(57)【要約】  本発明は、アミド化によって修飾されたグラルギンインスリン、特にＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇアミド（Ｂ３２）ヒトインスリン（グラルギンアミドインスリン）に関する。【選択図】  図１
2009542741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド化されたインスリングラルギン。
【請求項２】
Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−ＮＨ2ヒトインスリン（インスリングラルギンアミド）の形態にある、請求項１に記載のアミド化されたインスリングラルギン。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアミド化されたインスリングラルギンアミドを調製するための方法。
【請求項４】
Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンの形態のインスリングラルギンアミドの前駆体を、組換え的に調製し、トリプシン活性を有する酵素の存在下でアルギニンアミドとカップリングを行い、そしてインスリングラルギンアミドを単離する、請求項２に記載のインスリングラルギンアミドを調製するための、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
糖尿病を治療するための薬剤を製造する方法における、請求項１に記載のアミド化されたインスリングラルギンの使用。
【請求項６】
インスリングラルギンアミドをＩ型又はＩＩ型の糖尿病を治療するための薬剤を製造する方法において使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
インスリングラルギンアミドを含む医薬品。
【請求項８】
水性製剤を表す、請求項７に記載の医薬品。
【請求項９】
散剤を表す、請求項７に記載の医薬品。
【請求項１０】
インスリングラルギンアミドが、溶解された形態、結晶形態及び／又は無定形形態で存在する、請求項８に記載の医薬品。
【請求項１１】
１つ又はそれ以上のエキセンディン−４誘導体、又はＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）の活性に匹敵する活性を特徴とするペプチドをさらに含む、請求項８に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド化によって修飾されているインスリングラルギン、特にＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇアミド（Ｂ３２）ヒトインスリン（インスリングラルギンアミド）に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で約１億７千７百万人の人が、糖尿病に罹患している。これらには、現在のところ欠損している内分泌性インスリン分泌のその置換が唯一の可能な治療法である約１７００万人のＩ型糖尿病患者が含まれる。患者は、通常１日に何度ものインスリン注射に、生涯を通じて依存している。ＩＩ型糖尿病は、インスリンの欠乏が必ずしも存在しない点でＩ型糖尿病と対照的であるが、多くの症例では、特に進行した段階において、経口抗糖尿病薬と適切に組み合わせたインスリンによる治療が、最も好ましいタイプの治療法であるとされている。
【０００３】
健常者において、膵臓のβ細胞によるインスリンの放出は、血中グルコース濃度に厳密に結びついている。食後に生じる高血糖レベルなどの高血糖レベルは、インスリン分泌における対応した上昇によって、迅速に補償される。空腹状態において、血漿インスリンレベルは、インスリン感受性の器官及び組織へのグルコースの継続的な供給を保証し、夜間に肝臓グルコース生産を低く維持するのに十分であるベースライン値にまで低下する。外来性インスリンによる、通常インスリンの皮下投与による内在性インスリン分泌の置換は、通常は上述の血中グルコースの生理学的レギュレーションの質に近づくことはない。糖尿病患者がそれぞれの状況を不正確に判断するので、血中グルコースレベルの上向き又は下向きの乱れがしばしば起こる。しかしながら、さらに、何年間も続く高血中グルコースレベルは、初期症状がないのに、健康上のかなりの危険を呈する。米国における大規模なＤＣＣＴ研究（The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977986）は、慢性的に上昇した血中グルコースレベルが実質的に、後期糖尿病合併症の発症の原因になることを明快に証明した。後期糖尿病合併症は、微小血管及び大血管の損傷であり、これは幾つかの状況において、網膜症、腎症又は神経障害として現れることになり、そして失明、腎不全及び四肢の喪失に至り、さらに心臓血管障害の増大した危険と関連する。糖尿病の改善された治療法が、生理学的範囲内に可能な限りきっちりと血中グルコースを維持することを何よりもまず目的としなければならないことは、そこから推定すべきである。強化インスリン療法の方針は、速効性及び遅効性インスリン製剤を１日に何度も注射することによって、これを達成しようとするものである。速効性の製剤は、血中グルコースの食後の上昇を補償するために食事の時に与えられる。遅効性の基礎インスリンは、特に夜間低血糖に至らしめることなくインスリンの基礎供給を保証しようとするものである。
【０００４】
