(57)【要約】  ＤＮＡコンストラクトと宿主細胞との組合せを含めた新規生物を開示する。上記生物は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換するための単一炭素単位の供給を促進する酵素をコードするＤＮＡ配列を含む転写ユニット（例えばオペロン）を含む。例には、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、例えばＴ４  ｆｒｄ；セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばｇｌｙＡ；３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素遺伝子、例えばｓｅｒＡ；およびＴＨＦシンターゼ遺伝子、例えばＡＤＥ３が含まれる。上記生物は、ウリジンレベルの有意な低下を伴う、チミジンを産生する生物学的方法で使用される。
2009525738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡまたは増殖に必要なある種の染色体外ＤＮＡに対して、１つまたは複数の遺伝子改変を含む、培地中で増殖させた際にチミジンを産生できる生物であって、ｄＴＭＰに変換するためのｄＵＭＰに対する単一炭素単位の利用性を増大させる１つまたは複数の遺伝子改変の結果、ＵｄＲに代わってＴｄＲを優先的に生成するチミジン生合成経路をもたらす１つまたは複数の遺伝子改変を含むことを特徴とする生物。
【請求項２】
宿主株と、染色体外ＤＮＡを含む少なくとも１つのコンストラクトとを含む、請求項１に記載の生物。
【請求項３】
１つまたは複数のコンストラクトが失われた場合に、宿主生物がＤＮＡを作製できず、死滅するように、宿主株が安定化されている、請求項２に記載の生物。
【請求項４】
ヌクレオシドニリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．６）をコードする宿主株の遺伝子がノックアウトされているか、そうでない場合は不活性化または切除されている、請求項２に記載の生物。
【請求項５】
ＵｄＲに代わってＴｄＲを優先的に生成するチミジン生合成経路をもたらす１つまたは複数の遺伝子改変が、ＤＨＦからＣＨ２−ＴＨＦに到る葉酸サイクル経路に改変を含む、前記請求項のいずれかに記載の生物。
【請求項６】
遺伝子改変が、ＤＨＦからＴＨＦへの変換を促進する、請求項５に記載の生物。
【請求項７】
遺伝子改変が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＥＣ１．５．１．３）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項６に記載の生物。
【請求項８】
ジヒドロ葉酸還元酵素が、Ｔ偶数ファージのジヒドロ葉酸還元酵素である、請求項７に記載の生物。
【請求項９】
Ｔ偶数ファージがＴ４である、請求項８に記載の生物。
【請求項１０】
転写ユニットがｆｒｄ遺伝子である、請求項７から９のいずれかに記載の生物。
【請求項１１】
遺伝子改変が、ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換を促進する、請求項１から４のいずれかに記載の生物。
【請求項１２】
遺伝子改変が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．２．１）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項１１に記載の生物。
【請求項１３】
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼがｇｌｙＡによってコードされている、請求項１２に記載の生物。
【請求項１４】
遺伝子改変が、グリシン開裂酵素複合体を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項１１に記載の生物。
【請求項１５】
グリシン開裂酵素複合体がｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、およびｌｐｄによってコードされている、請求項１４に記載の生物。
【請求項１６】
遺伝子改変が、３−Ｐグリセリン酸からＬ−セリンへの変換を促進する、請求項１から４に記載の生物。
【請求項１７】
遺伝子改変が、３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．９５）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項１６に記載の生物。
【請求項１８】
３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素がｓｅｒＡによってコードされている、請求項１７に記載の生物。
