(57)【要約】本発明は遺伝子発現の解析を利用して、鼻腔上皮細胞の情報から肺疾患を診断する方法に関する。さらに具体的には、本発明は鼻腔上皮細胞のサンプルから被験動物、好ましくはヒトの被験体における肺疾患、特に肺癌、を検出するための診断および予後診断の方法に関する。本発明はまた、鼻腔上皮細胞サンプルから肺疾患を解析するために、その発現が利用できる遺伝子をも提供する。一つの実施形態において、本発明は肺疾患の診断や予後診断、あるいは疾患の進行や治療効果の追跡調査のための、鼻腔上皮細胞の遺伝子発現解析を利用した方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における肺癌を診断する方法であって、
ａ）該被験体から採取された鼻腔上皮組織を含む生物学的サンプルの、表６に記載される少なくとも２０の遺伝子転写産物の発現について測定する工程および、
ｂ）前記の少なくとも２０の遺伝子産物発現を、癌のない被験体から採取された前記転写産物の対照サンプルに比較する工程、
を含む方法であって、表６の最後のカラムに負の数値で表示される該遺伝子転写産物の発現の増加そして／または表６の最後のカラムに正の数値で表示される該遺伝子産物の発現減少は該被験体が肺癌に罹患していることを指摘する方法。
【請求項２】
少なくとも４０の遺伝子転写産物が測定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも６０の遺伝子転写産物が測定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも７０の遺伝子転写産物が測定される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
測定される前記遺伝子転写産物が表５に表示される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
測定される前記遺伝子転写産物が表７に表示される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
測定される前記遺伝子転写産物が表１に表示される請求項１に記載の方法において、該被験体が肺癌に罹患しているかどうかを決定するために、前記対照に比較した前期遺伝子産物の肺癌における発現の増減を表示した表１の３番目のカラムを用いる方法。
【請求項８】
測定される前記遺伝子産物が少なくとも表３に記載される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
使用される前記転写産物が少なくとも表４に表示される転写産物である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
大気汚染物質に曝露された被験体において肺疾患を診断する方法であって、
ａ）被験体から採取された鼻腔上皮サンプルにおける遺伝子グループの発現プロファイルを測定する工程、および
ｂ）該被験体発現プロファイルを、類似の大気汚染物質に曝露され、前記肺疾患に罹患していない一次対照被験体の発現プロファイル、および類似の大気汚染物質に曝露され、前記肺疾患に罹患する二次対照の発現プロファイルに比較する工程を有する方法であって、
該被験体の前記発現プロファイルが、前記二次対照の発現プロファイルよりも前記一次対照の発現プロファイルに類似すれば、該被験体が肺疾患に罹患していないことを指摘し、該被験体の前記発現プロファイルが、前記一次対照の発現プロファイルよりも、前記二次対照の発現プロファイルに類似すれば、該被験体が前記肺疾患に罹患しているか、前記肺疾患を発症する危険性が高いことを指摘する方法。
【請求項１１】
前記遺伝子グループがＧｅｎＢａｎｋ識別番号のＮＭ＿００３３３５；  ＮＭ＿０００９１８；
2009529329.tif 000089
ＮＭ＿０２０７０６；  ＡＩ５２３６１３；そしてＮＭ＿０１４８８４から成るグループから選択された少なくとも３０遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子グループが、ＧｅｎＢａｎｋ  識別番号のＮＭ＿００７０６２．１；  ＮＭ＿００１２８１．１；
2009529329.tif 000090
2009529329.tif 000091
そしてＡＦ１９８４４４．１から成るグループから選択された遺伝子配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子グループがＧｅｎＢａｎｋ  識別番号のＮＭ＿００７０６２．１；  ＮＭ＿００１２８１．１；  
2009529329.tif 000092
ＮＭ＿０１４１２８．１；  ＡＡ１３３３４１；  そしてＡＦ１９８４４４．１から成る遺伝子グループから選択された遺伝子配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記グループがＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号のＮＭ＿０３０７５７．１；  Ｒ８３０００；  
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そしてＢＣ０２８９１２．１の遺伝子から成る遺伝子グループから選択された遺伝子の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記グループがＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号のＮＭ＿００３３３５；  ＮＭ＿００１３１９；  
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2009529329.tif 000095
ＡＩ５２３６１３；  そしてＮＭ＿０１４８８４から成るグループから選択される遺伝子の配列を含むグループである、請求項１に記載の方法において、これらの遺伝子のうちの少なくとも５つの遺伝子の発現減少は、該被験体が肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項１６】
前記グループがＧｅｎＢａｎｋ  あるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号のＮＭ＿０３０７５７．１；  Ｒ８３０００；  
2009529329.tif 000096
そしてＡＦ２５７０９９．１の遺伝子から成るグループから選択された遺伝子の配列を含む、請求項１に記載の方法において、これらの遺伝子のうちの少なくとも５つの遺伝子の発現減少は、該被験体が肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、前記グループは以下のＧｅｎＢａｎｋ  あるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号の遺伝子から成るグループから選択される遺伝子の配列を含むグループであってそれらの遺伝子識別番号とはＢＦ２１８８０４；  ＡＫ０２２４９４．１；
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ＡＫ０２５６５１．１；  ＡＡ１３３３４１；  そしてＡＦ１９８４４４．１であり、これらの遺伝子のうちの少なくとも５遺伝子の発現減少は該被験体が前記肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、前記グループが以下のＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号からなるグループから選択される遺伝子の配列を含むグループであって、それらの識別番号とはすなわち、ＮＭ−０００９１８；  ＮＭ＿００６４３０．１；  
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そしてＮＭ＿０１８５０９であり、これらの遺伝子のうちの少なくとも５遺伝子の発現増加は該被験体が前記肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法において、前記グループが以下のＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号の遺伝子から成るグループから選択された遺伝子の配列を含むグループであって、それらの識別番号とは、ＮＭ−０１４１８２．１；
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そしてＢＣ０２８９１２．１であり、これらの遺伝子のうちの少なくとも５遺伝子の発現増加は、該被験体が前記肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項２０】
請求項４−７に記載の方法において、前記グループが以下のＧｅｎＢａｎｋ  あるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号の遺伝子から成るグループから選択される遺伝子の配列を含むがそれらの識別番号とは、ＮＭ＿００７０６２．１；  
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そしてＡＢ０１４５７６．１であり、これらの遺伝子のうちの少なくとも５遺伝子の発現増加は、該被験体が肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、前記グループがグループ１とグループ２から選択される遺伝子の配列の５−９個を含む方法であって、グループ１はＧｅｎＢａｎｋ  またはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号が
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そしてＮＭ＿０１４８８８４の遺伝子からなり、グループ２がＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅの識別番号がＮＭ＿０００９１８；  ＮＭ＿００６４３０．１；  ＮＭ＿００４１６．１；  ＮＭ＿００４０９０；  
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そしてＮＭ＿０１８５０９の遺伝子から成り、そしてグループ３とグループ４から選択された少なくとも２０個の遺伝子のグループを含み、グループ３はＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅ  識別番号がＢＦ２１８８０４；
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とＡＦ１９８４４４．１の遺伝子からなり、グループ４はＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号がＮＭ＿００７０６２．１；
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の遺伝子からなる方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、グループ１のいずれか一つの遺伝子の発現減少、グループ２のいずれか一つの遺伝子の発現増加、グループ３の遺伝子の発現減少そしてグループ４の遺伝子の発現増加は該被験体が肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、前記グループがグループ５とグループ６から選択される遺伝子の５−９個の配列を含み、グループ５はＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｇｅｎｅの識別番号がＮＭ＿０３０７５７．１；  Ｒ８３０００；  ＡＫ０２１５７１．１；  ＮＭ＿１７９３２．１；  Ｕ８５４３０．１；  ＡＩ６８３５５２；  ＢＣ００２６４２．１；  
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2009529329.tif 000107
（Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ）；  ＡＦ３６５９３１．１；  そしてＡＦ２５７０９９．１の遺伝子から成り、グループ６はＧｅｎＢａｎｋ  あるいはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号がＮＭ＿０１４１８２．１；  ＮＭ＿００１２８１．１；  ＮＭ＿０２４００６．１；  ＡＦ１３５４２１．１；  Ｌ７６２００．１；  
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ＢＣ０４８０９６；とＢＣ０２８９１２．１の遺伝子から成り、そして、グループ３とグループ４から選択される少なくとも２０個の遺伝子を含み、グループ３はＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｇｅｎｅ識別番号のＢＦ２１８８０４；  ＡＫ０２２４９４．１；  
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ＡＫ０２５６５１．１；  ＡＡ１３３３４１；  とＡＦ１９８４４４．１  の遺伝子から成り、グループ４はＧｅｎＢａｎｋあるいはＵｎｉｇｅｎｅの識別番号がＮＭ＿００７０６２．１；  ＮＭ＿００１２８１．１；  ＢＣ０００１２０．１；  ＮＭ＿０１４１５５．１；
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とＡＢ０１４５７６．１の遺伝子から成り、グループ５の遺伝子発現減少とグループ６の遺伝子の発現増加、そしてグループ３の遺伝子の減少とグループ４の遺伝子の増加は該被験体が肺疾患に罹患していることを指摘する方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法において、前記転写産物が、ＣＹＰ１Ｂ１；  ＡＫＲ１Ｂ１０；  ＣＹＰ１Ｂ１；ＣＹＰ１Ａ１；  ＣＹＰ１Ｂ１；  ＣＥＡＣＡＭ５；
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2009529329.tif 000112
である方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法において、前記転写産物が次の転写産物からから成るグループから選択される方法：
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【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、前記転写産物が次の転写産物から成るグループから選択される方法：
2009529329.tif 000114
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、前記転写産物が次の転写産物から成るグループから選択される方法：
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府機関からの援助）
本発明は一部、米国医薬品食品衛生研究所のグラント番号Ｎｏ．ＨＬ０７７４９８の支援により行われ、米国政府は本発明に対してある程度の権利を保有する。
【０００２】
（関連出願への相互参照）
本出願では、合衆国法典第３５巻、特許法第１１９（ｅ）条の下で、２００６年３月９日に米国に出願された米国仮特許出願番号６０／７８０，５５２の利益を主張し、当該出願の内容は参照によりその全体がここに組み込まれる。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は遺伝子発現の解析を利用して、鼻腔上皮細胞の情報から肺疾患を診断する方法に関する。さらに具体的には、本発明は鼻腔上皮細胞のサンプルから被験動物、好ましくはヒトの被験体における肺疾患、特に肺癌、を検出するための診断および予後診断の方法に関する。本発明はまた、鼻腔上皮細胞サンプルから肺疾患を解析するために、その発現が利用できる遺伝子をも提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
肺疾患は、現代社会における深刻な健康問題を代表するものである。例えば、肺癌は、米国で毎年１５万人の命を奪い、これは乳癌、前立腺癌および結腸直腸癌の死亡数を合わせたよりも多い。喫煙は、肺癌の最も主要な原因である。現在、米国人口の２５％が喫煙するが、ヘビースモーカーの１０−１５％が肺癌を発症するにすぎない。また喫煙に関連する、肺気腫のような他の疾患もある。また、例えば二次的喫煙のような喫煙者に曝露される人々からも健康上の問題が提起されつつある。元喫煙者には、癌を含むそのような疾患を発症する危険性が残り、今や、新たな肺癌患者が生じる大きな予備軍となっている。喫煙に加えて、アスベストやスモッグのようなその他の大気汚染物質への曝露は、それらの物質に晒された人々にとっての重篤な肺疾患発症の危険を引き起こす。
【０００５】
全肺癌患者のほぼ８５％が診断後３年以内に死亡する。遺憾ながら、生存率はこの数十年間、変化していない。この理由は主として、肺癌発症の危険が最も大きい喫煙者を見つける効果的な方法がないことや、早期診断のための有効な手段がないことによる。
【０００６】
肺癌を診断するために現在、使われている方法には、胸部Ｘ線解析、気管支鏡検査、痰の細胞学的分析、胸部コンピューター画像診断解析、およびポジトロン電子線画像診断解析（ＰＥＴ）などが含まれる。しかしながら、これらのいずれの方法も、最適な診断用検査に必要とされる感度と特異性を合わせ持たない。
【０００７】
本発明者らは、これまでに気管支上皮細胞から得られた生物学的サンプルの遺伝子グループの発現パターン解析が、肺癌のような肺疾患発症の正確な診断や予後診断をもたらすことを発見している（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４１３２）。
【０００８】
しかしながら、気管支組織から上皮細胞を採取する方法は、他の多くの方法に比較して侵襲性が少ないにもかかわらず、幾つかの欠点がある。例えば、患者は、検査前の６−１２時間、飲食物の摂取ができない可能性がある。また、操作に硬い気管支鏡が使われれば、患者はある程度の危険を伴う全身麻酔を必要とすることになる。柔軟性のある気管支鏡が使用される場合は、操作は局所麻酔下に行われる。患者のうちの数人は、そのような操作中に、窒息感のような不快な感覚を覚え、再度の操作を受けることに、かなりの抵抗感を示す。また、気管支鏡の操作を受けた後は、数日間、咽喉に不快感が残ることがある。
【０００９】
遺伝子発現解析のために口腔上皮細胞からＲＮＡが分離され得る（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．  １０／５７９，３７６）ことはすでに報告されているが、そのようなサンプルが、正確な診断や予後診断の方法に使用できる気管支のサンプルと同じ遺伝子発現の変化を常に反映できるかどうかについては明らかにされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、原発性の肺悪性疾感を含めて、肺癌や肺癌発症の危険性といった肺疾患を個々の患者において評価するための、簡単で侵襲性の少ないスクリーニングの方法の開発には、多大の興味と必要性がある。もしそのような方法が、例えば、疾病の多様な進行過程において発現が変化するマーカー遺伝子を見つける事により、伝統的な胸部Ｘ線撮影、あるいはＰＥＴ解析や細胞学的解析よりも更に正確であれば、より好ましい。
【００１１】
従って、非侵襲性の検査は非常に有用となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、鼻腔上皮細胞における遺伝子発現の解析に基づく、肺癌のような肺疾患の診断のための、非常に侵襲性の少ない方法を提供する。
【００１３】
本発明者らは、驚いた事に、鼻腔上皮細胞の遺伝子発現の変化が肺上皮細胞の遺伝子発現の変化を密接に反映することを発見した。従って、本発明は肺疾患の診断や予後診断、あるいは疾患の進行や治療効果の追跡調査のための、鼻腔上皮細胞の遺伝子発現解析を利用した方法を提供する。
【００１４】
また、本発明者らは、気管支上皮細胞と鼻腔上皮細胞の遺伝子発現パターンは非常に相関性が高いことを発見した。このことは、これまでに研究した他のどの組織の上皮細胞における遺伝子発現パターンとも対照的である。肺と鼻腔において、発現が特に高い相関を示す遺伝子について、表８、９および１０に示す。
【００１５】
本発明の方法は、例えば、肺疾患の発症の危険性がある被験体、特に、タバコや葉巻の煙、またはアスベストや他の既知の汚染物質に曝露されたことがあるために特に肺癌の発症の危険性がある被験体、においての悪性疾患を指摘する変化をスクリーニングするための最適な手段を提供する。本発明の方法は、気管支鏡操作について訓練された専門家を必要としない、また気管支鏡検査に必要な複雑な装置を必要としないので、年１回の定期的検診でのスクリーニングを可能にする。
【００１６】
本発明者らは、気管支組織と鼻腔道の上皮細胞の遺伝子発現に有意な相関があることを発見した。これは、癌患者のサンプルの解析と同時に、喫煙者と非喫煙者からのサンプルの解析を行うことで発見された。
【００１７】
本発明者らは、類肉腫症のある被験体をそれのない被験体から区別する遺伝子を解析した際に、気管支組織と鼻腔の上皮細胞における遺伝子発現プロファイルに高い相関性を発見した。
【００１８】
本発明者らはまた、喫煙者と喫煙の経験がない被験体との間で、遺伝子発現パターンを比較した際に、同様な事実を発見した。
【００１９】
従って、本発明者らは、診断、予後診断または追跡調査のための、気管支組織からではなく、鼻腔道からの上皮細胞を採取する侵襲性が非常に少ない方法を発見し、また喫煙家と非喫煙家における肺癌のような肺疾患の効果的な予測因子であると実証された同じ遺伝子が、鼻腔道の上皮細胞の解析に利用できることを発見した。
【００２０】
遺伝子発現解析は、表８、９および１０に記載された、また例えばＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４１３２に説明された遺伝子や遺伝子グループを使って行うことができる。当然ながら、もし発見されれば、他の診断用遺伝子もまた利用することができる。
【００２１】
従って、本発明は、鼻腔上皮細胞からのサンプルを使った、肺疾患の診断、予後診断および追跡調査のための、実質的に侵襲性の少ない方法を提供する。より改良された解析を提供するために、遺伝子発現解析が好んで使われる。
【００２２】
肺癌のような肺疾患の高度の診断に、個々の、あるいはグループとしてのまたはサブセットの遺伝子の発現解析を用いることができる。
【００２３】
同様に、本技術が病因となる因子、すなわち汚染物質、あるいは微生物や他の気道刺激物質による場の影響を受けるような肺疾患に関連した遺伝子発現の変化についての発見が進むにつれて、本発明に説明される解析や発見によって、それらの遺伝子発現の変化が鼻腔の上皮細胞を用いて、解析可能であることが結論づけられ、従って、一般的な肺疾患のための侵襲性がより少なく、より正確な診断法を提供することになる。例えば、上記のような方法を使って、以下の疾患が含まれるがそれらに限定されるものではない、検出可能な遺伝子発現の変化をもたらす全ての肺疾患の診断ができる。それらの疾患には、急性肺好酸球増多症（レフレル症候群）、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）肺炎、慢性肺コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、播種性結核（感染性）、慢性肺ヒストプラズマ症、慢性肺放線菌症、肺アスペルギルス菌症（菌腫）、肺アスペルギルス菌症（侵襲型）、肺組織球腫Ｘ  （好酸球性肉芽腫）、  肺ノカルジア症、肺結核や類肉芽腫があげられる。事実、その一例としては、被験体が類肉芽腫を発症すると、その発現が変化する遺伝子グループが示される。
【００２４】
鼻腔上皮細胞を使った本発明の診断／予後診断検査に有用な遺伝子転写産物グループの一例を表６に示す。本発明者らは、表６に記載された遺伝子の少なくとも２０遺伝子からなるグループを用いると、単なる可能性というよりも、遥かに優れた診断能が提供されることを発見した。
【００２５】
