(57)【要約】耐塩性を増加させる分子ツールが決定された。本発明は、耐塩性と共に分離される、テラピアにおけるトランスフェリンにリンクする遺伝マーカー（マイクロサテライト−トランスフェリン  ハロタイプ）、トランスフェリン遺伝子において上記マーカーと一致し、この種の耐塩性と緊密にリンクした機能的変異とみなされる機能的変異（ＳＮＰｓ）に関する。更に、塩水に暴露したテラピアにおいてトランスフェリンが有意にアップレギュレーションされた。耐塩性に関与する遺伝子に関する知識が増大することによって、海岸地域における養殖施設が要望されるテラピア養殖産業の拡大に必要なこの形質を選択することが容易になる。このような開発は、成長過程及び健康に影響がないような、塩水に耐性のテラピアを前提とするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚の耐塩性を向上させるためのマーカー支援選択のためのツールとしての、トランスフェリンのハロタイピングの使用。
【請求項２】
魚がテラピアである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
塩分濃度レベルによって規定される環境に対して生物をカスタマイズするための選択又は管理レジメにおけるクライテリア又はツールを開発するための、表３におけるマイクロサテライト−トランスフェリンハロタイプ１及び２の使用。
【請求項４】
塩分濃度レベルによって規定される環境に対して生物をカスタマイズするための選択又は管理レジメにおけるクライテリア又はツールを開発するための表２及び表３におけるトランスフェリンＳＮＰ多型の使用。
【請求項５】
生物が水生種、脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項６】
生物が陸上種、脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項７】
生物が脊椎動物、陸上又は水生動物である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項８】
生物が硬骨魚類の種である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項９】
生物がカワスズメ科に属する種である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項１０】
生物がOreochromis属に属する種である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項１１】
生物がOreochromis niloticus （ナイルテラピア）である、請求項３又は４記載の使用。
【請求項１２】
塩分濃度における多様性によって規定される様々な環境に対して個体をカスタマイズするための、トランスフェリンにリンクするマイクロサテライトマーカーであるＴＦ−Ａ（配列番号３）及びＴＦ−Ｂ（配列番号４）の使用。
【請求項１３】
塩分濃度における多様性によって規定される様々な環境に対して個体をカスタマイズするための、表２又は表３におけるＳＮＰｓの使用。
【請求項１４】
個体のカスタマイズが、選択的繁殖、他の遺伝的増加レジメ、又は、トランスフェリン又はトランスフェリンとリンクする他の遺伝子の発現に影響を及ぼす操作によるものである、請求項１２又は１３記載の使用。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が配列番号５，６，７又は８のいずれか一つで示される配列から成るか又は該配列を含む、ＰＣＲプライマー。
【請求項１６】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列から成るか又は該配列を含む核酸分子。
【請求項１７】
配列番号３又は４で示されるヌクレオチド配列から成るか又は該配列を含む核酸分子。
【請求項１８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るか又は該配列を含むポリペプチド。
【請求項１９】
最適なトランスフェリン発現を有する動物の選択による動物の生産、又は、動物若しくは生産物／消耗品を製造する方法。
【請求項２０】
生物においてトランスフェリン遺伝子と共に分離され遺伝的にリンクする少なくとも一つの遺伝マーカーを検出する方法であって、該遺伝マーカーの存在に関して該生物のゲノムにおけるトランスフェリン遺伝子情報領域を分析することを含む該方法。
【請求項２１】
遺伝マーカーがＴＦ−Ａ（配列番号３）及びＴＦ−Ｂ（配列番号４）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
更に、配列番号５−８のいずれかをプローブとして、又はこれらのヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するプローブを該遺伝マーカーの存在の検出のために使用することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
生物においてトランスフェリン遺伝子と共に分離され遺伝的にリンクする少なくとも一つの多型遺伝子を検出する方法であって、該多型が発現の量的多様性を生じ、各発現平均レベルが該遺伝子の特異的遺伝子型と関連し、該方法が該リンクする遺伝子の発現分析を通してリンクするトランスフェリンハロタイプを間接的に定義及び／又は選択することに使用できる、前記方法。
【請求項２４】
トランスフェリン発現用の調節要素に関する情報の、トランスフェリン遺伝子の発現を操作するための使用。
【請求項２５】
トランスフェリン発現用の調節要素がリンクしているか又はリンクしていない調節要素である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
耐塩性を向上させる方法でトランスフェリン発現を調節することが出来る薬剤又は補助食品。
【請求項２７】
トランスフェリン発現に影響して増加させ、それによって、耐塩性を向上させる環境因子。
【請求項２８】
商業用又は類似用途で、個体におけるトランスフェリン発現レベルを測定することを含む、高い耐塩性を有する個体を選択する方法。
【請求項２９】
