(57)【要約】  ある具体例において、本発明は、デルタ様リガンド４(Ｄｌｌ４)シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法及び利用する方法を提供する。
2009507796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈形成を刺激する方法であって、Ｄｌｌ４の細胞外ドメインを含む有効量の治療用ポリペプチドをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【請求項２】
治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:１のＤＳＬドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療用ポリペプチドが、望ましい薬物動力学的特性を与える部分に共有結合されたSEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２４よりなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該部分が、Ｆｃドメイン又はポリオキシアルキレン部分よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
治療用ポリペプチドが、モノマーポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療用ポリペプチドが、哺乳動物内皮細胞において、有効濃度で、動脈表現型の発現を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
動脈表現型を、ＥｐｈｒｉｎＢ２の発現及びコネキシン３７の発現よりなる群から選択する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
治療用ポリペプチドが、哺乳動物内皮細胞において、有効濃度で、静脈表現型の発現を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
静脈表現型が、ＥｐｈＢ４の発現である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者が、虚血性疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
患者が、冠動脈疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
患者が、末梢動脈疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者が、虚血事象の危険にあると診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
血管において動脈の特性を採択することを促進する方法であって、有効量のＤｌｌ４細胞外ドメインを含む治療用ポリペプチドをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【請求項１６】
治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:１のＤＳＬドメインを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
治療用ポリペプチドが、望ましい薬物動力学的特性を与える部分に共有結合されたSEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２４よりなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
該部分を、Ｆｃドメイン又はポリオキシアルキレン部分よりなる群から選択する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
血管が、静脈移植片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
静脈移植片が、伏在静脈移植片である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血管形成を阻止する方法であって、有効量のＤｌｌ４細胞外ドメインを含む治療用ポリペプチドをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【請求項２３】
治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:１のＤＳＬドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２４を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
治療用ポリペプチドが、望ましい薬物動力学的特性を与える部分に共有結合されたSEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２４よりなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
該部分を、Ｆｃドメイン又はポリオキシアルキレン部分よりなる群から選択する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
治療用ポリペプチドが、哺乳動物内皮細胞において、有効濃度で、ＶＥＧＦに刺激された血管形成を阻止する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
患者が、血管形成関連疾患を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
血管形成関連疾患を、癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、末梢血管拡張症、出血性関節、血管線維腫、創傷顆粒形成、創傷治癒、末梢血管拡張乾癬硬皮症、発熱性肉芽腫、冠動脈側枝、虚血性四肢における血管形成、ルベオーシス、関節炎、及び糖尿病性新血管新生よりなる群から選択する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該治療用ポリペプチドと共に、血管形成を阻止する少なくとも一種の更なる抗血管形成剤を追加的又は相乗的仕方で投与することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
試験薬剤のＤｌｌ４シグナリングに対する効果を評価する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)内皮系統の細胞を該試験薬剤と接触させること；及び
(ｂ)動脈又は静脈の表現型と関連する表現型を検出すること
を含み、ここに、動脈表現型を採択することを促進する試験薬剤又は静脈表現型を採択することを阻止する薬剤は、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニストであり、動脈表現型を採択することを阻止し又は静脈表現型を採択することを促進する試験薬剤は、Ｄｌｌ４シグナリングのアンタゴニストである当該方法。
【請求項３２】
試験薬剤を、下記よりなる群から選択する、請求項２７に記載の方法：
(ａ)Ｄｌｌ４に選択的に結合する抗体；
(ｂ)Ｎｏｔｃｈ１に選択的に結合する抗体；
(ｃ)Ｎｏｔｃｈ４に選択的に結合する抗体；
(ｄ)Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４に結合する抗体；
(ｅ)Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈレセプター結合性部分を含むポリペプチドモノマー；
(ｆ)Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈレセプター結合性部分を含む２以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー；
(ｇ)Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４のＤｌｌ４結合性部分を含むポリペプチドモノマー；
(ｈ)Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４のＤｌｌ４結合性部分を含む２以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー。
【請求項３３】
動脈表現型を、ＥｐｈｒｉｎＢ２の発現及びコネキシン３７の発現よりなる群から選択する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
静脈表現型が、ＥｐｈＢ４の発現である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
血管形成を刺激する方法であって、有効量のＤｌｌ４シグナリングのアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【請求項３６】
血管において動脈の特性を採択することを促進する方法であって、有効量のＤｌｌ４シグナリングのアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【請求項３７】
血管形成を阻止する方法であって、有効量のＤｌｌ４シグナリングのアンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【請求項３８】
血管形成を破壊する方法であって、有効量のＤｌｌ４シグナリングのアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
血管形成(既存の脈管構造の内皮からの新しい血管の発生)は、固体腫瘍の宿主における成長、進行、及び転移において決定的に重要な過程である。生理的に正常な血管形成において、血管内皮の、周囲間質の成分とのオートクリン、パラクリン及びアンフィクリンの相互作用は、空間的時間的に厳密に調節されている。加えて、前血管形成サイトカイン及び血管形成サイトカイン並びに成長因子のレベル及び活性は、バランスが維持されている。対照的に、活性な腫瘍の成長に必要な病理的血管形成は、持続性であって、正常な血管形成システムの調節異常を示す。固体及び造血性腫瘍型は、特に、高レベルの異常な血管形成と関連している。一層最近、ある種の白血病は、血管形成に含まれるシグナリングによっても影響を受けるということが明らかとなった。
【背景技術】
【０００２】
血管形成を阻止する薬剤は、癌治療において有用である。Ａｖａｓｔｉｎ(商標)(ベバシツマブ)、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)に結合するモノクローナル抗体は、様々な癌の治療において効果的であることが判明している。ＳＤＦ／ＣＸＣＲ４シグナリング経路のアンタゴニストは、腫瘍の新血管新生を阻止して、マウスモデルにおける癌に対して効果的である(Guleng等、Cancer Res. 2005年７月１日; 65(13):5864-71)。イソクマリン−２−(８−ヒドロキシ−６−メトキシ−１−オキソ−１ Ｈ−２−ベンゾピラン−３−イル)プロピオン酸(ＮＭ−３)は、生体利用可能な経口の血管形成インヒビターとして、フェーズＩの臨床評価を完了している。ＮＭ−３は、内皮細胞と腫瘍細胞を直接殺し、マウスにおける種々のヒト腫瘍異種移植片の治療において有効である(Agata等、Cancer Chemother Pharmacol. 2005年６月10日; [印刷に先行する電子ジャーナル])。
【０００３】
血管形成は、他の、非新生物疾患の特徴である。様々な眼病、特に、増殖性網膜症及び加齢関連黄斑変性、並びに炎症性疾患例えばリウマチ様関節炎及び乾癬は、患部組織の増大した新血管新生により特徴付けられる。抗血管形成性薬剤は、これらの疾患の治療に有効である。Ｍａｃｕｇｅｎ(商標)(ＶＥＧＦに結合するアプタマー)は、新血管新生性(湿潤型)加齢関連黄斑変性の治療に有効であることが判明している。リウマチ様関節炎の治療におけるＴＮＦ−アルファアンタゴニストの成功は、部分的に、炎症の生じた関節組織に対する抗血管形成効果に帰せられるものである(Feldmann等、Annu Rev Immunol. 2001;19:163-96)。
【０００４】
動脈形成(血管形成とは関連するが異なる過程)は、既存の血管の内腔が増大して側枝を形成するときに起きる。心筋梗塞又は末梢(例えば、四肢、腎臓など)の虚血後に、小動脈は、冒された組織への主動脈の閉塞後の血流を維持するために一層重要な伝導性血管になる。従って、動脈形成を促進する薬剤は、心筋梗塞及び他の虚血性事象を治療するために利用することができ、部分的な動脈閉塞が検出され又は疑われる虚血性事象を防止するためにも利用することができる。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ経路(特に、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４)は、血管形成過程に関わっている。Ｎｏｔｃｈシグナリングは、一般に、細胞の増殖、分化、特化及び生存という様々な過程の調節に関係している(Artavanis-Tsakonas等、1999)。脊椎動物におけるその複雑さは、各々異なる発現パターンを有する多数のＮｏｔｃｈレセプターとリガンドの存在により説明される。哺乳動物では、４種類のＮｏｔｃｈレセプター(ｎｏｔｃｈ１〜４)及び５種類のリガンド(ｊａｇｇｅｄ１、２及びＤｌｌ１、３及び４)がある。マウスにおいて、Ｎｏｔｃｈレセプター及びリガンドの突然変異は、３つの生殖細胞系列すべてに由来する血管系を含む様々な器官における異常へと導く(Iso等、2003)。このＮｏｔｃｈ経路は、局所的細胞相互作用を介して機能し、一つの細胞の表面に存在するリガンドの細胞外ドメインは、隣接細胞上のレセプターの細胞外ドメインと相互作用する。この相互作用は、２つのＡＤＡＭプロテアーゼのＮｏｔｃｈの細胞外ドメインに対する作用とその後のγ−セクレターゼの膜貫通ドメインに対する作用を可能にし(これは、細胞内ドメインを細胞膜から遊離させて核に向かうことを可能にする)、それは、ＣＳＬと共に機能して、エンハンサー・オブ・スプリット(enhancer-of-split)ファミリーの転写リプレッサーの発現を活性化する(Mumm及びKopan, 2000)。
【０００６】
動脈と静脈の何れに分化するかは、長い間、主に、血圧及び酸素濃度などの物理的因子によると考えられてきた。しかしながら、最近、循環の開始より十分前に動脈又は静脈内皮細胞で特異的に発現される幾つかの遺伝子の同定が、動脈と静脈の間の第一次分化事象において、内皮細胞の遺伝的決定について重要な役割を示すようである。これらの遺伝子の内には、静脈内皮細胞で特異的に発現されるｅｐｈ−Ｂ４(Adams等、1999)及び、動脈内皮細胞で特異的に発現されるｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２(Adams等、1999; Gale等、2001)、ｎｏｔｃｈ１(Krebs等、2000)、ｎｏｔｃｈ４(Uyttendaele等、1996)及びｄｌｌ４(Shutter等、2000)がある(他の内で)。
【０００７】
ゼブラフィッシュＮｏｔｃｈ同族体の突然変異を用いた研究は、動脈と静脈の内皮の分化の調節におけるこの経路の重要性を示している(内皮の動脈特異的様式で最初に発現される遺伝子は、血管内皮成長因子及びソニックヘッジホッグの下流で、ｅｐｈｒｉｎ経路の上流にある(Lawson等、2002))。ゼブラフィッシュ及びマウスの両方において、Ｎｏｔｃｈ機能が、動脈内皮細胞の運命の確立に決定的に重要であるということの増大する証拠がある(Lawson等、2002; Fischer等、2004; Duarte等、2004)。
【０００８】
血管形成、動脈形成及び血管の同定のための薬剤及び治療剤を提供することは、本開示のゴールである。
【０００９】
発明の概要
ある面において、この開示は、Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様４(Ｄｌｌ４)のアゴニスト及びアンタゴニストの利用及びそれらを同定する方法を提供する。驚くべきことには、ここに教示するように、Ｄｌｌ４のアゴニスト及びアンタゴニストの両者は、血管形成を生じているか又は他の状況にあって、血管形成を阻止し又は破壊することが望ましい腫瘍を治療するために利用することができる。その上、この開示は、動脈形成をＤ１１４アゴニストを投与することにより刺激する方法を提供する。動脈形成は、典型的には虚血組織における、側枝動脈の形成及び成長の過程である。それ故、Ｄｌｌ４アゴニストは、虚血事象例えば末梢虚血又は冠状動脈虚血を患い又はその危険にある患者を治療するために利用することができる。この開示は、更に、Ｄｌｌ４のアップレギュレーションが、内皮細胞に動脈の個性をもたせ、Ｄｌｌ４の阻止が内皮細胞に静脈の個性(identity)をもたせるという発見にも関係する。それ故、この開示は、適宜、Ｄｌｌ４のアゴニスト又はアンタゴニストを利用することにより、静脈又は動脈の個性を変える方法を提供する。更に、この開示は、関心ある薬剤がＤｌｌ４シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを評価するために利用することのできるバイオマーカーを提供する。
