(57)【要約】  １０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を含む１０以上の標準のセットであって、当該規定数の粒子が、当該セットの各標準の間で１０％以下の誤差の範囲内である、前記セット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を含む１０以上の標準のセットであって、当該粒子の規定数が、当該セットの各標準の間で１０％以下の誤差の範囲内である、前記セット。
【請求項２】
前記粒子が、細胞、微生物、又は小さい対象から選ばれる、請求項１に記載の標準のセット。
【請求項３】
前記細胞が、精子、卵子、幹細胞、動物細胞、植物細胞、花粉、卵、幼生、胞子又はそれらの混合物から選ばれる、請求項２に記載の標準のセット。
【請求項４】
前記微生物が、細菌、真菌、酵母、ウイルス、プロトゾア、プリオン又はそれらの混合物から選ばれる、請求項２に記載の標準のセット。
【請求項５】
前記微生物が、レジオネラ(Legionella)、サルモネラ(Salmonella)、レプトスピロシス(Leptospirosis)、サッカロマイシス(Saccharomyces)、クロストリジウム(Clostridium)、ビブリオ(Vibrio)、シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイシス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、カンピロバクター(Campylobacter)、アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、エンテロバクター(Enterobacter)、エンテロコッカス(Enterococcus)、リステリア(Listeria)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、シトロバクター(Citrobacter)、プロテウス(Proteus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、クレブシエラ(Klebsiella)、アエロモナス(Aeromonas)、ジゴサッカロマイシス(Zygosaccharomyces)、アシネトバクター(Acinetobacter)、セラチア(Serratia)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、ロドコッカス(Rhodococcus)、エルシニア(Yersinia)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ガルドネラ(Gardnerella)、マイコバクテリア(Mycobacteria)、ボルデタラ(Bordetalla)、ヘモフィラス(Haemophilus)、シゲラ(Shigella)、クルイヘラ(Kluyvera)、スピロカエート(Spirochaeta)、リゾビウム(Rhizobium)、リゾバクター(Rhizobacter)、ブルセラ(Brucella)、ナイセリア(Neisseria)、リケッチアス(Rickettsias)及びクラミジア(Chlamidia)、又はそれらの混合物から選ばれる、請求項４に記載の標準のセット。
【請求項６】
前記微生物が、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、ギアルジア(Giardia)、シクロスポラ(Cyclospora)、トキソプラスマ(Toxoplasma)、エイメリア(Eimeria)、及びそれらの混合物から選ばれる、請求項５に記載の標準のセット。
【請求項７】
前記小さい対象が、ビーズ、ミネラル粒子、磁性粒子、インク粒子、リポソーム、金属粒子、ナノマシーン、ナノ構造、ナノボット、生体物質の乾燥化、結晶化、若しくは個別化された粒子、又はそれらの混合物から選ばれる、請求項２に記載の標準のセット。
【請求項８】
前記粒子の規定数が、２０００〜５００,０００である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の標準のセット。
【請求項９】
前記粒子の規定数が、５,０００〜１００,０００である、請求項８に記載の標準のセット。
【請求項１０】
液体形態、凍結形態、又は固体形態の請求項１〜９のいずれか一項に記載の標準のセット。
【請求項１１】
前記固体形態が、規定数の粒子を含むビーズ又はボールである、請求項１０に記載の標準のセット。
【請求項１２】
１０〜１０００の標準を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の標準のセット。
【請求項１３】
２０の標準、又は５０の標準、又は１００の標準、又は５００の標準又は１０００の標準を含む、請求項１２に記載の標準のセット。
【請求項１４】
前記誤差が、１％〜１０％である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の標準のセット。
【請求項１５】
前記標準が、固体形態において容器間で移すことができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の標準のセット。
【請求項１６】
前記標準が、液体状態で粒子を放出することができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の標準のセット。
【請求項１７】
異なるバッチで調製された１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を含む１０以上の標準の複数のセットであって、当該標準が１０％以下の誤差だけバッチ間で変動する平均を有する、前記セット。
【請求項１８】
規定数の粒子を含む１０以上の標準のセットを製造する方法であって、以下の：
当該粒子を検出することにより１０００〜１,０００,０００の粒子の規定数を計数し；
液滴中に規定数の粒子を回収し；そして
標準のセットを形成する回収ステップを繰り返し；ここで当該規定数の粒子が、当該セットの各標準間で、１０％以下の誤差の範囲内である
を含む、前記方法。 
【請求項１９】
規定数の粒子を含む液滴が、標準のセットを形成するように分注される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記粒子が、懸濁状態で提供され、そして当該液滴が凍結体に捕捉される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記粒子の検出が、粒子を検出できる装置により行なわれる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
粒子を検出できる前記装置が、特定波長での吸光度、密度、磁性、比重、インピーダンス、光散乱、発光、又は蛍光を使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
粒子を検出できる前記装置が、サイトメーターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
粒子を検出できる前記装置が、フローサイトメーターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
粒子を検出できる前記装置が、粒子を分析及びソートするフローサイトメトリーと組み合わせて、コールター検出又はラマン顕微鏡を使用する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法により製造される標準のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正確な数の粒子を有する標準のセット(sets of standards)及び当該標準の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、細菌、酵母、真菌、ウイルス、プロトゾア、精子、卵、胚、幼生、花粉、ビーズ、インク粒子などの小粒子の操作に関する多くの方法が実施されている。一般的に、小粒子の操作は元々難しいものである。なぜなら、粒子は小さすぎて裸眼では見ることができないからである。
