(57)【要約】  本発明は、新規の伝達ドメイン、そのような伝達ドメインを含む組成物、およびｉｎ  ｖｉｖｏ分子送達のためのその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉによるアミノ酸配列を備える、単離されたポリペプチド。
一般式Ｉ：（Ｘ１Ｘ２Ｂ１Ｂ２Ｘ３Ｂ３Ｘ４）ｎ（配列番号１）
（前記配列中、Ｘ１〜Ｘ４は独立して任意の疎水性アミノ酸であり、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は独立して任意の塩基性アミノ酸であり、ｎは１から１０の間である）
【請求項２】
Ｘ１〜Ｘ４が独立して、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、およびＡｌａからなるグループから選択される任意の疎水性アミノ酸であり、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３が独立して、アルギニン、ヒスチジン、またはリシンである請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
Ｂ１とＢ２とが両方ともアルギニンまたはリシンであり、Ｂ３は、リシンまたはアルギニンのいずれかであるがＢ１およびＢ２と同じではない請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
Ｂ１とＢ２とがアルギニンであり、Ｂ３がリシンである請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ１〜Ｘ４が独立して、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＡｌａからなるグループから選択される請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１がＴｒｐであり、Ｘ２がＬｅｕであり、Ｘ３がＩｌｅであり、もしくはＸ４がＡｌａであり、またはそのあらゆる組合せである請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
ｎが１、２、または３である請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
（ａ）請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、および
（ｂ）カーゴ
を備える、単離された組成物。
【請求項９】
前記カーゴが前記単離されたポリペプチドと共有結合している請求項８に記載の単離された組成物。
【請求項１０】
前記カーゴが、治療薬、診断薬、予後薬、および造影剤からなるグループから選択される薬剤を備える請求項８または請求項９に記載の単離された組成物。
【請求項１１】
前記カーゴが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、および有機分子からなるグループから選択される分子を備える請求項８から請求項１０のいずれか一項に記載の単離された組成物。
【請求項１２】
前記カーゴが、解熱薬、鎮痛薬、ステロイド系抗炎症薬、冠拡張薬、末梢血管拡張薬、抗生物質、合成抗菌薬、抗ウイルス薬、抗痙攣薬、鎮咳薬、去痰薬、気管支拡張薬、利尿薬、筋弛緩薬、脳代謝改良薬、精神安定薬、ベータ遮断薬、抗不整脈薬、痛風治療薬、抗凝血薬、肝疾患薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、制吐薬、降圧薬、高脂血症薬、交感神経刺激薬、経口糖尿病治療薬、経口制癌薬、ビタミン類、オピオイド、およびアンジオテンシン変換酵素阻害薬からなるグループから選択される分子を備える請求項８から請求項１１のいずれか一項に記載の単離された組成物。
【請求項１３】
前記カーゴがＨＳＰ２０ペプチドを備える請求項８または請求項９に記載の単離された組成物。
【請求項１４】
前記ＨＳＰ２０ペプチドが下記式１によるアミノ酸配列を備える請求項１３に記載の単離された組成物。
式１：Ｘ３−Ａ（Ｘ４）ＡＰＬＰ−Ｘ５（配列番号７）
（前記配列中、Ｘ３は、配列ＷＬＲＲ（配列番号８）のうちの０、１、２、３、または４個のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、リン酸セリン類似体、およびリン酸チロシン類似体からなるグループから選択され、Ｘ５は、属Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３の配列のうちの０、１、２、または３個のアミノ酸であり、ただし、Ｚ１は、ＧおよびＤからなるグループから選択され、Ｚ２は、ＬおよびＫからなるグループから選択され、Ｚ３は、Ｋ、ＳおよびＴからなるグループから選択される）
【請求項１５】
前記ＨＳＰ２０ペプチドが配列番号９によるアミノ酸配列を備える請求項１３に記載の単離された組成物。
【請求項１６】
前記ＨＳＰ２０ペプチドが下記式２によるアミノ酸配列を備える請求項１３に記載の単離された組成物。
式２：Ｘ２−Ｘ３−ＲＲＡ−Ｘ４−ＡＰ（配列番号１３）
（前記配列中、Ｘ２は、存在しないかまたはＷであり、Ｘ３は、存在しないかまたはＬであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、リン酸セリン類似体、およびリン酸チロシン類似体からなるグループから選択される）
【請求項１７】
前記単離されたポリペプチドが配列番号３によるアミノ酸配列を備える請求項１３から請求項１６のいずれか一項に記載の単離された組成物。
【請求項１８】
ｎが１、２、または３である請求項１７に記載の単離された組成物。
【請求項１９】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、または請求項８から請求項１８のいずれか一項に記載の単離された組成物を備える薬剤組成物。
【請求項２０】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２１】
請求項１３から請求項１８のいずれか一項に記載の組成物をコードする単離された核酸。
【請求項２２】
請求項２１または請求項２２に記載の単離された核酸に作動可能に連結されたＤＮＡ制御配列を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項８から請求項１８のいずれか一項に記載の単離された組成物、または請求項１９に記載の薬剤組成物を備える、改良された生物医学デバイス。
【請求項２５】
請求項８から請求項１８のいずれか一項に記載の単離された組成物、または請求項１９に記載の薬剤組成物をその必要がある対象に投与する工程を備える、活性薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ送達のための方法。
【請求項２６】
以下の治療上の使用：
（ａ）平滑筋細胞増殖および／または移動を阻害すること、（ｂ）平滑筋弛緩を促進すること、（ｃ）心筋の収縮速度を高めること、（ｄ）心筋弛緩の速度を高めること、（ｅ）創傷治癒を促進すること、（ｆ）瘢痕形成を減少させること、（ｇ）接着斑を分離させること、（ｈ）アクチン重合を調節すること、ならびに（ｉ）内膜過形成、狭窄、再狭窄、アテローム性動脈硬化、平滑筋細胞腫瘍、平滑筋攣縮、狭心症、プリンツメタル狭心症（冠攣縮狭心症）、虚血、脳卒中、徐脈、高血圧、肺高血圧症、喘息（気管支痙攣）、妊娠中毒症、早産、子癇前症／子癇、レイノー病または現象、溶血性尿毒症、非閉塞性腸管膜虚血、裂肛、アカラシア、インポテンス、片頭痛、平滑筋攣縮随伴性虚血性筋障害、移植脈管障害などの脈管障害、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症および拡張機能障害の１つまたは複数を治療するまたは抑制することのうちの１つまたは複数のための方法であって、
請求項１３から請求項１８のいずれか一項に記載の単離された組成物の１つまたは複数の治療上の使用を実施するのに有効な量を、それを必要とする個体に投与する工程を備える方法。
【請求項２７】
前記治療上の使用が、内膜過形成を治療または抑制することを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療上の使用が、平滑筋弛緩を促進することを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療上の使用が、創傷治癒を促進することを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療上の使用が、瘢痕形成を減少させることを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療上の使用が、血管攣縮を治療または抑制することを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管攣縮が、狭心症、冠攣縮狭心症、プリンツメタル狭心症、虚血、脳卒中、徐脈、高血圧からなるグループから選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療上の使用が、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、肺高血圧症、気絶心筋および拡張機能障害からなるグループから選択される心障害を治療または抑制することを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
伝達ドメインとカーゴを組み合わせる工程、および活性薬剤を送達することになる対象の皮膚に接触させる工程を備え、活性カーゴが該対象の皮膚を経て送達される、カーゴの局所的または経皮的送達のための方法。
【請求項３５】
前記カーゴが、前記伝達ドメインに共有結合されていない請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記伝達ドメインが、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドを備える請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記伝達ドメインが、（Ｒ）４〜９（配列番号４０）；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１８）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１９）；ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号２０）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２１）；ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ（配列番号２２）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２３）；ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２４）；ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ（配列番号２５）；ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰ（配列番号２６）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２７）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２８）；ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３０）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＡＡＧＣ（配列番号３１）；ＡＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３２）；ＫＡＦＡＡＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３３）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＱＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３４）；ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３５）；およびＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３６）からなるグループから選択されるポリペプチドを備える請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年１１月１日出願の米国特許仮出願第６０／７３２，３６５号の優先権を主張する。該特許文献の開示は本願明細書に援用する。
政府の利益についての告知
米国政府は国立衛生研究所を通じてグラント番号ＲＯ１  ＨＬ５８０２７の下で本プロジェクトに財政的援助を与えた。したがって、米国政府は本発明に対してある種の権利を所有している可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）は細胞浸透性ペプチドとしても知られるが、哺乳動物細胞の原形質膜を浸透することができる小ペプチドの一種である［６］。いくつかの公知のＰＴＤがあり、すなわち、ＨＩＶ転写因子ＴＡＴ（配列番号４３）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ホメオドメインタンパク質由来Ａｎｔｐペプチド、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２、およびアルギニンオリゴマーである［７〜９］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらのペプチドは、コンジュゲートペプチド、オリゴヌクレオチドなど多くの種類と分子量の化合物、および哺乳動物細胞を横切るリポソームなどの小粒子を運ぶことが報告されている［９、１１〜１３］。したがって、ＰＴＤは薬剤送達デバイスの重要な種類を表し、薬剤送達での使用のために追加のＰＴＤを提供することが当技術分野では望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１の態様では、本発明は、下記一般式Ｉによるアミノ酸配列を備える、単離されたポリペプチドを提供する。
一般式Ｉ：（Ｘ１Ｘ２Ｂ１Ｂ２Ｘ３Ｂ３Ｘ４）ｎ（配列番号１）
（前記配列中、Ｘ１〜Ｘ４は独立して任意の疎水性アミノ酸であり、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は独立して任意の塩基性アミノ酸であり、ｎは１から１０の間である）
種々の好ましい実施形態では、Ｂ１およびＢ２と、Ｂ３とが独立してアルギニンまたはリシンである。さらに好ましい実施形態では、ｎは１から３の間である。
【０００５】
第２の態様では、本発明は、治療的活性分子または化合物からなるカーゴと組み合わせた本発明のポリペプチドを備える組成物を提供する。種々の実施形態では、ポリペプチドとカーゴは共有結合することができ、または連結しなくてもよい。好ましい実施形態では、該化合物はＨＳＰ２０化合物を備える。
【０００６】
第３の態様では、本発明は、本発明の１種または複数のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を備える薬剤組成物を提供する。
第４の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。第５および第６の態様では、本発明は、本発明の核酸配列を備える組換え発現ベクター、および本発明の組換え発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞をそれぞれ提供する。
【０００７】
第７の態様では、本発明は、生物医学デバイス上または内に配置された本発明の１種または複数のポリペプチドを備える、改良された生物医学デバイスを提供する。種々の実施形態では、そのような生物医学デバイスには、ステント、グラフト、シャント、ステントグラフト、血管形成デバイス、バルーンカテーテル、フィステル、創傷ドレッシング、およびあらゆる埋込み型薬剤送達デバイスがある。
【０００８】
第８の態様では、本発明は、本発明による組成物を調製し、それを使用して、カーゴを使用した治療の必要がある個体に適切なカーゴを送達する工程を備える薬剤送達の方法を提供する。この第８の態様の種々の実施形態では、本発明は、以下の治療上の使用、
