(57)【要約】Ａｐｏ−Ｂ１００遺伝子に向けられたオリゴヌクレオチドが、Ａｐｏ−Ｂ１００の発現をモデュレートするために提供される。組成物は、Ａｐｏ−Ｂ１００をコードする核酸にターゲティングされたオリゴヌクレオチド、とりわけアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。Ａｐｏ−Ｂ１００発現をモデュレートするため、およびＡｐｏ−Ｂ１００の過剰発現か、突然変異Ａｐｏ−Ｂ１００の発現かまたはその両者のいずれかと関連する疾患の治療のために、これら化合物を使用する方法が提供される。疾患の例は、癌、例えば、肺、乳、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、胸腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸管、腸、脊髄、洞、膀胱、尿管または卵巣の癌である。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドまたは核酸アナログ、例えば、ロックト核酸またはその組合せから構成されていてよい。
2009507499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全部で12-50のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなるオリゴヌクレオチド化合物であって、該化合物は少なくとも10のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列はSEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25および26よりなる群から選ばれた配列に対応し、該化合物は少なくとも3のヌクレオチドアナログを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
二本鎖のオリゴヌクレオチドからなり、各鎖が全部で16-30のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、該化合物は少なくとも10のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列はSEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25および26から選ばれた配列内に位置しており、該化合物は少なくとも3のヌクレオチドアナログを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該サブ配列が少なくとも3のヌクレオチドアナログを含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
該サブ配列が、2-6の一続きのヌクレオチドアナログと、それに続く4-12の一続きのヌクレオチドと、それに続く2-6の一続きのヌクレオチドアナログを含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
該サブ配列が、SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25および26よりなる群から選ばれた該配列中の対応配列と比較したときに1または2のミスマッチを含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
12-25のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,または22のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
15または16のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
該ヌクレオチドが、リン酸基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基よりなる群から選ばれた結合基を含み、インターヌクレオシド結合が-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-である、請求項１ないし８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
該結合がリン酸基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
該結合がホスホロチオエート基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
すべての結合がホスホロチオエート基である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
3-12のヌクレオチドアナログを含む、請求項１ないし１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
6または7のヌクレオチドアナログを含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
該ヌクレオチドアナログの少なくとも１がロックト核酸（LNA）である、例えば、少なくとも3、またはすべてのヌクレオチドアナログがLNAである、請求項１ないし１４のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
LNAが、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNAおよびベータ-D-チオ-LNAから選ばれる、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
該ヌクレオシドおよび／またはLNAが互いにリン酸基またはホスホロチオエート基により結合している、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
該サブ配列が、SEQ ID No: 63、SEQ ID NO: 2、SEQ ID No: 3、およびSEQ ID No: 11よりなる群から選ばれる、請求項１ないし１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
該サブ配列が、SEQ ID No: 64、例えばSEQ ID No: 18または19；SEQ ID NO: 65、例えばSEQ ID No: 20または21；SEQ ID No: 66、例えばSEQ ID No: 22、23、または24；SEQ ID No: 67、例えばSEQ ID No: 25または26、およびSEQ ID No: 68、例えばSEQ ID No: 4または5よりなる群から選ばれる、請求項１ないし１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
式：
5'-[(LNA)2-6-(DNA/RNA)4-12-(LNA)2-6-(DNA/RNA)0-1]-3'
または
5'-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8-9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「DNA」および「RNA」は、それぞれデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを示す）で示される、請求項１ないし１９のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
SEQ ID NOS: 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47よりなる群から選ばれる化合物。
【請求項２２】
SEQ ID NO: 29である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 30である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２４】
SEQ ID NO: 37である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物と、該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基とを含むコンジュゲート。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物または請求項２４に記載のコンジュゲート、および薬理学的に許容しうる希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項２７】
経口投与に適合される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
少なくとも１のコレステロール低下化合物をさらに含む、請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
該化合物が、胆汁酸塩封鎖樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩）、HMGCoA-リダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プレバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブル酸誘導体（例えば、クロフィブレート、ゲンフィブロジル、フェノフィブレート、ベンザフィブレート、およびシプロフィブレート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、プラント−スタノールエステル、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、インプリタピド、胆汁酸トランスポーター（apical sodium-dependent bile acid transporters）の阻害剤、肝臓CYP7aのレギュレーター、エストロゲン補充療法剤（例えば、タモキシフェン）、および抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド）よりなる群から選ばれる、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
医薬として使用するための請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物または請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
異常なレベルのＡｐｏ−Ｂ１００の治療用医薬の製造のための、請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物または請求項２５に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項３２】
該異常なレベルのＡｐｏ−Ｂ１００が、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症または高脂血症よりなる群から選ばれた医学的状態の存在と相関関係を有する、請求項２７に記載の使用。
【請求項３３】
アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症よりなる群から選ばれた疾患または状態を罹患する患者を治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項２６ないし２９のいずれかに記載の医薬組成物またはコンジュゲートを投与する工程を含む方法。
【請求項３４】
該医薬組成物またはコンジュゲートを経口投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
アポリポタンパク質Ｂをダウンレギュレーションする方法であって、患者、例えば請求項３３に記載の患者に請求項２６ないし２９のいずれかに記載の医薬組成物またはコンジュゲートを投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｐｏ−Ｂ１００の発現をモデュレートするための化合物および方法を提供する。とりわけ、本発明は、Ａｐｏ−Ｂ１００をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド化合物に関する。これらオリゴヌクレオチド化合物はＡｐｏ−Ｂ１００の発現をモデュレートすることが示され、その医薬製剤および癌疾患の治療剤としてのその使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ、アポリポタンパク質Ｂ−１００；ＡｐｏＢ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８；ＡｐｏＢ−４８およびＡｇ（ｘ）抗原としても知られる）は、脂質のアセンブリーおよび分泌において、および特定のクラスのリポタンパク質の輸送およびレセプター媒介取り込みおよび送達において、欠くことのできない役割を果たす大きな糖タンパク質である。ＡｐｏＢは、リポタンパク質の循環レベルの制御において重要な役割を果たしており、それゆえ、アテローム性動脈硬化症の罹病性（アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の周辺濃度と高度の相関関係を有する）と関係している。哺乳動物中に存在する２つの形態のＡｐｏＢ、その構造およびＡｐｏＢの医学的重要性のさらなる詳細についてはDavidsonおよびShelness (Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193)を参照のこと。
【０００３】
ＡｐｏＢ−１００含有リポタンパク質Lp(a)の血漿レベルの増大は、アテローム性動脈硬化症と、高コレステロール血症（Seedら、N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499）、心筋梗塞（Sandkampら、Clin. Chew., 1990, 36, 20-23）、および血栓症（Nowak-Gottlら、Pediatrics, 1997, 99, Eli）を含むその徴候とのリスクの増大と関係している。
【０００４】
Lp(a)の血漿濃度は遺伝的因子の影響を強く受け、大抵の医薬や食事操作に対し難治性である（KatanおよびBeynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessbyら、Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71）。上昇したLp(a)レベルの薬理療法はささやかな成功しか博しておらず、未だにアフェレーシスが最も有効な治療適用である（HajjarおよびNachman, Annul Rev. Med., 1996, 47, 423-442）。
【０００５】
哺乳動物では２つの形態のアポリポタンパク質Ｂが存在する。ＡｐｏＢ−１００は、4536アミノ酸残基を含む完全長タンパク質を表し、もっぱらヒト肝臓で合成される（DavidsonおよびShelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。ＡｐｏＢ−４８として知られる先端欠失形態は、アミノ末端の2152残基に対応し、すべての哺乳動物の小腸で合成される（DavidsonおよびShelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。
【０００６】
アポリポタンパク質Ｂの共通する構造遺伝子が２つの区別されるタンパク質イソ型を生成する基礎は、ＲＮＡ編集として知られるプロセスである。部位特異的なシトシンからウラシルへの編集反応はUAA停止コドンを生成し、アポリポタンパク質Ｂの翻訳終止はＡｐｏＢ−４８を生成する（DavidsonおよびShelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。
【０００７】
哺乳動物ＡｐｏＢの医学的重要性は、トランスジェニックマウス研究を用いて過剰発現ヒトＡｐｏＢか（KimおよびYoung, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Nishinaら、J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869）またはＡｐｏＢノックアウトマウス（Fareseら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778; KimおよびYoung, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723）のいずれかで実証されている。
【０００８】
今日、アポリポタンパク質Ｂ機能の抑制に向けられた戦略は、Lp(a)アフェレーシス、抗体、抗体フラグメントおよびリボザイムに限られている。さらに、低い生物安定性および／または低い結合アフィニティーのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、PCT公開WO00/97662, WO03/11887およびWO2004/44181に開示され、特許請求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、アポリポタンパク質Ｂ機能を有効に拮抗することができ、それゆえ血漿Lp(a)レベルを低下させることのできるさらなる薬剤に対する必要性が依然として存在する。
【００１０】
本発明は、有効なロックト核酸（Locked Nucleic Acid；LNA）オリゴマー化合物および、アポリポタンパク質Ｂの別のイソ型であるＡｐｏＢ−４８の抑制を含む、アポリポタンパク質Ｂ発現をモデュレートする方法における該化合物の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＢ−４８）の発現をモデュレートするための組成物および方法を提供する。とりわけ、本発明は、特定のモチーフに対してアポリポタンパク質Ｂをターゲティングするオリゴヌクレオチド化合物に関する。これらモチーフは、SEQ ID NOS: 2-26、とりわけSEQ ID NOS: 2, 3,10, 11および21である。LNA含有オリゴヌクレオチド化合物の特別のデザインもまた開示される。特に好ましい化合物は、SEQ ID NOS: 29-47、とりわけSEQ ID NOS: 29, 30, 31, 36, 37, 38, 40および42である。本発明の化合物は、アポリポタンパク質ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の強力なインヒビターである。インビトロでは、SEQ ID NOS: 29および30は、ＡｐｏＢ発現を約1-5nMのIC50でダウンレギュレートし、SEQ ID No 37は、約0.5nMのIC50を示した。インビボでは、ＡｐｏＢ−１００ｍＲＮＡ発現は、SEQ ID NO: 29で処置後、肝臓および空腸で用量依存的な仕方で抑制された。ＡｐｏＢ−１００レベルの低下と同時に、血漿中の全コレステロールは70%低下した。
