(57)【要約】  本開示は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連する方法およびソフトウェアシステムに関する。
2009525346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項２】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドがロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを含む請求項１または２記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項３】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが免疫グロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを含む請求項２記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項４】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが本質的にＬＲＲ−様ドメイン、Ｉｇ−様ドメインおよびストークドメインを含む請求項１記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項５】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項６】
結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが空間群Ｐ２ｌ２ｌ２を有する請求項１〜５のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項７】
結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが単位格子寸法ａ＝２０１．５Ａ、ｂ＝１４９．７Ａ、ｃ＝１５７．５Ａおよびα＝β＝γ＝９０°を有する請求項６記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項８】
結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが空間群Ｉ２２２を有する請求項１〜５のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項９】
結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが単位格子寸法ａ＝１４８．７Ａ、ｂ＝１５８．６Ａ、ｃ＝２００．０Ａおよびα＝β＝γ＝９０°を有する請求項８記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１０】
結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが単位格子寸法ａ＝１４９．６Ａ、ｂ＝１５７．３Ａ、ｃ＝２００．３Ａおよびα＝β＝γ＝９０°を有する請求項８記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１１】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが哺乳動物種由来である請求項１および６〜１０のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１２】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが非哺乳動物種由来である請求項１および６〜１０のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１３】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドがヒト由来である請求項１および６〜１０のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１４】
結晶化ポリペプチドが少なくとも約３．７Ａの分解能までＸ線を回折することができる請求項１記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１５】
結晶化ポリペプチドが表２の構造座標＋／−１．５Ａ以下のアルファ炭素原子についての二乗平均平方根を含む請求項１および６〜１０のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１６】
結晶化ポリペプチドが、配列番号１に示されるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアミノ酸Ａｓｐ１３、Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、Ａｒｇ４３、Ｇｌｕ６０、Ｇｌｕ６２、Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、Ｍｅｔ１２３、Ｈｉｓ１７６、Ｔｙｒ１４２、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ２３３、Ａｌａ２３８、Ｔｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ａｒｇ３５２、Ｇｌｎ３５３、Ｐｈｅ３９６、Ａｒｇ４０８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｐｈｅ４３８、Ａｓｐ４４０、Ａｒｇ４４６、Ｔｙｒ４４７およびＩｌｅ４５９の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む請求項１および６〜１０のいずれか１項記載の結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【請求項１７】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、およびＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアゴニストまたはＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアンタゴニストであるリガンドを含む結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１８】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドがロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを含む請求項１７記載の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１９】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが免疫グロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを含む請求項１７または１８記載の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２０】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが本質的にＬＲＲ−様ドメイン、Ｉｇ−様ドメインおよびストークドメインを含む請求項１７記載の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２１】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１７記載の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２２】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの三次元モデルを用いてＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する薬剤を設計することを特徴とする方法。
【請求項２３】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメインを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＩｇ−様ドメインを含む請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
三次元モデルが本質的にＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇ−様ドメインおよびストークドメインからなる請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害する請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子の構造座標を含む請求項２２〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
構造座標が実験的に決定された座標である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
構造座標が表２の値＋／−１．５Ａ以下のアルファ炭素原子についての二乗平均平方根にしたがう請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
三次元モデルが、配列番号１に示されるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアミノ酸Ａｓｐ１３、Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、Ａｒｇ４３、Ｇｌｕ６０、Ｇｌｕ６２、Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、Ｍｅｔ１２３、Ｈｉｓ１７６、Ｔｙｒ１４２、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ２３３、Ａｌａ２３８、Ｔｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ａｒｇ３５２、Ｇｌｎ３５３、Ｐｈｅ３９６、Ａｒｇ４０８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｐｈｅ４３８、Ａｓｐ４４０、Ａｒｇ４４６、Ｔｙｒ４４７およびＩｌｅ４５９の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む請求項２２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子と薬剤の原子との間の距離を計算することを特徴とする請求項２２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む組成物を提供することを特徴とする請求項２２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
組成物がＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合するように設計された薬剤を含む請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
さらに、薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用を実験的に決定することを特徴とする請求項２２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
さらに、薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用を、第２の薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用と比較することを特徴とする請求項２２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体の三次元モデルを用いて、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する薬剤を設計することを特徴とする方法。
【請求項３７】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメインを含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＩｇ−様ドメインを含む請求項３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
三次元モデルが本質的にＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇ−様ドメインおよびストークドメインからなる請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害する請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
さらに、薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用を実験的に決定することを特徴とする請求項３６〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む複合体の三次元モデルを用いて、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する薬剤を設計することを特徴とする方法。
【請求項４３】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメインを含む請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＩｇ−様ドメインを含む請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
三次元モデルが本質的にＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇ−様ドメインおよびストークドメインからなる請求項４２または４３記載の方法。
【請求項４６】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害する請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
三次元モデルがＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子の構造座標を含む請求項４２〜４６のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
構造座標が実験的に決定された座標である請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
構造座標が表２の値＋／−１．５Ａ以下のアルファ炭素原子についての二乗平均平方根にしたがう４８記載の方法。
【請求項５０】
三次元モデルが、配列番号１に示されるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアミノ酸Ａｓｐ１３、Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、Ａｒｇ４３、Ｇｌｕ６０、Ｇｌｕ６２、Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、Ｍｅｔ１２３、Ｈｉｓ１７６、Ｔｙｒ１４２、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ２３３、Ａｌａ２３８、Ｔｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ａｒｇ３５２、Ｇｌｎ３５３、Ｐｈｅ３９６、Ａｒｇ４０８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｐｈｅ４３８、Ａｓｐ４４０、Ａｒｇ４４６、Ｔｙｒ４４７およびＩｌｅ４５９の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む請求項４２〜４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子と薬剤の原子との間の距離を計算することを特徴とする請求項４２〜４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む組成物を提供することを特徴とする請求項４２〜４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
組成物がＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合するように設計された薬剤を含む請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
さらに、薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用を実験的に決定することを特徴とする請求項４２〜４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５５】
さらに、薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用を、第２の薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用と比較することを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことにより薬剤を選択し、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと薬剤を接触させ、次いで、
薬剤のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する結合能を検出することを特徴とする方法。
【請求項５７】
薬剤がコンピューターモデリングによって選択される請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
さらに、薬剤を合成することを特徴とする請求項５６または５７記載の方法。
【請求項５９】
さらに薬剤のＬＩＮＧＯ−１活性阻害能を検出することを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
薬剤の、イン・ビトロまたはイン・ビボでのミエリン形成増加能を検出することを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドおよび薬剤を含む補足的結晶複合体を得、
該補足的結晶複合体の三次元構造を決定し、
該補足的結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことにより第２の薬剤を選択し、
第２の薬剤をＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと接触させ、次いで、
第２の薬剤のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する結合能を検出することを特徴とする、請求項５６〜６０のいずれか１項記載の方法。
【請求項６２】
第２の薬剤がコンピューターモデリングによって選択される請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
さらに、第２の薬剤を合成することを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
さらに、第２の薬剤のＬＩＮＧＯ−１活性阻害能を検出することを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
さらに、第２の薬剤のイン・ビトロまたはイン・ビボでミエリンレベル増加能を検出することを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことにより薬剤を選択し、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと薬剤を接触させ、次いで、
薬剤のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する結合能を検出することを特徴とする方法。
【請求項６７】
薬剤がコンピューターモデリングによって選択される請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
さらに、薬剤を合成することを特徴とする請求項６６〜６７のいずれか１項記載の方法。
【請求項６９】
薬剤のＬＩＮＧＯ−１活性阻害能を検出することを特徴とする請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
さらに、薬剤のイン・ビトロまたはイン・ビボでミエリン形成増加能を検出することを特徴とする請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドおよび薬剤を含む補足的結晶複合体を得、
該補足的結晶複合体の三次元構造を決定し、
該補足的結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことにより第２の薬剤を選択し、
第２の薬剤をＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと接触させ、次いで、
第２の薬剤の、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する結合能を検出することを特徴とする、請求項６６〜７０のいずれか１項記載の方法。