【００１０】
この開示は、更に、Ｄｌｌ４の細胞外ドメインの一部を含むモノマー性ポリペプチドが低濃度で血管形成を促進し、一層高濃度ではＶＥＧＦ媒介の血管系性を阻害することを示す。可溶性Ｄｌｌ４ポリペプチドは、動脈化又は動脈形成をすべての濃度で促進する。従って、モノマー性可溶性Ｄｌｌ４ポリペプチドの適当な投与量を選択することにより、血管形成に対する種々の効果を達成することができる。ある具体例において、可溶性Ｄｌｌ４ポリペプチドは、SEQ ID NO:１のＤＳＬドメイン(アミノ酸１７３〜２３３)を含むが、膜貫通部分と細胞内部分(アミノ酸５５２〜６８５)を欠く。適宜、このＤｌｌ４ポリペプチドは、アミノ酸SEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５２８の領域に少なくとも２００アミノ酸を含む。適宜、Ｄｌｌ４ポリペプチドは、SEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜４８６(好ましくは、アミノ酸２７〜５２４)を含む。ある具体例において、この可溶性Ｄｌｌ４ポリペプチドは、Ｆｃドメイン又はポリオキシアルキレン部分(例えば、ＰＥＧ)などの、望ましい薬物動力学特性を付与する部分を含む。
【００１１】
ある具体例において、この開示は、動脈形成を刺激する方法を提供する。かかる方法は有効量のＤｌｌ４シグナリングアゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含みうる。この患者は、虚血状況を有しうるか又はその危険にありうる。この患者は、例えば狭心症を含む冠動脈疾患を有するかもしれず又は心筋梗塞を有したかもしれない。この患者は、末梢動脈疾患例えば四肢、脳又は腎臓などの器官における虚血事象又は部分的閉塞を有しうる。この患者は、虚血事象の危険があると診断されうる。
【００１２】
ある具体例において、この開示は、血管における動脈の特徴をもつことを促進する方法を提供する。かかる方法は、有効量のＤｌｌ４シグナリングアゴニストをそれを必要とする血管に生体外で又は患者に投与することを含みうる。血管は、静脈移植片例えば伏在静脈移植片であってよい。
【００１３】
ある具体例において、この開示は、血管形成を阻止する方法であって、有効量のＤｌｌ４シグナリングアンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む当該方法を提供する。この患者は、血管形成関連疾患を有していてよい。血管形成関連疾患の例には、血管形成依存性の癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、末梢血管拡張症、出血性関節、血管線維腫、創傷顆粒形成、創傷治癒、末梢血管拡張乾癬硬皮症、発熱性肉芽腫、皮膚潮紅、関節炎及び糖尿病性新血管新生が含まれる。方法は、更に、少なくとも一種の、血管形成を阻害する抗血管形成剤投与することを含むことができる。かかる追加の薬剤は、追加的又は相乗的仕方でＤｌｌ４シグナリングアンタゴニスト共に用いることができる。
【００１４】
ある具体例において、この開示は、血管形成を破壊する方法を提供する。かかる方法は、有効量のＤｌｌ４シグナリングアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含みうる。
【００１５】
ある具体例において、この開示は、腫瘍の脈管構造を破壊する方法を提供する。かかる方法は、有効量のＤｌｌ４シグナリングアゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含みうる。
【００１６】
ある具体例において、この開示は、試験薬剤のＤｌｌ４シグナリングに対する効果を評価する方法を提供する。方法は、(ａ)内皮系統の細胞を該試験薬剤と接触させること；及び(ｂ)動脈又は静脈の表現型と関連する表現型を検出することを含みうる。動脈表現型を取ることを促進する試験薬剤又は静脈表現型を取ることを阻止する薬剤は、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニストであり、動脈表現型を取ることを阻止し又は静脈表現型を取ることを促進する試験薬剤は、Ｄｌｌ４シグナリングのアンタゴニストである。
【００１７】
この開示は、Ｄｌｌ４シグナリグのアゴニストとアンタゴニストを識別するために利用することのできる特徴を提供する。一般に、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニストは、哺乳動物内皮細胞において、動脈表現型の発現を刺激して、静脈表現型の発現を阻止する。一般に、Ｄｌｌ４シグナリングのアンタゴニストは、哺乳動物内皮細胞において、動脈表現型の発現を阻止して、静脈表現型の発現を刺激する。動脈及び静脈の内皮細胞を識別する如何なる公知の特徴も、動脈及び静脈の表現型を評価する目的のために検出することができる。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２の発現及びコネクシン３７の発現は、動脈表現型の指標として利用することができる。他の例として、ＥｐｈＢ４の発現は、静脈表現型の指標として利用することができる。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトのデルタ様リガンド４タンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１；GeneBank ＮＰ＿０６１９４７)を示している。シグナル配列(アミノ酸１〜２６)に下線を引いてある。膜貫通ドメイン(アミノ酸５３２〜５５２)を太字にしてある。成熟タンパク質の細胞外ドメインは、アミノ酸２７〜５３１であるが、シグナルペプチドのプロセッシングにおける不明確さは、多少長さの異なるタンパク質を生じうる。細胞内ドメインは、アミノ酸５３２〜６８５である。
図２は、ヒトのデルタ様リガンド４タンパク質(SEQ ID NO:２；GenBank ＮＭ＿０１９０７４)をコードする核酸配列(ｃＤＮＡ)を示している。コード配列は、核酸３２１〜２３７８である。
図３．ｐＺ／ＥＧ−ｍＤｌｌ４遺伝子導入ベクター及びＣｒｅ活性の結果。
図４．(ａ)Ｅ８．０のＺＥＧ−ｍＤｌｌ４胚のＬａｃＺ染色；(ｂ)Ｅ８．５のｄｔ胚におけるＥＧＦＰ発現。(ｃ)Ｅ９．０のｄｔ胚における出血及び心膜浮腫。
図５．Ｅ９．０及びＥ９．５ｄｔ胚並びに対照用胚の全載ＰＥＣＡＭ１免疫染色。(ａ)Ｅ９．０の対照用胚、(ｂ)肥厚した背側大動脈(左下の矢印)、分岐したＡＣＶ(右下矢印)及び頭部領域における未熟脈管叢(上部矢印)を示すＥ９．０のｄｔ胚 (ｃ)Ｅ９．５の対照用胚、(ｄ)肥厚した背側大動脈及びを示すがＡＣＶ、頭部領域における未熟脈管叢及び肥厚した静脈洞及び心室のサインを殆ど示さないＥ９．５のｄｔ胚。染色したＥ９．５の胚の半断面は、ｄｔ胚(ｆ)の大動脈が静脈洞への接続の直後で萎縮していることを示した(下部矢印)が、対照用杯(ｅ)では、胚全体で同じ口径を維持している。ｄｔ胚(ｈ)の体節内血管(上部矢印)は、対照用胚(ｇ)のものより僅かに広くて短いように見える。ｄｔ胚の背側領域(下部矢印)においては、血管形成を生じることができていない。(ｉ)Ｅ９．５の対照用胚の卵黄嚢、(ｊ)対照用胚における脈管構造の高度に組織化された構造と対照的な一次叢の改変(remodelling)の欠如を示すｄｔ胚の卵黄嚢。
図６．低温切片化及び細血管造影法におけるＰＥＣＡＭ１免疫染色。(ａ〜ｇ) 静脈洞(下部矢印)への接続の直前での大動脈(右上矢印)とＡＣＶ(左上矢印)の間の融合を示しているＥ９．５ｄｔ胚の一連の切片(前方−後方)。切片(ａ)では、ＡＣＶは、細い毛細血管の叢よりなり(左上矢印)、それらは、背大動脈との融合の直前で結合して、大きい内腔を有する単一の血管を形成する。切片(ｅ)は、静脈洞の後方領域で、大動脈の萎縮を示している。(ｆ、ｇ)上述と同じ領域を描写しているＥ９．５の野生型胚の一連の切片。墨汁の注入を用いる細血管造影法は、胚の背大動脈とＡＣＶの間の機能的接続の存在を確認し、墨汁は、対照用胚(ｈ)で認められる規則的な流れと対照的に、大動脈(左手矢印)から静脈洞(右手矢印)に直接流れている。
図７．ｄｔ胚における動脈マーカーの静脈での発現。Ｅ９．０ｄｔ胚に由来する低温切片の、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２(ａ、ｂ、ｃ)及びコネキシン−３７(ｄ、ｅ、ｆ)特異的リボプローブを用いるイン・サイチューハイブリダイゼーション。変異型胚は、これらの動脈特異的マーカーの、背大動脈(ＡＤ)及び前心臓静脈(ＶＣＡ)の両方で付随的発現を示している。対照用胚(ｃ、ｆ)では、予想されるように、この発現は、大動脈に限定されている。
図８．変異型胚の静脈内皮におけるＮｏｔｃｈシグナリングのアップレギュレーション。Ｅ９．０のｄｔ胚に由来する低温切片の、ｈｅｙ１(ａ、ｂ、ｃ)及びＮｏｔｃｈ１(ｄ、ｅ、ｆ)特異的リボプローブを用いるイン・サイチューハイブリダイゼーション。両遺伝子は、前心臓静脈(ＶＣＡ)において、アップレギュレートされるようである。対照用胚(ｃ、ｆ)では、予想されるように、この発現は、大動脈に限定されている。
図９．ｄｔ胚における静脈特異的マーカーのダウンレギュレーション。Ｅ９．０のｄｔ胚に由来する低温切片のイン・サイチューハイブリダイゼーション及び免疫染色、(ａ)抗Ｅｐｈ−Ｂ４免疫染色、(ｃ)ｅｐｈ−ｂ４ ｍＲＮＡ、及びＥ９．０対照用胚、(ｂ)抗−Ｅｐｈ−Ｂ４免疫染色、(ｄ)ｅｐｈ−ｂ４ ｍＲＮＡ。
図１０は、ヒトのＤｌｌ４のドメイン構造(上段)及び注釈を付けたヒトＤｌｌ４のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１)(下段)の図解を示している。シグナル配列及びＤＳＬドメインには下線を引いて示してある。８つのＥＧＦ８ドメイン(ＥＧＦ８)には影を付けてある。ΔＸＢ(ΔＥＧＦ８)構築物は、１９のエキストラアミノ酸(ＲＳＰＳＣＩＹＲＲＳＷＲＳＲＧＡＯＩＬ)(SEQ ID NO:３)をＣ末端に、ＥＧＦ８リピートのＣＡＳ残基の後に含む。Ｐ５２４−Ｈｉｓ構築物は、Ｐ５２４(膜貫通ドメインの前の４アミノ酸)で終端しており、Ｃ末端には６×Ｈｉｓタグを有している。完全長の構築物は、Ｍｙｃタグを有するか又はタグを有しない。
図１１は、ニッケルカラム精製(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＣＢＢ−Ｇ２５０染色)後の純粋なｈＤｌｌ４−Ｐ５２４−６×Ｈｉｓタンパク質(ヒスチジンタグ付きｈＤｌｌ４−Ｐ５２４)を示している。
図１２．ｈＤｌｌ４は、ヒト動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)における管形成を阻害する。ＶＥＧＦを、２０ｎｇ／ｍｌで、陽性対照として用いた。低濃度のＤｌｌ４(５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌ)は、管形成を促進したが、５００ｎｇ／ｍｌのＤｌｌ４は、管形成を阻害した。
図１３．ｈＤｌｌ４は、ヒト動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)における萌芽を阻害する。ＶＥＧＦを、２０ｎｇ／ｍｌで、陽性対照として用いた。Ｄｌｌ４は、１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌでは、萌芽を促進したが、５００ｎｇ／ｍｌでは、阻害した。
図１４．ｈＤｌｌ４は、ヒト動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)におけるＶＥＧＦ刺激された萌芽を阻害する。ＶＥＧＦを、２０ｎｇ／ｍｌで用いた。１００ｎｇ／ｍｌのＤｌｌ４は、殆ど効果を有しなかったが、２００ｎｇ／ｍｌのＤｌｌ４は、ＶＥＧＦ刺激された萌芽を阻害した。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的に、デルタ様リガンド４の機能が、イン・ビボでの血管形成に必須であり、更に、デルタ様リガンド４活性の増加が、動脈内皮細胞の増大した増殖及び内皮細胞による動脈個性の増大した採択と関連するという発見に基づいている。出願人は、血管形成における投薬量感受性欠如を示すマウスのＤｌｌ４ノックアウト変異を生成した。その上、出願人は、Ｄｌｌ４過剰発現マウスモデルを生成して、Ｄｌｌ４の増大した発現が、ときに、動脈組織の肥厚を生じ、更には、静脈組織に動脈個性を採択させることを示した。これらの結果に基づいて、動脈及び静脈の系が生成される血管形成は、Ｄｌｌ４活性に高度に感受性であり、Ｄｌｌ４の阻害又は活性亢進によって混乱され(例えば、阻害され又は無秩序若しくは無効な仕方での血管形成を引き起こされ)うることが明らかである。それ故、驚くべきことに、Ｄｌｌ４のアゴニスト及びアンタゴニストの両者は、血管形成を伴う腫瘍を治療するために利用することができる。更に、この発明は、Ｄｌｌ４の過剰発現が、動脈の成長を刺激しえて、それ故、動脈形成を刺激するために利用することができるという発見に関係する。動脈形成は、典型的には虚血組織における、側枝動脈の形成及び成長の過程である。従って、Ｄｌｌ４アゴニストは、虚血事象例えば末梢若しくは冠動脈虚血を患い又はその危険にある患者を治療するために利用することができる。更に、この開示は、可溶性のモノマーＤｌｌ４ポリペプチドが、血管形成を、低濃度又は高濃度で、それぞれ、阻止又は促進するように作用することができることを示している。
【００２０】
この発明は、更に、関心ある薬剤が、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを評価するために利用することのできるバイオマーカーに関係する。Ｄｌｌ４を含むデルタタンパク質に一般的に関係する科学文献は、特定の薬剤が、Ｄｌｌ４に媒介されるシグナリングを活性化又は阻害するかどうかに関して明らかにしていない。例えば、Ｄｌｌ４及びデルタの細胞外ドメイン(例えば、可溶性のモノマー型、欠失した細胞内ドメインを有する型、及び可溶性Ｆｃ融合物)は、様々なアッセイにて試験されてきており、観察された効果の何れかがアゴニスト若しくはアンタゴニスト活性によるものであるのかどうか、又は何らかの意味のある活性があるのかどうかは、不明のままである。更に、試薬は、Ｄｌｌ４シグナリングに、様々な経路で影響しうる。例えば、ある試薬は、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ４活性化に、又は逆行Ｄｌｌ４シグナリングの活性化(おそらく、Ｄｌｌ４細胞内ドメインにより媒介される)に影響しうる。ある試薬は、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４の両方に影響しうるプレセリンプロテアーゼ活性の活性にも影響しうる。本開示は、Ｄｌｌ４活性亢進が、内皮細胞の動脈表現型の採択を引き起こす(ＥｐｈｒｉｎＢ２及びコネキシン３７の発現により示される)が、機能のＤｌｌ４欠如は、内皮細胞の静脈個性の採択を引き起こす(ＥｐｈＢ４の発現により示される)ことを示す。この遺伝的に決定されたＤｌｌ４活性のイン・ビボでの効果についての情報は、公知の薬剤及び新規に発見された薬剤の両者の、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストしての同定を可能にする。
【００２１】
従って、ある面において、この開示は、癌並びに血管形成関連疾患及び望ましくない血管形成関連過程を治療するために利用することのできる多くのポリペプチド化合物(剤)を提供する。
【００２２】
Ｄｌｌ４は、Ｎｏｔｃｈリガンドであって、シグナル配列、ＤＳＬドメイン、８つの上皮成長因子様反復、膜貫通ドメイン、及び細胞内領域を含み、これらのすべては、デルタタンパク質ファミリーのメンバーの特徴である。デルタ４ｍＲＮＡの組織分布は、以前に、Ｎｏｔｃｈ４(Ｉｎｔ−３)転写物について記載されたものと似ている。デルタ４の細胞外部分の可溶型は、ヒトの大動脈内皮細胞の見かけの増殖を阻害するが、ヒトの肺動脈内皮細胞の見かけの増殖は阻害しない。Yoneya等、Biochem. Vol.129, p.27-34 (2001)。
【００２３】
