(57)【要約】  ｐＨインジケータ、重合性基、及びこれらの間のスペーサを含む、組成物。重合性基は、アクリレート又はメタクリレートであってよく、そしてスペーサは、オキシアルキル基、オキシプロピル基、又はオキシベンゾイル基であってよい。組成物は、指示用ポリマー及びオプトードを形成するために、重合してコポリマーにすることができる。
2009516030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨインジケータ；重合性基；及びこれらの間のスペーサを含む、組成物。
【請求項２】
該ｐＨインジケータが、ナイルブルー誘導体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該重合性基が、アクリレート又はメタクリレートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該スペーサがオキシアルキル基である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
該スペーサがオキシプロピル基である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
該スペーサがオキシベンゾイル基である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
構造：
【化１】
2009516030.tif 000004
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
構造：
【化２】
2009516030.tif 000005
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物を重合することによって形成される、ポリマー。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物を、重合性モノマーと共重合することにより形成される、指示ポリマー。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物とコモノマーとのコポリマーを含む、指示ポリマー。
【請求項１２】
該ｐＨインジケータがナイルブルー誘導体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
該コモノマーが、アクリレートとメタクリレートとから成る群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
該コモノマーが、メチルメタクリレートとデシルメタクリレートとを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
コモノマーが、ポリ(n-ブチルアクリレート)を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載のポリマーを含む、ｐＨを指示するためのオプトード。
【請求項１７】
さらに、自己可塑化ポリマーを含む、請求項１６に記載のオプトード。
【請求項１８】
さらに、グラフト型イオノフォアを含む、請求項１６に記載のオプトード。
【請求項１９】
粒子状オプトードであって：
ＮＢ１及びＮＢ２から成る群から選択された少なくとも１種の組成物を含む指示用ポリマーと；
ポリ(n-ブチルアクリレート)と
を含む、粒子状オプトード。
【請求項２０】
さらに、グラフト型イオノフォアを含む、請求項１９に記載の粒子状オプトード。
【請求項２１】
ｐＨインジケータ、スペーサ、及び重合性基を含むモノマーを用意し；そして
該モノマーとコモノマーとを合体させ；
コポリマーを形成するために、該モノマーとコモノマーとを重合する
ことを含む、標的イオンに対する選択性を有するコポリマーの製造方法。
【請求項２２】
該モノマーと該コモノマーとが、熱開始ラジカル溶液重合によって重合される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１１月１０日付けで出願された米国特許仮出願第６０／７３５，３１４号明細書の優先権を主張し、その内容全体を参考のため本明細書中に引用する。
【０００２】
連邦政府委託研究に関する声明
本発明は、National Science Foundationからの認可番号第ＢＩＯ８−００４−００、及びNational Institutes of Healthからの認可番号第ＤＥ１４５９０号及びＥＢ００２１８９号によって支援された作業の過程において為された。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
背景
本発明は、試料中の標的イオンを検出するシステム、及び臨床検査設備においてこのシステムを使用する方法に関する。
【０００４】
この出願全体を通して、種々の参考文献を括弧内に示す。本発明が関連する従来技術をさらに十分に記述するために、これらの刊行物の開示内容全体を、参考のため本明細書中に引用する。これらの参考文献の書誌的引用全体は、特許請求の範囲に先立つ、本出願の最後に見いだすことができる。
【０００５】
イオン分析における重要な検知プラットフォームは、バルク・オプトードであり、このオプトードは、好適な支持体上に塗布された高分子膜内部に捕捉された、選択的であり且つ親油性のイオノフォア、クロモイオノフォア、及びイオン交換体を含有する。クロモイオノフォアは、イオン選択的オプトード内で使用される、通常は親油性のｐＨインジケータである。このような色素は普通、十分な親油性（ｌｏｇＰTLC＞１０．６）、大きいモル吸光係数、高い化学・光安定性、及びＨ+に対する高い選択性を必要とする（１，２）。クロモイオノフォアは、これらの脱プロトン化形態の電荷に応じて、中性クロモイオノフォアと荷電クロモイオノフォアとに分類することができる。この２０年で、種々異なる塩基性を有する一連の親油性Ｈ+選択的クロモイオノフォアが合成された（２）。具体的な分析ニーズに対応する種々異なる測定範囲を有するオプトードを設計するために、親油性Ｈ+選択的クロモイオノフォアは、種々異なるイオノフォアと合体させることができる（２）。
【０００６】
これらのクロモイオノフォアの多くは、高親油性であり、一般用途に適している。しかし、これらのクロモイオノフォアに基づくオプトードは、親油性試料、例えば不希釈血清において短い寿命を示す。さらに、可塑剤及びその他のセンサ成分の浸出は、センサのサイズが低減されてマイクロメートル範囲（３）又はナノメートル範囲（４，５）のミクロ粒子になると、より劇的になる。さらに、このようなセンサを用いたin vivo測定における炎症性応答を防止するために、また、隣接するミクロスフェア間の交差汚染を回避するために、クロモイオノフォアを含む検知成分は、ポリマーマトリックス上に固定化される。
【０００７】
以前の研究では、クロモイオノフォアは官能化ポリ(塩化ビニル)上（６，７）、及びポリウレタンマトリックス上（８）に共有結合されているが、しかし、このようなポリマーは、可塑剤なしでは使用することができず、より長い応答時間をもたらす。他方において、ポリマー上への非発色性イオノフォアの固定化が、一層幅広く研究されている。Ｎａ+、Ｋ+、及びＰｂ+に対して選択的なイオノフォアは、ポリシロキサンマトリックスに共有結合的にグラフトされ、そしてＣＨＥＭＦＥＴセンサの製作に適用されている（９，１０）。
【０００８】
