(57)【要約】  本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に付着し、動物に注入されると、その中で大きく高められた平均滞留時間（ＭＲＴ）を有する錯体を形成するブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）を提供する。また、ヒトのような動物が曝されたまたは曝され得るときの、神経毒のような毒物の中毒作用を治療および／または防止するこうした錯体の組成物、これらの錯体の調製方法、およびこれらの錯体と組成物の使用方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に化学的に結合したブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）タンパク質を含むＰＥＧ化ブチリルコリンエステラーゼ（ＰＥＧ−ＢＣｈＥ）。
【請求項２】
該ＢＣｈＥが組換え型ＢＣｈＥである請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項３】
該ＢＣｈＥが遺伝子導入で生成したＢＣｈＥである請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項４】
該ＢＣｈＥが、共有結合によって該ＰＥＧに化学的に結合した請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項５】
該ＰＥＧが、該ＢＣｈＥのアミノ基に付着した請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項６】
該アミノ基が、該ＢＣｈＥのＮ末端アミノ基である請求項５に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項７】
該ＰＥＧが、該ＢＣｈＥのチオール基に付着した請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項８】
該チオール基が、該ＢＣｈＥのＮ末端アミノ酸上にある請求項５に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項９】
該ＰＥＧが、該ＢＣｈＥのグリカン基に付着した請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１０】
該ＰＥＧが、シアル酸基を介して該グリカンに付着した請求項９に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１１】
該ＰＥＧが線状構造を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１２】
該ＰＥＧが枝分かれまたはフォーク状の構造を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１３】
該ＰＥＧが、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、およびｍＰＥＧ−ＭＡＬ２からなる群より選択された一員である請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１４】
該ＰＥＧが、５０００〜５０００００キロダルトンの分子量を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１５】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも５時間の該哺乳類中の半減期を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１６】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも１０時間の該哺乳類中の半減期を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１７】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも１５時間の該哺乳類中の半減期を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１８】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも２０時間の該哺乳類中の半減期を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項１９】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも３０時間の該哺乳類中の半減期を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２０】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも４０時間の該哺乳類中の半減期を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２１】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも１０％の生物学的利用率を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２２】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、少なくとも２０％の生物学的利用率を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２３】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、該哺乳類中で少なくとも３０％の生物学的利用率を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２４】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、該哺乳類中で少なくとも４０％の生物学的利用率を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２５】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、該哺乳類中で少なくとも５０％の生物学的利用率を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２６】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルが、哺乳類に投与されたとき、該哺乳類中で少なくとも６０％の生物学的利用率を有する請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２７】
該サンプルが、約２０キロダルトンの平均分子量を有するＰＥＧを含む請求項１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２８】
該ＢＣｈＥタンパク質が、哺乳類ＢＣｈＥのアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項２９】
該哺乳類が人間である請求項２８に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥ。
【請求項３０】
ＢＣｈＥに対する活性化ＰＥＧの化学結合を促進する条件下で、ＢＣｈＥタンパク質を活性化ＰＥＧ部分に接触させることを含む、請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥを調製する方法。
【請求項３１】
該ＢＣｈＥが、組換え型ＢＣｈＥまたは遺伝子導入ＢＣｈＥである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該活性化ＰＥＧが５０００〜５０００００ダルトンの分子量を有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
該接触が、４〜１１のｐＨを有する緩衝液の中で生じる請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
活性化ＰＥＧとＢＣｈＥタンパク質の比（ＰＥＧ：タンパク質）が４０：１〜１２０：１である請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
活性化ＰＥＧとＢＣｈＥタンパク質の比（ＰＥＧ：タンパク質）が約８０：１である請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
該ＢＣｈＥが少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
該ＢＣｈＥが０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該接触が４℃〜５０℃の間の温度で生じる請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
ＢＣｈＥタンパク質のサンプルが活性化ＰＥＧ部分のサンプルと接触する請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
該接触が、少なくとも１０分間にわたって継続することが許容される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該接触が、２４時間以下にわたって継続することが許容される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、プロカインアミド親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製される請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
該化学結合が、該ＢＣｈＥタンパク質のアミノ基に対してである請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
該活性化ＰＥＧが、スクシンイミジル誘導体の単官能メトキシ活性化ポリマーである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
該スクシンイミジル誘導体が、スクシンイミジルプロピオン酸（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、α−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）からなる群より選択された一員である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該アミノ基がＮ末端アミノ基である請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
該活性化ＰＥＧが、１または複数のアルデヒド基を有する単官能メトキシ活性化ポリマーである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該単官能メトキシ活性化ポリマーがブチルＡＬＤ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ）である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該化学結合が、該ＢＣｈＥタンパク質のチオール基に対してである請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
該活性化ＰＥＧがマレイミド−カップリング−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該チオール基が、該ＢＣｈＥタンパク質のＮ末端アミノ酸にある請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
該活性化ＰＥＧが単官能メトキシ活性化ＰＥＧである請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
