(57)【要約】  授乳基準で、（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、（Ｃ）ラクトフェリン類および（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含み、シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものである乳児用調乳が開示されている。ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、この濃縮物は授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める。前記調乳を用いて下痢乳児のリスクを低減する方法、および母乳栄養乳児のものと同様の腸内微生物叢プロファイルを形成する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
授乳基準で、
（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、
（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、
（Ｃ）ラクトフェリン類および
（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸
を含み、前記シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものであり、
前記ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、前記濃縮物が授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める
乳児用調乳。
【請求項２】
前記脂質結合シアル酸が総シアル酸の約２．７重量％から約５重量％を占める、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項３】
授乳基準で、（Ａ）約７ｍｇ／Ｌから約５０ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌのリン脂質および（Ｃ）約９０ｍｇ／Ｌから約２５０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項４】
授乳基準で約５０ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌのラクトフェリンを含み、このラクトフェリンのうちの少なくとも約６重量％が天然ラクトフェリンである、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項５】
前記総リン脂質が少なくとも２０重量％のスフィンゴミエリンを含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項６】
前記リン脂質が、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリンを含む、請求項５に記載の乳児用調乳。
【請求項７】
約０．０５％から約５％のフルクト多糖をさらに含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項８】
前記調乳が、授乳基準で約０．５％未満の遊離グリコマクロペプチドを含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項９】
前記乳児用調乳が、リン脂質、卵リン脂質およびこれらの組み合わせを実質的に含まない、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１０】
前記乳児用調乳が、授乳基準で約０．２重量％未満の乳脂を含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１１】
前記乳児用調乳が粉末である、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１２】
前記乳児用調乳が即時授乳用液体である、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１３】
授乳基準で、約６．５ｇ／Ｌから約１０．９ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物を含む、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１４】
前記ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約６０％から約９０重量％が強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、該濃縮物が授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める、請求項１に記載の乳児用調乳。
【請求項１５】
（Ｉ）授乳基準で、
（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、
（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、
（Ｃ）ラクトフェリン類および
（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸
を含み、前記シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものであり、
前記ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、前記濃縮物が授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める、乳児用調乳を製造する段階、
（ＩＩ）前記調乳を乳児に投与するまたはそれを投与するよう介護者に指示する段階
を有する、
乳児での下痢のリスクを低下させる方法。
【請求項１６】
前記調乳を唯一の栄養源として投与する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記乳児用調乳が、授乳基準で約５０ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌのラクトフェリンを含み、このラクトフェリンのうちの少なくとも約６重量％が天然ラクトフェリンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂質結合シアル酸が総シアル酸の約２．７重量％から約５重量％を占める、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記乳児用調乳が、授乳基準で、（Ａ）約７ｍｇ／Ｌから約５０ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌのリン脂質および（Ｃ）約９０ｍｇ／Ｌから約２５０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記総リン脂質が少なくとも２０重量％のスフィンゴミエリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記乳児用調乳が、授乳基準で約０．２重量％未満の乳脂を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記調乳が、授乳基準で約０．５％未満の遊離グリコマクロペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記乳児用調乳が、授乳基準で、約６．５ｇ／Ｌから約１０．９ｇ／Ｌの強化乳清タンパク質濃縮物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約６０％から約９０重量％が強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、該濃縮物が授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
（Ｉ）授乳基準で、
（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、
（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、
（Ｃ）ラクトフェリン類および
（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸
を含み、前記シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものであり、
前記ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、前記濃縮物が授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ乳児用調乳を占める、乳児用調乳を製造する段階、
（ＩＩ）前記調乳を乳児に投与するまたはこれを投与するよう介護者に指示する段階
を有する、
母乳栄養乳児のものと同様の腸内微生物叢プロファイルを形成する方法。
【請求項２６】
前記調乳が、授乳基準で約５０ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌのラクトフェリンを含み、このラクトフェリンのうちの少なくとも約６重量％が天然ラクトフェリンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記調乳が、授乳基準で約０．５％未満の遊離グリコマクロペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約６０％から約９０重量％が強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、該濃縮物が授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ガングリオシド、リン脂質およびシアル酸の前記組み合わせのうちの約５０重量％から１００重量％が強化乳清タンパク質濃縮物からのものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂質結合シアル酸が総シアル酸の約２．７重量％から約５重量％を占める、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記調乳が、授乳基準で、（Ａ）約７ｍｇ／Ｌから約５０ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌのリン脂質および（Ｃ）約９０ｍｇ／Ｌから約２５０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記総リン脂質が少なくとも２０重量％のスフィンゴミエリンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記乳児用調乳が、授乳基準で約０．２重量％未満の乳脂を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記調乳が、授乳基準で約０．５％未満の遊離グリコマクロペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記調乳が、約０．０５％から約５％のフルクト多糖をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質類、ラクトフェリン、ガングリオシド類およびシアル酸のそれぞれが強化乳清タンパク質濃縮物によって完全にまたは部分的に提供されることで人乳の自然の組成および効用により近づけるリン脂質類、ラクトフェリン、ガングリオシド類およびシアル酸の特定の組み合わせにより強化されておりおよびこの特定の組み合せを含む、乳児用調乳に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、市販の乳児用調乳は、若年期に補助または唯一の栄養源を提供することを目的として用いられるのが一般的である。これらの調乳は、成長期の乳児の栄養的ニーズを満足する上での広範囲の栄養素を含み、通常脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン、ミネラルおよび至適な乳児の成長および発達に役立つ他の栄養素などを含む。
