(57)【要約】本発明は、IL-17A単独、またはIL-17Aポリペプチド分子およびIL-17Fポリペプチド分子の両方の活性を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和することに関する。IL-17AおよびIL-17Fは、炎症プロセスおよびヒト疾患に関与しているサイトカインである。IL-17RAは、IL-17Aの受容体であり、かつ、IL-17Fにも結合する。本発明は、切断型の可溶性IL-17RA、ならびにそのような切断型の可溶性受容体を用いて、IL-17AまたはIL-17AおよびIL-17Fの両方に拮抗するための方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO：5を含む、単離された可溶性受容体ポリヌクレオチド。
【請求項２】
SEQ ID NO：5からなる、請求項1記載の単離された可溶性受容体ポリヌクレオチド。
【請求項３】
SEQ ID NO：6を含む可溶性受容体ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
可溶性受容体ポリペプチドがSEQ ID NO：6からなる、請求項3記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO：6を含む第1のサブユニットを含む、単離された可溶性受容体。
【請求項６】
第2のサブユニットを含み、サブユニットがポリペプチドリンカーによって相互に連結されている、請求項5記載の可溶性受容体。
【請求項７】
IL-17AまたはIL-17Fの炎症誘発性活性を減少させる、請求項5記載の可溶性受容体。
【請求項８】
IL-17AおよびIL-17Fの両方の炎症誘発性活性を減少させる、請求項5記載の可溶性受容体。
【請求項９】
ポリペプチドリンカーが、約100個〜240個のアミノ酸残基を有する、請求項6記載の可溶性受容体。
【請求項１０】
IL-17Aによって誘発される炎症またはIL-17Fによって誘発される炎症を軽減させる方法であって、炎症を有する哺乳動物に、炎症を軽減させるのに十分な量の請求項1〜9のいずれか一項記載の可溶性受容体の組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項１１】
IL-17Aによって誘発される炎症およびIL-17Fによって誘発される炎症を軽減させる方法であって、炎症を有する哺乳動物に、炎症を軽減させるのに十分な量の請求項1〜9のいずれか一項記載の可溶性受容体の組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項１２】
IL-17AまたはIL-17Fがある役割を果たしている炎症性疾患に苦しむ哺乳動物を治療する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項記載の可溶性受容体を投与する段階を含み、IL-17AまたはIL-17Fのいずれかの炎症性活性が減少する方法。
【請求項１３】
IL-17AおよびIL-17Fがある役割を果たしている炎症性疾患に苦しむ哺乳動物を治療する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項記載の可溶性受容体を投与する段階を含み、IL-17AおよびIL-17Fの炎症性活性が減少する方法。
【請求項１４】
疾患が喘息である、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
疾患が、内毒素血症、敗血症、トキシックショック症候群、または感染症を含む急性炎症性疾患である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
IL-17RA活性に関連する、対象における病理学的状態を治療する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項記載の可溶性受容体の有効量を投与し、それによって、該病理学的状態を治療する段階を含む方法。
【請求項２０】
病理学的状態が喘息である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
病理学的状態が慢性炎症性状態である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
慢性炎症性状態が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、または乾癬を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
病理学的状態が急性炎症性状態である、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
急性炎症性状態が、内毒素血症、敗血症、トキシックショック症候群、または感染症を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
IL-17RAがある役割を果たしている炎症性疾患に苦しむ哺乳動物を治療する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項記載の可溶性受容体を含み、炎症性活性が減少する、方法。
【請求項２６】
疾患が喘息である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
疾患が慢性炎症性疾患である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、アトピー性皮膚炎、または乾癬を含む慢性炎症性疾患である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
疾患が急性炎症性疾患である、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
疾患が、内毒素血症、敗血症、トキシックショック症候群、または感染症を含む急性炎症性疾患である、請求項29記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
サイトカインは、多くの細胞型の増殖および分化の調節を含む様々な生物学的作用を媒介する、可溶性の小型タンパク質である(例えば、Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59：783(1990)（非特許文献1）、Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3：311(1991)（非特許文献2）、Paul and Seder、Cell 76：241(1994)（非特許文献3）を参照されたい)。サイトカイン群を構成するタンパク質には、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、および他の調節分子が含まれる。例えば、ヒトインターロイキン-17は、インターロイキン-6、細胞内接着分子1、インターロイキン-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現、およびプロスタグランジンE2発現を刺激し、かつ、CD34+造血前駆体の好中球への優先的成熟においてある役割を果たしているサイトカインである(Yao et al., J. Immunol. 155：5483(1995)（非特許文献4）、Fossiez et al., J. Exp. Med. 183：2593(1996)（非特許文献5）)。
【０００２】
サイトカインに結合する受容体は、典型的には、高い親和力でサイトカインに結合し、かつ、特定の受容体サブユニットの細胞質内部分を介して、この結合事象を細胞に伝達する、1つまたは複数の内在性膜タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、細胞外のリガンド結合ドメインの類似性に基づいて、いくつかのクラスにグループ分けされている。
【０００３】
サイトカインおよびそれらの受容体の実証されたインビボ活性により、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインアゴニスト、およびサイトカインアンタゴニストの臨床上の可能性およびそれらの必要性が例示される。例えば、炎症誘発性サイトカインファミリーの実証されたインビボ活性により、炎症誘発性分子のアンタゴニストの並外れた臨床上の可能性およびそれらの必要性が例示される。
【０００４】
【非特許文献１】Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59：783(1990)
【非特許文献２】Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3：311(1991)
【非特許文献３】Paul and Seder、Cell 76：241(1994)
【非特許文献４】Yao et al., J. Immunol. 155：5483(1995)
【非特許文献５】Fossiez et al., J. Exp. Med. 183：2593(1996)
【発明の開示】
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症誘発性サイトカインIL-17AおよびIL-17Fに対するアンタゴニストを提供することによってこれらの必要に取り組む。具体的には、本発明のアンタゴニストは、SEQ ID NO：6に示す操作された変種である(ポリヌクレオチドはSEQ ID NO：5に示す)。SEQ ID NO：6に示す変種ポリペプチドは、otPAプレプロシグナル配列と共にFc5に融合されたIL-17RAのエキソン7〜10を含む。IL-17RA変種はまた、ネイティブなIL-17RAシグナル配列を有してもよく、かつ、Fc10に融合されてよい。具体的には、炎症誘発性サイトカインIL-17AおよびIL-17Fは、高度の配列類似性を有し、多くの生物学的特性を共有し、かつ両方とも、活性化T細胞によって産生される。これらは両方とも、関節リウマチおよび喘息を含む、様々な自己免疫性疾患および炎症性疾患の進行をもたらす因子として意味付けられている。実際に、IL-17A機能を打ち消す反応物は、ヒト疾患のいくつかのマウスモデルにおいて疾患の発生率および重症度を有意に改善する。IL-17Aは、その同族受容体であるIL-17受容体(IL-17RA)、およびIL-17Fに対するIL-17RAとの相互作用を介してその作用を実現する。以前に、本発明者らは、IL-17RAが、IL-17AおよびIL-17Fの両方に対する受容体であり、かつ、同様の高い親和力で両方に結合することを報告した。その一方で、IL-17RAは、高い親和力でIL-17Aに結合するが、非常に低い親和力でIL-17Fに結合する。これと一致して、可溶型のIL-17RAが、いずれかの受容体を発現する細胞においてIL-17A結合およびシグナル伝達を妨害するが、IL-17RAへのIL-17Fの結合にも機能にも干渉しないことが示されている。したがって、本発明は、短縮型のIL-17RA可溶性受容体が、IL-17A、およびおそらくはIL-17Fを妨害するのに使用され得ることを決定した。IL-17A介入は、いくつかの自己免疫疾患に対する有効な療法として提案されているため、このような切断型の可溶性受容体を使用することにより、より長い可溶性受容体の免疫原性にまつわる懸念に対処できる可能性がある。したがって、本発明は、IL-17A、IL-17F、またはIL-17AおよびIL-17Fの両方の活性を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和し得る、SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：6において本明細書で説明する切断型の可溶性受容体のようなIL-17RAアンタゴニストを対象としている。本発明はさらに、炎症性疾患におけるその使用、ならびに関連する組成物および方法も提供する。
【０００６】
A)概要
免疫に関連した疾患および炎症性疾患は、正常な生理においては、傷害または損傷に応答し、傷害または損傷からの修復を開始し、かつ、外来の生物に対抗する先天性防御および後天性防御を始めるのに重要である、かなり複雑で、しばしば複数の相互に連結した生物学的経路の症状発現または結果である。疾患または病状は、これらの正常な生理学的経路が、応答の強度に直接関連して、異常な調節もしくは過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、またはこれらの組合せとして、さらなる傷害または損傷を引き起こす場合に生じる。
【０００７】
これらの疾患の起源は、多くの場合、多段階経路、および、しばしば複数の異なる生物学的系/経路を含むが、1つまたは複数のこれらの経路中の重要な点への介入は、改善効果または治療的効果を有し得る。治療的介入は、有害なプロセス/経路への拮抗または有益なプロセス/経路の刺激のいずれかによって起こり得る。
【０００８】
多くの免疫関連疾患が公知であり、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫介在性炎症性疾患(関節リウマチ、免疫介在性の腎疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、および喘息など)、非免疫介在性炎症性疾患、感染症、免疫不全疾患、新形成などが含まれる。
【０００９】
Tリンパ球(T細胞)は哺乳動物の免疫応答の重要な構成要素である。T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)内の遺伝子によってコードされる自己分子と結合している抗原を認識する。抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片などの表面にMHC分子と共に提示され得る。T細胞系は、宿主哺乳動物に健康上の脅威を与えるこれらの改変細胞を排除する。T細胞には、ヘルパーT細胞および細胞障害性T細胞が含まれる。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞上の抗原-MHC複合体を認識した後に、大規模に増殖する。また、ヘルパーT細胞は様々なサイトカイン、すなわちリンホカインも分泌し、これは、B細胞、細胞障害性T細胞、および免疫応答に関与する様々な他の細胞の活性化において中心的な役割を果たす。
【００１０】
体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方における中心的事象は、ヘルパーT細胞の活性化およびクローン増殖である。ヘルパーT細胞の活性化は、T細胞受容体(TCR)-CD3複合体と抗原提示細胞の表面上の抗原-MHCとの相互作用により開始される。この相互作用は、休止ヘルパーT細胞を誘導して細胞周期に移行させる(G0からG1に移行)生化学的事象のカスケードを媒介し、その結果、IL-2、および時にはIL-4に対する高親和性受容体の発現をもたらす。活性化されたT細胞は、周期を通じて発展して増殖し、かつ、記憶細胞またはエフェクター細胞に分化する。
【００１１】
TCRによって媒介されるシグナルに加えて、T細胞の活性化は、抗原提示細胞によって放出されるサイトカインによって、または抗原提示細胞およびT細胞上の膜結合型分子との相互作用を通じて誘導される付加的な同時刺激も伴う。サイトカインIL-1およびIL-6は、同時刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面に発現されるB7分子とT細胞表面で発現されるCD28分子およびCTLA-4分子との相互作用も、T細胞活性化をもたらす。活性化T細胞は、数の増加した細胞接着分子、例えば、ICAM-1、インテグリン、VLA-4、LFA-1、CD56などを発現する。
【００１２】
混合リンパ球培養物または混合リンパ球反応(MLR)におけるT細胞増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。多くの免疫応答において、炎症細胞は、損傷部位または感染部位に浸潤する。遊走細胞は、罹患組織の組織学的検査によって決定することができるように、好中球性、好酸球性、単球性、またはリンパ球性でよい。Current Protocols in Immunology、John. E. Coligan編、1994, John Wiley & Sons, Inc.。
【００１３】
免疫関連疾患は、免疫応答を抑制することによって治療され得る。免疫刺激活性を有する分子を阻害する可溶性受容体および/または中和抗体を使用することは、免疫介在性疾患および炎症性疾患の治療において有用であると思われる。免疫応答を阻害する分子は、免疫応答を阻害し、それによって、免疫関連疾患を改善するのに使用され得る(タンパク質を直接使用、または抗体アゴニストの使用を介する)。
【００１４】
インターロイキン-17(IL-17A)は、Tリンパ球向性リスザルヘルペスウイルス(Herpes virus Saimiri)(HSV)によってコードされるタンパク質の細胞性相同分子種として同定されている[Rouvier et al., J. Immunol., 150(12)：5445-5456(19993)、Yao et al., J. Immunol., 122(12)：5483-5486(1995)、およびYao et al., Immunity, 3(6)：811-821(1995)を参照されたい]。その後の特徴付けにより、このタンパク質が、多種多様の末梢組織において炎症誘発性応答を誘導するために作用する強力なサイトカインであることが示された。IL-17Aは、活性化されたCD4+記憶T細胞によってのみ合成および分泌される、ジスルフィド結合した約32kDaのホモ二量体サイトカインである(Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16：541-551 [1998]に総説がある)。具体的には、IL-17は、19〜23残基のN末端シグナル配列を有する155アミノ酸のポリペプチド前駆体として合成され、かつ、ジスルフィド結合したホモ二量体糖タンパク質として分泌される。IL-17Aは、WO9518826(1995)、WO9715320(1997)、およびWO9704097(1997)、ならびに米国特許第6,063,372号において開示されている。
【００１５】
組織分布が限局的であるにもかかわらず、IL-17Aは、様々な細胞型に対する多面的な生物活性を示す。IL-17Aは、多くのサイトカインの産生を刺激することが見出されている。これは、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、および内皮細胞のような接着細胞による、IL-6、IL-8、IL-12、白血病抑制因子(LIF)、プロスタグランジンE2、MCP-1、およびG-CSFの分泌を誘導する。IL-17Aはまた、ICAM-1の表面発現、T細胞増殖、ならびにCD34+ヒト前駆体の増殖および好中球への分化を誘導する能力も有する。IL-17Aはまた、骨代謝にも関係があるとされており、かつ、関節リウマチおよび骨移植片のゆるみなど活性化T細胞の存在およびTNF-α産生を特徴とする病理学的状態において重要な役割を果たしていることが示唆されている(Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14：1513-1521 [1999])。関節リウマチ患者に由来する滑膜組織の活性化T細胞は、正常な個体または変形性関節症患者に由来するものよりも、より多量のIL-17Aを分泌することが見出された(Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42：963-970 [1999])。この炎症誘発性サイトカインが、関節リウマチにおける滑膜炎症に能動的に寄与することが示唆された。その炎症誘発性役割に加えて、IL-17Aは、さらに別のメカニズムによって関節リウマチの病理に寄与するようである。例えば、IL-17Aは、骨芽細胞において破骨細胞分化因子(ODF)mRNAの発現を誘導することが示されている(Kotake et al., J. Clin. Invest., 103：1345-1352 [1999])。ODFは、骨吸収に関与している細胞である破骨細胞への前駆細胞の分化を刺激する。
【００１６】
IL-17Aのレベルは、関節リウマチ患者の滑液において有意に上昇しているため、IL-17Aによって誘導される破骨細胞形成は、関節リウマチでの骨吸収において非常に重要な役割を果たしていると思われる。また、IL-17Aは、多発性硬化症のようないくつかの他の自己免疫障害においても重要な役割を果たすと考えられている(Matusevicius et al., Mult. Scler., 5：101-104 [1999])。IL-17Aは、細胞内シグナル伝達によって、ヒトマクロファージにおけるCa2+流入および[cAMP]の減少を刺激することもさらに示されている(Jovanovic et al., J. Immunol., 160：3513 [1998])。IL-17Aで処理された線維芽細胞は、NF-κBの活性化を誘導するのに対し[Yao et al., Immunity, 3：811(1995)、Jovanovic et al.、前記]、これで処理されたマクロファージは、NF-κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化する(Shalom-Barek et al., J.Biol. Chem., 273：27467 [1998])。
【００１７】
さらに、IL-17Aはまた、硬骨および軟骨の成長に関与している哺乳動物サイトカイン様因子7との配列類似性を共有する。IL-17Aポリペプチドが配列類似性を共有する他のタンパク質は、ヒト胚由来インターロイキン関連因子(EDIRF)およびインターロイキン-20である。
【００１８】
IL-17Aの広範囲の作用と一致して、IL-17Aに対する細胞表面受容体が多くの組織および細胞型において幅広く発現されていることが見出されている(Yao et al., Cytokine, 9：794 [1997])。ヒトIL-17A受容体(IL-17RA)(866アミノ酸)のアミノ酸配列から、単一の膜貫通ドメインおよび525アミノ酸の長い細胞内ドメインを有するタンパク質が予想されるが、受容体配列は独特であり、サイトカイン/増殖因子受容体ファミリーに由来する受容体のいずれの配列にも類似していない。IL-17Aそれ自体が他の公知のタンパク質との類似性を欠くことと合わせて、このことから、IL-17Aおよびその受容体が、シグナル伝達タンパク質および受容体の新規なファミリーの一部分であり得ることが示唆される。IL-17A活性は、その独特な細胞表面受容体への結合によって媒介されることが実証されており、以前の研究により、T細胞と可溶型のIL-17A受容体ポリペプチドを接触させると、PHA、コンカナバリンA、および抗TCRモノクローナル抗体によって誘導されるT細胞増殖およびIL-2産生が阻害されたことが示されている(Yao et al., J. Immunol., 155：5483-5486 [1995])。したがって、公知のサイトカイン受容体、具体的にはIL-17A受容体に対する相同性を有する新規なポリペプチドを同定および特徴付けすることに大きな関心が寄せられている。
【００１９】
IL-17Fの発現パターンは、IL-17Aのものと同様であると思われ、これは、活性化されたCD4+T細胞および単球のみを含む(Starnes et al. J. Immunol. 167：4137-4140 [2001])。IL-17Fは、線維芽細胞におけるG-CSF、IL-6、およびIL-8(Hymowitz et al, EMBO J. 20：5322-5341 [2001])、ならびに内皮細胞におけるTGF-b(Starnes et al. J. Immunol. 167：4137-4140 [2001])を誘導することが実証された。樹状細胞によって産生されるサイトカインであるIL-23が、主に記憶T細胞においてIL-17AおよびIL-17Fの両方の産生を媒介できることが、最近報告された(Aggarwal et al. J. Biol. Chem. 278：1910-1914 [2003])。
【００２０】
さらに、IL-17AおよびIL-17Fの両方の過剰発現または上方調節が、関節炎の個体および喘息の個体において示されている(Moseley et al. CytokineGrowth Factor Rev 14：155-174 [2003]に総説がある)。関節炎に関しては、これらのサイトカインは、関節リウマチおよび変形性関節炎に関連する軟骨および関節の破壊に特徴的な様式で作用する。例えば、IL-17AおよびIL-17Fは、新しいプロテオグリカンおよびコラーゲンの合成を阻害しつつ、軟骨プロテオグリカングリコサミノグリカンおよびコラーゲン断片の放出によって関節軟骨移植片中の基質分解を促進することが実証されている(Cai et al. Cytokine 16：10-21 [2001]、Attur et al Arthritis Rheum 44：2078-2083 [2001])。
【００２１】
IL-17Aと同様に、マウスにおけるIL-17Fの過剰発現もまた、肺好中球動員を増加させ、かつ、IL-6、IFN-γ、IP-10、およびMIGを含む、肺中のTh1関連サイトカインの発現の増大をもたらすことが示されている(Starnes et al. J. Immunol. 167：4137-4140 [2001])。IL-17Fはまた、アレルゲンでチャレンジされた喘息患者に由来するT細胞において上方調節されており(Kawaguchi et al J. Immunol 167：4430-4435 [2001])、かつ、NHBEにおいてIL-6およびIL-8の産生を誘導することが見出された。IL-17Aと対照的に、IL-17Fは、インビトロで血管新生を阻害すると思われる(Starnes et al. J. Immunol. 167：4137-4140 [2001])。
【００２２】
IL-17F mRNAは、様々なヒト組織においてノーザンブロットによって検出されなかったが、CD4+ T細胞および単球が活性化されると、劇的に誘導された。前掲書。マウスにおいて、Th2細胞および肥満(mastr)細胞は、活性化されるとIL-17Fを発現することが見出された。Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3)(2003)を参照されたい。IL-17Aと同様に、IL-17Fの発現も、マウスにおいてIL-23によって上方調節されることが判明した。
【００２３】
IL-17サイトカイン/受容体ファミリーは、免疫応答および炎症応答の操作に対する革新的なアプローチを与えると考えられる、サイトカインネットワーク内の独特なシグナル伝達システムに相当すると思われる。したがって、本発明は、新規なIL-17ファミリー受容体IL-17RA、ならびにIL-17AおよびIL-17Fの両方へのその結合能力の発見に基づいている。
【００２４】
したがって、本発明のIL-17RA可溶性受容体のようなIL-17FおよびIL-17Aの活性に対するアンタゴニストは、炎症性疾患の治療的処置において、特に、炎症の治療における、単独または併用のIL-17FおよびIL-17Aの両方に対するアンタゴニストとして有用である。さらに、本発明のIL-17RA可溶性受容体のようなIL-17F活性に対するアンタゴニストは、他の炎症性疾患の治療的処置において有用であり、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎、IBD、結腸炎、内毒素血症、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、成人呼吸器疾患(ARD)、敗血症ショック、多臓器不全、炎症性肺損傷、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気道応答性亢進、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、細菌性肺炎など、乾癬、湿疹、ならびに、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患、ピロリ菌(Helicobacter pylori)感染症、腹膜炎症の結果としての(すなわち、感染、損傷などに起因する)腹腔内癒着および/または腹腔内膿瘍、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、全身性硬化症、ネフローゼ症候群、臓器同種移植拒絶、移植片対宿主疾患(GVHD)、腎臓、肺、心臓などの移植拒絶、連鎖球菌細胞壁(SCW)によって誘発された関節炎、変形性関節症、歯ぎん炎/歯周炎、ヘルペス性間質角膜炎、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸部癌を含む癌、白血病、血管新生、再狭窄、および川崎病の治療において、IL-17FおよびIL-17Aを(個々にまたは共に)結合、妨害、阻害、低減、拮抗、または中和する。
【００２５】
サイトカイン受容体サブユニットは、リガンド結合ドメインおよび典型的にはシグナル伝達に関与しているエフェクタードメインを含むマルチドメイン構造を特徴とする。多量体サイトカイン受容体には、単量体、ホモ二量体(例えば、PDGF受容体ααアイソフォームおよびββアイソフォーム、エリスロポエチン受容体、MPL[トロンボポエチン受容体]、およびG-CSF受容体)、サブユニットがそれぞれリガンド結合ドメインおよびエフェクタードメインを有するヘテロ二量体(例えば、PDGF受容体αβアイソフォーム)、ならびに、異なる機能を有する構成要素サブユニットを有する多量体(例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、およびGM-CSF受容体)が含まれる。いくつかの受容体サブユニットは、複数の受容体に共通である。例えば、それ自体ではリガンドに結合できないが細胞内シグナル伝達ドメインを含む、AIC2Bサブユニットは、IL-3受容体およびGM-CSF受容体の構成要素である。多くのサイトカイン受容体は、その構造および機能に基づいて、4種の関連ファミリーのうちの1つに分類することができる。例えば、クラスI造血受容体は、保存されているシステイン残基およびWSXWSモチーフを含むドメインの存在を特徴とする。プロテインキナーゼドメイン、フィブロネクチンIII型ドメイン、および免疫グロブリンドメインを含む、ジスルフィド結合されたループを特徴とするその他のドメインは、いくつかの造血受容体中に存在する。サイトカイン受容体構造についての総説は、Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26：221-228, 1991およびCosman, Cytokine 5：95-106, 1993にある。一般に、生物が新しい生物学的機能を獲得する際の選択圧下で、新しい受容体ファミリーメンバーが、既存の受容体遺伝子の重複から生じて、多重遺伝子ファミリーの存在をもたらしたと考えられている。したがって、ファミリーメンバーは、先祖遺伝子の痕跡を含み、かつ、これらの特徴的な特徴は、その他のファミリーメンバーの単離および同定において活用することができる。
【００２６】
他の発明の中で、本発明は、「IL-17RA」または「可溶性IL-17RA」もしくは「sIL-17RA」と呼ばれる(これらはすべて、本明細書において同義的に使用され得る)可溶性受容体、または/およびIL-17RAサイトカイン受容体に対する中和抗体の新規な使用を提供する。本発明はまた、ヒトの炎症性疾患および自己免疫疾患において使用するための可溶性IL-17RAポリペプチド断片および融合タンパク質も提供する。本発明の抗IL-17RA中和抗体を含む、本発明の抗IL-17RA抗体および可溶性IL-17RA受容体は、炎症、ならびに乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、結腸炎、喘息、同種移植拒絶、免疫介在性腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、または変性関節疾患、および本明細書において開示する他の炎症性状態などの炎症性疾患の治療において、IL-17FもしくはIL-17Aのいずれか、またはIL-17AおよびIL-17Fの両方の活性を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和するのに使用することができる。
【００２７】
切断型のIL-17RA可溶性受容体をコードする例示的なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：6に示される。具体的には、この切断型変種は、otPAプレプロシグナル配列と共にFc5に融合されたIL-17RAのエキソン7〜10を含む。変種はまた、ネイティブなIL-17RAシグナル配列を有してもよく、かつ、Fc10に融合されてよい。
【００２８】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照すると、明らかになると考えられる。さらに、様々な参考文献が下記に特定され、かつ、それらの全体が参照により組み入れられる。
【００２９】
B)定義
以下の説明において、いくつかの用語が広範に使用される。以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって作製された断片、ならびに、ライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって作製された断片を意味する。核酸分子は、天然のヌクレオチドである単量体(DNAおよびRNAなど)、もしくは天然のヌクレオチドの類似体(例えば、天然のヌクレオチドのα-鏡像異性型)、または両方の組合せから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変更を有してよい。糖改変には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による1つもしくは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、または、糖は、エーテルもしくはエステルとして官能化されてよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環系糖類似体など立体的かつ電子的に類似した構造体で置換されてもよい。塩基部分の改変の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環系置換が含まれる。核酸単量体は、リン酸ジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結されてよい。リン酸ジエステル結合の類似体には、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニリダート、およびホスホルアミダートなどが含まれる。「核酸分子」という用語はまた、ポリアミド主鎖に結合された天然または改変された核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかでよい。
【００３１】
「核酸分子の相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比べて相補的なヌクレオチド配列および反対の向きを有する核酸分子を意味する。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は、5' CCCGTGCAT 3'に相補的である。
【００３２】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、あるポリペプチドをコードする参照核酸分子と比べて1つまたは複数の縮重コドンを含む、ヌクレオチド配列を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットは、それぞれAspをコードする)。
【００３３】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、次いで、特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される核酸分子を意味する。
【００３４】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムDNA中に組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された、増殖因子をコードするDNA分子は、単離DNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない、化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種に由来する染色体の完全なDNA分子より小型である。
【００３５】
「核酸分子構築物」は、天然には存在しない配置で組み合わされ、かつ並べられた核酸のセグメントを含むように、ヒトの介入によって改変された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００３６】
「直鎖DNA」は、遊離の5'末端および3'末端を有する非環状DNA分子を示す。直鎖DNAは、酵素的消化または物理的破壊によって、プラスミドのような閉じた環状DNA分子から調製することができる。
【００３７】
「相補的DNA(cDNA)」は、酵素逆転写酵素によってmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部分に相補的なプライマーが、逆転写の開始のために使用される。また、当業者は、そのような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指すために、「cDNA」という用語も使用する。「cDNA」という用語はまた、RNA鋳型から合成されたcDNA分子のクローンも意味する。
【００３８】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の5'非コード領域中、構造遺伝子の転写開始部位の近位側に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7：551(1993))、環状AMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1：47(1990))、糖質コルチコイド応答エレメント(GRE)、ならびに、CRE/ATF(O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267：19938(1992))、AP2(Ye et al., J. Biol. Chem. 269：25728(1994))、SP1、cAMP 応答エレメント結合タンパク質(CREB; Loeken, Gene Expr. 3：253(1993))、および八量体因子(一般に、Watson et al.編、Molecular Biology of the Gene、第4版(The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)ならびにLemaigreおよびRousseau, Biochem. J. 303：1(1994)を参照されたい)など他の転写因子に対する結合部位が含まれる。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は、誘導物質に応答して上昇する。一方、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質によって調節されない。抑制プロモーターもまた、公知である。
