(57)【要約】本発明は、悪性細胞の、細胞傷害への対抗ならびに化学療法もしくは放射線療法を生き延びるために必要な遺伝的変化を行うことを阻害する、トランスクリプトーム修飾剤の使用に関する。前記トランスクリプトーム修飾剤の組み合わせは、ヒストン脱アセチル化を阻害する物質とＤＮＡメチル化機構を阻害する薬剤とからなる。本発明は、ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムの場合にはその塩の効果的な用量の投与に関する治療キットであり、癌患者の治療における放射線療法もしくは化学療法と併用使用するよう意図されるキットに関する。【代表図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法もしくは放射線療法と共に癌治療を補助する、トランスクリプトーム修飾剤の組み合わせからなる医薬組成物。
【請求項２】
該トランスクリプトームを修飾する組み合わせが、ヒドララジンとバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩とからなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アセチル化が遅いと判断された個体に投与される、薬学的に許容される媒体中に５０〜１００ｍｇのヒドララジンならびに２０〜５０ｍｇ／ｋｇのバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を含む、請求項１および請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
アセチル化が速いと判断された個体に投与される、薬学的に許容される媒体中に１５０〜２００ｍｇのヒドララジンならびに２０〜５０ｍｇ／ｋｇのバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を含む、請求項１および請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該バルプロ酸の塩が、バルプロ酸マグネシウムである、請求項１〜４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該化学療法剤が、クロラムブチル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファランチオテパ、カルマスティン、ロムスチン、アルトレタミン、ダカルバジン、ならびにプロカルバジン、シスプラチン、カルボプラスチン（carboplastin）ならびにオキサリプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、レチノイド、ホルモン剤、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、インターロイキン、インターフェロン、トラスツズマブ、セテュキマブ、リツキサン、マイロターグといったモノクローナル抗体、ならびにゲフィチニブ、エルロチニブおよびイマチニブといった抑制性低分子を含むが、これらに限定されない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、肺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、胆嚢癌、膵癌、結腸癌および直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎腫瘍、胃癌、腎臓癌、クロム親和性細胞腫、ウィルムス腫瘍、精巣癌、神経芽細胞腫、肉腫、急性白血病および慢性白血病、リンパ腫ならびに骨髄異形成症候群の任意の固形腫瘍を含むが、これらに限定されない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
化学療法もしくは放射線療法と共に癌治療を補助する、トランスクリプトーム修飾剤の該医薬組成物からなる治療キット。
【請求項９】
該医薬組成物が、ヒドララジンとバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩との組み合わせである、請求項８に記載の治療キット。
【請求項１０】
該医薬組成物が、アセチル化の遅い個体の場合には、５０〜１００ｍｇのヒドララジンならびに２０〜５０ｍｇ／ｋｇより多いバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩の用量で、毎日経口投与される、請求項８および請求項９に記載の治療キット。
【請求項１１】
該医薬組成物が、アセチル化の速い個体の場合には、１５０〜２００ｍｇのヒドララジンならびに２０〜５０ｍｇ／ｋｇより多いバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩の用量で、毎日経口投与される、請求項８および請求項９に記載の治療キット。
【請求項１２】
前記バルプロ酸塩が、バルプロ酸マグネシウムである、請求項８〜１１に記載の治療キット。
【請求項１３】