【請求項７２】
薬剤がコンピューターモデリングによって選択される請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
さらに、薬剤を合成することを特徴とする請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
さらに、第２の薬剤のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド活性阻害能を検出することを特徴とする請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
さらに、第２の薬剤の、イン・ビトロまたはイン・ビボでミエリンレベル増加能を検出することを特徴とする請求項７１記載の方法。
【請求項７６】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む組成物を提供し、次いで、
該組成物を結晶化して、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む結晶複合体を形成させることを特徴とし、ここに、該結晶複合体が少なくとも約３．７Ａの分解能までＸ線を回折することができる、方法。
【請求項７７】
ハンギングドロップ蒸気拡散を用いることを含む請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体を含む組成物を提供し、次いで、
該組成物を結晶化して、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体を含む結晶を形成させることを特徴とし、ここに、該結晶が少なくとも約３．７Ａの分解能までＸ線を回折することができる、方法。
【請求項７９】
ハンギングドロップ蒸気拡散を用いることを含む請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
コンピューターシステムに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、
候補薬剤に関連する情報を受け取らせ、次いで、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する候補薬剤の結合性を決定させる命令を含み、ここに、該決定がＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報に基づいている、ソフトウェアシステム。
【請求項８１】
１以上のプロセッサーによって実行された時に、１以上のプロセッサーに、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受け取らせ、
候補薬剤に関連する情報を受け取らせ、次いで
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する候補薬剤の結合性を決定させる複数の命令が格納されており、ここに、該決定がＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報に基づいている、コンピューターで読み取り可能な媒体に存在するコンピュータープログラム。
【請求項８２】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、次いで、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと候補薬剤との結合性をモデル化することを特徴とする方法であって、ソフトウェアシステムによって実行される方法。
【請求項８３】
１以上のプロセッサーによって実行された時に、１以上のプロセッサーに、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、次いで
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと候補薬剤との結合性をモデル化させる複数の命令が格納された、コンピューターで読み取り可能な媒体に存在するコンピュータープログラム。
【請求項８４】
コンピューターシステムに、
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、次いで
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと候補薬剤との結合性をモデル化させる命令を含むソフトウェアシステム。
【請求項８５】
合理的薬物設計を用いてＬＩＮＧＯ−１活性を調節することのできる薬剤を選択し、次いで、
治療上有効量の薬剤を対象に投与することを特徴とする、対象においてＬＩＮＧＯ−１活性を調節する方法。
【請求項８６】
薬剤がミエリンレベルをイン・ビボで増加することができる請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
合理的薬物設計がＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む結晶複合体の三次元構造を用いることを含む請求項８５または８６記載の方法。
【請求項８８】
結晶複合体がさらにリガンドを含む請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
合理的薬物設計を用いてＬＩＮＧＯ−１活性に影響を及ぼすことのできる薬剤を選択し、次いで、
治療上有効量の薬剤を対象に投与することを特徴とする、ＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態を有する対象を治療する方法。
【請求項９０】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害することができる請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
薬剤がミエリンレベルをイン・ビボで増加することができる請求項８９または９０記載の方法。
【請求項９２】
病態が脱髄疾患である請求項８９〜９１のいずれか１項記載の方法。
【請求項９３】
病態が多発性硬化症である請求項８９〜９１のいずれか１項記載の方法。
【請求項９４】
対象がＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態に罹りやすいことを決定し、
合理的薬物設計を用いてＬＩＮＧＯ−１活性に影響を及ぼすことのできる薬剤を選択し、次いで、
治療上有効量の薬剤を対象に投与することを特徴とする、ＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態に罹りやすい対象を予防的に治療する方法。
【請求項９５】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害することができる請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９６】
薬剤がミエリンレベルをイン・ビボで増加することができる請求項９４または９５記載の方法。
【請求項９７】
病態が脱髄疾患である請求項９４〜９６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９８】
病態が多発性硬化症である請求項９４〜９７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９９】
ＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態の予防または治療のための医薬の製造における請求項２２〜７５のいずれか１項記載の設計または選択された薬剤の使用。
【請求項１００】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害することができる請求項９９記載の使用。
【請求項１０１】
病態が脱髄疾患である請求項９９または１００記載の使用。
【請求項１０２】
病態が多発性硬化症である請求項９９〜１０１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０３】
薬剤がリガンド結合部位でＬＩＮＧＯ−１に結合する請求項９９〜１０２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０４】
リガンド結合部位がＬＲＲドメインの凹状表面に位置する請求項１０３記載の使用。
【請求項１０５】
ＬＲＲドメインの凹状表面が、Ｔｒｐ３４６およびＡｒｇ３５２；Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９およびＨｉｓ２３３；Ａｓｐ１３；Ｇｌｕ６０およびＧｌｕ６２；またはＡｒｇ２０、Ａｒｇ２２およびＡｒｇ４３の１以上を含む請求項１０４記載の使用。
【請求項１０６】
リガンド結合部位がＬＲＲドメインの凸状表面に位置する請求項１０３記載の使用。
【請求項１０７】
ＬＲＲドメインの凸状表面が、Ｔｙｒ１４２およびＨｉｓ１４５；Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０およびＭｅｔ１２３；Ｈｉｓ１７６；またはＡｌａ２３８の１以上を含む請求項１０６記載の使用。
【請求項１０８】
リガンド結合部位がＩｇドメインに位置する請求項１０３記載の使用。
【請求項１０９】
Ｉｇドメインが、Ａｒｇ４４６およびＴｙｒ４４７；Ａｒｇ４０８、Ｐｈｅ４３８およびＡｓｐ４４０；Ｐｈｅ３９６；またはＬｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６およびＩｌｅ４５９の１以上を含む請求項１０８記載の使用。
【請求項１１０】
ＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態の予防または治療において有用な請求項２２〜７５のいずれか１項記載の設計または選択された薬剤。
【請求項１１１】
薬剤がＬＩＮＧＯ−１活性を阻害することができる請求項１１０記載の薬剤。
【請求項１１２】
病態が脱髄疾患である請求項１１０または１１１記載の薬剤。
【請求項１１３】
病態が多発性硬化症である請求項１１０〜１１２のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項１１４】
リガンド結合部位でＬＩＮＧＯ−１に結合する請求項１１０〜１１３のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項１１５】
リガンド結合部位がＬＲＲドメインの凹状表面に位置する請求項１１４記載の使用。
【請求項１１６】
ＬＲＲドメインの凹状表面が、Ｔｒｐ３４６およびＡｒｇ３５２；Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９およびＨｉｓ２３３；Ａｓｐ１３；Ｇｌｕ６０およびＧｌｕ６２；またはＡｒｇ２０、Ａｒｇ２２およびＡｒｇ４３の１以上を含む請求項１１５記載の使用。
【請求項１１７】
リガンド結合部位がＬＲＲドメインの凸状表面に位置する請求項１１４記載の使用。
【請求項１１８】
ＬＲＲドメインの凸状表面が、Ｔｙｒ１４２およびＨｉｓ１４５；Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０およびＭｅｔ１２３；Ｈｉｓ１７６；またはＡｌａ２３８の１以上を含む請求項１１７記載の使用。
【請求項１１９】
リガンド結合部位がＩｇドメインに位置する請求項１１４記載の使用。
【請求項１２０】
Ｉｇドメインが、Ａｒｇ４４６およびＴｙｒ４４７；Ａｒｇ４０８、Ｐｈｅ４３８およびＡｓｐ４４０；Ｐｈｅ３９６；またはＬｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６およびＩｌｅ４５９の１以上を含む請求項１１９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年２月３日に出願された米国仮出願第６０／７６５，４４３号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連する方法およびソフトウェアシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＬＩＮＧＯ−１（ＬＲＲおよびＩｇドメイン−含有、Ｎｏｇｏレセプター−相互作用タンパク質）はｐ７５との膜貫通型コレセプターである。該コレセプターは、リガンド結合Ｎｏｇｏ−６６レセプター（ＮｏｇｏＲ）と共に、Ｎｏｇｏレセプター複合体を形成し、それは一般にニューロンに位置する。ＬＩＮＧＯ−１が位置するＮｏｇｏレセプター複合体を無能化すると、ミエリンおよび神経線維成長を誘導することができる。ＬＩＮＧＯ−１は、オリゴデンドロサイトとして知られるミエリン形成細胞において活性であることが分かっており、ＬＩＮＧＯ−１の阻害もまた、ミエリン形成を誘導することが示された。かくして、ＬＩＮＧＯ−１シグナル伝達は、ミエリン産生の負のレギュレーターであると予想される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
一の態様において、本発明は、結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを特徴とする。
別の態様において、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、およびＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるリガンドを含む結晶化ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。
【０００５】
また別の態様において、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの三次元モデルを用いてＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。
さらなる態様において、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体の三次元モデルを用いて、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。
【０００６】
別の態様において、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む複合体の三次元モデルを用いて、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。
【０００７】
別の態様において、本発明は、例えば、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、またはＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことにより、薬剤を選択し；ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと薬剤を接触させ；次いで、薬剤のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する結合能を検出することを含む方法を特徴とする。具体例において、該方法は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドおよび薬剤を含む補足的結晶複合体を得る工程、該補足的結晶複合体の三次元構造を決定する工程、例えば、該補足的結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことにより、第２の薬剤を選択する工程、第２の薬剤をＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと接触させる工程、および／または、第２の薬剤のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する結合能を検出する工程の１以上を含む。該方法は、さらに、第２の薬剤を合成する工程、第２の薬剤のＬＩＮＧＯ−１活性阻害能を検出する工程、および／または第２の薬剤の、イン・ビトロまたはイン・ビボでミエリンレベル増加能を検出する工程の１以上を含む。
【０００８】
具体例において、本明細書中に開示される組成物および方法におけるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、免疫グロブリン様（Ｉｇ−様）ドメイン、および／またはストーク（stalk）ドメイン、またはその組み合わせを含むか、または、本質的に、ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、免疫グロブリン様（Ｉｇ−様）ドメイン、および／またはストークドメイン、またはその組み合わせからなる。他の具体例において、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、ヒト）または非哺乳動物起源由来のアミノ酸配列を含むか、または本質的に、哺乳動物（例えば、ヒト）または非哺乳動物起源由来のアミノ酸配列からなり、例えば、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、またはその変種（例えば、その保存的置換）を含むことができるか、または配列番号１のアミノ酸配列、またはその変種（例えば、その保存的置換）からなることができる。他の具体例において、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、結晶化されており、例えば、少なくとも約３．７Ａ（オングストローム）の分解能までＸ線を回折することができる。具体例において、結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、空間群Ｐ２ｌ２ｌ２またはＩ２２２を有する。他の具体例において、結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ａ＝２０１．５Ａ、ｂ＝１４９．７Ａ、ｃ＝１５７．５Ａおよびα＝β＝γ＝９０°、ａ＝１４８．７Ａ、ｂ＝１５８．６Ａ、ｃ＝２００．０Ａおよびα＝β＝γ＝９０°、ａ＝１４９．６Ａ、ｂ＝１５７．３Ａ、ｃ＝２００．３Ａおよびα＝β＝γ＝９０°の１以上から選択される単位格子寸法を有する。また別の具体例において、結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、表２の構造座標＋／−１．５Ａ以下のアルファ炭素原子についての二乗平均平方根を含む三次元構造を有する。別の具体例において、結晶化ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、配列番号１に示されるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアミノ酸Ａｓｐ１３、Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、Ａｒｇ４３、Ｇｌｕ６０、Ｇｌｕ６２、Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、Ｍｅｔ１２３、Ｈｉｓ１７６、Ｔｙｒ１４２、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ２３３、Ａｌａ２３８、Ｔｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ａｒｇ３５２、Ｇｌｎ３５３、Ｐｈｅ３９６、Ａｒｇ４０８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｐｈｅ４３８、Ａｓｐ４４０、Ａｒｇ４４６、Ｔｙｒ４４７および／またはＩｌｅ４５９の１以上の原子から選択される原子の構造座標を含む三次元構造を有する。
【０００９】
他の具体例において、本明細書中に開示される方法を用いて設計またはスクリーニングされた薬剤は、ＬＩＮＧＯ−１活性を阻害する。例えば、薬剤は、ＬＩＮＧＯ−１にリガンド結合部位で結合することができ、および／またはＬＩＮＧＯ−１とリガンドとの間の相互作用を干渉することができる。具体例において、リガンド結合部位は、ＬＲＲドメインの凹状表面、例えば、配列番号１にしたがって、Ｔｒｐ３４６およびＡｒｇ３５２；Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９およびＨｉｓ２３３；Ａｓｐ１３；Ｇｌｕ６０およびＧｌｕ６２；またはＡｒｇ２０、Ａｒｇ２２およびＡｒｇ４３の１以上を含むＬＲＲドメインの表面に位置する。他の具体例において、リガンド結合部位は、ＬＲＲドメインの凸状表面、例えば、配列番号１にしたがって、Ｔｙｒ１４２およびＨｉｓ１４５；Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０およびＭｅｔ１２３；Ｈｉｓ１７６；またはＡｌａ２３８の１以上を含むＬＲＲドメインの表面に位置する。他の具体例において、リガンド結合部位は、Ｉｇドメイン、例えば、配列番号１にしたがって、Ａｒｇ４４６およびＴｙｒ４４７；Ａｒｇ４０８、Ｐｈｅ４３８およびＡｓｐ４４０；Ｐｈｅ３９６；またはＬｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６およびＩｌｅ４５９の１以上を含むドメインに位置する。
【００１０】
