(57)【要約】本発明は、健康増進剤、特に抗菌剤の分野に全般的に関し、抗菌ペプチドおよび該抗菌ペプチドを与える細菌株を提供する。ある態様において、本発明は、その試料が２００５年１１月１８日にスコットランドアバディーンのナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリアにアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３５４の下で寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株、または乳もしくは乳製品から抗菌活性を有するペプチドを製造できるその派生株もしくは変異株の生物学的に純粋な培養物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群より選択される１つまたは複数のペプチドを含む抗菌化合物。
【請求項２】
試料が２００５年１１月１８日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３５４の下でスコットランド、アバディーンのナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）に寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株、または乳もしくは乳製品から抗菌活性を有するペプチドを製造できるその派生株もしくは変異株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３】
請求項２に記載の培養物から得られる無細胞培養上清またはその画分。
【請求項４】
ＤＰＣ６０２６により製造される化合物であって、乳または乳製品から１つまたは複数の抗菌ペプチドを製造できる化合物。
【請求項５】
前記抗菌ペプチドが、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群より選択される１つまたは複数である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の抗菌化合物、請求項２に記載の培養物、請求項３に記載の上清および請求項４または請求項５に記載の化合物からなる群より選択される１つまたは複数を含む抗菌組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物、および請求項６に記載の組成物からなる群のうちの１つまたは複数の、微生物感染または微生物汚染の管理における使用。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物、および請求項６に記載の組成物からなる群のうちの１つまたは複数を、動物またはヒトに投与することを含む、微生物感染または微生物汚染を防止または治療または制限する方法。
【請求項９】
前記微生物感染または微生物汚染が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓからなる群のうちの１つまたは複数を原因とする汚染または感染である請求項７に記載の使用または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記感染または汚染が、乳腺炎である請求項７もしくは請求項９に記載の使用または請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記感染または汚染が、髄膜炎である請求項７もしくは請求項９に記載の使用または請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物、株、上清または組成物が、乳をベースとする調合乳に供給される請求項１１に記載の使用または方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物、および請求項６に記載の組成物の、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素（ＡＣＥ）の阻害、オピオイド調節、免疫調節および抗血栓症治療から選択される群のうちの１つまたは複数における使用。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物、および請求項６に記載の組成物を、動物またはヒトに投与することを含む、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素（ＡＣＥ）の阻害、オピオイド調節、免疫調節または血栓症抑制の方法。
【請求項１５】
乳または乳製品に、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物および請求項６に記載の組成物からなる群のうちの１つまたは複数を加えることを含む、乳または乳製品から抗菌ペプチドを製造する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物および請求項６に記載の組成物の１つまたは複数を含む食品。
【請求項１７】
前記食品が、幼児用調合乳、粉乳、ヨーグルト、チーズ、生菌飲料、乳児用食品調合乳、乳ベースの飲料および食品補助物質からなる群より選択される１つまたは複数である請求項１６に記載の食品。
【請求項１８】
治療有効量の、請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の株、請求項３に記載の上清、請求項４または請求項５に記載の化合物、および請求項６に記載の組成物のうちの１つまたは複数を含む医薬組成物。
【請求項１９】
添付の図面および表を参照して本明細書に実質的に記載される化合物、株、上清、組成物、タンパク質、方法、使用、食品または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、健康増進剤、特に抗菌剤の分野に全般的に関し、抗菌ペプチドおよび該抗菌ペプチドを与える細菌株を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
病原菌による感染により、ヒトおよび動物の両方において重大な健康問題が起こり得る。特に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａのような病原株による感染は、ひどく衰弱させ得る。病原菌に対する抗菌剤を供給する必要性があることが認識されている。
【０００３】
病原菌の抗生物質に対する耐性の増加は、主要な問題点であり、新規薬物の探索が続いている（３５）。多剤耐性のＥ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、およびＥ．ｓａｋａｚａｋｉｉの株は、驚くべき速度で増加しており、免疫無防備状態の宿主にしばしば関連して、該宿主にひどい影響を与え得る（６、１４）。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種は、それらがより古い抗菌剤に対する先天的な耐性を有し、かつそれらの院内感染との関連が増加しているために、近年、重要性が増加している病原体として認識されている（４１）。３０年より長きにわたって、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉは、新生児の髄膜炎の特有の症候群の原因として認識されている（２０）。４０〜８０％の死亡率が報告されており、乳ベースの幼児用調合乳が感染の病原巣として働くという興味深い証拠が増加している（（２０）、（３３）、（３４））。Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ感染を制御するための現在の工業的な努力は、製造における衛生業務の改善および生物体についての最終製品の試験に焦点を当てている（３４）。新規な抗菌ペプチドの候補を同定するためのある可能な経路は、乳タンパク質の探索にある。
【０００４】
乳タンパク質は、生物活性ペプチドの豊富な供給源であり、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素（ＡＣＥ）阻害、オピオイド、免疫調節、抗血栓および抗菌活性を含む一連の健康増進特性を有すると報告されている（９）。生物活性ペプチドは、カゼインおよびホエーのような乳タンパク質にコード化された形で存在し、プロペプチドまたは成熟Ｃ末端ペプチドとして貯蔵され（１３、１９）、それらの放出にはタンパク質分解が必要である（１１）。これらの機能的ペプチドのうち最も特徴付けられているものは、カゼインに由来し、心血管系、主にＡＣＥ阻害における効果を有することが示されており、その結果、抗高血圧の特徴を有する（４３）。ＭａｒｕｙａｍａおよびＳｕｚｕｋｉ（２８）は、カゼインのトリプシン加水分解物が、ＡＣＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を阻害したことを報告した。Ｐｉｈｌａｎｔｏ−Ｌｅｐｐａｌａら（３７）は、乳酸菌（ＬＡＢ）で発酵させ、その後消化酵素で加水分解したホエーおよびカゼインタンパク質からのペプチドのＡＣＥ阻害活性を研究した。同定されたペプチドは、αｓ１−カゼインｆ（１４２−１４７）、ｆ（１９４−１９９）およびβ−カゼインｆ（１０８−１１３）、ならびにホエーからの２種のＡＣＥ阻害ペプチドであった（３７）。さらに、一連の抗菌ペプチドは、ウシのαｓ２カゼインから単離されている（２３）。これらは、カソシジン（Ｃａｓｏｃｉｄｉｎ）−１，ｆ（１６４−１７９）：ＫＴＫＬＴＥＥＥＫＮ  ＲＬＮＦＬＫＫＩＳＱ  ＲＹＱＫＦＡＬＰＱＹ  ＬＫＴＶＹＱＨＱＫ、ｆ（１６４−１７９）：ＫＫＴＫＬＴＥＥＥＫ  ＮＲＬＮＦＬ、およびｆ（１８７−２０７）：ＱＫＦＡＬＰＱＹＬＫ  ＴＶＹＱＨＱＫＡＭＫ  Ｑを含む。
【０００５】
これらの３種のペプチドは、牛乳を酢酸および硫酸カルシウムで処理して混合物を形成し、次いでこれを加熱して沈殿物および上清を形成することから導かれる。上清は回収され、カチオン交換樹脂で処理される。ペプチドを、クロマトグラフィー手法を用いて溶出させ、活性ペプチドであるカソシジン−１を、消化プロテアーゼを用いて遊離させる。製造のコストは、これらの３つのペプチドの広い利用の１つの可能な制限である。特に、カソシジン−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで殺菌性であることが示されている（５１）。
【０００６】
しかし、カソシジン−Ｉを直接製造する細菌株は知られておらず、このことは、カソシジン−Ｉの製造が、製造コストを付加する酵素および化学物質の使用を必要とすることを意味する。さらなる情報は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ」の表題のＵＳ６５７９８４９に見出し得る。上記の特許にはこれらのペプチドの活性に対する制限は述べられていないが、Ｚｕｃｈｔら、（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７２号（１９９５年）１８５〜１８８頁）は、これらのペプチドの阻害の範囲を記載し、グラム陰性細菌のみがこれらのペプチドにより影響を受けるようであり、このことは、グラム陽性菌の感染および汚染が、ＵＳ６５７９８４９のペプチドでは治療し得ないことを意味する。