Kimuraは、イオノフォア及びイオン交換体を固定化するためにゾル・ゲル技術を導入した（１１，１２，１３）。イオノフォア・グラフトにおける別の方向は、一段階溶液重合法によって、重合性イオノフォアとブランク・ポリマーとを共重合することである。このタイプの手順は、２種の親水性クラウンエーテル・タイプのカリウム選択的イオノフォア、すなわち4'-アクリロイルアミドベンゾ-15-クラウン-5（ＡＡＢ１５Ｃ５）及び4'-アクリロイルアミドベンゾ-18-クラウン-6（ＡＡＢ１８Ｃ６）（１４，１５，１６）、ナトリウム選択的イオノフォア、すなわち4-tertブチルカリックス[4]アレーン四酢酸テトラエチルエステル（１７）、カルシウムイオノフォア、すなわちN,N-ジシクロヘキシル-N'-フェニル-N'-3-(2-プロペノイル)オキシフェニル-3-オキサペンタンジアミド（ＡＵ−１)（１６）、並びに重合性イオン交換体（１８）を、アクリルポリマー上に共有結合するために、利用される。この手順の簡潔さは、上記のほとんどの他の方法に勝る重要な利点となる。グラフト型イオノフォアを含有するこれらのポリマーは、遊離した未結合イオノフォアに基づくＩＳＥと比較して、比較可能な選択性及び改善された寿命を示した。
【０００９】
従来技術の欠点を取り除く、改善されたクロモイオノフォアが必要である。
【００１０】
概要
本発明は、１実施態様によれば、ｐＨインジケータ、スペーサ、及び重合性基を有する重合性組成物の合成に関する。重合性基は、アクリレート又はメタクリレートであることが可能である。スペーサは、オキシアルキル基、オキシプロピル基、又はオキシベンゾイル基であることが可能である。組成物は、図１に示すＮＢ１又はＮＢ２の構造を有することができる。
【００１１】
本発明はまた、１実施態様によれば、ｐＨインジケータ、スペーサ、及び重合性基を有する組成物と、コモノマーとのコポリマーを含む指示用ポリマーに関する。コモノマーは、アクリレート又はメタクリレートであることが可能である。任意には、コモノマーは、メチルメタクリレートとデシルメタクリレートとを含む。任意には、コモノマーは、ポリ(n-ブチルアクリレート)を含む。
【００１２】
本発明はまた、１実施態様によれば、ｐＨインジケータ、スペーサ、及び重合性基を有する組成物と、コモノマーとのコポリマーを有する指示用ポリマーを有するオプトードに関する。オプトードは自己可塑化ポリマーを有することもできる。オプトードはさらに、グラフト型イオノフォアを有することができる。任意には、オプトードは、粒子状オプトードである。
【００１３】
本発明はまた、１実施態様によれば、標的イオンに対する選択性を有するコポリマーの製造方法に関する。この方法は、ｐＨインジケータ、スペーサ、及び重合性基を含むモノマーを用意し；モノマーとコモノマーとを合体させ；そしてコポリマーを形成するために、モノマーとコモノマーとを重合する、ことを含む。モノマーとコモノマーとは、熱開始ラジカル溶液重合によって重合することができる。
【００１４】
詳細な説明
本発明は、１実施態様によれば、アクリル基を有する重合性ナイルブルー誘導体の合成、及び単純な一段階溶液重合による、ＭＭＡ−ＤＭＡ系又はｎＢＡ系ポリマー中でのクロモイオノフォアの共有結合に関する。
【００１５】
クロモイオノフォアは典型的には、プロトン化されたとき及び脱プロトン化されたときに、異なる吸光度スペクトル及び蛍光スペクトルを有し、親油性ｐＨインジケータとして作用する。バルク・オプトードの場合、クロモイオノフォアのプロトン化及び脱プロトン化の変化は、２つのイオンが膜相内に競合的に抽出されることによる標的イオンの活性の変化に関連する。
【００１６】
通常のイオン選択的センサにとって十分な親油性を提供するために、バルク・オプトードは長いアルキル鎖を含有する。しかし、センサの寿命を改善し、そしてin vivo測定中における親油性試料中への成分の浸出を排除するために、クロモイオノフォアを共有結合的にグラフトすることが重要である。本発明は、全てが高分子から成る材料を調製し、そしてこの浸出問題を排除するために、スペーサ及び重合性アクリル基と組み合わされたｐＨインジケータを有する重合性クロモイオノフォアに関する。
【００１７】
本発明の目的に適したｐＨインジケータは、高塩基性オキサジン色素分子ナイルブルーである。図１に示されたナイルブルー誘導体、例えばＥＴＨ ５２９４、ＥＴＨ ２４３９、ＥＴＨ ５３５０、ＥＴＨ ５４１８は当業者によく知られている。本発明に適し得る他のｐＨインジケータは、ニュートラル・レッド（トルイレン・レッド）；クロモイオノフォアＸ（ＥＴＨ４００４）、4-ジオクチルアミノ-4'-(トリフルオロアセチル)スチルベン；クロモイオノフォアＩＶ（ＥＴＨ２４１２）、5-オクタデカノイルオキシ-2-(4-ニトフェニルアゾ)フェノール；クロモイオノフォアＶＩ（ＥＴＣＨ７０７５）、4',5'-ジブロモフルオレセインオクタデシルエステル；及びクロモイオノフォアＶＩＩＩ（ＴＢＴＥ）、3',3'',5',5''-テトラブロモフェニルフタレインエチルエステルを含む。
【００１８】
本発明の目的に適したスペーサは、オキシアルキル、オキシプロピル、及びオキシベンゾイル基を含む。一般に、好適なスペーサは、炭素原子数が約２〜約１８の長さの炭素鎖を有する。
【００１９】
「重合性クロモイオノフォア」という用語は、クロモイオノフォアがコポリマーに共有結合されるようになるのを可能にする重合性基を有するクロモイオノフォアを意味する。重合性基は、クロモイオノフォアがコポリマーの反応性基、例えば炭素−炭素二重結合と反応して共有結合を形成するのを可能にするために必要となり、これにより、クロモイオノフォアは、コポリマー上に共有結合的にグラフトされるようになる。このような重合性基の一例としては、炭素−炭素二重結合、例えばアクリル及びメタクリル基、炭素−炭素三重結合、及びカルボニル基が挙げられる。
【００２０】
本明細書中に使用する「共有結合的にグラフトされたクロモイオノフォア」という用語は、共有結合を介してポリマーに結合されたクロモイオノフォアを意味する。
【００２１】
本発明による重合性クロモイオノフォアは、例えば下記例において記載した方法によって合成することができる。重合性クロモイオノフォアの形成方法は典型的には：（１）スペーサを重合性基に結合し；そして（２）例１に記載したように、ｐＨ指示用色素、例えばナイルブルー誘導体をスペーサに結合する。
【００２２】
「ポリマー」及び「コポリマー」という用語は相互交換可能に使用され、重合によって形成され、そして反復モノマー単位を含む化合物又は化合物の混合物を意味し、ポリマーは、１つのタイプのモノマー単位を含むことができ、又は２つ又は３つ以上の異なるタイプのモノマー単位を含有することもできる。
【００２３】
好ましいポリマーは、他の成分と混合できるように、そしてコンベンショナルな塗布方法によって塗膜に変換できるように、有機溶剤中の十分な溶解度を有することになる。ポリマーはさらにイオン透過性であるべきである。ポリマーの誘電定数は、１００Ｈｚ及び室温で、好ましくは２〜２５、特に好ましくは５〜１５である。光学的透明度は好ましくは約４００〜約１２００ｎｍであり、特に好ましくは約４００〜約９００ｎｍである。
【００２４】
好適なポリマーは、当業者に知られている。これらは、ホモポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、グラフトポリマー、及びポリマー合金であることが可能である。ポリマー合金の成分は、２種又は３種以上のポリマー成分の組み合わせであってよく、前記成分は、高いガラス転移温度と低いガラス転移温度とを有している。ガラス転移温度は、例えば、構造単位の極性及び鎖長及び含有率によって、調節することができる。ガラス転移温度は好ましくは、−１３０℃〜０℃である。Ｔg値が極めて低いポリマーは、通常の場合、著しく軟質であり、また機械的に取り扱うのがより難しい。Ｔgは典型的には、この目的において標準的な機器である示差走査熱量計を用いて、実験によって決定される。
