(57)【要約】  プロテオームアプローチを用いて、ＭＡＴ１Ａ遺伝子についてのノックアウトマウス（ＭＡＴ１Ａ−／−）の肝臓における肝細胞癌（ＨＣＣ）のマーカーが同定された（Ｓ−アデノシルメチオニンの合成不全）。解析した腫瘍の少なくとも５０％において発現が変化している２７のタンパク質が検出された。中でも、１３のタンパク質は、異なる病因のＨＣＣの患者の生検材料において確認され、それらのタンパク質のうちの７つのタンパク質は、ＨＣＣの発現前段階である肝硬変の患者の生検材料において確認された。こういったことにより、その疾患の前段階を各々区別し、さらには異なる病因（ウイルス性およびアルコール性）を区別することが可能になる。利用可能なマーカーのパネルを有することは、ＨＣＣの発現に関連する変化をより正確に定義づけることにつながり得、そしてこの疾患の予後および診断を容易にし得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において肝細胞癌（ＨＣＣ）を診断するための、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該病状の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するためのin vitro方法であって、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子［ＡＤＨ遺伝子］、抗酸化タンパク質２（ＡＯＰ２）をコードする遺伝子［遺伝子ＡＯＰ２］、レギュカルチン（ＳＭＰ３０）をコードする遺伝子［ＳＭＰ３０遺伝子］、ステロール運搬タンパク質２（ＮＳＬＴ）をコードする遺伝子［ＮＳＬＴ遺伝子］、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）をコードする遺伝子［ＳＤＨ遺伝子］、アルブミン（ＳＡＰ）をコードする遺伝子［ＳＡＰ遺伝子］、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）をコードする遺伝子［ＰＧＭ遺伝子］、フェニルアラニン  ４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）をコードする遺伝子［Ｐ４Ｈ遺伝子］、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）をコードする遺伝子［ＡＰＯＡ１遺伝子］、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ（ＣＡＩＩＩ）をコードする遺伝子［ＣＡＩＩＩ遺伝子］、２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｄＤＨｍ）をコードする遺伝子［３０ＡｄＤＨｍ遺伝子］、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）をコードする遺伝子［ＯＡＴ遺伝子］、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）をコードする遺伝子［ＯＣＴ遺伝子］およびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルの発現レベルに対する低下がＨＣＣを示し、あるいは、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、抗酸化タンパク質２（ＡＯＰ２）、レギュカルチン（ＳＭＰ３０）、ステロール運搬タンパク質２（ＮＳＬＴ）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、アルブミン（ＳＡＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、フェニルアラニン  ４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ（ＣＡＩＩＩ）、２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｄＤＨｍ）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルのレベルに対する低下がＨＣＣを示すことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴの任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２の遺伝子の発現レベルを定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１３の遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴの発現レベルを定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴの任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２のタンパク質のレベルを定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１３のタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴの発現レベルを定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＣＣ治療の有効性の検証および評価のためのin vitro方法であって、該疾患の異なる時期もしくは段階に、または治療もしくはそれを行わない期間中に、同じ被験体において、タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベル、および／または遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベルを定量することと、それらを、正常であると考えられる対照値または同じ被験体の前値と比較することとを含み、ある治療薬が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベル、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルを高める場合に、該治療薬がＨＣＣ治療の候補になる、方法。
【請求項７】
被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するための、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該疾患の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するための、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴから選択される遺伝子のヌクレオチド配列、または該遺伝子の１つの特異的断片を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド対、または該遺伝子の１つを同定するためのプローブの使用。
【請求項８】
被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するための、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該疾患の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するための、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴから選択されるタンパク質の使用。
【請求項９】
被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するための、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該疾患の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するための、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と結合する能力を有する抗体の使用。
【請求項１０】
ＨＣＣ治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価における、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴおよびそれらの組合せから選択される遺伝子の、および／またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴおよびそれらの組合せから選択されるタンパク質の使用。
【請求項１１】
ＨＣＣ治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価のための方法であって、（ｉ）低下したレベルの遺伝子を発現する細胞系を候補化合物と接触させることと、（ｉｉ）該遺伝子の発現を評価し、該遺伝子の発現が高まる場合に、該候補化合物が、ＨＣＣ治療において潜在的に有用な化合物であるとすることとを含み、該遺伝子が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴおよびそれらの組合せから選択される、方法
【請求項１２】
被験体において肝細胞癌（ＨＣＣ）の発現前段階を確認するためのin vitro方法であって、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、およびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルの発現レベルに対する低下がＨＣＣの発現前段階を示す、あるいは、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルのレベルに対する低下がＨＣＣの発現前段階を示すことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭの任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの遺伝子のレベルを定量することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
７つの遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭのレベルを定量することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭの任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つのタンパク質のレベルを定量することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
７つのタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭの発現レベルを定量することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
in vitroでＨＣＣの発現前段階を確認するための、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択される遺伝子のヌクレオチド配列、または該遺伝子の１つの特異的断片を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド対、または該遺伝子の１つを同定するためのプローブの使用。
【請求項１８】
in vitroでＨＣＣの発現前段階を確認するための、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭから選択されるタンパク質の使用。
【請求項１９】
in vitroでＨＣＣの発現前段階を確認するための、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択されるタンパク質と結合する能力を有する抗体の使用。
【請求項２０】
ＨＣＣの発現前段階の治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価における、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭおよびそれらの組合せから選択される遺伝子の、および／またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭおよびそれらの組合せから選択されるタンパク質の使用。
【請求項２１】
ＨＣＣの発現前段階の治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価のための方法であって、（ｉ）低下したレベルの遺伝子を発現する細胞系を候補化合物と接触させることと、（ｉｉ）該遺伝子の発現を評価し、該遺伝子の発現が高まる場合に、該候補化合物が、ＨＣＣの発現前段階の治療において潜在的に有用な化合物であるとすることとを含み、該遺伝子が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭおよびそれらの組合せから選択される、方法。
【請求項２２】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの活性を増強する化合物の治療上有効な量を、１種以上の薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに含む医薬組成物、ならびに遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの活性を増強する化合物の治療上有効な量を、１種以上の薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに含む医薬組成物から選択される医薬組成物。
【請求項２３】
ＨＣＣ治療のための医薬組成物の製造における、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの活性を増強する化合物の使用。
【請求項２４】
ＨＣＣの発現前段階の治療のための医薬組成物の製造における、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの活性を増強する化合物の使用
【請求項２５】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片を特異的に増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド対。
【請求項２６】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される１つ以上の遺伝子を同定するためのプローブ。
【請求項２７】
ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と結合する能力を有する抗体。
【請求項２８】
（ｉ）遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される１つ以上の遺伝子を同定するための１つ以上のプローブを含む固相支持体、ならびに（ｉｉ）ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と結合する能力を有する１つ以上の抗体を含む固相支持体から選択される固相支持体。
【請求項２９】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベルの検出のための試薬を含むキット。
【請求項３０】
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴのｍＲＮＡもしくはそれらの対応するｃＤＮＡの断片の特異的増幅のための１以上のプライマーオリゴヌクレオチド対、および／または
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される１つ以上の遺伝子の同定のための１つ以上のプローブ、および／または
−ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と、もしくは抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ以上の抗体
を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
