(57)【要約】本発明は、シグナル配列のN−領域及び／または前記N−領域及び／または親水性ポリペプチドを含む前記シグナル配列の疎水性断片を含む改変されたシグナル配列で構成された分泌エンハンサーを使用した、外来タンパク質の分泌効率向上方法に関するものである。本発明の方法は、不溶性沈澱を防いでペリプラズムまたは細胞外流体への組換えタンパク質の分泌効率を増加させることで組換え外来タンパク質の生産に利用することができ、また、強力な分泌エンハンサーを使用して組換えタンパク質の膜透過性を高めることで治療用途のタンパク質の伝達にも利用することができる。2009525042.tif 000010
2009525042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（I）プロモーター、及び
（II）前記プロモーターに作動可能に連結されたシグナル配列（signal  sequence）のN−領域を含む、ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む、
外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項２】
前記プロモーターが、ウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターである、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ウイルス起源のプロモーターが、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）（CMV）プロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、鶏痘ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、牛乳頭腫ウイルスプロモーター、鳥類肉腫ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、B型肝炎ウイルスプロモーター、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターまたは猿ウイルス40（SV40）プロモーターからなる群より選択される、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記原核生物起源のプロモーターが、T7プロモーター、SP6プロモーター、熱ショックタンパク質（heat−shock  protein）70プロモーター、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、またはtacプロモーターからなる群より選択される、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記真核生物起源のプロモーターが、酵母起源のプロモーター、植物起源のプロモーターまたは動物細胞起源のプロモーターである、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項６】
酵母起源のプロモーターが、3−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、エノラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルベートジカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、グルコース−6−リン酸イソメラーゼプロモーター、3−ホスホグリセレートムターゼプロモーター、ピルベートキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ2プロモーター、イソチトクロムCプロモーター、酸ホスファターゼ（acidic  phosphatase）プロモーター、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）GAL1プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL7プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL10プロモーター、またはピキア・パストリス（Pichia  pastoris）AOX1プロモーターからなる群より選択される、請求項5に記載の発現ベクター。
【請求項７】
動物細胞起源のプロモーターが、熱ショックタンパク質プロモーター、プロアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターからなる群より選択される、請求項5に記載の発現ベクター。
【請求項８】
シグナル配列が、ウイルス、原核生物または真核生物起源のシグナル配列または先導配列（leader  sequence）である、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項９】
シグナル配列が、OmpAシグナル配列、CT−B（コレラトキシンサブユニットB（cholera  toxin  subunit B））シグナル配列、LTIIb−B（大腸菌不安定性エンテロトキシンBサブユニット（E．coli  heat−labile  enterotoxin  B  subunit））シグナル配列、BAP（細菌アルカリホスファターゼ（bacterial  alkaline  phosphatase））シグナル配列、酵母カルボキシペプチダーゼ（Yeast  carboxypeptidase）Yシグナル配列、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces  lactis）のキラートキシンガンマサブユニット（killer  toxin  gamma  subunit）シグナル配列、牛成長ホルモン（bovine  growth  hormone）のシグナル配列、インフルエンザノイラミニダーゼ（influenza  neuraminidase）のシグナルアンカー（signal−anchor）、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファ（Translocon−associated  protein  subunit  alpha）のシグナル配列、及び双方アルギニン転座（Twin−arginine  translocation）（Tat）シグナル配列からなる群より選択される、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
N−領域を含むポリペプチド断片が、特徴的にシグナル配列の1番目ないし3番目アミノ酸を含む3ないし21個のアミノ酸の長さで構成されるペプチドである、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記N−領域を含むポリペプチド断片のpI値が、少なくとも8である、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された分泌エンハンサーをさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
分泌エンハンサーが、少なくとも60％の親水性アミノ酸である2ないし50個のアミノ酸で構成された親水性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項12に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
N−領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドに作動可能に連結されたタンパク質分解酵素認識部位をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
タンパク質分解酵素認識部位が、Xa因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼ（Genenase）I認識部位及びフリン（Furin）認識部位からなる群より単独または融合の形態で選択される、請求項14に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
分泌エンハンサーをコードするヌクレオチドがタンパク質分解酵素認識部位をコードするヌクレオチドに作動可能に連結された、請求項12に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
タンパク質分解酵素認識部位が、Xa因子タンパク質分解認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位及びフリン認識部位からなる群より単独または融合の形態で選択される、請求項16に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
外来タンパク質をコードする遺伝子の挿入のための制限酵素部位をさらに含む、請求項1または請求項12に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
外来タンパク質が、一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメイン（amphipathic  domain）がないタンパク質である、請求項18に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインのない外来タンパク質が、Mefp1である、請求項18に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
遺伝子コンストラクトが外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
（I）プロモーター、
（II）前記プロモーターに作動可能に連結されたシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性領域で構成された疎水性断片をコードするポリヌクレオチド、及び
（III）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された分泌エンハンサー、
から構成された遺伝子コンストラクトを含む、
外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項２３】
前記プロモーターが、ウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターである、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記ウイルス起源のプロモーターが、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、鶏痘ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、牛乳頭腫ウイルスプロモーター、鳥類肉腫ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、B型肝炎ウイルスプロモーター、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターまたは猿ウイルス40（SV40）プロモーターからなる群より選択される、請求項23に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記原核生物起源のプロモーターが、T7プロモーター、SP6プロモーター、熱ショックタンパク質70プロモーター、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、またはtacプロモーターからなる群より選択される、請求項23に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記真核生物起源のプロモーターが、酵母起源のプロモーター、植物起源のプロモーターまたは動物細胞起源のプロモーターである、請求項23に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
酵母起源のプロモーターが、3−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、エノラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルベートジカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、グルコース−6−リン酸イソメラーゼプロモーター、3−ホスホグリセレートムターゼプロモーター、ピルベートキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ2プロモーター、イソチトクロムCプロモーター、酸ホスファターゼプロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL1プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL7プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL10プロモーター、またはピキア・パストリスAOX1プロモーターからなる群より選択される、請求項26に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
動物細胞起源のプロモーターが、熱ショックタンパク質プロモーター、プロラクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターからなる群より選択される、請求項26に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
シグナル配列が、ウイルス、原核生物または真核生物起源のシグナル配列または先導配列である、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
シグナル配列が、OmpAシグナル配列、CT−B（コレラトキシンサブユニットB）シグナル配列、LTIIb−B（大腸菌不安定性エンテロトキシンBサブユニット）シグナル配列、BAP（細菌アルカリホスファターゼ）シグナル配列、酵母カルボキシペプチダーゼYシグナル配列、クルイベロマイセス・ラクティスのキラートキシンガンマサブユニットシグナル配列、牛成長ホルモンのシグナル配列、インフルエンザノイラミニダーゼのシグナルアンカー、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファのシグナル配列、及び双方アルギニン転座（Tat）シグナル配列からなる群より選択される、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
シグナル配列の疎水性断片が、シグナル配列の1番目ないし6番目アミノ酸を含む6ないし21個のアミノ酸で構成されるペプチドである、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
分泌エンハンサーが、少なくとも60％が親水性アミノ酸である2ないし50個のアミノ酸で構成されたペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
分泌エンハンサーが、pI値が少なくとも10の親水性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
親水性アミノ酸が、リジンまたはアルギニンである、請求項32に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
分泌エンハンサーが、親水性アミノ酸が6個反復したペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドがタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドに作動可能にさらに連結された、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドが外来遺伝子の挿入のための制限酵素部位にさらに連結された、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドが遺伝子コンストラクトに作動可能にさらに連結された、請求項22に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
外来タンパク質が、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質である、請求項37または請求項38に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質が、平目ヘプシジンIである、請求項39に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
請求項1〜請求項22の一方の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して製造した、非ヒト形質転換体。
【請求項４２】
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質、またはシグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及び分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン及び両親媒性ドメインが有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー（secretional  enhancer）、及び前記外来タンパク質を順次に含む融合タンパク質、またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；及び
6）工程5）の形質転換体を培養する工程を含む、
外来タンパク質の分泌効率を高める方法。
【請求項４３】
前記外来タンパク質が、不溶性タンパク質である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
疎水性親水性指標プロファイルが、疎水性親水性指標プロファイル分析用コンピューターソフトウェアまたはウェブ基盤のアプリケーションで分析される、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
コンピューターソフトウェアが、DNASIS（商標）、Visual  OMP、Lasergene、pDRAW32及びNetSupportからなる群より選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
分泌エンハンサーが、少なくとも60％が親水性アミノ酸である2ないし50個のアミノ酸で構成されたペプチドである、請求項42に記載の方法。
【請求項４７】
分泌エンハンサーが、pI値が少なくとも10の親水性ペプチドである、請求項42に記載の方法。
【請求項４８】
親水性アミノ酸が、リジンまたはアルギニンである、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及びタンパク質分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン及び両親媒性ドメインを有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び外来タンパク質を順次に含む融合外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；
6）工程5）の形質転換体を培養する工程；及び
7）工程6）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程を含む、
融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項５０】
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及びタンパク質分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン及び両親媒性ドメインを有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；
6）工程5）の形質転換体を培養する工程；及び
7）工程6）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；及び
8）前記タンパク質分解酵素認識部位をタンパク質分解酵素で切断した後、工程7）の分離した融合外来タンパク質から元の形態の外来タンパク質を分離する工程を含む、
元の形態の外来タンパク質の製造方法。
【請求項５１】
1）請求項18の発現ベクターの制限酵素部位に外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して組換え発現ベクターを構築する工程；
2）工程1）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び
3）工程2）の形質転換体を培養する工程を含む、
外来タンパク質の分泌効率を高める方法。
【請求項５２】
1）請求項37の発現ベクターの制限酵素部位に外来タンパク質をコードする遺伝子を作動可能に連結して組換え発現ベクターを構築する工程；
2）工程1）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び
3）工程2）の形質転換体を培養する工程を含む、
外来タンパク質の分泌効率を高める方法。
【請求項５３】
1）請求項38の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
2）工程1）の形質転換体を培養する工程；
3）培養液から前記外来タンパク質を分離する工程；及び
4）前記分離した外来タンパク質にタンパク質分解酵素を処理して、元の形態の外来タンパク質を分離する工程を含む、
元の形態の外来タンパク質の製造方法。
【請求項５４】
