(57)【要約】本発明は、サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在または非存在を同時に検出するための下記ステップ；(i)第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識されている第一基質を提供すること、および(ii)第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識されている第二基質を提供すること、(iii)サンプル中に存在する第一および第二酵素を、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質と相互作用させて、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質断片を形成させるように、該サンプルに該標識された基質を暴露すること;そして、フルオロフォア標識した基質断片の存在を検出すること、を含む方法を提供する。
2009525742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在または非存在を同時に検出するための方法であって、
(i)
(a)第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識された第一基質、および
(b)第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識された第二基質、
を、該サンプルに、サンプル中に存在する第一および第二酵素が、存在する場合に、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質と相互作用して、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質断片を形成できるように、暴露するステップ;
(ii)該フルオロフォア標識した基質断片の存在を検出するステップ、
のステップを含む、方法。
【請求項２】
少なくとも２つの浮遊酵素のレベルを検出するための方法であって、下記ステップ:
(i)基質をサンプルに暴露する前に、空気の第一サンプルを得るステップ；および
(ii)第一サンプル中に存在する酵素粒子を捕捉するステップ、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
捕捉した酵素粒子を液体と混合してサンプルを形成することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
液体が水性緩衝液である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
第一サンプルが液体と共に混合される区域から、該サンプルが該基質に暴露される反応区域に、該サンプルを運ぶことをさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
サンプルを基質に暴露するステップが、第一および／または第二酵素と個々の基質と相互作用し、フルオロフォア標識基質断片を形成することが出来るために十分な期間行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
検出するステップが、第一および／または第二のフルオロフォア標識された基質断片により放出されたシグナルを検出することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第一および／または第二の基質が、タンパク質またはポリペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
タンパク質またはポリペプチドが、ゼラチン、ブタのチログロブリン、コラーゲン、イムノグロブリンまたはその断片およびウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
基質の少なくとも１つが支持体上で担持されている、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
支持体が固相支持体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
支持体が、ガラス、ゾルゲルビーズ、セルロースファイバまたはシリカ粒子から作成されるか、またはガラス、ゾルゲルビーズ、セルロースファイバまたはシリカ粒子を含む、請求項１０または請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
支持体が磁化可能である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第一および／または第二の酵素が、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、α−アミラーゼまたはコラゲナーゼからなる酵素群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼが、サブチリシン型、トリプシン、パパイン、エスペラーゼおよびアルカラーゼからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１６】
第一および／または第二のフルオロフォアが、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミン、テキサス・レッド（登録商標）およびルシファー・イエローから選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、空気の第一サンプルから得られる、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
第一および第二の基質の一つまたは両方が、プロテアーゼについての基質である、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
まずサンプルを、第一または第二の基質の一つに暴露すること、次いで該サンプルを第一または第二の基質のもう一方に暴露することを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
モニターされる酵素の少なくとも１つがプロテアーゼであり、第一および第二の基質の少なくとも１つがプロテアーゼのための基質である、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
酵素がサブチリシン型酵素であり、そして基質がα−アミラーゼである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
サンプルを、第一基質および第二の基質に同時に暴露することを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在の同時検出において使用するための容器であって、使用の際に、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識されている第一基質、および第二酵素のための、第二フルオロフォアによって標識されている第二の基質を含んでいる、容器。
【請求項２４】
第一および第二の基質の少なくとも１つが支持されている支持体を含む、請求項２３記載の容器。
【請求項２５】
支持体が、ガラスまたはゾルゲルビーズ、シリカ粒子またはセルロースファイバを含んでいる固相支持体である、請求項２３または請求項２４記載の容器。
【請求項２６】
容器が、第一および第二の基質の不均質混合物を含有する、請求項２５記載の容器。
【請求項２７】
容器が、第一基質を実質的に含んでいる少なくとも１つの層、および第二基質から実質的に含んでいる少なくとも１つの層を含有する、請求項２６記載の容器。
【請求項２８】
サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出において使用するための装置であって、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識されている第一基質、および第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識されている第二基質を含む容器を含んでおり、蛍光基質断片を検出するための検出手段をさらに含んでいる、装置。
【請求項２９】
第一および第二の基質が容器内で層化されている、請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
第一および第二の基質の一つがプロテアーゼ酵素のための基質である場合、それはもう一つの基質の下流に存在するように位置づけられている、請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
サンプル中で少なくとも２つの酵素の同時検出において使用するための装置であって、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識されている第一基質を含む第一容器を含んでおり、該第一装置は第二容器に接続可能であり、該第二容器は、第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識されている第二の基質を含んでおり、該装置はさらに蛍光基質断片を検出するための検出手段を含んでいる、装置。
【請求項３２】
第一基質または第二基質の一つがプロテアーゼ酵素のための基質である場合、それはもう一方の容器から下流の容器内にあり、検出手段に近接して位置している、請求項３１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の技術分野）
本発明は、サンプル中で少なくとも２つの酵素の存在をモニターするための方法に関する。該酵素は、酵素の混合物と見なされ得る。本発明の実施態様において、該方法は、継続的またはほぼ継続的に酵素混合物をモニターすることを含む。本発明の方法は、また酵素の混合物の中に含まれる酵素の濃度を決定するために使用され得る。また、本発明の開示内容に含まれるものは、該方法における使用のための産物および装置である。
【０００２】
（本発明の背景）
様々なタイプの酵素が、様々な産業全体、例えば医薬品工業、バイオ産業、石鹸および洗剤工業および食品工業において広く使用される。職場空気中に放出された酵素の吸入により、呼吸器感作による暴露された従業員に対する有害な健康への影響を引き起こし得ることが観察されてきた。法定暴露限界は、例えばタンパク質分解酵素サブチリシンおよび関連酵素に対して特定されており、この酵素のクラスについては40 ng/m3の職場暴露限界(WEL)が実行されていることが法定要件である[1]。この要件に従うためには、長期間、定期的な間隔でまたは継続した暴露をモニターすることが必要である。
【０００３】
浮遊酵素をモニターするためのシステムは、現在、酵素を空気から捕捉すること、捕捉された酵素を溶液に抽出すること、および構成酵素について得られる溶液を分析することを含む。捕捉のための最も一般的な方法は空気をフィルターに通過させることからなり、分析は広く分光的または蛍光分光法を基にされる、ここで酵素は溶液中［２］またはイムノアッセイ態様、例えばＥＬＩＳＡ［３］中で標識された基質の分子を加水分解する。フィルター上での捕捉後の複雑な抽出および分析の組合せは、浮遊酵素の準実時間モニタリングのための高感受性、試薬不使用のおよび継続的方法を生み出すように開発されることが出来ず、酵素の断続的放出をモニターできないので、得られた結果は時間平均値を表す。
【０００４】
サイクロン表面上の衝突による空気からの捕捉およびサイクロンの洗浄された表面からの捕捉された酵素の即時分析を組み合わせる方法が説明される。後者は、固定化されたベッドまたはバイオリアクター内に含有した固相支持体上で固定される目的とする酵素に特異的な蛍光標識された基質を用いて達成される。バイオリアクターを酵素が通過して、基質の部分消化および蛍光標識された断片の下流での検出［４］をもたらす。このシステムにより、空気中に存在し得る一つの酵素を継続的かつ準実時間モニタリング出来る［５］。
【０００５】
現在まで、継続的および準実時間で少なくとも２つの浮遊酵素を含む混合物を同時にモニターできることが記載されたシステムはなかった。継続的使用のために酵素混合物をモニターするため、または高頻度の間隔でモニターするための方法を提供することが、本発明の実施態様の目的である。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、酵素をモニターする改良方法を提供することであり、これは継続的使用または頻繁に短い時間間隔でのモニターに適切である。特に、本明細書に記載された方法および装置は、サンプル中の複数の酵素の存在を迅速にかつ長期にわたる分析ステップを必要とせずにモニター出来る。記載した方法および装置は、様々な分野における用途、例えばかかる酵素の存在がその区域内で働く労働者の健康への悪影響をもたらす可能性がある現場での浮遊酵素のモニタリングを有する。
【０００７】
本明細書に記載した方法は、行われるべき少なくとも２つの酵素の存在についてサンプルを同時に定性的および／または定量的にモニターすることを可能にする。
【０００８】
本発明の局面に従って、サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出のための方法を提供するものであって、該方法は、下記ステップ；
(a)  
(i) 第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識された第一基質、および
(ii) 第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識された第二基質、
を、該サンプルに、サンプル中に存在する第一および第二酵素が、存在する場合に、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質と相互作用して、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質断片を形成できるように、暴露するステップ;
(b) フルオロフォア標識した基質断片の存在を検出するステップ、
を含む方法。
【０００９】
ある実施態様において、本発明の方法は、酵素が産生されるかおよび／または使用される環境内、例えば研究室または工場床で、浮遊酵素の存在および／または濃度レベルを検出するための方法である。
【００１０】
本発明のさらなる局面において、サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在の同時検出において使用するための容器が提供され、該容器は、第一酵素のための第一フルオロフォアで標識されている第一基質、および第二酵素のための第二フルオロフォアで標識されている第二基質を含む。
【００１１】
本発明の別の局面において、サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出における使用のための装置であって、該装置は、第一酵素のための第一フルオロフォアで標識されている第一基質および第二酵素のための第二フルオロフォアで標識されている第二基質を含む容器を含んでおり、該装置が蛍光性基質断片を検出するための検出手段をさらに含む。
【００１２】
また、本発明に包含されるものは、サンプル中の少なくとも２つの酵素の検出のために本明細書に記載した装置の使用である。該使用は、浮遊酵素の存在の検出のためであり得る。また、該使用は、空気のサンプル中に存在する少なくとも２つの酵素のレベルを定量できる。
【００１３】
本発明の詳細な説明
ある局面において、本発明は、サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出のための方法を提供するものであって、該方法は下記ステップ;
(a)
(i) 第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識された第一基質、および