具体例において、本明細書中に開示される方法は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、またはＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体を含む組成物を提供し、および／または該組成物を結晶化して、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、またはＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド−リガンド複合体を含む結晶性複合体を形成させることを含む。結晶性複合体は、少なくとも約３．７Ａの分解能までＸ線を回折することができる。本明細書中に開示される方法は、さらに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子と薬剤の原子との間の距離を計算する工程、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと薬剤との相互作用を決定する工程、薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用を、第２の薬剤とＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとの間の相互作用と比較する工程、コンピューターモデリングによって薬剤を選択する工程、薬剤のＬＩＮＧＯ−１活性阻害能を検出する工程、および／または薬剤のイン・ビトロまたはイン・ビボでのミエリン形成増加能を検出する工程の１以上を含むことができる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法を用いて設計または選択される薬剤を特徴とする。
別の態様において、本発明は、コンピューターシステムに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、候補薬剤に関連する情報を受け取らせ、次いで、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する候補薬剤の結合性を決定させる命令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。結合性の決定は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報に基づくことがきできる。
【００１２】
また別の態様において、本発明は、１以上のプロセッサーによって実行された時に、１以上のプロセッサーに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受け取らせ、候補薬剤に関連する情報を受け取らせ、次いで、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する候補薬剤の結合性を決定させる複数の命令が格納された、コンピューターで読み取り可能な媒体に存在するコンピュータープログラムを特徴とする。結合性の決定は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報に基づくことができる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取り、次いで、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと候補薬剤との結合性をモデル化することを含む方法を特徴とする。該方法は、ソフトウェアシステムによって実行することができる。
【００１４】
また別の態様において、本発明は、１以上のプロセッサーによって実行された時に、１以上のプロセッサーに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、次いで、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと候補薬剤との結合性をモデル化させる複数の命令が格納された、コンピューターで読み取り可能な媒体に存在するコンピュータープログラムを特徴とする。
【００１５】
別の態様において、本発明は、コンピューターシステムに、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造に関連する情報を受け取らせ、次いで、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと候補薬剤との結合性をモデル化させる命令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、合理的薬物設計）を用いて、ＬＩＮＧＯ−１活性を調節することのできる薬剤を選択し、次いで、有効量の薬剤を対象に投与してＬＩＮＧＯ−１活性を調節することを含む、対象においてＬＩＮＧＯ−１活性を調節する方法を特徴とする。
【００１７】
別の態様において、本発明は、例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、合理的薬物設計）を用いて、ＬＩＮＧＯ−１活性に影響を及ぼすことのできる薬剤を選択し、次いで、治療上有効量の薬剤を対象に投与することを含む、ＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態を有する対象を治療する方法を特徴とする。
【００１８】
また別の態様において、本発明は、対象がＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態に罹りやすいことを決定し、例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、合理的薬物設計）を用いて、ＬＩＮＧＯ−１活性に影響を及ぼすことのできる薬剤を選択し、次いで、治療上有効量の薬剤を対象に投与することを含む、ＬＩＮＧＯ−１活性に関連する病態に罹りやすい対象を予防的に治療する方法を特徴とする。
【００１９】
具体例において、本明細書中に開示される方法、例えば、本明細書中に開示される治療および予防方法において使用される薬剤は、ＬＩＮＧＯ−１活性を阻害し、および／またはイン・ビボでミエリンレベルを増加する。具体例において、該病態は、脱髄疾患、例えば、多発性硬化症である。
本発明の他の特徴および利益は、明細書、図面および請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
詳細な記載
一般に、該開示は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連する方法およびソフトウェアシステムに関する。理論に捕らわれることは望ましくないが、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶構造およびＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／リガンド複合体の結晶は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと相互作用することのできるリガンドの設計または同定に有用であると考えられる。
【００２１】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと相互作用するリガンドは、ＬＩＮＧＯ−１活性を阻害または増加することができる。一例として、ＬＩＮＧＯ−１阻害は、ミエリン形成を誘導することが示された。したがって、ＬＩＮＧＯ−１阻害剤の同定は、ミエリン欠乏によって特徴付けられる障害、例えば、多発性硬化症、Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病、中枢神経系外傷、Ｋｒａｂｂｅ病またはＣａｎａｖａｎ病などの大脳白質萎縮症、またはビタミンＢ１２欠乏の治療に有用であると考えられる。
【００２２】
図１は、ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン（アミノ酸１−３８２）、免疫グロブリン様（Ｉｇ−様）ドメイン（残基３８３−４７７）、ストーク領域（アミノ酸４７８−５１６）、およびストーク領域のＣ末端に融合したヘキサヒスチジンタグを含むヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのフラグメント（ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６）のアミノ酸配列（配列番号１）である。ヘキサヒスチジンタグは、精製を容易化した。ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６ポリペプチド中には、全長ヒトＬＩＮＧＯ−１のＮ末端に見出される３３アミノ酸シグナル配列が存在しない。野生型配列は、また、タンパク質のＣ末端に、膜貫通型ドメインおよび短い細胞質尾部を含む（Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８，２００４）。図２は、２．７Ａ分解能まで分解されたＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６構造の電子密度地図である（表１参照）。図３は、ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６ポリペプチドの構造を示すリボン図である。ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６ポリペプチドの結晶構造の座標は、表２に示される。
【００２３】
ＬＩＮＧＯ−１の構造を決定するために、ヒトＬＩＮＧＯ−１−ポリペプチドを下記のように調製し、結晶化することができる。一般に、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを記載のように調製することができる。例えば、いくつかの具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドをＤＮＡプラスミドから発現させる。発現は、プロモーター、例えば、誘導プロモーターまたは構成的プロモーター、例えば、サイトメガロウイルスプロモーターによって駆動させることができる。ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、適当なタグ、例えば、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｍｙｃ、ＨＡ、ＳｔｒｅｐまたはＦＬＡＧタグと共に融合タンパク質として発現させることができる。タグは、細胞、例えば、細菌細胞または哺乳動物細胞系統からのヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの単離を容易化することができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させ、該細胞から単離することができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ヘキサヒスチジンタグに融合させ、細胞抽出物をニッケル樹脂（例えば、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂）と接触させて該ヘキサヒスチジンタグを結合させ、次いで、イミダゾールを含有するバッファーで樹脂を洗浄することにより該ポリペプチドを遊離させることによって単離することができる。さらに、融合ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、融合タンパク質に工作されたプロテアーゼ部位、例えば、ポリペプチドとタグとの間の融合部位で、またはその近くで切断することができる。
【００２４】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、スペクトルデータ、ＮＭＲデータの収集のために、または結晶成長のために、溶液中に置かれることができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、塩（例えば、ナトリウム塩および／またはアンモニウム塩）の存在下で結晶化することができる。結晶は、種々の方法によって、例えば、攪拌またはハンギングドロップ（hanging drop）蒸発拡散によって成長させることができる。一般に、結晶化は、約４℃〜約６０℃（例えば、約１０℃〜約４５℃、例えば、約１２℃、約１５℃、約１８℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃）で行うことができる。
【００２５】
一般に、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、約３．７Ａ以下（例えば、約３．６Ａ以下、約３．５Ａ以下、約３．２Ａ以下、約３．０Ａ以下、約２．７Ａ以下、約２．４Ａ以下、約２．３Ａ以下、約２．２Ａ以下、約２．１Ａ以下、約２．０Ａ以下、約１．９Ａ以下、約１．８Ａ以下、約１．７Ａ以下、約１．６Ａ以下、約１．５Ａ以下、または約１．４Ａ以下）の分解能までＸ線を回折することができる。いくつかの具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、約１．７Ａ〜約３．７Ａの分解能までＸ線を回折することができる（例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、約２．７Ａ、約３．５Ａまたは約３．６ＡにＸ線を回折することができる）。
【００２６】
ある具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、単位格子パラメーターａ＝１４８．７Ａ、ｂ＝１５８．６Ａ、ｃ＝２００．０Ａおよびα＝β＝γ＝９０°を有する空間群Ｉ２２２に属する。他の具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、単位格子パラメーターａ＝１４９．６Ａ、ｂ＝１５７．３Ａ、ｃ＝２００．３Ａおよびα＝β＝γ＝９０°を有する空間群Ｉ２２２に属する。他の具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、単位格子パラメーターａ＝２０１．５Ａ、ｂ＝１４９．７Ａ、ｃ＝１５７．５Ａおよびα＝β＝γ＝９０°を有する空間群Ｐ２１２１２に属する。空間群は、結晶の総合的な対称性を示し、点対称性および空間対称性を包含する。ある具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、空間群Ｉ２２２に属し、非対称単位におけるヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの２つの分子を含有する。他の具体例において、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶は、空間群Ｐ２１２１２に属し、非対称単位におけるヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの４つの分子を含有する。非対称単位は、空間群の対称操作を用いることによって結晶構造を生じることのできる最小単位である。結晶は、一般に、非対称単位における空間群対称操作によって規定されるモチーフ、およびそのモチーフの結晶格子中での並進で構成されている。
【００２７】
結晶を示す構造データは、例えば、Ｘ線回折によって得ることができる。Ｘ線回折データは、種々の線源、Ｘ線波長および検出器によって収集することができる。いくつかの具体例において、回転陽極およびシンクロトロン放射源（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  （ＡＬＳ）、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  （ＡＰＳ）、Ａｒｇｏｎｎｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）をＸ線源として用いることができる。ある具体例において、回折データを生じるためのＸ線は、約０．５Ａ〜約１．６Ａ（例えば、約０．７Ａ、約０．９Ａ、約１．０Ａ、約１．１Ａ、約１．３Ａ、約１．４Ａ、約１．５Ａ、または約１．６Ａ）の波長を有することができる。いくつかの具体例において、面積検出器および／または電荷結合素子（ＣＣＤｓ）を検出器として用いることができる。
【００２８】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの結晶のＸ線回折データを用いて、複合体における原子の構造座標を得ることができる。構造座標は、三次元空間における原子の位置を複合体中の他の原子との関連で示すデカルト座標である。例えば、表２に挙げられる構造座標は、結晶性ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造座標である。表２の構造座標は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）および（配列番号８）の原子の位置を相互の関連で示す。構造座標は、数学的操作によって、例えば、反転または整数加算もしくは減算によって修飾することができる。したがって、構造座標は相対的な座標である。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドにおける原子の位置を示す構造座標は、表２の実際のｘ、ｙおよびｚ座標に特に限定されない。
【００２９】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造座標は、ポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントの表示（例えば、二次元表示または三次元表示）を導くために用いることができる。かかる表示は、例えば、ポリペプチドの活性部位の視覚化、同定および特徴付けを包含するいくつかの応用に有用である。ある具体例において、三次元表示は、表２にしたがうヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造座標±約１．５Ａ以下（例えば、約１．０Ａ以下、約０．５Ａ以下）のアミノ酸のアルファ炭素原子由来の二乗平均平方根（ｒｍｓ）偏差を包含する。
【００３０】
ＲＭＳ偏差は、平均からのずれの二乗の相加平均の平方根であり、構造座標からのずれまたは差異を表現する手段である。アミノ酸の保存的置換（下記参照）は、示されるｒｍｓ偏差内の構造座標を有する分子表示をもたらすことができる。例えば、保存的アミノ酸置換によって互いに相違するポリペプチドの２つの分子モデルは、示されるｒｍｓ偏差内、例えば、約１．５Ａ以下（例えば、約１．０Ａ以下、約０．５Ａ以下）の骨格分子の座標を有することができる。ポリペプチドの骨格原子は、アルファ炭素（ＣαまたはＣＡ）原子、カルボニル炭素（Ｃ）原子、およびアミド窒素（Ｎ）原子を含む。
【００３１】
種々のソフトウェアプログラムは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントの表示を得るために、１セットの構造座標の図画的表示を可能にする。一般に、かかる表示は、構造座標、または構造座標から誘導される情報、例えば、特徴（feature）間の距離または角度を正確に（比較的、および／または絶対的に）反映すべきである。いくつかの具体例において、表示は、二次元図、例えば、立体的二次元図である。ある具体例において、表示は、相互二次元ディスプレー、例えば、相互立体的二次元ディスプレーである。相互二次元ディスプレーは、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントの種々の面を示すために回転することのできるコンピューターディスプレーであることができる。ある具体例において、表示は、三次元表示である。一例として、三次元モデルは、分子構造の物理的モデル（例えば、ボール・アンド・スティックモデル）であることができる。別の例として、三次元表示は、分子構造の図画的表示（例えば、コンピューターディスプレー上に提供された図面または図形）であることができる。二次元図画的表示（例えば、図面）は、例えば、遠近法、描影法、または観察者により近い特徴による観察者からより遠い特徴の妨害によって二次元表示が三次元情報を反映する場合、三次元表示に対応することができる。ある具体例において、表示は１レベル以上でモデル化することができる。一例として、三次元表示がポリペプチド、例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを包含する場合、該ポリペプチドは、１以上の異なるレベルの構造、例えば、一次（アミノ酸配列）、二次（例えば、α−へリックスおよびβ−シート）、三次（全体の折り畳み）および四次（オリゴマー化状態）構造で表示することができる。表示は、異なるレベルのディティールを含むことができる。例えば、表示は、原子の位置を明示することなく、タンパク質の二次構造特徴の相対的位置を含むことができる。より詳細な表示は、例えば、原子の位置を含むことができた。
【００３２】
いくつかの具体例において、表示は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドにおける原子の構造座標の他に情報を含むことができる。例えば、表示は、溶媒接触可能表面の形状、モデルの原子のファン・デル・ワールス半径、および溶媒（例えば、水）のファン・デル・ワールス半径に関する情報を提供することができる。表示から誘導することができる他の特徴は、例えば、静電ポテンシャル、高分子構造内の空隙またはポケットの位置、および水素結合および塩架橋の位置を包含する。
【００３３】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと相互作用（例えば、結合）する薬剤は、ポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントの表示の使用を包含する方法によって、同定または設計することができる。表示の典型例は、上記の表示を包含する。いくつかの具体例において、表示は、類似のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの表示であることができる。該表示と相互作用する候補薬剤は、該表示を用いる候補薬剤のコンピューターフィッティング分析を実施することによって設計または同定することができる。一般に、薬剤は分子である。薬剤の例は、ポリペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する）、ステロイドおよび非ステロイド性有機化合物を包含する。ポリペプチド（例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド）と相互作用する薬剤は、該ポリペプチドと一時的に、または安定的に相互作用することができる。相互作用は、例えば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用およびファン・デル・ワールス相互作用を包含する本明細書中に示されるいずれかの力によって媒介されることができる。