（ａ）平滑筋細胞増殖および／または移動を阻害すること、（ｂ）平滑筋弛緩を促進すること、（ｃ）心筋の収縮速度を高めること、（ｄ）心筋弛緩の速度を高めること、（ｅ）創傷治癒を促進すること、（ｆ）瘢痕形成を減少させること、（ｇ）接着斑を分離させること、（ｈ）アクチン重合を調節すること、ならびに（ｉ）内膜過形成、狭窄、再狭窄、アテローム性動脈硬化、平滑筋細胞腫瘍、平滑筋攣縮、狭心症、プリンツメタル狭心症（冠攣縮狭心症）、虚血、脳卒中、徐脈、高血圧、肺高血圧症、喘息（気管支痙攣）、妊娠中毒症、早産、子癇前症／子癇、レイノー病または現象、溶血性尿毒症、非閉塞性腸管膜虚血、裂肛、アカラシア、インポテンス、片頭痛、平滑筋攣縮随伴性虚血性筋障害、移植脈管障害などの脈管障害、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症および拡張機能障害の１つまたは複数を治療するまたは抑制することのうちの１つまたは複数のための方法であって、ＨＳＰ２０組成物の１つまたは複数の治療上の使用を実施するのに有効な量を、それを必要とする対象に投与する工程を備える方法を提供する。
【０００９】
第９の態様では、本発明は、伝達ドメインと、伝達ドメインと共有結合していない活性カーゴとを組み合わせる工程、および該活性薬剤が送達されることになる対象の皮膚に接触させる工程を備え、該活性カーゴが該対象の皮膚を通じて送達される、活性カーゴの局所的または経皮的送達の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示され説明される前に、これらは、他の方法で指定しない限り、特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー方法に、または、他の方法で指定しない限り、特定の試薬に限定されるものではないことを理解すべきである。本願で使用する用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解すべきである。
【００１１】
「任意選択の」または「任意選択で」は、それに続いて記載される事象または状況が起こり得ること、ならびにその記載には前記事象または状況が起こる例および前記事象または状況が起こらない例を含むことを意味する。
【００１２】
単一文字および三文字アミノ酸略語の両方が本願の中で使用される。当業者が公知のように、そのような単一文字命名は以下の通りである。
Ａはアラニン；Ｃはシステイン；Ｄはアスパラギン酸；Ｅはグルタミン酸；Ｆはフェニルアラニン；Ｇはグリシン；Ｈはヒスチジン；Ｉはイソロイシン；Ｋはリシン；Ｌはロイシン；Ｍはメチオニン；Ｎはアスパラギン；Ｐはプロリン；Ｑはグルタミン；Ｒはアルギニン；Ｓはセリン；Ｔはスレオニン；Ｖはバリン；Ｗはトリプトファン；Ｙはチロシンである。
【００１３】
本願を通じて種々の出版物が引用される。これらの出版物の開示は、これが属する技術分野の水準をより十分に説明するために、本願にその全体を援用する。開示された参考文献も、そこに含まれ該参考文献に頼っている文章の中で議論される物質のために、個々におよび具体的に本願に援用する。
【００１４】
第１の態様では、本発明は、下記一般式１によるアミノ酸配列を備える、単離されたポリペプチドを提供する。
一般式Ｉ：（Ｘ１Ｘ２Ｂ１Ｂ２Ｘ３Ｂ３Ｘ４）ｎ（配列番号１）
（前記配列中、Ｘ１〜Ｘ４は独立して任意の疎水性アミノ酸であり、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は独立して任意の塩基性アミノ酸であり、ｎは１から１０の間である）
したがって、「ｎ」は１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０になり得る。好ましい実施形態では、ｎは１、２、または３である。
【００１５】
これらのポリペプチドは、本発明の組成物を調製し（下を参照されたい）、かつ／または該組成物を、哺乳動物の細胞膜を通過して運搬するために有用であることが明らかにされている。
【００１６】
この第１の態様のさらに好ましい実施形態では、Ｘ１〜Ｘ４は独立して、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、およびＡｌａからなるグループから選択される任意の疎水性アミノ酸であり、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は独立して、アルギニン、ヒスチジン、またはリシンである。
【００１７】
この第１の態様の種々の好ましい実施形態では、Ｂ１とＢ２とは両方ともアルギニンまたはリシンであり、Ｂ３はリシンまたはアルギニンのいずれかであるがＢ１およびＢ２と同じではない。最も好ましい実施形態では、Ｂ１およびＢ２はアルギニンであり、Ｂ３はリシンである。
【００１８】
この第１の態様のさらに好ましい実施形態では、Ｘ１〜Ｘ４は独立して、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＡｌａからなるグループから選択される。本発明の第１の態様の種々のさらに好ましい実施形態では、Ｘ１はＴｒｐであり、Ｘ２はＬｅｕであり、Ｘ３はＩｌｅであり、もしくはＸ４はＡｌａであり、またはそのあらゆる組合せである。
【００１９】
この一般式によるポリペプチドは、本願では、タンパク質伝達ドメインとして効果的であり、したがって、種々の治療薬を、哺乳動物の細胞膜を通過して送達するのに有用であることが実証されている。本願でさらに実証されるように、該ポリペプチドは、カーゴが該ポリペプチドに共有結合していても、単に該ポリペプチドと組み合わされているだけで物理的に連結していなくても、皮膚を通過して治療部分（「カーゴ」）を運搬することもできる。
【００２０】
用語「ポリペプチド」はその最も広い意味で使われて、一連のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣薬を指す。該サブユニットは、言及する場合以外はペプチド結合により連結されている。本願に記載のポリペプチドは、化学的に合成されてもよいし、組換えにより発現されてもよい。組換え発現は一般に、ポリペプチドの発現を実施する細胞機構を提供するために、宿主細胞にトランスフェクトするまたは形質導入するのに使用可能な発現ベクターへの、ポリペプチドの発現を導くことができる核酸配列のクローニングを含む当技術分野の標準的方法を使用して実現することができる。そのような発現ベクターは、細菌またはウイルス発現ベクターからなることができ、そのような宿主細胞は原核生物でも真核生物でもあり得る。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法で使用するためのポリペプチドは、化学的に合成される。合成ポリペプチドは、固相、液相、もしくはペプチド縮合技術、またはそのあらゆる組合せという公知の技術を使用して調製されるが、天然および非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用するアミノ酸は、たとえば、標準脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコル付きの標準Ｂｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸レジンでもよいし、塩基不安定性Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸でもよい。ＦｍｏｃとＢｏｃＮα−アミノ保護アミノ酸の両方が、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ケンブリッジリサーチバイオケミカル社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、または当業者に知られた他の化学会社から入手可能である。さらに、該ポリペプチドは、当業者が精通する他のＮα−保護基で合成可能である。
【００２２】
固相ペプチド合成は、当業者が精通する技術により実現され、および提供されてもよいし、自動合成装置を使用して実現され提供されてもよい。本発明のポリペプチドは、特別な特性を伝えるために、Ｄ−アミノ酸（ｉｎ  ｖｉｖｏでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに抵抗性である）、Ｄ−とＬ−アミノ酸の組合せ、ならびに種々の「デザイナー」アミノ酸（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸、等）からなるものでよい。合成アミノ酸類似体には、リシンに対するオルニチン、およびロイシンまたはイソロイシンに対するノルロイシンがある。
【００２３】
さらに、前記ポリペプチドは、新規の特性を有するポリペプチドを調製するために、エステル結合などのペプチド模倣結合を有することができる。たとえば、還元型ペプチド結合、すなわちＲ１−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２で、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基または配列を組み込まれているペプチドを作製してもよい。還元型ペプチド結合はジペプチドサブユニットとして導入されてもよい。そのようなポリペプチドはプロテアーゼ活性に抵抗性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは長い半減期を有すると考えられる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、アミノおよびカルボキシル終端の一方または両方で追加のアミノ酸残基を含んでいてよいし、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインイソチオシアネート−β−アラニン、ダンシルグリシン、アミノ酸に結合したダンシル、アセチル基に結合した蛍光標識を含むがこれに限定されることはない検出可能な標識；Ｆｍｏｃまたはその他のＮ−末端保護基（たとえば、Ｂｏｃ）を含むがこれに限定されることはない保護基；および特異的チオールカップリングのためのシステインを含むがこれに限定されることはない前記ポリペプチドを誘導体化するための残基などの追加の基をさらに含んでもよい。追加の実施形態では、前記ポリペプチドまたはその部分は環状でもよい。
【００２５】
最も好ましい実施形態では、本発明の第１の態様のポリペプチドは、アミノ酸配列（ＷＬＲＲＩＫＡ）ｎ（配列番号２）を含む、またはそれからなり、ｎは１〜１０である。したがって、この実施形態では、該ポリペプチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーのＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）を含む、またはそれからなり得る。この最も好ましい実施形態の好ましい実施形態では、ｎは１、２、または３である。そのようなポリペプチドの非限定的例には、
ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）；
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号４）；および
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号５）がある。
【００２６】
ポリペプチド属（Ｘ１Ｘ２Ｂ１Ｂ２Ｘ３Ｂ３Ｘ４）ｎ（配列番号１）は、非限定的例ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）を中心に開発された。塩基性アミノ酸または塩基性アミノ酸の繰り返しは、記載の属内でペプチドの伝達を与える、または増強するため、１種または複数の疎水性アミノ酸に取り囲まれている必要があると仮定されている。ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）の例では、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３はそれぞれアルギニン、アルギニン、およびリシンである。Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３位が、生理学的に適切なｐＨで正味の正電荷を有する、リシン、アルギニン、およびヒスチジンなどの任意のアミノ酸で満たされても、それでも伝達が起きると仮定されている。したがって、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３位が同じまたは異なる塩基性アミノ酸で満たされ得るポリペプチド属が開発された。ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）の例では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれトリプトファン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンである。これらのアミノ酸は、それぞれ疎水性であり、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４で示される位置のいずれでもまたはすべてにおいて使用することができると仮定される。いかなる疎水性アミノ酸も、疎水性と塩基性アミノ酸を組み合わせると伝達を促進または増強するという仮説のために、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４位で使用することができるとさらに仮定される。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドおよびカーゴを備える組成物を提供する。本願で使用するように、「カーゴ」は、あらゆる長さのペプチド、ポリヌクレオチド、有機分子、抗体、およびリポソームを含むがこれに限定されることはないあらゆる分子または化合物を意味する。好ましい実施形態では、該カーゴは、ペプチド、ポリヌクレオチド、および有機分子からなるグループから選択される。本願で開示するように、本発明のポリペプチドを使用して、哺乳動物の細胞膜の他に皮膚も通過してカーゴを運ぶことができる。カーゴが共有結合していても、単に本発明のポリペプチドと組み合わされているだけで直接連結していなくても、そのような活性が示される。したがって、そのような組成物は、たとえば治療薬として有用である。
【００２８】
この第２の態様の好ましい実施形態では、カーゴはポリペプチドと共有結合している。例となるカーゴには、放射性核種、蛍光マーカー（緑色蛍光タンパク質および類似の蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されることはない）、色素、造影剤、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ；アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ウイルス核酸配列、ウイルスポリペプチド、ワクチン、ならびに解熱剤、鎮痛剤、および消炎剤（たとえば、インドイネサシン（ｉｎｄｏｉｎｅｔｈａｃｉｎ）、アスピリン、ジクロフェナクナトリウム、ケトプロフェン、イブプロフェン、メフェナム酸、アズレン、フェナセチン、イソプロピルアンチピリン、アセトアミノフェン、ベンザダック（ｂｅｎｚａｄａｃ）、フェニルブタゾン、フルフェナム酸、サリチル酸ナトリウム、サリチルアミド、サザピリン（ｓａｚａｐｙｒｉｎｅ）およびエトドラク）を含むがこれに限定されることはない他の治療カーゴ；ステロイド系抗炎症薬（たとえば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロンおよびトリアムシノロン）；抗潰瘍薬（たとえば、エカベトナトリウム、エンプロスチル、スルピリド、塩酸セトラキサート、ゲファルナート、マレイン酸イルソグラジン、シメチジン、塩酸ラニチジン、ファモチジン、ニザチジンおよび塩酸ロキサチジンアセタート）；冠拡張薬（たとえば、ニフェジピン、硝酸イソソルビド、塩酸ジルチアゼム、トラピジル、ジピリダモール、塩酸ジラゼプ、ベラパミル、ニカルジピン、塩酸ニカルジピンおよび塩酸ベラパミル）；末梢血管拡張薬（たとえば、酒石酸イフェンプロジル、マレイン酸シネパシド、シクランデレート、シンナリジン（ｃｙｎｎａｒｉｄｉｎｅ）およびペントキシフィリン）；抗生物質（たとえば、アンピシリン、アモキシシリン、セファレキシン、エチルコハク酸エリスロマイシン、塩酸バカンピシリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、セフタジジム、セフロキシムナトリウム、アスポキシシリンおよび水和リチペネムアコキシル）；合成抗菌薬（たとえば、ナリジクス酸、ピロミド酸、ピペミド酸三水和物、エノキサシン、シノキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、塩酸シプロフロキサシンおよびスルファメトキサゾール−トリメトプリム）；抗ウイルス薬（たとえば、アシクロビルおよびガンシクロビル）；抗痙攣薬（たとえば、臭化プロパンテリン、硫酸アトロピン、臭化オキシトロピウム、臭化チメピジウム、臭化ブチルスコポラミン、塩化トロスピウム、臭化ブトロピウム、メチル硫酸Ｎ−メチルスコポラミンおよび臭化メチルオクタトロピン）；鎮咳薬（たとえば、ヒベンズ酸チペピジン、塩酸メチルエフェドリン、リン酸コデイン、トラニラスト、臭化水素酸デキストロメトルファン、リン酸ジメモルファン、塩酸クロフェナドール、塩酸ホミノベン、リン酸ベンプロペリン、塩酸エプラジノン、塩酸クロフェダノール、塩酸エフェドリン、ノスカピン、クエン酸ペントキシベリン、クエン酸オキセラジンおよびクエン酸イソアミニル）；去痰薬（たとえば、塩酸ブロムヘキシン、カルボシステイン、塩酸エチルシステインおよび塩酸メチルシステン）；気管支拡張薬（たとえば