(57)【要約】  本発明の目的は、高感度で、迅速かつ低コストで実施でき、そして疾患の初期段階にプリオンの検出が可能な、病原性プリオンの検出方法を創出することである。上述の目的は、固定化捕獲抗体が、試料中に含まれる病態型及び非病態型のプリオン蛋白質に結合すると、結合した非病態型がプラスミンを用いて特異的に分割されるという事実によって達成される。固定化捕獲抗体によって結合された分割されない病態型のプリオン蛋白質は、その結果検出抗体の助けによって容易に検出可能となる。本発明方法は病原性プリオンの検出に使用される。
2009529130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の病原性プリオン蛋白質のインビトロでの検出方法であって、
ａ）プリオン蛋白質の病態型（ＰｒＰSc）並びに非病態型（ＰｒＰC）の両者を認識する捕獲抗体を固相に固定化し；
ｂ）試料を工程ａ）の固定化抗体とインキュベートして、固定化抗体に結合した病態型及び非病態型のプリオン蛋白質がそれにより複合体を形成し；
ｃ）試料を生成した複合体から分離し；
ｄ）複合体をプラスミンとインキュベートし、それにより非病態型のプリオン蛋白質を切断し；
ｅ）プラスミンとのインキュベーションを介して得られる切断断片を複合体から分離し；そして
ｆ）複合体に含まれる非切断プリオン蛋白質を検出抗体を用いて検出する；
上記方法。
【請求項２】
検出が工程ｆ）で定量的に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出抗体がプリオン蛋白質の病態型及び非病態型の両者を認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出抗体がアミノ酸残基の１〜１１０の領域外にあるエピトープに向けられる場合、捕獲抗体はアミノ酸残基の１〜１１０の領域に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられ、又は捕獲抗体がアミノ酸残基の１〜１１０の領域外にあるエピトープに向けられる場合、検出抗体はアミノ酸残基の１〜１１０の領域に位置するエピトープに向けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固相の自由結合部位が工程ａ）の後で遮断緩衝剤で飽和される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
固相がマイクロタイタープレート又は常磁性若しくは非磁性ビーズである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）におけるインキュベーション時間が約２時間以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）におけるインキュベーション時間が約３０分以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アプロチニンの添加が工程ｄ）においてプラスミンとのインキュベーションに続く、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
洗浄工程が個々の工程の間で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
検出抗体がビオチン、蛍光マーカ及び／又はナノビーズ、特にユウロピウムで標識したナノビーズを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｆ）での検出がＥＬＩＳＡ試験を用いて行なわれる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
試料中の病原性プリオンをインビトロで検出するための診断キットであって、
ａ）プリオン蛋白質の病態型（ＰｒＰSc）及び非病態型（ＰｒＰC）の両者に向けられる捕獲抗体；
ｂ）プラスミン；及び
ｃ）検出抗体；
を含むキット。
【請求項１４】
捕獲抗体が固相に既に固定されている、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１５】
固相がマイクロタイタープレート又はビーズである、請求項１４に記載の診断キット。
【請求項１６】
検出抗体が病態型及び非病態型のプリオン蛋白質を認識する、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１７】
固相の自由結合部位を飽和するための遮断緩衝剤、洗浄緩衝剤及び／又はアプロチニンを更に含む、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１８】
プラスミンが緩衝液中に溶解して又は凍結乾燥されて固体として存在する、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１９】
検出抗体がアミノ酸残基の１〜１１０の領域外にあるエピトープに向けられる場合、捕獲抗体はアミノ酸残基の１〜１１０の領域に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられ、又は捕獲抗体がアミノ酸残基の１〜１１０の領域外にあるエピトープに向けられる場合、検出抗体はアミノ酸残基の１〜１１０の領域に位置するエピトープに向けられる、請求項１３に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の病原性プリオン類のインビトロでの検出方法、及び本方法を実施するための診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）すなわちプリオン病は脳変性疾患であり、脳における特徴的な海綿状組織変化を伴い、常に致命的な転帰をたどる。Prusiner理論(Science 1982, 216:136−144)によれば、これらの疾患の病因は検出可能な核酸のない感染性蛋白質のプリオン（「蛋白質性感染因子」）である。これは天然蛋白質の異常折り畳み型（ＰｒＰSc、Ｓｃ：「スクレイピー」）である、細胞内プリオン蛋白質（ＰｒＰC）に関係している。この病原体の増殖は、プリオン蛋白質の正常構造の異常折り畳み型への変換を介して行なわれ、その発現は感染又は疾患に関与している。この仮説に一致して、プリオン蛋白質を欠くマウス株は実験的に感染することができない。その結果として、ＴＳＥの病原体も、またしばしばプリオンと呼ばれ、これらの症候群の総体的部類はプリオン病として一緒にグループ分けされる。
【０００３】
海綿状脳症はヒトを含む多くの哺乳類で起こる。ヒトの場合には、これがクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、クールー病及び変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）となる。ヒツジのスクレイピーが最も古くから知られている。１９８４年以来、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、及び１９９６年以来、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病が記録されている。以来１８０,０００頭以上のウシが牛海綿状脳症（ＢＳＥ）に罹患し、英国や他のＥＵ諸国で屠殺された。ドイツでは２９０頭以上のＢＳＥが発見されている。
【０００４】
１９９３年に初めて、２名の英国の若い農夫が異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）に罹患し、これがＣＪＤの新しい変異型（ｖＣＪＤ）として１９９６年に記載された。今日まで１００人以上の英国人が本疾患に罹患した。現在、これがヒトのＢＳＥに関与することは間違いないと想定することができる。
【０００５】
致死的な転帰、ヒトへの伝染性、長期インキュベーション時間、及び治療法のないことを考慮すると、伝染性海綿状脳症の診断が、非常に重要である。
【０００６】