【０００３】
小粒子を容器(例えば、試験管)に加えることに関する手順が行なわれる場合、正確に又は少なくとも最小限の誤差(degree of error)で、どれだけ多くの粒子が加えられたかを知ることを可能にする利用可能な単純技術は一般的に存在していない。一般的に、粒子の懸濁液を調製し、そして次に、液量あたりの粒子数を見積もるために、当該懸濁液が分析(例えば、顕微鏡又はアガープレート上での培養による計数)される。見積もられた粒子数を含む一定量の懸濁液が、当該一定量中の粒子の正確な数が知られることなく用いられる。
【０００４】
少量の液体を正確に分注することができる様々な装置が利用できる。通常この目的のためにピペットが使用されており、そして０.０００１ｍｌ〜２０ｍｌの範囲の体積を正確かつ確実に分注することができる。細胞などの小粒子を操作するためにピペットを用いる場合、分注された液量中の正確な細胞数は知られておらず、そして調節することができない。液量のみを調節することができる。
【０００５】
ピペットなどの機器は、化学物質又は可溶性分子を溶液状態で含む液体をかなりうまく分注できる。これは、化学物質又は可溶性分子が、当該液体を通して等しく分散している(つまり溶解している)ためである。これは、細胞などの粒子の場合当てはまらない。粒子は、典型的に、液体中にランダムに分布している。これは、粒子の懸濁液から採られた２つの同一量の液体が、同数の粒子を含まないということを意味する。ピペットなどの機器は、その結果既知の数の粒子を高い正確性及び精度で分注することはできない。その結果、細胞又は微生物などの粒子の既知の数を正確に分注するために使用できる方法に対する必要性がある。
【０００６】
フローサイトメトリーは、粒子を分注するために使用できる技術である。フローサイトメトリーは、識別子として様々な検出器から得た情報を用いて、細胞などの粒子を物理的にソートするために使用できる。ソートは、混合物から特定の粒子タイプを精製することを可能にする。しかしながら、フローサイトメトリーは、典型的に粒子を、一つづつしか分別できない。
【０００７】
フローサイトメトリーによる粒子分別の標準方法は、液滴偏向分別（droplet deflection sorting）として知られている。これは、フローセルに圧電変換機を使用して、シース液(sheath fluid)の液滴を作ることに依る。変換機を通して交流電流が流れ、フローセルが電流と同じ周波数で上下に振動することをもたらす。フローセルの振動は、振動がフローセルからなくなった場合、シース液内にうねり（undulation）が形成することを引き起こす。フローセルのさらに下流では、シース液流のうねりは、当該流れが液滴になるまで、さらに確定される。流れが液滴になる以前の流れにおける最後のうねりは、最終付着液滴(the last attached droplet)として知られている。
【０００８】
粒子が回収される場合、当該粒子が最終付着液滴内に存在するちょうどそのときにシース液に電荷が付される。荷電は、圧電結晶が１回振動する間に生じる。これは、１の液滴をもたらし、当該液滴は、ソートされる粒子を含み、荷電されている。フローセルのさらに下流では、液滴の流れが２個のプレートの間を通過する。１つは正に、もう１つは負に荷電されている。荷電された液滴がプレートの間を通過する場合、液滴のメインストリームから外れる。ソートプロセスは、現在のサイトメーターを用いて、一秒あたり、数千回の割合で行なうことができる。
【０００９】
しかしながら、液滴偏向ソートを用いるフローサイトメトリーは、高い技術を有するオペレーターによる少なくとも毎日の調整を必要とする、高価で大規模精巧な機器である。ソートの設定も難しく、そして相互作用領域から最終付着液滴まで粒子が移動するのにかかる時間の計算を含む多くの較正を必要とする。時間は、液滴の遅延として知られている。ひとたびソートがセットアップされると、液滴の遅延が変化しないことを保証するために厳密にモニターされる。
【００１０】
液滴偏向ソートの制限は、１超の粒子を含む液滴を作成することができないということである。液滴偏向ソートについてのさらなる問題点は、液滴偏向ソートが、エアロゾルを作成することがあり、その結果、生細胞の生存性又は完全性を維持するのに特に適していない生物学的に有害な条件の分析に適していないということである。液滴遅延ソートの使用についての難しさは、当該技術を専門研究室での使用へと限定した。
【００１１】
フローサイトメトリーソートの代替形態は、US5,030,002(Method and apparatus for sorting particles with a moving capture tube)に記載されている。このソートプロセスは、粒子を捕捉するためにサンプル流の中及び外に機械的に移動される捕捉チューブを使用する。これは、当該粒子の特定の性質を検出し、そして当該粒子を一つづつ容器に向けるか、又は廃液容器へと仕分けることにより、粒子をソートすることを可能にする。例えば、このソートプロセスは、Becton Dickinson FACS Calibur フローサイトメーターにより用いられる。このフローサイトメーターは、操作が単純であり、そして較正又は粒子をソートする前に行われる複雑なセットアップ法を必要としない。サンプルを分析し、そして目的の粒子をソートすることは、当該装置のスイッチを単にＯｎにするだけである。
【００１２】
しかしながら、このタイプのソートフローサイトメーターの制限は、粒子をソートするスピードである。捕捉チューブは、通常、１秒あたり３００回のスピードで、粒子の流れの中及び外へと移動することができる。当該システムは、一粒子ずつソートするように設計されている。こうして３００は、このような従来技術のサイトメーターを用いて１秒あたりにソートできる最大粒子数である。
【００１３】
本出願人は、かなり少数(１０００未満、そして一般的に約１００以下)の微生物について正確性を有する標準を作成することができた (US6780581；WO 2003/02095)。残念ながら、これらの標準を作成するために用いた方法は、約１０００を超える微生物を有する標準を産生することができなかった。約１,０００,０００を超える正確な粒子数を有する標準についての長年にわたり必要性があったが、このような標準は、妥当な商業規模で産生する事ができなかった。現在の計測機器の制限の結果として、標準又は対照として用いるための比較的多数の粒子、例えば細胞又は微生物、を産生できなかった。
【００１４】
本発明者は、１０００〜１,０００,０００の粒子を有する正確かつ再現性のある標準を産生する方法を新たに開発した。
【発明の開示】
【００１５】
第一態様では、本発明は、１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を含む１０以上の標準のセットであって、当該粒子の規定数が、当該セットの各標準の間で１０％以下の誤差の範囲内である、前記セットを提供する。
【００１６】
当該標準は、液体形態、凍結形態、又は規定数の粒子を含むビーズ又はボールなどの固体形態であってもよい。
【００１７】
好ましくは、当該標準は、規定数の粒子を含む液滴から作成される。
【００１８】
第二態様では、本発明は、異なるバッチで調製される１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を含む標準の複数のセットであって、当該標準が、バッチ間で１０％以下の誤差しか変動しない平均を有する、前記セットを提供する。
【００１９】
本発明のさらなる利点は、バッチ内及びバッチ間で再現性を持って標準を製造できるように標準のバッチ間の変動を低減し又は制御できるということである。
【００２０】
第三の態様では、本発明は、規定数の粒子を含む１０以上の標準からなるセットを形成するプロセスであって、以下の：
１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を、当該粒子を検出することにより計数し、
液滴内に規定数の粒子を回収し；そして