【請求項１９】
遺伝子改変が、ホスホセリントランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５２）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項１６に記載の生物。
【請求項２０】
ホスホセリントランスアミナーゼがｓｅｒＣによってコードされている、請求項１９に記載の生物。
【請求項２１】
遺伝子改変が、ホスホセリンホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．３）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項１６に記載の生物。
【請求項２２】
ホスホセリンホスファターゼがｓｅｒＢによってコードされている、請求項２１に記載の生物。
【請求項２３】
遺伝子改変が、ギ酸からＣＨ２−ＴＨＦへの変換を促進する、請求項１から４のいずれかに記載の生物。
【請求項２４】
遺伝子改変が、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ（ＥＣ６．３．４．３）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項２３に記載の生物。
【請求項２５】
遺伝子改変が、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．４．９）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項２３に記載の生物。
【請求項２６】
遺伝子改変が、メチレンテトラヒドロ葉酸脱水素酵素（ＥＣ１．５．１．５）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項２３に記載の生物。
【請求項２７】
遺伝子改変が、ピルビン酸からギ酸への変換を促進する、請求項１から４のいずれかに記載の生物。
【請求項２８】
遺伝子改変が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＥＣ２．３．１．５４）を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項２７に記載の生物。
【請求項２９】
ピルビン酸ギ酸リアーゼがｐｆｌＢＡによってコードされている、請求項２８に記載の生物。
【請求項３０】
遺伝子改変が、ＴＨＦシンターゼ複合体を発現できる転写ユニットの導入を含む、請求項２３に記載の生物。
【請求項３１】
ＴＨＦシンターゼ複合体がＡＤＥ３である、請求項３０に記載の生物。
【請求項３２】
請求項８から１０、１１から１５、１６から２２、２３から２６、２７から２９または３０から３１のいずれかに記載の複数の遺伝子改変を含む、請求項１から４のいずれかに記載の生物。
【請求項３３】
チミジル酸シンターゼ遺伝子（ＥＣ２．１．１．４５；ＥＣ２．１．１．１４８）を発現できる転写ユニットをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の生物。
【請求項３４】
チミジル酸シンターゼ遺伝子がＴ４  ｔｄ、ｔｈｙＡまたはｔｈｙＸによってコードされている、請求項３３に記載の生物。
【請求項３５】
デオキシチミジル酸ホスホヒドロラーゼを発現できる転写ユニットをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の生物。
【請求項３６】
デオキシチミジル酸ホスホヒドロラーゼがｄＴＭＰアーゼ（ＴＭＰアーゼとも称する）である、請求項３５に記載の生物。
【請求項３７】
ＤＮＡまたは増殖に必要なある種の染色体外ＤＮＡに対して、１つまたは複数の遺伝子改変を含んだ生物を培地中で増殖させる工程を含む、チミジンを産生する方法であって、該生物は、ｄＴＭＰに変換するためのｄＵＭＰに対する単一炭素単位の利用性を増大させる１つまたは複数の遺伝子改変の結果、ＵｄＲに代わってＴｄＲを優先的に生成するチミジン生合成経路をもたらす、１つまたは複数の遺伝子改変を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
ＵｄＲ含量がＴｄＲ含量の５％未満である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
５ｍｇ／ｌ／時間／ｇ乾細胞重量を超える比生産速度でＴｄＲを産生する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１から３６のいずれかに記載の生物を含む培地。
【請求項４１】
