクのフォールド形成では比較的小さな役割しか果たしていない。疎水性コアを持つ大型タンパクは、３Ｄ構造の創出に与る、たくさんの側鎖接触点を持つ傾向がある。この、Ｈｕｂｅｒｔ  Ｙｏｃｋｅｙ（１９７４）によって定義される、いわゆる高情報含量解決策では、ＤＢＰは、統計学的に場所的に固定され、ＤＢＰの進化的変化はほとんど起こりえない。構造的進化は、低情報含量のタンパク、すなわち、構造および機能のために必要とされる残基をほとんど持たないタンパクにのみ利用可能であると考えられる。ランダム突然変異発生に対する感受性と定義される、タンパクの情報含量は、該タンパクの進化年齢の関数として単純に時間と共に増加するものではない。例えば、遺伝子が二重になると、二つのコピーの内の一方は、もしもその遺伝子について一コピーしかなかったならその情報含量は高くなると予想されるのに、自由に進化し、その情報含量は効果的にきわめて低い。情報含量が低い状況では、多数のアミノ酸の突然変異、および大きな構造変化が起こり得、それらの変化が単一コピー遺伝子に起こったならば、致命的と考えられる。あるタンパクの情報含量はまた、考慮の対象とされる特異的機能的側面に依存する。ある機能（すなわち、触媒作用）は、別の機能（すなわち、９ＡＡ  Ｔ細胞エピトープに基づくワクチン）よりもはるかに高い情報含量を持つ。冗長性は、有毒動物では一般的であり、通常、有毒動物はそれぞれ、その毒の中に、同じ、または異なる遺伝子から得られた１００種を超えるトキシンを持つ。冗長性は、同じ遺伝子の複数コピーとして、および／または、多様なトキシンをコードする種々の遺伝子の単一コピーとして、ＨＤＤタンパクの急速な進化を助けるようである。
【０１６７】
標的に対する結合に関して選択されたクローンのプールは、その結合機能を与えるドメインのほんの一部（サブ、またはミクロ・ドメイン、または１本以上のループ）を持つだけでよい。典型的な１０ｅ１０ライブラリーの最良クローンでも、平均して、完全に最適化されたアミノ酸はほんの約７個にすぎない。これは、１サイクルのパンニングで付加される最大（平均）情報含量は、ライブラリーのサイズ（すなわち、１０ｅ１０）だからである。それ以上に情報含量を集積するためには、一般に、複数サイクルのライブラリー生成およびスクリーニングが必要とされる。１０ｅ１０の３サイクルは、理論上、最大１０ｅ３０の情報含量をもたらすことになるが、通常、この数字は、加算性に対する実地の限界によってそれよりもはるかに少ないと予想される。通常、ドメインのアミノ酸の多くは、標的に直接接触することはせず、全部ではないにしろ、種々のアミノ酸によって置換されることが考えられる。構造的進化の一つの目的は、非結合部のＤＢＰを進化させて、標的に結合する部分のアミノ酸配列をまったく変えることなく、より高いアフィニティーの標的結合を実現する修飾構造をもたらすことである。
【０１６８】
好ましい方法は、各単一配列から、複数の構造の形成を奨励することである。これを、第１サイクルで行うか、または、１サイクル以上のパンニングで多様性が低下した後に行う。それによって、それぞれが異なるＤＢＰおよび構造を取ることが可能な、各ファージクローンの多数コピー（＞１０ｅ４）が得られる。パンニング前にライブラリーの構造の多様性を増すための一つの方法は、ライブラリーを１０−３０秒加熱した後、部分的にフォールド形成した構造の全てを除去するために、ライブラリーに高濃度の酸化剤を急激に添加することである。タンパクがアニールし、そのフォールド形成経路を探索する機会を持つ前に、ジスルフィドを急激に形成させることによって多様性の増加が得られるはずである。もっとも得られたフォールドの平均的品質は、この方法では低下するおそれがあるが。均一なフォールド形成を実現するためには、反対の方法が使用され、これは、通常、透析によって還元剤をゆっくりと除去することを含む。これによって、ゆっくりしたフォールド形成およびゆっくりしたスルフヒドリル酸化が得られる。この方法はまた、オリゴヌクレオチドのアニーリングと同様の、温度のゆっくりした低下を含む。ＤＢＰ−多様化を、第１ラウンドのパンニングでライブラリーに適用する場合、大きなライブラリーの余剰分、例えば、異なるクローン数（通常、１０ｅ９−１０ｅ１０）よりも１０ｅ５倍たくさんの粒子を創製することが重要である。これは、各配列から創製される可能性のある、大きな数の、異なる構造をカバーするためである。
【０１６９】
ＤＢＰの多様化：ＤＢＰのスペクトラムおよび分布は、同じライブラリーの分液を、多様な、種々の条件に暴露することによって多様化することが可能である。これらの条件として、ある範囲のｐＨ、温度、酸化剤、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（ベータメルカプトエタノール）、グルタチオン、ポリエチレングリコール（分子密集化し、散発的ＤＢＰをより高頻度にする）などが挙げられる。
【０１７０】
複数スカフォールドライブラリー：高いアフィニティーで標的に結合するミクロタンパク・ドメインを特定するために、下記の３工程プロセスに従って、複数スカフォールドライブラリーが用いられる。
【０１７１】
１．  複数スカフォールド、またはシステイン距離パターン（ＣＤＰ）、および各種ランダム化スキームに基づいてサブライブラリーを構築する。
【０１７２】
２．  対象標的に対しいくつかのサブライブラリーをパンニングすることによって初回ヒットを特定する。これは、各ライブラリーを別々にパンニングすることによって行ってもよいし、あるいは、サブライブラリーの混合物をパンニングして行ってもよい。
【０１７３】
３．  突然変異発生および選択またはスクリーニングを含む反復過程であるアフィニティー熟成によって初回ヒットを最適化する。
【０１７４】
複数スカフォールドライブラリーの使用は、個々のスカフォールドに注目する従来の方法とは大きく異なる。単一スカフォールドライブラリーでは、大抵のライブラリーメンバーは、類似の全体構造、すなわちフォールドを共有するが、主に、そのアミノ酸側枝において異なる。単一スカフォールドライブラリーの例は、フィブロネクチンによるもの（Ｋｏｉｄｅ，Ａ．，ら、（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２８４：１１４１−５１）、リポカリン（Ｂｅｓｔｅ，Ｇ．，ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１８９８−９０３）、またはタンパクＡ−ドメイン（Ｎｏｒｄ，Ｋ．，ら、（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５：７７２−）によるものであった。さらに別の、多くのスカフォールドがＢｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，ら、（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１２５７−６８に記載されている。ある場合では、単一スカフォールドライブラリーは、個別のループ長において僅かな差を示すメンバー、例えば、抗体ライブラリーにＣＤＲを含んでいた。単一スカフォールドライブラリーは、限られた量の形状空間しかカバーしない傾向がある。そのため、低アフィニティー結合子しか得られないことがよくある。これらの分子は、その標的の形状にぴったりと合致しない。しかしながら、接触区域を形成するアミノ酸は、形状の相補性の不足を部分的に補うように最適化されてきている。スカフォールドと標的の間の接触区域におけるアミノ酸の多様性を改善するため、多くの公刊物が、ライブラリーサイズを増大させる試み（すなわち、リボソームディスプレイ、組み換えファージディスプレイ）を記載する。しかしながら、このプロセスは、通常、結合タンパクにおける外部の、ＣＤＲ様ループにおける小さな変化を強調するが、ドメインの全体構造には影響を及ぼさない。固定スカフォールドのアフィニティー熟成が、全体フォールドおよび結合タンパクの構造に大きな変化をもたらした例はない。大きな変化が起こった稀な場合では、そのようなクローンは一般には除去される。それらの免疫原性および製造性質が予測不能と考えられるからである。
【０１７５】
複数スカフォールドライブラリーは、全体構造が大きく異なる、多様なスカフォールド（多くの場合、無関係の）を有するクローンを含む。一般に、各ＣＤＰは、異なる形状を表し、各サブライブラリーは、ある特定のＣＤＰ周囲の配列空間をほとんど抽出しない突然変異集団を含む。（それぞれが異なるＣＤＰを持つたくさんのサブライブラリーから得られる）多くの、異なる形状を有する分子を調べることによって、その構造が、標的表面に緊密に当てはまる結合タンパクを特定する機会が増す。各サブライブラリーは、ＣＤＰの周辺の配列空間に関する比較的小さいサンプルを表すにすぎないので、この過程から最適結合配列を獲得する可能性は低い。複数スカフォールドライブラリーの初回ヒットは、その標的の形状を模倣するが、ヒットと標的の間の接触面の構造は、最適以下の可能性がある。そのため、構造を大きく変えることなく特定のタンパク配列の最適化に重点を注ぐ、その後のアフィニティー熟成において、結合アフィニティーの改善が達成される可能性が高い。単純化して言うと、目的は、標的に適合する最良構造を見出し、次いで、この構造に適合する最良配列を見出し、標的に対する最適相補性を実現することである。
【０１７６】
新規スカフォールドを見つけ出すための実験法：ライブラリー設計改良のためのもう一つの方法は、多様な設計を競合させることによって、タンパク自身に、その最良解決案を計算させることである。完全にフォールド形成し、十分に発現されたタンパクを選択し、配列決定する。フォールド形成タンパクをもっとも高い割合（入力メンバーについて補正した）で持つ設計が好ましい。好ましいＣＤＰおよび配列モチーフを見出すには、いくつかの異なる方法がある。
【０１７７】
方法１：ランダムＣＤＰ、ランダム配列
ランダム空間および配列法は、天然の多様性に存在する空間または配列にはよらない、したがって、ランダム配列を受け容れる、その方法の能力に比例して、新規および既存のｃｙｓ−空間パターンを見出すことが可能である。
【０１７８】
この方法は、設計ＣＸ（０−８）ＣＸ（０−８）ＣＸ０−８）ＣＸ（０−８）ＣＸ（０−８）Ｃによって、例えば、１０ｅ１０ディスプレイライブラリーなどの広範な、開放ライブラリー作製し、次いで、アガロースゲル、大腸菌における発現を用いて、２５−３５ＡＡ全長に関して選択し、このディスプレイライブラリーから、遊離チオールカラムを用いてフォールド未形成タンパクを全て除去し（または、発現レベルについて個々のクローンをスクリーニングし）、かつ、十分に発現され、完全にフォールド形成されたタンパクをコードする２００−１０００クローンについて配列決定を行うことを含む。
【０１７９】
このライブラリーでは、距離パターンは全て近似頻度で起こる。天然タンパクに見られる間隔／距離パターンにおいて強いバイアスを見出すこと、多くの間隔パターンが新規であることが期待される。例えば、距離パターンＡが、０．０１％しかフォールド形成タンパクを許容せず、パターンＢが、１０％のフォールド形成タンパクを生成するとしたならば、パターンＢを有するクローンは、パターンＡを有するクローンよりも１０００倍より高頻度に出現するはずである。１０００クローンの配列決定は、ループ配列とは無関係に、フォールド形成能力のもっとも高い１０−３０間隔を特定するのに十分であるはずである。この方法によって見出される多くの間隔パターンは、新規である可能性が高く、これらの間隔に基づいて別々のライブラリーを作製するために使用することが考えられる。
【０１８０】
この方法によって見出される新規間隔は、通常、次の方法において、天然のファミリーにおける間隔と組み合わされる。
【０１８１】
方法２：天然ＣＤＰ、ランダム配列
１０−１００の特異的天然ファミリーのＣＤＰが、ランダムＡＡ組成物（すなわち、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＮＳ、または類似のコドン）を用いて合成され、次にライブラリーに変換され単一プールとされ、前述のようにフォールド形成および発現について選択またはスクリーニングされ、次いで、最良フォールド形成および発現クローンの配列が決定される。この方法は、ランダム配列を受容する能力について、天然ファミリーのスカフォールドのランク付けをもたらす。この方法は、より高い平均品質レベルを生成する傾向がある。これは、フォールド形成クローンの割合が、ランダムＣＤＰ法よりもはるかに高いからであるが、同じぐらいたくさんのスカフォールドという点では評価されない。
【０１８２】
好ましい間隔パターンを選択した後、フォールド形成を改善するためには、ある特異的間隔パターンにおいてどの非−ｃｙｓ残基が必要なのかを決定する。
【０１８３】
方法３：天然ＣＤＰ、天然ＡＡ配列混合物
１０−１００特異的天然ファミリーの間隔パターンを、各位置に現れる（整列で決定した場合に）ＡＡ組成物の天然の混合物を用いて合成し、次にライブラリーに変換、単一プールとし、前述のようにフォールド形成および発現について選択またはスクリーニングし、次いで、最良フォールド形成および発現クローンの配列を決定する。この方法は、最高の平均品質レベルを生成する傾向があり、フォールド形成クローンの割合が、従来法よりもはるかに高い。しかし、この方法は、自然がもう既に探索した配列空間に関する高密度探索に、多少限定される。
【０１８４】
最高品質ライブラリー（すなわち、商品標的に対しすぐに有用な）は、固定された非−ｃｙｓ残基の全てを有するが、各位置にある程度の変動を持つ天然のファミリー（天然ＣＤＰ）を合成することによって得られると考えられる。次に、十分にフオールド形成したクローンの配列を分析することによって、固定残基の内のどれが真に必要であるのか、どの残基において変動が許容されるのかが分かると考えられる。
【０１８５】
構造進化：ジスルフィド含有タンパクがフォールド形成して、はっきりと定められた３−Ｄ構造へ変換されるのは、主に、インビボでもインビトロでも、現在の還元性環境の性質に依存する。例えば、ジスルフィド結合の還元は、タンパク構造の完全な喪失をもたらし、構造の維持におけるジスルフィド結合の重要性を強調する。その反対極では、完全に還元され、フォールドの解けたタンパクのフォールド形成時には、フォールド形成時近接するジスルフィド同士の酸化によって理論的に多数のジスルフィド異性形が可能である。４個のシステインを含むタンパクでは、理論的に３通りのジスルフィド異性形、６個のシステインでは１５種の異性形、８個のシステインでは１０５種の異性形が存在する。このような多様ではあるが、多くの場合非生産的異性形も、タンパクのフォールド形成過程で観察されるが、天然の立体配置では、通常、システイン対合の内ただ一つだけが代表とされる。これが、インビトロのフォールド再形成実験において、ジスルフィド異性体形成が、多くの研究者によって重大問題と見なされる理由である。一方、ジスルフィド富裕ミクロタンパクの構造多様性の進化のために、ジスルフィド異性体形成を利用することが可能である。小型であり、かつ、高いジスルフィド含量を持つために、これらのタンパクは、折りたたまれた立体配置を維持するために、システインの共有結合のみに依存することが多い。多くのミクロタンパクは、大型タンパクのフォールド形成において一般的基礎力と見なされる疎水性コアを完全に欠如する。それぞれ異なるジスルフィド異性形が、ミクロタンパクファミリー、例えば、ソマトメジンＢおよび蛇のコノトキシン（Ｙ．Ｋａｍｉｋｕｂｏ，ら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：６５１９−３４；Ｊ．Ｌ．Ｄｕｔｔｏｎ，ら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：４８８４９−５７）の単一メンバーにおいて実験的に観察されている。しかしながら、これらの公刊物は、複数の異性形の存在を、克服すべき問題点として記載しており、タンパク設計に利用すべき機会としては見ていない。したがって、ミクロタンパクの構造進化の駆動力としてジスルフィド異性形形成を使用するための、一般的に適用が可能な概念および実験手順の開発が可能とされる。
【０１８６】
ジスルフィドシャッフリングによる構造進化：下記の文節は、構造進化のためにジスルフィド異性形を利用する、特定の実験法を示す。特定のミクロタンパクに融合されたファージ粒子の分泌後、混合物を、ミリモル濃度の還元グルタチオンとインキュベートすることによって、これらの粒子を高度の還元条件に暴露して、レドックス活性、ジスルフィド含有トリペプチドを生成する。次に、遊離チオールの空気酸化を防ぐために、ミリモル濃度のＥＤＴＡを含むバッファーにおいて、ファージ粒子を還元剤から精製する。このライブラリーは、多数の、還元され、構造的に多様なポリペプチド鎖を含む。これらの、異性形の還元された混合物を接触させた後、ライブラリーを、標的結合の際、酸化条件、例えば、ミリモル濃度の酸化されたグルタチオンに暴露し、そのチオールの酸化によって好適なミクロタンパク立体配置に固定する。この方法は、最初に、その還元状態において標的と相互作用を持ち、次いで、急速な酸化によって結合立体配置に固定されたミクロタンパク結合因子を選択的に選び出す。選ばれたミクロタンパクプールは、標的タンパクに対し形状として相補的であり、このプロセスは、ジススルフィド依存性標的誘発フォールド形成と呼ばれる。最良結合因子が選択され、指向性進化（突然変異発生およびパンニング）の、さらに追加のサイクルに暴露され、最終的に、標的独立的なやり方で、すなわち、所望の立体配置を誘発するのに標的はもはや必要でなくなるので、タンパクの製造がよりやり易くなるやり方で、活性の高い、十分酸化された立体配置が実現される。
【０１８７】
別法として、ファージライブラリーは、ジスルフィドシャッフリングを可能とするために、中間レドックス電位を持つバッファーに暴露される。これは、様々な比率の酸化および還元グルタチオンを有するバッファー組成物を選択することによって簡単に実行される。これによって、システイン残基のサブセットの部分的酸化、およびそれに続くジスルフィドシャッフリング、例えば、既存のボンドの破壊と、多くのジスルフィド結合の集積に好都合となる再形成が可能となる。したがって、この条件下では、多くの異なる構造的組み合わせ（ある任意のミクロタンパクのシステイン残基数に依存する）のプールが存在する。次に、もっとも強力なクローンが選択され、さらにもう１ラウンドのジスルフィドシャッフリングに暴露される（アミノ酸配列の最適化付きで、または無しで）。
【０１８８】
ジスルフィド結合を介する標的との共有結合：長く保持されてきた考えとは違って、最近の研究では、ジスルフィド結合の特異的還元は、細胞外環境で起こることが示されている（Ｐ．Ｊ．Ｈｏｇｇ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，２８：２１０−４）。内皮細胞は、トロンボスポンジン１と特定することが可能な還元性活性物を上清に分泌することが示された。このトロンボスポンジン１は、カルシウム結合ドメインにおいてレドックス活性を持つチオールを有する糖タンパクである（Ｊ．Ｅ．Ｐｉｍａｎｄａ，ら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ，１００：２８２３−８）。注目すべきことに、トロンボスポンジン１の遊離チオールは、分子間ジスルフィド結合を還元することによって、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ因子の接着タンパクの長さを調節する。この所見は、ジスルフィド含有標的タンパクに対する、新規ミクロタンパクを共有的に連結するの利用することが可能である。方法は、標的タンパクのジスルフィド結合の近傍に結合する、部分的に還元された、レドックス活性を持つミクロタンパクを選択することになると考えられる。例えば、標的タンパクに対する結合後、ミクロタンパク変種のファージディスプレイ・ライブラリーについて、酸化条件下での洗浄には耐性を示すが、還元条件下での洗浄には特異的に溶出されるように選択が行われる。したがって、タンパク進化の際、ミクロタンパク構造を安定化する、あるジスルフィド結合は形成されるが、一方、別のあるものは、レドックス活性遊離チオールの選択のために、捨てられる。
【０１８９】
構造多様性の進化とは、ある特異的クローンによって経験される構造の変化を指す。構造変化は、通常、配列変化に依存するが、二つの同一配列であっても、異なる構造を取ることが可能である。構造の差は、ジスルフィド結合パターン、またはフォールドレベルでも起こり得るが、これは、一般に、ループ長における構造的に著明な変化による。構造進化は、構造の多様性（例えば、多くの複数スカフォールドライブラリーによって使用される）とは異なる。後者の場合、複数のスカフォールド構造が使用されるが、各クローンは常に、その親配列の構造を取る。構造進化では、各クローンは、親配列とは異なる構造を有することが可能である。
【０１９０】
図１５５は、優勢３ＳＳ結合パターン（１８の異なる天然ファミリー）、および、一工程でそれから創製されるジスルフィド変種を示す。天然ファミリーの多くは、優勢３ＳＳパターン（１４  ２５  ３６）の１工程以内にある。図１５５はさらに、既存のジスルフィドのいずれも変えることなく、優勢３ＳＳパターン（１４  ２５  ３６）に１ジスルフィドを加えることによって創製される４ＳＳ変種を示す。天然の４ＳＳ結合パターンの内の１１／１５は、３ＳＳジスルフィド結合のいずれも破壊することなく、優勢３ＳＳパターンに１ジスルフィドを加えることによって獲得することが可能である。合計が１０５通りであるので、データは、既存の３ＳＳタンパクに対するジスルフィドの添加に向けて強力な優先的指向性のあることを示唆する。この分析によって、この逆、すなわち、４ＳＳタンパクからジスルフィドを取り去って３ＳＳタンパクを創製することが好ましい経路であるかどうかについても解答が得られると思われる。データベースの不完全性がこの結果に影響を及ぼさない限り（可能である）、１４  ２５  ３６、および、１ジスルフィドの付加によって得られる、その４ＳＳ誘導体は好ましいスタート点となるようである。
【０１９１】
ミクロタンパク構築法：この構築法の目的は、標的に対する結合タンパクの段階的アフィニティー熟成を実現することである。各サイクルにおいて、先行選択サイクルで得られた産物に、一対のシステイン、プラス、ランダム配列（通常、新規ループ）を加えてライブラリーが創製され、次いで、ライブラリーパンニングを行って、標的に対し最高のアフィニティー、または活性を持つクローンを選抜する。スタート点は、単一配列であってもよいし、あるいは、配列プールであってもよく、開始点のランダム区域の配列は、既知、または未知でもよい。
【０１９２】
スタート点としての１−ジスルフィド（‘１ＳＳ’）の創製：二つ以上のジスルフィドを有する新規ミクロタンパクを、構築法を用いて、単一ジスルフィド含有タンパクから創製することが可能である。一つの構築法は、二つの固定システイン残基（１−ジスルフィド、すなわち‘１ＳＳ’タンパクのための）を含むタンパクから始める。要すれば任意に、このタンパクは、好ましい（通常、天然の）ジスルフィド結合パターンの一ループの中に認められるものと同じシステイン間隔または長さ（「スパン」と呼ばれる、システインは除く）を持ってもよい。このような相似性は、既存の２ＳＳ、３ＳＳ、４ＳＳ，またはさらに高次のスカフォールドへの、１ＳＳペプチドの移植を容易にする。１ＳＳライブラリーのスパンは、通常、０から２０アミノ酸長であるが、好ましくは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５であり、さらに好ましくは、７、８、９、１０、１１、１２であり、理想的には９、１０、１１アミノ酸長である。前記システインペアの外側（すなわち、ループまたは「スパン」の外側）の残基に対しさらにランダム化が行われてもよい。初期の１ＳＳタンパクは、通常、システイン間において完全に、または部分的にランダム化されるが、時に、フォールド形成を行う、または標的分子（単複）に対しアフィニティーを持つ固定アミノ酸（システイン以外の）を含むことがある。
【０１９３】
１ＳＳから２ＳＳまたはさらに高次のスカフォールドの構築：以前に選択された１ＳＳタンパクを熟成させる一つの方法は、固定タンパクに、あるいは、ライブラリーとして種々の好ましい位置に、二つの新規ｃｙｓ残基を設けることである。通常、この二つの新規システイン、および新規ループに側接する残基はランダム化される。
【０１９４】
偶数のシステインを有するタンパクは、毒性を持ち、および／または、発現が低い傾向があり、発現宿主によって効率的に排除される。したがって、たとえランダムな数のシステインをコードしても、偶数のシステインをコードするＤＮＡ配列のみが、機能的ファージ粒子として発現される。したがって、以前に選択された１ＳＳペプチド（単複）（プール）を、２ＳＳペプチド（単複）（プール）に拡大する一つの方法は、単一の、第３固定システイン、および、それより大きな（かつ変動する）数のランダム残基、その内のいくつかは、Ｃｙｓ残基をコードすることが統計的に期待される、を有するライブラリーを創製することである。これらのランダム位置のある既知の割合が、システイン残基をコードし、ファージ増殖によって奇数システインを有する配列が除去された後、第２ペアシステインを有する２ＳＳタンパクは、ファージライブラリーの＞５０％、好ましくは＞６０−８０％、場合によっては＞９０−９５％を構成する。この新規システイン（単複）および／または新規ランダム化区域は、開始タンパクのＮ−末端か両末端、または、該タンパクのＣ−末端か両末端、あるいは、比較的一般的ではないが、開始タンパク配列の内部に存在してもよい。ジスルフィド結合パターンは、構築過程において変化することも可能である。元のジスルフィド結合（単複）は、異なるシステインを連結するジスルフィド結合によって置換されてもよ（新規ＤＢＰ）。
【０１９５】
延長法：標的に結合するタンパク（任意の長さ、またはジスルフィド数を持つ）は、それらを、ランダム化ライブラリー配列に融合させることによって延長することが可能である。配列は、通常、いくつかのランダム位置によって隔てられた、一（またはそれ以上）ペア（単複）の、任意に変動する間隔を有するシステインを含む。このようなタンパクのライブラリーを、標的分子に対する結合アフィニティーの強化について選択する。この方法は、最初の結合部位とは別にフォールド形成する、異なる配列の第２結合部位をもたらす可能性が高い。
【０１９６】
二量化法：特に、ホモ・マルチマーであるか、細胞表面に局在する標的に対しては、以前に選択された結合部位を二重化し、それによって、それぞれが標的の同じ部位に結合することが可能な、同じジスルフィド含有配列の二量体、三量体、四量体、五量体、または六量体を創製することは興味そそられる。もしも標的の複数部位に同時に結合することが可能であるなら、結合アビディティは増す。最適アビディテイの実現は、通常、種々の長さ、および、場合によってはさらに種々の組成を持つ各種スペーサを調べることによって、結合部位間の間隔を最適化することを必要とする。ヒトのＶＥＧＦに結合する、ホモの二量体の例が本明細書に記載される。結合部位の間に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒから成るスペーサを使用し、長さは、二量体ＶＥＧＦ標的に対し最適アビディティを実現するように調節することが可能である。
【０１９７】
既存のＣＤＰシリーズ：各１ＳＳ、２ＳＳ、または３ＳＳ構築体の間隔（「システイン距離パターン」、ＣＤＰ）が、既存のタンパクファミリーのＣＤＰと同じになるように、例えば、構築の各段階が天然のＣＤＰを使用するように、ジスルフィドを加えることが可能である。さらに、既存の３ＳＳ、４ＳＳ、または５ＳＳスカフォールドに、選ばれた１ＳＳまたは２ＳＳタンパクを、同様のループ長となる場所に移植することも可能である。既存のジスルフィド結合パターンを変える目的でジスルフィドを加え、構造変種またはＤＢＰ変種のライブラリーを創製することも可能であるし、あるいは、既存の結合パターンを維持することも可能である。ＤＢＰに対する調節は、主に、新規システインペアおよび新規ランダム配列が、既存タンパクの一端のみに付加されるのか（既存ＤＢＰを保存する傾向がある）、あるいは、それらの配列は、既存タンパクの両端（すなわち、各端に一システイン）に付加されるのか（ＤＢＰに変更をもたらす傾向がある）に依存する。既存のジスルフィド結合（単複）を保存したいのならば、古いシステインペアと、新たに付加されたシステインペア（単複）の間に、いくつかの余分のスペーサ残基を残すのが有効である。このようなスペーサは、任意の配列を持っていてよいが、グリシン富裕スペーサが好ましい（すなわち、ＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳのマルチマー）。標的分子が二量体（可溶性）か、細胞結合性である場合、二つのミクロタンパクモチーフが、その標的に結合するのを可能とするほど長いスペーサは、両部位における同時結合をもたらし、アビディテイの上昇、あるいは見かけのアフィニティーの増加を招く。
【０１９８】
メガプライマー法による構築：メガプライマー法は、配列ライブラリーの存在から生じる複雑性を回避しながら、先行ライブラリーからの新規ライブラリーの創製を可能とする。以前に選択された１ＳＳタンパクのプールを含むＰＣＲ断片が生成され、この断片を、一つまたは二つの新規Ｃｙｓ残基を有する新規ライブラリーをコードする新規ＤＮＡ断片（オリゴ、またはＰＣＲ産物）と重ねる。この重複断片から創製されるｓｓＤＮＡラン・オフＰＣＲ産物（「メガプライマー」）は、ベクターに対して相同な末端を含むので、ベクターにアニールされ、このメガプライマーによって置換される区域に終止コドンを含む鋳型による、Ｋｕｎｋｅｌ様ポリメラーゼ伸長反応を駆動するために使用される。別法として、一対の独自の制限部位を用いて、以前に選択されたベクターのライブラリーの内部に新規ライブラリーを創製することも可能である。ファージタンパクｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩに対する遺伝学的融合によって、ファージカプシドにおけるタンパクの提示が可能となる。偶数システインを有するタンパクは、ｉ）ファージ増殖、ｉｉ）アフィニティー選択、ｉｉｉ）遊離チオール精製、および／または、ｉｖ）ＤＮＡ配列のスクリーニングによって選択することが可能である。この方法を１サイクル、または複数サイクル用いることによって、１ＳＳ、２ＳＳ、３ＳＳ、４ＳＳ、５ＳＳ、６ＳＳ、またはより大きなジスルフィド数までジスルフィド含量を積み上げることが可能である。スタート点として任意のジスルフィド数を使用することが可能である。
【０１９９】
いくつかの特定の、例示の構築過程を下記に述べる。
【０２００】
２３４設計プロセス：図１３８を参照されたい。好ましい一方法は‘２３４’と呼ばれる。その理由は、先ず、三つの結合パターン全てから成る混合物を含む２ジスルフィドライブラリーを創製し、パンニングし、次いで、最良クローンを選び、これを用いて、さらに別の（部分的）ランダム化アミノ酸位置、およびさらに別の１ペアのシステインを有する新規ライブラリーを創製し、このようにして、最大１５種の異なる構造を取ることが可能な３ジスルフィドライブラリーを形成し、その内のいくつかは、元の四つのシステインに異なる結合パターンを取らせ、それによって、元の２ＳＳ配列の構造進化を可能とするからである。各「ライブラリー伸長セグメント」は、通常、複数のアミノ酸（すなわち、ＮＮＫ、ＮＮＳ、または類似の混合コドンによってコードされる）の混合物をコードするいくつかのコドン、プラス、一つ以上のシステイン（外側に配される）を含み、以前に選ばれた配列プールの５’またはＮ−末端に付加されるか、あるいは、以前に選ばれた配列プールの３’またはＣ−末端に付加されるか、あるいは両端に付加される。遊離チオールを回避するために、偶数のシステイン（２、４、６）を、各クローンに付加することが望ましい。これは、両端にライブラリー延長セグメントを付加することによって（各端に１システイン、および４−５ランダムコドン）、あるいは、Ｃ−末端のみ、またはＮ−末端のみに付加される二つ（または４または６）のシステイン、および６−８のあいまいコドン（アミノ酸の所望の混合物をコードする）として付加することによって実行することが可能である。このプロセスを複数回繰り返すことが可能である。
【０２０１】
したがって、２３４指向性進化プロセスは、下記の諸工程から構成される。初期のライブラリー構築（２ＳＳ）、標的パンニング（任意、個々のクローンのスクリーニングおよび最良クローンのプール蓄積）、伸長ライブラリーの構築（３ＳＳ）、標的パンニング（任意、個々のクローンのスクリーニングおよび最良クローンのプール蓄積）、伸長ライブラリーの構築（４ＳＳ）、標的パンニング、および個々のクローンの最終的スクリーニングで、最良の４ＳＳ結合因子を特定すること。
【０２０２】
このプロセスについては多くの変法を工夫することが可能である。４、５、６、７、またはそれ以上のジスルフィドを用いること、または、例えば、１−ジスルフィドジャンプの代わりに２ジスルフィドジャンプを用いること、あるいは、一つの標的に対して一つのライブラリーをパンニングし、第２の標的に対し下記のライブラリーの構築を用いることが可能である。前記において、二つの標的は近縁であっても、無関係であってもよい。
【０２０３】
好ましい方法は、天然の３ＳＳにも認められる（好ましくは普通に）ＣＤＰを有する２ＳＳライブラリーを作製すること、および、天然の４ＳＳタンパクにも認められるＣＤＰを有する３ＳＳライブラリーを作製することである。このようにして、２ＳＳが熟成して３ＳＳになること、３ＳＳが熟成して４ＳＳになることを正当に確信することが可能になる。
【０２０４】
３ｘ０−８および４ｘ０−８設計プロセス：図１３９を参照されたい。この‘３ｘ０−８’および‘４ｘ０−８’の好ましい設計プロセスは、標的パンニングのために最大の構造多様性および配列多様性を提示するために、１５通りの３ジスルフィド構造の全て、１０５通りの４ジスルフィド構造の全てを創製することを目指す。同じ方法を、５−、６−、または場合によっては７−ジスルフィドミクロタンパク（５ｘ０−８、６ｘ０−８、７ｘ０−８）にまで拡張することが可能である。
【０２０５】
天然の３−ジスルフィドミクロタンパクの全てのループ長の分析から、ループは、０−１０アミノ酸のサイズ範囲を持つ傾向のあることが示された。五つのループ（Ｃ１−Ｃ２、Ｃ２−Ｃ３、Ｃ３−Ｃ４、およびＣ５−Ｃ６）の平均は、きわめて近似している（最長ループのいくつかは望ましくないので除くと、０−８から３−１２の範囲）。ただし、異なるスカフォールドファミリーの間には、ループサイズに大きな差がある。例えば、コノトキシンのループＣ１−Ｃ２は、アナトドメインの０ＡＡ長に対し６ＡＡ長であり、それでいて両者は、同じジスルフィド結合パターンを有する。
【０２０６】
配列モチーフＣ１ｘ０−８Ｃ２ｘ３−１０Ｃ３ｘ０−１０Ｃ４ｘ０−８Ｃ５ｘ０−９Ｃ６は、天然の３ＳＳタンパクの９０％以上、および、有用な性質を持つ、未知の全ての３ＳＳミクロタンパクの圧倒的多数をカバーすることが予想される。ライブラリーの構築プロセスは、等しい長さ、例えば、０−８を持つループでは比較的容易であり、Ｃ１ｘ０−８Ｃ２ｘ０−８Ｃ３ｘ０−８Ｃ４ｘ０−８Ｃ５ｘ０−８Ｃ６のライブラリー配列モチーフ、または、この設計の４ＳＳバージョン、Ｃ１ｘ０−８Ｃ２ｘ０−８Ｃ３ｘ０−８Ｃ４ｘ０−８Ｃ５ｘ０−８Ｃ６ｘ０−８Ｃ７ｘ０−８Ｃ８が得られる。使用が可能な他のループ長としては、０−１０、０−９、０−８、０−７、０−６、０−５、０−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、または１−１０がある。ただし大抵のループ長が有効であることが期待される。
【０２０７】
このタイプのライブラリーは、ヘテロ性にフォールド形成する多数の配列を含むことが予想される。これは、これらの配列は、たくさんの異なる構造を取ることは可能であるが、均一な形としては簡単に製造することはできないことを意味する。この異質性は、タンパクの生産には不利であるが、多様性の増大は、パンニングと早期のリガンド発見のためには有利である。
【０２０８】
合成タンパク多様性の従来のディスプレイライブラリーでは、クローンは全て、同じ固定タンパクスカフォールドを共有する。膨大な多様性を持つ配列が創製されるが、それらは皆同じ構造を共有し、著明な構造的多様性は存在しない。逆に、３ｘ０−８および４ｘ０−８ライブラリーは、１５通り、場合によっては１０５通りもの異なる構造体から成る等量混合物を含む。
【０２０９】
典型的ファージディスプレイ・ライブラリーは、１０ｅ９から１０ｅ１０の異なるクローンを含み、これらは、通常、それぞれ異なる配列を持つ。しかしながら、パンニングの対象になるのは、各配列またはクローンの、平均して、約１０００−１０，０００コピーを含む約１０ｅ１３のファージ粒子である。このコピー数は、「ライブラリー当量数」と呼ばれる。同じ配列の１０００−１０，０００コピーのそれぞれが、ジスルフィド結合形成によって仲介されるフォールド形成の異質性によって異なる構造を取ることが可能である。したがって、３ｘ０−８、４ｘ０−８、または５ｘ０−８ライブラリーの実効ライブラリーサイズは、単一スカフォールドライブラリーよりも１０、１００、または１０００倍大きい。したがって、この設計のライブラリーは、理論的に可能な構造、ジスルフィド結合パターンおよびフォールドの全て、またはほとんどを含むことが予想される。
【０２１０】
平均タンパクを小さいままに維持し、それによって不要の構造の形成を阻止し、かつ、所望の構造の頻度を増すために、ループの長さ範囲を狭めることも可能である。中間のループ長、例えば、２−６、２−７、２−８、２−９、または２−１０アミノ酸、または３−４、３−５、３−６、３−７、３−８、３−９、または３−１０アミノ酸、または４−５、４−６、４−７、４−８、４−９、または４−１０アミノ酸、または５−６、５−７、５−８、５−９、または５−１０アミノ酸を使用することも可能である。
【０２１１】
さらに、ライブラリーのために、単一の固定ループ長、通常、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長を取ることも可能である。
【０２１２】
平均タンパクサイズを小さいままに維持するための相補性法とは、上限として：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８，２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８，３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０アミノ酸、および下限として：１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片を選択するために、ＤＮＡ断片サイズ分画ゲルを用いることである。
【０２１３】
４Ｘ６設計プロセス：図１４０を参照されたい。好ましい方法は、‘３ｘ６’または‘４ｘ６’プロセスであり、これは、３または４個のジスルフィド、および、変動配列を持つことが可能な６個のアミノ酸から成る固定ループサイズを有するライブラリーから始める。４Ｘ６ライブラリーのタンパク配列モチーフは、Ｃ１ｘ６Ｃ２ｘ６Ｃ３ｘ６Ｃ４ｘ６Ｃ５ｘ６Ｃ６ｘ６Ｃ７ｘ６Ｃ８である（下付文字は、塩基の混合物（多くの場合、ＮＮＫ、ＮＮＳ、または類似のあいまいコドンによってコードされるもの；Ｃの後の数字は、タンパクにおいてＮ−末端からＣ−末端に向かうシステインの順番を指す））。天然のミクロタンパクファミリーでは、結合されるシステイン同士は、タンパク鎖バックボーンにおいて、平均１０−１４アミノ酸（平均１２）隔てられる。我々は、この距離を「ジスルフィドスパン」と呼ぶ。このスパンは、約８−９アミノ酸未満になることは滅多にない。隣接システイン同士がジスルフィド結合を形成する場合、それらは、多くの用途において望ましくないサブドメインを形成する。なぜなら、そのサブドメインは、自身の熱およびプロテアーゼ不安定性プロフィールを持つからである。この不要なサブドメインは、隣接システイン同士の結合を不可能とするほど短いループ長、すなわち、９アミノ酸未満を選ぶことによって根絶することが可能である。６ＡＡの固定間隔が、特に好都合のようである。それは、この間隔が、サブドメインを阻止し、かつ、（非隣接の）システインが、天然タンパクの平均と同じという点で理想的な１２アミノ酸隔てられる複数位置を創出するからである。サブドメインの根絶は、６９通りの最悪の４ＳＳジスルフィド結合パターンを取り除くので、３６通りの最良の４ＳＳジスルフィド結合パターンが得られる。４、５、７、または８アミノ酸、またはそれらの組み合わせから成る固定間隔も実行可能である。