これまで３種のＢＳＥ迅速検査がＥＵ認可を受けている(EUROPEAN COMMISSION (1999) DIRECTORATE−GENERAL XXIV CONSUMER POLICY AND CONSUMER HEALTH PROTECTION Directorate B − Scientific Health Opinions The Evaluation of Tests for the Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy in bovines www.eu−komission.de)：
・Prionics AG社（Zurich、スイス）により最初に開発されたPrionics Checkは、２００１年２月１日以来Roche Diagnosticsから世界中で販売されている。この試験はウェスタンブロット法に基づいており、検査時間は７から８時間である。
・Platelia（登録商標）ＢＳＥ検査は、Bio−Rad Laboratories社（米国）で市販されており、原子力委員会（フランス）と共同で開発された。これはＥＬＩＳＡに基づくもので、検査時間は４から７時間である。
・Enfer Technology社（アイルランド）によるEnfer TSEはＥＬＩＳＡの原理に基づくもので、検査時間は４時間である。
【０００７】
３種の検査は全てＰｒＰ27-30断片に対するプリオン特異的抗体を用いる。ＰｒＰC及びＰｒＰScを蛋白質分解酵素のプロテイナーゼＫで処理した場合、ＰｒＰCは完全に消化されるが、ＰｒＰScは構造類似性が無いために部分的にしか消化されない。プロテイナーゼＫ抵抗性のＰｒＰ27-30フラグメントは残り、次いでこれを検出する。プロテイナーゼＫによる消化は、長期処理後に病原性プリオンもほとんど完全に消化されるように、これらの試験における更なる作業工程、及び酵素の濃度及び作用時間の正確な制御を必要とする。消化は試料中で先ず起こり、その後プリオン類が特異的に検出されるので、この方法は感度を失う。１つの更なる一般的な特徴としては、これらの試験が死後にのみ実施でき、特に多くのＰｒＰSc分子が蓄積する脳幹の１ｇ未満の組織を必要とすることである。３種の試験全ての欠点は、不十分な感度である。本疾患は、明確な試験結果が得られるためには、ＢＳＥプリオン類の相当顕著な蓄積を伴う末期にならざるを得ない。従って、当局及び公的機関は、疑わしい場合又は診断を確定するために、組織病理や免疫組織化学などの他の方法を用いる。免疫−ＰＲＣ、特異的リガンド吸着及び蛍光相関分光法（ＦＣＳ）などの新技術が、試験感度を向上させるために研究されている。
【０００８】
別の方法として、コンホメーション依存性検定（コンホメーション依存性免疫学的検定−ＣＤＩ；Safar J. et al., Nature Medicine 1998, 4: 10, 1157−1165）は、ＰｒＰSc分子の特異的コンホメーションに基づいており、又より正確にはモノクローナル抗体３Ｆ４に対する部分的隠蔽結合部位に基づいている。生来及び変性（折り畳まれていないＰｒＰ分子）試料間の信号比率が病態型の検出に使用される。この方法は、また試料の更なる予備的処理を必要とし、そして相対的に多くの時間を要する。
【０００９】
別の系列の検出法では、病原性プリオン類を含む試料を濃縮する技術を用いる。この系列の1つの方法は、Soto (Serono社; Castilla J. et al. Nature Medicine Online Publication 28.08.2005)のＰＭＣＡ（蛋白質の誤って折り畳まれたサイクル増幅）法である。ここでは、その後の超音波処理で破壊されるＰｒＰSc凝集体を増加させるために、ＰｒＰScが過剰のＰｒＰC中でインキュベートされ、それによって新しい小型の凝集体が形成される。後者は、より新しいＰｒＰSc凝集体の形成の「マトリックス」の機能を果たす。
【００１０】
このサイクルは多数回反復される（１５０回まで）。ＰＭＣＡ法では、報告された感度が達成されるまでに７５時間が経過する。加えて、「マトリックス」としてハムスター脳組織が添加され、そして検査する動物の感染がどの段階であるかが不明確である。
【００１１】
セリンプロテアーゼプラスミン（好ましい切断部位Ｌｙｓ−Ｘａａ＞Ａｒｇ−Ｘａａ）は、フィブリンの可溶性産物への変換（線維素溶解）及び細胞外マトリックスの蛋白質分解（血漿誘導プロテオリシス）において重要な役割を担う普遍的な（ubiquitary）ザイモーゲン前駆体である、プラスミノーゲンから合成された酵素である。最近、プラスミンがインビトロでＰｒＰCを切断することができること、そしてＰｒＰC及びＰｒＰ分子のＮＨ2領域がｔ−ＰＡ（組織型プラスミノーゲン活性化因子）付与プラスミン形成を活性化できることが報告されている。また、プラスミンの一次切断部位がアミノ酸残基１０８〜１１２の領域のＰｒＰ分子上にあることも見出された。しかしながら、病態型（ＰｒＰSc）に対するプラスミンの活性に関して、それ以上の知見は得られていない。
【００１２】
従って、これまで、インキュベーション期間中、すなわち臨床的に発見可能な症状の発現前に、生きた動物又はヒトで明確な早期診断を行うことができる、日常的に使用可能な如何なる試験方法もないのが現状である。
【００１３】
従って、先行技術の前述の欠点を克服する、病原性プリオン類検出の迅速試験が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の課題は、高度の感度を示す、ほとんど時間を消費せず比較的低コストで、必要に応じて自動的に実施することができ、疾患の初期に病原性プリオン類を検出することができ、またプロテイナーゼＫ処理が省略できる、病原性プリオン類検出の試験法を提供することであった。
【００１５】
当業者に周知のこの課題及び他の課題は、以下に記載される本発明によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、プリオン蛋白質の病態型が、以下の方法により、高選択性でかつ相対的に低コストでインビトロにて試料中に検出できることが見出された。その方法は：
ａ）プリオン蛋白質の病態型（ＰｒＰSc）並びに非病態型（ＰｒＰC）の両者を認識する捕獲抗体を固相に固定化し；
ｂ）試料を工程ａ）の固定化抗体とインキュベートして、固定化抗体に結合した病態型及び非病態型のプリオン蛋白質がそれにより複合体を形成し；
ｃ）試料を生成した複合体から分離し；
ｄ）複合体をプラスミンとインキュベートし、それにより非病態型のプリオン蛋白質を切断し；
ｅ）プラスミンとのインキュベーションを介して得られる切断断片を複合体から分離し；そして
ｆ）複合体に含まれる非切断プリオン蛋白質を検出抗体を用いて検出する；
方法である。
【００１７】
非病態型のプリオン蛋白質は、プラスミンとの処理によって驚くほど切断されるが、病態型プリオン蛋白質は非消化の状態である。病態型はプリオン蛋白質の生理型と同じアミノ酸配列を有するが、その空間的構造はそれと異なる。プラスミンでの一次切断部位は、調べた種の全てにおいて、プリオン蛋白質のアミノ酸残基１０６から１２６の領域に位置することが見出されている。病態型の一次切断部位は部分的に不顕性であり、隠蔽されていて（「埋没コア」）、それ故プラスミンの酵素活性を明らかにすることは困難である。病態型の乏しい切断可能性に比べて、生理型の良好な切断可能性は、２つのプリオン型間を識別する本発明で開発された方法の主要原理である。
【００１８】
本発明によれば、病原性プリオン蛋白質類は本方法で検出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書で使用される記号は、以下を意味する。
ＰｒＰ：  例えば、プリオン蛋白質の構造特性について言及する場合の一般的なプリオン蛋白質；
ＰｒＰC：  プリオン蛋白質の細胞型、すなわち正常細胞に存在するその非病態型；及び
ＰｒＰSc：  プリオン蛋白質の病態型。
【００２０】
本方法で採取される試料は、原則として病態型のプリオン蛋白質を発現することが疑われるヒト又は動物のいずれかの対象に由来するものであり得る。試料は例えばヒト起源であっても、又は雌牛若しくはハムスター起源であってもよい。試料は、生体又は死体から採取できる。原理上、病態型のプリオン蛋白質を含む可能性のある被検体に由来する液体又は固体材料のいずれも、試料の出発材料として使用可能である。試料の典型的な出発材料は、血液試料、組織試料、又は尿、ミルク、脳脊髄液若しくは唾液のような体液であってよい。特に固体試料の場合、病態型のプリオン蛋白質が、本発明に記載の方法に適切な形態で存在するように、先ず出発材料を分解する必要がある。これらの分解方法は長年当業者に周知となっている。
【００２１】
