(57)【要約】  本発明は、α２β１インテグリンＩドメイン（特にＭＩＤＡＳ）の精巧且つ詳細な分子モデルに関し、また、新規なインテグリンモジュレータ（特にα２β１インテグリンモジュレータ）を設計するための、かかるモデルの使用に関する。更に、本発明は、新規なα２β１インテグリンモジュレータであって、治療可能性を有するモジュレータに関する。更に、本発明は、コラーゲン受容体、四環系ポリケチド及びスルホンアミドと相互作用する、小分子モジュレータの特定のファミリーに関する。更に、本発明は、血栓症、血管疾患、炎症及び／又は癌用の医薬を製造するための、かかるモジュレータの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸座標（amino acid coordinates）Ａｓｐ１５１、Ｓｅｒ１５３、Ｓｅｒ１５５、Ｔｈｒ２２１、Ａｓｐ２５４、Ｔｙｒ２８５、Ｌｅｕ２８６及びＬｅｕ２９６により特徴付けられる、α２β１インテグリンＩドメインのＭＩＤＡＳの精巧なインシリコ（in silico）モデル。
【請求項２】
アミノ酸座標Ａｓｎ１５４、Ｇｌｙ２１８、Ａｓｐ２１９、Ｇｌｙ２５５、Ｇｌｕ２５６、Ａｓｎ２８９、Ｌｅｕ２９１及びＡｓｐ２９２により特徴付けられる、請求項１記載のモデル。
【請求項３】
表１に示すアミノ酸座標により特徴付けられる、請求項２記載のモデル。
【請求項４】
鍵となる水分子Ｗ５１４、Ｗ６９９、Ｗ７０１、Ｗ７００、Ｗ６６８、Ｗ５９７、Ｗ６４４及びＷ５０６によって特徴付けられる、請求項１〜３の何れか一項に記載のモデル。
【請求項５】
α２β１インテグリンを調節する化合物を同定する方法であって：
（ａ）α２β１Ｉドメイン含有インテグリンの原子座標に、３次元分子モデリング用アルゴリズムを適用して、前記インテグリンの金属イオン依存結合部位（ＭＩＤＡＳ）の空間座標を決定する工程；及び
（ｂ）保存された一組の候補化合物の立体座標を、工程（ａ）で決定された前記空間座標に対するインシリコ（in silico）スクリーニングにかけ、前記インテグリンのＭＩＤＡＳに結合可能な化合物を同定する工程；
を含んでなる方法。
【請求項６】
（ｃ）前記モデルで使用されたアミノ酸残基を含有する、インテグリンα２Ｉドメインの断片を提供する工程；
（ｄ）前記断片を前記候補モジュレータに接触させる工程；及び
ｅ）前記ペプチド断片の前記潜在的阻害剤との結合能力を決定する工程
を更に含んでなる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、インテグリン阻害剤である、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７の何れか一項に記載の方法により同定又は取得される、α２β１Ｉドメイン含有インテグリン調節化合物。
【請求項９】
一般式（Ｉ）を有する
【化１】
2009509939.tif 000012
（式中、
ＲCは、ジアルキルアミノ、ＮＯ2、ＣＮ、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルカノイル、オキサゾル−２−イル、オキサゾリルアミノカルボニル、アリール、アロイル、アリール−ＣＨ（ＯＨ）−、アリールアミノカルボニル、フラニル、グアニジニル−（ＣＨ2）Z−Ｎ（Ｒ’）−、Ｈｅｔ−（ＣＨ2）Z−Ｎ（Ｒ’）−、Ｈｅｔ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ’）−、Ｈｅｔ−ＣＨ（ＯＨ）−及びＨｅｔ−ＣＯ−からなる群より選択され、ここで、アリール、アロイル及びフラニル部分は置換されていてもよく、Ｈｅｔは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい４員〜６員の複素環式環であり、Ｒ’は水素又はアルキルであり、ｚは１〜５の整数であり；
ＲAは、式
【化２】
2009509939.tif 000013
を有する基
（式中、
Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アリール、アルコキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、シアノ、トリフルオロメチル、アルカノイル、アルカノイルアミノ、トリフルオロメトキシ、置換されていてもよいアリール基を表わす）であり；
ＲBは、水素、アルキル、アルカノイル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノアルキル、モノ−又はジ−アルキルアミノアルキル又はＨｅｔ−アルキルであり、ここでＨｅｔは上で定義された通りであり；
但し、
（iv）ＲCがジアルキルアミノの場合、ＲBは水素又はアルキルではなく；
（ｖ）ＲAが式（Ｃ）の基であり、Ｒ3が水素であり、Ｒ4がメトキシである場合、ＲCはＨｅｔ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ’）−ではなく；
（vi）ＲAが式（Ｃ）の基であり、Ｒ3及びＲ4が水素又はハロゲンである場合、ＲCはニトロではない）、
請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
インテグリン阻害剤である、請求項７記載の化合物。
【請求項１１】
４’−フルオロビフェニル−３−スルホン酸（４−ベンゾイルフェニル）アミドである、請求項８記載の化合物。
【請求項１２】
４’−フルオロビフェニル−３−スルホン酸（３−ベンゾイルフェニル）アミドである、請求項８記載の化合物。
【請求項１３】
４’−フルオロビフェニル−３−スルホン酸（α−ヒドロキシベンジルフェニル）アミドである、請求項８記載の化合物。
【請求項１４】
２−オキソ−イミダゾリジン−１−カルボン酸｛４−［（４’−フルオロ−ビフェニル−３−スルホニル）−メチル−アミノ］−フェニル｝−アミドである、請求項８記載の化合物。
【請求項１５】
四環系ポリケチドである、請求項８記載の化合物。
【請求項１６】
メチル２−エチル−２，５，７，１２−テトラヒドロキシ−４，６，１１−トリオキソ−１，２，３−トリヒドロナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
メチル２−エチル−４，５，７，１２−テトラヒドロキシ−６，１１−ジオキソナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１４記載の化合物。
【請求項１８】
メチル４，５，７，１２−テトラヒドロキシ−２−（メチルエチル）−６，１１−ジオキソナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１４記載の化合物。
【請求項１９】
メチル２−エチル−４，５，７−トリヒドロキシ−６，１１ジオキソナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１４記載の化合物。
【請求項２０】
請求項８〜１８の何れか一項に記載の化合物の使用であって、血栓症、血管疾患、癌、線維症及び炎症の治療用の医薬組成物を製造するための使用。
【請求項２１】
前立腺癌、胃癌、膵又は子宮癌、又はメラノーマの治療用、並びに腫瘍血管形成の予防用の医薬組成物を製造するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
転移の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、請求項１０記載の使用。
【請求項２３】
脳卒中、心筋梗塞、糖尿病性網膜症又は網膜静脈閉鎖症の治療用の医薬組成物を製造するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２４】
線維症及び骨折に関連する炎症疾患の治療用医薬組成物を製造するための、請求項１９記載の使用。
【請求項２５】
血栓症、癌、線維症及び炎症を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、請求項８〜１８の何れか一項に記載の化合物を有効量投与することによる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｉドメイン（特にＭＩＤＡＳと呼ばれる金属イオン依存性接着部位）の、精巧且つ詳細な分子モデルに関し、また、新規なインテグリンモジュレータ（特にα２β１インテグリンモジュレータ）を設計するための、かかるモデルの使用に関する。更に、本発明は、ＭＩＤＡＳアミノ酸残基に必要な鍵となる相互作用によって特徴付けられる新規なα２β１インテグリンモジュレータであって、インテグリンのＩドメイン相互作用（特にコラーゲン結合及びコラーゲン機能）を調節し、治療可能性を有するモジュレータに関する。更に、本発明は、コラーゲン受容体、四環系ポリケチド及びスルホンアミドと相互作用する、小分子モジュレータの特定のファミリーに関する。更に、本発明は、血栓症、血管疾患、炎症及び／又は癌用の医薬を製造するための、かかるモジュレータの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは細胞接着受容体の大ファミリーであって、ヒトのあらゆる細胞において、周囲の細胞外マトリックスへの固定を媒介している。更に、インテグリンは、細胞分裂、細胞分化、細胞移動及び細胞生存等の、他の様々な細胞機能にも関与している。ヒトインテグリン遺伝子ファミリーは、１８種のαインテグリン遺伝子及び８種類のβインテグリン遺伝子を含有し、これらは対応するαサブユニット及びβサブユニットをコード化している。各機能細胞表面受容体には、αサブユニット１種とβサブユニット１種とが必要になる。即ち、ヒト細胞には２４種の異なるα−βの組み合わせが存在する。αサブユニットのうち９種は、特異的な「挿入」Ｉドメインを有しており、これがリガンドの認識及び結合に関与している。αＩドメイン含有インテグリンサブユニットのうち４種、すなわち、α１、α２、α１０及びα１１は、コラーゲンの主な細胞受容体となっている。これら４種のαサブユニットは各々、β１サブユニット（これも、別のＭＩＤＡＳを有するＩ様ドメインを含有している）と共に、ヘテロダイマーを形成する（Springer and Wang, 2004）。即ち、コラーゲン受容体のインテグリンは、α１β１、α２β１、α１０β１及びα１１β１である（White et al., Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36:1405-1410 に概説あり）。コラーゲンは、細胞外マトリックスタンパク質の最も大きいファミリーであり、少なくとも２７種の異なるコラーゲンサブタイプ（コラーゲンＩ〜XXVII）から構成されている。