【０００３】
市販の乳児用調乳は、人乳の組成および機能にできるだけ近づくように設計されている。米国では、連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＦＤＣＡ）は、乳児用調乳を「人乳を模倣するものであること、または人乳の完全もしくは部分的代替物として好適であることを理由として、乳児向けの食品として単独で特殊な食事に使用されることを謳っているまたはそれが説明されている食品」と定義している（ＦＦＤＣＡ２０１（ｚ））。
【０００４】
ＦＦＤＣＡ規則下での市販の乳児用調乳は、米国において非免除乳児用調乳に製剤されるべき基本的栄養素によって規定されている。これらの栄養素には、調乳１００ｋｃａｌ当たり、タンパク質（１．８から４．５ｇの少なくとも栄養的にカゼインに等価）、脂肪（３．３から６．０ｇ）、リノール酸（少なくとも３００ｍｇ）、レチノール等価物としてのビタミンＡ（７５から２２５ｍｃｇ）、ビタミンＤ（４０から１００  ＩＵ）、ビタミンＫ（少なくとも４．０ｍｃｇ）、ビタミンＥ（少なくとも０．７  ＩＵ／ｇリノール酸）、アスコルビン酸（少なくとも８．０ｍｇ）、チアミン（少なくとも４０ｍｃｇ）、ボフラビン（少なくとも６０ｍｃｇ）、ピリドキシン（調乳中にタンパク質１５ｍｃｇ／ｇを含む少なくとも３５．０ｍｃｇ）、ビタミンＢ１２（少なくとも０．１５ｍｃｇ）、ナイアシン（少なくとも２５０ｍｃｇ）、葉酸（少なくとも４．０ｍｃｇ）、パントテン酸（少なくとも３００．０ｍｃｇ）、ビオチン（少なくとも１．５ｍｃｇ）、コリン（少なくとも７．０ｍｇ）、イノシトール（少なくとも４．０ｍｇ）、カルシウム（少なくとも５０．０ｍｇ）、リン（少なくとも２５．０ｍｇで、カルシウム／リンの比が１．１から２．０である）、マグネシウム（少なくとも６．０ｍｇ）、鉄（少なくとも０．１５ｍｇ）、ヨウ素（少なくとも５．０ｍｃｇ）、亜鉛（少なくとも０．５ｍｇ）、銅（少なくとも６０．０ｍｃｇ）、マンガン（少なくとも５．０ｍｃｇ）、ナトリウム（２０．０から６０．０ｍｇ）、カリウム（８０．０から２００．０ｍｇ）および塩素化物（５５．０から１５０．０ｍｇ）などがある。
【０００５】
厳しい規制管理があっても、市販の乳児用調乳は現在でもなお、人乳と組成面でも機能面でも同一ではない。人乳において、ほぼ２００種類の異なる化合物が同定されており、そのうちの１００を超えるものが、通常は人乳中で有意な量で認められず、市販の調乳では全く認められない。そのような化合物には、各種の免疫グロブリン類、酵素、ホルモン、ある種のタンパク質、ラクトフェリン、ガングリオシド類、リン脂質（スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール）などがある。これらの材料のうちの多くが人乳に特有のものである、あるいは牛乳や市販の乳児用調乳を製造するのに用いられる他のタンパク質源に低い濃度でのみ存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６３６５２１８号（ボルシェル（Borschel））
【特許文献２】米国特許出願第２００３０１１８７０３Ａ１号（グエン（Nguyen）ら）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ladisch S. and Gillard B. (1985) A. solvent partition method for microscale ganglioside purification.  Anal. Biochem. 146: 220-231
【非特許文献２】Williams M and McCluer R (1980), The use of Sep-PakTM C18 cartridges during the isolation of gangliosides, J. Neurochem, 35: 266-269
【非特許文献３】Gazzotti G., Sonnion S., Ghidonia R (1985), Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. J Chromatogr. 348:371-378
【非特許文献４】Gibson, G. R. and M. B. Roberfroid, 1995, Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, 125: 1401-1412
【非特許文献５】Knol, J., Scholtens, P., Kafka, C., Steenbakkers, J., Gross, S., Helm. K., Klarczyk, M., Schopfer H., Bockler. H. -M , and Wells, J., 2004, Colon microflora in infants fed formula with galacto- and fructo-oligosaccharides: more like breast-fed infants, Journal Pediatric Gastroenterology, 40(1): 36-42
【非特許文献６】Marleen H. M. C. van Nuenen, P. Diederick Meyer, and Koen Venema, 2003, The effects of various inulins and Clostridium difficile on the metabolic activity of the human colonic microbiota in vitro, Microbial Ecology in Health Disease, 15: 137-144
【非特許文献７】Miller, E.R., Ullrey, The pig as model for human nutrition, Annu Rev Nutr 1987; 7: 361-82
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、人乳中で認められる天然成分をさらに多く含むことで、母乳栄養児が現在享受している栄養的利益のうちのより多くのものを提供できるようにする新たな乳児用調乳が、現在も必要とされている。
【０００９】
本発明は、リン脂質、ガングリオシド類、ラクトフェリンおよびシアル酸などの人乳中に固有に認められる特定の濃度および種類の化合物を含む乳児用調乳に関するものである。これらの特定の成分およびそれらの乳児用調乳での相当する濃度のため、本明細書に記載の乳児用調乳の栄養素プロファイルは、従来の乳児用調乳よりも人乳との類似性が高い。
【００１０】
人乳で認められる成分のうちの一部に似せる以外に、本発明の乳児用調乳には、本明細書に記載の動物試験で示されるように下痢のリスクをも低下させることが発見された。その試験は、ラクトフェリン、リン脂質およびガングリオシドをほとんど含まない市販の乳児用調乳と本発明の乳児用調乳を比較して、動物モデルでの下痢の期間の短縮を示している。
【００１１】
ＴＮＯ生活の質（TNO Quality of Life）が開発した大腸の検証された動学的イン・ビトロモデルシステム（ＴＮＯイン・ビトロモデルまたはＴＩＭ−２）を用いて示されたように、本発明の乳児用調乳は、人工栄養児で認められるものと同様の腸内微生物叢プロファイルの発達を加速することも発見された。母乳栄養児および人工栄養児は、かなり異なる腸内微生物叢プロファイルを有しており、これらの両者の中では母乳栄養児のものの方が健全性が高いことは良く知られている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明の第１の実施形態は、授乳基準で、（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、（Ｃ）ラクトフェリン類および（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含み、シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものである乳児用調乳に関するものである。ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、この濃縮物は授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を占める。
【００１３】
本発明の第２の実施形態は、乳児における下痢のリスクを低減する方法に関するものであり、この方法は、下痢になった場合に、乳児における下痢の期間を短縮する方法を含む。この方法は、授乳基準で（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質、（Ｃ）ラクトフェリンおよび（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含み、シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合シアル酸としてのものである調乳を、処置を必要とする乳児に投与する段階を有する。ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、その濃縮物は授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を表す。
【００１４】
本発明の第３の実施形態は、母乳栄養児で認められるものと同様の腸内微生物叢を促進する方法に関するものである。この方法は、授乳基準で（Ａ）少なくとも約５ｍｇ／Ｌのガングリオシド、（Ｂ）少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌのリン脂質および（Ｃ）ラクトフェリンおよび（Ｄ）少なくとも約７０ｍｇ／Ｌのシアル酸を含み、シアル酸のうちの少なくとも約２．５重量％が脂質結合している調乳を、処置を必要とする乳児に投与する段階を有する。ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸のそれぞれの約５０から１００重量％が、強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、この濃縮物は授乳基準で少なくとも約６．５ｇ／Ｌ調乳を表す。
【００１５】
人乳で認められる成分のうちの一部に似せる以外に、本発明の乳児用調乳には、下記に記載の動物試験で示されるように下痢のリスクをも低下させることが発見された。この試験は、市販の乳児用調乳と本発明の乳児用調乳を比較して、動物モデルでの下痢の期間の短縮を示している。
【００１６】
ＴＩＭ−２を用いて示されたように、本発明の乳児用調乳が、人工栄養児で認められるものと同様の腸内微生物叢プロファイルの発達を促進することも発見された。母乳栄養児および人工栄養児が、かなり異なる腸内微生物叢プロファイルを有しており、この両者の中では母乳栄養児のものの方が健全性が高いことは良く知られている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】母乳栄養叢の７２時間発酵後における０．５ｇ／Ｌ短鎖ＦＯＳを有する従来の乳児用調乳についての短鎖脂肪酸プロファイルをまとめた円グラフである（実験１）。
【図２】母乳栄養叢の７２時間発酵後における２．０ｇ／Ｌ短鎖ＦＯＳを有する従来の乳児用調乳についての短鎖脂肪酸プロファイルをまとめた円グラフである（実験１）。
【図３】母乳栄養叢の７２時間発酵後における２．０ｇ／Ｌ短鎖および長鎖ＦＯＳを有する従来の乳児用調乳についての短鎖脂肪酸プロファイルをまとめた円グラフである（実験１）。
【図４】母乳栄養叢の７２時間発酵後における０．８ｇ／Ｌ短鎖ＦＯＳを有する本発明の乳児用調乳実施形態についての短鎖脂肪酸プロファイルをまとめた円グラフである（実験１）。
【図５】腸内の微生物叢による発酵から得られる母乳栄養乳児についての代表的な短鎖脂肪酸プロファイルをまとめた円グラフである（実験１）。
