(57)【要約】  本発明は、細胞におけるＤＮＡの断片化の形成を修飾する作用物質の検出のための方法を提供する。開示された方法は、ハイスループットスクリーニングの適用に修正可能なアッセイフォーマットに構成される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定する方法であって、
ａ）一連の容器中に細胞を提供すること；
ｂ）少なくとも１つの容器に作用物質を添加すること；
ｃ）所定の期間、作用物質を細胞と共にインキュベートすること；
ｄ）細胞を溶解すること；
ｅ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を上記少なくとも１つの容器へ添加すること；
ｆ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること；及び
ｇ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較すること
を含み、それにより差異が、所定の閾値を超える場合、上記作用物質を修飾剤として同定する方法。
【請求項２】
ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定する方法であって、
ａ）一連の容器中に細胞を提供すること；
ｂ）誘導剤、阻害剤、調節剤、誘導剤の調節剤及び阻害剤の調節剤からなる群より選択される構成要素を少なくとも１つの容器へ添加すること；
ｃ）所定の期間、構成要素を細胞と共にインキュベートすること；
ｄ）上記少なくとも１つの容器に作用物質を添加すること；
ｅ）所定の期間、作用物質を細胞と共にインキュベートすること；
ｆ）細胞を溶解すること；
ｇ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を上記少なくとも１つの容器へ添加すること；
ｈ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること；及び
ｉ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較すること
を含み、それにより差異が、所定の閾値を超える場合、上記作用物質を修飾剤として同定する方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が、工程（ｂ）と組み合わされ、そして工程（ｅ）が、工程（ｃ）と組み合わされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
染色体ＤＮＡを、ＤＮＡ断片から分離した後に、インターカレートした検出可能な化合物の量を測定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
染色体ＤＮＡを、遠心分離、濾過、沈降、電気泳動、分子篩、沈殿及びアフィニティ精製からなる群より選択される方法によって、二本鎖ＤＮＡ断片から分離する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
検出可能な化合物が、放射性同位体、発蛍光化学物質、ペプチドタグ、シンチラント活性化合物、酵素、及び検出可能な抗体によって認識されるエピトープからなる群より選択される物質を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
検出可能な化合物が、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ、ＹＯＰＲＯ、ＢＥＮＡ４３５、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＤＡＰＩ、ＤＲＡＱ５、ＯｌｉＧｒｅｅｎ及びヨウ化プロピジウムからなる群より選択される物質を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、原核細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、真核細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのタンパク質を過剰発現させるために、細胞を、一過性に又は安定的に形質転換する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
細胞を、生物学的試料からの単離後に提供する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料が、ヒト由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、ＨＬ６０細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ又はそれ以上の工程が、ロボット装置によって行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞を、界面活性剤含有溶解緩衝液、低張性溶解緩衝液、超音波処理及び凍結／解凍からなる群より選択される方法によって溶解する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮａｓｅを、工程（ｄ）又は工程（ｅ）中に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮａｓｅを、工程（ｆ）又は工程（ｇ）中に添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定する方法であって、
ａ）一連の容器中に細胞を提供すること；
ｂ）少なくとも１つの容器に作用物質を添加すること；
ｃ）所定の期間、作用物質を細胞と共にインキュベートすること；
ｄ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を上記少なくとも１つの容器へ添加すること；
ｅ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること；及び
ｆ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較すること
を含み、それにより差異が、所定の閾値を超える場合、上記作用物質を修飾剤として同定する方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定する方法であって、
ａ）一連の容器中に細胞を提供すること；
ｂ）誘導剤、阻害剤、調節剤、誘導剤の調節剤及び阻害剤の調節剤からなる群より選択される構成要素を少なくとも１つの容器へ添加すること；
ｃ）所定の期間、構成要素を細胞と共にインキュベートすること；
ｄ）上記少なくとも１つの容器に作用物質を添加すること；
ｅ）所定の期間、作用物質を細胞と共にインキュベートすること；
ｆ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を上記少なくとも１つの容器へ添加すること；
ｇ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること；及び
ｈ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較すること
を含み、それにより、差異が、所定の閾値を超える場合、上記作用物質を修飾剤として同定する方法。
【請求項２０】
第二の一連の容器を提供することをさらに含み、ここで、工程（ｄ）が、細胞デブリから上清を分離することをさらに含み、そして工程（ｅ）が、ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を、分離された上清の試料を含有する上記第二の一連の容器の少なくとも１つの容器に添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第二の一連の容器を提供することをさらに含み、ここで、工程（ｆ）が、細胞デブリから上清を分離することをさらに含み、そして工程（ｇ）が、ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を、分離された上清の試料を含有する上記第二の一連の容器の少なくとも１つの容器に添加することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定するためのアッセイシステムであって、
ａ）一連の容器；
ｂ）溶解緩衝液；
ｃ）ＤＮＡ内にインターカレートできる検出可能な化合物；及び
ｄ）少なくとも１つの構成要素（ここで該構成要素が作用物質、誘導剤、阻害剤、調節剤、誘導剤の調節剤、阻害剤の調節剤、コントロール及び細胞からなる群より選択される）
を含む、アッセイシステム。
【請求項２３】
請求項２０〜２２に記載のアッセイシステムの少なくとも１つの要素、及び使用のための説明書を含むキット。
【請求項２４】
疾患の生物マーカーがＤＮＡ断片の形成を含む、疾患の治療を診断又はモニターする方法であって、
ａ）一連の容器に生物学的試料を提供すること；
ｂ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を少なくとも１つの容器に添加すること；
ｃ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること；及び
ｄ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較すること
を含み、それにより、差異が、所定の閾値を超える場合、疾患の治療を診断又はモニターする方法。
【請求項２５】