タンパク質のＮｏｔｃｈファミリーのメンバーは、特徴的な多数の上皮成長因子(ＥＧＦ)様反復並びに保存されたドメイン例えばＲＡＭ、アンキリン様反復及びＰＥＳＴ配列を含む膜貫通レセプターである。Ｎｏｔｃｈタンパク質のリガンドは、キイロショウジョウバエのデルタ及びセレート、線虫のＬＡＧ−２及びＡＰＸ−１、並びに脊椎動物のデルタ及びセレート(又はジャッグド)を含む。これらのリガンドは又、膜貫通タンパク質でもあって、高度に保存されたＤＳＬ(デルタ−セレート−ＬＡＧ−２)モチーフを、数の変化しうるＥＧＦ様反復の上流に含む。このＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈリガンドの特徴であり、タンパク質機能にとって重要であり；従って、ＬＡＧ−２におけるＤＳＬドメインの点突然変異は、活性の喪失を生じる。脊椎動物のデルタ及びジャッグド(セレート)タンパク質が類似の構造を示しても、タンパク質の各グループは又、幾つかの異なる特徴をも有する。それ故、脊椎動物のデルタタンパク質は８つのＥＧＦ様反復を含むが、ジャッグドタンパク質は、１６のかかる反復を含む。更に、ジャッグドタンパク質では、これらのＥＧＦドメインの後ろには、システインリッチなドメインが続いているが、デルタタンパク質ではそうでない。しかしながら、これらの構造的差異の重要性は、不明なままである。
【００２４】
Uyttendaele等(1996)は、マウスのＮｏｔｃｈ４遺伝子の完全なコード領域に相当するｃＤＮＡをクローン化した。イン・サイチューハイブリダイゼーションは、Ｎｏｔｃｈ４転写物が、主として、胚及び成体において内皮細胞に限られていることを示したが、これは、脊椎動物の内皮の発生におけるＮｏｔｃｈ４の役割を示唆している。
【００２５】
Li等(Genomics. 1998 Jul 1;51(1):45-58)は、ヒトのＮＯＴＣＨ４遺伝子が、３０のエキソンを含み、約３０ｋｂに及ぶことを報告した。彼らは、６．７ｋｂのＮＯＴＣＨ４(Ｓ)及び９．３ｋｂのＮＯＴＣＨ４(Ｌ)ｍＲＮＡイソ型に対応するｃＤＮＡを単離した。ＮＯＴＣＨ４(Ｓ)によりコードされる予想されたタンパク質は、２，００３アミノ酸長であり、特徴的なＮｏｔｃｈモチーフ：１のシグナルペプチド、２９の上皮成長因子(ＥＧＦ)様反復、３のＮｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２反復、１の膜貫通領域、６のｃｄｃ１０(６０３１５１)／アンキリン反復、及びＣ末端のＰＥＳＴ保存領域を含んでいる。これらのマウス及びヒトのＮＯＴＣＨ４タンパク質の配列は、８２％同一である。不完全にスプライシングを受けたＮＯＴＣＨ４(Ｌ)ｃＤＮＡは、潜在的に、２つの異なるタンパク質をコードしている。第一のものは、７つのＥＧＦ反復よりなる。第二のものは、膜貫通ドメインと細胞内領域を含み、マウスのｉｎｔ３プロトオンコタンパク質と類似している。ノーザンブロット分析は、ＮＯＴＣＨ４(Ｓ)が、主たる転写物であって、広範囲の組織で発現されていることを示した。
【００２６】
Krebs等(2000)は、遺伝子ターゲティングによってＮｏｔｃｈ４欠損マウスを生成した。この変異についてホモ接合である胚は正常に発生して、ホモ接合変異型の成体は、生存可能で繁殖可能であった。しかしながら、このＮｏｔｃｈ４変異は、関連するＮｏｔｃｈ１遺伝子のターゲティングによる変異と遺伝的相互作用を示した。Ｎｏｔｃｈ１変異体とＮｏｔｃｈ１／Ｎｏｔｃｈ４二重変異体胚の両方とも、血管形成の血管改変における重大な欠損を示した。Ｎｏｔｃｈファミリーレセプターのリガンドをコードする遺伝子の発現パターンの分析は、Ｄｌｌ４遺伝子のみが、初期胚の脈管構造において、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４レセプターのリガンドをコードする遺伝子について予想されるものと一致するパターンで発現することを示した。それ故、血管の形態形成及び改変の調節において、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路について必須の役割があり、Ｎｏｔｃｈ４遺伝子は、胚発生において必須でないが、Ｎｏｔｃｈ４及びＮｏｔｃｈ１遺伝子は、マウスの胚発生において部分的に重複した役割を有していることを示している。
【００２７】
上記のように、この開示は、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニストを利用する方法及び同定する方法を提供する。候補のアゴニスト及びアンタゴニストは、一般に、例えば、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４及びプレゼニリンを含むＤｌｌ４シグナリング経路に関係するタンパク質に結合する任意の抗体又は該タンパク質の可溶性部分である。候補のアゴニスト及びアンタゴニストは又、この経路のメンバーに結合し又は影響を及ぼす小型分子又は他の薬剤であってもよい。アンチセンス又はＲＮＡｉ核酸は、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４若しくはプレゼニリン又はこのシグナリング経路の他のメンバーのアンタゴニストとして利用することができる。
【００２８】
薬剤の例は、下記を含む：
(ａ)Ｄｌｌ４に選択的に結合する抗体；
(ｂ)Ｎｏｔｃｈ１に選択的に結合する抗体；
(ｃ)Ｎｏｔｃｈ４に選択的に結合する抗体；
(ｄ)Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４に結合する抗体；
(ｅ)Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈレセプター結合性部分を含むポリペプチドモノマー；
(ｆ)Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈレセプター結合性部分を含む２以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー；
(ｇ)Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４のＤｌｌ４結合性部分を含むポリペプチドモノマー；
(ｈ)Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４のＤｌｌ４結合性部分を含む２以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー。
【００２９】
プレゼニリン活性又は他のメタロプロテイナーゼに干渉する薬剤(例えば、クズバニアン)は、Ｄｌｌ４シグナリングを変調することが予想される。これらの薬剤の各々は、上記のように、アゴニスト又はアンタゴニスト活性について評価することができる。
【００３０】
ある面において、この薬剤は、SEQ ID NO:１のアミノ酸２７〜５３１に示したような、Ｄｌｌ４タンパク質の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドである。特定の具体例において、このＤｌｌ４可溶性ポリペプチドは、Ｄｌｌ４タンパク質のＤＳＬドメインを含む。
【００３１】
ここで用いる場合、主題の可溶性ポリペプチドは、Ｄｌｌ４可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型を含む。これらの主題の可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型は、Ｄｌｌ４のアゴニスト又はアンタゴニストとしての活性について、内皮細胞における動脈又は静脈表現型に対する効果を評価することにより試験することができる。
【００３２】
ある具体例において、主題の可溶性ポリペプチドの単離された断片を、Ｄｌｌ４をコードする核酸の対応する断片からの組換えにより生成したポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、断片は、当分野で公知の技術例えばメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学を利用して化学的に合成することができる。これらの断片を、(組換え又は化学合成により)生成し、試験して、Ｄｌｌ４シグナリングを変調することのできるペプチド性断片を同定することができる。
【００３３】
ある具体例において、Ｄｌｌ４可溶性ポリペプチドの機能性変異体は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列の残基２７〜５３１と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
ある具体例において、本発明は、機能的変異体を、主題の可溶性ポリペプチドの構造を治療若しくは予防効力又は安定性(例えば、エキス・ビボでの貯蔵寿命及びイン・ビボでのタンパク質分解への耐性)を増進させるなどの目的のために改変することによって作成することを企図する。改変された可溶性ポリペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加によって生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの孤立した置換、又はアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での類似した置換(例えば、保存的突然変異)は、その結果生成した分子の生物学的活性に大きな効果を有しないであろうと予想することは妥当なことである。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起きるものである。
【００３５】
この発明は、更に、Ｄｌｌ４ポリペプチドのコンビナトリアル変異体並びに切り詰められた変異体のセットを生成する方法を企図し、これは、機能的変異体配列の同定に本質的に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、Ｄｌｌ４のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる可溶性ポリペプチド変異体を生成することであってよい。天然の可溶性ポリペプチドと比較して選択的効能を有するコンビナトリアル由来の変異体を生成することができる。かかる変異体タンパク質は、組換えＤＮＡ構築物から発現された場合、遺伝子治療プロトコールで利用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型可溶性ポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じうる。例えば、変化したタンパク質は、タンパク質分解又は関心あるタンパク質(例えば、可溶性ポリペプチド)の破壊若しくは不活性化を生じる他の細胞過程に対して一層安定にされうるし又は一層安定でなくされうる。かかる変異体及びそれらをコードする遺伝子を利用して、主題の可溶性ポリペプチドレベルを、それらの半減期を変調することにより変えることができる。短い半減期は、一層一過性の生物学的事象を生じうるし、誘導可能な発現系の部分の場合は、組換え可溶性ポリペプチドの細胞内レベルの一層厳密な制御を可能にしうる。上記のように、かかるタンパク質(及び特にそれらの組換え核酸構築物)は、遺伝子治療プロトコールで利用することができる。
【００３６】
潜在的同族体のライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することのできる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動化ＤＮＡシンセサイザーで行なうことができ、その合成遺伝子を、次いで、発現のために適当な遺伝子中に連結することができる。遺伝子の縮重セットの目的は、一の混合物中に、潜在的な可溶性ポリペプチド配列の所望のセットをコードするすべての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当分野で周知である(例えば、Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura等(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Watron 編、Amsterdam： Elsevier p273-289; Itakura等(1984) Annu.Rev.Biochem.53:323; Itakura等 (1984) Science 198:1056; Ike等(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。かかる技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化において採用されている(例えば、Scott等(1990) Science 249:386-390; Roberts等(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin等(1990) Science 249: 404-406; Cwirla等(1990) PNAS USA 87:6378-6382;並びに米国特許第５，２２３，４０９号、５，１９８，３４６号、及び５，０９６，８１５号を参照されたい)。
【００３７】
或は、他の型の突然変異誘発を、コンビナトリアルライブラリーを生成するために利用することができる。例えば、可溶性ポリペプチド変異体(例えば、アンタゴニスト型)を生成して、ライブラリーから、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発などを利用してスクリーニングすることにより(Ruf等(1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang等(1994) J.Biol.Chem. 269:3095-3099；Balint等(1993) Gene 137:109-118；Grodberg等(1993) Eur.J.Biochem. 218:597-601; Nagashima等(1993) J.Biol.Chem. 268:2888-2892)；Lowman等(1991) Biochemistry 30:10832-10838；及び Cunningham等(1989) Science 244:1081-1085)；リンカースキャニング突然変異誘発(Gustin等(1993) Virology 193:653-660；Brown等(1992) Mol.Cell Biol. 12:2644-2652；McKnight等(1982) Science 232:316)により；飽和突然変異誘発(Meyers等(1986) Science 232:613)により；ＰＣＲ突然変異誘発(Leung等(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19)により；又は化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発(Miller等(1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 及び Greener等(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)により単離することができる。リンカースキャニング突然変異誘発(特に、コンビナトリアルセッティングにおけるもの)は、切り詰められた(生物活性な)型の主題の可溶性ポリペプチドを同定するための魅力的な方法である。
【００３８】
当分野では、点突然変異及び切り詰めにより作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのための、そしてこの問題について、ある種の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡをスクリーニングするための広範な技術が知られている。かかる技術は、一般に、主題の可溶性ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合させることができる。最も広く利用されている大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローン化すること、適当な細胞をトランスフォームしてベクターのライブラリーを生じること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が産物の検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で発現させることを含む。下記の例証アッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術により造られた多数の縮重配列のスクリーニングに必要な高スループット分析に従順である。
【００３９】