捕獲抗体は、本発明に記載の方法において、先ず固相に固定化される。
【００２２】
捕獲抗体は、プリオン蛋白質の病態型（ＰｒＰSc）並びに非病態型（ＰｒＰC）の両者を認識し結合する性質を有する。捕獲抗体は、例えば、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。適切な捕獲抗体は標準法により自己生産するか、又は市販のものを入手することもできる。典型的な捕獲抗体は、抗ＰｒＰ抗体のＳＡＦ３２及びＳＡＦ６１である（Spi−Bio社、 Montigny le Bretonneux、フランス）。
【００２３】
固相としては、原理的に捕獲抗体を固定することができ、病態型のプリオン蛋白質の検出を妨害しない固体材料は全て使用可能である。固相としては、好ましくはマイクロタイタープレート又は磁性若しくは非磁性粒子が使用される。固相としてのマイクロタイタープレートの使用は、特に好ましい。
【００２４】
固相への捕獲抗体の固定は、当業者に周知の方法で行なうことができる。捕獲抗体は固相に直接結合することができる。例えば、捕獲抗体は固相に共有結合で結合することができる。他方では、捕獲抗体は固相の表面に吸着することもできる。このために、抗体は、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの底にピペットで加えられ、適切な時間（例えば、少なくとも１６時間）、適切な温度（例えば、４℃）でインキュベートされる。捕獲抗体は、また当業者に周知のビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系を用いて、固相で結合することも可能である。代わりに、捕獲抗体の固定は、また固相への捕獲抗体の結合をもたらす、架橋抗体を用いて行なうこともできる。しかしながら、捕獲抗体は固相に直接固定することが好ましい。
【００２５】
固定後、固相の自由結合部位は、その個々の成分を当業者が周知している適切な遮断緩衝剤で飽和することができる。適切な遮断緩衝剤は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの様な遮断試薬を用いた適切な緩衝系を含むことができる。
【００２６】
捕獲抗体を固相に固定後、試料とインキュベーションが行なわれる。それにより、固定化捕獲抗体へのプリオン蛋白質の病態型（ＰｒＰSc）並びに非病態型（ＰｒＰC）の結合が行なわれる。インキュベーションは、プリオン蛋白質の両型が捕獲抗体によって可能な限り定量的に結合するのに十分な時間にわたって行なわれる。インキュベーション時間は、好ましくは２時間以下である。
【００２７】
インキュベーション後、残りの試料は、固相、捕獲抗体及びプリオン蛋白質を含む生成複合体から分離される。マイクロタイタープレートを固相として用いた場合、試料の除去は、例えば、吸引によって行なうことができる。ビーズを固相として使用する場合、ビーズを含有する複合体は遠心によって、又は磁性ビーズの場合には磁力作用によって沈殿させることができ、そして上清に存在する試料は除去することができる。
【００２８】
固相、捕獲抗体及びプリオン蛋白質の両型を含む複合体は、次いでプラスミンと混合される。この工程の基礎を成すのは、プラスミンが複合体に含まれる非病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰC）を特異的に切断するが、一方で、やはり複合体に含まれる病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰSc）を切断しないという、明白かつ驚くべき原理である。非病態型のプリオン蛋白質の切断後、複合体は、固相、捕獲抗体及び無傷の消化されない病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰSc）、そして各々捕獲抗体によって結合した非病態型のプリオン蛋白質の切断断片を含む。捕獲抗体と結合しない非病態型のプリオン蛋白質の切断断片は、この工程において複合体から除去される。
【００２９】
ＰｒＰCの切断に使用されるプラスミンは、プリオン蛋白質の非病態型を特異的に切断するが、病態型は切断しない位置になければならないことを除いては、それ以上制限されない。上述のように、例えば、それは組換え又は天然のプラスミンであってよい。それは当業者に周知の方法、例えば、アクチベータ（例えば、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼ）でのプラスミノーゲンの活性化によって産生することができ、例えば、マトリックス結合され得る。それはヒトプラスミン又は他の種のプラスミンであっても良い。それによりプラスミンの本発明の活性が有害作用を受けることなしに、変異又は欠失をプラスミンのアミノ酸配列に導入することが可能なことも、当業者には明白である。この方法で改変されたプラスミンも、また本発明に含まれる。
【００３０】
非病態型のプリオン蛋白質の切断では、プラスミンは、好ましくは、例えば、ＰＢＳなどの生理的緩衝剤を含む溶液中に存在する。プラスミン濃度は、切断に供される時間間隔に対応して、複合体に含まれる非病態型のプリオン蛋白質の切断に十分なように選択される。プラスミンの濃度は、好ましくは１０ｎＭから２μＭに、より好ましくは２５ｎＭから１μｍに、そして更に好ましくは４０ｎＭから６０ｎＭになる。複合体とプラスミンとのインキュベーション時間は特に限定されない。しかしながら、インキュベーション時間は、好ましくは３０分以下となる。
【００３１】
好ましい実施態様において、非病態型のプリオン蛋白質の切断は、プラスミンの活性を阻害する適切な試薬の添加によって停止される。アプロチニンは、このために好ましく使用される。プラスミンの活性を阻害する試薬は、固体で又は好ましくは液体の形態で、そしてプラスミン活性の阻害に十分な濃度で添加される。アプロチニンの場合、好ましい濃度は４から６μＭになる。
【００３２】
捕獲抗体によって結合されないプラスミンとのインキュベーションで得られる非病態型のプリオン蛋白質の切断断片は、次いで固相、捕獲抗体及び病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰSc）を含む複合体から分離され、そして各々プラスミンによる切断で生成し、また捕獲抗体によって結合した非病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰC）の切断断片が分離される。分離の特性は、用いる検出システムに適合するもの、特に使用する固相に適合している。全ての場合、非結合ＰｒＰC切断断片は、単純に吸引によって除去することが望ましい。
【００３３】
複合体から非結合ＰｒＰC切断断片を分離した後、複合体に含まれる非切断プリオン蛋白質を検出抗体で検出する。非切断プリオン蛋白質は、主として専ら病態型の非切断プリオン蛋白質（ＰｒＰSc）である。その検出に使用される検出抗体は、特異的にＰｒＰScを結合する能力を有する。非病態型のプリオン蛋白質は、基本的には複合体から完全に除去されているので、抗体も又ＰｒＰSc及びＰｒＰCの両者を認識する検出抗体として使用できる。
【００３４】
検出抗体の検出は当業者に周知のいずれの方法でも行われる。その目的のために、多数の適切な検出方法が先行技術において周知である。これらの技術の非網羅的な選択として、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）、ＥＩＡ（酵素抗体法）、ナノビーズ法（例えば、ユウロピウムで標識したナノビーズによる）、蛍光（例えば、時間分解蛍光）及びルミネセンス法を挙げることができる。
【００３５】
その検出は、好ましくは当業者に周知のＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）法を用いて行なわれる。例えば、検出抗体はビオチンと結合してもよく、その検出はストレプトアビジンポリペルオキシダーゼ複合体を介して行なわれ、これは、例えば、発光又はＴＭＢ（３,３’,５,５’−テトラエチルベンジジン）などの活性化剤と測定の直前に混合される。検出は、捕獲抗体がまだこの系で固相に固定されていない場合には、好ましくはビオチン／ストレプトアビジン又はアビジン系を用いて行なわれる。本発明の検出抗体の例は、ビオチン化抗ＰｒＰ抗体のＳＡＦ３２及びＳＡＦ６１である(Spi−Bio社、 Montignyle Bretonneux、フランス)。