それぞれが前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴもしくはＯＣＴの１つに特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは１３のプライマーオリゴヌクレオチド対、またはそれぞれが前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴもしくはＯＣＴの１つの同定に特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは１３のプローブ、またはそれぞれが前記タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴの１つと、または抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは１３の抗体を含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記プローブおよび前記抗体が固相支持体上に固定されている、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するための、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該疾患の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するための、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
ＨＣＣの発現前段階を確認するためのin vitro方法の実施のためのキットであって、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現レベルの検出のための試薬を含む、キット。
【請求項３５】
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭのｍＲＮＡもしくはそれらの対応するｃＤＮＡの断片の特異的増幅のための１以上のプライマーオリゴヌクレオチド対、および／または
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択される１つ以上の遺伝子の同定のための１つ以上のプローブ、および／または
−ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択されるタンパク質と、もしくは抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ以上の抗体
を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
それぞれが前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰもしくはＰＧＭの１つに特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つのプライマーオリゴヌクレオチド対、またはそれぞれが前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰもしくはＰＧＭの１つの同定に特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つのプローブ、またはそれぞれが前記タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭの１つと、または抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つの抗体を含む、請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記プローブおよび前記抗体が固相支持体上に固定されている、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、肝細胞癌（ＨＣＣ）の患者の肝腫瘍組織における遺伝子およびタンパク質の発現の変化の解析に関する。特に、本発明は、一連のヒト遺伝子およびタンパク質に関し、この一連のヒト遺伝子およびタンパク質は、ＨＣＣに罹患している被験体の癌性肝組織において、正常肝組織における同じ遺伝子およびタンパク質の発現とは異なって発現される。それゆえ、該遺伝子およびタンパク質は、ＨＣＣの分子マーカーまたはバイオマーカーの役割を果たす。
発明の背景
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、悪性肝細胞腫としても知られている、罹患率第五位、癌による死亡原因第三位の新生物性疾患であり、毎年新たに５００，０００を超える人が診断を受けている。ＨＣＣの主な原因はよく知られており、中でも、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、もしくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染、アフラトキシンで汚染された食品の消費、または暴飲であるが、病変の攻撃性や有効な治療の欠如の理由からＨＣＣの患者の予後は悪い。
【０００３】
ＨＣＣは、呈する症状（食欲および体重の減少、発熱、疲労、ならびに衰弱を含む）の非特異性から早期に検出することが困難である。ＨＣＣの早期検出に現在利用可能な唯一のツールは、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血清レベルの測定と肝超音波検査である。しかしながら、ＡＦＰレベルは低い感度および特異性を示し、そのような理由によりバイオマーカーとしてのその用途は非常に限られている。また、超音波検査は、操作者に依存し、ＨＣＣと再生結節を区別しようとする場合には有効性が限られている。さらなる診断法には、非放射性画像診断法（Ｘ線、血管造影、ＣＴスキャン、ＭＲＩなど）、放射性物質を用いた肝臓スキャナーまたは肝生検がある。ＨＣＣ治療は、検出が行われるのが遅すぎるという事実により全く役に立たないことが多い。治療法には、手術、化学療法および放射線療法（単独または組合せ）がある。
【０００４】
そういったことから、ＨＣＣの分子病態についての知識を高めることや早期診断を可能にするバイオマーカーを同定することは、非常に重要であり、臨床肝臓病学の主な優先事項の１つを示す。
【０００５】
ゲノミクスおよびプロテオミクスなどの技術（何千もの遺伝子およびタンパク質の同時解析を可能にする技術）の最近の発展は、一連のＨＣＣバイオマーカーの出現につながった(Lok AS, Marrero J. Newer Markers for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology 2004;127:S113-S119；Chen Li, Ye-Xiong Tan, Hu Zhou et al. Proteomic Analysis of Hepatitis B Virus Associated Hepatocellular Carcinoma: Identification of Potential Tumor Markers. Proteomics 2005; 5:1125-1139；Beretta L, Chignard N. Proteomics for Hepatocellular Carcinoma Marker Discovery. Gastroenterology 2004; 127:S120-S125；Schwegler EE, Cazares L et al. SELDI-TOF MS Profiling of Serum for Detection of the Progression of Chronic Hepatitis C to Hepatocellular Carcinoma. Hepatology 2005; 41:634-42；Yokoyama Y, Kuramitsu Y et al. Proteomic Profiling of Proteins Decreased in Hepatocellular Carcinoma from Patients Infected with Hepatitis C Virus. Proteomics 2004; 4:2111-6；Thorgeirsson S et al. Genome-Scale Profiling of Gene Expression in Hepatocellular Carcinoma: Classification, Survival Prediction and Identification of Therapeutic Ta
rgets. Gastroenterology 2004;127:851-855；Maria W. Smith, Zhaoxia N et al. Identification of Novel Tumors Markers in Hepatitis C Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research 2003; 63:859-864；Xin Chen, Siu Tim Cheung et al. Gene Expression Patterns in Human Liver Cancers. Molecular Biology of the Cell 2002; 13:1929-1939)。
【０００６】
差異に基づくプロテオミクスを用いて、ＨＣＣバイオマーカーとして提示されており、その疾患の発現において重要な役割が割り当てられていることもある、特異的に変化した発現パターンを有するタンパク質のパネルを得た。しかしながら、異なる研究で同定された異なるタンパク質レパートリーにはあまり共通点がなく、このため、それらにはＨＣＣバイオマーカーとしての相対的価値しかない。異なる研究室で実施された研究の間にある相違は、用いた方法論または解析したサンプルの性質もしくは種類の違いによるものであるかもしれない。
【０００７】
異なる前臨床研究で同定されたＨＣＣバイオマーカーとしては、以下に記載されているものを見つけることができる(Lok AS, Marrero J. Newer Markers for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology 2004;127:S113-S119の変形)。
【０００８】
【表１】
2009509517.tif 000002
【０００９】
疾患の臨床病理学的性質を理解し、ＨＣＣの患者の治療を改善しようとするために様々な研究が実施されたにもかかわらず、従来の臨床病理学的パラメーターには、非常に限られた予測能力しかない。それゆえに、ＨＣＣに関連する分子バイオマーカーを同定する必要性がまだある。分子バイオマーカーを同定し、それらの機能的効果を研究することは、ＨＣＣの予防および／または治療だけでなく、ＨＣＣの治療、予防および／または治癒に有用である薬物の探索および開発にも役立ち得る。
【発明の概要】
【００１０】
プロテオームアプローチは、ＭＡＴ１Ａ遺伝子についてのノックアウトマウス（ＭＡＴ１Ａ−／−）の肝臓における肝癌発症のマーカーの同定に用いられてきた（Ｓ−アデノシルメチオニンの合成不全）。解析した腫瘍の少なくとも５０％において発現が変化している２７のタンパク質が検出された。中でも、１３のタンパク質は、異なる病因のＨＣＣの患者の生検材料において確認され、それらのタンパク質のうちの７つのタンパク質は、ＨＣＣの発現前段階である肝硬変の患者の生検材料において確認された。この研究により、その疾患の前段階を各々区別し、さらには異なる病因（ウイルス性およびアルコール性）を区別することが可能になった、その結果、利用可能なマーカーのパネルを有することは、ＨＣＣの発現に関連する変化をより正確に定義づけることにつながり得、そしてこの疾患の予後および診断を容易にし得る。
【００１１】
バイオマーカーを同定するために、ヒトサンプルの解析に先立ち、ＭＡＴ１Ａ−／−マウスがスクリーニング系として用いられてきた。その実験モデルにより、新生物発生前段階からの長期的な研究を行うことや肝癌発症プロセスに関連するタンパク質を同定することが可能になり、それゆえ、その実験モデルはＨＣＣマーカーの同定に有効である。本発明において生じたタンパク質発現パターンは、系に、これまでに記載されてきた系、すなわちバイオマーカーに基づくものや組織学的および臨床的基準に基づくものと比べて、より正確なその疾患の予後を提供する。現在、ある特定の遺伝子（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）ならびにタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）の発現レベルは、ＨＣＣの患者由来の肝組織サンプルにおいて、肝疾患のない正常被験体由来の肝組織サンプル（対照）における同じ遺伝子およびタンパク質の発現レベルと比べて低いことが見出された。また、ある特定の遺伝子（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ）ならびにタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ）の発現レベルは、ＨＣＣの発現前段階である肝硬変の患者由来の肝組織サンプルにおいて、正常被験体由来の肝組織サンプル（対照）における同じ遺伝子およびタンパク質の発現レベルと比べて低いことも見出された。
【００１２】
よって、本発明は、一般に、ＨＣＣバイオマーカーとしての遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、および／またはそれらの対応するタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）の使用に関する。本発明はまた、ＨＣＣの発現前段階のバイオマーカーとしての遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、および／またはそれらの対応するタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ）の使用にも関する。加えて、本発明は、本発明の実施のための方法およびキットに関する。
【００１３】
一態様では、本発明は、被験体においてＨＣＣを診断するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、または該疾患に罹患している被験体に施与された療法の効果をモニタリングするためのin vitro方法であって、ＨＣＣバイオマーカーとしての前記遺伝子（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）および／またはタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）の使用を含む方法に関する。
【００１４】
もう１つの態様では、本発明は、被験体においてＨＣＣの発現前段階を確認するためのin vitro方法であって、ＨＣＣの発現前段階のバイオマーカーとしての前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、および／またはタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ）の使用を含む方法に関する。
【００１５】
特許請求の範囲は、本発明に関連するさらなる態様を含む。
【発明の具体的説明】
【００１６】
定義
本明細書に記載されている本発明の理解のために、本発明に関連するいくつかの用語および表現の意味を以下に説明する：
【００１７】
用語「被験体」とは、哺乳類動物種の一メンバーを指し、限定されるものではないが、家畜、霊長類およびヒトが含まれ、被験体は、好ましくは、任意の年齢または人種の男性または女性のヒトである。また、用語「個体」も、ヒトを示すために本記載において用いられる場合がある。
【００１８】
用語「ＨＣＣ」とは、肝細胞癌または悪性肝細胞腫を指す。
【００１９】
用語「タンパク質」とは、共有または非共有結合によって連結されたアミノ酸の分子鎖を指す。その用語には、あらゆる形の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化またはアセチル化が含まれる。
【００２０】
用語「抗体」とは、「抗原」と特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。用語「抗体」には、組換え抗体、モノクローナル抗体、もしくはポリクローナル抗体、無傷のもの、または抗原と結合する能力を維持するそれらのフラグメント、コンビボディー(combibodies)など、ヒトのもしくはヒト化されたものおよび非ヒト起源のものが含まれる。
【００２１】
用語「プライマーオリゴヌクレオチド」とは、本発明では、選択された遺伝子のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を指す。各プライマーオリゴヌクレオチドはその標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ重合の開始点としての役割を果たす。
【００２２】
ＨＣＣの分子バイオマーカーおよび利用
多くの生物学的機能は、転写制御（例えば開始制御、ＲＮＡ前駆体、ＲＮＡプロセッシングを通じた）および／または翻訳制御による様々な遺伝子の発現の変化と同時に起こる。例として、ある特定の必須生物学的プロセス、例えば細胞周期、細胞分化および細胞死は、遺伝子群の発現レベルの変動によって特徴付けられる。
【００２３】
同様に、遺伝子発現の変化は様々な病状の発生（発病）とも関係があり、例えば、機能性腫瘍および／または癌遺伝子／原癌遺伝子の過剰発現を抑制する遺伝子の十分な発現がないと、腫瘍形成または増殖性細胞の増殖に至る可能性がある。そのため、ある特定の遺伝子（例えば癌遺伝子または腫瘍サプレッサント(tumour suppressants)）の発現の変化は、様々な病状の存在および進行を評価するのに利用し得る。