【００２５】
ポリマーは、例えば、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリイミド、ポリエステルアミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリエステルウレタン、ポリ尿素、ポリウレタン尿素、及びポリシロキサンから成る群から選択することができ、ポリマーが、イオン化可能な塩基性基（例えばアミノ基）、又はイオン化可能な酸性基（例えばカルボキシル又はスルホニル基）を含有することが可能であり、これらの基は、親油性塩の対イオンの代わりとして使用されてよく、改善されたイオン輸送を提供することができる。
【００２６】
ポリオレフィンを調製するためのモノマーのいくつかの例は、Ｃ2−Ｃ12オレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、アクリル酸及びメタクリル酸のＣ1−Ｃ30エステル、アクリル酸及びメタクリル酸のＣ1−Ｃ30アミド、アクリルアミド及びメタクリルアミド、Ｃ1−Ｃ20カルボン酸のビニルエステル、アクリロニトリル、ブタジエン、イソプレン、クロロブタジエン、スチレン、α-エチルスチレン、塩化ビニル、フッ化ビニル、塩化ビニリデン、及びＣ1−Ｃ30アルコールのビニルエーテルである。
【００２７】
ポリエステル、ポリエステルアミド、及びポリアミドは好ましくは、Ｃ2−Ｃ12ジカルボン酸及びＣ2−Ｃ18ジオール又はジアミンから合成される。ポリイミドは好ましくは、Ｃ2−Ｃ18テトラカルボン酸及びＣ2−Ｃ18ジアミンから合成される。ポリエーテルは好ましくは、脂肪族Ｃ2−Ｃ12ジオール（1,2-又はα，ω-ライニング）、又はこれらのジオールとＣ8−Ｃ30ジグリシジルエーテルとの線状アダクトから合成される。ポリウレタン及びポリ尿素は好ましくは、Ｃ2−Ｃ18ジオール又はジアミン、及びＣ2−Ｃ20ジイソシアネート、及び／又はトリイソシアネートから合成される。ポリシロキサンは好ましくは、ジ(Ｃ1−Ｃ4)アルキルシリルジクロロシランである。
【００２８】
好ましい実施態様の場合、ポリマーは、種々異なるペンダント・アルキル基Ｒ1及びＲ2を有するメタクリレートモノマーのコポリマーを含み、Ｒ1は、Ｃ1-3アルキル基のいずれかであってよく、そしてＲ2は、Ｃ4-12アルキル基のいずれかであってよい。
【００２９】
本明細書中に使用する「アルキル」という用語は、炭素原子数１〜１２の飽和型の線状又は分枝鎖状の一価炭化水素基を意味し、アルキル基は任意には、下記１つ又は２つ以上の置換基で独立して置換されてよい。アルキル基の一例としては、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、及びイソヘキシルなどを含む。
【００３０】
本発明の実施態様によれば、好ましくはＲ1は、Ｃ1-2アルキル基であり、そしてＲ2は、Ｃ8-12アルキル基である。１実施態様の場合、本発明のメチルメタクリレート−デシルメタクリレート（ＭＭＡ−ＤＭＡ）コポリマーマトリックスを形成するために、メチルメタクリレートモノマーとデシルメタクリレートモノマーとが使用される。
【００３１】
本発明のメタクリレートモノマーは、例えばPolysciences, Inc.(Warrington, Pa.)から商業的に入手可能である。或いは、メタクリレートモノマーは、当業者に知られた標準的な方法によって、又は熱開始溶液を介して調製することができる。
【００３２】
１実施態様の場合、クロモイオノフォアモノマーは、重合性基を含み、そしてクロモイオノフォアは、クロモイオノフォアモノマーとメタクリレートコモノマー、例えばＭＭＡ及びＤＭＡモノマーとを共重合することにより、ポリマー鎖上に共有結合的にグラフトされる。このような実施態様の場合、コポリマーは、ＭＭＡ−ＤＭＡポリマー鎖内部に、固定化されたクロモイオノフォアのランダムな分布を含んでよい。
【００３３】
共有結合的にグラフトされたクロモイオノフォアを含む本発明のグラフトコポリマーは、当業者に知られた方法、又は本明細書中に記載された方法に従って形成することができる。例えば、１実施態様の場合、グラフトコポリマーは、本明細書において例３に詳細に記載されているように、メタクリレートモノマーと、重合性クロモイオノフォアとの混合物の、熱開始ラジカル溶液重合によって調製される。
【００３４】
或いは、クロモイオノフォアを共有結合的にグラフトするために、当業者に知られている他の方法を用いることもできる。例えば、グラフトコポリマーを調製するために、ゾル・ゲル技術を用いることができる。別のアプローチは、活性部位を有する既存のポリマー上にクロモイオノフォアを直接的にグラフトすることを伴う。さらに別のアプローチは、一方がグラフト型クロモイオノフォアを含有する２種の異なるポリマーを互いにブレンドすることを伴う。重合と、メタクリレートコポリマー上への重合性クロモイオノフォアの共有結合とを引き起こすために、メタクリル化モノマーと重合性クロモイオノフォアとを含有する溶液に、電子ビームを照射することもできる。
【００３５】
コポリマーの所期特性の所望の改善、例えばイオン選択性、より高速の応答・回復時間、及びより長い寿命を達成するために、十分な量の重合性クロモイオノフォアがコポリマーと合体される。このような特性は、よく知られた試験法によって定量測定することができる。
【００３６】
このような特性を著しく向上させるのに必要とされる重合性クロモイオノフォアの最適な量は、採用される成分の化学組成、構造、及び分子量、並びに達成されるグラフトの程度に応じて変化する。グラフトコポリマーは典型的には、ポリマーの量を基準として、例えば約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．１重量％〜約５重量％の量でクロモイオノフォアを含有する。しかし一般には、コポリマー１０００重量部毎に、少なくとも１重量部の重合性クロモイオノフォアを使用することが有利となる。
【００３７】
ポリマー組成物の成分の少なくとも部分的なグラフトを達成するために必要な条件は、個々の成分の反応性に応じて変化する。例えば、クロモイオノフォアが重合性アクリル基を含む場合、グラフト条件は、溶剤、例えばＥｔＯＡｃ中の熱又は光開始型共重合を含んでよい。グラフトコポリマーは、平均分子量が少なくとも５，０００，好ましくは少なくとも１０，０００、そして特に好ましくは少なくとも２０，０００ダルトン、例えば２０，０００〜２００，０００ダルトン、好ましくは５０，０００〜２００，０００ダルトンとなることが好都合である。
【００３８】
１実施態様の場合、特性又は性能特徴が改善されたブレンドを得るために、本発明のグラフトコポリマーは他のポリマーとブレンドし、混和し、又は合体させることができる。
【００３９】
例えば、ポリマー組成物は、ポリ(塩化ビニル)又はポリウレタン及び可塑剤、例えばビス(2-エチルヘキシル)セバケート（ＤＯＳ）又はo-ニトロフェニルオクチルエーテル（ＮＰＯＥ）とブレンドすると、機械的堅牢度が増大するという有益な効果を有する。ＰＶＣポリマー：グラフトポリマー組成物の相対比は、所望の通り変化してよく、好ましくは重量を基準として約９５：５〜約８０：２０であってよい。
【００４０】
本発明のグラフトポリマー及びブレンドポリマー組成物は、標的アニオンとイオノフォアとの相互作用を検出することができる種々のアニオン選択的センサにおいて使用するように適合させることができる。例えばグラフトポリマー及びブレンドポリマー組成物は、イオン選択的な膜、フィルム、又は粒子、例えばキャリヤをベースとするイオン選択的な電極（ＩＳＥ）、薄膜イオン特異的オプトード、粒子をベースとするオプトード、及びバルク・オプトードを製作するために使用することができる。