該医薬組成物が、化学療法もしくは放射線療法による治療を始める７日前に投与開始される、請求項８に記載の治療キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性細胞の、細胞傷害への対抗ならびに化学療法もしくは放射線療法を生き延びるのに必要な遺伝子変化の達成を防ぐことによって、悪性腫瘍の治療を補助するための、トランスクリプトーム修飾剤の使用に関し、より具体的には、ＤＮＡメチル化およびヒストン脱アセチル化を阻害する、トランスクリプトーム修飾剤の併用使用に関し、さらにより具体的には、化学療法もしくは放射線療法による癌の治療を共に補助するための、ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのような任意のその塩からなる治療キットによる併用使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌または悪性腫瘍は、固形腫瘍または造血系腫瘍として分類することができる。１つめの腫瘍の例は、とりわけ乳癌、頭頸部癌、結腸癌および直腸癌といった癌を含む。血液タイプの例は、白血病およびリンパ腫を含む。細胞核中のＤＮＡは、クロマチンの状態にアレンジされて存在し、いくつかのレベルの階級を有している。クロマチンの構成ユニットは、ヒストンとして公知の８量体の核タンパクから成り、それにＤＮＡが巻き付く、ヌクレオソームである。ヌクレオソームにおけるＤＮＡのアレンジまたはパッキングは、遺伝子調節に対して重要な役割を果たす。アセチル化のようなヒストンの共有結合修飾は、クロマチン調節および遺伝子発現に対して基本的な役割を果たす。（非特許文献１)。
【０００３】
現在、癌は世界的に重要な健康問題として存在し、国際癌研究機関（International Cancer Research Agency）および世界保健機構によれば、この疾患の発生率は劇的に増加しており、推定では癌の新しい症例は、２０００年に１０００万例観察され、２０年後には１５００万例になるだろう（非特許文献２）。一方では、肺癌、前立腺癌および乳癌のような最も頻度の高い癌に罹患した患者の生存率は、近年少しずつ改善してきた。５年生存率は１９７４年には５０％であり、１９９２年から１９９９年の期間には６３％に増加した（非特許文献３）。
【０００４】
治療形式の進歩は生存率に関してはわずかな改善をもたらしたが、この結果は最善とは言いがたい。現在のところ、非常に大多数の癌患者が手術を伴った化学療法ならびに放射線療法を必要とするので、この治療法の形式は、なお治療の基本的な柱である。
【０００５】
近年の癌の分子基盤について生み出された幅広い知識によって、一般に癌遺伝子機能の妨害または抑制遺伝子発現の再活性化に対して向けられる新形式の治療法のデザインが可能となった。これらの取り組みの例示的なものは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２などのようないくつかの癌遺伝子受容体に対するモノクローナル抗体の使用である。抑制遺伝子の場合には、治療上の取り組みは、ｐ５３の機能的産物に対するコーディング遺伝子を有する組み換え型アデノウイルスの使用である（非特許文献４）。
【０００６】
一般的に言えば、この癌治療の新形式は単一の遺伝子産物または単一の遺伝子治療に対して向けられている。しかしながら、悪性細胞のゲノムは非常に適応性があり、癌の性質は複数の段階を経たものであるので、この療法は大きな欠点を有しており、したがって、悪性表現型の発生原因である単一の遺伝的変化は存在しない。遺伝子もしくは遺伝子産物の妨害もしくは回復は重要な抗腫瘍効果をもたらすことができるが、悪性細胞が、前記治療による効果を受け入れるよりも遺伝子の発現を増加または減少させて、前記治療に対する抵抗性を結局は確実に獲得してしまうので、前記効果は維持されないことを意味する（非特許文献５）。
【０００７】
現在のところ、悪性細胞は、エピジェネティックな変化とともに、複数の欠陥、すなわち変異、欠失、重複、増幅を有し、前者は、主としてクロマチン修飾（ＤＮＡメチル化およびヒストンアセチル化のさらに２つの重要な変化）による安定的な機能転換であることは周知である。エピジェネティックな変化は特定の状態にあり、「悪性恒常性」を維持するために完全な機能的バランスで働くに違いない。悪性細胞のすべての欠損が単に加重だとは限らないので、この概念は非常に重要であり、遺伝子にコード化されたタンパク質が、正および負のフィードバックの制御を示す、複雑で相互作用的機能のネットワークにおいて、複数の役割を果たすという事実と一致している。さらに細胞は、腫瘍発生において生じる複数の段階過程を通じて、増殖および細胞死の過程が悪性状態のダイナミクスに従って生じることを確実にするために、発癌経路および抑制遺伝子の双方からの正のおよび負のシグナルの間で定常状態を維持するべきである（非特許文献６）。
【０００８】
