(57)【要約】  本発明は第一の側面において、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物を同定のための方法であって、ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と接触させる、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体を、所定の化合物と共にインキュベーションする、そして化合物が、固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離することができるかどうかを決定する、というステップを包含する前記方法を提供する。さらに本発明は、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１、および所定の化合物と接触させる、そしてインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体を検出する、というステップを包含する前記方法に関する。加えて本発明は、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物の２つのアリコートを提供する、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、一方のアリコートを、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と接触させる、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、他方のアリコートを、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１、および所定の化合物と接触させる、そしてインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の量を決定する、というステップを包含する前記方法を提供する。さらに本発明は、ＬＲＲＫ２の精製のための方法であって、ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固体化されたインドールリガンド９１と接触させる、そして固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離する、というステップを包含する前記方法に関する。2009529860.tif 000008
2009529860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固体化されたインドールリガンド９１と接触させる、
ｃ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体を、所定の化合物と共にインキュベーションする、そして
ｄ）化合物が、固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離することができるかどうかを決定する、
というステップを包含する、前記方法。
【請求項２】
ステップｄ）が、ＬＲＲＫ２の検出またはＬＲＲＫ２の量の決定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
質量分析法または免疫検出法により、ＬＲＲＫ２が検出される、またはＬＲＲＫ２の量が決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１、および所定の化合物と接触させる、そして
ｃ）ステップｂ）で形成されたインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体を検出する、
というステップを包含する、前記方法。
【請求項５】
ステップｃ）において、前記検出を、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の量を決定することにより行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）からｃ）を、異なる化合物を検査するために、いくつかのタンパク質調製物を用いて行う、請求項４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物の２つのアリコートを提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、一方のアリコートを、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と接触させる、
ｃ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、他方のアリコートを、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１、および所定の化合物と接触させる、そして
ｄ）ステップｂ）およびｃ）で形成されたインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の量を決定する、
というステップを包含する、前記方法。
【請求項８】
ステップｂ）と比較して、ステップｃ）で形成されたインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の低減した量は、ＬＲＲＫ２が化合物の標的であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の量が、固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離し、そしてその後にＬＲＲＫ２の量を決定することにより決定される、請求項５から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＬＲＲＫ２の量が、質量分析法または免疫検出法により決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
中程度の処理量またはハイスループットのスクリーニングとして行う、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、合成化合物、または有機合成薬剤、より好ましくは低分子有機薬剤、および天然の低分子化合物、からなる群より選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物が、ＬＲＲＫ２の阻害物質である、請求項１から１２にいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
固体支持体が、アガロース、修飾されたアガロース、セファロースビーズ（例えばＮＨＳ−活性化セファロース）、ラテックス、セルロース、および鉄粒子または強磁性粒子、からなる群より選択される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
インドールリガンド９１が、共有結合により固体支持体にカップリングする、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
医薬組成物を調製するための方法であって、以下の
ａ）請求項１から１５のいずれかに従ってＬＲＲＫ２が相互作用する化合物を同定する、そして
ｂ）相互作用する化合物を医薬組成物に製剤化する、
というステップを包含する、前記方法。
【請求項１７】
ＬＲＲＫ２の精製のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固体化されたインドールリガンド９１と接触させる、そして
ｃ）固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離する、
というステップを包含する、前記方法。
【請求項１８】
ステップｃ）の後に、ＬＲＲＫ２に結合する能力のあるタンパク質の同定をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｃ）の後に、翻訳後修飾のＬＲＲＫ２の決定をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｃ）の後に、ＬＲＲＫ２および/またはＬＲＲＫ２に結合する能力のあるタンパク質のどちらかが、質量分析法または免疫検出法により特徴づけられる、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質調製物の提供が、ＬＲＲＫ２を含有する少なくとも１つの細胞を収集し、その細胞を溶解するステップを含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成のステップを、本質的に生理学的な条件下で行う、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための、インドールリガンド９１の使用。
【請求項２４】
ＬＲＲＫ２の精製のための、インドールリガンド９１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＲＲＫ２のリガンドとしてインドールリガンド９１を使用しての、ＬＲＲＫ２が相互作用する分子の同定、およびＬＲＲＫ２の精製のための方法に関する。さらに本発明は、例えばパーキンソン病の治療のための、前記の相互作用する分子を包含する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）[ＯＭＩＭ１６８６００、ヒトのオンラインメンデル遺伝データベース（ＯＭＭ）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=168600]は、大脳基底核の黒質内のドーパミン作動性ニューロンの変性を特徴とする、不均一な運動性障害である。６０歳以上の人口の２％に発症する。
【０００３】
ＰＤに関する現在の治療戦略は、主にドーパミン作動性薬物療法（例えばレボドパ/カルビドパ）を使用しての、その症状の重症度の低減に集中している。これらの薬物療法は患者に利点を提供できるものの、有害な副作用を示し、長期的治療後には無効となる（ウェアリング・オフ効果）と思われる。これらの治療はどれも、根底にある問題、すなわちドーパミン作動性ニューロンの漸減に対処するものではない。
【０００４】
大きくは、ＰＤには２つの臨床病理学的構成要素がある。第一に、パーキンソン病の運動性障害の主要な特色を包含する症状の用語である、臨床的に定義されたパーキンソニズムが存在する。これら症状は、安静時振戦、寡動（動作の遅さ）、固縮、および姿勢保持反射障害、すなわち動作の開始または停止におけるすべての問題である。これらの病理学的相関は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失である。第二にパーキンソン病は、残存ニューロンにおけるレビー小体およびレビー神経突起の存在によって、死後に特色づけられる。これらは、ユビキチンおよびアルファ−シヌクレインを含む脂質およびタンパク質の細胞内の凝集である。ＰＤの病理学的定義には、黒質細胞の喪失およびインタクトな線条体ニューロンと合わせて、残存黒質ニューロンにおけるアルファ−シヌクレイン陽性レビーの病理の存在が必要である(Cookson, 2005. Annual Reviews in Biochemistry 74, 29-52)。
【０００５】
タンパク質の凝集についてのアルファ−シヌクレイン−中心(centric)理論は近年、タンパク質ＤＪ１、ＰＩＮＫ１およびＯＭＩ/ＨＴＲＡ２の発見により補強された。すなわちそれらタンパク質はすべてミトコンドリアに関連しており、酸化的損傷に対する細胞の保護作用に関係づけられた (Abou-Sleiman et al., 2006. Nature Reviews Neuroscience 7, 207-219)。
【０００６】
ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（Leucine-rich repeat kinase 2、ＬＲＲＫ２、Dardarin（ダーダリン）と同義)の変異が、以前にＰＡＲＫ８遺伝子座に関連付けらた常染色体優性のＰＤを引き起こす、という遺伝的エビデンスが最近提示された。ＬＲＲＫ２の変異は、家族歴を有するＰＤ症例の５から６％を占めると見積もられており、散発例においても同定された。ＬＲＲＫ２は、Ｎ末端のロイシンリッチ反復配列、ＧＴＰアーゼ  ＲＯＣ/ＣＯＲドメイン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）、およびＣ末端のＷＤ４０反復配列から成る、大きな複数のドメインを持つタンパク質である(Paisan-Ruiz et al., 2004. Neuron 44, 595-600; Zimprich et al., 2004. Neuron 44, 601-607)。Paisan-Ruzおよび共同研究者らはこのタンパク質産生物を、振戦を意味するバスク語の”dardara”に由来して、ダーダリンと命名したが、このタンパク質は後にＬＲＲＫ２と改名された。
【０００７】
現在、ＬＲＲＫ２の機能についてはほとんど分かっていないが、予備的な観察がin vitroの過剰発現系においてなされた。ＬＲＲＫ２はプロテインキナーゼをコードし、自己リン酸化の能力がある (West et al., 2005. PNAS 102, 16842-16847, Gloeckner, et al., 2005. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232)。Westらの公開文献は、特異的抗体の助けを用いての、リコンビナントＬＲＲＫ２の精製について記載している。しかし得られたタンパク質の量は、非常に少量であった。
【０００８】
３つのＰＤに関連するＬＲＲＫ２の変異、すなわちキナーゼドメインの２つ（Ｇ２０１９Ｓ およびＩ２０２０Ｔ）ならびにＲＯＣ/ＣＯＲ  ＧＴＰアーゼドメインの１つ（(Ｒ１４４１Ｃ）の変異は、有意にＬＲＲＫ２の自己リン酸化を増大し、優性の機能獲得メカニズムを示唆する。事実ＬＲＲＫ２のＲ１４４１Ｃ、Ｙ１６９９ＣまたはＧ２０１９Ｓ変異体の過剰発現は、マウスの一次皮質ニューロンにおけるニューロンの変性を誘発するのに十分である(Smith et al., 2005. PNAS 102, 18676-18681)。
【０００９】
さらにキナーゼドメインを“kinase-dead”変異のバージョンで置き換えることによる、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性の遺伝子操作は、２つのＰＤの細胞表現型である、封入体の形成を阻害し、細胞死を遅延させる(Greggio et al., 2006. Neurobiol. Dis. 23(2), 329-341)。この観察は、キナーゼの阻害物質が、ＬＲＲＫ２変異を持つ患者、そしておそらく散発性ＰＤの患者の有用な治療薬となることを示唆する。
【００１０】
ＬＲＲＫ２変異が、アルファ−シヌクレイン、タウ、およびユビキチンの病理学を含む、多形性病理学を伴う遅発型ＰＤをもたらすという最近の発見は、パーキンソニズムの一般的な神経変性経路においてＬＲＲＫ２を上流に置く。こうしてＬＲＲＫ２は、パーキンソン病における治療介入および神経保護の魅力的な治療標的となった(Taylor et al., 2006. Trends in Molecular Medicine 12, 76-82)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の点から見て、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法を有効に提供すること、ならびにＬＲＲＫ２の精製のための方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この必要性に答えるため本発明は、第一の側面において、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と接触させる、
ｃ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体を、所定の化合物と共にインキュベーションする、そして
ｄ）化合物が、固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離することができるかどうかを決定する、
というステップを包含する、前記方法を提供する。
【００１３】
さらに第二の側面において本発明は、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、タンパク質調製物を、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１、および所定の化合物と接触させる、そして
ｃ）ステップｂ）で形成されたインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体を検出する、
というステップを包含する、前記方法に関する。
【００１４】
第三の好ましい側面において本発明は、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物の２つのアリコートを提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、一方のアリコートを、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と接触させる、
ｃ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、他方のアリコートを、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１、および所定の化合物と接触させる、そして
ｄ）ステップｂ）およびｃ）で形成されたインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の量を決定する、
というステップを包含する、前記方法を提供する。
【００１５】
本発明の文脈において、驚くことに、インドールリガンド９１がＬＲＲＫ２に関するリガンドであることが発見された。このことはスクリーニングアッセイにおける、すなわちＬＲＲＫ２の競合的スクリーニングアッセイにおける、ならびにＬＲＲＫ２の精製のための方法における、インドールリガンド９１の使用を可能にする。
【００１６】
インドールリガンド９１、すなわち（５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−アミノ−プロピル）−アミド）の構造を、図１に示す。この化合物は、キナーゼ阻害物質Sutent (SU11248; Sun et al., 2003. J. Med. Chem. 46, 1116-1119)と構造的に類似する分子である。インドールリガンド９１は、適切な固体支持体材料に一級アミノ基を介して共有結合によりカップルし、結合するタンパク質の単離に使用することができる。インドールリガンド９１の合成は、実施例１に記載する。本発明に従って、“インドールリガンド９１”という表現はまた、同一のコアを包含するが、固体支持体との連結のための別のリンカー、好ましくは環状構造の部分ではないＮＨ基にカップルしたリンカーを有する化合物を含む。典型的にはリンカーは、８，９または１０原子の骨格を有してよく、カルボキシ−活性基またはアミノ−活性基のどちらかを含有してよい。
【００１７】
本発明に従って、“ＬＲＲＫ２”という表現は、図３に示したようなタンパク質を意味するだけでなく、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または低ストリンジェンシーの条件下で前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるバリアントもまた意味する。好ましくは、これらの低ストリンジェンシーの条件は、３５％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ/ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（ｗｔ/ｖｏｌ）デキストラン硫酸を包含するバッファー中で、１８−２０時間、４０℃でのハイブリダイゼーション、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳから成るバッファー中で、１−５時間、５５℃での洗浄、そして２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳから成るバッファー中で、１．５時間、６０℃での洗浄、を含む。
【００１８】
さらに本発明に従って、“ＬＲＲＫ２”という表現は、ＬＲＲＫ２の変異体の形、好ましくはＰＤ（家族型、ならびに散発性の症例）において観察されるそのような変異体の形を含む。ＬＲＲＫ２遺伝子における変異は、家族性の常染色体優性ＰＤを引き起こすことが示されている(West et al., 2005. PNAS 102, 16842-16847)。より好ましくはこれらの変異体の形は、ただ１つのアミノ酸の変異を含む。
【００１９】
ただ１つのアミノ酸の置換であるＧ２０１９Ｓは、最も高頻度に観察される変異の１つである(Taylor et al, 2006. Trends in Molecular Medicine 12, 76-82)。この変異は活性化ループの保存領域内のキナーゼドメインに位置しており、キナーゼの活性の調節が病理学的メカニズムに関与すると思われることを示唆する。ＰＤで観察される他の変異は、Ｒ１４４１Ｃ、Ｙ１６９９Ｃ、およびＩ２０２０Ｔを含む (Taylorらの表２を参照のこと)。
【００２０】
したがって好ましい態様において、“ＬＲＲＫ２”という表現はまた、Ｇ２０１９Ｓ、Ｒ１４４１Ｃ、Ｙ１６９９Ｃ、またはＩ２０２０Ｔの変異を有するＬＲＲＫ２タンパク質を含む。より好ましくは“ＬＲＲＫ２”という表現はまた、以下の点変異：Ｇ２０１９Ｓ、Ｒ１４４１Ｃ、Ｙ１６９９Ｃ、またはＩ２０２０Ｔの１つを有するＬＲＲＫ２タンパク質を含む。
【００２１】
さらに１５の付加的な推定の病理学的アミノ酸の置換が、ＬＲＲＫ２において同定された(Taylor et al, 2006. Trends in Molecular Medicine 12, 76-82、特に図２を参照のこと)。
【００２２】
したがって好ましい態様において、“ＬＲＲＫ２”という表現はまた、Ｒ７９３Ｍ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｉ１１２２Ｖ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｔ２３５６ＩまたはＧ２３８５Ｒの変異を有するＬＲＲＫ２タンパク質を含む。より好ましくは“ＬＲＲＫ２”という表現はまた、以下の点変異：Ｒ７９３Ｍ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｉ１１２２Ｖ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｔ２３５６ＩまたはＧ２３８５Ｒの１つを有するＬＲＲＫ２タンパク質を含む。
【００２３】
本発明の方法において、最初にＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する。本発明の方法は、ＬＲＲＫ２が調製物中で可溶化されている限り、出発材料としてあらゆるタンパク質調製物を用いて行うことができる。例としては、いくつかのタンパク質の液体混合物、本来の細胞中に存在するすべてのタンパク質を含有しない部分的な細胞溶解物、またはいくつかの細胞溶解物の組み合わせを含む。
【００２４】
部分的な細胞溶解物は、最初に細胞小器官（例えば核、ミトコンドリア、リボソーム、ゴルジ、等）を単離した後、これら細胞小器官由来のタンパク質調製物を調製することにより、得ることができる。細胞小器官の単離法は、当該技術において公知である(”Current Protocols in Protein Science”、編集者: John.E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8における、第4.2章  Purification of Organelles from Mammalian Cells（哺乳類細胞由来の小器官の精製）)。
【００２５】