【図６】母乳栄養叢の７２時間発酵後における従来の乳児用調乳についての代表的な短鎖脂肪酸プロファイルをまとめた円グラフである（実験１）。
【図７】飼料Ａ（従来の乳清タンパク質濃縮物を含む市販の乳児用調乳）または飼料ＢおよびＣ（授乳基準で７．１ｇ／Ｌ調乳のレベルで強化乳清タンパク質濃縮物を含む乳児用調乳）のいずれかを与えた仔ブタにおける下痢の期間（日数）を示す棒グラフである［データは平均±ＳＥＭである。（＊）は群Ａと有意差がある（ｐ＜０．０５）。］（実験２）。
【図８】飼料ＡおよびＣ（従来の乳清タンパク質濃縮物を含む市販の乳児用調乳）または飼料Ｂ（授乳基準で６．４ｇ／Ｌ調乳のレベルで強化乳清タンパク質濃縮物を含む乳児用調乳）のいずれかを与えた仔ブタにおける下痢の期間（日数）を示す棒グラフである（実験３）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の組成物は、ガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸を含むものであり、このそれぞれは完全にまたは部分的に強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され、このそれぞれについて下記で詳細に説明する。
【００１９】
本明細書で使用される「乳児」という用語は、約年齢が約１歳以下の個人を指し、０ヶ月から約４ヶ月齢の乳児、約４から約８ヶ月齢の乳児、約８から約１２ヶ月齢の乳児、誕生時２５００ｇ未満の低出生体重児および約３７週妊娠期間未満、代表的には約２６週から約３４週の妊娠期間で生まれた早期産児を含む。
【００２０】
本明細書で使用される「乳児用調乳」という用語は、別段の断りがない限り、補助栄養源、主栄養源または唯一の栄養源として乳児に経口投与するのに好適な脂肪、タンパク質、炭水化物、ビタミンおよびミネラルを含む製剤を指し、その例には再生用粉末、希釈用濃縮物および即時投与用液体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本明細書で使用される「授乳での」という用語は、別段の断りがない限り、乳児への直接経口投与に好適な液体調乳を指し、その調乳は即時投与液体、再生粉末または希釈用濃縮物である。
【００２２】
本発明の乳児用調乳を特徴付けるのに用いられる本明細書で使用される全ての成分範囲は、別段の断りがない限り、授乳基準において乳児用調乳の重量を基準としたものである。
【００２３】
本明細書で使用される全てのパーセント、部および比率は、別段の断りがない限り、組成全体の重量基準である。列挙された成分に関するそのような全ての重量は活性レベルに基づいたものであり、したがって、別段の断りがない限り、市販の材料に含まれる可能性がある溶媒や副生成物は含まない。
【００２４】
本発明の乳児用調乳は、本明細書に記載の場合による成分もしくは特定の必須成分や構成要素を実質的に含まないものであることもできるが、ただし、残りの調乳はなお、本明細書に記載の必要な成分や構成要素を全て含むものである。この文脈においておよび別段の断りがない限り、「実質的に含まない」という用語は、選択された組成物が、機能する量に満たない量の場合による成分、代表的には０．１重量％未満であって０重量％を含むそのような場合による成分もしくは選択された必須成分を含むことを意味する。
【００２５】
別段の断りがあるまたは言及が行われている文脈によって逆の内容が明瞭に示唆されていない限り、本発明の単数での特徴または限定についての言及はいずれも、相当する複数の特徴または限定を包含するものであり、その逆も当てはまる。
【００２６】
別段の断りがあるまたは言及が行われている文脈によって逆の内容が明瞭に示唆されていない限り、本明細書で使用される方法およびプロセスの組み合わせはいずれも、いかなる順序で行っても良い。
【００２７】
本発明の方法および成分を含めた組成物は、本明細書に記載の本発明の必須の要素および限定、ならびに栄養調乳用途において有用な本明細書その他で記載の別のもしくは場合による成分、構成要素もしくは限定を含むまたはこれらから成るまたは本質的にこれらからなるものであることができる。
【００２８】
強化乳清タンパク質濃縮物
本発明の乳児用調乳は、完全もしくは部分的に調乳中のガングリオシド、ラクトフェリン、リン脂質およびシアル酸成分を提供する特定レベルの強化乳清タンパク質濃縮物を含む。強化乳清タンパク質濃縮物は、重量基準で、乳児用調乳における全リン脂質、ガングリオシド、ラクトフェリンおよびシアル酸レベルのそれぞれの約１０％から１００％、例えば約５０％から約１００％、さらに例えば約５０％から約９０％、さらに例えば約６０％から約８５％を提供することができる。後者の化合物は哺乳動物の乳汁その他の好適な入手源からの単離された化合物として個別かつ別個に加えることができるが、そのような化合物の全てでなくともほとんどが強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されることが好ましい。
【００２９】
乳児用調乳における強化乳清タンパク質濃縮物のレベルは、授乳基準で約６．５ｇ／Ｌ調乳を超えるものでなければならない。そのような濃度は、授乳基準で、約６．５から約１０．９ｇ／Ｌ、例えば約６．６から約８．５ｇ／Ｌ、さらに例えば約６．７から約７．３ｇ／Ｌ調乳の範囲であり得る。
【００３０】
本発明の乳児用調乳で使用される強化乳清タンパク質濃縮物は、高濃度の乳脂肪球皮膜物質を有するものである。乳脂肪球皮膜物質は、ウシその他の哺乳動物乳中のトリアシルグリセロール豊富乳脂肪球を囲む膜および膜関連物質である。乳脂肪球皮膜物質中で確認されている化合物の多くが、市販の乳児用調乳中よりもかなり高い濃度で人乳中に存在する。このような物質が強化された乳清タンパク質濃縮物を乳児用調乳に加えることで、得られる調乳は、人乳と組成がより類似するようになり、特にガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸の人乳濃度に関してそうなる。
【００３１】
本明細書で使用される「強化乳清タンパク質濃縮物」という用語は、別段の断りがない限り、少なくとも約３％、より代表的には少なくとも約５重量％のリン脂質（そのうち、少なくとも約２０重量％がスフィンゴミエリン）；少なくとも約０．５％、代表的には少なくとも約１．２重量％のシアル酸；および少なくとも約０．０５％、代表的には少なくとも約０．１重量％のガングリオシドを有する乳清タンパク質濃縮物を指す。濃縮物からの少なくとも約２から５重量％のシアル酸が脂質に結合している。
【００３２】
本発明での使用に好適な強化乳清タンパク質濃縮物の入手源には、強化成分のレベルが上記のものである乳清タンパク質濃縮物などがあり、その例には、ＬＡＣＰＲＯＤＡＮ（登録商標）ＭＦＧＭ−１０、すなわち濃縮物の重量基準で、６．５％リン脂質、０．２％ガングリオシド、１．８０％シアル酸（総シアル酸の重量基準で少なくとも２．５％が脂質結合シアル酸）および１．５％ラクトフェリンを含むアルファ・フード・イングレディエンツ（Arfa Food Ingredients, Denmark）から入手可能な乳清タンパク質濃縮物などがあるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
シアル酸
本発明の乳児用調乳は、授乳基準で、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、例えば約９０ｍｇ／Ｌから約４０００ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約１９０ｍｇ／リットルから約２０００ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約３００ｍｇ／Ｌから約９００ｍｇ／Ｌの濃度でシアル酸を含み、重量基準で少なくとも２．５％、例えば約２．６％から約１０％、例えば約２．７％から約５％のシアル酸が脂質結合している。シアル酸の一部または全てが、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されるものであり得る。
【００３４】
乳児用調乳の脂質結合シアル酸成分は、最も代表的には、本質的に脂質結合シアル酸を含むガングリオシドの形態である。従って、下記に記載されている本発明のガングリオシド成分は、本発明の脂質結合シアル酸成分の主要もしくは唯一の供給源であることができる。
【００３５】
本明細書で使用される「シアル酸」という用語は、別段の断りがない限り、シアル酸誘導体を含む、全ての複合型および非複合型のシアル酸を指す。従って、本発明の乳児用調乳におけるシアル酸には、遊離のシアル酸、タンパク質結合シアル酸、脂質結合シアル酸（ガングリオシドなど）、炭水化物結合シアル酸およびこれらの組み合わせもしくは誘導体などがあり得る。本明細書に記載の全てのシアル酸濃度は、タンパク質、脂質、炭水化物その他のシアル酸構造に結合した複合体を除く、シアル酸化合物もしくは部分自体の重量パーセントに基づいたものである。
【００３６】
乳児用調乳で使用されるシアル酸源は、別個の成分として加えたり、得ることができる。しかしながら、より代表的には、シアル酸は主として、乳清タンパク質濃縮物成分からの、好ましくは本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物からの固有の成分として提供される。さほど好ましくはないが、シアル酸は別個の成分として乳児用調乳から得たり、乳児用調乳に加えても良く、この場合、加えられるシアル酸は、他の成分からの固有のシアル酸と組み合わせて、乳児用調乳中における総シアル酸含有量を得る。
【００３７】
個々の化合物もしくは部分として、シアル酸は炭素数９個のアミノ糖であり、その構造は、化学文献に容易に記載されている。Ｎ−アセチルノイラミン酸に関して他の一般に認められている名称には、シアル酸；ｏ−シアル酸；５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロソン酸；５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヌロソン酸；アセノイラミン酸；Ｎ−アセチル−ノイラミネート；Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＮＡＮＡ；ＮＡＮＡ、Ｎｅｕ５Ａｃ；およびＮｅｕＳＡｃなどがある。
【００３８】
好適なシアル酸源は、天然もしくは合成のいずれであっても良く、４０を超える天然の現在確認されているシアル酸誘導体のいずれかを含み、これらには遊離シアル酸、オリゴ糖結合体（例：シアリルオリゴ糖）、脂質結合体（すなわち、糖脂質）、タンパク質結合体（すなわち、糖タンパク質）およびこれらの組み合わせなどがある。
【００３９】
本発明での使用に好適なシアル酸には、天然であるか合成であるかを問わず、一般に人乳で認められるシアリルオリゴ糖などがあり、これらの最も豊富な２つのものは３′シアリルラクトース（３′ＳＬ、ＮｅｕＮＡｃα２−３ガラクトースβ１−４グルコース）および６′シアリルラクトース（６’ＳＬ、ＮｅｕＮＡｃα２−６ガラクトースβ１−４グルコース）である。他の好適なシアリルオリゴ糖には、より大きい人乳その他のより複雑なオリゴ糖に結合した１以上のシアル酸分子を含むものなどがある。
【００４０】
本明細書で使用される他の好適なシアル酸には、乳児用調乳での使用にやはり好適である相当する糖脂質などがあり、これらには脂肪酸、スフィンゴシン、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルノイラミン酸分子を含むシアル酸含有糖脂質のようなガングリオシド類などがある。これらのシアル酸化合物は、シアリル化されていることが知られている人乳中で一般に認められているいくつかの糖タンパク質（例：κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン）のうちのいずれか１以上を含むこともできる。
【００４１】
本明細書での使用に好適なシアル酸源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳もしくは乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物のように、牛乳が本発明での使用に好ましい入手源である。
【００４２】