回収ステップを繰り返して、標準のセットであって、当該粒子の規定数が、当該セットの各標準の間で１０％以下の誤差の範囲内である、セットを形成する
を含む、プロセスを提供する。
【００２１】
第四の態様では、本発明は、規定数の粒子を含む１０以上の標準からなるセットを形成するプロセスであって、以下の：
懸濁状態の粒子を準備し；
当該粒子を検出できる手段により懸濁液から１０００〜１,０００,０００の粒子の規定数を選択し；
規定数の粒子を液滴中に捕捉し；そして
規定数の粒子を含む液滴を分注して、標準のセットを形成し、ここで当該粒子の規定数が、当該セット中の各標準間で１０％以下の誤差の範囲内である、
を含む、プロセスを提供する。
【００２２】
第五の態様では、本発明は、規定数の粒子を含む１０以上の標準からなるセットを形成するプロセスであって、以下の：
懸濁状態の粒子を準備し；
当該粒子を検出できる手段により懸濁液から１０００〜１,０００,０００の粒子の規定数を選択し；
凍結体中に規定数の粒子を捕捉し；
複数の凍結体を形成する捕捉ステップを繰り返し；そして
凍結体を乾燥させて、規定数の粒子を含む標準のセットであって、ここで当該粒子の規定数が、各標準の間で１０％以下の誤差の範囲内であるセットを産生する
を含む、プロセスを提供する。
【００２３】
好ましくは、当該粒子の検出が、粒子を検出できる装置により行なわれる。適切な検出システムは、非限定的に、特定波長での吸光度、密度、磁性、比重、インピーダンス、光散乱能力、発光、又は蛍光を含む。さらに、本発明者は、粒子を分析及びソートするために、フローサイトメトリーと併せてコールター検出（Coulter sensing）及びラマン顕微鏡の使用を予期する。
【００２４】
好ましくは、粒子の選別は、サイトメーター、好ましくは液滴中に規定数の粒子を回収できるフローサイトメーターにより行なわれる。
【００２５】
好ましくは、当該製品は、その固体形態で容器間を移すことができる。
好ましくは、当該標準は、液体状態において当該粒子を放出できる。
好ましくは、当該粒子は、細胞、微生物、又は小さい対象から選ばれる。
好ましくは、当該細胞は、精子、卵子、幹細胞、動物細胞、植物細胞、花粉、卵、幼生、胞子又はそれらの混合物から選ばれる。
好ましくは、当該微生物は、細菌、真菌、酵母、ウイルス、プロトゾア、プリオン、又はそれらの混合物から選ばれる。
【００２６】
好ましい形態では、微生物は、レジオネラ(Legionella)、サルモネラ(Salmonella)、レプトスピロシス(Leptospirosis)、サッカロマイシス(Saccharomyces)、クロストリジウム(Clostridium)、ビブリオ(Vibrio)、シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイシス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、カンピロバクター(Campylobacter)、アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、エンテロバクター(Enterobacter)、エンテロコッカス(Enterococcus)、リステリア(Listeria)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、シトロバクター(Citrobacter)、プロテウス(Proteus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、クレブシエラ(Klebsiella)、アエロモナス(Aeromonas)、ジゴサッカロマイシス(Zygosaccharomyces)、アシネトバクター(Acinetobacter)、セラチア(Serratia)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、ロドコッカス(Rhodococcus)、エルシニア(Yersinia)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ガルドネラ(Gardnerella)、マイコバクテリア(Mycobacteria)、ボルデタラ(Bordetalla)、ヘモフィラス(Haemophilus)、シゲラ(Shigella)、クルイヘラ(Kluyvera)、スピロカエート(Spirochaeta)、リゾビウム(Rhizobium)、リゾバクター(Rhizobacter)、ブルセラ(Brucella)、ナイセリア(Neisseria)、リケッチアス(Rickettsias)及びクラミジア(Chlamidia)、並びにその混合物から選ばれる。
【００２７】
好ましい形態では、微生物は、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、ギアルジア(Giardia)、シクロスポラ(Cyclospora)、トキソプラスマ(Toxoplasma)、エイメリア(Eimeria)、及びそれらの混合物から選ばれる。
【００２８】
好ましい形態では、微生物は、製品中で生存している。
好ましくは、小さい対象が、ビーズ、ミネラル粒子、磁性粒子、インク粒子、リポソーム、金属粒子、ナノマシーン、ナノ構造、ナノボット及び乾燥結晶又は生物物質の個別の粒子から選ばれる。
【００２９】
本発明に記載される標準のセットは、細菌、酵母、真菌、ウイルス、植物及び動物細胞などの微生物の規定数でありうる。規定数の粒子は、ビーズ、胞子、卵及び嚢胞でありうる。規定数の粒子、例えばビーズは、被膜されていることもあるし、又は規定量のタンパク質、糖、薬剤、化学物質、又は核酸を含むことがある。或いは、当該粒子は、タンパク質、糖、薬剤、化学物質又は核酸などの化合物の顆粒形態であってもよい。
【００３０】
好ましくは、粒子の規定数は、２０００〜５００,０００である。より好ましくは、規定数は、５０００〜１００,０００である。本発明は特に、１,０００、２,０００、３,０００、４,０００、５,０００、６,０００、７,０００、８,０００、９０００、１０,０００、１５,０００、２０,０００、３０,０００、４０,０００、５０,０００、６０,０００、７０,０００、８０,０００、９０,０００、１００,０００、１５０,０００、２００,０００、３００,０００、４００,０００、５００,０００、６００,０００、７００,０００、８００,０００又は９００,０００粒子からなる規定数を有する標準を産生するの特に有用である。
【００３１】
当該セットは、５以上の標準、１５以上の標準、２０以上の標準、５０以上の標準、１００以上の標準、５００以上の標準、１０００以上の標準、２０００以上の標準、３０００以上の標準、又は４０００以上の標準を含むことができる。
【００３２】
典型的に、本発明に記載される標準は、１０以上、好ましくは約１００以上のバッチで作成され、そして使用するために、１０以上、好ましくは２０以上のより小さいセットでパッケージされる。典型的に、１０、２０、５０、７０、又は１００の標準を含む製品は、消費者に便利である。標準のセットが、必要とされる標準の任意の適切な数を含むことができるということが認められよう。
【００３３】
好ましくは、誤差は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％である。より好ましくは、誤差は１％〜１０％である。
【００３４】
誤差は、好ましくは、標準セットからサンプルを分析し、そして平均及び標準偏差を計算することにより好ましくは測定される。分析されるサンプル数は、一般的に標準の全セットの３％〜１０％である。サンプルの分析は、どれだけ多くの粒子が各サンプル中に存在するかについて正確に計測する手段により行なわれる。
【００３５】
誤差は典型的に、変動係数の割合として定義されている。これは、標準偏差を平均で割り、そして１００をかけることにより計算される。
【００３６】
好ましい形態では、標準が実質的に固体である場合、製品は、規定数の粒子を含む液量を急速凍結し、そして凍結体を乾燥させて適切な固体生成物を形成することにより形成される。好ましくは、急速凍結は、規定数の微生物を含む体積を、低温液体に配置することにより行なわれる。好ましくは、低温液体は、液体窒素、液体ヘリウム、及び液体酸素から選ばれる。より好ましくは、低温液体は液体窒素である。