【００３９】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写開始部位を含む、プロモーター機能のために不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義により、コアプロモーターは、活性を増大させ得るか、または組織特異的な活性を与え得る特定の配列の不在下で検出可能な活性を有してもよく、または有さなくてもよい。
【００４０】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調整するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織、または細胞小器官において排他的または優先的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含んでよい。これらのタイプの調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」な様式で発現される遺伝子と結合している。
【００４１】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離にも向きにも関わらず、転写の効率を高めることができるタイプの調節エレメントである。
【００４２】
「異種DNA」は、所与の宿主細胞内に天然には存在しない、DNA分子またはDNA分子の集団を意味する。特定の宿主細胞に異種のDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち、外来性DNA)と結合していない限りにおいて、宿主細胞種に由来するDNA(すなわち、内在性DNA)を含んでよい。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNAセグメントに機能的に連結された、あるポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子とみなされる。逆に、異種DNA分子は、外来性プロモーターと機能的に連結された内在性遺伝子を含んでよい。別の例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が、野生型遺伝子を欠く変異細胞中に導入される場合には、異種DNAとみなされる。
【００４３】
「ポリペプチド」は、天然に産生されるか合成的に作製されるかを問わず、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【００４４】
「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、炭水化物基のような非ペプチド性構成要素を含んでもよい。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によって、そのタンパク質に付加されてよく、かつ、細胞のタイプによって異なる。タンパク質は、本明細書において、そのアミノ酸主鎖の構造の観点から定義され、炭水化物基のような置換基は一般に特定されないが、それでもなお存在してよい。
【００４５】
非宿主DNA分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００４６】
「クローニングベクター」は、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなど、宿主細胞において自主的に複製する能力を有する核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの極めて重要な生物学的機能を喪失せずに、決定可能な様式で核酸分子を挿入することを可能にする1つまたは小数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選別に使用するのに適しているマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子には、典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が含まれる。
【００４７】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子は、プロモーター「に機能的に連結された」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合には、調節エレメントおよびコアプロモーターは、機能的に連結されている。
【００４８】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本発明の文脈において、組換え宿主の例は、発現ベクターからIL-17RAを産生する細胞である。一方、IL-17RAは、IL-17RAの「天然供給源」であり、かつ、発現ベクターを欠く細胞によって産生され得る。
【００４９】
「組込み形質転換体」は、異種DNAが細胞のゲノムDNA中に組み込まれた組換え宿主細胞である。
【００５０】
「融合タンパク質」は、少なくとも2種の遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、アフィニティマトリックスに結合するポリペプチドと融合されたIL-17RAポリペプチドの少なくとも一部分を含んでよい。このような融合タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーを用いて多量のIL-17RAを単離するための手段を提供する。
【００５１】
「受容体」という用語は、「リガンド」と呼ばれる生理活性分子に結合する、細胞関連タンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの作用を媒介する。受容体は、膜結合型、細胞質ゾル内、または核内でよく、単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β-アドレナリン作動性受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体、およびIL-6受容体)でよい。膜結合型受容体は、細胞外のリガンド結合ドメインおよび典型的にはシグナル伝達に関与している細胞内のエフェクタードメインを含むマルチドメイン構造を特徴とする。ある種の膜結合型受容体において、細胞外のリガンド結合ドメインおよび細胞内のエフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別々のポリペプチドに位置している。
【００５２】
一般に、受容体にリガンドが結合すると、受容体の立体配置が変化して、細胞中のエフェクタードメインと他の分子との相互作用が引き起こされ、その結果として、細胞の代謝が変更される。受容体-リガンド相互作用にしばしば関係があるとされる代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生の増加、細胞カルシウムの動員、膜脂質の流動、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【００５３】
「可溶性受容体」は、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメイン、ならびにグリコホスホイノシトール(gpi)を介する結合のような細胞膜への他の結合を欠く、最も一般的なリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を提供するか、もしくは、基質へのポリペプチドの結合部位を提供するアフィニティータグ、または免疫グロブリン定常領域配列など付加的なアミノ酸残基を含んでよい。多くの細胞表面受容体は、タンパク分解によって産生されるか、または選択的にスプライシングされたmRNAから翻訳される、天然の可溶性対応物を有する。可溶性受容体は、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体でよく、多量体受容体は、一般に、9個を超えるサブユニットを含まず、好ましくは、6個を超えるサブユニットを含まず、および最も好ましくは、3個を超えるサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、それぞれ膜固定またはシグナル伝達を提供するのに十分な膜貫通ポリペプチドセグメントおよび細胞内ポリペプチドセグメントの部分をそれらが欠いている場合、これらを実質的に含まないと言われる。サイトカイン受容体の可溶性受容体は、一般に、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない細胞外サイトカイン結合ドメインを含む。例えば、代表的な可溶性受容体には、IL-17RAの可溶性受容体が含まれる。公知のサイトカイン受容体配列のどの配列が、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない細胞外サイトカイン結合ドメインを含むかを正確に叙述することは、当業者が十分に対応できるレベルの範囲内である。さらに、当業者は、遺伝コードを用いて、このような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００５４】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大型のポリペプチドの構成要素として、合成される場である細胞の分泌経路を介してその大型ポリペプチドを誘導するペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を示す。この大型ポリペプチドは、一般に、分泌経路を介して移行する間に切断されて、分泌ペプチドが除去される。
【００５５】
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、または天然にポリペプチドに結合している他のタンパク質性の不純物など、混入した細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態の、すなわち、少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％超の純度、例えば、96％、97％、もしくは98％またはそれ以上の純度、または99％超の純度のポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示す1つの方法は、そのタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後のシングルバンドの出現による。しかしながら、「単離された」という用語は、二量体あるいはグリコシル化型または誘導体化型など、代替の物理的形態の同じポリペプチドの存在を除外しない。
【００５６】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書において、ポリペプチド内部の位置を示すために使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して、近接または相対的位置を示すために使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシ末端に位置した特定の配列は、その参照配列のカルボキシ末端の近位側に位置するが、必ずしも、ポリペプチド全体のカルボキシル末端にはない。
【００５７】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、mRNAへの構造遺伝子の転写および1種または複数種のポリペプチドへのmRNAの翻訳を含む。
【００５８】
「スプライス変種」という用語は、本明細書において、ある遺伝子から転写されたRNAの代替形態を示すために使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、または、頻度は低いものの、別々に転写されたRNA分子間の選択的スプライシング部位の使用を通じて天然に起こり、その結果、同じ遺伝子から転写されたいくつかのmRNAが生じ得る。スプライス変種は、アミノ酸配列が変更されたポリペプチドをコードする場合がある。また、スプライス変種という用語は、本明細書において、ある遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変種によってコードされるポリペプチドを示すのにも使用される。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「免疫調節物質」という用語は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、共刺激分子、および造血因子など、ならびに、これらの分子の合成類似体を含む。
【００６０】
「相補体/抗相補体ペア」という用語は、適切な条件下で、非共有結合的に結合した安定なペアを形成する、非同一な部分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補体/抗相補体ペアの典型メンバーである。他の例示的な相補体/抗相補体ペアには、受容体/リガンドペア、抗体/抗原(またはハプテンもしくはエピトープ)ペア、およびセンス/アンチセンスポリヌクレオチドペアなどが含まれる。相補体/抗相補体ペアのその後の分離が望ましい場合、相補体/抗相補体ペアは、好ましくは、109M-1未満の結合親和力を有する。
【００６１】
「抗イディオタイプ抗体」は、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本発明の文脈において、抗イディオタイプ抗体は、抗IL-17RA抗体の可変領域と結合し、したがって、抗イディオタイプ抗体は、IL-17RAのエピトープを模倣している。
【００６２】
「抗体断片」は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、およびFabなど抗体の一部分である。構造に関わらず、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗IL-17RAモノクローナル抗体断片は、IL-17RAのエピトープと結合する。
【００６３】
「抗体断片」という用語はまた、軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位など、特定の抗原に結合する合成ポリペプチドまたは遺伝的に操作されたポリペプチドも含む。
【００６４】
「キメラ抗体」は、げっ歯動物抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含むが、抗体分子の残りの部分はヒト抗体に由来する、組換えタンパク質である。
【００６５】
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のマウスの相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの重鎖可変鎖および軽鎖可変鎖からヒト可変ドメイン中に移入されている、組換えタンパク質である。マウス抗体に由来する、ヒトタンパク質に結合するか、または中和するもののようなヒトにおいて治療的に使用するためのヒト化抗体の構築は、当業者の技能の範囲内である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「治療物質」は、抗体部分に結合されて、治療法に有用である結合体を生じる、分子または原子である。治療物質の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性物質または光活性色素、および放射性同位体が含まれる。
【００６７】
「検出可能な標識」は、抗体部分に結合されて、診断に有用な分子を生じることができる、分子または原子である。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性物質、放射性同位体、蛍光物質、常磁性イオン、または他のマーカー部分が含まれる。
【００６８】
「アフィニティータグ」という用語は、本明細書において、第2のポリペプチドに結合されて、第2のポリペプチドの精製もしくは検出を実現するか、または第2のポリペプチドが基質に結合するための部位を提供することができる、ポリペプチドセグメントを示すために使用される。主に、抗体または他の特異的結合物質がそれらに対して利用可能である任意のペプチドまたはタンパク質は、アフィニティータグとして使用され得る。アフィニティータグには、ポリヒスチジン領域、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4：1075(1985)、Nilsson et al., Methods Enzymol. 198：3(1991))、グルタチオンSトランスフェラーゼ(SmithおよびJohnson、Gene 67：31(1988))、Glu-Gluアフィニティータグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：7952(1985))、サブスタンスP、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology(6：1204(1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。一般に、Ford et al., Protein Expression and Purification 2：95(1991)を参照されたい。アフィニティータグをコードするDNA分子は、商業的な供給業者(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手可能である。
【００６９】
「裸抗体」は、抗体断片と対立するものとして、完全な抗体であり、治療物質と結合していない。裸抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびに、キメラ抗体およびヒト化抗体などある種の組換え抗体が含まれる。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「抗体構成要素」という用語は、完全な抗体および抗体断片の両方を含む。
【００７１】
「免疫複合体」は、抗体構成要素と治療物質または検出標識との結合体である。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体構成要素およびIL-17RAポリペプチド構成要素を含む組換え分子を意味する。抗体融合タンパク質の例には、IL-17RA細胞外ドメインおよびFcドメインまたは抗原結合領域のいずれかを含むタンパク質が含まれる。
【００７３】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」は、少なくとも1つのエピトープを含み、かつ、腫瘍細胞または感染病原体抗原を保有する細胞などの標的細胞上で発現される、アミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対して主要組織適合性複合体分子によって提示されるペプチドエピトープを認識し、かつ、典型的には、標的細胞を溶解するか、または標的細胞の部位に他の免疫細胞を動員し、それによって標的細胞を死滅させる。
【００７４】
「抗原ペプチド」は、主要組織適合性複合体分子と結合して、T細胞によって認識されるMHC-ペプチド複合体を形成し、それによって、T細胞に提示された際に細胞障害性リンパ球応答を誘導すると考えられるペプチドである。したがって、抗原ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、かつ、細胞溶解または抗原に結合するか、もしくは抗原を発現する標的細胞に対する特異的サイトカイン放出など細胞障害性T細胞応答を誘導することができる。抗原ペプチドは、クラスIまたはクラスII主要組織適合性複合体分子の場合、抗原提示細胞または標的細胞上で結合され得る。
【００７５】
真核生物において、RNAポリメラーゼIIは、構造遺伝子の転写を触媒して、mRNAを生成させる。RNA転写物が特定のmRNAの配列に相補的である配列を有する核酸分子は、RNAポリメラーゼII鋳型を含むように設計することができる。RNA転写物は、「アンチセンスRNA」と呼ばれ、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は、「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合して、mRNA翻訳を阻害することができる。
【００７６】
「IL-17RAに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「IL-17RAアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、(a)IL-17RA遺伝子の一部分と安定な三重鎖(triplex)を形成することができるか、または(b)IL-17RA遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な二重鎖を形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００７７】
「リボザイム」は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己切断RNA、およびこれらの触媒機能を果たす核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と呼ばれる。
【００７８】
「外部ガイド配列」は、特定の種類の細胞内mRNAに内因性リボザイム、RNase Pを誘導して、RNase PによるmRNAの切断をもたらす核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と呼ばれる。
【００７９】
「変種IL-17RA遺伝子」という用語は、公知のIL-17RAアミノ酸配列の改変体であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。
【００８０】
あるいは、変種IL-17RA遺伝子は、配列比較によって同定することもできる。2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大限一致するように整列された際に同じである場合には、2つのアミノ酸配列は「100％のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大限一致するように整列された際に同じである場合には、2つのヌクレオチド配列は「100％のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR(Madison, Wisconsin)によって制作されているLASERGENEバイオインフォマティクス演算セットに含まれるもののような標準的ソフトウェアプログラムを用いて実施することができる。最適アライメントを決定することによって2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である(例えば、PeruskiおよびPeruski、The Internet and the New Biology：Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press, Inc. 1997)、Wu et al.(編)、「Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins」、Methods in Gene Biotechnology、123〜151頁(CRC Press, Inc. 1997)、およびBishop(編)、Guide to Human Genome Computing、第2版(Academic Press, Inc. 1998)を参照されたい)。配列同一性を決定するための具体的な方法は後述する。
【００８１】
変種IL-17RA遺伝子または変種IL-17RAポリペプチドを同定するために使用される個々の方法に関わらず、変種遺伝子または変種遺伝子によってコードされるポリペプチドは、抗IL-17RA抗体に特異的に結合する能力を機能的に特徴付けることができる。変種IL-17RA遺伝子または変種IL-17RAポリペプチドはまた、本明細書において説明する生物学的アッセイ法または生化学的アッセイ法を用いて、そのリガンド、例えば、IL-17Aおよび/またはIL-17Fに結合する能力を機能的に特徴付けることができる。
【００８２】
「対立遺伝子変種」という用語は、本明細書において、同じ染色体座位を占める、ある遺伝子の2つまたはそれ以上の代替形態のいずれかを示すために使用される。対立遺伝子変異は、突然変異によって天然に起こり、その結果、集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子変異はサイレントでよく(コードされるポリペプチドは無変化)、または、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてよい。対立遺伝子変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされるタンパク質を示すのにも使用される。
【００８３】
「オルソログ」という用語は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を示す。オルソログ間の配列差異は、種分化の結果である。
【００８４】
「パラログ」は、生物によって産生される、独特であるが、構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって発生すると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは、互いのパラログである。
【００８５】
本発明は、IL-17RA遺伝子の機能的断片を含む。本発明の文脈内で、IL-17RA遺伝子の「機能的断片」は、本明細書において説明するドメインであるか、または少なくとも、抗IL-17RA抗体と特異的に結合するIL-17RAポリペプチドの一部分をコードする核酸分子を意味する。
【００８６】
標準的な解析方法が不正確なため、ポリマーの分子量および長さは、概算値であると理解される。このような値が「約(about)」Xまたは「約(approximately)」Xとして表現される場合、表示されたXの値は、±10％まで正確であると理解される。
【００８７】
C)IL-17RAポリヌクレオチドまたは遺伝子の作製
ヒトIL-17RA遺伝子をコードする核酸分子は、IL-17RAの配列に基づいたポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技術は標準的かつ十分に確立されており、商業的供給業者から入手可能なクローニングキットを用いて遂行することができる。例えば、Ausubel et al.(編)、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、John Wiley & Sons 1995;Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; AvivおよびLeder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69：1408(1972); Huynh et al.、「Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11」、DNA Cloning：A Practical Approach 第1巻、Glover(編)、49頁(IRL Press, 1985); Wu(1997) 47〜52頁を参照されたい。
【００８８】
ヒトIL-17RA遺伝子をコードする核酸分子はまた、IL-17RA遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列に基づいているヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって得ることもできる。PCRを用いてライブラリーをスクリーニングするための一般的方法は、例えば、Yu et al .、「Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries」、Methods in Molecular Biology、第15巻：PCR Protocols：Current Methods and Applications、White(編)、Humana Press, Inc., 1993によって提供されている。さらに、PCRを用いて関連遺伝子を単離するための技術は、例えば、Preston、「Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members」、Methods in Molecular Biology、第15巻：PCR Protocols：Current Methods and Applications、White(編)、Humana Press, Inc. 1993によって説明されている。代替案として、IL-17RA遺伝子は、交互にプライミングする(mutually priming)長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書において説明するヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することによって得ることができる(例えば、Ausubel(1995)を参照されたい)。ポリメラーゼ連鎖反応法を用いる確立された技術により、少なくとも2キロベース長のDNA分子を合成することができる(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21：1131(1993)、Bambot et al., PCR Methods and Applications 2：266(1993)、Dillon et al.、「Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes」、Methods in Molecular Biology、第15巻：PCR Protocols：Current Methods and Applications、White(編)、263〜268頁、(Humana Press, Inc. 1993)、およびHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4：299(1995))。ポリヌクレオチド合成に関する総説については、例えば、GlickおよびPasternak、Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press 1994)、Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53：323(1984)、およびClimie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87：633(1990)を参照されたい。
【００８９】
D)IL-17RA遺伝子変種の作製
本発明は、本明細書において開示するIL-17RAポリペプチドをコードする、DNA分子およびRNA分子を含む様々な核酸分子を提供する。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列変化がこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを容易に認識すると考えられる。
【００９０】
当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列変化がこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを容易に認識すると考えられる。
【００９１】
表1は、縮重したヌクレオチド位置を示す1文字記号を示す。「変換(Resolution)」は、記号文字によって示されるヌクレオチドである。「相補体」は、相補的ヌクレオチドの記号を示す。例えば、記号YはCまたはTのいずれかを示し、かつ、その相補体RはAまたはGを示し、AはTに相補的であり、GはCに相補的である。
【００９２】
【表１】
2009525765.tif 000002
【００９３】
所与のアミノ酸に対して存在し得る全コドンを包含する縮重コドンを表2に示す。
【００９４】
【表２】
2009525765.tif 000003
【００９５】
当業者は、あるアミノ酸をコードする存在し得る全コドン表す縮重コドンを決定する際に、いくらかの曖昧性が導入されることを理解すると考えられる。例えば、セリンの縮重コドン(WSN)は、いくつかの状況において、アルギニン(AGR)をコードすることができ、アルギニンの縮重コドン(MGN)は、いくつかの状況において、セリン(AGY)をコードする。同様の関係が、フェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間で存在する。したがって、縮重配列に含まれるいくつかのポリヌクレオチドは、変種アミノ酸配列をコードし得るが、当業者は、IL-17RAのアミノ酸配列を参照することにより、そのような変種配列を容易に同定することができる。変種配列は、本明細書において説明するような機能性に関して容易に試験することができる。
【００９６】
異なる種は、「優先的コドン使用」を示し得る。一般に、Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8：1893(1980)、Haas et al. Curr. Biol. 6：315(1996)、Wain-Hobson et al., Gene 13：355(1981)、GrosjeanおよびFiers、Gene 18：199(1982)、Holm, Nuc. Acids Res. 14：3075(1986)、Ikemura, J. Mol. Biol. 158：573(1982)、SharpおよびMatassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4：851(1994)、Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6：494(1995)、ならびにMakrides, Microbiol. Rev. 60：512(1996)を参照されたい。本明細書において使用される場合、「優先的コドン使用」または「優先コドン」という用語は、特定の種の細胞において最も頻繁に使用され、したがって、各アミノ酸をコードする存在し得るコドン(表2を参照されたい)のうち1つまたは少数の代表物を好んで使用する、タンパク質翻訳コドンを意味する技術用語である。例えば、アミノ酸トレオニン(Thr)は、ACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされ得るが、哺乳動物細胞においては、ACCが最も一般に使用されるコドンであり、他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌においては、異なるThrコドンが優先され得る。特定の種に対する優先コドンを、当技術分野において公知の様々な方法によって、本発明のポリヌクレオチド中に導入することができる。組換えDNA中への優先コドン配列の導入は、例えば、特定の細胞型または種内のタンパク質翻訳をより効率的にすることによって、タンパク質産生を促進することができる。したがって、本明細書において開示する縮重コドン配列は、当技術分野において一般に使用され、かつ本明細書において開示する様々な細胞型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先コドンを含む配列は、様々な種における発現に関して試験および最適化することができ、かつ、本明細書において開示するような機能性に関して試験することができる。
【００９７】
IL-17RAをコードするcDNAは、完全もしくは不完全なヒトcDNAを用いたプロービングまたは開示する配列に基づいた1つもしくは複数の縮重プローブセットを用いたプロービングのような様々な方法によって単離することができる。また、cDNAは、本明細書において開示する代表的なヒトIL-17RA配列から設計されたプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法によってクローン化することもできる。さらに、cDNAライブラリーは、宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクトするために使用することができ、かつ、対象となるcDNAの発現は、IL-17RAポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。
【００９８】
当業者は、IL-17RA配列がヒトIL-17RAの単一の対立遺伝子を表すこと、ならびに対立遺伝子変異および選択的スプライシングが生じると予測されることを認識すると考えられる。この配列の対立遺伝子変種は、標準手順に従って、様々な個体に由来するcDNAまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによってクローン化することができる。サイレント変異を含むもの、および変異によってアミノ酸配列が変化しているものを含む、本明細書において開示するヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は、本明細書において開示するアミノ酸配列の対立遺伝子変種であるタンパク質と同様に、本発明の範囲内である。IL-17RAポリペプチドの特性を保持している、選択的にスプライシングされたmRNAから作製されたcDNA分子は、そのようなcDNAおよびmRNAによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明の範囲内に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当技術分野において公知の標準手順に従って、様々な個体または組織に由来するcDNAまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによってクローン化することができる。
【００９９】
上記の方法を用いて、当業者は、IL-17RAの配列またはその対立遺伝子変種に実質的に相同である可溶性IL-17RA受容体サブユニットを含み、かつ、野生型IL-17RA受容体のリガンド結合特性を保持している様々なポリペプチドを調製することができる。また、このようなポリペプチドは、本明細書において一般に開示するその他のポリペプチドセグメントも含んでよい。
【０１００】
本発明の特定の態様において、単離された核酸分子は、本明細書において開示するヌクレオチド配列を含む核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。例えば、このような核酸分子は、IL-17RAのヌクレオチド配列を含む核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０１０１】
