(57)【要約】  本発明は、ＣＤ５２結合性のヒト化抗体、即ち、カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）、の定量に特異的な新規なイムノアッセイの設計に関する。この方法は、薬物動態学的研究およびモニタリングに使用することができる。本発明は、従来から使用されている方法よりも特異性と感受性を高めるための改善点を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中に存在する、ＣＤ５２細胞膜受容体結合性のヒト化抗体カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）をアッセイするための競合アッセイ方法であって、
（ａ）抗体の存在を分析するための試験試料を提供し、
（ｂ）ＣＤ５２受容体含有細胞またはＣＤ５２受容体含有細胞膜調製物をフィルタープレートメンブランに結合し、
（ｃ）検出可能な標識で標識した検出用抗体と試験試料を該フィルタープレートメンブランと接触させて、フィルタープレートメンブラン上の細胞膜受容体との結合に対して、試験試料中の抗体と標識した抗体とを競合させ、
（ｄ）未結合の試薬がフィルタープレートメンブランを通過するように除去し、そして
（ｅ）標識した抗体の存在を検出し、標準検量曲線を参照してカンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）を定量する
ことを包含する方法。
【請求項２】
標識した抗体が、蛍光標識を付したカンパス−１Ｈであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識した抗体が、Ｅｕ標識カンパス−１Ｈであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物試料が血清試料、血漿試料、全血試料、脊髄液試料または滑液試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの方法を使用した、薬物動態学的研究またはモニタリング。
【請求項６】
ＣＤ５２細胞膜受容体結合性のヒト化抗体カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）をアッセイするための試験キットであって、適切な容器に入った以下の成分を包含する試験キット。
−検出用抗体であるカンパス−１Ｈに結合した、検出可能な標識、
−フィルタープレートメンブラン、および
−（凍結乾燥または凍結した）細胞または細胞膜。
【請求項７】
Ｅｕ標識カンパス−１を包含することを特徴とする、請求項６に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化抗体、即ち、カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）、の定量に特異的な新規なイムノアッセイの設計、および新規アッセイの、例えば、薬物動態学的研究およびモニタリングにおける使用に関する。イムノアッセイによる測定に適した生物試料は生体液、例えば、血清試料である。本発明は、従来から使用されている方法よりも特異性と感受性を高めるための改善点を開示する。
【背景技術】
【０００２】
カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）とは、細胞膜に提示されたＣＤ５２分子との結合に特異的なヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧｌ）である。ＣＤ５２抗原は、リンパ球といくつかの他の種類の細胞が多量に発現する脂質アンカー型糖タンパク質である。成熟抗原はわずか１２個のアミノ酸からなるタンパク質成分を含有する。カンパス−１Ｈの認識する抗原エピトープは、Ｃ末端のいくつかのアミノ酸と脂質アンカーの一部を含んでおり、この構造ゆえに、カンパス−１Ｈの解析は難しい。従って、カンパス−１Ｈとの高親和性結合には完全な細胞膜受容体が必要である。更に、一般的に使用されている二次抗生物種抗体試薬は、生物試料中の余分な非特異的ヒト抗体と交差反応するため、選択性に乏しく、可変率が高い。
【０００３】
カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）は、補体仲介細胞毒性および抗体依存性細胞仲介細胞毒性によって、正常および悪性リンパ球の融解を引き起こす。カンパス−１Ｈは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療や、移植のための免疫抑制剤や、更には自己免疫疾患の治療のために開発された。
【０００４】