【００２４】
薬剤のスクリーニングおよび開発中に遺伝子発現の変化をモニタリングすることで、ある特定の利益ももたらし得る。
【００２５】
本発明者らは、ＭＡＴ１Ａ遺伝子についてのノックアウトマウス（ＭＡＴ１Ａ−／−）の肝臓における肝癌発症のマーカーの同定にプロテオームアプローチを用いて、解析した腫瘍の少なくとも５０％において発現が変化している２７のタンパク質を検出した。中でも、１３のタンパク質は、異なる病因のＨＣＣの患者の生検材料において確認され、それらのタンパク質のうちの７つのタンパク質は、ＨＣＣの発現前段階である肝硬変の患者の生検材料において確認された。こういったことにより、その疾患の異なる前段階を区別し、さらには異なる病因（ウイルス性およびアルコール性）を区別することが可能になる、その結果、このことが、ＨＣＣの発現に関連する変化をより正確に定義づけることにつながり得、そしてこの疾患の予後および診断を容易にし得る。
【００２６】
本発明は、細胞の状態（例えば非癌性と癌性）に応じて異なって発現され得る遺伝子およびタンパク質の発現レベルを検出するように設計された組成物および方法を提供する。これらの発現プロフィールは、いくつかある用途の中で特に、疾患（ＨＣＣ）の診断、または該疾患を発現する被験体の素因もしくは危険性の評価、該疾患のモニタリング、該疾患の治療に潜在的に有用な薬物の同定、ならびに該薬物の毒性および代謝の確認に有用な分子ツールを提供する。該遺伝子および／またはタンパク質の発現プロフィールの、対照サンプルにおける該遺伝子および／またはタンパク質のベースライン発現（基礎発現レベル）（参照正常値または対照値）と比較したときの変化が、上記のような効果の指標として用いられ得る。当業者ならば、本発明において同定された１以上の遺伝子および／またはそれらの断片および／またはタンパク質の発現レベルを評価するように設計された公知技術の種類のうちの任意のものを使用して、目的の組織またはサンプルにおける発現プロフィールの変化を観察し得るであろう。
【００２７】
一態様では、本発明は、癌性（ＨＣＣ）および非癌性肝組織において異なって発現されるいくつかの遺伝子を同定する。具体的に言えば、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、および／またはそれらの対応するタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）の発現レベルが、ＨＣＣと診断されている患者由来の癌性肝組織サンプルにおいて、ＨＣＣと診断されていないまたはＨＣＣの病歴のない被験体（対照被験体）由来の肝組織サンプルにおける同じ遺伝子および／またはタンパク質のレベルと比べて低いという発見に基づいている。
【００２８】
研究対象の被験体由来の肝組織サンプルと、対照として用いた肝組織サンプルとの間の、前記遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルの、少なくとも５％、有利には、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、さらに好ましくは、少なくとも２５％の低下は、解析サンプルを提供した被験体がＨＣＣに罹患しているか、またはＨＣＣを発現する危険性もしくは素因を有することを示す。
【００２９】
当業者ならば、特定のサンプルをアッセイするために、前記遺伝子および／またはタンパク質の１つ以上を選択し得る。例として、被験体由来の肝組織サンプルを研究するために、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは１３の前記遺伝子またはタンパク質を選択し得る。特定の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１もしくは１２の前記遺伝子またはタンパク質が選択される。もう１つの特定の実施形態では、研究対象の被験体由来の肝組織サンプルを研究するために、前記１３の遺伝子またはタンパク質が選択される。前記１３の遺伝子（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴ）の差次的発現（対照に対する低下）は、ＨＣＣのゲノムインプリント（フィンガープリント）となる。同様に、前記１３のタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴ）の差次的発現（対照に対する低下）は、ＨＣＣのプロテオームインプリント（フィンガープリント）となる。マーカーのパネルの同定は、個々のマーカーの使用にとどまらず、病状のより特異的な診断の実施に貢献するであろう。利用可能なマーカーのパネルを有することで、さらに、時間的な進展を評価することが可能になり、このような点で、該疾患の進行（またはその進展の段階）を、ある時点におけるある特定の代表的なマーカーの出現と関連づけることが可能になる。
【００３０】
こういったことから、ＨＣＣの診断または予後のために、被験体由来の肝組織サンプルにおける前記遺伝子、および／またはそれらの対応するタンパク質の発現レベルの評価および比較を利用し得る。例として、被験体由来の肝組織サンプルにおける本発明において同定された１つ以上のＨＣＣマーカーのレベルが、対照被験体（すなわちＨＣＣの病歴のない被験体および／またはＨＣＣに罹患していない被験体）由来の、または（一般に、対照被験体から得た）正常参照値を有する生体サンプルにおける同じマーカーのレベルと比べて低下していることは、ＨＣＣ、または該疾患を発現する被験体の危険性もしくは素因がより高いことを示す。ＨＣＣと診断されていても診断されていなくとも、ある時点において被験体における該マーカーのレベルを、同じ被験体由来の前のサンプルのものと比較することにより、該疾患の進展および予後または被験体に施与している治療の有効性（妥当な場合）を示し得る。
【００３１】
従って、本発明の教示は、いくつかある用途の中で特に、診断試験もしくはアッセイまたはＨＣＣを発現する被験体の危険性もしくは素因の評価試験に、予後試験に、療法の有効性および該疾患の進展を解析するための、被験体に施与した療法の効果についての追跡試験に、ならびにＨＣＣ治療において潜在的に有用な化合物のスクリーニング試験に用い得る。
【００３２】
本発明は、とりわけ、被験体由来の肝組織サンプルにおける遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現、および／またはそれらの対応するタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ）のものを検出および定量するように設計された方法を提供する。
【００３３】
よって、一態様では、本発明は、被験体において肝細胞癌（ＨＣＣ）を診断するための、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該病状の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するためのin vitro方法に関し、本発明の方法は、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子［ＡＤＨ遺伝子］、抗酸化タンパク質２（ＡＯＰ２）をコードする遺伝子［遺伝子ＡＯＰ２］、レギュカルチン（ＳＭＰ３０）をコードする遺伝子［ＳＭＰ３０遺伝子］、ステロール運搬タンパク質２（ＮＳＬＴ）をコードする遺伝子［ＮＳＬＴ遺伝子］、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）をコードする遺伝子［ＳＤＨ遺伝子］、アルブミン（ＳＡＰ）をコードする遺伝子［ＳＡＰ遺伝子］、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）をコードする遺伝子［ＰＧＭ遺伝子］、フェニルアラニン  ４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）をコードする遺伝子［Ｐ４Ｈ遺伝子］、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）をコードする遺伝子［ＡＰＯＡ１遺伝子］、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ（ＣＡＩＩＩ）をコードする遺伝子［ＣＡＩＩＩ遺伝子］、２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｄＤＨｍ）をコードする遺伝子［３０ＡｄＤＨｍ遺伝子］、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）をコードする遺伝子［ＯＡＴ遺伝子］、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）をコードする遺伝子［ＯＣＴ遺伝子］およびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルの発現レベルに対する低下が、ＨＣＣを示す、あるいは、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、抗酸化タンパク質２（ＡＯＰ２）、レギュカルチン（ＳＭＰ３０）、ステロール運搬タンパク質２（ＮＳＬＴ）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、アルブミン（ＳＡＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、フェニルアラニン  ４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ（ＣＡＩＩＩ）、２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｄＤＨｍ）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルのレベルに対する低下が、ＨＣＣを示すことを特徴とする。
【００３４】
本発明により提供される方法は、高い感度および特異性を示し、ＨＣＣと診断されている被験体由来の（癌性）肝組織が、対照サンプルとしての、肝疾患がなく、かつＨＣＣの病歴のない正常被験体由来の肝組織サンプルにおける遺伝子および／またはタンパク質のレベルと比べて、低いレベルの、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴに対応するｍＲＮＡ、および／または低い濃度のタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴを示す、との事実に基づくものである。
【００３５】
本発明の方法を実施するためには、検査される被験体由来の肝組織サンプルを得る。サンプルは、任意の従来の方法によって、例えば、外科的切除により得られる肝組織生検材料を用いて得てよい。サンプルは、これまでにＨＣＣと診断された被験体（患者）から、またはこれまでにＨＣＣと診断されたことのない被験体から、またはＨＣＣと診断され、治療を受けている患者から、またはＨＣＣと診断され、これまでに治療を受けたことのある被験体から得てよい。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体由来の肝組織サンプルにおいて、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴ、およびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルを定量することと、該レベルを対照肝組織サンプルのものと比較することとを含み、該発現レベルの、対照サンプルにおける同じ遺伝子の発現レベルに対する低下は、ＨＣＣを示す。本発明の方法には、該遺伝子のただ１つの発現レベルを定量する可能性だけでなく、該遺伝子の任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２の遺伝子の発現レベル、さらには該１３の遺伝子の発現レベルを定量する可能性も含まれる。
【００３７】
遺伝子の発現レベルは、遺伝子の転写によって得られるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベル、あるいは、そのｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のレベルを定量することにより定量してよい。この場合、本発明の方法は、全ＲＮＡを得るための抽出ステップの実施を含み、このステップは従来の技術によって行ってよい。実際には任意の従来の方法を本発明の範囲内で用いて、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのｍＲＮＡレベル、またはそれらの対応するｃＤＮＡを検出および定量してよい。例として、限定されるものではないが、該遺伝子のｍＲＮＡレベルは、従来の方法を用いて定量してよく、例えば、その方法は、ｍＲＮＡの増幅と、そのｍＲＮＡの増幅産物の定量（例えば、適当な標識プローブとのハイブリダイゼーションとシグナルの検出とによるか、あるいは、ノーザンブロットと目的のｍＲＮＡ（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴまたはＯＣＴ）に特異的なプローブの使用、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ＲＴ−ＬＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどによる）とを含む。同様に、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのレベルも従来の技術を用いて定量してよく、この場合、本発明の方法は、対応するｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）によるｃＤＮＡ合成ステップを含み、その後、そのｃＤＮＡの増幅とその増幅産物の定量を行い、特定の実施形態では、増幅は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴまたはＯＣＴの領域を特異的に増幅するプライマーオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ（例えば定量ＰＣＲ、適当な標識を用いたリアルタイム定量ＰＣＲなど）により定性的にまたは定量的に行われる。
【００３８】
もう１つの特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体由来の肝組織サンプルにおいて、タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴ、およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベル（濃度）を定量することと、該レベルを対照肝組織サンプルのものと比較することとを含み、該レベルの、対照サンプルにおける同じタンパク質のレベルに対する低下は、ＨＣＣを示す。本発明の方法には、該タンパク質のただ１つのレベルを定量する可能性だけでなく、該タンパク質の任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２のタンパク質のレベル、さらには該１３のタンパク質のレベルを定量する可能性も含まれる。
【００３９】
前記タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベル（濃度）は、被験体由来のサンプルにおいて該タンパク質を検出および定量することが可能な任意の従来の方法により定量してよい。この場合、本発明の方法は、該タンパク質を含むタンパク質抽出物を得るための抽出ステップの実施を含み、このステップは従来の技術を用いて行ってよい。
【００４０】
実際には任意の従来の方法を本発明の範囲内で用いて、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルを検出および定量してよい。例として、限定されるものではないが、該タンパク質のレベルは、従来の方法を用いて定量してよく、例えば、その方法は、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴまたはＯＣＴ（あるいは抗原決定基を含むそれらの断片）と結合する能力を有する抗体を使用し、その後、形成された複合体を定量することを含む。これらのアッセイに用いられる抗体は、標識抗体でも非標識抗体でもよい。使用し得る標識の説明に役立つ実例としては、放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質もしくは補助因子、酵素阻害剤、粒子、染料などが挙げられる。本発明に使用し得る公知のアッセイは幅広く存在し、それらのアッセイでは非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を使用し、これらの技術としては、ウエスタンブロットもしくはウエスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的手法、特異的抗体を含むタンパク質バイオチップもしくはマイクロアレイの使用に基づく手法または試験紙などの形式でのコロイド沈殿に基づくアッセイが挙げられる。タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴまたはＯＣＴを検出および定量するための他の方法には、アフィニティークロマトグラフィー手法、リガンド結合アッセイなどがある。
