(57)【要約】  本発明は、ヒトにおいてヒトスルビビンに対する免疫応答を誘発して、スルビビンを過剰発現している腫瘍罹患細胞を攻撃するワクチン組成物を提供する。特に、本発明は、非哺乳類スルビビン由来の、および哺乳類、特にヒトの改変されたスルビビン由来のペプチドを含むワクチン組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける腫瘍および腫瘍関連疾患の治療に使用するためのワクチンであって、
（ａ）ヒトスルビビンのＡｓｐ１６からＬｅｕ８７にわたるＢＩＲドメインとのアミノ酸同一性が５０％と９０％との間であるＢＩＲドメインを含む非哺乳類スルビビン由来のペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸、または
（ｂ）ＢＩＲドメインに備わっている生物学的活性を実質的に消失するＢＩＲドメイン内の変異を含む改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸、および
（ｃ）場合によってアジュバントを含み、
ヒトにおいてヒトスルビビンに対する免疫応答を惹起するワクチン。
【請求項２】
ワクチンによって引き起こされた前記免疫応答が、ヒトスルビビンを発現する細胞を攻撃するＣＤ８+Ｔ細胞を生じさせる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ペプチドが非哺乳類スルビビン由来である、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ＢＩＲドメインの前記ヒトスルビビンＢＩＲドメインとのアミノ酸同一性が５０％と８０％との間である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記非哺乳類スルビビンが鳥類、魚類、は虫類または両生類由来である、請求項３または４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記非哺乳類スルビビンがニワトリ由来である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
非哺乳類スルビビン由来の前記ペプチドが、ＭＨＣ分子に結合することによってＴ細胞抗原提示を促進する１個または複数の変異を含む、請求項３から６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
前記非哺乳類スルビビンがニワトリのものであり、前記変異がニワトリスルビビンのＡｓｎ９７、Ｔｈｒ９９、Ｖａｌ１００またはＧｌｎ１０１の位置の１個または複数でのアミノ酸置換である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記変異が以下の、Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００ＬまたはＱ１０１Ｇの１個または複数である、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記変異がＮ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００ＬおよびＱ１０１Ｇであり、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記非哺乳類スルビビンが、ＢＩＲドメインに備わっている生物学的活性を実質的に消失するＢＩＲドメイン内の変異を含む、請求項３から１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
消失する前記生物学的活性がアポトーシスである、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
非哺乳類スルビビン由来の前記ペプチドが、ヒトスルビビンのＡｒｇ１８、Ｐｒｏ４７、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７およびＣｙｓ８４に対応する位置の１個または複数にアミノ酸置換を含有する、請求項１１または１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
ＭＨＣ分子と結合したとき、ヒトスルビビンペプチド配列を認識するＴ細胞を活性化することができる、請求項３から１３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ヒトスルビビンペプチド配列がＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、ＣＰＴＥＮＥＰＤＬおよびＥＰＤＬＡＱＣＦＦからなるペプチドの群から選択された、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ペプチドが、改変された哺乳類スルビビン由来である、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記改変された哺乳類スルビビンがヒトスルビビンである、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
改変されたヒトスルビビン由来の前記ペプチドが、ヒトスルビビンのＡｒｇ１８、Ｐｒｏ４７、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７およびＣｙｓ８４の位置の１個または複数にアミノ酸置換を含有する、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
改変された哺乳類スルビビン由来である前記ペプチドが、改変されたヘリカルドメインを含む、請求項１６から１８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
改変されたヒトスルビビン由来の前記ペプチドが、ヒトスルビビンのＬｙｓ１２２、Ａｌａ１２８およびＩｌｅ１３５の位置の１個または複数にアミノ酸置換を含有する、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記変異が以下の、Ａｌａ１２８ＰおよびＩｌ２１３５Ｐの１個または複数である、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
以下の変異、Ｒ１８Ｅ、Ｐ４７Ｌ、Ｑ５６Ｌ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８ＰおよびＩ１３５Ｐを有する改変されたヒトスルビビンおよび配列番号５６に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１７から２１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２３】
前記改変された哺乳類スルビビンペプチドが、アミノ酸配列ＬＴＬＧＥＦＬＫＬまたはＬＭＬＧＥＦＬＫＬを含む、請求項１６または１７に記載のワクチン。
【請求項２４】
非哺乳類スルビビン由来のペプチドおよび改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドがＦｃ部分と融合している、請求項１から２３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２５】
エフェクター分子由来のペプチドをさらにコードするか、または含む、請求項１から２４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２６】
前記エフェクター分子がＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択されたサイトカインである、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
非哺乳類スルビビンまたは改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードする前記核酸が哺乳類プロモーターを含む、請求項１から２６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２８】
前記核酸が裸ＤＮＡである、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記核酸が、哺乳類細胞へのトランスフェクションを促進する試薬とともに製剤化された、請求項１から２８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項３０】
前記核酸がウイルス粒子の一部である、請求項１から２９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項３１】
前記ウイルス粒子がアデノウイルス粒子である、請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記ワクチンが前記核酸を含む細菌を含む、請求項１から３１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項３３】
前記細菌が腸内細菌である、請求項３２に記載のワクチン。
【請求項３４】
前記細菌がサルモネラである、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれかに記載のワクチンを、許容される担体、希釈剤または賦形剤と場合によって一緒に含む、スルビビンを過剰発現している腫瘍細胞に対してヒトを免疫するための医薬組成物。
【請求項３６】
ヒトスルビビンを過剰発現している腫瘍細胞に対して患者を免疫するための医薬品を製造するための、請求項１から３４のいずれかに記載のワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腫瘍を治療するためのワクチン戦略に関する。具体的に、本発明は、ヒトにおいてヒトスルビビンに対する免疫応答を誘発して、スルビビンを過剰発現している腫瘍罹患細胞を攻撃するワクチン組成物に関する。特に、本発明は、非哺乳類スルビビン由来、および哺乳類、特にヒトの改変されたスルビビン由来のペプチドを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
免疫系は、一つには、細胞のタンパク質組成をモニターすることによってその監視機能を実行する。Ｔ細胞抗原提示と称されるプロセスにおいて、細胞内のタンパク質はペプチドに処理される。処理されたペプチドのサブセットである抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体として知られている受容体の１クラスの１メンバーと特異的に結合して、細胞表面に運ばれる。これらのＭＨＣ−ペプチド複合体は、特殊化された免疫細胞、Ｔ細胞によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られているＴ細胞表面タンパク質との相互作用を介して抽出される。所与のＴ細胞はそれぞれ、表面上に固有のＴＣＲを備えている。Ｔ細胞のＴＣＲとＭＨＣ−ペプチド複合体との生産的な相互作用によって、免疫応答が活性化され、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞の排除が引き起こされる。一般的に、提示された抗原が宿主由来、すなわち「自己」抗原の場合、相互作用は、非生産的である。通常、免疫応答は、外来タンパク質由来の抗原、例えば、感染ウイルスの構成タンパク質由来の抗原と相互作用することによって活性化される。
【０００３】
活性免疫化によって腫瘍を治療する目的は、腫瘍細胞を認識して、排除する免疫系を誘導することである。その他のあらゆる細胞と同様に、腫瘍細胞上のペプチド抗原は、発現したタンパク質の全範囲から得られる。腫瘍で個別に発現したタンパク質から得られた腫瘍に豊富な抗原は、ウイルス抗原が感染細胞中に存在するのとちょうど同じように、原則として免疫監視の標的となる。したがって、腫瘍を排除する目的のために、細胞内感染に対抗するために進化した免疫系の分岐を利用することは有用である。
【０００４】
このような腫瘍で豊富な１タンパク質は、スルビビンである。腫瘍細胞はしばしば、スルビビンタンパク質を過剰発現し、アポトーシスを遮断して、腫瘍細胞の異常増殖を防ぐ機構を妨害すると考えられている。他方、正常細胞は、スルビビンをほとんど発現しない（例えば、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ他、（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：９１７〜９２１を参照）。したがって、スルビビンは、理想的な腫瘍特異的または腫瘍に豊富な抗原である。このことは、スルビビンに対する免疫応答を誘発するように、抗原型のスルビビンタンパク質を抗原提示細胞に輸送するために役立つだろう。しかし、ウイルス感染細胞とは対照的に、スルビビンは、腫瘍で個別に発現しているその他の多くのタンパク質と同様に、宿主タンパク質であり、免疫系を活性化しない。したがって、腫瘍細胞、特にスルビビンの過剰発現が特徴である腫瘍細胞に対して効果的に免疫応答を惹起するのに有効な組成物および方法を開発することが、当業界では依然として必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、腫瘍細胞に対して効果的に免疫応答を惹起するのに有効な組成物および方法を提供する。具体的に、本発明は、Ｔ細胞抗原として、腫瘍に豊富なタンパク質の抗原型を使用したワクチン接種戦略を提供する。特に、本発明は、腫瘍に豊富なタンパク質、スルビビンの抗原型を提供する。
【０００６】
したがって、本発明は、一態様では、非哺乳類スルビビン由来の少なくとも１種のペプチドをコードする核酸を含むワクチンに関する。あるいは、本発明は、非哺乳類スルビビン由来の少なくとも１種のペプチドを含むワクチンに関する。本明細書で使用した「非哺乳類スルビビン」は、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとのアミノ酸同一性が５０％超９０％未満である、例えば、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとの同一性が少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％であるＢＩＲドメイン（またはＩＡＰドメイン）を含む任意のスルビビンタンパク質を少なくとも包含する。「非哺乳類スルビビン」には、当業者に公知の非哺乳類種で同定された任意のスルビビンタンパク質も含まれる。本明細書で使用した「ペプチド」は、完全長スルビビンタンパク質を含む、任意の数のアミノ酸を有するペプチドを包含する。特に、ペプチドは、少なくとも８、９、１０、１５、２０、２５、３０個以上のアミノ酸を含有することができる。
【０００７】
好ましい一実施形態では、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードする核酸が含まれる。核酸は、哺乳類のプロモーターを含んでよい。一実施形態では、核酸は裸ＤＮＡである。他の実施形態では、核酸は哺乳類細胞へのトランスフェクションを促進する試薬とともに製剤化される。本発明のワクチンはアジュバントも含んでよい。
【０００８】
一実施形態では、核酸はウイルス粒子、例えば、アデノウイルス粒子の一部である。本発明に適したアデノウイルス粒子には、複製可能なアデノウイルス由来のもの、または特定の細胞でのみ、もしくは特定の条件下でのみ複製する条件付きで複製するアデノウイルス（「ＣＲＡＤ」）由来のもの、または複製能力がないアデノウイルス由来のものが含まれる。その他の適切なウイルス粒子には、限定はしないが、ほんの少数の例を挙げれば、レンチウイルスもしくはその他のＲＮＡウイルス、アデノ随伴ウイルス、ロタウイルス、またはワクシニアウイルス由来のウイルス粒子が含まれる。
【０００９】
一実施形態では、ワクチンは核酸を含有する細菌を含む。好ましくは、この細菌は腸内細菌、例えば、サルモネラ、大腸菌またはクレブシラである。その他の細菌、例えば、リステリア種もこのような核酸の宿主となるために使用することができる。この細菌は、野生型細菌であってよく、または、例えば、その病原性を弱めた変異を含有してよい。一般的に、細菌の変異型、例えば、栄養要求体を使用することが好ましい。
【００１０】
他の好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、非哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードするか、または含む。好ましくは、非哺乳類スルビビン由来のペプチドには、ＢＩＲドメインが含まれる。一般的に、非哺乳類スルビビン由来のＢＩＲドメインは、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとのアミノ酸同一性が５０％超８０％未満である。非哺乳類スルビビンは、鳥類、魚類、は虫類、両生類またはその他の脊椎動物から得られる。好ましい実施形態では、非哺乳類スルビビンは、ニワトリから得られる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、Ｔ細胞抗原提示を促進する変異を有する非哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードするか、または含む。例えば、非哺乳類スルビビン変異ペプチドは、ヒトスルビビンのＡｓｎ９７、Ｔｈｒ９９、Ｖａｌ１００またはＧｌｎ１０１に対応する位置にアミノ酸置換を含有してよい。より具体的には、ニワトリまたはその他の種由来の非哺乳類スルビビンは、以下のアミノ酸置換、Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００ＬまたはＱ１０１Ｇの１つを含有してよい。他の例では、カエルＳＩＸスルビビン由来のペプチドは、同等の位置Ｔｈｒ１１０および／またはＳｅｒ１１２に置換を含有する。具体的な例では、カエルＳＩＸスルビビン由来のペプチドは、Ｔｈｒ１１０Ｍｅｔおよび／またはＳｅｒ１１２Ｇｌｙの置換を含有する。
【００１２】
その他の実施形態では、本発明のワクチンは、ＢＩＲドメインの生物学的活性が潜在的に消失する変異を有する非哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードするか、または含む。例えば、非哺乳類スルビビン由来のペプチドは、ヒトスルビビンのＡｒｇ１８、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７またはＣｙｓ８４に対応する位置に少なくとも１個のアミノ酸置換を含有してよい。
【００１３】
さらに、非哺乳類スルビビンは、場合によってアミノ酸欠失を含有してよい。一実施形態では、非哺乳類スルビビン部分は、Ｃ末端に欠失を含有する。他の実施形態では、非哺乳類スルビビンは、Ｎ末端に欠失を含有する。
【００１４】
その他の実施形態では、本発明のワクチンは、癌細胞上でＭＨＣ分子と結合したとき、ヒトスルビビンペプチド配列を認識するＴ細胞を活性化することができる。具体的に、このようなヒトスルビビンペプチド配列は、例えば、ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１）、ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ（配列番号２）またはＥＰＤＬＡＱＣＦＦ（配列番号３）であってよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、非哺乳類スルビビン由来のペプチドは、Ｆｃ部分と融合するか、または結合している。好ましいＦｃ部分は、哺乳類Ｆｃ領域由来で、より好ましくはヒトＦｃ領域由来である。Ｆｃ部分は、集合を改善する変異、例えば、ＩｇＧ１ヒンジの配列ＥＰＫＳＣＤＫ（配列番号４）のシステインとセリンの置換を含有してよい。結果的に、Ｆｃ部分は、改変された配列ＥＰＫＳＳＤＫ（配列番号５）を含有してよい。Ｆｃ部分はまた、免疫応答が望ましくない領域、例えば、融合タンパク質間の連結点の免疫原性を減少させる変異を含有してよい。
【００１６】
選択された実施形態では、非哺乳類スルビビン由来のペプチドは、免疫応答に寄与するエフェクター分子と相まって作用する。例えば、このようなエフェクター分子は、限定はしないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカイン成分、または任意のその他のサイトカイン、特にＴｈ１免疫応答を活性化できるものであってよい。このようなエフェクター分子はまた、免疫系を抑制するサイトカインの阻害剤、例えば、ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ＳＴＡＴ３βなどのドミナントネガティブＳＴＡＴ３タンパク質）であってよい。サイトカインまたはその他のエフェクター分子はまた、変異を含有してよい。例えば、サイトカインは、ＩＬ−２のＣｙｓ１２５に対応する位置にＳｅｒ置換を含有してよい。
【００１７】
したがって、好ましい実施形態では、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビン由来のペプチドおよび免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドをコードする核酸が含まれる。非哺乳類スルビビンペプチドおよびエフェクター分子ペプチドをコードする領域は、単一の転写単位、または２つに分離した転写単位に存在することができる。あるいは、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードする核酸および免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドをコードする別の核酸が含まれる。
【００１８】
その他の実施形態では、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビン由来のペプチドおよび免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドが含まれる。一実施形態では、非哺乳類スルビビン由来のペプチドは、エフェクター分子を含むペプチドと融合するか、または結合している。非哺乳類スルビビンおよびエフェクター分子融合タンパク質は、前述のようにＦｃ部分とさらに融合しているか、または結合していてよい。
【００１９】