該単官能メトキシ活性化ＰＥＧがｍＰＥＧ−ＯＰＴＥである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該化学結合が、該ＢＣｈＥのグリカン基に対してである請求項３０に記載の方法。
【請求項５５】
該活性化ＰＥＧがシアル酸に結合した請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
薬学的に許容される担体中に請求項１に記載のＰＥＧ−ＢＣｈＥを含み、該ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、毒素または毒物を中和するのに有効な量で存在する医薬組成物。
【請求項５７】
該組成物が、ＰＥＧ化されていないＢＣｈＥをさらに含む請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
動物内の毒素または毒物を中和する方法であって、請求項５６に記載の医薬組成物の有効量を該動物に投与することを含む方法。
【請求項５９】
該動物が哺乳類である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該哺乳類が人間である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該毒素または毒物が、神経系に作用する毒素または毒物である請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
該毒素または毒物がＣ系神経ガスである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該毒素または毒物がＶ系神経ガスである請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
該毒素または毒物が有機リン酸化合物である請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
該毒素または毒物が、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＦＰ）、ＧＡ（タブン）、ＧＢ（サリン）、ＧＤ（ソマン）、ＣＦ（シエロサリン）、ＧＥ、ＣＶ、ｙＥ、ＶＧ（アミトン）、ＶＭ、ＶＲ（ＲＶＸまたはロシアＶＸ）、ＶＳ、およびＶＸから選択された一員である請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
該医薬組成物が、カルバメート、抗ムスカリン剤、コリンエステラーゼ再賦活薬、および痙攣阻止剤からなる群より選択された薬剤を、さらに含むまたは組み合わせて投与される請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
該カルバメートがピリドスチグミンである請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
該抗ムスカリン剤がアトロピンである請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
該コリンエステラーゼ再賦活薬は塩化プラリドキシム（２−ＰＡＭ、Ｐｒｏｔｏｐａｍ）である請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
該痙攣阻止剤がジアゼパムである請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年８月４日に出願された米国仮出願第６０／８３５８２７号の優先権を主張し、当該出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、医薬用途および生物防御用途に、タンパク質の循環平均滞留時間（ＭＲＴ）を改良し、タンパク質免疫原性を低減するための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）の化学的改質に関する。
【背景技術】
【０００３】
過去数十年間にわたって、駆除剤としておよび戦争において有機リン系化合物および関連の化合物を使用してきたことは、深刻で遅延性の中毒件数の増加をもたらし、末梢および中枢神経系に障害を生じさせ、筋疾患、精神病、進行麻痺、および死亡に至らしめる。こうした有害物質は、コリンエステラーゼ酵素を阻害することによって作用し、それによって、アセチルコリンのような神経伝達物質の分解を妨げ、神経系の運動亢進を生じさせる。例えば、アセチルコリンの発達は、ムスカリン性受容体部位（外分泌腺と平滑筋）およびニコチン性受容体部位（骨格筋）の継続した刺激を生じさせる。また、コリンエステラーゼ阻害物質に暴露することは、症状の範囲を軽度（例えば、単収縮、震え）から重度（例えば、麻痺呼吸、痙攣）に移行させ、極端な場合には、含まれるコリンエステラーゼ阻害物質の種類と量によっては、死亡にいたる。有機リン系化合物やカルバメートのようなコリンエステラーゼ阻害物質の作用は、昆虫をコントロールするためのような、殺虫剤としてそれらを非常に有効なものにする。ヒトのような哺乳類がこれらの化合物に曝されると（例えば、吸入による）、同じ悪影響を受けることが多い。
【０００４】
特定のコリンエステラーゼ阻害物質のヒトに及ぼす甚大な影響は、「神経ガス」または化学兵器としてこれらの化合物の開発を導いた。神経ガスは、中でも毒性が高い。こうした化合物は、リン酸の両方のエステルという点で有機リン殺虫剤に関係する。主な神経ガスには、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＦＰ）、ＧＡ（タブン）、ＧＢ（サリン）、ＧＤ（ソマン）、ＣＦ（シエロサリン）、ＧＥ、ＣＶ、ｙＥ、ＶＧ（アミトン）、ＶＭ、ＶＲ（ＲＶＸまたはロシアＶＸ）、ＶＳ、およびＶＸが挙げられる。
【０００５】
有機リン中毒は、現在、カルバメート（例えば、ピリドスチグミン）、抗ムスカリン（例えば、アトロピン）、および塩化プラリドキシム（２−ＰＡＭ、プロトパム）のような再賦活薬を含む薬物の組み合わせの静脈投与または筋肉内投与によって治療される。１つのアプローチは、有機リン系化合物暴露の治療のためにコリンエステラーゼ酵素を使用することであった。暴露後の毒性は、コリンエステラーゼを用いた前治療によって防止することができ、有機リン系化合物が生理学的標的に到達する前に、毒性の有機リン系化合物を隔離する作用をする。
【０００６】
前治療薬物としてのコリンエステラーゼの使用は、非ヒト霊長類などの動物においては、成功裏に実証されてきた。例えば、ウシ胎仔血清由来ＡＣｈＥまたはウマ血清由来ＢＣｈＥを用いた赤毛猿の前治療は、化学兵器として使用される高い毒性の有機リン系化合物であるピナコリルメチルホスホノクロリダート（ソマン）のＬＤ５０の２〜５回の攻撃に対してそれらを保護した（非特許文献１〜２）。十分な外来性ヒトＢＣｈＥの投与は、マウス、ラット、およびサルを、致死量の有機リン系化合物中毒から保護することができる（例えば、非特許文献３〜５参照）。精製したヒトＢＣｈＥは、ヒトにおける有機リン中毒の治療のために使用されており、有意な悪い免疫的または心理的効果は見られない（非特許文献６）。
【０００７】
インビトロとインビボの双方の有機リン化合物の滴定は、有機リン系化合物阻害酵素と有毒神経ガス蓄積量の間で１：１の化学量論を実証している。
【０００８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による医薬品の改質は、半減期を改良し、免疫原性を低減することが報告されている。ＰＥＧによって改質されてＦＤＡに認可されたタンパク質には、ＥｎｚｏｎのＡＤＡＧＥＮ（登録商標）（ウシペガデマーゼ）、ＥｎｚｏｎのＯＮＣＡＳＰＡ（登録商標）（ペグアスパルガーゼ）、ＲｏｃｈｅのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ａ）、シェリング・プラウ社のＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、およびアイテック＆ファイザー社のＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガブタニブ）が挙げられる。
【０００９】
ＰＥＧは、タンパク質の種々の箇所に付着することができ、リジン残基上またはＮ−終端のようなアミノ基のほかに、システイン上のチオール基、またはタンパク質表面上の他の反応性基などがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Broomfield et al., J. Pharmacol. Exp. Then, 1991, 259:633-638
【非特許文献２】Wolfe et al., Toxicol, Appl. Pharmacol., 1992, I17(2):189-193
【非特許文献３】Raveh et al,. Biochemical Pharmacology, 1993, 42:2465-2474
【非特許文献４】Raveh et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1997, 145:43-53
【非特許文献５】Allon et al,, Toxicol. Sei., 1998, 43:121-128
【非特許文献６】Cascio et al., Minerva Anestesiol., 1998, 54:337
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、酵素のようなタンパク質のＰＥＧ改質は、以下のような問題があることが知られている：（１）不特定の付着箇所、（２）生物活性の低下または損失（酵素活性など）、および（３）ＰＥＧ化の結果が予測できないことが多い。理想的には、例えば、タンパク質に対するＰＥＧの付着は、ヒトのような動物における薬物の循環時間を増加すると同時に、免疫原性とインビボ分解を低下すべきである。
【００１２】
ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）は、単量体、二量体、および四量体の形態で自然界に見出すことができる。また、ＢＣｈＥは、遺伝子導入動物の生成などの組み換え技術によって生成することもできる。生成した遺伝子導入（ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）の名称で指称）ＢＣｈＥは、二量体と単量体、および少量の四量体の混合物である。例えば、ヤギのミルクの中に分泌される遺伝子導入組換え型ＢＣｈＥは、約８０％の二量体と２０％の単量体である（ＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーとそれに続く収集画分のエルマン活性アッセイによって測定）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様において、本発明は、遺伝子導入ヤギのミルクに生成するもののような、ＰＥＧ化（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）に付着することを意味）組換え型ブチリルコリンエステラーゼ（ＰＥＧ−ＢＣｈＥ）に関する。
【００１４】
特定の実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬は、スクシンイミジルプロピオン酸、α−酪酸メチル、およびＮ−ヒドロキシスクシミニジルのようなスクシンイミジル誘導体の単官能メトキシ活性化ポリマーを含む。これらの試薬は、タンパク質のアミノ基に対するＰＥＧの付着を促進する。
【００１５】
特定の限定されない実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬は、ブチラールデヒジル−ＰＥＧのようなアルデヒド基を有する単官能メトキシ活性化ポリマーである。タンパク質のＮ末端アミノ基は、これらの試薬によって特に標的にされる。
【００１６】
別の特定の限定されない実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬は、ｏ−ピリジルチオエステルを有する単官能メトキシ活性化ポリマーである。Ｎ末端チオール基（システイン）は、これらの試薬によって特に標的にされる。
【００１７】
さらなる特定の限定されない実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬は、マレイミドカップリングＰＥＧのようなチオール基特異性である。タンパク質上の遊離チオール基（システイン）は、これらの試薬によって特に標的にされる。
