(57)【要約】  組織試料に由来する核酸の抽出および増幅に対する輸送培地の悪影響を実質的に補償する添加剤、およびその添加剤を使用するための方法。添加剤は、組織試料が輸送培地と混合される前に、混合中に、または混合された後で、輸送培地と混合される。添加剤は、負に荷電したイオン種の供給源となる。添加剤は、例えば過酸化水素、過酸化ナトリウム、過炭酸ナトリウム、過酸化尿素、金属塩、過酸化物と金属塩の組合せ、または負に荷電したイオン種の他の供給源を含有する。添加剤は、負に荷電したイオン種が存在するような環境で試料と混合される。
2009540827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン性輸送培地と、負に荷電したイオン種の供給源を含む添加剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記負に荷電したイオン種の供給源は、過酸化水素、過酸化ナトリウム、過炭酸ナトリウム、および過酸化尿素からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記負に荷電したイオン種は、塩化物、硫化物、炭酸、フッ化物、次亜塩素酸、チオシアン酸、硝酸、亜硝酸およびリン酸のイオンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記添加剤は金属塩を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記金属塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、フッ化ナトリウム、および硫酸第一鉄からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記添加剤は過酸化水素を含み、前記組成物中の前記過酸化水素の前記濃度は約０．０１容量％から約３容量％であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記添加剤は硫酸第一鉄を含み、前記組成物中の前記硫酸第一鉄の前記濃度は約１５ｍＭから３０ｍＭであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記添加剤は塩化ナトリウムを含み、前記組成物中の前記塩化ナトリウムの前記濃度は約５ｍＭから約２５ｍＭであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記添加剤は塩化ナトリウムをさらに含み、前記組成物中の前記塩化ナトリウムの前記濃度は約５ｍＭから約２５ｍＭであることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記陽イオン性輸送培地は緩衝化ホルマリンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
陽イオン性輸送培地に貯蔵された試料を分析する方法であって、
試料と、負に荷電したイオン種の供給源を含む添加剤および陽イオン性輸送培地とを混合するステップと、
試料中の細胞を溶解するステップと、
試料から核酸を抽出するステップと、
試料中の標的核酸を増幅するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記標的核酸はＤＮＡであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸はＲＮＡであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料は血液試料であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料は膣スワブに由来する細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記輸送培地は、ホルムアルデヒド、ギ酸、メタノール、エタノール、緩衝化ホルマリン、ＥＤＴＡ、ポリペプチド、ポリアミノ酸、および多糖類からなる群から選択される少なくとも１つの成分を有することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記輸送培地は緩衝化ホルマリンを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記負に荷電したイオン種の供給源は、過酸化水素、過酸化ナトリウム、過炭酸ナトリウム、および過酸化尿素からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記負に荷電したイオン種の供給源は過酸化水素であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記負に荷電したイオン種は、硫化物、炭酸、塩化物、フッ化物、次亜塩素酸、チオシアン酸、硝酸、亜硝酸およびリン酸のイオンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記添加剤は金属塩を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記金属塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、フッ化ナトリウム、および硫酸第一鉄からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記添加剤は塩化ナトリウムおよび追加的な金属塩を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加的な金属塩は硫酸第一鉄であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抽出するステップは手作業のプロセスにより実施されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅するステップは手作業のプロセスにより実施されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記抽出および増幅するステップは自動化プロセスにより実施されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
核酸を抽出するための診断キットであって、陽イオン性成分を有し、組織試料を保存するために準備される培地と、負に荷電したイオン種の供給源である添加剤とを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項２９】
前記添加剤は過酸化水素を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の診断キット。
【請求項３０】
前記添加剤は硫酸第一鉄を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の診断キット。
【請求項３１】
前記添加剤は塩化ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の診断キット。
【請求項３２】
前記添加剤は塩化ナトリウムをさらに含むことを特徴とする、請求項３０に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年６月１９日に出願された米国特許仮出願第６０／８１４，７８７号の出願日の利益を主張し、その開示は、それによって参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、保存された生体試料に対して遺伝子検査を行うための方法および組成物に関し、特にそのような保存された試料に対して核酸抽出および増幅法を実施することに関する。
【背景技術】
【０００３】
医学的診断と医学研究の分野では、研究を支援するために被検体の状態を決定する、医学的診断を行うために患者の現在の状態を決定する、治療または処置の現在の過程に対する患者の応答を決定するなどのために、患者または被検体（例えば、ヒト患者、ヒト被検者、ヒト疾病の実験動物モデル）から試料（例えば、組織）を採取する。
【０００４】
医学的診断を実施するか、または科学的研究で使用するかのいずれかのために分析用に取得された試料は、被検体から採取された際に、試料の分解または腐敗を防止するために特別の輸送／保存用培地中に置かれることが多い。したがって、試料は、被検体から採取された時と可能な限り近いまさにその状態にある。これにより、試料が採取時の患者または被検体の状態を正確に反映することが保証され、したがって試料に関するその後の任意の研究において最も正確な結果がもたらされよう。これらの研究の中には、核酸（例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））の抽出および増幅が伴うものもある。
【０００５】
生体試料からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出するには、数あるステップの中でもとりわけ、細胞壁の溶解（原核細胞の場合）、細胞膜の溶解（ある種の真核細胞の場合）またはウイルスカプシドの溶解（ウイルスの場合）が必要である。その後の増幅には、ある程度、プライマーが標的核酸内の特異的部位に結合することが必要である。
【０００６】
核酸の抽出およびその後の増幅に利用可能なプロトコルは数多く存在する。これらのプロトコルの一部で、ハイスループット装置が利用される。ハイスループットデバイスは、試料が適切な化学薬品と共にデバイス内に置かれ、作業者がそれ以上の入力をせずに抽出および増幅ステップが行われるという意味で自動的である（例えば、本件特許出願人によるＶｉｐｅｒ（商標）システム）。別のプロトコルでは、それほど精巧でない器具が使用され、これは典型的には手作業と呼ばれる。しかしながら、プロトコルにかかわらず、核酸を放出するために細胞またはウイルスカプシドを溶解する必要性、残りの試料から核酸を抽出するために酸化第一鉄などの化学薬品を結合させる必要性、および核酸を増幅するためにプライマーを標的核酸に結合させる必要性は残る。