悪性細胞の全体的な遺伝子発現の固有の複雑度に加えて、外部刺激の結果として、特に化学療法もしくは放射線療法の効果から、遺伝子発現を制御しようとする場合、臨床像ははるかに複雑になる。化学療法および放射線療法は、遺伝子転写において迅速な変化を産生し、これらの変化は、主として発癌過程に関係するそれらの遺伝子だけではなく、代謝、輸送などに関与する遺伝子のような、発癌過程に直接参加しない遺伝子においてもまた生じる。（非特許文献７）。しかしながら最も重要な一面は、有害な刺激に対する適切な転写反応が可能な細胞のみが、傷害を免れる細胞であるということである。明らかに、生存に「適応した」このような反応が生じるためには、転写を制御するエピジェネティックな機序が損なわれないことが不可欠である。したがって、悪性細胞がトランスクリプトーム修飾剤の影響下にあれば、生存に必要な転写反応は生じず、細胞では機能的に不可逆な変化またはアポトーシスが起こるであろう。真核細胞の転写は、当該細胞が生物学的に活性なタンパク質を発現する能力として定義することができる。したがって、転写は非常に制御された現象である。この過程は遺伝子レベルで始まり、タンパク質レベルで終了し、複数の事象を含んでいる。従って転写には、１）調節タンパク質が遺伝子制御領域もしくはプロモータ領域に結合する能力を決定するクロマチンパッキングのレベルを含むＤＮＡの物理的構造であるクロマチン構造、２）転写開始の制御、３）転写物の輸送、４）転写物のプロセッシングおよび修飾、５）転写物の安定、６）翻訳開始、７）翻訳後の変化、ならびに８）タンパク質の輸送および安定、のいくつかのレベルの調節がある。（非特許文献８）。確かに、転写調節のレベルに対する影響が大きいほど、転写効果はより重大になるであろう。したがって、トランスクリプトーム修飾剤は、最高レベルで調節に作用することによって、全体的な遺伝子発現に対して非常に大きな影響を及ぼすであろう。
【０００９】
アセチル化のようなヒストンの共有結合修飾、およびＤＮＡメチル化には、クロマチンパッキングの階級の決定および最終的に全体的な遺伝子発現の決定における重要な役割があり、そのために、ＤＮＡメチル化およびヒストン脱アセチル化を阻害する薬剤は、発現を著しく変更する特性を有することが実証されてきた。メチル化の消失により、特定の遺伝子座においてメチル化された領域に結合するタンパク質複合体の数は減少し、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が阻害しなければならないヒストン脱アセチル化酵素活性の減少に結びつく。さらに、転写を抑制する複合体の消失は、ヒストンアセチル化酵素活性を有する転写を活性化する複合体と遺伝子プロモータとの再結合を促進することができる。ＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＭＴ１）の最も多い型がヒストン脱アセチル化酵素に直接結合することができ、アミノ末端もまたコリプレッサに結合する能力を有することが公知である（非特許文献９、１０）。
【００１０】
【非特許文献１】Cho KS, Elizondo LI, Boerkoel CF：「クロマチン再構築およびヒト疾患における進歩」（"Advances in chromatin remodeling and human disease"）、Curr Opin Genet Dev 2004; 14:308-15
【非特許文献２】Mignogna MD, Fedele S, Russo LL.、「世界癌報告および口腔癌の負担」（"The World Cancer Report and the burden of oral cancer"）、Eur J Cancer Prev. 2004; 13: 139-42
【非特許文献３】Jemal A, Murray T, Ward E, Samuels A, Tiwari RC, Ghafoor A, Feuer EJ, Thun MJ.、「２００５年  癌統計」（"Cancer statistics, 2005"）、CA Cancer J Clin. 2005; 55:10-30
【非特許文献４】Hermiston TW, Kirn DH.、「遺伝学に基づいた癌治療：従来の創薬および薬剤開発との類似性および対比」（"Genetically based therapeutics for cancer: similarities and contrasts with traditional drug discovery and development"）、Mol Ther. 2005; 11:496-507
【非特許文献５】Ross JS, Schenkein DP, Pietrusko R, Rolfe M, Linette GP, Stec J, Stagliano NE, Ginsburg GS, Symmans WF, Pusztai L, Hortobagyi GN.、「２００４年  癌を標的にした治療」（"Targeted therapies for cancer 2004"）、Am J Clin Pathol. 2004; 122:598-609
【非特許文献６】非特許文献６：Weinstein IB.、「癌。癌遺伝子への依存−癌の弱点」（"Cancer. Addiction to oncogenes - the Achilles heal of cancer"）、Science. 2002;297(5578):63-4
【非特許文献７】Alaoui-Jamali MA, Dupre I, Qiang H.、「転写およびプロテオームのプロファイリングによる、癌における薬剤感度および薬剤抵抗性の予測」（"Prediction of drug sensitivity and drug resistance in cancer by transcriptional and proteomic profiling"）、Drug Resist Updat. 2004;7:245-55
