(57)【要約】  本発明は、例えば、ワクチン、または他の医薬品もしくは研究用途でのウイルスの調製、それらの安定化、及び、こういった製剤の製造方法、さらには、例えばワクチンとして、またはウイルスベクターとしてのそれらの利用に関する。製剤には、糖、保存料、分散剤、熱安定剤、緩衝剤、及び、凍結乾燥された製剤の構造的外観に影響を与えることのない、３種類までのアミノ酸が含まれる。
2009516519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを安定な形態で維持するための製剤であって、該製剤が、糖、保存料、分散剤、熱安定剤、緩衝剤、及び３種類までのアミノ酸を含むことを特徴とする製剤。
【請求項２】
ウイルスを安定な形態で維持するための製剤であって、該製剤が、糖、保存料、分散剤、熱安定剤、緩衝剤、及び２種類までのアミノ酸を含むことを特徴とする製剤。
【請求項３】
ウイルスを安定な形態で維持するための製剤であって、該製剤が、糖、保存料、分散剤、熱安定剤、緩衝剤、及び１種類のアミノ酸を含むことを特徴とする製剤。
【請求項４】
前記糖がしょ糖またはソルビトールであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項５】
前記緩衝剤がトリスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の製剤。
【請求項６】
前記分散剤がポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の製剤。
【請求項７】
前記分散剤がポリビニルピロリドン４０であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の製剤。
【請求項８】
前記アミノ酸がアルギニン、セリン、及びグリシンから選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の製剤。
【請求項９】
前記アミノ酸がアルギニンであることを特徴とする請求項８記載の製剤。
【請求項１０】
前記アミノ酸がセリンであることを特徴とする請求項８記載の製剤。
【請求項１１】
前記アミノ酸がグリシンであることを特徴とする請求項８記載の製剤。
【請求項１２】
前記アミノ酸が約１００ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で製剤中に存在することを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１３】
前記アミノ酸が約８０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在することを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１４】
５℃での溶解時間が１５秒以下であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１５】
約−２０℃で約５２週間保存後の凍結乾燥物の外観が滑らかな白層を呈することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１６】
５℃での溶解時間が１５秒以下であり、約−２０℃で約５２週間保存後の凍結乾燥物の外観が滑らかな白層を呈することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１７】
組換えウイルスをさらに含むことを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１８】
前記ウイルスがアデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポックスウイルス、及びレトロウイルスからなる群より選択されることを特徴とする請求項１７記載の製剤。
【請求項１９】
前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求項１８記載の製剤。
【請求項２０】
前記ポックスウイルスがオルトポックスウイルスまたはアビポックスウイルスであることを特徴とする請求項１９記載の製剤。
【請求項２１】
前記オルトポックスウイルスが痘疹、ＭＶＡ、およびＮＹＶＡＣからなる群より選択されることを特徴とする請求項２０記載の製剤。
【請求項２２】
前記アビポックスウイルスがカナリア痘瘡、鶏痘、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（２）からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０記載の製剤。
【請求項２３】
前記組換えウイルスが、そのゲノム内に、感染体または癌に関係する抗原をコードしている少なくとも１つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項１７〜２２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２４】
前記感染体が、バチルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、レジオネラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、ノカルジア属、パスツレラ属、プロテウス属、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、ビブリオ属、コロナウイルス、ＣＭＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ＥＢＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプス・ウイルス、パピローマウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳＶ、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、アスペルギルス属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、コクシジウム属、クリプトスポリジウム属、エントアメーバ属、ジアルジア属、リーシュマニア属、プラスモジウム属、住血吸虫属、トキソプラズマ属、旋毛虫属、及びトリパノソーマ属からなる群より選択されることを特徴とする請求項２３記載の製剤。
【請求項２５】