他の態様では、本発明は、改変された哺乳類スルビビンペプチドをコードする核酸を含むワクチンに関する。あるいは、本発明は、改変された哺乳類スルビビンペプチドを含むワクチンに関する。改変された哺乳類スルビビンペプチドは、生物学的に不活性であるが、哺乳類スルビビンと免疫学的に実質的に類似である。本明細書で使用したように、「生物学的に不活性」とは、正常なスルビビンに通常関連した活性を実質的に発揮できないか、または影響を及ぼすことができないスルビビンペプチドを意味する。例えば、「生物学的に不活性」なスルビビンペプチドは、実質的にアポトーシス阻害活性を持たず、内在性スルビビンタンパク質に通常関連しているアポトーシス阻害活性を実質的に妨害することができない。生物学的に不活性なスルビビンは一般的に、実質的にドミナントネガティブ効果を持たない。本明細書で使用したように、「哺乳類スルビビンと免疫学的に実質的に類似である」とは、対応する改変していない哺乳類スルビビンペプチドの標的配列に対する免疫応答と同様の免疫応答を少なくとも１種惹起することができる改変されたスルビビンペプチドを意味する。免疫応答は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団または標的配列に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出によって測定することができる。
【００２０】
好ましい一実施形態では、本発明のワクチンには、改変された哺乳類スルビビンペプチドをコードする核酸が含まれる。核酸は、哺乳類のプロモーターを含んでよい。一実施形態では、核酸は裸ＤＮＡである。他の実施形態では、核酸は哺乳類細胞へのトランスフェクションを促進する試薬とともに製剤化される。本発明のワクチンはアジュバントも含んでよい。
【００２１】
一実施形態では、改変された哺乳類スルビビンペプチドをコードする核酸はウイルス粒子、例えば、アデノウイルス粒子の一部である。本発明に適したアデノウイルス粒子には、複製可能なアデノウイルス由来のもの、または特定の細胞でのみ、もしくは特定の条件下でのみ複製する条件付きで複製するアデノウイルス（「ＣＲＡＤ」）由来のもの、または複製能力がないアデノウイルス由来のものが含まれる。その他の適切なウイルス粒子には、限定はしないが、ほんの少数の例を挙げれば、レンチウイルスもしくはその他のＲＮＡウイルス、アデノ随伴ウイルス、ロタウイルス、またはワクシニアウイルス由来のウイルス粒子が含まれる。
【００２２】
一実施形態では、ワクチンには、改変された哺乳類スルビビンペプチドをコードする核酸を含有する細菌が含まれる。好ましくは、この細菌は腸内細菌、例えば、サルモネラ、大腸菌またはクレブシラである。その他の細菌、例えば、リステリア種もこのような核酸の宿主にするために使用することができる。この細菌は、野生型細菌であってよく、または例えばその病原性を弱めた変異を含有してよい。一般的に、細菌の変異型、例えば、栄養要求体を使用することが好ましい。
【００２３】
他の好ましい実施形態では、本発明のワクチンには、改変された哺乳類スルビビンペプチドが含まれる。好ましくは、改変された哺乳類スルビビンペプチドには、改変されたＢＩＲドメインが含まれる。改変されたＢＩＲドメインは、ヒトスルビビンのＡｒｇ１８、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７およびＣｙｓ８４に対応する位置に少なくとも１個のアミノ酸置換を含んでよい。あるいは、または、さらに、改変された哺乳類スルビビンペプチドには、改変されたヘリカルドメインが含まれる。改変されたヘリカルドメインは、ヒトスルビビンのＬｙｓ１２２、Ａｌａ１２８およびＩｌｅ１３５に対応する位置に少なくとも１個のアミノ酸置換を含んでよい。例えば、改変されたヘリカルドメインは、ヒトスルビビンのＡｌａ１２８に対応する位置にＰｒｏを含有してよい。改変されたヘリカルドメインは、Ｉｌｅ１３５に対応する位置にＰｒｏを含んでいてもよい。改変された哺乳類スルビビンペプチドは、１個または複数のＭＨＣクラスＩＴ細胞エピトープを含有することが好ましい。例えば、改変された哺乳類スルビビンペプチドは、アミノ酸配列ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１）またはＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号６）を含んでよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、改変された哺乳類スルビビンペプチドには、Ｆｃ部分と融合している。好ましいＦｃ部分は、哺乳類Ｆｃ領域由来で、より好ましくはヒトＦｃ領域由来である。Ｆｃ部分は、集合を改善する変異、例えば、ＩｇＧ１ヒンジの配列ＥＰＫＳＣＤＫ（配列番号４）のシステインとセリンの置換を含有してよい。結果的に、Ｆｃ部分は、改変された配列ＥＰＫＳＳＤＫ（配列番号５）を含有してよい。Ｆｃ部分はまた、免疫応答が望ましくない領域、例えば、融合タンパク質成分間の連結点の免疫原性を減少させる変異を含有してよい。
【００２５】
ある種の実施形態では、改変された哺乳類スルビビンペプチドは、免疫応答に寄与するエフェクター分子と相まって作用する。例えば、このようなエフェクター分子は、限定はしないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカイン成分、または任意のその他のサイトカイン、特にＴｈ１免疫応答を活性化できるものであってよい。このようなエフェクター分子はまた、免疫系を抑制するサイトカインの阻害剤、例えば、ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ＳＴＡＴ３βなどのドミナントネガティブＳＴＡＴ３タンパク質）であってよい。サイトカインまたはその他のエフェクター分子はまた、変異を含有してよい。例えば、サイトカインは、ＩＬ−２のＣｙｓ１２５に対応する位置にＳｅｒ置換を含有してよい。
【００２６】
したがって、好ましい実施形態では、本発明のワクチンには、改変された哺乳類スルビビンペプチドおよび免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドをコードする核酸が含まれる。改変された哺乳類スルビビンペプチドおよびエフェクター分子ペプチドをコードする領域は、単一の転写単位、または２つに分離した転写単位に存在することができる。あるいは、本発明のワクチンには、改変された哺乳類スルビビンペプチドをコードする核酸および免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドをコードする別の核酸が含まれる。
【００２７】
その他の実施形態では、本発明のワクチンには、改変された哺乳類スルビビンペプチドおよび免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドが含まれる。一実施形態では、改変された哺乳類スルビビンペプチドは、エフェクター分子を含むペプチドと融合するか、または結合している。改変された哺乳類スルビビンペプチドおよびエフェクター分子融合タンパク質は、前述のようにＦｃ部分とさらに融合しているか、または結合していてよい。
【００２８】
他の態様では、本発明は、ヒトスルビビンを発現する細胞に対する免疫応答を惹起することができる核酸に関する。この核酸は、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとの同一性が５０％超８０％未満であるアミノ酸配列を含むペプチドをコードし、この核酸は、哺乳類細胞のペプチドを発現することができるプロモーターを含有する。
【００２９】
本発明はまた、前述のワクチンまたは核酸を投与することを含む治療方法に関する。特に、本発明は、癌および所望しない細胞増殖が関連する他の疾患の治療方法を提供する。本発明の治療方法は、その他のステップ、例えば、高レベルのスルビビンの発現について患者の腫瘍を最初に試験するステップを場合によって含んでよい。他の任意選択のステップは、本発明のワクチンまたは核酸を投与する前に、患者を弱い免疫抑制剤、例えば、低用量のシクロホスファミドで前処理することである。理論によって結びつけることは望まないが、このような前処理の１効果は、制御性Ｔ細胞の数を減少させることである。したがって、同様の効果を有するその他の前処理は本発明に包含される。
【００３０】
スルビビンに加えて、本発明は、抗原として利用できる多種多様なタンパク質、例えば、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原およびその他の抗原に適用することができる。本発明は、スルビビンに加えて、腫瘍特異的抗原の中でも上皮細胞接着分子、Ｒａｓなどの癌遺伝子、癌胎児抗原およびその他の腫瘍特異的、または腫瘍に豊富なタンパク質に適用することができる。本発明は、ウイルス抗原の中でもＨＩＶのｐ２４、インフルエンザ赤血球凝集素およびその他のウイルスタンパク質に適用することができる。
【００３１】
要するに、本発明は以下に関する。
・ヒトにおける腫瘍および腫瘍関連疾患の治療に使用するためのワクチンであって、
（ａ）ヒトスルビビンのＡｓｐ１６からＬｅｕ８７にわたるＢＩＲとのアミノ酸同一性が５０％と９０％との間であるＢＩＲドメインを含む非哺乳類スルビビン由来のペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸、または（ｂ）ＢＩＲドメインに備わっている生物学的活性を実質的に消失するＢＩＲドメイン内の変異を含む改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸、および（ｃ）場合によってアジュバントを含み、ヒトにおいてヒトスルビビンに対する免疫応答を惹起するワクチン。
・ワクチンによって引き起こされた前記免疫応答が、ヒトスルビビンを発現する細胞を攻撃するＣＤ８+Ｔ細胞を生じさせる対応するワクチン。
・ペプチドが非哺乳類スルビビン由来である対応するワクチン。
・前記ＢＩＲドメインが、前記ヒトスルビビンＢＩＲドメインとのアミノ酸同一性が５０％と８０％との間である対応するワクチン。
・非哺乳類スルビビンが鳥類、魚類、は虫類または両生類、好ましくはニワトリ由来である対応するワクチン。
・非哺乳類スルビビン由来のペプチドが、ＭＨＣ分子に結合することによってＴ細胞抗原提示を促進する１個または複数の変異を含む対応するワクチン。
・非哺乳類スルビビンがニワトリのものであり、変異がニワトリスルビビンのＡｓｎ９７、Ｔｈｒ９９、Ｖａｌ１００またはＧｌｎ１０１の位置の１個または複数でのアミノ酸置換である対応するワクチン。好ましい変異は、Ｎ９７Ｅおよび／またはＴ９９Ｍおよび／またはＶ１００Ｌおよび／またはＱ１０１Ｇである。
・変異がＮ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００ＬおよびＱ１０１Ｇである配列番号１２のワクチン。
・非哺乳類スルビビンが、ＢＩＲドメインに備わっている生物学的活性を実質的に消失するＢＩＲドメイン内の変異を含む対応するワクチン。
・消失する前記生物学的活性がアポトーシスである対応するワクチン。
・非哺乳類スルビビン由来の前記ペプチドが、ヒトスルビビンのＡｒｇ１８、Ｐｒｏ４７、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７およびＣｙｓ８４に対応する１個または複数の位置にアミノ酸置換を含有する対応するワクチン。
・ＭＨＣ分子と結合したとき、ヒトスルビビンペプチド配列を認識するＴ細胞を活性化することができる対応するワクチンであって、前記ヒトスルビビンペプチド配列がＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、ＣＰＴＥＮＥＰＤＬおよびＥＰＤＬＡＱＣＦＦからなるペプチドの群から選択されることが好ましいワクチン。
・ペプチドが、改変された哺乳類スルビビン、好ましくはヒトスルビビン由来である対応するワクチン。
・改変されたヒトスルビビン由来の前記ペプチドが、ヒトスルビビンのＡｒｇ１８、Ｐｒｏ４７、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７およびＣｙｓ８４の１個または複数の位置にアミノ酸置換を含有する対応するワクチン。
・改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドが、改変されたヘリカルドメインを含み、ヒトスルビビンのＬｙｓ１２および／またはＡｌａ１２８および／またはＩｌｅ１３５の位置にアミノ酸置換を含有する対応するワクチン。
・変異が少なくともＡｌａ１２８Ｐおよび／またはＩｌ２１３５Ｐである対応するワクチン。
・以下の変異、Ｒ１８Ｅ、Ｐ４７Ｌ、Ｑ５６Ｌ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８ＰおよびＩ１３５Ｐを有する改変されたヒトスルビビンを含む配列番号５６のワクチン。
・改変された哺乳類スルビビンペプチドが、アミノ酸配列ＬＴＬＧＥＦＬＫＬまたはＬＭＬＧＥＦＬＫＬを含む対応するワクチン。
・非哺乳類スルビビン由来のペプチドおよび改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドがＦｃ部分と融合している対応するワクチン。
・エフェクター分子、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択されたサイトカイン由来のペプチドをさらにコードするか、または含む対応するワクチン。
・非哺乳類スルビビンまたは改変された哺乳類スルビビン由来のペプチドをコードする核酸が哺乳類プロモーターを含み、好ましくは裸ＤＮＡである対応するワクチン。
・核酸が、哺乳類細胞へのトランスフェクションを促進する試薬とともに製剤化されている対応するワクチン。
・核酸がウイルス粒子、好ましくはアデノウイルス粒子の一部である対応するワクチン。
・核酸を含む細菌を含み、細菌が好ましくは腸内細菌、より好ましくはサルモネラである対応するワクチン。
・特許請求の範囲および明細書のいずれかに記載のワクチンを、許容される担体、希釈剤または賦形剤と場合によって一緒に含む、スルビビンを過剰発現している腫瘍細胞に対してヒトを免疫するための医薬組成物。
・ヒトスルビビンを過剰発現している腫瘍細胞に対して患者を免疫するための医薬品を製造するための対応するワクチンの使用。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１は、スルビビン相同体のタンパク質配列のアラインメントである。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ法によって実施した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０参照）。配列は、以下のアクセッション番号を使用して、ＮＣＢＩデータベースから入手した。ヒトスルビビン（アクセッション番号ＮＷ＿００１１６８、配列番号８）、イヌスルビビン（ＮＰ＿００１００３０１９、配列番号９）、ブタスルビビン（ＮＰ＿９９９３０６、配列番号３９）、ウシスルビビン（ＮＰ＿００１００１８５５、配列番号４０）、ネコスルビビン（ＮＰ＿００１００９２８０、配列番号４１）、マウススルビビン（ＮＰ＿０３３８１９、配列番号１０）、ラットスルビビン（ＡＡＦ８２５８６、配列番号４２）、オランウータンスルビビン（ＣＡＨ９１２３１、配列番号４３）、ニワトリスルビビン（ＮＰ＿００１０１２３１８、配列番号１１）、アフリカツメガエルＳＩＸ（ＡＡＯ２００８５、配列番号１３）、アフリカツメガエルスルビビン相同体（ＡＡＭ７６７１４、配列番号４６）、アフリカツメガエルスルビビン相同体２（ＡＡＨ８９２７１、配列番号４７）、ナマズスルビビン相同体（ＣＫ４１９４６６、配列番号５２）、ゼブラフィッシュスルビビン相同体（(ＮＰ＿９１９３７８、配列番号４８）、ゼブラフィッシュスルビビン相同体２（ＮＰ＿６６０１９６、配列番号４９）、フグスルビビン様相同体（ＣＡＧ０４４３２、配列番号５０）およびフグスルビビン様相同体２（ＣＡＧ０７４３３、配列番号５１）。ＢＩＲドメインには下線が引いてある。アスタリスクはＺｎ配位に関与する表記残基を示し、波線はアラインメントのギャップを示す。非ヒト配列において、ヒト残基と同一の残基は、ピリオドによって表し、その他の残基は１文字アミノ酸コードで表す。
【００３３】
図２は、様々なスルビビン相同体のＢＩＲドメインを比較するためのアミノ酸のパーセント同一性を示した表である。配列１は、ヒト配列、配列２はイヌ由来、配列３はブタ由来、配列４はウシ由来、配列５はネコ由来、配列６はマウス由来、配列７はラット由来、配列８はオランウータン由来、配列９はニワトリ由来、配列１０はアフリカツメガエルＳＩＸタンパク質由来、配列１１はアフリカツメガエル相同体由来、配列１２はアフリカツメガエル相同体２由来、配列１３はナマズ相同体由来、配列１４はゼブラフィッシュ相同体由来、配列１５はゼブラフィッシュ相同体２由来、配列１６はフグスルビビン様タンパク質１由来、および配列１７はフグスルビビン様タンパク質２由来である。
【００３４】
図３は、無脊椎動物のＢＩＲドメイン配列とヒトスルビビンとのアラインメントである。ヒトスルビビンＢＩＲドメイン配列を配列番号６３に示す。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ法によって実施した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０参照）。配列は、以下のアクセッション番号を使用して、ＮＣＢＩデータベースから入手した。ヒトスルビビン（ＮＭ＿００１１６８、配列番号６３で示したＢＩＲドメイン配列）、キイロショウジョウバエ（ＡＡＦ５５３９９、配列番号５３で示したＢＩＲドメイン相同体）およびエレガンス線虫（ＮＰ＿５０５９４９、配列番号５４で示したＢＩＲドメイン相同体）。ＢＩＲドメインには下線が引いてある。アスタリスクは、Ｚｎ配位に関与する表記残基を示し、波線はアラインメントのギャップを示す。非ヒト配列において、ヒト残基と同一の残基は、ピリオドによって表し、その他の残基は１文字アミノ酸コードで表す。
【００３５】
図４は、スルビビンポリペプチドをコードしているプラスミドを有するサルモネラによるＤＮＡワクチン接種の方法の概略を示す。腸管内腔のサルモネラはバイエル板のＭ細胞によって腸管上皮に侵入する。一旦上皮に入ると、サルモネラはマクロファージおよび樹状細胞などの細胞に侵入する。細菌死およびプラスミド輸送によって、マクロファージによるプラスミド発現が可能になり、ＭＨＣクラスＩ分子におけるコードされたスルビビンポリペプチドからのペプチドの提示が引き起こされる。さらに、スルビビンポリペプチドを発現しているアポトーシスマクロファージの樹状細胞による取り込みによって、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子におけるペプチド提示から生じる交差提示が引き起こされる。
【００３６】
図５は、癌細胞に曝露したスルビビンワクチン接種マウスから単離されたＴ細胞からのＩＦＮγ放出を示した棒グラフである。ＩＦＮγ放出は、ＥＬＩＳｐｏｔ測定法で測定した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、マウスまたはニワトリスルビビン発現プラスミドを有するサルモネラでワクチン接種するか、あるいはワクチン接種せず（ｘ軸）、Ｔ細胞をＢ１６／ＫＳＡ（縞模様の棒）またはＬＬＣ／ＫＳＡ（黒い棒）癌細胞系に曝露した後、播種したＴ細胞５×１０5個当たりのＩＦＮγスポットの数（ｙ軸）を測定した。
【００３７】
図６は、癌細胞に曝露したスルビビンワクチン接種マウスから単離されたＴ細胞からのＩＦＮγ放出を示した棒グラフである。ＩＦＮγ放出は、ＥＬＩＳｐｏｔ測定法で測定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、マウスまたはニワトリスルビビン発現プラスミドを有するサルモネラでワクチン接種するか、ワクチン接種せず（ｘ軸）、Ｔ細胞を４Ｔ１／ＫＳＡ（縞模様の棒）またはＡ２０（黒い棒）癌細胞系に曝露した後、播種したＴ細胞５×１０5個当たりのＩＦＮγスポットの数を測定した。
【００３８】
図７は、サルモネラＳＬ７２０７ニワトリスルビビンまたはマウススルビビンでワクチン接種したマウスの生存プロットである。生存したＢａｌｂ／ｃマウスの％（ｙ軸）を、マウススルビビン（黒三角）またはニワトリスルビビン（黒四角）またはＰＢＳ（黒ひし形）の発現プラスミドを有するサルモネラでワクチン接種したマウスのＣＴ２６／ＫＳＡ曝露後の日数（ｘ軸）に対してプロットする。
【００３９】
図８は、サルモネラＳＬ７２０７ニワトリスルビビンまたはマウススルビビンでワクチン接種したマウスの生存プロットである。生存したＣ５７Ｂｌ／６マウスの％（ｙ軸）を、マウススルビビン（黒三角）またはニワトリスルビビン変異体、ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）（黒四角）またはＰＢＳ（黒ひし形）の発現プラスミドを有するサルモネラでワクチン接種したマウスのＬＬＣ／ＫＳＡ曝露後の日数（ｘ軸）に対してプロットする。
【００４０】
図９は、腫瘍曝露１０日目に対するワクチン接種時期の効果を評価するための投与計画の概略図である。「Ｄ」は、「日」の略語である。したがって、例えば、マウス数匹には、１日目に経口的にワクチン接種を行い、１０日目に腫瘍曝露し、１３日目に経口的にワクチン接種を行い、その他のマウスには、１０日目に腫瘍曝露と経口的ワクチン接種を行い、１８日目に２度目の経口的ワクチン接種を行った。肺癌罹患は、２９日目に評価した。
【００４１】
図１０は、１日目および１３日目、７日目および１３日目、１０日目および１８日目、または１３日目および２１日目にワクチン接種を受けたマウスあるいはＰＢＳを受けたマウスの肺の重量を示した図である。マウスには全て、１０日目に静脈内にＬＬＣ／ＫＳＡ細胞の腫瘍曝露を行った。マウスそれぞれの肺転移スコアも示した。
【００４２】
図１１は、１日目および１５日目にニワトリスルビビンによるサルモネラ媒介ワクチン接種を行い、４日目にＬＬＣ／ＫＳＡ細胞で静脈内に腫瘍曝露し、１１日目に腹腔内にシクロホスファミド（ＣＴＸ）で、１２〜１５日目にインドメタシンで処理することを含む投与計画の概略図である。肺を２８日目の腫瘍罹患について記録した。
【００４３】
図１２は、腫瘍曝露のみ（媒体）；１日目（初回）および１５日目（追加）にニワトリスルビビンでワクチン接種し、４日目に腫瘍曝露（ＰＣＢ）；ＣＴＸおよびインドメタシンおよび腫瘍曝露Ｃ（ＣＩ）；初回、曝露、ＣＴＸ、インドメタシン、および追加（ＰＣ（ＣＩ）Ｂ）；初回、曝露、ＣＴＸおよびインドメタシン（ＰＣ（ＣＩ））、または曝露、ＣＴＸ、インドメタシンおよび追加Ｃ（ＣＩ）Ｂを受けたマウスの肺重量を示した図である。マウスそれぞれの肺転移スコアも示した。
【００４４】
図１３は、非哺乳類スルビビンをコードするプラスミドを有するサルモネラでワクチン接種した後のマウスにおけるＣＤ４４明、ＣＤ３低細胞の新規集団の外観を示す末梢血細胞のフローサイトメトリーデータを表した図である。ｘ軸はＣＤ３細胞を表し、ｙ軸はＣＤ４４細胞を表す。
【００４５】
図１４は、１日目の皮下腫瘍曝露、４、１１、１８および２５日目の非哺乳類スルビビンによるサルモネラ媒介ワクチン接種、ならびに８、９および１０日目の静脈内免疫サイトカイン処理を含む投与計画の概略図である。
【００４６】