これらの遺伝子産物の２０よりも多くの数を使うことが好ましく、例えば、約２０−１００およびその間の全ての組み合わせ、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０等を使うことが好ましい。本発明者らにとって好ましいグループとしては、３６１（表８）、１０７（表９）、７０（表１０）、９６（表１）、８４（表２）、５０（表３）、３６（表４）、８０（表５）、５３５（表６）、および２０（表７）が挙げられる。
【００２６】
本発明者らは、ある場合には、これらの特異的なグループのいずれかに、幾つかの遺伝子を追加することで、診断の正確度を高めることができることを発見した。これらのグループが使用される場合、グループに含まれる遺伝子が対照あるいは対照群に比較される。対照群としては、非喫煙者のように、特定の大気汚染物質に曝露されたことのない被験体や、喫煙者、あるいは、元喫煙者、または気道において、“場の影響”を起こし肺疾患を発症する危険性をもたらすウィルスや他の物質に曝露されていない被験体であったりできる。典型的には、もしある疾患を診断しようとすれば、対照のサンプルはその疾患に罹患していない個人からのものとし、また、同様な、または異なる肺疾患に罹患している複数の個人からの一つ以上のサンプルを含めてもよい。そのようにして、サンプルを、サンプル中の発現パターンが最も密接に似通っている発現パターンをもつ対照の疾患として診断できる。好ましくは、ある個人の生物学的サンプル中の遺伝子転写産物または発現産物を、肺気腫や肺癌のような肺疾患を持たないこと以外は、類似した被験体からなるグループと比較する。例えば、喫煙者からの生物学的サンプルを、肺癌に罹患していない喫煙者グループに対して比較できる。特定の遺伝子を目当てに、前述の表に記載されている、遺伝子転写産物や発現物を、対照に対する発現の増加あるいは減少で比較する場合、調べる全ての遺伝子の増減がみられる訳ではない。しかしながら、調べる遺伝子の少なくとも５０％が供述されたパターンを必ず示すと考えられる。割合が１００％に近づくにつれて、信頼度が高まる。従って、態様の一つにおいては、調べる遺伝子の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、あるいは９９％が、以下の表に示すように、肺癌のような肺疾患を指摘する変化したパターンを示すことが望まれる。
【００２７】
態様の一つにおいては、大気汚染物質や大気中に存在し吸入される微生物のような、その他の気道の刺激物質への曝露のために、肺癌のような肺疾患を発症する危険がある被験体において変化が見られる一群の遺伝子について、鼻腔上皮細胞のサンプルが解析される。これは、大気汚染物質を発見したからである。本発明の方法は、また、大気中に存在する微生物やウィルスを含めたそのような大気汚染物質への曝露のために、肺疾患を発症する危険性のある被験体において、グループとして一貫して変化がみられる遺伝子のグループについての鼻腔上皮細胞のサンプルの解析にも利用できる。
【００２８】
肺癌のような肺疾患や肺癌のタイプさえも診断するために使用できる発現パターンやプロファイルを示す遺伝子グループを使った、本発明の方法により、６０％を越える、好ましくは６５％を越える、さらにより好ましくは少なくとも約７０％を越える、さらにより好ましくは約７５％の、あるいはさらにより好ましくは約８０％−９５％の精度で、肺癌のような肺疾患をスクリーニングされる被験体の気道から採取されたサンプルを用いて、鼻腔上皮細胞を解析できる。
【００２９】
態様の一つにおいては、本発明は、鼻腔上皮細胞と、本発明に説明される遺伝子グループの遺伝子発現パターンとの組み合わせを用いて、肺癌のような肺疾患を診断する方法を提供する。
【００３０】
従って、本発明は、肺癌の診断と予後診断に直接利用できる遺伝子発現パターンがみられる鼻腔上皮細胞の遺伝子グループを解析するための方法を提供する。  特に、本発明は、大気汚染物質に晒された被験体において、肺疾患を決定するための診断および予後診断検査を提供する発現プロファイルを示す、鼻腔上皮細胞の遺伝子グループの解析を提供する。例えば、本発明は、鼻腔上皮細肪を使った解析と、肺癌患者と肺癌患者でない被験体から区別できる発現プロファイルを示す遺伝子のグループを提供する。
【００３１】
態様の一つにおいては、本発明は開示された遺伝子発現プロファイルについての鼻腔上皮細胞の解析を使って、肺癌初期の無症候疾患をスクリーニングするシステムを提供する。このようなスクリーニングは、例えば、結腸癌のスクリーニングのための大腸内視鏡検査を行う年齢グループと同じ年齢グループに遂行されることができる。肺癌において、早期検出は、効果的な治療に必須であるので、本発明の遺伝子発現解析システムは、腫瘍細胞を検出するための改善された方法を提供する。従って、本解析はスクリーニングを目的として、一年に１回あるいは二年に１回といった多様な時間間隔で行うことが出来る。あるいは、もし治療に対する反応としての疾患の進行や退行をモニターしたければ、さらに頻回のサンプル採取も可能である。例えば、同じ患者のサンプルを週に１回、月に１−２回、３、４、５、または６ヶ月に１回、採取することもできる。
【００３２】
本発明の遺伝子グループの発現を測定するためのプローブは、本発明で同定された個々の遺伝子／転写産物にハイブリッド形成のできる核酸プローブであっても良いし、あるいは、本発明の個々の遺伝子グループの遺伝子産物によりコードされた蛋白質に対する抗体であってもよい。プローブは、被験体においての肺疾患の診断や予後診断ができるように、遺伝子あるいは蛋白質チップのように、固体表面に固定化されていることが好ましい。
【００３３】
好ましい態様の一つにおいては、本発明は鼻腔上皮細胞を使った肺疾患の診断に使用できる遺伝子のグループを提供する。これらの遺伝子を使って、同定された。
【００３４】
態様の一つにおいては、本発明は肺疾患の個々の予測因子として使用できる遺伝子のグループを提供する。これらの遺伝子はｔ−検定による確率を使って同定され、喫煙者において、非喫煙者とは異なる発現パターンを示すものである。遺伝子グループは、以下のＧｅｎＢａｎｋ配列識別番号（ＩＤ  番号）（各遺伝子のＩＤ番号は「；」を間に挟んで区別し、代替のＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ番号  は「／／／」を挟んで区別してある）によって同定される遺伝子からなるグループから選択される１から９６、およびその間の全ての組み合わせの数の、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、例えば少なくとも３６、例えば少なくとも約４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または９６の遺伝子転写産物からなり：
【００３５】
【化１】
2009529329.tif 000003
【００３６】
【化２】
2009529329.tif 000004
とＮＭ＿１４８８４であり、その発現  プロファイルが例えば肺癌のような肺疾患を、肺癌を発症していない、あるいはその危険性がない喫煙者の同じ遺伝子グループの発現パターンと比較することによって、喫煙者からの肺細胞サンプルにおいて診断するために使用できる遺伝子である。
【００３７】
別の態様においては、遺伝子／転写産物の解析は、約１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０、８０−９０、９０−１００、１００−１２０、１２０−１４０、１４０−１５０、１５０−１６０、１６０−１７０、１７０−１８０、１８０−１９０、１９０−２００、２００−２１０、２１０−２２０、２２０−２３０、２３０−２４０、２４０−２５０、２５０−２６０、２６０−２７０、２７０−２８０、２８０−２９０、２９０−３００、３００−３１０、３１０−３２０、３２０−３３０、３３０−３４０、３４０−３５０、３５０−３６０、３６０−３７０、３７０−３８０、３８０−３９０、３９０−４００、４００−４１０、４１０−４２０、４２０−４３０、４３０−４４０、４４０−４５０、４５０−４６０、４６０−４７０、４７０−４８０、４８０−４９０、４９０−５００、５００−５１０、５１０−５２０、５２０−５３０、そして約５３５個までの、表６に示された遺伝子または転写産物から成るグループから選択される遺伝子のグループから成る。
【００３８】
態様の一つにおいては、遺伝子は、表５に示された遺伝子また転写産物から成るグループから選択される。
【００３９】
また別の態様においては、遺伝子は表７に示された遺伝子または転写産物から成るグループから選択される。
【００４０】
態様の一つにおいては、転写産物解析用遺伝子グループは、単独で、あるいはグループで、その発現の変化が肺疾患を予測する個々の遺伝子のグループ、そして以下の遺伝子から成るグループから選択される遺伝子転写産物である：
【００４１】
【化３】
2009529329.tif 000005
態様の一つにおいては、遺伝子グループは、少なくとも３６の遺伝子産物の全てに特異的にハイブリッド形成が可能な一組のプローブを含む。遺伝子産物は、オリゴヌクレオチドまたは修飾されたオロゴヌクレオチドのプローブによって認識されることができるｍＲＮＡ、あるいは、プローブが、例えばその蛋白質またはその抗原エピトープに特異的な抗体であっても良い蛋白質であっても良い。
【００４２】
さらにまた別の態様においては、本発明は、遺伝子グループの発現パターンが肺疾患の診断をもたらす遺伝子グループを提供する。該遺伝子グループは、以下のＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  番号によって同定される遺伝子からなるグループから選択される、少なくとも例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、好ましくは少なくとも３６、さらにより好ましくは４０、さらにより好ましくは４５、そしてさらにより好ましくは４６、４７、４８、４９の遺伝子、または５０遺伝子全てから成るグループである：
【００４３】
【化４】
2009529329.tif 000006
好ましい態様の一つにおいては個々の予測遺伝子と重複する３６のうち少なくとも２０の遺伝子および、例えば、重複しない５−９遺伝子を、そしてそれらの組み合わせを使っても良い。
【００４４】
また別の態様においては、本発明は約３０−１８０、好ましくは３６−１５０、さらにより好ましくは３６−１００、さらにより好ましくは３６−５０の、喫煙者において肺癌が診断できる発現プロファイルを示す遺伝子のグループを提供する。
【００４５】
態様の一つにおいては、本発明はその発現が、肺癌を罹患する被験体においては減少する遺伝子のグループを提供する。態様の一つにおいては、遺伝子のグループは、以下に示す遺伝子からなるグループから選択される、少なくとも５−１０、１０−１５、１５−２０、２０−２５の遺伝子を含む：
【００４６】
【化５】
2009529329.tif 000007
これらの遺伝子に一つ以上の他の遺伝子を解析混合物に加えても良い。
【００４７】
別の態様では、遺伝子グループは以下の遺伝子からなるグループから選択される遺伝子から成る：ＮＭ＿０１４１８２．１；  ＮＭ＿００１２８１．１；  ＮＭ＿０２４００６．１；  ＡＦ１３５４２１．１；  Ｌ７６２００．１；
【００４８】
【化６】
2009529329.tif 000008
また別の態様では、遺伝子グループは以下の遺伝子のグループから選択される遺伝子のグループから成る：
【００４９】
【化７】
2009529329.tif 000009
態様の一つにおいては、本発明は肺癌を罹患している被験体おいてその発現が増大する遺伝子のグループを提供する。ある態様では、遺伝子のグループは以下の遺伝子からなるグループから選択される遺伝子からなる：
【００５０】
【化８】
2009529329.tif 000010
ある態様では、遺伝子グループは以下の遺伝子のグループから選択される遺伝子からなる：
【００５１】
【化９】
2009529329.tif 000011
ある態様では、遺伝子グループは以下の遺伝子からなるグループから選択される遺伝子からなる：ＢＦ２１８８０４；  ＡＫ０２２４９４．１；  ＡＡ１１４８４３；  ＢＥ４６７９４１；  ＮＭ＿００３５４１．１；  Ｒ８３０００；
【００５２】
【化１０】
2009529329.tif 000012
さらに別の態様では、本発明は、大気汚染物質に曝露された被験体の肺、気道または口腔から採取された核酸サンプルを入手し、サンプル中の、本発明によって提供される一つ以上の遺伝子グループの遺伝子転写産物のレベルを解析し、サンプル中の遺伝子グループの発現パターンを、同様な大気汚染物質に曝露されながら肺癌や肺気腫のような肺疾患を持たない個人においての同じ遺伝子グループの発現パターンと比較することを含む肺疾患の診断方法であって、ここで発現のパターンの相違は被験体が肺疾患を発症しているか、あるいはその危険性が高いことを予測する方法を提供する。対照と比較して、一つ以上の遺伝子の、好ましくは表１−４に「減少」として記載されている遺伝子を含めた全ての遺伝子の発現の減少、そして／または同様な大気汚染物質に暴露されながら肺疾患を持たない個人に比較して、一つ以上の遺伝子の、好ましくは表１−４に「増加」と記載されている全ての遺伝子の発現の増加は、被験体が肺疾患というよりむしろ肺癌を発症しているか、近い将来に発症する危険性が高く、早期治療のために頻回の追跡検査をする必要があることを指摘する。
【００５３】
好ましい態様に一つにおいては、肺疾患は肺癌である。ある態様では、大気汚染物質はタバコまたはタバコの煙である。
【００５４】
あるいは、本診断は鼻腔上皮細胞においての本発明の遺伝子グループの発現パターンを解析することで、喫煙者群から肺癌のような肺疾患を発症する危険性の少ない個人を区別することができ、そのような個人を侵襲性で頻回の追跡検査から除外する方法を提供する。
【００５５】
従って、態様の一つでは、本発明は、喫煙者から採取された鼻腔上皮細胞サンプルを入手し、本発明の遺伝子グループの発現プロファイルを解析することを含む肺疾患の予後診断、診断および治療のデザインを提供するがここで、該遺伝子発現パターンが、健常な、年齢、人種、および性別がマッチした喫煙者のそれから相違することは肺疾患を発症する危険性の増加を指摘する。表１−４は、同様な大気汚染物質にさらされながら肺疾患をもたない個人を対照として比較した、発現パターンが、減少あるいは増加による相違を示す。
【００５６】
本発明はまた、非喫煙者から採取された鼻腔上皮細胞サンプルを入手し、本発明の遺伝子グループの発現プロファイルを解析することを含む予後診断、診断および治療のデザインのための方法を提供するがここで、該遺伝子グループの発現が正常な年齢、人種、性別のマッチした喫煙者のそれとは相違することは肺疾患を発症する危険性が増加することを指摘する。
【００５７】
態様の一つにおいては、本発明の解析は生物学的サンプル中の核酸、好ましくはＲＮＡ  を使って実施される。
【００５８】
態様の一つにおいては、該解析は、サンプル中の、本発明の遺伝子グループの遺伝子にコードされた蛋白質量の解析によって行われる。
【００５９】
態様の一つにおいては、該解析は本発明の遺伝子グループの遺伝子発現調節領域について、単一核酸多型またはＳＮＰのような核酸の多型を利用して、ＤＮＡの解析を行うことによって遂行されるが、ここで、増加あるいは減少する発現と関連づけられることがわかっている単一核酸多型を使って、被験体における増加あるいは減少した遺伝子発現を指摘する。例えば、これらの遺伝子の調節領域のメチル化のパターンを解析することができる。
【００６０】
態様の一つにおいては、本発明は、例えばアレイに基づく遺伝子発現プロファイリングによって、該遺伝子グループの発現プロファイルが解析できる、鼻腔上皮細胞ＲＮＡ  を得るのに侵襲性が最小限なサンプル調達方法を提供する。これらの方法は。肺癌のような肺疾患に既に冒されている被験体や、大気汚染物質に曝露された結果として、肺癌のような肺疾患を発症する危険性の高い被験体を診断するために使用できる。これらの方法はまた、例えば癌や肺気腫のような肺障害／疾患を診断できる遺伝子発現パターンをさらに発見し、肺疾患を発症する危険性のある被験体を見つけることにも使用できる。
【００６１】
本発明はさらに、本発明によって提供される遺伝子グループの一つ以上から成る、とりわけ肺疾患の診断や予測、あるいは肺疾患に対する個人の罹病性の決定を意図した遺伝子グループマイクロアレイを使って鼻腔上皮細胞を解析する方法を提供する。
【００６２】
態様の一つにおいては、本発明は、診断を受ける被験体から、核酸や蛋白質のサンプルを鼻腔上皮細胞から取得すること、および該サンプル中の同定された遺伝子グループの発現を測ることを含む肺疾患または肺障害の診断方法に関連し、被験体と同様なライフスタイルと環境にある健常者の同じ遺伝子の発現パターンに比較した、それらの遺伝子の発現の変化は、被験体が肺疾患に冒されていることを指摘する。
【００６３】
態様の一つにおいては、本発明は、診断を受ける被験体から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいはそれより多くの回数の間隔をおいて少なくとも２個の鼻腔上皮細胞サンプルを、サンプルは核酸あるいは蛋白質のサンプルであるが、採取すること、および該サンプル中の同定された遺伝子グループの発現を決定することを含む肺の疾患または障害を診断する方法に関連し、ある時間の経過後に採取されたサンプル中に、それよりも以前に採取されたサンプルに比較して、少なくとも例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、好ましくは少なくとも約３６、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、または１８０のそのような遺伝子の発現の変化は肺疾患のあることを指摘する。
【００６４】
態様の一つにおいては、肺の疾患は、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、原発性肺高血圧症、急性呼吸窮迫症候群、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、持続性真菌感染症、肺線維症、全身性硬化症、特発性肺血鉄素症、肺胞蛋白症、そして腺癌や扁平上皮癌、小細胞肺癌、大細胞肺癌のような肺癌、および肺の良性新生物（例えば、気管支線腫や肺過誤腫）からなるグループから選択される。
【００６５】
特定の態様においては、核酸サンプルはＲＮＡである。
【００６６】
態様の一つにおいては、診断を受ける被験体とは、タバコの煙に曝露された人、喫煙の経験のある人、または現在喫煙している人である。
【００６７】
本発明はまた、例えば、タバコの煙のような大気汚染物質に曝露され、肺疾患の発症や発症の危険性がある気道に、同様な大気汚染物質に曝露された人やそのような大気汚染物質に晒されていない気道に比較して、発現が異なる該遺伝子グループの遺伝子に特異的にハイブリッド形成する複数のオリゴヌクレオチドを固定化した肺疾患の診断用のマイクロアレイのようなアレイを使った鼻腔上皮細胞の解析を提供する。態様の一つにおいては、該オリゴヌクレオチドは肺疾患において発現パターンの異なる一つ以上の遺伝子の対立遺伝子の一つの型に特異的にハイブリッド形成する。特定の態様の一つにおいては、発現パターンの異なる該遺伝子は、表１−４に示された遺伝子のグループから、好ましくは表３の遺伝子のグループから選択される。好ましい態様の一つにおいては、該遺伝子グループは、表３から選択される少なくとも２０の遺伝子のグループと、さらに表１と２から選択される５−１０の追加の遺伝子を含む。好ましい態様の一つにおいては、少なくとも、１０の遺伝子が表４から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
（発明の詳細な説明）
本発明は肺疾患の診断、予後診断および追跡調査のための新規な方法について説明する。該方法は、本発明者らによって発見された肺における遺伝子発現の変化を密接に反映する鼻腔上皮細胞の遺伝子発現の変化を検出することに基づく。
【００６９】
具体的には、本発明者らは、二つのモデル系において、肺上皮細胞における変化に比較して、鼻腔上皮細胞において同様な遺伝子発現の変化がみられることを発見した。実験の一つにおいて、本発明者らは、喫煙に反応した宿主の遺伝子発現は、肺上皮細胞において測定しても、鼻腔上皮細胞において測定しても同様であることを示した（図３）。従って、本発明者らは、気管支上皮細胞で得られる結果とデータが信頼できることを発見した。この相関度は、たとえ同一ではなくとも、類似しており、典型的には７５％よりも高い。従って、気管支上皮細胞で診断そして／または予後診断に使える同じ遺伝子グループを調べることで、それらのグループはまた鼻腔上皮細胞での診断そして／または予後診断に使用できる。本発明者らはまた、類肉腫のような肺疾患に冒された被験体と、冒されていない被験体とを区別する遺伝子発現の変化を示した。
【００７０】
従って、本発明は、鼻腔上皮細胞から採取されたサンプルの遺伝子発現の解析を使って肺疾患の診断、予後診断および追跡調査のための、実質的により侵襲性の低い方法を提供する。
【００７１】
被験体から鼻腔上皮細胞をブラシや綿棒を使って採取できる。発明の分野での熟練者に知られているどの方法によっても鼻腔上皮細胞を採取できる。例えば、鼻腔のブラッシングを用いることができる。例えば、鼻甲介下そして／または隣接する鼻側壁のブラッシングをすることで鼻腔上皮細胞を採取できる。例えば、２％リドカイン溶液で麻酔後、ＣＹＴＯＢＲＵＳＨ（登録商標）（ＭｅｄＳｃａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、マルモ、スウェーデン）あるいは同様なデバイスを明視化のために鼻鏡を使いながら、外鼻孔、例えば右の外鼻孔、の鼻甲介の下に挿入する。上皮細胞を採取するために、ブラシを２回、例えば、１、２、３、４、５回、回転させる。
【００７２】
細胞サンプルから核酸を分離するには、細胞を直ちに核酸の分解を防ぐ溶液中に入れる。例えば、もし細胞がＣＹＴＯＢＲＵＳＨを使って採取されたなら、そしてＲＮＡ  の分離を希望するなら、該ブラシを直ちにＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）のようなＲＮＡの安定化溶液に入れる。
【００７３】
またＤＮＡ  を分離することも出来る。ブラッシングの後、該デバイスをＤＮＡ分離のためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝液に入れてもよい。
【００７４】
続いて、該核酸を遺伝子発現解析に供する。該核酸は分離精製されていることが好ましい。しかしながら、もしマイクロ流体デバイスのような技術を使うのであれば、そのようなデバイスに、精製しないで細胞全体を乗せてもよい。
【００７５】
好ましい態様の一つにおいては、遺伝子／転写産物のグループと、これらの遺伝子／転写産物のグループの発現プロファイルを肺疾患の診断と予後診断に用いる方法を使って、鼻腔上皮細胞の遺伝子発現を解析する。
【００７６】
本発明者らは、気管支サンプルの解析をするよりも、非常に侵襲性の少ない方法を提供する。ここに提供される該方法は、肺癌のような肺疾患の診断の精度を有意に高めるだけでなく、また解析の侵襲性を顕著に少なくし、従って、患者と医師にとって非常に実施しやすい方法である。本発明の遺伝子発現解析と気管支内視鏡を合わせると、肺癌の診断は、現時点で利用できるどの方法よりも早期の癌の検出ができ、他のどの方法よりも、はるかに少ない誤った陰性結果そして／または誤った陽性結果を提供することにより、際立って優れたものとなる。
【００７７】
態様の一つにおいては、遺伝子発現解析を使って、肺癌のような肺疾患のより強化された診断のために、個別に、そしてグループで、あるいは部分集合として使用できる遺伝子転写産物のグループについて鼻腔上皮細胞を解析する。
【００７８】
態様の一つにおいて、本発明は表８、９、そして／または１０に記載されるように、鼻腔上皮細胞サンプルを用いた肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供する。
【００７９】
態様の一つにおいては、表８に記載された遺伝子の少なくとも１、そして３６１以下の遺伝子を使って鼻腔上皮細胞を、解析しようとする。例えば、表８に記載される遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０−１５、１５−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくともまたは最大で１７０、少なくともまたは最大で１８０、少なくともまたは最大で１９０、少なくともまたは２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、あるいは少なくとも３６１または最大３６１遺伝子を解析してもよい。