本発明での使用に好適なシアル酸の個々の入手源には、アルファ・フード・イングレディエンツ（デンマーク）から入手可能なラクプロダン（Lacprodan）ＣＧＭＰ−１０（４．２％シアル酸を含むカゼイノグリコマクロペプチド）およびダビスコ・フーズ・インターナショナル（Davisco Foods International, Eden Prairie, Minnesota, USA）から入手可能なバイオピュア・グリコマクロペプチド（Biopure glycomacropeptide）（７から８％のシアル酸含有）などがある。
【００４３】
乳児用調乳は、シアル酸源としてグリコマクロペプチドを含むことができるが、この調乳は好ましくは、グリコマクロペプチドの含有率がかなり低下されている。グリコマクロペプチドは、牛乳タンパク質カゼイン分子の一部である。スキムミルク中では、ごく微量の遊離グリコマクロペプチドが認められるが、乳清タンパク質濃縮物は、比較的高い量の遊離グリコマクロペプチドを含む。グリコマクロペプチドが、乳児によっても、さらには他のシアル酸源によっても耐容されないことが認められている。従って、乳清タンパク質濃縮物を用いて製造された乳児用調乳は、比較的高いグリコマクロペプチド含有率を有するが、乳児による耐容性も低いものと考えられる。この文脈において、「実質的に低下」という用語は、乳児用調乳が好ましくは、授乳基準で遊離グリコマクロペプチドとして、調乳の重量基準で０．５％未満、例えば０．４％未満、および例えば０．３５％未満、さらには例えば０パーセントを含むことを意味する。従来の乳児用調乳は代表的には、チーズ乳清からの代表的な乳清タンパク質濃縮物からの固有成分として、０．６から０．８％のグリコマクロペプチドを含む。
【００４４】
ガングリオシド
本発明の乳児用調乳は、オリゴ糖鎖に連結された１以上のシアル酸（ｎ−アセチルノイラミン酸）を有するグリコスフィンゴ糖脂質（セラミドおよびオリゴ糖）からなる化合物群である１以上のガングリオシドを強化濃度で含む。ガングリオシドの一部または全体は、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され得る。
【００４５】
ガングリオシドは、哺乳動物細胞の原形質膜の通常の成分であり、ニューロン膜で特に豊富である。これは、疎水性部分であるセラミドおよび親水性部分である１以上のシアル酸分子を含むオリゴ糖鎖を含む酸性スフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドのオリゴ糖部分は、ガングリオシドの分離およびこれらの個々の物質としての認識についての基準を構成する異なる化学構造を有する。最も一般的なガングリオシドのセラミド部分は、Ｃ１８およびＣ２０の誘導体が多い不均一な脂肪酸組成を有する。
【００４６】
ガングリオシドは、それぞれモノ、ジおよびトリシアロガングリオシドを指すＭ、ＤおよびＴの呼称を用いて呼ばれることが最も一般的であり、１、２、３などの数字は薄層クロマトグラフィーでのガングリオシドの移動順を指す。例えば、モノシアロガングリオシド類の移動順序は、ＧＭ３＞ＧＭ２＞ＧＭ１である。塩基性構造内での変化を示すのに、さらに下付文字を加え、例えばＧＭ１ａ、ＧＤ１ｂなどとする。
【００４７】
本発明の乳児用調乳は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、例えば約７ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約１０から約３０ｍｇ／Ｌのガングリオシドを含む。これらのガングリオシド濃度は、人乳で認められるものと類似しており、人乳は代表的には少なくとも約３ｍｇ／Ｌのガングリオシド、より代表的には約３ｍｇ／Ｌから約３０ｍｇ／Ｌのガングリオシドを含む。乳児用調乳で用いられるこれらのガングリオシドは代表的には、ガングリオシド類であるＧＤ３、Ｏ−アセチル−ＧＤ３およびＧＭ３のうちの１以上、より代表的には全てを含む。これらのガングリオシドは一般に、本発明における乳児用調乳中の総ガングリオシドの少なくとも約８０重量％、より代表的には少なくとも約９０重量％を占める。
【００４８】
本発明で使用される好適なガングリオシド源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳または乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物など、牛乳が、本発明で使用される好ましいガングリオシド源である。
【００４９】
本発明での使用に好適な個々のガングリオシド源には、フォンテラ（Fonterra, New Zealand）から入手可能なガングリオシド５００（＞０．５％ＧＭ３および＜１．０％ＧＤ３）およびガングリオシド６００（＞１．２％ＧＤ３）などがある。
【００５０】
本発明の乳児用調乳の定義に関してのガングリオシド濃度は、下記に記載のガングリオシド法に従って測定される。
【００５１】
リン脂質
本発明の乳児用調乳は、強化濃度のリン脂質を含む。このような濃度は、従来の乳児用調乳で認められるものより高く、人乳で認められるものと同様である。リン脂質の一部または全てが、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供されて良い。
【００５２】
本発明での使用に好適なリン脂質には、牛乳その他の哺乳動物の乳汁で一般に認められるものなどがある。好ましいリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンおよびこれらの組み合わせなどがある。最も好ましいものは、５種類全てのリン脂質の組み合わせであり、特にはスフィンゴミエリンが総リン脂質の少なくとも２０重量％を占めるような組み合わせである。
【００５３】
本発明の乳児用調乳でのリン脂質濃度は、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、例えば約２００ｍｇ／Ｌから約６００ｍｇ／Ｌ、さらに例えば約２５０から約４５０ｍｇ／Ｌである。比較のため、人乳は一般に、約１６３から約４０４ｍｇ／Ｌのリン脂質を含み、スフィンゴミエリンは総リン脂質の約５１％を占める。
【００５４】
本発明での使用に好適なリン脂質源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳または乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物など、牛乳が本発明での使用に好ましいリン脂質源である。
【００５５】
他の好適なリン脂質源には、大豆、例えば大豆レシチンなどがある。しかしながら、本発明の乳児用調乳は、好ましくは、大豆からのリン脂質は実質的に含まないものとする。乳児用調乳は、また、好ましくは、卵レシチンとも称される卵リン脂質を実質的に含まないものとする。この文脈では、「実質的に含まない」という用語は、乳児用調乳が０重量％を含めて０．５重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満の大豆または卵リン脂質を含むことを意味する。
【００５６】
本発明での使用に好適な個々のリン脂質源には、フォンテラ（ニュージーランド）から入手可能なリン脂質濃縮物６００（＞１８．０％スフィンゴミエリン、＞３６．０％ホスファチジルコリン、＞９．０％ホスファチジルエタノールアミン、４．０％ホスファチジルセリン）などの牛乳由来の入手源などがある。
【００５７】
ラクトフェリン
本発明の乳児用調乳は、人乳で認められる鉄輸送タンパク質であるラクトフェリンを含む。これらの調乳は、従来の乳児用調乳で認められるものよい高いレベルで強化濃度のラクトフェリンを含む。ラクトフェリンの一部または全てが、本明細書に記載の強化乳清タンパク質濃縮物によって提供され得る。
【００５８】
本明細書で使用される「ラクトフェリン」という用語は、変性ラクトフェリンおよびラクトフェリンの大きく生理活性のある断片（例えば、ラクトフェリン断片）および非変性もしくは天然ラクトフェリンの両方を含む。ラクトフェリンは、鉄輸送体またはトランスフェリンファミリーに属する糖タンパク質である。これは、乳清タンパク質の少量タンパク質成分として、牛乳その他の哺乳動物乳中で認められる。ラクトフェリンは、７０３個のアミノ酸を含み、８０キロダルトンの分子量を有し、人乳でも認められる。
【００５９】
本明細書で使用される「天然ラクトフェリン」という用語は、他のタンパク質や脂質と凝集していないラクトフェリンを指す。しかしながら、天然ラクトフェリンは鉄その他のミネラルに結合していよう。
【００６０】
本発明の乳児用調乳でのラクトフェリン濃度は、好ましくは少なくとも約５０ｍｇ／Ｌであり、例えば約５０ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌであり、例えば約１００から約１５００ｍｇ／Ｌであり、好ましくは少なくとも約６重量％、例えば約６から約３０％、さらに例えば約７から１４％のラクトフェリンが天然ラクトフェリンである。比較のため、人乳は一般に、約１３９０から約１９４０ｍｇ／Ｌのラクトフェリンを含む。
【００６１】
本発明での使用に好適なラクトフェリン源には、人乳および牛乳などの哺乳動物乳または乳製品の単離物、濃縮物または抽出物などがある。本明細書の記載の強化乳清タンパク質濃縮物など、牛乳が本発明での使用に好ましいラクトフェリン源である。本発明での使用に好適な個々のラクトフェリン源には、ＤＭＶインターナショナル（DMV International, Veghel, The Netherlands）から入手可能なラクトフェリンＦＤ（８０％ラクトフェリン）などがある。
【００６２】
他の栄養素
本発明の乳児用調乳は、脂肪、タンパク質、炭水化物、ビタミンおよびミネラルを含み、これらはいずれも、対象となる乳児または所定の乳児群の唯一、主要もしくは補助栄養上のニーズを満足する種類および量にて選択される。多くの異なる入手源および種類の炭水化物、脂肪、タンパク質、ミネラルおよびビタミンが知られており、本発明における基本調乳で用いることができるが、ただし、このような栄養素は特定の製剤中で添加される成分と適合性のものであり、さもなければ乳児用調乳での使用に好適なものである。
【００６３】
本発明での使用に好適な炭水化物は、単純もしくは複合の、乳糖を含有するまたは乳糖を含まないまたはこれらの組み合わせであることができ、例としては加水分解、無処理、天然および／または化学修飾されたコーンスターチ、マルトデキストリン、グルコースポリマー、ショ糖、コーンシロップ、コーンシロップ固体、米またはジャガイモ由来の炭水化物、グルコース、果糖、乳糖、高果糖コーンシロップならびにフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）およびこれらの組み合わせなどの消化可能なオリゴ糖などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
本発明における調乳での使用に好適なタンパク質には、加水分解、部分加水分解および非加水分解もしくは無処理のタンパク質もしくはタンパク質源などがあり、牛乳（例えば、カゼイン、乳清、人乳タンパク質）、動物（例えば、肉、魚）、穀類（例えば、米、トウモロコシ）、野菜（例えば、大豆）またはこれらの組合せなどの公知であるまたはさもなければ好適な供給源由来のものであることができる。
【００６５】
本発明で使用されるタンパク質は、乳児用調乳での使用に関して公知であるまたはさもなければ好適な遊離アミノ酸を含みまたは遊離アミノ酸によって完全もしくは部分的に置き換わっていても良く、これらのアミノ酸の例には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、カルニチン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、タウリン、チロシン、バリンおよびこれらの組合せなどがあるが、これらに限定されるものではない。これらのアミノ酸は、最も代表的にはＬ型で使用されるが、相当するＤ−異性体も、栄養的に等価であれば使用可能である。ラセミ混合物または異性体混合物も使用可能である。
【００６６】