【００３４】
上記のように、Ｘ線結晶学を用いて、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造座標を得ることができる。しかしながら、かかる構造座標は、ＮＭＲ技術を包含する他の技術を用いて得ることができる。付加的な構造情報は、スペクトル技術（例えば、旋光分散（ＯＲＤ）、円偏光二色性（ＣＤ））、ホモロジーモデリング、およびコンピューターによる方法（例えば、分子力学由来のデータを含むことができるコンピューター法、動力学アッセイ由来のデータを含むコンピューター法）から得ることができる。
【００３５】
いくつかの具体例において、Ｘ線回折データを用いて、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントの電子密度地図を構築することができ、該電子密度地図を用いて、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの表示（例えば、二次元表示、三次元表示）を導くことができる。電子密度地図の創作は、典型的に、Ｘ線散乱の位相に関する情報を用いることを含む。位相情報は、例えば、回折データから、または電子密度地図の構築を完了するための補助的な回折実験から抽出することができる。Ｘ線回折データから位相を計算する方法は、例えば、多波長異常分散（ＭＡＤ）、多重同型置換（ＭＩＲ）、異常散乱を用いる多重同型置換（ＭＩＲＡＳ）、異常散乱を用いる単一同型置換（ＳＩＲＡＳ）、逆格子空間溶媒平坦化（reciprocal space solvent flattening）、分子置換、またはそのいずれかの組み合わせを包含する。これらの方法は、例えば重原子を含むこと、またはすでに存在する重原子の散乱力を変化させることによって、同型構造修飾を天然タンパク質に施し、次いで、天然タンパク質およびその修飾ケースの各々について回折振幅を測定することによって位相情報をもたらす。付加的な重原子の位置または散乱強度における変化が知られている場合、各回折されたＸ線の位相は、１セットの同時位相方程式を解くことによって決定することができる。重原子部位の位置は、コンピュータープログラム、例えば、ＳＨＥＬＸＤ（Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはＳＨＥＬＸＳ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ａｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＸＰＲＥＰ（Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて同定することができ、回折データは、コンピュータープログラム、例えば、ＭＯＳＦＬＭ、ＳＣＡＬＡ、ＳＯＬＯＭＯＮおよびＳＨＡＲＰ（”Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ，５４：９０５−９２１，１９９７；ｄｅＬａ  Ｆｏｒｔｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｂｒｉｇｏｇｎｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：４７２−４９４，１９９７）を用いて加工することができる。結晶性ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに関するＸ線散乱の位相は、例えば、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの白金誘導体の結晶を用いるＳＩＲＡＳによって決定することができる。結晶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの白金誘導体を作成するために、結晶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを白金を含有する溶液中に浸漬することができる。次いで、白金誘導体からＳＩＲＡＳによって得られた位相は、例えば、非結晶学的対称（ＮＣＳ）平均化、およびＤＭ（Ｃｏｗｔａｎ  ａｎｄ  Ｍａｉｎ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ４９：１４８−１５７，  １９９３）などのコンピュータープログラムにおける位相拡張を用いて精密化することができる。得られたモデルは、さらに、第２のデータセットを用いる分子置換によって誘導されることができる。例えば、空間群Ｉ２２２を有する結晶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドから誘導されたモデルは、空間群Ｐ２１２１２を有する結晶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド由来のデータセット��の分子置換を用いて精密化することができる。次いで、天然結晶性ポリペプチドおよびその白金誘導体の結晶からＳＩＲＡＳによって得られた位相を用いて、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの電子密度地図を作製することができる。
【００３６】
電子密度地図は、電子密度地図を用いてポリペプチドの三次元モデルをアラインメント(align)させることによって、ポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントの表示を導くために用いることができる。例えば、天然結晶性ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対応する電子密度地図を、同型置換法によって誘導された結晶性ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド複合体の白金誘導体に対応する電子密度地図を用いてアラインメントさせることができる。
【００３７】
アラインメント（alignment）プロセスは、計算された電子密度地図が以前に知られているポリペプチドまたは以前に知られている複合体のモデルと異なる程度を示す比較モデルをもたらす。次いで、比較モデルを１サイクル以上（例えば、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル）精密化して、電子密度地図によりフィットするようにする。ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ５４：９０５−９２１，１９９８）およびＲＥＦＭＡＣ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４．  Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ５０：７６０−７７６，１９９４）などのソフトウェアプログラムを用いて、モデルを精密化することができる。比較モデルにおけるフィットの質は、例えば、ＲｆａｃｔｏｒまたはＲｆｒｅｅ値によって測定することができる。より小さな値のＲｆａｃｔｏｒまたはＲｆｒｅｅは、一般に、よりフィットしていることを示す。比較モデルにおけるミスアラインメントは、修飾した比較モデルおよびより低いＲｆａｃｔｏｒまたはＲｆｒｅｅ値を提供するように調整することができる。該調整は、適宜、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのバリエーションに関連する情報（例えば、配列バリエーション情報、代替構造情報、重原子誘導体情報）に基づくことができる。一例として、結晶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの重原子誘導体のモデルを用いる具体例において、調整は、天然ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの近似モデルを重原子誘導体のモデルにフィットさせることを含むことができる。別の例として、ある具体例において、調整は、以前に知られているＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド中のアミノ酸を類似構造を有するアミノ酸で置換すること（保存的アミノ酸変化）を含むことができる。修飾された比較モデルへの調整が電子密度地図に対する最も良好なフィットを満足させる場合、得られるモデルは、Ｘ線データが由来するポリペプチドまたは複合体を表すことが決定されたものである。かかるプロセスの方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７７，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７のＣａｒｔｅｒおよびＳｗｅｅｔ編、”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”およびその引用文献、例えば、ＪｏｎｅｓおよびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，”Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍａｐ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ”，ｐ．１７３、およびＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ，”Ｍｏｄｅｌ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，ｐ．２０８に開示される。
【００３８】
コンピューターなどの機械は、機械に連結されたディスプレー上に構造座標の図画的表示をもたらすことのできるプログラムと一緒に、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造座標をメモリにプログラム化することができる。また、ソフトウェアシステムも、構造座標を受入れ、格納するよう設計、および／または利用することができる。ソフトウェアシステムは、構造座標の図画的表示をもたらすことができる。ソフトウェアシステムは、また、外部のデーターベースにアクセスして、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと相互作用する可能性のある１以上の候補薬剤を同定することができる。
【００３９】
構造データを含有するメモリを有する機械、またはかかるデータを含有するソフトウェアシステムは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドアゴニストまたはヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドアンタゴニストの合理的設計または選択を援助することができる。例えば、かかる機械またはソフトウェアシステムは、薬剤のヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド結合能の評価に役立ち、あるいはヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する構造または配列ホモロジーによって関連付けられる化合物またはタンパク質のモデリングに役立つことができる。本明細書中で使用される場合、アゴニストとは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を増強する化合物をいい、アンタゴニストとは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を阻害または中和する化合物をいう。例えば、神経細胞によるミエリン産生速度を増加することによって、またはヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとＮｏｇｏレセプター複合体との相互作用を阻害することによって、化合物は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアンタゴニストとして機能しうる。
【００４０】
機械は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントの表示（例えば、二次元表示、三次元表示）を作成することができる。ソフトウェアシステムは、例えば、機械にかかる情報をもたらすことができる。機械は、機械で読み取り可能なデータでコード化されたデータ保存物質を包含する機械で読み取り可能なデータ保存媒体を含むことができる。機械で読み取り可能なデータは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子の構造座標を含むことができる。機械で読み取り可能な保存媒体（例えば、データ保存物質）は、例えば、従来のコンピューターハードドライブ、フロッピーディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤおよび他の磁気性、磁気光学的、光学的媒体、および機械（例えば、コンピューター）で利用するのに適した他の媒体を包含する。機械は、また、機械で読み取り可能なデータを処理するための命令を保存するための作業メモリ、ならびに機械で読み取り可能なデータを所望の三次元表示中に処理する目的で作業メモリおよび機械読み取り可能データ保存媒体に連結させた中央処理装置（ＣＰＵ）を有する。ディスプレーは、ユーザーが三次元表示を視覚化できるように、ＣＰＵに連結することができる。したがって、データを使用する命令をプログラムに組み込んだ機械（例えば、本明細書に記載の種類の１以上のプログラムをロードしたコンピューター）と共に用いる場合、該機械は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、複合体、または複合体フラグメントのいずれかの図画的表示（例えば、二次元図示、三次元図示）を表示することができる。
【００４１】
ディスプレー（例えば、コンピューターディスプレー）は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのフラグメントの表示を示すことができる。ユーザーは、その表示を検査することができ、該表示から得られた情報を用いて、リガンドに結合したヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのモデルを作成することができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの以前に存在していた表示を改変することによって、該モデルを作成することができる。所望により、ユーザーは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの表示上に三次元モデルを重ねることができる。薬剤は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアゴニスト（例えば、候補アゴニスト）であることができる。いくつかの具体例において、薬剤は、既知化合物または既知化合物のフラグメントであることができる。ある具体例において、薬剤は、以前に知られていない化合物、または以前に知られていない化合物のフラグメントであることができる。
【００４２】
薬剤は、活性部位の形状を補足する形状を有することが望ましい。薬剤の原子およびヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの原子間に、好ましい距離、または距離範囲が存在することができる。好ましい距離より長い距離は、薬剤および活性部位（例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの活性部位）の間の弱い相互作用に関連しうる。好ましい距離よりも短い距離は、薬剤および該ポリペプチドの間の相互作用を弱めることのできる斥力に関連しうる。原子間の距離が短すぎる場合、立体衝突が起こる可能性がある。立体衝突は、２つの原子の位置が過度に密接する場合、例えば、２つの原子がそれらのファン・デル・ワールス半径の合計よりも短い距離で引き離されている場合に起こる。立体衝突が存在する場合、ユーザーは、薬剤の、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する位置を立体衝突が軽減されるまで調整することができる（例えば、薬剤の剛体並進または回転）。ユーザーは、薬剤のコンホメーション、または薬剤の近辺のヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのコンホメーションを調整して、立体衝突を軽減することができる。立体衝突は、また、薬剤の構造を改変することによって、例えば、芳香環などの「嵩高い基」を小さな基、例えば、メチルまたはヒドロキシル基に変えることによって、または堅い基を、立体衝突を生じないコンホメーションを提供することのできる柔軟な基に変えることによって、除去することができる。また、静電気力も、薬剤およびリガンド結合ドメインの間の相互作用に影響を及ぼすことができる。例えば、静電気性質は、薬剤およびヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの間の相互作用を弱めることのできる斥力に関連することができる。静電気斥力は、薬剤の電荷を改変することによって、例えば、正電荷基を中性基に置き換えることによって軽減することができる。
【００４３】
候補薬剤およびヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド間の結合力に影響を及ぼす力は、各々、ポリペプチド／薬剤モデルにおいて評価することができる。これらは、例えば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、双極子−双極子相互作用、π−スタッキング力、およびカチオン−π相互作用を包含することができる。ユーザーは、これらの力を、例えば、水素結合に適当な距離および角度で配列させた水素結合ドナー／アクセプター対に注目することによって、視覚的に評価することができる。評価に基づいて、ユーザーは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドおよび薬剤間のより好ましい相互作用を見出すために該モデルを改変することができる。モデルの改変は、例えば、アミノ酸側鎖または骨格二面角のコンホメーションを改変することによって、該ポリペプチドの三次元構造をその化学構造を改変することなく変化させることを包含することができる。モデルの改変は、上記のように、薬剤の位置またはコンホメーションを改変することを包含することができる。モデルの改変は、また、例えば、基を置換、付加または除去することによって、薬剤の化学構造を改変することを包含することができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド上の水素結合ドナーが薬剤上の水素結合ドナーの近くに位置するならば、ユーザーは、薬剤上の水素結合ドナーを水素結合アクセプターと置き換えることができる。
【００４４】
薬剤およびヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの相対的位置、またはそれらのコンホメーションを、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する特定の薬剤の最適化した結合幾何構造を見出すために調整することができる。最適化した幾何構造は、例えば、好ましい水素結合距離および角度、最大静電気引力、最小静電斥力、水性環境からの疎水性基の隔離、および立体衝突の非存在によって特徴付けられる。最適化された幾何構造は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド／薬剤複合体について可能な幾何構造の一群の最も低い計算されたエネルギーを有することができる。最適化された幾何構造は、例えば、分子力学または分子動力学計算によって、決定することができる。
【００４５】
種々の薬剤を結合したヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの一連の表示を作成することができる。各表示についてスコアを計算することができる。スコアは、例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドおよび薬剤間の相互作用の予想される強度を表すことができる。スコアは、結合強度に影響を及ぼす上記の因子の一つを反映することができる。スコアは、１以上の因子を反映する総スコアであることができる。スコアにしたがって種々の薬剤をランク付けすることができる。
【００４６】
薬剤設計における工程は、機械による自動様式で実施することができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの表示は、候補薬剤の表示と共に、機械においてプログラム化されることができる。機械は、活性部位に対する各候補薬剤の最適化した幾何構造を見出すことができ、一連の薬剤のなかでどれがヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと最も強く相互作用する見込みがあるかを決定するためのスコアを計算することができる。
【００４７】