【００３６】
従って、上記の検出方法の１つ又は業界で周知の他の方法により検出するために、検出抗体が、検出分子、検出に適切な基又は固体構造（例えば、マイクロビーズ、又はユウロピウム・ナノビーズなどのナノビーズ）と結合できることは業界で周知である。それ故、例えば、ビオチン又は蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン−イソチオシアナート又はローダミンなど）と結合される検出抗体を用いることが好ましい。検出抗体は、例えば、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであってもよい。適切な検出抗体は、標準法による自己生産であっても又は市販のものでも良い。
【００３７】
好ましい実施態様において、捕獲抗体及び検出抗体は、検出抗体がプラスミンの一次切断部位としてカルボキシ末端に配列するプリオン蛋白質のエピトープを認識する場合には、捕獲抗体がプラスミンの一次切断部位としてアミノ末端に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられるように選択される。従って、検出抗体がプラスミンの一次切断部位としてアミノ基末端に配列するプリオン蛋白質のエピトープを認識する場合には、捕獲抗体がプラスミンの一次切断部位としてカルボキシ末端に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられることも又好ましい。
【００３８】
従って、好ましい実施態様において、検出抗体及び捕獲抗体は、検出抗体がアミノ酸残基１〜１１０の領域の外側に位置するエピトープに向けられる場合には、捕獲抗体がアミノ酸残基１〜１１０の領域に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられるか、又は捕獲抗体がアミノ酸残基１〜１１０の領域の外側に位置するエピトープに向けられる場合には、検出抗体がアミノ酸残基１〜１１０の領域に位置するエピトープに向けられるように選択される。
【００３９】
別の好ましい実施態様において、複合体に含まれる非切断プリオン蛋白質の検出は定量的に行なわれる。これは、例えば、ＥＬＩＳＡ試験がプリオン蛋白質の検出に使用され、測定した信号強度が試料中に検出されたプリオン蛋白質の量に比例する場合に可能である。本発明の方法を、例えば、試料の重複に対して使用する場合、そして１つの試料を、この条件（例えば５０ｎＭプラスミンで３０分間）で十分な時間非病態型のプリオン蛋白質の完全切断に十分な量のプラスミンでインキュベートする場合、そして更に他の試料を処理しない場合に、未処理試料の信号強度に対する処理試料の信号強度の比に基づいて、プリオン蛋白質の全体の切断が起こる程度を確認することが可能である。
【００４０】
更に、本発明の方法は、本方法の１つ又はそれ以上の個々の工程の間に、１つ又はそれ以上の洗浄工程が実施され、そのために当業者に周知の適切な洗浄緩衝液が使用される場合に有利となり得る。
【００４１】
本発明によれば、病型プリオン蛋白質を検出する本発明の方法を実行するためにキット類も使用することができる。
【００４２】
本発明のキット類は、プリオン蛋白質の病態型（ＰｒＰSc）及び非病態型（ＰｒＰC）の両者に向けられる捕獲抗体、プラスミン及び検出抗体を含む。
【００４３】
本発明に必須のキットのこれらの成分の特徴は、既に詳細に記述されている。
【００４４】
このように、例えば、捕獲抗体が固相にあらかじめ固定されていることは有利となる。マイクロタイタープレート又は磁性若しくは非磁性ビーズは、固相として好ましく使用される。
【００４５】
１つの実施態様において、キットに含まれる検出抗体は、プリオン蛋白質の病態型及び非病態型の両者を認識する。
【００４６】
好ましい実施態様において、キットに含まれる捕獲抗体は、検出抗体がプラスミンの一次切断部位としてカルボキシ末端で配列するプリオン蛋白質のエピトープを認識する場合には、プラスミンの一次切断部位としてアミノ末端に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられる。代わりに、検出抗体がプラスミンの一次切断部位としてアミノ末端で配列するプリオン蛋白質のエピトープを認識する場合には、捕獲抗体がプラスミンの一次切断部位としてカルボキシ末端に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられることも、また好ましい。
【００４７】
別の好ましい実施態様において、キットに含まれる捕獲抗体は、検出抗体がアミノ酸残基の１〜１１０の領域の外側に位置するエピトープに向けられる場合、アミノ酸残基の１〜１１０の領域に位置するプリオン蛋白質のエピトープに向けられる。他方、キットに含まれる検出抗体は、また捕獲抗体がアミノ酸残基の１〜１１０の領域の外側に位置するエピトープに向けられる場合、アミノ酸残基の１〜１１０の領域に位置するエピトープに向けられることもあり得る。
【００４８】
尚更なる好ましい実施態様において、このキットは、更に固相の３つの結合部位を飽和するための遮断緩衝剤、洗浄緩衝剤及び／又はアプロチニンを含む。
【００４９】
尚更なる好ましい実施態様において、プラスミンは、緩衝液中に溶解されるか又は凍結乾燥されて固体としてキット中に存在する。
【００５０】
アプロチニンがキットに含まれる場合、これも緩衝液中に溶解されるか又は凍結乾燥されて固体として存在することができる。キットに含まれる溶液へのいずれの添加物（例えば、洗浄剤、遮断剤）も、キットに含まれ得る。
【００５１】
本発明の方法は、病原性プリオン蛋白質を、疾患の早期に低コストで少ない消費時間で、高い特異性を持ってかつ高感度で、必要に応じて自動検査の一環として、検出することが可能である。ＰｒＰScの検出は、ヒト、ハムスター又は雌ウシなどの種々の種において、とりわけ高感度で奏功する。
【００５２】
ＩＤ50用量（曝露動物の少なくとも５０％に疾患を引き起こす感染用量; Prusiner S.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 10, 95, 13363−13383）を決定することによって、病原性プリオン類の検出試験の感度が確認できる（ＩＤ50／ｍｌ値が低いほど、検査感度は高い）。１,０００ＩＤ50／ｍｌ以下の値は、本発明の方法によって達成できる。市販の検査法の、Prionics Check（ＩＤ50／ｍｌ：１,０００,０００〜１００,０００；試料としてＢＳＥホモジネート；検出限界１０0〜１０-1希釈）、Platelia（登録商標）ＢＳＥ検査（ＩＤ50／ｍｌ：３,０００；試料としてＢＳＥホモジネート；検出限界１０-2.5希釈）及びEnfer ＴＳＡ（ＩＤ50／ｍｌ：３０,０００；試料としてＢＳＥホモジネート；検出限界１０-1.5希釈）が、比較の目的のために引用される。
【００５３】
本発明の方法は、病態型の低切断性に比べて、プラスミンによる生理的ＰｒＰ型の高切断性に基づいている。プラスミンに対して一次切断部位を隠蔽するＰｒＰSc分子の特異的折り畳み、及びプラスミンの高い酵素選択性が、プリオン類の固定化後に２型間の識別を可能にする。プラスミンの使用は、ＰｒＰCのみが切断され完全には消化されず、用いた
抗体が元の状態を保つという、プロテインキナーゼＫに優る利点を有する。
【００５４】
全体として、本方法は約３.５時間を要するが、例えば、Platelia（登録商標）ＢＳＥ検査のように試料の何ら特別な予備的処理を必要としない。プリオンの吸着がマイクロタイタープレートの表面上に非特異的に起こるようなEnfer検査とは異なり、プリオンの結合は当初から特異的である。更に、本発明の方法による所要時間は、検出がウェスタンブロットによって行なわれるPrionics Checkの場合よりも非常に少ない。
【００５５】
本発明の方法は、特異抗体型への依存度を低下させ、それ故に極めて融通性に富む：ＰｒＰCが基本的にプラスミンによって２つの断片に切断されることから、ＰｒＰ分子のアミノ末端領域か又はカルボキシ末端領域のいずれかが検出できるように、種々の抗体が使用可能である。
【００５６】
既知の他の方法と対照的に、更に、本発明の方法は、ＰｒＰC切断の初速度の測定を可能にする。本発明の方法は、日常的な使用に好ましい自動方式で容易に実施できる。加えて、本方法は、プリオン検出の他の免疫学的方法（「弱い」消化、それ故良好な信号対雑音比）の感度を増加させて使用することもできる。
