(57)【要約】Ｂ群レンサ球菌は、世界の多くの部分における妊婦または新生児の疾病率および死亡率の重要な要因である。本発明は、Ｂ群レンサ球菌（グラム陽性細菌のモデル）の敗血症播種を予防する阻害剤のための新ターゲットの同定方法であり、これらの病原性決定要素を用いて細菌感染が治療される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターpTCV-Tアーゼの使用を含むＧＢＳの挿入変異誘発方法。
【請求項２】
遺伝子gbs 0052（配列番号１）、gbs 0100（配列番号２）、gbs 0307（配列番号３）、gbs 0582（配列番号４）、gbs 0653（配列番号５）、gbs 0683（配列番号６）、gbs 1787（配列番号７）、gbs 2100（配列番号８）の挿入変異体。
【請求項３】
変異体ライブラリのインビトロスクリーニング方法であって、抗菌カチオン性ペプチドである先天性免疫成分の模倣物としてコリスチンを用いる工程と、外側の膜透過性において欠陥を有する変異体を検出するためにノボビオチンを用いる工程とを包含する方法
【請求項４】
インビトロスクリーニングの結果を突然変異のインビボ作用と結び付けて、インビボ病原性についての必須機能を有するターゲットタンパク質を同定する方法。
【請求項５】
宿主内の細菌播種を予防する薬物を見出すために有用な、請求項１〜３のいずれか１つの方法により同定されたＧＢＳにおけるターゲットのタンパク質配列。
【請求項６】
ＧＢＳに存在し、全長配列上で少なくとも２２％の同一性を有し、１００の連続アミノ酸配列において２５％の同一性を有する、グラム陽性細菌における相同配列である請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
グラム陽性感染を治療する薬物を見出すための、相同タンパク質は、肺炎球菌（ＳＰＮ）に存在する、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
GBS 0307に対する阻害剤をスクリーニングするための生化学アッセイであって、発光ＡＴＰまたは蛍光ＡＤＰ検出のいずれかに基づくことを特徴とする生化学アッセイ。
【請求項９】
請求項８に記載の生化学アッセイであって、
−  ＧＢＳ、ミエリン塩基性タンパク質およびＡＴＰを含む基質混合物を、ＤＭＳＯまたは類似物質、または、ＤＭＳＯまたは類似物質に溶解した阻害剤と共に予備インキュベートされたアッセイバッファに加える工程と、
−  室温でインキュベートする工程と、
−  曝露混合物を加える工程と、
−  発光を測定する工程と
を包含する生化学アッセイ。
【請求項１０】
請求項６に記載の生化学アッセイであって、
−  ＧＢＳ、ミエリン塩基性タンパク質；ＡＴＰ、ピルビン酸塩およびＮａＤＨを含む基質混合物を加える工程と、
−  ＮａＤＨの蛍光強度（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を測定する工程と、
−  適合初期速度から阻害率（％）を導き出す工程と、
を包含する生化学アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ群レンサ球菌の病原性に関与する遺伝子の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ群レンサ球菌（Streptococcus agalactiaeまたはＧＢＳ）は、グラム陽性細菌であり、ヒトの生殖器および腸管の広範囲にわたる共生生物である。ＧＢＳは、ヒトの疾患の重要な原因として現れ、今や、新生児期の間の生命にかかわる侵襲性の細菌感染（敗血症、肺炎および髄膜炎）の最も一般的な原因であり（非特許文献１）、免疫不全成人における死亡率の主要な原因である（非特許文献２）。新生児感染症は、胎盤膜を通じた細菌の通過または分娩中の感染した膣内細菌叢の細菌の吸気のいずれかに起因する。ＧＢＳは、膣上皮、胎盤膜、気道上皮および血液脳関門内皮を含む種々のヒトの細胞に付着する。
【０００３】
９種のＧＢＳに関して、それらの莢膜多糖構造に基づいて相異なる抗原型が抗原的に同定された。タイプIa、Ib、II、IIIおよびVは、侵襲性ヒトＧＢＳ疾患の大部分の原因となる。抗原型IIIのＧＢＳは、相当な割合の早期発症型疾患（すなわち、生後第一週以内で起こる感染）および大部分の晩期発症型疾患（すなわち、生後第一週以降に起こる感染）を引き起こすため、特に重要である。全体にわたって、莢膜抗原型IIIは、新生児ＧＢＳ髄膜炎の大抵の症例（８０％）の原因となる。
【０００４】
細菌は、先天性免疫系の重要な武装因子（arm）でありかつ適応免疫系における作動因子である補体を回避するための特異的な機構を発達させた。しかしながら、補体は、ＧＢＳの全身的浸潤を防止するのに十分でない。
【０００５】
カチオン性抗菌ペプチド（cationic antimicrobial peptide：ＣＡＰ）は、直接的な抗菌活性および免疫調節的作用の両方を通じて、先天性の免疫防御において基本的な役割を果たす。ＣＡＰ支配的ターゲットは細菌膜であり、殺作用反応は、細菌の成長速度より速くなければならない。臨床的な症例により、これらのペプチドの欠乏症は、重篤な症状を与えることが示される。Ｂ群レンサ球菌に対するカチオン性ペプチドの活性は、細菌の陽性電荷表面が減るに従って高くなる。
【０００６】
抗生物質耐性菌の羅漢率が高くなることによって、抗感染療法の病院における管理（administer）の複雑性が増した。耐性の現象は新しくはないが、ますます抗生物質が無効にされるにつれて懸念が大きくなった。このようなことから、耐性グラム陽性病原菌をターゲットにする新規な殺菌剤、特に、ＧＢＳ感染におけるものを開発する緊急の必要性がある。
【０００７】
ＧＢＳの完全なゲノム配列の入手可能性は、細菌の全身性播種に関与する遺伝子の同定の道を切り開いた。
【０００８】
