(57)【要約】  本発明は、ハロゲン化有機化合物および爆発物を含む有機化合物により汚染された土壌および地下水のバイオレメディエーションの方法およびそれに用いる気体組成物を提供する。前記の気体組成物は、(a)少なくとも1種の気体の微生物代謝誘導物質、および(b)担体ガスを含有する。気体組成物は、場合により、1種以上の気相の栄養素、気体の炭素源、気相の還元剤、および水分源を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも1種の気体の微生物代謝誘導物質および(b)担体ガスを含む気体組成物。
【請求項２】
前記の誘導物質が、ジシクロプロピルケトン、ジシクロプロピルメタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項３】
前記の誘導物質がジシクロプロピルケトンである、請求項2に記載の気体組成物。
【請求項４】
前記のジシクロプロピルケトンが約0.0005%〜約10%（体積／体積）の濃度で存在する、請求項3に記載の気体組成物。
【請求項５】
前記の濃度が約0.05%（体積／体積）である、請求項4に記載の気体組成物。
【請求項６】
前記の担体ガスが空気、不活性ガス、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項７】
さらに水素(H2)を含む、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項８】
さらに少なくとも1種の気相の栄養素を含み、前記気相の栄養素が、トリエチルホスフェート、トリメチルホスフェート、トリブチルホスフェート、亜酸化窒素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項９】
さらに、揮発性アルカン、揮発性アルコール、揮発性エステル、およびそれらの組合せからなる群より選択される気相の炭素源を含む、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項１０】
さらに水蒸気または加湿した空気を含む、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項１１】
前記の誘導物質がジシクロプロピルケトンであり、前記の担体ガスが窒素(N2)であり、そこにおいて、前記の組成物がさらに(c)トリエチルホスフェート、(d)水素(H2)、(e)プロパン、(f)場合によりエタノール、および(g)場合により酢酸エチルを含む、請求項1に記載の気体組成物。
【請求項１２】
組成物が(f)エタノールおよび(g)酢酸エチルを含む、請求項11に記載の気体組成物。
【請求項１３】
地下環境において少なくとも1種の汚染物質の微生物分解を刺激する方法であって、地下環境に(a)少なくとも1種の気体の微生物代謝誘導物質を含む気体組成物および(b)担体ガスを接触させることを含む前記方法。
【請求項１４】
前記の誘導物質が、ジシクロプロピルケトン、ジシクロプロピルメタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル，イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記の誘導物質がジシクロプロピルケトンである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記のジシクロプロピルケトンが約0.0005%〜約10%（体積／体積）の濃度で存在する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記の濃度が約0.05%（体積／体積）である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記の担体ガスが空気、不活性ガス、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１９】
前記の気体組成物がさらに水素(H2)を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２０】
前記の気体組成物がさらに、トリエチルホスフェート、トリメチルホスフェート、トリブチルホスフェート、亜酸化窒素、およびそれらの組合せからなる群より選択される微生物の栄養素の相を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２１】
前記の気体組成物がさらに、揮発性アルカン、揮発性アルコール、揮発性エステル、およびそれらの組合せからなる群より選択される気相の炭素源を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２２】
前記の気体組成物がさらに水蒸気または加湿した空気を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２３】
前記の地下環境が、下層土、地下水、またはその両方を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２４】
前記の接触を連続的にまたはパルス状に実施する、請求項13に記載の方法。
【請求項２５】
前記の汚染物質が、アルカン、アルケン、塩素化アルカン、塩素化アルケン、芳香族化合物、シクロテトラメチレンテトラニトラミン(HMX)、シクロトリメチレントリニトラミン(RDX)、トリニトロトルエン(TNT)、過塩素酸塩およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項２６】
前記の汚染物質が過塩素酸塩を含み、前記の気体組成物が、
(a) 前記の気体の誘導物質としてジシクロプロピルケトン、
(b) 前記の担体ガスとして窒素、
(c) トリエチルホスフェート、トリメチルホスフェート、またはそれらの組合せを含む気相のリン酸エステル栄養素
(d) 水素(H2)、
(e) プロパン、
(f) 場合によりエタノール、および
(g) 場合により酢酸エチル
を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項２７】
前記の組成物がエタノールおよび酢酸エチルを含む、請求項26に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
2005年9月14日に出願された本出願No. 11/225,859は、2003年3月24日に出願された米国特許出願No. 10/394,646の一部継続出願であり、2002年3月25日に出願された米国仮出願No. 60/366,459の優先権を主張する。前記の2件の出願を全体として参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００２】
地下環境の化学汚染は、地域の生態系に損傷を与え、地下水を飲料水または灌漑用水の源として使用している場合には健康上の危険をもたらす。このような汚染は、化学物質保存場所、ゴミ投棄場、交通機関、および地上および地下に設けられた保存タンクを含む種々の工業および都市の発生源から生じる。
【０００３】
汚染された土壌および地下水を処理するための多くの方法が以前から利用可能であった。たとえば、土壌を掘削し、現場から離れた施設で処理し、焼却および／または廃棄することができる。他の方法は、バイオレメディエーション技術である。バイオレメディエーション法は、自然過程を用いて汚染された土壌または水を分解する。この方法は種々の汚染を効果的に処理する。例えば、汚染された地下水を地表に汲み上げ、汚染物質を除去または分解する。同様に、汚染された土壌を現場から除去し、生物体により処理することができる（Buchanan, 米国特許第5,622,864号; Stonerら、米国特許第5,453,375号）。しかしながら、これらの方法は、費用および労力がかかる傾向があり、有効な処理に長い時間を必要とし、また、汚染物質を大気に曝す危険を有する。
【０００４】