カンパス−１Ｈのアッセイに関する出版物はわずかであり、それらは細胞に基づく蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析法［Rebello and Hale, J Imm Meth 2002, 260; 285-302］、または最近になって報告された酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）[Jilani et al., Leukemia Res 2004, 28; 1255-62］であり、いずれのアッセイ法も、薬物動態学的研究またはモニタリングに必要な選択率と感受性を満たすものではない。Rebello and HaleおよびJilani et al.の報告にあるＬＬＯＱ（定量下限値）はそれぞれ０．５μｇ／ｍｌと０．２５μｇ／ｍｌだった。更に、選択率と感受性が不十分である点に加え、ＦＡＣＳ解析は手間と時間がかかり、Jilani et al.の方法は、追試が成功していない。
【０００５】
発明の概要と好ましい態様 
我々は、標識抗体および市販のフィルタープレートを用いる競合アッセイフォーマットの使用に基づいて、ヒト試料中のヒト化抗体であるカンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）の高感度および特異的な検出を可能にする新規な競合アッセイを設計し、そのバリデーションを実施した。
【０００６】
従って、本発明の目的の１つは、生物試料中に存在する、ＣＤ５２細胞膜受容体結合性のヒト化抗体カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）をアッセイするための競合アッセイ方法であって、
（ａ）抗体の存在を分析するための試験試料を提供し、
（ｂ）ＣＤ５２受容体含有細胞またはＣＤ５２受容体含有細胞膜調製物をフィルタープレートメンブランに結合し、
（ｃ）検出可能な標識で標識した検出用抗体（カンパス−１Ｈ）と試験試料を該フィルタープレートメンブランと接触させて、フィルタープレートメンブラン上の細胞膜受容体との結合に対して、試験試料中の抗体と標識した抗体とを競合させ、
（ｄ）未結合の試薬がフィルタープレートメンブランを通過するように除去し、そして
（ｅ）標識した抗体の存在を検出し、標準検量曲線を参照して検出用抗体を定量する
ことを包含する方法である。
【０００７】
本発明の好ましい競合アッセイは、蛍光標識、好ましくはＥｕ標識、で標識したカンパス−１Ｈに基づくものである。
【０００８】
本発明の更なる目的は、カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）をアッセイするための試験キットであって、適切な容器に入った以下の成分を包含する試験キットである。
−検出用抗体であるカンパス−１Ｈに結合した、検出可能な標識、
−フィルタープレートメンブラン、および
−ＣＤ５２受容体を含有する（凍結乾燥または凍結した）細胞または細胞膜。
所望により、試験キットは試験に必要な適切なバッファーを更に包含してもよい。
【０００９】
好ましくは、試験キットはＥｕ標識カンパス−１Ｈを包含する。本発明の方法および試験キットに使用するフィルタープレートメンブランとしては、例えば、市販のアクロウェル９６フィルタープレート（Pall Life Sciences）が挙げられる。
【００１０】
以下、添付の図面に参照しながら本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
発明の詳細な説明 
本発明の方法でアッセイする抗体はカンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）である。しかし、細胞膜受容体に結合する全ての動物抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体をそれに対応する方法でアッセイすることができる。このような抗体としては、例えば、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（マイロターグ）およびリツキシマブ（リツキサン／マブセラ）が挙げられ、これらに対応する細胞膜受容体はＣＤ３３とＣＤ２０である。本発明の方法でアッセイすることのできる他のモノクローナル抗体としては、アブシキシマブ（レオプロ／セントリクス）、バシリキシマブ（シムレクト）、ベバシズマブ（アバスチン）、セツキシマブ（アービタックス）、ダクリズマブ（ゼナパックス）、エファリズマブ（ラプティバ）、インフリキシマブ（レミケード／アバカイン）、リンツズマブ（ザミル）、ナタリズマブ（タイサブリ）、オマリズマブ（ゾレア）、パリビズマブ（シナギス）、パニツムマブ（ベクチビックス）、トシツモマブ（ベキサール）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、および他のキメラモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１２】
分析する生体液は、例えば、血清試料、血漿試料、全血試料、脊髄液試料または滑液試料であり、血清試料が好ましい。
【００１３】