外来タンパク質が、脳を標的にする治療用タンパク質である、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
請求項54に記載の方法で製造され、脳血管障壁通過を促進する膜貫通領域を有した、組換え外来タンパク質。
【請求項５６】
請求項55のタンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項５７】
脳疾患の治療に使用される、請求項56に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
宿主細胞が、原核生物細胞または真核生物細胞である、請求項41に記載の形質転換体。
【請求項５９】
原核生物細胞が、ウイルス、大腸菌、バシルス属（Bacillus）からなる群より選択される、請求項58に記載の形質転換体。
【請求項６０】
真核生物細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、及び植物細胞からなる群より選択される、請求項58に記載の形質転換体。
【請求項６１】
1）プロモーター、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性領域を含む疎水性断片をコードするポリヌクレオチド、分泌エンハンサー候補の挿入のための制限酵素部位、及び外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドがお互いに作動可能に連結された遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを構築する工程；
2）発現ベクターの制限酵素部位に親水性アミノ酸を含む分泌エンハンサー候補配列をコードするポリヌクレオチドを挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
3）工程2）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
4）前記工程3）の形質転換体を培養する工程；
5）工程1）の発現ベクターで形質転換された形質転換体（対照群）と工程4）の形質転換体との培養水溶液で前記外来タンパク質の発現程度を測定する工程；及び
6）対照群と比べて有意に前記挿入外来タンパク質の発現程度を増加させた分泌エンハンサーを選別する工程を含む、
外来タンパク質の分泌向上を誘導する分泌エンハンサーのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、シグナル配列（directional  signal）、分泌エンハンサー（secretional  enhancer）及び分解酵素認識部位による元の形態の水溶性組換えタンパク質生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
現代のバイオテクノロジーにおける核心は、組換えタンパク質の生産であり、その中でも重要なことは水溶性である元の形態のタンパク質を手軽に生産することである。水溶性タンパク質は、活性タンパク質の生産及び回収、機能研究のための結晶化、産業化などに非常に重要である。現在まで多くの組換えタンパク質の生産研究が大腸菌を使用して多く進行されてきたが、それは、大腸菌は操作しやすくて、成長時間が短く、発現が安全で、低費用であり規模を容易に変えることができる長所を有しているからである。
【０００３】
しかし、大腸菌（E．coli）で生産された外来起源の組換えタンパク質は、適切な転写後シャペロン（post−translational  chaperons）や転写後過程（post−translational  processing）がないため、生産された組換えタンパク質の適切な折りたたみ（fold）が起きなかったりまたは不可溶性タンパク質凝集体（inclusion  body）が形成されたりする（Baneyx，Curr．Opin  Biotechnol．，1999年，第10卷，411−421頁（非特許文献1））。
【０００４】
大腸菌のシグナル配列（signal  sequence）がタンパク質を大腸菌ペリプラズム（periplasm）外で分泌するようにし（Inouye  and  Halegoua，CRC  Crit．Rev．Biochem．，1980年，第7卷，339−371頁（非特許文献2））、アミノ末端塩基性領域（amino  terminal  basic  region）（Lehnhardt等，J．Biol．Chem．，1988年，第263卷，10300−10303頁（非特許文献3））、疎水性領域（hydrophobic  region）（Goldstein等，J．Bacteriol．，1990年，第172卷，1225−1231頁（非特許文献4））、及び切断領域（cleavage  region）（Duffaud  and  Inouye，J．Biol．Chem．，1988年，第263卷，10224−10228頁（非特許文献5））がシグナルペプチドの構造及び機能に関与するという研究が裏付けられた。同時に、水溶性タンパク質を生産するために様々なシグナル配列を使用したベクターが開発された（ompA：Ghrayeb等，EMBO  J．，1984年，第3卷，2437−2442頁（非特許文献6）；Duffaud等，Methods  Enzymol．，1987年，第153卷，492−507頁（非特許文献7）；Delrue等，Nucleic  Acids  Res．，1988年，第16卷，8726頁（非特許文献8）；phoA：Dodt等，FEBS  Lett．，1986年，第202卷，373−377頁（非特許文献9）；Kohl等，Nucleic  Acids  Res．，1990年，第18卷，1069頁（非特許文献10）；eltA：Morika−Fujimoto等，J．Biol．Chem．，1991年，第266卷，1728−1732頁（非特許文献11）；bla：Oka等，Agric  Biol．Chem．，1987年，第51卷，1099−1104頁（非特許文献12）；eltIIb−B：Jobling等，Plasmid，1997年，第38卷，158−173頁（非特許文献13））。
【０００５】
しかし、今までシグナル配列を使用したベクターは、水溶性タンパク質を発現させるのには限界があり、また発現したタンパク質が組換え融合（fusion）タンパク質として生産されるので、タンパク質分解酵素の切断部位を有し、元の形態のアミノ末端を有した組換えタンパク質を得ることはとても難しいのが実情である。
【０００６】
シグナル配列を使用した組換えタンパク質の生産が難しい原因としては、1）水溶性タンパク質の生産に対する予測が不可能で、多くの研究者等が組換えタンパク質の水溶性は全体タンパク質のアミノ酸配列の特性にかかっていると推測している。2）シグナル配列と作用する他の配列があまりにも多くて、シグナル配列の機能を直接的に調査することができる分析方法が開発されなかったからである（Triplett等，J．Biol．Chem．，2001年，第276卷，19648−19655頁（非特許文献14））。
【０００７】
それで、本発明者等は、タンパク質の分泌効率を高めることができる分泌エンハンサーがどのような要素なのかを確認するために鋭意努力した結果、タンパク質のシグナル配列の塩基性N−領域自体で、または塩基性N−領域及び中央特異的疎水性領域を含むシグナル配列に連結される親水性アミノ酸で構成されたペプチドが分泌エンハンサーになることができることを確認することにより、本発明を完成した。
【０００８】
【非特許文献１】Baneyx，Curr．Opin  Biotechnol．，1999年，第10卷，411−421頁
【非特許文献２】Inouye  and  Halegoua，CRC  Crit．Rev．Biochem．，1980年，第7卷，339−371頁
【非特許文献３】Lehnhardt等，J．Biol．Chem．，1988年，第263卷，10300−10303頁
【非特許文献４】Goldstein等，J．Bacteriol．，1990年，第172卷，1225−1231頁
【非特許文献５】Duffaud  and  Inouye，J．Biol．Chem．，1988年，第263卷，10224−10228頁
【非特許文献６】Ghrayeb等，EMBO  J．，1984年，第3卷，2437−2442頁
【非特許文献７】Duffaud等，Methods  Enzymol．，1987年，第153卷，492−507頁
【非特許文献８】Delrue等，Nucleic  Acids  Res．，1988年，第16卷，8726頁
【非特許文献９】Dodt等，FEBS  Lett．，1986年，第202卷，373−377頁
【非特許文献１０】Kohl等，Nucleic  Acids  Res．，1990年，第18卷，1069頁
【非特許文献１１】Morika−Fujimoto等，J．Biol．Chem．，1991年，第266卷，1728−1732頁
【非特許文献１２】Oka等，Agric  Biol．Chem．，1987年，第51卷，1099−1104頁
【非特許文献１３】Jobling等，Plasmid，1997年，第38卷，158−173頁
【非特許文献１４】Triplett等，J．Biol．Chem．，2001年，第276卷，19648−19655頁
【発明の開示】
【０００９】
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、外来起源の遺伝子から効果的に水溶性組換え融合タンパク質を生産して元の形態のアミノ末端を有するタンパク質として回収する方法を提供することである。
【００１０】
課題を解決するための手段
前記目的を達成するために、本発明はシグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性領域を含むシグナル配列の疎水性断片、及び前記シグナル配列のN−領域の断片及びシグナル配列の疎水性断片に連結された親水性増加配列で構成された分泌エンハンサーを含む改変したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。
【００１１】
また、前記発現ベクターに外来遺伝子が挿入され、前記改変したシグナル配列及び外来遺伝子融合タンパク質の生産のための組換え発現ベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記発現ベクターまたは組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換した形質転換体を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記形質転換体を使用した組換えタンパク質の分泌効率向上方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記組換え融合タンパク質の生産方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記生産方法によって生産された組換え融合タンパク質を提供する。
【００１６】
また、本発明は、外来タンパク質の生産方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記組換え融合タンパク質の薬学的用途を提供する。
【００１８】
以下、本発明で使用した用語を説明する。
【００１９】
「外来タンパク質（heterologous  protein）または目的外来タンパク質（target  heterologous  protein）」は、当業者が大量に生産しようとするタンパク質であり、組換え発現ベクターに前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して、形質転換体で発現が可能なすべてのタンパク質を意味する。
【００２０】
「融合タンパク質（fusion  protein）」は、元の外来タンパク質の配列のN−末端またはC−末端に他のタンパク質が連結されたり他のアミノ酸配列が付加されたりしたタンパク質を意味する。
【００２１】
「シグナル配列（signal  sequence）」は、外来タンパク質が、ウイルス、原核生物細胞または真核生物細胞で発現される外来タンパク質をペリプラズムまたは細胞外部に分泌するために細胞内膜を通過できるように助ける効率的な配列を意味する。シグナル配列は、N−末端に陽電荷が充電されたN−領域（positively  charged  N−region）、中央の特異的な疎水性領域（central  characteristic  hydrophobic  region）及びC−末端切断領域（C−region  with  a  cleavage  site）で構成されている。本発明で使用したシグナル配列断片は、N−末端に陽電荷が充電された領域と中央の特異的な疎水性領域及びC−末端切断領域の全体または一部を意味する。
【００２２】
「ポリペプチド（polypeptide）」は、二つ以上のアミノ酸がペプチド結合で連結された重合体分子を意味し、タンパク質もポリペプチドの一種である。
【００２３】
「ポリペプチド断片（polypeptide  fragment）」は、特定ポリペプチドの機能を維持しながら最小長さまたはそれ以上の大きさを有するポリペプチド配列を意味する。本文書で特別に言及しない限り、全体長さのポリペプチドはこれに含まれない。例えば、本文書で言及している「シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片」は、シグナル配列の中でシグナル配列に機能する短縮されたシグナル配列を意味し、全体シグナル配列はこれに含まれない。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、二つ以上の核酸分子がリン酸ジエステル結合で連結された重合体分子を意味し、DNA及びRNAがこれに含まれる。
【００２５】
「分泌エンハンサー（secretional  enhancer）」は、シグナル配列（signal  sequence）の親水性を増加させる親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドを意味する。
【００２６】
「N−領域（N−region）」は、通常のシグナル配列で保存的に発見される部分であり、N−末端に位置した塩基性が強い配列を意味してシグナル配列によって、3ないし10個のアミノ酸で構成される。
【００２７】
「中央特異的疎水性領域（central  specific  hydrophobic  region）」は、一般的なシグナル配列の構造の中でN−領域のすぐ後に続く領域で、多数の疎水性アミノ酸によって疎水性を強く帯びた部分を意味する。
【００２８】
「改変したシグナル配列（modified  signal  sequence）」は、シグナル配列の全体ではない前記シグナル配列のN−領域自体を意味するかまたはN−領域またはN−領域及び中央特異的疎水性領域で構成された疎水性シグナルペプチド断片（truncated  hydrophobic signal  peptide）に前記分泌エンハンサーが連結されたポリペプチド、または前記ポリペプチドにタンパク質分解酵素認識部位が付加的に連結されたポリペプチドを意味する。
【００２９】
「シグナル配列断片（signal  sequence  fragment）または切断したシグナル配列（truncated  signal  sequence）」はすべて、シグナル配列の一部を意味し、本文書で特別に言及しない限り、シグナル配列のC−末端部位が切断されて除去された断片を意味する。
【００３０】
「制限酵素部位」は、特別な言及がない限り、DNA制限酵素が特定位置を認識して切断するポリヌクレオチド配列を意味する。
【００３１】
「タンパク質分解酵素認識部位」は、タンパク質分解酵素が特定位置を認識して切断するアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
「両親媒性ドメイン（amphipathic  domain）」は、親水性及び疎水性領域が混在しているドメインで、膜貫通ドメインと類似の構造を有するタンパク質内部の領域を意味する。したがって、本文書では「膜貫通類似ドメイン（transmembrane−like  domain）」と等しい意味で使用される。
【００３３】
「膜貫通類似ドメイン（transmembrane−like  domain）」は、ポリペプチドのアミノ酸配列分析時、膜タンパク質の膜貫通ドメインと類似の構造を有することが予測される部位を意味する（Brasseur等，Biochim．Biophys．Acta，1990年，第1029（2）卷，267−273頁）。一般的に前記膜貫通類似ドメインは、膜貫通ドメインを予測する多様なコンピューターソフトウェアを通じて容易に予測が可能である。前記コンピューターソフトウェアの例では、TMpred（／／www．ch．embnet．org／software／TMPRED＿form．html）、HMMTOP（／／www．enzim．hu／hmmtop／html／submit．html）、TBBpred（／／www．imtech．res．in／raghava／tbbpred／）、DAS−TMfilter（：／／www．enzim．hu／DAS／DAS．html）などが存在する。前記「膜貫通類似ドメイン」は、実際に膜電位特性を有することが解明された「膜貫通ドメイン」も含む。
【００３４】
「発現ベクター」は、発現ベクターの転写に提供される追加断片に作動可能に連結された目的とするポリペプチドを暗号化する断片で構成される線形または円形のDNA分子である。このような追加断片は、プロモーター及び終了暗号配列を含む。発現ベクターはまた、一つ以上の複製開始点、一つ以上の選択マーカー、増幅剤（enhancer）、ポリアデニル化シグナル、その他などを含む。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルスDNAから誘導されたり、またはその両方の要素を含んだりする。
【００３５】
「作動可能に連結された」は、断片は配列されてそれらは一斉にそれらの意図した目的、例えば、転写はプロモーターで開始して暗号化断片を通じて終止コドンに進行するのに作用することを示す。
【００３６】
「プロモーター」は、RNAポリメラーゼが結合してmRNA合成が開始される遺伝子の部分である。
【００３７】
「宿主細胞（host  cell）」は、組換え遺伝子の再生産または外来タンパク質の生産が可能になるように、ウイルスまたはプラスミドベクターのような他の遺伝子運搬体によって感染され得る細胞を意味する。
【００３８】
「脳血管障壁（blood−brain  barrier）」は、特定の物質が血管から入って行くことを防ぐ機能的な障壁を意味する。脳血管障壁をなす主な構造は、毛細管内皮細胞（capillary  endothelial  cell）にある密着結合（tight  junction）（密着帯（zonula  occludens））と推測される。
【００３９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００４０】
本発明者等は、反復された接着性タンパク質、Mefp1（Waite等，Biochemistry，1985年，第24卷，5010−5014頁）を発現する過程で、Hisタグ（tag）を有したpETベクターを基本に、シグナル配列を使用した水溶性外来タンパク質を生産するため、シグナル配列としてOmpAシグナルペプチド（OmpASP）の全体及び一部の配列と外来遺伝子をPCR反応で連結してベクターを構成した後、融合タンパク質を水溶性で発現させた。また、切断したOmpASP（truncated  OmpASP  or  OmpASPtr）とfactor  Xa認識部位を連結した、OmpASPtr−factor  Xa  cleavage  site改変したシグナル配列領域に外来遺伝子をPCR反応で連結してベクターを構成した後、融合タンパク質を水溶性で発現させた後、分解酵素を処理して元の形態のアミノ末端を有したタンパク質を生産した。これを通じてシグナル配列の全体及び一部は一定のpI値を有し、このpI値が水溶性タンパク質発現に重要であることを確認した。
【００４１】
同時に遂行した発現実験で平目ヘプシジンIは、短いシグナル配列のOmpASPtrで水溶性の融合タンパク質として発現されなかった。2）したがって、シグナル配列だけで外来タンパク質が水溶性に生産されない場合には、分泌エンハンサーである高いpI値と親水性を有したアミノ酸であるArg及びLysのコード配列をシグナル配列領域のC−末端に挿入して、分解酵素認識部位と外来遺伝子をPCR反応で連結してベクターを構成した後、水溶性タンパク質を生産した。ここで、外来遺伝子の前部分全体を改変したシグナル配列領域と称した。
【００４２】
前記改変したシグナル配列領域をOmpASPtr−SmaI−Xa（接着性タンパク質の場合）またはOmpASPtr−（   ）−Xa（平目ヘプシジンIの場合）の形態でデザインして、SmaIまたは（   ）部分にpI及び疎水性／親水性に係わるアミノ酸を六個選択して同じアミノ酸を六個ずつ挿入してクローンを作って発現を調査した結果、高いpI値と親水性を有したアミノ酸であるArg及びLysに該当する塩基配列が挿入されたクローンで水溶性発現の増加現象が観察されたが、水溶性接着性タンパク質の場合には水溶性発現が若干増加した一方、水溶性平目ヘプシジンI組換えタンパク質の場合には水溶性発現が非常に増加して、分泌エンハンサーとしての機能をした。これは結局、塩基性アミノ酸であるArg及びLysがC−末端に挿入されてシグナル配列領域の親水性値とpI値を高めることにより、タンパク質の水溶性発現が増加されることを意味する。
【００４３】
実際に、シグナル配列領域でN−末端のシグナル配列長さを縮小し、C−末端に高いpI値と親水性を有したアミノ酸であるArg及びLys配列を追加するほど親水性値が高くなり、発現が増加されることを確認した。したがって、改変したシグナル配列領域の高いpI値と親水性値が水溶性発現の鍵（key）になり得、また疎水性親水性指標プロファイルも補助鍵（secondary  key）になり得る。すなわち、シグナル配列の長さを一定の大きさ以上使用してシグナル配列領域をデザインすると、シグナル配列部分が通常の膜貫通ドメインまたは膜貫通類似ドメインより親水性値が大きい膜貫通類似ドメインの構造を有するようになり、このような構造を有するタンパク質の水溶性発現が可能であると判断した。
【００４４】