【００４１】
例えば、本発明の例４において記載された方法、又は当業者に知られた他の方法に従って、イオン選択的電極（ＩＳＥ）のポリマー膜を製作するために、本発明のグラフトポリマーを使用することができる。
【００４２】
本発明のポリマーは、薄膜イオン特異的オプトードにおいて使用されるべき薄膜を製作するために、又は当業者に知られている方法に従って、粒子をベースとするオプトードにおいて使用されるべきミクロスフェア粒子を製作するために使用することもできる。例えば、例５及び６において考察するように、溶剤流延技術又はスピン塗布技術によって、電極及びオプトードを調製することができる。
【００４３】
本発明によるクロモイオノフォアは、既知の、そして低廉な光源、例えばハロゲン又はキセノンランプ又は発光ダイオードの使用を可能にする好適な吸収波長範囲及び発光波長範囲を有する。採用することができる検出器の例は、光ダイオードである。蛍光分光法に加えて、他の光測定法、例えば吸収分光法を用いることもできる。
【００４４】
本発明のイオン検出センサは、全てのタイプの体液試料のイオンを検出するために使用することができる。試料の例としては、例えば全血、髄液、血清、尿、唾液、精液、涙液が挙げられる。体液試料は、薄めずに、又は希釈後又は緩衝剤による処理後にアッセイすることができる。
【００４５】
例
本発明は、下記例及び下記考察を参照すると、よりよく理解することができる。
【００４６】
試薬
4-ヒドロ安息香酸、塩化アクリロイル、塩化チオニル、N,N-ジメチルホルムアミド、四塩化炭素、2-カルボキシエチルアクリレート、トリエチルアミン及びビス4(2-オキソ-3-オキアゾリジニル)-ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）は、Aldrich (Milwaukee, WI)から入手された試薬等級であった。ナイルブルー塩化をStrem (Newburyport, MA)から入手した。合成のために使用された全ての溶剤は、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)から入手し、使用前にこれらを乾燥させた。モノマーであるメチルメタクリレート９９．５％、n-デシルメタクリレート９９％、n-ブチルアクリレート９９％を、Polysciences, Inc.(Warrington, Pa.)から得た。重合開始剤2,2'-アゾビスイソブチロニトリル９８％（ＡＩＢＮ）を、Aldrichから得た。エチルアセテート、ジクロロメタン、及び1,4-ジオキサンは試薬等級であり、Fisherから入手した。報告済の方法（１９）によって、モノマーから阻害剤を除去した。ＡＩＢＮは使用前に、高温メタノールから再結晶化した。9-(ジエチルアミノ)-5-オクタデカノイルイミノ-5H-ベンゾ[a]フェノキサジン（クロモイオノフォアＩ、ＥＴＨ ５２９４）、tert-ブチルカリックス[4]アレーン-テトラキス(N,N-ジメチルチオアセトアミド)（鉛イオノフォアＩＶ）、4-tert-ブチルカリックス[4]アレーン四酢酸テトラエチルエステル（ナトリウム・イオノフォアＸ）、ナトリウムテトラキス[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ボレート（ＮａＴＦＰＢ）、o-ニトロフェニルオクチルエーテル（ＮＰＯＥ）、ビス(2-エチルヘキシル)セバケート（ＤＯＳ）、高分子量ポリ(塩化ビニル)、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、及び全ての塩は、Fluka (Milwaukee, WI)から、Selectophore又はpuriss品質において購入した。
【００４７】
Nanopure精製水（１８ＭＱ ｃｍ）中に適切な塩化物を溶解することにより、水溶液を調製した。
【００４８】
例１
ＮＢ１の合成
工程１：５５ｍＬの水中２５ｍＬの四塩化炭素と９．２ｇのＮａＯＨとの混合物中に、１３．８ｇ（０．１モル）の4-ヒドロ安息香酸を溶解した。続いて、低温混合物に０．１２モルのアクリレート塩化物を液滴状に添加した。室温で６時間にわたって撹拌した後、反応混合物を希塩酸で中和した。結果として生じた沈殿物を濾過し、そして温水、希塩酸、及び水で洗浄した。粗生成物をエタノールから再結晶化した。白色の固形粉末を得た（収率９０％）。
【００４９】
工程２：９．６ｇ（０．０５モル）の4-アクリロイルオキシ安息香酸を、数滴のN,N-ジメチルホルムアミドを含有する３０ｍＬの塩化チオニルと、１０時間にわたって反応させ、次いで、減圧下で過剰塩化チオニルを除去することにより、対応する酸塩化物を提供した（収率８５％）。
工程３：１３ｍＬのＣＨ2ＣＬ2中の３１７ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の塩基性ナイルブルーの溶液に、２ｍＬのＣＨ2ＣＬ2中に溶解された２４２ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）の4-アクリロイルオキシベンゾイルクロリドを添加した。
【００５０】
室温で１５分間にわたって撹拌した後、反応混合物を５０ｍＬのＣＨ2ＣＬ2で希釈し、次いで５０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。有機相を濾過し、溶剤を蒸発し、そして残留物をフラッシュ・クロマトグラフィ（シリカゲル、エチルアセテート）によって、そしてエチルアセテートからの再結晶化によって精製することにより、３７０ｍｇ（０．６３ｍｍｏｌ、４０％）のＮＢ１を提供した。ＮＢ１の構造を1ＨＮＭＲによって確認した。
【００５１】
例２
ＮＢ２の合成
３０ｍＬの乾燥ＣＨ2ＣＬ2中2-カルボキシエチルアクリレート（０．７３６ｇ）及び塩基性ナイルブルー（０．５２９ｇ）の溶液に、撹拌しながら室温でＥｔ3Ｎ（０．８ｇ）を添加した。次いで、０．６１２ｇのＢＯＰ−Ｃｌを添加した。混合物を２４時間にわたって還流した。反応混合物を１０ｍＬの飽和型ＮａＨＣＯ3及び水で洗浄した。溶剤の分離及び蒸発後に有機相を得た。残留物をフラッシュ・クロマトグラフィ（１：５のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）を使用して精製した。溶剤の蒸発後に、固形物を３１％の収率で得た。ＮＢ２の構造を1ＨＮＭＲによって確認した。
【００５２】
例３
ポリマーの合成及び特徴付け
熱開始ラジカル溶液重合を介して、全てのポリマーを合成した。使用したメチルメタクリレート及びn-デシルメタクリレートの量は、前に報告されたものと同じであった（１６，２０）。グラフト型イオノフォアを含有するポリマーの場合、１重量％のナイルブルー誘導体（２０ｍｇ）、０．７８ｇのＭＭＡ、及び０．２０ｇのＤＭＡを、無水ＥｔＯＡｃ中に溶解した。５．１ｍｇのＡＩＢＮを添加する前に、溶液を２０分間にわたってＮ2でパージした。均一溶液を連続して撹拌し、そして温度を所定の勾配で９０℃まで上昇させ、これを１６時間にわたって維持した。反応が完了した後、溶剤を蒸発させ、そしてポリマーを１０ｍＬのジオキサン中に再溶解した。
【００５３】
ポリマー溶液のアリコート（２ｍＬ）を、強力に撹拌しながら１００ｍＬの蒸留水に添加した。沈殿物を捕集し、２５ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、続いて、無水ＮａＳＯ4で水を除去し、そして濾過した。溶液を蒸発させ、その結果生じたポリマーをメタノールで洗浄することにより、遊離イオノフォアの完全な除去を保証した。ポリマーを、周囲実験室条件下で乾燥させた（収率８０％）。グラフト型ポリマーを、報告されているように（２１，２２）、Ｈ1ＮＭＲによって特徴づけた。
