(57)【要約】本発明は概して、ヒトを含む対象における癌の治療のための治療プロトコールに関する。より詳細には、本発明は、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体、および少なくとも1つの他の薬剤の投与を含む、癌を治療するための方法を提供する。好ましくは、後者の薬剤は、抗癌剤であるか、または抗癌作用を有するもしくは誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療するための治療プロトコールであって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、治療プロトコール。
【請求項２】
アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体と薬剤との組み合わせが、1未満の併用指数（combination index）（CI）をもたらし、この際、CIは下記式を用いて決定される、請求項1記載の治療プロトコール：
CI＝［(C)1/(Cx)1］＋［(C)2/(Cx)2］＋［α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2］
式中、(Cx)1は、薬物単独でのxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、(C)1は、もう一方のアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤である(C)2との併用下で同じxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、αは定数であって、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤の抗癌活性の様式が相互排反的または非排反的である場合にαはそれぞれ0または1である。
【請求項３】
アンゲリカ酸インゲノールがインゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体である、請求項1または2記載の治療プロトコール。
【請求項４】
アンゲリカ酸インゲノールがインゲノール-3-アンゲレートである、請求項3記載の治療プロトコール。
【請求項５】
インゲノール-3-アンゲレートがユーフォルビア-ペプルス（Euphorbia peplus）から得られる、請求項4記載の治療プロトコール。
【請求項６】
インゲノール-3-アンゲレートが化学合成手段によって生成される、請求項4記載の治療プロトコール。
【請求項７】
薬剤が表1に提示されたリストより選択される、請求項1記載の治療プロトコール。
【請求項８】
薬剤が抗癌化学療法薬である、請求項1記載の治療プロトコール。
【請求項９】
薬剤が、細胞傷害性T細胞であるか、または癌細胞に対して細胞傷害性T細胞を刺激もしくは活性化することができる、請求項7記載の治療プロトコール。
【請求項１０】
薬剤が、抗癌細胞抗体であるか、または抗癌細胞抗体の生成を刺激することができる、請求項7記載の治療プロトコール。
【請求項１１】
薬剤が抗癌細胞抗原ワクチンである、請求項10記載の治療プロトコール。
【請求項１２】
薬剤が癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、請求項10記載の治療プロトコール。
【請求項１３】
薬剤が、好中球を含むか、または好中球を刺激もしくは活性化することができる、請求項12記載の治療プロトコール。
【請求項１４】
対象がヒトである、請求項1記載の治療プロトコール。
【請求項１５】
癌が、ABL1原癌遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢癌腫、副腎皮質癌、特発性骨髄化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌（bone cancer）、腸癌、脳幹神経膠腫、脳およびCNSの腫瘍、乳癌、CNS腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟部組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛膜癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌腺癌（endocrine cancer）、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌（esophageal cancer）、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌（eye cancer）、眼の黒色腫、網膜芽細胞腫、ファロピウス管癌、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌（gastric cancer）、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液悪性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リー-フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性腎横紋筋肉腫様腫瘍（malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney）、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口部癌（mouth cancer）、多発性内分泌腺腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌（NMSC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、眼球癌（ocular cancer）、食道癌（oesophageal cancer）、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、オストミー卵巣癌（ostomy ovarian cancer）、膵癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、稀な癌および関連疾患、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（SCLC）、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌（皮膚）、胃癌（stomach cancer）、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎盂-/-尿管）、絨毛性癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン（uroplakin）、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍からなるリストより選択される、請求項1または14記載の治療プロトコール。
【請求項１６】
インゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療するための治療プロトコールであって、
インゲノール-3-アンゲレートと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、インゲノール-3-アンゲレートまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、治療プロトコール。
【請求項１７】
薬剤が表1に提示されたリストより選択される、請求項16記載の治療プロトコール。
【請求項１８】
薬剤が抗癌化学療法薬である、請求項17記載の治療プロトコール。
【請求項１９】
薬剤が、細胞傷害性T細胞であるか、または癌細胞に対して細胞傷害性T細胞を刺激もしくは活性化することができる、請求項17記載の治療プロトコール。
【請求項２０】
薬剤が、抗癌細胞抗体であるか、または抗癌細胞抗体の生成を刺激することができる、請求項17記載の治療プロトコール。
【請求項２１】
薬剤が抗癌細胞抗原ワクチンである、請求項20記載の治療プロトコール。
【請求項２２】
薬剤が癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、請求項20記載の治療プロトコール。
【請求項２３】
薬剤が、好中球を含むか、または好中球を刺激もしくは活性化することができる、請求項22記載の治療プロトコール。
【請求項２４】
対象がヒトである、請求項16記載の治療プロトコール。
【請求項２５】
癌が、ABL1原癌遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢癌腫、副腎皮質癌、特発性骨髄化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳およびCNSの腫瘍、乳癌、CNS腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟部組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛膜癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌腺癌、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼の黒色腫、網膜芽細胞腫、ファロピウス管癌、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液悪性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リー-フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性腎横紋筋肉腫様腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口部癌、多発性内分泌腺腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌（NMSC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、眼球癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、オストミー卵巣癌、膵癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、稀な癌および関連疾患、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（SCLC）、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎盂-/-尿管）、絨毛性癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍からなるリストより選択される、請求項16または24記載の治療プロトコール。
【請求項２６】
アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療するための方法であって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、方法。
【請求項２７】
薬剤が表1に提示されたリストより選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
薬剤が抗癌化学療法薬である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が、細胞傷害性T細胞であるか、または癌細胞に対して細胞傷害性T細胞を刺激もしくは活性化することができる、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
薬剤が、抗癌細胞抗体であるか、または抗癌細胞抗体の生成を刺激することができる、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
薬剤が抗癌細胞抗原ワクチンである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
薬剤が癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
薬剤が、好中球を含むか、または好中球を刺激もしくは活性化することができる、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
対象がヒトである、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
癌が、ABL1原癌遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢癌腫、副腎皮質癌、特発性骨髄化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳およびCNSの腫瘍、乳癌、CNS腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟部組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛膜癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌腺癌、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼の黒色腫、網膜芽細胞腫、ファロピウス管癌、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液悪性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リー-フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性腎横紋筋肉腫様腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口部癌、多発性内分泌腺腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌（NMSC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、眼球癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、オストミー卵巣癌、膵癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、稀な癌および関連疾患、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（SCLC）、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎盂-/-尿管）、絨毛性癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍からなるリストより選択される、請求項26または34記載の方法。
【請求項３６】
アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を含む第1の部分を有し、かつ薬剤またはその薬学的に許容される塩を含む第2の部分を有する、複数の部分で構成される薬学的製剤であって、該部分が任意で1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤をさらに含み、該薬剤が以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、製剤。
【請求項３７】
アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体と、薬剤またはその薬学的に許容される塩と、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤とを含む製剤であって、該薬剤が以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、製剤。
【請求項３８】
アンゲリカ酸インゲノールがインゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体である、請求項36または37記載の製剤。
【請求項３９】
アンゲリカ酸インゲノールがインゲノール-3-アンゲレートである、請求項38記載の製剤。
【請求項４０】
インゲノール-3-アンゲレートがユーフォルビア-ペプルスから得られる、請求項38または39記載の製剤。
【請求項４１】
インゲノール-3-アンゲレートが化学合成手段によって生成される、請求項38または39記載の製剤。
【請求項４２】
薬剤が表1より選択される、請求項36または37記載の製剤。
【請求項４３】
薬剤が抗癌化学療法薬である、請求項42記載の製剤。
【請求項４４】
薬剤が、細胞傷害性T細胞であるか、または癌細胞に対して細胞傷害性T細胞を刺激もしくは活性化することができる、請求項42記載の製剤。
【請求項４５】
薬剤が、抗癌細胞抗体であるか、または抗癌細胞抗体の生成を刺激することができる、請求項42記載の製剤。
【請求項４６】
薬剤が抗癌細胞抗原ワクチンである、請求項45記載の製剤。
【請求項４７】
薬剤が癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、請求項45記載の製剤。
【請求項４８】
薬剤が、好中球を含むか、または好中球を刺激もしくは活性化することができる、請求項47記載の製剤。
【請求項４９】
癌の治療のための医用薬剤の製造における、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体、および薬剤またはその薬学的に許容される塩の使用であって、該薬剤が以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、使用。
【請求項５０】
アンゲリカ酸インゲノールがインゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体である、請求項49記載の使用。
【請求項５１】
アンゲリカ酸インゲノールがインゲノール-3-アンゲレートである、請求項50記載の使用。
【請求項５２】
インゲノール-3-アンゲレートがユーフォルビア-ペプルスから得られる、請求項50または51記載の使用。
【請求項５３】
インゲノール-3-アンゲレートが化学合成手段によって生成される、請求項50または51記載の使用。
【請求項５４】
薬剤が表1より選択される、請求項49記載の使用。
【請求項５５】
薬剤が抗癌化学療法薬である、請求項54記載の使用。
【請求項５６】
薬剤が、細胞傷害性T細胞であるか、または癌細胞に対して細胞傷害性T細胞を刺激もしくは活性化することができる、請求項54記載の使用。
【請求項５７】
薬剤が、抗癌細胞抗体であるか、または抗癌細胞抗体の生成を刺激することができる、請求項54記載の使用。
【請求項５８】
薬剤が抗癌細胞抗原ワクチンである、請求項57記載の使用。
【請求項５９】
薬剤が癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、請求項57記載の製剤。
【請求項６０】
薬剤が、好中球を含むか、または好中球を刺激もしくは活性化することができる、請求項59記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、ヒトを含む対象における癌の治療のための治療プロトコールに関する。より詳細には、本発明は、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体、および少なくとも1つの他の薬剤の投与を含む、癌を治療するための方法を提供する。好ましくは、後者の薬剤は、抗癌剤であるか、または抗癌作用を有するもしくは誘導する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書中に著者により言及された刊行物の文献学的な詳細は、明細書の最後にまとめられている。
【０００３】
本明細書におけるあらゆる先行技術に対する言及は、この先行技術がいずれかの国において周知の一般的な知識の一部をなすことを承認したものでも何らかの形で示唆したものでもなく、そのようにみなされるべきでもない。
【０００４】
天然物スクリーニングとは、生物活性分子についての自然環境のスクリーニングに対して適用される用語である。特に探索される生物活性分子は、有用な治療薬としての潜在能力を有するものである。自然環境には、植物、微生物、土壌、サンゴおよび海生動物が含まれる。癌の治療のための潜在的な治療薬に対する探索は依然として重要な関心の的となっている。
【０００５】
トウダイグサ科（Euphorbiaceae family）植物は、トウダイグサ属（Euphorbia）の種の植物を含む多岐にわたる植物を範囲に含む。この群の中で最も集中的に研究された種の一つはユーフォルビア-ピルリフェラ L(Euphorbia pilulifera L)（E.ヒルタ L.(E. hirta L.)、E.キャピタタ-ラム(E capitata Lam.)と同義）であり、これらの俗名には、ピルベアリング-スパージ（pill-bearing spurge）、スネークウィード、キャッツヘア（cat's hair）、クイーンズランド-アズマ-ウィード（Queensland asthma weed）およびフラワリーヘディッド-スパージ（flowery-headed spurge）が含まれる。この植物は、インドを含む熱帯諸国、およびクイーンズランドを含む北オーストラリアに広く分布している。ユーフォルビア-ペプルス（Euphorbia peplus）は、抗癌特性のあるアンゲリカ酸インゲノールが単離されているもう1つの種である（米国特許第6,432,452号(特許文献1)、同第6,787,161号(特許文献2)、および同第6,844,013号(特許文献3)を参照）。PEP005はユーフォルビア-ペプルスから抽出および精製されたアンゲリカ酸インゲノールであり、とりわけ、短期間の局所投与による光線角化症および非黒色腫皮膚癌（NMSC）の治療に有用である。PEP005の細胞傷害性はインビトロで多くの細胞株について示されており、インビボでのその効力は臨床的に確立されている。PEP005の化学名はインゲノール-3-アンゲレートである。
【０００６】
癌は、細胞集団が過剰増殖した時に起こる細胞性疾患である。米国だけでも、1990〜1994年の間に2,604,650人が癌のために死亡しており、内訳は男性（53％）の方が女性（47％）よりも多い。癌による死亡で数が多いのは、肺（〜30％）、結腸および直腸（〜11％）、乳房（〜8％）ならびに前立腺（〜6.5％）の癌の結果であった。女性の中で発生頻度の高い癌は、乳房（〜31％）、肺（〜12％）、結腸および直腸（〜12％）、子宮（〜6％）および卵巣（〜4％）のものである。2005〜2006年には570,280人が何らかの形態の癌のために死亡すると推定されている。
【０００７】
癌治療は一般に、外科手術、放射線照射および/または化学療法のうちの1つまたは複数を含む治療プロトコールを必要とする。化学療法は、癌に対する特に一般的で十分に確立された治療である。しかし、抗癌レジメンが患者に有意な利益を与えるという事実にもかかわらず、それらの使用は毒性および有害反応に伴う問題のために限定される恐れがある。事実、末期疾患の患者は、生活の質に対する深刻な影響のために積極的治療を受けることを選択しないことが時にある。
【０００８】
悪性疾患を治療する場合に、低分子量（LMW）抗癌薬は治療効力の不足を示し、このことは癌治療に対する癌治療集学的アプローチの必要性の増大を強く示している（Jain, J Natl Cancer Inst 81:570, 1989(非特許文献1)；Jain, Science 271:1079, 1996(非特許文献2)）。薬物の薬物動態、薬力学、非特異的毒性、免疫原性、生体認識および効力を制御するための新たな概念が生まれており、それらは高分子化学、薬剤学、バイオコンジュゲート化学および分子生物学の学際的アプローチに基づく新たな薬物送達システムの開発をもたらしている。薬物と高分子の組み合わせは、水溶性ポリマー担体、ミセル形成性ブロックコポリマー、ナノスフェア、ミクロスフェア、リポソーム、デンドリマーおよびヒドロゲルを基にした薬物送達システムである新たなクラスの治療薬を作り出している（Kim and Lim, Arch Pharm Res 25:229, 2002(非特許文献3)）。しかし、そのLMW対応物とは異なり、高分子薬は往々にして、望ましいものを上回る特性の達成を制約する恐れのある、重大な透過性の障壁に直面する。このため、透過性と滞留性の増強（EPR）効果（Maeda Adv Enzyme Regul 41:189, 2001(非特許文献4)）として知られる現象である、腫瘍の形成不十分な血管構造およびその結果としての悪性塊内部への高分子の受動的蓄積のために腫瘍選択性が往々にして高くなるとはいえ、腫瘍細胞膜は、細胞死を引き起こすためにまず標的細胞に入らなければならない高分子にとっては依然として手ごわい障壁である。腫瘍のリンパ流が十分に発達していなければ、腫瘍内圧も悪性塊の深部への高分子薬の送達を損なわせる恐れがある（Swartz et al, J Biomech 32:1297, 1999(非特許文献5)）。
【０００９】
もう1つの重要な薬物送達システムは、複数の異なる症状を治療するため、または1つもしくは複数の薬剤の活性を強化するために複数の薬剤を投与する併用療法を含む。他の化合物と同時投与することによって抗癌剤の毒性を低下させうることが癌治療における長期的な目標となっている。
【００１０】
このため、効力が強化された、癌の治療のための製剤およびプロトコールを開発することには需要がある。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第6,432,452号
【特許文献２】米国特許第6,787,161号
【特許文献３】米国特許第6,844,013号
【非特許文献１】Jain, J Natl Cancer Inst 81:570, 1989
【非特許文献２】Jain, Science 271:1079, 1996
【非特許文献３】Kim and Lim, Arch Pharm Res 25:229, 2002
【非特許文献４】Maeda, Adv Enzyme Regul 41:189, 2001
【非特許文献５】Swartz et al, J Biomech 32:1297, 1999
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、癌の治療のための治療プロトコールを提供する。本プロトコールは、アンゲロイル置換インゲナン（すなわち、アンゲリカ酸インゲノール）またはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体、および少なくとも1つまたは複数の他の薬剤の投与を含む。後者の薬剤は直接的な抗癌特性を有してもよく、または癌細胞もしくは組織のサイズ、成長および/または伝播（例えば、転移）の低下を誘導もしくは促進してもよい。本発明はしたがって、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体の、以下のものから選択される1つまたは複数の特性を呈する薬剤と一緒の、または関連づけての投与を含む、癌の治療のための併用療法を想定している：抗癌活性を有する；癌細胞に対する免疫応答において好中球または他の免疫細胞または免疫エフェクター分子（例えば、抗体）を刺激する；癌細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ADCC）を媒介する能力を有する；癌細胞と結合しうる抗体の産生を刺激する；および/または癌細胞に対する細胞傷害性T細胞活性を有する。
【００１３】
本発明は、癌を有する対象を治療するために抗癌活性を誘導するための、併用化学療法プロトコール、または化学療法効果と免疫療法効果の併用（すなわち、化学免疫療法効果）を提供する。本併用療法プロトコールは、アンゲリカ酸インゲノールまたは他の薬剤の単独での使用と比較して、プロトコールの抗癌活性または効力を強化することが提唱される。
【００１４】