(ii) 第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識された第二基質、
を、該サンプルに、サンプル中に存在する第一および第二酵素が、存在する場合に、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質と相互作用して、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質断片を形成できるように暴露するステップ;
(b) 該フルオロフォア標識した基質断片の存在を検出するステップ、
を含む。
【００１４】
本方法は、サンプル中の複数の酵素の存在の同時検出に関する。本明細書で使用したように、用語“同時”とは、同時または実質的に同時に少なくとも２つの酵素の存在の検出、例えば少なくとも２つの酵素の検出が、本方法の一回の操作において行われることを指す。該方法は、第一酵素の検出および第二酵素の検出の間に、使用者からのいずれの追加の入力も要しない同サンプル内で複数の酵素の検出に関し得る。
【００１５】
該方法はサンプル中の少なくとも２つの酵素の検出に関するが、特定の実施態様において、ある場合には、該サンプルが１つの酵素のみを含むか、または酵素を含まない可能性もあることは明白であろう。しかしながら、該方法は、酵素がサンプル中に存在する場合、少なくとも２つの酵素を検出するのに適当である。
【００１６】
本明細書に記載した方法は、主要部として、２つの酵素のモニタリングを示す。当業者には明らかであろうが、本発明の方法を使用して、２以上、例えば、３、４、５、６以上の酵素の存在を検出すること、および／または該レベルを定量することが出来る。該方法を使用してサンプル中の２以上の酵素を検出する場合、対応する数の標識化基質が提供される。例えば、該方法を使用して、サンプル中の３つの酵素型を検出する場合、３つの標識された基質、酵素即ち検出されるべき酵素に対応する各基質が提供され、検出できるように酵素と相互作用する標識された基質を提供する。
【００１７】
ある実施態様において、該方法は、少なくとも２つの浮遊酵素の存在を検出するためのものである。
【００１８】
この実施態様において、該方法は、まず、空気の第一サンプルを液体と混合して、該基質と接触させるサンプルを形成する溶液を形成することを含み得る。この実施態様において、該方法は、空気の第一サンプルを、粒子、例えば空気中に運ばれる酵素粒子を収集する装置中に吸引することを含み得る。該方法は、溶液を生成するために回収された粒子を混ぜる液体を装置に提供することをさらに含み得る。ある実施態様において、該装置はテーパード・コーン型である。ある実施態様において、該方法は、該装置中で空気流速度をモニターすることを含み、もし必要であれば、空気流を調整して、人が吸気する場合の一般的な空気の取込み速度を模倣するようにする。これにより、該方法の範囲によって得られたデータと、通常の呼気中に個人が取込む浮遊酵素の予測量との間で為されるべき比較が出来る。
【００１９】
ある実施態様において、液体は、継続的に貯蔵容器から該装置に添加される。この実施態様において、貯蔵容器中の液体のレベルは、継続的な補給によって一定に保たれる。別の実施態様において、貯蔵容器中の液体のレベルは一定には維持されない。代わりに、該方法は、例えば空気の第一サンプルを採取した各時点の後、または例えばいくらかの数の空気サンプル、例えば２つ、３つ、４つまたは５つの空気サンプルを採取した後に、貯蔵容器を空にすることおよび定期的に再充填することを含む。貯蔵容器は、該方法のサイクルが行われた後に、空にされて、再充填され得る。ある実施態様において、使用される場合、貯蔵容器は、約１０〜２０分間毎に、例えば約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分間以上で、空にされ、再充填される。
【００２０】
ある実施態様において、該方法は、上記した装置からサンプルを反応区域に運ぶことを含み得る、ここで該サンプルはフルオロフォア標識された基質と接触するようにされる。該反応区域は、反応容器または複数の容器を含み得る。該方法は、該サンプルを、酵素とその対応する基質との間の反応が、反応産物、例えば標識化基質断片が形成出来るまでの十分な時間、該基質とを接触させることを含む。その後、反応産物が検出され得る。ある実施態様において、検出するステップは、該基質断片に結合したフルオロフォアによって放出されたシグナルのレベルを検出する検出手段の使用を含む。ある実施態様において、検出手段は、次いでサンプル中に存在する酵素の存在および酵素量を決定するために使用され得る分光光度計である。ある実施態様において、検出手段は、予め調整された光源(励起)および複数の光子倍増管(pmt-検出システム)に連結されたフローセルに連結された光ファイバーを包含する。
【００２１】
ある実施態様において、該サンプルは、少なくとも約１秒、５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、または６０分の反応時間の間、第一および第二の基質と接触させる。好ましくは、該サンプルは、少なくとも約１分、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、または少なくとも約１５分間の反応時間、標識化基質と接触される。
【００２２】
通常、本方法で使用される該基質は、モニターされるべき酵素が反応する/分解するようなもの中から選択される。本明細書で使用したように、用語“基質”は、該物質における変化をもたらすような様式で酵素と相互作用する物質を指す。例えば、該酵素は、該基質と反応できおよび／または該基質を断片中に消化できる。本発明で使用した基質は、酵素と該基質の相互作用の検出が出来るような方法で標識した。特に、標識がフルオロフォアである。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様において、基質は、タンパク質またはポリペプチドである。用語"ポリペプチド"、"ペプチド"および"タンパク質"は、本明細書において互換的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを示す。該ポリマーは、直鎖または分鎖であってもよく、修飾アミノ酸またはアミノ酸アナログを含んでもよく、非アミノ酸により介入されていてもよい。また、用語は、天然または介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはその他の操作または修飾、例えば標識化成分との連結。
【００２４】
アミノ酸置換は、１以上のアミノ酸を変更または修飾することから、区域、例えば可変区域の完全な再設計までにおよぶ。アミノ酸置換は、ペプチドのホールディングまたは機能特性に悪影響しない保存的置換が好ましい。保存的置換が為され得る範囲内で機能的に関連のあるアミノ酸の群は、グリシン/アラニン；バリン/イソロイシン/ロイシン;アスパラギン/グルタミン;アスパラギン酸/グルタミン酸;セリン/スレオニン/メチオニン；リシン/アルギニン；およびフェニルアラニン/チロシン/トリプトファンであり得る。この発明において使用されるポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化形態で存在し得るか、翻訳後に修飾(例えば、アセチル化およびリン酸化)され得るかまたは合成的に修飾(例えば、標識基の連結)され得る。
【００２５】
ある実施態様において、第一基質は、ゼラチン、ブタのチログロブリン、コラーゲン、イムノグロブリンおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される。ある実施態様において、第二基質は、ゼラチン、ブタのチログロブリン、コラーゲン、イムノグロブリン、ウシ血清アルブミンからなる群から選択される。実施態様において、第一基質がゼラチンである。第一および第二の基質は、互いに同一または異なっていてもよい。
【００２６】