【０００７】
ＬＡＢを含む微生物起源のプロテイナーゼは、それらの特異性および活性により、カゼインからのペプチドの作製および抗菌ペプチドの遊離の可能性において主要な役割を演じる（２９）。したがって、発酵の間、これらのプロテイナーゼを製造する微生物は、乳中で成長するために、カゼインおよびホエーのような乳タンパク質を分解できなければならない。ＬＡＢによるカゼイン分解および分解産物のその後の利用は、複雑なタンパク質分解系を必要とする（９）。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（２２、３８）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（２７、５０）のようなＬＡＢの高いタンパク質分解性、ならびに乳中での成長のために乳タンパク質を分解するそれらの必要性のために、生物活性ペプチドの作製のためのそれらのスターター培養物としての使用が報告されている（１２、２５、３２、４５）。非特許文献１（３０）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＰＲ４からのプロテイナーゼを用いて、６種の哺乳類からの乳のカゼインナトリウムから、抗菌活性を示す生物活性ペプチドを製造した。ヒトβ−カゼインｆ（１８４−２１０）に相当する抗菌ペプチドは、ヒトカゼインナトリウムの、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＰＲ４の部分精製プロテイナーゼを用いる加水分解により製造され、いくつかのグラム陽性細菌、およびＥ．ｃｏｌｉに対しても抗菌活性を示した（３０）。カゼイン分解の間に製造されるペプチドの特徴付けは、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（１１、４９）について、およびＬ．ｃａｓｅｉ（７）についてより少ない程度で記載されている。また、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＣＡ−ＤＣ  １７８の細胞壁結合プロテイナーゼが特徴付けされ、β−カゼインに対するその特異性が文書化されている（４５）。
【０００８】
カゼイン由来抗菌ペプチドはほとんど報告されておらず、記載されているものは、成熟Ｃ末端ペプチドに対する酵素の作用により得られ、このことは活性ペプチド配列の遊離を導く（４３）。カゼイン起源の最初の抗菌ペプチドは、Ｈｉｌｌら（１７）により同定され、彼らは、カゼインをキモシンでｐＨ６．４にてタンパク質分解した後に、カセシジンとして知られる抗菌糖ペプチドを単離した。１次アミノ酸構造Ｒ１ＰＫＨＰＩＫＨＱＧＬＰＱＥＶＬＮＥＮＬＬＲＦ２３を有するαｓ１−カゼインペプチド残基１−２３である正に荷電した抗菌ペプチド、イスラシジン（１７）は、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方に対して広い範囲の活性を有し（２３）、ヒツジおよびウシの乳房炎感染を予防する（１２）ことが示された。
【０００９】
病原菌が時間の経過とともに、現存する抗菌化合物に対する耐性を発達させるという永続的な問題もある。よって、耐性菌により示される攻撃に継続的に対応するために、新規な抗菌ペプチドの開発に対する持続的な必要性が存在する。新規な抗菌化合物は、濃度の増加、投与回数の増加のようなより煩わしい投与法を必要とし得るか、あるいは狭い範囲の標的種に対してしか有効になり得ない場合がある。これらの状況であっても、新規な抗菌物質は、耐性の増加の問題のために、現存する化合物よりもまだ有利である。さらに、細菌の株を提供してこのような抗菌ペプチドを製造できることは、このことが、まず、該ペプチドの経済的な製造方法を提案でき、次に、該ペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕの状況で製造する手段を提供し得るので、非常に利益がある。
【非特許文献１】Ｍｉｎｅｒｖｉｎｉ，Ｆ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：５２９７−５３０５（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の目的）
本発明の目的の１つは、少なくとも１種の抗菌ペプチドを製造する細菌の新規な株を提供することである。少なくとも１種の抗菌ペプチドを提供することは、本発明のさらなる目的である。さらなる目的は、多剤耐性生物に対して用いるための抗菌ペプチドを提供することである。抗菌剤を含有する安全性が向上された食品を提供することも、本発明の目的である。ＡＣＥ阻害の方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。抗菌特性が向上された調合乳を提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
ある実施形態において、本発明は、配列番号１（ＩＫＨＱＨＰＱＥ）、配列番号２（ＳＤＩＰＮＰＩＧＳＥＮＳＥＫ）および配列番号３（ＶＬＮＥＮＬＬＲ）からなる群より選択される１つまたは複数のペプチドを含む抗菌化合物を提供する。別の実施形態において、本発明は、その試料が２００５年１１月１８日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５４の下でスコットランドアバディーンのナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）に寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株、または乳もしくは乳製品から抗菌活性を有するペプチドを製造できるその派生株もしくは変異株の生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００１２】
本発明は、ＤＰＣ６０２６により製造されるタンパク質も提供する。特に、本発明は、乳から抗菌ペプチドを製造できる１つまたは複数のペプチドを製造できる、ＤＰＣ６０２６により製造される新規なタンパク質分解酵素タンパク質を提供する。これらのペプチドは、乳または乳製品からの配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群のうちの１つまたは複数に実質的に等しい配列を有するものであってよい。
【００１３】
本発明は、乳または乳製品に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株、または乳もしくは乳製品から抗菌活性を有するペプチドを製造できるその派生株もしくは変異株の生物学的に純粋な培養物、ＤＰＣ６０２６培養物から得られる無細胞培養上清またはその画分、およびＤＰＣ６０２６により製造されるタンパク質であって、乳または乳製品から１つまたは抗菌ペプチドを製造可能であるタンパク質からなる群のうちの１つまたは複数を加えることを含む、乳または乳製品から抗菌ペプチドを製造する方法も提供する。
【００１４】
本発明は、乳または乳製品から配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの少なくとも１つを製造可能であるタンパク質分解特性、触媒特性および／または酵素特性を有するＤＣＰ６０２６からの１つまたは複数種のタンパク質を製造する方法も提供する。
【００１５】
請求項１に記載の抗菌化合物、請求項２に記載の培養物、請求項３に記載の上清および請求項４に記載のタンパク質からなる群より選択される１つまたは複数を含む抗菌組成物。
【００１６】
本発明は、ＤＰＣ６０２６株から得られる無細胞培養上清もしくはその画分、あるいは上記の１もしくは複数のペプチド、化合物、上清または株を適切な担体または希釈剤とともに含む抗菌組成物も提供する。
【００１７】
本発明は、上記の化合物、ペプチド、株、タンパク質、上清または組成物の、微生物感染または微生物汚染の管理における使用も提供する。本発明の態様は、本発明の１つまたは複数の化合物、株、上清もしくは組成物を動物またはヒトに投与することを含む、微生物感染もしくは微生物汚染を予防または治療または制限する方法を提供する。微生物感染または微生物汚染は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓからなる群の１もしくは複数種を原因とする汚染または感染であってよい。特に、感染または汚染は乳腺炎であってよい。
【００１８】
別の実施形態において、感染または汚染は髄膜炎であってよく、新生児の乳腺炎であってよい。ある実施形態において、化合物、ペプチド、株、上清または組成物は、乳ベースの調合乳に供給してよい。つまり、本発明のペプチドは、幼児用調合乳製品の製造における組込まれた防御系として用い得る。１つまたは複数のペプチドは、特に、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｓａｋａｚａｋｉｉ汚染に対して有効であり得る。
【００１９】
構造、活性の範囲および効力の点での生物活性ペプチドの多様な性質のために（３９）、これらのペプチドは、可能性のある新しい薬物設計の主な標的である。乳タンパク質由来の配列番号１（ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ）および配列番号３（ＶＬＮＥＮＬＬＲ）のような抗菌ペプチドを、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ  ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８）のような病原株に対する防御の組込まれた機構として用いる可能性は、幼児用調合乳製造において用いられるもののような粉乳の安全性を増進させる有用なアプローチを提供し得る。
【００２０】
本発明は、候補の動物またはヒトを、本発明の１つまたは複数の組成物、化合物、上清、ペプチドまたは株で処置することを含む、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素（ＡＣＥ）の阻害、オピオイド調節、免疫調節および血栓症抑制の方法も提供する。
【００２１】
本発明のペプチド、株、化合物、組成物および上清は、ウシおよびヒツジの乳房炎の治療に用いることもできる。配列番号１および配列番号３は、抗菌ペプチドであるイスラシジンの切断産物に類似する。配列番号２も用いてよい。イスラシジンは、マウスあたり１０μｇ程度の低い用量で投与したときに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して強い防御効果を有すると記載され、ヒツジおよびウシの乳房炎の治療において以前に用いられたこともある。