【００１８】
別の実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬は、シアル酸に結合し、ＢＣｈＥ上のグリカン標的化を促進する。
【００１９】
他の実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬は、ｍＰＥＧ−ＳＰＡのような線状ＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳのような枝分かれＰＥＧ、またはｍＰＥＧ−ＭＡＬ２のようなフォーク状ＰＥＧであることができる。
【００２０】
付加的な実施形態において、本発明の生成物は、未変性ＢＣｈＥアミノ酸配列または変異したアミノ酸配列のいずれかを有するＰＥＧ化した組換え型ＢＣｈＥである（後者は、未変性ＢＣｈＥの生物活性を実質的に保有する）。
【００２１】
別な態様において、本発明は、本発明の化合物（即ち、ＰＥＧ化ＢＣｈＥのようなＰＥＧ化タンパク質）のいずれかの組成物に関し、好ましくは、こうした化合物は、薬学的に許容される担体の中に治療的有効量で存在する。こうした組成物は、一般に、中毒性でない量でこうした化合物を含む（即ち、治療上の使用にとって安全な量）。
【００２２】
特定の実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬の分子量は、５０００ダルトン（ＤまたはＤａ）から５０００００ダルトンの範囲である。他の特定の限定されない実施形態において、カップリング反応が、ｐＨ４〜１１を有する緩衝液の中で行われ、ある場合には、ｐＨ４〜１０であり、別な場合には、ｐＨ５〜１０、またはｐＨ６〜１０、またはｐＨ６〜９であり、ｐＨ値として、約６、７、８、または９が最も有利である。本明細書に開示の方法において、共役結合反応におけるＰＥＧ：タンパク質のモル比は、２〜５００、より具体的には、５〜４００、または１０〜３００、または２０〜２００、または３０〜１００、または５０〜１００、または６０〜９０、または７０〜９０であり、約８０：１の比が有利である。また、本発明の方法において、共役結合反応の温度は、１０℃〜４０℃、または１５℃〜３０℃、または約２０℃〜２５℃であり、約２５℃が有利である。また、本発明の方法において、共役結合反応の時間は、１０分間から２５時間までである。また、本発明の方法において、共役結合反応におけるタンパク質濃度は０．１〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００２３】
本発明の実施形態によると、ＰＥＧ化生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、または光散乱によって分析することができる。１つの実施形態において、光散乱は、本発明にしたがって製造したＰＥＧ−ＢＣｈＥが、２０ｋＤの平均分子量のＰＥＧを含むことを示す。ＰＥＧの付着箇所は、質量分析を用いたペプチドマッピングによって、また、例えば、トリプシン消化によりＰＥＧ化タンパク質を精査することによって、特定することができる。
【００２４】
さらなる実施形態において、ＰＥＧ−ＢＣｈＥの活性（エルマンアッセイによって測定）は、組換え型ＢＣｈＥと実質的に同じであり、このため、ＰＥＧによるＢＣｈＥの改質は、その生物活性に不利な影響を及ぼさない。
【００２５】
本発明にしたがうと、ＰＥＧ−ＢＣｈＥのインビボ半減期は、ＢＣｈＥのそれよりも長い。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、対象の神経ガス中毒を治療する方法に関し、神経ガスを中和する酵素、好ましくは、ＰＥＧ−ＢＣｈＥの有効量を与えることを含み、とりわけ、その薬剤は、例えば、注射によって全身的に送達される。特定の限定されない対象は、神経ガスから保護する必要のある任意の動物であり、好ましくは、哺乳類であり、最も好ましくは、人間である。
【００２７】
あるいは、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは液体の形態である。こうした実施形態において、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、さらに賦形剤を含むことができる。さらなるこうした実施形態において、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、吸入器または噴霧器を用いて投与される。
【００２８】
さらに別の実施形態において、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、乾燥粉末の形態の中に収められる。こうした実施形態において、神経ガスを中和する酵素は、さらに賦形剤を含むことができる。さらなる実施形態において、神経ガスを中和する酵素は、吸入器または噴霧器を用いて投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】還元性条件下でＰＥＧ化した（レーン１とレーン２）およびＰＥＧ化していない（レーン３）の双方のＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン４は分子量マーカーを示す。
【図２】四量体の組換え型ＢＣｈＥ（ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）−４ＭＥＲ−２００ｍｇ静注）またはＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）のＰＥＧ誘導体のいずれかを注射した子供ブタについての時間経過の結果を示す。酵素活性は、Ｕ／ｍＬと時間（Ｈｒ）の単位で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
［定義］
以下に規定する用語は、本明細書の全体を通して使用し、本発明の範囲と実施を理解するために役立つものと考えられる。
【００３１】
「神経ガス」は、概して、化学的合成または自然源から調製される物質であって、吸入、吸収、消化、またはその他の仕方で接触すると、例えば、背景技術に記載したように、コリンエステラーゼに対する高い反応性と阻害のために、生命体に有害なまたは不都合な作用を起こし得る物質を意味する。これらの神経ガスは、上記の全ての神経ガスが挙げられ、例えば、有機リン系化合物のジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＦＰ）、ＧＡ（タブン）、ＧＢ（サリン）、ＧＤ（ソマン）、ＣＦ（シエロサリン）、ＧＥ、ＣＶ、ｙＥ、ＶＧ（アミトン）、ＶＭ、ＶＲ（ＲＶＸまたはロシアＶＸ）、ＶＳ、ＶＸ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。これらは例示であって、限定されるものではない。
【００３２】
「神経ガス中毒」は、神経ガスまたは有機リン系化合物殺虫剤に曝された生命体に対する有害なまたは不都合な作用を意味する。有機リン系化合物殺虫剤には、アセフェート、アジンホスメチル、ベンスリド、カズサホス、クロルエトキシホス、クロルピリホス、クロルピリホスメチル、クロルチオホス、クーマホス、ダイアリフロール、ダイアジノン、ジクロボス（ＤＤＶＰ）、ジクロトホス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルホトン、エチオン、エトプロップ、エチルパラチオン、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、ホノホス、イサゾホスメチル、イソフェンホス、マラチオン、メタミドホス、メチダチオン、メチルパラチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレッド、オキシデメトンメチル、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ホステバピリム、ピリミホスメチル、プロフェノホス、プロペタムホス、スルホテップ、スルプロホス、テメホス、テルブホス、テトラクロビンホス、トリブホス（ＪＤＥＦ）、トリクロルホンが挙げられる。これらは例示であって、限定されるものではない。
【００３３】
本明細書において用いられる語句「治療的有効量」は、ホストにおいて、臨床的に意義のある条件で改善を生じさせるのに十分な量を意味する。例えば、治療的有効量は、ホストの活性、機能、および応答における臨床的に意義のある不足を、約１５％、好ましくは約５０％、より好ましくは約９０％まで低減する、最も好ましくは防止するのに十分な量であることができる。
【００３４】
本明細書において用いられる語句「薬学的に許容される」は、「概ね安全と見なされる」分子的な実体または組成物を指称し、例えば、生理的に我慢することができ、典型的に、ヒトに投与したとき、アレルギー反応、または異常亢進、目眩のような同様な有害反応を生じないことを言う。好ましくは、本明細書において用いられる語句「薬学的に許容される」は、動物、およびより詳しくは、ヒトにおける使用に関し、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認された、または米国薬局方その他の一般に認められた監督官庁によって掲げられたものを意味する。用語「担体」は、それとともに化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を言う。こうした調剤上の物質は、石油、動物、野菜、または合成物質に由来するものなどの水やオイルのような無菌液体であることができ、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などが挙げられる。水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、およびグリセロール水溶液は、特に注射溶液用に担体として好ましく使用される。適切な調剤用担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎに記載されている。
【００３５】
本明細書において用いられる用語「対象」は哺乳類を言う（例えば、齧歯類のマウスまたはラット、ブタ、霊長類、またはコンパニオンアニマル、例えば、イヌ、ネコなど）。特定の限定されない実施形態において、この用語はヒトを指称する。
【００３６】
用語「約」と「およそ」は、当業者による測定により、特定の値について許容できる誤差範囲内を意味し、１つには、その値を測定するまたは求める仕方、即ち、その測定システムの限界によって決まると考えられる。例えば、「約」は、その技術分野における実施にとって許容できる標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の±２０％以下、好ましくは±１０％以下、より好ましくは±５％以下、さらにより好ましくは＋１％以下の範囲であることができる。あるいは、特に生物系またはプロセスに関し、この用語は、桁の大きさ内を意味することができ、好ましくは、ある値の２倍以内である。特定の値が、本明細書や特許請求の範囲で記載された場合、特段の明記がなければ、用語「約」は、黙示的なものとしてあり、その文脈の意味において、特定の値について許容できる誤差範囲内であることを意味する。
【００３７】
用語「神経ガス中和酵素」は、神経ガスを中和するまたは分解することができる酵素を意味する。これらの酵素には、背景技術で記載した全ての酵素が含まれ、例えば、コリンエステラーゼ、アリールジアルキルフォスファターゼ、オルガノフォスフェートヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、カルボキシルステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスフォジエステラーゼ、パラオキソナーゼ、有機リン酸脱水酵素、ジイソプロピルフルオロホスファターゼが挙げられる。１つの実施形態において、本発明は、コリンエステラーゼの使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、ブチリルコリンエステラーゼの使用を提供する。これらの神経ガス中和酵素は、１：１の比で神経ガスと結合して不活性化することにより、化学量論比で作用することができる。また、これらの神経ガス中和酵素は、神経ガスを酵素的に分割することによって作用することもでき、１つの神経ガス中和酵素と２０以上の神経ガス分子の比で神経ガスを不活性化することができる。