生物学的試料が、細胞、組織、器官及び血液からなる群より選択される試料を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
疾患の生物マーカーがＤＮＡ断片の形成を含む、疾患の治療を診断又はモニターするアッセイシステムであって、
ａ）一連の容器；
ｂ）ＤＮＡ内にインターカレートできる検出可能な化合物；及び
ｄ）少なくとも１つのコントロール
を含む、アッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
正常に機能する生物系において、細胞数は、細胞増殖とアポトーシスとの間の均衡によって制御される。細胞増殖とアポトーシスとの不適切な均衡は、多くの疾患の病因に結びつけられている。例えば、アポトーシス機構の憎悪は、アルツハイマー病等の神経変性疾患、多発性硬化症によって例示される自己免疫疾患、及び脳卒中等の虚血関連損傷の一因になると考えられている。逆に、適切なアポトーシス経路の低下は、がん等の疾患の基礎的な機構であると考えられている。
【０００２】
アポトーシスは、細胞の萎縮及び細胞膜のブレッビング（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、染色質の凝縮、核ＤＮＡの断片化並びにタンパク質変性を含む幾つかの顕著な特徴によって特徴付けられる。少なくとも２つの区別可能なアポトーシス経路、すなわち外因性経路及び内因性経路がある（総説に関しては、Oncogene 23:2861-2874, 2004; Photochem. Photobiol.Sci. 3:721-729, 2004参照）。外因性又は受容体介在性経路は、腫瘍壊死因子等の死受容体リガンドによって誘導される。死受容体リガンドは、カスパーゼカスケードを通ってシグナル伝達し、その結果、最終的に、カスパーゼによって活性化されるヌクレアーゼによって核ＤＮＡの消化が生じる。ミトコンドリア機構を通ってシグナル伝達する内因性経路は、紫外線又は薬物のような環境ストレス因子に感受性である。これらのストレスは、ミトコンドリア膜の透過性上昇を引き起こし、チトクロムｃ、エンドヌクレアーゼＧ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）及び他の未同定の多くの分子の放出をもたらす。アポトーシスに対する外因性又は内因性経路の相対的な寄与は、アポトーシス促進性因子と細胞生存因子との間の均衡によって決定される（総説に関しては、J. Intern. Med. 258:479-517, 2005参照）。
【０００３】
アポトーシスは、死受容体リガンド結合、アポトーシス誘導因子の活性化、カスパーゼの活性化、細胞生存分子のダウンレギュレーションを通じて、又は他の公知の及び未知の新規な機構を通じて誘導され得る。これらは全て、ＤＮＡの断片化をもたらし、従って表現型のＤＮＡ断片化アッセイにより、作用様式とは関係なく全てのアポトーシス誘導化合物が同定され、新規な機構を有する化合物が潜在的に同定されることになる。ゲルベースのＤＮＡラダーアッセイは、ＤＮＡ断片化のための優れた標準的アッセイである。しかしながら、ゲルベースのＤＮＡラダーアッセイが労働集約的で多工程の性質であるので、ハイスループットスクリーニングの取り組みには受け入れられない。従って、古典的なアポトーシス経路、及びその上新規な機構を通じて作用する作用物質を同定することになるスクリーニングアッセイが必要である。細胞毒性アッセイは、使用できる可能性があるが、アポトーシス仲介性及び非アポトーシス仲介性の両細胞死に関与する化合物を同定する点で、これらのアッセイは、非選択的であり、有意な偽陽性をもたらす可能性がある。ハイスループットスクリーニングを受け入れられる非放射性の頑健なアッセイが好ましいことになる。
【０００４】
現在、３つの異なるフォーマットが、アポトーシスに関与する化合物のスクリーニングのために利用されている。第一のフォーマットは、放射測定濾過方法に基づいており、細胞を３Ｈ−チミジン中で増殖させ、次いでガラス繊維フィルタープレートを使用して、完全な（ｉｎｔａｃｔ）のＤＮＡを、断片化されたＤＮＡから分離するものである（Anal. Biochem. 242:187-196, 1996）。放射測定アッセイの処理量は、大量の放射能と関連した危険及びアッセイの手間のかかる性質によって制限される。第二のアッセイフォーマットは、トランスフェラーゼ酵素による蛍光ｄＵＴＰを有する３’二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の標識及びその後のフローサイトメトリ又は画像化方法による検出に基づいたＴＵＮＥＬアッセイである。多くのＴＵＮＥＬアッセイキットが利用可能であるが、それらは全て労働集約的であり、１回のアッセイにつき数個の試料しか試験できない。第三のアッセイフォーマットは、抗ＤＮＡ抗体及び抗ヒストン抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである。このアッセイも労働集約的であり、２つの抗体を必要とするので、ハイスループット化合物スクリーニングにとって比較的高価となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
効率的かつ非放射性のアッセイフォーマットは、断片化されたＤＮＡを検出するためのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ又はヨウ化プロピジウム等のＤＮＡインターカレーターを使用することになる。例えば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、ｄｓＤＮＡの主要溝内にインターカレートする小さな有機分子である。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、血液試料中のＤＮＡレベルを研究するための有用なツールである（Scan. J. Immunol. 57:525 - 533, 2003、Clin. Immunol. 106:139 -147, 2003、Blood 102(6):2243 - 2250, 2003）。本発明は、ＤＮＡインターカレーターを使用して、細胞中のＤＮＡ断片の形成を修飾し、ハイスループットスクリーニングの適用に受け入れられる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏ）又はＤＭＳＯ（コントロール）で細胞の処理後のＨＬ−６０溶解物の相対蛍光単位（ＲＦＵ）におけるＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光の変化を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド）
【図２】ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光シグナル（ＲＦＵ、相対蛍光単位）が、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏ）でＨＬ−６０細胞の処理後の細胞溶解物のＤＮＡのレベルに依存性であることを示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位）
【図３】ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出して、ＨＬ−６０細胞におけるＤＮＡ断片化に及ぼすカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏ）、スタウロスポリン及びブレオマイシン等の選択された化合物の効果を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位）
【図４】ヨウ化プロピジウムによって検出して、ＨＬ−６０細胞におけるＤＮＡ断片化に及ぼすカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏ）の効果を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位）
【図５】ＥＬＩＳＡによって検出して、ＨＬ−６０細胞におけるＤＮＡ断片化に及ぼすカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏ）、スタウロスポリン及びブレオマイシンの効果を示す。（Ａｂｓ、吸光度）
【図６】ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出して、カンプトテシン誘導性ＤＮＡ断片化に及ぼすアポトーシス阻害剤ＺｎＣｌ2の効果を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位）
【図７】ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出して、ＨＬ−６０細胞溶解物におけるのＤＮＡ断片化シグナル対背景の比を、ＲＮａｓｅ処理が改善することを示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位）
【図８】ＨＬ−６０溶解物における、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出されるＤＮＡ断片化に及ぼすカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏ）効果の時間経過を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位；ｈｒ、時間；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド）