インスリンは、２個のアミノ酸鎖に分割される、５１個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸を、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸を有する。鎖は、２個のジスルフィド架橋によって一緒に連結される。インスリン製剤は、糖尿病の治療のために長年使用されてきた。さらに、天然のインスリンだけでなく、より最近ではインスリン誘導体及び類似体も使用される。
【０００５】
インスリン類似体は、天然インスリン、すなわち、ヒトインスリン又は動物インスリンの類似体であり、これは少なくとも１つの天然アミノ酸残基の他のアミノ酸残基による置換によって、及び／又は対応する、さもなくば同一の、天然のインスリンからの少なくとも１つのアミノ酸残基の付加／欠失によって、異なる。例えば米国特許第５，６５６，７２２号には、例えばインスリングラルギン（Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン）が記載されている。付加される及び／又は置換されるアミノ酸残基は、天然には生じないアミノ酸残基でもあってもよい。
【０００６】
インスリン誘導体は、天然インスリン又はインスリン類似体の誘導体であって、ここで、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基、並びに／又はＡ鎖及び／若しくはＢ鎖のＮ末端若しくはＣ末端が、官能基によって置換される。官能基は、アミド残基、アミン残基、カルボキシル残基、アルキル残基、アルコール残基及びアルコキシ残基を含む群より選択される。
【０００７】
効率的なインスリン療法は、いわゆる基礎インスリンを活用する。基礎インスリンは外来投与インスリンのゆっくりとした継続的な放出を可能にする製剤を意味する。この療法で、糖尿病に罹患しているヒトの生理学的状態に及ぼす有利な効果を有する、身体中のベースラインインスリン濃度を、長期にわたって達成する。理想的には、インスリンの効果の開始を遅延させ、可能な限りフラットな時間／効果プロファイルを持たせ、短時間低血糖のリスクを、明白に最小にし、食物をあらかじめ摂取しなくても、投与を可能にする。
【０００８】
組換えインスリン類似体Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン（インスリングラルギン；米国特許第５，６５６，７２２号）は、これに関連して、基礎効果を達成するために、わずかに２４時間ごと、すなわち１日に１回のみ身体に供給する必要がある多くの患者において重要である。血中グルコースのコントロールは、改善され、例えばＨｂａ１ｃレベルの低下をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，６５６，７２２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977986
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
いまや驚くべきことに、インスリングラルギンの位置Ｂ３２におけるアルギニンのアミド化から生成するインスリングラルギンアミドが、インスリングラルギンそれ自体よりも明らかにフラットな、従って有利な時間／効果プロファイルを示すことを発見した。作用の開始時に、血中グルコースレベルは、顕著な最低ポイント（底）なしに低下する。このことは、インスリングラルギンアミドが、薬理学的な意味において驚くべき有利な性質を有することを意味する。従って、投与の際の低血糖症のリスクは、最小化される。ランタスアミドの投与は、７０〜１１０ｍｇ／グルコースｄＬの正常な空腹状態血中グルコースレベルを回復させる。さらに、インスリングラルギンアミドは、驚くべきことに、インスリングラルギンと比較して持続した効果を示す。本発明は従って、インスリングラルギンアミドに関する。
【００１２】
これに関連して、当業者には、インスリングラルギンアミドが、医薬製剤と関連することが明白である。これが意味するのは、投与後にインスリングラルギンアミドの効果を最良の様式で有利に示す医薬混合物である。これに関連して、水性液剤が、基礎とされる。さらなる成分は、適切に混和性でなければならない。製剤に、動物源由来の何れかの成分を含めようとしなかったことは有利である。従ってウイルス汚染のリスクが最小化される。さらに、保存料を添加することによって、微生物汚染を防止することは有利である。等張化剤を添加することによって、投与部位での組織細胞の生理学に及ぼす製剤の起こり得る副作用を補償することは可能である。プロタミンを添加することにより、安定化効果を得ることができ、実質的に塩を含まないインスリン製剤を、プロタミンの製剤への添加を介して得ることが可能である。フェノール性成分の添加によってインスリン類似体の六量体構造が安定化し、従って、作用の開始に及ぼす遅延効果を促進し得る。グラルギンアミドは、開発中のApidra（登録商標）、NovoRapid（登録商標）、Humalog（登録商標）等の速効性インスリン若しくはインスリン誘導体、又は対応する時間／作用プロファイルを有する製剤と並行して与えることができる。これと関連して、それぞれのインスリン成分の適切に製剤化された混合物を、本目的のために使用し得ることも、当業者に明らかである。さらに、本アミドは、Exubera（登録商標）等の吸入可能なインスリンを使用する個体が摂取でき、好ましい。グラルギンアミドはさらに、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）の活性に匹敵する活性によって特徴が説明されるペプチドを含む医薬製剤で使用することが可能である。このようなペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）、エクセナチド（Byetta（登録商標））又は、ペプチドの調製が国際特許出願公開WO2006/058620、WO2001/04156及びWO2004/005342において記載される前記ペプチドによって例示される。