、テオフィリン、アミノフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、塩酸プロカテロール、塩酸トリメトキノール、ジプロフィリン、硫酸サルブタモール、塩酸クロルプレナリン、フマル酸ホルモテロール、硫酸オルシプレナリン、塩酸ピルブテロール、硫酸ヘキソプレナリン、メシル酸ビトルテロール、塩酸クレンブテロール、硫酸テルブタリン、塩酸マブテロール、臭化水素酸フェノテロールおよび塩酸メトキシフェナミン）；強心薬（たとえば、塩酸ドーパミン、塩酸ドブタミン、ドカルパミン、デノパミン、カフェイン、ジゴキシン、ジギトキシンおよびユビデカレノン）；利尿薬（たとえば、フロセミド、アセタゾラミド、トリクロルメチアジド、メチクロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、エチアジド、シクロペンチアジド、スピロノアクトン、トリアムテレン、フロロチアジド、ピレタニド、メフルシド、エタクリン酸、アゾセミドおよびクロフェナミド）；筋肉弛緩薬（たとえば、カルバミン酸クロルフェネシン、塩酸トルペリゾン、塩酸エペリゾン、塩酸チザニジン、メフェネシン、クロルゾキサゾン、フェンプロバメート、メトカルバモール、クロルメザノン、メシル酸プリジノール、アフロクアロン、バクロフェンおよびダントロレンナトリウム）；脳代謝改善薬（たとえば、ニセルゴリン、塩酸メクロフェノキサートおよびタルチレリン）；マイナートランキライザー（たとえば、オキサゾラム、ジアゼパム、クロチアゼパム、メダゼパム、テマゼパム、フルジアゼパム、メプロバメート、ニトラゼパムおよびクロルジアゼポキシド）；メジャートランキライザー（たとえば、スルピリド、塩酸クロカプラミン、ゾテピン、クロルプロマジンおよびハロペリドール）；β遮断薬（たとえば、フマル酸ビゾプロロール、ピンドロール、塩酸プロプラノール、塩酸カルテオロール、酒石酸メトプロロール、塩酸ラベタノール、塩酸アセブトロール、塩酸ブフェトロール、塩酸アルプレノロール、塩酸アロチノロール、塩酸オクスプレノロール、ナドロール、塩酸ブクモロール、塩酸インデノロール、マレイン酸チモロール、塩酸ベフノロールおよび塩酸ブプラノロール）；抗不整脈剤（たとえば、塩酸プロカインアミド、リン酸ジソピラミド、コハク酸シベンゾリン、アジマリン、硫酸キニジン、塩酸アプリンジン、塩酸プロパフェノン、塩酸メキシレチンおよび塩酸アジミリド）；抗痛風薬（たとえば、アロプリノール、プロベネシド、コリスチン、スルフィンピラゾン、ベンズブロマロンおよびブコローム）；抗凝固薬（たとえば、塩酸チクロピジン、ジクマロール、ワルファリンカリウム、および（２Ｒ，３Ｒ）−３−アセトキシ−５−［２（ジメチルアミノ）エチル］−２，３−ジヒドロ−８−メチル−２−（４−エチルフェニル）−１，５−ベンゾチアゼピン−４（５Ｈ）−ｏ−ｎｅマレイン酸）；血栓溶解薬（たとえば、塩酸メチル（２Ｅ，３Ｚ）−３−ベンジリデン−４−（３，５−ジメトキシ−アルファ−メチルベンジリデン）−Ｎ−（４−メチルピペラジン−１−イル）スクシナミン酸）；肝臓病薬（たとえば、（＋）−ｒ−５−ヒドロキシメチル−ｔ−７−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］フラン−ｃ−６−カルボキシラク���ン）；抗てんかん薬（たとえば、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、メタルビタールおよびカルバマゼピン）；抗ヒスタミン薬（たとえば、マレイン酸クロルフェニラミン、フマル酸クレマスチン、メキタジン、酒石酸アリメマジン、塩酸シプロヘプタジンおよびベシル酸ベポタスチン）；制吐薬（たとえば、塩酸ジフェニドール、メトクロプラミド、ドンペリドンおよびベータヒスチンメシル酸塩、ならびにマレイン酸トリメブチン）；降圧薬（たとえば、レセルピリン酸ジエチルアミノエチル二塩酸塩、レシナミン、メチルドパ、塩酸プラゾシン、塩酸ブナゾシン、塩酸クロニジン、ブドララジン、ウラピジルおよびＮ−［６−［２−［（５−ブロモ−２−ピリミジニル）オキシ］エトキシ］−５−（４−メチルフェニル）−４−ピリミジニル］−４−（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチルエチル）ベンゼンスルホンアミドナトリウム）；高脂血症薬（たとえば、プラバスタチンナトリウムおよびフルバスタチンナトリウム）；交感神経刺激薬（たとえば、メシル酸ジヒドロエルゴタミン、塩酸イソプロテレノールおよび塩酸エチレフリン）；経口糖尿病治療薬（たとえば、グリベンクラミド、トルブタミドおよびグリミジンナトリウム）；経口抗癌物質（たとえば、マリマスタット）；ビタミン類（たとえば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣおよび葉酸）；頻尿治療薬（たとえば、塩酸フラボキサート、塩酸オキシブチニンおよび塩酸テロリディン）；アンジオテンシン変換酵素阻害薬（たとえば、塩酸イミダプリル、マレイン酸エナラプリル、アセラプリルおよび塩酸デラプリル）、ＨＳＰ２０、ＴＧＦ−β、コフィリン、１４−３−３、ＰＫＡキナーゼ阻害薬、レプチン、ＩＮＦ−α、シクロスポリン、バシトラシン、ならびにパルミトイル−グリシル−ヒスチジル−リシントリペプチドがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明のこの第２の態様の追加の実施形態では、カーゴはペプチド治療薬を備える。一つの特定の好ましい実施形態では、カーゴはＨＳＰ２０、それに由来するペプチド、またはその類似体（まとめて「ＨＳＰ２０ペプチド」と呼ぶ）であり、該組成物は「ＨＳＰ２０組成物」と呼ばれる。一つの実施形態では、該ＨＳＰ２０組成物のＨＳＰペプチド部分は、完全長ＨＳＰ２０：Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ（配列番号６）を含むか、またはそれからなる。
【００３０】
別の実施形態では、前記ＨＳＰ２０組成物のＨＳＰ２０ペプチド部分は、下記式１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
式１：Ｘ３−Ａ（Ｘ４）ＡＰＬＰ−Ｘ５（配列番号７）
（前記配列中、Ｘ３は、配列ＷＬＲＲ（配列番号８）の０、１、２、３、または４個のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン類似体およびホスホチロシン類似体からなるグループから選択され、Ｘ５は、属Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３の配列の０、１、２、または３個のアミノ酸であり、ただし、Ｚ１は、ＧおよびＤからなるグループから選択され、Ｚ２は、ＬおよびＫからなるグループから選択され、およびＺ３は、Ｋ、ＳおよびＴからなるグループから選択される）
Ｘ４はＳ、Ｔ、またはＹであることがこの実施形態ではより好ましく、Ｘ４はＳまたはＴであることがより好ましく、Ｘ４はＳであることが最も好ましい。Ｘ４がＳ、Ｔ、またはＹであるこれらの実施形態では、Ｘ４がリン酸化されていることが最も好ましい。Ｘ４がＤまたはＥの場合、これらの残基はリン酸化状態を模倣する負電荷を有する。ＨＳＰ２０ペプチドは、Ｘ４がリン酸化されている、ホスホセリンもしくはホスホチロシン模倣体であるか、またはＤもしくはＥ残基などのリン酸化されたアミノ酸残基の別の模倣体である場合、本発明の方法において最適に効果的である。ホスホセリン模倣体の例には、スルホセリン、リン酸酸素のメチレン置換を含有するアミノ酸模倣体、４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニン、およびＬ−２−アミノ−４−（ホスホノ）−４，４−ジフオロブタン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他のホスホセリン模倣体を当業者が作製することができ、たとえば、オタカら（Ｏｔａｋａ  ｅｔ  ａｌ．）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第３６巻、９２７〜９３０ページ（１９９５年）を参照されたい。ホスホチロシン模倣体の例には、ホスホノメチルフェニルアラニン、ジフルオロホスホノメチルフェニルアラニン、フルオロ−Ｏ−マロニルチロシンおよびＯ−マロニルチロシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない（たとえば、アカマツら（Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９７年１月；５（１）：１５７〜６３ページを参照されたい）。
【００３１】
式１の最も好ましい実施形態では、ＨＳＰ２０ペプチドは、ＷＬＲＲＡＳ＊ＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号９）を含むか、またはそれからなり、Ｓ＊はリン酸化セリン残基を表す。この実施形態では、ＨＳＰ２０組成物は、好ましくは、
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＡＳ＊ＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号１０）；
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＡＳ＊ＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号１１）；および
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＡＳ＊ＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号１２）から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００３２】
ＨＳＰ２０組成物の別の実施形態では、ＨＳＰ２０ペプチドは下記式２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
式２：Ｘ２−Ｘ３−ＲＲＡ−Ｘ４−ＡＰ（配列番号１３）
（前記配列中、Ｘ２は、存在しないかまたはＷであり、Ｘ３は、存在しないかまたはＬであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ホスホセリン類似体、およびホスホチロシン類似体（式１で記載された好ましい実施形態を有する）からなるグループから選択される）
式２の最も好ましい実施形態では、ＨＳＰ２０ペプチドは、ＲＲＡＳ＊ＡＳ（配列番号１４）を含むか、またはそれからなり、Ｓ＊はリン酸化されたセリン残基を表す。この実施形態では、ＨＳＰ２０組成物は、好ましくは、
ＷＬＲＲＩＫＡＲＲＡＳ＊ＡＰ（配列番号１５）；
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＲＲＡＳ＊ＡＰ（配列番号１６）；および
ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＲＲＡＳ＊ＡＰ（配列番号１７）
から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００３３】
前記ポリペプチドおよび／または組成物は、滅菌などの従来の製薬工程を受けてもよいし、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等などの従来のアジュバントを含有してもよい。
【００３４】
第３の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体、または本発明の組成物および薬学的に許容される担体を備える薬剤組成物を提供する。そのような薬剤組成物は、下に記載する本発明の方法を実施するために特に有用である。
【００３５】
投与のためには、前記ポリペプチドまたは組成物は通常、指示された投与経路に適した１つまたは複数のアジュバントと組み合わされる。前記ポリペプチドまたは組成物は、ラクトース、ショ糖、デンプン粉末、アルカン酸の繊維素エステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、デキストラン硫酸、ヘパリン含有ゲル、ならびに／またはポリビニルアルコールと混合され、従来の投与のために錠剤またはカプセルでもよい。代わりに、ポリペプチドまたは組成物は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガントガム、および／または種々の緩衝液に溶解されてもよい。他のアジュバントおよび投与形態は製薬技術では公知である。担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を単独で含んでもよく、ワックス、または当技術分野で公知の他の物質と一緒でもよい。ポリペプチドまたは組成物は、ポリエチレングリコールなどの、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期の増加を促進する他の化合物と連結してもよい。そのような連結は、当業者が理解しているように、共有結合でも非共有結合でも可能である。
【００３６】
前記薬剤組成物は、経口、非経口を含むいかなる適切な経路でも、吸入スプレー、経皮、経粘膜、直腸、膣、または局所的経路により、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、および媒体を含有する用量単位製剤で投与されてもよい。本願で使用される用語「非経口」には、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱索内、脊髄内、脳内、胸腔内、注入技術、または腹腔内がある。投与の好ましい実施形態は、治療する状態に対して異なる。
【００３７】
前記薬剤組成物は、固形（顆粒、粉末、もしくは坐剤を含む）、軟膏、または液状（たとえば、溶液、懸濁液、もしくは乳濁液）で作製されてもよい。薬剤組成物は、種々の溶液で適用されてもよい。本発明に従って使用するための適切な溶液は、無菌であり、十分な量のポリペプチドまたは組成物を溶解し、および提唱される適用に有害ではない。
【００３８】
第４の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは組成物をコードする単離された核酸を提供する。本発明のこの態様による適切な核酸は、本願に提供される開示、および当技術分野の一般的水準に基づけば当業者には明らかであろう。
【００３９】
第５の態様では、本発明は、本発明の第４の態様の単離された核酸に作動可能に連結されたＤＮＡ制御配列を含む発現ベクターを提供する。本発明の核酸に作動可能に連結された「制御配列」とは、本発明の核酸の発現を起こすことができる核酸のことである。該制御配列は、その発現を導くように機能する限り、該核酸と接触している必要はない。したがって、たとえば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列と前記核酸配列の間に存在することができ、該プロモーター配列はそれでも、前記コード配列に「作動可能に連結している」と見なすことができる。他のそのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、およびリボソーム結合部位を含むが、これらに限定されるものではない。そのような発現ベクターには、プラスミドおよびウイルスベースの発現ベクターを含むがこれらに限定されることはない、当技術分野で知られるいかなる種類のものも可能である。
【００４０】
第６の態様では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む遺伝子工学的に改変された宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でも可能であり、一過性または安定的にトランスフェクトされることができ、またはウイルスベクターを形質導入されることができる。そのような宿主細胞を使用して、たとえば、大量の本発明のポリペプチドまたは組成物を産生することができる。
【００４１】
第７の態様では、本発明は、生物医学デバイス上または内に配置された本発明のポリペプチドまたは組成物からなる改良された生物医学デバイスを提供する。好ましい実施形態では、生物医学デバイスは、上に開示したＨＳＰ２０組成物を含む。本願で使用するように、「生物医学デバイス」とは、所望の結果をもたらすために対象、たとえば、ヒトに植え込まれるまたは接触させるデバイスのことである。本発明のこの態様による特に好ましい生物医学デバイスには、ステント、グラフト、シャント、ステントグラフト、フィステル、血管形成デバイス、バルーンカテーテル、植え込み式薬物送達デバイス、フィルム（たとえば、ポリウレタンフィルム）などの創傷ドレッシング、親水コロイド（ポリウレタンフィルムに結合した親水性コロイド粒子）、ハイドロゲル（約少なくとも６０％の水を含有する架橋ポリマー）、気泡（親水性でも疎水性でも）、アルギン酸カルシウム（アルギン酸カルシウム製の繊維の不織布複合体）、セロファン、および生体高分子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本願で使用するように、用語「グラフト」とは、天然と人工の両方のグラフトおよびインプラントのことである。最も好ましい実施形態では、該グラフトは代用血管である。