【０００３】
インテグリンα２β１は、上皮細胞、血小板、炎症細胞、並びに多くの間葉細胞（例えば内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞及び軟骨芽細胞等）で発現している（上掲のWhite et al.,において概説）。疫学的な証拠によれば、血小板におけるα２β１の高い発現レベルは、心筋梗塞及び脳血管発作（Santoso et al., Blood, 1999, Carlsson et al., Blood. 1999, 93:3583-3586）、糖尿病性網膜症（Matsubara et al., Blood. 2000, 95:1560-1564）及び網膜静脈閉鎖症（Dodson et al., Eye. 2003, 17:772-777）のリスク増加と関連付けられる。動物モデルで得られた証拠は、血栓症について提唱されているα２β１の役割を支持している。また、インテグリンα２β１は、浸潤性前立腺癌、悪性メラノーマ、膵癌、胃癌及び卵巣癌等の癌でも過剰発現されている。これらの知見から、α２β１インテグリンは、癌浸潤及び癌転移と関連付けられる。更に、癌関連血管形成は、抗α２機能阻害抗体によって部分的に阻害され得る（Senger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:13612-13617）。最後に、白血球は炎症過程において、α２β１機能に部分依存性を示す（de Fougerolles et al., J. Clin. Invest., 2000, 105:721-729）。組織分布及び実験証拠によれば、炎症、線維症、骨折治癒及び癌血管形成には、α１β１インテグリンが重要であると考えられるのに対して（White et al.、上掲）、骨及び軟骨の調節には、４種のコラーゲン受容体インテグリン全てが関与している可能性がある。
【０００４】
種々の病理過程におけるコラーゲン受容体の関与を示す有力な証拠から、コラーゲン受容体は医薬開発の潜在的標的となっている。α１又はα２サブユニットに対する機能阻害抗体は、炎症性疾患及び癌血管形成のモデルを含む幾つかの動物モデルで有効であった。合成ペプチド阻害剤の他に、α１β１及びα２β１の機能を阻害するヘビ毒ペプチドが報告されている（EbIe, Curr Pharm Design 2005, 11 :867-880）。国際特許公報ＷＯ９９／０２５５１には、α２β１の発現を調節する小分子の薬物候補が１つ開示されているが、これは実際にはインテグリンに結合しない。
【０００５】
コラーゲン結合αＩドメインは、コラーゲン受容体を標的とした合理的薬物設計において、極めて重要な役割を果たす。α２ＩドメインがコラーゲンＩ中の高親和性モチーフの１つに結合する機序が知られている。しかし、αＩドメインは他にも、潜在的に薬剤開発の興味の対象となり得る部位を複数有している。
【０００６】
α２Ｉドメインの構造は、非連結型の（unligated）「不活性な」（「閉鎖」）形態については、Emsley et al. in J. Biol. Chem, 1997, 272: 28512-7 に記載されている。Ｉドメイン及び関連するｖＷｆＡドメインの重要な特徴は、これらが５本の平行及び１本の逆平行のβストランドからなる特徴的な集合構造を有し、これらのストランドが安定な構造の骨格を形成することである。Ｉドメインのもう一つの重大な特徴は、配列ＤｘＳｘＳ（ｘは任意のアミノ酸を表す）で表わされるアミノ酸モチーフを有することである。これらの３つのアミノ酸、Ｄ１５１、Ｓ１５３及びＳ１５５は、α２Ｉドメインの最初のβストランドから延びるＮ末端ループ内に存在し、近傍のペプチドループ内の他の酸素含有残基と共に、金属イオンに配位結合して金属イオン依存接着部位（ＭＩＤＡＳ）を構成する。
【０００７】
国際特許公報ＷＯ０１／７３４４４には、インテグリンα２Ｉドメインと複合体形成したコラーゲン模倣三重らせんペプチドの結晶構造が記載されている。本文献の開示によれば、この活性化（「開放」）高次構造では、前掲の１９９７年の不活性構造に記載のように、金属イオンはＡｓｐ２５４ではなくＴｈｒ２２１に配位結合する。この配位結合の変化に加えて、ＷＯ０１／７３４４には、Ｃへリックスが巻き戻され、隣のへリックスにおいて更なる巻きが存在することが開示されている。現在までのところ、これが、Ｉドメイン／コラーゲン複合体構造に対する最も優れた近似である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現時点で本発明者等が知る限りでは、コラーゲン受容体インテグリンα２β１のＭＩＤＡＳに結合することが示された小分子阻害剤は知られていない。インテグリンＭＩＤＡＳのコラーゲン結合部位の表面は非常に大きいため、物理的に結合部位全体を覆う構造の小型（サイズ＜６００ｇ／ｍｏｌ）分子を設計することは不可能である。即ち、創薬において所望されるコラーゲン２１とインテグリンα２β１との相互作用を調節するような、新規な小分子の設計を可能にするために、（インテグリンα２β１のＩドメイン）ＭＩＤＡＳの改良モデルや、小分子結合の試験法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、表１に示されるアミノ酸座標（amino acid coordinates）、特にアミノ酸座標Ａｓｐ１５１、Ｓｅｒ１５３、Ｓｅｒ１５５、Ｔｈｒ２２１、Ａｓｐ２５４、Ｔｙｒ２８５、Ｌｅｕ２８６及びＬｅｕ２９６並びにアミノ酸座標Ａｓｎ１５４、Ｇｌｙ２１８、Ａｓｐ２１９、Ｇｌｙ２５５、Ｇｌｕ２５６、Ａｓｎ２８９、Ｌｅｕ２９１及びＡｓｐ２９２により特徴付けられる、インテグリンＩドメインのＭＩＤＡＳの精密なインシリコ（in silico）モデルに関する。更に本発明は、鍵となる水分子Ｗ５１４、Ｗ６９９、Ｗ７０１、Ｗ７００、Ｗ６６８、Ｗ５９７、Ｗ６４４及びＷ５０６によって特徴付けられるモデルに関する。
【００１０】
また、本発明は、潜在的なモジュレータを設計又は選択するべく、前記モデルを用いてＩドメイン含有インテグリンの潜在的なモジュレータを同定する方法に関する。
【００１１】
更に、本発明は、α２β１インテグリンを調節する化合物、好ましくはα２β１インテグリン阻害剤を同定する方法に関する。前記方法では、空間配座Ｉドメイン含有インテグリンの原子座標に３次元分子モデル用のアルゴリズムを適用し、該インテグリンのＭＩＤＡＳの空間配座を決定する。続いて、保存された一組の候補化合物の立体座標を、前記空間座標に対するインシリコスクリーニングにかける。この比較に基づいて、前記インテグリンのＭＩＤＡＳに結合できる化合物が同定される。かかる化合物としては、インテグリン阻害剤が好ましい。
【００１２】
更に、本発明は、本発明の方法により同定又は取得される、Ｉドメイン含有インテグリンの新規なモジュレータにも関する。本発明のインテグリンモジュレータは、水素結合ドナー又はアクセプターの相互作用、疎水性相互作用、水素結合ドナー相互作用及び金属イオン相互作用等の、ＭＩＤＡＳのアミノ酸残基に必要な鍵となる相互作用により特徴付けられる。
【００１３】
更に、本発明は、四環系ポリケチド及びスルホンアミド誘導体等の新規なインテグリン阻害剤に関する。
【００１４】
更に、本発明は、本発明のモジュレータの使用に関し、好ましくは、血栓症、癌、線維症又は炎症の治療用の医薬組成物を製造するための阻害剤の使用に関する。
【００１５】
更に、本発明は、本発明の阻害剤を有効量投与することによる、血栓症、血管疾患、癌、線維症又は炎症の治療方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、新たなモジュレータと複合体形成したＩドメイン（特にＭＩＤＡＳ）の、精巧且つ詳細な分子モデルに関し、また、新規なインテグリンの小分子モジュレータ（特にα２β１インテグリンモジュレータ）を設計するための、かかる分子モデルの使用に関する。かかる小分子インテグリンモジュレータは、コラーゲン模倣ペプチドについて現在知られている結合メカニズとは、異なる結合メカニズムに従ってインテグリンと結合する。
【００１７】
更に、本発明は、Ｉドメインの金属イオン依存接着部位（ＭＩＤＡＳ）の分子モデル、並びに、この結合部位の原子と、この部位に結合した小分子モジュレータとの間における相互作用の原子的詳細に関する。より具体的に、本発明は、αＩドメインとモジュレータ（合成四環系ポリケチド及びスルホンアミドインテグリンモジュレータ等）との間の複合体形成に関与する、重要なアミノ酸、ペプチド主鎖原子及び水分子について説明する。構造に基づく小分子設計を用いて見出された四環系ポリケチド化合物が、α２Ｉドメインに結合することを実験により示す。
【００１８】
更に、本発明は、公に入手可能なＸ線データ由来のαＩドメイン構造モデルに基づいて新規なα２インテグリン結合性小分子を設計するための、構造に基づく基準に関する。
【００１９】
本発明で報告するＭＩＤＡＳアミノ酸結合性小分子の基準は、リガンドがＩドメインに結合する際に重要であると認められている既報の分子間相互作用を満足する限りにおいて、四環系ポリケチド又はスルホンアミド以外の化学物質の結合にも適用することが可能である。
【００２０】
更に、本発明の方法は、α２β１インテグリンの他に、コラーゲン受容体インテグリンα１β１、α１０β１及びα１１β１に結合する阻害剤を設計し、スクリーニングする上でも有用であることを示す。
【００２１】
更に、本発明は、ＭＩＤＡＳのアミノ酸残基に必要な、鍵となる相互作用により特徴付けられる、新規なαＩドメインモジュレータに関する。かかる相互作用としては、水素結合ドナー又はアクセプター（ＨＢＤＡ）の相互作用、疎水性（ＨＹＤ）相互作用、水素結合ドナー（ＨＢＤ）相互作用及び金属イオン（Ｍｇ）相互作用が挙げられる。また、本発明のモジュレータは、ＭＩＤＡＳ内に存在する水分子と相互作用し、又はこれを置換することも可能である。