【０００７】
輸送培地は、典型的には、ある種の試料特性を保存する（例えば、細胞溶解による細胞壁または細胞膜の分解を防ぐ）１つまたは複数の成分を含む。さらに、これらの成分の幾つかは、試料の保存および汚染除去の二重の目的に役立つ。典型的には、これらの成分は、陽イオン性であるか、または輸送培地の陽イオン特性の保存に寄与するかのいずれかである。これらの成分は、細胞膜および細胞壁を溶解する能力、核酸抽出の際に使用される化学薬品を結合させる能力、および標的核酸を増幅する能力に干渉することが知られている。
【０００８】
ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（Ｔｒｉｐａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．社、Ｎ．Ｃ．）またはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．社、ＭＡ）などの輸送培地は、それに曝露した試料から増幅可能な標的核酸を抽出する能力に悪影響を及ぼす。この観察された悪影響について説明するために、１）培地中の成分による核酸の分解と、２）培地中の成分による核酸の化学的変質と、３）抽出および増幅する核酸の放出を阻害する、組織中の細胞溶解機序の阻害とを含む数多くの理由が示唆された。
【０００９】
輸送培地のある種の成分が核酸に与える影響を克服するための現行方法は、典型的には、追加的な加熱／冷却サイクルおよび追加的な遠心分離ステップを含む。そのような追加的なステップは、例えば前述のＶｉｐｅｒ（商標）システムなどの多数のハイスループット自動化装置と適合しない。自動化とは関係がない状況でさえ、そのようなステップにはやはり時間がかかる。これらのステップが必要とする追加的な時間は、検査結果の取得を遅延させうるため、好ましくは回避される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Molecular Biology techniques Manual, 3rd edition, Coyne, Vernon E.他編
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細胞溶解の困難さ、輸送培地中の保存用／汚染除去用の成分に曝露した試料に由来する標的核酸の核酸抽出不良、および増幅不良に関する問題に取り組む。本発明は、溶解または増幅を容易にする／達成するために加熱または追加的な遠心分離に頼る必要性がなく、細胞溶解、核酸抽出、および核酸増幅の所望のステップを実施することが可能となる添加剤を使用する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、陽イオン性輸送培地と陰イオン種の供給源である添加剤とを含む組成物であり、この添加剤は、輸送培地に含有される保存用／汚染除去用成分の望ましくない影響を実質的に補償する。添加剤は、前述の追加的ステップを必要とせずに、試料中の細胞が溶解され、試料中の核酸が抽出および増幅されるのを可能にする。
【００１３】
本発明の第２の態様は、試料の添加前に、試料の添加と同時に、または試料の添加後のいずれかで前記添加剤を輸送培地に添加するステップを含む、陽イオン性輸送培地に曝露した試料を処理する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】標的核酸でスパイクした試料（輸送培地または脱イオン水）から核酸を抽出し増幅する能力の低下を、添加剤、すなわち硫酸第一鉄でさらに処理した類似の試料からの標的核酸の抽出および増幅の増加と比較したグラフである。
【図１Ｂ】標的核酸でスパイクした試料（輸送培地または脱イオン水）から核酸を抽出し増幅する能力の低下を、添加剤、すなわち硫酸第一鉄でさらに処理した類似の試料からの標的核酸の抽出および増幅の増加と比較したグラフである。
【図２】標的核酸でスパイクした試料（輸送培地または希釈剤）から核酸を抽出し増幅する能力の低下を、添加剤、すなわち過酸化水素溶液でさらに処理した類似の試料からの標的核酸の抽出および増幅の増加と比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、輸送培地のマイナスの影響を中和し、したがって核酸抽出および増幅など、該試料に対するその後の分析を容易にするように、輸送培地と接触した生体試料を処理するための組成物、および処理方法を対象とする。
【００１６】