「抗癌活性」に対する言及は、癌細胞のアポトーシス、壊死、溶解、死滅、老化、および/または細胞周期停止を含む。これはまた、癌の転移の抑制および癌細胞に対する免疫記憶の誘導も含む。「抗癌効力」には、抗癌活性のほか、とりわけ、以下のような他の特性が含まれる：癌細胞の細胞傷害、アポトーシス、壊死、老化、および/または細胞周期停止を誘導する割合、時期、および有効性；転移を治療または抑制する能力；癌細胞に対する免疫応答を誘導または刺激すること；癌細胞の再発に対して免疫記憶を誘導すること；必要とされるアンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤の一方またはもう一方の個々の量を減らすこと；対象に対する抗癌療法の毒性副作用を軽減すること；および寛解期間後の癌増殖を低下させること。
【００１５】
「癌」に対する言及は、腫瘍、白血病、肉腫または癌腫などの固形癌および血液媒介癌を含む。アンゲリカ酸インゲノールと他の薬剤との組み合わせは、単一の製剤として、または投与前に混合する別個の製剤として投与してもよく、または別個の製剤から同時または逐次的に投与してもよい。「癌」および「腫瘍」という用語は、本明細書において互換的に用いうる。「新生物」疾患も癌または腫瘍の一つの形態である。
【００１６】
したがって、本発明の1つの局面は、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療するための治療プロトコールであって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、プロトコールを想定している。
【００１７】
T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅の一例は、細胞傷害性T細胞を介した抑制または細胞死である。
【００１８】
本発明はさらに、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、そのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療する方法であって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、方法を提供する。
【００１９】
それ故に、一緒に投与される場合の両方の薬剤の総量は別々に投与される場合より少なくても相加的であってもよいが、にもかかわらず、改良または強化された抗癌活性または効力を有するという意味で、治療的により有効である。
【００２０】
本発明はさらに、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体と、以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する少なくとも1つの他の薬剤とを投与する段階を含む、対象における癌を治療するための治療プロトコールであって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きく；
アンゲリカ酸インゲノールと薬剤との組み合わせが、1未満の併用指数（CI）をもたらし、この際、CIが下記式を用いて決定される、プロトコールを提供する：
CI＝［(C)1/(Cx)1］＋［(C)2/(Cx)2］＋［α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2］
式中、(Cx)1は、薬物単独でxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、(C)1は、もう一方のアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤である(C)2との併用下で同じxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、αは定数であって、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤の抗癌活性の様式が相互排反的または非排反的である場合にαはそれぞれ0および1である。
【００２１】
本発明はまた、アンゲリカ酸インゲノールおよび以下のうちの1つまたは複数の投与を伴う治療プロトコールも提供する：（1）第2の抗癌剤；（2）抗癌細胞傷害性T細胞などの抗癌T細胞；（3）好中球刺激薬；（4）ADCC促進薬（好中球を含む）；（5）抗癌細胞抗体；および/または（6）（1）から（5）のうちの1つまたは複数を誘導する、刺激する、または引き起こす薬剤。
【００２２】
本発明のもう1つの局面は、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を含む第1の部分を有し、かつ薬剤またはその薬学的に許容される塩を含む第2の部分を有する、複数の部分で構成される薬学的製剤であって、前記部分が任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤をさらに含み、前記薬剤が以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、製剤を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体と、薬剤またはその薬学的に許容される塩と、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤とを含む製剤であって、前記薬剤が以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、製剤を提供する。
【００２４】
本発明のさらにもう1つの局面は、癌の治療のための医用薬剤の製造における、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体、および薬剤またはその薬学的に許容される塩の使用であって、前記薬剤が以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、使用を対象とする。
【００２５】
製剤および使用に関連して、1つの好ましい態様において、アンゲリカ酸インゲノールと薬剤との組み合わせのCIは1未満である。1未満であるCI値に対する言及は、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、および0.99という値、ならびにそれらの間の値を含む。
【００２６】
1つの好ましい態様において、アンゲリカ酸インゲノールはインゲノール-3-アンゲレートであり、これは本明細書中で「PEP005」と呼ばれる。「アンゲリカ酸インゲノール」、「インゲノール-3-アンゲレート」、「PEP005」または抗癌剤に対する言及は、天然の単離された形態、化学修飾された形態、化学合成された形態、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、または類似体を含む。
【００２７】
本発明によって想定される抗癌剤には、固形癌および血液媒介癌などの新生物疾患の治療に有用な、細胞傷害性、壊死性、アポトーシス性、細胞周期停止性および静止性の薬剤が含まれる。具体的な抗癌剤の例は表1に列記されている。「抗癌剤」という用語には、細胞傷害性T細胞および他の種類のT細胞および他の免疫細胞、ならびに抗体および好中球刺激薬およびADCC促進薬、ならびに以上の任意の1つまたは複数を誘導する薬剤も含まれる。
【００２８】
対象は、ヒトなどの哺乳動物を含む、任意の動物であってよい。
【００２９】
本発明はさらに、本製剤のための送達システムを想定している。1つの態様において、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤は別々に維持され、投与の前に混合される。この態様において、製剤は、限定的ではないがシリンジおよび針などの、単一の体組織侵入性注入デバイスを通して、または複数の体組織侵入性注入デバイスを通して投与される。したがって、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤の同時投与、またはいずれの順序でもよい逐次的投与は、本発明の一部である。
【００３０】
（表１）癌の治療のためにアンゲロイル置換インゲナンとの併用医用薬剤として用いるための薬剤の例
2009516651.tif 000002
2009516651.tif 000003
2009516651.tif 000004
2009516651.tif 000005
【００３１】
それ故に、表1に列記された薬剤には、癌特異的抗原に対する、または癌細胞に特異的な抗原の組み合わせに対する抗原、ならびにある範囲にわたる他の生物的または化学的に合成された細胞傷害性、アポトーシス性、壊死性、静止性および細胞周期停止性の薬剤に加えて、化学療法用の化合物および分子が含まれる。
【００３２】
本明細書の全体を通して、文脈が他のものを要求しない限り、「含む（comprise）」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」などの変形物は、言及した要素もしくは整数または要素の群もしくは整数の群を含むものの、他の要素または整数または要素の群もしくは整数の群を除外しないことを意味すると解釈されるものとする。
【００３３】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列識別番号（SEQ ID NO）によって参照される。SEQ ID NOは、数値上は配列識別子<400>1（SEQ ID NO:1）、<400>2（SEQ ID NO:2）などに対応する。配列識別子の概要は表2に提示されている。配列表は特許請求の範囲の後に提示されている。
【００３４】
（表２）配列識別子の概要
2009516651.tif 000006
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の記載および請求においては、以下の用語が、下記の定義に従って用いられる。
【００３６】
別に指定のない場合には、本発明が構成要素の特定の製剤、製造方法、投与レジメンなどには限定されず、それらが異なってもよいことが理解されるべきである。また、本明細書に用いられる用語は、特定の態様のみを記載することを目的としており、限定を意図しないことも理解されるべきである。
【００３７】
「1つ（a）」、「1つ（an）」および「その（the）」は、文脈で明らかに別の指示がなされない限り、複数の局面を含む。したがって、例えば、「1つの癌」に対する言及は、単一の癌または2つもしくはそれ以上の癌を含み；「1つのアンゲロイル置換インゲナン」または「1つのアンゲリカ酸インゲノール」に対する言及は、単一の化合物のほかに、2つまたはそれ以上の化合物を含み；「その製剤」に対する言及は単一の製剤または2つもしくはそれ以上の製剤を含み、その他についても同様である。
【００３８】
「化合物」、「薬剤」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」、および「薬物」という用語は、所望の薬理的および/または生理的効果を誘導する化合物、タンパク質（例えば、抗体）または細胞のことを指すために、本明細書において互換的に用いられる。これらの用語はまた、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、類似体などを非限定的に含む、本明細書で具体的に言及した活性薬剤の、薬学的に許容される薬理活性のある成分も包含する。「化合物」、「薬剤」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」、および「薬物」という用語が用いられる場合、これには、活性薬剤それ自体のほかに、薬学的に許容される薬理活性のある塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などが含まれることが理解されるべきである。所望の薬理的または生理的効果は、癌細胞または癌化する性向を有する細胞の細胞傷害、アポトーシス、壊死、老化、および/または細胞周期停止を含む、抗癌活性または効力である。本発明は、いずれかの薬剤の単独での使用と比較してより大きな抗癌効力をもたらす、少なくとも2つの薬剤の組み合わせである。このようなより大きな抗癌効力には、とりわけ、抗癌剤の毒性の低下、癌細胞の死滅もしくは増殖停止を誘導する効力の増加、対象に対する副作用の低下、転移の減少もしくはその治療、および/または癌細胞に対する免疫応答もしくは免疫記憶が含まれる。
【００３９】
以上の用語（すなわち、「化合物」、「薬剤」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」、および「薬物」）は「薬剤」と総称され、これには抗癌化学療法薬、抗体ならびにT細胞（細胞傷害性T細胞など）および他の免疫細胞、ならびに好中球刺激薬およびADCC促進薬、ならびに後者の効果の任意のものを誘導する薬剤が含まれる。それ故に、アンゲロイル置換インゲナンと組み合わされる薬剤は、癌細胞の細胞傷害、アポトーシス、壊死、老化、または細胞周期停止のうちの1つまたは複数を誘導する化学療法薬；T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を誘導しうるT細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）またはそれを誘導しうる薬剤；癌細胞上の抗原または癌細胞上に支配的もしくは独占的な抗原の組み合わせに対して特異的な抗体；または好中球、もしくは好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害（ADCC）を誘導する薬剤であってよい。
【００４０】
「化合物」、「薬剤」、「活性薬剤」、「化学薬剤」、「薬理活性薬剤」、「医用薬剤」、「活性物」、および「薬物」に対する言及は、例えば、2つまたはそれ以上のアンゲリカ酸インゲノールまたは2つまたはそれ以上の薬剤というような、2つまたはそれ以上の活性物の組み合わせを含む。「組み合わせ」には、薬剤が別々に提供されて、別々に投与もしくは投薬される、または投薬の前に混合される、2つの部分で構成される組成物のような、複数の部分で構成される組成物も含まれる。例えば、複数の部分で構成される製剤パックが、2つまたはそれ以上の活性薬剤を別々に保持してもよい。これはまた、「抗癌剤」および「化学療法薬」という用語、および他の薬剤、例えば細胞（例えば、細胞傷害性T細胞または好中球）または抗体などにも適用される。
【００４１】
本発明で用いられる薬剤の「有効量」および「治療有効量」という用語は、抗癌活性または効力、具体的には、癌細胞の死滅もしくは除去（ablation）もしくはアポトーシスもしくは老化もしくは静止もしくは細胞周期停止もしくは壊死、寛解後の癌増殖の再発低下、転移の減少もしくは治療、免疫に基づく抗癌活性、癌細胞に対する免疫記憶、および/または対象に対する毒性の低下である、所望の治療的または生理的な効果または成果を提供するのに十分な薬剤（例えば、アンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤）の量のことを意味する。望ましくない影響、例えば副作用は、ときに所望の治療効果とともに現れる；それ故に、実地医は適切な「有効量」が何かを決定するにあたって潜在的有益性と潜在的リスクとのバランスをとる。求められる厳密な量は、対象の種、齢および全身状態、投与様式などに応じて対象毎に異なると考えられる。このため、厳密な「有効量」を特定するのは不可能であると思われる。しかし、当業者は定型的な実験のみを用いて任意の個別の場合における適切な「有効量」を決定することができる。
【００４２】
それ故に、本明細書で用いる場合、「有効量」とは、適した投薬レジメンに従って投与した場合に、癌細胞増殖を低下させる所望の効果を提供する活性薬剤の量のことを指す。投与される活性薬剤の合わせた量（combined amount）は、癌細胞の所望の細胞傷害、老化、細胞周期停止、壊死および/もしくは除去、または抗癌効力の他の指標を提供する量であることが好ましい。投薬は、数分、数時間、数日、数週または数カ月の間隔で行うことができる。適した投薬量およびレジメンは、担当する医師または獣医師によって決定されうる。
【００４３】
1つの態様において、アンゲリカ酸インゲノールと薬剤との組み合わせの有効量は、いずれかをもう一方の非存在下で用いた場合よりも少ないことが提唱される。もう1つの態様において、合わせた量は、たとえ治療法がより有効であっても相加的である。それ故に、アンゲロイル置換インゲナンの組み合わせは、いずれの薬剤の単独での活性または効力と比較してより大きな抗癌活性または効力を提供することが提唱される。抗癌活性または効力には、癌細胞の細胞傷害、アポトーシス、壊死、老化、および/または細胞周期停止を誘導する割合、時期、および有効性；転移を治療または抑制する能力；癌細胞に対する免疫応答を誘導または刺激すること；癌細胞の再発に対して免疫記憶を誘導すること；必要とされるアンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤の一方またはもう一方の量を減らすこと；対象に対する抗癌療法の毒性副作用を軽減すること；および寛解期間後の癌増殖を低下させることが含まれる。
【００４４】
1つの態様においては、有効量を算出すると、1未満の併用指数（CI）が与えられ、この際、CIは下記式を用いて決定される：
CI＝［(C)1/(Cx)1］＋［(C)2/(Cx)2］＋［α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2］
式中、(Cx)1は、その薬物単独でxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、(C)1は、もう一方のアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤である(C)2との併用下で同じxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、αは定数であって、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤の抗癌活性の様式が相互排反的または非排反的である場合にαはそれぞれ0または1である。
【００４５】
1未満であるCI値に対する言及は、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、および0.99という値、ならびにそれらの間の値を含む。
【００４６】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または希釈剤とは、生物学的にも他の様式でも望ましくないわけではない材料、すなわち、有害反応を全くまたは実質的に引き起こすことなく選択された、活性薬剤とともに対象に投与しうる材料から構成される薬学的媒体を意味する。担体には、賦形剤のほか、希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、保存料などの他の添加物が含まれうる。
【００４７】
同様に、本明細書で提供するような化合物の「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体は、生物学的にも別の様式でも望ましくないわけではない塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体である。
【００４８】
本明細書で用いる「治療すること」および「治療」という用語は、治療しようとする病状の症状の重症度および/または頻度の低下、症状および/または基礎をなす原因の排除、病状の症状の発生および/またはそれらの基礎をなす原因の予防、ならびに病状に続く障害の改善または矯正または回復のことを指す。
【００４９】
対象を「治療すること」は、感受性のある個体における病状または他の有害な生理的事象の予防、ならびにその病状の症状を回復させることによる臨床的に症候性の個体の治療を伴いうる。「治療すること」という用語はまた、最初に治療されている可能性のある原発癌以外に、続発性または転移性の癌にも適用される。それはまた、癌細胞に対する免疫記憶の誘導も範囲に含む。治療を、本明細書で先に定義したように改善または強化された抗癌活性または効能を誘導するための治療プロトコールと称してもよい。
【００５０】
本明細書で用いる「対象」とは、本発明の薬学的製剤および方法から利益を得ることができる動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトのことを指す。ここに記載した薬学的製剤および方法から利益を得ることができる動物の種類に限定はない。ヒトであるか非ヒト動物であるかを問わず、対象は個体、患者、動物、宿主、またはレシピエントと称することができる。本発明の化合物および方法は、ヒトの医学、獣医学、ならびに一般に家畜または野生動物の畜産における用途を有する。
【００５１】
以上に示したように、好ましい動物は、ヒト、またはオランウータン、ゴリラ、マーモセットなどの他の霊長動物、家畜、実験用試験動物、愛玩動物、または捕獲された野生動物、ならびに鳥類種である。
【００５２】
実験用試験動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、サル目動物、モルモット、およびハムスターが含まれる。ウサギ、齧歯動物、およびサル目動物は、都合の良い試験系または動物モデルを提供する。家畜にはヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびロバが含まれる。
【００５３】
本発明は、一部には、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象に対する少なくとも2つの薬剤の投与を含む治療プロトコールであって、少なくとも1つの薬剤がアンゲロイル置換インゲナン（すなわち、アンゲリカ酸インゲノール）またはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体であり、少なくとも1つの他の薬剤が、以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈し、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、治療プロトコールを対象とする。
【００５４】
本治療プロトコールは、したがって、対象に対するアンゲリカ酸インゲノール、および以下のうちの1つまたは複数の投与を含む：（1）もう1つの抗癌剤；（2）癌特異的T細胞（細胞傷害性T細胞など）；（3）好中球刺激薬；（4）ADCC促進薬（好中球を含む）；（5）抗癌細胞抗体；および/または（6）（1）から（5）のうちの1つまたは複数を誘導する、刺激する、または引き起こす薬剤。
【００５５】
本発明は、（i）から（iv）のうちの1つの特性のみ、または2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つすべての特性を有する薬剤に及ぶ。
【００５６】
本発明の治療プロトコールは、さらに、癌細胞のADCCを誘発する前に好中球の閾値を低くするためのアンゲリカ酸インゲノールの使用にも及ぶ。
【００５７】
好中球刺激薬の一例には、アンゲリカ酸インゲノール（例えば、PEP005）またはインターロイキン（例えば、IL-6）が含まれる。
【００５８】
部分（ii）におけるT細胞の一例は細胞傷害性T細胞である。
【００５９】
ADCC促進薬の一例には抗体が含まれる。補体を介した細胞死をモジュレートする薬剤も本発明は想定している。
【００６０】
「アンゲリカ酸インゲノール」に対する言及は、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）の種などの植物から単離された化合物、ならびにそれらの誘導体、相同体、類似体、または機能的等価物、ならびにそれらの化学合成形態、ならびにそれらの薬学的に許容される塩が含まれる。これはPEP005に対しても適用される。
【００６１】
本明細書におけるトウダイグサ科のメンバーに対する言及には、以下の属からの種に対する言及が含まれる：エノキグサ（Acalypha）、アシドトン（Acidoton）、アクチノステモン（Actinostemon）、アデリア（Adelia）、アデノクリン（Adenocline）、アデノクレピス（Adenocrepis）、アデノファエドラ（Adenophaedra）、アディスカ（Adisca）、アグロスティスタチス（Agrostistachys）、アルコルネア（Alchornea）、アルコルネオプシス（Alchorneopsis）、アルシナエアンザス（Alcinaeanthus）、アルコセリア（Alcoceria）、アレウリテス（Aleurites）、アマノア（Amanoa）、アンドラチネ（Andrachne）、アンゴスチレス（Angostyles）、アニソフィラム（Anisophyllum）、アンチデスマ（Antidesma）、アフォラ（Aphora）、アポロサ（Aporosa）、アポロセラ（Aporosella）、アルギタムニア（Argythamnia）、アストロコッカス（Astrococcus）、アストロギネ（Astrogyne）、バッカンレア（Baccanrea）、バリオスペルマム（Baliospermum）、ベルナルディア（Bernardia）、ベイリオプシス（Beyeriopsis）、ビスコフィア（Bischofia）、ブラチア（Blachia）、ブルメオドンドロン（Blumeodondron）、ボナニア（Bonania）、ブラドレイア（Bradleia）、ブレイニア（Breynia）、ブレイニオプシス（Breyniopsis）、ブリデリア（Briedelia）、ブラエアビア（Buraeavia）、カペロニア（Caperonia）、カリオデンドロン（Caryodendron）、セリアネラ（Celianella）、セファロクロトン（Cephalocroton）、チャエノセカ（Chaenotheca）、チャエトカルプス（Chaetocarpus）、チャマエシス（Chamaesyce）、チェイロサ（Cheilosa）、チロペタラム（Chiropetalum）、コリオフィラム（Choriophyllum）、シッカ（Cicca）、チャオキシロン（Chaoxylon）、クレイドン（Cleidon）、クレイスタンザス（Cleistanthus）、クルイティア（Cluytia）、クネスモネ（Cnesmone）、クニドスコラス（Cnidoscolus）、コッコセラス（Coccoceras）、コディアエウム（Codiaeum）、コエロディスカス（Coelodiscus）、コナミ（Conami）、コンセベイバ（Conceveiba）、コンセベイバストラム（Conceveibastrum）、コンセベイバム（Conceveibum）、コリセア（Corythea）、クロイザティア（Croizatia）、クロトン（Croton）、クロトノプシス（Crotonopsis）、クロゾフォラ（Crozophora）、クバンザス（Cubanthus）、クヌリア（Cunuria）、ダクチロステモン（Dactylostemon）、ダレチャンピア（Dalechampia）、デンドロコウシンシア（Dendrocousinsia）、ディアスペルサス（Diaspersus）、ディディモシスタス（Didymocistus）、ディモルフォカリックス（Dimorphocalyx）、ディスコカルパス（Discocarpus）、ディタキシス（Ditaxis）、ドデカスティングマ（Dodecastingma）、ドライペテス（Drypetes）、ディソプシス（Dysopsis）、エラテリオスペルマム（Elateriospermum）、エンダデニウム（Endadenium）、エンドスペルマム（Endospermum）、エリスマンザス（Erismanthus）、エリソロカルパス（Erythrocarpus）、エリソロチラス（Erythrochilus）、ユーメカンザス（Eumecanthus）、ユーフォルビア（Euphorbia）、ユーフォルビオデンドロン（Euphorbiodendron）、イクスコエカリア（Excoecaria）、フルエッゲア（Flueggea）、カレアリア（Calearia）、ガルシア（Garcia）、ガバッレティア（Gavarretia）、ゲロニウム（Gelonium）、ギアラ（Giara）、ギボティア（Givotia）、グロキディオン（Glochidion）、グロキディオノプシス（Clochidionopsis）、グリシデンドロン（Glycydendron）、ギムナンゼス（Gymnanthes）、ギムノスパリア（Gymnosparia）、ヘマトスペルマム（Haematospermum）、ヘンデカンドラ（Hendecandra）、ヘベア（Hevea）、ヒエロニマ（Hieronima）、ヒエロニマ（hieronyma）、ヒッポクレパンドラ（Hippocrepandra）、ホマランザス（Homalanthus）、ヒメノカルディア（Hymenocardia）、ジャニファ（Janipha）、ジャトロファ（Jatropha）、ジュロクロトン（Julocroton）、ラシオクロトン（Lasiocroton）、レイオカルパス（Leiocarpus）、レオナルディア（Leonardia）、レピダンザス（Lepidanthus）、ロイコクロトン（Leucocroton）、マベア（Mabea）、マカランガ（Macaranga）、マロタス（Mallotus）、マニホット（Manihot）、マッパ（Mappa）、マプロウネア（Maprounea）、メランゼサ（Melanthesa）、メルカリアリス（Mercurialis）、メッテニア（Mettenia）、ミクランドラ（Micrandra）、ミクロデスミス（Microdesmis）、ミクロエルス（Microelus）、ミクロスタチイ（Microstachy）、マオクロトン（Maocroton）、モナデニウム（Monadenium）、モジンナ（Mozinna）、ネオスコルテキニア（Neoscortechinia）、オマランザス（Omalanthus）、オムファレア（Omphalea）、オフェランザ（Ophellantha）、オルビクラリア（Orbicularia）、オストデス（Ostodes）、オキシデクテス（Oxydectes）、パレンガ（Palenga）、パンタデニア（Pantadenia）、パラドリペプテス（Paradrypeptes）、パウサンドラ（Pausandra）、ペディランザス（Pedilanthus）、ペラ（Pera）、ペリディウム（Peridium）、ペタロスティグマ（Petalostigma）、フィランザス（Phyllanthus）、ピクロデンドロ（Picrodendro）、ピエラルディア（Pierardia）、ピリノフィタム（Pilinophytum）、ピメレオデンドロン（Pimeleodendron）、ピランヘア（Piranhea）、プラチギナ（Platygyna）、プルケネティア（Plukenetia）、ポドカリックス（Podocalyx）、ポインセチア（Poinsettia）、ポラレシア（Poraresia）、プロサルテマ（Prosartema）、シューダンザス（Pseudanthus）、ピクノコマ（Pycnocoma）、クアドラシア（Quadrasia）、レベルコニア（Reverchonia）、リチェリア（Richeria）、リチェリエラ（Richeriella）、リシネラ（Ricinella）、リシノカルプス（Ricinocarpus）、ロットレラ（Rottlera）、サゴティア（Sagotia）、サンウィチア（Sanwithia）、サピウム（Sapium）、サビア（Savia）、スクレロクロトン（Sclerocroton）、セバスティアナ（Sebastiana）、セクリネガ（Securinega）、セネフェルデラ（Senefeldera）、セネフィルデロプシス（Senefilderopsis）、セロフィトン（Serophyton）、シフォニア（Siphonia）、スパチオステモン（Spathiostemon）、スピキシア（Spixia）、スティリンギア（Stillingia）、ストロフィオブラチア（Strophioblachia）、シナデニウム（Synadenium）、テトラコッカス（Tetracoccus）、テトラプランドラ（Tetraplandra）、テトロルチディウム（Tetrorchidium）、チルサンセラ（Thyrsanthera）、チチマラス（Tithymalus）、トラゲイア（Trageia）、トレヴィア（Trewia）、トリゴノステモン（Trigonostemon）、チリア（Tyria）、およびキシロフィラ（Xylophylla）。