【００５７】
本発明は以下に実施例を用いて例示されるが、後者は限定するためのものではないと解釈すべきである。
【００５８】
〔実施例１〕
プラスミンによる非固定ＰｒＰの切断
組換えヒトＰｒＰ（ｒｈｕＰｒＰ）、並びに天然ＰｒＰC（ヒト血清、ハムスター脳ホモジネート）の両者は、一連の試験においてプラスミンによりインビトロで切断されたが、プラスミン消化はサンプル管内で行なわれ、そしてプリオン蛋白質は消化の時点では固定化されなかった。
【００５９】
組換えヒトＰｒＰ（ｒｈｕＰｒＰ）、ヒトＰｒＰC（血清；ｈｕＰｒＰC）及びハムスターＰｒＰC（脳ホモジネート；ｈａｍＰｒＰC）を、５５３から５７５ｐｇ／ｍｌ（組換えヒトＰｒＰに対する較正；Roboscreen社）の初期濃度において、３７℃で３０分間、サンプル管中で種々の濃度のヒトプラスミンにてインキュベートした。次いで反応をアプロチニンの添加によって停止し、ＰｒＰをＥＬＩＳＡ法で検出した。ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８と８９間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチンで結合した３Ｆ４（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０８と１１１間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。ＥＬＩＳＡ法では、試料をストレプトアビジンポリペルオキシダーゼ複合体（ＳＡｐｏｌｙＨＲＰ、Pierce社、 Rockford、 米国）と混合し、これを反応緩衝剤中に１：５,０００に希釈し（遮断緩衝剤１部＋ＰＢＳ４部）、そして室温で２０分間インキュベートした。次いで、ＴＭＢ（３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン）を基質として試料に加えて、３０分間インキュベートした。停止溶液（蒸留水中０．２５％Ｈ2ＳＯ4）の添加後、試料の吸光度をＥＬＩＳＡリーダー(Tecan Genios; Tecan、スイス)を用いて４０５ｎｍで測定した。
【００６０】
検出抗体のエピトープは、プリオン蛋白質の一次切断部位に正確に存在し、その結果として、試料中の非切断プリオン蛋白質だけがＥＬＩＳＡで検出できる(図１)。
【００６１】
試料中にあるプラスミン阻害剤の存在を介した、インビトロでの天然のＰｒＰCの切断は、消化がプリオン蛋白質の事前の固定化なしにサンプル管で行われる場合のみ、困難ではあるが制御可能であることが明らかになった。従って、約２００ｎＭのプラスミン濃度がサンプル管中の組換えヒトＰｒＰの有意な切断に必要であるが、同じ程度のヒトＰｒＰC及びハムスターＰｒＰCの切断は、１μｍ以上のプラスミン濃度でのみ達成される(図２)。
【００６２】
このために、試料中に含まれるプリオンをモノクローナル抗体を用いて先ず固定し、次いでヒトプラスミンで処理し、その後残りの非切断プリオンを別の標識抗体で検出する、１つの試験法を開発した。試料はプラスミン消化の前に固定化抗体とプリオン蛋白質の複合体から分離されることから、試料中に含まれるプラスミン阻害剤又はプラスミン基質が、消化時にプラスミン活性を阻害し又は影響することは不可能である。
【００６３】
〔実施例２〕
プラスミンによる固定化ＰｒＰの切断
更なる試験において、プラスミンによるＰｒＰの切断を、マイクロタイタープレートに固定した抗体を用いて固定化後に検討した（図３及び図４）。このために、ＰｒＰ分子(図１；図５)、並びにプラスミンの切断部位のリジン残基がアラニンに置換されたｒｈｕＰｒＰ（図６及び図７）の、異なるエピトープに向けられる抗体の両者が使用された。
【００６４】
実施例２.１：
ヒト血漿又はハムスター脳ホモジネートによって固定化されたＰｒＰCの切断
ヒト血漿由来の固定化ＰｒＰCの切断のために、３種の透明マイクロタイタープレート(Lumi−Nunc Maxi−Sorp F96; Nunc社、Wiesbaden)を、１００μｌ／ウェルのモノクローナル抗体（抗−ＰｒＰ: SAF32、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス; 濃度: ｐＨ９.０の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で１μｇ／ｍｌ、 Perbio社、ボン）により、４℃で１６〜１８時間コーティングした。残液を吸引し、自由結合部位を１００μｌの遮断緩衝剤(Superblock、Perbio社、ボン)の各ウェルへの添加によって１時間飽和させた。遮断緩衝剤をプレートから吸引し、試料（反応緩衝剤中に適宜希釈したプールしたヒトクエン酸塩血漿：遮断緩衝剤１部＋ＰＢＳ４部）をプレートへピペットで加えた。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄緩衝剤(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps、Pierce社、Rockford、米国))で洗浄した。次いでＰＢＳ(Perbio社、ボン)中５０ｎＭのヒトプラスミン(Chromogenix社、Stockholm、スウェーデン)の１００μｌをウェルへピペットで加えた。プレートを５００回転／分のサーモシェーカー(THERMOSTAR、BMG社、Offenburg)中、３７℃で０、１０、２０及び３０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ中５μＭのアプロチニン(Merck Biosciences社、Schwalbach)の２５μｌを各ウェルにピペットで加えた。室温で５分のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。反応緩衝剤中の１００μｌのビオチニル化検出抗体(3F4、Signet社、Dedham、米国; １２５ｎｇ/ｍｌ)を、非消化ＰｒＰの検出のために各ウェルにピペットで加えた。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ試験：
ＥＬＩＳＡ試験では、インキュベーションを、検出抗体を用いて、暗所中緩やかな振盪下に室温で１時間行った。各ケース３００μｌの洗浄緩衝剤(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps, Pierce社、Rockford、米国))で６回洗浄後、ストレプトアビジンポリペルオキシアビジン複合体 (SApolyHRP、Pierceｓ社、Rockford、米国)を反応緩衝剤（遮断緩衝剤１部＋ＰＢＳ４部）中１：５０,０００に希釈し、マイクロタイタープレート上のウェル当たり１００μｌをピペットで加えた。暗所中で緩やかな振盪下に室温で２０分のインキュベーション後、再び洗浄を各ケース３００μｌの洗浄緩衝剤で６回実施した。次いで室温にした１００μｌのＴＭＢ（３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン）を、各ウェルへ基質として各ケースにおいてピペットで加え、暗所中で緩やかな振盪下に室温で３０分間インキュベートした。ウェル当り５０μｌの停止溶液（蒸留水中０．２５％Ｈ2ＳＯ4）の添加後、試料の吸光度をＥＬＩＳＡリーダー(Tecan Genios; Tecan、スイス)を用いて４０５ｎｍで測定した。
【００６６】
ヒト血漿由来の固定化ＰｒＰCの切断結果を図３に示す。試料としてプールしたヒトクエン酸血漿を使用しないで、健常動物由来のハムスター脳ホモジネートを使用したこと以外は、これと同様にして、ハムスター脳ホモジネート由来の固定化ＰｒＰCの切断も実施した。ハムスター脳ホモジネート由来の固定化ＰｒＰCの切断結果を図４に示す。
【００６７】
図３及び図４に示される指数関数的に低減する百分率強度は、ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０８及び１１１間のエピトープを認識する検出抗体として使用されたビオチニル化３Ｆ４が、インキュベーション時間の進行と共にエピトープの検出を次第に少なくすることを明瞭に示す。このことは、このＰｒＰ抗体のエピトープがＰｒＰC断片上に存在し、プラスミンによる切断によって分解され、検出抗体による検出前に洗浄されることを示す。