前記感染体が、炭疽菌、気管支敗血症菌、パラ百日咳菌、百日咳菌、ライム病ボレリア、クラミジア・トラコマチス、ボツリヌス菌、ジフテリア菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、結核菌、髄膜炎菌、淋菌、腸炎菌、チフス菌、赤痢菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、コレラ菌、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、痘疹、天然痘、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、及びトキソプラズマからなる群より選択されることを特徴とする請求項２４記載の製剤。
【請求項２６】
前記癌が、結腸、直腸、乳、皮膚、肺、脳、および血液からなる群より選択されることを特徴とする請求項２３記載の製剤。
【請求項２７】
前記核酸配列が腫瘍抗原をコードしていることを特徴とする請求項２３記載の製剤。
【請求項２８】
前記腫瘍抗原が、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ-１/Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ７５（ＴＲＰ-１）、チロシナーゼ、黒色腫プロテオグリカン、 ＭＡＧＥ系の抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ系の抗原、ＧＡＧＥ系の抗原、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＲＡＧＥ系の抗原、ＲＡＧＥ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、β−カテニン、ＭＵＭ−１、サイクリン依存性キナーゼ−４、ｐ２１−ｒａｓ、ＢＣＲ-ａｂｌ、ｐ５３、ｐ１８５ ＨＥＲ２／ｎｅｕ、上皮細胞増殖因子受容体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連変異化ムチン、ＭＵＣ−１遺伝子産物、エプスタイン・バール・ウイルスＥＢＮＡ遺伝子産物、パピローマウイルスＥ７、パピローマウイルスＥ６、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、イディオタイプの抗原、ＫＳＡ、キネシン２、ＨＩＰ−５５、ＴＧＦβ−１抗アポトーシス因子、腫瘍タンパク質Ｄ５２、Ｈ１ＦＴ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−７５、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＢＲ−８７、ＮＹ−ＢＲ−９６、ＢＣＹ１、ＢＦＡ４、ＢＣＹ３、ＢＣＺ４、それらの断片、及びそれらの誘導体からなる群より選択されることを特徴とする請求項２７記載の製剤。
【請求項２９】
請求項１７〜２８のいずれか１項記載の製剤を含む免疫製剤。
【請求項３０】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項２９記載の免疫製剤。
【請求項３１】
請求項１７〜２８のいずれか１項記載の製剤を含む、ヒトまたは動物用のワクチン。
【請求項３２】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項３１記載のワクチン。
【請求項３３】
前記製剤が凍結乾燥されていることを特徴とする請求項１７〜３２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項３４】
請求項１７〜３３のいずれか１項記載の凍結乾燥された製剤を、生理的に許容される緩衝剤中で再構成し、該製剤を宿主に投与することを含む、病状を治療し、または予防する方法。
【請求項３５】
前記病状が癌である、または感染体によって生じたものであることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記感染体の種属が、バチルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、レジオネラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、ノカルジア属、パスツレラ属、プロテウス属、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、ビブリオ属、コロナウイルス、ＣＭＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ＥＢＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプス・ウイルス、パピローマウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳＶ、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、アスペルギルス属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、コクシジウム属、クリプトスポリジウム属、エントアメーバ属、ジアルジア属、リーシュマニア属、プラスモジウム属、住血吸虫属、トキソプラズマ属、旋毛虫属、及びトリパノソーマ属からなる群より選択されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記感染体が、炭疽菌、気管支敗血症菌、パラ百日咳菌、百日咳菌、ライム病ボレリア、クラミジア・トラコマチス、ボツリヌス菌、ジフテリア菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、結核菌、髄膜炎菌、淋菌、腸炎菌、チフス菌、赤痢菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、コレラ菌、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、痘疹、天然痘、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、及びトキソプラズマからなる群より選択されることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が、結腸、直腸、乳、皮膚、肺、脳、および血液からなる群より選択されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記組換えウイルスがそのゲノム内に腫瘍抗原をコードしている核酸を含むことを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
