(57)【要約】  本発明は、発光を利用して試料中のＡＴＰを検出する方法に関する。本法では、抽出溶媒による前処理も受けていない試料に発光試薬を添加してＡＴＰ複合体を形成させ、その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光を測定する。
2009517657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光によって試料中のＡＴＰを検出する方法であって、
ＡＴＰ複合体を形成するために抽出溶媒でどんな前処理も受けていない試料に発光試薬を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光を測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記発光試薬の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に体細胞抽出溶媒を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体細胞抽出溶媒の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に微生物の抽出溶媒を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光を測定することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発光試薬の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に微生物の抽出溶媒を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発光を少なくとも１０秒間測定することを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発光を少なくとも２０秒間測定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発光を少なくとも６０秒間測定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発光を連続的に測定して、時間の関数としての発光を得ることを特徴とする請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載に方法。
【請求項９】
前記時間の関数としての発光と時間の関数としての参照値との比較に基づいて、存在する前記微生物の細胞を識別することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料で測定された時間の関数としての発光を、複数の体細胞と複数の微生物細胞から選択された少なくとも１つの細胞に対する時間の関数としての発光に対する１つまたはそれ以上の参照値と比較し、
前記測定された時間の関数としての発光が、前記参照値に対応するかどうかがを決定し、対応する場合に、前記参照値を有する細胞が前記試料中に存在することを決定することを特徴とする請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中のＡＴＰを検出する方法を実行するためのコンピュータプログラムであって、
ＡＴＰ複合体を形成するために抽出溶媒でどんな前処理も受けていない試料に発光試薬を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定してフリーＡＴＰの発光に対する測定値を得て、フリーＡＴＰの測定値を基準値と比較し、
前記フリーＡＴＰの測定値が前記基準値より高いことが確立された場合に、ＡＴＰが高濃度で存在することを決定することを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１２】
前記発光試薬の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に体細胞抽出溶媒を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定して体細胞ＡＴＰの発光に対する測定値を得て、請求項１１に基づいて得られたフリーＡＴＰの測定値と比較し、
前記体細胞ＡＴＰの測定値が前記フリーＡＴＰの測定値より高い場合に、体細胞ＡＴＰが存在することを決定することを特徴とする請求項１１に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１３】
前記体細胞抽出溶媒の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に微生物の抽出溶媒を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定して微生物ＡＴＰの発光に対する測定値を得て、請求項１２に基づいて得られた体細胞ＡＴＰの測定値と比較し、
前記微生物ＡＴＰの測定値が前記体細胞ＡＴＰの測定値より高い場合に、微生物ＡＴＰが存在することを決定することを特徴とする請求項１２に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１４】
前記発光試薬の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に微生物の抽出溶媒を添加し、
その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定して微生物ＡＴＰの発光に対する測定値を得て、請求項１１に基づいて得られたフリーＡＴＰの測定値と比較し、
前記微生物ＡＴＰの測定値が前記フリーＡＴＰの測定値より高い場合に、微生物ＡＴＰが存在することが決定することを特徴とする請求項１１に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１５】
時間の関数としての発光を得るために、少なくとも１０秒間、発光をほぼ絶え間なく測定し、測定したデータを異なる種類の微生物細胞およびオプションの体細胞に対する時間の関数としての１つまたはそれ以上の参照値と比較し、
前記試料中に存在する微生物細胞およびオプションの体細胞の種類を決定することを特徴とする請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、発光（ルミネッセンス）を利用した試料中のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の検出方法およびそのコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
汚染物の存在に関するいくつかの政府の規制が、食品や飲料工業、臨床、製薬および化粧品工業などの様々な産業に適用される。例えば、微生物細胞（例えば、細菌、酵母、および細菌類）などの汚染物の存在に対して全製品を試験する（または試験のために手配する）義務を含んでいる。製品中に微生物が存在すると、製品の早い腐敗が起こり得る。さらに、これらの微生物細胞は、製品を消費する消費者の健康への重要な危険を構成し得る。
【０００３】
微生物の汚染を検出する慣用の方法は、肉眼で識別できるまで微生物細胞の成長を含む。この欠点は、その工程が遅く、結果を得るには何日もかかり得ることである。この手間がかかる態様は、その工程を高価にする。
【０００４】