当業者に公知の別のバイオレメディエーション技術は、注入井戸によりin situで栄養を供給することにより、汲み上げまたは他の方法により汚染された物質を地表に移動する必要性を回避するものである。これらの技術は、汚染物質を分解することができる常在微生物個体群により高い濃度の栄養を供給することによりバイオレメディエーション速度を増大する。例えば、Looneyら（米国特許第5,480,549号）は、トリエチルホスフェートおよびトリブチルホスフェートなどの気相のリン酸エステルをガス流に一定量で混入し、これを注入井戸を通して汚染された土壌および地下水に注入して炭化水素汚染物質の微生物分解を刺激する方法を記載している。しかしながら、この方法の有効性は炭化水素汚染物質の生分解に限定され、そのため、ハロゲン化炭化水素（ハロカーボン）などのより有害な汚染物質が存在するバイオレメディエーション現場には不適切である。
【０００５】
ハロカーボンは、広く存在しており、ドライクリーニング剤、脱脂剤、溶媒、および農薬などの種々の目的に使用される。残念なことに、それらは最も広範に存在し有害な地下水および土壌の汚染物質のクラスの一つである。テトラクロロエチレン(PCE)、トリクロロエチレン(TCE)、ジクロロエチレン(DCE)、および塩化ビニル(VC)などの塩素化炭化水素（クロロカーボン）は、典型的なよく見られる汚染物質である。このクラスの化合物は微生物分解に対して抵抗性が高いため、環境中に長期間にわたって残存する傾向がある。ハロカーボン中のハロゲン原子はそれらが結合する炭素原子の酸化ポテンシャルを上げるので、特に高度にハロゲン化された化合物において、好気的生分解過程はエネルギー的により不利である。その結果、高度にハロゲン化された化合物はより嫌気的分解を受けやすい。
【０００６】
有機化合物は一般的に電子供与体として作用する。しかしながら、ポリハロゲン化化合物は、電気的陰性のハロゲン置換基が存在する結果として、還元的環境において電子受容体として作用する。そのため、化合物が高度にハロゲン化されるほど、好気的分解を受けにくくなり、嫌気的分解を受けやすくなる。
【０００７】
環境において、ハロゲン化化合物は、種々の化学反応および微生物に仲介される反応により自然に脱ハロゲン化される。ある化合物は、親化合物よりも分解性の高い生成物に変換され、または異なる環境条件下ではより分解性が高い場合がある。例えば、土壌および地下水中に放出されたばかりのPCEはあまり分解されていない。そのため、分解（脱ハロゲン化）は大部分がPCEに作用し、嫌気的環境において最も効果的である。一方、かなり以前に放出されたPCEは、ある程度自然に脱ハロゲン化されて娘化合物であるTCE、DCEおよびVCになっており、これらは好気的環境において最も容易に分解される。
【０００８】
ある環境では、存在する炭素源を嫌気的に代謝することができ、その結果過剰な水素(H2)を発生する有機栄養微生物が生息する。その結果として生じる還元的環境中で、PCEはTCEに脱ハロゲン化され得る。同様に、TCEはDCEおよびVCに脱ハロゲン化され得る。上記の通り、これらの後者の生成物は嫌気的条件下では容易に分解されないが、好気的条件下では酸化され得る。
【０００９】
高度に塩素化された炭化水素により汚染された土壌および地下水のバイオレメディエーションは当業者に公知である。ハロカーボンを分解することができる常在微生物の活性を刺激する方法は、地下環境を、コーンシロップおよび酵母抽出物（Keaslingら、米国特許第6,150,157号）および糖蜜（Suthersan、米国特許第6,143,177号および第6,322,700号）などのある種の炭素栄養により処理することにより達成された。しかしながら、これらの方法は、多くの注入井戸の使用を必要とし、炭素源を分散することが可能な地下水のレメディエーションに限定される。その結果、それらはコーンシロップおよび糖蜜などの栄養の移動性がごくわずかしかない不飽和帯のレメディエーションには実用的でない。これらの限界を克服するための一つの試みがHughesら（米国特許第5,602,296号）により開示されたが、この方法は汚染された地下領域への純粋な水素(H2)の注入を必要とする。塩素化された炭化水素の還元的脱塩素化は常在嫌気性細菌により仲介されることが示唆された。しかしながら、この方法は強い還元的な環境を作り出すので、DCEおよびVCなどの部分的に塩素化された炭化水素の分解には効果がない。さらに、これはハロゲン化されていない汚染物質の処理には効果がない。また、水素は非常に引火性が高く、そのため、それを純粋な気体として使用する場合には重大な健康上の危険を引き起こす。
【００１０】
過塩素酸塩汚染は、この汚染の原因が続々と判明するにつれて、また土壌および地下水中にこの化合物を検出することができるより感度の高い分析法が開発されるにつれて、アメリカ合衆国においてより広い関心を集めるようになっている。過塩素酸塩汚染は、この化合物の難分解性で毒性の性質のため、およびその物理的および化学的性質が処理を困難にしているために特に関心を集めている。その噴射剤および火薬中の酸化剤としての使用に加えて、過塩素酸塩はエレクトロニクス工業から医薬品に至る領域で幅広い用途を有する。
【００１１】
in situバイオレメディエーション(ISB)は汚染された地下水および土壌における過塩素酸塩を処理するためにしばしば使用される技術である。これは過塩素酸塩を嫌気的条件下で塩化物および酸素に還元することができる微生物を使用する。この過程は、電子供与体および微生物の成長を維持するための適切な基質の供給を必要とする。ISBは地下水において過塩素酸塩濃度を4 ug/L未満に減少させた。
【００１２】
in situバイオレメディエーション(ISB)は、微生物が過塩素酸塩を塩化物および酸素に変換する制御された生物過程である。バイオレメディエーションは、嫌気的条件下において選択された細菌の種による酵素的分解により過塩素酸塩を還元する。これには微生物の成長を維持するために適切な栄養の供給が必要である（UrbanskyおよびSchock, 1999; Rosen, 2003）。UrbanskyおよびSchock、「飲料水における過塩素酸塩に関する危険への対処について」(Issues in managing the risks associated with perchlorate in drinking water)、56 J. Environmental Management 79 (1999)によれば、ある種の細菌は、嫌気的条件下で過塩素酸塩を塩化物および酸素に分解する天然の傾向を有する。これらの細菌には、イデオネラ・デクロラタンス(Ideonella dechloratans)、プロテオバクテリア(Proteobacteria)、ビブリオ・デクロラチカンス(Vibrio dechloraticans)、クゼンソベ(Cuzensove) B- 1168、およびウォリネラ・スキノゲネス(Wolinella succinogenes) HAP-1が含まれる(UrbanskyおよびSchock, 1999)。過塩素酸塩を還元することができる他の細菌は、デクロロモナス(Dechloromonas)およびデクロロソマ(Dechlorosoma)属に同定されている。州間技術規制委員会(Interstate Technology Regulatory Council)(ITRC)、「概説：過塩素酸塩概説」(Overview: Perchlorate Overview)、2005年3月；Coatesら、「異化的（過）塩素酸還元細菌の遍在性および多様性」(The ubiquity and diversity of dissimilatory (per)chlorate-reducing bacteria), 65 Applied and Environmental Microbiolgy 5234 (1999); Coatesら、「（過）塩素酸塩還元の多様な微生物学」(The diverse microbiology of (per)chlorate reduction)、「環境中の過塩素酸塩」(Perchlorate in the Environment)中、 (E. Urbansky編)、Kluwer Academic/Plenum Publishers, NY (2000), pp 257-270を参照されたい。
【００１３】