【非特許文献８】Archambault J, Friesen JD.、「真核細胞ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩの遺伝学」（"Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III"）、Microbiol Rev. 1993;57:703-24
【非特許文献９】Nakao M.、「エピジェネティックス：ＤＮＡメチル化およびクロマチンの相互作用」（"Epigenetics : interaction of DNA methylation and chromatin"）、Gene. 2001; 278:25-31
【非特許文献１０】Robertson KD.、「ＤＮＡメチル化およびクロマチン−からんだクモの巣をほどく」（"DNA methylation and chromatin- unraveling the tangled web"）、Oncogene. 2002;21:5361-79
【非特許文献１１】Yung R, Chang S, Hemati N, Johnson K, Richardson B.、「薬剤誘発性全身性エリテマトーデスの機序。ＩＶ。インビトロおよびインビボにおける類似化合物によるプロカインアミドおよびヒドララジンの比較」（"Mechanisms of drug-induced lupus. IV. Comparison of procainamide and hydralazine with analogs in vitro and in vivo"）、Arthritis Rheum. 1997; 40:1436-43
【非特許文献１２】Segura B, Trejo-Becerril C, Perez E, Chavez A, Salazar AM, Lizano M, Duenas-Gonzalez A.、「心臓脈管薬のヒドララジンおよびプロカインアミドによる腫瘍抑制遺伝子の再活性化および癌治療におけるそれらの使用の可能性」（"Reactivation of tumor suppressor genes by the cardiovascular drugs hydralazine and procainamide and their potential use in cancer therapy"）、Clin Cancer Res. 2003;9: 1596-603
【非特許文献１３】Angeles EE, Vazquez-Valadez, VH, Vasquez-Valadez O, Velazquez-Sanchez AM, Ramirez A, Martinez L, Diaz-Barriga S, Romero-Rojas A, Cabrera G, Lopez-Castanares R, Duenas- Gonzalez A：、「抗腫瘍薬としての１−ヒドラジノフタラジン（ヒドララジン）のコンピュータ上の研究。メチル基転移酵素についてのドッキング研究。」（"Computational studies of 1-hydrazinophthalazine (Hydralazine) as antineoplastic agent. Docking studies on methyltransferase."）、Letters Drug Design Discovery 2005;4:282-286
【非特許文献１４】Perucca E: 「バルプロエートの薬理学的特性および治療上の特性：３５年間の臨床経験後の要約」（"Pharmacological and therapeutic properties of valproate: a summary after 35 years of clinical experience."）、CNS Drugs 2002, 16:695-714
【非特許文献１５】Gurvich N, Tsygankova OM, Meinkoth JL, Klein PS、「ヒストン脱アセチル化酵素はバルプロ酸を介した細胞分化の標的である」（"Histone deacetylase is a target of valproic acid-mediated cellular differentiation"）、Cancer Res 2004,64:1079-1086
【非特許文献１６】Zambrano P, Segura-Pacheco B, Perez-Cardenas E, Cetina L, Revilla-Vazquez A, Taja-Chayeb L, Chavez- Blanco A, Angeles E, Cabrera G, Sandoval K, Trejo-Becerril C, Chanona-Vilchis J, Duenas- Gonzalez A.、「腫瘍抑制遺伝子の発現を脱メチル化し再活性化するヒドララジンのフェーズＩ試験」（"A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes"）、BMC Cancer 2005; 5:44