したがって、例えば、米国特許第４,３０３,７５２号から、生きている微生物細胞中に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）分子の測定に基づいて、製品中の微生物汚染を検出する方法の使用が知られている。ＡＴＰは、例えば、酵素ルシフェラーゼと補助因子ルシフェラーゼの組み合わせからなる発光酵素があると、数秒以内の時間で検出することができる。結果として起こる反応は、一般的に「ホタル反応」と呼ばれ、すぐに、ＡＴＰ発光として知られている光放出を生成する。生成した光は、試料中に含まれるＡＴＰの量に比例している。発光は、例えば、ルミノメータなどの計測器を用いて測定することができる。
【０００５】
中国特許第６７８０６５号から、最初に体細胞抽出溶媒（somatic extractant）を加え、体細胞ＡＴＰ（somatic ATP）の放出をもたらし、それに続いて発光試薬を加えることにより、ＡＴＰを検出することが知られている。その結果、フリーＡＴＰと体細胞ＡＴＰの合わさった量が測定される。そして、前記合わさったＡＴＰは加水分解により取り除くことができる。それに続いて、微生物の抽出溶媒（microbial extractant）が、微生物ＡＴＰ（microbial ATP）の放出を引き起こすように加えられ、それに続いてＡＴＰを測定し得る。
【０００６】
シュラム他のJournal of Bioluminescence and Chemiluminescence, part4, pp390-398,1989によると、哺乳類ＡＴＰアーゼ（アデノシントリホスファターゼ）を使用する中国特許第６７８０６５号の改良が知られている。
【０００７】
米国特許第６９５１７２３号から、ＡＴＰの分解生成物であるＡＤＰ（アデノシン二りん酸）を測定すること、あるいは、ＡＤＰをＡＴＰに変換しそれに続いてＡＴＰを測定することが知られている。
【０００８】
しかしながら、ＡＴＰ発光のためのそのような慣用の方法は、製品中の生きている微生物細胞の存在を検出するために使用されるとき、重大な問題が起こり得る。
【０００９】
第一に、ＡＴＰは生きている微生物細胞中に存在するばかりではなく、体細胞と呼ばれる他の微生物でない細胞中にも存在する。そのような体細胞は、しばしば製品中の不可欠部分を形成する。食品製品と飲料は、例えば、野菜細胞、例えば、果汁中に果物細胞を含み得るが、それらは一般的に体細胞ＡＴＰと呼ばれるかなりの量のＡＴＰを含んでいる。
【００１０】
製品は、いわゆるフリーＡＴＰを含み得る。フリーＡＴＰは、試料中に自由に存在するＡＴＰであり、「死んだ」、および／または、破壊された、および／または、損傷した体細胞、および／または微生物細胞に由来する。
【００１１】
そこで、試料中には、ＡＴＰの３つの可能なソースとして、目に見えるフリーＡＴＰ、微生物細胞中に含まれる体細胞ＡＴＰ、体細胞に含まれる体細胞ＡＴＰがあり、３つの種類のＡＴＰは、化学的に同じであって識別はつかない。それで、微生物細胞の存在を決定するために微生物ＡＴＰを検出する前に、フリーＡＴＰと体細胞ＡＴＰを取り除かなければならない。
【００１２】
微生物ＡＴＰを決定することに関して解決すべき第２の問題は、微生物細胞に含まれる微生物ＡＴＰはすぐに発光を生成するホタル反応を活性化するために利用可能でないことである。この目的のために微生物細胞に含まれる微生物ＡＴＰを最初に微生物細胞から放出または抽出しなければならない。なぜならホタル反応は、ＡＴＰが試料中で自由に利用可能であり、発光試薬と複合体（いわゆる「ＡＴＰ複合体」）を形成する場合にのみ効果があるからである。この放出は、いわゆる抽出溶媒、例えば、第４アンモニウム化合物によって通常もたらされ、抽出溶媒は、細胞膜、および/または、体細胞および／または微生物細胞の細胞壁に、いわば穴を開けてＡＴＰをそこから流出させる。体細胞は、微生物細胞より抽出溶媒に対して傷つきやすいので、その結果、体細胞に含まれた体細胞ＡＴＰは、微生物ＡＴＰが微生物細胞から放出される前に最初に放出される。従って、この体細胞ＡＴＰが放出されると、関連する微生物ＡＴＰの光放出が隠されるか、あるいは間違った陽性（positive）の結果を導く。
【００１３】
上の問題は、先行技術において、まず最初に微生物細胞を破裂させずに体細胞からの体細胞ＡＴＰを放出するのに適切であるだけであるそれほど強力でない抽出溶媒を使用することによって解決された。これはフリーＡＴＰと放出された体細胞ＡＴＰとを含み、微生物ＡＴＰが未破壊の生きている微生物細胞にのみ含まれている試料をもたす。この体細胞ＡＴＰを放出した後に、微生物ＡＴＰを微生物細胞から放出して測定する前に、既に存在する放出された体細胞ＡＴＰとフリーＡＴＰの両方を排除しなければならない。放出された体細胞ＡＴＰとフリーＡＴＰは、一般的にＡＴＰアーゼと呼ばれる酵素、例えば、酵素アピラーゼで試料を処理することによって排除される。アピラーゼは微生物細胞などの未破壊の生きている細胞に含まれるＡＴＰを分解せずに試料に含まれるフリーＡＴＰを選択的に分解することができる。これは、この分野で使用される標準的な方法である。
【００１４】
未破壊細胞は、細胞壁、および／または、細胞膜がいまだ健全であり、その結果、その周囲に全くＡＴＰを放出していない細胞であることが理解される。もはや「生きていない」細胞は、通常、破壊されており、その結果、それらに含まれるＡＴＰは放出されている。
【特許文献１】米国特許第４,３０３,７５２号
【特許文献２】中国特許第６７８０６５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前述の方法の不都合な点は、フリーＡＴＰと放出された体細胞ＡＴＰが分解された後にアピラーゼが活性なまま残ることである。これは、微生物の抽出溶媒が加えられて、微生物ＡＴＰが微生物細胞から放出されるとき、アピラーゼによって一部が分解されることを意味する。そのため得られる発光値が予想より低くなるので、アピラーゼは測定結果に陰性（NEG：ネガティブ）の影響を与える。特に、少量の微生物細胞のみが存在する場合において、このことは、間違った陰性（NEG）の結果を導きかねない、なぜなら発光によって微生物細胞を測定可能となる前にすべての微生物ＡＴＰがアピラーゼによって分解されてしまうからである。そのような状況は好ましくない、なぜなら微量の微生物細胞が存在するとユーザの健康が危険となり、腐敗、および／または、風味の損失につながりかねないからである。
【００１６】
したがって、速くて信頼できるやり方で微生物ＡＴＰを測定する方法に対する必要性がある。
【００１７】
さらに、間違って陰性（NEG）の結果をもたらさない方法に対する必要性がある。
【００１８】
本発明の別の目的は、異なった種類の微生物細胞を速く正確に計測することと異なる種類の微生物細胞を互いに識別することである。例えば、細菌と酵母と真細菌を互いに識別する方法および異なる種類の細菌と酵母を識別する方法、例えば、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌を互いに識別する方法や異なるグラム陽性細菌を互いに識別する方法の必要性がある。
【００１９】
本発明の別の目的は、試料中のフリーＡＴＰ量、および／または、体細胞ＡＴＰ量を決定することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前置きのパラグラフの後に続く目的の１つまたはそれ以上は、抽出溶媒でどんな前処理もを受けていない試料に発光試薬を添加してＡＴＰ複合体の形成を形成させ、その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光を測定する方法によって達成される。
【００２１】
従って、本発明では、発光試薬を抽出溶媒、例えば、体細胞抽出溶媒または微生物の抽出溶媒でどんな前処理も受けていない試料に添加する。
【００２２】