前記腫瘍抗原が、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ-１/Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ７５（ＴＲＰ-１）、チロシナーゼ、黒色腫プロテオグリカン、 ＭＡＧＥ系の抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ系の抗原、ＧＡＧＥ系の抗原、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＲＡＧＥ系の抗原、ＲＡＧＥ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、β−カテニン、ＭＵＭ−１、サイクリン依存性キナーゼ−４、ｐ２１−ｒａｓ、ＢＣＲ-ａｂｌ、ｐ５３、ｐ１８５ ＨＥＲ２／ｎｅｕ、上皮細胞増殖因子受容体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連変異化ムチン、ＭＵＣ−１遺伝子産物、エプスタイン・バール・ウイルスＥＢＮＡ遺伝子産物、パピローマウイルスＥ７、パピローマウイルスＥ６、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、イディオタイプの抗原、ＫＳＡ、キネシン２、ＨＩＰ−５５、ＴＧＦβ−１抗アポトーシス因子、腫瘍タンパク質Ｄ５２、Ｈ１ＦＴ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−７５、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＢＲ−８７、ＮＹ−ＢＲ−９６、ＢＣＹ１、ＢＦＡ４、ＢＣＹ３、ＢＣＺ４、それらの断片、及びそれらの誘導体からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ワクチン、または他の医薬品もしくは研究用途でのウイルスの調製、それらの安定化、及び、そのような製剤の製造方法、さらには、例えばワクチンとして、またはウイルスベクターとしてなどのそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンまたは他の目的のための生ウイルス製剤の製造について、様々な方法が知られている。ウイルス活性を保つことを目的とした研究もしくはワクチン用途での冷凍、凍結乾燥、または他の保存方法による生存ウイルスの調剤に有用な製剤及び方法もまた知られている。
【０００３】
典型的には、組換えウイルスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のしょ糖、カゼイン加水分解物及び／またはコラーゲンを含む凍結乾燥された小丸薬の形態で保存される。これらの小丸薬は、０．４〜０．９％ＮａＣｌなどの医薬として許容される溶液中で戻される(re-hydrated)。しかしながら、こういった製剤には重大な欠点が存在し、そのことは当技術分野で知られている。中でも、動物由来の物質の利用、不完全に定義された成分、複雑な調製工程、高コスト、およびウイルスの特定の所望される特性が維持できないことが挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
免疫製剤及びワクチンに利用する安定化ウイルスの調製に適した製剤が、当技術分野には依然として必要とされている。ウイルスの生存能力及び伝染力を含めた、ウイルス、免疫製剤またはワクチンの所望の特性を保持する安定化製剤の提供が望まれている。さらには、動物を媒体とする伝染病に関する懸念から、動物性の製品に由来しない安定化製剤が、当技術分野で必要とされている。急速凍結乾燥処理がし易い、高力価低用量(high-titer low volume)の製剤を提供することもまた、望まれている。本願は、こういった製剤、およびこれらの利用方法について記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、免疫製剤及びワクチンを含めた様々な用途を目的とする、ウイルスベクターなどのウイルスを保存するための安定化製剤（「安定剤」）を提供する。ある実施の形態では、製剤は、糖、保存料、分散剤、熱安定剤(thermal stability agent)、緩衝剤、及び３種類までの異なる種類のアミノ酸（すなわち、１、２または３種類のアミノ酸）を含む。ある実施の形態では、製剤は、３種類のアミノ酸を含む。別の実施の形態では、製剤は２種類のアミノ酸を含む。別の実施の形態では、製剤は１種類のアミノ酸を含む。アミノ酸は、アルギニン、アラニン、セリンまたはグリシンが好ましい。アミノ酸は、アルギニン、セリンまたはグリシンであることがさらに好ましい。ウイルスを安定化製剤に加え、所望の時間、測定可能な特性（すなわち、生存能力、感染力）を特に保持する。好ましい製剤は、以下に記載のウイルスが存在する特定の条件下、好ましい外観及び溶解時間などの特定の所望の測定可能な特性を保持する。本発明の他の実施の形態は、以下に示す説明、実施例、及び、添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０００６】
典型的には、アビポックスウイルスであるＡＬＶＡＣなどの組換えウイルスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のしょ糖、カゼインの加水分解物、及び／またはコラーゲンを含む凍結乾燥された小丸薬の形態で保存されている。これらの小丸薬は、次に、０．４〜０．９％ＮａＣｌなどの医薬として許容される溶液中で戻される。しかしながら、こういった製剤に関連し、対処するのが難しいことが当該技術分野で知られている重大な欠点がある。したがって、本願は、以下に記載する新規な安定化製剤を提供する。
【０００７】
本発明は、発現ベクター、免疫製剤、及び／またはワクチンの用途として、組換えウイルスを含めたウイルスを安定に保管及び保存することを目的とした製剤を提供する。本製剤は、非常に簡便で、低コスト、かつ、現在市販されている製剤と比較してウイルス活性が大幅に低下しない、該ウイルスを調製し、保管し、使用する方法として有用である。こういった製剤は「安定化製剤」と称されることがあり、典型的には、糖（すなわち、しょ糖(sucrose)またはソルビトール、トレハロース、白糖(saccharose)、マンニトール、ラクトース）、保存料（糖、アミノ酸、他の成分であってよい）、分散剤（すなわち、ポリビニルピロリドン４０、デキストラン、ＰＥＧ）、熱安定剤（すなわち、尿素）、緩衝剤（すなわち、トリス、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リン酸ナトリウム、酢酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＥＧ）および１種類以上のアミノ酸を含んでいる。
【０００８】
製剤中に、１、２、３、または４種類以下のアミノ酸が含まれることが好ましい。当然ながら、成分の説明において言及されるアミノ酸は、調製後の製剤に加えられるウイルス、アジュバントまたは他の成分に由来する、製剤中に認められる、または製剤中に放たれるアミノ酸を含めないことは、当業者に理解されよう。よって、製剤の一部として記載されるアミノ酸は、製剤にウイルスまたはアジュバントを加える前に存在しているものである。
【０００９】