加えてタンパク質調製物は、細胞抽出物の分画、それにより特定のタイプのタンパク質、例えば細胞質タンパク質または膜タンパク質を濃縮することにより調製することができる(”Current Protocols in Protein Science”、編集者: John.E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8における、第4.3章 Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells（組織培養細胞の細胞内分画）)。
【００２６】
さらに体液（例えば血液、脳脊髄液、腹水、および尿）由来のタンパク質を使用することができる。
例えばモデル生物体、例えば線虫(C. Elegans)の定義された発達段階または成体期由来の全胚溶解物、を使用することができる。加えて、臓器全体、例えばマウスから解離した心臓を、タンパク質調製物の原料とすることができる。これらの臓器はまた、タンパク質調製物を得るためにin vitroで灌流することができる。
【００２７】
さらにタンパク質調製物は、リコンビナントにより産生されたＬＲＲＫ２を含有する調製物であってよい。原核生物および真核生物の細胞においてリコンビナントタンパク質を産生するための方法は、広く確立されている(”Current Protocols in Protein Science”、編集者: John.E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, 1995, ISBN: 0-471-14098-8における、第5章Production of Recombinant Proteins（リコンビナントタンパク質の産生）)。
【００２８】
本発明の方法の好ましい態様において、タンパク質調製物の提供は、ＬＲＲＫ２を含有する少なくとも１つの細胞を収集し、その細胞を溶解するステップを含む。
好ましい態様において、細胞は細胞培養系の一部であり、細胞培養系からの細胞の収集法は、当該技術において公知である（上記文献）。
【００２９】
細胞の選択は、主にＬＲＲＫ２の発現に依存する、というのは選択された細胞中にこのタンパク質が基本的に存在することが保証なければならないからである。所定の細胞が本発明の方法のための適切な出発システムであるかどうかを決定するため、ウェスタンブロット、ＰＣＲを基本とする核酸検出法、ノーザンブロット、およびＤＮＡマイクロアレイ法（“ＤＮＡチップ”）のような方法が、興味ある所定のタンパク質が細胞中に存在するかどうかを決定するために適切かもしれない。
【００３０】
細胞の選択はまた、研究の目的によっても影響を受けることになる。所定の薬剤に関するin vivoの有効性を分析する必要がある場合には、所望の治療効果が起こる細胞または組織（例えば抗神経変性薬に関しては脳組織）が選択されることになる。反対に望ましくない副作用を仲介するタンパク質標的の解明には、副作用が観察される細胞または組織（例えば薬剤代謝に関しては肝組織）を分析することになる。
【００３１】
さらに、ＬＲＲＫ２を含有する細胞は、例えば生検により生物体から得てよいことは、本発明の範囲内と認識される。対応する方法は、当該技術において公知である。例えば生検は、少量の組織を入手するために使用される診断法であり、その組織を次に顕微鏡によりまたは生化学的方法で調べることができる。生検は、疾患を診断、分類し、ステージを決定するために重要であるが、薬剤治療を評価しモニタリングするためにも重要である。
【００３２】
少なくとも１つの細胞の収集と同時に溶解を行うことは本発明の範囲内に包括的に含まれる。しかし細胞を最初に収集し、次に別に溶解することも等しく好ましい。
細胞の溶解のための方法は、当該技術において公知である(“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry”, Wiley 2003、編集者: Somenath Mitra, 出版ISBN：0471328456; オンラインISBN: 0471457817における、第８章、Karwa and Mitra: Sample preparation for the extraction, isolation, and purification of Nuclei Acids（核酸の抽出、単離および精製のためのサンプルの調製）)。異なる細胞タイプおよび組織の溶解は、ホモジェナイザー（例えばPotter−ホモジェナイザー）、超音波破砕器、酵素による溶解、界面活性剤（例えばＮＰ−４０、Triton Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ）、浸透圧ショック、凍結および解凍を繰り返すこと、またはこれらの方法の組み合わせ、により達成することができる。
【００３３】
本発明の方法に従ってタンパク質調製物は、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と接触させる。
【００３４】
本発明において、“インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体”という用語は、例えば共有結合により、または最も好ましくは非共有結合により、インドールリガンド９１がＬＲＲＫ２と相互作用する複合体を表示する。
【００３５】
当業者は、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を可能にするために、どのような条件を適用することができるかわかるだろう。
本発明の文脈において、“複合体の形成を許容する条件下”という用語は、そのような形成、好ましくはそのような結合が可能であるすべての条件を含む。この条件には、固定化された相上に固体支持体を有し、その上に溶解物を注ぐという可能性を含む。もう１つの好ましい態様において、固体支持体は粒子状の形であり細胞溶解物と混合することもまた含まれる。
【００３６】
非共有結合という状況において、インドールリガンド９１とＬＲＲＫ２間の結合は、例えば塩橋、水素結合、疎水性相互作用、またはそれらの組み合わせを介する。
好ましい態様において、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成のステップは、本質的に生理学的条件下で行う。細胞内のタンパク質の生理学的状態は、Petty, 1998 (Juan S. Bonifacino, Mary Dasso, Joe B. Harford, Jennifer Lippincott-Schwartz、, and Kenneth M. Yamada (編) Current Protocols in Cell Biology、著作権 (c) 2003 John Wiley & Sons, Inc. 著作権所有．における、Howard R. Petty、第1章、単元1.5。DOI: 10.1002/0471143030.cb0101s00  オンライン投稿日:2001年５月、出版公開日: 1998年10月)に記載されている。
【００３７】
本質的に生理学的な条件下での接触は、リガンド、細胞調製物（すなわち特徴づけられるべき酵素）および所望により当該化合物間の相互作用が、可能な限り天然の条件を反映するという利点を有する。“本質的に生理学的な条件”は、とりわけ、本来の未加工のサンプル材料において存在する条件である。それらには、生理学的タンパク質濃度、ｐＨ、塩濃度、バッファー能力、および関与するタンパク質の翻訳後修飾を含む。“本質的に生理学的な条件”という用語は、サンプルの由来する、本来の生存している生物体における条件と同一である条件を必要するのではなく、本質的に細胞様の条件または細胞の条件に近い条件を必要とする。当業者はもちろん、結果的により細胞様でない条件をもたらす実験上の設定によって、ある種の束縛が生じてよいことを理解するだろう。例えば生きている生物体からサンプルを採取し加工する時に、結果的には必要な細胞壁または細胞膜の破壊は、生物体内に見出される生理学的条件と同一ではない条件を必要としてよい。本発明の方法を実践するための生理学的条件の適切なバリエーションは、当業者には明らかとなろう、そしてまた本明細書において使用する場合“本質的に生理学的な条件”という用語により包括的に含まれる。まとめると、“本質的に生理学的な条件”という用語は、例えば天然の細胞において見出されるような生理学的条件に近い条件に関するが、必ずしもこれらの条件が同一である必要はない。
【００３８】
好ましくは“本質的に生理学的な条件”は、５０−２００ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ６．５−８．５、２０−４５℃、および０．００１−１０ｍＭ  二価カチオン（例えばＭｇ＋＋、Ｃａ＋＋）を包含してよい；より好ましくは、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ７．２から７．６、５ｍＭ  二価カチオン、そしてしばしば０．０１−１．０パーセントの不特定のタンパク質（例えばＢＳＡ）を含んでよい。非イオン系界面活性剤 (Tween、ＮＰ−４０、Triton−Ｘ１００)もしばしば存在することができ、通常約０．００１から２％、典型的には０．０５−０．２％（容積/容積）で存在することができる。一般的なガイダンスとして、以下の緩衝化水性条件：二価カチオン（１種または複数種）および/または金属キレート剤、および/または非イオン系界面活性剤の所望による添加を伴う、１０−２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５−５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ５−８、を適用可能としてよい。
【００３９】
本発明の内容においてインドールリガンド９１は、固体支持体上に固定化される。本発明を通して、“固体支持体”という用語は、低分子のリガンドをその表面上に固定化することのできるあらゆる不溶性支持体に関する。
【００４０】
さらに好ましい態様に従って固体支持体は、アガロース、修飾されたアガロース、セファロースビーズ（例えばＮＨＳ−活性化セファロース）、ラテックス、セルロース、および鉄粒子(ferro particle)または強磁性粒子、からなる群より選択される。
【００４１】
インドールリガンド９１は、共有結合または非共有結合のどちらかにより、固体支持体にカップリングしてよい。非共有結合には、ストレプトアビジンマトリクスに結合するビオチンアフィニティーリガンドを介しての結合を含む。
【００４２】
好ましくはインドールリガンド９１は、共有結合により固体支持体にカップルする。
カップリングの前にマトリクスは、インドールリガンド９１とのカップリング反応を可能にする活性な基、例えばＮＨＳ、カルボジイミド等を含有することができる。インドールリガンド９１は、直接的なカップリングにより（例えば官能基、例えばアミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、およびケトン基を使用して）、および間接的なカップリングにより（例えばビオチンを介して：ビオチンはインドールリガンド９１に共有結合により結合し、そしてビオチンが、固体支持体に直接結合するストレプトアビジンに非共有結合により結合する）、固体支持体にカップルすることができる。
【００４３】
固体支持体材料への連結は、開裂可能なリンカーおよび非開裂リンカーを伴ってよい。開裂は、酵素による開裂または適切な化学的方法を用いての処理により達成してよい。
インドールリガンド９１を固体支持材料に結合するための好ましい結合の接合部分は、Ｃ原子の骨格を持つリンカーである。典型的にはリンカーは、８、９または１０原子の骨格を有する。等しく好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。
【００４４】
当業者は、本発明の方法の個々のステップ間に洗浄ステップが必要であってよいことを認識するだろう。そのような洗浄は当業者の知識の一部である。洗浄は、固体支持体から細胞溶解物の非結合成分を除去するのに役立つ。非特異的な（例えばシンプルなイオン性の）結合の相互作用は、低レベルの界面活性剤を加えることにより、または洗浄バッファーの塩濃度に対する適度の調整により最小とすることができる。
【００４５】