【００２２】
本発明のインテグリンモジュレータは、直接ＩドメインＭＩＤＡＳ結合性モジュレータと、アロステリックＩ様ドメインＭＩＤＡＳ結合性モジュレータとを包含する。かかるモジュレータは阻害剤であることが好ましい。
【００２３】
即ち、本発明は、四環系ポリケチド及びスルホンアミド誘導体等の新規なインテグリン阻害剤を提供する。
【００２４】
本発明は、血栓症、癌、線維症及び炎症に関連する疾患の治療用医薬の製造における、かかるインテグリンモジュレータの使用を提供する。
【００２５】
Ｉドメインの構造上の特徴の説明
現在のα２インテグリンの構造に関する知見は、Ｉドメインの２つの静的構造である閉鎖構造及び開放構造について記載された、上述の刊行物に基づくものである。実際には、Ｉドメイン、特にＭＩＤＡＳの種々の部分は動的である。Ｉドメインは、細胞内における分子環境に応じてその高次構造を変化させる。ＭＩＤＡＳに別の分子が結合すると、異なる高次構造が生じ得る。生体分子と競合的に結合することで、生物学的に重要な分子実体とＭＩＤＡＳとの相互作用を調節可能な小分子の設計には、単に２つの静的受容体モデルからは導き出すことのできない受容体−リガンド相互作用の動態に関する詳細な情報が必要となる。
【００２６】
前述した既報の２つの構造は、可動ドメインの２つの「写真」と比較することができる。本発明では、結晶構造から得られた情報を分子モデリングによって拡張し、いわゆるアンサンブルモデル（ensemble-models）を作成した。Ｉドメイン（特にＭＩＤＡＳ）が結合リガンドの構造と一致する可能性を、Bodil Modeling Environment（Lehtonen et. al. 2004）を用いて検討した。更に、リガンドの高次構造空間及び受容体誘導性高次構造変化について、フレキシブルドッキング試験（flexible docking study）（Sybyl, Tripos Inc.製プログラムFlexX ）を用いて検討した。
【００２７】
Ｉドメインのコラーゲンとの相互作用は、以前から変異実験によって研究されており、コラーゲンのα２Ｉドメインとの接触を構成する部位は、β Ａ−鎖及びαへリックス１と結合するＡｓｎ１５４；αへリックス３及び４と結合するＡｓｐ２１９及びＬｅｕ２００；β Ｄ−鎖及びαへリックス５と結合するＧｌｕ２５６、Ｈｉｓ２５８；Ｃへリックス、αへリックス６、β Ｃ−鎖及びαへリックス６と結合するＴｙｒ２８５、Ａｓｎ２８９、Ｌｅｕ２９１、Ａｓｎ２９５及びＬｙｓ２９８であることが示されている。Ｇｌｕ２５６及びＡｓｎ２９５におけるＡｌａ変異では、コラーゲン結合に変化が生じないことも知られている。
【００２８】
Ａｓｐ１５１、ＳｅＭ５３、Ｔｈｒ２２１及びＡｓｐ２５４に影響する変異は、コラーゲン結合に変化を引き起こすことが知られている。かかる効果の主な原因は、これらのアミノ酸がコラーゲン結合に不可欠なＩドメインの金属イオンに結合する、という事実にある。
【００２９】
国際特許公報ＷＯ０１／７３４４４は、α２Ｉドメインに結合する３量体コラーゲン模倣ＧＦＯＧＥＲ−ペプチドが、以下のアミノ酸の影響を受けることを開示している。即ち、へリックス１の中央ストランドでは、グルタミン酸が金属に配位結合し、ＡｒｇがＡｓｐと塩橋を形成し、フェニルアラニンがＧｌｎ２１５とＡｓｎ１５４との間に位置する。最外側へリックス２の垂下ストランドでは、フェニルアラニンがＴｙｒ１５７、Ｌｅｕ２８６と接触し、アルギニンがＧｌｕ２５６と近接しているが、結晶構造中で塩橋を形成しない。へリックス３の主鎖では、Ａｓｎ１５４とＴｙｒ１５７との間に水素結合が存在してコンタクトループ１を形成し、ループ３にＨｉｓ２５８が存在する。
【００３０】
コラーゲン模倣ペプチドがＭＩＤＡＳに結合する際には、明らかな高次構造変化が生じる。Ｍｇ2+金属配位が変化し、ＩドメインのＣへリックスは金属に配位結合するためにコラーゲンから離れて行く。この移動の結果生じる構造変化によって、Ｉドメインの対極にまで構造衝撃が伝わる。
【００３１】
国際特許公報ＷＯ０１／７３４４４に記載のように、Ｉドメインが閉鎖形から開放形に変化するとき、コラーゲンは金属をアミノ酸Ｔｈｒ２２１側に「押す（pushes）」。この動きにＭＩＤＡＳ内ループも伴動する。Ｓｅｒ１５３及びＳｅｒ１５５の金属配位結合は変化しないが、Ａｓｐ２５４金属結合は切断される。Ｇｌｙ２５５ペプチド結合が１８０度回転し、金属から離れる。Ｇｌｕ２５６は水を介して金属と結合を形成する。Ｔｙｒ１７５及びＨｉｓ２５８は、少なくともコラーゲン模倣ペプチドとの関係で、コラーゲン３量体へリックスストランドに沈みこむ。
【００３２】
この結果、へリックス７は劇的に変化し、ＭＩＤＡＳのＣへリックスが巻き戻され、αへリックス６内に新たなコイルが形成される。錯体形成の観点から最も重要な高次構造変化は、コラーゲンのグルタミン酸が金属に向かって移動し、その金属に配位結合することである。コラーゲンがＩドメインＭＩＤＡＳ金属と接触可能になるには、Ｔｙｒ２８５側鎖による立体阻害を克服しなければならない。このアミノ酸は、ＩドメインのＣへリックス内に位置する。
【００３３】
αＩドメインの高次構造変化によって、αβヘテロ２量体全体に別の高次構造変化が生じ、これによって更に細胞内信号経路の活性化が生じる。これはおそらく、αサブユニット及びβサブユニットの細胞質ドメインが互いに離れるためであると考えられる。
【００３４】
既存モデルのモデリング及び改善時には、モジュレータ設計に関する以下の所見が得られた。
【００３５】
Ｉドメイン内Ｃへリックスの生物学的役割として、コラーゲンの金属への結合を阻害するという点が考えられる。コラーゲン結合の小分子モジュレータを設計する場合、この事実を考慮に入れることが重要である。受容体の閉鎖形Ｉドメインへのコラーゲンの結合は、Ｃへリックス高次構造によって阻害される。従って、閉鎖形にあるＣへリックスを更に安定化できるというモジュレータ特性は、新規な小分子のコラーゲン結合モジュレータを設計する場合には重要な特性となる。この特性を考慮して設計されたモジュレータは、コラーゲンの結合を阻害する。これは、本発明者等の実験が示す通りである。図２では、Ｉドメインの閉鎖形を灰色で示し、コラーゲン模倣ＧＦＯＧＥＲペプチドの結合した開放形を黒色で示している（明確化のため、コラーゲンペプチドは図示を省略している）。コラーゲン結合阻害モジュレータを設計する場合、モジュレータの結合によってＩドメインの閉鎖形が安定化され、コラーゲン結合が阻害されるようにすべきである。
【００３６】
ＭＩＤＡＳの構造に基づくモジュレータの設計のための一般的な観察及び基準
過去に報告されたコラーゲン模倣薬結合時の構造変化に関する解釈とは異なり、本発明者等は、新規コラーゲン結合モジュレータの設計に重要な、鍵となるＭＩＤＡＳアミノ酸であるセリン及びトレオニン（Ｓｅｒ１５３、Ｓｅｒ１５５及びＴｈｒ２２１）の位置及び距離（ジオメトリ）に関する特徴も見出した。剛性タンパク質座標における変化の解釈は、座標の上書き（superimposing）に用いられる方法に依存するため、重ね合わせ（superposition）の解釈に影響を与える。本モデリングでは、タンパク質の全体構造を上書きの手段として用いるのではなく、ＭＩＤＡＳ構造のみに限定して上書きに供した。驚くべきことに、これによって、コラーゲン模倣ＧＦＯＧＥＲペプチドの結合時に生じる構造変化の新規な解釈が得られる。本発明において、開放形と閉鎖形との重ね合わせは、鍵となるアミノ酸Ｓｅｒ１５３（及びＳｅｒ１５５）側鎖の座標を用いて行なう。すると、過去の解釈とは反対に、ＭＩＤＡＳの金属イオンは移動することなく、原位置付近に留まる。むしろ、金属を取り囲むタンパク質の主鎖が再構成され、Ｉドメインの開放高次構造では閉鎖形に比べて、互いにより近接した位置に移動する。
【００３７】
Ｍｇ2+金属配位に変化が生じる。Ｔｈｒ２２１が金属に配位結合し、配位結合していた水分子１つが除去される。この別の重ね合わせから得られる知見は、開放高次構造では同時に、金属を取り囲むタンパク質の主鎖が、互いに新しい接触を形成するということである。Ｓｅｒ１５３とＴｈｒ２２１とは、閉鎖形よりも開放形において、互いにより近接している。即ち、閉鎖形を安定化することを目的とした調節剤の特性は、Ｔｈｒ２２１が水分子を介して金属と配位結合し続けるように、閉鎖形におけるＴｈｒ２２１の位置を安定化することに重点を置いたものとすべきである。これによって、Ｔｈｒ２２１が金属イオンに向かって移動し、Ｉドメインの開放形との間で典型的な金属配位を取るのを防止できる。結晶水Ｗ５９７は、Ｉドメインの閉鎖形では、受容体及びＴｈｒ２２１に強く結合している。モジュレータは、例えばＷ５９７から水素結合を受容し、Ｔｈｒ２２１近傍の結晶水を補足することで作用を及ぼす（後に詳細を記載する）。開放高次構造では、水Ｗ５９７は除去される。Ｔｈｒ２２１−結晶水−金属安定化モジュレータはこのように閉鎖形を安定化することにより、コラーゲン結合を阻害し得るのである。
【００３８】
更に、ＩドメインのＣへリックス内の結合ポケットの壁部にあるアミノ酸の特定の特徴が、モジュレータの構造設計に有用であることが見出された。モジュレータがＩドメインの閉鎖形のＣへリックス（例えば、図１のＣへリックスの疎水面）と構成的に相互作用すれば、それによってＣへリックス構造が安定化し、コラーゲン結合の更なる調節が可能となる。
【００３９】
図１において、ＭＩＤＡＳのリガンド結合キャビティーの疎水面（白い部分）は、結合リガンドによって埋められることが好ましい。このリガンド部位は、マグネシウムイオンとＧｌｕ２５６（ＨＢＤ）の主鎖アミノ基及びＴｙｒ２８５の水酸基との、鍵となる相互作用によって安定化され得る。これらの相互作用は、受容体を「閉鎖」高次構造に維持するための鍵となる安定化相互作用であり、これによって新規リガンド発見の基礎となるファルマコフォアが形成される。
【００４０】
例えば、四環系ポリケチドはＣへリックス内のＴｙｒ２８５と、芳香族−芳香族（π−π）相互作用を形成し得る。図３に、ＣへリックスにおけるＴｙｒ２８５の位置が、リガンドの結合高次構造を安定化することを示す（ドッキングしたリガンド全てを線モデルで示している）。シミュレーション実験によれば、このクラスのモジュレータ内の水素結合アクセプターがチロシンの水酸基との間で水素結合を形成し、また、モジュレータの水酸基とカルボニル基との間にも水素結合を形成することが示された。