【００６８】
また、プラスミンとのわずか２０分のインキュベーション後、固定化ＰｒＰCの総量は、１：２００希釈のヒト血漿由来のプラスミンによって切断された。１：５０及び１：１００希釈では、更なる非切断ヒトＰｒＰCは、３０分のプラスミンインキュベーション後には殆ど存在しなかった(図３)。
【００６９】
ハムスターホモジネート（１：４００希釈）の例では、固定化ＰｒＰCの総量は、２０分のプラスミンインキュベーション後プラスミンによって切断された。１：１００及び１：２００希釈では、更なる非切断ヒトＰｒＰCは、プラスミンによる３０分のインキュベーション後殆ど検出できなかった（図４）。
【００７０】
実施例２.２：
ＰｒＰの切断の抑制
プラスミンによるＰｒＰ切断を抑制するために、２種の透明なマイクロタイタープレート(Lumi−Nunc Maxi−Sorp F96; Nunc社、Wiesbaden)を１００μｌ／ウェルのモノクローナル抗体(抗−ＰｒＰ: PRI308、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス; 濃度:
ｐＨ９.０の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で１μｇ／ｍｌ、Perbio社、ボン)の１００μｌ／ウェルにより、４℃で１６〜１８時間コーティングした。残液を吸引し、自由結合部位を１００μｌの遮断緩衝剤(Superblock、 Perbio社、ボン)の各ウェルへの添加によって１時間飽和させた。遮断緩衝剤をプレートから吸引し、試料（反応緩衝剤中に適宜希釈した健常動物由来のハムスター脳ホモジネートエキス：遮断緩衝液１部＋ＰＢＳ４部）をプレートへピペットで加えた。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄緩衝剤(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps、Pierce社、Rockford、米国))で洗浄した。ＰＢＳ(Perbio社、ボン)中５０ｎＭのヒトプラスミン(Chromogenix社、Stockholm、スウェーデン)の１００μｌを１つのマイクロタイタープレートへピペットで加え、一方で、１００μｌのＰＢＳを第２のマイクロタイタープレートへピペットで加えた。プレートを５００回転／分のサーモシェーカー(THERMOSTAR、BMG社、Offenburg)中、３７℃で３０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ中の５μＭのアプロチニン(Merck Biosciences社、Schwalbach)の２５μｌ／ウェルを両方のプレートへピペットで加えた。室温で５分のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。反応緩衝剤中の１００μｌのビオチニル化検出抗体（SAF32、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス；１２５ｎｇ／ｍｌ）を、非消化ＰｒＰの検出用に各ウェルへピペットで加えた。次いで、ＥＬＩＳＡ法を上記指示に従って実施した。
【００７１】
図５で見られるように、プラスミンによる切断は、エピトープとしてＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０６〜１２６を認識する捕獲抗体（ＲＲＩ３Ｏ８）では、天然ＰｒＰCの固定化した後では可能ではない。このことは、ＰｒＰCの一次結合部位が、捕獲抗体によるＰｒＰCの結合によってプラスミンに対してマスクされ、そしてＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０６〜１２６間に位置する可能性を示す。
【００７２】
実施例２.３：
組換ＰｒＰCの切断
組換えＰｒＰCの切断では、４種の透明なマイクロタイタープレート(Lumi−Nunc Maxi−Sorp F96; Nunc社、Wiesbaden)を１００μｌ／ウェルのモノクローナル抗体(抗−ＰｒＰ: SAF61、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス; 濃度: ｐＨ９.０の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中１ μｇ／ｍｌ、Perbio社、ボン)の１００μｌ／ウェルにより、４℃で１６〜１８時間コーティングした。残液を吸引し、自由結合部位を１００μｌの遮断緩衝剤(Superblock、Perbio社、ボン)の各ウェルへの添加によって１時間飽和させた。遮断緩衝剤をプレートから吸引し、試料（Institut fur Labormedizin, Charite, Campus Virchow Klinikumからの、リジンクラスター２（ｄＬＣ２）中アラニンによって置換されたリジン残基を有する組換えヒトＰｒＰ；反応緩衝剤中に適宜希釈：遮断緩衝液１部＋ＰＢＳ４部）をプレートへピペットで加えた。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄緩衝液(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps、Pierce社、Rockford、米国))で洗浄した。次いで、ＰＢＳ(Perbio社、ボン)中５０ｎＭのヒトプラスミン(Chromogenix社、Stockholm、スウェーデン)の１００μｌを、マイクロタイタープレートへピペットで加えた。プレートを５００回転／分のサーモシェーカー(THERMOSTAR、BMG社、Offenburg)中、３７℃で０、５、１５及び３０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ中の５μＭのアプロチニン(Merck Biosciences社、Schwalbach)の２５μｌを全プレートへピペットで加えた。室温で５分のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。反応緩衝液中の１００μｌのビオチニル化検出抗体（SAF32、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス；１２５ｎｇ／ｍｌ）を、非消化ＰｒＰCの検出のために各ウェルへピペットで加えた。次いで、ＥＬＩＳＡ法を上記指示に従って実施した。
【００７３】
結果（図６）は、ヒトＰｒＰのリジンクラスター２（ｄＬＣ２）中の、リジン残基のアラニンによる置換が、プラスミンによるＰｒＰの切断の重大な障害に至ることを示す。３０分後、変異ＰｒＰCの７０％以上が、２５.７ｎｇ／ｍｌの濃度で変異ＰｒＰCを含む試料においてまだ非消化状態である。プラスミン切断も、また低濃度の変異ＰｒＰCで大きく阻害される。
【００７４】
実施例２.４：
混合物中の固定化組換え及び天然のＰｒＰCの切断
混合物中の固定化組換え及び天然のＰｒＰCの切断では、７種の透明なマイクロタイタープレート(Lumi−Nunc Maxi−Sorp F96; Nunc社、Wiesbaden)を１００μｌ／ウェルのモノクローナル抗体(抗−ＰｒＰ: SAF61、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス; 濃度: ｐＨ９.０の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で１μｇ／ｍｌ、Perbio社、ボン)により、４℃で１６〜１８時間コーティングした。残液を吸引し、自由結合部位を１００μｌの遮断緩衝剤(Superblock、Perbio社、ボン)の各ウェルへの添加によって１時間飽和させた。遮断緩衝剤をプレートから吸引し、試料（Institut fur Labormedizin, Charite, Campus Virchow Klinikumからの、リジンクラスター２（ｄＬＣ２）中アラニンによって置換されたリジン残基を有する組換えヒトＰｒＰ；ウシ脳ホモジネート中に２５.７；１４.１及び７.１ｎｇ／ｍｌに希釈し、反応緩衝剤で１：１００に希釈；反応緩衝剤：遮断緩衝液１部＋ＰＢＳ４部）をプレートへピペットで加えた。