【０２１４】
既知の、天然の３ＳＳトキシンの大多数は、下記の組成：Ｃ１−（ｘ０−１０）−Ｃ２−（ｘ２−１２）−Ｃ３−（ｘ０−１０）−Ｃ４−（ｘ０−１０）−Ｃ５−（ｘ０−１２）−Ｃ６を有する、単一「全スカフォールド」ライブラリーに含まれると考えられる。このようなライブラリーはさらに、未知の天然トキシンの大部分、さらに、より多数の、非天然トキシンを含むと考えられる。このようなライブラリーによってコードされるタンパクの平均長は、１＋５＋１＋７＋１＋５＋１＋５＋１＋５＋１＝３３アミノ酸長となると考えられる。
【０２１５】
より短いタンパクを創製するには、長い配列をコードするオリゴに対し、より高いモル比の、短い配列をコードするオリゴを使用すること、あるいは、最大ループ長を、１０−１２ａａではなく、僅かな８ａａに限定することが可能と考えられる。
【０２１６】
同様に、下記の組成を有する全スカフォールドライブラリーは、１０５通りの異なるジスルフィド結合パターン、および可能な１０００を超えるフォールドを有する、４−ジスルフィドＨＤＤトキシンの大多数を含むと考えられる。
【０２１７】
Ｃ１−（ｘ０−１０）−Ｃ２−（ｘ０−１０）−Ｃ３−（ｘ０−１０）−Ｃ４−（ｘ０−１０）−Ｃ５−（ｘ０−１０）−Ｃ６−（ｘ０−１０）−Ｃ７−（ｘ０−１０）−Ｃ８
および、５−ジスルフィドの「全スカフォールド」ライブラリーは、
Ｃ１−（ｘ０−１０）−Ｃ２−（ｘ０−１０）−Ｃ３−（ｘ０−１０）−Ｃ４−（ｘ０−１０）−Ｃ５−（ｘ０−１０）−Ｃ６−（ｘ０−１０）−Ｃ７−（ｘ０−１０）−Ｃ８（ｘ０−１０）−Ｃ９−（ｘ０−１０）−Ｃ１０によって指定されると考えられる。
【０２１８】
ｘは通常、アミノ酸の望ましい混合物を指す。アミノ酸の混合物をコードするのにＮＮＮコドンを使用することが可能であるが、他のコドンも利点を持つ。各コドンは、異なるアミノ酸混合物を提供する。
【０２１９】
例えば、ＮＮＫは、終止コドンの頻度を３倍下げる。異なる用途には異なるコドンが有用である。親水性アミノ酸を優先する混合物が望ましく、終止コドン、トリプトファン、その他の疎水性アミノ酸の回避、および、ループにおけるシステインの回避も望ましい。分子生物学者であれば、所望の混合物を生産するコドンの選択法を知っている。コドンは、通常、コドンの第１塩基として、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または、混合塩基文字Ｎ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｂ、Ｄ、Ｖ、またはＨを含み、コドンの第２塩基として、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または、混合塩基文字Ｎ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｂ、Ｄ、Ｖ、またはＨを含み、かつ、コドンの第３塩基として、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または、混合塩基文字Ｎ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｂ、Ｄ、Ｖ、またはＨを含むように選ばれ、それぞれが、異なるアミノ酸から成る混合物をコードする、多数の可能なコドンをもたらす。
【０２２０】
天然のＨＤＤタンパクのループ配列は、タンパクのフォールド形成に役割を果たすと思われる、少数の固定残基を含む。従来の方法は、単純に、ランダムコドンを用い、それらが真にフォールド形成に重要である場合は、多様性にそれらの残基の支給をまかせるというものである。このランダムコドン法は、各位置においてアミノ酸の天然組成を用いるライブラリーに比べてライブラリーの質が低下するが、新規フォールドの可能性を探る点では最良である。
【０２２１】
しかしながら、もしも例えば、フォールド形成または機能のためにＷが必要とされるのに、その位置にＮＮＫコドンが使用される場合、ライブラリーの内の僅かに１／６４クローンがこの要求を満たすだけであるので、このライブラリーの実効サイズは６４倍下がる。これは、有用な結合因子の獲得を阻止するのに十分である。したがって、天然配列において固定されるように見える任意の残基は、ライブラリーにおいても固定するのが重要と考えられる。
【０２２２】
ランダムコドン（ＮＮＫ、または上述の他の、多くのものの内の一つ）の使用に代わる代替法は、ある特定のタンパクファミリーのループの正確な共通配列によってオリゴヌクレオチドを合成することである。この方法は、ループ２設計は、ライブラリーのループ２の位置にのみ組み込むこと、ループ３配列は、ループ３の位置にのみ組み込むことを要求する。これは、複数のシステインが、重複反応が起こる場合、それぞれ、三つのシステインコドンの内の異なる一つによってコードされる場合に実現される。より効率的な重複ＰＣＲ反応を実現するために、ｃｙｓコドンの前後の１から３塩基も同様に固定してよい。重複反応効率は、ライブラリーの多様性を制限する可能性があるので、これは、検出されない、または簡単に調節されない重要な危険因子である。一般に、数塩基の付加が、低ライブラリー多様性の重大な危機を下げるための効果的方法である。
【０２２３】
種々のファミリーのループ配列の全てを混ぜ合わせ、それらを重複ＰＣＲで組み込んだ後は、合成ループ配列は全て、その天然位置においてのみ出現するはずである。このライブラリー法は、種々のファミリー由来のループの相互関係にシャッフリングをもたらす。
【０２２４】
ライブラリーの多様性の増大：天然および指向性進化の力は、選択圧に曝される多様性に関連する。より多くの、より多様なクローンから得られた選抜体は、一般に、より良い結果を生む。生物は、遺伝子の数を超えてタンパク構造の多様性を増すために複数の方法を用いる。この拡大された天然の多様性によって、選択に対するより多くの解法が得られ、かつ、天然進化力の増大が得られる。
【０２２５】
指向性進化の力を増すことを目的として、同じ数のクローン、または同数の配列から得ることが可能な構造の多様性を増すには、様々な、たくさんの方法がある。
【０２２６】
この原理は、単一遺伝子、複数遺伝子経路、全体ゲノム（前核細胞、古細胞、真核細胞）、および生物の全共同体（すなわち、細菌共同体）の最適化にも応用することが可能である。
【０２２７】
一般に、単一遺伝子の発現は、様々の、異なるｍＲＮＡ配列を生み出す。これは、複数のプロモーター、選択的スプライシング、トランススプライシング、または分解のためである。各ｍＲＮＡ配列は、違ったやり方でフォールド形成し、様々の、異なった構造を取り、かつ、その結果も、他のＲＮＡ（ミクロ−、ｔＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）の存在によって修飾されるばかりでなく、ＲＮＡと相互作用を持つタンパクによっても修飾される。これらのｍＲＮＡ構造はそれぞれ、複数の翻訳開始および停止シグナルの存在によって幾分違ったやり方で翻訳されたり、リボソーム上の異なる休止による変種、あるいは、低度ではあるが、様々な度合いの、「非天然」アミノ酸を含む、アミノ酸の組み込みミスがある。さらに、各タンパク翻訳産物は異なるやり方でフォールド形成する：あるものは凝集し、あるものはミスフォールド形成し、あるものはプロテアーゼによって分解され、あるものはユビキチン化され、あるものは折りたたまれて複数の安定構造を形成する。重要で、実際的な差別機序は、タンパクの誘導体形成、アミノ酸側鎖の化学的変化、および、小型分子、例えば、糖類、ＰＥＧのようなポリマーの、タンパク鎖に対する化学的連結である。これらの化学法は、全体ライブラリー（大抵の）、または精製単一タンパクに対して適用することが可能である。
【０２２８】
ライブラリーに適用した場合、小型分子は、特に低量で与えた場合、異種集団が得られるので多様性を劇的に増す。例えば、５リシン残基を含むタンパクライブラリーにおけるリシン残基に対し、ＰＥＧまたは炭水化物分子を、非網羅的に接合した場合、５−階乗＋１種類の分子（１２２変種）が得られる。最良変種をパンニングによって選び、次に、数種の標識レシピを、どのレシピが最良結果を与えるかを見出すために、ライブラリー等価物、クローンプール、または単一クローンに付与する。さらに、このタンパク配列を進化させ、所望の活性の保持および改善について選択する。例えば、最良突然変異は、活性に寄与しない４個のリシンを失うかもしれないが、誘導体形成された場合、活性レベルの増加をもたらすリシンは保持する。タンパクの誘導体形成に用いられる試薬（すなわち、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌのオンライン・カタログ）は全て、原理的には、この方法に使用することが可能である。細胞機能と多様性のための一意で、安定な構造と、細胞の進化を加速する、ある程度の不安定性の間には微妙な平衡がある。
【０２２９】
これらの機序はそれぞれ、実験的介入のためのポテンシャル点となる。これらの調節はそれぞれ、自然進化によって現在の変動レベルに設定されるが、その多様性は、指向性進化の目標に応じて増加または減少することが可能である。
【０２３０】
特に商業的関心の集まる領域は、ディスプレイライブラリー（ファージ、酵母、細菌表面、ポリソーム、リボソーム、プロフュージョン、または遺伝子融合ライブラリー）による結合タンパクの指向性進化である。最良精選クローンの頻度および品質は、直接、ライブラリーのサイズに相関することが十分に確かめられている。ライブラリーが大きければ大きいほど、結合因子の数は大きくなり、かつ、最良クローンはより良くなる。このため、どんどん大きいライブラリーを創製するために様々な方法が開発されており、例えば、１０ｅ６のクローンから成る二つの免疫グロブリンライブラリーを組み合わせて、１０ｅ１２クローンから成る単一ライブラリーを形成する組み換え法がそうである。しかしながら、この例では、ライブラリータンパクは全て、同じ免疫グロブリンフォールドを持つので、単一構造における多様性に重点を置いており、ある用途、すなわち、全体抗体産物にとっては有利であるが、種々の構造の多様性を創出するためには好適ではない。ライブラリーにおけるクローン数の増加ではなく、単一配列から創製される構造の数を増すことによって、ライブラリーの実効サイズを増すことも可能である。
【０２３１】
ライブラリーにおけるクローン数の増加ではなく、ライブラリーの多様性を増す別の方法は、各クローンによって採用される構造の多様性を増すことである。これは、脱安定化タンパクを用いることによって実現が可能である。この脱安定化タンパクは、それぞれが、短時間ではあるが、多様な構造として存在する点で、溶融小球により似る。この方法は、高度に構造化されたタンパクから成るライブラリーにおいてはアクセスされない、新規バックボーン構造を含む、はるかに大きい空間の探索を可能とする。この比較的大規模な探索によって、比較的大規模な最適フォールドの特定が可能となり、さらに、指向性進化を用いて、この新規フォールドの安定なフォールド形成変種および均一に製造することが不可能な変種を創製することが可能となる。
【０２３２】
標的は通常タンパクであるが、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）、炭水化物、脂質、代謝産物、または任意の生物的、または非生物的材料であってもよい。ライブラリータンパクは、（部分的に）構造未形成であるので、該タンパクは、それぞれ短時間であるが、たくさんの異なる構造を取る。これは、ライブラリーの分子の多様性を増すので、多数のライブラリー等価物の使用には好都合である。標準的ファージライブラリーのパンニングのためには、通常、１００個のライブラリー等価物、または、ライブラリーが１０ｅ１０の多様性を持つ場合、１０ｅ１２ファージを用いる。ライブラリーからある特定の（構造化された）クローンを高い信頼度で回収するためにはこの１００倍の余剰が必要であることが実験的に見出されている。高アフィニティークローンのためには、使用する余剰はもっと低くてもよいが、低アフィニティークローンのためには、使用する余剰はもっと高くなければならない。
【０２３３】
多様性を創出する他の方法と区別して、我々は、これを、「一過性多様性」と呼ぶ。なぜなら、この多様性は、それぞれが短時間起こる多数の構造体によって実現されるからである。同じ単一遺伝子からの多様な構造体の創製は、生物進化にとって重要な原理であり、生物組織の多数レベルに存在する。
【０２３４】
ディスプレイライブラリーの多様性の拡大：ファージライブラリーは、通常、１０ｅ１０の異なる配列から成る多様性を持つ、約１０ｅ１４ファージを含む。アフィニティークロマトグラフィーは、このようなライブラリー（１０ｅ１０濃縮体）から、結合タンパクを発現する単一配列を選択することが可能であることが十分確かめられている。高いアフィニティーで結合することが可能なファージのほぼ１００％がアフィニティーカラムによって結合されるのであるから、この方法によって（１０ｅ１４濃縮体）ファージの単一コピーも、高い信頼度で選択することが可能である。
【０２３５】
ファージに提示されるペプチドは、通常、１０ｅ３−１０ｅ６の異なる、不安定な立体配置において存在し、その内の一つだけがカラムに結合する。カラム結合は、そのペプチドの活性的立体配置を安定化するので、そのようなペプチドは効率的に濃縮され、濃縮体（１０ｅ１７−１０ｅ２０）を生成する。したがって、バックボーン立体配置における屈曲性は、ライブラリーの実効サイズを１０ｅ２０に増す。パンニングの第１ラウンド後、多様性は既に１０００倍低下し、そのため、その後のライブラリーでは、各クローンは、１０００以上のコピーで表されることになる。これは、タンパクが取る、異なる一過性構造の全てが、統計的に十分抽出されることを意味する。さらにその後の指向性進化の過程において、目標は、標的に対して高いアフィニティーを示す構造体として存在する時間割合の大きいクローンを選ぶことである。目的は、選択と組み合わせて各種の突然変異法を用いることによって、アフィニティーを徐々に改善するばかりでなく、タンパクの安定性を向上させることである。
【０２３６】
標的誘発性フォールド形成：ミクロタンパクの構造は、標的結合によって誘発することが可能である（標的結合後ジスルフィドを形成することによって）、あるいは、ミクロタンパクの構造は、その標的に結合している際に最適化することが可能である。
【０２３７】
標的への結合は、必ず、ある程度の誘発性適合を含み、したがって、ジスルフィドの内のいくつか（結合された部分のもの）を安定化し、他のジスルフィドを脱安定化し、還元剤に対する差別的感受性をもたらすことが予想される。還元剤および酸化剤において（各種濃度および間隔で）滴定することによって、もっとも安定性の低いジスルフィドの急速な還元および再酸化が可能とされ、これは、結合パターンに変化があると、構造的適応をもたらし、結合標的に対するより優れた適合を生ずる。この方法は、最高の結合アフィニティーを有するクローンの生存率を高める。
【０２３８】
生産のためには、タンパクのフォールド形成が、標的独立性となるまで進化することが望ましい場合がある。
【０２３９】
ミクロタンパクのアミノ酸組成の最適化：大抵のタンパクまたはタンパクドメインは、タンパクの安定性および立体配置にとって決定的に重要な疎水性コアを含む。これらのタンパクの疎水性コアは、高い割合の疎水性アミノ酸を含む。アミノ酸の特性は、その疎水性によって決めることが可能である。いくつかのスケールが開発されている。一般的に使用されるスケールは、（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ（１９７６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０４，５９、＃３２３３）によって開発されたもので、これは、（Ｈｏｐｐ，ＴＰ，ら、（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８，３８２４，＃３２３２）に掲載される。疎水性残基はさらに、脂肪族残基のロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニン、および芳香族残基のトリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンに分けられる。図１は、Ｂｒｏｏｋｓ，ＤＪ，ら、（２００２）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １９，１６４５，＃３２３４に発表された全てのタンパクにおけるアミノ酸量を比較し、さらに、Ｇｕｐｔａ，Ａ．，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，１３：２０４５−５８に発表されたデータベースに含まれる８５５０のミクロタンパクドメインについて計算されたアミノ酸の平均量を付け加える。
【０２４０】
図１３を参照されたい。タンパクにおけるアミノ酸の出現率である。図は、他のタンパクに比べ、ミクロタンパクでは、脂肪族疎水性アミノ酸の量が有意に低い傾向のあることが明らかに示す。このことは、従来技術でこれまで認識されていない。逆に、芳香族疎水性アミノ酸（Ｗ，Ｆ、Ｙ）は、平均的タンパクと同様である。脂肪族アミノ酸の量がこのように低いのは、ミクロタンパク構造は、疎水性コアを不要とする、いくつかのジスルフィド結合によって安定化されるという事実を反映する。脂肪族炭素原子を含む、他の、いくつかのアミノ酸残基（グルタミン酸塩、リシン、アラニン）も、他のタンパクに比べ、ミクロタンパクにおける量は低い。
【０２４１】
低疎水性を有するスカフォールドの有用性：タンパクにおける脂肪族アミノ酸量の低下は、製薬、およびその他の用途におけるそれらのタンパクの有用性を著明に増す。多くのタンパクは、フォールド形成時凝集体を形成する傾向を有する。これは、タンパクが、異種宿主において高濃度で生産される場合、および、インビトロで再度天然化される場合、さらに悪化する可能性がある。凝集およびミスフォールド形成は、商業的生産時、タンパクの収率を著明に下げる可能性がある。タンパク配列における脂肪族アミノ酸の割合を下げることによって、凝集体を形成する傾向を下げ、したがって、適正にフォールド形成したタンパクの収率を上げることが可能となる。
【０２４２】
脂肪族アミノ酸量の低いタンパクは、他のタンパクに比べて、免疫原性がより低い。脂肪族アミノ酸は、免疫反応の形成において決定的ステップとなる、ＭＨＣに対するペプチドの結合の度合いを増す傾向がある。その結果、低い割合の脂肪族アミノ酸しか含まないタンパクは、大抵の、他のタンパクに比べ、含むＴ細胞エピトープの数はより少ない。
【０２４３】
脂肪族残基は、親油性相互作用を形成する傾向を有する。その結果、大きい割合の脂肪族アミノ酸を有するタンパクは、他のタンパク、膜、および、他の表面に、非特異的に結合する可能性がより高い。タンパクの表面に暴露される脂肪族残基は、他のタンパクと、非特異的相互作用を持つ傾向が特に高い。ミクロタンパク中のアミノ酸の多くは、ミクロタンパクの小型サイズのため、ある程度表面を露出させる。
【０２４４】
したがって、本発明は、３個以上のジスルフィドを有し、２０−６０アミノ酸から成る単一ドメインを含み、かつ、ヒトの血清暴露タンパクに結合し、５％未満の脂肪族アミノ酸しか含まない非天然タンパクを提供する。要すれば、この非天然タンパクは、４％、３％、２％未満、場合によっては１％未満の脂肪族アミノ酸しか含まない。さらに、本発明は、このような性質を有する非天然タンパクのライブラリーを提供する。
【０２４５】
疎水性の低いスカフォールドの特定：大抵のミクロタンパクは、大抵の通常タンパクに比べ、その含む脂肪族アミノ酸の数が少ないが、種々のミクロタンパクファミリー間において、脂肪族アミノ酸の含量には著明なばらつきがある。表４は、脂肪族含量の低い製薬タンパクの加工においてスタート点として特に有用な、いくつかのミクロタンパク・ファミリーを列挙する。
【０２４６】
免疫原性の低いタンパクの設計：免疫原性の低いタンパクは、ヒトに投与した場合、有害な免疫反応を引き起こす確率が低いので、治療薬としてより望ましい。いくつかの点で、望ましい標的結合特性を有する主題のミクロタンパクは、一般に、同じ標的に結合するが、所望のシステイン結合パターンまたはフォールドを持たないタンパクよりも免疫原性が低い。一実施態様では、主題のミクロタンパクは、免疫原性が、１倍低い、好ましくは２倍低い、好ましくは３倍低い、好ましくは５倍低い、好ましくは１０倍低い、好ましくは１００倍低い、好ましくは５００倍低い、さらに好ましくは１０００倍低い。ある実施態様では、免疫原性の低いミクロタンパクは、本明細書に記載されるＨＤＤタンパクである。
【０２４７】
タンパクの免疫原性は、ＴＥＰＩＴＯＰＥのようなプログラムを用いて予測することが可能である。このプログラムは、大きな１組のアフィニティー測定値を用いて、主要なヒトのＨＭＣクラスＩＩ対立遺伝子全てにたいする、免疫原由来の、重複する９個のアミノ酸ペプチド全てについて、その結合アフィニティーを計算する（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ら、１９９９；ｗｗｗ．ｂｉｏｖａｔｉｏｎ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｅｐｉｖａｘ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）。このようなプログラムは、ヒトのＴ−細胞エピトープの予測および除去に広く使用され、その使用は、ＦＤＡによって奨励されている。
【０２４８】
これらのアルゴリスムを用いて、我々は、２５−９０残基、および１０％システインを有するミクロタンパクが、平均的タンパクよりも、通常、ＭＨＣＩＩに対する予測結合アフィニティーが３１６倍低いことを見出した。図１６６の赤色曲線は、中央長が３７２アミノ酸である、全て２６，０００のヒト・タンパクの予測免疫原性を示す。青色曲線は、中央長が３８アミノ酸である、全て１０，５００のミクロタンパクの予測免疫原性を示す。緑色曲線は、ミクロタンパクと同じ長さ分布を持つ、タンパク断片から成る非天然グループの予測免疫原性を示す。各グループの平均スコアの比較から、ミクロタンパク単独の１−ｌｏｇのサイズ低下は、免疫原性の６７倍の低下をもたらし、ミクロタンパクのアミノ酸組成は、さらに４．７倍の低下を生ずることが示された。図１６７の上段パネルは、脂肪族疎水性アミノ酸（Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ）が、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリスム（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）においてもっとも強力な接触因子としてランクされ、予測免疫原性にもっとも多く寄与することを示す。図１６７下段パネルは、上記脂肪族残基が、ヒトのタンパクと比べると、ミクロタンパクではもっとも出現率が低く、予測免疫原性における、組成物由来１−ｌｏｇ低下の大部分を説明することを示す。
【０２４９】
ミクロタンパクにおける脂肪族疎水性残基の低レベルは、他のタンパクでは通常である疎水性コアの欠如によって可能とされる。その代わりに、ミクロタンパクは、架橋結合して、鎖内ジスルフィドを形成する、少数のシステインを含む。この、少数のジスルフィドによる、多数の疎水性アミノ酸の置換は、タンパクが安定でいられる最小サイズを下げ、それによって、ミクロタンパクがより小さくなり、脂肪族アミノ酸の頻度を減らし、予測免疫原性において３ｌｏｇの低下をもたらすことを可能にする。
【０２５０】
免疫原性低下は、様々の表示、例えば、１）樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、免疫タンパクからペプチドを放出する能力（抗原処理）；２）ＨＬＡ  ＩＩ分子に対する結合を決める、これらのペプチドにおけるＴ−細胞エピトープの存在；３）ＡＰＣ表面におけるペプチド−ＨＬＡＩＩ複合体を認識する、血中の未洗練Ｔ細胞の数；および、４）血清における抗体レベルを含む表示によって測定することが可能である。
【０２５１】
タンパクの免疫原性を下げるためには多くの方法があり、その全てが、ＨＤＤおよび非ＨＤＤタンパクに適用することが可能である。一つの方法は、コンピュータのモデル化および合理的設計を通じてジスルフィドを加えることである。もう一つの方法は、指向性進化または合理的設計を用いてタンパクを微調整することによって既存のジスルフィドを改善することである。ジスルフィドをタンパクの内部に納めるか、または、そのシステインに、保護作用を持つアミノ酸側鎖を側接させることによって、ジスルフィドを化学的攻撃から保護することが可能である。タンパクの免疫原性はまた、ＴＥＰＩＴＯＰＥまたはＰｒｏｐｒｅｄなどのプログラムを用いて予測することが可能である。このプログラムは、大きな１組のアフィニティー測定値を用いて、主要なヒトのＨＭＣクラスＩＩ対立遺伝子全てにたいする（ＭＨＣクラスＩに対して使用される別のプログラムもある）、免疫原由来の、重複する９個のアミノ酸ペプチド全てについて、その結合アフィニティーを計算する。Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．，ら、（１９９９）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ＨＬＡ  ｌｉｇａｎｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｔｕａｌ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５．さらに、ｗｗｗ．ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｂｉｏｖａｔｉｏｎ．ｃｏｍ；およびｗｗｗ．ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍも参照されたい。このようなプログラムは、ヒトＴ細胞エピトープの予測および除去のために広く使用されており、その使用はＦＤＡによって奨励されている。
【０２５２】
免疫原性の低いミクロタンパクを生成するためのもう一つの方法は、化学的架橋剤による、タンパク内架橋を介するものである。多様な架橋剤が、Ｐｉｅｒｃｅなどの販売業者から入手が可能である。適用可能な架橋剤としては、アルギニン反応性架橋剤、ホモ双官能性架橋剤、例えば、アミン反応性ホモ双官能性架橋剤、スルフヒドリル反応性ホモ双官能性架橋剤、ヘテロ双官能性架橋剤、例えば、アミン−カルボキシル反応性ヘテロ双官能性架橋剤、およびアミノ基反応性ヘテロ双官能性架橋剤が挙げられる。
【０２５３】
さらにもう一つの方法は、複数結合部位を持つ小型分子を作製し、各ドメインを、２から３の結合部位に分離することである。例えば、ドメインの一方の面は、一つの標的に結合し、他の半分は、もう一つの標的に結合する。この二つの面は平行して設計し（すなわち、同時に別々のライブラリーで）、融合して一つのドメインにまとめることが可能である。それに代わるものとして、二つの面を継時的に設計し、面１の残基において一ライブラリーを創製し、このライブラリーを、標的１に対する結合についてパンニングし、一つ以上の最良クローンを選択し、残余のアミノ酸、ライブラリー１で使用されなかったアミノ酸において新規ライブラリー２を創製し、次いで、標的２に対してパンニングを行い、標的２に対する結合因子、および標的１に対する結合の保持についてスクリーニングを行う方法がある。面１に対するアミノ酸は、面２に対するアミノ酸と相互にかみ合う傾向を持つので、これらのライブラリーを、異なる配列を持つクローンプールとして構築することは、いくつかのアミノ酸を固定し、これらの固定アミノ酸が、ＰＣＲによる重複伸長に必要な接触点となるようにすれば、簡単に実行が可能である。システインは固定化される傾向を持つので、これらは、種々のオリゴヌクレオチドのための重複点として論理的選択となる。しかしながら、重複点は、それが４個以上の塩基を持つと、よりよく活動するので、システインの一側にさらに別のアミノ酸を固定するのが有用である。したがって、２面ライブラリーのスカフォールドは、３組のアミノ酸および塩基を有する：面１／ライブラリー１用に１組、面２／ライブラリー２用に１組、および、重複伸長によってこの二つのライブラリーを結合するための固定された１組である。制限部位を用いることは原理的には可能であるが、重複法の方が一般にうまく作動する。
【０２５４】
さらにもう一つの方法は、システイン間ループの長さを最小化することによってタンパクのサイズを下げることである。典型的方法は、ライブラリーにおいて、あるものは天然に見られ、あるものは天然に見られるものよりも短い、ある範囲のループ長を用いることである。
【０２５５】
さらにもう一つの方法は、親水性を増すことである。ＨＤＤタンパクの多くは、きわめて親水性が高く、これは、機能（特異性、非免疫原性）のためばかりでなく、タンパクのフォールド形成のためにも重要である場合がある。親水性は、タンパクライブラリーの各位置に使用されるアミノ酸混合物において、オリゴヌクレオチドの合成のために所望のコドン（の混合物）を選ぶことによって調整することが可能である。好ましい一般的方法は、各アミノ酸位置について天然組成を模倣することであり、これを、いくつかの所望の残基に都合のよいように変形する。クローンを、サイズ、およびＤＮＡ配列決定によって親水性についてスクリーニングする。前述の各種の方法を、単独で、あるいは組み合わせて使用することが可能である。
【０２５６】
さらに続く修飾のために、主題のミクロタンパクのいずれのものも使用が可能である。非限定的例としては、ＨＤＤタンパク、例えば、修飾されたＡ−ドメイン、ＬＮＲ／ＤＳＬ／ＰＤ、ＴＮＦＲ、アナト、ベータインテグリン、Ｋｕｎｉｔｚ、および動物のトキシンファミリー、トキシン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ミオトキシン、コノトキシン、および、デルタ−、およびオメガ−アトラコトキシンが挙げられる。本明細書に記載される脱免疫化法は、多様なヒトまたは霊長類タンパク、例えば、サイトカイン、増殖因子、受容体細胞外ドメイン、ケモカインなどに適用することが可能である。この方法はまた、他の、非ＨＤＤスカフォールドタンパク、例えば、フィブロネクチンＩＩＩを含む免疫グロブリン、および、アンキリン、タンパクＡ、ユビキチン、クリスタリン、リポカリンに適用することも可能である。免疫原性が最小化される限り、非ヒトフカフォールドの方が、天然のヒトタンパクとの、免疫性交差反応の可能性が低下するために、（近−）天然ヒトタンパクおよびヒト由来スカフォールドよりも好ましい。
【０２５７】
ＨＤＤタンパクの免疫原性低下を定量するにはいくつかの方法がある。例えば、ヒトまたは動物ＡＰＣによるタンパク分解を定量することが可能である。このアッセイは、ヒトまたは動物の抗原提示細胞、ＡＰＣ−由来リソソーム、またはＡＰＣプロテアーゼに、対象タンパクを添加すること、および、該タンパクの分解を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求めることを含む。ＡＰＣは、血中単球由来の、または、他の標準法によって得られた樹状細胞であってもよい。ヒトのＡＰＣではなく、動物のものを使用してもよく、あるいは、丸ごとの細胞ではなく、細胞分解物を使用してもよく、あるいは、一つ以上の酵素分画、または、リソソームのような細胞分画を使用してもよい。細胞の分解は、分解性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によってもっとも簡単に定量される。分解されたタンパクは、ゲルにおいて見かけ上、より低い分子量としてより速やかに移動する。一つの方法は、各クローンを蛍光的に、または放射能的に（放射能：３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ；染料および蛍光標識、例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ３など）、あるいは、他の、任意の、適切な化学的標識で、対象タンパク、および、その分解産物のみが、ＵＶ暴露またはオートラジオグラフィーによってゲル上に可視化されるように標識することである。ウェスタンブロットにおいて抗体を用いて検出することが可能な、ペプチドタグ・タンパクを用いることも可能である。
【０２５８】
免疫原性を定量するためのもう一つの方法は、タンパクの凝集傾向を定量することである。タンパク凝集は、光散乱によって簡単に定量され、ダイナミック光散乱装置（ＤＬＳ）、または分光光度計（すなわち、ＯＤ３００−６００対ＯＤ２８０）によって実行することが可能である。
【０２５９】
また、Ｔ細胞刺激およびサイトカイン活性化レベルを定量することも可能である。サイトカイン活性化は、ヒトのＰＢＭＣにおいて、ＦＡＣＳによって、免疫系が刺激されたことを示す、樹状細胞（ＣＤ８３など）における活性化抗原の有無、Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９、ＩＬ−２ｒなど）の有無の外、多くの共刺激因子（ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の有無に関して測定される。さらに細胞は、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、４、５、６、８、１０、ＴＮＦアルファ、ベータ、ＩＦＮガンマ、Ｉｌ−１ベータなどの生産について調べることが可能である。標準的マイトゲンおよびＬＰＳが好ましいコントロールとして使用が可能である。
【０２６０】
さらに、Ｔ細胞受容体に対する結合を定量することも可能である。Ｔｏｌｌ様受容体１−９（ＴＬＲ１−ＴＬＲ９）に対する、治療タンパクの結合は、自然免疫の有用なインディケータである。いくつかの販売業者、例えば、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎが、細胞構築体において、トランスジェニックＴｏｌｌ−受容体接続リポーター遺伝子を全て供給する。
【０２６１】
さらに、タンパクを、宿主動物、例えば、ウサギおよびマウスに直接注入することによって、タンパクの免疫原性を評価するための動物実験を行うことも可能である。
【０２６２】
下記は、ＨＬＡ  ＩＩに対する結合アフィニティーの低いミクロタンパクの加工法の一例を与える。図１６１を参照されたい。ヘルパーＴ細胞の活性化は、最重要ステップであり、外来タンパクに対する免疫反応の起動にとって必須である。Ｔ細胞活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原摂取、抗原の分解によるペプチド変換、および、ＡＰＣ表面におけるペプチドの提示、およびヒト白血球抗原ＤＲ群（ＨＬＡ−ＤＲ）のタンパクとの複合体形成を含む。ＨＬＡ−ＤＲ分子は、提示されたペプチドと相互作用を持つ、複数の結合ポケットを含む。これらＨＬＡ−ＤＲポケットの特異性は、インビトロで測定することが可能であり、得られた特異性プロフィールを用いて、各種ＨＬＡ−ＤＲタイプに対するペプチドの結合アフィニティーを予測することが可能である（Ｈａｍｍｅｒ，Ｊ．（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：２６３−９）。それを用いるとＨＬＡ−ＤＲ結合配列を特定することが可能なコンピュータプログラムが記載されている（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．，ら、（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５−６１）。本発明は、親ミクロタンパクの所望の製薬学的、およびその他の性質は維持しながら、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合を下げるやり方でミクロタンパク配列を修飾する目的で、これらのアルゴリスムを利用する。第１ステップとして、親ミクロタンパクの配列を、ＨＬＡ−ＤＲ予測アルゴリスムを用いて分析する。親配列における非システイン残基の、全ての、単一アミノ酸突然変異を、親配列と比較し、ＨＬＡ−ＤＲタイプに対する結合を予測する。目的は、親ミクロタンパク、またはその誘導体によって治療される予定の患者集団において高頻度に出現する、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合を下げると予測される、一組の突然変異を特定することである。その後、ライブラリー中の変異種が、ＨＬＡ−ＤＲ結合を下げると予測される、一つ以上の突然変異を含む、組み合わせライブラリーを構築する。計画された突然変異のサブセットを含む、いくつかのサブライブラリーを構築することは有利な場合がある。次に、得られたライブラリー、またはサブライブラリーについて、適切な標的に結合する変異種を特定するためにスクリーニングが行われてもよい。さらに、ライブラリーのメンバーについて、安定性、可溶性、発現レベル、および、最終的性質にとって重要な、他の性質に関してスクリーニングを行ってもよい。スクリーニングの前に、所望の標的結合アフィニティーおよび特異性を保持する、組み合わせ変異種を単離するために、ファージパンニングまたは同様の濃縮法を、この組み合わせライブラリーに対して実行してもよい。このプロセスによって、親タンパクの所望の性質は全て保持するが、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合が低下し、したがって、免疫原性が低下すると予測された、親ミクロタンパクの変異種が特定される。要すれば任意に、得られた改良変異種に対し、ＨＬＡ−ＤＲ結合性配列除去の、さらにもう１ラウンドを実行してもよい。この後続の１ラウンドは、単純に前述の手順の繰り返しであってもよい。それに代わるものとして、第２の組み合わせライブラリーを、所望のミクロタンパク機能と適合し、ＨＬＡ−ＤＲ結合をさらに���げると予測されるプロセスの第１ラウンドにおいて特定された突然変異のみに限定してもよい。このプロセスの第２ラウンドを、これらのあらかじめ選択された突然変異に限定することによって、比較的小さいライブラリーを構築しながら、改良変異種単離の頻度を増すことが可能である。
【０２６３】
【化１７】
2009509535.tif 000015
平均的タンパクは、２６．１％の脂肪族アミノ酸を含む。
治療タンパクにおける疎水性アミノ酸の割合を下げる方法