請求項３７または３９に記載の方法に従って産生されたチミジンから製造されるジドブジン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチミジンの生物生産に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子操作された生体物質を利用する方法に関する。遺伝子操作されたその生体物質には、細菌などのチミジン産生生物、または１種もしく複数のＤＮＡコンストラクト、例えばプラスミドが含まれうる。それは、適した宿主細胞との組合せにおいて、適切な培地中で培養した場合、チミジンの生物生産をもたらすであろう。
【背景技術】
【０００２】
ピリミジンデオキシリボヌクレオシドのチミジンは医薬品中間体として有用である。それは、ジドブジンまたはアジドチミジンとしても知られているＡＺＴの化学合成にとりわけ重要である。これは、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）クラスの抗レトロウイルス薬であり、Ｒｅｔｒｏｖｉｒという商標で、ＨＩＶ感染症の治療に認可された最初の薬物であった。
【０００３】
ＨＩＶ／エイズは、通常、３種以上の抗レトロウイルス薬の組合せを用いて治療する（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１３：４３９−４７８、２００４年）。ＡＺＴは、併用療法の主要成分としての重要かつ広範な役割を有し、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ、Ｚｉｄｏｖｉｒ、Ｖｉｒｏ−Ｚ、Ａｖｉｒｏ−Ｚ、およびＺｉｄｏ−Ｈを含めた様々な商標で販売されている。
【０００４】
ＡＺＴは、ＮＲＴＩ薬物である３ＴＣ（ラミブジン）と併用した際にとりわけ価値が大きい。これらの２種の薬物は、ＣｏｍｂｉｖｉｒおよびＤｕｏｖｉｒという商標で、単一の丸薬に処方されて利用可能である。ＡＺＴ、３ＴＣ、およびアバカビルという３種のＮＲＴＩの組合せは、Ｔｒｉｚｉｖｉｒという商標で販売されている。ＡＺＴと併用される他のＮＲＴＩ薬物には、ジダノシン、エムトリシタビン、およびザルシタビンが含まれる。
【０００５】
ＡＺＴは、アンプレナビル、アタザナビル、インジナビル、リトナビル、およびサキナビルを含めたＨＩＶプロテアーゼ阻害剤薬との併用、ならびにデラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピンを含めた非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）との併用にも有用である。
【０００６】
ＡＺＴは、妊娠中の使用が認可されている唯一の抗ＨＩＶ薬である（Ｌｙａｌｌら、ＨＩＶ  Ｍｅｄ．２：３１４−３３４、２００１年）。１９９７年には、母子感染によって罹患したエイズによって約６０万人の小児が死亡した。妊娠最終三カ月間に摂取したＡＺＴは、ウイルス伝播の危険性を６７％低減しうる（ＭｉｔｃｈｌａおよびＳｈａｒｌａｎｄ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１：２３９−２４８、２０００年）。
【０００７】
発酵技法は、ＡＺＴ製造に必要な多量のチミジンを商用に調製するための、化学合成に代わる魅力的な代替手段である。発酵法は、抗生物質、アミノ酸、およびビタミンなどの生体分子を大規模かつ比較的低コストで生産する手段として工業的に定着している（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＭａｖｉｔｕｎａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版、米国ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）所在、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９１年）。
【０００８】
しかし、チミジンは通常、「遊離した」形態では天然に存在せず、一リン酸のチミジル酸として産生され、三リン酸としてＤＮＡに組み込まれる。生体系は、天然には有意な量のチミジンを産生せず、それゆえ、変異体または改変生物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）が必要である。
【０００９】
欧州特許第０３４４９３７号では、好気培養でのチミジン産生用に選択されたブレビバクテリウム属の株が開示されている。日本特許公報昭３９−１６３４５号も参照している。これは、チミジンを含有する多糖の発酵生産におけるバシラス・サチリスの突然変異株の使用を教示するものである。
【００１０】
米国特許第５２１３９７２号（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ）では、チミジンおよび２’−デオキシウリジンなどのピリミジンデオキシリボヌクレオシド（ＰｄＮ）を生産する方法が開示されている。この特許の全内容を参照により本明細書に組み込み、読者がそれを参照するように明確に示す。ＰｄＮ一リン酸をＰｄＮに変換するＰｄＮホスホヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列を組み込み、発現する、複製可能な微生物が教示されている。