基質を標識するために本発明の方法で使用したフルオロフォアは、通常の蛍光分析方法によって検出出来るように選択される。さらに、フルオロフォアは、特に、各フルオロフォアのスペクトル特性が、混合物中に存在する他の酵素とその特異的基質との反応を介して同時に放出される他のフルオロフォアの蛍光シグナルと干渉しないように選択される。好ましくは、選択されたフルオロフォアは、周囲条件、例えばpHレベルにおける変化によって影響されない。ある実施態様において、第一および第二のフルオロフォアは、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミン、テキサス・レッド（登録商標）、クレゾール・バイオレットおよびルシファー・イエローからなる群から独立して選択される。好ましくは、第一基質を標識するために使用したフルオロフォアは、第二基質を標識するために使用したフルオロフォアとは異なる。
【００２７】
標識された基質は、多くの場合において、適切な支持体、例えばガラスビーズ、繊維様セルロースまたはゾル・ゲル粒子であるがこれらに限定するものではない、に有利に置かれる。支持体、例えば固相支持体は、当分野では十分に知られており、生物学的、非生物学的、有機、非有機またはこれらのあらゆる組合せであってよい；但しそれらが標識された基質とサンプル中に存在する任意の酵素の間の反応と相互作用しない場合。本発明に使用され得る固体支持体の例示は、粒子、ビーズ、鎖状物、沈殿物、ゲル、シート、管、球体、コンテナ、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドを包含するが、これらに限定しない。粒子サイズは、直径100 nmから100 μmの範囲であり得る。
【００２８】
標識された基質は、当分野では知られた様々な手段により該支持体に結合され得る。例えば、該基質は、支持体表面に共有的に結合され得る。ある実施態様において、該基質は、直接吸収を介して支持体表面へ連結され得る。
【００２９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、該支持体は、磁化可能なビーズを含む。ある実施態様において、該支持体は、該基質と結合された複数のシリカ粒子を含む。固体支持体の他のタイプは当業者にはよく知られており、本発明に包含される。
【００３０】
ある実施態様において、該基質は支持体上に存在できない。例えば、セルロースの場合において、水中のその不溶性に関して、該基質はかかる支持体以外の固体粒子として使用され得る。
【００３１】
該方法を使用して、サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在をモニターする。本開示の方法の用途によって検出され得る酵素タイプの例示は、多くのプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼまたはコラゲナーゼのファミリーを包含するが、これらに限定するものではない。ある実施態様において、セルラーゼは該基質の一つとして標識されたセルロースを用いてモニターされ得る、および／またはコラゲナーゼは、該基質の一つとして標識されたコラーゲンを用いてモニターされ得る。
【００３２】
実施態様において、少なくとも２つの酵素の一つはプロテアーゼである。実施態様において、該プロテアーゼは、サブチリシン型酵素、トリプシン、パパイン、エスペラーゼおよびアルカラーゼからなる群から選択され得る。
【００３３】
本発明のある実施態様において、第一基質はゼラチンである。この実施態様において、検出および／または定量されるべき第一酵素は、サブチリシン型酵素である。ある実施態様において、第二基質は、スターチ、アミロースおよびアミロペクチンである。この実施態様において、第二酵素はα−アミラーゼである。酵素の様々な組合せ物が、本発明の開示した方法によって検出され得る。
【００３４】
サンプルが少なくとも１つの該基質と相互作用する酵素を含有する場合、サンプルが基質に暴露されてから、酵素の存在および対応する基質との間に反応が起こる。ある実施態様において、酵素と基質との間の反応は、該基質の断片の形成をもたらす。酵素を含有するサンプルに暴露された後に、各容器から放出された標識された基質断片が、特定のフルオロフォアまたは複数のフルオロフォアに対して調整された蛍光分光計を用いて下流でモニターされる。該方法は、第一および第二のフルオロフォアを検出するように蛍光分光計を調整するステップをさらに含み得る。
【００３５】
上記したように、この方法の一つの用途において、サンプルを空気の第一サンプルから得る。本方法の一つの用途は、浮遊酵素に対する従業員の暴露に関する法定限界が存在する職場である。特に、該方法は、例えば洗剤粉末および食料品などを製造するために酵素が使用されている区域内で実施され得る。
【００３６】
本方法は様々な方法で実現される。ある実施態様において、該方法は、サンプルを継続的して溶液を含有する回収器中に運ぶことによって継続的に行われる。次いでサンプルは、例えば容器または複数の容器を含有する、反応区域内で標識された基質を接触させる。
【００３７】
上記したように、実施態様において、サンプルは空気の第一サンプルから得られ、該空気は溶液中に置かれる。ある実施態様において、該溶液は、該システムを通るために特定のpHを該溶液が有することを理由に選択される緩衝液である。こうして、ある実施態様において、該溶液は水溶性緩衝液である。ある実施態様において、水性緩衝液は、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水である。
【００３８】
ある実施態様において、蛍光シグナルの再現性は、溶液中で少量の洗剤の混入によってさらに増強される。実施態様において、該方法は、該溶液に洗剤を提供することを含む。該洗剤は、例えばTween 20であることも可能である。該洗剤は、フロー・インジェクション分析システム内において放出された断片と表面との間の非特異的結合を低下させるために利用され得る。
【００３９】
本発明の方法の実施態様において、該基質は、該サンプル内に含有する酵素が、同時に第一基質および第二基質を接触するように反応容器内で提供される。例えば、実施態様において、基質はビーズ上に支持され、反応容器はビーズの不均質混合物を含んでおり、これらのいくつかは標識された第一基質を支持し、またこれらのいくつかは標識された第二基質を支持する。実施態様において、該反応容器はカラムである。ある実施態様において、該反応容器は、小さい容器、即ち運ばれ得るか、またはモニターされるべき部位で組み込まれ得るような大きさ、であり得る。
【００４０】
本発明の方法の別の実施態様において、サンプルから得られた酵素を、第一基質と第二基質とを順に接触させる。例えば、該反応容器は異なる基質の層をなす均質層を含有する。こうして、反応容器は支持体の層を含み得る、各層は基質の主な一つのタイプを含む。結果として、酵素の混合物を含有するサンプルは、例えば支持された第一基質の層の後に支持された第二基質の層と接触する。
【００４１】
あるいは、該方法は、複数の反応容器を順に提供することを含み、各反応容器は標識された基質の一つのタイプを含有する。結果として、該サンプルは、第一基質と接触し、次いで第二基質と接触する。
【００４２】
即ち、ある実施態様において、本発明は少なくとも２つの反応容器を用い、これらは連続して位置し、異なる基質を各々含有する。該容器は、サンプルを、該容器の間に搬送する導管で連結され得る。本発明のこの実施態様において、第一容器は第一基質を含有でき、第二容器は第二基質を含有できる。もう一つの酵素に対してはもう一つの基質を含有するさらなる反応容器が提供され得る。
【００４３】
ある実施態様において、本発明は、サンプルを複数の反応容器を介して第一基質および第二基質と順に接触させる異なる容器タイプの混合物を提供することを含み得る。
【００４４】