図１５は、ＰＢＳ、免疫サイトカイン、非哺乳類スルビビン、または免疫サイトカインおよび哺乳類スルビビンで処理したマウスの経時的腫瘍体積を示した図である。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、疾患細胞に対して効果的に免疫応答を惹起する組成物および方法を提供することによって、癌またはその他の疾患の治療を改善する。癌は、第１の標的疾患であるが、本発明は、その他の疾患および症状、例えば、正常細胞の望ましくない増殖、例えば、類線維腫組織に適用される。本発明はまた、ウイルス感染、例えば、ＨＩＶ感染、インフルエンザウイルス感染、およびその他のウイルス感染を治療するための組成物および方法を企図する。
【００４８】
特に、癌またはその他の腫瘍を治療するために、本発明は、哺乳類において癌または腫瘍細胞に対して適応した免疫応答を惹起するために、抗原提示細胞上に、腫瘍特異的または腫瘍に豊富なタンパク質に関連したペプチドを提示するための組成物および方法を提供する。本発明のために好ましい１種の腫瘍特異的または腫瘍に豊富な抗原はスルビビンである。
【００４９】
（Ｔ細胞抗原提示の概要）
抗原提示とは、細胞内のタンパク質がペプチドに処理されて、その後分泌経路に沿って細胞表面に輸送される細胞プロセスである。処理されたペプチドは、ＭＨＣとして知られる特殊化されたペプチド提示膜タンパク質との安定な複合体として輸送される。このプロセスは、免疫系の成分、例えば、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+Ｔ細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはＣＤ８+Ｔ細胞）がＭＨＣ−ペプチド複合体を抽出することによって細胞の組成を調査することを可能にする。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体と相互作用し、一方細胞傷害性Ｔ細胞はＭＨＣＩ−ペプチド複合体と相互作用する。相互作用は、Ｔ細胞の表面上に発現したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して起こる。Ｔ細胞はそれぞれ、固有のＴＣＲを発現している。抗体と類似して、ＴＣＲの多様性は、染色体のＴＣＲ座の再構成によって生じる。抗体産生細胞のように、Ｔ細胞分化の間に自己抗原（すなわち、細胞に存在する内在性タンパク質から生じる抗原ペプチド）と遭遇することによって、その特定のＴ細胞のネガティブ選択を引き起こす。ネガティブ選択中に排除されないＴ細胞はさらに、成熟Ｔ細胞に発達する。結局、ＭＨＣと結合した外来抗原との相互作用は、特に第２の刺激の存在下で、Ｔ細胞活性化を引き起こす。
【００５０】
（スルビビン）
スルビビンタンパク質の特徴は、ＢＩＲドメイン（またはＩＡＰドメイン）として知られている約７０個の保存されたアミノ酸ドメインである。ヒトスルビビンでは、このＢＩＲドメインは、Ａｓｐ１６からＬｅｕ８７にわたる領域に対応する。癌または腫瘍細胞はしばしば、スルビビンタンパク質を過剰発現し、これらの細胞のアポトーシスを阻害して、癌または腫瘍細胞の異常増殖を防御する機構を妨害すると考えられている。他方、正常細胞は、スルビビンをほとんど発現しない。したがって、スルビビンは、理想的な腫瘍特異的または腫瘍に豊富な抗原である。したがって、スルビビン発現腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発できるように、抗原型のスルビビンタンパク質を抗原提示細胞に輸送することは本発明の目的である。ヒトおよび哺乳類のスルビビンタンパク質および遺伝子は、米国特許第６２４５５２３号またはＷＯ２００４／０６７０２３号に詳細に記載されている。
【００５１】
（非哺乳類スルビビン）
本発明の一態様は、非哺乳類スルビビン遺伝子および／またはタンパク質を癌およびその他の疾患のためのワクチンで使用できるという驚くべき発見を中心に展開している。例えば、マウスまたはヒトを、ニワトリスルビビンをコードする核酸で免疫すると、マウスまたはヒトスルビビンを発現する細胞をそれぞれ攻撃するＣＤ８+Ｔ細胞を生じさせることができる。この発見は、ニワトリスルビビンタンパク質が免疫学的にヒトスルビビンと実質的に類似であることを示しており、ニワトリスルビビンは哺乳類において免疫応答を惹起する抗原型のスルビビンタンパク質として使用できることを示唆している。
【００５２】
哺乳類および非哺乳類種のスルビビンタンパク質を図１に整列させた。アラインメントに含めたスルビビンタンパク質は、ヒトスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６８または０１５３９２、配列番号８）、イヌスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００３０１９、配列番号９）、ブタスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９９９３０６、配列番号３９）、ウシスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００１８５５、配列番号４０）、ネコスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００９２８０、配列番号４１）、マウススルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３８１９、配列番号１０）、ラットスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ８２５８６、配列番号４２）、オランウータンスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＨ９１２３１、配列番号４３）、ニワトリスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０１２３１８、配列番号１１、「野生型」）、アフリカツメガエルＳＩＸスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ２００８５、配列番号１３）、アフリカツメガエルスルビビン相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ７６７１４、配列番号４６）、アフリカツメガエルスルビビン相同体２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ８９２７１、配列番号４７）、ナマズスルビビン相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＫ４１９４６６、配列番号５２）、ゼブラフィッシュスルビビン相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９１９３７８、配列番号４８）、ゼブラフィッシュスルビビン相同体２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６６０１９６、配列番号４９）、フグスルビビン様相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ０４４３２、配列番号５０）およびフグスルビビン様相同体２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ０７４３３、配列番号５１）である。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって本明細書で開示した配列は全て、参考として援用している。図１に含まれる配列はまた、明細書の配列表に挙げてある。
【００５３】
さらに、２種類のニワトリスルビビン変種も、添付の配列表に含まれており、変種１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０１２３１９、配列番号４４）は異なるＣ末端を得るために配列番号１１で示した野生型ニワトリスルビビン配列とはアミノ酸残基１１６での開始が異なっており、変種２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０１２３１７、配列番号４５）は、配列番号１１で示した野生型ニワトリスルビビン配列とはアミノ酸残基３８での開始が異なっている。
【００５４】
以下の配列がさらに配列表に含まれる。ヒトスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６８．２、配列番号６４）、ホモサピエンススルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｏ１５３９２、配列番号６５）、イヌスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００３０１９．１、配列番号６６）、ブタスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９９９３０６．１、配列番号６７）、ウシスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００１８５５．２、配列番号６８）、ネコスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００９２８０．１、配列番号６９）、マウススルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３８１９．１、配列番号７０）、ラットスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ８２５８６．１、配列番号７１）、オランウータンスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＨ９１２３１．１、配列番号７２）、ニワトリスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０１２３１８．１、配列番号７３）、アフリカツメガエルＳＩＸスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ２００８５．１、配列番号７４）、アフリカツメガエルスルビビン相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ７６７１４．１、配列番号７５）、アフリカツメガエルスルビビン相同体２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ８９２７１．１、配列番号７６）、ナマズスルビビンをコードする核酸（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＫ４１９４６６．１、配列番号７７）、ゼブラフィッシュスルビビン相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９１９３７８．１、配列番号７８）、ゼブラフィッシュスルビビン相同体２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６６０１９６．１、配列番号７９）、フグスルビビン様相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ０４４３２．１、配列番号８０）、フグスルビビン様相同体２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ０７４３３．１、配列番号８１）、キイロショウジョウバエスルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ５５３９９．１、配列番号８２）およびエレガンス線虫スルビビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５０５９４９．１、配列番号８３）。
【００５５】
本発明は、図１で開示したスルビビン配列などの天然に見いだされるスルビビン配列だけでなく、図１で開示した配列の少なくとも１つとのアミノ酸同一性が、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるその他のアミノ酸配列を使用することを企図する。
【００５６】
図１で示したように、アラインメント中の哺乳類スルビビンタンパク質は、ヒトスルビビンとの同一性が８０％超であるのに対して、アラインメント中のスルビビンの非哺乳類性相同体は、ヒトスルビビンとの同一性が６０％未満である。しかし、ＢＩＲドメイン（図１のアラインメントの下線領域）内では、非哺乳類スルビビンタンパク質は、ヒトスルビビンとの同一性が６０％超８０％未満であり、一方、哺乳類スルビビンタンパク質は、ヒトスルビビンとの同一性が９０％超である。スルビビン相同体のＢＩＲドメインの配列対パーセント同一性を図２にまとめて示す。例えば、ニワトリスルビビンは、ＢＩＲドメインでのヒトスルビビンとの同一性が約７８％である。
【００５７】
図１で示したように、ニワトリスルビビンでは、ＢＩＲドメイン内の１種の９‐merペプチド（１８〜２６：ＳＴＲＡＡＴＦＲＮ）（配列番号７）のみが、対応するヒト配列に対して５０％超のアミノ酸変動を含有する（この特定の９‐merペプチドにおいて、９個のアミノ酸のうち５個が異なっている）ことは重要である。ニワトリスルビビンのＢＩＲドメイン内のほとんどの９‐merペプチドが含有する配列変化は２個以下である（６４個のペプチドのうち４８個）。理論に結びつけることは望まないが、この配列保存性の程度によって、ニワトリスルビビンは、効果的にヒトスルビビンと免疫学的に実質的に類似することができると考えられる。
【００５８】
一般的に、ニワトリスルビビンＢＩＲドメインと図２に示した哺乳類スルビビンＢＩＲドメインとの間のパーセント同一性は、約７２％と約７８％との間で変化する。さらに、ＢＩＲドメインのニワトリスルビビン由来９‐merペプチドの約７５％は、対応する哺乳類９‐merペプチドと比較して２個以下の配列変化を含有している。例えば、ニワトリスルビビンはＢＩＲドメインでマウススルビビンとの同一性が７５％であり、このことは、以下の実施例６で説明するように、ニワトリスルビビンがマウススルビビンと免疫学的に実質的に類似しているという結果と一致している。
【００５９】
以下の実施例で例示したように、非哺乳類スルビビン組成物、例えば、ニワトリスルビビン組成物が、マウスにおいてマウススルビビンを発現している腫瘍に対して免疫応答を誘導する効果は、本発明の基本的方針、すなわち、非哺乳類スルビビン分子を哺乳類にワクチン接種すると、哺乳類スルビビンまたは哺乳類スルビビンを過剰発現している細胞に対する免疫応答を誘導するのに有用であることを強調している。したがって、免疫学的応答は哺乳類間で十分に保存されているので、ニワトリスルビビンはまた、ヒトにおいてヒトスルビビンを過剰発現する細胞、例えば、多くの腫瘍細胞に対して効果的な免疫応答を引き起こすのに有用である。
【００６０】
対照的に、無脊椎動物のＢＩＲからヒトのスルビビンＢＩＲドメインまでのアラインメントによって、Ｄ．メラノガスター（ＡＡＦ５５３９９、配列番号５３）およびＣ．エレガンス（ＮＰ＿５０５９４９、配列番号５４）のＢＩＲドメインは、ヒトスルビビンＢＩＲドメイン配列に対する同一性が５０％以下であるが（図３）、Ｚｎキレート化のために不可欠な残基は保存されている（図３のアラインメントのアスタリスク参照）。例えば、ハエスルビビンＢＩＲドメインは、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとの同一性が約５０％である。ハエＢＩＲドメインが含有する、対応するヒトペプチドと比較して２個以下のアミノ酸置換を有する９‐merペプチドは３個のみであること（６４個のうち３個）は重要である。
【００６１】
本発明では、本明細書で使用した「非哺乳類スルビビン」という用語には、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとのアミノ酸同一性が少なくとも５０％超であるが９０％未満、例えば、ヒトスルビビンＢＩＲドメインとの同一性が少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％であるＢＩＲドメイン（またはＩＡＰドメイン）を有する任意のスルビビンタンパク質を少なくとも包含する。
【００６２】
パーセント同一性を計算するために、各配列の整列したアミノ酸を順次比較する。アミノ酸が同一でなければ、ペアワイズ同一性スコアはゼロである。その他の場合、ペアワイズ同一性スコアは１．０である。生の同一性スコアは、同一の整列アミノ酸の合計である。次に、生スコアを、候補配列または参照配列のより小さいアミノ酸の数で除し、その結果に１００を乗ずることによって正規化する。正規化された生スコアがパーセント同一性である。挿入および欠失は、パーセント同一性の計算のためには無視される。したがって、ギャップペナルティーは、この計算に使用しない。
【００６３】
複数の配列アラインメントを作製する方法は、当業者には周知である。スルビビン配列を整列させるために、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（商標）６ソフトウェアパッケージのＭｅｇａｌｉｇｎ６．１モジュールを、ＣｌｕｓｔａｌＶアラインメントアルゴリズムを適用して、初期設定を用いて使用した（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｓ（１９８９）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１〜３）。スルビビンＢＩＲドメインのサブアラインメントには、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（「ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ」）法を初期設定を用いて適用した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜８０）。
【００６４】
非哺乳類スルビビンはまた、哺乳類スルビビンよりもＴヘルパー細胞応答を生じさせる潜在力を有するペプチドを多く含有することができるものと考えられる。理論に結びつけることは望まないが、増強された免疫効果は、免疫応答における、ＭＨＣＩによる細胞傷害性Ｔ細胞の関与およびＭＨＣＩＩによるＴヘルパー細胞の関与によって実施することができるものと考えられる。内在性ヒトスルビビンと非哺乳類スルビビンとの間の配列の違いは、ヒト免疫系が寛容化されていない提示されたいくつかのペプチドをもたらすものと思われる。有効なＭＨＣＩＩエピトープの存在は、公的に使用可能な予測アルゴリズム、例えば、ＰｒｏＰｒｅｄ分析（ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ；Ｓｉｎｇｈ他、（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：１２３６〜１２３７、内容を本明細書に参考により組み込む）を使用して分析することができる。このようなアルゴリズムを使用して、ヒトまたはイヌスルビビンなどの哺乳類スルビビンタンパク質に対して、ニワトリスルビビンまたはカエルＳＩＸスルビビンなどの非哺乳類スルビビンタンパク質は、ＭＨＣＩＩ分子に結合するペプチドおよび／またはＭＨＣＩＩ分子に対して高い結合親和性を有するペプチドを多く含有すると予測されることがわかる。
【００６５】
【表１−１】
2009509991.tif 000002
【００６６】
【表１−２】
2009509991.tif 000003
【００６７】
【表１−３】
2009509991.tif 000004
【００６８】
【表１−４】
2009509991.tif 000005
【００６９】
表１は、少なくとも１個のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合する９‐merペプチドそれぞれの開始位置（番号）および配列（ペプチド）を示している。結合数は、任意の結合閾値、この場合２０％を上回ってペプチドが結合する対立遺伝子の数（５０個のうち）を意味している。２０％閾値とは、Ｐｒｏｐｒｅｄで実施したようなアルゴリズムによって計算した場合、理論的最大結合スコアの２０％を意味する。スコアは、そのペプチドが結合する全ＨＬＡ対立遺伝子での累積的スコアを意味する。参考として、ヒトにおいて抗ＭＢＰ抗体を生じることが知られているタンパク質（ＭＢＰ（８５〜９９））の部分から得られたヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドＶＶＨＦＦＫＮＩＶ（配列番号１４）は、累積スコア１０８７．６で２９個のＨＬＡ対立遺伝子に結合する。
【００７０】
ＭＨＣ分子と結合すると、ヒトスルビビンペプチド配列を認識するＴ細胞を活性化することができる非哺乳類スルビビン由来のペプチドを含むか、またはコードするワクチンを提供することが望ましい。このようなヒトスルビビンペプチドまたはそれら由来のペプチドには、限定はしないが、ＥＰＤＬＡＱＣＦＦ（配列番号３）、ＥＰＤＬＡＱＣＦＹ（配列番号１５）、ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ（配列番号２）およびＣＰＴＥＮＥＰＤＹ（配列番号１６）が含まれる。他のヒトペプチドおよびＴ細胞を活性化するか、Ｔ細胞の活性化を増強するために有用な改変は、本明細書に参考として内容を援用した米国特許出願公開第２００４−０２１００３５号に記載されている。
【００７１】
したがって、非哺乳類スルビビン配列に、公知のヒトスルビビンエピトープに対応する変異、またはそのようなペプチド配列がＭＨＣに結合するのを増強することができる変異を導入するために有用であり得る。例えば、ニワトリスルビビン配列のＡｓｎ９７、Ｔｈｒ９９、Ｖａｌ１００またはＧｌｎ１０１の位置にアミノ酸置換を導入することは有用であり得る。理論に結合させることは望まないが、ニワトリスルビビンのＴｈｒ９９の位置の置換は、得られたペプチドがＭＨＣ分子に結合するのを増強することができる。具体的な例では、ニワトリスルビビン由来のペプチドは、以下のアミノ酸置換、Ａｎ９７Ｇｌｕ、Ｔｈｒ９９Ｍｅｔ、Ｖａｌ１００ＬｅｕおよびＧｌｎ１０１Ｇｌｙの少なくとも１つを含有することができる。他の例では、カエルＳＩＸスルビビンに、Ｔｈｒ１１０またはＳｅｒ１１２でのアミノ酸置換を導入することは有用であり得る。アフリカツメガエルＳＩＸスルビビンのアミノ酸配列（Ｔ１１０Ｍ、Ｓ１１２Ｇ）を配列番号５５に示す。理論に結びつけることは望まないが、Ｔｈｒ１１０の位置の置換は、得られたペプチドがＭＨＣ分子に結合するのを増強することができる。具体的な例では、カエルスルビビン由来のペプチドは、以下の置換、Ｔｈｒ１１０Ｍｅｔ、Ｓｅｒ１１２Ｇｌｙの少なくとも１つを含有することができる。
【００７２】
本発明に適した非哺乳類スルビビンペプチドはまた、アミノ酸欠失を含有することができる。例えば、非哺乳類スルビビンペプチドは、Ｃ末端切断またはＮ末端切断を含有することができる。
【００７３】