【００２２】
αｓ１−カゼインの最初の９残基はチーズの作製において蓄積し、いくつかのチーズに存在する苦味の原因であるので（Ｆｏｘら、１９９５年、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｅｓｅ（Ｍａｌｉｎ，  Ｅ．  Ｌ．およびＴｕｎｉｃｋ，  Ｍ．  Ｈ．編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、５９〜９８頁）、本発明のペプチド、株、化合物、組成物および上清は、苦味チーズの製造における苦味に寄与するために用い得る（Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、１９９９年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８１号、４５９２〜４５９７頁）。
【００２３】
本発明のペプチド、株、化合物、組成物および上清は、上記のような配列番号１、配列番号３および配列番号２の広い範囲の活性のために、食品または腐敗しやすい商品の、病原性グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する防腐剤として用い得る。
【００２４】
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６は、ブタの小腸から単離され、コークのＤａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＤＰＲＣ），Ｔｅａｇａｓｃ  Ｍｏｏｒｅｐａｒｋ，Ｆｅｒｍｏｙ，Ｃｏ．に貯蔵されている新規な株である。イスラシジンまたはその断片の製造を示す細菌株は、以前に記載されていなかった。イスラシジンは、キモシンで処理したαｓ１−カゼインに由来した（ＨｉｌｌらＪ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９７４年；４１号：１４７頁）。このことは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６は、その天然の状態で、酵素を必要とせずに３つのペプチドＩＫＨＱＧＬＰＱＥ、ＶＬＮＥＮＬＬＲおよびＳＤＩＰＩＧＳＥＮＳＥＫを製造し、工業的なレベルで発酵プロセスの余分な経費を回避するので、経済的に有利である。イスラシジンのペプチド配列は、そのより長い鎖の長さのために、化学合成するには配列番号１、配列番号２および配列番号３よりも高価である。配列番号１、配列番号２、配列番号３はそれぞれ、より短い鎖長を有し、よって、化学合成がより安価である。
【００２５】
イスラシジンαｓ１−カゼインｆ（１−２３）は、溶液中で比較的安定な立体配置を維持するようである（Ｍａｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０号、３９１〜４０４頁）。立体配置が安定なペプチドは、アレルゲンに特徴的であることが知られており、αｓ１−カゼインのこのセグメントは、アレルゲン性であることが知られている（Ｓｐｕｅｒｇｉｎら、１９９６年  Ａｌｌｅｒｇｙ  ５１号、３０６〜３１２頁）。残基２０の周囲のαｓ１−カゼインの領域は、ヒトＩｇＥにより認識される重要なアレルゲン性エピトープを含むことが示唆されている（Ｓｐｕｅｒｇｉｎら、１９９６年）。さらに、配列番号３は、ヒトＩｇＥにより認識される重要なアレルゲン性エピトープを含むと考えられているαｓ１−カゼインの残基２０を欠失しているので、アレルゲン性エピトープを提示し得ない（Ｓｐｕｅｒｇｉｎら、１９９６年）。
【００２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの透過
イスラシジンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓに対する防御効果を示すことが示されている。配列番号１および配列番号３は、病原性乳腺炎原因株に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏでより大きい防御効果を示す。この理由は、より短い生物活性ペプチドが、よりよいｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すことであると仮定されている（Ｖｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  （２００４年）、９２号、３５７〜３６６頁）。
【００２７】
αｓ１−カゼインｆ（１−９）（ＲＰＫＨＰＩＫＨＱ）は、自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ）において抗高血圧効果を有することが示されている（Ｓａｉｔｏら、２０００年、Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、８３号、１４３４〜１４４０頁）。配列番号１は、最後の４アミノ酸（ＩＫＨＱ）と１００％の相同性を共有する。これは、ペプチドのＣ末端にプロリン、グルタミンおよびグルタミン酸も有する。ＡＣＥ活性は、Ｃ末端トリペプチド領域でのプロリンの存在により、非常に遅くなる（Ｖｅｒｍｅｉｒｓｓｅｎら、２００４年、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、９２号、３５７〜３６６頁）。この事象は、配列番号１がＡＣＥ阻害活性を有し得ることを示唆し、イスラシジンを２つのより短いペプチドに切断することの可能な利点を示唆する。
【００２８】
ある状況下では、イスラシジン耐性の機構は、配列番号１によっても配列番号３によっても提示されない分子の「抗原性」領域により媒介されると仮定されてもいる。
【００２９】
ラクトフェリシンＢのような他のカチオン性抗菌ペプチドは、プロテアーゼを産生するので、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのような耐性株を有することが知られており、このことは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによるマゲイニンのような他のカチオン性抗菌ペプチドに対する主要な耐性機構として示唆されている（Ｕｌｖａｔｎｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００３年）５０号、４６１〜４６７頁）。イスラシジンを本発明のペプチドの２つ、配列番号１および配列番号３に切断することは、イスラシジンに比較してより短いこれらの配列を切断できるプロテアーゼがより少ないので、耐性株の発生の可能性を低減させるようである（コンピュータプログラムｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ．ｐｌを用いて証明されるように）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
材料および方法
基質および化学薬品
ペプチドインドリシジンおよびセクロピンＰ１、ならびに酵素プロテイナーゼＫはＳｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ、ドイツシュタインハイム）から購入した。ピマリシンは、Ｍｅｒｃｋ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツダルムシュタット）から購入した。ペプチドイスラシジンは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．，（英国フェアラム）により合成された。Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＭＲＤ）は、Ｏｘｏｉｄ（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．，イングランドベイジングストーク）から購入した。ウシカゼインナトリウムは、Ｄａｉｒｙｇｏｌｄ（アイルランドコークミッチェルズタウン）からであった。パルスフィールド保証アガロースは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国ＣＡ９４５４７ハーキュリーズ）からであった。酵素Ａｐａ  Ｉおよび低分子量ＰＦＧマーカー（ＮＯ３５０Ｓ）は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（英国ハートフォードシャーＳＧ４  ＯＴＹ）から購入した。低融点アガロースは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニアリッチモンド）から購入した。
【００３１】
微生物および培養条件
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２およびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７は、ブタの小腸から単離し（データは未公表）、アイルランドコークのＴｅａｇａｓｃ  Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅの培養コレクションに貯蔵した。これらの株を、ＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ、英国ベイジングストーク）中で嫌気的に２４時間、３７℃にて増殖させた。標準培養物は、１０ｍｌのＭＲＳ培地に、１０μｌの冷凍ストック（−８０℃）を接種することにより調製し、次いで、３７℃にて１６〜２４時間インキュベートした。ＮＣＩＭＢ（ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア、スコットランドアバディーンＡＢ２４  ３ＲＹ）から購入したＬ．ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ  ５９２０（ＡＴＣＣ  １２８６８）、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ  ８２７２（ＮＣＴＣ８１５５）、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３（Ｔｅａｇａｓｃ  Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、アイルランドコーク）を、試験株として用いた。
スキムミルク寒天（ＳＭＡ）プレート上でのタンパク質分解活性の初期スクリーニング
ブタの腸起源の２０５種の細菌単離物ならびにヒト成人および幼児の糞便起源の５５種の単離物（データは未公表）を、以前に記載されたようにして（３６）ＳＭＡプレートを用いてタンパク質分解活性についてスクリーニングした。点在させた培養物の周囲の透明領域が、タンパク質分解を示した。直径４．０ｍｍ以上の領域を発生させる単離物を、さらなる研究のために選択した。