最も好ましい実施の形態では、製剤中には、１種類のみのアミノ酸が含まれる。好ましい実施の形態では、製剤は、アルギニン、セリンまたはグリシンのうちの少なくとも１つを含む。さらに好ましい実施の形態では、製剤はアルギニン、セリンまたはグリシンである、１種類のアミノ酸を含む。アミノ酸は、約１００ｍｇ／ｍｌ以下で製剤中に存在することが好ましい。アミノ酸は、約９０〜９５ｍｇ／ｍｌ、約８５〜９０ｍｇ／ｍｌ、約８０〜８５ｍｇ／ｍｌ、または約８０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在することがさらに好ましい。個々のアミノ酸は、当業者にとって広く入手可能なものである。
【００１０】
安定化製剤は、液体、凍結乾燥製剤(freeze-dried preparation, lyophilized preparation)、または他の形態での保管に利用するのが好ましい。液体に関しては、液体製剤は調合薬であることが好ましい。凍結乾燥製剤は、典型的には医薬として許容される担体などの液体を使用して再構成することにより、液体の形態に転化される。医薬として許容される担体は、例えば、緩衝剤及び塩（すなわちＰＢＳ）を含む液体担体であって構わない。適切な緩衝剤及び塩、さらには、他の種類の医薬として許容される担体の例については、当業者に周知である。
【００１１】
ウイルス製剤を保存するための特定の製剤についての適合性の評価では、製剤のウイルスの外観が適合性の重要な指標として測定されている。例えば、最も適当な製剤は、凍結乾燥し、約−２０℃で５２週間保存した後のバイアルの側面に後退のみられない、滑らかな、白層または「ケーキ」を与える。あまり適切ではない製剤では、「溶けた」、「煮沸された」、あるいは奇形の外観が見られ、保存後のバイアルの側面から後退している。以下の実験結果が示すように、滑らかな白層は、溶解時間の速さと関係しており、これは、本明細書に記載する製剤の別の所望の特性である。滑らかな白層ケーキは、ウイルスを安定に保存するのに有用な製剤と強く相関している。
【００１２】
上述のように、溶解時間は適切な製剤の非常に重要な特性である。ウイルス製剤の凍結乾燥に続いて、該製剤を約５℃で約５２週間保存後のＰＢＳなどの医薬として許容される担体への溶解時間は、約２０〜２５秒、約１５〜２０秒、または、好ましくは約１５秒以下である。これにより、当技術分野への即時の使用に適した製剤が当業者に提供される。
【００１３】
ウイルスが安定化製剤中で維持される温度は、保存期間中（すなわち、約５２週間まで）、所望の状態（すなわち、外観の観察、溶解時間、感染価または製剤の他の特性）で、ウイルス／製剤を維持するのに適した温度である。製剤は、典型的および最も好都合には、約１０℃未満（すなわち、約５℃）の温度で維持される。特定の状況では、製剤は約−２０℃で維持されるであろう。
【００１４】
再構成後の製剤の適切なｐＨは、ウイルスが、保存期間中（すなわち、約５２週間まで）、所望の状態（すなわち、生存能力、感染価、溶解時間）で維持されるのに適した任意のｐＨである。例えば、液体製剤のｐＨは、約６〜９、６〜８．５、６．５〜８．５、７〜８．５、７．５〜８．５、６〜８、６．５〜８、７〜８、７．５〜８、または７〜７．５が望ましい。製剤は、ｐＨ約７．５であることが好ましい。液体製剤は、任意の適切な容器内に入れる（例えば、維持する、または保存する）ことができる。典型的には、容器は、バイアルまたは他の保存容器の形態のガラスまたはプラスティックを含む、それらから実質的に成る、またはそれらから成るであろう。
【００１５】
非常に様々なウイルスが本発明の実施に利用可能であろう。適切なウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、バクテリオファージ、エンテロウイルス、胃腸炎ウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））、インフルエンザウイルス、ノーウォークウイルス、ポリオウイルス、コルドポックスウイルス(Chordopoxviridae)（すなわち、５オルトポックスウイルス、痘疹、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、アビポックスウイルス、カナリア痘瘡、ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ（２）、鶏痘、ラブドウイルス、レオウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、カルシウイルス、カリモウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、ノダウイルス、オルトミクスウイルス、パラミクソウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、フィコドナウイルス、ピコマウイルス(Picomaviridae)、及びトガウイルス、ならびに、前記または他の適切なウイルスのいずれかに由来する、これらを基礎とした、または、これらと実質的に同様の修飾ウイルス
が挙げられる。本発明の実施に使用する好ましいウイルスは、ポックスウイルス、特に、ＡＬＶＡＣである。他の適切なウイルスについては、例えば、FieldsらのVirology (34th ed., Lippincott Williams & Wilkins (2001))に記載されているなど、当技術分野で公知である。
【００１６】
ある実施の形態では、組換えウイルスには、そのゲノム内に抗原または免疫原をコードした核酸配列が含まれることから、ウイルスを免疫製剤またはワクチンとして用いて差し支えない。「組換えウイルス」という用語は、天然ではないウイルスゲノムである異種遺伝子がウイルスゲノム内に組み込まれた任意のウイルスのことをいう。免疫製剤は、宿主に投与すると、ウイルスによってコードされた抗原または免疫原を対象とする、またはそれらに反応性の免疫反応を有するものである。この免疫反応が、宿主に対する免疫を保護または提供するかどうかは不明である。ワクチンは、宿主にコードされた抗原または免疫原を対象とした、またはそれらに反応性の防御免疫反応を、宿主に発現させるような製剤である。免疫反応は、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ、ＤＯＴ−ＢＬＯＴ、免疫拡散法を含む、当業者に知られている利用可能な多くの技法のいずれかによって測定して差し支えない。
【００１７】