【００８０】
態様の一つにおいては、本発明は遺伝子を提供する
本発明の診断／予後診断検査の検査に有益な遺伝子転写産物グループの一例を表６に記載する。本発明者らは、表６の遺伝子の少なくとも２０を含むどのグループをとっても偶然の機会よりもはるかに優れた診断能力を提供し、これらの変化は鼻腔上皮細胞において、ＰＣＴ／  ＵＳ２００６／０１４１３２に記載された気管支サンプルにおける変化と実質的に同じであることを発見した。
【００８１】
好ましくは、鼻腔上皮細胞を、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０等の、２０よりも多いこれらの遺伝子転写産物を、例えば、約２０−１００そしてその間の全ての組み合わせを使って解析しようとする。好ましいグループは、９６（表１）、８４（表２）、５０（表３）、３６（表４）、８０（表５）、５３５（表６）、そして２０（表７）からなるグループである。ある実例においては、本発明者らはこれらの特異的なグループのいづれかに追加の遺伝子を加えることにより、診断の精度を高め得ることを見つけた。
【００８２】
当然のことながら、本発明の教示に従って、表１−７に表示された遺伝子そして／または転写産物の一つ以上を多種癌のスクリーニングキットのためのキットまたはシステムに含めることもできる。例えば、表７に記載されたものから一つ以上のいずれかの遺伝子そしてまたは転写産物を加えて、遺伝子発現解析のための肺癌マーカーとしてもよい。
【００８３】
前記のグループが用いられる場合、該グループの該遺伝子は対照または対照群と比較される。対照群は、非喫煙者、喫煙者、あるいは元喫煙者であってもよい。好ましくは、被験体の鼻腔上皮細胞のサンプルにおける遺伝子転写産物または発現産物が、対照群に含まれる個人が肺気腫や肺癌のような肺疾患に冒されていないこと以外は類似したグループと比較される。例えば、喫煙者の鼻腔上皮細胞サンプルに対して肺癌を持たない喫煙者の対照群が比較される。対照に対して、前記の表に記載されるような特定の遺伝子によって、転写産物や発現産物の発現の増加あるいは減少を比較する−調べられる遺伝子の全てに増加や減少がみられるわけではない。しかしながら、少なくとも調べられる遺伝子の５０％が記載されたパターンを示す必要がある。もしその割合が１００％に達すれば、信頼性はより高まる。従って、態様の一つにおいては、調べられる遺伝子の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％が下記の表に記載したような、肺癌のような肺疾患を指摘する変化したパターンを示すことを期待する。
【００８４】
ここで記載される本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、肺癌に罹患しやすい被験体のスクリーニングにも使用できる。例えば、ある年齢を超えた、例えば４０歳を越えた、例えばある年数にかけて、喫煙したことのある喫煙者は肺癌のスクリーニングを受けたいと希望するかもしれない。本発明で説明される鼻腔上皮細胞の遺伝子発現解析は肺癌の非常に早期の正確な診断を提供できる。これは、癌の検出が早いほど生存率が高いことから、肺癌の診断に特に有益である。
【００８５】
例えば、本発明者らが遺伝子発現結果を解析した際、もし、より低ストリンジェントな閾値条件を適用すれば、表５に記載される８０遺伝子からなるグループは、１０００回の統計学的試験の全体にわたって最も頻回に選択された遺伝子に含まれることを見つけた（統計学的試験の詳細については実施例を参照）。任意のデータを使って、本発明者らは１０００回のうち６７回より多く、選択される任意の遺伝子はないことを発見した。そのような切捨て条件下で、本発明者らのデータでは表６の５３５遺伝子が１０００回のうち６７回よりも多く選択される。表５の８０遺伝子の全てが該５３５遺伝子の一部に含まれる。表７は上位２０遺伝子が該５３５遺伝子リストの部分をしめることを示す。発現の変化の方向については、信号対雑音比を使って示される。  表５、６、と７におけるマイナスの数はこの遺伝子または転写産物の発現が肺癌サンプルにおいて増加していることを意味する。表５、６、と７のプラスの数はこの遺伝子または転写産物の発現が肺癌において下降していることを意味する。
【００８６】
従って、表６の遺伝子そして／または転写産物の全ての組み合わせを使用することができる。態様の一つにおいては、表６に示す遺伝子または転写産物からなるグループから選択される少なくとも５−１０、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０、９０−１００、１００−１２０、１２０−１４０、１４０−１５０、１５０−１６０、１６０−１７０、１７０−１８０、１８０−１９０、１９０−２００、２００−２１０、２１０−２２０、２２０−２３０、２３０−２４０、２４０−２５０、２５０−２６０、２６０−２７０、２７０−２８０、２８０−２９０、２９０−３００、３００−３１０、３１０−３２０、３２０−３３０、３３０−３４０、３４０−３５０、３５０−３６０、３６０−３７０、３７０−３８０、３８０−３９０、３９０−４００、４００−４１０、４１０−４２０、４２０−４３０、４３０−４４０、４４０−４５０、４５０−４６０、４６０−４７０、４７０−４８０、４８０−４９０、４９０−５００、５００−５１０、５１０−５２０、５２０−５３０、のいずれの組み合わせも使用でき、そして約５３５までの遺伝子が使用できる。
【００８７】
表７は、癌を持たない被験体のサンプルに比較して、肺癌に最も頻回に変わりやすく発現される２０遺伝子を提供する。従って、態様の一つにおいては、表７の遺伝子そして／または転写産物の約３−５、５−１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０全部のすべての組み合わせ、あるいはそれらの次位組み合わせの全てが使用される。
【００８８】
態様の一つにおいては、本発明は遺伝子グループに肺疾患を診断するのに有益で、以下の９６遺伝子配列のの１から９６、そしてその間のすべての組み合わせ、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、少なくとも３６、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０まで、少なくとも８０まで、少なくとも９０まで、あるいは９６全て、にわたってハイブリッド形成するプローブを含む鼻腔上皮細胞の発現プロファイルを提供する：
【００８９】
【化１１】
2009529329.tif 000013
【００９０】
【化１２】
2009529329.tif 000014
態様の一つにおいては、本発明は、以下の８４遺伝子配列の少なくとも、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、少なくとも３６、少なくとも４０まで、少なくとも５０まで、少なくとも６０まで、少なくとも７０まで、少なくとも８０まで、あるいは８４全て、にわたってハイブリッド形成するプローブを含む鼻腔上皮細胞の発現プロファイルが肺疾患を診断するのに有益な遺伝子グループを提供する：
【００９１】
【化１３】
2009529329.tif 000015
態様の一つにおいては、本発明は、以下の５０遺伝子配列の少なくとも、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、好ましくは少なくとも３６さらにより好ましくは少なくとも４０まで、さにより好ましくは少なくとも４５、さらにより好ましくは５０全てにわたって、例えば２０、２１、２２、そして３６を含めて３６までのいずれかの、そして全てのメンバーを含むことが可能であるが、ハイブリッド形成するプローブを含む肺疾患を診断するのに有益な鼻腔上皮細胞の発現プロファイルを示す遺伝子グループを提供する：
【００９２】
【化１４】
2009529329.tif 000016
【００９３】
【化１５】
2009529329.tif 000017
そしてＡＦ１９８４４４．１。好ましい態様の一つにおいては、ｔ−検定を使った解析で同定された個々の予測遺伝子と重複する５０遺伝子の少なくとも２０−３０、３０−４０、および例えば、ｔ−検定解析を使って個々の予測遺伝子と同定された重複しない遺伝子の５−９およびそれらの組み合わせを使うことができる。
【００９４】
態様の一つにおいては、本発明は、、以下の３６遺伝子配列の少なくとも例えば５、１０、１５、２０、好ましくは少なくともは約２５、さらにより好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは３６全てにわたってハイブリッド形成するプローブを含む、肺疾患を診断するのに有益な鼻腔上皮細胞の発現プロファイルを示す遺伝子グループを提供する：
【００９５】
【化１６】
2009529329.tif 000018
そしてＡＦ１９８４４４．１。好ましい態様の一つにおいては、個々の予測遺伝子と重複する３６遺伝子の少なくとも２０と、重複しない５−９遺伝子、そしてそれらの組み合わせを使うことが出来る。
【００９６】
個々のサンプルにおける遺伝子グループの発現は、前記グループの遺伝子メンバーによってコードされる核酸配列または蛋白質産物配列に特異的なプローブのいずれをつかっても解析が可能である。例えば、態様のひとつにおいては、本発明の方法において有用なプローブセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  社のＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３の遺伝子チップに含まれ、プローブＩＤ番号が以下のように同定された核酸プローブの１０−１５、１５−２０、２０−１８０、好ましくは３０−１８０、さらにより好ましくは３６−９６、さらにより好ましくは３６−８４、さらにより好ましくは３６−５０から選択される：
【００９７】
【化１７】
2009529329.tif 000019
【００９８】
【化１８】
2009529329.tif 000020
個々の予測遺伝子と重複する１８０遺伝子の少なくとも、例えば１０−２０、２０−３０、３０−４０  、４０−５０、５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０、９０−１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０．または１７０と、重複しない５−９遺伝子そしてそれらの組み合わせを使うことが出来る。
【００９９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプローブの配列はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  社から入手できる。関心のある遺伝子を認識するその他のプローブや配列は、例えば、合成オリゴヌクレオチドや組み換えオリゴヌクレオチドを使って簡単に調製できる。これらの配列は、そのＨＵＧＯ  ＩＤ、ＧｅｎＢａｎｋ  識別番号、あるいはＵｎｉｇｅｎｅ  識別番号によって指摘される遺伝子について公表されている配列情報に基づいて該遺伝子のいずれかの、好ましくはユニークな配列部分から選択することが出来る。
【０１００】
どの肺疾患についても、該発現データを解析して、それに関連する発現パターンを同定することができる。例えば、タバコの煙、アスベストあるいは他のすべての汚染物質のような大気汚染物質への曝露により惹き起こされる疾患を解析することができる。例えば、該解析は次のような実施することができる。まず、試験グループサンプルにハイブリッド形成されたプローブを有する遺伝子チップまたはビーズをスキャンする。例えば、肺疾患のない被験体と肺疾患のある被験体の間で発現パターンの相違する遺伝子グループを見つけるには、非喫煙者と喫煙者、アスベストに曝露されていない被験体とアスベストに曝露された被験体、スモッグに曝露されていない被験体とスモッグに曝露された被験体、肺疾患のない喫煙者と肺疾患のある喫煙者からのサンプルを使う。当然、可変事項として単一の大気汚染物質が選択される適切なグループを選ぶ必要がある。そこで、例えば、アスベストに曝露されたがスモッグには曝露されていない非喫煙者とアスベストにもスモッグにも曝露されていない非喫煙者を比較できる。
【０１０１】
マイクロアレイやマイクロビーズによる未処理のデータから得られる発現解析はシグナルの強度と検出のためのｐ−値からなる。データを標準化あるいは一定の基準を決めて測り、良質でないチップ／ビーズのセットを発現データのイメージ、対象プローブ、そしてヒストグラムに基づいて、除外する。また非上皮細胞の混在する試料をふりわけ除外する。最後に、検出ｐ−値を使って、関心のある遺伝子をふりわける。これによって、正常な気道に存在する転写産物（正常な気道のトランスクリプトーム）の同定がなされる。変数重回帰分析を使うことができる。これによって、気道上皮細胞の転写における喫煙の影響も同定される。この分析にはＴ−検定とピアソン相関解析が利用できる。また、肺癌のような肺疾患のあるサンプルと癌のないサンプルとの間で発現が異なる転写産物のグループまたは組を同定することができる。この解析はクラス予測モデルを使っておこなわれる。
【０１０２】
該データの解析には、例えば加重多数決法を使うことができる。加重多数決法は二クラス間の遺伝子発現の信号対雑音比によって、全ての遺伝子をランク付けし、「Ｐ」    の加重を与える：Ｐ＝平均（クラス１）−平均（クラス２）／標準偏差（クラス１）＝標準偏差（クラス２）。上位にランクされた多様なサイズの遺伝子メンバーを試験サンプルの評価に用いるが、ｐ−値により意味のある遺伝子は、より大きな加重を課せられる。試験サンプル中の各メンバー遺伝子は、その遺伝子発現がクラス１の平均またはクラス２の平均にどれだけ近いかに基づいていずれかのクラスに投票する。Ｖ（遺伝子Ａ）＝Ｐ（遺伝子Ａ）すなわち、試験サンプル中の発現レベルは２クラスの平均発現レベルよりも小さい。  各クラスへの投票を集計し、勝ったクラスが予測強度をＰＳ＝Ｖ勝ち−Ｖ負け／Ｖ勝ち＋Ｖ負けとして決定される。最後に、精度が交差検定＋／−独立サンプルによって検証される。。
【０１０３】
表１は、癌のある喫煙者と癌のない喫煙者を区別するグループとして同定された９６遺伝子を示す。発現の違いは右側のカラムに、その特定の転写産物が癌のない喫煙者に比べて、癌のある喫煙者において低いことを意味する“下降”と、その特定の転写産物の発現が癌のない喫煙者に比べて、癌のある喫煙者において高いことを意味する“上昇”のいづれかで示される。態様のひとつにおいては、“人ゲノムＵ１３３  チップにおいてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＩＤ番号”とされるカラムに示された典型的なプローブの使用が可能である。
【０１０４】
【化１９】
2009529329.tif 000021
【０１０５】
【化２０】
2009529329.tif 000022
【０１０６】
【化２１】
2009529329.tif 000023
【０１０７】
【化２２】
2009529329.tif 000024
【０１０８】
【化２３】
2009529329.tif 000025
【０１０９】
【化２４】
2009529329.tif 000026
表２は、癌のない喫煙者から癌のある喫煙者を区別するグループと同定された好ましい８４遺伝子のグループを示す。発現の相違については、右側のカラムに、その特定の転写産物の発現が、癌のない喫煙者に比較して、癌のある喫煙者においてより低いことを意味する“下降”と、その特定の遺伝子の転写産物の発現が癌のない喫煙者に比較して、癌のある喫煙者においてより高いことを意味する“上昇”で示した。これらの遺伝子は従来のスチューデントｔ−検定によって同定された。
【０１１０】
態様のひとつにおいては、発現解析に、“人のゲノムＵ１３３チップにおけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ”のカラムに示された具体例としてのプローブが使用できる。
【０１１１】
【化２５】
2009529329.tif 000027
【０１１２】
【化２６】
2009529329.tif 000028
【０１１３】
【化２７】
2009529329.tif 000029
【０１１４】
【化２８】
2009529329.tif 000030
表３は癌のない喫煙者から癌のある喫煙者を区別するグループとして同定された５０遺伝子の好ましいグループのひとつを示す。発現の相違については、右側のカラムに、癌のない喫煙者に比べて癌のある喫煙者においてその特定の転写産物の発現がより低いことを意味する“下降”か、癌のない喫煙者に比べてその特定の転写産物が癌のある喫煙者においてより高いことを意味する“上昇”によって表示される。
【０１１５】
この遺伝子グループはＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した加重多数決アルゴリズムを含むＧｅｎｅＰａｔｔｅｍサーバーを使って同定された。デフォールトの設定、すなわち信号対雑音比および遺伝子のふるいわけなし、が用いられた。
【０１１６】
態様のひとつにおいては、“人のゲノムＵ１３３チップにおいてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ”のカラムに示された具体例としてのプローブを、該発現解析に使うことができる。
【０１１７】
【化２９】
2009529329.tif 000031
【０１１８】
【化３０】
2009529329.tif 000032
表４は癌のない喫煙者から癌のある喫煙者を区別するグループとして同定された好ましい３６遺伝子のグループのひとつである。発現の相違については、右側のカラムに、癌のない喫煙者に比べて癌のある喫煙者においてその特定の転写産物の発現がより低いことを意味する“下降”か、癌のない喫煙者に比べてその特定の転写産物が癌のある喫煙者においてより高いことを意味する“上昇”によって表示される。
【０１１９】
態様のひとつにおいては、「人のゲノムＵ１３３チップにおいてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＩＤ」のカラムに示される具体例としてのプローブを発現解析に使ってもよい。
【０１２０】
【化３１】
2009529329.tif 000033
【０１２１】
【化３２】
2009529329.tif 000034
態様のひとつにおいては、本発明の遺伝子グループは表１−４に記載された遺伝子の少なくとも、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、より好ましくはすくなくとも３６、さらにより好ましくは少なくとも約４０、さらにより好ましくは少なくとも約５０、さらにより好ましくは少なくとも約６０、さらにより好ましくは少なくとも約７０、さらにより好ましくは少なくとも約８０、さらにより好ましくは少なくとも約８６、さらにより好ましくは約９０、さらにより好ましくは少なくとも約９６の遺伝子を含む。
【０１２２】
好ましい態様の一つにおいては、遺伝子グループは表１−４に記載された遺伝子からなるグループから選択された３６−１８０遺伝子を含む。
【０１２３】
態様の一つにおいては、本発明は、癌のある被験体においてその発現がより低い遺伝子のグループを提供する。
【０１２４】
従って、態様の一つにおいては、本発明は肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供し、該遺伝子グループの発現は、大気汚染物質に曝露され癌の発症がある被験体において、同じ大気汚染物質に曝露されて癌の発症がない被験体に比較して低く、該グループは以下の転写産物（転写産物はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  またはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ番号を使って同定でき、対応する遺伝子名は表１に記載されている）の少なくとも５、好ましくは少なくとも約５−１０、さらにより好ましくは少なくとも約１０−２０、さらにより好ましくは少なくとも約２０−３０、さらにより好ましくは少なくとも約３０−４０、さらにより好ましくは少なくとも約４０−５０、さらにより好ましくは少なくとも約５０−６０、さらにより好ましくは少なくとも約６０−７０、さらにより好ましくは約７２遺伝子にハイブリッド形成するプローブを含むグループである：
【０１２５】
【化３３】
2009529329.tif 000035
【０１２６】
【化３４】
2009529329.tif 000036
また別の態様においては、本発明は肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供し、該遺伝子グループの発現は、大気汚染物質に曝露され癌の発症がある被験体において、同じ大気汚染物質に曝露されて癌の発症がない被験体に比較して低く、該グループは以下の転写産物（転写産物はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  またはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ番号を使って同定でき、対応する遺伝子名は表２に記載されている）の少なくとも５、好ましくは少なくとも約５−１０、さらにより好ましくは少なくとも約１０−２０、さらにより好ましくは少なくとも約２０−３０、さらにより好ましくは少なくとも約３０−４０、さらにより好ましくは少なくとも約４０−５０、さらにより好ましくは少なくとも約５０−６０、さらにより好ましくは約６３遺伝子にハイブリッド形成するプローブを含むグループである：
【０１２７】
【化３５】
2009529329.tif 000037
また別の態様においては、本発明は肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供し、該遺伝子グループの発現は、大気汚染物質に曝露され癌の発症がある被験体において、同じ大気汚染物質に曝露されて癌の発症がない被験体に比較して低く、該グループは以下の転写産物（転写産物はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  またはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ番号を使って同定でき、対応する遺伝子名は表３に記載されている）の少なくとも５、好ましくは少なくとも約５−１０、さらにより好ましくは少なくとも約１０−２０、さらにより好ましくは少なくとも約２０−２５、さらにより好ましくは約２５遺伝子にハイブリッド形成するプローブを含むグループである：
【０１２８】
【化３６】
2009529329.tif 000038
また別の態様においては、本発明は肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供し、該遺伝子グループの発現は、大気汚染物質に曝露され癌の発症がある被験体において、同じ大気汚染物質に曝露されて癌の発症がない被験体に比較して高く、該グループは以下の転写産物（転写産物はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  またはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ番号を使って同定でき、対応する遺伝子名は表１に記載されている）の少なくとも５、好ましくは少なくとも約５−１０、さらにより好ましくは少なくとも約１０−２０、さらにより好ましくは少なくとも約２０−２５、さらにより好ましくは約２５遺伝子にハイブリッド形成するプローブを含むグループである：
【０１２９】
【化３７】
2009529329.tif 000039
また別の態様においては、本発明は肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供し、該遺伝子グループの発現は、大気汚染物質に曝露され癌の発症がある被験体において、同じ大気汚染物質に曝露されて癌の発症がない被験体に比較して高く、該グループは以下の転写産物（転写産物はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  またはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ番号を使って同定でき、対応する遺伝子名は表２に記載されている）の少なくとも５、好ましくは少なくとも約５−１０、さらにより好ましくは少なくとも約１０−２０、さらにより好ましくは少なくとも約２０−２３、さらにより好ましくは約２３遺伝子にハイブリッド形成するプローブを含むグループである：