【００５４】
グラフトされた色素の濃度を、Ｈ1ＮＭＲスペクトルから、４０ｍｍｏｌ／ｋｇであると推定した。n-ブチルアクリレートとの重合のために、１ｇのn-ＢＡを含有するＥｔＯＡｃ溶液を、３０分間にわたって９０℃で加熱した。反応温度を６０℃まで低下させ、そしてさらに１６時間にわたって、溶液に２５ｍｇのＮＢ２を添加した。この改変された手順は、色素の分解を防止するために用いた。上述のように、ポリマー（収率６０％）を精製して特徴づけた。グラフト型ＮＢ２の濃度を、1ＨＮＭＲスペクトルから、４０ｍｍｏｌ／ｋｇであると推定した。
【００５５】
例４
ＩＳＥ膜の調製及び測定
１．５ｍＬのＴＨＦ中１４０ｍｇの総カクテル塊を提供するように、クロモイオノフォア（１０ｍｍｏｌ／ｋｇ）、ＮａＴＦＰＢ（２ｍｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＶＣ、及び可塑剤（ＤＯＳ又はＮＰＯＥ）を溶解することにより、ＩＳＥ膜を調製した。グラフト型クロモイオノフォアを有する膜のカクテルは、２ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、グラフトされたインジケータ、ＰＶＣ及び可塑剤（ＤＯＳ又はＮＰＯＥ）を含む１０重量％ＭＭＡ−ＤＭＡを含有した。カクテルをガラス顕微鏡スライド上に固定されたガラス・リング（内径２．２ｃｍ）内に注いだ。
【００５６】
溶剤を一晩蒸発させることにより、透明な膜を提供した。親膜を、次いでｐＨ緩衝溶液中で少なくとも１２時間にわたって状態調節した。ｐＨ滴定のために、緩衝溶液は、１Ｍ標準ＨＣｌによってｐＨ１．５に調節された指示濃度（１０ｍＭ又は０．１ｍＭ）のＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸、及び１０ｍＭホウ酸であるか、又はバックグラウンドとしてのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液である。溶液は、０．１Ｍ標準ＮａＯＨ溶液で滴定し、そして試料ｐＨをモニターするために、ｐＨ電極を使用した。与えられた全ての試験結果は、計算された標準偏差を伴う、少なくとも３つの電極の平均値である。
【００５７】
グラフト型クロモイオノフォアのｐＫａを測定するために、サンドイッチ膜法（２３，２４）を用いた。一方の単一親膜は、ＰＶＣ−ＤＯＳ、ＰＶＣ−ＮＰＯＥ、又はＭＭＡ−ＤＭＡポリマー中に１０ｍｍｏｌ／ｋｇのクロモイオノフォアと、５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢとを含有するのに対して、他方のセグメントは、同じマトリックス中にＮａＴＦＰＢだけを含有した。グラフト型イオノフォアの場合、一方の単一膜は、ＰＶＣ−ＤＯＳ、又はブランクＭＭＡ−ＤＭＡ中に１．５ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢと、１０重量％のＭＭＡ−ＤＭＡ−ＮＢポリマーとを含有するのに対して、他方の膜は、ＰＶＣ−ＤＯＳ、又はブランクＭＭＡ−ＤＭＡポリマー中に同じ量のＮａＴＦＰＢを含有した。親膜を、クエン酸−ホウ酸緩衝溶液中で一晩にわたって条件調節した。
【００５８】
全ての膜電極電位測定を、１Ｍ ＬｉＯＡｃブリッジ電解質を有するＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対する無撹拌塩溶液（条件調節・内部充填溶液と同一）中で実験室周囲温度で行った。
【００５９】
例５
オプトード膜の調製及び測定
オプトード薄膜をスピン塗布によって調製した。カクテルは、ＴＨＦ中に溶解された遊離クロモイオノフォア、又はグラフト型クロモイオノフォア、ＰＶＣ，及び可塑剤を含有した。２００μＬアリコートのカクテルを、スピン塗布装置内に配置された石英ディスク上にシリンジを用いて移した（１）。結果として生じた２〜３μｍ厚の膜を、種々異なる溶液中で平衡させた。
【００６０】
以前に報告されているように（３，２５）、ＨＰ８４５２Ａダイオード・アレイ分光光度計を用いて、吸光度スペクトルを記録し、そして、蛍光顕微鏡法及び分光法によって、蛍光スペクトルを記録した。ＮＢ１及びＮＢ２のモル吸収効率（ｅ）をメタノール中で測定した。ＭｅＯＨ中２ｍＬの２ｘ１０ＭのＮＢ１又はＮＢ２を、１ｃｍ石英セル内に入れた。先ず３μＬの１Ｍ ＮａＯＨを、次いで１０μＬの１Ｍ ＨＣｌを添加することにより、それぞれクロモイオノフォアのプロトン化形態及び脱プロトン化形態を得た後で、吸収スペクトルを報告した。
【００６１】
Ｐｂ2+選択的な三成分薄膜をベースとするオプトードの場合、５重量％のＮＢ１−ＭＭＡ−ＤＭＡ、８．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、１８．６ｍｍｏｌ／ｋｇのＰｂ（ＩＶ）イオノフォア、及びＰＶＣ−ＤＯＳ（１：２）を含有する、全部で３００ｍｇの膜成分を、１．７５ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。Ｎａ+選択的な三成分薄膜をベースとするオプトードの場合、５重量％のＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ、１０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａＴＦＰＢ、２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＮａ（Ｘ）イオノフォア、及びＰＶＣ−ＤＯＳ（１：２）を含有する、全部で３００ｍｇの膜成分を、１．７５ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。
【００６２】
上記と同じスピン塗布装置及び蛍光顕微鏡によって、薄膜を調製し、そして特徴づけた。全てのデータポイントは、計算された標準偏差を伴う、５つの測定値の平均である。
【００６３】
例６
粒子の調製及び測定
可塑剤を含まないミクロスフェアを、以前に記載された高スループット粒子キャスティング装置（２５）を用いて調製した。カクテルは、２．０９ｍｇ（５３ｍｍｏｌ／ｋｇ）のＮａイオノフォア（Ｘ）、０．７５ｍｇ（２１ｍｍｏｌ／ｋｇ）のＮａＴＦＰＢ、ＰｎＢＡ（１０ｍｍｏｌ／ｋｇ）中１１ｍｇのグラフト型ＮＢ２、及び１．５ｍＬのシクロヘキサノン中に溶解された２５．４ｍｇのブランクＰｎＢＡを秤量することにより調製した。混合物をボルテックス混合器内で３０分間にわたって振盪し、次いで、静かに撹拌しながら２５ｍＬのジクロロメタンにこれを液滴状に添加した。
【００６４】
０．５ｍＬのキシレンを添加した後、溶液を０．４５μｍのGelmanフィルタを通して濾過し、そして気密なHamiltonシリンジに移した。ポリマーコア溶液を含有するシリンジを、シリンジポンプ（Stoelting, Wood Dale, IL）上に取り付け、そして０．２９ｍＬ／分の速度で流れるように設定した。４３ｍＬ／分の速度で流れるシース液体流として使用される脱イオン水を、圧力調節器を介して制御した。周波数発生器は、１１．９〜１２．３ｋＨｚの設定値で動作させる。
【００６５】
内径１．０ｍｍ及び壁厚０．１５ｍｍのホウケイ酸ガラス・マイクロ毛管を、応答時間測定のために使用した。捕集された粒子の５０Ｌアリコートを、毛管セル内部にピペットで入れ、次いで、粒子を数時間にわたって沈降させておいた。毛管の各端部に、ポリエチレン管を取り付け、そして毛管を０．１ｍＬ／分の速度で動作する蠕動ポンプに接続した。その後、蛍光顕微鏡（３，２６）による測定を３０〜６０秒毎又はこれよりも長い間隔で行った。