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物を含む医薬組成物その他の組成物もまた提供される。さらに、細胞または組織においてアポリポタンパク質Ｂの発現をモデュレートする方法であって、該細胞または組織を本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物の１またはそれ以上と接触させることを含む方法もまた提供される。また、本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物の１またはそれ以上の治療学的または予防学的有効量を投与することによる、アポリポタンパク質Ｂの発現と関連する疾患または状態に罹患しているかまたは罹患しそうな動物またはヒトを治療する方法も開示される。さらに、アポリポタンパク質Ｂの発現の抑制のため、およびアポリポタンパク質Ｂ活性と関連する疾患の治療のためにオリゴヌクレオチド化合物を使用する方法が提供される。そのような疾患の例は、種々のタイプのＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール不均衡；異常脂血症（dyslipidemias）、例えば、家族性高リポタンパク質血症、後天性高リポタンパク質血症、高コレステロール血症；スタチン耐性高コレステロール血症；冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、冠状心疾患（ＣＨＤ）、アテローム性動脈硬化症である。
【００１３】
本発明は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ−１００および／またはＡｐｏＢ−４８など）をコードする核酸分子の機能をモデュレートするのに使用するため、オリゴマー化合物、とりわけアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。モデュレーションは、最終的には生成したアポリポタンパク質Ｂの量の変化である。一つの態様において、このことは、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸（例えばメッセンジャーＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を提供することによって達成される。モデュレーションは、アポリポタンパク質Ｂの発現の抑制、すなわち、生成された機能的なタンパク質の数の低減に導くのが好ましい。
【００１４】
図１は、LNAヌクレオチドアナログを含むｓｉＲＮＡおよび一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、インビトロで同じナノモル範囲で有効であることを示している。しかしながら、インビボでは、本発明の16-mer LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドは非修飾ｓｉＲＮＡおよびコレステリルコンジュゲートｓｉＲＮＡの両者よりも優れている。
【００１５】
図２Ａおよび２Ｂは、コレステリルコンジュゲートｓｉＲＮＡに比べてインビボで８倍まで一層有効である本発明のLNAオリゴヌクレオチドを示す。LNAオリゴヌクレオチドはマウス血漿中の全コレステロールを低下させたが、ｓｉＲＮＡ処置は低下させなかった（図３）。さらに、LNAオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡよりも生物安定である。
【００１６】
標的の発現をモデュレートするオリゴマー化合物は、実験によって、または標的に対する配列情報および所望の標的に対してオリゴヌクレオチド化合物を如何にして最良にデザインするかについてのノウハウに基づく合理的デザインによって、同定される。これら化合物の配列は本発明の好ましい態様である。同様に、これら好ましいオリゴマー化合物によってターゲティングされる配列モチーフは、好ましいターゲティング部位である。
【００１７】
オリゴマー化合物およびオリゴヌクレオチド化合物
「オリゴマー化合物」（「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド化合物」と同義）とは、本発明に関連して用いるときは、オリゴマー、すなわち核酸ポリマー（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または当該技術分野で知られたものの核酸アナログ、好ましくはロックト核酸（LNA）、またはそれらの混合物）をいう。この語は、天然に存在する核酸塩基、糖およびインターヌクレオシド（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに天然に存在しない部分を有し同様に機能するかまたは特別の改善された機能を有するオリゴヌクレオチドを包含する。完全にまたは部分的に修飾または置換したオリゴヌクレオチドが、そのようなオリゴヌクレオチドの幾つかの望ましい特性、例えば、細胞膜を通る能力、細胞外および細胞内ヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的に対する親和性および特異性のために、天然形態のものよりも屡々好ましい。LNAアナログが、例えば上記特性に関して特に好ましい。それゆえ、極めて好ましい態様において、本発明による「オリゴマー化合物」、オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」および「オリゴヌクレオチド化合物」は、LNA単位などのヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの両単位で構成され、12-50のヌクレオチド／ヌクレオチドアナログのポリマー化合物（オリゴマー）を形成する化合物である。
【００１８】
「単位」なる語は、モノマーと理解される。
【００１９】
本発明のオリゴマー化合物は、アポリポタンパク質ＢメッセンジャーＲＮＡおよび／または哺乳動物アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ）ＤＮＡセンスまたは相補鎖にハイブリダイズすることができる。NCBIアクセッション番号NM_000384は、ヒトアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ配列を提供する。本発明のオリゴマー化合物は、NCBIアクセッション番号NM_000384に開示された核酸または好ましい態様において該ヒトアポリポタンパク質に由来するｍＲＮＡ核酸標的を含むその逆相補鎖（reverse complement）にハイブリダイズすることができるのが極めて好ましい。
【００２０】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも37℃、例えば、少なくとも40℃、少なくとも50℃、少なくとも55℃、または少なくとも60℃のTmにてＡｐｏＢｍＲＮＡなどの標的核酸に対してハイブリダイズして二本鎖を形成することができる。一つの側面において、Tmは、37℃〜80℃、例えば、50〜70℃である。
【００２１】
Tmの測定
10mMリン酸ナトリウム/100mM NaCl/0.1nM EDTA, pH 7.0中の化合物の3μM溶液を、10mMリン酸ナトリウム/100mM NaCl/0.1nM EDTA, pH 7.0中の3μMの濃度のその相補鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと90℃にて１分間混合し、静置して室温に冷却する。ついで、二本鎖の融解曲線を、25〜95℃の範囲で1℃/分の加熱割合にて260nmでの吸光度を測定することによって決定する。Tmは、融解曲線の第一派生物（first derivative）の最大として測定する。
【００２２】
オリゴマー化合物は好ましくはアンチセンスオリゴマー化合物であり、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「アンチセンスインヒビター」とも称する。
【００２３】
そのようなアンチセンスインヒビターは、標的核酸に相補的なヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ配列を含む化合物であり、「ｓｉＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、「リボザイム」、「オリゴザイム」の形態をとる。しかしながら、好ましくはアンチセンスインヒビターは一本鎖オリゴヌクレオチドである。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的核酸の対応領域に相補的であるのが好ましい。
【００２４】
典型的に、一本鎖「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは標的遺伝子のｍＲＮＡと特異的に相互作用して、例えばＲＮアーゼＨ機構による該ｍＲＮＡのターゲティングされた分解を惹き起こすか、または他の仕方で翻訳を妨害する。
【００２５】
一つの態様において、本発明によるオリゴマー化合物は、哺乳動物ＡｐｏＢをコードするＤＮＡ、例えば、センスまたはアンチセンスＤＮＡ鎖をターゲティングする。ｓｉＲＮＡは標的ＤＮＡと相互作用できることが知られている。
【００２６】
本発明によるオリゴマー化合物は、少なくとも３のヌクレオチドアナログを含むのが好ましい。この少なくとも３のヌクレオチドアナログは、ロックト核酸ヌクレオチドアナログであるのが好ましく、そのようなヌクレオチドアナログを含むオリゴマー化合物は本明細書において「LNAオリゴマー化合物」、「LNAオリゴヌクレオチド化合物」および「LNAオリゴヌクレオチド」と称する。
【００２７】
適切には、本発明による「オリゴヌクレオチド化合物」、「オリゴマー化合物」、「LNAオリゴマー化合物」は、例えば、水素結合による標的核酸への結合によってヒトにおいて所望の治療効果を誘発することのできる、本明細書に規定するオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
本発明は、8-50、例えば、10-50、とりわけ12-50または12-25のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなるオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物に関し、該化合物は、少なくとも8、例えば、少なくとも10、例えば、少なくとも12、例えば、少なくとも14、例えば、少なくとも15、例えば、14, 15, 16または17のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列は、Ａｐｏ−Ｂ１００および／またはＡｐｏＢ−４８核酸標的配列の配列内（すなわち、配列に対応）に位置する。ヌクレオチドアナログは、配列SEQ ID NOS: 2-26、とりわけSEQ ID NOS: 2, 3, 10, 11および21の各ヌクレオチドのアナログである。それゆえ、本発明の化合物の配列は、SEQ ID NOS: 2-26、とりわけSEQ ID NOS: 2, 3, 10, 11および21よりなる群から選ばれた配列内（すなわち、配列に対応）に位置するか、またはSEQ ID NOS: 2-26、とりわけSEQ ID NOS: 2, 3, 10, 11および21の配列内のヌクレオチドのアナログを含む。
【００２９】
その内部に化合物のサブ配列が位置する（またはその内部にサブ配列がヌクレオチドのアナログを含む）好ましい配列群は、SEQ ID NO: 2および3; SEQ ID NO: 2および3および11; SEQ ID NO: 10および11; SEQ ID No 21を含む。
【００３０】
一つの態様において、その内部に化合物のサブ配列が位置する（またはその内部にサブ配列がヌクレオチドのアナログを含む）配列群は、SEQ ID No 3である。 
【００３１】
一つの態様において、その内部に化合物のサブ配列が位置する（またはその内部にサブ配列がヌクレオチドのアナログを含む）配列群は、以下よりなる群から選ばれる配列である：SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 48およびSEQ ID No 50。
【００３２】
関心のもたれる態様において、本発明の化合物は、8-50ヌクレオチドを含み、該化合物は、少なくとも8ヌクレオチドのサブ配列を含み、該サブ配列はSEQ ID NOs: 2および3よりなる群から選ばれた配列内に位置し、少なくとも１のヌクレオチドが対応ヌクレオチドアナログによって置換され、３'末端がヌクレオチドアナログではなくヌクレオチドを含む。
【００３３】
8-50ヌクレオチドを含み、該化合物が少なくとも8ヌクレオチドのサブ配列を含み、該サブ配列がSEQ ID NOs: 2および3よりなる群から選ばれた配列内に位置する本発明の化合物の態様において、配列は、典型的に、本明細書において規定する2-6の一続きのLNAと、それに続く4-12の一続きのヌクレオチドと、それに続く本明細書において規定する2-6の一続きのLNAを含む。
【００３４】
「内部に位置する」および「対応する」とは、本発明のオリゴマー化合物のヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの配列またはそのサブ配列と、以下の等価ヌクレオチド配列との組合せ間での比較をいう：（i）アポリポタンパク質Ｂ核酸配列（すなわち、核酸標的）の逆相補鎖、および／または（ii）SEQ ID NOS: 2-26,および59-67よりなる群にて提供されるヌクレオチドの配列（すなわち、配列モチーフ）、または一つの態様において、その逆相補鎖。ヌクレオチド配列は、その等価ヌクレオチドと直接比較される。
【００３５】
配列は、SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67およびSEQ ID No 68よりなる群から選ばれた核酸中に存在する連続ヌクレオチドの等価数に対応する、少なくとも8、例えば、少なくとも9、例えば、少なくとも10、例えば、少なくとも11、例えば、少なくとも12、例えば、少なくとも13、例えば、少なくとも14、例えば、少なくとも15、例えば、少なくとも16、例えば、少なくとも17、例えば、少なくとも18、例えば、少なくとも19、または少なくとも20のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む（図７参照）。
【００３６】
好ましくは、少なくとも3のヌクレオチドアナログが、該サブ配列内に、任意に少なくとも3ヌクレオチドアナログの連続配列として、例えば、3, 4, 5または6ヌクレオチドアナログの連続配列として位置する。
【００３７】
一つの好ましい態様において、オリゴマー化合物は、サブ配列のみからなる、すなわち、オリゴマー化合物の全配列が、SEQ ID No 2-26およびSEQ ID No 59-62よりなる群から選ばれた配列など、対応配列中に見出される。
【００３８】
好ましくは、ＡｐｏＢ標的配列の対応領域と相関させたときにミスマッチを生成するヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが存在しない、すなわち、本発明のオリゴマー中に存在するすべてのヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログがＡｐｏＢ核酸標的配列と連続した塩基対を形成することができる。
【００３９】
しかしながら、一つの態様において、サブ配列および核酸標的配列内に１のミスマッチまたは２のミスマッチが存在してもよい。ミスマッチが存在する場合、それらミスマッチがヌクレオチドアナログと標的配列との間のものでないのが好ましい。しかしながら、ギャップマー（gapmer）（ＲＮアーゼＨを再利用することができる）のギャップにおいては、ミスマッチはＲＮアーゼＨ再利用能の喪失に導く。十分なＲＮアーゼＨ活性を確実にするには、典型的に5または6の連続相補的ヌクレオチドが必要である。
【００４０】
好ましい態様において、本発明によるオリゴヌクレオチド化合物は、SEQ ID NO 59および／またはSEQ ID NO. 60に対応する配列を含み、その際、該サブ配列は、任意に１またはそれ以上のミスマッチを含んでいてよい。
【００４１】
一つの態様において、本発明によるオリゴヌクレオチド化合物は、SEQ ID NO 61および／またはSEQ ID NO. 62に対応する配列を含み、その際、該サブ配列は、任意に１またはそれ以上のミスマッチを含んでいてよい。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、サブ配列は、SEQ ID No 63中の等価数の連続ヌクレオチド内に位置する（すなわち対応する）少なくとも8、例えば、少なくとも10、または少なくとも12、例えば、少なくとも14、例えば、14, 15, 16, 17, 18, 19または20のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み、その際、該サブ配列は、任意に１またはそれ以上のミスマッチを含んでいてよい。
【００４３】
本発明のさらなる態様において、サブ配列は、SEQ ID No 64, SEQ ID No 65, SEQ ID No 66, SEQ ID No 67およびSEQ ID No 68よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列中の等価数の連続ヌクレオチド内に位置する（すなわち対応する）少なくとも8、例えば、少なくとも10、または少なくとも12、例えば、少なくとも14、例えば、14, 15, 16, 17, 18, 19または20のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み、その際、該サブ配列は、任意に１またはそれ以上のミスマッチを含んでいてよい。
【００４４】
一つの態様において、本発明によるオリゴマー化合物は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、その際、各鎖は合計16-30のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む（または、からなる）。該二本鎖複合体（オリゴヌクレオチド）の一方の鎖は本明細書に規定するオリゴヌクレオチド化合物に対応すること、および他方の鎖は相補的配列を有するオリゴヌクレオチドであることが理解されなければならない。
【００４５】
合計が例えば8-50のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログは、8-50のヌクレオチドまたは8-50のヌクレオチドアナログ、または組み合わせたヌクレオシド単位の合計が50を超えないそれらの組合せを意味する。
【００４６】
化合物は、好ましくは、12-25のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, または24のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、15〜22のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、14〜18のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、さらに好ましくは15または16のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログからなる。
【００４７】
この文脈において、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、その通常の意味で用いられる。例えば、それは、その１番目炭素原子により窒素原子含有塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはグアニン（Ｇ）に結合した2-デオキシリボース単位を含む。
【００４８】