【０１３０】
【化３８】
2009529329.tif 000040
そしてＢＣ０２８９１２．１。
【０１３１】
また別の態様においては、本発明は肺疾患の診断に有用な遺伝子のグループを提供し、該遺伝子グループの発現は、大気汚染物質に曝露され癌の発症がある被験体において、同じ大気汚染物質に曝露されて癌の発症がない被験体に比較して高く、該グループは以下の転写産物（転写産物はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  またはＵｎｉｇｅｎｅ  ＩＤ番号を使って同定でき、対応する遺伝子名は表３に記載されている）の少なくとも５、好ましくは少なくとも約５−１０、さらにより好ましくは少なくとも約１０−２０、さらにより好ましくは少なくとも約２０−２５、さらにより好ましくは約２５遺伝子にハイブリッド形成するプローブを含むグループである：
【０１３２】
【化３９】
2009529329.tif 000041
態様の一つにおいては、本発明は、肺疾患に罹っているか、または肺疾患に罹る高い危険性が疑いのある個人（すなわち被験体）における遺伝子グループの発現プロファイルを測定する工程と、該発現プロファイルを被験体と同様な大気汚染物質に曝露されながら肺疾患のない個人（すなわち対照被験体）の発現プロファイル（すなわち対照プロファイル）に比較する工程を有する肺疾患を診断する方法で、上記被験体および対照被験体間の遺伝子発現の相違が少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも３６、さらにより好ましくは３６−１８０の間、さらにより好ましくは３６−９６の間、さらにより好ましくは３６−８４の間、されにより好ましくは３６−５０の間の遺伝子にあれば被験体が肺疾患に罹患していることが指摘される。表４に示される約３６の遺伝子、表３に示される約５０の遺伝子、表２に示される約８４の遺伝子、表１に示される約９６の遺伝子からなるグループが好ましい。異なる遺伝子グループはまた組み合わせてもよく、そうすることによって被験体を、表１−４に示される全ての、３つの、２つのまたはただ１つの遺伝子グループについてスクリーニングすることが出来る。
【０１３３】
例えば、タバコの煙に曝露された被験体の遺伝子プロファイルが表３に示される５０遺伝子の発現プロファイルについて表３に記載される遺伝子チップ上に設定されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプローブを使って比較される場合、該発現プロファイルが図１０に示す癌患者のそれと類似すれば、被験体が癌を罹患していることを指摘する。あるいは、該発現プロファイルが、図１０に示される癌のない個人のそれに類似すれば被験体に癌がないであろうことを指摘する。
【０１３４】
加重多数決アルゴリズムを含むＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  のＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎサーバーを使って５０遺伝子のグループが同定された。デフォールトの設定、すなわち信号対雑音比、および遺伝子をふるいわけしないという設定が使用された。ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎはウェブサイトのｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎｅｐａｔｔｅｒｎからアクセスできる。このプログラムは、個々の遺伝子についてよりも遺伝子のグループとしてのデータ分析を可能にする。従って、好ましい態様の一つにおいては、表３の５０遺伝子の実質的に全てが同時に解析される。以下の遺伝子から成るグループから選択された遺伝子の正常な発現よりも低い発現プロファイルを得た場合：ＢＦ２１８８０４；  ＡＫ０２２４９４．１；  ＡＡ１１４８４３；  ＢＥ４６７９４１；  ＮＭ＿００３５４１．１；  Ｒ８３０００；
【０１３５】
【化４０−１】
2009529329.tif 000042
および以下の遺伝子から成るグループから選択された遺伝子の発現プロファイルが正常な発現プロファイルよりも高い場合には：
【０１３６】
【化４０−２】
2009529329.tif 000043
該被験体が肺癌のような肺疾患に罹患しているか発症する危険性が高いことを指摘する。好ましい態様の一つにおいては表３の全ての遺伝子の発現パターンが解析される。態様の一つにおいては、表３の予測遺伝子の他に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０−１５、１５−２０、２０−３０またはそれよりも多くのｔ−検定によって同定された個々の予測遺伝子が解析される。例えば、予測遺伝子グループの５−１０またはそれ以上の遺伝子と、５−１０またはそれ以上の個々の遺伝子のどんな組み合わせを使っても良い。
【０１３７】
本発明の“発現プロファイル”という用語はサンプル中の解析された個々の遺伝子のそれぞれの遺伝子産物の量を意味する。該“発現プロファイル”は図１０において個々に対してＹ軸上に示されるように、個人に特有の発現マップを意味する
本発明の  “肺疾患”  という用語は、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、原発性肺高血圧症、および呼吸窮迫症候群を含むがこれらに限定されない疾患を意味する。本発明において、説明される方法はまた過敏性肺実質炎、好酸球性肺炎、持続性真菌感染症、肺線維症、全身性硬化症、特発性肺血鉄素症、肺胞蛋白症のような免疫系の関与する肺疾患、腺癌、扁平上皮癌、小細胞あるいは大細胞癌のような肺癌、そして気管支腺腫や過誤腫を含む肺の良性新生物を含む肺疾患の診断また治療に使用されても良い。好ましい態様の一つにおいて、前記肺疾患は肺癌である。
【０１３８】
本発明の“大気汚染物質”という用語は、タバコの煙、葉巻の煙、スモッグ、アスベスト、そしてその他の肺疾患との関連が疑われるかまたは実証された大気汚染物質のような大気汚染物質または環境による気道のストレス誘導因子を意味する。
【０１３９】
本発明の  “被験体”という用語は、好ましくは人を意味する。しかしながら、該方法は人に限定されず、その分野の熟練者は本発明の診断／予後診断のための遺伝子のグループを例えば、実験動物、好ましくはサル、マウスやラットを含むがそれらに限定されないネズミ、犬、羊、豚、モルモット、そして他のモデル動物のような有肺動物、に使用しても良い。そのような実験は、例えば、肺疾患を治療または予防する目的の薬物の前臨床動物試験において実施されてもよい。
【０１４０】
本発明の“変化した発現”という表現は、癌のある、喫煙者のように大気汚染物質に曝露された被験体において、同じような大気汚染物質に曝露されながら癌のない被験体から得られた肺細胞の発現パターンに比較して、増加あるいは減少した発現を意味する。表１と２は、本発明の好ましい、発現パターンの変化を示す。表中の“上昇”および“下降”は癌のある喫煙者においての発現量の、癌のない喫煙者の発現量との比較を意味する。同様な発現パターンの変化は、おそらく他の大気汚染物質に曝露された被験体における発癌に関連する可能性がある。。
【０１４１】
態様の一つにおいては、その発現が肺癌の診断そして／または予後診断のために解析される遺伝子のグループが表５に記載される８０遺伝子のグループから選択される。該８０遺伝子から遺伝子のどんな組み合わせを選択してもよい。態様の一つにおいては、表７に示される２０遺伝子の組み合わせが選択される。ある態様においては、表６の遺伝子の組み合わせが選択される。
【０１４２】
【化４１】
2009529329.tif 000044
【０１４３】
【化４２】
2009529329.tif 000045
【０１４４】
【化４３】
2009529329.tif 000046
【０１４５】
【化４４】
2009529329.tif 000047
【０１４６】
【化４５】
2009529329.tif 000048
【０１４７】
【化４６】
2009529329.tif 000049
【０１４８】
【化４７】
2009529329.tif 000050
【０１４９】
【化４８】
2009529329.tif 000051
【０１５０】
【化４９】
2009529329.tif 000052
【０１５１】
【化５０】
2009529329.tif 000053
【０１５２】
【化５１】
2009529329.tif 000054
【０１５３】
【化５２】
2009529329.tif 000055
【０１５４】
【化５３】
2009529329.tif 000056
【０１５５】
【化５４】
2009529329.tif 000057
【０１５６】
【化５５】
2009529329.tif 000058
【０１５７】
【化５６】
2009529329.tif 000059
【０１５８】
【化５７】
2009529329.tif 000060
【０１５９】
【化５８】
2009529329.tif 000061
【０１６０】
【化５９】
2009529329.tif 000062
【０１６１】
【化６０】
2009529329.tif 000063
＊  １０００回の試験的測定において、癌サンプルの発現に相違があると指摘された測定回数。
【０１６２】
＊＊  負の数値は肺癌において発現が増大することを意味し、正の数値は肺癌において発現が減少することを意味する。
【０１６３】
上記の表を、転写産物の発現、および遺伝子産物すなわち蛋白質の発現との比較あるいは相関をみるために使用してもよい。該表において示されるように、転写産物の発現増加は遺伝子産物の発現増加に一致する。同様に、表に示されるように、転写産物の発現減少は遺伝子産物の発現減少に一致する。
【０１６４】
好ましい態様の一つにおいては、表８、９、そして／または１０に記載された遺伝子のうちの好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、あるいはそれ以上の遺伝子を使用してもよい。態様の一つにおいては、表  ８−１０に記載された遺伝子のうちの少なくとも５、６、７，  ８、９、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７０、１−７０の遺伝子を含む最大数５００、４００、３００、２００、１００、または５０の遺伝子を使用してもよい。
【０１６５】
【表８−１】
2009529329.tif 000064
【０１６６】
【表８−２】
2009529329.tif 000065
【０１６７】
【表８−３】
2009529329.tif 000066
【０１６８】
【表８−４】
2009529329.tif 000067
【０１６９】
【表８−５】
2009529329.tif 000068
【０１７０】
【表８−６】
2009529329.tif 000069
【０１７１】
【表８−７】
2009529329.tif 000070
【０１７２】
【表８−８】
2009529329.tif 000071
【０１７３】
【表８−９】
2009529329.tif 000072
【０１７４】
【表８−１０】
2009529329.tif 000073
【０１７５】
【表８−１１】
2009529329.tif 000074
【０１７６】
【表８−１２】
2009529329.tif 000075
【０１７７】
【表９−１】
2009529329.tif 000076
【０１７８】
【表９−２】
2009529329.tif 000077
【０１７９】
【表９−３】
2009529329.tif 000078
【０１８０】
【表９−４】
2009529329.tif 000079
【０１８１】
【表９−５】
2009529329.tif 000080
【０１８２】
【表１０−１】
2009529329.tif 000081
【０１８３】
【表１０−２】
2009529329.tif 000082
【０１８４】
【表１０−３】
2009529329.tif 000083
さらに、表９に記載された遺伝子のいずれかを、あるいはいずれかの組み合わせを使ってもよい。
【０１８５】
本発明の遺伝子グループまたはサブグループの一つ以上の遺伝子そして／または転写産物の発現の解析は、その分野の熟練者に知られているどの遺伝子発現法を使って行っても良い。そのような方法には、核酸チップ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  チップ）や、例えば、転写産物のリアルタイム検出を使った定量的なＲＴ−ＰＣＲ法などが含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明による転写産物のレベルの解析は、手始めの材料としては、本発明の診断用の遺伝子グループにおいて同定される遺伝子の全ＲＮＡ  または、メッセンジャーＲＮＡ、あるいは該当する遺伝子にコードされる蛋白質を測ることで、実施できる。好ましい態様においては、該分析は、表１−７に示される遺伝子そして／または転写産物によってコードされる蛋白質の少なくとも約１０−２０、２０−３０、好ましくは、少なくとも３６、少なくとも約３６−５０、５０、約５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０、９６、１００−１８０、１８０−２００、２００−２５０、２５０−３００、３００−３５０、３５０−４００、４００−４５０、４５０−５００、５００−５３５を含む蛋白質に対する抗体を使った免疫組織化学的分析である。
【０１８６】
被験体における該遺伝子グループの転写産物の解析法には、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクション法、そして逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）に基づく方法が含まれる。非常に感度が高く、そのために、診断検査には望ましい、少量のサンプルしか必要としないので、種々のＲＴ−ＰＣＲに基づく方法が本発明の診断を目的とする最適な定量法である。多数の定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法が報告され、それらは本発明による転写産物の定量には有益である。これらの方法には、ＰＣＲと相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）アレイを使ったＲＮＡ定量法（Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６  （７）  ：  ６３９−４５  １９９６；Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（８）：１４３５−４２，  １９９６）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機にもとづく方法を使ったリアルコンペティティブＰＣＲ法  （Ｄｉｎｇら、ＰＮＡＳ  １００：３０５９−６４，  ２００３）、プライマー伸長反応に基づく固相ミニ配列決定法（米国特許第６，０１３，４３１号公報、Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊｕｎ；１５  （２）：１２３−３１  ２０００）、イオンペア高性能液体クロマトグラフィー（Ｄｏｒｉｓら、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  Ｍａｙ  ８、８０６  （１）：４７−６０，  １９９８）そして５’ヌクレアーゼアッセイ法またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０，  １９９１）が含まれる。
【０１８７】
ＲＴ−ＰＣＲと、望ましい標的とする配列をさけたエンドヌクレアーゼ制限酵素切断部位と長さの異なる内部標準とを使って、標的核酸と内部標準をゲル電気泳動によって分離し、標的核酸をデンシトメーターを用いて定量する方法も開発され、本発明による転写産物の検出に使用できる（例えば、米国特許第５，  ８７６，９７８、５，  ６４３，７６５、および５，  ６３９，６０６号公報を参照）。
【０１８８】
該サンプルは、例えば、気管支ファイバースコピーと連結させた内視鏡細胞ブラシを使って気管支道から採取されるのが好ましい。態様の一つにおいては、例えば、擦り取った頬側粘膜のような被験体の口腔内から得られる頬側の細胞を用いる。
【０１８９】
好ましい態様の一つにおいては、本発明は肺疾患を発症する危険性の検定のための、ディップスティック細胞診のような予後診断そして／または診断のための免疫組織化学的検索方法を提供する。本発明の遺伝子グループによってコードされた蛋白質やその抗原エピトープに対する抗体は、市販品を用いたり、その分野の熟練者にはよく知られた方法を使って調製することができる。
【０１９０】
本発明は、全ての、診断に重要な遺伝子産物を検出できる一回のディップスティック細胞採取、または本発明の診断用の蛋白質のより少数のサブグループを検出できる一連のディップスティック細胞採取を意図する。
【０１９１】
抗体は技術分野では旧知の方法によって調製が可能である。“抗体”という用語には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体や、希望する抗原と選択的に反応する組み換え型核酸技術によって調製された抗体が含まれる。本発明の診断用遺伝子グループのいずれかの遺伝子によってコードされた蛋白質に対する抗体は、技術分野に知られる方法で、容易に作成できる。Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ．ｃｏｍのａｂｍａｔｒｉｘのようなサイトを通して、技術分野の熟練者に、Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅは、本発明により提供される全ての蛋白質に対する既存の抗体の入手先を知るための有用な手段をもたらす。
【０１９２】
本発明による診断用の蛋白質に対する抗体は、診断のための気道プロテオームの蛋白質発現量の定量のためのウェスターンブロット法や免疫組織化学的手法のような標準的技術に用いることが出来る。これは遺伝子転写産物の発現量の定量と一致し、すなわち、転写産物発現の増加は、遺伝子産物、すなわち蛋白質の発現の増加に一致する。同様に、転写産物の発現の減少は遺伝子産物または蛋白質の発現の減少に一致する。肺疾患、特に肺癌、における抜擢された転写産物発現の増加あるいは減少についての詳細は本発明の表に記載されている。例えば、表５と６は肺癌において発現が変化する遺伝子のグループが記載されている。
【０１９３】
免疫組織化学的な適用法には例えば、唾液や痰のサンプルから蛋白質の増加が検定できるアッセイが含まれる。
【０１９４】
本発明による免疫組織化学的アッセイは、固体の支持相を使った方法によっても遂行できる。固体の支持相は、ディップスティック、膜、吸着パッド、ビーズ、マイクロタイターウェル、試験管等を含む免疫アッセイに用いられるどんな固相であってもよい。好ましくは、そのための訓練を全く受けていない、あるいは最小限にしか受けていない被験体または患者によって簡便に使用可能な検査用デバイスがよい。そのような好ましい検査用デバイスには、米国特許第４，６３２，９０１号公報に記載されるようなディップスティック、膜アッセイ系が含まれる。そのような従来の検査系の調製と使用は、特許、医学的、および科学的文献に十分に記載がある。もしも、スティックを使用する場合、抗蛋白質抗体は、先端の抗体が蛋白質の検出のために下記に記載されるように、検査溶液に浸せるように、スティックの一端に結合されている。あるいは、該サンプルをピペットまたは点滴器具によって抗体でコートされたディップスティックや膜上に滴下してもよい。
【０１９５】
該診断用気道のトランクリプトームによってコードされる蛋白質（該“蛋白質”）に対する該抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのようなどんなアイソタイプでもよく、またＦａｂ分画等でもよい。該抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、例えば、参照により本発明に組み込まれたＨａｒｌｏｗ  とＬａｎｅ  によるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（抗体）、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （実験室操作の手引き）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８にみられるように、一般的に記載された方法によって作成しても良い。該抗体は、直接的あるいは間接的な方法で固体の支持相に結合させることができる。間接的な結合は、抗体の蛋白質結合部位自体が支持体への結合に関与していないので、そのアッセイ溶液への露出を最大限とすることができる。ポリクローナル抗体は該蛋白質の種々のエピトープを識別でき、アッセイの感度を高められるのでポリクローナル抗体を使うことが好ましい。
【０１９６】
固体の支持相は、抗体を支持体に結合させた後に非特異的なブロック操作を行うことが好ましい。抗体部位の周囲の非特異的なブロック操作には、牛の全血清アルブミンまたは誘導体化された牛の血清アルブミン、あるいは他の動物のアルブミン、動物全血清、カゼイン、脱脂ミルク等を使うことができる。
【０１９７】
サンプルは、該蛋白質が前記の抗体を解して支持体に結合できるように、その蛋白質に特異的な抗体を結合させた固体の支持相に適用する。サンプル中の過剰な、結合しなかった成分は除去し、抗体‐抗原複合体が支持体に保持されるように、支持体を洗浄することが好ましい。支持体は、Ｔｗｅｅｎ−２０やＴｗｅｅｎ−８０のような界面活性剤、あるいはドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄液で洗うことができる。
【０１９８】
該蛋白質を支持相に結合させた後に、蛋白質と反応する二次抗体を適用する。二次抗体は、好ましくは視覚的標識で、標識することができる。標識は可溶性でも微粒子でもよく、染色された免疫グロブリン結合物質、単純な染色剤、または染色剤ポリマー、染色されたラテックスビーズ、染色剤を含んだリポゾーム、染色された細胞または有機体、あるいは金属性、有機性、無機性物質または固体の染色剤を含むことができる。標識は、技術分野でよく知られた多様な方法によって抗体蛋白質に結合させることができる。本発明のある態様においては、標識はシグナル発生系に結合させた酵素であってもよい。視覚的標識の例には、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、やビオチンが含まれる。多くの酵素−クロモゲン、または酵素−基質−クロモゲンの組み合わせが知られていて、酵素結合アッセイに使用される。染色剤標識にはまた、放射性標識や蛍光染色剤も含まれる。
【０１９９】
サンプルと同時に、既知量の該蛋白質についても同じステップの操作を加えることができ、そのようなステップはアッセイの標準として使用できる。タバコの煙のような、同様な大気汚染物質に曝露された健常人からのサンプルは、診断用の遺伝子グループによってコードされるいずれかの、あるいは全ての該蛋白質についての標準として使用することができる。
【０２００】
固体の支持体は、未結合の標識抗体を除去するために、再び洗浄され、標識抗体は視覚化され定量される。標識の蓄積は一般的に、視覚的な検定が可能である。この視覚的検出は、用いる標識によって例えば、赤色、黄色、茶色、または緑色のような種々の色による検出を可能にする。蓄積される標識はまた、反射光光度計やビデオ画像分析機のような光学的検出機器によっても検出可能である。蓄積された標識の可視分光強度は、サンプル中の蛋白質濃度に相関する。蓄積された標識の可視分光強度と蛋白質量の相関は、一連の基準となる標準物質についての可視分光高度との比較によって達成できる。標準物質は未知サンプルと同じようにアッセイすることが好ましく、また同じ支持体あるいは別の支持体上において、サンプルと同時にアッセイすることがさらに好ましい。
【０２０１】
使用する標準物質の濃度は蛋白質約１ｍｇ／Ｌから蛋白質約５０ｍｇ／Ｌの範囲とする。好ましくは、発色強度の比較による未知量の定量がより正確になるように、気道の遺伝子グループにコードされた蛋白質の２種類以上の濃度を使用する。
【０２０２】