【００６６】
例の検討
第１の重合性クロモイオノフォアＮＢ１は、アクリロイルオキシベンゾイル基に結合された高塩基性オキサジン色素分子ナイルブルーの誘導体である。ＮＢ１系のイオン選択的電極（ＩＳＥ）膜のｐＨ応答を先ず調べた。遊離ＮＢ１を含有するＩＳＥ膜を調製した。しかし、このクロモイオノフォアは、不十分な親油性に基づき、緩衝剤と接触する状態調節工程中に、膜から浸出することが判った。
【００６７】
従って、エチルアセテート中のＮＢ１、ＭＭＡ及びＤＭＡの溶液重合によって、また開始剤としてＡＩＢＮを用いて、ＮＢ１グラフト型ポリマーを調製した。溶液が無色のままになり、またポリマー中の未反応遊離ＮＢ１の除去を示すまで、精製されたポリマーを洗浄した。１重量％のＮＢ１を含有するポリマーを、1Ｈ−ＮＭＲによって特徴づけた。アクリレート基の二重結合に対応するδ＝６．５〜７．４ｐｐｍ付近での信号の消失は、ポリマー中に残された遊離色素がないことを裏付けた。イオノフォアがグラフトされたＭＭＡ−ＤＭＡポリマーと、他のポリマー、例えば可塑化ＰＶＣとをブレンドすると、このことは、センサ応答に対して顕著な影響を示さないが、しかしＩＳＥ膜の機械的安定性を改善できることが、以前に報告されている（１６）。この研究において、ＩＳＥ膜における初期評価のために、同じブレンド法が採用された。ここでは、１０重量％のグラフト型ＮＢ１−ＭＭＡ−ＤＭＡを、９０重量％のＰＶＣ及びＤＯＳ（１：２質量比）と混合することにより、ＩＳＥ膜を調製した。状態調節中及び測定中には、色素の浸出は観察されなかった。
【００６８】
図２Ａ及び２Ｂは、結果として生じた膜の、記録されたｐＨ応答を示す。ネルンスト応答が、３未満のｐＨでのみ見いだされた。対応するＰＶＣ−ＮＰＯＥ膜の場合、ｐＨ範囲約１〜５でネルンスト応答が見いだされた。ＮＰＯＥ膜のより広い応答範囲は、ＮＰＯＥ系膜内の色素のより高いｐＫａ値と一致する。この傾向は以前に報告されており、クロモイオノフォアの測定範囲及びｐＫａ値は、異なる可塑剤と共に変化する（２，２４）。
【００６９】
グラフト型ＮＢ１をベースとする膜のカチオン選択性を、０．１Ｍ ＮａＣｌバックグラウンドにおけるｐＨ応答曲線を測定することによる固定干渉法（２７）に従って測定した。Ｎａ+に対するＨ+の対応対数選択係数は、ＰＶＣ−ＤＯＳに関してはｌｏｇＫH,Napot＝−３．１として、またＰＶＣ−ＮＰＯＥに関してはｌｏｇＫH,Napot＝−５．３として計算した。
【００７０】
相対的に小さなイオン選択性、及び狭いｐＨ応答範囲は、他の報告されているナイルブルー誘導体とは著しく異なる。これは、クロモイオノフォアの低いｐＫａ値、又はナトリウム・イオン干渉に対する顕著な結合親和力によって説明することができる。新しい色素ＮＢ１のｐＫａ値は、一般に使用されるクロモイオノフォア、例えばＥＴＨ５２９４よりも低いことが予想される。ＮＢ１におけるカルボキシル基及びベンゾイル基は、強い電子求引効果を有し、そしてジエチルアミノ基の窒素上の電子密度を減少させる。この窒素上の電子は、ＥＴＨ５２９４よりも大きく非局在化されており、そして色素の塩基性を減少させる。
【００７１】
膜ブレンド中のグラフト型ＮＢ１の見かけｐＫａ値は、いわゆるサンドイッチ膜法によって、ＰＶＣ−ＤＯＳに関しては４．４２±０．０５と測定され、またＰＶＣ−ＮＰＯＥに関しては７．１２±０．０２と測定された。これらのデータは、グラフト型ＮＢ１を含有する膜の測定範囲を概ね説明するように見えるが、しかしＮＢ１内のエステル官能性は、以前の研究（８，２０）と同様に、何らかのアルカリ金属結合に部分的に関与することもある。
【００７２】
図３Ａは、ＴＨＦ溶液中の脱プロトン化形態及びプロトン化形態を成すＮＢ１の吸光度スペクトルを示し、それぞれ５１０ｎｍ及び５６０／６４０ｎｍで最大値を示す。ＮＢ１の吸光度スペクトルは、ＥＴＨ５２９４の吸光度スペクトルと極めて類似している。バルク・オプトードにおいて使用されるクロモイオノフォアが、高いモル吸収係数（ε)を必要とすることが報告されている。モル吸収係数（ε)は、参考文献（２）に従って測定して、メタノール中、２．９ ｘ １０4Ｌ ｍｏｌ-1ｃｍ-1（６６０ｎｍ、プロトン化形態）、及び２．２ ｘ １０4Ｌ ｍｏｌ-1ｃｍ-1（５１０ｎｍ、脱プロトン化形態）であると見いだされた。これらの値は、ナイルブルー誘導体にとって典型的である。
【００７３】
ＮＢ１の低いｐＫａ値は、低い試料ｐＨで遷移金属イオンを測定するための光学センサにおいてＮＢ１を極めて魅力的にする。例えば、ｐＨ４の水溶液における鉛イオンの蛍光検出が、バルク・オプトード（２６）とともに以前に報告された。蛍光測定に基づく光学センサは、吸光度モードに基づくオプトードと類似の組成を有するが、しかし蛍光活性ｐＨインジケータを必要とする。
【００７４】
アゾ色素ＥＴＨ５３１５は、オプトード膜において５．５のｐＫａを示し、酸性溶液中の重金属検出に適することになる。残念ながら、これは極めて貧弱な蛍光特性を示す。ナイルブルー誘導体は通常、蛍光性なので、ｐＫａ値８．８のＥＴＨ５４１８が、鉛測定のための代替物として選択された。残念ながら、蛍光に基づく測定のためにＥＴＨ５４１８を使用するためには、内部フィルターによるアプローチの開発が必要となる。それというのもＥＴＨ５４１８の塩基性形態は発光性ではないからである。従って、付加的な親油性基準色素が必要となる。図３Ｂは、それぞれ０．０１ＭのＨＣｌ溶液及び０．０１ＭのＮａＯＨ溶液と接触したＭＭＡ−ＤＭＡポリマー中のグラフト型ＮＢ１の蛍光スペクトルを示す。６４０ｎｍ及び６８０ｎｍにおける発光ピークは、色素の脱プロトン化形態及びプロトン化形態に対応する。
【００７５】
ポリマーマトリックス中のグラフト型ＮＢ１の蛍光スペクトルは、従って、一般的な色素ＥＴＨ５２９４の蛍光スペクトルとほとんど同一である。ＮＢ１のこれらの魅力的な蛍光特徴、及びその低いｐＫａは、ＮＢ１を、酸性媒質中の鉛又は他の遷移金属イオンを測定するのに好適にする。この点を推定するために、鉛イオンのための光学センサを製作した。今日まで報告されているほとんどの場合、完全に可塑剤のないメタクリレートコポリマー・オプトード膜は、可塑化ＰＶＣ膜よりも低速の拡散挙動、及び長い応答時間を示した（２８）。許容できる程度に高速の応答時間（＜１５分）は、イオノフォア（ＡＵ−１）が共有結合された１０重量％のＭＭＡ−ＤＭＡをＤＯＳ−ＰＶＣと混合すると得られた（２８）。従って、ここでは、Ｐｂ+オプトードは、ＭＭＡ−ＤＭＡ中のＰｂ−イオノフォア（ＩＶ）、イオン交換体ＮａＴＦＰＢ、グラフト型ＮＢ１（５重量％）と、ＰＶＣ−ＤＯＳ（１：２質量比、９０重量％）とを含有した。
【００７６】
オプトード機能を評価するために採用される検知原理は、イオン交換メカニズム：
２ ＩｎｄＨ+(ｏｒｇ)＋ｎ Ｌ(ｏｒｇ)＋Ｐｂ2+(ａｑ)＋２Ｒ-(ｏｒｇ)＝＝
２ Ｉｎｄ(ｏｒｇ)＋ＬnＰｂ2+(ｏｒｇ)＋２Ｈ+(ａｑ)＋２Ｒ-(ｏｒｇ)
（１）
に基づく（２９）。
【００７７】
ここで、それぞれ、Ｉｎｄは中性クロモイオノフォアであり、Ｌはイオノフォアであり、そしてＲ-は、カチオン交換体である。有機検知相及び水性相は、(ｏｒｇ)及び(ａｑ)として示される。オプトード膜が鉛イオンと接触すると、鉛イオンは膜内に抽出され、そしてその過程において、膜内部の電気的中性を保つために、水素イオンを駆出する。膜からのプロトン放出の結果であるフルオロイオノフォアのプロトン化の程度の変化は、その蛍光特性の測定可能な変化をもたらす。実験で入手可能な脱プロトン化クロモイオノフォアのモル分率αの関数として与えられた、イオン交換平衡に基づく膜の応答は、