【００３８】
「コリンエステラーゼ」（ＣｈＥ）は、神経インパルス伝達に関与する酵素族を意味する。ＣｈＥ酵素の主な作用は、コリン作動性シナプスで、化合物アセチルコリンの加水分解を触媒することである。シナプスと称される電気的スイッチングの中心は、ヒトのほか、脊椎動物や昆虫の神経系の全体に見られる。筋肉、腺、および神経細胞が、これらのシナプスを横切る信号の一定の興奮によって刺激または阻害される。刺激的信号は、神経伝達物質アセチルコリンによって運ばれ、ＣｈＥ酵素の作用によって分断され、アセチルコリンの加水分解的崩壊を生じさせる。これらの化学反応は、非常に大きい速度で連続的に生じ、アセチルコリンが刺激を引き起こして、ＣｈＥ酵素が信号を終わらせる。ＣｈＥの作用は、筋肉、腺、および神経細胞が、その静止状態に戻ることを可能にし、必要により別の神経インパルスを受ける準備をする。
【００３９】
「ブチリルコリンエステラーゼ酵素」または「ＢＣｈＥ酵素」は、アセチルコリンとブチリルコリンを加水分解することができるペプチドを意味し、その触媒活性は、化学的阻害剤イソ−ＯＭＰＡによって阻害される。本発明によって得られる特定の限定されないＢＣｈＥ酵素は、哺乳類ＢＣｈＥ酵素である。特定の限定されない哺乳類ＢＣｈＥ酵素には、ヒトＢＣｈＥ酵素が挙げられる。用語「ＢＣｈＥ酵素」は、こうしたポリペプチドの薬学的に許容される塩もまた包含する。
【００４０】
「組換え型ブチリルコリンエステラーゼ」または「組換え型ＢＣｈＥ」は、一時的に形質移入した、安定に形質移入した、または遺伝子導入宿主細胞もしくは動物によって生成したＢＣｈＥ酵素を意味する。用語「組換え型ＢＣｈＥ」は、こうしたポリペプチドの薬学的に許容される塩もまた包含する。組換え型ブチリルコリンエステラーゼは、当技術分野でよく知られており、容易に入手できる（Ａｒｐａｇｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９０，  ２９：１２４−１３１：米国特許第５２１５９０９号明細書；Ｓｏｒｅｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８９，  ２６４：１０６０８−１０６１３；Ｓｏｒｅｑ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １９８４，  ３（６）１３７１−１３７５）。特定の限定されない例において、組換え型ＢＣｈＥは、遺伝子導入動物のミルクまたは尿から高い収率で得られる（国際特許第ＷＯ  ０３／０５４１８２号）。
【００４１】
用語「ＰＥＧ化」または「ペグ化」は、タンパク質、抗体などの生体分子の官能基にカップリングするためにポリエチレングリコール（ＰＥＧまたはポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）−α−ヒドロ−ω−ヒドロキシ）を使用することを言う。ここで、ＰＥＧは、コリンエステラーゼ、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）である分子に付着する。こうしたＰＥＧ化は、反応条件によって異なり、具体的には、ＰＥＧ化される分子の性質、特定のＰＥＧ化部位、ＰＥＧ化に使用される試薬、およびＰＥＧ化の範囲によって決まり、さらに、反応時間、およびＰＥＧと物質とのモル比によることもある。こうしたＰＥＧ化のためのタンパク質の部位には、アミン基（第１級と第２級の双方）、チオール基、およびカルボキシル基が挙げられる。使用されるＰＥＧは、通常、ペグ化操作によって使用前に活性化される。通常使用される活性化ＰＥＧには、マレイミドやアミンに付着したものが挙げられる。特定の活性化された基の使用は、通常、ペグ化される部位の性質によって決まると考えられる。
【００４２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ペグ化された治療用タンパク質を提供するものであり、例えば、低下した必要用量、増大した循環時間、高い溶解性、持続した吸収、および低下した免疫原性のような改良された臨床特性を有するペグ化ブチリルコリンエステラーゼ（ＰＥＧ−ＢＣｈＥ）を提供する。
【００４３】
ヒト血清に由来するブチリルコリンエステラーゼは、約３４０ｋＤａの分子量を有する球状の四量体分子である。９つのＡｓｎ結合した炭水化物鎖が、各５７４アミノ酸サブユニット（または単量体）に見られる。ＢＣｈＥの四量体の形態は、最も安定であり、特効があるが、治療目的に限定されない。野生型、変形、および人工的なＢＣｈＥ酵素を、組換えまたは化学合成的手段によって、当業者により製造することができる。
【００４４】
好ましくは、本発明の方法にしたがって使用されるＢＣｈＥ酵素は、哺乳類ＢＣｈＥ、例えば、ヒトＢＣｈＥに見られる配列と実質的同じアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＢＣｈＥ配列は、ヒトＢＣｈＥと同じである。本発明のＢＣｈＥは、典型的に、二量体または単量体として製造される。特定の限定されない実施形態において、本発明のＢＣｈＥは、未変性のヒトＢＣｈＥのグリコシル化プロフィルと実質的同じグリコシル化プロフィルを有する。
【００４５】
野生型ヒトＢＣｈＥのアミノ酸配列は、ブルームフィールドらの米国特許第６００１６２５号明細書に記載されており、その全体が本願明細書において組み入れられる。また、この特許は、１１７位のグリシン残基がヒスチジンに置き換わった（Ｇ１１７Ｈとして特定）変異体のヒトＢＣｈＥ酵素を開示している。この変異体ＢＣｈＥは、有機リン系化合物による不活性化に特に抵抗性があることが示されている（Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９７）  ３６：７８６−７９５）。したがって、この特定の形態のＢＣｈＥ酵素は、殺虫剤または化学兵器ガスの中毒の治療のために特に有用である。本発明の方法にしたがって製造することができるさらなる変形や変異体のＢＣｈＥ酵素は、米国特許第６００１６２５号明細書に開示されている。
【００４６】
標的の核酸配列内に突然変異を導入するには、いくつかの方法が当技術分野で知られており、変異体ＢＣｈＥ酵素をコード化する変異体核酸配列を発生し同定するために適用することができる。こうした変異体ＢＣｈＥ酵素は、コカインその他の基質および／または特定の有機リン系化合物について、変わった触媒特性、温度プロフィル、安定性、循環時間、および親和性を有することができる。
【００４７】
記載した変異原性プロトコルのいずれかに使用される鋳型核酸配列は、ＰＣＲ反応（米国特許第４６８３２０２号明細書、同４６８３１９５号明細書）を用いた増幅またはその他の増幅もしくはクローン化法によって得ることができる。記載した技術は、点変異、欠失、挿入、反転、および本来は結合しない配列組換えなどの様々な核酸配列の変化を発生させるために使用することができる。ここで留意すべきは、いずれの場合も、変異と選択の順次サイクルは、変異核酸配列によってコード化される変異ＢＣｈＥ酵素をさらに変化させるために行うことができる。
【００４８】
変異は、当技術分野において公知の多くのいろいろな標準的技術によって、標的の核酸配列内に導入することができる。部位特異的なインビトロ変異技術には、リンカー挿入、入れ子欠失、リンカー走査、およびオリゴヌクレオチド仲介変異が挙げられる（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：  １９８９、および“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９８９に記載）。変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、変異した核酸配列のライブラリーを発生させるために使用することができる（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９８９、およびＣａｄｗｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９２  ２：２８−３３）。また、変化したＢＣｈＥコード化核酸配列は、フィッシャーの米国特許第５２４８６０４号明細書の方法にしたがって生成させることができる。特定の領域が、合成的に変異させたオリゴヌクレオチドで置き換わったカセット式変異誘発を使用することもできる（Ａｒｋｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９２）  ８９：７８１１−７８１５；Ｏｌｉｐｈａｎｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  （１９８６）  ４４：１７７−１８３；Ｈｅｒｍｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９０）  ８７：６９６−７００）。あるいは、宿主細胞の変異誘発株を使用し、導入されたＢＣｈＥコード化核酸配列の変異頻度を高めることもできる（Ｇｒｅｅｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９５）  ７：３２）。
【００４９】
種々の形態のＢＣｈＥ（例えば、単量体、二量体、三量体）が、基質活性を実証しており、これらのペグ化形態は、本発明に包含される。本発明にしたがうと、ＢＣｈＥのペグ化した二量体と単量体が、有機リン中毒、コカイン過量摂取のような症状、およびその他の疾病の治療に有用である。ＢＣｈＥの単量体と二量体に関し、ペグ化は、それらの安定性を大きく改良し、それを受け入れた動物の体系に、より長い存続期間を与える。即ち、ペグ化した単量体は、本発明の目的を満足させ、場合により好ましい。
【００５０】
ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）は、β−カゼイン／ｈＢＣｈＥ導入遺伝子を用いて生成したある形態のＢＣｈＥである。この遺伝子は、遺伝子導入動物を発生させるために使用され、二量化したニワトリβ−グロビン遺伝子絶縁体（２．４ｋｂ）、ヤギのカゼインプロモーター、β−カゼイン遺伝子を含有し、エクソン２のシグナルペプチド配列、ヒトＢＣｈＥのｃＤＮＡ遺伝子配列を含み、終止コンドン、およびβ−カゼインのコード化と３’非コード化領域からなる６ｋｂフラグメントが追従する。ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）を製造するために使用される方法論は、米国特許出願第２００４／００１６００５号（２００４年１月２２日）、米国特許第５９０７０８０号明細書（１９９９年５月２５日）、および米国特許第５７８０００９号明細書（１９９８年７月１４日）に十分に記載されており、その開示事項の全体が、本明細書においても全体として参照して組み入れられる。本発明にしたがうと、ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）は、ペグ化のために有用な基質であり、ペグ化生成物は、本明細書に開示の症状を治療するために有用であり、例えば、有機リン中毒、コカインの過量摂取と付加、およびその他の疾患である。
【００５１】
０．１Ｍのリン酸カリウム中の１ｍＭのブチリルチオコリンを用いて２５℃とｐＨ８．０で測定した７２０Ｕ／ｍｇの比活性を、純粋な（即ち、１００％）ヒトＢＣｈＥについての標準として使用した。単位／ｍＬについて得られた活性値は、１ｍｇの活性ｈＢＣｈＥ＝７２０単位、の関係を用い、ｍｇの活性ｈＢＣｈＥに変換した。ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）は、さらに、本明細書に記載のポリエチレングリコールの付着による改質に供した。ＰＥＧ付着のありとなしのＢＣｈＥのゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の比較を図１に示す。改質しない二量体のＰＥＧ化形態についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の低下した遊走を図２に示す。
【００５２】