本発明の同定法に従って、読み取りシステムは、ＬＲＲＫ２の検出または決定（本発明の第一の側面）、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の検出（本発明の第二の側面）、インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の量の決定（本発明の第三の側面）のいずれかである。
【００４６】
本発明の第二の側面に従ってのインドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の検出は、ＬＲＲＫ２に対して作成された標識抗体、および適切な読み取りシステムを使用することにより行うことができる。
【００４７】
ＬＲＲＫ２に対して作成される抗体およびそれらの使用法は、当該技術において公知であり、抗体の標識化のための方法（例えば蛍光色素による）もまた知られている。抗−ＬＲＲＫ２抗体は、市販により入手可能である(Sant Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)。加えて、ＬＲＲＫ２の変異型（例えばＰＤの家族型において観察されるＧ２０１９ＳおよびＩ２０２０Ｔのアミノ酸の置換）に対して作成された抗体も、市販により入手可能である(Abgent, San Diego, CA, USA)。
【００４８】
しかし本発明の第二および第三の側面の過程において、ＬＲＲＫ２は固定化されたインドールリガンド９１から分離されることが好ましい。
本発明に従って分離は、インドールリガンド９１とＬＲＲＫ２間の相互作用を断ち切るあらゆる措置を意味する。これには、好ましい態様において、固定化されたインドールリガンド９１からのＬＲＲＫ２の溶出を含む。
【００４９】
溶出は、以下に詳細に記載するような非特異的な試薬（イオン強度、ｐＨ値、界面活性剤）を使用することにより達成することができる。加えて、興味ある化合物がＬＲＲＫ２を特異的に溶出することができるかどうかを、検査することができる。そのようなＬＲＲＫ２が相互作用する化合物については、以下のセクションにさらに記載する。
【００５０】
相互作用を断ち切るためのそのような非特異的方法は、基本的には当該技術において公知であり、リガンド酵素の相互作用の性質に依存する。基本的には、イオン強度、ｐＨ値、温度の変化、または界面活性剤を用いてのインキュベーションが、標的酵素を固体化されたリガンドから解離するための適切な方法である。溶出バッファーを適用することで、極端なｐＨ値（高いｐＨもしくは低いｐＨ；例えば０．１Ｍクエン酸塩を使用することによりｐＨをｐＨ２−３に低下させる）、イオン強度の変化（例えばＮａＩ、ＫＩ、ＭｇＣｌ２、もしくはＫＣｌを使用しての高い塩濃度）、疎水性相互作用を断ち切る極性を低減させる物質（例えばジオキサンもしくはエチレングリコール）、または変性剤（カオトロピックな塩もしくは界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ；総説：Subramanian A., 2002, Immunoaffinty chromatography）により、結合パートナーを解離することができる。
【００５１】
一部の場合、固体支持体は好ましくは、放出された材料から分離されなければならない。このことに関する個々の方法は、固体支持体の性質に依存し、当該技術においては公知である。支持体材料がカラム内に含有される場合、放出される材料は、カラムからの流出物として集めることができる。支持体材料が溶解物成分と混合されている（いわゆるバッチ法）場合は、付加的な分離ステップ、例えば緩やかな遠心が必要と思われ、放出された材料は上清として集められる。あるいは、ビーズを磁気装置を使用することによりサンプルから除去することができるように、磁気ビーズを固体支持体として使用することができる。
【００５２】
本発明の最初の側面に従っての方法のステップｄ）において、ＬＲＲＫ２が、固定化されたＬＲＲＫ２から分離されたかどうかを決定する。このステップに、ＬＲＲＫ２の検出またはＬＲＲＫ２の量の決定を含んでよい。
【００５３】
結果的に、本発明のすべての同定法の好ましい態様において、ＬＲＲＫ２の検出、またはその量の決定のための方法が使用される。そのような方法は当該技術において公知であり、物理化学的方法、例えばタンパク質のシーケンシング（例えばエドマン分解法）、質量分析法、またはＬＲＲＫ２に対して作成された抗体を利用する免疫検出法、による分析を含む。
【００５４】
好ましくは質量分析法または免疫検出法により、ＬＲＲＫ２を検出する、またはＬＲＲＫ２の量を決定する。
質量分光分析（質量分析法）を用いてのタンパク質の同定は、当該技術において公知であり（Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858; Mann et al., 2001, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry（質量分析法によるタンパク質およびプロテオームの分析）、 Annual Review of Biochemistry 70, 437-473）、実施例のセクションでさらに説明する。
【００５５】
好ましくは質量分光分析は、定量的な様式で、例えばｉＴＲＡＱ技術(相対的および絶対的定量のための同重体タグ)、またはｃＩＣＡＴ（開裂可能な、同位体でコードされたアフィニティタグ）を使用することにより行う(Wu et al., 2006. J. Proteome Res. 5, 651-658)。
【００５６】
本発明のさらに好ましい態様に従って、質量分析法（ＭＳ）による特徴づけは、ＬＲＲＫ２のプロテオティピック(proteotypic)ペプチドの同定により行う。プロテオティピックペプチドの概念は、実施例のセクションで詳細に記載する。考え方は、ＬＲＲＫ２をプロテアーゼで消化し、得られたペプチドをＭＳにより決定するというものである。結果として、同じ原料タンパク質由来のペプチドに関するペプチドの頻度は大きく異なっているが、このタンパク質の同定に“典型的に”寄与する最も高頻度に観察されるペプチドを、“プロテオティピックペプチド”と名付ける。したがってプロテオティピックペプチドは、本発明において使用する場合、特定のタンパク質またはタンパク質のアイソフォームを一意的に同定する、実験的に十分に観察可能なペプチドである。
【００５７】
好ましい態様に従って、本発明の方法を実践する過程で得られたプロテオティピックペプチドを、公知のプロテオティピックペプチドと比較することにより、特徴づけを行う。というのは、ＭＳにおけるタンパク質の同定のために、プロテアーゼ消化により調製されたフラグメントを使用する場合、所定の酵素に関しては通常同じプロテオティピックペプチドが観察され、所定のサンプルに関して得られたプロテオティピックペプチドを、酵素の所定のクラスの酵素に関して既に知られているプロテオティピックペプチドと比較し、それによりサンプル中に存在する酵素を同定することが可能であるからである。
【００５８】
質量分光分析に代わるものとして、溶出されたＬＲＲＫ２（共溶出される結合パートナーまたは足場タンパク質を含む）を、ＬＲＲＫ２に対して作成された特異的抗体を使用することにより検出することができる。
【００５９】
さらにもう１つの好ましい態様において、共溶出される結合パートナーの正体が質量分光分析によって一度確立されてしまえば、各結合パートナーを、このタンパク質に対して作成された特異的な抗体を用いて検出することができる。
【００６０】
適切な抗体に基づいたアッセイには、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、および抗体アレイ、またはそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない。そのような分析が確立されていることは当該技術において公知である（Short Protocols in Molecular Biology.第４版, 編集：F.M. Ausubelら, Wiley, New York, 1999における：第11章, Immunology（免疫学）, ページ11-1 から11-30 ）。
【００６１】
これらのアッセイは、興味ある酵素を検出し定量するという方向で設定できるだけでなく、翻訳後修飾のパターン、例えばリン酸化を分析することも可能である。例えばキナーゼの活性化状態は、特異的な抗ホスホチロシン抗体、抗ホスホセリン抗体、または抗ホスホスレオニン抗体を用いて、リン酸化の状態を探索することにより、決定することができる。そのような抗ホスホ抗体を選択し使用する方法は、当該技術において公知である（Zhang et al., 2002. Journal of Biological Chemistry 277, 43648-43658）。
【００６２】
さらに本発明の同定法は、ＬＲＲＫ２が相互作用する分子であるというそれらの能力について検査する化合物の使用を伴う。
基本的には本発明に従って、そのような化合物は、ＬＲＲＫ２と相互作用することのできるあらゆる分子であることができる。好ましくは化合物は、ＬＲＲＫ２における効果、例えば刺激、活性化、または阻害の効果を有する。
【００６３】
好ましくは前記化合物は、合成のまたは天然に産生される化学化合物または有機合成薬剤、より好ましくは低分子、有機薬剤、または天然の低分子化合物、からなる群より選択される。好ましくは前記化合物は、そのような化合物を含有するライブラリから出発して同定される。その場合、本発明の過程において、そのようなライブラリをスクリーニングする。
【００６４】
そのような低分子は、好ましくはタンパク質または核酸ではない。好ましくは低分子は、１０００Ｄａより小さい、より好ましくは７５０Ｄａより小さい、最も好ましくは５００Ｄａより小さい分子量を呈する。
【００６５】
本発明に従っての“ライブラリ”は、異なる個々の実体の高速の機能分析（スクリーニング）、そして同時にライブラリを形成する個々の実体の迅速な同定を提供する、その双方を可能にする選別様式において提供される、（多数の）異なる化学的実体の（ほとんどは大きな）コレクションに関する。例としては、ハイスループット形式で、１つまたはそれより多くの定義された潜在的に相互作用するパートナーとの反応に加えることのできる化学化合物を含有する、試験管、またはウェル、または表面上のスポットのコレクションである。双方のパートナーの所望の“ポジティブな”相互作用の同定の後、それぞれの化合物をライブラリの構築により迅速に同定することができる。合成および天然の由来物質のライブラリは、当業者が購入またはデザインする、そのどちらかとすることができる。
【００６６】
ライブラリの構築の例は、例えばBreinbauer R, Manger M, Scheck M, Waldmann H. Natural product guided compound library development（天然産生物から導かれた化合物のライブラリの開発）. Curr Med Chem. 2002 Dec;9(23):2129-45に提供されており、同文献において、天然の産生物は、それが生物学的関連性の立証された記録を有する場合に、コンビナトリアルライブラリのデザインのための生物学的に認められた出発ポイントとして記載されている。医化学および化学的生物学における天然産生物のこの特別な役割は、構造生物学およびバイオインフォマティクスにより獲得されるタンパク質のドメイン構造に関する新しい洞察をふまえて、解釈することができる。ドメインファミリー内の個々の結合ポケットの具体的な必要性を満たすために、天然産生物の構造を化学的バリエーションにより最適化することが必要となると思われる。固相化学は、この最適化プロセスのための有効なツールとなると言われており、この分野における最近の進歩が、この総説の文献において強調されている。その他の関連する参考文献として、Edwards PJ, Morrell AI. Solid-phase compound library synthesis in drug design and development.（薬剤のデザインおよび開発における固相の化合物ライブラリの合成） Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Jul;5(4):594-605.； Merlot C, Domine D, Church DJ. Fragment analysis in small molecule discovery.（低分子の発見におけるフラグメント分析） Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 May;5(3):391-9. 総説；Goodnow RA Jr. Current practices in generation of small molecule new leads.（低分子新規リード化合物の創出における現在の実践） J Cell Biochem Suppl. 2001;Suppl 37:13-21；を含み、同文献は、多くの製薬会社における現在の薬剤発見のプロセスは、ハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用するための、高品質のリード構造の大きなそして増大するコレクションを必要とする、と記載している。多様な構造および“薬剤様”の特性を持つ低分子のコレクションは、これまでにいくつかの手段により：従来の内部リードの最適化努力の保存記録により、化合物の販売元からの購入により、および会社合併後の別々のコレクションの統合により、獲得されてきた。ハイスループット/コンビナトリアル化学は、新規リードの創出の過程における重要な構成要素であるとして記載されているが、合成のためのライブラリデザインの選択、およびその後のライブラリメンバーのデザインは、挑戦および重要性の新たなレベルへと進化してきた。多数の生物学的標的に対して多数の低分子化合物をスクリーニングするライブラリデザインの潜在的利点が、新規リードの構造を発見するための実質的な機会を提供している。