本発明の競合アッセイ方法においては、細胞または細胞膜調製物をフィルタープレートメンブランに結合する。必要な細胞膜受容体ＣＤ５２を発現する細胞株およびその細胞培養用培地は市販されているものを使用するか、当業者に周知の技術に基づいて調製することができる。細胞膜調製物は、当業者に周知の技術に基づいたホモジェナイゼーションとそれに続く遠心分離工程によって調製することができる。
【００１４】
適切なフィルタープレートメンブランは市販されており、一例としてPall Life Sciencesから入手可能なアクロウェル フィルタープレートメンブランが挙げられる。
【００１５】
本発明の目的に適した検出可能な標識は、蛍光標識である。適切な場合には、代わりに、酵素標識や放射性標識、あるいは磁気粒子を使用することもできる。好ましい蛍光標識としては、一般的に使用される蛍光標識、例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）が挙げられる。抗体の標識は、例えば、未修飾のアミノ基を標識することで達成される。問題となる標識の検出に適した標識計測基を用いて標識を検出することができる。
【００１６】
検量標準曲線は、検出用抗体の検量用標準を作製し、シグナルを測定して得られたデータを標準曲線に（好ましくは適切な評価用ソフトウエアを用いて）あてはめることで作製する。
【００１７】
まとめると、我々は、生物試料（例えば血清）中の、受容体結合性抗体であるカンパス−１Ｈ（アレムツズマブ）を高感度且つ特異的に検出するための新規な技術概念を確立した。以下に示す、既に報告されているカンパス−１Ｈのアッセイ方法よりも定量下限値（ＬＬＯＱ）が１０倍超に改良された方法が、注意深く最適化したアッセイデザインにおいて優れた技術性能を発揮する試薬の使用によって達成された。カンパス−１Ｈアッセイの優れた特異性、特に豊富に存在する循環非特異的ヒト抗体との交差反応に関する特異性は、主として競合アッセイ法の採用（従って、２次抗ヒト抗体試薬の不使用）とフィルタープレートの使用によって達成することができた。
【００１８】
本発明の更なる態様においては、患者の薬物動態学的研究またはモニタリングが必要な場合に、本発明を患者由来の試料に適応することが最も有望な用途である。
【実施例】
【００１９】
１．  材料と方法 
1.1  抗体、細胞株、試薬および装置 
カンパス−１Ｈ（アレムツズマブ／マブカンパス、ドイツ国、Schering AG）の１０ｍｇ／ｍＬ点滴用溶液を薬局から入手した。ＣＤ５２受容体を発現するＴ−細胞リンパ球皮膚リンパ腫細胞株ＨｕＴ ７８（カタログ番号ＴＩＢ−１６１）および細胞培養用培地はＡＴＣＣ（米国、バージニア州、マナサス）から入手した。アクロウェル ９６フィルタープレート（製品番号５０２０）はPall Life Sciences (米国、ミシガン州、アン・アーバー）から入手した。Superdex ７５カラム、200 HR 10/30 FPLCカラムとＮＡＰ−５カラムは、Amersham Pharmacia Biotech（スウエーデン国、ウプサラ）から入手した。Victorマルチラベルカウンター、MultiCalc評価ソフトウエア、DELFIA Ｅｕ標識キット、LxR結合アッセイバッファー、LxR洗浄溶液と増強用溶液はPerkin-Elmer Life Sciences（フィンランド国、ツルク）製を使用した。マルチスクリーン真空洗浄マニフォールドはMillipore（米国、マサチューセッツ州、ビレリカ）から入手した。
【００２０】
1.2  カンパス−１ＨのＥｕ標識 
約２〜３Ｅｕ／カンパス−１Ｈになるように、カンパス−１ＨをＥｕ−キレートで標識した。簡単に説明すると、後から添加するＥｕ−キレートと反応しうるアミノ基を有するトリスバッファーを除去するために、カンパス−１Ｈ抗体溶液をＮＡＰ−５カラムに添加し、０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．８）で溶出した。抗体溶液をモル量で１２０倍過剰量のＮ１−Ｅｕ+3キレート（Ｎ1−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレントリアミンＮ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラ酢酸Ｅｕ）に添加し、４℃で一晩インキュベートした。Ｅｕ標識したカンパス−１Ｈと遊離Ｅｕ−キレートとの分離は、DELFIA Ｅｕ標識キットの取扱説明書に従い、Superdex 200 HR 10/30カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーとＴＳＡバッファー（ｐＨ７．８）による溶出で行った。
【００２１】
1.3  アッセイデザイン 
本発明においては、完全な細胞または細胞膜、Ｅｕ標識カンパス−１Ｈおよびフィルタープレートの使用に基づいて、ヒト血清中のカンパス−１Ｈを測定するための新規な競合アッセイを設計し、そのバリデーションを実施した。
【００２２】
1.4  アッセイのバリデーション 
1.4.1  選択率 
選択率は、健康な献血者と最小６人の個別の対照患者からなる血清プールを試験することで検討した。
【００２３】
1.4.2  精度と真度 