同様に、「ヌクレオチド」とは、例えば、本発明の化合物に関する好ましい態様において、その１番目炭素原子により窒素原子含有塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはグアニン（Ｇ）に結合し、その５番目の炭素原子によりインターヌクレオシドリン酸に（または、一つの態様において、その等価物、例えば、ホスホロチオエート基に）、または末端基に結合した2-デオキシリボース単位をいう。ヌクレオチドはまた、例えば、一つの態様において、リボース単位、例えば、ＲＮＡヌクレオチドを含んでいてよい。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「ヌクレオチドアナログ」とは、例えば、一つの好ましい態様において、リボース単位が2-デオキシリボースと異なっているか、および／または窒素原子含有塩基がＡ、Ｃ、ＴおよびＧと異なっているか、および／またはインターヌクレオシドリン酸結合基が異なっている、天然に存在しないヌクレオチドをいう。ヌクレオシドアナログの具体例は、例えば、FreierおよびAltmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213により、およびスキーム１に記載されている。
【００５０】
「対応ヌクレオシド／ヌクレオチドアナログ」および「対応ヌクレオシド／ヌクレオチド」とは、ヌクレオシド／ヌクレオチドアナログおよびヌクレオシド／ヌクレオチド中の窒素原子含有塩基が同一であることを示すことを意図している。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位がアデニンに結合している場合、「対応ヌクレオシドアナログ」はアデニンに結合したペントース単位（2-デオキシリボースと異なる）を含む。
【００５１】
「核酸」は、１またはそれ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子として定義される。「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同義である。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡが核酸である。
【００５２】
「核酸アナログ」とは、天然に存在しない核酸結合化合物、すなわち、好ましい態様において、少なくとも１のヌクレオチドと少なくとも１のヌクレオチドアナログ（例えば、LNA単位など）との配列などの化合物をいう。そのような化合物は、哺乳動物で天然には認められない（あるいは、一つの態様において、本発明の時点では哺乳動物で見出されることが公には知られていない）。
【００５３】
好ましいヌクレオチドアナログは、LNA、例えば、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNAおよびベータ-D-チオ-LNA、最も好ましくはベータ-D-オキシ-LNAである。本発明の化合物は、典型的に、該ヌクレオチドが、リン酸基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート（boranophosphate）基よりなる群から選ばれた結合基を含むものであり、インターヌクレオシド結合は、-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-、とりわけ、リン酸基および／またはホスホロチオエート基であってよい。特別の態様において、すべてのヌクレオチドがホスホロチオエート基を含む。一つの態様において、ヌクレオチドの幾つかまたはすべてが、互いにホスホロチオエート基によって結合されている。適切には、すべてのヌクレオチドが互いにホスホロチオエート基によって結合されている。
【００５４】
ヌクレオチドは、典型的に、互いに結合基によって結合されている。
【００５５】
ヌクレオチドアナログおよび核酸アナログは、例えば、FreierおよびAltmann（Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443）およびUhlmann（Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3(2): 293-213）に記載されている。スキーム１および２は、核酸を製造するのに適したヌクレオチドアナログの選択された例を説明するものである。
【００５６】
スキーム１
【化１】
2009507499.tif 000003
【００５７】
関心のもたれる態様において、化合物は3-12のヌクレオチドアナログ、例えば、6または7のヌクレオチドアナログを含む。さらに一層好ましい態様において、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１がロックト核酸（LNA）、例えば、ヌクレオチドアナログの少なくとも2、または少なくとも3または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または少なくとも8、または少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11がLNAであってよく、一つの態様において、すべてのヌクレオチドアナログがLNAであってよい。
【００５８】
「LNA」とは、１の二環ヌクレオチドアナログを含むヌクレオチドアナログをいい、LNAモノマーをもいう。
【００５９】
「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で用いる場合の「LNA」は、１またはそれ以上の二環ヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドをいう。本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いるロックト核酸（LNA）は、以下の一般式の構造を有する：
【化２】
2009507499.tif 000004
（式中、XおよびYは、独立に、基-O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -CH2-または-CH-（二重結合の一部である場合）, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2-または-CH2-CH-（二重結合の一部である場合）, -CH=CH-、ここで、Rは水素原子およびC1-4-アルキルから選ばれる；ZおよびZ*は、独立に、インターヌクレオシド結合、末端基または保護基から選ばれる；Bは、天然または非天然のヌクレオ塩基を構成する；および非対称基はいずれの方向であってもよい）。
【００６０】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いるロックト核酸（LNA）は、以下の化学式のいずれかによる少なくとも１のロックト核酸（LNA）を含む：
【化３】
2009507499.tif 000005
（式中、Yは-O-, -S-, -NH-, またはN(RH)；ZおよびZ*は、独立に、インターヌクレオシド結合、末端基または保護基から選ばれる；Bは、天然または非天然のヌクレオ塩基を構成する；およびRHは水素原子およびC1-4-アルキルから選ばれる）。
【００６１】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いるロックト核酸（LNA）は、-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-（式中、RHは水素原子およびC1-4-アルキルから選ばれる）よりなる群から選ばれたインターヌクレオシド結合を含む。
【００６２】
上記に記載したように、本発明の関心のもたれる態様において、オリゴヌクレオチド化合物は、LNA（Locked Nucleic Acid）と呼ばれる化学の少なくとも１の単位を含む。
【００６３】
特に好ましいLNA単位をスキーム２に示す。
スキーム２
【化４】
2009507499.tif 000006
【００６４】
「チオ-LNA」は、上記一般式においてXまたはYの少なくとも１つがSまたは-CH2-S-から選ばれるロックトヌクレオチドを含む。チオ-LNAは、ベータ-D-配置およびアルファ-L-配置の両者であってよい。
【００６５】
「アミノ-LNA」は、上記一般式においてXまたはYの少なくとも１つが-N(H)-, -N(R)-, CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-（式中、Rは水素原子およびC1-4-アルキルから選ばれる）から選ばれるロックトヌクレオチドを含む。アミノ-LNAは、ベータ-D-配置およびアルファ-L-配置の両者であってよい。
【００６６】
「オキシ-LNA」は、上記一般式においてXまたはYの少なくとも１つが-O-または-CH2-O-であるロックトヌクレオチドを含む。オキシ-LNA、ベータ-D-配置およびアルファ-L-配置の両者であってよい。
【００６７】
「エナ-LNA（ena-LNA）」は、上記一般式においてXまたはYの少なくとも１つが-CH2-O-（ここで、-CH2-O-の酸素原子は、ヌクレオ塩基Bの2'-位に結合している）であるロックトヌクレオチドを含む。
【００６８】
好ましい態様において、LNAは、ベータ-D-オキシ-LNA, アルファ-L-オキシ-LNA, ベータ-D-アミノ-LNAおよびベータ-D-チオ-LNAから選ばれ、とりわけベータ-D-オキシ-LNAである。ヌクレオシドおよび／またはLNAは、典型的に、リン酸基によりおよび／またはホスホロチオエート基により互いに結合している。
【００６９】
「少なくとも１つ」なる語は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17等々の１よりも大きいかまたは１に等しい整数を含む。
【００７０】
本明細書において使用する場合、「標的核酸」なる語は、Ａｐｏ−Ｂ１００をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ編集を含む）、およびそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含する。
【００７１】
「標的タンパク質」は、哺乳動物アポリポタンパク質Ｂ、好ましくはヒトアポリポタンパク質Ｂである。ＡｐｏＢ−１００およびＡｐｏＢ−４８の両者は同じ遺伝子配列に由来するので、本発明によるオリゴマー化合物はアポリポタンパク質Ｂのいずれかまたは両形態、およびＡｐｏＢ−１００をコードするｍＲＮＡ、およびＲＮＡ編集形態（Ａｐｏ−Ｂ４８をコードする）の両者をダウンレギュレーションするのに用いることができることが認識されるであろう。
【００７２】
本明細書において使用する場合、「遺伝子」なる語は、エクソン、イントロン、非コード５'および３'領域および調節配列を含む遺伝子および現在知られているその変異体および解明しうるさらなる変異体を意味する。
【００７３】
本明細書において使用する場合、「ｍＲＮＡ」なる語は、標的遺伝子の現在知られているｍＲＮＡ転写物、および同定されうるさらなる転写物を意味する。
【００７４】
本明細書において使用する場合、「モデュレーション」なる語は、遺伝子の発現の増大（刺激）かまたは低減（抑制）のいずれかを意味する。本発明においては、抑制は遺伝子発現のモデュレーションの好ましい形態であり、ｍＲＮＡは好ましい標的である。
【００７５】
本明細書において使用する場合、アンチセンス化合物を特定の標的核酸に「ターゲティング」するとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、意図する標的にアンチセンス化合物が結合し、その機能をモデュレートしうるような仕方で細胞、動物またはヒトに提供することを意味する。
【００７６】
好ましいヌクレオチドアナログはLNAである。
【００７７】
さらに好ましいヌクレオチドアナログは、インターヌクレオシドリン酸結合がホスホロチオエートであるものである。
【００７８】
さらに一層好ましいヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドがインターヌクレオシドホスホロチオエート結合を有するLNAであるものである。
【００７９】
関心のもたれる態様において、本発明の化合物の３'末端は、ヌクレオチドアナログではなくヌクレオチドを含む。
【００８０】
好ましくは、本発明によるオリゴマー化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１のロックト核酸（LNA）単位、例えば、3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,または10のロックト核酸（LNA）単位、好ましくは4〜9のLNA単位、例えば、6〜9のLNA単位、最も好ましくは6, 7または8のLNA単位を含む。好ましくは、LNA単位は、少なくとも１のベータ-D-オキシ-LNA単位、例えば、4, 5, 6, 7, 8, 9,または10のベータ-D-オキシ-LNA単位を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物は１を超えるタイプのLNA単位を含むことが考えられるが、すべてのLNA単位がベータ-D-オキシ-LNA単位であってよい。適切には、オリゴマー化合物は、ベータ-D-オキシ-LNAと、以下のLNA単位の１またはそれ以上との両者を含む：D-ベータまたはL-アルファ配置のいずれかにあるチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、エナ-LNAおよび／またはアルファ-LNAまたはそれらの組合せ。
【００８１】
ヌクレオチドアナログ、例えば、LNAヌクレオチドアナログを含む本発明の化合物の態様において、サブ配列は、典型的に、本明細書において規定する2-6の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、LNAヌクレオチドアナログと、それに続く4-12の一続きのヌクレオチドと、それに続く本明細書において規定する2-6の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、LNAヌクレオチドアナログを含む。
【００８２】
一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、LNAヌクレオチドアナログと、それに続く一続きのヌクレオチドと、それに続く一続きのヌクレオチドアナログLNAを含むサブ配列は、ギャップマーとして知られる。
【００８３】
適切には、そのような「ギャップマー」の一つの態様において、該サブ配列は、4の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書において規定するLNAヌクレオチドアナログと、それに続く8の一続きのヌクレオチドと、それに続く4の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書において規定するLNAヌクレオチドアナログを含み、３'末端に任意に単一ヌクレオチドを有する。
【００８４】
「ギャップマー」のさらなる一つの態様において、該サブ配列は、3の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書において規定するLNAヌクレオチドアナログと、それに続く9の一続きのヌクレオチドと、それに続く3の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書において規定するLNAヌクレオチドアナログを含み、３'末端に任意に単一ヌクレオチドを有する。そのようなデザインは、驚くべきことに極めて有効であることが見出された。
【００８５】
「ギャップマー」のさらなる一つの態様において、該サブ配列は、4の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書において規定するLNAヌクレオチドアナログと、それに続く8の一続きのヌクレオチドと、それに続く3の一続きのヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書において規定するLNAヌクレオチドアナログを含み、３'末端に任意に単一ヌクレオチドを有する。
【００８６】
好ましくは、オリゴマー化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、LNAおよびDNAの両単位を含む。好ましくは、LNAおよびDNAの両単位の組み合わせた合計は、14-20、例えば、15-18、さらに好ましくは16または17のLNA/DNA単位である。好ましくは、本発明のオリゴマー化合物中のLNA／DNA比は、0.3〜1、さらに好ましくは0.4〜0.9、例えば、0.6〜0.8である。
【００８７】
好ましくは、本発明によるオリゴマー化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、式（５'から３'に向かって）：A-B-C（および任意にD）（式中、A（５'領域）は、少なくとも１のLNA単位、例えば、1-6のLNA単位、好ましくは2-5のLNA単位、最も好ましくは4のLNA単位からなるまたは含む；B（中央領域）は、好ましくはAの直ぐ３'側にあり、少なくとも１のDNA糖単位、例えば、1-12のDNA単位、好ましくは4-12のDNA単位、さらに好ましくは6-10のDNA単位、例えば、7-9のDNA単位、最も好ましくは8のDNA単位からなるまたは含む；C（３'領域）は、好ましくはBの直ぐ３'側にあり、少なくとも１のLNA単位、例えば、1-6のLNA単位、好ましくは2-5のLNA単位、最も好ましくは4のLNA単位からなるまたは含む）で示されるポリヌクレオチド配列を含むギャップマーである。
【００８８】
ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、上記中央ドメイン（C）（好ましくはＤＮＡ単位を含むまたはＤＮＡ単位からなる）内にミスマッチが存在しないのが好ましい。ＲＮアーゼＨ消化のためには、少なくとも5の連続ヌクレオチド（またはＲＮアーゼＨをオリゴ／標的ハイブリッドに再利用することのできるアナログ）が中央ドメインにおいて必要であることが典型的にわかっている。それゆえ、中央ドメインが5を超える連続ヌクレオチドであるギャップマーについては、好ましくはないにしても、2のミスマッチが許容しうる。
【００８９】
ギャップマーオリゴヌクレオチドの一つの態様において、ミスマッチはギャップマーの５'末端または３'末端の方に位置しているのが好ましい。そのような態様において、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを含むギャップマーオリゴヌクレオチドでは、そのようなミスマッチが５'領域および／または３'領域のいずれかに位置していること、および／または該ミスマッチが該ギャップマーオリゴヌクレオチドおよび標的分子の５'末端または３'末端ヌクレオチド単位の間にあるのが好ましい。
【００９０】
一つの態様において、式：A-B-Cで示されるギャップマーは、さらなる領域Dを含み、該領域は、オリゴマー化合物の３'領域（C）の１またはそれ以上のＤＮＡ糖残基、例えば、1-3のＤＮＡ糖残基（1-2のＤＮＡ糖残基を含む）、最も好ましくは1のＤＮＡ糖残基からなるまたは含む、好ましくはからなる。
【００９１】
一つの態様において、LNAを含む本発明によるオリゴマー化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、すべてのLNA C残基が５'メチル-シトシンである。
【００９２】
一つの特別に関心のもたれる態様において、化合物は式：