【発明の開示】
【００１１】
何百もの可能性のある抗腫瘍薬剤がテストされたが、多くの抗腫瘍治療は部分的にのみ効果的であり、実質上はすべての系に副作用をもたらす可能性があるので、ヒトの癌の治療にはなお挑戦的である。したがって、より効果的な治療上の選択肢を有するだけでなく、遺伝子の転写に対してより選択的な方法で悪性細胞を攻撃するいくつかのより特異的な治療法を有する必要がある。この理由のため、本発明の目的の１つは、化学療法もしくは放射線療法によって生じる有害刺激に対して細胞の生存を不可能にする、ヒドララジンおよびバルプロ酸マグネシウムのような転写修飾剤の使用による、トランスクリプトームの変化に基づいた癌治療を補助するための組成物を提供することである。
【００１２】
血圧降下薬ヒドララジンは、実験系において低メチル化Ｔ細胞ＤＮＡに対して用いられるＤＮＡメチル化阻害剤であり、これらの細胞を自己反応性にする薬剤である。（非特許文献１１）。より最近では、ヒドララジンが抑制遺伝子由来のプロモータ領域の脱メチル化をもたらし、インビトロモデルおよびインビボモデルにおいて再活性化を誘導すること、およびさらに、再活性化された遺伝子産物は機能的であることが実証された（非特許文献１２）。
【００１３】
ヒドララジンはＤＮＡメチル基転移酵素に対する直接的な抑制効果を有し、インビトロのモデルにおいて、この分子の２つの窒素原子が、抑制遺伝子機能の脱メチル化および再活性化特性の原因となる酵素活性部位のアミノ酸のＬｙｓ１６２およびＡｒｇ２４０と相互作用することが実証された。（非特許文献１３）。
【００１４】
バルプロ酸またはその塩、バルプロ酸マグネシウムの場合ではＶＰＡとしてもまた公知の２−プロピルペンタン酸は、十分に実証された安全性プロフィールで長年抗けいれん薬として使用されてきた薬剤である（非特許文献１４）。最近では、この医薬品がヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であることが実証された。阻害される酵素は、ヒストン脱アセチル化酵素６および１０を例外とした、クラスＩファミリーおよびクラスＩＩファミリーのヒストン脱アセチル化酵素である。インビトロおよびインビボで観察されるヒストンＨ３およびヒストンＨ４の高アセチル化は、この酵素ファミリーに対する酵素抑制効果にともなって起こる。ヒストンに対するこの作用は、分化の誘導、アポトーシスの誘導および細胞増殖の阻害に対する重要な効果をもたらす。（非特許文献１５）。
【００１５】
この理由のために、本発明は、癌に対して使用される通常の治療法に寄与する、ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその任意の塩によって構成される治療キットを提供することをもう一つの目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆおよび１Ｇは、本発明のトランスクリプトーム修飾組成物により処理された異なる悪性細胞株における細胞傷害効果を示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、本発明のトランスクリプトーム修飾組成物が、代表的な化学療法剤（シスプラチン、ドキソルビシンおよびゲムシタビン）の悪性細胞株における細胞傷害効果の増強をどのようにもたらすかを示す。
【図３】図３Ａは、本発明による各遺伝子のメチル化頻度を示す。図３Ｂは、本発明によるメチル化頻度の代表例を示す。図３Ｃは、本発明によるメチル化の割合およびヒドララジン用量の間の相関性を示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、治療前および治療後の生検におけるｍＲＮＡの遺伝子発現の実例を示す。
【図５】図５は、本発明によるヒストン脱アセチル化酵素活性のデータを示す。
【図６】図６は、本発明によるヒストン脱アセチル化酵素活性のデータを示す。
【図７】図７は、本発明によるヒストン脱アセチル化酵素活性のデータを示す。
【図８】図８は、本発明の組成物のヒストン脱アセチル化酵素抑制効果のデータを示す。
【図９】図９は、本発明による組成物の投与をした動物および投与をしなかった動物における腫瘍成長阻止効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、化学療法もしくは放射線療法による治療を補完するトランスクリプトーム修飾化合物の使用による悪性腫瘍の治療に役立つ、組成物および治療キットの使用を提供する。
【００１８】
トランスクリプトーム修飾剤の組成物は、ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのような任意のその塩の組み合わせであり、クロラムブチル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファランチオテパ、カルマスティン、ロムスチン、アルトレタミン、ダカルバジン、ならびにプロカルバジン、シスプラチン、カルボプラスチン（carboplastin）ならびにオキサリプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、レチノイド、ホルモン剤、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、インターロイキン、インターフェロン、トラスツズマブ、セテュキマブ、リツキサン、マイロターグといったモノクローナル抗体、ならびにゲフィチニブ、エルロチニブ、およびイマチニブといった抑制性低分子であり得るが、これらの化合物に限定されない化学療法を補助する。