【００１３】
本件特許出願と同日に続けて出願した「二塩基性Ｂ鎖末端を有するインスリン類似体を調製するための方法」という表題の特許出願に、とりわけインスリングラルギンアミドを調製するための方法を記載している。これは、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンに対するトリプシン触媒連結反応による高収量のアルギニンアミドの付加を引き起こす。この場合、好ましい産物が、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）アミドの形態のインスリン類似体であるよう、反応を調節することが可能である。特に、保護されたアルギニン誘導体が、様々な溶媒に不安定である可能性について、文献に記載がある。この理由のために、ペプチド化学において改善された安定性をもたらす新たな保護基が、継続的に開発されている。収量に及ぼす正の影響は、保護基又はアミド基に従って反応条件を変えることによって可能である。このことは、当業者によく知られており、本発明はそれにも関する。米国特許第５，６５６，７２２号には、融合タンパク質の一部としてミニプロインスリンの発現を可能にするプラスミドｐＢ４０及びｐＩＮＴ９１ｄが記載されている。インスリンＡ鎖の位置２１におけるグリシンによるアスパラギンの置換によって、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ミニプロインスリンを、これらの融合タンパク質から直接調製することができ、そしてそれをトリプシン消化の後、インスリングラルギンアミドを調製するための、前駆体に直接変換することができる。対応する融合タンパク質は、細胞内で必ずしも調製される必要はない。また、このプロインスリン類似体が、続いて周辺質への及び／又は培養上清への分泌を伴う細菌発現によっても調製され得ることは当業者に明らかである。欧州特許出願公開第１，３６４，０２９（Ａ）号には、一例としてこれが記載されている。本発明は、このような細菌法からの発現後に直接的に得られるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン前駆体の使用にも関する。
【００１４】
インスリン類似体のアミド化は、一般的に、様々な地点で行うことができる。Ｃ末端カルボキシル基をアミド化したインスリングラルギンは、インスリングラルギンアミドと呼ばれる。
【００１５】
さらに、例証として記載した発現システムが、タンパク質の組換え調製のために開発された宿主／ベクター系の小さなセグメントのみを表すという事実は、当業者にはよく知られている。従って、標的ペプチドの調製を可能にする宿主／ベクター系も、本発明の一部を形成する。
【００１６】
従って、本発明は、アミド化されたインスリングラルギン、特にＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−ＮＨ2ヒトインスリン（インスリングラルギンアミ
ド）の形態のアミド化されたインスリングラルギンに関する。
本発明はさらに、アミド化されたインスリングラルギンアミド、特にインスリングラルギンアミドを調製するための方法であって、ここでＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンの形態のインスリングラルギンアミドの前駆体を、組換え的に調製し、トリプシン活性を有する酵素の存在下でアルギニンアミドとカップリングを行い、そしてインスリングラルギンアミドを単離する方法に関する。
【００１７】
本発明はさらに、糖尿病、特にＩ型又はＩＩ型糖尿病、を治療するための薬剤を製造する方法におけるインスリングラルギンアミドの使用に関する。
【００１８】
本発明はさらに、特に水性製剤又は散剤を表すインスリングラルギンアミドを含む医薬品に関する。
【００１９】
医薬品は、好ましくは注射目的のための溶液又は懸濁液である医薬製剤であり；それはある含量の、少なくとも１つのアミド化されたインスリングラルギン、特にインスリングラルギンアミド、並びに／又は少なくとも１つの溶解された形態、無定形形態及び／若しくは結晶形態、好ましくは溶解された形態にある生理学的に許容されるその塩を特徴とする。
【００２０】
製剤は、好ましくはｐＨ約２．５〜８．５、特に４．０〜８．５を有し、
適した等張化剤、
適した保存料、及び
適切な適した緩衝液
を含み、また好ましくは特定の亜鉛イオン濃度
を含み、全てが、自然に滅菌水溶液中にある。製剤担体は、活性成分とは別に製剤成分全体を形成する。
【００２１】
適した等張化剤は、グリセリン、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウム又はマグネシウムの化合物、例えばＣａＣｌ2等である。
【００２２】
アミド化されたインスリングラルギン又は生理学的に許容されるその塩の溶解度は、弱酸性のｐＨ値で等張化剤及び／又は保存料の選択によって影響される。
【００２３】
適した保存料は、例えばフェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール及び／又はｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルである。