主として記載されているＧＢＳの病原性因子は、多糖莢膜、リポテイコ酸、溶血素、Ｃ５−ペプチダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびプロテアーゼCspA（非特許文献３）である。Jonesらによる新生児ラットモデルにおけるシグナチャータグ化変異誘発法(Signature-tagged mutagenesis：ＳＴＭ)によるタイプIa株の１６００の変異体の分析（非特許文献４）により、ＧＢＳ病原性に関連する新規な遺伝子が同定された。大抵の同定された遺伝子は、輸送、調節および付着機能に作用し、ＧＢＳの病原性におけるそれらの役割が強調された。しかしながら、ＳＴＭの技術的な制約および限界のため、この研究が完全でなく、それ故に、ＧＢＳの病原性に関与する多くの他の遺伝子が未だに知られていない可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ギプス（Gibbs）ら著、「Obs Gyn」、2004年、第104号、ｐ．1062-76
【非特許文献２】ファーレイ（Farley）著、「Clin Inf Dis.」、2001年、第33号、ｐ．556-61
【非特許文献３】リンダール（Lindahl）ら著、「Clinical Mic review」、2005年
【非特許文献４】ジョーンズ（Jones）ら著、「Mol Mic」、2000年 、第37巻、ｐ．1444-1455
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＧＢＳ病原性に関与する新規な遺伝子を提供することにある。この目的のために、本発明者らは、ＳＴＭ法および抗原型IIIのＢ型レンサ球菌の挿入変異体ライブラリの細胞壁欠陥スクリーニングによって、その構成を記録する。コリスチン（抗菌ペプチド）およびノボビオシン（抗生物質）のスクリーニングにより９７の遺伝子が同定される。２７の変異体が動物モデルにおいて試験され、１３が野生型タイプの株よりも病原性に乏しかった。ＧＢＳ病原性に重要である８の新規な遺伝子が同定された。これらの遺伝子は、抗菌薬のための新しいターゲットである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、それ故に、ＧＢＳの挿入突然変異誘発方法であって、ベクターpTCV-Tアーゼ（「材料および方法」を参照）の使用を含む方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、遺伝子の挿入変異体gbs 0052（配列番号１）、gbs 0100（配列番号２）、gbs 0307（配列番号３）、gbs 0582（配列番号４）、gbs 0653（配列番号５）、gbs 0683（配列番号６）、gbs 1787（配列番号７）、gbs 2100（配列番号８）に関する。
【００１３】
本発明はまた、変異体ライブラリのインビトロのスクリーニング法であって、抗菌カチオン性ペプチドである先天性免疫成分の模倣体としてコリスチンを用いる工程と、外側の膜透過性における欠陥を伴う突然変異を検出するためにノボビオチンを用いる工程とを包含する方法に関する。インビボ病原性の必須機能を有するターゲットタンパク質を同定するためのインビトロのスクリーニング結果と突然変異のインビボ作用との組合せの方法も、本発明の一部である。
【００１４】
本発明はまた、宿主内の細菌播種を予防する、抗病原性ターゲットと呼ばれる薬物を見出すために有用な、ＧＢＳにおけるこれらのターゲットのタンパク質の配列に関する。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＧＢＳ中のタンパク質の配列およびその全長配列に関して少なくとも２２％の同一性および１００の連続アミノ酸配列において２５％の同一性を有するグラム陽性細菌における相同配列に関する。特に、グラム陽性感染症を治療するための薬物を見出すための、肺炎球菌（Streptococcus Pneumoniae：ＳＰＮ）中に存在する相同タンパク質である。
【００１６】
小分子の阻害剤をスクリーニングするために開発された、以下に記載される生化学アッセイも、本発明の範囲に入る。
【００１７】
本発明は、それ故に、ＧＢＳに対する阻害剤をスクリーニングするための生化学アッセイであって、発光ＡＴＰまたは蛍光ＡＤＰのいずれかの検出に基づくことを特徴とするアッセイに関する。
【００１８】
発光検出に基づく生化学アッセイは、
−  ＧＢＳ、ミエリン塩基性タンパク質およびＡＴＰを含む基質混合物を、ＤＭＳＯまたは類似物質またはＤＭＳＯまたは類似物質に溶解した阻害剤を有する予備インキュベートされたアッセイバッファに加える工程と、
−  室温でインキュベートする工程と、
−  曝露（revelation）混合物を加える工程と、
−  発光を測定する工程と
を包含する。
【００１９】
蛍光検出に基づく生化学アッセイは、
−  ＧＢＳ、ミエリン塩基性タンパク質；ＡＴＰ、ピルビン酸塩（pyruvate）およびＮＡＤＨを含む基質混合物を加える工程と、
−  ＮａＤＨの蛍光強度（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を測定する工程と、
−  適合（fitted）初期速度から阻害率（％）を導き出す工程と、
を包含する。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例において与えられ、以下の図１〜４が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、（Ａ）ＧＢＳについての細胞の計測数、（Ｂ）変異体ＯＲＦに関する結果を示す。
【図２】図２は、（Ａ）ＳＰについての細菌の計測数および（Ｂ）変異体ＯＲＦに関する結果を示す。
【図３】図３は、スタウロスポリンのＩＣ５０を示す。
【図４】ＡＭＰのＩＣ５０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（材料と方法）
細菌株、培地および成長条件。大腸菌株TOP10（Invitrogen）が、ＤＮＡのクローニングおよびプラスミド伝播のために用いられた。大腸菌は、液体または固体のルリア−ベルターニ（Luria-Bertani：ＬＢ）培地により３７℃で成長させられた。
【００２３】