前述のように、脂肪族アミノ酸が低量のミクロタンパクを創製する一つの方法は、僅かな脂肪族アミノ酸しか含まないスカフォールドおよびライブラリーから開始することによる。さらに、各種のタンパク工学技術を用いることによって、タンパク中の脂肪族アミノ酸の量を下げることが可能である。例えば、１個または数個の脂肪族アミノ酸が、たくさんの親水性アミノ酸の出現を可能とするランダムコドンによって置換される、タンパクライブラリーを構築することが可能である。特に興味深いのは、親水性アミノ酸の割合を大きくするが、脂肪族または疎水性アミノ酸の割合を下げるあいまいコドンである。例えば、コドンＶＶＫは、１２種のアミノ酸（アラニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン、ヒスチジン、リシン、アルパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン）の出現を可能にするが、脂肪族および芳香族アミノ酸は全て回避する。このようなライブラリーから所望の性質を持つタンパクを単離すること、したがって、芳香族疎水性および脂肪族疎水性アミノ酸の量を下げることが可能である。さらに、脂肪族アミノ酸を含む、複数のアミノ酸位置をランダム化する、組み合わせタンパクライブラリーを構築することが可能である。このようなライブラリーから得られる複数の変異種についてその配列および性能を決定することによって、前記タンパクにおいて、親水性アミノ酸による置換を可能とする位置を特定することが可能となる。
スカフォールドの有用性を評価する方法
天然配列の特定ファミリーに基づいて設計を創出せよ。各アミノ酸位置において、その位置におけるアミノ酸の天然の多様性を反映するアミノ酸の混合物が使用される。タンパクのＮ−末端にＨＡタグが付加され、Ｃ−末端にはＨｉｓ６タグが付加される。
【０２６４】
このタンパク設計をコードするオリゴヌクレオチドが合成される。同時に、単一的に、または、異なる設計の混合物として、１−３０の異なる設計が構築される。
【０２６５】
（主題組成物の発現）
細胞内・対・細胞外環境
ジスルフィド結合は、主に、分泌（細胞外ゾル）タンパクである。その形成は、多細胞生物の小胞体（ＥＲ）の中に存在するいくつかの酵素によって触媒される。一方、ジスルフィド結合は、一般に、非ストレス条件下では、細胞質ゾルには認められない。これは、遊離システインを酸化から保護する、グルタチオン還元酵素およびチオレドキシン還元酵素などの還元系の存在による。例えば、リボヌクレオチド還元酵素は、その反応サイクルにおいてジスルフィド結合を形成するが、このジスルフィド結合の還元は、反応の進行にとって必須である（Ｐｒｉｎｚ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１５６６１）。
【０２６６】
天然のミクロタンパクは、細菌、動物（いそぎんちゃく、腹足類、昆虫、さそり、蛇）、および植物によって発現される。しかしながら、組み換えミクロタンパクの異種発現は、一般に、大腸菌において行われている。ただし、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｃｈｉａ）、および、糸状真菌、例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＦｕｓａｒｉｕｍの外、哺乳類細胞系統、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＰｅｒＣ６も、ミクロタンパクの発現に使用することが可能である。文献の例では、異種的に発現されるミクロタンパクは、通常、大腸菌の細胞原形質において生産される。
【０２６７】
組み換え発現に対する代替法は化学的合成である。ミクロタンパクは、化学的合成を可能とするほど十分に小さく、経済的に十分見合うコストで合成によって生産することが可能と考えられる。
【０２６８】
ジスルフィドを含む無関係産物（多くは、Ａｂ断片、および丸ごとのＡｂを含むＩｇ−ドメイン含有産物）は、一般に、周辺ゾルまたは培養液に対する分泌によって、哺乳類組織培養、または大腸菌において生産される。分泌産物は、タンパク分解的に取り除かれるシグナルペプチドを持ち、フォルミル化されないＮ−末端を残す。一方、大腸菌の細胞原形質において生産されるタンパクは、ｆＭｅｔに続くアミノ酸（単複）に依存して、Ｎ−末端フォルミルメチオニンを保持することが多い。文献は、ｆＭｅｔに続くどのアミノ酸が、ｆＭｅｔ除去を実行するかを記載する。
【０２６９】
ミクロタンパクは、細菌および古細菌ではほぼ完全に見られないが（若干の例外）、親水性ミクロタンパクは全て大腸菌内で簡単に作製することが可能である。
【０２７０】
少数の細菌性ミクロタンパクとして、例えば、大腸菌および関連腸内細菌由来の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ−ＩａおよびＳＴ−Ｉｂと呼ばれる）がある。熱安定性エンテロトキシン、例えば、ＳＴａ（ＰＦＡＭ０２０４８）およびＳＴｂは、配列レベルでは無関係である。Ｓｔ−Ｉａの配列整列は、７２ａａの前駆体を示す。このタンパクは、二つの独立したタンパク分解事象によって処理されて、熟成トキシンを生成する。このトキシンは、１４  ２５  ３６の空間配置を持つ三つのジスルフィド結合を含む。ＳＴ−Ｉａのモチーフは、ＣｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣＣｘｘＣＣｘｘｘＣｘｘＣ
である。
【０２７１】
ミクロタンパクを発現し、ミクロタンパクを培養液に分泌するための有望な方法は、ＳＴ−Ｉａプロモーター、およびリーダーペプチドおよび前駆体で、ただし異なるミクロタンパクに接続されるものを用い、現在の３ＳＳ  １４  ２５  ３６モジュールを、異なるミクロタンパクで置換することである。ＳＴ−Ｉａは、培養液に（周辺ゾルではなく）分泌されるが、これは、大腸菌ではきわめて稀であり、ジスルフィドがどのように形成されるかを説明する。ＳＴ−Ｉａは、特別のリーダーペプチドを持っていて、そのため、ＳＴ−Ｉａは、３または４通りの異なる特別分泌系の内の一つを介して、大腸菌から分泌されることが可能となるらしい。ミクロタンパクと接続されるこのリーダーペプチドは、効率的分泌、および他のミクロタンパクのジスルフィド結合形成を可能とするばかりでなく、培養上清の速やかなスクリーニングにも有用であるようである。
【０２７２】
ミクロタンパクは、前核細胞および真核細胞を含む、種々の発現システムにおいて生産することが可能である。好適な発現宿主としては、例えば、酵母、真菌、哺乳類細胞培養体、昆虫細胞がある。特に興味深いのは、大腸菌、桿菌、または他の宿主生物を用いる細菌発現システムである。ミクロタンパクの異種発現は、通常、大腸菌の細胞原形質において行われる。ジスルフィド結合は、一般に、細胞原形質では、還元的環境であるために形成されないが、細胞が分解された後には形成される。ミクロタンパクの特徴解明および精製は、タンパク発現後に細胞を加熱することによって促進される。このプロセスによって、細胞は分解され、多くの大腸菌タンパクの沈殿が起こる。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．，ら、（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）。大腸菌における種々のミクロタンパクの発現レベルは、該ミクロタンパクを、ＧＦＰのようなリポーター、またはＨＲＰ、ベータ・ラクタマーゼ、またはアルカリフォスファターゼのような酵素と融合させた場合、コロニースクリーニングによって互いに比較することが可能である。特に興味深いのは、熱およびプロテアーゼ安定酵素である。なぜなら、これらは、熱またはプロテアーゼストレスの条件下で、ミクロタンパクの安定性の定量を可能とするからである。例としては、子牛腸内アルカリフォスファターゼ、またはベータ・ラクタマーゼの熱安定性変異種がある（Ａｍｉｎ，Ｎ．，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，１７：７８７−９３）。酵素またはリポーターに対するミクロタンパクの融合も、ミクロタンパクの結合性の分析をやり易くする。リポーター酵素の存在によって標的結合ミクロタンパクを検出することが可能となるからである。ミクロタンパクは、１種以上のエピトープタグとの融合物として発現させることも可能である。例として、ＨＡ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｅ−タグ、Ｔ７−タグがある。このようなタグは、サンプルの精製をやり易くするが、サンドイッチＥＬＩＳＡ、またはその他の方法によって結合性を測定するのに使用することも可能である。タンパク、またはペプチドリガンドの結合性を検出するために、他にも多くのアッセイが記載されているが、これらの方法もミクロタンパクに適用することが可能である。例としては、表面プラズモン共鳴、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、アフラスクリーン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ベータガラクトシダーゼ酵素断片相補性アッセイ（ＣＥＤＩＡ）がある。
【０２７３】
ミクロタンパクの異種発現は、通常、大腸菌の細胞原形質において行われる。ジスルフィド結合は、一般に、細胞原形質では、還元的環境であるために形成されないが、細胞が分解された後には形成される。大腸菌における種々のミクロタンパクの発現レベルは、該ミクロタンパクを、ＧＦＰのようなリポーター、またはＨＲＰ、またはアルカリフォスファターゼ（好ましくは、熱安定型、例えば、子牛腸内アルカリフォスファターゼ）のような酵素と融合させた場合、コロニースクリーニングによって互いに比較することが可能である。
【０２７４】
本発明はさらに、本明細書に開示されるシステイン含有スカフォールド、およびその断片を含む融合タンパクを含む。この融合は、本発明の二つ以上のスカフォールドと、関連または無関係スカフォールドとの間で行われてもよい。有用な融合パートナーとしては、ポリペプチドの細胞内局在を促進する配列、血清半減期反応性を延長する配列、または、免疫アッセイ支持体、またはワクチン担体に対するペプチドの結合を促進する配列である。
【０２７５】
（ジスルフィド結合の安定性における変動）
一般に、タンパクのジスルフィド結合の安定性にはある程度の変動がある。例えば、分泌タンパクにおけるジスルフィド結合は、細胞ゾルタンパクの「不要の」ジスルフィド結合よりも安定である傾向を持つ。一般に、ジスルフィド結合は、埋め込まれると還元に対して抵抗性を持ち、Ｗｅｄｅｍｙｅｒらによれば、ジスルフィド結合は、一般に、埋め込まれる。したがって、分泌タンパクにおけるジスルフィド結合は、完全にフォールド形成すると、還元に対してむしろ抵抗性を持ち、ジスルフィド結合に接触可能とするように、局所的巻き戻しを誘発するためには、低濃度の変性剤を加えなければならない。
【０２７６】
複数のジスルフィド結合を持つタンパクが、フォールド形成状態で細胞ゾルに向けて輸送され、摂取の間タンパクがフォールド形成状態を続けている場合、そのジスルフィド結合は、還元に対し耐性を持つ。このための前提条件は、どのジスルフィド結合も還元剤に接触されてはならないということである。細胞ゾル内では、チオレドキシンおよびグルタチオンが、ジスルフィド結合の直接の酸化剤として働く。ＤＴＴと比べてそれらの分子量は比較的大きいために、フォールド状態のタンパクに埋め込まれたジスルフィド結合に対するアクセスはごく制限される。
【０２７７】
タンパクのジスルフィド結合の接触可能度は、結晶構造を用いてインシリコで定量するか、または、実験的にＮＭＲによって定量することが可能であり、変性感度の定量と比較することが可能である（すなわち、Ｄ５０は、野生型のジスルフィドの５０％が存在するが、５０％が存在しなくなる、還元剤の濃度である）。
標的に対する共有結合
あるタンパクは、ジスルフィド結合を交換することによって別のタンパクに共有的に結合し、例外的結合アフィニティーを実現することが可能である。一つの有用な例はミニコラーゲンであり、この場合、ｃ−末端尾部配列が、Ｎ−末端頭部配列に共有的に結合し、二つのタンパクの間に６ジスルフィドの形成を実現する。図１１３を参照されたい。
【０２７８】
（スクリーニングおよび特徴解明ツール）
前述の２３４、３ｘ０−８、４ｘ０−８、および４ｘ６法の早期サイクルにおいて得られるタンパクライブラリーおよび個別のタンパククローンは、異種的にフォールド形成する傾向を持つ。
【０２７９】
ある程度まで、この異種性を無視することは可能であるが、所望の性質、特に、高いアフィニティー（通常ピコモル）および高い特異性の外、均一フォールド形成および高い発現レベルが得られるまで、指向性進化によって、タンパクを進化し続ける。
ファージライブラリーを構築し、選択する方法
（ディスプレイのタイプ）
変異種から成る大きなライブラリーにおいて結合分子を特定することを可能とする様々な方法がこれまでに記載されている。一つの方法は化学的合成である。ビーズにおいてライブラリーメンバーを、各ビーズが異なるペプチド配列を担持するように合成する。所望の特異性を持つリガンドを担持するビーズを、標的された結合パートナーを用いることによって特定することが可能である。もう一つの方法は、繰り返し手順において特異的結合配列の特定を可能とする、ペプチドのサブライブラリーの作製である（Ｐｉｎｉｌｌａ，Ｃ．，ら、（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，１３：９０１−９０５）。さらに一般的に使用されるのは、変異種のライブラリーが、ファージ、タンパク、または細胞表面において発現されるディスプレイ法である。この方法では、共通の特性として、ライブラリーの各変異種をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが、物理的にリガンドに連結される。これによって、対象とするリガンドを検出または回収することが可能となり、かつ、付属のＤＮＡまたはＲＮＡの配列を決定することによってそのペプチド配列を決めることが可能となる。ディスプレイ法によって、当業者は、ランダムな配列から成る大きなライブラリーから、所望の結合性を有するライブラリーメンバーを濃縮することができる。多くの場合、所望の結合性を有する変異種は、濃縮ライブラリーの個別の分離体について所望の性質の有無に関してスクリーニングすることによって特定することが可能である。ディスプレイ法の例として、ｌａｃレプレッサーに対する融合（Ｃｕｌｌ，Ｍ．，ら、，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１８６５−１８６９）、細胞表面ディスプレイ（Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２：３９５−９）がある。特に興味深いのは、ランダムペプチドまたはタンパクが、ファージ粒子に連結される方法である。一般的に使用されるのは、Ｍ１３ファージ（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，ら、（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ，９７：３９１−４１０）およびＴ７ファージ（Ｄａｎｎｅｒ，Ｓ．，ら、（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９８：１２９５４−９）である。Ｍ１３ファージにおいてペプチドまたはタンパクを提示するためには複数の方法の利用が可能である。多くの場合、ライブラリー配列は、Ｍ１３ファージのペプチドｐＩＩＩのＮ−末端に融合される。ファージは、通常、このタンパクの３−５コピーを担持するので、このライブラリーのファージは、多くの場合、ライブラリーメンバーの３−５コピーを担持する。この方法は、多価性ディスプレイと呼ばれる。別法は、ファージミドディスプレイである。この方法では、ライブラリーはファージミドにコードされる。ファージ粒子は、ファージミドを担持する細胞を、ヘルパーファージによって感染させることによって形成することが可能である。（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，ら、，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２−１０８３８）。このプロセスは、通常、一価性ディスプレイをもたらす。ある場合には、一価性ディスプレイは、高アフィニティー結合因子をもたらす点で好まれる。別の場合では、多価性ディスプレイが好まれる（Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．，ら、（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３２１：４９−５６）。
【０２８０】
所望の特徴を持つ配列を、ファージディスプレイによって濃縮するための種々の方法が記載されている。対象標的は、免疫試験管、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または他の表面に結合させることによって固定することが可能である。次いで、ファージライブラリーを、固定標的に接触させ、結合リガンドを欠如するファージを洗い流し、標的特異的リガンドを担持するファージを、種々の条件によって溶出することが可能である。溶出は、低ｐＨ、高ｐＨ、尿素、または、タンパク−タンパク接触を破断する傾向を持つ他の条件によって実行することが可能である。さらに、結合ファージに、大腸菌細胞を、溶出ファージが直接その添加大腸菌宿主に感染できるようなやり方で添加することによって溶出させることが可能である。興味深いプロトコールは、ファージ結合リガンド、または固定標的を分解することが可能なプロテアーゼによる溶出である。プロテアーゼはまた、プロテアーゼ耐性ファージ結合リガンドを濃縮するためのツールとして利用することが可能である。例えば、対象標的によるパンニングの前に、１種以上の（ヒトまたはマウス）プロテアーゼと共に、ファージ結合リガンドのライブラリーをインキュベートしてもよい。このプロセスは、前記ライブラリーのプロテアーゼ感受性リガンドを分解し、除去する（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，ら、（１９９８）Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ，３：３２１−８）。リガンドのファージディスプレイ・ライブラリーは、複雑な生物サンプルに対する結合のために濃縮することも可能である。例は、固定された細胞膜分画（Ｔｕｒ，Ｍ．Ｋ．，ら、（２００３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，１１：５２３−７）、または丸ごとの細胞（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．，ら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９：６０６−１２；Ｋｅｌｌｙ，Ｋ．Ａ．，ら、（２００３）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，５：４３７−４４）によるパンニングである。ある場合、ファージライブラリーの細胞特異的結合因子の濃縮度を上げるためにパンニング条件を最適化しなければならない（Ｗａｔｔｅｒｓ，Ｊ．Ｍ．，ら、（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：２１−９）。ファージパンニングはまた、生きている患者または動物において実行することも可能である。この方法は、血管標的に結合するリガンドの特定のために特に興味深い（Ａｒａｐ，Ｗ．，ら、（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，８：１２１−７）。
【０２８１】
ライブラリーを構築するためのクローニング法
文献は、当業者に対し、ペプチドリガンドのライブラリーをコードするＤＮＡ配列のライブラリーを作製することを可能とする、広く様々の方法を記載する。ヌクレオチドのランダム混合物を用い、一つ、または複数のランダム位置を含むオリゴヌクレオチドを合成してもよい。このプロセスによって、ランダム位置の数ばかりでなく、ランダム化の程度を調節することが可能である。さらに、生物サンプル由来のＤＮＡを部分的に消化することによってランダムな、または半ランダムなＤＮＡ配列を得ることが可能である。ランダムオリゴヌクレオチドは、あらかじめ定められた位置においてランダム化されたプラスミドまたはファージのライブラリーの構築に使用することが可能である。これは、（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ，Ｊ．，ら、（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２４８：９７−１０５）に記載されるように、ＰＣＲ融合によって実行される。他のプロトコールは、ＤＮＡ連結に基づく（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．，ら、（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２２：３０１−１０；Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，ら、（１９９３）Ｇｅｎｅ，１２８：５９−６５）。もう一つの一般的に使用される方法は、Ｋｕｎｋｅｌの突然変異発生である。この方法では、プラスミドまたはファージミドの突然変異１本鎖が、鋳型として、１本鎖サイクリックＤＮＡによって合成される。Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，ら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２８：３３３−６３；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−８２を参照されたい。
【０２８２】
Ｋｕｎｋｅｌ突然変異発生法は、ＣＪ２３６のような大腸菌株から得られた、ランダムに組み込まれたウラシル塩基を含む鋳型を使用する。このウラシル含有鋳型鎖は、大腸菌において形質転換されると分解されることが好ましい。一方、インビトロで合成された突然変異発生鎖は保持される。その結果、多くの形質転換細胞は、ファージミドまたはファージの突然変異発生バージョンを担持する。ライブラリーの多様性を増すための貴重な方法は、複数のサブライブラリーを合わせることである。これらのサブライブラリーは、前述の方法の内の任意の方法によって作製されてよく、同じ、または異なるスカフォールドに基づいていてもよい。
【０２８３】
短いペプチドから成る大きなファージライブラリーを作製するための有用な方法が最近記載された（Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｍ．Ｄ．，ら、（２００５）Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｒｈｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，８：５４５−５１）。この方法は、Ｋｕｎｋｅｌ法に関連するが、ランダムウラシル塩基を含む、単一鎖のＤＮＡ鋳型の作製を要しない。その代わり、この方法は、突然変異を誘発すべき区域の近くに一つ以上の突然変異を担持する鋳型ファージから始め、かつ、前記突然変異は、ファージを非感染性とする。方法は、いくつかの位置にランダムコドンを担持し、かつ、鋳型におけるファージ不活性化突然変異を補正する突然変異発生オリゴヌクレオチドを用いる。その結果、形質転換後、突然変異発生ファージ粒子のみが感染性を持ち、そのライブラリーには親ファージはほとんど含まれなくなる。この方法は、いくつかのやり方でさらに修飾することが可能である。例えば、複数の突然変異発生オリゴヌクレオチドを用い、ファージの複数の、不連続領域において同時に突然変異を発生させてもよい。我々は、これを、＜１０、１５、または３０アミノ酸ではなく、さらに新たな目標として、＞２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０アミノ酸から成るミクロタンパク全体に適用することによって、この方法をさらに１ステップ推し進めた。この方法は、現在では、１回の形質転換で、１０ｅ１０を超える（最大１０ｅ１１）のライブラリーを作製し、このため、１０回の形質転換では、１０ｅ１２の多様性を持つ単一ライブラリーが期待される。
【０２８４】
（反復突然変異発生法）
Ｓｃｈｏｌｌｅ法の新規変法は、突然変異発生オリゴヌクレオチドを、鋳型のアンバー終止コドンが、オークル終止コドンに変換され、突然変異発生の次回サイクルにおいてオークルがアンバーに変換されるように、設計することである。この場合、鋳型ファージおよび突然変異発生ライブラリーメンバーは、大腸菌の異なるサプレッサー株において、オークルサプレッサーとアンバーサプレッサーと交互に、培養されなければならない。このように、２種類の終止コドンおよび二つのサプレッサー株の間を交互に行き来することによって、ファージの突然変異発生の連続ラウンドを実行することが可能である。
【０２８５】
Ｓｃｈｏｅｌｌｅ法の、もう一つの新規変法は、単一鎖のファージＤＮＡ鋳型と共にメガプライマーを使用することを含む。メガプライマーは、パンニングの前回ラウンドから選ばれたファージプールのライブラリー挿入体から作製された長いｓｓＤＮＡである。目的は、一つ以上の区域で突然変異を発生させた、前回プールのライブラリー挿入体の完全な多様性を捕捉し、これを、新規ライブラリーに、さらに別の区域において突然変異発生が可能となるように転送することである。このメガプライマープロセスは、対象遺伝子の中に終止コドンを含む、同じ鋳型を用いて複数サイクル反復することが可能である。メガプライマーは、下記を含むｓｓＤＮＡ（任意にＰＣＲによって作製される）である：１）前記ｓｓＤＮＡ鋳型に対し相補性を持つ少なくとも１５塩基の５’および３’重複区域、および、２）以前に選ばれたクローンのプールからコピーされた（任意にＰＣＲによって）、一つ以上の、以前に選ばれたライブラリー区域（１、２、３、４、またはそれ以上）、および、３）パンニングの次回ラウンドにおいて選ばれるはずの新規突然変異発生区域。メガプライマーは、１）新たに合成されるライブラリー区域をコードする一つ以上のオリゴヌクレオチドを合成すること；および、２）これを、任意に重複ＰＣＲを用いて、以前に最適化された、他の、任意のライブラリー区域を含むＤＮＡ断片（任意にＰＣＲによって得られた）に融合すること、によって任意に調製される。組み合わせた（重複）ＰＣＲ産物のランオフまたは１本鎖ＰＣＲを用い、以前に最適化された区域全てを含むばかりでなく、次のパンニング実験において最適化される予定の別区域の新規ライブラリーを含む１本鎖メガプライマーを作製する。図２８を参照されたい。この方法は、サイクル当たり１０ｅ１１から１０ｅ１２の多様性を生成する、パンニングを伴う、速やかな、複数のライブラリー創製サイクルによるタンパクのアフィニティー熟成を可能とすることが期待される。
【０２８６】
ミクロタンパクの結合性または、製造、安定性、または免疫原性のようなその他の性質を強化する目的で、（前回選択された、または未洗練の）ミクロタンパク・ライブラリーに配列多様性を導入するため、または、個々のミクロタンパク・クローンを突然変異させるために、様々の方法の適用が可能である。原理的に、ライブラリーの作製に使用することが可能な方法は全て、ミクロタンパクの濃縮（以前に選択された）ライブラリーに多様性を導入するために使用することが可能である。特に、所望の結合またはその他の性質を有する変異種を合成し、これらの配列に基づいて部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチドを設計することが可能である。このプロセスによって、ランダム化の位置、およびランダム化の程度を調節することが可能である。各種コンピュータアルゴリスムを用いて、複数の変異種の配列データから、タンパク中の個別の突然変異の有用性を導き出すことが可能である（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｊ．，ら、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２１：７３３−９；Ａｍｉｎ，Ｎ．，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，１７：７８７−９３）。濃縮ライブラリーの再度の突然変異発生のために特に興味深いのは、ＤＮＡシャッフリングである（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１）。これは、濃縮ライブラリーにおいて個々の配列の組み換えを生成する。シャッフリングは、様々の改変ＰＣＲ条件を用いて実行が可能であるが、組み換えを強調するために鋳型は部分的に分解してもよい。それに代わるものとして、制限酵素クローニング用い、あらかじめ定められた位置に組み換えを実行する方法がある。特に興味深いのは、ＤＮＡを、その配列認識部位の外側で切断する、ＩＩＳ型制限酵素を利用する方法である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．，ら、（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３１７−３８）。非パリンドローム・オーバーハングを生成する制限酵素を利用して、複数位置において変異種混合物をコードするプラスミド、またはその他のＤＮＡを切断し、連結によって完全プラスミドを再集合することが可能である（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ら、（１９９３）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１４：５７１−９）。多様性を導入するもう一つの方法は、ＰＣＲ突然変異発生法である。この方法では、ライブラリーメンバーをコードするＤＮＡ配列に対し、突然変異発生条件下でＰＣＲを行う。比較的高い突然変異頻度で突然変異を起こすＰＣＲ条件は記載されている（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．，ら、（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５）。さらに、忠実性の低下したポリメラーゼを採用することも可能である（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ，Ｔ．，ら、（２００５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３３９：９−１４）。特に興味深い方法は、ミューテーター株による（Ｉｒｖｉｎｇ，Ｒ．Ａ．，ら、（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１２７−４３；Ｃｏｉａ，Ｇ．，ら、（１９９７）Ｇｅｎｅ，２０１：２０３−９）。これらは、一つ以上のＤＮＡ修復遺伝子に欠陥を持つ株である。これらの株におけるプラスミド、またはファージ、または他のＤＮＡは、正常の複製の間に突然変異を��積する。ミューテーター株中の、個々のクローン、または濃縮集団を伝播して、遺伝子の多様性を導入することが可能である。前述の方法の多くは、反復プロセスに利用することが可能である。複数ラウンドの突然変異発生および、スクリーニングまたはパンニングを、遺伝子全体、または遺伝子の一部に適用することが可能であり、あるいは、各後続ラウンド毎に、タンパクの様々な部分に突然変異を起こさせることが可能である（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．，ら、（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２５４：３９２−４０３）。
【０２８７】
（ライブラリー処理）
ファージパンニングの既知のアーチファクトとして、１）疎水性に基づく非特異的結合、および２）標的に対する多価性結合で、ａ）ｐＩＩＩファージタンパクの５価性によるもの、または、ｂ）異なるミクロタンパク間のジスルフィド形成によるマルチマー形成によるもの、または、ｃ）固相支持体における標的の高密度コーティングによるもの、および３）背景依存性標的結合で、標的の背景、またはミクロタンパクの背景が、結合または阻害活性を決定しているもの、が挙げられる。これら問題点の大きさを最小化するために、種々の処理工程の採用が可能である。理想的には、この処理は、ライブラリー全体に適用されるが（ライブラリー処理）、不正クローンを除去するいくつかの有用な処理は、可溶性タンパクプール、または個々の可溶性タンパクにのみ適用される。
【０２８８】
ミクロタンパク・ライブラリーは、他のタンパクに架橋結合して指向性進化を複雑化する可能性のある遊離チオールを含む確率が高い。一つの方法は、ライブラリーを遊離チオールカラムを通過させ、一つ以上の遊離スルフヒドリルを有する全てのクローンを取り除くことによって、該ライブラリーから、最悪クローンを除去することである。遊離ＳＨ基を有するクローンはさらに、ビオチン−ＳＨ試薬と反応することが可能であり、ストレプトアビジン・カラムによる、反応性ＳＨ基を有するクローンの効率的除去を可能とする。もう一つの方法は、遊離チオールを除去せず、それらを、スルフヒドリル反応性薬品、例えば、ヨード酢酸によってキャップ封印して不活性化することである。特に興味深いのは、非特異的標的結合を抑える、嵩張った、または親水性のスルフヒドリル試薬、またはその修飾変種である。
【０２８９】
背景依存性の例は、全ての定常配列、例えば、ｐＩＩＩタンパク、リンカー、ペプチドタグ、ビオチン−ストレプトアビジン、Ｆｃ、および、相互作用に寄与する、その他の融合タンパクを含む配列である。背景依存を回避するための典型的方法は、蓄積を避けるために、できるだけ頻繁に背景を切り替えることを含む。これは、異なるディスプレイシステム（すなわち、Ｍ１３・対・Ｔ７、またはＭ１３・対・酵母）の間、使用されるタグ同士およびリンカー同士の間、固定のために使用される（固相）支持体（すなわち、固定化学）、および、標的タンパクそのもの（異なる販売業者、異なる融合バージョン）を交互に行き来することを含む。
【０２９０】
さらにライブラリー処理を用いて、好ましい性質を持つタンパクを選択することが可能である。一つの選択肢は、ライブラリーから不安定変異種を除くために、ライブラリーをプロテアーゼで処理することである。使用されるプロテアーゼは、通常、用途の中で遭遇することが予想されるものである。肺輸送のためには、例えば、肺洗浄によって得られる肺プロテアーゼを用いることが考えられる。同様に、血清、唾液、胃、小腸、皮膚、鼻などから、プロテアーゼの混合物を得られよう。しかしながら、単一の精製プロテアーゼの混合物を使用することも可能である。プロテアーゼの広範なリストが付録Ｅに示される。
【０２９１】
例えば、ライブラリーを、低濃度の還元剤（すなわち、ＤＴＴ、またはベータメルカプトエタノール）に暴露して、先ず、安定性のもっとも低い構造を除去し、それから次第に濃度を増すことによって、もっとも安定な構造、すなわち、最強のジスルフィド結合を有する構造に関してライブラリーを選択することが可能である。通常、還元剤（すなわち、ＤＴＴ、ＢＭＥなど）の濃度は、所望の安定性に応じて、２．５ｍＭから５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または場合によっては１００ｍＭと考えられる。
【０２９２】
さらに、全体ディスプレイライブラリーを、高濃度の還元剤で還元し、次いで、このタンパクライブラリーを徐々に再び酸化して再度ジスルフィドを形成し、次いで、前述のように遊離ＳＨ基を持つクローンを除去することによって、インビトロにおいて効率的に再度フォールド形成することが可能なクローンを選択することが可能である。このプロセスは、インビトロにおいて再度フォールド形成する効率が低いクローンを除去するために、１回または複数回適用することが可能である。
【０２９３】
一つの方法は、Ａ．Ｃ．Ｆｉｓｈｅｒ  ら、（２００６）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（オンライン）によって記載されるように、タンパクの発現レベル、フォールド形成、および可溶性に関して遺伝子選択を適用することである。ディスプレイライブラリーのパンニングの後では（任意）、標的結合、発現レベル、およびフォールド形成に関して、タンパクレベルで、数千のクローンをスクリーニングするのは避けたいであろう。別法として、選ばれた挿入体の全プールを、ベータラクタマーゼ融合ベクターにおいてクローンすることがある。このクローンを、ベータラクタムにプレートしたところ、発現性の高い、ジスルフィド結合の完全な、かつ可溶なタンパクについて選択的であることを作者らは証明した。
【０２９４】
Ｍ１３ファージによるタンパクライブラリーのディスプレイ、および、１サイクル以上の標的に対するパンニングの後、その後の進行には様々の道がある。
【０２９５】
ファージＥＬＩＳＡによる個々のファージクローンのスクリーニング。  これは、固定標的に結合する、ファージ粒子の数（抗Ｍ１３抗体を用いて）を測定する。
【０２９６】
Ｍ１３からＴ７ファージディスプレイ・ライブラリーへの転送。単一ライブラリー方式はどれも、標的に対し高アビディティ接触を形成することが可能なクローンを優先的に取る傾向がある。これが、可溶性タンパクのスクリーニングが重要である理由である。ただし、これは手間ひまのかかる解決策ではある。Ｔ７ファージディスプレイにおいて実現される多価性は、Ｍ１３ディスプレイにおいて実現されるものとはきわめて異なるようであり、Ｔ７およびＭ１３の間で往復サイクルすることは、原子価に基づく擬似陽性の出現を抑えるための優れた方法と考えられる。
【０２９７】
フィルターリフト。  大きな寒天プレートにおいて高密度（１０ｅ２−１０ｅ５）で育成した細菌コロニーについてはフィルターリフトを実行することが可能である。少量の、いくつかのタンパクは、培養液に分泌され、フィルター膜（ニトロセルロース、またはナイロン）に結合して終わる。次に、フィルターは、非脂肪ミルク、１％カゼイン加水分解物、または１％ＢＳＡ液においてブロックされ、蛍光染料、またはインディケータ酵素（直接、または、間接的に、抗体またはビオチン−ストレプトアビジンを介して）によって標識された標的タンパクとインキュベートされる。コロニーの位置は、フィルターを、プレートの背面に重ねることによって決定され、全ての陽性コロニーが選択され、さらなる特徴解明のために使用される。フィルターリフトの利点は、様々の期間洗浄した後シグナルを読み取ることによって、アフィニティー選択的とすることが可能であることである。高アフィニティークローンのシグナルは、ゆっくりと褪色するが、低アフィニティークローンのシグナルは、速やかに褪色する。このアフィニティー特徴の解明は、通常、ウェル使用アッセイでは３点アッセイを必要とするが、ウェル使用アッセイよりも、クローンからクローンの近似性はより優れる。コロニーを格子で区切ってアレイとするやり方は、コロニー・サイズまたは位置による差を最小化するので有用である。
【０２９８】
（製薬組成物）
本発明はさらに、主題のシステイン含有タンパクを含む製薬組成物を提供する。この組成物は、経口的に、鼻腔内に、非経口的に、または吸引治療によって投与されてもよく、錠剤、ローゼンジ、顆粒、カプセル、丸剤、アンプル、坐剤として、またはエロゾル形として摂取されてもよい。組成物はまた、水性、または非水性希釈剤に溶解した活性成分の縣濁液、溶液、または乳液、シロップ、顆粒、または粉末の形で摂取されてもよい。さらに、この製薬組成物は、さらに、他の製薬学的に活性な化合物、または、複数の、本発明の化合物を含んでもよい。
【０２９９】
本発明のシステイン含有タンパクはまた、各種液相担体、例えば、滅菌、または水溶液、製薬学的に受容可能な担体、縣濁液、および乳液と混ぜ合わせられてもよい。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が挙げられる。
【０３００】
