(57)【要約】  本発明は、新規な炎症阻害薬、およびこれらの阻害薬を使用することによって炎症を治療する方法を提供する。より具体的には、本発明は、転写阻害薬、すなわち、インターロイキン１β（ＩＦＮ−１β）などの炎症性サイトカインの産生を阻害できる、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥ２タンパク質の内部領域に由来するペプチドフラグメント、ならびにそのＩＥ２フラグメントの使用による、炎症性疾患およびＣＭＶ感染および関連疾病を治療する方法を提供する。その転写阻害薬を含む医薬組成物も提供される。【選択図】  図１Ａ−Ｄ
2009510092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期２（ＩＥ２）タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）（配列番号１）を含む単離したポリペプチドを含む抗炎症剤であって、該ポリペプチドが炎症を阻害する抗炎症剤。
【請求項２】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期２（ＩＥ２）タンパク質のアミノ酸残基２９１−３６４（ＩＥ２ ２９１−３６４）（配列番号２）、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３４３（ＩＥ２ ２９１−３４３）（配列番号３）、およびｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）（配列番号１）からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項３】
治療有効量の請求項２に記載のポリペプチドおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
アミノ酸残基２９１−３６４（ＩＥ２ ２９１−３６４）（配列番号２）に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸残基（ＩＥ２ ２９１−３４３）（配列番号３）に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸残基（ＩＥ２ ３１５−３２８）（配列番号１）に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、１４〜７５アミノ酸残基長のＩＥ２ポリペプチドフラグメント。
【請求項８】
請求項４、５、６、または７に記載のポリペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
Ｓｐｉ−１調節型分子の転写を阻害できるペプチド模倣体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
対象に、請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドを含む医薬組成物の十分な量を投与するステップを含む、炎症を阻害する必要がある対象で炎症を阻害する方法。
【請求項１１】
対象に、請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、炎症性疾病を治療する必要がある対象で炎症性疾病を治療する方法。
【請求項１２】
炎症性疾病が、関節炎、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、固形臓器の移植、急性感染、急性期応答、アレルギー性喘息、摂食障害、喘息、悪液質、アテローム性動脈硬化症、回復期（resolving）心筋梗塞、凝血、発熱、歯肉炎、移植片対宿主疾患、出血、多発性硬化症、新生血管緑内障、骨関節炎、歯周病、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ熱、リューマチ性関節炎、ショック、ならびに固形腫瘍増殖および二次転移による腫瘍浸潤からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象に、一種または複数の追加の抗炎症剤と組み合せて、請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、炎症性疾病を治療する必要がある対象で炎症性疾病を治療する方法。
【請求項１４】
追加の抗炎症剤が、選択的ＣＯＸ−２阻害薬、コルチコステロイド、インターロイキン−１アンタゴニスト、ジヒドロオロト酸合成酵素阻害薬、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬、ＴＮＦ−α阻害薬、ＴＮＦ−α金属イオン封鎖剤、およびメトトレキサートからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象に、請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、対象でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染に随伴する疾患または疾病を治療する方法。
【請求項１６】
ＣＭＶに随伴する疾患または疾病が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎、肝炎、ＣＭＶ随伴性急性横断性脊髄炎、多発性単神経障害、脳炎、発熱、発疹、および疲労からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞と請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドとを接触させるステップを含む、細胞中でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の発現を阻害する方法。
【請求項１８】
細胞と請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドとを接触させるステップを含む、細胞中で炎症促進性サイトカインの発現を阻害する方法。
【請求項１９】
細胞が単球である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
炎症促進性サイトカインがＩＬ−１βである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
炎症促進性サイトカインがＴＮＦである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
対象に、請求項２、４、５、６、または７に記載のポリペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、対象でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ウイルス感染を治療し、予防し、制限する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも部分的に、新規な炎症阻害薬、およびこれらの阻害薬を使用し炎症を治療する方法に関する。より具体的には、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥ２タンパク質に由来するペプチドフラグメント、これらのペプチドをコードするＤＮＡ、ペプチド模倣体、および炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）および他の炎症性サイトカインの産生を阻害できる小型分子、ならびにそのペプチドフラグメントの投与によって炎症性疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、一連の組織学的事象によって特徴付けられ、そして身体損傷および感染性損傷を含む組織損傷の様々な形態が介在する複雑な過程である。対象の身体防御および修復機序は、ＩＬ−１βの機能に依存する。炎症という事象は治癒には重要であるが、長期にわたる、または制御されない炎症は、病気を引き起こす組織損傷および症状をもたらしうる。例えば、入院患者で病的状態および死亡の主要原因である敗血症性ショックは、部分的に、ＩＬ−１βが血管平滑筋および心筋機能に作用することによって生じる。リューマチ性関節炎は、壊滅的な慢性炎症性疾患であり、その病変が主として関節に限定されることによって特徴付けられる。リューマチ性関節炎は、関節の慢性全身性疾患であり、滑膜組織および関節構造体における炎症性変化、ならびに骨萎縮および骨粗鬆を特色とする。軟骨びらんおよび骨びらんは、ＩＬ−１βが介在する（Dinarello, C. A. (2002) Clin Exp Rheumatol 20(5 Suppl 27): S1-13; van’t Hof, R. J., K. J. Armourら，(2000) Proc Nad Acad Sci USA 97(14): 7993-8）。アテローム性動脈硬化症および虚血性再灌流障害を含む他の状態もまた、ＩＬ−１βの作用に依存するものである（Kato, A., C. Gabayら，(2002) Am J Pathol 161(5): 1797-803; Burne, M. J., A. Elghandourら，(2001) J Leukoc Biol 70(2): 192-8.; Haq, M., J. Normanら，(1998). J Am Soc Nephrol 9(4): 614-9); van’t Hof, R. J., K. J. Armourら，(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(14): 7993-8）。
【０００３】
ＩＬ−１βは、（損傷を受けた上皮細胞および内皮細胞からも少量放出されるが）主として単球によって産生されるタンパク質であり、この単球は、損傷に続いて身体に早期警戒シグナルを発する白血球である。Ｔｏｌｌ様受容体など、単球上の様々な受容体は、刺激に続いてＩＬ−１β産生を誘導するシグナルを核に送る。次いで、ＩＬ−１βは、周囲の環境に放出され、局所標的および遠隔標的に働きかけて身体防御の警戒態勢を取らせる。よく認識されているこのストレスシグナルの結果が発熱である。敗血症性ショック、ならびにリューマチ性関節炎およびループスを含む自己免疫疾患など、ある種の状況では、ＩＬ−１βは、関節、骨、および他の組織に重篤な損傷を引き起こす炎症の一因となる。リューマチ性関節炎で、ＩＬ−１βタンパク質の下流機能を遮断することは有益であることが分かっている。固形臓器移植の動物モデルでは、ＩＬ−１β機能の遮断は、拒絶という結果に至らないように移植を保護することが分かった。他の臨床試験では、ＩＬ−１βの封鎖が歯の健康に有益であることが実証されている。ＩＬ−１βの影響下で、慢性歯肉炎が、骨びらんを招き歯の安定性を失わせるためである。従って、ＩＬ−１β阻害薬にはいくつかの潜在的な治療的用途がある。