【図９】ＨＬ−６０溶解物における、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出されるＤＮＡ断片化に及ぼすＨＬ−６０細胞密度の効果を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド）
【図１０】ＨＬ−６０細胞密度との関連でＰｉｃｏＧｒｅｅｎのＤＮＡ断片化シグナルにおける誘導倍率（ｆｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を示す。
【図１１】ＨＬ−６０細胞に及ぼすＤＭＳＯ濃度の効果を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド）
【図１２】バリノマイシン、ビンブラスチン又はビンクリスチンと共にＨＬ−６０細胞をインキュベートした後のＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出されるＤＮＡ断片化の誘導を示す。
【図１３】エトポシド、ゲニステイン、ピューロマイシン又はラパマイシンと共にＨＬ−６０細胞をインキュベートした後のＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって検出されるＤＮＡ断片化の誘導を示す。
【図１４】ＨＬ−６０溶解物における、ＤＮＡ断片化のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ検出を使用する無作為なケミカルライブラリのスクリーニングのデータ分布を示す。（ＲＦＵ、相対蛍光単位）
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書で引用される刊行物は全て、参照により本明細書に組み入れられる。別段の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の関係する当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【０００８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される専門用語は、特定の実施態様を説明するだけの目的のためであり、本明細書における使用は、本発明を制限することを意図したものではない。語の単数形は、本文脈が別段に明確に記さない限り、複数形を含むものとする。例えば、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の単数形は、複数形を含むものとする。さらに、作用物質への言及には、２つ又はそれ以上の作用物質の混合物が含まれ得る。従って、「作用物質」という用語には、その混合物及び／又は鏡像体を含む複数の作用物質が含まれる。内容が別段に明確に指示しない限り、「又は」という用語は、「及び／又は」を含むその意味で一般的に使用されていることにも留意すべきである。さらに、本明細書において使用される場合、「を含む」及び／又は「を含むこと」という用語が、記載される特徴、工程、要素及び／又は構成要素の存在を特定するが、１つ又はそれ以上の他の特徴、工程、要素、構成要素及び／又はその群の存在又は付加を排除するものではないことはさらに当然のことと理解されるであろう。
【０００９】
さらに、本発明に従って使用され得るものに、本分野の技術内での従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術がある。このような技術は、文献に十分説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (herein “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【００１０】
従って、本発明の一実施態様は、ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定する方法であって、方法は、（ａ）一連の容器に細胞を提供すること、（ｂ）少なくとも１つの容器へ作用物質を添加すること、（ｃ）作用物質を細胞と共に所定の期間インキュベートすること、（ｄ）細胞を溶解すること、（ｅ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を、上記少なくとも１つの容器に添加すること、（ｆ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること、及び（ｇ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較し、それにより、差異が所定の閾値を超える場合、上記作用物質を修飾剤として同定することを含む。
【００１１】
該アッセイは、ＤＮＡ断片を検出する。ＤＮＡ断片は、細胞溶解物の細胞質画分中の小さな二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）断片及び培地中にアポトーシス性細胞から放出されたｄｓＤＮＡ断片であり得る。さらに、ＤＮＡ断片は、細胞溶解物の細胞質画分中の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）断片及び培地中にアポトーシス性細胞から放出されたｓｓＤＮＡ断片であり得る。本発明の一実施態様において、アッセイは、以下に限定されるわけではないが、異なる細胞型又は異なる培養条件の存在又は非存在下で共培養中のアポトーシスなど、自発的アポトーシスを測定するために利用される。従って、ＤＮＡ断片の形成は、ウシ胎仔血清等の培地から成分を取り出すことによって誘導され得る。本発明の別の実施態様は、アポトーシスの非存在を測定するためにアッセイを利用することである。別の実施態様において、アポトーシスの存在若しくは増大又はアポトーシスの非存在若しくは低下は、作用物質で細胞を処理している間に測定され得る。本発明のさらなる実施態様において、アッセイは、細胞生存又は細胞増殖を測定するために利用される。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、ＤＮＡ断片の形成を修飾する作用物質を同定する方法であって、方法は、（ａ）一連の容器に細胞を提供すること、（ｂ）少なくとも１つの容器へ、誘導剤、阻害剤、調節剤、誘導剤の調節剤及び阻害剤の調節剤からなる群より選択される構成要素を添加すること、（ｃ）構成要素を細胞と共に所定の期間インキュベートすること、（ｄ）作用物質を上記少なくとも１つの容器へ添加すること、（ｅ）作用物質を細胞と所定の期間インキュベートすること、（ｆ）細胞を溶解すること、（ｇ）ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を上記少なくとも１つの容器へ添加すること、（ｈ）インターカレートした検出可能な化合物の量を測定すること、及び（ｉ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量をコントロールと比較し、それにより、差異が、所定の閾値を超える場合、上記作用物質を修飾剤として同定することを含む。
【００１３】
単一工程で誘導剤、阻害剤又は調節剤を作用物質と共に添加するなどの改良は、十分当業者の知識及び能力の範囲内であり、本発明の実施態様とされる。
【００１４】
本発明の実施態様は、アポトーシス、細胞生存又は細胞増殖に影響することによって、ＤＮＡ断片の形成を修飾する構成要素である。構成要素は、誘導剤、阻害剤、調節剤、誘導剤の調節剤及び阻害剤の調節剤からなる群より選択される。
【００１５】
細胞生存は、好ましい又は好ましくない条件で生存し続ける細胞の能力である。好ましくない条件には、１つ若しくはそれ以上の毒性化合物の存在、栄養不足又は酸素欠乏が含まれるが、それらに限定されるわけではない。非限定的な例として、幾つかのがん細胞は、例えばアポトーシスに対して細胞を抵抗性にする生存タンパク質、例えばＢｃｌ２の亢進した発現を有する。他のがん細胞は、低酸素レベルの条件下で、アポトーシスに対して細胞生存をより良好にし又はよりなりにくくさせる機構を発達させている。
【００１６】
細胞増殖は、細胞数の増加である。細胞増殖の非限定的な例は、正常な細胞分裂、細胞分裂の誘導又は細胞死の阻害による細胞数の増加である。
【００１７】
本発明の一実施態様は、アポトーシスを受ける細胞によるＤＮＡ断片形成を修飾する作用物質を同定する方法である。しかしながら、本発明は、細胞死の何れかの特定の形態に限定されない。本発明は、ＤＮＡ断片化が最終的な事象である細胞死のどのような機構にも適用可能である。
【００１８】
「阻害剤」という用語は、アポトーシス、細胞生存又は細胞増殖に関与する細胞の反応、活性又は経路を遮断、中断又は防止できるあらゆる薬物、化学物質、タンパク質又はタンパク質断片を包含する。さらに、阻害剤は、例えば細胞のタンパク質の発現を遮断し、それにより経路を直接的に又は間接的に阻害する分子シャペロン、抗体又は抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。「阻害剤」とは、酸素の増大若しくは欠乏等の培養条件の操作、又は細胞の反応を遮断、中断若しくは防止するような様式で培地構成要素を交換することであってもよい。
【００１９】
「誘導剤」という用語は、アポトーシス、細胞生存又は細胞増殖に関与する細胞の反応、活性又は経路を開始又は刺激できるあらゆる薬物、化学物質、タンパク質又はタンパク質断片を包含する。さらに、誘導剤とは、細胞のタンパク質の発現を遮断し、それにより阻害を除去し、又は細胞の反応、活性又は経路を直接的に開始させ又は刺激する、分子シャペロン、抗体又は抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。「誘導剤」とは、酸素の増大若しくは欠乏等の培養条件の操作、又は細胞の反応を遮断、中断若しくは防止するような様式で培地構成要素を交換することであってもよい。