ソフトウェアシステムは、これらの工程を容易化するように設計および／または実行されることができる。表示を作成するため、またはフィッティング分析を実施するために使用されるソフトウェアシステム（例えば、コンピュータープログラム）は、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＭＣＳＳ、Ｌｕｄｉ、ＱＵＡＮＴＡＲ（登録商標）（巨大分子Ｘ線結晶学ソフトウェア）、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩＲ（生物学的化合物モデリングおよびシミュレーションソフトウェア）、Ｃｅｒｉｕｓ２Ｒ（モデリングおよびシミュレーションソフトウェア）、ＣＨＡＲＭｍＲ（生物学的巨大分子のシミュレーションのためのソフトウェア）、ＣＨＡＲＭｍＲ（生物学的巨大分子のシミュレーションのためのソフトウェア）、およびＭｏｄｅｌｅｒ；ＴＲＩＰＯＳ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製のＳＹＢＹＬＲ（分子モデリングソフトウェア）、Ｕｎｉｔｙ、ＦｌｅＸＸ、およびＬＥＡＰＦＲＯＧ；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；およびＦｌｏ＋およびＦｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＮＪ）を包含する。他の有用なプログラムは、Ｏｐｅｎｅｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ）製のＲＯＣＳ、ＺＡＰ、ＦＲＥＤ、Ｖｉｄａ、およびＳｚｙｂｋｉ；Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）製のＭａｅｓｔｒｏ、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ、およびＧｌｉｄｅ；ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ）、Ａｌｌｅｇｒｏｗ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌ．  Ｓｅｃｔ．  Ｄ  ５４：９０５−９２１，１９９７）およびＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：４３−５３，１９９５）を包含する。また、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ、ＲＡＳＴＥＲ３ＤまたはＰＹＭＯＬを用いてヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの三次元構造を視覚化するために、構造座標を用いることができる（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：９４６−９５０，１９９１；Ｂａｃｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．６：２１９−２２０，１９９８；ＤｅＬａｎｏ，Ｔｈｅ  ＰＹＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）。
【００４８】
薬剤は、例えば、適当なデータベースをスクリーニングすることによって選択することができ、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの立体配座および帯電電位を適当なソフトウェアシステムで分析することによって新たに設計することができ、および／または既知のリガンド、例えば、ニューロトロフィンレセプターｐ７５およびＮｏｇｏレセプター（ＮｏｇｏＲ）の特徴を用いて設計することができる。該方法を用いて、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを設計または選択することができる。データベース検索、および／または薬剤選択および設計を容易化するために、ソフトウェアシステムを設計および／または実行することができる。
【００４９】
いったん薬剤が設計または同定されたならば、それを入手または合成し、さらに、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの活性に対するその効果について評価することができる。例えば、薬剤は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと接触させ、ポリペプチド活性に対する薬剤の効果を測定することによって、評価することができる。薬剤を評価する方法は、イン・ビトロまたはイン・ビボで実施される活性アッセイを包含することができる。
【００５０】
活性アッセイは、例えば、細胞に基づいたアッセイであることができる。細胞に基づいたアッセイは、ミエリン産生に対する候補薬剤の効果をモニターすることを包含することができる。ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド阻害剤に関するかかるアッセイは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを発現している細胞を候補阻害剤と接触させ、次いで、細胞形態に対する効果についてアッセイすることを含みうる。例えば、神経細胞系統を候補薬剤と接触させ、該細胞を、オリゴデンドロサイト分化に対する影響についてモニターすることができる。ＬＩＮＧＯ−１活性の減少は、細胞プロセスの長さの増加によって明らかなように、細胞の成熟したオリゴデンドロサイトへの分化を増加させることが示された（Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：７４５−７５１，２００５）。また、ＬＩＮＧＯ−１活性は、ミエリン産生に関与するタンパク質、例えば、髄鞘形成の開始時に発現するタンパク質であるミエリン関連糖蛋白（ＭＡＧ）、ミエリンの主要タンパク質成分であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ならびにオリゴデンドロサイト−ミエリン糖蛋白（ＯＭｐｇ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白（ＭＯＧ）および環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）を包含する他のミエリン成分のレベルを測定することによって、アッセイすることができる。ＬＩＮＧＯ−１阻害剤は、これらの各タンパク質の発現のアップレギュレーションを促進することが示された（Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：７４５−７５１，２００５）。タンパク質レベルは、標準的なタンパク質検出技術、例えば、ウェスタンブロット分析による免疫組織化学または培養細胞もしくは全組織切片におけるイン・サイトゥ・ハイブリダイゼーションによってアッセイすることができる。
【００５１】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対する薬剤の作用に依存して、薬剤は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。例えば、アゴニストは、ミエリン産生速度を減少させうるか、またはヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＮｏｇｏレセプター複合体に対する結合アフィニティーを増加しうる。逆に、アンタゴニストは、ミエリン産生速度を増加させうるか、またはヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＮｏｇｏレセプター複合体に対する結合アフィニティーを減少させうる。Ｎｏｇｏレセプター複合体の１以上の成分（例えば、ｐ７５またはＮｏｇｏ６６）の存在下に薬剤をヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと接触させて、薬剤が、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＮｏｇｏレセプター複合体に対する結合を阻害するかどうかを決定することができる。同定された薬剤に結合したヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含有する結晶を成長させることができ、構造はＸ線結晶学によって決定される。第２の薬剤は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと第１の薬剤との相互作用に基づいて設計または同定することができる。
【００５２】
種々の分子分析および合理的薬物設計技術は、さらに、例えば、米国特許第５，８３４，２２８号、第５，９３９，５２８号および第５，８５６，１１６号、ならびに、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９号（ＷＯ９９／０９１４８として公開される）において開示されている。
【００５３】
ある特定の具体例を記載するが、他の具体例も考えられる。
【００５４】
一例として、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに関する具体例を記載するが、本明細書の記載は、より一般的に、いずれのＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドにも向けられる。
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、全長の成熟ポリペプチドであることができ、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのいずれのイソ型の全長アミノ酸配列をも包含する。イソ型は、一次構造が異なるタンパク質のいくつかの多様な形態のいずれかである。ヒトＬＩＮＧＯ−１の全長アミノ酸およびヌクレオチド配列を図８Ａ−８Ｂに開示する。
【００５５】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのフラグメント、例えば、シグナル配列、ＬＲＲ型ドメイン、Ｉｇ−様ドメイン、膜貫通型ドメイン、細胞質ドメイン、またはその組み合わせであることができる。ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのフラグメントは、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド配列（例えば、配列番号１）の４０％、５０％、６０％、８０％、９０％またはそれ以上を包含することができる。例えば、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、下記のドメイン：ＬＲＲ型ドメイン（例えば、およそ配列番号１のアミノ酸１−３８２）、またはそのフラグメントもしくは選択された残基（例えば、配列番号１のアミノ酸Ａｓｐ１３、Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、Ａｒｇ４３、Ｇｌｕ６０、Ｇｌｕ６２、Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、Ｍｅｔ１２３、Ｈｉｓ１７６、Ｔｙｒ１４２、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ２３３、Ａｌａ２３８、Ｔｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ａｒｇ３５２、および／またはＧｌｎ３５３の１以上）；Ｉｇ−様ドメイン（例えば、およそ配列番号１のアミノ酸３８３−４７７）、またはそのフラグメントもしくは選択された残基（例えば、配列番号１のアミノ酸Ｐｈｅ３９６、Ａｒｇ４０８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｐｈｅ４３８、Ａｓｐ４４０、Ａｒｇ４４６、Ｔｙｒ４４７および／またはＩｌｅ４５９の１以上）；および／またはストーク領域（例えば、およそ配列番号１のアミノ酸４７８−５１６）、またはそのフラグメントもしくは選択された残基を包含することができる。他の具体例において、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、１以上の活性部位および／または折り畳み構造を含有することができる。ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、類似の三次元構造を生じる１以上の保存的アミノ酸置換を含有しうる。例えば、いくつかの具体例において、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド（またはそのフラグメント）は、予め決定された配列、例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１アミノ酸配列（例えば、配列番号１）由来の５、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０または２００まで、またはそれ以上の保存的置換を包含する。
【００５６】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、活性部位を有することができる。例えば、ＬＲＲ−様ドメインは、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのおそらく活性部位を含む。一般に、活性部位は、リガンド結合部位、またはリン酸化、グリコシル化、アルキル化、アシル化または他の共有結合修飾の部位を包含することができる。リガンド結合部位は、Ｎｏｇｏレセプター複合体の成分、またはＬＩＮＧＯ−１活性のアゴニストもしくはアンタゴニストの結合部位であることができる。活性部位は、グリコシル化部位を包含することができる。リガンド結合部位は、リガンドとの相互作用時に活性に影響を及ぼしうる実際の結合部位に近接または隣接した補助的な結合部位を包含することができる。ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの候補活性部位は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造を他の既知ポリペプチドの相同構造と比較することによって同定することができる。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの１以上の活性部位は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの構造を血小板膜糖蛋白Ｇｐ１ｂαの構造と比較することによって同定することができる。Ｔｒｐ３４６およびＡｒｇ３５２を包含するＬＩＮＧＯ−１上の候補活性部位は、Ｇｐ１ｂα上におけるリガンド結合部位の構造との類似性によって同定された。ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの表面に位置するキャビティーもまた、候補リガンド結合部位を示す。
【００５７】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの活性部位は、配列番号１のアミノ酸を包含することができる（図１）。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの活性部位は、配列番号１のアミノ酸位置において示した場合、アミノ酸Ａｓｐ１３、Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、Ａｒｇ４３、Ｇｌｕ６０、Ｇｌｕ６２、Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、Ｍｅｔ１２３、Ｈｉｓ１７６、Ｔｙｒ１４２、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ２３３、Ａｌａ２３８、Ｔｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ａｒｇ３５２、Ｇｌｎ３５３、Ｐｈｅ３９６、Ａｒｇ４０８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｐｈｅ４３８、Ａｓｐ４４０、Ａｒｇ４４６、Ｔｙｒ４４７およびＩｌｅ４５９の１以上を包含することができる。活性部位は、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの特定領域に位置するアミノ酸のサブセットを包含することができる。例えば、活性部位は、ＬＲＲ−ドメインの凹状表面に位置することができ、配列番号１のＴｒｐ３４６およびＡｒｇ３５２；Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９およびＨｉｓ２３３；Ａｓｐ１３；Ｇｌｕ６０およびＧｌｕ６２；またはＡｒｇ２０、Ａｒｇ２２およびＡｒｇ４３を包含することができる。別の例において、活性部位は、ＬＲＲ−ドメイン上の凸状表面に位置することができ、配列番号１のＴｙｒ１４２およびＨｉｓ１４５；Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０およびＭｅｔ１２３；Ｈｉｓ１７６；またはＡｌａ２３８を包含することができる。別の例において、活性部位は、Ｉｇ−ドメイン上に位置することができ、配列番号１のＡｒｇ４４６およびＴｙｒ４４７；Ａｒｇ４０８、Ｐｈｅ４３８およびＡｓｐ４４０；Ｐｈｅ３９６；またはＬｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６およびＩｌｅ４５９を包含することができる。
【００５８】
ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、本明細書に示されるものと異なっていてもよく、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの配列は、同じ三次元構造を生じるある特定の保存的アミノ酸置換を含有していてもよい。例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの番号付けは、図１に示されるものと異なっていてもよく、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの配列は、保存的アミノ酸置換を含有していてもよいが、表２の座標によって定義され、図２−４および図５Ａ−５Ｃにおいて図示されるのと同じ構造を生じる。他のイソ型または類似体における対応するアミノ酸および保存的置換は、関連するアミノ酸配列の視覚的検査によって、または市販のホモロジーソフトウェアプログラム（例えば、ＭＯＤＥＬＬＡＲ，ＭＳＩ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いることによって容易に同定される。表２に示される結晶構造座標は、空間群Ｐ２１２１２を有する結晶から決定されたが、同じ座標＋／−１．５Ａ以下のアルファ炭素原子の二乗平均平方根が、Ｉ２２２などの異なる空間群を有する結晶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに対応することができる。
【００５９】
類似体は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。保存的置換は、１のアミノ酸を、同様の極性、立体配置を有するか、または同じクラス（例えば、疎水性、酸性または塩基性）の別のアミノ酸と交換することを包含することができ、また、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドと相互作用する薬剤の同定および設計に関して、ならびに分子置換分析および／またはホモロジーモデリングにとって、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの三次元構造に対する取るに足らない影響を有する置換を包含することができる。
【００６０】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの変種または変異体は、本明細書に開示される方法、組成物および三次元モデルにおいて使用することができる。ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの変種または変異体、またはそのフラグメントは、該変種が天然タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部、または天然タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する限り、キメラまたは融合タンパク質、標識化タンパク質（例えば、放射能標識タンパク質）、融合タンパク質、変異タンパク質、類似（例えば、実質的に類似）の配列（例えば、アミノ酸置換（例えば、保存されたアミノ酸置換）、欠失、挿入を有するタンパク質）、タンパク質フラグメント、模倣物を包含する。具体例において、変異体ＬＩＮＧＯ−１は、配列番号１のアミノ酸配列またはそのフラグメントと、５、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０または２００個までの、またはそれ以上のアミノ酸残基が異なる。他の具体例において、変異体ＬＩＮＧＯ−１は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド配列、例えば、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド（例えば、配列番号１）に対して少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上同一である。