【０００４】
ＩＬ−１βを標的にする強みは、非常に早い段階で炎症を撹乱することである。実際、ＩＬ−１βの炎症促進作用のいくつかには、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）、ＮＳＡＩＤが阻害する酵素群の誘導が介在し、ＮＳＡＩＤは、数例を挙げるとViox（登録商標）およびCelebrex（登録商標）などである。本発明のＩＬ−１β阻害薬の一利点は、いくつかのＣＯＸ阻害薬とは違って、ＩＬ−１βがＣＯＸ機能を阻害しないことである。従って、ＩＬ−１βの発現を阻害したために生じる心筋梗塞など、ある種の有害事象を懸念する先験的理由が存在しない。
【０００５】
ＩＬ−１βプロモーターは、ＩＬ−１β遺伝子の前に位置するＤＮＡ領域であり、そして転写因子と呼ばれる一連のタンパク質と結合することによって転写を調節する。転写因子は、プロモーター中に存在する特異的ＤＮＡ配列に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。結合すると、トランス活性化因子と呼ばれる転写に必要な他のタンパク質が、転写因子表面上の他のドメインと結合することによってプロモーターへ召集される。単球では、ＩＬ−１βプロモーターの主要な転写因子がＳｐｉ−１（ＰＵ．１ともいう）である。Ｓｐｉ−１は、転写因子であるＥＴＳファミリーのメンバーであり、造血中は細胞系譜の決定（lineage commitment）において中心的役割を果たし、そして中でもＴＮＦα、ＩＬ−６、およびミエロペルオキシダーゼを含む免疫系中の複数のエフェクター遺伝子のトランス活性化に重要である（Friedman, A. D. (2002) Oncogene 21(21): 3377-90）。Ｓｐｉ−１は、ＩＬ−１βプロモーター上の２個の別々の標的部位と結合し、そして機能するためには別の転写因子であるＣ／ＥＢＰβも必要としうる（Kominato, Y., D. Galsonら，(1995) Mol Cell Biol 15(1): 59-68）。
【０００６】
単球細胞系がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染すると、ＩＬ−１βが誘導されることが判明している（Iwamoto, G. K., M. M. Monickら，(1990). J Clin Invest 85(6): 1853-7）。後に、この観察は、ＣＭＶにコードされたトランス活性化因子前初期２タンパク質（ＩＥ２）は、細胞中にＳｐｉ−１と共に同時形質移入すると、ＩＬ−１β遺伝子の転写を誘導できることによって説明された。さらに、ＩＥ２活性は、ＩＬ−１プロモーター上のＳｐｉ−１と物理的に相互作用するその能力によって説明された。（Wara-aswapati, N., Z. Yangら，(1999). Mol Cell Biol 19(10): 6803-14）。
【０００７】
多数の抗炎症治療が知られ、一般的に使用されている。その最も一般的なものが、アスピリンおよび非ステロイド系抗炎症剤、例えば、ナプロキセン、イブプロフィン（ibuprofin）、ジフルニサル、メフェナム酸、およびケトロラックトロメタミンである。一般的に、これらの薬剤は、短期の軽度の炎症および疼痛の治療に使用される。関節炎など、さらに重篤な炎症性疾患は、グルココルチコイドおよびアンタゴニスト抗体によって治療する。一般的に、前者は、多くの副作用のために慢性的にはあまり忍容性が高くなく、後者は製造するには非常に高価である。
【０００８】
炎症を低減する抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）モノクローナル抗体が入手可能であり、現在、リューマチ性関節炎の治療にRemicadeTMおよびHumiraTMなどが市販されている。しかし、近年、これらの抗体の投与によって、癌と同様に感染の危険性も増大しうることが分かっている（Bongartzら，(2006) J. of the American Medical Association 295;2275）。
【非特許文献１】Dinarello, C. A. (2002) Clin Exp Rheumatol 20(5 Suppl 27): S1-13
【非特許文献２】van't Hof, R. J., K. J. Armourら，(2000) Proc Nad Acad Sci USA 97(14): 7993-8
【非特許文献３】Kato, A., C. Gabayら，(2002) Am J Pathol 161(5): 1797-803
【非特許文献４】Burne, M. J., A. Elghandourら，(2001) J Leukoc Biol 70(2): 192-8
【非特許文献５】Haq, M., J. Normanら，(1998). J Am Soc Nephrol 9(4): 614-9)
【非特許文献６】van't Hof, R. J., K. J. Armourら，(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(14): 7993-8
【非特許文献７】Friedman, A. D. (2002) Oncogene 21(21): 3377-90
【非特許文献８】Kominato, Y., D. Galsonら，(1995) Mol Cell Biol 15(1): 59-68
【非特許文献９】Iwamoto, G. K., M. M. Monickら，(1990). J Clin Invest 85(6): 1853-7
【非特許文献１０】Wara-aswapati, N., Z. Yangら，(1999). Mol Cell Biol 19(10): 6803-14
【非特許文献１１】Bongartzら，(2006) J. of the American Medical Association 295;2275
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、入手可能なＩＬ−１β特異的阻害薬は数種しかない。遺憾ながら、これらの阻害薬は、ＩＬ−１βが既に合成され、放出され、そして機能し始めた後にのみ、標的細胞上のその受容体と結合することによってＩＬ−１βを阻止する。この型のＩＬ−１β阻害は、いくつかの炎症状況によっては遅すぎるであろうし、または治療の有効性を最小限に抑えかねない。抗炎症剤の多くは短時間しか作用せず、重度の副作用を招くことも多く（例えばグルココルチコイド）、かつ／または製造するには高価（例えば、モノクローナル抗体）なので、新規な療法の必要性が生じている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、少なくとも部分的に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期２（ＩＥ２）タンパク質のある内部領域に由来するペプチドフラグメントが、炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の産生を阻害し、インタクトなＩＥ２の機能を阻止または阻害するという発見に基づく。本発明は、発現がＳｐｉ−１により調節される分子、例えば、ＩＬ−１βおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの炎症促進性サイトカインの発現に干渉する、競合的アンタゴニストを使用することによって、炎症を阻止し、それによって炎症を阻害し、予防し、そして治療するための新規な手法を提供する。
【００１１】
単球細胞系がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染すると、ＩＬ−１βが誘導される（Iwamoto, G. K., M. M. Monickら，(1990) J Clin Invest 85(6): 1853-7）。この誘導は、ＣＭＶにコードされたトランス活性化因子である前初期２タンパク質（ＩＥ２）が、Ｓｐｉ−１との結合後にＩＬ−１β遺伝子の転写を誘導することができるために生じる（Wara-aswapati, N., Z. Yangら，(1999) Mol Cell Biol 19(10): 6803-14）。
【００１２】
ＩＥ２タンパク質は、細胞でのＣＭＶの複製に役立つ。ＣＭＶ ＩＥ２のアミノ酸配列の一例を配列番号４として記載し、ＣＭＶ ＩＥ２ヌクレオチド配列の一例を配列番号５として記載する（Stenberg, RM, Depto, ASら，(1989) J Virol 63(6): 2699-2708; Stenberg RM, Witte, PRら，(1985) J Virol 56(3): 665-675、およびChee, M. S., Bankier, A. Tら，(1990) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154: 125-169も参照）。ＩＥ２は、ＤＮＡとタンパク質に結合活性を有する、ウイルスおよび宿主細胞の強力な遺伝子トランス活性化因子である。ＩＥ２をＳｐｉ−１と共に細胞中に同時形質移入すると、ＩＬ−１β遺伝子の転写が誘導される。転写因子Ｃ／ＥＢＰβもＩＬ−１β遺伝子の転写に関与する。
【００１３】
ＩＬ−１βプロモーターにおけるＳｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰβの機能は、遺伝子レポーターアッセイによって実証される（図１Ｂおよび１Ｃ）。これらの研究では、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（Ｓｐｉ−１を発現しない非骨髄球細胞系）に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に連結させたＩＬ−１βプロモーターを含むレポーターベクターを一時的に形質移入させた。これらの転写因子のｃＤＮＡを含む真核生物発現ベクターを加えると、このベクターは、滴定可能な方式でルシフェラーゼレポーターを発現する。レポーターアッセイでＳｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰβを同時発現させると、ＩＥ２によるＩＬ−１βプロモーターの超活性化が観察された（図１Ｄ）。
【００１４】
本発明は、少なくとも部分的に、ＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のペプチドフラグメントが、競合的アンタゴニストとして、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦα）ＩＬ−６、さらにミエロペルオキシダーゼ、および転写がＳｐｉ−１によって調節される他の分子の転写に必要な天然の転写因子の機能を阻止または阻害し、それによってこれらのサイトカインおよび他の分子の発現を阻害し、さらにインタクトなＩＥ２の機能を阻止または阻害する機能を有するという驚くべき発見に基づく。