例えば、本発明は、タバコの煙に曝露された被験体における肺癌発症の危険性を検出するための、被験体の生物学的サンプル中における本発明の一つ以上の遺伝子グループにコードされる蛋白質を含む鼻腔上皮細胞サンプルの転写プロファイルを測定することを含む方法を提供する。好ましくは、被験体の生物学的サンプル中の、少なくとも約３０、さらにより好ましくは少なくとも約、３６、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、あるいは約１８０の、気道のトランスクリプト−ムにコードされた蛋白質が解析される。本発明の方法は、該遺伝子グループによってコードされた各蛋白質（該“蛋白質”）に対する抗体を、ディップスティック、および膜から成るグループから選択される固体の支持相に結合させる工程と、該支持体を分析するサンプルを抗体−抗原複合体が形成される条件下で反応させる工程、該支持体をシグナルを生成する検出化合物と複合体を形成させた、抗蛋白質抗体と反応させる工程、前記シグナルが前記サンプル中の蛋白質量に比例する、前記シグナルを視覚的に検出する工程、同じグループの蛋白質の前記標準に比較した、そして前期サンプル中の該蛋白質量の違いが肺癌の診断あるいは肺癌を発症する危険性の増大を指摘する、前記サンプル中のシグナルを標準物質と比較する工程を有する。タバコの煙に曝露されながら、癌のない気道においての発現レベルを示すために、標準的レベルが測定される。
【０２０３】
アッセイ試薬、ピペット／滴下器具、および試験管は、キットとして提供されてもよい。従って、本発明はさらに、該気道遺伝子グループによってコードされた蛋白質の視覚的検出の検査キットであって、対照被験体のパターンとは異なるレベルの検出が、該被験体においての肺疾患発症の危険性の増大を指摘すると考えられる検査キットを提供する。該検査キットは、標準液としての既知濃度の気道の該トランスクリプトームによりコードされた一つ以上の蛋白質（該“蛋白質”）を含む一つ以上の溶液、酵素に結合させた抗蛋白質抗体溶液、酵素活性によって色調や色合いの明暗が変化するクロモゲン、その表面に該蛋白質に対する抗体を保持するディップスティックや膜から成るグループから選択される固体の支持相を有する。表１および２によって提供されるグループの各遺伝子の上昇あるいは下降の動向を含めた使用説明書が該キットに含まれる。
【０２０４】
本発明の実施は、特に指摘のない限り、通常の技術の範囲の、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技術を含めて）、細胞生物学、生化学、そして免疫学の従来の技術と説明を利用する。そのような従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリッド形成、ライゲーション、および標識を使ったハイブリッド形成の検出が含まれる。適切な技術の具体的な例証については以下の実施例を参照することで得られる。しかしながら、当然、他の同等な従来手段も使用が可能である。そのような従来の技術と説明は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ゲノム解析）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  （Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ）  （実験操作の手引きシリーズ、第Ｉ−ＩＶ卷）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （抗体の使用）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（実験操作の手引き）、Ｃｅｌｌｓ（細胞）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （実験操作の手引き）、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  （ＰＣＲプライマー）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （実験操作の手引き）、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （実験操作の手引き）（全て、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版）、Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （４ｔｈ  Ｅｄ）  （生化学、第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ，  ニューヨーク，  Ｇａｉｔ，  “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（オリゴヌクレオチド合成：“実践的取り組み”）１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ロンドン，  Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ  （２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（生化学原理、第３版），  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，  ニューヨーク、ＮＹ、及び、Ｂｅｒｇら  （２００２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  、５ｔｈ、Ｅｄ．（生化学、第５版）、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，  ニューヨーク、ＮＹ，  のような標準的な実験操作の手引き書に見られ、これらは全て、あらゆる目的で、参照によりその全体を本発明に組み込まれる。
【０２０５】
本発明の方法は、いくつかの好ましい態様におけるアレイを含め、固体の基板を利用できる。  ポリマー（蛋白質を含めて）アレイ合成に利用できる方法や技術は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、国際公開番号ＷＯ  ００／５８５１６号および、以下の    
（国際公開番号ＷＯ  ９９／３６７６０）やＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５にみられ、それらは全て、あらゆる目的で、参照により、本発明に組み込まれる。
【０２０６】
具体的な態様において合成技術について説明のある特許には、米国特許第５，４１２，０８７、６，１４７，２０５、６，２６２，２１６、６，３１０，  １８９、５，８８９，１６５、および５，９５９，０９８が含まれる。核酸アレイは、上記特許の多くに説明されるが、同じ技術がポリペプチドと蛋白質アレイに応用される。
【０２０７】
本発明に有用な核酸アレイには、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（サンタクララ、カリフォルニア州）からＧｅｎｅＣｈｉｐ７の商標名で、市販されているアレイが含まれるが、それに限定されるものではない。アレイの例は、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍのウェブサイトに示されている。
【０２０８】
遺伝子発現のモニタリングの実施例、および本発明の方法に有用なプロファイル作成法は、米国特許第５，８００，９９２、６，０１３，４４９、６，０２０，１３５、６，０３３，８６０、６，０４０，１３８、６，１７７，２４８および６，３０９，８２２号に示される。その他の使用の実施例は、米国特許第５，８７１，９２８、５，９０２，７２３、６，０４５，９９６、５，５４１，０６１、および６，１９７，５０６号に組み入れられている。
【０２０９】
本発明はまた、幾つかの好ましい態様において、サンプルの調製法についても熟慮する。発現解析に先立つか、あるいはそれと同時に、核酸サンプルは、ＰＣＲ  を利用してもよいが、多様なメカニズムによる増幅を行ってもよい。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＣＲ技術）：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＤＮＡ増幅の原理と応用）（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９２）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＰＣＲのプロトコール）：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（方法と応用のガイド）（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州、１９９０）、Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９  ４９６７  （１９９１）、Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＰＣＲ法と応用）１，  １７  （１９９１）、ＰＣＲ  （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  オックスフォード）；および米国特許第４，６８３，２０２、４，６８３，１９５、４，８００，１５９、４，９６５，１８８そして５，３３３，６７５号広報を参照するとよく、これらは、それぞれ、すべての目的でこの参照によりその全体が組み込まれる。サンプルはアレイ上で増幅されてもよい。例えば、米国特許第６，３００，０７０号公報、および米国特許出願第０９／５１３，３００号を参照すればよく、これらはこの参照により組み込まれる。
【０２１０】
その他の適切な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕとＷａｌｌａｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，  ５６０  （１９８９）  、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，  １０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ら、Ｇｅｎｅ  ８９：  １７７  （１９９０）  ）、転写増幅（Ｋｗｏｈ  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６    １１７３  （１９８９）  および国際公開番号第ＷＯ８８／１０３１５号）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７、１８７４  （１９９０）  および国際公開番号第ＷＯ９０／０６９９５号）、標的ポリヌクレオチドの選択的増幅（米国特許第６，４１０，  ２７６号公報）、共通配列プライマーによるＰＣＲ（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，  ９７５号公報）、任意のプライマーによるＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９  および５，８６１，２４５）  号公報）そして核酸にもとづく配列増幅（ＮＡＢＳＡ）（米国特許第５，４０９，８１８、５，５５４，  ５１７および６，０６３，６０３号公報）が含まれる。その他の利用できる増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４、５，４９４，８１０、４，９８８，６１７号公報および米国特許出願第０９／８５４，３１７号に説明があり、これらのそれぞれは、この参照により組み込まれる。
【０２１１】
サンプル調製および核酸サンプルの複雑さを軽減する技術のための追加の方法は、例えば、Ｄｏｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１，  １４１８  （２００１）、米国特許第６，３６１，９４７、と６，３９１，５９２号公報、米国特許出願第０９／９１６，１３５、０９／９２０，４９１、０９／９１０，２９２  および１０／０１３，５９８号に説明がある。
【０２１２】
ポリヌクレオチドハイブリッド形成アッセイを行う方法は技術分野においてよく開発されている。ハイブリッド形成アッセイの操作と条件は応用によって異なり、以下の参照とされる方法を含めて、旧知の一般的な結合方法に従って選択される：Ｍａｎｉａｔｉｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （実験室操作の手引き）（２ｎｄ  Ｅｄ．  第二版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９）；ＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （酵素研究法）、Ｖｏｌ．  １５２、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （分子クローニング技術のガイド）  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、サン・ディエゴ、カリフォルニア州、１９８７）；Ｙｏｕｎｇ  とＤａｖｉｓｍ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、８０：  １１９４（１９８３）。繰りかえしのそして制御されたハイブリッド形成反応を行う方法と器具については、例えば、米国特許第５，８７１，９２８、５，８７４，２１９、６，０４５，９９６、６，３８６，７４９および６，３９１，６２３号公報に説明され、そのそれぞれは、この参照により組み込まれる。
【０２１３】
本発明はまた、幾つかの態様において、サンプルとプローブ間のハイブリッド形成の信号検出についても熟考する。例えば、米国特許第５，１４３，８５４、５，５７８，８３２、５，６３１，７３４、５，８３４，７５８、５，９３６，３２４、５，９８１，９５６、６，０２５，６０１、６，１４１，０９６、６，１８５，０３０、６，２０１，６３９、６，２１８，８０３、および６，２２５，６２５、そして米国仮出願第６０／３６４，７３１号とＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（国際公開番号ＷＯ９９／４７９６４として公開）を参照のこと。
【０２１４】
シグナルの検出と強度のデータ処理の方法と機器の実施例については、例えば、米国特許第５，１４３，８５４、５，５４７，８３９、５，５７８，８３２、５，６３１，７３４、５，８００，９９２、５，８３４，７５８、５，８５６，０９２、５，９０２，７２３、５，９３６，３２４、５，９８１，９５６、６，０２５，６０１、６，０９０，５５５、６，１４１，０９６、６，１８５，０３０、６，２０１，６３９、６，２１８，８０３、および６，２２５，６２５号公報、そして米国特許出願第６０／３６４，７３１号、とＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（国際公開番号ＷＯ９９／４７９６４として公開）に開示がある。
【０２１５】
本発明の実践にはまた従来の生物学的方法、ソフトウェア、やシステムを使用してもよい。本発明のコンピューターソフトウェア製品には典型的には、本発明の方法のロジックなステップを遂行するコンピューターにより実行可能な指示のあるコンピューターで判読可能な媒体が含まれる。適切なコンピューター判読可能な媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリー、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ等が含まれる。コンピューター実行可能な指示は、適切なコンピューター言語または数種類の言語の組み合わせで書かれていてもよい。基礎的な生命情報科学の方法については、例えば、Ｓｅｔｕｂａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（生命情報科学入門）（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ボストン、１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ，  Ｓｅａｌｅｓ，  Ｋａｓｉｆ（Ｅｄ．）（編）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における情報科学的方法）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  アムステルダム、１９９８）、ＲａｓｈｉｄｉとＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ（バイオインフォーマティクスの基礎）；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（生物科学と医学への応用）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、２０００）そしてＯｕｅｌｅｔｔｅ  とＢｚｅｖａｎｉｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（バイオインフォーマティクス）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（遺伝子と蛋白質の解析のために実践的ガイド）（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、２ｎｄ  Ｅｄ．、第二版、２００１）  に記載されている。
【０２１６】
本発明はまた、プローブデザイン、データ管理、解析、そして機器の運転操作のような多様な目的のために種々のコンピュータープログラム製品やソフトウェアを利用する。例えば、米国特許第５，５９３，８３９、５，７９５，７１６、５，７３３，７２９、５，９７４，１６４、６，０６６，４５４、６，０９０，５５５、６，１８５，５６１、６，１８８，７８３、６，２２３，１２７、６，２２９，９１１、そして６，３０８，１７０号公報を参照のこと。
【０２１７】
さらに、本発明は、例えば米国特許出願第１０／０６３，５５９、６０／３４９，５４６、６０／３７６，００３、６０／３９４，５７４、と６０／４０３，３８１号に示されるようにインターネットのようなネットワークを通して、遺伝子発現プロファイルの情報を提供する方法を含めた態様があっても良い。
【０２１８】
本明細書を通して、本発明の多様な側面が範囲フォーマットによって表示される。範囲フォーマットにおいての記載は、単に簡便さと簡潔さのためであることを理解するべきであり、本発明の範囲に固定した限界を定めるものと解釈するべきではない。従って、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値と同様に、可能な全ての下位範囲を具体的に開示するものとみなされるべきである。例えば、１０−２０のような範囲の記載は、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、そして２０のようなその範囲の個々の数と同じく、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１１−１４、１１−１６等の下位範囲を具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関わらず適用される。さらに、端数の範囲もまた記載された例示数に含まれる。従って、例えば、１−３の範囲には、１．１、１．２、１．３、１．４，  １．５、１．６等の端数が含まれる。これは特に、いずれの特定の遺伝子または転写産物の増加あるいは減少量についても適用される。
【０２１９】
本発明には多くの好ましい態様があり、その技術分野の専門家には旧知の詳細について、多くの特許、応用例やその他の参照を信頼するものである。従って、例えば、本明細書に特許出願のような参照文献が引用される場合、それは参照により、その全体が、再引用の提案と同時に、すべての目的でここに組み込まれることを理解すべきである。
【実施例】
【０２２０】
（実施例１）
本研究において、本発明者らは鼻腔上皮細胞から核酸サンプル（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を入手した。本発明者らはまた、対照の一つとして、血液からも核酸を入手した。本発明者らの発見は、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４１３２に開示された気管支上皮細胞の遺伝子発現プロファイルを、この実施例において発見された鼻腔上皮細胞からの遺伝子発現パターンと比較するために、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１４１３２において使用した。
【０２２１】
本発明者らは、吸引された毒性物質が、気道全体に及ぶ上皮細胞の“傷害の場”を形成するという概念について探索した。本発明者らによる最近の高密度遺伝子発現アレイを使って測定された結果、この  “傷害の場”  が毒性物質への気道の曝露の程度とその毒性物質に対する被験体の反応についての情報を提供するという仮説をたてた。ほとんどの吸入される毒性物質は気道の上皮細胞の遺伝子発現に変化をもたらすと思われるが、本発明者らの研究は肺癌とＣＯＰＤの主要な原因であるタバコの煙に焦点をあてるものである。
【０２２２】
本発明者らは、まず、診断のための気管支内視鏡検査の際に気道からブラシで採取した気管支上皮細胞における対立遺伝子欠失について調べた。他者によっても示されたように、本発明者らは喫煙者の肺内気道全体にわたって癌病巣の反対側にも、癌病巣の側にも対立遺伝子欠失がおこることを発見した。程度はより少ないが、癌のない喫煙者の気道上皮細胞でも対立遺伝子の欠失はみられる（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：２０２５，  １９９９）。本発明者らはこれらの研究を発展させ、喫煙者と非喫煙者からの腺癌について調べ、喫煙者の癌のない組織においては“傷害の場”がみられるが、非喫煙者においてはみられないことを報告した（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、３９：２３，  ２００３，Ａｍ  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９：１５７，  ２００３）。
【０２２３】
本発明者らは、さらに進めて、高密度のアレイを使って喫煙者と非喫煙者の中枢気道において生じる遺伝子発現のパターンを検索した。本発明者らは、タバコの煙によって誘導される遺伝子のタイプ、喫煙量との関係、被験体のタバコの煙に対する反応の人種差（ＡＴＳ）、喫煙を中止する被験体においての可逆的、および非可逆的な変化（ＰＮＡＳ．  １０１：１０１４３−１０１４８，  ２００４）について明らかにした。さらに、本発明者らは、肺癌を発症する喫煙者に起こる変化（投稿済み、およびＡＡＣＲ）、そしてＣＯＰＤ  を発症する喫煙者に起こる変化（Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３１：６０１，２００４）について、最近、発表した。これらの研究の全ては本発明者らの研究室で進行中であり、これらは全て、疫学的調査においての多数住民の調査には向かない採取過程である気管支内視鏡による中枢気道上皮細胞の採取に依存するものである。
【０２２４】
多数の喫煙者において、気管支内視鏡を使わないで、気道上皮細胞の遺伝子発現を検定することができる手段を開発するために、本発明者らは、口腔粘膜の上皮細胞を使う可能性について探索し始めた。本発明者らは、口腔上皮細胞からＲＮＡ  を得る方法を開発し、喫煙者の気管支上皮において変化した幾つかの遺伝子の発現レベルを測定することができたが、口腔から得られたＲＮＡの量と質については問題点があることからこの方法の広範囲な適用は制限された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：４８４−８７  ２００４）。
【０２２５】