【００３２】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
ＳＭＡプレートを用いてタンパク質分解活性を示す単離物を、カゼインナトリウム溶液（２．５％ｗ／ｖ）に接種し（１％ｗ／ｖ）、嫌気的に３７℃にて一晩インキュベートした。次いで、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（サイズ；６００ｍｍ×７．５ｃｍ、Ｖａｒｉａｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニアウォルナットクリーク）を用いる高性能液体クロマトグラフィーを、得られた発酵生成物に対して行った。移動相は、トリフルオロ酢酸（０．１％ｖ／ｖ）含有のアセトニトリルとＨＰＬＣ等級の水（３０％ｖ／ｖ）との２成分混合物であった。流速は、１ｍｌ／分であった。ブタ腸単離物および幼児糞便単離物によるカゼインの分解を、ＨＰ１１００ダイオードアレイ検出器を用いて２１４ｎｍでのＵＶ吸収の測定により監視した。
【００３３】
パルスフィールドゲル電気泳動
ＭＲＳ培地からの１５種の単離物のそれぞれからの高分子量ＤＮＡの調製は、プラグスライスの制限消化のために２０Ｕの制限酵素ＡｐａＩを用いた以外は、Ｓｉｍｐｓｏｎら（４２）により以前に記載されたとおりであった。
株の種同定のための単離物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定
ブタの腸、ならびに幼児ヒトおよび成人の糞便の１５種の単離物は、著しいタンパク質分解活性を示すことが示され、個別の株の種同定のために１６ｓリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列決定に付した（Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，英国エセックス）。２つの１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマー、５’末端についてＣＯ１（５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）および３’末端についてＣＯ２（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴ−３’）を用いて、約１．５ｋｂの１６Ｓ  ｒＤＮＡ生成物を、以前に記載された（４２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下で作製した。このＰＣＲ生成物を、ＣＯ１プライマー（Ｌａｒｋ）を用いて部分的に配列決定した。ＢＬＡＳＴプログラムを用いることにより得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の比較により、株を特定の種に割り当てることが可能であった。通常、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の類似性の値がＢＬＡＳＴプログラムを用いて９７％を超えると、それらの株は同じ種に属すると考えられる（４４）。
【００３４】
ＧＲＡＳ株を用いる大規模発酵
タンパク質分解活性を示す１５種の単離物のうち、３種の遺伝的に別個の株であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７およびＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２を、それらのタンパク質分解能力に基づいて、およびそれらが全て一般的に安全であるとみなされているので（ＧＲＡＳ）、さらなる発酵に個別に用いた。３つの別々の発酵を、３回ずつ行った。カゼインナトリウム基質（２．５％ｗ／ｖ）に、各株（１％ｗ／ｖ）を接種し、１００ｒｐｍで混合しながら、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加により維持する一定のｐＨ７で、３７℃にて２４時間インキュベートした。発酵生成物を、次いで、８０℃に加熱して培養物を不活性化し、その後、サイズ排除Ｓ１Ｙ１０  １０ｋＤａらせんカートリッジフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ．，英国ハートフォードシャー）を通してろ過し、１０ｋＤａ未満のペプチドを分離した。これらのペプチドを含む画分を凍結乾燥し、さらなる使用まで−２０℃にて貯蔵した。
【００３５】
発酵生成物の逆相ＨＰＬＣ分析
サイズが１０ｋＤａ未満のペプチドを、狭い口径のカラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８、５ｍｍ×２５０ｍｍ：Ｖａｒｉａｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニアウォルナットクリーク）、および２１４ｎｍで作動するＵＶ検出器を含むＲＰ−ＨＰＬＣ逆相高性能液体クロマトグラフィーシステムを用いてカゼインナトリウム加水分解物から分離した。凍結乾燥粉末の一定量を、ＨＰＬＣ等級の蒸留水で希釈し、０．４５μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、３０ｍｇ／ｍｌの発酵生成物をカラムに添加した。移動相は、トリフルオロ酢酸（０．１％ｖ／ｖ）含有のアセトニトリルおよびＨＰＬＣ等級の水（１００％ｖ／ｖ）の２成分混合物であった。移動相中のアセトニトリル含量を、１ｍｌ／分の流速で、０から１００％まで７２分間で直線的に増加させた。ペプチドを、２１４ｎｍの波長で作動する検出器を用いて検出した。回収した画分から、セントリバップコンソール（ｃｅｎｔｒｉｖａｐ  ｃｏｎｓｏｌｅ）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カンザスシティ）を用いる蒸発により溶媒を除去した。画分を、その後の抗菌活性のアッセイの前に、１ｍｌの蒸留水に再溶解した。
【００３６】
タンパク質濃度の決定
画分のタンパク質濃度は、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイ法（２４）を用いて決定した。５９５ｎｍの吸光度を決定し、タンパク質濃度をｍｇ／ｍｌとして報告した。
【００３７】
抗菌活性
ペプチドおよび合成した画分の抗菌活性の予備的特徴付けは、９６ウェルアッセイでの成長阻害の測定（１、１０）、および寒天拡散法の使用（１６、３９）を含んだ。９６ウェルプレートアッセイは、各ペプチド画分単独の対照（セクロピンＰ１およびインドリシジン）とともに、ペプチド画分を含まない対照（増殖対照）を含んだ。細菌を含まない対照（無菌性対照）も含めた。プレートを３７℃にて６時間インキュベートし、培養成長を１時間ごとに監視した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、マイクロタイタープレートリーダーでのＯＤ６００を記録することにより測定される、認識可能な成長がない最低濃度とした。ウェル拡散アッセイ（１６、４０）を用いて、精製および化学合成したペプチドの抗菌活性を検出した。これらのアッセイは、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８）またはＥ．ｓａｋａｚａｋｉｉ８２７２（ＮＣＴＣ８１５５）の指示株の一晩培養物１ｍｌを播種した脳心臓浸出物（ＢＨＩ）、ルリアベルタニ（ＬＢ）または栄養寒天（ＮＡ）のいずれかで行った。直径４．６ｍｍのウェルを、これらの寒天プレート中に切り取って入れ、各ウェル中に３０μｌ（０．１６２ｍｇ／ｍｌ）のペプチド画分を入れた。プレートを４℃にて４時間貯蔵して、ペプチドの放射状の拡散を許容し、３０℃にて嫌気的にまたは３７℃にて好気的に２４時間インキュベートし、阻害領域について調べた。ペプチドに対する株の感度を、ウェルの周囲の阻害領域の直径に従って評点した。実験は、３回行い、平均の領域サイズを計算した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８）およびＥ．ｓａｋａｚａｋｉｉ８２７２（ＮＣＴＣ８１５５）についてイスラシジン、セクロピンＰ１、およびＬ．ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６に対してインドリシジンを対照として用いた。
【００３８】
抗菌ペプチドの精製、配列決定および合成
抗菌活性を示すタンパク質画分を、上記のＲＰ−ＨＰＬＣ条件により再分画し、指示株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３の成長を、市販のペプチドセクロピンＰ１と同様のタンパク質濃度で阻害した画分を回収して、３３７ｎｍで作動するレーザおよび２０ｋＶの加速電圧で飛行時間型マトリクス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を用いる質量分析（ＭＳ）により、ペプチド組成を分析した。各画分中のペプチドのアミノ酸配列を、誘導体化およびエドマン分解の後に決定した。これらのステップは、４９４Ａプロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。抗菌活性を示す各画分中の同定された全てのペプチド（ＭＳ分析およびアミノ酸配列決定により）を、その後、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．，（英国フェアラム）により化学合成した。合成ペプチドの純度は、製造者により証明されるようにＨＰＬＣ分析により決定して、９５％を超えていた。
化学合成ペプチドおよび粗画分のプロテイナーゼＫでの処理
化学合成ペプチドおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３に対して抗菌活性を示す画分を、プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）に対する感受性について、プロテイナーゼＫ（２０５０Ｕ／ｍｌ）とペプチドまたは画分（０．５５４ｍｇ／ｍｌ）との１：１の容量比での４℃で６時間のインキュベーションにより、寒天ウェル拡散アッセイ（４０）を用いて試験した。プレートを、３７℃にて２４時間インキュベートした。用いた陽性対照は、ペプチドイスラシジン（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．，）およびセクロピンＰ１（Ｓｉｇｍａ  ＴＭ）であった。
【実施例】
【００３９】
本研究の目的の１つは、哺乳動物の腸起源のＬＡＢのタンパク質分解能力を用いて放出されたウシカゼインから新規な生物活性ペプチドを発見することであった。ブタ小腸から得られた２０５種の単離物ならびにヒトの成人および幼児の糞便起源の５５種の単離物を、本研究において用いた。
【００４０】
タンパク質分解活性を有する単離物のスクリーニング