ある具体例において、この発明の可溶性ポリペプチドは、更に、翻訳後修飾を含みうる。かかる修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含むが、これらに限られない。結果として、修飾された可溶性ポリペプチドは、非アミノ酸エレメント例えばポリエチレングリコール、脂質、多糖類又は単糖類、及びリン酸を含むことができる。かかる非アミノ酸エレメントの、可溶性ポリペプチドの機能性に対する効果は、Ｄｌｌ４に対するそのアゴニスト又はアンタゴニスト効果について試験することができる。
【００４０】
ある面において、主題の可溶性ポリペプチドの機能的変異体又は改変型は、可溶性ポリペプチドの少なくとも一部と少なくとも一つの融合ドメインとを有する融合タンパク質を包含する。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ及び免疫グロブリン重鎖定常領域(Ｆｃ)、マルトース結合性タンパク質(ＭＢＰ)が含まれる(これらは、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる単離に特に有用である)が、これらに限られない。アフィニティー精製の目的のためには、アフィニティークロマトグラフィー用の適当なマトリクス例えばグルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、及びニッケル又はコバルト結合樹脂を利用する。当分野で周知の他の融合ドメインは、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)である。融合ドメインには又、通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」も含まれ、これに対する特異的抗体を利用することができる。特異的モノクローナル抗体を容易に利用することのできる周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)及びｃ−ｍｙｃタグが含まれる。幾つかの場合には、これらの融合ドメインは、因子Ｘａ又はトロンビンなどのプロテアーゼ開裂部位を有し、これは、適当なプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、それにより、組換えタンパク質を遊離させることを可能にする。それらの遊離されたタンパク質を、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって融合ドメインから単離することができる。ある具体例において、本発明の可溶性ポリペプチドは、それらの可溶性ポリペプチドを安定化することのできる少なくとも一の改変を含む。例えば、かかる改変は、これらの可溶性ポリペプチドのイン・ビトロ半減期を増大させ、同ポリペプチドの循環半減期を増大させ又は同ポリペプチドのタンパク質分解による分解を低減させる。
【００４１】
ある具体例において、この発明の可溶性ポリペプチド(改変されたもの又はされてないもの)を当分野で公知の様々な技術により生成することができる。例えば、かかる可溶性ポリペプチドは、Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993)及びGrant G. A. (編)、Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)に記載されたような標準的タンパク質化学の技術を利用して合成することができる。加えて、自動化ペプチドシンセサイザーが、市販されている(例えば、Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600)。或は、これらの可溶性ポリペプチド、それらの断片又は変異体を、当分野で周知の様々な発現系(下記参照)を利用して組換えにより生成することができる。
【００４２】
ある面において、この発明は、Ｄｌｌ４ポリペプチドをコードする単離された及び／又は組換えの核酸に関係する。主題の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってよい。これらの核酸は、治療剤として有用でありうる。例えば、これらの核酸は、細胞又は個人に治療剤として投与される組換え可溶性ポリペプチドの作成に有用である。或は、これらの核酸は、細胞又は個人に治療剤として(遺伝子治療などにおいて)直接投与することができる。
【００４３】
ある具体例において、この発明は、SEQ ID NO:２に描いたヌクレオチド配列の一領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である単離された又は組換えの核酸配列を提供する。当業者は、主題の核酸に相補的な核酸配列及び主題の核酸の変異体も又、この発明の範囲内にあることを認めよう。更なる具体例において、この発明の核酸配列は、単離することができ、異質ヌクレオチド配列と組み換え及び／又は融合することができ、又はＤＮＡライブラリー中にあってよい。
【００４４】
他の具体例において、この発明の核酸は又、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:２に描いたヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、又はそれらの相補的配列を含む。上記のように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件は、変えることができるということを容易に理解できよう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件は、変化しうるということを容易に理解するであろう。例えば、ハイブリダイゼーションを、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)で、約４５℃で行なって、その後、２．０×ＳＳＣにより５０℃で洗うことができよう。例えば、洗浄工程での塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ(５０℃)の低ストリンジェンシー〜約０．２×ＳＳＣ(５０℃)の高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、この洗浄工程での温度は、低ストリンジェンシー条件の室温(約２２℃)から高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。温度と塩の両方を変えることができ又は温度若しくは塩濃度を他を変えつつ一定に維持することができる。一具体例において、この発明は、６×ＳＳＣ(室温)の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズした後に２×ＳＳＣ(室温)で洗浄した核酸を提供する。
【００４５】
主題の核酸と遺伝コードの縮重のために異なる単離された核酸も又、この発明の範囲内にある。例えば、幾つかのアミノ酸が、一のトリプレット以上によって指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ちシノニム(例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異を生じうる。しかしながら、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化へと導くＤＮＡ配列の多型が哺乳動物細胞間には存在するということが予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の少なくとも一つのヌクレオチドにおけるこれらの変異(最大でヌクレオチドの３〜５％)が、自然の対立遺伝子変異のために、所定の種の個体間に存在しうるということを認めよう。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変異及びその結果生じるアミノ酸の多型は、この発明の範囲内にある。
【００４６】
ある具体例において、この発明の組換え核酸は、発現用構築物中の少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列に操作可能に結合することができる。調節用ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために用いる宿主細胞に適している。多くの種類の適当な発現ベクター及び適当な調節配列は、様々な宿主細胞について当分野で公知である。典型的には、該少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれるが、これらに限られない。当分野で公知の構成的及び誘導性プロモーターは、この発明により企図される。これらのプロモーターは、天然のプロモーターであってよいし、又は一つより多くのプロモーターのエレメントを結合したハイブリッドプロモーターであってもよい。発現用構築物は、細胞中で、エピソーム例えばプラスミドとして存在してよいし、又は染色体内に挿入されていてもよい。好適具体例において、この発現ベクターは、トランスフォームされた宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当分野で周知であり、用いる細胞によって変わる。
【００４７】
この発明のある面において、主題の核酸は、Ｄｌｌ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて与えられて、少なくとも一つの調節配列に操作可能に結合される。調節配列は、当分野で認められており、可溶性ポリペプチドの発現を指示するように選択される。従って、用語調節配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントを包含する。典型的な調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列を操作可能に結合した場合にその発現を制御する任意の様々な発現制御配列を、これらのベクターにおいて利用して、可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。かかる有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルス若しくはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ若しくはＴＲＣシステム、Ｔ７プロモーター(その発現は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより指示される)、ラムダファージの主要オペレーター及びプロモーター、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ若しくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター(例えば、Ｐｈｏ５)、酵母のα交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター及び 原核若しくは真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することの知られた他の配列これらの様々な組合せが含まれる。発現ベクターのデザインは、かかるトランスフォームすべき宿主細胞の選択及び／又は発現を所望するタンパク質の種類などの因子に依存しうるということは理解されよう。その上、ベクターのコピー数、そのコピー数及びそのベクターによりコードされる任意の他のタンパク質(抗生物質マーカーなど)の発現を制御する能力も又、考慮すべきである。
【００４８】
この発明は又、少なくとも一種の主題の可溶性ポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関係する。この宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。例えば、この発明の可溶性ポリペプチドは、細菌細胞(例えば、大腸菌)、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を利用)、酵母、又は哺乳動物細胞において発現させることができる。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００４９】
従って、本発明は、更に、主題の可溶性ポリペプチドを製造する方法に関係する。例えば、Ｄｌｌ４可溶性ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、Ｄｌｌ４可溶性ポリペプチドの発現を可能にして生じさせるのに適した条件下で培養することができる。このＤｌｌ４可溶性ポリペプチドは、該可溶性ポリペプチドを含む細胞及び培地の混合物から分泌させて単離することができる。或は、これらの可溶性ポリペプチドは、細胞質に維持するか又は膜画分に維持することができ、そしてこれらの細胞を収穫し、溶解させて、該タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地及び他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、当分野で周知である。これらの可溶性ポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、又は両者から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及び免疫アフィニティー精製(可溶性ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を利用)を含むタンパク質の精製のための当分野で公知の技術を利用して単離することができる。好適具体例において、この可溶性ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。
【００５０】
この発明の組換え核酸は、クローン化遺伝子又はその一部分を、原核細胞、真核細胞(酵母、昆虫又は哺乳動物)又は両方における発現に適したベクター内に連結することにより生成することができる。組換え可溶性ポリペプチドの生成のための発現用ビヒクルは、プラスミド又は他のベクターを包含する。例えば、適当なベクターには、次の種類のプラスミドが含まれる：ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミド及びｐＵＣ由来のプラスミド(大腸菌などの原核細胞における発現用)。
【００５１】
好適な哺乳動物用発現ベクターは、該ベクターの細菌における増殖を促進するための原核配列と、真核細胞で発現される一種以上の真核生物用転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの幾つかは、原核及び真核細胞の両方で複製及び薬物耐性を促進するために、細菌プラスミド由来の配列例えばｐＢＲ３２２により改変される。或は、ウシパピローマウイルス(ＢＰＶ−１)、又はエプスタイン−バールウイルス(ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来の及びｐ２０５)などのウイルスの誘導体を、タンパク質の真核細胞における一過性発現のために利用することができる。他のウイルス性発現系(レトロウイルスを含む)の例は、下記の遺伝子治療送達系の記載に見出すことができる。プラスミドの調製及び宿主生物体のトランスフォーメーションにおいて用いらるこれらの様々な方法は、当分野で周知である。原核細胞及び真核細胞の両方のための他の適当な発現系並びに一般的な組換え手順については、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第二版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、第１６及び１７章を参照されたい。幾つかの例においては、組換え体ＳＬＣ５Ａ８ポリペプチドを、バキュロウイルス発現系の利用によって発現することが望ましい。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター(ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１など)、ｐＡｃＵＷ由来のベクター(ｐＡｃＵＷ１など)、及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター(β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ)が含まれる。
【００５２】