場合によっては、組換えウイルスには１種類以上の腫瘍抗原（「ＴＡ」）がコードされていて構わない。ＴＡには腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）の両方が含まれ、癌細胞が抗原の供給源である。ＴＡＡは正常細胞に見られるよりも腫瘍細胞の表面に多く発現される抗原、もしくは胎児の発育期に正常細胞に発現される抗原である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有の抗原であり、正常細胞では発現しない。ＴＡには、さらに、ＴＡＡまたはＴＳＡ、それらの抗原断片、及び、それらの抗原性を保持する修飾されたものが含まれる。ＴＡは、典型的には、その発現型、機能、または遺伝的原因によって５種類に分類される：癌−精巣（ＣＴ）抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１）；メラニン細胞分化抗原（すなわち、Ｍｅｌａｎ Ａ/ＭＡＲＴ-１、チロシナーゼ、ｇｐ１００）；変異抗原（すなわち、ＭＵＭ−１、ｐ５３、ＣＤＫ−４）；過剰発現された「自己」抗原（すなわち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３）；および、ウイルス抗原（すなわち、ＨＰＶ、ＥＢＶ）。本発明を実施する目的に適したＴＡは、ＴＡが投与される宿主における抗腫瘍免疫反応を誘起または促進する任意のＴＡである。適切なＴＡとしては、「野生型」（すなわち、通常はゲノムによってコードされ、天然に存在している）、修飾された、変異したもの、さらには、他の断片、及びそれらの誘導体を含む、ｇｐ１００（Cox et al., Science, 264:716-719 (1994)）、ＭＡＲＴ-１/Ｍｅｌａｎ Ａ（Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352 (1994)）、ｇｐ７５（ＴＲＰ-１）（Wang et al., J. Exp. Med., 186:1131-1140 (1996)）、チロシナーゼ（Wolfel et al., Eur. J. Immunol., 24:759-764 (1994)；国際公開第２００１／０７５１１７号、同第２００１／０７５０１６号、同第２００１／０７５００７号の各パンフレット）、ＮＹ-ＥＳＯ-１（国際公開第９８／０１４４６４号、同第９９／０１８２０６号の各パンフレット）、黒色腫プロテオグリカン（Hellstrom et al., J. Immunol., 130:1467- 1472 (1983)）、 ＭＡＧＥ系の抗原（すなわち、ＭＡＧＥ−１、２、３、４、６および１２；Van der Bruggen et al., Science, 254:1643-1647 (1991)；米国特許第６，２３５，５２５号明細書）、ＢＡＧＥ系の抗原（Boel et al., Immunity, 2:167-175 (1995)）、ＧＡＧＥ系の抗原（すなわち、ＧＡＧＥ−１、２；Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 182:689-698 (1995)；米国特許第６，０１３，７６５号明細書）、RAGE系の抗原（すなわち、ＲＡＧＥ−１；Gaugler et at., Immunogenetics, 44:323-330 (1996)；米国特許第５，９３９，５２６号明細書）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ（Guilloux et at., J. Exp. Med., 183:1173-1183 (1996)）、ｐ１５（Robbins et al., J. lmmunol. 154:5944-5950 (1995)）、β−カテニン（Robbins et al., J. Exp. Med., 183:1185-1192 (1996)）、ＭＵＭ−１（Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980 (1995)）、サイクリン依存性キナーゼ−４（ＣＤＫ４）（Wolfel et al., Science, 269:1281-1284 (1995)）、ｐ２１−ｒａｓ（Fossum et at., Int. J. Cancer, 56:40-45 (1994)）、ＢＣＲ-ａｂｌ（Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684 (1995)）、ｐ５３（Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11993-11997 (1995)）、ｐ１８５ ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂ−Ｂ１； Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117 (1995)）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2 (1994)）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）��Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990 (1995) ；米国特許第５，７５６，１０３号、同第５，２７４，０８７号、同第５，５７１，７１０号、同第６，０７１，７１６号、同第５，６９８，５３０号、同第６，０４５，８０２号の各明細書；欧州特許第２６３９３３号、同第３４６７１０号および同第７８４４８３号の各明細書）； 癌関連変異化ムチン(carcinoma-associated mutated mucins)（すなわち、ＭＵＣ−１遺伝子産物；Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662 (1993)）、ＥＢＶのＥＢＮＡ遺伝子産物（すなわち、ＥＢＮＡ−１；Rickinson et al., Cancer Surveys, 13:53-80 (1992)）、ヒトパピローマウイルスのＥ７、Ｅ６タンパク質（Ressing et al., J. Immunol, 154:5934-5943 (1995)）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ； Xue et al., The Prostate, 30:73-78 (1997)）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ；Israeli, et al., Cancer Res., 54:1807-1811 (1994)）、例えば免疫グロブリンイディオタイプまたはＴ細胞受容体イディオタイプなどのイディオタイプのエピトープまたは抗原（Chen et al., J. Immunol., 153:4775-4787 (1994)）、ＫＳＡ（米国特許第５，３４８，８８７号明細書）、キネシン２（Dietz, et al., Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7;275(3):731-8）、ＨＩＰ−５５、ＴＧＦβ−１抗アポトーシス因子（Toomey, et al., Br J Biomed Sci 2001;58(3):177-83）、腫瘍タンパク質Ｄ５２（Bryne J.A., et al., Genomics, 35:523-532 (1996)）、Ｈ１ＦＴ、ＮＹ−ＢＲ−１（国際公開第０１／４７９５９号パンフレット）、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−７５、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＢＲ−８７、ＮＹ−ＢＲ−９６（Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY）、ＢＣＹ１、ＢＦＡ４、ＢＣＡ４、およびＢＦＹ３が挙げられる。