【００２０】
「調節剤」という用語は、アポトーシス、細胞生存又は細胞増殖に関与する細胞の反応、活性又は経路の強度、割合又は特徴を調節できるあらゆる薬物、化学薬品、タンパク質又はタンパク質断片を包含する。さらに、調節剤とは、細胞のタンパク質の発現を遮断し、それにより阻害を除去し、又は細胞の反応、活性又は経路を誘導する分子シャペロン、抗体又は抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であり得る。「調節剤」とは、酸素の増大若しくは欠乏等の培養条件の操作、又は細胞の反応を遮断、中断若しくは防止するような様式で培地構成要素を交換することであってもよい。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様において、調節剤は、誘導剤の調節剤によって誘導剤がより強力になり（例えば、増大した細胞反応を生じる）、又は誘導剤がより弱くなる（例えば、低下した細胞反応を生じる）ように、誘導剤と共に使用され得る。阻害剤の調節剤によって、阻害剤はより弱くなり（例えば、増大した細胞反応）、又は阻害剤はより強力になる（例えば、低下した細胞反応）。
【００２２】
阻害剤、誘導剤又は調節剤は、疾患状態の経路又は側面を模擬するために利用可能である。非限定的な説明的な例として、本発明の一実施態様は、炎症性サイトカイン等の潜在的な調節因子の存在下でアルツハイマー病の側面を模擬するために、βアミロイド断片によってアポトーシスを誘導することであろう。非限定的な説明的なさらなる例である、本発明の一実施態様は、がんの１つ又は複数の側面においてアポトーシスを促進する作用物質を同定することである。このようなパラダイムを使用して、本発明の企図されている実施態様は、がんの細胞、組織又は器官においてアポトーシスを誘導又は亢進する試験作用物質の能力を定量化することである。アポトーシスの誘導剤は、細胞死に導く多くの経路を包含して、広範に作用し得る。あるいは、アポトーシスの誘導剤は、単一のアポトーシス性経路に非常に特異的であってもよく、又は特定の疾患若しくは病理学的状態の治療に限定的であってもよい。従って、本発明の一実施態様は、アポトーシスが、阻害すべきと考えられる疾患状態、例えばがんを改善し得る試験作用物質を同定するためのスクリーニング方法を包含する。このようながんには、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び固形腫瘍が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、１つを超える誘導剤、阻害剤又は調節剤の使用である。１つを超える誘導剤、阻害剤又は調節剤を使用することは、相加的効果、カウンター効果（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）、相乗的効果を有し得、又は複数の経路に影響を与え得るが、それらに限定されるわけではない。
【００２４】
本発明の一実施態様は、インターカレートする検出可能な化合物を利用する。非限定的な例は、インターカレートする蛍光色素である。インターカレーターは通常、ＤＮＡ二本鎖中の２つの塩基対の間に挿入する芳香族複素環多環式分子である。しかしながら、本発明は、芳香族複素環多環式分子に限定されない。ＲＮＡ又はタンパク質に対して非選択的結合をほとんど又は全くしないＤＮＡ断片の存在下で発光又は励起パラメータにおける蛍光の有意な増強又はシフトを示す何れかのインターカレートする分子が、本発明によって意図されている。このようなインターカレート色素は、当業者に公知であり、ビスベンズイミド色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を含むが、それに限定されない。インターカレートする検出可能な別の有用な化合物は、ヨウ化プロピジウムである。本発明の一実施態様は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを利用する。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、非対称性モノメチンシアニン色素のファミリーに属する。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、ＤＮＡとの高い結合定数を示し、ＤＮＡに結合する場合、蛍光性が高いのに対し、溶液中で遊離の場合、実質的に非蛍光的である。本発明のさらなる実施態様は、ヨウ化プロピジウムを使用する。さらに、幾つかのインターカレーターは、ＴＯＴＯ（Nucleic Acids Res. 23:1215-1222, 1995）及びＯｌｉＧｒｅｅｎ（Molecular Probes, カタログ番号07582, カタログ番号011492）等ｓｓＤＮＡに結合可能である。本発明の一実施態様は、ＢＥＮＡ４３５（Nucleic Acids Res. 34:）等の細胞透過性ＤＮＡプローブを利用し、従って、ＤＮＡを標識するために細胞を溶解する必要性を排除する。本発明のさらなる実施態様は、ＹＯＰＲＯ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＤＡＰＩ及びＤＲＡＱ５を利用する。
【００２５】
インターカレートする検出可能な分子は、蛍光色素に限定されない。ＤＮＡ断片の量は、当業者に公知の任意の方法論を使用して定量可能である。ＤＮＡ中に組み込まれたインターカレート分子の量は、放射性同位体又はシンチラント活性化化合物等の標識によって定量可能であるが、それらに限定されるわけではない。検出方法には、ペプチドタグ、酵素活性、吸光度、蛍光、時間分解蛍光、偏光蛍光、蛍光共鳴エネルギー転移、ルミネッセンス、生物発光共鳴エネルギー転移、放射性標識及びシンチレーション近接法又は本分野で一般的に使用される他の方法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。別の実施態様において、標識された抗体、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、金属キレート化アフィニティ試薬又はＧＳＴ−グルタチオンアフィニティ試薬を使用する間接的な標識方法を使用し得るが、それらに限定されるわけではない。当業者に公知の直接的又は間接的な何れかの標識方法は、本発明の一部とされる。さらなる実施態様において、ＤＮＡの量は、２６０ｎｍでの吸光度（Ａ２６０）の測定によって定量可能である。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様は、ＤＮＡ断片から染色体ＤＮＡを分離した後に、インターカレートしている検出可能な化合物の量を測定することである。ＤＮＡ断片からの染色体ＤＮＡの分離は、本技術で公知の方法によって行い得る。非限定的な例には、遠心分離、濾過、沈降、電気泳動、分子篩、アフィニティ精製及び沈殿が含まれる。当業者は、任意の分離方法を、ＤＮＡ断片から染色体ＤＮＡを分離又は除去するために、採用し得る。
【００２７】
本発明の一実施態様は、細胞を溶解することを包含する。細胞は、界面活性剤含有の添加によって溶解可能である。しかしながら、本発明は、溶解緩衝液中の界面活性剤の使用に限定されるわけではなく、細胞を溶解するのに適切な任意の方法を含み得る。例えば、細胞は、低張性緩衝液への曝露、超音波処理又は凍結／解凍によって溶解し得る。細胞を溶解する他の方法は、当業者によく知られている。
【００２８】
本発明のさらなる実施態様は、内因性細胞ＲＮＡに起因するバックグラウンド蛍光シグナルを低下させることによってシグナル：バックグラウンド比を増大させる目的のために、ＤＮａｓｅを含有しないＲＮａｓｅを利用して、細胞溶解物中のＲＮＡを除去する。
【００２９】
本発明の一実施態様は、細胞及び培地等の他の材料を収容することが可能な一連の容器を含む。一連の容器は、本発明の範囲内で細胞を保持するのに適した少なくとも１つ又はそれ以上の容器からの任意の数の容器であり得る。例には、フラスコ、培養皿、１．５ｍＬチューブ等のチューブ、１２ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、及びおそらく４０００個の容器を有する小型化したマイクロタイタープレート（米国特許出願第２００５０２５５５８０号）が含まれるが、それらに限定されない。一連の容器は、保護カバーの付加に修正可能であり得、従って、混入物の進入又は内容物の蒸発を防止し得る。
【００３０】
容器のさらなる特徴は、容器によって分析が可能となり得ることであり、非限定的な例には、分光光度分析、シンチレーション計数及び蛍光測定が含まれる。しかしながら、このことは、試料がさらなる分析のために修正可能な適切な容器に移され得ることを考慮すれば、本発明の範囲内で使用できる容器を限定するものではない。非限定的な例は、方法が、第二の一連の容器を提供することを含み、ここで、細胞を溶解する工程が、細胞デブリから上清を分離することをさらに含み、及び次の工程が、ＤＮＡ断片内にインターカレートできる検出可能な化合物を、上記分離された上清の試料を含有する上記第二の一連の容器の少なくとも１つの容器に添加することをさらに含むよう、方法を改変することである。
【００３１】