さらに詳細には、本発明の製薬組成物は、任意の適切なルート、例えば、経口、直腸内、鼻腔内、局所（経皮、エロゾル、頬内、および舌下）、膣内、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内）、および肺内を含むルートを通じて投与してよい。さらに、好ましいルートは、レシピエントの状態および年齢、および治療される病気に応じて変動することが理解される。
【０３０１】
（製品形式）
多様な用途、例えば、試薬、診断薬、予防薬、体外治療剤、および、静脈内、皮下、硬膜下腔内、眼内、経強膜、腹腔内、経皮、経口、頬内、腸内、膣内、鼻腔内、肺内、および他の剤形などのインビボ治療薬のための、種々の薬剤輸送法用の特殊形式を含む用途に使用されるために、広範な製品形式が考えられている（図１５９を参照）。
【０３０２】
このような製品形式としては、ドメイン・モノマー、およびドメインマルチマー（単一または複数タンパク鎖の中に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０，４０、５０、場合によっては１００ドメインを有する製品）が挙げられる。ドメインは、固有配列または構造モチーフしか含んでなくともよいし、あるいは、二重配列または構造モチーフ、またはより高次の反復配列または構造モチーフ（反復タンパク列）を含んでもよい。各ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なる標的に対する、単一連続的、または複数不連続的（空間的、または配列定義による）結合部位を持ってもよい。標的は、治療、診断（インビボ、インビトロ）、試薬、または材料標的であってもよく、かつ、タンパク、炭水化物、脂質、金属、または、他の、任意の、生物的、または非生物的材料（その組み合わせ）であってもよい。ドメインモノマーおよびマルチマーは、同じ標的に対し複数の結合部位を持ち、任意にアビディティをもたらしてもよい。ドメインマルチマーはまた、異なる標的に対し、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の結合部位を持ち、多重特異性をもたらしてもよい。ドメインマルチマーは、任意に、長さが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０ＡＡの範囲のペプチドリンカーを含む。このドメインには、様々の要素、例えば、タグ（例えば、抗体またはＮｉ−ＮＴＡによる検出または精製のための）を含む、直鎖または環状ペプチドが融合されてもよい。
【０３０３】
半減期延長形式：製品の血清排泄半減期を所望の分泌半減期、１、２、４、８、または１６時間から、１、２、３、４、５、または６日から、１週、２週、３週、または１、２、３ヶ月の範囲に延長するために好ましい方法は、融合ペプチド（直鎖、単環、または二環、それぞれ、０、１、または２ジスルフィドを意味する）またはタンパクドメインで、血清アルブミン、免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）、赤血球、または他の血液分子または、血清接触分子への結合を実現するものを使用することが好ましい。それに代わる別法は、部分的に重複する、または重複しない種々の結合部位を用いて、ドメインが、製薬学的標的に対してだけでなく、半減期延長標的、例えば、血清アルブミンにも結合するようにドメインを設計することである。望ましい方法は、一区域においてランダム化され、かつ、半減期標的（すなわちＨＳＡ）に結合するように選ばれるスカフォールドを創出し、次に、これらの構築体を用いて、一つ以上の製薬学的標的に対して結合するように設計される、さらに別の区域をランダム化し、このようにして、半減期標的にも、製薬学的標的にも結合するドメインを創製することである。血清タンパク、または血清接触タンパクに対して結合することによって半減期延長を実現するドメインは、非ミクロタンパク、例えば、ヒトのサイトカイン、増殖因子、およびケモカインに融合させてもよい。任意の応用として、このようなヒトタンパクの半減期の延長、または、ヒトタンパクの特定組織に対する標的照準がある。このような相互作用において好ましいアフィニティーは、１０ｕＭ、１ｕＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ未満（または上回るレベル）である。もう一つの選択肢は、ドメインのＳｔｏｋｅｓ流体力学半径を拡張し、それによって、その血清分泌半減期を延長するために、ドメイン（単複）に、長い、非構造的で、屈曲性に富むグリシン富裕配列を融合させることである。もう一つの選択肢は、ペプチド結合ではなく、ジスルフィド結合、または他の化学的連結を通じて、ドメインを、他のドメインに共有的に連結することである。もう一つの選択肢は、小型分子（製薬学的に活性な薬剤担体を含む）、放射性標識（すなわち、キレート剤）、およびＰＥＧまたはＰＥＧ様分子または炭水化物を、タンパクに化学的に接合することである。
【０３０４】
薬剤輸送の別形式：平均的ミクロタンパクの性質は、大抵の代替（非注入）輸送形式に好適であるが（サイズ、プロテアーゼ安定性、可溶性、親水性）、特定の好ましい輸送形式に対する可能性をさらに改善するために加工法の使用が考えられる。Ｗｅｒｌｅ，Ｍ．ら、（２００６）Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １４：１３７−１４６は、３種の異なるミクロタンパクが、プロテアーゼに対し、例えば、エラスターゼ、ペプシン、キモトリプシンに対してばかりでなく、血漿プロテアーゼ（血清）および腸膜プロテアーゼ（２／３）に対しても高い耐性を持つことを示す。彼らはまた、二つのミクロタンパクの見かけの移動係数（Ｐａｐｐ）が、各種ペプチドおよび小型タンパクについて創製された標準曲線から予想されるものよりも３倍高いことを示す。組織障壁を横断する輸送、例えば、鼻腔内、経皮、経口、頬内、腸内、または経強膜輸送では、効率およびバイオアベイラビリティは、主に、タンパクのサイズによって決められる。各種の賦形剤、例えば、アルキルサッカリドは、タンパク製剤の輸送を最大約１０倍改善することが報告されている（Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（２００６）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ３：１−１１）。これらの輸送強化剤の内のいくつかは、ＧＲＡＳであるか、または、食品添加剤として使用されており、そのため、製剤におけるその使用は、長々しいＦＤＡの承認手続きを必要としない。これらの強化剤のいくつかは、両親媒性であり、親水性部分（すなわち、炭水化物）および疎水性部分（すなわち、アルキル鎖）を持つために、ミセルを形成することが可能である。ミクロタンパク、および非ミクロタンパクペプチドまたはタンパクに遺伝学的に融合された、親水性および疎水性タンパク配列を用いてこれを模倣することが可能である。例えば、親水性タンパクは、グリシン（非イオン性）、グルタミン酸塩、およびアスパラギン酸塩（負に荷電）、またはリシンおよびアルギニン（正に荷電）に富んでもよく、疎水性配列は、トリプトファンに富んでもよい。疎水性突出尾部（すなわち、５−２０トリプトファン残基）を持つタンパクを、膜挿入によって長い半減期を実現する疎水性薬剤と同様、そのポリ・トリプトファンを細胞膜に挿入させて半減期の延長を実現するように使用してもよい。タンパクそのものは不変であるので、その結合特異性は、低下しないことが予想され、ただ、その（ミクロの）生体分布が変化するだけである。それに代わる別法は、ミクロタンパクに、薬剤輸送体、例えば、ＰｅｐＴ１、ＰｅｐＴ２、ＨＰＴ１、ＡＢＣ輸送体に結合する、またはそのような輸送体によって取り込まれることが知られる、ペプチドまたは小型分子を接合することである。参照文献は、Ｌｅｅ，ＶＨＬ（２００１）Ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒ  ２９：４１−４４；および、Ｋｕｎｔａ  ＪＲ  ａｎｄ  Ｓｉｎｋｏ，ＰＪ（２００４）Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ．���ｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５：１０９−１２４；Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＣＵ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｉｎ，Ｂ（２００３）Ｄｉ−／Ｔｒｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔａｒｇｅｔｓ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４：３７３−３８８；Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ，Ｊ．ら、（２００４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ５８：１４２−１５２．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，ＣＧ  ら、（２００５）；ＡＢＣ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ：ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｓ  ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ．Ｇｕｔ  ５２：１７８８−１７９５；Ｙａｎｇ  ＣＹ  ら、（１９９９）Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１３３１−１３４３である。
【０３０５】
ミクロタンパクは、理想的には、半減期延長が必要とされないので、局所輸送に好適である。ミクロタンパクは、単回投与によって持続輸送が実現されるため、沈着処方を通じて輸送されてもよい。
【０３０６】
沈着処方（例えば、インプラント、ナノ小球、ミクロ小球、およびゲルなどの注入可能溶液）は、ある程度の半減期延長は有利ではあるけれども、薬剤（溶液形）の半減期の延長を要求しない。
【０３０７】
ミクロタンパク・ドメイン、および、様々のアミノ酸組成を持つポリペプチドスペーサを重合して、粘ちょうな、長いポリマーに変換することは、可溶性薬剤がそれからゆっくりと放出される沈着物を生成することが期待される。これらのポリマーは、ミクロタンパクに融合されてもよいし、あるいは、それらは別々のタンパクであってもよい。粘ちょう液体は、皮下、または筋肉下に注入されることも考えられる。タンパクポリマーを用いる代わりに、タンパクを、他の、様々の生物分解性基質、例えば、ポリ無水物、またはポリエステル、またはＰＬＧ（ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド））、またはＳＡＩＢ（スクロースアセテートイソブチレート）、またはポリ−エチレングリコール（ＰＥＧ）、および、その他のヒドロゲル、脂質発泡体、コラーゲン、およびヒアルロン酸などの基質と混合してもよい。小型のサイズ、プロテアーゼ、機械的、および熱に対する耐性、および高度の親水性のため、ミクロタンパクは、他のタンパクが実現できない過酷な処方にも好適である。小型のサイズのために、ミクロタンパクは、イオン導入、粉末弾丸輸送、可聴輸送、および電気穿孔輸送にも好適である（Ｃｌｅｌａｎｄ，ＪＬ  ら、（２００１）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：２１２−２１９）。
【０３０８】
融合タンパクの経口輸送：経口輸送に対する別の方法は、既存の細菌トキシン、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン（ＰＥ３８、ＰＥ４０）に対するミクロタンパク薬剤の融合を含む。このトキシンは、細胞膜を横断して、薬剤を細胞の原形質の中に輸送することが可能である。この方法は、タンパク薬剤を、細胞（すなわち、腫瘍細胞）内へ輸送するばかりでなく、効率的経口輸送、すなわち、小腸腔から血流への輸送にも有効であることが証明されている（Ｍｒｓｎｙ，ＲＪ  ら、，（２００２）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：２４７−２５８）。
【０３０９】
経口（および肺内）輸送に対するもう一つの方法は、ミクロタンパクをＦｃ−受容体に融合し、小腸からの、新生児Ｆｃ受容体仲介摂取を用い、トランスサイトーシスを通じて血流に輸送することである（Ｌｏｗ，ＳＣ  ら、，（２００５）Ｏｒａｌ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＦＳＨ−Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖｉａ  ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（印刷中））。
【０３１０】
ミクロタンパクの細胞内輸送：Ｒｏｔｈｂａｒｄらは、天然のアルギニン富裕ペプチド、例えば、ＨＩＶ−ｔａｔが、細胞膜を横切って輸送されること、および合成ａｒｇ−富裕ペプチドも同様であることを実証した。これを模倣する一つの方法は、ミクロタンパクのＮ−またはＣ−末端にａｒｇ−富裕ペプチドを付着させることであり、第２の方法は、ライブラリーの設計時、ミクロタンパクのアルギニン含量を増し、かつ、スクリーニング時、高いａｒｇ含量のクローンを優先的に取ることである。アルギニン含量は、最大約３％、好ましくは５％、多くの場合７．５％、時に１０％、理想的には１５、２０、２５、３０、または３５％に増してもよい。
【０３１１】
マルチマー形式：ミクロタンパクは、アビディティの上昇および半減期の延長を含む、多くの理由でマルチマーとしてもよい。我々は、複数のドメインが、グリシン富裕の、長い親水性スペーサで隔てられる形式に注目したが、ただし、複数のドメインを、スペーサ無しで、または天然のスペーサを用いて重合することも可能である。
【０３１２】
長いグリシン富裕配列は、大きな流体力学半径を持ち、そのため、ＰＥＧ化による半減期延長を模倣する。各グリシン富裕配列スペーサは、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２４０、２８０、３２０アミノ酸長、またはそれ以上であってもよい。ホモのマルチマー標的、および細胞表面標的では、さらにモノマー標的でも、ミクロタンパク結合部位をマルチマー化し、結合部位間に、さらに（任意に）、Ｎ−末端およびＣ−末端に、グリシン富裕スペーサを配することが有用である。このタンパクでは、タンパクにおけるグリシンポリマーの全長は、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または場合によっては４００アミノ酸に達してもよい。このタンパクは、それぞれが、同じ標的（同じコピー、または異なるコピー）の異なる部位に結合する、複数の、異なる結合部位を含んでもよい。このようにして、例えば、一部はその長さおよび半径のために、一部は、血清アルブミン、または免疫グロブリン、またはその他の、血清接触タンパクに対する（ミクロタンパクの）結合部位の存在のために、きわめて長い半減期を有するタンパクを創製することが可能である。
【０３１３】
抗体も、その長い半減期を獲得するために、サイズおよび受容体結合の両方を利用するが、最長の半減期のためには両方の機序が必要とされるようである。結合性および非結合性要素から成るこのようなポリマーを実現するためには、様々な方法および組成物がある。１）単一タンパク鎖において結合された（遺伝学的融合）結合モチーフの複数コピー；コピーは同じであっても、異なっていてもよい、２）結合部位の単一（または複数）コピーが、別々のタンパクとして発現され、化学的結合によって、ＮからＣ末端にかけてマルチマー化される。各種化学的結合法の使用が可能である（結合剤のリストについてはｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅ．ｃｏｍ参照）；コピーは同じであっても、異なっていてもよい、３）単一タンパク鎖における結合部位の複数コピーで、非結合リンカーによって分離される、４）結合部位および非結合部位が、それぞれ、別々のタンパクとして発現され、化学的結合によってマルチマー化される。各種の化学的結合の使用が可能である（Ｐｉｅｒｃｅの結合剤リストを加えよ）；コピーは同じであっても、異なっていてもよい、５）各タンパクは、一つの結合部位、および一つの非結合部位を含み、これらのタンパクが、化学的結合によってマルチマー化される。各種化学的結合法の使用が可能である（ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅ．ｃｏｍ参照）；コピーは同じであっても、異なっていてもよい、６）各タンパクは、結合部位、および、任意に非結合リンカーを含み、各タンパクは、Ｎ−およびＣ−の両末端において、互いに結合してタンパクの、方向性を持つ直線的マルチマーを創製する「連結ペプチド」を有する。各種のペプチド配列、例えば、ＳＫＶＩＬＦ（Ｅ）、またはＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ、およびその誘導体などの使用が可能であり、コピーは同じであっても、異なっていてもよい。ＳＫＶＩＬＦ（Ｅ）は、反対平行的に、ホモの二量体を形成し（Ｂｏｄｅｎｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．）、かつ、ＤＡＤＡＤＡ（または［ＤＡ］ｎ）に結合するＲＡＲＡＲＡ（または［ＲＡ］ｎ）は、ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡから得られることが、Ｎａｒｍｏｎｅｖａ，ＤＡ  ら、（２００５）Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｓｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６：４８３７−４８４６に報告されている。ドメイン、またはドメインのマルチマーの一端に［ＲＡ］ｎ、他端（Ｃ−またはＮ−末端）に［ＤＡ］ｎを配置することは、一タンパクのＮ−末端を、同じタンパクの別コピーのＣ−末端に連結することによって、直線的で、方向性を持つポリマーの創製を可能とする。ポリマーをきわめて長く作製するか、または架橋させて、皮下の注入部位を効率的に離脱することがないようにした場合、沈着、または徐放処方が実現される。一つの方法は、血清プロテアーゼのためのプロテアーゼ切断部位を、ゆっくりと崩壊するポリマーを生成するように設計することである。
【０３１４】
製薬標的：主題のミクロタンパクは、一般に、ある任意の標的に対して特異的な結合特異性を示す。ある実施態様では、主題のミクロタンパクは、下記の、非限定的リストから選ばれる一つの標的に結合することが可能である。すなわち、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、アルファ３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０、ＩＬ−１ｂ、ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦまたはＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０，ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−１−Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１−Ａ５、エフリンＢ１−Ｂ３、アルファ−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１，２、ＩＦＮａ，ｂ，ｇ、カスパーゼ２、３、７、８、１０、ＡＤＡＭ  Ｓ１、Ｓ５、８、９、１５、ＴＳ１、ＴＳ５；アジポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−１、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンギオゲニン、アンフィレグリン、アンギオポエチン１，２、４、Ｂｃｌ−２、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２、３、４、５、６、７、８；ＣＲＰ、カドヘリン６、８、１１；カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｘ；ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ  Ｆタンパク、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、α４β１、α４β７、ＴＮＦ／リンフォトキシン、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘、肝炎、ＣＭＶ、破傷風、ワクシニア、抗毒、ボツリヌム、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えば、ＬＡ  ＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンフォトキシンａ／ｂ受容体、Ｗｓ１−１、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６  ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳ��９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテグリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ  Ｌ／ＴＮＦＳＦ１１，４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８である。
【０３１５】
ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ  １０Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、プロ−ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンフォトキシン・ベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンフォトキシン・ベータＲ（ＬＴｂＲ）／Ｆｃキメラ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ−ベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡＲ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ。
【０３１６】
下記の実施例は、本発明の方法に有用な物質の製造法、および、本発明の方法の操作的実施態様を提供することによって本発明を具体的に説明することを意図するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０３１７】
（実施例１：ＣＤＰ６＿６＿１２＿３＿２のランダム化）
下記の実施例は、ＣＤＰ６＿６＿１２＿３＿２に基づくライブラリーの設計を記載する。タンパク配列のＴｒＥＭＢＬデータベースについて、ＣＤＰ６＿６＿１２＿３＿２に合致する部分的配列を探索した。合計７１個の配列がこのＣＤＰに合致した。表５に示す通り、各位置について、アミノ酸の出現率を計算した。各非システイン位置について、我々は、下記の基準に基づいてランダム化スキームを選んだ。ａ）終止コドンの導入を避ける、ｂ）余分のシステイン残基の導入を避ける、ｃ）特定位置に＞３％で観察されるアミノ酸の多数を許容する、ｄ）ＣＤＰに合致する７１個の天然配列のいずれにも観察されないアミノ酸の導入を最小とする。
【０３１８】
【化１８】
2009509535.tif 000016
（実施例２：大腸菌におけるタンパクの発現およびフォールド形成）
オリゴヌクレオチドを、発現バクターにクローンし、大腸菌の細胞原形質におけるタンパクの発現を駆動する。好ましいプロモーターは、大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３のＴ７である（ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴベクターシリーズ；Ｋａｎマーカー）。このオリゴを挿入するのに好ましいプロセスは、Ｋｕｎｋｅｌの変法である（Ｓｃｈｏｌｌｅ，Ｄ．，Ｋｅｈｏｅ，ＪＷ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．（２００５）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．＆  ＨＴＰ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ８：５４５−５５１）。別の方法は、ベクター（全体または部分的）の２−オリゴＰＣＲ、次いで、断片のオリゴ由来末端の、特有の制限部位の消化、次いで、適合性の、非パリンドローム・オーバーハングの連結（効率的断片内連結）である。第３の方法は、重複ＰＣＲによる、２または４個のオリゴからの挿入体の集合、集合挿入体の末端における制限酵素部位の消化、次いで、連結による消化ベクターへの変換である。連結ＤＮＡは、コンピテント大腸菌細胞において形質転換され、ＬＢ−Ｋａｎプレートに撒かれ、一晩増殖された後、個別のコロニーが採取され、２ｘＹＴ培養液を含む９６ウェルプレートに接種され、培養体は、シェーカーにおいて３７Ｃで一晩育成される。
【０３１９】
プレートは８０Ｃで２５分加熱され、６０００ｇで遠心され、凝集大腸菌タンパクのペレットを形成する。
【０３２０】
（実施例３：抗凍結タンパクの設計工程）
目的：抗凍結反復性タンパクのライブラリーを設計する
戦略：ライブラリー設計の開始配列は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ由来の抗凍結タンパク（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ１６０４９４）から得られる。このタンパクは、大腸菌でよく発現することが知られる。結晶構造およびＮＭＲ構造の両方が知られる。このタンパクは、円筒形を形成する反復単位から構築される。構造のコアは、疎水性アミノ酸を欠くが、反復単位当たり一つのジスルフィド結合、および一つの不変のセリンおよびアラニン残基を含む。最初の２回の回転は、３個のジスルフィド結合を有するキャップモチーフを形成する。このキャップモチーフが、フォールド形成の核を構成することが仮定される。したがって、インビトロ進化の際、最初の二つの反復単位は、通常、不変のまま維持される。図１２７を参照されたい。
【０３２１】
交差点を選び、Ｓｃｈｏｌｌｅの突然変異発生のためのグルタミン残基の位置を見出すために、抗凍結タンパクの構造特徴を分析した。
【０３２２】
交差点は、赤で示されるが、構造に認められるベータ・シート積層体を保存するように選ばれた。末端キャップのループについては、抗凍結オープン読み枠の外に位置する、一般的上流熟成部位を用いて後期段階で突然変異を発生させることが可能である。突然変異発生のためのコドンを選ぶために、抗凍結タンパクファミリーを記載するＰｆａｍのウェブページから、２１５反復単位から成る整列（ＰｆａｍデータベースにおいてＰＦ０２４２０）をダウンロードした。このテキストファイルを、プログラムＰｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ｖ１．０において、システイン位置“２．８”、および反復列の全長“１２”に設定して分析した。この設定によって、１２アミノ酸反復当たり３個のシステインを含むＮ−末端反復単位が排除された。したがって、プログラムは、８９個の配列を排除し、抗凍結反復列における各アミノ酸の保存および出現を示す、残余の１２６個の配列を分析する。この出力を、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに貼り付け、ライブラリー設計の開始点として用いた。
【０３２３】
（実施例４：３本指トキシン（エラブトキシン）の設計工程）
目的：３本指トキシンのフカフォールドを用いてライブラリーを設計する。
【０３２４】
背景：３本指トキシンは、四つのジスルフィドコア、およびこのコアから突出する３本の長いループを有する独特の構造を呈する。これらのループは、様々のタンパク・タンパク相互作用に関与することが知られ、かつ、指向性進化の標的対象となり得る。
【０３２５】
方法：もっとも一般的なシステインの間隔パターンは、１０−６−１６−３−１０−０−４、１３−６−１６−１−１０−０−４、および１３−５−１６−１−１０−０−４である。エラブトキシンの配列：
ＴＲＩＣＦＮＨＱＳＳＱＰＱＴＴＫＴＣＳＰＧＥＳＳＣＹＮＫＱＷＳＤＦＲＧＩＩＥＲＧＣＧＣＰＴＶＫＰＧＩＫＬＳＣＣＥＳＥＶＣＮＮＡ開始配列として選ばれ、これは、１３−６−１６−１−１０−０−４に一致する。この配列が選ばれたのは、これは大腸菌で発現可能であるからである。
【０３２６】
ループ領域において最大多数の突然変異を可能とするために二つの交差点を選んだ。
【０３２７】
（実施例５：プレキシンの設計工程）
目的：プレキシンおよびＰＳＩスカフォールドを利用するライブラリーを設計する。
【０３２８】
このスカフォールドの利点：このスカフォールドは、個々のシステイン残基間に長さ変動を導入するのに独特の利点を提供する。天然では、ＰＳＩフォールドのシステイン間には著明な長さ変動が認められるが、これは、この設計原理を支持する。ループ長の多様性は、ミクロタンパク・ファミリーにおいて最高にランクされる。図１３５は、ＡＡ残基の付加による、ゆっくりした長さ延長によって創製される「マルチ・プレキシン」を示す。
【０３２９】
戦略：Ｐｆａｍデータベースは、４６８ファミリーメンバーを列挙する。Ｃｙｓ５／Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ６／Ｃｙｓ７、およびＣｙｓ７／Ｃｙｓ８間のシステイン間隔は、きわめて変動性が高い。したがって、開始の共通配列を選ぶことが困難である。Ｍｅｔ受容体のＰＳＩドメインのＮＭＲ構造は解明されており、５，２，８，２，３，５，９のパターンを示す。このタンパクは、やや低レベルではあるが（細胞９リットル当たり１ｍｇ）、大腸菌において発現されている。データベースについて、５，２，８，２間隔を呈するメンバーを探索したところ、９９個の配列が見つかった。しかしながら、これらの内の僅かに１１％だけがモチーフ５，２，８，２，３を持つにすぎず、５，２，８，２，３，５，９を持つのは３メンバーにしかない。したがって、この空間パターンは無視し、このファミリーのもっとも一般的間隔パターンを求めた。５，２，７，２，５による探索から、５４個の配列が得られた。これらの配列を、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに整列させ、各位置におけるもっとも一般的コドンを得た。最終間隔がもっとも変動性が高く、全体タンパクドメインの偶数挿入が認められる。５，２，７，２，５を有する５４メンバーの最終位置におけるもっとも一般的間隔は、“１５”である。まとめると、ＰＳＩフォールドの共通配列は、パターン５，２，７，２，５，１５を有するファミリーメンバーから得られた。
【０３３０】
構造“１ｓｓｌ”は、Ｍｅｔ受容体のＰＳＩドメインを示す。交差点は、もっともよく保存されるファミリーモチーフＣＧＷＣが不変となるように設計した。これによって、スカフォールドの最初の半分のランダム化が可能となる。第２の交差点は、Ｃｙｓ７に挿入された。これによって、天然では大きな長さ変動を示す、システイン間隔５、６、および７のランダム化を最大とすることが可能になる。図１１９を参照されたい。
【０３３１】
図１２０：ライブラリー共通配列と、共通配列５，２，８，２，３，５（１１メンバーのみ）との整列は、２５％の同一性を示す。最大の多様性は、最後のｃｙｓ間隔にあり、これは、式、および他のメンバーとの比較と一致する。
【０３３２】
（実施例６：ソマトメジンの設計工程）
目的：ソマトメジンスカフォールドを利用してライブラリーを設計する。
【０３３３】
戦略：共通配列ＥＥＳＣＫＧＲＣＧＥＧＦＮＲＧＫＥＣＱＣＤＥＬＣＫＹＹＱＳＣＣＰＤＹＥＳＶＣＫＰＫは、同じシステイン間隔パターンを持つ４４配列から得られた。
【０３３４】
交差点は、配列の両半分における突然変異発生を可能とするために、タンパクのほぼ中点に選んだ。図１２１を参照されたい。
【０３３５】
（実施例７：ミクロタンパクのスカフォールド発現の評価）
抗凍結タンパク（ＡＦ）、３本指トキシン（ＴＦ）、ソマトメジン（ＳＭ）、およびプレキシン（ＰＬ）の、ミクロタンパク・オープンリーディングフレームを、ｐＥＴ３０由来ベクターでクローンし、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。一晩の培養体を、１：２００で希釈し２０ｍＬ  ＬＢとし、３時間育成し、２ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発し、さらに４時間育成した。培養体を５０００ｘｇで１０分回転させ、ＰＢＳに再縣濁した。２５０μｌのサンプルを、３０℃で３０分加熱し、ＲＴで１０分遠心した。加熱工程（５０μｌサンプル）の上清を、５％ＢＭＥを含む２５μｌのサンプルと混ぜ合わせ、再縣濁細胞（５０μｌ）を直接、５％ＢＭＥを含む２５μｌのサンプルバッファーと混ぜ合わせた。サンプルを１０分煮沸し、次いで１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。
【０３３６】
結果：図１２２を参照されたい。左から右へ（１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：部分的に精製されたタンパク：陽性コントロール、新規ＡＦスカフォールド、新規ＴＦスカフォールド、新規ＳＭスカフォールド、ＰＬ（短小バージョン）、コントロール、ＮＥＢ広範囲、次に、同じタンパクの全体細胞標本について同じ順序。
【０３３７】
結論：タンパクＴＦ、ＳＭ、ＰＬは、上清に高濃度に存在し、極めて耐熱性が高い。
【０３３８】
（実施例８：ファージミドベクターｐＭＰ０００３の構築）
我々は、ミクロタンパク・ライブラリーの効率的構築のためにベクターを構築した。ベクターの背景は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドベクターに基づく。ｌａｃＺプロモーターによって駆動される発現カセットを挿入した。コード配列は下記の要素を含む。ｏｍｐＡシグナルペプチド、ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩ部位によって側接される、短い詰め物配列、リンカー要素、ヘキサヒスチジン・タグ、ヘムアグルチニン（ＨＡ）タグ、アンバー終止コドン、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩタンパクのＣ−末端断片、終止コドンである。詰め物配列は僅かに４０ｂｐ長である。これは、ＴＡＡおよびＴＧＡの二重終止コドン、および固有のＢｓｓＨＩＩ部位を含む。大型のファージミドライブラリーの構築は、消化された精製ベクター断片の十分な量が得られないことによって制限されることが多い。ｐＭＰ０００３の設計は、予備的なアガロースゲル電気泳動によるベクター断片の精製の必要を回避するために、準備工程を大いに簡便化する。プラスミドｐＭＰ０００３を、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＸＩ、およびＢｓｓＨＩＩによって三重に消化することによって、二つの、きわめて短い、１９および２１ｂｐ長の、詰め物断片が放出される。これらは、ＹＭ−１００カラム（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）による限外ろ過によって除去することが可能である。詰め物におけるＢｓｓＨＩＩ部位の存在によって、ｐＭ０００３に基づくライブラリーにおける非組み換えクローンの頻度の著明な減少が得られる。
【０３３９】
（実施例９：ライブラリーＬＭＢ００２０の設計と構築）
ランダムクローンノライブラリーは、多くのミクロタンパク配列に基づいて構築される。プロセスは、いくつかの工程：１）適切なミクロタンパク・スカフォールドを特定すること、２）ランダム化のための残基を特定すること、３）各ランダム化位置に対しランダム化スキームを選択すること、４）ミクロタンパク・スカフォールドをコードし、かつ、ランダム化スキームに従って特定位置にヌクレオチド混合物を組み込む、部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを設計すること、５）ミクロタンパク断片を集合すること、６）制限消化および精製、７）断片を、消化されたベクター断片に連結すること、７）コンピテント細胞における形質転換、を含む。
【０３４０】
ライブラリーＬＭＢ００２０は、ｓｑｕａｓｈファミリープロテアーゼ阻害剤の１メンバーである、トリプシン阻害剤ＥＥＴＩ−ＩＩの配列に基づく（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ，Ａ．，ら、（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１２：７９７−８０６）。ＥＥＴＩ−ＩＩの結晶構造が調べられ、１０位置がランダム化のために選ばれた。９位置は、ランダムコドンＮＮＫを用いてランダム化された。これは、１６種のアミノ酸（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ）の導入を可能にする。１位置では、ランダムコドンＶＮＫが使用され、これは１６種のアミノ酸（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ）を可能にする。得られたランダム配列は：ＧＣＰＸＸＸＸＸＸＣＫＱＤＳＤＣＸＸＧＣＶＣＺＰＸＧＸＣＧＳＰであり、式中、ＸはコドンＮＨＫを表し、ＺはコドンＶＮＫを表す。このランダム化スキームによって、１０１２を上回る異なるアミノ酸配列から成る理論的多様性が可能となる。ランダム化トリプシン阻害剤をコードする遺伝子断片は、下記の配列を有する、二つのオリゴヌクレオチドの重複伸長によって集合した。
【０３４１】
ＬＭＢ００２０Ｆ＝ＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＴＣＣＴＮＨＫＮＨＫＮＨＫＮＨＫＮＨＫＴＧＴＡＡＡＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧ
【０３４２】
【化１９】
2009509535.tif 000017
オリゴヌクレオチドＬＭＢ０００２０ＦおよびＬＭＢ００２０Ｒは、２０ヌクレオチドの相補性領域を共有する。二つの相補的プライマーをアニールした後、充填反応を行って、２段階ＰＣＲ増幅を実行した。次に、産物を、制限部位を含むスカフォールド・プライマーＬＩＢＰＴＦおよびＬＩＢＰＴＲを用いて増幅した。
【０３４３】
得られた産物は、ＹＭ−３０フィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）を用いて濃縮し、１．２％アガロースによる予備的アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０３４４】