魚の耐塩性の指標を得る方法であって、該魚から得た核酸試料における表２又は３に定義された該魚のトランスフェリン遺伝子の一つ又はそれ以上のＳＮＰｓの有無を測定し、表３に定義したハロタイプ２の一つ又はそれ以上のＳＮＰｓが存在する場合には、表３に定義したハロタイプ１の一つ又はそれ以上のＳＮＰｓを有する魚に較べて耐塩性が増加している魚であることの指標となる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物における耐塩性を増大させる分子ツールに関する。より特異的には、本発明は、国際的な水産養殖において重要な種における耐塩性を増大させることに関する。本発明は生物におけるトランスフェリンにリンクする遺伝マーカー（マイクロサテライト−トランスフェリン−ハロタイプ）に関し、該遺伝マーカーは耐塩性と共に分離され、更に、本発明はトランスフェリン遺伝子において上記マーカーハロタイプと一致する機能的変異（ＳＮＰｓ）に関し、該変異は耐塩性と緊密にリンクした機能的変異とみなされるものである。
【背景技術】
【０００２】
テラピア（Tilapias）はカワスズメ科（cichlid family）に属する魚で、ナイルテラピア（Nile tilapia: Oreochromis niloticus）を筆頭に世界的に有数の水産養殖種となりつつある（Bentsen et al., 1998; Kocher, 2002; Roderick, 1999;20 Trewavas,1983）。
【０００３】
テラピアの養殖及び捕獲は容易であり、豊富な藻及び動物性プランクトンを食餌として与えることが出来る。商業的に最も重要な種及び株は主に淡水中で発見されている。淡水の利用は多くの国において限られている為に、典型的には廃棄された沿岸のエビ養殖場のような、半塩水地域及び施設を利用することによって、僅かの投資でテラピアの水産養殖を拡大する機会が提供され得る（Yi et al., 2002）。このような開発は、成長過程及び健康に影響がないような海水に耐性のテラピアを前提とするものである。耐塩性に関与する遺伝子に関する知識が増大すれば、このような形質を選択することが可能となる。
【０００４】
Oreochromis属は半塩水（brackish water）に耐性であるが、種の間に大きな変異が見られる。Oreochromis mossambicus及びO. aureus（ブルーテラピア）はナイルテラピアよりも耐塩性が強い（Avella et al., 1993; Cataldi et al., 1988; Doudet, 1992）ので、耐塩性は遺伝的因子によって調節されていることが示唆される。
【０００５】
トランスフェリンは鉄結合性糖タンパク質である。これは鉄輸送体を初めとして、広範囲の生物においていくつかの生物学的機能に関与している。トランスフェリンへの鉄の結合によって複製する病原体による鉄の利用が制限されるので、トランスフェリンは免疫系において重要な役割を担っている(Cnaani et al., 2002;Stafford and Belosevic, 2003)。トランスフェリン（ＴＦ）は主に肝臓で発現し、血漿中で輸送されて主な生体組織に鉄を供給しているが、いくつかの他の器官でも発現している（Briggs et al.,1999）。実験によれば、大西洋タラ（Gadus morhua）の脳内で該遺伝子が発現しており、これは、サケ及び他の脊椎動物では脳内発現は見られないことと対照的である（Denovan-Wright et al., 1996）。トランスフェリンは卵トランスフェリン（ＯＴＦ）及びラクトトランスフェリン（ＬＴＦ）を含む遺伝子ファミリーに属する。ＯＴＦは鳥トランスフェリン遺伝子によってコードされ卵で発現し、ＬＴＦは乳腺によって乳中に分泌されて進入する微生物の増殖を防いでいる。これらトランスフェリンの変異体は局所的に産生されるので（鳥類及び哺乳類）、血漿中のトランスフェリンによっては容易に到達できないと考えられている（Briggs et al., 1999; Lambert et al., 2005）。
【０００６】
トランスフェリンファミリーの全てのメンバーは単一ポリペプチド鎖から成り、アミノローブ（lobe）及びカルボキシローブと呼ばれる２つの球状の半分に畳込まれている。ＴＦ，ＯＴＦ及びＬＴＦにおいて、各ローブは４つのアミノ酸リガンド（2 Tyr, 1 His及び1 Asp）を含む鉄結合に、相乗的アニオンを提供する２つのリガンド（Thr 及びArg）を配位している（Lambert et al., 2005）。これら２つのローブは、それら各々の遺伝子のエクソン間において、サイズ、ヌクレオチドセグメント及びアミノ酸組成が類似しているので、これらはトランスフェリン遺伝子の融合及び重複から生じたものと考えられている（Parketal., 1985）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Avelia, M., Berhaut, J., Bomancin, M., 1993. Journal ofFish Biology 42, 243-254. ,
【非特許文献２】Bentsen, H.B., Eknath, A.E., Palada-de Vera, M.S., Danting, J.C., Bolivar, H.L., Reyes, R.A., Dionisio, E.E., Longalong, F.M., Circa, A.V., Tayamen, M.M., GJ'erde, B., 1998. Aquaculture 160, 145-173
【非特許文献３】Briggs, D.A., Sharp, D.J., Miller, D., Gosden, R.G., 1999.. Molecular human reproduction 5, ll07-ll14.
【非特許文献４】Cataldi, E., Crosetti, D., Conte, G., D'0vidio, D., Cataudelia, S., 1988. Journal of Fish Biology 32, 191-196.
【非特許文献５】Cnaani, A., Ron, M., Lee, B.Y., Hulata, G., Kocher, T.D., Seroussi, E., 2002 Mapping the transferrin gene in tilapia. Animal Genetics 33, 78-80.