上の結果を基に水溶性発現をなしたクローンのシグナル配列領域の疎水性親水性指標プロファイルを調査した結果、水溶性発現をなしたクローンのシグナル配列領域には平目ヘプシジンIが分子内に有している両親媒性ドメインまたは膜貫通類似ドメインより、大きさが類似かまたはさらに大きい親水性プロファイルの膜貫通類似ドメインを有していることが判明した。したがって、この結果から平目ヘプシジンIのように分子内に両親媒性ドメインを有している外来タンパク質を水溶性で発現させるためには、シグナル配列領域内により大きい親水性の膜貫通類似ドメインが必要であるということが分かった。
【００４５】
これを通じてシグナル配列領域の疎水性平均値（hydrophobicity  average  value）が、水溶性タンパク質発現に重要であることを確認した。また、コンピュータープログラムDNASIS（商標）（Hitachi，日本，1997年）を通じて改変したシグナル配列の疎水性平均値（Hopp  ＆ Woods  scale）をあらかじめ計算して、疎水性親水性指標プロファイルを最適化することができるので、シグナル配列領域に目的外来タンパク質が有している膜貫通類似ドメインより大きい親水性を有する膜貫通類似ドメインを有するようにデザインすることで、水溶性タンパク質の発現を増加させることができる。
【００４６】
本発明を下記にてさらに具体的に説明する。
【００４７】
本発明者等は、外来タンパク質をコードする塩基配列7×mefp1の5’末端に大腸菌で分泌を誘導するシグナル配列OmpAの一部であるOmpASP1−3から全部であるOmpASP1−23のコード配列を融合して、図2の鋳型を使用してPCR方法でpET−22b（＋）［ompASP（  ）−7×mefp1＊］クローンを製作した（表1）。製作されたクローンベクターを大腸菌BL21（DE3）に形質転換し、IPTGでタンパク質発現を3時間誘導した。その結果、前記製作されたクローンは大腸菌内ですべて水溶性Mefp1組換えタンパク質を発現した（表1及び図3参照）。
【００４８】
シグナル配列は、Metで始まり陽電荷N−区域（positively  charged  N−region）、中央特異疎水性区域（central  characteristic  hydrophobic  region）、切断位置を有したC−末端区域（C−region  ending  with  cleavage  site）を有している。シグナル配列は、前駆タンパク質の折りたたみ（folding）を調節して、タンパク質の分泌において必須な役割をする（Izard等，Biochemistry，1995年，第34卷，9904−9912頁；Wickner等，Annu．Rev．Biochem．，1991年，第60卷，101−124頁）。
【００４９】
今までは、組換え融合タンパク質の発現が水溶性タンパク質で発現されるのに影響を及ぼす要因は、全体タンパク質のpI値、疎水性、分子量及び安全性などであると知られていた。そこで本発明者等は、本発明の改変シグナル配列としてシグナル配列OmpASPの一部であるOmpASP1−3から全部であるOmpASP1−23のpI値を調査した結果、すべて長さに関係なく均一な10．55を有することを確認した（表2）。すべてのクローンは、シグナル配列の長さに関係なくIPTGで誘導して3時間以後、全体及び水溶性のMefp1タンパク質を生産した（図3参照）。したがって、前記結果から水溶性Mefp1の発現は、シグナル配列OmpASPの一部及び全体で疎水性値ではなく高いpI値が指向性シグナル（directional  signal）として作用したことが分かった。これは、全体シグナル配列の中で陽電荷を帯びたN−領域だけでも未完成ポリペプチド鎖（nascent  polypeptide  chains）を水溶性形態で分泌させることができるということを意味して、これは本発明者が最初に解明したことであり、非常に驚くべき発見である。一方、シグナル配列の中でN−領域に陽電荷を帯びた塩基性アミノ酸ではないグルタミン酸またはアスパラギン酸が位置する場合もあるので、pI値が4以下の場合にも本発明のN−領域を含むシグナル配列のポリペプチド断片で使用が可能である。ここで、改変したシグナル配列のpI値は、少なくとも８であることが好ましく、少なくとも9であることがさらに好ましく、少なくとも10であることが最も好ましい。
【００５０】
本発明では、大腸菌起源のOmpAシグナル配列を使用したが、前記シグナル配列と類似の構造を有するCT−B（コレラトキシンサブユニットB（cholera  toxin  subunit  B））シグナル配列、LTIIb−B（大腸菌熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット（E．coli  heat−labile  enterotoxin  B  subunit））シグナル配列、BAP（細菌アルカリホスファターゼ（bacterial  alkaline  phosphatase））シグナル配列（Izard  and  Kendall，Mol．Microbiol．，1994年，第13卷，765−773頁）、酵母カルボキシペプチダーゼ（Yeast  carboxypeptidase）Yシグナル配列（Blachly−Dyson  and  Stevens，J．Cell．Biol．，1987年，第104卷，1183−1191頁）、クルイベロミセスラクティス（Kluyveromyces  lactis）のキラートキシンガンマサブユニット（killer  toxin  gamma  subunit）シグナル配列（Stark等，EMBO  J．，1986年，第5（8）卷，1995−2002頁）、牛成長ホルモン（bovine  growth  hormone）のシグナル配列（Lewin，B．（Ed）、GENES  V，290頁．Oxford  University  Press，1994年）、インフルエンザノイラミニダーゼ（influenza  neuraminidase）のシグナルアンカー（signal−anchor）（Lewin，B．（Ed）、GENES  V，297頁．Oxford  University  Press，1994年）、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファ（Translocon−associated  protein  subunit  alpha）（TRAP−α）（Prehn等，Eur．J．Biochem．，1990年，第188（2）卷，439−445頁）のシグナル配列、双方アルギニン転座（Twin−arginine  translocation：Tat）シグナル配列（Robisnon，Biol．Chem．，2000年，第381（2）卷，89−93頁）などをすべて使用することができる。また、前記シグナル配列と類似の構造を有するこれ以外のあらゆるウイルス、原核生物及び真核生物起源のシグナル配列と先導配列も使用が可能である。前記配列は、すべて高い疎水性値を有している場合である。
【００５１】
組換え融合タンパク質を生産する時、シグナル配列のC−末端にタンパク質分解酵素認識部位を有した改変したシグナル配列領域（changed  signal  sequence  region）と外来タンパク質との間を連結して、組換えタンパク質を発現して分解酵素処理をすると元の形態（native  form）のアミノ末端を有した外来タンパク質を回収することが容易である。本発明者等は、上記の実験結果を基にOmpASP1−8にC−末端を切断することができるfactor  Xa分解酵素認識部位を付けてmefp1を鋳型（図2）にPCR方法でpET−22b（＋）（ompASP1−8−Xa−7×mefp1＊）クローンを製作して大腸菌で発現を調査した（表1）。その結果、前記クローンは水溶性タンパク質を生産し、分解酵素factor  Xaで処理して指向性シグナルで使用した改変したシグナル配列領域を除去し、元の形態のアミノ末端を有するMefp1タンパク質を生産することができることを成功的に確認した（図4参照）。
【００５２】
本発明の組換えタンパク質で使用するfactor  Xaの認識部位は、配列（Ile−Glu−Gly−Arg）を使用することが好ましい。また、本発明の分解酵素は、factor  Xa、エンテロキナーゼ（Asp−Asp−Asp−Asp−Lys）、ジェネナーゼI（His−Tyr）、フリン（Arg−X−X−Arg）からなる群より選択された分解酵素を使用することが好ましい。
【００５３】
本発明者等は、組換えタンパク質を発現してタンパク質を集めてタンパク質機能に異常がないかどうか確認した。組換えで生成されたMefp1の接着性を調査した結果、対照群に使用したBSAに比べて著しい接着性を有していた（図5参照）。これを通じて、本発明の組換えタンパク質生産方法は、外来タンパク質の機能に影響を与えないで外来タンパク質を効果的に水溶性タンパク質として生産することができることが分かる。
【００５４】
また、本発明者等は、シグナル配列OmpASPの断片以外の領域で接着性タンパク質の水溶性発現に及ぼす影響を調べるため、平滑末端（blunt  end）を便利にクローニングできるSmaI部位を選択して、OmpASP1−8−SmaI−Xa形態にシグナル配列領域をデザインして上記のような方法でPCRを遂行してpET−22b（＋）（ompASP1−8−SmaI−Xa−7×mefp1＊）クローンを製作した（表1参照）。また、SmaI位置に高いpI値と親水性アミノ酸であるアルギニン（Arg）またはリジン（Lys）を代替するクローンを製作した。SmaI位置に高いpI値と親水性のアミノ酸を処理したクローンも、組換え外来タンパク質を生産して分泌が一部増強することを確認した。
【００５５】
同時に遂行した発現実験で平目ヘプシジンIは、短いシグナル配列のOmpASPtrで水溶性の融合タンパク質に発現しなかった（表3参照）。
【００５６】
したがって、本研究者等は、分泌エンハンサーをスクリーニングするためにシグナル配列領域をOmpASP1−10−（  ）−Xaでデザインして、pI及び疎水性／親水性に影響を与えるアミノ酸を六個ずつ6×Arg、6×Lys、6×Glu、6×Asp、6×Tyr、6×Phe、6×Trpを（  ）中に挿入して（表4参照）、平目ヘプシジンI遺伝子（Kim等，Biosci．Biotechnol．Biochem．，2005年，第69卷，1411−1414頁）を鋳型にPCR方法でpET−22b（＋）［ompASP1−10−（    ）−Xa−ofhepcidinI＊＊］の一般的なクローンを構成した（表3参照）。前記クローンに対して大腸菌で発現させた結果、高いpI値と親水性アミノ酸である6×Arg及び6×Lysの配列を挿入したクローンは、水溶性平目ヘプシジンIを強く発現したが、他のアミノ酸を挿入したクローンは水溶性平目ヘプシジンIを非常に弱く発現した（図6参照）。したがって、水溶性平目ヘプシジンIの発現は、高いpI値と親水性アミノ酸であるArg及びLysによる親水性値の増加と関連があり、シグナル配列領域のC−末端に挿入されたアミノ酸Arg及びLysが、分泌エンハンサーであることが明確に明かされた（表4参照）。
【００５７】
上記の実験結果を基に、本発明者等はシグナル配列領域でN−末端のシグナル配列OmpASPの断片とC−末端−（   ）−Xa部分の改変がシグナル配列領域内で親水性にいかなる影響を及ぼすのかを調査した。まず、N−末端部分のシグナル配列OmpASPの様々な長さを一定のC−末端−6×Arg−Xaに連結してPCR方法でpET−22b（＋）［ompASP（  ）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］の一般的なクローンを構成した（表3参照）。前記クローンに対して大腸菌で発現させた結果、シグナル配列OmpASP長さが短いほどホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods    scale）値による親水性が増加して（実施例6）、発現が増加した（図7参照）。しかし、ホップアンドウッズスケールによるプロファイルは、調査したシグナル配列OmpASPの長さが最も短い、OmpASP1−6で構成されたOmpASP1−6−6×Arg−Xaは、N−末端に疎水性曲線がみられず親水性曲線のみが示れた。その外の場合、シグナル配列の大きさがOmpASP1−8以上は、−6×Arg−Xaに連結されてN−末端に疎水性曲線を、C−末端には親水性曲線を示して一般的な膜貫通類似ドメイン（transmembrane−like  domain）の形態を示した。前記の結果を総合する時、シグナル配列の塩基性N−領域及び中央特異疎水性領域で構成された前記シグナル配列の塩基性断片及び疎水性断片のC−末端に親水性が強いアミノ酸で構成されたペプチドを付加する場合、タンパク質内に存在する膜貫通ドメインと類似の構造を有するようになり、そのようにシグナル配列のC−末端に増加された親水性が未完成ポリペプチド鎖（nascent  polypeptide  chains）の内部に存在する膜貫通ドメインまたは膜貫通類似ドメインの親水性部位より高い場合、前記未完成ポリペプチド鎖が水溶性形態で分泌されるという点である。このような事実は、本発明者によって最初に解明されたことであり、非常に驚くべきものである。こんな特徴を使用する場合、膜タンパク質のように一般的には分泌が不可能なタンパク質を水溶性形態で生産することが可能になり、生物学的製剤に使用される各種タンパク質の膜透過性を高めることで、医薬伝達（drug  delivery）に効果的に使用することができる。特に、医薬物質伝達に関して、従来のタンパク質製剤が脳血管障壁（blood−brain  barrier）を通過することができないという短所を解消して、脳血管障壁を通過でき有用に使用することができる。すなわち、本発明の方法を通じて、各種脳疾患に適用することができる治療用途のタンパク質（例えば、抗−ベータアミロイド抗体）を脳室に直接注入する必要がなく、血管注射を通じて投与することが可能になる。
【００５８】
以後、本発明者等は、シグナル配列のN−末端はOmpASP1−10一定にして、C−末端部分−（   ）−Xaに親水性アミノ酸を2個から10個まで追加してPCR方法でpET−22b（＋）［ompASP1−10−（   ）−Xa−ofhepcidinI＊＊］の一般的なクローンを構成した（表3参照）。前記クローンに対して大腸菌で発現させた結果、シグナル配列領域（改変したシグナル配列）に親水性アミノ酸が追加されるほど、ホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）値による親水性が大きくなり（実施例6）、発現が増加した（図8参照）。この場合、ホップアンドウッズスケールによるプロファイルによって水溶性タンパク質を発現させたすべてのシグナル配列領域の疎水性親水性指標プロファイルは、N−末端に疎水性曲線を、C−末端には親水性曲線を示して一般的な膜貫通類似ドメインの形態を示した。
【００５９】
前記二つの場合、シグナル配列領域を改変させて親水性値を高めて水溶性発現がなりたちホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）値がインデックス（index）になることができると考えられる。したがって、シグナル配列領域でN−末端に位置したシグナル配列OmpASP断片は、pI値が指向性シグナルに重要に作用して、C−末端に位置した−（   ）−Xaで親水性値は、分泌エンハンサーとしての役割と相関関係が高かった。N−末端をOmpASP1−10一定にして、C−末端部分を改変させた場合、水溶性発現が成り立ったすべてのシグナル配列領域は、N−末端に疎水性曲線を、C−末端には親水性曲線を示して膜貫通ドメインと類似の形態の双曲線（hyperbolic  curve）を有していて、ホップアンドウッズスケール値による疎水性親水性指標プロファイルは、補助インデックスとしての活用が便利である。
【００６０】
以後、本発明者等は、コンピュータープログラムでシグナル配列領域と平目ヘプシジンI部分（＊＊部分は除外）のホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）による疎水性親水性指標プロファイルを調査した（図9参照）。ここで、対照群である平目ヘプシジンIは、分子内に一つの両親媒性ドメインを有していて（図9のA）、仮想的なシグナル配列領域平目ヘプシジンI融合タンパク質は、二つの膜貫通類似ドメイン（transmembrane−like  domain）を有していることが示されたが、一つはシグナル配列領域に、他の一つは平目ヘプシジンI部分に有していた（図9のB，C，D）。ここで、水溶性で強く発現した組換え平目ヘプシジンIは、シグナル配列領域にヘプシジンIが有している両親媒性ドメインより親水性程度が大きい膜貫通類似ドメインを有していた（図9のD）。一例として、図9のDの融合タンパク質に該当するクローンpET−22b（＋）［ompASP1−10−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］は、水溶性に発現した（図8のレーン4参照）。この結果から分子内に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有する分子の水溶性発現には、当該膜貫通類似ドメインが発現の障害になるので、前記膜貫通類似ドメインより親水性が大きい膜貫通類似ドメインを有したシグナル配列領域が必要であることが分かる。したがって、目的タンパク質の水溶性発現のためには、ホップアンドウッズスケールによる疎水性値だけではなく、疎水性親水性指標プロファイルも水溶性発現を予測する基準になることができることを立証した。
【００６１】
前記結果からして本発明は、元の形態のN−末端を有した水溶性外来タンパ質生産に有用に使用することができる。
【００６２】
発明の形態
以下、本発明の好ましい実施態様を詳しく説明する。
【００６３】
本発明は、（I）プロモーター及び（II）前記プロモーターに作動可能に連結されたシグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドから構成された遺伝子コンストラクトを含む、外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクターを提供する（図1（a）参照）。
【００６４】
ここで、前記プロモーターは、ウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターであることが好ましい。前記ウイルス起源のプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、鶏痘ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、牛乳頭腫ウイルスプロモーター、鳥類肉腫ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、B型肝炎ウイルスプロモーター、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターまたは猿ウイルス40（SV40）プロモーターであることが好ましいが、これに制限されるものではない。前記の原核生物起源のプロモーターは、T7プロモーター、SP6プロモーター、熱ショックタンパク質（heat−shock  protein）70プロモーター、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、またはtacプロモーターであることが好ましいが、これに制限されるものではない。前記真核生物起源のプロモーターは、酵母起源のプロモーター、植物起源のプロモーターまたは動物細胞起源のプロモーターであることが好ましい。前記酵母起源のプロモーターは、3−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、エノラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルベートジカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、グルコース−6−リン酸イソメラーゼプロモーター、3−ホスホグリセレートムターゼプロモーター、ピルベートキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ2プロモーター、イソチトクロムCプロモーター、酸ホスファターゼプロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL1プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL7プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL10プロモーター、またはピキア・パストリスAOX1プロモーターからなる群より選択されることが好ましいが、これに制限されるものではない。前記動物細胞起源のプロモーターは、熱ショックタンパク質プロモーター、プロアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターからなる群より選択されることが好ましいがこれに制限されるものではない。本発明でプロモーターでは、本発明の外来遺伝子を宿主細胞で正常に発現させることができるものならすべて使用可能である。
【００６５】
前記シグナル配列は、ウイルス、原核生物または真核生物起源のシグナル配列または先導配列であることが好ましく、OmpAシグナル配列、CT−Bシグナル配列、LTIIb−Bシグナル配列、BAPシグナル配列（Izard  and  Kendall，Mol．Microbiol．，1994年，第13卷，765−773頁）、酵母カルボキシペプチダーゼYシグナル配列（Blachly−Dyson  and  Stevens，J．Cell．Biol．，1987年，第104卷，1183−1191頁）、クルイベロマイセス・ラクティスのキラートキシンガンマサブユニットシグナル配列（Stark等，EMBO  J．，1986年，第5（8）卷，1995−2002頁）、牛成長ホルモンのシグナル配列（Lewin，B．（Ed）、GENES  V，290頁．Oxford  University  Press，1994年）、インフルエンザノイラミニダーゼのシグナルアンカー（Lewin，B．（Ed）、GENES  V，297頁．Oxford  University  Press，1994年）、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファ（TRAP−α）（Prehn等，Eur．J．Biochem．，1990年，第188（2）卷，439−445頁）のシグナル配列、双方アルギニン転座（Tat）シグナル配列（Robisnon，Biol．Chem．，2000年，第381（2）卷，89−93頁）などが使用され得るが、これらに限定されるものではなく、塩基性が高いN−領域を有するシグナル配列ならすべて使用することができる。