【００１１】
より詳細には、同上のＭｃＣａｎｄｌｉｓｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎは、バシラス・サチリスバクテリオファージＰＢＳ１由来のデオキシチミジル酸ホスホヒドロラーゼ（ｄＴＭＰアーゼ）の発現を用いた、チミジンの生産に使用できる発酵法について記載している。この型の酵素は、天然で、チミジンの代わりに２’−デオキシウリジンまたは５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジンなどのＰｄＮをそれらのＤＮＡに組み込むバクテリオファージによって発現されることが見出されている。
【００１２】
米国特許第５２１３９７２号に記載のチミジン発酵では、チミジンが蓄積するように、チミジンを分解する酵素（チミジンホスホリラーゼおよびウリジンホスホリラーゼ）が変異によって除去されている。したがって、ｄＴＭＰアーゼ酵素の使用は、チミジン合成を可能にする経路を生成する助けとなる。しかし、ｄＴＭＰアーゼのみの発現では、商業的に実用的なレベルのチミジン生産が保証されない可能性がある。
【００１３】
国際公開第０１／０２５８０号では、ｄＴＭＰアーゼを発現する細胞によるチミジンの産生増大をもたらす改良が記載されている。この公開の全内容も参照により本明細書に組み込み、読者がそれを参照するように明確に示す。
【００１４】
しかし、生物学的に産生されるチミジンの製造における問題は、発酵法において、２’−デオキシウリジン（ＵｄＲ）が同時に産生されることにある。これら２種の分子は類似した特性を有し、構造は単一のメチル基が相違しており、後処理プロセス中の分離は困難かつ高価である。ＡＺＴ合成などの医薬用途では、ＵｄＲのレベルが低い高純度チミジンが必要となりうる。
【００１５】
発酵によって生物学的に産生されたチミジンが、現行の方法と比較して有意に低いレベルのＵｄＲを与えるならば、それによって、この物質を除去するために下流の精製を行う必要性が最小限となるか、またはなくなり、有益であろう。
【００１６】
有意に低いとは、発酵チミジン産物中における、ＵｄＲの（混入）レベルが２５％未満、より好ましくははるかに１０％未満、より好ましくははるかに５％未満、さらに４％、３％、および２％を経て、１％およびそれ未満のレベルまでを構成することを意味する。
【００１７】
理想的には、「高」レベルのチミジンを達成するべきである。チミジンのレベルは、「比生産速度」の値として示すことができ、その際、この尺度は、誘導の４〜６時間後に測定する。５ｍｇ  ＴｄＲ／ｌ／時間／ｇ乾細胞重量を超えるレベル、より特定すれば１０ｍｇ  ＴｄＲ／ｌ／時間／ｇ乾細胞重量を超えるレベル、より好ましくは、１５を超え、２０および２５を経た値の比生産速度が好ましい。
【００１８】
これらのレベルは、上述した低いレベルのＵｄＲで得られることが最も好ましく、それゆえ、例えば５％未満のＵｄＲを含有して、例えば５ｇ／ｌのＴｄＲ滴定濃度が得られるように、そうした数値を組み合わせることができる。
【００１９】
実際、国際公開第０１／０２５８０号に開示されている通り、宿主株ＣＭＧ２４５１でプラスミドｐＣＧ５３２を用いる従来技術の方法は、振とうフラスコ試験で、３４．５％という平均ＵｄＲ含量を産生する。そのような高レベルでは、ＵｄＲからチミジンを分離する後処理プロセスは困難かつ高価である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の一目的は、ＵｄＲの有意な同時産生を伴わずにチミジンを産生するように、チミジン産生生物を改変することである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「生物」という用語には、その染色体中にコードされているＤＮＡ（例えば、欧州特許第０３４４９３７号に開示の通り）またはそれを宿主とするＤＮＡ（例えば米国特許第５２１３９７２号および国際公開第０１／０２５８０号に開示の通り）の発現を介してチミジンを産生できる生物が含まれる。この宿主ＤＮＡは、例えば１または複数種のプラスミドなど、１または複数種のＤＮＡコンストラクトとして存在しうる。
【００２２】
特に、国際公開第０１／０２５８０号に開示されたコンストラクト／宿主の組合せと比較した際、産生されるチミジンの品質の改良を提供することが、一目的である。
【００２３】
コンストラクトを宿主細胞に導入し、その組合せを培養した際に、コンストラクトが存在しない場合には宿主が増殖できない、すなわち、コンストラクトが失われればその生物が死滅するように、コンストラクトに加えられる任意の遺伝子改変が安定であることを確実にすることが、別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