【００６７】
本発明の第二の側面の好ましい態様において、ＬＲＲＫ２は、最初に化合物と共に、次に固定化されたインドールリガンド９１と共にインキュベーションする。しかし化合物および固定化されたインドールリガンド９１を、ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質と共に同時にインキュベーションすること（共インキュベーション）も、等しく好ましい（競合的結合アッセイ）。
【００６８】
好ましくはＬＲＲＫ２は、最初に化合物と共に１０から６０分間、より好ましくは３０から４５分間、４℃から３７℃の温度で、より好ましくは４℃から２５℃、最も好ましくは４℃の温度でインキュベーションする。好ましくは化合物は、１μＭから１ｍＭ、好ましくは１０から１００μＭの範囲である濃度で使用する。固定化されたリガンドと接触させる第二のステップは、好ましくは１０から６０分間、４℃で行う。
【００６９】
同時にインキュベーションする場合、ＬＲＲＫ２は好ましくは、化合物および固定化されたインドールリガンド９１と共に、１０から１２０分間、より好ましくは２０から６０分間、４℃から３７℃の温度で、より好ましくは４℃から２５℃、最も好ましくは４℃から８℃の温度で、同時にインキュベーションする。好ましくは化合物は、１ｎＭから１００μＭ、好ましくは１０ｎＭから１０μＭの範囲である濃度で使用する。
【００７０】
さらに本発明の第二の側面のステップａ）からｃ）は、異なる化合物を検査するため、いくつかのタンパク質調製物を用いて行ってよい。本態様は、中程度の処理量またはハイスループットのスクリーニングの状況において、殊に興味深い（以下参照）。
【００７１】
第三の側面に従っての本発明の方法の好ましい態様において、ステップｂ）と比較して、ステップｃ）で形成されたインドールリガンド９１の低減した量が、ＬＲＲＫ２が化合物の標的であることを指摘する。これは、本発明のこの方法のステップｃ）において、化合物がＬＲＲＫ２との結合に関してリガンドと競合するという事実に起因する。もし化合物と共にインキュベーションしたアリコート中に、より少量のＬＲＲＫ２しか存在していなければ、この結果は好ましくは、化合物が酵素との相互作用に関して阻害物質と競合したこと、したがって化合物はこの酵素の直接的な標的であり、逆もまた真であることを意味する。
【００７２】
好ましくは本発明の同定法は、中程度の処理量またはハイスループットのスクリーニングとして行う。そのようなアッセイは当業者に公知である（Mallari et al., 2003, A generic high-throughput screening assay for kinases: protein kinase A as an example（キナーゼ：一例としてプロテインキナーゼＡ、に関するジェネリックなハイスループットスクリーニング）, Journal of Biomolecular Screeing 8, 198-204； Rodems et al., 2002, A FRET-based assay platform for ultra-high density screening of protein kinases and phosphatases（プロテインキナーゼおよびホスファターゼの超高密度スクリーニングのためのＦＲＥＴに基づいたアッセイプラットフォーム）, Assay and Drug Development Technologies 1 (1PT1), 9-19）。
【００７３】
本発明に従って同定された相互作用化合物は、それがＬＲＲＫ２活性、例えばそのキナーゼ活性における効果を有するかどうかを決定することにより、さらなる特徴づけを行ってよい（West et al., 2005. PNAS 102, 16842-16847）。そのようなアッセイは当該技術において、また中程度の処理量からハイスループットのスクリーニングを認容にするフォーマットにおいて、公知である。
【００７４】
手短には、フルオレセイン標識ペプチドの基質をチロシンキナーゼ（例えばＬＲＲＫ２）、ＡＴＰ、および抗ホスホチロシン抗体と共にインキュベーションしてよい。反応の進行につれて、リン酸化されたペプチドは抗ホスホチロシン抗体と結合し、結果として分極シグナルの増加をもたらす。キナーゼを阻害する化合物は、低い分極シグナルという結果をもたらすことになる。
【００７５】
あるいはアッセイは、修飾された間接的なフォーマットにおいて設定することができる。蛍光ホスホペプチドを、高い分極シグナルを生じる抗−ホスホ−チロシン抗体との複合体の形成のトレーサーとして使用する。標識されていない基質がキナーゼによりリン酸化されると、産生物は抗体に関して、蛍光リン酸化ペプチドと競合する。その時蛍光ペプチドは抗体から溶液中に放出され、結果として分極シグナルを喪失することになる。直接的および間接的なアッセイの双方を、プロテインチロシンキナーゼ活性の阻害物質を同定するために使用することができる（Seethala, 2000, Methods 22, 61-70; Seethala and Menzel, 1997, Anal. Biochem. 253, 210-218; Seethala and Menzel, 1998, Anal. Biochem. 255, 257-262）。
【００７６】
この蛍光分極アッセイは、抗ホスホチロシン抗体を、抗ホスホセリン抗体または抗ホスホスレオニン抗体に置き換えることにより、プロテインセリン/スレオニンキナーゼを用いての使用に適応することができる（Turek et al., 2001, Anal. Biochem. 299, 45-53, PMID 11726183; Wu et al., 2000, J. Biomol. Screen. 5, 23-30, PMID 10841597）。
【００７７】
本発明に従って同定された化合物は、さらに最適化してよい（リードの最適化）。そのような化合物のこのその後の最適化は、これらのリード創出ライブラリにコードされている構造活性相関(structure-activity relationship、ＳＡＲ)の情報故に、しばしば加速される。リードの最適化は、フォローアップ合成に関するハイスループット化学（ＨＴＣ）法を容易に適用できるため、しばしば促進される。
【００７８】
そのようなライブラリおよびリード化合物の最適化の一例は、Wakeling AE, Barker AJ, Davies DH, Brown DS, Green LR, Cartlidge SA, Woodburn JR. Specific inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by 4-anilinoquinazolines（４−アミイリノキナゾリンによる上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼの特異的な阻害）. Breast Cancer Res Treat. 1996;38(1):67-73に記載されている。
【００７９】
本発明はさらに、医薬組成物の調製のための方法であって、以下の
ａ）上に記載したようなＬＲＲＫ２が相互作用する化合物を同定する、そして
ｂ）相互作用する化合物を医薬組成物に製剤化する、
というステップを包含する、前記方法に関する。
【００８０】
したがって本発明は、被験者に有効量で投与してよい医薬組成物の調製のための方法を提供する。好ましい側面において、治療薬は実質的に精製される。治療する被験者は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、等のような動物を含むがこれに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。特定の態様において、ヒト以外の哺乳動物が被験者である。
【００８１】
一般に本発明の医薬組成物は、治療有効量の治療薬、および医薬的に受容可能な担体を包含する。特定の態様において、“医薬的に受容可能な”という用語は、国家もしくは州政府の規制当局によって認可されていること、または米国薬局方、もしくは動物、そしてより特定すればヒトにおける使用に関するその他の一般に認識されている薬局方に列記されていること、を意味する。“担体”という用語は、それ共に治療薬を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。そのような医薬的担体は、滅菌された液体、例えば水、および石油、動物、野菜または合成由来のものを含む油類、すなわちピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油、等を含むがこれに限定されない、であることができる。水は、医薬組成物が経口投与される場合、好ましい担体である。生理食塩水およびブドウ糖水溶液は、医薬組成物が静脈内投与される場合、好ましい担体である。生理食塩水溶液およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液は、注射可能な溶液用の液体担体として好ましく利用される。適切な医薬用賦形剤として、スターチ、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石灰粉末、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、等を含む。所望であれば組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放製剤、等の形をとることができる。組成物は、座剤として、従来の結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いて、製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等を含むことができる。適切な医薬用担体の例は、E.W. Martin による"Remington's Pharmaceutical Sciences" に記載されている。そのような組成物は、治療有効量の治療薬を、好ましくは精製された形で、患者への適当な投与のための剤形を提供するような適切な量の担体と共に、含有することになる。製剤は、投与の様式に適合していなければならない。
【００８２】