【００６２】
本発明の実施のために好ましい属であって、特に適する属はトウダイグサ属である。この属の特に有用な種には、以下が含まれる：ユーフォルビア-アーロン-ロッシ（Euphorbia aaron-rossii）、ユーフォルビア-アブレビアタ（Euphorbia abbreviata）、ユーフォルビア-アクタ（Euphorbia acuta）、ユーフォルビア-アラトカウリス（Euphorbia alatocaulis）、ユーフォルビア-アルビカウリス（Euphorbia albicaulis）、ユーフォルビア-アルゴマルギナタ（Euphorbia algomarginata）、ユーフォルビア-アリセア（Euphorbia aliceae）、ユーフォルビア-アルタ（Euphorbia alta）、ユーフォルビア-アナカムプセロス（Euphorbia anacampseros）、ユーフォルビア-アンドロメダ（Euphorbia andromedae）、ユーフォルビア-アングスタ（Euphorbia angusta）、ユーフォルビア-アントニイ（Euphorbia anthonyi）、ユーフォルビア-アンチグエンシス（Euphorbia antiguensis）、ユーフォルビア-アポシニフォリア（Euphorbia apocynifolia）、ユーフォルビア-アラビカ（Euphorbia arabica）、ユーフォルビア-アリエンシス（Euphorbia ariensis）、ユーフォルビア-アリゾニカ（Euphorbia arizonica）、ユーフォルビア-アルカンサナ（Euphorbia arkansana）、ユーフォルビア-アルテアガエ（Euphorbia arteagae）、ユーフォルビア-アランデラナ（Euphorbia arundelana）、ユーフォルビア-アストロイテス（Euphorbia astroites）、ユーフォルビア-アトロコッカ（Euphorbia atrococca）、ユーフォルビア-バセリシス（Euphorbia baselicis）、ユーフォルビア-バタバネンシス（Euphorbia batabanensis）、ユーフォルビア-ベルゲリ（Euphorbia bergeri）、ユーフォルビア-ベルムディアナ（Euphorbia bermudiana）、ユーフォルビア-ビコロル（Euphorbia bicolor）、ユーフォルビア-ビフォルミス（Euphorbia biformis）、ユーフォルビア-ビフルカタ（Euphorbia bifurcata）、ユーフォルビア-ビロバタ（Euphorbia bilobata）、ユーフォルビア-ビラメンシス（Euphorbia biramensis）、ユーフォルビア-ビウンシアリス（Euphorbia biuncialis）、ユーフォルビア-ブレファロスティプラ（Euphorbia blepharostipula）、ユーフォルビア-ブロドゲッティ（Euphorbia blodgetti）、ユーフォルビア-ボエルハビオイデス（Euphorbia boerhaavioides）、ユーフォルビア-ボリビアナ（Euphorbia boliviana）、ユーフォルビア-ブラセイ（Euphorbia bracei）、ユーフォルビア-ブラチアタ（Euphorbia brachiata）、ユーフォルビア-ブラチセラ（Euphorbia brachycera）、ユーフォルビア-ブランデッゲ（Euphorbia brandegee）、ユーフォルビア-ブリットニイ（Euphorbia brittonii）、ユーフォルビア-カエシア（Euphorbia caesia）、ユーフォルビア-カルシコラ（Euphorbia calcicola）、ユーフォルビア-カムペストリス（Euphorbia campestris）、ユーフォルビア-カンデラブルム（Euphorbia candelabrum）、ユーフォルビア-カピテラッタ（Euphorbia capitellata）、ユーフォルビア-カルメネンシス（Euphorbia carmenensis）、ユーフォルビア-カルンクラタ（Euphorbia carunculata）、ユーフォルビア-カエンシス（Euphorbia cayensis）、ユーフォルビア-セラストロイデス（Euphorbia celastroides）、ユーフォルビア-カリコフィラ（Euphorbia chalicophila）、ユーフォルビア-カマエルホドス（Euphorbia chamaerrhodos）、ユーフォルビア-カマエスラ（Euphorbia chamaesula）、ユーフォルビア-チアペンシス（Euphorbia chiapensis）、ユーフォルビア-チオゲノイデス（Euphorbia chiogenoides）、ユーフォルビア-チネラスセンス（Euphorbia cinerascens）、ユーフォルビア-クラリオネンシス（Euphorbia clarionensis）���ユーフォルビア-コリマエ（Euphorbia colimae）、ユーフォルビア-コロラタ（Euphorbia colorata）、ユーフォルビア-コムタタ（Euphorbia commutata）、ユーフォルビア-コンソクイットラエ（Euphorbia consoquitlae）、ユーフォルビア-コンボルブロイデス（Euphorbia convolvuloides）、ユーフォルビア-コラリフェラ（Euphorbia corallifera）、ユーフォルビア-クレベッリマ（Euphorbia creberrima）、ユーフォルビア-クレヌラタ（Euphorbia crenulata）、ユーフォルビア-クベンシス（Euphorbia cubensis）、ユーフォルビア-クスピダタ（Euphorbia cuspidata）、ユーフォルビア-シムビフォルミス（Euphorbia cymbiformis）、ユーフォルビア-ダルリングトニ（Euphorbia darlingtonii）、ユーフォルビア-デフォリアタ（Euphorbia defoliata）、ユーフォルビア-デゲネリ（Euphorbia degeneri）、ユーフォルビア-デルトイデア（Euphorbia deltoidea）、ユーフォルビア-デンタタ（Euphorbia dentata）、ユーフォルビア-デプレッサ（Euphorbia depressa）、ユーフォルビア-ディクチオスペルマ（Euphorbia dictyosperma）、ユーフォルビア-ディクチオスペルマ（Euphorbia dictyosperma）、ユーフォルビア-ディオエカ（Euphorbia dioeca）、ユーフォルビア-ディスコイダリス（Euphorbia discoidalis）、ユーフォルビア-ドルシベントラリス（Euphorbia dorsiventralis）、ユーフォルビア-ドルモンディ（Euphorbia drumondii）、ユーフォルビア-デュクロウキシ（Euphorbia duclouxii）、ユーフォルビア-デュッシ（Euphorbia dussii）、ユーフォルビア-エアノフィラ（Euphorbia eanophylla）、ユーフォルビア-エッゲルシ（Euphorbia eggersii）、ユーフォルビア-エグランデュロサ（Euphorbia eglandulosa）、ユーフォルビア-エラタ（Euphorbia elata）、ユーフォルビア-エナッラ（Euphorbia enalla）、ユーフォルビア-エリオゴノイデス（Euphorbia eriogonoides）、ユーフォルビア-エリオフィラ（Euphorbia eriophylla）、ユーフォルビア-エスクラエフォルミス（Euphorbia esculaeformis）、ユーフォルビア-エスピリツエンシス（Euphorbia espirituensis）、ユーフォルビア-エスラ（Euphorbia esula）、ユーフォルビア-エキシシサ（Euphorbia excisa）、ユーフォルビア-エキシクルサ（Euphorbia exclusa）、ユーフォルビア-エキシスティピタタ（Euphorbia exstipitata）、ユーフォルビア-エキシスティプラタ（Euphorbia exstipulata）、ユーフォルビア-フェンドレリ（Euphorbia fendleri）、ユーフォルビア-フィリカウリス（Euphorbia filicaulis）、ユーフォルビア-フィリフォルミス（Euphorbia filiformis）、ユーフォルビア-フロリダ（Euphorbia florida）、ユーフォルビア-フルチクロサ（Euphorbia fruticulosa）、ユーフォルビア-ガルベル（Euphorbia garber）、ユーフォルビア-ガウメリ（Euphorbia gaumerii）、ユーフォルビア-ゲラルディアナ（Euphorbia gerardiana）、ユーフォルビア-ゲイエリ（Euphorbia geyeri）、ユーフォルビア-グリプトスペルマ（Euphorbia glyptosperma）、ユーフォルビア-ゴルゴニス（Euphorbia gorgonis）、ユーフォルビア-グラシリオル（Euphorbia gracilior）、ユーフォルビア-グラシリマ（Euphorbia gracillima）、ユーフォルビア-グラディイ（Euphorbia gradyi）、ユーフォルビア-グラミネア（Euphorbia graminea）、ユーフォルビア-グラミニエア（Euphorbia graminiea）、ユーフォルビア-グリセア（Euphorbia grisea）、ユーフォルビア-グアダラヤラナ（Euphorbia guadalajarana）、ユーフォルビア-グアナレンシス（Euphorbia guanarensis）、ユーフォルビア-ギムナデニア（Euphorbia gymnadenia）、ユーフォルビア-ヘマタンザ（Euphorbia haematantha）、ユーフォルビア-ヘディオトイデス（Euphorbia hedyotoides）、ユーフォルビア-ヘルドリッチ（Euphorbia heldrichii）、ユーフォルビア-ヘレナエ（Euphorbia helenae）、ユーフォルビア-ヘレッリ（Euphorbia helleri）、ユーフォルビア-ヘルヴィッギ（Euphorbia helwigii）、ユーフォルビア-ヘンリクソニイ（Euphorbia henricksonii）、ユーフォルビア-ヘテロフィラ（Euphorbia heterophylla）、ユーフォルビア-ヘキサゴナ（Euphorbia hexagona）、ユーフォルビア-ヘキサゴノイデス（Euphorbia hexagonoides）、ユーフォルビア-ヒンクレイオルム（Euphorbia hinkleyorum）、ユーフォルビア-ヒントニイ（Euphorbia hintonii）、ユーフォルビア-ヒルツラ（Euphorbia hirtula）、ユーフォルビア-ヒルタ（Euphorbia hirta）、ユーフォルビア-ホオベリ（Euphorbia hooveri）、ユーフォルビア-フミストラタ（Euphorbia humistrata）、ユーフォルビア-ヒペリシフォリア（Euphorbia hypericifolia）、ユーフォルビア-イヌンダタ（Euphorbia inundata）、ユーフォルビア-インボルタ（Euphorbia involuta）、ユーフォルビア-ヤリスセンシス（Euphorbia jaliscensis）、ユーフォルビア-ジェジュナ（Euphorbia jejuna）、ユーフォルビア-ジョンストン（Euphorbia johnston）、ユーフォルビア-ジュッタエ（Euphorbia juttae）、ユーフォルビア-クヌッチ（Euphorbia knuthii）、ユーフォルビア-ラシオカルパ（Euphorbia lasiocarpa）、ユーフォルビア-ラタ（Euphorbia lata）、ユーフォルビア-ラタジ（Euphorbia latazi）、ユーフォルビア-ラテリコロル（Euphorbia latericolor）、ユーフォルビア-ラキシフロラ（Euphorbia laxiflora）、ユーフォルビア-レチェオイデス（Euphorbia lecheoides）、ユーフォルビア-レディエニイ（Euphorbia ledienii）、ユーフォルビア-ロイコフィラ（Euphorbia leucophylla）、ユーフォルビア-リネアタ（Euphorbia lineata）、ユーフォルビア-リングイフォルミス（Euphorbia linguiformis）、ユーフォルビア-ロンゲコルヌタ（Euphorbia longecornuta）、ユーフォルビア-ロンゲペティオラタ（Euphorbia longepetiolata）、ユーフォルビア-ロンゲラモサ（Euphorbia longeramosa）、ユーフォルビア-ロンギンスリコラ（Euphorbia longinsulicola）、ユーフォルビア-ロンギピラ（Euphorbia longipila）、ユーフォルビア-ルプリナ（Euphorbia lupulina）、ユーフォルビア-ルリダ（Euphorbia lurida）、ユーフォルビア-リシオイデス（Euphorbia lycioides）、ユーフォルビア-マクロポドイデス（Euphorbia macropodoides）、マクバウギアナ（macvaughiana）、ユーフォルビア-マンカ（Euphorbia manca）、ユーフォルビア-マンドニアナ（Euphorbia mandoniana）、ユーフォルビア-マングレティ（Euphorbia mangleti）、ユーフォルビア-マンゴ（Euphorbia mango）、ユーフォルビア-マリランディカ（Euphorbia marylandica）、ユーフォルビア-マヤナ（Euphorbia mayana）、ユーフォルビア-メラナデニア（Euphorbia melanadenia）、ユーフォルビア-メラノカルパ（Euphorbia melanocarpa）、ユーフォルビア-メリデンシス（Euphorbia meridensis）、ユーフォルビア-メルトニイ（Euphorbia mertonii）、ユーフォルビア-メキシアエ（Euphorbia mexiae）、ユーフォルビア-ミクロセファラ（Euphorbia microcephala）、ユーフォルビア-ミクロクラダ（Euphorbia microclada）、ユーフォルビア-ミクロメラ（Euphorbia micromera）、ユーフォルビア-ミセラ（Euphorbia misella）、ユーフォルビア-ミスリカ（Euphorbia missurica）、ユーフォルビア-モンタナ（Euphorbia montana）、ユーフォルビア-モンテレヤナ（Euphorbia montereyana）、ユーフォルビア-ムルチカウリ��（Euphorbia multicaulis）、ユーフォルビア-ムルチフォルミス（Euphorbia multiformis）、ユーフォルビア-ムルチノディス（Euphorbia multinodis）、ユーフォルビア-ムルチセタ（Euphorbia multiseta）、ユーフォルビア-ムスシコラ（Euphorbia muscicola）、ユーフォルビア-
ネオメキシカナ（Euphorbia neomexicana）、ユーフォルビア-ネフラデニア（Euphorbia nephradenia）、ユーフォルビア-ニクエロアナ（Euphorbia niqueroana）、ユーフォルビア-オアキサカナ（Euphorbia oaxacana）、ユーフォルビア-オッシデンタリス（Euphorbia occidentalis）、ユーフォルビア-オドントデニア（Euphorbia odontodenia）、ユーフォルビア-オリバセア（Euphorbia olivacea）、ユーフォルビア-オロヴァルアナ（Euphorbia olowaluana）、ユーフォルビア-オプタルミカ（Euphorbia opthalmica）、ユーフォルビア-オバタ（Euphorbia ovata）、ユーフォルビア-パチポダ（Euphorbia pachypoda）、ユーフォルビア-パチリザ（Euphorbia pachyrhiza）、ユーフォルビア-パディフォリア（Euphorbia padifolia）、ユーフォルビア-パルメリ（Euphorbia palmeri）、ユーフォルビア-パルディコラ（Euphorbia paludicola）、ユーフォルビア-パルシフロラ（Euphorbia parciflora）、ユーフォルビア-パリシ（Euphorbia parishii）、ユーフォルビア-パリイ（Euphorbia parryi）、ユーフォルビア-パキシアナ（Euphorbia paxiana）、ユーフォルビア-ペディクリフェラ（Euphorbia pediculifera）、ユーフォルビア-ペプリディオン（Euphorbia peplidion）、ユーフォルビア-ペプロイデス（Euphorbia peploides）、ユーフォルビア-ペプルス（Euphorbia peplus）、ユーフォルビア-ペルガメナ（Euphorbia pergamena）、ユーフォルビア-ペルリグネア（Euphorbia perlignea）、ユーフォルビア-ペタロイデア（Euphorbia petaloidea）、ユーフォルビア-ペタロイデア（Euphorbia petaloidea）、ユーフォルビア-ペトリナ（Euphorbia petrina）、ユーフォルビア-ピカチェンシス（Euphorbia picachensis）、ユーフォルビア-ピロスラ（Euphorbia pilosula）、ユーフォルビア-ピルリフェラ（Euphorbia pilulifera）、ユーフォルビア-ピナリオナ（Euphorbia pinariona）、ユーフォルビア-ピネトラム（Euphorbia pinetorum）、ユーフォルビア-ピオノスペルマ（Euphorbia pionosperma）、ユーフォルビア-プラティスペルマ（Euphorbia platysperma）、ユーフォルビア-プリカタ（Euphorbia plicata）、ユーフォルビア-ポエッピギイ（Euphorbia poeppigii）、ユーフォルビア-ポリオスペルマ（Euphorbia poliosperma）、ユーフォルビア-ポリカルパ（Euphorbia polycarpa）、ユーフォルビア-ポリクネモイデス（Euphorbia polycnemoides）、ユーフォルビア-ポリフィッラ（Euphorbia polyphylla）、ユーフォルビア-ポルトリセンシス（Euphorbia portoricensis）、ユーフォルビア-ポルツラコイデス（Euphorbia portulacoides）、ユーフォルビア-ポルツラナ（Euphorbia portulana）、ユーフォルビア-プレスリイ（Euphorbia preslii）、ユーフォルビア-プロストラタ（Euphorbia prostrata）、ユーフォルビア-プテロネウラ（Euphorbia pteroneura）、ユーフォルビア-ピクナンテマ（Euphorbia pycnanthema）、ユーフォルビア-ラモサ（Euphorbia ramosa）、ユーフォルビア-ラプラム（Euphorbia rapulum）、ユーフォルビア-レミイ（Euphorbia remyi）、ユーフォルビア-レトロスカブラ（Euphorbia retroscabra）、ユーフォルビア-レボルタ（Euphorbia revoluta）、ユーフォルビア-リブラリス（Euphorbia rivularis）、ユーフォルビア-ロブスタ（Euphorbia robusta）、ユーフォルビア-ロモサ（Euphorbia romosa）、ユーフォルビア-ルビダ（Euphorbia rubida）、ユーフォルビア-ルブロスペルマ（Euphorbia rubrosperma）、ユーフォルビア-ルピコラ（Euphorbia rupicola）、ユーフォルビア-サンマルテンシス（Euphorbia sanmartensis）、ユーフォルビア-サキサティリス M. Bieb（Euphorbia saxatilis M. Bieb）、ユーフォルビア-シゾロバ（Euphorbia schizoloba）、ユーフォルビア-スクレロシアチウム（Euphorbia sclerocyathium）、ユーフォルビア-スコプロラム（Euphorbia scopulorum）、ユーフォルビア-セニリス（Euphorbia senilis）、ユーフォルビア-セルピリフォリア（Euphorbia serpyllifolia）、ユーフォルビア-セルラ（Euphorbia serrula）、ユーフォルビア-セティロバ Engelm（Euphorbia setiloba Engelm）、ユーフォルビア-ソノラエ（Euphorbia sonorae）、ユーフォルビア-ソオビイ（Euphorbia soobyi）、ユーフォルビア-スパルシフロラ（Euphorbia sparsiflora）、ユーフォルビア-スファエロスペルマ（Euphorbia sphaerosperma）、ユーフォルビア-シフィリティカ（Euphorbia syphilitica）、ユーフォルビア-スプルセアナ（Euphorbia spruceana）、ユーフォルビア-スブコエルレア（Euphorbia subcoerulea）、ユーフォルビア-ステラタ（Euphorbia stellata）、ユーフォルビア-スブマミラリス（Euphorbia submammilaris）、ユーフォルビア-スブペルタタ（Euphorbia subpeltata）、ユーフォルビア-スブプベンス（Euphorbia subpubens）、ユーフォルビア-スブレニフォルメ（Euphorbia subreniforme）、ユーフォルビア-スブトリフォリアタ（Euphorbia subtrifoliata）、ユーフォルビア-スセダネア（Euphorbia succedanea）、ユーフォルビア-タマウリパサナ（Euphorbia tamaulipasana）、ユーフォルビア-テレフィオイデス（Euphorbia telephioides）、ユーフォルビア-テヌイッシマ（Euphorbia tenuissima）、ユーフォルビア-テトラポラ（Euphorbia tetrapora）、ユーフォルビア-チルカリ（Euphorbia tirucalli）、ユーフォルビア-トメンテラ（Euphorbia tomentella）、ユーフォルビア-トメントサ（Euphorbia tomentosa）、ユーフォルビア-トラルバシイ（Euphorbia torralbasii）、ユーフォルビア-トバリエンシス（Euphorbia tovariensis）、ユーフォルビア-トラチスペルマ（Euphorbia trachysperma）、ユーフォルビア-トリコロル（Euphorbia tricolor）、ユーフォルビア-トロヤナ（Euphorbia troyana）、ユーフォルビア-ツエルクヘイミイ（Euphorbia tuerckheimii）、ユーフォルビア-ツルクザニノヴィイ（Euphorbia turczaninowii）、ユーフォルビア-ウムベルラタ（Euphorbia umbellulata）、ユーフォルビア-ウンデュラタ（Euphorbia undulata）、ユーフォルビア-ベルミフォルミス（Euphorbia vermiformis）、ユーフォルビア-ベルシコロル（Euphorbia versicolor）、ユーフォルビア-ビリフェラ（Euphorbia villifera）、ユーフォルビア-ビオラセア（Euphorbia violacea）、ユーフォルビア-ウィテイ（Euphorbia whitei）、ユーフォルビア-キサンチ Engelm（Euphorbia xanti Engelm）、ユーフォルビア-キシロポダ Greenm.（Euphorbia xylopoda Greenm.）、ユーフォルビア-ヤヤレシア Urb.（Euphorbia yayalesia Urb.）、ユーフォルビア-ユンガセンシス（Euphorbia yungasensis）、ユーフォルビア-ゼラブスチャニカ（Euphorbia zeravschanica）、およびユーフォルビア-ジニイフロラ（Euphorbia zinniiflora）。
【００６３】
シナデニウム（Synadenium）属の特に好ましい種には、シナデニウム-グランティ（Synadenium grantii）およびシナデニウム-コムパクツム（Synadenium compactum）が含まれる。
【００６４】
モナデニウム（Monadenium）属の特に好ましい種には、モナデニウム-ルガルダエ（Monadenium lugardae）およびモナデニウム-グエンセリ（Monadenium guentheri）が含まれる。
【００６５】
エンダデニウム（Endadenium）属の好ましい種は、エンダデニウム-ゴスヴェイレニ（Endadenium gossweileni）である。
【００６６】
ユーフォルビア-ペプルスは、アンゲリカ酸インゲノールの供給源を提供するという点で、本発明の実施に特に有用である。本明細書における「ユーフォルビア-ペプルス」またはその省略形である「E.ペプルス」に対する言及には、この植物のさまざまな亜種、株、系統、雑種、または派生物、ならびにその植物学的もしくは園芸学的な近縁植物が含まれる。さらに、本発明は、トウダイグサ科の植物体全体もしくは樹液もしくは種を含むその部分を用いて実施してもよく、または他の再生材料を用いてもよい。一般に、種または再生材料を使用するためには、植物または苗木をまず繁殖させることが必要である。