一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびpHにおける個々の配列の熱融点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする(所定のイオン強度およびpHのもとの)温度である。ハイブリダイゼーション後、核酸分子を洗浄して、ストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしなかった核酸分子を除去することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al.(編)、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc. 1987); BergerおよびKimmel(編)、Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press, Inc. 1987); ならびにWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26：227(1990))を参照されたい。OLIGO 6.0(LSR; Long Lake, MN)およびPrimer Premier 4.0(Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)などの配列解析ソフトウェア、ならびにインターネット上のサイトは、所与の配列を解析し、かつ使用者が定義した基準に基づいてTmを計算するために利用可能な手段である。特定のポリヌクレオチドハイブリッドと共に使用するためにハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を適応させることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０２】
本発明はまた、IL-17RAの配列のポリペプチドまたはそれらのオルソログと実質的に同様な配列同一性を有する、単離されたIL-17RAポリペプチドも提供する。「実質的に同様な配列同一性」という用語は、本明細書において、IL-17RAまたはそれらのオルソログの配列に示される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、例えば、96％、97％、98％、または95％を超える配列同一性を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、変種IL-17RA受容体およびオルソロガスなIL-17RA受容体は、免疫応答を生じさせ、かつ、ヒトIL-17RAに対して交差反応性の抗体を産生させるのに使用することができる。このような抗体は、ヒト化し、本明細書において説明するように改変することができ、かつ、乾癬、乾癬性関節炎、IBD、結腸炎、内毒素血症を治療するために、ならびに本明細書において説明する他の治療的用途において、治療的に使用することができる。
【０１０３】
配列同一性パーセントは、従来の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio.48：603(1986)、ならびにHenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915(1992)を参照されたい。手短に言えば、ギャップ形成ペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ1、ならびに表3に示す(アミノ酸は、標準的な1文字記号によって示される)HenikoffおよびHenikoff(同書)の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用いて、アライメントスコアを最適化するように2つのアミノ酸配列を整列させる。次いで、同一性パーセントを([同一マッチの総数]/[より長い配列の長さ+2つの配列を整列させるために、より長い配列中に導入されるギャップ数])(100)として計算する。
【０１０４】
【表３】
2009525765.tif 000004
【０１０５】
当業者は、2つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解する。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性探索アルゴリズムは、本明細書において開示するアミノ酸配列および推定上のIL-17RA変種のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを検査するための適切なタンパク質アライメント方法である。FASTAアルゴリズムは、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85：2444(1988)、ならびにPearson, Meth. Enzymol.183：63(1990)によって記述されている。手短に言えば、FASTAは、最初に、保存的なアミノ酸置換も、挿入も、欠失も考慮せずに、クエリ配列(例えば、IL-17RAの配列)および最も高い同一性(ktup変数が1である場合)または同一性のペア(ktup=2の場合)のいずれかを有する試験配列によって共有される領域を同定することによって、配列類似性を特徴付ける。次いで、アミノ酸置換行列を用いて全ペアのアミノ酸の類似性を比較することによって、同一性の最も高い10個の領域のスコアを再びつけ、かつ、最も高いスコアに寄与する残基のみを含むように、領域の末端を「切って整える」。「カットオフ値」(配列の長さおよびktup値に基づいて予め定められた式によって計算する)より大きなスコアを有するいくつかの領域がある場合には、整えられた最初の領域を検査して、それらの領域が連結してギャップを有する正確に近いアライメントを形成することができるかどうかを判定する。最後に、2つのアミノ酸配列の最もスコアの高い領域を、アミノ酸の挿入および欠失を可能にする、Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48：444(1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26：787(1974))の改良法を用いて整列させる。FASTA解析のための例示的なパラメーターは、ktup=1、ギャップ開始ペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換行列=BLOSUM62である。これらのパラメーターは、Pearson, Meth. Enzymol. 183：63(1990)の補遺2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル(「SMATRIX」)を改良することによって、FASTA プログラムに導入することができる。
【０１０６】
FASTAはまた、上記に開示する比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定するのにも使用することができる。ヌクレオチド配列比較の際、ktup値は1〜6の間、好ましくは3〜6、最も好ましくは3の範囲でよく、他のパラメーターは、前述したように設定される。
【０１０７】
本発明は、本明細書において開示するアミノ酸配列と比べて保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、以下のようなIL-17RA配列の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む変種を得ることができる：IL-17RAアミノ酸配列中のアルキルアミノ酸が別のアルキルアミノ酸で置換されているもの、IL-17RAアミノ酸配列中の芳香族アミノ酸が別の芳香族アミノ酸で置換されているもの、IL-17RAアミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸が別の硫黄含有アミノ酸で置換されているもの、IL-17RAアミノ酸配列中のヒドロキシ含有アミノ酸が別のヒドロキシ含有アミノ酸で置換されているもの、IL-17RAアミノ酸配列中の酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸で置換されているもの、IL-17RAアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で置換されているもの、または、IL-17RAアミノ酸配列中の二塩基性モノカルボキシアミノ酸が別の二塩基性モノカルボキシアミノ酸で置換されているもの。一般的なアミノ酸のうちで、例えば、「保存的アミノ酸置換」の例は、以下のグループのそれぞれの内でのアミノ酸間の置換である：(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびトレオニン、(4)アスパルタートおよびグルタマート、(5)グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6)リシン、アルギニン、およびヒスチジン。BLOSUM62表は、500グループを超える関連タンパク質の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの局所的マルチプルアラインメント約2,000個に由来するアミノ酸置換マトリックスである(HenikoffおよびHenikoff、Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 89：10915(1992))。したがって、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存的アミノ酸置換を定めるのに使用することができる。(前述の)化学的特性にのみ基づいてアミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という用語は、好ましくは、-1より大きいBLOSUM62値によって示される置換を意味する。例えば、置換が、0、1、2、または3のBLOSUM62値を特徴とする場合、そのアミノ酸置換は保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば1、2、または3)のBLOSUM62値を特徴とし、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2(例えば2または3)のBLOSUM62値を特徴とする。IL-17RAの特定の変種は、対応するアミノ酸配列(例えば、IL-17RAの配列)に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％を超える、例えば、96％、97％、98％、もしくは99％またはそれ以上の配列同一性を有することを特徴とし、アミノ酸配列中の変異は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因する。
【０１０８】
IL-17RA遺伝子中の保存的アミノ酸変化は、例えば、IL-17RAの配列中で挙げられるヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換することによって導入することができる。このような「保存的アミノ酸」変種は、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、およびポリメラーゼ連鎖反応法を用いた変異誘発などによって得ることができる(Ausubel(1995);およびMcPherson(編)、Directed Mutagenesis：A Practical Approach(IRL Press 1991))を参照されたい。変種IL-17RAポリペプチドは、抗IL-17RA抗体に特異的に結合する能力によって同定することができる。
【０１０９】
本発明のタンパク質はまた、非天然のアミノ酸残基を含み得る。非天然のアミノ酸には、trans-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、cis-4-ヒドロキシプロリン、trans-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、allo-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンが含まれるが、それに限定されるわけではない。タンパク質中に非天然のアミノ酸残基を組み入れるためのいくつかの方法が、当技術分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化させたサプレッサーtRNAを用いてナンセンスな変異が抑制される、インビトロ系が使用され得る。アミノ酸の合成およびtRNAのアミノアシル化のための方法は、当技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳は、典型的には、大腸菌(E. coli) S30抽出物ならびに市販の酵素および他の試薬を含む、無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113：2722(1991)、Ellman et al., Methods Enzymol. 202：301(1991)、Chung et al., Science 259：806(1993)、およびChung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：10145(1993)を参照されたい。
【０１１０】
第2の方法において、翻訳は、変異させたmRNAおよび化学的にアミノアシル化させたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによって、アフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞中で実施される(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271：19991(1996))。第3の方法では、大腸菌細胞が、置換されるべき天然アミノ酸(例えばフェニルアラニン)の不在下、かつ所望の非天然アミノ酸(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養される。非天然アミノ酸は、その天然の対応物の代わりにタンパク質中に組み入れられる。Koide et al., Biochem. 33：7470(1994)を参照されたい。天然のアミノ酸残基は、インビトロの化学的改変によって非天然の種類に変換することができる。化学的改変を部位特異的変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡大することができる(WynnおよびRichards、Protein Sci. 2：395(1993))。
【０１１１】
IL-17RAアミノ酸残基は、限定的な数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、非天然アミノ酸、および非自然アミノ酸で置換されてよい。
【０１１２】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発など当技術分野において公知の手順に従って同定することができる(CunninghamおよびWells、Science 244：1081(1989)、Bass et al., Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 88：4498(1991)、CoombsおよびCorey、「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」、Proteins：Analysis and Design, Angeletti(編)、259〜311頁(Academic Press, Inc. 1998))。後者の技術では、分子中のすべての残基に単一のアラニン変異が導入され、かつ、分子の活性に不可欠であるアミノ酸残基を同定するために、結果として生じる変異体分子の生物活性が試験される。Hilton et al., J. Biol. Chem. 271：4699(1996)も参照されたい。
【０１１３】
配列解析を用いて、IL-17RAリガンド結合領域をさらに定めることができるが、(IL-17AもしくはIL-17Fのいずれか、または抗IL-17RA抗体へのIL-17RAの結合のような)IL-17RA結合活性においてある役割を果たしているアミノ酸は、推定上の接触部位アミノ酸の変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶構造解析、電子解析、または光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理的解析によって決定することもできる。例えば、de Vos et al., Science 255：306(1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224：899(1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309：59(1992)を参照されたい。
【０１１４】
Reidhaar-OlsonおよびSauer(Science 241：53(1988))またはBowieおよびSauer(Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 86：2152(1989))によって開示されたもののような変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換を行い、かつ試験することができる。手短に言えば、これらの著者は、ポリペプチド中の2つまたはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、変異誘発されたポリペプチドの配列決定をして、各位置で許容できる置換の範囲を決定するための方法を開示している。使用され得る他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30：10832(1991) 、Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Huse、国際公開WO 92/06204、および領域指定変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46：145(1986)、およびNer et al., DNA 7：127,(1988))が含まれる。さらに、ビオチンまたはFITCで標識されたIL-17RAは、IL-17RAリガンドの発現クローニングのために使用され得る。
【０１１５】
開示するIL-17RAヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変種はまた、Stemmer, Nature 370：389(1994)、Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91：10747(1994)および国際公開WO97/20078によって開示されるようなDNAシャッフリングによって作製することもできる。手短に言えば、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化とそれに続くPCRを用いた再構築によるインビトロの相同組換えによって、変種DNA分子が作製される。この技術は、対立遺伝子変種または異なる種に由来するDNA分子などの親DNA分子ファミリーを用いて、付加的な変異性をプロセスに導入することによって、改良することができる。続いて変異誘発およびアッセイ法をさらに繰り返す、所望の活性の選択またはスクリーニングは、同時に不利益な変化を避けて選択しつつ望ましい変異を選択することによって、配列の迅速な「進化」を提供する。
【０１１６】
本明細書において開示する変異誘発方法は、宿主細胞中のクローン化され変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するためのハイスループットな自動スクリーニング方法と組み合わせることができる。生物学的に活性なポリペプチドまたは抗IL-17RA抗体と結合するポリペプチドをコードする変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収し、かつ、最新の機器を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法により、関心対象のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することが可能になり、かつ、これらの方法は、構造の不明なポリペプチドに適用することもできる。
【０１１７】
本発明はまた、IL-17RAポリペプチドの「機能的断片」およびそのような機能的断片をコードする核酸分子も含む。核酸分子のルーチンな欠失解析を実施して、IL-17RAポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。例として、IL-17RAの配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連の入れ子(nested)欠失を得ることができる。次いで、これらの断片を発現ベクターの適切なリーディングフレーム中に導入し、かつ、発現されたポリペプチドを単離し、抗IL-17RA抗体に結合する能力について試験する。エキソヌクレアーゼ消化の1つの代替方法は、オリゴヌクレオチド指定変異誘発を用いて、所望の断片の産生を指定する欠失または停止コドンを導入することである。あるいは、IL-17RA遺伝子の特定の断片は、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて合成することができる。
【０１１８】
この一般的アプローチは、HorisbergerおよびDi Marco、Pharmac. Ther. 66：507(1995)によって要約されている、インターフェロンの一方または両方の末端での切断に関する研究によって例示されている。さらに、タンパク質の機能解析のための標準技術は、例えば、Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240：113(1993);Content et al., 「Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon」、Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems、Cantell(編)、65〜72頁(Nijhoff 1987);Herschman、「The EGF Receptor」、Control of Animal Cell Proliferation、第1巻、Boynton et al.(編)169〜199頁(Academic Press 1985);Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270：29270(1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270：25291(1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50：1295(1995)、およびMeisel et al., Plant Molec. Biol. 30：1(1996)によって記述されている。
【０１１９】
本発明はまた、本明細書において開示するアミノ酸配列と比べてアミノ酸が変化しているIL-17RA遺伝子の機能的断片も企図する。変種IL-17RA遺伝子は、上述したように、開示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することにより、構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変種遺伝子を同定することへの代替のアプローチは、潜在的な変種IL-17RA遺伝子をコードする核酸分子が、IL-17RAの配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができるかどうかを判定することである。
【０１２０】
本発明はまた、IL-17RAポリペプチドの機能的断片、抗原エピトープ、IL-17RAポリペプチドのエピトープを有する部分、および、IL-17RAポリペプチドのそのような機能的断片、抗原エピトープ、エピトープを有する部分をコードする核酸分子を使用することも含む。このような断片は、IL-17AもしくはIL-17F、またはIL-17AおよびIL-17Fの両方に結合し、活性を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和する抗体および結合相手を作製する際に使用するためのポリペプチドを作製するのに使用される。本明細書において定義される「機能的」IL-17RAポリペプチドまたはその断片は、IL-17AもしくはIL-17Fの炎症活性、増殖活性、もしくは分化活性を妨害、阻害、低減、拮抗、もしくは中和する能力、特殊な細胞機能を誘導もしくは阻害する能力、または、抗IL-17RA抗体、細胞、IL-17A、もしくはIL-17Fに特異的に結合する能力を特徴とする。本明細書において前述したように、IL-17RAは、本明細書において説明する独特なサイトカイン受容体構造およびドメインを特徴とする。したがって、本発明はさらに、(a)前述の1つまたは複数のドメインを含むポリペプチド分子、および(b)1つまたは複数のこれらのドメインを含む機能的断片を含む融合タンパク質を使用することも企図する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、IL-10R、IL-13R、IL-17RA、IL-10RB(CRF2-4)など別のサイトカイン受容体によって、または、融合タンパク質の分泌を促進する、非ネイティブおよび/もしくは無関係な分泌シグナルペプチドによって付与され得る。
【０１２１】
本発明はまた、本明細書において説明するIL-17RAポリペプチドのエピトープを有する部分を含む、ポリペプチド断片またはペプチドも提供する。このような断片またはペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合に抗体応答を誘発するタンパク質の一部分である、「免疫原エピトープ」を含んでよい。免疫原エピトープを有するペプチドは、標準的な方法を用いて同定することができる(例えば、Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81：3998(1983)を参照されたい)。
【０１２２】
一方、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である、「抗原エピトープ」を含んでよい。ある種のエピトープは、アミノ酸の直線状または連続したストレッチからなり、かつ、そのようなエピトープの抗原性は、変性剤によって破壊されない。あるタンパク質のエピトープを模倣することができる比較的短い合成ペプチドを使用して、そのタンパク質に対する抗体の産生を刺激できることは、当技術分野において公知である(例えば、Sutcliffe et al., Science 219：660(1983)を参照されたい)。したがって、本発明の抗原エピトープを有するペプチド、抗原ペプチド、エピトープ、およびポリペプチドは、本明細書において説明するポリペプチドと結合する抗体を産生させるため、かつ、(個々にまたは共に)IL-17FおよびIL-17Aの活性を中和している、およびそれらを結合、妨害、阻害、低減、拮抗、または中和し得る抗IL-17RAモノクローナル抗体を同定およびスクリーニングするために有用である。このような本発明のモノクローナル中和抗体は、IL-17RA抗原エピトープに結合することができる。Hopp-Woodsの親水性プロファイルを用いて、IL-17RA配列内で抗原性の最も高い可能性がある領域を決定することができる(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78：3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88：1-18, 1986、および Triquier et al., Protein Engineering 11：153-169, 1998)。プロファイルは、6残基のスライディングウィンドウに基づいている。埋もれたG残基、S残基、およびT残基ならびに露出したH残基、Y残基、およびW残基は無視した。IL-17RA中のこれらの領域は当業者によって決定され得る。さらに、例えばDNASTAR Proteanプログラム(DNASTAR Inc., Madison, WI)を用いて、Jameson-Wolfプロットによって予測されるIL-17RA抗原エピトープは、好ましい抗原エピトープとしての機能を果たし、かつ、当業者によって決定され得る。
【０１２３】
好ましい態様において、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、例えば、(個々にまたは共に)IL-17RAおよびIL-17AまたはIL-17Fとのリガンド受容体結合に重要であるIL-17RAの残基を含む。
【０１２４】
抗原エピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書において開示するアミノ酸配列の少なくとも4個〜10個のアミノ酸、少なくとも10個〜15個のアミノ酸、または約15個〜約30個のアミノ酸を含んでよい。このようなエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書において説明するように、IL-17RAポリペプチドを断片化することによって、または化学的ペプチド合成によって作製され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択され得る(例えば、LaneおよびStephen、Curr. Opin. Immunol. 5：268(1993)、およびCortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7：616(1996)を参照されたい)。エピトープを同定し、かつ、エピトープを含む小型ペプチドから抗体を作製するための標準的方法は、例えば、Mole、「Epitope Mapping」、Methods in Molecular Biology、第10巻、Manson(編)、105〜116頁(The Humana Press, Inc. 1992);Price、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」、Monoclonal Antibodies：Production, Engineering, and Clinical Application、RitterおよびLadyman(編)、60〜84頁(Cambridge University Press 1995)、ならびにColigan et al.(編)、Current Protocols in Immunology、9.3.1〜9.3.5頁および9.4.1〜9.4.11頁(John Wiley & Sons 1997)によって記述されている。
【０１２５】
変種および融合タンパク質を含む、任意のIL-17RAポリペプチドに関して、当業者は、上記の表1および表2において示した情報を用いて、その変種をコードする十分に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に作製することができる。さらに、当業者は、標準的なソフトウェアを用いて、本明細書において説明するヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づき、IL-17RA変種を考案することもできる。
【０１２６】
E)IL-17RAポリペプチドの作製
完全長ポリペプチド;可溶性単量体受容体、ホモ二量体受容体、ヘテロ二量体受容体、および多量体受容体;完全長受容体;受容体断片(例えば、リガンド結合断片および抗原エピトープ)、機能的断片、ならびに融合タンパク質を含む、本発明のポリペプチドは、従来の技術に従って、組換え宿主細胞中で作製することができる。IL-17RA遺伝子を発現させるには、ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクターにおいて転写発現を制御する調節配列に機能的に連結されており、次いで、宿主細胞中に導入されなければならない。プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列および発現ベクターを有する細胞の選択に適しているマーカー遺伝子を含んでよい。
【０１２７】
真核細胞における外来タンパク質の作製に適している発現ベクターは、典型的には、(1)細菌宿主における発現ベクターの増殖および選択を提供するための細菌の複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードする原核生物DNAエレメント、(2)プロモーターのような、転写開始を制御する真核生物DNAエレメント、ならびに(3)転写終結/ポリアデニル化配列のような転写物のプロセッシングを制御するDNAエレメントを含む。上述したように、発現ベクターはまた、宿主細胞の分泌経路中に異種ポリペプチドを誘導する分泌配列をコードするヌクレオチド配列も含んでよい。例えば、IL-17RA発現ベクターは、IL-17RA遺伝子および任意の分泌遺伝子に由来する分泌配列を含んでよい。
【０１２８】
本発明のIL-17RAタンパク質は、哺乳動物細胞において発現され得る。適切な哺乳動物宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎臓細胞(Vero; ATCC CRL1587)、ヒト胚性腎臓細胞(293-HEK;ATCC CRL 1573)、仔ハムスター腎臓細胞(BHK-21、BHK-570;ATCC CRL8544、ATCC CRL10314)、イヌ腎臓細胞(MDCK; ATCC CCL34)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44(Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12：555, 1986))、ラット脳下垂体細胞(GH1; ATCC CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC CCL2.2)、ラット肝癌細胞(H-4-II-E;ATCC CRL 1548)、SV40形質転換サル腎臓細胞(COS-1; ATCC CRL1650)、およびマウス胚性細胞(NIH-3T3; ATCC CRL1658)が含まれる。
【０１２９】
哺乳動物宿主の場合、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、哺乳動物ウイルス源、例えば、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、またはサルウイルスなどに由来してよく、その際、調節シグナルは、高レベルに発現される特定の遺伝子と結合している。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子、例えば、アクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネインの遺伝子から得ることもできる。
【０１３０】
転写調節配列は、RNA合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1：273(1982))、ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight, Cell 31：355(1982))、SV40 初期プロモーター(Benoist et al., Nature 290：304(1981))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79：6777(1982))、サイトメガロウイルスプロモーター(Foecking et al., Gene 45：101(1980))、およびマウス乳癌ウイルスプロモーター(一般に、Etcheverry、「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」、Protein Engineering：Principles and Practice、Cleland et al.(編)、163〜181頁(John Wiley & Sons, Inc. 1996))が含まれる。
【０１３１】
あるいは、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターのような原核生物プロモーターが、その原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合には、哺乳動物細胞におけるIL-17RA遺伝子発現を制御するのに使用され得る(Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10：4529(1990)およびKaufman et al., Nucl. Acids Res. 19：4485(1991))。
【０１３２】
特定の態様において、IL-17RA可溶性受容体ポリペプチド、またはIL-17RAポリペプチドの断片をコードするDNA配列は、発現ベクター内で、一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現のために必要とされる他の遺伝子エレメントに機能的に連結されている。ベクターはまた、普通、1つまたは複数の選択マーカーおよび1つまたは複数の複製起点も含むと考えられるが、当業者は、特定の系では、選択マーカーが別のベクター上で提供されてよく、かつ、外来性DNAの複製が、宿主細胞ゲノム中への組込みによって提供され得ることを認識すると考えられる。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、および他のエレメントの選択は、当業者のレベルの範囲内のルーチンな設計の事柄である。多くのこのようなエレメントは文献に記載されており、かつ商業的な供給業者を通して入手可能である。可溶性受容体複合体の複数の構成要素は、個別の発現ベクター上で同時トランスフェクトされてよく、または、単一の発現ベクター中に含まれてもよい。タンパク質複合体の複数の構成要素を発現させるこのような技術は、当技術分野において周知である。
【０１３３】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、マイクロプロジェクタイルによる送達、およびエレクトロポレーションなどを含む様々な標準技術を用いて、宿主細胞中に導入することができる。トランスフェクトされた細胞を選択し、かつ増殖させて、宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供することができる。真核細胞中にベクターを導入するための技術、および優性の選択マーカーを用いてそのような安定な形質転換体を選択するための技術は、例えば、Ausubel(1995)によって、およびMurray(編)、Gene Transfer and Expression Protocols(Humana Press 1991)によって記述されている。