典型的には、過塩素酸塩のISBは増強技術を含む。過塩素酸塩の生物学的分解は、微生物、主に細菌の種の選択、および栄養および電子供与体の形の十分な量の修正を必要とする(UrbanskyおよびSchock, 1999; およびOwsianiakら、「増強された嫌気的条件の誘導による宙水からの過塩素酸塩のin situ除去」(In Situ Removal of Perchlorate from Perched Groundwater by Inducing Enhanced Anaerobic Conditions), Seventh International In Situ and On-Site Bioremediation Symposium, 2003年6月2〜5日)。広く使用される電子供与体には、酢酸塩、クエン酸塩、および乳酸塩などの有機酸；グルコースなどの糖；エタノールなどのアルコール；およびカザミノ酸および乳性などのタンパク質を多く含む物質が含まれる(ITRC, 2005)。増強されたISBのために、電子供与体および栄養物質を汚染された区域に注入する。注入点の数および間隔は、汚染物質のプルーム、注入フィールドの設計（例えば、再循環、障壁、または格子）、地下の岩石学、および注入される物質のタイプを含むいくつかのファクターに依存する。注入された物質は汚染された媒体の中で生じる過塩素酸塩還元反応を起こす(Owsianiakら、2003; KoenigsbergおよびWillett、「水素放出化合物による地下水中の過塩素酸塩の増強されたin situバイオレメディエーション」(Enhanced In Situ Bioremediation of Perchlorate in Groundwater with Hydrogen Release Compound) (HRCC), NGWA Conference on MTBA and Perchlorate, 2004年6月4日)。
【００１４】
in situバイオレメディエーションによる過塩素酸塩の生物学的分解を導く反応については、現在研究が行なわれているところである。進行中の研究は、過塩素酸塩が3段階の過程で還元されることを示している。まず、過塩素酸イオンがClO3に還元され、次にClO2に、次いでClおよびO2に還元される。上で論じた反応は、過塩素酸レダクターゼおよび亜塩素酸ジスムターゼの酵素により触媒される。Beiselら、「過塩素酸塩汚染地下水のex situ処理」(Ex Situ Treatment of Perchlorate Contaminated Groundwater), NGWA Conference on MTBA and Perchlorate, 2004年6月4日; Naval Facilities Engineering Command (NAVFAC), http://www.perchlorateinfo.com/perchlorate-case-40.html (2000); Polkら、「過塩素酸汚染地下水のex-situ生物学的処理のケーススタディ」(Case Study of Ex-Situ Biological Treatment of Perchlorate-Contaminated Groundwater),the 4th Tri-Services Environmental Technology Symposium, 2001年6月18〜20日を参照されたい。
【００１５】
前記の考察に基づいて、当技術分野において、ハロカーボン、過塩素酸化合物およびハロゲン化されていない化合物を含む種々の汚染物質に対して有用な生分解の方法が依然として必要とされている。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、種々の有機物質により汚染された現場での土壌および地下水のバイオレメディエーションに関する。
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、(a)少なくとも1種の気体の微生物代謝誘導物質および(b)担体ガスを含む気体組成物である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、地下環境における少なくとも1種の汚染物質の微生物分解を刺激する方法であって、地下環境を(a)少なくとも1種の気体の微生物代謝誘導物質を含む気体組成物および(b)担体ガスと接触させることを含む上記方法である。
【００１９】
本発明の別の目的は、地下環境を気体の微生物の栄養組成物と接触させることによる、地下環境における1種以上の汚染物質のin situ微生物分解を刺激する方法である。前記組成物は、水素(H2)および1種以上の揮発性リン酸エステル栄養素を含み、前記の1種以上の汚染物質を分解するのに十分な速度、圧力、および時間で地下環境に導入される。気体組成物は、汚染物質を分解することができる常在細菌の成長および繁殖を刺激する。
【００２０】
本発明の別の目的は、水素(H2)および1種以上の揮発性リン酸エステル栄養素を含む気体の微生物の栄養組成物を提供することである。リン酸エステル栄養素は、標準的な条件下で液体であってもよいが、水素を含有する担体ガスがリン酸エステル栄養素をその気相に容易に取り込むことができるように、十分に揮発性である。それにより、水素およびリン酸エステルは蒸気の形でレメディエーション現場に送達され、それにより現場全体に効果的に分散する。
【００２１】
本発明の別の態様は、地下環境を、水素(H2)および1種以上の揮発性リン酸エステル栄養素を含む気体の微生物の栄養組成物と接触させる段階を含み、そこにおいて、組成物を1種以上の汚染物質を分解するのに十分な速度、圧力および時間で地下環境に導入する、地下環境において1種以上の汚染物質のin situ微生物分解を刺激する方法を提供する。揮発性リン酸エステル栄養素は、0.001%〜1% (v/v)；0.005%〜0.5% (v/v)；0.008%〜0.02% (v/v)；または0.01% (v/v)の濃度のトリエチルホスフェート(TEP)およびトリブチルホスフェート(TBP)であってよい。気体の微生物の栄養組成物はさらに0.01%〜10% (v/v)；0.015%〜5% (v/v)；または0.1% (v/v)の亜酸化窒素(N2O)を含んでもよい。組成物はさらに1%〜50%、1%〜10% (v/v)のH2、2%〜7% (v/v)のH2、3%〜5% (v/v)のH2、または4% (v/v)のH2を含んでもよい。それに加えて、組成物はさらに0.01%〜10% (v/v)；0.015%〜5% (v/v)；または0.1% (v/v)の亜酸化窒素(N2O)を含んでもよい。気体の微生物の栄養組成物は、さらに、0.1%〜20% (v/v)；2%〜6% (v/v)；4% (v/v)の二酸化炭素(CO2)を含んでもよい。組成物は、さらに、メタン、エタン、プロパン、ブタンまたはペンタンなどの揮発性のアルカンを含んでもよい。気体の微生物の栄養組成物はさらに空気、窒素(N2)、またはヘリウム(He)、ネオン(Ne)もしくはアルゴン(Ar)などの希ガスなどの担体ガスを含んでもよい。気体の微生物の栄養組成物は、4% (v/v) H2；0.1% (v/v) N2O；および0.01% (v/v) TEP、TBPを含むことができる。
【００２２】
本発明の別の態様において、地下環境を、水素(H2)、亜酸化窒素(N2O)、トリエチルホスフェート(TEP)およびトリブチルホスフェート(TBP)の一方または両方、担体ガス、および場合により揮発性アルカンを含む気体の微生物の栄養組成物と接触させる段階を含み、そこにおいて、組成物を、1種以上の汚染物質を分解するのに十分な速度、圧力、および時間で前記の地下環境に導入する、地下環境における有機汚染物質のin situ微生物分解を刺激する方法が提供される。揮発性リン酸エステル栄養素は、0.001%〜1% (v/v)；0.005%〜0.5% (v/v)；0.008%〜0.02% (v/v)；または0.01% (v/v)の濃度のトリエチルホスフェート(TEP)およびトリブチルホスフェート(TBP)であってよい。気体の微生物の栄養組成物はさらに0.01%〜10% (v/v)；0.015%〜5% (v/v)；または0.1% (v/v)の亜酸化窒素(N2O)を含んでもよい。気体の微生物の栄養組成物はさらに1%〜50%、1%〜10% (v/v)のH2、2%〜7% (v/v)のH2、3%〜5% (v/v)のH2、または4% (v/v)のH2を含んでもよい。組成物はさらに0.01%〜10% (v/v)；0.015%〜5% (v/v)；または0.1% (v/v)の亜酸化窒素(N2O)を含んでもよい。気体の微生物の栄養組成物は、さらに、0.1%〜20% (v/v)；2%〜6% (v/v)；4% (v/v)の二酸化炭素(CO2)を含んでもよい。気体の微生物の栄養組成物はさらにメタン、エタン、プロパン、ブタンまたはペンタンなどの揮発性のアルカンを含んでもよい。それに加えて、組成物はさらに空気、窒素(N2)、またはヘリウム(He)、ネオン(Ne)もしくはアルゴン(Ar)などの希ガスなどの担体ガスを含んでもよい。最終的に、気体の微生物の栄養組成物は、4% (v/v) H2；0.1% (v/v) N2O；および0.01% (v/v) TEP、TBPを含むことができる。