5'-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8-9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「DNA」および「RNA」は、それぞれデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを示す）で示される。
【００９３】
さらに詳細には、化合物は、SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46および47よりなる群から選ばれてよい。好ましい化合物は、SEQ ID No: 29, 30, 31, 32, 36, 37, 38, 40, 41および42よりなる群から、またはSEQ ID No: 30および31よりなる群から、および／またはSEQ ID No: 36, 37および38よりなる群から、および／またはSEQ ID No: 41および42よりなる群から選ばれてよい。現在、最も好ましい化合物は、SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30およびSEQ ID NO: 37よりなる群から選ばれたものである。
【００９４】
適切には、該ヌクレオチドおよび／または該LNAは、リン酸基および／またはホスホロチオエート基またはそれらの組合せによって互いに結合していてよい。
【００９５】
一つの態様において、該ヌクレオチドおよび／または該LNAは、ホスホロチオエート基によって互いに結合しているのが好ましい。
【００９６】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 29を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【００９７】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 30を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【００９８】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 31を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【００９９】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 32を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１００】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 33を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０１】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 34を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０２】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 35を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０３】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 36を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０４】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 37を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０５】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 38を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０６】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 39を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０７】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 40を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０８】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 41を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１０９】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 42を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１１０】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 43を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１１１】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 44を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１１２】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 45を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１１３】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 46を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１１４】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 47を含むまたはからなるオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【０１１５】
一つの態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、SEQ ID No: 48, 49, 50または51である場合、３'末端は、末端リボヌクレオチドに直ぐ近接した、２つの共結合した（co-joined）2'-O-メチル修飾リボヌクレオチド単位を含む。
【０１１６】
オリゴヌクレオチド化合物の調製
LNAヌクレオチドおよびアナログ構築ブロック（β-D-オキシ-LNA, β-D-チオ-LNA, β-D-アミノ-LNAおよびα-L-オキシ-LNA）は、以下の刊行された手順およびその中に引用された文献、例えば、WO03/095467A1; D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802−808; M. D. Sorensen, L. Kvaerno, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-l-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176; S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2’-Amino- and 2’-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079; C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2’-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663；およびWO2004/069991A2に従って調製することができる。
【０１１７】
チミジンLNAモノマーの一つの具体例は、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(チミン-1イル)-2,5-ジオキサ-ビシクロ[2:2:1]ヘプタンである。
【０１１８】
LNAオリゴヌクレオチドは、実施例およびWO99/14226, WO00/56746, WO00/56748, WO00/66604, WO00/125248, WO02/28875, WO2002/094250およびWO03/006475の記載に従って調製することができる。それゆえ、LNAオリゴヌクレオチドは、有機化学の当業者によく知られた核酸化学の重合方法を用いて製造することができる。一般に、ホスホルアミダイト法（S. L. BeaucageおよびR. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. BeaucageおよびR. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223）の標準重合サイクルを用いるが、例えば、Ｈ−ホスホネート化学、ホスホトリエステル化学を用いることもできる。
【０１１９】
幾つかのモノマーでは、より長いカップリング時間、および／または繰り返しカップリング、および／またはより高濃度のカップリング試薬の使用が、必要であるかまたは有利である。
【０１２０】
使用したホスホルアミダイトは、典型的に、満足のいく>95%の段階収率でカップリングする。リン(III)からリン(V)への酸化は、通常、例えば、ヨウ素/ピリジン/H2Oを用いて行う。これにより、脱保護後、天然のホスホロジエステルインターヌクレオシド結合が得られる。ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合が調製される場合、ホスホロジエステルインターヌクレオシド結合の合成に使用する通常の（例えば、ヨウ素/ピリジン/H2O）酸化をADTT試薬（水素化キサンテン（アセトニトリル:ピリジン 9:1; v/v中に0.01M))を使用する酸化で置き換えることにより、チオール化工程を行う。BeaucageやPADSなどの他のチオール化試薬を使用することもできる。ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドが、段階カップリング収率>=98%で効率的に合成された。
【０１２１】
β-D-アミノ-LNA, β-D-チオ-LNA、および／またはα-L-LNAを含むLNAオリゴヌクレオチドもまた、ホスホルアミダイト法を用いて段階カップリング収率≧98%で効率よく合成することができる。
【０１２２】
LNAオリゴヌクレオチドの精製は、使い捨ての逆相精製カートリッジおよび／または逆相ＨＰＬＣおよび／またはエタノールもしくはブタノールからの沈殿を用いて行うことができる。毛管ゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、およびＥＳＩ−ＭＳを用い、合成したLNAオリゴヌクレオチドの純度を確認した。
【０１２３】
塩
LNAオリゴヌクレオチドは、様々な薬理学的に許容しうる塩にて用いることができる。本明細書において、この語は、LNAオリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持し、かつ最小の所望でない毒性作用を示す塩をいう。そのような塩の非制限的例は、有機アミノ酸、および金属カチオン、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどとの、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンから生成するカチオンとの塩基付加塩；またはその組み合わせ、例えば、亜鉛タンニン酸塩などで生成することができる。
【０１２４】
そのような塩は、ホスホジエステル基および／またはホスホロチオエート基を有するLNAオリゴヌクレオチドから生成され、例えば、適当な塩基との塩である。これら塩としては、例えば、元素周期表のIa族, Ib族, IIa族およびIIb族の金属由来の非毒性金属塩、とりわけ、適当なアルカリ金属塩、例えば、リチウム、ナトリウムまたはカリウム塩、またはアルカリ土類金属塩、例えば、マグネシウム塩またはカルシウム塩が挙げられる。これら塩としては、さらに亜鉛およびアンモニウム塩、および適当な有機アミン、例えば、非置換またはヒドロキシル置換されたモノ-、ジ-またはトリ-アルキルアミン、とりわけ、モノ-、ジ-またはトリ-アルキルアミンと生成される塩、または第四級アンモニウム化合物、例えば、N-メチル-N-エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ-、ビス-またはトリス-(2-ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、例えば、モノ-、ビス-またはトリス-(2-ヒドロキシエチル)アミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミンまたはトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N,N-ジ-低級アルキル-N-(ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、例えば、N,N-ジメチル-N-(2-ヒドロキシエチル)アミンまたはトリ-(2-ヒドロキシエチル)アミン、またはN-メチル-D-グルカミンと生成される塩、または第四級アンモニウム化合物と生成される塩、例えば、テトラブチルアンモニウム塩が挙げられる。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩またはカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。
【０１２５】
プロドラッグ
一つの態様において、LNAオリゴヌクレオチドはプロドラッグの形態であってよい。オリゴヌクレオチドは実質的に負に荷電している。細胞膜の親油性の性質のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の等価物に比べて低減している。この極性「妨害」は、プロドラッグアプローチ（例えば、Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T., Antisense Research and Application. Springer-Verlag, ベルリン、ドイツ、vol. 131, pp. 103-140を参照）を使用することで回避することができる。このアプローチでは、LNAオリゴヌクレオチドは、投与されたときに中性となるように保護された形態で調製される。これら保護基は、LNAオリゴヌクレオチドが細胞によって取り込まれたときに除去されるような仕方にデザインされる。そのような保護基の例は、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これら保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
【０１２６】
コンジュゲート
本発明のさらなる側面は、本明細書で定義した化合物を含むコンジュゲートに関し、該化合物には少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基が共有結合している。
【０１２７】
本発明の関連する側面において、本発明の化合物はコンジュゲートを形成すべくリガンドに結合しており、該リガンドはアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して該コンジュゲートの細胞取り込みを増大させることを意図している。
【０１２８】
本発明の化合物またはコンジュゲートはまた、活性な医薬物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、コレステロール低下剤、抗糖尿病薬、化学療法剤または抗生物質にコンジュゲートしまたはさらにコンジュゲートしていてよい。
【０１２９】
本発明との関連において、「コンジュゲート」なる語は、本明細書に記載するLNAオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの配列を含む化合物）が１またはそれ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基に共有結合することによって生成する不均一分子を示すことを意図している。
【０１３０】
それゆえ、LNAオリゴヌクレオチドは、LNAオリゴヌクレオチドが二量体構造または樹木状構造に配置されるように、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質（例えば、標的タンパク質の抗体）、巨大分子、低分子量医薬物質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、ミセル形成基、抗体、炭水化物、レセプター結合基、ステロイド、例えば、コレステロール、ポリペプチド、インターカレート剤、例えば、アクリジン誘導体、長鎖アルコール、デンドリマー（dendrimer）、リン脂質および他の親油性基またはそれらの組み合わせなどを含む非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基とコンジュゲートしまたはキメラを形成することができる。LNAオリゴヌクレオチドはまた、活性な医薬物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、コレステロール低下剤、抗糖尿病薬、化学療法剤または抗生物質にコンジュゲートしまたはさらにコンジュゲートしていてよい。
【０１３１】
このようにコンジュゲートすることで、LNAオリゴヌクレオチドの薬動力学的特性に関して有利な特性が付与される。とりわけ、このようにしてコンジュゲートすることは増大した細胞取り込みを達成する。
【０１３２】
一つの態様において、LNAオリゴヌクレオチドはコンジュゲートを形成すべくリガンドに結合され、該リガンドは、アンチセンスLNAオリゴヌクレオチドに比べて該コンジュゲートの細胞取り込みを増大させることを意図するものである。この結合は、末端位置の5'/3'-OHで行うことができるが、リガンドの結合はまた糖および／または塩基でも行うことができる。とりわけ、アンチセンスLNAオリゴヌクレオチドがコンジュゲートする増殖因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含む。高レベルのトランスフェリンまたは葉酸レセプターを発現する細胞による取り込みのため、トランスフェリン-ポリリシン-オリゴヌクレオチド複合体または葉酸-ポリリシン-オリゴヌクレオチド複合体を調製することができる。コンジュゲート／リガンドの例は、コレステロール残基、二本鎖インターカレート剤、例えば、アクリジン、ポリ−Ｌ−リシン、１またはそれ以上のホスホロモノチオエートなどのヌクレアーゼ耐性連結基での「末端キャッピング（end-capping）」などである。
【０１３３】
細胞中へのオリゴヌクレオチド取り込みの担体としてのトランスフェリン複合体の調製は、Wagnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記載されている。葉酸レセプターエンドサイトーシスによる葉酸-巨大分子コンジュゲートの細胞送達（アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を含む）は、Lowらの米国特許第5,108,921号に記載されている。Leamonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991)をも参照のこと。