通常は試料として、液体形態、すなわち、けん濁液、ミルク濁液または溶液が好ましい。そういうものとして、既に天然の液体である試料が使用され得る。例えば、ミルク、ワイン、果汁、化粧水、および同等物である。天然で液体でないまたはほとんど液体でない試料は、好ましくは計測の前にけん濁液、ミルク濁液または溶解技術によって液体の形態にされる。この例は、野菜、果実、クリーム、および同等物である。食糧あるいは飲料の試料は、臨床、製薬、または、化粧品など他の分野からの試料と同様に試験され得る。
【００２３】
本法を使用すると、試料中のフリーＡＴＰ量を決定することが可能となる、なぜなら抽出溶媒やアピラーゼが試料に添加される前に未処理の試料の発光を測定するからである。フリーＡＴＰのそのような決定方法は、先行技術において今まで行われたことがなかった。
【００２４】
本方法に基づいて測定されるフリーＡＴＰの量は、例えば、特定の試料が処理される工場および／または設備の衛生状態の測定であり、また、現在の技術技術に基づく方法を使用する場合にはわからないまま残る原料の前の汚染状況を知ることができる。このことは以下で説明されるだろう。現在の技術水準に基づく方法ではフリーＡＴＰを測定できない。このことは、例えば、工場に供給される前に、汚染された試料をある温度まで加熱して存在する微生物細胞を殺菌する場合、このことは現在の技術水準に基づく方法で証明することができない。このことは、本発明の方法に基づく方法を用いるとフリーＡＴＰが決定されるので可能である。なぜなら、本法は、試料からの破裂された細胞ＡＴＰが放出され（「フリーＡＴＰ」）、試料中に含まれているまたは含まれていた「死んだ」あるいは「損傷した」（「破裂した」）細胞の量を測定するからである。したがって、本発明は、早期段階で起こった汚染を証明することができる。このように、本発明は、例えば、ミルクを工場に配達する前に微生物細胞を殺すための熱処理に晒すかどうかを決定することができる。現在の技術水準の方法を用いると、そのようなミルクは「汚染されていない」ものとして分類されるが、本発明の方法を用いると、そのようなミルクは「汚染された」ものとして分類される。従って、本発明は、たとえ製品がもはや全く完全に微生物細胞を含まなくても、（ブランクの発光値が基準値より高いという事実に基づいて）試料に何か「間違い」があることを証明するために使用することができる。汚染されていない試料は既に製品の調製から得られるある量のフリーＡＴＰを含み得るので、次にこの量を「基準」として採用し、次に基準値に対する増加分だけを汚染物として示す。
【００２５】
本発明の別の利点は、アピラーゼの使用が（ほとんど）完全に排除されるため間違った陰性（NEG）の結果や長い待機時間などの関連する難点を減らせることである。本発明の方法を使用すると、上で説明されたような従来の発光試験の場合の１５〜４０分の分析時間と比較すると、約１分未満まで分析時間を減少することができる。しかしながら、特殊な場合、例えば、多量の体細胞ＡＴＰとフリーＡＴＰが存在すると予想される場合、少量のアピラーゼを使用することは依然として好ましい。多量のＡＴＰは多くの発光を生成し、測定される微生物ＡＴＰの信号／雑音比を擾乱する。このような場合にアピラーゼを使用するが、アピラーゼの効果が、間違って陰性（NEG）の結果が得られないように、分析時間中ほぼ連続する発光の計測することにより単に決定されかつ評価される。
【００２６】
本発明は、多数の製品でＡＴＰを測定するのに使用することができる。可能性のある適用分野は、食品工業（ミルク、他のミルク製品、ワイン、スープ、野菜と果物のジュースと製品、および同等物）、化粧品工業（洗剤、ボディーローション、口紅、紫外線保護製品、髪のケア製品、および同等物）、農業（茎、からの樹液を試験することによる切り花の新鮮さ、果菜類、および同等物）、臨床業（血液試料、尿試料、他の試料、および同等物）、および製薬業（薬、および同等物）である。
【００２７】
本発明の方法は、好ましくは発光が少なくとも１０秒間で測定されるように行われる。発光は、好ましくは少なくとも２０秒間、特に好ましくは少なくとも６０秒間測定される。
【００２８】
ある期間の間、規則的にまたは連続的に発光を測定することによって、複数の微生物細胞および異なる種類の体細胞と微生物細胞と比較してＡＴＰが体細胞から放出される速度としての因子に関する情報が得られる。
【００２９】
発光は、好ましくは時間の関数としての発光を得るためにほぼ絶え間なく測定されて、例えば、時間の関数としての発光カーブによって表される。このカーブの形状から、例えば、種々の体細胞、および／または、微生物細胞からＡＴＰが放出される速度に関する情報を得ることができ、それは細胞の種類の情報を提供する。この連続する測定は、また、アピラーゼを使用するときにも重要であり、その場合、時間と共に発光の減少が観測される。また、個々の測定の間にある間隔である時間での間、発光を測定することも可能である。また、これを説明する実施例が参照される。
【００３０】
好適な実施例では、存在する微生物は、時間の関数としての参照値と比較し、時間の関数としての発光に基づいて特定される。これらの参照値は、例えば、異なる種類の細菌と酵母の標準カーブである。そのような比較から、例えば、特定の細菌、あるいは酵母、またはその両方が存在するか否か、および、どの種類の細菌が存在するかを推論することができる。これにより、本方法は、正確に異なる種類の微生物細胞、すなわち、例えば、酵母と細菌、例えば、カンジダ・アルビカンス（酵母）、クロストジウム・スポロゲネス（グラム陽性細菌）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（グラム陽性細菌）、バチルス・セレウス（グラム陽性細菌）、バチルス・サブチリス（グラム陽性細菌）、およびエシュリキア属大腸細菌（グラム陰性細菌）を特定するのに適切である。
【００３１】
このような識別法の利点は、有害な微生物細胞の存在を、好ましいまたは必要な微生物細胞の存在から識別することができるという点である。この実施例は、ワイン製造工程の間、圧縮されたブドウ中でともに存在し得る好ましくない腐敗を引き起こす細菌と発酵に必要な酵母を識別することである。現在の技術水準の方法は、微生物細胞の存在を明らかにすることができるだけであり、細菌と酵母を識別することはできない。したがって、本発明は、そのような識別を可能にする解決法を提供する。さらに、ワイン製造工程では、ワインは圧搾後にすぐに瓶に入れられる。そのような場合において、適切な酵母が存在することが必要であるばかりでなく、酵母は瓶詰め工程の前に瓶中の後発酵を防ぐために適切な程度まで取り除かなければならない。なぜなら酵母は瓶中でガスを形成し、それにより瓶の爆発をもたらすので、ガスの形成は良くないし危険でさえある。したがって、本発明は、また、異なる段階で異なる細菌と真菌の存在を証明するためにワイン製造工程で使用され得る。
【００３２】
本発明を用いると、異なる種類の製品に対して決定される多くの基準発光値、例えば、汚染されていない試料の基準値、例えば、殺菌された試料と、例えば、体細胞を含む試料の基準値を測定することによって、研究の対象とすることが可能である。これらの基準値は、本発明の方法の前に決定され得るか、または、本コンピュータプログラムと共に提供され得る。例えば、汚染されていない試料（ブランク値あるいは陰性（NEG）値）に対する３つの基準値、とりわけ、０〜５秒の時間間隔で比較できる殺菌された製品の測定値の計算された平均値である第１の基準値と、５〜１０秒の時間間隔の第２の基準値と、１５〜２０秒の時間間隔の第３の基準値を決定することは好ましい。しかしながら、これらの時間間隔と基準値の数は、分析されるべき製品と予想される汚染物質に依存して当業者が決定することができるのは明確であるだろう。
【００３３】