【００２３】
本発明の方法は、場合により置換された不飽和炭化水素、場合により置換された部分的飽和炭化水素、場合により置換された飽和炭化水素、ハロカーボン、またはそれらの混合物である汚染物質の生分解に使用される。汚染物質は塩素化炭化水素、単環式芳香族炭化水素、または多環式芳香族炭化水素であってもよい。また、汚染物質はベンゼン、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、ジニトロベンゼン、トルエン、キシレン、ビフェニル、ハロビフェニル、ポリハロゲン化ビフェニル、メシチレン、フェノール、クレゾール、アニリン、ナフタレン、ハロナフタレン、アントラセン、フェナントレン、フルオレン、ベンゾピレン、スチレン、ジメチルフェノール、ハロトルエン、ベンゾアンテン(benzoanthenes)、ジベンゾフラン、クリセン、カテコール、トルイル酸、エチレンジブロミド、クロロホルム、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニル、メチル-tert-ブチルエーテル、ヘキサデカン、メタノール、およびそれらの混合物であってよい。
【００２４】
従来のレメディエーション技術に対する本発明の一つの利点は、処理およびそれに続く廃棄のために土壌または地下水を除去する必要がない点である。その代わり、汚染物質のバイオレメディエーションは完全に地下の領域内のin situでおこなわれる。そのため、本発明には汚染物質が大気中に放出される危険性がほとんどない。
【００２５】
本発明により提供される別の利点は、実施が簡単におこなわれることである。装置は単純で、使用する材料は容易に入手できる。さらに、伝統的なレメディエーション技術と比べて、レメディエーションがはるかに短い時間枠内におこなわれる。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明を注意深く読むことにより、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書に詳細に記載されるように、本発明は、さまざまな汚染物質を生分解するための非常に効率的な独自の方法を提供する。
【００２８】
一つの実施形態において、担体ガスに混入させる揮発性リン酸エステル栄養素はトリエチルホスフェート(TEP)およびトリブチルホスフェート(TBP)の混合物である。あるいは、TEPまたはTBPを単独のリン酸エステル源として使用してもよい。TEPおよびTBPはどちらも高い蒸気圧を示し、そのため担体ガスと容易に混合するので、バイオレメディエーション現場全体に高い濃度の栄養が送達される。さらにTEPおよびTBPは比較的無害であり、蒸発させることができるリン酸エステル化合物の中で最も安全である。
【００２９】
別の実施形態において、組成物は担体ガスを含む。担体ガスは、好気的または嫌気的環境のいずれかを促進するように選択することができる。好気的環境が望まれる場合、担体ガスは空気を含む。嫌気的環境が望まれる場合、担体ガスは不活性である。ガスの一例は窒素(N2)である。あるいは、不活性担体は希ガスを含有してもよい。希ガスの具体的な例はヘリウム、ネオン、およびアルゴンである。そこで、当業者は生分解が好気的または嫌気的環境のどちらで最も効率的であるか決定し、それに従って容易に担体ガスを調整することができる。
【００３０】
水素(H2)および揮発性リン酸エステルの他に、本発明の気体組成物は場合により他の成分を含有する。一つの実施形態において、組成物は、レメディエーション現場において常在微生物の付加的な栄養として作用する亜酸化窒素を含有する。ほとんどの環境において、汚染された場所の効果的なバイオレメディエーションをおこなうのには揮発性リン酸エステル栄養素および水素を含有する気体組成物の注入で十分である。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、気体組成物は揮発性アルカンを含有する。アルカンは、ハロカーボンなどの特に有害な汚染物質が存在する場合に、付加的な微生物のエネルギー源として作用し得る完全に飽和した炭化水素である。揮発性アルカンの例には、メタン、エタン、プロパン、ブタンおよびペンタンが含まれる。最後に、気体組成物は、特にアルカリ性の地下領域のpHを下げることができる二酸化炭素(CO2)を含んでもよい。そこで、典型的な組成物は水素、亜酸化窒素、TEPおよびTBPの一方または両方、担体ガス、および場合により揮発性アルカンを含む。
【００３２】
上記の通り、本発明は多くの汚染物質の生分解に有用である。汚染物質は、典型的には石油廃棄物に関連するものなどの有機化合物でありうる。例えば、これらには、場合により置換された不飽和炭化水素、場合により置換された部分的飽和炭化水素、場合により置換された飽和炭化水素、ハロカーボン、またはそれらの混合物が含まれる。より具体的には、汚染物質は、塩素化炭化水素、単環式芳香族炭化水素、および多環式芳香族炭化水素である。これらのクラスの汚染物質の例には、ベンゼン、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、ジニトロベンゼン、トルエン、キシレン、ビフェニル、ハロビフェニル、ポリハロゲン化ビフェニル、メシチレン、フェノール、クレゾール、アニリン、ナフタレン、ハロナフタレン、アントラセン、フェナントレン、フルオレン、ベンゾピレン、スチレン、ジメチルフェノール、ハロトルエン、ベンゾアンテン(benzoanthenes)、ジベンゾフラン、クリセン、カテコール、トルイル酸、エチレンジブロミド、クロロホルム、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニル、メチル-tert-ブチルエーテル、ヘキサデカン、メタノール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の主要な利点は、その実用化に、標準的な送風機、亜酸化窒素タンク、配管、バルブ、および圧力ゲージなどの安価で容易に入手可能な設備を使用することである。例えば、本発明の個々の気体成分は容易に購入することができ、シリンダーまたはデュワー、バルク移動タンク、および低温保存タンクを含むがこれらに限定されない、当業界において使用される通常の容器に便利に保存される、または前記容器から分配される。さらに、水素などの成分のいくつかは、網目、膜、電気分解、または燃料電池の製造などの手段を用いて現場発生により発生させることができる。
【００３４】