【００６１】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ポリペプチドをコードしている第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との融合物であって、第１および第２のアミノ酸配列が単一のポリペプチド鎖の一部として天然に存在しないものである。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「実質的に類似」（または「実質的に」または「十分に」「相同性」または「同一」）なる語は、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列が第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して同一または等価の（例えば、類似の側鎖を有する、例えば、保存されたアミノ酸置換を有する）十分数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有して、その結果、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が同様の活性を有することをいう。本明細書中に開示される配列と類似または相同（例えば、少なくとも約８５％配列同一性）の配列は、本出願の一部でもある。ある具体例において、配列同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。
【００６３】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」の計算は、下記のように実施される。最適な比較目的で、配列をアラインメントさせる（例えば、最適なアラインメントのための第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、比較目的で非相同配列を無視することができる）。典型的には、比較目的でアラインメントさせた参照配列の長さは、該参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」なる語は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要のあるギャップの数およびギャップの長さを考慮して、該配列で共通の同一位置の数の関数である。
【００６４】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。一の具体例において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおける市販のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびにギャップ・ウェイト（gap weight）１６、１４、１２、１０、８、６または４およびレングス・ウェイト（length weight）１、２、３、４、５または６を用いて決定される。また別の具体例において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおける市販のＧＡＰを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびにギャップ・ウェイト４０、５０、６０、３０、７０または８０およびレングス・ウェイト１、２、３、４、５または６を用いて決定される。パーセント相同性を決定するために典型的に使用されるパラメーターは、ギャップ・ペナルティ１２、ギャップ拡張（ｅｘｔｅｎｄ）ペナルティ４、およびフレームシフト・ギャップ・ペナルティ５を有するＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリング・マトリックスである。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、また、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０残基重量表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップ・ペナルティ４を用いて決定することができる。
【００６５】
ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、非哺乳動物または哺乳動物種に由来することができる。哺乳動物ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、例えば、ヒトに由来することができる。例示的な非ヒト哺乳動物は、非ヒト霊長類（例えば、サルまたは類人猿）、マウス、ラット、ヤギ、雌牛、雄牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、イノシシ、ラッコ、ネコおよびイヌを包含する。例示的な非哺乳動物種は、ニワトリ、七面鳥、エビ、ワニおよび魚を包含する。いくつかの哺乳動物および非哺乳動物種（例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、チンパンジーおよびニワトリを包含する）由来のＬＩＮＧＯ−１アミノ酸およびヌクレオチド配列は、当該分野で知られている（例えば、Ｍｉら、（２００５）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：７４５−７５１；Ｃａｒｉｍ−Ｔｏｄｄ，Ｌ．ら、（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（１２）：３１６７−３１８２；およびＯｋａｆｕｊｉら、（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ６（１）：５７−６２参照）。
【００６６】
薬剤は、例えば、化学化合物（例えば、ポリペプチド、核酸、ペプチド模倣物）であることができる。ペプチド模倣物は、ある特定の生理学的分子、例えば、タンパク質および核酸を認識するペプチドの能力を模倣することのできる化学化合物である。ある例において、ペプチド模倣物は、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣または拮抗することのできる非ペプチド性構造エレメントを包含する。例えば、切れやすいペプチド結合を１以上の切れ難いジペプチド等配電子体（isosteres）で置き換えることができる。
【００６７】
下記の実施例は例示であって、限定する目的ではない。
【実施例】
【００６８】
ＬＩＮＧＯ−１を結晶化し、その構造を決定した。ヒトＬＩＮＧＯ−１は、シグナル配列、ロイシン−リッチリピート様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ストークドメイン、膜貫通型ドメインおよび短い細胞質尾部を含有する６１４アミノ酸タンパク質である（Ｍｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８，２００４）。ヒトＬＩＮＧＯ−１の細胞外領域（ＬＲＲモチーフ、Ｉｇ−様ドメインおよびストーク領域を含み、シグナル配列を含まない）をそのＣ末端で、ヘキサヒスチジンタグに融合した（図１）。得られたＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６構築物は、ｐＳＭＥＧベクター（配列番号２）（図６および７Ａ−１ないし７Ａ−３）中、ネズミサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの後ろにサブクローン化した（Ｋ５４９は、３３アミノ酸シグナル配列を含む全長ヒトＬＩＮＧＯ−１構築物のアミノ酸位置２４９にて現れるリジンを示す。シグナル配列は、ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６ポリペプチドには存在しなかった）。哺乳動物チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養し、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中、３７℃で維持した。Ｌｅｃ３．２．８．１細胞のための細胞培養およびＤＮＡトランスフェクションは、Ｚｈｏｎｇら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７２３：１４３−１５０，２００５）に記載されている。Ｌｅｃ３．２．８．１（１０４２−５）におけるＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６構築物の安定なクローンは、抗ｈｉｓ４抗体でスクリーニングすることによって確立された。ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６のための馴化培地の大規模生産法は、以前に記載されたとおりであった（Ｚｈｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７２３：１４３−１５０，２００５）。
【００６９】
ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６を精製するために、融合タンパク質（図１）を発現している馴化ＣＨＯ培地を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌのバッファーと交換し、そこに、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを加えた（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪの完全阻害剤）。融合タンパク質を獲得するために、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化し、次いで培養培地に加え、２時間、バッチ結合（回転）させた。培養培地を除去するとすぐに、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂をカラム中にパックした。カラムをＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＨＰＬＣ）に連結し、４〜５カラム容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。タンパク質は、１２カラム容量の０％〜１００％５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾールの勾配で溶出された。収集したタンパク質フラクションを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中に透析した。結晶化のために、タンパク質をカルボキシペプチダーゼＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に、２５℃で１４〜１６時間インキュベートし、次いで、５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．１、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に透析した。透析後、タンパク質をＳＰセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷し、４〜５カラム容量の５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．１、５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。タンパク質は、１２カラム容量の０％〜１００％  ５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．１、７５ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。タンパク質ピークフラクションを収集し、５〜８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで、ＴＢＳで平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上に負荷した。タンパク質ピークフラクションを一緒にプールし、結晶化のために４〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。精製したタンパク質を完全にグリコシル化した。
【００７０】
ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６結晶は、１８℃でハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて得られた。回折性結晶を４ｍｇ／ｍＬのタンパク質を有するタンパク質溶液から成長させ、１．２〜１．４Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１Ｍクエン酸Ｎａ，ｐＨ５．０の溶液で沈澱させた。タンパク質を同一条件下、２つの形態で結晶化させ、両方の形態が同じ結晶滴において見出された。Ｉ２２２は、非対称単位あたり２分子を有し、７４％溶媒含量であり、Ｐ２１２１２は、非対称単位あたり４分子を有し、７３％溶媒含量であった。データ収集のために、結晶を母液から、２．９Ｍマロン酸ナトリウムを含有する安定化−凍結防止溶液（ｐＨ５．２）へ徐々に移した（Ｈｏｌｙｏａｋら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｄ５９：２３５６−２３５８，２００３）。該溶液中、結晶は数日間、ｐＨ範囲５〜７で安定であることが分かっているが、該溶液を結晶誘導体化に用いた。該結晶を５０ｍＭ  Ｋ２ＰｔＣｌ６および２．９Ｍマロン酸ナトリウム中、ｐＨ７．０で２４時間浸すことによって生成した白金誘導体から、異常散乱を用いる単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）法によって構造決定が可能な単一の誘導体を得た。データ収集の前に、全ての結晶を窒素流下１００Ｋにて、フラッシュ冷却した。
【００７１】
空間群Ｉ２２２の結晶から得られた２つのデータセット、３．５Ａネイティブ（native）データセットおよび白金誘導体に関する３．６Ａデータセット（どちらも、ＦＲ−Ｅ  Ｃｕ  Ｋα回転陽極（Ｒｉｇａｋｕ，Ｊａｐａｎ）上に据え付けたＳａｔｕｒｎ９２  ＣＣＤを用いて社内で測定された）を位相決定に用いた。より高い分解能のネイティブデータセットは、Ｐ２１２１２空間群に属する結晶から、ＳＥＲ−ＣＡＴのビームライン２２−ＩＤを用いる改良型光子源（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）（ＡＰＳ）（Ａｒｇｏｎｎｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）にて２．７Ａに収集された。全てのデータをＨＫＬ２０００で積分し、概算した（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６，１９９７）。
【００７２】
誘導体結晶における白金（Ｐｔ）原子の初期位置を、Ｃｕ  Ｋα−エッジにおけるＰｔ原子の異常分散差（anomalous differences）を用いて、ＳＨＥＬＸＤ（２００１，Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ，ＸＭ，Ｖｅｒ．６．１２；Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で位置決定した。インプットＳＡＳ係数は、ＸＰＲＥＰ（２００１  Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ，Ｖｅｒ．６．１２；Ｂｒｕｋｅｒ−ＡＸＳ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて準備された。ＳＯＬＯＭＯＮ（ＡｂｒａｈａｍｓおよびＬｅｓｌｉｅ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５２：３０−４２，１９９６）による重原子パラメーター、位相計算および密度修正の精密化は、ＳＨＡＲＰ（ｄｅ  Ｌａ  ＦｏｒｔｅｌｌｅおよびＢｒｉｃｏｇｎｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：４７２−４９４，１９９７）で２０〜３．６Ａ分解能にて、ネイティブおよび誘導体データセット由来の異常分散差および同形差の両方を用いて実施された。ＳＨＡＲＰを用いて作製される最終的に３．６Ａの異常散乱を用いる単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）地図は、解釈可能な質であり、非対称単位において２つのＬＩＮＧＯ−１分子を示した。ＳＨＡＲＰ位相は、さらに、２回（two-fold）非結晶学的対称性（ＮＣＳ）平均化およびＤＭにおける３．５Ａへの位相拡張によって改善された（ＣｏｗｔａｎおよびＭａｉｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ４９：１４８−１５７，１９９３）。得られた地図により、ＱＵＡＮＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、最初の９０％完全（〜８５５残基）モデルの構築が可能になった。次いで、該モデルをＰ２１２１２データセットでの分子置換に用いて、より高い２．７Ａ分解能データを利用した。非対称単位における４分子の透明溶液をＰＨＡＳＥＲで同定した（ＭｃＣｏｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６１：４５８−４６４，２００５）。Ｉ２２２およびＰ２１２１２結晶形態は、同じ四量体パッキングを有し、該四量体は、２回転軸の周りで二量体を折り曲げることによって構築することができる。その後の２．７Ａデータセットに対する再構築および精密化のラウンドは、結晶学的物体に向けられたツールキット（(Crystallographic Object)-Oriented Toolkit）（ＣＯＯＴ）（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓ．  Ｄ  ６０：２１２６−２１３２，２００４）およびＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ  ５３：２４０−２５５，１９９７）を用いて行った。
【００７３】
最終的なモデルは、４つのタンパク質分子（残基Ａ１−４７７、Ｂ３−４７５、Ｃ２−４７７およびＤ３−４７６）、３９個のＮ−アセチルグルコサミンおよび１２個のマンノース残基、および３１０個の水分子を含有する。Ｂ、ＣおよびＤのＮ末端での残基１−２、ＢおよびＤのＣ末端での残基４７６−４７７、および残基Ｄ３２−３４は、おそらく無秩序化のせいで、十分な電子密度がないために、該構造中にモデル化されなかった。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙで実施した最終的な精密化構造の幾何解析は、全残基の９４％を好ましい領域に配置し、アウトライアーとして０．１６％を配置する。データ収集、位相整合および精密化のための統計値を表１にまとめる。
【００７４】
表２は、空間群Ｐ２１２１２の結晶から推測される結晶構造座標を挙げる（表１参照）。空間群Ｉ２２２を有するネイティブおよび誘導体構造は、本質的に同じ構造を示し、位相整合を手助けするために用いられた。表２において、「＃」カラムは、座標が与えられた各原子の索引を示す。「ｎａｍｅ」カラムは、どのタイプの原子であるかを示し、「ｒｅｓ」カラムは、原子がどのタイプの残基に属するかを示す。「ｃｈａｉｎ」カラムは、原子がどのポリペプチドに属するかを示す。「Ｒｅｓ＃」カラムは、原子に関する残基番号を示す。例えば、原子番号１（表２における第１列）は、Ｔｈｒ１の窒素（Ｎ）である（配列番号１に示される配列にしたがう）。そのｘ、ｙおよびｚ構造座標は、各々、Ｘ、ＹおよびＺカラムに示される。頭に「ｏｃｃ」が付いたカラムは、原子に割り当てられた占有率を示し（１．００＝最大占有率）、「Ｂ」カラムは、（Ａ）２の単位におけるＢ因子（または温度因子）を提供する。「ｅｌｅｍｅｎｔ」と標識されたカラムは、原子の元素記号を挙げる。水は、「ＨＯＨ」で示される、「ＮＡＧ」および「ＭＡＮ」は、各々、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノース残基を示す。
【００７５】
【表１−１】
2009525346.tif 000003
【００７６】
【表１−２】
2009525346.tif 000004
【００７７】
【表１−３】
2009525346.tif 000005
【００７８】
ＬＩＮＧＯ−１（Ｉ２２２およびＰ２１２１２）の両方の結晶形態は、ゲル濾過データおよび動的光散乱測定値に一致した四量体構造を示し、それにより、ＬＩＮＧＯ−１が分子量〜２４０ｋＤａを有する溶液中で四量体として存在することを示した。図２は、精密化した２．７Ａ分解能構造の電子密度のフラグメントを示す。
【００７９】
一量体ＬＩＮＧＯ−１構造の全体図は、図３に示される。各一量体は、２つの別個のドメインから形成され、残基１−３８２はＮ末端ＬＲＲ−ドメインを構成し、残基３８３−４７７はＣ末端Ｉｇ−様ドメインを形成する。２つの構成ドメインの相対的配向は、一量体構造に、計り知れない形状を与える。
【００８０】
ＬＲＲ−ドメイン（残基１−３８２）は、平行した１５鎖のβシートをその内部凹面に有し、かつ、非常に不規則な第２構造をその外部凸面に有する長い弧形状を採用する（図３）。全体として、１２個のＬＲＲが存在し、２３〜２５残基毎に一緒に連続的な右巻きのスーパーヘリックス集合を創造する。各ＬＲＲは、β鎖で始まり、コンセンサスな２４残基配列反復モチーフ：
ｘＬ２ｘｘＬ５ｘＬ７ｘｘＮ１０ｘＬ１２ｘｘＬ１５ｘｘｘｘＦ２０ｘｘＬ２３ｘ（配列番号９）
［ここに、ｘは、いずれかのアミノ酸であり、Ｌは、疎水性残基であり、好ましくはＬｅｕであるが、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＴｈｒであってもよく、Ｎは天然ではあまり保存されておらず、主としてＡｓｎを包含するが、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、ＬｅｕまたはＴｒｐであってもよく、Ｆは、疎水性残基ＰｈｅまたはＬｅｕを示す］