【非特許文献６】Denovan-Wright, E.M., Ramsey, N.B., Mccormick, C.J., Lazier, C.B., Wright, J,M., 1996. Part B, Biochemistry & molecular biology 1 13, 269-273.
【非特許文献７】Doize, F.,Roux, 1., Martineau-Doize, B., DeRoth, L., 1990, Can J Vet. Res. 54, 397-399.
【非特許文献８】Doudet, T., 1992. Aquaculture 102, 275-288
【非特許文献９】Katagiri, T., Asakawa, S., Minagawa, S., Shimizu, N., Hirono, 1., Aoki, T., 2001. Animal Genetics 32, 200-204.
【非特許文献１０】Kocher, T.D,, 2002. Tilapia Genomics and Applications. Available at http://nps.ars.usda,gov/static/arsoibiotecws2001/contributions/Kocher.htm.
【非特許文献１１】Lambert, L.A., Perri, H., Halbrooks, P.J., Mason, A.B., 2005. Part B, Biochemistry & molecular biology 142, 129-141.
【非特許文献１２】Park, 1., Schaeffer, E., Sidoli, A., Baralle, F.E., Cohen, G.N., Zakin, M.M., 1985. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82, 3149-3153.
【非特許文献１３】Rengmark,A.H., Slettan,A., Lee,WJ,, Lie,a, Lingaas,F. 2006. Identification and mapping of genes associated with salt tolerance of tilapia . (UnPub)
【非特許文献１４】Roderick, E., 1999. Seafood International 46-50.
【非特許文献１５】Sambrook, J., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
【非特許文献１６】Stafford, J.L., Belosevic,, M., 2003. Developmental and comparative immunology 27, 539-554
【非特許文献１７】Trewavas, E., 1983. Tilapiine fishes: of the genera Sarotherodon, Oreochromis and Danakilia / Ethelwynn Trewavas. British Museum (Natural History), London.
【非特許文献１８】Yi, Y., Lin, C.K., Diana, J.S., 2002. Nineteenth Annual Technical Report _ Culture of Red Tilapia in Brackishwater Ponds. Available at http://pdacrsp.oregonstate.edu/pubs/technica1/l9tch/9NS4.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
耐塩性に関連する遺伝子を同定する我々の試みは、ディファレンシャル発現分析及び候補遺伝子戦略を含むものである。我々は、トランスフェリンが耐塩性に関連する候補遺伝子である、と仮説を立てた。従って、本発明においては、塩水実験におけるトランスフェリンの発現、及び、特に遺伝的配列の解明によるナイルテラピアのトランスフェリン遺伝子の構造に焦点が当てられている。本研究までには、他のテラピア種（O. aureus 及びO.mossambicus）からは配列の断片のみが入手可能であった（Cnaani et al., 2002）。トランスフェリン遺伝子の効果を確認する為に、機能的研究、即ち、トランスフェリンに緊密にリンクしている多型マーカーの遺伝子型及び該遺伝子内の検出されたＳＮＰｓの同定に基づき塩水に対して生存したものとそうではないものとの間のハロタイプ分離分析を実施し、更に、同じ魚においてトランスフェリンのディファレンシャル発現研究を実施した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、トランスフェリンが耐塩性に関与していることを示した。増大する塩度（塩分濃度）中に数日間暴露されたテラピアにおける発現分析が実施された。トランスフェリンはリアルタイムＰＣＲで分析した結果、有意なアップレギュレーションを示した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、耐塩性テラピアのトランスフェリンマーカーハロタイプ、及び、該マーカーハロタイプと一致し該種における耐塩性と緊密に関連すると思われる、トランスフェリン遺伝子における機能的変異（ＳＮＰｓ）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ナイルテラピアと、赤タイ、黒タイ、日本ネダカ及びブラウントラウトのタンパク質ブラストの結果（メガ）を示す。各シンボルは以下の通りである。（．）同一なアミノ酸；（−）配列整列におけるインデル；（＊）終止コドン。太字は保存鉄およびアニオン結合残基（Lambert et al, 2005）。Lambert et al, 2005ではヒトタンパク質がモデルとして使用されており、そこでの番号はアミノ酸１９（すべての種に共通）におけるシグナルペプチド開裂後に始まっているので、この番号は該文献のとは異なる。ナイルテラピアにのみある３つのアミノ酸の挿入は下線が引かれている。アミノ酸変化を生じるＳＮＰｓにも同様に下線が引かれている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