【００６７】
本明細書におけるトウダイグサ科植物、トウダイグサ属の種またはE.ペプルスに対する言及は、さらに、遺伝的に改変された植物も包含する。遺伝的に改変された植物には、トランスジェニック植物、またはある形質が除去された植物、または内因性遺伝子配列がダウンレギュレートされた植物、突然変異した植物、または特定の遺伝子に対する調節効果を呈する遺伝物質の改変もしくは導入を含む他の様式で改変された植物が含まれる。したがって、トウダイグサ科植物またはトウダイグサ属の種またはE.ペプルスにおいて自然には存在しない特性を呈する植物は、それにもかかわらず本発明に包含され、上述した用語の範囲内に含まれる。
【００６８】
アンゲリカ酸インゲノールは一般に、トウダイグサ科植物の抽出物中に存在する。抽出物にはしたがって、葉、茎、花、種子、皮もしくは皮と茎との間から滲出する、またはそれらに存在する、樹液または液体または半液体の物質が含まれうる。抽出物は樹液から得るのが最も好ましい。さらに、抽出物には、トウダイグサ科植物の樹液、葉、茎、花、皮または他の植物材料から抽出された画分中に存在する液体または半液体の物質が含まれうる。例えば、植物材料を、植物繊維および細胞外マトリックス材料を破壊するための物理的操作に供して、中間組織および内部組織を水性環境を含む溶媒中に抽出することができる。化学合成経路によって得られる化合物を含む、アンゲリカ酸インゲノールのこのようなすべての供給源は、本発明に包含される。
【００６９】
本発明の最も好ましい化合物は、化学的にインゲノール-3-アンゲレートと呼ばれ、これは本明細書では「PEP005」とも呼ばれる。本明細書における「インゲノール-3-アンゲレート」または「PEP005」に対する言及は、天然の、ならびに化学合成された形態、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、および類似体を含む。
【００７０】
アンゲロイル置換インゲナンと併用される薬剤の一例は、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、分裂阻害剤、ステロイド、性ホルモン、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ホルモン作動薬、および微小管阻害剤などの化学療法薬である。
【００７１】
代謝拮抗剤は、細胞の増殖および複製のために必要なタンパク質合成またはDNA合成といった身体の化学プロセスと干渉する。代謝拮抗薬は細胞分裂を阻止することができ、それは癌治療における要求条件である。その例には、アザセリン、D-サイクロセリン、ミコフェノール酸、トリメトプリム、5-フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ara-C）、およびフルダラビンが含まれる。
【００７２】
抗腫瘍抗生物質は、酵素および有糸分裂を停止させることによって、または細胞周囲の膜を変化させることによってDNAと干渉する。これらの薬剤は細胞周期のすべての時期に作用する。このため、それらは種々の癌に対して広く用いられている。抗腫瘍抗生物質の例には、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、およびミトキサントロンが含まれる。
【００７３】
分裂阻害剤は、植物アルカロイド、および天然物に由来する他の化合物である。それらは有糸分裂を阻害もしくは停止させること、または細胞の複製のために必要なタンパク質を生成するための酵素を阻害することができる。これらは細胞周期のM期に作用する。分裂阻害剤の例には、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド（VP-16）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【００７４】
ステロイドは、ある種の癌（リンパ腫、白血病および多発性骨髄腫など、ただしこれらには限定されない）ならびに他の疾病の治療に有用な天然ホルモンおよびホルモン様薬物である。これらの薬物を、癌細胞を死滅させるため、またはそれらの増殖を緩徐にするために用いる場合には、それらは抗癌薬とみなされる。また、それらを、他の種類の化学療法薬と、それらの有効性を高めるために併用することもできる。その例にはプレドニゾンおよびデキサメサゾンが含まれる。
【００７５】
性ホルモンまたはホルモン様薬は、女性または男性ホルモンの作用または産生を変化させる。それらは、体内のホルモンレベルに応じて通常は増殖する、乳房、前立腺および子宮内膜（子宮の内層）の癌の増殖を緩徐にするために用いられる。その例には、抗エストロゲン剤（タモキシフェン、フルベストラント）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール）、プロゲスチン（酢酸メゲストロール）、抗アンドロゲン剤（ビカルタミド、フルタミド）、およびLHRH作動薬（ロイプロリド、ゴセレリン）が含まれる。
【００７６】
アルキル化剤はDNAに直接作用して癌細胞の複製を阻止する。このクラスの薬物として、これらの薬剤は時期特異的ではない（換言すると、それらは細胞周期のすべての時期に作用する）。これらの薬物は、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、ならびに肺、乳房、および卵巣のある種の癌に対して活性がある。アルキル化剤の例には、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（DTIC）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、およびメルファランが含まれる。
【００７７】
塩酸塩の結晶形態にあるナイトロジェンマスタードは、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、および脳腫瘍の治療における薬物として用いられる。ナイトロジェンマスタードは、細胞の遺伝物質における突然変異を引き起こし、それによって有糸分裂または細胞分裂を途絶させる。細胞のナイトロジェンマスタードに対する感受性はさまざまであり、急速に増殖している腫瘍および癌細胞が最も感受性が高い；赤血球を生成する骨髄も感受性が高く、赤血球生成の低下はナイトロジェンマスタード療法の頻度の高い副作用である。ナイトロジェンマスタードは免疫応答も抑制する。他の種類には芳香族マスタードであるメルファランおよびクロラムブシルが含まれる。
【００７８】
ニトロソウレアはアルキル化剤と同様のやり方で作用する。それらはDNAの修復を助ける酵素と干渉する。これらの薬剤は脳に移行しうるため、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および悪性黒色腫のほかに脳腫瘍を治療するためにも用いられる。ニトロソウレアの例には、カルムスチン（BCNU）およびロムスチン（CCNU）が含まれる。
【００７９】
ホルモン作動薬の例には、前立腺癌などに対するロイプロリド（Lupron、Viadur、Eligard）、乳癌および前立腺癌に対するゴセレリン（Zoladex）、ならびに卵巣癌および前立腺癌に対するトリプトレリン（Trelstar）、ならびに酢酸ナファレリン（Synarel）が含まれる。
【００８０】
微小管阻害剤には、「ビンカ」アルカロイド、タキソイド、およびベンゾイミダゾールが含まれる。この種の抗癌剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、マイトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコフォルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（DES）などの抗癌剤が非限定的に含まれる。
【００８１】
本発明の薬剤にはまた、抗体または他の免疫相互作用分子も含まれる。例えば、特定の癌特異的抗原に対する抗体を投与してもよく、または癌特異的抗原を対象とする抗体製剤を誘導するために抗原を提供する。抗体は、抗癌プロトコールにおいてアンゲロイル置換インゲナンとともに投与される薬剤の一例である。さらに、対象のT細胞または他の免疫細胞を単離して、培養下で増殖させ、続いて対象に戻すこともできる。後者に関して、本発明は、癌患者を選択し、T細胞またはT細胞を含む試料を単離し、T細胞をインビトロ培養下で増殖させて、任意で細胞をインターロイキン（例えば、IL-6）もしくは他のサイトカインまたはアンゲリカ酸インゲノール（例えば、PEP005）で刺激して、増殖させたT細胞集団を対象に戻すことを伴うプロトコールに及ぶ。アンゲロイル置換インゲナン（例えば、PEP005）による癌の除去を受けることも考えられる。もう1つの態様においては、T細胞をワクチン接種または他の免疫増強剤によって生成させるか、または患者に養子移入する。続いてPEP005または他のアンゲリカ酸インゲノールを、T細胞活性を改善するために用いる。
【００８２】
前者に関して、抗体は、癌細胞に対するADCCを強化するため、または細胞傷害性T細胞応答もしくは免疫細胞からの他の応答を促進するために選択することができる。
【００８３】
抗体に関しては、ポリクローナル抗体を用いることが簡便であるが、モノクローナル抗体が、大量に生産しうること、および生産物の均一性のために特に好ましい。モノクローナル抗体生産のためのハイブリドーマ細胞株の調製物は、不死細胞株と、免疫原性調製物（すなわち、癌抗原を含むもの）に感作されたリンパ球とを融合させることによって得られる。
【００８４】
本発明はさらに、1つの動物または鳥類の生物に由来する抗体を、同じまたは異なる種の別の動物または鳥類の生物において実質的に非免疫原性にするための生化学的手法の適用も提供する。この生化学的プロセスは、本明細書において「脱免疫化（deimmunization）」と呼ばれる。本明細書における「脱免疫化」に対する言及は、いずれも特定の宿主（例えば、ヒト対象）における免疫相互作用分子（例えば、抗体）の免疫原性を低下させることを目的とする、相補性決定領域（CDR）グラフト法、免疫相互作用分子のフレームワーク領域に関する「再構築（reshaping）」および可変（v）領域突然変異などの工程が含まれる。ここでの場合に、好ましい免疫相互作用分子は、癌細胞に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの抗体である。1つの最も好ましい態様において、免疫相互作用分子は、1つの動物または鳥類の生物に由来し、限定はされないがヒトなどの同じまたは異なる種からの別の動物または鳥類の生物において低下した免疫原性を呈するモノクローナル抗体である。
【００８５】
「実質的に非免疫原性」に対する言及は、親抗体、すなわち非免疫原化の工程にさらされる前の抗体と比較して、低下した免疫原性を含む。「免疫原性」という用語は、宿主における体液性および/またはT細胞を介した応答を惹起、誘導または他の様式で促進する能力を含む。特に簡便な免疫原性の基準には、抗体の可変（v）領域に由来するアミノ酸配列がMHCクラスII分子と相互作用し、それによって、T細胞により補助される体液性応答を含む、T細胞を介する応答を刺激または促進する能力が含まれる。
【００８６】
「抗体」とは、抗原と合体する、相互作用する、または他の様式で会合する、免疫グロブリンファミリーのタンパク質を意味する。抗体はしたがって抗原結合性分子である。「抗体」は免疫相互作用分子の一例であり、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が含まれる。本発明の好ましい免疫相互作用分子は、モノクローナル抗体である。「抗体」という用語はまた、癌細胞上の2種類の抗原に対する二重特異性抗体などの、人工的に操作された抗体も含む。
【００８７】
「抗原」という用語は、本明細書において、免疫応答において反応しうる、および/またはそれを誘導しうる物質を指して、その最も広い意味で用いられる。「抗原」に対する言及は、抗原決定基またはまたはエピトープまたは癌細胞を含む。
【００８８】
「抗原結合性分子」とは、標的抗原に対する結合親和性を有する任意の分子を意味する。この用語が、免疫グロブリン（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）、免疫グロブリンの断片、および抗原結合活性を呈する免疫グロブリン以外に由来するタンパク質フレームワークにも及ぶことは理解されるであろう。「抗体」および「抗原結合分子」という用語は、これらの分子の脱免疫化形態も含む。
【００８９】
「抗原決定基」または「エピトープ」とは、特定の免疫応答の対象となる抗原性分子の部分を意味し、これにはハプテンが含まれる。典型的には、動物において、抗原はいくつかの、さらには多数の抗原決定基を同時に提示する。「ハプテン」とは、抗体と特異的に合体しうるが、担体と結合していなければ免疫応答をほとんどまたはわずかしか誘導することのできない物質のことである。ハプテンは典型的には、単一の抗原決定基またはエピトープを含む。
【００９０】
本発明の好ましい抗体は、ヒトにおける使用のためのマウスモノクローナル抗体の脱免疫化形態であるが、本発明は、任意の源からの、任意の宿主における使用のために脱免疫化された抗体にも及ぶ。動物および鳥類の源および宿主の例には、ヒト、霊長動物、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ロバ）、実験用試験動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ）、および猟鳥（例えば、キジ）が含まれる。
【００９１】
免疫処置およびその後のモノクローナル抗体の生産は、例えば、KohlerおよびMilsteinによって記載された標準的なプロトコールを用いて行うことができる（Kohler et al, Nature 256:495-499, 1975およびKohler et al, Eur. J. Immunol. 6(7):511-519, 1976, Coligan et al, Current Protocols in Immunology, 1991-1997またはToyama et al, Monoclonal Antibody, Experiment Manual, published by Kodansha Scientific, 1987）。本質的には、抗体産生細胞、特に抗体産生性体細胞（例えば、Bリンパ球）を生成させるために、動物に対して、抗原を含むもの（例えば、癌抗原）またはその画分による免疫処置を標準的な方法によって行う。続いて、これらの細胞を免疫処置動物から不死化のために取り出す。抗原をまず担体と会合させることが必要な場合もある。
【００９２】
「担体」とは、典型的には高分子量であって、免疫原性がないまたは乏しい物質（例えば、ハプテン）と自然下でまたは人工的に結合して、その免疫原性を強める任意の物質を意味する。
【００９３】
抗体産生細胞の不死化は、当技術分野で周知の方法を用いて行うことができる。例えば、不死化は、エプスタイン-バーウイルス（EBV）を用いる形質転換法によって達成することができる［Kozbor et al, Methods in Enzymology 121:140, 1986］。1つの好ましい態様において、抗体産生細胞は、モノクローナル抗体の生産のために広く用いられている細胞融合法（Coligan et al, 前記、1991-1997に記載）を用いて不死化される。この方法では、抗体を産生する潜在能力を有する抗体産生性体細胞、特にB細胞を、骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、感作動物、好ましくはマウスおよびラットなどの齧歯動物の、リンパ節、脾臓、および末梢血に由来するものであってよい。本発明の例示的な態様においては、マウスの脾臓細胞を用いる。しかし、その代わりにラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギの細胞、または他の動物種からの細胞を用いることもできる。
【００９４】
リンパ球性腫瘍から、ハイブリドーマ生成融合法に用いるための特別な骨髄腫細胞株が開発されている（Kohler et al, 前記、1976；Kozbor et al, 前記、1986；およびVolk et al, J. Virol. 42(1):220-227, 1982）。これらの細胞株は、少なくとも3つの理由で開発された。第1は、融合ハイブリドーマを、融合しておらず同様に無限に自己増殖する骨髄腫細胞から選別することを容易にするためである。通常、これはハイブリドーマの増殖を支援するある種の選択培地においてそれらを増殖不能にする酵素欠損を伴う骨髄腫細胞を用いて達成される。第2の理由は、リンパ球性腫瘍細胞がそれら自身の抗体を産生する固有の能力に由来する。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生をなくすために、内因性の免疫グロブリン軽鎖および重鎖を産生することのできない骨髄腫細胞株を用いる。これらの細胞株を選択する第3の理由は、融合に対するそれらの適性および効率である。
【００９５】
数多くの骨髄腫細胞株を融合細胞ハイブリッドの調製に用いることができ、これには例えば、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8.653、P3/NS1-Ag4-1（NS-1）、Sp2/0-Ag14およびS194/5.XXO.Bu.1が含まれる。P3X63-Ag8およびNS-1細胞株については、Kohler and Milstein（Kohler et al, 前記、1976）によって記載されている。Shulman et al, Nature 276:269-270, 1978は、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞株を開発した。S194/5.XXO.Bu.1株はTrowbridge, J. Exp. Med. 148(1):220-227, 1982によって報告されている。
【００９６】
抗体を産生する脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを形成する方法は、通常は体細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ10：1の割合で（ただしこの割合は約20：1〜約1：1まででさまざまであってよい）、細胞膜の融合を促進する1つまたは複数の薬剤（化学物質、ウイルスまたは電気）の存在下で混合することによる。融合法については記載がある（Kohler et al, 前記、1975；Kohler et al, 前記、1976；Gefter et al, Somatic Cell Genet. 3:231-236, 1977；およびVolk et al, 前記、1982）。これらの研究者らが用いた融合促進剤はセンダイウイルスおよびポリエチレングリコール（PEG）であった。
【００９７】
融合手順では生存しうるハイブリッドが極めて低い頻度でしか得られないため（例えば、脾臓を体細胞の源として用いる場合、おおよそ1×105個の脾臓細胞当たり1個のハイブリッドが得られるに過ぎない）、融合細胞ハイブリッドを残りの非融合細胞、特に非融合骨髄腫細胞から選択する手段があることが好ましい。結果として生じた他の融合細胞ハイブリッドの中から、所望の抗体産生ハイブリドーマを検出する手段も必要である。一般に、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドーマの増殖を支援するものの、通常は無限に分裂を続ける非融合骨髄腫細胞の増殖を阻止する培地中で細胞を培養することによって達成される。融合に用いた体細胞はインビトロ培養下で長期生存性を維持せず、それ故に問題を生じない。本発明の実施例においては、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェフーゼを欠く（HPRT陰性）骨髄腫細胞を用いた。これらの細胞に対する選択は、ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン（HAT）培地、すなわち融合細胞ハイブリッドが脾臓細胞のHPRT陽性遺伝子型のために生き残る培地中で行われる。遺伝子型の上でコンピテントなハイブリッドの増殖を支援する培地中で選別しうる、異なる遺伝子欠損（薬物感受性など）をもつ骨髄腫細胞の使用も可能である。
【００９８】
融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するためには数週間が必要である。この期間の初期には、後にそれらをクローン化して増殖させるために、所望の抗体を産生するハイブリッドを同定する必要がある。一般に、得られたハイブリッドの10％前後が所望の抗体を産生するが、約1〜約30％であることが稀ではない。抗体産生性ハイブリッドの検出は、例えば、米国特許第6,056,957号に記載されたような、いくつかの標準的なアッセイ法のいずれかによって達成することができる。
【００９９】
ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞株としてクローン化されると、それぞれの細胞株を二通りの標準的な方法のいずれかによって増殖させることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性動物に注射することができる。続いて、注射された動物には腫瘍が発生し、これが融合細胞ハイブリッドにより産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する。動物の体液、例えば血清または腹水を採取して、モノクローナル抗体を高濃度で得ることができる。または、個々の細胞株をインビトロで実験用培養器内において増殖させることもできる。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度で含む培地をデカンテーション、濾過、または遠心分離によって採取し、その後に精製することができる。
【０１００】
細胞株を、関心対象の抗原を検出する特異性に関して、任意の適した免疫検出手段によって試験する。例えば、細胞株を多数のウェルに分けて入れ、インキュベートした上で、各ウェルからの上清を固相酵素免疫アッセイ（ELISA）、間接蛍光抗体法などによって分析することができる。標的抗原を認識しうるが標的でないエピトープは認識しないモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し、続いてインビトロで直接培養するか、または組織適合性のある動物に注入して腫瘍を形成させ、求める抗体を産生させ、収集した上で精製する。
【０１０１】
したがって、本発明は、癌細胞と特異的に相互作用して、とりわけ癌細胞のADCCを誘導する、または他の様式で細胞死もしくは静止を促進する、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。
【０１０２】
続いて、モノクローナル抗体は一般に、脱免疫化の手段に供せられる。このような工程は、本発明に従って調製されたモノクローナル抗体と同じまたは類似の特異性を有するキメラ抗体の調製を含む、さまざまな形態のいずれをとってもよい。キメラ抗体とは、その軽鎖および重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から、典型的には遺伝子操作によって構築された抗体のことである。すなわち、本発明によれば、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得たところで、1つの種の結合領域が別の種の抗体の非結合領域と組み合わされた種間（interspecific）モノクローナル抗体を作製するための技法を用いる（Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443, 1987）。例えば、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体由来の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体とつなぎ合わせ、それによってマウス抗体を「ヒト化」することができる（欧州特許公報第0 239 400号；Jones et al, Nature 321:522-525, 1986；Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536, 1988およびRichmann et al, Nature 332:323-327, 1988）。この場合には、脱免疫化工程はヒトに対して特異的である。より詳細には、CDRを、ヒト定常領域を有するまたは有しないヒト抗体の可変領域とつなぎ合わせることができる。CDRを提供する非ヒト抗体は一般に「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体は一般に「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は必ずしも存在しなくてよいが、存在する場合には、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約85〜90％同一、好ましくは約95％またはそれ以上同一でなければならない。このため、おそらくはCDRを除く、ヒト化抗体のすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。したがって、「ヒト化抗体」は、ヒト化された軽鎖およびヒト化された重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ドナー抗体は「ヒト化」の工程によって「ヒト化」されたと言われるが、これは結果として生じるヒト化抗体が、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原と結合すると予想されるためである。本明細書における「ヒト化」に対する言及は、特定の宿主、この場合にはヒト宿主に対して脱免疫化された抗体に対する言及を含む。
【０１０３】
脱免疫化抗体が、抗原結合および他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換を有してもよいことは理解されると考えられる。
【０１０４】
本発明による脱免疫化抗体を作製するために用いうる方法の例は、例えば、Chou et al, 前記、1988；米国特許第6,056,957号；Queen et al（米国特許第6,180,377号）；Morgan et al（米国特許第6,180,377号）およびChothia et al, J. Mol. Biol. 196:901, 1987に記載されている。
【０１０５】
したがって、アンゲリカ酸インゲノールとともに用いることが想定される具体的な薬剤には、表1に列記されたものが含まれる。しかし、本発明は、以下である任意の薬剤に対しても適用される：
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する；
（ii）T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる。
【０１０６】
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力は、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きいことが提唱される。
【０１０７】
それ故に、本発明は、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療するプロトコールであって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、プロトコールを提供する。
【０１０８】
本発明はさらに、アンゲロイル置換インゲナンまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有する対象を治療する方法であって、
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲロイル置換インゲナンまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、方法を提供する。
【０１０９】