ＬＡＢ寒天プレートでの２６０種の単離物全てを、基質としてＳＭＡおよびカゼインナトリウムを用いてタンパク質分解活性についてスクリーニングした。ブタの腸起源の５種の単離物と、ヒトの幼児および成人の糞便起源の１０種の単離物を、それらのタンパク質分解能力およびカゼインナトリウムから１０ｋＤａ以下のペプチドを生じる能力に基づいて、選択した。１５種全ての単離物は、タンパク質分解活性を示す直径サイズ４ｍｍ以上の領域サイズを生じ、１５種全ての単離物の小規模カゼイン発酵生成物のＨＰＬＣ分析により、最も複雑なペプチドプロファイルが示された。ＰＦＧＥおよび１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定の後に、選択された１５種の単離物のうち、９種が乳酸桿菌の別個の種であると同定された（表１）。全てヒトの成人の糞便起源の５種の単離物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓと９９〜１００％の相同性を示し（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて）、よって、腸球菌は通常、安全とはみなされないので（ＧＲＡＳ）（２１）、大規模発酵でのさらなる使用には適さないと考えられた。単離物３Ｌ７および３３Ｌ１（ヒト幼児糞便単離物）は、それぞれＥ．ｈｉｒａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓと１００％の相同性を示し（ＢＬＡＳＴプログラム）、これらも、非ＧＲＡＳ状態のために、さらなる研究から排除した。９種の乳酸桿菌単離物のうちの３種は、ＰＦＧＥ（図１）および１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列決定により、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２およびＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７と同定された。
【００４１】
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７およびＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２のカゼインナトリウム（２．５％  ｗ／ｖ）での２４時間後のインキュベーション、ならびにその後の１０ｋＤａの膜を通してのろ過の後に得られたペプチドプロファイルを、図２に示す。これらの３種の乳酸桿菌でのカゼインナトリウムの発酵は、カゼインナトリウム（図２Ａ）のより低分子量のペプチド（図２Ｂ〜２Ｄ）への実質的な分解をもたらし、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６は、カゼインナトリウムのより小分子量のペプチドへの最大程度の分解を示した（表１）。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６は、得られたペプチドの６０．７４％が≦０．５ｋＤａ未満であり、１７．４９％が１〜０．５ｋＤａの間のペプチドであり、１１．５７％が１〜２ｋＤａの間のペプチドである発酵生成物を生じた。この株は、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７およびＬ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ＤＰＣ６０２８よりも０．５ｋＤａ〜２．０ｋＤａの間のペプチドをより多く製造した（表１）。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＰＣ６１００、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｒｉ  ＤＰＣ６０９３、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＣ６０９５およびＬ．ｂｒｅｖｉ  ＤＰＣ６１０２により製造されたＨＰＬＣペプチドプロファイルは、選択した株と同程度のカゼインナトリウムの分解を示さず（表１）（ＨＰＬＣプロファイルは示さず）、よって、さらなる研究のために選択しなかった。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＤＰＣ６１０４は、生物活性ペプチドの作製のためのその使用が以前に記載されているので、選択しなかった（１１）。
【００４２】
抗菌ペプチドの検出
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７およびＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２により製造されたカゼインナトリウム発酵生成物は、抗菌画分であった。しかし、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６から作製された画分のみを抗菌活性についてアッセイした。なぜなら、この株は、示したクロマトグラフィープロファイル（図２）から示されるように、３つの株のうちで最高のタンパク質分解活性により特徴付けられたからである。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８）およびＥ．ｓａｋａｚａｋｉｉ８２７２（ＮＣＴＣ８１５５）の株に対する９６ウェルプレートアッセイまたはウェル拡散アッセイのいずれかを用いて、粗発酵生成物の抗菌活性は検出されなかった。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６により製造されたカゼインナトリウム発酵生成物を、サイズ排除Ｓ１Ｙ１０  １０ｋＤａらせんカートリッジフィルタを通してろ過して、１０ｋＤａ以下のペプチドを含む透過物を得た。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６により製造されたろ過カゼインナトリウム発酵生成物の７２個の画分を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより回収して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８）、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ８２７２（ＮＣＴＣ８１５５）およびＬ．ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６に対する抗菌活性について、ウェル拡散アッセイによりアッセイした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３およびＬ．ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６に対するこれらの画分の抗菌活性は、９６ウェルプレートアッセイ法を用いてＯＤ６００を測定することによってもアッセイした。３つの画分、Ａ１−４５、Ａ１−４９およびＡ１−５４は、最も効力が高い抗菌活性を有し、それぞれ０．５５４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌおよび１．２４ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度を有していた。これらの全ての画分は、試験株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３に対して、それぞれこれらの濃度で阻害活性を示した。
【００４３】
ペプチドの精製、配列決定および特徴付け
画分Ａ１−４５、Ａ１−４９およびＡ１−５４中のペプチド混合物を、質量分析およびエドマン分解に付した。アミノ酸組成は、配列決定（Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によっても決定した。画分Ａ１−４５は、ペプチド配列ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（配列番号１）を含むことが見出された（表２）。このペプチド配列は、αｓ１−カゼインｆ（２１−２９）に相当する。画分Ａ１−４９は、αｓ１−カゼインｆ（１８３−２０７）に相当するペプチド配列ＳＤＩＰＮＰＩＧＳＥＮＳＥＫ（配列番号２）を含んでいた。Ａ１−５４は、αｓ１−カゼインｆ（３０−３７）に相当するペプチド配列ＶＬＮＥＮＬＬＲ（配列番号３）を含むことが見出された。各ペプチドの推定および計算された質量を報告する（表２）。寒天ウェル拡散アッセイにより決定されたように、画分４５に存在する配列番号１は、指示生物であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３を、０．０５ｍＭの濃度で阻害した（図３Ｂ）。このペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７派生株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５４およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５５）、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８）のような臨床対象の潜在的な病原細菌に対しても、同じ濃度（０．０５ｍＭ）で阻害を示した（図３Ｂ）。画分５４に存在する配列番号３は、指示生物であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３を０．２２ｍＭの濃度で（図３Ｃ）、また、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ  ＤＰＣ６０９１のような潜在的病原株を同じ濃度で阻害したが（図３Ｃ）、配列番号２を含む画分Ａ１−４９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６に対してわずかな阻害活性しか示さず、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３に対しては全く活性を示さなかった（表３）。
【００４４】
ペプチドの化学合成
強い抗菌活性を示し、かつ広い範囲の活性を有していた画分から同定されたペプチドを、化学合成して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により同定された配列が、画分中の抗菌配列であるかを確認した。これらは、αｓ１−ＣＮ  ｆ（２１−２９）（配列番号１）、αｓ１−ＣＮ  ｆ（３０−３７）（配列番号３）およびαｓ１−ＣＮ  ｆ（１８３−２０７）（配列番号２）であった。化学合成ペプチド配列番号１および配列番号３は、未精製のペプチドを含む画分と同じ微生物を阻害した。合成ペプチド配列番号２（画分Ａ１−４９に存在）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６に対していくらかの阻害活性を示したが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３に対しては活性を示さなかった（表３）。