非哺乳類スルビビンタンパク質内のある種の保存性の低い配列は、ヒトスルビビンと同様の発現プロファイルを持つことができず、したがって腫瘍特異的であることができないその他の非スルビビンヒトタンパク質に割り当てることができる。このことは、短い、ほぼ正確な一致を同定する設定で、非重複ヒトタンパク質データベースに対して、非哺乳類スルビビンの多岐にわたる領域の配列でＢＬＡＳＴ検索を実施することによる最初の方法で評価することができる。例えば、ニワトリスルビビン配列のＣ末端ドメイン（ａａ９０−ａａ１４２）での検索では、ほぼ正確な一致で同定されたヒトタンパク質は数個のみであった（ヒットは５個未満）。次に、そのようなヒトタンパク質を、まず以下に説明したインシリコ法によって、発現パターンに関して、および抗原ペプチドを生じる能力に関してさらに分析することができる。
【００７４】
（改変されたスルビビン）
他の態様では、本発明は、哺乳類スルビビンタンパク質に改変を導入することによって、スルビビンタンパク質の抗原型を提供する。具体的に、本発明は、生物学的に不活性であるが、哺乳類スルビビンと免疫学的に実質的に類似している改変された哺乳類スルビビンペプチドを企図する。本発明のこの態様はまた、抗原提示細胞の細胞質内でスルビビンタンパク質を単に発現するという単純な取り組みで、２つの特定の問題を解決する。第１の問題は、生物学的に活性のあるスルビビンタンパク質は、抗原提示細胞の生理機能を破壊し得ることである。第２の問題は、スルビビンまたは本質的に任意のその他のタンパク質を細胞内で発現させるとき、細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって抗原ペプチドを提示するような方法でほんの小量のタンパク質が分解されることである。
【００７５】
したがって、本発明は、ヒトスルビビンの変異体種または非ヒト哺乳類スルビビンの変異体種を含む改変された哺乳類スルビビンタンパク質を企図する。本発明はまた、図１で開示したスルビビン配列などの、天然に見いだされるスルビビン配列だけでなく、図１で開示した配列の少なくとも１つとのアミノ酸同一性が、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるその他のアミノ酸配列も使用することを企図する。
【００７６】
ヒトスルビビンの構造は決定されている（Ｃｈａｎｔａｌａｔ他、（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：１８３〜１８９、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）タンパク質構造アクセッション番号ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｅ３１、Ｖｅｒｄｅｃｉａ他、（２０００）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．７：６０２〜６０８、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）タンパク質構造アクセッション番号ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｆ３Ｈ、いずれの教示も本明細書に参考として援用している）。３Ｄ構造に基づいて、ヒトスルビビンは、少なくとも２個のドメイン、ＢＩＲまたはＩＡＰドメインと称される亜鉛結合部位を含むＮ末端球状ドメインおよび本明細書ではヘリカルドメインと称される伸長したＣ末端アルファヘリックスを含む。好ましい実施形態では、本発明は、Ｎ末端ＢＩＲドメインおよび／またはＣ末端ヘリカルドメインにおいて変異を有するスルビビンの形態を提供する。最適な効果は両領域を変異させることによって実施できることが本発明の知見である。理論に結びつけることは望まないが、Ｎ末端ＢＩＲドメインおよびＣ末端ヘリカルドメインはそれぞれ生物学的活性を有するものと考えられる。例えば、ＢＩＲドメインは、ヘリカルドメインがなくてもあるレベルのアポトーシス阻害活性を有する。さらに、ヘリカルドメインは、細胞骨格結合活性を有し、異なった生物学的活性を有し得る。
【００７７】
具体的に、ＢＩＲドメインでは、例えば、好ましい変異には、限定はしないが、ヒトスルビビンのＣｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７またはＣｙｓ８４に対応する位置でのアミノ酸置換が含まれる。例えば、改変されたＢＩＲドメインは、以下の置換、Ｃｙｓ５７Ｓｅｒ、Ｃｙｓ６０Ｓｅｒ、Ｈｉｓ７７ＰｈｅおよびＣｙｓ８４Ｓｅｒの少なくとも１つを含有することができる。これらのアミノ酸のいずれかをアラニンまたはプロリンに置換することも好ましい。これらの変異は、ＢＩＲドメインの亜鉛結合部位を破壊するものと考えられる。亜鉛結合部位を破壊する効果を有するその他の変異も使用することができる。さらに、ヒトスルビビンＡｒｇ１８に対応する位置、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸の変異を使用して、不活性なＢＩＲドメインを生じることができる。亜鉛結合アミノ酸が２、３または４個の位置で変異した、改変されたＢＩＲドメインが特に好ましい。
【００７８】
機能を破壊するためにヘリカルドメインのどこかにプロリン残基を導入することは、一般的に有用である。特に、プロリン置換は、ヒトスルビビンＡｌａ１２８またはＩｌｅ１３５に対応する位置に導入することができる。ヘリカルドメインを破壊することができるその他のアミノ酸置換も好ましい。
【００７９】
好ましい改変された哺乳類スルビビンは、Ａｒｇ１８、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７および／またはＣｙｓ８４での変異およびヘリカルドメインのプロリンを含有することができる。Ａｒｇ１８、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７、Ｃｙｓ８４、Ａｌａ１２８およびＩｌｅ１３５の位置の前述のアミノ酸はそれぞれ、ヒトとニワトリスルビビンの間で保存されており、したがって、同一の変異を導入して、生物学的に不活性なニワトリスルビビンを作製することができる。同様の変異は、その他の非哺乳類スルビビンタンパク質の対応する位置にも導入することができる。
【００８０】
前記の変異のいずれかを、ヒトスルビビンのＬｅｕ９８に対応する位置における変異、例えば、Ｌｅｕ９８Ａｒｇ、Ｌｅｕ９８ＬｙｓおよびＬｅｕ９８Ａｌａなどと組み合わせることができる。ニワトリスルビビンでは、ヒトＬｅｕ９８に対応する位置はＶａｌ１００である。
【００８１】
その他の有用な変異は、実施例で説明したように、通常の実験によって同定することができる。例えば、変異をスルビビンタンパク質に導入して、例えば、生物学的活性の欠如、および／または分解の促進、および／または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する能力について試験する。これらの試験の例となる測定法は、以下の実施例に記載されており、当業界では公知である。
【００８２】
一般的に、好ましい改変されたスルビビンペプチドは、３個、４個、５個以上の変異を含有する。しかし、本発明によって企図される改変されたスルビビンの１用途は、ＭＨＣクラスＩ分子によってスルビビン由来のＴ細胞エピトープペプチドを提示することである。したがって、哺乳類スルビビンと免疫学的に実質的な類似性を維持するために、５０個未満（または３０個未満または２０個未満）のアミノ酸を変異させることが一般的に好ましい。
【００８３】
（抗原提示）
本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのプロセシングがあまり妨げられないように、スルビビンまたはその他のタンパク質配列に変異を最適に導入するための方針を提供する。
【００８４】
特定のスルビビン変異は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示され、特定のＴ細胞受容体によって認識されるペプチド部分内に位置することができる。エピトープが切断されるか、またはエピトープは切断されないが、新たなエピトープが好ましく作出されるように、変異によって、スルビビンのペプチドエピトープへのタンパク質分解処理を改変することも可能である。抗原提示の問題に取り組むために、公的に使用できるデータベースおよびスルビビンタンパク質の候補ＭＨＣクラスＩエピトープを同定し、その後ある変異がエピトープを変化させるかどうかを決定する情報を使用することができる。例えば、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズムを使用することができる（その教示を本明細書に参考として援用したｗｗｗ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ．ｕｎｉ．ｋｘｉ、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ他、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：２１３〜２１９も参照。）あるいは、ＢＩＭＡＳアルゴリズムを使用することができる（その教示を本明細書に参考として援用したｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／、Ｐａｒｋｅｒ他、（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３〜１７５も参照）。ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質をコードするＨＬＡ遺伝子は多形性が高く、様々なペプチドモチーフに結合する様々なＭＨＣクラスＩタンパク質を備えているので、１つの軸に様々なＭＨＣクラスＩ分子を有し、他方の軸にスルビビン配列を有する潜在的エピトープの表を作製する。この表の項目は、所与のＭＨＣクラスＩ分子のエピトープの位置を同定している。候補の変異の効果は、様々なエピトープに対する効果に基づいて判断される。結局、変異または変異類は、例えば、様々なＨＬＡ対立遺伝子の対立遺伝子頻度またはＨＬＡ対立遺伝子の群特異的頻度を考慮して、ワクチンの必要性に基づいて選択される。タンパク質分解プロセシングの問題と取り組むために、本発明では、公的に使用できるデータベース、および候補プロテアソーム切断部位を同定し、その後変異がこのような切断部位を変化させるかどうかを決定する情報を使用することができる。例えば、公的に使用できるデータベースＮｅｔＣｈｏｐを使用することができる（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＣｈｏｐ／）。切断部位の変化を回避することが一般的に好ましい。
【００８５】
例示の目的のために、実施例１２は、スルビビンタンパク質において有用な置換を決定する例示的分析法を提供する。
【００８６】
本発明では、「イムノプロテアソーム」を検討することも有用である。抗原提示細胞では、プロテアソームはタンパク質の多少異なる組成物を有し、そのタンパク質分解特異性は、Ｃ末端を疎水性残基に切断する酵素によって支配されている。結局、プロテアソームは、ＭＨＣクラスＩをＣ末端疎水性アンカー残基に結合させることができるペプチドを生成する。イムノプロテアソーム切断パターンの特異性を維持することが望ましいならば、このような疎水性残基、特にロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンは変異させないことが好ましい。同様に、その他の残基もロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンに変異させないことが好ましい。したがって、Ａｒｇ１８、Ｃｙｓ５７、Ｃｙｓ６０、Ｈｉｓ７７およびＣｙｓ８４の変異は、スルビビンの構造を不安定にすること、およびイムノプロテアソーム切断部位を除去しないことの両方について有利である。さらに、タンパク質配列のＮ末端に隣接した７個から９個のアミノ酸に、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンへの変異を導入しないことが好ましい。
【００８７】
したがって、本発明は、免疫原性の高いタンパク質を生成するために、タンパク質配列中の好ましい変異部位を同定する一般的方法を提供する。この方法に基づいて、タンパク質配列中の好ましい変異部位は、以下の特性を有する。第１に、この部位の１個または複数の変異は、タンパク質構造を不安定にする。第２に、不安定化変異では、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファンまたはフェニルアラニンを導入しない。第３に、この位置の通常のアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンではない。この方法は、抗原として利用できる多種多様なタンパク質、例えば、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原およびその他の抗原などに適用することができる。腫瘍特異的抗原の中でも、スルビビンに加えて、この方法は、上皮細胞接着分子、Ｒａｓなどの癌遺伝子、癌胎児抗原などに適用することができる。ウイルス抗原の中でも、この方法は、ＨＩＶのｐ２４、インフルエンザ赤血球凝集素およびその他のウイルスタンパク質に適用することができる。
【００８８】
（非哺乳類および／または改変されたスルビビンを含む融合タンパク質）
スルビビン部分の分解およびＭＨＣクラスＩ分子によって提示することができるペプチドへのプロセシングを促進するために、非哺乳類スルビビンまたは前述の変異スルビビンペプチドを適切な第２のタンパク質に融合することが望ましい。例えば、ユビキチンは、この目的のために特に好ましい融合相手である。ユビキチン−スルビビン融合タンパク質は、以下の配置、Ｎ末端−ユビキチン−スルビビン−Ｃ末端またはＮ末端−スルビビン−ユビキチン−Ｃ末端の１つに構築することができる。Ｎ末端−ユビキチン−スルビビン−Ｃ末端の方向が好ましい。さらに、スルビビンＮ末端メチオニンは、好ましくはアルギニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異させることが望ましい。ユビキチン−スルビビン融合タンパク質のヒトスルビビンＩｌｅ１９またはＶａｌ２１に対応する位置にリシンを導入することも望ましい。
【００８９】
本発明のスルビビンをＦｃ部分に融合することも望ましい。好ましいＦｃ部分は、抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有し、場合によってヒンジ領域を含有する。Ｆｃ部分は、スルビビンのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合させることができる。成熟ヒトＦｃ−Ｃｈｉｃｋｅｎスルビビンのタンパク質配列を配列番号２５に示す。成熟マウスＦｃ−Ｃｈｉｃｋｅｎスルビビンのタンパク質配列を配列番号２７に示す。
【００９０】
さらに、スルビビンおよびＦｃ部分を含有する融合タンパク質はさらに、その他の部分、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０７０８１に記載されているような免疫系を刺激するサイトカインを含有することができる。理論に結びつけることは望まないが、Ｆｃ部分の存在は、スルビビン含有融合タンパク質の抗原提示細胞への取り込みを促進することができる。Ｆｃ部分は、治療する生物由来であることが一般的に好ましい。例えば、ヒトの治療の場合、ヒトＦｃ部分を使用することが好ましい。
【００９１】
Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質またはこの融合タンパク質をコードする核酸は、分泌用にシグナル配列を含有することが好ましい。シグナル配列の存在は、哺乳類細胞系、例えば、ＮＳ／０細胞における融合タンパク質の発現を容易にし、対応する核酸を患者に投与するならば、融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの分泌を可能にすることができる。Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質をコードする配列は、イムノグロブリン重鎖またはその変異型の少なくとも一部とインフレームで融合した、例えば、抗体軽（Ｌ）鎖から、好ましくはヒトイムノグロブリンγ１遺伝子のＦｃγ１領域から得られた「リーダー配列」と５’から３’の方向で開始することが好ましい。イムノグロブリンＦｃγ１遺伝子のＦｃγ１領域は、好ましくは少なくともヒンジドメインの一部およびＣＨ３ドメインを含み、より好ましくは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【００９２】
シグナル配列をコードするＤＮＡの一部は、Ｆｃ融合タンパク質の分泌を目的とし、その後Ｆｃ融合タンパク質の残部から切り離されるペプチド部分をコードすることが好ましい。本発明のシグナル配列は、小胞体膜を貫通したタンパク質輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明に有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ他、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１）、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ他、（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ、２８６：５７７４）および当業界で公知のその他の任意のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：５１４５参照）が含まれる。
【００９３】
シグナル配列は、当業界でよく特徴付けられていて、典型的にはアミノ酸残基を１６個から３０個含有しているが、より多い、またはより少ないアミノ酸残基を含有してよい。一般的なシグナルペプチドは、３個の領域、塩基性Ｎ末端領域、中央の疎水性領域および極性の高いＣ末端領域からなる。中央の疎水性領域は、新生ポリペプチドが輸送される間、膜の脂質二重層を貫通してシグナルペプチドを係留する４個から１２個の疎水性残基を含有する。開始後、シグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼとして知られている細胞性酵素によって小胞体の管腔内で切断される。シグナルペプチドの潜在的な切断部位は、一般的に「（−３、−１）法則」に則る。したがって、一般的なシグナルペプチドは、−１と−３に位置する小さな中性のアミノ酸残基で、この領域内にはプロリン残基が含まれない。シグナルペプチダーゼは、このようなシグナルペプチドをアミノ酸−１と＋１との間で切断する。したがって、シグナル配列は、分泌中に融合タンパク質のアミノ末端から切断され得る。これはＦｃ融合タンパク質の分泌中に生じる。本発明の実行に有用なシグナルペプチド配列は、当業界では周知である。例えば、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：４６８３を参照。
【００９４】
「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」という用語は、本明細書で同義に使用される。
【００９５】
分泌された融合タンパク質は、正確に折り畳まれたＦｃドメインを通例有することができるが、スルビビン部分は不正確に折り畳まれている。理論に結びつけることは望まないが、スルビビンがＦｃ−スルビビン融合タンパク質のＦｃ部分によって強制的に分泌経路に入ると、特にスルビビンはジスルフィド結合に関係し得るシステインを数多く含有しているので、スルビビンの折り畳み構造が緩む。スルビビン部分の正確な折り畳み構造は、本発明のワクチンの活性に必要ではない。
【００９６】
遺伝子操作技術によるタンパク質の融合の代替法として、タンパク質部分を連結するために、従来の化学的架橋剤を使用した化学結合法を使用することができる。
【００９７】
（核酸）
本発明はまた、非哺乳類および／または改変されたスルビビンおよび前述のようなスルビビンを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。例えば、ヒトスルビビンのヌクレオチド配列は、配列番号５７に示されており、アフリカツメガエルＳＩＸスルビビンのヌクレオチド配列は、配列番号５８に示されており、アフリカツメガエルスルビビン相同体のヌクレオチド配列は、配列番号５９に示されており、ゼブラフィッシュスルビビン相同体のヌクレオチド配列は配列番号６０に示されており、ナマズスルビビン相同体のヌクレオチド配列は配列番号６１に示されている。核酸は、真核細胞、特に、哺乳類細胞における発現を可能にする因子と結合して、互いに組み合わさって、発現カセットを形成することが好ましい。一般的に、スルビビンをコードする発現カセットには、以下の調節因子、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ターミネーター、ポリアデニル化シグナルなどの少なくとも１個が含まれる。好ましくは、哺乳類プロモーターが含まれる。本明細書で使用したように、「哺乳類プロモーター」とは、哺乳類または通常哺乳類で増殖するウイルスで見いだされるプロモーター由来の遺伝子プロモーターを意味する。例えば、好ましいプロモーターには、哺乳類細胞で増殖するウイルス、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、モロニーサルウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）に存在するプロモーター、または哺乳類アクチン、ベータグロビン、ミオシンなどの哺乳類遺伝子由来のプロモーター、またはファシンもしくはその他の当業界で公知のＡＰＣ特異的遺伝子などの抗原提示細胞で好ましくは発現する哺乳類遺伝子由来のプロモーターが場合によって含まれる。有用なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルから得られたシグナルである。
【００９８】
発現因子は、全真核細胞においてスルビビンタンパク質の発現を対象とすることができるか、または、例えば、抗原提示細胞における発現を対象とする細胞型特異的エンハンサーを有することができる。発現カセットのコーディング部分はまた、真核細胞、特に哺乳類またはヒトの細胞において最も一般的に使用されるコドンを有するように設計することが好ましい。
【００９９】