提供される量は、一緒に加えられる個々の量よりも小さくてもよく、または相加的でもよい。いずれの事象においても、治療的成果はより有効であることが提唱される。これはその「抗癌効力」と呼ばれ、これには、癌細胞の細胞傷害、アポトーシス、壊死、老化、または細胞周期停止；T細胞を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を誘導しうる細胞傷害性T細胞、またはそれを誘導しうる薬剤；癌細胞上の抗原または癌細胞上に支配的もしくは独占的な抗原の組み合わせに対して特異的な抗体；または好中球、もしくは好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害（ADCC）を誘導する薬剤、のうちの1つまたは複数が含まれる。
【０１１０】
「抗癌作用」には、癌細胞の細胞傷害、壊死、静止、老化、細胞周期停止、および除去が含まれる。この用語はまた、抗癌活性を促す抗体、好中球、および細胞傷害性T細胞、またはそれを誘導する薬剤にも及ぶ。
【０１１１】
本発明はまた、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体と、少なくとも1つの他の薬剤またはその薬学的に許容される塩とを投与する段階を含む、対象における癌を治療するための治療プロトコールであって、アンゲリカ酸インゲノールと薬剤との組み合わせが、1未満の併用指数（CI）をもたらし、この際、CIが下記式を用いて決定される、治療プロトコールも提供する：
CI＝［(C)1/(Cx)1］＋［(C)2/(Cx)2］＋［α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2］
式中、(Cx)1は、薬物単独でのxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、(C)1は、もう一方のアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤である(C)2との併用下で同じxパーセントの効果を生じるためのアンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、αは定数であって、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤の抗癌活性の様式が相互排反的または非排反的である場合にαはそれぞれ0または1である。
【０１１２】
アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤は、逐次的もしくは同時のいずれかとして別個に投与してもよく、または、対象に対して投与される単一の組成物として製剤化してもよい。インゲノール置換インゲナンおよび薬剤の投与様式は同じでも異なってもよく、例えば両方を例えば、静脈内、皮下、局所的、病変間もしくは病変内、腹腔内、または鼻腔内投与を介して提供してもよく、またはそれぞれを異なる投与経路を介して提供してもよい。
【０１１３】
1つの特に好ましい態様において、本発明は、インゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象を治療するプロトコールであって、
インゲノール-3-アンゲレートと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、インゲノール-3-アンゲレートまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、プロトコールを提供する。
【０１１４】
本発明のもう1つの局面は、インゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を対象に投与する段階、ならびに以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
の1つまたは複数を呈する薬剤を対象に投与する段階を含む、癌を有する対象を治療する方法であって、
インゲノール-3-アンゲレートと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、インゲノール-3-アンゲレートまたは薬剤のいずれか単独よりも大きい、方法を提供する。
【０１１５】
本発明は、インゲノール-3-アンゲレートまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体と、表1のリストより選択される少なくとも1つの他の薬剤とを投与する段階を含む、対象における癌を治療するための治療プロトコールであって、インゲノール-3-アンゲレートと選択された薬剤との組み合わせが、1未満の併用指数（CI）をもたらし、この際、CIが下記式を用いて決定される、治療プロトコールも提供する：
CI＝［(C)1/(Cx)1］＋［(C)2/(Cx)2］＋［α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2］
式中、(Cx)1は、薬物単独でのxパーセントの効果を生じるためのインゲノール-3-アンゲレートまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、(C)1は、もう一方のインゲノール-3-アンゲレートまたは薬剤である(C)2との併用下で同じxパーセントの効果を生じるためのインゲノール-3-アンゲレートまたは薬剤のうちの一方の濃度であり、αは定数であって、インゲノール-3-アンゲレートおよび薬剤の抗癌活性の様式が相互排反的または非排反的である場合にαはそれぞれ0または1である。
【０１１６】
もう1つの態様において、本発明は、アンゲリカ酸インゲノールおよび抗癌作用を有する薬剤を含む製剤であって、さらに1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤を含む製剤を対象とする。
【０１１７】
特に、本発明は、アンゲリカ酸インゲノールと、以下の特性
（i）癌細胞のアポトーシス、壊死、老化、細胞傷害、および/または細胞周期停止を誘導する特性；
（ii）T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）を介した癌細胞の抑制もしくは死滅を媒介する、またはそのようなT細胞を刺激もしくは活性化することができる特性；
（iii）抗癌細胞抗体の特性を呈する、またはそのような抗体を生成させることができる特性；
（iv）好中球により促進される癌細胞の抗体依存性細胞傷害を媒介する、またはそのような好中球を生成させることができる特性
より選択される1つまたは複数の特性を有する薬剤とを含む製剤であって；
アンゲロイル置換インゲナンと薬剤との組み合わせの抗癌活性または効力が、アンゲリカ酸インゲノールまたは薬剤のいずれか単独よりも大きく、
1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤をさらに含む、製剤を対象とする。
【０１１８】
さらにもう1つの態様において、本発明は、複数の部分で構成される製剤であって、アンゲリカ酸インゲノールを含む少なくとも1つの部分、および薬剤を含む少なくとも1つの他の部分を含む製剤を提供する。これらの部分またはそのほかの部分がさらに、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤を含んでもよい。
【０１１９】
抗癌作用または抗癌治療に対する言及は、その薬剤（またはアンゲロイル置換インゲノールと薬剤との組み合わせ）が癌細胞のみに対して選択的に細胞傷害性であるとみなされるべきではないが、そのような選択性も本発明の範囲内にある。
【０１２０】
薬剤は、化学合成された分子でも単離された分子でもよく、または抗体などの生体分子でも細胞傷害性T細胞または他の免疫細胞などの細胞でもよく、または癌細胞に対する抗体を誘導するワクチンでもよく、または所望の特性の任意のものを誘導する分子でもよい。
【０１２１】
「薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、または類似体」という語句は、対象に対する投与後に、当該化合物またはその生理的（例えば、鎮痛性）活性化合物、代謝産物、もしくは残留物を（直接的または間接的に）提供することのできる、任意の薬学的に許容される互変異性体、塩、プロドラッグ、水和物、溶媒和物、代謝産物、または他の化合物を範囲に含むものとする。適した誘導体の一例は、OH基またはSH基と、適したカルボン酸、例えばC1-3アルキル-CO2HおよびHO2C-(CH2)n-CO2H（ここでnは1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10であるが、好ましくは1〜4である）およびCO2H-CH2フェニルとの反応によって形成されるエステルである。
【０１２２】
このため、活性化合物は、遊離化合物または溶媒和物（例えば、水和物）として結晶形態にあってもよい。溶媒和の方法は当技術分野で一般に知られている。
【０１２３】
本発明の活性化合物の塩は薬学的に許容されることが好ましいが、薬学的に許容されるわけではない塩も、これらは薬学的に許容される塩の調製における中間体として有用であるため、同じく本発明の範囲にあることは理解されるであろう。薬学的に許容される塩の例には、薬学的に許容される陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどの塩；薬学的に許容される無機酸、例えば塩酸、オルトリン酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸および臭化水素酸などの酸付加塩；または薬学的に許容される有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トリハロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸および吉草酸などの塩が含まれる。
【０１２４】
「プロドラッグ」という用語は、本明細書において、インビボで関心対象の化合物に変換されうる化合物（例えば、酵素性または加水分解性の切断により）を含むように、その最も広い意味で用いられる。その例には、エステル、例えばヒドロキシ基またはチオ基の酢酸化物、ならびにリン酸化物およびスルホン酸化物が含まれる。ヒドロキシ基またはチオ基をアシル化するための工程は当技術分野で公知であり、例えば、アルコール（ヒドロキシ基）またはチオ基をカルボン酸と反応させることによる。適したプロドラッグの他の例は、Design of Prodrugs, H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されており、その開示内容はその全体が参照により本明細書に含められる。
【０１２５】
「代謝産物」という用語は、活性薬剤がひとたび対象に投与された後にインビボで変換されて生じる任意の化合物を含む。そのような代謝産物の例には、グルクロニド、サルフェート、およびヒドロキシレートがある。
【０１２６】
本明細書に記載したような活性薬剤が互変異性体の形態で存在してもよいことは理解されるであろう。「互変異性体」という用語は、本明細書において、2つの異性体形態の間の平衡状態として存在することのできる化合物を含むように、その最も広い意味で用いられる。そのような化合物は、2つの原子もしくは基を連結する結合、または化合物中のこれらの原子または基の位置に違いがありうる。具体的な一例はケト-エノール互変異性である。
【０１２７】
本発明の化合物は電気的に中性であってもよく、または、電気的中性のために陰イオンが会合しているポリ陽イオンの形態をとってもよい。適した会合陰イオンには、硫酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、塩素イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、ハロスルホン酸イオン、またはトリハロスルホン酸イオンが含まれる。
【０１２８】
活性薬剤は、任意の適した経路によって治療のために投与することができる。適した投与の経路には、経口、直腸、鼻内、エアロゾル、または微粒子の吸入、局所的（口腔内および舌下を含む）、経皮的、膣、膀胱内、病変内、および非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、胸骨内、髄腔内、硬膜外、および皮下）が含まれうる。
【０１２９】
本明細書における「癌」に対する言及は、固形癌および血液媒介癌、白血病、肉腫および癌腫を含む。本発明のプロトコールを用いて治療しうる癌の例には、以下のものが非限定的に含まれる：ABL1原癌遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢癌腫、副腎皮質癌、特発性骨髄化生、脱毛症、胞状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌（bone cancer）、腸癌、脳幹神経膠腫、脳およびCNSの腫瘍、乳癌、CNS腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児脳腫瘍、小児癌、小児白血病、小児軟部組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛膜癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌腺癌（endocrine cancer）、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌（esophageal cancer）、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌（eye cancer）、眼の黒色腫、網膜芽細胞腫、ファロピウス管癌、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌（gastric cancer）、胃腸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科癌、血液悪性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リー-フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性腎横紋筋肉腫様腫瘍（malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney）、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口部癌（mouth cancer）、多発性内分泌腺腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌（NMSC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、眼球癌（ocular cancer）、食道癌（oesophageal cancer）、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、オストミー卵巣癌（ostomy ovarian cancer）、膵癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、稀な癌および関連疾患、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（SCLC）、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌（皮膚）、胃癌（stomach cancer）、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎盂-/-尿管）、絨毛性癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン（uroplakin）、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍。「癌」および「腫瘍」という用語は、本明細書の全体を通して互換的に用いうる。「新生物疾患」も癌または腫瘍の一形態である。
【０１３０】
本発明はまた、アンゲリカ酸インゲノールまたはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体および薬剤を、1つまたは複数の薬学的に許容される添加物、ならびに任意で他の医用薬剤とともに含む組成物にも関する。薬学的に許容される添加物は、担体、希釈剤、補助剤および/または賦形剤の形態にあってよく、これにはすべての従来の溶媒、分散剤、充填剤、固形担体、コーティング剤、抗真菌薬または抗菌薬、皮膚浸透剤、表面活性剤、等張剤および吸収剤、ならびに緩徐または制御放出性マトリックスが含まれる。活性薬剤は、活性薬剤の同時、別々、または逐次的投与を可能にするように適合された構成要素のキットの形態で提示することもできる。それぞれの担体、希釈剤、補助剤および/または賦形剤は、組成物の他の成分と適合性があって、かつ対象によって生理的に認容されるという意味で「薬学的に許容され」なければならない。組成物は単位投薬剤形として提示することが好都合であり、これは薬学の技術分野で周知の方法によって調製することができる。このような方法は、有効成分を、1つまたは複数の付随成分をなす担体と会合させる段階を含む。一般に、組成物は、有効成分を液体担体、希釈剤、補助剤、および/または賦形剤、または微細化された固形担体と均一かつ密接に会合させ、続いて必要であれば生成物を成形することによって調製される。
【０１３１】
経口投与のために適した本発明の組成物は、それぞれが規定量の有効成分を含む、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤などの離散的な単位として；粉末または顆粒として；水相または非水相液体中にある溶液または懸濁液として；または水中油型液体エマルションもしくは油中水型エマルションとして、提示することができる。有効成分を大型丸剤、舐剤、またはペーストとして提示することもできる。
【０１３２】
錠剤は、任意で1つまたは複数の付随成分との、圧縮または成形によって作製しうる。圧縮錠は、粉末または顆粒などの流動状の活性成分を、任意で結合剤（例えば、不活性希釈剤、保存料崩壊剤、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤と混合して、適した装置において圧縮することによって調製しうる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成形することによって作製しうる。錠剤に任意で、当技術分野で周知の方法に従ってコーティングしたり刻み目を入れてもよく、中にある有効成分の緩徐または制御放出が得られるように、例えば、所望の放出プロフィールを与えるために比率をさまざまに変えたヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて製剤化してもよい。錠剤に任意で、胃以外の消化管の部分での放出をもたらすように腸溶コーティングを施してもよい。
【０１３３】
非経口投与のために適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図する対象の血液と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の滅菌注射液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。組成物を単位用量または多回用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアルに入れて提示してもよく、滅菌液体担体、例えば注射用水を使用直前に加えるだけでよい冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保存してもよい。または、即時調合注射溶液および懸濁液を、前述した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
【０１３４】
皮膚に対する局所投与、すなわち経皮投与のために適した組成物は、任意の適した担体または基剤中に溶解または懸濁化した活性薬剤を含むことができ、ローション剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、軟膏などの形態にあってよい。適した担体には、鉱油、プロピレングリコール、蝋状物質、ポリオキシエチレン、および長鎖アルコールが含まれる。経皮デバイス、例えばパッチなどを用いてもよく、これは硝酸/酢酸セルロース、プロピレン、およびポリカーボネートなどの適した材料でできた微孔性膜を含みうる。パッチは適した皮膚接着材料および裏当て材料も含みうる。
【０１３５】
本発明の活性化合物を、ポリマーが生体適合性であって非毒性である、薬物を保有するポリマー材料を含みうるインプラントとして提示してもよい。適したポリマーには、ヒドロゲル、シリコーン、ポリエチレン、および生分解性ポリマーが含まれうる。
【０１３６】
本発明の化合物を、持続性（すなわち、制御的）または緩徐性の放出形態として投与してもよい。持続放出製剤とは、ひとたび投与されると有効成分が対象の体内に緩徐に放出され、所望の薬物濃度をある最小限の期間にわたって維持するものである。持続放出製剤の調製は当業者に十分に理解されている。剤形には経口剤形、インプラント、および経皮剤形が含まれうる。緩徐放出投与のためには、例えば、有効成分を緩徐放出性粒子として、またはリポソーム内部にある状態で懸濁化することができる。
【０１３７】
本発明の薬学的組成物は、販売のために他の活性薬剤とともにパッケージ化すること、または代替的には、他の活性薬剤を、アンゲリカ酸インゲノールおよび薬剤またはそれらの薬学的塩、誘導体、相同体、もしくは類似体とともに製剤化することができる。
【０１３８】
したがって、本発明のさらなる特定の局面は、活性薬剤の両方または少なくとも1つの活性薬剤またはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体の制御放出のためのシステムであって、該システムが、
（a）活性物質の有効量を含み、かつ定義された幾何学的形状を有する貯蔵核（deposit-core）、および
（b）貯蔵核に適用される支持プラットフォーム、
を含み、この際、貯蔵核が少なくとも1つの活性物質、ならびに以下のもの
（i）水または水性液体との接触によって膨潤するポリマー材料およびゲル化可能なポリマー材料であって、膨潤性ポリマー材料とゲル化可能なポリマー材料の比が1：9から9：1の範囲である材料、ならびに
（ii）膨潤およびゲル化特性の両方を有する単一のポリマー材料
からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーを含み、
支持プラットフォームが、貯蔵核の表面を部分的に覆い、貯蔵核の水和による変化に従って水性の液体中で緩徐に可溶化および/または緩徐にゲル化しうるように貯蔵核に適用される弾性支持体である、システムを提供する。
【０１３９】
支持プラットフォームは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのポリマー、グリセリドなどの可塑剤、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乳糖およびシリカなどの親水性物質、ならびに/またはステアリン酸マグネシウムおよびグリセリドなどの疎水性物質を含んでもよい。ポリマーは典型的には、重量比で支持プラットフォームの30〜90％、例えば約35〜40％を占める。可塑剤は、重量比で支持プラットフォームの少なくとも2％、例えば約15〜20％を占めてもよい。結合剤、親水性物質および疎水性物質は、典型的には、合計して、重量比で支持プラットフォームの約50％、例えば約40〜50％となる。
【０１４０】
錠剤コーティングは、1つまたは複数の非水溶性または難水溶性の疎水性賦形剤を含みうる。このような賦形剤は、アルキルセルロース、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの誘導体；ポリメタクリル酸ポリマー、ポリ酢酸ビニル、および酢酸セルロースポリマー；脂肪酸またはそれらのエステルもしくは塩；長鎖脂肪アルコール；ポリオキシエチレンアルキルエーテル；ステアリン酸ポリオキシエチレン；糖エステル；ラウロイルマクロゴール-32グリセリル、ステアロイルマクロゴール-32グリセリルなどを含む、任意の公知の疎水性セルロース誘導体およびポリマーから選択してよい。ヒドロキシプロピルメチルセルロース材料は好ましくは、低分子量および低粘度材料のもの、例えば、USPで定義されたE型メトセルおよび29-10型などから選択される。
【０１４１】
コーティングに疎水性を与えるその他の薬剤または賦形剤は、錠剤の賦形剤としての用法が知られている任意の油性物質から選択しうる。好ましくは、それらのHLB値は5未満であり、より好ましくは約2である。適した疎水性物質には、カルナウバ蝋、パラフィン、微結晶ワックス、蜜蝋、セチルエステルワックスなどの蝋状物質；またはリン酸カルシウム塩、例えば第二リン酸カルシウムなどの非脂肪性疎水性物質が含まれる。
【０１４２】
好ましくは、コーティングは、リン酸カルシウム塩、ベヘン酸グリセリル、およびポリビニルピロリドン、またはそれらの混合物、および1つまたは複数の補助剤、希釈剤、潤滑剤、または充填剤を含む。
【０１４３】
コーティング中の好ましい成分は以下の通りであり、一般的に適したパーセンテージ量をコーティングの重量パーセントとして併せて示している。
【０１４４】
ポリビニルピロリドン（ポビドン）は、好ましくは、コーティングの重量比にして約1〜25％の量、より詳細には4〜12％、例えば6〜8％で存在する。
【０１４５】
ベヘン酸グリセリルは、グリセロールとベヘン酸（C22脂肪酸）とのエステルである。ベヘン酸グリセリルはそのモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステル、またはそれらの混合物として存在しうる。好ましくは、そのHLB値は5未満であり、より好ましくは約2である。これはコーティングの重量比にして約5〜85％、より詳細には重量比にして10〜70％の量で存在してよく、ある種の好ましい態様では30〜50％の量で存在してよい。
【０１４６】
リン酸カルシウム塩は第二リン酸カルシウム二水和物であってよく、これはコーティングの重量比にして約10〜90％、好ましくは20〜80％、例えば40〜75％の量で存在してよい。
【０１４７】
コーティングは、潤滑剤、着色剤、結合剤、希釈剤、流動促進剤、および矯味剤または着香剤などのその他の一般的な錠剤賦形剤を含んでもよい。
【０１４８】
賦形剤の例には、酸化第二鉄、例えば黄色酸化第二鉄などの着色剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；および二酸化ケイ素、例えばコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤が含まれる。黄色酸化第二鉄はコーティングの重量比にして約0.01〜0.5％で用いてよい；ステアリン酸マグネシウムはコーティングの重量比にして1〜20％、より好ましくは2〜10％、例えば0.5〜1.0％の量で存在してよい；コロイド状ケイ素はコーティングの重量比にして0.1〜20％、好ましくは1〜10％、より好ましくは0.25〜1.0％の量で存在してよい。
【０１４９】
コアは、薬物に加えて、即時放出型製剤に用いられる当業者に周知の崩壊剤または崩壊剤の混合物を含む。本発明の遂行において有用な崩壊剤は、水性媒質の存在下で起泡または膨潤し、それによってコーティング材料を機械的に破壊するのに必要な力を与える材料であってよい。
【０１５０】
好ましくは、コアは、薬物に加えて、架橋ポリビニルピロリドンおよびクロスカルメロースナトリウムを含む。
【０１５１】
以下は、好ましいコア材料のリストである。量はコアの重量に対する重量比パーセントとして表されている。
【０１５２】
架橋ポリビニルピロリドンについては上述しており、これは崩壊剤として有用であり、コアに対比して開示した量でコア中に用いることができる。
【０１５３】
クロスカルメロースナトリウムは、崩壊剤として有用な内部架橋性カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ac-Di-Solとしても知られる）である。
【０１５４】
崩壊剤は、コアに対する重量比にして5〜30％で用いてよい。しかし、より多量のある種の崩壊剤は膨潤し、薬物の放出を変化させるマトリックスを形成する可能性がある。したがって、特に遅延時間後の迅速放出が必要な場合には、崩壊剤を重量比にして最大約10％、例えば約5〜10％で用いることが好ましい。