本発明の一実施態様は、コントロールを使用する。コントロールとは、当業者によって十分理解される専門用語である。適切なコントロールは、利用されるアッセイパラメーター又は調査下にある実験上の問題に依存し得る。コントロールは、アッセイ条件の特定のセット、又は特定の化合物の培地への添加若しくは排除であり得る。コントロールは、アッセイ条件又は添加されるコントロール化合物が、予測された反応をもたらすという点でポジティブコントロールが考慮される。例えば、調査下の作用物質が、アポトーシスを誘導すると期待される場合、ポジティブコントロールは、アポトーシスを誘導することが公知の化合物になる。ポジティブコントロールの非限定的な例は、硫酸ビンブラスチンの添加である。コントロールは、またネガティブコントロールであり得る。ネガティブコントロールは、アッセイ条件の特定のセット、又は予測された反応をもたらすはずの培地への特定の化合物の添加若しくは排除であり得る。例えば、調査下の作用物質が、アポトーシスを誘導すると期待される場合、ネガティブコントロールは、アポトーシスを誘導しないことが見込まれることになる。コントロールは、「ビヒクル」コントロールであり得る。例えば、試験作用物質が、ＤＭＳＯ中に溶解される場合、ビヒクルコントロールは、試験作用物質を有さないＤＭＳＯになる。コントロールは、単純に、経過データの使用であってもよい。
【００３２】
本発明の一実施態様は、市販の細胞系を使用する。例えば、使用され得る細胞は、American Tissue Culture Companyから入手可能である。一実施態様において、ＨＬ−６０細胞が使用される。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。本発明は、使用される細胞の型によって限定されない。初代培養も利用し得る。未分化細胞は、細胞を特定の表現型へと分化を引き起す様々な作用物質にさらすことができる。例えば、オリゴデンドロサイトに分化するよう誘導された前駆細胞は、本発明の一実施態様になる。使用される特定の細胞型は、所望の細胞型によって特異的に発現されるマーカーによって選択することができ、又はそれに代わるものとして、特定のマーカーの消失によって選択することができる。細胞は、当業者によって一般的に使用されるフローサイトメトリ等の方法によって分離又は選別可能である。
【００３３】
本発明の一実施態様は、均一な細胞集団を使用する。本発明の代替的な実施態様は、不均一な細胞集団を使用する。細胞は、本発明のアッセイを完了させるのに任意の型のもの及び任意の割合のものであり得る。
【００３４】
細胞は、生物学的試料から得られ得る。生物学的試料には、組織又は体液、生検及び剖検の試料等の組織切片、並びに組織学的目的のために採取された凍結切片が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。このような試料には、血液、痰、組織、培養細胞、例えば初代培養、外植片及び形質転換細胞、大便、尿等が含まれる。生物学的試料は、霊長類、例えばチンパンジー、マカク若しくはヒト、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えばモルモット、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物、又は鳥類、爬虫類又は魚類を含む、真核生物から得ることが可能である。
本発明の別の実施態様は、少なくとも１つのタンパク質を過剰発現し又は発現しないよう一過性に又は安定的に形質転換した細胞を使用して、そのタンパク質の発現又は欠失が、ＤＮＡの断片化に影響するかどうかを決定することである。発現は、誘導でき又は構成的であり得る。作用物質は、形質転換細胞においてＤＮＡ断片化を修飾する能力に関して試験することが可能である。さらに、試験作用物質は、アポトーシスの誘導剤又は阻害剤の存在下又は非存在下で、形質転換細胞においてＤＮＡ断片化を修飾する能力に関して試験することが可能である。このような実施態様は、コントロールを構成し得る。
【００３５】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態にある核酸分子を含む。従って、本発明の組換え発現ベクターには、発現に使用しようとする宿主細胞に基づいて選択された１つ又はそれ以上の調節配列を含み得、これは、発現しようとする核酸に作動可能に連結される。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、インビトロでの転写／翻訳システムにおいて、又はベクターが宿主細胞中に導入される場合の宿主細胞において）、関心対象のヌクレオチド配列が、調節配列へ連結されることを意味するものとする。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列には、宿主細胞の多くの型におけるヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるものが含まれる（例えば、組織特異的調節配列）。発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等の因子に依存し得ることは、当業者によって十分理解されるであろう。本発明の発現ベクターは、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質又はペプチドを生産するために宿主細胞中に導入することが可能である。
【００３６】
本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、ポリペプチドを正常に発現する細胞における又はポリペプチドを正常には発現しない細胞におけるポリペプチドの発現の正常なレベルより大きいレベルでの、細胞によるポリペプチド、例えばアポトーシス又は細胞生存機構に関与し得る分子、の発現をいう。例えば、ポリペプチドの発現が、ポリペプチドを正常に発現する野生型細胞におけるポリペプチドの発現と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０、８０％、９０％、１００％又はそれ以上までであり得る。関心対象のポリペプチドの突然変異体、変異体又は類似体は、過剰発現し得る。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「一過性」発現という用語は、細胞の染色体とは別個の外来性核酸分子の発現を指す。一過性発現は一般的に、外来性核酸の導入の最大２〜３日後に到達し、その後低下する。
【００３８】
本発明において使用されるように、「安定的に」発現という用語は、細胞の染色体の一部である外来性核酸分子の発現を指す。一般的に、遺伝子の安定的発現のためのベクターには、１つ又はそれ以上の選択マーカーが含まれる。
【００３９】
形質転換された、形質転換されていない、初代培養及び生物学的試料のための細胞培養技術は、本技術でよく知られている。生物学的試料又は培養細胞は、使用のために必要とされるまで保存することが可能である。培養のために使用される培地は、特異的に設計され又は商業的供給源から購入することが可能である。
【００４０】
本発明は、ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡの断片の形成を修飾する作用物質を同定（例えば、スクリーニング、検出、特徴付け、分析及び定量化）するための方法を提供する。本明細書で使用される「作用物質」、「試験作用物質」、「試験化合物」、「薬物候補」又は「調節剤」という用語又は文法上の等価物は、天然の又は合成した例えばタンパク質、オリゴペプチド（例えば、約５〜約２５個のアミノ酸長の、好ましくは約１０〜２０個又は１２〜１８個のアミノ酸長の、好ましくは１２、１５又は１８個のアミノ酸長）、小有機分子、多糖、脂質（例えば、スフィンゴ脂質）、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の任意の分子を示し、これは本発明のアッセイにおいて使用され、ＤＮＡ断片化又はアポトーシスを修飾する能力に関してアッセイされる。アッセイされ得る化合物に関して格別な制限は存在しない。例には、単一の作用物質、又は低、中若しくは高分子量の化学分子のライブラリ、精製されたタンパク質、遺伝子ライブラリの発現産物、合成ペプチドライブラリ、細胞抽出物及び培養上清が含まれる。作用物質には、異なる作用物質との任意の組み合わせが含まれる。
【００４１】
作用物質には、少なくとも１つ又はそれ以上の可溶性及び不溶性因子、細胞マトリックス構成要素、条件培地、細胞抽出物、組織抽出物、外植片、ｐＨ修飾剤、気体、浸透圧修飾剤、イオン強度修飾剤、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は遺伝子断片が含まれ得る。作用物質は、十分な範囲の多様性を与える、又は逆に類似した構造又は特徴に限定される、コンビナトリアルライブラリー又はランダム化ライブラリ等の試験作用物質のライブラリの形態であり得る。作用物質は、融合パートナー、例えば、標的化合物、レスキュー化合物（ｒｅｓｃｕｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、二量体化化合物、安定化化合物、指定可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）化合物、及び他の機能部分に、場合により連結していてもよい。通常、有用な特性を有する新たな化学実体は、幾つかの望ましい特性又は活性、例えば阻害活性又は調節活性を有する試験作用物質（「リード化合物」又は「リード」と呼ばれる）を同定することによって生み出される。次に、リード化合物は、リード化合物の変形を創作し、その変形化合物の特性及び活性をさらに評価するための足場として使用される。
【００４２】