トランスフェリンに密接にリンクしている多型マーカーの遺伝子型同定（genotyping）及び該遺伝子内に検出されたＳＮＰｓに基づき、塩水に対してチャレンジ後に、生存したものとそうではないものとの間のハロタイプ分析を実施した。３０pptより高い塩分濃度において生存したもの、及び、低塩分濃度において死滅したものを含む、塩水実験における２つのファミリーからの魚に対して、密接にリンクしているマーカーであるＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂを用いて遺伝子型の同定を実施した。この２つのマーカーの遺伝子型同定によって２つのハロタイプがリターンされ、その結果、有意な分離ひずみ（segregation distortion）が示された（表１）。耐塩性魚はハロタイプ２の多数部分を占め、耐塩性が低い魚はハロタイプ１の多数部分を占めた。ＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂの２つのマーカーの分離ひずみはトランスフェリン遺伝子に密接にリンクしており、トランスフェリンが耐塩性に関与していることが強く示された。続いて、子孫における分離ひずみを示す可能性のある機能的変異（ＳＮＰｓ）を捜す目的で、塩水チャレンジ実験において親及び子孫がチェック（配列決定）された。これらの研究によって、幾つかのＳＮＰｓを含むハロタイプがマイクロサテライトＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂと共に分離することが示された。この２つのハロタイプのひとつのであるハロタイプ２は耐塩性の増大と強い関連を有していた。
【００１３】
トランスフェリン遺伝子内に検出されたＳＮＰｓのうちの１４個はアミノ酸変化を伴うものであり、幾つかのナイルテラピアのトランスフェリンタンパク質内におけるこれらの変異は耐塩性の向上と機能的に関連していることが強く示唆するものである。
【００１４】
トランスフェリンにリンクする２つのマイクロサテライトマーカーである、ＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂは、ハロタイプ変異体である287-184及び289-188、並びに、それらに伴うトランスフェリン内の発現変異（ＳＮＰｓ）をリターンし、それらは本発明の実験において耐塩性に対するディファレンシャルな効果を示し、塩分濃度における多様性によって規定される様々な環境の変化に対して個体をカスタマイズすることに使用できる可能性がある。これは、選択的繁殖、他の遺伝的増加レジメによって達成されるか、又は、トランスフェリン又はトランスフェリンとリンクする他の遺伝子の発現に影響を及ぼす操作によって達成できる可能性がある。マーカー支援選択（marker-assisted selection）において上記マーカーを採用することによって遺伝的獲得がなされる可能性は、トランスフェリンハロタイプ２を有する群における生存率は６３％であるのに対して、トランスフェリンハロタイプ１を有するテラピアにおける生存率は３８％である事実から明らかである。魚のこの集団におけるハロタイプ２への起因率は１１％（全生存率：４９％、ハロタイプ１魚の生存率：３８％、４９％−３８％＝１１％）である。系統的選択を行なうことにより、ハロタイプ２の頻度を更に１００％まで増加させることは可能であると考えられる。又、これによって直ちに、生存率が１４％増加することが期待される（０．６３−０．４９＝１４％）。更に、本発明によって、より生存率の高い、新規なトランスフェリンハロタイプが見出された。
【００１５】
本発明で得られる情報を用いて、調節経路を介して個体の耐塩性を変化させることの可能性は、このような多型可能性（本明細書には記載なし）及び調節要素は本発明に記載のハロタイプとリンク又は経路が関連し、従って、向上又はカスタマイゼーションのための代替ツールとして使用できる可能性から予測することが出来、本発明に基づき更に開発される。
【００１６】
耐塩性と関連し、本発明によって解明された任意のトランスフェリン遺伝子変異は、本発明のハロタイプとリンクしているか否かに係わらず、本発明の目的を達成するために使用することが出来る、耐塩性を増大させるための新規な分子ツールである。
【００１７】
本発明によって、異なるトランスフェリン遺伝子型及びトランスフェリンハロタイプを有するテラピアは塩水中において生存率が異なることが示される。本発明は更に、トランスフェリンのハロタイピングを魚の耐塩性を向上させるためのマーカー支援選択のためのツールとして使用することを示唆する。従って、テラピア又は他の魚において、未だ検出されていない、新たなトランスフェリンハロタイプを検出する目的で、異なるトランスフェリン変異体を有する個体を調査・比較し、記載された以外の別のトランスフェリンハロタイプを用いて耐塩性を増加させるために本発明を利用することができる。トランスフェリン、本発明のハロタイプ、又は、本発明に基づき検出される他の任意の多型にリンクするか、又は、耐塩性と関連する、脊椎動物ゲノム又はテラピアにおける任意の配列タグ部位（無名タグ又は発現タグ）は本発明の目的である、耐塩性を増大させるための新規な分子ツール、を達成するために使用することが出来る。耐塩性と関連するこのような多型タグ又は部位は本発明のゲノム多型構造と緊密に又は緩くリンクしている。かなり緩いリンクが所望の方向に遺伝子構成を変化させるために有用である幾つかの例がある。最も良く知られたこの一例として、ハロタン感受性遺伝子座（後に、リャノディン受容体遺伝子、として発見された）にリンクするマーカーのハロタイプを用いた、該遺伝子座の頻度における変化である（Doize et al., 6 1990）。従って、本発明は本発明自体の代わりに、リンクした遺伝子座位に基づく遺伝的試験を開発するために使用することも出来る。