予想外なことに、チミジンの産生には重要な律速工程があり、それはｄＵＭＰからｄＴＭＰへの変換の近辺に存在するため、ｄＵＭＰは同時にＵｄＲの産生へと誘導しうることが見出された。この制限は、この変換反応を触媒する酵素であるチミジル酸シンターゼを単純に過剰発現することでは解除できない。しかし、即時供給できるドナーメチル基の供給源の利用性を確実にすることによって、本出願人は、混入しているＵｄＲのレベルを有意に低減させて（約３５％から５％未満まで、場合によっては１％未満まで）チミジンを産生できると判定した。
【００２５】
本発明の第１の態様によると、ＤＮＡまたは増殖に必要なある種の染色体外ＤＮＡに対して、１つまたは複数の遺伝子改変を含む、培地中で増殖させた際にチミジンを産生できる生物であって、ｄＵＭＰからｄＴＭＰに変換するための単一炭素単位の利用性を増大させる１つまたは複数の遺伝子改変の結果、ＵｄＲに代わってＴｄＲを優先的に生成するチミジン生合成経路をもたらす１つまたは複数の遺伝子改変を含むことを特徴とする生物が提供される。
【００２６】
上記１つまたは複数の改変は、チミジル酸シンターゼがｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換するのに利用可能な５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（ＣＨ２−ＴＨＦ）の量を増大させる改変であることが好ましい。ＣＨ２−ＴＨＦは、知られている両クラスのチミジル酸シンターゼ（ＥＣ２．１．１．４５およびＥＣ２．１．１．１４８）に共通の一炭素単位ドナーである。これら２種の酵素によって触媒される反応を図２で比較する。
【００２７】
多くの場合、ドナー分子のメチレン基をメチル基に還元するのに必要な水素原子は、ＣＨ２−ＴＨＦそれ自体によって提供され、それゆえ、ｄＵＭＰからｄＴＭＰへの変換は、ＣＨ２−ＴＨＦからジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）への同時変換を必要とする。この型の酵素は、ＥＣ２．１．１．４５と指定され、例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｈｙＡ遺伝子またはバクテリオファージＴ４のｔｄ遺伝子によってコードされている。
【００２８】
ＥＣ２．１．１．１４８に指定されており、例えば、ヘリコバクター・ピロリのｔｈｙＸ遺伝子によってコードされている、この酵素のもう一方の型では、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）などのフラビンヌクレオチドの還元型によって２原子の水素原子が提供される。この場合、チミジル酸シンターゼ反応において、ＣＨ２−ＴＨＦがテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）に、そしてＦＡＤＨ２がＦＡＤに変換される（Ｍｙｌｌｙｋａｌｌｉｏ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１０５−１０７、２００２年）。
【００２９】
通常、ＣＨ２−ＴＨＦは、ＴＨＦに一炭素単位を転移させることによって再生される。ＥＣ２．１．１．４５チミジル酸シンターゼを利用する生物では、最初の工程として、例えばイー・コリｆｏｌＡ遺伝子またはＴ４  ｆｒｄ遺伝子によって発現される、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＥＣ１．１．５．３）の作用によるＤＨＦからＴＨＦへの変換がなければならない。ＥＣ２．１．１．１４８型のチミジル酸シンターゼでは、この工程は必要ない。
【００３０】
ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦを生成する主要な代謝経路は、糖質代謝における中間体である３−ホスホグリセリン酸から開始して、アミノ酸であるセリンおよびグリシンを介する経路である。このセリン−グリシン−Ｃ１経路を図３に示す。最初に遂行される工程は、例えばイー・コリのｓｅｒＡ遺伝子によってコードされているホスホグリセリン酸脱水素酵素の作用による３−ホスホヒドロキシピルビン酸の生成である。
【００３１】
ＣＨ２−ＴＨＦはこの経路における２つの工程で生成される。第１は、例えばイー・コリｇｌｙＡの遺伝子によってコードされているセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの作用によるＬ−セリンからグリシンへの変換である。第２は、少なくとも４つの遺伝子の産物であるグリシン開裂酵素複合体によるグリシンから二酸化炭素およびアンモニアへの変換である。
【００３２】