【０１３４】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を提供する遺伝子である。この場合、選択は、G-418などのようなネオマイシン型薬物の存在下で実施される。選択系はまた、対象となる遺伝子の発現レベルを増大させる、「増幅」と呼ばれるプロセスのためにも使用され得る。増幅は、低レベルの選択物質の存在下でトランスフェクタントを培養し、次いで、導入された遺伝子の産生物を高レベルで産生する細胞を選択するために、選択物質の量を増加させることによって実施される。適切な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)である。他の薬物耐性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。あるいは、緑色蛍光タンパク質のような表現型変更を導入するマーカー、またはCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼなどの細胞表面タンパク質が、FACS選別または磁性ビーズ分離技術などの手段によって、非トランスフェクト細胞からトランスフェクトされた細胞を選別するのに使用され得る。
【０１３５】
IL-17RAポリペプチドはまた、ウイルス送達系を用いて培養された哺乳動物細胞によって産生され得る。この目的のための例示的なウイルスには、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)が含まれる。アデノウイルスは二本鎖DNAウイルスであり、現在、異種核酸を送達するための最も良く研究された遺伝子トランスファーベクターである(総説については、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43：161(1994)、ならびにDouglasおよびCuriel、Science & Medicine 4：44(1997)を参照されたい)。アデノウイルス系の利点には、比較的大きなDNA挿入物の収容力、高力価になるまで増殖する能力、広範囲の哺乳動物細胞型に感染する能力、および、様々なプロモーターを含む多数の入手可能なベクターと共に使用することを可能にする柔軟性が含まれる。
【０１３６】
アデノウイルスゲノムを部分的に除去することによって、異種DNAのより大きな挿入物(最大7kb)が収容され得る。これらの挿入物は、直接的ライゲーションによって、または、同時トランスフェクトされるプラスミドを用いた相同組換えによってウイルスDNA中に組み入れることができる。1つの選択肢は、ウイルスベクターから不可欠なE1遺伝子を除去することであり、これにより、E1遺伝子が宿主細胞によって提供されない場合には、複製することができなくなる。例えば、アデノウイルスベクターに感染されたヒト293細胞(ATCC番号CRL-1573、45504、45505)は、接着細胞として、または懸濁培養において比較的高い細胞密度で増殖して、かなりの量のタンパク質を産生することができる(Garnier et al., Cytotechnol. 15：145(1994)を参照されたい)。
【０１３７】
IL-17RAはまた、鳥類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞など他の高等真核細胞においても発現され得る。バキュロウイルス系は、クローン化されたIL-17RA遺伝子を昆虫細胞中に導入するための効率的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)多核多角体病ウイルス(AcMNPV)に基づいており、かつ、ショウジョウバエ(Drosophila)熱ショックタンパク質(hsp)70プロモーター、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス最初期遺伝子プロモーター(ie-1)および後初期39Kプロモーター、バキュロウイルスp10プロモーター、ならびにショウジョウバエメタロチオネインプロモーターなど周知のプロモーターを含む。組換えバキュロウイルスを作製する第2の方法は、Luckow(Luckow, et al., J.Virol. 67：4566(1993))によって記述されているトランスポゾンに基づいた系を使用する。トランスファーベクターを使用するこの系は、BAC-to-BACキット(Life Technologies, Rockville, MD)において販売されている。この系は、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクターPFASTBAC(Life Technologies)を用いて、IL-17RAポリペプチドをコードするDNAを、「バクミド」と呼ばれる大型プラスミドとして大腸菌中に保持されているバキュロウイルスゲノム中に移動させる。Hill-PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 71：971(1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75：1551(1994)、ならびにChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Chem. 270：1543(1995)を参照されたい。さらに、トランスファーベクターは、発現されるIL-17RAポリペプチドのC末端またはN末端のエピトープタグ、例えばGlu-GluエピトープタグをコードするDNAとのインフレームの融合物を含んでよい(Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82：7952(1985))。当技術分野において公知の技術を用いて、IL-17RA遺伝子を含むトランスファーベクターが大腸菌中に形質転換され、かつ、組換えバキュロウイルスを示す分断されたlacZ遺伝子を含むバクミドに関してスクリーニングされる。次いで、一般的な技術を用いて、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAが単離される。
【０１３８】
例示的なPFASTBACベクターは、かなりの程度まで改変されてよい。例えば、ポリヘドリンプロモーターは除去され、かつ、バキュロウイルス感染時により早期に発現されるバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Pcor、p6.9、またはMPプロモーターとしても公知)で置換されてよく、分泌タンパク質を発現させるのに有利であることが示されている(例えば、Hill-PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 71：971(1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75：1551(1994)、ならびにChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Chem. 270：1543(1995)を参照されたい)。このようなトランスファーベクター構築物において、塩基性タンパク質プロモーターの短い種類または長い種類が使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列でネイティブなIL-17RA分泌シグナル配列を置換するトランスファーベクターが構築され得る。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA)、またはバキュロウイルスgp67(PharMingen：San Diego, CA)に由来する分泌シグナル配列が、ネイティブなIL-17RA分泌シグナル配列を置換するために構築物中で使用され得る。
【０１３９】
組換えウイルスまたはバクミドは、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞には、IPLB-Sf-21由来の細胞株、Sf9(ATCC CRL 1711)、Sf21AE、およびSf21(Invitrogen Corporation; San Diego, CA)などのスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) 蛹卵巣細胞株、ならびにショウジョウバエシュナイダー-2細胞、およびイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)(米国特許第5,300,435号)に由来するHIGH FIVEO細胞株(Invitrogen)が含まれる。市販されている無血清培地が、細胞を増殖させ、かつ維持するために使用され得る。適切な培地は、Sf9細胞に対しては、Sf900 II(商標)(Life Technologies) または ESF 921(商標)(Expression Systems)であり、イラクサギンウワバ(T. ni)細胞に対してはEx-cellO405(商標)(JRH Biosciences, Lenexa, KS)またはExpress FiveO(商標)(Life Technologies)である。組換えウイルスが使用される場合、細胞は、典型的には、約2×105〜5×105細胞の接種密度から1×106〜2×106細胞の密度まで増殖させられ、この時、組換えウイルスストックが0.1〜10、より典型的には約3の感染多重度(MOI)で添加される。
【０１４０】
バキュロウイルス系において組換えタンパク質を作製するための確立された技術は、Bailey et al.、「Manipulation of Baculovirus Vectors」、Methods in Molecular Biology、第7巻：Gene Transfer and Expression Protocols、Murray(編)、147〜168頁(The Humana Press, Inc. 1991)によって、Patel et al.、「The baculovirus expression system」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Glover et al.(編)、205〜244頁(Oxford University Press 1995)によって、Ausubel(1995)、16-37〜16-57頁によって、Richardson(編)、Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995)によって、およびLucknow、「Insect Cell Expression Technology」、Protein Engineering：Principles and Practice、Cleland et al.(編)、183〜218頁(John Wiley & Sons, Inc. 1996)によって提供される。
【０１４１】
酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本明細書において説明する遺伝子を発現させるために使用され得る。この点に関して特に対象となる酵母種には、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)が含まれる。酵母における発現に適したプロモーターには、GAL1(ガラクトース)、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、ADH(アルコールデヒドロゲナーゼ)、AOX1(アルコールオキシダーゼ)、およびHIS4(ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ)などに由来するプロモーターが含まれる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手可能である。これらのベクターには、YIp5のようなYIpベースのベクター、YRp17のようなYRpベクター、YEp13のようなYEpベクター、およびYCp19のようなYCpベクターが含まれる。外来性DNAを用いてS.セレビシエ(S. cerevisiae)細胞を形質転換し、かつ、それらから組換えポリペプチドを産生させるための方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasaki et al.、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Welch et al.、米国特許第5,037,743号、およびMurray et al.、米国特許第4,845,075号によって開示されている。形質転換細胞は、選択マーカー、一般に、薬物耐性または特定の栄養物(例えばロイシン)の不在下で増殖する能力によって決定される表現型に基づいて選択される。サッカロミケス・セレビシエにおいて使用するのに適したベクター系は、グルコースを含む培地における増殖に基づいて形質転換細胞を選択することを可能にする、Kawasaki et al.(米国特許第4,931,373号)によって開示されているPOT1ベクター系である。酵母において使用するためのその他の適切なプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素遺伝子(例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsman et al.、米国特許第4,615,974号、およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照されたい)およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するものが含まれる。また、米国特許第4,990,446号、同第5,063,154号、同第5,139,936号、および同第4,661,454号も参照されたい。
【０１４２】
ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミケス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、トウモロコシ黒穂菌(Ustilago maydis)、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・グイリエルモンジイ(Pichia guillermondii)、およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含む、他の酵母用の形質転換系が当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132：3459(1986)およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス属(Aspergillus)細胞は、McKnight et al.、米国特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換させるための方法は、Sumino et al.、米国特許第5,162,228号によって開示されている。アカパンカビ属(Neurospora)を形質転換させるための方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号によって開示されている。
【０１４３】
例えば、組換えタンパク質の作製用の宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、Raymond、米国特許第5,716,808号、Raymond、米国特許第5,736,383号、Raymond et al., Yeast 14：11-23(1998)、ならびに国際公開WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536、およびWO 98/02565において開示されている。P.メタノリカを形質転換する際に使用するためのDNA分子は、一般に、二本鎖の環状プラスミドとして調製され、好ましくは、形質転換の前に直鎖状にされる。P.メタノリカにおけるポリペプチド作製の場合、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、P.メタノリカアルコール使用遺伝子(AUG1またはAUG2)のようなP.メタノリカ遺伝子のものでよい。他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトン合成酵素(DHAS)遺伝子、ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)遺伝子、およびカタラーゼ(CAT)遺伝子のものが含まれる。宿主染色体中へのDNAの組込みを容易にするには、プラスミドの発現セグメント全体の両末端が宿主DNA配列に隣接していることが好ましい。ピキア・メタノリカにおいて使用するのに適した選択マーカーは、P.メタノリカADE2遺伝子であり、これは、ホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC;EC 4.1.1.21)をコードし、かつ、ade2宿主細胞がアデニンの不在下で増殖することを可能にする。メタノールの使用を最小限に抑えることが望ましい大規模な工業プロセスの場合、両方のメタノール使用遺伝子(AUG1およびAUG2)が欠失している宿主細胞が使用され得る。分泌タンパク質を作製する場合、宿主細胞は、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4およびPRB1)が欠損していてよい。エレクトロポレーションは、P.メタノリカ細胞中への関心対象のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの導入を容易にするために使用される。P.メタノリカ細胞は、2.5kV/cm〜4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/cmの電界強度を有する指数的に減衰するパルス電界、および1ミリ秒〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の時定数(t)を用いるエレクトロポレーションによって、形質転換され得る。
【０１４４】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、完全な植物組織、または単離された植物細胞中にも導入され得る。植物組織中に発現ベクターを導入するための方法には、アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による植物組織の直接的な感染または共培養、マイクロプロジェクタイルによる送達、DNA注入、およびエレクトロポレーションなどが含まれる。例えば、Horsch et al., Science 227：1229(1985)、Klein et al., Biotechnology 10：268(1992)、およびMiki et al.、「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology、Glick et al.(編)、67〜88頁(CRC Press, 1993)を参照されたい。
【０１４５】
あるいは、IL-17RA遺伝子は、原核生物宿主細胞においても発現され得る。原核生物宿主においてIL-17RAポリペプチドを発現させるのに使用され得る適切なプロモーターは当業者に周知であり、T4ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、Sp6ポリメラーゼ、およびT7ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのPRプロモーターおよびPLプロモーター、大腸菌のtrpプロモーター、recAプロモーター、熱ショックプロモーター、lacUV5プロモーター、tacプロモーター、lpp-lacSprプロモーター、phoAプロモーター、およびlacZプロモーター、枯草菌(B. subtilis)のプロモーター、バチルス属(Bacillus)のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセス属のプロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターが含まれる。原核生物プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1：277(1987)、Watson et al., Molecular Biology of the Gene、第4版(Benjamin Cummins 1987)、およびAusubel et al.(1995)によって概説されている。
【０１４６】
適切な原核生物宿主には、大腸菌および枯草菌(Bacillus subtilus)が含まれる。大腸菌の適切な株には、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF''、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、およびER1647が含まれる(例えば、Brown(編)、Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991)を参照されたい)。枯草菌の適切な株には、BR151、YB886、MI119、MI120、およびB170が含まれる(例えば、Hardy、「Bacillus Cloning Methods」、 DNA Cloning：A Practical Approach、Glover(編)(IRL Press 1985)を参照されたい)。
【０１４７】
大腸菌のような細菌においてIL-17RAポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として、細胞質中に保持されてよく、または、細菌分泌配列によって細胞周辺腔に誘導されてよい。前者の場合、細胞は溶解され、かつ、顆粒は回収され、例えば、グアニジンイソチオシアナートまたは尿素を用いて変性させられる。次いで、変性したポリペプチドは、例えば、尿素の溶液および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの組合せに対する透析とそれに続く緩衝生理食塩水に対する透析によって、変性剤を希釈することによって、リフォールディングおよび二量体化することができる。後者の場合、ポリペプチドは、(例えば、超音波処理または浸透圧ショックによって)細胞を破壊して、細胞周辺腔の内容物を放出させ、かつ、タンパク質を回収し、それによって、変性およびリフォールディングの必要を回避することによって、可溶性かつ機能的な形態で細胞周辺腔から回収することができる。
【０１４８】
原核生物宿主においてタンパク質を発現させるための方法は当業者に周知である(例えば、Williams et al.、「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Glover et al.(編)、15頁(Oxford University Press 1995)、Ward et al.、「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」、Monoclonal Antibodies：Principles and Applications、137頁(Wiley-Liss, Inc. 1995)、およびGeorgiou、「Expression of Proteins in Bacteria」、 Protein Engineering：Principles and Practice、Cleland et al.(編)、101頁(John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照されたい)。
【０１４９】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準的方法は、例えば、Ausubel(1995)によって提供されている。
【０１５０】
哺乳動物細胞系によって産生される外来タンパク質を発現および回収するための一般的方法は、例えば、Etcheverry、「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」、Protein Engineering：Principles and Practice、Cleland et al.(編)、163頁(Wiley-Liss, Inc. 1996)によって提供される。細菌系によって産生されるタンパク質を回収するための標準技術は、例えば、Grisshammer et al.、「Purification of over-produced proteins from E. coli cells」、 DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Glover et al.(編)、59〜92頁(Oxford University Press 1995)によって提供される。バキュロウイルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson(編)、Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995)によって記述されている。
【０１５１】
代替案として、本発明のポリペプチドは、排他的な固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合、または古典的な溶液合成によって合成され得る。これらの合成方法は当業者に周知である(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85：2149(1963)、Stewart et al.、「Solid Phase Peptide Synthesis」(第2版)、(Pierce Chemical Co. 1984)、BayerおよびRapp、Chem.Pept.Prot. 3：3(1986)、Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press 1989)、FieldsおよびColowick、「Solid-Phase Peptide Synthesis」、Methods in Enzymology Volume 289(Academic Press 1997)、ならびにLloyd- Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins(CRC Press, Inc. 1997)を参照されたい)。「ネイティブ化学ライゲーション」および「発現タンパク質のライゲーション」など総合的な化学合成戦略の変形法もまた、標準的である(例えば、Dawson et al., Science 266：776(1994)、Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94：7845(1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287：34(1997)、Muir et al., Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 95：6705(1998)、ならびにSeverinovおよびMuir、J. Biol. Chem. 273：16205(1998)を参照されたい)。
【０１５２】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、IL-17RAの配列の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む。例として、ポリペプチドは、IL-17RAの配列の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含んでよい。本発明の特定の態様において、ポリペプチドは、これらのアミノ酸配列の20個、30個、40個、50個、100個、またはそれ以上の連続した残基を含む。このようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーおよびプローブとして有用である。
【０１５３】
さらに、IL-17RAポリペプチドおよびその断片は、高等真核細胞内で、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体として発現され得る。このような細胞は、少なくとも1つのIL-17RAポリペプチドを含む、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体のIL-17RA受容体ポリペプチド(「IL-17RAを含む受容体」もしくは「IL-17RAを含む受容体ポリペプチド」)を作製するのに使用されてよく、または、スクリーニング系においてアッセイ用細胞として使用されてよい。本発明の1つの局面において、IL-17RA細胞外ドメインを含む本発明のポリペプチドは、培養細胞によって産生され、かつ、その細胞は、天然リガンド、IL-17F、ならびにIL-17A、またはさらに天然リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストを含む、受容体に対するリガンドをスクリーニングするのに使用される。このアプローチを要約すると、受容体をコードするcDNAまたは遺伝子が、発現に必要とされる他の遺伝子エレメント(例えば転写プロモーター)と組み合わされ、かつ、結果として生じる発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。DNAを発現し、かつ、機能的受容体を産生する細胞が選択され、かつ、様々なスクリーニング系内で使用される。単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体の受容体複合体の各構成要素は、同じ細胞において発現され得る。さらに、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体の受容体複合体の構成要素はまた、前述したような複合体組立およびトランスフェクタントのスクリーニングを可能にするために、膜貫通ドメインまたは他の膜融合部分に融合されてもよい。
【０１５４】
本発明のIL-17AおよびIL-17Fのアンタゴニストポリペプチドならびに抗体を分析するために、IL-17RAを含む受容体またはIL-17AもしくはIL-17Fに結合することが公知の他の受容体を発現させ(例えば、IL-17RAを発現する細胞)、かつ、受容体を介したシグナルを伝達する際に使用するのに適した哺乳動物細胞には、IL-17RAと機能的な複合体を形成し得る他の受容体サブユニットを発現する細胞が含まれる。また、発現される受容体と同じ種に由来する細胞を使用することも好ましい。好ましい態様において、細胞は、増殖に関して、外因的に供給される造血性増殖因子に依存している。このタイプの好ましい細胞株は、GM-CSF依存性のヒト白血病細胞株であるヒトTF-1細胞株(ATCC番号CRL-2003)およびAML-193細胞株(ATCC番号CRL-9589)、ならびにIL-3依存性マウスプレB細胞株であるBaF3(PalaciosおよびSteinmetz、Cell 41：727-734,(1985))である。他の細胞株には、BHK細胞、COS-1細胞、およびCHO細胞が含まれる。適切な宿主細胞は、必要な受容体サブユニットまたは所望の細胞応答に必要とされる他の細胞構成要素を産生するように操作され得る。細胞株を操作して、任意の種に由来する受容体サブユニットを発現させ、それによって種特異性に起因する潜在的な制限を克服することができるため、このアプローチは有利である。ヒト受容体cDNAの種オルソログは、BaF3細胞株におけるマウスcDNAのように、同じ種に由来する細胞株内でクローニングし、かつ使用され得る。したがって、GM-CSFまたはIL-3などの1種の造血性増殖因子に依存している細胞株は、IL-17FまたはIL-17AなどIL-17RA受容体を介して作用する別のサイトカインに依存するように操作され得る。
【０１５５】
機能的な受容体を発現する細胞が、スクリーニングアッセイ法において使用される。様々な適切なアッセイ法が当技術分野において公知である。これらのアッセイ法は、標的細胞における生物学的応答の検出に基づいている。1つのこのようなアッセイ法は細胞増殖アッセイ法である。細胞は試験化合物の存在下または不在下で培養され、かつ、細胞増殖が、例えば、トリチウムチミジンの取込みを測定することによって、または、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)の代謝分解に基づいた比色アッセイ法によって(Mosman, J. Immunol. Meth. 65：55-63,(1983))、検出される。代替のアッセイ法形式では、レポーター遺伝子を発現するようにさらに操作されている細胞を使用する。レポーター遺伝子は、受容体と結合した経路に応答性であるプロモーターエレメントに連結されており、アッセイ法は、レポーター遺伝子転写の活性化を検出する。この点に関して好ましいプロモーターエレメントは、血清応答エレメントまたはSREである。例えば、Shaw et al., Cell 56：563-572,(1989)を参照されたい。好ましいこのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である(de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7：725,(1987))。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当技術分野において公知の方法(例えば、Baumgartner et al., J.Biol. Chem. 269：29094-29101,(1994); SchenbornおよびGoiffin, Promega_Notes 41：11, 1993)を用いて、ルミネセンスによって検出される。ルシフェラーゼ活性アッセイ法キットは、例えば、Promega Corp.(Madison, WI)から市販されている。このタイプの標的細胞株は、化学物質のライブラリー、細胞馴化培地、真菌培養液、土壌試料、および水試料などをスクリーニングするのに使用され得る。例えば、細胞馴化培地試料のバンクを標的細胞において分析して、リガンドを産生する細胞を同定することができる。次いで、陽性細胞を用いて、哺乳動物発現ベクター中でcDNAライブラリーが作製され、これはプールに分割され、宿主細胞中にトランスフェクトされ、かつ発現される。次いで、トランスフェクトされた細胞に由来する培地試料が分析され、その後、プールへの分割、再トランスフェクション、継代培養、および陽性細胞の再分析が行われて、リガンドをコードするクローン化cDNAが単離される。
【０１５６】
本発明によって提供されるその他のスクリーニングアプローチは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を含む。これらのハイブリッドポリペプチドは、2つの一般的クラスに分類される。第1のクラスでは、IL-17RAの細胞内ドメインが、第2の受容体のリガンド結合ドメインに連結されている。第2のクラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第2の受容体、好ましくは造血サイトカイン受容体の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインと共にIL-17RAの細胞外(リガンド結合)ドメインを含む。この第2のクラスの本発明の受容体のハイブリッドIL-17RA単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体は、第2の受容体によって伝達されるシグナルに応答できることが公知の細胞において発現される。総合すると、これら2つのクラスのハイブリッド受容体により、IL-17FまたはIL-17Aの検出用のアッセイ法を開発するための応答性細胞型を同定することが可能になる。さらに、このような細胞をIL-17FまたはIL-17Aの存在下で使用して、競合型のアッセイ法において本発明の可溶性受容体アンタゴニストを分析することができる。このようなアッセイ法において、本発明の可溶性受容体の存在下でIL-17FまたはIL-17Aの増殖またはシグナル伝達活性が減少する場合、アンタゴニスト活性が実証される。さらに、IL-17RA可溶性受容体結合アッセイ法、細胞ベースのアッセイ法もまた、可溶性受容体が、IL-17FまたはIL-17Aに結合し、活性を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和するかを評価するために使用され得る。
【０１５７】
F)IL-17RA融合タンパク質および結合体の作製
1つの一般的クラスのIL-17RA類似体は、本明細書において開示するアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を有する変種である。IL-17RA類似体の別の一般的クラスは、後述するように、抗イディオタイプ抗体、およびその断片によって提供される。さらに、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体が、類似体として使用され得る(例えば、Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108：420(1996)を参照されたい)。抗イディオタイプIL-17RA抗体の可変ドメインはIL-17RAを模倣するため、これらのドメインは、IL-17RA結合活性を提供し得る。抗イディオタイプの触媒抗体を作製する方法は当業者に公知である(例えば、Joron et al., Ann.N Y Acad. Sci. 672：216(1992)、Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47：229(1994)、およびAvalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864：118(1998)を参照されたい)。
【０１５８】
IL-17RA類似体の同定に対する別のアプローチは、コンビナトリアルライブラリーの使用によって提供される。ファージディスプレイおよび他のコンビナトリアルライブラリーを構築およびスクリーニングするための方法は、例えば、Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins(Academic Press 1996)、Verdine、米国特許第5,783,384号、Kay, et. al.、米国特許第5,747,334号、およびKauffman et al.、米国特許第5,723,323号によって提供されている。
【０１５９】
IL-17RAポリペプチドは、インビボ用途およびインビトロ用途の両方を有する。例として、IL-17RAの可溶型を細胞培養培地に添加して、培養細胞によって産生されるIL-17RAリガンド(すなわち、IL-17F、IL-17A、または両方)の作用を阻害することができる。
【０１６０】