【００４５】
これらのペプチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、イスラシジンを陽性対照として用いて決定した。イスラシジンは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３を、０．０５ｍＭ〜１．９ｍＭの範囲の濃度で阻害した（図４Ａ）。イスラシジンについてのＭＩＣは、記載される実験条件下では０．０５９ｍＭであると見出されたが、配列番号１についてのＭＩＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３の成長を阻害すると示された（図４Ｂ）０．０７８ｍＭであり、配列番号３は、この微生物を０．２２ｍＭ〜１．２ｍＭの範囲の濃度で阻害した（図４Ｃ）。配列番号３について得られたＭＩＣは、０．２２ｍＭであった。つまり、本発明は、驚くべきことに、全てが抗菌特性を有する３種の新規ペプチドを製造した。イスラシジンは、最良の標準物である陽性対照とみなした。配列番号１は、イスラシジンに好ましく匹敵するが、配列番号２および配列番号３は、同じ濃度では、効果が１桁小さい。しかし、より大きい濃度が必要であるが、配列番号２および配列番号３はともに、抗菌特性を明らかに示していた。
【００４６】
配列番号２および配列番号３に必要な濃度は、抗菌化合物として通常の濃度範囲内である。これらは、例えば、カソシジン−１、および望ましい組成物の濃度が０．１ｍｇ〜１ｍｇであると示すＵＳ６５７９８４９「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ」に記載されるペプチドによく匹敵する。Ｆｌｏｒｉｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ、２００３年、９号、１２５７〜１２７５頁は、イスラシジンが「比較的高濃度（０．１〜１ｍｇ／ｍＬ）ではあるが、乳酸桿菌および他のグラム陽性細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長を阻害することが見出された」と述べている。
【００４７】
アッセイ条件下では、全ての化学合成ペプチドおよび粗画分は、プロテイナーゼＫで処理したときにそれらの抗菌活性を喪失した。コンピュータプログラムＥｘｐａｓｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ．ｐｌ）を用いて、ペプチド配列ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（配列番号１）、ＶＬＮＥＮＬＬＲ（配列番号３）、ＳＤＩＰＩＧＳＥＮＳＥＫ（配列番号２）が全て、トリプシンおよびキモトリプシンにより加水分解されることが見出された。
【００４８】
考察
この研究において、カゼインナトリウムを、タンパク質分解株Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７およびＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２を用いてタンパク質分解に付した。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株を、発酵で用いるために選択し、生じたペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ＤＰＣ６０５３およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ  ＤＰＣ６０９０（ＡＴＣＣ１２８６８）のような潜在的病原株に対する抗菌活性についてアッセイした。
【００４９】
本研究で同定されたペプチド配列ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（配列番号１）、ＶＬＮＥＮＬＬＲ（配列番号３）およびＳＤＩＰＩＧＳＥＮＳＥＫ（配列番号２）は、抗菌活性について以前に報告されていない（８、４７）。
【００５０】
（Ｄｚｉｕｂａら、１９９９年（８））は、種々の供給源からの一連の生物活性ペプチドを含む生物活性データベースを参照している。データベースに含まれるペプチドは、抗菌ペプチド、アンギオテンシン−Ｉ変換酵素阻害ペプチド（ＡＣＥ−Ｉ阻害ペプチド）、オピオイドペプチドおよびブラディキニン増強ペプチドである。行った実験で病原菌に対する最良の陽性対照として用いたペプチド、イスラシジン（ペプチドデータＩＤ  ３０３５、名称イスラシジン、配列ＲＰＫＨＰＩＫＨＱＧＬＰＱＥＶＬＮＥＮＬＬＲＰ）は、このデータベースに詳述されている。
【００５１】
（Ｗａｎｇら、２００４年（４７））は、抗菌ペプチドデータベースのみについて詳述するが、イスラシジンについてはわずかしか述べていない。
【００５２】
研究の結論
牛乳タンパク質からの既知の抗菌ペプチドは、Ｒ１ＰＫＨＰＩＫＨＱＧＬＰＱＥＶＬＮＥＮＬＬＲＦ２３と決定された一次アミノ酸配列を有するイスラシジン、αｓ１−ＣＮ  ｆ１−２３である（２６）。このペプチドは、広い範囲の活性を有し（２３）、配列番号１および配列番号３との高い程度の相同性のために、本研究において陽性対照として用いた。配列番号１は、イスラシジンと９残基が共通し、配列番号３はイスラシジンのＣ末端と８残基が共通している。ペプチド配列番号１は、０．０５ｍＭのＭＩＣを示したイスラシジン、ならびにより効力が高い商業的に入手可能なペプチドであるセクロピンＰ１およびインドリシジン（０．０５ｍＭのＭＩＣ）に匹敵する０．０７８ｍＭのＭＩＣを示した。配列番号３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３に対して、イスラシジンのＭＩＣ（０．０５ｍＭ）に匹敵する０．２２ｍＭのＭＩＣを示した。配列番号１のペプチド（ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ）は、＋２の正電荷を含み、疎水性（イソロイシン）末端および親水性（グルタメート）ドメインを有し、かつＥ．ｓａｋａｚａｋｉｉおよびＥ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性細菌に対して、グラム陽性細菌よりもよい活性を示す。
【００５３】
抗菌ペプチドは、通常、５〜６０の間のアミノ酸を有し、１０ｋＤａ未満の分子質量を有し、通常、両親媒性であり、通常、広い範囲の活性を有する（Ｆｌｏｒｉｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２００３年）。配列番号３（ＶＬＮＥＮＬＬＲ）は、これらの特徴が共通している。
【００５４】
ペプチドのカチオン性および疎水性の二重の特徴が、ペプチドと細菌膜との最初の相互作用に重要であることが知られている。正電荷は、細菌の外膜および細胞質膜との相互作用を促進する（Ｗｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９９年）。アルギニン（Ｒ）の強い正電荷が、Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９９年  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：１３１７〜１３２３頁に記載されるように、配列番号３（ＶＬＮＥＮＬＬＲ）がグラム陰性細菌のリポ多糖領域と相互作用し、負に荷電した細胞質膜を透過することを可能にする。
【００５５】
配列番号３はまた、疎水性領域（ＶＬ）および親水性領域（Ｒ）も有する。これは、また、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａのようなグラム陽性株に対するよりも病原性グラム陰性細菌に対して、より強力な活性を示す。また、化学合成ペプチドも、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ  ＤＰＣ３３０６に対するよりもＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３のようなグラム陰性株に対してより強力な活性を示した。
【００５６】
ＬＡＢのプロテイナーゼは、β−ＣＮおよびαｓ１−ＣＮのペプチド結合の４０％より多くを加水分解して、オリゴペプチドを生じることが示されている（２２）。次いで、ＬＡＢの複合ペプチダーゼは、これらのオリゴペプチドに対して作用する（３１）。Ｍｉｎｅｒｖｉｎｉらは、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＰＲ４からの部分精製プロテイナーゼを用いるＡＣＥ阻害ペプチドの作製を報告した（３０）。このグループは、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方に対して活性を示したヒトβ−ＣＮ  ｆ（１８４−２１０）からの抗菌ペプチドも同定した。β−ＣＮ由来のいくつかのカソキニンは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＣＰ７９０の細胞壁会合セリン型プロテイナーゼにより、遊離されている（４９）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＣＡ−ＤＣ１７８からの細胞壁結合プロテイナーゼは、β−ＣＮから４つのペプチドを遊離させたが（４５）、これらのペプチドの生物活性は報告されていなかった。
【００５７】
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６は、カゼインに対するそのタンパク質分解能力、よって抗菌活性のような生物活性を有する多数のペプチドを作製するその能力を示した最初のアッセイに基づいて選択された。セクロピンＰ１は、ブタ小腸から単離されたペプチドであり、その活性の範囲が主にグラム陰性細菌に対するものであるので、対照として用いた（５）。
【００５８】