本発明の発現カセットは、培養細胞において本発明のタンパク質を産生するために使用することができる。したがって、この発現カセットは、適切な薬剤耐性遺伝子、ＤＮＡ複製起点および発現カセットの選択および複製を容易にするその他の因子に連結することができる。一実施形態では、この発現カセットの核酸配列は、細菌で複製することができるプラスミドに組み込まれる。本発明に適切なプラスミドは、細菌細胞で選択するためのマーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子を有することができる。あるいは、適切なプラスミドは、抗生物質耐性マーカーがなくてもよいが、代謝酵素をコードする遺伝子、サプレッサーｔＲＮＡ、非薬剤耐性菌のゲノムで通常見いだされる他の遺伝子を場合によって含んでよい。したがって、本発明の例示的実施形態は、抗生物質耐性マーカーを含まず、哺乳類プロモーターに操作可能に結合した本発明のスルビビンペプチドをコードする核酸を含有するプラスミドである。このようなプラスミドを細菌に形質転換し、次に、この細菌を使用して、患者に抗生物質耐性遺伝子を導入することなく患者にワクチン接種することができる。あるいは、このようなプラスミドは、生きた担体がなくても患者に導入することができる。例えば、このようなプラスミドは、裸ＤＮＡとして、またはビーズ内に封入された、もしくはビーズ表面上にコーティングされたＤＮＡとして導入することができる。
【０１００】
本発明の発現カセットは、ウイルスゲノム、裸ＤＮＡ投与に適したプラスミド、または細菌ゲノムに組み込むことができる。ウイルスゲノムの場合、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどの２本鎖ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを使用することが望ましい。発現カセットをこのようなウイルスのゲノムに標準的技術によって挿入する。こうして、本発明は、核酸のＤＮＡおよびＲＮＡ両方の形態を提供する。
【０１０１】
（エフェクター分子）
本発明はまた、非哺乳類ペプチドまたは改変された哺乳類スルビビンペプチドが、免疫応答に寄与するエフェクター分子と相まって作用することが可能な実施形態を提供する。例えば、このようなエフェクター分子は、限定はしないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＧＭ−ＣＳＦまたは任意のその他のサイトカインを含むサイトカイン部分、特にＴｈ１免疫応答を活性化できるものであってよい。このようなエフェクター分子はまた、免疫系を抑制するサイトカインの阻害剤、例えば、ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ＳＴＡＴ３βなどのドミナントネガティブＳＴＡＴ３タンパク質）であってよい。サイトカインまたはその他のエフェクター分子はまた、変異を含有してよい。例えば、サイトカインは、ＩＬ−２のＣｙｓ１２５に対応する位置にＳｅｒ置換を含有してよい。
【０１０２】
したがって、好ましい実施形態では、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビンペプチドまたは改変された哺乳類スルビビンペプチドおよび免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドをコードする核酸が含まれる。非哺乳類スルビビンペプチドまたは改変された哺乳類スルビビンペプチドおよびエフェクター分子ペプチドをコードする領域は、単一の転写単位、または２つに分かれた転写単位であってよい。あるいは、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビンペプチドまたは改変された哺乳類スルビビンペプチドをコードする核酸および免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドをコードする別の核酸が含まれる。
【０１０３】
その他の実施形態では、本発明のワクチンには、非哺乳類スルビビンペプチドまたは改変された哺乳類のスルビビンペプチドおよび免疫応答に寄与する前述のエフェクター分子を含む第２のペプチドが含まれる。一実施形態では、非哺乳類スルビビンペプチドまたは改変された哺乳類スルビビンペプチドは、エフェクター分子を含むペプチドと融合するか、または結合している。スルビビンペプチドおよびエフェクター分子融合タンパク質は、前述のようにＦｃ部分とさらに融合しているか、または結合していてよい。
【０１０４】
（投与）
本発明のワクチンは、スルビビン過剰発現と関連した疾患を表すか、危険性があるヒトまたは哺乳類を治療するために使用される。このような疾患には、癌またはスルビビンを過剰発現する細胞を特徴とするその他の腫瘍が含まれる。
【０１０５】
本発明によって生成されるワクチンは、いかなる経路によっても哺乳類宿主に投与することができる。タンパク質抗原の注射は通常、哺乳類において免疫応答を惹起するために使用される。しかし、本発明のワクチンはまた、核酸、例えば、ＤＮＡの注射によってＡＰＣに送達することができる。通常使用される技術は、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡ発現ベクターを筋肉内に注射することである。特殊化されたＡＰＣ、例えば、マクロファージおよび樹状細胞は、注射または投与部位に移行し、抗原提示プロセスとして知られているプロセスによって抗原を捉え、提示すると考えられる。
【０１０６】
したがって、適切ならば、投与は、経口的、または静脈内および腹腔内投与経路を含む非経口的であってよい。さらに、投与は、ワクチンボーラスの断続的注射によって行うことができ、または外部の貯蔵体（例えば、バッグ）からの静脈内または腹腔内投与によってより継続的に行うことができる。ある実施形態では、本発明のワクチンは、医薬品等級であってよい。すなわち、ある種の実施形態は、ヒトに投与するために必要な純度および品質管理の基準を満たしている。獣医学的な適用はまた、本明細書で使用した企図した意味の範囲内である。
【０１０７】
獣医学的およびヒトへの医学的使用のための本発明によるワクチンの製剤は一般的に、薬学的に許容されるアジュバント、担体および場合によってはその他の成分と関連してこのようなワクチンを含む。担体は、製剤のその他の成分と適合しており、それの受容者に対して有害ではないという意味で「許容される」ことができる。この点に関して、薬学的に許容される担体は、医薬品投与に適合したありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のこのような媒体および薬剤の使用は、当業界で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物またはその投与媒介物に不適合である場合を除いて、組成物におけるそれらの使用は企図される。（本発明で同定された、および／または当業界で公知の）補助活性化合物はまた、組成物に組み込むことができる。製剤は、便利に投与単位形態に形成することができ、製薬／微生物の業界で周知の方法のいずれかによって調製することができる。一般的に、いくつかの製剤は、ワクチンを液体担体または微粉砕固体担体またはそれらの両方に結合させ、次に、必要に応じて、その生成物を所望する製剤に成形することによって調製される。
【０１０８】
本発明のワクチン組成物は、企図する投与経路に適合させて製剤化される。投与経路の例には、経口または非経口、例えば、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所）、筋肉内および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液には、以下の成分、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調節のための薬剤を含めることができる。ｐＨは、塩化水素酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。
【０１０９】
経口または非経口投与に有用な溶液は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．、１９９０に記載された製薬業界で周知の方法のいずれかによって調製することができる。非経口投与用の製剤はまた、頬側投与用のグリココール酸、結腸投与用のメトキシサリチル酸または膣投与用のクエン酸を含むことができる。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスティック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与用バイアルに封入することができる。結腸投与用の座剤はまた、薬剤を非刺激性賦形剤、例えば、カカオ脂、その他のグリセリド、または室温では固体で、体温では液体であるその他の組成物と混合することによって調製することができる。製剤はまた、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、野菜由来の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。直接投与用の製剤は、グリセロールおよび粘度の高いその他の組成物を含むことができる。これらのワクチンのためにその他の潜在的に有用な非経口用担体には、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植用注入システムおよびリポソームが含まれる。吸入投与用の製剤は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含有することができるか、あるいは、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を含有する水性溶液、または点鼻剤の形態で、もしくは鼻腔内に適用するジェルとして投与するための油性溶液であることができる。保持浣腸も結腸輸送のために使用することができる。
【０１１０】
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが予め測定された量の薬剤を含有する区別された単位、例えば、カプセル、ゼラチンカプセル、サシェ、錠剤、トローチまたは薬用ドロップの形態、粉末または顆粒の形態、水性液体または非水性液体に溶かした溶液または懸濁液の形態、水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンの形態であってよい。ワクチンはまた、ボーラス、舐剤またはペーストの形態で投与することができる。錠剤は、場合によって１種または複数の付属成分と共に圧縮するか、または成形することによって製造することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの易流動形態の薬剤を、適切な機械で、場合によって結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合して圧縮することによって調製することができる。成形された錠剤は、適切な機械で、粉末化された薬剤と不活性液体希釈剤で湿潤させた適切な担体との混合物を成形することによって製造することができる。
【０１１１】
経口用組成物は通例、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口用ワクチン投与のために、活性化合物を賦形剤と共に組み込むことができる。口腔洗浄剤として使用するために液体担体を用いて調製した経口組成物には、液体担体に溶かした化合物が含まれ、経口的に適用して、うがいをしたり、はき出したり、嚥下したりする。薬学的に適合した結合剤および／または補助剤物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、澱粉またはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモジェルまたはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテスなどの潤滑剤、コロイド状二酸化珪素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバなどの矯味矯臭剤または同様の性質の化合物のいずれかを含有することができる。
【０１１２】
注射可能な使用に適したワクチン組成物には、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能溶液もしくは分散液の即時調合のための滅菌粉末が含まれる。静脈投与のために、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合も、組成物は滅菌されていることが可能で、容易に注射針を通過して存在する範囲まで流体であることができる。製造および保存の条件下で安定であることが可能で、真菌などの微生物の汚染作用から保護され得る。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散剤の場合必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコールおよび塩化ナトリウムを組成物に含めることは好ましい。注射可能な組成物の吸収持続は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１１３】
滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒中に上記に列記した成分の１種または組み合わせと共に活性化合物を必要な量で組み入れて、必要であれば、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上記に列記した成分以外の必要な成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法には、活性成分および任意の追加的な所望する成分の粉末を、既に滅菌濾過したそれらの溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥が含まれる。
【０１１４】
関節内投与に適した製剤は、微結晶形態、例えば、水性微結晶懸濁液の形態であってよいワクチンの滅菌水性調製物の形態であることができる。関節内投与および眼科的投与のためのワクチンを作製するために、リポソーム製剤または生分解性ポリマー系も使用することができる。
【０１１５】
局所投与に適した製剤には、リニメント剤、ローション、ジェル、膏薬、クリームなどの水中油または油中水エマルジョン、軟膏またはペーストなどの液体または半液体調製物、あるいは滴剤などの溶液または懸濁液が含まれる。皮膚表面への局所投与用製剤は、ワクチンをローション、クリーム、軟膏または石けんなどの皮膚科学的に許容される担体で分散させることによって調製することができる。いくつかの実施形態では、塗布の位置を特定し、除去を阻止するフィルムまたは層を皮膚上に形成することができる担体が有用である。組織表面への接着を所望する場合、組成物はフィブリノーゲン−トロンビン組成物またはその他の生体接着物に分散させたワクチンを含むことができる。次に、ワクチンを所望する組織表面に塗布、噴霧またはその他の場合は適用することができる。内部組織表面への局所投与の場合、薬剤を液体組織接着物または組織表面への吸着を増強することが知られているその他の物質に分散させることができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノーゲン／トロンビン溶液を有利に使用することができる。あるいは、組織コーティング溶液、例えば、ペクチン含有製剤を使用することができる。
【０１１６】
吸入治療の場合、スプレー缶、ネブライザーまたはアトマイザーで分散させた粉末（自己噴射製剤または噴霧製剤）の吸入を使用することができる。このような製剤は、粉末吸入装置または自己噴射粉末分配製剤から肺投与するために微細に粉砕された粉末の形態であることができる。自己噴射溶液および噴霧製剤の場合、その効果は、所望する噴霧特性を有する（すなわち、所望する粒径を有する噴霧を生成することができる）バルブを選択するか、または制御された粒径の懸濁粉末として活性成分を取り込むことによって実現することができる。吸入によって投与するために、ワクチンはまた、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する圧縮容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアロゾル噴霧の形態で送達させることができる。点鼻薬も使用できる。
【０１１７】
経粘膜または経皮手段によって全身投与することもできる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透する障壁に適切な浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は一般的に当業界では公知で、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁塩およびフィルシディック酸（ｆｉｌｓｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻噴霧または座剤を使用して実現することができる。経皮投与の場合、ワクチンは一般的に、当業界で一般的に公知であるように、軟膏、膏薬、ジェルまたはクリームに製剤化される。
【０１１８】
一実施形態では、ワクチンは体からの迅速な排泄を防御する担体、例えば、移植片およびマイクロカプセル化輸送系を含む放出制御製剤と共に調製される。生分解性の生体適合ポリマー、例えば、エチレンビニル酢酸、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．から商用に入手できる。リポソーム懸濁液も、薬剤として許容できる担体として使用することができる。これらは、当業界で公知の方法、例えば、米国特許第４５２２８１１号に記載されたように調製することができる。ミクロソームおよび微粒子も使用することができる。
【０１１９】
経口用または非経口用組成物は、投与が容易で、投薬が一定した投与単位形態に製剤化することができる。投与単位形態とは、治療する対象のための単位製剤として適した物理的に区別された単位を意味し、各単位は、必要な医薬品担体と関連して所望するワクチン効果を生じるように計算された活性化合物の予め決定された量を含有する。本発明の投与単位形態の詳細は、活性化合物特有の特性および実現する特定のワクチン効果ならびに個体を治療するためにこのような活性化合物を調合する業界固有の限界によって影響を受け、直接左右される。
【０１２０】
一般的に、本発明によって同定されたワクチンは、治療有効量で、例えば、所望する効果を誘導するために十分な時間、標的組織に適切な濃度の薬剤をもたらす量で、ヒトまたはその他の哺乳類に非経口または経口投与するために製剤化することができる。さらに、本発明のワクチンは、単独で、または関心のある特定の疾患または適応症に対して有益な効果を有することが知られているその他の分子と組み合わせて投与することができる。ほんの一例として、有用な補因子には、消毒薬、抗生物質、抗ウイルス薬および抗真菌薬を含む症状を緩和する補因子ならびに鎮痛薬および麻酔薬が含まれる。
【０１２１】
ワクチン組成物中における送達すべき本発明で同定されたワクチンの効果的な濃度は、投与する薬剤の最終的に所望する製剤および投与経路を含むいくつかの要素によって変化する。投与する好ましい製剤はまた、治療する疾患または適応症の種類および程度、特定の患者の全体的健康状態、送達するワクチンの相対的生物学的効果、ワクチンの処方、製剤中の賦形剤の存在および種類ならびに投与経路のような変数に左右されるようである。いくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、非ヒト霊長類および齧歯類を使用した前述の哺乳類の研究から推定された一般的な容量単位を使用して、個体に提供することができる。前述したように、投薬単位とは、ワクチンをそれ自体として、または固体もしくは液体の医薬希釈剤もしくは担体との混合物として含む、物理的および生物学的に安定な単位用量として維持されている、患者に投与することができ、取り扱いおよび包装が容易であり得る単一の、すなわち１回の用量のことを意味している。
【０１２２】
（ビーズを含むスルビビン核酸の送達形態）
他の実施形態では、本発明の核酸は、ビーズなどの送達媒体と共に構成することができる。例えば、本発明の核酸は、その教示を本明細書に参考として援用した米国特許出願公開第２００３−０１６６５９４号に記載されているような方法に従ってセルロースビーズにコーティングすることができる。本発明の核酸は、その教示を本明細書に参考として援用した米国特許第５７８３５６７号に記載されているような方法に従ってポリマービーズに組み込むことができる。
【０１２３】
ある実施形態では、生物（例えば、細菌、哺乳類細胞およびウイルス粒子）を操作して本発明のスルビビンを産生させる。これらの生物は、収集するためにスルビビンを放出し、患者に直接ワクチンとして導入することができる。
【０１２４】
（ウイルス内のスルビビン核酸の送達形態）
本発明の核酸は、ウイルス送達媒体と共に構成することができる。ウイルス送達媒体は、場合によってアジュバント効果を有することができる。例えば、適切なウイルス粒子には、限定はしないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ロタウイルス、またはワクシニアウイルスが含まれる。ウイルスの変異体または無能化形態、例えば、複製能力がないウイルスを使用することが好ましいことが多い。本発明の核酸を、ウイルスゲノムに挿入し、さらにウイルス粒子に組み込む。この核酸は、遺伝子治療の業界で周知のヘルパーウイルス系を使用して封入される。
【０１２５】
（細菌内のスルビビン核酸の送達形態）
本発明の核酸は、例えば、それぞれの教示を本明細書に参考として援用したＧｅｎｔｓｃｈｅｖ他（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８３：１９〜２６；またはＳｔｏｃｋｅｒ  ＢＡＤ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８３：４５〜５０に記載されているように、微生物宿主内で輸送するために構成することができる。核酸（例えば、ＤＮＡ）輸送のために適した細菌には、限定はしないが、サルモネラ、シゲラ、リステリアまたは大腸菌が含まれる。変異体、弱毒型の細菌、例えば、栄養要求体を使用することがしばしば好ましい。例えば、適切なサルモネラ種には、限定はしないが、サルモネラチフィムリウム  アロＡ、栄養要求体ＳＬ７２０２（例えば、Ｄａｒｊｉ他、（１９９７）Ｃｅｌｌ、９１：７６５〜７７５参照）、サルモネラチフィムリウム  アロＡｄａｍ-栄養要求体ＲＥ８８（例えば、Ｈｅｉｔｈｏｆｆ他、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：９６７〜７０参照）、サルモネラチフィムリウムｍｓｂ-、ｐｕｒＩ栄養要求体ＶＮＰ２０００９（例えば、Ｃｌａｉｒｍｏｎｔ他、（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８１（６）：１９９６〜２００２、Ｌｏｗ他、（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、９０：４７〜６０参照）、またはサルモネラチフィムリウム原栄養体ＬＴ２（ＡＴＣＣ＃７００７２０）が含まれる。サルモネラによるＤＮＡワクチン接種様式の例を図４に示す。