【００４１】
シミュレーションにおいて、Ｃヘリックス及びヘリックス６のアミノ酸Ｌｅｕ２８６及びＬｅｕ２９１が、モジュレータの疎水性イソプロピルエチル基、及び該構造の芳香族末端基とで疎水性相互作用を形成することが示された。この相互作用はＣへリックスの安定化に重要であることも判明した。
【００４２】
α２Ｉドメインと潜在的なモジュレータとの間の特異的な相互作用
本発明は、Ｉドメインの閉鎖形のＭＩＤＡＳの一般的な３次元形態を提供する。ＭＩＤＡＳの形状は、モジュレータを設計する上で重要である。また、閉鎖形のタンパク質−モジュレータ間の形状適合性によって、可溶性、吸収性又は代謝等の薬理学的特性等の改善のために追加される新たな化学基の導入／除去が制限される。これらの改善によって、化合物の結合親和性が過度に妨げられるべきではない。このことは、首尾よくリード化合物を得るための最優先の要件である。
【００４３】
表１並びに図５及び図１１Ｂに、２α２Ｉドメイン結合部位のアミノ酸、主鎖の原子及び結晶水を詳細に記載する。これらは何れも、α２Ｉドメインと相互作用するモジュレータを設計する際に、構造上重要である。
【００４４】
Bodil Modeling Environment（Lehtonen et al., al. http://www.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/iohnson/bodil.html: 2004）及びSybyl（6.9.1. St. Louis, MO, USA, Tripos Inc.）を用いたドッキングシミュレーション実験によれば、表１に示す以下のアミノ酸が同定される。表１では、モジュレータに対する各アミノ酸の相対距離を記す。
【００４５】
【表１】
2009509939.tif 000002
【００４６】
表１に列挙するアミノ酸は、四環系ポリケチドを用いた分子ドッキング実験において、重要な相互作用を生じたものである。ＭＩＤＡＳアミノ酸を三層に分割した。これらの層はそれぞれ、図４及び図５における白色、灰色及び黒色に対応する。層１は、ドッキングしたリガンドから４Å以内のＭＩＤＡＳアミノ酸を挙げたものであり、図４及び図５では黒色で示す。層２（図４及び図５の灰色）は、ドッキングしたリガンドから４〜８Åの範囲内の距離にあるＭＩＤＡＳアミノ酸を挙げたものである。層３（図４及び図５の白色）は、ドッキングしたリガンドから８Åを超えるＭＩＤＡＳのアミノ酸を挙げたものである。結合部位アミノ酸側鎖の最も重要な相互作用は、リガンド構造との直接的な相互作用である（層１、図４及び図５における黒色）。また、他の層も、層１のアミノ酸を「押す（pushing）」ことにより、或いは層１のアミノ酸への影響を通じて、ＭＩＤＡＳへのリガンドの結合に影響し得る。結合部位は柔軟であるため、異なる層に存在するアミノ酸の位置や向きが、結合リガンドに応じて動的に変化し得る。リガンドは受容体に複数の異なる高次構造を生じさせ得る。本発明のリガンド設計ストラテジーは、生物学的に重要な分子（コラーゲン）のＭＩＤＡＳへの結合の調節を可能にする点に焦点を絞っている。従って、新規リガンドの設計には、３層全てが重要である。
【００４７】
閉鎖形を安定化する更なる潜在的相互作用
モジュレータ／リガンドと、タンパク質主鎖原子及び官能基との間の相互作用は、構造設計過程において重要である。アミノ酸の主鎖原子は側鎖原子に比べて可動性が低いので、これを用いれば、モジュレータを構成的相互作用によって、タンパク質に効果的に固定することができる。新規小分子コラーゲン結合モジュレータの構造を設計する際に使用可能な主鎖相互作用のリストを以下に提供する。殆どの場合、相互作用形成には、ＭＩＤＡＳの結晶水分子の置換が必要となる。本リストでは以下の定義を使用する。−ＮＨ−は主鎖アミノ基を規定し、Ｏ＝は主鎖のカルボニル基を規定する。本発明者等は、主鎖の相互作用の番号付けの際に、ＰＤＢ構造ＰＤＢ：１ａｏｘにおいて既報の、Ｉドメインの閉鎖高次構造からの番号付けを用いた。
【００４８】
・Ｓｅｒ１５５、−ＮＨ−は、一つの水素結合をモジュレータに供与可能。例えば水素結合ドナー（１*ＨＢＤ）。
【００４９】
・Ｇｌｙ２１８、Ｏ＝は、一つの自由非共有電子対が、モジュレータからの水素結合を自由に受容。例えば水素結合アクセプター（１*ＨＢＡ）。
【００５０】
・Ａｓｐ２１９、Ｏ＝、１*ＨＢＡ、一つの非共有電子対が水素結合を許容可能。Ａｓｐ２１９の２つ目の非共有電子対へのリガンドの接触は、鍵となるアミノ酸Ｈｉｓ２５８のイミダゾール環による立体障害を受ける。
【００５１】
・Ａｓｐ２５４、Ｏ＝、１*ＨＢＡ、第２の位置は結晶水Ｗ７０１により占有され、さもなくばその位置は埋没し、モジュレータが接近し難い。
【００５２】
・Ｇｌｕ２５６は、モデリングによれば、結合モジュレータの鍵となる接点の一つである。
【００５３】
・更なる定義：Ｇｌｕ２５６、−ＮＨ−、１*ＨＢＤ、Ｇｌｕ２５６アミノ酸側鎖の向きの変化により、それ自体が回転し、モジュレータのＯＨ基等との間で相互作用を形成可能。幾何学的にも物理的にも、モジュレータのＯＨ基は同時に、Ｇｌｕ２５６の−ＮＨ−とも接触を形成し得る。近傍には結晶水も存在し、それによって更に、Ｇｌｕ２５６アミノ酸側鎖の再配置が安定化され得る。
【００５４】
・Ｓｅｒ２５７、Ｏ＝、２*ＨＢＡ、結晶水Ｗ６５０は、この官能基に最も近接した可能な相互作用。
【００５５】
・Ｇｌｙ２６０、−ＮＨ−、１*ＨＢＤ、Ｓｅｒ２５７（埋没）の側鎖酸素と弱い相互作用。
【００５６】
・Ａｓｐ２９２、Ｏ＝、任意により２*ＨＢＡ、−ＮＨ− １＊ＨＢＤ、閉鎖形において、本アミノ酸は疎水性ポケット内に位置し、Ｗ５０６に水素結合している。弱結合水をモジュレータの適切な官能基で置換することが推奨される。この相互作用は更に結晶水により定義される。
【００５７】
・Ａｓｎ２９５、−ＮＨ−、１＊ＨＢＤ、埋没しており、モジュレータが接近し難い。
【００５８】
・Ｌｅｕ２９６、−ＮＨ−、１＊ＨＢＤ、埋没しており、モジュレータが接近し難い。
【００５９】
結晶水分子
水分子を対応するモジュレータ置換基（例えば−ＯＨ）で置換するのは、モジュレータの結合を改善するための選択肢の一つである。コラーゲン結合事象の際に、水分子が積極的な役割を果たすことも示されている。本明細書に詳細に記載するように、水分子は鍵となる分子間相互作用の媒体として、重要な役割を果たし得る。結晶水の番号付けは、ＰＤＢ構造ＰＤＢ：１ａｏｘ中の、既報の閉鎖高次構造のＩドメインの番号付けに対応する。
【００６０】
シミュレーション実験において、更に以下の知見が得られた。即ち、正しい結晶水分子を安定化させるモジュレータは、閉鎖形の安定化に機能的な役割を有し得る。なぜなら、結晶水分子は、ＭＩＤＡＳが開放形に向けて再組織化する際にその位置を変えるアミノ酸の、複数の原子と水素結合を形成するからである。α２β１インテグリンＩドメイン内の鍵となる水分子の位置を図４に示す。
【００６１】
アミノ酸Ｇｌｕ２５６は、閉鎖形で水分子Ｗ５１４と配位結合している。試験／設計されたα２Ｉドメイン４環系及びスルホンアミドモジュレータは、そのＯＨ基を置換することが可能である。
【００６２】
金属に配位結合する水は、Ｗ６９９、Ｗ７０１及びＷ７００である。水Ｗ６９９は、トレオニンＴｈｒ２２１の位置も安定化させる。結合リガンドは、水の出口の経路を封鎖することにより、この水位置を間接的に安定化し得る。これによって、Ｔｈｒ２２１が開放形の金属配位位置を取ることが、物理的に防止される。分析によれば、水Ｗ６９９の他方の非共有電子対は、閉鎖高次構造では不飽和であり、モジュレータからの水素結合ドナー相互作用の影響を受けているものと思われる。
【００６３】
水Ｗ７００は、多くのモジュレータによって結合時に置換される傾向があるが、Ｓｅｒ１５５の主鎖のアミノ基及び金属と配位結合している。Ｓｅｒ１５５の主鎖アミノ基は、モジュレータに強い水素結合を供与し得る部位である。この水分子は、開放形のＩドメインへのコラーゲン模倣体の結合により置換される。モジュレータを設計する際には、２つのアプローチを選択可能である。水素結合アクセプターをこの位置に導入することによって、モジュレータの結合を改善するべく水を置き換えてもよく、或いは、閉鎖形の安定化に水が重要である場合には、モジュレータによって水を保持してもよい。
【００６４】
水Ｗ６６８は他の水分子のみに配位結合し、モジュレータの結合によって、通常はＭＩＤＡＳから置き換えられる。
【００６５】
水Ｗ５９７は３つの部位に水素結合している。水Ｗ６６８、及び、主鎖Ｇｌｕ２５６のＯ＝である。更に、この水はＴｈｒ２１１からの水素結合を受容する。この水分子がトレオニンＴｈｒ２２１の位置を安定化するのは明らかである。分子設計において、この水は閉鎖高次構造を安定化させるために重要であることから、コラーゲン結合の調節に関して鍵となる機能性を有することが示唆される。水Ｗ５９７は、モジュレータに水素結合を供与するのに適した位置にあり、この水は３つの水素結合によってその位置に固定されることになる。
【００６６】
水Ｗ６４４及びＷ５０６はＡｓｐ２９２と近接している。これらの水分子はＡｓｐ２９２のカルボキシル基に水素結合を供与する。水Ｗ５０６は溝に位置し、この溝はＡｓｐ２９２の主鎖の酸素の近傍を除いて基本的に疎水性である。この溝については上にも述べたように、以下によって定義可能である。ＭＩＤＡＳ上のタンパク質の主鎖（アミノ酸２５５及び２５６）；Ｌｅｕ２８６（疎水側鎖）；Ａｓｐ２９２（Ｏ＝及び−ＮＨ−、主鎖のＣ−β炭素）；Ｔｈｒ２９３（主鎖、ペプチド結合面）；Ｌｙｓ２９４（トレオニンとのペプチド結合）；Ａｓｎ２９５（主鎖−ＮＨ−、Ｃ−β炭素、溝に向かって回転可能）；Ｌｅｕ２９６（主鎖−ＮＨ−、Ｃ−β炭素）；及びＧｌｕ２５６（カルボキシル基がモジュレータへ向かって回転可能）。
【００６７】
潜在的Ｉドメイン結合モジュレータの特性決定
Ｉドメイン結合モジュレータの化学構造には相当なばらつきが許容されるが、その何れもが、上述の結合部位のアミノ酸、主鎖の原子及び結晶水分子と形成する接点においては、構造的及び化学的類似性を有している必要がある。