複雑ではないが、この装置は、地下環境が典型的に不均一な物理的、化学的、および生物学的組成を特徴とするレメディエーション現場において利用される。そのような環境におけるレメディエーション現場の汚染物質の効果的な除去を保証するために、本発明は、気体組成物を注入する深さ、体積、および圧力などの操作パラメーターに対する高度な制御を提供する。そこで、土壌の特性および層序をこれらのパラメーターの慎重な制御により補正することができる。また、地下領域に存在する天然の生物体が水素を奪い合う可能性がある。それに対して、当業者は、場所ごとにこの水素の付加的な消費を考慮して、注入する水素の濃度を慎重に補正することができる。地下環境中の汚染物質および蒸気の透過に影響を与え得る他の土壌の特性は、当業者に公知の土壌掘削調査技術により決定することができる。このような技術は、例えば、Johnsonら、「in situ土壌通気システムの設計、操作、およびモニタリングの実用的アプローチ」(A Practical Approach to the Design, Operation, and Monitoring of In Situ Soil-Venting Systems)、Ground Water Monitoring Review 10, no. 1, 1990, pp. 159 - 178、およびG.D. Sayles、「生物通気のフィールド処理能力試験の試験計画および技術プロトコール」(Test Plan and Technical Protocol for a Field Treatability Test for Bioventing)、the Environmental Services Office, US Air Force Centers for Environmenal Excellence (AFCEE), 1992年5月に記載されている。
【００３５】
気体組成物は1箇所以上の注入点を通して地下環境に導入することができ、必要な注入点の数は当業者が容易に決定することができる。本発明は気体の栄養組成物を利用するので、液体組成物を使用する先行技術の方法と異なり、注入点は、気体組成物が飽和層の地下水中に拡散するか、不飽和帯(vadose zone)中に生物通気(biovent)するか、その両方のいずれかであるように設けられる。気体組成物の流速は、注入点あたり0.5〜7立方フィート／分(CFM)の範囲とすることができる。気体組成物を注入する圧力は広い範囲で変化するが、場所に応じて決定しなければならない。一般的に、注入圧力は、気体組成物を注入する深さ、およびそれを地下水の上、中、または下のどこに注入するのかを含むファクターに依存する。
【００３６】
本発明の方法により地下環境に運ばれた栄養は、レメディエーション現場に既に存在していた栄養と共に、汚染物質を分解する微生物の成長および汚染物質が分解される速度を最大限に高める。微生物は、炭素、窒素、およびリンをそれら自体の体積C:N:P比とおよそ同じ比で利用する。このC:N:P比は微生物の種類のみでなく、汚染物質のタイプ、水の利用可能性、土壌のpH、および酸化還元電位などの環境条件によっても異なるが、本発明の気体組成物をこの比と一致するように調整した場合に微生物個体群の最適な刺激が達成される。したがって、気体組成物の最適なC:N:P比は与えられたレメディエーション現場の条件に特異的である。
【００３７】
気体組成物に含まれる揮発性リン酸エステルの量は変化する。本発明の典型的な適用において、揮発性リン酸エステルの濃度は0.001%〜1%の範囲である。ある実施形態において、前記濃度は約0.005%〜0.5%または約0.008&%〜0.02% (v/v)の範囲である。揮発性リン酸エステルの典型的な量は0.01% (v/v)である。
【００３８】
水素の濃度も変化し、個々のレメディエーション現場の必要に合わせて調節しなければならない。水素は、ハロゲン化された汚染物質、特に高いハロゲン含有量を有する汚染物質の、微生物により仲介される還元的脱ハロゲン化において消費される。先行技術において使用されたような高濃度の水素の使用は理論的には可能である。しかしながら、現実的には、通常地下汚染が起こる都市地域に存在する電線用導管および他の発火の原因となり得るものなどを考慮すると、水素濃度は安全なレベルに制限される。典型的には、気体組成物中の水素濃度は、約1%〜50%、約1%〜10%、約2%〜7%、および約3%〜5% (v/v)で変化し得る。典型的な水素の量は約4% (v/v)である。
【００３９】
ある地下領域では、微生物の成長を維持するために必要な天然に存在する窒素の量が不適切に低い場合がある。その場合、本発明の気体組成物は亜酸化窒素(N2O)を補足する必要がある。亜酸化窒素を使用する場合、それは典型的には約0.01%〜10%、または約0.015%〜5%の量で存在する。典型的な亜酸化窒素の量は約0.1% (v/v)である。
【００４０】
気体組成物は他の成分を含有することができる。上記の通り、揮発性アルカンを付加的な微生物の栄養として使用してもよい。典型的には、アルカンは1%〜10% (v/v)の量で存在する。特にアルカリ性の環境のpHを下げるために二酸化炭素を使用してもよい。使用する場合、二酸化炭素は気体組成物中に約0.1%〜20%または約2%〜6% (v/v)の量で存在する。二酸化炭素の典型的な量は約4% (v/v)である。
【００４１】
本発明の方法はさまざまな汚染物質により汚染された場所に適用することができる。本発明の気体組成物により処理した後に現場に残留する汚染物質の濃度は、検出限界未満のレベルにまで減少し得る。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、少なくとも1種の気体の微生物代謝誘導物質を含む気体組成物である。気体の誘導物質は、例えば、alkBおよび／またはalkS発現の誘導物質である。alkBおよび／またはalkS発現の誘導物質は当業者に公知である。例えば、Smitsら、2001, Plasmid 46(1):16-24; Grand, A.ら、Journal of Bacteriology, 1975, vol. 123(2); p. 546-556; Eggink, G.ら、Journal of Biological Chemistry, 1988, vol. 263(26), p. 13400-13405; Panke, S.ら、1999, vol. 65(6), p. 2324-2332を参照されたい。これらのすべての文献を全体として参照により本明細書に組み入れる。気体の誘導物質は、例えば、6〜12個の炭素原子を有するアルカン、アルケン、ハロアルカン、酢酸エチルなどの揮発性酢酸エステル、ジエチルエーテルなどの揮発性エーテル、ジシクロプロピルケトン(DCPK)、ジシクロプロピルメタノール(DCPM)、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)またはそれらの組合せである。2種以上の気体の誘導物質の組合せも使用することができる。
【００４３】
一つの実施形態において、気体の誘導物質はDCPKを含む。気体組成物中のDCPKの濃度は、例えば、約0.0005%〜約10%（体積／体積）(v/v)、約0.001%〜約5% (v/v)、または約0.01%〜約1% (v/v)の範囲である。組成物中のDCPKの典型的な量は約0.05% (v/v)である。
【００４４】
気体組成物はさらに担体ガスを含むことができる。ある実施形態において、担体ガスは空気である。別の実施形態において、担体ガスは窒素、ヘリウム、ネオン、アルゴンまたはそれらの組合せなどの化学的に不活性な気体である。担体ガスは好気的または嫌気的環境のいずれかを促進するように選択することができる。好気的環境が望まれる場合、担体ガスは空気を含む。嫌気的環境が望まれる場合、担体ガスは不活性である。不活性ガスの例は窒素(N2)である。あるいは、不活性担体ガスは希ガスを含有してもよい。希ガスの例はヘリウム、ネオン、およびアルゴンである。したがって、当業者は生分解が好気的または嫌気的環境のどちらで最も効率的であるかを決定し、それに従って容易に担体ガスを調節することができる。
【００４５】
ある実施形態において、気体組成物はさらに水素(H2)などの気体の還元剤を含むことができる。典型的には、気体組成物中の水素濃度は、約1%〜約50%、約1%〜約10%、約2%〜約7%、および約3%〜約5% (v/v)の範囲で変化する。典型的な水素の量は約4% (v/v)である。
【００４６】
気体組成物はさらに少なくとも1種の気相の栄養素を含むことができる。気相の栄養素は、例えば、トリメチルホスフェート、トリエチルホスフェート、トリプロピルホスフェート、トリブチルホスフェートまたはそれらの組合せなどの揮発性リン酸エステルを含む。気体組成物中の揮発性リン酸エステルの量は変化し得る。本発明の典型的な適用において、揮発性リン酸エステルの濃度は、約0.001%〜約1%、約0.005%〜約0.5%、および約0.01%〜約0.1% (v/v)の範囲である。揮発性リン酸エステルの典型的な量は約0.05% (v/v)である。ある実施形態において、気相の栄養素は亜酸化窒素(N2O)を含む。亜酸化窒素を使用する場合、それは典型的には約0.01%〜約10%または約0.015%〜約5%の量で存在する。亜酸化窒素の典型的な量は約0.1% (v/v)である。