好ましい態様において組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応する医薬組成物として、ルーチンの製法に従って製剤化する。典型的には静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水溶性バッファー中の溶液である。必要な場合には、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬、例えばリドカインを含んでよい。一般に成分は、ユニット投与剤形中に、別々にまたは一緒に混合してのどちらかで、例えば活性薬剤の量を指し示す密閉封入容器、例えばアンプルまたはサシェ内の、乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されることになる場合、組成物は、滅菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入瓶を用いて分注することができる。組成物が注射により投与される場合、注射用の滅菌水または滅菌生理食塩水のアンプルを、投与前に成分を混合してよいように、提供することができる。
【００８３】
本発明の治療薬は、中性または塩の形として製剤化することができる。医薬的に受容可能な塩は、遊離カルボキシル基で形成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、等から誘導されるもの、遊離アミン基で形成されるもの、例えばイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等から誘導されるもの、そしてナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄、等から誘導されるものを含む。
【００８４】
特定の障害または状態の治療において有効となる本発明の治療薬の量は、障害または状態の性質に依存することになり、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、in vitroアッセイを所望により利用して、最適投与量の範囲を同定する助けとしてもよい。製剤中に利用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重症度にも依存し、担当医の判断および各患者の状況に従って決定されなければならない。しかし静脈内投与用の適切な投与量の範囲は、一般に体重１キログラム当たり、約２０−５００マイクログラムの活性化合物である。鼻腔内投与用の適切な投与量の範囲は、一般に約０．０１ｐｇ/ｋｇ体重から１ｍｇ/ｋｇ体重である。有効な用量は、in vitroまたは動物モデルの検査システムから導かれた用量−応答曲線より外挿してもよい。一般に座剤は、０．５％から１０％（重量）の範囲の活性成分を含有してよい；経口製剤は好ましくは１０％から９５％の活性成分を含有する。
【００８５】
様々な送達システムが知られており、本発明の治療薬を投与するために使用することができる、例えばリポソーム内の封入、微粒子、およびマイクロカプセルの使用：治療薬を発現する能力のあるリコンビナント細胞の使用、受容体を介したエンドサイトーシスの使用（例えばWu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）；レトルウイルスまたはその他のベクターの一部としての治療薬の核酸の構築、等が挙げられる。導入の方法は、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口という経路を含むが、これに限定されない。化合物は、あらゆる利用しやすい経路により、例えば注入により、ボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜（例えば経口、直腸、および腸粘膜、等）を通しての吸収により投与してよく、そして他の生物学的に活性な薬剤と合わせて投与してよい。投与は全身性でも局所的であることもできる。加えて本発明の医薬組成物を、心室内および包膜内への注射を含むあらゆる適切な経路により、中枢神経系内に導入することが望ましくてもよい；心室内注射は、例えばレザーバー(reservoir)、例えばオマヤレザーバー(Ommaya reservoir)につないだ心室内カテーテルにより促進してよい。経肺投与もまた、例えば吸入器またはネブライザー、およびエアゾール化剤を含む製剤を使用することにより、利用することができる。
【００８６】
特定の態様において、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所的に投与することが望ましくてよい。これは、限定するものではないが、術中の局所注入、局所的な塗布、例えば術後の創傷のドレッシングと組み合わせて、注射により、カテーテルの手段により、座剤の手段により、または植込みの手段により、達成してよい。前記の植込みは、メンブレン、例えばシアラスチック(sialastic)メンブレン、もしくはファイバーを含む、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質の材料から成る。１つの態様において投与は、悪性腫瘍または新生物または前新生物の組織の部位（または以前に存在した部位）への直接的な注射によるものであることができる。
【００８７】
もう１つの態様において、治療薬は小胞内、特にリポソーム内にて送達することができる(Langer, 1990, Science 249:1527-1533）。
なおもう１つの態様において、治療薬はコントロールされた放出システムを介して送達することができる。１つの態様において、ポンプを使用してよい（Langer、前出）。なおもう１つの態様において、コントロールされた放出システムは治療標的の近位、すなわち脳におくことができ、したがって全身への用量の一部分しか必要としない。
【００８８】
本発明はさらに、ＬＲＲＫ２の精製のための方法であって、以下の
ａ）ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物を提供する、
ｂ）インドールリガンド９１−ＬＲＲＫ２複合体の形成を許容する条件下で、固体支持体上に固定化されたインドールリガンド９１と、タンパク質調製物を接触させる、そして
ｃ）固定化されたインドールリガンド９１からＬＲＲＫ２を分離する、
というステップを含む、前記方法に関する。
【００８９】
上述のように、驚くことにインドールリガンド９１はＬＲＲＫ２のリガンドであることが、発見された。このことは、効率的なＬＲＲＫ２精製法を可能にする。
ＬＲＲＫ２、ＬＲＲＫ２を含有するタンパク質調製物、インドールリガンド９１と接触させるための条件、固定化されたインドールリガンド９１、インドールリガンド−ＬＲＲＫ２複合体、固定化されたインドールリガンド９１からのＬＲＲＫ２の分離、およびＬＲＲＫ２の検出またはその量の決定に関して、本発明の同定法について上に定義したような態様をまた、本発明の精製法に適用する。
【００９０】
好ましい態様において、本発明の精製法はさらにステップｃ）の後に、ＬＲＲＫ２に結合する能力のあるタンパク質の同定を包含する。このステップは、複合体の形成が本質的に生理学的な条件下で行われる場合、殊に興味深い。というのはその場合結合パートナー、酵素サブユニット、または翻訳後修飾の存在を含む酵素の、天然の条件を保持することが可能であり、次にはそれを質量分析法（ＭＳ）の助けを持って同定することができるからである。
【００９１】
結論として好ましい態様において、本発明の精製法はさらに、ステップｃ）の後にＬＲＲＫ２が翻訳後修飾されているかどうかの決定を包含する。
本発明はさらに、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定のため、およびＬＲＲＫ−２の精製のための、インドールリガンド９１の使用に関する。上に定義したような態様はまた、本発明の使用にも適用する。
【００９２】
本発明をさらに以下の図および実施例により説明するが、これらは本出願の請求項によって与えられた保護の範囲について限定するものとして考慮されるものではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１：開裂可能なインドールリガンド９１の合成）
インドールリガンド９１：  ５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−アミノ−プロピル）−アミドの合成
ステップ１：５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン
ヒドラジン水和物（５５％、１０ｍｌ）中の５−フルオロイサチン（１ｇ）の溶液を、１１０℃で３０分間加熱した。一度懸濁液が溶液になったら、反応液を１１０℃で４時間加熱し、その後０℃に冷却した。沈殿物を濾過し、水で洗浄した。固体を水（１０ｍｌ）に懸濁し、濃ＫＣｌを加えてｐＨをｐＨ２に下げ、溶液を室温で５時間撹拌した。沈殿物を集め、固体を水（２×１５ｍｌ）で洗浄し、真空オーブン中で４０℃で乾燥させた（０．２６ｇ、３０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２（ｓ，１Ｈ）；  ６．８−７．０（ｄｄ，２Ｈ）；６．６（ｍ，１Ｈ）；３．２（ｓ，２Ｈ）；。ＬＣＭＳ：方法Ｄ，ＲＴ＝１．７３６分，［ＭＨ＋＝１５２］。
【００９４】
ステップ２：｛３−［（５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル）−アミノ］−プロピル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル
ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）中の、５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾル−３−カルボン酸（０．３００ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（０．５１６ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．３６４ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．５０２ｍｌ、３．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパン（０．３７５ｍｌ、２．１５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１５時間撹拌した。かん水（１．５ｍｌ）、水（１．５ｍｌ）、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）の混合物を加え、１０Ｎ  水酸化ナトリウムを加えて、溶液のｐＨを１２に調整した。溶液からジクロロメタン：メタノール（９：１）の混合物で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル（５０から１００％））により精製して、所望の化合物を黄色固体（０．３０ｇ、５２％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９０（ｓ，１Ｈ）；９．５０（ｓ，１Ｈ）；７．５０（ｍ，１Ｈ）；６．９０（ｍ，１Ｈ）；３．２０（ｑ，２Ｈ）；３．００（ｑ，２Ｈ）；２．３０（ｓ，３Ｈ））；２．２０（ｓ，３Ｈ））；１．６０（ｍ，２Ｈ））；１．４０（ｓ，９Ｈ）。ＬＣＭＳ：方法Ｄ，ＲＴ＝２．１０３分，［Ｍ＋Ｎａ＋＝３４６］，および  Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｎａ＋＝２４６］。
【００９５】
ステップ３：［３−（｛５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル｝−アミノ）−プロピル］−カルバミン酸tert−ブチルエステル