【００１５】
炎症の初期段階を阻害することによって、本発明は市販の抗炎症剤またはアンタゴニスト、例えば、グルココルチコイドまたはモノクローナル抗体よりも有利である。これらの市販薬は、炎症カスケードの最初期事象を停止させることができず、かつ慢性的に使用すると著しい副作用を示し、または製造するには高価である。
【００１６】
従って、本発明の一態様は、ＣＭＶ ＩＥ２タンパク質の単離したポリペプチドフラグメント（例えば、配列番号４中のＩＥ２ ２９１−３６４およびＩＥ２ ２９１−３４３）を対象とし、これらのフラグメントは、ＩＬ−１βおよび他の炎症促進性サイトカインの発現を阻止することによって炎症を阻害する能力を有する。本発明の別の態様は、ＩＥ２ ２９１−３６４ポリペプチド中に含まれるＳｐｉ−１最小相互作用領域（配列番号４中のＩＥ２ ３１５−３２８）を含む小型ペプチドを対象とする。すなわち、一態様では、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期２（ＩＥ２）タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（配列番号４中のＩＥ２ ３１５−３２８）、好ましくは配列番号４中のヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）ＩＥ２ ３１５−３２８を含む単離したポリペプチドを対象とする。好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３６４（ＩＥ２ ２９１−３６４）、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３４３（ＩＥ２ ２９１−３４３）、およびｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）を含み、またはそれらからなるＩＥ２タンパク質フラグメントである。本発明はまた、上記のポリペプチドのフラグメントであるポリペプチド、および上記のペプチドに少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同するポリペプチド、同様にそれらの誘導体も提供し、その際、そのポリペプチドは、Ｓｐｉ−１に結合し、かつ／または炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦなど、Ｓｐｉ−１調節型分子の転写を阻害する能力を保持する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）を含み、かつＩＥ２の全長アミノ酸配列未満までで、少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００アミノ酸長以上であり、ならびにＳｐｉ−１に結合し、かつ／または炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦなど、Ｓｐｉ−１調節型分子の転写を阻害する能力を保持する、ＩＥ２ポリペプチド／ＩＥ２フラグメントを対象とする。
【００１８】
本発明はまた、本発明のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントをコードする核酸分子も対象とする。
【００１９】
本発明は、ＩＥ２ペプチドフラグメントに限定されない。本発明の転写阻害薬はまた、Ｓｐｉ−１に結合し、かつ／またはＳｐｉ−１調節型分子の転写を阻害するように機能する、ペプチド模倣体および低分子も含む。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、本発明の転写阻害薬の治療有効量および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。
【００２１】
一態様では、本発明は、それを必要とする対象に本発明の転写阻害薬または医薬組成物の十分な量を投与するステップによる炎症を阻害する方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に、本発明の転写阻害薬または医薬組成物の治療有効量を投与するステップによる炎症性疾病を治療する方法を提供する。本発明が企図する炎症性疾病には、それだけには限らないが、関節炎、リューマチ性関節炎、自己免疫疾患（例えば、炎症性腸疾患および全身性エリテマトーデス）、固形臓器の移植、急性感染、急性期応答、アレルギー性喘息、摂食障害、喘息、悪液質、心血管作用、凝血、発熱、歯肉炎、移植片対宿主疾患、出血、多発性硬化症、新生血管緑内障、骨関節炎、歯周病、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ熱、ショック、ならびに固形腫瘍増殖および二次転移による腫瘍浸潤が含まれる。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に、それだけには限らないが、選択的ＣＯＸ−２阻害薬、インターロイキン−１アンタゴニスト、ジヒドロオロト酸合成酵素阻害薬、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬、ＴＮＦ−α阻害薬、ＴＮＦ−α金属イオン封鎖剤、およびメトトレキサートを含む一種または複数の追加の抗炎症剤と組み合せて、本発明の転写阻害薬または医薬組成物の治療有効量を投与するステップによる、炎症性疾病の治療する方法を提供する。個々の阻害薬による治療では、ヒトでの試行において結果に著しい改善が見られない敗血症性ショックのような疾患で、この手法は成果をあげることができる（Vincent, J. L. (1997). "New therapies in sepsis." Chest 112(6): 330S-338）。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、単球などの細胞と、ポリペプチド／ＩＥ２フラグメントなどの転写阻害薬の十分な量とを接触させるステップを含む、細胞中で炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦの発現を阻害する方法を提供する。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、対象に、本発明のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントなどの転写阻害薬または医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、対象でＣＭＶ感染に随伴する疾患または疾病を治療する方法を提供する。一実施形態では、ＣＭＶに随伴する疾患または疾病は、例えば、ＣＭＶ網膜炎、肝炎、ＣＭＶ随伴性急性横断性脊髄炎、多発性単神経障害、脳炎、発熱、発疹、または疲労である。
【００２６】
別の態様では、本発明は、細胞と、本発明のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントなどの転写阻害薬とを接触させるステップを含む、細胞中でＣＭＶの発現を阻害する方法を提供する。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明は、対象に、本発明のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントなどの転写阻害薬、医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、対象でＣＭＶウイルス感染を治療し、予防し、または制限する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、少なくとも部分的に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期２（ＩＥ２）タンパク質の内部領域に由来するペプチドフラグメント（例えば、配列番号４中のＩＥ２アミノ酸３１５−３２８、例えば、配列番号４中のＩＥ２アミノ酸２９１−３６４または２９１−３４３を含む、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）ＩＥ２フラグメント）は、炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の産生を阻害し、そしてインタクトなＩＥ２の機能を阻止または阻害するという発見に基づく。ＩＬ−１βは、炎症カスケードの最初期段階の一つに関与するので、本発明によって実現するＩＬ−１βの阻害によって、順次、炎症または炎症性疾患が予防され治療されうる。
【００２９】
ＩＬ−１βに加えて主要な炎症促進性遺伝子（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をコードするものを含む）は、Ｓｐｉ−１に類似する転写因子を必要とするので、特定の実施形態では、本発明の転写阻害薬は、それだけには限らないが、ＴＮＦαなどのＴＮＦ、ＩＬ−６、およびリソソーム酵素ミエロペルオキシダーゼを含む、これらの追加の分子の発現も阻止できると本発明は考えられる。従って、他の多くの抗炎症剤は炎症の一経路しか阻止しないので、本発明の転写阻害薬は有利な抗炎症剤である。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、本発明の転写阻害薬は、遺伝コードをタンパク質に転換する初期過程である遺伝子転写レベルで、ＩＬ−１βの産生を阻害する小型のアンタゴニストペプチドである。特定の理論によって制限する意図はないが、炎症カスケードの初期段階でＩＬ−１βの産生を減少させることにより、ある型の炎症応答を阻害して治療上の利益を得られる可能性が高まると考えられる。また、ＩＥ２フラグメントなどの小型のペプチドは、製造するのが容易、すなわち安価であり、従って本発明は医薬開発において魅力的な選択になると考えられる。本発明が提供するＩＥ２フラグメントおよびその同定された標的転写因子相互作用部位は、別の種類の新規抗炎症薬として役立ちうる、さらに小型の分子を開発するための基礎として使用できるということも企図されている。
【００３１】
また、特定の理論によって制限する意図はないが、本発明のＩＥ２フラグメントは、Ｓｐｉ−１と結合するが、遺伝子の転写を活性化する機能は持たないと考えられる。というのは、ＩＥ２フラグメントは、転写を起こさせるのに必要なＩＥ２タンパク質の機能性成分が欠損しているからである。本ＩＥ２フラグメントは、Ｓｐｉ−１との結合を求めてインタクトな機能性ＩＥ２タンパク質と競合し、それによってＩＬ−１βなどの炎症性サイトカイン、および他のＳｐｉ−１調節型分子の転写を阻害すると考えられる。また、ＩＥ２ペプチドフラグメントは、感染細胞内でＣＭＶの発現を阻害することにより、抗ウイルス剤として有効で有り得ると考えられる。それはＩＥ２ペプチドが、ＩＥ２依存性遺伝子の作用を阻止することもできることが実証されたからである。 