【００３７】
好ましい形態では、低温液体を容器内に配置し、規定数の粒子を含む液滴を容器内に入れて凍結体を形成し、そして次に凍結体を含む容器を凍結乾燥にかけて、容器中の実質的に乾燥している固体製品を形成する。
【００３８】
好ましくは、乾燥後に、製品の貯蔵及び輸送のために容器に蓋をするか、又は密封される。
【００３９】
好ましくは、実質的に固体製品は、ボール又は球形の小さい丸みを帯びた塊である。
【００４０】
本発明はさらに、粒子タイプの混合物から所望の粒子タイプを選択することをさらに含むこともある。
【００４１】
本発明は、さらに、１以上の補助剤を当該粒子に加えることをさらに含むこともある。好ましくは、補助剤は、凍結保存剤、グリセロール、ジメチルスルホキシド、炭、蜂蜜、グルタミン酸ナトリウム、ラフィノース、動物血清、又はそれらの混合物から選ばれる。
【００４２】
第六の態様では、本発明は、１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子を有する１０以上の標準のセットの製造方法であって、以下の：
(a)   (i)液体ソースから液流中に粒子を移動させる手段；
(ii)液流中の粒子を同定しそして計数するように適用された識別手段；
(iii)廃液を受容するための、識別手段の下流に配置される廃液経路；
(iｖ)所望される数の粒子を含む回収液体を受容するための、識別手段の下流に配置される回収経路；
(ｖ)所望の数の粒子を含む回収経路から液体を分注する分注手段；及び
(ｖi)液流を廃液経路又は回収経路へと仕向ける制御手段
を含む計測装置を準備し；
(ｂ)  計測装置を用いて所望数の粒子を回収し；
(ｃ)  所望される数の粒子を液滴又は一定量に分注して標準を作成し；そして
(ｄ)  分注ステップを繰り返して、標準のセットであって、当該規定数の粒子がセットの各標準の間で１０％以下の誤差の程度の範囲内である、標準のセットを形成する
を含む。
【００４３】
好ましくは、粒子を液流中に移動させる手段はポンプである。
好ましくは、識別手段は以下の：
液流中の粒子を照らす光線を提供する手段；
粒子に関して光を検出し、そして検出された光を、各粒子の１以上の特徴について関連付けて、粒子の特徴に応答するシグナルを作成する手段；
シグナルを受容する手段
を含む。
【００４４】
好ましくは、廃液経路は、廃液回収部に向けられた廃液チューブを含む。
【００４５】
１の好ましい形態では、回収経路は、規定体積を有する捕捉チューブを含む。
【００４６】
別の好ましい実施態様では、回収経路は、規定体積を有する捕捉チューブと    を通過する規定体積を有する回収チューブを含む。
【００４７】
捕捉チューブは、好ましくは入口から出口までの流路を含む。典型的に、当該流路は、約２００ｍｍの規定された長さ(約１０μｌの体積を与える)、好ましくは約１００ｍｍの長さ未満(約５μｌの体積を与える)である。より好ましい長さは、約１５３ｍｍである(約７μｌの体積を与える)。捕捉チューブの流路の正確な長さが、他の因子、例えば流路の直径などに依存して変化しうるということが理解されよう。
【００４８】
本発明に記載される計測装置は、約１μｌ〜５００μｌを分注するのに適している。通常、約１０μｌ〜５０μｌの体積、より好ましくは約４０μｌの体積である。
【００４９】
検出器を通過する粒子数を記録又は計測することができる。所望される数の粒子が分注されるように、流れを制御して、粒子の流れを回収チューブへの流れを停止及び開始することができる。
【００５０】
代わりの検出システムは、特定の波長での吸光度、密度、磁力、比重、インピーダンス、光を散乱する能力、発光、又は蛍光を含む。さらに、発明者は、生体材料などの粒子を分析し、そしてソートするフローサイトメトリーと併せたコールター検出及びラマン顕微鏡の使用を予期する。
【００５１】
分注された粒子数を制御するために流れを停止及び開始させる代わりに、流れは所望される数の粒子が分注されると、廃液へと仕分けられることもある。これは、流れを廃液又はディスペンサーのいずれかに仕向けるスイッチを必要とする。
【００５２】
第七態様では、本発明は、本発明の第二、第三、第四又は第五態様のいずれか１に従ったプロセスにより製造された標準のセットを提供する。
【００５３】
本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」という語句、又は「comprises」「comprising」などの変化形は、記載された要素、整数又はステップ、或いは要素、整数又はステップの群を含むが、他の要素、整数、又はステップ、或いは要素、整数、又はステップの群を除外することはないということを意味すると理解されよう。
【００５４】
本明細書に含まれた、文書、行為、物質、装置、文献などの全ての記載は、単に本発明の背景を提供することを目的としている。これらの事情のいずれか又は全てが、本出願の各請求項の優先日の前にオーストラリアに存在しているからといって、当該事情のいずれか又は全てが従来技術の一部を形成すること又は本発明に関する分野の周知の一般知識であったということを認める物として理解されるべきではない。
【００５５】
本発明をより明確に理解できるようにするため、好ましい実施態様が、添付の図面及び以下の実施例を参照して記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
微生物などの粒子が固有の光物理的性質を示す場合、これらの粒子は、フローサイトメトリー又はコールター分離(coulter separation)を用いて混合物中の他の成分からソートすることができる。微生物の大きさ、形、及び反射指数は、ソートプロセスを行なうための有用なパラメーターである。なぜなら培養された微生物のそのままの懸濁物が、化学的前処理(例えば蛍光標識)を行なわずに識別することができるからである。
【００５７】
慣用されているフローサイトメトリーは、光電子増倍管(ＰＭＴ)を用いてレーザーの焦点で対象から分散又は放出される光を回収する。ＰＭＴからの出力を、アナログ技術を用いて増幅し、そして処理し、そしてこのシグナルを次にデジタル化して、識別及び報告プロセスを手助けした。フローサイトメーターに接続されたホストコンピューターを用いて、ソートプロセスを制御するオンボードマイクロプロセッサーにより使用されるパラメーターをプログラムした。
【００５８】
本発明者らは、粒子を同定及び計数するフローサイトメトリーからの前方散乱及び側方散乱を計測するデジタル識別ユニット(ＳＤＵ)を設計した。さらに、当該ＳＤＵは、正確に制御された数の粒子をサンプル流から単離し、そして捕捉容器にデリバリーするように、回収捕捉チューブを制御するために用いられる。標準フローサイトメーターでは、回収チューブを操作する圧電駆動は、最大周波数３００Ｈｚのパルスモードで駆動される。こうして、回収チューブの最大捕捉スピードは、１秒あたり約３００回である。標準未改変装置は、全ての事象が捕捉されることを保証する低い速度で実行されることが必要とされる。ＳＤＵの制御は、予め決定された数の粒子を捕捉する位置に捕捉チューブを保持し、次に正確なカウントが達成された際に当該メカニズムを放出することにより、この制限を克服した。この様式で、回収速度は、かなり多くの粒子を回収でき、そして高生産率が可能であるように、極めて高く設定されうる。
【００５９】
装置
粒子を一つずつ捕捉するためにサンプル流の中と外へと機械的に動かされる捕捉チューブを使用するBecton Dickinson FACScaliburフローチャンバーを改変して、当該捕捉チューブが粒子のバッチをソートすることを可能にした。捕捉チューブの長さを以前に記載される様に改変し(WO 03/036273)、ソートされた粒子を含む液滴の形成を可能にした。
【００６０】
フローサイトメーターを製品説明書に従って用いたが、当該サイトメーターに追加装備を接続して、データーの高速分析を可能にした。フローサイトメーターを制御するコンピューターとソフトウェアは、１秒あたり、最大で６０００粒子の速度でデーターを分析することができる。当該コンピューターとソフトウェアは、極めて早い速度(最大で１秒あたり１００,０００粒子)でデーターを分析することを可能にするようにバイパスされた。追加装備をこのフローサイトメーターに接続して、上に記載されたようにソートメカニズムの移動を制御した。