作用物質には、処理条件（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）並びに外部及び内部の条件又は環境の操作が含まれ得る。このような作用物質の非限定的な例には、紫外線が含まれる。
【００４３】
本発明の一実施態様は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法における使用である。ＨＴＳは、生物学的メカニズム又は疾患病理の側面をモデル化するよう設計されたアッセイにおける何千もの異なる化合物の自動化された同時試験である。１つより多い化合物、例えば複数の化合物を、例えば１つのバッチにおいて同時に試験することが可能である。一実施態様において、ＨＴＳスクリーニング方法という用語は、１つの化合物又は複数の化合物の、選択の読み出しに影響を及ぼす能力を試験するアッセイを指す。
【００４４】
流体取り扱いシステム、蛍光リーダー又はシンチレーションカウンター等の分析装置、並びに細胞培養物及び試料の操作のためのロボットは、本技術でよく知られている。ロボットアーム又は「チェリーピッキング」装置等の機械システムは、当業者に利用可能である。市販のプレートリーダーは、従来の９６ウェル又は３８４ウェルプレートを分析するために利用可能である。所定のウェルを分析し、及び生データ報告を発生させる単一の試料、複数の試料又はプレート試料のリーダーが、利用可能である。生データを、多様な方法で変換し及び提示することが可能である。
【００４５】
本発明の一実施態様は、二本鎖ＤＮＡ断片の形成を調節する作用物質を同定するためのアッセイシステムであり、アッセイシステムは、
（ａ）一連の容器、（ｂ）溶解緩衝液、（ｃ）二本鎖ＤＮＡ内にインターカレートできる検出可能な化合物、並びに（ｄ）少なくとも一つの構成要素、ここで構成要素は作用物質、アポトーシスの誘導剤、アポトーシスの阻害剤、コントロール及び細胞からなる群より選択される
を含む。
【００４６】
本発明のさらなる実施態様は、アッセイシステムの少なくとも１つの要素及び使用のための説明書を含むキットである。従って、アッセイシステムの構成要素は、別々に提供することができ、又はキットにおける等一緒に提供することもできる。アッセイシステムの構成要素は、個々の構成要素の安定性を最大化する方法に従ってキットに調製でき及びその中に含め得る。このような方法は、当業者が精通している。例えば、アッセイシステムの細胞は、懸濁液として提供でき又は凍結乾燥され得る。システムのさらなる構成要素は、緩衝液、マイクロプレート若しくは検査チューブ等のアッセイ構成要素を混合するための容器なども含まれ得る。アッセイシステムは、アッセイを実行するための説明書とデータの取り扱い及び解釈のための説明書とを含むキットの形態で提供可能である。
【００４７】
本発明の実施態様は、本発明の方法によって同定される作用物質の治療的有効量と、医薬的に許容される担体とを含むＤＮＡ断片形成の調節のための医薬組成物である。
【００４８】
「治療的有効量」という用語は、対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ）又は哺乳動物において疾患又は障害を治療するのに効果的な作用物質の量を指す。がんの場合、薬物の治療的有効量は、がん細胞の数を低下させ、腫瘍の大きさを減少させ、末梢器官内へのがん細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで遅延させ、好ましくは停止させ）、腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度まで遅延させ、好ましくは停止させ）、ある程度まで腫瘍の増殖を阻害し、及び／又はがんと関連した症状の１つ又はそれ以上をある程度まで軽減し得る。薬物が既存のがん細胞の増殖を予防し及び／又は死滅させ得る程に、それは、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性であり得る。ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡ断片の形成を調節する作用物質が、多くの変化した疾患に対して適用を有するはずであるから、がんに対する例には限定はない。
【００４９】
ＤＮＡ断片の形成の調節のための医薬組成物は、作用物質の治療的有効量を含み得、ここで、作用物質は、受容体タンパク質を介するＤＮＡ断片形成を調節する。従って、医薬組成物は、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストである試験作用物質を含み得る。さらに、医薬組成物は、ペプチド、そのペプチド断片、同族体、コンジナー、模擬体、類似体、又は分泌細胞及びその可溶性分子である試験作用物質を含み得る。本発明のさらなる実施態様は、同定された作用物質の治療的有効量と医薬的に許容される担体とを含むＤＮＡ断片の形成の調節のための医薬組成物であり、ここで、医薬組成物は、アポトーシスの経路又は機構を効果的に調節する。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「アゴニスト」という用語は、受容体に結合したとき、細胞内応答を活性化し、又は膜へのＧＴＰ結合を亢進する部分（例えば、リガンド及び作用物質だが、これらに限定されない）を指す。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「部分アゴニスト」という用語は、受容体に結合したときアゴニストが結合するよりも低い程度／範囲で、細胞内応答を活性化し、又はアゴニストが亢進するよりも低い程度／範囲で膜へのＧＴＰ結合を亢進する部分（例えば、リガンド及び作用物質だが、これらに限定されるわけではない）を指す。
本明細書で使用されるように、「アンタゴニスト」という用語は、アゴニストが結合するのと同一の部位で受容体に競合的に結合する部分（例えば、リガンド及び作用物質だが、これらに限定されるわけではない）を指す。しかしながら、アンタゴニストは、受容体の活性型によって開始される細胞内応答を活性化せず、それにより、アゴニスト又は部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害することが可能である。関連する側面において、アンタゴニストは、アゴニスト又は部分的アゴニストの非存在下におけるベースラインの細胞内応答を低下させない。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「インバースアゴニスト」という用語は、構成的に活性な受容体に結合し、ベースラインの細胞内応答を阻害する部分（例えば、リガンド及び作用物質だが、これらに限定されるわけではない）を指す。ベースライン応答は、アゴニスト又は部分的アゴニストの非存在下で観察される活性の正常なベースレベルを下回る受容体の活性型、又は膜へのＧＴＰ結合の減少によって開始される。
本明細書で使用されるように、「リガンド」という用語は、別の分子に結合する部分をいい、ここで部分が特にホルモン又は神経伝達物質を含むがそれらに限定されず、さらに受容体に立体選択的に結合するリガンドをいう。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、他の治療剤との組み合わせで使用され得る。例えば、がんの治療において、医薬組成物は、サイトカイン又は多様な化学療法化合物との組み合わせで付与され得る。
【００５４】
本発明のさらなる実施態様は、疾患の生物マーカーがＤＮＡ断片の形成を含む、疾患の治療を診断又はモニターする方法であって、（ａ）一連の容器に生物学的試料を提供すること、（ｂ）ＤＮＡ断片内にインタカレートできる検出可能な化合物を少なくとも１つの容器へ添加すること、（ｃ）インターカレート検出可能な化合物の量を測定すること、及び（ｄ）差異を決定するために、インターカレートした検出可能な化合物の量を参照と比較することを含み、それにより差異が、所定の閾値を超える場合、疾患の治療を診断又はモニターする、方法である。
【００５５】
生物マーカーは、当業者によく知られた用語である。非限定的な例は、細胞、生物体及び哺乳動物の特定の状態を定量する、又は定性的に示すのに使用し得るあらゆる生理学的反応、表現型又は特性を包含するための生物マーカーという用語の使用である。
【００５６】
生物マーカーは、試験される生物学的試料のサブセット間の差異が有意である場合、疾患の診断、モニター及び予測する上で又は疾患の治療をモニターする上での支援に有用であると考えられている。生物マーカーのレベルは、その特定の生物マーカーのたまたま同定される確率が、所定の値より低い場合、「有意に異なる」。このような確率を算出する方法は、ｔ検定又は同様の統計的分析等、サブセット間のレベルを比較するために利用される的確な方法に頼ることになる。当業者によって当然のことと理解されるように、所定の閾値は、利用される試料の数に応じて変動することになる。
【００５７】
生物学的試料は、非ヒト動物又はヒトの器官に由来する器官試料、非ヒト動物又はヒトの組織に由来する組織試料、及び非ヒト動物若しくはヒトに由来する又は細胞培養物に由来する細胞試料であり得る。動物実験には、生物学的試料は、剖検又は生検後に得られる標的器官組織、及び血液等の体液を含む。生物マーカーの臨床的使用に、特に好ましい試料には、血液、血清、血漿、尿、滑液、髄液、脳脊髄液、精液又はリンパ液等の体液、及び生検から得られる体組織が含まれる。
【００５８】
参照物は、当業者によって理解されている。参照物には、罹患していない対象由来の生物学的試料が含まれ得るが、それに限定されるわけではなく、ここで、対象は非ヒト動物又はヒトである。さらに、参照物は、治療されていない対象由来の生物学的試料であり得る。あるいは、参照物は、治療の前、治療中の及び治療後の同一対象に由来し得る。参照物は同一の対象由来であってもよいが、参照物は生物マーカーを測定するのに使用される細胞、組織又は器官の源とは異なる細胞、組織又は器官の試料であってもよい。参照物は、生物学的試料である必要はないが、ＤＮＡ断片の既知の量を備えた試料であり得る。