本発明にしたがうと、ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ｈＢｕＣｈＥ）は、いくつかの動物種において、有機リン酸化合物の毒性を防ぐのに有効であることが示された。大量でかつその長い循環安定性におけるこの酵素の有効性は、バイオ捕捉剤インビボとしてのその広範な使用に対する必要条件である。本研究は、遺伝子導入的に生成した組換え型ｈＢｕＣｈｅ（ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標））のＰＥＧ化形態の薬物動態を評価した。遺伝子導入ヤギのミルクから生成したＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）は、約７００ｕ／ｍｇの比活性を有し（エルマンアッセイで測定）、還元性条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の単一帯として移動した。ブチリルチオコリンを用いて活性について染色した非変性ＰＡＧＥゲルは、遺伝子導入ヤギのミルクに分泌されたＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）が、単量体、二量体、および四量体の化学種の混合物からなり、二量体が支配的な形態であることを明らかにした。これらの形態の混合物は、ポリプロリンを用いて四量体インビトロ（約６０〜７０％の四量体含有率）の中に集めるか、または標準的技術を用いてＰＥＧ化に供した。両方の製剤を、ラット、約３００ｇ、ｂｗ（ｎ＝４、３２ｇのＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標））、または子供ブタ、約２０ｋｇ、ｂｗ（ｎ＝３、２００ｍｇのＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標））に静脈内注射した。エルマンアッセイを用いた一連の血液サンプルの分析は、四量体の対照標準と比較して、両方の化学種におけるＰＥＧ化ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）製剤のＭＲＴの実質的向上を明らかにした。
【００５３】
【表１】
2009545329.tif 000002
【００５４】
上記の表１に関し、ラットの重さはそれぞれ約３００ｇであり、それぞれが３２ｍｇ（静脈内）のＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）の用量を受け入れ、一方、子供ブタは、重さがそれぞれ約３０ｋｇであり、それぞれが２００ｍｇ（静脈内）のＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）を受け入れた。子供ブタについての時間経過を図２に示す。１つの実施形態において、ポリ−Ｌ−プロリンを用いた二量体の四量体化は、二量体以上にＭＲＴを有意に増加せず、一方、二量体のペグ化は、非ペグ化二量体またはポロプロリンを用いて二量体から生成した四量体に対比して、有意にＭＲＴを増加させた。これらの結果は、ＰＥＧ化が、ＰＲＯＴＥＸＩＡ（登録商標）インビボのＭＲＴを改質するための有効な方策であることを示唆する。
【００５５】
回収した酵素は、純度が９８％超であり、接線流ろ過、ＨＱアニオン交換クロマトグラフィー、およびプロカインアミドを用いた親和性クロマトグラフィーを用いて、ミルクから分離することができる。次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本明細書に記載のように、活性化ＰＥＧ試薬を用いてＢＣｈＥに結合する。
【００５６】
線状単官能ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈを有するエチレン単位のポリマーであり、末端にメトキシ基を有して商業的に入手することができる（モノメチルエーテルＰＥＧを形成）。活性化ＰＥＧのみが、本発明の誘導体を形成するのに有用である。また、本発明で使用される活性化ＰＥＧは、出来るだけ純粋であるべきであり、ジオール（潜在的な架橋剤）のような不純物の濃度は出来るだけ低くあるべきである。ジオールは、最初にＰＥＧをカルボキシル化した後に、イオン交換クロマトグラフィーによって除去することができる。こうした不純物は、活性化の前に除去するべきである。
【００５７】
ＰＥＧはポリマーであるため、分子量が考慮され、約５ｋＤから約５００ｋＤまでの分子量を有するＰＥＧが最も有用であり、さらに大きい分子量のＰＥＧも、依然として同じような価値がある。いずれかの箇所に２〜８のアームを有するなどの複数アームを有する活性化ＰＥＧに関し（例えば、フォーク状ＰＥＧ）、ＰＥＧの架橋中心は、グリセリンの誘導体のように任意の選択箇所でよく、例えば、ヘキサグリセリンは、８アームのＰＥＧまたはエリスリトールを形成し、例えば、ペンタエリスリトールは４アームＰＥＧを形成する。
【００５８】
ＰＥＧ−ＢＣｈＥの薬物動態を、モルモットにおいて研究し、組換え型ＢＣｈＥの半減期は２時間未満であり、一方、ＰＥＧ−ＢＣｈＥのそれは４０時間超である。さらに、本発明にしたがうと、組換え型ＢＣｈＥの生物学的利用率は、１０％未満であり、一方、ＰＥＧ−ＢＣｈＥのそれは４０〜６０％であり、インビトロ効率テストは、ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、未変性ＢＣｈＥと同じ効率で普通の神経ガスと反応することを示し、インビボ効率テストは、ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、未変性ＢＣｈＥと同様に効率的に作用することを示す。
【００５９】
留意すべきことは、本明細書に開示の試薬および／または方策によらず、ＢＣｈＥのＰＥＧ化は、完全に均一な生成物をもたらさなくてもよいことである。即ち、主なＰＥＧ化生成物の割合を最大限にするための分取が有益なことがある。
【００６０】
ＰＥＧは、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような種々の有機溶媒、および水に、いずれも室温で容易に溶けるが、メタノールやエタノールのような溶媒には溶解性が低い傾向にあり、エーテルには極めて不溶性である。ＢＣｈＥのようなペグ化分子の構造は、タンパク質の構造を研究するために使用される一般的な方法によって決定することができ、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳＰＡＧＥ）、質量分析、および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。多くの場合、タンパク質生成物は、ＰＥＧ付着の位置または部位を決めるためにマッピングされた後、液体クロマトグラフィーと質量分析による分析のためにフラグメントに縮小される。
【００６１】
本発明に使用されるＰＥＧは、線状ＰＥＧなどの種々の種類のものであることができる。後者は、互いに同じまたは異なってもよい１つまたは複数の基を有する直鎖ＰＥＧである。例えば、線状の単官能性ＰＥＧは、１つだけの末端に反応基を有し、線状のホモ二官能性ＰＥＧは、ＰＥＧの各末端に同じ反応部分を有し、線状のヘテロ二官能性ＰＥＧは、ＰＥＧの各末端に異なる反応基を有する。ＰＥＧの１つの末端での反応の防止が望まれる場合、この末端は、メトキシ基のような化学的に非反応性の基に結合させてもよい。
【００６２】
また、本発明の生成物を製造するのに有用なＰＥＧは、枝分かれしてもよく、中核に付着した２つのＰＥＧと含んでもよく、そこから選択の反応基が伸びるか、または１つの末端に２つの反応基を有するフォーク状ＰＥＧであってもよい。多官能性ＰＥＧは、複数のＢＣｈＥ部分が単一ＰＥＧに付着することを許容することにより、本発明のＢＣｈＥのように、付着部分の効率の起こり得る増加を可能にする。
【００６３】
本発明の生成物を生成させる反応に使用されるＰＥＧは、一般に、最も均一であるものであり、それによって、ポリ多様性の最も少ない値を有する（ＰＥＧの分子量分布の幅の尺度であり、重量平均分子量（Ｍｗ）に対する数平均分子量（Ｍｎ）の比から計算される）。１の値は、これらの値が等しく、ポリマーが単分散であることを意味する。典型的に、本発明において有用なＰＥＧは、１に近い多分散性を有する（但し、この値は殆ど常に１を超える）。
【００６４】
静脈内に注射したときのＰＥＧそのものの平均寿命は、ものの数分間から２０時間以下であってよく、ＰＥＧの分子量が高くなると、さらに長くなることがある。
【００６５】
ＰＥＧの腎クリアランス速度は、腎臓の糸球体ろ過量によって決まる。短い線状ストランドのＰＥＧは、大きい腎クリアランス速度を有するが、大きい線状ＰＥＧ、多数アームのＰＥＧ、およびＰＥＧ化タンパク質は、遅いクリアランス速度を有する傾向にある。ＰＥＧとペグ化タンパク質を取り扱う方法は、数多くの刊行物に記載されており、例えば、Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．，  ｅｄｓ，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０  （１９９７）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｍ．，  ｅｄｓ，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，”  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００２）  ５４（４）：４５３−６０９；Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  Ｆ．  Ｍ．，  ｅｄｓ，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ＩＩ  -  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，”  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００３）  ５５（１０）：  １２５９−１３５０；Ｐａｓｕｔ，  Ｇ．，  Ｇｕｉｏｔｔｏ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ  （２００４）  １４（５）：  １−３６などが挙げられる。
【００６６】
上述のように、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に化学的に結合したブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）タンパク質を含むＰＥＧ化ブチリルコリンエステラーゼ（ＰＥＧ−ＢＣｈＥ）に関する。特定の限定されない実施形態において、ＢＣｈＥは、組換え型ＢＣｈＥであり、１つの実施形態において、遺伝子導入で生成したＢＣｈＥであり、最も好ましくは、そのＢＣｈＥは、共有結合によってそのＰＥＧに化学的に結合する。その特定の実施形態において、ＰＥＧは、そのＢＣｈＥのアミノ基に付着し、とりわけ、そのアミノ基は、そのＢＣｈＥのＮ末端アミノ基であり、あるいは、そのＰＥＧは、そのＢＣｈＥのチオール基に付着し、とりわけ、そのチオール基は、そのＢＣｈＥのＮ末端アミノ酸にあり、あるいは、そのＰＥＧは、そのＰＥＧは、そのＢＣｈＥのグリカン基に付着し、とりわけ、そのＰＥＧは、シアル酸基を介してそのグリカンに付着する。
【００６７】
別の実施形態において、ＰＥＧは、線状の構造を有し、あるいは、枝分かれまたはフォーク状の構造を有する。
【００６８】
ある実施形態において、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、およびｍＰＥＧ−ＭＡＬ２からなる群より選択された一員である。
【００６９】
別の実施形態において、ＰＥＧは、５０００〜５０００００キロダルトンの分子量を有する。
【００７０】
別な例としては、本発明のＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルは、哺乳類に投与されると、その哺乳類の中で、少なくとも５時間の半減期または平均滞留時間（ＭＲＴ）を有する場合が挙げられ、より好ましくは、少なくとも１０時間、さらに好ましくは、少なくとも１５時間、さらに好ましくは、少なくとも２０時間、または、少なくとも３０時間もしくは４０時間もの長さである。
【００７１】