【００６８】
また、小分子結合部位の一般的構造を考慮に入れることも重要である。特定エネルギー窓におけるＩドメイン構造と一致し得ないモジュレータは、Ｉドメインに結合することができないからである。
【００６９】
四環系ポリケチドのシミュレーションに基づき、Ｉドメインを標的とするモジュレータが通常占有し得る形状及び体積を図５に示す。ＭＩＤＡＳアミノ酸を３層に分割した。これらは図４及び図５の白色、灰色、及び黒色に対応する。これらの層は、ドッキングしたリガンドからのアミノ酸の距離を示している（表１も参照）。最も重要な結合部位アミノ酸側鎖相互作用は、リガンド構造と直接相互作用するものである（図４及び図５の層１、黒色）。他の層も、層１のアミノ酸を「押す（pushing）」ことにより、さもなくば層１のアミノ酸への影響を通じて、ＭＩＤＡＳへのリガンドの結合に影響を与え得る。結合部位は柔軟であるため、異なる層に存在するアミノ酸の位置や向きが、結合リガンドに応じて動的に変化し得る。リガンドは受容体に複数の異なる高次構造を生じさせ得る。本発明のリガンド設計ストラテジーは、生物学的に重要な分子（コラーゲン）のＭＩＤＡＳへの結合の調節を可能にする点に焦点を絞っている。従って、新規リガンドの設計には、３層全てが重要である。
【００７０】
図１は、リガンド結合溝の疎水面が、リガンドにより埋められていることを示している。更に、このリガンド位置は、マグネシウムイオンとＧｌｕ２５６（ＨＢＤ）の主鎖アミノ基及びＴｙｒ２８５の水酸基との、鍵となる相互作用によって安定化されている。これらの相互作用は、受容体を「閉鎖」高次構造に維持するための鍵となる安定化相互作用であり、これによってリガンド発見の基礎となるファルマコフォアが形成される。
【００７１】
Ｉドメイン含有インテグリン機能を調節し得る潜在化合物は、仮想的なスクリーニング技術を、インテグリンＩドメインのＭＩＤＡＳの３次元座標に基づくファルマコフォアモデルと組み合わせて用いることにより同定した。ファルマコフォアモデルはモジュレータ結合のための鍵となる上記の相互作用部位を含んでいた。
【００７２】
上述した改良コンピュータ支援分子モデルに基づいて、本発明は、ＭＩＤＡＳを受容するα２Ｉドメイン表面の谷間に適合する分子を提供する。より具体的には、インシリコで設計されウェットラボで試験された化合物であって、Ｍｇと相互作用し、高い親和性をもって結合し、コラーゲン結合を阻害する化合物を提供する。
【００７３】
ＭＩＤＡＳと相互作用しそうな適切な酸素原子を含有する扁平四環系化合物であるストレプトミセス由来の香族ポリケチドを、スクリーニング用の適切なライブラリーとして選択した。谷間及び第２環内の酸素に適合するようモデリングされた化合物は、ＭＩＤＡＳ内のＭｇイオンと相互作用すると推定された（図６）。これらの化合物を固相α２Ｉドメイン結合アッセイでスクリーニングし、試験仮説を確認した。４つのαＩドメイン全てによるコラーゲンＩ結合が、これらの化合物によって阻害されたという事実から、これらの化合物が共通の結合メカニズムを有することが示された。
【００７４】
更に前記インシリコモデルを用いて、新規なコラーゲン受容体モジュレータを同定した。スルホンアミド誘導体は、本発明に係るインシリコの方法を用いて同定した化合物の例であり、上記の基準を満たしている。本明細書に記載のアッセイを用いて、かかる化合物がコラーゲン受容体モジュレータであることを更に確認した。
【００７５】
本発明の方法により同定されたスルホンアミド誘導体は、例えば式（Ｉ）によって表わされる。
【００７６】
【化１】
2009509939.tif 000003
【００７７】
式中、
ＲCは、ジアルキルアミノ、ＮＯ2、ＣＮ、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルカノイル、オキサゾル−２−イル、オキサゾリルアミノカルボニル、アリール、アロイル、アリール−ＣＨ（ＯＨ）−、アリールアミノカルボニル、フラニル、グアニジニル−（ＣＨ2）Z−Ｎ（Ｒ’）−、Ｈｅｔ−（ＣＨ2）Z−Ｎ（Ｒ’）−、Ｈｅｔ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ’）−、Ｈｅｔ−ＣＨ（ＯＨ）−及びＨｅｔ−ＣＯ−からなる群より選択され、ここで、アリール、アロイル及びフラニル部分は置換されていてもよく、Ｈｅｔは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい４員〜６員の複素環式環であり、Ｒ’は水素又はアルキルであり、ｚは１〜５の整数であり；
ＲAは、式
【化２】
2009509939.tif 000004
を有する基
（式中、
Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アリール、アルコキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、シアノ、トリフルオロメチル、アルカノイル、アルカノイルアミノ、トリフルオロメトキシ、置換されていてもよいアリール基を表わす）であり；
ＲBは、水素、アルキル、アルカノイル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノアルキル、モノ−又はジ−アルキルアミノアルキル又はＨｅｔ−アルキルであり、ここでＨｅｔは上で定義された通りであり；
但し、
（iv）ＲCがジアルキルアミノの場合、ＲBは水素又はアルキルではなく；
（ｖ）ＲAが式（Ｃ）の基であり、Ｒ3が水素であり、Ｒ4がメトキシである場合、ＲCはＨｅｔ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ’）−ではなく；
（vi）ＲAが式（Ｃ）の基であり、Ｒ3及びＲ4が水素又はハロゲンである場合、ＲCはニトロではない。
【００７８】
本発明の典型的なスルホンアミド化合物を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2009509939.tif 000005
【００８０】
【表３】
2009509939.tif 000006
【００８１】
【表４】
2009509939.tif 000007
【００８２】
【表５】
2009509939.tif 000008
【００８３】
【表６】
2009509939.tif 000009
【００８４】
好ましい化合物の具体例としては、４’−フルオロビフェニル３−スルホン酸（４−ベンゾイルフェニル）アミド、４’−フルオロビフェニル３−スルホン酸（３−ベンゾイルフェニル）アミド、４’−フルオロビフェニル３−スルホン酸（α−ヒドロキシベンジルフェニル）アミド、２−オキソイミダゾリジン−１−カルボン酸｛４−［（４’−フルオロビフェニル３−スルホニル）メチルアミノ］フェニル｝アミドが挙げられる。
【００８５】
即ち、本発明は、改良インシリコモデルに記載のような、ＭＩＤＡＳアミノ酸残基に必要な鍵となる相互作用を満たす、新規なインテグリン阻害剤を提供する。好ましいインテグリン阻害剤としては、表２に列挙するスルホンアミド誘導体、及び、表３に列挙する四環系ポリケチドが挙げられる。
【００８６】
本発明は、血栓症、癌、線維症及び炎症に関連する疾患の治療用医薬の製造のための、かかるインテグリンモジュレータの使用を提供する。
【００８７】
本発明の化合物は強力なコラーゲン受容体モジュレータであり、インビボ又はインビトロにおけるコラーゲンへの細胞の接着、又はコラーゲンを通じた細胞の遊走及び浸潤を防止又は予防するのに有用である。本明細書に記載の化合物は、悪性細胞の遊走を阻害することから、例えば前立腺癌、胃癌、膵癌及び子宮癌等の癌や、メラノーマ等を治療するのに有用であり、中でもα２β１インテグリン依存細胞の接着／浸潤／遊走が、悪性化機序、癌浸潤、並びに癌転移又は血管形成に寄与している可能性がある場合に、とりわけ有用である。
【００８８】
また、本発明の化合物は、血小板のコラーゲンへの接着及びコラーゲン誘導性の血小板凝集を阻害する。即ち、本発明の化合物は、血栓塞栓症状態（即ち、コラーゲンへの血小板の接着及びコラーゲン誘導性血小板凝集を防止する必要性を特徴とする疾患）の予防的又は寛解的治療（例えば、脳卒中、心筋梗塞、不安定狭心症、糖尿病性網膜症又は網膜静脈閉塞症等の治療及び予防）を必要とする患者の治療に有用である。更に、本発明の化合物は、炎症、線維症及び骨折等の炎症性過程を特徴とする疾病の患者を治療するための医薬として有用である。
【００８９】
結論として、本発明は、αＩドメインのＭＩＤＡＳを標的とするコラーゲン受容体インテグリン阻害剤を設計するための、優れたストラテジーを提供する。芳香族ポリケチド及びスルホンアミドは、コラーゲン受容体αＩドメインの潜在的遮断薬の基準を満たし、これらはコラーゲンへの細胞接着をも防止するが、改良インシリコモデルによって定義される基準を満たす他の化合物についても、本発明に係る化合物として考慮される。
【実施例】
【００９０】
本発明を例示するために以下の実施例を示すが、これらは本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【００９１】
実施例１
四環系生合成
四環系化合物ライブラリーを、変異ストレプトミセス株の発酵によって作製した。発酵は、５リットルのバッチで６日間かけて、Ｅ１培地中で３０℃にて、２８０ｒｐｍでの攪拌下、５ｌ／ｈで通気しながら行なった。
【００９２】
代謝産物をメタノール抽出により細胞分画から回収し、その後、ジクロロメタンで細胞を抽出し、分解して蒸散させた。
【００９３】
２度のクロマトグラフィー処理によって化合物の予備精製を行なった後、沈殿形成を行なった。精製を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニターした。最初のクロマトグラフィー分離は、クロロホルム：メタノール：酢酸中にシリカを含むカラムを用いて行なった。２％メタノールで画分を溶離した。画分を纏めて更にシリカカラムで精製し、トルエン：ＭｅＯＨ：ＨＣＯＯＨにより溶離した。
【００９４】
回収した分画を纏め、少量のクロロホルムで希釈し、ヘキサンで沈殿させた。四環系化合物はヘキサン相に濃縮された。ヘキサンを蒸散させ、この画分を更なる精製の出発物質として用いた。