特定の理論に結び付けることは望まないが、本出願者は、以下の機序の少なくとも一方、おそらくはその両方により、核酸抽出および増幅に対して輸送培地の悪影響が引き起こされると考える。第１には、輸送培地の成分に曝露した試料中の細胞は、溶解に対してより抵抗性である。この溶解に対する抵抗性の増加は、核酸の放出を阻害し、抽出および増幅に利用可能な核酸の量を低減する。第２には、負に荷電した核酸は、いったん放出されれば、輸送培地中の１つまたは複数の陽イオン性成分と相互作用する。これにより、核酸の結合部位が占有され、例えば酸化第一鉄または増幅用プライマーの結合が阻止され、核酸の抽出および増幅が阻害される。
【００１７】
また特定の理論に結び付けることは望まないが、本出願者は、添加剤が輸送培地中の陽イオン性成分の標的核酸への結合を阻害するか、または陽イオン性成分を核酸から遊離させるかのいずれかであると考える。いずれの理論においても、核酸は、本明細書中に記載した添加剤の利点を有しない輸送培地と接触して置かれた核酸より、抽出段階において成分と結合するための結合部位および増幅段階中にプライマーに結合するための結合部位をより多く有する。また、他の実施形態では、本発明の添加剤を選択して、細胞溶解を容易にし、したがって抽出および増幅するための核酸の利用が増す。
【００１８】
抽出に関して、添加剤は、抽出手順の一部として、例えば酸化第一鉄粒子が標的核酸に結合する能力に干渉する輸送培地成分の悪影響を少なくとも部分的に補償する。核酸増幅に関して、添加剤は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅するために使用するプライマーが核酸の結合部位に結合する能力に対する、輸送培地の悪影響を少なくとも部分的に補償する。
【００１９】
本開示の理解を容易にするために、以下の定義を使用する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「核酸を抽出する」または「抽出」という用語には、それらに制限されないが、細胞溶解（ウイルス粒子の場合はカプシド溶解）ステップ後に核酸を捕獲するステップ、残りの試料から核酸を分離するステップが含まれる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれか、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「自動化プロトコル」という用語は、核酸抽出後に核酸を増幅するための自動化システムを使用するプロトコルを指す。そのような自動化システムの一例は、本件特許出願人によるＶｉｐｅｒ（商標）システムである。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「手作業プロトコル」という用語は、核酸抽出および増幅のための自動化システムを使用しないプロトコルを指す。手作業プロトコルは、厳密に手作業ステップだけを使用するのではなく、手作業ステップに加えて幾つかの自動化ステップを含んでもよい。自動化プロトコルおよび手作業プロトコルは、両方とも当業者に周知であり、種々の参照文献中に見出すことができる（例えば、非特許文献１参照）。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、例えば体器官から一団として採取される細胞の一群、または単一の細胞（例えば膣スワブに由来する細胞または全血に由来する細胞画分、例えば白血球）を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「微生物」という用語は、細菌またはウイルスのいずれかを指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「試料」あるいは「生体試料」という用語は、分析用に採取された任意の試料を指し、組織、細胞群、単一細胞（真核生物または原核生物）またはウイルスを含むが、それらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「輸送培地」または複数形の「輸送培地」という用語は、組織試料の物理的および化学的特性が保存され、かつ／または組織試料の汚染除去が達成されるように、組織または生体試料が置かれる任意の培地を指す。さらに、本明細書で使用される場合、輸送培地（複数可）という用語は、貯蔵培地（複数可）と同義である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「添加剤」という用語は、負イオン性の（つまり、陰イオン性の）種からなる、または負イオン性の種を遊離できる化学薬品または化学的組成物を指す。
【００２９】
本発明の一態様は、陽イオン性輸送培地および陰イオン性添加剤を含む組成物である。
【００３０】
生体試料の保存および／または汚染除去に使用される輸送培地は、当技術分野で周知である。これらの培地は、例えば、ホルムアルデヒド、ギ酸、メタノール、エタノール、ホルマリン、ＥＤＴＡ、陽イオン性ポリペプチド（例えば、ポリミキシン）、陽イオン性ポリアミノ酸（例えば、ポリ−１−リジン）、陽イオン性多糖類、またはそれらの組合せを含有する組成物を含む。これらの例に加えて、当業者であれば、陽イオン種を産出し、生体試料の保存／汚染除去に使用される多数の輸送培地成分が存在することを認識している。輸送培地中のこれらの保存用／汚染除去用成分の濃度は、その後の分析のために試料および試料の構成要素（例えば、核酸）を適切に保存する間に汚染除去が達成される程度である。そのような培地は数多く市販されている。