【００６６】
前記N−領域を含むポリペプチド断片は、シグナル配列の1番目ないし3番目アミノ酸を含む3ないし21個のアミノ酸の長さで構成されるペプチドであることが好ましく、当該シグナル配列のN−領域の疎水性親水性指標プロファイル及びpI値などを考慮して、適切な長さに調節することができる。さらに好ましい態様として、前記シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片のpI値は少なくとも8のものであることが好ましく、少なくとも9であることがさらに好ましく、最も好ましいのは少なくとも10である。N−領域は、塩基性アミノ酸、例えばリジン、アルギニンのような陽電荷を帯びたアミノ酸またはアスパラギン酸、グルタミン酸のような陰電荷を帯びたアミノ酸が少なくとも二つ以上存在して、これらのpI値は陽電荷を帯びたアミノ酸が位置する場合には少なくとも８が、陰電荷を帯びたアミノ酸が位置する場合は4以下の値を有するようになる。したがって、公知のシグナル配列の中でN−領域のpI値が少なくとも８のシグナル配列すべてを本発明の発現ベクターに使用されるシグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片に使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
前記シグナル配列において、N−領域の一つ以上のアミノ酸を他の塩基性アミノ酸、すなわち、アルギニン、リジンのようなアミノ酸に代替が可能である。前記のようにアルギニン、リジンなどpI値の高いアミノ酸がN−領域に一つまたは二つ以上存在する場合、分泌効率の増加が予想される。前記のようなアミノ酸の置換方法は、当業界でよく知られている（Sambrook等，1989年．“Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual”，2nd  ed．Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，New  York）。
【００６８】
さらに、本発明のベクターの前記N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを連結することができる（図1（c）参照）。分泌エンハンサーは、高いpI値と親水性アミノ酸で構成されていて、これを通じてシグナル配列の親水性を増加させて外来タンパク質のペリプラズム（periplasm）外への移動を促進してやることができる。前記分泌エンハンサーは、少なくとも60％の親水性アミノ酸で構成された親水性ペプチドであり、さらに好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸で構成されたポリペプチドであり、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであることが好ましく、より好ましくは4ないし25個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、さらに好ましくは6ないし15個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、最も好ましい場合は6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するポリペプチドで構成される。前記分泌エンハンサーのpI値は、特別に制限されず、少なくとも10であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００６９】
一方、本発明の一実施態様で、本発明の発現ベクターの前記N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能にタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドが連結される（図1（d）参照）。ここで、前記タンパク質分解酵素認識部位は、Xa因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位またはフリン認識部位を単独で使用したり、いずれか二つ以上を順次に連結して使用したりすることができる。一方、前記タンパク質分解酵素認識部位は、因子Xaの場合、Ile−Glu−Gly−Argであることが好ましい。
【００７０】
また、他の実施態様で、本発明の発現ベクターで前記分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドは、前記N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド及びタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドの間に挿入される（図1（e）参照）、このような挿入の場合、前記N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドとタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドとの間に挿入された制限酵素部位、特にSmaIのような平滑末端を生成する制限酵素によって切断される制限酵素部位を通じて行われることが好ましい。同様に、前記タンパク質分解酵素認識部位は、Xa因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位及びフリン認識部位からなる群より選択される1つ以上のものである。
【００７１】
また他の実施態様で、本発明の発現ベクターは、さらに外来タンパク質をコードする遺伝子挿入のための制限酵素部位が含まれる（図1（b）及び（f）参照）。前記制限酵素部位は、前記シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド後に連結されて（図1（b））、分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドが含まれたベクターの場合には前記ポリヌクレオチド後に連結することができる（図1（f））。万一、ベクター内にタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドが存在する場合には、制限酵素部位は付加したり付加されないこともあり、元の形態のタンパク質を生産するという観点では、制限酵素部位を通じた外来タンパク質をコードする遺伝子のクローニングが好ましくないこともある。
【００７２】
一方、上述したベクターの中でいずれか一つ以上に、外来タンパク質をコードする遺伝子がさらに挿入され得る。ここで、前記外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を組換え融合タンパク質に発現することができる。または、前記外来タンパク質は内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないタンパク質であることが好ましく、前記内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインのないタンパク質は、特別にこれに制限されるものではないが、Mefp1重合体であることが好ましい。
【００７３】
本発明は、また、（I）プロモーター、及び（II）前記プロモーターに作動可能に連結されたシグナル配列（signal  sequence）のN−領域及び中央特異的疎水性領域、から構成された疎水性断片をコードするポリヌクレオチド、及び（III）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドで構成された遺伝子コンストラクトを含む外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクターを提供する（図1（g）参照）。
【００７４】
前記発現ベクターにおいて、前記プロモーターは特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターからなる群より選択されることが好ましい。前記ウイルス起源のプロモーターは、特別にこれに制限されるのではないが、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、鶏痘ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、牛乳頭腫ウイルスプロモーター、鳥類肉腫ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、B型肝炎ウイルスプロモーター、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターまたは猿ウイルス40（SV40）プロモーターからなる群より選択されることが好ましい。前記の原核生物起源のプロモーターは、特別にこれに制限されるのではないが、T7プロモーター、SP6プロモーター、熱ショックタンパク質70プロモーター、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、またはtacプロモーターからなる群より選択されることが好ましい。前記真核生物起源のプロモーターは、酵母起源のプロモーター、植物起源のプロモーターまたは動物細胞起源のプロモーターであることが好ましく、ここで、前記酵母起源のプロモーターは、特別にこれに制限されるものではないが、3−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、エノラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルベートジカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、グルコース−6−リン酸イソメラーゼプロモーター、3−ホスホグリセレートムターゼプロモーター、ピルベートキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ2プロモーター、イソチトクロムCプロモーター、酸ホスファターゼプロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL1プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL7プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL10プロモーター、またはピキア・パストリスAOX1プロモーターからなる群より選択されることが好ましい。前記動物細胞起源のプロモーターは、特別にこれに制限されるものではないが、熱ショックタンパク質プロモーター、プロアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターからなる群より選択されることが好ましい。
【００７５】
前記発現ベクターにおいて、シグナル配列は、特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス、原核生物または真核生物起源のシグナル配列または先導配列であることが好ましく、さらに好ましくは、OmpAシグナル配列、CT−Bシグナル配列、LTIIb−Bシグナル配列、BAPシグナル配列（Izard  and  Kendall，Mol．Microbiol．，1994年，第13卷，765−773頁）、酵母カルボキシペプチダーゼYシグナル配列（Blachly−Dyson  and  Stevens，J．Cell．Biol．，1987年，第104卷，1183−1191頁）、クルイベロマイセス?ラクティスのキラートキシンガンマサブユニットシグナル配列（Stark等，EMBO  J．，1986年，第5（8）卷，1995−2002頁）、牛成長ホルモンのシグナル配列（Lewin，B．（Ed）、GENES  V，290頁．Oxford  University  Press，1994年）、インフルエンザノイラミニダーゼのシグナルアンカー（Lewin，B．（Ed）、GENES  V，297頁．Oxford  University  Press，1994年）、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファ（TRAP−α）（Prehn等，Eur．J．Biochem．，1990年，第188（2）卷，439−445頁）のシグナル配列、双方アルギニン転座（Tat）シグナル配列（Robisnon，Biol．Chem．，2000年，第381（2）卷，89−93頁）などが使用され得るが、これらに限定されるものではなく、塩基性が高いN−領域を有するシグナル配列ならすべて使用することができる。
【００７６】
前記シグナル配列の疎水性断片は特別にこれ制限されるものではないが、シグナル配列の1番目ないし6番目アミノ酸を含む6ないし21個のアミノ酸で構成されるペプチドであることが好ましい。
【００７７】
前記のようにアルギニン、リジンなどpI値の高いアミノ酸がN−領域に一つまたは二つ以上存在する場合、分泌効率の増加が予想される。前記のようなアミノ酸の置換方法は、当業界によく知られている（Sambrook等，1989年．“Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual”，2nd  ed．Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，New  York）。また、前記N−領域に対する突然変異化（mutagenesis）を伴うか伴わないまま、前記中央特異的疎水性領域に対する突然変異化を誘発することができる。すなわち、中央特異的疎水性領域の一つ以上のアミノ酸を公知の方法を使用して他の疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、イソロイシン、スレオニン及びアラニン）に置換することは当業者の能力の範囲内にあり、当業者が本発明の内容を理解すれば、そのような変異によっても当該全体改変したシグナル配列の疎水性親水性指標プロファイルが、本発明のシグナル配列と類似の場合、本発明のシグナル配列と同等な効果を示すと認めるであろう。
【００７８】
前記分泌エンハンサーは、少なくとも60％の親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも60％の親水性アミノ酸、最も好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含み、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸で構成されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで構成されることが好ましく、より好ましくは4ないし25個のアミノ酸で構成されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで構成され、さらに好ましくは6ないし15個のアミノ酸で構成されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで構成されて、最も好ましい場合は6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで構成される。ここで、前記親水性アミノ酸は特別にこれに制限されるものではないが、アスパラギン、グルタミン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることが好ましく、リジンまたはアルギニンであることがさらに好ましく、最も好ましいのはリジンまたはアルギニンのような親水性の強いアミノ酸が6個反復したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記分泌エンハンサーによってコードされるポリペプチドのpI値は特別にこれに制限されるものではないが、少なくとも８であることが好ましく、少なくとも9であることがさらに好ましく、少なくとも10であることが最も好ましい。
【００７９】
本発明の他の実施態様で、本発明の発現ベクターは前記分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドをさらに含む（図1（i）参照）。ここで、前記タンパク質分解酵素認識部位は、Xa因子タンパク質分解認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位またはフリン認識部位を単独で使用したりいずれか二つ以上を順次に連結して使用したりすることができる。一方、前記タンパク質分解酵素認識部位は因子Xaの場合、Ile−Glu−Gly−Argであることが好ましい。
【００８０】
また、本発明の他の好ましい実施態様で、前記分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドは、前記シグナル配列の疎水性断片をコードするポリヌクレオチド後に作動可能に連結されたSmaI認識部位（OmpASP断片−SmaI−Xa）を通じて挿入可能であり、全体分泌エンハンサーまで含む改変したシグナル配列に対応するポリヌクレオチド配列をすべて含むプライマーを使用したPCRを通じて挿入することができる。前記SmaI認識部位によって分泌エンハンサーで当業者が所望するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを自由自在に挿入することができるようになる。
【００８１】
本発明の他の実施態様で、前記発現ベクターは前記分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドに連結された制限酵素部位をさらに含むことができ、前記制限酵素部位を通じて外来タンパク質をコードする遺伝子を容易にクローニングすることができる（図1（h）参照）。
【００８２】
本発明のまた他の実施態様で、本発明の発現ベクターは、前記遺伝子コンストラクトに作動可能に連結された外来タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。前記外来遺伝子は、制限酵素部位を通じてクローニングすることができ、タンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドが使用された場合には、前記ポリヌクレオチドとフレームが合うように（in  frame）連結され、外来タンパク質分泌後にタンパク質分解酵素で切断時、元の形態の外来タンパク質が生産されるようにできる。
【００８３】
ここで、前記外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質であることが好ましい。前記膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有した外来タンパク質は、＋荷電を有している部分が膜の脂質二重層（lipid  bilayer）に付着してこのような膜貫通類似構造が一種のアンカーの役割を遂行して、細胞外部へ分泌がよくなされないと推測される。このような分泌困難なタンパク質を細胞外に分泌させるのに、本発明の前記発現ベクターは非常に効率的である。しかし、たとえ本発明の前記分泌エンハンサーを使用した発現ベクターが、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有したタンパク質の生産により効果的であるとしても、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有していないタンパク質の場合にも分泌効率が増加されるので、どのような種類のタンパク質でも前記分泌エンハンサーを使用した本発明の発現ベクターを使用して水溶性に生産可能である。本発明のベクターが前記のように膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有したタンパク質の水溶性生産に相応しいのは、本発明の改変したシグナル配列が有している指向性シグナル（directional  signal）と高い親水性が外来目的タンパク質が内部に有している膜貫通ドメインが有している親水性よりも大きい場合、未完成タンパク質（nascent  polypeptide）をペリプラズムの外に移動が可能であるためであると思慮される。その原理は、前記ドメインが脂質二重層に付く力より、改変したシグナル配列が有する方向性と高い親水性がさらに大きくて分泌が促進されるからであると推測される。
【００８４】
前記膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有した外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、平目ヘプシジンIであることが好ましい。他のタンパク質の場合にも、疎水性親水性指標プロファイルを分析する時、タンパク質の内部に、膜貫通類似ドメインで判定される部分が示されたり、連続的な多数の疎水性アミノ酸で構成された配列後に連続的な多数の親水性アミノ酸で構成された配列が示される場合、膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有したタンパク質で判定して本発明の発現システムに適用することができる。そのような判定のため、コンピューターソフトウェアを使用することができ、代表的なものは、DNASIS（商標）、DOMpro（Cheng等，Knowledge  Discovery  and  Data  Mining，2006年，第13（1）卷，1−20頁，／／www．ics．uci．edu／〜baldig／dompro．html）、TMpred（／／www．ch．embnet．org／software／TMPRED＿form．html）、HMMTOP（／／www．enzim．hu／hmmtop／html／submit．html）、TBBpred（／／www．imtech．res．in／raghava／tbbpred／）、DAS−TMfilter（／／www．enzim．hu／DAS／DAS．html）などが存在する。
【００８５】