【数１】
2009516030.tif 000003
として提供される（２９）。
【００７８】
ここでＬT、ＣT、及びＲT-はそれぞれ、イオノフォア、クロモイオノフォア、及び親油性イオン交換体の総濃度であり、ＺIは、被分析物の電荷であり（ここではＺI＝２）、ｎは、複素化学量論値であり（ここではｎ＝１）、そしてｋexchは、イオン交換定数である(ｅｑ２とする）。
【００７９】
図４は、試験データが、ｅｑ２で計算された理論応答曲線（実線）に十分に対応することを示す。ｐＨ４．７における動的な鉛（ＩＩ）測定範囲は、Ｐｂ（ＩＩ）のｌｏｇ ｋexchが−４．３であるとして、１０-7Ｍ〜１０-3Ｍであることが見いだされた。これは、ＥＴＨ５４１８（それぞれＰＶＣ−ＤＯＳ及びＰＶＣ−ＮＰＯＥ中でｐＫａ＝８．６及び１１．７、（２４））に基づく別の鉛オプトード（２６）の場合の−２．４の対数イオン交換定数と同等である。
【００８０】
中性ｐＨで動作することができる、共有結合的にグラフトされたクロモイオノフォアを有する光学センサを実現するために、第２の重合性クロモイオノフォアＮＢ２を合成した。遊離溶解されたＮＢ２を含有するＩＳＥ膜に対して明らかな浸出が観察されないので、遊離ＮＢ２は、ＮＢ１よりも高親油性であることが判った。ＰＶＣ−ＤＯＳ膜及びＰＶＣ−ＮＰＯＥ膜における遊離ＮＢ２のｐＨ応答が、図５Ａ及び図５Ｂに示すように測定された。
【００８１】
ＮＢ２系の膜は、ＤＯＳ膜に関してはｐＨ６〜１０、ＮＰＯＥ膜に関してはｐＨ５〜１１のネルンスト応答範囲をもたらした。Ｎａ+に対するＨ+の対数選択係数は、遊離ＮＢ２を含有するＤＯＳ膜に関しては−１０．３、そして遊離ＮＢ２を含有するＮＰＯＥ膜に関しては＜−１１であることが見いだされた。サンドイッチ法によって測定されたＤＯＳ膜及びＮＰＯＥ膜における遊離ＮＢ２のｐＫａ値は、１０．１０±０．０２（ＤＯＳ）及び１２．４９±０．０２（ＮＰＯＥ）であった。これらの値は、それぞれ同じ方法を用いたＥＴＨ５２９４のｐＫａ値（１１．４及び１４．８）よりも僅かに小さい。この相違は、ＥＴＨ５２９４中には存在しないＮＢ２中のエステルの誘導効果によって引き起こされ得る。
【００８２】
上で用いられたのと同じ溶液重合法によって、ＮＢ２を、ＭＭＡ−ＤＭＡポリマーマトリックス内に共有結合的にグラフトした。図６は、ＰＶＣ−ＤＯＳ又はＰＶＣ−ＮＰＯＥとブレンドされたグラフト型ＮＢ２系膜のｐＨ応答を示す。ネルンストｐＨ応答範囲は、ＤＯＳ膜に関してはｐＨ３〜８、そしてＮＰＯＥ膜に関してはｐＨ４〜９であることが見いだされた。サンドイッチ法によって測定されたＤＯＳ膜及びＮＰＯＥ膜内の遊離ＮＢ２の見かけｐＫａ値は、９．２±０．０２（ＤＯＳ）及び１１．２４±０．０２（ＮＰＯＥ）であった。
【００８３】
グラフト型ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ膜の場合、Ｎａ+に対するＨ+の対数選択係数は、ＤＯＳ膜に関しては−８．８、そしてＮＰＯＥ膜に関しては−９．３であることが見いだされた。遊離ＮＢ２を含有する膜と比較した、僅かに減少した選択性は、エステル官能性に由来する何らかのイオン結合特性を有するメタクリレート・タイプのコポリマーの影響によって部分的に説明することができる。図７Ａに示すように、ＮＢ２の吸光度特性をＴＨＦ溶液中で特徴づけた。ＮＢ１及びＥＴＨ５２９４と同様に、ＮＢ２はまた、脱プロトン化形態の場合、５５０ｎｍでピークを示し、またプロトン化形態の場合６１０／６７０ｎｍでピークを示す。メタノール中のＮＢ２のε値は、３．５ x １０（６６０ｎｍ、プロトン化形態）、及び２．８ x １０4（５５０ｎｍ、脱プロトン化形態）であると測定された。これらの値は、ＥＴＨ５２９４に関して報告された値（２）と極めて近い。
【００８４】
図７Ｂは、ＨＣｌ溶液及びＮａＯＨ溶液と接触した遊離ＮＢ２系ＰＶＣ−ＤＯＳ膜の蛍光スペクトルを表す。６４０ｎｍ及び６８０ｎｍにおけるピークは、それぞれ色素の脱プロトン化形態及びプロトン化形態の発光最大値に相当する。ポリマーマトリックス中のＮＢ２の蛍光スペクトルはまた、ＥＴＨ５２９４の蛍光スペクトルとほとんど同一である（３，３０）。
【００８５】
これらの結果は、共有結合が、クロモイオノフォアの蛍光特性を変化させないこと、そしてグラフト型ＮＢ２を、中性ｐＨで測定されるオプトードを用いた蛍光比の検出のためのＨ+−フルオロイオノフォアとして使用できることを示している。例５において、Ｎａ選択的オプトード薄膜を調製した。膜は、ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ、ナトリウムイオノフォアＮａ−Ｘ及びＮａＴＦＰＢを含有した。オプトード機能を評価するために採用される検知原理は、上記のものと同じ塩基性イオン交換メカニズムに基づく（ｅｑ２においてＺI＝１及びｎ＝１）。
【００８６】
Ｎａ+に対するオプトード膜の応答曲線、及び対応する選択性挙動が図８に示されている。データポイントは、標準偏差を表すエラーバーを伴う平均実験値（ｎ＝３）に対応する。実線は、ｅｑ２に基づいた理論曲線を描く。ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ膜で観察された応答曲線は、理論上予測される挙動に十分に対応し、このことは、フルオロイオノフォアがその共有結合状態において十分に機能的で有り続けることを裏付ける。観察されたイオン交換定数は、ｌｏｇ ｋexch＝−４．５であることが判り、この値は、同じＮａイオノフォアとイオン交換体とを含有するが、しかしより塩基性のクロモイオノフォアであるＥＴＨ５２９４を含有する膜に対応する−６．３（実験値）と同等である。２つのｌｏｇ ｋexch値の差は、ｐＫａ値の差によく対応する。図８において破線で示されているように、マグネシウム、カリウム、及びナトリウム・イオンが全て良好に識別される。ナトリウム曲線と同じｐＨの１Ｍカチオン塩化物塩溶液中で、選択性を特徴づけた。カリウム、マグネシウム、及びカルシウム・イオンに対するナトリウムの対数選択係数は、それぞれ−２．０３、−２．９７、及び−３．０７であることが判った（クロモイオノフォアの半プロトン化において）。これら３つの干渉イオンのそれぞれの対数値は、文献の値（３１，３２）に良好に対応する。
【００８７】
過去の研究において、完全に可塑剤のないメタクリレートコポリマー・オプトード膜はしばしば、可塑化ＰＶＣ膜よりも低速の拡散挙動、及び著しく長い応答時間を示した。ＭＭＡ−ＤＭＡから成るミクロスフェアの応答時間は、１２時間もの長さであることが判った（２８）。応答時間を短縮するために、可塑剤無しのセンサを調製するための「内部可塑剤」としてポリn-ブチルアクリレート（ＰｎＢＡ）を使用することができる。その低いＴｇ及び高い流動性により、ＰｎＢＡは単独では、ＩＳＥ膜を形成するのに適さず、他の、Ｔｇがより高いポリマーと一緒に使用されなければならない。しかしながら、ポリ(n-ブチルアクリレート)は、可塑剤無しのミクロスフェアの調製には適していることが見いだされ、拡散はこのマトリックス中で迅速に生じる。
【００８８】
例６において、ＮＢ２がグラフトされたポリ(n-ブチルアクリレート)を、ＥｔＯＡｃ中でＮＢ２とn-ブチルアクリレートとの共重合によって調製した。結果として生じたＰｎＢＡ粒子を、以前に記載された高スループット粒子キャスティング装置（２５）を用いて大量に製作した。図９は、ナトリウム・イオンに対するＰｎＢＡ粒子の蛍光応答を示す。粒子は、イオノフォアＮａ−Ｘ、ＮａＴＦＰＢ、ＮＢ２−ＰｎＢＡ、及びブランクＰｎＢＡを含有した。粒子の応答を、上述の類似のスピン塗布膜の応答と比較する。各データポイントは、１０の測定値の平均であり、実線は、ｅｑ２に基づく理論上予測される応答である。