本明細書で使用するように、「転写阻害薬」または「アンタゴニスト」という用語は、Ｓｐｉ−１調節型遺伝子、例えば、それだけには限らないが、ＩＬ−１β、ＴＮＦαなどのＴＮＦ、ＩＬ−６、およびミエロペルオキシダーゼなどの転写を阻害できるあらゆる分子を含むものとする。アンタゴニストは、例えば、本発明のＩＥ２タンパク質フラグメント、ペプチド模倣体、核酸分子、または低分子を含みうる。転写阻害薬は、ＣＭＶの発現および／または感染を阻害するために使用することもできる。本明細書で使用するように、本発明の「抗炎症剤」という用語は、上記アンタゴニストのいずれかを含み、ペプチドに限定されない。
【００３２】
「炎症性疾病」、「炎症性疾患」、または「炎症状態」は、毛細管拡張、白血球性浸潤、発赤、発熱、疼痛、腫脹、およびしばしば機能喪失によって特徴付けられる細胞損傷に対する局所的な応答を伴う、または局所的な応答を引き起こす傾向がある状態を意味する。「炎症性疾病」、「炎症性疾患」、または「炎症状態」における哺乳動物の身体防御および修復機序は、ＩＬ−１βの機能に依存すると考えられる。「炎症性疾病」、「炎症性疾患」、または「炎症状態」は、自己免疫疾患または疾病も含む。
【００３３】
「ＣＭＶ感染に随伴する疾患または疾病」は、ＣＭＶによる感染に関する、またはＣＭＶによる感染によって生じたあらゆる疾患、疾病、または状態を意味する。ＣＭＶ感染に随伴する疾患または疾病には、それだけには限らないが、ＣＭＶ網膜炎、肝炎、ＣＭＶ随伴性急性横断性脊髄炎、多発性単神経障害、脳炎、発熱、発疹、および疲労が含まれる。
【００３４】
「ＩＥ２フラグメント」は、任意の前初期２（ＩＥ２）タンパク質に由来し、炎症促進性サイトカインの転写を誘導しないペプチドフラグメントを意味する。ＩＥ２フラグメントは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８を含むが、炎症促進性遺伝子（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ）の転写を誘導するのに必要な、そのＩＥ２タンパク質中のいかなる機能性成分も含まないペプチドフラグメントであることが好ましい。より好ましくは、配列番号４中のアミノ酸残基２９１からアミノ酸残基３６４の範囲のｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質領域に由来し、配列番号４中のアミノ酸残基３１５−３２８を含むペプチドフラグメントが本発明によって企図される。
【００３５】
「治療有効量」は、状態または疾患、特に炎症状態または炎症性疾患を治療するのに必要な用量を意味する。「治療有効量」は、細胞中で、炎症またはＣＭＶ感染を阻害するのに有効であると主張する、ポリペプチド／本発明のＩＥ２フラグメントの量、または複数のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントの組合せの量を含むものとする。
【００３６】
「治療」または「治療する」という用語は、哺乳動物における、特にヒトにける疾患状態、例えば、炎症性疾患または疾病または感染の治療を意味し、以下を含む。（ａ）哺乳動物で疾患状態が発生しないように予防することであって、特に、哺乳動物が疾患状態になりやすいが、まだその疾患または状態にあるとは診断されていない場合に予防すること、（ｂ）疾患状態を阻害すること、すなわち、その進行（development）を抑止すること、（ｃ）疾患状態、または感染、またはそれらの臨床症状を低減し、軽減し、または寛解すること、すなわち、疾患状態の退行を引き起こすこと；および／または（ｄ）疾患の継続時間を短縮すること。
【００３７】
疾患状態を「予防する」と、その用語を本明細書で使用するように、つまり、炎症性疾患または感染などの疾患状態にあるとはまだ診断されていない個体に与薬を行う場合、その個体が、疾患状態と診断されるに至るという危険性が減少する。
【００３８】
感染を「制限する」ことは、その用語を本明細書で使用するように、個体内で、かつ／または個体間で感染の伝播を制限することを意味する。
【００３９】
「対象」は、任意の哺乳動物対象、好ましくはヒトをさす。
【００４０】
Ｉ．ポリペプチド
本発明によれば、ＩＥ２タンパク質のペプチドフラグメント、例えば、配列番号４中のアミノ酸領域２９１−３６４間のペプチドフラグメントは、ＩＬ−１βプロモーター上でＳｐｉ−１の機能を阻害することができる。一実施形態では、Ｓｐｉ−１と相互作用する本発明のペプチドフラグメントは、ＩＥ２のアミノ酸２９１−２６４中の１４アミノ酸領域（ＩＥ２ ３１５−３２８）である。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、少なくとも一種のポリペプチド／本発明のＩＥ２フラグメントを含む、抗炎症剤を対象とする。
【００４２】
特定の理論によって制限する意図はないが、ＩＥ２フラグメントは、Ｓｐｉ−１ ＥＴＳドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン）相互作用領域を含み、そしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）主鎖の存在下で三次構造的統合性を保持すると考えられる。ＩＥ２フラグメントには、ＩＥ２のトランス活性化ドメインの大部分が欠損しているので、ＩＬ−１βプロモーター上で協同的ＩＥ２／Ｓｐｉ−１相互作用を阻止することによって、ＩＥ２フラグメントは優性阻害機能をもたらし、それによってＩＬ−１βの転写を低減させ、従って抗炎症剤として機能すると考えられる。
【００４３】
本発明の一実施形態は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期２（ＩＥ２）タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）（配列番号１）、好ましくはヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）ＩＥ２ ３１５−３２８を含む、単離しまたは精製したポリペプチドであって、炎症を阻害するポリペプチドを対象とする。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、それだけには限らないが、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３６４（ＩＥ２ ２９１−３６４）（配列番号２）を含むＩＥ２タンパク質フラグメントである。本発明のポリペプチドはまた、Ｓｐｉ−１と結合し、かつ／またはＳｐｉ−１調節型分子、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦの転写を阻害する能力を保持する、ＩＥ２のアミノ酸２９１−３６４中に含まれる任意のＩＥ２タンパク質フラグメント、例えば、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３４３（ＩＥ２ ２９１−３４３）（配列番号３）およびｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）（配列番号１）なども含む。さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、全長ＩＥ２タンパク質未満ではあるが、少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５アミノ酸またはそれ以上でありうる。本フラグメントはまた、本ポリペプチドの阻害機能に作用しない、ＩＥ２のアミノ酸２９１−３６４の外側の追加のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、上に挙げた配列中のアミノ酸の一つまたは複数が、別の天然または非天然アミノ酸で置換されている、上記ポリペプチドの誘導体または類似体も含み、その際、そのポリペプチドは、その活性、例えば、Ｓｐｉ−１と結合し、かつ／またはＳｐｉ−１調節型分子、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦの転写を阻害する能力を保持する。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、一個または複数の予想される非必須アミノ酸残基で行われている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されているものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタリン（glutarine）、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００４５】
ある実施形態では、アミノ酸と同様の置換または交換である相同置換、例えば、塩基性アミノ酸に対して塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸に対して酸性アミノ酸、極性アミノ酸に対して極性アミノ酸なども生じうる。非相同置換が生じることもあり、すなわち、一クラスの残基が別のクラスの残基へ置換されて、または代わりに非天然アミノ酸、例えば、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの封入を伴って生じることもある。アミノ酸置換は、変異体ペプチドの疎水性、変異体ペプチドの両親媒性性質を高め、そして変異体ペプチドがα−へリックス構造または下部構造を形成する確率を上昇しまたは低下させるために選択することができる。