本方法の好適な実施例では、体細胞抽出溶媒は、発光試薬の添加後に同じ試料に添加され、ＡＴＰ複合体を形成する。その結果、試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光が測定される。この実施例では、十分な複合化されていない発光試薬が放出された体細胞ＡＴＰの複合化のために残るように、存在するフリーＡＴＰに対して過剰の量の発光試薬を加えるのが好ましい。
【００３４】
したがって、ここで形成されたＡＴＰ複合体は、試料中に既に存在している発光試薬と体細胞から放出されたＡＴＰとの複合体である。従って、このように、試料中の体細胞ＡＴＰの量を発光によって決定することができる。従って、このＡＴＰ複合体は、上で説明されたように、発光試薬とフリーＡＴＰの前に形成されたＡＴＰ複合体に追加される。
【００３５】
本方法のそのような好適な実施例は、体細胞が製品中に存在する（存在する可能性がある）場合にのみ実行する必要性がある、例えば、果汁を含む飲料で期待されるが、化粧品中では期待されない。
【００３６】
この実施例では、発光試薬の添加に続いて、試料中のフリーＡＴＰ量が最初に測定され、その後、例えば、体細胞抽出溶媒がそれに続いて、好ましくは発光計測の間に、使用されたルミノメータに接続された注入ポンプによって同じ試料に添加される。体細胞体細胞抽出溶媒は、体細胞ＡＴＰが体細胞から放出されるように体細胞の細胞壁、および／または、膜を破損および／または破裂し、その結果、放出された体細胞ＡＴＰの量は、ＡＴＰ複合体を形成しそれに続く発光を経由して測定される。
【００３７】
本方法のさらに別の好適な実施例では、微生物の抽出溶媒は、試料に添加され、微生物ＡＴＰを放出するように体細胞抽出溶媒とともに処理される。この放出された微生物ＡＴＰは、発光試薬と複合し、その結果、試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光が測定される。
【００３８】
この実施例では、ＡＴＰは、最初に、体細胞から放出されて測定され、存在する微生物細胞から放出されたＡＴＰが測定される。
【００３９】
本方法の別の好適な実施例では、微生物抽出溶媒は、微生物ＡＴＰを放出するために発光試薬の添加後に試料に添加される。放出された微生物ＡＴＰは、発光試薬とＡＴＰ複合体を形成し、その結果、試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光が測定される。
【００４０】
製品中のフリーＡＴＰの量を上で説明されるように決定した後に、微生物抽出溶媒がすぐに、試料中の微生物細胞を破損および／または破裂させるのに使用され得る。これは微生物ＡＴＰの放出を引き起こし、それに続く発光を使用することによってＡＴＰ複合体の形態でＡＴＰを測定することができる。このように微生物ＡＴＰの存在を決定することができる。
【００４１】
本発明は、更に、体細胞と微生物細胞から選択された少なくとも１つの細胞に対して、時間の関数として発光に対する１つまたはそれ以上の参照値と比較し、時間の関数として測定された発光が参照値に対応するかどうかを決定し、参照値を有する細胞が試料中に存在する場合を決定する。
【００４２】
本発明は、また、試料中のＡＴＰを検出する方法を実行するためのコンピュータプログラムに関し、該コンピュータプログラムでは、ＡＴＰ複合体を形成するように抽出溶媒でどんな前処理も受けていない試料に発光試薬を添加し、その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定してフリーＡＴＰの発光に対する測定値を得て、測定されたフリーＡＴＰの値を基準値と比較し、前記フリーＡＴＰに対する測定値が前記基準値より高い場合、ＡＴＰが高濃度で存在することを決定する。「高濃度」とは、いわゆる汚染されていないブランク試料中に既に存在するものより大きいＡＴＰ量であることが理解される。その結果、ＡＴＰが高濃度で存在する場合、このことは、体細胞および／または微生物細胞の存在を暗に意味する。
【００４３】
基準値は、ブランクおよび汚染していない試料の発光値である。この基準値は、上で既に示されたように決定することができる。基準値とほぼ同じフリーＡＴＰの測定値が得られる場合、試料は高濃度のフリーＡＴＰを含んでいない。このような場合に試料は「フリーＡＴＰで汚染されない」と評価される。基準値より高いフリーＡＴＰの測定値が得られる場合、試料は、「汚染（されている）可能性がある」と評価される。
【００４４】
コンピュータプログラムの好適実施例では、前記発光試薬の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に体細胞抽出溶媒を添加し、その結果、前記試料に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定して体細胞ＡＴＰに対する測定値を得て、測定された体細胞ＡＴＰの発光の測定値は、上で説明されるように、フリーＡＴＰに対して得られる測定値と比較され、体細胞ＡＴＰの測定値がフリーＡＴＰの測定値より高い場合に、体細胞ＡＴＰが存在することを決定する。
【００４５】
体細胞ＡＴＰの測定値がフリーＡＴＰの値とほぼ同じ場合、試料は体細胞ＡＴＰを含まない。このような場合には、試料は「体細胞で汚染されない」として評価される。体細胞ＡＴＰの測定値がフリーＡＴＰの測定値より高い場合、試料は「体細胞で汚染されている」として評価される。このことは問題となる必要はない、なぜなら、体細胞は、ある場合、例えば、果汁の場合不可欠なものであるからである。
【００４６】
コンピュータプログラムの更なる実施例では、前記体細胞抽出溶媒の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に微生物抽出溶媒を添加し、その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定して微生物ＡＴＰの発光に対する測定値を得て、測定された微生物ＡＴＰの値は体細胞ＡＴＰの測定値と比較し、前記微生物ＡＴＰの測定値が前記体細胞ＡＴＰの測定値より高い場合に、微生物ＡＴＰが存在することを決定する。
【００４７】
コンピュータプログラムのさらに別の実施例では、前記発光試薬の添加後に、ＡＴＰ複合体を形成するために前記試料に微生物の抽出溶媒を添加し、その結果、前記試料中に形成されたＡＴＰ複合体の発光をルミノメータを使用して測定して微生物ＡＴＰの発光に対する測定値を得て、前記微生物ＡＴＰの測定値を上で説明されたようにフリーＡＴＰの測定値と比較し、前記微生物ＡＴＰの測定値がフリーＡＴＰの測定値より高い場合に、微生物ＡＴＰが存在することを決定する。
【００４８】
微生物ＡＴＰの測定値がフリーＡＴＰおよび／または、体細胞ＡＴＰの測定値とほぼ同じ場合、使用する方法に依存して、試料中に微生物ＡＴＰは存在しない。このような場合には、試料は「微生物細胞で汚染されていない」として評価する。微生物ＡＴＰの測定値がフリーＡＴＰまたは体細胞ＡＴＰの測定値より高い場合、使用する方法に依存して、試料は「微生物細胞で汚染されている」として評価する。このことは問題である必要はない、なぜなら微生物細胞は、例えばワイン中の酵母のようないくつかの場合に不可欠であるからである。そのような場合、以下で説明されるように、異なる種類の細菌と酵母の発光測定に対する多くの基準カーブを使用することによって、どんな種類の微生物細胞が存在するかを決定することができる。
【００４９】