【００５９】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これは特許請求の範囲において開示される本発明の範囲を限定するものではない。本発明は、当業者が本発明を製造し及び使用するのに十分詳細に記載され及び例証されているが、様々な代替、改変及び改善は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく明らかなはずである。当業者は、本発明が、その目的を達成し、記載した目標及び利点、並びにその中に内在しているものを得るのに十分適合していることを容易に正しく理解する。以下の実施例は、実施態様の記載であり、本発明の範囲の限定として意図されているものではない。その中での改変及び他の使用は、当業者であれば思いつくであろう。これらの改変は、本発明の趣旨の範囲内に包含され、特許請求の範囲によって規定される。様々な置換及び改変は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書で開示された本発明に対して為すことができる。
【００６０】
本明細書に例証的に記載される本発明は、本明細書で具体的には記載されていない、何れかの要素、制限の非存在、においても実施され得る。採用されている用語及び表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語ではなく、かつこのような用語及び表現の使用において、示され及び記載された特徴又はその部分の何れかの等価物を排除する意図は全くないが、様々な改変が、特許請求した本発明の範囲内で可能なはずである。従って、本発明を、実施態様及び随意選択の特徴によって特に開示しているが、当然のことながら本明細書に開示された概念の改変及び変形が、当業者によって為され得、かつこのような改変及び変形が、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の範囲内であるとされる。
【実施例】
【００６１】
実施例１
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによるＤＮＡ断片の検出：
一般的なアッセイ条件及び考慮を記載する。しかしながら、以下に提供されるその後の実施例に関しては、アッセイ条件を、変数を試験するために、及び実験目的に合わせるために改変したが、本発明を特定の実施態様に必ずしも限定するものではない。
ＨＬ−６０は、ＡＴＣＣから市販されたヒトＡＭＬ細胞系であった（ATCCカタログ番号CCL-240 （登録商標））。完全細胞培地を以下のとおり調製した。熱不活化した１００ｍＬのウシ胎仔血清、２０ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンストック溶液（表１参照）を１ＬのＲＰＭＩ−１６４０培地へ添加した。完全に混合した後、０．２２μｍの濾過滅菌装置（Nalgene）を通して、完全培地を濾過した。インキュベーション培地を以下のとおり調製した。５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンストック溶液及び熱不活化した２５ｍＬのウシ胎仔血清を５００ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０と混合した（フェノールレッド及びＬ−グルタミンはなし）。
【００６２】
一般的な実験手法を以下のプロトコールで行った。化合物処理の４〜５日前に細胞を培養した。細胞生存率は、約９２％より大であるべきである。細胞密度を計数し、Viacount 2.12プログラムを備えたGUAVA PCAを使用して、生存率を確認した。細胞をアリコートにし、３００×ｇで６分間遠心分離した。上清を廃棄し、５％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ（フェノールレッドなし）で細胞ペレットを１５万個／ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液のアリコートの４０μＬを３８４ウェルの各ウェルに分注した。特定の実験条件下で、細胞を適切な時間、インキュベートした。次に、細胞溶解緩衝液４５μＬを細胞試料へ添加した。
【００６３】
溶解緩衝液を以下のとおり調製した。溶解緩衝液１Ｌを作製するために、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４０ｍＬ、２０％トゥイーン２０溶液１０ｍＬ、２０％トリトンＸ−１００溶液１０ｍＬを９２０ｍＬの脱イオン水と混合した。使用直前に、ＲＮａｓｅＡストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬを溶解緩衝液へ添加し、０．０５ｍｇ／ｍＬの終濃度にした。溶解緩衝液の添加後、プレートを室温で６０分間放置した。細胞培養プレートを２０００×ｇで２０分間遠心分離し、ＤＮＡ断片を含有する細胞溶解物の上清１０μＬをＣｙＢｉｏウェル３８４と共に検出プレート（Corning Costar 384-ウェルポリスチレンアッセイプレート、黒色、非結合表面）中に移した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ検出溶液のアリコート１０μＬを検出プレートの各試料ウェルに添加した。使用前に、ＤＭＳＯストック溶液を検出緩衝液中に１：２００に希釈することによって、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ検出溶液を新鮮にした。５０ｍＬの１０×トリス−ＨＣｌ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ，ｐＨ８．０）及び２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）ストック溶液を脱イオン水と混合して、５００ｍＬの最終容量にすることによって、検出緩衝液を調製した。PerkinElmer Envisionを使用して、蛍光強度を分析した。
表１は、非限定的な典型的な試薬及び材料、濃度、機能及び供給元を掲記した。
【００６４】
【表１】
2009540834.tif 000003
【００６５】
表２は、非限定的な装置の例、このような装置がどのように使用可能であるか及び供給元を掲記した。
【００６６】
【表２】
2009540834.tif 000004
【００６７】
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎに関する測定パラメータは、次のとおりであった。励起に関して、ミラーはＦＩＴＣであり、励起フィルターはＦＩＴＣ４８５であり、発光フィルターはＦＩＴＣ５３５であり、フラッシュ数は２５に等しく、励起光は１％であり、検出ゲインは１に等しく、及び測定高は８ｍｍであった。
【００６８】
各アッセイは、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール及びブランクコントロールを含有した。使用される適切なコントロールは、達成しようとする実験目的によって決定した。典型的には、ポジティブコントロールは、１％ＤＭＳＯ中の５μＭ硫酸ビンブラスチンで処理されたＨＬ−６０細胞であった。ネガティブコントロールは、１％ＤＭＳＯで処理されたＨＬ−６０細胞であった。シグナルブランクは、１％ＤＭＳＯを有するインキュベーション培地であった（ＨＬ−６０細胞なし）。
【００６９】
データ分析は、実験パラメータ又は調査下のパラダイムに調整可能であった。典型的には、形成された断片化ＤＮＡの相対的な量は、試料の蛍光強度（ＦＩ）によって表された。ＨＬ−６０細胞におけるＤＮＡ断片化に及ぼす作用物質処理の効果は、ＤＭＳＯコントロール試料に対する蛍光強度における変化に基づいて算出された。％効果は、次のように決定した。
【数１】
2009540834.tif 000005
【００７０】
実施例２
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、ＨＬ−６０細胞において放出されたＤＮＡ断片を特異的に検出した：
図１は、カンプトテシンで処理されたＨＬ−６０においてＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光強度が増大したことを示した。中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（４０万個／ｍＬ）を０．１％ＤＭＳＯ担体溶媒又は３．２μＭカンプトテシンの何れかで５．５時間処理した。溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％トゥイーン２０）の等容量を全細胞培養物中に添加した。室温で４５分間放置した後、細胞溶解物を２０００×ｇで２０分間遠心分離に供し、上清の上部を抜き取り、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素との混合による蛍光強度の読み出しを使用して、ＤＮＡ含量を定量した。培地ブランクは、細胞培養培地と溶解緩衝液との等量混合物であった。
【００７１】
実施例３
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光シグナルは、細胞溶解物中のＤＮＡレベルに依存した：