本発明者らは、この発明において鼻腔粘膜のブラッシングによって得られた上皮細胞が肺疾患の診断や予後診断の手段として使用できることを示した。予備的な検査結果は、鼻腔から簡単に（プロトコールを下記に示す）、十分量の高品質のＲＮＡやＤＮＡ  を得られること、このＲＮＡ  と高密度マイクロアレイを使って遺伝子発現が測定できること、そして気管支上皮細胞において喫煙によって変化する遺伝子の多くが、鼻腔でもまた変化することを示した（図１を参照）。本発明者らはさらに、鼻腔の上皮細胞の遺伝子発現を、類肉腫症が臨床的には肺を含まない場合でさえも、類肉腫症の患者における、潜在的な遺伝子発現の診断および臨床的ステージの特異的なパターンを決定するために、使用できることを示した（図２を参照）。本発明者らはまた、これらの同じ試料から、遺伝子発現の変化を説明する、遺伝子のメチル化のパターンや遺伝的多型性の評価を可能にするＤＮＡを得ることができる。
【０２２６】
これらの研究は、非侵襲性の方法で得られた鼻腔上皮細胞における遺伝子発現がタバコの煙のような多様な吸入毒性物質に対する被験体の反応を示し、肺に関わる多様な疾患についての診断や、おそらく予後診断および病理学的情報をも提供できることを示す。
【０２２７】
従って、本発明者らの研究に基づき、ここに、個々の被験体や被験体集団の多様な環境毒性物質に対する反応を評価する技術やスクリーニングの手段として、また肺癌を含む種々の肺疾患の診断／予後診断のための手段として、鼻腔上皮細胞を解析する方法を開発した。初期の研究は“発見に基づく”ゲノム全体の発現プロファイリングを利用したが、初期の研究が究極的には、より簡単で安価で、また技術分野で使用可能な“限定された遺伝子”のプラットフォームへ導くと考える。
【０２２８】
鼻腔上皮細胞ＲＮＡ  およびＤＮＡ分離のための非侵襲性のプロトコール：
２％リドカイン溶液局所麻酔を行い、鼻鏡を使って見ながらＣｙｔｏｓｏｆｔブラッシを外鼻孔の鼻甲介の下方に挿入する。ブラシを３回、回転させて上皮細胞を採取し、直ちにＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ溶液に入れる。ブラッシングを繰り返し、２度目のブラッシはＤＮＡ分離のためにＰＢＳ液に入れる。
気道の“傷害の場”の口腔と鼻腔への拡大
本発明者らは、現行の、累積的な、そして過去のタバコへの曝露に関与する気管支上皮においての遺伝子発現における相違を示したが、比較的侵襲性のある気管支内視鏡の使用は、大規模な住民調査や、疾患を発症する危険性が低い被験体の調査のためには、サンプル採取が困難になる。タバコによる傷害の場は気道全体の上皮細胞に及ぶであろうという本発明者らの仮説に基づいて、鼻腔や口腔の頬側の上皮細胞はタバコの煙に曝露され、非侵襲性の方法で採取できることから、本発明者らは、タバコへの曝露に反応おける気管支、口腔および鼻腔間の関係を探索するためのパイロット調査を行った。このパイロット調査においては、研究方法とデザインの項目に記載されるように、１５の鼻腔上皮細胞サンプル（８非喫煙者と７現喫煙者）を右鼻甲介下のブラッシングによって採取した。さらに、以前に記述した［３８］（付録を参照）、こすり取り用の器具を使って頬側の口腔上皮細胞を１０人の被験体（５非喫煙者、５現喫煙者）から採取した。全てのサンプルをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイを用いて測定した。口腔から採取されたＲＮＡサンプルが少量で（１−２μｇ）、一部分解がみられたために、サンプルは各被験体から毎月一回連続的に採取したものを集めて十分量のＲＮＡを得た（６−８μｇ）。おそらくは口腔サンプル中において完全長のｍＲＮＡ量が少ない結果として、口腔サンプルからは低い転写検出率が得られた。
【０２２９】
３種類全ての組織においてのタバコにより誘導された遺伝子発現パターン間の関連性については、まず、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （遺伝子集合濃縮解析）  （ＧＳＥＡ；  ［３９］  ）により同定が行われ、気管支において発現に相違のみられた遺伝子は口腔および鼻腔においても変化がみられた（ＧＳＥＡ  ｐ＜０．０１）。本発明者らは次に、二元配置の２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ法により、ｐ＜０．００１で、喫煙により３組織の全てに発現の相違がみられた３６５遺伝子を同定した。これら３６５遺伝子について、各組織内で標準化された全てのサンプルのＰＣＡを図５に示す。
【０２３０】
最後に、この鼻腔および口腔のパイロット調査は遺伝子群のクラス予測には十分ではないが、本発明者らは、タバコへの曝露に関するバイオマーカーの同定にこれらの組織を使う可能性について探索した。喫煙者と非喫煙者の間で、信号対雑音比が最も高い２０遺伝子と最も低い２０遺伝子が、鼻腔と口腔の両方で同定された。次にクラシファイヤ（分類機）を気管支上皮細胞サンプル（１５現喫煙者、１５非喫煙者）においてこれらの遺伝子を使って調整を行い、別個の４１サンプルからなるテスト群に応用した。口腔と鼻腔から選別された遺伝子は、現喫煙者と非喫煙者からの気管支上皮サンプルを高い精度で類別する：
【０２３１】
【化６１】
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このパイロット調査は、ＤＮＡマイクロアレイ研究のために適切な良質のＲＮＡ  の有意量を鼻腔粘膜のブラッシングによって採取することの実行可能性を示し、すでに決定されていた気管支道においての喫煙に関連した変化と、鼻腔上皮において起こる変化の間にみられる関連性を示した。頬側の口腔粘膜から採取されたＲＮＡの量と質は、Ｕ１３３Ａプラットフォームでの解析を複雑化するが、サンプルを貯めることによって行われた調査結果は、タバコへの曝露による遺伝子発現は気管支道のそれに関連していることを示唆する。これらの結果は、上気道における遺伝子発現プロファイルが曝露にたいする宿主の反応を反映するという中心仮説を支持する。本発明者らは、一部に分解のあるＲＮＡにおいて遺伝子発現が測定できる可能性のある新規なアレイプラットフォームを使って、鼻腔および口腔からのサンプルを用いて、タバコへの曝露によるバイオマーカーを決定する能力についてさらに十分の探索を行うことを提案する。
【０２３２】
（実施例２）
口腔、鼻腔および気道上皮における喫煙に対するゲノムの反応の比較
世界中でほぼ１３億人が喫煙し、年間、約５００万人の予防可能な死亡者がでる（１）。喫煙は、米国において癌による死亡の主要な原因である肺癌や、全ての死因のうちのトップから４番目にあたる慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の重要な発症危険因子である。ほぼ９０％の肺癌は喫煙が原因であるが、喫煙者の１０−１５％のみに、この疾患が発症する  （２）  。肺癌とＣＯＰＤ  における病因としての喫煙の役割については、旧知であるが、少数の喫煙者のみが発症する理由の分子疫学的説明についてはほとんど解明されていない。
【０２３３】
喫煙が、細胞異型  （３、４）  、異常な遺伝子発現、異型接合性の欠失（３、５）、やプロモーターのメチル化過剰を含めた多くの変化を、上位および下位の気道上皮に誘導することは明確にされている。著者の何人かは、喫煙者の組織学的には正常な部分を含めて気道上皮全体に、ＬＯＨのような分子的で遺伝子的な変化、あるいは、マイクロサテライトの変化があることを報告している（４、６）。本発明者らはこれまでに、健常人の気道上皮のトランスクリプトームに対する喫煙の影響について調べ、喫煙は炎症や腫瘍抑制に関与する遺伝子の発現を抑える一方、酸化剤によるストレス、異物代謝、および発癌に関連する気道遺伝子の発現を誘導することを発見した（７）。この気管支内視鏡による研究は、喫煙に関連する肺障害のバイオマーカー候補の可能性のある遺伝子の幾つかを明らかにしたが、現在、喫煙に関連する肺障害の研究のための代替となる、侵襲性の低い方法による臨床サンプルを得ようという強い趨勢がある。
【０２３４】
口腔および鼻腔粘膜は、高濃度の吸入発癌物質に曝露されることや、喫煙に関連する疾患に明らかに結びつけられるので、バイオマーカーの探策にとって魅力的な候補サンプルである  （８）  。本発明者らは、これまでに、唾液や鼻腔分泌物中の高濃度のＲＮＡ分解酵素の存在（１１、１２）にもかかわらず、鼻腔（９）および頬粘膜の両方から、遺伝子発現解析のための十分なＲＮＡ  の獲得が実行可能であることを示した（１０）。これらのいずれの組織についても、全体的は遺伝子発現について調べた研究はほとんどなく、喫煙によって起こる、上位および下位気道での遺伝子発現の変化を結びつけようとする努力は払われなかった。Ｓｍｉｔｈ  らによるパイロット研究は、ｃＤＮＡマイクロアレイに用いるＲＮＡ  を得るために、喫煙者と非喫煙者から頬粘膜をブラッシにより採取した生検材料として使用し、調整用で試験用のセットにおいて２群を区別することのできるほぼ１００の遺伝子を発見した。この研究は、これらの多くの遺伝子が未決定のＥＳＴではあっても、喫煙に伴い頬粘膜の遺伝子発現が変化するという励ましとなる証拠を提供したが、上位と下位の気道における遺伝子の反応の間の潜在的な関連性については何も言及されなかった。Ｓｐｉｖａｋらは、肺癌の検査を受ける１１患者においての、それぞれの頬粘膜とレーザー切除による肺上皮細胞について、９つの発癌あるいは酸化剤代謝遺伝子（１３）についてＰＣＲ（すなわち、検出の有無）を使って、定性的な関連性があることを見つけた。しかしながら、これらの遺伝子の頬粘膜における定量的なリアルタイムＰＣＲによって、肺癌群と対照群の間に信頼できる予測をつけることが出来なかった。鼻腔のブラッシングによる全体的な遺伝子発現プロファイリングが最近、喘息（１４）と嚢胞性線維症  （１５）  を持つ子供において調べられたが、喫煙が鼻腔上皮の遺伝子発現に及ぼす影響についての研究については、これまでに見あたらない。
【０２３５】
この研究においては、本発明者らは、ここで“正常な頬側の口腔および鼻腔のトランスクリプトーム”と言及される、正常者の頬粘膜の最初のゲノム全体の発現アッセイについて報告する。本発明者らは、次にこれらのトランスクリプトームに与える喫煙の影響を評価し、過去に得られた気管支上皮の遺伝子発現のデータセットと比較する。口腔、鼻腔  および気管支における喫煙により誘導される変化を比較することにより、タバコの煙に対する上気道と下気道の遺伝子反応の間の関連性を確立し、さらに、全体的な遺伝子発現レベルでの、喫煙により誘導される“場の損傷”の概念を推進させる。最後に、頬粘膜から得られる少量の分解したＲＮＡを使って、多様な遺伝子発現研究のための実行可能な方法として、質量分析の使用について検証する。
【０２３６】
試験集団
マイクロアレイ解析は、合計２５被験体において実施され、質量分析による検証は追加の１４被験体において実施された。マイクロアレイおよび質量分析による検証に用いられた被験体グループの人口統計学的なデータを表１１に示す。
【０２３７】
正常な組織サンプルのマイクロアレイ解析は、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（遺伝子発現オムニバス、ＧＥＯ）から収集したこれまでに公開されたデータセットについて実施された。この研究から取られた非喫煙者の鼻腔および頬粘膜上皮の１２サンプルを含めて、１０種類の組織タイプにわたる９２サンプルが同時に解析された。別の研究から集められた鼻腔組織における遺伝子発現パターンの再現性を決めるために、さらに正常な鼻腔上皮サンプルからの追加のマイクロアレイデータも加えられた。解析に使われた組織のそれぞれの詳細と各組織タイプのサンプル数については表１２に示す。
正常な気道上皮細胞間の関連性
１０組織タイプ（ｎ＝９２  サンプルの合計数）にわたる正常な組織サンプルの主成分分析（ＰＣＡ）は、これまでに特色づけられた（Ｓｐｉｒａら、２００４、ＰＮＡＳ）正常な気道のトランスクリプトームを含めた２３８２遺伝子にわたって実施された。図７は、これらの２３８２遺伝子の発現に基づく気管支および鼻腔上皮サンプルが同じグループに明瞭にグループ分けされたことを示す。
【０２３８】
２３８２の正常な気道のトランスクリプトーム遺伝子のなかで、機能遺伝子（“機能セット”）のカテゴリーに大きな比率を占めるセットがＥＡＳＥ解析によって決定された。表１３に、正常な気道トランスクリプトームのなかで、有意に大きな比率を占める１６の機能セットを記載する。平均して、機能クラスターあたりほぼ１０９のプローブセットがあった。１０組織タイプにわたり、もっとも異なっている機能セットを決定するために変動性測定基準が使われた。アルデヒド脱水素酵素、抗原のプロセシングと提示、微小管と細胞骨格複合体は、もっとも変動の大きい機能セットであった。最も変動の少ないセットには、リボソームサブユニットや核および蛋白質輸送が含まれる。各セットの全ての遺伝子にわたってどの組織が似通った発現パターンを示したかを決定するために、これらの１６の各機能セットに二次元の階層クラスタリングも行われた。上記のうち、最も変動性の高い３機能セットにおいて、気管支および鼻腔の上皮細胞サンプルは常に同じグループに入った（データは示していない）。
【０２３９】
気管支上皮組織と他の組織との関連性を更に調べるために、気道上皮に通例、発現される遺伝子を、正常な気道のトランスクリプトームから選択した。それらの遺伝子アノテーション（遺伝子注釈）に基づいて、正常な気道のトランスクリプトームにおける２３８２遺伝子から、ムチン、ダイニン、微小管、ケラチン、グルタチオン、チトクロームＰ４５０  、およびアルデヒド脱水素酵素の機能グループの遺伝子が選択された。これらの機能グループからの５９遺伝子は正常な気道のトランスクリプトームに存在し、図８に示すように、スーパーバイズド階層クラスタリングを使って、解析された。その多くはこれらの２組織においてより高いレベルの発現を示した、これら５９遺伝子の発現に基づいて、気管支および鼻腔上皮サンプルが一緒にクラスターされた。気管支および鼻腔上皮に発現の高い遺伝子は一般に、前記５つの機能グループに、等しく分布されていた。幾つかのダイニン、チトクロームＰ４５０  ，そしてアルデヒド脱水素酵素の遺伝子は、他の組織に比較して、気管支および鼻腔上皮に発現が高かった。頬粘膜のサンプルは主として、特異的なケラチン遺伝子の高い発現を伴い、肺組織のサンプルとともにクラスターされた。ある種のケラチンは皮膚と食道の上皮に特異的な発現がみられたが、ＫＲＴ７  、ＫＲＴ８  、ＫＲＴ１８  、やＫＲＴ１９のような他のケラチンは、主として気管支および鼻腔上皮に発現が見られた。同じパターンがムチンの遺伝子にもみられ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、そしてＭＵＣ１６は、主として気管支および鼻腔上皮に発現されたがＭＵＣ１  は他の上皮組織に発現された。グルタチオン遺伝子はその他の組織においてと同様に、気管支および鼻腔上皮に高い発現がみられた。微小管遺伝子の発現は、全ての組織にわたって、かなり均等な分布がみられた。
【０２４０】
気管支および鼻腔上皮間の似通った発現パターンを探索するために、気管支および鼻腔サンプル間で発現の相関性の高いサブセットの遺伝子を、機能的に関係のある５９の正常なトランスクリプトーム遺伝子のうちから選択して、メタ遺伝子（遺伝子の集約）を作成した。機能的にその区分の大きな比率を占めるセットを決定するために、該メタ遺伝子に相関性の高い全ての遺伝子が（Ｒ＞  ．６、ｐ＜  ．００１）が選択され、ＥＡＳＥを使って、解析された。メタ遺伝子の発現パターンと最も相関性が高い遺伝子のうちで、微小管と細胞骨格複合体の機能セットの、有意な強化がみられた。
【０２４１】
同じマイクロアレイプラットフォームによる、正常な鼻腔上皮サンプルの別のセット  （１６）  が気管支と鼻腔上皮間の遺伝子発現における関連性の再現性を決定するために、本発明者らの鼻腔上皮のデータセットの代わりに使われた。この別個の鼻腔上皮データセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ１３３Ａマイクロアレイによって測定された１１の正常な上皮サンプルから成る。これらのサンプルは、まず過去の解析からの９２の正常な組織サンプルと共に検討された。組織タイプ内の各サンプルセットと、他の組織タイプからのサンプルとの平均的なピアソンの相関を決定するために相関マトリックスが作成された。二つの鼻腔上皮のデータセットは、相互に最も高い相関を示し、次に高い相関は、鼻腔と気管支上皮サンプル間にみられた。これら１１の鼻腔上皮サンプルは、また正常なトランスクリプトームの全体にわたって、気管支上皮サンプルおよび、もとの８鼻腔上皮サンプルの代わりに使われた場合には、トランスクリプトームからの５９の機能的に関連のある遺伝子のサブセットとクラスターを形成した。
【０２４２】
気道上皮に与える喫煙の影響
タバコの煙が気道の上皮細胞に与える影響を調べるために、現喫煙者および非喫煙者の頬および鼻腔上皮細胞サンプルを、これまでに発表された現喫煙者と非喫煙者の気管支上皮からのサンプル（Ｓｐｉｒａ  ら、２００４、ＰＮＡＳ）とともに解析した。これら３種類の組織タイプから合計８２サンプル（５７気管支、１０頬上皮、１５鼻腔）が使われた。タバコの煙に対する反応のこれら３組織間の関係を決定するために、これまでに気管支上皮細胞において喫煙者と非喫煙者を区別すると報告された３６１遺伝子の発現（Ｓｐｉｒａ  ら、２００４、ＰＮＡＳ）について、気管支、鼻腔および頬上皮からの８２サンプルの全てにわたって検索した。
【０２４３】
現喫煙者と非喫煙者間で、発現が最も異なる、表８に示された３６１遺伝子は、頬上皮サンプル間の幾つかの例外以外は概して、気管支、鼻腔および頬上皮サンプルを、主成分分析により、喫煙状態に基づき、区別することが可能であった（図３）。この発見は、タバコの煙に反応した気管支と上気道の上皮細胞における遺伝子発現プロファイル間に関連性のあることを示唆する。さらに、この関連性を気道全体の上皮細胞に確立するために、喫煙状況によって気管支上皮において発現の相違が最大である遺伝子が、鼻腔および頬上皮において、喫煙によって変化する遺伝子のなかで、大きな割合を占めるかどうかを決定するために、遺伝子集合濃縮分析（ＧＳＥＡ）を実施した。本発明者らは、喫煙によって誘導される気道の遺伝子は、頬粘膜において、喫煙によって、“最先端のサブセット”（ｐ＜    ．００１）を構成する１０１遺伝子を含む、最も影響を受ける遺伝子群に有意に濃縮されることを示した。最先端のサブセットは、頬粘膜サンプルにおいて気道遺伝子の濃縮に最も貢献する遺伝子から成る。図６は、同様に、喫煙者の気管支上皮全体で、最も相違のある遺伝子はまた、最先端のサブセットを構成する１０７遺伝子を含めて、鼻腔上皮細胞サンプルにおいて喫煙によって最も影響を受けた遺伝子の中に有意に濃縮されることを示す（ｐ＜．００１）。最先端遺伝子のＰＣＡは、それらの遺伝子が、喫煙状況によって、頬粘膜サンプルと鼻腔上皮サンプル（図７）を区別できることを示し、このことは、喫煙に反応した気道上皮細胞全体に遺伝子発現について広域にわたる関連性があることを示唆する。図５の最先端遺伝子セットのＥＡＳＥ分析は、これらの遺伝子リストの大半を占める機能区分には、酸化還元酵素活性、金属イオン結合、そして電子輸送活性が含まれることを明らかにした  （表１３を参照）。
【０２４４】
試験集団
本発明者らは、頬サンプルのマイクロアレイ調査  （ｎ＝１１）、鼻腔サンプルのマイクロアレイ調査（ｎ＝１５）、そしてそれに続く、期待される頬上皮細胞サンプルの質量分析による検証（ｎ＝１４）のためにボストンメディカルセンターから、現喫煙者と比喫煙者のボランティアを募集した。各グループの現喫煙者は、少なくとも累積的な１０パック・イヤー（１日１箱を１０年間喫煙に相当）の喫煙歴を持ち、前月に少なくとも１日１０本のタバコを喫煙していた。かなりの量の環境的なタバコへの曝露のある、呼吸器系に症状がある、呼吸器系、鼻、または口腔の疾患が知られている、あるいは吸入による医薬品を常用している非喫煙のボランティアは除外された。各被験体について、パック・イヤーの数、一日あたりのパック数、喫煙を始めた年齢、環境的なタバコへの曝露を含めた喫煙歴の詳細を入手した。現喫煙者と非喫煙者は、年齢、人種、性別において、一致させた。この調査は、ボストンメディカルセンターの治験審査委員会によって承認され、全ての被験体から書面による同意書の提出を受けた。
【０２４５】
頬上皮細胞の採取
頬上皮細胞が、これまでに報告されたように  （Ｓｐｉｒａら、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）  ２５  被験体から（頬サンプルのマイクロアレイ検査のために１１、質量分析による検証のために１４）採取された。簡単に説明すると、本発明者らは、鋸の歯状の縁をもったプラスチックの弓形の道具を使って、口腔から少量のＲＮＡを採取する非侵襲性の方法を開発した。簡単に説明すると、穏やかな圧力を加えて、左側の頬の内側の頬粘膜に、歯状の縁を５回擦り付けて、直ちに１ｍＬのＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ  溶液（Ｑｉａｇｅｎ、ヴァレンシア、カリフォルニア州）に浸した。この操作を右頬の内側で繰り返し、細胞試料は１本の試験管に合わせた。２４時間までの室温での保管の後に、全ＲＮＡを細胞沈渣から、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使って、製造会社のプロトコールに従って、分離した。このＲＮＡに損傷がないことは、ＲＮＡ変性用ゲル上で確認された。上皮細胞の内容物は、細胞沈渣をを７００ｘｇ（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ，ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ，ピッツバーグ、ペンシルベニア州）で細胞遠心させて、細胞骨格に対する抗体（Ｓｉｇｎｅｔ、デッドハム、マサチューセッツ州）で染色して定量した。このプロトコールを使って、本発明者らは、サンプル採取あたり、平均して１８２３  ｎｇ  ＋／−  １２４３  ｎｇの全ＲＮＡを入手できた。頬上皮細胞は、被験体あたり最小限８  μｇのＲＮＡを得るために、６週間にわたって連続的に採取した。質量分析による検証に含まれた１４被験体については、一回の採取で十分であった。
【０２４６】
鼻腔上皮細胞の採取
鼻腔上皮細胞は、まず右外鼻孔を１ｃｃの１％リドカインで麻酔して採取した。鼻鏡（Ｂｉｏｎｉｘ、トレド、オハイオ州）を使って、外鼻孔を広げ、標準的な細胞学的ブラッシ（Ｃｙｔｏｓｏｆｔ  Ｂｒｕｓｈ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、キャマリロ、カリフォルニア州）を鼻甲介下に挿入した。ブラッシをその場所で一度回転させ、取り出して、直ちに１ｍＬのＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ溶液（Ｑｉａｇｅｎ、ヴァレンシア、カリファルニア州）に浸した。４°Ｃで一夜保管した後に、ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ミニキットを使って、製造会社のプロトコールに従って分離した。上記のように、ＲＮＡに損傷がないことはＲＮＡ変性用ゲル上で確認し、上皮細胞の内容物は細胞遠心によって定量した。
【０２４７】
気管支上皮細胞の採取
気管支上皮細胞もまた質量分析による検証研究の患者のサブセットから（Ｎ＝６、合計１４）気管支ファイバースコープ検査中に、３つの内視鏡細胞ブラッシを使ったブラッシング（Ｃｅｌｌｅｂｒｉｔｙ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  Ｃｙｔｏｂｒｕｓｈ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ボストン）で右側主気道から採取した。ブラッシを取り出して、直ちにＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浸し、ＲＮＡを分離する時まで−８０°Ｃで保存した。ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使って、製造会社のプロトコールに従って、ブラッシからＲＮＡを分離し、患者あたり平均収量８−１５μｇのＲＮＡを得た。ＲＮＡ  に損傷がないことは、ＲＮＡ変性用ゲルを使って確認し、上皮細胞の内容物は細胞遠心と細胞骨格の染色によって定量した。
【０２４８】
マイクロアレイデータ収集と前処理