【００４１】
特定の実施形態では、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルの定量は、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴまたはＯＣＴ（あるいは抗原決定基を含むそれらの断片）と結合する能力を有する抗体を使用し、その後、形成された複合体を、例えば、抗原抗体結合の定量が可能な免疫化学的技術、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、タンパク質バイオチップなどにより定量することによって行われ、好ましくは、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルの定量は、該タンパク質と結合することが可能な適当な抗体を用いた、タンパク質バイオチップを用いてまたはウエスタンブロットによって行われる。そのような抗体は市販されており、また、当業者に公知の従来の方法により得てもよい。
【００４２】
本発明の方法はまた、検査対象の被験体由来の肝組織サンプルにおいて決定された遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベル、および／またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルを、対照として用いた（すなわち肝疾患のない正常被験体から一般に得られる参照値を有する）肝組織サンプルにおける該遺伝子および／またはタンパク質のレベルと比較するステップも含む。遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベル、ならびにタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルは、肝疾患のない、好ましくは、正常被験体由来の、肝組織サンプルにおいて上述の技術を用いて決定してよい。検査対象の被験体の肝組織サンプルにおける遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベル、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルの、対照肝組織サンプルにおける対応するレベルに対する低下は、ＨＣＣを示す。
【００４３】
もう１つの態様では、本発明は、ＨＣＣ治療の有効性の検証および評価のためのin vitro方法に関する。この方法は、該疾患の異なる時期もしくは段階において、または治療およびその不在の期間中に同じ被験体においてタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルおよび／または遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベルを定量することと、それらを、正常であると考えられる対照値または同じ被験体の前値と比較する。治療薬が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現を高める場合に、その治療薬がＨＣＣ治療の候補になる。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＣの被験体に施与された療法の効果を評価するためのin vitro方法であって、（ｉ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴおよびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルおよび／またはＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴ、およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベルを定量することと、（ｉｉ）該レベルを療法施与前の同じ被験体由来の肝組織サンプルのものと比較することを含む方法に関する。この場合、該遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルの、療法施与前のレベルに対する増加は、その被験体に施与された療法が有効であることを示す。本発明の方法に関連してこれまでに記載してきたように、該遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルの定量ならびにその発現レベルの比較は、従来の方法により行ってよい。
【００４５】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのヌクレオチド配列は、該遺伝子の特異的断片を増幅するのに有用であるプライマーオリゴヌクレオチドを設計するためにだけでなく、該遺伝子を同定するのに潜在的に有用なプローブを得るためにも用いられ、従って、該遺伝子の該ヌクレオチド配列、ならびに該プライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブを、被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するためにもしくはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するために、または被験体において該疾患の進行を評価するために、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するために、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するために、例えば、該疾患に罹患している被験体に施与された療法の効果を評価するために用い得る。
【００４６】
同様に、タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、あるいは該タンパク質の１以上の抗原決定基（エピトープ）を含むそれらの断片は、該タンパク質に対する抗体を作製するために用い得る。従って、該タンパク質およびそれらの断片、ならびに該タンパク質またはそれらの断片と結合する能力を有する該抗体を、被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するためにもしくはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するために、または被験体において該疾患の進行を評価するために、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するために、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するために、例えば、該疾患に罹患している被験体に施与された療法の効果を評価するために用い得る。
【００４７】
もう１つの態様では、本発明は、被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するためのもしくはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するための、または被験体において該疾患の進行を評価するための、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するための、例えば、該疾患に罹患している被験体に施与された療法の効果を評価するための抗体の使用に関し、その抗体は、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と、または該タンパク質の抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する抗体である。該抗体は、組換え抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、無傷のもの、または該タンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴまたはＯＣＴ）と結合する能力を維持するそれらのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどのフラグメント、ヒト、ヒト化もしくは非ヒト抗体であってよい。
【００４８】
本発明において同定された分子バイオマーカー、例えば遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、および／またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴは、ＨＣＣ治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価において用い得る。
【００４９】
従って、もう１つの態様では、本発明は、ＨＣＣ治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価のための方法であって、（ｉ）低下したレベルの遺伝子を発現する細胞系を候補化合物と接触させることと、（ｉｉ）該遺伝子の発現を評価し、該遺伝子の発現が高まる場合に、該候補化合物が、ＨＣＣ治療において潜在的に有用な化合物であるとすることとを含み、該遺伝子が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴ、ＯＣＴおよびそれらの組合せから選択される、方法に関する。該細胞系は、実際には、該マーカーの１つ以上が低下している任意の細胞系、例えばかかるマーカーのレベルの低下を示す形質転換ヒト細胞系、例えばＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７などの細胞系であり得る。該遺伝子の発現は、任意の従来の方法により、例えば、該遺伝子のｍＲＮＡもしくはそれらの対応するｃＤＮＡのレベルを定量することにより、または本発明の方法に関連してこれまでに記載した方法のいずれかによってタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴもしくはＯＣＴを定量することにより評価し得る。化合物が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのいずれかの発現レベルまたはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベル（濃度）を高める場合に、該化合物がＨＣＣ治療に潜在的に有用な候補となる。もう１つの態様では、本発明は、ＨＣＣ治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価のための方法における、該遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴ、および／または該タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの使用に関する。
【００５０】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの活性を増強する化合物は、ＨＣＣ治療に用い得る。該化合物の、限定されない、説明に役立つ実例としては、該遺伝子の発現または該タンパク質の活性の正のモジュレーターが挙げられる。
【００５１】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの活性を増強する化合物の治療上有効な量を、１種以上の薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、該医薬組成物は、該遺伝子の発現の正のモジュレーターまたは該タンパク質の活性の正のモジュレーターを含む。
【００５２】
賦形剤、担体および補助剤は、薬学的にも薬理学的にも許容されなければならず、かつ処方物の他の成分と組み合わせることが可能でなければらず、かつ治療中の被験体に悪影響を及ぼしてはならない。このような医薬組成物は、任意の適当な投与形態、例えば、経口および非経口投与（例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹膜内およびくも膜下腔内投与を含む）に適した剤形で与えてよい。処方物は、単回投与量であってよく、古典的な製剤方法に従って調製されるものとする。薬物投与のための異なる剤形およびその調製についての総説は、C. Fauli i Trilloによる書籍「Tratado de Farmacia Galenica」（10th Edition, 1993, Luzan 5, S. A. de Ediciones）に記載されている。
【００５３】
もう１つの態様では、本発明は、ＨＣＣ治療のための医薬組成物の製造における、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの活性を増強する化合物の使用に関する。
【００５４】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片の特異的増幅に有用なプライマーオリゴヌクレオチド対に関する。特定の実施形態では、該プライマーオリゴヌクレオチド対は、配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４、ならびに配列番号２５および配列番号２６からなるオリゴヌクレオチド対の群から選択される。
【００５５】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される遺伝子を同定するためのプローブに関する。特定の実施形態では、本発明は、該１３の遺伝子を同定するための１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２もしくは１３のプローブを提供し、該プローブは、所望により、該プローブの支持体への固定を容易にするために処理された、固相支持体（例えば、メンブレン、プラスチックまたはガラス）上に固定されている。遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される１つの遺伝子を同定するための少なくとも１つのプローブを含む該固相支持体は、アレイ技術を用いた該遺伝子の転写産物（またはそれらの対応するｃＤＮＡ）の同定に用い得、この固相支持体は本発明のさらなる態様となる。特定の実施形態では、該固相支持体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３の該プローブを含む。
【００５６】
もう１つの態様では、本発明は、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と結合する能力を有する抗体に関する。特定の実施形態では、本発明は、該１３のタンパク質の同定のための１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３の抗体を提供し、該抗体は、所望により、該抗体の支持体への固定を容易にするために処理された、固相支持体（例えば、メンブレン、プラスチックまたはガラス）上に固定されている。タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と結合し、それを同定する能力を有する少なくとも１つの抗体を含む該固相支持体は、アレイ技術を用いたタンパク質の同定に用い得、この固相支持体は本発明のさらなる態様となる。特定の実施形態では、該固相支持体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３の該抗体を含む。
【００５７】
もう１つの態様では、本発明は、本明細書に記載の方法論の実施において有用なキットに関する。よって、該キットは、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴの発現レベルの検出に、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよび／またはＯＣＴのレベルの検出に必要な試薬の総てまたは一部を含み得、そのような試薬には以下が含まれる：
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴのｍＲＮＡ（もしくはそれらの対応するｃＤＮＡ）の断片の特異的増幅のための１以上のプライマーオリゴヌクレオチド対、および／または
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択される１つ以上の遺伝子の同定のための１つ以上のプローブ、および／または
−ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、Ｐ４Ｈ、ＡＰＯＡ１、ＣＡＩＩＩ、ＡｄＤＨｍ、ＯＡＴおよびＯＣＴから選択されるタンパク質と、もしくは抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ以上の抗体。
【００５８】