さらなる特定の限定されない実施形態としては、ＰＥＧ−ＢＣｈＥのサンプルは、哺乳類に投与されると、少なくとも１０％の生物学的利用率を有するものが挙げられ、より好ましくは、少なくとも２０％、さらに好ましくは、少なくとも３０％、さらにより好ましくは、少なくとも４０％、より一層好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも６０％である。
【００７２】
好ましくは、本発明のＰＥＧ−ＢＣｈＥは、約２０キロダルトンの平均分子量を有するＰＥＧを含む。
【００７３】
別の例において、本発明で使用されるＢＣｈＥタンパク質は、哺乳類ＢＣｈＥのアミノ酸配列を含み、とりわけ、その哺乳類は人間である。
【００７４】
また、本発明は、ＰＥＧ−ＢＣｈＥを調製する方法に関し、ＢＣｈＥタンパク質、例えば、組換え型の単量体または二量体を、そのＢＣｈＥに対するその活性化ＰＥＧの化学的結合を促進する条件下で、活性化ＰＥＧ部分と接触させることを含む。特定の限定されない実施形態において、そのＢＣｈＥは、組換え型ＢＣｈＥまたは遺伝子導入ＢＣｈＥであり、その活性化ＰＥＧは、５０００〜５０００００ダルトンの分子量を有する。また、特定の限定されないものとして、接触が、４〜１１のｐＨを有する緩衝液中で生じ、および／または、活性化ＰＥＧとＢＣｈＥタンパク質の比（ＰＥＧ：タンパク質）が少なくとも２であり、より好ましくは、活性化ＰＥＧとＢＣｈＥタンパク質の比（ＰＥＧ：タンパク質）が２〜５００である。本明細書で開示の使用に関し、活性化ＰＥＧとＢＣｈＥの適切な比は、約８０〜１であり、これは、ＰＥＧ対ＢＣｈＥのモノマー単位を生成することが見出されており、生成物は殆どが二量体である（即ち、二量体あたり約２のＰＥＧ）。一般に、ＢＣｈＥの生物活性を損ねない限り、使用されるペグ化用試薬の性質に応じて、任意の比を使用することができる。
【００７５】
特定の実施形態において、活性化ＰＥＧ試薬の分子量は、５０００ダルトンから５０００００ダルトンまでの範囲である。他の特定の限定されない実施形態において、カップリング反応は、４〜１１のｐＨを有する緩衝液の中で行われ、ある場合はｐＨ４〜１０であり、別の場合はｐＨ５〜１０、またはｐＨ６〜１０、またはｐＨ６〜９であり、約ｐＨ６、７、８、または９のｐＨ値が最も有利である。本明細書に記載の方法において、抱合反応におけるタンパク質のモル比は、２〜５００であり、より具体的には、５〜４００、１０〜３００、２０〜２００、３０〜１００、５０〜１００、６０〜９０、または７０〜９０である。１つの限定されない例において、ＰＥＧ−ＢＣｈＥを生成するために約８０：１の比が使用された。また、本発明の方法において、抱合反応の温度は、１０℃〜４０℃、１５℃〜３０℃、または約２０℃〜２５℃であり、約２５℃が最も有利である。また、本発明の方法において、抱合反応の時間は、１０分間から２４時間である。また、本発明の方法において、抱合反応におけるタンパク質濃度は０．１〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００７６】
他の実施形態において、ＢＣｈＥは、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、より好ましくは、ＢＣｈＥは、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。また、特定の限定されないものとして、接触が、４℃〜５０℃の温度で生じる。さらなる特定の限定されないものとして、ＢＣｈＥタンパク質のサンプルが、活性化ＰＥＧ部分のサンプルと接触する。別の特定の限定されない実施形態において、接触が、少なくとも１０分間にわたって継続することが許容され、より好ましくは、少なくとも２４時間である。
【００７７】
これらの方法のさらなる実施形態において、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、プロカインアミド親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製される。プロカインアミドを使用する欠点は、最終製品の中に存在し得る可能性であり、望ましくない。ＨＰＬＣのような別な方法がより有利なことがある。留意すべきことは、最終製品を精製する方法は、本発明のペグ化ＢＣｈＥの性質と有用性を全く制限しないことである。本発明のＰＥＧ−ＢＣｈＥ構造を製造するのに有用な他の方法には、いろいろな種類の樹脂の使用が挙げられ、例えば、ヒドロキアパタイト、イオン交換、特殊ＨＰＬＣ結果、および親和性クロマトグラフィーである。また、精製を容易にするＰＥＧ部分の存在の使用は、当業者の技術の範囲内であり、本方法においても使用が見出される。一般に、感水物質を除去し、ペグ化生成物を分画する（サイズに基づく、例えば、単量体、二量体、および四量体を分離）ことによって処置することができ、次いで、樹脂と他の手順を用いて所望の構造物、例えば、ペグ化単量体について操作する。次いで、調製用ＨＰＬＣのような他の操作が行われる。
【００７８】
本発明のペグ化ブチリルコリンエステラーゼ（ＰＥＧ−ＢＣｈＥ）を精製するにおいて、２つまでの処理工程を必要とすることがあり、即ち、ＢＣｈＥの精製とその後のＰＥＧ−ＢＣｈＥ最終生成物の精製である。さらに、スケールアップが一般に必要である。精製ＢＣｈＥは、上述のようにして得ることができ、ＰＥＧ−ＢＣｈＥ、または他の本発明のペグ化タンパク質とペプチドについて説明する。ペグ化タンパク質のような本発明のペグ化生成物を得るにおいて、留意すべきことは、ペグ化タンパク質は、一般に、元の未変性タンパク質よりも大きいサイズと低い表面電荷を有し、こうした生成物のサンプルは、不都合な副生物を十分に含むことがあり、生成方式（即ち、ペグ化後の精製）のみならず治療目的のための本発明の生成物の使用にかなりの影響を及ぼす問題が生じ得ることである。
【００７９】
また、純粋な生成物が望ましいものの、意図する治療上の使用のために収率もまた問題である。例えば、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、主として、毒物暴露の作用を制御および／または防止するにおいて、その治療上の価値を見出している。即ち、ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、有機リン酸化合物の毒素に対する暴露の影響を寛解させるために使用される場合、その方法は、必然的に、大きい分子（ＰＥＧ−ＢＣｈＥ）と小さい分子（小さな有機毒素）の反応を必要とし、暴露された被害部に既に存在し得るＢＣｈＥを強化するために多量のＰＥＧ−ＢＣｈＥ（言わば、数グラム）の投与が必要なことがある。即ち、スケールアップの考慮が重要である。収率と対比した純度の重み付けが必要であり、双方が最適化されなければならない。要するに、本明細書で意図する用途にとって、より多量の物質が望まれる。
【００８０】
言うまでもなく、神経毒状態の治療が行われるべき場合において、純度の考慮は少なくてよく、その理由は、ＰＥＧ−ＢＣｈＥの何らかの不純物の影響が、無力にすべき毒物の作用よりもはるかに問題が少ないためである。また、ＰＥＧが存在するため、一般的に使用される精製方法は、ほとんど価値がなく、例えば、ＢＣｈＥ上の部位を頼りにする親和性カラムは、ペグ化によるこうした目的にとってもはや利用できない（但し、ＢＣｈＥの活性部位は、ペグ化によって最少限度で影響されなければならない）。即ち、親和性クラマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高性能液体クラマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クラマトグラフィー）、ＩＥＣ（イオン交換クラマトグラフィー）、ＨＩＣ（疎水性相互作用クラマトグラフィー）、ＩＥＦ（等電点電気泳動）、およびＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のような技術は、いずれもタンパク質分子上のＰＥＧの存在によって影響されると考えられる。こうした方法は、本発明の生成物を精製するのに有用なだけでなく、例えば、トリプシン消化、または他のエンドペプチダーゼもしくはエクソペプチダーゼ消化の後のタンパク質内のＰＥＧ結合部位の位置をマッピングするのに使用されることができる。
【００８１】
ペグ化タンパク質は、非常に大きな分子であるため、ペグ化タンパク質のあり得る半径は、タンパク質の分子量または結合に使用されるＰＥＧの分子量から推測することができる。こうしたサイズ効果は、サイズ排除に基づく未変性物とペグ化生成物の分離に役立つことができる（例えば、ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００などのような樹脂とともにゲルクロマトグラフィーを使用）。本発明にしたがうと、ＢＣｈＥのペグ化単量体が本発明の方法に使用されて製造される場合、ゲルクロマトグラフィー（サイズ排除に基づく）が、本発明の生成物を精製するための有用な操作である。
【００８２】
イオン交換クロマトグラフィーまたは等電点電気泳動が精製のために採用される場合、溶出緩衝液のｐＨ値が充填時のｐｌ値から程遠いように、ペグ化が等電点（ｐｌ）に影響を及ぼすことができる。また、ｐｌは、使用前にペグ化タンパク質について測定すべきである。また、初期サンプルの何らかの損失を検出するように、初期流出液はモニターすべきである。こうした全ての手順において、段階的勾配の使用は、生成物の高い収率を得る上で、直線的勾配よりも効率がよいことができる。
【００８３】
ペグ化ＢＣｈＥは、本方法において、高い純度と血漿中の長い存続寿命を有して製造されている（表１参照）。当然ながら、いろいろなＢＣｈＥのＰＥＧ誘導体は、いろいろなＭＲＴ値を有し、これらを使用して、６０時間またはそれ以上もの長いＭＲＴを容易に決定することができる。高いＭＥＴ値を有する本発明のペグ化誘導体を製造するにおいて、留意すべきことは、ＢＣｈＥ分子のペグ化のための特定の限定されない部位が存在し、これは、ペグ化の後に分子を細かく調べ、次いで、ＰＥＧ部分の範囲と位置と、いろいろな誘導体の観察されたＭＲＴ値とを関係付けることによって容易に求め得ることである。ここで、留意すべきことは、ＢＣｈＥタンパク質の中で特定の限定されないペグ化されるリジンが存在するようにリジン誘導体を変えるために変化が生じ（ＢＣｈＥ中に存在する約４０リジンの組み合わせ）、その選択されたペグ化が、大きいＭＲＴ値をもたらすことである。本発明にしたがうと、最大のＭＲＴは、サブユニットあたり１つであって、リジン残基に付着したＰＥＧを有するペグ化ＢＣｈＥを受け入れたモルモットにおいて観察された。
【００８４】
本発明による方法によって製造されたペグ化ＢＣｈＥ構造は、本明細書に記載の方法に有用であり、単量体のみならず二量体の形態であることができる。こうした単量体は、１つの単量体あたり１つまたは複数のＰＥＧを有することができ、１つの単量体あたり１つのＰＥＧが１つの特定の実施形態である。こうしたペグ化単量体の使用は、本発明の特定の実施形態であり、組換え型手段によるＢＣｈＥの生成を特に考慮しており、この方法は、単量体（即ち、単一のポリペプチド鎖）生成物の生成を特にもたらし、分子間ジスルフィド結合の形成または単量体の超分子構造へのアセンブリーを必要とせず、但し、二量体が本発明の組成物の中に存在することもある。
【００８５】
他の実施形態において、化学結合は、そのＢＣｈＥタンパク質のアミノ基に対してであり、より好ましくは、活性化ＰＥＧは、スクシンイミジル誘導体の単官能メトキシ活性化ポリマーである。その特定の実施形態において、スクシンイミジル誘導体は、スクシンイミジルプロピオン酸（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、α−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）からなる群より選択された一員である。また、特定の限定されない例において、アミノ基は、Ｎ末端アミノ基である。
【００８６】
こうした方法の他の特定の限定されない実施形態において、活性化ＰＥＧは、１つまたは複数のアルデヒド基を有する単官能のメトキシ活性化ポリマーであり、好ましくは、その単官能のメトキシ活性化ポリマーは、ブチルアルデヒジル−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ブチルＡＬＤ）である。他のこうした実施形態において、その化学結合は、そのＢＣｈＥタンパク質のチオール基に対してであり、好ましくは、その活性化ＰＥＧは、マレイミド−カップリング−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）であり、または、チオール基は、そのＢＣｈＥタンパク質のＮ末端アミノ酸にある。特定の限定されない実施形態において、活性化ＰＥＧは、単官能のメトキシ活性化ＰＥＧであるか、またはｍＰＥＧ−ＯＰＴＥである。