【００６１】
前方散乱(ＦＳＣ)と側方散乱(ＳＳＣ)シグナルを、前置増幅ボードから直接とり、そして２つのノイズと閾値比較機に接続した(ＬＮ３１１、National Semi Conductor)。シグナルをＸＹモードでオシロスコープ上に表示して、散乱プロットを生成した。ＬＮ３１１からの閾値線をオシロスコープ上で表示した。２つの電位差計及び増幅器を用いて、オシロスコープ上の閾値線を所望の位置(目的の集合のすぐ下)へと調整した。
【００６２】
閾値よりも高い一致パルス(ＦＳＣ及びＳＳＣ)が同時に検出された場合、標準ＣＭＯＳ論理回路を用いて一致カウントシグナルを生成した。この一致カウントシグナルを、シグナルの数を計数する専用のマイクロコントローラー(Motorola MC68HC11F1)に送った。捕捉チューブの移動を制御するシグナルを伝達するリボンケーブルを介して、マイクロコントローラーをフローサイトメーターのソートボードに接続した。マイクロコントローラーは、ソートされた粒子の数である数の入力を可能にする。マイクロコントローラーは、次に、捕捉チューブを粒子流に移動させる一方、ＣＭＯＳ論理回路から受容されるシグナルの数を計数した。シグナルの数がソートされた粒子の予め決められた数に達した場合、捕捉チューブを粒子の流れから戻した。
【００６３】
改変されたサイトメーターを用いて、実施例において標準のセットを製造したが、得られた誤差の程度で標準のセットを得るために他の手段が使用できるということが認められよう。正確な標準のセットを産生することができるので、より多くの用途に利用できよう。例として、非限定的に、微生物、医薬、臨床、獣医、食品技術、飲料、環境、飲料水、サイトメーター、コールターカウンター、分光光度計、蛍光光度計、質量分析計、照度計、顕微鏡、クロマトグラフィー、ＰＣＲ機械及びリアルタイムＰＣＲ機械などのＤＮＡ増幅装置、伝導計、電気泳動装置、マイクロアレイ、分光器、スペクトログラフ、光度計、蛍光光度計、屈折計、偏向計、ガスクロマトグラフィー、Ｘ線分光計、Ｘ線蛍光分析器、Ｘ線回折計、核磁気共鳴分光計、フロースペクトロメーター及び分光放射計などの装置の較正標準が挙げられる。
【００６４】
使用
１０００超の粒子を含む正確な標準のセットを製造できるので、３の異なる桁数で標準のセットを製造できるということを意味する。例えば、１０、１００、及び１０００の粒子を含む標準のセットが製造できる。このような標準のセットが、分析試験の較正のために有用である。なぜなら当該標準を分析することから得られる結果をグラフにして、検量線を作成することができるからである。次に、当該検量線を使用して、標準のセットの値の間又は外の数値を予測することができる。正確な検量線を作成するために、試験のダイナミックレンジをカバーする３以上の別個の較正標準が使用されるということが重要である。これらの標準のセットを有する較正曲線を作成することは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)などの核酸分析法を較正するのに特に有用である。
【００６５】
本発明に記載される標準のセットは、品質制御目的に有用である。これは、サンプルをスパイクし、そして品質制御のための試験法の回収効率を試験することを含みうる。例えば、食品の分析のために使用される微生物試験法の性能は、食品サンプルに既知の数の微生物を植菌することにより測定することができる。当該サンプルの一部が試験されるべきである大規模サンプルでは、多数の微生物を含む標準についての必要性が存在する。例えば、当該サンプルを１００ｍｌの緩衝化されたペプトン上に配置することにより、２５ｇの鳥サンプルをサルモネラの存在について試験される。１０,０００個のサルモネラ生細胞を含む標準を鳥サンプルに加え、そしてこのサンプル全体をホモジェナイズした。次に１ｍｌの一定量のサンプルをとり、そしてサルモネラ・ペトリフィルム上に配置した。ペトリフィルムをインキュベートし、そしてコロニーの数を数えた。このサンプルでは、もし５０コロニーが検出されたならば、当該方法の回収率は５０％であった。他の食品サンプルに同様の様式で標準をスパイクしてもよい。標準に必要とされる微生物の数は、試験法の感度に依存する。水サンプル、臨床サンプル、環境サンプル及び医薬として許容されるサンプルが同様の様式でスパイクされてもよい。
【００６６】
本発明に記載される標準のセットは、医薬工業において微生物試験のために特に有用である。滅菌試験及び保存効率試験は、微生物をスパイクされるサンプルを必要とする。これらは米国薬局方及び欧州薬局方に記載されている。当該方法は、サンプルにスパイクされた微生物の数が、狭い範囲内であるということが、当該方法により必要とされる。しかしながら、狭い範囲内でのスパイクが、技術的に難しく、そして高い失敗率を有する。１００〜１,０００,０００を含む標準の正確なセットは、これらの困難を克服し、そして薬局方の方法に特によく適している。
【００６７】
１０００〜１,０００,０００粒子を含む標準は、大規模サンプルがとられ、そしてそれより小さいサブサンプルが分析される試験方法での品質制御方法に有用である。当該標準は、当該試験が低い感度しか有さず、その結果多数の粒子が陽性結果を与えるために必要とされる試験法における品質制御法に有用である。
【００６８】
凡その数の粒子をおのおの含む複数の一定量は、１０００〜１,０００,０００粒子を含む標準から生成することができる。当該標準を既知の体積の液体に再水和又は希釈することにより、ある量の液体に既知数の粒子を有する懸濁液を調製することができる。標準として用いる液体の少量を取るために、ピペットを使用することができる。多くの小さい標準が、１つの標準から調製できるということを意味する。これは、多くの標準が必要とされる用途についての費用節約となる解決方法である。再水和又は希釈された標準を低温で貯蔵して、長い期間のあいだ標準の小サブセットの調製を可能にする。
【００６９】
標準のセットから標準の複数のサブセットを調製する方法は、医薬工業の微生物試験についての特に有用な費用節約となる方法である。製薬会社における品質管理研究室は、滅菌試験の間において増殖促進研究について１０〜１００の微生物を含む多数の標準を用いる。１０００〜１,０００,０００の微生物を含む標準を用いて、１０〜１００の微生物を含む、多数の少量の一定量を調製するために使用できる。これは、薬局方により必要とされる正確なレベルに適合する標準を調製する有効量である。
【００７０】
標準のセットから標準の複数のサブセットを調製する方法は、水及び食品微生物試験工業においても有用である。５〜１０００の範囲の微生物の正確な数を含む凍結乾燥ペレット形態の標準は、食品及び水試験研究室により現在使用されている。これらの標準は、単一のサンプル又はプロセスをスパイク又は試験するために使用される。１の標準は、１のサンプルをスパイクするために使用される。多数のこれらの標準が必要とされる場合、これらの標準について必要とされる費用は極めて高い。多くの数の微生物を含む標準を使用することにより、研究室は、多くの目的のため十分な精度を有する複数のサブサンプルを作成することができる。この例は、１００００のＥ.ｃｏｌｉ生細胞を含む凍結乾燥ペレットの形態の標準のセットである。水試験研究は、各々が凡そ１００個の細胞を含むサブサンプルを作成した各日にこれらの標準のうちの一つを使用できる。これを行なうために、研究室は、凍結乾燥ペレットを１０ｍｌの滅菌水に再水和する。この１０ｍｌのサンプルは次にボルテックスにより完全に混合される。１００μｌの体積の一定量を次にサンプルから写し、そして水サンプルをスパイクするために使用した。各１００μｌは、約１００個の大腸菌を含む。各一定量の細胞の数の変化は、使用されるピペットの正確性及び精度に依存するが、典型的に７０から１３０の細胞である。このレベルの生存性は、水サンプルを大腸菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)でスパイクするのに十分であることが多い。再水和された標準を冷蔵庫で数日間、大腸菌細胞に有害な効果を与えることなく貯蔵することができる。これは、水生微生物試験研究所における標準としての要求を満たすかなり費用効率のよい方法である。食品及び臨床微生物研究所における費用効率的な標準についての同様の要求が存在する。