本コンピュータプログラムのさらに別の実施例では、時間の関数としての発光を得るために、発光を少なくとも１０秒間、好ましくは、少なくとも２０秒間、特に好ましくは、少なくとも６０秒間、ほぼ絶え間なく測定し、測定したデータを、参照値、例えば、異なる種類の微生物細胞およびオプションの体細胞（ある種類の細菌、酵母および同等物）に対する時間の関数としての基準カーブと比較し、前記試料中に存在する微生物細胞およびオプションの体細胞の種類を決定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本出願は多くの限定されない実施例を参照して以下でさらに説明されるだろう。これらの実施例は、本願発明を説明することを意図する。各実施例１〜１１において、細菌、酵母またはそれらの混合物などのある種の微生物細胞を接種したミルクを試料として使用する。次に、汚染されたミルクは、本発明の方法にかけられる。発光測定の結果が図に示される。本発明の方法を使用することによって、どの程度までミルクが汚染されるかが示される。このように、未知の汚染物を含むミルク試料は、微生物汚染の存在の可能性を調べるために分析され得る。更に試料を実施例１２〜１３で試験する。
【００５１】
使用材料
実施例１〜１１の試験で、全ミルクは基質、特に、３.５％の固体脂含量を有するＵＨＴミルクとして使用される。実施例１２の試験では、化粧品試料、すなわち、ハンドローションを試験する。実施例１３で試験では、製剤試料、すなわち、アセチルサルチル酸（アスピリン）の水溶液を試験する。いわゆる、安定した光放出（ＡＴＰ発光に適した）を有するホタル発光酵素ルシフェラーゼ試薬を発光試薬として使用する。試薬は、ｐＨ７.７５のトリスＥＤＴＡ緩衝液中に含まれる。ｐＨ７.７５のトリスＥＤＴＡ緩衝液中に含まれるじゃがいもから得られるアピラーゼをアピラーゼ試薬として使用する。第四アンモニウム化合物と界面活性剤の混合水溶液を微生物の抽出溶媒として使用する。洗剤の混合水溶液物を体細胞として使用する。
【００５２】
各光子を計測するための低ノイズ光電子増倍管を有するコンピュータ制御されたルミノメータをルミノメータとして使用する（プロミコル製のPromiLite III）。注入ポンプは試料への試薬の供給を制御する。試料を９６個のマイクロタイタープレート中に入れ、各試料を分離されたウェルに入れる。
【００５３】
実施例１〜１１のそれぞれにおいて、表中で「ＮＥＧ」または陰性と呼ばれるブランク試料は、各試験で使用される。これは、この試料が微生物ＡＴＰを全く含まないことを意味し、接種されていない滅菌ミルクであり、したがって、微生物に汚染されていないものである。このブランクは試料は、３２℃で２４時間、ミルク（１リットル紙パック）の未開封パックを培養することによって得られる。ブランク試料に加えて、各実施例で１つまたはそれ以上の種類の細菌、酵母および／または、それらの混合物を接種した１つまたはそれ以上の汚染された試料を使用する。それらは、図中で、それぞれ「POS-BAC（細菌で汚染）」、「POS-YEAST（酵母で汚染）」および「POS-MIX（細菌と酵母で汚染）」と呼ばれる。図は、秒の時間の関数として相対的な発光単位で示している。測定は、実施例で２０秒間あるいは６０秒間行った。実施例１２〜１３の測定は図に示さない。
【００５４】
実施例１
「POS-BAC（細菌で汚染）」の調製
バクテリウム・バチルス・サブチルスの培養物は、蘇生媒質中で調製し、３２℃で２４時間培養した。次に、培養物５０μｌを２０ｍｌのミルクに加えて、３２℃で２４時間培養した。そのような試料を抽出溶媒で前処理されていない試料として見なす。
【００５５】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-BAC（細菌で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移し、以下の連続工程による発光測定にかける。
【００５６】
・注入ポンプ１に発光試薬を有するホルダを接続する
・注入ポンプ２に微生物の抽出溶媒を有するホルダを接続する
・５０μｌの発光試薬を注入する
・２.０５秒の猶予
・０.４秒の計測間隔で時間t＝０で計測開始
・ｔ＝５秒ですべてのウェルに５０μｌの微生物の抽出溶媒を注入
・ｔ＝２０秒で計測終了
得られた結果を図１に示す。図１では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を細菌で汚染されたミルク（「POS-BAC」（細菌で汚染））の測定結果と比較する。
【００５７】
図１のｔ＝０秒からｔ＝５秒までの時間間隔において、「POS-BAC（細菌で汚染）」の値が「NEG（陰性）」の値より少し高く、このことは、細菌で汚染されたミルクがある量のフリーＡＴＰを含むことを意味し、既に死んだ微生物細胞の存在を暗に意味し、このことは、このゆえにミルクの可能な汚染に対するある種の警告として機能すると推論することができる。存在する微生物細胞を破壊して、存在する微生物ＡＴＰを放出させる微生物の抽出溶媒は、時間ｔ＝５秒で添加する。図からいくつかの微生物細胞が１秒（時間ｔ＝６秒）後に既にＡＴＰを放出したと推論することができる。微生物ＡＴＰの放出工程は、時間ｔ＝１０秒まで続く。この後で、発光は一定となり、すべての微生物ＡＴＰが放出されたことを示す。
【００５８】
図１から本発明の方法がミルク中の細菌汚染の存在を決定するのに使用することができると推論することができる。
【００５９】
実施例２
「POS-YEAST（酵母で汚染）」の調製
果汁の自然の汚染物としてたえず見られる野生酵母種の培養物は、蘇生媒質中で調製し、２６℃で２４時間培養した。次に、培養物５０μｌを２０ｍｌのミルクに添加し、再び２６℃で２４時間培養した。このような試料を抽出溶媒で前処理されていない試料と見なす。この実施例は、酵母を細菌の代わりに使用する点で実施例１と異なる。
【００６０】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移し、実施例１に記載と同様の連続工程による発光測定にかける。
【００６１】
得られた結果を図２に示す。図２では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-YEAST（酵母で汚染）」）の測定結果と比較する。
【００６２】
図２のｔ＝０秒からｔ＝５秒までの時間間隔において、「POS-YEAST（酵母で汚染）」の値が「NEG（陰性）」の値より少し高い、このことは、酵母で汚染されたミルクがある量のフリーＡＴＰを含むことを意味し、既に死んだ微生物細胞の存在を暗に意味し、このことは、このゆえにミルクの可能な汚染に対する警告として機能すると推論することができる。存在する微生物細胞を破壊して、存在する微生物ＡＴＰを放出させる微生物の抽出溶媒を時間ｔ＝５秒で添加する。図から微生物の抽出溶媒添加後に直ちに発光の減少が起きると推論することができる。この減少は２つの因子に起因しており、第１の因子は微生物の抽出溶媒の添加に続いて起こる希釈効果であり、第２の因子はいわゆるクエンチング（停止）効果である。また、いくつかの微生物細胞は、約５秒（時間ｔ＝１０秒）後にのみ微生物ＡＴＰを放出し、細菌（実施例１参照）の場合より遅いことが明白である。微生物ＡＴＰの放出工程は、分析（ｔ＝２０秒）の終わりまで続く。
【００６３】
図２から本発明の方法がミルク中に酵母による汚染の存在を決定するのに使用することができることを明瞭に推論することができる。
【００６４】
実施例３
「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」の調製:
実施例１で調製された「POS-BAC（細菌で汚染）」と実施例２で調製した「POS-YEAST（酵母で汚染）」の混合物を、微生物の汚染物の両方の種の微生物ＡＴＰの見積量が同じ大きさのオーダ（細菌：酵母＝１：３０）となるように調製した。このような試料を抽出溶媒によって前処理されていない試料と見なす。実施例３は、細菌と酵母の組み合わせを使用する点で実施例１および実施例２と異なる。
【００６５】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移し、実施例１に記載と同様の連続工程による発光測定にかける。
【００６６】