Ｂ群レンサ球菌NEM316（その配列は、Pasteur Institutによって決定された：Glaser et al, 2002. Mol Mic. 45:1499-513）は、致死的な敗血症の原因であり、莢膜抗原型IIIのものである（Gaillot et al 1997 gene 204:213-218）。ＧＢＳ株は、別段の規定がなければ、トッド・ヒューイット（Todd-Hewitt：ＴＨ）ブイヨンまたは寒天（Difco Laboratories, Detroit, MI）において３７℃で成長させられた。
【００２４】
肺炎球菌R6（そのゲノムは、配列決定された：Hoskins et al, J Bacteriol. 2001 Oct;183(19):5709-17）は病原性でないため、その病原性の前駆体肺炎球菌D39が用いられた。このものは、１９１６年に得られた臨床分離株であり、肺炎球菌性感染の病因についての研究において一般的に用いられる。肺炎球菌株は、特に明記しない限り、ＴＨ培地において３７℃、５％ＣＯ２中で成長させられた。
【００２５】
大腸菌株の抗生物質選択のために、カナマイシン（Ｋｍ）が６０μｇ／ｍＬで、エリスロマイシン（Ｅｍ）が１５０μｇ／ｍＬで用いられた。Ｂ群レンサ球菌NEM316および肺炎球菌D39に由来する株を選択するために、Ｋｍ濃度は１０００μｇ／ｍＬでありＥｍは１０μｇ／ｍＬであった。
【００２６】
遺伝技術およびＤＮＡ操作。レンサ球菌のゲノムＤＮＡは、０．６％グリシンが補給されたＴＨ中の終夜培養から単離された。細菌は、５分間にわたって５０００×ｇで採取され、次いで、６００μＬの冷却ＰＢＳ中に再懸濁させられた。細菌懸濁液は、lysing Matrix B（QBiogen）に加えられ、細菌は、Fast Prep計器（QBiogen）を用いて機械的に粉砕された。５分間にわたる５０００×ｇでの遠心分離の後、上澄みは新鮮な管に移され、Wizard（登録商標）Genomic DNA Purification Kit（Promega）を用い、製造業者の指示書に従ってＤＮＡが抽出された。
【００２７】
推奨されるサザンブロット分析が行われた（Sambrook, et al.）。ＤＮＡ配列は、Genoscreen（Lille,France）によって行われた。
【００２８】
プラスミドＤＮＡ調製物は、Wizard（登録商標）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）を用いて単離された。
【００２９】
ベクターpTCV-Tアーゼの構築。遺伝子aphA3なしでプラスミドpTCV-erm（Poyart et al. 2001 J Bac 183：6324-6334）を増幅させるために配列番号９（5’-CCTATCACCTCAAATGGTTCGCTGGG-3’）からのオリゴヌクレオチドKana-5および配列番号１０（5’-CTGGGGATCAAGCCTGATTGGGAG-3’）からのKana-3が用いられた。ＰＣＲ産物は、平滑末端化され、リン酸化され、次いで、再循環可能化された。ベクターpET29C9のＤＮＡからプロモータレスHimar1トランスポザーゼC9遺伝子を増幅させるために配列番号１１（5’-ATATCCATGGATGGAAAAAAAGGAATTTCGTG-3’）のオリゴヌクレオチドTaseFおよび配列番号１２（5’-AATCTGCAGTTATTATTCAACATAGTTCCCTTC-3’）のTaseRの対が用いられた。NcoIおよびPstI（太線の配列）による消化の後、このアンプリコンは、aphA-3が削除されたpTCV-ermのマルチクローニングサイトにおいてクローニングされた。０．５ＫｂのPaphA3プロモータ含有EcoRI-NcoI  ＤＮＡフラグメント（Poyart et al. 1997 FEMS Microbiology Letters 156:193-198）が、トランスポザーゼ遺伝子の上流に挿入されて、pTCV-Tアーゼが与えられた。
【００３０】
Ｂ群レンサ球菌のエレクトロポレーション。細菌は、０．６％のグリシンが補給されたＴＨ中３７℃で終夜成長させられた。培養物は、５００ｍＬの０．６％グリシン含有ＴＨに１：１０に希釈され、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）が０．３〜０．５になるまで成長するようにされた。培養物は、１０分間にわたる５０００ｒｐｍの遠心分離によって採取され、１００ｍＬの冷却無菌洗浄バッファ（９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５Ｍのショ糖、ｐＨ７．４）中に２回洗浄され、３ｍＬの洗浄バッファおよび１０％グリセロールに再懸濁させられ、一定分量で凍らせられたか、または、直接的に用いられた。
【００３１】
エレクトロポレーションのために、５００ｎｇ〜１μｇのプラスミドＤＮＡが氷上の７５μＬの細胞懸濁液に加えられ、予備冷却された２ｍｍのエレクトロポレーション・キュベット（BioRad Laboratories）に移され、Bio-Rad Gene Pulser装置を用いて２５μＦ、２５００Ｖおよび２００Ωでエレクトロポレーションが行われた。懸濁液は、すぐに０．２５Ｍのショ糖を含むＴＨ１ｍＬに希釈され、３時間にわたって３７℃でインキュベートされ、次いで、適切な抗生物質を含有するＴＨ寒天プレート上に塗布された。
【００３２】
肺炎球菌の軽質転換。肺炎球菌細胞は、Echeniqueらによって記載されたプロトコルに従って形質転換された。簡単には、細菌は、ＣＴＭ（ｐＨ７）中３７℃で０．１〜０．２のＯＤ４００まで成長させられ、次いで、１０％グリセロール中で凍らせられた。細菌は、解凍され、遠心分離にかけられ、ＣＴＭ（ｐＨ８）５０ｎｇ／ｍＬ中で再懸濁させられた。ＣＳＰが加えられ、細胞は、１０分間にわたって３７℃でインキュベートされた。形質転換ＤＮＡ（０．０１〜０．０５μｇ／ｍＬ）が次いで加えられた。最適なＤＮＡの取込は、室温での２０分の混合物のインキュベーションによって得られた。混合物は、次いで、ＣＡＴ培地中に１：１０に希釈され、３７℃で２時間にわたってインキュベートされて、染色体分離および表現型発現が可能にされた。形質転換体は、適切な条件下に塗布することによって選択され、個々のコロニーが、分析のために取得された。
【００３３】