【００４７】
気体組成物はさらに、少なくとも1種の気体の炭素源を含むことができる。気体の炭素源は、揮発性／気体のアルカン、揮発性アルコール、揮発性エーテルまたはそれらの組合せを含むことができる。揮発性アルカンは、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン（異性体を含む）、ペンタン（異性体を含む）、ヘキサン（異性体を含む）、ヘプタン（異性体を含む）、オクタン（異性体を含む）、ノナン（異性体を含む）、デカン（異性体を含む）、またはそれらの組合せであってよい。揮発性アルコールは、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノールまたはそれらの組合せであってよい。揮発性のエステルは、例えば酢酸エチルであってよい。
【００４８】
ある実施形態において、気体組成物はさらに、水蒸気または加湿した空気などの水蒸気源を含むことができる。水蒸気源を含む気体組成物は乾燥した環境において特に有用である。気体組成物中の水蒸気の量は約0.0001%〜約5%の範囲であってよい。
【００４９】
気体組成物は、気体組成物を地下環境に接触させることにより、土壌／下層土または地下水などの地下環境において少なくとも1種の汚染物質または不純物の微生物による生分解を刺激するために使用することができる。気体組成物による微生物の生分解の刺激は、in situで、またはex situで実施することができる。一つの実施形態において、方法をin situで実施する。すなわち、気体組成物をその自然の位置で地下環境に適用する。別の実施形態において、方法をex situで実施する。すなわち、例えば汚染された土壌、水、またはその両方を、その自然の位置から除去して気体組成物により処理する。
【００５０】
気体組成物は、前記の1種以上の汚染物質を分解するのに十分な速度、圧力、および時間で地下環境に導入することができる。ある実施形態において、気体組成物の地下環境との接触は連続的に実施する。別の実施形態において、気体組成物の地下環境との接触はパルス状に実施する。パルスの持続時間および頻度は当業者が決定することができる。具体的な持続時間およびパルスは、当業者が、例えば岩石学、地下水および土壌の化学、および標的の汚染物質を考慮に入れて決定することができる。
【００５１】
ある実施形態において、組成物の地下環境への接触は、気体組成物を第一地点で注入した後、第二地点で抽出することにより、組成物を地下環境の汚染された領域を通して吸引することを含む。注入および抽出は注入井戸またはモニター井戸などの井戸を通して、または穴を開けた配管などの配管を通して実施することができる。組成物の抽出は第二地点で負の圧力を加えることを含む。
【００５２】
本発明の気体組成物は、1)アルカン；2)アルケン；3)トリクロロエタン(TCA)およびジクロロエタン(DCA)を含むがこれらに限定されない塩化アルカン；4)テトラクロロエテン(PCE)、トリクロロエチレン(TCE)、ジクロロエチレン(DCE)および塩化ビニル(VC)を含むがこれらに限定されない塩化アルケン；5)ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、およびスチレンを含むがこれらに限定されない芳香族化合物；6)シクロテトラメチレンテトラニトラミン(HMX)、シクロトリメチレントリニトラミン(RDX)およびトリニトロトルエン(TNT)などの爆発性化合物；7)農薬；8)ポリ塩化ビフェニル；9) DowthermsRおよびフェニルベンゼン、フェノキシベンゼン、エチレングリコール、プロピレングリコールを含むがこれらに限定されないDowtherm成分、および10)溶液中の過塩素酸イオンを含む過塩素酸化合物を含むがこれらに限定されない種々の汚染物質の微生物分解を刺激するために適用することができる。
【００５３】
少なくとも1種の汚染物質が過塩素酸化合物である場合、地下環境と接触させる典型的な気体組成物は、(a)前記の気体の誘導物質としてジシクロプロピルケトン、(b)前記の担体ガスとして窒素、(c)トリエチルホスフェート、トリメチルホスフェートまたはその組合せ、(d)水素(H2)、(e)プロパン、(f)場合によりエタノール、および(g)場合により酢酸エチルを含む。ある実施形態において、気体組成物はエタノールおよび酢酸エチルの両方を含む。上記の組成物において、リン酸エステル栄養素の濃度は約0.001%〜約10% (v/v)、約0.01%〜約1%、または約0.02%〜約0.1% (v/v)の範囲であり得る。典型的な量は約0.05%(v/v)である。DCPKの濃度は、約0.001%〜約10%、約0.01%〜約2%；または約0.05%〜約0.5%の範囲であり得る。典型的な濃度は約0.2%(v/v)である。酢酸エチルの濃度は、約0%〜約50%、約1%〜約20%、または約8%〜約12%(v/v)の範囲であり得る。エタノールの濃度は、約0%〜約30%、約1%〜約15%、または約5%〜約10%の範囲であり得る。
【００５４】
本発明の特定の実施形態により発明をさらに説明するために次の実施例を提供する。実施例は発明の非限定的な説明を目的とするものである。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
カリフォルニア州Herlongに位置する塩化メチレンおよびTCEなどの高度に塩素化された化合物を含有する汚染物質のプルームに、まず、水素および炭素が豊富な嫌気的還元的環境を誘導するように、かつ常在微生物の迅速な細胞の成長を維持するのに十分な窒素およびリンを含有するように設計された注入計画を実施した。気体の微生物の栄養組成物は、担体ガスとして50%の濃度の窒素、ならびに45%の濃度の水素源、4%の濃度のプロパン、0.1%の濃度の亜酸化窒素および0.01%の濃度の蒸気相TEPを含むものであった。TEPは、組成物（TEPを含まない）を、ロタメーターおよび混合管を有するシリンダーガスマニホールド中に通し、それをヘッドスペース接触相値においてTEPと接触させることにより気体組成物中に導入した。気体の微生物の栄養組成物を、週に8時間、8週間に渡って、地表から100フィート下に位置する散布点を通して地下領域に注入した。上記の通り、水素は塩化メチレンおよびTCEの即時の脱塩素化のために提供された。最終的に、成長するバイオマスが自然に水素供給を補足した。
【００５６】
気体の微生物の栄養組成物を注入する前に、地下水中の塩化メチレン濃度は、EPA法8260により測定して117 ppbであった。最初の2週間の処理の後、塩化メチレン濃度は検出限界未満(<1 ppb)に減少した。
【００５７】
（実施例２）
過塩素酸塩バイオレメディエーションのための気相増強 - ベンチ規模の微生物による還元の研究
いくつかの微小生態系を、上に一般的に記載した通りに、本発明に従って処理した。土壌および汚染された地下水の入った数個の土壌および地下水反応容器を、Los Alamos National Laboratory (LANL)の所有地にあるMortandad Canyonから得た。研究のために、地下50〜200フィートに汚染物質が移されたMortandad Canyon上流域を選んだ。土壌の切断物は、新しい井戸の建造中に宙水領域から得た。切断物を本研究のために混合し、5個の5ガロンの容器に充填した。地下水は近くのモニター用井戸から得た。処理の構成要素および計画は、還元的代謝メカニズムが働く嫌気的ミクロ環境を誘導することを目的とした。微小生態系の研究の目的は、気相の炭素源および代謝誘導物質が、in situでの微生物による過塩素酸塩の塩化物および酸素への還元を維持する環境を持続することが可能であることを証明し、本方法による過塩素酸塩の還元の下限濃度を決定することであった。
【００５８】
微小生態系は、野外でのパイロット規模の計画の間に採用する過程および処理計画を概算するために、処理の構成要素を個々に時間および量を計測しながら注入することができるように設計した。系は柔軟で、研究結果に対応してすぐに処理の構成要素および処理計画を修正することができる。