本発明における調乳で使用するのに好適な脂肪には、ヤシ油、大豆油、トウモロコシ油、オリーブ油、紅花油、高オレイン酸紅花油、藻類油、ＭＣＴ油（中鎖脂肪酸トリグリセリド）、ひまわり油、高オレイン酸ひまわり油、パーム油およびパーム核油、パームオレイン、カノーラ油、魚油、綿実油ならびにこれらの組合せなどがある。本発明の乳児用調乳には、授乳基準で約１重量％未満、例えば約０．２重量％未満、さらに例えば０重量％の乳脂を含む実施形態などがある。
【００６７】
調乳での使用に好適なビタミン類および同様の他の成分には、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビタミンＢ１２、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コリン、イノシトール、これらの塩および誘導体ならびにこれらの組み合わせなどがある。
【００６８】
基本調乳での使用に好適なミネラルには、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、クロム、ヨウ素、ナトリウム、カリウム、クロライドおよびこれらの組み合わせなどがある。
【００６９】
本発明の乳児栄養調乳は好ましくは、対象となる消費者もしくはユーザー群に関する関連の乳児用調乳ガイドラインに従って栄養素を含むものであり、このガイドラインの例としては、乳児調乳法２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション３５０（ａ）があろう。調乳で使用する上で好ましい炭水化物、脂質およびタンパク質濃度を、下記の表に示してある。
【００７０】
【表１】
2009542226.tif 000002
【００７１】
乳児用調乳は、調乳１００ｋｃａｌ当たり、ビタミンＡ（約２５０から約７５０ＩＵ）、ビタミンＤ（約４０から約１００ＩＵ）、ビタミンＫ（約４μｍより多い）、ビタミンＥ（少なくとも約０．３ＩＵ）、ビタミンＣ（少なくとも約８ｍｇ）、チアミン（少なくとも約８μｇ）、ビタミンＢ１２（少なくとも約０．１５μｇ）、ナイアシン（少なくとも約２５０μｇ）、葉酸（少なくとも約４μｇ）、パントテン酸（少なくとも約３００μｇ）、ビオチン（少なくとも約１．５μｇ）、コリン（少なくとも約７ｍｇ）およびイノシトール（少なくとも約２ｍｇ）のうちの１以上を含むこともできる。
【００７２】
乳児用調乳は、調乳１００ｋｃａｌ当たり、カルシウム（少なくとも約５０ｍｇ）、リン（少なくとも約２５ｍｇ）、マグネシウム（少なくとも約６ｍｇ）、鉄（少なくとも約０．１５ｍｇ）、ヨウ素（少なくとも約５μｇ）、亜鉛（少なくとも約０．５ｍｇ）、銅（少なくとも約６０μｇ）、マンガン（少なくとも約５μｇ）、ナトリウム（約２０から約６０ｍｇ）、カリウム（約８０から約２００ｍｇ）、クロライド（約５５から約１５０ｍｇ）およびセレン（少なくとも約０．５ｍｃｇ）のうちの１以上を含むこともできる。
【００７３】
乳児用調乳はさらに、フルクト多糖（fructopolysaccharides）を含むことができ、その濃度は授乳基準で調乳の約５重量％以下の範囲、例えば約０．０５％から約３％、さらに例えば約０．１％から約２％の範囲であることができる。これらのフルクト多糖は、長鎖（例：イヌリン）、短鎖（例：ＦＯＳまたはフルクト多糖）またはこれらの組み合わせであることができ、混合物は多様な鎖長の構造を有しており、ほとんどの場合、約２から約６０のＤＰ（重合度）を有する。
【００７４】
本発明の乳児用調乳はさらに、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸またはこれらの組み合わせなどの多価不飽和脂肪酸を含むことができる。そのような長鎖多価不飽和脂肪酸のいずれの供給源も、本発明での使用に好適であるが、そのような供給源は乳児での使用に安全かつ効果的であり、およびさもなければ乳児用調乳中の他の選択成分と適合性であるものである。本発明の乳児用調乳でのアラキドン酸濃度は、調乳中の総脂肪酸の重量基準で約２．０％以下、より好ましくは約０．１％から約１．０％、さらに好ましくは約０．１５から約０．７％、例えば約０．２％から約０．４５％、さらに例えば約０．３８％から約０．４３％の範囲であることができる。本発明の乳児用調乳でのドコサヘキサエン酸濃度は、調乳中の総脂肪酸の重量基準で約１．０％以下、例えば約０．０９％から約１．０％、さらに例えば約０．１％から約０．３６％の範囲であることができる。アラキドン酸および／またはドコサヘキサエン酸の一部の好適な供給源の例としては、魚油、卵由来油、菌類油、藻類油、他の単細胞油およびこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
乳児用調乳はさらに、組成物の物理的、化学的、美的または加工上の特性を変えることができ、対象の乳児もしくは乳児群で用いた場合に医薬成分または追加の栄養成分として役立ち得る他の場合による成分を含むことができる。多くのそのような場合による成分は、公知でありまたはさもなければ、栄養製品での使用に好適であり、本発明の乳児用調乳で使用することもでき、そのような適宜材料は、本明細書に記載の必須材料と適合性であり、さもなければ乳児用調乳での使用に好適であるものである。
【００７６】
このような場合による成分の例としては、追加の酸化防止剤、乳化剤、緩衝剤、着色剤、香味剤、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよび関連誘導体、増粘剤ならびに安定剤などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
使用方法
本発明はさらに、乳児用調乳を製造してから、それを栄養の唯一供給源、主要供給源または補助供給源として乳児に投与するまたは投与するよう介護者に指示することで、乳児での下痢のリスクを低減する方法であって、下痢を発症しやすいかそれを発症している乳児での下痢の期間の短縮によってそのようなリスクを低減する方法を含むものである。単一供給源の栄養が好ましい。
【００７８】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法に従って乳児用調乳を製造してから、その調乳を栄養の唯一供給源、主要供給源または補助供給源として乳児に投与するまたは投与するよう介護者に指示することで、母乳栄養乳児で認められるものと同様の腸内微生物叢プロファイルを形成する方法に関するものでもある。単一供給源の栄養が好ましい。
【００７９】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法に従って乳児用調乳を製造してから、その調乳を栄養の唯一供給源、主要供給源または補助供給源として乳児に投与するまたは投与するよう介護者に指示することで、乳児に栄養を提供する方法に関するものである。単一供給源の栄養が好ましい。
【００８０】
本発明の方法の文脈において、乳児用調乳は、単一、主要または補助栄養を乳児に提供することができる。粉末の実施形態において、各方法は、水系媒体、最も代表的には水もしくは人乳で粉末を再生して、所望のカロリー密度を形成する段階を有することができ、その後にこれを乳児に経口もしくは非経口的に与えることで、所望の栄養を提供する。粉末は、一定量の水または人乳などの他の好適な流体で再生して、約１回の授乳に好適な容量および栄養プロファイルを得る。
【００８１】
本発明の乳児用調乳は最も代表的には、授乳基準で約１９から約２４ｋｃａｌ／液量オンス、より代表的には約２０から約２１ｋｃａｌ／液量オンスのカロリー密度を有する。
【００８２】
ガングリオシド分析法
本発明で使用されるガングリオシド濃度は、下記の分析方法に従って測定される。
【００８３】
総脂質を、ラクプロダン（Lacprodan）ＭＦＧＭ−１０または乳児用調乳サンプルから、クロロホルム：メタノール：水の混合物で抽出する。ガングリオシドを、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）／１−ブタノール／水相分配およびＣ−１８カートリッジによる固相抽出の組み合わせによって総脂質抽出物から精製する。精製ガングリオシド中の脂質結合シアル酸（ＬＢＳＡ）を、レゾルシノールとの反応によって分光光度的に測定する。ＬＢＳＡに変換係数を掛けることで、サンプル中のガングリオシドの量を得る。この係数は、ガングリオシド単位およびシアル酸単位の分子重量比から得られる。ガングリオシドは異なる分子量およびシアル酸残基数を有する化合物のファミリーであることから、ＨＰＬＣ分離を用いて個々のガングリオシド分布を測定することで、この変換係数をより正確に計算する。
【００８４】
標準
・ウシ脳からのジシアロガングリオシドＧＤ１ａ、最低９５％（ＴＬＣ）、シグマ（SIGMA）参照番号Ｇ−２３９２。
・ウシ脳からのモノシアロガングリオシドＧＭ１、最低９５％（ＴＬＣ）、シグマ参照番号Ｇ−７６４１。
・ウシバターミルクからのジシアロガングリオシドＧＤ３アンモニウム塩、最低９８％（ＴＬＣ）、カルバイオケム（Calbiochem）参照番号３４５７５２またはマトレヤ（Matreya）参照番号１５０３。
・牛乳からのモノシアロガングリオシドＧＭ３アンモニウム塩、最低９８％（ＴＬＣ）、カルバイオケム参照番号３４５７３３またはマトレヤ参照番号１５０４。
・大腸菌からのＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮＡＮＡ）、最低９８％シグマ、参照番号Ａ−２３８８。
【００８５】
供給者が濃度を保証しないのが普通であることから、ガングリオシド標準は真の標準とは見なされない。そのため、濃度はレゾルシノール法によって測定されるＬＢＳＡとして計算される。ガングリオシドの種類に応じて、標準をクロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）１：１（体積比）で１から２．５ｍｇ／ｍＬの理論濃度まで希釈する。少量サンプル１０、２０および４０μＬを取り、Ｎ２気流下に乾燥させ、下記の説明する方法に従って測定する（ＬＢＳＡの測定）。３つの少量サンプルの平均濃度を、ＬＢＳＡとして表されるガングリオシド標準の濃度と見なす。ガングリオシド濃度は、分子量比から得られる変換係数をＬＢＳＡに掛けることで得られる（変換係数：
【００８６】
【数１】
2009542226.tif 000003
式中、ｎ＝シアル酸単位数である）。
【００８７】
【表２】
2009542226.tif 000004
【００８８】
手順
脂質抽出：脂質抽出物は次のように得る。調乳１ｇまたはラクロプロダン（Lacprodan）ＭＦＧＭ−１０  １００ｍｇのサンプルを、丸底ガラス製遠心管（調乳には５０ｍＬ管およびラクロプロダンＭＦＧＭ−１０には１０ｍＬ管）中に秤量する。サンプル１ｇ当たりクロロホルム：メタノール：水（Ｃ：Ｍ：Ｗ）５０：５０：１０（体積比）２５ｍＬを加え、渦攪拌および超音波処理を１分間交互に行うことで、サンプルを完全に分散させる。１５分ごとに１分の浴超音波パルスを用いて、激しく継続的な渦攪拌（２０００ｒｐｍ）を行いながら、室温で４５分間にわたって管を温置する。サンプルを遠心する（１５００×ｇ、１０分間、１５℃）。上清を４０ｍＬ円錐底ガラス遠心管に移し、Ｎ２下に３７℃での乾燥を開始させる。一方で、ペレットについて、連続的渦攪拌（２０００ｒｐｍ）および７．５分ごとに１分間の浴超音波パルスを行いながら、室温て１５分間にわたり、１ｇ当たりＣ：Ｍ：Ｗ  １２．５ｍＬによって再抽出する。遠心後、上清を４０ｍＬ管中で最初のものと合わせ、溶媒留去を続ける。ペレットをＣ：Ｍ１：１（体積比）で洗浄し、超音波パルスは５分ごととして、前記と同じ条件で１０分間温置する。遠心後、上清をさらに、４０ｍＬ管に加え、溶媒留去する。
【００８９】
ガングリオシド画分を、ラディシュら（Ladisch S. and Gillard B. (1985) A. solvent partition method for microscale ganglioside purification. Anal. Biochem. 146: 220-231）が記載しているジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）／１−ブタノール／水相分配の組み合わせによって総脂質抽出物から精製する。これに続いて、ウィリアムスらの報告（Williams M and McCluer R (1980), The use of Sep-PakTM C18 cartridges during the isolation of gangliosides, J. Neurochem, 35: 266-269）に記載の方法に変更を加えたものに従って、Ｃ−１８カートリッジによる固相抽出を行う。