【０１２６】
（併用療法）
本発明のワクチンは、患者の治療に使用するその他の治療法と併用することができる。治療の一実施形態では、ワクチンは腫瘍の手術による切除と合わせて使用される。治療の実施形態の他の例では、ワクチンは、腫瘍の大きさを縮小するか、潜在的に腫瘍の脈管構造に損傷を与えるか、または腫瘍を免疫応答に感受性にさせる化学療法または放射線療法と組み合わせて使用される。本発明のワクチンとの併用療法に特に有用な化学療法薬または放射線療法薬には、限定はしないが、シクロホスファミドなどのＤＮＡ損傷薬、ゲムシタビンなどの抗代謝薬、およびタキソールなどの細胞骨格機能を破壊する薬剤が含まれる。このような薬剤は、腫瘍増殖を減少させ、腫瘍の脈管構造に損傷を与えることができ、理論と結びつけることは望まないが、腫瘍を免疫応答により感受性にさせると考えられる。
【０１２７】
併用治療では、化学療法および照射は一般的にワクチンの投与の前に行われ、効果的な抗腫瘍免疫応答の形成がこの前治療の残存の可能性がある効果によって損なわれることがないようにする。
【０１２８】
併用治療の他の実施形態では、ワクチン治療は、免疫サイトカイン治療と併用することができる。理論に結びつけることは望まないが、サイトカインが促進する免疫応答が腫瘍の微小環境に存在すると、ワクチンはより効果的な免疫応答を生じるものと考えられる。例えば、特に有用な免疫サイトカインは、Ｔｈ１応答を惹起するもの、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１２である。併用療法中に、例えば、患者にまず本発明のワクチンを投与して腫瘍に対する免疫応答を起こさせ、その後腫瘍を標的とし、腫瘍における免疫応答を支持することができる免疫サイトカインを投与することができる。好ましい免疫サイトカインは一般的に、例えば、腫瘍に特徴的な表面抗原、例えば、ＥｐＣＡＭを認識する抗体部分、または腫瘍の壊死性核、例えば、ＤＮＡの特徴を認識する抗体部分を有する。免疫サイトカインはまた、一般的に、ＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＴｈ１応答を優先的に導くその他のものなどのサイトカイン部分を有する。本発明に適した免疫サイトカインは、内容を本明細書に参考として援用した米国特許第５６５０１５０号に記載されている。
【０１２９】
（実施例）
本発明の実施は、例示のためのみに本明細書に提示しており、いかなる方法によっても本発明を限定すると解決すべきではない以下の実施例によってより完全に理解されよう。
【０１３０】
実施例１；  ニワトリスルビビンのクローニング、ニワトリスルビビン変種の作製、サルモネラで複製し、哺乳類細胞中でニワトリスルビビンを発現するプラスミドの構築
所望するＤＮＡ分子を単離する方法は、当業者によく知られている。例えば、所望するＤＮＡ分子の配列が公知の場合、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通常使用するか、ＤＮＡ分子は、商用供給業者、例えば、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ、ＷＡ）を使用して化学合成によって得ることができる。野生型ニワトリスルビビンをコードするＤＮＡを得るために、ＲＴ−ＰＣＲを、ニワトリ肝臓から単離したポリＡ+ｍＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号６３６３０７）で、Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  Ｋｉｔ用Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  １段階ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１回目の逆転写および増幅では１組の外部プライマーを使用して、ならびにＳｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２回目の増幅用に１組の内部プライマーを使用して実施した。外部プライマーは、センスプライマー５’−ＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＴＧＣ−３’（配列番号１７）およびアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＣＧＴＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号１８）であり、内部プライマーはそれぞれ、ＸｂａＩ制限部位（下線部）を含むセンスプライマー５’−ＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１９）およびＸｈｏＩ制限部位（下線部）を含むアンチセンスプライマー５’−ＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号２０）である。増幅されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動によって分離し、単離して、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、その配列を確認した。野生型ニワトリスルビビンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２１および配列番号１１としてあげた配列に示す。
【０１３１】
完全長野生型ニワトリスルビビンをコードする核酸断片を、哺乳類細胞で発現させるために適した発現ベクターに移した。例えば、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化した野生型ニワトリスルビビンをコードする配列の断片を、同様に消化したプラスミドｐｄＣｓ（Ｌｏ他、（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５）に挿入し、野生型ニワトリスルビビン遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下に配置した。
【０１３２】
他の例として、野生型ニワトリスルビビンをコードする断片を発現ベクターｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｌｏ他、（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５）に挿入し、開始メチオニンを欠如した完全長野生型ニワトリスルビビンをヒトＦｃをコードする配列の下流に配置し、ｈｕＦｃ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ融合タンパク質をコードするプラスミドを作製した。簡単に説明すると、ＰｆｌＭＩ／ＸｈｏＩ野生型ニワトリスルビビン断片（ＰｆｌＭＩ部位は野生型ニワトリスルビビンのヌクレオチド２６にある）、ＳｍａＩ／ＸｈｏＩｐｄＣｓ−ｈｕＦｃプラスミド断片（Ｌｏ他、（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５）および野生型ニワトリスルビビン配列の５’末端を修復するアダプターオリゴヌクレオチド２本鎖分子で３重連結を実施し、開始ＡＴＧコドンは除いた。２本鎖アダプター分子は、相補的オリゴヌクレオチド、センス５’−ＧＧＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡ−３’（配列番号２２）およびアンチセンス５’−ＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣ−３’（配列番号２３）オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成した。正確にコードされた融合タンパク質が作製されたことは、配列決定によって確認した。成熟ヒトＦｃγ１−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎから開始Ｍｅｔを除いたもの）のヌクレオチド配列を配列番号２４として挙げた配列に示す。
【０１３３】
ｍｕＦｃ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎをコードする発現ベクターを得るために、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎからＳｍａＩ／ＸｈｏＩで消化した野生型ニワトリスルビビン断片を、同様に処理したｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ由来の発現ベクターに移して、ニワトリスルビビンをｍｕＦｃのＣＨ３部分をコードする配列のすぐ下流にインフレームで配置した、ｍｕＦｃと野生型ニワトリスルビビンとのキメラ配列を生じさせた。この発現ベクターによってコードされたｍｕＦｃ部分は、ＩｇＧ２ａアイソタイプのものであった。成熟ｍｕＦｃγ２−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎから開始Ｍｅｔを除いたもの）のヌクレオチド配列を配列番号２６に示す。成熟ｍｕＦｃ−ニワトリスルビビンのアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
【０１３４】
ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）をコードするニワトリスルビビン配列を、突然変異誘発プライマーを組み込むＰＣＲアプローチによって作製した。突然変異誘発センスプライマー（Ｍｕｔ１ｓ）５’−ＣＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＧＡ≪Ｇ≫ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴ−３’（配列番号２８）およびアンチセンスプライマー（Ｍｕｔ１ａ）５’−ＡＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２９）におけるコドン置換は、下線を引いて示してあり、ＥｃｏＲ１部位を除去するＡからＧへの置換は太字で示してある。野生型ニワトリスルビビンＤＮＡ鋳型の２種類の重複ＰＣＲ断片をそれぞれ増幅用に作製し、上流断片は隣接プライマーＰｒｌｓ（５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧ−３’）（配列番号３０）およびＭｕｔ１ａを使用して、下流断片は隣接プライマーＰｒ１ａ（５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＣ−３’）（配列番号３１）およびＭｕｔ１ｓを使用して作製した。ＰＣＲ反応を、プライマーＰｒ１ｓおよびＰｒ１ａと一緒にして、得られたＰＣＲ断片で実施し、完全長産物を作製し、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、その配列を確認した。ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）をコードする断片は、ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩで切り出して、同様に消化したｐｄＣｓ発現ベクターに連結した。ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）のタンパク質配列は、配列番号１２として示され、アミノ酸配列は配列番号６２として示されている。
【０１３５】
実施例２；  その他の非哺乳類由来のスルビビン遺伝子の合成および哺乳類発現ベクターの構築
本発明では、その他の非哺乳類脊椎動物から得られたスルビビン遺伝子およびタンパク質をワクチン組成物に使用する。例えば、フグ、サメ、ナマズまたはゼブラフィッシュなどの魚由来、またはアフリカツメガエルなどの両生類由来、またはアメリカワニ、アフリカワニ、カメ、トカゲまたはサンショウウオなどのは虫類由来、またはニワトリに加えてその他のトリ由来のスルビビン遺伝子を、実施例１に記載した方法に類似した方法または分子生物学の当業者に公知のその他の方法によって得る。いくつかの場合では、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ナマズおよびフグのスルビビン相同体（その配列はこの明細書に挙げた配列にある）などのスルビビン相同体は記載されており、ＰｕｂＭｅｄなどの公的データベースから入手することができる。スルビビン相同体の遺伝子配列が公知の場合、対応するＤＮＡは、商用ＤＮＡ合成企業、例えば、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）から入手できる。
【０１３６】
このような魚、両生類、は虫類および鳥類のスルビビン相同体を、実施例３、４および５の方法と類似の方法によってワクチン組成物に構成する。例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ナマズおよびフグのスルビビン遺伝子は、コーディング配列の末端に５’ＸｂａＩ部位および３’ＸｈｏＩ部位を付加した後、プラスミドｐｄＣｓに配置される。これは、例えば、実施例１の方法と類似のＰＣＲ法を使用して、またはリンカーが隣接した関連するコーディング配列の全遺伝子合成によって、実施される。次に、ｐｄＣｓ−スルビビンプラスミドを実施例３に記載した方法によってサルモネラ種に配置する。
【０１３７】
あるいは、スルビビン遺伝子は、実施例１におけるようにＦｃ−スルビビン融合タンパク質を発現するプラスミドに構成し、Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質をワクチンとして使用する。例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ナマズまたはフグのスルビビン遺伝子は、コーディング配列の末端に５’ＸｍａＩ部位および３’ＸｈｏＩ部位を付加した後、プラスミドｐｄＣｓに配置される。これは、例えば、実施例４の方法と類似のＰＣＲ法を使用して、またはリンカーが隣接した関連するコーディング配列の全遺伝子合成によって、実施される。次に、Ｆｃ−スルビビンプラスミドを高レベル発現に適した哺乳類細胞系、例えば、ＮＳ／０細胞に配置して、得られた分泌タンパク質を収集して、実施例４のように精製して、アジュバントと共に製剤化し、実施例５のようにヒトまたは動物のワクチン接種に使用する。
【０１３８】
実施例３；  本発明のプラスミドを含有するサルモネラ株の構築
ワクチン接種に使用するための本発明のプラスミドを有するサルモネラ株は、当業者によく知られている以下に概略を示した標準的エレクトロポレーション法によって作製した。例えば、プラスミドｐｄＣｓ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎを弱毒化サルモネラチフィムリウムａｒｏＡ株ＳＬ７２０７などのプラスミドを含まないサルモネラ株に形質転換した。その他の弱毒化サルモネラ株、例えば、遺伝子型ａｒｏＡ、ｄａｍ−のＲＥ８８、遺伝子型ｍｓｂ−、ｐｕｒＩのＶＮＰ２０００９、または原栄養体ＬＴ２株も使用することができる。好ましくは弱毒化されたサルモネラチフィムリウム株も使用できる。
【０１３９】
電気的コンピテント細菌を用意するために、サルモネラの対数増殖期の培養物５０ｍｌをＯＤ６００が少なくとも０．５で収穫し、氷上で冷却し、細胞を同量次いで半量の氷冷したＨＥＰＥＳ１ｍＭで洗浄し、再度ペレットにした。次に、細胞を冷却した１０％グリセロール、ＨＥＰＥＳ１ｍＭ、１ｍｌに再懸濁し、ペレットにして、最終的に、ゆっくりピペッティングすることによって冷却した１０％グリセロール、ＨＥＰＥＳ１ｍＭ、０．５ｍｌに再懸濁した。さらに使用するまで氷上に細胞を維持するか、小分けして−８０℃で保存した。
【０１４０】
エレクトロポレーションについては、電気的コンピテントな細菌４０マイクロリットルを予め冷却した１．５ｍｌの微小遠心管に添加し、２ミクロリットルまでの量で２００ｎｇまでのスーパーコイルプラスミドｐｄＣｓ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎと一緒にして、軽打によって混合した。細菌−ＤＮＡ混合物を予め冷却した０．２ｃｍのギャップの容器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移し、２５００Ｖ、２５μＦ、２００ｏｈｍの電気パルスでエレクトロポレーションし、一般的に時定数は４．５＋／−０．２が得られ、それからＳＯＣ溶媒１ｍｌを添加した。１時間３７℃でインキュベーションした後、細胞０．１ｍｌをＬＢ抗生物質選択プレート（１００マイクログラム／ｍｌアンピシリン）に蒔いた。
【０１４１】
単一のコロニー単離物を得て、培養し、プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析によってその特性を確認した。新たに増殖させた検証用培養物に１５％グリセロールを補給し、５００マイクロリットルずつ新鮮な状態で凍結し、−８０℃で保存した。
【０１４２】
実施例４；  Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質のトランスフェクション、発現、予備的な特徴付け、および精製
Ａ．Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質のトランスフェクションおよび発現
タンパク質発現を迅速に分析するために、プラスミド発現、例えば、ｍｕＦｃ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎまたはｍｕＦｃ−ｍｕＳｕｒｖｉｖｉｎは通常、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一時的にトランスフェクションすることによって、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）などの細胞系に導入される。
【０１４３】
Ｆｃ−スルビビンタンパク質を発現する安定してトランスフェクションされたクローンを得るために、例えば、適切なプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによってマウス骨髄腫ＮＳ／０細胞に導入した。ＮＳ／０細胞を、熱不活性化牛胎児血清１０％、グルタミン２ｍＭおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補給したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。約５×１０6個の細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ０．５ｍｌに再懸濁した。その後、直線化したプラスミドＤＮＡ１０μｇを細胞とＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ容器（電極間隔０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中において、氷上で１０分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して０．２５Ｖおよび５００ｍＦの設定で実施した。細胞を氷上で１０分間回復させ、その後増殖培地に再懸濁し、２枚の９６ウェルプレートに蒔いた。安定してトランスフェクションされたクローンを、メソトレキセート（ＭＴＸ）１００ｎＭの存在下で増殖させることによって選択し、トランスフェクション後２日目に増殖培地に添加した。細胞を３日毎に２回から３回以上培地交換すると、２から３週間のうちにＭＴＸ耐性クローンが出現した。クローンの上清を抗ＦｃＥＬＩＳＡによって測定して、産生の多いものを同定した。産生の多いクローンを単離し、ＭＴＸ１００ｎＭを含有する増殖培地で増殖させた。一般的に、Ｈ−ＳＦＭまたはＣＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）増殖培地を使用した。
【０１４４】
あるいは、前述の方法と類似の方法によって、安定してＦｃ−スルビビン融合タンパク質を発現するクローンをメソトレキセート選択によってヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞で得る。ＨＥＫ２９３クローンを、１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ中で維持する。
【０１４５】
Ｂ．Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質の精製および分析
Ｆｃを含有する融合タンパク質の標準的な精製は、プロテインＡに対するＦｃタンパク質部分の親和性に基づいて実施した。簡単に説明すると、Ｆｃ−スルビビン融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクションした細胞は通常、ローラーボトル内でＭＴＸ０．１μＭを補給したＨ−ＳＦＭ中で増殖させ、融合タンパク質を含有する細胞上清を予め平衡化した（リン酸化ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、中性ｐＨ）プロテインＡセファロースファストフローカラムに添加した。カラムをこの緩衝液で徹底的に洗浄して、結合したタンパク質をｐＨの低い（ｐＨ２．５）前記と同様の緩衝液で溶出し、画分は１Ｍトリス塩基ｐＨ１１でｐＨ６．７にした。
【０１４６】
プロテインＡセファロース−精製したＦｃ−スルビビン融合タンパク質は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、一般的に物質の大部分が凝集した状態であることが発見された。この結果は、スルビビンは通常細胞質タンパク質であるので予期できないことではなかった。理論に結びつけることは望まないが、スルビビンがＦｃ−スルビビン融合タンパク質のＦｃ部分によって強制的に分泌経路に入ると、特にスルビビンはジスルフィド結合で結合することができるシステインを数多く含有しているので、スルビビンの折り畳み構造は緩む。この凝集は、生物学的活性を妨げる可能性があるが、タンパク質をワクチンとして使用するとき、凝集は有害ではない。
【０１４７】
融合タンパク質の状態および純度は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって確認した。最も強いバンドが約４５ｋＤａに見られ、融合タンパク質の予測される大きさであった。多数の第２のバンドがまた存在しており、タンパク質が実際に凝集していることがさらに証明された。