前記キットは、それぞれが前記遺伝子の１つに特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３のプライマーオリゴヌクレオチド対を含み得る。前記キットに含めることができるプライマーオリゴヌクレオチド対の説明に役立つ非限定的な実例としては、次のオリゴヌクレオチド対が挙げられる：配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４、および／または配列番号２５および配列番号２６。
【００５９】
あるいは、前記キットは、それぞれが前記遺伝子の１つの同定に特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３のプローブを含み得る。もう１つの代替実施形態では、前記キットは、それぞれが前記タンパク質の１つと結合する能力を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３の抗体を含み得る。
【００６０】
前記試薬、具体的に言えば、プローブおよび抗体は、これまでに記載したように、固相支持体上に固定されていてよい。
【００６１】
前記キットは、被験体においてＨＣＣをin vitroで診断するために、またはＨＣＣを発現する被験体の素因を評価するために、または被験体において該疾患の進行を評価するために、または被験体において該疾患の段階もしくは重篤度を決定するために、またはＨＣＣ治療の有効性を検証し、評価するために、例えば、該疾患に罹患している被験体に施与された療法の効果を評価するために用い得る。
【００６２】
ＨＣＣの発現前段階のマーカー
これまでに示したように、本発明はまた、硬変した肝組織（すなわちＨＣＣの発現前段階時）および正常肝組織において異なって発現されるいくつかの遺伝子も同定する、具体的に言えば、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、および／またはそれらの対応するタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ）の発現レベルが、肝硬変（ＨＣＣの発現前段階）の患者由来の肝組織サンプルにおいて、肝疾患のない正常被験体（対照被験体）由来の肝組織サンプルにおける同じ遺伝子および／またはタンパク質のレベルと比べて低いということも観察された。研究対象の被験体由来の肝組織サンプルと、対照として用いた肝組織サンプルとの間の、前記遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルの、少なくとも５％、有利には、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも２０％、さらに好ましくは、少なくとも２５％の低下は、研究対象の被験体が、時がたてばＨＣＣに進展する可能性のある肝硬変に罹患していることを示す。
【００６３】
当業者ならば、特定のサンプルをアッセイするために、前記遺伝子および／またはタンパク質の１つ以上を選択し得る。例として、被験体由来の肝組織サンプルを研究するために、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つの前記遺伝子またはタンパク質を選択し得る。特定の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの前記遺伝子またはタンパク質が選択される。もう１つの特定の実施形態では、研究対象の被験体の肝組織サンプルを研究するために、前記７つの遺伝子またはタンパク質が選択される。前記７つの遺伝子（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭ）の差次的発現（対照に対する低下）は、ＨＣＣの発現前段階（肝硬変）のゲノムインプリント（フィンガープリント）となる。同様に、前記７つのタンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭ）の差次的発現（対照に対する低下）は、ＨＣＣの発現前段階（肝硬変）のプロテオームインプリント（フィンガープリント）となる。
【００６４】
こういったことから、ＨＣＣの発現前段階を確認し、適切な措置を取るために、被験体由来の肝組織サンプルにおける前記遺伝子および／またはそれらの対応するタンパク質の発現レベルの評価および比較を利用し得る。
【００６５】
よって、もう１つの態様では、本発明は、被験体において肝細胞癌（ＨＣＣ）の発現前段階を確認するためのin vitro方法に関し、この方法は、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、およびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルの発現レベルに対する低下が、ＨＣＣの発現前段階を示す、あるいは、
ａ）該被験体由来の肝組織サンプルにおいて、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベルを定量することと、
ｂ）該レベルを対照サンプルのものと比較することと、
を含み、
該レベルの、対照サンプルのレベルに対する低下が、ＨＣＣの発現前段階を示すことを特徴とする。
【００６６】
前記方法を実施するためには、研究する被験体由来の肝組織サンプルを、本発明により提供されるＨＣＣを診断するために設計されたin vitro方法に関連してこれまでに示したように、例えば、生検により得る。サンプルは肝硬変の被験体から得てよい。
【００６７】
特定の実施形態では、上述の方法は、被験体由来の肝組織サンプルにおいて、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、およびそれらの組合せから選択される遺伝子の発現レベルを定量することと、該発現レベルを対照肝組織サンプルと比較することとを含み、該発現レベルの、対照サンプルにおける同じ遺伝子の発現レベルに対する低下が、ＨＣＣの発現前段階を示す。該方法の実施には、該遺伝子のただ１つの発現レベルを定量する可能性だけでなく、該遺伝子の任意の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの遺伝子の発現レベル、さらには該７つの遺伝子の発現レベルを定量する可能性も含まれる。該遺伝子の発現レベルは、本発明により提供されるＨＣＣを診断するために設計されたin vitro方法に関連してこれまでに記載してきたように、該遺伝子のｍＲＮＡのレベル、あるいは、そのｍＲＮＡのｃＤＮＡのレベルを定量することにより定量してよい。特定の実施形態では、ｍＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロットと目的のｍＲＮＡ（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰまたはＰＧＭ）に特異的なプローブの使用により、または遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰまたはＰＧＭの領域を特異的に増幅するプライマーオリゴヌクレオチドを用いた定量ＰＣＲ、例えばリアルタイム定量ＰＣＲにより決定される。
【００６８】
もう１つの特定の実施形態では、上述の方法は、被験体由来の肝組織サンプルにおいて、タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭ、およびそれらの組合せから選択されるタンパク質のレベル（濃度）を定量することと、該レベルを対照肝組織サンプルのものと比較することとを含み、該レベルの、対照サンプルにおける同じタンパク質のレベルに対する低下が、ＨＣＣの発現前段階を示す。該方法の実施には、該タンパク質のただ１つのレベルを定量する可能性だけでなく、該タンパク質の任意の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのタンパク質のレベル、さらには該７つのタンパク質のレベルを定量する可能性も含まれる。該タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭのレベルは、本発明により提供されるＨＣＣを診断するために設計されたin vitro方法に関連してこれまでに記載してきたように、任意の従来の方法により定量してよい。
【００６９】
特定の実施形態では、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭのレベルの定量は、該タンパク質（または抗原決定基を含むそれらの断片）と結合する能力を有する抗体を使用し、その後、形成された複合体を、例えば、抗原抗体結合の定量が可能な免疫化学的技術、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、タンパク質バイオチップなどにより定量することによって行われる。
【００７０】
上述の方法はまた、研究対象の被験体の肝組織サンプルにおいて決定された遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現レベル、および／またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭのレベルを、対照として用いた（すなわち肝疾患のない正常被験体から一般に得られる参照値を有する）肝組織サンプルにおける該遺伝子および／またはタンパク質のレベルと比較するステップも含む。研究対象の被験体の肝組織サンプルにおける遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現レベル、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭのレベルの、対照肝組織サンプルにおける対応するレベルに対する低下は、ＨＣＣの発現前段階を示す。
【００７１】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭのヌクレオチド配列は、該遺伝子の特異的断片を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを設計するためにだけでなく、該遺伝子を同定するのに潜在的に有用なプローブを得るためにも用い得る、従って、該遺伝子の該ヌクレオチド配列、ならびに該プライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブを、被験体においてin vitroでＨＣＣの発現前段階を確認するために用い得る。
【００７２】
同様に、タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、あるいは該タンパク質の１以上の抗原決定基（エピトープ）を含むそれらの断片は、該タンパク質に対する抗体を作製するために用い得る。従って、該タンパク質およびそれらの断片、ならびに該タンパク質と結合する能力を有する該抗体を、被験体においてin vitroでＨＣＣの発現前段階を確認するために用い得る。
【００７３】
もう１つの態様では、本発明は、被験体においてin vitroでＨＣＣの発現前段階を確認するための抗体の使用に関し、その抗体は、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択されるタンパク質と、または該タンパク質の抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する抗体である。該抗体は、組換え抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、無傷のもの、または該タンパク質（ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰまたはＰＧＭ）と結合する能力を維持するそれらのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどのフラグメント、ヒト、ヒト化もしくは非ヒト抗体であってよい。
【００７４】
同定された分子バイオマーカー、例えば遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、および／またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭは、被験体におけるＨＣＣの発現前段階の治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価において用い得る。
【００７５】
従って、もう１つの態様では、本発明は、被験体におけるＨＣＣの発現前段階の治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価のための方法であって、（ｉ）低下したレベルの遺伝子を発現する細胞系を候補化合物と接触させることと、（ｉｉ）該遺伝子の発現を評価し、該遺伝子の発現が高まる場合に、該候補化合物が、ＨＣＣの発現前段階の治療において潜在的に有用な化合物であるとすることとを含み、該遺伝子が遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰ、ＰＧＭおよびそれらの組合せから選択される、方法に関する。該細胞系は、実際には、該マーカーの１つ以上が低下している任意の細胞系、例えばかかるマーカーのレベルの低下を示す形質転換ヒト細胞系であり得る。該遺伝子の発現は、任意の従来の方法により、例えば、該遺伝子に関するｍＲＮＡもしくはそれらの対応するｃＤＮＡのレベルを定量することにより、または上述の方法のいずれかによって該タンパク質を定量することにより評価し得る。化合物がＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現を高める場合に、該化合物がＨＣＣの発現前段階の治療に潜在的に有用な候補となる。
【００７６】
よって、もう１つの態様では、本発明は、被験体におけるＨＣＣの発現前段階の治療における化合物のスクリーニング、調査、同定、開発および有効性評価のための方法における、前記遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、および／または前記タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの使用に関する。
【００７７】
遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの活性を増強する化合物は、ＨＣＣの発現前段階の治療に用い得る。該化合物の、限定されない、説明に役立つ実例としては、該遺伝子の発現または該タンパク質の活性の正のモジュレーターが挙げられる。
【００７８】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの活性を増強する化合物の治療上有効な量を、１種以上の薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、該医薬組成物は、該遺伝子の発現の正のモジュレーターまたは該タンパク質の活性の正のモジュレーターを含む。
【００７９】
賦形剤、担体および補助剤は、薬学的にも薬理学的にも許容されなければならず、かつ処方物の他の成分と組み合わせることが可能でなければらず、かつ治療中の被験体に悪影響を及ぼしてはならない。このような医薬組成物は、任意の適当な投与形態、例えば、経口および非経口投与（例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹膜内およびくも膜下腔内投与を含む）に適した剤形で与えてよい。処方物は、単回投与量であってよく、古典的な製剤方法に従って調製されるものとする。薬物投与のための異なる剤形およびその調製についての総説は、C. Fauli i Trilloによる書籍「Tratado de Farmacia Galenica」（10th Edition, 1993, Luzan 5, S. A. de Ediciones）に記載されている。
【００８０】
もう１つの態様では、本発明は、ＨＣＣの発現前段階の治療のための医薬組成物の製造における、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの活性を増強する化合物の使用に関する。
【００８１】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭから選択される遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片を特異的に増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド対に関する。特定の実施形態では、該プライマーオリゴヌクレオチド対は、配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、ならびに配列番号１３および配列番号１４からなるオリゴヌクレオチド対の群から選択される。
【００８２】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択される遺伝子を同定するためのプローブに関する。特定の実施形態では、本発明は、該７つの遺伝子を同定するための１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つのプローブを提供し、該プローブは、所望により、該プローブの支持体への固定を容易にするために処理された、固相支持体（例えば、メンブレン、プラスチックまたはガラス）上に固定されている。遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭから選択される１つの遺伝子を同定するための少なくとも１つのプローブを含む該固相支持体は、アレイ技術を用いた該遺伝子の転写産物（またはそれらの対応するｃＤＮＡ）の同定に用い得、この固相支持体は本発明のさらなる態様となる。特定の実施形態では、該固相支持体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの該プローブを含む。