１０μｇの産物を、ＳｆｉＩ／ＢｓｔＸＩによって５０℃で５時間消化し、ＰＣＲカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で急速精製したところ、４μｇの精製断片が得られた。ベクターｐＭＰ０００３は、ＱＩＡＧＥＮ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｍａｘｉキットを用いて調製した。１５０μｇのベクターＤＮＡを、３本の、別々のエッペンドルフチューブにおいて、ＳｆｉＩ／ＢｓｔＸＩ／ＢｓｓＨＩＩによって５０℃で４時間消化し、ＹＭ−１００カラム（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）において精製した。全体収率は、消化ベクターの１１２．５μｇ（７５％）であった。ライブラリーにおける形質転換株の数を最大化するために、様々な挿入体・対・ベクター比を、小規模実験で調べた。７本の連結チューブにおいて大規模連結を行った。各チューブは、総容量４００μｌに溶解した、３μｇの消化ベクター、０．５μｇの消化挿入体（１：２．５比）、４０μｌのリガーゼバッファー、２０μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む。連結は、１６℃で一晩行った。得られた産物は、各ライブラリーについて、８本のチューブにおいて、−２０℃で一晩エタノール沈殿によって精製した。各チューブにおける連結ＤＮＡは、３０ｍｌの蒸留水に溶解し、２ｘ１５μｌに分割し、ライブラリー当たり形質転換のために１６本のチューブを生成した。
【０３４５】
電気的受容能を備えた大腸菌ＥＲ２７３８を下記のプロセスによって調製した。１）ＬＢ寒天に新たに線条接種したグリセロールから得た、大腸菌単一コロニーを、５０−ｍｌポリプロピレンチューブにおいて、１５ｍｌのあらかじめ温めたＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ培養液（ＳＢ）に接種する。テトラサイクリンを３０μｇ／ｍｌ（９０μｌの、５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリン）まで加え、３７℃においてシェイカーで２５０ｒｐｍで一晩育成する。２）２．５ｍｌの培養体を、４本の２リットルフラスコのそれぞれにおいて、５００ｍｌのＳＢ培養液にて希釈し、１０ｍｌの２０％グルコース、５ｍｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、および５００μｌの５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加える。２５０ｒｐｍ、３７℃で、６００ｎｍにおける吸光度が約０．９になるまで（２時間４５分）振とうする。３）培養体、および４本の５００−ｍｌ瓶を氷上で１５分冷却する。４）培養体を、４本の５００−ｍｌ瓶に移し、４℃で２０分４０００ｒｐｍで回転する。５）上清を傾斜除去し、各ペレットを、２５−ｍｌのあらかじめ冷却したピペットを用い、あらかじめ冷却した、２５ｍｌの１０％グリセロールに再縣濁する。１本の２５０−ｍｌ瓶に２ペレットを合わせ、１０％グリセロールを加え、２５０ｍｌを生成する。前と同様に遠心する。６）上清を傾斜除去し、工程５を繰り返す。７）上清を捨て、残余の容量（３．５ｍｌ）に各ペレットを再縣濁する。全ての縣濁液を合わせる。ライブラリーの電気穿孔には３００μｌの分液を使用する。任意に行ってよいもの：保存するために、３２０μｌの分液をエッペンドルフチューブに移し、エタノールおよびドライアイスを用いて瞬間凍結する。チューブをキャップで閉じ、それらを−８０℃で保存する。８）ＬＢ寒天（１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン）の上に５０μｌの細胞縣濁液をプレートし、ベクターファージの汚染について調べる。ＬＢ寒天（５０ｍｇ／ｌのカナマイシン）の上に５０μｌの細胞縣濁液をプレートし、ヘルパーファージの汚染について調べる。
【０３４６】
ライブラリーの電気穿孔は、下記の工程を用いて実行した。１）連結されたＤＮＡ（通常１６）および対応する数のキュベットを、氷上に１０分置く。２）新しく調製したＥＲ２７３８細胞を、各連結ライブラリーサンプルに加え、１回パイペッティングすることによって混ぜ合わせ、キュベットに移す。氷上に１分保存する。２．５ｋＶ、２５μＦ、および２００オームで電気穿孔する。ただちに、２ｍｌ、次いで１ｍｌのＳＯＣ培養液でキュベットを室温で噴射する。１０ｍｌの培養チューブにおいて３ｍｌの培養体を合わせる。３７℃で１時間３００ｒｐｍで振とうする。３）二つの３ｍｌサンプルを合わせ、５０−ｍｌのポリエチレンチューブに移す。９ｍｌのあらかじめ温めておいた（３７℃）ＳＢ培養液、３μｌの１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリン、および１５μｌの５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加える。形質転換細菌の力価定量のために、培養体を、２００μｌのＳＢ培養液に希釈し、この１：１００希釈液の１０μｌおおび１μｌをＬＢ寒天（１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン）にプレートする。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。コロニーの数を数え、培養体容量を掛け、プレート容量で割ることによって形質転換細胞の総数を計算する。１５−ｍｌの培養体を３７℃で１時間３００ｒｐｍで振とうし、４．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを加え、さらに１時間３７℃において３００ｒｐｍで振とうする。４）二つの１５ｍｌサンプルを合わせ、３ｍｌのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加える。５００−ｍｌのポリプロピレン遠心瓶に移す。１６７ｍｌの、あらかじめ温めた（３７℃）ＳＢ培養液、９２．５μｌの１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリン、および１８５μｌの５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加える。この２００−ｍｌ培養体を３００ｒｐｍで３７℃において１．５−２時間振とうする。５）２８０μｌの５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを加え、３７℃で一晩３００ｒｐｍで振とうを続ける。６）４℃で１５分４０００ｒｐｍで遠心する。上清を、清潔な５００−ｍｌの遠心瓶に移し、５０ｍｌの２０％ＰＥＧ−８０００／ＮａＣｌ２．５Ｍを加える。氷上に３０分保存する。７）４℃で１５分９０００ｒｐｍで遠心する。上清を捨て、遠心瓶をペーパータオルの上に少なくとも１０分倒立して液体を排除し、遠心瓶の上部から、残余の液体をペーパータオルで拭い去る。８）ファージペレットを、２ｍｌの、トリスバッファー生食液（ＴＢＳ）に溶解した１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）において、遠心瓶の側面におけるパイペッティングによって再縣濁し、２−ｍｌのミクロ遠心チューブに移す。１−ｍｌのピペットの先端を用いてさらにパイペッティングすることによって再縣濁し、ミクロ遠心チューブにおいて４℃で５分間フルスピードで遠心し、上清を、０．２μｍフィルターを通過させて、滅菌した２−ｍｌミクロ遠心チューブに移す。このファージ標本を４℃で保存する。長期の保存のために、アジ化ナトリウムを０．０２％（ｗ／ｖ）まで加えてもよい。得られた、ＬＭＢ００２０のライブラリーサイズは、２．４ｘ１０９形質転換体であった。
【０３４７】
（実施例１０：ライブラリーＬＭＢ００２０のパンニング）
１）Ｃｏｓｔａｒの９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに、２５μｌのＰＢＳに溶解した０．２５μｇのＣＤ２２抗原をコートする。プレートを、プレートシーラーにて覆う。コーティングは、４℃で一晩、または３７℃で１時間行ってもよい。第１ラウンドのパンニングでは、スクリーニングされるライブラリー当たり２ウェルをコートする。１ウェルで、後続ラウンドのそれぞれに十分である。標的濃度は、パンニングのラウンド３から６においてウェル当たり０．１ｕｇに下げる。
【０３４８】
２）コーティング液を十分に振とうした後、１５０μｌのＴＢＳ／ＢＳＡ３％（３％ウシ血清アルブミンを含むトリスバッファー生食液）を加えることによってウェルをブロックする。シールし、３７℃で１時間インキュベートする。
【０３４９】
３）ブロッキング液を十分に振とうした後、５０μｌの新たに調製したファージライブラリーをウェルに加える（インプットサンプル）。プレートをシールし、３７℃で２時間インキュベートする。その間、２ｍｌのＳＢ培養液、プラス２μｌの５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンに対し、２μｌのＥＲ２７３８細胞標本を接種し、３７℃で２．５時間２５０ｒｐｍで育成させる。各ライブラリー当たり、スクリーニングされる１培養体、インプット力価測定のためにさらに１培養体を育成する。
【０３５０】
４）ファージ溶液を十分に振とうした後、１５０μｌの、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％をウェルに加え、活発に５回パイペッティングを行う。５分待ち、十分振とうし、この洗浄工程を繰り返す。第１ラウンドのパンニングではこのようにして４回洗浄し、第２ラウンドでは６回、第３ラウンドでは８回、以下同じ。
【０３５１】
５）最終洗浄液を十分振とうした後、５０μｌの、ＴＢＳに溶解した新たに調製した１０ｍｇ／ｍｌトリプシンを加え、シールし、３７℃で３０分インキュベートする。活発に１０回パイペッティングを行い、溶出液（第１ラウンドでは２ｘ５０μｌ、その後のラウンドでは１ｘ５０μｌ）を、調製された２−ｍｌの大腸菌培養体に移し、室温で１５分インキュベートする。
【０３５２】
６）６ｍｌの、あらかじめ温めておいたＳＢ培養液、および、１．６μｌの１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリン、および６μｌの５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加える。アウトプット力価測定のために、２μｌのサンプルを２００μｌのＳＢ培養液で希釈し、１００μｌおよび１０μｌのこのサンプルを、ＬＢ寒天（１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリン）にプレートする（アウトプットサンプル）。平行して、５０μｌの、調製された２−ｍｌの大腸菌培養体に対し、１μｌの、ファージ標本の１０−８希釈液を感染させることによってインプット力価測定を進め、室温で１５分インキュベートし、ＬＢ寒天（１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン）にプレートする。
【０３５３】
７）８−ｍｌの培養体を、３７℃で１時間２５０ｒｐｍで振とうし、２．４μｌの１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを加え、さらに１時間３７℃において２５０ｒｐｍで振とうする。
【０３５４】
８）１ｍｌのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加え、５００−ｍｌのポリプロピレン遠心瓶に移す。９１ｍｌの、あらかじめ温めておいた（３７℃）ＳＢ培養液、および４６μｌの、１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリン、および９２μｌの、５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加える。この１００−ｍｌ培養体を、３７℃で１  １／２から２時間３００ｒｐｍで振とうする。
【０３５５】
９）１４０μｌの、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを加え、３７℃で一晩３００ｒｐｍで振とうを続ける。
【０３５６】
１０）４℃で１５分４０００ｒｐｍで遠心する。上清を、清潔な５００−ｍｌの遠心瓶に移し、２５ｍｌの２０％ＰＥＧ−８０００／ＮａＣｌ２．５Ｍを加える。氷上に３０分保存する。
【０３５７】
１１）４℃で１５分９０００ｒｐｍで遠心する。上清を捨て、遠心瓶をペーパータオルの上に少なくとも１０分倒立して液体を排除し、遠心瓶の上部から、残余の液体をペーパータオルで拭い去る。
【０３５８】
１２）ファージペレットを、２ｍｌの、ＴＢＳ／ＢＳＡ  １％バッファーにおいて、遠心瓶の側面におけるパイペッティングによって再縣濁し、２−ｍｌのミクロ遠心チューブに移す。１−ｍｌのピペットの先端を用いてさらにパイペッティングすることによって再縣濁し、ミクロ遠心チューブにおいて４℃で５分間フルスピードで遠心し、上清を、０．２μｍフィルターを通過させて、滅菌した２−ｍｌミクロ遠心チューブに移す。
【０３５９】
１３）次のラウンドのために工程３）から続けるか、または、ファージ標本を４℃で保存する。長期の保存のために、アジ化ナトリウムを０．０２％（ｗ／ｖ）まで加えてもよい。各ラウンドには新鮮な調製ファージのみを使用しなければならない。
【０３６０】
【化２０】
2009509535.tif 000018
（実施例１１：標的結合に関する個別分離体のスクリーニング）
ＥＲ２７３８に、アウトプットファージを感染させ、ＬＢ寒天（１００ｍｇ／ｌカルベニシリン）にプレートした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。次いで、個々のコロニーについて、下記のように、標的タンパクに対する結合についてスクリーニングすることが可能である。
【０３６１】
１）５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む、０．７５ｍｌのＳＢ培養液を、ディープ・ディープウェルを有する９６ウェルに加える。滅菌楊枝を用いて個々のコロニーを各ウェルに移す。２）細菌培養体を含むプレートを３７℃で数時間３００ｒｐｍで振とうする。
【０３６２】
２）接種後６時間において、１μｌの各培養体を、ＬＢ寒天（１００ｍｇ／ｍｌのカルベニシリン）に滴下する。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。プレートをパラフィンでシールし、次いで４℃で保存する。これらのプレートは、後に、ＥＬＩＳＡ陽性シグナルを示す分離体を回収し、配列決定するのに用いられる。
【０３６３】
３）ＩＰＴＧを、１ｍＭ（７．５μｌの、水で１：１０に希釈した１Ｍ  ＩＰＴＧストック）となるまで加えて培養体を誘起し、３７℃で一晩培養する。
【０３６４】
４）誘発された大腸菌培養体を遠心する（４０００ｒｐｍ、２０分）。
【０３６５】
５）Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ液（Ｎｏｖａｇｅｎ）を調製する（１．５ｍｌの試薬、プラス１３．５ｍｌのＴＢＳおよび１５μｌのベンゾナーゼ）。
【０３６６】
６）ペレットを１５０μｌのｂｕｇｂｕｓｔｅｒに再縣濁する。プレートを室温で３０分インキュベートし、プレートを４０００ｒｐｍで２０分遠心する。
【０３６７】
７）ウェル当たり５０μｌの上清を、ＰＢＳに溶解し、３％ＢＳＡを含む、ウェル当たり１５０μｌのＴＢＳで１時間ブロックした、ウェル当たり１００ｎｇの標的タンパクで、４℃で一晩コートしたマイクロタイタープレートに移した。
【０３６８】
８）プレートを３７℃で２時間インキュベートする。
【０３６９】
９）水道水で１０回洗浄する。
【０３７０】
１０）ラットの、ビオチニル化抗ＨＡ抗体（３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ＴＢＳ／ＢＳＡ  １％で希釈する（１：５００希釈）。５０μｌの希釈抗体をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートする。
【０３７１】
１１）水道水で１０回洗浄する。
【０３７２】
１２）ストレプトアビジン／ＨＲＰをＴＢＳ／ＢＳＡ  １％で希釈し（１：２５００希釈）、３７℃で３０分インキュベートする。
【０３７３】
１３）ＡＢＴＳ液（２．９４ｍｌのクエン酸バッファー＋６０μｌのＡＢＴＳ＋１μｌのＨ２Ｏ２）を調製する。
【０３７４】
１４）水道水で１０回洗浄する。
【０３７５】
１５）各ウェルに５０μｌの基質液を加える。
【０３７６】
１６）ＲＴでインキュベートし、室温で２０分インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．を読み取る。
【０３７７】
ライブラリーＬＭＢ００２０の外、他の、二つのミクロタンパクライブラリーの、ラウンド５から得られたアウトプットに対し、前述のようにスクリーニングを行った。下表は、ＩｇＧでコートしたプレート、および、ＢＳＡでコートしたプレートから得られた結合データを示す。いくつかの分離体は、ＢＳＡでコートしたプレートに比べて、ＩｇＧでコートしたプレートにおいて有意に高い結合シグナルを示す。
【０３７８】
【化２１】
2009509535.tif 000019
三つのＩｇＧ−結合分離体の配列を決定した。分離体は全て、トリプシン抑制因子スカフォールドの６個のシステイン残基間の間隔を維持していた。三つの分離体は全て、そのアミノ酸配列において異なっていた。これは、この方法が、それぞれが、その後の最適化の開始点となる、複数の結合ドメインを生成することが可能であることを証明する。
ＬＭＢ００２０／ＳＭＰ００３Ｓ５．Ｂ２
ＧＰＳＧＰＧＣＰＩＬＹＡＨＣＫＱＤＳＤＣＶＴＧＣＶＣＲＰＬＧＭＣＧＳＰＧＱＳＧＧＳＧＨＨＨＨＨＨ
ＬＭＢ００２０／ＳＭＰ００３Ｓ５．Ｂ１２
ＧＰＳＧＰＧＣＰＳＬＰＴＰＣＫＱＤＳＤＣＤＥＧＣＶＣＫＰＮＧＴＣＧＳＰＧＱＳＧＧＳＧＨＨＨＨＨＨ
ＬＭＢ００２０／ＳＭＰ００３Ｓ５．Ｃ２
ＧＰＳＧＰＧＣＰＬＹＳＰＶＣＫＱＤＳＤＣＤＮＧＣＶＣＲＰＡＧＰＣＧＳＰＧＱＳＧＧＳＧＨＨＨＨＨＨ
（実施例１２：ミクロタンパク設計に対する構築法）
ＶＥＧＦに結合する１−ジスルフィドタンパク（１ＳＳ）を、プロテアーゼに対してより安定で、より免疫原性の低い２ＳＳミクロタンパクへと段階的に進化させた。図１は、１ＳＳファージ由来ペプチド（「ＶＥＧＦペプチド」）から得られた、二つの別々の２ＳＳタンパク（「クローン２」および「クローン７」）のＥＬＩＳＡ結果を示す。三つとも全てＶＥＧＦに対して特異的であるが、ＢＳＡなどの他のタンパクに対しては結合を示さない。ミクロタンパクを持たないＭ１３も、ＶＥＧＦまたはＢＳＡに結合しない。この２ＳＳタンパクは、ＶＥＧＦ結合を決めた１ＳＳ配列を、２ＳＳスカフォールド（アルファ−コノトキシン）に移動させることによって創製した。得られたタンパクは、ＶＥＧＦに対して特異的であるが、無関係なタンパク、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対しては結合しない。野生型ファージ粒子（Ｍ１３）は、ＶＥＧＦ、ＢＳＡのいずれにも結合を示さない。図１６８を参照されたい。
【０３７９】
（実施例１３：メガプライマー突然変異発生によるライブラリーの構築）
メガプライマー法とは、Ｋｕｎｋｅｌ型ポリメラーゼ伸長反応（終止コドン−置換を用いて、組み込みをきわめて高効率としたことを除いて）において、二つ（またはそれ以上）の異なるプライマーを組み合わせて、その両末端における相同性を通じて、プラスミドに組み込まれる、単一の大型プライマーを形成する方法である。メガプライマー法は、ＤＮＡおよびコードされたタンパク配列の複合プールの導入または転送のために、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または、好ましくは、１２０を超えるヌクレオチドまたは塩基対から成る２本鎖、または１本鎖ＤＮＡを使用する。我々の例では、これらのプールは、ミクロタンパク・ライブラリーをコードするが、同じ方法は、任意のＤＮＡまたはタンパクライブラリーをコードすることが可能である。メガプライマーは、通常、以前に選ばれた配列から成るプール（「先行ライブラリー」）の外、新たにランダム化された配列から成るプール（「新規ライブラリー」）を含む。したがって、メガプライマー法は、先行ライブラリーの配列決定を要することなく、先行ライブラリーから、新規ライブラリーの盲目的創製を可能とする。
【０３８０】
通常、ＰＣＲ断片は、以前に選ばれた配列プールのライブラリー区域（「ランダム化区域」）から創製され、この断片は、新たにランダム化されたライブラリー・セグメント（未選択）をコードする合成オリゴに対して連結され（ＰＣＲ−重複によって）、新規（未選択）および先行（選択）ランダム化区域の両方を含むｄｓＤＮＡ断片を創製する。同じ最終結果は、プライマーの一方が新規ライブラリーを導入する場合、「先行ライブラリー」区域の両側のプライマーを用いて、単一ＰＣＲにおいて実現することが可能である。このｄｓＤＮＡ断片は、非対称またはランオフＰＣＲによってｓｓＤＮＡメガプライマーに変換される。このｓｓＤＮＡメガプライマーの末端は、ベクターに対し、約１０−２５塩基の配列相同性を持つように設計され、これが、適正な位置への挿入を確実なものとする。
【０３８１】
２本鎖メガプライマーは、重複ＰＣＲを用い、２本以上のＰＣＲ断片および／または合成オリゴヌクレオチドから生成され、１本鎖ＤＮＡは、変性２本鎖ＰＣＲ産物および／または１本鎖ＤＮＡ「非対称ＰＣＲ」（「ランオフＰＣＲ」）を用いて生成することが可能である。この非対称ＰＣＲは、前記１本鎖ＤＮＡ鋳型に対し相補的な１本鎖配列を増幅する。メガプライマー配列は、単一配列を含むことも可能であるが、より一般的には、配列（例えば、ミクロタンパクの）ライブラリーを含む（図１４３に記載されるように）。１本鎖鋳型ＤＮＡ（ベクターまたはファージ）は、ユリジン含有であってもよく、あるいは、終止コドンを持たないメガプライマー配列と交換される、抑制性終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ）をコードしていてもよい。アニールされたメガプライマーは、ポリメラーゼによって、ＤＮＡの第２鎖の合成のプライマーとして作動し、かつ、この合成鎖の連結は、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、およびデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、共有的に閉鎖された環状ＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）を生成するのに使用される。得られたｃｃｃ−ＤＮＡは、ミクロタンパクを、不溶性タンパク、可溶性タンパク、またはタンパク融合物として発現させるために、細菌の細胞系統中に形質転換される。
【０３８２】
メガプライマー結果の例を下表に示す。図は、最初の１５位置において突然変異発生したミクロタンパクのアミノ酸配列を示す。最初のミクロタンパク鋳型に合致する保存残基には灰色に影をつけた。図２の配列を含むミクロタンパク・ライブラリーを、メガプライマー合成の開始点として用いた。「先行ライブラリー」区域、および新規ライブラリーを含むＰＣＲ断片を創製するために二つのＤＮＡプライマーを用いた。ｉ）ミクロタンパクの上流でアニールするプライマー、およびｉｉ）ミクロタンパク特異的アニーリング領域、およびＤＮＡ鋳型アニーリング領域によって側接される、新たにランダム化されたミクロタンパク配列（「新規ライブラリー」）を含むプライマー、である。ミクロタンパク・ライブラリーを、前記二つのプライマーを用い、ＰＣＲによって増幅し、非対称ＰＣＲによって増幅し、１本鎖ＤＮＡ鋳型にクローンし、二次的ミクロタンパク・ライブラリーを生成した。得られたクローン（図２下段）から、元の配列の第１半分および第２半分の両方においてランダム化されたミクロタンパクが明らかになった。
【０３８３】
【化２２】
2009509535.tif 000020
（実施例１４：ミクロタンパクの生産）
ミクロタンパク遺伝子を、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ３０にクローンし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。凍結グリセロールストックから２ｍｌのＬＢ（５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン）を接種し、３７℃で４時間培養した。２００μｌのこれらの開始培養体を、２５０ｍｌのＬＢ（５０ｍｇ／ｌのカナマイシン）に加え、振とうすることなく一晩インキュベートした。翌朝、シェーカーを２５０ｒｐｍにオンし、培養体をさらに１時間育成した。次に、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの最終濃度となるまで加え、振とうインキュベータにおいて、タンパクを３７℃で６時間発現させた。培養体を、３０００ｒｐｍで１５分遠心し、５ｍｌのＰＢＳに再縣濁し、７５℃で２０分加熱した。この工程によって、細胞分解物が得られ、大抵の大腸菌タンパクが変性した。この縣濁液を、ＳＳ３４ローターにおいて、１０，０００ｒｐｍで３０分遠心した。得られた上清を、硫酸ニッケルを充填したＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＥ）に負荷した。タンパクを、カラムメーカーの指示に従って、イミダゾールによって溶出した。得られたタンパクは、還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判断した場合、＞９０％純水であった。
【０３８４】
（実施例１５：ＤＢＰの複合性の変性）
複合性は、累積ジスルフィドスパンであり、これは、タンパク鎖におけるアミノ酸数で測定した、連結システイン間の累積距離に等しい。
【０３８５】
複合性は、架橋結合の程度、したがって、スカフォールドの剛性を表す測定値であり、複合性が高ければ高いほど、剛性も高い。剛性は、プロテアーゼ耐性の予測因子であるから、剛性はまた、免疫原性の有用な予測因子でもある。複合性がより高いことは、プロテアーゼ分解の減少、および免疫原性の低下を予測させる。
【０３８６】
複合性＝（Ｃａ−Ｃｂ）＋（Ｃｃ−Ｃｄ）＋（Ｃｅ−Ｃｆ）
【０３８７】
【化２３】
2009509535.tif 000021
（実施例１６：反復モチーフを持たないスカフォールド）
トキシンファミリーのスーパーファミリー
１）ｕＰＡＲ／Ｌｙ６／ＣＤ５９／蛇トキシン−受容体スーパーファミリー。ファミリー：Ａｃｔｉｖｉｎ＿ｒｅｃｐ；ＢＡＭＢＩ；ＰＬＡ２＿ｉｎｈ；Ｔｏｘｉｎ＿１；ＵＰＡＲ＿ＬＹ６を含む。
【０３８８】
２）さそりトキシン様ノッチンスーパーファミリーは、ファミリー、Ｔｏｘｉｎ＿２；Ｔｏｘｉｎ＿１７；Ｇａｍｍａ＿ｔｈｉｏｎｉｎ；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ＿２；Ｔｏｘｉｎ＿３；Ｔｏｘｉｎ＿５を含む。
【０３８９】
３）デフェンシン／ミオトキシン様スーパーファミリーは、ファミリー、ＢＤＳ＿Ｉ＿ＩＩ；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ＿１；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ＿ｂｅｔａ；Ｔｏｘｉｎ＿４を含む。
【０３９０】
４）オメガトキシン様スーパーファミリーは、ファミリー、Ｔｏｘｉｎ＿７；Ｔｏｘｉｎ＿３０；Ｔｏｘｉｎ＿２７；Ｔｏｘｉｎ＿２４；Ｔｏｘｉｎ＿２１；Ｔｏｘｉｎ＿１６；Ｔｏｘｉｎ＿１２；Ｔｏｘｉｎ＿１１；Ｏｍｅｇａ＿ｔｏｘｉｎ；Ａｌｂｕｍｉｎ＿Ｉ；Ｔｏｘｉｎ＿９を含む。
【０３９１】
５）コノトキシンＯ−スーパーファミリーは、同じ構造群に属するＣｏｎｕｓペプチドの３群から成る。これらの３群は、その薬理学的性質において異なる。カルシウムチャンネルを抑制するｗ−コノトキシン、電圧感受性を持つナトリウムチャンネルの不活性化速度を遅延するデルタ−コノトキシン、および、電圧感受性を持つナトリウム電流を阻止するｍｕＯ−コノトキシンである。
【０３９２】
６）コノトキシンＩ−スーパーファミリーは、トキシン１９ファミリーのみを含む。
【０３９３】
７）コノトキシンＴ−スーパーファミリーは、トキシン２６ファミリーのみを含む。
【０３９４】
（個別のトキシンファミリー）
ＰＦ０００８７：トキシン１
蛇トキシン。有毒なニューロトキシンおよびサイトトキシンから成るファミリー。構造は小型で、ジスルフィドに富み、ほぼ全てベータシートである。図６１を参照されたい。
【０３９５】
【化２４】
2009509535.tif 000022
ＰＦ００４５１：トキシン２
「蛇トキシン短小」。蛇毒は、哺乳類、昆虫、および甲殻類に有毒な、様々のペプチドを含む。これらのペプチドの中に、カルシウム活性化カリウムチャンネルを阻害する短いトキシン（３０から４０残基）のファミリーがある。図５５を参照されたい。空間配置は１−４  ２−６  ３−５．
【０３９６】
【化２５】
2009509535.tif 000023
ＰＦ００５３７：トキシン３
このファミリーは、ニューロトキシンと植物デフェンシンの両方を含む（Ｆ．Ｍ．Ａｓｓａｄｉ−Ｐｏｒｔｅｒ，ら、（２０００）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７６：２５９−６５）。マスタードトリプシン阻害剤、ＭＴＩ−２は植物デフェンシンである。これは、トリプシンの強力な阻害剤である。ＭＴＩ−２は、鱗翅類昆虫にとっては有毒である。さそりトキシン（ニューロトキシン）は、ナトリウムチャンネルに結合して、該チャンネルの活性化機構を抑制し、神経伝達を阻止する。図２２を参照されたい。空間配置は１−８  ２−５  ３−６  ４−７である。
【０３９７】
【化２６】
2009509535.tif 000024
ＰＦ００７０６：トキシン４
いそぎんちゃくニューロトキシン。いそぎんちゃくは、関連構造および機能を持つ、多くの、異なるニューロトキシンを生産する。このファミリーに属するタンパクはニューロトキシンを含み、その内には、カリトキシンおよびアントプレウリンを含むいくつかがある。ニューロトキシンは、ナトリウムチャンネルに特異的に結合し、シグナル伝達中その不活性化を遅らせ、そのため哺乳類心筋収縮の強力な刺激をもたらす。カリトキシン１は、甲殻類の神経筋標本に見出された。該標本において、カリトキシン１は、伝達物質の放出を増し、軸索の発火を引き起こす。このタンパクには、三つのジスルフィド結合が存在する。このファミリーは、デフェンシン／ミオトキシン様スーパーファミリー族のメンバーである。この族は、下記のＰｆａｍメンバーを含む：ＢＤＳ＿Ｉ＿ＩＩ；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ＿１；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ＿ｂｅｔａ；Ｔｏｘｉｎ＿４．いそぎんちゃくは、関連構造および機能を持つ、多くの、異なるニューロトキシンを生産する。このファミリーに属するタンパクはニューロトキシンを含み、その内には、カリトキシンおよびアントプレウリンを含むいくつかがある。ニューロトキシンは、ナトリウムチャンネルに特異的に結合し、シグナル伝達中その不活性化を遅らせ、そのため哺乳類心筋収縮の強力な刺激をもたらす。カリトキシン１は、甲殻類の神経筋標本に見出された。該標本において、カリトキシン１は、伝達物質の放出を増し、軸索の発火を引き起こす。このタンパクには、三つのジスルフィド結合が存在する。２５の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−５  ２−４  ３−６である。図８７。
【０３９８】
【化２７】
2009509535.tif 000025
ＰＦ０５２９４：トキシン５
さそり短小トキシン。図４６．
ＰＦ０５４５３：トキシン６
図９０．このファミリーは、Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ  Ｋａｒｓｃｈさそりから単離されたトキシン様ペプチドから成る。前駆体は、シグナルペプチド候補２８残基および１余分残基、成熟ペプチド３１残基、およびアミド化Ｃ−末端を有する、６０アミノ酸残基から成る。ペプチドは、他の、さそりＫ＋チャンネルトキシンと緊密な相同性を共有し、共通の、三次元フォールド、システイン−安定化アルファベータ（ＣＳアルファベータ）モチーフを提示する。このファミリーは、その被害者の、小さい、コンダクタンス型、カルシウム活性化カリウムイオンチャンネルを阻止することによって活動する。空間配置は１−４  ２−５  ３−６である。モチーフは：
【０３９９】
【化２８】
2009509535.tif 000026
ＰＦ０５９８０：トキシン７
このファミリーは、蜘蛛の、いくつかの短小ニューロトキシン・タンパクから成り、ジョウゴグモのトキシンの多くのものを含んでいる（Ｗ．Ｓ．Ｓｋｉｎｎｅｒ，ら、（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６４：２１５０−５５）。図６４を参照。
【０４００】
空間配置は１−４  ２−５  ３−８  ６−７である。
【０４０１】
【化２９】
2009509535.tif 000027
ＰＦ０７３６５：トキシン８
アルファコノトキシンおよび前駆体。このファミリーは、イモ貝種のメンバーから得られる、いくつかのアルファコノトキシン前駆体タンパクから成る。アルファ−コノトキシンは、魚を狩るイモ貝の毒から得られる、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を阻止する、小型ペプチドニューロトキシンである。図７２。
【０４０２】
ＰＦ０００９５：トキシン９
蜘蛛ニューロトキシンの、このファミリーは、カルシウムイオンチャンネル阻害剤と考えられている。
【０４０３】
図６３を参照。空間配置は１−４  ２−５  ３−８  ６−７である。
【０４０４】
【化３０】
2009509535.tif 000028
ＰＦ０７４７３：トキシン１１
このファミリーは、いくつかの痙攣性ペプチドｇｍ９ａ配列から成る（Ｍ．Ｂ．Ｌｉｒａｚａｎ，ら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：１５８３−８）。図２７参照。ＤＢＰ：１−５  ２−４  ３−６
【０４０５】
【化３１】
2009509535.tif 000029
ＰＦ０７７４０：トキシン１２
ＨａＴｘ１は、チリのタランチュラ毒から単離された３５アミノ酸ペプチドトキシンである。このものは、ｄｒｋ１電圧依存性Ｋ（＋）チャンネルを、孔を塞ぐのではなく、ゲートのエナージェティクスを変えることによって阻害する（Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ら、（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２９７：７７１−８０）。図５０参照。
【０４０６】
空間配置は１−４  ２−５  ３−６である。モチーフは、ＣｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘ（ｘ）ＣＣｘｘｘｘＣｘｘｘ（ｘｘｘ）ｘ（ｘｘ）ｘｘＣである。
【０４０７】
ＰＦ０７８２２：トキシン１３
このファミリーのメンバーは、海産ワームＣｅｒｅｂｒａｔｕｌｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓによって生産される甲殻類選択的ニューロトキシンである、ニューロトキシンＢ−ＩＶによく似る。この高度に陽イオン性のペプチドは、約５５残基であり、ヘアピン構造の明瞭な形状を持つループによって接続される、２本の逆平行螺旋を形成するように配される。ヘアピンの側枝は、四つのジスルフィド結合によって連結される。活性に重要であると特定された三つの残基、すなわち、Ａｒｇ−１７、−２５、および−３４は、分子の同じ面に見出されるが、一方、活性に重要なもう一つの残基、Ｔｒｐ３０は、反対側にある。このタンパクの活動方式は、完全には理解されていないが、電圧依存性ナトリウムチャンネルに対し、おそらく、これらのタンパクの、まだ解明されていない部位に結合することによって作用すると考えられる。その相互作用部位も比較的特異性が低く、例えば、負に帯電する膜脂質と相互作用を持つと考えられる。図６５参照。
【０４０８】
ＰＦ０７８２９：トキシン１４
アルファ−ＡコノトキシンＰＩＶＡは、魚食性イモ貝Ｃｏｎｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓによって生産される毒に認められる、主要な麻痺性トキシンである。このペプチドは、ニコチン性アセチルコリン受容体のアセチルコリン結合部位をブロックすることによって作動する（Ｋ．Ｊ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，ら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：２７２４７−５５）。図６６参照。
【０４０９】
【化３２】
2009509535.tif 000030
ＰＦ０７９４５：トキシン１６
ヤヌスアトラコトキシン・ファミリー。このファミリーは、蜘蛛Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａによって分泌される３種のペプチドを含む。これらは、筋肉のアセチルコリン受容体、または、他の、無脊椎動物に存在するアセチルコリン受容体サブタイプに拮抗することによって働く、昆虫選択的、興奮性ニューロトキシンである。ヤヌスアトラコトキシン−Ｈｖ１ｃは組織されて、ジスルフィド富裕小球状コア（残基３−１９）、およびベータ−ヘアピン（残基２０−３４）となる。４ジスルフィド架橋があり、その内の一つは、隣接ジスルフィド架橋である。これは、構造の維持には重要ではないが、殺昆虫活性には重要であることが知られる。ファミリーには三つのメンバーが知られる。空間配置は１−６  ２−７  ３−４  ５−８．図９１参照。
【０４１０】
【化３３】
2009509535.tif 000031
ＰＦ０８０８６：トキシン１７
このファミリーは、さそりによって分泌されるトキシンであるエルゴトキシンペプチドから成る。エルゴトキシンは、Ｋ＋チャンネルの機能を阻止することが可能である。さそり毒から、１００を超えるエルゴトキシンが見出されており、それらは、その一次構造に基づいて、三つのサブファミリーに分類される（Ｋ．Ｆｒｅｎａｌ，ら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，５６：３６７−７５）。
【０４１１】
ファミリーには２５の既知のメンバーがある。空間配置は１−４  ２−６  ３−７  ５−８。図６０参照。
【０４１２】
【化３４】
2009509535.tif 000032
ＰＦ０８０８７：トキシン１８
コノトキシンＯ−スーパーファミリー。このファミリーは、コノトキシンＯ−スーパーファミリーのメンバーから成る。コノトキシンＯ−スーパーファミリーは、同じ構造群に属するＣｏｎｕｓペプチドの３群から成る。これらの３群は、その薬理学的性質において異なる。カルシウムチャンネルを抑制するｗ−コノトキシン、電圧感受性を持つナトリウムチャンネルの不活性化速度を遅延するデルタ−コノトキシン、および、電圧感受性を持つナトリウム電流を阻止するｍｕＯ−コノトキシンである。図３１参照。
【０４１３】
【化３５】
2009509535.tif 000033
ＰＦ０８０８８：トキシン１９