頬上皮細胞（Ｎ＝１１）と鼻腔上皮細胞（Ｎ＝１５）から８μｇの全ＲＮＡを処理し、標識し、これまでに報告されたように（Ｓｐｉｒａら、２００４、ＰＮＡＳ）２２，２１５プローブセットを持ったＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリッド形成させた。各遺伝子についての一つの加重平均発現レベルは、ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ  ＳＵＩＴＥ  ５．０（ＭＡＳ  ５．０）のソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタ・クララ、カリフォルニア州）を使って得られた。ＭＡＳ  ５．０のソフトウェアはまた、転写産物が信頼の置ける検出によるものかどうかを示す一側のＷｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定を使った検出Ｐ値［Ｐ（検出）］をも算出した。検出された遺伝子の割合が、頬粘膜マイクロアレイサンプル全体にわたって検出された平均の割合から両側の標準偏差よりも低いために、それ以上の解析から除外され、残された１０サンプルについてさらに解析を進めた。１５鼻腔上皮細胞マイクロアレイサンプルの全ては、同じ判定基準において検出された遺伝子の割合が十分に高かったので、全てのサンプルについてさらに解析を続けた。５７気管支上皮細胞サンプルのマイクロアレイデータは、これまでに発表されたデータから得られた（Ｓｐｉｒａら、２００４、ＰＮＡＳ）。
【０２４９】
さらに正常な人の組織の７つのマイクロアレイデータがＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ  （ＧＥＯ）  のデータセットから追加された。該サンプルは、少なくとも組織タイプあたり５サンプルからなる正常な、疾患のない組織から選択された。全てのサンプルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ  １３３ＡあるいはＨＧＵ  １３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  マイクロアレイによって測定された。以下の７組織からの正常な組織サンプルからアレイデータを使用した（ＧＥＯ  アクセス番号を含める）：肺（ＧＳＥ１６５０）、  皮膚（ＧＳＥ５６６７）、食道（ＧＳＥ１４２０）、  腎臓（ＧＳＥ３５２６）、骨髄（ＧＳＥ３５２６）、  心臓（ＧＳＥ２２４０）、  そして脳（ＧＳＥ５３８９）。これらの組織のアレイデータの詳細な内訳は表１２に示される。
【０２５０】
上記の８データセットから得られた正常組織サンプルと同様に、頬粘膜、鼻腔上皮、および気管支上皮細胞サンプルはそれぞれ、ＭＡＳ  ５．０  を使って標準化され、その場合、各アレイ（上位および下位２％の遺伝子は除外された）の平均強度は、チップ上の全てのプローブの平均強度を１００と設定するために縮尺因子を使って補正された。ＨＧＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイで測定された組織サンプルについては、ＨＧＵ１３３Ａアレイに共通するプローブセットのみを選択し、ＭＡＴＬＡＢ  Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．１  （Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，  Ｉｎｃ．）を使って標準化し、その場合、選択されたプローブの（上位および下位２％の遺伝子は除外された）平均強度を縮尺因子を使って補正し、残りのプローブの平均強度が１００となるようにした。
【０２５１】
マイクロアレイデータ解析
臨床情報、アレイデータ、そして遺伝子アノテーションは相互作用可能なＰＥＲＬ（３７）においてコードされたＭＹＳＱＬ  データベースに保存されている。以下に説明されるデータベース内の全ての統計学的解析はＲ．ｖ．２．２．０  ソフトウェア（３８）を使って実施された。各プローブセットのために使用された遺伝子アノテーションはＤｅｃｅｍｂｅｒ  ２００４  ＮｅｔＡｆｆｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａのアノテーションファイルから得られた。
【０２５２】
主成分分析  （ＰＣＡ）  をＳｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ  ソフトウェアパッケージ（３９）を使って、以下の非喫煙者１０種類の組織タイプから得られた正常な組織サンプルについて実施した：気管支（ｎ  ＝  ２３）、鼻腔（ｎ＝  ８）、頬粘膜（ｎ  ＝  ５）、肺（ｎ  ＝１４）、皮膚（ｎ  ＝５）、食道（ｎ  ＝  ８）、腎臓（ｎ  ＝  ８）、骨髄（ｎ  ＝  ５）、心臓（ｎ  ＝  ５）、そして脳（ｎ  ＝１１）。ＰＣＡ  分析は、これまでに報告された（Ｓｐｉｒａら、２００４、ＰＮＡＳ）正常な気道のトランスクリプトーム全体にわたって、これらの組織タイプの遺伝子発現における関連性を決定するために使用された。
【０２５３】
機能アノテーションのクラスタリングは、正常な気道のトランスクリプトームのなかで、大きな割合を占める機能グループ（“機能セット”）のセットを決定するために、ＥＡＳＥソフトウェアパッケージ（４０）を使って実施された。クラスター内の各機能グループは、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｅｘａｃｔ（フィッシャーの正確確率検定）テストによって決定されたｐ−値を与えられた。該機能グループの有意性は、次にクラスター内の各機能グループのｐ−値の幾何平均をとって決定された。ＥＡＳＥによって戻される機能セットの数を制限するために、第五階層ノード以下のＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）  のデータベースからの機能グループのみを使用した。
【０２５４】
１０種類の組織タイプにわたる機能セットの変動性を決定するために、以下の式を使った：
Ｖ  ＝  Ｘ−（１．．．ｉ）［ＣＯＶ（Ｘ−Ｇｌ．．．Ｘ−Ｇｋ）］
ここでＧｋは組織タイプｋにおける全てのサンプルにわたる遺伝子Ｇの発現を意味し、ｉは機能クラスターにおいての遺伝子の合計数であり、ＣＯＶは全ての組織タイプにわたる遺伝子Ｇの平均発現の変動係数  （標準偏差を平均で割ったもの）  である。これによって、各機能クラスターについて一つの変動基準（Ｖ）が作成された。各機能クラスターの全ての遺伝子は次に、ピアソンの相関性を考慮した（非中心型）類似度評価基準を使った対数変換ｚ値により標準化されたデータと、ＣＬＵＳＴＥＲおよびＴＲＥＥＶＩＥＷソフトウェアを使った平均リンケージクラスター形成を用いた２Ｄ階層クラスター形成を使って解析された（４１）。
【０２５５】
気道上皮とその他の組織タイプの関係をさらに解析するために、気道上皮細胞に共通して発現される機能カテゴリーに含まれる正常な軌道のトランスクリプトームからの遺伝子について検索した。検索された機能区分は、ムチン、ダイニン、微小管、チトクロームＰ４５０、グルタチオン、アルデヒド脱水素酵素、およびケラチンであった。これらのカテゴリーの遺伝子は、遺伝子アノテーションに基づいてこれらの機能グループのいずれかに含まれた全ての遺伝子を正常な気道のトランスクリプトームから選択することで、決定された。興味のある機能カテゴリーにもわたる正常な気道のトランスクリプトームから５９遺伝子を、スーパーバイズド階層クラスター形成法を使って、１０の組織タイプにわたってさらに解析した。
【０２５６】
正常な気道のトランスクリプトーム以外の遺伝子が同様なレベルで気管支と鼻腔上皮に発現されるかどうかについて評価するために、本発明者らは、それらの遺伝子のピアソンの相関性を考慮した類似度評価基準に基づいて気管支および鼻腔上皮サンプルに発現の高い特定の機能カテゴリーに及ぶ正常な気道のトランスクリプトームから５９遺伝子のサブセットをとって、メタ遺伝子を作成した。つぎに、気管支と鼻腔上皮に類似の発現パターンをもった遺伝子を決定するために、１０の組織全部にわたるメタ遺伝子の平均発現と１０組織の全部にわたるＨＧＵ１３３Ａアレイ（計２２２１５プローブセット）上の各プローブセット間に相関行列が作成された（この解析の詳細については、付録の項に記載されている）。
【０２５７】
他の組織に比較して鼻腔上皮に見られた発現パターンの再現性を決定するために、二つめの鼻腔上皮のデータセット（Ｗｒｉｇｈｔら、２００６、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．）  を含めてさらに解析を行った。遺伝子発現パターンと鼻腔上皮および他の組織の間での関連性の再現性を決定するために、本発明者らによる元の８鼻腔上皮サンプルの代わりに使われたこの二番めのデータセット（ＧＳＥ２３９５）には全部で１１の鼻腔上皮サンプルが含まれた。
【０２５８】
気管支、頬、および鼻腔上皮細胞のタバコの煙に対する反応における関連性を決定するために、これまでの研究で決定された（Ｓｐｉｒａら、２００４、ＰＮＡＳ）気管支上皮細胞において、喫煙者と非喫煙者間に発現の相違があった３６１遺伝子（ｐ＜．００１）を使って喫煙者と非喫煙者からの８２サンプル（５７気管支、１０頬、１５鼻腔）の全体にわたってＰＣＡ分析を実施した。つぎに、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（４２）を使って、タバコの煙への反応における、これらの３種類の組織タイプからの遺伝子発現プロファイル間の全体的な関連性を確立した。本発明者らが目的とするのは、喫煙によって気管支上皮細胞に最も異なる発現を示した遺伝子が、信号対雑音比に基づいて、頬および鼻腔上皮細胞において喫煙により誘導された上位の遺伝子に、有意に濃縮されるかどうかを決定することである。有意な濃縮を決定するために、等級づけられた遺伝子ラベルの並べ替えと経験によるｐ値の設定によってＧＳＥＡによってｐ値が設定された。最先端のサブセットが鼻腔と頬上皮のデータセットにおいて、喫煙状況によってサンプルを区別できるかどうかを決定するために、鼻腔上皮および頬粘膜サンプルの上位のリストに最も有意に濃縮された気道遺伝子（最先端サブセット）はさらにＰＣＡを使って分析された。
【０２５９】
下記の表１１は、患者の人口統計学的データを示す。マイクロアレイ分析（ｎ＝１０）と質量分析（ｎ＝１４）に用いられた患者サンプルの人口統計学的データ。＊Ｐ−値はＦｉｓｈｅｒの正確度検定によって計算された。
【０２６０】
【化６２】
2009529329.tif 000085
下記の表１２は本発明で解析された全てのマイクロアレイデータセットの詳細を示す。
【０２６１】
【化６３】
2009529329.tif 000086
下記の表１３は、
【０２６２】
【化６４】
2009529329.tif 000087
下記の表１４は、ＧＳＥＡ分析から“最先端のサブセット”のうちで共通して、大きな割合を占めて発現される機能カテゴリーを示す。ＧＳＥＡ分析から最先端の遺伝子の共通するＥＡＳＥ分子機能。Ｐ−値はＥＡＳＥソフトウェアを使って計算された。
【０２６３】
【化６５】
2009529329.tif 000088
（参考文献）
ここに、および本明細書の全体にわたって参照される参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０２６４】
１．ＷＨＯ：  Ｔｈｅ  Ｆａｃｔｓ  Ａｂｏｕｔ  Ｓｍｏｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  （ＷＨＯ：  喫煙と健康に関する事実）  ３０  Ｍａｙ，  ２００６、（２００６年５月３０日）
［ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｗｐｒｏ．ｗｈｏ／ｉｎｔ／ｍｅｄｉａ＿ｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔ＿ｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ＿２００６０５３０．ｈｔｍ］
Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｐ．Ｇ．：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  （肺癌の分子疫学）  Ａｎｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １９９９，  Ｓｕｐｐｌ．  ５：７−１１．
２．Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＷＡ．  Ｇａｚｄａｒ  ＡＦ，  Ｈａｎｅｙ  Ｊ．，  Ｗｉｔｓｕｂａ  ＩＩ，  ＬａＲｏｓａ  ＦＧ，  Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｔ，  Ｒｉｔｃｈｅｙ  ＤＭ，  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ＹＥ．：  Ｗｉｄｅｌｙ  ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  ｐ５３  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｆｉｅｌｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  （呼吸器系上皮に散在するｐ５３変異。場の発癌の新規なメカニズム）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  １９９７，  １００：２１３３−２１３７．
３．  Ｗｉｔｓｕｂａ  ＩＩ，  Ｌａｍ  Ｓ，  Ｂｅｈｒｅｎｓ  Ｃ，  Ｖｉｒｍａｎｉ  ＡＫ，  Ｆｏｎｇ  ＫＭ，  ＬｅＲｉｃｈｅ  Ｊ，  Ｓａｍｅｔ  ＪＭ，  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，  Ｍｉｎｎａ  ＪＤ，  ａｎｄ  Ｇａｚｄａｒ  ＡＦ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｅｒ  ｓｍｏｋｅｒｓ．（現喫煙者と元喫煙者の気管支上皮における分子損傷）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  １９９７，  ８９：１３６６−１３７３．
４．Ｐｏｗｅｌｌ  ＣＡ，  Ｋｌａｒｅｓ  Ｓ，  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  Ｇ，  Ｂｒｏｄｙ  ＪＳ：  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ｂｒｕｓｈｉｎｇ：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．  （気管支ブラッシングによって得られた上皮細胞における異型接合性の欠失：肺癌においての臨床的有用性）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９９，  ５：  ２０２５−２０３４．
５．Ｔｈｉｂｅｒｖｉｌｌｅ  Ｌ，  Ｐａｙｎｅ  Ｐ．，  Ｖｉｅｌｋｉｎｄｓ  Ｊ，  ＬｅＲｉｃｈｅ  Ｊ，  Ｈｏｒｓｍａｎ  Ｄ，  Ｎｏｕｖｅｔ  Ｇ，  Ｐａｌｃｉｃ  Ｂ，  Ｌａｍ  Ｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｌｏｓｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｏｎｃｈｕｓ．（気管支上皮の前癌から癌への進行に伴う累積的な遺伝子欠失の証拠）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １９９５，５５：５１３３−９．
６．Ｓｐｉｒａ  ＡＳ，  Ｂｅａｎｅ  Ｊ，  Ｓｈａｈ  Ｖ，  Ｓｃｈｅｍｂｒｉ  Ｆ，  Ｙａｎｇ  Ｘ，  Ｐａｌｍａ  Ｊ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｙ  ＪＳ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．（タバコの煙が人の気道上皮のトランスクリプトームに与える影響）  ＰＮＡＳ，  ２００４、１０１：１０１４３−１０１４８．
７．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＤＥ，  Ｈｉｌｌ  Ｌ，  Ｗｅｌｌｅｒ  Ｍ，  Ｗｉｌｌｅｔｔ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｂａｋｅｗｅｌｌ  ＲＲ：  Ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｐｐｅｒ  ａｉｒｗａｙ  （タバコの煙と上気道）  Ｃｌｉｎ．  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．  ２００３，  ２８，  ４９２−４９６．
８．７．５  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｓａｌ  Ｍｕｃｏｓａ  ｉｎ  Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ  （７．５  類肉腫症における鼻腔粘膜の免疫表現型）  ［公開ページ：Ａ７９５］
９．Ｄ．Ｍ．  Ｓｅｒｌｉｎ，  ＭＤ，  Ｘ．Ｆ．  Ｌｉ，  ＰｈＤ，  Ｊ．  Ｓｐｉｅｇｅｌ，  ＭＤ，  Ｋ．  Ｓｔｅｉｌｉｎｇ，  ＭＤ，  Ｃ．Ｊ．  Ｏ’Ｈａｒａ，  ＭＤ，  Ａ．  Ｓｐｉｒａ，  ＭＤ，  Ａ．Ｗ．  Ｏ’Ｒｅｇａｎ，  ＭＤ，  Ｊ．Ｓ．  Ｂｅｒｍａｎ，  ＭＤ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，  Ｇａｌｗａｙ，  Ｉｒｅｌａｎｄ．  Ａｂｓｔｒａｃｔ  （抄録）、ＡＴＳ  ２００６
１０．Ｓｐｉｒａ  Ａ，  Ｂｅａｎｅ  Ｊ，  Ｓｃｈｅｍｂｒｉ  Ｆ，  Ｌｉｕ  Ｇ，  Ｄｉｎｇ  Ｃ，  Ｇｉｌｍａｎ  Ｓ，  Ｙａｎｇ  Ｘ，  Ｃａｎｔｏｒ  Ｃ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｙ  ＪＳ：  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｂｕｃｃａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  （遺伝子発現プロファイリングのための頬粘膜上皮細胞からのＲＮＡ採取  の非侵襲性の方法）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２００４，  ３６：４８４−４９７．
１１．Ｋｈａｒｃｈｅｎｋｏ  ＳＶ，  Ｓｈｐａｋｏｖ  ＡＡ：  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓａｌｉｖａ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ．（健常人と胃癌患者における唾液のＲＮＡ分解酵素活性の調節）  Ｉｎｚ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  Ｂｉｏｌ．  １９８９，  １：５８−６３．
１２．Ｃｅｄｅｒ  Ｏ．，  ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  Ｊ，  Ｅｒｉｃｓｏｎ  Ｔ，  Ｋｏｌｌｂｅｒｇ  Ｊ：  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｓａｌｉｖａ  ｆｒｏｍ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  （嚢胞性線維症患者の種々のタイプの唾液におけるＲＮＡ分解酵素）  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．  Ｓｃａｎｄ，  １９８５，  ７４：  １０２−１０４．
１３．  Ｓｐｉｖａｋ  Ｓ，  Ｈｕｒｔｅａｕ  Ｇ，  Ｊａｉｎ  Ｒ，  Ｋｕｍａｒ  Ｓ，  Ａｌｄｏｕｓ  Ｋ，  Ｇｉｅｒｔｈｙ  Ｊ，  Ｋａｍｉｎｓｋｙ  ＬＳ：  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｂｙ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ  Ｂｕｃｃａｌ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｃｅｌｌｓ．（落屑した頬粘膜細胞の定量的ｍＲＮＡプロファイリングによる遺伝子‐環境相互作用の特徴）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００４，  ６４：  ６８０５−６８１３．
１４．Ｇｕａｊａｒｄｏ  ＪＲ，  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ＫＷ，  Ｄａｉｎｅｓ  ＭＯ，  Ｒｕｄｄｙ  ＲＭ，  Ａｒｏｎｏｗ  ＢＪ，  Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  Ｍ，  Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＧＫ．    Ａｌｔｅｒｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｎａｓａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｒｅｆｌｅｘ  ｓｔａｂｌｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ａｃｕｔｅ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｓｔｈｍａ．（急性小児喘息と安定反射性喘息においての鼻腔気道上皮の変化した遺伝子発現プロファイル）  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５．  
１５．Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＭ，  Ｍｅｒｌｏ  ＣＡ，  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＪＢ，  Ｚｅｉｔｌｉｎ  ＰＬ，  Ｇａｒｃｉａ  ＪＮ，  Ｇｕｇｇｉｎｏ  ＷＢ，  Ｂｏｙｌｅ  ＭＰ．    Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｌｄ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．  （軽度のおよび重度の嚢胞性線維症肺疾患を持つ患者における呼吸器系上皮の遺伝子発現）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６，  ３５：  ３２７−３３６．
１６．Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＭ，  Ｍｅｒｌｏ  ＣＡ，  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＪＢ，  Ｚｅｉｔｌｉｎ  ＰＬ，  Ｇａｒｃｉａ  ＪＮ，  Ｇｕｇｇｉｎｏ  ＷＢ，  Ｂｏｙｌｅ  ＭＰ．    Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｌｄ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．  （軽度のおよび重度の嚢胞性線維症肺疾患を持つ患者における呼吸器系上皮の遺伝子発現）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６，  ３５：  ３２７−３３６．
１７．Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ  ＤＰ，  Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ  ＨＷ，  Ｓｍｅｊｋａｌ  Ｗ：  Ｆｉｅｌｄ  ｃａｎｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｏｒｉｇｉｎ．（口腔の層状の落屑性上皮における場の発癌）Ｃａｎｃｅｒ，  １９５３，  ６：  ９６３−９６８．