【００８３】
もう１つの態様では、本発明は、ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択されるタンパク質と結合する能力を有する抗体に関する。特定の実施形態では、本発明は、該７つのタンパク質を同定するための１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの抗体を提供し、該抗体は、所望により、該抗体の支持体への固定を容易にするために処理された、固相支持体（例えば、メンブレン、プラスチックまたはガラス）上に固定されている。タンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択されるタンパク質と結合し、それを同定する能力を有する少なくとも１つの抗体を含む該固相支持体は、アレイ技術を用いたタンパク質の同定に用い得、この固相支持体は本発明のさらなる態様となる。特定の実施形態では、該固相支持体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの該抗体を含む。
【００８４】
もう１つの態様では、本発明は、上述の、ＨＣＣの発現前段階を確認するために設計されたin vitro方法の実施において有用なキットに関する。該キットは、遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭ、またはタンパク質  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよび／またはＰＧＭの発現レベルを検出するのに必要な試薬の総てまたは一部を含み得、そのような試薬には以下が含まれる：
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰまたはＰＧＭのｍＲＮＡ（もしくはそれらの対応するｃＤＮＡ）の断片を特異的に増幅するための１以上のプライマーオリゴヌクレオチド対、および／または
−遺伝子  ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択される１つ以上の遺伝子を同定するための１つ以上のプローブ、および／または
−ＡＤＨ、ＡＯＰ２、ＳＭＰ３０、ＮＳＬＴ、ＳＤＨ、ＳＡＰおよびＰＧＭから選択されるタンパク質と、もしくは抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ以上の抗体。
【００８５】
前記キットは、それぞれが前記遺伝子の１つに特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つのプライマーオリゴヌクレオチド対を含み得る。前記キットに含めることができるプライマーオリゴヌクレオチド対の説明に役立つ非限定的な実例としては、次のオリゴヌクレオチド対が挙げられる：配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、および／または配列番号１３および配列番号１４。
【００８６】
あるいは、前記キットは、それぞれが前記遺伝子の１つの同定に特異的である１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つのプローブを含み得る。もう１つの代替実施形態では、前記キットは、それぞれが前記タンパク質の１つと、または抗原決定基を含むそれらの断片と結合する能力を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの抗体を含み得る。
【００８７】
前記試薬、具体的に言えば、プローブおよび抗体は、これまでに記載したように、固相支持体上に固定されていてよい。
【００８８】
次の実施例により本発明を説明するが、それを本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。
【００８９】
実施例１
材料と方法
実験動物
本発明者ら自身のコロニーで飼育され、本発明者らの研究室で開発されたＭＡＴ１Ａ−／−マウス(Lu SC, Alvarez L, Huang ZZ, Chen L, An W, Corrales FJ, Avila MA, Kanel G, Mato JM. Methionine Adenosyltransferase 1A Knockout Mice Are Predisposed to Liver Injury and Exhibit Increased Expression of Genes Involved in Proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5560-65)を使用した。野生型（ＷＴ）マウスおよびＭＡＴ１Ａ−／−マウスを犠牲にし、それらの肝臓を摘出した後、ＭＡＴ１Ａ−／−肝臓に存在する腫瘍のサイズを測定した。その肝臓サンプルをすぐに液体窒素で凍結させ、−８０℃に維持した。総ての試験手順を、実験動物の使用と取り扱いに関するナバラ大学(the University of Navarra)の制度的ガイドラインに従って行った。
【００９０】
患者
いくつかの群の肝臓サンプルを得た：
ａ）対照個体のサンプル（ｎ＝１０）。対照群のサンプルは、無症候性胆石症の治療のために胆嚢摘出術を受け、それらに同意して、肝生検を受けた患者から得た。これらの患者は正常な肝組織像を示し、彼らの肝臓機能は正常であった。
ｂ）アルコール性肝硬変に罹患している患者のサンプル（ｎ＝５）。
ｃ）ウイルス性肝硬変に罹患している患者（ｎ＝５）。
ｄ）異なる病因のＨＣＣの患者（ｎ＝１０）。
ｅ）正常肝臓から得られたＨＣＣの患者の非腫瘍領域の肝臓サンプル（ｎ＝７）。
ｆ）異なる病因のＨＣＣの患者の非腫瘍領域の肝臓サンプル：Ｃ型肝炎  ３サンプルとウイルス性肝硬変  ５サンプル（ｎ＝８）。
【００９１】
病理学的サンプルは、手術中または肝臓移植時に得た。
【００９２】
総ての組織をすぐに液体窒素で凍結させて、後に、ＲＮＡ抽出を行った。この研究はナバラ大学調査委員会による承認を得ていた。研究は、１９７５年のヘルシンキ宣言（１９８３年改定）において策定された倫理基準に従って行った。
【００９３】
プロテオーム解析
実験モデルに関する肝臓プロテオームおよび変化の特性解析を、以下に概略を説明するプロテオームアプローチに従い、二次元電気泳動と、その後の、質量分析による目的のタンパク質の同定とを用いた生体サンプル由来のタンパク質の混合物の解析を組み合わせることにより行った：
Ａ）予備段階
タンパク質のホモジナイゼーション／可溶化
等電点電気泳動（一次元目）
還元／アルキル化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（二次元目）
染色／脱染
Ｂ）予備段階
画像解析
特異なバンドの切除
酵素消化
質量分析（ＭＳ）による同定
【００９４】
ＷＴマウスおよびＭＡＴ１Ａ−／−マウスの両方の５０ｍｇ肝組織片を２０容量の溶解バッファーでホモジナイズし、溶解バッファーは組成：７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｖ／ｖ）３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、１％（ｖ／ｖ）ジチオトレイトール(dithiotreitol)（ＤＴＴ）および０．５％３−１０両性電解質(BioRad)であった。この抽出物を１５℃で１００，０００ｘｇで１時間遠心分離した。得られた上清中のタンパク質濃度を、標準としてウシアルブミンを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法(BioRad)により測定した。  一次元目を、等電点電気泳動ソース（BioRad社のＰｒｏｔｅａｎ  ＩＥＦ  ｃｅｌｌ）で、異なるｐＨ範囲で１７ｃｍゲル（BioRad社のＲｅａｄｙＳｔｒｉｐｓ  ＩＰＧ  ｓｔｒｉｐｓ）を用いて行った。
【００９５】
サンプル（１５０〜１，０００μｇ）を、活性再水和法を用いて５０Ｖおよび２０℃で１２時間ロードした。再水和後、製造業者推奨のプロトコールを用いて、ゲルに、６０，０００Ｖｘ時間に達するまで、漸増する電圧を印加した。ストリップを次の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．５、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｖ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２％（ｖ／ｖ）ＤＴＴおよび微量のブロモフェノールブルー を有するバッファーで平衡化し、その後、ＤＴＴの不在下で２．５％ヨードアセトアミドを含有する同じバッファー中でインキュベートした。そのストリップを１２．５％ポリアクリルアミドゲル（１８ｃｍｘ２０ｃｍｘ１ｍｍ）上に直接置き、１％低融点アガロースで密封して、ストリップの位置を固定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（二次元目）を９０Ｖで１４時間泳動し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ(Invitrogen)で染色した。あるいは、銀染料(Amersham Biosciences)およびＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ蛍光染色液(BioRad)を使用した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅまたは銀で染色されたゲルをＧＳ−８００目盛り付きデンシトメーター(Bio-Rad)でデジタル化した。蛍光染色されたゲルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸデンシトメーター(BioRad)でスキャンした。得られた画像を、BioRad社のＰＤＱｕｅｓｔ  ７．１ソフトウェアを用いて解析した。発現レベルにおいて３倍より大きな変化量を示し、少なくとも３つの独立した試験で確認されたものだけを、妥当と考えられる差異とした。総てのサンプルを二連で処理した。異なって発現されたタンパク質に関するバンドをゲルから手動で採取し、ロボット（ＭｉｃｒｏｍａｓｓのＭａｓｓ  Ｐｒｅｐ  ｓｔａｔｉｏｎ）で自動処理した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅまたは蛍光で染色された目的のバンドを５０ｍＭ重炭酸アンモニウムおよび５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで脱染し、一方、銀で染色されたバンドを１５ｍＭフェリシアン化カリウムおよび５０ｍＭチオ硫酸ナトリウムで脱染した。そのタンパク質を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム中の１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、同じバッファー中の５５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。続いて、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の６ｎｇ／μｌのトリプシンを用いて３７℃で５時間消化を行った。あるいは、Sigma社により開発された手法を用いた。得られたペプチド加水分解物(peptide hydrolisate)を１％（ｖ／ｖ）ギ酸および２％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで抽出した。続いて、各消化物の１．２μｌを０．１％トリフルオロ酢酸および５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中のα−シアノ−４−ヒドロキシ−トランス−シンナム酸(α-cyano-4-hydroxy-trans-cynnamic acid)の飽和溶液の１．２μｌと混合した。この混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に適合するプレートに被着した。消化物をWaters社のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＧＬ−ＲＥＦスペクトロメーターを用いた質量分析により解析した。ペプチドの配列決定および特性解析をWaters社のＱ−ＴＯＦマクロスペクトロメーターで行った。ナノ液体クロマトグラフィーをWaters社のＣａｐＬＣ（商標）システムを用いて行った。逆相クロマトグラフィーによるトリプシン消化物の分離をWaters社のＮａｎｏ  Ｅａｓｅ（商標）、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ−１８カラム、３μｍ、７５μｍｘ１０ｃｍで行った。カラムを５％アセトニトリルおよび０．２％ギ酸で平衡化した。サンプル６μｌを注入した後、そのカラムを同じバッファーで５分間洗浄し、５〜５０％アセトニトリルの直線勾配で３０分間、一定の流速０．２μｌ／分でペプチドを溶出した。そのカラムをＰｉｃｏＴｉｐ  ナノエレクトロスプレーイオン化ソース(Waters)を用いて質量分析計につないだ。キャピラリー温度は８０℃、電圧は１．８〜２．２Ｋｖであった。得られたフラグメンテーションデータを確立されたプログラムを用いて自動収集した各保持時間における。最も強い３つのイオンを、ウインドウ２．５および相対衝突エネルギー３５％での衝突誘起（ＣＩＤ）により断片化した。質量分析データは、Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．０ソフトウェア(Waters)を用いてを処理した。タンパク質の同定には、Ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ  ２．０ソフトウェア(Waters)を用いた。検索に利用したデータベースはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（登録数１７６，４６９のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４６．３）およびＥｎｓｅｍｂｌ（登録数３１，５３５のＥｎｓｅｍｂｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２９．３３）であった。最後に、同定されたタンパク質の分類および機能的解釈は、ＧＡＲＢＡＮソフトウェアを用いて行った(Luis A, Martinez-Cruz, Angel Rubio, Maria L. Martinez-Chantar, Alberto Labarga, Isabel Barrio, Adam Podhorski, Victor Segura, Jose L. Sevilla Campo, Matias A. Avila and Jose M. Mato. GARBAN: A New Tool for Genomic Analysis and Rapid Biological Annotation of cDNA Microarray and Proteomic Data. Bioinformatics 2003; 19:2158-60)。
【００９６】
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ
ヒトサンプル中に存在するＲＮＡの抽出では、Sigma社のＴＲＩ試薬を使用した。ＲＮＡ（２μｇ）をＤＮＡｓｅ  Ｉ(Invitrogen)で処理した後、ＲＮＡｓｅ  ＯＵＴ(Invitrogen)の存在下でＭ−ＭＬＶ逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写を行った。使用した総てのプライマーオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの増幅とｃＤＮＡの増幅とを区別するように設計されたものであった。特異性を確認するために、ＰＣＲ産物は総て配列決定した。リアルタイムＰＣＲは、ｉＣｙｃｌｅｒ(Bio-Rad)およびｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ混合物(Bio-Rad)を用いて１／２０のＲＴ反応で行った。次のプライマーオリゴヌクレオチドを使用した：
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）：５’−ＧＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＴＧＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号２）、