また、本発明は前記発現ベクターの中でいずれか一つで宿主細胞を形質転換して製造した非ヒト形質転換体を提供する。
【００８６】
ここで、前記宿主細胞は特別にこれに制限されるものではないが、原核生物細胞または真核生物細胞であることが好ましく、前記原核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス、大腸菌、バシルス属からなる群より選択されることが好ましく、前記真核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または植物細胞であることが好ましい。
【００８７】
同時に、本発明は、
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン、または両親媒性ドメインを内部に含むかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質、またはシグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及び分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン及び両親媒性ドメインを有するすると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、及び前記外来タンパク質を順次に含む融合タンパク質、またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；及び
6）工程5）の形質転換体を培養する工程を含む、外来タンパク質の分泌効率を高める方法を提供する。
【００８８】
ここで、前記外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、前記外来タンパク質は当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質であることが好ましくて、不溶性で発現されるタンパク質であることがさらに好ましい。本発明の実施例では、外来タンパク質にMefp1多重体及び平目ヘプシジンIを対象で遂行したが、これに限定されるものではない。
【００８９】
前記方法において、疎水性親水性指標プロファイルは特別にこれに制限されるものではないが、疎水性親水性指標プロファイル分析用コンピューターソフトウェアまたはウェブ基盤のアプリケーションで分析することが好ましく、前記コンピューターソフトウェアとしては、DNASIS（商標）（Hitachi，日本）、Visual  OMP（DNA  software，米国）、Lasergene（DNASTAR，米国）、pDRAW32（USA）及びNetSupport  DNA（NetSupport  Inc．，米国）からなる群より選択したプログラムを使用することが好ましく、DNASIS（商標）（Hitachi，日本）を使用することが最も好ましい。
【００９０】
前記方法において、前記分泌エンハンサーは特別にこれに制限されるものではないが、少なくとも60％の親水性アミノ酸を含むポリペプチドであることが好ましく、より好ましくは少なくとも60％の親水性アミノ酸、最も好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸を含むポリペプチドであり、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸の長さであることが好ましくて、4ないし25個のアミノ酸の大きさであることがより好ましく、6ないし15個のアミノ酸長さであることがさらに好ましくて、最も好ましい場合は6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するものである。また、前記分泌エンハンサーは、少なくとも60％の親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドであり、さらに好ましくは少なくとも60％の親水性アミノ酸、最も好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドであって、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであることが好ましく、さらに好ましくは4ないし25個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、最も好ましくは6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するポリペプチドである。一方、前記分泌エンハンサーはpI値が少なくとも８の親水性ポリペプチドであることが好ましいが、これに特別に制限されるのではなくて、pI値が少なくとも9であることがさらに好ましくて、少なくとも10であることが最も好ましい。
【００９１】
前記方法において、親水性アミノ酸は特別にこれに制限されるものではないが、アスパラギン、グルタミン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることが好ましく、さらに好ましくのはリジンまたはアルギニンである。
【００９２】
本発明の他の実施態様として、前記分泌エンハンサー及び外来タンパク質の間にタンパク質分解酵素認識部位がさらに挿入されていることが好ましい。
【００９３】
前記方法において、前記宿主細胞は特別にこれに制限されるものではないが、原核生物細胞または真核生物細胞であることが好ましく、前記原核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス、大腸菌、バシルス属からなる群より選択されたものが好ましくて、前記真核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または植物細胞であることが好ましい。
【００９４】
さらに、本発明は、
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及びタンパク質分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン及び両親媒性ドメインを有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；
6）工程5）の形質転換体を培養する工程；及び
7）工程6）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程を含む融合外来タンパク質の製造方法を提供する。
【００９５】
ここで、前記外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、前記外来タンパク質は当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質であることが好ましくて、不溶性に発現されるタンパク質であることがさらに好ましい。本発明の実施例では、外来タンパク質にMefp1多重体及び平目ヘプシジンIを対象に遂行したがこれに限定されるものではない。
【００９６】
前記方法において、疎水性親水性指標プロファイルは特別にこれに制限されるものではないが、疎水性親水性指標プロファイルである分析用コンピューターソフトウェアまたはウェブ基盤のアプリケーションで分析することが好ましくて、前記コンピューターソフトウェアとしては、DNASIS（商標）（Hitachi，日本）、Visual  OMP（DNA  software，米国）、Lasergene（DNASTAR，米国）、pDRAW32（USA）及びNetSupport  DNA（NetSupport  Inc．米国）からなる群より選択されられたプログラムを使用することが好ましくて、DNASIS（商標）（Hitachi，日本）を使用することが最も好ましい。
【００９７】
前記方法において、前記分泌エンハンサーは特別にこれに制限されるものではないが、少なくとも60％の親水性アミノ酸を含むポリペプチドであることが好ましくて、さらに好ましくは少なくとも60％の親水性アミノ酸、最も好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸を含むポリペプチドであり、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸の長さであることが好ましくて、4ないし25個のアミノ酸の大きさであることがより好ましくて、6ないし15個のアミノ酸の長さであることがさらに好ましくて、最も好ましい場合は6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するものである。また、前記分泌エンハンサーは、少なくとも60％の親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドであり、さらに好ましくは少なくとも60％の親水性アミノ酸、最も好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸で構成された親水性ポリペプチドであり、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであることが好ましくて、さらに好ましくは4ないし25個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、最も好ましくは6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するポリペプチドである。一方、前記分泌エンハンサーは、pI値が少なくとも８の親水性ポリペプチドであることが好ましくて、pI値が少なくとも9の親水性ポリペプチドであることがさらに好ましくて、pI値が少なくとも10の親水性ポリペプチドであることが最も好ましいが、これに特別に制限されるものではない。
【００９８】
前記方法において、親水性アミノ酸は特別にこれに制限されるものではないが、アスパラギン、グルタミン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることが好ましくて、さらに好ましくのはリジンまたはアルギニンである。
【００９９】
前記方法において、前記宿主細胞は特別にこれに制限されるものではないが、原核生物細胞または真核生物細胞であることが好ましく、前記原核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス、大腸菌、バシルス属からなる群より選択されることが好ましくて、前記真核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または植物細胞であることが好ましい。
【０１００】
前記融合外来タンパク質は、上述した発現ベクターが形質転換された形質転換体で発現してタンパク質を回収することにより生産することができる。回収方法は、当業者に公知された通常の方法を使用することができる。
【０１０１】
前記外来タンパク質は、特別にこれに制限されるものではないが、当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質であることが好ましく、不溶性タンパク質であることがさらに好ましい。本発明の実施例では、外来タンパク質にMefp1多重体及び平目ヘプシジンIを対象に遂行したが、これに限定されるものではない。
【０１０２】
さらに、前記外来タンパク質で脳を標的にする治療用タンパク質、例えばベータアミロイドに特異的なscFv（single−chain  variable  fragment）を使用する場合、本発明の方法によって製造された改変したシグナル配列と外来タンパク質間の融合タンパク質は、従来にはタンパク質が通過することができなかった脳血管障壁（blood−brain  barrier）を通過して脳に直接作用することができる。したがって、本発明の方法は薬物伝達体系（drug  delivery  system）、特に、脳疾患治療のための薬物伝達体系の発展に画期的な契機になり得る。前記脳血管障壁の通過問題だけではなく、本発明の製造方法によって製造された融合外来タンパク質は、経口投与時、胃内で分解される前に、胃壁を通過したり経皮に塗布したり貼り付けたりすることで皮膚を通過して体内に完全に伝達することができる。ゆえに、従来のタンパク質製剤の最大の問題点である投与方法の制限（静脈注射、筋肉注射、皮下注射または鼻腔投与）を解消して、より簡便な投与方法である経口投与、経皮投与を可能にできる。
【０１０３】
本発明は、前記方法によって製造された融合外来タンパク質を提供する。
【０１０４】
ここで、外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、脳を標的にする治療用タンパク質であることが好ましい。また、前記方法によって製造される融合外来タンパク質は、本発明の改変したシグナル配列によって脳血管障壁を通過することができる膜貫通領域を有するようになる。
【０１０５】
さらに、本発明は、本発明の製造方法によって製造された前記改変したシグナル配列と外来タンパク質の融合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。前記薬学的組成物は、特別にこれに制限されるものではないが、脳疾患治療に使用することが好ましい。
【０１０６】
同時に、本発明は、
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及びタンパク質分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメイン及び両親媒性ドメインを有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成されたシグナル配列の疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；
6）工程5）の形質転換体を培養する工程；
7）工程6）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；及び
8）タンパク質分解酵素で切断した後、工程7）の分離した融合外来タンパク質から前記タンパク質分解酵素認識部位を元の形態の外来タンパク質を分離する工程を含む、元の形態の外来タンパク質の製造方法を提供する。
【０１０７】
ここで、前記外来タンパク質は特別にこれに制限されるものではないが、前記外来タンパク質は当業者が所望するすべてのタンパク質が可能であり、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群より選択されるタンパク質であることが好ましく、不溶性タンパク質であることがさらに好ましい。本発明の実施例では、外来タンパク質にMefp1多重体及び平目ヘプシジンIを対象に遂行したが、それに限定されるものではない。
【０１０８】
前記方法において、疎水性親水性指標プロファイルの分析は特別にこれに制限されるものではないが、疎水性親水性指標プロファイル分析用コンピューターソフトウェアまたはウェブ基盤のアプリケーションで分析することが好ましく、前記コンピューターソフトウェアとしては、DNASIS（商標）（Hitachi，日本）、Visual  OMP（DNA  software，米国）、Lasergene（DNASTAR，米国）、pDRAW32（USA）及びNetSupport  DNA（NetSupport  Inc．米国）からなる群より選択したプログラムを使用することが好ましく、DNASIS（商標）（Hitachi，日本）を使用することが最も好ましい。ウェブ基盤のアプリケーションでは、イノバーゲン社（Innovagen，Inc．，Sweden）のホームページを通じて提供されるアプリケーションを使用することができる（／／www．innovagen．se／custom−peptide−synthesis／peptide−property−calculator／peptide−property−calculator．asp）。
【０１０９】
前記方法において、前記分泌エンハンサーは特別にこれに制限されるものではないが、少なくとも60％の親水性アミノ酸を含むポリペプチドであることが好ましく、さらに好ましくは少なくとも70％の親水性アミノ酸を含むポリペプチドであり、その長さは特別にこれに制限されるものではないが、2ないし50個のアミノ酸の長さであることが好ましく、4ないし25個のアミノ酸の大きさであることがより好ましくて、6ないし15個のアミノ酸の長さであることがさらに好ましく、最も好ましい場合は6個の親水性アミノ酸が反復する構造を有するものである。前記分泌エンハンサーとして用いられるのは、pI値が少なくとも８の親水性ポリペプチドであることが好ましく、pI値が少なくとも9の親水性ポリペプチドであることがさらに好ましくて、pI値が少なくとも10の親水性ポリペプチドであることが最も好ましいが、特別にこれに制限されるものではない。
【０１１０】
前記方法において、親水性アミノ酸は特別にこれに制限されるものではないが、アスパラギン、グルタミン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることが好ましく、最も好ましくはリジンまたはアルギニンである。
【０１１１】
本発明の他の実施態様で、前記分泌エンハンサー及び外来タンパク質の間にタンパク質分解酵素認識部位がさらに挿入されていることが好ましい。
【０１１２】
前記方法において、前記宿主細胞は特別にこれに制限されるものではないが、原核生物細胞または真核生物細胞であることが好ましく、前記原核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス、大腸菌、バシルス属からなる群より選択されたものが好ましくて、前記真核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母または植物細胞であることが好ましい。
【０１１３】
前記融合外来タンパク質は、上述した発現ベクターが形質転換された形質転換体で発現してタンパク質を回収することで生産することができる。回収方法は、当業者に公知された通常の方法を使用することができる。また、前記回収の前／後の融合外来タンパク質を当該融合外来タンパク質に挿入したタンパク質分解酵素認識部位をタンパク質分解酵素で処理して、元の形態の外来タンパク質のみを純粋分離することができ、前記タンパク質分解酵素としては、因子Xa、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼI、フリンを使用することができるが、必ずしもこれに制限されるものではない。一方、前記タンパク質分解酵素認識部位は、因子Xaの場合、Ile−Glu−Gly−Argであることが好ましい。
【０１１４】
一実施態様として、本発明は、
1）本発明の発現ベクターの制限酵素部位に外来タンパク質をコードする遺伝子を作動可能に連結して組換え発現ベクターを構築する工程；
2）工程1）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び
3）工程2）の形質転換体を培養する工程を含む外来タンパク質の分泌効率を高める方法を提供する。
【０１１５】
ここで、前記宿主細胞は特別に制限されるものではないが、原核生物細胞または真核生物細胞であることが好ましくて、前記原核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、ウイルス、大腸菌またはバシルス属中の微生物であることが好ましく、前記真核生物細胞は特別にこれに制限されるものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、及び植物細胞からなる群より選択されることが好ましい。
【０１１６】
さらに、本発明は下記の工程を含む外来タンパク質の分泌向上する分泌エンハンサーのスクリーニング方法を提供する：
1）プロモーター、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性領域を含む疎水性断片をコードするポリヌクレオチド、分泌エンハンサー候補配列挿入のための制限酵素部位、及び外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドがお互いに作動可能に連結された遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを構築する工程；
2）発現ベクターの制限酵素部位に親水性アミノ酸を含む分泌エンハンサー候補配列をコードするポリヌクレオチドを挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
3）工程2）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
4）前記工程3）の形質転換体を培養する工程；
5）工程1）の発現ベクターに形質転換された形質転換体（対照群）と工程4）の形質転換体との培養水溶液で前記外来タンパク質の発現程度を測定する工程；及び
6）対照群と比較して前記挿入外来タンパク質の発現程度を有意に増加させた分泌エンハンサーを選別する工程。
【０１１７】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。
【０１１８】
実施例1：接着性タンパク質遺伝子DNA多重体カセットのクローニング
本発明者等は、配列番号：1で記載されるアミノ酸配列を基本単位Mefp1（Ala  Lys  Pro  Ser  Tyr  Pro  Pro  Thr  Tyr  Lys）を根拠にして、配列番号：2で記載される正方向プライマー（5’−TAC  AAA  GCT  AAG  CCG  TCT  TAT  CCG  CCA  ACC−3’）と配列番号：3で記載される逆方向プライマー（5’−TTT  GTA  GGT  TGG  CGG  ATA  AGA  CGG  CTT  AGC−3’）を使用して合成mefp1DNAを製作した。左側アダプター（Left  adapter：以下「La」と略称する）合成DNAは、BamHI／EcoRI／SmaIを有する配列番号：4で記載される正方向プライマー（5’−GAT  CCG  AAT  TCC  CCG  GG−3’）と配列番号：5で記載される逆方向プライマー（5’−TTT  GTA  CCC  GGG  GAA  TTC  G−3’）で製作し、右側アダプター（Right  adapter：以下「Ra」と略称する）合成DNAは、Arg／HindIII／SalI／XhoIを有する配列番号：6で記載される正方向プライマー（5’−TAC  AAA  CGT  AAG  CTT  GTC  GAC  C−3’）と配列番号：7で記載される逆方向プライマー（5’−TCG  AGG  TCG  ACA  AGC  TTA  CG−3’）で製作して、大韓民国登録特許第379，025号に公示された方法でmefp1DNA多重体（multimer）を製作して、pBluescriptIISK（＋）ベクター（Stratagene，米国）にクローニングし、7回反復したmefp1DNA多重体を探索してpBluescriptIISK（＋）La−7×mefp1−Raと命名した（図2）。