本願で使用するように、用語「ステント」には、該ステントそれ自体を含み、他にもステント留置を促進するのに使用してよいあらゆるスリーブまたは他のコンポーネントも含む。
【００４３】
本願で使用するように、用語「上にまたは中に配置される」とは、ポリペプチドまたは組成物は、直接的でも間接的でも、生物医学デバイスの外表面、内表面に接触している、またはデバイス内に埋め込むことができることを意味する。「直接的」接触とは、生物医学デバイスをポリペプチドまたは組成物を含有する溶液に浸すこと、ポリペプチドまたは組成物を含有する溶液をデバイスにスピンコートするまたはスプレーすること、ポリペプチドまたは組成物を送達すると考えられるあらゆるデバイスを埋め込むこと、およびポリペプチドまたは組成物を、カテーテルを通じて直接表面にまたはあらゆる器官内に投与することを含むが、これらに限定されることはない、ポリペプチドまたは組成物を直接デバイス上または内に配置することである。
【００４４】
「間接的」接触とは、ポリペプチドまたは組成物が生物医学デバイスに直接接触していないことを意味する。たとえば、ポリペプチドまたは組成物は、生物医学デバイス上に配置されているゲルマトリックスまたは粘稠液などのマトリックスに配置されてもよい。そのようなマトリックスは、たとえば、必要に応じてポリペプチドまたは組成物の結合および放出特性を改変するように調製することができる。
【００４５】
第８の態様では、本発明は、本発明に従って組成物を調製し、それを使用してカーゴを使用した治療の必要がある個体に適したカーゴを送達する工程を備える薬物送達のための方法を提供する。そのような「カーゴ（複数可）」は、本発明の第２の態様に記載するいかなる化合物または分子であり得る。
【００４６】
特定の実施形態では、カーゴはＨＳＰ２０ペプチドを備え、したがって方法は個体を本願で開示するＨＳＰ２０組成物で治療する工程を備える。本発明者は、ＨＳＰ２０およびそれ由来のペプチドが、以下の（ａ）平滑筋細胞増殖および／または移動を阻害する、（ｂ）平滑筋弛緩を促進する、（ｃ）心筋の収縮速度を高め、（ｄ）心筋弛緩の速度を高め、（ｅ）創傷治癒を促進し、（ｆ）瘢痕形成を減少させ、（ｇ）接着斑を分離させ、（ｈ）アクチン重合を調節し、ならびに（ｉ）内膜過形成、狭窄、再狭窄、アテローム性動脈硬化、平滑筋細胞腫瘍、平滑筋攣縮、狭心症、プリンツメタル狭心症（冠攣縮狭心症）、虚血、脳卒中、徐脈、高血圧、肺高血圧症、喘息（気管支痙攣）、妊娠中毒症、早産、子癇前症／子癇、レイノー病またはレイノー現象、溶血性尿毒症、非閉塞性腸管膜虚血、裂肛、アカラシア、インポテンス、女性性的興奮障害（ＦＳＡＤ）、片頭痛、平滑筋攣縮随伴性虚血性筋障害、移植脈管障害などの脈管障害、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症および拡張機能障害の１つまたは複数を治療するまたは抑制するための治療薬として有望であることを以前実証済みである。（たとえば、２００３年３月２７日出願の米国特許出願公開第２００３００６０３９９号、２００４年３月４日公開の国際公開第２００４０１７９１２号、国際公開第０４／０７５９１４号、国際公開第０３／０１８７５８号、国際公開第０５／０３７２３６号を参照されたい）。
【００４７】
したがって、この態様の追加の実施形態では、本発明は、以下の治療上の使用：
（ａ）平滑筋細胞増殖および／または移動を阻害すること、（ｂ）平滑筋弛緩を促進すること、（ｃ）心筋の収縮速度を高めること、（ｄ）心筋弛緩の速度を高めること、（ｅ）創傷治癒を促進すること、（ｆ）瘢痕形成を減少させること、（ｇ）接着斑を分離させること、（ｈ）アクチン重合を調節すること、ならびに（ｉ）内膜過形成、狭窄、再狭窄、アテローム性動脈硬化、平滑筋細胞腫瘍、平滑筋攣縮、狭心症、プリンツメタル狭心症（冠攣縮狭心症）、虚血、脳卒中、徐脈、高血圧、肺高血圧症、喘息（気管支痙攣）、妊娠中毒症、早産、子癇前症／子癇、レイノー病またはレイノー現象、溶血性尿毒症、非閉塞性腸管膜虚血、裂肛、アカラシア、インポテンス、女性性的興奮障害（ＦＳＡＤ）、片頭痛、平滑筋攣縮随伴性虚血性筋障害、移植脈管障害などの脈管障害、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症および拡張機能障害の１つまたは複数を治療するまたは抑制すること、のうちの１つまたは複数のための方法であって、本発明によるＨＳＰ２０組成物の１つまたは複数の治療上の使用を実施するのに有効な量を、その必要がある個体に投与する工程を備える方法を提供する。好ましい実施形態では、該方法は、本発明の第２の態様に開示された好ましい実施形態の１つに従ってＨＳＰ２０組成物を個体に投与する工程を備える。
【００４８】
好ましい実施形態では、個体は哺乳動物であり、さらに好ましい実施形態では、個体はヒトである。本発明のすべての方法の好ましい実施形態では、ＨＳＰ２０ペプチドは、上に開示するようにリン酸化されている。
【００４９】
本願で使用するように、「治療する」または「治療すること」とは、以下の（ａ）障害の重症度を軽減すること、（ｂ）治療している障害に特徴的な症状の進行を制限するまたは予防すること、（ｃ）治療している障害に特徴的な症状の悪化を抑制すること、（ｄ）以前障害に罹ったことのある患者の該障害の再発を制限するまたは予防すること、および（ｅ）以前障害の徴候があった患者の症状の再発を制限するまたは予防することのうちの１つまたは複数を実現することを意味する。
【００５０】
本願で使用するように、用語「抑制する」または「抑制すること」とは、障害を発症する危険のある個体の該障害を制限することを意味する。
本願で使用するように、「投与すること」には、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の他にも、静脈グラフトなどをｅｘ  ｖｉｖｏで直接組織に投与することを含む。
【００５１】
内膜過形成はグラフト障害をもたらす複雑な過程であり、動脈バイパスグラフトの障害の最も一般的原因である。完全には理解されてはいないが、内膜過形成は、内皮細胞傷害とそれに続く血管平滑筋増殖および中膜から内膜への移動を含む一連の事象に媒介される。この過程には、収縮性から合成的表現型への平滑筋細胞の表現型の変化が付随する。該「合成的」平滑筋細胞は細胞外マトリックスタンパク質を分泌し、それによりグラフト狭窄さらに最終的にはグラフト障害をもたらす血管腔の病的狭窄を生じる。そのような内皮細胞損傷およびそれに続く平滑筋細胞増殖および内膜への移動は、閉塞血管を取り除く血管形成術後に最も一般的な再狭窄も特徴付ける。
【００５２】
平滑筋細胞増殖および／または移動を阻害する、または平滑筋弛緩を促進することと関連する方法など、本発明の方法のいくつかの実施形態では、投与は直接的で、治療中の対象の血管を本発明の１つまたは複数のポリペプチドと接触させることによるものでよい。たとえば、ＨＳＰ２０組成物の液体調製物を、多孔質カテーテルを通じて押し込むか、もしくはカテーテルを通じて損傷部位へ注入することができるし、または該ＨＳＰ２０組成物を含有するゲルもしくは粘稠液を該損傷部位へ薄く塗ることができる。直接送達のこれらの実施形態では、該ＨＳＰ２０組成物を損傷またはインターベンション部位の平滑筋細胞に送達することが最も好ましい。これは、たとえば、本発明の組換え発現ベクター（最も好ましくは、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター）を該部位に送達することにより、または該ＨＳＰ２０組成物を平滑筋細胞に直接送達することにより実現することができる。
【００５３】
本発明のこの方法、特に平滑筋細胞増殖および／または移動を阻害することに関する方法の種々の他の好ましい実施形態では、該方法は、血管形成術、血管ステント留置、動脈内膜切除、粥腫切除、バイパス手術（冠動脈バイパス手術；末梢血管バイパス手術など）、血管移植術、臓器移植、人工装具植え込み、微小血管再構築、形成外科フラップ構築、およびカテーテル据え付けからなるグループから選択される手法を受けたことがある、受けている、または受けることになっている対象に対して実施される。
【００５４】
ＨＳＰ２０およびそれに由来するポリペプチドは、それぞれが内膜過形成と結び付けられてきたアクチンストレスファイバー形成および接着板を分離することが明らかにされている（米国特許出願公開第２００３００６０３９９号を参照されたい）。該データは、内膜過形成に対する該ＨＳＰ２０ポリペプチドの直接抑制効果をさらに実証している（米国特許出願公開第２００３００６０３９９号を参照されたい）。したがって、別の実施形態では、該方法は、内膜過形成、狭窄、再狭窄、およびアテローム性動脈硬化からなるグループから選択される１つまたは複数の障害を治療するまたは抑制する工程を備え、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物の、内膜過形成、狭窄、再狭窄、および／またはアテローム性動脈硬化を治療するまたは抑制するのに有効な量をその必要がある対象に接触させる工程を備える。
【００５５】
本発明のこの態様の追加の実施形態では、方法を使用して平滑筋細胞腫瘍を治療する。好ましい実施形態では、該腫瘍は平滑筋肉腫であり、これは筋肉から生じる悪性腫瘍と定義されている。平滑筋肉腫は微小血管と大血管両方の壁から生じ得るために、身体のどこにでも発生し得るが、腹膜、子宮、および消化管（特に食道）平滑筋肉腫がより一般的である。代わりに、該平滑筋腫瘍は、平滑筋腫、非悪性平滑筋腫瘍であり得る。追加の実施形態では、方法は、化学療法、放射線療法、および腫瘍を除去するための手術など、平滑筋細胞腫瘍の他の治療と併用することが可能である。
【００５６】
追加の実施形態では、本発明の方法は、平滑筋痙攣を治療するまたは抑制するために使用され、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物の平滑筋痙攣を抑制するのに効果的な量を、それを必要とする対象またはグラフトに接触させる工程を備える。
【００５７】
ＨＳＰ２０およびそれに由来するペプチドは、血管痙攣などの平滑筋痙攣を抑制するのに効果的であり、平滑筋血管弛緩を促進し収縮を抑制することによりその抗平滑筋痙攣効果を発揮する可能性があることが明らかにされている（２００３年３月２７日出願の米国特許出願公開第２００３００６０３９９号を参照されたい）。
【００５８】
平滑筋は血管、気道の壁、消化管、および尿生殖路に存在する。平滑筋の病的強直性収縮が痙攣をなす。多くの病態には血管平滑筋、すなわち血管を裏打ちする平滑筋の痙攣（「血管痙攣」）が付随する。これは、（心臓動脈が関与している場合には）狭心症および虚血、または脳血管が関与している場合にはくも膜下出血誘発血管痙攣の場合のような脳卒中などの症状を引き起こし得る。高血圧症（高血圧）は、特に循環の小血管では、血管壁の過剰な血管収縮の他にも肥厚によって引き起こされる。
【００５９】
したがって、本発明の方法の追加の実施形態では、筋細胞痙攣は血管痙攣からなり、方法を使用して血管痙攣を治療または抑制する。方法の好ましい実施形態には、狭心症、冠動脈痙攣、プリンツメタル狭心症（心外膜冠動脈の突発性局部痙攣）、虚血、脳卒中、徐脈、および高血圧を治療するまたは抑制する方法を含むが、これらの方法に限定されるものではない。
【００６０】
本発明の方法の別の実施形態では、平滑筋痙攣は、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を使用した、静脈または動脈グラフトなどのグラフト治療により抑制される。末梢血管および冠血管再構築のための理想的な導管の１つは大伏在静脈である。しかし、該導管の摘出中の外科的処置により血管痙攣が起きることが多い。血管痙攣の正確な病因は複雑であり、たぶん多因子性である。大半の研究により、血管痙攣は、静脈の中膜の血管平滑筋の収縮が増強されるか、または弛緩が損なわれるせいであることが示唆されてきた。エンドセリン−１およびトロンボキサンなどの数多くの血管収縮物質が手術中に増加し、血管平滑筋収縮が起きる。ノルエピネフリン、５−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、ヒスタミン、アンジオテンシンＩＩ、およびフェニレフリンなどの他の血管収縮薬が静脈グラフト痙攣に関与してきた。パパベリンは、これまで使用されてきた平滑筋血管拡張薬である。パパベリンの存在の下でさえ痙攣が起きる状況では、外科医は、腔内機械的膨満を使用して該痙攣を断ち切る。このせいで静脈グラフト壁が損傷を受け、続いて内膜過形成が起きる。内膜過形成はグラフト障害の主要原因である。
【００６１】
したがって、この実施形態では、前記グラフトは、グラフトドナーから摘出中、摘出の後（移植前）、および／またはグラフトレシピエントへの移植中に（すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで）、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を接触させることができる。これは、たとえば、本発明の組換え発現ベクター（最も好ましくは、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター）を部位に送達し、平滑筋細胞にトランスフェクトすることにより、または該ＨＳＰ２０組成物の平滑筋への直接送達により実現することができる。グラフト移植中、ヘパリンはタンパク質伝達ドメインに結合し、該ドメインが細胞内に伝達されるのを妨げることが明らかにされているので、該対象にヘパリンを全身的に処置することが好ましい。このアプローチにより、グラフトのタンパク質伝達は局在化するのみで、末梢組織には至らないであろう。本発明のこの実施形態の方法は、グラフトの摘出および／または移植中の静脈グラフト痙攣を抑制し、したがって、短期グラフト成功も長期グラフト成功も改善する。
【００６２】
本発明の方法の種々の他の実施形態では、筋細胞痙攣には、肺高血圧症、喘息（気管支痙攣）、妊娠中毒症、早産、子癇前症／子癇、レイノー病またはレイノー現象、溶血性尿毒症、非閉塞性腸管膜虚血（腸への不十分な血流により引き起こされる腸の虚血）、裂肛（内肛門括約筋の持続性痙攣によって引き起こされる）、アカラシア（下部食道括約筋の持続性痙攣によって引き起こされる）、インポテンス（陰茎内血管の弛緩不足によって引き起こされる。勃起には陰核海綿体（陰茎）血管の血管拡張が必要である）、片頭痛（脳内血管の痙攣によって引き起こされる）、平滑筋攣縮随伴性虚血性筋障害、および移植脈管障害（アテローム性動脈硬化に類似する移植血管の反応であり、収縮性リモデリングおよび最終的には移植血管の閉塞が起き、これが心臓移植障害の主要原因である）などの脈管障害を含むが、これらに限定されることはない障害が付随する。
【００６３】
本発明の方法の異なる実施形態のこれらの種々の適応症のための好ましい送達経路は異なる。局所性投与は、静脈グラフト痙攣、内膜過形成、再狭窄、内膜過形成による人工血管障害、内膜過形成／収縮性リモデリングによるステント、ステントグラフト障害、血管痙攣による微小血管グラフト障害、移植脈管障害、ならびに男性および女性の性機能障害を治療または抑制することを含む方法にとって好ましい。本願で使用するように、「局所的投与」とは、ポリペプチドまたは組成物を器官の表面に送達することである。
【００６４】
くも膜下腔内投与は、ポリペプチドまたは組成物の脳脊髄液への送達として定義されるが、脳卒中、くも膜下出血誘発血管痙攣を治療または抑制するための好ましい送達経路である。腹腔内投与は、ポリペプチドまたは組成物を腹膜腔に送達することと定義されるが、非閉塞性腸管膜虚血を治療または抑制するための好ましい送達経路である。経口投与は、アカラシアを治療または抑制するための好ましい送達経路である。静脈内投与は、高血圧および徐脈を治療または抑制するための好ましい送達経路である。坐薬を介した投与は、裂肛を治療または抑制するために好ましい。エアロゾル送達は、喘息（すなわち、気管支痙攣）を治療または抑制するために好ましい。子宮内投与は、早産および子癇前症／子癇を治療または抑制するために好ましい。
【００６５】
本発明の方法の別の実施形態では、該方法を使用して心筋の収縮速度を増加させる。そのような治療から利益を得ることができる個体には、個体の正常な心拍数と比べても、類似の状態にある個体の「正常な」心拍数と比べても心拍数が低下している個体を含む。本願で使用するように、語句「心筋の収縮速度を増加させる」とは、患者に治療効果を与える収縮速度のあらゆる増加を意味する。そのような治療効果は、たとえば、収縮速度を個体の正常な収縮速度、類似の状態にある個体の正常な収縮速度、またはいくつかの他の所望の目標収縮速度に近づけるように増加させることにより実現することができる。好ましい実施形態では、該方法により、そのような治療の必要がある患者の収縮速度は少なくとも５％増加する。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法により、そのような治療の必要がある患者の収縮速度は少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％および／または５０％増加する。好ましい実施形態では、心筋の収縮速度を増加させることは、心筋の緩和速度を増加させる（すなわち、筋肉が速く緩和すれば、それだけ速く拍動する）ことにより実現される。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法により、そのような治療の必要がある患者の心筋緩和速度は少なくとも５％増加する。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法によりそのような治療の必要がある患者の心筋緩和速度は少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％および／または５０％増加する。