【００３１】
一実施形態では、輸送培地は１０％緩衝化ホルマリンである。別の実施形態では、輸送培地は、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）またはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）など市販の輸送培地に含有される組成物である。
【００３２】
組成物中の陰イオン性添加剤は、最終組成物中に陰イオン種をもたらすことができる任意の化合物または他の化学的成分である。本発明での使用に好適なそのような陰イオンをもたらす添加剤の例は、過酸化水素、過酸化ナトリウムおよび過酸化尿素である。例えば、過酸化水素は水溶液の中で解離し、陰イオン種であるＨＯＯ−を遊離する。例示的な一実施形態では、添加剤は過酸化水素である。
【００３３】
本発明に好適な他の化学化合物には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、フッ化ナトリウムおよび硫酸第一鉄などの金属塩が含まれる。本発明の別の例示的な実施形態では、添加剤は、水溶液（容積対容積）または固体（重量対容積）のいずれかとして添加される硫酸第一鉄である。
【００３４】
過酸化物イオン、ハロゲン化物イオンおよび硫酸イオンに加えて、負に荷電した他のイオン種（例えば、過炭酸ナトリウム）が、有用であるとして企図される。負に荷電した以下の種：硫化物；炭酸；フッ化物；次亜塩素酸；チオシアン酸；およびリン酸のイオンの供給源である添加剤も、好適であるとして企図される。硝酸イオンおよび亜硝酸イオンも、本明細書中での使用に好適な負に荷電したイオン種として企図される。水などの極性溶媒中で解離する際にこれらの負に荷電した種をもたらす添加剤は、当業者に周知であり、本明細書中に具体的には列挙されていない。
【００３５】
組成物を生成する際に、添加剤は、溶液（容量対容量）または固体（重量対容量）のいずれかとして輸送培地と混合される。必要な添加剤の量は、試料を著しくは害せずに陽イオン種の悪影響を中和できる量である。したがって、必要な添加剤の量は、輸送培地内に含有される陽イオン種のタイプおよび濃度に少なくとも多少は依存しようことが企図される。
【００３６】
例示的な一実施形態では、輸送培地の過酸化水素の終濃度が約０．０１％から約３％になるように、過酸化水素の溶液（典型的には３％または３０％溶液のいずれかで入手可能）が輸送培地に添加される。別の例示的な実施形態では、添加剤は、輸送培地の硫酸第一鉄の終濃度が約１５ミリモル（ｍＭ）から約３０ｍＭになるように、溶液形態の硫酸第一鉄または固体形態の硫酸第一鉄のいずれかとして添加される。別の例示的な実施形態では、添加剤は、輸送培地の塩化ナトリウムの終濃度が約５ｍＭから約２５ｍＭになるように、溶液形態または固体形態のいずれかで添加される塩化ナトリウムである。
【００３７】
最後に、さらなる例示的な実施形態では、培地中の終濃度が硫酸第一鉄については約１５ｍＭから約３０ｍＭ、塩化ナトリウムについては約５ｍＭから約２５ｍＭになるように、固体、液体、または固体および液体の組合せとして、硫酸第一鉄および塩化ナトリウムの添加剤が添加される。
【００３８】
本発明の別の態様は、曝露時点または曝露後のいずれかにおいて、陽イオン性輸送培地に曝露した試料を処理する方法である。具体的には、本発明では、生体試料が準備される。その試料は、１）輸送培地および２）陰イオン種を含有する添加剤と混合される。混合ステップの順序は重要ではない。したがって、添加剤は、試料が輸送培地と混合される直前に、試料が輸送培地と混合されると同時に、または試料が輸送培地と混合された後で、輸送培地と混合できる。添加剤の添加に引き続き、試料中の細胞は溶解され、核酸が残りの試料から抽出され、それらの抽出された核酸はさらなる分析のために増幅される。
【００３９】
試料は、多数の供給源から多数の医学的に承認される方法で取得できる。例としては、採血、生検、スワブ、ある種の細菌分析の場合には培養物が含まれるがそれらに制限されない。
【００４０】
組織を保存および／または汚染除去する輸送培地の成分は、そのような培地の例と同様に、本開示中に別記されている。例示的な実施形態では、輸送培地は、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）またはＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）などの市販の輸送培地に見出される調合物からなる輸送培地である。
【００４１】
本発明での使用に好適な陰イオンをもたらす添加剤の例は、本開示中に別記されている。前述したように、添加剤は、容積対容積の測定で溶液として、または重量対容積の測定で固体として、輸送培地と混合してもよい。