【００９０】
ジイソプロピルエーテル／１−ブタノール／水系ＮａＣｌ分配：ＤＩＰＥ／１−ブタノール６０：４０（体積比）４ｍＬを、乾燥させた脂質抽出物に加える。サンプルを渦攪拌および超音波処理して、脂質抽出物の微細懸濁液とする。０．１％ＮａＣｌ水溶液２ｍＬを加え、管について、２分間にわたって渦攪拌と１５秒パルスでの超音波処理を交互に行い、遠心する（１５００×ｇ、１０分間、１５℃）。境界相を除去しないように注意を払いながら、パスツールピペットを用いて、上層の有機相（中性脂質およびリン脂質を含有）を注意深く除去する。ガングリオシドを含む下層の水相を、最初の容量の有機溶媒で２回抽出する。容量が最初の容量の約半分に減るまで（ほぼ２ｍＬ）、３０から４５分間にわたり、３７℃でＮ２気流下に、サンプルを部分的に溶媒留去する。
【００９１】
逆相Ｃ−１８カートリッジによる固相抽出（ＳＰＥ）：５００ｍｇＣ−１８カートリッジを、２４ポートライナーＳＰＥ真空多岐管に取り付け、メタノール５ｍＬ、Ｃ：Ｍ２：１（体積比）５ｍＬおよびメタノール２．５ｍＬの３回の連続洗浄で活性化させる。次に、カートリッジを０．１％ＮａＣｌ水溶液：メタノール６０：４０（体積比）２．５ｍＬで平衡とする。部分的に溶媒留去した下側の相の容量を測定し、水で１．２ｍＬとし、メタノール０．８ｍＬを加える。次に、これを遠心して（１５００×ｇ、１０分間）、不溶物を除去し、Ｃ−１８カートリッジに２回乗せる。ＳＰＥカートリッジを蒸留水１０ｍＬで流して塩および水溶性汚染物を除去し、３０秒間真空乾燥する。ガングリオシドをメタノール５ｍＬおよびＣ：Ｍ２：１（体積比）５ｍＬで溶離し、Ｎ２気流下に乾燥させ、Ｃ：Ｍ  １：１（体積比）２ｍＬに再度溶解させる。サンプルおよび溶媒を重力によってカートリッジを通過させるまたは強制的に１から１．５ｍＬ／分の流量で弱い減圧を行う。ガングリオシドを分析まで−３０℃で保存する。総ガングリオシドを、ＬＢＳＡとして測定する。少量サンプル５００μＬを１０ｍＬガラス製遠心管に入れ、Ｎ２下に乾燥させ、レゾルシノールアッセイによって測定する（３）。
【００９２】
ＬＢＳＡの測定：レゾルシノール試薬１ｍＬおよび水１ｍＬを加える。管にキャップを施し、沸騰水浴で１００℃にて１５分間加熱する。加熱後、管を氷浴水で冷却する。酢酸ブチル：ブタノール８５：１５（体積比）２ｍＬを加え、管を１分間激しく振盪し、７５０×ｇで１０分間遠心する。上側の相を取り、分光光度計にて５８０ｎｍで測定する。ＮＡＮＡの標準溶液（０、２、４、８、１６、３２および６４μｇ／ｍＬ）を同様にして処理し、それを用いて、サンプル中のシアル酸濃度を計算する。
【００９３】
レゾルシノール試薬は次のように調製する。レゾルシノールの２％脱イオン水溶液１０ｍＬ、０．１Ｍ硫酸銅０．２５ｍＬ、濃塩酸８０ｍＬに水を加えて１００ｍＬとする。試薬は日光から保護して毎日調製する。
【００９４】
ＨＰＬＣによるガングリオシドの分離：フェノメネックス（Phenomenex）からのルナ（Luna）−ＮＨ２カラム、５μｍ、１００Å、２５０×４．６ｍｍ（参照番号００Ｇ−４３７８−ＥＯ）を用い、ウォーターズからのデュアル吸光度検出器（Dual Absorbance Detector）を搭載したアライアンス（Alliance）２６９０装置でのＨＰＬＣによって、ガングリオシドを分離する。それを、文献（Gazzotti G., Sonnion S., Ghidonia R (1985), Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. J Chromatogr. 348:371-378）の方法に従って、各種容量比および張度でのアセトニトリル−リン酸緩衝液の溶媒系を用いて、室温で溶離する。２つの移動相での勾配を用いる。
・溶媒Ａ：アセトニトリル−５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．６（８３：１７）。この緩衝液は、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．６８９９ｇを水１リットルに加えて調製し、ｐＨを５．６に調節する。
・溶媒Ｂ：アセトニトリル−２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．６（１：１）。この緩衝液は、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ２．７５６０ｇを水１リットルに加えて調製し、ｐＨを５．６に調節する。
【００９５】
下記の勾配溶離プログラムを用いる。
【００９６】
【表３】
2009542226.tif 000005
【００９７】
サンプルを、上記で説明した方法に従って、液相抽出し、分配し、固相抽出する。サンプルのＣ：Ｍ１：１溶液２ｍＬからの０．５ｍＬの少量サンプルを窒素下に溶媒留去し、水０．１５０ｍＬに溶かす。完全に再生させるため、サンプルを渦攪拌および超音波処理する。最終溶液をＨＰＬＣバイアルに移す。注入容量は、サンプルおよび標準について３０μＬである。
【００９８】
ＧＤ３およびＧＭ３標準を、レゾルシノール法によって測定し、真の濃度を上記の方法に従って計算する。ＧＤ３およびＧＭ３を含む４つの標準溶液ならびにブランクを、水で調製する。較正標準の濃度は、ＧＤ３に関して約０から０．５ｍｇ／ｍＬ、ＧＭ３に関して０から０．２ｍｇ／ｍＬの範囲とした。各組の標準の正確な濃度は、標準の純度に応じて変わり得る。
【００９９】
例えば新たなカラムに関して、システムを調整する都度、１組の標準を注入する。１０回の測定ごとに中間濃度の標準一つを注入することで、システムの適正な性能をチェックする。内挿濃度が理論濃度の９５％から１０５％の間にない場合、新たな較正セットを注入し、以後の計算に用いる。
【０１００】
天然ラクトフェリン分析方法
本発明で使用される天然ラクトフェリン濃度は、本明細書に記載のＨＰＬＣ法（サイズ排除クロマトグラフィー）に従って測定する。試験パラメータは、例えば下記の通りである。
・カラム（直列２本）：ショデックス（Shodex）ＫＷ−８０４（ウォーターズ＃３６６１３）およびショデックスＫＷ−８０３（ウォーターズ＃３５９４６）、
・移動相：ミリ−Ｑ（Milli-Q）プラス（Plus）Ｈ２Ｏ  ５２５ｍＬ、アセトニトリル４７５ｍＬ、トリフルオロ酢酸０．５ｍＬ、
・流量：０．２ｍＬ／分、
・温度：４０℃、
・検出：２０５ｎｍ、２１４ｎｍ、２８０ｎｍのＵＶ、
・注入：２．０μＬ、
・操作時間：１５０分間、
・ＬＦ標準範囲：２０から８０ｍｇ／Ｌ、
・ＷＰＣサンプル調製：約１．０ｍｇ／移動相ｍＬ。
【０１０１】
製造方法
本発明の乳児用調乳は、乳児用調乳その他の調乳の製造および調合に好適な公知であるまたはさもなければ有効な技術によって製造することができる。いずれか所定の調乳を得る上でのそのような技術およびそれの変法は、本明細書に記載の調乳の製造における乳児栄養の製剤または製造の業界での当業者であれば、容易に決定および使用するものである。
【０１０２】
本発明の乳児用調乳の製造方法は、水および１以上の下記の成分：炭水化物、タンパク質、脂質、安定剤、ビタミンおよびミネラルを含むことができる１以上の溶液からスラリーを形成する段階を含むことができる。このスラリーを、乳化、均質化および冷却する。得られた乳濁液に、各種の他の溶液、混合物その他の材料を加えてから、加える途中または加える前に、別の加工を行うことができる。この乳濁液を、さらに希釈、安定化および包装することで、即時授乳液または濃縮液を形成することができるまたはそれを安定化してから、処理し、再生可能な粉末（例：スプレー乾燥品、乾燥混合品、凝集品）として包装することができる。
【０１０３】
乳児用調乳製造に関しての他の好適な方法は、例えば米国特許第６３６５２１８号（ボルシェル（Borschel））および米国特許出願第２００３０１１８７０３Ａ１号（グエン（Nguyen）ら）（これらの記載は、参照によって本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【実施例】
【０１０４】
実験Ｉ
この実験の目的は、腸内微生物叢に対する本発明の乳児用調乳の効果を評価し、人乳から生じるものとそれの効果を比較することにある。これは、検証された大腸モデル系を用いて、人乳および乳児用調乳から得られる短鎖脂肪酸濃度を測定することで行われる。
【０１０５】
母乳栄養乳児の腸内微生物叢プロファイルが、調乳栄養乳児のものと異なっていることは公知であり、腸内微生物叢が腸内での短鎖脂肪酸の産生を行っていることから、母乳栄養乳児と調乳栄養乳児との間の腸内微生物叢プロファイルの差は、結腸での個々の短鎖脂肪酸濃度を測定することで評価することができる。母乳栄養乳児は代表的には、調乳栄養乳児と比較して、高い量の酢酸および低い量のプロピオン酸および酪酸を産生する。
【０１０６】
検証済み大腸モデル系を用いて評価を実施する（ＴＩＭ−２系、TNO Quality of Life, Zeist, Netherlands）。この特定の系では、母乳栄養乳児の結腸微生物叢を被験乳児用調乳に導入し、小鎖脂肪酸プロファイルで変化が起こると、それを記録する。
【０１０７】
評価対象の各乳児用調乳を前消化することで、ＴＩＭ−２系へのそれの添加は、乳児の胃および小腸を通過した後に大腸に入っていく乳児用調乳の化学特性を代表するものとなる。ＴＩＭ−２系は、専ら母乳栄養乳児の糞サンプルから、代表的には２から４ヶ月齢の乳児から培養した代表的な微生物叢を含む。
【０１０８】
７２時間の発酵期間にわたり、母乳栄養微生物叢に前消化された乳児用調乳を供給していくと、所定の短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）の相対的割合における変化によって反映されて、発酵最終産物（小鎖脂肪酸）が変化する。次いで、各被験調乳における７２時間の時点でのＳＣＦＡプロファイルを、人乳からの公知のＳＣＦＡプロファイルのもの（図５）および従来の乳児用調乳のもの（図６）と比較する。
【０１０９】
この実験は、以下の乳児用調乳（調乳１から４）のＳＣＦＡプロファイルを評価および比較するものである。
【０１１０】
【表４】
2009542226.tif 000006
【０１１１】
調乳１から４のそれぞれについての７２時間後のＳＣＦＡプロファイルのまとめを、図１から４にそれぞれ示してある。比較のため、２から４ヶ月齢母乳栄養乳児の結腸での代表的なＳＣＦＡプロファイルを図５に示し（Gibson, G. R. and M. B. Roberfroid, 1995, Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, 125: 1401-1412）、前消化された牛乳に基づく乳児用調乳（従来の乳児用調乳）を唯一の栄養源として導入した場合の７２時間後の代表的なＳＣＦＡプロファイルを図６に示している（Knol, J., Scholtens, P., Kafka, C., Steenbakkers, J., Gross, S., Helm. K., Klarczyk, M., Schopfer H., Bockler. H. -M , and Wells, J., 2004, Colon microflora in infants fed formula with galacto- and fructo-oligosaccharides: more like breast-fed infants, Journal Pediatric Gastroenterology, 40(1): 36-42）。
【０１１２】
上記でまとめた結果から、本発明の乳児用調乳（調乳４）によって、ｎ−酪酸、プロピオン酸および酢酸の相対的ＳＣＦＡ濃度によって反映されるように、母乳栄養乳児（図５）のものと類似し、従来の乳児用調乳に関連するプロファイル（図６）と大きく異なる代謝活性プロファイルを生じることがわかる。母乳栄養乳児のものと類似したこの代謝活性プロファイルは、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）などの可能な病原菌の増殖を阻害することができることから、感染性下痢疾患が起こらないようにすることができる腸環境を得る上で役立つ（Marleen H. M. C. van Nuenen, P. Diederick Meyer, and Koen Venema, 2003, The effects of various inulins and Clostridium difficile on the metabolic activity of the human colonic microbiota in vitro, Microbial Ecology in Health Disease, 15: 137-144）。