【００６６】
本発明の方法の追加の実施形態では、該方法は、心筋の収縮速度を増加させることから利益を得ることができる１つまたは複数の心障害を治療するよう実施される。そのような心障害には、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、肺高血圧症、気絶心筋、および拡張機能障害が含まれる。本願で使用するように、「徐脈性不整脈」とは、心拍数が毎分６０拍動未満まで異常に減少することを意味し、通常心臓への電気インパルス障害によって引き起こされる。徐脈性不整脈の共通原因は冠動脈心疾患であり、これにより、心臓組織への血流を制限する粥腫が形成され、したがって、心臓組織は損傷を受ける。冠動脈疾患による徐脈性不整脈は、心筋梗塞後はより頻繁に起きる。症状には、エネルギー損失、脱力感、失神、および高血圧が含まれるが、これらに限定されるものではない。本願で使用するように、「うっ血性心不全」とは、心臓が身体全体へ十分な血液供給量を送り出すことができないことを意味する。そのような心不全は、高血圧、貧血、甲状腺機能亢進症、大動脈狭窄、大動脈弁閉鎖不全、および三尖弁閉鎖不全を含むがこれらに限定されることはない心臓弁膜症；大動脈縮窄、中隔欠損症、肺動脈狭窄、およびファロー四徴症を含むがこれらに限定されることはない先天性心疾患；不整脈、心筋梗塞、心筋症、肺高血圧症、ならびに、慢性気管支炎および肺気腫を含むがこれらに限定されることはない肺疾患を含むがこれらに限定されることはない種々の状態または障害のせいであり得る。先天性心疾患の症状には、疲労、呼吸困難、肺水腫、ならびに足首および脚の腫脹を含むがこれらに限定されることはない。
【００６７】
本願で使用するように、「気絶心筋」とは、心虚血（心筋に供給する血管への血流／酸素の不足）のせいで機能（ポンピング／拍動）していない心筋を意味する。
本願で使用するように、「拡張機能障害」とは、心臓が弛緩期（心臓収縮の休止期）中に血液で満たされることができないことを意味する。この状態は、通常、左心室肥大という背景で起こる。該心筋は、十分満たされることができないほど肥大化し硬くなる。拡張機能障害は、心不全および不十分な心機能をもたらし得る。
【００６８】
本願で使用するように、「肺高血圧症」とは、肺に供給する動脈の血圧が異常に高い障害を意味する。原因には、慢性気管支炎および肺気腫などの肺への酸素供給不足；肺塞栓症、および腸肺線維症を含むがこれらに限定されるものではない。肺高血圧症の症状および徴候は、多くの場合、かすかであり非特異的である。後期には、肺高血圧症は、肝腫大、頚部静脈の拡張および全身性浮腫が付随する右心不全をもたらす。
【００６９】
本発明の方法の追加の実施形態では、該方法は、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症、および拡張機能障害のうちの１つまたは複数を患う個体に、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物の心筋収縮速度を増加させるのに効果的な量を投与することからなる心筋障害の治療のために使用される。
【００７０】
徐脈性不整脈の治療には、以下の（ａ）心拍速度を個体の正常なレベルの近く、所望の速度近くまで改善する、または少なくとも毎分６０拍動以上まで増やすこと、（ｂ）徐脈性不整脈を患う患者のエネルギー損失、脱力感、失神、および高血圧のうちの１つまたは複数の発生を制限すること、（ｃ）徐脈性不整脈およびその症状を患う患者のエネルギー損失、脱力感、失神、および高血圧のうちの１つまたは複数の悪化を抑制すること、（ｄ）以前に徐脈性不整脈を患った患者の徐脈性不整脈の再発を制限すること、ならびに（ｅ）以前に徐脈性不整脈を患った患者のエネルギー損失、脱力感、失神、および高血圧のうちの１つまたは複数の再発を制限すること、のうちの１つまたは複数を含む。
【００７１】
同様に、うっ血性心不全の治療には、以下の（ａ）十分な血液供給量を全身に送る心臓の能力を個体の正常なレベル近くまで、または所望のポンピング能力近くまで改善すること、（ｂ）うっ血性心不全を患う患者の疲労、呼吸困難、肺水腫、および足首と脚の腫脹の１つまたは複数の発症を制限すること、（ｃ）うっ血性心不全およびその症状を患う患者の疲労、呼吸困難、肺水腫、および足首と脚の腫脹の１つまたは複数の悪化を抑制すること、（ｄ）以前にうっ血性心不全を患った患者のうっ血性心不全の再発を制限すること、ならびに（ｅ）以前にうっ血性心不全を患った患者の疲労、呼吸困難、肺水腫、および足首と脚の腫脹の１つまたは複数の再発を制限すること、のうちの１つまたは複数を含む。
【００７２】
気絶心筋の治療とは、（ａ）虚血筋の酸素負荷を改善することにより、または心筋細胞の酸素に対する要求を減少させることにより、心筋のポンピング能力を改善すること、および（ｂ）以前に気絶心筋を患った患者の気絶心筋の再発を制限すること、のうちの１つまたは複数を意味する。
【００７３】
同様に、拡張機能障害の治療には、（ａ）心臓を緩和させてより完全に満たされるようにすることにより心不全および／または不十分な心機能を制限すること、（ｂ）以前に拡張機能障害を患った患者の拡張機能障害の再発を制限すること、ならびに（ｃ）以前に拡張機能障害を患った患者の心不全および／または不十分な心機能の再発を制限すること、のうちの１つまたは複数を含む。
【００７４】
肺高血圧症の治療には、以下の（ａ）肺に供給している動脈の血圧を個体の正常なレベル近くまで、または所望の血圧の近くにまで減少させること、（ｂ）肺高血圧症を患っている患者の頚部静脈の拡張、肝臓の腫大、および全身性浮腫の１つまたは複数の発生を制限すること、（ｃ）肺高血圧症およびその症状を患っている患者の頚部静脈の拡張、肝臓の腫大、および全身性浮腫の１つまたは複数の悪化を抑制すること、（ｄ）以前に肺高血圧症を患った患者の肺高血圧症の再発を制限すること、ならびに（ｅ）以前に肺高血圧症を患った患者の頚部静脈の拡張、肝臓の腫大、および全身性浮腫の１つまたは複数の再発を制限すること、のうちの１つまたは複数を含む。
【００７５】
追加の態様では、本発明は、徐脈性不整脈、徐脈、うっ血性心不全、気絶心筋、肺高血圧症、および拡張機能障害を発症する危険のある個体に、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物の心筋収縮速度を増加させるのに効果的な量を投与することからなる心筋障害を抑制するための方法を提供する。
【００７６】
たとえば、うっ血性心不全を抑制する方法は、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を、高血圧、貧血、甲状腺機能亢進症、大動脈狭窄、大動脈弁閉鎖不全、および三尖弁閉鎖不全を含むがこれらに限定されることはない心臓弁膜症；大動脈縮窄、中隔欠損症、肺動脈狭窄、およびファロー四徴症を含むがこれらに限定されることはない先天性心疾患；不整脈、心筋梗塞、心筋症、肺高血圧症、ならびに、慢性気管支炎および肺気腫を含むがこれらに限定されることはない肺疾患のうちの１つまたは複数を患っている対象に投与することを含む。
【００７７】
同様に、徐脈性不整脈を抑制する方法は、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を、冠動脈心疾患およびアテローム形成のうちの１つもしくは複数を患っている、または以前に心筋梗塞もしくは伝導障害に罹った対象に投与することを含む。
【００７８】
同様に、肺高血圧症を抑制する方法は、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を、慢性気管支炎、肺気腫、肺塞栓症、および腸肺線維症のうちの１つまたは複数を患っている対象に投与することを含む。
【００７９】
気絶心筋の抑制は、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を、心虚血を患っている対象に投与することを含む。
拡張機能障害の治療は、本発明に従ってＨＳＰ２０組成物を、左室肥大を患っている対象に投与することを含む。
【００８０】
本発明の方法の追加の実施形態では、該方法を使用して、創傷治癒を促進かつ／または瘢痕形成を減少させる。これらの実施形態では、「それを必要とする個体」とは、瘢痕形成する可能性があるか、もしくは瘢痕形成してしまった創傷を負ったか、または負うことになる（たとえば、外科的処置を介して）個体のことである。本願で使用するように、用語「創傷」は、広く皮膚および皮下組織への損傷のことである。そのような創傷には、裂傷；熱傷；穿刺；褥瘡；床ずれ；口内炎；外傷；咬傷；瘻孔；潰瘍；感染によって引き起こされる病変；歯周組織創傷；歯周創傷；口腔灼熱症候群；開腹術創傷；手術創；切開創傷；火傷後の拘縮；突発性肺線維症、肝線維症、腎線維症、後腹膜線維症、嚢胞性線維症、血管線維症、心臓組織線維症を含むがこれに限定されることはない組織線維化；および美容外科的処置による創傷を含むがこれに限定されるものではない。本願で使用するように、語句「瘢痕形成を減少する」は、患者に治療または美容効果を与える瘢痕形成のあらゆる減少を意味する。そのような治療または美容効果は、たとえば、本発明の方法での治療がない場合の瘢痕形成と比べて瘢痕の大きさおよび／もしくは深さを減少させることによって、または既存の瘢痕の大きさを縮小させることによって実現することができる。本願で使用するように、そのような瘢痕には、ケロイド；肥厚性瘢痕；および手術の結果として生じる癒着形成を含むがこれに限定されることはない臓器表面間の癒着形成を含むがこれらに限定されることはない。瘢痕形成を減少させるためのそのような方法は、初期瘢痕形成を減少させるためにも、既存の瘢痕の治療上の処置（すなわち、瘢痕をその形成後に切開し、本発明の化合物で治療し、該瘢痕をよりゆっくり治癒させること）のためにも、あらゆる種類の創傷を治療して瘢痕形成を減少させるのに臨床的に有用である。そのような創傷は上に記載している通りである。本願で使用するように、語句「創傷治癒を促進する」とは、患者に治療または美容効果を与える創傷治癒のあらゆる増加を意味する。そのような治療効果は、たとえば、未治療の個体と比べて、創傷治癒の速度を高める、かつ／または創傷治癒の程度を増加させることの１つまたは複数により実現することができる。そのような創傷は上に記載している通りである。
【００８１】
この実施形態では、ＨＳＰ２０組成物は、創傷ドレッシングの上もしくは中に、または他の局所的投与に配置するのが好ましい。フィルム（たとえば、ポリウレタンフィルム）、親水コロイド（ポリウレタンフォームに結合した親水性コロイド粒子）、ハイドロゲル（約少なくとも６０％の水を含有する架橋ポリマー）、気泡（親水性でも疎水性でも）、アルギン酸カルシウム（アルギン酸カルシウム製の繊維の不織布複合体）、セロファン、および２００３年１０月９日公開の米国特許出願公開第２００３０１９０３６４号に記載のポリマーなどの生体高分子を含むがこれらに限定されることはないそのような創傷ドレッシングは、当技術分野で使用することができる。
【００８２】
本発明の方法すべてにおいて本願で使用するように、ＨＳＰ２０組成物の「効果的な量」とは、目的とする治療効果を提供するのに足りる量である。用いることができるＨＳＰ２０組成物の効果的な量は、一般に、約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ体重から５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。しかし、投与量レベルは、損傷の種類、年齢、体重、性別、個体の病状、状態の重症度、投与経路、および用いている特定の化合物を含む種々の要因に基づく。したがって、投与計画は大きく異なる可能性があるが、標準方法を使用して医師が決定することができる。
【００８３】
ペプチドなどの高分子を皮膚バリアーを通過して送達することは、角質層の高度に機能化された構造のせいで困難である。いくつかの化合物および技術を使用して、皮膚バリアーを通過してカーゴ（薬物およびペプチドを含む高分子）の輸送を増加させてきた。これらの化合物および技術には、オレイン酸などの浸透促進剤、トランスフェロソームなどの薬物送達システム、ならびにエレクトロポレーションおよびイオン泳動などの物理的技術を含み、相乗効果を生み出すことが知られてきた。これらの技術およびシステムには利点はあるが、治療におけるカーゴの局所的および経皮的送達は依然として困難である。これらの困難には、高濃度での化学的促進剤の皮膚毒性、家庭で電気装置を使用する不便さ、および最新式薬物送達システムの高い生産コストが付随する。高分子量カーゴペプチドに連結されたＰＴＤに皮膚および経皮浸透を誘発するのは困難であった。最近まで、このカーゴは該ＰＴＤに共有結合しているだけであった。したがって、前記カーゴの皮膚浸透および経皮送達を増加させると考えられる広い範囲の分子量を有する種々のカーゴに共有結合も非共有結合もできるＰＴＤがあるのが望ましいであろう。
【００８４】
したがって、第９の態様では、本発明は、伝達ドメインと活性カーゴを組み合わせ、該活性薬剤を送達することになる対象の皮膚に接触させ、該活性カーゴが該対象の皮膚を通じて送達される工程を備える、活性カーゴの局所的または経皮的送達のための方法を提供する。好ましい実施形態では、該カーゴは該伝達ドメインに共有結合していない。例となるカーゴは上に記載している通りである。この態様の詳細は、以下に続く実施例において提供される。本発明のこの方法に従って使用することができる伝達ドメインの例には、本発明のポリペプチドの他にも、以下の、
（Ｒ）４〜９（配列番号４０）；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１８）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１９）；ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号２０）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２１）；ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ（配列番号２２）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２３）；ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２４）；ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ（配列番号２５）；ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰ（配列番号２６）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２７）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２８）；ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３０）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＡＡＧＣ（配列番号３１）；ＡＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３２）；ＫＡＦＡＡＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３３）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＱＬＹＲＫＡＧＣ（配列番号３４）；ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３５）；およびＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３６）の１つまたは複数を含むか、またはそれからなるポリペプチドを含むが、これらに限定されることはない。
【００８５】
説明のみを目的に意図されており、この文書に添付する特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない付随の実施例を参照すれば、本発明はさらによく理解されるであろう。
【実施例１】
【００８６】