【００２４】
特にｐＨを約４．０〜８．５間に設定するために使用可能な緩衝物質は、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等である。他に、生理学的に許容される希酸（典型的にはＨＣｌ）又は希アルカリ（典型的にはＮａＯＨ）も、ｐＨを設定するのに適している。
【００２５】
製剤が、亜鉛含量を有する場合、１μｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬのもの、特に亜鉛５〜２００μｇ／ｍＬが好ましい。
【００２６】
本発明の製剤の活性成分プロファイルを変える目的のために、未修飾インスリン、好ましくはウシ、ブタ又はヒトインスリン、特にヒトインスリン、又はそのインスリン類似体及び誘導体を混合することも可能である。同様に、１つ若しくはそれ以上のエキセンディン−４、又はＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）の活性に匹敵する活性を特徴とするペプチドを混合することが可能である。同様に、本発明は、このような医薬品（製剤）に関する。
【００２７】
好ましい活性成分濃度は、約１〜１５００国際単位／ｍＬ、さらに好ましくは約５〜１０００国際単位／ｍＬ、及び特に約４０〜４００国際単位／ｍＬに相当する濃度である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】イヌにおける様々なインスリン類似体の血糖低下作用。ＲＲ−ＣＯＯＨ＝インスリングラルギン；ＲＲ−ＮＨ2＝インスリングラルギンアミド。
【実施例】
【００２９】
以下に、それに制限されることのない実施例によって本発明を、更に詳細に説明する。
【００３０】
実施例１：パン酵母によるヒルジンＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリン融合タンパク質の分泌のための遺伝子配列
欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号により、酵母における価値のある医薬的に関心のあるタンパク質の発現及び分泌のための融合パートナーとしてのヒルジンの使用が提唱された。
欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例１には、ヒルジン誘導体とミニプロインスリンとからなる融合タンパク質を調製するための宿主−ベクター系が記載されている。この系は、特許請求したインスリングラルギンアミドに前駆体として導くミニプロインスリンを調製するために使用可能であった。
プライマーｉｎｓｎｃｏ１ｒｅｖを置換し、従って位置Ａ２１におけるコドンを変化させることによって、欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例と同様に、発現ベクターを構築した。
以下のプライマーを合成して、ミニプロインスリンを含む融合タンパク質（後にミニプロインスリンから生産されるＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンを有する）をコードする配列を調製した。
ins#gly_a21_rev
TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG（配列番号１）
【００３１】
この場合、プライマーは、インスリン類似体のアミノ酸Ａ１５〜Ａ２１をコードする遺伝子セグメントを完全にカバーする。このプライマーと、欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例１由来の配列番号４のプライマーとの組み合わせ、及びテンプレートとしてのプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓの使用によって、制限酵素Ｋｐｎｌ及びＮｃｏＩによる消化後それに伴って開かれる発現ベクター中に挿入される、ＤＮＡ断片のＰＣＲによる生成が可能となり、所望の融合タンパク質が構成される。
【００３２】
ベクターは、ｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１と命名された。欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例３に従って融合タンパク質を発現させ、実施例６に従って処理してＧｌｙ（Ａ２１）−ミニプロインスリンとし、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ミニプロインスリンを含有する画分の材料を使用して、本願の実施例５にあるように、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−ＮＨ2ヒトインスリンを調製した。
【００３３】
実施例２：パン酵母によるＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン前駆体の直接的な分泌のための遺伝子配列
欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例７に記載されるプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡを使用して、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンの直接的な分泌のためのベクターコンストラクトを調製した。