【０１４８】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ法
ＭＴＸ耐性クローンの上清中および他の試験試料中のＦｃ含有タンパク質生成物の濃度は、抗ＦｃＥＬＩＳＡによって測定した。以下に詳細に説明したような標準方法は本質的に以下の通りである。
ｉ．コーティングプレート
ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳに溶かしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）５μｇ／ｍＬで、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏプレートＭｘｉｓｏｒｐ）に１００μＬ／ウェルでコーティングした。コーティングしたプレートを覆って、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、ＰＢＳに溶かした１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清で、２００μｌ／ウェルでブロックした。ブロッキング緩衝液で３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、紙タオルに打ちつけて乾燥させた。
ｉｉ．試験試料および２次抗体とのインキュベート
試験試料は、適切ならば試料緩衝液（１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液）で希釈した。標準曲線は、濃度がわかっているキメラ抗体（ヒトＦｃを含む）を使用して作成した。標準曲線を作成するために、試料緩衝液で連続希釈を行い、１２５ｎｇ／ｍＬから３．９ｎｇ／ｍＬの範囲の標準曲線を得た。希釈した試料および標準物を１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。次に、各ウェルに、試料緩衝液で約１：１２００００に希釈した２次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌを添加した。使用する２次抗体の正確な希釈は、各ロットによって変化させる。３７℃で２時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。
ｉｉｉ．発色
基質溶液をプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。基質溶液は、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）３０ｍｇ（１錠）を、新たに添加した過酸化水素０．０３％を含有する０．０２５Ｍ  クエン酸／０．０５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ５、１５ｍＬに溶解することによって調製した。色を室温で暗所において約３０分間発色させた。発色時間は、コーティングしたプレートのロットの違い、２次抗体などに応じて変化させる。反応は、４Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェルで添加することによって停止させた。４９０ｎｍおよび６５０ｎｍの両方に設定し、４９０ｎｍのＯＤから６５０ｎｍの背景ＯＤを差し引くように設定されたプレートリーダーでプレートを読み取った。
【０１４９】
実施例５；  ワクチン輸送および腫瘍曝露の方法
Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂ／ｃマウス（７〜８週齢）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＭＥ）から購入した。マウスは、ＥＭＤ  Ｌｅｘｉｇｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡで飼育し、動物実験は全て、承認された実験動物施設作業手順に従って実施した。
【０１５０】
サルモネラワクチン試料を調製するために、ＬＢ／ＡＭＰの培養物５ｍｌを形質転換細菌単一コロニーに接種し、３７℃で一晩増殖させ、２０００×ｇで１０分間遠心し、ＰＢＳで１回洗浄して、その後ＰＢＳ２ｍｌに再懸濁した。培養物をＰＢＳで１：１０に希釈してＯＤ６００を測定し、（培養物の連続希釈物をＬＢ／アンピシリンプレートに蒔いて測定したように）１ＯＤ６００単位は、約１０9細菌／ｍｌに対応すると仮定して、培養物の濃度をＰＢＳで１０9細胞／ｍｌに調節した。経口強制投与によるワクチン接種は、胃に通した２０Ｇ×１．５″使い捨て栄養針を装備した１ｍｌシリンジで実施した。マウスは、胃酸を中和するために１０％重炭酸ナトリウム０．１ｍｌを経管投与して予め処理し、５分後にマウスにワクチン試料０．１ｍｌ（細菌１０8個）を投与した。
【０１５１】
ワクチンの効果は、哺乳類スルビビンを発現し、ＭＨＣにスルビビン由来抗原を提示する腫瘍細胞系で測定した。以下の実施例で使用した腫瘍細胞系は、マウス肺癌細胞系Ｄ１２１、マウスリンパ腫細胞系Ａ２０、マウス乳癌細胞系４Ｔ１、マウスルイス肺癌細胞系ＬＬＣ、マウス結腸癌細胞系ＣＴ２６およびマウス黒色腫細胞系Ｂ１６であるが、哺乳類スルビビンを発現し、スルビビン由来抗原を提示しているその他の細胞系を使用することもできた。いくつかの実施形態では、「ＫＳＡ」（例えば、ＬＬＣ／ＫＳＡ）と称されるヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように操作された腫瘍細胞系を使用した。スルビビン発現は、ウェスタンブロット、標準的方法によって便利に評価される。ヒトおよびマウススルビビンに対するウサギポリクローナル抗体（ＡＨＰ６０４、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）は、１：５００に希釈して使用した。
【０１５２】
以下の実施例で使用した腫瘍細胞系は、以下の培地で維持した。Ｄ１２１は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸Ｎａおよび１％非必須アミノ酸を補給した１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で増殖させた。Ａ２０および４Ｔ１は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ中で増殖させた。ＬＬＣは、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ中で増殖させた。ＣＴ２６は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ビタミンＢ１６媒体を含むＤＭＥＭ中で増殖させた。ＣＴ２６／ＫＳＡ培地はまた、１％ピルビン酸Ｎａおよび１％非必須アミノ酸を含んだ。さらにＥｐＣＡＭを発現する細胞系の培地はまた、Ｇ４１８１μｇ／ｍｌを含有した。
【０１５３】
ワクチンのマウス生存率または処理したマウスの肺腫瘍罹患に対する効果を評価するために、腫瘍細胞を静脈内に投与した。腫瘍細胞系をＰＢＳで洗浄して、３分間トリプシン処理して、トリプシンを調整培地で中和した。細胞をペレットにして、ＰＢＳで、またはＤ１２１細胞の場合は、ＰＢＳ、１％牛血清アルブミン、ＥＤＴＡ５０μＭで２回洗浄した。単一細胞の懸濁液は、複数の使い捨て１００μＭナイロンメッシュの篩（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）上に再懸濁した細胞を添加することによって得た。マウスの尾静脈に、２７ゲージの針を使用してマウス１匹当たり２００μｌの量の細胞懸濁液を静脈内注射した。肺を取り出し、重量を測定して、罹患した転移腫瘍と比較するために、腫瘍によって覆われている肺の領域割合を評価することによって記録した。
【０１５４】
実施例６；  ニワトリスルビビンをコードするＤＮＡで免疫すると哺乳類スルビビンと交差反応する抗体が生じる
ニワトリスルビビンをコードする核酸をワクチン接種すると哺乳類スルビビンと交差反応する抗体が生じ得るかどうかを試験するために、以下の実験を実施した。Ｄａｖｉｓ（（１９９６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１：３３）に記載された免疫方法を実験の基礎として使用した。７〜８週齢メスＢａｌｂ／ｃマウス（処理群当たりｎ＝２）を、野生型ニワトリスルビビン（ＣｈＳｕｒ）またはｍｕＦｃ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＦｃＣｈＳｕｒ）をコードする発現プラスミドあるいはｍｕＦｃ−癌胎児抗原（ＣＥＡ）（ＦｃＣＥＡ）をコードする対照発現プラスミドで１回（１日目）または３回（１、２１および４６日目）免疫した。マウスの前脛骨筋に心臓毒の１０μＭ溶液を１００μｌ注射し、注射して５日後にプラスミドＤＮＡ１００μｇを注射した。６２日目に、マウスから採血し、血清のマウススルビビンに対する抗体を測定した。連続希釈した血清を、ｍｕＦｃ−ｍｕＳｕｒｖｉｖｉｎ融合タンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加して、このプレートを洗浄して、試料をペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ２ａ抗体とインキュベートした。ＥＬＩＳＡは、比色測定法によって陰性対照の未処理のマウスと比較して抗スルビビン抗体の存在を検出した。表２に示した結果は、スルビビンＤＮＡワクチンがマウススルビビンに対する抗体反応を惹起するのに効果的であるが、一方対照ＤＮＡワクチンは効果的ではないことを示している。
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
マウス抗スルビビン抗体をウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのいずれかでヒトスルビビンに対する交差反応性をさらに試験する。ニワトリスルビビンワクチン組成物でマウスをワクチン接種することによって得られたマウススルビビン抗体はまた、ヒトスルビビンタンパク質に結合すると予測される。
【０１５７】
実施例７；  スルビビンをコードするＤＮＡを哺乳類にワクチン接種すると、癌細胞に対するＴ細胞免疫応答が惹起される
サルモネラをベースにしたスルビビンワクチンが癌細胞に対するＴ細胞応答を刺激する能力を測定するために、以下の実験を実施した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、実施例５で説明したように、ＡｒｏＡ変異（Ｍｅｄｉｎａ他（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、ｐｐ．１０９３〜１０９９）、およびマウススルビビン（ｎ＝２）または野生型ニワトリスルビビン（ｎ＝２）をコードする哺乳類発現ベクターも有するＳＬ７２０７サルモネラ株を０日目および１４日目にワクチン接種した。未処理の免疫していないマウス（ｎ＝２）をこの実験の陰性対照として使用した。
【０１５８】
１回目のワクチン接種の１ヵ月後に、各群の脾細胞を取り出し、収集した。ＣＤ８+Ｔ細胞を精製し、本質的に以下に説明したように、マウスＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ測定の反応体として使用した。この測定において、Ａ２０および４Ｔ１腫瘍細胞系をエフェクター細胞として使用した（図６）。４Ｔ１細胞は、ヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように操作したが、これは実験に関係ないと考えられた。対照動物よりもワクチン接種したマウスには著しく多くのＩＦＮγ反応性Ｔ細胞が存在した。マウスまたはニワトリスルビビン発現プラスミドを含有するサルモネラによるワクチン接種は、様々な腫瘍細胞系に応答してＩＦＮγを分泌する前駆体Ｔ細胞の数の増加と相関した。
【０１５９】
同様のワクチン接種プロトコールをＣ５７Ｂｌ／６マウスでも実施した。マウスＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔ測定では、これらのマウスの脾臓のＣＤ８+Ｔ細胞をルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）またはＢ１６黒色腫細胞と共にインキュベートした。ＬＬＣおよびＢ１６細胞は、ヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように操作したが、これは実験に関係ないと考えられた。両方のワクチンは、未処理Ｃ５７Ｂｌ／６動物と比較して、ＭＨＣクラスＩの場合に発現した標的抗原のペプチドに特異的な反応性Ｔ細胞の相対数の増加をもたらした（図５）。ＳＬ７２０７ニワトリスルビビンをワクチン接種したマウスでは、ＳＬ７２０７マウススルビビンを接種したマウスよりも、ＬＬＣ腫瘍細胞およびＢ１６細胞の両方に対して産生したＩＦＮγ分泌細胞が著しく多かった。
【０１６０】
考え合わせると、これらの結果は、両方のワクチン接種の取り組みは、ＭＨＣクラスＩエピトープの場合に、哺乳類スルビビンペプチドを提示する癌細胞と反応するＣＤ８+Ｔ細胞前駆体の数の増加を導くことを示している。これらの所見はまた、ニワトリスルビビンによる免疫は、耐性の破壊および哺乳類スルビビンを発現する標的細胞に特異的な免疫応答の発生についてより効力があり得ることを示唆している。
【０１６１】
この実施例および以下の実施例のいくつかにおいて、サルモネラチフィムリウムＳＬ７２０７株を使用したが、サルモネラチフィなどのその他のサルモネラ株を使用することができた。ヒトにおいてサルモネラチフィでヒトを治療するとき、一般的に、場合によってその他の弱毒化変異を有する栄養要求体を使用することが好ましい。
【０１６２】
マウスＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ測定プロトコール
ＥＬＩＳｐｏｔ測定法は、本質的にＰｏｗｅｒ他に記載されたように実施した（Ｐｏｗｅｒ他、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７：９９〜１０７）。ＣＤ８+Ｔ細胞は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＣＤ８+Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して脾細胞から単離し、製造業者の指示に従ってＡｕｔｏｍａｃｓ磁気ビーズ選別装置で選別した。ＣＤ８+Ｔ細胞は、ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）０．７ｎｇ／ｍｌを補給したＲＰＭＩ中で維持した。２４時間以内に、生細胞をＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）勾配で精製し、最終濃度１０6細胞／ｍｌになるように再懸濁した。ＣＤ８+Ｔ細胞を１０5細胞／ウェルから連続的に希釈して、抗マウスＩＦＮγ抗体５μｇ／ｍｌで予めコーティングしたマウスＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に蒔いた。全腫瘍細胞系を５×１０4細胞／ウェルの濃度で添加した。１８〜２４時間後、細胞を除去し、抗ＩＦＮγコーティング膜をＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄して、２％牛胎児血清を含むＰＢＳに溶かしたＩＦＮγに対する２次ビオチン化抗体とインキュベートし、結合した２次抗体をストレプトアビジン結合ＨＲＰおよびＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）酢酸溶液に曝露することによって視覚化した。ＩＦＮγ分泌ＣＤ８+Ｔ細胞に対応するスポットは、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ  ＥＬＩＳｐｏｔシステム（Ｍｕｅｎｃｈｅｎ−Ｈａｌｌｅｒｇｍｏｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量した。
【０１６３】
実施例８；  ヒト由来免疫細胞のニワトリスルビビンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫
非哺乳類スルビビン配列、例えば、ニワトリスルビビン配列がヒトにおいて抗スルビビン応答を惹起する能力を確かめるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫測定法を、患者の末梢血細胞（ｈｕＰＢＭＣ）を使用して実施する。根本的に、樹状細胞（ＤＣ）およびＴ細胞はｈｕＰＢＭＣから精製し、ＤＣに選択した抗原を負荷して、Ｔ細胞と共にインキュベートし、当業者によく知られている標準的方法を使用して、例えば、ヒトスルビビンを発現する標的細胞の形態で、スルビビンペプチドへの曝露に対するＴ細胞の応答を測定する。
【０１６４】
例えば、（ＨＬＡ−Ａ２＋患者のｈｕＰＢＭＣ由来で、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを使用して得られた）ＤＣをＨＬＡ−Ａ２＋対立遺伝子のエピトープであることが知られている対照スルビビンペプチド配列、例えば、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号６）でパルス標識するか、実験用ペプチド、例えば、（ｉ）３０マーニワトリスルビビン由来ペプチドＧＣＡＦＡＡＬＱＫＤＰＳＥＬＭＬＧＥＦＬＫＬＤＲＥＲＡＫＮＶ（配列番号３２）、（ｉｉ）野生型ニワトリスルビビンペプチド、あるいは（ｉｉｉ）ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）（配列番号１２）などの変異ニワトリスルビビンペプチドでパルス標識する。あるいは、これらの配列を発現するＤＮＡ構築物をＤＣに導入する。ペプチドもしくはタンパク質とのインキュベーション、または導入したＤＮＡの発現の後で、ＤＣを照射し、外部から添加した過剰なペプチドを除去するために洗浄し、次いでＩＬ−７およびＩＬ−２の存在下で合成Ｔ細胞と混合する。培養したＴ細胞を新たに処理し、照射したＤＣと共に混合することによって、Ｔ細胞を週１回の頻度で刺激する。
【０１６５】
一測定において、スルビビン反応Ｔ細胞の存在は、基本的に実施例７に説明したように、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ測定法によって検出する。あるいは、従来の［51Ｃｒ］放出測定法を使用して、ＭＨＣクラスＩ分子の場合においてスルビビンペプチドを提示している標的腫瘍細胞に［51Ｃｒ］を負荷し、これらのＴ細胞とインキュベートして、腫瘍細胞溶解物を［51Ｃｒ］放出によって定量して、これらの細胞の機能的活性を評価する。スルビビンを発現しない対照標的細胞系は、陰性対照として使用する。実験用調製物は、スルビビンに応答するＴ細胞の生成において少なくとも対照調製物と同様に有効であることが予測され、ニワトリスルビビン由来配列は、ヒトスルビビンを発現する細胞に対する特異的免疫応答を対象とするエピトープとして役立ち得ることを示している。
【０１６６】
実施例９；  肺癌に対するワクチンの効果
腫瘍罹患後まで２度目の治療を遅延させた場合、ワクチンによって惹起された免疫応答が転移腫瘍の増殖を阻害できるかどうかを決定するために、以下の実験を実施した。
【０１６７】
０日目に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（治療条件当たりｎ＝５）に、１０％重炭酸ナトリウム１００μｌ、続いて変異ニワトリスルビビンをコードするプラスミド（ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ））、ｍｕＦｃ−ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎをコードするプラスミド、または２個の転写単位、ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）をコードするものとアジュバントとして融合タンパク質ｍｕＦｃ−ｍｕＩＬ２をコードするものを有するプラスミドを含有するＳＬ７２０７サルモネラ１０8個を経口的にワクチン接種した。対照マウスはＰＢＳで治療した。
【０１６８】
マウスに経口的に１０％重炭酸ナトリウム１００μＬを予め投与し、ＳＬ７２０７サルモネラをＰＢＳに溶かして投与した（前述のように調製した）。初回ワクチン接種の１０日後に、マウスにＰＢＳ２００μｌに溶かしたＬＣＣ／ＫＳＡ細胞１×１０6個の単一細胞懸濁液を静脈注射して、同濃度のサルモネラを使用して２回目の経口ワクチン接種を行い追加免疫した。マウスを３２日目に殺処分した。
【０１６９】
一般的な結果を以下の表に示す（表３）。この結果は、どちらのニワトリスルビビン構築物の発現ベクターを有しているサルモネラでワクチン接種しても、転移性肺癌に対して同様の防御が得られることを示している。
【０１７０】
【表３】
2009509991.tif 000007
【０１７１】
表３では、（*）腫瘍罹患は、０〜３（０＝肺に腫瘍がない、１＝腫瘍罹患＜５％、２＝腫瘍罹患５〜５０％、３＝肺の＞５０％が腫瘍に覆われている）の等級で得点付けした。イタリック体および太字の腫瘍の得点は、尾の基部に肺以外の腫瘍の所見があるマウスを示している。
【０１７２】
実施例１０；  ＳＬ７２０７ニワトリスルビビンまたはマウススルビビンでワクチン接種すると死亡時期が著しく遅延する
スルビビン発現プラスミドを有するサルモネラＳＬ７２０７によるワクチン接種が腫瘍罹患を減少させ、生存率を増加させるかどうかを決定するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（治療条件当たりｎ＝５）に、ＰＢＳ、マウススルビビン発現プラスミドを有するＳＬ７２０７サルモネラ、または野生型ニワトリスルビビン発現プラスミドを有するＳＬ７２０７サルモネラを、前述のように経口的な経管投与によって２週間間隔で２回投与した。２度目のワクチンを接種してから２週間後に、マウスにＣＴ２６／ＫＳＡ同系細胞（ヒトＥｐＣＡＭタンパク質も発現していたが、実験には関係ないと考えられた）５×１０5細胞／ｍｌのＰＢＳ懸濁液２００μｌを静脈注射した。マウスの生存率をモニターした。図７に例示したように、ＰＢＳまたはＳＬ７２０７マウススルビビンによる治療と比較して、ＳＬ７２０７ニワトリスルビビンで治療したマウスにおける生存特性は延長した。
【０１７３】
実施例１１；  スルビビン発現ベクターを有するサルモネラでワクチン接種した結果としての、癌転移を有する哺乳類の生存期間の延長