コノトキシンＩ−スーパーファミリー。図６参照。このファミリーは、コノトキシンのＩ−スーパーファミリーから成る。これは、いくつかのＣｏｎｕｓ種の毒における新規クラスのペプチドである。これらのトキシンは、四つのジスルフィドによって特徴づけられ、神経細胞のイオンチャンネルを抑制または修飾する。Ｉ−スーパーファミリーは、イモ貝の５または６の主要クラスにおいて認められており、さらに多くの生物種に見出される可能性がある。
【０４１４】
ＰＦ０８０８９：トキシン９
Ｈｕｗｅｎトキシンファミリー。このファミリーは、蜘蛛によって分泌されるトキシンの、ｈｕｗｅｎトキシン−ＩＩ（ＨＷＴＸ−ＩＩ）ファミリーから成る。これらのトキシンは、鳥蜘蛛Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａ  ｈｕｗｅｎａ  Ｗａｎｇから分泌される毒の中に見出される。ＨＷＴＸ−ＩＩは、他のｈｕｗｅｎトキシンに見られるＩＣＫモチーフとは異なる新規スカフォールドを採用する。ＨＷＴＸ−ＩＩは、三つのジスルフィド架橋に関与する六つのシステインを含む、３７アミノ酸残基から成る。図５参照。
【０４１５】
ＰＦ０８０９１：トキシン２１
このファミリーは、オメガトキシン様族のメンバーである。このファミリーは、蜘蛛毒から単離された、殺昆虫ペプチドから成る。図５８参照。ファミリーには４の既知のメンバーがある。空間配置は未知である。構造データは無い。
【０４１６】
【化３６】
2009509535.tif 000034
ＰＦ０８０９２：トキシン２２
図４参照。このファミリーは、Ｈｅｘａｔｈｅｌｉｄａｅ蜘蛛の毒から単離されたＭａｇｉペプチドトキシンから成る（Ｍａｇｉ１、２、および５）。これらの、殺昆虫ペプチドトキシンは、ナトリウムチャンネルに結合し、鱗翅目幼虫に注入されると弛緩麻痺を誘発する。しかしながら、これらのペプチドは、マウスに対しては、２０ｐｍｏｌ／ｇで脳内に注入しても、毒性を持たない。
【０４１７】
ＰＦ０８０９３：トキシン２３
図３参照。このファミリーは、Ｈｅｘａｔｈｅｌｉｄａｅ蜘蛛の毒に見出される有毒ペプチド（Ｍａｇｉ５）から成る。Ｍａｇｉ５は、哺乳類のナトリウムチャンネルの部位４に対し結合アフィニティーを持つ、最初の蜘蛛トキシンであり、このトキシンは、幼虫に対し殺昆虫作用を持ち、幼虫に注入されると麻痺を起こす。
【０４１８】
ＰＦ０８０９４：トキシン２４
コノトキシンＴＶＩＩＡ／ＧＳファミリー。このファミリーは、イモ貝Ｃｏｎｕｓ  ｔｕｌｉｐａおよびＣｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓの毒から単離されたコノトキシンから成る。Ｃｏｎｕｓ  ｔｕｌｉｐａから単離されたコノトキシンＴＶＩＩＡは、他の、よく解明された、薬理学的ペプチドクラスとはほとんど相同性を示さないが、Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓから得られたペプチド、コノトキシンＧＳに対しては類似性を示す。これらのペプチドは両方とも、骨格筋のナトリウムチャンネルをブロックし、いくつかの生化学的特性を共有し、４−ループコノトキシンから成る独立サブグループを代表する（Ｊ．Ｍ．Ｈｉｌｌ，ら、（２０００）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６７：４６４２−８）。図２８参照。
【０４１９】
【化３７】
2009509535.tif 000035
ＰＦ０８０９５：トキシン２５
Ｈｅｆｕトキシンファミリー。このファミリーは、さそりＨｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ  ｆｕｌｖｉｐｅｓの毒に見出されるｈｕｆｅトキシンから成る。これらのトキシン、カッパ−ｈｅｆｕトキシン１およびカッパ−ｈｅｆｕトキシン２は、既知のいずれのトキシンにたいしても相同性を示さない。ｈｅｆｕトキシンは、カリウムチャンネルトキシンであり、１−４  ２−３空間配置を示す。図１７３参照。
【０４２０】
ＰＦ０８０９７：トキシン２６
コノトキシンＴスーパーファミリー。図２参照。このファミリーは、コノトキシンのＴ−スーパーファミリーから成る。五つのＣｏｎｕｓ種から得られた、異なる八つのＴ−スーパーファミリーが特定されている。これらのペプチドは、共通シグナル配列、およびシステイン残基の保存配置を共有する。Ｔ−スーパーファミリーは、全ての主要な採食型Ｃｏｎｕｓの毒管において発現することが見出されており、これは、Ｔ−スーパーファミリーが、５００の異なるＣｏｎｕｓ種において広く分布する、ペプチドの大きな、多様な群であることを示唆する。
【０４２１】
ＰＦ０８０９９：トキシン２７
さそりカルシンファミリー。図１参照。このファミリーは、さそりトキシンのカルシンファミリーから成る。カルシンファミリーは、ＭａｕｒｏｃａｌｃｉｎｅおよびＩｍｐｅｒｏｔｏｘｉｎから成る。これらのトキシンは、骨格筋の、リアノジン感受性カルシウムチャンネルの強力な作用因子であることが示されている。したがって、これらのトキシンは、ジヒドロピリジン受容体／リアノジン受容体との相互作用実験に有用である。
【０４２２】
ＰＦ０８１１６：トキシン２９
このファミリーは、ブラジルのＰｈｏｎｅｕｔｒｉａ  ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒの毒に見出されたＰｈＴｘ殺昆虫ニューロトキシンから成る。Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ  ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅの毒は、ある範囲の生物学的作用を持つ、３０−１４０アミノ酸から成る、数多くの神経毒ポリペプチドを含む。これらのニューロトキシンのあるものは、マウスに対し、脳室内注入後、致命的であるが、他のものは、双翅目およびＤｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ目の昆虫に対してはきわめて有毒であるが、マウスに対する毒作用ははるかに低い。図７参照。
【０４２３】
ＰＦ０８１１７：トキシン３０
Ｐｔｕファミリーとも呼ばれる。このファミリーは、サシガメの唾液から単離された毒性ペプチドから成る。この唾液は、餌食を不動化するか、または、それを消化するために、その虫によって用いられる、タンパクの複雑な混合物を含む。このタンパクの一つ（Ｐｔｕ１）は、精製されて、Ｎ−型カルシウムチャンネルを可逆的にブロックするが、ＢＨＫ細胞において発現されるＬ−およびＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルに対する特異性はより低いことが示されている。
【０４２４】
空間配置１−４  ２−５  ３−６．図７９参照。
【０４２５】
【化３８】
2009509535.tif 000036
ＰＦ０８１１９：トキシン３１
このファミリーは、酸性の、アルファ−ＫＴｘ短鎖さそりトキシンから成る。パラブトキシンと名づけられるこれらのトキシンは、電圧依存性Ｋチャンネルをブロックし、きわめて低いｐＩ値を有する。さらに、これらは、きわめて重要な、孔閉鎖性リシンを欠く。さらに、二連子の、第２の重要な残基、疎水性残基（ＰｈｅまたはＴｙｒ）も見られない。図８参照。
【０４２６】
ＰＦ０８１２０：トキシン３２
図９参照。このファミリーは、インド赤さそり（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｔａｍｕｌｕｓ）の毒に見出されるｔａｍｕｌｕｓトキシンから成る。ｔａｍａｌｕｓトキシンは、他のさそり毒トキシンとはまったく類似点を共有しないが、その、六つのシステイン残基の位置は、それが、同じ構造的スカフォールドを共有することを示唆する。ｔａｍｕｌｕｓトキシンは、カリュウムチャンネル遮断剤として活動する。
【０４２７】
【化３９】
2009509535.tif 000037
ＰＦ０８３９６：トキシン３４
蜘蛛トキシンオメガアゴトキシン／Ｔｘ１ファミリー。Ｔｘ１ファミリー、致命的蜘蛛ニューロトキシンは、マウスにおいて興奮性症状を誘発する。図１０参照。
【０４２８】
ＰＦ０１０３３：ソマトメジン
図１４参照。ソマトメジンＢ、機能未知の血清因子は、細胞基質の接着タンパク、ビトロネクチンのＮ−末端からタンパク分解によって得られる、小型の、シテイン富裕ペプチドである。ＳＭＢドメインは、四つのジスルフィド結合に配される、八つのＣｙｓ残基を含む（Ｙ．Ｋａｍｉｋｕｂｏ，ら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：６５１９−３４）。活性なＳＭＢドメインは、Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ３１ジスルフィド結合が保存される限り、相当なジスルフィド結合の異種性または変動性を許容することが示唆されている。ＳＭＢドメインの三次元構造はきわめてコンパクトであり、かつ、ジスルフィド結合は、共有結合コアを形成するドメインの中心にパックされる。このタンパクは、チオレドキシンのＣ−末端ドメインと共に可溶性融合タンパクとして発現される。
【０４２９】
【化４０】
2009509535.tif 000038
１−２  ３−４  ５−６  ７−８の空間配置が記載されているが、他の異性形も可能であり、ＮＭＲ構造計算とも一致する。
【０４３０】
ＰＦ０００８７、ＰＦ０００２１：３本指トキシンファミリー
図１４−１８参照。有毒ニューロトキシンおよびサイトトキシンから成るファミリー。構造は、小型で、ジスルフィド富裕、ほとんど全てがベータシート。このファミリーは、ｕＰＡＲ／Ｌｙ６／ＣＤ５９／蛇トキシン−受容体スーパーファミリー族である。この族は、下記のＰｆａｍメンバー：Ａｃｔｉｖｉｔｉｎ＿ｒｅｃｐ；ＢＡＭＢＩ；ＰＬＡ２＿ｉｎｈ；Ｔｏｘｉｎ＿１；ＵＰＡＲ＿ＬＹ６を含む。
【０４３１】
好ましいライブラリー戦略は、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ４、およびＣｙｓ５−Ｃｙｓ６の間にある、三つの最長ループをランダム化することである。二つの異なる設計戦略が用いられる。１）ジスルフィドコアはそのままで、三つのループだけを突然変異発生させる、２）ジスルフィドコアにおける突然変異発生を可能とし、それによって、より高い多様性のループ配置を生成する。もっとも保存されるシステイン間隔は、位置ｎ＝０およびｎ＝７である（‘ｎ６’は、Ｃ６とＣ７の間と定義され、‘ｎ７’は、Ｃ７とＣ８の間と定義される）。残りのＣＤＰを評価するのにこの情報が使用される。もっとも一般的ＣＤＰは、６９メンバーについて、１０、６、１６、３、１０、０、４である。
【０４３２】
【化４１】
2009509535.tif 000039
ＰＦ０１６０７，ＰＦ００１８７：キチン結合タンパク
二つの、異なるシステイン富裕キチン結合ファミリーがある（Ｚ．Ｓｈｅｎ，ら、（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１７６６５−７０）；Ｔ．Ｓｕｅｔａｋｅ，ら、（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：１７９２９−３２；Ｔ．Ｓｕｅｔａｋｅ，ら、（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１５：７６３−９）。ＰＦ００１８７は、菌類および植物に認められ、小麦胚アグルチニンを含む。Ｈｅｖｅｉｎは、四つのジスルフィド結合を含む、前駆体メンバーである。このファミリーは、きわめて保存されたシステイン位置、および空間配置１−４  ２−５  ３−６  ７−８を有する、３８２の、既知のファミリーメンバーを含む。ライブラリー設計においてスカフォールドとして使用した場合の、このファミリーの利点として、第１システインのＮ−末端位置、および最終システインのＣ−末端位置におけるアミノ酸の少数であること（＜３）が挙げられる。個々のシステイン間の距離は、１０未満であり、ドメインは、ジスルフィド結合に富む（四つのジスルフィド結合について約５０アミノ酸）。もっとも一般的ＤＢＰは、１−４  ２−５  ３−６の空間配置である。ドメインは、天然では反復列の中に見出される。
【０４３３】
ＰＦ０１６０７は、Ｐｅｒｉｔｏｐｈｉｎドメインとも呼ばれ、細胞外基質タンパクの一部として動物および昆虫に認められる。このドメインはまた、小型ペプチドタキサイチンにも出現する。タキサイチンおよびｈｅｖｅｉｎ（ＰＦ００１８７）の構造比較から、構造的類似性が明らかになった（整列を参照）。タキサイチンは、五つのジスルフィド結合をふくむが、このファミリーのメンバーは、通常、３ＳＳを含む（式参照）。タキサイチンの、３署名ＳＳは、１−３  ２−６  ４−５の空間配置を示す。１０７５の既知のファミリーメンバーがある。システイン位置は高度に保存される。第１システインのＮ−末端、および最終システインのＣ−末端におけるアミノ酸数は多くない（＜３）。
【０４３４】
図１９−２１参照。
【０４３５】
ＰＦ００１８７  キチン結合タンパク
【０４３６】
【化４２】
2009509535.tif 000040
ＰＦ０１６０７  キチン結合ドメイン：
【０４３７】
【化４３】
2009509535.tif 000041
ＰＦ０１８２６：トリプシン阻害剤
このファミリーは、トリプシン阻害剤の外、多くの細胞外ドメインに見られるドメインを含む（Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３７８：７０５−１６）。このドメインは通常、五つのジスルフィド結合を形成する、１０個のシステイン残基を含む。ＤＢＰは、１−７  ２−６  ３−５  ４−１０  ８−９である。４１４のファミリーメンバーが既知である。システイン位置は高度に保存される。図２３参照。
【０４３８】
【化４４】
2009509535.tif 000042
ＰＦ０２４２８：じゃがいもタンパク阻害剤
このファミリーは、遺伝子レベルの反復列に認められる。このタンパクは、大型の前駆体タンパクとして合成される。タンパク分解酵素による切断は、反復列の間ではなく、反復列の中で起こり、成熟ミクロタンパクを生成する（Ｅ．Ｂａｒｔａ，ら、（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，１８：６００−３）（Ｎ．Ａｎｔｃｈｅｖａ，ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，１０：２２８０−９０）。
【０４３９】
大型前駆体タンパクは合成されるが、前駆体のジスルフィドの空間配置は不明である。
【０４４０】
反復単位は発現され、そのＮＭＲ構造は解決されている。フォールドは、熟成ミクロタンパクと同様である。これは、円形組み合わせが起こっていること、この単位は祖形であることを示唆する。これは、この反復単位に一致する、円形組み合わせタンパクの発見によって支持される。リンカーまたはプロテアーゼ部位（ＥＥＫＫＮ）が、この祖形の構造の中に無秩序ループとして存在する。図２４参照。
【０４４１】
【化４５】
2009509535.tif 000043
タンパク分解酵素処理によって、熟成ミクロタンパクの配列は、上に示した式とは異なる。
【０４４２】
２Ｃ２ＣＣ５Ｃ１０Ｃ１１Ｃ３Ｃ８Ｃ２（熟成式−タンパクレベル）
３Ｃ３Ｃ８Ｃ１２Ｃ２ＣＣ５Ｃ１０Ｃ２（反復式−遺伝子レベル）
ＰＦ００３０４：ガンマチオニン
この熟成形では、これらの小型の植物タンパクは、一般に、約４５から５０アミノ酸残基から成る。ガンマ−プロチオニンのフォールド構造は、境界の明瞭な、３本の、逆平行シートおよび短い螺旋で特徴づけられる。三つのジスルフィド架橋が、螺旋とシートの間の疎水性コアに配され、システイン安定化螺旋モチーフを形成する（Ｐ．Ｂ．Ｐｅｌｅｇｒｉｎｉ，ら、（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３７：２２３９−５３）。この構造は、さそりのトキシンおよび昆虫のデフェンシンに類似する（Ｃ．Ｂｌｏｃｈ，Ｊｒ．，ら、（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３２：３３４−４９）。
【０４４３】
このドメインは、約５０アミノ酸当たり４ジスルフィド結合という高いジスルフィド密度を示し、１−８  ２−５  ３−６  ４−７の空間配置を持つ。個々のシステイン間のシステイン間隔は、１０よりは小さく、したがってライブラリー設計には好ましい。このファミリーの異なるメンバーの間で、システイン位置は高度に保存される。図２５参照。
【０４４４】
ＰＦ００３０４−ガンマ−チオニン
【０４４５】
【化４６】
2009509535.tif 000044
ＰＦ０２９５０：オメガ−コノトキシン
コノトキシンは、イオンチャンネルをブロックする、小型のニューロトキシンである。オメガ−コノトキシンは、シナプス前膜に作用し、カルシウムチャンネルをブロックする（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｙ，ら、（１９８８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５７：６６５−７００）。ドメインは、約２４アミノ酸当たり三つのジスルフィド結合という高いジスルフィド密度を示す。３８０を超える既知のファミリーメンバーがある。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０よりも小さく、したがってライブラリー設計には好ましい。このファミリーの異なるメンバーの間で、システイン位置は高度に保存される。ファミリーは、１−４  ２−５  ３−６の空間配置を有数る。
【０４４６】
図２６参照。
【０４４７】
【化４７】
2009509535.tif 000045
ジコノチドは、ＦＤＡ承認の２５ＡＡコノトキシン「プリアルト」である。ジコノチドは、＞７０００患者に試験され、非免疫原性であった（＜１％出現率）。これにより、これは、ヒトに使用される新規結合タンパクとして有望なスカフォールドと期待される。配列、および１−４  ２−５  ３−６ＤＢＰを図１２に示す。
【０４４８】
ＰＦ０５３７４：Ｍｕ−コノトキシン
Ｍｕ−コノトキシンは、電圧依存性ナトリウムチャンネルのペプチド阻害剤である（Ｋ．Ｊ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，ら、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：２７２４７−５５）。図２９参照。ＤＢＰ：１−４  ２−５  ３−６
【０４４９】
【化４８】
2009509535.tif 000046
ＰＦ０２８２２：アンチスタシン
ペプチドプロテイナーゼ阻害剤は、タンパクの中の単一ドメインタンパク、または、単一または複数ドメインとして認められる。これらは、それぞれ、単純または複合阻害剤と呼ばれる（Ｒ．Ｌａｐａｔｔｏ，ら、（１９９７）Ｅｍｂｏ  Ｊ，１６：５１５１−６１）。多くの場合、これらは、より大型の前駆体タンパクの一部として、プレペプチドとして、または、不活性ペプチダーゼまたはチモーゲンと関連するＮ−末端ドメインとして合成される。Ｐｆａｍ定義は、１−４  ２−５  ３−６のＤＢＰを有する、僅かに六つのシステインしか含まない。しかしながら、このファミリーの多くのメンバー（１ｂｘ７、１ｈｉａ）は、さらに二つのＮ−末端ジスルフィドを含む。したがって、このファミリーは、Ｎ−末端において延長することが可能である。
【０４５０】
このドメインは、３９−５４アミノ酸当たり３−５ジスルフィドという高いジスルフィド密度、および、１−３  ２−４  ５−８  ６−９  ７−１０の空間配置を示す。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０よりも小さく、したがってライブラリー設計には好ましい。このファミリーの異なるメンバーの間で、システイン位置は高度に保存される。図３２参照。
【０４５１】
このファミリーのメンバーは、きわめて親水性が高く、これは、ライブラリー設計には好ましい（非特異的結合が低く、Ｔ−細胞エピトープは少数である）。例えば、ヒルスタシンは、合計して、僅かに６個の疎水性残基しか含まない。結晶構造は、ほとんど二次構造要素を欠如することを示す。これを、５ＳＳで可能なジスルフィド異性形の多数であることと組み合わせると、ライブラリー設計のためのスカフォールドとしてきわめて有用となる。
【０４５２】
システイン位置は、５ジスルフィドについては高度に保存される：Ｃ４Ｃ５Ｃ６Ｃ１Ｃ４Ｃ４Ｃ１０Ｃ５Ｃ１Ｃ
ＰＦ０２８２２−アンチスタチン
【０４５３】
【化４９】
2009509535.tif 000047
Ｎ−末端の四つのシステイン残基を欠いた短小バージョン。
【０４５４】
【化５０】
2009509535.tif 000048
ＰＦ０５０３９：アグーチ関連
図３３参照。アグーチタンパクは、先端下に黄色バンドを持つ黒色毛を発生するマウス毛嚢における色素形成を調整する。きわめて相同性の高いタンパク、アグーチシグナルタンパク（ＡＳＩＰ）がヒトにおいて存在し、脂肪組織において高レベルで発現されるが、ここで該タンパクは、エネルギーホメオスターシスおよび、おそらくヒトの色素形成においても関与すると考えられる（Ｊ．Ｃ．ＭｃＮｕｌｔｙ，ら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：１５５２０−７；Ｊ．Ｖｏｉｓｅｙ，ら、（２００２）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５：１０−８）。
【０４５５】
Ｃｙｓ５とＣｙｓ１０の間のジスルフィド結合は、構造と機能には不要である。除去すると、ＤＢＰは１−４  ２−５  ３−８  ６−７となる。最初の三つのジスルフィド結合は、署名のシステインノットモチーフを形成する。受容体結合部位は、Ｃｙｓ７およびＣｙｓ８の間のＲＦＦモチーフ、および最初の１６アミノ酸によって形成されるループを含む。Ｃ末端は、無秩序であり、除去してもよい（Ｃｙｓ１とＣｙｓ１０は、Ｐｆａｍ式には存在しないことに注意）。
【０４５６】
下記の式は、ライブラリー設計に好ましい：ＰＦ０５０３９−アグーチ：
【０４５７】
【化５１】
2009509535.tif 000049
比較的短いＣ−末端、およびシステイン５およびシステイン１０を欠くようにタンパクを加工して、フォールド形成させたところ、天然タンパクと類似の構造を取る。この加工バージョンを、ライブラリー設計のためのスカフォールドとして用いた。これは、下記の式を有する：
【０４５８】
【化５２】
2009509535.tif 000050
完全長アグーチタンパクは、可溶性タンパクとして大腸菌において発現させることが可能である（Ｒ．Ｄ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１６０４１−５２）。
【０４５９】
ＰＦ０５３７５：ＰＭＰ阻害剤／パシファスチン
このファミリーのメンバーの構造から、これらは、三つのジスルフィド架橋によって接続される、３重鎖逆平行ベータシートから構成されることが示される。これは、このファミリーが、セリンプロテアーゼ阻害剤の新規ファミリーであることを規定する（Ｇ．Ｓｉｍｏｎｅｔ，ら、（２００２）Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１３２：２４７−５５；Ａ．Ｒｏｕｓｓｅｌ，ら、（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６：３８８９３−８）。図３４参照。
【０４６０】
３９のファミリーメンバーがある。システイン位置は、ジスルフィド空間配置１−４  ２−６  ３−５を有し、高度に保存される。個々のシステイン間の距離は＜１０である。Ｃ−末端は、構造の中で見えない。これは、ライブラリー設計において省略可能であることを示唆する。二つの、強力に保存されるアミノ酸としてＮ１５およびＴ２９がある。これらは、プロテアーゼ結合ループの形成と安定化に関与する。これらは、結合の多様性を増すために、ライブラリー設計から省略することも可能である。
【０４６１】
【化５３】
2009509535.tif 000051
ＰＦ０１５４９：ＳｈＴＫファミリーおよびＳｔｅｃｒｉｓｐ
Ｓｔｅｃｒｉｓｐは、ＳｈＴＫファミリーと、酷似する３Ｄ構造を示すが、ＳｈＴＫファミリー（ＰＦ０１５４９）の一部ではない（Ｍ．Ｇｕｏ，ら、（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８０：１２４０５−１２）。Ｓｔｅｃｒｉｓｐ配列に基づいてＢｌａｓｔ探索したところ、３０−１００％の同一性を持つ４８の合致例が得られたが、ＳｈＴＫファミリーのメンバーは全く得られなかった。図３５−３６参照。
【０４６２】
Ｐｆａｍ０１５４９は、機能不明のドメインであるが、いくつかのＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパクの中に認められる。このドメインは、３０アミノ酸長で、６個の保存されたシステイン位置を持ち、これらは３個のジスルフィド架橋を形成する。このドメインは、ＳｈＫトキシンにちなんで名づけられた（ＳＭＡＲＴによって）（Ｍ．Ｄａｕｐｌａｉｓ，ら、（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２：４３０２−９）。
【０４６３】
このドメインは、３９アミノ酸当たり３ジスルフィドという高いジスルフィド密度、および、１−６  ２−４  ３−５の空間配置を示す。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０よりも小さく、したがってライブラリー設計には有用である。このファミリーの異なるメンバーの間で、システイン位置は高度に保存される。
【０４６４】
ＰＦ０１５４９−ＳｈＴＫ。図３５参照。
【０４６５】
【化５４】
2009509535.tif 000052
ＳＴＥＣＲＩＳＰのＣ−末端ドメインおよび関連配列：図３６を参照されたい。
【０４６６】
ＰＦ０７９７４：ＥＧＦ２ドメイン
このファミリーのメンバーは、ＥＧＦスーパーファミリーに属する。このスーパーファミリーは、ＥＧＦフォールドの安定性に必須の、１−３  ２−４  ５−６の順序で３−４個のジスルフィド結合を形成する、６−８個のシステインを有することで特徴づけられる。これらのジスルフィド結合は、梯子状に配されて積層される。ラミニンＥＧＦファミリーは、さらにもう一つのジスルフィド結合を持つことによって区別される。このファミリーにおけるこれらのドメインの機能は不明であるが、主に構造的役割を果たしていると考えられている。通常、これらのドメインは、細胞外タンパクとして縦列反復列として配置されている。
【０４６７】
ＰＦ０７９７４−ＥＧＦ２：図３７参照。
【０４６８】
【化５５】
2009509535.tif 000053
他のＥＧＦ−様ドメイン
ＰＦ００００８−ＥＧＦ：図３８参照。
【０４６９】
【化５６】
2009509535.tif 000054
ＰＦ０００５３−Ｌａｍ−ＥＧＦ：図３９参照。ＤＢＰ：１−３  ２−４  ５−６  ７−８
【０４７０】
【化５７】
2009509535.tif 000055
ＰＦ０７６４５：Ｃａ−ＥＧＦ：図４０参照。
【０４７１】
【化５８】
2009509535.tif 000056
ＰＦ０４８６３：アリナーゼＥＧＦ−様：図４１参照。
【０４７２】
【化５９】
2009509535.tif 000057
ＰＦ００３２３：哺乳類デフェンシン；デフェンシン１
図４５参照。ＤＢＰ：１−６  ２−４  ３−５
【０４７３】
【化６０】
2009509535.tif 000058
ＰＦ０１０９７：節足動物デフェンシン：デフェンシン２
図４４参照。ＤＢＰ：１−４  ２−５  ３−６
【０４７４】
【化６１】
2009509535.tif 000059
ＰＦ００７１１：デフェンシンＢ、ベータ−デフェンシン
図４３参照。ＤＢＰ：１−４  ２−５  ３−６、または１−５＿２−４＿３−６
【０４７５】
【化６２】
2009509535.tif 000060
ＰＦ０８１３１：デフェンシン−様；デフェンシン３、図４２．
【０４７６】
【化６３】
2009509535.tif 000061
デフェンシン（様）３ファミリーは、カモノハシ毒から単離されたデフェンシン様ペプチド（ＤＬＰ）から成る（Ａ．Ｍ．Ｔｏｒｒｅｓ，ら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３４１（Ｐｔ３）：７８５−９４）。これらのＤＬＰは、ベータ−デフェンシン−１２、およびナトリウムチャンネル・ニューロトキシンＳｈｌのものと、近似の三次元フォールドを示す。しかしながら、ベータ−デフェンシン−１２およびＳｈｌにとって機能的に重要なことが知られる側鎖が、ＤＬＰでは保存されない。このことは、異なる生物学的機能を示唆する。この意見と一致して、ＤＬＰは、抗菌性を持たないことが示され、かつ、ラットの後根神経節のナトリウムチャンネル電流に対し観察可能な活性を持たない。３メンバーしか知られていないが、ベータデフェンシンに近似することは、このスカフォールドを魅力あるものにする。
【０４７７】
このドメインは、３６アミノ酸当たり３ジスルフィドという高いジスルフィド密度、および、１−５＿２−４＿３−６の空間配置を示す。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０よりも小さく、したがってライブラリー設計には有用である。このファミリーの異なるメンバーの間で、システイン位置は高度に保存される。
【０４７８】
ＰＦ００３２１：クランビン
クランビンは、小型の、基本的植物タンパクであり、４５から５０のアミノ酸長を持ち、三つから四つの保存されたジスルフィド結合を含む。このタンパクは、動物細胞に有毒であるが、恐らく細胞膜を攻撃し、それを透過的にするものと考えられる。これは、糖分接種の抑制を招き、カリウムイオンおよびリン酸イオン、タンパク、およびヌクレオチドを細胞から漏出させる。このファミリーは、ガンマ−チオニンＰＦ００３０４とは異なる（Ｐ．Ｂ．Ｐｅｌｅｇｒｉｎｉ，ら、，（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３７：２２３９−５３）。
【０４７９】
このドメインは、約４６アミノ酸当たり４ジスルフィドという高いジスルフィド密度を示す。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０よりも小さく、したがってライブラリー設計には有用である。このファミリーの異なるメンバーの間で、システイン位置は高度に保存される。図４６参照。
【０４８０】
システイン位置は高度に保存され、個々のシステイン間の距離は１０以下であり、空間配置は１−６  ２−５  ３−４であり、ドメインは小さく、６システインを有する。
【０４８１】
三つのジスルフィド結合を含むメンバーのモチーフは、
ＰＦ００３２１−クランビン
【０４８２】
【化６４】
2009509535.tif 000062
四つのジスルフィド結合、および空間配置１−８  ２−７  ３−６  ４−５を有するメンバーのモチーフは、下式によって特徴づけられる：
【０４８３】
【化６５】
2009509535.tif 000063
ＰＦ０６３６０：Ｒａｉｋｏｖｉ
僅かに６個のファミリーメンバーしか持たないが、システイン間アミノ酸は高密度である、拡散性ペプチドフェロモン（Ｍ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，ら、（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２：１０１７２−６）。システイン位置は高度に保存され、空間配置は１−４  ２−６  ３−５である。個々のシステイン間の距離は＜１０．図４７参照。
【０４８４】
【化６６】
2009509535.tif 000064
ＰＦ００６８３：ＴＢドメイン
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−結合タンパク様（ＴＢ）ドメインは、ヒトのフィブリンから得られた。このドメインは、細胞外基質の繊維状構造に局在する、フィブリン、および潜在的ＴＧＦ−結合タンパク（ＬＴＢＰ）に認められる（Ｘ．Ｙｕａｎ，ら、（１９９７）Ｅｍｂｏ  Ｊ，１６：６６５９−６６）。反復列は、このドメインが、フィブリンおよびＬＴＢＰにおいて複数コピーとして見出されることを意味する。図４９参照。
【０４８５】
式は、僅か６個の保存システインのみを示す。３種類の構造を分析した（１ｕｚｑ、１ａｐｊ、１ｋｓｑ）。消失システインは、Ｃｙｓ１と、Ｃｙｓ三重体の間に挿入される（位置８／１２、４／１２、９／１２）が、式では最後のシステインが消失したままである。空間配置は１−３  ２−６  ４−７  ５−８である。
【０４８６】
【化６７】
2009509535.tif 000065
ＰＦ０００９３：ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子型Ｃドメイン
ｖＷＦドメインは、各種血漿タンパク、補体因子、インテグリン、コラーゲンＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＶ型、および、その他の細胞外タンパクに認められる（Ｐ．Ｂｏｒｋ（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，３２７：１２５−３０）。高度に保存されたシステイン残基を有する、４８８の既知のファミリーメンバーがある。構造および配列比較から、ＣＲモジュールのＮ−末端サブドメインと、フィブロネクチン１型ドメインとの間には進化関係のあることが明らかにされており、これらのドメインが共通の祖先を共有することを示唆する（Ｊ．Ｍ．Ｏ‘Ｌｅａｒｙ，ら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９：５３８５７−６６）。図５０参照。
【０４８７】
ミニ・コラーゲンシステイン富裕ドメイン
ミニ・コラーゲンは、ヒドラの細胞壁に認められる。ミニ・コラーゲンは、分子内ジスルフィド結合前駆体として合成される、Ｃ−末端システイン富裕ドメインを含む。このＣ−末端ドメインは、独特のフォールドを有するミクロタンパクである（Ｓ．Ｍｅｉｅｒ，ら、（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５６９：１１２−６；Ｅ．Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ，ら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９：３０３９５−４０１）。１６種のファミリーメンバーの間で、システイン残基だけが高度に保存される。ジスルフィド結合は、分子内ジスルフィド結合に対してシャッフルされて、細胞壁安定基質を形成するものと考えられている。ジスルフィド空間配置は、１−５  ２−４  ３−６である。Ｃ−末端ドメインが、互いに分子内ジスルフィド結合を形成するという所見は、分子間ジスルフィド結合によって連結される二量体分子から成る組み合わせライブラリーを創製するのに利用することが可能である。図１３６参照。
モチーフ：ミニコラーゲンにおけるＣ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３ＣＣ、およびヒドラＨＯＷＡタンパクにおけるＣ５Ｃ３Ｃ３Ｃ３Ｃ３ＣＣ、これらにおいてこのドメインは反復体として出現する。
【０４８８】
ＰＦ０３７８４：シクロチド
このファミリーは、各種活性を有する、一組の環状ペプチドを含む。構造は、歪んだ、３重鎖ベータシート、および、ジスルフィド結合のシステインノット配置から成る（Ｄ．Ｊ．Ｃｒａｉｋ，ら、（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２９４：１３２７−３６）。図５１参照。
【０４８９】
空間配置は１−４＿２−５＿３−６である。
【０４９０】
【化６８】
2009509535.tif 000066
ＰＦ０６４４６：ヘプシジン
ヘプシジンは、肝臓において発現される抗菌および抗真菌タンパクであり、さらに、鉄代謝におけるシグナル伝達分子である。ヘプシジンタンパクは、システイン富裕であり、ヘアピンの曲がり角に見られる、異常なジスルフィド結合を有する、歪んだベータ−シートを形成する。
【０４９１】
図５２参照。空間配置は１−８  ２−７  ３−６  ４−５である。
【０４９２】
【化６９】
2009509535.tif 000067
ＰＦ０５３５３：デルタ−アトラコトキシン
アトラコトキシンの構造は、ベータ領域から突出する、３重鎖親指状延長体を含むコアベータ領域、およびＣ−末端螺旋を含む。ベータ領域は、他のニューロトキシンポリペプチドにも見られる特徴である、システインノットモチーフ含む。図５３参照。
【０４９３】
空間配置は１−４  ２−６  ３−７  ５−８である。
【０４９４】
【化７０】
2009509535.tif 000068
ＰＦ００２９９：セリンプロテアーゼ阻害剤
このｓｑｕａｓｈ阻害剤は、いくつかのセリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーの一つである。これらは、約３０残基長で、３ジスルフィド結合を形成する、６Ｃｙｓ残基を含む。空間配置は１−４  ２−５  ３−６である。図５６参照。
【０４９５】
【化７１】
2009509535.tif 000069
ＰＦ０１８２１：アナフィロトキシン様ドメイン
Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａアナフィロトキシンは、補体分子Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５の活性化の際血清中に酵素的に生成されるタンパク断片である。これらは、平滑筋収縮を誘発する。これらの断片は、フィブリンの３重反復体に対して相同である。空間配置は１−４  ２−５  ３−６である。このファミリーには１２３の既知のメンバーがある。図５７参照。
【０４９６】
【化７２】
2009509535.tif 000070
ＰＦ０５１９６：ミドカイン／ＰＴＮ
成長および分化の調節に関与する、いくつかの細胞外ヘパリン結合タンパクは、新しい、増殖因子ファミリーに属する（Ｗ．Ｉｗａｓａｋｉ，ら、（１９９７）Ｅｍｂｏ  Ｊ，１６：６９３６−４６）。３３のファミリーメンバーがある。システイン位置は高度に保存され、ジスルフィドの空間配置は１−４  ２−５  ３−６である。個々のシステイン間の距離は＜１０である。ミドカインのＮＭＲ構造は、きわめて無秩序なＮ−およびＣ−末端を示す。これは、これらは、ライブラリー設計から省略することが可能であることを示唆する。正に荷電する残基は、ヘアピン結合に関与するので、ライブラリー設計から省略することが可能である。図５９参照。
【０４９７】
【化７３】
2009509535.tif 000071
ＰＦ０２８１９：ＷＡＰ「４−ジスルフィドコア」
保存されたシステインのパターンは、これらの配列が、相似のフォールドを取ることを示唆するけれども、配列類似性の総合度は低い（Ｌ．Ｇ．Ｈｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，ら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１０：２６７７−８４）。２５の既知のファミリーメンバーがある。図６２参照。
【０４９８】
空間配置は１−６  ２−７  ３−５  ４−８である。
【０４９９】
【化７４】
2009509535.tif 000072
ＰＦ０２０４８，ＰＦ０７８２２：毒性ヘアピン
トキシン１３（ＰＦ０７８２２）は折りたたまれて、４ＳＳジスルフィドアルファ螺旋ヘアピンを形成する。ＳＣＯＰデータベースはさらに、熱安定性エンテロトキシン（ＰＦ０２０４８）を、１−４  ２−５  ３−６のＤＢＰを持つ毒性ヘアピンと掲載する。