【０１１９】
（表１）使用したプライマー、構築されたプラスミドクローン及び組換えMefp1タンパク質発現結果
2009525042.tif 000003
2009525042.tif 000004
【０１２０】
CATは、NdeI位置を保存するために延長された。
太いイタリック文字：OmpASP及びOmpASP一部の多様な大きさのオリゴヌクレオチドを適切に示す。
太い文字：SmaI位置のオリゴヌクレオチド。
下線を引いた太い文字：factor  Xa切断位置のオリゴヌクレオチド。
一般文字：図2で示されるMefp1部分のオリゴヌクレオチド。
逆方向プライマー：図2で示されるRa（右側アダプター；Arg／HindIII／SalI／XhoI）に相補的なオリゴリオヌクレオチド配列。
OmpAシグナルペプチド（OmpASP）は、23個のアミノ酸残基（MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAP：配列番号：46）で構成されている（Movva等，J．Biol．Chem．，1980年，第255巻，27−29頁）。
mefp1：Mefp1の遺伝子。
＊：Ra及びHisタグ（6×His）の残りの配列。
略字：T−全体タンパク質；S−水溶性タンパク質；及びP−ペリプラズム分画。
組換えMefp1タンパク質の発現結果は、無発現時は“−”で、発現時は“＋”で表示した。
【０１２１】
（表２）多様な長さのOmpASPに対するpI及び疎水性平均値と水溶性組換えMefp1タンパク質発現結果
2009525042.tif 000005
【０１２２】
OmpASPの多様な長さに対するpI及びホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale  with  window  size：6  and  threshold  line：0．00）による疎水性値は、DNASIS（商標）で計算した。ホップアンドウッズスケールによる疎水性値で＋が出る場合、当該ペプチドは親水性を帯びていて、−が出る場合は疎水性を帯びた。絶対値が大きいほど親水性または疎水性は程度が高いことを意味する。
【０１２３】
実施例2：接着性タンパク質発現調査
先行研究でMefp1は、Met−Mefp1を先導配列に使用する時は、不可溶性タンパク質凝集体を形成した（Kitamura等，J  Polym．Sci．Ser．A，1999年，第37巻，729−736頁）。そこで、本発明者等は水溶性発現のためにシグナル配列OmpASP（OmpA  signal  peptide）を導入して図2のmefp1塩基配列を鋳型にPCRを遂行して多くの大きさのシグナル配列OmpASPと前記製作したmefp1カセット（cassette）が連結されたクローンを製作した（表1）。
【０１２４】
前記表1のように製作したシグナル配列を有した発現ベクターをE．coli  BL21（DE3）に通常の方法で形質転換してLB培地［トリプトン（tryptone）20g、酵母抽出物5．0g、NaCl  0．5g、KCl  1．86mg／l］に50μg／mlアンピシリン（ampicillin）とともに30℃で16時間培養した。培養後、培養液をLB培地を使用して200倍に希釈した。希釈した培養液に1mM  IPTGを添加してOD600値が0．3になるように培養した。発現のために3時間培養した。培養液1mlを4，000×g、4℃で30分間遠心分離してペレット（pellet）を100ないし200μl試料バッファー（0．05M  Tris−HCl，pH6．8，0．1M  DTT，2％SDS，1％グリセロール，0．1％ブロモフェノールブルー）で懸濁した。懸濁液は、タンパク質を分離するためにソニケーター（sonicator）を使用して100  3−sパルスで粉砕し、細胞残物（cell  debris）を除去するために16，000rpm、30分、4℃で遠心分離を遂行して非水溶性部分を分離した。ペリプラズム分画は、急激な滲透圧変化（osmotic  shock）による滲透圧衝撃法（Nossal  and  Heppel，J．Biol．Chem．，1966年，第241卷，3055−3062頁）を使用して分離した。全体タンパク質、水溶性分画及びペリプラズム分画のタンパク質を16％SDS−PAGEゲルを使用してラエムリ（Laemmli）などの方法（Laemmli，Nature，1970年，第227卷，680−685頁）でSDS−PAGEを遂行してクマシーブルー染色法（Sigma，米国）で染色した。前記SDS−PAGEを遂行したゲルをニトロセルローズ膜（Roche，米国）に移動させた。以後、5％スキムミルク（Difco，米国）に浸した後、膜を0．4μg／ml  抗−His6モノクローナル抗体（Santa  Cruz  Biotechnology，米国）が含まれた溶液に37℃、2時間浸けた。以後、HRP−結合ウサギ抗−マウスIgG（horseradish  peroxidase  conjugated  rabbit  anti−mouse  IgG；Santa  Cruz  Biotechnology，米国）を2次抗体に使用して、3，3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB，Sigma，米国）を染色液に使用して染色した。
【０１２５】
本実験結果、先導配列であるOmpASP1−3以上OmpASP1−23までの大きさを有するすべてのベクタークローンは、全体タンパク質、水溶性分画（soluble  fraction）及びペリプラズム分画（periplasmic  fraction）でMefp1タンパク質を発現させた（表1及び図3）。ゆえに、Mefp1の水溶性発現のためには、OmpASP1−23の全体長さが必要ではなく、OmpASP1−3だけでもMefp1タンパク質前駆体をペリプラズムに転移させることができることが分かる。また、発現量は、先導配列の長さとは無関係でシグナル配列内の疎水性区域（central  characteristic  hydrophobic  region：OmpASP7−14）及び切断位置を有したC−末端区域（C−region  ending  with  cleavage  site：OmpASP15−23）には、分泌エンハンサーがないと判断した。シグナル配列OmpAの様々な長さに対するpI値とホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）による疎水性値を分析した結果、OmpASP1−3からOmpASP1−23までのすべての配列は、同一なpI値10．55を有し、ホップアンドウッズスケールによる疎水性値は変異が多かった（表2）。したがって、前記一定のpI値は、シグナル配列が水溶性発現のために指向性シグナルとして作用するのに最も重要だと思慮される。
【０１２６】
実施例3：元の形態（native  form）の接着性タンパク質生産
元の形態のN−末端接着性タンパク質を生産するため、短いOmpASPシグナル配列の水溶性発現結果を基に、本発明者等はC−末端が切断されるfactor  Xa切断部位（cleavage  site）を導入してOmpASP1−8−Xa−Mefp1のオリゴヌクレオチドを正方向プライマーで合成してpBluescriptIISK（＋）−La−7×mefp1−Ra（図2）を鋳型にPCRを遂行して、pET−22b（＋）（ompASP1−8−Xa−7×mefp1＊）（＊：Ra−6×His，Ra  derived  from  the  right  adaptor；6×His  derived  from  His  tag）クローンを製作した（表1）。前記ベクターを実施例2の形質転換方法とウエスタンブロット方法を遂行して発現を確認した。
【０１２７】
その結果、このクローンは、水溶性タンパク質OmpASP1−8−Xa−7×Mefp1＊を生産した。このように生産された組換え融合タンパク質を分解酵素factor  Xaで処理して水溶性発現を誘導したOmpASP1−8−Xa配列が除去された、元の形態のアミノ末端を有した7×Mefp1＊タンパク質を得ることができた（図4）。
【０１２８】
また、私たちは、上記のpET−22b（＋）（ompASP1−8−Xa−7×mefp1＊）クローンが元の形態のアミノ末端を有した接着性タンパク質を生産することができるので接着性タンパク質の遺伝子が短いため多くのコピーをクローニングする過程でPCRを通じて常に同じ数の接着性タンパク質の遺伝子をクローニングした後、シグナル配列を改変させるためには、SmaI部位をシグナル配列領域に導入することが便利であると判断して、pET−22b（＋）（ompASP1−8−SmaI−Xa−7×mefp1＊）クローン（表1）を製作し、発現したタンパク質は分解酵素factor  XaでOmpASP1−8−SmaI−Xaを切断して、元の形態のアミノ末端を有した7×Mefp1＊タンパク質を得た。また、pET−22b（＋）（ompASP1−8−SmaI−Xa−7×mefp1＊）クローン中でSmaI位置に6個のアルギニン（Arg）または6個のリジン（Lys）に該当するヌクレオチドを代替した結果、タンパク質分泌が若干増加することを確認した。
【０１２９】
実施例4：接着性タンパク質機能調査
pET−22b（＋）（ompASP1−8−Xa−7×mefp1＊）クローンからMefp1を下記のように分離した。発現が誘導された細胞を4，000×g、4℃で30分間遠心分離を遂行した。上澄み液は捨てて細胞ペレットを洗浄して−70℃に冷凍したり、すぐにPBS（pH8．0）に懸濁したりして、ソニケーターで粉砕した。粉砕した細胞は、12，000×g、4℃で30分間遠心分離を遂行した。上澄み液に分解酵素factor  Xa（New  England  Biolabs，米国）を処理してシグナル配列OmpASP1−8−Xa部分を切断した後、0．45μmシリンジフィルター（syringe  filter）を使用してろ過し、元の形態のmefp1タンパク質（7×Mefp1＊）を有した上澄み液を、His‐タグ精製キット（Qiagen，米国）を使用して製作社の方法にしたがって次のように精製した。Ni2＋キレーティング・レジン（chelating  resion）1mlを5ml蒸留水、3ml  50mM  NiSO4、5ml  1×結合バッファー（50mM  NaCl，20  mM  Tris−HCl，5mM  イミダゾール，pH7．9）で平衡化させた。上澄み液をカラムに通過させて、10mlの1×結合バッファーと6ml洗浄バッファー（60mM  イミダゾールin  PBS）で洗浄した。タンパク質は、6ml溶出バッファー（1，000mM  イミダゾールin  PBS）を使用して溶出し、溶出された分画は12％SDS−PAGEゲルを使用して分析した。
【０１３０】
前記のように得られた元の形態のアミノ末端を有した組換えMefp1タンパク質が、固有の機能を有しているか調査した。以後、5％アセト酸で透析（Hwang等，Appl．Environ．Microbiol．，2004年，第70巻，3352−3359頁）し後、チロシナーゼ（Sigma，米国）を使用してMefp1タンパク質のチロシンをDOPAで変換した。接着分析を遂行するために、1mg／mlタンパク質にチロシナーゼ10ユニットを加えて室温で撹拌しながら6時間処理した。対照群には、5％アセト酸バッファーに溶解したBSAを使用した。
【０１３１】
その結果、対照群に使用したBSAに比べて元の形態のアミノ末端を有した組換えMefp1タンパク質（7×Mefp1＊）は、顕著な接着性を示した（図5）。これを通じて、本発明の方法で生産された水溶性組換えMefp1タンパク質は、適当な構造で生産され、元々タンパク質の機能を有していることが分かった。
【０１３２】
実施例5：平目ヘプシジンIの水溶性タンパク質発現のための分泌エンハンサーのスクリーニング
実施例2の方法を使用した発現実験を通じて平目ヘプシジンI（Kim等，Biosci．Biotechnol．Biochem．，2005年，第69巻，1411−1414頁）を接着性タンパク質と同じ方法でOmpAシグナル配列（OmpASP）の様々な長さで融合タンパク質を発現させたが、水溶性に発現されなかった（表3）。平目ヘプシジンIの配列は、下記に示すとおりである（配列番号：47）：
His  Ile  Ser  His  Ile  Ser  Met  Cys  Arg  Trp  Cys  Cys  Asn  Cys  Cys  Lys  Ala  Lys  Gly  Cys  Gly  Pro  Cys  Cys  Lys  Phe。
【０１３３】
本発明者等は、平目ヘプシジンIとOmpASPtrの断片との融合タンパク質が水溶性に発現されない理由が、接着性タンパク質は平易な構造（pI：10．03；疎水性：−0．05）になっているが、平目ヘプシジンIは4個のジスルフィド結合と一つの両親媒性ドメインを有しているためであると推測した。
【０１３４】
したがって、水溶性タンパク質発現のための分泌エンハンサーをスクリーニングするため、私達は、平目ヘプシジンIに対してシグナル配列部分をOmpASP1−10−（  ）−XaでデザインしてpET−22b（＋）［ompASP1−10−（  ）−Xa−ofhepcidinI＊＊］を製作して、N−末端に位置したシグナル配列部分OmpASP1−10を固定させてC−末端に位置した（  ）−Xa部分を改変させるため、（  ）中にpIと疎水性／親水性値に多くの変化を与えるアミノ酸であるアルギニン（Arginine）、リジン（Lysine）、グルタミン酸（Glutamic  acid）、アスパラギン酸（Aspartic  acid）、チロシン（Tyrosine）、フェニルアラニン（Phenylalanine）、トリプトファン（Tryptophan）を六個ずつ追加して（表4）クローンを製作し（表3）、平目ヘプシジンIの水溶性発現を調査した。その結果、親水性アミノ酸であるアルギニン及びリジンが挿入されたクローンで水溶性ヘプシジンIが強く発現され、他のアミノ酸が挿入されたクローンでは発現が弱く起きた（図6）。これを通じて、平目ヘプシジンIではデザインしたシグナル配列のC−末端に追加した高いpI値と親水性を有したアミノ酸であるアルギニン及びリジンが強い分泌エンハンサーとしての役割をし、他のアミノ酸は比較的弱い分泌エンハンサーとして作用したことが分かった（図6及び表4）。したがって、前記結果から改変したシグナル配列領域C−末端に追加したアミノ酸は、高いpI値と親水性が分泌増強に大きな影響を及ぼすことを証明した。
【０１３５】
（表３）使用したプライマー、構築されたプラスミドクローン及び平目ヘプシジンIタンパク質発現結果
2009525042.tif 000006
2009525042.tif 000007
2009525042.tif 000008
【０１３６】
CATは、NdeI位置を保存するために延長された。
イタリック文字：OmpASP断片の多様な大きさのオリゴヌクレオチドを適切に示す。
太いイタリック文字：pI及び疎水性平均値と連関したアミノ酸のオリゴヌクレオチド。
太い文字：ヘプシジンI部分のオリゴヌクレオチド。
ofhepI：ofヘプシジン（Hepcidin）Iの遺伝子。
逆方向プライマー：ofHepcidienIのC−末端及びGlu／HindIII／SalI／XhoI部分が含まれた相補配列のオリゴヌクレオチド配列。
下線を引いた太い文字：factor  Xaの認識配列。
＊＊：Glu／HindIII／SalI／XhoI−6×His（Glu／HindIII／SalI／XhoIは、逆方向プライマーデザインから由来した；6×Hisは、Hisタグから由来した。）
略字：T−全体タンパク質；S−水溶性タンパク質；及びP−ペリプラズム分画。
組換えofHepI＊＊発現結果は、無発現時は“−”で、弱く発現時は：“＋／−”で、発現時は“＋”で表示した。
【０１３７】
（表４）多様なpI及び疎水性値を有したアミノ酸がOmpASP1−10−（  ）−Xaに挿入されたシグナル配列領域の疎水性値、及び図6及び表3のpET22b（＋）ompASP1−10−（  ）−Xa−ofHepI＊＊クローンで水溶性平目ヘプシジンIの発現結果
2009525042.tif 000009
【０１３８】
PI値及び（ウィンドウサイズ：6及び閾値ライン：0.00であるホップアンドウッズスケール）は、DNASIS（商標）で計算した。ホップアンドウッズスケール疎水性/親水性指標の'＋値'は親水性であるが、'-値'は親水性である。絶対値が大きいほど親水性または疎水性は程度が高いことを意味する。組換えofHepI＊＊発現結果は、弱く発現時は“＋／−”で、良好な発現時は“＋”で表示した。
【０１３９】
実施例6：シグナル配列の疎水性変化による平目ヘプシジンIの発現調査
疎水性変化による平目ヘプシジンIタンパク質の発現を調査するため、私達はシグナル配列のN−末端部分である指向性シグナルに使用したOmpASP断片の影響を調査するため、様々な長さに該当するシグナル配列OmpASP（  ）−6×Arg−Xaをデザインしてそれに該当するクローンを作って発現を調査した（表3及び図7）。デザインされたシグナル配列領域OmpASP1−6−6×Arg−Xa、OmpASP1−8−6×Arg−Xa、OmpASP1−10−6×Arg−Xa、OmpASP1−12−6×Arg−Xa、OmpASP1−14−6×Arg−Xaのホップアンドウッズスケールによる疎水性値は、それぞれ1．37、1．09、0．88、0．69及び0．62だった。その結果、ホップアンドウッズスケールによる疎水性値0．62以上ですべて水溶性に発現され、シグナル配列が短いほど親水性が大きくなって水溶性発現が増加された。また、ホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）を調査した結果、人為的にデザインして非常に短いシグナル配列OmpASP1−6（疎水性値−0．03）は、6×Arg−Xa（親水性値1．47）の融合によって親水性曲線のみを示し、少し長いシグナル配列（OmpASP1−8、OmpASP1−10、OmpASP1−12、OmpASP1−14）（疎水性値、表2参照）は、6×Arg−Xaの融合によってN−末端に疎水性曲線、C−末端に親水性曲線を示した。したがって、シグナル配列のホップアンドウッズスケールを自然な形態の疎水性及び親水性曲線を有する膜貫通類似疎水性親水性指標（transmembrane−like  hydropathy）を有するようにするためには、OmpASP1−8以上の大きさが適当であることが分かった。
【０１４０】
また、シグナル配列C−末端の分泌エンハンサーの機能を調査するため、シグナル配列OmpASP1−10を指向性シグナルに選択してN−末端に使用して、OmpASP1−10−（  ）−Xaをデザインして（  ）中に様々な長さの親水性アミノ酸を挿入してクローンを作り、発現を調査した（表3及び図8）。デザインされたシグナル配列領域OmpASP1−10−Xa、OmpASP1−10−LysArg−Xa、OmpASP1−10−4×Arg−Xa、OmpASP1−10−6×Arg−Xa、OmpASP1−10−8×Arg−Xa、OmpASP1−10−10×Arg−Xaのホップアンドウッズスケール値は、それぞれ−0．02、0．35、0．64、0．88、1．07及び1．23であった。その結果、ホップアンドウッズスケール値0．35以下では非常に弱く水溶性に発現し、ホップアンドウッズスケール値0．64以上ですべて良好に水溶性に発現して（図8）、親水性アミノ酸の長さが長いほど規則的に親水性が増加して水溶性発現が増加した。水溶性発現を誘導したすべてのシグナル配列のホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）を調査した結果、すべてのシグナル配列は膜貫通類似疎水性親水性指標と類似にN−末端に疎水性曲線とC−末端に親水性曲線を有していた。
【０１４１】
したがって、上記の結果からシグナル配列領域のホップアンドウッズスケールによる疎水性/親水性値は、平目ヘプシジンIの水溶性発現のための分泌エンハンサーの基準になり得ると考えられ、それによるホップアンドウッズスケールによる疎水性親水性指標プロファイルも、上記の結果を基にデザインする場合、分泌エンハンサーとして判断することができる補助基準になり得ると考えられる。
【０１４２】
実施例7：シグナル配列のホップアンドウッズスケールによる疎水性親水性指標プロファイルと平目ヘプシジンIの発現との相関性調査
実施例6の場合ホップアンドウッズスケール値は、平目ヘプシジンIの水溶性発現に対する良い基準になった。ゆえに、ホップアンドウッズスケールによる疎水性親水性指標プロファイルを分析して分泌エンハンサーの基準としての活用可能性を調査した。本発明者等は、コンピュータープログラムを使用して仮想的に平目ヘプシジンI（ofヘプシジンI）を対照群に使用して、シグナル配列と平目ヘプシジンIの融合タンパク質であるOmpASP1−10−Xa−ofヘプシジンI、OmpASP1−10−LysArg−Xa−ofヘプシジンI、及びOmpASP1−10−6×Arg−Xa−ofヘプシジンIのホップアンドウッズスケールによる疎水性親水性指標プロファイルを分析した（図9）。その結果、平目ヘプシジンIは、分子内に両親媒性ドメインを有していて、OmpASP1−10−Xa−ofヘプシジンI及びOmpASP1−10−LysArg−ofヘプシジンIは、二つの類似の大きさの膜貫通類似ドメインを有し、一つはシグナル配列で他の一つは平目ヘプシジンIの両親媒性ドメインに由来したものである。しかし、この仮想的なOmpASP1−10−Xa−ofヘプシジンI及びOmpASP1−10−LysArg−ofヘプシジンI融合タンパク質に該当する組換えタンパク質OmpASP1−10−Xa−ofヘプシジンI＊＊及びOmpASP1−10−LysArg−ofヘプシジンI＊＊は、水溶性に弱く発現した（表3及び図8）。しかし、仮想的な融合タンパク質OmpASP1−10−6×Arg−Xa−ofヘプシジンIのホップアンドウッズスケールのプロファイルは、二つの膜貫通類似ドメインをシグナル配列と平目ヘプシジンI分子内にそれぞれ一つずつ有し、シグナル配列の膜貫通類似ドメインは平目ヘプシジンI分子内にある両親媒性ドメインより大きさが大きく、それに一致するクローンから水溶性の組換えタンパク質OmpASP1−10−6×Arg−Xa−ofヘプシジンI＊＊が強く発現され、その発現量はシグナル配列の膜貫通類似疎水性親水性指標（transmembrane−like  hydropathy）の大きさとよく一致した（図8）。