【００１９】
本発明の組成物および治療キットは、乳癌、卵巣癌、子宮癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、肺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、胆嚢癌、膵癌、結腸癌および直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎腫瘍、胃癌、腎臓癌、クロム親和性細胞腫、ウィルムス腫瘍、精巣癌、神経芽細胞腫、肉腫、急性白血病および慢性白血病、リンパ腫ならびに骨髄異形成症候群を含むが、これらに限定されないいくつかの腫瘍タイプに対して使用することができる。
【００２０】
本発明の組成物は、アセチル化の遅い個体に対しては、８３ｍｇのヒドララジンに３０ｍｇ／ｋｇ重量の用量のバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を加えた処方で、またはアセチル化の速い個体に対しては、１８２ｍｇのヒドララジンに３０ｍｇ／ｋｇ重量の用量でバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を加えた用量で、経口経路または他の投与経路によって投与することができる。実施形態のいずれかにおける双方の薬剤は、化学療法もしくは放射線療法の治療の細胞毒性による傷害の起こる前に、トランスクリプトームの修飾を可能にするために、化学療法の初回投与または初回放射線療法セッションの７日前に放出制御の製剤で投与開始されるべきである。
【実施例】
【００２１】
使用１の実施例
トランスクリプトーム修飾組成物の、ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムが抗腫瘍効果を有することを実証するために、子宮頸癌(cervicouterine cancer)、乳癌、結腸癌、上気道癌および消化器癌、ならびに肉腫からの様々な悪性細胞株を使用した。細胞を、０．１ｍｌの完全培地中に１．５〜２．５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（ファルコン・ベクトン・ディキンソン（Falcon Becton Dickinson）社、ニュージャージー  フランクリンレイクス）中にプレーティングした。翌日、細胞を４日間１０μＭのヒドララジンおよび１ｍＭのバルプロ酸マグネシウムで処理した。翌日、細胞生存度をＭＴＴ分析を使用して測定した。簡潔には、リン酸緩衝液中の５０μｌのＭＴＴ試薬を各ウェルに加えた。ＭＴＴは、活性のあるミトコンドリアをともなう生細胞により、沈澱可能な紫色の化合物（フォルマザン）に還元され、これらを各ウェルへの１５０μｌのＤＭＳＯの添加により溶解する。その後、それをＥＬＩＳＡリーダ上で分光光度法により読み取る。すべての分析を３回繰り返して実行した。各処理の細胞傷害効果を、［（処理細胞のＡ５７０ｎｍ）／未処理細胞のＡ５７０ｎｍ］×１００として定義される、未処理の対照（％対照）と比較した細胞生存度の割合で表した。
【００２２】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、および１Ｇは、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、肉腫のＨＴ１０８０、乳癌のＭＣＦ−７、喉頭および口腔のそれぞれのＫＢおよびＨＥＰ２扁平上皮癌：結腸癌のＳＷ４８０、ＫＢ口腔扁平上皮癌、ＨＥＰ２喉頭扁平上皮癌、Ｄ５４のすべての処理された細胞株がトランスクリプトーム修飾組成物により、生存度の減少において１２．７％から４３．４％へと顕著な細胞毒性の変化をもたらしたことを示す。
使用２の実施例
【００２３】
トランスクリプトーム修飾組成物が、悪性細胞株の増殖に対する抑制効果を有することが実証された後、この組成物が化学療法剤の細胞傷害効果を増加させたかどうかが調べられた。この目的のために、このクラスの典型である３つの薬剤が選択された。アルキル化薬としてシスプラチン、抗生物質としてドキソルビシン、代謝拮抗剤としてゲムシタビンである。細胞を、０．１ｍｌの完全培地中に１．５〜２．５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（ファルコン・ベクトン・ディキンソン、ニュージャージー  フランクリンレイクス）中にプレーティングした。翌日、細胞は、１０μＭのヒドララジン、および１ｍＭのバルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムを加えて、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ中に示された濃度の化学療法剤により処理された。