【００３４】
次のプライマーを合成した。
alpha_insf1
5´- TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3´（配列番号２）
【００３５】
それは、α要素のＣ末端、Ｌｙｓ−Ａｒｇのためのコドン及びミニプロインスリン配列のＮ末端をカバーする。
ins_gly_rev2
5´- TTTTTTCCAT GGGTCGCTAT CAGCCACAGT AGTTTTCCAG CTGG-3´（配列番号３）
【００３６】
このプライマーは、プラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１中にクローニングされたインスリン類似体配列の３’末端とハイブリダイズする。ＰＣＲ（標準的な条件）によって、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩによる消化後に、それに伴って開かれる発現ベクター中に挿入されるＤＮＡ断片を生成させ、所望の融合タンパク質と構成した。酵母Ｙ７９系のコンピテント細胞において形質転換した。その後、上述の特許出願の実施例７に記載されるとおり、形質転換体を発現させた。
【００３７】
欧州特許出願公開第０，３４７，７８１（Ａ）号の実施例９に従って、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ミニプロインスリンを濃縮し、トリプシン切断の後、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ミニプロインスリンを含有する画分の材料を使用して、本願の実施例５にあるように、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンを調製した。
【００３８】
実施例３：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）によるヒルジン−Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン融合タンパク質の分泌のための遺伝子配列
発現ベクターのクローニングは、欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例４と同様に行った。この場合、配列プライマーｐｉｃｈｉａ＿Ｈ＿Ｉｒｅｖ２の代わりに、プライマーｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ｒｅｖ２を使用し、その後、そのＰＣＲ産物
5´- TTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG -3´（配列番号４）
でのＧｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの発現の見込みが可能となった。
得られたプラスミドを、ｐＰｉｃｈ＿Ｈｉｒ＿Ｉｎｓ−ＧｌｙＡ２１と命名した。出発材料としてのＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ミニプロインスリンの精製を、記載されるとおり行った。
【００３９】
実施例４：ピキア・パストリスによるＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）前駆体の直接的な分泌のための遺伝子配列
欧州特許出願公開第１，３６４，０３２（Ａ）号の実施例７と同様に、適切な発現ベクターを構築した。プラスミドｐＰｉｃｈ＿Ｈｉｒ＿ｉｎｓ−ＧｌｙＡ２１並びに２つのプライマーｐｉｃｈ＿ｉｎｓｇｌｙ＿ｄｉｒｆ及びｐｉｃｈ＿ｉｎｓｇｌｙ＿ｄｉｒｒｅｖのＤＮＡ
pich_insgly_dirf
5´-TTTTTTCTCGAGAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3´（配列番号５）
pich_insgly_dirrev
5´-TTTTTT GGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC-3´（配列番号６）
を必要とした。
出発材料としてのＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ミニプロインスリンの精製を、記載されるとおり行った。
【００４０】
実施例５：アルギニンアミドとのカップリングによるＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン前駆体からのＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−ＮＨ2−ヒトインスリンの調製
実施例１〜４にあるように調製されたＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン１００ｍｇを、アルギニンアミド溶液０．９５ｍＬ（４４６ｇ／Ｌ）に溶解し、Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）及びＤＭＦ２ｍＬを添加した。反応混合物を１２℃に冷却し、トリプシン０．０９４ｍＬ（０．０７５ｍｇ、Roche Diagnostics）を添加することによって開始した。
【００４１】