【００４６】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記のアミノ酸配列に実質的に同一であり、そしてＳｐｉ−１と結合し、かつ／またはＳｐｉ−１調節型分子、例えばそれだけには限らないが、ＩＬ−１βまたはＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインの転写を阻害する能力を保持し、さらに天然対立形質の変化または変異誘導のためにアミノ酸配列が異なる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記のペプチドに少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同するアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントまたは抗炎症剤は、公知の組換え分子生物学手順（例えば、Mullisら，Methods Enzymol. 155: 335-50 (1987)およびAusubelら，Current Protocols in Molecular Biology, 例えば3.17.1-10ページ）によって調製することができる。本発明のポリペプチドはまた、ペプチドライゲーション法（例えば、Dawsonら，Science 266: 776-9 (1994)およびColiganら，Native chemical ligation of polypeptides, Wiley: 18.4.1-21 (2000) 参照）によって合成しうる。ポリペプチド、模倣体、およびそれらの変異体は、当技術分野で公知の標準的化学的合成法（例えば、Applied Biosystems社から購入できるペプチドシンセサイザー）によって産生させることができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、標準的精製手順を使用し単離することができる。「単離した」、または「精製した」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、そのタンパク質が由来する細胞または供給源からの細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まない、あるいは化学的に合成した場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」は、非ＩＥ２ポリペプチド（本明細書では「混入タンパク質」ともいう）または、化学的前駆体、または非受容体、またはリガンドケミカルを約３０％、２０％、１０％、より好ましくは５％（乾燥重量による）未満含む、ポリペプチドまたはその変異体を調製すること意味する。本ポリペプチドまたはその生物活性部分を組換えによって産生する場合、実質的に培地を含まないことが多く、具体的にはその場合、培地は、ポリペプチド調製物の容量の約２０％未満、約１０％未満、およびしばしば約５％未満を占める。単離し、または精製したポリペプチド調製物は、乾燥重量で０．０１ｍｇ以上、または０．１ｍｇ以上、およびしばしば１．０ｍｇ以上、および１０ｍｇ以上でありうる。
【００４９】
同様に本発明に含まれるものは、追加の化合物、例えば、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰＥＧ化されたペプチド（一個または複数の結合ポリエチレングリコール分子を有する）、または核移行シグナル（ＮＬＳ）などに融合されたＩＥ２ペプチドフラグメントである。さらに、本発明のＩＥ２フラグメントは、第２のタンパク質に連結させることも、またはペプチドは、ＩＥ２ではない大型のペプチド中に含めて、例えば、細胞中での安定性を増大させることもできる。
【００５０】
本明細書に記載したペプチドに加えて、本発明の転写阻害薬は、本ＩＥ２ポリペプチドフラグメントの阻害活性を模倣する、小さなペプチド様分子であるペプチド模倣体も含む。
【００５１】
ＩＩ．核酸分子
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする、単離した核酸分子に関連する。例えば、本発明は、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３６４（ＩＥ２ ２９１−３６４）（配列番号２）、ｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基２９１−３４３（ＩＥ２ ２９１−３４３）（配列番号３）、およびｈＣＭＶ ＩＥ２タンパク質のアミノ酸残基３１５−３２８（ＩＥ２ ３１５−３２８）（配列番号１）、およびそれらの相補鎖をコードするＩＥ２核酸分子フラグメントを含む。Ｓｐｉ−１と結合し、かつ／またはＳｐｉ−１調節型分子、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦの転写を阻害する能力を保持するポリペプチドをコードする、これらの単離した核酸分子のフラグメントも本発明に含まれ、同様に上記のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の全長に少なくとも約８０％，８１％，８２％、８３％、８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子、あるいはＳｐｉ−１と結合し、かつ／または炎症促進性サイトカインなどのＳｐｉ−１調節型分子の転写を阻害する能力を保持する、これらのヌクレオチド配列のいずれかの一部、およびそれらの天然対立形質変異体および相同物も含まれる。
【００５２】
本明細書で使用するように、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を使用して発生させたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体も含むものとする。その核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００５３】
「単離した核酸分子」という用語は、その核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離させた核酸分子を含む。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離した」という用語は、そのゲノムＤＮＡに自然に付随する染色体から分離させた核酸分子を含む。好ましくは、単離した核酸は、その核酸を派生させたＤＮＡ中でその核酸を自然に側置する配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、「単離した」核酸分子は、組換え技術によって産生した場合は、他の細胞性物質または培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成した場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないようにすることができる。
【００５４】
ＩＩＩ．追加の抗炎症剤
特定の実施形態では、本発明はまた、ＩＬ−１βの産生を阻害する薬物設計法であって、それだけには限らないが、懸垂液滴法（hanging drop）、放置液滴法（sitting drop）、自由液体拡散法、バッチ法、またはマイクロバッチ法を含む当技術分野で十分に確立された任意の結晶化設備を使用し、ＩＥ２ ３１５−３２８およびＳｐｉ−１ ＥＴＳドメインを共結晶化するステップ、Ｓｐｉ−１ ＥＴＳドメインタンパク質上のＩＥ２ ３１５−３２８の少なくとも一つの結合部位の三次元表示を得るステップ、リガンド結合部位の三次元表示に、少なくとも一種の候補リガンド化合物、好ましくは分子サイズがＩＥ２のアミノ酸３１５−３２８よりも小さいリガンド化合物を重ねるステップ、候補化合物と結合部位間の結合を評価するステップ、およびそのリガンド結合部位に空間的に適合する化合物を選択するステップを含む薬物設計法も企図する。
【００５５】
ＩＶ．医薬組成物およびその投与
別の実施形態では、本発明は、少なくとも一種の本発明の転写阻害薬、例えば、本発明の、ポリペプチド／ＩＥ２フラグメント、ポリペプチド／ＩＥ２フラグメントをコードするＤＮＡ分子、ペプチド模倣体、または低分子、あるいはそれらの組合せの治療有効量、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。
【００５６】
ＩＥ２フラグメント、またはＩＥ２フラグメントコードする核酸、または本発明の転写阻害薬以外の転写阻害薬を含む医薬組成物の活性成分は、例えば、炎症の阻害で、および炎症性疾病もしくは疾患またはＣＭＶ感染の治療で有効な治療活性を示すと考えられる。従って、ＩＥ２フラグメントなどの転写阻害薬を含む本治療組成物の活性成分は、特定の疾患に依存する治療量で投与する。限定しない具体例として、有効量は、対象の体重に応じて約１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ、または約５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。例えば、リューマチ性関節炎を治療するためのＩＥ２フラグメントのピーク血中濃度は、一日当たり１００ｍｇ〜１０００ｍｇを使用し約５〜１００ｍｃｇ／ｍｌでありうる。投与計画は、最適治療応答を提供するように調節することができる。本発明による医薬組成物は、部分用量、単一用量、または複数回用量を含むことができる。例えば、数回分割用量は、毎日投与することができ、または当該用量は治療状況の緊急性によって示される通りに比例的に減少させることもできる。いくつかの実施形態では、本組成物は関節炎治療など、局所的に、または全身に投与される。
【００５７】
ＩＥ２ ３１５−３２８、ＩＥ２ ２９１−３４３、およびＩＥ２ ２９１−３６４など、本転写阻害薬の一種または複数の形態の投与も企図される。一実施形態では、本発明のＩＥ２ポリペプチドフラグメントは、これらと、細胞膜を超えるペプチドの輸送を促進するために、追加の形質導入配列、例えばタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）とを結合することによって細胞に送達される。タンパク質形質導入ドメインは、効率よく、そしてトランスポーターまたは特異的受容体から独立して生体膜を通過し、細胞へのペプチドおよびタンパク質、ＤＮＡ、および他の化合物の送達を促進する小型タンパク質ドメインである。ＰＴＤの例は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のＴＡＴタンパク質ドメイン、アンテナペディアホメオドメインの第３α−へリックスドメイン、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質ドメイン、およびポリアルギニンドメインである。例えば、公開されているＴａｔ形質導入シグナルペプチド配列ＹＡＲＡＡＡＡＱＡＲＡ（配列番号６）を使用することができる。他のＰＴＤも当技術分野で公知であり、例えば、Mi, Z.ら，(2000) Mol. Therapy (4):339-47; Ryu, Jら，(2003) Mol Cells., 16(3):385-91; Matsuiら，(2003) Curr Protein Pept Sci. (2):151; Matsuiら，(2003) Nippon Yakurigaku Zasshi 121(6):435; Dietz, G. P.およびBahr, M. (2004) Mol. Cell. Neurosci. 27(2):85; Torchilin (2006) Annual Review of Biomedical Engineering 8: 343-375；およびHaradaら，(2006) Breast Cancer 13(1):16にも記載されている。別のＰＴＤは、米国特許第６，８８１，８２５号、および米国特許出願第２００３０１０４６２２号Ａ１、同第２００３０２１９８２６号Ａ１、および同第２００５００７４８８４号Ａ１に記載されている。Ｐｅｐ−１と称する別のペプチド担体も記載され、本発明のポリペプチドを送達するために使用することができる。Morris, M.ら，Nat Biotechnol. 2001 (12):1173-6。上記の全ての文献の内容を明示して、参照により本明細書に組み込む。