【００５９】
土壌／地下水は、試験材料を充填する前に浄化した（Alconoxにより洗浄し、イソプロピルアルコールによりすすぎ、蒸留水によりすすいだ）、新しい食品用または実験用等級のプラスチック容器に入れた。容器あたりおよそ75%の土壌／岩石および25%地下水の試験材料を充填できるように、容器に目盛りを付けた。これには容器あたりおよそ3〜4ガロンの土壌および0.20ガロンの地下水が必要であった。研究に5個の容器を使用し、およそ20ガロンの土壌および1ガロンの汚染された地下水が必要であった。
【００６０】
試験材料は、Mortandad Canyonの現場から得た土壌および汚染された地下水からなるものであった。それぞれの試験容器に、既知の過塩素酸塩濃度の土壌／岩石基質および地下水の混合物を充填した。試験材料の採集の間に得られた土壌および地下水のサンプルを、認定された研究所および方法314（U.S. EPA、方法314.0、改訂1.0 (1999)、イオンクロマトグラフィーおよび質量分析を用いる飲料水における過塩素酸塩の測定(Determination of Perchlorate in Drinking Water Using Ion Chromatography with Mass Spectrometry)）により分析して、適切な過塩素酸塩濃度が研究に使用されたことを確認した。最初のサンプリングにより、土壌が検出可能な過塩素酸塩を含まず、地下水の濃度は非常に低い（20〜20.7μg/l）ことが示された。
【００６１】
地下水に過塩素酸ナトリウムを混合し、混合した地下水を土壌微小生態系に過塩素酸塩を加えるために使用することを決定した。
【００６２】
5個の反応容器は次のように調製した。
【００６３】
・対照として用いるための、地下水を加えた土壌からなり、いかなる構成成分によっても処理していない#1；
・地下水を加えた土壌からなり、基本注入混合物により処理した#2；
・地下水を加えた土壌からなり、酢酸エチルを加えた基本注入混合物により処理した#3；
・地下水を加えた土壌からなり、エタノールを加えた基本注入混合物により処理した#4；
・地下水を加えた土壌からなり、揮発性炭素源および代謝誘導物質（ジシクロプロピルケトン）の特許混合物を加えた基本注入混合物により処理した#5。
【００６４】
それぞれの反応容器は土壌を容器の底からおよそ3/4インチ上に保持する擬似底を有する構造とした。1つの注入点を容器の底に設け、土柱の水平および垂直方向の浸透を可能にした。持続的な嫌気的環境を維持するために容器を緊密に密封し、エアロックを装備した。
【００６５】
注入システムは、それぞれの処理される容器におよそ2 PSIで最低0.1立方フィート／分(CFM)を送達することができる窒素ガス源（シリンダー）；およそ3% (v/v)の水素を窒素流に送達することができる水素ガス源（シリンダー）；およそ1% (v/v)のプロパンを窒素流に送達することができるプロパンガス源（シリンダー）；およびおよそ0.04% (v/v)の揮発したトリエチルホスフェート(TEP)／トリメチルホスフェート(TMP)ガス混合物を窒素流に供給することができる液体接触装置を含み、同様の接触装置を特許の混合物およびDCPKに対しても使用した。補助的な炭素源接触装置は、ドルトンの法則に基づいて、適切な気相の炭素およびDCPK濃度を、基本の担体ガス混合物中に供給するように設計された。
【００６６】
注入システムは、注入計画により指示された通りの各注入成分の制御された注入を可能にするために、圧縮ガス調節装置、手動タイマー、およびバルブにより制御した。
【００６７】
注入システムには、流速ならびに窒素、プロパンおよび水素注入成分の絶対濃度を制御および調節するために、インライン流量計を取り付けた。
【００６８】
反応容器は冷蔵した環境には保存しなかったが、研究期間を通して環境温度をモニターし、記録した。研究区域の温度は65〜70oFに維持された。
【００６９】
処理プロトコール
注入プロトコールは次の処理成分および計測された量を含むものであった（反応容器#002、#003、#004および#005について）。
【００７０】
・反応容器#002には、
・およそ6立方フィート／時間(CFH)の窒素
・およそ0.18 CFHの水素
・およそ0.06 CFHのプロパン
・およそ0.03%の揮発したTEP/TMP
を含有する「基本混合物」を注入した。
【００７１】
・反応容器#003には、気相の酢酸エチルを加えた基本混合物を注入した。
【００７２】
・反応容器#004には、気相のエタノールを加えた基本混合物を注入した。
【００７３】
・反応容器#005には、プロパン、酢酸エチル、および／またはエタノールなどの炭素源と気相のDCPKとの気相混合物を加えた基本混合物を注入した。
【００７４】
反応容器#002、#003、#004および#005は、まず上記の成分の90分間の注入により処理し、次いで30日後に2回目の90分間の注入により処理した。
【００７５】
反応容器#001には処理をおこなわなかったが、他の3個の反応容器と同じスケジュールで土壌および地下水のサンプルを取り、分析した。
【００７６】
サンプリングおよび分析
表1に記載したパラメーターを、定められた分析法に従って試験した。
【表１】
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【００７７】
時間0のサンプリングにおいて土壌サンプルを採集して、資格のある研究所に送り、過塩素酸塩還元微生物を列挙し、亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子cldのDNAプローブにより分析をおこなった。土壌サンプルおよび地下水サンプルを環境研究所に提出し、EPA法314.0により過塩素酸塩および還元生成物の分析をおこなった。土壌サンプル中の過塩素酸塩を標準的な方法を用いて抽出した。
【００７８】
時間0のサンプリングの後、処理の4週間後にそれぞれの反応容器からさらなる土壌サンプルを取り出して、分析に送った。この分析には、上記の表1に記載したパラメーターが含まれる。処理の最後に、土壌サンプルをもう一度微生物分析に送った。この最後の分析のためにサンプルを容器内から複合した(composited)。それぞれの容器から1つのサンプルを分析した。
【００７９】
Access Analytical, Inc. of Irmo, SCを通して、EPAにより環境分析試験の実施を認定された研究所(Severn Trent Laboratories, Inc. in Savannah, GA)が過塩素酸塩、塩素酸塩および亜塩素酸塩の分析を実施した。研究所は、過塩素酸塩サンプルに対して10〜14日の標準納期を要した。微生物学試験(MPN列挙)および亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子cld酵素アッセイは、BioInsite, Inc of Carbondale, Illinoisにより実施された。
【００８０】
サンプルの採集の時に、それぞれのサンプルについて溶解した酸素、pH、比導電率、および酸化還元電位(ORP)を含む、水サンプルの「野外分析」を実施した。
【００８１】
結果および結論
背景
過塩素酸塩がいくつかの細菌により細胞呼吸のための電子受容体として利用され、塩素イオンまで完全に分解されることは広く受け入れられている。過塩素酸塩を分解する細菌は多様である。それらのほとんどすべてが、細菌の系統発生を評価するために使用することができる16s遺伝子に基づく組み換えDNA方法論である16s rDNA分類体系に基づく分類に含まれる。大部分の過塩素酸呼吸微生物(PRM)は、変化する環境条件下で機能することができ、最終電子受容体として、酸素、硝酸塩、および塩素酸塩(ClO3)を使用するが、硫酸塩は使用しない。過塩素酸塩は、新規の塩素酸レダクターゼ呼吸酵素により塩素酸塩に、次いで亜塩素酸塩(ClO2-)に連続して分解され得る。塩素酸呼吸細菌は、脱窒条件下であって、塩素酸還元条件下でない場合のみではあるが、ベンゼンを分解することができることが示された最初の分離株であった。
【００８２】