【００７１】
１０００〜１,０００,０００粒子を含む標準は、粒子を取り除き又は不活性化するように設計されている装置の性能を試験するためにも有用である。この例は、水から粒子を取り除くように設計されたフィルターである。本発明に従った標準のセットは、どれだけ多くの粒子がフィルターを通過するかを正確に決定するために水フィルターを検証するために使用することができる。このように試験できるプロセスの例として、ろ過、加熱及び圧力処理、例えばオートクレーブ、超音波処理、凝結、イオン化、クロマトグラフィー、電気泳動法、乾燥及び化学的又は酵素的溶解などを含む。これらの例の全てとして、比較的多数の粒子を含む標準は、除去プロセスの有効性を正確に決定するために必要とされている。
【００７２】
１０００〜１,０００,０００の粒子を含む標準のセットが有用である他の例は、細胞又は微生物を不活性化する消毒の試験又は検定である。消毒法の有効性は、１０００〜１,０００,０００の微生物又は細胞を含む標準でサンプルをスパイクすることにより試験することができる。次にサンプルを消毒法で処理し、そしてどれだけ多くの微生物又は細胞が生存しているかを決定するために試験される。消毒法の例として、照射、熱処理、塩素処理及びオゾン処理が挙げられる。
【００７３】
同様に、これらの標準のセットは、抗生物質、トキシン、及び保存剤などの抗微生物剤の有効性を試験するのに有効である。標準は、ホストセルの生存度について薬剤の効果を決定するために有用である。例えば、癌性及び非癌性細胞についての癌治療の効果は、癌性及び非癌性細胞の標準のセットを調製し、そして標準内の細胞の生存性について処理の効果を試験することにより評価することができる。
【００７４】
多数の粒子を含む標準のセットは、工業、環境及び臨床追跡試験において追跡目的に有用である。このような試験では、多数の粒子を含む標準は、低いレベルを正確に追跡することを可能にすることが必要とされる。例えば、下水排出口から河川への、そして排出口の下流のサンプリング地点への病原性微生物の移動を決定するために、下水排出口は、追跡可能な粒子、例えば蛍光ビーズ又は遺伝的に改変された細菌などの追跡可能な粒子を含む標準でスパイクされる。標準は、多数の追跡可能な粒子を含むことが必要とされ、そうでない場合河川での希釈は、当該粒子を検出できないレベルへと迅速に希釈してしまう。
【実施例】
【００７５】
実施例１
フローサイトメーターは、上に記載される様にかなり再現性のある数の粒子を含む液滴を製造することを可能にするように改変された。
【００７６】
エシェリシア・コリの調製
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)の株(ＮＣＴＣ９００１)を、１.６％(ｗ/ｖ)トリプトン及び１％(ｗ/ｖ)酵母抽出物、ｐＨ７.２において３７℃で２４時間増殖させた。細胞を最初にろ過済み(０.２２μｍ)リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(Sigma Chemical Company, Sydney NSW)で１：１０００に希釈し、そして直ぐに分析した。イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)を１秒あたり所望される数の細胞を得るためにフローサイトメーターで調節した。
【００７７】
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)の分析
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)のサンプルをフローサイトメーターに充填した。シース液は、ろ過された(０.２２μｍ)ＰＢＳ(Sigma Chemical Company)、ｐＨ７.４からなった。側方散乱及び前方散乱についての電圧を、イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)を表す集合が散布図の中央になるまで調節した。
【００７８】
オシロスコープを用いてデーターを試験し、そして２個の閾値線は、イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)細胞の集合の下に位置した。カウンターを１００の値にセットし、そしてソートプロセスを行なった。
【００７９】
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)の濃度を調節して、１秒あたり５００〜１００,０００細胞のデーター割合をもたらすように調製し、そしてソートプロセスを異なる割合の１秒あたりの細胞で繰り返した。
【００８０】
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)を含む液滴の集合
ソートされたイー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)を含む液滴を栄養アガープレート上に直接回収し、そしてプレートを回転することにより広げた。プレートを次に３７℃で１２時間インキュベートし、そしてコロニーを計数した。
【００８１】
液滴の凍結及び凍結乾燥
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)のサンプルを、一秒あたり３０,０００細胞の割合で分析し、１３,０００イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)細胞を含むサイトメーターから得た液滴を、液体窒素を含む試験管に回収した。液滴を回収した後に、試験管をTelstar Lyobeta凍結乾燥機に配置し、そして２×１０-1Torrの吸引及び-５０℃の濃縮温度で、一晩乾燥した。
【００８２】
翌日、凍結乾燥された粒子を凍結乾燥機から回収し、そして個別に１０ｍｌ滅菌生理食塩水溶液(０.７％)にいれ、そして完全に混合させた。２００μｌの一定量を次に栄養アガー上に撒き、滅菌プラスチックスプレッダーで広げ、そして３７℃で１２時間インキュベートした。
【００８３】
ピペットで希釈することによる液滴の製造
フローサイトメーターにより調製された液滴との比較として、約１００００CFUを含む液滴を連続希釈により調製し、そして次にパスツールピペットで液体を形成した。液滴を液体窒素に入れ、そして凍結乾燥をし、そして次に上記のように分析した。
【００８４】
異なるデーター割合で１００個の細胞をソートした結果
細胞の様々な割合で調製された液滴から回収されたイー.コリ(E.coli)の数。
【表１】
2009525470.tif 000002
【００８５】
回収数は再現性があり、そして誤差は、１秒あたり５０,０００細胞の割合で低かった。
【００８６】
１３,０００個のイー.コリ(E.coli)を含む液滴を凍結乾燥させた結果
表２は、１３,０００個のイー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)細胞を含む凍結乾燥された液滴中で検出されるＣＦＵ数の詳細を示す。
【００８７】
【表２】
2009525470.tif 000003
【００８８】
サイトメーターが産生した液滴内に検出されるＣＦＵ数は、ピペットで調製された液滴よりも、５倍超の優れた再現性がある。
【００８９】
実施例２
実施例１で使用されたのと同じ改変サイトメーターを用いて、正確な数の微生物を含んだ液滴を産生した。微生物中のＤＮＡのある断片を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)により検出した。標的ＧＦＰ ＤＮＡの単一コピーを各々含む細胞の正確な数を、ログスケールを用いることにより検量線を作成した。
【００９０】
イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)の調製