【００５８】
投与経路に応じて、転写阻害薬を含む本活性成分は、酸、および成分を不活化させうる他の自然条件の作用から成分を保護するために、物質でコートする必要があるかもしれない。例えば、転写阻害薬は、例えばプロテアーゼによる分解から転写阻害薬を保護するために（例えば、Arhewohら，2005, African J. Biotechnol 4:1591-1597を参照）、アジュバントで、またはリポソーム、微小球、ナノ粒子（Shinjiら，1997, Int.J. Pharmacol. 149:93-106参照）またはマイクロカプセルで投与することができる。本明細書で考えられるアジュバントには、レゾルシノール、非イオン界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。リポソームには、従来のリポソームと同様に水中油滴中水滴Ｐ４０乳濁液が含まれる。さらに特定の非限定的な例には、キトサンで被膜したアルギン酸ビーズ中の転写阻害薬、ヒドロゲル製剤中の転写阻害薬（例えば、Blanchetteら，2004, Biomed. & Pharmacother. 58:142-151参照）、経肺投与に適応させた液体製剤または乾燥粉製剤中に入れた転写阻害薬（例えば、Patton, 1997, Chemtech 27(12)27(12):34-38 and Patton, 1998, Nature Biotechnol. 16:141-143参照）、マトリックス放出器具中に組み込まれた転写阻害薬（Krishnaiahら，2001, J. Controlled Rel. 77:87-95参照）、またはプロドラッグ形の転写阻害薬（参照、Yanoら，2002, J. Controlled Rel. 79:103-112）を含む、製剤のカプセル化が含まれる。
【００５９】
通常の保存および使用条件下では、本発明の調製物は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。注射に使用するのに適切な医薬形には、（水溶性）滅菌水溶液、または滅菌注射液もしくは分散液の即席調製用の分散液および滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度に液体でなければならない。製造および保存条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用がないように保存しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜の使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、糖類または塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることも好ましいであろう。注射可能な組成物は、組成物に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することよって、長時間吸収させることができる。
【００６０】
滅菌注射液は、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に、好適な溶媒中に本活性化合物を必要量組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、基本的分散媒、および上記列挙したものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に、様々な本滅菌活性成分（すなわち、ＩＥ２フラグメント、またはＩＥ２フラグメントをコードするＤＮＡ分子、またはそれらの組合せ）を組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合には、好適な調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術によって、本活性成分に任意の追加所望成分を加えた粉末が、予めその滅菌ろ過した溶液から得られる。
【００６１】
投与を容易にし投薬量を均一にするためには、単位用量形に組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する単位用量形は、単位投薬量として、治療する哺乳動物対象に適した物理的に別個の単位をさし、各単位は、必要な医薬用担体と共に、所望の治療効果をもたらすように計算された本活性物質の所定量を含む。本発明の新規な単位用量形の規格は、（ａ）本活性物質の特性および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）本明細書で詳細に開示するように身体健康状態が損なわれている状態の生体対象で、損傷を治療するための活性物質など、配合の技術分野での固有の限界によって決定され直接それらに依存する。
【００６２】
主要な活性成分は、有効量で好都合に有効に投与するために、適切な製薬上許容される担体と共に、上記に開示するように単位用量形に調合される。単位剤形によって、例えば、一日当たり約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの投薬量で、本発明のＩＥ２ペプチドフラグメントの血中濃度を、例えば、約２ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｍｌにすることができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、その意図した投与経路と適合するように製剤化する。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、関節内、くも膜下腔内、眼内、脳室内、および経直腸投与が含まれる。本明細書で使用する「製薬上許容される担体」には、任意の全ての溶媒、分散媒、被膜、抗菌薬および抗真菌薬、等張化剤および吸着遅延剤などが含まれる。薬学活性物質にそのような媒体剤を使用することは、当技術分野で公知である。従来のいかなる媒体も、または薬剤も、本活性成分と不適合である場合を除き、治療組成物でのその使用が企図される。補足的な活性成分もまた、本組成物中に組み込むことができる。
【００６４】
記載の医薬組成物は、医療器具内に収めてもよい。限定しない一例では、その器具は注射器である。別の非制限的な例では、その器具は吸入器であり、その際、具体例では、その吸入器は、陽圧送達することができる（参照、米国特許第６，７０８，６８８号）。
【００６５】
ＩＥ２フラグメントなどの転写阻害薬の投与は、本転写阻害薬の変化させた形態または誘導体、あるいは対象でのその活性、安定性、または到達性を高める薬物も含みうる。適用可能な転写阻害薬増強薬物の同定は、上記のように共結晶化を使用する薬物設計法によって、あるいは薬物または転写阻害薬の（ＩＥ２フラグメントの）インビトロでのリン酸化の効果を検査することによって、容易に試験しまたはスクリーニングされる。
【００６６】
それを必要とする対象へのＩＥ２フラグメントをコードするＤＮＡの投与は、遺伝子転移技術によっても行うことができる。そのような技術には、それだけには限らないが、ウイルス、リポソーム、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの変化させた形態または誘導体が含まれる。
【００６７】
Ｖ．使用法
本発明は、炎症性疾患または疾病を治療し、制限し、または予防し、あるいはＣＭＶ感染または関連疾病を治療し、制限し、または予防するための、対象での転写阻害薬の使用を提供する。適切な転写阻害薬は先に記載され、前記転写阻害薬を含む適切な医薬組成物も同様に記載されている。
【００６８】
一態様では、本発明は、細胞中でＳｐｉ−１調節型分子、例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインの発現を阻害する方法であって、単球などの細胞と、転写阻害薬の十分な量とを接触させるステップを含む方法を提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に本発明の転写阻害薬または医薬組成物の十分な量を投与するステップによる炎症を阻害する方法を提供する。
【００７０】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に、本発明の抗炎症剤または医薬組成物の治療有効量を投与するステップによる、炎症性疾病を治療する方法を提供する。本発明が企図する炎症性疾病は、それだけには限らないが、関節炎、リューマチ性関節炎、自己免疫疾患（例えば、炎症性腸疾患および全身性エリテマトーデス）、固形臓器の移植、急性感染、急性期応答、アレルギー性喘息、摂食障害、喘息、悪液質、アテローム性動脈硬化症、回復期（resolving）心筋梗塞、凝血、発熱、歯肉炎、移植片対宿主疾患、出血、多発性硬化症、新生血管緑内障、骨関節炎、歯周病、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ熱、ショック、ならびに固形腫瘍増殖および二次転移による腫瘍浸潤を含む。
【００７１】
さらに別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、それだけには限らないが、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、ＮＳＡＩＤＳ）、アスピリン、コルチコステロイド、選択的ＣＯＸ−２阻害薬、インターロイキン−１アンタゴニスト、ジヒドロオロト酸合成酵素阻害薬、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬、ＴＮＦ−α阻害薬、ＴＮＦ−α金属イオン封鎖剤、およびメトトレキサートを含む、一種または複数の追加の抗炎症剤と組み合せて、本発明の転写阻害薬または医薬組成物の治療有効量を投与するステップによる炎症性疾病の治療する方法を提供する。
【００７２】
本発明は、対象に、本発明の転写阻害薬または医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、対象でＣＭＶ感染に随伴する疾患または疾病を治療する方法も提供する。一実施形態では、ＣＭＶに随伴する疾患または疾病は、ＣＭＶ網膜炎、肝炎、ＣＭＶ随伴性急性横断性脊髄炎、多発性単神経障害、脳炎、発熱、発疹、および疲労からなる群から選択される。
【００７３】