多くの生物で、ＣＨ２−ＴＨＦは、図４に示す通り、炭素原子を得るのにギ酸を用いた３つの工程でもＴＨＦから生成することができる。ギ酸は、中心的な代謝中間体であるピルビン酸から得ることができる。真核生物では、必要とされる３種の酵素活性が、例えば酵母サッカロミセス・セレビジエのＡＤＥ３遺伝子にコードされている単一の３機能タンパク質に存在しうる。
【００３３】
チミジン産生生物における染色体または染色体外ＤＮＡの、ＣＨ２−ＴＨＦの利用性を促進する遺伝子改変は、ＵｄＲのレベルが有意に低減した、良い収率のチミジン産生をもたらした。この型の遺伝子改変は、米国特許第５２１３９７２号および国際公開第０１／０２５８０号に教示されている遺伝子操作を用いて、ＰｄＮの総産生が増大している場合、その結果生じうるＵｄＲの増大を逆に戻すのに使用することができ、それによって、ＵｄＲ不純物の許容できない増大をもたらさずに、歩留りの改善を可能にする。
【００３４】
必須ではないが、好ましくは上記生物は細菌であり、より好ましくはイー・コリである。しかし、従来技術文献に開示され、以前に同定されているブレビバクテリウム種およびバシラス種、ならびに他のチミジン産生生物、例えば細菌コリネバクテリウムまたは酵母を、記載の発明に従って選択および改変することができよう。チミジン産生生物において、ＣＨ２−ＴＨＦの利用性を増大させうる様々な方式があること、およびそれぞれの場合で最も有効な方式は、その生物の遺伝的背景に依存すると見込まれることが理解されよう。
【００３５】
上記生物は、好ましくは、例えばｔｄまたはｔｈｙＡ遺伝子によってコードされたチミジル酸シンターゼと、例えばｄＴＭＰアーゼの遺伝子によってコードされた、例えばデオキシチミジル酸ホスホヒドロラーゼなど、ｄＴＭＰからのチミジンの産生を引き起こす１つまたは複数の遺伝子とを過剰発現できる転写ユニット（染色体性のものでも染色体外のものでもよい）も含むであろう。
【００３６】
好ましい実施形態では、チミジル酸シンターゼが、ＤＨＦを生成するＥＣ２．１．１．４５型である場合、上記生物は、発現された場合にＤＨＦからＴＨＦへの変換を促進する遺伝子を含有する。これは、ｆｏｌＡまたはｆｒｄなどのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子でありうる。好ましいジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子は、バクテリオファージ遺伝子であり、より好ましくはＴ偶数ファージ遺伝子であり、最も好ましくはＴ４バクテリオファージ遺伝子ｆｒｄである。
【００３７】
上記ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子は、上記生物の染色体ＤＮＡに直接導入しても、次に上記生物がその宿主となりうるＤＮＡコンストラクトに組み入れてもよい。上記ＤＮＡコンストラクトは、プラスミド、ウイルス、トランスポゾン、またはミニクロモソームなどのベクターであることが好ましい。
【００３８】
上記ＤＮＡを宿主細胞に導入するのにＤＮＡコンストラクトを用いる場合、そのＤＮＡコンストラクトは、意図している宿主中で安定に維持されるように設計されていることを保証するのが好ましい。
【００３９】
特に好ましい実施形態および最良の形態では、上記生物は、国際公開第０１／０２５８０号に開示されたｐＣＧ５３２に由来するプラスミドｐＣＧ６０９を保持する、国際公開第０１／０２５８０号に開示されたＣＭＧ２４５１株に由来するイー・コリ宿主株ＣＭＧ２５７６である。それらの構成に関するより完全な詳細は、実施例３および４に示す。この組合せは、「非誘導」条件下で増殖中の宿主株内で上記プラスミドが維持されることが確実となるように２重に安定化されている。
【００４０】
上記ＴＭＰアーゼ遺伝子は、バクテリオファージラムダＰＬプロモーターに連結されて宿主染色体に挿入される。上記プラスミドは、それ自体のプロモーターの制御下にあるバクテリオファージラムダｃＩ８５７温度感受性リプレッサーを保持する。これは、国際公開第０１／０２５８０号に開示された宿主株の染色体から転移されたものである。上記プラスミドが失われた場合、リプレッサーが生成されず、ＴＭＰアーゼ遺伝子が発現され、それによって、ＴＭＰがチミジンに変換され、上記生物が死滅する。
【００４１】
染色体に位置するＴＭＰアーゼ遺伝子の同時不活性化を伴うプラスミド喪失は、無プラスミドの派生物の増殖を可能にするのに十分に頻繁な事象なので、この安定化機構は多くの世代にわたる増殖が必要である大規模培養での使用に不十分であると本出願人は判断した。増殖および生存に必須である遺伝子が染色体から除去され、プラスミドに再配置される第２の安定化機構を追加した。ＣＭＧ２５７６とｐＣＧ６０９との組合せでは、この遺伝子はＴｈｙＡであり、ラクトースプロモータ制御下となるように上記プラスミドにクローニングされている。
【００４２】