配列番号１、配列番号２および配列番号３の化学合成ペプチド、ならびにこれらのペプチドを含む画分は、プロテイナーゼＫで処理したときにその抗菌活性を失うことが見出された。トリプシンおよびキモトリプシンは、抗菌性粗画分で同定された化学合成ペプチドの全てを不活性化させた。Ｅｘｐａｓｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ．ｐｌ）を用いて、ウシαｓ１−ＣＮは、３つのエンドペプチダーゼおよびプロテイナーゼの組合せにより加水分解されて、抗菌ペプチド配列番号１および配列番号３を放出し得ることが見出された。プロリンエンドペプチダーゼは、ウシαｓ１−ＣＮを、Ｐｒｏ２０のＣ末端側で切断し、エンドペプチダーゼは、Ｇｌｕ２９のＣ末端側で制限する。この酵素の組合せが、ウシαｓ１−ＣＮから抗菌ペプチドＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（配列番号１）を放出させるようである。プロリン特異的ペプチダーゼの存在が、カゼインからのプロリンに富むオリゴペプチドを分解するそれらの能力のために、ＬＡＢの最適な成長に必要であり、プロリン特異的ペプチダーゼは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから以前に単離されている（２）。ウシαｓ１−ＣＮをＡｒｇ３７位で制限するＡｒｇ−Ｃプロテイナーゼと、ウシαｓ１−ＣＮをＧｌｕ２９位で制限するエンドペプチダーゼとの組合せが、抗菌ペプチドＶＬＮＥＮＬＬＲ（配列番号３）を放出させるようである。
【００５９】
理論に結び付けられることを望まないが、本明細書に記載される条件（０．１Ｍ  ＮａＯＨで維持されたｐＨ７、１００ｒｐｍ、３７〜４２℃）下で発酵に用いられたＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６が、αｓ１−ＣＮを、ペプチド配列番号１（ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ）および配列番号３（ＶＬＮＥＮＬＬＲ）および配列番号２（ＳＤＩＰＩＧＳＥＮＳＥＫ）に切断可能なＡｒｇ−Ｃプロテイナーゼのような酵素（プロテイナーゼおよびペプチダーゼ）の新規な酵素の集団を生み出すと考えられている。この仮定は、コンピュータプログラムｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ．ｐｌ、およびαｓ１−ＣＮを切断して配列番号１、配列番号２および配列番号３を製造できるという条件での酵素リストからの酵素を用いるαｓ１−Ｃｎの切断分析に基づいている。
【００６０】
ほとんどの抗菌ペプチドは、６〜５０の間のアミノ酸残基を有する（４８）。現在までに知られている最小の抗菌ペプチドは、ウシのラクトフェリシンから単離された配列Ｒ１ＲＷＱＷＲを有するヘキサペプチドと命名されている（４６）。ほとんどが＋２以上の正電荷を有し、疎水性および親水性の両方のドメインを有する両親媒性の構造に折り畳まれる（４７）。これらの特徴により、グラム陰性細菌のリポ多糖領域と相互作用し、負に荷電した細胞質膜を透過することが可能になる（１５）。
【００６１】
配列データのみから、ペプチドの活性またはそれが形成し得る二次構造のいずれも予測することは困難であり得る（４）。ジスルフィド架橋を欠くペプチド（ペプチドＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（配列番号１）およびＶＬＮＥＮＬＬＲ（配列番号３）のように）は、水中で無作為な構造を有し、膜に結合するかまたは自己凝集するときのみ、これらは構造を形成する（１０）。しかし、これらのペプチドのいくつかの特徴は、作用機序が、カチオン性および中性の抗菌ペプチドについて以前に記載されている機構である（１５、４８）細胞質膜を介する自己促進型取り込みとそれに続く細胞質膜バリアとの干渉とを含み得ることを示唆する。
【００６２】
特徴は、以下のことを含む（１）細菌の細胞質膜との最初の相互作用に重要なペプチドのカチオン性に寄与するアルギニンのような正に荷電したペプチド。（２）疎水性−これは、ペプチド配列番号１においてはアミノ酸イソロイシン、およびペプチド配列番号３においてはアミノ酸バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）によりもたらされる。本発明は、これらのペプチドの疎水性を増加させて、脂質アシル鎖と疎水性コアとの間の疎水性相互作用の増大によるこれらのペプチドの膜への結合を増加させることも提供する。
【００６３】
結論
本研究は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株がカゼインからの抗菌ペプチドの作製に適し、該抗菌ペプチドのＭＩＣ濃度が商業的に合成されたペプチド（セクロピンＰ１）および既知の抗菌ペプチドであるイスラシジンに匹敵するので（２２）、このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を用いて製造されたカゼインナトリウム発酵生成物を、抗菌性の利点を有する機能性食品の成分としてみなし得ることを示す。
【００６４】
本研究は、ウシαｓ１−カゼインを、本研究で単離された広い範囲の抗菌ペプチドの前駆体としてみなすことができ、最終的には、これらのペプチドが、Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉのような病原性細菌に対する組込まれた防御系として幼児調合乳製品に用いられる可能性を有し得ることも示す。
【００６５】
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ抑制効果を有するカゼインナトリウム粉末の製造方法の例
（１）カゼインナトリウム基質（５％ｗ／ｖ）に、（１％ｗ／ｖ）のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６を接種して、１００ｒｐｍで混合しながら、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加により維持する一定のｐＨ７で、３７℃にて２４時間インキュベートしてよい。この発酵生成物を、次いで、８０℃に加熱して培養物を不活性化し、これを次いで凍結乾燥して微細粉末を製造できる。
（２）カゼインナトリウム基質（５％ｗ／ｖ）に、（１％ｗ／ｖ）のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６を接種して、１００ｒｐｍで混合しながら、０．１Ｍ  ＮａＯＨの添加により維持する一定のｐＨ７で、３７℃にて２４時間インキュベートしてよい。
（３）この発酵生成物を、次いで、８０℃に加熱して培養物を不活性化し、その後、サイズ排除カラム１０ｋＤａを通してろ過して、１０ｋＤａ未満のペプチドを含む粉末を作製してよい。この下流の処理により、活性ペプチドの活性が増大する。１０ｋＤａ膜ろ過物を凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵して、真空包装する。
（４）上記のようにしてステップ（２）に従ってよいが、３ｋＤａ膜フィルタを用いて、ペプチド配列番号１および配列番号３の活性をさらに増大させてよい。
【００６６】
上記の粉末は、１０〜１５％の濃度で乾燥乳ベースの幼児用調合乳に加えて、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉでの汚染およびこの病原菌を原因とするその後の大腸炎および髄膜炎を予防できる。
【００６７】
上記のようにして製造されるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ抑制粉末は、特に、カゼインベースの乳児用調合乳製品に加えた場合に、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉおよびその他の病原菌に対する内部の組込まれた防御機構を提供する。
【００６８】
ある実施形態において、本発明のペプチドは、免疫無防備で早産の新生児の感染の顕著な原因であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ汚染に対する保護のために、乳ベースの幼児用調合乳の調製方法のための補助物質として別々または一緒に用い得る。
【００６９】
本発明のペプチドは、αｓ１−ＣＮ（カゼイン）の最初の９残基が切断に耐性であり、チーズの熟成において苦味に寄与すると記載されているので（Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、１９９９年）、チーズ製造における苦味に寄与するために用いることができる。
【００７０】
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６による、αｓ１−ＣＮ由来抗菌ペプチドの製造は、以前に報告されていない。作製されたペプチド配列は、種々の文献およびデータベース検索で見出されず、この点において新規であると考えられる。
【００７１】
本発明に関連して本明細書で用いる場合、「含み／含む」の語および「有する／含有する」の語は、記載する特徴、整数、ステップまたは成分の存在が、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分もしくはそれらの群の存在または追加を排除しないことを明記するために用いられる。
【００７２】
【数１】
2009516738.tif 000002
【００７３】
【数２】
2009516738.tif 000003
【００７４】
【数３】
2009516738.tif 000004
【００７５】
【数４】
2009516738.tif 000005
表１：１未満〜２０ｋＤａの間のペプチドのサイズを生じる乳酸桿菌株を用いて導かれるカゼインナトリウムタンパク質由来加水分解画分
【００７６】
【表１】
2009516738.tif 000006
表２：ヒトの幼児および成人の糞便単離物、ならびにブタ小腸単離物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定
【００７７】
【表２】
2009516738.tif 000007
ＤＰＣ；Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｔｅａｇａｓｃ  Ｍｏｏｒｅｐａｒｋ，Ｆｅｒｍｏｙ，Ｃｏ．アイルランド、コーク
ａ．Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種との相同性の百分率。
ｂ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種との相同性の百分率。
ｃ．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種との相同性百分率。
【００７８】
表３：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６により製造されたカゼインナトリウム加水分解物からの粗画分に含まれるペプチドの配列および対応するカゼイン（ＣＮ）断片
【００７９】
【表３】
2009516738.tif 000008
ａアミノ酸について１文字記号を用いる。
ｂ各ペプチドの推定質量について、平均質量を報告する。
【００８０】
表４：カゼインナトリウム中でのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６の発酵に続いて合成された純粋ペプチドの阻害範囲
【００８１】
【表４】
2009516738.tif 000009
ａ．Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、アイルランドコーク。