融合遺伝子を作成する技術は、周知である。本質的には、種々のポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片を、慣用技術に従って結合することを行い、該技術では、鈍端又は付着末端を連結のために用い、制限酵素消化を適当な末端を与えるために用い、適宜粘着末端を埋め、望ましくない結合を回避するためにアルカリホスファターゼ処理を用い、そして酵素的連結を用いる。他の具体例においては、この融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用の技術によって合成することができる。或は、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、２つの連続的遺伝子断片の間で相補的オーバーハングを生じさせる(これらは、次いで、アニールされてキメラの遺伝子配列を生成することができる)アンカープライマーを利用することにより行なうことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編、John Wiley & Sons: 1992参照)。
【００５３】
ある面において、本発明は、Ｄｌｌ４シグナリングに対するアゴニスト又はアンタゴニスト効果を有する抗体を提供する。かかる抗体は、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４などの抗原に結合することができる。好ましくは、この抗体は、かかる抗原の細胞外ドメインに結合する。抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく；無傷であっても切り詰められていてもよく(例えば、Ｆ(ab')2、Ｆab、Ｆｖ)；異種性、同系、完全にヒト型又はその改変型であってよい(例えば、ヒト化キメラ)ということは理解される。完全にヒトの抗体は、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物から選択することができ又は抗体断片を発現する組換えライブラリーから組み立てることができる。
【００５４】
Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４由来の免疫原を利用することにより、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を、標準的プロトコールによって作成することができる(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照されたい)。哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギを、免疫原形態のペプチド(例えば、ポリペプチド又は抗体応答を誘出することのできる抗原性断片、又は融合タンパク質)を用いて免疫化することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与える技術は、キャリアーへの結合体化又は他の当分野で周知の技術を含む。抗原の免疫原性部分を、アジュバントの存在下に投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイを、免疫原を抗原として利用して抗体のレベルを評価することができる。
【００５５】
抗原性調製物を用いた動物の免疫化の後、抗血清を得ることができ、所望であれば、ポリクローナル抗体をその血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するには、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫化した動物から収穫して、標準的体細胞融合手順によって不滅化細胞例えばミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生成することができる。かかる技術は、当分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein, (1975) Nature, 256: 495-497によって最初に開発された)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar等 (1983) Immunology Today, 4: 72)、及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole等 (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. p.77-96)を含む。ハイブリドーマ細胞を、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４又は他の標的ポリペプチドと特異的に反応する抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングして、モノクローナル抗体をかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。
【００５６】
用語抗体は、ここで用いる場合、やはり抗原と特異的に反応するその断片を含むことを意図している。抗体を、慣用技術を利用して断片化して、それらの断片を、全抗体について上記したのと同様にして、有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab)2断片を、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。その生成したＦ(ab)2断片を処理して、ジスルフィド橋を還元してＦab断片を生成することができる。本発明の抗体は、更に、二官能性の、一本鎖の、並びに抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域により与えられる抗原に対する親和性を有するキメラの及びヒト化した分子を含むことを意図している。一本鎖抗体の生成のための技術(米国特許第４，９４６，７７８号)は又、一本鎖抗体の生成にも適合させることができる。又、トランスジェニックマウス又は他の生物体(他の哺乳動物を含む)を利用して、ヒト化抗体を発現させることもできる。好適具体例において、これらの抗体は、それらに結合させた標識を更に含み、検出することができる(例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素補因子であってよい)。
【００５７】
ある好適具体例において、この発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、ある具体例においては、この発明は、新規な抗体を生成する方法を利用可能にする。例えば、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、マウスにある量の、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与すること、そのマウスから抗体産生細胞(例えば、脾臓由来の細胞)を得ること及びそれらの抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること、そしてその抗体産生ハイブリドーマを試験して、該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含むことができる。一度得られれば、ハイブリドーマを、細胞培養にて増殖させることができ、適宜、ハイブリドーマ由来細胞が該モノクローナル抗体を生成する培養条件にて増殖させることができる。このモノクローナル抗体は、細胞培養物から精製することができる。
【００５８】
加えて、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために用いられるこれらの技術は、得られる抗体の特性に影響を与えうる。例えば、ある治療目的に用いるための抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的とすることができる。従って、この型の抗体を得るためには、関心ある抗原を発現する細胞に結合する抗体についてスクリーニングするのが望ましいであろう(例えば、蛍光活性化セルソーティングにより)。同様に、もし抗体を、溶液中の抗原に結合させるために用いるのであれば、溶液結合を試験することが望ましいであろう。抗体：抗原相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な技術を利用することができる。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacore binding assay, Bia-core AB, スウェーデン国、Uppsala)、サンドイッチアッセイ(例えば、IGEN International, Inc., メリーランド、Gaithersburg のパラマグネチックビーズシステム)、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ及び免疫組織化学が含まれる。
【００５９】
ある面において、この開示は、Ｄｌｌ４転写物に生理的条件下でハイブリダイズして、細胞におけるＤｌｌ４の発現を低減させる少なくとも一つの部分を含む単離された核酸化合物を提供する。かかる核酸は、ここに記載のように、Ｄｌｌ４アンタゴニストとして利用することができる。このＤｌｌ４転写物は、任意のプレスプライシング転写物(即ち、イントロンを含む)、ポストスプライシング転写物、並びに任意のスプライシング変異体であってよい。ある具体例において、このＤｌｌ４転写物は、SEQ ID NO:２に示したｃＤＮＡ、特にそのコード部分に対応する配列を有する。ある面において、この開示は、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４転写物に生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４の発現を低減させる少なくとも一つの部分を含む単離された核酸化合物を提供する。これらは、Ｄｌｌ４アンタゴニストとしても利用することができる。このＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４転写物は、任意のプレスプライシング転写物(即ち、イントロンを含む)、ポストスプライシング転写物、並びに任意のスプライシング変異体であってよい。
【００６０】
核酸化合物のカテゴリーの例には、核酸、ＲＮＡｉ構築物及び触媒性核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖化合物は又、オーバーハングの領域又は非相補的領域を含むこともでき、該領域では、鎖の一方又は他方は、一本鎖である。一本鎖化合物は、自己相補的領域を含むことができ、これは、その化合物が、二重らせん構造によって、いわゆる「ヘアピン」又は「ステムループ」構造を形成することを意味する。核酸化合物は、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４核酸配列の１０００ヌクレオチド以下の、５００ヌクレオチド以下の、２５０ヌクレオチド以下の、１００ヌクレオチド以下の、５０ヌクレオチド以下の配列よりなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。この相補的領域は、好ましくは、少なくとも８ヌクレオチドであり、適宜、少なくとも１０又は少なくとも１５ヌクレオチドである。相補的領域は、標的転写物のイントロン、コード配列又は非コード配列内(コード配列部分など)であってよい。一般に、核酸化合物は、約８〜５００ヌクレオチド長又は塩基対長を有し、適宜、その長さは、約１４〜５０ヌクレオチドである。核酸は、ＤＮＡ(特に、アンチセンス用)、ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであってよい。任意の一本鎖は、ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物、並びに容易にＤＮＡ又はＲＮＡとして分類できない改変型を含むことができる。同様に、二本鎖化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡであってよく、任意の一本鎖は、ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物、並びに容易にＤＮＡ又はＲＮＡとして分類できない改変型を含むこともできる。核酸化合物は、様々な改変の何れかを含むことができ、該改変には、主鎖に対するもの(ヌクレオチド間結合を含む、天然核酸の糖リン酸部分)又は塩基部分に対するもの(天然核酸のプリン又はピリミジン部分)が含まれる。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜３０ヌクレオチド長を有し、しばしば、血清、細胞又は化合物が送達されそうな場所(例えば、経口送達される化合物の場合の胃、及び吸入される化合物の場合の肺)での安定性などの特性を改善するための一つ以上の改変を含む。ＲＮＡｉ構築物の場合には、標的転写物に相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡ又はその改変物である。他方の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は他の変形物であってよい。二本鎖又は一本鎖「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の二本鎖部分は、好ましくは、１８〜４０ヌクレオチド長の、適宜、Ｄｉｃｅｒ基質として働きさえすれば、約２１〜２３ヌクレオチド長の長さを有する。触媒性又は酵素的核酸は、リボザイム又はＤＮＡ酵素であってよく、改変型をも含むことができる。核酸化合物は、細胞と生理的条件下で且つナンセンス又はセンスコントロールが殆どないか効果がない濃度で接触させたときに、標的の発現を、約５０％、７５％、９０％又はそれ以上阻止することができる。核酸化合物の効果を試験するの好適な濃度は、１、５及び１０マイクロモルである。核酸化合物は又、細胞表現型(例えば、動脈又は静脈の個性)に対する効果について試験することもできる。
【００６１】
Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する候補の薬剤についてのスクリーニングへの多くのアプローチがある。この開示は、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニストを識別するために利用することのできる特徴を提供する。一般に、Ｄｌｌ４シグナリングのアゴニストは、哺乳動物の内皮細胞において、動脈表現型の発現を刺激して、静脈表現型の発現を阻止する。一般に、Ｄｌｌ４シグナリングのアンタゴニストは、哺乳動物の内皮細胞において、動脈表現型の発現を阻止して、静脈表現型の発現を刺激する。動脈内皮細胞と静脈内皮細胞を識別する任意の公知の特徴を、動脈及び静脈表現型の評価の目的のために検出することができる。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２の発現及びコネキシン３７の発現を、動脈表現型の指標として利用することができる。他の例としては、ＥｐｈＢ４の発現は、静脈表現型の指標として利用することができる。
【００６２】
薬剤は又、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１若しくはＮｏｔｃｈ４への結合活性について、又はＮｏｔｃｈ１(ＮＩＣＤ)、Ｎｏｔｃｈ４若しくはＤｌｌ４の活性な細胞内ドメインの生成を刺激し若しくは阻止する能力についてスクリーニングすることもできる。ヘアリー／エンハンサー・オブ・スプリット(ＨＥＳ)感受性プロモーターからの発現は又、Ｎｏｔｃｈシグナリングが活性化されるかどうかの決定にも有用でありうる。ＮＩＣＤは、ＨＥＳ及びＨＥＳ駆動されるプロモーターの発現を刺激する。
【００６３】
任意のスクリーニング系により同定された化合物を、次いで、動物で試験して、それらの血管形成、動脈形成、又は抗腫瘍活性に対するイン・ビボでの効果並びに動脈又は静脈の個性に対するイン・ビボでの効果を評価することができる。
【００６４】
化合物又は分子の高スループットスクリーニングを行なって、血管形成を阻止し又は腫瘍成長を阻止する薬剤又は薬物を同定することができる。試験薬剤は、合成により作成した、組換え技術により作成した又は天然起源から単離した任意の化学物質(成分、分子、化合物、薬物)であってよい。例えば、試験薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、糖、ホルモン、又は核酸分子であってよい。加えて、試験薬剤は、小型分子又はコンビナトリアル化学により作成されて例えばライブラリーに構成された一層大きい複雑さの分子であってよい。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハロゲン化物、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル及び他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験薬剤は又、天然物であっても、細胞(細菌、動物又は植物)の溶解物若しくは成長培地から人為的に処理した生成物又は細胞溶解物若しくは成長培地自体であってもよい。試験化合物の試験系への提示は、単離した形態であってもよいし又は化合物の混合物としてでもよい(特に、初期のスクリーニング段階において)。