別の態様では、本発明は、細胞と本発明のポリペプチド／ＩＥ２フラグメントとを接触させるステップを含む、細胞中で、ＣＭＶの発現または感染を阻害する方法を提供する。関連する態様では、本発明は、対象に、本発明の、ポリペプチド／ＩＥ２フラグメント、抗炎症剤、または医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、対象でＣＭＶウイルス感染を治療し、予防し、または制限する方法を提供する。
【００７４】
例えば、医薬組成物に含まれるような転写阻害薬の治療有効量は、それだけには限らないが、（例えば、経鼻または経肺）エアロゾル、経口、皮下、局所的、眼内、筋肉内、静脈内、くも膜下腔内などを含む、任意の既知の投与経路によって投与することができる。
【００７５】
本転写阻害薬は、単一用量、または長期にわたって投与される複数回用量で投与してもよい。複数回用量間の時間間隔の限定しない例には、４時間まで、８時間まで、１２時間まで、２４時間まで、３６時間まで、４８時間まで、７２時間まで、１週間まで、２週間まで、１ヵ月まで、２ヵ月まで、３ヵ月まで、４ヵ月まで、６ヵ月、および１年までが含まれる。
【００７６】
転写阻害薬の有効量は、予防的に、あるいは疾患または疾病に罹患している人、または炎症性疾患または疾病の危険にさらされている人、またはＣＭＶウイルスに曝露されていることが分かっている、または懸念される人との状況において投与しうる。
【００７７】
以下の非制限的な実施例によって本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００７８】
方法および物質
細胞培養
ＨｅＬａ細胞（Ｓ３株）をＡＴＣＣから入手し、推奨に従って培養した。手短に言えば、細胞を１０％ＦＢＳおよび０．５％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。細胞を剥離するために、トリプシン（０．２５％）ＥＤＴＡ（０．１％）（Cellgro）を使用し３日毎に細胞を１：１０分割した。
【００７９】
レポーター構築体および発現ベクター
プロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドを構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ヒトＩＬ１βプロモーター領域（−１３１＋１２および−５９／＋１２およびその変異体（図１Ａ）を生成し、ｐＧＬ３−ベーシックベクター（Promega）のＭｌｕ ＩおよびＢｇＩ ＩＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入した。ＨＣＭＶ ＩＥ発現ベクターｐＥＱ２７３およびｐＥＱ３２６は、ｐＧＥＭ１ベクターに挿入したゲノムＨＣＭＶ ＩＥ ＤＮＡを含む。ＮＦＩＬ６ ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ１（Invitrogen）に挿入することによって、全長ＮＦＩＬ６と、２個のＳｐ１ Ｉ制限部位間に内部欠失を有する切断型異形とを発現するプラスミドを構築した（Tsukada, J., K. Saitoら，(1994) Mol Cell Biol 14(11): 7285-97）。ｐｃＤＮＡ３．１に、ＰＣＲ増幅した、アミノ酸２６９−３４５をコードするＮＦＩＬ６フラグメントを挿入することによって、ＮＦＩＬ６のｂＺＩＰ領域を含む発現ベクターを構築した（Yang, Z., N. Wara-Aswapatiら，(2000) J Biol Chem 275(28): 21272-7）。
【００８０】
形質移入およびレポーター遺伝子アッセイ
Effectene試薬（Qiagen Inc.）を使用し、ＨｅＬａ（Ｓ３）細胞に発現ベクターとルシフェラーゼレポータープラスミドを形質移入した。形質移入の２４時間前に、細胞を２４ウェルプレートに播種した。ウェル間で比較可能な形質移入効率を確実に得られるように、様々な量の親ベクターおよび／またはＮＦＩＬ６またはＩＥタンパク質を発現するベクターを加えることによって、各実験内でウェルごとに形質移入したＤＮＡの全量を一定に維持した。これらのベクターからの発現は、ウェスタンブロッティングによって確認した。形質移入２４時間後または４８時間後に、（Promega社製試薬を使用し）ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を定量して、プロモーターの活性を測定し、そしてそれぞれ、各実験でルシフェラーゼ活性を規準化できるようにした。エラーバーは、３回の反復の最小値の標準誤差を表す。
【００８１】
融合タンパク質の精製およびＧＳＴプルダウンアッセイ
前記方法（Wara-aswapati, 1999）を使用し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）ｐＬｙｓＳ（Promega, ウィスコンシン州マディソン）からＧＳＴ融合タンパク質を収集した。手短に言えば、培養を３、４時間０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、ペレットを１ｍＭ ＤＴＴ、PefaBloc（Roche、インディアナ州インディアナポリス）、およびComplete（登録商標）プロテアーゼ阻害薬カクテル（Roche）１錠／５０ｍｌを含む、ＮＥＴＮ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＮＰ−４０）に懸濁した。氷上で懸濁液を超音波処理し上清を採取した。グルタチオン−セファロースビーズをＮＥＴＮ緩衝液で洗浄し、融合タンパク質と共に４℃で終夜回転させながらインキュベートした。ビーズをＮＥＴＮ緩衝液で３回洗浄し、インビトロで翻訳した当該タンパク質プローブと共に、４℃で４５分間回転させながらインキュベートした。氷温ＮＥＴＮで３回洗浄後、ビーズを煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質を定量するためにゲルをSimplyBlue Safestain（Invitrogen）で染色し、オートラジオグラフィを使用し結合を分析をした。放射標識したタンパク質プローブをインビトロで合成し（TNT T7 Quick Coupled Reticulocyte Lysate System、Promega）、製造業者の使用説明書に従って３５Ｓメチオニン（Amersham）で標識した。
【００８２】
実施例１
ＩＥ２フラグメントによるＩＬ−１β上でのＳｐｉ−１機能の阻害
ＩＥ２ ２９１−３６４による、ＩＬ−１βプロモーター上でのＳｐｉ−１機能の阻害を試験するために、遺伝子レポーターアッセイを使用した。この系では、ホタルルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子の前でＩＬ−１βプロモーターをスプライスした。Ｓｐｉ−１によりプロモーターが活性化された場合、細胞は、ルシフェラーゼ酵素を産生する。次いで、細胞がいかに明るく輝くかによって酵素活性を測定することができる。この一般的な技術を使用したのは、ＩＬ−１βなどの遺伝子産物を測定するよりも、プロモーター機能を測定する方が簡単で感度が高い方法であるからである。
【００８３】
Ｓｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰβがＨｅＬａ−Ｓ３細胞中に形質移入されたとき、レポーターは滴定可能な応答を示した（図１Ｂおよび１Ｃ）。しかし、全長野生型ＩＥ２ を細胞形質移入に加えたときは、遺伝子活性が４〜１０倍増加した（図１Ｄ）。これによってＩＥ２の強度が示された。しかし、阻害薬ペプチドを滴定添加した場合は、全長ＩＥ２の非存在下および存在下で、レポーターの活性の減少が見られた（図２Ａ−２Ｂ）。
【００８４】
さらに、ＩＥ２ ２９１−３６４の効果を検証するために、ＲＡＷ２６４．７細胞系で試験を行った。この細胞系は、内在性ＩＬ１Ｂ遺伝子および形質移入したＩＬ１Ｂ遺伝子（Shirakawa, F., K. Saito,ら，Id.）のＬＰＳ誘導に応答することが示されており、豊富なレベルのＳｐｉ−１（Kominato, 1995）およびＣ／ＥＢＰβ（Tsukada, 1994）を発現する。ＲＡＷ２６４．７細胞系を細菌細胞壁産生物ＬＰＳで処理した場合は、それは、正常単球がＩＬ−１βを産生したのと同様にＩＬ−１βを産生した。ＩＥ２−２９１−３６４ペプチドは、ＩＬ−１βプロモーターレポーターをこの系で約５０％阻害した（図３）。
【００８５】
より厳密に、ＩＬ１β遺伝子発現に及ぼすＩＥ２ペプチドの阻害能力を試験するために、ＬＰＳ応答エンハンサーおよび細胞型特異的Ｓｐｉ−１−依存性プロモーター（Shirakawa, F., K. Saitoら，(1993). Mol Cell Biol 13(3): 1332-44）を含むＩＬ１Ｂ遺伝子の３．８ｋｂｐの単球特異的完全調節領域をルシフェラーゼレポーターとして、ＬＰＳ処理したＲＡＷ２６４．７単球細胞に形質移入した。３．８ｋｂｐの完全ＩＬ１Ｂ調節領域と、Ｈｉｓタグを含むＩＥ２ ２９１−３６４ペプチド発現ベクターとの同時形質移入によって、活性の用量依存的阻害がもたらされたことを結果は示している。ＩＥ２ベクターの非存在下、レポーターと比べた最大阻害は５０〜７５％であり、ＩＥ２ ２９１−３６４領域を含むが残基３１５−３２８は内部欠失している対照ベクターｄｅｌＡとの同時形質移入と比較した場合も阻害程度は類似する（図６）。
【００８６】
実施例２
形質移入アッセイでのＩＥ２フラグメントの発現
形質移入アッセイでＩＥ２フラグメントの発現を確認するために、これらのフラグメントをＧＦＰ発現ベクターに挿入して、これらが核に局在化するかどうか判定した（図４Ａ）。これにより、ＩＥ２フラグメント中に位置する推定核移行配列の機能と同様に、そのタンパク質の発現が示されるはずである。
【００８７】
形質移入から２４時間後、細胞質および核中にＧＦＰ２９１−３６４融合産生物が見られた。次いで、ＧＦＰ２９１−３６４フラグメントが、Ｓｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰβによってＨＴレポーターの内在性トランス活性化を阻害する能力を試験した。形質移入効率を制御するために、ＧＦＰを発現する細胞をＦＡＣＳによりまず精製した。次いで、同数の細胞を使用して、レポーターアッセイ用にライセートを準備した。これらのデータにより、どちらのＧＰＦ融合産生物も優性阻害機能を保持することが示された（図４Ｂ）。この機能は、挿入したＩＥ２フラグメントに特異的であった。Ｓｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰβと、空のＧＦＰ発現ベクター（ｅ．ｖ．）とを同時形質移入した場合は、高いレポーター活性が存在したからである。
【００８８】