シグナチャータグ化Ｂ群レンサ球菌の変異体ライブラリの生成。プラスミドpTCV-Tアーゼは、Ｂ群レンサ球菌NEM316においてエレクトロポレーションがなされて、「Sa NEM-Tアーゼ」が与えられた。この新しい低コピーベクタープラスミドは、Ｂ群レンサ球菌においてトランスポザーゼの合成を導き、抗生物質の選択圧（antibiotic selective pressure）の不存在下、４０℃での継体培養後に直ちに失われ得る。株「Sa NEM-Tアーゼ」は、次いで、カナマイシンカセットに隣接するHimar1逆方向反復を含有する自殺プラスミドおよび８０ｂｐのオリゴヌクレオチド・シグナチャータグ（V. Pelicicによって快く与えられた：Geoffroy et al.2003 Genome research 13:391-398）の一つと共にエレクトロポレーションに付された。細菌は、３７℃で０．２５Ｍのショ糖を有するＴＨ中３時間で回復することが可能にされ、次いで、カナマイシンを含有するＴＨプレート上に塗布された。そうして、インビボ転位イベントを経た細菌のみが選択された。
【００３４】
Himar1挿入部位の決定。挿入トランスポゾンに隣接するゲノムＤＮＡ配列の同定は、記載されたようにライゲーションＰＣＲ（ligation-mediated PCR：ＬＭＰＣＲ）（Prod’hom et al.1998）によってなされた（Pelicic et al. 2000）。簡単には、ゲノムＤＮＡは、Sau3AIによって消化され、これにより、短いＤＮＡフラグメントが生じた。リンカーは、配列番号１３（5’-TAGCTTATTCCTCCAAGGCACGAGC-3’）のLMP1を配列番号１４（5’-GATCGCTCGTGCCTT-3’）のLMP21によりアニーリングすることによって形成された；下線が引かれた配列は、プライマーにおける相補配列に対応し、これに対して、Sau3AIによって生じた付着末端に相補的な配列は太線になっている。リンカーは、消化されたＤＮＡに結紮され、次いで、挿入部位は、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（PE Applied Biosystem）により、LMP1および配列番号１５（5’-CGCTCTTGAAGGGAACTATGTTGA-3’）のISRまたは配列番号１６（5’-AATCATTTGAAGGTTGGTACTATA-3’）のISLを用いて増幅させられた。これらは、ミニトランスポゾンの内部にある外向きプライマーである。ＰＣＲ産物は、ゲル精製され、プライマーとしてISLまたはISLを用いて直接的に配列決定された。配列の相同性探索は、BLASTNを用いてデータベースに存在するレンサ球菌配列に対して行われた。
【００３５】
変異体ライブラリのカチオン性ペプチドであるコリスチンに対する感受性および細胞壁欠損についてのスクリーニング。Ｂ群レンサ球菌変異体は、ＴＨ−Ｋｎの９６ウェルのマイクロプレートにおいて終夜成長させられた。細菌は、次いで、１：１０００に希釈され、各希釈液は、２つのマイクロプレートに送られた。一方のマイクロプレートでは５０μＬのＴＨが加えられたのに対して、他方では５０μＬの５１２μｇ／ｍＬコリスチン（Sigma）または２μｇ／ｍＬのノボビオシン（Sigma）が加えられ、これにより、それぞれ、２５６μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの最終濃度が得られた。マイクロプレートは、終夜にわたって３７℃でインキュベートされた。マイクロプレートのＯＤ６００がMultiskan Ex装置（Thermo）により読み出された。
【００３６】
遺伝子ノックアウト変異体の構築。Ｂ群レンサ球菌の欠失変異体を構築するために、興味がある遺伝子のコード配列は、プロモータレスかつターミネーターレスのカナマイシン耐性カセットaphA-3と置換された（Trieu-Cuot and Courvalin, 1983）。これは、適切な酵素である３種のアンプリコンによるpG+host5への消化の後に連続的に結紮すること、および、得られた組み換えベクターをエレクトロポレーションによってNEM316に導入することによってなされた。期待された遺伝子置換をもたらす二重交差事象が得られかつ記載されたように確証された（Biswas et al. 1993. Journal of bacteriol）。
【００３７】
肺炎球菌欠失変異体は、興味のある遺伝子の５’および３’の９０ｂｐが隣接するaphA-3カセットを含有するＰＣＲ産物がクローニングされたpUC19プラスミドにより野生型株を形質転換させることによって達成された。
【００３８】
動物モデル。マウスの病原性の研究は、３週齢の雌のBALB/c＠Rjマウス（Janvier 研究所）を用いて行われた。
【００３９】
ＧＢＳのNEM316および誘導変異体は、指数期までブイヨン培地において成長させられた。３×１０７ＣＦＵ／ｍＬの細菌懸濁液２００μＬが、静脈注射によって８匹のマウスの群に投与された（６×１０６ＣＦＵ／マウス）。正確な接種数は、接種直後に懸濁液の１０倍希釈液をＴＨ寒天プレート上に塗布することによって測定された。感染後４４時間において、マウスは、頸椎脱臼によって犠牲にされた。マウスの腹腔が無菌的に開かれ、肝臓が摘出された。肝臓は、組織ホモジナイザー（Heidolph）により１ｍＬの無菌０．９％ＮａＣｌ中でホモジナイズされ、１０倍の連続希釈物が、ＴＨ寒天プレート上に塗布されて、細菌負荷が測定された。
【００４０】
肺炎球菌感染は、細菌接種物が１００μＬの容積中に３×１０２ＣＦＵ／マウスを含んでいたことを除いては同様の方法で行われた。病原性分析は、感染後４４時間における肺および血液中のＣＦＵの回復に基づいていた。
【００４１】
全ての動物実験は、制度上のガイドラインに従って行われた。
【００４２】
（説明）
シグナチャータグ化Ｂ群レンサ球菌ライブラリの構築および安定性
トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列は、グラム陽性複製プラスミドにおいて、一旦プラスミドがＢ群レンサ球菌NEM316株に導入された後にトランスポザーゼの発現を可能にする弱いプロモータ（pTCV-Tアーゼ）の下でクローニングされた。図１に示されるように、トランスポザーゼ含有プラスミドは、温度感受性複製起点を含んでおり、この温度感受性複製起点は、非許容状態温度においてプラスミドの効率的な喪失を許容した。Ｂ群レンサ球菌のシグナチャータグ化挿入変異体のライブラリは、記載されたように構築され、タグ化トランスポゾンにより自殺ベクターの、トランスポザーゼを発現する株へのエレクトロポレーションが行われた。４８のタグ化トランスポゾンは、それぞれ、種々のシグナチャータグによりラベリングされ、これらは、ライブラリを作るために用いられた。９６のランダムに選択された変異体の各タグは、マイクロプレート上に組織化され、このマイクロプレートは、２０％のグリセロール中で−８０℃に直ちに凍らせられた。こうして、４６０８の生存能力のある変異体のライブラリが得られた。
【００４３】
単一のエレクトロポレーション実験から得られた１５のランダムに選択された形質転換体のHindIII消化ＤＮＡは、aphA-3カセットをプローブとして用いるサザンブロッティングによって分析された。単一のハイブリッド形成フラグメントが各変異体について検出され、これは、所与の変異体について固有の転位事象が起こったことを示している。さらに、ハイブリッド形成ＤＮＡフラグメントのサイズは、各場合において、２ｋｂから１０ｋｂまでのサイズで異なっており（図１）、これにより、トランスポソンのＧＢＳ染色体へのランダムな挿入が示唆された。同様の結果が、EcoRI消化染色体ＤＮＡのサザン分析により得られ得た。
【００４４】
ライブラリの構築の間、トランスポザーゼ発現プラスミドを効率的に除去する際に困難に直面する。トランスポザーゼ含有プラスミドを維持するＢ群レンサ球菌変異体における突然変異の安定性を研究するために、３つの株がランダムに選ばれ、１３日間にわたって新鮮な培地において毎日株が継体培養された後に、それらのトランスポゾン挿入部位が配列決定された。それらのそれぞれについて、Ｊ０、Ｊ３、Ｊ８およびＪ１３において挿入部位が同定された。この結果により、染色体中の挿入は、プラスミドpTCV-Tアーゼ（これは、トランスポザーゼを発現する）の存在にも拘わらず安定であることが示された。この最後のポイントにより、pTCV-Tアーゼによるトランスポザーゼの発現はこうした条件において転位の第二の事象に導くために十分ではないか、または、試験された条件はさらなる転位を可能にしないかのいずれかが示唆される。
【００４５】
カチオン性ペプチドに対するＢ群レンサ球菌の抵抗性に関与する遺伝子についてのスクリーニング
他のポリミキシンと同じように、コリスチンは急速殺菌性であり、カチオン性界面活性剤として作用することによってその効果を示し、これにより、細菌の細胞膜の完全性の崩壊が引き起こされ、細胞内の内容物が漏れ出し、細胞死が生じる（Catchpole C.R et al, 1997, J. Antimic. Chem.）。コリスチンは、先天性免疫の抗菌カチオン性ペプチドの作用を低下させる。
【００４６】
それ故に、コリスチンに対して感受性の増加を示す変異体は、表層（envelope）の構造に関与する遺伝子中にトランスポゾンの挿入を有するかもしれない。全体で、野生型株（ＣＭＩ≧１０２４μｇ／ｍＬ）とは反対に２５６μｇ／ｍＬの濃度で成長することができないのでコリスチンに対して感受性がより高いとして４１の変異体株が同定された。
【００４７】
外側膜中に欠損を示す変異体を選択するための第二の抗生物質としてノボビオシンが選ばれた。この疎水性抗生物質は、ターゲット：細菌型II  トポイソメラーゼＤＮＡジャイラーゼおよびトポイソメラーゼIVに達するために細胞の細胞壁を通過することを必要とし、それ故に、細胞壁の変化は、ノボビオシン並びにＤＮＡ代謝の変異体に対する感受性の増加につながり得る。ノボビオシンに対する感受性についてのスクリーニングは、以前は、グラム陽性細菌において細胞壁欠損変異体を選択するために用いられた（Lui et al. 1999 PNAS）。このように、１５５の変異クローンが、ノボビオシンに対して感受性がより高いとして同定され、これらのうちの４６は、コリスチンに対しても感受性がより高かった。
【００４８】
要するに、試験されたインビトロ条件においてコリスチンおよび／またはノボビオシンに対して感受性がある１９６の変異体が明らかにされた。２５６μｇ／ｍＬのコリスチンとの成長について欠陥のある大抵の変異体はまた、ノボビオシンに対して感受性がより高いので、コリスチンおよびノボビオシンのスクリーニングによって検出された全ての変異体に関するコリスチンのＭＩＣが測定され、スクリーニングによりコリスチン感受性変異体が全く見逃されなかったことが実証された。結果は表２に示され、ノボビオシンスクリーンニングのみによって明らかにされた変異体はいずれもコリスチンに対して感受性を有しないことが示される。
【００４９】
コリスチンおよび／またはノボビオシン感受性クローンのトランスポゾン挿入部位のマッピング
コリスチンおよび／またはノボビオシン感受性クローン中のトランスポゾンの挿入部位は、ＬＭ−ＰＣＲおよび配列決定によって測定された（「材料および方法」を参照）。Pasteurから得られたゲノム配列データベースを用いて、変異ＯＲＦが同定された。このようにして、２５６μｇ／ｍＬのコリスチンおよび／または１μｇ／ｍＬのノボビオシンの存在下での成長についての欠損を示す１７０の変異体株は、８９のＯＲＦに対応することが観察された（表２）。
【００５０】
いくつかの遺伝子は、複数の突然変異を経たが、配列決定により、大多数の場合において転位部位が異なることが明らかにされ、これにより、トランスポゾン挿入のためのホットスポットがないことが示唆された。挿入部位が同一であれば、各場合において同じエレクトロポレーション事象に由来するので、クローンはおそらく同胞であるだろう。
【００５１】
NEM316のゲノム配列決定の後に確立された遺伝子の機能的分類により（Glaser et al, 2002. Mol Mic. 45:1499-513）、スクリーニングによって明らかにされた変異体の３分の１（５６）は、細胞表層および細胞過程に関与するとして分類された遺伝子の中にあった。６分の１（３１）は、中間代謝に関与する遺伝子の変異体に対応し、ほぼ同一の数（２９）は、情報経路、非定型条件への適応または解毒のために重要な遺伝子の変異体であった。最後に、変異体の３分の１（５４）の機能は未知であった。これらの結果により、スクリーニングは、細胞表層の構造に関与する遺伝子を見出す際に効果的であったことが確認される。