機能的なＴｈｙＡ遺伝子がなければ、細胞はＴＭＰを生成できず、したがって、ＤＮＡ合成のためのＴＴＰを生成できずに死滅する。遺伝子は容易に変異して機能を喪失しうるが、完全に欠失した遺伝子を再生するのははるかに困難であるので、この機構は特に有効である。さらに、この欠失酵素の産物は、機能細胞から出て、プラスミド保持の遺伝子を失った細胞に入ることによって「交差供給」され得ないリン酸化化合物である。
【００４３】
本発明の、より一般的な態様を示すために、必ずしも常に直接的に比較可能なものではないが、さらに別の例を詳細な説明に記載する。振とうフラスコテストデータには、しばしば、第２のプラスミド内の「試験遺伝子」の導入が含まれる。しかし、そのような多重プラスミド系に関しては、規模試験が行われておらず、大規模培養でのそれらの遺伝的安定性は測定されていない。
【００４４】
本発明の第２の態様によると、ＤＮＡまたは増殖に必要なある種の染色体外ＤＮＡに対して、１つまたは複数の遺伝子改変を含んだ生物を培地中で増殖させる工程を含む、チミジンを産生する方法であって、該生物は、ｄＴＭＰに変換するためのｄＵＭＰに対する単一炭素単位の利用性を増大させる１つまたは複数の遺伝子改変の結果、ＵｄＲに代わってＴｄＲを優先的に生成するチミジン生合成経路をもたらす、１つまたは複数の遺伝子改変を含むことを特徴とする方法が提供される。
【００４５】
ＵｄＲ含量は、チミジン含量の５％未満であることが好ましい。
【００４６】
チミジン含量は、比生産速度で、５ｍｇ  ＴｄＲ／ｌ／時間／ｇ乾細胞重量超であることが好ましく、７．５ｍｇ  ＴｄＲ／ｌ／時間／ｇ乾細胞重量超、１０を経て、２．５段階で２５ｍｇ  ＴｄＲ／ｌ／時間／ｇ乾細胞重量まで、またはそれを超えることがより好ましい。
【００４７】
本発明の第３の態様によると、本発明の生物の増殖およびチミジン産生を支持できる培地が提供される。
【００４８】
本発明のさらに別の態様によると、本発明の方法に従って産生されたチミジンから製造されるジドブジンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
第１の好ましい実施形態では、染色体外ＤＮＡとして、最も好ましくはプラスミドの形態で、遺伝子を間接的に生物に導入する（染色体に直接的に導入するのではなく）。好ましい遺伝子は、２’−デオキシウリジン（ＵｄＲ）に変換されるのとは対照的に、大部分のｄＵＭＰがｄＴＭＰにメチル化されるように、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）をチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）に変換するチミジル酸シンターゼ酵素（例えばＥＣ２．１．１．４５、ＥＣ２．１．１．１４８）に、即時供給メチル基を与えることを保証できる酵素を発現するものである。
【００５０】
この好ましい実施形態では、好ましいチミジル酸シンターゼ酵素は、ＥＣ２．１．１．４５型のものであり、好ましい遺伝子は、ジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）からテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）への変換を補助するものである。適した遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子である。これは、野生型または脱調節された細菌遺伝子でも、バクテリオファージ遺伝子でもよい。特定の好ましい遺伝子であり、かつ本発明を例示するのに使用されたものは、バクテリオファージＴ４のｆｒｄ遺伝子（Ｔ４  ｆｒｄ）である。
【００５１】
代替の実施形態では、ＴＨＦから５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（ＣＨ２−ＴＨＦ）への変換を補助するように遺伝子改変を行う。これらの遺伝子改変のすべては、ｄＵＭＰをＵｄＲに優先してｄＴＭＰに変換することを強制するという共通の目標を有する。
【００５２】
好ましい改変の代替として、またはそれとの組合せで働くことが示されている遺伝子改変には、以下のものが含まれる。
・ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換に直接的に作用する酵素に改変を加えること。そのような改変の１つは、Ｌ−セリンをグリシンに変換し、同時にＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換を触媒する酵素であるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現する遺伝子、例えばイー・コリのｇｌｙＡの導入である。さらに、そのような改変には、グリシンを二酸化炭素およびアンモニアに変換するのと同時にＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換を触媒するグリシン開裂酵素複合体の１つまたは複数の構成要素を発現する１つまたは複数の遺伝子、例えばイー・コリのｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰ、およびｌｐｄ遺伝子の導入が含まれるであろう。