IL-17RAの融合タンパク質は、組換え宿主においてIL-17RAを発現させ、かつ、産生されたIL-17RAを単離するために使用され得る。後述するように、特定のIL-17RA融合タンパク質はまた、診断および治療法における用途も有する。1つのタイプの融合タンパク質は、組換え宿主細胞に由来するIL-17RAポリペプチドを導くペプチドを含む。真核生物宿主細胞の分泌経路中にIL-17RAポリペプチドを誘導するために、分泌シグナル配列(シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知)が、IL-17RA発現ベクター中で提供される。分泌シグナル配列はIL-17RAに由来してよいが、適切なシグナル配列はまた、別の分泌タンパク質に由来してもよく、または、新規に合成されてもよい。分泌シグナル配列は、IL-17RAをコードする配列に機能的に連結されており、その結果、これら2つの配列は正確なリーディングフレーム中で連結され、かつ、新規に合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に誘導するように配置されている。分泌シグナル配列は、一般に、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して5'側に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象のヌクレオチド配列中の別の場所に位置してもよい(例えば、Welch et al.、米国特許第5,037,743号、Holland et al.、米国特許第5,143,830号を参照されたい)。
【０１６１】
IL-17RAまたは哺乳動物細胞によって産生される別のタンパク質の分泌シグナル配列(例えば、米国特許第5,641,655号などに記載されているような組織型プラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列)が、組換え哺乳動物宿主においてIL-17RAを発現させるために有用であるが、酵母細胞における発現のためには、酵母シグナル配列が好ましい。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母接合フェロモンα因子(MFα1遺伝子にコードされる)、インベルターゼ(SUC2遺伝子にコードされる)、または酸性ホスファターゼ(PHO5遺伝子にコードされる)に由来するものである。例えば、Romanos et al. 、「Expression of Cloned Genes in Yeast」、DNA Cloning 2：A Practical Approach、第2版、GloverおよびHames(編)、123〜167頁(Oxford University Press 1995)を参照されたい。
【０１６２】
IL-17RA可溶性受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、IL-17RAの配列を含むポリペプチド、または非ヒト受容体の対応する領域をコードする切断型DNAを発現させることによって、調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通ポリペプチドセグメントおよび細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない形態で調製されることが好ましい。宿主細胞からの受容体ドメインの搬出を指示するために、受容体DNAは、t-PA分泌ペプチドのような分泌ペプチドをコードする第2のDNAセグメントに連結されている。分泌された受容体ドメインの精製を容易にするために、ポリヒスチジンタグのようなC末端伸長、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6：1204-1210,(1988); Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手可能)、または、それに対する抗体もしくは他の特異的結合物質が入手可能な別のポリペプチドもしくはタンパク質を、受容体ポリペプチドに融合してよい。さらに、細胞外サイトカイン結合ドメインに由来するIL-17RA抗原エピトープもまた、前述したように調製される。
【０１６３】
代替のアプローチにおいて、IL-17RAの受容体細胞外ドメインまたは他のサイトカイン受容体構成要素は、免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的には、2つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが、可変領域を欠いているFc断片との融合物として発現され得る(Sledziewski, AZ et al.、米国特許第6,018,026号および同第5,750,375号を参照されたい)。本発明の可溶性IL-17RAポリペプチドには、このような融合物が含まれる。1つのこのような融合物を実施例8に示す。このような融合物は、典型的には、Fc部分が互いにジスルフィド結合されており、かつ、2つの受容体ポリペプチドが互いに接近して配列されている多量体分子として分泌される。このタイプの融合物は、リガンドを特異的に滴定することによってインビトロでシグナルを妨害、阻害、または低減させるためのインビトロのアッセイ法ツールとして、および、循環中のリガンドに結合し、かつ、それを血液循環から除くために非経口的にそれらを投与することによる、インビボでのアンタゴニストとして、溶液から同系リガンドをアフィニティー精製するために使用することができる。リガンドを精製するために、IL-17RA-Igキメラが、受容体-リガンド結合を促進する条件(典型的には、生理学的状態に近い温度、pH、およびイオン強度)下で、リガンドを含む試料(例えば、細胞馴化培地または組織抽出物)に添加される。次いで、キメラ-リガンド複合体が、固体支持体(例えば、不溶性の樹脂ビーズ)上に固定化されているプロテインAを用いた混合物によって分離される。次いで、リガンドは、塩またはpH勾配を用いるような従来の化学的技術を用いて溶離される。別の方法では、キメラ自体が固体支持体に結合されてよく、前述のように、結合および溶離が実施される。キメラは、血清アミロイドA(SAA)およびC反応性タンパク質(CRP)など、急性期応答を含む炎症応答を調節するためにインビボで使用され得る。結合親和性の高いキメラは、非経口的に(例えば、筋肉内注射、皮下注射、または静脈注射によって)投与される。循環中の分子はリガンドに結合し、かつ、通常の生理学的プロセスによって血液循環から除かれる。アッセイ法で使用する場合、キメラは、Fc領域を介して支持体に結合され、かつ、ELISA形式で使用される。
【０１６４】
本発明の抗IL-17RAおよび結合相手の単離を支援するために、リガンド結合受容体(もしくは抗体、相補体/抗相補体ペアの1つのメンバー)またはその結合断片、および市販されているバイオセンサー機器(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を使用するアッセイ法システムが有利に使用され得る。このような受容体、抗体、相補体/抗相補体ペアのメンバー、または断片は、受容体チップの表面に固定化される。この機器の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145：229-40, 1991ならびにCunninghamおよびWells、J. Mol. Biol. 234：554-63, 1993によって開示されている。受容体、抗体、メンバー、または断片は、フローセル内の金フィルムに結合されたデキストラン繊維に、アミンまたはスルフヒドリル化学反応によって共有結合的に結合される。試験試料に、そのセルを通過させる。リガンド、エピトープ、または相補体/抗相補体ペアの反対のメンバーが試料中に存在する場合には、それぞれ、固定化された受容体、抗体、またはメンバーに結合して、金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こすと考えられる。このシステムにより、結合速度および解離速度(これらから結合親和性を計算することができる)の決定、ならびに結合の化学量論の評価が可能になる。あるいは、リガンド/受容体結合は、SELDI(商標)技術(Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA)を用いて解析することができる。さらに、前述のBIACORE技術は、様々なモノクローナル抗体が、IL-17RAポリペプチド上の同じまたは異なるエピトープに結合するかどうかを判定するために競合実験において使用することができ、したがって、IL-17FまたはIL-17AおよびIL-17Fの両方を結合、妨害、阻害、低減、拮抗、または中和する本発明の中和抗体のエピトープマッピングを支援するのに使用することができる。
【０１６５】
リガンド結合受容体ポリペプチドはまた、当技術分野において公知の他のアッセイ系においても使用され得る。このような系には、結合親和性を決定するためのスキャッチャード解析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51 ：660-72, 1949を参照されたい)および熱量測定アッセイ法(Cunningham et al., Science 253：545-48, 1991、Cunningham et al., Science 245：821-25, 1991)が含まれる。
【０１６６】
本発明はさらに、様々な他のポリペプチド融合物および1つまたは複数のポリペプチド融合物を含む関連した多量体タンパク質を提供する。例えば、可溶性IL-17RA受容体は、米国特許第5,155,027号および同第5,567,584号において開示されている二量体化タンパク質に対する融合物として調製され得る。この点に関して好ましい二量体化タンパク質には、免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えば、IgGγ1、およびヒトκ軽鎖が含まれる。免疫グロブリン-可溶性IL-17RA融合物は、様々な多量体IL-17RA受容体類似体を産生させるために遺伝的に操作された細胞において発現され得る。補助的ドメインを可溶性IL-17RA受容体に融合して、特定の細胞、組織、または高分子(例えば、コラーゲン、またはIL-17RAリガンド、IL-17F、もしくはIL-17Aを発現する細胞)にそれらを標的化することができる。IL-17RAポリペプチドは、精製用のアフィニティータグおよびターゲティングドメインなど2種またはそれ以上の部分に融合されてよい。ポリペプチド融合物はまた、特にドメイン間に、1つまたは複数の切断部位も含んでよい。Tuan et al., Connective Tissue Research 34：1-9, 1996を参照されたい。
【０１６７】
細菌細胞では、発現されたタンパク質の毒性を減少させ、安定性を高め、かつ、回収を促進するために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現させることがしばしば望ましい。例えば、IL-17RAは、グルタチオンS-トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には可溶性であり、かつ、固定化されたグルタチオンカラム上で、大腸菌溶菌液から容易に精製することができる。同様のアプローチにおいて、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むIL-17RA融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムを用いて単離することができ、切断型プロテインA遺伝子のC末端を含む融合タンパク質は、IgG-セファロースを用いて精製することができる。細菌細胞において異種ポリペプチドを融合タンパク質として発現させるための確立された技術は、例えば、Williams et al.、「Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies」、 DNA Cloning 2：A Practical Approach、第2版、GloverおよびHames(編)、15〜58頁(Oxford University Press 1995)によって記述されている。さらに、市販されている発現系が利用可能である。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム(Promega Corporation; Madison, WI)は、アビジンを含む樹脂を用いて、発現の間にビオチン化されるポリペプチドを含む融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０１６８】
原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかによって発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチドタグには、ポリヒスチジンタグ(ニッケルキレート化樹脂に対する親和性を有する)、c-mycタグ、カルモジュリン結合タンパク質(カルモジュリンアフィニティクロマトグラフィーを用いて単離される)、サブスタンスP、RYIRSタグ(抗RYIRS抗体と結合する)、Glu-Gluタグ、およびFLAGタグ(抗FLAG抗体と結合する)が含まれる。例えば、Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329：215(1996)、Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23：67(1996)、およびZheng et al., Gene 186：55(1997)を参照されたい。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation(St. Louis, MO)から入手可能である。
【０１６９】
別の形態の融合タンパク質は、IL-17RAポリペプチドならびに免疫グロブリン重鎖、典型的には、2つまたは3つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが、可変領域を欠いているFc断片を含む。例として、Chang et al.、米国特許第5,723,125号では、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンFc断片を含む融合タンパク質を記述している。インターフェロンのC末端は、ペプチドリンカー部分によって、Fc断片のN末端に連結されている。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性であるT細胞不活性配列を主に含むペプチドである。例示的なペプチドリンカーは、アミノ酸配列：GGSGG SGGGG SGGGG Sを有する。この融合タンパク質において、例示的なFc部分は、ヒトγ4鎖であり、これは、溶液中で安定であり、かつ、補体活性化活性をほとんど持たないか、または全く持たない。したがって、本発明は、IL-17RA配列のアミノ酸配列を含むペプチドのように、IL-17RA部分のC末端がペプチドリンカーを介してFc断片のN末端に結合されている、IL-17RA部分およびヒトFc断片を含むIL-17RA融合タンパク質を企図する。IL-17RA部分は、IL-17RA分子またはその断片でよい。
【０１７０】
別の変形法において、IL-17RA融合タンパク質は、IgG配列、IgG配列のアミノ末端に共有結合されたIL-17RA部分、およびIL-17RA部分のアミノ末端に共有結合されたシグナルペプチドを含み、その際、IgG配列は、以下の順序の以下のエレメントからなる：ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。したがって、IgG配列はCH1ドメインを欠く。IL-17RA部分は、IL-17RAリガンドと結合する能力のような、本明細書において説明するIL-17RA活性を示す。抗体部分および非抗体部分の両方を含む融合タンパク質の作製に対するこの一般的アプローチは、LaRochelle et al., EP 742830(WO 95/21258)によって記述されている。
【０１７１】
IL-17RA部分およびFc部分を含む融合タンパク質は、例えば、インビトロのアッセイ法ツールとして使用され得る。例えば、生物試料中のIL-17RAリガンドの存在は、IL-17RA-免疫グロブリン融合タンパク質を用いて検出することができ、その際、IL-17RA部分は、リガンドに結合するために使用され、かつ、プロテインAまたは抗Fc抗体などの高分子は、融合タンパク質を固体支持体に結合させるのに使用される。このようなシステムを用いて、IL-17RAリガンド、例えば、IL-17FまたはIL-17AおよびIL-17Fの両方がそれらの受容体に結合するのを邪魔するアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。
【０１７２】
抗体融合タンパク質の他の例には、抗原結合ドメイン、およびIL-17RA細胞外ドメインを含むIL-17RA断片を含むポリペプチドが含まれる。このような分子を用いて、IL-17RA結合活性のために、特定の組織を標的とすることができる。
【０１７３】
本発明はさらに、様々な他のポリペプチド融合物も提供する。例えば、生物学的機能を与えるドメインの一部または全体は、サイトカイン受容体ファミリーの別のメンバーに由来する機能的に等価なドメインと、本発明のIL-17RA間で交換することができる。ポリペプチド融合物を組換え宿主細胞において発現させて、様々なIL-17RA融合物類似体を作製することができる。IL-17RAポリペプチドは、精製用のアフィニティータグおよびターゲティングドメインなど2種またはそれ以上の部分またはドメインに融合されてよい。ポリペプチド融合物はまた、特にドメイン間に、1つまたは複数の切断部位も含んでよい。例えば、Tuan et al., Connective Tissue Research 34：1, 1996を参照されたい。
【０１７４】
融合タンパク質は、当業者に公知の方法により、融合タンパク質の各構成要素を調製し、かつそれらを化学的に結合させることによって調製することができる。あるいは、適切なリーディングフレーム中で融合タンパク質の両方の構成要素をコードするポリヌクレオチドを、公知の技術を用いて作製し、かつ、本明細書において説明する方法によって発現させることもできる。融合タンパク質を酵素的切断および化学的切断するための一般的方法は、例えば、Ausubel(1995)、16-19〜16-25頁に記述されている。
【０１７５】
IL-17RA結合ドメインは、IL-17RAリガンドアゴニストの推定上の接触部位アミノ酸の変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶構造解析、電子解析、または光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理的解析によってさらに特徴付けることができる。例えば、de Vos et al., Science 255：306(1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224：899(1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309：59(1992)を参照されたい。
【０１７６】
本発明はまた、IL-17RAポリペプチドがポリマーと連結されている、化学的に修飾されたIL-17RA組成物も企図する。例示的なIL-17RAポリペプチドは、機能的な膜貫通ドメインを欠いている可溶性ポリペプチドである。典型的には、ポリマーは水溶性であり、その結果、IL-17RA結合体は、生理学的環境のような水性環境において沈殿しない。適切なポリマーの例は、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化ためのアルデヒドなど単一の反応性基を有するように修飾されたものである。このようにして、重合の程度を調節することができる。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノ(C1-C10)アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である(例えば、Harris, et al.、米国特許第5,252,714号を参照されたい)。ポリマーは分枝状または非分枝状でよい。さらに、ポリマーの混合物は、IL-17RA結合体を作製するために使用され得る。
【０１７７】
治療法用に使用されるIL-17RA結合体は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含んでよい。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1-C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカルボナートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマーが含まれる。適切なPEGは、例えば、5,000、12,000,、20,000、および25,000を含む、約600〜約60,000の分子量を有してよい。IL-17RA結合体はまた、このような水溶性ポリマーの混合物を含んでよい。
【０１７８】
IL-17RA結合体の1つの例は、IL-17RA部分およびIL-17RA部分のN末端に結合されたポリアルキルオキシド部分を含む。PEGは、1つの適切なポリアルキルオキシドである。例として、IL-17RAは、PEGで修飾されてよく、「PEG化」として公知のプロセスである。IL-17RAのPEG化は、当技術分野において公知のPEG化反応のいずれかによって実施することができる(例えば、EP 0 154 316、Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249(1992)、DuncanおよびSpreafico、Clin. Pharmacokinet. 27：290(1994)、およびFrancis et al., Int J Hematol 68：1(1998)を参照されたい)。例えば、PEG化は、アシル化反応によって、または、反応性のポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応によって実施することができる。代替のアプローチにおいて、IL-17RA結合体は、活性化PEGを縮合することによって形成され、その際、PEGの末端ヒドロキシ基またはアミノ基は、活性化リンカーによって置換されている(例えば、Karasiewicz et al.、米国特許第5,382,657号を参照されたい)。
【０１７９】
アシル化によるPEG化は、典型的には、PEGの活性なエステル誘導体をIL-17RAポリペプチドと反応させることを要する。活性化PEGエステルの例は、N-ヒドロキシスクシンイミドにエステル結合しているPEGである。本明細書において使用される場合、「アシル化」という用語は、IL-17RAおよび水溶性ポリマー間の以下のタイプの結合を含む：アミド、カルバマート、およびウレタンなど。アシル化によってPEG化IL-17RAを調製するための方法は、典型的には、(a)1つまたは複数のPEG基がIL-17RAに結合する条件下で、IL-17RAポリペプチドを(PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステルのような)PEGと反応させる段階、および(b)反応生成物を得る段階を含む。一般に、アシル化反応のために最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、PEG：IL-17RAの比率が大きいほど、ポリPEG化IL-17RA生成物のパーセンテージが大きくなる。
【０１８０】
アシル化によるPEG化の生成物は、典型的には、リシンε-アミノ基がアシル連結基を介してPEG化されている、ポリPEG化IL-17RA生成物である。連結結合の例は、アミドである。典型的には、結果として生じるIL-17RAは、少なくとも95％がモノペグ化、ジペグ化、またはトリペグ化されていると考えられるが、PEG化の程度がより高いいくつかの化学種が、反応条件に応じて形成され得る。PEG化された化学種は、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーなど標準的な精製方法を用いて、非結合型IL-17RAポリペプチドから分離することができる。
【０１８１】
アルキル化によるPEG化は、一般に、還元剤の存在下でPEGの末端のアルデヒド誘導体をIL-17RAと反応させることを含む。PEG基は、-CH2-NH基を介してポリペプチドに結合され得る。
【０１８２】
さらに、本発明の抗IL-17RA抗体または抗体断片は、当技術分野におけるものであり、本明細書において説明する方法を用いてPEG化することができる。
【０１８３】
モノPEG化生成物を作製するための還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化のために利用可能な様々なタイプの第一級アミノ基の差次的な反応性を利用する。典型的には、反応は、リシン残基のε-アミノ基とタンパク質のN末端残基のα-アミノ基の間のpKa差異を利用することを可能にするpHで実施される。このような選択的誘導体化によって、アルデヒドのような反応性基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される。ポリマーとの結合は、大部分はタンパク質のN末端で起こり、リシン側鎖アミノ基のような他の反応性基の顕著な修飾は伴わない。本発明は、IL-17RAモノポリマー結合体の実質的に均一な調製物を提供する。
【０１８４】
モノポリマーIL-17RA結合体分子の実質的に均一な集団を作製するための還元的アルキル化は、(a)還元的アルキル化条件下、IL-17RAのアミノ末端のα-アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したpHで、IL-17RAポリペプチドを反応性PEGと反応させる段階、および(b)反応生成物を得る段階を含んでよい。還元的アルキル化のために使用される還元剤は、水溶液中で安定であり、かつ、還元的アルキル化の初期プロセスにおいて形成されるシッフ塩基のみを還元できることが望ましい。例示的な還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランが含まれる。
【０１８５】
モノポリマーIL-17RA結合体の実質的に均一な集団の場合、還元的アルキル化反応条件は、IL-17RAのN末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にする反応条件である。このような反応条件は、一般に、リシンアミノ基とN末端のα-アミノ基の間のpKa差異を提供する。pHはまた、使用すべきポリマーとタンパク質の比率にも影響を及ぼす。一般に、pHが低い場合には、タンパク質に対してかなり過剰なポリマーが望ましいと考えられる。これは、N末端のα-基の反応性が低いほど、最適条件を実現するためにより多くのポリマーが必要とされるためである。pHが高い場合には、より多くの反応性基が利用可能であるため、ポリマー：IL-17RAの比率はそれほど大きい必要はない。典型的には、pHは、3〜9、または3〜6の範囲に収まると考えられる。この方法は、IL-17RAを含むホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体の可溶性受容体結合体を作製するために使用することができる。
【０１８６】
考慮すべき別の因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合され得るポリマー分子の数は少ない。PEG化反応の場合、典型的な分子量は、約2kDa〜約100kDa、約5kDa〜約50kDa、または約12kDa〜約25kDaである。水溶性ポリマーとIL-17RAのモル比は、一般に、1：1〜100：1の範囲にある。典型的には、水溶性ポリマーとIL-17RAのモル比は、ポリPEG化の場合には1：1〜20：1、およびモノPEG化の場合は1：1〜5：1である。
【０１８７】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含む結合体を作製するための一般的方法は、当技術分野において公知である。例えば、Karasiewicz et al.、米国特許第5,382,657号、Greenwald et al.、米国特許第5,738, 846号、Nieforth et al., Clin.Pharmacol. Ther. 59：636(1996)、Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247：434(1997))を参照されたい。この方法は、IL-17RAを含むホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体の可溶性受容体結合体を作製するために使用することができる。
【０１８８】
本発明は、本明細書において説明する可溶性受容体または抗体のようなペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を企図する。このような組成物は、担体をさらに含んでよい。担体は、従来の有機担体または無機担体でよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、およびトウモロコシ油などが含まれる。
【０１８９】
G)IL-17RAポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して、少なくとも約80％の純度まで、少なくとも約90％の純度まで、少なくとも約95％の純度まで、または95％を上回る、例えば96％、97％、98％、もしくは99％を超える純度まで、かつ、感染性物質および発熱性物質を含まないように、精製することができる。本発明のポリペプチドはまた、純度が99.9％を上回る、薬学的に純粋な状態まで精製することもできる。ある種の調製物において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に、動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１９０】
分別および/または従来の精製方法を用いて、天然供給源(例えばヒト組織供給源)から精製されたIL-17RA、合成IL-17RAポリペプチド、ならびに組換え宿主細胞から精製された組換えIL-17RAポリペプチドおよび融合IL-17RAポリペプチドの調製物を得ることができる。一般に、硫酸アンモニウム沈殿法および酸抽出またはカオトロープ抽出が、試料の分別のために使用され得る。例示的な精製段階には、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、FPLCクロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれてよい。適切なクロマトグラフィー媒体には、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、および特殊シリカなどが含まれる。PEI誘導体、DEAE誘導体、QAE誘導体、およびQ誘導体が適切である。例示的なクロマトグラフィー媒体には、フェニル基、ブチル基、またはオクチル基で誘導体化された媒体、例えば、Phenyl- Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas, Montgomeryville, PA)、およびOctyl-Sepharose(Pharmacia)など、またはAmberchrom CG71(Toso Haas)などのようなポリアクリル樹脂が含まれる。適切な固体支持体には、ガラスビーズ、シリカベースの樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂、および使用される条件下で不溶性である同種のものが含まれる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、および/または炭水化物部分によってタンパク質との結合を可能にする反応性基で修飾されてよい。
【０１９１】
結合化学反応の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびに、カルボジイミド結合化学反応の場合のカルボキシル誘導体およびアミノ誘導体が含まれる。これらの媒体および他の固体媒体は当技術分野において周知であり、広く使用されており、かつ、商業的供給業者から入手可能である。ポリペプチドを単離および精製するための特定の方法の選択は、ルーチンな計画の事柄であり、選択される支持体の特性によってある程度決定される。例えば、Affinity Chromatography：Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988)、およびDoonan, Protein Purification Protocols(The Humana Press 1996)を参照されたい。
【０１９２】
IL-17RAの単離および精製のその他の変形法は、当業者によって考案され得る。例えば、後述するように得られる抗IL-17RA抗体は、イムノアフィニティー精製によって大量のタンパク質を単離するのに使用され得る。
【０１９３】
本発明のポリペプチドはまた、特定の特性を活用することによっても単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーを用いて、ポリヒスチジンタグを含むものを含む、ヒスチジンに富むタンパク質を精製することができる。手短に言えば、最初に、二価金属イオンをゲルに添加してキレートを形成させる(Sulkowski, Trends in Biochem.3：1(1985))。ヒスチジンに富むタンパク質は、使用される金属イオンに応じて、様々な親和性でこのマトリックスに吸着されると考えられ、かつ、競合的溶出、pHの引き下げ、または強力なキレート剤の使用によって溶離される。他の精製方法には、レクチンアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによる、グリコシル化タンパク質の精製が含まれる(M.Deutscher(編)、Meth.Enzymol. 182：529(1990))。本発明のさらなる態様において、精製を容易にするために、関心対象のポリペプチドおよびアフィニティータグ(例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン)の融合物を構築することができる。さらに、IL-17RA細胞外ドメインのリガンド結合特性は、例えば、IL-17RAを含む可溶性受容体の精製のために活用することができる。例えば、アフィニティクロマトグラフィーを用いることにより、その場合、IL-17Fリガンドがカラムに結合され、IL-17RAを含む受容体が結合され、続いて、標準的なクロマトグラフィー法を用いて溶離される。
【０１９４】
IL-17RAポリペプチドまたはそれらの断片はまた、前述したように、化学合成によって調製され得る。IL-17RAポリペプチドは単量体または多量体、グリコシル化または非グリコシル化、PEG化または非PEG化のものでよく、かつ、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０１９５】
H)切断型IL-17RA可溶性受容体の治療的使用
可溶性IL-17RA活性を有するアミノ酸配列は、IL-17RAリガンドであるIL-17AおよびIL-17Fに結合し(個々にまたは共に)、それによって、IL-17RAリガンドと内因性IL-17RA受容体の結合を妨害することによって免疫系を調節するのに使用され得る。可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体などのIL-17RAアンタゴニストもまた、IL-17RAリガンドと内因性IL-17RA受容体の結合を阻害することによって免疫系を調節するのに使用され得る。したがって、本発明は、IL-17RA活性を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド(可溶性IL-17RAポリペプチド、IL-17RAポリペプチド断片、IL-17RA類似体(例えば、抗IL-17RA抗イディオタイプ抗体)、およびIL-17RA融合タンパク質など)の、適切な量のこのポリペプチドを欠くか、または過剰なIL-17RAリガンドを産生する対象に対する使用を含む。IL-17RAアンタゴニスト(例えば抗IL-17RA抗体)はまた、IL-17RAリガンドまたはIL-17RAのいずれかを過剰に産生する対象を治療するのにも使用され得る。適切な対象には、ヒトのような哺乳動物が含まれる。例えば、このようなIL-17RAポリペプチドおよび抗IL-17RA抗体は、炎症および炎症性疾患、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、結腸炎、喘息、同種移植拒絶、免疫介在性の腎疾患、肝胆道疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、または変性関節疾患、および本明細書において開示する他の炎症性状態などの治療において、IL-17AおよびIL-17Fを(個々にまたは共に)結合、妨害、阻害、低減、拮抗、または中和する際に有用である。
【０１９６】
好ましい態様において、実施例8に示すIL-17RAの可溶性受容体型は、インビボでIL-17FおよびIL-17Aを(個々にまたは共に)結合、妨害、阻害、低減、拮抗、または中和する単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体である。
【０１９７】
したがって、本発明の特定の態様は、炎症性および免疫性の疾患または状態、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚病態、関節リウマチ、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、憩室症、喘息、膵炎、I型糖尿病(IDDM)、膵臓癌、膵炎、グレーブス病、結腸癌および腸癌、自己免疫疾患、敗血症、臓器移植もしくは骨髄移植;内毒素血症、外傷、外科手術、もしくは感染に起因する炎症;アミロイド症;脾腫;移植片対宿主疾患など、ならびに、炎症の抑制、免疫抑制、造血細胞、免疫細胞、炎症細胞、もしくはリンパ系細胞、マクロファージ、T細胞(Th1細胞およびTh2細胞を含む)の増殖の低減、病原体もしくは抗原に対する免疫応答の抑制が望ましい場合、またはIL-17FサイトカインもしくはIL-17Aサイトカインの阻害が望ましい他の場合における、アンタゴニストとしての可溶性IL-17RAの使用を対象としている。
【０１９８】
さらに、本明細書において説明するIL-17RAポリペプチドに結合する抗体または結合ポリペプチド、およびIL-17RAポリペプチドそれら自体は、以下のことに有用である：
1)急性炎症、外傷、組織損傷、外科手術、敗血症、または感染の結果としての炎症、および喘息、炎症性腸疾患(IBD)、慢性結腸炎、脾腫、関節リウマチ、再発性の急性炎症エピソード(例えば、結核)などの慢性炎症性疾患の治療、ならびに、アミロイド症、およびアテローム性動脈硬化症、キャッスルマン病、喘息、および急性期応答の誘導に関連した他の疾患の治療において、IL-17A受容体またはIL-17F受容体を介したシグナル伝達を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和すること、