【００５２】
同定された変異体の役割のインビボ評価
スクリーニングによって明らかにされた細菌遺伝子のいくつかは、ＧＢＳの病原性に寄与する可能性がある。この仮説を試験するために、配列決定によって明らかにされたターゲット遺伝子が、他の関連グラム陽性病原体のゲノムにおけるホモログの有意性検出に基づく分析に付された。また、細胞壁の構造体におけるこれらの遺伝子の関与が、BlastPプログラムを用いて調査された。この方法によって、ノボビオシンおよびコリスチンに対して感受性がある２７の変異体が、細胞壁代謝において推定の機能を有するグラム陽性細菌の中に保存された遺伝子の中から選択された。これらの変異体は、「材料と方法」の項に記載されたようにして静脈内注射の感染モデルにおいて病原性表現型について試験された。結果は図３に示される。試験された変異体株の３０は、野生型株と比較して肝臓中のＣＦＵにおいて０．５〜３のｌｏｇ１０の減少を示した。９の変異体株は、野生型親株がするような挙動を示し、変異体株の５のみが、野生型より高いＣＦＵの有意数を示した。
【００５３】
減少した肝臓播種を有する変異体の同定は、ＧＢＳの病原性におけるこれらの染色体の遺伝子座の役割を示唆する。この関連性が変異遺伝子に厳密に依存するかどうか評価するために、特定の欠失が、ＧＢＳの染色体中の対立遺伝子置換によって１０遺伝子において形成され、同遺伝子型突然変異が生じさせられた。ＧＢＳの変異体はマウスに注射され、肝臓中の細菌のクリアランスが測定された。図４に示されるように、全ての欠失変異体は、野生型に対して低減した細菌計測数を示した。これらの結果は、挿入変異体により得られた結果と匹敵しており、変異体遺伝子と低病原性（hypo-virulent）表現型との間の特異的な関連性が確認された。
【００５４】
弱毒化された病原性を引き起こす全般的な成長欠損は、野生型株NEM316と並行して成育させられた個々の欠失変異体の成長曲線を生じさせることによって除外された。図４に列挙された全ての株の成長は、穏やかなインビトロ成長曲線の欠損を示したgbs 1830を除いて、親株NEM316の成長と基本的に同じであることが分かった。
【００５５】
病原性関連遺伝子の機能分類
ＧＢＳの配列決定の間に割り当てられた機能分類により、ＧＢＳの病原性にとって重要であると同定された遺伝子は、種々のクラスにグループ化され得た（表２）。
【００５６】
gbs 1787は、ミコバクテリウム・スメグマティス（mycobacterium smegmatis）のcydAに対して有意な相同性を示した。cydAは、シトクロム  ｂｄ  キノールオキシダーゼのサブユニットをエンコードする。それは、大腸菌（copper PA J.bact. 1990）および桿菌種（Winstedt et al. J.bact. 1998）を含む多くの原生動物におけるエネルギー変換呼吸において必要とされる。ＧＢＳにおいて、cydA遺伝子の不活性化は、成長特徴における変化を誘導した（yamamoto et al.）。
【００５７】
gbs 0683は、以前に、内皮細胞に対する浸潤性表現型の喪失についての変異体ライブラリのインビトロスクリーニングの後にＧＢＳにおいてiagAとして同定された。iagAは、他のグラム陽性細菌からの推定の糖転移酵素に対して相同性を共有する。iagAは、LTAの細菌細胞壁へのつなぎ止めを可能にする糖脂質であるDGlcDAGの形成を触媒する糖転移酵素として機能する（Doran et Al. JIC 2005）。
【００５８】
３種の遺伝子は、他の微生物からの未知のタンパク質に類似していた。しかしながら、いくつかの推定機能は、タンパク質配列の注釈付けから推測されるかもしれない。アシル基転移酵素ドメインがgbs 0052遺伝子産物上に見出された。レンサ球菌属において、アシル基転移酵素活性を有するタンパク質は、ペプチドグリカンまたは莢膜多糖の合成を含む多くの生物学的過程において必要とされた。gbs 0582およびgbs 2100の注釈付けは、ＤＨＨモチーフの存在を明らかにした。１つのアスパラギン酸残基および２つのヒスチジン残基からなるこのドメインは、大腸菌タンパク質RecJを含むホスホジエステラーゼ機能のタンパク質と関連していた（Han ES Nucleic Acids Res. 2006）。
【００５９】
gbs 0307遺伝子産物は、真核型セリン／トレオニンキナーゼファミリーに属する。セリン／トレオニンキナーゼは、結核菌（mycobacterium tuberculosis）のpknBを含む種々のグラム陽性細菌中に存在していた（Av-Gay et al. AIA 1999）。gbs 0307は、種々の基質をセリンおよびトレオニン残基上でリン酸化するキナーゼである、ＧＢＳ中のstk1として特徴付けられた（JinH et al. J Mol Biol. 2006; Rajagopal L et al. J Biol Chem. 2003; Rajagopal L et al.  Mol Microbiol. 2005）。stk1の不活性化は、ＧＢＳの細菌成長および細胞分離並びにプリンの生合成を減じた（Rajagopal L et al. J Biol Chem. 2003）。stk1のホモログは、他のレンサ球菌種において同定された。肺炎球菌のstkPは、受容能（competence）表現型において陽性作用を有していた（Echenique J et al.AIA 2004）。虫歯菌（S.mutans）において、バイオフィルムの形成、受容能および酸耐性は、stkP遺伝子を必要とした（Hussain H et al. J. bact. 2006）。セリン／トレオニンキナーゼはまた、動物モデルにおいてレンサ球菌属の病原性に重大な影響を及ぼした（Echenique J et al.AIA 2004）。
【００６０】