【０１１３】
留意すべき点として、調乳１から４のそれぞれは、腸内での微生物叢プロファイルに対する生菌効果に関して公知の成分であるＦＯＳを含んでいた。調乳２および３は２ｇ／ＬのＦＯＳを含んでおり、予想通りに、人乳のものと類似のＳＣＦＡプロファイルを生じたが、０．５ｇ／ＬのＦＯＳのみを含む同じ製剤（調乳１）では、興味深いことに、従来の乳児用調乳のものと類似したＳＣＦＡプロファイルとなった。調乳４では、ＦＯＳの含有量は０．８ｇ／Ｌであったにも拘わらず、人乳のものと類似のＳＣＦＡプロファイルが生じた。調乳４のラクトフェリン、シアル酸、リン脂質およびガングリオシドの選択された濃度および組み合わせによって、人乳のものと類似のＳＣＦＡプロファイルが得られるものと考えられる。
【０１１４】
実験ＩＩ
本試験の目的は、対照調乳または強化濃度のガングリオシド、リン脂質、ラクトフェリンおよびシアル酸を含む本発明の２つの異なる調乳実施形態のうちの一方のいずれかを与えた新生仔ブタでの成績効果を比較することにある。
【０１１５】
背景
新生仔ブタは、ヒト臨床試験の設計および実施に先だって、栄養介入を評価するための適切なモデルを構成する。これの好適性は、仔ブタの消化器生理がヒト新生児のものと類似している点にある。このモデルは、乳児用調乳の耐容性を予測する上で有用な手段である（Miller, E.R., Ullrey, The pig as model for human nutrition, Annu Rev Nutr 1987; 7: 361-82）。本試験は、本発明の二つの調乳実施形態の効果の生物学的評価を提供するよう設計されている。
【０１１６】
下痢リスクの低減、すなわち下痢期間の短縮の分野において有意差が認められる。
【０１１７】
実験計画
本試験は長期試験であり、実験飼料Ａ、ＢまたはＣを与える３つの仔ブタ群（表３参照）を含み、授乳８から９日、１５から１６日および２９から３０日後の３回の屠殺を行う。試験開始時に屠殺した別の群を、基準として用いる。本試験は２つの実験に分かれている。本試験における仔ブタは、認定された農場から供給される。
【０１１８】
本試験における２つの実験のうちの第１の実験では、３３頭の条件を合わせた家畜の仔ブタ（４から５日齢）を、２７から３０℃で順化前処置した部屋で、ステンレス製の飼育ケージ（ケージ当たり動物２頭）にて飼育する。動物には、栄養上の要件に従って、調整ブタ飼料を１日４回与える。３日間の馴致期間後、仔ブタ３頭を屠殺する。これらの動物を屠殺する時点を、本試験における時間ゼロと見なす。残りの仔ブタは、体重および同腹仔によってペアとし、３つの群に分け（それぞれ、ｎ＝１０．ｎ＝１０およびｎ＝１０）、やはり下記の飼料を１日４回与える。
・飼料Ａ：従来の乳清タンパク質濃縮物を含むアボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories, Columbus, Ohio, USA）から入手可能なシミラック（Similac；登録商標）アドバンス（Advance；登録商標）乳児用調乳と同様、
・飼料ＢおよびＣ：授乳基準で７．１ｇ／Ｌ調乳のレベルで強化乳清タンパク質濃縮物を含む本発明の乳児用調乳実施形態。
【０１１９】
飼料Ａ、ＢおよびＣについては、新生仔ブタの特殊な要件に対して、微量栄養素（ミネラルおよびビタミン）に関しての調整を行う。下記の表に、飼料Ａ、Ｂ、Ｃおよび標準ブタ飼料の組成を示してある。
【０１２０】
【表５】
2009542226.tif 000007
【０１２１】
【表６】
2009542226.tif 000008
【０１２２】
いずれの飼料も一旦製造したら、直ちに使用するまたは不活性雰囲気の缶の中で４℃にて保存し、２４時間以内に用いる。飼料は粉末形態であり、調整ブタ飼料の場合には水で再生して１８．８重量％とし、飼料Ａ、ＢおよびＣの場合には１２．８５重量％とする。再生した液体飼料はケージの餌入れに注ぐ。残った液体を除去して測定し、餌入れを洗浄してから、次の飼料を投入する。
【０１２３】
各群について、３または４頭の仔ブタを、対照（飼料Ａ）または実験調乳（飼料ＢおよびＣ）による給餌開始から８から９日、１５から１６日および２９から３０日に屠殺する。
【０１２４】
この試験の第２の実験では、４４頭の雄家畜仔ブタ（４から５日齢）を、第１の実験に記載のものと同じ種類のケージおよび同じ部屋で個別に飼育する。給餌プロトコールは同じであり、馴致期間後に４頭の仔ブタを屠殺して、基準群を完成する。仔ブタの残りのものは、体重および同腹仔でペアとし、飼料Ａ，ＢおよびＣを与える３つの群に分ける（それぞれ、ｎ＝１３、ｎ＝１３およびｎ＝１４）。各群にはさらに１もしくは２頭の仔ブタを含めることで、中止の場合の代わりとする。
【０１２５】
飼料摂取および体重増を、各仔ブタについてそれぞれ１日４回および２週間に２回記録する。下痢の発生率および期間を記録し、評価する。下痢は、２日以上にわたって水っぽいと評点される便の堅さ（評点５）があり、同時に成長の追いつきが乏しいものと定義される。持続的な下痢が確認されたら、罹患した仔ブタは、新生仔ブタについての標準的なプロトコールに従って抗生物質による治療を行う。
【０１２６】
結果
中止
実験１：群Ａの仔ブタ１頭は誕生時に非常に小さく、残りの仔ブタに成長が追いつかない。群Ｃのブタ１頭は、登録から１０日後に死亡している。群Ｃの別のブタ１頭は、実験終了後に確認された雌である。その結果、２９から３０日での群Ａにおけるｎは４ではなく３であり、同動物齢での群Ｃのｎは４ではなく２である。
【０１２７】
実験２：仔ブタ１頭が馴致期間中に死亡している。群Ｂの別の仔ブタ１頭が、登録から６日後に死亡している。群Ａの２頭のブタおよび群Ｂにおける１頭は、誕生児に非常に小さく、残りの仔ブタのように成長しないことから、試験から除外している。
【０１２８】
その結果、各時間点および群について仔ブタ７頭の完全試験目的が、２９から３０日での群Ａ（ｎ＝６）を除く全ての群で満足されている。
【０１２９】
体重および飼料摂取
体重および飼料摂取の発達は３つの異なる飼料群で非常に類似している。実験期間にわたって、群間で体重発達に差はない。飼料摂取は、１６日と２８日の間の期間のみで、群ＡおよびＢより群Ｃの方が有意に高い。それ以外の期間では、群間に差はない。摂取を累積飼料摂取として表すと、群間に差はない。同様に、体重ｇ数／摂取１００ｋｃａｌとして計算される飼料効率の発達は、３群において同様である。異なる時間間隔を考慮する場合、または全試験期間にわたり、群間に差はない。
【０１３０】
下痢
試験中に下痢を患ったブタの数は、３つの飼料群で同様である（有意差は認められない）。しかしながら、下痢のエピソードの期間を解析すると（図７）、群間に有意差を検出することができる。下痢の期間は、群Ａの場合より群Ｃの方が有意に短く、群Ｂは、このパラメータに関しては群Ａより短い傾向を示した（ｐ＝０．１５１２）。実際、この最後の比較にボンフェローニの補正を用いない場合には、より強い傾向が認められ、ｐ値は０．０５０４である。
【０１３１】
結論
下痢の期間は、群Ａの場合より群Ｃの方が有意に短く、群Ｂは、このパラメータに関しては群Ａより短い傾向を示した（ｐ＝０．１５１２）。実際、この最後の比較にボンフェローニの補正を用いない場合には、より強い傾向が認められ、ｐ値は０．０５０４である。
【０１３２】
下痢の期間短縮は、従来の乳清タンパク質単離物（シミラック・アドバンス（登録商標）乳児用調乳、アボット・ラボラトリーズ（Columbus, Ohio）−サンプルＡ用に調整）と比較して、強化レベルのラクトフェリン、リン脂質、シアル酸およびガングリオシド（サンプルＢおよびＣについてはＰＳＮＵ２９００ＷＰＣ）を含む乳清タンパク質濃縮物を用いた結果であるように思われる。
【０１３３】
実験ＩＩＩ
この第２の動物試験は、この試験で下記の飼養の成績効果を比較する以外は、実験ＩＩで用いたものと同様のプロトコールで行う。
・飼料Ａ：授乳基準で６．４ｇ／Ｌ調乳のレベルで強化乳清タンパク質濃縮物を含む本発明の乳児用調乳実施形態、
・飼料Ｂ：従来の乳清タンパク質濃縮物を含むアボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories, Columbus, Ohio, USA）から入手可能なシミラック（登録商標）アドバンス（登録商標）乳児用調乳、
・飼料Ｃ：従来の乳清タンパク質濃縮物を含むブリストル−マイヤーズ・スクイブ（Bristol-Myers Squibb；タイ）から入手可能なエンファラク（Enfalac）ＤＨＡ＋ＡＲＡ（商標名）乳児用調乳。
【０１３４】
実験計画
本試験は長期試験であり、実験飼料Ａ、ＢまたはＣを与える３つの仔ブタ群（表４参照）を含み、授乳７から８日および１４から１５日後の２回の屠殺を行う。ブタ乳栄養の仔ブタの別の群を試験に基準として含める。ブタ乳群における動物は動物齢を合わせることで、実験試料を与えた動物の屠殺時点が同時になるようにする。ブタ乳群からの動物は、試験開始時、１４から１６日齢後、２３から２４日齢後に屠殺する。
【０１３５】
家畜仔ブタ６０頭（３から４日齢）を、認定された農場から供給される。ブタ乳基準群からの仔ブタ８頭を屠殺する。仔ブタ４８頭を体重、同腹仔および性別でペアとし、３つの群に分ける（それぞれ、ｎ＝１６、ｎ＝１６およびｎ＝１６）。残りの仔ブタ４頭は、その３つの群に無作為に割り当てる（群Ａに１頭、群Ｂに１頭、群Ｃに２頭）。仔ブタは、２７℃で順化処置した部屋で、ステンレス製の飼育ケージにて飼育する。動物には、栄養上の要件に従って、３日間にわたり、調整ブタ飼料を１日４回与える。３日間の馴致期間後、仔ブタには３種類の実験飼料のうちのいずれかを１日４回与える。動物に最初に実験飼料を与えた時点を、この試験における時間ゼロと見なす。
【０１３６】
下記の表に、標準ブタ飼料ならびに飼料Ａ、ＢおよびＣの組成を示してある。
【０１３７】
【表７】
2009542226.tif 000009
【０１３８】
【表８】
2009542226.tif 000010
【０１３９】
いずれの飼料も一旦製造したら、直ちに使用するまたは不活性雰囲気の缶の中で４℃にて保存し、２４時間以内に用いる。飼料は粉末形態であり、飼料Ａ、ＢおよびＣの場合には水で再生して１２．８５重量％とする。再生した液体飼料はケージの餌入れに注ぐ。残った液体を除去して測定し、餌入れを洗浄してから、次の飼料を投入する。
【０１４０】
各群について、８頭の仔ブタを、対照（飼料ＢおよびＣ）または実験調乳（飼料Ａ）による給餌開始から７から８日および１４から１５日に屠殺する。
【０１４１】
結果
中止
各群からの４頭の仔ブタが死亡している。群Ａにおける仔ブタのうちの１頭および群Ｂにおける仔ブタのうちの１頭が、馴致期間中に死亡している。群Ｂからの仔ブタ１頭が非常に小さく、残りの仔ブタのよに成長しなかったことから、その仔ブタは除外している。
【０１４２】
結果的に、７から８日の時点では、群Ａのｎは７であり、群Ｂのｎは８であり、群Ｃのｎは８である。１４から１５日の時点では、群Ａのｎは６であり、群Ｂのｎは４であり、群Ｃのｎは６である。
【０１４３】
体重および飼料摂取
体重および飼料摂取の発達は３つの異なる飼料群で非常に類似している。実験期間にわたって、群間で体重発達に差はない。摂取を累積飼料摂取として表すと、群間に差はない。体重ｇ数／摂取１００ｋｃａｌとして計算される飼料効率の発達は、７日と１４日の間の期間のみで、群ＡおよびＢと比較して群Ｃの方が高いが、有意差はない。０日と６日の間の期間については高い変動性が認められるが、群間に差はない。
【０１４４】
下痢
試験中に下痢を患ったブタの数は、３つの飼料群で同様である（有意差は認められない）。さらに、群間で下痢の期間において有意差はない（図８）。
【０１４５】
結論
実験１から、従来の乳清タンパク質単離物（飼料Ａ）を含む乳児用調乳は下痢の期間を短縮しないことが明らかである。
【０１４６】