【００１８】
他の事例では、組換えウイルスは、病原体に由来する抗原または免疫原をコードしていて差し支えない。典型的な感染体として、バクテリア、ウイルス、菌、寄生生物などが挙げられる。特に典型的な感染体としては、数ある中でも、とりわけ、バチルス属（すなわち炭疽菌）、ボルデテラ属（すなわち、気管支敗血症菌、パラ百日咳菌、百日咳菌）、ボレリア属（すなわちライム病ボレリア）、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア属（すなわち、クラミジア・トラコマチス）、クロストリジウム属（すなわちボツリヌス菌）、コリネバクテリウム属（すなわちジフテリア菌）、エンテロバクター属、エシェリキア属（すなわち大腸菌）、ヘモフィルス属（すなわちインフルエンザ菌）、ヘリコバクター属（すなわちピロリ菌）、クレブシエラ属、レジオネラ属、リステリア属、マイコバクテリウム属（すなわち結核菌）、マイコプラズマ属、ナイセリア属（すなわち、髄膜炎菌、淋菌）、ノカルジア属、パスツレラ属、プロテウス属、リケッチア属、サルモネラ属（すなわち、腸炎菌、チフス菌）、シゲラ属（すなわち赤痢菌）、ブドウ球菌属（すなわち黄色ブドウ球菌）、連鎖球菌属（すなわち肺炎連鎖球菌）、ビブリオ属（すなわちコレラ菌）、コロナウイルス、ＣＭＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ＥＢＶ、肝炎ウイルス（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎）、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプス・ウイルス、パピローマウイルス（ヒト）、ポックスウイルス（すなわち、痘疹、天然痘）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳＶ、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、アスペルギルス属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、コクシジウム属、クリプトスポリジウム属、エントアメーバ属（すなわち赤痢アメーバ）、ジアルジア属（すなわちランブル鞭毛虫）、リーシュマニア属、プラスモジウム属、住血吸虫属、トキソプラズマ属（すなわちトキソプラズマ）、旋毛虫属、及びトリパノソーマ属などが挙げられる。
【００１９】
ある実施の形態では、免疫反応を高めるために、本発明の免疫製剤またはワクチンを１種類以上のアジュバントと共投与してもよい。典型的なアジュバントを表１に示す。
【表１】
2009516519.tif 000003
【００２０】
本発明は、以下の実施例にさらに記載される。実施例は、本発明を単に説明する役割をするものであって、多少なりとも本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【００２１】
ウイルス安定化製剤−材料
以下の化学物質、フィルタ、及びバイアルを下記の実験に使用した：尿素（ロット番号１０１Ｋ００４０、シグマ社製）、粉末Ｌ−アラニン（ロット番号０４２Ｋ０９００、シグマ社製）、ＭＳＧ（ロット番号９１Ｋ００９６、シグマ社製）、粉末Ｌ−アルギニン（ロット番号４２Ｋ０１８３、シグマ社製）、ＥＡＡ（ロット番号３０６５６０５、Gibco社製）、粉末グリシン（ロット番号３２Ｋ２５０２、シグマ社製）、トリス（ロット番号７３３７８Ｂ、BioRad社製）、粉末Ｌ−セリン（ロット番号１１１Ｋ０８８３、シグマ社製）、Ｄ−マンニトール（ロット番号２２Ｋ０１１１、シグマ社製）、ＮＥＡＡ（ロット番号３０６５６０３、Gibco社製）、ＮａＣｌ（ＢＤＨ社ロット番号１２８３３／ＭＯ８９１６０)、濃ＨＣｌ（ロット番号２９９１０２、ＢＤＨ社製）、しょ糖（ロット番号５１Ｋ００２６）、しょ糖（ロット番号０２２Ｋ００６５、シグマ社製；ロット番号Ｋ２７８１９８５３／００７６５３５Ｂ、メルク社製）、ＰＶＰ４０（ロット番号１２０Ｋ０１１７、ロット番号７１Ｋ００６４、シグマ社製）、ソルビトール（ロット番号５１Ｋ０００５、シグマ社製；ロット番号０４２Ｋ０１３５１シグマ社製）、グルタミン酸（ロット番号９１Ｋ００９６、シグマ社製）、バイアル（ＢＶ００３０、３ｍｌ管状の透明ガラスバイアル）、バイアル用ストッパー（３１０１８２０、１３ｍｍ Ｖ−３２ ４４３２／５０ Gray Butyl Serum Stopper Latex free）、シール材（ＣＳ０００１、１３ｍｍワンピース型アルミニウムシール）、フィルタ０．２μｍ（ロット番号４７６２９１、ナルゲン（登録商標）社製；ロット番号Ｍ２ＭＮ００５８６、ZapCap（登録商標）社製）。下記の実験用の典型的なウイルスとして、ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０をコードするＡＬＶＡＣウイルスｖＣＰ３０７、ロット番号ＰＸ−０２４６及びロット番号ＰＸ−０２３０を使用した。
【００２２】
方法−ｐＨ
凍結乾燥及び保存などの取り扱いによってｐＨが変化することから、凍結乾燥されたＡＬＶＡＣ製剤のｐＨの測定は、安定性の重要な指標である。ｐＨメーター（VWR Scientific Products社製ＳＢ３０１シンフォニー）を、試料の予想ｐＨ範囲にわたる標準ｐＨ緩衝液（Orion Application Solutions社製、ｐＨ緩衝液７．００、１０．０１及び４．０１）で調整する。生(fresh portion)の試料を試験管に入れ、そこに電極を浸し、デジタル表示が一定になってから、測定値を小数点以下２桁まで記録する。
【００２３】
オスモル濃度
オスモル濃度は、水溶液の総溶質濃度である。浸透圧計は、分子量またはイオン交換に関係なく、溶質粒子の数を測定する。この研究には、凝固点降下を利用してオスモル濃度を測定するAdvanced Micro-Osmometer Model 3300を使用した。浸透圧計は、製造仕様書に従い、１１３．５ｋＰａ(50mOsm/kg)及び１９２９．５ｋＰａ(850mOsm/kg)の較正基準を用いて調整した。２０μＬの試料をプランジャに充填し、浸透圧計の測定用試料投入口に挿入した。デジタル表示が一定になってから表示を記録する。
【００２４】
残留水分