実施態様において、分析されているサンプルはプロテアーゼを含んでおり、第一または第二の基質の一つがプロテアーゼに対する基質であると考えられる。この実施態様において、該サンプルが該基質を順に接触することを確実にすることが望ましい。さらに好ましくは、プロテアーゼに対する基質は検出手段に近接した位置にある。消化されたプロテアーゼ基質の断片は、もう一つの基質を持つ支持体、例えば固相支持体に組み込まれる得ることが見出された。即ち、例えば、該方法がα−アミラーゼおよびサブチリシン型酵素を包含する酵素の混合物を検出するためである場合に、サブチリシン型酵素に対する基質は、好ましくは検出手段に近接した位置、即ちもう一つの基質に関して下流にある。このように、プロテアーゼ酵素に対する基質を含有する反応容器は、酵素の他のタイプに対する基質を含有する反応容器から下流に位置する。
【００４５】
蛍光標識された基質断片の検出は、適切な装置、例えば分光光度計を利用出来るなら、現場で(例えば、工場で)行うことも出来る。あるいは、反応容器を、分析が行われる研究室に持ち込み得る。
【００４６】
本方法は、サンプル中に存在する少なくとも２つの酵素の量を標準物と比較することによって、結果を計算することをさらに含み得る。
【００４７】
本発明のさらなる態様に従って、サンプル中で少なくとも２つの酵素の同時検出に使用するための容器が提供され、該容器は、第一酵素のための第一フルオロフォアで標識された第一基質、および第二酵素のための第二フルオロフォアで標識された第二基質を含む。
【００４８】
本発明の実施態様において、標識された基質は、上記したように適当な支持体に対して実施される。ある実施態様において、支持体は、例えばガラスビーズ、セルロース、例えば繊維様セルロース、シリカ、例えばシリカ粒子またはゾル・ゲル粒子などからのものであるか、またはそれらから構成される。支持体が特定の材を含む場合、粒子サイズは直径約100nm〜約100μmにわたり得る。
【００４９】
本発明の実施態様において、該支持体が例えばビーズまたはシリカ粒子である場合、反応容器はビーズまたは粒子の不均質混合物を含む。即ち、ビーズまたは粒子の一部は第一基質を支持しているが、一方でビーズまたは粒子の一部は第二基質を支持しており、該ビーズの配置に対して識別できる秩序はない。別の本発明の実施態様において、該反応容器は該基質の層をなす均質層を含有する。
【００５０】
本発明のさらなる態様に従って、サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出に使用するための装置が提供され、該装置は、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識された第一基質、および第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識された第二基質を含む容器を含んでおり、該装置は、蛍光性反応産物を検出するための検出手段をさらに含む。ある実施態様において、第一および第二のフルオロフォアは異なるフルオロフォアである。該フルオロフォアは本明細書に記載された通りのものであり得る。
【００５１】
実施態様において、第一および第二の基質は、容器内で層をなす層を形成出来る。ある実施態様において、第一または第二の基質の一つは、プロテアーゼに対する基質である。この実施態様において、該容器は、もう一つの基質よりも検出手段に近い位置でプロテアーゼ基質の層を含む。即ち、ある実施態様において、プロテアーゼ酵素に対する基質は、検出手段の近く、即ち、もう一つの基質から下流に位置づけられる。
好ましくは、検出手段は分光光度計である。
【００５２】
本発明のさらなる態様に従って、サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出のための装置を提供し、該装置は、使用の際に、第一容器は、第一酵素のための第一フルオロフォアで標識された第一基質を含み、該第一装置は第二容器に連結され、ここで該第二容器は第二酵素のための第二フルオロフォアで標識された第二基質を含んでおり、該装置は、蛍光性反応産物を検出するための検出手段をさらに含んでいる。該反応産物は、酵素およびそのフルオロフォア標識された基質との間の相互作用から生成される。
【００５３】
装置の好ましい実施態様において、第二容器内の基質はプロテアーゼであって、第二容器が検出手段に近接して位置する。
【００５４】
ある実施態様において、該装置は２以上の反応容器を含む、例えば３つ、４つ、５つ以上の反応容器を含む。各反応容器は、酵素に対するフルオロフォア標識された基質を含む。
【００５５】
検出手段が分光光度計であるのが好ましい。
【００５６】
この明細書の詳細な説明および請求項をとおして、用語“含む”および“含有する”およびその用語の派生語、例えば“含んでいる”および“含有”とは、“限定しないが包含する”を意味し、他の成分、添加物、成分、整数またはステップを排除する（また排除しない）ことを意図しない。
【００５７】
この明細書の詳細な説明および請求項をとおして、文脈上別途必要でなければ、単数は複数を包含する。特に、曖昧に冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上別途必要とされなければ、複数に加えて単数を指すと理解されるべきである。
【００５８】
本発明の特定の局面、態様または実施例に関連して記載された特性、整数、特徴、化合物、化学成分または群は、相応しくない限り本発明に記載されたあらゆる特定の局面、態様または実施例に用い得ると解される。
【００５９】
図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面をただ一例として、また参照として説明するものである。
図１ａ；サブチリシン型プロテアーゼ(サビナーゼ（登録商標）)酵素単独に対する計測プロット。
図１ｂ；α−アミラーゼ酵素(Termamyl(登録商標))単独に対する計測プロット。
図１ｃ；サブチリシン型プロテアーゼおよびα−アミラーゼの等量濃度混合物におけるα−アミラーゼに対する計測プロット。
図２：本発明の実施態様のモニタリングシステムの図示。
【００６０】
実施例
実施例1
例えば、職場の空気中のサブチリシン型酵素を含む多様な浮遊酵素の浮遊濃度を継続的にモニター出来るシステムを説明する。サンプル採取は２つの段階を含む：600l /分のサンプル採取速度で約1 m s-1にてヒトの呼吸を模倣するように設計されるサンプル採取ヘッドを用いること。第二段階において、捕捉粒子は、緩衝溶液噴流にて継続的に洗浄されるサイクロンの内部表面上に、空気流からの衝撃により付着される。次いで、付着粒子は貯蔵容器中に流され、この貯蔵容器からサンプルを５−６分間毎に採取し、継続的なフロー・インジェクション分析システムに自動的に注入される。サンプル中のタンパク質分解酵素は、約４０℃に維持されたバイオリアクターを通過する。ある実施態様において、これは、基質としてテキサス・レッドの標識されたゼラチンを共有的に固定化したセルロース固相マトリックスを含有する。バイオリアクターは、追加の酵素に対する第二基質も含有できる。あるいは、第二基質を含有するもう一つのバイオリアクターを第一バイオリアクターに連結する(示さない)。
【００６１】
本発明の別の実施態様において、該基質はシリカ粒子上に固定され得る。通過する酵素は、蛍光計測器と連結したフローセル内での下流で検出されるフルオロフォアを放出する基質を部分的に消化する。該システムは、酵素標準物を用いて計測され、そして外部空気サンプルから得られるピークの強度が、ＰＣ中にプログラムされた数学的モデルを用いて浮遊濃度に変換される。該システムは、４.８ng m-3の検出限界および５−６０ng m-3のダイナミックレンジを有する。この範囲内の分析精度(ＲＳＤ)は、該範囲を超える６.３−９.６%である。この範囲内のバッチ精度は、２０ng m-3で２０.３%であり、バッチ間で対応する値は１９.５%である。該システムを８時間までの期間および４時間までの期間行い、得られた値を該結果の合理的同意が観察された場合に従来のギャラリーサンプラーおよびインハウス分析から得られた時間平均値と比較した。定期的に注入された標準物を有する２１日にわたる継続的使用の該システムの安定性を試験した。全ての標準プロットについての直線性が観察された。２１日目の終了時に、サビナーゼの２３９５ng ml-1に等しい全暴露等量後の５.０ng ml-1 の標準物によるシグナルは、依然として容易に検出出来る。
【００６２】
実験装置