2)IDDM、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、関節リウマチ、およびIBDなどの自己免疫疾患の治療においてIL-17A受容体またはIL-17F受容体を介したシグナル伝達を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和して、IL-17RAを介した免疫細胞(例えば、リンパ球、単球、白血球)におけるシグナル伝達を妨害または阻害すること。あるいは、IL-17RAを含む受容体に対するモノクローナル抗体(MAb)のような抗体もまた、望まれない免疫細胞を減少させて自己免疫疾患を治療するためのアゴニストとして使用され得る。喘息、アレルギー、および他のアトピー性疾患は、免疫応答を阻害するか、または不都合な細胞を減少させるために、例えば、可溶性IL-17RA可溶性受容体に対するMAbを用いて治療することができる。本発明のポリペプチドおよび抗体を用いて、IL-17RAを介したシグナル伝達を妨害、阻害、低減、または拮抗することはまた、膵臓、腎臓、脳下垂体、および神経細胞の疾患にも利益を与え得る。IDDM、NIDDM、膵炎、および膵臓癌は、利益を得ることができる。IL-17RAは、癌のMAb療法に対する標的としての機能を果たし得、その際、拮抗性のMAbは癌増殖を阻害し、かつ免疫を介した死滅を標的とする(Holliger PおよびHoogenboom、H：Nature Biotech. 16：1015-1016, 1998)。可溶性IL-17RAに対するMabはまた、糸球体硬化症、膜性神経障害(membranous neuropathy)、アミロイド症(他の組織のうちで腎臓も冒す)、腎動脈硬化症、様々な起源の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患などの腎症、ならびに、SLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、腎腫瘍および他の疾患に関連した腎機能障害を治療するのにも有用な場合がある。
3)IDDM、MS、SLE、重症筋無力症、関節リウマチ、およびIBDなどの自己免疫疾患の治療において、IL-17A受容体またはIL-17F受容体を介したシグナル伝達を作用(agonize)、増強、増加、または開始させること。抗IL-17RA中和抗体およびモノクローナル抗体は、リンパ球または他の免疫細胞にシグナル伝達して、分化させるか、増殖を変更するか、または、自己免疫を改善するサイトカインもしくは細胞表面タンパク質の産生を変化させ得る。具体的には、代替パターンのサイトカイン分泌に対するTヘルパー細胞応答の調節により、自己免疫応答が逸脱して、疾患が改善され得る(Smith JA et al., J.Immunol. 160：4841-4849, 1998)。同様に、アゴニストの抗可溶性IL-17RA単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体 、および多量体モノクローナル抗体は、喘息、アレルギー、およびアトピー性疾患に関与している免疫細胞にシグナル伝達し、それらを枯渇させ、かつ逸脱させるのに使用され得る。IL-17RAを介したシグナル伝達はまた、膵臓、腎臓、脳下垂体、および神経細胞の疾患にも利益を与え得る。IDDM、NIDDM、膵炎、および膵臓癌は、利益を得ることができる。IL-17RAは、膵臓癌のMAb療法に対する標的としての機能を果たし得、その際、シグナルを伝達するMAbは癌増殖を阻害し、かつ免疫を介した死滅を標的とする(Tutt, AL et al., J Immunol. 161 ：3175-3185, 1998)。同様に、腎細胞癌は、本発明のIL-17RAを含む可溶性受容体に対するモノクローナル抗体で治療され得る。
【０１９９】
本明細書において説明する可溶性IL-17RAポリペプチドは、自己免疫疾患、アトピー性疾患、NIDDM、膵炎、および前述の腎機能障害の治療において、IL-17F活性またはIL-17A活性を個々にまたは共に、結合、妨害、阻害、低減、拮抗、または中和するのに使用され得る。可溶型のIL-17RAは、Th細胞によって媒介される抗体応答を促進するか、かつ/またはリンパ球もしくは他の免疫細胞によるIL-4もしくは他のサイトカインの産生を促進するのに使用され得る。
【０２００】
本発明の可溶性のIL-17RAを含む受容体は、IL-17AサイトカインまたはIL-17Fサイトカインのアンタゴニストとして有用である。このような拮抗性の作用は、IL-17AまたはIL-17Fの直接的な中和または結合によって実現され得る。アンタゴニスト用途の他に、本発明の可溶性受容体は、IL-17Fに結合し、かつ、体内の様々な組織、器官、および細胞にリガンドを輸送するために、IL-17AサイトカインまたはIL-17Fサイトカインの担体タンパク質として作用することができる。したがって、本発明の可溶性受容体は、可溶性受容体-リガンド複合体を特定の部位、例えば、組織、特定の免疫細胞、または組織に誘導する分子、ポリペプチド、または化学的部分に融合または結合されてよい。例えば、急性の感染症またはいくつかの癌において、利益は、IL-17Fの作用による炎症および局所的急性期応答タンパク質の誘導の結果として生じ得る。したがって、本発明の可溶性受容体は、IL-17AまたはIL-17Fの作用を特異的に指示するために使用され得る。Cosman, D. Cytokine 5：95-106, 1993およびFernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9：497-513, 2000を参照されたい。
【０２０１】
さらに、本発明の可溶性受容体は、分解もしくはクリアランスされないようにリガンドを安定化することによって、または、体内の作用部位にリガンドを導くことによって、リガンドの生物学的利用能、治療的寿命、および/または有効性を増大させるために、IL-17FまたはIL-17Aを安定化させるのに使用され得る。例えば、天然のIL-6/可溶性IL-6R複合体は、IL-6を安定化させ、かつ、gp130受容体を介してシグナル伝達することができる。前記のCosman, D.および前記のFernandez-Botran, R.を参照されたい。さらに、IL-17RAは、リガンド/可溶性受容体複合体を含むように、IL-17Fのような同系リガンドと組み合わされてよい。このような複合体は、例えば、pDIRS1(IL-17ARB)またはCRF2-4(IL-10RB)などのコンパニオン受容体サブユニットを提示する細胞からの応答を刺激するために使用され得る。IL-17RA/リガンド複合体の細胞特異性は、単独で投与されたリガンドに対して認められる特異性とは異なる場合がある。さらに、複合体は、半減期、用量/応答、および器官特異性または組織特異性に影響を及ぼすような、独特の薬物動態学的特性を有する場合がある。したがって、IL-17RA/IL-17F複合体またはIL-17RA/IL-17A複合体は、免疫応答を増強するか、メサンギウム細胞を刺激するか、または肝細胞を刺激するアゴニスト活性を有する場合がある。あるいは、複合体とヘテロ二量体を形成するシグナル伝達サブユニットを発現する組織のみが、IL6/IL6R複合体に対する応答と同様に影響を受ける可能性がある(Hirota H. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92：4862-4866, 1995;Hirano, T. 、Thomason, A.(編)、「The Cytokine Handbook」、第3版、208〜209頁)。IL-12およびCNTFに対する可溶性受容体/サイトカイン複合体は、同様の活性を示す。
【０２０２】
さらに、炎症は、侵入物質を避けるための、生物による防御応答である。炎症は、多くの細胞性メディエーターおよび液性メディエーターを含むカスケード式の事象である。一方では、炎症応答を抑制すると、宿主が免疫無防備状態にされる場合がある;しかしながら、抑制されないままの場合には、炎症は、慢性炎症性疾患(例えば、乾癬、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、および炎症性腸疾患など)、敗血症ショック、ならびに多臓器不全を含む重篤な合併症をもたらし得る。重要なことには、これらの多様な疾患状態は、共通の炎症メディエーターを共有する。炎症を特徴とする集合的疾患は、ヒトの罹患率および死亡率に大きな影響を与える。したがって、IL-17RAおよび抗IL-17RA抗体などの抗炎症性タンパク質が、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血症ショックに至る膨大な数のヒト疾患および動物疾患に対して非常に重要な治療可能性を有する可能性があることは明らかである。
【０２０３】
1  関節炎
変形性関節炎、関節リウマチ、および損傷の結果としての関節炎関節などを含む関節炎は、本発明のIL-17RAポリペプチドのような抗炎症性タンパク質の治療的使用から利益を受けると考えられる一般的な炎症性状態である。例えば、関節リウマチ(RA)は、全身を冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の一つである。これは、疼痛、こわばり、熱感、発赤、および腫脹を引き起こす関節の内側を覆う膜の炎症を特徴とする。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節内層、すなわち滑膜が、骨および軟骨に浸潤し、かつ損傷を与えて、関節の変質および他の生理的作用の中でも重度の疼痛をもたらし得る。関与した関節は、その形状および配列を失って、疼痛および動作低下を起こし得る。
【０２０４】
関節リウマチ(RA)は、重度の障害および死亡率の増加をもたらす炎症およびその後の組織損傷を特に特徴とする免疫介在性疾患である。様々なサイトカインが、リウマチ関節において局所的に産生される。多数の研究により、2種のプロトタイプの炎症誘発性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜の炎症および進行性の関節破壊に関与するメカニズムにおいて重要な役割を果たすことが実証された。実際、RA患者にTNF-αおよびIL-1阻害剤を投与すると、炎症の臨床徴候および生物学的徴候が劇的に改善され、かつ、骨侵食および軟骨破壊の放射線学的徴候が減少する。しかしながら、これらの励みになる結果にもかかわらず、かなりの比率の患者はこれらの作用物質に応答せず、他のメディエーターも同様に関節炎の病態生理学に関与していることが示唆されている(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2)：135-149.,2002)。これらのメディエーターの一つは、IL-17AまたはIL-17Fである可能性があり、したがって、可溶性IL-17RA、IL-17RAポリペプチド、または抗IL-17RA抗体もしくは結合相手など、IL-17FもしくはIL-17Aに結合するか、またはそれらの活性を阻害する分子は、関節リウマチおよび他の関節炎疾患において炎症を減少させるための価値ある治療物質としての機能を果たし得る。
【０２０５】
当技術分野において公知のいくつかの関節リウマチ動物モデルがある。例えば、コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルにおいて、マウスはヒトの関節リウマチに非常に似た慢性炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと同様な免疫学的特徴および病理学的特徴を共有するため、これは、潜在的なヒト用抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。CIAモデルは、その発生が免疫応答および炎症応答の両方に依存する、周知のマウスモデルである。免疫応答は、抗原として与えられるコラーゲンに応答したB細胞およびCD4+T細胞の相互作用を含み、かつ、抗コラーゲン抗体の産生を招く。炎症相は、これらの抗体のいくつかがマウスの生来のコラーゲンと交差反応し、かつ補体カスケードを活性化させた結果としての炎症のメディエーターからの組織応答の結果である。CIAモデルを使用する際の利点は、病因の基本的なメカニズムが公知であることである。II型コラーゲン上の関連するT細胞エピトープおよびB細胞エピトープが同定されており、かつ、免疫介在性関節炎に関する様々な免疫学的パラメーター(例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体)ならびに炎症性パラメーター(例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解酵素)が決定されており、したがって、これらを用いて、CIAモデルにおける試験化合物の有効性を評価することができる(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3：407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89：9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61：1861-78, 1997;およびWang et al., Immunol. 92：8955-959, 1995)。
【０２０６】
抗マウスIL-17抗体は対照マウスと比べてマウスCIAモデルにおいて症状を減少させることが一つの研究グループによって示され、したがって、可溶性IL-17RA-Fcが、ヒト疾患の治療において有用となる可能性があることが概念的に示された。マウスIL-17に特異的なラット抗血清を1回投与すると、予防的に導入された場合、または関節炎の症状が既にモデルに存在していた後の場合、動物における関節炎の症状は軽減した(Lubberts et al., Arthritis Rheum. 50：650-9, 2004)。したがって、IL-17RA-Fcは、関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、結腸炎、および本明細書において開示する他の炎症性状態など特定のヒト疾患の治療において、IL-17Aおよび/またはIL-17Fを中和するために使用され得る。
【０２０７】
これらのCIAモデルマウスへのIL-17RA-Fc4または他のIL-17RA可溶性タンパク質および融合タンパク質など可溶性のIL-17RAを含むポリペプチド(IL-17RA)の投与を用いて、疾患の症状を改善するため、および疾患の経過を変更するために使用されるIL-17Fに対するアンタゴニストとしての可溶性IL-17RAの使用を評価する。さらに、IL-17RAによるIL-17Fの阻害を示す結果は、可溶性IL-17RAまたはそれに対する中和抗体など他のIL-17Fアンタゴニストもまた、疾患の症状を改善するため、および疾患の経過を変更するために使用され得るという概念の証拠を提供すると思われる。さらに、IL-17Aおよび/またはIL-17Fは、IL-1bおよびTNF-a(いずれも、関節リウマチの病因および進行に関係があるとされている)の産生を誘導するため、IL-17RA-Fc4のような可溶性IL-17RAを含むポリペプチドまたは他のIL-17F可溶性受容体(例えばIL-17RA)および抗IL-17RA抗体、ならびに融合タンパク質の全身投与または局所投与は、RAにおける炎症応答を潜在的に抑制し得る。例として、非限定的に、マウス1匹当たりIL-17RA-Fc 10ug〜200ugを注射すると(1週1〜7回、非限定的に最長4週間、皮下、腹腔内、または筋肉内の投与経路による)、疾患スコア(足スコア、炎症または疾患の発生率)は有意に低下し得る。IL-17RA-Fc 投与の開始時期に応じて(例えば、コラーゲン免疫化前、もしくは免疫化時、または、疾患が既に進行している時点を含む、2回目のコラーゲン免疫化後の任意の時点)、IL-17RAは、関節リウマチの予防、ならびにその進行の防止に有効となり得る。他の潜在的な治療物質には、IL-17RAポリペプチド、抗IL-17RA抗体、または抗IL-17F抗体もしくは結合相手などが含まれる。
【０２０８】
2  内毒素血症
内毒素血症は、細菌および他の感染症病原体などの感染病原体、敗血症、トキシックショック症候群に一般に起因するか、または日和見性感染症などにかかりやすい免疫無防備状態の患者において起こる重度の病態である。本発明のIL-17RAポリペプチドおよび抗体など治療的に有用な抗炎症性タンパク質は、ヒトおよび動物において内毒素血症を予防および治療する際に役立ち得る。IL-17RAポリペプチド、または抗IL-17RA抗体もしくは結合相手は、内毒素血症において炎症および病理学的作用を減少させるための貴重な治療物質として役立ち得る。
【０２０９】
リポ多糖類(LPS)によって誘発される内毒素血症には、感染症において病理学的作用をもたらす炎症誘発性メディエーターの多くが関与しており、げっ歯動物におけるLPS誘発性内毒素血症は、潜在的な炎症誘発物質または免疫調節物質の薬理学的効果を研究するために広く使用され、かつ許容されているモデルである。グラム陰性菌において産生されるLPSは、敗血症ショックの病因論における主要な原因物質である(Glausner et al., Lancet 338：732, 1991)。ショック様の状態は、実際、LPSを動物に1回注射することによって実験的に誘導することができる。LPSに応答する細胞によって産生される分子は、直接または間接的に病原体を標的とすることができる。これらの生物学的応答は、侵入病原体から宿主を保護するが、それらはまた、害を引き起こす場合もある。すなわち、重度のグラム陰性菌感染の結果として起こる先天性免疫の強い刺激により、サイトカインおよび他の分子が過剰に産生され、かつ、発熱、低血圧、播種性血管内凝固、および多臓器不全を特徴とする、致死的症候群である敗血症ショック症候群が発症する(Dumitru et al. Cell 103：1071-1083, 2000)。
【０２１０】
LPSのこれらの毒性作用は、多数の炎症性メディエーターの放出をもたらすマクロファージ活性化に主に関係しているこれらのメディエーターのうちで、TNFは、中和性抗TNF抗体の投与によるLPS毒性の予防によって示されるように、非常に重要な役割を果たしていると思われる(Beutler et al., Science 229：869, 1985)。大腸菌LPS 1ugをC57Bl/6マウスに注射すると、注射後約2時間で、循環中のIL-6、TNF-α、IL-1、および急性期タンパク質(例えばSAA)が有意に増加することは十分に確立されている。これらのメディエーターに対抗する受動免疫によって死亡率が減少し得るため、LPSの毒性は、これらのサイトカインによって媒介されていると思われる(Beutler et al., Science 229：869, 1985)。敗血症ショックの予防および/または治療のための潜在的な免疫介入戦略には、抗TNF mAb、IL-1受容体アンタゴニスト、LIF、IL-10、およびG-CSFが含まれる。
【０２１１】
これらのLPS誘発性モデルへのIL-17RA-Fc4または他のIL-17RA可溶性タンパク質および融合タンパク質など可溶性IL-17RAを含むポリペプチドの投与を用いて、LPS誘発性疾患の症状を改善するため、および疾患の経過を変更するためのIL-17RAの使用を評価することができる。さらに、IL-17RAによるIL-17Fの阻害を示す結果は、可溶性IL-17RAまたはそれに対する抗体など他のIL-17Fアンタゴニストもまた、LPS誘発性モデルの症状を改善するため、および疾患の経過を変更するために使用され得るという概念の証拠を提供する。このモデルから、LPS注射によるIL-17Fの誘導、およびIL-17RAポリペプチドによる疾患の治療の可能性が示される。LPSは、おそらく内毒素血症の病理の一因となる炎症誘発性因子の産生を誘導するため、アンタゴニストであるIL-17RAポリペプチドによるIL-17F活性または他の炎症誘発性因子の中和を用いて、エンドトキシンショックにおいて認められる症状のような内毒素血症の症状を減少させることができる。他の潜在的な治療物質には、IL-17RAポリペプチド、抗IL-17RA抗体、または結合相手などが含まれる。
【０２１２】
3  炎症性腸疾患IBD
米国では、約500,000名の人々が、結腸および直腸(潰瘍性大腸炎)またはその両方、小腸および大腸(クローン病)を冒し得る炎症性腸疾患(IBD)に罹患している。これらの疾患の病因は不明瞭であるが、これらは罹患組織の慢性の炎症を伴う。IL-17RAポリペプチド、抗IL-17RA抗体または結合相手は、IBDおよび関連疾患において炎症および病理学的作用を減少させるための貴重な治療物質として役立ち得る。
【０２１３】
潰瘍性大腸炎(UC)は、結腸の粘膜または最内側の内壁の炎症および潰瘍を特徴とする、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症が原因で、結腸はしばしば空になり、結果として下痢が起こる。症状には、便のゆるみ、ならびに付随する腹部有痛性痙攣、発熱、および体重減少が含まれる。UCの正確な原因は不明であるが、最近の調査により、身体の天然防御が、身体が異物と考える身体中のタンパク質に対抗して作動していることが示唆されている(「自己免疫反応」)。おそらくは、それらが腸中の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症プロセスを扇動または刺激し得る。結腸内層が破壊されるにつれ、潰瘍が形成して、粘液、膿汁、および血液を放出する。この疾患は、通常、直腸領域で始まり、かつ、最終的に、大腸全体に拡大し得る。炎症エピソードの反復は、瘢痕組織を伴う腸および直腸の壁の肥厚を招く。結腸組織の死滅または敗血症が、重度の疾患と共に発生することがある。潰瘍性大腸炎の症状の重症度は様々であり、それらの発症は、漸進的または急激な場合がある。発病は、呼吸器感染症またはストレスを含む多くの要因によって誘発され得る。
【０２１４】
現在、UCの治癒法は利用可能ではないが、治療は、結腸内壁における異常な炎症プロセスを抑制することに焦点を合わせている。コルチコステロイド、免疫抑制薬(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキサート)ならびにアミノサリチル酸を含む治療薬が、この疾患を治療するために利用可能である。しかしながら、コルチコステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制薬の長期の使用は、骨の希薄化、白内障、感染症、ならびに肝臓および骨髄への影響を含む重大な副作用をもたらし得る。現在の治療法が成功していない患者においては、外科手術が選択肢である。外科手術は、結腸全体および直腸の切除を含む。
【０２１５】
慢性の潰瘍性大腸炎をある程度再現し得るいくつかの動物モデルがある。最も広く使用されているモデルは、結腸における慢性的な炎症および潰瘍形成を誘発する、2,4,6-トリニトロベンスルホン酸(trinitrobenesulfonic acid)/エタノール(TNBS)誘発性結腸炎モデルである。TNBSが、感受性の高いマウスの結腸に直腸内点滴注入によって導入された場合、これは、結腸粘膜においてT細胞性免疫応答を誘導して、この場合、大腸壁全体に広がるT細胞およびマクロファージの密な浸潤を特徴とする広範囲の粘膜炎症をもたらす。さらに、この組織病理学的病像は、進行性の体重減少(痩せ)、血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19：51-62, 2000)。
【０２１６】
別の結腸炎モデルは、硫酸デキストランナトリウム(DSS)を使用し、これは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮化、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍形成が認められる急性結腸炎を誘発する。DSS誘発性結腸炎は、組織学的に、リンパ様過形成、限局性の陰窩損傷、および上皮潰瘍形成を伴う、固有層中への炎症細胞の浸潤を特徴とする。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性作用に起因し、かつ、固有層細胞の食作用ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって発生すると考えられている。一般的に使用されているものの、ヒト疾患との関連性に関するDSSのメカニズムについてのいくつかの問題は、依然として解明されていない。DSSは、SCIDマウスのようなT細胞欠損動物において観察されるため、T細胞非依存性モデルとみなされている。
【０２１７】
これらのTNBSモデルまたはDSSモデルへのIL-17RA-Fc4または他のIL-17RA可溶性タンパク質および融合タンパク質など可溶性IL-17RAを含むポリペプチドの投与を用いて、胃腸疾患の症状を改善するため、および胃腸疾患の経過を変更するための可溶性IL-17RAの使用を評価することができる。さらに、IL-17RAによるIL-17Fの阻害を示す結果は、可溶性IL-17RAまたはそれに対する抗体など他のIL-17Fアンタゴニストもまた、結腸炎/IBDモデルの症状を改善するため、および疾患の経過を変更するために使用され得るという概念の証拠を提供する。
【０２１８】
4  乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人に発症する慢性皮膚病態である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖した結果、古い皮膚が十分な速さで剥がれ落ちていない、炎症を起こし、隆起し、かつ鱗屑を有する皮膚部分を生じる場合に発生する。最も一般的な型である尋常性乾癬は、銀白の鱗屑で覆われた、皮膚の炎症部分(「病変」)を特徴とする。乾癬は、少数のプラークに限定されるか、または中程度から広範囲の皮膚領域を含む場合があり、頭皮、膝、肘、および胴に最も一般的に現れる。極めて目立つが、乾癬は、接触感染性疾患ではない。これらの疾患の病因は、罹患組織の慢性的な炎症に関係する。IL-17RAポリペプチド、抗IL-17RA抗体または結合相手は、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚アレルギーおよび粘膜アレルギー、ならびに関連した疾患における炎症および病理学的作用を減少させるための貴重な治療物質として役立ち得る。
【０２１９】
乾癬は、かなりの不快感を引き起こし得る、皮膚のT細胞性炎症性障害である。これは、治癒法が無く、かつあらゆる年齢の人々に発症する疾患である。乾癬は、ヨーロッパ人および北米人の人口の約2％に発症する。軽度の乾癬に罹患している個体は、しばしば、局所剤を用いて疾患を制御することができるが、世界中の100万人を超える患者は、紫外線療法または全身的免疫抑制療法を必要とする。残念ながら、紫外線放射は不便でリスクがあり、かつ、多くの治療法は毒性があるため、長期の使用には制限がある。さらに、患者は、通常、乾癬を再発し、症例によっては、免疫抑制療法の中止後すぐに、元に戻る。
【０２２０】
IL-17RA可溶性受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体もまた、IL-17FまたはIL-17Aリガンドの循環レベルを検出するための診断システム内、および急性期炎症応答に関連したIL-17Fの検出において使用され得る。関連した態様において、本発明のIL-17RA可溶性受容体に特異的に結合する抗体または他の作用物質は、循環中の受容体ポリペプチドを検出するのに使用することができる。逆に、IL-17RA可溶性受容体それら自体を用いて、循環中または局所的に作用しているIL-17FポリペプチドまたはIL-17Aポリペプチドを検出することもできる。リガンドまたは受容体ポリペプチドのレベルの上昇または低下は、炎症または癌を含む病理学的状態を示している場合がある。IL-17Fは、関連する急性期炎症応答を誘導することが公知である。さらに、IL-17AまたはIL-17Fなどの急性期タンパク質または分子の検出は、ある種の疾患状態(例えば、喘息、乾癬、関節リウマチ、結腸炎、IBD)における慢性炎症性状態を示し得る。このような状態の検出は、疾患の診断を助けるのに役立ち、かつ、医師が適切な治療法を選択するのに役立つ。
【０２２１】
可溶性IL-17RAの子宮内投与を用いて、IL-17Fを過剰発現するIL-17Fトランスジェニック仔、またはIL-17Aを過剰発現するIL-17Aトランスジェニック仔に関連した表現型を減少または消失させることによって、疾患モデルにおけるインビボでの有効性を示すことができる。当技術分野において、中和性モノクローナル抗体(mAb)のようなアンタゴニストを用いた子宮内治療に関する先例がある。1つの例において、B細胞のB-1サブセットの発達は、B細胞特異的分子であるCD19に対して特異的なmAbで妊娠中の雌マウスを処置することによって、劇的に影響を受けた(例えば、Krop I.Et al., Eur.J.Immunol. 26(1)：238-42, 1996)。Kropらは、ラット抗マウスCD19 mAb(またはアイソタイプを一致させたラット対照Ab)500ugのPBS溶液を計画妊娠マウスに妊娠9日目から腹腔内注射し、その後、出産まで1日おきに注射した。仔にも、これらの抗体500ugを10日齢の時点で1回注射した。別の例において、Tanakaらは、IL-2受容体β鎖に対するモノクローナル抗体による子宮内処置が Thy-1+樹状表皮細胞の発達を完全に抑制することを発見した。IL-2受容体の2つの異なるサブユニット、すなわちα鎖(IL-2Rα)およびβ鎖(IL-2Rβ)は、胎仔胸腺個体発生の間一貫して、ほとんど相互に排他的に発現される。IL-2Rβに対する中和性mAbを投与することによって、IL-2Rのシグナル伝達構成要素であるIL-2Rβを妨害すると、Thy-1+皮膚樹状表皮細胞の完全かつ選択的な消失が起こった。他の任意のT細胞サブセットの発達は損なわれなかった。このことから、IL-2、が胎仔Vγ5+細胞およびその子孫の発達において非常に重要な役割を果たしていることが示された(Tanaka, T. et al., Int Immunol. 4(4)：487-9, 1992を参照されたい)。さらに、Schattemann GCらは、PDGF-Aが正常なマウス心血管発達に必要とされることを子宮内の系を用いて示した。いくつかの証拠から、血小板由来増殖因子A鎖(PDGF-A)が、正常な胎仔心血管発達に必要とされることが示唆されている。子宮内でマウス脱落膜に抗PDGF-A中和抗体を導入すると、インビボでのPDGF-Aリガンド-受容体相互作用が18時間〜24時間選択的に破壊され、PDGF-Aが心血管発達にとって必要であるかどうか、および必要とされる時期はいつかを評価することが可能になった(Schattemann GC et al., Dev. Biol. 176(1)：133-42. 1996を参照されたい)。これらの結果、ならびに当技術分野において説明される他の結果から、中和性mAbまたは可溶性受容体などのアンタゴニストが子宮内で強力な作用を引き出し得るという証拠が提供される。同様に、IL-17AおよびIL-17Fをそれぞれ過剰発現するIL-17AおよびIL-17Fトランスジェニック仔において認められる皮膚表現型を減少または消失させるための、疾患モデルにおけるインビボでの可溶性受容体および/またはモノクローナル抗体によるIL-17AもしくはIL-17Fの中和の有効性を示すデータも示すことができる。
【０２２２】
本明細書において説明する他の疾患モデルに加えて、ヒト乾癬病変に由来する炎症組織に対する可溶性IL-17RAおよび/または抗IL-17RA抗体の活性は、重症複合免疫不全(SCID)マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。ヒト細胞が免疫不全マウスに移植された、いくつかのマウスモデルが開発されている(まとめて、異種移植モデルと呼ばれる)。例えば、Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18：513-22, 1994、およびFlavell, DJ, Hematological Oncology 14：67-82, 1996を参照されたい。乾癬のインビボ異種移植モデルとして、ヒト乾癬皮膚組織をSCID マウスモデルに移植し、かつ、適切なアンタゴニストでチャレンジする。さらに、当技術分野における他の乾癬動物モデルも、IL-17AアンタゴニストおよびIL-17Fアンタゴニストを評価するのに使用することができ、例えば、AGR129マウスモデルにヒト乾癬皮膚移植片を移植し、かつ、適切なアンタゴニストでチャレンジする(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Boyman, O. et al., J. Exp. Med.オンライン出版番号20031482、2004を参照されたい)。IL-17FまたはIL-17AおよびIL-17Fの両方に結合し、活性を妨害、阻害、低減、拮抗、または中和する可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体が好ましいアンタゴニストである。しかしながら、抗IL-17Aおよび抗IL-22抗体(単独または併用)、可溶性IL-17RA、ならびに他のIL-17AアンタゴニストおよびIL-17Fアンタゴニストもこのモデルにおいて使用され得る。同様に、ヒト結腸炎、IBD、関節炎、または他の炎症性病変由来の組織または細胞をSCIDモデルにおいて使用して、本明細書において説明するIL-17AアンタゴニストおよびIL-17Fアンタゴニストの抗炎症特性を評価することができる。
【０２２３】
可溶性IL-17RA、抗IL-17RA抗体、またはその誘導体、アゴニスト、結合体、もしくは変種を用いて炎症を消滅、遅延、または減少させるように計画された治療法は、ヒト炎症組織(例えば、乾癬病変など)を有するSCIDマウスまたは本明細書において説明する他のモデルに、抗IL-17RA抗体または可溶性IL-17RA化合物を投与することによって試験することができる。治療の有効性は、当技術分野において周知の方法を用いて、処置集団における抗炎症作用の経時的な増大として測定され、かつ統計学的に評価される。いくつかの例示的な方法には、例えば、乾癬モデルにおいて、表皮の厚さ、真皮上層中の炎症細胞の数、および錯角化のグレードを測定することが含まれるが、それに限定されるわけではない。このような方法は当技術分野において公知であり、かつ本明細書において説明される。例えば、Zeigler, M. et al. Lab Invest 81：1253, 2001; Zollner, T.M. et al. J. Clin. Invest. 109：671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbio.l Immunol. 45：507, 2001; Raychaudhuri, S.P. et al. Br. J. Dermatol. 144：931, 2001; Boehncke, W. H et al. Arch. Dermatol. Res. 291：104, 1999; Boehncke, W. H et al., J. Invest. Dermatol. 116：596, 2001; Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146：580, 1995; Boehncke, W.H et al. J.Cutan. Pathol. 24：1, 1997; Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17：85, 1998;およびVilladsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112：1571, 2003を参照されたい。また、フローサイトメトリー(またはPCR)のような周知の方法を用いて経時的に炎症をモニターして、試料中に存在する炎症細胞または損傷細胞の数、IBDに関するスコア(体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ)、CIA RAモデルの足疾患スコアおよび炎症スコアを定量することもできる。例えば、このようなモデルにおいて試験するために適切な治療戦略には、可溶性IL-17RAとそのリガンドであるIL-17AおよびIL-17Fとの相互作用の破壊に基づいて、可溶性IL-17RA、抗IL-17RA抗体、他のIL-17AアンタゴニストおよびIL-17Fアンタゴニスト(単独もしくは併用)、または関連する結合体もしくはアンタゴニストを用いる直接的治療、または可溶性IL-17RAもしくは抗IL-17RA抗体またはその誘導体、アゴニスト、結合体、もしくは変種を利用した細胞に基づく治療法が含まれる。
【０２２４】
さらに、乾癬は、過形成表皮ケラチノサイトならびにCD4+記憶T細胞、好中球、およびマクロファージを含む浸潤性単核細胞を伴う慢性炎症性皮膚疾患である(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110：199, 1996)。疾患を開始し、かつ疾患の病状を引き起こすにあたって、環境抗原が重要な役割を果たしていると現在考えられている。しかしながら、乾癬の病状をもたらすと考えられているのは自己抗原に対する寛容性の喪失である。樹状細胞およびCD4+T細胞は、病状を招く免疫応答をもたらす抗原提示および認識において重要な役割を果たすと考えられている。本発明者らは、最近、CD4+CD45RB導入モデルに基づく乾癬モデルを開発した(Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2：653-672)。本発明の可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体をマウスに投与する。疾患スコア(皮膚病変、炎症性サイトカイン)が抑制される場合、乾癬におけるIL-17AアンタゴニストおよびIL-17Fアンタゴニスト、例えば抗IL-17RA抗体またはIL-17RA可溶性受容体の有効性が示される。
【０２２５】
5  アトピー性皮膚炎
ADは、ヘルパーT細胞サブセット2(Th2)の活性化過剰サイトカインを特徴とする一般的な慢性炎症性疾患である。ADの正確な病因は不明であるが、活動過多のTh2免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲン、および遺伝的素因を含む多数の要因が関係があるとされている。疾患の重要な特徴には、乾皮症(皮膚の乾燥)、そう痒症(皮膚の痒み)、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染、血液好酸球増加症の亢進、血清IgEおよびIgG1の上昇、ならびにT細胞、肥満細胞、マクロファージ、および好酸球の浸潤を伴う慢性皮膚炎が含まれる。黄色ブドウ球菌(S. aureus)によるコロニー形成または感染は、ADを増悪し、かつ、この皮膚疾患の慢性を持続させることが認識されている。
【０２２６】
ADは喘息患者およびアレルギー性鼻炎患者において認められることが多く、しばしば、アレルギー性疾患の最初の症状発現である。西欧諸国の人口の約20％がこれらのアレルギー性疾患に罹患しており、先進諸国におけるADの発病率は理由が不明なものの上昇している。ADは典型的には小児期に始まり、しばしば、思春期から成人期まで持続し得る。ADの現在の治療法には、局所用コルチコステロイド、経口シクロスポリンA、タクロリムス(FK506軟膏)のような非コルチコステロイド免疫抑制薬、およびインターフェロンγが含まれる。ADの治療法は多様であるが、多くの患者の症状は改善しないか、または患者は薬剤投与に対する副作用を有するため、他のより効果的な治療物質を探す必要がある。本発明の中和性抗ヒトIL-17RA抗体を含む、本発明の可溶性IL-17RAポリペプチドおよび抗IL-17RA抗体は、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚病態、および本明細書において開示する他の炎症性状態など特定のヒト疾患の治療において、IL-17FおよびIL-17Aを中和するために使用することができる。
【０２２７】
6  喘息