ＦＩＴＣ−（ｂ）ＡＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３７）（ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）モノマー）、ＦＩＴＣ−（ｂ）ＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３８）（ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）ダイマー）、およびＦＩＴＣ−（ｂ）ＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３９）（ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）トリマー）は、Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成を使用して０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。ペプチドは水に可溶化し、３ｍＭの原液を作製した。３Ｔ３線維芽細胞を、２ｍＭグルタミン酸、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、４ウェルチャンバースライド（４スライドを使用）にウェル当たり５０，０００細胞の密度（１ｍｌの５０，０００細胞／ｍｌ）で播種した。スライドは、４時間加湿インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２と共にインキュベートし、細胞をスライドに付着させた。４時間後、各ウェルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。各ペプチドの３ｍＭ原液およびフルオレセイン水溶液の３ｍＭ原液合わせて５０μｌを、２ｍＭグルタミン酸、抗生物質、および１０％ＦＢＳを含む３ｍｌのＤＭＥＭを含有する１５ｍｌチューブに、ならびに２ｍＭグルタミン酸および抗生物質を含む３ｍｌの無血清ＤＭＥＭを含有する１５ｍｌチューブに添加した。処理は、血清含有ＤＭＥＭでも無血清ＤＭＥＭでも２回実施した。各スライドシステム上で、各ウェルに、フルオレセイン、ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）モノマー、ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）ダイマー、ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）トリマーを含む（血清ありまたはなしの）培地を受けた。すべての場合で、最終ペプチドまたはフルオレセイン濃度はウェル当たり５０μＭであった。処理を加えると、スライドを、加湿インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２と共に１時間インキュベートした。次に、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ洗浄に続いて、０．２ｍｌトリプシンを各ウェルに添加し、外部細胞膜に結合した残存ペプチドを消化し、スライドは、３７℃で１０分間インキュベートした。トリプシンを失活するために、血清を含む１ｍｌＤＭＥＭを各ウェルに添加し、スライドを４時間インキュベートして細胞をスライドに再び付着させた。４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、血清を含む１ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加した。次に、４０倍対物レンズを使用してスライドを撮像した。位相および蛍光像を７５分の露出時間で得た。細胞をフルオレセインで処理したどの状態でも、蛍光シグナルは観察されなかった。したがって、フルオレセイン処理は負の対照として働いた。培地が血清を含有する、しないとは無関係に、ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）モノマーで処理した細胞で蛍光がないのは、ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）モノマー単独では細胞に浸透できないことを示していた。ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）ダイマー、およびＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）トリマー処理では、細胞を血清と共にインキュベートする、血清なしでインキュベートするとは無関係に、細胞内で明るい蛍光を発していた。
【実施例２】
【００８７】
ペプチドを、細胞膜および皮膚を通過して分子を運ぶその能力を試験するように設計した。ペプチドＷ３（ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ）（配列番号５）はペプチドＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）のトリマーである。皮膚を通過して運ばれるよう選ばれた分子（「カーゴ」）は、蛍光プローブ（フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）に連結したＨＳＰ２０のフラグメント（ＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ、ｐＳはリン酸化セリン）（配列番号９）であった。対照は、既知のタンパク質伝達ドメイン、ＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号３６）およびＰＴＤ（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）（配列番号１９）であった。
【００８８】
ペプチドを、アリゾナ州立大学（ＡＳＵ）で、自動ペプチド合成装置（Ａｐｅｘ３９６、アドバンスドケムテク社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、ルーイビル、ケンタッキー州）、および固相技術を使用して合成した。ＦＩＴＣ標識ペプチドを、ペプチドのＮ末端に付加したβ−アラニンにＦＩＴＣを連結させることにより得た。ペプチドを、逆相カラムを使用したＦＰＬＣ（Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、アマシャムファルマシアバイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により精製し、ＭＡＤＩ−ＴＯＦまたはＥＳＩ−ＭＳ（ウォーターズコーポレーション社（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミルフォード、マサチューセッツ州）により同定した。
【００８９】
細胞膜通過伝達を評価するのに使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、初代ラットアストロサイト細胞であった。細胞を、記載の通りに単離され（イノチェンティら（Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第２０巻、１８００〜１８０８ページ、２０００年）、約３×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、フル血清（α−ＭＥＭ中１０％ＦＢＳ）中で一晩培養した。一部の細胞を、伝達ペプチドでの処理に先立って１〜２４時間０．５％ＦＢＳ中で培養することにより血清不足にした。細胞を、少なくとも２４時間持続する効率的な伝達を実証するために、５０μＭ  Ｗ３（ＷＬＲＲＩＫＡ（配列番号３）トリマー）で１時間処理した。偽性ダイマーＷＬＲＲＩＫＡ−ＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号１０）（ＷＬ−Ｐ２０）を使用した伝達には用量依存性があり、５０μＭでは効率的な伝達、２５μＭでは伝達はわずかに減少し、および１μＭでは伝達なしであった。対照として、偽性モノマーＷＬＲＲＩＫＡ−（ＷＬ−ｓｃｒＰ２０）（配列番号３）を５０、２５、および１μＭで試験したが、伝達はまったく観察されなかった。
【００９０】
最大伝達は、偽性ダイマー（ＷＬ−Ｐ２０）（配列番号１０）で約２０分で起きた。類似の結果はＷ３を使用して得られた。
皮膚伝達研究のために選択されたｅｘ  ｖｉｖｏモデルは、新たに切除されたブタの耳であった。地元の食肉処理場から耳を入手後、以前記載した通りに、耳の外表面の皮膚を（確実に皮下脂肪を最大限除去するようにして）慎重に解体した。清浄なブタ耳の皮膚を、角質層がドナー区画（製剤が適用される）に面し、真皮がＰＢＳ（３ｍＬ）で満たされているレセプター区画に面している、改変フランツ拡散セル（１ｃｍ２の拡散面積、ラボラトリーグラスアパレイタス社（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｌａｓｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、バークリー、カリフォルニア州）に直ちに乗せた。システムは３７℃で、および一定攪拌の下で維持した。ペプチドのＰＢＳ溶液またはプロピレングリコール製剤（７０μｌ）を、拡散セルのドナー区画に最大８時間適用した。
【００９１】
実験終了時、皮膚表面を蒸留水で徹底的に洗浄し、過剰な製剤を取り除いた。角質層（ＳＣ）を残った表皮（Ｅ）および真皮（Ｄ）から分離するために、皮膚片をテープストリッピングにかけた。皮膚を１５枚の粘着テープで剥ぎ取り、ＳＣを含有するテープを、３ｍＬの水：メタノール（１：１ｖ／ｖ）溶液にボルテックスして２分間浸し、３０分間バス超音波処理した。残った［Ｅ＋Ｄ］を小片に切断し、２ｍＬの水：メタノール（１：１ｖ／ｖ）溶液中で２分間ボルテックスし、１分間の組織ホモジナイザーおよび３０分間のバス超音波処理を使用してホモジナイズした。次に、こうして得られた混合物を１分間遠心分離にかけた。皮膚を透過したペプチドの量をレセプター相で決定した。すなわち、１．５ｍＬのレセプター相を回収し凍結乾燥して、残留物は１５０μＬの水に懸濁した。
【００９２】
ＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］内に浸透し、皮膚を透過したＦＩＴＣ標識ペプチドの量を、Ｇｅｍｉｎｉ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）プレートリーダー（モレキュラーデバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベール、カリフォルニア州）を励起４９５ｎｍおよび発光５１８ｎｍで使用して分光蛍光分析的に決定した。ペプチドの標準曲線を対照として用いた。
【００９３】
１００μＭのＰＴＤまたはＷ３（非共有結合）の濃度ではＰ２０（配列番号９）を皮膚を通過して運ばなかった（図１、パネルＡ）。しかし、１ｍＭのＷ３を使用してＰ２０（配列番号９）を運んだ場合には、著しい皮膚浸透［Ｅ＋Ｄ］が起きた（図１、パネルＢ）。Ｐ２０（配列番号９）をＰＴＤもしくはＷ１にコンジュゲートした場合、またはＷ３を単独で使用した場合は、皮膚浸透は著しく増強され、コンジュゲートした伝達ドメインにより皮膚浸透が増強されることが示された（１００μＭ、図１、パネルＣ）。これは、タンパク質伝達ドメイン（Ｗ３）が非共有結合分子を皮膚中に運ぶことができることを発明者らが知った最初の証拠である。これらのデータは、生物活性分子を治療目的のために皮膚中に送達するために重大な意味を有する。
【実施例３】
【００９４】
タンパク質伝達ドメインの皮膚浸透
方法：ＹＡＲＡ（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１９）として定義される）、ＴＡＴ（配列番号４３）、ＹＫＡｃ（ＹＫＡＬＲＩＳＲＫＬＡＫ（配列番号４１）として定義される）、Ｐ２０（ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号９）として定義される）、ＹＡＲＡ−Ｐ２０（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号４２）として定義される）、ＴＡＴ−Ｐ２０（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号４３）として定義される）をＦｍｏｃ化学により合成した。フランツ拡散セルに乗せたブタ耳の皮膚を使用して、脂質浸透促進剤（モノオレインまたはオレイン酸）の存在または非存在の下で、蛍光的にタグを付けたペプチドの局所的および経皮的送達を評価した。皮膚（局所的送達）およびレセプター相（経皮的送達）でのペプチド濃度を分光蛍光分析により評価した。蛍光顕微鏡を使用して異なる皮膚層のペプチドを視覚化した。
【００９５】
結果：ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）は皮膚に大量に浸透し、この組織を中程度に透過したが、ＹＫＡｃ（配列番号４１）では結果が異なった。モノオレインおよびオレイン酸はＴＡＴ（配列番号４３）またはＹＡＲＡ（配列番号１９）の局所的および経皮的送達を増強しなかったが、ＹＫＡｃ（配列番号４１）の局所的送達は増加させた。重要なことに、ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）は、コンジュゲートしたペプチド、すなわちＰ２０（配列番号９）を皮膚中に運んだが、経皮的送達は非常にわずかであった。蛍光顕微鏡により、フリーのおよびコンジュゲートしたＰＴＤが皮膚の生存可能層に到達することが確証された。
【００９６】
結論：ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでブタ耳の皮膚に浸透し、コンジュゲートしたモデルペプチドのＰ２０（配列番号９）を一緒に運ぶ。したがって、ＰＴＤの使用は、皮膚病の治療のためにペプチドの局所的送達を増加させる有用な戦略になり得る。
【００９７】
本研究の第１の目的は、ｉｎ  ｖｉｒｔｏで皮膚に浸透するＹＡＲＡ（配列番号１９）の能力を評価することであった。ＹＡＲＡ（配列番号１９）の浸透は、公知の伝達ドメインＴＡＴ（配列番号４３）の浸透、および非伝達ペプチド、ＹＫＡＬＲＩＳＲＫＬＡＫ（配列番号４１）（ＹＫＡｃ）の浸透と比較した。ペプチドはすべて類似の分子量を有する。
【００９８】
発明者らの第２の目的は、ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＴＡＴ（配列番号４３）、およびＹＫＡｃ（配列番号４１）の局所的および経皮的送達に対する化学的浸透促進剤（モノオレインまたはオレイン酸）の影響を調べることであった。発明者らの第３の目的は、コンジュゲートしたモデルペプチド、すなわちＰ２０（配列番号９）の皮膚浸透および経皮的送達を増加させるＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）の能力を立証することであった。このペプチドは親水性で、高分子量（２００５Ｄａ）を有する。特徴が類似する多くのペプチドは、皮膚病の治療のための治療可能性があり（６、３１）、その皮膚浸透は極めて乏しいことが明らかにされている（３２）。
【００９９】
材料および方法
材料：アミノ酸を含むペプチド合成のための試薬は、アドバンスドケムテク社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）（ルーイビル、ケンタッキー州、米国）、アナスペック社（Ａｎａｓｐｅｃ）（サンノゼ、カリフォルニア、米国）、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティー、カリフォルニア、米国）、およびノボバイオケム社（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｈｅｍ）（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）から購入した。フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ「異性体１」）は、モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（ユージーン、オレゴン州、米国）から購入した。モノオレインはクエスト社（Ｑｕｅｓｔ）（ナーデン、オランダ）から、オレイン酸はシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手した。溶剤および化学物質はすべて分析グレードであった。新たに切除したブタ耳は地元の食肉処理場（サウスウェスト食肉処理会社（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  ｍｅａｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、クイーンクリーク、アリゾナ州、米国）から入手した。
【０１００】