エタノール（２ｍｌ）中の、｛３−［（５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル）−アミノ］−プロピル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（０．２００ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、および５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（０．０１１ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ピロリジン（０．００３ｍｌ）の溶液を、７８℃で３時間加熱した。反応液を０℃に冷却し、得られた沈殿物を濾過し、冷却エタノールで洗浄した。産生物をエタノール（４ｍｌ）中に懸濁し、７２℃で３０分間撹拌した。反応液を濾過し、沈殿物を真空オーブン中で４０℃で乾燥させて、所望の化合物を固体（０．２６５ｇ、９４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．８（ｓ，１Ｈ）；１１．００（ｓ，１Ｈ）；７．８０（ｍ，２Ｈ）；７．７０（ｍ，１Ｈ）；７．０（ｍ，１Ｈ）；６．９（ｍ，２Ｈ）；３．３０（ｑ，２Ｈ）；３．１０（ｑ，２Ｈ）；２．５０（ｄｄ，６Ｈ）１．６０（ｍ，２Ｈ））；１．４０（ｓ，９Ｈ）。ＬＣＭＳ：方法Ｄ，ＲＴ＝２．８６分，［Ｍ＋Ｎａ＋＝４７９］，および［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｎａ＋＝３７９］。
【００９６】
ステップ４：５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−アミノ−プロピル）−アミド
［３−（｛５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル｝−アミノ）−プロピル］−カルバミン酸tert−ブチルエステルを、メタノール中に懸濁した。ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｎ）２ｍｌを加え、反応液を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去して、所望の化合物（０．０９８ｇ、９１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．８（ｓ，１Ｈ）；１１．００（ｓ，１Ｈ）；７．９０−７．７０（ｍ，５Ｈ）；６．９（ｍ，２Ｈ）；３．３０（ｑ，２Ｈ）；２．８０（ｑ，２Ｈ）；２．５０（ｄｄ，６Ｈ）１．８０（ｍ，２Ｈ）。ＬＣＭＳ：蛍光により不確定。
【００９７】
すべての反応は不活性の雰囲気下で行った。ＮＭＲスペクトルは、Bruker dpx400にて得た。ＬＣＭＳは、zorbax SBC-18、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ−５μカラム、または小さなカラム：ZORBAX（登録商標）SB-C18、４．６×７５ｍｍ、３．５ミクロン（“ショートカラム”）を用いてAgilent 1100にて行った。カラム流量は１ｍｌ/分であり、使用した溶媒は、１０μｌの注入容積を含み、水およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）であった。波長は２５４および２１０ｎｍであった。方法を以下に記載する。
【００９８】
【表１】
2009529860.tif 000003
【００９９】
【表２】
2009529860.tif 000004
【０１００】
（実施例２：固定化されたインドールリガンド９１を用いての薬剤のプルダウン、およびＬＲＲＫ２の同定）
本実施例は、マウス脳の溶解物由来のＬＲＲＫ２の同定のための、固定化されたインドールリガンド９１の使用を実証する。固定化されたインドールリガンド９１に結合するタンパク質は、化学的なプロテオミクスの方法を使用して同定した。結合しているタンパク質は、インドールリガンド９１を共有結合により結合した樹脂上で精製した。その後結合したタンパク質を溶出し、その後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し（図２を参照のこと）、適切なゲルのバンドを切り出し、タンパク質をＬＣ−ＭＳ/ＭＳ質量分析法により分析した。
【０１０１】
結果は、固定化されたインドールリガンド９１を使用して、マウス脳の溶解物由来のＬＲＲＫ２を濃縮し、特徴づけることができることを示す。質量分析法により同定された１２のＬＲＲＫ２ペプチドを、表４に列記する。
【０１０２】
１．低分子アミン化合物の固定化
ＮＨＳ−活性化セファロース4 Fast Flow (Amersham Biosciences,17-0906-01)を無水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Fluka、４１６４８、Ｈ２Ｏ＜＝０．００５％）で平衡化した。１ｍｌの落ち着かせた(settled)ビーズを、１５ｍｌのファルコン試験管に入れ、化合物のストック溶液（通常ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中の１００ｍＭ）を加え（最終濃度０．２−２μｍｏｌ/ｍｌビーズ）、同様に１５μｌのＴＥＡを加えた。ビーズを、室温、暗所で、転倒型振盪機(Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.)上で、１６−２０時間インキュベーションした。カップリングの効率をＨＰＬＣにより決定した。未反応のＮＨＳ基は、アミノエタノールと共に室温、転倒型振盪機上で、一晩インキュベーションすることによりブロックした。ビーズを１０ｍｌのＤＭＳＯで洗浄した。洗浄したビーズは、イソプロパノール中で４℃で保存した。
【０１０３】
２．細胞の溶解物の調製
マウス脳組織は、Potter S ホモジェナイザー中（１つの脳当たり５ｍｌ）：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＣＨＡＰＳＯ、５％グリセロール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５、でホモジェナイズした。２５ｍｌのバッファー当たり、１錠のコンプリートＥＤＴＡフリー(complete EDTA-free) 錠(プロテアーゼインヒビターカクテル、Roche Diagnostics, 1 873 580)を加えた。材料を、機械化されたPOTTER Sを使用して１０回粉砕し、５０ｍｌのファルコン試験管に移し、３０分間氷上でインキュベーションし、４℃、２０，０００ｇ(予冷したSorvall SLA600にて１０，０００ｒｐｍ)で１０分間遠沈した。上清を超遠心機（ＵＺ）のポリカーボネートチューブ(Beckmann, 355654)に移し、４℃、１００，０００ｇ（予冷したTi50.2にて３３．５００ｒｐｍ）で１時間遠心した。上清を再び新しい５０ｍｌのファルコン試験管に移し、タンパク質濃度をBradford アッセイ(BioRad)により決定し、１アリコート当たり５０ｍｇのタンパク質を含有するサンプルを調製した。サンプルは直ちに実験に使用するか、または液体窒素中で凍結して−８０℃で凍結保存した。
【０１０４】
３．化合物のプルダウン実験
固定化された化合物を伴うセファロースビーズ（１回のプルダウン実験当たり１００μｌビーズ）を溶解バッファー中で平衡化し、５０ｍｇのタンパク質を含有する細胞溶解物サンプルと共に、転倒型振盪機(Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.)上で２時間、４℃でインキュベーションした。ビーズを採集し、Mobicol-カラム (MoBiTech 10055)に移し、０．５％界面活性剤（ＮＰ４０）を含有する１０ｍｌの溶解バッファーで洗浄し、続いて０．２５％界面活性剤を含む５ｍｌの溶解バッファーで洗浄した。結合したタンパク質を溶出するため、６０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、カラムを３０分間５０℃で加熱し、溶出液を、遠心分離により微量遠心管に移した。次にタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。
【０１０５】
４．質量分析法によるタンパク質の同定
４．１  質量分光分析前のタンパク質の消化
ゲルで分離したタンパク質を、本質的にはShevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68:850-858により記載されている方法に従って、ゲル中で還元、アルキル化、および消化を行った。手短にはゲルで分離したタンパク質は、清浄なメスを使用してゲルから切除し、１０ｍＭ  ＤＴＴ（５ｍＭ  炭酸水素アンモニウム中、５４°Ｃ、４５分）を使用して還元し、その後に５５ｍＭ  ヨードアセトアミド（５ｍＭ  炭酸水素アンモニウム中）を用いて、室温、暗所で（３０分間）アルキル化した。還元およびアルキル化したタンパク質を、５ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の１２．５ｎｇ/μｌのプロテアーゼ濃度のブタトリプシン(Promega)を含むゲル中で消化した。消化は、４時間、３７℃で放置して進行させ、その後に５μｌの５％ギ酸を用いて反応を停止させた。
【０１０６】
４．２  質量分析法による分析前のサンプル調製
ゲルのプラグ(plug)から、２０μｌの１％ＴＦＡで２回抽出し、酸性化した消化上清と共にプールした。サンプルを真空遠心機中で乾燥させ、１３μｌの１％ＴＦＡ中に再懸濁した。
【０１０７】
４．３  質量分析のデータの獲得
ペプチドサンプルを、四重極型ＴＯＦ(QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass)、またはイオントラップ型(LCQ Deca XP)質量分析計のどちらかに直接連結したナノＬＣシステム(CapLC, Waters またはUltimate, Dionex) 中に注入した。ペプチドは、水性溶媒および有機性溶媒（以下参照）の濃度勾配を使用して、ＬＣシステムにて分離した。溶媒Ａは、０．５％ギ酸中の５％アセトニトリルであり、溶媒Ｂは、０．５％ギ酸中の７０％アセトニトリルであった。
【０１０８】
【表３】
2009529860.tif 000005
【０１０９】
４．４  タンパク質の同定
ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ実験で得られたペプチドの質量および断片化のデータを使用して、ＮＣＢＩ（the NCBInr、dbESTならびにヒトゲノムおよびマウスゲノムに関する) および欧州生命情報学研究所(European Bioinformatics Institute、ＥＢＩ、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、および線虫のプロテオームデータベースに関する)にて維持され、定期的にアップデートされている、fastaフォーマットによるタンパク質配列および核酸配列のデータベースにクエリーを行った。測定されたペプチドの質量およびフラグメンテーションのデータを、ソフトウェアツールMascotを使用して、データベースにエントリーされているものから計算された同じデータと、相関させることによりタンパク質を同定した(Matrix Science; Perkins et al., 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data（質量分析データを使用して配列データベースを検索することによる可能性に基づいたタンパク質の同定）.  Electrophoresis 20, 3551-3567)。検索基準は、どの質量分析計を分析に使用したかに依存して修正した。
【０１１０】
【表４】
2009529860.tif 000006
【０１１１】
（実施例３：ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物の同定に関するスクリーニングアッセイ）
本実施例は、検査化合物を細胞溶解物に直接加える、競合的結合アッセイについて記載する。検査化合物、および固定化されたインドールリガンド９１を伴うアフィニティーマトリクスを、溶解物のアリコートに加え、放置して溶解物サンプル中に含有されるタンパク質に結合させる。インキュベーション時間の後、捉えたタンパク質を伴うビーズを溶解物から分離する。次に結合したタンパク質を溶出し、溶出液中のＬＲＲＫ２の存在を、ドットブロット法およびOdyssey赤外検出システムにおいて、特異的な抗体を使用して検出および定量する。様々な濃度の検査化合物を使用することにより、用量応答曲線を作成する。さらなる実験情報は、ＷＯ２００６／１３４０５６に開示されている。
【０１１２】
アフィニティーマトリクスの洗浄