【００９５】
予備精製により得られた画分を、オキサレート処理シリカカラムで更に精製し、クロロホルム中４０％ヘキサンで溶離した。四環系化合物を含む画分を、調製用Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムでアセトニトリル：水：蟻酸を用いて更に精製した。純粋な画分を纏め、クロロホルムに溶解させ、蒸散させた。
【００９６】
以上により取得し、更なる試験に供した化合物は、メチル２−エチル−２，５，７，１２−テトラヒドロキシ−４，６，１１−トリオキソ−１，２，３−トリヒドロナフタセンカルボキシレート（Ｌ３００７）、メチル２−エチル−４，５，７，１２−テトラヒドロキシ−６，１１−ジオキソナフタセンカルボキシレート（Ｌ３００８）、メチル４，５，７，１２−テトラヒドロキシ−２−（メチルエチル）−６，１１−ジオキソナフタセンカルボキシレート（Ｌ３００９）、及びメチル２−エチル−４，５，７−トリヒドロキシ−６，１１ジオキソナフタセンカルボキシレート（Ｌ３０１５）であった。これらの化合物の構造を表３に示す。
【００９７】
【表７】
2009509939.tif 000010
【００９８】
実施例２
ヒト組み換えインテグリンＩドメイン
【００９９】
ヒトインテグリンαＩドメインのクローニング  −  α１Ｉドメイン及びα２ＩドメインをコードするｃＤＮＡは、ヒトインテグリンα１及びα２のｃＤＮＡを鋳型として用いて、先行技術文献に記載のようにＰＣＲによって生成した。ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクター及びｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Pharmacia）を用いて、それぞれヒトα１Ｉドメイン及びα２Ｉドメインの組み換えによるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を生成した。α１０ＩドメインのｃＤＮＡは、ＫＨＯＳ−２４０細胞（ヒトコーカサス骨肉腫）から単離されたＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって生成した。細胞の全ＲＮＡは、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて単離した。ＲＴ−ＰＣＲはGene Amp PCR KIT（Perkin Elmer）を用いて行なった。クローニングの詳細は先行技術文献に記載されている（Tulla et al., 2001）。増幅したα１０ＩドメインｃＤＮＡは、ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）と共にＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素（Promega）を用いて消化した。SureClone Ligation Kit（Amersham Phamacia Biotech）を用いて、α１０ｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２Ｔベクターにライゲーションした。構築物は、産生のためE. coli BL21株内へと形質転換した。構築物のＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングにより確認し、既報のα１０ＤＮＡ配列（Camper et al., 1998）と比較した。α１１ＩドメインをＰＣＲで生成した場合には、ヒトインテグリンα１１のｃＤＮＡを鋳型として用いた。
【０１００】
αＩドメインの発現及び精製−  E. coli BL21のコンピテントセルを、タンパク質産生用のプラスミドで形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌのＬＢ培地（Biokar）に、野生型又は変異型のＢＬ２１／ｐａｌの一晩培養物５０ｍｌを播種し、懸濁物のＯ．Ｄ．６００が０．６〜１．０になるまで３７℃で培養物を増殖させた。細胞をＩＰＴＧによって誘発し、典型的には室温で更に４時間から６時間成長させた後、遠心分離によって回収した。ペレット状にした細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理によって溶解し、その後、Triton X-100を加え、終濃度２％とした。氷上で３０分間インキュベートした後、懸濁物を遠心分離し、上清をプールした。グルタチオンセファローズ（登録商標）４Ｂ（Amersham Pharmacia Biotech）をライセートに加え、穏やかに攪拌しながら３０分間室温でインキュベートした。次いで、ライセートを遠心し、上清を除去し、融合タンパク質が結合したグルタチオンセファローズ（登録商標）４Ｂを使い捨てのクロマトグラフィーカラム（Bio-Rad）に移した。カラムをＰＢＳで洗浄し、融合タンパク質を３０ｍＭの還元グルタチオンを用いて溶離した。
【０１０１】
精製した組み換え及びグルタチオンタグ化αＩドメインを、ＳＤＳ及び非変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析した。タンパク質濃度をブラッドフォード法（Bradford, 1976）で計測した。産生された組み換えαＩドメインは長さ２２７アミノ酸で、α１インテグリン全体のアミノ酸１２３〜３３８に相当し、α２Ｉドメインは長さ２２３アミノ酸で、α２インテグリン全体のアミノ酸１２３〜３３８に相当するものであった。α１Ｉドメイン及びα２Ｉドメインのカルボキシル末端は、それぞれ非インテグリンアミノ酸を１０個及び６個含有していた（Kapyla et al., 2000, Tulla et al., 2001）。産生した組み換えα１０Ｉドメインは長さ１９７アミノ酸で、α１０インテグリン全体のアミノ酸１４１〜３３７に相当するものであった。アミノ末端は２つの非インテグリン残基を含み、α１０Ｉのカルボキシ末端は６つの非インテグリンアミノ酸を含んでいた（Tulla et al., 2001）。組み換えα１１Ｉドメインは、全体で２０４個のアミノ酸を有する。アミノ末端には、残基１５９〜３５４のα１１Ｉの前に、２つの付加的な残基が存在し、カルボキシル末端には、６つの付加的なアミノ酸が存在する。組み換えα１１Ｉドメインは、発現及び精製時の内在性プロテアーゼ活性により、不純物として一定のＧＳＴを含有する（Zhang et al., 2003）。組み換えαＩドメインを、コラーゲン結合実験のためのＧＳＴ融合タンパク質として用いた。
【０１０２】
部位特異的変異導入−  ｐＧＥＸ−２Ｔ又はｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターへのαＩドメインｃＤＮＡの部位特異的変異導入は、ＰＣＲを用いて、StratageneのQuickChange Mutagenesis Kitの使用説明書に従って行なった。変異の存在はＤＮＡシーケンシングにより確認した。続いて、変異導入した構築物を、組み換えタンパク質の産生のため、大腸菌株ＢＬ２１へと形質転換した（Kapyla et al., 2000; Tulla et al., 2001）。
【０１０３】
実施例３
α２Ｉドメインの突然変異体の生成
α２Ｉドメイン中の部位特異的変異導入は、Stratagene QuickChange mutagenesis kitを用いて、製造者の使用説明書に従って行なった。両ＤＮＡ鎖に所望の変異を有するＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲはＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene）を用いて行なった。これは６８℃において、α２Ｉドメイン配列を含むＧＥＸ−２Ｔベクター（Amersham Pharmacia Biotech）全体のコピーを１つ作製する。ＰＣＲ産物をＤｐｎｌで処理した。これはメチル化ＤＮＡのみを切断する。その後、所望の変異を有するＰＣＲ産物のＤＮＡ鎖をペア化した。
【０１０４】
実施例４
αＩドメイン結合アッセイ
αＩドメインの固相結合アッセイ−  ５μｇ／ｃｍ2（１５μｇ／ｍｌ）コラーゲン又は２０μｇ／ｍｌの３本鎖らせんペプチドを含む０．１ｍｌのＰＢＳに、９６ウェル高結合性マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩暴露することにより被覆した。ブランク用のウェルはDelfia（登録商標）Diluent II（Wallac）及びＰＢＳの１：１溶液でコーティングした。全ウェル上の残余タンパク質吸着部位を、Delfia（登録商標）Diluent II（Wallac）及びＰＢＳの１：１溶液０．１ｍｌでブロックした。組み換えタンパク質（αI-GST）をDelfia（登録商標）アッセイバッファーで所望の濃度とし、前記の被覆ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ユーロピウム標識抗ＧＳＴ抗体（Wallac）を加え（典型的には１：１０００）、混合物を室温で１時間インキュベートした。上記のインキュベーションは何れも、２ｍＭのＭｇＣｌ2存在下で行なった。Delfia（登録商標）強化溶液（enhancement solution）（Wallac）を各ウェルに加え、ユーロピウム信号を時間分解蛍光測定法（Victor2 multilabel counter, Wallac）により測定した。少なくとも３つの平行するウェルで分析した。一部の場合では、多少の変更を加えた固相アッセイを用いた。これはTulla et al, 2001に従って行なった。これはユーロピウム標識抗ＧＳＴ抗体の代わりに、抗ＧＳＴ及びユーロピウム標識Ｇタンパク質を用いる。
【０１０５】
実施例５
細胞接着アッセイ