【００１８】
トランスフェリン又は本発明のハロタイプのいずれにもリンクしないが、耐塩性と関連し本発明の助けで解明された、脊椎動物ゲノム又はテラピアにおける任意の配列タグ部位／多型ゲノムタグ（無名タグ又は発現タグ）は本発明の目的である、耐塩性を増大させるための新規な分子ツール、を達成するために使用することができる。これは、同じトランスフェリンハロタイプを有する物質を見出すか、又は、トランスフェリン変異を統計的に調節するために、塩水における挙動又は耐塩性に影響を与える他の遺伝的因子を検出する為の手段として本発明を利用することによって達成される。
【００１９】
トランスフェリン発現又はトランスフェリンに密接にリンクする他の遺伝子発現を用いる任意の発現研究を用いて、トランスフェリンハロタイプを間接的に同定することが出来、本発明と関連する耐塩性に関する情報を提供することが出来る。同じ又は他の染色体のプロモーター、エンハンサー、又は調節要素のようなリンクしないか又はリンクする調節遺伝子を研究することによって、直接的又は間接的に、本発明に関連する、他の遺伝子、多型、又は、発現パターンを発見することができる。
【００２０】
本発明は、耐塩性に関連する新規な遺伝子を同定する方法にも係る。徐々に増大する塩分濃度によって異なる種又は幾つかの魚の耐塩性を増加することが出来る。ディファレンシャル発現研究によって、淡水中の魚又は異なる種を比較して新規な遺伝子を同定することが出来る。
【００２１】
本発明に基づき達成され得る耐塩性に関連する向上又はカスタマイゼーションは魚／動物又は植物の繁殖又は向上に限定されず、ヒトの薬理学及び福祉に適用可能である。塩水発現研究によって、生体におけるトランスフェリン発現は容易に変化し、これによって健康／生存を増大させ、様々な環境条件及びそのシフトに適合することを可能ならしめている。例えば、増加／最適トランスフェリン発現を有する豚／子豚を選択することによって、腸におけるトランスフェリン発現の増加／変化が結果として得られ、トランスフェリン／鉄レベルを調節して感染性疾患に対する抵抗性を向上させることが出来る。又は、増加／最適トランスフェリン発現を有する畜牛を選択することによって、乳腺におけるトランスフェリン発現の増加／変化が得られ、乳腺感染症に対する抵抗性が増す。
【００２２】
健康／抵抗性、生存率、挙動、長寿を向上させる目的で、トランスフェリン遺伝子型又は発現レベルの最適レベルを系統的に変化させる為に、テラピア、サケ、魚、動物及び植物の繁殖を通じて、トランスフェリン発現の間接的調節／最適化が可能である。
【００２３】
最適トランスフェリン発現（生産物における最適濃度を生じる）を有する動物の選択による動物又は生産物／消耗品（ミルク、肉、植物、抽出物又は他の品）の生産（製造）は、ヒト、魚、動物、植物にとって、生存率、健康、福祉が向上するように、これを健康産物として市場に提供するためである。
【実施例１】
【００２４】
生物学的材料
ナイルテラピア集団に対して耐塩性実験を実施した。５つの異なるファミリーからの全ての兄弟姉妹を入れた容器の塩分濃度を３日間で0-30 pptで増加させた。最終塩分濃度において、一番目のファミリー（ファミリー no.1）から２３匹の子孫が生存し、２４匹が死滅した。更に、二番目のファミリー（ファミリー no.2）からは３７匹の子孫が生存し、４０匹が死滅した。
【００２５】
MagAttract M48 kit (Qiagen)を用いて推奨される方法でＤＮＡを抽出した。ひれ断片を溶解緩衝液及びプロテイナーゼＫ中に３７℃で一晩溶解した。BioRobot M96 ワークステーション(Qiagen) で自動化単離を完了し、ＤＮＡ（50μl）を溶出した。ナイルテラピアのギル（ひれ）及び脳からの全ＲＮＡをRNAlater（登録商標：Ambion）中−20℃で保存し、Rneasy Midi Kit (Qiagen)を用い標準的プロトコールで単離した。この器官を適当量のRLT緩衝液（溶解）に添加し滅菌プラスチックバック（Seaward, Stomacher）内でローラーによりモホジナイズし、更に、この溶解物を滅菌19G シリンジに通すことによりモホジナイズした。ＲＮＡを150μlのRnaseフリー水で２回溶出させ、標準的方法によりエタノールで沈殿させて濃縮した。濃度はLambda EZ 201 (Perkin Elmer) で測定し、この器官を保存した。その後、プロトコールで推奨されているように、全ＲＮＡをDNA-free（登録商標：Ambion）により処理して、ＲＮＡ抽出物から夾雑ＤＮＡを除去した。
【実施例２】
【００２６】
トランスフェリンの配列決定
テラピア種であるO.aureus 及びO.mossambicusの公開されているトランスフェリンのエクソン７，９及び１０の配列（acc No.AJ318861, AJ312311）に基づき、フォワード及びリバース方向のジーンウォーキング（Gene walking）のためのプライマーを構築した。ジーンウォーキングは、DNA Walkig SpeedUp（商標）Kit (Seegene, Inc.)を用いて実施した。ジーンウォーキングのプロセスは、該キットで提供されるユニバーサルＰＣＲプライマーと我々のＴＦ特異的に設計した両方向のＰＣＲプライマーセットを用いる数段階のＰＣＲから成る。
【００２７】