８時間後、ＴＦＡをｐＨ２．５まで添加することによって反応を停止させ、ＨＰＬＣによって分析した。６０％を超えるＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンが生成した。米国特許第５，６５６，７２２号と同様に、トリプシン阻害剤溶液を添加した後、アミド化された類似体（インスリングラルギンアミド）を精製した。
【００４２】
実施例６：パン酵母によるＬｙｓ（Ｂ３１）前駆体の直接的な分泌のための遺伝子配列
２つのプライマーを合成した。これらは配列Ａｌａ（Ｂ３１）、Ａｌａ（Ｃ１）、Ｌｙｓ（Ｃ２）を導入するように機能する。
a29_a30_k31f
5´-GTTTCTTCTACACTCCAAAGGCGGCTAAAGGTATCGTTGAACAATGTTG-3´（配列番号７）
及びa29_a30_k31rev
5´-CAACATTGTT CAACGATACC TTTAGCCGCC TTTGGAGTGT AGAAGAAAC -3´（配列番号８）
プライマーalpha_insf1
5´- TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3´（配列番号９）
は、α要素のＣ末端、Ｌｙｓ−Ａｒｇのコドン及びミニプロインスリン配列のＮ末端の配列をカバーする。出願公開ＷＯ０２／０７０７２２Ａ１の実施例１由来のプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓのＤＮＡは、２回のポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして機能する。反応１において、プライマーａ２９＿ａ３＿ｋ３１ｆ及びｉｎｓｎｃｏ１ｒｅｖ（ＷＯ０２／０７０７２２Ａ１由来の配列番号６）を使用し、反応２において、プライマーａ２９＿ａ３０＿ｋ３１ｒｅ及びａｌｐｈａ＿ｉｎｓｆ１を使用した。標準的な反応を行い、得られたＰＣＲ断片を単離した。２つの生産物のアリコートを組み合わせ、これらはプライマーｉｎｓｎｃｏ１ｒｅｖ及びＷＯ０２／０７０７２２Ａ１由来の配列番号６を使用する第三の反応のためのテンプレートとして機能する。得られたＰＣＲ断片をクローニングし、実施例８に記載のとおり発現させた。結果として、Ａｌａ（Ｂ３１）、Ａｌａ（Ｃ１）、Ｌｙｓ（Ｃ１）−ミニプロインスリンが生じ、これはリシルエンドペプチダーゼでＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）スプリットインスリンに変換され、標的タンパク質を調製するための中間体として機能する。
【００４３】
実施例７：リシルエンドペプチダーゼ及びＴｈｒ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２の反応
独国特許第３８４４２１１号に記載のとおり、インスリン前駆体をリシルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）及びトリプシンと反応させ、精製した（実施例１）。この目的のために、インスリン前駆体１０ｍｇをトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、リソバクター酵素前駆体（ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅ）由来のＬＥＰを添加した（１ｍｇ／ｍＬ濃度の水溶液０．０１ｍＬ、Merckbiosciences）。インキュベーションを室温で２時間行い、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Nucleosil  120-5カラム）によって精製した。Ｇｌｙ（Ａ２１）Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２０）スプリットインスリン前駆体を、独国特許第３８４４２１１号に従って、Ｔｈｒ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２と反応させた。この目的のために、ｄｅｓＴｈｒ−インスリン前駆体１０ｍｇを１０Ｍ酢酸０．２５ｍＬ中に溶解し、ＤＭＳＯ／１，３−ブタンジオール（１：１）に溶解した１．５ＭのＴｈｒ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２の０．７ｍＬを添加した。次に、ＬＥＰ０．１５ｍＬ（１５ｍｇ／ｍＬ、水に溶解）を添加した。混合物を室温で２時間インキュベートした。次に、メタノール／メチル第三級ブチルエーテル（ｖ／ｖ＝１：４）５ｍＬを添加することに
よってタンパク質を沈殿させ、乾燥させた。１Ｍ  ＨＣｌ／酢酸を添加し、０℃でインキュベートすることによって、保護基を除去した。
【００４４】
実施例８：インスリングラルギンアミドの血糖降下作用
ビーグル種の健常な雄イヌで血糖降下作用を調査した。０．３ＩＵ／体重ｋｇの用量を皮下投与した。コントロール群において、インスリングラルギンの同一用量でイヌを処置し、さらなる群には、インスリンの添加されていないプラセボ注射を投与した。注射後最初の２時間の３０分ごとに血中グルコースの測定のために動物から採血した後、８時間までの毎時ごとに採血した。インスリングラルギンと同様に、インスリングラルギンアミドは遅延した時間／効果プロファイルを示すが、反応の開始の際に、血中グルコースレベルが明瞭な低いポイント（底）なしに低下するので、本アミドのプロファイルが確かに有利であることが明らかになった。結果を図１に示した。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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