１８．  Ｗｉｓｔｕｂａ  Ｌ，  Ｌａｍ  Ｓ，  Ｂｅｈｒｅｎｓ  Ｃ，  Ｖｉｒｍａｎｉ  Ａ，  Ｆｏｎｇ  ＫＷ，  ＬｅＲｉｃｈｅ  Ｊ，  Ｓａｍｅｔ  Ｊ，  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，  Ｍｉｎｎａ  Ｊ，  Ｇａｚｄａｒ  Ａ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｅｒ  ｓｍｏｋｅｒｓ．  （現喫煙者と元喫煙者の気管支上皮における分子傷害）  ＪＮＣＩ．  ８９：１８．１３６６−１３７３．
１９．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍ，  Ｅｍｉｌｉｏｎ  Ｇ，  Ｐａｔｅｒｏｍｉｃｈｅｌａｋｉｓ  Ｓ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｅ，  Ｌａｎｇｄｏｎ  Ｊ．  Ｆｉｅｌｄ  ｃａｎｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｓｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｈ  ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｅｓｉｏｎｓ．（口腔の場の発癌：異型性および悪性病巣のある症例における一連の分子変化の比較）  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９７、３３：３３２−３３７．
２０．Ｂｏｓａｔｒａ  Ａ，  Ｂｕｓｓａｎｉ  Ｒ，  Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  Ｆ：  Ｆｒｏｍ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｔｏ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ａｎ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．  （頭頸部の上皮異型性から扁平上皮癌まで：疫学的評価）  Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ。Ｓｕｐｐｌ．，  １９９７，  ５２７：  ４９−５１．
２１．  Ｓｕｄｂｏ  Ｊ，  Ｋｉｌｄａｌ  Ｗ，  Ｒｉｓｂｅｒｇ  Ｂ，  Ｋｏｐｐａｎｇ  ＨＳ，  Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  ＨＥ，  Ｒｅｉｔｈ  Ａ：  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａ．（口腔白斑症患者における予後診断マーカーとしてのＤＮＡ  内容）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ２００１，  ３４４（１７）：１２７０−１２７８．
２２．Ｄｅｍｅｄｔｓ  ＩＫ，  Ｄｅｍｏｏｒ  Ｔ，  Ｂｒａｃｋｅ  ＫＲ，  Ｊｏｏｓ  ＧＦ，  Ｂｒｕｓｓｅｌｌｅ  ＧＧ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＣＯＰＤ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｍｐｈｙｓｅｍａ．（ＣＯＰＤと肺気腫の病因におけるアポプトーシスの役割）Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｒｅｓ．，  ２００６，  ７：５３．
２３．Ｌｏｒｏ  ＬＬ，  Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ  ＡＣ，  Ｖｉｎｔｅｒｍｙｒ  ＯＫ：  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２  ｉｎ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｏｒａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ  ｄｙｓｐｌａｓｉａｓ．  （中等度および重度の口腔上皮異型におけるｂｃｌ‐２の発現減少）  Ｏｒａｌ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２００２，  ３８（７）：  ６９１−６９８．
２４．Ｙａｎｇ  ＳＲ，  Ｃｈｉｄａ  ＡＳ，  Ｂａｕｔｅｒ  ＭＲ，  Ｓｈａｆｉｑ  Ｎ，  Ｓｅｗｅｒｙｎｉａｋ  Ｋ，  Ｍａｇｇｉｒｗａｒ  ＳＢ，  Ｋｉｌｔｙ  Ｉ，  Ｒａｈｍａｎ  Ｉ：  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．（タバコの煙は、マクロファージにおけるＮＦ−ｋＢの活性化とヒストンデアセチラーゼの翻訳後修正によって前炎症性サイトカインの遊離を促す）  Ａｍ．Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２００６，  ２９１（１）：  Ｌ４６−５７．
２５．  Ｓａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ｓ，  Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｙ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｙ，  Ｋｉｒｉｙａｍａ  Ｍ，  Ｆｕｋａｉ  Ｉ，  Ｙａｍａｋａｗａ  Ｙ，  Ｆｕｊｉｉ  Ｙ：  Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  １  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  （肺癌におけるヒストンデアセチラーゼ１のｍＲＮＡ発現）  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００４，  ４６（２）：  １７１−１７８．
２６．Ｂａｌｃｉｕｎａｉｔｅ  Ｅ，  Ｓｐｅｋｔｏｒ  Ａ，  Ｌｅｎｔｓ  ＮＨ，  Ｃａｍ  Ｈ，  Ｔｅ  Ｒｉｅｌｅ  Ｈ，  Ｓｃｉｍｅ  Ａ，  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ  ＭＡ，  Ｙｏｕｎｇ  Ｒ，  Ｄｙｎｌａｃｈｔ  ＢＤ：  Ｐｏｃｋｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  （ポケット蛋白質複合体は休止状態および増殖中の細胞の明確な標的に集まる）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２００５，  ２５（１８）：  ８１６６−８１７８．  
２７．Ｓｏｎｉ  Ｓ，  Ｋａｕｒ  Ｊ，  Ｋｕｍａｒ  Ａ，  Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ  Ｎ，  Ｍａｔｈｕｒ  Ｍ，  Ｂａｈａｄｕｒ  Ｓ，  Ｓｈｕｋｌａ  ＮＫ，  Ｄｅｏ  ＳＶ，  Ｒａｌｈａｎ  Ｒ：  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｂ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  （ｒｂ経路の構成分の変化は口腔上皮異型の患者に頻回にみられ、扁平上皮癌患者において臨床結果を予測させる）  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２００５，  ６８（４−６）：  ３１４−３２５．
２８．Ｘｕｅ  Ｊｕｎ  Ｈ，  Ｇｅｍｍａ  Ａ，  Ｈｏｓｏｙａ  Ｙ，  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｋ，  Ｎａｒａ  Ｍ，  Ｈｏｓｏｍｉ  Ｙ，  Ｏｋａｎｏ  Ｔ，  Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  Ｆ，  Ｓｅｉｋｅ  Ｍ，  Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｋ，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ，  Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ，  Ｋｕｄｏｈ  Ｓ：Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＢ２／ｐ１３０  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  （人の肺癌におけるＲＢ２／ｐ１３０遺伝子の転写の減少）  Ｍｏｌ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，  ２００３，  ３８（３）：  １２４−１２９．  
２９．Ｍｉｓｈｉｎａ  Ｔ，  Ｄｏｓａｋａ−Ａｋｉｔａ  Ｈ，  Ｈｏｍｍｕｒａ  Ｆ，  Ｎｉｓｈｉ  Ｍ，  Ｋｏｊｉｍａ  Ｔ，  Ｏｇｕｒａ  Ｓ，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍ，  Ｋａｔｏｈ  Ｈ，  Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ．：  Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ．（非小細胞肺癌における予後診断マーカーとしての可能性があるサイクリンＥの発現）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２０００，  ６（１）：  １１−１６．  
３０．  Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｓ，  Ｍｉｈａｒａ  Ｍ，  Ｎａｋａｈａｒａ  Ｙ，  Ｋｉｙｏｔａ  Ａ，  Ｕｅｙａｍａ  Ｙ，  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｔ，  Ｗｏｎｇ  ＤＴ．：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ．    （口腔窩の正常な上皮、前悪性および悪性病巣においての細胞サイクル調節蛋白質の発現）  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．    ２００２，  ３８（３）：  ２３５−２４３．  
３１．Ｋｉｍ  ＪＨ，  Ｓｈｅｒｍａｎ  ＭＥ，  Ｃｕｒｒｉｅｒｏ  ＦＣ，  Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ  ＦＰ，  Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  ＰＴ，  Ｓｕｔｔｅｒ  ＴＲ：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ４５０  １Ａ１  ａｎｄ  １Ｂ１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｍｏｋｅｒｓ，  ｎｏｎ−ｓｍｏｋｅｒｓ，  ａｎｄ  ｅｘ−ｓｍｏｋｅｒｓ．（喫煙者、非喫煙者および元喫煙者の肺におけるチトクロームＰ４５０  １Ａ１  と１Ｂ１の発現）  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００４，  ２９９：  ２１０−２１９．  
３２．Ｒｕｓｚｎａｋ  Ｃ，  Ｍｉｌｌｓ  Ｐ，  Ｄｅｖａｌｉａ  Ｊ，  Ｓａｐｓｆｏｒｄ  Ｒ，  Ｄａｖｉｅｓ  Ｒ，  Ｌｏｚｅｗｉｃｚ  Ｓ．：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−１ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｓＩＣＡＭ−１  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｎｅｖｅｒ−ｓｍｏｋｅｒｓ，  ｓｍｏｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．  （非喫煙者、喫煙者およびＣＯＰＤ患者からの培養気管支上皮細胞の透過性、ＩＬ−１  ｂｅｔａ  とｓＩＣＡＭ−１遊離に与えるタバコの煙の影響）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０００，  ２３：  ５３０−５３６．
３３．Ｋａｔｓｕｒａｇｉ  Ｈ，  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ａ，  Ｓａｉｔｏ  Ｋ：  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  ｉｎ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｍｏｋｅｒｓ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  （進行した歯周炎患者における、喫煙者と非喫煙者のメタロチオネインの分布）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ６８（１０）：１００５−９．
３４．Ｃａｒｄｏｓａ  ＳＶ，  Ｂａｒｂｏｓａ  ＨＭ，  Ｃａｎｄｅｌｌｏｒｉ  ＩＭ，  Ｌｏｙｏｌａ  ＡＭ，  Ａｇｕｉａｒ  ＭＣ：  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  ｏｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ．  （口腔扁平上皮癌へのメタロチオネインの予後への影響）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ，  ２００２，  ４４１（２）：  １７４−１７８．
３５．Ｌｉ  Ｙ，  Ｍａｉｅ，  Ａ，  Ｚｈｏｕ  Ｘ，  Ｋｉｍ，  Ｙ，  Ｓｉｎｈａ  Ｕ，  Ｊｏｒｄａｎ  Ｒ，  Ｅｉｓｅｌｅ  Ｄ，  Ａｂｅｍａｙｏｒ  Ｅ，  Ｅｌａｓｈｏｆｆ  Ｄ，  Ｐａｒｋ  Ｎ，  Ｗｏｎｇ  Ｄ：  Ｓａｌｉｖａｒｙ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｏｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  （口腔癌検出のための唾液のトランスクリプトームの診断的特徴）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００４，  １０：  ８４４２−８４５０．
３６．Ｌｉ  Ｙ，  Ｚｈｏｕ  Ｘ，  Ｓｔ．Ｊｏｈｎ  ＭＡＲ，  Ｗｏｎｇ  ＤＴＷ：  ＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓａｌｉｖａ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（マイクロアレイ技術を使った無細胞唾液のＲＮＡプロファイリング）Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．  ２００４，  ８３（３）：１９９‐２０３．
３７．Ｔｈｅ  Ｍｏｕｔｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｄｄｒｅｓｓ  （口腔データベースのウェブサイトアドレス）
ｐｕｌｍ．ｂｕｍｃ．ｂｕ．ｅｄｕ／ＭｏｕｔｈＤＢ／ｉｎｄｅｘ．
３８．Ｔｈｅ  Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｄｄｒｅｓｓ  （統計学的コンピューター操作のためのＲ−プロジェクトのウェブサイトアドレス）
ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ
３９．Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｄｄｒｅｓｓ（スポットファイアのウェブサイトアドレス）  ｓｐｏｔｆｉｒｅ．ｃｏｍ
４０．ＥＡＳＥ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｄｄｒｅｓｓ  （ＥＡＳＥのウェブサイトアドレス）        ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ．ｊｓｐ
４１．ＣＬＵＳＴＥＲ，ＴＲＥＶＩＥＷ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｄｄｒｅｓｓ  （ＣＬＵＳＴＥＲ，とＴＲＥＶＩＥＷのウェブサイトアドレス）  ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ＥｉｓｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ
４３．  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ａ，  Ｔａｍａｙｏ  Ｐ，  Ｍｏｏｔｈａ  ＶＫ，  Ｍｕｒｋｈｅｒｊｅｅ  Ｓ，  Ｅｂｅｒｔ  ＢＬ，  Ｇｉｌｌｅｔｔｅ  ＭＡ，  Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ  Ａ，  Ｐｏｍｅｒｏｙ  ＳＬ，  Ｇｏｌｕｂ  ＴＲ，  Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，  Ｍｅｓｉｒｏｖ  ＪＰ：  Ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．  （遺伝子セット濃縮分析：ゲノム全体の発現プロファイル解釈のための知識ベースに基づくアプローチ）  ＰＮＡ，  ２００５，  １０２（４３）：  １５５４５−１５５５０．
４４．Ｄｉｎｇ  Ｃ，  Ｃａｎｔｏｒ，  ＣＲ：  Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ＭＳ．  （競合的ＰＣＲとマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析機を使った高速大量遺伝子発現解析技術）  ＰＮＡＳ，  ２００３，  １００（６）：  ３０５９−３０６４
４５．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ，  Ｄｅ  Ｐｒｅｔｅｒ  Ｋ，  Ｐａｔｔｙｎ  Ｆ，  Ｐｏｐｐｅ  Ｂ，  Ｖａｎ  Ｒｏｙ  Ｎ，  Ｄｅ  Ｐａｅｐｅ  Ａ，  Ｓｐｅｌｅｍａｎ  Ｆ：  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｄａｔａ  ｂｙ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｅｎｅｓ．  （複数の内部標準遺伝子の幾何平均によるリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲデータの正確な標準化）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，  ２００２，  ３（７）．
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】図１は、鼻腔上皮細胞において喫煙により発現レベルが変化する６０の遺伝子の発現による、現喫煙者（縞のボックス）と非喫煙者（白いボックス）からの気管支気道上皮細胞から採取されたサンプルの階層的クラスタリングを示す。気道サンプルは。適切なクラスとグループを形成する傾向がある。濃いグレイはより高いレベルの発現を意味し、薄いグレイはより低いレベルの発現を意味する。
【図２】図２は、類肉腫（縞のボックス）  のある患者と健常者（白いボックス）の鼻腔上皮細胞サンプルの、２グループ間で、ｔ−検定により発現が最も異なる２０の遺伝子（Ｐ＜．００００５）による階層的クラスタリングを示す。ほとんど例外なく、サンプルは適切なクラスにグループを形成する。  薄いグレイ＝低い発現レベル、黒＝平均的な発現レベル、濃いグレイ＝高い発現レベル。
【図３】図３は、口腔、鼻腔および気管支における喫煙に関連する遺伝子を示す。主成分分析（ＰＣＡ）は現喫煙者（濃いグレイ）と非喫煙者（黒）におけるタバコへの曝露によって影響を受ける遺伝子の発現の変動を示す。気道上皮細胞のタイプは符号の形により示される：気管支（円）、鼻腔（三角形）、口腔（正方形）。口腔からのサンプル以外は、サンプルは第一主成分の全域にわたって、喫煙状態により大まかに分離する。これは、気管支上皮細胞と鼻腔上皮細胞の両方にみられる、共通した宿主反応としての遺伝子発現であることを指摘する。
【図４】図４は、癌サンプルのスーパーバイズド階層的クラスタ解析を示す。類肉腫を有する個人と有しない個人から肺組織と鼻腔組織を採取した。遺伝子発現解析は、３７遺伝子の発現が、気管支あるいは鼻腔からの癌サンプルを癌でないサンプルから区別するために使用できることを示した。クラスタ解析の薄いグレイは低いレベルの発現を意味し、濃いグレイは高いレベルの発現を意味する。円の隣の星印は、これらのサンプルが、０−１期の類肉腫患者から採取されたことを意味する。円の隣の点は、これらのサンプルが４期の類肉腫患者から採取されたことを意味する。
【図５】図５は、表９に示された最先端の１０７遺伝子を含めて、気道サンプルのｔ−検定遺伝子を鼻腔のデータに投影させたものを示す。喫煙に反応して鼻腔上皮細胞で顕著に変化した遺伝子のなかで、気道上皮細胞で発現の異なった遺伝子の強化。ＧＳＥＡ解析の結果は、発現の異なる主要な最先端の気管支上皮細胞の３６１遺伝子組が、喫煙に反応して鼻腔上皮細胞の発現の異なる遺伝子のリストの上位に大きな比率を占めることを示す。”主要な最先端の遺伝子サブセット”（Ｐ＜０．００１）を構成する１０７遺伝子がある。
【図６】図６は、気道においての１０７の主要な最先端遺伝子を示す  −  鼻腔のサンプルのＰＣＡ  による。円の隣の星印は現喫煙者を意味する。濃いグレイの円は非喫煙者からのサンプルであることを意味する。気管支上皮細胞からの１０７の”最先端”遺伝子の主成分分析は鼻腔上皮細胞の遺伝子発現プロファイルにおいて濃縮されることを示した。鼻腔上皮細胞の発現プロファイルに濃縮された。気管支上皮細胞に特徴的な１０７の“最先端”遺伝子の二次元ＰＣＡ．
【図７】図７は、１０の組織からの気管支への投影を示す。この図から、気管支上皮細胞（点のある正方形）のサンプルと鼻腔上皮細胞（交差線のある正方形）からのサンプルが密接に重複し、口腔を含めて他の組織からのサンプルから明瞭に区別されることがわかる。１０組織の全体にわたる正常な気道のトランスクリプトームからの２３８２遺伝子の主成分分析。異なる１０の組織タイプの全体にわたる正常な気道のトランスクリプトームからの２３８２遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）。トランスクリプトーム遺伝子の発現に基づいて、サンプルの分離がみられる。
【図８】図８は、上皮細胞の機能カテゴリーにわたる５１遺伝子の階層的クラスタリングを示す。ムチン、ダイニン／微小管、チトクローム  Ｐ４５０、グルタチオン、およびケラチンの機能的遺伝子のカテゴリーにわたる５１遺伝子のスーパーバイズド階層的クラスタ解析。該５１遺伝子は、各機能グループとは別に、１０の組織の全体にわたって、クラスターを形成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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