【０１３４】
医薬組成物
本発明の特に興味のもたれる側面は、本明細書に記載の化合物またはコンジュゲートおよび薬理学的に許容しうる希釈液、担体またはアジュバントを含む医薬組成物に関する。特に興味のもたれる側面において、医薬組成物は経口投与用に適合されている。
【０１３５】
医薬組成物の製造の指針は、Alfonso R. Gennaroによる「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」および以下の記載に見出すことができる。
【０１３６】
本発明はまた、活性成分として少なくとも１の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド構築物を含む医薬組成物に特に関連することが理解されなければならない。本発明による医薬組成物は任意に薬理学的に許容しうる担体を含むこと、および医薬組成物はさらに任意にアンチセンス化合物、化学療法剤、コレステロール低下剤、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および／または免疫モデュレート化合物を含むことが理解されなければならない。
【０１３７】
上記に記載したように、本発明の医薬組成物は、少なくとも１の治療／予防化合物をさらに含んでいてよい。該化合物は、典型的に、以下よりなる群から選ばれる：胆汁酸塩封鎖樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩）、HMGCoA-リダクターゼ阻害剤（、例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プレバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブル酸（fibric acid）誘導体（例えば、クロフィブレート、ゲンフィブロジル、フェノフィブレート、ベンザフィブレート、およびシプロフィブレート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、プラント−スタノール（plant-stanol）エステル、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、インプリタピド、胆汁酸トランスポーター（apical sodium-dependent bile acid transporters）の阻害剤、肝臓CYP7aのレギュレーター、エストロゲン補充療法剤（例えば、タモキシフェン）、および抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド）。
【０１３８】
本発明に含まれるオリゴヌクレオチド化合物またはコンジュゲートは、様々な薬理学的に許容しうる塩にて用いることができる。本明細書において使用する場合、この語は、本明細書において同定する化合物の所望の生物学的活性を保持し、最小の所望でない毒性作用を示す塩をいう（「コンジュゲート」を参照）。
【０１３９】
本発明の一つの態様において、オリゴヌクレオチド化合物またはコンジュゲートは、プロドラッグの形態であってよい（「プロドラッグ」を参照）。
【０１４０】
本発明はまた、本明細書に開示する１またはそれ以上のオリゴヌクレオチド化合物またはコンジュゲートの製剤をも包含する。薬理学的に許容しうる結合剤およびアジュバントは、製剤医薬の一部である。カプセル剤、錠剤および丸剤等は、例えば、以下の化合物を含んでいてよい：結合剤として、微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤として、デンプンまたはラクトース；滑沢剤としてステアリン酸塩；種々の甘味剤または香味剤。カプセル剤については、投与単位は脂肪油などの液体担体を含んでいてよい。同様に、糖衣または腸溶剤は投与単位の一部である。オリゴヌクレオチド製剤はまた、活性な医薬成分とミセルエマルジョンを形成する脂質とのエマルジョンであってもよい。そのような製剤は、経口投与に特に有用である。
【０１４１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、所望の作用を損なうことないいかなる物質とも、あるいは所望の作用を補う物質と混合することができる。これらには、他のヌクレオシド化合物を含む他の薬剤が含まれる。
【０１４２】
非経口、皮下、皮内または局所投与のためには、製剤は、滅菌希釈液、緩衝液、張性の調節剤および抗菌剤を含んでいてよい。活性化合物は、分解または生体からの即座の排除に対して保護する担体（徐放特性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む）とともに調製することができる。静脈内投与のためには、好ましい担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。
【０１４３】
好ましくは、オリゴヌクレオチド化合物は、治療する患者に重篤な副作用を引き起こすことなく治療学的有効量を送達するに充分な量にて、薬理学的に許容しうる担体または希釈液中などの単位製剤に含有される。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は、局所あるいは全身処置が望まれるか否かおよび処置する領域に依存して多くの仕方で投与することができる。投与は、（ａ）経口、（ｂ）肺で行う、例えば、粉末またはエアゾル剤の吸入（ネブライザーによるもの、気管内、鼻内を含む）、（ｃ）表皮、経皮、眼内および粘膜（膣および直腸送達を含む）を含む局所、または（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入、または頭蓋内（例えば、くも膜下腔内または脳室内）投与を含む非経口であってよい。一つの態様において、活性なLNAオリゴヌクレオチドは、静脈内、腹腔内、経口、局所またはボーラス注射により投与し、または標的臓器に直接投与する。
【０１４５】
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、噴霧剤、坐剤、液剤および粉末薬が挙げられる。通常の製薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などは必要または所望される。被覆コンドーム、グラブ（gloves）なども用いることができる。好ましい局所製剤としては、本発明のオリゴヌクレオチドが局所送達剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤および界面活性剤と混合されるものが挙げられる。
【０１４６】
経口投与のための組成物および製剤としては、これらに限られるものではないが、粉末薬または顆粒剤、ミクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水媒体中の懸濁剤または水溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤（sachets）、錠剤またはミニ錠剤（minitablets）が挙げられる。
【０１４７】
非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および製剤としては、緩衝液、希釈液および他の適当な添加剤、例えば、これらに限られるものではないが、透過促進剤、担体化合物および他の薬理学的に許容しうる担体または賦形剤を含んでいてよい滅菌水溶液が挙げられる。
【０１４８】
本発明の医薬組成物としては、これらに限られるものではないが、液剤、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が挙げられる。これら組成物は、前もって生成した液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む（これらに限られるものではない）様々な成分から調製できる。肝臓組織への薬剤の送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアを含む（これらに限られるものではない）担体媒体送達により促進することができる（Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27）。
【０１４９】
本発明の医薬製剤は、単位投与剤型にて都合よく提供することができ、製薬産業においてよく知られた常法に従って調製することができる。そのような常法は、活性成分を製薬担体または賦形剤と混合する工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または細かく分割した固体担体または両者と均一かつ密に混合することにより調製する。
【０１５０】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、軟ゲルおよび坐剤などの（これらに限られるものではない）多くの可能な剤型に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体中の懸濁剤としても製剤化することができる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含んでいてよい。懸濁剤はまた、安定化剤をも含んでいてよい。
【０１５１】
LNA含有オリゴヌクレオチド化合物は、上記のように多くの治療適用に対して有用である。一般に、本発明の治療方法は、治療学的有効量のLNA含有オリゴヌクレオチドを哺乳動物、とりわけヒトに投与することを含む。
【０１５２】
ある態様において、本発明は、（ａ）１またはそれ以上のアンチセンス化合物および（ｂ）１またはそれ以上の他のコレステロール低下剤（非アンチセンス機構により機能する）を含む医薬組成物を提供する。本発明の化合物とともに用いる場合、そのようなコレステロール低下剤は、個々に（例えば、アトルバスタチンおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、アトルバスタチンおよびオリゴヌクレオチドを投与した所定期間の後に他の薬剤およびオリゴヌクレオチド）、またはそのような１またはそれ以上のコレステロール低下剤と併用して、用いることができる。当該技術分野で当業者に知られたすべてのコレステロール低下剤が、本発明による化合物との併用療法として本明細書中に引用される。
【０１５３】
抗炎症剤（非ステロイド抗炎症剤およびコルチコステロイドを含むが、これらに限られるものではない）、抗ウイルス剤、およびイムノモデュレーターをも本発明の組成物と組み合わせることができる。２またはそれ以上の組み合わせた化合物は、一緒に、または連続して使用できる。
【０１５４】
他の態様において、本発明の組成物は、第一の核酸をターゲティングする１またはそれ以上のアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドと、第二の核酸標的にターゲティングする１またはそれ以上の別のアンチセンス化合物とを含有していてよい。２またはそれ以上の組み合わせた化合物は、一緒に、または連続して使用できる。
【０１５５】
投与量は、処置しようとする疾患状態の重篤度および応答性、および数日から数ヶ月、または治癒が有効となるかまたは疾患状態の縮減が達成されるまで持続する処置の経過に依存する。最適の投与スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積の測定から計算することができる。
【０１５６】
最適の投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に依存して変わる。一般に、それは、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて評価することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０.０１μｇ〜１ｇであり、毎日、毎週、毎月または毎年１回またはそれ以上、あるいは２〜１０年に１回、または数時間から数ヶ月の間の連続注入により投与できる。投与の繰り返し頻度は、体液または組織中の薬剤の測定した残留時間および濃度に基づいて評価することができる。成功した処置後、患者に維持療法を受けさせて疾患状態の再発を防ぐのが望ましい。
【０１５７】
処置の方法
当業者であれば、LNAを含むオリゴヌクレオチド化合物がアポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ１００）関連疾患と多くの異なる原理により闘うのに用いることができることを評価するであろう（それゆえ、これは本発明の意図の範囲内である）。
【０１５８】
LNAオリゴヌクレオチド化合物は、小さな二本鎖ＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡとしてデザインすることができ、これは未だ十分には理解されていない「アンチセンス様機構」により特定の内生または外来の遺伝子をサイレンシングするのに細胞で用いられる。
【０１５９】
β-D-オキシ-LNAはＲＮアーゼＨ活性を支持しないことが示されている。しかしながら、これは、ギャップマーと呼ばれるβ-D-オキシ-LNAとＤＮＡとからなるキメラオリゴヌクレオチドを作製することにより、本発明に従って変えることができる。ギャップマーは、典型的にβ-D-オキシ-LNAの1〜6残基（フランク）によってフランキングされた、ＲＮアーゼＨによって認識されることができ開裂されうる一続きの中央の4-12 ntのＤＮＡまたは修飾モノマーに基づく。フランクもまたLNA誘導体で構築することができる。ＲＮアーゼＨ媒介機構によって作用することのできる本発明による他のキメラ構築物が存在する。ヘッドマー（headmer）は、連続した一続きのβ-D-オキシ-LNAまたはLNA誘導体と、その５'末端に３'末端に向かって続く連続した一続きのＲＮアーゼＨによって認識されることができ開裂されうるＤＮＡまたは修飾モノマーとからなるものとして定義され、テールマー（tailmer）は、連続した一続きのＲＮアーゼＨによって認識されることができ開裂されうるＤＮＡまたは修飾モノマーと、その５'末端に３'末端に向かって続く連続した一続きのβ-D-オキシ-LNAまたはLNA誘導体とからなるものとして定義される。ミックスマー（mixmers）と呼ばれる本発明による他のキメラは、ＲＮアーゼＨによって認識されることができ開裂されうるＤＮＡまたは修飾モノマーとβ-D-オキシ-LNAおよび／またはLNA誘導体との交互の組成からなり、これもまたＲＮアーゼＨ結合および開裂に媒介することができる。α-L-LNAはある程度までＲＮアーゼＨ活性を再利用するので、ギャップマー構築物について、ＲＮアーゼＨによって認識されることができ開裂されうるＤＮＡまたは修飾モノマーのギャップは一層小さいことが必要であり、ミックスマー構築物では一層大きな可撓性が導入される。
【０１６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、その薬動力学的特性、例えば、吸収、分布、細胞による取り込み、代謝および排泄にかなりの程度依存する。これらパラメーターは、今度は、オリゴヌクレオチドの基礎をなす化学およびサイズおよび三次元構造によって有意に左右される。
【０１６１】
本発明によるLNAオリゴヌクレオチドの薬動力学的特性をモデュレートすることは、さらに、様々な異なる残基の結合によって達成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドが細胞膜を通過する能力は、例えば、コレステロール残基、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質またはポリアミンなどの脂質残基をオリゴヌクレオチドに結合することにより高めることができる。同様に、LNAオリゴヌクレオチドの細胞中への取り込みは、膜中の分子と相互作用する残基をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることにより高めることができ、これにより細胞質中への輸送が媒体される。
【０１６２】
薬力学的特性は、本発明により、オリゴマーの取り込みを改善し、生体安定性を促進し、例えば、分解に対するオリゴマー耐性を促進し、および／または標的、例えばｍＲＮＡ配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性の特異性および親和性を増大させる基を用いて高めることができる。
【０１６３】
本発明による医薬組成物は、異常なレベルのＡｐｏＢ−１００と関連する状態の治療に用いることができる。
【０１６４】
そのような状態の例は、高リポタンパク質血症、家族性３型高リポタンパク質血症（家族性異βリポタンパク質血症）、および家族性高αリポタンパク質血症；高脂血症、混合型高脂血症、多リポタンパク質型高脂血症、および家族性高脂血症；高グリセリド血症、家族性高グリセリド血症、および家族性リポタンパク質リパーゼ；高コレステロール血症、スタチン耐性高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、多遺伝子性高コレステロール血症、家族性欠損アポリポタンパク質Ｂ；アテローム性動脈硬化症および冠状動脈疾患を含む心血管疾患；血栓症；末梢血管疾患；フォン・ギールケ病（グリコーゲン貯蔵病Ｉ型）；リポジストロフィー（先天性および後天性のもの）；クッシング症候群；性器発育正常性発育不全性小人症（単離成長ホルモン欠損症）；糖尿病；甲状腺機能亢進症；高血圧症；神経性食欲不振；ヴェルナー症候群；急性間欠性ポルフィリン症；原発性胆汁性肝硬変；肝外胆汁５閉塞；急性肝炎；ヘパトーマ；全身性エリテマトーデス；単クローン性高ガンマグロブリン血症（骨肉腫、多発性骨髄種、マクログロブリン血症、およびリンパ腫を含む）；内分泌障害；肥満；ネフローゼ症候群；メタボリックシンドローム；炎症；甲状腺機能低下症；尿毒症（尿酸過剰血症）；不能症；閉鎖性肝臓疾患；特発性高カルシウム血症；異グロブリン血症（dysqlobulinemia）；上昇したインスリンレベル；Ｘ症候群（Syndrome X）；デュピュイトラン拘縮；ＡＩＤＳ；およびアルツハイマー病および痴呆である。
【０１６５】
本発明はまた、アポリポタンパク質Ｂ発現を抑制するのに十分な量の本発明の化合物を個体に投与する工程を含む、状態のリスクを低減する方法であって、該状態が、妊娠；間欠性跛行；痛風；および水銀中毒およびアマルガム病から選ばれる方法をも提供する。本発明はさらに、アポリポタンパク質Ｂ発現を抑制するのに十分な量の本発明の化合物を個体に投与する工程を含む、コレステロール粒子の血管内皮への結合を抑制する方法をも提供し、その結果、本発明はまた、アポリポタンパク質Ｂ発現を抑制するのに十分な量の本発明の化合物を個体に投与する工程を含む、以下のリスクを低減する方法をも提供する：(i)コレステロール粒子の酸化；(ii)単球の内皮への結合；(iii)単球のマクロファージへの分化；(iv)マクロファージによる酸化脂質30粒子の摂取およびサイトカイン（IL-l, TNF-アルファ, TGF-ベータを含むが、これらに限られるものではない）放出；(v)線維脂肪病変および炎症の血小板生成（platelet formation of fibrous fibrofatty lesions and inflammation）；(vi)血栓に導く内皮病変；および(vii)心筋梗塞や脳卒中に導く血栓。
【０１６６】
本発明はまた、アポリポタンパク質Ｂ発現を抑制するのに十分な量の本発明の化合物を個体に投与する工程を含む、アルコール中毒、喫煙、経口避妊薬の使用、グルココルチコイドの使用、ベータ−アドレナリン阻害薬の使用、またはイソトレチニオン（１３−シスレチノイン酸）の使用に関連する高脂血症を低減する方法をも提供する。