該システムを図２に示す。ガラスサイクロン(Ｂ)にプラスチックチューブを介して結合した一対の円形金属板(Ａ)を含むサンプル採取ヘッドを包含する。空気は市販の真空クリーナー(Ｃ)を用いてＡおよびＢから吸引される。空気流速度を、オリフィス板を用いてモニターし、必要なら調節した。針(Ｄ)をＢに結合させて、緩衝溶液を調整可能な蠕動ポンプ(Ｅ)を用いて該オリフィスから汲み出した。空気はサイクロンを通るので、水流はサイクロンの内部表面を網羅し、サイクロンから貯蔵容器(Ｆ)に流入し、Ｅを介してサイクロンに戻り再循環された。
【００６３】
空気のサンプル採取後に、緩衝液の既知容量を、サーモスタット制御されたカラムヒーター(Ｈ)内のバイオリアクターまたは複数のバイオリアクターと結合した自動化フロー・インジェクションシステム(Ｇ)中にＦから定期的に採取した。下流には、光源(Ｊ)および分光光度計(Ｋ)に結合した２つの光学ファイバーを備えた光学フローセル(Ｉ)が位置する。リン酸塩緩衝生理食塩は、蠕動ポンプ(Ｌ)を用いるＦＩＡシステムを通り、ＫからのシグナルはラップトップＰＣ(Ｍ)を用いて記録された。また、このＰＣは、自動化フロー・インジェクションシステムを制御した。両システムにおいて使用したプログラムは、これらの２つシステム製造会社によって供給された(FIAlab, Medina, WA, USA)。
【００６４】
別法において、貯蔵容器は、貯蔵容器レベルを一定に保つように継続的に補充されない。代わりに、サンプルを上記したように約１２分間採取した。その後、該サンプルを分析し、貯蔵容器を、完全に流し出して再充填した。その後、サンプルおよび分析を得る新規サイクルが開始される。この方法は、酵素濃度に対して示す貯蔵容器を再充填する効果を計算する複雑なシステムを必要としない利点を有する。結果として、この方法は実施するためにより簡易であり得る。
【００６５】
自動化フロー・インジェクションシステム(Ｇ)は、FIAlab Instrumentsのモデル 3500であった。カラムヒーター(Ｈ)はEppendorf CH500ヒーター(Phenomenex, Macclesfield, Cheshire, UK)であって、０.７ml/分の流速で４０℃の出口の緩衝液温度にて操作するように設定された。フローセル(Ｉ)は、２つのステンレススチール被覆光学ファイバー(P400-2)、LS-1 タングステンハロゲン光源およびS2000 分光器(Ｊ)も備えたFIAlabのモデルXであった。蠕動ポンプ(Ｋ)は、Pharmacia (Milton Keynes, Buckinghamshire, UK)のモデル P-1であった。
【００６６】
サイクロンの設計
サイズ(４０mm 直径、２０mm出口、３０×１０ mm 長方形の入口、および８０mm長の本体および８０mm 長のコーン)のガラスサイクロンを構築し、これは循環液体を導入するための針が上限３箇所まで可能となるように空気の吸入口チューブ内に予めドリルで空けた３つの穴を有する。これらの穴は、注入チューブの中心および６mmのいずれかの側面に位置する。ステンレスの細長い針を、循環液体をサイクロンに汲み出すことが出来るように直角に曲げた(先端から１０mm)。
【００６７】
サイクロンを、空気力学的粒子サイズ(ＡＰＳ)を用いて、サイクロン吸入口から微細な塵を負荷させて、粒子サイズにおける差違およびサイクロン中に投入された該塵の濃度およびサイクロンを出て行く塵の濃度を測定することにより、そのグレード効率を測定するために試験した。
【００６８】
フロー・インジェクション分析システムで使用した試薬および材料
フロー・インジェクションシステムおよびバイオリアクター産生において使用した緩衝液の組成物、酵素の起源、および化学物質ならびに他の材料は、以前5-8に記載したものである。ゼラチンタイプＢ(約７５ブルーム)は、Sigma (Poole, Dorset, UK)のものである。テキサス・レッド（登録商標）スクシンイミジルエステルは、Molecular Probes（Eugene, OR, USA)のものである。試験したセリン型タンパク質分解酵素は、プラフェクト(Purafect)(Genencor International Inc., Rochester, USA)、およびリパーゼおよびセルラーゼ酵素も提供したNovozymes, Bagsvaerd, Denmarkからのサビナーゼである。パパインは、Papayer Latexからのものであり、Sigmaにより供給された。
【００６９】
ゼラチン−テキサスレッド結合体の合成
【００７０】
基質の一つは、ゼラチン−テキサス・レッド結合体である。ゼラチン(0.105g)を、重炭酸ナトリウム緩衝液(pH 8.3、0.1 M, 10 ml)に、ゼラチンを加熱しながら(40 1C)溶解した。テキサス・レッド（登録商標）スクシンイミジルエステル(5 mg)を、ジメチルスルホキシド（500 ml）に溶解した。次いで、この混合物を溶解したゼラチン溶液に添加した。該容器をホイルで巻いて、ローター混合機上にて１時間室温で混合した。４℃で貯蔵した場合、標識化ゼラチンのこの溶液は約３-４週間安定である。
【００７１】
セルロース−ゼラチン−テキサス・レッド固相の合成
媒体のセルロース・ファイバー(５g)を、脱イオン化水ですすぎ、上清溶液を除去する前に遠心分離した(2000 rpm、6分間)。これを、サイズ２の焼結ガラス漏斗(BDH Poole, Dorset)を用いてセルロースを真空下で濾過した後に３回繰り返した。ナトリウムm-過ヨウ素酸塩溶液(0.5 M、80 ml)を、湿気を帯びたセルロースに加え、該混合物を２１０分間室温で回転させた。その後、活性化セルロースを濾過し、２ｌの脱イオン水で上記のように洗浄した。活性化セルロースを、０.０２% アジ化ナトリウムを含有する脱イオン水中に４℃で貯蔵し、３−４週間安定であった。
【００７２】
活性化セルロース(濾過後2.5 g)を０.１Ｍ無水二塩基ナトリウムリン酸塩緩衝液(65 ml)に懸濁した。これにゼラチン−テキサス・レッド結合体 (10 ml)を添加した。該容器を、アルミニウムホイルで被覆し、ナトリウム・シアノ-ホウ化水素(250 mg)の添加前に４５分間室温で回転させた。チューブを回転機上に置き、室温で一晩混合させた。連結後、セルロース−ゼラチン−テキサス・レッド固相を上記のとおり真空下で濾過し、２ｌの脱イオン水で洗浄した。得られるセルロース−ゼラチン−テキサス・レッド固相は、０.０２％アジ化ナトリウムを含有する脱イオン水中に冷蔵下で貯蔵した場合３−４週間安定であった。
【００７３】
フロー・インジェクション分析システムの開発
ＦＩＡ条件
ＦＩＡ緩衝液および酵素標準物のためのものは、リン酸塩緩衝液生理食塩溶液(PBST)であった。これは、1リットルあたり塩化ナトリウム(7.2 g)、無水二塩基ナトリウムリン酸塩(1.48 g)、二水素オルトリン酸ナトリウム一水和物(0.5 g)、アジ化ナトリウム(0.5 g)およびポリオキシエチレンソルビタン一水和物(1.0 ml) (Tween 20s ICI Americas, Inc.)を含有した。ＦＩＡの流速を、蠕動ポンプの若干の調整を用いて0.7 ml /分で維持した。サンプル採取プログラムを、Windows version 5に対してFIALabを用いてまとめた。使用したサンプル採取量は１００mlであり、１２mls-1の流速で全注射容量１８０mlであった。５９０nm フィルターを、光源(Ｊ)の径中に挿入し、分光光度計(Ｋ)を６１２nmで設定した。
【００７４】
結果
空気サンプル採取システムの設計
サイクロン設計およびその性能試験
サイクロンを、空気流の範囲に渡って(９つの様々な176〜732l/分 空気流)試験して、６０８ l/分では、１.１%のＳＤにて約０.７７mmのd５０を有することを示した。該サイクロンは、１.５mmの粒子の少なくとも９０%およびＢ６００ l/分の空気流以上で効果的に捕捉することが理解され得る。サイクロンは、その目的に必要とされるような粒子サイズ、および１.２ mmの孔サイズを有するギャラリーサンプラー内で使用したフィルターと同様のサイズの粒子を捕捉出来ることを確立する。
【００７５】