IL-17は、アレルゲンによって誘導されるT細胞活性化および気道中への好中球流入において重要な役割を果たす。IL-17の受容体は気道中で発現され(Yao, et al. Immunity 3：811(1995))、アレルギー性喘息においてIL-17によって媒介される好中球動員は、IL-17に刺激されたヒト気管支上皮細胞(HBEC)およびヒト気管支線維芽細胞によって産生される化学誘引物質IL-8、GRO-αおよびマクロファージ炎症タンパク質-2(MIP-2)によって大部分は誘導される(Yao, et al. J Immunol 155：5483(1995)); Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108：430(2001))。IL-17はまた、HBECを刺激して、好中球活性化因子であるL-6を放出させ(Fossiez, et al., J Exp Med 183：2593(1996)およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126：179(2001))、かつ、TNF-αと協同して、インビトロでのヒト好中球の生存を延長することも示されている(Laan, et al. Eur Respir J 21：387(2003))。さらに、IL-17は、線維化促進(profibrotic)サイトカインであるIL-6およびIL-11、ならびに炎症メディエーターである顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)など気道の組織修復に関係があるとされているサイトカインの分泌を促進する能力によって、喘息における炎症応答を増幅することができる(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108：430(2001))。
【０２２８】
臨床エビデンスにより、喘息の急性かつ重度の増悪が、気道における好中球の動員および活性化に関連していることが示されており、したがって、IL-17は、喘息において重要な役割を果たしている可能性が高い。軽度の喘息患者は、遊離の可溶性IL-17Aタンパク質の局所濃度の検出可能な増加を示す(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108：430(2001))のに対し、ブタの飼育舎(confinement)に曝露することによって重度の気道炎症を誘発させた健常なヒトボランティアは、気管支肺胞空間における遊離の可溶性IL-17Aタンパク質の濃度の顕著な増加を示す(Fossiez, et al, J Exp Med 183：2593(1996)およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126：179(2001))。さらに、痰中のIL-17レベルは、気道の反応性亢進が増大した個体と相関関係があった(Barczyk, et al. Respir Med 97：726(2003))。
【０２２９】
気道応答性亢進の動物モデルにおいて、感作マウスに卵白アルブミンを長期的に吸入させると、気管支の好中球増加と共に、気管支の好酸球性炎症および炎症を起こした肺組織におけるIL-17 mRNA発現の早期の誘導が起こった(Hellings, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28：42(2003))。抗IL-17モノクローナル抗体は、気管支への好中球流入を大きく減少させたが、気管支肺胞洗浄液および血清の両方におけるIL-5レベルを有意に上昇させ、かつ、アレルゲンに誘導された気管支への好酸球流入を悪化させたことから、IL-17Aが、抗原侵襲後の好中球および好酸球の蓄積のバランスを決定することに関与している可能性があることが示唆される(同書)。
【０２３０】
IL-17ファミリーのメンバーのうちで、IL-17FがIL-17Aに最も密接に関連している。IL-17Fによって媒介される生物活性は、IL-17Aのものに類似しており、IL-17Fは、IL-6、IL-8、およびG-CSFの産生を刺激する(Hurst, et al. J Immunol 169：443(2002))。IL-17Fはまた、内皮細胞において、IL-2、形質転換増殖因子(TGF)-□、および単球走化性タンパク質(MCP)の産生も誘導する(Starnes, et al. J Immunol 167：4137(2001))。同様に、アレルゲンチャレンジにより、アレルギー性喘息患者において局所的IL-17Fを増加させることができる(Kawaguchi, et al. J Immunol 167：4430(2001))。マウス肺にIL-17Fを遺伝子導入すると、気管支肺胞空間中の好中球が増加するのに対し、IL-17F遺伝子を粘膜に移入すると、Agにより誘発された肺好中球増加およびメタコリンに対する気道応答性のレベルが上昇する(Oda, et al. Am J Respir Crit Care Med 171：12(2005))。
【０２３１】
喘息以外に、いくつかの慢性炎症性気道疾患が、気道における好中球動員を特徴とし、IL-17は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、細菌性肺炎、および嚢胞性線維症などの呼吸器病態の病因において重要な役割を果たすことが報告されている(Linden, et al. Eur Respir J 15：973(2000)、Ye, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25：335(2001)、Rahman, et al. Clin Immunol 115：268(2005))。抗IL-17A治療的分子および/または抗IL-17F治療的分子は、慢性炎症性気道疾患に有効であることを炎症のインビトロモデルにおいて実証することができる。IL-17Aおよび/またはIL-17Fによって誘導される、培養されたHBECまたは気管支線維芽細胞からのサイトカインおよびケモカイン産生を阻害するための、IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/またはIL-17A活性に対するアンタゴニストの能力は、IL-17Aおよび/またはIL-17F刺激に直接起因する炎症メディエーターの産生の防止におけるそのようなアンタゴニストの有効性の指標として使用することができる。IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/またはIL-17A活性に対するアンタゴニストを添加すると、炎症メディエーターの産生および発現が著しく減少する場合には、慢性の気道炎症に付随する炎症局面において有効であることが予想される。
【０２３２】
医薬用途の場合、本発明の可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体は、従来の方法に従って、非経口送達、特に静脈内送達または皮下送達用に製剤化される。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプもしくは他の適切な技術を用いる制御放出によって、または、1時間〜数時間の典型的な期間に渡る輸注によって行われる。一般に、薬学的製剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、または5％デキストロース水溶液など薬学的に許容されるビヒクルと共に造血タンパク質を含む。製剤はさらに、バイアル表面などの上でのタンパク質損失を防止するために、1種または複数種の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミンを含んでよい。このような併用療法を利用する場合、サイトカインは、単一の製剤中に混合してもよく、または別々の製剤中で投与してもよい。調剤方法は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton PA, 1990において開示されている。治療用量は一般に、0.1mg/kg患者体重/日〜100mg/kg患者体重/日、好ましくは0.5mg/kg/日〜20mg/kg/日の範囲であり、正確な用量は、治療される病態の性質および重症度、患者の体質などを考慮に入れて、容認されている標準に従って臨床家が決定する。用量の決定は当業者のレベルの範囲内である。タンパク質は、一般に、化学療法もしくは骨髄移植後の最長28日の期間に渡って、または血小板数が20,000個/mm3、好ましくは50,000個/mm3を超えるまで投与される。より一般的に、タンパク質は、1週間またはそれ未満に渡って、しばしば1日〜3日間に渡って投与される。一般に、本発明の可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体の治療的有効量は、リンパ系または骨髄系前駆細胞の増殖および/または分化の臨床的に有意な増大をもたらすのに十分な量であり、この増大は、成熟細胞(例えば、血小板または好中球)の循環レベルの上昇として顕在化する。したがって、血小板障害の治療は、血小板数が少なくとも20,000個/mm3、好ましくは50,000個/mm3に達するまで継続される。本発明の可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体はまた、IL-3、IL-6、およびIL-11;幹細胞因子;エリスロポエチン;G-CSFおよびGM-CSFなど他のサイトカインと組み合わせて投与することもできる。併用療法の治療計画において、他のサイトカインの1日量は一般的に以下のとおりである：EPO、150U/kg;GM-CSF、5 lg/kg〜15 lg/kg;IL-3、1 lg/kg〜5 lg/kg;およびG-CSF、1 lg/kg〜25 lg/kg。例えば、EPOとの併用療法は、EPOレベルが低い貧血患者において適用される。
【０２３３】
一般に、投与される可溶性IL-17RA(またはIL-17RA類似体もしくは融合タンパク質)、または抗IL-17RA抗体の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的医学的状態、および既往歴などの要因に応じて変動すると考えられる。典型的には、約1pg/kg〜10mg/kg(作用物質の量/患者の体重)の範囲の投薬量の可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、これより少ない投薬量または多い投薬もまた、状況に応じて投与してよい。
【０２３４】
対象への可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、くも膜下腔内、局所カテーテルによる灌流、または直接的な病巣内注射でよい。治療用タンパク質を注射によって投与する場合、投与は、持続輸注によって、または単回ボーラスもしくは複数回ボーラスによって行ってよい。
【０２３５】
その他の投与経路には、経口、粘膜、肺、および経皮が含まれる。経口送達は、ポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、プロテイノイドマイクロスフェア、ポリシアノアクリラートマイクロスフェア、および脂質ベースの系に適している(例えば、DiBaseおよびMorrel、「Oral Delivery of Microencapsulated Proteins」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、255〜288頁(Plenum Press 1997)を参照されたい)。鼻腔内送達の実現可能性は、インスリン投与のような様式によって示される(例えば、HinchcliffeおよびIllum、Adv. Drug Deliv. Rev. 35：199(1999)を参照されたい)。可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体を含む乾燥粒子または液体粒子を調製し、乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーを用いて吸入することができる(例えば、PettitおよびGombotz、TIBTECH 16：343(1998);Patton et al., Adv Drug. Deliv. Rev. 35：235(1999))。このアプローチは、エアロゾル化したインスリンを肺に送達する手持ち型電子吸入器であるAERX糖尿病管理システムによって例示される。研究により、低周波超音波の助けを借りて48,000 kDaほどの大型タンパク質が皮膚を通過して治療的濃度で送達されることが示されており、これは、経皮投与の実現可能性を示す(Mitragotri et al., Science 269：850(1995))。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、IL-17RA結合活性を有する分子を投与するための別の手段を提供する(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10：213(1997))。
【０２３６】
可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体を含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調製することができ、それにより、治療用タンパク質は薬学的に許容される担体との混合物中に混合される。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合、「薬学的に許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者に周知である。例えば、Gennaro(編)、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第19版(Mack Publishing Company 1995)を参照されたい。
【０２３７】
治療法のために、可溶性IL-17RAまたは抗IL-17RA抗体分子および薬学的に許容される担体は、治療的有効量で患者に投与される。本発明の治療的分子および薬学的に許容される担体の組合せは、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療的有効量」で投与されると言われる。作用物質は、その存在により、レシピエント患者の生理機能に検出可能な変化がもたらされる場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を治療するのに使用される作用物質は、その存在により、炎症応答が軽減される場合、生理学的に有意である。
【０２３８】
IL-17RA(またはIL-17RA類似体もしくは融合タンパク質)または中和性抗IL-17RA抗体を含む薬学的組成物は、液状形態で、エアロゾルで、または固形形態で提供され得る。液状形態の例は、注射液剤および経口懸濁剤である。例示的な固形形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態の例は、ミニ浸透圧ポンプおよび埋め込み剤である(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10：239(1997); Ranade、「Implants in Drug Delivery」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger(編)、95〜123頁(CRC Press 1995); Bremer et al.、「Protein Delivery with Infusion Pumps」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、239〜254頁(Plenum Press 1997); Yewey et al.、「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、93〜117頁(Plenum Press 1997))。
【０２３９】
リポソームは、静脈内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、筋肉内に、皮下に、または、経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与を介して、対象に治療的ポリペプチドを送達するための1つの手段を提供する。リポソームは、水溶性の区画を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である(一般に、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(補遺1)：S61(1993)、Kim, Drugs 46：618(1993)、およびRanade、「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger(編)、3〜24頁(CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは、組成が細胞膜に類似しており、結果として、リポソームは安全に投与することができ、かつ生分解性である。調製方法によって、リポソームは、単層または多重層でよく、かつ、リポソームのサイズは様々でよく、直径は0.02μm〜10μm超の範囲である。様々な作用物質をリポソーム中に封入することができる。疎水性作用物質は二重層に分配し、親水性作用物質は内側の水溶性空間内に分配する(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46：1576(1989)を参照されたい)。さらに、リポソームサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面の特徴を変更することによって、封入された作用物質の治療的有効性を制御することも可能である。
【０２４０】
リポソームは、実質的にどんなタイプの細胞にも吸着し、次いで、封入された作用物質をゆっくりと放出することができる。あるいは、吸着されたリポソームは、食作用を有する細胞によるエンドサイトーシスを受け得る。エンドサイトーシスの後に、リポソーム脂質のリソソーム内分解および封入された作用物質の放出が続く(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446：368(1985))。静脈内投与後、小型リポソーム(0.1μm〜1.0μm)は、典型的には、肝臓および脾臓に主に位置する網内系の細胞によって取り込まれるが、3.0μmより大きいリポソームは、肺に蓄積される。網内系の細胞による小型リポソームのこの選択的取り込みは、マクロファージおよび肝臓の腫瘍に化学療法剤を送達するために用いられている。
【０２４１】
網内系は、大量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化を含むいくつかの方法によって回避することができる(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta. 802：428(1984))。さらに、糖脂質またはポリエテレン(polyethelene)グリコールで誘導体化したリン脂質をリポソーム膜中に組み込むと、網内系による取込みの有意な減少が起こることが示されている(Allen et al.,Biochim. Biophys. Acta. 1068：133(1991);Allen et al.,Biochim. Biophys. Acta. 1150：9(1993))。
【０２４２】
リポソームはまた、リン脂質組成を変更することによって、または受容体もしくはリガンドをリポソーム中に挿入することによって、特定の細胞または器官を標的とするように調製することもできる。例えば、高い含有量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは、肝臓を標的とするために用いられている(Hayakawa et al., 日本国特許第04-244,018号;Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16：960(1993))。これらの製剤は、大豆ホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化硬化ヒマシ油(HCO-60)をメタノール中で混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで、水で混合物を溶解することによって調製された。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)を含むジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的とすることが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20：881(1997))。
【０２４３】
あるいは、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質など様々なターゲティングリガンドをリポソームの表面に結合させてもよい。例えば、リポソームを分枝型のガラクトシル脂質誘導体で修飾して、肝臓細胞表面で専ら発現される、アシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的にさせることができる(KatoおよびSugiyama、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14：287, 1997、Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20：259, (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27：772(1998)では、アシアロフェツインでリポソームを標識すると、リポソームの血漿半減期が短縮され、かつ、アシアロフェツイン標識リポソームの肝細胞による取込みが大幅に増強されたことが示された。一方で、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインを前もって注射することにより阻害され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20：259(1997))。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞にリポソームをターゲティングするための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 94：11681(1997))。さらに、Gehoらの米国特許第4,603,044号では、肝臓の特殊な代謝細胞に関連した肝胆道受容体に対する特異性を有する、肝細胞を対象とするリポソーム小胞送達系を記載している。
【０２４４】
組織ターゲティングに対するより一般的なアプローチでは、標的細胞は、標的細胞によって発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体で前標識される(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99(1998))。遊離抗体を血漿から除去した後、ストレプトアビジンを結合させたリポソームが投与される。別のアプローチでは、ターゲティング抗体がリポソームに直接結合される(Harasym et al., Adv. Drug Deliv.Rev. 32：99(1998))。
【０２４５】
ポリペプチドおよび抗体は、タンパク質マイクロカプセル化の標準的技術を用いて、リポソーム内に封入され得る(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31：1099(1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50：1853(1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063：95(1991)、Alving et al. 「Preparaton and Use of Liposomes in Immunological Studies」、Liposome Technology、第2版、第3巻、Gregoriadis(編)、317頁(CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149：124(1987)を参照されたい)。上記のように、治療的に有用なリポソームは、様々な成分を含んでよい。例えば、リポソームは、ポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含んでよい(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150：9(1993))。
【０２４６】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するために設計された。マイクロスフェアは、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性酢酸エチルビニルポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、その際、タンパク質はポリマー中に閉じ込められる(GombotzおよびPettit、Bioconjugate Chem. 6：332(1995); Ranade、「Role of Polymers in Drug Delivery」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger(編)、51〜93頁(CRC Press 1995);RoskosおよびMaskiewicz、「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、45〜92頁(Plenum Press 1997);Bartus et al., Science 281：1161(1998);PutneyおよびBurke、Nature Biotechnology 16：153(1998);Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2：548(1998))。ポリエチレングリコール(PEG)でコーティングされたナノスフェアもまた、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10：167(1997)を参照されたい)。
【０２４７】
本発明はまた、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体のIL-17RA可溶性受容体、およびIL-17RAアンタゴニスト、例えば抗IL-17RA抗体もしくは結合ポリペプチド、または中和性抗IL-17RA抗体などIL-17RA結合活性を有し、前述したようにポリペプチドがポリマーと結合している、化学的に修飾されたポリペプチドも企図する。
【０２４８】
他の剤形は、例えば、AnselおよびPopovich、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第5版(Lea&Febiger 1990)、Gennaro(編)、Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版(Mack Publishing Company 1995)によって、かつ、RanadeおよびHollinger、Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)によって示されているように、当業者によって考案され得る。
【０２４９】
例として、薬学的組成物は、IL-17RA細胞外ドメインを有するポリペプチド、例えば単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、もしくは多量体のIL-17RA可溶性受容体、またはIL-17RAアンタゴニスト(例えば、IL-17RAポリペプチドに結合する抗体もしくは抗体断片、または中和性抗IL-17RA抗体)を含む容器を含むキットとして供給されてよい。治療的ポリペプチドは、単回投与もしくは複数回投与用の注射液剤の形態で、または、注射前に溶解される滅菌粉末として、提供され得る。あるいは、このようなキットは、治療的ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーも含んでよい。このようなキットは、薬学的組成物の適応症および使用法に関する書面情報をさらに含んでよい。さらに、このような情報は、IL-17RA組成物がIL-17RAに対する過敏性が公知である患者には禁忌であるという記載も含んでよい。
【０２５０】
抗IL-17RA抗体もしくは結合相手(もしくは抗IL-17RA抗体断片、抗体融合物、およびヒト化抗体など)、またはIL-17RA可溶性受容体を含む薬学的組成物は、液状形態で、エアロゾルで、または固形形態で提供され得る。液状形態の例は、注射液剤、エアロゾル、液滴、トポロジー(topological)液剤、および経口懸濁剤である。例示的な固形形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態の例は、ミニ浸透圧ポンプおよび埋め込み剤である(Bremer et al., Pharm.Biotechnol. 10：239(1997); Ranade、「Implants in Drug Delivery」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger(編)、95〜123頁(CRC Press 1995); Bremer et al.、「Protein Delivery with Infusion Pumps」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、239〜254頁(Plenum Press 1997); Yewey et al.、「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、93〜117頁(Plenum Press 1997))。他の固形形態には、クリーム剤、パスタ剤、および他のトポロジー外用剤(topological application)などが含まれる。
【０２５１】
リポソームは、静脈内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、筋肉内に、皮下に、または、経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与を介して、対象に治療的ポリペプチドを送達するための1つの手段を提供する。リポソームは、水溶性の区画を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である(一般に、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(補遺1)：S61(1993)、Kim, Drugs 46：618(1993)、およびRanade、「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger(編)、3〜24頁(CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは、組成が細胞膜に類似しており、結果として、リポソームは安全に投与することができ、かつ生分解性である。調製方法によって、リポソームは、単層または多重層でよく、かつ、リポソームのサイズは様々でよく、直径は0.02μm〜10μm超の範囲である。様々な作用物質をリポソーム中に封入することができる。疎水性作用物質は二重層に分配し、親水性作用物質は内側の水溶性空間内に分配する(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46：1576(1989)を参照されたい)。さらに、リポソームサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面の特徴を変更することによって、封入された作用物質の治療的有効性を制御することも可能である。
【０２５２】
リポソームは、実質的にどんなタイプの細胞にも吸着し、次いで、封入された作用物質をゆっくりと放出することができる。あるいは、吸着されたリポソームは、食作用を有する細胞によるエンドサイトーシスを受け得る。エンドサイトーシスの後に、リポソーム脂質のリソソーム内分解および封入された作用物質の放出が続く(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446：368(1985))。静脈内投与後、小型リポソーム(0.1μm〜1.0μm)は、典型的には、肝臓および脾臓に主に位置する網内系の細胞によって取り込まれるが、3.0μmより大きいリポソームは、肺に蓄積される。網内系の細胞による小型リポソームのこの選択的取り込みは、マクロファージおよび肝臓の腫瘍に化学療法剤を送達するために用いられている。
【０２５３】
網内系は、大量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活化を含むいくつかの方法によって回避することができる(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta. 802：428(1984))。さらに、糖脂質またはポリエテレン(polyethelene)グリコールで誘導体化したリン脂質をリポソーム膜中に組み込むと、網内系による取込みの有意な減少が起こることが示されている(Allen et al.,Biochim. Biophys. Acta. 1068：133(1991);Allen et al.,Biochim. Biophys. Acta. 1150：9(1993))。
【０２５４】
リポソームはまた、リン脂質組成を変更することによって、または受容体もしくはリガンドをリポソーム中に挿入することによって、特定の細胞または器官を標的とするように調製することもできる。例えば、高い含有量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは、肝臓を標的とするために用いられている(Hayakawa et al.、日本国特許第04-244,018号;Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16：960(1993))。これらの製剤は、大豆ホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化硬化ヒマシ油(HCO-60)をメタノール中で混合し、混合物を真空下で濃縮し、次いで、水で混合物を溶解することによって調製された。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)を含むジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的とすることが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20：881(1997))。
【０２５５】
あるいは、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質など様々なターゲティングリガンドをリポソームの表面に結合させてもよい。例えば、リポソームを分枝型のガラクトシル脂質誘導体で修飾して、肝臓細胞表面で専ら発現される、アシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的にさせることができる(KatoおよびSugiyama、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14：287(1997)、Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20：259(1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27：772(1998)では、アシアロフェツインでリポソームを標識すると、リポソームの血漿半減期が短縮され、かつ、アシアロフェツイン標識リポソームの肝細胞による取込みが大幅に増強されたことが示された。一方で、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインを前もって注射することにより阻害され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20：259(1997))。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞にリポソームをターゲティングするための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94：11681(1997))。さらに、Gehoらの米国特許第4,603,044号では、肝臓の特殊な代謝細胞に関連した肝胆道受容体に対する特異性を有する、肝細胞を対象とするリポソーム小胞送達系を記載している。
【０２５６】
組織ターゲティングに対するより一般的なアプローチでは、標的細胞は、標的細胞によって発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体で前標識される(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99(1998))。遊離抗体を血漿から除去した後、ストレプトアビジンを結合させたリポソームが投与される。別のアプローチでは、ターゲティング抗体がリポソームに直接結合される(Harasym et al., Adv. Drug Deliv.Rev. 32：99(1998))。
【０２５７】
抗IL-17RA中和抗体およびIL-17F結合活性もしくはIL-17A結合活性を有する結合相手、またはIL-17RA可溶性受容体は、タンパク質マイクロカプセル化の標準的技術を用いて、リポソーム内に封入され得る(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31：1099(1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50：1853(1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063：95(1991)、Alving et al. 「Preparaton and Use of Liposomes in Immunological Studies」、Liposome Technology、第2版、第3巻、Gregoriadis(編)、317頁(CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149：124(1987)を参照されたい)。上記のように、治療的に有用なリポソームは、様々な成分を含んでよい。例えば、リポソームは、ポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含んでよい(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150：9(1993))。