【０１４３】
したがって、この結果から平目ヘプシジンIのように分子内に両親媒性ドメインを有している外来タンパク質を水溶性に発現させるためには、シグナル配列領域内にさらに大きい膜貫通類似ドメインの疎水性親水性指標が必要であるということが分かる。
【０１４４】
初めに本発明者等は、平目ヘプシジンIがOmpASPの断片と融合タンパク質の水溶性に発現されない理由を4個のジスルフィド結合と一つの両親媒性ドメインを有するためであると仮定したが、上記の実験を通じて膜貫通類似ドメインが最も重要な障害であると考えられる。その外の4個のジスルフィド結合に対しては、ペリプラズムで排出された未完成ポリペプチド鎖（nascent  polypeptide  chains）がペリプラズムの酸化的環境でジスルフィドイソメラーゼ（disulfide  isomerases）のようなDsbAによってジスルフィド結合を形成して（Bardwell等，Cell，1991年，第67巻，581−589頁；Kamitani等，EMBO  J．，1992年，第11巻，57−62頁）、また潜在折りたたみ助力子（potential  folding  aid）であるDsbAと一緒に発現させても目的タンパク質の発現に影響を与えない（Beck  and  Burtscher，Protein  Expression  and  Purification，1994年，第5巻，192−197頁）という報告があるので、ジスルフィド結合が水溶性発現の障害にならないと判断される。
【０１４５】
産業上の利用可能性
前記で詳しくみたように、本発明は組換えタンパク質の不溶性沈澱を防止して、細胞質外またはペリプラズムへの分泌効率を高めることで、組換え外来タンパク質の生産に有用に使用することができるのみならず、強力な分泌エンハンサーを使用して膜侵透性を高めて、有用治療用タンパク質の移動（transduction）に利用することができる。
【０１４６】
当業者は、前記説明で開示される概念と具体的な実施態様が本発明の同目的を果たするための他の実施態様を改変するか設計するための基礎として容易に用いられうることを認識すると考えられる。当業者はまた、このような等価の実施態様が添付の特許請求の範囲で説明される本発明の精神と範囲から逸脱しないことも認識すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
本発明の好ましい実施態様の適用は、添付の図面を参照して最もよく理解される。
【図１】本発明の発現ベクターに多様な実施態様を示した概略図である。
【図２】クローニングされたmefp1クローン、pBluescriptIISK（＋）−La−7×mefp1−Raの塩基配列を示した図である；La（left−adaptor）：下線を引いたBamHI／EcoRI／SmaI  region；Linker：linker  DNA（TACAAA）；AlaLysProSerTyrProProThrTyrLys：Mefp1の基本ユニット；及びRa（right  adaptor）：下線を引いたArg／HindIII／SalI／XhoI領域。
【図３】pET−22b（＋）［ompASP（  ）−7×mefp1＊］（＊：Ra−6×His）クローンの誘導体から得られた組換えMefp1融合タンパク質の水溶性上澄み液発現結果を示した図で、抗−His  tag抗血清（antiserum）は、3’末端にHis  tagが含まれたpET−22b（＋）によって生産される組換えMefp1を検出するために使用された；（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；右側上端矢印：組換えMefp1；右側下端矢印：OmpAシグナル配列（OmpASP）が切断したMefp1（OmpAシグナルペプチダーゼによってOmpASP1−21が切断されたmatured  form）；レーン1：OmpASP1−3−7×Mefp1＊；レーン2：OmpASP1−5−7×Mefp1＊；レーン3：OmpASP1−7−7×Mefp1＊；レーン4：OmpASP1−9−7×Mefp1＊；レーン5：OmpASP1−11−7×Mefp1＊；レーン6：OmpASP1−13−7×Mefp1＊；レーン7：OmpASP1−15−7×Mefp1＊；レーン8：OmpASP1−21−7×Mefp1＊（OmpAシグナル配列一部が不足な状態でMefp1配列が連結されてOmpAシグナルペプチダーゼによってOmpASP1−21が半分は切断され半分は切断されないもの）；及びレーン9：OmpASP1−23−7×Mefp1＊で、（OmpAシグナル配列を完全に有していてOmpAシグナルペプチダーゼによってOmpASP1−21が切断されたもの）。
【図４】クローンpET−22b（＋）（ompASP8−Xa−7×mefp1＊）（＊：Ra−6×His）から得られた水溶性組換えMefp1タンパク質及び元の形態のアミノ末端を有した7×Mefp1＊の発現結果を示した図である：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；右側上端矢印：組換えMefp1（OmpASP1−8−Xa−7×Mefp1＊）；右側下端矢印：元の形態のMefp1（7×Mefp1＊）；レーン1：3時間発現誘導していない全体細胞（whole  cell）試料；レーン2：3時間発現誘導された全体細胞試料；レーン3：3時間発現誘導された水溶性上澄み液（soluble  supernatant  fraction）試料；及びレーン4：3時間発現誘導された水溶性上澄み液試料をfactor  Xa分解酵素で処理して得られた元の形態のN−末端を有したMefp1試料。
【図５】組換えタンパク質Mefp1に対するガラス板コーティングを示した図である：   ＋：チロシナーゼ処理した試料；及び   −：チロシナーゼ処理していない試料。
【図６】pET22b（＋）［ompASP1−10−（   ）−Xa−ofhepcidinI＊＊］（＊＊：Glu／HindIII／SalI／XhoI−6×His）クローンから組換え平目（olive  flounder，学名：Paralichthys  olivaceus）ヘプシジンI（ofヘプシジンI）発現のためのOmpASPtr−（  ）−Xaの分泌エンハンサー結果である。pI及び疎水性定数値は、表4から分かるようにOmpASP1−10−（   ）−Xaのカッコの中に挿入するアミノ酸と連関している：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；矢印：組換えofヘプシジンI；M：マーカー；レーン1：対照群；レーン2：6×Arg；レーン3：6×Lys；レーン4：6×Glu；レーン5：6×Asp；レーン6：6×Try；及びレーン7：6×Trp。
【図７】指向性シグナルとしてOmpASP断片の長さがofヘプシジンI水溶性発現に及ぼす効果を示した図である。水溶性上層分画は、IPTGで3時間誘導した。ウエスタンブロットは図3のような方法で遂行した：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；矢印：組換えofヘプシジンI；M：マーカー；レーン1：pET22b（＋）［ompASP（1−6）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン2：pET22b（＋）［ompASP（1−8）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン3：pET22b（＋）［ompASP（1−10）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン4：pET22b（＋）［ompASP（1−12）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；及びレーン5：pET22b（＋）［ompASP（1−14）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］。
【図８】シグナル配列領域の高いpI及び親水性アミノ酸が、ofヘプシジンI発現に及ぼす効果を示した図である。水溶性上層分画は、IPTGで3時間誘導した。ウエスタンブロットは図3と同じ方法で遂行した：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；矢印：組換えofヘプシジンI；M：マーカー；レーン1：対照群；pET22b（＋）［ompASP1−10−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン2：pET22b（＋）［ompASP1−10−（LysArg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン3：pET22b（＋）［ompASP1−10−（4×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン4：pET22b（＋）［ompASP1−10−（6×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン5：pET22b（＋）［ompASP1−10−（8×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］；及びレーン6：pET22b（＋）［ompASP1−10−（10×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］。
【図９】コンピュータープログラムでofヘプシジンI及びその変異体でシグナル配列領域のC−末端の親水性アミノ酸を挿入した後、疎水性親水性指標プロファイルをホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）値で分析した結果である：（A）ofヘプシジンI（26aa，Av  −0．21）；（B）OmpASP1−10−Xa−ofヘプシジンI（40aa，Av  −0．19）；（C）OmpASP1−10−LysArg−Xa−ofヘプシジンI（42aa，Av  −0．04）；（D）OmpASP1−10−6×Arg−Xa−ofヘプシジンI（46aa，Av  0．22）；aa：アミノ酸数；及びAv：疎水性平均値。
【図１】
2009525042.tif 000011
【図２】
2009525042.tif 000012
【図３】
2009525042.tif 000013
【図４】
2009525042.tif 000014
【図５】
2009525042.tif 000015
【図６】
2009525042.tif 000016
【図７】
2009525042.tif 000017
【図８】
2009525042.tif 000018
【図９】
2009525042.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月30日(2008.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（I）好ましくはウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターである、プロモーター、及び
（II）前記プロモーターに作動可能に連結されたシグナル配列（signal  sequence）、好ましくは、ウイルス、原核生物または真核生物起源のシグナル配列または先導配列（leader  sequence）である前記シグナル配列、さらに好ましくは、OmpAシグナル配列、CT−B（コレラトキシンサブユニットB（cholera  toxin  subunit B））シグナル配列、LTIIb−B（大腸菌不安定性エンテロトキシンBサブユニット（E．coli  heat−labile  enterotoxin  B  subunit））シグナル配列、BAP（細菌アルカリホスファターゼ（bacterial  alkaline  phosphatase））シグナル配列、酵母カルボキシペプチダーゼ（Yeast  carboxypeptidase）Yシグナル配列、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces  lactis）のキラートキシンガンマサブユニット（killer  toxin  gamma  subunit）シグナル配列、牛成長ホルモン（bovine  growth  hormone）のシグナル配列、インフルエンザノイラミニダーゼ（influenza  neuraminidase）のシグナルアンカー（signal−anchor）、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファ（Translocon−associated  protein  subunit  alpha）のシグナル配列、及び双方アルギニン転座（Twin−arginine  translocation）（Tat）シグナル配列からなる群より選択される前記シグナル配列のN−領域を含む、ポリペプチド断片、好ましくは特徴的にシグナル配列の1番目ないし3番目アミノ酸を含む3ないし21個のアミノ酸から構成されるペプチドであるN−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、で構成された遺伝子コンストラクトを含む、
外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項２】
（I）好ましくはウイルス起源のプロモーター、原核生物起源のプロモーターまたは真核生物起源のプロモーターである、プロモーター、
（II）疎水性断片、好ましくは、前記プロモーターに作動可能に連結されたシグナル配列、好ましくはウイルス、原核生物または真核生物起源のシグナル配列または先導配列である前記シグナル配列、さらに好ましくはOmpAシグナル配列、CT−B（コレラトキシンサブユニットB）シグナル配列、LTIIb−B（大腸菌不安定性エンテロトキシンBサブユニット）シグナル配列、BAP（細菌アルカリホスファターゼ）シグナル配列、酵母カルボキシペプチダーゼYシグナル配列、クルイベロマイセス・ラクティスのキラートキシンガンマサブユニットシグナル配列、牛成長ホルモンのシグナル配列、インフルエンザノイラミニダーゼのシグナルアンカー、トランスロコン結合タンパク質サブユニットアルファのシグナル配列、及び双方アルギニン転座（Tat）シグナル配列からなる群より選択される前記シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性領域を含むシグナル配列の1番目ないし6番目アミノ酸を含む6ないし21個のアミノ酸で構成されるペプチドであるシグナル配列の疎水性断片をコードするポリヌクレオチド、及び
（III）分泌エンハンサーが、好ましくは、少なくとも60％が親水性アミノ酸である2ないし50個のアミノ酸で構成されたペプチドをコードするポリヌクレオチド、pI値が少なくとも10の親水性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または親水性アミノ酸が6個反復したペプチドをコードするポリヌクレオチドである、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された分泌エンハンサー、から構成された遺伝子コンストラクトを含む、
外来タンパク質の分泌効率向上のための発現ベクター。
【請求項３】
前記ウイルス起源のプロモーターが、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）（CMV）プロモーター、ポリオマウイルスプロモーター、鶏痘ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、牛乳頭腫ウイルスプロモーター、鳥類肉腫ウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、B型肝炎ウイルスプロモーター、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターおよび猿ウイルス40（SV40）プロモーターである、請求項1または請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記原核生物起源のプロモーターが、T7プロモーター、SP6プロモーター、熱ショックタンパク質70プロモーター、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター、およびtacプロモーターである、請求項1または請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記真核生物起源のプロモーターが、酵母起源のプロモーターであり、好ましくは前記酵母起源のプロモーターが、3−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、エノラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ピルベートジカルボキシラーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、グルコース−6−リン酸イソメラーゼプロモーター、3−ホスホグリセレートムターゼプロモーター、ピルベートキナーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ2プロモーター、イソチトクロムCプロモーター、酸ホスファターゼプロモーター、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）GAL1プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL7プロモーター、サッカロマイセスセレビシエGAL10プロモーター、またはピキア・パストリス（Pichia  pastoris）AOX1プロモーター、植物起源のプロモーターまたは動物細胞起源のプロモーターであり、好ましくは前記動物細胞起源のプロモーターが、熱ショックタンパク質プロモーター、プロラクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターからなる群より選択される、請求項1または請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記N−領域を含むポリペプチド断片のpI値が、少なくとも8である、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項７】
N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが、作動可能に連結された分泌エンハンサー、好ましくは少なくとも60％が親水性アミノ酸である2ないし50個のアミノ酸で構成された親水性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである前記分泌エンハンサーをさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項８】
N−領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドに作動可能に連結されたタンパク質分解酵素認識部位、好ましくはXa因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼ（genenase）I認識部位及びフリン（furin）認識部位からなる群より単独または融合の形態で選択される前記タンパク質分解酵素認識部位をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項９】
分泌エンハンサーをコードするヌクレオチドが、タンパク質分解酵素認識部位、好ましくは、Xa因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位及びフリン認識部位からなる群より単独または融合の形態で選択される前記タンパク質分解酵素認識部位をコードするヌクレオチドに作動可能に連結される、請求項2または請求項7に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
外来タンパク質、好ましくは一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがない外来タンパク質、さらに好ましくは内部に膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインがないMefp1である外来タンパク質をコードする遺伝子の挿入のための制限酵素部位をさらに含む、請求項1または請求項7に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
遺伝子コンストラクトが外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
親水性アミノ酸がリジンまたはアルギニンである、請求項2または請求項7に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドが外来遺伝子の挿入のための制限酵素部位にさらに連結された、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドが遺伝子コンストラクトに作動可能にさらに連結され、好ましくは外来タンパク質が、内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質であり、さらに好ましくは内部に一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを有しているタンパク質が、平目ヘプシジンIである、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項1〜請求項2の一方の発現ベクターで、宿主細胞、好ましくは原核生物細胞または真核生物細胞である宿主細胞を形質転換して製造した、非ヒト形質転換体。
【請求項１６】