翌日に薬剤を含む培地を除去し、追加の４８時間、新しいヒドララジンおよびバルプロ酸マグネシウムを同じ濃度で加えた。翌日（４日目）に、細胞生存度をＭＴＴ分析を使用して測定した。簡潔には、リン酸緩衝液中の５０μｌのＭＴＴ試薬を各ウェルに加えた。ＭＴＴは、活性のあるミトコンドリアをともなう生細胞により、沈澱可能な紫色の化合物（フォルマザン）に還元され、これらを各ウェルへの１５０μｌのＤＭＳＯの添加により溶解する。その後、それをＥＬＩＳＡリーダ上で分光光度法により読み取る。すべての分析を３回繰り返して実行した。各処理の細胞傷害効果を、［（処理細胞のＡ５７０ｎｍ）／未処理細胞のＡ５７０ｎｍ］×１００として定義される、未処理の対照（％対照）と比較した細胞生存度の割合で表した。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、すべての場合において、化学療法剤を加えたトランスクリプトーム修飾組成物には、より高い細胞毒性があることを示す。これらの条件の下では、トランスクリプトーム修飾組成物により処理された場合、抑制濃度５０（ＩＣ５０）である１２μＭシスプラチン濃度は、ＨｅＬａ細胞において３７％の生存度の減少をもたらした。類似した効果が、アドリアマイシンおよびゲムシタビンについてもまた、２７％および３７％のそれぞれの減少で実証された。
使用３の実施例
【００２４】
抑制遺伝子の転写により脱メチル化し再活性化する効果を臨床的に達成できることを実証するために、ヒドララジンがどのくらいの用量で、癌患者において転写の脱メチル化および再活性化効果があるかを実証するフェーズI臨床研究が行なわれた。この目標のために、ヒドララジンを、１）５０ｍｇ／日、２）７５ｍｇ／日、３）１００ｍｇ／日および４）１５０ｍｇ／日の用量で、各群につき４人の患者のいる群に対して１０日間投与した。生検サンプルおよび末梢血サンプルを、投与開始前および投与１１日目で採取した。ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現状態に加えて、処理前のメチル化の状態および処理後のメチル化の状態は、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ；ＥＲ、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＲＡＲβ、ＦＨＩＴおよびｐ１６の遺伝子のプロモータについて分析された。さらに、ゲノム中のメチル化されたサイトカインの全体的な含有量に加えて、親株の不活性化Ｈ１９の遺伝子のメチル化の状態、および通常はメチル化されているゲノムのクローンを評価した。ヒドララジンに対する毒性は、米国国立癌研究所（ＣＴＣ  ＮＣＩ）の尺度を使用して評価された。ヒドララジンは良好な耐容性を示し、悪心、吐き気、疲労、頭痛および動悸の副作用のみが記録された。遺伝子に関して、分析されたサンプルの７０％（１２８のうちの８９）が、処理前の生検において少なくとも１つのメチル化された遺伝子、１６人の生検患者の各々当たり８つのメチル化された遺伝子を有すること、および全患者は腫瘍中に少なくとも１つのメチル化された遺伝子を有することが発見された。各遺伝子に対する個別の分析により、ＡＰＣは９４％、ＥＲは２５％、ＦＨＩＴは８８％、ＧＳＴＰ１は８８％、ＭＧＭＴは８１％、ｐ１６は１９％、ＲＡＲβは６２％、およびＤＡＰＫは１００％のメチル化頻度であることが実証された。処理後生検では、ＭＧＭＴについては１３サンプルのうちの２サンプルで１５％から、遺伝子ｐ１６については３サンプルのうち２サンプルで６７％まで変化して、各遺伝子において脱メチル化の可変的な頻度があることが発見された。図３Ａ。代表例を図３Ｂに示す。脱メチル化の割合とヒドララジンの用量との間の相関性は、図３Ｃにおいて見ることができるように、５０ｍｇで４０％、７５ｍｇで５２％、１００ｍｇで４３％、１５０ｍｇで３２％であった。
【００２５】
遺伝子の発現の分析から、腫瘍サンプルの９０％（１２８のうちの１１６）が、処理前生検および処理後生検において遺伝子のメチル化状態とは無関係にｍＲＮＡを発現し、したがってそれらが有益でなかったことが示された。１２の有益な症例のうちで、９つが処理前にはメチル化された遺伝子を発現していないことが発見されたが、処理後これらの遺伝子は脱メチル化され、再度遺伝子発現が起こった。代表例は図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに示され、遺伝子再発現の全体の頻度は図４Ｄに要約される。
【００２６】
上記の結果は、５０〜１５０ｍｇの範囲のヒドララジン用量が癌患者における遺伝子の発現を変更するのに効果的であることを実証する。（非特許文献１６）。
使用４の実施例
【００２７】
バルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩が、癌患者の腫瘍におけるヒストンの高アセチル化およびヒストン脱アセチル化酵素の活性の阻害を誘導することを証明するために、異なった用量のバルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を、子宮頸癌の患者へ投与する別の臨床研究が行われた。最近子宮頸癌と診断され、未治療の１２人の患者に対して、４人の患者の群にわけて、バルプロ酸マグネシウムを、１群、２０ｍｇ／ｋｇ、２群、３０ｍｇ／ｋｇ、３群、４０ｍｇ／ｋｇの用量で与えた。腫瘍の生検および血液サンプルを、投与前に、およびバルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を分割された用量で８時間ごとに５日間投与した翌日（６日目）に採取した。ウェスタンブロットによる腫瘍中のサンプルにおけるヒストンＨ３およびヒストンＨ４の高アセチル化、比色分析を使用する腫瘍の核抽出物中のヒストン脱アセチル化酵素の活性、血清におけるバルプロ酸のレベルを分析した。遺伝子ｐ２１およびＣＡＲの発現のレベルもまた処理後の生検において分析した。投与の毒性をサイクルの終了時に記録した。全患者に対する投与を終え、２０、３０および４０ｍｇ／ｋｇの用量にそれぞれ対応する１２４５、２０００および２４２５ｍｇの平均では、平均用量は１８９０ｍｇ／日だった。グレード２の眠気が１２人の患者のうちの９人において観察された。投与後に、９人および７人の患者において、それぞれＨ３およびＨ４の高アセチル化が見つかり、それらのうちの６人は双方のヒストンにおいて高アセチル化が起こった。（陽性対照および陰性対照は、それぞれトリコスタチンで処理したまたは処理しなかったＨｅＬａ細胞）。８人の患者ではヒストン脱アセチル化酵素の活性は低下したが、２人の患者においては変化がなく、それは統計的に有意であった（両側検定のｔ検定、ｐ<０．０２６４）。（陽性対照および陰性対照は、トリコスタチンで処理したまたは処理しなかったＨｅＬａ細胞の核抽出物）、図５、６および７。このデータは、バルプロ酸マグネシウムは用いられた用量でヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤として効果的で良好な耐容性を示すことを実証し、発現が増加するｐ２１（図８）のような遺伝子発現の変化を反映する。
使用５の実施例
【００２８】
ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩の患者の腫瘍における遺伝子発現を変化させる能力が評価された後、これらのトランスクリプトーム修飾剤の組成物が、免疫不全のマウスの肉腫モデルにおいて化学療法の抗腫瘍効果を増加させるかどうかを調べた。この目標のために、６匹の雌の無胸腺マウス群に、肉腫ＨＴ１０８０細胞株の６００万個の細胞を注入し研究を行なった。腫瘍が形成されると、動物に、患者で使用されるものと同等の用量のヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を全身投与した。投与群は、１）食塩水を投与した対照群、２）アドリアマイシンを毎週投与した群、３）７日間ヒドララジンおよびバルプロエートの組成物を投与し、後続して同様の一週間のアドリアマイシン投与を行なった群であった。この結果から、５週目において非投与動物の腫瘍は体積２〜３ｃｍ３に達し、アドリアマイシン投与は投与３週後にほぼ完全な抗腫瘍効果をもたらすが、それにもかかわらず腫瘍はこの時点からさらに増殖すること、しかし図９において見ることができるように、組成物を投与した動物では腫瘍の再増殖は妨げられることが実証される。上記は、トランスクリプトーム修飾剤の併用により、腫瘍細胞の増殖能力回復に必要な転写変化の達成が阻害されることを示唆する。完全なまたはほぼ完全な抗腫瘍反応の後に再発が観察されるというこの現象は、癌患者の治療において一般に生じる。したがって本発明の組成物は、腫瘍の寛解の延長または完全寛解を誘導する可能性がある。
【００２９】
本発明の組成物は、アセチル化の遅い個体であるならば、８３ｍｇのヒドララジンに３０ｍｇ／ｋｇ重量の用量でバルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を加えた処方で、またはアセチル化の速い個体であるならば、１８２ｍｇのヒドララジンに３０ｍｇ／ｋｇ重量の用量でバルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩を加えた用量で、経口的または他の投与経路によって投与される治療キット中に組み入れることができる。ヒドララジンならびにバルプロ酸もしくはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩によってもたらされた血中濃度におけるピークを回避し、その急速な吸収による副作用を低減するために、双方の薬剤は、放出制御製剤で投与されるべきである。
【００３０】
メチル化の阻害に対するヒドララジンの効果は少なくとも投与の４８時間後に始まり、転写に対するバルプロ酸またはバルプロ酸マグネシウムのようなその塩の効果は、脱メチル化のバックグラウンドに基づきより高くなり得るので、組成物による治療は、化学療法もしくは放射線療法の細胞毒性による傷害の前にトランスクリプトームの修飾を可能にするために、化学療法もしくは放射線療法の初回投与の７日前に好ましくは開始しなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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