得られた結果を図３に示す。図３では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を細菌と酵母で汚染されたミルク（「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」）の測定結果と比較する。
【００６７】
図３のｔ＝０秒からｔ＝５秒までの時間間隔において、「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」の値が「NEG（陰性）」の値より少し高い、このことは、細菌と酵母で汚染されたミルクがある量のフリーＡＴＰを含むことを意味し、既に死んだ微生物細胞の存在を暗に意味し、このことは、このゆえにミルクの可能な汚染に対する警告として機能すると推論することができる。存在する微生物細胞を破壊して、存在する微生物ＡＴＰを放出させる微生物の抽出溶媒を時間ｔ＝５秒で添加する。実施例２で記載されたように、図から微生物の抽出溶媒添加後に直ちに発光の減少が起こると推論することができる。いくつかの微生物細胞は、約１秒（時間ｔ＝６秒）後に、既にそれらのＡＴＰを放出している。この微生物ＡＴＰの放出工程は、時間ｔ＝１０秒まで続く。
【００６８】
図３から本発明の方法がミルク中に細菌と酵母の両方による汚染の存在を決定するために使用することができることを明瞭に推論することができる。
【００６９】
実施例１、２、３の図の差を示すために、図４Ａと４Ｂで一緒に示す。図４Ｂは図４Ａの拡大図である。図は、細菌と酵母で汚染されたミルクの結果に根本的な相違があることを示している。細菌で汚染されたミルクは、微生物の抽出溶媒の添加後に急速に発光が増加し、急速に発光値が一定となる高い発光値によって特徴付けられる発光プロフィールを示しているが、酵母で汚染されたミルクは、微生物の抽出溶媒の添加後に発光が遅く増加し、２０秒の時間間隔で一定の発光値とならず、低い発光値を有する発光プロフィールを有する。
【００７０】
この比較は、本方法が微生物汚染の存在を証明をするばかりでなく、どんな種類の（酵母、細菌または組み合わせ）が存在するかを決定するのに適切であることを明確に示している。
【００７１】
実施例４
「POS-BAC（細菌で汚染）」の調製：
バクテリウム・バチルス・セレウス（ＡＴＣＣ１１７７８）の培養物は、蘇生媒質中で調製し、３２℃で２４時間培養した。次に、培養物５０μｌを２０ｍｌのミルクに加えて、再び３２℃で２４時間培養した。そのような試料を抽出溶媒によって前処理されていない試料と見なす。実施例１との差は、異なる種類の細菌を使用したことである。
【００７２】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-BAC（細菌で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移し、以下の連続工程による発光測定にかける。
【００７３】
・注入ポンプ１に発光試薬を有するホルダを接続する
・注入ポンプ２に微生物の抽出溶媒を有するホルダを接続する
・５０μｌの発光試薬を注入する
・２.０５秒の猶予
・１．２秒の計測間隔で時間t＝０で計測開始
・ｔ＝５秒ですべてのウェルに５０μｌの微生物の抽出溶媒を注入
・ｔ＝６０秒で計測終了
得られた結果を図５に示す。図５では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を細菌で汚染されたミルク（「POS-BAC」（細菌で汚染））の測定結果と比較する。
【００７４】
実施例５
「POS-BAC（細菌で汚染）（アピラーゼ処理）」：
実施例４で記載されたような「POS-BAC（細菌で汚染）」ミルクを調製する。
【００７５】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-BAC（細菌で汚染）（アピラーゼ処理）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移す。５０μｌのアピラーゼを各ウェルに加えて１５分間培養する。それに続いて試料を実施例４で記載されのと同じ連続工程による発光測定にかける。
【００７６】
得られた結果を図５に示す。図５では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を細菌で汚染されたミルク（「POS-BAC」（細菌で汚染）（アピラーゼ処理））の測定結果と比較しする。
【００７７】
図５の「POS-BAC（細菌で汚染）」カーブ（実施例４）から、ｔ＝６秒からｔ＝１０秒までの時間間隔における発光の急速増加の後に、発光はしばらく（最大ｔ＝２０秒）一定となり、その後、発光の減少が観測されると推論することができる。この減少が何に起因しているか不明であるが、本発明者は、微生物ＡＴＰと発光試薬の間で形成された複合体に何らかの分解が起こるという意見である。
【００７８】
図５の「POS-BAC（細菌で汚染）（アピラーゼ処理）」カーブ（実施例５）からｔ＝６秒からｔ＝１０秒までの時間間隔での発光の比較的急速な増加の後に、その発光値が「POS-BAC（細菌で汚染）」の発光値より低いと推論することができる。このことは実施例５によるアピラーゼ処理が低い値に導くことを意味する。ここで、アピラーゼ処理は、アピラーゼの存在によって放出された微生物ＡＴＰの分解を引き起こす。さらに、発光は、一定値に達しないで、アピラーゼ処理を受けていない実施例４の「POS-BAC（細菌で汚染）」よりも急速に減少する。したがって、このことは、少なくとも本発明により、アピラーゼの欠点を一部解決することができることを示している。本実施例では、アピラーゼ処理は、低い発光をもたらすが、少量の微生物細胞だけが存在する場合において、アピラーゼ処理は「間違った」陰性の結果に導くことが明確である。
【００７９】
したがって、図５から本発明の方法が少なくとも現在の技術水準のアピラーゼ処理に含まれる問題の一部を解決することを明確に推論することができる。
【００８０】
実施例６
「POS-YEAST（酵母で汚染）」の調製：
実施例２で記載されたように「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルクを調製する。
【００８１】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移し、実施例４の記載と同様の連続工程による発光測定にかける。
【００８２】
得られた結果は、図６に示す。図６では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-YEAST（酵母で汚染）」）の測定結果と比較する。
【００８３】
実施例７
「POS-YEAST（酵母で汚染）（アピラーゼ処理）」：
実施例４で記載されたような「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルクを調製する。
【００８４】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-YEAST（酵母で汚染）（アピラーゼ処理）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移す。５０μｌのアピラーゼを各ウェルに加えて１５分間培養する。それに続いて試料を実施例４に記載と同じ連続工程による発光測定にかける。
【００８５】
得られた結果は、図６に示され、図６では、ブランク測定（「NEG（陰性）」）の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-YEAST（酵母で汚染）（アピラーゼ処理）」）の測定結果と比較する。
【００８６】
図６の「POS-YEAST（酵母で汚染）」カーブ（実施例６）から、発光の遅い増加が観測され、その増加は、ｔ＝６０秒の計測の終わりまで続くと推論することができる。