既に癌が存在している哺乳類にスルビビン発現プラスミドを有するサルモネラをワクチン接種することができるかどうかを解決するために、以下の実験を実施した。この実験では、０日目に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを１０％重炭酸ナトリウム０．１ｍｌで予め治療して、次に（前述のように調製した）ＰＢＳに溶かしたマウススルビビン（ｎ＝５）またはＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）（ｎ＝５）のベクターを含有するＳＬ７２０７サルモネラ約１億個を経口的にワクチン接種した。対照マウスには、重炭酸ナトリウムおよびＰＢＳ（ｎ＝５）を経管投与した。初回ワクチンを接種してから１０日後に、マウスにＬＬＣ／ＫＳＡ細胞（ヒトＥｐＣＡＭタンパク質も発現していたが、実験には関係ないと考えられた）１×１０6細胞のＰＢＳ懸濁液２００μｌを静脈注射した。腫瘍を注射してから４時間後に、免疫応答を刺激するために投与した同濃度のサルモネラを使用して、全マウスに２度目の経口ワクチン接種を追加投与した。
【０１７４】
腫瘍曝露後１２週間にわたって生存を追跡した。対照マウスは全て、腫瘍投与後３５日以内に死亡した。スルビビン構築物の１種でワクチン接種したマウスは全て、３５日目でもまた生きていた。ＳＬ７２０７ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）治療群のマウスは全て、ＬＬＣ／ＫＳＡを注射して１０週間以内に死亡した。ＳＬ７０２７マウススルビビンで治療した群では、３ヵ月後も生存した動物が１匹いた。２つの治療群の間には生存期間の有意差はなかった（ｐ＝０．２４３）。
【０１７５】
図８に、ＬＬＣ／ＫＳＡ細胞による腫瘍曝露に対するワクチン接種の生存曲線を示した。
【０１７６】
実施例１２；  スルビビン配列における置換を評価するための予測アルゴリズムの使用
本発明のスルビビン変種が潜在的抗原エピトープを損なうかどうか、または逆に、準優位な抗原エピトープが潜在的に改善され得るかどうかを評価するために、予測アルゴリズムを使用することができる。例えば、ｈｕＳｕｒｖｉｖｉｎ変種ｈｕＳｕｒ（Ｒ１８Ｅ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８Ｐ）（配列番号８４）を、タンパク質分解酵素切断部位予測のために公的に使用できるデータベース、例えば、ＮｅｔＣｈｏｐ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ＮｅｔＣｈｏｐ）および主要ＭＨＣＩＨＬＡスーパータイプのエピトープ予測のためのデータベース、例えば、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｈｅｉｔｈｉ．ｄｅ）を使用して分析した。ＮｅｔＣｈｏｐを使用すると、切断パターンはＲ１８Ｅ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８Ｐの置換をヒトスルビビンに導入しても（「Ｓ」は、閾値０．８を上回る潜在的切断部位を示す）、以下のように、大幅には変化しないことがわかる。
【０１７７】
【表４】
2009509991.tif 000008
【０１７８】
ＨＬＡ−Ａ０２０１サブタイプに結合することが既に同定された抗原エピトープは、太字および下線で示してあり、ＮｅｔＣｈｏｐでこのエピトープのＣ末端切断部位を予測する。
【０１７９】
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを使用して、ヒト集団の少なくとも約８５％に及ぶＨＬＡスーパータイプＡ２、Ａ３およびＢ７に結合するエピトープについてｈｕＳｕｒ（Ｒ１８Ｅ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８Ｐ）（配列番号８４）配列を分析する（Ｓｅｔｔｅ他、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．５０：２０１〜２１２）。野生型ｈｕＳｕｒｖｉｖｉｎと比較した場合、上位の順位付けされるエピトープはＨＬＡ−Ａ０２０１およびＨＬＡ−Ａ０３では同一であったが、ＨＬＡ−Ｂ０７０２では同一ではなく、このスルビビン変種配列は、Ｈ７７Ａの置換によってより好ましいＣ末端アンカー残基が実現するため、上位に順位付けされるエピトープを生じる。したがって、ペプチドＥＰＤＤＤＰＩＥＥＡ（配列番号３３）は、ペプチドＥＰＤＤＤＰＩＥＥＨ（配列番号３４）より好ましい抗原ペプチドであり得る。
【０１８０】
ＮｅｔＣｈｏｐ分析から示唆されるように、Ｐ４７ＬおよびＱ５６Ｌなどの置換をさらにｈｕＳｕｒ（Ｒ１８Ｅ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８Ｐ）に導入することができ、この配列を上記のようにＳＹＦＰＥＩＴＨＩによって再分析することができる。ＨｕｍａｎＳｕｒｖｉｖｉｎの配列（Ｒ１８Ｅ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８Ｐ）を配列番号８４に示す。ＨｕｍａｎＳｕｒｖｉｖｉｎの配列（Ｒ１８Ｅ、Ｐ４７Ｌ、Ｑ５６Ｌ、Ｈ７７Ａ、Ｃ８４Ａ、Ａ１２８Ｐ、Ｉ１３５Ｐ）を配列番号５６に示す。具体的に、変異Ｐ４７Ｌは、ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ（配列番号２）のアンカー位置２を強化し、ＣＬＴＥＮＥＰＤＬ（配列番号３５）に変化させる。
【０１８１】
同様に、置換Ｑ５６Ｌによって、ＡＱＣＦＦＣＦＫＥＬ（配列番号３７）と比較して２番目の位置が好ましいアンカー残基であり、ＨＬＡ−Ａ０２０１に対する結合力がかなり弱いことが予測されるペプチドＡＬＣＦＦＣＦＫＥＬ（配列番号３６）が生成する。野生型ｈｕＳｕｒｖｉｖｉｎと比較すると、Ｑ５６Ｌ変種スルビビン配列は、確認されているｈｕＳｕｒｖｉｖｉｎ抗原ペプチドＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号３８）と同じ強さの抗原であることが予測されるペプチドを生じる（Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８６９〜８７２）。
【０１８２】
本発明では、このような分析は、例えば、準優位なエピトープに対する応答を促進することによって、ＣＴＬが寛容化されにくい抗原性の強いペプチドを含有するスルビビン配列をもたらすことができる。
【０１８３】
実施例１３；  非哺乳類スルビビンを発現するベクターを含有するワクチンによるヒト癌患者の治療
本発明では、癌を有するヒトを以下のように本発明のワクチンで治療する。まず、治療のための候補者を、癌細胞がスルビビンを過剰発現しているかどうかを試験する診断薬で場合によって分類する。例えば、腫瘍試料は、抗スルビビン抗体による免疫蛍光法によって分析することができる。あるいは、候補患者の腫瘍試料は、逆転写酵素ＰＣＲによってスルビビンｍＲＮＡレベルを検出する遺伝子チップとのハイブリダイゼーション、またはスルビビンｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを検出するその他の任意の方法によって分析することができる。患者はまた、その他の診断試験、例えば、ＭＨＣ発現レベル、Ｔ細胞媒介性の死滅に関与することが知られているシグナル伝達分子のレベル、または機能は知られていないが、免疫療法に対する応答性と関連することが経験的に知られている分子のレベルの試験に基づいた応答の可能性で分類することができる。
【０１８４】
腫瘍のほとんどの手術切除を行ったヒト患者を選択することは特に有用である。これによって、前述のように腫瘍の診断分析が可能になる。さらに、理論に結びつけることは望まないが、大きくて、嵩のある腫瘍は単純に免疫系を徐々に高める可能性があるので、手術によって切除した後、治療することが有利である。さらに、腫瘍は、小さな転移より大きな塊において高濃度をもたらす拡散性の免疫抑制因子を分泌する。
【０１８５】
治療のために選択された患者は、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経膠芽腫、頭部および頚部癌およびその他の癌を有する。
【０１８６】
適切に診断して患者を選択した後、非哺乳類スルビビン発現ベクター（哺乳類細胞で非哺乳類スルビビンを発現するベクター）を有するサルモネラ株で患者を治療する。例えば、患者に、哺乳類プロモーターからニワトリスルビビンを発現するプラスミドを有する生きたサルモネラＬＴ２約１０9個から１０13個を投与することができる。好ましくは、約１０10〜１０12個の細菌を使用し、より好ましくは約２×１０11個のサルモネラを投与する。サルモネラ株は好ましくは栄養要求性であり、実施例で触れた株のいずれも使用することができる。
【０１８７】
胃の酸性環境におけるサルモネラ細菌の生存問題を解決するために、２種類の他の方法を使用する。第１の方法では、患者はまず、安全かつ有効な量の重炭酸ナトリウムを摂取して、胃酸を中和する。第２の方法では、胃を通過して、小腸で溶解するように腸溶性コーティングされた丸剤としてサルモネラ細菌を製剤化する。
【０１８８】
副作用には、サルモネラチフィムリウム株を使用するときの軽い下痢が含まれ、サルモネラチフィムリウムは天然ではマウスの病原体であり、通常ヒトには病原性を持たない。このような軽い下痢を対症療法的に治療することが好ましいが、抗生物質で治療することはワクチン作用を無効にする可能性があるので、好ましくない。
【０１８９】
実施例１４；  腫瘍曝露に対するワクチン接種の時期
腫瘍曝露の時間に対するニワトリスルビビンのワクチン接種の時期の重要性を試験するために実験を実施した。マウスに、ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）をコードするプラスミドを含有するサルモネラを経口から経管投与した。投与計画を図９に示す。図示したように、１０日目のＬＬＣ／ＫＳＡ細胞の静脈内曝露および２９日目の肺癌罹患の評価に対して、経口からの経管投与を１日目および１３日目、７日目および１３日目、１０日目および１８日目、または１３日目および２１日目に実施した。図１０に示したように、ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）をコードするプラスミドを含有するサルモネラの経口からの経管投与は、使用した投与計画に関係なく肺癌罹患の減少に有効であった。ワクチンの効果は、初回ワクチンを腫瘍曝露の３日より前に投与したとき、より顕著であった。
【０１９０】
肺転移に対する様々な投与計画の効果も評価した。肺の転移は以下のように採点した。肺表面の５０％超が腫瘍に覆われているマウスのスコアは３であり、肺表面の５〜５０％が腫瘍に覆われているマウスのスコアは２であり、肺表面の５％未満が腫瘍に覆われているマウスのスコアは１であり、肺に腫瘍のコロニーが視認できないマウスのスコアは０であった。図１０に示したように、腫瘍曝露前の最初の投与を含む投与計画は、後に投与する計画またはＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）で経口的に免疫されていないマウスと比較して、肺転移のスコアが減少する傾向があった。
【０１９１】
実施例１５；  スルビビンワクチンと化学療法の併用治療
スルビビンに対するワクチンと化学療法の組み合わせの効果も評価した。試験方法を図１１に示す。図に示したように、完全な治療を受けたマウスを、野生型ニワトリスルビビンをコードするプラスミドを有するサルモネラで１日目に刺激した。ＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を４日目に静脈内に導入（曝露）した。シクロホスファミド（ＣＴＸ）を１１日目に腹腔内投与して、インドメタシンを１２〜１５日目に投与した。１５日目に、マウスに野生型ニワトリスルビビンプラスミドを有するサルモネラで２回目の経口による経管投与（追加免疫）を行い、肺癌罹患を２８日目に評価した。
【０１９２】
その他のマウスは治療の一部のみを受けた。例えば、初回免疫、曝露、および追加免疫のみを受けた（ＰＣＢ）、曝露、ＣＴＸおよびインドメタシンは受けたが初回または追加免疫は受けなかった（Ｃ（ＣＩ））、初回、曝露、ＣＴＸおよびインドメタシンは受けたが追加免疫は受けなかった（ＰＣ（ＣＩ））、または曝露、ＣＴＸ、インドメタシン、および追加免疫は受けたが初回免疫は受けなかった（Ｃ（ＣＩ）Ｂ）。
【０１９３】
図１２に示したように、初回免疫、曝露および追加免疫のみを受けたマウスは腫瘍罹患の軽減を示し、陰性対照と比較して肺転移スコアが減少した。ＣＴＸおよびインドメタシンは肺転移スコアに対して同様の効果を有し、腫瘍罹患がより全体的に軽減した。最低の腫瘍罹患および最低の肺転移が、少なくとも初回免疫およびＣＴＸおよびインドメタシンを受けたマウスで認められ、ワクチン治療および化学療法が協同して腫瘍罹患および肺転移を軽減し得ることを示している。
【０１９４】
実施例１６；  非哺乳類スルビビンをコードするＤＮＡによるサルモネラをベースにしたワクチン接種は、活性化された記憶表現型のＴ細胞の出現と相関する
末梢血リンパ球は、以前の実施例で説明したＰＣＢ、ＣＩ、ＰＣ（ＣＩ）、Ｃ（ＣＩ）Ｂまたは完全な（ＰＣ（ＣＩ）Ｂ）治療を受けたマウスから単離した。この治療が活性化した記憶Ｔ細胞の出現を誘導したかどうかを決定するために、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。記憶Ｔ細胞の有無は、ＣＤ４４の発現が多く、ＣＤ３の発現が少ない細胞（ＣＤ４明ＣＤ３低）をモニターすることによって決定した。図１３に示したように、初回免疫−曝露−追加免疫（ＰＣＢ）プロトコールで治療されたマウスは、活性化した記憶Ｔ細胞の出現を示すＣＤ４４明発現プロファイルを有するＴ細胞を示した。ニワトリスルビビンをコードするプラスミドを有するサルモネラによる免疫を含むプロトコールのそれぞれにおいて、同様のプロファイルが認められたが、化学療法のみで治療されたマウス（および陰性対照のマウス）では認められなかった。
【０１９５】
実施例１７；  免疫サイトカインと非哺乳類スルビビンをコードするＤＮＡによるワクチン接種との併用治療
非哺乳類スルビビンを使用したワクチン接種が免疫サイトカインをベースにした腫瘍の治療の効果を増強するかどうかを測定するために、１日目にマウスの皮下にＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を曝露し、図１４に示した計画に従って治療した。ＣｈｉｃｋｅｎＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎ９７Ｅ、Ｔ９９Ｍ、Ｖ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｇ）をコードするプラスミドを含むサルモネラを経口的に経管投与されたマウスは、４、１１、１８および２５日目に投与された。この実験で使用するために選択された免疫サイトカインは、米国特許出願公開第２００３−０１５７０５４号明細書に記載されているように、ＩＬ−２と脱免疫された抗ＥｐＣＡＭ抗体との融合物であった。免疫サイトカインを投与されたマウスは、８、９および１０日目に免疫サイトカイン２０μｇを静脈内に投与された。
【０１９６】
経時的に得られた腫瘍体積を図１５に示す。ワクチン接種も免疫サイトカインによる治療も経時的な腫瘍増殖を遅らせるのに十分であった。ワクチンおよび免疫サイトカインの両方を投与されたマウスはさらに良好で、ワクチン接種単独または免疫サイトカイン治療単独と比較して腫瘍増殖速度のさらなる抑制が示された。
【０１９７】
実施例１８；  本発明のスルビビン構築物の生物学的活性の評価
本発明のある種のスルビビン変種は、生物学的に不活性であるように設計されている。したがって、このタンパク質自体は、細胞内において、野生型スルビビンタンパク質によって妨害され得るアポトーシスを通常は誘導する条件下で発現しても、アポトーシス阻害活性を示さない。同様に、このタンパク質は、アポトーシス誘導剤の作用から細胞を防御する内在性野生型スルビビンの活性を妨害しない。
【０１９８】
スルビビンタンパク質が生物学的に不活性であることは、ＢａＦ３リンパ球前駆細胞を使用して試験することができる。ＢａＦ３細胞は、増殖のためにＩＬ−３に依存しており、増殖因子を除去するとアポトーシスを受けるが、スルビビンの活性によって対抗することができる（例えば、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ他（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：９１７〜９２１）。ＢａＦ３細胞を、本発明のスルビビン構築物、野生型スルビビンタンパク質または空の挿入物、および外部から導入されたＤＮＡを発現する細胞をモニターできるようにＧＦＰなどのマーカータンパク質を追加的にコードしているプラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクションから回復した後、ＩＬ−３を培地から除去し、ＢａＦ３細胞のアポトーシスを、例えば、１、２、３および４日目に％生存率を評価するか、または当業者によく知られているアポトーシスを示す測定法、例えば、核形態学（ＤＮＡ凝縮および断片化）によってモニターする。野生型スルビビンをトランスフェクションされたＢａＦ３細胞のほとんどが４日間生存する一方、空のプラスミドまたは本発明のスルビビン変種をトランスフェクションされたＢａＦ３細胞の生存は維持されず、ほとんどがアポトーシスの指標となる核形態を示した。
【０１９９】
本発明のスルビビン構築物が生物学的に不活性であることはまた、ＨｅＬａ細胞を使用して試験することができる。ＨｅＬａ細胞は、著しいレベルで内因性スルビビンを発現し、特定の変異体、例えばｈｕＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｃ８４Ａ）はスルビビンのドミナントネガティブ型（ＤＮスルビビン）として作用し、これらの細胞でアポトーシスを誘導することが知られている（例えば、Ｌｉ他（１９９９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：４６１〜４６６参照）。ＨｅＬａ細胞を、外来から導入されたＤＮＡを発現する細胞をモニターできるように、ＧＦＰなどのマーカータンパク質に加えて、ＤＮスルビビンまたは本発明のスルビビン構築物をコードするプラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクションから回復した後、ＨｅＬａ細胞を４８時間増殖させ、固定し、核をＤＡＰＩで染色して、細胞の核形態を免疫蛍光顕微鏡によって分析する。ＤＮスルビビンをトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞が一般的にアポトーシスを受けた特徴、例えば、凝縮し、断片化した核を有する一方、本発明のスルビビン構築物をトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞は正常に増殖することが発見されている。
【０２００】
実施例１９；  本発明のスルビビン構築物の安定性の評価
スルビビン構築物の安定性を評価するために、発現したスルビビンタンパク質の量を標準に対して測定できるように、ＧＦＰなどのマーカータンパク質を追加的に発現するベクターから発現させることができる。ＢＨＫ細胞などの組織培養細胞を一時的にトランスフェクションして、スルビビン構築物の発現レベルを、マーカー発現で正規化したウェスタンブロットで測定する。使用可能な抗スルビビン抗体がこのタンパク質を認識しないならば、これらの変種のＣ末端にタグ付けしたものを使用することができる。野生型スルビビンと比較して、本発明のある種の好ましい改変されたスルビビン構築物、例えば、多重不安定化変異を有するものは、はるかに少ないレベルで検出されることが発見された。
【０２０１】
安定状態レベルの評価に加えて、分解速度を経時変化実験で評価することができる。翻訳阻害剤シクロヘキシミドを細胞に０時に添加し、細胞を４時間インキュベートする。０、２、５、１０、２０、６０および２４０分後に試料を取り出し、ウェスタンブロット分析する。改変されたスルビビン構築物と野生型スルビビンとの間の速度を比較するために、量を０時点で正規化する。本発明のある種の好ましい改変されたスルビビン構築物は、野生型スルビビンよりも迅速に分解することがわかる。
【０２０２】
プロテアソーム媒介経路によって分解が進行するかどうかを評価するために、細胞をプロテアソーム阻害剤、例えば、ラクタシスチン（２時間、１００μＭ）の存在下または非存在下で場合によってインキュベートし、スルビビンレベルをウェスタンブロットによって再度測定する。ラクタシスチンの存在下では、本発明のスルビビン変種および野生型ｈｕＳｕｒｖｉｖｉｎは同レベルで検出されることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】スルビビン相同体のタンパク質配列のアラインメントを示す図である。
【図２】様々なスルビビン相同体のＢＩＲドメインを比較するためのアミノ酸のパーセント同一性を示した図である。
【図３】無脊椎動物のＢＩＲドメイン配列とヒトスルビビンとのアラインメントを示す図である。
【図４】スルビビンポリペプチドをコードしているプラスミドを有するサルモネラによるＤＮＡワクチン接種の方法を示す概略図である。
【図５】癌細胞に曝露したスルビビンワクチン接種マウスから単離されたＴ細胞からのＩＦＮγ放出を示した棒グラフである。
【図６】癌細胞に曝露したスルビビンワクチン接種マウスから単離されたＴ細胞からのＩＦＮγ放出を示した棒グラフである。
【図７】サルモネラＳＬ７２０７ニワトリスルビビンまたはマウススルビビンでワクチン接種したマウスの生存プロットである。
【図８】サルモネラＳＬ７２０７ニワトリスルビビンまたはマウススルビビンでワクチン接種したマウスの生存プロットである。
【図９】腫瘍曝露１０日目に対するワクチン接種時期の効果を評価するための投与計画の概略図である。
【図１０】異なる経過時間後にワクチン接種を受けたマウスあるいはＰＢＳを受けたマウスの肺の重量を示した図である。
【図１１】ワクチン接種、ＬＬＣ／ＫＳＡ細胞による静脈内への腫瘍曝露、腹腔内のシクロホスファミド（ＣＴＸ）、インドメタシン処理に関する投与計画の概略図である。
【図１２】ワクチン接種後に腫瘍曝露したマウスの肺重量を示した図である。
【図１３】非哺乳類スルビビンのワクチン接種した後のマウスにおけるＣＤ４４明、ＣＤ３低細胞の新規集団の外観を示す図である。
【図１４】皮下腫瘍曝露、非哺乳類スルビビンによるサルモネラ媒介ワクチン接種、ならびに静脈内免疫サイトカイン処理を含む投与計画の概略図である。
【図１５】ＰＢＳ、免疫サイトカイン、非哺乳類スルビビン、または免疫サイトカインおよび哺乳類スルビビンで処理したマウスの経時的腫瘍体積を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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