【００６５】
例えば、Ｄｌｌ４（リガンド）のＮｏｔｃｈ１／Ｎｏｔｃｈ４(レセプター)への結合を特異的に阻止する(又はその逆の)化合物について、例えば、標識したリガンド−又はレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の不滅化細胞への結合の阻止により、アッセイを行なってスクリーニングすることができる。
【００６６】
２つの細胞表面分子(例えば、Ｎｏｔｃｈ１及びＤｌｌ４)の相互作用に干渉する物質を同定するためのアッセイの一具体例において、細胞表面分子の一つの型を発現する細胞の試料を、標識したリガンドと又は標識したリガンド及び試験化合物(又は試験化合物の群)と接触させる。これらの細胞に結合した標識したリガンドの量を測定する。試験化合物と接触させた試料中の一層少ない量の標識(標識は、例えば、放射性同位体、蛍光又は比色標識であってよい)は、試験化合物が、結合に干渉することの指標である。リガンドを発現する細胞を利用する相互アッセイを利用して、Ｅｐｈレセプター又はその可溶性部分の結合に干渉する物質について試験することができる。
【００６７】
Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ１／Ｎｏｔｃｈ４との間の相互作用に干渉する物質を同定するためのアッセイを、試験化合物と競合しない、固体支持体に結合された成分(例えば、細胞、融合タンパク質及び結合活性を有する部分を含む精製したタンパク質)を用いて行なうことができる。この固体支持体は、任意の適当な固相又はマトリクス例えばビーズ、プレートの壁又は他の適当な表面(例えば、ミクロ滴定プレートのウェル)、カラム細孔ガラス(ＣＰＧ)又は溶液(ウェル中など)に沈めることのできるピンであってよい。細胞又は精製したタンパク質の固体支持体への結合は、直接でもよいし又は一つ以上のリンカー分子を介してでもよい。
【００６８】
一具体例において、単離した又は精製したタンパク質は、適当なアフィニティーマトリクス上に、標準的技術例えば化学的架橋又は単離し若しくは精製したタンパク質に対して高めた抗体によって固定化することができ、固体支持体に結合することができる。このマトリクスは、カラム又は他の適当な容器に詰めることができ、少なくとも一種の試験すべき化合物(例えば、混合物)と、その化合物の該タンパク質への結合に適した条件下で接触される。例えば、化合物を含む溶液を作成して該マトリクスを通して流すことができる。該マトリクスは、適当な洗浄緩衝液で洗って未結合の化合物及び非特異的に結合した化合物を除去することができる。結合したままの化合物を、適当な溶出用緩衝液によって遊離させることができる。例えば、溶出用緩衝液のイオン強度又はｐＨの変化は、化合物の遊離へと導くことができる。或は、この溶出用緩衝液は、化合物の結合を破壊するためにデザインされた遊離用成分(例えば、適宜、試験化合物の該タンパク質への結合を破壊し又は競合的に阻害することのできる一種以上のリガンド又はレセプター、又はその類似体)を含むことができる。
【００６９】
天然で見出されるタンパク質中に存在しない第二の部分に結合されたタンパク質の全部又は一部を含む融合タンパク質を、この方法の他の具体例で用いるために調製することができる。この目的のための適当な融合タンパク質には、第二の部分がアフィニティーリガンド(例えば、酵素、抗原、エピトープ)を含むものが含まれる。これらの融合タンパク質は、該タンパク質又はその一部分をアフィニティーリガンドをコードする適当な発現ベクターに挿入することによって生成することができる。この発現ベクターを、発現のための適当な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞を破壊して、融合タンパク質を含む細胞物質を適当なアフィニティーマトリクスに、融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分のアフィニティーマトリクスへの結合に十分な条件下で接触させることにより、該細胞物質を、アフィニティーマトリクスと結合させることができる。
【００７０】
この具体例の一面において、融合タンパク質を、適当なアフィニティーマトリクス上に、融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分を該マトリクスに結合させるのに十分な条件下で固定化することができ、該融合タンパク質は、試験すべき一種以上の化合物(例えば、混合物)と、化合物の結合した融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合に適した条件下で接触される。次に、この結合した融合タンパク質を有するアフィニティーマトリクスを、適当な洗浄緩衝液で洗って未結合化合物及び非特異的に結合した化合物を、特異的に結合した化合物の結合を有意に破壊することなく除去することができる。結合したままの化合物を、融合タンパク質を結合して有するアフィニティーマトリクスを適当な溶出用緩衝液(化合物溶出用緩衝液)と接触させることにより遊離させることができる。この面において、化合物溶出用緩衝液を、融合タンパク質のアフィニティーマトリクスによる保持を可能にするが、試験する化合物の融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合に干渉するように配合することができる。例えば、溶出用緩衝液のイオン強度又はｐＨの変化は、化合物の遊離へと導くことができ、又はこの溶出用緩衝液は、化合物の融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合を破壊するようにデザインされた遊離用成分(例えば、化合物の融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合を破壊することのできる一種以上のリガンド又はレセプター、又はその類似体)を含むことができる。固定化は、適宜、融合タンパク質を化合物と接触させる前に、接触と同時に、又は接触後に行なうことができる。試験する化合物、選択したアフィニティーマトリクス、及び溶出用緩衝液の処方などの因子によって、様々な方法の入れ替えが可能である。例えば、洗浄工程後に、化合物を結合して有する融合タンパク質を、アフィニティーマトリクスから適当な溶出用緩衝液(マトリクス溶出用緩衝液)を用いて溶出させることができる。融合タンパク質がトロンビン開裂部位などの開裂可能なリンカーを含む場合には、アフィニティーリガンドからの開裂は、化合物を結合して有する融合タンパク質の一部分を遊離させることができる。次いで、結合した化合物を、融合タンパク質又はその開裂生成物から、抽出などの適当な方法によって遊離させることができる。
【００７１】
ある具体例において、本発明は、血管形成を阻止する方法及び血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。他の具体例において、本発明は、腫瘍の成長を阻止し又は低減させる方法及び癌を患っている個人を治療する方法を提供する。これらの方法は、その個人に治療上有効な量の上記の一種以上のＤｌｌ４シグナリングのモジュレーターを投与することを含む。これらの方法は、特に、動物特にヒトの治療及び予防的処置を目的としている。
【００７２】
上記のように、血管形成関連疾患には、血管形成依存性の癌(例えば、固形腫瘍、血液担持される腫瘍例えば白血病)、及び腫瘍の転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び発熱性肉芽腫；炎症性疾患例えば免疫又は非免疫性炎症；慢性関節リウマチ及び乾癬；眼の血管形成性疾患例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス；オスラー−ウェッバー症候群、角膜病、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新血管新生が含まれるが、これらに限られない。
【００７３】
特に、本発明の治療剤は、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、カポジ肉腫、及び白血病を含む(但し、これらに限られない)癌(腫瘍)を治療し又は予防するのに有用である。
【００７４】
かかる方法のある具体例において、一種以上の治療剤を、一緒に(同時に)又は異なる時点で(順次的に)投与することができる。加えて、治療剤は、癌治療のための又は血管形成阻止のための他の型の化合物と共に投与することができる。
【００７５】
ある具体例において、この発明の主題の方法は、単独で用いることができる。或は、主題の方法は、増殖性疾患(例えば、腫瘍)の治療又は予防に向けられる他の慣用の抗癌治療アプローチと組み合わせて用いることができる。例えば、かかる方法は、癌の予防、癌の外科手術後の再発及び転移の防止において、及び他の慣用の癌治療の補助剤として利用することができる。本発明は、慣用の癌治療(例えば、化学療法、光線療法、免疫療法、及び外科手術)の有効性を、主題のポリペプチド治療剤の利用によって増進させることを認識する。
【００７６】
慣用の化合物の広いアレイは、抗新生物活性を有することが示されている。これらの化合物は、化学療法における医薬として、固形癌を収縮させ、転移及び更なる成長を防止し、又は白血病若しくは骨髄の悪性腫瘍における悪性細胞の数を減らすために用いられてきた。化学療法は、様々な種類の悪性腫瘍の治療に有効であったが、多くの抗新生物化合物は、望ましくない副作用を誘発する。２種類以上の異なる治療剤を組み合わせた場合、それらの治療剤は、共同作用的に働いて各治療剤の投薬量を減らすことを可能にし、それにより、各化合物の一層高い投薬量により生じる有害な副作用を低減することが示されている。他の事例において、治療剤に不従順な悪性腫瘍は、２種類以上の異なる治療剤の組合せ両方には応答しうる。
【００７７】
本発明の治療剤を他の慣用の抗新生物剤と組み合わせて、同時に又は順次的に投与する場合、かかる治療剤は、該抗新生物剤の治療効果を増進させ又は細胞のかかる抗新生物剤への耐性を克服することが示される。これは、抗新生物剤の投薬量の減少を可能にし、それにより、望ましくない副作用を低減させ又は抵抗性細胞における抗新生物剤の効力を回復させることを可能にする。
【００７８】
組合せ抗腫瘍療法に利用することのできる医薬化合物には、単に説明のために、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタクセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコーチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレクスト、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが含まれる。
【００７９】
これらの化学療法用抗腫瘍性化合物は、それらの作用機構によって、例えば、次の群に分類されうる：代謝拮抗剤／抗癌剤、例えばピリミジン類似体(５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン)及びプリン類似体、葉酸アンタゴニスト及び関連インヒビター(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン(クラドリビン))；抗増殖剤／抗有糸分裂剤(天然物を含む)、例えばビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン)、微小管破壊剤例えばタキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロン及びナベルビン、エピジポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、ＤＮＡ損傷剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カムプトテシン、カーボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、マイトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド(ＶＰ１６))；抗生物質例えばダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、マイトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びマイトマイシン；酵素(Ｌ−アスパラギンを全身で代謝して、アスパラギンを合成する能力を有しない細胞を涸渇させるＬ−アスパラギナーゼ)；抗血小板剤；抗増殖剤／抗有糸分裂アルキル化剤例えばナイトロジェンマスタード(メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン及びメチルメラミン(ヘキサメチルメラミン及びチオテパ)、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア(カルムスチン(ＢＣＮＵ)及び類似体、ストレプトゾシン)、トラゼン−ダカルバジニン(ＤＴＩＣ)；抗増殖剤／抗有糸分裂代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体(メトトレキセート)；白金配位錯体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、マイトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)及びアロマターゼインヒビター(レトロゾール、アナストロゾール)；抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビンのインヒビター)；フィブリン溶解剤(例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗移動剤；抗分泌剤(ブレベルジン)；免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(ＦＫ−５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル)；抗血管形成性化合物(ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン)及び成長因子インヒビター(血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)インヒビター、繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)インヒビター)；アンギオテンシンレセプターブロッカ；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体(トラスツヅマブ)；細胞周期インヒビター及び分化誘導剤(トレチノイン)；ｍＴＯＲインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カムプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びマイトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コーチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、メチルペドニゾロン、プレドニゾン、及びプレニゾロン)；成長因子シグナル変換キナーゼインヒビター；ミトコンドリア機能不全誘導剤及びカスパーゼアクチベーター；及びクロマチン破壊剤。
【００８０】