温度プロファイル及び反応設定はプロトコールで推奨されている通りにした。産物を１％アガロースゲルで試験し、ExoSAP-ITで精製し、その後、選んだ試料を標準的プロトコールに従い、0.25μl 10μM ユニバーサルプライマー(Seegene, Inc.)、及び 全体（nested）及び２回目の全体設計した各プライマー（0.5μl 5μM ）を用いる BigDye （登録商標）ターミネーター（v 3.1）Cycle Sequencing Kit (Applied Bosystems) により、ABI PRISM （登録商標）3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)で配列を決定した。
【００２８】
ジーンウォーキングの補足として、全ＲＮＡに対するＲＡＣＥ技術及びＲＴ−ＰＣＲを用いてｃＤＮＡ配列データを増した。
【００２９】
ＲＡＣＥ技術はGeneRacer（登録商標）RACE Ready cDNA Kit マニュアル（Invitrogen）により推奨されているように実施した。遺伝子特異的プライマー(GSP)、フォワード、リバース及び全体のプライマーは存在する配列及びプロトコールによる推奨に基づき構築した。全ての工程はプロトコールで推奨されているように実施した。ＰＣＲ産物はExoSAP-IT (Amersham Biosciences) で精製し、その後、標準的プロトコールに従い、各ＰＣＲプライマー、リバース及びフォワードを用いる BigDye （登録商標）ターミネーター（v 3.1）Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) により、ABI PRISM （登録商標）3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上で配列を決定した。
【００３０】
Ready-to-Go-RT-PCR ビーズ(Amersham Biosciences)の二工程プロトコールを推奨通りに実施した。ＰＣＲ産物をExoSAP-IT (Amersham Biosciences) で精製し、上記の通り配列を決定した。
【００３１】
得られたエクソン配列に基づき、イントロンをまたぐＰＣＲのためのプライマーを構築した。ＰＣＲ条件は以下の通りである。2μl 10x PCR 緩衝液（15 mM MgCl2 (Amersham Biosciences含有)）, 2μl dNTP (2mM), 0.5μl MgCl2(25mM),  〜75ng DNA, 1μl PCRプライマー、リバース及びフォワード(5pmol/μl), 0.2μl AmpliTaq （登録商標）DNA ポリメラーゼ（5U/μl, Applied Biosystems）及び水を含み、全体量 20μlとした。アニーリングは５８℃で１分間、ＰＣＲは３５サイクル行なった。ＰＣＲ産物は上記方法で配列決定した。ＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列はSequencher 4.2.4 (Gene Codes Co.)で整列させ、エクソン‐イントロン境界を明らかにした。整列（アラインメント）は、NCBIにおけるblastn (Basic Local Alignment Search Tool for nucleotides)及びb12seq （２つの配列のアラインメント）によっても実施した。日本メダカ（Oryzias latipes: acc. No.:D64033）のトランスフェリンの配列を参照配列として使用した。
【００３２】
エクソン‐イントロン境界の詳細な情報を含む、ナイルテラピアのトランスフェリン遺伝子の完全なＤＮＡ配列は本特許出願後にはGenBank (acc no.:DQ272465)からも入手可能である。該遺伝子は7,010 bp (塩基対)からなり、5’及び3’ＵＴＲ領域を含み、16のイントロンで分離された17個のエクソンから構成される（配列番号１）。完全なコード領域配列（ＣＤＳ）は2,085 bp（配列番号２）から構成される。
【００３３】
ナイルテラピアのトランスフェリンのタンパク質は694個のアミノ酸から成る。タンパク質‐タンパク質BLAST (blastp)によれば、メダカのトランスフェリンのタンパク質配列と最大の類似性マッチ（同一性スコア：７７％）を示し、赤タイ及び黒タイ及びブラウントラウトと、夫々、７３，７２及び６７％の同一性を示した。これらタンパク質の詳細な比較は図１に示した。図１は、これら種の間に、幾つかの高い保存領域と多様なアミノ酸を含む幾つかの領域を示している。更に、テラピアの該タンパク質配列にのみ３個のアミノ酸の挿入が見出された。
【００３４】
該タンパク質の２つのローブにおける鉄及びアニオン結合残基は比較した５つの魚の種において保存されていたが（Lambert et al., 2005）、該タンパク質のＮ−ローブにおいて保存されている一つの残基（ヒスチジン）がテラピアではアスパラギン酸に置換されていた。
【実施例３】
【００３５】
トランスフェリンと密接にリンクするマイクロサテライトのゲノムタイピング
トランスフェリンとリンクするマイクロサテライトは、入手可能なテラピアの集合ＢＡＣ−ライブラリー（Katagiri et al., 2001）に対して、該遺伝子の利用可能な配列に基づき設計されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって該遺伝子を含有するＢＡＳクローンをスクリーニングすることで同定された（Cnaani et al., 2002）。推奨されるプロトコールに従い、Clone BAC DNA kit (Princeton Separations) を用いてＢＡＣクローンを単離した。該クローンを適当な制限酵素で断片化し、500-1,000 bp のＤＮＡ断片をStrataPrep（登録商標）Gel Extraction Kit (Stratagene)で精製した。
【００３６】