ペプチド合成：ＹＡＲＡ（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ，ＭＷ：１６６８）（配列番号１９）、ＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ，ＭＷ：２０２０）（配列番号３６）、ＹＫＡｃ（ＹＫＡＬＲＩＳＲＫＬＡＫ，ＭＷ：１９０７）（配列番号４１）、Ｐ２０（ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ，ＭＷ：２００５）（配列番号９）、ＹＡＲＡ−Ｐ２０（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ，ＭＷ：３１１１）（配列番号４２）、およびＴＡＴ−Ｐ２０（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ，ＭＷ：３４６６）（配列番号４３）を含むフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ペプチドを、自動ペプチド合成装置（Ａｐｅｘ３９６、アドバンスドケムテク社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、ルーイビル、ケンタッキー州、米国）、および固相技術を使用して合成した。ＦＩＴＣを、ペプチドのＮ末端に付加されたβアラニン残基に連結した。ペプチドを、逆相カラムを使用した高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、アマシャムファルマシアバイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）により精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ、ウォーターズコーポレーション社（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）により同定した。
【０１０１】
製剤：化学的浸透促進剤を必要とする実験の場合を除いて、ＦＩＴＣ標識ペプチドはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．２）に溶解し、ペプチド濃度は１００μＭであった。浸透促進剤を必要とする実験では、モノオレインおよびオレイン酸が新油性であるためにＰＢＳを溶剤として使用することはできなかった。プロピレングリコールは、脂質もペプチドも可溶化するので、それを溶剤として使用した。１０％（ｗ／ｗ）モノオレインを含有する、５％（ｗ／ｗ）オレイン酸を含有する、またはこれらの浸透促進剤をなにも含有しないプロピレングリコール中のＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）、ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）、およびＦＩＴＣ−ＹＫＡｃ（配列番号４１）（１００μＭ）の製剤を調製した。製剤は、モノオレインまたはオレイン酸をプロピレングリコールと混合し、ペプチドをシステムにその後直ちに付加することにより調製した。
【０１０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚浸透：前記ペプチドの局所的および経皮的送達を評価するために、フランツ拡散セルに乗せた新たに切除したブタ耳の皮膚の表面にＦＩＴＣ標識ＴＡＴ（配列番号４３）、ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＹＫＡｃ（配列番号４１）、Ｐ２０（配列番号９）、ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）、またはＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の製剤を適用した。
【０１０３】
ブタ耳の皮膚は、特に組織学的および生化学的特性ならびに薬物に対する透過性に関して、それがヒトの皮膚に類似しているために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚浸透研究のためのモデル皮膚として使用した（３３）。新たに切除したブタ耳を地元の食肉処理場から入手した。耳の外表面の皮膚を、確実に皮下脂肪を最大限除去するようにして、慎重に解体した（３４）。皮膚の完全性を維持するよう最大の注意を払い、その完全性は組織学により確かめた。清浄なブタ耳の皮膚は、角質層がドナー区画（製剤が適用される）に面し、真皮がＰＢＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．２、３ｍＬ）で満たされているレセプター区画に面している、フランツ拡散セル（１ｃｍ２の拡散面積、ラボラトリーグラスアパレイタス社（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｌａｓｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、バークリー、カリフォルニア州、米国）に直ちに乗せた。レセプター相は３７℃で、および一定攪拌の下で維持した。より高い再現性を実現するために、皮膚試料は、どの製剤の適用にもその前に３０分間拡散セル条件に平衡化した。
【０１０４】
ペプチド（各７０μＬ）のＰＢＳ溶液またはプロピレングリコール製剤を皮膚表面（ドナー区画）に適用した。ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）、およびＦＩＴＣ−ＹＫＡｃ（配列番号４１）の皮膚中（局所的送達の指標）およびレセプター相（経皮的送達の指標）中での濃度は適用の４時間後に決定した。ＦＩＴＣ−Ｐ２０（配列番号９）、ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）、およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の皮膚内およびレセプター相内での濃度は適用の０．５、１、２、４および８時間後に決定した。
【０１０５】
実験終了時、皮膚表面は蒸留水で徹底的に洗浄して、過剰な製剤を取り除き、ティッシュペーパーで慎重にふき取った。角質層（ＳＣ）を残った表皮（Ｅ）および真皮（Ｄ）から分離するために、皮膚をテープストリッピングにかけた。皮膚を１５枚の粘着テープ（スリーエム社（３Ｍ）、セントポール、ミネソタ州、米国）で剥ぎ取り、ＳＣを含有するテープは、３ｍＬの水：メタノール（１：１ｖ／ｖ）溶液にボルテックスして２分間浸し、３０分間バス超音波処理した。残った［Ｅ＋Ｄ］は小片に切断し、２ｍＬの水：メタノール（１：１ｖ／ｖ）溶液中で２分間ボルテックスし、１分間の組織グラインダーおよび３０分間のバス超音波処理を使用してホモジナイズした。こうして得られた混合物は１分間遠心分離にかけた。レセプター相に存在するペプチドは、以下のようにして濃縮した（１０倍）。レセプター相の試料（２ｍＬ）を２４時間凍結乾燥し、残留物を２００μＬのハイドロアルコール（２０％エタノール）溶液に溶解した。
【０１０６】
溶液はすべて、Ｇｅｍｉｎｉ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）プレートリーダー（モレキュラーデバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベール、カリフォルニア州、米国）を励起４９５ｎｍおよび発光５１８ｎｍで使用して蛍光定量分析にかけた。方法は、調べた濃度範囲内（０．０５〜２．０μＭ）では線形であった。抽出法で皮膚からのペプチドの回収を評価するために、組織切片（１ｃｍ２）は、ペプチドの０．２および０．５ｍＭ溶液の２０μＬでスパイクした。組織切片は、上に記載する通りに、組織グラインダー、ボルテックスミキサー、およびバス超音波処理器を使用してホモジナイズした。ペプチドの回収は、ペプチドにより８３〜９０％であった。発明者らは、ペプチドの数量化においてそのような回収割合を説明した。
【０１０７】
組織学：ＦＩＴＣ標識ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＴＡＴ（配列番号３６）、ＹＫＡｃ（配列番号４１）、Ｐ２０（配列番号９）、ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）、またはＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の適用４時間後に、皮膚試料の拡散領域は−３０℃でイソペンタンを使用して凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ化合物（ペルコインターナショナル社（Ｐｅｌｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、レディング、カリフォルニア州、米国）に埋め込み、クリオスタットミクロトーム（レイカ社（Ｌｅｉｃａ）、ウェッツラー、ドイツ）を使用して区分化した。皮膚切片（８μｍ）をガラススライドに乗せた。スライドは、追加の染色または２０倍対物レンズによる処置なしで、ＦＩＴＣ用のフィルターおよびＡｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えたツァイス（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡（カールツァイス社（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）、ソーンウッド、ニューヨーク州、米国）を使用して視覚化した。
【０１０８】
統計解析：結果は平均値±標準偏差として報告する。データは、ノンパラメトリッククラスカル−ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定により、続いてダン（Ｄｕｎｎ）ポスト検定により統計学的に分析した（６）。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１０９】
結果
ＰＴＤの局所的および経皮的送達：発明者らの第１の目的は、ＰＴＤをペプチドの局所的および／または経皮的送達のための担体として使用することができるように、皮膚に浸透しこの組織を透過するＰＴＤの能力を評価することであった（結果は図２に示す）。この実験では、ＰＢＳを媒体として使用した。発明者らは、適用の４時間後に、ＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］におけるＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）、およびＦＩＴＣ−ＹＫＡｃ（配列番号４１）の浸透の他にも、その経皮的送達を決定した。対照、すなわち非伝達ペプチドＦＩＴＣ−ＹＫＡｃ（配列番号４１）のＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］両方における浸透は非常にわずかであり、レセプター相ではペプチドはまったく見つからなかった（経皮的送達がないことを示している）。一方、ＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］におけるＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）の浸透は、対照ペプチドの浸透の８から１０倍であった。ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）の経皮的送達は適用の４時間後ではわずかであり、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）と比べて、レセプター相で検出されたＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）の量には有意差はなかった。レセプター相では、わずか０．０５３±０．００９ｎｍｏｌのＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）および０．０５８±０．００８ｎｍｏｌのＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）しか見つからず、これは、皮膚（ＳＣ＋［Ｅ＋Ｄ］）に浸透したＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）の量は、皮膚を透過した量のそれぞれ３４倍および３０倍だったことを意味している。
【０１１０】
ＰＴＤの局所的および経皮的送達に対する浸透促進剤の影響：発明者らは次に、ＦＩＴＣ標識ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＴＡＴ（配列番号４３）、およびＹＫＡｃ（配列番号４１）の局所的ならびに経皮的送達に対するモノオレインおよびオレイン酸の影響を評価した（結果は図２に示す）。この実験で、浸透促進剤およびペプチドはプロピレングリコールに溶解した。ＰＢＳと比べて、プロピレングリコールは、適用の４時間後のＹＫＡｃ（配列番号４１）、ＹＡＲＡ（配列番号１９）、およびＴＡＴ（配列番号４３）の皮膚浸透に影響を与えなかった。特に、モノオレインまたはオレイン酸の製剤への添加により、［Ｅ＋Ｄ］において非伝達ペプチド、すなわちＦＩＴＣ−ＹＫＡｃ（配列番号４１）の浸透は有意に（ｐ＜０．０５）増加した（約２．５倍）。しかし、同じ浸透促進剤は、ＴＡＴ（配列番号４３）およびＹＡＲＡ（配列番号１９）のすでに高度な局所的ならびに経皮的送達をさらに増加させることはできなかった。
【０１１１】
ＰＴＤによるコンジュゲートペプチドＰ２０（配列番号９）の皮膚内へのおよび通過する輸送：ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）が、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）と類似する程度に皮膚に浸透することを実証した後、発明者らはコンジュゲートペプチドの浸透を増加させるその能力を評価した。発明者らは、ペプチドＰ２０（配列番号９）をＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）に結合させ、その局所的ならびに経皮的送達を時間の関数として評価した。調べたＰＴＤは、コンジュゲートＰ２０（配列番号９）をＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］内に運び入れることができた（図３）。Ｐ２０（配列番号９）をＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）にコンジュゲートすると、ＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］の両方におけるその浸透は、調べたすべての時点で非コンジュゲートＰ２０（配列番号９）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図３Ａ〜Ｆ）。［Ｅ＋Ｄ］におけるＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の濃度は、適用後の０．５〜４時間に進行的に増加した（ｐ＜０．０５）（図３Ｅおよび３Ｆ）が、４時間と８時間の間では追加の増加は見られなかった。皮膚の生存可能層（［Ｅ＋Ｄ］）におけるＰＴＤ−Ｐ２０コンジュゲートの濃度は、適用の４時間後および８時間後で、非コンジュゲートＰ２０（配列番号９）の５〜７倍であった。全皮膚（ＳＣ＋［Ｅ＋Ｄ］）におけるＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の浸透の最大速度は、適用の１時間後に達成された（図３Ｋ〜Ｌ）。ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の経皮的送達は非常にわずかであり（ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）で、それぞれ、０．０３１±０．０１１ｎｍｏｌおよび０．０２７±０．００９ｎｍｏｌ）、ペプチドは適用の８時間後にはじめてレセプター相で検出された。ＦＩＴＣ−Ｐ２０はまったく皮膚を透過しなかった。
【０１１２】
蛍光顕微鏡を使用したペプチドの皮膚浸透の視覚化：予想通りに、ＰＢＳで処理した皮膚は非常に弱い自己蛍光を示した（特にＳＣ）。ＦＩＴＣ−ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＦＩＴＣ−ＴＡＴ（配列番号４３）で皮膚を処理すると、ＳＣおよび生存可能表皮が強く蛍光染色した。真皮でもある程度蛍光を観察することができ、これらのＰＴＤがＳＣを通過し皮膚の生存可能層に到達できることを実証していた。一方、ＦＩＴＣ−ＹＫＡｃ（配列番号４１）は、主にＳＣに局在化し、表皮では微弱な蛍光しか観察されなかった。Ｐ２０（配列番号９）をコンジュゲートしたＦＩＴＣ標識ＹＡＲＡ（配列番号１９）またはＴＡＴ（配列番号４３）で皮膚を処理すると、ＳＣおよび生存可能な表皮において強い蛍光の存在も発明者らは観察した。皮膚をＦＩＴＣ−Ｐ２０（配列番号９）で処理すると、ＳＣにおいてのみ蛍光を見出した。
【０１１３】
考察
本研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでブタ耳の皮膚に浸透するＰＴＤ  ＹＡＲＡ（配列番号１９）の能力を実証した。ＹＡＲＡ（配列番号１９）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、ＴＡＴ（配列番号４３）よりも効果的に細胞内に伝達されることが以前実証済みであるという事実にもかかわらず（２８）、これら２つのペプチドの皮膚に浸透する能力に有意差はまったく見られなかった。一方、類似の分子量の非伝達ペプチド、すなわちＹＫＡｃ（配列番号４１）の皮膚浸透はＳＣでも［Ｅ＋Ｄ］でもごくわずかであり、それはこのペプチドが親水性であり、高分子量（１９０７Ｄａ）であるために予想されていることである。
【０１１４】