【００８７】
別の特定の限定されない実施形態において、化学結合は、そのＢＣｈＥのグリカン基に対してであり、例えば、活性化ＰＥＧがシアル酸に結合する場合である。活性化ＰＥＧは、商業的に購入してもよい。
【００８８】
ＰＥＧが、ＢＣｈＥのアミノ基に結合する場合、そのＰＥＧは、求電子基で活性化してもよい。こうしたタンパク質群にとって有用な活性化されたＰＥＧ誘導体には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルが挙げられる。即ち、リジンまたはＮ末端アミンのε−アミノ基とＮＨＳエステルの間の反応は、生理学的に安定なアミド結合を生成する。得られる単官能ポリマーは、メトキシ基によって１つの末端でキャップすることができ（ｍＰＥＧ）、架橋結合のない生成物を生成することができる。こうしたＰＥＧ−ＮＨＳ活性化エステルの使用は、標的タンパク質（ここではＢＣｈＥ）とのカップリングを生理的ｐＨで行うことができるため、有利である。ここで、反応のｐＨ、温度、および長さの変化もまた、標的上のどのリジンが活性化ＰＥＧと反応するかを決める上で助けになることがある。
【００８９】
【化１】
2009545329.tif 000003
【００９０】
スクシンイミジル−α−メチルブタノエートは、ＢＣｈＥのようなタンパク質上のアミノ基との反応のための立体障害活性エステルを提供するα−メチル置換ＰＥＧであり、得られるアミド結合のより高い安定性のために、活性化エステルの高められた加水分解安定性をもたらすことができる。さらに重要なことには、活性化エステルは、反応性が比較的低く、そのため、ＢＣｈＥとの反応の際に、より大きい標的選択性を与えることができる（即ち、特定の攻撃されるアミノ基に関する選択性）。さらに、α−メチル基によって与えられる立体障害は、ＰＥＧ−ＢＣｈＥを用いて治療される対象において、酵素分解を遅くすることができる。こうした試薬は、次のような構造を有し、示したようなＢＣｈＥとの誘導体を形成する。
【００９１】
【化２】
2009545329.tif 000004
【００９２】
ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートのような試薬は、生理的に安定なアミド結合を提供するために、アミン官能基のＰＥＧ化に使用されるエステルである。活性化試薬にＢＣｈＥ誘導体を加えると以下のようになる。
【００９３】
【化３】
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【００９４】
また、有用なものとして、枝分かれした試薬のＰＥＧ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがあり、立体的に大きくて１つの部位に複数のＰＥＧを付着する高分子量の単官能化合物である。また、この試薬は、化合物が純粋に単官能でありながら、同じ分子量の対応する線状ＰＥＧよりも大きいような挙動をするといった特性を有する。このため、得られるＰＥＧ−ＢＣｈＥは、分解する反応とプロセスにより大きく抵抗することから、より大きいインビボ安定性とより長いＭＲＴを呈することができる。また、こうした誘導体は、低下した抗原性を有してｐＨ分解に対するより大きい抵抗性を示し、免疫反応を引き起こす可能性を有する。さらに、配位子の大きい体積から、得られるタンパク質複合体は、より大きい酵素活性を示すことができ、これは、こうしたより大きい構造が活性部位に入り込む可能性が少なく、ＢＣｈＥの活性部位のためのはるかに小さい有機構造体と競合する可能性が低いためである。同様に、この大体積のラジカルのより大きい立体効果は、タンパク質との反応を遅くすることができ、それによって、反応基のより大きい選択性を与え、この結果、全てではない露出アミンがＰＥＧに固定されると考えられる。こうした枝分かれ試薬と対応するＢＣｈＥ誘導体の構造は、以下の通りである。
【００９５】
【化４】
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【００９６】
アルデヒド基に付着したＰＥＧは、還元剤（例えば、シアノ水素化ほう素ナトリウム）を用いて還元的アミノ化によって第１級アミンと反応する。こうした試薬は、穏やかな条件下で、アミンとのみ反応する。しかしながら、多くのこうした試薬は、一部は試薬の不安定性により、タンパク質のＰＥＧ化に対して問題を示すことがある。こうした問題は、選択したＰＥＧ化用試薬の使用によって克服することができる。こうした試薬は、商業的に入手可能であり、例えば、より選択的で中性ｐＨで安定なＰＥＧ−ブチルアルデヒド試薬が挙げられる。Ｎ末端アミンのｐＫａは、リジンまたはアルギニンの側鎖のそれよりも低く、こうした試薬は、ＢＣｈＥのようなタンパク質のＮ末端の選択的改質に対して有用である。１つのこうした活性化ＰＥＧは、ＰＥＧ−−−−−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）ｎの構造を有し、ここで、ｎは１または２である。枝分かれ構造もまた使用してもよく、共通部分を通して２つのＰＥＧが、１つのブチルアルデヒド基のγ−炭素に付着する。試薬と対応ＢＣｈＥ誘導体の構造は以下の通りである。
【００９７】
ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ
ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＢＣｈＥ
【００９８】
ペグ化すべき基がＢＣｈＥのチオール基の１つである場合、こうした基に付着させるためのいくつかの試薬が使用可能である。本発明にとって有用な試薬の１つの例は、ＰＥＧのマレイミド誘導体であり、ＰＥＧは、マレイミド環系の窒素に付着する。こうした試薬と対応ＢＣｈＥ誘導体の構造は以下の通りである。
【００９９】
【化５】
2009545329.tif 000007
【０１００】
示したように、ＢＣｈＥのチオール基に対するマレイミドのカップリングは（一般に、チオール基に高度に固有な反応）、３−チオールスクシンイミジルエーテル結合を形成し、それによって、ＰＥＧをＢＣｈＥに付着させる。こうした反応は、中性ｐＨで生じることが多く、タンパク質の未変性構造を維持するのに有用である。また、アミノ基よりもＢＣｈＥに結合するチオール基が少ないため、得られる生成物は、より選択的で構造が均一であることができる。
【０１０１】
また、こうした活性化試薬は、共通部分を介して１つのマレイミド系に結合した２つのＰＥＧを有する枝分かれ構造の形態であることができ、または１つのＰＥＧに２つのマレイミドが付着し（フォーク状構造）、または以下の構造を有するＰＥＧに付着する。
【０１０２】
【化６】
2009545329.tif 000008
【０１０３】
別の実施形態において、ジスルフィド基を介してオルト−ピリジルジスルフィドに付着したＰＥＧを含む活性化試薬は、ＢＣｈＥに結合したシステインにジスルフィド結合を与える。ここで、ｏ−ピリジルジスルフィド基は、酸性と塩基性の両方の条件下で（ｐＨ３〜１０）チオール固有の遊離スルフヒドリル基であり、ＢＣｈＥ分子の遊離スルフヒドリル基に酸化的にカップリングする。この結合は、安定であるが、還元性条件に導入されると元に戻り（例えば、ジチオスレイトールまたはメルカプトエタノール）、元の遊離スルフヒドリル基を与える。その他の有利な点は、ピリジン−２−チオンの放出が挙げられ、さらなるジスルフィド不純物を回避する非反応性化合物であり、この放出は、３４３ｎｍにおける吸収の増加によって容易に監視される。有用な試薬は、以下の構造を有すると考えられる。
【０１０４】
【化７】
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【０１０５】
本発明にしたがうと、有用な試薬には、さらに、２つのＢＣｈＥ分子に付着するための２つのピリジルジスルフィド部分に付着した１つのＰＥＧが挙げられる。また、本発明の実施にとって有用な試薬には、遊離チオール形成のチオール固有ペグ化のために１つまたは２つの簡単なチオール−ＳＨ基に付着したＰＥＧが挙げられ、ＢＣｈＥタンパク質のシステイン側鎖に共役なジスルフィド架橋ポリマーを形成する。側鎖アミノ基よりもＢＣｈＥのシステインが少ないため、結合ＰＥＧの位置に対してより大きい制御を行うことができる。
【０１０６】
留意すべきことは、多官能性ＰＥＧ誘導体を使用するにおいて、各場合において同じ部分を有する必要がないことである。即ち、２つの異なる活性化部分に付着したＰＥＧは、反応条件が、双方の部分が標的タンパク質に結合する機能をすることを許容する限り、完全に本発明の範囲内にある。また、ＢＣｈＥを使用するにおいて留意すべきことは、１つだけのＰＥＧが１つのＢＣｈＥに付着するものと一般に考えられるが、本発明は必ずしもその実施形態に限定されず、即ち、所与のＰＥＧに対して複数の単一ＢＣｈＥを結合させる二官能試薬もまた本発明の方法に用途を見出し得ることである。こうしたヘテロ二官能ＰＥＧは、商業的に入手可能である。
【０１０７】
ＰＥＧアミン（ＰＥＧ−ＮＨ２の構造を有する）もまた本発明の試薬として用途を見出している。こうした用途は、１つの態様において、ＢＣｈＥが糖タンパク質であって、こうしたアミノ基がＢＣｈＥの糖部分と高度に反応性がある場合が考えられる（例えば、Ｕｒｒｕｔｉｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２，  １４５  （１９８９）参照）。
【０１０８】
いずれの場合も、ＢＣｈＥのような標的タンパク質上のＰＥＧ部分の量と分布は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、さらには当業者によく知られた技術によって測定することができる。ＳＥＣ−ＨＰＬＣのような方法は、ＢＣｈＥのような標的部分のペグ化範囲を測定するためだけに使用することができるが、合成された調剤間のペグ化の均一性（即ち、バッチごとの一定性）を実証するための定量的クロマトグラフィー法として使用することもできる。
【０１０９】
また、ペグ化は、他の触媒分子、あるいは、誤りがちなＥ．  ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉがクローン作成用のＤＮＡを生成するために使用される標的発生法によって開発されたもの（複製の忠実性を制御するドメイン内で変異を含むＰｏｌ  Ｉ）を改質するために用いることもできる。
【０１１０】
本発明のＢＣｈＥ−ＰＥＧ薬剤は、好ましくは、注射による全身投与を意図するものであるが、このほか、吸入器が使用されて吸入によって投与されてもよい。
【０１１１】
本明細書に記載の神経ガス中和用酵素は、医薬組成物の一部として存在することができる。医薬組成物は、神経ガス中和用酵素と組み合わせて、１つまたは複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。こうした組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、ブドウ糖、マンノース、サッカロース、または右旋糖）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸の例えばグリシン、酸化防止剤、キレート化剤の例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および／または保存剤を含むことができる。さらに別の実施形態において、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方することもできる。
【０１１２】