【００８７】
図６の「POS-YEAST（酵母で汚染）（アピラーゼ処理）」カーブ（実施例７）から、実施例６の「POS-YEAST（酵母で汚染）」カーブに対してわずかな違いがあることを推論することができる。最大発光値はアピラーゼ処理の場合でわずかに低く、カーブ形状はわずかに異なっている。
【００８８】
実施例８
「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」の調製：
実施例４で調製した「POS-BAC（細菌で汚染）」ミルクと実施例６で調製した「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルクの混合物を、両方の種類の微生物汚染の微生物ＡＴＰの推定量が同じ大きさのオーダー（細菌：酵母＝１:１０）となるように調製した。
【００８９】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移し、実施例４に記載と同様の連続工程による発光測定にかける。
【００９０】
得られた結果を図７に示す。図７では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を酵母と細菌で汚染されたミルク（POS-MIX（酵母と細菌で汚染））の測定結果と比較する。
【００９１】
実施例９
「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）（アピラーゼ処理）」の調製:
実施例６で記載されたように「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」ミルクを調製した。
【００９２】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）（アピラーゼ処理）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移す。５０μｌのアピラーゼを各ウェルに加えて１５分間培養する。試料を実施例４に記載されたのと同様の連続工程による発光測定にかける。
【００９３】
得られた結果を図７に示す。図７では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を細菌と酵母で汚染されたミルク（「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」（アピラーゼ処理））の測定結果と比較する。
【００９４】
図７の「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」カーブ（実施例８）からｔ＝６秒からｔ＝１０秒までの時間間隔での発光の急激な増加後に、発光はある時間（最大ｔ＝３０）一定となり、その後発光の更なる増加がｔ＝６０秒まで観測されることを推論することができる。この更なる増加は、存在する酵母細胞の破壊とそこらからの微生物ＡＴＰの放出に起因している。
【００９５】
図７の「POS-MIX（アピラーゼ処理）」カーブ（実施例９）から、発光値がｔ＝６秒からｔ＝１０秒までの時間間隔で比較的速く増加した後の発光値は「POS-MIX（酵母と細菌で汚染）」の発光値より低いと推論することができる。さらに、発光の減少が観測され、それに続いてわずかに一時的に増加する。この減少は、アピラーゼによる存在するＡＴＰの分解に起因し、この増加は、上で記載されたように酵母細胞の破壊に起因している。この増加と減少とは互いに相殺され、その結果、試料中の酵母の存在に対する間違った陰性の結果をもたらす、このことは実施例８に基づく方法では得られない。
【００９６】
上記のことは、実施例９によるアピラーゼを用いる処理がアピラーゼの存在によって放出された微生物ＡＴＰの分解を引き起こして低い値を得ることを示す。したがって、これは、少なくとも本発明によってアピラーゼの欠点が一部解決できることを示している。
【００９７】
図８Ａと８Ｂは、実施例４〜９の図の差違を示すために一緒にまとめた図として示している。図８Ｂは図８Ａの拡大図であり、図４Ａと４Ｂに対して上記議論した比較から細菌と酵母で汚染されたミルクの結果の間に根本的な相違があることを示している。この比較は、本方法が微生物汚染の存在を証明をするばかりでなく、どんな種類の酵母、細菌または両方が存在するかを決定するのに適切であることを明確に示している。
【００９８】
実施例１０
「POS-YEAST（酵母で汚染）」の調製：
実施例２で記載されたような培養物を調製する。次に、５０μｌの培養物を２０ｍｌのバニラレモンの味つけされたミルクに加え、再び２６℃で２４時間培養する。前の実施例に対する違いは、この試料が体細胞を含んでいることである。
【００９９】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルク５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移して、次の連続工程による発光測定にかける。
・注入ポンプ１に発光試薬を有するホルダを接続する
・注入ポンプ２に微生物の抽出溶媒を有するホルダを接続する
・５０μｌの発光試薬を注入する
・２.０５秒の猶予
・０.５６秒の計測間隔で時間t＝０で計測開始
・ｔ＝３秒ですべてのウェルに５０μｌの体細胞を注入
・ｔ＝８秒ですべてのウェルに５０μｌの微生物の抽出溶媒を注入
・ｔ＝２８秒で計測終了
【０１００】
得られた結果を図９に示す。図９では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-YEAST（酵母で汚染）」）の計測結果と比較する。
【０１０１】
図９のｔ＝０秒からｔ＝５秒までの時間間隔において、「POS-YEAST（酵母で汚染）」の値は、「NEG（陰性）」の値より少し高い、このことは、酵母で汚染されたミルクがある量のフリーＡＴＰを含むことを意味し、既に死んだ酵母細胞の存在を暗に意味し、このことは、このゆえにミルクの可能な汚染に対する警告として機能すると推論することができる。また、「NEG（陰性）」ミルクが、フリーＡＴＰ、野菜細胞（バニラ−レモン味つけ）からの多分体細胞ＡＴＰの存在を示すある量のＡＴＰを含むことが理解される。存在する体細胞を破壊して、存在するＡＴＰを放出させるようにする体細胞抽出溶媒を時間ｔ＝３秒で加える。図から発光の増加が「NEG（陰性）」ミルクと「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルクの両方で、体細胞の添加直後に起こり、バニラ−レモン味つけ由来の両方の試料が体細胞を含むことを暗に示すことを推論することができる。存在する微生物細胞を破壊し、存在するＡＴＰの放出を引き起こす微生物の抽出溶媒は、時間ｔ＝８秒で加えられる。図から、実施例２で既に説明したように、発光の減少が微生物の抽出溶媒の添加直後に起こると推論することができる。この初期の減少は、「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルクの場合に発光の遅い増加を伴うが、「NEG（陰性）」ミルクの場合には発光の遅い増加を伴わず、このことは、「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルクが微生物汚染を含んでいて、「NEG（陰性）」ミルクが微生物汚染を全く含まないことを示している。「POS-YEAST（酵母で汚染）」ミルク中の微生物ＡＴＰの放出工程が、分析の終わり（ｔ＝２８秒）まで続く。
【０１０２】
図９から本発明の方法が１つの測定工程でミルク中の体細胞汚染と微生物汚染の両方の存在を決定するために使用することができると明瞭に推論することができるが、このことは、現在の技術水準の方法では不可能であると今まで考えられていた。