【０１５５】
コアがさらに、コーティング材料に関連して上述したような一般的な錠剤賦形剤を含んでもよい。適した賦形剤には、潤滑剤、希釈剤、および充填剤が含まれ、これにはラクトース（例えば一水和物）、酸化第二鉄、ステアリン酸マグネシウム、およびコロイド状ケイ素が非制限的に含まれる。
【０１５６】
ラクトース一水和物は、1つのグルコース部分および1つのガラクトース部分からなる二糖類である。これは本発明の錠剤において充填剤または希釈剤として作用しうる。これは約10〜90％の範囲で存在してよく、好ましくは20〜80％、ある種の好ましい態様では65〜70％の範囲で存在してよい。
【０１５７】
上述したように、適切なコーティング厚を有することが保証されるように、コアがコーティング内部に正しく配置されることは、本発明の1つの重要な面である。
【０１５８】
こうすることにより、遅延時間に信頼性および再現性が得られるとともに、生物学的利用能の個体内変動および個体間変動を避けることができる。
【０１５９】
もう1つの態様においては、経口投与のための経口投与のための多粒子放出アンゲリカ酸インゲノール/薬剤組成物が提供される。この製剤は、活性薬剤またはその薬学的に許容される塩、誘導体、相同体、もしくは類似体を、任意で、典型的には150ミクロン未満である小さな粒子の形態にあるイオン交換樹脂と複合体化することによって作製される。多粒子製剤を調製するためには、以下の種類の粒子のうちの1つまたは複数を、最終的な投薬形態として製剤化する：（a）薬物含有粒子を、中性媒質の唾液においては不溶性であるが胃の酸性環境においては溶解するポリマーでコーティングすることによって調製される、即時放出粒子；（b）薬物含有粒子を、胃の酸性環境においては不溶性であるが小腸の中性環境においては溶解するポリマーでコーティングすることによって調製される、腸溶性粒子；（c）薬物含有粒子を、水不溶性であるが水透過性の膜を形成するポリマーでコーティングすることによって調製される、徐放性粒子；（d）徐放性薬物粒子を腸溶性コーティングでコーティングすることによって調製される腸溶性徐放性粒子；（e）薬物含有粒子を、胃の酸性環境および小腸上部の環境においては不溶性であるが小腸下部または大腸上部においては溶解するポリマーでコーティングすることによって調製される、遅延放出性粒子。
【０１６０】
癌の治療のためには、製剤は、治療薬に対する耐性を低下させるのを補助する化合物も含みうる。そのような化合物の例には、P-糖タンパク、または薬物の細胞内蓄積の排除に関与する他の細胞機構を抑制するものがある。
【０１６１】
製剤はまた、担体、希釈剤、および賦形剤も含みうる。薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤、ならびに薬学的組成物および製剤を調製する方法の詳細は、Remmingtons Pharmaceutical Sciences 18th Edition, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USAに提供されている。
【０１６２】
それ故に、本発明は、癌を有する対象を治療するための、PEP005などのアンゲロイル置換インゲナン、および、抗体、癌抗原およびT細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）または他の免疫細胞を含む、表1に列記された薬剤などの薬剤の使用を想定している。「治療」は、癌細胞の死滅をもたらしてもよく、またはそれが癌細胞増殖を停止させてもよく、または転移を予防しても、および/または癌に対する免疫記憶を誘導してもよい。したがって、治療は、癌細胞の死滅、壊死、細胞傷害、老化、細胞周期停止または静止をもたらしてもよい。
【０１６３】
本発明を、以下の実施例を参照しながらさらに説明するが、それらは例示のみを目的としており、本明細書で前述した本発明の一般性を限定することは意図していない。
【０１６４】
実施例の項では、以下の材料および方法を用いている。
【０１６５】
細胞株
細胞株はすべて、ATCC（Rockviile, MD, USA）から入手した。細胞を、10％ v/vウシ胎仔血清（InVitrogen, Cergy-Pontoise, France）、2mMグルタミン、100単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを加えたRPMI、DMEMまたはMcCoy培地中で単層として増殖させた。細胞はすべて週2回ずつトリプシン/EDTA（それぞれ0.25％ w/vおよび0.02％ w/v、InVitrogen, Cergy-Pontoise, France）を用いて分割し、2.5×104個/mlの濃度で播いた。細胞株はすべて、Stratageneキット（La Jolla, CA）を用いるPCRによってマイコプラズマ汚染に関して定期的に検査した。
【０１６６】
12種の細胞株を分析し、それらの特性を表3にまとめた（データはNCI細胞株スクリーニングによる）。
【０１６７】
（表３）
2009516651.tif 000007
wt：野生型；mut：突然変異
【０１６８】
薬物
精製PEP005（インゲノール-3-アンゲレート）は、Peplin Limited（Brisbane, Australia）により供給された。60mM貯蔵液をDMSO中に調製し、暗所にて20℃で保存した。
【０１６９】
インビトロ増殖抑制アッセイ（MTTアッセイ）
MTTアッセイは、以前に記載された通りに実施した（Hansen et al, J lmmunol Methods 119(2):203-210, 1989）。手短に述べると、細胞を96ウェル組織培養プレートに2×103個/ウェルの密度で播いた。黄色で水溶性のテトラゾリウムMTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France）の紫色で水不溶性のホルマザンへの色彩変化により、細胞の生存度を120時間のインキュベーション後に決定した。この反応はミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって触媒され、生細胞の相対数と推定するために用いられる（Mosmann, J. Immunol. Methods 65(1-2):55-63, 1983）。細胞を0.4mg/mlのMTTとともに37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後に、上清を廃棄し、細胞ペレットを0.1mlのDMSO中に再懸濁させて、吸光度を560nmでマイクロプレートリーダー（Dynatech, Michigan）の使用によって測定した。非処理細胞のウェルまたは細胞を伴わずに薬物を含む培地のウェルをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。増殖抑制曲線を、非処理対照細胞のパーセンテージとしてプロットした。
【０１７０】
単一薬剤試験
細胞を96ウェルプレートに2×103個/ウェルで播き、24時間後にさまざまな濃度のPEP005で処理した。1時間、24時間または48時間のインキュベーション後に細胞を洗浄し、薬物非含有培地中で72時間ポストインキュベートした。続いて増殖抑制をMTTアッセイによって決定した。
【０１７１】
PEP005と他の薬物との同時曝露
同時薬物曝露に関しては、細胞を96ウェルプレートに2×103個/ウェルで播き、24時間後にさまざまな濃度のPEP005により、単独で、またはIC20、IC40、もしくはIC60値に対応する種々の濃度のもう1つの薬物とともに処理した。倍加時間のおよそ4倍（120時間）の後に、増殖抑制効果をMTTアッセイによって測定した。
【０１７２】
PEP005および他の薬物に対する逐次的曝露
細胞を96ウェルプレートに2×103個/ウェルで播き、24時間増殖させた。続いて細胞を種々の濃度の第1の薬物に1時間/24時間/48時間曝露させて、薬物を除去し、細胞を洗浄して、第2の薬物を添加した。さらなる薬物に曝露させた後に、第2の薬物を除去し、細胞を洗浄し、薬物非含有培地中で72時間ポストインキュベートした。続いて増殖抑制をMTTアッセイによって決定した。
【０１７３】
統計分析および相乗活性の決定
薬物の組み合わせの効果を、半数有効量の原理に基づくChouおよびTalalayの方法を用いて評価した（Chou and Talalay, Adv Enzyme Regul 22:27-55, 1984）。これは、各薬物に関して、および複数の希釈した固定比率の組み合わせに関して、式fa/fu＝(C/Cm)mを用いて用量効果曲線をプロットすることを伴い、式中、Cは薬物濃度、IC50は最大半量効果（すなわち、細胞増殖の50％抑制）のために必要な濃度、faは薬物濃度Cによって影響される細胞の割合（例えば、細胞増殖が90％抑制されるならば0.9）、fuは影響されない割合であり、mは濃度-効果曲線のシグモイド係数である。組み合わせの中の各薬物に関する曲線の勾配に基づいて、その薬物が、互いに排反でない効果を有するか否か（例えば、独立性または相互作用性の作用様式）を判定することができる。続いて、併用指数（CI）が下記式によって決定される：
CI＝［(C)1/(Cx)1］＋［(C)2/(Cx)2］＋［α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2］
式中、(Cx)1は、その薬物単独でのxパーセントの効果を生じるために必要な薬物1の濃度であり、(C)1は、(C)2との併用下で同じxパーセントの効果を生じるために必要な薬物1の濃度である。これらの薬物の作用様式が相互排反的または非排反的であれば、αはそれぞれ0または1である。CI値は、faの種々の値（すなわち、細胞増殖抑制の種々の程度）に関して式を解くことによって算出される。1未満のCI値は相乗作用を表し、値が1であれば相加作用を表し、1を上回る値は拮抗作用を表す。データは、マイクロコンピュータ用の濃度効果分析ソフトウエア（Biosoft, Cambridge, UK）を用いてIBM-PCコンピュータ上にて分析した。統計分析およびグラフに関してはInstatおよびPrismソフトウエア（GraphPad, San Diego, USA）を用いた。被験薬物に関する単独または対の組み合わせでの用量-効果関連を、選択した各細胞株についてのそれらの相対力価（IC50）、形状（m）および同調性（r）を決定するための半数有効プロット分析に供した。上述したように、IC50値およびm値をそれぞれ、CIの式に基づいて相乗作用および拮抗作用を算出するために用いた。結果は、2組ずつ施行した少なくとも3回の実験の平均±標準偏差として表した。各実験において、細胞を、上記のように対の組み合わせに対して38時間曝露させた。平均および標準偏差をスチューデントのt検定（両側でのp値）を用いて比較した。
【０１７４】
細胞周期分析およびアポトーシス
細胞周期分析、およびアポトーシス性細胞のパーセンテージの測定は、フローサイトメトリーによって評価した。手短に述べると、細胞を25cm3フラスコに播き、処理しないままにするか、または種々の濃度のPEP005で処理した。さまざまな時点で付着性および非付着性の細胞を回収し、PBSで洗浄して、70％ v/vエタノール中で固定し、使用時まで＋4℃で保存した。細胞をPBS中で脱水し、250μg/mlのRNAse AおよびTriton X-100とともに室温で20分間インキュベートし、50μg/mlのヨウ化プロピジウムとともに暗所にて＋4℃で20分間インキュベートした。細胞周期の分布およびアポトーシス性細胞のパーセンテージはFACScanフローサイトメーターを用いて決定した。
【０１７５】
実施例1
単一薬剤試験
図1は、一団の細胞株においてPEP005を1時間、24時間、および48時間にわたって与えた経時的実験の効果を示している。データに基づき、48時間の曝露を、本発明者らの一団の癌細胞株におけるPEP005以後の評価のために選択した。この期間の曝露は、ほとんどの感受性ヒト癌細胞株におけるPEP005の抗増殖作用を観察するために最適であることが示された。各点はそれぞれ2組ずつ行った少なくとも3回の独立した実験の平均である。PEP005は、ヒト結腸COLO205細胞およびHCC2998細胞、乳癌細胞株MDA-MB-435に対する細胞傷害効果を示し、COLO205が最も感受性が高かった。
【０１７６】
48時間曝露に関するIC50は表4に示されている。
【０１７７】
（表４）
2009516651.tif 000008
【０１７８】
対照として、PEP005に対する感受性があることが以前に示されている白血病細胞株を用いた。
【０１７９】
PEP005は、K562およびCCRF-CEM白血病細胞株の生存（図2）を抑制し、IC50はそれぞれ0,006±0,001μMおよび60±14μMであることが示されている。
【０１８０】
他の2通りのPEP005投与スケジュールも検討した：3時間を3日間および3時間を5日間。これらの実験の結果により、同じ条件下でのCOLO205およびMDAの感受性の増大が示された。3時間×3日間の場合のIC50は0.1（COLO205）および1μM（MDA）であった。3時間×5日間の場合、それらはCOLO205およびMDAに関してそれぞれ0.002および0.0015μMであった。これらの2種類の投与様式は、他の細胞株のPEP005に対する感受性プロフィールを変化させなかった。
【０１８１】
実施例2
COLO205細胞におけるPEP005での細胞周期の変化およびアポトーシス誘導
細胞周期の進行に対するPEP005の効果を、PIを用いて透過処理した場合にアポトーシス性細胞から溶出する断片化DNAの評価を可能にするフローサイトメトリーによって調べた。1件の経時的実験においては、COLO205細胞を0.03μM、0.3μMおよび1μMのPEP005とともに1時間、5時間、12時間、24時間、および48時間にわたりインキュベートした。一定のPEP005曝露により、G0-G1期にある細胞の用量依存的な蓄積が導かれ、S期はほとんど完全にブロックされた（図3）。
【０１８２】
PEP005の効果はまた、アポトーシス誘導の特徴と考えられる、低倍数体DNA含有量（サブG1画分）に対応する粒子の累加的生成ももたらした。アポトーシス性の割合を定量し、総細胞数に対するパーセンテージとしてプロットした（図4）。これらの結果はアネキシンV染色によって確かめられた。24時間のPEP005処理の後にはそれ以上のアポトーシスはみられず、壊死が示された。
【０１８３】
実施例3
PEP005の細胞傷害性と他の抗癌剤との比較試験
図5は、一団の細胞株における、PEP005の細胞傷害性とオキサリプラチン、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ara-Cおよび5FUとの比較分析を示すグラフ表示である。結果は（IC50−IC50平均）として提示されている。
【０１８４】
実施例4
薬剤併用試験
PEP005とオキサリプラチン、シスプラチン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビンおよび5FUとに対する逐次的曝露および同時曝露の効果を、IC50に対応する薬物の濃度に対して影響された割合を表す併用指数を用いて決定した。0.8未満の併用指数の算出値は相乗作用を表し、1.2を上回るものは拮抗作用を表し、一方、0.8〜1.2の併用指数は相加作用に相当する。
【０１８５】
実施例5
5FU-PEP005の組み合わせ
COLO205において、PEP005と5FUとの組み合わせは、5FUをPEP005の前または後に投与した場合に、さまざまな程度の相乗活性（図6）を導く。各点は、3回ずつ行った1つの実験を表している。PEP005の前または後に与えた5FUは、1未満の併用指数の値を導き、これはこれらの2つの化合物の間の相乗効果を示している。
【０１８６】
実施例6
ドセタキセル-PEP005の組み合わせ
図11に示されているように、ドセタキセルをPEP005の前または後に与えた場合には、相加的および相乗的な効果が観察された。ドセタキセルをPEP005と同時に与えた場合には、拮抗的効果が観察された。
【０１８７】
実施例7
ドキソルビシン-PEP005の組み合わせ
即時的な逐次曝露において相乗作用が得られている。他のスケジュールはほとんど拮抗性である（図7）。
【０１８８】
実施例8
オキサリプラチン-PEP005の組み合わせ
PEP005とオキサリプラチンとの組み合わせ（同時または即時的な逐次曝露）は拮抗性である（図8A）。オキサリプラチンとPEP005との間のこの拮抗作用は、COLO205がPEP005の24〜72時間後にオキサリプラチンを曝露された場合には逆転し、その場合にはこの順序は非常に相乗的である（図8B）。
【０１８９】
実施例9
ゲムシタビン-PEP005の組み合わせ
ゲムシタビンの後にPEP005という順序は相乗的であり、これらの薬剤を同時に投与した場合、またはPEP005をゲムシタビンの前に投与した場合の拮抗作用とは対照的である。この拮抗作用は、ゲムシタビンをPEP005曝露の終了時から24時間後に投与した場合には逆転し、この場合にはこの組み合わせは相乗的であり、ほとんどの濃度に関してCIは1未満である（図9）。
【０１９０】
実施例10
ビノレルビン-PEP005の組み合わせ
この組み合わせでは、PEP005をドセタキセルと組み合わせた場合に観察されたのと同じ結果が再現された。ビノレルビンの後にPEP005という順序では相乗活性が得られている。他のすべてのスケジュールは拮抗性である（図10）。
【０１９１】
実施例11
シスプラチン-PEP005の組み合わせ
オキサリプラチンとは対照的である；同時または即時的な逐次曝露において観察される拮抗作用は、2つの薬物の間に24時間のウォッシュアウトをおいても維持される。その結果は図12に示されている。
【０１９２】
実施例12
他の薬剤との組み合わせにおけるPEP005の抗癌作用
以上の実施例により、PEP005がヒトCOLO205結腸癌細胞およびMDA435乳癌細胞における抗増殖作用を示すことが示された。ヒトの感受性癌細胞において、PEP005の抗増殖作用は、細胞周期の変化（S期にある細胞の減少）、カスパーゼ3活性化を伴うアポトーシス、および細胞壊死を伴っていた。これらの効果は、薬物に対する曝露が24時間から48時間までの間で最適であるように思われる。
【０１９３】
PEP005は特有の細胞傷害性プロフィールを示す。他の抗癌剤との組み合わせは、5FU ドキソルビシン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、ビノレルビン、ドセタキセルおよびシスプラチンなどのいくつかの古典的な細胞傷害性薬物との相加的および/または相乗的な効果を示した。スケジュール依存性に関するある程度の証拠が観察された。これにより、一方の薬物がもう一方の細胞傷害作用を何らかの形で防御する可能性が示唆された。興味深いこととして、PEP005によって誘導される細胞周期の遮断を考慮して、実験でPEP005の投与の間に24時間の遅延時間を導入するという考えも生まれた。ほとんどの状況では、PEP005を第2の薬物の投与と24時間隔てるというスケジュールが、細胞傷害作用を誘導する効率がより高いように思われる。予備的ではあるが、PEP005の組み合わせに関する時間/スケジュール依存性については明らかに解明する必要がある。
【０１９４】
実施例13
さまざまな化学療法薬との組み合わせにおけるPEP005の抗癌作用
この実施例では、PEP005と3種（細胞株U937に対して）または4種（細胞株K562に対して）の化学療法薬との組み合わせ適用（同時に投与）について調べた。それぞれ、化学療法薬は対数半値刻み（half-log increments）の10種類の濃度で適用し、PEP005は2通りの固定濃度で同時に添加した。
【０１９５】
試験の設計は表5に示されている。
【０１９６】
（表５）試験の設計
2009516651.tif 000009
【０１９７】
この実施例の目的は、リンパ腫細胞株U937および慢性骨髄性白血病（CML）細胞株K562における、さまざまな化学療法薬と組み合わせたPEP005のインビトロ抗癌活性を調べることであった。
【０１９８】
2種類の細胞株を、加湿雰囲気下（95％ v/v空気、5％ v/v CO2）で、10％ v/vウシ胎仔血清（PAA, Germany）および0.1mg/mlのゲンタマイシン（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を加えたRPMI 1640培地（PAA, Germany）中にて37℃で増殖させた。細胞を週1回、型通りに継代した。それらを20継代よりも長く培養下に維持することはしなかった。
【０１９９】
どちらの細胞株もATCC（Rockville, USA）から購入した。U937は組織球性リンパ腫の患者から樹立された（Sundstrom and Nilsson, Int. J. Cancer 17:565-577, 1976）。連続継代細胞株K562は、LozzioおよびLozzioにより、末期の急性転化した慢性骨髄性白血病を有する53歳女性の胸水から樹立された（Lozzio and Lozzio, Blood 45:321-334, 1975）。
【０２００】
2つの被験細胞株における化学療法薬の活性に対するPEP005の効果を評価するために、改変ヨウ化プロピジウム（PI）アッセイ（Dengler et al, Anticancer Drugs 6:522-532, 1995）を用いた。手短に述べると、細胞を指数的増殖期の培養物から遠心によって収集し、算定した上で、96ウェル平底マイクロタイタープレートに20,000個/ウェルの細胞密度でプレーティングした。細胞に指数的増殖を再開させるための24時間の回復期間の後に、10μlの培養基（6個の対照ウェル/プレート）および化学療法薬を含む培養基（6個のウェル/濃度）を細胞に添加した。その直後に、PEP005を一方の固定濃度で含む10μlの培養基を添加した。各プレートに対してPEP005のみ（固定濃度で）を6個のウェルに添加した。その後に細胞を4日間の期間にわたって連続的にインキュベートした。
【０２０１】
その後に、50μlのPI水溶液をウェルに添加した（最終PI濃度は7μg/ml）。30分間のインキュベーション期間の後に、Cytofluor 4000マイクロプレートリーダー（励起530nm、発光620nm）を用いて蛍光（FU1）を測定し、死細胞の直接測定値を得た。続いてマイクロプレートを-20℃に24時間保ち、全細胞を死滅させた。プレートの解凍および2回目の蛍光測定（FU2）の後に、FU2からFU1を差し引くことによって生細胞の量を算出した。
【０２０２】
それぞれの実験では、処理群（PEP005単独ならびに組み合わせ）および非処理対照細胞を6組ずつ測定した。計算のためには6組のデータの平均を用いた。増殖抑制は試験/対照×100（％T/C）として表した。T/C値に基づいて、細胞増殖をそれぞれ50％（T/C＝50％）および70％（T/C＝30％）抑制するために必要な薬物濃度であるIC50およびIC70の値を、化合物濃度に対して細胞生存度（T/C）をプロットすることによって決定し、IC値を点対点曲線当てはめの原理に基づいて算出した。用量-反応関係に対する効果を図示するために、化学療法薬の単独での、および2通りのPEP005固定濃度との組み合わせ適用での濃度-反応曲線を、1つのグラフ中に一緒に当てはめた。
【０２０３】
PEP005はPeplin Limited, Brisbane, Australiaにより乾燥粉末として提供された。10mg/mlの貯蔵液をDMSO中に調製し、アリコートを-20℃で保存した。この貯蔵物のアリコートを使用日に解凍し、投薬の前および最中は室温で保存した。中間希釈段階はRPMI 1640細胞培養基を用いて行い、最終濃度で15倍の溶液とした。最終希釈段階（1：15）に関しては、これらの溶液の10μlをウェル内の培養被験細胞の上の140μlの培地に対して直接添加した。
【０２０４】
ダウノルビシン（#D8809）、シタラビン（#C1768）、エトポシド（E1383）およびビンクリスチン（V8879）はSigma（Taufkirchen, Germany）により供給された。4-ヒドロペルオキシシクロホスファミド（活性化シクロホスファミド）はAsta Medica（Frankfurt, Germany）により供給され、アドリアマイシンは薬局からの臨床用製剤として用いた（Medac, Hamburg, Germany）。
【０２０５】
組み合わせ試験の結果は表6（細胞株U937）および表7（細胞株K562）にまとめられている。
【０２０６】
細胞株U937を、トポイソメラーゼII阻害剤であるダウノルビシンおよびエトポシド（VP16）、ならびにDNAを損傷させる薬剤であるシタラビンとの組み合わせでPEP005により処理した。表6は3回の独立した実験の結果を示している。PEP005はそれぞれ3および10ng/mlの固定濃度で適用した。PEP005単独での効果はT/C＝62％からT/C＝89％の範囲であった。シタラビンおよびVP16とのPEP005の正の相互作用が検出された。濃度10ng/mlのPEP005は、実験GF578においてIC70値の0.74μg/ml（シタラビン単独）から0.037μg/mlの低下（シタラビン単独と比較して5％の低下）、第2の実験（GF624）において0.24μg/mlから0.074μg/mlへの低下（31％に低下）、および第3の実験（GF769）において0.3μg/mlから0.173μg/mlへの低下（58％）を生じさせた。PEP005は、濃度-反応曲線の左側への推移を生じさせ、IC50およびIC70の値の低下をもたらした。濃度10ng/mlのPEP005とVP16との組み合わせは、実験GF578においてIC70値の1.67μg/ml（VP16単独）から0.24μg/mlへの低下（IC70値が14％に低下）、第2の実験（GF624）において1.15μg/mlから0.19μg/mlへの低下（17％に低下）、および第3の実験（GF769）において2.22μg/mlから1.32μg/mlへの低下（59％に低下）を生じさせた。
【０２０７】
CML細胞株K562では、有意な正の相互作用は認められなかった（表7）。K562細胞を、化学療法薬アドリアマイシン（トポイソメラーゼII阻害剤）、活性化シクロホスファミド（アルキル化剤）、ビンクリスチン（チューブリン結合剤）およびVP16（トポイソメラーゼII阻害剤）との組み合わせでPEP005により処理した。3回の独立した実験を行い、PEP005は単独で79％〜108％の試験/対照値を生じさせた。PEP005によるIC70値の有意な低下（化学療法薬単独でのIC70値の50％未満に）は、この細胞株では検出されなかった。
【０２０８】
この実施例により、PEP005がリンパ腫細胞株U937において、シタラビンおよびVP16との組み合わせで、インビトロでの抗腫瘍活性の顕著な上昇を引き起こすことが示された。
【０２０９】
（表６）リンパ腫細胞株U937における3種の化学療法薬との組み合わせでのPEP005のインビトロ抗癌活性
2009516651.tif 000010
1）PEP005単独でのT/C［％］
PEP005と化学療法薬との間の正の相互作用の評価：
-、IC70（組み合わせ）＞化学療法薬単独でのIC70の50％
+、IC70（組み合わせ）＜＝化学療法薬単独での50％
++、IC70（組み合わせ）＜＝化学療法薬単独での30％
+++、IC70（組み合わせ）＜＝化学療法薬単独での10％
【０２１０】
（表７）細胞株K562（慢性骨髄性白血病、CML）における4種の化学療法薬との組み合わせにおけるPEP005のインビトロ抗癌活性
2009516651.tif 000011
1）PEP005単独でのT/C［％］
n.e.：評価できず
PEP005と化学療法薬との間の正の相互作用の評価：
-、IC70（組み合わせ）＞化学療法薬単独でのIC70の50％
+、IC70（組み合わせ）＜＝化学療法薬単独での50％
++、IC70（組み合わせ）＜＝化学療法薬単独での30％
+++、IC70（組み合わせ）＜＝化学療法薬単独での10％
【０２１１】
実施例14
好中球を介した抗体依存性細胞傷害（ADCC）