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄緩衝液(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps、Pierce社、Rockford、米国))で洗浄した。ＰＢＳ(Perbio社、ボン)中５０ｎＭのヒトプラスミン(Chromogenix社、Stockholm、スウェーデン)の１００μｌを、マイクロタイタープレートへピペットで加えた。プレートを５００回転／分のサーモシェーカー(THERMOSTAR、BMG社、Offenburg)中、３７℃で０、５、１０、１５、２０、２５及び３０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ中の５μＭのアプロチニン(Merck Biosciences社、Schwalbach)の２５μｌ／ウェルを、全てのプレートへピペットで加えた。室温で５分のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。反応緩衝剤中の１００μｌのビオチニル化検出抗体（SAF32、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス；１２５ｎｇ／ｍｌ）を、非消化ＰｒＰCの検出のために各ウェルへピペットで加えた。次いで、ＥＬＩＳＡ試験を上記指示に従って実施した。
【００７５】
図７から、天然のウシＰｒＰCも、プラスミンによるその切断が変異のために強く抑制される、種々の濃度の変異した組換えヒトＰｒＰの混合物から切断できることを認めることができる（前記実施例を参照）。
【００７６】
〔実施例３〕
ＰｒＰCをもつ試料におけるＰｒＰScの検出試験
更なる一連の試験において、スクレイピー試料（ハムスター２６３Ｋ株）をプラスミンで検討した。末期の感染動物由来の脳ホモジネートについて、ＰｒＰScの存在に対して種々の濃度で調べた(図８)。更に、高濃度の正常型の存在下で病態型の検出を調べるために、感染動物由来の種々の量の脳ホモジネートを、健常動物由来の脳ホモジネートに添加した。
【００７７】
実施例３.１：
マイクロタイタープレートに固定後のプラスミンによる、感染動物からのハムスター脳ホモジネート由来のＰｒＰCの切断
試料の調製のために、スクレイピーに感染した動物由来の４０μｌのハムスター脳ホモジネートを４０μｌの２％サルコシル（Sigman社、Seelze）と混合し、超音波（ultrasound device UP100H、Dr. Hielscher社、Teltow）によりステージ３で６０秒処理し、そしてローター（neoLab−Rotor、Roth社、Karlsruhe）にて、室温で２時間インキュベートした。次いで希釈系列を反応緩衝剤で調製した。
【００７８】
４種の透明なマイクロタータープレート(Lumi−Nunc Maxi−Sorp F96; Nunc社、Wiesbaden)を１００μｌ／ウェルのモノクローナル抗体(抗−ＰｒＰ: SAF61、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス; 濃度: ｐＨ９.０の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で１ μｇ／ｍｌ、Perbio社、ボン)の１００μｌ／ウェルにより、４℃で１６〜１８時間コーティングした。残液を吸引し、自由結合部位を１００μｌの遮断緩衝剤(Superblock、Perbio社、ボン)の各ウェルへの添加によって１時間飽和させた。遮断緩衝剤をプレートから吸引し、調製試料をプレートへピペットで加えた。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄緩衝液(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps、Pierce社、Rockford、米国))で洗浄した。ＰＢＳ(Perbio社、ボン)中５０ｎＭのヒトプラスミン(Chromogenix社、Stockholm、スウェーデン)の１００μｌを、マイクロタイタープレートへピペットで加えた。プレートを５００回転／分のサーモシェーカー(THERMOSTAR、BMG社、Offenburg)中、３７℃で５、１５及び３０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ中の５μＭのアプロチニン(Merck Biosciences社、Schwalbach)の２５μｌ／ウェルを、全てのプレートへピペットで加えた。室温で５分のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。反応緩衝剤中の１００μｌのビオチニル化検出抗体（SAF32、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス；１２５ｎｇ／ｍｌ）を、非消化ＰｒＰの検出用に各ウェルへピペットで加えた。次いで、ＥＬＩＳＡ試験を上記指示に従って実施した。
【００７９】
ＰｒＰSc自体は、スクレイピーに感染した動物からハムスター脳ホモジネートの１：６,４００希釈において、緩衝剤中になお明瞭に検出できることが明らかになった。測定した強度は、ハムスター脳ホモジネートの濃度に（従って、ＰｒＰScの濃度にも）比例する。
【００８０】
実施例３.２：
マイクロタイタープレートに固定後のプラスミンによる、過剰のＰｒＰCにおけるハムスター脳ホモジネート由来のＰｒＰScの切断
試料の調製のために、スクレイピーに感染した動物由来の４０μｌのハムスター脳ホモジネートを、４０μｌの２％サルコシル（Sigman社、Seelze）と混合し、超音波（ultrasound device UP100H、Dr. Hielscher社、Teltow）によりステージ３で６０秒間処理し、そしてローター（neoLab−Rotor、Roth社、Karlsruhe）にて、室温で２時間インキュベートした。次いでスクレイピーホモジネートの希釈系列を正常ホモジネートで調製した。試料をプレートへピペットで加える直前に、反応緩衝剤中に１：１００希釈した。
【００８１】
７種の透明なマイクロタータープレート(Lumi−Nunc Maxi−Sorp F96; Nunc社、Wiesbaden)を１００μｌ／ウェルのモノクローナル抗体(抗−ＰｒＰ: SAF61、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス; 濃度: ｐＨ９.０の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で１ μｇ／ｍｌ、Perbio社、ボン)の１００μｌ／ウェルにより、４℃で１６〜１８時間コーティングした。残液を吸引し、自由結合部位を１００μｌの遮断緩衝剤(Superblock、Perbio社、ボン)の各ウェルへの添加によって１時間飽和させた。遮断緩衝剤をプレートから吸引し、調製試料をプレートへピペットで加えた。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄緩衝剤(TBS (Burph TBS、Pierce社、Rockford、米国) with 0.5％ Tween−20 (Surfact−Amps、Pierce社、Rockford、米国))で洗浄した。ＰＢＳ(Perbio社、ボン)中５０ｎＭのヒトプラスミン(Chromogenix社、Stockholm、スウェーデン)の１００μｌを、マイクロタイタープレートへピペットで加えた。プレートを５００回転／分のサーモシェーカー(THERMOSTAR、BMG社、Offenburg)中、３７℃で５、１５及び３０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ中の５μＭのアプロチニン(Merck Biosciences社、Schwalbach)の２５μｌ／ウェルを、全てのプレートへピペットで加えた。室温で５分のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。反応緩衝剤中の１００μｌのビオチニル化検出抗体（SAF32、Spi−Bio社、Montigny le Bretonneux、フランス；１２５ｎｇ／ｍｌ）を、非消化ＰｒＰの検出用に各ウェルへピペットで加えた。次いで、ＥＬＩＳＡ試験を上記指示に従って実施した。
【００８２】