＋＋＋、直径２．０ｃｍを超える阻害の領域が生じた。
＋＋、直径１．５ｃｍを超える阻害の領域が生じた。
＋、直径１．０ｃｍを超える阻害の領域が生じた。
−、領域は検出されず。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】制限酵素ＡｐａＩについてのＰＦＧＥの巨視的な制限パターン。  パルス時間は、示すゲルについて１〜１５秒であった。レーン１は、低分子量ＰＦＧマーカー（１％  ＬＭＰアガロースに埋め込まれたラムダＤＮＡ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片およびラムダコンカテマーの混合物）、レーン２〜６は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７、Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ＤＰＣ６０２８およびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＤＰＣ６１０４を含んでいた。
【図２】ＧＲＡＳ株のタンパク質分解活性。  ウシカゼインナトリウム（Ａ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＤＰＣ６０９２（Ｂ）、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＤＰＣ６０２７（Ｃ）およびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６（Ｄ）での発酵後のそのカゼインナトリウム加水分解物の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のペプチドプロファイル。ＨＰＬＣは、２１４ｎｍにて２４時間監視した。試料３０μｌを、１ｍｌ／分の流速のＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ−１８（６００ｍｍ×７．５ｃｍ）に添加した。タンパク質分解は、室温で行った。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６は、カゼインナトリウムのほぼ完全な分解を示した（Ｄ）。
【図３】Ａ．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６と２４時間インキュベートしたｐＨ７でのカゼインナトリウムの逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラム。矢印は、ペプチド画分Ａ１−４５およびＡ１−５４の位置を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣは、室温で、材料および方法の部分に示す条件に従って行った。Ｂ．画分Ａ１−４５（基質としてのカゼインナトリウムおよびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株を用いて単離した）の、ペプチドが検出されたｍ／ｚ領域で記録された飛行時間型マトリクス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）スペクトル。ペプチド画分Ａ１−４５は、質量１０４９．４３のペプチドを含有することが見出され、これは、配列決定の後に、αｓ１−ＣＮ  ｆ（２１−２９）に相当するＩＫＨＱＧＬＰＱＥであるとわかった。１．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６でのカゼインナトリウム加水分解物の画分Ａ１−４５中で同定される化学合成ペプチドＩＫＨＱＧＬＰＱＥによるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３の阻害。寒天ウェル拡散アッセイ法を用いて、直径２．５ｃｍの領域を記録した。２．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６でのカゼインナトリウム加水分解物の画分Ａ１−４５中で同定される化学合成ペプチドＩＫＨＱＧＬＰＱＥによるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ５９２０（ＡＴＣＣ１２８６８２）の阻害。寒天ウェル拡散アッセイ法を用いて、直径２．０ｃｍの領域を記録した。Ｃ．画分Ａ１−５４（基質としてのカゼインナトリウムおよびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６株を用いて単離した）の、ペプチドが検出されたｍ／ｚ領域で記録された飛行時間型マトリクス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）スペクトル。ペプチド画分Ａ１−５４は、質量９７０．１１９のペプチドを含有することが見出され、これは、配列決定の後に、αｓ１−ＣＮ  ｆ（３０−３７）に相当するＶＬＮＥＮＬＬＲであるとわかった。１．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６でのカゼインナトリウム加水分解物の画分Ａ１−５４中で同定される化学合成ペプチドＶＬＮＥＮＬＬＲによるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３の阻害。寒天ウェル拡散アッセイ法を用いて、直径１．５ｃｍの領域を記録した。２．Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＰＣ６０２６でのカゼインナトリウム加水分解物の画分Ａ１−５４中で同定される化学合成ペプチドＶＬＮＥＮＬＬＲによるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ８２７２（ＮＣＴＣ８１５５）の阻害。寒天ウェル拡散アッセイ法を用いて、直径２．２ｃｍの領域を記録した。
【図４Ａ】Ａ．９６ウェルプレートアッセイを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３（ＬＢ培地で１：１０に希釈した一晩培養物）のＯＤ６００に対する種々の濃度のイスラシジンの影響。セクロピンＰ１を対照ペプチドとして用いる。記号：■、セクロピンＰ１（０．５２ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。−、何も添加しないＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３対照。◆、イスラシジン（１．９ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。×、無菌性対照（何も添加しないＬＢ培地）。●、０．２３ｍＭの濃度のイスラシジンとインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。Ｘ、イスラシジン（０．０５９ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３の生存度。
【図４Ｂ】９６ウェルプレートアッセイを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３（ＬＢ培地で１：１０に希釈した一晩培養物）のＯＤ６００に対する種々の濃度のペプチドＩＫＨＱＧＬＰＱＥの影響。記号：−、何も添加しないＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。Ｘ、ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（０．０７８ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。■、セクロピンＰ１（０．５２ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。●、ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（０．１５ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。・、ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（０．３１ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。◆、ＩＫＨＱＧＬＰＱＥ（０．６２５ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。ｘ、無菌性対照（何も添加しないＬＢ培地）。
【図４Ｃ】９６ウェルプレートアッセイを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３（ＬＢ培地で１：１０に希釈した一晩培養物）のＯＤ６００に対する種々の濃度のペプチドＶＬＮＥＮＬＬＲの影響。記号：Ｘ、何も添加しないＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。■、ＶＬＮＥＮＬＬＲ（０．２２ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。−、ＶＬＮＥＮＬＬＲ（０．４５ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。◆、ＶＬＮＥＮＬＬＲ（１．２ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。Ｘ、セクロピンＰ１（０．５２ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３の生存度。●、ＶＬＮＥＮＬＬＲ（２．５ｍＭ）とインキュベートしたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＰＣ６０５３。▲、無菌性対照−何も添加しないＬＢ培地。
【図１】
2009516738.tif 000010
【図２】
2009516738.tif 000011
【図３】
2009516738.tif 000012
【図４Ａ】
2009516738.tif 000013
【図４Ｂ】
2009516738.tif 000014
【図４Ｃ】
2009516738.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月30日(2008.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009516738000001.app
【国際調査報告】
2009516738.tif 000016
2009516738.tif 000017
2009516738.tif 000018
2009516738.tif 000019
2009516738.tif 000020