抗酸化タンパク質２（ＡＯＰ２）：５’−ＣＡＡＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣ−３’（配列番号３）および５’−ＴＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号４）、
加齢指標タンパク質３０（ＳＭＰ３０）：５’−ＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５）および５’−ＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号６）、
非特異的脂質輸送タンパク質（ＮＳＬＴ）：５’−ＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号７）および５’−ＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号８）、
ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）：５’−ＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣ−３’（配列番号９）および５’−ＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０）、
血清アルブミン（ＳＡＰ）：５’−ＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号１２）、
ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）：５’−ＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１３）および５’−ＧＡＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１４）、
フェニルアラニン４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）：５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１５）および５’−ＧＧＣＧＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号１６）、
アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）：５’−ＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号１８）、
カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ（ＣＡＩＩＩ）：５’−ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１９）および５’−ＴＧＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２０）、
ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｄＤＨｍ）：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２２）、
オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）：５’−ＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号２３）および５’−ＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２４）、
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）：５’−ＧＧＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号２５）および５’−ＣＴＧＴＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号２６）、
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ：５’−ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番号２７）および５’−ＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧ−３’（配列番号２８）、
グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ：５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２９）および５’−ＣＣＴＴＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧ−３’（配列番号３０）、
アポリポタンパク質Ｅ：５’−ＧＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号３１）および５’−ＴＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号３２）、
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ２：５’−ＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧＡＣＣＴＣ−３’（配列番号３３）および５’−ＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３４）、
メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩ：５’−ＡＧＴＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＧＣＡＴＣ−３’（配列番号３５）および５’−ＧＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＴＣ−３’（配列番号３６）、
ジスルフィドイソメラーゼタンパク質：５’−ＴＣＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣ−３’（配列番号３７）および５’−ＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号３８）、
アデノシルホモシステイナーゼ：５’−ＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号３９）および５’−ＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号４０）、
７１−ｋＤａ熱ショックタンパク質：５’−ＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号４１）および５’−ＣＡＡＴＡＧＴＧＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号４２）、
アルギナーゼ１：５’−ＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号４３）および５’−ＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号４４）、
セレン結合タンパク質：５’−ＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号４５）および５’−ＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号４６）、
グルタミンシンターゼ：５’−ＡＧＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号４７）および５’−ＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣ−３’（配列番号４８）、
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭｕＩ：５’−ＣＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号４９）および５’−ＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号５０）。
【００９７】
ＰＣＲ産物の特異性は、変性曲線と電気泳動により解析した。これまでに記載されているように、転写量を算出し、Ｈ３Ｆ３Ａヒストン対照遺伝子との相対的差異として表した（２ΔＣｔ、ここで、ΔＣｔは、標的遺伝子と対照遺伝子とのサイクル数の差を表す）(KJ. Livak, T. D. Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔCT Method. Methods 2001; 25:402-408)。５対照個体のＲＮＡの混合物を反応の陽性対照として用い、ｍｉｌｌｉＱ水を陰性対照として用いた。
【００９８】
生物統計学的解析
対照個体と肝疾患の患者とのｍＲＮＡレベルを比較するために用いた統計的検定はマンホイットニーＵ検定であり、有意値ｐ＜０．０５とした。
【００９９】
結果
１．１  ＭＡＴ１Ａ−／−マウスの肝臓におけるＨＣＣのプロテオームプロフィール
１８ヶ月齢では１００％のＭＡＴ１Ａ−／−マウスがＨＣＣを発現する。形質転換された肝細胞は、楕円形核と突起した核小体を示すことを特徴とする。これらの肝細胞は、内皮細胞で覆われた索状ストランドを形成する。異なるＭＡＴ１Ａ−／−マウスに存在する腫瘍結節の巨視的解析では、そのサイズの不均質性が明らかになった（図１）。
【０１００】
解析した群それぞれにおいて観察されたプロテオームの均質性は、差異に基づくプロテオーム研究において重要なパラメーターの１つである。この研究では、ＷＴマウスの肝臓間で測定された変動（解析したバンドの総数に対する特異なバンドの割合として定義した）は１％（ｐ＜０．０１）であった。しかしながら、同じＭＡＴ１Ａ−／−の肝臓の腫瘍結節を比較すると、プロテオームの変動は１０ｍｍより大きな病変において３％（ｐ＜０．０１）に達し、異なるマウスの結節を比較した場合には、腫瘍のサイズに関して１０％まで増加した（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、腫瘍増殖だけでなく、個体特異的な因子も悪性形質転換後のプロテオームの不安定性をもたらす可能性があることを示唆している（図２）。
【０１０１】
肝癌発症に関連する肝臓プロテオームにおける変化を定義するために、１８ヶ月齢のＭＡＴ１Ａ−／−マウスとＷＴマウスの肝臓サンプルを二次元電気泳動および質量分析により解析した。総ての解析を重複して行い、両方のレプリカにおいて少なくとも３倍の発現差を示すタンパク質だけを、そのようなものとして考えられる差異とした。異なるマウスの６つの腫瘍結節をＷＴ肝臓サンプルと比較した。腫瘍結節において検出された総ての変化の中で、１５１のタンパク質が同定された。得られた同定を確かめるために、タンパク質配列に基づいて算出した理論ＭｗおよびｐＩと、２Ｄゲルに基づいて算出した対応するバンドの実験Ｒｆとの関係を表した。図３より分かるように、理論パラメーターと実験パラメーターとの間には良好な相関が得られたが、実験ＭｗとｐＩの両方において少しずれが生じており、このずれば恐らくはタンパク質種の翻訳後修飾または選択的プロセシングによるものと考えられる。一部の腫瘍で観察される数例の異常電気泳動挙動は：アルデヒドデヒドロゲナーゼ（２型）、アルブミンおよびグルタチオントランスフェラーゼＭｕ１である。これらのタンパク質の正確な同定を確認するために、それらをＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ質量分析により部分的に配列決定した。
【０１０２】
同定されたタンパク質は、ＧＡＲＢＡＮバイオコンピュータープログラムを用いて、遺伝子オントロジーの基準に従い、それらの細胞内部位とそれらが関与する生物学的プロセスに基づいて分類した(Ashburner M, Ball CA, Blake JA et al. Gene Ontology: Tool for the Unification of Biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000; 25: 25-9)。得られた結果を図４に示しており、この図から同定されたタンパク質がミトコンドリア（大部分）、サイトゾル、細胞骨格、小胞体、核およびその他の細胞内部位に存在していることが分かる。同定されたタンパク質が関与する生物学的プロセスには、外部刺激に対する応答、シグナル変換、細胞組織化および形成、代謝（大部分）ならびに輸送が含まれる。
【０１０３】
１５１の同定されたタンパク質の、６１．３％の変化は、恐らくは形質転換プロセス中に肝細胞が漸進的に脱分化することにより腫瘍においてレベルが低下していたタンパク質に対応していた。影響を受けやすい生物学的機能は、異なる解析間で差異が観察されるにもかかわらず、シグナル伝達、細胞組織化、代謝および輸送であった。解析により、細胞骨格および小胞体が損傷を受けたが、最多数の変化が累積している細胞内小器官はミトコンドリアであることが示された。ＭＡＴ１Ａ−／−肝臓で行った代謝変化の研究では、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）でそうあるように、それらのほとんどが炭水化物、脂質およびアミノ酸の代謝と関連していることが示された。さらに、プリンおよびピリミジンの代謝と関連している酵素の発現において増加が観察された。この観察結果は、増殖中の細胞による遺伝物質の合成要求を反映している可能性がある。
【０１０４】
ヒトＨＣＣに関連するタンパク質を同定するために、解析したＭＡＴ１Ａ−／−腫瘍の少なくとも５０％において発現が変化している２７のタンパク質だけに研究を向けることに決めた（表１）。
【０１０５】
【表２】
2009509517.tif 000003
【０１０６】
ＭＡＴ１Ａ−／−肝臓において２７のタンパク質のうち１９のタンパク質の発現が低下していた（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ、１３０００１８Ｌ０９  Ｒｉｋタンパク質、グルタミンシンセターゼ、セレン結合タンパク質２、アデノシルホモシステイナーゼ、抗酸化タンパク質２、レギュカルチン、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニン４−ヒドロキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、アルギナーゼ１、ホスホグルコムターゼ、オルニチンアミノトランスフェラーゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、ステロール運搬タンパク質２、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび２８１０４３５Ｄ１２  Ｒｉｋタンパク質）（図５）。残る８つのタンパク質（グルタチオントランスフェラーゼＰ２、７１ｋＤａ熱ショックタンパク質、アポリポタンパク質Ａ１およびＥ、アルブミン、２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼＭｕＩならびにジスルフィドイソメラーゼタンパク質）は、解析した腫瘍において増加した。それらのタンパク質のうちの４つのタンパク質については、新たに現れた、ｐＩおよびＭｗの両方において観察される変化によって異常電気泳動挙動を示したバンドに基づいて解析した。これらのような異常アイソフォームは、翻訳後修飾の結果として生じる可能性があるため、これらのタンパク質が過剰発現されると結論づけることはできない（図６）。
【０１０７】
１．２  ヒトＨＣＣにおける遺伝子発現の解析