所定の指示に従い、ＢＡＣ  ＤＮＡ断片をpUS19プラスミドＤＮＡベクター（Sigma-Aldrich Co）に結合しXL-10-Gold（登録商標）Ultracompetent Cells（Stratagene）に形質導入した。ハイブリダイゼーション技術は従来の方法（Sambrook, 1989）によって、コロニーリフト用にColony/Plaque Screen（商標）ナイロン膜（NEF 990A, Perkin Elmer NEN）を用いて実施した。gt10及びct10プローブを、4μlのgt10プローブ溶液（1μg/μl, MGW）、4μlのct10プローブ溶液（1μg/μl, MGW）, 6μlのT4 ポリヌクレオチドキナーゼ  10 U/μl (NNEB)、12μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液 10x (NEB), 50μlの [γ３２Ｐ]ＡＴＰ 500μCi (Amersham Biosciences)及び44μlのＨ２０を含む溶液中で、３７℃で４０分間、９５℃で１０分間、１５分間氷上にて末端標識した。
【００３７】
標準的方法に従って、標識プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に加え、フィルターを一晩ハイブリダイゼーションした。該フィルターを洗浄し、サランラップ（Saran Wrap）で覆い、ハイパーフィルムＭＰ(Amersham Biosciences)に‐70℃で一晩感光した後、現像した。陽性コロニーを同定し、上記の一次スクリーニングに関して記載したように、二次スクリーニングを実施した。
【００３８】
陽性クローンを取り上げ、ＤＮＡプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて推奨されたプロトコールにより精製した。その後、標準的プロトコールに従い、ABI PRISM （登録商標）3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)で、Ｍ１３プライマーを用いる BigDye （登録商標）ターミネーター（v 3.1）Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) によりベクター挿入物の配列を決定し、マイクロサテライト候補を見出した。
【００３９】
こうして取り上げたＢＡＣクローンが正しい遺伝子を含むことを確認する為に、ＢＡＣライブラリー中で特異的クローンを見つけたときに使用したものと同じプライマーを用いるＰＣＲで単離したＢＡＣクローンを増幅した。夫々のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ産物を上記記載のように配列決定した。得られた結果をＢＬＡＳＴによって順次ランさせて、該配列が正しい遺伝子と一致することを確認した（Rengmark et al., 2006）。
【００４０】
トランスフェリン遺伝子を含むＢＡＣクローン中で、２つのマイクロサテライトマーカーが同定された。ＴＦ−Ａは(GT)10 反復配列（配列番号３）からなり、ＴＦ−Ｂは(GT) 14 反復配列（配列番号４）から成る。
【００４１】
トランスフェリンと密接にリンクしているこれら２つのマイクロサテライトマーカーであるＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂを、耐塩性実験におけるファミリー１及び２からの生存テラピア及び死滅（非生存）テラピアにおいてゲノムタイピングした。ＰＣＲ条件は既に記載の通りであるが、アニーリングは５５℃で４５秒間実施し、３２サイクルであった。ゲノタイプマーカーＴＦ−Ａ用のＰＣＲプライマーは配列番号５及び６、ゲノタイプマーカーＴＦ−Ｂ用のＰＣＲプライマーは配列番号７及び８である。試料はABI PRISM （登録商標）3100上でランし、結果をGeneMApper v 3.0 Kit (Applied Biosystems)で分析した。
【００４２】
耐塩性テラピアのハロタイプ
２つの遺伝子座位が一つのハロタイプブロックとして遺伝していた。ハロタイプ１は対立遺伝子２８７及び１８４、及び、ハロタイプ２は対立遺伝子２８９及び１８８であり、夫々、マーカーＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂで示される。試験した親は、ファミリー２におけるサイア（sire）以外は両方のマーカーに対して異型接合であり、該サイアは対立遺伝子２８７及び１８４を有する２つの遺伝子座位についての同型接合であった。ハロタイプ及びχ２分布を表１に示す。耐塩性の魚はハロタイプ２を有する傾向があり、耐塩性が低い魚はハロタイプ１の多数部分を占めていることが判った。分離ひずみはp<0.025及び0.05で有意であった。
【００４３】
表１：２つのＱＴＬファミリーにおける２つのハロタイプのχ２分布は、耐塩性の個体はハロタイプ２を有していることを示す。
【００４４】
【表１】
2009540816.tif 000002
【実施例４】
【００４５】
トランスフェリン遺伝子におけるＳＮＰｓの同定
上記遺伝子の発現部分におけるＳＮＰｓ候補を見つける為に、更にプライマー対を設計した。まず、ファミリー２親に対して標準的ＰＣＲを実施し、DyEnamic（商標）ET Dye Terminator Kit (Amersham Biosciences)を用いる MegaBACE（商標）1000 DNA Analysis Systems (Amersham Biosciences) によって配列を決定した。反応条件は以下の通りである。4μl ET試薬プレミックス、4.5μl Ｈ２Ｏ, 1μl PCR-産物、0.5μl プライマー（5μM）。９５℃で１５秒、５８℃で１０秒、６０℃で１分間からなる工程を２８回繰り返した。反応後のクリーンアップはエタノール及び7.5M 酢酸アンモニウムを用いてプロトコールで推奨されている通りに実施した。Sequencer 4.1.4 (Gene Codes Co.)により配列を整列し比較することによりＳＮＰｓを同定した。ＳＮＰｓが検出された場合には、該ファミリーにおける２つの子孫（塩水生存及び非生存）について当該ＳＮＰｓについて配列決定し、それらの遺伝子型を規定した。