サイクロン設計を、エアーサンプル採取入口システムに接続した。これは、約６００ l/分のサンプル採取速度および約１m s-1の吸入流で操作する場合ヒトの呼吸を模倣するよう設計される。
【００７６】
分析システム内で、新規基質を使用して、一つの酵素について所望のシグナルを生じさせる。ゼラチンをテキサス・レッド（登録商標）と結合させて、セルロース支持マトリックス上に共有結合的に固定化させた蛍光標識を作成した。ゼラチンを本発明の基質の一つとして選択した。これは、蛍光連結体および潜在的な酵素加水分解のための多くの部位を与えるためである。サブチリシン様プロテアーゼ酵素に暴露するために、固定化ゼラチンのタンパク質分解解裂がおこり、分光光度計によって記録された蛍光シグナルをもたらす。他の基質もまた本方法に利用される。
【００７７】
上記した装置は、産業界で、浮遊濃度、例えば酵素の濃度を決定するために準実時間システムを構成する。選択した緩衝液は、酵素のプロテアーゼ活性およびフルオロフォアシグナルを維持するために適当である。また、フルオロフォアの洗脱を最小にする。こうしてバイオリアクターの寿命を長くする(データを示していない)。
【００７８】
該システムは、バッチ内およびバッチ間変動の十分なアッセイ内の精度および合理性をもつ。該変動は、バイオリアクターの製造中のカラムの不整合充填カラムから主に生じる。これは、現在のところ手動にて行われるが、自動化されたシステムによりさらに改良されたバッチの一貫性をもたらすであろう。
【００７９】
該システムは、比較的持ち運び可能なシステムであって、長期間にわたり上手くいっていることが示されている。該システムは、サンプル採取期間中、酵素の浮遊濃度の非継続的な記録も提供する。該システムは、工業的条件下で５分の応答および８時間にわたって継続してモニターする能力を有する近時間システムである。
【００８０】
実施例２
別の実施態様において、該方法は、該基質のための様々な支持体を利用する。グリシドキシプロピルトリメトキシシランによって活性化されたゾル・ゲル粒子を、サブチリシン型プロテアーゼ(例えば、サビナーゼ（登録商標）)のための固相の基質被覆した固相支持体を生成するために予めテキサス・レッド（登録商標）で標識したゼラチンで処理した。
【００８１】
アミノプロピルトリメトキシシランによって活性化した他のゾル・ゲル粒子を、フルオレセインエチレンジアミンで標識したスターチを用いて処理して、α−アミラーゼ(例えば、Termamy(商標))のための固相基質を作成する。
【００８２】
２つの固体相試薬の等量を層化し、次いで、底部層がサブチリシン型酵素に対する基質によって被覆された粒子から構成され、上部層はα−アミラーゼに対する基質で被覆された粒子から構成されるように、ミニカラム中に充填した。ミニカラムに、流速０.７ml/分で、Tween 20 (0.1%)を有するリン酸塩緩衝液生理食塩(pH 7.4)中に５〜２５ng/mlのサビナーゼおよびアミラーゼの混合物または個々の酵素成分を含有するサンプルを用いて送出した。サンプルを上記したサイクロンを用いて得た。ミニカラムを、下流に順に連結された２つの蛍光分光計に接続して、最初はフルオレセイン蛍光(490nm 励起、535nm 放出)、次にテキサス・レッド（登録商標）蛍光(590nm 励起、620nm 放出)にて、そして２つのフルオロフォアの蛍光強度を同時および継続的にモニターした。サンプルによりいずれかの酵素について観察された２分間の反応時間を、５分間毎に可能であれば繰返す。カラムに注入した時の直線的なシグナル/濃度標準曲線を、単一酵素(図１a、プロテアーゼのみ；図１b、アミラーゼのみ)について、およびこの濃度範囲にわたる２つの酵素の混合物(図１c、示されたアミラーゼに対する応答)について得た。
【００８３】
実施例３
α−アミラーゼのためのバイオリアクターを充填する際に使用するための蛍光基質の調製
蛍光色素標識エチレンジアミン(ＥＤＡ−ＦＩＴＣ)の調製
使用した材料は、Fluorescein Isothioyanate Isomer I (FITC), Sigma (F-7250), N,N-ジメチルホルムアミド (DMF),Aldrich (31,993-7)、1,4 ジオキサン,Aldrich (27,053-9)およびエチレンジアミン,Aldrich (E 2,626-6)であった。
【００８４】
５０mlの乾性ガラスビンを用いて、ＦＩＴＣ(39 mg)を正解に計量した。ＤＭ(200μl)を添加することによってＦＩＴＣを溶解した。１,４ジオキサン(4.8 ml)をＦＩＴＣ溶液に添加する。エチレンジアミン（6.68μl)をＦＩＴＣに添加する。ＥＤＡ−ＦＩＴＣ溶液を、アルミニウムホイルで被覆したものを保持することにより室温にて１hr マグネチックスターラー上で攪拌した。暗橙色の沈殿物が形成される。
【００８５】
１時間攪拌後、ビンから取り出し、３０００rpmで３分間遠心分離した。廃溶媒中の上清を廃棄し、１,４ジオキサン(5 ml)を添加し、ボルテックスにかけ、３０００rpmで３分間遠心分離した。廃溶媒中の上清を廃棄し、１,４ ジオキサンの最小量を用いて沈殿物を丸底フラスコに移した。ロータリーエバポレーターによって溶媒を５０℃で約３時間蒸発させた。沈殿物が乾燥してから、それを秤量し、乾性ガラスバイアルに移して、それをホイルで被覆して４℃でデシケーター中に貯蔵した。
【００８６】
標識したエチレンジアミン(ＥＤＡ−ＦＩＴＣ)の活性化
必要な材料は、塩化シアヌル, Aldrich (C 9,550-1)、標識したエチレンジアミン(EDA-FITC)(上記Ref1を参照されたい)、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ),Aldrich (31,993-7)、トリエチルアミン, Fluka (90340)およびアジドを有するリン酸塩緩衝液生理食塩,pH 7.4(アジドを有するPBS)(SOP-緩衝液 003を参照されたい)である。
【００８７】
乾性ガラスビン中に１で調製したようにＥＤＡ−ＦＩＴＣ(43 mg)を秤量し、ＤＭＦ(４.３ ml)にそれを溶解することによって、ＥＤＡ−ＦＩＴＣ 溶液(10mg/ml)の４.３ mlを調製する。塩化シアヌルの２１.５ mgを秤量し、ＥＤＡ−ＦＩＴＣ溶液に添加する。トリエチルアミン溶液（1mg/ml）（20 ml）を、アジドを有する２０mlのＰＢＳ中のトリエチルアミン(27.5 μl)を、活性化ＥＤＡ−ＦＩＴＣ溶液に添加することによって調製した。混合物を確実に混合するためにボルテックスに供した。沈殿物が形成するはずである。該沈殿物を暗所４℃で貯蔵する。
【００８８】
活性化した標識エチレンジアミン(ACT-EDA-FIFC)へのスターチ基質の結合(アミロペクチンおよびアミロースも使用され得る)
必要とされる材料は：スターチ可溶性物, Sigma(S-9765)、アジドを有するリン酸塩緩衝液生理食塩,ｐＨ７.４(アジドを有するPBS)、活性化ＥＤＡ−ＦＩＴＣ(上記参照)および炭酸ナトリウム, Sigma(S-7795)である。
０.５Ｍ炭酸ナトリウム溶液の調製: 
１００ml 容量のフラスコ内に炭酸ナトリウム（5.495 g）を秤量し、脱イオン水の最小量を用いて溶解する。一旦溶解してからその印までに調製する。
【００８９】
Ａｃｔ−ＥＤＡ−ＦＩＴＣをスターチ基質に結合させる
乾性ガラスビン(25 ml)内に可溶性スターチ(0.5 g）を秤量した。ＰＢＳ（15 ml）を該スターチに加え、約６０−７０℃に維持した水浴中で透明な懸濁液を形成するまで、攪拌を継続しながら加熱した。粘性のゼリー状の透明な懸濁液を形成する。
【００９０】
スターチ懸濁液に、活性化ＥＤＡ−ＦＩＴＣ(上記Ref2)(2ml)を加えて、均一な懸濁液を提供するためにボルテックスに供した。それを水浴中に戻して、暗所で継続的に攪拌することにより加熱を続ける(６０-７０℃)。１０分後に、０.５Ｍ炭酸ナトリウム溶液（200μl）を添加し、７０℃で１hr暗所にて攪拌を続ける。１時間後に温浴から懸濁液を取り出し、ドラフトチャンバー内に静置してそれを室温まで冷却する。
【００９１】