ＩＥ２ ２９１−３６４領域は、ＩＥ２上の３個のＴＢＰ結合部位の一個として予めマップしたので、阻害機能はＴＢＰとの相互作用によるものとも考えられた。この可能性を取り除くために、それらのプロモーター中のＴＡＴＡボックスを含む２個の他の遺伝子の発現を調査した。最初に、発現ベクターからのＣ／ＥＢＰβの発現をウエスタンブロット（図４Ｃ）により観察した。これでは、ＧＦＰ２９１−３６４の同時発現による、Ｃ／ＥＢＰβタンパク質の減少は示されなかった。第二に、Ｈｉｓタグ付き阻害薬をｅｖ ＧＦＰと共に同時形質移入し、形質移入細胞の幾何平均輝度をフローサイトメトリー（図４Ｄ）によって測定した。どちらの阻害薬もＧＦＰ発現を低減させず、ＩＬ−１βプロモーター活性の阻害が、ＩＥ２フラグメント阻害薬とＴＢＰとの間の広汎な相互作用によるものではないことが示された。従って、本発明の実施例により、Ｓｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰβと競合的に相互作用することによってＩＬ−１β遺伝子の発現を阻害することができるＩＥ２分子のペプチドフラグメントを発現する能力が実証された。相互作用の基礎は、ＩＥ２分子の残基３１５−３２８に局在すると考えられる。それは、３１５−３２８領域が欠損しているＩＥ２ ２９１−３６４の変異体（ｄｅｌＡ）は、ＧＳＴ融合プルダウンアッセイでＳｐｉ−１ ＥＴＳドメインと結合しないからである（図５）。
【００８９】
本開示は、様々な変更形態および代替形を受け入れることができるが、具体例の実施形態を図に示し、本明細書により詳細に記載した。しかし、具体例の実施形態の記述は、本発明を開示した特定の形態に制限するものではなく、これに反して本開示は、添付の特許請求の範囲によって定義する通り全ての変更形態および同等物を包含すると理解されるものとする。
【００９０】
特許、特許出願、刊行物、商品説明、およびプロトコル、および本明細書に引用した参照文献は全て、全ての目的において、そして特に参照した方法または手順を参照により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】Ｓｐｉ−１、Ｃ／ＥＢＰβ、およびＩＥ２による、ＩＬ−１βプロモーターの協同的トランス活性化を示す図である。転写開始部位に近接する２個の複合体Ｓｐｉ−１−Ｃ／ＥＢＰβ結合部位を示すＩＬ−１βプロモーターの概略図である。遺伝子レポーターホタルルシフェラーゼを含むベクター中に全長プロモーター（ＨＴ）をスプライスして挿入し、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞での一時的形質移入アッセイに使用した。
【図１Ｂ】Ｓｐｉ−１、Ｃ／ＥＢＰβ、およびＩＥ２による、ＩＬ−１βプロモーターの協同的トランス活性化を示す図である。滴定したＳｐｉ−１発現ベクター、および同時形質移入した固定量のＣ／ＥＢＰβ発現ベクターに対するＨＴレポーターの用量応答を示すグラフである。
【図１Ｃ】Ｓｐｉ−１、Ｃ／ＥＢＰβ、およびＩＥ２による、ＩＬ−１βプロモーターの協同的トランス活性化を示す図である。滴定したＣ／ＥＢＰβ発現ベクター、および固定量のＳｐｉ−１発現ベクターに対するＨＴレポーターの用量応答を示すグラフである。
【図１Ｄ】Ｓｐｉ−１、Ｃ／ＥＢＰβ、およびＩＥ２による、ＩＬ−１βプロモーターの協同的トランス活性化を示す図である。ＩＥ２との機能的協同性を示すグラフである。ＨＴレポーターは、滴定したＳｐｉ−１発現ベクター（白棒）と、または固定量のＣ／ＥＢＰβ発現ベクター（碁盤縞棒）と、あるいはＣ／ＥＢＰβおよびＩＥ２両発現ベクター（線影棒）と同時形質移入した。
【図２Ａ】ＩＬ−１Βプロモーターの協同的トランス活性化が、ＩＥ２由来のフラグメントであるＩＥ２ ２９１−３６４およびＩＥ２ ２９１−３４３によって阻害されることを示すグラフである。ここで示すデータは、３個の独立した実験からプールした。Ｈｅｌａ Ｓ３細胞に、（図１に記載した）Ｓｐｉ−１およびＣ／ＥＢＰ発現ベクターと共に、ＨＴレポーターを一時的に形質移入したことを示すグラフである。示した形質移入群には、滴定した量のＩＥ２ ２９１−３６４または２９１−３４３発現ベクターを同時形質移入した。
【図２Ｂ】ＩＬ−１Βプロモーターの協同的トランス活性化が、ＩＥ２由来のフラグメントであるＩＥ２ ２９１−３６４およびＩＥ２ ２９１−３４３によって阻害されることを示すグラフである。ここで示すデータは、３個の独立した実験からプールした。野生型ＩＥ２によるＩＬ−１βプロモーターの外来的調節に及ぼすＩＥ２フラグメントの阻害効果を示すグラフである。図２Ｂにより記載した実験は、図２Ａにより記載した実験に類似するが、野生型ＩＥ２も示した形質移入群に加えた点が異なる。これらは、３個の独立した実験からプールしたデータである。
【図３】ＩＥ２ ２９１−３６４フラグメントが、単球細胞系ＲＡＷ２６４．７で全長ＩＬ−１βレポーターを阻害することを示すグラフである。ルシフェラーゼ遺伝子レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に、未変性ＩＬ−１β上流フラグメント（ＸＴ）をスプライシングすることにより作製したが、このフラグメントはプロモーター配列を通じてエンハンサーを含む。リン酸カルシウム沈殿によりＲＡＷ２６４．７細胞中に、これと、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ空ベクター（対照）またはｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＩＥ２ ２９１−３６４を（滴定した用量で）同時形質移入した。レポーターを活性化させるために、細胞はＬＰＳで刺激した。
【図４Ａ】ＨｅＬａ−Ｓ３細胞への形質移入後、ＧＦＰ−ＩＥ２ ２９１−３４３融合タンパク質の細胞質局在および核局在を示す図である。
【図４Ｂ】ＩＬ−１βプロモーター活性のＧＦＰ ＩＥ２ ２９１−３４３阻害を示すグラフである。
【図４Ｃ】図２Ｂに記載したように形質移入したＨｅＬａ−Ｓ３から得た細胞ライセートをウエスタンブロット分析することにより、ペプチドＩＥ２ ２９１−３６４がＣ／ＥＢＰβの発現を阻害しないことを示す特異的制御を示す図である。
【図４Ｄ】対照ＧＦＰ発現ベクターが、ＩＥ２ ２９１−３４３またはＩＥ２ ２９１−３６４の影響を受けなかったことを示す別の特異的制御を示す表である。ＨｅＬａ−Ｓ３細胞はどちらも、ＧＦＰ発現ベクターを形質移入し、かつＩＥ２ ２９１−３４３またはＩＥ２９１−３６４発現ベクターを同時形質移入し、そして２４時間後に蛍光活性化した細胞の分取器(fluorescence activated cell sorter)によりＧＦＰ発現を分析した。
【図５Ａ】ＩＥ２、Ｓｐｉ−１ ＥＴＳドメイン、およびＣ／ＥＢＰβ ｂＺＩＰドメインの放射標識プローブと、残基３１５−３２８が内部欠失しているＩＥ２ ２９１−３６４フラグメント（ｄｅｌＡ）との相互作用の消失を示す図である。示したプローブの相互作用は、対照ペプチドＩＥ２ ２９１−３４３およびＩＥ２ ２９１−３６４で保持されている。この結果は、ＩＥ２領域３１５−３２８が、これらのリガンドとの結合をもたらし、そして最小のペプチド阻害薬であろうことを示すものである。
【図５Ｂ】ＩＥ２、Ｓｐｉ−１ ＥＴＳドメイン、およびＣ／ＥＢＰβ ｂＺＩＰドメインの放射標識プローブと、残基３１５−３２８が内部欠失しているＩＥ２ ２９１−３６４フラグメント（ｄｅｌＡ）との相互作用の消失を示す図である。示したプローブの相互作用は、対照ペプチドＩＥ２ ２９１−３４３およびＩＥ２ ２９１−３６４で保持されている。この結果は、ＩＥ２領域３１５−３２８が、これらのリガンドとの結合をもたらし、そして最小のペプチド阻害薬であろうことを示すものである。
【図６】ルシフェラーゼレポーターとして、全長ＩＬ−１β調節タンパク質と共に、ＲＡＷ細胞中に形質移入したＩＥ２ ２９１−３６４Δ３１５−３２８またはＩＥ２ ２９１−３６４を発現するベクターの増加量を示すグラフである。ＣａＰＯ４により一時的に形質移入後、ＲＡＷ細胞ライセートをルミノメーターによる測定に使用し、形質移入効率用に制御するために、同時形質移入したβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターにより導入したβ−ガラクトシダーゼ活性に結果を規準化した。見ての通り、ＩＥ２ ２９１−３６４Δ３１５−３２８の値は、野生型フラグメント３１５−２６４と比較した相対的ルシフェラーゼ活性の％割合として報告する。
【図７−１】ＩＥ２分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の一例（配列番号４）、および本発明のフラグメントをコードするヌクレオチド配列の一例（配列番号５）を示す図である。図７は、配列番号１、２、および３として記載したＩＥ２ペプチドフラグメントの例も含む。そのアミノ酸配列は、GenBank受託番号Ｐ１９８９３（ＧＩ：５９８０３０１８）に含まれており、そのヌクレオチド配列はGenBank受託番号Ｍ１１２９８（ＧＩ：３３０５５２）に含まれている。本発明は、任意の特定のＣＭＶ株に由来するＩＥ２配列に限定されない。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の別の変形例も公的に入手することができる。
【図７−２】ＩＥ２分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の一例（配列番号４）、および本発明のフラグメントをコードするヌクレオチド配列の一例（配列番号５）を示す図である。図７は、配列番号１、２、および３として記載したＩＥ２ペプチドフラグメントの例も含む。そのアミノ酸配列は、GenBank受託番号Ｐ１９８９３（ＧＩ：５９８０３０１８）に含まれており、そのヌクレオチド配列はGenBank受託番号Ｍ１１２９８（ＧＩ：３３０５５２）に含まれている。本発明は、任意の特定のＣＭＶ株に由来するＩＥ２配列に限定されない。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の別の変形例も公的に入手することができる。
【図１Ａ】
2009510092.tif 000003
【図１Ｂ】
2009510092.tif 000004
【図１Ｃ】
2009510092.tif 000005
【図１Ｄ】
2009510092.tif 000006
【図２Ａ】
2009510092.tif 000007
【図２Ｂ】
2009510092.tif 000008
【図３】
2009510092.tif 000009
【図４Ａ】
2009510092.tif 000010
【図４Ｂ】
2009510092.tif 000011
【図４Ｃ】
2009510092.tif 000012
【図４Ｄ】
2009510092.tif 000013
【図５Ａ】
2009510092.tif 000014
【図５Ｂ】
2009510092.tif 000015
【図６】
2009510092.tif 000016
【図７−１】
2009510092.tif 000017
【図７−２】
2009510092.tif 000018
【配列表】
2009510092000001.app
【国際調査報告】
2009510092.tif 000019