【０１６７】
本発明はさらに、本明細書に開示したあらゆる状態の治療用医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０１６８】
一般に、本発明の一つの側面は、異常なレベルのＡｐｏＢ−１００と関連する状態を罹患しているかまたは罹患しやすい哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、Ａｐｏ−Ｂ１００をターゲティングした１またはそれ以上のLNA単位を含むオリゴヌクレオチドの治療学的有効量を投与することを含む方法に関する。
【０１６９】
本発明の関心のもたれる側面は、上記の状態の治療用医薬の製造のための本明細書に記載の化合物または本明細書に記載のコンジュゲートの使用に関する。
【０１７０】
本発明の方法は、異常なレベルのＡｐｏＢ−１００によって引き起こされる疾患の治療または予防に用いられるのが好ましい。
【０１７１】
さらに、本明細書に記載する本発明は、そのような療法を必要とするヒトに、治療学的有効量のＡｐｏ−Ｂ１００モデュレートオリゴヌクレオチド化合物（オリゴマーの高投与量を含むが、これに限られるものではない）を含む、疾患を予防または治療する方法を包含する。本発明はさらに、Ａｐｏ−Ｂ１００モデュレートオリゴヌクレオチド化合物の投与の短期間の使用を包含する。
【０１７２】
本発明の一つの態様において、オリゴヌクレオチド化合物は、リガンド／コンジュゲートに結合している。それはアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞摂取を増大させるための方法である。
【０１７３】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物はまた、活性な医薬物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、または抗菌剤または抗生物質にコンジュゲートしてよい。
【０１７４】
別に記載したように、本発明はさらに、異常なレベルのＡｐｏＢ−１００を治療する方法であって、本明細書に記載の化合物、または本明細書に記載のコンジュゲートまたは本明細書に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含み、別の化学療法剤のさらなる投与を含む方法に関する。該さらなる投与は、別の化学療法剤が本発明の化合物にコンジュゲートされ、医薬組成物中に配合され、または別個の製剤で投与されるようなものであってよい。
【０１７５】
本発明のLNA含有オリゴヌクレオチド化合物はまた、診断、治療および予防の研究薬剤に利用することもできる。研究において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞および実験動物においてＡｐｏ−Ｂ１００遺伝子の合成を特異的に抑制し、それによって標的の機能的分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にするのに用いることができる。診断において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞または組織でのＡｐｏ−Ｂ１００発現をノーザンブロッティング、インシトゥハイブリダイゼーションまたは同様の方法によって検出および定量するのに用いることができる。治療のためには、疾患または障害を罹患していると思われＡｐｏ−Ｂ１００の発現をモデュレートすることによって治療することのできる動物またはヒトを、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって治療する。さらに、治療学的または予防学的有効量の１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することによる、Ａｐｏ−Ｂ１００の発現と関連する疾患または状態を罹患しているかまたは罹患しやすいと思われる動物、とりわけマウスおよびヒトを治療し、ヒトを治療する方法が提供される。
【０１７６】
本発明はまた、医薬として使用するための本明細書に記載の化合物またはコンジュゲートにも関する。
【０１７７】
本発明はさらに、異常なレベルのＡｐｏＢ−１００の治療用医薬の製造のための本明細書に記載の化合物またはコンジュゲートの使用に関する。典型的に、該異常なレベルのＡｐｏＢ−１００は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症または高脂血症の形態である。
【０１７８】
さらに、本発明は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症よりなる群から選ばれた疾患または状態を罹患する患者を治療する方法であって、それを必要とする患者に本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法に関する。好ましくは、医薬組成物を経口投与する。
【０１７９】
本発明の幾つかの態様
１．全部で12-50のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなる化合物であって、該化合物は少なくとも10のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列は配列番号：SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 48およびSEQ ID No 50よりなる群から選ばれた配列内に位置しており、該化合物は少なくとも3のヌクレオチドアナログを含むことを特徴とする化合物。
【０１８０】
２．二本鎖オリゴヌクレオチドからなり、各鎖が全部で16-30のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、該化合物は少なくとも10のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列はSEQ ID NOS: 27, 28, (および／または48または50)よりなる群から選ばれた配列内に位置しており、該化合物は少なくとも3のヌクレオチドアナログを含むことを特徴とする請求項１の化合物。
【０１８１】
３．12-25のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、態様１の化合物。
【０１８２】
４．15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,または22のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、態様３の化合物。
【０１８３】
５．16のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、態様４の化合物。
【０１８４】
６．該ヌクレオチドが、リン酸基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基よりなる群から選ばれた結合基を含み、インターヌクレオシド結合が-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-である、態様１〜５のいずれかの化合物。
【０１８５】
７．該結合がリン酸基である、態様６の化合物。
【０１８６】
８．該結合がホスホロチオエート基である、態様６の化合物。
【０１８７】
９．すべてのヌクレオチドがホスホロチオエート基を含む、態様６の化合物。
【０１８８】
１０．3-12のヌクレオチドアナログを含む、態様９の化合物。
【０１８９】
１１．6のヌクレオチドアナログを含む、態様１０の化合物。
【０１９０】
１２．該ヌクレオチドアナログの少なくとも１がロックト核酸（LNA）である、態様１０〜１１のいずれかの化合物。
【０１９１】
１３．LNAが、ベータ-D-オキシ-LNA, アルファ-L-オキシ-LNA, ベータ-D-アミノ-LNAまたはベータ-D-チオ-LNAから選ばれる、態様１２の化合物。
【０１９２】
１４．該ヌクレオシドおよび／またはLNAが互いにリン酸基により結合している、態様１３の化合物。
【０１９３】
１５．該ヌクレオシドおよび／または該LNAが互いにホスホロチオエート基により結合している、態様１４の化合物。
【０１９４】
１６．該サブ配列がSEQ ID NO: 2である、態様１２の化合物。
【０１９５】
１７．該サブ配列がSEQ ID NO: 3である、態様１２の化合物。
【０１９６】
１８．３'末端LNAが対応天然ヌクレオシドで置換されている、態様１６〜１７のいずれかの化合物。
【０１９７】
１９．SEQ ID No: 29からなる化合物。
【０１９８】
２０．SEQ ID No: 30からなる化合物。
【０１９９】
２１．態様１〜２０のいずれかの化合物と、該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基とを含むコンジュゲート。
【０２００】
２２．態様１〜２０のいずれかの化合物または態様２１のコンジュゲート、および薬理学的に許容しうる希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物。
【０２０１】
２３．少なくとも１のコレステロール低下化合物を含む、態様２２の医薬組成物。
【０２０２】
２４．該化合物が、胆汁酸塩封鎖樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩）、HMGCoA-リダクターゼ阻害剤（、例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プレバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブル酸（fibric acid）誘導体（例えば、クロフィブレート、ゲンフィブロジル、フェノフィブレート、ベンザフィブレート、およびシプロフィブレート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、プラント−スタノール（plant-stanol）エステル、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、インプリタピド、胆汁酸トランスポーター（apical sodium-dependent bile acid transporters）の阻害剤、肝臓CYP7aのレギュレーター、エストロゲン補充療法剤（例えば、タモキシフェン）、および抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド）よりなる群から選ばれる、態様２３の医薬組成物。
【０２０３】
２５．医薬として使用するための態様１〜２０のいずれかの化合物または態様２１のコンジュゲート。
【０２０４】
２６．異常なレベルのＡｐｏ−Ｂ１００の治療用医薬の製造のための、態様１〜２０のいずれかの化合物または態様２１のコンジュゲートの使用。
【０２０５】
２７．該異常なレベルのＡｐｏ−Ｂ１００が、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症または高脂血症である、態様２６の使用。
【０２０６】
本発明を以下の実施例により非制限的な仕方でさらに説明する。
【０２０７】
実施例
実施例１：モノマー合成
LNAモノマー構築ブロックおよびその誘導体を、以下の刊行された方法およびその中で引用された文献に従って調製した：
WO 03/095467 A1
D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) LNAホスホルアミダイトの調製, Synthesis 6, 802-808
M. D. Sorensen, L. Kvaerno, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) α-L-リボ-配置Locked Nucleic Acid (α-l-LNA):合成および特性, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176.
S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) 新規なビシクロ[2.2.1]リボヌクレオチド: 2'-アミノ- および2'-チオ-LNAモノマーヌクレオシドの合成, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.
C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-アミノ-LNAの合成:新規な戦略, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.
D. S. Pedersen, T. Koch (2003) LNA (Locked Nucleic Acid)のアナログ 2'-チオ-LNAチミンおよび5-メチルシトシンホスホルアミダイトの合成, Synthesis 4, 578-582.
【０２０８】
実施例２：オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、Expedite 8900/MOSS合成機（Multiple Oligonucleotide Synthesis System）でのホスホルアミダイトアプローチを用い、1μモルまたは15μモルのスケールで合成した。より大きなスケールの合成にはAkta Oligo Pilotを用いた。合成の終了時（DMT-on）、水性アンモニアを室温で１〜２時間用いてオリゴヌクレオチドを固相支持体から開裂し、６５℃で４時間さらに脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。ＤＭＴ基の除去後、ＡＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＣＧＥによりオリゴヌクレオチドを特徴付け、分子量をＥＳＩ−ＭＳによりさらに確認した。詳細は以下を参照。
【０２０９】
LNA-固相支持体の調製：
LNAスクシニルヘミエステルの調製
5'-O-Dmt-3'-ヒドロキシ-LNAモノマー（500mg）、無水コハク酸（1.2当量）およびDMAP（1.2当量）をDCM（35mL）に溶解した。反応液を室温で一夜攪拌した。NaH2PO4 0.1M pH 5.5 (2×)および食塩水(1×)で抽出した後、有機層をさらに無水Na2SO4で乾燥させ、濾過および蒸発させた。ヘミエステルを95%の収率で得、さらに精製することなく用いた。
【０２１０】
LNA-支持体の調製
上記で調製したヘミエステル誘導体（90μモル）を最小量のDMFに溶解し、DIEAおよびpyBOP（90μモル）を加え、1分間攪拌した。この前活性化混合物をLCAA-CPG（500オングストローム、80-120メッシュサイズ、300mg）と手動合成機中で混合し、攪拌した。室温で1.5時間後、支持体を濾去し、DMF、DCMおよびMeOHで洗浄した。乾燥後、負荷を57μモル/gと決定した（Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In: F.Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. オックスフォード: IRLプレス, 1991: 13-14を参照）。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドの伸長
ホスホルアミダイト（A(bz), G(ibu), 5-メチル-C(bz))またはT-β-シアノ-エチル-ホスホルアミダイト）のカップリングを、アセトニトリル中の0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイトの溶液およびアクチベーターとしてアセトニトリル（0.25M）中のDCI（4,5-ジシアノイミダゾール）を用いて行う。チオール化を、水素化キサンテン（アセトニトリル：ピリジン10%中に0.01M）を用いて行う。残りの試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に典型的に使用するものである。供給者により提供されるプロトコールを都合よく最適化した。
【０２１２】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
カラム:Xterra RP18
流速：3mL/分
緩衝液：0.1M酢酸アンモニウム、pH8およびアセトニトリル
【０２１３】
略語
DMT：ジメトキシトリチル
DCI：4,5-ジシアノイミダゾール
DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
DCM：ジクロロメタン
DMF：ジメチルホルムアミド
THF：テトラヒドロフラン
DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
PyBOP：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Bz：ベンゾイル
Ibu：イソブチリル
【０２１４】
実施例３：オリゴヌクレオチド化合物のデザイン
ｓｉＲＮＡは、21-ヌクレオチドセンス鎖（SEQ ID NO: 27）および23ヌクレオチドアンチセンス鎖（SEQ ID NO: 28）であり、その結果、該アンチセンス鎖の３'に２のヌクレオチドの突出を有する。
【０２１５】
ApoB-siRNAセンス5'-GUCAUCACACUGAAUACCAA*U-3'(SEQ ID NO: 48)、ApoB-1-siRNAアンチセンス鎖5'-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAc*a*C-3(SEQ ID NO: 49)およびApoB-siRNA-Cholセンス鎖:5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU*Chol-3'(SEQ ID NO: 50)をRNATEC（Leuven）により合成した。
【０２１６】
本発明の一つの態様において、SEQ ID NOS: 2-26は、SEQ ID NOS: 29-47におけると同様、少なくとも3のLNAヌクレオチド、例えば、6または7のLNAヌクレオチドを含む。
【０２１７】
表１：本発明のオリゴヌクレオチド化合物
SEQ ID NOS: 27, 28, 48, 49, 50において、大文字はリボヌクレオチド単位を示し、下付きの「s」はホスホロチオエート結合を表す。
【０２１８】
【表１】
2009507499.tif 000007
【０２１９】
【表２】
2009507499.tif 000008
【０２２０】
【表３】
2009507499.tif 000009
【０２２１】
【表４】
2009507499.tif 000010
【０２２２】
SEQ ID No: 30は、本発明による関心のもたれる化合物である。
【０２２３】
実施例４：ヒトまたはラット血漿でのLNA化合物の安定性
LNAオリゴヌクレオチドの安定性を、ヒトまたはラットからの血漿（マウス、サルまたはイヌからの血漿であってもよい）で試験した。45μlの血漿に5μlのオリゴヌクレオチドを加える（最終濃度20μM）。オリゴを血漿中、0-96時間の範囲の時間、37℃にてインキュベートする（血漿は、ヌクレアーゼ活性について96時間試験して、ヌクレアーゼ開裂パターンで差違を示さない）。指定の時間に試料を液体窒素中で急速凍結乾燥（snap-frozen）した。血漿中の2μl（40ピコモルに等しい）のオリゴヌクレオチドに15μlの水および3μlの6×負荷染料（Invitrogen）を加えて希釈した。マーカーとして10bpラダー（Invitrogen：10821-015）を用いる。1μlのラダーに1μlの6×負荷染料および4μlの水を加えた。試料を混合し、65℃に10分加熱し、プリランゲル（prerun gel）(16%アクリルアミド、7M尿素、1×TBE；50ワットで1時間、前処理（pre-run）)に負荷し、50-60ワットで2時間半処理した。その後、ゲルを1×TBE中の1×SyBRゴールド（モレキュラープローブ）で15分染色した。Bioradからのリン造影剤（phosphoimager）を用いてバンドを可視化した。