【００４２】
試料を処理するのに必要な添加剤の量は、有益な効果をもたらすためには多数の要因に依存して変動する。これらには、例示が目的であり制限が目的ではないが、特定の添加剤、添加剤の濃度、特定のタイプの輸送培地、輸送培地内の陽イオン成分の濃度、およびそのように処理される輸送培地の量が含まれる。特定の用途で使用される添加剤の量を決定するこれらの要因は、重要度の順に列挙されていない。
【００４３】
添加剤は、有効量で輸送培地と混合される。本明細書で使用される場合、有効量とは、試料に悪影響を及ぼさずに、有益な効果（つまり試料溶解の改善／輸送培地に曝露した試料中の核酸を適切に増幅する能力の改善）をもたらすのに十分な量である。当業者であれば、添加剤、輸送培地および試料の任意の所与の組合せについて、添加剤濃度の上限および下限を容易に確認できる。
【００４４】
ある種の好ましい実施形態では、添加剤は、プライマーが核酸に結合するための結合部位の数を（さらにまた、添加剤を有しない輸送培地に曝露した核酸に利用可能な結合部位の数と比較して）増加させると共に、細胞溶解を促進する。好ましい実施形態では、添加剤は、上記で特定した培地中の陰イオン種が所望の濃度になるように輸送培地に添加される３％過酸化水素水溶液である。
【００４５】
代替の実施形態では、添加剤は、以前に輸送培地に曝露した試料がその後に添加される希釈剤（希釈剤は、典型的には表面活性剤を有する、または有しない緩衝液であり、当業者に公知で、そのような希釈剤の一例は本件特許出願人のＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）システムにより使用されている希釈剤である）とも混合される。好ましい実施形態では、添加剤は、試料を含有する輸送培地に添加される。
【００４６】
添加剤は、必要に応じて輸送培地の重量パーセントまたは容積パーセントとして添加される。好ましい実施形態では、添加剤は、輸送培地の容積パーセントとして液体の形態で提供される。
【００４７】
本発明の一実施形態では、添加剤の量は、輸送培地中の陽イオン性成分の悪影響を中和するのに必要なイオン種の量により決定される。好ましい実施形態では、約７５マイクロリットル（μＬ）から約３５０μＬの３％過酸化水素水溶液が、約１ミリリットル（ｍＬ）の輸送培地に添加される。好ましい実施形態の一例では、約２００μＬの３％過酸化水素水溶液が、約１ｍＬのＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）輸送培地に添加される。
【００４８】
さらなる例示的な実施形態では、約４ミリグラム（ｍｇ）から約８ｍｇの硫酸第一鉄が、約１ｍＬの輸送培地に添加され、結果として輸送培地中の硫酸第一鉄の終濃度は約１５ｍＭから３０ｍＭとなる。別の例示的な実施形態では、約０．２９ｍｇから約１．４５ｍｇの塩化ナトリウムが、約１ｍＬの輸送培地に添加され、結果として塩化ナトリウムの終濃度は約５ｍＭから２５ｍＭとなる。
【００４９】
さらに別の実施形態では、約４ｍｇから約８ｍｇの硫酸第一鉄および約０．２９ｍｇから約１．４５ｍｇの塩化ナトリウムが、約１ｍＬの輸送培地に添加され、結果として硫酸第一鉄の終濃度が約１５ｍＭから３０ｍＭに、塩化ナトリウムの終濃度が約５ｍＭから２５ｍＭになる。
【００５０】
核酸を抽出するためのプロトコルには、酸化第一鉄または抽出目的のために設計された市販の溶液を利用するプロトコルが含まれる。これらの方法は当業者に周知であり、本明細書ではこれ以上説明しない。
【００５１】
核酸を増幅するためのプロトコルには、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）および鎖置換増幅法（ＳＤＡ）が含まれる。核酸増幅のためのこれらのプロトコルはありふれており、当業者に周知である。そのため、本明細書では、これらの機序および過程について詳しくは考察しない。
【００５２】
特定の実施形態について上述した本発明は、以下の実施例を参照するとさらに理解される。
【００５３】
図１Ａおよび１Ｂに関して、脱イオン水（ＤＩ  Ｈ2０）または輸送培地（ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標））は、標的核酸（核酸は、クラミジア・トラコマーティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（伝染性基本小体）または淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のいずれかの細胞２００個内に含有されていた）でスパイクした。試料（ｎ＝１２；図中では点により表される）はすべて、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（登録商標）社によるＶｉｐｅｒ（商標）システムを使用して、核酸抽出および増幅用に調製した。スパイクされた試料は、３０分間室温でインキュベートした。２ｍＬの各スパイクされた試料を、個々の試料チューブに移した。１つの試料は、１００ｍＭまたは２００ｍＭのいずれかの初期濃度で使用され、試料中で混合される添加剤である硫酸第一鉄とさらに混合した。