この実施例は、好中球が、PEP005による局所治療後の皮膚腫瘍の再発を予防するために必要であるという証拠を提供する。局所的なPEP005治療は、腫瘍細胞の原発性壊死を誘導し、プロテインキナーゼCを強く活性化し、顕著な好中球浸潤を特徴とする急性T細胞非依存性炎症反応を伴う。好中球が欠乏しているFoxn1nuマウスおよびCD18欠損マウス（好中球の血管外漏出が高度に障害されている）において、PEP005治療は腫瘍再発率の70％を上回る上昇を伴った。NK細胞または単球/マクロファージの欠損は再発率に対して全く影響を及ぼさなかった。インビトロおよびマウスでの両方で、PEP005は、いずれも好中球動員および活性化のメディエーターであるMIP-2/IL-8、TNFαおよびIL-1βを誘導した。インビトロではPEP005はヒト内皮細胞を活性化して好中球付着をもたらし、殺腫瘍性の活性酸素中間体を生成するようにヒト好中球も誘導した。PEP005による腫瘍の治療は抗癌抗体のレベルを有意に上昇させ、それは好中球を介した抗体依存性細胞傷害（ADCC）をインビトロで促進させることができた。SCIDマウスにおいて増殖した腫瘍のPEP005治療でも、腫瘍再発率の70％を上回る上昇がみられた。これらのデータを総合すると、再発の予防における、好中球を介したADCCの中心的な役割が示唆される。このため、腫瘍のPEP005を介した治癒には、初期の化学的除去（chemoablation）の後の、好中球依存性ADCCを介した残存疾患の駆除が関与するように思われ、このことは特異的な化学療法薬による重要な抗癌活性を媒介するように好中球を誘導させうることを実証している。
【０２１２】
材料および方法
細胞および細胞培養
B16マウス黒色腫細胞株（ATCC CRL-6322）、LK2 UV誘発性マウス扁平上皮癌（SCC）細胞株（Cavanagh and Halliday, Cancer Res 56:2607-2615, 1996）およびヒト黒色腫細胞株MM96L（Parsons and Hayward, Photochem Photobiol 42:287-293, 1985）およびMe10538（Larizza et al, Clin Exp Metastasis 7:633-644, 1989）は、10％ v/vウシ胎仔血清（FCS）（CSL Biosciences, Parkville, Australia）、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100lU/mlのペニシリン（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）を加えたRPMI 1640培地（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）（完全培地）中にて37℃および5％CO2の下で培養した。ヒト表皮ケラチノサイトは、以前に記載された通りに（Hotchin and Watt, J Biol Chem 267:14852-14858, 1992）、新生児の前腕皮膚から単離し、マイトマイシンCで処理した3T3フィーダー層の存在下で培養した。ヒト皮膚線維芽細胞は、以前に記載された通りに（Parsonage et al, Thromb Haemost 90:688-697, 2003）、関節置換手術の時に採取した組織消化物から単離して数週間にわたって増殖させた。ヒト好中球は、以前に記載された通りに（de Boer and Roos, J. Immunol 136:3447-3454, 1986）、パーコール密度遠心法によって末梢血から単離し、純度をギムザ染色によって評価したところ通常は95％を上回った。
【０２１３】
PEP005治療および組織学検査
LK2細胞（106個）を、6〜10週齡のFoxn1nu（BALB/c nu-/nu-）マウス（Animal Resource Centre, Perth, Australia）の側腹部に皮下注射した（2つの腫瘍部位/マウス、1群当たりマウス2匹）。腫瘍、および反対側の側腹部の正常皮膚の2つの区域に対して、PEP005またはプラセボによる局所治療を行った（イソプロパノールを基剤とするゲル）。PEP005は100％ v/vアセトン中に溶解し、25％ v/vイソプロピルアルコールおよび25％ w/wプロピルアルコール水溶液（pH 4〜6）で構成されるイソプロパノールを基剤とするゲルで希釈して、10μgのPEP005を10μlのゲルに対して適用した。PEP005粉末は、98.5％を上回る純度でPeplin Limited（Brisbane, Australia）から入手した。マウスをPEP005治療の1、2、6、24、および48時間後に安楽死させ、治療した部位を切り出し、ホルマリン固定して、パラフィン蝋で包埋し、標準的なH&E染色を用いる組織学検査のために加工処理した。スライドはScanScopeT2スライドスキャナ（APerio Technologies）を用いて検査した。
【０２１４】
好中球欠乏マウスにおけるPEP005治療
LK2細胞（106個）を、6〜10週齡のFoxn1nuマウスの側腹部（4つの腫瘍部位/マウス）に皮下注射した（n＝マウス3匹、1群当たり腫瘍n＝12個）。2週後（腫瘍がほぼ（≒）14mm3に達した時点）に、6匹のマウスにラット抗Ly-6G抗顆粒球抗体（100μg、PBS中）（RB6-8C5；BD Biosciences, San Diego, CA）の腹腔内注射を行った。別の6匹のマウスにはアイソタイプを一致させた対照抗体（100μgのラットIgG2b、PBS中）（A95-1；BD Biosciences）を腹腔内注射した。抗体は、第0日のPEP005またはプラセボ治療の開始を基準として第-2日、第0日および第2日に注射した。さらに6匹の対照マウスには抗体を投与しなかった。合計9匹のマウス（n＝3、抗体なし、n＝3 A95-1処理、およびn＝3 RB6-8C5処理）の腫瘍を、上記のようにPEP005によって毎日、3日間にわたり局所治療した。上記のようにグループ化した別の9匹のマウスは、同じ容積のプラセボ（イソプロピルを基剤とするゲル）による治療を行った。腫瘍および紅斑のサイズをキャリパーを用いて測定した。血液は尾の先端から毎週2回採取し、塗沫処理してスライドガラス上で風乾させた後、Quick Dip（Fronine Laboratory Supplies, Melbourne, Australia）で染色した。すべての腫瘍実験マウスを、各マウス当たりの累積腫瘍量が1000mm3を上回った時点で安楽死させた。
【０２１５】
CD18欠損マウスにおけるPEP005治療
B6.129S7-Itgb2tm1Bay/Jマウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）は、B6バックグラウンドを有するCD18低形質マウスであり、顆粒球上でのCD18発現が正常の2〜16％である（Wilson et al, J Immunol 151:1571-1578, 1993）。B16細胞（5×105個）を、6〜10週齡のマウスの側腹部（1つの腫瘍部位/マウス）に皮下注射し（1群当たりn＝マウス9匹）、6日後（腫瘍がほぼ14mm3に達した時点）にマウスをPEP005またはプラセボで治療した。腫瘍および紅斑のサイズを上記の通りに測定した。
【０２１６】
NK欠乏マウスにおけるPEP005治療
LK2細胞（106個）を、6〜10週齡のFoxn1nuマウスの側腹部（4つの腫瘍部位/マウス）に皮下注射した（n＝マウス3匹、および1群当たり腫瘍n＝12個）。腫瘍がほぼ14mm3に達した時点である2週後に、マウスをPEP005またはプラセボで治療し（第0、1および2日）、腫瘍体積を上記のようにモニターした。マウスには第-2日および第2日（PEP005治療の開始を基準として）に抗アシアロGM1ポリクローナル抗血清（50μl、腹腔内）（Cedarlane, Ontario, Canada）を投与した。NK欠乏（＞90％）は、抗体投与の2日後に、並行した動物群からの脾細胞およびFACs分析を用いて確認した（汎NK抗体DX5、BD Biosciences Pharmingen）。
【０２１７】
op/opマウスにおけるPEP005治療
B16細胞（5×105個）を、6〜10週齡のop/op低形質マウス（Herston Medical Research Centre, Brisbane, Australia）の側腹部（4つの腫瘍部位）に皮下注射した（n＝3、および1群当たりの腫瘍n＝12個）。腫瘍を上記の通りにPEP005またはプラセボにより治療し、モニターした。
【０２１８】
SCIDマウスにおけるPEP005治療
LK2細胞（106個）を、6〜10週齡のSCIDマウス（Animal Resource Centre）の側腹部（4つの腫瘍部位/マウス）に皮下注射した（n＝マウス3匹、および1群当たりの腫瘍n＝12個 ）。腫瘍を上記の通りにPEP005またはプラセボにより治療し、モニターした。
【０２１９】
統計分析
SPSS 13.0 for Windows（リリース13.0）を統計分析のために用いた。異なる群の間の再発率を比較するためにCox回帰分析を用い、マウス1匹当たり4つの腫瘍を用いた場合のマウス効果に関して調整した。この分析により、再発までの時間に対するマウスの影響は有意でないことが示され（p＝0.88およびp＝0.315）、各腫瘍が本質的には独立に振る舞うことが実証された。
【０２２０】
インビボでのサイトカイン応答
LK2細胞を、上記のように6〜10週齡のFoxn1nuマウスの側腹部（2つの腫瘍部位/マウス）に注射した。2週後（腫瘍がほぼ14mm3に達した時点）に、上記のように、腫瘍、および反対側の側腹部の正常皮膚の2つの皮膚部位に対してPEP005による治療を行った。並行したマウス（1つの時点当たりn＝2）を治療の0、1、2および6時間後に安楽死させ、腫瘍および皮膚部位を切り出した。全RNAを、製造元の指示に従って（RNeasy Protect-midi kit；Qiagen, Clifton Hill, Australia）、皮膚および腫瘍組織から抽出および精製した。全RNA（4ug）を、（Oligo d（T15））およびSuperscript III（Life Technologies）を用いて逆転写させた。ゲル電気泳動および染色の後のPCR産物の強度は、用いたサイクル数に対して線形的であることが判明し、そのことからこの分析は半定量的であると考えられた。PCR反応は、GeneAmp PCR System 9700（Perkin Elmer, Norwalk, CT）、DyNAZyme II DNAポリメラーゼ（Finnzymes, Espoo, Finland）およびHot Star Taq DNAポリメラーゼ（Qiagen）を以前の記載の通りに用いて実施した（Mateo et al, Intervirology 43:55-60, 2000）。プライマーは、
2009516651.tif 000012
とした。
【０２２１】
PEP005で処理したヒト細胞によるサイトカイン産生
Me10538細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞（24ウェルプレートの1ウェル当たり細胞ほぼ5×105個、集密度75％）および好中球（96ウェルプレートの1ウェル当たり細胞104個）の培養物を、PEP005（1〜100ng/ml）の非存在下または存在下で6時間インキュベートした。上清を収集して、以下のサイトカイン；TNFα、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、およびGM-CSFの存在に関して、マルチプレックス検出キット（Biosource International, Nivelles, Belgium）を用いて分析した。
【０２２２】
血管内皮のPEP005により誘導される活性化
血管内皮に対する好中球の付着を、標準的な静的付着アッセイ（Butler et al, Exp Cell Res 310:22-32, 2005）を用いて測定した。初回継代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、20％ v/vウシ胎仔血清（FBS）（Sigma, St Louis, MO）、1ng/mlの上皮増殖因子（Sigma, St Louis, MO）、1μg/mlのヒドロコルチゾン（Sigma, St Louis, MO）、28μg/mlのゲンタマイシン（David Bull Laboratories, Warwick, UK）および2.5μg/mlのアンホテリシンB（Sigma, St Louis, MO）を加えた培地199（Life Technologies, Edinburgh, UK）を用いて、24ウェルプレートのウェル内のカバーグラス上で集密化するまで増殖させた。PEP005を培養ウェルに1〜100ng/mlで添加し、TNFαを100単位/mlで陽性対照として用いた。内皮細胞をTNFαまたはPEP005に4時間曝露させ、その後にPEP005またはTNFαを除去するために十分に洗浄した。続いてヒト好中球（7.5×105個/ウェル）を内皮細胞に添加し、37℃で5分間おいて付着させた。続いて細胞を洗浄し、2％ w/vのグルタルアルデヒド中で固定して、内皮細胞単層に付着する好中球の数を決定するために位相差顕微鏡により検査した。
【０２２３】
インビトロでの好中球によるMM96L細胞の死滅
ヒト好中球を、10ng/mlのPEP005の存在下および非存在下で、MM96Lヒト黒色腫細胞（96U-ウェルプレートに5000個、3組ずつ）に添加した。24時間後に、好中球およびPEP005を除去するために培養物をPBSで洗浄し、続いて完全培地にさらに6日間維持させた。細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、メタノール中で固定して、付着MM96L細胞の全タンパク質量を、以前に記載された通りにスルホローダミンBを用いて決定した（Skehan et al, J Natl Cancer Inst 82:1107-1112, 1990）。細胞の生存度は、黒色腫細胞のみを含むウェルで測定した全タンパク質量に対するパーセンテージとして表した。
【０２２４】
インビトロでの好中球による溶解メディエーターの放出
好中球（107個）を10ng/mlのPEP005で2時間処理して、（i）ルシゲニンを利用するアッセイを用いて測定したスーパーオキシドの生成（Gyllenhammar, J Immunol Methods 97:209-213, 1987）、（ii）市販のキット（Biosource International）を用いるELISAによって測定した可溶性TRAILの放出、および（iii）市販のキット（Cell Sciences Inc, Canton, MA）を用いるELISAによって測定したデフェンシン1〜3の放出、に関して評価した。
【０２２５】
抗癌抗体の測定
B16細胞（106個）を、6〜10週齡のC57BL/6マウス（Animal Resource Centre）の側腹部に皮下注射し（1つの腫瘍/マウス）、腫瘍がほぼ30〜60mm3に達した時点で、上記のようにそれらをPEP005によって治癒させた。第11日および第135日に血清を採取し、B16に対して特異的な抗体に関するELISAによって分析した。PEP005で治療していない一群のB16保有動物、および無処置群を含めた。B16細胞を炭酸緩衝液（pH＝9）中で超音波処理して、Immuno Maxisorp 96ウェルプレート（Nunc）上に一晩かけて吸収させ、乾燥させた。プレートを、PBS中の5％ v/v FBS、0.01％ v/v Tweenにより、37℃で1時間かけてブロックした。被験血清を2組ずつ系列希釈し、ラット抗マウスビオチン化一次抗体（BD Biosciences Pharmingen）およびHRP標識ストレプトアビジン（Biosource International, Camarillo, CA）、その後にABTS基質（Sigma）を用い、405nmでのODの測定を行うことによって検索した。
【０２２６】
インビトロでの好中球ADCCアッセイ
LK2腫瘍（ほぼ14mm3）をFoxn1nuマウスに樹立させ（4つの腫瘍部位/マウス）、それを上記の通りにPEP005によって治癒させた。治療開始後の第11日に抗血清を心臓穿刺によって採取してプールした。並行したマウス群には治療を行わず、血清を同じく第11日に採取したが、その時点までに腫瘍はほぼ50mm3に成長していた。無処置動物からの血清を同じ時点で採取した（1群当たりn＝3匹）。LK2細胞を96丸底ウェルに3組ずつ播き（4×103個/ウェル）、1：3に希釈した抗血清とともに4℃で2時間インキュベートした（総容積13ul）。続いてモルモット補体（Gibco）（最終希釈度1：10）、PEP005（最終濃度10/ng/ml）または培地（対照）を、マウス好中球とともに、エフェクター：標的比が100：1となるように添加した（最終総容積200ul）。プレートを4℃に保ち、50gで5分間遠心した。続いてプレートを37℃で4日間、2回の培地交換をしながらインキュベートし、付着LK2細胞の全細胞タンパク質量を、以前の記載の通りにクリスタルバイオレット染色を用いて測定した（Antalis et al, J Exp. Med. 187:1799-1811, 1998）。マウス好中球は、腹腔洗浄の18時間前に分離したカゼインの2回の腹腔内注射をマウスに行い、赤血球を溶解させなかったことを除き、以前の記載の通りに調製した（Bergman et al, Cancer Immunol. Immunother. 49:259-266, 2000）。
【０２２７】
結果
PEP005治療後の好中球動員および組織形態
UV誘発性マウス扁平上皮癌細胞株であるLK2を、Foxn1nuマウスにおいて皮下腫瘍として増殖させた。腫瘍部位およびプラセボ（イソプロパノールゲル）による局所的治療を行った正常皮膚のH&E染色を用いた組織学的検査により、少数の白血球が存在する正常な形態が明らかとなった。しかし、PEP005の局所適用から6時間後に入手した皮膚は、毛胞および皮脂腺の完全性の低下、ならびに局所血管の拡張性の増大を示した。治療した領域では好中球数の少々の増加が観察された。同様の結果が、PEP005で治療した腫瘍部位でもこの時点で認められた。PEP005による治療から24時間後には多数の好中球およびある程度のマクロファージが、治療した皮膚ならびに治療した腫瘍部位の内部および周囲に認められ、好中球は腫瘍の末梢部で豊富であった。局所血管のある程度の出血もこの時点でみられた。腫瘍塊を取り囲む領域のより高倍率な像は、好中球の特徴である多葉性の核および赤色に染色された細胞質を有する多数の細胞を明らかに示している。同様の好中球浸潤パターンは、この実験をC57BL/6マウスおよびB16黒色腫を用いて繰り返した場合にも観察された（非提示データ）。したがって、PEP005治療の後に起こる急性炎症反応は、顕著な好中球浸潤によって特徴づけられた。
【０２２８】
以前に報告されているように、PEP005治療後の美容上の効果は究めて好ましいものであった。PEP005治療のおよそ3週後に、治療部位の皮膚は未治療皮膚と同様であって、正常な弾性を有しており、2〜3カ月まで、瘢痕または紅斑の徴候はあったにしてもわずかしか認められなかった（Ogbourne et al, Cancer Res 64:2833-2839, 2004）。
【０２２９】
PEP005による局所化学療法後の好中球欠乏マウスにおける腫瘍再発
PEP005は、Foxn1nuマウスにおいて増殖させたさまざまな種類の腫瘍を、有意な再発を伴わずに治癒させうることが示されており、これは有効な治療のためにT細胞は必要ではないことを実証している（Ogbourne et al, 前記 2004）。好中球はFoxn1nuマウスにおいて十分な活性を有しており、LK2腫瘍を保有するマウスにおいてこれらの細胞を欠乏させるために抗Ly-6G抗体（RB6-8C5）を用いることにより、PEP005の抗癌活性に対するそれらの意義を調べた。抗Ly-6G（RB6-8C5）抗体を投与された動物と比較して、対照動物（抗体を投与されていない）および対照抗体（A95-1）を投与された動物では、腫瘍はわずかにより緩徐に増殖した。
【０２３０】
1件の別の実験では、LK2腫瘍を、対照動物、対照抗体を投与された動物、および抗Ly-6G抗体を投与された動物において樹立させた。腫瘍がほぼ14mm3に達した時点で、それらをPEP005により毎日、3日間にわたって局所的に治療した。腫瘍の初期の化学的除去がすべての群でみられた；しかし、抗Ly-6G抗体で治療された群では第25日の後に腫瘍が再び出現しはじめた。この実験からのデータは、各群における経時的な腫瘍再発のパーセンテージとしても提示されている。対照動物では1例/12例（8.3％）のみで腫瘍が再発し、対照抗体を投与された動物では腫瘍が再発しなかった。しかし、抗Ly-6G抗体によって好中球が欠乏した動物では（以下を参照）、再発率の83％への有意な上昇が観察された（Cox回帰分析でのp＝0.005、Wald統計量＝7.92、抗Ly-6G抗体と対照抗体との比較に関して）。これらのデータは、PEP005治療後の再発を予防するためには好中球が必要であることを示唆している。
【０２３１】
PEP005で治療した動物とともに、（PEP005の代わりに）プラセボで治療した並行した動物群を樹立した。急性紅斑はプラセボで治療されたすべての動物に存在しなかったが、PEP005で治療したすべての腫瘍部位にみられた。しかし、第2日での最大の紅斑は、抗Ly-6G抗体を投与されたマウスの方が、対照抗体で治療された動物と比較しておよそ50％軽度であった（p＜0.001、独立ステューデントt検定）。このため、好中球浸潤は、PEP005により誘発される炎症反応に有意に寄与するように思われた。
【０２３２】
血液中の好中球数を、動物群のそれぞれに関して決定した。プラセボで治療されたマウス、PEP005で治療されたマウス、および対照抗体で治療されたマウスにおける白血球数は、本質的には同一であった。これに対して、血液中の好中球のパーセンテージは、プラセボで治療した動物およびPEP005で治療した動物のいずれにおいても、抗Ly-6G抗体治療の後に全白血球のほぼ80％からほぼ3％へと劇的に低下した。好中球数は、最後の抗体注射のおよそ10〜12日後に正常レベルに回復した。
【０２３３】
CD18欠損マウスにおけるB16腫瘍のPEP005治療後の急速な再発
CD18欠損マウスでは炎症部位への好中球の血管外漏出が高度に障害されている（Schruefer et al, J Vasc Res 43:1-11, 2005；Wilson et al, 前記 1993；Arnaout, Immunol Rev 114:145-180, 1990）が、抗体応答およびある種のT細胞応答は完全なままである（Lee et al, Nat Med 9:1281-1286, 2003）。B16腫瘍は、C57BL/6マウスと比べてCD18欠損マウスにおいてより早く増殖するため、CD18欠損およびC57BL/6マウスにおいて腫瘍サイズが同等になるように、前者においてPEP005治療を腫瘍細胞の移植後のより早期に開始した。C57BL/6マウスでは、平均体積がほぼ14mm3であるB16腫瘍の100％がPEP005の3回の局所適用によって治癒したが、CD18欠損マウスにおける治療した同様のサイズの腫瘍はすべて、同じPEP005治療の後に急速に再発した。急性紅斑がPEP005治療後にみられ、その面積はCD18欠損マウスおよび野生型マウスでは同程度であったが、前者の動物ではその強度がかなり弱かった。CD18欠損マウスにおける紅斑は主として、いくつかのマウスでわずかな発赤を伴った退色であったが、野生型マウスはすべての治療部位で顕著な発赤を示した。
【０２３４】
このように、第2の好中球欠損モデルでは、PEP005で治療した腫瘍は再発し、PEP005により誘発される炎症の強度が低下した。複数の白血球相互作用がCD18欠損によって影響される可能性があるが、これらのデータは、顕性の好中球浸潤を伴う急性炎症反応がPEP005の抗腫瘍効力のために必要であるという見方を支持する。
【０２３５】
NK細胞およびマクロファージの役割
NK細胞およびマクロファージはFoxn1nuマウスに存在し、これらの細胞種はPKCを活性化する薬剤によって活性化される可能性がある（Borrego et al, Immunology 97:159-165, 1999；Martin and Edwards, J Immunol 150:3478-3486, 1993）。PEP005の抗腫瘍作用に対する潜在的な寄与について明らかにするために、NK細胞を欠乏させるためにポリクローナル抗アシアロGM1ポリクローナル抗体を用いて実験を繰り返した（NK欠乏動物では対照と比べて腫瘍が1.5〜2倍早く増殖した）。これらの群間で紅斑および再発率に関して有意差はなかった（p＝0.47）。このため、NK細胞はPEP005治療後の再発予防において大きな役割は果たさないように思われた。
【０２３６】
B16腫瘍を用いる実験を、機能的なマクロファージ-コロニー刺激因子を欠き、このため高度の単球減少症であるCsfm（op）/Csfm（op）（op/op）マウスにおいて繰り返した（Schonlau et al, J Leukoc Biol 73:564-573, 2003）。PEP005治療は、再発を伴うことなく腫瘍の100％を治癒させることができ、このことはマクロファージがPEP005治療後の再発予防において重要な役割を果たさないことを示している。
【０２３７】
SCIDマウスにおけるPEP005で治療した腫瘍の再発
再発を伴わないPEP005治療の奏効のためにB細胞および抗体産生が必要であるか否かを明らかにするために、LK2腫瘍をSCIDマウスで増殖させて、PEP005によって治療し、再発に関してモニターした。SCIDマウスで増殖させてPEP005で治療したLK2腫瘍の再発率は、顆粒球欠乏性Foxn1nuマウスにおいて増殖させてPEP005で治療したLK2腫瘍に関して認められたものと極めて類似しており、腫瘍の80％超が第40日までに再発した。これに対して、Foxn1nuマウスにおいて増殖させた同程度のサイズのLK2腫瘍をPEP005で治療した場合にはほとんどすべての腫瘍が治癒した（Cox回帰分析でのp＝0.006、Wald統計量＝7.68、Foxn1nuマウスと比べたSCIDにおける再発率に関して）。LK2腫瘍はSCIDマウスおよびFoxn1nuマウスにおいて同様に増殖し、PEP005により誘発される紅斑も2つのマウス系統において同様であった。SCIDマウスにおける再発率の高さは、PEP005治療後の抗癌抗体産生も再発を予防するために必要であることを示している。
【０２３８】
インビボでのPEP005治療後のMIP-2、TNFα、およびIL-1βの誘導
PEP005によって誘発される急速な炎症が炎症誘発メディエーターの産生を伴うか否かを明らかにする目的で、PEP005で治療した腫瘍部位およびPEP005で治療した正常皮膚におけるIL-6、KC/Groα、MIP-2、TNFα、およびIL-1βのmRNA発現を評価するためにRT-PCRを用いた。PEP005で治療した全層マウス皮膚から単離したmRNAは、治療6時間以内に、MIP-2 mRNAのほぼ250倍の増加、TNFαのほぼ8倍の増加、およびIL-1β mRNAのほぼ2倍の増加を示した。腫瘍組織を周囲の皮膚および真皮組織から分離したところ、治療6時間以内に、MIP-2 mRNAのほぼ17倍の増加、TNFαのほぼ2倍の増加、およびIL-1β mRNAのほぼ1.5倍の増加を示した。IL-6およびKC/Groα転写物には全く変化が検出されなかった。このため、インビボの皮膚および腫瘍組織の両方において、PEP005治療はMIP-2、TNFαを誘導し、より低い程度でIL-1βを誘導した；いずれのメディエーターも好中球の移動および活性化に関与する（Ferrante, Immunol Ser 57:417-436, 1992；Cataisson et al, J lmmunol 174:1686-1692, 2005）。
【０２３９】
インビトロでのPEP005処理後のヒトケラチノサイト、線維芽細胞、好中球および黒色腫細胞における炎症誘発性サイトカインの誘導
PEP005治療後にマウスで誘導される炎症メディエーターのプロフィールがヒト細胞にも当てはまるか否かを明らかにするために、ヒトケラチノサイト、好中球およびヒト黒色腫細胞株（Me10538）のPEP005処理後のサイトカインおよびケモカインの誘導をインビトロで評価した。PEP005による処理から6時間後に、培養基をサイトカインおよびケモカインに関して分析した。MIP-2のヒトでの対応物であるIL-8は、検討したすべての細胞で誘導され、ケラチノサイトおよび好中球が5ng/mlのPEP005という最大レベルで産生した（表8）。10ng/mlのPEP005での好中球の応答の低下（5ng/mlと比較して）は、PEP005が、活性化により誘導される細胞死を導く好中球活性化の強力な誘導物質であったことから（以下を参照）、おそらくアポトーシスに起因すると思われる。TNFαレベルは、1ng/mlのPEP005の存在下でケラチノサイトにおいてほぼ60倍に誘導され、IL-6は10ng/mlを上回るPEP005による処理後に線維芽細胞においてわずかに誘導された（表8）。PEP005処理後に、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12およびGM-CSFは、検討したいずれの細胞種においても検出されなかった。したがって、PEP005は、ケラチノサイト、線維芽細胞、好中球および腫瘍細胞において好中球走化性物質IL-8を誘導し、ケラチノサイトにおいてTNFα産生を強力に誘導した。