【０５００】
このファミリーのメンバーは、海産ワームＣｅｒｅｂｒａｔｕｌｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓによって生産される甲殻類選択的ニューロトキシンである、ニューロトキシンＢ−ＩＶによく似る。この高度に陽イオン性のペプチドは、約５５残基であり、ヘアピン構造の明瞭な形状を持つループによって接続される、２本の逆平行螺旋を形成するように配される。ヘアピンの側枝は、四つのジスルフィド結合によって連結される。活性に重要であると特定された三つの残基は、分子の同じ面に見出されるが、一方、活性に重要なもう一つの残基、Ｔｒｐ３０は、反対側にある。このタンパクの活動方式は、完全には理解されていないが、電圧依存性ナトリウムチャンネルに対し、おそらく、これらのタンパクの、まだ解明されていない部位に結合することによって作用すると考えられる。図６５参照。トキシン１３の空間配置は１−８  ２−５  ３−６  ４−５である。
【０５０１】
【化７５】
2009509535.tif 000073
ＰＦ０６３５７：オメガ−アトラコトキシン
オメガ−アトラコトキシン−Ｈｖ１ａは、昆虫特異的ニューロトキシンであり、その系統発生的特異性は、脊椎動物ではできないが、昆虫の電圧依存性カルシウムチャンネルに拮抗する能力から得られる（Ｘ．Ｗａｎｇ，ら、（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６４：４８８−９４）。空間配置は１−６＿２−７＿３−４＿５−８。
【０５０２】
図６６参照。空間配置は１−４＿２−５＿３−６。
【０５０３】
【化７６】
2009509535.tif 000074
ＰＦ０６９５４：レジスチン
このファミリーは、いくつかの哺乳類のレジスチンタンパクから成る。レジスチンの循環レベルの上昇は、インスリンの一定の生理的レベルの存在下にグルコース生産を刺激し、他方では、インスリンはレジスチンの発現を抑制することが実証されている。
【０５０４】
レジスチンは、Ｃ末端のジスルフィド富裕部分のマルチマー化に関与するＮ−末端アルファ螺旋を含む。図６７参照。空間配置は１−１０  ２−９  ３−６  ４−７  ５−８。
【０５０５】
ジスルフィド−富裕ミクロタンパクのみが示される。Ｎ−末端アルファ螺旋モチーフは、ミクロタンパクのマルチマー化に使用することが可能である。
【０５０６】
【化７７】
2009509535.tif 000075
ＰＦ０００６６：ノッチ／ＤＳＬ
動物の発達過程に与る膜貫通タンパクの細胞外ドメイン（Ｊ．Ｃ．Ａｓｔｅｒ，ら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：４７３６−４２；Ｄ．Ｖａｒｄａｒ，ら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：７０６１−７）。ＤＳＬ反復列は縦列で起こる（３ｘ）。三つの保存されたＡｓｐまたはＡｓｎ残基。ＮＭＲ構造では、Ｄ１２、Ｎ１２、Ｄ３０、Ｄ３３がＣａ２＋結合部位を形成する。一異性形だけが、ミリモルのＣａ２＋の存在下に形成され、複数の異性形は、Ｍｇ２＋またはＥＤＴＡの存在下に観察される。システイン位置は高度に保存され、１−５  ２−４  ３−６空間配置を持つ。第１システインのＮ−末端および最終システインのＣ−末端のアミノ酸は多くはない（＜３）。個々のシステイン間の距離は＜１０．図６８参照。
【０５０７】
【化７８】
2009509535.tif 000076
ＰＦ０００２０：ＴＮＦＲ
いくつかのタンパクは、その内のあるものは増殖因子の受容体であることが知られるが、Ｎ−末端領域にシステイン富裕ドメインを含むことが判明しており、このドメインは、さらに、その全てが鎖内ジスルフィド結合に関与する、六つの保存システインを含む、４個の（ある場合には、３個の）反復列に分割される（Ｍ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ，ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１４９１４−２３）。このドメインは、空間配置１−２  ３−５  ４−６を有する、高度に保存されるシステイン残基を含む。
【０５０８】
図６９参照。
【０５０９】
【化７９】
2009509535.tif 000077
ＰＦ０００３９：フィブロネクチンＩＩ型ドメイン
フィブロネクチンは、複数ドメイン糖タンパクであり、血漿中では可溶形として見られ、細胞表面、および、各種化合物、例えば、コラーゲン、フィブリン、ヘパリン、ＤＮＡ、およびアクチンなどに結合する。
【０５１０】
図７０参照。１−３  ２−４空間配置。
【０５１１】
【化８０】
2009509535.tif 000078
ＰＦ０２０１３：セルロースまたはタンパク結合ドメイン
好気性細菌に見られるものは、セルロース（または、他の炭水化物）に結合するが、嫌気性真菌類では、それらは、タンパク結合ドメインであり、ドッケリンドメイン、またはドッキングドメインと呼ばれる。
【０５１２】
１−２  ３−４の空間配置。図７１参照。
【０５１３】
【化８１】
2009509535.tif 000079
ＰＦ００７３４：菌類セルロース結合ドメイン
構造的に、セルラーゼおよびキシラーゼは、一般的に、プロリンおよび／またはヒドロキシ−アミノ酸富裕な短いリンカー配列によって、セルロース結合ドメイン（ＣＯＤ）に接続される触媒ドメインから成る（Ｎ．Ｒ．Ｇｉｌｋｅｓ，ら、（１９９１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，５５：３０３−１５）。いくつかの菌類セルラーゼのＣＢＤは、３６アミノ酸残基から成ることが示されており、ＣＢＤは、該酵素のＮ−末端またはＣ−末端のどちらかに見出される。このファミリーのメンバーは、二つのジスルフィド結合を持ち、空間配置は１−３  ２−４である。図７２参照。
【０５１４】
【化８２】
2009509535.tif 000080
ＰＦ００２１９：インスリン様増殖因子結合タンパク
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、細胞外液において、特異的結合タンパクに高いアフィニティーをもって結合する。このファミリーのメンバーは、二つのジスルフィド結合を持ち、空間配置は１−３  ２−４である。図７４，７５参照。
【０５１５】
ＰＦ００３２２：エンドセリンファミリー
エンドセリン（ＥＴ）は、知られるもっとも強力な血管収縮因子である。２１残基長の、これらのペプチドは、二つの分子内ジスルフィド結合を含み、１−４  ２−３の空間配置を持つ。図７６参照。
【０５１６】
ＰＦ０２０５８：グラニュリン前駆体
１５アミノ酸ペプチドであるグラニュリンは、ＳｔａＲという名で知られる小腸受容体グアニレートシクラーゼＣの内因性リガンドである。これらのペプチドは、二つの分子内ジスルフィド結合を含み、１−３  ２−４の空間配置を持つ。図７７参照。
【０５１７】
ＰＦ０２９７７：カルボキシペプチダーゼ阻害剤
ペプチドプロテイナーゼ阻害剤は、タンパクの中の単一ドメインタンパク、または、単一または複数ドメインとして認められる。これらは、それぞれ、単純または複合阻害剤と呼ばれる。多くの場合、これらは、より大型の前駆体タンパクの一部として、プレペプチドとして、または、不活性ペプチダーゼまたはチモーゲンと関連するＮ−末端ドメインとして合成される。第２ペプチダーゼとの相互作用、または自己触媒的切断による、Ｎ−末端阻害剤ドメインの除去は、チモーゲンを活性化する。
【０５１８】
３５の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−４  ２−５  ３−６である。
【０５１９】
【化８３】
2009509535.tif 000081
ＰＦ０６３７３：ＣＡＲＴ
ＣＡＲＴは、主に、システインノットに共通な逆平行ベータ・シートから成る、数枚の僅かな延長体によって構成されるコンパクトな枠組みによって囲まれる、巻き回転およびループから成る。１３の既知のファミリーメンバーがある。
【０５２０】
空間配置は１−３  ２−５  ４−６。図８１参照。
【０５２１】
他の全てのファミリーとは違って、非ｃｙｓ−残基は、むしろ保存されるので、このファミリーは、ランダム化には好ましい選択であるようには見えない。
【０５２２】
フォリスタチン
ヒトのフォリスタチンは、ＦＤＡ承認製品であり、非免疫原性で、したがって、７０−７２ＡＡのフォリスタチンドメインは、魅力的なスカフォールドである。これは、合計３６システイン残基を含むが、これらは、四つの自律的フォールド形成単位に対応する、ジスルフィド架橋の、非重複組の中に配置されると考えられている。これらの単位の内の第１は、我々はこれをＦｓ０と呼ぶが、成熟ポリペプチドの、６３Ｎ−末端残基を含むが、既知の構造を持つ他の、どのタンパクとも配列類似性を持たない。それと対照的に、フォリスタチン鎖の残余部分は、フォールド形成して、一連の、三つの連続する、７０−７４残基長のフォリスタチンドメインを形成する。これらは、Ｆｓ１、Ｆｓ２、およびＦｓ３と呼ばれる構造的反復列であるが、細胞外基質タンパクＢＭ−４０のフォリスタチン様ドメインに対し相同性を示し、さらに、他の細胞外基質タンパク、例えば、アグリン、トモレグリン、および補体タンパクＣ６およびＣ７にも認められる。各６９−７２ＡＡフォリスタチンドメインは、１−３  ２−４  ５−９  ６−８  ７−１０のＤＢＰを有する。
【０５２３】
ＰＦ００７１３：ヒルジン
ヒルジンファミリーは、ＭＥＲＯＰＳ阻害剤ファミリー、ＩＭ族に属するプロテイナーゼ阻害剤の１群である。これらは、Ｓ１ファミリーのセリンペプチダーゼを抑制する。
【０５２４】
ヒルジンは、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ  ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ（バッファロー・ヒル）およびＨｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ（医用ヒル）の唾液腺によって分泌される強力なトロンビン阻害剤である。これは、アルファ−トロンビンと安定な非共有的複合体を形成し、トロンビンのフィブリノーゲン切断能力を破壊する。ヒルジンの構造は、ＮＭＲによって解決されており、組み換えヒルジン−トロンビン複合体の構造は、Ｘ線結晶学によって２．３Ａまで決定されている。ヒルジンは、Ｎ−末端の小球ドメインと、延長したＣ−ドメインとから成る。残基１−３は、トロンビンの残基２１４−２１７と平行なベータ鎖を形成し、残基１の窒素原子は、触媒部位のＳｅｒ１９５  Ｏガンマ原子と水素結合を形成する。Ｃ−末端は、トロンビンの陰イオン結合性細胞外部位と、数多くの静電気的相互作用を形成し、一方、最後の５個の残基は、多くの疎水性接触を形成する螺旋ループの中に納まる。図１２３参照。
【０５２５】
ＰＦ０６４１０：グルマリン
グルマリンは、トウワタ蔓植物Ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｅから得られた３５−残基ポリペプチドである。これは、ラットにおいて甘味に対する神経反応を選択的に抑制する能力を持つので、従来、甘味転換の研究において薬学的ツールとして利用されている。
【０５２６】
二つの既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−４  ２−５  ３−６．図８２参照。
【０５２７】
【化８４】
2009509535.tif 000082
ＰＦ０８０２７：アルブミン−１
このアルブミン−１タンパクは、ホルモン様ペプチドであるが、膜結合４３ｋＤａ受容体に結合するとキナーゼ活性を刺激する。このドメインの構造は、フォールド様ノッチンの存在を明らかにし、３本のベータ鎖から構成される。３４の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−４  ２−５  ３−６．図８３−８４参照。
【０５２８】
ＰＦ０８０２８：ニューロトキシン（ＡＴＸＩＩＩ）
このファミリーは、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａトキシンＩＩＩ（ＡＴＸ  ＩＩＩ）ニューロトキシンファミリーから成る。ＡＴＸ  ＩＩＩは、いそぎんちゃくによって生産されるニューロトキシンである。これは、四つの反転巻き回転および、他の、二つの鎖翻転を含むコンパクトな構造を採用するが、正規のアルファ−螺旋またはベータ−シートを持たない。このペプチドの表面に認められる疎水性パッチは、ナトリウムチャンネル結合表面の一部を構成するようである。二つの既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−４  ２−５  ３−６。
【０５２９】
図８５参照。
【０５３０】
【化８５】
2009509535.tif 000083
ＰＦ０１１４７：ＣＨＨ／ＭＩＨ／ＧＩＨ神経ホルモン  
節足動物は、ニューロペプチドのファミリーを発現するが、その中には、甲殻類から分泌される高血糖ホルモン（ＣＨＨ）、脱皮抑制ホルモン（ＭＩＨ）、性腺抑制ホルモン（ＧＩＨ）、および下顎器官抑制ホルモン（ＭＯＩＨ）、および、いなごから分泌されるイオン輸送ペプチド（ＩＴＰ）が含まれる。
【０５３１】
１３１の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−５  ２−４  ３−６．図８６参照。
【０５３２】
ＰＦ０４７３６：エクロシオン
エクロシオンファミリーは、脱皮行動の実行を起動する昆虫ニューロペプチドであり、脱皮の最後に古いクチクラの脱ぎ捨てを起こさせる。５の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−５  ２−４  ３−６．構造データは無い。図８８参照。
【０５３３】
【化８６】
2009509535.tif 000084
ＰＦ０１１６０：内因性オピオイドニューロペプチド
脊椎動物の、内因性オピオイドニューロペプチドは、前駆体タンパクの翻訳後タンパク分解酵素切断によって放出される。この前駆体は、下記の成分から成る。約５０残基の保存領域に先行するシグナル配列、可変長領域、およびニューロペプチドそのものの配列。配列分析から、前駆体の保存されたＮ−末端領域が、ジスルフィド結合の形成に与ると思われる６個のシステインを含むことが明らかになった。この領域は、ニューロペプチドの処理に重要と想定される。５０の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−５  ２−４  ３−６．構造データは無い。図８９参照。
【０５３４】
【化８７】
2009509535.tif 000085
ＰＦ０８０３７：軟体動物フェロモン
このファミリーは、水性フェロモンのアトラクチンファミリーから成る。Ａｐｌｙｓｉａの交尾誘引は、産卵時に放出される、アトラクチンペプチドの形を取る長距離の水性シグナルを含む。これらのペプチドは、６個の保存システインを含み、折りたたまれて二つの逆平行螺旋を形成する。第２螺旋は、Ａｐｌｙｓｉａアトラクチンに保存されるＩＥＥＣＫＴＳ配列を含む。５の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−６  ２−５  ３−４．図９０参照。
【０５３５】
【化８８】
2009509535.tif 000086
ＰＦ０３９１３：ＡＭＢＶタンパク
Ａｍｂ  Ｖは、Ａｍｂｒｏｓｉａ  ｓｐ（ブタクサ）タンパクである。Ａｍｂ  Ｖは、主要なＴ細胞エピトープとしてＣ−末端螺旋を含むことが示されている。遊離スルフヒドリル基も、これらの関連アレルゲンにおける交差反応性Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞の認識において大きな役割を果たしている。
【０５３６】
３の既知のファミリーメンバーがある。空間配置は１−７  ２−５  ３−６  ４−８．図９２参照。
【０５３７】
【化８９】
2009509535.tif 000087
付録Ｂ：二重モチーフを含むＨＤＤドメイン
ＰＦ０１４３７：プレキシンＰＳＩ
システイン富裕反復列が、いくつかの異なる細胞外受容体に認められている（Ｊ．Ｓｔａｍｏｓ，ら、（２００４）Ｅｍｂｏ  Ｊ，２３：２３２５−３５；Ｊ．Ｐ．Ｘｉｏｎｇ，ら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９：４０２５２−４）。反復列の機能は未知である。プレキシンには反復列の三つのコピーが認められる。反復列の２コピーは、マホガニータンパクの中に認められる。関連のＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパクは、反復列の４コピーを含む。Ｍｅｔ受容体は、反復列の単一コピーを含む。Ｐｆａｍ整列によって、６個の高度に保存されるシステイン残基が示された。これらは、三つの保存されたジスルフィド架橋を形成するようであるが、一方、さらに二つのシステインが、位置５および７にも観察され、これらもジスルフィド結合に関与しているようである。空間配置は１−４＿２−８＿３−６＿５−７（構造１ｓｈｙ）。セマフォリン（構造１ｏｌｚ）は、空間配置１−４＿２−６＿３−５を持つ、僅かに三つのジスルフィド結合しか含まない。図９３参照。
【０５３８】
【化９０】
2009509535.tif 000088
Ｃｙｓ７およびＣｙｓ８の間のループは、挿入に対し極めて寛容である。例えば、インテグリンのベータサブユニット構造では、ハイブリッドドメインが、これらのシステインの間に挿入される（Ｊ．Ｐ．Ｘｉｏｎｇ，ら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９：４０２５２−４）が、Ｃｙｓ８は、依然としてＣｙｓ２とジスルフィド結合を形成する。これを利用して、Ｃｙｓ７の後に任意の配列を挿入することが可能である。
【０５３９】
設計：ＣｘｘｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）（“ａｎｙｓｅｑｕｅｎｃｅ”）Ｃ
これは、複数プレキシンを創製するのに使用することが可能である。
【０５４０】
第１挿入：ＣｘｘｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）（“ＰＬＥＸ”）Ｃ。式中、ＰＬＥＸは、ＣｘｘｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘＣに対応する。
【０５４１】
第２挿入：
ＣｘｘｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）（“ＰＬＥＸＩＮ”（“ＰＬＥＸＩＮ”））Ｃ。式中、（“ＰＬＥＸＩＮ”（“ＰＬＥＸＩＮ”））は、Ｃｙｓ７の後、“ＰＬＥＸ”、および、挿入プレキシン配列の中に、複数の、その後の挿入のＣｙｓ７の後、ＣｘｘｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）（“ＰＬＥＸ”）Ｃへの、ＣｘｘｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘＣｘｘＣｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘＣｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘＣの挿入に対応する。
【０５４２】
ＰＦ０００８８：トレフォイルおよび大型トレフォイル
いくつかの真核細胞細胞外タンパクにおいて、約４５アミノ酸残基から成るシステイン富裕モジュールが認められている（Ｍ．Ｄ．Ｃａｒｒ  ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：２２０６−１０；Ｔ．Ｙａｍａｚａｋｉ，ら、（２００３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２７０：１２６９−７６）。ヒトのＴＦＦ３は、大腸菌の周辺ゾルにおいて高濃度に発現される（１５ｍｇ／ｌ培養体）。このモジュールは、４５アミノ酸当たり３ジスルフィド結合を有する、高いジスルフィド密度を示し、空間配置は１−５  ２−４  ３−６である。大型トレフォイルは、もう一つのジスルフィド結合によって連結される二つの隣接モジュールから成り、接続性は、１−１４  ２−６  ３−５  ４−７  ８−１２  ９−１１  １０−１３である。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０未満であり、したがってライブラリー設計には有用である。システイン位置は、このファミリーの異なるメンバーの間で高度に保存される。図９４−９５参照。
【０５４３】
【化９１】
2009509535.tif 000089
二つの隣接モジュール、および余分の１−１４ジスルフィド連結を有する大型トレフォイル変異種の式は：
【０５４４】
【化９２】
2009509535.tif 000090
および誘導体。
【０５４５】
図１３４は、トレフォイルモチーフから創製することが可能な、反復性「ポリ・トレフォイル」構造を示す。
【０５４６】
ＰＦ０００９０：トロンボスポンジン１
このモジュールは、トロンボスポンジンタンパクの中に存在し、該タンパクの、補体経路に関与するいくつかのタンパク、および細胞外基質タンパクにおいて３回反復される。これは、細胞−細胞相互作用、血管形成およびアポトーシスの抑制に関与することが示されている（Ｐ．Ｂｏｒｋ（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，３２７：１２５−３０）。図９６参照。
【０５４７】
このドメインは、約５０アミノ酸当たり３ジスルフィド結合を有する、高いジスルフィド密度を示し、空間配置は１−５＿２−６＿３−４である（Ｔ．Ｍ．Ｍｉｓｅｎｈｅｉｍｅｒ，ら、（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０未満であり、したがってライブラリー設計には有用である。システイン位置は、このファミリーの異なるメンバーの間で保存される。
【０５４８】
【化９３】
2009509535.tif 000091
ＰＦ００２２８：ボウマン・バーク阻害剤
ボウマン・バーク阻害剤ファミリーは、数多くの、セリンプロテイナーゼ阻害剤ファミリーの一つである。これらは、二重構造を持ち、一般に、二つの、異なる抑制部位を有する。これら阻害剤は、主に、植物、特に、豆類の種子および穀粒に認められる（Ｒ．Ｆ．Ｑｉ，ら、（２００５）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ），３７：２８３−９２）。
【０５４９】
二つの異なるクラスがある。１）１４システインおよび空間配置１−１４  ２−６  ３−１３  ４−５  ７−９  ８−１２  １０−１１を有するドメイン、または、１０システインおよび空間配置１−１０  ２−５  ３−４  ６−８  ７−９を有するドメイン。これらのサブファミリーのために、式におけるＣｙｓ位置は十分に保存されているようには見えないが、各サブファミリーについては保存されている。
【０５５０】
このドメインは、約５０アミノ酸当たり５から７ジスルフィド結合を有する、高いジスルフィド密度を示す。個々のシステイン間のシステイン間隔は１０未満であり、したがってライブラリー設計には有用である。システイン位置は、このファミリーの異なるメンバーの間で保存される。図９７−９８参照。
【０５５１】
ＰＦ００１８４：神経下垂体ホルモン、Ｃ−末端ドメイン
ノナペプチドホルモンであるバソプレッシン、およびオキシトシンは、ニューロフィジンとも呼ばれるジスルフィド富裕タンパククラスと１：１比で複合体を形成する神経分泌性顆粒に高濃度で見出される。二つの緊密に関連するＮＰクラスが特定されており、一つはバソプレッシンと、他方はオキシトシンと複合体を形成する（Ｌ．Ｑ．Ｃｈｅｎ，ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：４２４０−４）。このファミリーには７５メンバーがあり、システイン位置は高度に保存される。式では、システイン富裕モジュールが二重化される。図９９参照。
【０５５２】
両モジュールとも相同のジスルフィド空間配置を有する。一ジスルフィドは、Ｃｙｓ１およびＣｙｓ８によって二つのモジュールを接続する。このジスルフィド結合を無視すると、各モジュールのジスルフィド空間配置は、１−３  ２−６  ４−５である。図１００参照。
【０５５３】
ニューロフィジンの結晶構造から、一モノマーは、それぞれ四つの逆平行ベータ鎖を有する、二つの相同の層から成ることが明らかにされた。この二つの領域は、螺旋とそれに続く長いループによって接続される。モノマー−モノマー接触は、逆平行ベータ・シート相互作用を含み、これは、８枚のベータ・シートから成る２層を有する二量体を形成する。
【０５５４】
ＰＦ００２００：拡張可能二量体ジスインテグリン
ジスインテグリンは、全てジスルフィド結合に関与するたくさんのシステインを含む、約５０−８０のアミノ酸残基から成るペプチドである。ジスインテグリンは、多くの接着タンパクの認識部位である、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含む。ジスインテグリンのＲＧＤ配列は、糖タンパクＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体と相互作用を持つと考えられている。
【０５５５】
ジスインテグリンは、長さとシステイン含量にしたがって分類される（Ｊ．Ｊ．Ｃａｌｖｅｔｅ，ら、（２００５）Ｔｏｘｉｃｏｎ，４５：１０６３−７４）。
【０５５６】
短小：ＣｘｘｘｘＣＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘ）ＣｘｘｘｘＣｘＣ、４ＳＳおよびジスルフィド空間配置１−４  ２−６  ３−７  ５−８。
【０５５７】
中間：ｘＣｘｘｘｘｘｘＣＣｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣｘ（ｘｘｘ）ｘｘｘＣＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘＣ
６ＳＳおよびジスルフィド空間配置１−５、２−４、３−８、６−８、７−１１、１０−１２。
【０５５８】
長大：
ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘＣｘｘｘｘＣｘｘｘＣＣｘｘｘｘＣｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣｘ（ｘｘｘ）ｘｘｘＣＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘＣ、７ＳＳおよびジスルフィド空間配置１−４、２−７、３−６、５−１１、８−１０、９−１３、１２−１４。
【０５５９】
二量体：ＣＣｘｘｘｘＣｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣｘ（ｘｘｘ）ｘｘｘＣＣｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣｘｘｘｘｘｘＣ、４ＳＳ、およびジスルフィド空間配置１−７、４−６、５−１０、８−１０、および、Ｃｙｓ２およびＣｙｓ３を含む、二つの分子間ＳＳが、二量体インテグリンを生成する。図１０１および１５７参照。ジスルフィド結合の欠失／付加によって特徴づけられる、これらの異なる群の間の進化的関係が認められた。したがって、このモチーフは、インビトロ進化の際、延長することが可能である。
【０５６０】
付録Ｃ：高度に反復されるモチーフを有するスカフォールド
システイン富裕反復性タンパク（ＣＲＲＰ）
ＰＦ００３９６：グラニュリン
グラニュリンは、複数の生物学的活性を持つと考えられる、約６Ｋｄのシステイン富裕ペプチドである（Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，ら、（１９９８）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１５８：１４５−５１）。前駆体タンパク（アクログラニンと呼ばれる、配列については後記参照）は、七つの異なるグラニュリン形（ｇｒｎＡからｇｒｎＣ）をコードすると予想され、これらは、翻訳後のタンパク分解処理によって放出されると考えられる。グラニュリンは、移動イナゴの脳間部から抽出されるペプチドである、ＰＭＰ−Ｄ１と進化的に関連する。図１０３参照。グラニュリン間隔：
【０５６１】
【化９４】
2009509535.tif 000092
サイズを拡張するための設計（キャッピングモチーフには下線を施し、１反復列はイタリック体、１反復列はゴシック体）
【０５６２】
【化９５】
2009509535.tif 000093
捩れを導入するための設計
【０５６３】
【化９６】
2009509535.tif 000094
天然の８−６−５−５パターン、またはより規則的な５−５−５−５パターンを使用することも可能である。構造はベータシートであるので、一つの方法は、良好なベータシート形成材料であるアミノ酸を積極的に選び、ベータシート形成材料でないアミノ酸を回避することである。下記のアミノ酸は好ましく、混合コドンによって得ることが可能である。バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびトレオニン。
【０５６４】
５ＡＡランダム配列を取ることを設計する。
【０５６５】
【化９７】
2009509535.tif 000095
最小スタータータンパクは二つのエンドキャップしか持っていない。
Ｃ６Ｃ５Ｃ５Ｃ（１７ランダムＡＡ）
最小単位増加を加える。
【０５６６】
【化９８】
2009509535.tif 000096
加工工程：ライブラリー作製、水平延長、ランダム化５ＣＣ５単位の付加、水平延長、５ＣＣ５単位の付加など。
【０５６７】
ＰＦ０２４２０：抗凍結タンパク
抗凍結タンパクは、ベータ螺旋構造を形成する、８ｋＤａタンパクである（Ｍ．Ｅ．Ｄａｌｅｙ，ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：５５１５−２５）。Ｎ−末端キャッピングモチーフは、ミクロタンパクドメインおよび１−３  ２−５  ４−６空間配置によって形成される。ジスルフィド結合１−２を有する２Ｃ５Ｃ３の反復単位が、このモチーフに付加される。トレオニンは、氷結合に関与するので保存されるが、設計のためには省略してよい。セリンおよびアラニンは、小さな側鎖のみが螺旋の内部に適合するので保存される。疎水性コアの完全な欠失は注目すべきことである。図１０４は、いくつかの抗凍結由来反復性タンパクである。図１０４は、いくつかのモチーフを示す。図１２７参照。
【０５６８】
天然配列：
【０５６９】
【化９９】
2009509535.tif 000097
反復列は、このように示すと多少明確になる。
【０５７０】
【化１００】
2009509535.tif 000098
様々な設計（キャッピングドメインは下線；反復はイタリック体）
【０５７１】
【化１０１】
2009509535.tif 000099
ＰＦ００７５７：フリン様ドメイン
フリン様システイン富裕領域は、真核細胞由来の各種タンパク、受容体凝集に与る、受容体チロシンキナーゼによるシグナル変換の機構に関与するタンパクに認められている。図１０５参照。
【０５７２】
式のサブセットは折りたたまれてラセン状の反復列を形成し、ライブラリ設計：
【０５７３】
【化１０２】
2009509535.tif 000100
のためのスカフォールドとして使用される。このモチーフの空間配置は、１−３＿２−４＿５−７＿６−８である。このファミリーのメンバーは、そのシステイン位置および間隔に高度の保守性を示す。この反復列は、
【０５７４】
【化１０３】
2009509535.tif 000101
を、前記モチーフのＣ−末端に付加することによって延長させることが可能である。
【０５７５】
ＰＦ０３１２８：ＣｘＣｘＣｘ
この反復列は、Ｘが任意のアミノ酸である、保存パターンＣＸＣＸＣを含む。この反復列は、血管内皮細胞増殖因子Ｃにおいて最大５コピー認められる。双翅類Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｔｕｓの唾液腺では、特定のメッセンジャーリボ核タンパク（ｍＲＮＰ）粒子、Ｂａｌｂｉａｎｉリング（ＢＲ）顆粒が、遺伝子にたいするその集合時、および、核・原形質輸送の際に、視認される。この反復列は、その７０を超えるコピーが、ｂａｌｂｉａｎｉリングのタンパク３（下記参照）の中に認められる。反復列はまた、いくつかの絹タンパクにも認められる。
【０５７６】
ＣＸＣＸＣ反復列は、内部ではジスルフィド結合を形成せず、したがって、ループは、三つのアミノ酸にまたがるだけであり、データベースのどのミクロタンパクも、３のシステインスパンを持たない。図１０９に示すように、ＣｘＣｘＣｘモチーフのシステインは、ジスルフィドが反復列の異なるコピーを連結する、真の反復列の形成に与る。通常、ＣｘＣｘＣｘ反復列の間にはただ一つのシステインしか認められない（式では保存されるが、位置は変動する可能性がある）。図１０６、１０７、１０８参照。
【０５７７】
実際：
【０５７８】
【化１０４】
2009509535.tif 000102
抽出、開始と終末：
【０５７９】
【化１０５】
2009509535.tif 000103
ジスルフィド結合構造のモデルを図１０９に示す。
【０５８０】
ＰＦ０５４４４：ＤＵＦ７５３
ショウジョウバエにおいて機能未知のいくつかのドメインで反復される配列。
【０５８１】
図１１０．
ＰＦ０１５０８：パラメシウム
前述の反復列の３７コピーを含む表面抗原。構造的役割が示唆される。二次構造予測から、アルファヘリックスの欠如、およびベータ・シート構造の存在が示唆された（これをどのように行ったのかは分からない、ジスルフィドの存在は、予測を妨げる可能性がある）。図１１１−１１２参照。
【０５８２】
ＰＦ００５２６：ジクティー
いくつかのＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ（タマホコリカビ）種は、保存反復列を含むタンパクを有する。これらのタンパクは、細胞外基質タンパクＢ、環状ヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ阻害剤前駆体、前柄タンパク前駆体、カルモジュリン結合タンパク候補ＣａｍＢＰ６４、システイン富裕、酸性統合膜タンパク前駆体、および、仮定的タンパクなど様々に記載されている。図１１３参照。
【０５８３】
ＰＦ０３８６０：ＤＵＦ３２６
このファミリーは、小型のシステイン富裕反復列である。システインは、多くの場合、ＣｘｘＣｘｘｘＣｘｘＣｘｘｘＣｘｘＣパターンに従う。もっともシステインは、しばしば、反復列の他の位置にも現れる。図１１４参照。
【０５８４】
ＰＦ０２３６３：システイン富裕反復列
このシステイン反復列ＣｘｘｘＣｘｘｘＣｘｘｘＣは、このファミリーの配列の中で、Ｏ１７９７０＿ＣＡＥＥＬでは３４回繰り返される。この反復列の機能は、それらの出現するタンパクの機能と同様、不明である。このファミリーの配列の多くは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（線虫）由来である。
【０５８５】
図１１５−１１６参照。
【０５８６】
【化１０６】
2009509535.tif 000104
【０５８７】
【化１０７】
2009509535.tif 000105
【０５８８】
【化１０８】
2009509535.tif 000106
【０５８９】
【化１０９】
2009509535.tif 000107
【図面の簡単な説明】
【０５９０】
【図１】図１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１のモチーフ：
【化１１０】
2009509535.tif 000108
【図２】図２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２のモチーフ：
【化１１１】
2009509535.tif 000109
【図３】図３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３のモチーフ：
【化１１２】
2009509535.tif 000110
【図４】図４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４のモチーフ：
【化１１３】
2009509535.tif 000111
【図５】図５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５のモチーフ：
【化１１４】
2009509535.tif 000112
【図６】図６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６のモチーフ：
【化１１５】
2009509535.tif 000113
【図７】図７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７のモチーフ：
【化１１６】
2009509535.tif 000114
【図８】図８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８のモチーフ：
【化１１７】
2009509535.tif 000115
【図９】図９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９のモチーフ：
【化１１８】
2009509535.tif 000116
【図１０】図１０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１０のモチーフ：
【化１１９】
2009509535.tif 000117
【図１１】図１１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。
【化１２０】
2009509535.tif 000118
【図１２】図１２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１１のモチーフ：
【化１２１】
2009509535.tif 000119
【図１３】図１３は、タンパクにおけるアミノ酸の出現プロフィールを示す。
【図１４】図１４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２のモチーフ：
【化１２２】
2009509535.tif 000120
【図１５】図１５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３のモチーフ：
【化１２３】
2009509535.tif 000121
【図１６】図１６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４のモチーフ：
【化１２４】
2009509535.tif 000122
【図１７】図１７は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図１８】図１８は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図１９】図１９は、は、各種無脊椎動物および植物タンパク間における配列整列を示す。
【図２０】図２０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２０のモチーフ：
【化１２５】
2009509535.tif 000123
【図２１】図２１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２１のモチーフ：
【化１２６】