実施例１に記載したようなアフィニティーマトリクスを、０．４％ＮＰ４０を含有する１×ＤＰバッファーで２回洗浄した後、０．４％ＮＰ４０（２０％ビーズスラリー）を含有する１×ＤＰバッファー中に再懸濁する。
【０１１３】
【表５】
2009529860.tif 000007
【０１１４】
５倍濃縮（５×）ＤＰバッファーを０．２２μｍフィルターを通して濾過し、−８０℃で保存する。１×ＤＰバッファーを得るためには、５×ＤＰバッファーを蒸留水で１：５に希釈する。ストック溶液は、以下の供給元より得る：１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５(Sigma, T-2663)、８７％グリセロール (Merck, カタログ番号04091.2500)；１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２(Sigma, M-1028)；５．０Ｍ  ＮａＣｌ(Sigma, S-5150)。
【０１１５】
検査化合物の調製
検査化合物のストック溶液は、最終的な所望の検査濃度と比較して、１００倍の高濃度に対応するものをＤＭＳＯ中に調製する（例えば４００μＭストック溶液を、４μＭの最終検査濃度用に調製する）。この希釈スキームは、結果的にアッセイにおいて１％の最終ＤＭＳＯ濃度となる。すべてのサンプルが１％ＤＭＳＯを含有するように、コントロール実験（検査化合物なし）用には１％ＤＭＳＯを含有するバッファーを使用する。
【０１１６】
細胞溶解物の調製および希釈
細胞溶解物は、実施例２に記載したように調製する。典型的な実験として、５０ｍｇのタンパク質を含有する１つの溶解物のアリコートを３７℃の水浴中で解凍した後、４℃に維持する。この溶解物に、１倍量(one volume)の１×ＤＰバッファーを０．４％の最終ＮＰ４０濃度となるように加える。次に５０倍濃縮プロテアーゼ阻害剤溶液の最終容積の１/５０量を加える（１錠のプロテアーゼ阻害剤を、０．４％ＮＰ４０を含有する０．５ｍｌの１×ＤＰバッファー中に溶かす；Roche Diagnostics, カタログ番号41647による、ＥＤＡＴフリー錠プロテアーゼインヒビターカクテル）。５ｍｇ/ｍｌの最終タンパク質濃度となるように、０．４％ＮＰ４０を含有する１×ＤＰバッファーを加えることにより、溶解物をさらに希釈する。
【０１１７】
検査化合物およびアフィニティーマトリクスを伴う溶解物のインキュベーション
容量１００μｌの希釈した溶解物を、９６ウェルフィルタープレートの各ウェルに分注する。次にＤＭＳＯ中に希釈した１．５μｌの検査化合物を加える。コントロール反応用に、検査化合物を含まない１．５μｌ  ＤＭＳＯを使用する。次に１ウェル当たり５０μｌのアフィニティーマトリクス（２０％スラリー）を加える。このプレートを２時間、４℃で、振盪機上でインキュベーションする。プレートを、真空マニフォールド装置(Millipore, MAVM 096 0R)を使用して洗浄する。各ウェルを、０．４％ＮＰ−４０を含有する４００μｌの１×ＤＰバッファーで４回、そして０．２％ＮＰ−４０を含有する４００μｌの１×ＤＰバッファーで２回、洗浄する。
【０１１８】
溶出のため、フィルタープレートをコレクションプレート上に置き、ＤＴＴ（最終濃度５０ｍＭ）を含む、４０μｌの２×サンプルバッファー（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８；４％ＳＤＳ；２０％グリセロール；０．０２％ブロムフェノールブルー）を各ウェルに加える。プレートを３０分間、室温で振盪機上て(７５０ｒｐｍ、Thermomixer, Eppendorf)インキュベーションする。その後にプレートを２分間、１１００ｒｐｍ(Heraeus遠心機)で遠心し、溶出液をコレクションプレートのウェル内に集める。
【０１１９】
溶出されたＬＲＲＫ２の検出および定量
溶出液中のＬＲＲＫ２タンパク質は、ＬＲＲＫ２に対して作成された第一抗体（Santa Cruz Biotechnolgy, Santa Cruz, CA, USA）および蛍光標識された第二抗体（抗マウスIRDye（商標）800, Rockland, 610-732-124より）を使用して、ドットブロット法により検出および定量する。LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA)によるThe Odyssey Infrared Imaging（Odyssey赤外画像）システムを、製造元により提供された使用説明書に従って操作する(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence（赤外蛍光を用いての定量的な２色ウェスタンブロット検出）. 2004 年5月、LI-COR Biosciences, www.licor.comにより公開)。
【０１２０】
ドットブロット装置は、供給元(Bio-Dot 精密濾過装置、BioRad 170-65)の使用説明書に従って使用する。ニトロセルロース膜(BioTrace NT Nitrocellulose, PALL BTNT30R)は、２０％エタノールで処理し、その後１×ＰＢＳバッファーで洗浄する。１ドット当たり、３０μｌの溶出液サンプルを使用する。
【０１２１】
ＬＲＲＫ２の検出のため、膜は、Odysseyブロッキングバッファー(LICOR, 927-40000)を用いて１時間、室温でインキュベーションすることにより、最初にブロックする。次にブロックした膜を、０．２％  Tween-２０を含有するOdysseyブロッキングバッファー中に希釈した抗ＬＲＲＫ２抗体と共に、１６時間、４℃でインキュベーションする。膜は、０．１％  Tween２０を含有する１×ＰＢＳバッファーで４回洗浄した後、０．２％  Tween-２０を含有するOdysseyブロッキングバッファー中に希釈した検出抗体（抗マウスIRDye（商標）800, Rockland, 610-732-124より）と共に、４０分間インキュベーションする。その後膜を、１×ＰＢＳバッファー/０．１％  Tween２０、各々５分間で、４回、そして１×ＰＢＳバッファー、５分間で、１回、洗浄する。膜はＰＢＳバッファー中に４℃で維持し、その後Odyssey装置でスキャンし、シグナルを記録し、製造元の使用説明書に従って分析する。
【０１２２】
（実施例４：ＬＲＲＫ２キナーゼアッセイ）
本実施例は、ＬＲＲＫ２が相互作用する化合物が、ＬＲＲＫ２キナーゼ阻害物質であるかどうかを決定するために使用することができるアッセイについて記載する。このアッセイは、先に記載されているように（West et al., 2005. PNAS 102, 16842-16847）行う。
【０１２３】
Ｍｙｃエピトープタグを含む完全長ＬＲＲＫ２  ｃＤＮＡクローンを、哺乳類の発現ベクター中にクローン化する。発現プラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ  ６．０試薬 (Roche Applied Science)を、製造元の使用説明書に従って使用することにより、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中に一過的に形質移入する。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン （１００ユニット/ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したOpti-ＭＥＮ培地 (Invitrogen)中で培養する。キナーゼアッセイ用のリコンビナントＬＲＲＫ２タンパク質を調製するため、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を免疫沈降バッファー（ＰＢＳ中の、０．５％Triton−Ｘ−１００、１×コンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)）中で収集し、溶解物を４℃で１時間インキュベーションし、続いて１７，５００×ｇで１５分間遠心する。上清分画を、マウスモノクローナル抗−ｃ−ｍｙｃ抗体（クローン9E10; Roche）と予め複合体化させたプロテインＧセファロース4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech)と結合させ、続いて試験管を回転させながら一晩インキュベーションする。プロテインＧセファロース複合体を、遠心してペレット化し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを補充したバッファーで５回、１×ＰＢＳバッファーで１回洗浄する。
【０１２４】
Ｇセファロースに結合した、Ｍｙｃタグを付けたＬＲＲＫ２タンパク質を、２５μＭ  ビオチン化ミエリン塩基性タンパク質(ＭＢＰ; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)と共に、氷上で、キナーゼバッファー（２０ｍＭ  Hepes、ｐＨ７．４；１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５ｍＭ  ＥＧＴＡ；２０ｍＭ  ベータ−グリセロールホスフェート）中に再懸濁する。キナーゼの反応は、０．５μＣｉの［ガンマ３２Ｐ］ＡＴＰ(Perkin Elmer)および１５μＭ  ＡＴＰを加えることにより開始する。混合物を３０℃で１５分間インキュベーションする。反応液を氷上に置き、２．５Ｍ  グアニジン−ＨＣｌを加えることにより反応を停止させる。ユニバーサルキナーゼアッセイキット(Calbiochem)を使用して、反応液にアビジン溶液(Calbiochem)を加えて、２５℃で１０分間インキュベーションすることにより、ビオチン化ＭＢＰに取り込まれた放射性同位元素を定量する。反応液を８００×ｇで２分間遠心し、上清をアビジン結合膜を含有するカラムに入れ、製造元のプロトコルに従って洗浄する。取り込まれた放射性同位元素の量を、液体シンチレーションのカウントにより測定する。
【０１２５】
ＬＲＲＫ２の自己リン酸化活性は、ＭＢＰを加えないことを除き、上に記載したようなキナーゼ反応液において決定する。反応液は、１５分間３０℃でインキュベーションし、５％  ２−メルカプトエタノールを含有するLaemmliサンプルバッファーを加えることにより反応を停止させる。反応液を１０分間７５℃で加熱した後、氷上に置く。短い遠心の後、サンプル（上清）を６％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移し、BioMax フィルム(Kodak)に暴露させる。膜を、抗ｃ−ｍｙｃ抗体(9E10; Roche)でプローブし、各反応におけるＬＲＲＫ２の量を決定する。オートラジオグラフィーおよびウェスタンブロットのバンドを、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ  ５．０を使用し、それによりリン酸化ＭＢＰの量を各実験のＬＲＲＫ２の量に対して標準化することにより、定量する。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１：開裂可能なインドールリガンド９１の構造    図は、連結可能なインドールリガンド９１の構造を示す。遊離一級アミノ基を、固体支持体材料との共有結合のカップリングに使用することができる。
【図２】図２：固定化されたインドールリガンド９１を用いての薬剤のプルダウン実験    図は、クーマシーブルーによる染色後のタンパク質のゲルの図を示す。固定化されたインドールリガンド９１に結合したタンパク質を、ＳＤＳサンプルバッファーで溶出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。指摘されたゲル領域をゲルのスライスとして切り出し、タンパク質を質量分析法により分析を行った。ＬＲＲＫ２を含有するバンドの位置は、００ｂおよび０１ａ間のゲルの上部のサンプル０１にある。
【図３】図３：ＬＲＲＫ２の同定されたペプチド    マウスＬＲＲＫ２配列 (IPI00227565.2, 2527アミノ酸)の、質量分光分析によって同定されたペプチドを下線で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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