【０２４０】
PEP005によるヒト内皮細胞の活性化
炎症部位への好中球の動員は、好中球結合を促進させるための血管内皮の活性化を必要とし、これは血管外漏出および組織浸潤のための前提条件である（Jutila et al, Transplantation 48:727-731, 1989）。PEP005は血管内皮細胞を用量依存的な様式で活性化することができ、10ng/mlのPEP005で顕著な好中球結合が起こった。TNFαは血管内皮を活性化することが知られており、TNFαによって誘導される好中球結合が陽性対照として示されている（図13A）。
【０２４１】
PEP005により活性化された好中球の直接的な抗腫瘍活性
PEP005で治療した腫瘍部位に動員された好中球が直接的な抗腫瘍活性を有しうるか否かを明らかにするために、ヒト好中球を、PEP005（10ng/ml）の存在下および非存在下でMM96Lヒト黒色腫細胞と共培養した。好中球および薬物を24時間後に除去し、細胞をさらに6日間培養した。PEP005の非存在下では、好中球はMM96L細胞の生存度に対して影響を及ぼさなかった。しかし、PEP005の存在下では、好中球は、好中球と標的との比が3：1でMM96L細胞の生存度をほぼ50％、好中球と標的との比が100：1で90％を上回って低下させることができた（図13B）。
【０２４２】
PEP005で刺激されたヒト好中球による潜在的な抗腫瘍薬の産生について調べた。10ng/mlを上回るPEP005濃度は、ヒト好中球による顕著なスーパーオキシド産生を誘導することができた（図13C）。100ng/mlでは（10ng/mlではなく）、PEP005は、ある程度の抗癌活性を有することが報告されている好中球顆粒タンパク質であるデフェンシンのわずかな放出を誘導した（Lichtenstein et al, Cell Immunol 114:104-116, 1988）。可溶性TNF関連アポトーシス誘導リガンド（sTRAIL/Apo-2リガンド）（Tecchio et al, Blood 103:3837-3844, 2004）の産生は、1〜100ng/mlのPEP005濃度によって誘導されなかった。したがって、PEP005はそれ自体では好中球の脱顆粒化を効率的に誘導しなかったが、PEP005は活性酸素種の生成を誘導することができた。
【０２４３】
MM96Lヒト黒色腫細胞は活性酸素種に対する感受性を有し（Parsons et al, Cancer Res. 42:3783-3788, 1982）、これらのメディエーターは好中球によって分泌されると腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有しうることが知られておいる（Lichtenstein, Blood 67:657-665, 1986；Di Carlo et al, Chem Immunol Allergy 83:182-203, 2003）。PEP005により誘導される活性酸素種が抗腫瘍活性を媒介しうるか否かを明らかにするために、ヒト好中球を、PEP005（10ng/ml）の存在下および非存在下においてMM96L細胞と共培養した。好中球および薬物を24時間後に除去し、細胞をさらに6日間培養した。PEP005の非存在下では好中球はMM96L細胞の生存度に対して影響を及ぼさなかった。しかし、PEP005の存在下では、好中球は、好中球と標的との比が3：1でMM96L細胞の生存度をほぼ50％、好中球と標的との比が100：1で90％を上回って低下させることができた。
【０２４４】
腫瘍のPEP005治療後の抗癌抗体レベルの上昇
養子移入された抗腫瘍抗体は、好中球を介した腫瘍細胞のADCCを促進することが示されている（Hernandez-Ilizaliturri et al, Clin Cancer Res 9:5866-5873, 2003；Niitsu et al, Clin Cancer Res 11:697-702, 2005；De Carlo et al, 前記 2003）。PEP005治療が抗腫瘍抗体レベルの上昇を導くか否かを明らかにするために、C57BL/6マウスにおいて増殖させたB16腫瘍をPEP005によって治癒させた。30〜60mm3の腫瘍のPEP005治療後の第11日という早期から抗癌抗体レベルが上昇し、この時点で大きな腫瘍量を有していた未治療動物で認められたものを有意に上回る応答がみられた（図13D）［1/100希釈でp＝0.045、独立ステューデントt検定］。このため、PEP005を介した癌の治癒は抗癌抗体のレベルを上昇させるように思われる。
【０２４５】
インビトロでのLK2細胞のマウス好中球を介したADCC
本データは、Foxn1nuマウスのLK2腫瘍のPEP005治療後の腫瘍再発が、好中球を介したADCCによって予防されることを示唆する。Foxn1nuマウスは有意なIgG応答を生じることができないが、それらは、補体を固定し、それによって補体受容体を介した好中球脱顆粒化を誘発することのできるIgM応答を生じることができる（Nielsen et al, Eur. J. Immunol. 27:2914-2919, 1997）。このため、LK2腫瘍がPEP005によって治癒されたFoxn1nuマウスからの血清が、インビトロでのADCCを媒介しうるか否かを明らかにしようとした。そのようなマウスからの抗血清は、マウス好中球および添加された補体の存在下でLK2細胞の生存度を有意に低下させることができた（p＝0.006、独立ステューデントt検定）。LK2腫瘍が治療されていないFoxn1nuマウスからの抗血清も無処置Foxn1nuマウスからの抗血清も、同じ条件下でLK2細胞の生存度を有意に低下させることはできなかった。マウス血清中（熱不活化されていない）に存在する補体レベルがより低いことは、これらのアッセイ条件下において好中球の抗癌活性を活性化するには不十分であった。しかしながら、10ng/mlのPEP005を添加した場合には、PEP005 LK2抗血清に対する抗癌活性が再び認められたが、LK2および無処置血清ではそうではなかった。PEP005または添加された補体の非存在下では、いずれの抗血清もLK2細胞の生存度を有意に低下させることはできなかった。したがって、LK2腫瘍がPEP005治療によって治癒されたFoxn1nuマウスからの抗血清は、添加された補体または低レベルのPEP005の存在下で、インビトロでのLK2細胞の好中球を介したADCCを誘導することができた。
【０２４６】
（表８）インビトロでのヒト細胞における炎症誘発性サイトカインの誘導
細胞を指定濃度のPEP005とともに6時間インキュベートし、上清を指定のサイトカインに関して分析した（ND‐検出されず、nt‐試験せず）。
2009516651.tif 000013
【０２４７】
実施例15
PEP005による免疫応答の増強
エフェクターT細胞に対するPEP005の抗アポトーシス効果により、腫瘍に対するワクチン応答または免疫療法においてT細胞応答を増強させるためにPEP005を用いることの潜在的な有用性が示された。この実施例の目的は、これらの観察所見の理解をさらに深め、T細胞の免疫増強剤としての全身性PEP005の潜在的な有用性を明らかにすることであった。
【０２４８】
実験計画：
‐インビトロでのCD8 T細胞の生存に対するPEP005治療の効果の存続時間を明らかにすること。
‐PEP005によってどのT細胞サブセットが主として影響されるか（すなわち、PEP005は増殖期またはエフェクター期の間に活性があるか?）を調べること。
‐CTLによる標的細胞の死滅に対するPEPの効果を検討すること。
【０２４９】
この実施例の目的は4つであった：
1）PEP005がCD8+ 活性化T細胞のアポトーシスを抑制しうるか否かを検討すること；
2）PEP005の抗アポトーシス効果の効力および持続時間を調べること；
3）CD8+ T細胞のサブセットに対するPEP0005の効果に違いがあるか否かを検討すること；および
4）いかにしてPEP005がCD8+ T細胞の細胞傷害性に影響を及ぼすかを検討すること。
【０２５０】
サイトカイン離脱によって誘導されるCD8+ T細胞のアポトーシスに対するPEP005の効果を検討するために、インビトロアッセイを用いる。その後に、T細胞アポトーシスに対するPEP005の効果の経時的推移、ならびに単離された無処置および記憶CD8+ T細胞に由来するT細胞に対する効果の比較について調べる。この目的には、T細胞クローンおよび抗原がロードされた標的細胞を用いる細胞傷害性アッセイが用いられる。
【０２５１】
-70℃で乾燥保存し、秤量して1〜2mgのアリコートとしてDMSO中に再構成したPEP005を、0.0001〜10μg/mlの強度で用いた。
【０２５２】
インビトロ系に対する単回投与を用いた。
【０２５３】
CD8+ T細胞株は、健常ヒトドナーの末梢血からのCD8+ T細胞の単離によって作製した。これらの細胞はIL2などの抗アポトーシス性サイトカインの存在に対して依存性である。これらが欠乏すると、それらは急速にアポトーシスに入る。用いたアッセイ系では、アポトーシスに対する効果を検討するために、細胞をIL-2の非存在下および存在下で、さまざまな濃度のPEP005とともに培養した。
【０２５４】
CD8+ T細胞は、MACSに基づくシステムを用いる陰性選択によって単離した。精製された細胞を10μg/mlのPHAで刺激し、共刺激シグナルを供給するために照射EBV形質転換B細胞を用いた。25U/mlのIL2の存在下で維持した細胞を7日間隔で再刺激し、第3継代の時点でアリコートとして凍結させた。これらを各実験のために液体窒素から取り出し、再刺激した上で、再現性のある細胞源を維持するために第7日に生存アッセイに用いた。生存アッセイのためには、細胞をIL2（25U/ウェル）の存在下または非存在下において1×106個/mlの密度で培養し、0.01〜1μg/mlのPEP005により48時間処理した。アポトーシス性細胞のパーセンテージを、アポトーシスのマーカーとしての活性化カスパーゼ-3のフローサイトメトリー検出によって測定した。実験は3組ずつ行った。
【０２５５】
ブロモデオキシウリジン（BrdU）取り込みの分析による細胞増殖の検出を、生存アッセイと合わせて行った。BrdUはチミジンの類似体であり、細胞が細胞周期のS（合成）期にあるとDNAの中に取り込まれうる。続いて、BrdUが取り込まれたDNAエピトープを認識する、蛍光色素を結合させた抗体を用いることで、通常は2日間を要する生存アッセイ中のさまざまな時点で、細胞周期が進行中の細胞の比率をモニターするためにフローサイトメトリーを用いることができる。
【０２５６】
Ficoll-Paqueによって単離された第5継代（刺激7日後）のCD8+ T細胞をRPMI 1640で2回洗浄し、生存アッセイの設定と同じやり方で、96ウェルプレート内で2×106個/mlで培養した。細胞に0.01μg/ml（20nM）のPEP005または培地のいずれかを投与した。各実験の開始から0、24時間および48時間の時点で、細胞の各ウェルに対して10μM BrdUによるパルス刺激を37℃で2時間行った。続いて細胞を2回洗浄し、それらの元の培養条件に対応するIL2およびPEP005の存在下/非存在下での培地中（以後は補充培地と呼ぶ）に再懸濁させた。補充培地は各実験の開始時に作製し、細胞培養物と同じ時間にわたってインキュベートした。48時間時点のBrdUパルスの後に、細胞を再懸濁させてPBS中で1回洗浄し、BrdUフローキット（BD Biosciences, UK）を製造元の指示に従って用いて、BrdUおよび活性カスパーゼ-3に関して染色した。FACSデータはCeliQuest Pro（BD Biosciences, UK）を用いて分析した。
【０２５７】
CTLアッセイの開始時に、エフェクターCD8+ T細胞を、10％HIFCSを含むRPMI 1640中に希釈した種々の濃度のPEP005を含む培地（RPMI 1640＋10％熱不活化（HI）ウシ胎仔血清（HIFCS））中に1×106個/mlで再懸濁させ、15mlチューブ内で37℃、5％CO2の下で30分間おいた。エフェクター細胞のPEP005処理の間に、リンパ芽球細胞株（LCL）標的細胞を5μCiのNa51CrO4で標識し、DMSO中に溶解し、RPMI 1640中に希釈した潜在性または溶解性のEBV抗原ペプチドにより、37℃、5％CO2の下で1.5時間にわたり感作させた；DMSO溶媒の希釈物を対照として用いた。PEP005で処理したエフェクター細胞をRPMI 1640中で1回洗浄し、RPMI＋10％HIFCS中に再懸濁させて、種々のエフェクター/標的比で希釈し、96Vウェルアッセイプレートに移した。51Crで標識され、ペプチドで感作された標的細胞をRPMI 1640で2回洗浄し、RPMI＋10％HIFCS中に再懸濁させて、エフェクター細胞を含む96Vウェルアッセイプレートに2500個/ウェルで移した。標的細胞はまた、自然溶解および最大溶解の対照として、培地のみまたは1％ w/vドデシル硫酸ナトリウム（SDS）とともにインキュベートした。続いてプレートを37℃、5％CO2の下で4時間インキュベートした。4時間のインキュベーションの後に、細胞をペレット化するためにプレートを1300rpmで5分間遠心した。各ウェルの100μlの上清を蛍光活性化細胞選別（FACS）チューブに移し、放射能を測定した。特異的な標的を用いた試料の特異的溶解のパーセンテージを以下のように算出した。
2009516651.tif 000014
【０２５８】
3組ずつの対照および被験物の数を平均化し、ステューデントt検定を用いて比較した。
【０２５９】
この試験の目的の一つは、活性化CD8+ T細胞のアポトーシスが抑制されるか否かを検討することであった。活性化CD8+ T細胞は、生存誘導性サイトカインの非存在下では通常、アポトーシスを起こす。このことはここでは、生存アッセイにおける細胞のカスパーゼ-3染色のフローサイトメトリー分析によって示されている。CD8+ T細胞の生存に対するPEP005の効果を、第5継代で刺激後第7日のCD8+ T細胞に対する種々のPEP005を用いて滴定した。PEP005の濃度が上昇すると、IL-2を欠乏させたCD8+ T細胞のアポトーシスのパーセンテージが有意に低下した（図14B、白抜きのバー）。IL2を欠乏させたCD8+ T細胞のアポトーシスのパーセンテージは、PEP005を0.01μg/mlで用いた場合に最小値の19％に低下し、これに対して非処理細胞では42.47％であった。
【０２６０】
生存アッセイの結果から、PEP005が、IL-2で処理したCD8+ T細胞においてわずかな程度のアポトーシスを誘導することが観察された（図14AおよびB）。IL-2は増殖の刺激に対して直接的な効果を及ぼすため、IL-2によって誘導された増殖中の細胞がPEP005によって同じくアポトーシスを起こすように誘導されるか否かについて調べた。BrdUおよび活性カスパーゼ-3の同時染色法により、第2日に認められたアポトーシス性細胞が生存アッセイの経過における任意の所定の時点で以前に増殖していたか否かを本発明者らが追跡することが可能になった。増殖中の全集団における種々の時点でのアポトーシス性細胞の比率が、さまざまな処理に関して図15に示されている；非増殖性の対応物は図15Dに示されている。
【０２６１】
IL-2で処理されていない増殖中および非増殖性の両方の細胞のアポトーシスのレベルは高いままであり、75％前後であった。PEP005で処理した細胞の中では、増殖性でないアポトーシス性細胞（図15D）およびアポトーシスを起こした増殖中の細胞（図15C）の比率は同程度のパーセンテージであった。これらのデータにより、以前の生存アッセイで認められたIL-2およびPEP005の両方で処理した細胞における高度のアポトーシスは、この系それ自体においてIL2によって引き起こされる増殖に起因するのではないことが示唆された。
【０２６２】
ほとんどの実験では、生存アッセイにおけるアポトーシスのパーセンテージを第2日に分析した。
【０２６３】
しかし、抗アポトーシス効果の持続時間を評価するには、PEP005によって生じた生存性の強化が生存アッセイにおいてどの程度長く持続しうるかを調べることが必要であった。この目的について検討するために、生存アッセイを第7日まで延長し、カスパーゼ-3染色を用いてアポトーシスのパーセンテージを毎日測定した。IL-2、PEP005またはこれらの組み合わせとともに培養した細胞のアポトーシスは、有意に2〜3日遅れた。この観察所見は、この群において他の生存強化サイトカインを用いて得られるものと類似している。
【０２６４】
以前の刊行物は、PKC活性化物質であるPMAが、抗原特異性が弱いまたは皆無である標的細胞に対する細胞傷害性を含む、最適に及ばない（sub-optimal）条件下で、CD8+ T細胞の細胞傷害性を高めうることを示唆している（Russell, J. Immunol. 136(1):23-7, 1986）。PEP005がPMAと共通してこの効果を有するか否かについて検討した。この目的のために、抗原特異的CD8+ T細胞クローン（SY30C23、IM106およびSY3/2）およびペプチドでパルス刺激したLCL細胞株を用いる細胞傷害性アッセイを用いた。標的細胞上にロードされるHLA拘束性EBV抗原ペプチドの濃度を下げながら微調整し、続いてCD8+ T細胞の細胞傷害性に対するさまざまな濃度のPEP005の効果を検討した。
【０２６５】
5μg/mlのペプチドローディング濃度で、非処理エフェクター細胞が標的細胞の最適な特異的溶解を行うことが可能となった。1μg/mlのペプチドを標的細胞の感作に用いた場合、PMAで処理したCD8+ T細胞クローンは非処理細胞よりも高度な細胞傷害性を呈し、この観察所見は、PMAは最適に及ばない条件下でのみ細胞傷害性を高めうるという以前に刊行された観察所見を裏づける。0.1μg/mlのペプチドでは、すべての条件下で細胞傷害性は低レベルに過ぎなかった。2nM〜2μMの範囲にわたるPEP005の濃度は、CD8+クローンの細胞傷害性に影響を及ぼさなかった。
【０２６６】
本データは、PEP005がCD4+およびCD8+活性化T細胞のいずれの寿も延長させることを示している。抗アポトーシス効果は増殖中および非増殖性の細胞に対して同じ程度で作用する。細胞傷害活性の上昇も低下も検出されなかった。したがって、インビトロ研究からの結論は、インビボ抗腫瘍活性の上昇は、細胞傷害性の増大ではなくPEP005の抗アポトーシス効果に起因するというものである。
【０２６７】
当業者は、本明細書に記載した本発明に対して、具体的に記載したもの以外に変更および修正を行えることを理解していると考えられる。本発明にはこのようなあらゆる変更および修正が含まれ、それらもその精神および範囲に含まれることが理解される必要がある。本発明はまた、本明細書において個別的または一括的に言及または指摘されたすべての段階、特徴、組成物および化合物、ならびに任意の2つまたはそれ以上の前記の段階または特徴の任意およびすべての組み合わせも含む。
【０２６８】
参考文献
2009516651.tif 000015
2009516651.tif 000016
2009516651.tif 000017
2009516651.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
いくつかの図はカラーの表示または実体を含む。カラー写真は、請求に応じて特許権所有者から、またはしかるべき特許庁から入手可能である。特許庁から入手する場合には料金が課せられる可能性がある。
【０２７０】
【図１】一団の細胞株においてPEP005を1時間、24時間、および48時間にわたって与えた実験コースの効果を示すグラフ表示である。
【図２】2種類の白血病細胞株、K562およびCCRF-CEMにおける、24、48、および72時間にわたる投与後のPEP005の細胞傷害性を示すグラフ表示である。
【図３】PEP005に対する0、1、5、12、24、および48時間の曝露に伴う細胞周期変化の写真およびグラフを表している。
【図４】図4AおよびBは、アポトーシス誘導を表したものである。（A）サブG1 DNA含有量、PI染色および（B）PI-アネキシンV染色。
【図５】一団の細胞株におけるPEP005の細胞傷害性と他の抗癌薬との比較分析を示すグラフ表示である。データは、HT29（1）、HCT116（2）、HCC2998（3）、COLO205（4）、MCF7（5）、MDA435（6）、HOP62（7）、HOP92（8）、IGROV1（9）、およびOVCAR3（10）細胞株に関して（IC50−IC50平均）として提示されている。
【図６】ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005と5FUとの相互作用を示すグラフ表示である。PEP-5FU；PEP005の後に5FU；5FU-PEP：5FUの後にPEP005；PEP＋5FU：PEP005および5FUの同時投与。併用指数の算出値が0.8未満であれば相乗作用、1.2を上回れば拮抗作用を指し示し、一方、0.8〜1.2の間の併用指数は相加作用に対応する。
【図７】ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とドキソルビシンとの相互作用を示すグラフ表示である。PEP-ドキソルビシン：PEP005の後にドキソルビシン；ドキソルビシン-PEP：ドキソルビシンの後にPEP005；PEP＋ドキソルビシン：PEP005およびドキソルビシンの同時投与。
【図８】図8AおよびBは、以下を示すグラフ表示である。（A）ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とオキサリプラチンとの相互作用。PEP-24h-oxa：PEP005を24時間、その後にR10培地中でのポストインキュベーションを24時間、その後にオキサリプラチンを24時間；PEP-72h-oxa；PEP005を1時間、5時間、24時間、その後にR10培地中でのポストインキュベーションを72時間、その後にオキサリプラチンを24時間。（B）間隔をおかないPEP-オキサリプラチンの組み合わせ。ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とオキサリプラチンとの相互作用を示すアイソボログラム（isoblogram）。
【図９】ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とゲムシタビンとの相互作用を示すグラフ表示である。PEP-ゲムシタビン：PEP005の後にゲムシタビン；ゲムシタビン-PEP：ゲムシタビンの後にPEP005；PEP＋ゲムシタビン：PEP005およびゲムシタビンの同時投与。
【図１０】ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とビノレルビンとの相互作用を示すグラフ表示である。PEP-ビノレルビン：PEP005の後にビノレルビン；ビノレルビン-PEP：ビノレルビンの後にPEP006；PEP＋ビノレルビン：PEP005およびビノレルビンの同時投与。
【図１１】ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とドセタキセルとの相互作用を示すグラフ表示である。PEP-ドセタキセル：PEP005の後にドセタキセル；ドセタキセル-PEP：ドセタキセルの後にPEP005；PEP＋ドセタキセル：PEP005およびドセタキセルの同時投与。
【図１２】ヒトCOLO205癌細胞株におけるPEP005とシスプラチンとの相互作用を示すグラフ表示である。PEP-シスプラチン：PEP005の後にシスプラチン；シスプラチン-PEP：シスプラチンの後にPEP005；PEP＋シスプラチン：PEP005およびシスプラチンの同時投与。
【図１３】図13A〜Dは、内皮細胞および好中球のスーパーオキシド生成ならびに抗体産生に対するPEP005の影響のグラフ表示である。（A）PEP005によるヒト内皮の活性化。内皮細胞をPEP005で4時間処理した後に好中球を添加し、内皮細胞層に対する付着を評価した。100U/mlのTNFαを陽性対照として用いた。データは5回の別々の実験の平均±SEである。ANOVA分析により、好中球付着のレベルに対するPEP005の用量の有意な影響が示された（p＝0.003）。（B）インビトロでのPEP005により活性化されたヒト好中球による黒色腫細胞の死滅。ヒトMM96L黒色腫細胞を好中球と共培養し、PEP005で24時間処理した。好中球およびPEP005を取り出し、6日後に黒色腫細胞の生存を判定した。死滅はPEP005および好中球の非存在下における腫瘍細胞の生存率として表現し、好中球：MM96Lの比が0：1の場合を100％（□）として示している。（C）PEP005で処理した好中球によるスーパーオキシド生成。ヒト好中球をPEP005とともに2時間培養し、スーパーオキシドの生成をルシゲニン利用アッセイによって判定した。（D）B16腫瘍のPEP005処理後の抗体応答。C57BL/6マウスにて増殖しているB16腫瘍を、30〜60mm3に達した後にPEP005処理によって治し（マウス1匹当たり腫瘍1つ）、B16特異的なIgG1およびIgG2a抗体価を、治療開始11日後（n＝6）（■）または治療開始135日後（n＝5）（▲）に採取した血液を用いる標準的なELISAを用いて測定した。第11日までに腫瘍が121.5±SD 20.1に達したプラセボ処理動物（n＝4）に関する抗体価も示されている（○）。無処置マウス（n＝5）には腫瘍を投与しなかった（□）。
【図１４】図14AおよびBは、PEP005がIL-2欠乏性の活性化CD8+ T細胞をアポトーシスから救出することのグラフ表示である。（A）非処理細胞、およびIL-2（25U/ml）とともに培養した細胞の前方/側方散乱図。R1にゲーティングされた細胞を、下方のパネルに、FITC蛍光によって表されるそれらの活性カスパーゼ-3発現に対してプロットした。太い黒線は無関係な対照を示す。アポトーシスを来した細胞の割合は、ゲーティングされた全細胞のうちマーカー1（M1）の下にある事象のパーセンテージから、無関係な対照におけるM1下の同じ割合を差し引くことによって算出した。（B）IL-2を与えた細胞（塗りつぶしたバー）およびIL-2を欠乏させた細胞（白抜きのバー）におけるアポトーシスのパーセンテージを種々の濃度のPEP005に対してプロットした。データは3回の独立した実験から得た。値は平均±SDとしてプロットした。統計分析は独立両側スチューデントt検定によって行い、p値を示してCI＝95％を取得しており、*は有意水準を表している。
【図１５】図15A〜Dは、PEP005が0.01μg/m1（20nM）で増殖およびアポトーシス救出を誘導したことのグラフ表示である。方法の項に記載した通りに、種々の処理を受けた細胞に対してBrdUをパルス投与し、BrdUおよびカスパーゼに関して染色した。0、24、および48時間の実験の時点で増殖している細胞のパーセンテージ（A）。第2日に分析した全アポトーシス性細胞のパーセンテージ（B）。定められた時点で増殖している細胞のうち第2日でのアポトーシス性細胞のパーセンテージ（C）。定められた時点で増殖していない細胞のうちアポトーシス性細胞のパーセンテージを第2日に分析した（D）。
【図１】
2009516651.tif 000019
【図２】
2009516651.tif 000020
【図３】
2009516651.tif 000021
【図４Ａ】
2009516651.tif 000022
【図４Ｂ】
2009516651.tif 000023
【図５】
2009516651.tif 000024
【図６】
2009516651.tif 000025
【図７】
2009516651.tif 000026
【図８Ａ】
2009516651.tif 000027
【図８Ｂ】
2009516651.tif 000028
【図９】
2009516651.tif 000029
【図１０】
2009516651.tif 000030
【図１１】
2009516651.tif 000031
【図１２】
2009516651.tif 000032
【図１３Ａ】
2009516651.tif 000033
【図１３Ｂ】
2009516651.tif 000034
【図１３Ｃ】
2009516651.tif 000035
【図１３Ｄ】
2009516651.tif 000036
【図１４Ａ】
2009516651.tif 000037
【図１４Ｂ】
2009516651.tif 000038
【図１５Ａ】
2009516651.tif 000039
【図１５Ｂ】
2009516651.tif 000040
【図１５Ｃ】
2009516651.tif 000041
【図１５Ｄ】
2009516651.tif 000042
【配列表】
2009516651000001.app
【国際調査報告】
2009516651.tif 000043
2009516651.tif 000044
2009516651.tif 000045