野生型α２インテグリンを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を細胞接着アッセイに用いた。０．１ｍｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Sigma）を含む無血清培地に細胞を懸濁させ、この細胞と共に化合物をプレインキュベートしてからウェルに移送した。細胞（１５００００／ウェル）を、コラーゲンＩ型被覆ウェルに、（阻害化合物の存在下及び不在下で）３７℃で２時間付着させた後、非接着細胞を除去した。新鮮な無血清培地を加え、cell viability kit（Roche）を用いて、製造者のプロトコルに従って生細胞を検出した。
【０１０６】
実施例６
分子モデリング
発見された四環系ポリケチド及びスルホンアミドα２インテグリンＩドメインモジュレータの結合様式は、本研究以前は公知ではなかった。本発明者等は、標準的及び独自仕様の分子モデリングツールを実験による証拠と併用し、α２インテグリンリガンド結合（ＭＩＤＡＳ）部位と複合体形成した四環系ポリケチド及びスルホンアミドの生物活性高次構造を同定した。ＭＩＤＡＳ構造はＢＯＤＩＬを用いてモデリングした。モデリングしたＭＩＤＡＳ構造を用い、構造的及び機能的に多様なモジュレータを重ね合わせた。モデリングシミュレーションにおいて、本発明者等はＭＩＤＡＳの化学的及び構造的特徴を考慮しながら、モジュレータの立体座標空間を探索した。この過程によって、各リガンド構造にとって好ましい結合高次構造が与えられた。次いで、この情報を用いて、α２インテグリンＭＩＤＡＳを介してコラーゲン結合を調節する小分子に必要な相互作用の構造上の基準を導き出した。
【０１０７】
分子モデリングの出発点として用いたＩドメインの開放形（ＰＤＢ ＩＤ：１ｄｚｉ）及び閉鎖形（ＰＤＢ ＩＤ：１ａｏｘ）の結晶構造は、Protein Data Bankから検索した。BODILソフトウェア中でアミノ酸側鎖高次構造を変化させ、BODILロータマーライブラリーを用いてタンパク質高次構造のアンサンブルを作成した。ＭＩＤＡＳに結合した鍵となる構造水は、結晶構造の一部としてドッキングシミュレーションに含ませた。タンパク質構造及び水分子の全ての水素原子は、Sybyl6.9.1（rotate）を用いて追加した。SYBYL6.9.1のFlexX及びBODILの自動回転−並進方法を用いてドッキングを行ない、これによって、SY-BYL6.9.1のComfort/Concordを用いて作成した非束縛性のリガンド高次構造をドッキングした。FlexXスコアリングに加え、Xscoreを用いて、ドッキングしたリガンド構造の各々について、結合の自由エネルギーを評価した（Wang et al., 2002）。
【０１０８】
実施例７
インシリコで同定した化合物によるコラーゲン結合の阻害
実施例４に記載したαＩドメインアッセイを用いて、α１Ｉドメイン及びα２Ｉドメインへのコラーゲン結合の阻害について、実施例１で合成した四環系ストレプトミセス化合物をスクリーニングした。四環系ポリケチドＬ３０１５は、Ｉ型コラーゲンへのα２Ｉドメインの結合に対する比較的強力な阻害剤であった。Ｉ型コラーゲンへのα２Ｉドメインの結合にたいする用量依存的な阻害が示された（濃度０．００３ｍＭで約５０％の阻害；図６Ａ）。Ｌ３０１５は、α１Ｉドメイン及びα２Ｉドメインの双方のＩ型及びIV型コラーゲンへの結合を阻害できた（図６Ｂ）。
【０１０９】
ＲＫＫペプチドはα２ＩドメインのＭＩＤＡＳへ結合することが知られている（Ivaska et al., 1999）。Ｌ３０１５の存在下でのインテグリンα２ＩドメインのＲＫＫ−ペプチドへの結合を、実施例４に記載するユーロピウム標識Ｇタンパク質アッセイで試験した。その結果は、Ｌ３０１５がＭＩＤＡＳのＲＫＫペプチドを置換可能であることを示している。
【０１１０】
更に、ロバスタチン存在下でのα１Ｉドメイン及びα２ＩドメインのコラーゲンＩへの結合を、実施例４に記載するユーロピウム標識抗ＧＳＴアッセイで試験した。ロバスタチンは、白血球のインテグリンαＩドメイン（例えば、αＬ Ｉドメイン）のアロステリック阻害剤であり、ロバスタチンの結合部位は、存在しうるモジュレータのオプション的な結合部位を表す。しかし、ロバスタチンは、αＩドメインのコラーゲンＩ型への結合に対して何らの影響も有しないことが示された（図７Ａ）。これらの生物学的試験により、四環系ポリケチドによるＭＩＤＡＳ表面上の直接的なブロックによりコラーゲン受容体αＩドメインが阻害されるという更なる証拠が得られた。
【０１１１】
３次元モデルを利用して、ポリケチドファミリーの他の化合物を試験した。これらの化合物は、実施例４に記載するユーロピウム標識抗ＧＳＴアッセイで試験した。四環系ポリケチドＬ３００７、Ｌ３００８、Ｌ３００９はＩ型コラーゲンに結合するα２Ｉドメインを阻害可能であった（図８Ａ）。最も活性の高い構造の一つであるＬ３００９の一つの用量依存的な阻害効果が、図８Ｂに示されている。
【０１１２】
Ｌ３００９の阻害効果を、実施例４の記載と同様に、コラーゲン結合インテグリンαＩドメイン、α１Ｉ、α２Ｉ、α１０Ｉ、及びα１１Ｉの全てについて試験した。Ｌ３００９は、濃度０．０５ｍＭにおいて、４つ全てのαＩドメインのコラーゲンＩ結合を阻害できた（図９）。
【０１１３】
細胞表面上のインテグリンヘテロ二量体の機能を調べるために、最も強力な化合物Ｌ３００９を、実施例５に記載した機能細胞接着アッセイで更に試験した。この目的のため、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトして、α２β１インテグリンを唯一のコラーゲン受容体として表面に発現させた。
【０１１４】
Ｌ３００９は、ＥＣ５０値が約２０μＭで、Ｉ型コラーゲンへの細胞接着の強力な阻害剤であった（図１０Ａ）。
【０１１５】
インシリコモデルを用いて、新規なコラーゲン受容体モジュレータを同定した。スルホンアミド誘導体である化合物４３４及び化合物１６１は、この方法により同定した新規な分子の例である。化合物４３４を、実施例５に記載した機能細胞接着アッセイで試験した。図１０Ｂ及び表４には、化合物４３４がコラーゲンＩ型への細胞接着の強力な阻害剤であることが示されている。
【０１１６】
【表８】
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【０１１７】
実施例８
インテグリンα２Ｉドメイン突然変異体
モジュレータ結合におけるα２β１インテグリンα２Ｉドメインのアミノ酸の役割を確認するために、部位特異的変異導入アプローチを用いた。選択したアミノ酸変異を、実施例３の記載と同様に導入した。α２Ｉドメイン領域内の単一アミノ酸を変異させ、変異α２β１インテグリンを発現するＣＨＯを用いた接着実験で試験した。野生型α２β１発現細胞をコントロールとして用いた。細胞接着実験を実施例５の記載と同様に行なった。試験の結果、α２Ｉドメインの３つのアミノ酸（即ち、チロシン２８５、ロイシン２８６及びロイシン２９６）が、Ｌ３００８の阻害機能にとって重要であることが明らかとなった。これらのアミノ酸の変異は、α２β１を発現するＣＨＯ細胞のコラーゲンＩへの結合における四環系ポリケチドＬ３００８、スルホンアミド化合物１６１及びスルホンアミド化合物４３４の阻害効果を顕著に減少させた（データは示さず）。
【０１１８】
実施例９
インビトロでの阻害剤の抗癌剤としての能力を示すための細胞浸潤アッセイ
細胞外マトリックス基底膜と相互作用する能力は、悪性癌細胞表現型及び癌転移において必須である。α２β１レベルは腫瘍化した細胞において上方制御されていることが知られている。過剰発現により、細胞外マトリックスへの細胞接着及び移動並びに細胞外マトリックスを介した浸潤が制御される。コラーゲン等の細胞外マトリックス構成要素とα２β１との間の相互作用をブロックすることにより、インビトロで癌細胞の移動及び浸潤をブロックすることが可能である。α２β１を内在的に発現する前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を用いて、本発明のモジュレータによるインビトロでの抗癌剤としての能力を試験した。
【０１１９】
実験方法。BD Biocoat浸潤インサート（BD Biocoat invasion insert：BD Biosciences）を用いて、マトリゲル中のPC-3細胞（CRL-1435、ATCC）の浸潤を試験した。インサートは−２０℃で保存した。実験前にインサートを室温に調整した。５００μｌの無血清培地（ハムＦ１２Ｋ培地、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／ｌの炭酸水素ナトリウム）をインサートに加え、セルインキュベータ内で、３７℃で２時間かけて再水和した。残存する培地をアスピレートした。PC-3細胞を剥離し、ペレット化させ、無血清培地に懸濁させた（５００００細胞／５００μｌ）。３００μｌの細胞懸濁液を、本発明の阻害剤が存在しない状態（コントロール）又は存在する状態でインサートに加えた。インサートを２４ウェルプレート上に播種した；各ウェルは、化学誘引物質としてウシ胎児血清３％を含有する７００μｌの細胞培養培地を含む。細胞をセルインキュベータ内で３７℃にて７２時間かけて浸潤させた。インサートを７００μｌのＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで１０分間かけて固定した。パラホルムアルデヒドをアスピレートし、細胞を７００μｌのＰＢＳで洗浄し、インサートをヘマトキシリンと共に１分間インキュベーションすることにより染色した。インサートを７００μｌのＰＢＳで洗浄することにより染料を除去した。インサートを乾燥させた。固定された浸潤した細胞を顕微鏡下で計算した。浸潤％を、コントロールとの比較として計算した。
【０１２０】
この細胞浸潤アッセイをインビトロでの癌転移モデルとして用いた。スルホンアミド分子が、インビトロで腫瘍細胞の浸潤を阻害することが示された（表４）。マイクロモル以下の濃度であっても浸潤を阻害する構造もある。
【０１２１】
実施例１０
血小板機能分析機ＰＦＡ−１００を用いたα２β１モジュレータの抗血栓能の実証
血小板機能分析機ＰＦＡ−１００を用いてα２β１モジュレータの潜在的な抗血栓症効果を示した。ＰＦＡ−１００は、小血管損傷後の一次止血を促進する、高せん断誘導装置である。この装置は、コラーゲンとエピネフリンでコーティングした生物活性膜を含む試験カートリッジを有する。定常的な真空状態の下、抗凝集全血サンプルを毛細管に通した。膜上の血小板アゴニスト（エピネフリン）及び高せん断速度により血小板の凝集が活性化され、安定な血小板血栓による開口の閉塞が生じた。開口の完全な閉塞を達成するために必要な時間を、「閉塞時間」と定めた。良好な各化合物を全血サンプルに添加し、ＰＦＡ−１００で閉塞時間を計測した。コントロールサンプルと比較して閉塞時間が増加した場合、前記良好な化合物は抗血栓活性を有すると示唆された。