【０２２４】
実施例５：インビトロモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の作用は、該標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、様々な細胞型のいずれにおいても試験することができる。標的は、内生的に、または該核酸をコードする核酸の一過性または安定なトランスフェクションにより発現させることができる。
【０２２５】
標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、定量的ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いてルーチンに決定することができる。以下の細胞型が例示目的で提供されるが、選択した細胞型で標的が発現されることを条件として他の細胞型をルーチンに用いることができる。
【０２２６】
細胞を以下に記載する適当な培地で培養し、３７℃で95-98%の湿度および5%CO2に保持した。細胞を毎週2-3回、ルーチンに継代した。
【０２２７】
BNCL-2：マウス肝臓細胞株BNCL-2をATCCから購入し、DMEM（Sigma）中、10%FBS + Glutamax I + 非必須アミノ酸 + ゲンタマイシンとともに培養した。
【０２２８】
Hepa1-6：マウス肝臓細胞株Hepa1-6をATCCから購入し、DMEM（Sigma）中、10%FBS + Glutamax I + 非必須アミノ酸 + ゲンタマイシンとともに培養した。
【０２２９】
HepG2：ヒト肝臓細胞株HepG2をATCCから購入し、Eagle MEM（Sigma）中、10%FBS + Glutamax I + 非必須アミノ酸 + ゲンタマイシンとともに培養した。
【０２３０】
実施例６：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理
細胞培養およびトランスフェクション：BNCL-2またはHepa1-6細胞を12-ウエルプレートに37℃（5%CO2）にて10%FBS, Glutamax Iおよびゲンタマイシンを添加した増殖培地に播種した。細胞が60-70%コンフルエントになったとき、リポフェクタミン2000 (5μg/mL)を用いて異なる濃度のオリゴヌクレオチド（0.04-25nM）で２回ずつトランスフェクションした。トランスフェクションは本質的にDeanら（1994, JBC 269:16416-16424）の記載に従って行った。簡単に説明すると、細胞を10分間、リポフェクタミンとともにOptiMEM中でインキュベートし、ついでオリゴヌクレオチドをウエル当たり全量0.5mLのトランスフェクション混合物となるように加えた。4時間後、トランスフェクション混合物を除き、細胞を洗浄し、37℃で約20時間増殖させた（適当な増殖培地でのｍＲＮＡ分析およびタンパク質分析）。ついで、細胞をタンパク質およびＲＮＡ分析のために回収した。
【０２３１】
実施例７：インビトロモデル：ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡの単離
RNeasyミニキット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、1%メルカプトエタノールを添加したCell Lysis Buffer (RTL, Qiagen)をウエルに直接加えた。数分後、試料を製造業者の指示に従って処理した。
【０２３２】
第一鎖の合成は、OmniScript Reverse TranscriptaseキットまたはM-MLV Reverse transcriptase（本質的に製造業者（Ambion）の記載に従う)のいずれかを製造業者の指示に従って用いて行った。OmniScript Reverse Transcriptaseを用いる場合は、0.5μgの全ＲＮＡの各試料を12μlに調節し、0.2μlのポリ(dT)12-18（0.5μg/μl) (Life Technologies)、2μlのdNTP混合物 (各5mM)、2μlの10×RT緩衝液、0.5μlのRNAguardTM RNaseインヒビター（33単位/mL、Amersham）および1μlのOmniScript Reverse Transcriptaseと混合し、ついで37℃で60分間インキュベートし、93℃で5分間加熱して不活化した。
【０２３３】
第一鎖をランダムデカマーおよびM-MLV-Reverse Transcriptase（本質的に製造業者（Ambion）の記載に従う）を用いて行う場合は、0.25μgの全ＲＮＡの各試料をH2O中で10.8μlに調節し、2μlのデカマーおよび2μlのdNTP混合物（各2.5mM）を加えた。試料を70℃に3分間加熱し、直ちに氷水中で冷却し、3.25μlの混合物（2μlの10×RT緩衝液；1μlのM-MLV Reverse Transcriptase；0.25μlのRNAaseインヒビター）を加えた。ｃＤＮＡを42℃で60分間合成し、ついで95℃で10分間加熱して不活化し、最後に4℃に冷却した。
【０２３４】
実施例８：インビトロおよびインビボモデル：リアルタイムＰＣＲによるＡｐｏ−Ｂ１００発現のオリゴヌクレオチド抑制の分析
Ａｐｏ−Ｂ１００発現のアンチセンスモデュレーションは、当該技術分野で知られた様々な仕方でアッセイすることができる。例えば、Ａｐｏ−Ｂ１００ｍＲＮＡレベルを、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲにより定量することができる。リアルタイム定量的ＰＣＲが現在のところ好ましい。ＲＮＡ分析は全細胞のＲＮＡまたはｍＲＮＡで行うことができる。
【０２３５】
ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析などのＲＮＡ分析の方法は当該技術分野でルーチンであり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに教示されている。
【０２３６】
リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、BioRADから利用できる市販のiQ Multi-Color Real Time PCR Detection Systemを用いて都合よく行うことができる。リアルタイム定量的ＰＣＲは当該技術分野でよく知られた技術であり、例えば、Heidら、Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994に教示されている。
【０２３７】
Ａｐｏ−Ｂ１００ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
処理した試料および非処理の試料での相対マウスＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルを決定するため、生成したｃＤＮＡをBioRadからのiCyclerを用いた定量的ＰＣＲ分析に用いた。
【０２３８】
8μlの5倍（Gapdhおよびベータ-アクチン）希釈したｃＤＮＡに、29.5μlのPlatinum qPCRを含有する52μlの混合物を加えた。
【０２３９】
Supermix-UDG（in-vitrogen)、1030nMの各プライマー、0.57×SYBR Green（Molecular probes）および11.4nMのFluorescein（Molecular probes）。
【０２４０】
２つずつの25μlをQ-PCRに用いた：50℃で120秒、95℃で120秒、および40サイクル[95℃で30秒および60℃で60秒]。
【０２４１】
ＡｐｏＢ発現を、50倍希釈したｃＤＮＡおよび標準Q-PCRプロトコールを用いて定量した。プライマー（フォアウォードプライマーおよびリバースプライマーの各最終濃度は0.6μMおよび0.9μM）およびプローブ（最終濃度0.1μM）を2×Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG（カタログ#11730, Invitrogen）と混合し、3.3μlのｃＤＮＡに最終容量25μlとなるように加えた。各試料を２つずつ分析した。ＰＣＲプログラム：50℃で2分、95℃で10分、ついで95℃で15秒、60℃で1分を40サイクル。
【０２４２】
ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現をマウスβ-アクチンまたはGapdh ｍＲＮＡ（同様にQ-PCRを用いて定量した）に対して正規化した。
【０２４３】
プライマー：
mGapdh：5'-agcctcgtcccgtagacaaaat-3'(SEQ ID NO: 51)および5'-gttgatggcaacaatctccacttt-3'(SEQ ID NO: 52)
【０２４４】
mβ-アクチン：5'-ccttccttcttgggtatggaa-3'(SEQ ID NO: 53)および5'-gctcaggaggagcaatgatct-3'(SEQ ID NO: 54)
【０２４５】
mApoB：5'-gcccattgtggacaagttgatc-3'(SEQ ID NO: 55)および5'-ccaggacttggaggtcttgga-3'(SEQ ID NO: 56)
【０２４６】
mApoB Taqmanプローブ：5'-fam-aagccagggcctatctccgcatcc-3'(SEQ ID NO: 57)
【０２４７】
未処理マウス肝細胞株（Hepa1-6細胞）（5倍希釈し、ＡｐｏＢおよびβ-アクチンまたはGapdhの両者を発現）から合成したｃＤＮＡの2倍希釈を用いてアッセイの標準曲線を調製した。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの相対量を、iCycler iQ Real Time Detection Systemソフトウエアを用いて計算した閾値サイクルから決定した。
【０２４８】
実施例９：インビトロ分析：Ａｐｏ−Ｂ１００タンパク質レベルのウエスタンブロット分析
Ａｐｏ−Ｂ１００タンパク質レベルに対するＡｐｏ−Ｂ１００オリゴのインビトロでの作用をウエスタンブロッティングにより決定した。
【０２４９】
細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を添加した50mM Tris-HCl pH 6.8、10%グリセリン、2.5%SDS、5mM DTTおよび6M尿素中で溶解した。全タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いて測定した。50μgの全タンパク質を、MOPS緩衝液中の10-12%Bis-Trisゲルまたは3-8%Tris Acetateゲルで泳動し、製造業者の教示（Invitrogen）に従ってPVDFメンブレンにブロットした。ブロッキング緩衝液（5%低脂肪粉ミルクを添加したPBS-T）中で一夜インキュベートした後、メンブレンをＡｐｏ−Ｂ１００を検出する一次抗体とともに一夜インキュベートした。負荷の対照として、NeoMarkerからのモノクローナル抗体を用いてチューブリンまたはアクチンを検出した。ついで、メンブレンを二次抗体とともにインキュベートし、色素産生免疫検出キット（Invitrogen）または化学ルミネセンスECL+検出キット（Amersham）を用いて可視化した。
【０２５０】
実施例１０：インビトロ分析：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトＡｐｏ−Ｂ１００発現のアンチセンス抑制
本発明に従い、一連のオリゴヌクレオチドをヒトＡｐｏ−Ｂ１００ ＲＮＡの異なる領域をターゲティングするようにデザインした。表１参照。SEQ ID NO: 29、ｓｉＲＮＡ（非修飾）またはコレステリル修飾ｓｉＲＮＡの脂質介助した取り込み後のマウス肝細胞（Hepa1-6細胞）でのＡｐｏ−Ｂ１００ ｍＲＮＡをノックダウンする効能（図１Ａ）および２つのLNAオリゴヌクレオチドSEQ ID No:29およびSEQ ID No:30によるBNLCL2での（図１Ｂ）、およびSEQ ID No:29およびSEQ ID No:37によるHepa 1-6細胞での（図４）Ａｐｏ−Ｂ１００のノックダウンの比較について評価した。
【０２５１】
データは、モックトランスフェクション細胞と比較したダウンレギュレーションのパーセントとして表してある。転写の定常状態は、リアルタイムＰＣＲによりモニターし、GAPDH転写物定常状態に正規化した。
【０２５２】
実施例１１：LNA含有オリゴヌクレオチド化合物のインビボ標的ダウンレギュレーション
C57BL/6マウス（20g）に6.25, 12.5, 25または50mg/kgを３日連続で静脈内投与した（7匹のマウスのグループサイズ）。アンチセンスオリゴヌクレオチドと比べたsiRNA-Chol分子量が約3:1であるので、本発明者らは、より少ないアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した。すべてのｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを0.9%食塩水（NaCl）に溶解し、10mL/kg体重（注射当たり〜0.2ml）で与えた。屠殺時に肝臓の重量を記録した。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の測定のための組織を、使用するまでRNA later（Ambion）中、-20℃で貯蔵した。空腸および肝臓でのｍＲＮＡ分析および血漿中の全コレステロールを最後の静脈内注射の24時間後に行った（図２Ａおよび２Ｂ参照）。
【０２５３】
実施例１２：血漿中のコレステロールレベル
ABX Pentraからの比色アッセイCholesterol CPを用い、全コレステロールレベルを血漿中で測定した。コレステロールは、酵素的加水分解および酸化の後に測定する。21.5μLの水を1.5μLの血漿に加えた。250μLの試薬を加え、5分以内にコレステロール含量を540nMの波長で測定する。各動物での測定は２回ずつ行った。感度および線形性を2倍希釈した対照化合物（ABX Pentra N対照）で試験した。相対的コレステロールレベルをバックグラウンドの控除によって決定し、食塩水で処理したマウスの血漿でのコレステロールレベルとの対比として表した（図３参照）。
【０２５４】
実施例１３：LNA含有オリゴヌクレオチド化合物のインビボ標的ダウンレギュレーション
C57BL/6マウス（20g）に6.25, 12,または25mg/kgを３日連続で静脈内投与した（7匹のマウスのグループサイズ）。アンチセンスオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 37）を0.9%食塩水（NaCl）に溶解し、10mL/kg体重（注射当たり〜0.2ml）で与えた。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の測定のための組織を、使用するまでRNA later（Ambion）中、-20℃で貯蔵した。空腸および肝臓でのｍＲＮＡ分析および血漿中の全コレステロールおよびLDLコレステロールを最後の静脈内注射の24時間後に行った（図５Ａ、５Ｂ、６Ａおよび６Ｂ参照）。
【０２５５】
実施例１４：LNAオリゴヌクレオチド化合物のマウスへの経口投与
C57BL/6マウス（20g）に10mL/kg、すなわち、滅菌H2O中の1.0mLのオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO: 29またはSEQ ID NO: 37）（7.5mg/ml)、0.1mLのTween80、1.9mLのオリーブ油の新たに調製した調合物を投与した。オリゴヌクレオチド化合物の最終濃度：2.5mg/mL。この調合物を1分間振盪し、5分間超音波処理した（3回繰り返した）。負の効果は観察されなかった。
【０２５６】
実施例１５：インビトロ分析：細胞培養（ヒト肝細胞Huh-7）での用量応答／ヒトＡｐｏ−Ｂ１００発現のアンチセンス抑制
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドをヒトＡｐｏ−Ｂ１００ ｍＲＮＡの異なる領域をターゲティングすべくデザインした。表１参照。SEQ ID NO: 31-32, 36-38および40-42の脂質介助した取り込み後のヒト肝細胞（Huh-7細胞）でのＡｐｏ−Ｂ１００ ｍＲＮＡをノックダウンする効能について評価した（図８）。実験は実施例５〜８の記載と同様にして行った。その結果は、すべての化合物について25nMで非常に強力なダウンレギュレーション（>80%）を示した。しかしながら、1nMでは、わずかに2の化合物（SEQ ID NO: 37および40）が70%もの高さでＡｐｏ−Ｂ１００ ｍＲＮＡをダウンレギュレーションするという結果となった（これは非常に強力なダウンレギュレーションである）。
【０２５７】
実施例１６：７の選択したLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞培養（ヒト肝細胞Huh-7）でのIC50
最良のインビトロダウンレギュレーションを示す7つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ａｐｏ−Ｂ１００ ｍＲＮＡ発現の50%抑制をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を決定するIC50研究のために選択した。実験は実施例５〜８の記載と同様にして行った。SEQ ID NO: 36および37のみが約1nMのIC50を有し、一方、SEQ ID NO:38は5.7もの高いIC50を有していた（図９）。0.5nMのIC50は非常に強力な化合物を示しており、このことはSEQ ID NO: 37についてインビボデータで確認された（実施例１７および１８）。
【０２５８】
実施例１７：SEQ ID NO: 37の１回、２回または３回投与の作用持続時間
C57BL/6マウス（20g）に6.25または25mg/kg/投与量を１日、２日または３日連続で腹腔内投与した（5匹のマウスのグループサイズ）。すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを0.9%食塩水（NaCl）に溶解し、10mL/kg体重（注射当たり〜0.2ml）で与えた。屠殺時（3, 5, 8, 13および21日目）に肝臓の重量を記録した。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の測定のための組織を、使用するまでRNA later（Ambion）中、-20℃で貯蔵した。肝臓に対するｍＲＮＡ分析は屠殺時に行い、一方、血漿中のLDL-および全コレステロールは最後の腹腔内投与の24時間、2または3および、6、11、および19日後に行った（図１１）。この研究は、SEQ ID NO: 37の投与後のＡｐｏ−Ｂ１００ ｍＲＮＡの非常に強力なダウンレギュレーションを示した：１の投与は投与後の3日目〜8日目に45-60%のＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現という結果となり、一方、３の投与では13日目に85-90%および21日目に約70%のダウンレギュレーションという結果となり、２または３の投与量を投与した場合には20日以上長い作用持続時間を示した。ＡｐｏＢ−１００ ｍＲＮＡ発現および全コレステロールは、実施例８および１２と同様にして測定した。