ある具体例において、組合せ抗血管形成療法に利用することのできる医薬化合物には：(１)「血管形成性分子」例えばｂＦＧＦ(塩基性繊維芽細胞成長因子)の放出のインヒビター；(２)血管形成性分子の中和剤例えば抗βｂＦＧＦ抗体；及び(３)内皮細胞の血管形成刺激に対する応答のインヒビター(コラゲナーゼインヒビター、基底膜ターンオーバーインヒビター、アンギオスタチックステロイド、真菌由来血管形成インヒビター、血小板因子４、トロンボスロンジン、関節炎用薬物例えばＤ−ペニシラミン及び金チオリンゴ酸、ビタミンＤ3類似体、アルファ−インターフェロンなどを含む)が含まれる。更なる提案される血管形成のインヒビターについては、Blood等、Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses等、Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber等、Lab. Invest., 59:44-51 (1988), 及び米国特許第５，０９２，８８５号、５，１１２，９４６号、５，１９２，７４４号、５，２０２，３５２号、及び６５７３２５６号を参照されたい。加えて、血管形成を阻止するために利用することのできる広範な化合物例えば、ＶＥＧＦに媒介される血管形成経路をブロックするペプチド又は薬剤、エンドスタチンタンパク質又は誘導体、アンギオスタチンのリジン結合性断片、メラミン又はメラミン促進性化合物、プラスミノーゲン断片(例えば、プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅｓ１−３)、トロポインサブユニット、ＳａｐｏｓｉｎＢ由来のビトロネクチンαvβ3ペプチドのアンタゴニスト、抗生物質又は類似体(例えば、テトラサイクリン又はネオマイシン)、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドに結合したＭｅｔＡＰ−２阻害性コアを含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコン及びその類似体、及びナーラダーゼインヒビターがある。例えば、米国特許第６，３９５，７１８号、６，４６２，０７５号、６，４６５，４３１号、６，４７５，７８４号、６，４８２，８０２号、６，４８２，８１０号、６，５００，４３１号、６，５００，９２４号、６，５１８，２９８号、６，５２１，４３９号、６，５２５，０１９号、６，５３８，１０３号、６，５４４，７５８号、６，５４４，９４７号、６，５４８，４７７号、６，５９９，１２６号、及び６，５６９，８４５号を参照されたい。
【００８１】
組合せ療法の性質に依り、この発明の治療剤の投与を、他の治療を施与しながら及び／又は施与後に持続することができる。これらのポリペプチド治療剤の投与は、単一投与量で行なうこともできるし、多数回の投与で行なうこともできる。幾つかの事例では、これらの治療剤の投与は、慣用の治療の少なくとも数日前に開始するが、他の事例では、投与を、慣用の治療の施与の直前又は当該施与時に開始する。
【００８２】
ある具体例において、この開示は、動脈形成を刺激する方法を提供する。かかる方法は、有効量のＤｌｌ４シグナリングアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含むことができる。その患者は、虚血状態を有し又はその危険にありうる。その患者は、例えばアンギナを含む冠動脈疾患を有し又は心筋梗塞を発生したことがありうる。その患者は、末梢動脈疾患例えば虚血事象又は四肢、脳又は腎臓などの臓器における部分的閉塞を有しうる。その患者は、虚血事象の危険にあると診断されうる。
【００８３】
ある具体例において、この開示は、血管において動脈の特徴を採択することを促進する方法を提供する。かかる方法は、有効量のＤｌｌ４シグナリングのアゴニストを、血管にエキソ・ビボで又はそれを必要とする患者に投与することを含みうる。この血管は、冠動脈バイパス外科手術で利用されるような伏在静脈移植片などの静脈移植片であってよい。
【００８４】
ある具体例において、本発明の主題の治療剤は、製薬上許容しうるキャリアーと配合される。かかる治療剤は、単独で投与することができ又は医薬配合物(組成物)の一成分として投与することができる。これらの化合物は、投与のために、ヒト用又は獣医学用医薬において利用する慣用の方法で配合することができる。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤(ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなど)並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味料、調味料及び香料、防腐剤及び抗酸化剤も又、これらの組成物中に存在してよい。
【００８５】
ある面において、この開示は、Ｄｌｌ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４又はこの経路の他のメンバーを標的とする様々な核酸化合物の何れかを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、一般に、製薬上許容しうるキャリアーを含む。
【００８６】
非経口投与に適した医薬組成物は、一種以上のポリペプチド治療剤を、一種以上の製薬上許容しうる無菌の等張水溶液又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液と、又は無菌の粉末(使用直前に無菌の注射溶液又は分散液に再構成することができるもの)と組み合わせて含むことができ、これらには、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図するレシピエントの血液と等張の配合物与える溶質又は懸濁化剤若しくは増粘剤が含まれうる。この発明の医薬組成物で用いることのできる適当な水性又は非水性のキャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)及びこれらの適当な混合物、植物油例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル例えばオレイン酸エチルが含まれる。適当な流動性を、例えば、レシチンなどの被覆材の利用により、必要な粒度を維持することにより(分散液の場合)、及び界面活性剤の利用によって維持することができる。
【００８７】
これらの組成物は又、補助剤例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含むこともできる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含有させることにより確実にすることができる。等張剤例えば糖類、塩化ナトリウムなどをこれらの組成物中に含むことも又、望ましいであろう。加えて、この注射用医薬形態の延長された吸収を、吸収を遅延させる薬剤例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。
【００８８】
注射可能なデポー剤を、一種以上のポリペプチド治療剤の、生物分解性ポリマー例えばポリラクチド−ポリグリコリド中の微小封入マトリクスを形成することにより作成することができる。薬物のポリマーに対する比及び用いた特定のポリマーの性質によって、薬物放出の速度を制御することができる。他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(アンヒドリド)が含まれる。注射可能なデポー剤配合物は又、薬物を、身体の組織と適合性のリポソーム又はミクロエマルジョン中に捕捉することによっても製造することができる。
【００８９】
主題のポリペプチド治療剤の配合物には、経口投与／鼻投与、局所投与、非経口投与、直腸投与及び／又は膣内投与に適したものが含まれる。これらの配合物は、便利に、投薬単位形態で提供することができ、製薬業分野で周知の任意の方法によって製造することができる。キャリアー物質と組み合わせて単一投薬形態を生成することのできる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与方法によって変化する。キャリアー物質と組み合わせて単一投薬形態を生成することのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量である。
【００９０】
ある具体例において、これらの配合物又は組成物を製造する方法は、他の種類の抗腫瘍又は抗血管形成治療剤及びキャリアー及び、適宜、一種以上の補助成分を組み合わせることを含む。一般に、これらの配合物は、液体キャリアー若しくは微粉固体キャリアー又は両方を用いて製造することができ、その後、必要であれば、生成物に付形する。
【００９１】
経口投与のための配合物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、菓子錠剤(風味付きベース、通常、ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムを使用)、粉末、顆粒の形態であってよく、又は溶液若しくは懸濁液(水性若しくは非水性液体中)、又は水中油若しくは油中水液体エマルジョン、又はエリキシル若しくはシロップ、又は芳香製剤(不活性ベース例えばゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアラビアゴムを使用)、及び／又は口腔洗浄剤などであってよく、各々は、予め決めた量の主題の治療剤を活性成分として含んでいる。
【００９２】
経口投与のための固体投薬形態(カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など)において、本発明の一種以上のポリペプチド治療剤を、一種以上の製薬上許容しうるキャリアー例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は次の何れかと混合することができる：(１)充填剤及び増量剤、例えば澱粉、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；(２)結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、及び／又はアラビアゴム；(３)湿潤剤、例えばグリセロール；(４)崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯澱粉又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のシリケート、及び炭酸ナトリウム；(５)溶液緩染剤、例えばパラフィン；(６)吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物；(７)湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート；(８)吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレイ；(９)潤滑剤、例えばタルク、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物；及び(１０)着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合には、これらの医薬組成物は、緩衝剤をも含むことができる。類似の種類の固体組成物は又、ラクトース又は乳糖並びに高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を利用して、ソフトフィルド及びハードフィルドゼラチンカプセルにおいて充填剤としても用いることができる。
【００９３】
経口投与のための液体投薬形態は、製薬上許容しうるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。活性成分に加えて、これらの液体投薬形態は、当分野で一般に用いられる不活性希釈剤例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類(特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、及び胡麻油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他にも、これらの経口組成物は、補助剤例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、調味料、着色剤、香料、及び防腐剤をも含むことができる。
【００９４】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム、及びこれらの混合物を含むことができる。
【００９５】
この発明の治療剤は、皮膚又は頸部及び膣などの粘膜に局所投与することができる。これらの局所用配合物は、更に、一種以上の様々な、皮膚又は角質層透過増進剤として有効であることが知られた薬剤を含むことができる。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、及びアゾンである。更なる薬剤を、更に含有させて、化粧用として許容しうる配合物を作成することができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、染料、芳香剤、防腐剤、安定剤、及び表面活性剤である。角質溶解剤例えば当分野で公知のものも含有させることができる。例は、サリチル酸及び硫黄である。
【００９６】
この局所投与又は経皮投与のための投薬形態には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入が含まれる。主題のポリペプチド治療剤は、無菌条件下で、製薬上許容しうるキャリアー、及び任意の防腐剤、緩衝剤、又は噴射剤(必要とされうる)と混合することができる。これらの軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、主題のポリペプチド剤に加えて、賦形剤例えば動物性及び植物性の脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含むことができる。
【００９７】
粉末及びスプレーは、主題のポリペプチド治療剤に加えて、賦形剤例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物 を含むことができる。スプレーは、更に、通例の噴射剤例えばクロロフルオロ炭化水素及び揮発性不飽和炭化水素例えばブタン及びプロパンを含むことができる。
【００９８】
膣又は直腸投与のための配合物は、坐薬として調製することができ、それは、一種以上のこの発明の化合物を一種以上の適当な賦形剤又はキャリアー(例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックス又はサリチル酸塩を含む)と混合することにより調製することができ、室温で固体であるが、体温では液体であり、それ故、直腸又は膣内腔で融解して活性化合物を放出する。
【００９９】
他の具体例において、この発明のポリペプチド治療剤は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現させることができる。例えば、Ｄｌｌ４又はＮｏｔｃｈ１／Ｎｏｔｃｈ４の可溶性ポリペプチドを、適当なベクターから真核細胞内で発現させることができる。これらのベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミド又はウイルス性ベクターである。ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて(但し、これらに限られない)構築することができる。好ましくは、これらのベクターは、安定に標的細胞に導入されて維持される。或は、一過性の発現を与えるウイルス性ベクターを利用することができる。かかるベクターは、必要なときに反復して投与することができる。主題のポリペプチド治療剤をコードするベクターの送達は、静脈若しくは筋肉内投与によるか、患者由来の外植された標的細胞へ投与した後その患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする他の手段によるなどして、全身的であってよい(総説としては、Couture等、1996, TIG., 12, 510を参照されたい)。
【実施例】
【０１００】
典型的具体例
この発明を今一般的に説明したので、それは、下記の実施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明を目的とするものであって、この発明を制限することを意図するものではない。
【０１０１】
実施例１：動脈の発生におけるマウスのＤｌｌ４の投薬量感受性要求
Duarte等(Genes Dev. 2004 Oct 15;18(20):2474-8)は、マウスＤｌｌ４における機能喪失変異が脈管形成及び血管形成の欠損を引き起こすこと、及びこれらの欠損が投薬量依存性であることことを示し、Ｄｌｌ４+/-マウスは、ホモ接合のＤｌｌ４-/-マウスよりも一層軽い表現型を示す。加えて、Ｄｌｌ４機能の喪失は、動脈血管の個性の喪失を引き起こす。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ経路では先例のないＤｌｌ４シグナリングに対する感受性のレベルを示している。血管発生のＤｌｌ４投薬量に対する感受性は、Ｄｌｌ４−Ｎｏｔｃｈ１／４シグナリング経路のアンタゴニストが、血管形成の阻止において高度に有効であろうことを示している。
【０１０２】
実施例２：ｍＤＬＬ４過剰発現は、発生中のマウス胚において、動脈肥厚及び静脈個性の喪失を引き起こす。