を有する。示される位置のコンセンサスな残基は、ＬＲＲ−ドメインの内部を形成する。いくつかの他のＬＲＲタンパク質におけるように、ＬＲＲ疎水性コアのＮ−およびＣ−末端は、２つのＬＲＲキャップ、すなわち、「Ｎｃａｐ」および「Ｃｃａｐ」によって溶媒から保護されている（図３）。「Ｎｃａｐ」は、塩基（Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ９およびＣｙｓ７−Ｃｙｓ１８）に２つのジスルフィド架橋と共に２つの逆平行β鎖を有し、その配置はＮｏｇｏＲの構造に非常に似ている（Ｈｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１７７−１８５，２００３）。「Ｃｃａｐ」もまた、２つのジスルフィド架橋（Ｃｙｓ３３４−Ｃｙｓ３５７およびＣｙｓ３３６−Ｃｙｓ３８２）によって支持されており、ＮｏｇｏＲと同様に、１つのα−へリックスおよび３つの短い３１０−へリックスからなる特徴的なモチーフを有する。しかしながら、ＮｏｇｏＲの場合と異なり、ＬＩＮＧＯ−１における「Ｃｃａｐ」の内部は、ほとんど全て、フェニルアラニンクラスター（Ｐｈｅ３４２、Ｐｈｅ３５０、Ｐｈｅ３６２、Ｐｈｅ３６８、Ｐｈｅ３７１、Ｐｈｅ３８０由来の６個の芳香環、およびＴｙｒ３７９由来の１個の芳香環）で満たされている。さらに、α−へリックスの後の短いループセグメント（残基３４９−３５３）は、ＮｏｇｏＲとはわずかに異なる方法で、規範的なＬＲＲ構造中に組み込まれている。その結果、５残基ループの頂点がβシートから離れて凹面空間へ、少なくとも７．５Ａ突き出ているので、ＮｏｇｏＲにおける同じ長さの対応するセグメントよりも、突出性を示す。突出（bulge）ループは、血小板膜糖蛋白Ｇｐ１ｂαにおけるリガンド結合β−スイッチに相当するが（Ｈｕｉｚｉｎｇａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１７６−１１７９，２００２）、該突出ループの位置（図３）は、表面が露出した突出性の側鎖（ループの先端におけるＴｒｐ３４６、Ａｒｇ３４７、およびＡｓｎ３４９、Ａｓｎ３５１、Ｇｌｎ３５３、およびＡｒｇ３５２）の特徴と相俟って、リガンドとの相互作用のための有力な候補物質を示唆する。分子の静電表面（図４）は、Ｎ末端凸状側面に見出される１つの比較的大きな疎水性パッチを除き、ＬＲＲドメインの全ての側面における陽性および陰性パッチの顕著なセットを示す。
【００８１】
四量複合体の構造に基づいて、ＬＲＲドメインの凹状表面に位置するアミノ酸の５つのサブセットが候補リガンド結合部位であると決定された。すなわち、（１）Ｔｒｐ３４６およびＡｒｇ３５２；（２）Ｈｉｓ１８５、Ｈｉｓ２０９、およびＨｉｓ２３３；（３）Ａｓｐ１３；（４）Ｇｌｕ６０およびＧｌｕ６２；および（５）Ａｒｇ２０、Ａｒｇ２２、およびＡｒｇ４３である。同様に、ＬＲＲドメインの凸状表面に位置するアミノ酸の４つのサブセットが候補リガンド結合部位であると決定された。すなわち、（１）Ｔｙｒ１４２およびＨｉｓ１４５；（２）Ｌｅｕ９４、Ｌｅｕ１２０、およびＭｅｔ１２３；（８）Ｈｉｓ１７６；および（９）Ａｌａ２３８である。
【００８２】
ＬＲＲ−ドメインを完成後、該ポリペプチド鎖はコンパクトなＩｇ−様折り畳み（残基３８３−４７７）に侵入し、それは、１つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ４０７−Ｃｙｓ４５８）によって架橋された２つのβ−シートからなる古典的なβ−サンドウィッチを示す。４つのストランド（Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ）が１つのβ−シートを形成し、５つのストランド（Ａ’、Ｃ、Ｃ’、ＦおよびＧ）が第２のβ−シートを形成する。ＥおよびＦストランドを連結する１つの３１０α−ヘリックスターンが存在する。他のＩｇ−様構造との比較により、ＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇ−様ドメインの最も近い構造類似体が神経細胞接着分子ＮＣＡＭのＩｇ３−分子（Ｓｏｒｏｋａら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １０：１２９１−１３０１，２００３）であることが示され、２つの配列間の計算された同一性は〜３０％である。驚くべきことではないが、大部分のアミノ酸置換は、側鎖容量および／または表面極性を改変しているＩｇ−ドメイン表面で起こり、保存的アミノ酸のほとんどは構造のコアに位置し、折り畳みを満足させるために同等のコンホメーションを有する。表面静電電位は、ＡＢＤＥ−表面における陰性および陽性パッチの組み合わせである。対照的に、反対側のＡ’ＣＣ’ＦＧ−表面は、いくつかの極性正電荷残基によって取り囲まれた疎水性残基（Ａｌａ４１６、Ｌｅｕ４１８、Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、Ｌｅｕ４５７、Ｉｌｅ４５９、Ａｌａ４６１、Ａｌａ４６３）に非常に富む。
【００８３】
Ｉｇ−ドメイン配向は、該ドメインが凸状ＬＲＲ弧から離れて突き出るような向きであり、それにより、ＬＲＲ−ドメインの裏側に溶媒に露出された幅広い裂け目を作出し、肘角度は〜９０度である（図４）。裂け目の壁は、片方の側面がＬＲＲのＣ末端凸状表面によって形成されており（反復１０−１２およびＣｃａｐ）、もう片方の側面がＩｇ−ドメインのＡ’ＣＣ’ＦＧβ−シートによって形成されている。向かい合う表面は、比較的離れており、異なる特性を有する。凸状表面は、主として極性の帯電残基からできており、一方、向かい合うＩｇ−表面は、かなり平らであり、主に疎水性のアミノ酸（上記のような）と並んでいる。小さなドメイン間相互作用が肘の先端で起こり、ＦＧ−ループ上（Ａｌａ４６３、Ｇｌｙ４６４）およびＬＲＲのＣ末端部位上（Ｃｙｓ３３６、Ａｒｇ３３７およびＣｙｓ３８２）の残基間のファン・デル・ワールス接触を含む。注目すべきは、肘の先端でのジスルフィド結合Ｃｙｓ３３６−Ｃｙｓ３８２、およびドメイン間リンカーがないこと（Ａｒｇ３８３は、最初のβ−ストランドの最初の残基であって、ＡＢＤＥβ−シートの成分であるから）である。ドメイン間のかかる連結は、互いに相対的な２つの位置付けを束縛する。
【００８４】
四量複合体の構造に基づいて、Ｉｇドメイン上のアミノ酸の５つのサブセットが候補リガンド結合部位であると決定された。すなわち、（１）Ａｒｇ４４６およびＴｙｒ４４７；（２）Ａｒｇ４０８、Ｐｈｅ４３８、およびＡｓｐ４４０；（３）Ｐｈｅ３９６；および（４）Ｌｅｕ４２０、Ｌｅｕ４２６、およびＩｌｅ４５９である。
【００８５】
ＣＨＯ制限細胞におけるＬＩＮＧＯ−１の糖型は、主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２などの高マンノース型グリカンであると予想され、それは、発明者らの質量分光データと一致する。結晶化された糖蛋白は、８個の典型的なＮ−グリコシル化コンセンサス部位を含有する。それらのうち６個は、ＬＲＲ−ドメインに位置し（Ａｓｎ１０５、Ａｓｎ１６３、Ａｓｎ２２５、Ａｓｎ２３５、Ａｓｎ２５４、およびＡｓｎ３０２）、Ｉｇ−様ドメインに２つが位置する（Ａｓｎ４６６およびＡｓｎ４５３）。これらの部位のうち全てがドメイン表面に配置する。電子密度は、Ａｓｎ４６６部位を除くこれらの位置の全てで炭水化物部分に割り当てることができる。Ａｓｎ４６６部位の場合、表面に位置するが、下記および図５Ｂに示すように、対称性に関係するＬＩＮＧＯ−１パートナーで密接に包まれている。該蛋白質パッキングは、Ａｓｎ４６６でのグリコシル化のための余地を残さないので、Ａｓｎ４６６に連結されたＮ−グリカンは、結晶において観察されるＬＩＮＧＯ−１四量体化を妨げるであろう。残りの７つの部位のオリゴ糖は、図４において番号を付けた残基によって示されるように（ここに、＃１はＡｓｎ１０５に対応し、＃２はＡｓｎ１６３に、＃３はＡｓｎ２２５に、＃４はＡｓｎ２３５に、＃５はＡｓｎ２５４に、＃６はＡｓｎ３０２に、＃７はＡｓｎ４５３に対応する）、構造中に広がっている。ＬＲＲ−ドメインの４つの表面のうち、凸状外面だけが完全に炭水化物がなく、かかる知見は自己会合におけるその役割と一致する。凹状表面および２つの側面（各々、２つのＮ−グリカン結合部位を有する）は、炭水化物で大部分が覆われている。最後の炭水化物部分は、Ｃ末端に隣接し、分子間の接触面から離れているＩｇ−フェイスＡ’ＣＣ’ＦＧに位置する（図４）。
【００８６】
一般に、糖蛋白表面における広範囲なグリコシル化の存在は、リガンドとの相互作用に関するそれらの接近性を制限し、多くの場合、糖によって被覆されない表面は、リガンドが結合すると予測される場所である（Ｒｕｄｄら、ＪＭＢ２９３：３５１  ３６６，１９９９）。したがって、弧中心の右に２つの糖部分を有するＬＩＮＧＯ−１の凹状ＬＲＲ表面は、ＮｏｇｏＲまたはｐ７５のような大きいタンパク質パートナーを提供するのに主要な役割を果たすことができるとは考えられない。このことは、しばしばリガンドとの相互作用に凹状表面を利用する他のＬＲＲ−含有レセプターとは反対である（Ｂｅｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：５２８，２００３）。Ａｓｎ−結合型Ｎ−グリカンが直接リガンド結合に関与することを示唆する証拠がないので、ＬＩＮＧＯ−１グリコシル化が、非特異的タンパク質−タンパク質相互作用を防ぐ助けとなるか、またはその後のリガンド結合のための適当な足場を維持する助けとなる可能性もある。
【００８７】
結晶化、サイズ排除クロマトグラフィーおよび動的光散乱は全て、ＬＩＮＧＯ−１が結晶中および溶液中の両方において、四量体形態を採用することを示す。結晶中、ＬＩＮＧＯ−１の４つの独立したコピーは、相互に作用して、凝縮された四量体構造を構築する。疑似４回転軸は、大きな穴を中心に有する環様構造における４分子に関係する（〜４０Ａ直径；外環径〜９５Ａ；図５Ａ）。該配置は、各ＬＲＲ−ドメインのＮ末端凸状側面を隣接する分子のドメイン間の肘におき（図５Ｂ）、サイトカイン／レセプター結合モードを暗示する。後者の場合、２つの分子間の結合点は、３つの表面、すなわち、Ｎ末端曲線状反復１−６によって形成された１つ、および上記のように、Ｃ末端曲線状反復１１−１２によって形成された２つの肘表面、各々、「Ｃ−ｃａｐ」およびＡ’ＣＣ’ＦＧβ−ストランドによって提供される。したがって、４つのＬＲＲ−ドメインは、頭尾（head-to-tail）様式で環を連結し、対応するＩｇ−様モジュールは、ランディング・ギア（landing gear）様式で環の周囲から伸長する（図５Ｃ参照）。細胞表面に相対的な該幾何構造を適用するならば、タンパク質回転軸は、同じ方向を向いている、すなわち、細胞膜に向いている膜近接Ｃ末端を有する表面に対しおよそ垂直に位置するであろう。
【００８８】
各分子間接触面は、結合表面間のきっちりとした幾何学的対合、および相互作用の正確な立体化学的相補性を示す。各分子間接触面に埋もれた溶媒にアクセス可能な表面積は、比較的大きく、３つの個々の成分の合計で〜２４００（Ａ）２であり、これは、強い会合を示唆する。上記の証拠は、相互作用の多価性と組み合わせて、四量体における接触が単なる結晶の接触ではないことを示唆する。
【００８９】
表２．ＬＩＮＧＯ−１Ｋ５４９ｈｉｓ６ポリペプチドの構造座標（各々、配列番号５〜８）
【表２−１】
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【００９０】
【表２−２】
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【００９１】
【表２−３】
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【００９２】
【表２−４】
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【００９３】
【表２−５】
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【００９４】
【表２−６】
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【００９５】
【表２−７】
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【００９６】
【表２−８】
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【００９７】
【表２−９】
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【００９８】
【表２−１０】
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【００９９】
【表２−１１】
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【０１００】
【表２−１２】
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【０１０１】
【表２−１３】
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【０１０２】
【表２−１４】
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【０１０３】
【表２−１５】
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【０１０４】
【表２−１６】
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【０１０５】
【表２−１７】
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【０１０６】
【表２−１８】
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【０１０７】
【表２−１９】
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【０１０８】
【表２−２０】
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【０１０９】
【表２−２１】
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【０１１０】
【表２−２２】
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【０１１１】
【表２−２３】
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【０１１２】
【表２−２４】
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【０１１３】
【表２−２５】
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【０１１４】
【表２−２６】
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【０１１５】
【表２−２７】
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【０１１６】
【表２−２８】
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【０１１７】
【表２−２９】
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【０１１８】
【表２−３０】
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【０１１９】
【表２−３１】
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【０１２０】
【表２−３２】
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【０１２１】
【表２−３３】
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【０１２２】
【表２−３４】
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【０１２３】
【表２−３５】
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【０１２４】
【表２−３６】
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【０１２５】
【表２−３７】
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【０１２６】
【表２−３８】
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【０１２７】
【表２−３９】
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【０１２８】
【表２−４０】
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【０１２９】
【表２−４１】
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【０１３０】
【表２−４２】
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【０１３１】
【表２−４３】
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【０１３２】
【表２−４４】
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【０１３３】
【表２−４５】
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【０１３４】
【表２−４６】
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【０１３５】
【表２−４７】
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【０１３６】
【表２−４８】
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【０１３７】
【表２−４９】
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【０１３８】
【表２−５０】
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【０１３９】
【表２−５１】
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【０１４０】
【表２−５２】
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【０１４１】
【表２−５３】
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【０１４２】
【表２−５４】
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【０１４３】
【表２−５５】
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【０１４４】
【表２−５６】
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【０１４５】
【表２−５７】
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【０１４６】
【表２−５８】
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【０１４７】
【表２−５９】
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【０１４８】
【表２−６０】
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【０１４９】
【表２−６１】
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【０１５０】
【表２−６２】
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【０１５１】
【表２−６３】
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【０１５２】
【表２−６４】
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【０１５３】
【表２−６５】
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【０１５４】
【表２−６６】
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【０１５５】
【表２−６７】
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【０１５６】
【表２−６８】
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【０１５７】
【表２−６９】
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【０１５８】
【表２−７０】
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【０１５９】
【表２−７１】
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【０１６０】
【表２−７２】
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【０１６１】
【表２−７３】
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【０１６２】
【表２−７４】
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【０１６３】