実験１からはさらに、それぞれが完全もしくは部分的に強化乳清タンパク質濃縮物（授乳基準で７．１ｇ／Ｌ調乳のＰＳＮＵ２９００ＷＰＣ）によって提供される強化レベルのラクトフェリン、リン脂質、シアル酸およびガングリオシドを含む乳児用調乳（飼料ＢおよびＣ）は下痢の期間を短縮したことが明らかである。
【０１４７】
実験２から、強化レベルのラクトフェリン、リン脂質、シアル酸およびガングリオシドを含むが、強化乳清タンパク質濃縮物のレベルは相対的に低い乳児用調乳（飼料Ａ）（授乳基準で６．４ｇ／Ｌ調乳のＰＳＮＵ２９００ＷＰＣ）は下痢の期間を短縮しないことが明らかである。
【０１４８】
従って、両方の実験の結果は、強化レベルのラクトフェリン、リン脂質、シアル酸およびガングリオシドを含む乳児用調乳は、その調乳が最小閾値レベルの本明細書で定義の強化乳清タンパク質濃縮物を含むものであれば、下痢の期間を短縮することを示唆している。
【０１４９】
実施例
下記の実施例は、本発明の範囲に含まれる具体的な実施例を代表するものであり、そのそれぞれは例示のみを目的として提供されているものであり、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて、それらの多くの変形形態が可能であることから、本発明の限定と解釈されるべきではない。例示されている量は、別段の断りがない限り、組成物の総重量に基づいた重量パーセントである。
【０１５０】
粉末乳児用調乳
下記のものは、乳児での調乳の使用方法を含めた本発明の粉末調乳実施形態である。各調乳における成分を、以下の表に挙げてある。
【０１５１】
【表９】
2009542226.tif 000011
【０１５２】
例示のものはそれぞれ、少なくとも２つの別個のスラリーを作ることで、同様にして製造することができ、それらのスラリーはその後混合し、加熱処理し、標準化し、溶媒留去し、乾燥し、包装する。
【０１５３】
最初に、オイル混合槽で、窒素条件下に、高オレイン酸ヒマワリ油、大豆油およびやし油を合わせ、次にパルミチン酸アスコルビル、βカロテン、ビタミンＡＤＥＫおよび混合トコフェロールを加えることで、オイルスラリーを調製する。槽を２０分間攪拌し、ＱＡ分析を行う。ＱＡクリアランス後であって加工直前に、ＡＲＡオイルおよびＤＨＡオイルを、オイル混合槽に加える。得られたオイルスラリーを、他方の調製スラリーと混合するまで、室温（＜３０℃）で中程度の攪拌下に保持する。
【０１５４】
連続攪拌プロセスで３５から４５℃にて、約４０％の流体スキムミルク中でオイル混合スラリーを合わせ、次に強化乳清タンパク質濃縮物を加えることで、スキムミルク−オイルスラリーを調製する。このオイル−タンパク質スラリーを加熱して６５から７０℃とし、１５．４から１９．０ＭＰａ（１５４から１９０バール）／２．５から４．５ＭＰａ（２５から４５バール）で２段階で均質化し、冷却して３から６℃とし、プロセスサイロ中で保存する。
【０１５５】
乳糖およびスキムミルク粉末を６０から７５℃で約６０％の流体スキムミルクに溶かすことで、スキムミルク−炭水化物スラリーを調製する。このスラリーを約２分間にわたって可溶化槽中で攪拌下に保持してから、プレート熱交にポンプ送りし、そこで冷却して３から６℃とし、プロセスサイロに運び、そこでスキムミルク−オイルスラリーと混合する。
【０１５６】
塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびクエン酸カリウムを室温で水に溶かすことでミネラルスラリー１を調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ミネラルスラリー１をプロセスサイロに加える。
【０１５７】
リン酸三カルシウムおよび炭酸カルシウムを４０から６０℃で水に溶かすことでミネラルスラリー２を調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ミネラルスラリー１をプロセスサイロに加える。ミネラルスラリー２をプロセスサイロに加える。
【０１５８】
オリゴ果糖を４０から６０℃で水に溶かすことでオリゴ果糖スラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。オリゴ果糖スラリーをプロセスサイロに加える。
【０１５９】
バッチをプロセスサイロで最低４５分間攪拌してから、サンプルを分析試験用に採取する。品質管理試験の分析結果に基づいて、適切な標準化プロセスを行う。
【０１６０】
クエン酸カリウムおよびアスコルビン酸を室温で水に溶かすことでビタミンＣスラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ビタミンＣスラリーをプロセスサイロに加える。
【０１６１】
クエン酸カリウム、水溶性ビタミンプレミックスおよびイノシトールを４０から６０℃で水に溶かすことで水溶性ビタミン−イノシトールスラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。水溶性ビタミン−イノシトールスラリーをプロセスサイロに加える。
【０１６２】
クエン酸カリウムおよび硫酸第一鉄を室温で水に溶かすことで硫酸第一鉄スラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。
【０１６３】
ヌクレオチド−コリンプレミックスを室温で水に溶かすことでヌクレオチド−コリンスラリーを調製し、最低５分間攪拌下に保持する。ヌクレオチド−コリンスラリーをプロセスサイロに加える。
【０１６４】
最終バッチをプロセスサイロ中にて最低６０分間攪拌してから、分析試験用にサンプルを採取する。品質管理試験の分析結果に基づいて、適切なビタミンＣおよびｐＨ補正を実施することが可能であると考えられる。最終バッチを３から６℃で中程度の攪拌下に保持する。
【０１６５】
７日以内の期間待機した後、得られた混合物を９０から９６℃まで前加熱し、１１０から１３０℃で３秒間加熱する。加熱した混合物をフラッシュ冷却器に通すことで、温度を９３から９７℃に下げ、エバポレータに通すことで所望の固体を得る。次に、生成物を加熱して７５から７８℃とし、スプレー乾燥塔にポンプ送りする。得られた粉末生成物を回収し、バルク粉末サイロ中で保存し、品質試験を行う。最終生成物を好適な容器に入れる。プロセス中および最終生成物段階の両方での微生物試験および分析試験用にサンプルを採取する。
【０１６６】
別法
例示のものはそれぞれ、少なくとも２つの別個のスラリーを作ることで、同様にして製造することができ、これらのスラリーは、その後混合し、加熱処理し、標準化し、乾燥し、乾燥混合し、包装する。
【０１６７】
最初に、約８０％のスキムミルク粉末を脱塩水に６０から８５℃で溶かし、次にクエン酸カリウムおよび水酸化カリウムを加えることで、スキムミルク−ミネラルスラリーを調製する。得られた混合物のｐＨを、水酸化カリウムまたはクエン酸を用いて７．７から８．７に調節する。
【０１６８】
残りのスキムミルク粉末および塩化マグネシウムを、前記の混合物に加える。得られた混合物のｐＨを、水酸化カリウムまたはクエン酸を用いて６．７から７．２に調節する。
【０１６９】
別の槽中で、塩化コリンおよびイノシトールを脱塩水に室温で溶かすことで、新たなスラリーを調製する。得られたスラリーをスキムミルク−ミネラルスラリーと合わせ、後に別の成分と混合するまで、１時間以内の期間にわたり、６０から６５℃で中等度の攪拌下に保持する。
【０１７０】
別の槽中、タウリンを脱塩水に７０℃で溶かすことで、新たなスラリーを調製する。得られたスラリーをスキムミルク−ミネラルスラリーと合わせ、後に別の成分と混合するまで、１時間以内の期間にわたり、６０から６５℃で中等度の攪拌下に保持する。
【０１７１】
強化乳清タンパク質濃縮物をスキムミルク−ミネラルスラリーに加え、次に乳糖およびオリゴ果糖を加える。スラリーを最低３０分間プロセスサイロ中で攪拌してから、分析試験用にサンプルを採取する。得られた混合物のｐＨを水酸化カリウムまたはクエン酸を用いて６．５から７．１に調節する。
【０１７２】
オイルプロセス槽で、窒素条件下に、高オレイン酸ヒマワリ油、大豆油およびやし油を合わせ、次にビタミンＡＤＥＫ、βカロテン、混合トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ＡＲＡオイルおよびＤＨＡオイルを加えることで、オイルスラリーを調製する。得られたオイルスラリーを、後にタンパク質−炭水化物−ミネラルスラリーと混合するまで６時間以内にて、室温で中程度の攪拌下に保持する。
【０１７３】
３０分以上で６時間以内の期間にわたって待機した後、タンパク質−炭水化物−ミネラルスラリーを７０から８０℃で脱気し、さらに加熱して８４から８６℃とする。このプロセスのこの時点で、オイルスラリーを５０から８０℃でオンラインにて注入する。最終混合物を冷却して６８から７２℃とし、二段ホモジナイザーによって、第１段階では１４．５から１５．５ＭＰａ（１４５から１５５バール）、第２段階では３．０から４．０ＭＰａ（３０から４０バール）で乳化させる。加熱した混合物をプレート冷却器に通すことで、温度を３から５℃まで下げ、プロセスサイロで保存する。
【０１７４】
下記の成分を処理した混合物に加えることで、ミネラル溶液およびアスコルビン酸溶液を別個に調製する。ミネラル溶液は、クエン酸、硫酸マンガン、セレン酸ナトリウムおよび硫酸亜鉛という成分を十分な量の脱塩水に攪拌下で加えることで調製する。アスコルビン酸溶液は、成分を溶解させるだけの量の脱塩水にアスコルビン酸を加えることで調製する。処理した混合物を４８時間以内で、３から５℃で中等度の攪拌下に保持する。分析試験用にサンプルを採取する。
【０１７５】
冷却した混合物を６９から７３℃で加熱し、６．０から７．０／３．０から４．０ＭＰａ（６０から７０／３０から４０バール）で均質化し、スプレー乾燥塔に送る。その基本粉末生成物を回収し、バルク粉末容器中で保存する。微生物試験および分析試験用にサンプルを採取する。
【０１７６】
相当する分析試験および微生物試験が完了した後、基本粉末生成物を、残りの成分との乾燥混合に供する。最終粉末生成物を得るのに必要な残りの成分の量を決定し、自動重量システムに入力する。そのシステムは、乾燥混合プレミックスの全ての成分を秤量する（乳糖、炭酸カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、水溶液プレミックス、ヌクレオチドシチジン５−１リン酸、ヌクレオチドウリジン５−１リン酸二ナトリウム、ヌクレオチドグアノシン５−１リン酸二ナトリウム、ヌクレオチドアデノシン５−１リン酸、硫酸銅および第三リン酸カルシウム）。基本粉末生成物および乾燥混合プレミックスを混合機に運搬する。混合物を、２０分以内の期間で攪拌下に保持する。
【０１７７】
混合が完了した後、最終生成物を包装機に運搬し、好適な容器に入れる。微生物試験および分析試験用にサンプルを採取する。
【０１７８】
例示の調乳（実施例１から４）は、本発明の粉末調乳実施形態の例であるが、これらに限定されるものではない。各調乳は、使用前に水で再生して約１９から約２４ｋｃａｌ／液量オンスの範囲のカロリー密度としてから、誕生から最初の４ヶ月間を含む誕生から最初の９ヶ月間にわたり、唯一の栄養源として乳児に与える。その調乳を用いる乳児では、下痢のリスク低下があり、罹患した場合にゲルの期間短縮の形で重度が低下する。これらの乳児も、母乳栄養乳児のものと類似の腸内微生物叢を生じる。
【０１７９】
液体乳児用調乳
実施例１から４を従来の手段によって変えることで、本発明の即時投与液体調乳実施形態（実施例５から８）を形成する。実施例５から８の成分は、それぞれ実施例１から４での成分に相当する。
【０１８０】
例示の調乳（実施例５から８）は、本発明の液体調乳実施形態の例であるが、これらに限定されるものではない。各調乳は、約１９から約２４ｋｃａｌ／液量オンスの範囲のカロリー密度に調節する。その調乳を、誕生から最初の４ヶ月間を含む誕生から最初の９ヶ月間にわたり、唯一の栄養源として乳児に与える。この調乳を用いた乳児では、罹患した場合にゲルの期間短縮の形で下痢のリスク低下がある。これらの乳児も、母乳栄養乳児のものと類似の腸代謝活性プロファイルを生じる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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