【０２５８】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するために設計された。マイクロスフェアは、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性酢酸エチルビニルポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、その際、タンパク質はポリマー中に閉じ込められる(GombotzおよびPettit、Bioconjugate Chem. 6：332, 1995; Ranade、「Role of Polymers in Drug Delivery」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger(編)、51〜93頁(CRC Press 1995);RoskosおよびMaskiewicz、「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren(編)、45〜92頁(Plenum Press 1997);Bartus et al., Science 281：1161(1998);PutneyおよびBurke、Nature Biotechnology 16：153(1998);Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2：548(1998))。ポリエチレングリコール(PEG)でコーティングされたナノスフェアもまた、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10：167(1997)を参照されたい)。
【０２５９】
本発明はまた、前述したようにポリマーと結合している、化学的に修飾された抗IL-17RA抗体または結合相手、例えば、抗抗IL-17RA抗体またはIL-17RA可溶性受容体も企図する。
【０２６０】
他の剤形は、例えば、AnselおよびPopovich、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第5版(Lea&Febiger 1990)、Gennaro(編)、Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版(Mack Publishing Company 1995)によって、ならびにRanadeおよびHollinger、Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)によって示されているように、当業者によって考案され得る。
【０２６１】
本発明は、抗IL-17F抗体の組成物、ならびに本明細書において説明する抗体、ペプチド、またはポリペプチドを含む方法および治療的使用を企図する。このような組成物は、担体をさらに含んでよい。担体は、従来の有機担体または無機担体でよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、およびトウモロコシ油などが含まれる。
【０２６２】
K)トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウスは、全組織において、または組織特異的もしくは組織優先的な調節エレメントの制御下で、IL-17F遺伝子、IL-17A遺伝子、またはIL-17RA遺伝子のいずれかを過剰発現するように操作することができる。これらの過剰産生マウスは、過剰発現に起因する表現型を特徴付けるために使用することができ、かつ、トランスジェニック動物は、過剰なIL-17F、IL-17A、またはIL-17RAによって引き起こされるヒト疾患のモデルとして役立ち得る。また、これらのうちいずれかを過剰発現するトランスジェニックマウスは、大型動物の乳または血液中の可溶性IL-17RAのようなIL-17RAを作製するためのモデルバイオリアクターも提供する。トランスジェニックマウスを作製するための方法は当業者に周知である(例えば、Jacob、「Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice」、Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice、Jacob(編)、111〜124頁(Academic Press, Ltd. 1994), MonasterskyおよびRobl(編)、Strategies in Transgenic Animal Science(ASM Press 1995)、ならびにAbbudおよびNilson、「Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice」、Gene Expression Systems：Using Nature for the Art of Expression、FernandezおよびHoeffler(編)、 367〜397頁(Academic Press, Inc. 1999)を参照されたい)。
【０２６３】
例えば、IL-17RA遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製するための方法は、繁殖力のある成体雄マウス(種マウス)(B6C3f1、2月齢〜8月齢(Taconic Farms, Germantown, NY))、精管切除された雄マウス(繁殖不能)(B6D2f1、2月齢〜8月齢(Taconic Farms))、思春期前の妊娠可能な雌マウス(ドナー)(B6C3f1、4週齢〜5週齢(Taconic Farms))、および妊娠可能な成体雌マウス(レシピエント)(B6D2f1、2月齢〜4月齢、(Taconic Farms))を用いて始めることができる。ドナーを1週間順化させ、次いで、約8IU/マウスの妊馬血清ゴナドトロピン(Sigma Chemical Company; St.Louis, MO)を腹腔内注射し、かつ、46〜47時間後、8IU/マウスのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG(Sigma))を腹腔内注射して、過剰排卵を誘導する。ホルモン注射の後に、ドナーを種マウスと交尾させる。排卵は、一般に、hCG 注射から13時間以内に起こる。交尾は、交尾後の朝に膣栓の存在によって確認する。
【０２６４】
受精卵は、外科用スコープのもとで採取する。輸卵管を採取し、ヒアルロニダーゼ(Sigma)を含む尿検査スライドに卵を放出させる。ヒアルロニダーゼ中で1回、ならびに、5％CO2、5％O2、および90％N2と共に37℃でインキュベートしておいたホイットン(Whitten)のW640培地(例えば、MeninoおよびO'Claray、Biol.Reprod. 77：159(1986)、ならびにDienhartおよびDowns、Zygote 4：129(1996)によって記述されている)中で2回、卵を洗浄する。次いで、マイクロインジェクションするまで、卵を37℃/5％CO2インキュベーター中で保存する。
【０２６５】
IL-17RAをコードする配列を含むプラスミドDNA 10マイクログラム〜20マイクログラムを直線化し、ゲル精製し、かつ、マイクロインジェクション用に、10mM Tris-HCl(pH7.4)、0.25mM EDTA(pH8.0)中に再懸濁して最終濃度5ナノグラム/マイクロリットル〜10ナノグラム/マイクロリットルにする。
【０２６６】
温かいCO2平衡化鉱油で覆われたW640培地の液滴中に含まれる採取した卵に、プラスミドDNAを微量注入する。DNAを注射針中に吸い上げ(内径0.75mm、外径1mmのホウケイ酸ガラス毛細管から引っ張る)、個々の卵中に注射する。各卵の一倍体前核の一方または両方に、注射針を貫通させる。
【０２６７】
ピコリットルのDNAを前核中に注入し、かつ、核小体と接触しないように注射針を引き抜く。すべての卵に注入するまで、この手順を繰り返す。成功裡に微量注入された卵を、前もって気体を供給したW640培地を入れた器官組織培養皿中に移し、37℃/5％CO2インキュベーター中で一晩保管する。
【０２６８】
翌日、2細胞期胚を偽妊娠レシピエントに移入する。レシピエントは、精管切除された繁殖不能マウスと交尾させた後に、交尾栓の存在によって確認する。レシピエントに麻酔をかけ、背部左側を剪毛し、かつ、外科用顕微鏡に移す。胸郭、鞍状部、および後肢によって輪郭を描かれた腹部領域の中央、すなわち膝と脾臓の中間の皮膚および筋肉壁を通る小切開部を作る。小さな外科用ドレープ上に生殖器官を露出させる。脂肪パッドを外科用ドレープ上に広げ、小型止血小鉗子(Roboz, Rockville, MD)を脂肪パッドに取り付け、かつ、マウスの背中の上にぶら下がったままにして、器官が中に戻るのを防ぐ。
【０２６９】
鉱油、続いて交互にW640および気泡を含む細い移入ピペットを用いて、前日の注入から得られる12〜17個の健常な2細胞期胚をレシピエント中に移入する。膨らんだ膨大部の位置を特定し、膨大部と嚢の間の輸卵管を保持し、膨大部にも嚢にも傷をつけないように確認しつつ、嚢の近くの輸卵管に28g針で切れ目を入れる。
【０２７０】
輸卵管中の切れ目にピペットを入れ、胚を吹き入れて、最初の気泡がピペットから出て行くのを可能にする。脂肪パッドを穏やかに腹膜中に押し入れ、生殖器官を中に戻らせる。腹腔壁を一針縫って閉じ、皮膚を創傷クリップで閉じる。37℃のスライドウォーマー上で最低4時間、マウスを回復させる。
【０２７１】
レシピエントを2匹1組でケージに戻し、19日〜21日間の妊娠期間を与える。出産後、19日〜21日間の出産後期間を与えた後、離乳する。離乳マウスの性別を区別し、別々の性別ケージに入れ、かつ、清潔なハサミを用いて、(遺伝子タイピングのために使用する)0.5cm生検を尾部から切り取る。
【０２７２】
例えば、QIAGEN DNEASYキットを製造業者の取扱い説明書に従って用いて、尾部小片からゲノムDNAを調製する。IL-17RA遺伝子または同じプラスミド中に導入された選択マーカー遺伝子を増幅するように設計されたプライマーを用いるPCRによってゲノムDNAを解析する。動物がトランスジェニックであることを確認した後、雌トランスジェニックマウスを野生型雄マウスと一緒にすることによって、または雄トランスジェニックマウスを1匹もしくは2匹の野生型雌マウスと一緒にすることにより、それらを戻し交雑して近交系にする。仔マウスが産まれ、離乳すると、性別を分け、遺伝子タイピングのために尾部を切り取る。
【０２７３】
生動物における導入遺伝子の発現を確認するために、部分的肝切除を実施する。剣状突起(zyphoid process)の真下の上腹部から外科的調製物を作製する。無菌的技法を用いて、胸骨下に1.5cm〜2cmの小切開を行い、肝臓の左側葉を露出させる。4-0シルクで下葉の周りを縛って、体腔の外側にそれを固定する。非外傷性クランプを用いて、結び目を保持しつつ、吸収性のDexon(American Cyanamid; Wayne, NJ.)の第2の輪を第1の結び目の近位に作る。遠位切断をDexonの結び目から行い、約100mgの切除された肝臓組織を、無菌ペトリ皿に入れる。切除された肝臓切片を、14mlのポリプロピレン製丸底試験管に移し、液体窒素中で急速凍結し、次いで、ドライアイス上で保存する。手術部位を縫合および創傷クリップによって閉じ、動物のケージを37℃の加熱パッド上に手術後24時間置く。手術後、動物を毎日検査し、創傷クリップを手術後7日〜10日目に取り外す。IL-17RA mRNAの発現レベルを、RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法またはポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、個々のトランスジェニックマウスについて検査する。
【０２７４】
IL-17F、IL-17A、またはIL-17RAを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製することに加えて、これらの遺伝子のうちいずれかを異常に少なく発現するか、または全く発現しないトランスジェニックマウスを設計することも有用である。このようなトランスジェニックマウスは、IL-17F、IL-17A、またはIL-17RAの欠失に関連する疾患に関する有用なモデルを提供する。上述したように、IL-17RA遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、または外部ガイド配列遺伝子を用いて阻害することができる。IL-17RA遺伝子を過小発現するトランスジェニックマウスを作製するためには、このような阻害配列にIL-17RA mRNAを標的とさせる。特定の遺伝子を異常に低く発現するトランスジェニックマウスを作製するための方法は、当業者に公知である(例えば、Wu et al.、「Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies」、Methods in Gene Biotechnology、205〜224頁(CRC Press 1997)を参照されたい)。
【０２７５】
IL-17RA遺伝子発現をほとんどまたは全く有さないトランスジェニックマウスを作製するための代替アプローチは、少なくとも1つの正常なIL-17RA対立遺伝子が非機能的IL-17RAによって置換されているマウスを作製することである。非機能的IL-17RAを設計する１つの方法は、選択マーカー遺伝子のような別の遺伝子を、IL-17RAをコードする核酸分子内に挿入することである。これらのいわゆる「ノックアウトマウス 」を作製するための標準的な方法は、当業者に公知である(例えば、Jacob、「Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice」、Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice、Jacob(編)、111〜124頁(Academic Press, Ltd. 1994)、およびWu et al.、「New Strategies for Gene Knockout」、Methods in Gene Biotechnology、339〜365頁(CRC Press 1997))を参照されたい)。
【０２７６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【０２７７】
実施例
実施例1
IL-17F mRNAは、喘息のマウスモデルにおいて上方調節される
感作および気道チャレンジマウスモデルにおいてIL-17F mRNAレベルを測定した。0日目および7日目に、組換えヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)アレルゲン 1(DerP1)(Indoor biotechnologies, Cardiff, UK)10 ugの50 ％ Imject Alum(Pierce)溶液を腹腔内注射することによって、8週齢〜10週齢のマウス群を感作した。7日後、3日間連続して(14日目、15日目、および16日目)、DerP1 20ugの50 ul PBS溶液でマウスをチャレンジした。この群に相当するマウスは4匹であった。陰性対照は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)感作とそれに続くPBSチャレンジを受けたマウス5匹を含んだ。さらに、3匹のマウスは、DerP1感作とそれに続くPBSチャレンジを受けた。アレルゲンチャレンジまたは対照チャレンジ後48時間目に、肺組織全体を採取し、かつ全RNAを単離した。
【０２７８】
各対象に由来する同一量の全RNAを用いて、第1の鎖cDNAを調製した。Qiagenホットスターポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)および製造業者の推奨によって、IL-17F PCRを実施した。IL-17F PCRでは、SEQ ID NO：1に示すセンスプライマーおよびSEQ ID NO：2に示すアンチセンスプライマーを用いた35サイクルの増幅を使用した。鋳型の質が対象すべての間で均一であることを確かめるために、IL-17F増幅において使用される同量の各鋳型にβアクチンPCRを適用した。ΒアクチンPCRは、SEQ ID NO：3に示すセンスプライマーおよびSEQ ID NO：4に示すアンチセンスプライマーを用いた25サイクルのPCRを含んだ。
【０２７９】
DerP1で感作し、DerP1でチャレンジした処置群(喘息摸擬)のマウス4匹はすべて、活発なIL-17F増幅を示した。一方、DerP1感作/PBSチャレンジ処置群に相当する対象3匹のうち3匹およびPBS感作/PBSチャレンジ処置群の対象5匹のうち5匹を含む陰性対照からは、弱いIL-17F増幅が認められた。Βアクチン増幅は、陰性対照に対して、喘息を模擬した対象の場合と少なくとも同じくらい活発であったことから、陰性対照の弱いIL-17F増幅は鋳型の問題が原因ではないことが実証された。
【０２８０】
実施例2
IL-17Aは、ヒト末梢血単核細胞中のIFN-γおよびTNF-αのレベルの上昇を誘導する
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をフィコール密度勾配遠心分離によって精製し、次いで、培地単独、50ng/ml抗ヒトCD3抗体、または50ng/ml抗ヒトCD3抗体と1μg/ml抗ヒトCD28抗体の組合せ中、37℃で一晩インキュベートする。これらの各条件に対する複製培養物を準備し、サイトカイン無し、25ng/mlヒトIL-17A、または25ng/mlヒトIL-17Fを与える。24時間インキュベーションした後、各培養物の上清を採取し、B-D Bioscience'sヒトTh1/Th2 Cytometric Bead Array(CBA)を用いてサイトカイン含有量を分析する。本発明者らは、抗CD3または抗CD3および抗CD28のいずれかで刺激され、かつ、IL-17Aを補充された培養物が、サイトカインを添加されなかった培養物またはIL-17Fを与えられた培養物よりも、有意に高いレベルのIFN-γおよびTNF-α(それぞれ3〜5倍上昇)を含むことを発見した。抗CD3刺激を与えられなかった培養物は、サイトカインレベルの有意な変化を示さなかった。さらに、IL-17A添加は、CBAを用いて分析した、IL-2、IL-4、IL-5、およびIL-10を含む他のサイトカインの有意な変化も誘導しなかった。このデータから、IL-17Aは、抗CD3または抗CD3および抗CD28で刺激したPBMC培養物におけるIFN-γおよびTNF-αの産生を増大させることができるが、IL-17Fはこれをできないことが示唆される。
【０２８１】
実施例3
IL-17RA-Fcは、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルにおいて疾患の発生率および進行を低減させる
A)マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデル
10週齢のDBA/1J雄マウス(Jackson Labs)をマウス13匹/群の3群に分ける。21日前に、(Chondrex(Redmond, WA)によって調製された)完全フロイントアジュバント中で調製した1mg/mlニワトリII型コラーゲン50μl〜100μlを動物の尾部に皮内注射し、3週間後の0日目に、不完全フロイントアジュバン中で調製した以外は同じ注射液をそれらに注射する。IL-17RA-Fcは、1週3回、4週間、0日目からマウスの大多数が疾患の中程度の症状を示す日までの範囲の様々な時点に腹腔内注射によって投与する。マウス群には、10μg/動物/用量または100μg/動物/用量のIL-17RA-Fcのいずれかを与え、対照群には、ビヒクル対照のPBS(Life Technologies, Rockville, MD)を与える。動物は、2回目のコラーゲン注射後に関節炎の症状を示し始め、ほとんどの動物が1.5〜3週間以内に炎症を発症する。各足の疾患の程度を、足の厚みを測定するためのカリパスを用い、かつ、各足に対して以下の臨床スコア(0〜3)を割り当てることによって評価する：0＝正常、0.5＝足指の炎症、1＝軽度の足の炎症、2＝中等度の足の炎症、および3＝下記に詳述する重度の足の炎症。
【０２８２】
B)疾患のモニタリング
動物は、2回目のコラーゲン注射後まもなく、足の炎症の徴候を示し始める場合があり、一部の動物は、2回目のコラーゲン注射前に足指の炎症の徴候を示し始める場合さえある。ほとんどの動物は、追加免疫注射から1.5〜3週間以内に関節炎を発症するが、一部の動物は、より長い期間を必要とする場合がある。このモデルにおける疾患の発生率は、典型的には95％〜100％であり、動物40匹を用いた研究では、典型的には非応答動物0匹〜2匹(6週間の観察後に判定)が認められる。炎症が始まると、多様な軽度の足炎症または足指炎症が一般的に一過性に発生し得ることに留意されたい。この理由から、動物は、顕著で持続的な足の腫脹を発症するまでは、確立された疾患を有するとみなされない。
【０２８３】
全ての動物を毎日観察して、足の疾患の状態を評価する。これは、各足に定性的臨床スコアを割り当てることによって実施する。毎日、臨床疾患の状態に従って、各動物の4つの足を採点する。臨床スコアを決定するために、足は、3つの領域、すなわち足指、足それ自体(手または足)、および手首または足首の関節を有すると考えることができる。以下を含む、これらの領域に対する炎症の程度および重症度に注目する：各足指の腫脹の観察;爪の裂傷または足指の発赤;任意の足における浮腫または発赤の任意の証拠に関する記録;腱または骨の微細解剖学的境界の任意の消失に関する記録;手首または足首の任意の浮腫または発赤の評価;および、炎症が脚の基部方向に及んでいるかの記録。足スコア1、2、または3は、第1に重症度の全体的印象に基づき、第2に、いくつの領域が関与しているかに基づく。臨床スコアリングのために使用される尺度を以下に示す。
C)臨床スコア
0＝正常
0.5＝1つまたは複数の足指が関与しているが、足指のみが炎症を起こしている
1＝足を含む軽度の炎症(1つの領域)。1つまたは複数の足指を含んでよい
2＝足における中等度の炎症。足指および/または手首/足首のうちいくつかを含んでよい(2つの領域)
3＝足、手首/足首、および足指の一部または全体における重度の炎症(3つの領域)。
【０２８４】
確立された疾患は、連続して2日間持続する、2またはそれ以上にランク付けされる定性的スコアの足炎症として定義される。確立された疾患が存在したら、その日付を記録し、「確立された疾患」を有する動物の最初の日と呼ぶ。
【０２８５】
抗コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清免疫グロブリンレベルおよびサイトカインレベルをモニターするために、実験を通して血液を採取する。血清中の抗コラーゲン抗体は、疾患の重症度とよく相関している。動物を21日目に安楽死させ、血清およびCBCを得るために血液を採取する。各動物から、1つの罹患足を組織学のために10％NBF中に採取し、かつ、1つを液体窒素中で凍結し、mRNA解析のために-80℃で保存する。同様に、脾臓1/2、胸腺1/2、腸間膜リンパ節1/2、肝葉1つ、および左腎臓をRNA解析用にRNAlater中に採取し、脾臓1/2、胸腺1/2、腸間膜リンパ節1/2、残りの肝臓、および右腎臓を組織学用に10％NBF中に採取する。免疫グロブリンアッセイ法およびサイトカインアッセイ法用に血清を採取し、-80℃で凍結する。
【０２８６】
すべての時点のIL-17RA-Fcを与えられたマウス群は、足炎症の発生および/または進行の遅延を特徴とする。これらの結果から、IL-17RAが、このモデルに関連する炎症、ならびに疾患の発生率および進行を低減させ得ることが示唆される。これらの結果は、IL-17RA-Fcが、血清TNFa、IL-1b、および抗コラーゲン抗体のレベルの低下をもたらしたという観察結果によってさらに裏付けられる。
【０２８７】
実施例4
切断型IL-17RA可溶性受容体は、炎症性腸疾患(IBD)モデルにおいて疾患の発生率および進行を低減させる
このモデルは、IBD患者由来の培養された腸組織が、健常な対照由来の組織と比べて、より高レベルの炎症メディエーターを産生することを示すために設計される。炎症メディエーター(IL-Ib、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなどを含むがこれらに限定されるわけではない)の産生のこの増大は、炎症経路および下流のエフェクター細胞の活性化に対する作用を介して、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)などのIBDに関連する症状および病理の一因となる。次いで、これらの経路および成分は、インビボで観察される組織および細胞の損傷/破壊をもたらす。したがって、このモデルは、IBDの炎症メディエーターが増強されたこの状況を模擬し得る。さらに、健常な対照またはヒト腸上皮細胞(IEC)株に由来する腸組織をこれらの炎症性成分の存在下で培養する場合、炎症経路シグナル伝達、ならびに組織および細胞の損傷の証拠が観察され得る。
【０２８８】
ヒトIBDにおいてインビボで有効であると思われる治療薬は、炎症メディエーターの産生および/または存在を阻害および/または中和することによって、上記のエクスビボモデルまたはIECモデルにおいて作用するはずである。
【０２８９】
このモデルでは、ヒト腸組織を、IBD患者もしくは腸生検、切除を受けた健常対照から、または死後の組織採集から採取し、Alexakis et al(Gut 53：85-90; 2004)の改変法を用いて処理する。無菌条件下で、大量のPBSで試料を穏やかに洗浄し、続いて、完全組織培養培地(および細菌の過剰増殖を防止するための抗生物質)の存在下で、細かく切った組織切片を培養する。細かく切った組織の同じプールに由来する試料を以下のうち1種で処理する：ビヒクル(PBS)、組換えヒト(rh)IL-17A、rhIL-17F、またはrhIL-17A+rhIL-17F。さらに、IL-17AまたはIL-17Fのいずれかのアンタゴニストを用いて、または用いずに、単独でまたは組み合わせて(可溶性IL-17RAなど)、これらを処理する。この実験プロトコールは、細胞が既存のストックから継代培養される点を除いて、ヒトIEC株を用いた研究用のプロトコールに従う。様々な期間(1時間〜数日間)培養した後、上清を採取し、上記に挙げたものを含む炎症メディエーターのレベルを解析する。IBD患者由来の試料において、またはrhIL-17Aおよび/もしくはrhIL-17Fで処理した試料において、炎症性サイトカインおよび炎症性ケモカインのレベルは、未処理の健常な対照組織試料と比べて上昇している。IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/またはIL-17A活性に対するアンタゴニストを添加すると、炎症メディエーターの産生が著しく減少し、したがって、ヒトIBDおいて有効であることが予想される。
【０２９０】
実施例5
切断型IL-17RA可溶性受容体は、多発性硬化症(MS)モデルにおいて疾患の発生率および進行を低減させる
多発性硬化症(MS)は、リンパ球性および単核性の細胞炎症性浸潤物の存在ならびにCNSの全体にわたる脱髄を含む、いくつかの要因によって媒介されると考えられている複合疾患である。ミクログリアは、中枢神経系(CNS)に存在し、かつ、損傷または炎症の際に活性化されるマクロファージ様細胞である。ミクログリアは、MSを含む様々なCNS疾患において重大な役割を果たすと意味付けられており、疾患の開始、進行、および治療法のメカニズムを研究するために使用され得る(Nagai et al. Neurobiol Dis 8：1057-1068; 2001、Olson et al. J Neurosci Methods 128：33-43; 2003)。したがって、不死化されたヒトミクログリア細胞株および/または樹立されたヒトアストログリア細胞株は、これらの細胞型に対する炎症メディエーターの作用のいくつかおよび中和に対するそれらの可能性を研究するために使用することができる。炎症メディエーター(IL-Ib、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、RANTES、IP-10、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSFなどを含むがこれらに限定されるわけではない)は、炎症経路および下流のエフェクター細胞の活性化に対する作用を介して、MSに関連する症状および病理の一因となり得る。
【０２９１】
IL-17AおよびIL-17Fの炎症誘発性作用、ならびにこれらの作用を中和または減少させるための、IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/またはIL-17A活性に対するアンタゴニストの能力を評価するために、培養したグリア細胞を以下のうち1種で処理する：ビヒクル、rhIL-17A、rhIL-17F、rhIL-17A+IL-17F。さらに、IL-17AまたはIL-17Fのいずれかのアンタゴニストを用いて、または用いずに、単独でまたは組み合わせて(可溶性IL-17RAなど)、これらを処理する。様々な期間(1時間〜数日間)培養した後、上清および細胞を採取し、上記に挙げたものを含む炎症メディエーターのレベルおよび/または発現を解析する。炎症性サイトカインおよび炎症性ケモカインのレベルは、ビヒクルのみで処理した培養物と比べて、rhIL-17Aおよび/またはIL-17Fの存在下で上昇している。IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/またはIL-17A活性に対するアンタゴニストを添加すると、炎症メディエーターの産生および発現が著しく減少し、したがって、ヒトMSに関連した炎症性状況において有効であることが予想される。
【０２９２】
実施例6
切断型IL-17RA可溶性受容体は、関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)モデルにおいて疾患の発生率および進行を低減させる
このモデルは、ヒト滑膜培養物(滑膜マクロファージ、滑膜線維芽細胞、および関節軟骨細胞を含む)ならびにRA患者およびOA患者由来の外植片が、健常な対照に由来する培養物/外植片と比べて、より高いレベルの炎症メディエーターを産生することを示すために設計される。炎症メディエーター(オンコスタチンM、IL-Ib、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、IP-10、RANTES、RANKL、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSF、一酸化窒素などを含むがこれらに限定されるわけではない)の産生のこの増大は、炎症経路および下流のエフェクター細胞の活性化に対する作用を介して、RAおよびOAに関連する症状および病理の一因となる。次いで、これらの経路および成分は、炎症性浸潤物、軟骨および基質の減少/破壊、骨量減少、ならびにプロスタグランジンおよびシクロオキシゲナーゼの上方調節をもたらす。したがって、このモデルは、インビトロ実験およびエクスビボ実験においてRAおよびOAの破壊的な炎症性状況を模擬することができる。さらに、健常な対照に由来する外植片および滑膜培養物が、これらの炎症性成分(例えば、オンコスタチンM、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17AおよびIL-17F、IL-15など)のうちいくつかの存在下で培養される場合、炎症経路のシグナル伝達が観察され得る。ヒトRAにおいてインビボで有効であると思われる治療薬は、炎症メディエーターの産生および/または存在を阻害および/または中和することによって、上記のインビトロモデルおよびエクスビボモデルにおいて作用するはずである。
【０２９３】
このモデルでは、ヒト滑膜外植片は、RA患者、OA患者、もしくは関節置換術を受けた健常な対照から、または死後の組織採取から採取し、かつ、WooleyおよびTetlow(Arthritis Res 2：65-70; 2000)ならびにvan't Hof et al(Rheumatology 39：1004-1008; 2000)の改変法を用いて処理する。同様に、滑膜線維芽細胞、滑膜マクロファージおよび関節の軟骨細胞の培養物も研究する。複製試料を以下のうち1種で処理する：ビヒクル(PBS)、組換えヒト(rh)IL-17A、rhIL-17F、またはrhIL-17A+rhIL-17F。一部の試料は、オンコスタチンM、TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F、およびIL-15の様々な組合せを含む。さらに、IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/もしくはIL-17A活性に対するアンタゴニストを用いて、または用いずに、これらを処理する。様々な期間(1時間〜数日間)培養した後、上清を採取し、上記に挙げたものを含む炎症メディエーターのレベルを解析する。RA患者もしくはOA患者由来の試料において、または(単独もしくは他の炎症性サイトカインと組み合わせて)rhIL-17Aおよび/もしくはrhIL-17Fで処理した試料において、炎症性サイトカインおよび炎症性ケモカインのレベルは、未処理の健常な対照外植片または未処理の細胞培養物と比べて上昇している。IL-17RA可溶性受容体ならびに本発明の抗ヒトIL-17RAモノクローナル抗体および中和抗体を含むそれらに対する抗体などIL-17F活性および/またはIL-17A活性に対するアンタゴニストを添加すると、炎症メディエーターの産生が著しく減少し、したがって、ヒトRAおよびOAおいて有効であることが予想される。
【０２９４】
実施例7
マウス疾患モデルにおけるIL-17A、IL-17F、およびIL-17RAの発現
4種のマウス疾患モデル(喘息、DSS結腸炎、アトピー性皮膚炎、および実験的アレルギー性脳脊髄炎)を、公知の技術を用いて、IL-17A、IL-17F、およびIL-17RAの発現に関して分析した。
【０２９５】
喘息モデルにおいて、IL-17AおよびIL-17Fは、罹患マウスおよび非罹患マウスの肺、脾臓、肺流入領域リンパ節、および肺浸潤細胞において非常に低いレベルから検出不可能なレベルで発現される。IL-17RAメッセージは、脾臓およびリンパ節よりも肺において高発現されることが判明したが、疾患によって調節されていなかった。IL-17RAは、肺よりも脾臓および肺流入領域リンパ節において高発現されていたが、やはり疾患によって調節されていなかった。
【０２９６】
喘息モデルとは異なり、IL-17AおよびIL-17Fは、罹患マウスDSS結腸炎モデルの近位結腸および遠位結腸の両方において著しく上方調節されていたが、正常マウスのモデルでは上方調節されていなかった。どちらのサイトカインも、腸間膜リンパ節において有意に上方調節されていなかった。さらに、急性のDSS誘発性結腸炎において両方のサイトカインが上方調節されるが、慢性のDSS誘発性結腸炎においては上方調節されないことも判明した。IL-17RAは、近位結腸および遠位結腸と比べて腸間膜リンパ節において顕著に発現されることが判明したが、疾患によって調節されていなかった。一方、IL-17RAは、腸間膜リンパ節よりも近位の遠位結腸組織において高発現された。IL-17RA発現もまた、疾患によって調節されていなかった。
【０２９７】
アトピー性皮膚炎において、IL-17A mRNAは検出可能ではなかった。IL-17Fは、皮膚および皮膚流入領域リンパ節の両方において発現されることが判明したが、疾患によって有意に調節されていないと思われた。IL-17RA mRNAは、皮膚よりも皮膚流入領域リンパ節において高発現されていたが、疾患によって調節されていなかった。IL-17RAは、皮膚流入領域リンパ節よりも皮膚において高発現されていたが、やはり、疾患によって調節されていなかった。
【０２９８】
実験的アレルギー性脳脊髄炎において、IL-17AおよびIL-17Fの両方とも、罹患マウスの脊髄において上方調節されているようであったが、健常マウスにおいてはそうではなかった。IL-17Fは、脊髄よりもリンパ節で高発現されている場合があったが、リンパ節における発現は疾患によって調節されていなかった。しかしながら、これらの組織における発現の総合的レベルは非常に低かった。IL-17RAは、脳および脊髄よりもリンパ節組織において高発現されていた。IL-17RAは試験しなかった。
【０２９９】
要するに、IL-17AおよびIL-17Fの発現は、DSS誘発性結腸炎モデルおよび実験的アレルギー性脳脊髄炎モデルにおいては疾患によって調節されていると思われたが、喘息またはアトピー性皮膚炎の場合はそのように見受けられなかった。IL-17RAおよびIL-17RAの発現は疾患によって調節されていると思われないが、IL-17RA発現は、リンパ組織において強化されていると思われ、IL-17RA発現は、非リンパ組織において強化されていると思われる。
【０３００】
実施例8
IL17RA短縮型変種のプレートベースのタンパク質結合アッセイ法
捕捉EIAの形式は以下のとおりである：1μg/mlのヤギ抗ヒトIgGでELISAプレートをコーティングし、4℃で一晩インキュベートする。洗浄し、室温にて1時間、200μl/ウェルの1％BSAでプレートをブロッキングする。洗浄し、前述の操作されたIL-17RA受容体変種を以下の希釈系列(100μg/ml〜0.10μg/ml)でプレートに添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、ビオチン標識リガンドを10：1(IL17A)または6：1(IL17F)で添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、0.5μg/mLのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、TMB基質を4分間添加する。停止液を添加することによって反応を停止させる。(注意：別段の記載が無い限り、反応物体積はすべて50μl/ウェルであった)。陽性の結果は、高いOD値、一般に0.5超である。
【０３０１】
中和EIAの形式は以下のとおりである：1μg/mlの前述の操作されたIL-17RA変種でELISAプレートをコーティングし、4℃で一晩インキュベートする。洗浄し、室温にて1時間、200μl/ウェルの1％BSAでプレートをブロッキングする。ブロッキングしている間、別のプレート中で、操作されたIL-17RA可溶性受容体変種の希釈系列(50μg/ml〜0.05μg/ml)を、10：1(IL17A)または6：1(IL17F)のビオチン標識リガンドと共に、等体積にて室温で1時間インキュベートする。ブロッキングしたプレートを洗浄し、ブロッキングしたプレートに受容体-リガンド複合体を添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、0.5μg/mLのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄し、TMB基質を7分間添加する。停止液を添加することによって反応を停止させる。(注意：別段の記載が無い限り、反応物体積はすべて50μl/ウェルであった)。陽性の結果は、低いOD値、一般に0.5未満である。中和から、変種タンパク質がビオチン化リガンドに結合していることが示唆される。
【０３０２】
前述の内容から、本発明の特定の態様が、例証のために本明細書において説明されるが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を実施し得ることが、理解されると考えられる。
【配列表】
2009525765000001.app
【国際調査報告】
2009525765.tif 000005
2009525765.tif 000006
2009525765.tif 000007
2009525765.tif 000008