【００５４】
図１に関連して、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）に曝露されその後硫酸第一鉄で処理された試料に由来する標的核酸の抽出および増幅は、曝露されなかった試料からの回収率と対比して大きく増強された。具体的には、図１Ａは、ＰＡＴが輸送培地中の細胞にほとんど観察されなかったことを示す。対照として、ＤＩ  Ｈ2０中の細胞試料について、ＰＡＴを得た。それらの試料のＰＡＴは、培地を有する試料が有しない試料より著しく低いＰＡＴを有することをかなりよく示していた。図１Ｂは、硫酸第一鉄（１００ｍＭ〜２００ｍＭの濃度）をそれに添加した際に、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）培地を有する試料のＰＡＴ値が著しく増加したことを示す。
【００５５】
図２に関して、清浄な希釈剤（ＤＭＳＯ、リン酸塩、グリセロール、およびツイーン２０）または輸送培地（ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標））は、標的核酸（核酸は、クラミジア・トラコマーティス（伝染性基本小体）または淋菌の細胞１００個内に含有されていた）でスパイクした。スパイクされた試料（ｎ＝１８、図中では点で表される）は、３０分間室温でインキュベートした。２ｍＬの各スパイクされた試料を、個々の試料チューブに移した。１つの試料は、その後さらに、輸送培地１ｍＬあたり２００μＬの添加剤濃度で、添加剤、すなわち３％過酸化水素溶液を用いて処理した。試料はすべて、本件特許出願人によるＶｉｐｅｒ（商標）システムを使用して、核酸抽出および増幅用に調製した。
【００５６】
さらに図２に関連して、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）に曝露されその後過酸化水素溶液で処理された試料に由来する標的核酸の抽出および増幅は、そのように処理されなかった試料からの回収率と対比して大きく増強されたことを結果は示している。
【実施例１】
【００５７】
輸送培地が増幅に与える影響に関する過酸化物の緩和効果（ＰＡＴにより測定される）を評価した。この効果は、加熱溶解および非加熱溶解の両方がなされた試料で検討され、輸送培地が溶解に影響したかどうかを判断した。この実施例では、試料はすべて、本件特許出願人によるＶｉｐｅｒ（商標）システムを使用して、核酸抽出および増幅用に調製した。この分析については、試料はすべて、清浄な希釈液（ＤＭＳＯ、リン酸塩、グリセロール、およびツイーン２０）、輸送培地（ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標））および標的核酸（核酸はクラミジア・トラコマーティス（伝染性基本小体）または淋菌のいずれかを含有していた）を含有していた。試料は分析のために２つの第１次群に分割された。１つの群は、クラミジア・トラコマーティス（ＣＴ）でスパイクされた試料であった。他方の群は、淋菌（ＧＣ）でスパイクされた試料であった。各第１次群は、３％の過酸化水素溶液（試料中で０．７５％（容積で））でスパイクされた第１の試料セットと、過酸化物を有しない第２の試料セットとにさらに細分した。試料は、その上さらに、標的核酸が加熱溶解された第１の試料セットと、加熱溶解されなかった第２のセットとに細分した。加熱溶解は、１１４℃で生じた。活性の結果（ＰＡＴ）を下記の表１に報告する。合計２４個の試料を各評価のために調製した。各評価の活性（ＰＡＴ）分布を表１に報告する。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
容易に観察されるように、試料が加熱溶解されたか否かは、ＣＴおよびＧＣ標的の両方のＰＡＴ結果に対して無視できる効果しか有しなかった。対照的に、過酸化物の存在は、ＣＴおよびＧＣ標的の両方について同様に改善した、活性に対する明白な効果を有した。すなわち、過酸化物を有した試料は、過酸化物が添加されなかった試料と比較して著しく高い平均ＰＡＴを有した。
【００６０】
本明細書中の発明は特定の実施形態に関して説明されたが、これらの実施形態は本発明の原理および用途の単なる例証にすぎないことが理解されるべきである。したがって、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、例示的な実施形態に多数の変更がなされてもよく、他の配置が工夫されてもよいことが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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