【０１０３】
実施例１１
上記説明されたように、本方法は異なる種類の酵母と細菌を特定するのに非常に適切である。この実施例では、酵母と３つのグラム陽性細菌を本方法に基づいて互いに識別できるかどうかを評価するために互いに比較する。
【０１０４】
使用する微生物細胞は、カンジダ・アルビカンス（酵母：ＡＴＣＣ１０２３１）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（グラム陽性細菌：ＡＴＣＣ７９５３）、クロストリジウム・スポロゲネス（グラム陽性細菌：ＡＴＣＣ１９４０４）、バチルス・セレウス（グラム陽性細菌：ＡＴＣＣ１１７７８）である。
【０１０５】
「C. albicans(カンジダ・アルビカンス)」の調製:
トリプシンの大豆寒天−寒天プレート上の酵母カンジダ・アルビカンスのコロニーを９ｍｌの蘇生媒質中に導入し、２２〜２５℃で２４時間培養した。
【０１０６】
「G. stearothermophilus(ジオバチルス・ステアロサーモフィラス)」の調製:
トリプシンの大豆寒天−寒天プレート上のバクテリウム・ジオバチルス・ステアロサーモフィラスのコロニーを９ｍｌの蘇生媒質中に導入して、５５℃で２４時間培養した。
【０１０７】
「C. Sporogenes (クロストリジウム・スポロジェン)」の調製：
血液寒天−寒天プレート上のバクテリウム・クロストリジウム・スポロゲネスのコロニーを９ｍｌの液体チオグリコール酸塩媒質中に導入して、３５℃で２４時間培養した。
【０１０８】
「B.cereus(バクテリウム・バチルス・セレウス)」の調製:
トリプシン大豆寒天−寒天プレート上のバクテリウム・バチルス・セレウスのコロニーを９ｍｌの蘇生媒質中に導入して、３５℃で２４時間培養した。
【０１０９】
「NEG（陰性）」の調製:
蘇生媒質を３５℃で２４時間培養した。
【０１１０】
計測
「NEG（陰性）」ミルク５０μｌと、「C. albicans(カンジダ・アルビカンス)」、「G. stearothermophilus(ジオバチルス・ステアロサーモフィラス)」、「C. Sporogenes (クロストリジウム・スポロジェン)」、「B.cereus(バクテリウム・バチルス・セレウス)」の各５０μｌをピペットでマイクロタイタープレートに移して、実施例４で記載された連続工程による発光測定にかける。
【０１１１】
得られた結果は、図１０Ａと１０Ｂに示す。図では、ブランク測定（「NEG（陰性）」の結果を各種細菌を有する汚染された試料の計測結果と比較する。図１０Ｂは図１０Ａの拡大図である。
【０１１２】
図１０Ｂのｔ＝０秒からｔ＝５秒までの時間間隔において、「B.cereus(バクテリウム・バチルス・セレウス)」と「C. Sporogenes (クロストリジウム・スポロジェン)」の値は、「NEG（ブランク計測）」の値より少し高い、このことは、細菌で汚染された試料が、ある量のフリーＡＴＰを含むことを意味し、既に死んだ細菌細胞の存在を暗に意味し、このことは、このゆえに試料の可能な汚染に対する警告として機能すると推論することができる。存在する微生物細胞を破壊して、存在するＡＴＰを放出させるようにする微生物の抽出溶媒を時間ｔ＝５秒で添加する。図１OＡと１０Ｂからいくつかの微生物細胞が既に１秒（時間ｔ＝６秒）後に微生物ＡＴＰを放出したと推論することができる。また、カーブの傾斜によって示されるように、異なる微生物細胞の放出速度が異なることを理解することができる。図１０Ｂは、酵母「C. albicans(カンジダ・アルビカンス)」が、実施例１と２で上記説明されたすべての試験された細菌より小さな傾斜を有することを明確に示している。また、「B.cereus(バクテリウム・バチルス・セレウス)」のカーブの傾斜が「G. stearothermophilus(ジオバチルス・ステアロサーモフィラス)」のカーブの傾斜よりも大きいことが理解できる。微生物ＡＴＰの放出工程は、「G. stearothermophilus(ジオバチルス・ステアロサーモフィラス)」の場合、ほぼｔ＝９秒まで続き、「B.cereus(バクテリウム・バチルス・セレウス)」の場合、ほぼｔ＝１０秒まで続き、「C. Sporogenes (クロストリジウム・スポロジェン)」の場合、ほぼｔ＝１７秒まで続き、「C. albicans(カンジダ・アルビカンス)」の場合にｔ＝４３秒まで続く。また、異なる微生物細胞のカーブの形状は異なる。
【０１１３】
したがって、関心のある微生物細胞の種類をカーブの傾斜、放出過程の持続時間、およびカーブの形状から推論することができる。未知の汚染を有する試料が測定される場合、図１０Ａと１０Ｂで示されたカーブに基づいてどの微生物細胞を含んでいるかを決定することができる。
【０１１４】
本発明の方法を用いると、異なる種類の微生物細胞の速くて正確な計測を行って、それらを、例えば、細菌、酵母、および真菌類に識別することができるし、また、異なる種類の細菌と酵母の間の識別、例えば、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の間の識別、異なるグラム陽性細菌の間の識別をすることができる。また、本発明の方法を用いると、単一試料で製品中のフリー抽出溶媒の量に加えて体細胞ＡＴＰの量と微生物ＡＴＰの量を識別することが可能である。
【０１１５】
実施例１２
ハンドローションを水中で懸濁し、実施例１で説明されたような測定を実行し、また、「POS-BAC（細菌で汚染）」試料が２０ｍｌのけん濁液を用いて実施例１の５０μｌの培養物に添加して調製した。それに続いて、「NEG（陰性）」試料と「POS-BAC（細菌で汚染）」試料を測定した。結果（図示せず）から、細菌での汚染を明確に証明することができることがわかった。
【０１１６】
実施例１３
実施例１２が繰り返され、けん濁液が５ｗｔ％のアセチルサリチル酸水溶液で置換された。結果（図示せず）から、細菌の汚染を明確に証明することができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ブランク測定（「NEG」）の結果を細菌で汚染されたミルク（「POS-BAC」）の測定結果と比較した図である。
【図２】ブランク測定（「NEG」）の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-yeast」）の測定結果と比較した図である。
【図３】ブランク測定（「NEG」）の結果を細菌と酵母で汚染されたミルク（「POS-MIX」）の測定結果と比較した図である。
【図４Ａ】図１〜３の違いを示した図である。
【図４Ｂ】図４Ａの拡大図である。
【図５】ブランク測定（「NEG」）の結果を細菌で汚染されたミルク（「POS-BAC」）の測定結果と比較した図である。
【図６】ブランク測定（「NEG」）の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-yeast」）の測定結果と比較した図である。
【図７】ブランク測定（「NEG」）の結果を細菌と酵母で汚染されたミルク（「POS-MIX」）の測定結果と比較した図である。
【図８Ａ】図５〜７の違いを示した図である。
【図８Ｂ】図８Ａの拡大図である。
【図９】ブランク測定（「NEG」）の結果を酵母で汚染されたミルク（「POS-yeast」）の測定結果と比較した図である。
【図１０Ａ】ブランク測定（「NEG」）の結果を色々な細菌で汚染された試料の測定結果と比較した図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの拡大図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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