残留水分（ＲＭ）は、最初に乾燥した後の凍結乾燥生成物中に残る結合水の量である。この研究に使用する、残留水分の試験に用いるカール・フィッシャー法は、容量滴定によって水分含量を決定する。これは、乾燥生成物の総重量と比較した残留水分の重量％として測定される。ＲＭは、保存中の水分曝露についての安定性の指標となる。欧州薬局方（第５版）では、３％未満のＲＭを推奨している。このＲＭは、化学分解及び物理的劣化を防ぐと同時に、微生物の繁殖を回避する手助けとなる。カール・フィッシャー電量法では、電流測定で終点を決定する、三菱化学製の全自動滴定装置ＣＡ−０６モデルを使用する。該装置は、五酸化リン、及び２０〜２５℃の範囲の温度の５ｍｌ／分以下の一定流量の乾燥した空気をと共に、少なくとも相対湿度１５％未満に維持された乾燥ボックス内で稼動させる。重量は、乾燥ボックス内に設置された天秤で量る。
【００２５】
感染価（ＣＣＩＤ５０）
ＣＣＩＤ５０は、ウイルスの力価（感染力）、本事例においては凍結乾燥させたＡＬＶＡＣ製剤の溶解後の力価を決定するのに用いられる技法である。力価は、接種された細胞培養の所定の一群のうち５０％感染させるのに必要とされるウイルスの希釈を示す。測定法は、細胞を破壊するウイルス粒子（細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じさせる能力のあるもの）の存在及び測定に基づいている。宿主細胞は、等量に分けたウイルス希釈液が加えられた、融合性の正常な単層内、典型的には、９６ウェルプレート内で生長させる。培養によりウイルスが複製され、子孫ウイルス粒子が放出され、順々に健康な細胞を感染させる。ＣＰＥを一定期間増殖させ、ウェルについてＣＰＥの有無を記録する。本方法は、希釈ごとのウェル数を増加させることにより、より正確なものとなる。この試験は、保存期間中に弱力化したＡＬＶＡＣウイルスの活性の損失の測定に欠かせないものである。
【００２６】
ＡＬＶＡＣウイルスを凍結乾燥させた生成物試料を、標準作業手順書（ＳＯＰ）Number 22 PD-039 v.1.0に従って９６ウェルプレートに連続的に滴下した。ＱＴ３５（ウズラ）細胞の懸濁液を各ウェルプレートに加えた。３６℃±１℃で６日間培養後、細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したウェル数を数えた。生成物中のウイルスの濃度は、最小二乗法を利用して算出し、生成物１ｍｌあたりの５０％感染用量として表した。
【００２７】
凍結乾燥サイクル
凍結乾燥とは、湿った物質を凍結させ、真空下、得られた凍結物を蒸発させることによって、凝華過程を経て（融解させずに）乾燥状態を達成する脱水法である。この方法は、通常、３つの工程に分けられる。すなわち、凍結前、第一のまたは凝華による乾燥、及び、第２のまたは脱離乾燥(desorption drying)である。以下の表２にまとめたとおり、ＡＬＶＡＣ系発現ベクターを２４時間凍結乾燥サイクルに供した。
【表２】
2009516519.tif 000004
【００２８】
安定化製剤の様々な成分、例えば、アミノ酸、糖（しょ糖、ソルビトール、マンニトール）およびポリマー（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））などの定性的及び定量的寄与を、異なる安定剤を用いた製剤について評価した。成分及び濃度を表３に示す。製剤の安定性は、以下の測定法を利用して評価した：外観、溶解時間、溶解後の外観、ｐＨ値、残留水分、および感染価（ＣＣＩＤ５０）。
【表３】
2009516519.tif 000005
【００２９】
層流条件下、各安定化製剤を調製した。各製剤のｐＨを、製剤ごとに約７．２〜約７．４に合わせた。各製剤を０．２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）使い捨てフィルタに通し、ラベルし、ロット番号を指定し、凍結乾燥されるまで５℃で保存した。
【００３０】
凍結乾燥の１日前に、ＡＬＶＡＣウイルスの粗採取物(crude harvest)（１０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）緩衝液中）を、３０℃±２℃の湯浴で溶解させた。粗採取物から２種類の希釈物（１／２及び１／６）を作製し、１２０ｍｌの大量の最終生成物（ＦＢＰ）を調製した。第１の希釈物は濃縮された安定剤を使用して調製し、第２希釈物は注射用蒸留水（ＷＦＩ）で安定剤を１：２に希釈したものを使用して調製した。
【００３１】
凍結乾燥法の開始には、多くの工程が含まれた。まず、各製剤につき４００本のバイアルを、３ｍｌのＵＳガラスバイアルを用い、アイソレーター中のＦＢＰ０．３ｍｌで満たした。第２に、すべてのバイアルを４種類の保存棚上のトレーに詰め、また、対照として、現行の凍結乾燥用安定剤であるＰＯ６及びＰＯ７についても行った。倒壊を避けるため、各トレーを各保存棚の中央に置き、また、保存棚との直接の接触を避けるため、内側に置いた。チャンバーの前に熱電対を供えたバイアルを置き、生成物の温度をモニタできるようにした。最後に、適合している、２４時間のＡＬＶＡＣ凍結乾燥サイクルを行った（材料及び方法を参照のこと）。
【００３２】
実施後、バイアルを取り出し、ポリビニルカーボン（ＰＶＣ）ストッパーで栓をするとともに、Ａｌｕ-Ａｌｕキャップで密封した。凍結乾燥器のグラフを分析し、サイクルが、不慮の事態を経ることなく、各工程を行ったことが保証された。次に、バイアルを−２０℃に保存し、さらなるサンプリング及び試験に備えた。
【００３３】
凍結乾燥されたタンパク質の安定性における製剤の効果を、実時間安定性試験および促進安定性試験の両方を用いて調べた。様々な時点および様々な温度で（１〜６、８、１２、２６および５２週目のそれぞれについて、−２０℃、２〜８℃、３５〜３９℃）、５試料からなる各セットについて各測定を行った。次に、各試料の以下の特性を記録した：凍結乾燥物の外観、溶解時間、溶解後の外観、ｐＨ及び感染価（ＣＣＤＩ５０）。
【００３４】
次に、さらなる安定性の研究を、最も所望される特性を有する製剤を使用して行った。各測定法は、様々な時点および様々な温度で（０、３、７、１１、１４、２１、２５、２８、３５、５６、８４、１８２、及び３６４日目のそれぞれについて、−２０℃、２〜８℃、３７℃、及び４５℃）、４〜６の試料からなる各セットについて行った。次に、各試料の以下の特性を記録した：凍結乾燥物の外観、溶解時間、溶解後の外観、ｐＨ、残余水分、及び感染価（ＣＣＤＩ５０）。対照及びＦ１２（ｎ＝６）には、４５週目に追加の観察点を加えた。
【００３５】
凍結乾燥されたＡＬＶＡＣ製剤Ｆ１２（先の研究からさらに期間が延長された試料）の最終的な安定性の研究を、１、３、５、８及び１２週目に（ｎ＝６）、バイアルのセットについて、２３〜２７℃で行った。次に、感染価（ＣＣＤＩ５０）、ｐＨ、再構成時間、外観及びオスモル濃度について、製剤を評価した。
【００３６】
安定化製剤