【表２−７５】
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【０１６４】
【表２−７６】
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【０１６５】
【表２−７７】
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【０１６６】
【表２−７８】
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【０１６７】
【表２−７９】
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【０１６８】
【表２−８０】
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【０１６９】
【表２−８１】
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【０１７０】
【表２−８２】
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【０１７１】
【表２−８３】
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【０１７２】
【表２−８４】
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【０１７３】
【表２−８５】
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【０１７４】
【表２−８６】
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【０１７５】
【表２−８７】
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【０１７６】
【表２−８８】
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【０１７７】
【表２−８９】
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【０１７８】
【表２−９０】
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【０１７９】
【表２−９１】
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【０１８０】
【表２−９２】
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【０１８１】
【表２−９３】
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【０１８２】
【表２−９４】
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【０１８３】
【表２−９５】
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【０１８４】
【表２−９６】
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【０１８５】
【表２−９７】
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【０１８６】
【表２−９８】
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【０１８７】
【表２−９９】
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【０１８８】
【表２−１００】
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【０１８９】
【表２−１０１】
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【０１９０】
【表２−１０２】
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【０１９１】
【表２−１０３】
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【０１９２】
【表２−１０４】
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【０１９３】
【表２−１０５】
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【０１９４】
【表２−１０６】
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【０１９５】
【表２−１０７】
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【０１９６】
【表２−１０８】
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【０１９７】
【表２−１０９】
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【０１９８】
【表２−１１０】
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【０１９９】
【表２−１１１】
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【０２００】
【表２−１１２】
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【０２０１】
【表２−１１３】
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【０２０２】
【表２−１１４】
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【０２０３】
【表２−１１５】
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【０２０４】
【表２−１１６】
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【０２０５】
【表２−１１７】
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【０２０６】
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【表２−１１９】
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【表２−１２０】
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【０２０９】
【表２−１２１】
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【０２１０】
【表２−１２２】
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【表２−２０８】
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【表２−２０９】
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【表２−２１０】
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【０２９９】
【表２−２１１】
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【０３００】
【表２−２１２】
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【０３０１】
【表２−２１３】
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【０３０２】
【表２−２１４】
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【０３０３】
【表２−２１５】
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【０３０４】
【表２−２１６】
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【０３０５】
【表２−２１７】
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【０３０６】
【表２−２１８】
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【０３０７】
【表２−２１９】
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【０３０８】
【表２−２２０】
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【０３０９】
【表２−２２１】
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【表２−２２２】
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【０３１１】
【表２−２２３】
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【０３１２】
【表２−２２４】
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【表２−２２５】
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【表２−２２６】
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【０３１５】
【表２−２２７】
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【０３１６】
【表２−２２８】
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【表２−２２９】
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【表２−２３０】
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【表２−２３１】
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【０３２０】
【表２−２３２】
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【０３２１】
【表２−２３３】
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【表２−２３４】
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【表２−２３５】
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【０３２４】
【表２−２３６】
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【０３２５】
【表２−２３７】
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【０３２６】
【表２−２３８】
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【０３２７】
【表２−２３９】
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【０３２８】
【表２−２４０】
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【０３２９】
【表２−２４１】
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【０３３０】
【表２−２４２】
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【０３３１】
【表２−２４３】
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【０３３２】
【表２−２４４】
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【０３３３】
【表２−２４５】
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【０３３４】
【表２−２４６】
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【０３３５】
【表２−２４７】
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【０３３６】
【表２−２４８】
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【０３３７】
【表２−２４９】
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【０３３８】
【表２−２５０】
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【０３３９】
【表２−２５１】
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【０３４０】
【表２−２５２】
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【０３４１】
【表２−２５３】
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【０３４２】
【表２−２５４】
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【０３４３】
【表２−２５５】
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【０３４４】
【表２−２５６】
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【０３４５】
【表２−２５７】
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【０３４６】
【表２−２５８】
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【０３４７】
【表２−２５９】
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【０３４８】
【表２−２６０】
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【０３４９】
【表２−２６１】
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【０３５０】
【表２−２６２】
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【０３５１】
【表２−２６３】
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【０３５２】
【表２−２６４】
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【０３５３】
【表２−２６５】
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【０３５４】
【表２−２６６】
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【０３５５】
【表２−２６７】
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【０３５６】
【表２−２６８】
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【０３５７】
【表２−２６９】
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【０３５８】
【表２−２７０】
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【０３５９】
【表２−２７１】
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【０３６０】
【表２−２７２】
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【０３６１】
【表２−２７３】
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【０３６２】
【表２−２７４】
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【０３６３】
【表２−２７５】
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【０３６４】
【表２−２７６】
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【０３６５】
【表２−２７７】
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【０３６６】
【表２−２７８】
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【０３６７】
【表２−２７９】
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【０３６８】
【表２−２８０】
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【０３６９】
【表２−２８１】
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【０３７０】
【表２−２８２】
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【０３７１】
【表２−２８３】
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【０３７２】
【表２−２８４】
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【０３７３】
【表２−２８５】
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【０３７４】
【表２−２８６】
2009525346.tif 000291
【０３７５】
【表２−２８７】
2009525346.tif 000292
【０３７６】
【表２−２８８】
2009525346.tif 000293
【０３７７】
他の具体例を請求の範囲に示す。
【図面の簡単な説明】
【０３７８】
【図１】図１は、ヒスチジン−タグ付加されたＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸１−５１６および６−Ｈｉｓ−ｔａｇ）（配列番号１）である。結晶化に使用されるフラグメントに下線を付す。
【図２】図２は、精密化した２．７Ａ分解能ＬＩＮＧＯ−１構造の２ｆｏ−ｆｃ電子密度地図である（表１も参照）。
【図３】図３は、ＬＩＮＧＯ−１一量体のリボン図である。
【図４】図４は、ＬＩＮＧＯ−１一量体の空間を埋めたモデルである。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、ＬＩＮＧＯ−１結晶構造の四量体組織を示す構造図である。図５Ａは、四量体構造の上面図である。図５Ｂは、２つの一量体間で相互作用している表面を示す。図５Ｃは、四量体構造の側面図である。
【図６】図６は、ｐＳＭＥＧプラスミドの地図である。
【図７】図７Ａ−１〜７Ａ−３は、ｐＳＭＥＧプラスミドの配列を示す（配列番号２）。
【図８】図８Ａ−８Ｂは、ヒトＬＩＮＧＯ−１の全長アミノ酸およびヌクレオチド配列を示す（各々、配列番号３および４）。該コーディング配列は、配列番号４のヌクレオチド５３〜１９１５によってコード化される。
【図１】
2009525346.tif 000294
【図２】
2009525346.tif 000295
【図３】
2009525346.tif 000296
【図４】
2009525346.tif 000297
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2009525346.tif 000300
【図６】
2009525346.tif 000301
【図７Ａ−１】
2009525346.tif 000302
【図７Ａ−２】
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【図７Ａ−３】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
2009525346000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月1日(2008.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009525346000001.app
【国際調査報告】
2009525346.tif 000318
2009525346.tif 000319
2009525346.tif 000320
2009525346.tif 000321