gbs 0100遺伝子産物の分析は、ホスホメチルピリミジンキナーゼモチーフの存在を明らかにし、枯草菌（B.subtilis）等の多くのグラム陽性細菌において見出されたthiD遺伝子産物に対する相同性を示した（Park JH et al. J.bact. 2004）。thiDは、チアミンピロリン酸（thiamine pyrophosphate：ＴＰＰ）の生合成において必要とされる。
【００６１】
gbs 0653は、最初、ＧＢＳのβ溶血素活性のために必要とされる遺伝子座の一部として同定された（Pritzlaff CA et al. Mol.mic. 2001）。cylオペロンのメンバーとしてのタンパク質は、そのＮ末端領域においてCylHに対応し、CylIはタンパク質のＣ末端を構成する。gbs 0653は、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼに対して相同性を有する産物をエンコードし、脂肪酸合成経路に関与する大腸菌のfabF産物に対して有意の相同性を有していた。Ｂ群レンサ球菌において、cylオペロンの発現は、CovR/Sの二成分系によってきびしく調節されることが示された（Lamy MC et al. Mol. mic. 2004）。
【００６２】
グラム陽性病原体におけるＧＢＳホモログの同定および役割
公的に入手可能な微生物ゲノムにおける相同性探索により、見出された全ての遺伝子は、いくつかの関連病原性グラム陽性種のゲノム配列においてオルソログであることが明らかにされた。ＧＢＳ遺伝子（gbs 1787を除く）は、関連のＡ群レンサ球菌属（肺炎球菌および化膿レンサ球菌（S.pyogenes））のゲノム並びにもう少し異なる種、例えば黄色ブドウ球菌（S.aureus）、腸球菌（E.faecalis）または炭疽菌（B.anthracis）のゲノムにおいて合致した（表４）。ほとんど全ての場合において、相同性は小ドメインに制限されなかったが、タンパク質全体をカバーしており、このことにより、オルソログタンパク質は、他のグラム陽性細菌において機能的であるかもしれないことおよびこの機能はＢ群レンサ球菌において観察される機能に類似するかもしれないことが示唆された。
【００６３】
この仮説を検証するために、ＧＢＳ病原性遺伝子のパラログの遺伝子ノックアウトが、肺炎球菌D39において、この株の天然の応答能を利用することによって行われた。肺炎球菌変異体の表現型は、マウス感染モデルにおいて評価された。細菌数の測定は、肺炎球菌D39が静脈注射されたマウスの肺および血液においてなされた。ＧＢＳ変異体とは対照的に、肺炎球菌変異体は、マウスの接種の後に種々の表現型を示した。静脈注射の後、野生型D39株は汎発され、肺において細菌および有意な細菌の存在に至った。sp 1450（gbs 0100ホモログ）およびsp 1979（gbs 1830）等の欠失変異体は、野生型の株と同様に振る舞うので、肺炎球菌の病原性に関与しないようであった。しかしながら、低病原性表現型は、遺伝子の変異体sp 1868（gbs 0052ホモログ）、sp 1577（gbs 0307）、sp 1176（gbs 0582）と関連しており、これより低い程度であるが、sp 2010（gbs 2100）と、菌血症および肺播種の有意な減少によって関連していた（図２）。
【００６４】
本発明は、生化学アッセイの設計にも関する。
【００６５】
１；ターゲットGBS 0307に対する阻害剤についてのスクリーニングアッセイとしての生化学アッセイは、多様なタンパク質のリン酸化を触媒する細菌のセリン／トレオニンキナーゼであるが、その性質は未だに論争中である（化膿レンサ球菌についてのヒストン様タンパク質、Ｂ群レンサ球菌についての無機ピロホスファターゼ）。文献において記載されたようなGBS 0307アッセイは、基本的に放射能に基づいている（Journal of Molecular Biology, 2006, 357(5), p.1351-1372 およびJournal of Biological Chemistry, 2003, Vol. 278, 16, p.14429-14441）。下記に記載される非放射能アッセイは、発光ＡＴＰ検出または蛍光ＡＤＰ検出のいずれかに基づいている。それらは、原型基質ＭＢＰ（myelin basic protein：ミエリン塩基性タンパク質）を用い、ＨＴＳにより要求されるように小型のフォーマットおよび迅速な読み出しに容易に従う。
【００６６】
GBS 0307発光アッセイ
アッセイバッファ「assay buffer：ＡＢ」は、５０ｍＭのHepes（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．０１２％のTriton-X100および１ｍＭのＤＴＴを含有する。以下の成分が、白色ポリスチレンCostarプレート中に、３０μＬの最終容積までＡＢ中に加えられる：３μＬのＤＭＳＯまたはＤＭＳＯに溶解した阻害剤および２７μＬのMTB26。室温での予備インキュベーションの３０分後に、ＡＢ中の３０μＬの基質混合物が、それぞれのウェルに６０μＬの最終容積まで加えられる。その時点で、この反応混合物は、アッセイバッファ中５ｎＭのGBS 0307（Ｂ群レンサ球菌から自家製造されたもの）、０．３μＭのミエリン塩基性タンパク質（Sigma）および０．３μＭのＡＴＰ（Sigma）からなる。室温でのインキュベーションの９０分後、３０μＬの曝露混合物（revelation mix）が９０μＬの最終容積に加えられ、このものは、以下の成分を各最終濃度で含む：２ｎＭのルシフェラーゼ（Sigma）、３０μＭのＤ−ルシフェリン（Sigma）、１００μＭのＮ−アセチルシステアミン（Aldrich）。Analyst-HT（Molecular Devices）により蛍光強度が直ちに測定され、阻害率（％）に変換される。ＩＣ５０決定のために、阻害剤は、６〜１０の異なる濃度で試験され、関連する阻害はXLFIT （IDBS）を用いて古典的なラングミュアの平衡モデルに適合させられる。
【００６７】
GBS 0307蛍光アッセイ