ペプチドの皮膚浸透に対する化学的促進剤の影響を、モノオレインおよびオレイン酸を含有するプロピレングリコール製剤を使用して評価した。プロピレングリコールの溶剤としての使用は調べたペプチドの局所的ならびに経皮的送達にまったく影響を与えなかった。モノオレインおよびオレイン酸を含有する製剤は、皮膚への対照の非伝達ペプチドＹＫＡｃ（配列番号４１）の浸透を確かに有意に増強した。この所見は、モノオレインおよびオレイン酸がいくつかの機構により、ＳＣのペプチドを含む薬剤に対する透過性を増加させるように作用するという事実と一致する（３６、３７）。これらの機構には、脂質ドメインの改変およびＳＣからの脂質の抽出を含む（１０、３６〜３８）。一方、モノオレインもオレイン酸も、ＹＡＲＡ（配列番号１９）またはＴＡＴ（配列番号４３）の局所的および経皮的送達に影響を与えなかった。結果は、調べた化学的浸透促進剤がペプチドの皮膚浸透を増加させるのに有用になり得るが、これらのペプチドに伝達能力がまったくなく、それ自体では高度に皮膚に浸透しない場合に限ってであることを示唆している。
【０１１５】
ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の皮膚浸透は非常に速く、そのコンジュゲートは、Ｐ２０（配列番号９）単独と比べて高度にＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］に浸透することができた。蛍光顕微鏡分析により、ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）がＳＣ障壁を効率的に通過することが確証され、これらの比較的大きな分子が生存可能な表皮に均一に分散していることが明らかになった。ＰＴＤ−ペプチドのコンジュゲートがマウス皮膚を急速に浸透することができ、適用の早くも１時間後に高濃度に到達することはすでに明らかにされている（３９、４０）。ロビンズら（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）（３９）は、適用の０．５から１時間後のヘプタアルギニン−ヘマグルチニンエピトープの皮膚浸透にわずかな差しか観察しなかった。本研究では、コンジュゲートの皮膚浸透の最大速度は適用の１時間後に起きたが、皮膚内でのその濃度は適用の４時間後まで進行的に増加する（ｐ＜０．０５）ことを発明者らは観察した。ペプチドにコンジュゲートしたタンパク質伝達ドメインの皮膚浸透は、おそらくＰＴＤおよび使用した実験モデル皮膚によって変動する可能性がある。なぜならば、浸透の機構は異なる化合物間で変わり、皮膚の特性および特徴は動物間で異なる可能性があるからである（２０、３３）。
【０１１６】
皮膚における代謝活性は他の組織（粘膜など）における活性よりも小さいが、皮膚中でのペプチドの安定性は重要な問題である（４１）。数名の筆者が、ＦＩＴＣ標識高分子は皮膚を含む生物組織内で良好な安定性を示すことを実証している。拡散セルのレセプター相におけるＦＩＴＣ−ポリ−リシンの完全性は、化合物の電流または超音波への曝露後でも、ＨＰＬＣおよび質量分析によって実証された（４２、４３）。様々な分子量のＦＩＴＣ標識デキストランは、サイズ排除クロマトグラフィーにより実証されたように、その構造完全性を経皮的送達後に維持していた（４４）。大事なことを言い忘れていたが、皮膚中でのＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチドの完全性は、ウェスタンブロットにより実証された（４５）。この研究に使用されたＰＴＤの安定性も、３７℃で生物組織と接触した数時間のインキュベーションの前後で実証されていた。コンジュゲートＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）の薬理学的活性は、３７℃での静脈セグメントと一緒の２日間のインキュベーション後に保存されていた（２９）。
【０１１７】
したがって、ＰＴＤ−ペプチドのコンジュゲートの局所的投与は、局所皮膚障害に対する治療可能性を有していることがある。ペプチドの局所的送達は、皮膚疾患の治療、および（化粧品の場合には）皮膚特性の改善にとってのこれらの化合物の重要性のせいで、ますます研究されている。他に数ある中でも、ＴＧＦ−β、レプチン（両方とも創傷治癒のため）、ＩＮＦ−α（抗ウイルス）、シクロスポリン（自己免疫疾患の治療のため）、バシトラシン（皮膚感染のため）、およびパルミトイル−グリシル−ヒスチジルリシントリペプチド（コラーゲン合成の刺激のため）を含むいくつかのペプチドの局所的投与は魅力的だと考えられる（６、１１、２５、３１、４６〜４８）。さらに、いくつかのペプチドが皮膚に適用され、局所ワクチンの開発のための抗原として研究されてきた（４９）。このような文脈において、ＰＴＤの使用は、皮膚へのペプチド送達を首尾よく増加させるのに有用である可能性があり、これは全身性副作用の回避を伴う治療効果および患者に役立つものをもたらすことができる重大な成果となろう。
【０１１８】
様々なＰＴＤの皮膚浸透が文献において報告されてきた（２５〜２７、３９）が、正確な作用機構は依然未知のままである。角質層の細胞間脂質領域は、脂質組成に関してのみならず、含水量および脂質／タンパク質の割合に関しても細胞膜とは異なっている（５０）。さらに、皮膚の最外層は生育不能細胞で構成されており、エンドサイトーシスは期待されない。したがって、ＰＴＤが皮膚に浸透する機構は、おそらくＰＴＤが細胞膜を通過する機構とは異なっている。ロスバードら（Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）（２５）は、ＳＣは代謝的に活性な環境であり（生細胞で構成されてはいないが）、そのことはＰＴＤの輸送に貢献することができることを示唆した。さらに、いくつかのＰＴＤは脂質と相互作用することができることは公知であり（５１）、そのことはＳＣを通過するその輸送にとり重要である可能性がある。実際、ポリ−Ｌ−アルギニンは、鼻粘膜上皮の密着結合の透過性（５２）およびデキストランの輸送を増加させることは実証された。この効果は、ポリアルギニンと細胞の負の電荷をもつ脂質の相互作用により誘発された（５３）。皮膚中の密着結合の存在はすでに実証されており（５４）、これらの構造物の調べられたＰＴＤによる分解は、皮膚の生存可能層へのＰＴＤの浸透にとり重要である可能性がある。さらに、ＰＴＤはおそらく皮膚の異なる層に浸透する可能性があり、こうして得られた勾配は、おそらくＰＴＤの皮膚への浸透を促進する力となる可能性がある（２５）。
【０１１９】
ＹＡＲＡ−Ｐ２０（配列番号４２）およびＴＡＴ−Ｐ２０（配列番号４３）の局所的送達は高かったが、その経皮的送達はわずかであり、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏではいくらかゆっくり起こることを発明者らは見出した。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これらの化合物の経皮的送達は、生きている皮膚はこれらの実験で使われたｅｘ  ｖｉｖｏ皮膚よりも動的なので、より多く速い可能性があり、局所的に投与されたＰＴＤ−Ｐ２０がさらに深い組織で効果を生じるかどうかを評価するには追加の研究が必要である。最近実証された血管拡張を引き起こすＰ２０（配列番号９）の能力のためにこれは特に興味深いようである（２９、３０）。そのような効果は、たとえば、男性および／または女性の性機能障害の局所的治療のために使える。
【０１２０】
結論
ＰＴＤ  ＹＡＲＡ（配列番号１９）、ＴＡＴ（配列番号４３）およびペプチドＰ２０（配列番号９）とのそのコンジュゲートはｉｎ  ｖｉｔｒｏでブタ皮膚に高度に急速に浸透すると発明者らは結論付ける。これらの結果は、ＰＴＤを担体分子として使用して、治療的興味のあるペプチドを皮膚に送達することができることを示唆している。ＹＡＲＡ（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）の皮膚浸透は、化学的浸透促進剤モノオレインまたはオレイン酸を含有する製剤によりさらに改良されることはないが、同一浸透促進剤は大きなしかし非伝達ペプチドの局所的送達を改良することも、発明者らは結論付ける。
【０１２１】
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【実施例４】
【０１２２】
ムコサール送達
蛍光的に標識されたＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）（Ｋ−Ｙゼリー中１ｍＭ、ＦＩＴＣ−ｂＡ−ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号４４）、ｂＡはｂｅｔａ−アラニンおよびｐＳはリン酸化セリン）を使用して、ムコサール送達を調べた。ペプチドを、アプリケーターを使用して膣および肛門管の両方に適用し、４時間浸透させた。組織を切除し、凍結切片化のために凍結組織包埋媒質（ＨｉｓｔｏＰｒｅｐ）に埋め込んだ。切片を抗フェード試薬に乗せ、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）を使用して調べた。膣でのムコサール浸透が実現されたが、肛門管では最小の蛍光しか観察されなかった。これらの結果は、ＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）伝達は、直腸粘膜よりも膣粘膜のほうが効率的であることを示唆している。
【実施例５】
【０１２３】
血管弛緩
ラット大動脈を結合および脂肪組織から完全に単離して解体した。幅３．０ｍｍの横行環を切断して絹縫合に結合させた。重炭酸緩衝液（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭグルコース、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＣＯ３、ｐＨ７．４）を含有し、３７℃で９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化したマッスルバスに組織を懸濁させた。環は一方の末端でステンレス鋼ワイヤーに固定化し、マッスル灌流システム中でフォーストランスデューサーに結合させた（Ｒａｄｎｏｔｔｉ）。次に、環を徐々に伸ばし、１１０ｍＭ  ＫＣｌ（重炭酸緩衝液でのＮａＣｌの等モル置換）に応答して生じる等尺力を一貫した最大力が生じるまで決定した。アゴニストおよびペプチドはバスに直接添加した。１１０ｍＭ  塩化カリウム（ＫＣｌ）で、続いて１．０ｍＭ  ＷＬ−Ｐ２０（ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ、ｐＳはリン酸化セリン）（配列番号１０）で前収縮させた組織は、未処理対照と比べて弛緩した（１０分で１３％弛緩、３０分で５０％弛緩、および約６０分で最大８８％弛緩、図４）。弛緩割合は、ＫＣｌで生じる最大力に対して算出した。これらのデータは、ＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）が、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号４２）よりも長い時間変化にわたり組織を弛緩させる（最大弛緩は５〜１０分以内に到達した）ことを示している。そのような相違は浸透および／または細胞内局在化の機構が異なることから生じることがある。
【実施例６】
【０１２４】
抗線維性活性
ＨＳＰ２０ペプチドの抗線維性活性のキーマーカーとして、発明者らは、形質転換増殖因子ｂｅｔａ−１（ＴＧＦβ１）による刺激の後のヒトケロイド線維芽細胞における結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の発現レベルを以前調べていた。細胞は、３７℃、１０％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ならびに追加のペニシリンおよびストレプトマイシン（１％）を含むＤＭＥＭ中７０％コンフルエンスまで１０ｃｍ２皿で培養した。細胞を、実験前に４８時間、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で血清不足にした。細胞を、未処理（対照）にするか、またはＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）リンペプチド（ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ、ｐＳはリン酸化セリン）（１０または５０μＭ）の存在の下で、または非存在の下で、２４時間、ＴＧＦβ１（２．５ｎｇ／ｍＬ）で処理した。実験終了時、細胞はＰＢＳですすぎ、尿素−ジチオスレイトール−キャップ（ＵＤＣ）緩衝液を使用してホモジナイズした。可溶化液を混合し、２０分間遠心分離にかけ（６０００倍ｇ）、上澄みをタンパク質発現の決定のために使用した。試料（２０μｇのタンパク質）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填し、タンパク質を電気泳動的にイモビロン膜に移動させた。ＣＴＧＦ抗体での免疫ブロットを、近赤外検出抗体と共同して使用して、ＣＴＧＦ発現を決定した（Ｏｄｙｓｓｅｙ  リ・コル社（Ｌｉ−Ｃｏｒ）、リンカーン、ネブラスカ州）。負荷差はＧＡＰＤＨ発現に規準化することにより補正した。
【０１２５】
異なる伝達ドメイン（ＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ付きのＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１９））（配列番号９）を使用した以前の実験に類似して、ＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）も、ＴＧＦβ１誘発ＣＴＧＦおよびコラーゲン発現を阻害する（図５）。ヒトケロイド線維芽細胞を４８時間、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で血清不足にし、２４時間、２．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−ｂｅｔａ１で処理し、同時に２４時間、ＷＬ−２０（配列番号１０）（１０または５０μＭ）で処理した。ウェスタンブロットバンドを濃度測定により定量化し、ＣＴＧＦおよびコラーゲン発現をＧＡＰＤＨ発現と関連付けて、負荷差を補正した。対照細胞におけるＣＴＧＦおよびコラーゲンの発現を、異なるブロットとの比較のために１に設定した。
【０１２６】
実際、ＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）は線維化応答をより強く阻害するように思われる。たとえば、ＣＴＧＦ発現は、ＴＧＦβ１と比べて５０μＭ  ＷＬ−Ｐ２０で４６％減少し、５０μＭ  ＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ（配列番号９）の用量は、ＴＧＦβ１処理に対して３０％減少の最大効果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】（Ａ）ＰＴＤまたはＷ３（非共有結合）伝達（Ｂ）１ｍＭ  Ｗ３を使用してＰ２０（配列番号９）（非共有結合）を運ぶ場合の皮膚浸透［Ｅ＋Ｄ］（Ｃ）Ｐ２０（配列番号９）をＰＴＤもしくはＷ１にコンジュゲートした場合、またはＷ３を単独で使用した場合の皮膚浸透を示す図。
【図２】ＰＢＳまたは浸透促進剤モノオレイン（ＭＯ、１０％Ｗ／Ｗ）もしくはオレイン酸（ＯＡ、５％Ｗ／Ｗ）を含有する製剤を使用した４時間後のＳＣ、［Ｅ＋Ｄ］、およびその経皮的送達におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド浸透を示す図。複製物の数は実験グループ当たり４〜８である。＊、プロピレングリコール溶液と比べてｐ＜０．０５。ＰＬ：プロピレングリコール、ＳＣ：角質層、［Ｅ＋Ｄ］：角質層のない表皮および真皮。
【図３】０．５、１、２、４または８時間後のＳＣ（Ａ〜Ｃ）、［Ｅ＋Ｄ］（Ｄ〜Ｆ）、および皮膚全体（Ｇ〜Ｉ）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド浸透の時間変化を示す図。図は皮膚全体における前記ペプチドの浸透を使用して算出した皮膚浸透速度も示している（Ｊ〜Ｌ）。複製物の数は実験グループ当たり６〜８である。ＳＣ：角質層、［Ｅ＋Ｄ］：角質層のない表皮と真皮。Ｐ２０（配列番号９）をＹＡＲＡ（ＰＴＤ）（配列番号１９）およびＴＡＴ（配列番号４３）にコンジュゲートした場合、ＳＣおよび［Ｅ＋Ｄ］両方におけるその浸透は、調べたすべての時点で非コンジュゲートＰ２０（配列番号９）の浸透よりも有意（ｐ＜０．０５）に高かった。
【図４】ＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）は平滑筋を弛緩させることを示す図。ラット大動脈をＫＣｌ（１１０ｍＭ）で前収縮させ、次に１ｍＭ  ＷＬ−Ｐ２０（配列番号１０）で処理した。最大弛緩（８８％）は約６０分で起きた。
【図５】ＴＧＦβ１処理後のＣＴＧＦおよびコラーゲン発現を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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