アッセイ内およびアッセイ間の精度と真度は、ヒト血清マトリクス内で作製した５種の異なる品質評価サンプル濃縮物について、２人の異なる研究員が数日間にわたって６回の繰り返し測定（各測定は２つの結果の平均値である）で解析する（従って、一人につき３回の解析を行う）ことにより評価した。
【００２４】
1.4.3  定量下限と定量上限 
精度が２５％未満、真度が７５〜１２５％の最低品質管理レベルを、定量下限（ＬＬＯＱ）とした。精度が２０％未満、真度が８０〜１２０％の最高品質管理レベルを、定量上限（ＵＬＯＱ）とした。
【００２５】
２  結果 
2.1  アッセイデザイン 
アッセイデザインの模式図を図１に示した。
【００２６】
2.1.1  細胞培養と細胞膜の調製 
ＣＤ５２受容体を発現するＴ−細胞リンパ球皮膚リンパ腫細胞株ＨｕＴ ７８は、溶液（イスコフの変性ダルベッコ培地＋２０％胎児ウシ血清）中で培養した。膜ストック溶液は氷冷ＴＭＥバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2と１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で調製し、ビーズミルホモジェナイザーでホモジェナイズした。核と壊れた細胞を、４℃、約２２０ｇで１０分の遠心分離で除去した。上清を再度、４℃、約４００００ｇで４５分の遠心分離に付した。最終的なペレットをＴＭＥバッファーに懸濁し、使用するまで−７０℃で保存した。
【００２７】
2.1.2  競合アッセイ
ＬｘＲ結合バッファーで希釈した全細胞または膜ストック調製物をフィルタープレートに添加し（５０μＬ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。次に、濃度範囲が０．００５〜３μｇ／ｍＬであるヒト血清を用いて作製した検量用標準試料、ヒト血清で作成した品質管理試料、および検討用試料（３０μＬ／ウェル）をそれぞれ２つずつのウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。最後に、ＬｘＲ結合バッファーで希釈したＥｕ標識カンパス−１Ｈ（２．５ｎｇ／ウェル／５０μＬ）を加え、４℃で一晩インキュベートした。ＬｘＲ洗浄バッファーを用いて、Millipore真空マニフォールドでプレートを６回洗浄し、次にDELFIA増強溶液（２００μＬ／ウェル）を加えた。蛍光（Ｅｕ）は、振とう下、室温で１５分のインキュベーションの後に測定した。標準値のあてはめと濃度データの作製には、MultiCalc評価ソフトウエアを用いた。３つのアッセイセットのための検量標準曲線を図２に示した。
【００２８】
2.2  アッセイのバリデーション 
2.2.1  選択率 
試験したヒト対照血清のプール（ｎ＝２）と６人の試験した個別の健常試料の全てにおいて、濃度はＬＬＯＱ（０．０２μｇ／ｍＬ）未満だった。
【００２９】
2.2.2  精度と真度 
ヒト血清濃度が０．０２、０．０３、０．０５、０．１および０．５μｇ／ｍＬである品質管理（ＱＣ）試料に対する本発明の方法のアッセイ内精度（ＣＶ）は、４．２〜２８．２％（表１）だった。ヒト血清濃度が０．０２、０．０３、０．０５、０．１および０．５μｇ／ｍＬである品質管理試料に対する本発明の方法のアッセイ内真度（ＡＣ）は、８８〜１１７％（表１）だった。
【００３０】
【表１】
2009529133.tif 000002
【００３１】
ヒト血清濃度が０．０２、０．０３、０．０５、０．１および０．５μｇ／ｍＬである品質管理（ＱＣ）試料に対する本発明の方法のアッセイ間精度（ＣＶ）は、７．１〜１８．１％（表２）だった。ヒト血清濃度が０．０２、０．０３、０．０５、０．１および０．５μｇ／ｍＬである品質管理試料に対する本発明の方法のアッセイ間真度（ＡＣ）は、１０２〜１０９％（表２）だった。
【００３２】
【表２】
2009529133.tif 000003
【００３３】
2.2.2.1  定量下限と定量上限 
最低品質管理濃度の精度を２５％未満、真度を７５〜１２５％とした、表２に示したアッセイ間品質管理データに基づいて決定した定量下限（ＬＬＯＱ）は、０．０２μｇ／ｍＬだった。
【００３４】
最高品質管理濃度の精度を２０％未満、真度を８０〜１２０％とした、表２に示したアッセイ間品質管理データに基づいて決定した定量上限（ＵＬＯＱ）は、０．５μｇ／ｍＬだった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に基づく、カンパス−１Ｈを分析するためのアッセイデザインの模式図。
【図２】ヒト血清の競合カンパス−１Ｈアッセイのための、アッセイ用標準検量曲線（平均＋ＳＤ）であり、ＬＬＯＱとＵＬＯＱ（定量上限）を示す。
【図１】
2009529133.tif 000004
【図２】
2009529133.tif 000005
【国際調査報告】
2009529133.tif 000006
2009529133.tif 000007
2009529133.tif 000008
2009529133.tif 000009