図９から、病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰSc）は、非病態型のプリオン蛋白質（ＰｒＰC）の６,４００倍過剰でもなお明瞭に検出し得ることを認めることができる。このことは、本発明の方法によるＰｒＰScの検出は、ＰｒＰScの濃度がＰｒＰCの濃度を超える、疾患の末期の被検者に対して奏功するだけでなく、そのかなり前の、初期の発症前段階において、既に可能なことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】代表的な試験に使用される抗ＰｒＰ抗体のエピトープを示す。
【図２】種々のプラスミン濃度に応じた、ヒトプラスミンによる非固定プリオン蛋白質のインビトロ切断を示す。凡例において、記号表示は以下の意味を表す：ｒｈｕＰｒＰ：組換えヒトＰｒＰ、ｈｕＰｒＰC：ヒトＰｒＰC(血清)、ｈａｍＰｒＰC：ハムスターＰｒＰC（脳ホモジネート）。３回の独立した試験の平均値と標準偏差を示す。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対し、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。表示値は全てバックグラウンド補正値である。
【図３】マイクロタイタープレート上に固定した後の、ヒトプラスミンによる天然のヒトＰｒＰCの切断を示す。ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８と８９間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチニル化３Ｆ４（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０８と１１１間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。種々の試料希釈液を、３７℃において種々のインキュベーション時間によりプレート上で直接プラスミンにより処理した。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対する、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。表示値は全てバックグラウンド補正値である。
【図４】マイクロタイタープレート上に固定した後の、ヒトプラスミンによる天然のハムスターＰｒＰCの切断を示す。ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８と８９間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチニル化３Ｆ４（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０８と１１１間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。種々の試料希釈液を、３７℃において種々のインキュベーション時間によりプレート上で直接プラスミンにより処理した。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対する、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。
【図５】マイクロタイタープレート上に固定した後の、ヒトプラスミンによる天然のＰｒＰC（ハムスター脳ホモジネート）の切断を示す。ＰＲＩ３Ｏ８（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１０６〜１２６間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチニル化ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８〜８９間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。ＰＲＩ３Ｏ８エピトープはプラスミンの切断部位を含み、その結果としてＰｒＰCの切断が抑制される。
【図６】マイクロタイタープレート上に固定した後の、ヒトプラスミンによるリジンクラスター（ｄＬＣ２）中の置換リジン残基による組換えヒトＰｒＰの切断を示す。リジンクラスター２は、ＰｒＰの１０１から１１０のアミノ酸残基を含む。その１０１、１０４、１０６及び１１０に含まれるリジン残基はアラニンで置換された。種々の試料濃度で検討した。ＳＡＦ６１（ＰｒＰ分子のアミノ酸基１４２〜１６０間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチニル化ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸基５８〜８９間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対する、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。表示値は全てバックグラウンド補正値である。
【図７】ｂＰｒＰ（ウシ脳ホモジネート由来のウシＰｒＰ）過剰でのマイクロタイタープレート上に固定した後のヒトプラスミンによる、リジンクラスター２（ｄＬＣ２）中の置換リジン残基による組換えヒトＰｒＰの切断を示す。ＳＡＦ６１（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１４２〜１６０間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチニル化ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８〜８９間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対する、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。表示値は全てバックグラウンド補正値である。
【図８】マイクロタイタープレート上に固定した後の、ヒトプラスミンによるハムスター脳ホモジネート由来のＰｒＰScの切断を示す。ＳＡＦ６１（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１４２〜１６０間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ＳＡＦ３２−ビオチン（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８〜８９間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。スクレイピーに感染した動物の脳ホモジネートの種々の希釈液を示す。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対する、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。表示値は全てバックグラウンド補正値である。３つの独立した試験の平均値と標準偏差を示す。
【図９】マイクロタイタープレート上に固定した後の、ヒトプラスミンによる天然ＰｒＰC過剰のＰｒＰSc（ハムスター脳ホモジネート由来）の切断。ＳＡＦ６１（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基１４２〜１６０間のエピトープを認識する）を捕獲抗体として使用し、ビオチニル化ＳＡＦ３２（ＰｒＰ分子のアミノ酸残基５８〜８９間のエピトープを認識する）を検出抗体として使用した。ＰｒＰCは、ＰｒＰの正常な細胞型を示し、ＰｒＰScはＰｒＰの病態型を示す。スクレイピーハムスター由来の脳ホモジネートは、健常ハムスター由来の脳ホモジネートで希釈された。３つの独立した試験の平均値と標準偏差を示す。プラスミンとインキュベーションしない試料の強度に対する、プラスミンと表示インキュベーション時間後の試料の強度の百分率を示す。表示値は全てバックグラウンド補正値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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