この研究において、出願人は、哺乳動物の血管の発生におけるｍＤｌｌ４の役割を、マウスの機能亢進変異体を生成して特性決定することによって更に研究することを企てた。ｍＤｌｌ４の全身に広がった過剰発現を達成するために、条件付きトランスジェニックマウス系統、ＺＥＧ−ｍＤｌｌ４を生成した。構成的ｃｒｅ系統、ＣＡＧ−Ｃｒｅマウス(Sakai等、1997)との交雑に際して、これらのマウスは、ネイティブ型のｍＤｌｌ４を、ニワトリのベータアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーの制御下で発現する。続くものは、認められた機能亢進表現型の記載である。
【０１０３】
ｍＤｌｌ４ｃＤＮＡを、ｐＣＡＬＬ２−ＭｉｇＲ(Lobe等、1999)中にクローン化して、ｐＺ／ＥＧ−ｍＤｌｌ４トランスジェネシスベクター(図７)を生成し、Ｒ１マウスの胚性幹(ＥＳ)細胞中にエレクトロポレーションした。これらのエレクトロポレーションを受けたＥＳ細胞から標準的方法(Nagy及びRossant, 2000)により得られたトランスジェニックマウス系統を、構成的ｃｒｅ系統、ＣＡＧ−Ｃｒｅと交雑した。その結果生成した胚を、ＥＧＦＰ蛍光、第二レポーター(Ｃｒｅ組換えが起きた細胞中でＤｌｌ４と同時発現される)につき分析した。ＥＧＦＰ発現は、二重トランスジェニック胚(ｄｔ)で強く且つ全身的であることが見出され(図８)、これは、正常なＥ８．５〜Ｅ９．５のメンデル比で起きた。これらの胚は、頭、心臓、鰓弓及び後背側領域での激しい出血、心膜浮腫及び不完全な転換をＥ９．０で示した(図８ｃ)。Ｅ１０．５の後、二重トランスジェニック胚は、回収されなかった。
【０１０４】
二重トランスジェニック胚の全載の低温切片におけるＰＥＣＡＭ１抗血清による免疫染色は、動静脈奇形を、特に背大動脈と前主動脈との融合(図１０)をＥ８．５ほどの早期に示した。このステージでは、明白な程度の大動脈肥厚もあって、これは、Ｅ９．５まで漸進的に一層明白になったが、このことは、内皮細胞増殖の調節におけるＮｏｔｃｈ経路の役割を示唆している(図９)。この仮説と調和して、ＢｒｄＵ取込みの研究は、内皮細胞増殖の４０％平均の増加を、二重トランスジェニック胚の前背大動脈で示した(示してない)。他方、前主動脈(ＡＣＶ)は、それらが正しい血管形成の改変を受けなかったかのように、分岐して見え(図９)、又は、静脈洞に直接結合した領域を除いて殆ど存在しなかった(図１０)。血管形成の改変は又、卵黄嚢及び心臓領域において生じることができておらず、一次毛細血管叢が、両方の場合において残っている(図９)。体節間血管は、正常より僅かに広がって短く、これは、おそらく、動脈と静脈の融合及び背側の最も末端での分岐の失敗の結果であろう(図９)。それらは又、ときに体節に侵入しているのが見られ、これは、それらの成長進路方向の破壊を示唆する(示してない)。Ｅ９．５では、ｄｔ胚の大動脈は、静脈洞領域に直接結合しているのが見られ(図１０)、これは、心臓の末端における微小循環を造っている。おそらく、不十分な血流の結果として、この大動脈は、後方がひどく萎縮して静脈洞に結合している(図９及び１０)。墨汁の注入を用いる細血管造影法による研究は、これらの変異体において、血液が、大動脈弓から大動脈へ流れ、その後、直接、静脈洞に流れ込み、殆どの血液は、後背大動脈に達しないことを示す(図１０)。
【０１０５】
動脈及び静脈特異的マーカー発現の特性表示は、胚のすべての血管が専ら動脈マーカーを提示するという著しい変異体表現型を示した。これらの二重トランスジェニック胚の静脈は、動脈特異的マーカー例えばｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２、コネキシン３７、ｈｅｙ１及びｎｏｔｃｈ１の異所的発現を示した(図１１及び１２)。他方、静脈マーカー(例えば、ＥｐｈＢ４)の発現は、これらの変異体において検出できなかった(図１３)。その上、通常、大動脈−性腺−中腎領域における主動脈に特異的である造血クラスターが、Ｅ９．０の変異体胚の静脈洞領域で検出され(示してない)、これは、静脈構造の機能的動脈化の証拠を与えるものである。
【０１０６】
ｍＤｌｌ４の過剰発現は、大動脈肥厚及び動静脈短絡、局所的血管形成阻止、静脈における内皮の動脈個性マーカーの異所的発現、及び内皮の静脈個性マーカーのダウンレギュレーションを引き起こす。
【０１０７】
これらの結果は、内皮細胞の個性の確立におけるｍＤｌｌ４の役割を示しており、その血管芽細胞／内皮細胞の増殖及び血管形成の調節への関与を示唆している。
【０１０８】
実施例３：ヒトのデルタ様リガンド(ｈｄｌｌ４)は、内皮細胞の管形成及び内皮細胞の萌芽を調節する。
ヒトのｄｌｌ４の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:１のアミノ酸２６〜５２４)を、Ｈｉｓタグ又はＦｃタグと共に哺乳動物用発現ベクター中にクローン化して、分泌タンパク質として２９３細胞及びＣＨＯ−Ｋ細胞で発現させた。精製したｄｌｌ４を、先ず、Ｎｏｔｃｈ１に結合することを示し、次いで、マトリゲル上で培養した場合の内皮細胞に対するイン・ビトロ活性について試験した。図１０及び１１を参照されたい。内皮細胞は、８〜２４時間以内に組織化されて管様構造を形成し、該管形成は、成長因子涸渇条件において最少であった。２０ｎｇ／ｍｌでのＶＥＧＦの添加は、管形成を誘導する。成長因子欠乏条件で試験した場合、Ｄｌｌ４は、低投与量レベル(１００及び２００ｎｇ／ｍｌ)で管形成を誘導したが、一層高レベルの５００ｎｇ／ｍｌの投与量では、管形成を誘導することができなかった(図１２)。しかしながら、Ｄｌｌ４は、ＶＥＧＦ含有培養物に加えた場合に、管形成を誘導しなかった。
【０１０９】
ヒトｄｌｌ４は、内皮細胞スフェロイドを変化する投与量レベルのｄｌｌ４で処理する萌芽アッセイにおいても試験した(図１３及び１４)。一層低レベルの投与量では萌芽が誘導されたが、一層高レベルの投与量では、萌芽を促進することができなかった(図１３)。対照的に、ＶＥＧＦ処理された内皮細胞の萌芽は、一層低レベルのｄｌｌ４によって最少の影響を受けたが、一層高レベルの投与量で顕著な減少を示した(図１４)。
【０１１０】
実施例３の方法及び材料：
内皮細胞、平滑筋細胞、及び同時培養スフェロイドの生成
限定した細胞数の内皮細胞及び平滑筋細胞スフェロイドを生成した。簡単にいえば、ＳＭ又はＨＵＶＥ細胞を、０．２５％(ｗ／ｖ)カルボキシメチルセルロースを含む対応する培養培地に懸濁させて、非粘着性丸底９６ウェルプレートに播種した。これらの条件下で、すべての懸濁細胞は、限定した大きさ及び細胞数のウェル当たり単一のスフェロイドの形成に寄与する(標準的大きさ：２２５０細胞／スフェロイド；イン・ビトロ血管形成：７５０〜１０００細胞／スフェロイド)。同時培養スフェロイドを生成するために、等量の懸濁させたＳＭ及びＨＵＶＥ細胞(標準的大きさ：１１２５ＳＭＣ及び１１２５ＨＵＶＥＣ／スフェロイド；イン・ビトロ血管形成：５００ＳＭＣ及び５００ＨＵＶＥＣ／スフェロイド)を混合して、上記のように非粘着性丸底９６ウェルプレートに播種した。スフェロイドを、少なくとも２４時間培養し、対応する実験に用いた。
【０１１１】
イン・ビトロ血管形成アッセイ
コラーゲンゲルにおけるイン・ビトロ血管形成を、前記のように、内皮細胞、平滑筋細胞、及び同時培養スフェロイドを利用して定量した。簡単にいえば、７５０〜１０００細胞を含むスフェロイドを一晩生成し、その後、それらをコラーゲンゲル中に包埋した。コラーゲンストック溶液を、使用前に、８容のラットの尾の酸性コラーゲン抽出物(２ｍｇ／ｍｌ、４℃に平衡化)を、１容の１０×ＥＢＳＳ(Gibco BRL, ドイツ国、Eggenstein)；１容の０．１Ｎ ＮａＯＨと混合してｐＨ７．４に調整することにより調製した。このストック溶液(０．５ｍｌ)を、０．５ｍｌの室温の培地(コラーゲンゲルの重合前のスフェロイドの沈降を防ぐために０．５％(ｗ／ｖ)カルボキシメチルセルロースを含むＥＣＧＭ基礎培地[PromoCell]に４０％ＦＣＳを加えたもの)、５０個のスフェロイド、及び対応する試験物質と混合した。このスフェロイド含有ゲルを迅速に予備加温した２４ウェルプレートに移して、重合させ（１分間）、その後、０．１ｍｌ ＥＣＧＭ基礎培地を該ゲルの上にピペットで加えた。これらのゲルを、５％ＣＯ2中で、３７℃、湿度１００％でインキュベートした。２４時間後に、イン・ビトロ血管形成を、各スフェロイドから伸出した萌芽の長さ(接眼グリッド(ocular grid)倍率１００)を、実験群及び実験当たり少なくとも１０個のスフェロイドを分析するデジタルイメージングソフトウェアＤＰ−Ｓｏｆｔ(Olympus)を利用して測定することにより計数した。
【０１１２】
蛍光細胞標識
ＳＭＣ及びＨＵＶＥＣを、蛍光染料ＰＫＨ２６(赤色蛍光)及びＰＫＨ６７(緑色蛍光)を製造業者の指示に従って利用して標識した。トリプシン処理後に、懸濁細胞を、ＨＢＳＳで一回洗い、膜をＰＫＨ２６又はＰＫＨ６７で５分間標識して、対応する培養培地で３回洗った。細胞標識の品質を、蛍光顕微鏡観察を用いて検査した。
【０１１３】
超微細構造分析
スフェロイドを、Karnovsky固定液中で固定し、１．０％オスミウムテトロキシド中で後固定し、ある等級シリーズのエタノール中で脱水して、Ｅｐｏｎ中に包埋した。０．５μｍの切片を切って、光学顕微鏡評価のためにアズレ１１メチレンブルーで染色した。極薄切片(５０〜８０ｎｍ)を切り、銅製グリッド上に集めて、Ｚｅｉｓｓ ＥＭ１０電子顕微鏡による観察のために酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で自動的に染色した。
【０１１４】
表面スフェロイド内皮細胞における内皮間接合点複合体の定量のために、２つの独立の調製物において、実験群当たり２０の無作為に選んだスフェロイドのすべての接合点複合体を計数した。結果を、１００個の表面単層内皮細胞当たりの、接合点複合体の数として表した(実験群当たり少なくとも２００ＥＣの分析)。
【０１１５】
形態及び免疫組織化学的分析
スフェロイドを収穫して、３分間、２００ｇで遠心分離した。培養した単層細胞をトリプシン処理により収穫して、遠心分離により集めた。スフェロイド及びペレット化した単層細胞を、４％パラホルムアルデヒドを含むＨＢＳＳ中で固定して、パラフィン包埋のために処理し；脱水(エタノール及びイソプロパノールの等級化シリーズ、各１時間)後、これらの試料を、先ず、パラフィンＩ(４２℃で融解)に１２時間、６０℃で浸した。スフェロイド及び単層細胞を、再び、遠心分離により集めて、パラフィンＩＩ(５６℃で融解)に１２時間、７０℃で浸した。その結果得られたパラフィンブロックを、最後に、室温まで冷却して、切片化のために整えた。組織化学的分析のために、パラフィン切片(４μｍ)を切り、脱パラフィンして、脱水した。次いで、切片を、３％Ｈ2Ｏ2とＨ2Ｏ中でインキュベートして内在性ペルオキシダーゼを阻害した。リン酸緩衝塩溶液中での洗浄後、これらの切片を、３０分間、ブロッキング溶液(１０％正常ヤギ血清)とインキュベートした後、対応する一次抗体と、加湿チャンバー内で４℃での一晩のインキュベーションを行なった。その後、それらを、二次抗体(ビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン又はビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体；Zymed, カリフォルニア、San Francisco)とインキュベートして、ストレプトアビジンペルオキシダーゼに曝露し、ジアミノベンジジン(基質)で顕色させて、ヘマトキシリンで弱く対比染色した。
【０１１６】
スフェロイドにおけるアポトーシス細胞の検出
アポトーシス細胞を、ヌクレオソーム断片化生成物(ＴＵＮＥＬ)の組織化学的検出により可視化した(Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ キットを製造業者の指示に従って適用)。簡単にいえば、パラフィン包埋スフェロイドの切片中のヌクレオソーム断片化生成物を、脱パラフィン及びプロテイナーゼＫ消化後に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いるフルオレセイン−ｄＵＴＰによる３’標識によって検出した。標識を、蛍光顕微鏡により直接可視化し又はこれらの切片をペルオキシダーゼ標識した抗フルオレセイン抗体とインキュベートしてジアミノベンジジン(基質)により顕色させた後に間接的に可視化した。
【０１１７】
ＤＮＡ断片化酵素結合イムノアッセイ(ＥＬＩＳＡ)
断片化ＤＮＡの定量を、ＥＬＩＳＡ(Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ キット)により行なった。１０個のスフェロイドの断片化ＤＮＡを、６０分間、室温で、激しく攪拌しながら溶解させることにより抽出した。抽出物を、１０分間、１３，０００ｇで遠心分離して、３００μｌの上清を、ペルオキシダーゼ標識した抗ＤＮＡ抗体及びビオチン化抗ヒストン抗体と、製造業者の指示に従って、ストレプトアビジンコートしたミクロ滴定プレート中でインキュベートした。洗浄後、モノ及びオリゴヌクレオソームＤＮＡの結合を、ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳ(２，２’−アジノ−ジ[３−エチルベンズチアゾリン−スルホネート])により顕色させることにより可視化した。プレートを、自動化ミクロ滴定プレートリーダーを用いて４０５ｎｍで分析した。
【０１１８】
統計的分析
すべての結果を、平均値±ＳＤとして表した。実験群間の差異を、片側スチューデントｔ検定により分析した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０１１９】
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【０１２０】
参考文献の援用
言及したすべての刊行物及び特許を、そっくりそのまま、本明細書中に、各々が個別に援用されることを示されたように、参考として援用する。
【０１２１】
主題の発明の特定の具体例を論じてきたが、上記の明細書は、説明用であって制限するものではない。この明細書及び下記の請求の範囲を概観すれば、この発明の多くの変形物が、当業者には、明らかとなろう。この発明の全範囲は、同等物の全範囲を加えた請求の範囲及びかかる変形物を加えた明細書を参照することにより決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】ヒトのデルタ様リガンド４タンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１；GeneBank ＮＰ＿０６１９４７)を示している図である。
【図２−１】ヒトのデルタ様リガンド４タンパク質(SEQ ID NO:２；GenBank ＮＭ＿０１９０７４)をコードする核酸配列(ｃＤＮＡ)を示している図である。
【図２−２】ヒトのデルタ様リガンド４タンパク質(SEQ ID NO:２；GenBank ＮＭ＿０１９０７４)をコードする核酸配列(ｃＤＮＡ)を示している図である。
【図３】ｐＺ／ＥＧ−ｍＤｌｌ４遺伝子導入ベクター及びＣｒｅ活性の結果を示している図である。
【図４】Ｅ８．０のＺＥＧ−ｍＤｌｌ４胚のＬａｃＺ染色、Ｅ８．５のｄｔ胚におけるＥＧＦＰ発現及びＥ９．０のｄｔ胚における出血及び心膜浮腫を示した図である。
【図５】Ｅ９．０及びＥ９．５ｄｔ胚並びに対照用胚の全載ＰＥＣＡＭ１免疫染色を示している図である。
【図６】低温切片化及び細血管造影法におけるＰＥＣＡＭ１免疫染色を示している図である。
【図７】ｄｔ胚における動脈マーカーの静脈での発現を示している図である。
【図８】変異型胚の静脈内皮におけるＮｏｔｃｈシグナリングのアップレギュレーションを示している図である。
【図９】ｄｔ胚における静脈特異的マーカーのダウンレギュレーションを示している図である。
【図１０】ヒトのＤｌｌ４のドメイン構造(上段)及び注釈を付けたヒトＤｌｌ４のアミノ酸配列(SEQ ID NO:１)(下段)の図解を示している図である。
【図１１】ニッケルカラム精製(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＣＢＢ−Ｇ２５０染色)後の純粋なｈＤｌｌ４−Ｐ５２４−６×Ｈｉｓタンパク質(ヒスチジンタグ付きｈＤｌｌ４−Ｐ５２４)を示している図である。
【図１２】ｈＤｌｌ４が、ヒト動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)における管形成を阻害することを示している図である。
【図１３】ｈＤｌｌ４が、ヒト動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)における萌芽を阻害することを示している図である。
【図１４】ｈＤｌｌ４が、ヒト動脈内皮細胞(ＨＵＡＥＣ)におけるＶＥＧＦ刺激された萌芽を阻害することを示している図である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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