冷却してから、該懸濁液を透析チューブに移し、脱イオン水に対する透析を３７℃で維持した。脱イオン水中で観察される蛍光がなくなるまで透析を続ける。これは、約３〜４日間要するはずである。透析してから、該懸濁液を３０mlの滅菌チューブに移し、ホイルでチューブを包み、冷蔵庫内で貯蔵する。
【００９２】
アミノプロピル・トリエトキシシラン(APTES)被覆ゾル・ゲル、シリカまたはシリカゲル粒子の調製
必要な材料は、ゾル・ゲル粒子、アミノプロピル トリエトキシシラン(APTES),Sigma (A3648)およびリン酸塩緩衝液生理食塩水(pH 7.2 (アジドを有するPBS)である。
滅菌チューブ(50 ml)中で乾燥ゾル・ゲル粒子(125-180 μm)を秤量（約10g）した。ＰＢＳ(20 ml)を添加し、該粒子をボルテックスにかけた。３０００rpm、３分間遠心分離した。上清を廃棄し、ＡＰＴＥＳ(2 ml)を加え、ローター内で２hrs回転させた。ローター内からそれを取り出し、３０００rpmで３分間遠心分離した。廃溶媒に上清を廃棄し、ＰＢＳ(20 ml)を添加し、３０秒間ボルテックスし、５分間回転させた。洗浄を、ステップ５および６の後、即ちローターから取り出して３０００rpmで３分間遠心分離した後に、３回以上洗浄を繰り返す。上清を廃溶媒に廃棄し、ＰＢＳ(20 ml)を添加し、３０秒間ボルテックスし、５分間回転させた。ＡＰＴＥＳ被覆粒子は使用出来る状態にある。貯蔵のために、ＰＢＳの最小量で粒子を懸濁し、４℃で貯蔵する。
【００９３】
ＡＰＴＥＳ被覆ゾル・ゲルおよび同様のシリカ粒子へのスターチ-ＥＤＡ−ＦＩＴＣの固定化
必要とする材料は、ＡＰＴＥＳ被覆化ゾル・ゲル粒子(上記参照)、リン酸塩緩衝液生理食塩水, ｐＨ７.２，(アジドを有するＰＢＳ)およびスターチ-ＥＤＡ−ＦＩＴＣ(上記を参照されたい)である。
３０mlの滅菌プラスチックチューブ内にＡＰＴＥＳ被覆ゾル・ゲル粒子(125-180 μm)の湿重量(約5 g)を秤量した。ＰＢＳアジド(20 ml)を添加し、粒子をボルテックスした。スターチ-EDA-FITC基質（5 ml）を添加し、一晩回転させた。ローターからそれを取出して、３０００rpmで３分間遠心分離した。上清を廃溶媒中に廃棄し、ＰＢＳ(20 ml)を添加し、３０秒間ボルテックスにかけ、５分間回転させた。それをローターから取出すステップの後に３回以上洗浄を繰り返して、３０００rpmで３分間遠心分離し、次いで上清を廃溶媒中に廃棄し、ＰＢＳ(20 ml)を添加し、３０秒間ボルテックスに供し、５分間回転させる。ゾル・ゲル粒子上に固定されたスターチ基質は充填できる状態にある。
【００９４】
ＰＢＳアジドの最小量中で固定化したスターチ粒子を４℃で貯蔵し、調製３日以内に使用する。上記したゼラチン-セルロースおよびプロテアーゼバイオリアクターカラムに対する条件について記載したとおり、カラムに湿誘導粒子（約0.8 g)を充填する。
【００９５】
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【００９６】
また、本発明の開示物に包含されるものは、下記の章の発明の内容である:
【００９７】
１．サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在を同時に検出するための方法であって、
第一酵素のための第一基質を提供すること、該第一基質は第一フルオロフォアで標識されている、
第二酵素のための第二基質を提供すること、該第二基質は第二フルオロフォアで標識されている、
サンプル中に存在する第一および第二酵素が、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質と相互作用させて、各々第一および第二のフルオロフォア標識した基質断片を形成させるように、該サンプルに標識された基質を暴露すること、
フルオロフォア標識した基質断片の存在を検出すること、
のステップを含む方法。
２．第一および／または第二の基質がタンパク質またはポリペプチドである、章１の方法。
３．タンパク質またはポリペプチドが、ゼラチン、ブタのチログロブリン、コラーゲン、イムノグロブリンまたはウシ血清アルブミンからなる群から選択される、章２の方法。
４．基質の少なくとも１つが支持体上に担持されている、章１から３に記載の方法。
５．支持体が、ガラス、ゾルゲルビーズまたはセルロースファイバを含む固相支持体である、章４の方法。
６．ビーズが磁化可能である、章４または５に記載の方法。
７．第一および第二酵素が、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、α−アミラーゼまたはコラゲナーゼからなる酵素群から選択される、章１から６いずれかに記載の方法。
８．プロテアーゼが、サブチリシン型、トリプシン、パパイン、エスペラーゼおよびアルカラーゼからなる群から選択される、章７記載の方法。
９．第一および第二のフルオロフォアが、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド（登録商標）およびルシファー・イエローから選択される、章１から８のいずれかに記載の方法。
１０．サンプルが空気である、章１から９のいずれかに記載の方法。
１１．サンプルから得られた酵素が、第一基質および第二基質を同時に接触させる、章１から１０いずれかに記載の方法。
１２．サンプルから得られた酵素が、第一基質および第二基質を順番に接触させる、章１から１１いずれかに記載の方法。
１３．第二基質がプロテアーゼに対する基質である、章１１または１２に記載の方法。
１４．サンプル中の少なくとも２つの酵素の存在を同時に検出する際に使用するための容器であって、該容器は、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識された第一基質、および第二酵素のための、第二フルオロフォアによって標識された第二基質を含んでいる。
１５．基質の少なくとも一つが支持体上に担持されている、章１４記載の容器。
１６．支持体が、ガラス、ゾルゲルビーズまたはセルロースファイバーを含む固相支持体である、章１５記載の容器。
１７．容器が、第一および第二基質の不均質混合物を含む、章１６記載の容器。
１８．容器が、第一基質の層および第二基質の層を含む、章１６記載の容器。
１９．サンプル中の少なくとも２つの酵素の同時検出において使用するための装置であって、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識されている第一基質、および第二酵素のための、第二フルオロフォアで標識されている第二基質を含んでおり、蛍光基質断片を検出するための検出手段をさらに含んでいる、装置。
２０．第一基質または第二基質が該容器内に層化されており、プロテアーゼ酵素のための基質である第二基質の層は検出手段に近接して位置する、章１９記載の装置。
２１．サンプル中で少なくとも２つの酵素の同時検出において使用するための装置であって、第一酵素のための、第一フルオロフォアで標識されている第一基質を含んでおり、該第一装置が第二容器に接続可能であって、ここで該第二容器は、第二酵素のための第二のフルオロフォアで標識されている第二基質を含んでおり、該装置は蛍光基質断片を検出するための検出手段をさらに含んでいる、装置。
２２．第二容器内の基質がプロテアーゼであって、該第二容器が検出手段に近接して位置する、章２１記載の方法。
２３．実施例および図１を参照して、本明細書において実質的に記載される方法、容器または装置。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、図１ａ；サブチリシン型プロテアーゼ(サビナーゼ（登録商標）)酵素単独に対する計測プロット。図１ｂ；α−アミラーゼ酵素(Termamyl(登録商標))単独に対する計測プロット。図１ｃ；サブチリシン型プロテアーゼおよびα−アミラーゼの等量濃度混合物におけるα−アミラーゼに対する計測プロット、である。
【図２】図２は、本発明の実施態様のモニタリングシステムの図示である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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