【０１２２】
実験方法。静脈穿刺によりドナーから抗凝集物質として３．２％の緩衝クエン酸ナトリウムを含んだ回収チューブに血液を回収した。血液を１５ｍＬチューブに分注し、阻害化合物又はコントロール（ＤＭＳＯ）の何れかで処理した。サンプルを回転させながら１０分間室温に保ち、その後その血液の閉塞時間を計測した。
【０１２３】
機器の測定範囲を超える結果（３００秒を超える）が得られた場合には、３００秒の値を割り当てた。各処理について平均偏差及び標準偏差を計算した。得られたデータにスチューデントｔ検定を施した。
【０１２４】
化合物４３４が、血液の閉塞時間を増加させることが示された（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１（Figure 1）は、分子のコア構造のドッキング及びＩドメインＭＩＤＡＳの内部の四環系化合物の鍵となる分子間相互作用を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂ（Figures 2A and 2b）は、α２Ｉドメインの「開放」（黒色）及び「閉鎖」（灰色）高次構造を示す。重ね合わせ（superposition）は、マグネシウムイオン（黒球）に配位結合した２つのセリン残基（１５３及び１５５；球棒）に基づく。「開放」高次構造では、Ｔｈｒ２２１は金属イオンに配位結合するのに対し、閉鎖高次構造にはこの相互作用が存在しない。図２ＡはＭＩＤＡＳ上方から見た図を示し、図２Ｂは側面から見た図を示す。
【図３】ＣへリックスにおけるＴｙｒ２８５の位置により、阻害リガンドの結合高次構造が安定化される（結合した四環系ポリケチドリガンド全てを線モデルで示す）。
【図４】インテグリンα２Ｉドメイン内部の鍵となる水分子の位置。ドッキングシミュレーションの結果から導き出されたＭＩＤＡＳアミノ酸を、黒色（結合した四環系ポリケチドから４Å以内）、灰色（結合した四環系ポリケチドから４〜８Åの距離）、又は白色（結合した四環系ポリケチドから８Åを超える）で色分けして示す。
【図５】コラーゲン結合性の小分子モジュレータのアンサンブルがα２ＩドメインＭＩＤＡＳ内に占める形状及び大きさ。ドッキングシミュレーションの結果から得られるＭＩＤＡＳアミノ酸を、黒色（結合した四環系ポリケチドから４Å以内）、灰色（結合した四環系ポリケチドから４〜８Åの距離）、又は白色（結合した四環系ポリケチドから８Åを超える）で色分けして示す。
【図６Ａ】図６Ａ（Figure 6A）は、タイプＩコラーゲンへのα２Ｉドメイン（２００ｎｇ）の結合に対する四環系ポリケチドＬ３０１５の用量依存的な効果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂ（Figure 6B）は、タイプＩ及びタイプＩＶコラーゲンへのα１Ｉ及びα２Ｉドメイン（８００ｎｇ）の結合に対する四環系ポリケチドＬ３０１５の効果を示す。
【図７Ａ】図７Ａ（Figure 7A）は、α１Ｉ及びα２ＩドメインのタイプＩコラーゲンへの結合に対するロバスタチンの効果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂ（Figure 7B）は、α２ＩドメインのＲＫＫペプチド（約０．５ｍＭ）への結合に対する四環系ポリケチドＬ３０１５の効果を示す。
【図８Ａ】図８Ａ（Figure 8A）は、α２Ｉドメイン（８００ｎｇ）のタイプＩコラーゲンへの結合に対する四環系ポリケチドＬ３００７、Ｌ３００８及びＬ３００９の効果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂ（Figure 8B）は、４タイプＩコラーゲンに対するα２Ｉドメイン（８００ｎｇ）の結合を四環系ポリケチドＬ３００９の濃度の関数として示す。
【図９】図９（Figure 9）は、四環系ポリケチドＬ３００９による、α１Ｉ、α２Ｉ、α１０Ｉ及びα１１ＩドメインのタイプＩコラーゲンへの結合の阻害を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ（Figure 10A）は、四環系ポリケチドＬ３００９によるＣＨＯ−α２細胞のコラーゲンタイプＩへの接着の用量依存的な阻害を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ（Figure 10B）は、スルホンアミド誘導体である化合物４３４による阻害を示す。
【図１１Ａ】本研究で報告する化合物内に存在する四環系の小分子の構造のＭＩＤＡＳ内での好ましい位置を示すα２Ｉドメインの構造。
【図１１Ｂ】Ｉドメインの閉鎖形（非コラーゲン結合性）内の潜在的なＩドメインリガンドの近傍のアミノ酸配列。半径４Å以内の鍵となる残基を黒色、４〜８Åの範囲内の残基を灰色、８〜１２Åの範囲内の残基を白色で示す。
【図１２】図１２（Figure 12）は、化合物４３４が血液の閉塞時間を上昇させることを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
2009509939.tif 000029
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月15日(2008.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
インテグリン阻害剤である、請求項８記載の化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
４’−フルオロビフェニル−３−スルホン酸（４−ベンゾイルフェニル）アミドである、請求項９記載の化合物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
４’−フルオロビフェニル−３−スルホン酸（３−ベンゾイルフェニル）アミドである、請求項９記載の化合物。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
４’−フルオロビフェニル−３−スルホン酸（α−ヒドロキシベンジルフェニル）アミドである、請求項９記載の化合物。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
２−オキソ−イミダゾリジン−１−カルボン酸｛４−［（４’−フルオロ−ビフェニル−３−スルホニル）−メチル−アミノ］−フェニル｝−アミドである、請求項９記載の化合物。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
四環系ポリケチドである、請求項９記載の化合物。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
メチル２−エチル−２，５，７，１２−テトラヒドロキシ−４，６，１１−トリオキソ−１，２，３−トリヒドロナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１５記載の化合物。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
メチル２−エチル−４，５，７，１２−テトラヒドロキシ−６，１１−ジオキソナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１５記載の化合物。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
メチル４，５，７，１２−テトラヒドロキシ−２−（メチルエチル）−６，１１−ジオキソナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１５記載の化合物。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
メチル２−エチル−４，５，７−トリヒドロキシ−６，１１ジオキソナフタセンカルボキシレートの式を有する、請求項１５記載の化合物。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】
請求項８〜１９の何れか一項に記載の化合物の使用であって、血栓症、血管疾患、癌、線維症及び炎症の治療用の医薬組成物を製造するための使用。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１】
前立腺癌、胃癌、膵又は子宮癌、又はメラノーマの治療用、並びに腫瘍血管形成の予防用の医薬組成物を製造するための、請求項２０記載の使用。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
転移の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、請求項２１記載の使用。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２３】
脳卒中、心筋梗塞、糖尿病性網膜症又は網膜静脈閉鎖症の治療用の医薬組成物を製造するための、請求項２０記載の使用。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２４】
線維症及び骨折に関連する炎症疾患の治療用医薬組成物を製造するための、請求項２０記載の使用。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２５】
血栓症、癌、線維症及び炎症を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、請求項８〜１９の何れか一項に記載の化合物を有効量投与することによる、方法。
【国際調査報告】
2009509939.tif 000032
2009509939.tif 000033
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