亜塩素酸塩は細菌に対して毒性があるので、塩素酸塩および過塩素酸塩を用いる細菌の成長の鍵は、亜塩素酸塩のO2およびCl-への不均化を触媒する非呼吸酵素である亜塩素酸ジスムターゼの存在である。亜塩素酸ジスムターゼによる亜塩素酸塩の不均化の速度は、塩素酸レダクターゼによる塩素酸塩の還元およびシトクロムによる酸素の利用よりも大きく、最も遅い段階は過塩素酸塩の還元である。その結果、通常、過塩素酸塩の生分解の間に中間物質は溶液中に蓄積しない。実際に、ヘムをベースとした亜塩素酸ジスムターゼはPRMにより大量に生産されるので、塩素酸塩または過塩素酸塩により嫌気的に成長した高濃度の細胞懸濁液に亜塩素酸塩を加えると、O2の放出のために目に見える発泡が起こる。
【００８３】
結果
土壌を受け取った後、2004年11月に微小生態系を作成した。05年11月23日に5つの微小生態系からサンプルを取った後、検出可能なレベルの過塩素酸塩が含まれないことが測定された。2004年12月にこの情報を得る前に、微小生態系に週に1時間の注入を3回おこなった。注入は地下水が得られるまで中断した。2005年1月に地下水を受け取った後、この地下水のサンプルを研究所に提出して過塩素酸塩の測定をおこなった。地下水も低レベルの過塩素酸塩（およそ20 ppb）を示した。過塩素酸ナトリウム試薬を用いて2ガロンの地下水を150,000 ppbの過塩素酸塩濃度に調製し、これを土壌の微小生態系に過塩素酸塩を加えるために用いた。
【００８４】
0.5 Lの150,000 ug/l過塩素酸塩溶液（75 mgの過塩素酸塩）を5つの微小生態系のすべてに加えて、完全に混合した。基準を確立するために再度サンプルを取った。対照中の残留過塩素酸塩濃度は8800 ug/lであり、微小生態系002〜004においては2200〜3400μg/lであった。しかしながら、微小生態系005は、過塩素酸塩を加えた後に検出可能なレベルの過塩素酸塩を示さなかった。
【００８５】
微小生態系002および003を05年2月18日および05年3月17日に90分間処理した。微小生態系004および005を05年4月15日および05年4月25日に90分間処理した。微小生態系004および005を05年5月5日にサンプリングして過塩素酸塩を測定した。微小生態系002および003を05年4月15日にサンプリングして過塩素酸塩を測定した。
【００８６】
DCPKを含む微小生態系#005に関する考察
05年2月18日にサンプリングの結果を受け取った後、サンプルの取り扱いに何かの誤りが生じたかどうかを決定するために、微小生態系#005に最初に加えた過塩素酸塩の50%の量の過塩素酸塩を再度加えることを決定した。05年3月16日に、250 mlの150,000 mg/lの過塩素酸塩により汚染された地下水（37.5 mgの過塩素酸塩）を微小生態系に加えて、完全に混合し、再度サンプルを取った。今回も過塩素酸塩濃度の結果は検出不可能なレベルであった。
【００８７】
DCPK因子を加えたために過塩素酸塩を加える前に作られた酵素活性がこの微小生態系に作用していると判断された。05年4月15日に、微小生態系に1リットルの150000μg/lの過塩素酸塩により汚染された地下水（150 mgの過塩素酸塩）を再度加え、微小生態系を完全に混合した後、再度サンプルを取った。この添加の結果、基準線として6900μg/lの過塩素酸塩の残留を示した。
【００８８】
上記の通りに、気相の基本混合物中の炭素混合物およびDCPKのさらに2回の注入をおこない、#005微小生態系を2005年5月5日にサンプリングした。
【００８９】
化学分析の結果
微小生態系#003、#004および#005はすべて、過塩素酸塩の検出不可能なレベルまでの完全な還元を示した。対照の微小生態系(#001)は過塩素酸塩の21.59%の還元を示した。基本処理のみをおこなった微小生態系(#002)は過塩素酸塩の53.94%の還元を示した。どのサンプルにも、過塩素酸塩還元副生成物（塩素酸塩および亜塩素酸塩）は検出されなかった。
【００９０】
化学分析および還元の結果を表2に示す。
【表２】
2009507642.tif 000003
2009507642.tif 000004
2009507642.tif 000005
【００９１】
過塩素酸塩を還元する微生物の計数
過塩素酸塩を還元する微生物(PRM)が存在し、すべてのサンプルの処理前および後に最確数(MPN)計数により数えた。気相の酢酸エステルを添加すると、微小生態系の中のPRM個体数が3桁近く増加することが見出された。
【００９２】
気相のエタノールを添加すると、微小生態系の中のPRM個体数が1桁近く増加することが見出された。
【００９３】
気相の炭素混合物と共にDCPKを添加するとPRM個体数が3桁以上増加することが見出された。この組合せは、過塩素酸塩を還元する微生物個体数の最大のプラスの変化および最大のPRMの絶対数をもたらした。DCPK混合物を与えられた微小生態系において、より多くの微生物が培養された。一桁以上高い個体数レベル(7.49x107 MPN)がこの微小生態系において観察された。
【００９４】
過塩素酸塩を還元する微生物の計数(MPN)の結果を表3に示す。
【表３】
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【００９５】
亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子cldプローブの結果
亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子(cld)は受け取った状態のすべてのサンプルにおいて存在が確認された。亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子は、試験の終了時に、対照(#001)および基本処理のみをおこなった(#002)微小生態系において見出されないか、不明瞭であった。亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子は、試験の終了時に、微小生態系#003、#004（ごくわずか）および#005に見出された。亜塩素酸ジスムターゼ遺伝子の同定の結果は、上記の表3に記載されている。
【００９６】
野外のパラメーター分析の結果
上記のサンプル採取の時に、それぞれのサンプルについて、溶解した酸素、pH、比導電率、および酸化還元電位(ORP)の評価を含む水サンプルの「野外分析」を実施した。
【００９７】
結論
酢酸エチルおよびエタノールを個々に、ならびに気相の炭素源とDCPKの混合物を、過塩素酸塩により汚染された微小生態系に気相として導入することができる。
【００９８】
それぞれの気体混合物は、微小生態系において過塩素酸塩の完全な分解を促進するのに十分な微生物環境を提供する。
【００９９】
気相の酢酸エステルを加えると、微小生態系におけるPRM個体数が3桁近く増加することが見出された。
【０１００】
気相のエタノールを加えると、微小生態系におけるPRM個体数が1桁近く増加することが見出された。
【０１０１】
気相の炭素混合物を含むDCPKを加えると、PRM個体数が3桁以上増加することが見出された。この組合せは、過塩素酸塩を還元する微生物個体数の最大のプラスの変化および最大のPRMの絶対数をもたらした。
【０１０２】
DCPKを加えた微小生態系により、酢酸エチルまたはエタノールのみを加えた微小生態系と比べて350%以上の過塩素酸塩が分解された。2回の別の事例において過塩素酸塩を加えた直後に過塩素酸塩の還元が起こったので、これは微小生態系による酵素生産の増加の結果であるという仮説が立てられる。
【０１０３】
DCPK混合物を加えた微小生態系においてより多数の微生物が培養された。この微小生態系において1桁以上高い個体数レベル(7.49x107)が観察された。
【０１０４】
発明者らは、DCPKが、ある種の遺伝子を発現し、過塩素酸塩還元過程に有益な膜結合ヘム酵素を含有する過塩素酸塩を還元する微生物の好ましい増殖をもたらすことができると考えている。
【０１０５】
本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく上記の実施形態に多くの変更および置換をおこなうことができることは、当業者には明白であろう。本明細書に引用したすべての公開された文献を、全体として、本明細書に特に組み入れる。
【国際調査報告】
2009507642.tif 000008