【０２５９】
実施例１８：SEQ ID NO: 37の投与処方
標的（ＡｐｏＢ−１００）ｍＲＮＡダウンレギュレーションおよび血漿コレステロール濃度（１週間に１回回収）に対する作用を調べるため、C57BL/6マウス（20g）に2.mg/kg/投与量を１週間に２回４週間または5mg/kg/投与量を１週間に１回４週間腹腔内投与した（5匹のマウスのグループサイズ）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを0.9%食塩水（NaCl）に溶解し、10mL/kg体重（注射当たり〜0.2ml）で投与した。屠殺時（28日目）に肝臓の重量を記録した。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の測定のための組織を、使用するまでRNA later（Ambion）中、-20℃で貯蔵した。肝臓に対するｍＲＮＡ分析は屠殺時に行い、一方、血漿中のLDLコレステロール濃度は7、14、21および28日目に行った（図１０）。その結果は、LDLコレステロール濃度の経時的な線形低下を示し、2.5mg/kg/投与量を１週間に２回投与後の7日目および食塩水群に比べて28日目に30%の低下という結果となった。同様の結果は、同じ合計量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するが5mg/kg/投与量を１週間に１回のみ投与する場合にも得られた。さらに、屠殺時（28日目）の肝臓中のＡｐｏＢ−１００ ｍＲＮＡレベルは、投与処方（１週間に１回または２回）の如何に拘わらず、20mg/kg投与後、28日にわたって30-40%のダウンレギュレーションを示した。これら結果は、低い投与量のSEQ ID NO 37においてさえもＡｐｏＢ−１００ ｍＲＮＡの有意のダウンレギュレーション、およびこのダウンレギュレーションが血漿LDL-コレステロールにおける30%低減として測定される治療的読み出し（read out）に影響を及ぼすことを示している。ＡｐｏＢ−１００ ｍＲＮＡ発現および全コレステロールは、実施例８および１２と同様にして測定した。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１Ａ】図１Ａは、SEQ ID NO: 29、ｓｉＲＮＡ（非修飾）またはコレステリル修飾ｓｉＲＮＡの脂質介助摂取後のマウス肝細胞（Hepa1-6細胞）での相対的なＡｐｏＢｍＲＮＡ発現を示す。
【０２６１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、SEQ ID NOS: 29および30で処置後のBNLCL2細胞での相対的なＡｐｏＢｍＲＮＡ発現を示す。両化合物は、1nMまたは5nMの濃度で既にＡｐｏＢ−１００ｍＲＮＡの強力なインヒビターである。
【０２６２】
【図２Ａ】図２Ａは、SEQ ID NO: 29、ｓｉＲＮＡ（非修飾）（SEQ ID NOs: 48/49）またはコレステリル修飾ｓｉＲＮＡ（SEQ ID NOs: 50/49）で処置後（静脈内毎日投与を３日間）の肝臓での相対的なＡｐｏＢ−１００ｍＲＮＡ発現を示す。
【０２６３】
【図２Ｂ】図２Ｂは、SEQ ID NO: 29、ｓｉＲＮＡ（非修飾）（SEQ ID NOs: 48/49）またはコレステリル修飾ｓｉＲＮＡ（SEQ ID NOs: 50/49）で処置後（静脈内毎日投与を３日間）の空腸での相対的なＡｐｏＢ−１００ｍＲＮＡ発現を示す。
【０２６４】
【図３】図３は、SEQ ID NO: 29、ｓｉＲＮＡ（非修飾）（SEQ ID NOs: 48/49）またはコレステリル修飾ｓｉＲＮＡ（SEQ ID NOs: 50/49）で処置したマウスの血漿中のコレステロールの相対濃度を示す。
【０２６５】
【図４】図４は、BNCLまたはHepa 1-6細胞でのインビトロＡｐｏＢ−１００標的ダウンレギュレーションを示す。マウス細胞株からのＡｐｏＢｍＲＮＡレベル（GapDHに正規化）に対するSEQ ID No: 29および37の用量応答作用。
【０２６６】
【図５Ａ】図５Ａは、C57BL/6マウスのLNAアンチセンス処置後の肝臓でのインビボＡｐｏＢ−１００サイレンシングを示す。C57BL/6マウスにてLNAアンチセンス分子を１投与（6.25, 12.5または25mg/kg）およびｓｉＲＮＡ（50mg/kg）を３日間連続投与した。ＡｐｏＢ−１００発現をｑＰＣＲにより測定し、Gapdhに正規化した。データは平均±ＳＤ（n=7）を表す。
【０２６７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、C57BL/6マウスのLNAアンチセンス処置後の空腸でのインビボＡｐｏＢ−１００サイレンシングを示す。C57BL/6マウスにてLNAアンチセンス分子を１投与（6.25, 12.5または25mg/kg）およびｓｉＲＮＡ（50mg/kg）を３日間連続投与した。ＡｐｏＢ−１００発現をｑＰＣＲにより測定し、Gapdhに正規化した。データは平均±ＳＤ（n=7）を表す。
【０２６８】
【図６Ａ】図６Ａは、LNAアンチセンス処置後の血漿コレステロール濃度を示す。C57BL/6マウスにてLNAアンチセンス分子を１投与（6.25, 12.5または25mg/kg）およびｓｉＲＮＡ（50mg/kg）を３日間連続投与した。ＬＤＬ−コレステロール濃度を比色分析キットを用いて決定した。データは平均±ＳＤ（n=7）を表す。
【０２６９】
【図６Ｂ】図６Ｂは、LNAアンチセンス処置後の血漿コレステロール濃度を示す。C57BL/6マウスにてLNAアンチセンス分子を１投与（6.25, 12.5または25mg/kg）およびｓｉＲＮＡ（50mg/kg）を３日間連続投与した。血漿全コレステロール濃度を比色分析キットを用いて決定した。データは平均±ＳＤ（n=7）を表す。
【０２７０】
【図７】図７は、本発明によるオリゴマー化合物をデザインするのに用いた、ＡｐｏＢ標的核酸の好ましい配列の逆相補鎖（reverse compliment）の配列比較を示す。
【０２７１】
【図８】図８は、種々のLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したHuh-7（肝細胞）細胞でのインビトロスクリーニングおよび用量応答（1, 5または25nM）および標的ｍＲＮＡ（ＡｐｏＢ−１００）ダウンレギュレーション（ＱＰＣＲ）として測定したオリゴヌクレオチドの作用を示す。
【０２７２】
【図９】図９は、７の選択したLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ＱＰＣＲによりHuh-7細胞で測定したIC50（標的（ＡｐｏＢ−１００）発現の50%抑制を得るのに必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度）を示す。
【０２７３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、屠殺日（28日目）に肝臓で測定したＡｐｏＢ−１００ｍＲＮＡレベルを示す。C57BL/6マウスを、2.5mg/kg/投与で１週間に２回か（全部で8投与）または5mg/kgで１週間に１回（全部で4投与）、４週間投与した。
【０２７４】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、後眼窩血（retro orbital blood）にて１週間に１回、４週間測定した血漿ＬＤＬ濃度を示す。C57BL/6マウスを、2.5mg/kg/投与で１週間に２回か（全部で8投与）または5mg/kgで１週間に１回（全部で4投与）、４週間投与した。
【０２７５】
【図１１Ａ】図１１Ａは、屠殺時、3, 5, 8, 13または21日目に肝臓でのＡｐｏＢ−１００ｍＲＮＡレベルとして測定した作用持続時間を示す。C57BL/6マウスに、25mg/kg/投与のSEQ ID NO:37の１、２または３投与を、1, 2または3日目の各日にそれぞれ連続して投与した。
【０２７６】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、屠殺時、3, 5, 8, 13または21日目に測定した全血漿コレステロールを示す。C57BL/6雌マウスに、25mg/kg/投与のSEQ ID NO:37の１、２または３投与を、1, 2または3日目の各日にそれぞれ連続して投与した。
【図１Ａ】
2009507499.tif 000011
【図１Ｂ】
2009507499.tif 000012
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2009507499.tif 000018
【図６Ａ】
2009507499.tif 000019
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
2009507499.tif 000022
【図９】
2009507499.tif 000023
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月19日(2008.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009507499000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月4日(2008.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全部で12-50のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなるオリゴヌクレオチド化合物であって、該化合物は少なくとも10のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列はSEQ ID NOS: 59, 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16および17 よりなる群から選ばれた配列に対応し、該化合物は少なくとも3のヌクレオチドアナログを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
二本鎖のオリゴヌクレオチドからなり、各鎖が全部で16-30のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、該化合物は少なくとも10のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列はSEQ ID NOS: 59, 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16および17 から選ばれた配列内に位置しており、該化合物は少なくとも3のヌクレオチドアナログを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該サブ配列が該少なくとも3のヌクレオチドアナログを含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
該サブ配列が、2-6の一続きのヌクレオチドアナログと、それに続く4-12の一続きのヌクレオチドと、それに続く2-6の一続きのヌクレオチドアナログを含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
該サブ配列が、SEQ ID NOS: 59, 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16および17 よりなる群から選ばれた該配列中の対応配列と比較したときに1または2のミスマッチを含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
12-25のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,または22のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
15または16のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
該ヌクレオチドが、リン酸基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基よりなる群から選ばれた結合基を含み、インターヌクレオシド結合が-O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-である、請求項１ないし８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
該結合がリン酸基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
該結合がホスホロチオエート基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
すべての結合がホスホロチオエート基である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
3-12のヌクレオチドアナログを含む、請求項１ないし１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
6または7のヌクレオチドアナログを含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
該ヌクレオチドアナログの少なくとも１がロックト核酸（LNA）である、例えば、少なくとも3、またはすべてのヌクレオチドアナログがLNAである、請求項１ないし１４のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
LNAが、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNAおよびベータ-D-チオ-LNAから選ばれる、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
該ヌクレオシドおよび／またはLNAが互いにリン酸基またはホスホロチオエート基により結合している、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
該サブ配列が、SEQ ID No: 63、SEQ ID NO: 2、SEQ ID No: 3、およびSEQ ID No: 11よりなる群から選ばれる、請求項１ないし１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
該サブ配列が、SEQ ID No: 9、SEQ ID No: 10、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID No: 12よりなる群から選ばれる、請求項１ないし１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
式：
5'-[(LNA)2-6-(DNA/RNA)4-12-(LNA)2-6-(DNA/RNA)0-1]-3'
または
5'-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8-9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3'
（式中、「LNA」はLNAヌクレオチドを示し、「DNA」および「RNA」は、それぞれデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを示す）で示される、請求項１ないし１９のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
SEQ ID NOS: 29、30、31、34、35、36、37および38 よりなる群から選ばれる化合物。
【請求項２２】
SEQ ID NO: 29である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 30である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
SEQ ID NO: 37である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
13または14のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログからなる、請求項１ないし２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の化合物と、該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド残基とを含むコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれかに記載の化合物または請求項２６に記載のコンジュゲート、および薬理学的に許容しうる希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項２８】
経口投与に適合される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
少なくとも１のコレステロール低下化合物をさらに含む、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
該化合物が、胆汁酸塩封鎖樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩）、HMGCoA-リダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プレバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブル酸誘導体（例えば、クロフィブレート、ゲンフィブロジル、フェノフィブレート、ベンザフィブレート、およびシプロフィブレート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、プラント−スタノールエステル、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、インプリタピド、胆汁酸トランスポーター（apical sodium-dependent bile acid transporters）の阻害剤、肝臓CYP7aのレギュレーター、エストロゲン補充療法剤（例えば、タモキシフェン）、および抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド）よりなる群から選ばれる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
医薬として使用するための請求項１〜２５のいずれかに記載の化合物または請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
異常なレベルのＡｐｏ−Ｂ１００の治療用医薬の製造のための、請求項１〜２５のいずれかに記載の化合物または請求項２６に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項３３】
該異常なレベルのＡｐｏ−Ｂ１００が、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症または高脂血症よりなる群から選ばれた医学的状態の存在と相関関係を有する、請求項３２に記載の使用。
【国際調査報告】
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