ＭＡＴ１Ａ−／−マウスにおいてこれまでに観察された変化をヒトにおいて可能性のあるＨＣＣバイオマーカーであると考えることができるかどうかを調査するために、２７のタンパク質のうちの２３のタンパク質のレベルを、定量ＰＣＲ技術を用いて、様々な病因の１０種類のＨＣＣにおいて解析した。メチオニンアデノシルトランスフェラーゼおよびグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が低下することは、本発明者らの研究室でこれまでに証明されている(Avila MA, Berasain C, Torres L, Martin-Duce A, Corrales FJ, Yang H, Prieto J, Lu SC, Caballeria J, Rodes J, Mato JM. Reduced ARNm Abundance of the Main Enzymes Involved in Methionine Metabolism in Human Liver Cirrhosis and Hepatocellular Carcinoma. J Hepatol 2000; 33: 907-914)。１３０００１８Ｌ０９  Ｒｉｋタンパク質と２８１０４３５Ｄ１２  Ｒｉｋタンパク質は、データベースの割り当てが他のタンパク質との配列相同性によることから、この研究に含めなかったため、それらの機能はまだ実験的には証明されていない。設計されたプライマーオリゴヌクレオチドを検証するため、２３のＲＴ−ＰＣＲ反応をヒト腫瘍細胞系の混合物で行い、それらの総ての発現が対照肝臓に対して低下していることが実証された。転写量はＨ３Ｆ３Ａヒストン対照遺伝子との相対的差異として表した（２ΔＣｔ、ここで、ΔＣｔは、標的遺伝子と対照遺伝子とのサイクル数の差を表す）。実施した総ての解析ではマンホイットニーＵ検定を有意値ｐ＜０．０５で用いた。ＲＴ−ＰＣＲにより行った発現解析では、２３のタンパク質のうちの１３のタンパク質が対照群に対して有意な変化を示すことが示された。これらのタンパク質は：アルコールデヒドロゲナーゼ、抗酸化タンパク質２、レギュカルチン、ステロール運搬タンパク質２、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、アルブミン、ホスホグルコムターゼ、フェニルアラニン４−ヒドロキシラーゼ、アポリポタンパク質Ａ１、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ、２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ、オルニチンアミノトランスフェラーゼおよびオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼであった。観察された変化が、ＨＣＣを除外するものであるかまたは前腫瘍段階例えば肝硬変に存在するものであるかを調査するために、１３の変化したタンパク質（変化した発現パターンを有するタンパク質）の発現レベルを、腫瘍を発現していないアルコール原因の肝硬変患者（ｎ＝５）とウイルス原因の肝硬変患者（ｎ＝５）の両方のサンプルにおいて、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。この発現解析は、肝硬変の患者において１３のタンパク質のうちの７つのタンパク質（アルコールデヒドロゲナーゼ、抗酸化タンパク質２、レギュカルチン、ステロール運搬タンパク質２、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、アルブミンおよびホスホグルコムターゼ）の発現が対照群に対して有意に変化したことを反映していた。これらの変化は、ウイルス性肝硬変とＨＣＣに罹患している個体の腫瘍周辺組織の５つのサンプルにおいても検出された。解析した組織が腫瘍と関係しているかどうかにかかわらず、有意差は観察されず、そのため、後の研究ではウイルス性肝硬変の患者（ｎ＝１０）を群にすることに決めた。続いて、ＨＣＣを有するが肝硬変のない個体の腫瘍周辺組織サンプルにおいて、１３のタンパク��の発現を解析した。この目的のために、ＲＴ−ＰＣＲにより、肝炎の患者のサンプル（ｎ＝３）および正常肝臓でＨＣＣを発現した患者のサンプル（ｎ＝７）における発現レベルを測定した。アルコールデヒドロゲナーゼは、対照群（ｎ＝６）に対して有意な発現差が観察された唯一のタンパク質であった。
【０１０８】
要約すると、ＭＡＴ１Ａ−／−マウスにおけるＨＣＣのプロテオーム解析により、研究したケースの少なくとも５０％において２７の変化したタンパク質（変化した発現パターンを有するタンパク質）を同定することが可能になった。中でも、１３のタンパク質は、ヒト肝細胞癌において定量ＰＣＲにより検出された。最後に、腫瘍周辺の硬変またはＨＣＣに関係していない硬変における１３の変化のうちの７つの変化が同定されたことにより、診断だけではなく前腫瘍段階の早期検出においてもこのような可能性のあるバイオマーカーパネルの有用性が示唆される（図７）。
【０１０９】
考察
ＷＴ肝臓プロテオームとＭＡＴ１Ａ−／−マウスの腫瘍結節との比較により、腫瘍生物学を特徴づける変化の一部の分子基盤をつくっている、ＨＣＣのプロテオームインプリントをもたらす、１５１の特異なタンパク質を同定することが可能になった。同定された特異なタンパク質の群における変動は、腫瘍結節のプロテオームの不均質性の表れである。さらに、６１．３％の変化は、恐らくは形質転換プロセス中に肝細胞が漸進的に脱分化することにより腫瘍においてレベルが低下しているタンパク質に関連していることが観察された。観察された変化の機能的解析では、形質転換された肝細胞には、代謝活性の低下だけでなく、ＡｄｏＭｅｔの欠乏によって加わる圧力に対する適応であると考えられ得る、ストレス応答に関連するタンパク質の増加もあることが示される。特異なタンパク質は、ミトコンドリア、細胞質、小胞体および細胞骨格に特異的に存在する。特異なタンパク質または遺伝子を比較した際に観察される一致レベルが低いにもかかわらず、代謝および呼吸欠損、ならびにストレス応答は、ゲノムまたはプロテオームアプローチを用いた異なる研究に共通するＨＣＣの機能的プロフィールとなる(Xu XR, Huang J, Xu ZG, Qian BZ et al. Insight into Hepatocellular Carcinogenesis at Transcriptome Level by Comparing Gene Expression Profiles of Hepatocellular Carcinoma with Those of Corresponding Noncancerous Liver. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15089-94; Cynthia RM Yliang, Chon Kar Leow et al. Proteome Analysis of Human Hepatocellular Carcinoma Tissues by Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry. Proteomics 2005; 5: 2258-2271)ため、用いた実験モデルにおいてそれらが特異的に生産されるということを除外することができる。一度病変が生じたら、これらの変化は、肝臓の機能的変化を単純に表しているのかどうか、またはそれは実際にヒトＨＣＣの発症に関与するのかどうかはまだ解明していない。しかしながら、肝臓代謝の変化や数種類の癌の発症に関与する因子の１つとして提示されているミトコンドリア活性の低下は、生まれたばかりのＭＡＴ１Ａ−／−マウスの肝臓で、疾患の兆候が組織学的レベルにおいて検出される前から起こっており、このことからＨＣＣの発現へのそれらの関与が示唆される。
【０１１０】
ＭＡＴ１Ａ−／−マウスの肝臓における１５１の変化したタンパク質（変化した発現パターンを有するタンパク質）のうち、２７のタンパク質が、解析した腫瘍の少なくとも５０％において差異として検出され、このような理由でそれらのタンパク質が可能性のあるＨＣＣマーカーであると考えられた。強調すべきは、高頻度であるために選択されたこの変化群が上述の腫瘍機能表現型：代謝酵素を再現するということであり、その代謝酵素の変化は炭水化物（ホスホグルコムターゼ）、アミノ酸（アルギナーゼ１、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）代謝、メチル基代謝（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ、アデノシルホモシステイナーゼ、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ）、脂質代謝および輸送（ステロール運搬タンパク質２、アポリポタンパク質Ａ１およびＥ）の欠損、ならびに解毒およびストレス応答に関与するタンパク質（７１−ｋＤＡ熱ショックタンパク質、ジスルフィドイソメラーゼタンパク質、グルタチオントランスフェラーゼのアイソフォームＭｕ１およびＰ２）の増加である。さらに、セレン結合タンパク質は、その低下が腫瘍の発現に有利に働く可能性があることから、繊維形成や加齢に関係していた。ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性の変化は、肝臓損傷の指標となるパラメーターとして利用されている。ＭＡＴ１Ａ−／−マウスの腫瘍結節におけるＳＤＨの低下は、形質転換細胞におけるソルビトール代謝能力の喪失と関連している。レギュカルチン（加齢指標タンパク質とも呼ばれる）は、肝臓におけるホメオスタシスおよび細胞機能の維持において重要な役割を果たすカルシウム結合タンパク質である。最後に、グルタミンシンセターゼおよびオルニチンアミノトランスフェラーゼはグルタミン代謝に関与する酵素であり、それらの過剰発現は、一部Ｗｎｔ／β−カテニン経路により、肝癌発症と関連している。齧歯類では、グルタミンシンセターゼ陽性表現型が腫瘍増殖に有利に働くが、この変化は総ての病変に存在するわけではないということが証明されている。ＭＡＴ１Ａ−／−マウスの腫瘍におけるグルタミンシンセターゼレベルの低下は、このような肝臓ＡｄｏＭｅｔ欠乏実験モデルの特性であるかもしれない。しかしながら、本発明者らによって得られた結果からは、用いた解析条件下では検出できない新たな種を生み出す可能性のある翻訳後修飾を除外することはできない。
【０１１１】
ＨＣＣに関連する発現における変化を検出するために腫瘍周辺組織を参照として用いるゲノム研究もプロテオーム研究もある(Kim JW, Ye Q, Forgues M, Chen Y et al. Cancer-Associated Molecular Signature in the Tissue Samples of Patients with Cirrhosis. Hepatology 2004; 39: 518-27；Xu XR, Huang J, Xu ZG, Qian BZ et al. Insight into Hepatocellular Carcinogenesis at Transcriptome Level by Comparing Gene Expression Profiles of Hepatocellular Carcinoma with Those of Corresponding Noncancerous Liver. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15089-94；Lim SO, Park SJ, Kim W, Park SG, Kim HJ et al. Proteome Analysis of Hepatocellular Carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 2002; 291: 1031-37；Kim J, Kim SH, Lee SU, Ha GH, Kang DG et al. Proteome Analysis of Human Liver Tumour Tissue by Two Dimensional Gel Electrophoresis and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry for Identification of Disease-Related Proteins. Electrophoresis 2002; 23: 4142-4156；Kim W, Lim SO, Ryu YH, Byeon JY et al. Comparison of Proteome between Hepatitis B Virus and Hepatitis C Vi
rus Associated Hepatocellular Carcinoma. Clin Cancer Res 2003; 9: 5493-5500；Li C, Hong Y, Tan YX, Zhou H, Ai JH et al. Accurate Quality and Quantitative Proteomic Analysis of Clinical Hepatocellular Carcinoma Using Laser Capture Microdissection Coupled with Isotope-Coded Affinity Tag and Two Dimensional Liquid Chromatography Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics 2004; 3: 399-409；Li C, Tan YX, Zhou H, Ding SJ, Li SJ et al. Proteomic Analysis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma: Identification of Potential Tumour Markers. Proteomics 2005; 5: 1125-1135)。この戦略では、非腫瘍部分に共通した変化や腫瘍に共通した変化の検出はできず、肝炎においてまたはＨＣＣの発現前段階である肝硬変において発現が最初に変化するタンパク質の同定はできないであろう。
【０１１２】
ヒトサンプル解析前のスクリーニング系としてＭＡＴ１Ａ−／−マウスを使用することは、ＨＣＣマーカーの同定に有効であることが分かった。プロテオームの複雑性は、ＭＡＴ１Ａ−／−マウスを用いて行った解析から推定された２７の可能性のあるマーカーとなり、そのうちの１３のマーカーについては、ヒトＨＣＣにおいて、定量ＰＣＲ研究により確認された。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、オルニチンアミノトランスフェラーゼ、ミトコンドリア２型アルデヒドデヒドロゲナーゼ、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ１およびフェニルアラニン４−ヒドロキシラーゼにおける低下は腫瘍でのみ観察されたため、それらは悪性形質転換マーカーであると考えることができた。しかしながら、アルコールデヒドロゲナーゼ、抗酸化タンパク質２、レギュカルチン、ステロール運搬タンパク質２、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、アルブミンおよびホスホグルコムターゼにおける変化、ならびにメチオニンアデノシルトランスフェラーゼおよびグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼにおける変化は、解析した組織が腫瘍と関係しているかどうかにかかわらず、硬変した肝臓で検出された。肝硬変は、ＨＣＣ発現の危険度の高い状況であると考えられるため、これらの変化は、腫瘍にも残り、新生物発生前段階を定義づけることができる初期マーカーとなり得た。正常組織サンプルまたはＨＣＣの肝臓のＣ型肝炎ウイルス−もしくはＢ型肝炎ウイルス−感染組織でのこれらのマーカーの解析は、全く異なる病因の肝臓病変プロセスと関係していたアルコールデヒドロゲナーゼを唯一の例外として、陰性であった。要するに、可能性のあるＨＣＣマーカーのレパートリーは、あるものは初期特異的、他のものは腫瘍特異的であると記載されており、危険にさらされている集団のモニタリングにおいて、そしてこの疾患の早期検出において大変有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】異なるマウス肝臓の一連の写真であり、プロテオーム技術によって解析した腫瘍結節を示している。Ａ）１８ヶ月齢ＷＴの肝臓。Ｂ）ＭＡＴ１Ａ−／−の肝臓（ここでは、およそ５ｍｍの大きさの２つの腫瘍結節が観察できる）。Ｃ）ＭＡＴ１Ａ−／−の肝臓（ここでは、１つの１０−ｍｍ腫瘍結節が観察できる）。
【図２】腫瘍プロテオームの不均質性を示す図である。Ａ）解析した腫瘍結節のプロテオーム変動を例示する二次元ゲル切片。Ｂ）異なるＭＡＴ１Ａ−／−マウスの腫瘍結節間の変動の増加を例示するグラフ。変動率は、解析したバンドの総数に対して観察された差異の割合として定義した。各群につき少なくとも３つの独立した試験を行った。
【図３】同定されたタンパク質の配列に基づいて推測した分子量（Ｍｗ）および等電点(isolectric point)（ｐＩ）と、２Ｄゲルに基づいて算出した対応するバンドの相対移動度（Ｒｆ）との線形相関を示す図である。
【図４】腫瘍結節において異なって発現されたタンパク質の全体的解析を示す図である。１５１の同定されたタンパク質は、Ａ）それらが関与する生物学的プロセスに基づいて、そしてＢ）それらの細胞内部位に基づいて分類された。カラムは、ＷＴと腫瘍の６回の比較のそれぞれにおける変性タンパク質（異なって発現されたタンパク質または発現が変化しているタンパク質）を示す。発現が低減または増加するタンパク質は、それぞれ、緑色および赤色で表している。
【図５】ＭＡＴ１Ａ−／−マウスの肝臓において発現が低いＨＣＣ関連タンパク質を示す図である。
【図６】ＨＣＣ関連タンパク質を示す図である。Ａ）ＭＡＴ１Ａ−／−マウスの肝臓において発現が増加するＨＣＣ関連タンパク質。Ｂ）異常電気泳動挙動を示すＨＣＣ関連タンパク質。
【図７】本発明において同定された、可能性のあるＨＣＣバイオマーカーを示す図である。対照個体におけるｍＲＮＡレベルと異なる肝疾患の患者におけるｍＲＮＡレベルとを、マンホイットニーＵ検定により比較した。アスタリスクの数は達した有意水準を示している（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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