【００４６】
トランスフェリン遺伝子において同定されたＳＮＰｓ
トランスフェリン遺伝子において２５個の異型接合ＳＮＰｓが同定され、その内の１５個はエクソン７，８，１４，１５及び１６に位置していた。これらの中の１４個はアミノ酸変異を伴っていた（表２）。
【００４７】
ファミリー２からの子孫でゲノタイプした全てのＳＮＰｓが２つのマイクロサテライトを含む２つのハロタイプブロックとして分離していることを見出した。ハロタイプの分布の詳細は表１に示されている。連鎖ひずみ（linkage distortion）はハロタイプ２を有する個体がより耐塩性であることを強く意味している。ハロタイプの完全な様子は表３に示した。鉄及びアニオン結合残基は、一つを除いて全て保存されている（図１）。ナイルテラピアにおいてＮ−ローブにおけるヒスチジン残基がアスパラギン酸(GAC) に変化している（258 位置）。他の全ての魚はこの位置がヒスチジン（CAC又はCAT）である。Lambert et al. (2005)は、このヒスチジン位置がＮ−ローブにおいて最も重要であり、この位置のアスパラギン酸はショウジョウバエ及びシロアリのような異なる昆虫に見出されることを報告している。興味深いことに、このエクソン７中のこの位置は、アスパラギン酸の上流隣にある、魚の生存群におけるアラニンからグリシンへのアミノ酸変化を起こしているアミノ酸内のＳＮＰを含んでいる（表２参照）。
【００４８】
表２：トランスフェリン遺伝子内で同定されたＳＮＰｓ。該遺伝子における位置、塩基対番号（GenBank, acc.no.DQ272465における配列に対応）、野生型における遺伝子型及びＳＮＰ，アミノ酸変化、アミノ酸位置（位置に下線が付されている図１も参照）
【００４９】
【表２】
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【００５０】
表３：耐塩性のナイルテラピアにおけるトランスフェリン内の２５個のＳＮＰｓ、及び、２つの遺伝的にリンクしたマイクロサテライトマーカー（ＴＦ−Ａ及びＴＦ−Ｂ）にわたるハロタイプ１及び２の様子
【００５１】
【表３】
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【実施例５】
【００５２】
トランスフェリンの発現試験
発現試験のために並行塩水実験を実施した。この実験には４つの異なるファミリーのナイルテラピア２００匹を使用した。平均体長は１０ｃｍで、性分布はほぼ等しかった。各ファミリーから２５匹を同じ物理的環境の２つのタンクに集めた。一つのタンクの塩分濃度を二日毎に１０日間に亘り増加（0-32 ppt）させ、更にその塩条件下で５日間飼育した。その後、全ての魚を殺して切断した。脳及びギルを直ちにRNAlater（登録商標）(Ambion)に移して−２０℃で保存した。
【００５３】
各処理物からの脳及びギルを別の容器に集め、全ＲＮＡをRNeasy Maxi Kit (Qiagen) で推奨されている通りに抽出した。脳及びギル単離物の等量を混合し、夫々、塩水及び淡水プールとした。このような器官プールの意図は耐塩性代謝の全発現を解明することである。ABI PRISM（登録商標）7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)上のＲＴ−ＰＣＲによってトランスフェリンを分析した。プロトコールで推奨されるとおりに、全ＲＮＡをDNA-free（商標）(Ambion)で処理し、含まれるＤＮＡを除去した。推奨されるＰＣＲ試薬及びサイクル条件を用いて、TaqMan（登録商標）Gold RT-PCR Kit(Applied Biosystems)により２段階のＰＣＲを実施した。この２段階ＰＣＲは、ＰＣＲからの持ち越し夾雑物の防ぐためのAmpErase UNGを添加することが含まれている。特異的TaqMan（登録商標）プライマー及びプローブをプロトコールの条件で構築した。最適なＲＴ−ＰＣＲ条件の為の最適なMgCl2、プライマー及びプローブ濃度を試験するために、予め幾つかの段階希釈を実施した。３つの並行ランに基づき各試料に関して標準偏差を計算した。
【００５４】
ギルのみに加えて、テラピアのギルと脳からの全ＲＮＡのプールに対して行なったＲＴ−ＰＣＲが成功した。この結果は、トランスフェリンがギル及び脳で発現されていることを示すものである。これまでにトランスフェリンは大西洋タラ（Atlantic cod）以外の脊椎動物では検出されていない（Denovan-Wright et al., 1996）。ＲＴ−ＰＣＲで分析した結果、トランスフェリンは有意なアップレギュレーションを示した。
【００５５】
配列表
【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
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【００５８】
【表６】
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【００５９】
【表７】
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【００６０】
【表８】
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【００６１】
【表９】
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【図１】
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【国際調査報告】
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