緑色蛍光タンパク質遺伝子(ＧＦＰ)を組み込まれたエシェリシア コリ(Escherichia coli)BL21を、３７℃で２１時間増殖させた。これをろ過済み(０.２２μｍ)脱イオン水で希釈し、そして実施例１のサイトメーター上で、ろ過済み(０.２２μｍ)脱イオン水をシース液として用いて分析した。
【００９１】
５及び５０ｃｆｕをソートするために、サイトメーター・ソート・メカニズムをＷＯ２００３/０３６２７３に詳述されるとおりに用いた。５００及び５０００ｃｆｕの液滴を得るために、改変されたサイトメーターを用いた。
【００９２】
Ｅ.ｃｏｌｉ液滴の回収及び凍結乾燥
４種のｃｆｕ、５、５０、５００、及び５０００ｃｆｕの各々のために、９６ウェルＰＣＲプレートへと直接３個の液滴を個別に回収した。実施例１に記載される様にプレートをTelstar Lyobeta中に凍結乾燥した。
【００９３】
ＰＣＲアッセイの準備
凍結乾燥の直後に、ＰＣＲアッセイ液を各反応ウェル(ｒｘｎ)に加えた：
Ｓｙｂｒグリーンマスターミックス(APPLIED Biosystems, Sydney)１０μｌ/ｒｘｎ、GFPインサートについてのフォワード及びリバースプライマー３００ｎMを各２μｌ/ｒｘｎ(Sigma Chemical Company、 Sydney, NSW)をろ過済み(０.２２μｍ)試薬水８μｌ/ｒｘｎ。
【００９４】
ＰＣＲプレートを、ＲｅａｌｐｌｅｘＳ４(Eppendorf, Germany)を用いて、９５℃で１５秒、６０℃で１分のサイクルを４０回繰り返した。
【００９５】
ＰＣＲ分析についての５、５０、５００、及び５０００ｃｆｕのイー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)のソート結果
４個のｃｆｕの各々の３個の複製産物を開始ｃｆｕ数(これは、ＧＦＰ ＤＮＡの開始コピー数と等しい数)のログスケールでプロットした。熱サイクル数(Ｃｔ)は、Ｃｙｂｒグリーン蛍光を検出するためにＲｅａｌｐｌｅｘ装置に必要とされた。バックグランド基線を越える蛍光の閾値を、Ｙ軸にプロットした。４個の異なるコピー数の間に見られるトレンドラインを図１に示す。
【００９６】
【表３】
2009525470.tif 000004
【００９７】
ソートされた正確な数のイー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)の複製産物間の変動は、かなり正確であり、開始コピー数についての既知の正確な絶対量を用いて、正確な検量線を作成することを可能にする。変動は、ＰＣＲ法の検出限界に近い低コピー数で増加した。
【００９８】
検量線でＤＮＡの標準コピーの開始数を測定する標準的な方法は、ＤＮＡの濃縮ストックの定量的分光光度計での光学密度分析、及び正確なストックの希釈に依存する。ＤＮＡコピーの実際の数は、その結果、常に複製サンプルとの間の潜在的な広範囲の変動を用いて近似される。
【００９９】
実施例３
標準のセットを得るための従来技術の方法の一般的な正確性を示すために、 比較例が行なわれた。微生物細胞の希釈を調製し、そして凍結乾燥して、１,０００,０００の生細胞を含む凍結乾燥粒子を提供した。
【０１００】
細胞の調製
エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)ＮＣＴＣ７７５を、１.６％(ｗ／ｖ)トリプトン及び１％(ｗ／ｖ)酵母抽出物、ｐＨ７.２中で、３７℃で２４時間増殖させた。当該培養物は、約２.５×１０9細胞／ｍｌを含んだ。
【０１０１】
細胞の希釈
幾つかの異なる希釈液を調製して、凍結乾燥後に最終細胞数を試験した。これらの希釈液を、連続二日間で２回行なった。
希釈１：５０％のＰＢＳと混合された５０％の培養物
希釈２：９５％のＰＢＳと混合された５％の培養物
希釈３：９９.５％のＰＢＳと混合された０.５％の培養物
【０１０２】
凍結乾燥された液滴の調製
各培養物を混合し、そしてガラス製パスツールピペットを満たし、そして一滴の培養液の液滴を作り出した。液体窒素を含む試験管の中に当該液滴を落として凍結させた。試験管を次にTelstar Lyobetaに写し、そして実施例１に記載される様に凍結乾燥させた。
【０１０３】
翌日に、凍結乾燥された粒子を凍結乾燥機から取り出し、そして個別に５０ｍｌの滅菌生理食塩水(０.７％)に入れ、そして完全に混合した。
【０１０４】
３００ｃｆｕ未満であり、そしてその結果アガープレート上で計測可能であるアガープレート上でカウントを数えるため、凍結乾燥された液滴を以下のように希釈した。
希釈１：５０ｍｌの希釈液から１０μｌを１ｍｌの生理食塩水に加え、混合し、２０μｌを各プレートに加えた(希釈率×２５０,０００)
希釈２：５０ｍｌの希釈液から５μｌを各プレートに加えた(希釈率×１０,０００)
希釈３：５０ｍｌの希釈液から５０μｌを各プレートに加えた(希釈率×１０００)。
【０１０５】
全ての希釈液をウマ血液アガー上に撒き、滅菌プラスチック製スプレッダーを用いてスプレッドし、そして３７℃で１５時間インキュベートした。
【０１０６】
細菌数の結果を表４に要約する。
【０１０７】
【表４】
2009525470.tif 000005
【０１０８】
凍結乾燥された粒子につき１,０００,０００細胞に最も近い結果を、第一実験における希釈２を用いて得られた。しかしながら、実験を繰り返す場合、培養物そのもの又は希釈系列における初期細胞数は、繰り返し希釈においてかなり異なるコロニー数を与えた。凍結乾燥粒子内の細胞と同じ数は、細胞の希釈がされる場合に不可能である。
【０１０９】
実施例４
２０００〜１,０００,０００微生物のサンプルを調製する従来技術の手段を超える本発明の効力をさらに示すために、比較例を以下に提供する。
【０１１０】
本発明以前では、１００,０００個の微生物というサンプルが必要とされる場合、微生物の濃縮サンプルから調製された。サンプル中の微生物の数が(適切な任意の手段により)計測された。サンプルが所望の数より少ない場合、必要数の微生物が加えられる。同様に、サンプルが所望される数よりも多かった場合、一定量がサンプルから取り除かれて微生物の数を低下させた。当該プロセスを大体の数が得られるまで繰り返した。標準のセットが必要とされる場合、当該方法は複数のサンプルについて行なわれた。理解できるように、このプロセスは時間がかかり、そして１０％以下の誤差を有する標準のセットをもたらすことができなかった。
【０１１１】
このような、要領の悪い方法を用いることは、約２０％を超える誤差をもたらす。本発明以前では、規定数の粒子が、各標準間で１０％以下の誤差であるサンプルセットを達成することができなかった。
【０１１２】
本発明は、以下の用途：微生物試薬、培地及びプロセスの品質制御；研究室熟練スキーム；試験キットの品質制御、暴露試験；消毒効率試験；抗微生物処理の試験；医薬試験の品質制御；食品試験の品質制御；臨床試験の品質制御；水試験の品質制御及び飲料試験の品質制御の標準を作成するのに適している。
【０１１３】
表５は、本発明に従って標準として適切である細菌のリストを含む。しかしながら、以下の表は網羅的ではないということが認められよう。
【０１１４】
【表５】
2009525470.tif 000006
【０１１５】
【表６】
2009525470.tif 000007
実施例６
【０１１６】
１０,０００ＣＦＵを含む２０００のサンプルのセットが、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、シュードモナス・フルオレセンス(fluorescens)、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)及びエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)について調製された。実施例１に記載される方法が、本発明によるか、又はピペットで液滴を作成すること(従来技術)のいずれかにより、サンプルのセットを製造するために使用された。
【０１１７】
各セットからのサンプルを、各サンプルのＣＦＵの数を測定するために、適切なアガープレートへとプレーティングすることにより分析した。各サンプルセットの誤差は、以下の表６に示される。
【０１１８】