2009509535.tif 000124
【図２２】図２２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２２のモチーフ：
【化１２７】
2009509535.tif 000125
【図２３】図２３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２３のモチーフ：
【化１２８】
2009509535.tif 000126
【図２４】図２４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２４のモチーフ：
【化１２９】
2009509535.tif 000127
【図２５】図２５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２５のモチーフ：
【化１３０】
2009509535.tif 000128
【図２６】図２６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２６のモチーフ：
【化１３１】
2009509535.tif 000129
【図２７】図２７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２７のモチーフ：
【化１３２】
2009509535.tif 000130
【図２８】図２８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２８のモチーフ：
【化１３３】
2009509535.tif 000131
【図２９】図２９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図２９のモチーフ：
【化１３４】
2009509535.tif 000132
【図３０】図３０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３０のモチーフ：
【化１３５】
2009509535.tif 000133
【図３１】図３１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３１のモチーフ：
【化１３６】
2009509535.tif 000134
【図３２】図３２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３２のモチーフ：
【化１３７】
2009509535.tif 000135
【図３３】図３３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３３のモチーフ：
【化１３８】
2009509535.tif 000136
【図３４】図３４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３４のモチーフ：
【化１３９】
2009509535.tif 000137
【図３５】図３５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３５のモチーフ：
【化１４０】
2009509535.tif 000138
【図３６】図３６は、各種無脊椎動物および植物タンパク間における配列整列を示す。
【図３７】図３７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３７のモチーフ：
【化１４１】
2009509535.tif 000139
【図３８】図３８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３８のモチーフ：
【化１４２】
2009509535.tif 000140
【図３９】図３９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図３９のモチーフ：
【化１４３】
2009509535.tif 000141
【図４０】図４０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４０のモチーフ：
【化１４４】
2009509535.tif 000142
【図４１】図４１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４１のモチーフ：
【化１４５】
2009509535.tif 000143
【図４２】図４２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４２のモチーフ：
【化１４６】
2009509535.tif 000144
【図４３】図４３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４３のモチーフ：
【化１４７】
2009509535.tif 000145
【図４４】図４４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４４のモチーフ：
【化１４８】
2009509535.tif 000146
【図４５】図４５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４５のモチーフ：
【化１４９】
2009509535.tif 000147
【図４６】図４６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４６のモチーフ：
【化１５０】
2009509535.tif 000148
【図４７】図４７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４７のモチーフ：
【化１５１】
2009509535.tif 000149
【図４８】図４８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４８のモチーフ：
【化１５２】
2009509535.tif 000150
【図４９】図４９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図４９のモチーフ：
【化１５３】
2009509535.tif 000151
【図５０】図５０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５０のモチーフ：
【化１５４】
2009509535.tif 000152
【図５１】図５１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５１のモチーフ：
【化１５５】
2009509535.tif 000153
【図５２】図５２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５２のモチーフ：
【化１５６】
2009509535.tif 000154
【図５３】図５３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５３のモチーフ：
【化１５７】
2009509535.tif 000155
【図５４】図５４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５４のモチーフ：
【化１５８】
2009509535.tif 000156
【図５５】図５５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５５のモチーフ：
【化１５９】
2009509535.tif 000157
【図５６】図５６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５６のモチーフ：
【化１６０】
2009509535.tif 000158
【図５７】図５７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５７のモチーフ：
【化１６１】
2009509535.tif 000159
【図５８】図５８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５８のモチーフ：
【化１６２】
2009509535.tif 000160
【図５９】図５９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図５９のモチーフ：
【化１６３】
2009509535.tif 000161
【図６０】図６０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６０のモチーフ：
【化１６４】
2009509535.tif 000162
【図６１】図６１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６１のモチーフ：
【化１６５】
2009509535.tif 000163
【図６２】図６２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６２のモチーフ：
【化１６６】
2009509535.tif 000164
【図６３】図６３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６３のモチーフ：
【化１６７】
2009509535.tif 000165
【図６４】図６４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６４のモチーフ：
【化１６８】
2009509535.tif 000166
【図６５】図６５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６５のモチーフ：
【化１６９】
2009509535.tif 000167
【図６６】図６６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６６のモチーフ：
【化１７０】
2009509535.tif 000168
【図６７】図６７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６７のモチーフ：
【化１７１】
2009509535.tif 000169
【図６８】図６８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６８のモチーフ：
【化１７２】
2009509535.tif 000170
【図６９】図６９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図６９のモチーフ：
【化１７３】
2009509535.tif 000171
【図７０】図７０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７０のモチーフ：
【化１７４】
2009509535.tif 000172
【図７１】図７１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７１のモチーフ：
【化１７５】
2009509535.tif 000173
【図７２】図７２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７２のモチーフ：
【化１７６】
2009509535.tif 000174
【図７３】図７３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７３のモチーフ：
【化１７７】
2009509535.tif 000175
【図７４】図７４は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図７５】図７５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７５のモチーフ：
【化１７８】
2009509535.tif 000176
【図７６】図７６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７６のモチーフ：
【化１７９】
2009509535.tif 000177
【図７７】図７７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７７のモチーフ：
【化１８０】
2009509535.tif 000178
【図７８】図７８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７８のモチーフ：
【化１８１】
2009509535.tif 000179
【図７９】図７９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図７９のモチーフ：
【化１８２】
2009509535.tif 000180
【図８０】図８０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８０のモチーフ：
【化１８３】
2009509535.tif 000181
【図８１】図８１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８１のモチーフ：
【化１８４】
2009509535.tif 000182
【図８２】図８２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８２のモチーフ：
【化１８５】
2009509535.tif 000183
【図８３】図８３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８３のモチーフ：
【化１８６】
2009509535.tif 000184
【図８４】図８４は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図８５】図８５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８５のモチーフ：
【化１８７】
2009509535.tif 000185
【図８６】図８６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８６のモチーフ：
【化１８８】
2009509535.tif 000186
【図８７】図８７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８７のモチーフ：
【化１８９】
2009509535.tif 000187
【図８８】図８８は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８８のモチーフ：
【化１９０】
2009509535.tif 000188
【図８９】図８９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図８９のモチーフ：
【化１９１】
2009509535.tif 000189
【図９０】図９０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９０のモチーフ：
【化１９２】
2009509535.tif 000190
【図９１】図９１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９１のモチーフ：
【化１９３】
2009509535.tif 000191
【図９２】図９２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９２のモチーフ：
【化１９４】
2009509535.tif 000192
【図９３】図９３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９３のモチーフ：
【化１９５】
2009509535.tif 000193
【図９４】図９４は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図９５】図９５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９５のモチーフ：
【化１９６】
2009509535.tif 000194
【図９６】図９６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９６のモチーフ：
【化１９７】
2009509535.tif 000195
【図９７】図９７は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９７のモチーフ：
【化１９８】
2009509535.tif 000196
【図９８】図９８は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図９９】図９９は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図９９のモチーフ：
【化１９９】
2009509535.tif 000197
【図１００】図１００は、例示配列の一次および二次構造を示す。
【図１０１】図１０１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１０１のモチーフ：
【化２００】
2009509535.tif 000198
【図１０２】図１０２は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１０２のモチーフ：
【化２０１】
2009509535.tif 000199
【図１０３】図１０３は、グラニュリンの配列および三次構造を示す。
【図１０４】図１０４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１０４のモチーフ：
【化２０２】
2009509535.tif 000200
【図１０５】図１０５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１０５のモチーフ：
【化２０３】
2009509535.tif 000201
【図１０６】図１０６は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１０６のモチーフ：
【化２０４】
2009509535.tif 000202
【図１０７】図１０７は、ＣＸＣモチーフ反復列を示す。
【図１０８】図１０８は、ＶＥＧＦのＣ末端ドメインおよびバルビアニ環分泌タンパクの配列を示す。
【図１０９】図１０９は、システイン含有反復列の予想構造を示す。
【図１１０】図１１０は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１１０のモチーフ：
【化２０５】
2009509535.tif 000203
【図１１１】図１１１は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１１１のモチーフ：
【化２０６】
2009509535.tif 000204
【図１１２】図１１２は、例示のシステイン含有反復タンパクの配列を示す。
【図１１３】図１１３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１１３のモチーフ：
【化２０７】
2009509535.tif 000205
【図１１４】図１１４は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１１４のモチーフ：
【化２０８】
2009509535.tif 000206
【図１１５】図１１５は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。
【化２０９】
2009509535.tif 000207
【図１１６】図１１６は、例示のシステイン含有反復タンパクの配列を示す。
【図１１７】図１１７は、例示の抗凍結タンパクの構造を示す。
【図１１８】図１１８は、エラブトキシンの構造を示す。
【図１１９】図１１９は、プレキシンの構造を示す。
【図１２０】図１２０は、プレキシンの配列を示す。
【図１２１】図１２１は、ソマトメチンの構造を示す。
【図１２２】図１２２は、分子量に従って発現ミクロタンパクを分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１２３】図１２３は、遺伝子パッケージの中に含まれる各種スカフォールドおよびモチーフを示す。図１２３のモチーフ：
【化２１０】
2009509535.tif 000208
【図１２４】図１２４は、システイン富裕反復タンパクのアフィニティー熟成過程スキームを示す。
【図１２５】図１２５は、グラニュリン反復性タンパクの構造を示す。
【図１２６】図１２６は、ランダム化のためのスキームを示す。
【図１２７】図１２７は、抗凍結タンパク由来反復タンパクの構造および配列を示す。
【図１２８】図１２８は、螺旋状反復性タンパクスカフォールドを示す。
【図１２９】図１２９は、反復性タンパクのアフィニティー熟成過程のスキームを示す。
【図１３０】図１３０は、システイン含有反復性タンパクの命名法を示す。
【図１３１】図１３１は、システイン含有反復性タンパクの命名法を示す。
【図１３２】図１３２は、システイン含有反復性タンパクの命名法を示す。
【図１３３】図１３３は、Ａ−ドメイン由来の反復性タンパクを示す。
【図１３４】図１３４は、ポリ・トレフォイルスカフォールドを示す。
【図１３５】図１３５は、マルチ・プレキシンスカフォールドを示す。
【図１３６】図１３６は、ミニコラーゲンスカフォールドを示す。
【図１３７】図１３７は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１３８】図１３８は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１３９】図１３９は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１４０】図１４０は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１４１】図１４１は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１４２】図１４２は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１４３】図１４３は、プラスミドサイクリングおよびメガプライマーを示す。
【図１４４】図１４４は、疎水性プロットである。
【図１４５】図１４５は、低分子量システイン含有ドメインを拡大するための各種方法を示す。
【図１４６】図１４６は、抗凍結タンパクによる異なる構造体を接続する各種方法を示す。
【図１４７】図１４７は、抗凍結タンパクによる異なる構造体を接続する各種方法を示す。
【図１４８】図１４８は、ライブラリーを設計するための戦略を示す。
【図１４９】図１４９は、Ａ−ドメイン構造を示す。
【図１５０】図１５０は、ミクロタンパクの、標的誘発性フォールド形成の模式図である。
【図１５１】図１５１は、フォリスタチンドメインの構造組織および配列を示す。
【図１５２】図１５２は、システイン含有タンパクの構造多様性を示す。
【図１５３】図１５３は、システイン含有タンパクの構造多様性を示す。
【図１５４】図１５４は、ジスルフィドシャフリングによる構造進化、および、天然のシステイン含有タンパクの進化を示す。
【図１５５】図１５５は、ジスルフィドシャフリングによる構造進化、および、天然のシステイン含有タンパクの進化を示す。
【図１５６】図１５６は、５０８個のジスルフィド含有タンパクから成るファミリーを示す。
【図１５７】図１５７は、異なるインテグリン間の配列関係を示す。
【図１５８】図１５８は、各種産物フォーマットの比較を示す。
【図１５９】図１５９は、各種ミクロタンパク産物フォーマットを示す。
【図１６０】図１６０は、アフィニティー熟成過程の各種スキームを示す。
【図１６１】図１６１は、免疫原性を下げるための機序を示す。
【図１６２】図１６２は、大腸菌由来の各種スカフォールドの発現を示すゲルである。図１６２のモチーフ：
【化２１１】
2009509535.tif 000209
【図１６３】図１６３は、ＨＬＡ−結合の組み合わせ低下を示す。
【図１６４】図１６４は、各種ＴＮＦＲファミリー・ミクロタンパクの配列および構造を示す。
【図１６５】図１６５は、２−３−４積み上げ法を示す。
【図１６６】図１６６は、ヒトおよびミクロタンパクの、予測ＭＨＣＩＩ結合アフィニティーを示す。グラフは、五つの主要ＨＬＡ対立遺伝子について計算された各タンパクのスコアの分布を示す。赤色曲線：長さ中央値３７２ＡＡを持つ、全長２６，０００のヒトタンパク。青色曲線：ジスルフィドパターンのデータベース（２２）から採取した、少なくとも１０％のシステインで、偶数のシステインを有する、２５−９０ＡＡ（中央値３８ＡＡ）の１０，５２５のミクロタンパク。緑色曲線：ミクロタンパク・データベースのサイズ分布に適合する２６，０００個のヒトタンパク断片。各ヒトタンパク配列について、我々のミクロタンパク・データベースからランダムに選ばれたタンパクの長さに一致する断片をランダムに生成した。コーカソイド集団において高頻度に出現する５種類のＨＬＡ対立遺伝子、ＨＬＡ＊１０１、ＨＬＡ＊３０１、ＨＬＡ＊４０１、ＨＬＡ＊７０１、ＨＬＡ＊１５０１について、ＭＨＣＩＩ結合を分析した。ＴＥＰＩＴＯＰＥに基づくＭＨＣＩＩ結合基質を用いた。結合基質は、プログラムＰｒｏＰｒｅｄからダウンロードした。ＴＥＰＩＴＯＰＥ基質は、システイン残基に関するスコアを含まないので、代わりにアラニンスコアを用いた。各タンパクおよび各ＨＬＡ対立遺伝子について、ＴＥＰＩＴＯＰＥの最高スコアを特定した。各対立遺伝子のデータは、全てのヒトタンパクにおける最高スコアの平均を差し引くことによって正規化した。
【図１６７】図１６７の上段パネルは、ＭＨＣＩＩ結合に対するアミノ酸のアフィニティー寄与を示す。ＴＥＰＩＴＯＰＥ基質における全ての非疎水性残基のＰ１スコアは、そのＰ１スコアが平均スコアを支配できないように−９９９から−２に変えられた。アミノ酸は、各エピトープに対するその平均スコアに従ってランクづけされた。図は、５種のもっとも優勢なＨＬＡ対立遺伝子（＊１０１、＊３０１、＊４０１、＊７０１、＊１５０１）における平均ランクを示す。下段パネルは、ミクロタンパク対ヒトタンパクにおけるアミノ酸の相対量を示す。アミノ酸量は、図１６６に示す配列を用いて、ヒトタンパクおよびミクロタンパクについて計算した。データから、脂肪族疎水性残基Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌが、免疫原性に対しもっとも強力な寄与をすること、および、平均的ヒトタンパクと比べ、ミクロタンパクではもっとも出現頻度が低いことが示される。したがって、タンパクの免疫原性の低下は、高い方から低い方に向かって下記の順序で高得点アミノ酸の含量を下げることによって実現することが可能である：ＩＶＭＬＦＹＳＮＲＡＨＱＴＧＷＫＰＥＤ。
【図１６８】図１６８は、２−３−４積み上げ法のデモンストレーションとして、ファージクローンから発現されたＶＥＧＦミクロタンパクについてＥＬＩＳＡした結果を示す。
【図１６９】図１６９は、還元条件下におけるミクロタンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：ソマトメジン、レーン２：プレキシン、レーン３：トキシンＢ、レーン４：トマト・プロテアーゼ阻害剤、レーン５：蜘蛛トキシン、レーン６：アルカリフォスファターゼ・コントロール、レーン９：分子量マーカー
【図１７０】図１７０は、レドックス処理ライブラリー、および未処理ライブラリーの比較を示す。
【図１】
2009509535.tif 000212
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2009509535.tif 000222
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
2009509535.tif 000260
【図５０】
2009509535.tif 000261
【図５１】
2009509535.tif 000262
【図５２】
2009509535.tif 000263
【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
2009509535.tif 000270
【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
2009509535.tif 000281
【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
2009509535.tif 000288
【図７８】
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【図７９】
2009509535.tif 000290
【図８０】
2009509535.tif 000291
【図８１】
2009509535.tif 000292
【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
2009509535.tif 000300
【図９０】
2009509535.tif 000301
【図９１】
2009509535.tif 000302
【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
2009509535.tif 000310
【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
2009509535.tif 000314
【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
2009509535.tif 000317
【図１０７】
2009509535.tif 000318
【図１０８】
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【図１０９】
2009509535.tif 000320
【図１１０】
2009509535.tif 000321
【図１１１】
2009509535.tif 000322
【図１１２】
2009509535.tif 000323
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
2009509535.tif 000328
【図１１７】
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【図１１８】
2009509535.tif 000330
【図１１９】
2009509535.tif 000331
【図１２０】
2009509535.tif 000332
【図１２１】
2009509535.tif 000333
【図１２２】
2009509535.tif 000334
【図１２３】
2009509535.tif 000335
【図１２４】
2009509535.tif 000336
【図１２５】
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【図１２６】
2009509535.tif 000338
【図１２７】
2009509535.tif 000339
【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
2009509535.tif 000342
【図１３１】
2009509535.tif 000343
【図１３２】
2009509535.tif 000344
【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
2009509535.tif 000347
【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３８】
2009509535.tif 000350
【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４２】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
2009509535.tif 000362
【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
2009509535.tif 000372
【図１６１】
2009509535.tif 000373
【図１６２】
2009509535.tif 000374
【図１６３】
2009509535.tif 000375
【図１６４】
2009509535.tif 000376
【図１６５】
2009509535.tif 000377
【図１６６】
2009509535.tif 000378
【図１６７】
2009509535.tif 000379
【図１６８】
2009509535.tif 000380
【図１６９】
2009509535.tif 000381
【図１７０】
2009509535.tif 000382
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月8日(2008.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、標的分子に対し結合特異性を示す、非天然のシステイン（Ｃ）−含有スカフォールドを提供する。この実施態様において、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドは、式：
【数１】
2009509535.tif 000383
によって表される組み合わせの群から選ばれるパターンによるスカフォールド内システインを含む。式中、ｎは、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数に等しく、かつ、
【数２】
2009509535.tif 000384
は、（２ｉ−１）の積を表し、この式においてｉは、１からｎまでの範囲の正の整数である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ジスルフィド固有の特徴は、同じ一組のシステインが、原理的には、様々の別形のジスルフィド結合パターンとして連結することが可能であることである。なぜなら、ジスルフィドは組み合わせだからである。例えば、二つのジスルフィドタンパクは、３通りの異なるジスルフィド結合パターン（ＤＢＰ）を有し、三つのジスルフィドタンパクは、１５通りの異なるＤＢＰを有し、かつ、四つのジスルフィドタンパクは、最大１０５通りの異なるＤＢＰを有することが可能である。２ＳＳ  ＤＢＰの全て、３ＳＳ  ＤＢＰの大部分、および４ＳＳ  ＤＢＰの半分未満において天然例が存在する。一局面において、ジスルフィド結合パターンの全数は、式：
【数３】
2009509535.tif 000385
に従って計算することが可能である。式中、ｎ＝システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数であり、かつ、式中、
【数４】
2009509535.tif 000386
は、（２ｉ−１）の積を表す。この式においてｉは、１からｎまでの範囲の正の整数である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
したがって、一実施態様では、標的分子に対して結合特異性を示す、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドを提供する。この実施態様において、非天然システイン（Ｃ）−含有スカフォールドは、式：
【数５】
2009509535.tif 000387
によって表される組み合わせの群から選ばれるパターンによるスカフォールド内システインを含む。式中、ｎは、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数に等しく、かつ、式中、
【数６】
2009509535.tif 000388
は、（２ｉ−１）の積を表し、この式においてｉは、１からｎまでの範囲の正の整数である。一局面において、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−２，３−４、Ｃ１−３，２−４、およびＣ１−４，２−３から成る群から選ばれるパターンに従って、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成される二つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。別の局面では、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−２，３−４，５−６、Ｃ１−２，３−５、４−６、Ｃ１−２，３−６，４−５、Ｃ１−３，２−４、５−６、Ｃ１−３，２−５，４−６、Ｃ１−３，２−６、４−５、Ｃ１−４，２−３，５−６、Ｃ１−４，２−６、３−５、Ｃ１−５，２−３，４−６、Ｃ１−５，２−４、３−６、Ｃ１−５，２−６，３−４、Ｃ１−６，２−３、４−５、およびＣ１−６，２−５、３−４から成る群から選ばれるパターンに従って、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成される三つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。別の局面において、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、前述の式によって定義される組み合わせの群から選ばれるパターンに従って、ポリペプチドに含まれるシステインを対合させることによって形成される、少なくとも四つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む、標的分子に対して結合特異性を示すポリペプチド、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクを含む。さらに別の局面では、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−９、Ｃ１−１０、Ｃ２−９、Ｃ２−１０、Ｃ３−９、Ｃ３−１０、Ｃ４−９、Ｃ４−１０、Ｃ５−９、Ｃ５−１０、Ｃ６−９、Ｃ６−１０、Ｃ７−９、Ｃ７−１０、Ｃ８−９、Ｃ８−１０、およびＣ９−１０から成る群から選ばれるパターンに従って、タンパク内のシステインを対合させることによって形成される、少なくとも五つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。さらに別の局面では、標的分子に対し結合特異性を示す、非天然システイン（Ｃ）−含有タンパクは、Ｃ１−１１、Ｃ１−１２、Ｃ２−１１、Ｃ２−１２、Ｃ３−１１、Ｃ３−１２、Ｃ４−１１、Ｃ４−１２、Ｃ５−１１、Ｃ５−１２、Ｃ６−１１、Ｃ６−１２、Ｃ７−１１、Ｃ７−１２、Ｃ８−１１、Ｃ８−１２、およびＣ９−１１、Ｃ９−１２、Ｃ１０−１１、Ｃ１０−１２、およびＣ１１−１２から成る群から選ばれるパターンに従って、タンパク内のシステインを対合させることによって形成される、少なくとも六つのジスルフィド結合を有するポリペプチドを含む。前式において、ハイフンで連結される二つの数字は、ポリペプチドのＮ末端から数えて、どの二つのシステインがペア形成をしてジスルフィド結合を形成するかを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
【数７】
2009509535.tif 000389
式中、ｎ＝システイン残基によって形成されるジスルフィド結合の予測数であり、かつ、
【数８】
2009509535.tif 000390
は、（２ｉ−１）の積を表し、この式においてｉは、１からｎまでの正の整数である。