本発明に使用するのに適切な担体は、ペグ化タンパク質の等張性と化学的安定性を高める物質として、少量の添加剤を含むことができ、こうした物質は、一般に、本発明で用いる用量と濃度において、レシピエントに対して毒性がない。これらには、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、または他の有機酸および／またはその塩、および酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、低分子量（約８〜９未満の残基）ペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド、さらに、タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または抗体、さらには、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリン、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、対イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムなど、および／またはノニオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポリオキサマー、および特定の洗浄剤が挙げられる。
【０１１３】
本発明に使用するのに適切な神経ガス中和酵素の製剤には、乾燥粉末、溶液、懸濁液またはスラリー、および噴霧剤中に懸濁または溶解した粒子が挙げられる。
【０１１４】
本発明の神経ガス中和酵素の組成物は、薬学的に許容される賦形剤を混合することができ、限定されるものではないが、（ａ）炭水化物、例えば、フルクトース、ガラクトース、グルコース、Ｄマンノース、ソルボースのような単糖類；ラクトース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン類；ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖類；（ｂ）グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リジンなどのアミノ酸；（ｃ）有機酸と塩基から調製した有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、トリメチルアミン塩酸塩など；（ｄ）ポリペプチドとタンパク質、例えば、アスパルテーム、ヒト血清アルブミン、ゼラチンなど；（ｅ）アルジトール類、例えば、マンニトール、キシリトールなど挙げられる。特定の限定されない例として、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マニトデキストリン、グリセリン、クエン酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン、およびマンニトールが挙げられる。
【０１１５】
投与される神経ガス中和酵素の量は、所望の結果を得るために神経ガス中和酵素の治療的有効量を送達するのに必要な量である。実際には、この量は、特定の神経ガス中和酵素、状態の重症度、対象の体重、および所望の治療効果によって大きく異なると考えられる。実際には、神経ガス中和酵素の用量は、１回または複数回の投与で送達される。
【０１１６】
本発明の神経ガス中和酵素の組成物は、溶液中に懸濁、分散、または溶解させることができる。液体の担体または媒介物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールなど）、植物油、毒性のないグリセリンエステル、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒体であることができる。リポソームの生成、分散系の場合における適切な粒子径の投与、または界面活性剤の添加によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤や抗かび剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、またはソルビン酸の添加によって行うことができる。多くの場合、例えば、糖、緩衝剤、および塩化ナトリウムのような等張性物質が推奨され、体液とりわけ血液と同じ浸透圧を確保する。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、本発明の任意の化合物の組成物に関し、好ましくは、その化合物は、薬学的に許容される担体中に、治療的に有効な量で存在する。こうした組成物は、一般に、毒性のない量でその化合物を含む（即ち、治療用途にとって安全な量）。即ち、本発明は、本明細書で開示のＰＥＧ−ＢＣｈＥを薬学的に許容される担体の中に含む医薬組成物に関し、そのＰＥＧ−ＢＣｈＥは、毒素または毒物を中和するのに有効な量で存在する。特定の限定されない実施形態において、この組成物は、ＰＥＧ化されていないＢＣｈＥをさらに含む。
【０１１８】
また、本発明の神経ガス中和酵素の処方を適切な溶媒、および上記の１または複数の賦形剤と混合した後、無菌ろ過することによって、無菌溶液を調製することもできる。無菌注射液の調製に使用されるのに適切な無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、真空凍結乾燥による乾燥が挙げられ、以降の無菌溶液の調製のための、等構造の疑似多形と所望賦形剤の粉末混合物を得る。
【０１１９】
投与に適切な量、期間、および頻度は、患者の状態、患者の疾病の種類と重症度、および投与方法のような因子によって決定される。一般に、適切な投与量と治療計画は、治療上および／または予防上の利点を与えるのに十分な量で、その神経ガス中和酵素を与える。適切な投与量を決めるための種々の考え方が、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １９８０，  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１２０】
適切な投与量は、実験的モデルおよび／または臨床試験を用いて決めることもできる。一般に、有効な治療を与えるのに十分な最小用量の使用は、固有であるが限定されない。身体の検査、画像解析、または治療もしくは予防する条件に適切なアッセイを用い、治療効果のために患者をモニターすることができ、これらは、当業者によく知られている。用量の調節を、モニター上の発見に基づいて行うことができる。例えば、神経ガスに暴露された個人は、神経ガスによって生じる症状を休止させるために、本発明の神経ガス中和酵素の投与を受ける。上記の考え方に基づいた適切な投与量の決定は、当業者によって一般に行われる実験以上のものは必要としない。
【０１２１】
本発明のＰＥＧ−ＢＣｈＥのような治療薬を用いて想定される治療方法には、静脈内（ＩＶ）投与、筋肉内（ＩＭ）投与、および存続期間１箇月以下のパッチ使用の投与が挙げられる。このパッチ投与は、毒剤に対するあり得る暴露が予想されるものの、特定の時間枠が確定できない場合の予防目的に特に有用である（例えば、戦闘領域またはあり得る毒物源に入り込む人間（兵士など）であって、その領域を離れる時間が最初は不明）。投与の前は、こうした薬剤は（例えば、本発明のＰＥＧ−ＢＣｈＥ）、凍結乾燥粉末として保管され、適切な担体、賦形剤または希釈剤、例えば、水（蒸留ありまたはなし）、緩衝液、例えば、ＰＢＳ、またはその他の薬学的に適切な溶媒もしくは懸濁化剤と混合する状態になっている。こうした製剤は、無菌であってもなくてもよい。適切な混合を決めるにおいて、治療的に許容できて効果的な担体であることだけでなく、溶解性についても考慮する必要があり、未変性タンパク質に対比して、ペグ化タンパク質は若干異なることがある。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓは、こうした材料の良好な源である。また、安定性の問題について考慮する必要がある。即ち、ＰＥＧ−ＢＣｈＥのような本発明の製品の処方は、種々の時間において安定でなければならない。即ち、ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、例えば、病院その他の臨床環境で必要により使用されるために保持され、臨床担当者によって投与される場合、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、必要により使用されるために再構成すうることができる凍結乾燥粉末として保存してもよい。ここで、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）のような担体が便利である。あるいは、ＰＥＧ−ＢＣｈＥが、担当者によって潜在的に危険な領域に運ばれた後、必要により使用される場合、毒剤に対する潜在被爆を治療するのに、再構成が不適切なことがある。このような場合、ＰＥＧ−ＢＣｈＥは、担体が既に存在する懸濁状態に保存する必要があり、例えば、必要な対象に直ぐに使用するため、無菌で収められた注射器が使用される（例えば、毒剤に対する把握されたまたは疑わしい暴露の直後）。
【０１２２】
特定の実施形態において、投与量が必要により投与される。当業者は、本発明の製剤中の神経ガス中和酵素の濃度に基づき、この投与量に対応する神経ガス中和酵素製剤の体積または重量を容易に決定することができる。本発明の別な実施形態において、正常な生理的機能が回復していなければ、付加的な投与量を投与してもよい。
【０１２３】
また、本発明は、動物における毒素または毒物を中和する方法に関し、本発明のＰＥＧ−ＢＣｈＥ医薬組成物の有効量をその動物に投与することを含み、好ましくは、その動物は哺乳類であり、最も好ましくは、その哺乳類は人間である。また、特定の限定されないものとして、その毒素または毒物は、Ｃ系神経ガス、Ｖ系神経ガス、または有機リン酸化合物を含む神経系に作用する毒素または毒物である。また、特定の限定されないものとして、その毒素または毒物は、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＦＰ）、ＧＡ（タブン）、ＧＢ（サリン）、ＧＤ（ソマン）、ＣＦ（シエロサリン）、ＧＥ、ＣＶ、ｙＥ、ＶＧ（アミトン）、ＶＭ、ＶＲ（ＲＶＸまたはロシアＶＸ）、ＶＳ、およびＶＸから選択された一員である。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明にしたがって開示されたＢＣｈＥのＰＥＧ誘導体は、例えば、有機リン薬剤の中毒になったヒトなどの哺乳類の治療に使用することができ、あるいは、こうした薬剤に曝される可能性のある哺乳類に予防的に使用することができる。本発明の組成物は、高いＭＲＴを有するＢＣｈＥ誘導体を含むため、前もって、例えば、予想される暴露の数日前に投与することもできる。その他の用途には、ＢＣｈＥの投与、あるいは、何らかの他の触媒体、例えば、他のコリンエステラーゼ、または何らかの他の酵素もしくは触媒剤、またはさらには他のタンパク質やペプチドの投与が、例えば、コカイン過剰摂取のような個々の状態、殺虫剤、例えば、有機リン酸化合物の中毒、アルツハイマー病のような長期間疾病、および他のこうした苦痛を防止または治療することができる任意のものが挙げられる。これらは、同様に、その疾病の作用を治療、処置、または防止することができる。
【０１２５】
さらなる特定の限定されない実施形態において、その医薬組成物は、カルバメート、抗ムスカリン剤、コリンエステラーゼ再賦活薬、および痙攣阻止剤からなる群より選択された薬剤をさらに含む、あるいは、それらと組み合わせて投与され、好ましくは、そのカルバメートはピリドスチグミンであり、その抗ムスカリン剤はアトロピンであり、そのコリンエステラーゼ再賦活薬は塩化プラリドキシム（２−ＰＡＭ、Ｐｒｏｔｏｐａｍ）である。別の特定の限定されない実施形態において、その痙攣阻止剤はジアゼパムである。
【０１２６】
本発明を実施する上で、当然ながら、特定の緩衝液、媒体、試薬、細胞、培養条件などへの言及は、限定される意図ではないことを理解するべきであり、議論された特定の文脈において当業者が関心のあるまたは価値のあると認識する全ての関係材料は、包含されるものと理解するべきである。例えば、ある緩衝系または培養媒体を別なものに変えても、同一でなくても同様な結果が得られることが多い。当業者は、過度の実験をすることなく、変化を加えることができ、本明細書に開示の方法と手順を用いた目的に最適に役立つように、こうした系と方法に関して十分な知識を有している。
【０１２７】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその範囲を限定されるものではない。実際、上述の説明と添付図面から、当業者には、本明細書の記載に加えて種々の変更が明らかであろう。こうした変更は、特許請求の範囲に包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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