【表７】
2009525470.tif 000008
【０１１９】
本発明に従って調製されたサンプルセットの誤差は、４.２％〜８.４％の範囲であった。比較として、発明者に知られている最も正確な従来技術の方法によって調製されたサンプルについての誤差は、２０％を超えていた。さらに、他の方法は、３０％を超える誤差を有する。
【０１２０】
本発明を用いて、１０,０００の微生物数を有する多数の異なるサンプルセットが製造された。各セットにおけるサンプルの誤差の範囲は、４.０〜８.５％の範囲を有した。
【０１２１】
本発明は、短い製造時間を有する。一般的に、細菌の４０００の株のセットが、２時間以内に作成することができる。本発明以前では、このような生産工程は不可能であり、そして１日以上かかることがあった。
【０１２２】
【表８】
2009525470.tif 000009
【０１２３】
【表９】
2009525470.tif 000010
【０１２４】
【表１０】
2009525470.tif 000011
【０１２５】
【表１１】
2009525470.tif 000012
【０１２６】
【表１２】
2009525470.tif 000013
【０１２７】
【表１３】
2009525470.tif 000014
【０１２８】
広く記載された本発明の本質又は範囲から逸脱することなく、具体的実施態様に示される本発明に対して多くのバリエーション及び/又は改変が成され得るということが当業者により認められよう。その結果、本実施態様は、全ての点において例示として、考慮すべきであり、そして制限的ではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、細菌の４つの異なる遺伝子のコピー数の間の標準曲線を示す。
【図１】
2009525470.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月15日(2008.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーにより検出できる細胞、微生物、又は小さい対象から選ばれる規定数の粒子を含む１０以上の標準のセットを製造する方法であって：
１０００〜１,０００,０００の規定数の粒子をフローサイトメーターにより計数し；
フローサイトメーターから分注された液滴中に規定数の粒子を回収し；
当該計数と回収ステップを繰り返して、標準のセットであって、当該粒子の規定数が、当該セットの各標準の間で１０％以下の誤差の範囲内である、前記セットを形成する
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記細胞が、精子、卵子、幹細胞、動物細胞、植物細胞、花粉、卵、幼生、胞子又はそれらの混合物から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、細菌、真菌、酵母、ウイルス、プロトゾア、プリオン又はそれらの混合物から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、レジオネラ(Legionella)、サルモネラ(Salmonella)、レプトスピロシス(Leptospirosis)、サッカロマイシス(Saccharomyces)、クロストリジウム(Clostridium)、ビブリオ(Vibrio)、シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイシス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、カンピロバクター(Campylobacter)、アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、エンテロバクター(Enterobacter)、エンテロコッカス(Enterococcus)、リステリア(Listeria)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、シトロバクター(Citrobacter)、プロテウス(Proteus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、クレブシエラ(Klebsiella)、アエロモナス(Aeromonas)、ジゴサッカロマイシス(Zygosaccharomyces)、アシネトバクター(Acinetobacter)、セラチア(Serratia)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、ロドコッカス(Rhodococcus)、エルシニア(Yersinia)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ガルドネラ(Gardnerella)、マイコバクテリア(Mycobacteria)、ボルデタラ(Bordetalla)、ヘモフィラス(Haemophilus)、シゲラ(Shigella)、クルイヘラ(Kluyvera)、スピロカエート(Spirochaeta)、リゾビウム(Rhizobium)、リゾバクター(Rhizobacter)、ブルセラ(Brucella)、ナイセリア(Neisseria)、リケッチアス(Rickettsias)、クラミジア(Chlamidia)、又はそれらの混合物から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、ギアルジア(Giardia)、シクロスポラ(Cyclospora)、トキソプラスマ(Toxoplasma)、エイメリア(Eimeria)、及びそれらの混合物から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記小さい対象が、ビーズ、ミネラル粒子、磁性粒子、インク粒子、リポソーム、金属粒子、ナノマシーン、ナノ構造、ナノボット、生体物質の乾燥化、結晶化、若しくは個別化された粒子、又はそれらの混合物から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子の規定数が、２０００〜５００,０００である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子の規定数が、５,０００〜１００,０００である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標準のセットが、液体形態、凍結形態、又は固体形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体形態が、規定数の粒子を含むビーズ又はボールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記誤差が、１％〜１０％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標準が、固体形態において容器間で移すことができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標準が、液体状態で粒子を放出することができる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により産生された標準のセット。
【請求項１５】
１０〜１０００の標準を含む、請求項１４に記載の標準のセット。
【請求項１６】
２０個の標準、又は５０個の標準、又は１００個の標準、又は５００個の標準、又は１０００個の標準を含む、請求項１５に記載の標準のセット。
【請求項１７】
異なるバッチで調製された請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により製造された１０以上の標準の複数のセットであって、当該標準が、１０％以下の誤差によりバッチ間で変化する平均を有する、前記標準の複数のセット。
【請求項１８】
前記誤差が、１％〜１０％である、請求項１７に記載の標準の複数のセット。
【国際調査報告】
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