いくつかの新規な安定化製剤を開発し、試験した。こういった各製剤中に含まれる成分を表３に示す。ＰＶＰ４０を製剤に加える際には、特別な注意が必要とされることに注意されたい。ある程度の時間は攪拌速度を上げ、ＰＶＰ４０が溶解したら速度を下げるべきである。速度を上げない場合には、通常、望ましくない凝集物が現れるであろう。当然のことながら当業者に理解されるように、混合時間及び速度は調製量によって異なる。
【００３７】
実験結果
凍結乾燥物の外観
−２０℃及び５℃で５２週間保存後の、種々の製剤について、凍結乾燥物の外観を評価した。最初の実験における製剤Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１及びＦ１２のケーキの外観は、要求仕様書を満たした（バイアルの縁から後退していない滑らかな白層）。これらの所要の「ケーキ」の外観規格は、該製剤が、終局的崩壊または融解からウイルス及び周囲環境を保護することにより、該ウイルスの物理化学的インテグリティを維持可能であることを示唆している。ケーキの崩壊の原因は、長期間の保存または高温など、攻撃的な凍結乾燥工程または保存状態にあるかもしれない。ケーキの適切な外観が、ウイルスの安定化に適した環境を提供することがわかっている。以前に使用された２０種類の必須アミノ酸および非必須アミノ酸の混合物は、凍結乾燥による構造的外観に影響を与えることなく、高濃度のＬ−アルギニン、Ｌ−アラニン、セリン、及び／またはグリシンに置き換え可能であろうこともわかった。
【００３８】
他の数種類の製剤は、バイアルの縁から沸騰／融解し、後退した外観を有し、不均一な外観を呈した（すなわち、滑らかではない、白層）。したがって、これらが外観の基準を満たしていないことから、不合格とした。以下に論ずるように、この外観は、望ましくない溶解時間の遅延と関係があった。これらの不合格となった製剤のそれぞれは、分散剤（すなわち、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ４０）、ソルビトール）が使用されておらず、よって、ケーキの構造におけるこれらの成分の影響が重大であることが実証された。バイアルの縁から崩れ、または後退した外観を呈するこれらの製剤のケーキもまた、外観基準に基づいて不合格とした。
【００３９】
溶解時間、溶解後の外観、ｐＨ、およびオスモル濃度
−２０℃及び５℃での５２週間の保存後の製剤Ｆ９の溶解時間は、他の安定剤（Ｆ１０〜１２）が１５秒未満で溶解したのに比べて、わずかに増加した。各バイアルを１ｍｌの０．４％ＮａＣｌで再構成し、ケーキ全体が溶解するまで手動でかき混ぜた。ＰＶＰ４０を含有させることにより、最終製品の溶解時間に好ましい効果をもたらすことが結論付けられた。ストレスがかかった条件下（３５〜３７℃）で保存された試料では、溶解時間は、すべての製剤で、１５秒〜１分を超えるまでに大幅に増加した。さらには、ケーキの外観が融解している場合、バイアル中に保存されていた製品は、凍結乾燥物を再構成することが困難であった。
【００４０】
試験したすべての条件下のすべての製剤において、ｐＨは７．５±０．５の安定した状態が保たれた。
【００４１】
製剤Ｆ１２では、オスモル濃度は７９４．５±２２７ｋＰａ（350±100mOsm/kg）であった。
【００４２】
残留水分
製剤Ｆ１２では、残留水分は＜３％であり、欧州薬局方（第５版）の勧告に準拠していた。他の製剤については試験を行なわなかった。
【表４】
2009516519.tif 000006
【００４３】
感染価
ウイルス活性の著しい減少は、約１０〜２０％を超える活性の降下と考えられている。すべての製剤が、−２０℃および２〜８℃での５２週間の保存後において、その感染価を維持しているように思われた。試験されたすべての製剤が、対照と同様の結果を有し、このことから、本方法の正確性（±０．３ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌ)が確認された。ストレス条件では、対照の感染価と試験された製剤の感染価は、３５〜３７℃で丸８週間、維持された。
【００４４】
液体と凍結乾燥製剤の安定性
上記の結果を踏まえて、Ｆ１２（凍結乾燥物）を液体製剤（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ中のＡＬＶＡＣ、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）との比較用に選択した。これらの製剤を、「実時間」（２〜８℃）及びストレスまたは促進条件下（２３〜２５℃及び３５〜３９℃）の両方において感染価の安定性を比較し、また、対照条件（−７０℃及び−２０℃）とも比較した。両製剤とも、等容積、等量のＡＬＶＡＣ精製採取物を用いて調製した。感染価を、ＣＣＩＤ５０測定法を用いて測定した。図１に示すように、凍結乾燥したＦ１２は、２〜８℃の液体製剤（及び−２０℃及び−７０℃の対照温度）と同様の結果を示し、２５℃及び３７℃では、液体製剤よりも優れた感染価を示した。Ｆ１２が凍結乾燥された製剤であり、当業者にとって好ましい製剤の形式であることから、Ｆ１２が、現在利用可能な液体製剤よりも優れていると結論付けることができる。
【００４５】
ＰＶＰ４０及び／またはソルビトールなどの分散剤を含めた本明細書に記載の研究は、凍結乾燥製剤の外観（すなわち、「ケーキ」）の維持に不可欠であり、所望の溶解特性を機能的に予測するものである。さらには、２０種類の必須アミノ酸および非必須アミノ酸の以前に使用した混合物を、感染価を維持しつつ、凍結乾燥物の構造的外観に影響を与えることなく、高濃度のＬ−アルギニン、Ｌ−アラニン、セリン、及び／またはグリシンと置換して差し支えないことは、明白である。これは、製剤の調製工程の単純化およびそれに関連して費用を低減できるという点において特に有意義である。感染価のデータに基づく結果は、様々な製剤において有意な差異は示されなかった。すべての製剤で、２〜８℃で５２週間、感染価を維持することができた。
【００４６】
本発明は、好ましい実施の形態に関して述べてきたが、当業者が変更及び／または修正を行ないうることは理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲が、請求する本発明の範囲内に入るであろうこういった等価的変化のすべてを包含することが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】液体製剤と、本発明の一実施形態である新規の凍結乾燥製剤Ｆ１２（ＦＤ）についての、様々な温度における組換えウイルス製剤の安定性の比較。表示されている時間ごとに各ウイルス製剤の感染価（ＣＣＩＤ５０）を測定した。
【図１】
2009516519.tif 000007
【国際調査報告】
2009516519.tif 000008
2009516519.tif 000009
2009516519.tif 000010
2009516519.tif 000011
2009516519.tif 000012