０．１％ＤＭＳＯ担体溶媒又は３．２μＭカンプトテシンの何れかで５．５時間処理した後、ＥＤＴＡを含有しない溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２％トゥイーン２０及び３μｇ／ｍＬＲＮａｓｅ）の等量をＨＬ−６０全細胞培養物に添加した。室温で４５分間放置した後、細胞溶解物を遠心分離し、上清の上部を抜き取り、ＲＮａｓｅを含有しないＤＮａｓｅと共に３７℃で、指定時間インキュベートした（図２）。処理の２時間後、ＤＮａｓｅＩは、ＤＭＳＯコントロール試料の蛍光強度を約５０％ほど低下させることができた。カンプトテシンで処理された細胞に関するシグナルは、ＤＮａｓｅＩ処理前により高い蛍光強度を有し、ＤＮａｓｅＩ処理したＤＭＳＯコントロールのシグナルと同様のレベルにまで効果的に低下した。これらの結果は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光シグナルが、細胞溶解物中の断片化されたＤＮＡの存在によることを示した。
【００７２】
実施例４
ｄｓＤＮＡを検出するためのＰｉｃｏＧｒｅｅｎとヨウ化プロピジウム又はＥＬＩＳＡとの比較：
中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（３０万個／ｍＬ）をカンプトテシン、スタウロスポリン又はブレオマイシンの異なる用量で２０時間処理した。溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％トゥイーン２０及び５μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ）の等量を全細胞培養物に添加した。細胞可溶解物を２０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清の上部を引き抜き、ＥＬＩＳＡキット（Roche Applied Sciences）又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ若しくはヨウ化プロピジウムを使用する蛍光強度の読み出しの何れかを使用して、ＤＮＡ含量を定量した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ検出を使用するカンプトテシンの用量反応曲線（図３）を、ヨウ化プロピジウム検出（図４）と比較した。０．５ｍｇ／ｍＬストックから、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の０．００１２５ｍｇ／ｍＬ作用溶液へと、ヨウ化プロピジウムを希釈した。ヨウ化プロピジウム作用溶液２０μＬを試料溶液２０μＬと混合した後、励起波長５３１ｎｍ、発光波長６３５ｎｍで、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎで蛍光強度を測定した。
【００７３】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎで検出されたカンプトテシン、スタウロスポリン又はブレオマイシンに関する用量反応曲線を図３に示した。カンプトテシンについてのＥＣ50値は、１．４８μＭであり、スタウロスポリンは、０．４１μＭであり、ブレオマイシンは、１００μＭより大であった。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって測定されるＥＣ50値は、ＥＬＩＳＡ検出キットによるものと（図５）と良好に一致した。ＥＬＩＳＡによって決定されるＥＣ50値は、カンプトテシンについて１．１１μＭ、スタウロスポリンについて０．１９μＭ及びブレオマイシンについて１００μＭより大であった。
【００７４】
実施例５
ＨＬ−６０細胞におけるカンプトテシン誘導ＤＮＡ断片化に及ぼすアポトーシス阻害剤であるＺｎＣｌ2の効果：
亜鉛は、化学的アゴニスト及び死受容体アゴニストの両者によって誘導されるアポトーシスを阻害することが公知である。アポトーシスにおけるＤＮＡ断片化の尺度としてｄｓＤＮＡを検出及び定量するためにＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを適用する可能性をさらに立証するために、塩化亜鉛の種々の用量の存在下で、中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（３０万個／ｍＬ）を３．２μＭカンプトテシンで２０時間処理した（図６）。細胞から放出されるＤＮＡ断片を上述のとおりＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬で定量した。カンプトテシンを含有し、塩化亜鉛を含有せず又は低濃度で含有する試料に関して、蛍光シグナルは、ＤＭＳＯ処理をした試料由来のシグナルの３倍より大であった。塩化亜鉛濃度が、１００μＭ又はそれ以上にまで増大した場合、蛍光シグナルのレベルによって反映されるＤＮＡ断片化の程度は、ＤＭＳＯ処理のみをした試料と同一のレベルにまで低下した。
【００７５】
実施例６
ＨＬ−６０溶解物中のＤＮＡ断片化シグナル対バックグラウンドの比に及ぼすＲＮａｓｅ処理の効果：
中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（４０万個／ｍＬ）を０．１％ＤＭＳＯ担体溶媒又は３．２μＭカンプトテシンの何れかで５．５時間処理した。ＤＮａｓｅを含有しないＲＮａｓｅ（Roche Applied Sciences 1579681）の種々の濃度を含有する溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％トゥイーン２０）の等量を、全細胞培養物に添加した。室温で４５分間放置した後、細胞溶解物を２０００×ｇで２０分間遠心分離に供した。上清の上部を抜き取り、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素との混合によって、ＤＮＡ含量を定量した。ＲＮａｓｅの高濃度を含有する細胞溶解物の処理は、細胞ＲＮＡによるバックグラウンド蛍光を低下させ、シグナルウィンドウ（ｓｉｇｎａｌ  ｓｉｎｄｏｗ）を改善した（図７）。
【００７６】
実施例７
ＨＬ−６０細胞におけるＤＮＡ断片化に及ぼすカンプトテシン効果の時間経過：
中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（４０万個／ｍＬ）を０．１％ＤＭＳＯ担体溶媒又は３．２μＭカンプトテシンの何れかで処理した（図８）。示される各時点で、細胞懸濁液１００μＬを抜き取り、溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％トゥイーン２０）の等量と混合した。カンプトテシンは、迅速に作用するアポトーシス誘導剤である。処理４時間で、カンプトテシンはＤＮＡ断片化における有意な増加を既に引き起こした。
【００７７】
実施例８
ＨＬ−６０細胞におけるＤＮＡ断片化に及ぼす細胞密度の効果：
細胞培地中のＨＬ−６０細胞を、３００×ｇで６分間スピンダウンした。培地を廃棄した後、示された濃度になるよう、化合物インキュベーション培地中に細胞を再懸濁した。次に、細胞懸濁液を０．１％ＤＭＳＯ担体溶媒又は３．２μＭカンプトテシンの何れかの１／１０容と共に２０時間インキュベーションした後、溶解及び検出手法を行った。培地ブランクは、細胞培養培地と溶解緩衝液との等量混合物であった。図９は、シグナルウィンドウに及ぼす細胞密度の効果を示し、図１０は、細胞密度に対するシグナルの誘導倍率をグラフで表した。
【００７８】
実施例９
ＨＬ−６０細胞におけるＤＭＳＯ耐性：
中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（３０万個／ｍＬ）をＤＭＳＯの種々の用量で２０時間処理した。溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％トゥイーン２０及び５μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ）の等量を全細胞培養物に添加した。細胞溶解物を２０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清の上部を抜き取り、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光アッセイを使用して、ＤＮＡ含量を定量した。図１１は、１％までのＤＭＳＯが、ＨＬ−６０細胞によって２０時間のインキュベーションに耐性であり得たことを示す。
【００７９】
実施例１０
作用の異なるメカニズムを有する細胞毒性作用物質のパネルの用量反応曲線：
中間対数期におけるＨＬ−６０細胞（３０万個／ｍＬ）を、公知のアポトーシス誘導化合物の種々の用量で２０時間処理した。図１２は、バリノマイシン、ビンブラスチン及びビンクリスチンの細胞毒性活性を示した。図１３は、エトポシド、ゲニステイン、ピューロマイシン及びラパマイシンの細胞毒性活性を示した  。
【００８０】
実施例１１
ランダム化学ライブラリのスクリーニングのデータ分布：
３８４ウェルの第１〜２２列のウェル中に化合物ライブラリを分注した。ポジティブコントロールであるビンブラスチン（５μＭ）を第２４列のウェルへ添加した。第２３列のウェルをネガティブコントロール（化合物なし）用に使用した。ＨＬ−６０細胞を各ウェルにアリコートし、４０時間インキュベートした（図１４）。実施例１において記載した手法を使用して、ＤＮＡの断片化を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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