アッセイバッファ「ＡＢ」は、５０ｍＭのHepes（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．０１２％のTriton-X100および１ｍＭのＤＴＴを含有する。以下の成分が、黒色ポリスチレンCostarプレートに５０μＬの最終容積までＡＢ中に加えられる：５μＬのＤＭＳＯまたはＤＭＳＯに溶解した阻害剤および４５μＬのGBS 0307。室温での３０分の予備インキュベーションの後、ＡＢ中５０μＬの基質−曝露混合物が各ウェルに１００μＬの最終容積に加えられる。その時点で、この反応混合物は、アッセイバッファ中、１０ｎＭのMTB26（Ｂ群レンサ球菌から自家製造されたもの）、２μＭのミエリン塩基性タンパク質（Sigma）、０．３μＭのＡＴＰ（Sigma）、５ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（Pyruvate Kinase）（Sigma）、５０μＭのホスホエノールピルバート（Sigma）、５ｕ／ｍＬの乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma）および３μＭのＮＡＤＨ（Sigma）からなる。ＮＡＤＨの蛍光強度（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）は、直ちに、Fluostar Optima（ＢＭＧ）によって動力学的に測定される。阻害率（％）は、適合初期速度から導き出される。ＩＣ５０の決定のために、阻害剤は、６〜１０の異なる濃度で試験され、関連する阻害は、XLFIT（IDBS）を用いて古典的なラングミュア平衡モデルに適合させられる。
【００６８】
GBS 0307の基準阻害剤
本発明者らにより、スタウロスポリンは、２３±８ｎＭのＩＣ５０を有するMTB26の阻害剤であることが示された（図３）。
【００６９】
２．ターゲットGBS 0582の阻害剤についてのスクリーニングアッセイとしての生化学アッセイ
導入
GBS 0582は、未知機能のタンパク質であって、DHHドメイン（ホスホエステラーゼ型の活性に関連する）およびDHHA1ドメイン（基質認識におそらく関連する）を含むものである。配列の比較から、GBS 0582は、知られていない性質のホスホエステル結合を加水分解することが仮定され得る（プロテインホスファターゼ、糖ホスファターゼ、ピロ−またはポリ−リン酸ヒドロラーゼ、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ等）。ピロ−またはポリ−ホスファートについてのMTB27のあらゆる加水分解活性は実験的に示されなかった。しかし、リン酸４−メチルウンベリフェリル（多くのホスファターゼのための人工基質）がMTB27によって認識されかつ加水分解されたことが示され、それ故に、フルオロフォア４−メチルウンベリフェロンの形成を通じて蛍光シグナルが生じた。当該分野における文献がないので、これが、GBS 0582についての活性アッセイの最初の報告であり、そのホスホエステラーゼ機能が確認された。天然の基質は未だに発見されていない。
【００７０】
MTB27蛍光アッセイ
アッセイバッファ「ＡＢ」は、５０ｍＭのHepes（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．００６％のTriton-X100、２ｍＭのＤＴＴを含有する。以下の成分が、黒色ポリスチレンCostarプレート中に６０μＬの最終容積までＡＢ中に加えられる：３μＬのＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ溶解した阻害剤、４７μＬのリン酸４−メチルウンベリフェリルおよび１０μＬのGBS 0582。この反応混合物は、アッセイバッファ中１０ｎＭのGBS 0582（Ｂ群レンサ球菌から自家製造されたもの）および３００μＭのリン酸４−メチルウンベリフェリル（Sigma）からなる。９０分のインキュベーションの後、４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度（λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）が、Fluostar Optima（ＢＭＧ）により読み出され、阻害率（％）に変換される。あるいは、インキュベーションの９０分の間に動力学的にプレートを読み出し、適合初期速度から阻害率（％）を導き出すことができる。ＩＣ５０の決定のために、６〜１０の異なる濃度で阻害剤が試験され、関連する阻害はXLFIT （IDBS）を用いて古典的なラングミュアの平衡モデルに適合させられる。
【００７１】
GBS 0582の基準阻害剤
本発明者らにより、アデノシンモノホスファート（Adenosine monophosphate：ＡＭＰ）が、２３５±４５μＭのＩＣ５０を有するMTB27の阻害剤であったことが示される。ＡＤＰは、MTB27を同様に阻害するが、効率性は劣る（ＩＣ５０＝４０５μＭ）（図４）。
【表１】
2009540819.tif 000002
【表２】
2009540819.tif 000003
【００７２】
（配列表）
【化１】
2009540819.tif 000004
【化２】
2009540819.tif 000005
【化３】
2009540819.tif 000006
【化４】
2009540819.tif 000007
【化５】
2009540819.tif 000008
【化６】
2009540819.tif 000009
【化７】
2009540819.tif 000010
【化８】
2009540819.tif 000011
【図１Ａ】
2009540819.tif 000012
【図１Ｂ】
2009540819.tif 000013
【図２Ａ】
2009540819.tif 000014
【図２Ｂ】
2009540819.tif 000015
【図３】
2009540819.tif 000016
【図４】
2009540819.tif 000017
【配列表】
2009540819000001.xml
【国際調査報告】
2009540819.tif 000036
2009540819.tif 000037
2009540819.tif 000038
2009540819.tif 000039
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