1）好ましくは疎水性親水性指標プロファイルが、コンピューターソフトウェアで分析され、好ましくは、コンピューターソフトウェアが、外来タンパク質、好ましくは不溶性タンパク質である外来性タンパク質の疎水性親水性指標プロファイル分析用の、DNASIS（商標）、Visual  OMP、Lasergene、pDRAW32及びNetSupportからなる群より選択されるコンピューターソフトウェアまたはウェブ基盤のアプリケーションである、疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質、またはシグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及び分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインおよび両親媒性ドメインが有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー（secretional  enhancer）、好ましくは少なくとも60％が親水性アミノ酸である2ないし50個のアミノ酸で構成されたポリペプチドまたはpI値が少なくとも10の親水性ペプチドである分泌エンハンサー、及び前記外来タンパク質を順次に含む融合タンパク質、またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；及び
6）工程5）の形質転換体を培養する工程を含む、
外来タンパク質の分泌効率を高める方法。
【請求項１７】
親水性アミノ酸がリジンまたはアルギニンである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及びタンパク質分解酵素認識部位に前記外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインおよび両親媒性ドメインを有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び外来タンパク質を順次に含む融合外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；
6）工程5）の形質転換体を培養する工程；及び
7）工程6）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程を含む、
融合外来タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
1）外来タンパク質の疎水性親水性指標プロファイルを分析する工程；
2）前記工程1）で分析された外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを内部に含むのかどうかを判定する工程；
3）（a）工程2）で前記外来タンパク質が膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインまたは両親媒性ドメインを含まないと判定された場合には、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片及びタンパク質分解酵素認識部位に外来タンパク質が連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築して、かつ
（b）工程2）で前記外来タンパク質が一つ以上の膜貫通ドメイン、膜貫通類似ドメインおよび両親媒性ドメインを有すると判定された場合には、シグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性配列で構成された疎水性断片、分泌エンハンサー、タンパク質分解酵素認識部位及び前記外来タンパク質を順次に含む融合外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドで構成される遺伝子コンストラクトを構築する工程；
4）工程3）で製造された遺伝子コンストラクトを発現ベクターに作動可能に挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
5）工程4）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を構築する工程；
6）工程5）の形質転換体を培養する工程；及び
7）工程6）の培養液から融合外来タンパク質を分離する工程；及び
8）前記タンパク質分解酵素認識部位をタンパク質分解酵素で切断した後、工程7）の分離した融合外来タンパク質から元の形態の外来タンパク質を分離する工程を含む、
元の形態の外来タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
1）請求項10の発現ベクターの制限酵素部位に外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して組換え発現ベクターを構築する工程；
2）工程1）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び
3）工程2）の形質転換体を培養する工程を含む、
外来タンパク質の分泌効率を高める方法。
【請求項２１】
1）請求項13の発現ベクターの制限酵素部位に外来タンパク質をコードする遺伝子を作動可能に連結して組換え発現ベクターを構築する工程；
2）工程1）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；及び
3）工程2）の形質転換体を培養する工程を含む、
外来タンパク質の分泌効率を高める方法。
【請求項２２】
1）請求項14の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
2）工程1）の形質転換体を培養する工程；
3）培養液から、前記外来タンパク質、好ましくは脳を標的にする治療用タンパク質である前記外来タンパク質を分離する工程；及び
4）前記分離した外来タンパク質にタンパク質分解酵素を処理して、元の形態の外来タンパク質を分離する工程を含む、
元の形態の外来タンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法で製造され、脳血管障壁通過を促進する膜貫通領域を有した、組換え外来タンパク質。
【請求項２４】
請求項23のタンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
脳疾患の治療に使用される、請求項24に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
原核生物細胞が、ウイルス、大腸菌、バシルス属（Bacillus）からなる群より選択される、請求項15に記載の形質転換体。
【請求項２７】
真核生物細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、および植物細胞からなる群より選択される、請求項15に記載の形質転換体。
【請求項２８】
1）プロモーター、シグナル配列のN−領域を含むポリペプチド断片またはシグナル配列のN−領域及び中央特異的疎水性領域を含む疎水性断片をコードするポリヌクレオチド、分泌エンハンサー候補の挿入のための制限酵素部位、及び外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドがお互いに作動可能に連結された遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを構築する工程；
2）発現ベクターの制限酵素部位に親水性アミノ酸を含む分泌エンハンサー候補配列をコードするポリヌクレオチドを挿入して組換え発現ベクターを構築する工程；
3）工程2）の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を製造する工程；
4）前記工程3）の形質転換体を培養する工程；
5）工程1）の発現ベクターで形質転換された形質転換体（対照群）と工程4）の形質転換体との培養水溶液で前記外来タンパク質の発現程度を測定する工程；及び
6）対照群と比べて有意に前記挿入外来タンパク質の発現程度を増加させた分泌エンハンサーを選別する工程を含む、
外来タンパク質の分泌向上を誘導する分泌エンハンサーのスクリーニング方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月21日(2008.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明の組換えタンパク質で使用するfactor  Xaの認識部位は、配列（Ile−Glu−Gly−Arg：配列番号48）を使用することが好ましい。また、本発明の分解酵素は、factor  Xa、エンテロキナーゼ（Asp−Asp−Asp−Asp−Lys：配列番号49）、ジェネナーゼI（His−Tyr）、フリン（Arg−X−X−Arg）からなる群より選択された分解酵素を使用することが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
したがって、本研究者等は、分泌エンハンサーをスクリーニングするためにシグナル配列領域をOmpASP1−10−（  ）−Xaでデザインして、pI及び疎水性／親水性に影響を与えるアミノ酸を六個ずつ6×Arg：配列番号50、6×Lys：配列番号51、6×Glu：配列番号52、6×Asp：配列番号53、6×Tyr：配列番号54、6×Phe：配列番号55、6×Trp：配列番号56を（  ）中に挿入して（表4参照）、平目ヘプシジンI遺伝子（Kim等，Biosci．Biotechnol．Biochem．，2005年，第69卷，1411−1414頁）を鋳型にPCR方法でpET−22b（＋）［ompASP1−10−（    ）−Xa−ofhepcidinI＊＊］の一般的なクローンを構成した（表3参照）。前記クローンに対して大腸菌で発現させた結果、高いpI値と親水性アミノ酸である6×Arg及び6×Lysの配列を挿入したクローンは、水溶性平目ヘプシジンIを強く発現したが、他のアミノ酸を挿入したクローンは水溶性平目ヘプシジンIを非常に弱く発現した（図6参照）。したがって、水溶性平目ヘプシジンIの発現は、高いpI値と親水性アミノ酸であるArg及びLysによる親水性値の増加と関連があり、シグナル配列領域のC−末端に挿入されたアミノ酸Arg及びLysが、分泌エンハンサーであることが明確に明かされた（表4参照）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
一方、本発明の一実施態様で、本発明の発現ベクターの前記N−領域を含むポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能にタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドが連結される（図1（d）参照）。ここで、前記タンパク質分解酵素認識部位は、Xa因子認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位またはフリン認識部位を単独で使用したり、いずれか二つ以上を順次に連結して使用したりすることができる。一方、前記タンパク質分解酵素認識部位は、因子Xaの場合、Ile−Glu−Gly−Arg：配列番号48であることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
本発明の他の実施態様で、本発明の発現ベクターは前記分泌エンハンサーをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたタンパク質分解酵素認識部位をコードするポリヌクレオチドをさらに含む（図1（i）参照）。ここで、前記タンパク質分解酵素認識部位は、Xa因子タンパク質分解認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、ジェネナーゼI認識部位またはフリン認識部位を単独で使用したりいずれか二つ以上を順次に連結して使用したりすることができる。一方、前記タンパク質分解酵素認識部位は因子Xaの場合、Ile−Glu−Gly−Arg：配列番号48であることが好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
前記融合外来タンパク質は、上述した発現ベクターが形質転換された形質転換体で発現してタンパク質を回収することで生産することができる。回収方法は、当業者に公知された通常の方法を使用することができる。また、前記回収の前／後の融合外来タンパク質を当該融合外来タンパク質に挿入したタンパク質分解酵素認識部位をタンパク質分解酵素で処理して、元の形態の外来タンパク質のみを純粋分離することができ、前記タンパク質分解酵素としては、因子Xa、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼI、フリンを使用することができるが、必ずしもこれに制限されるものではない。一方、前記タンパク質分解酵素認識部位は、因子Xaの場合、Ile−Glu−Gly−Arg：配列番号48であることが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
実施例3：元の形態（native  form）の接着性タンパク質生産
元の形態のN−末端接着性タンパク質を生産するため、短いOmpASPシグナル配列の水溶性発現結果を基に、本発明者等はC−末端が切断されるfactor  Xa切断部位（cleavage  site）を導入してOmpASP1−8−Xa−Mefp1のオリゴヌクレオチドを正方向プライマーで合成してpBluescriptIISK（＋）−La−7×mefp1−Ra（図2）を鋳型にPCRを遂行して、pET−22b（＋）（ompASP1−8−Xa−7×mefp1＊）（＊：Ra−6×His（配列番号63），Ra  derived  from  the  right  adaptor；6×His（配列番号63）  derived  from  His  tag）クローンを製作した（表1）。前記ベクターを実施例2の形質転換方法とウエスタンブロット方法を遂行して発現を確認した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
本発明の好ましい実施態様の適用は、添付の図面を参照して最もよく理解される。
【図１】本発明の発現ベクターに多様な実施態様を示した概略図である。
【図２】クローニングされたmefp1クローン、pBluescriptIISK（＋）−La−7×mefp1−Raの塩基配列を示した図である；La（left−adaptor）：下線を引いたBamHI／EcoRI／SmaI  region：配列番号60；Linker：linker  DNA（TACAAA）；AlaLysProSerTyrProProThrTyrLys：Mefp1：配列番号1の基本ユニット；及びRa（right  adaptor）：下線を引いたArg／HindIII／SalI／XhoI領域：配列番号62。
【図３】pET−22b（＋）［ompASP（  ）−7×mefp1＊］（＊：Ra−6×His）クローンの誘導体から得られた組換えMefp1融合タンパク質の水溶性上澄み液発現結果を示した図で、抗−His  tag抗血清（antiserum）は、3’末端にHis  tagが含まれたpET−22b（＋）によって生産される組換えMefp1を検出するために使用された；（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；右側上端矢印：組換えMefp1；右側下端矢印：OmpAシグナル配列（OmpASP）が切断したMefp1（OmpAシグナルペプチダーゼによってOmpASP1−21が切断されたmatured  form）；レーン1：OmpASP1−3−7×Mefp1＊；レーン2：OmpASP1−5−7×Mefp1＊；レーン3：OmpASP1−7−7×Mefp1＊；レーン4：OmpASP1−9−7×Mefp1＊；レーン5：OmpASP1−11−7×Mefp1＊；レーン6：OmpASP1−13−7×Mefp1＊；レーン7：OmpASP1−15−7×Mefp1＊；レーン8：OmpASP1−21−7×Mefp1＊（OmpAシグナル配列一部が不足な状態でMefp1配列が連結されてOmpAシグナルペプチダーゼによってOmpASP1−21が半分は切断され半分は切断されないもの）；及びレーン9：OmpASP1−23−7×Mefp1＊で、（OmpAシグナル配列を完全に有していてOmpAシグナルペプチダーゼによってOmpASP1−21が切断されたもの）。
【図４】クローンpET−22b（＋）（ompASP8−Xa−7×mefp1＊）（＊：Ra−6×His（配列番号63））から得られた水溶性組換えMefp1タンパク質及び元の形態のアミノ末端を有した7×Mefp1＊の発現結果を示した図である：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；右側上端矢印：組換えMefp1（OmpASP1−8−Xa−7×Mefp1＊）；右側下端矢印：元の形態のMefp1（7×Mefp1＊）；レーン1：3時間発現誘導していない全体細胞（whole  cell）試料；レーン2：3時間発現誘導された全体細胞試料；レーン3：3時間発現誘導された水溶性上澄み液（soluble  supernatant  fraction）試料；及びレーン4：3時間発現誘導された水溶性上澄み液試料をfactor  Xa分解酵素で処理して得られた元の形態のN−末端を有したMefp1試料。
【図５】組換えタンパク質Mefp1に対するガラス板コーティングを示した図である：   ＋：チロシナーゼ処理した試料；及び   −：チロシナーゼ処理していない試料。
【図６】pET22b（＋）［ompASP1−10−（   ）−Xa−ofhepcidinI＊＊］（＊＊：Glu／HindIII／SalI／XhoI−6×His（配列番号63））クローンから組換え平目（olive  flounder，学名：Paralichthys  olivaceus）ヘプシジンI（ofヘプシジンI）発現のためのOmpASPtr−（  ）−Xaの分泌エンハンサー結果である。pI及び疎水性定数値は、表4から分かるようにOmpASP1−10−（   ）−Xaのカッコの中に挿入するアミノ酸と連関している：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；矢印：組換えofヘプシジンI；M：マーカー；レーン1：対照群；レーン2：6×Arg；レーン3：6×Lys；レーン4：6×Glu；レーン5：6×Asp；レーン6：6×Try；及びレーン7：6×Trp。
【図７】指向性シグナルとしてOmpASP断片の長さがofヘプシジンI水溶性発現に及ぼす効果を示した図である。水溶性上層分画は、IPTGで3時間誘導した。ウエスタンブロットは図3のような方法で遂行した：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；矢印：組換えofヘプシジンI；M：マーカー；レーン1：pET22b（＋）［ompASP（1−6）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン2：pET22b（＋）［ompASP（1−8）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン3：pET22b（＋）［ompASP（1−10）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン4：pET22b（＋）［ompASP（1−12）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］；及びレーン5：pET22b（＋）［ompASP（1−14）−6×Arg−Xa−ofhepcidinI＊＊］。
【図８】シグナル配列領域の高いpI及び親水性アミノ酸が、ofヘプシジンI発現に及ぼす効果を示した図である。水溶性上層分画は、IPTGで3時間誘導した。ウエスタンブロットは図3と同じ方法で遂行した：（A）SDS−PAGE；（B）ウエスタンブロット；矢印：組換えofヘプシジンI；M：マーカー；レーン1：対照群；pET22b（＋）［ompASP1−10−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン2：pET22b（＋）［ompASP1−10−（LysArg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］；レーン3：pET22b（＋）［ompASP1−10−（4×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］：配列番号57；レーン4：pET22b（＋）［ompASP1−10−（6×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］：配列番号50；レーン5：pET22b（＋）［ompASP1−10−（8×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］：配列番号58；及びレーン6：pET22b（＋）［ompASP1−10−（10×Arg）−Xa−ofhepcidinI＊＊］：配列番号59。
【図９】コンピュータープログラムでofヘプシジンI及びその変異体でシグナル配列領域のC−末端の親水性アミノ酸を挿入した後、疎水性親水性指標プロファイルをホップアンドウッズスケール（Hopp  ＆ Woods  scale）値で分析した結果である：（A）ofヘプシジンI（26aa，Av  −0．21）；（B）OmpASP1−10−Xa−ofヘプシジンI（40aa，Av  −0．19）；（C）OmpASP1−10−LysArg−Xa−ofヘプシジンI（42aa，Av  −0．04）；（D）OmpASP1−10−6×Arg−Xa−ofヘプシジンI（46aa，Av  0．22）；aa：アミノ酸数；及びAv：疎水性平均値。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2009525042.tif 000020
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009525042000001.app
【国際調査報告】
2009525042.tif 000021
2009525042.tif 000022
2009525042.tif 000023