【００８９】
粒子は、薄膜をベースとするオプトードと同じ選択シーケンスを有する。交換定数及び選択性も、薄膜オプトードに極めて類似しており、このことは、粒子が薄膜と完全に類似して機能することを示唆する。図１０は、ガラス毛管セルの底部に堆積され、そしてナトリウム・イオン濃度を変化させる流動流れにおいて特徴付けられる単一の検知粒子の典型的な応答時間を示す。図１０に見られるように、１０μｍ粒子の平衡応答は、事実上１０分以内に達成され、この応答時間は、以前に報告された１２時間と比較して劇的に短縮され、多くの臨床用途及び生物医学用途にとって許容できるものである。
【００９０】
２種の重合性ナイルブルー誘導体（ＮＢ１及びＮＢ２）を合成した。これらの誘導体は、確立済のナイルブルー誘導体ＥＴＨ５２９４と同様の吸光度及び蛍光スペクトルを示す。２種の色素の間の構造的な変化は、幅広く異なるｐＫａ値、及び結果として生じる検知膜の測定範囲の大きなシフトをもたらす。ポリマーマトリックス中に色素が共有結合されると、この新しい材料は、イオン選択的オプトードにおけるｐＨインジケータ及びフルオロイオノフォアとして成功裡に使用することができる。
【００９１】
ＮＢ１−ＭＭＡ−ＤＭＡは、低いｐＫａ値と２つの蛍光発光ピークとを示し、そして、低いｐＨ値及び／又は低い被分析物濃度で動作する遷移金属選択的オプトードを製作するために、ＥＴＨ５４１８よりも適したクロモイオノフォアであると思われる。ＰＶＣ−ＤＯＳ又はＮＰＯＥとブレンドされたＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡは、より大量のイオン（特にアルカリ金属イオン及びアルカリ土類金属イオン）の測定のために近中性ｐＨで使用されるイオン・オプトードを調製するのに適している。
【００９２】
より高速の応答時間を有するポリマーを調製するために、ＮＢ２をＰｎＢＡと共重合することもできる。グラフト型ＮＢ２を含有し、且つ可塑剤を含有しない最初に報告された疎水性バルク・オプトードを、ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡを使用して調製し、このオプトードは、高速応答時間と共に、古典的なオプトード理論に基づいて機能的なＮａ+応答を示した。一般的な干渉、例えばＣａ、Ｋ+、及びＭｇ+に対して観察される選択性は、高いことが判った。
【００９３】
特定の好ましい実施態様を参照しながら本発明をかなり詳細に説明してきたが、他の実施態様も可能である。従って、添付の特許請求の思想及び範囲は、本明細書中に記載された好ましい実施態様の記述内容に限定されるべきではない。
【００９４】
特許請求の範囲、要約、及び図面を含む本明細書中に開示された全ての特徴、並びに、開示された任意の方法又はプロセスにおける工程全ては、このような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが互いに排他的であるような場合の組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。特許請求の範囲、要約、及び図面を含む本明細書中に開示されたそれぞれの特徴は、特に明示的な定めのない限り、同一、同等、又は類似の目的のために役立つ代わりの特徴によって置き換えることができる。従って、特に明示的な定めのない限り、開示されたそれぞれの特徴は、包括的な一連の同等又は類似の特徴の一例に過ぎない。
【００９５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
添付の図面を参照すれば、本発明がよりよく理解される。
【図１】図１は、Ｈ+−クロモ及びフルオロイオノフォアとして利用可能な、商業的に入手可能なナイルブルー誘導体、並びに本発明の実施態様に従って調製されるＮＢ１及びＮＢ２を示す概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施態様に従って調製されるＮＢ１−ＭＭＡ−ＤＭＡ系ＰＶＣ−ＤＯＳ膜の電位差測定ｐＨ応答を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施態様に従って調製されるＮＢ１−ＭＭＡ−ＤＭＡ系ＰＶＣ−ＮＰＯＥ膜の電位差測定ｐＨ応答を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭｅＯＨ中のプロトン化形態及び脱プロトン化形態を成す遊離ＮＢ１の吸光度スペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＭｅＯＨ中のプロトン化形態及び脱プロトン化形態を成す遊離ＮＢ１の蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】図４は、グラフト型ＮＢ１−ＭＭＡ−ＤＭＡ、Ｐｂ−イオノフォア（ＩＶ）、ＮａＴＦＰＢ、ＰＶＣ、及びＤＯＳを含有するＰｂ2+−選択的オプトード膜の蛍光応答曲線を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、遊離溶解されたＮＢ２を含有するＰＶＣ−ＤＯＳ膜の電位差測定ｐＨ応答曲線を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、遊離溶解されたＮＢ２を含有するＰＶＣ−ＮＰＯＥ膜の電位差測定ｐＨ応答曲線を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、グラフト型ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ系ＰＶＣ−ＤＯＳ膜の電位差測定応答を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、グラフト型ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ系ＰＶＣ−ＤＯＳ膜の電位差測定応答を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭｅＯＨ中のプロトン化形態及び脱プロトン化形態を成す遊離ＮＢ２の吸光度スペクトルを示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭｅＯＨ中のプロトン化形態及び脱プロトン化形態を成す遊離ＮＢ２の蛍光スペクトルを示す図である。
【図８】図８は、ｐＨ７．４における、ナトリウム（開いた円）、マグネシウム、カリウム、及びカルシウムイオンに対する、ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ、Ｎａ（Ｘ）、及びＮａＴＦＰＢを含有するオプトード膜の蛍光応答曲線、及び観察された選択性を示すチャートである。
【図９】図９は、ナトリウム・イオンに対する、ＮＢ２−ＭＭＡ−ＤＭＡ、ポリ(n-ブチルアクリレート)、Ｎａ（Ｘ）、及びＮａＴＦＰＢを含有する１０μｍ直径のオプトード・ミクロスフェアの蛍光応答曲線、及び選択性を示すチャートである。
【図１０】図１０は、ガラス毛管セルの底部に堆積され、そしてナトリウム・イオン濃度を変化させる流動流れにおいて特徴付けられる図９の単一の検知ミクロスフェアの典型的な応答時間を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2009516030.tif 000022
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