・必要な一炭素単位を提供するのにギ酸を用いるＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換に直接的に作用する遺伝子改変を加えること。そのような改変の１つは、ホルミル−ＴＨＦシンターゼ、メテニル−ＴＨＦシクロヒドロラーゼ、およびＣＨ２−ＴＨＦ脱水素酵素を活性化する酵素を発現する１つまたは複数の遺伝子の導入である。一例は、これらの活性すべてを有する３機能タンパク質をコードする酵母ＡＤＥ３遺伝子であろう。さらに別の例は、ちょうどホルミル−ＴＨＦシンターゼのみをコードする遺伝子のイー・コリへの導入であろう。この場合、この変換に必要な他の酵素は既に存在している。
・ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換に作用する反応の基質利用性を増大させる遺伝子改変を加えること。そのような事例の１つは、糖質からＬ−セリンまで経路における最初の工程を触媒する３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を発現するイー・コリｓｅｒＡなどの遺伝子の導入を介した、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの基質としてのＬ−セリンの利用性の促進である。さらに別の例は、イー・コリのｓｅｒＣおよびｓｅｒＢなど、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸からのＬ−セリンの生成に関与するさらに後の酵素を発現する遺伝子の導入、または酵母ＡＤＥ３遺伝子によってコードされている酵素複合体へのギ酸の利用性を増大させる任意の遺伝子改変が含まれるであろう。
【００５３】
本発明のそれぞれの態様は、米国特許第５２１３９７２号および国際公開第０１／０２５８０号の両方の教示に優る顕著な進歩をもたらし、チミジンの商業的生産に使用するためのコンストラクトを含む改善されたＤＮＡコンストラクトおよび宿主細胞を提供する。それらは、他のチミジン産生生物の改変にも適用できる。
【００５４】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の記述から明らかとなろう。しかしこれらは、本発明の好ましい実施形態を代表し、例示のみを目的とするものであることを理解するべきである。本発明の趣旨および範囲に包含される様々な改変および変更は、当業者には明らかとなるであろう。
【００５５】
本発明のコンストラクトは、染色体性でもよく、またはより好ましくは、例えばベクター上に位置した、染色体外のものでもよい。
【００５６】
本発明のベクターには、プラスミド、ウイルス（ファージを含める）、トランスポゾン、およびミニクロモソームが含まれ、それはプラスミドであることが好ましい。
【００５７】
ベクターは、当業者に知られている任意の好都合な方法、例えばＰ１形質導入、エレクトロポレーションまたは形質転換に従って、宿主細胞内に導入することができる。
【００５８】
本発明で有用な適した宿主細胞には、真核生物（例えば真菌）および原核生物（例えば細菌）が含まれる。原核生物には、イー・コリ、サルモネラ、シュードモナス、ブレビバクテリウム、バシラス、ならびにその株および変異体が含まれる。
【００５９】
本発明のベクターは、調節エレメント（例えば、ラムダＰＬなどのプロモーター、オペレータ、アクチベーター、ラムダリプレッサーなどのリプレッサー、特に温度感受性変種、および／またはエンハンサー）、適切な終止配列、開始配列、およびリボソーム結合部位を含むことが好ましい。上記ベクターは、選択マーカーをさらに含みうる。別法では、調節エレメント（特にラムダレプレッサー）が宿主細胞染色体上に位置しうる。
【００６０】
本発明に従って改変された宿主細胞は、チミジンの商業的生産に特に有用である。本発明の特に有利な使用では、本発明（特に米国特許第５２１３９７２号または国際公開第０１／０２５８０号の教示と併せて）に従って改変されたプラスミドを含む（宿す、または組み込んでいる）イー・コリ宿主細胞がチミジンの商業的生産に使用されうる。したがって、本発明に従って改変された宿主細胞は、例えばＰＢＳ１に由来するｄＴＭＰアーゼと、米国特許第５２１３９７２号に教示されている変異、例えば、ｄｅｏＡ、ｔｄｋ−１、およびｕｄｐ−１と、国際公開第０１／０２５８０号に教示されているコンストラクトへのさらなる改良、例えば、Ｔ４  ｎｒｄＣＡＢ、Ｔ４  ｔｄ、ｄｃｄ、およびｕｄｋとをさらに含みうる。
【００６１】
国際公開第０１／０２５８０号に教示されている通り、通常は、発酵法を用いる。発酵法は、適した容器内に含有されている培地中に細胞を浸すものである。適切な条件下で培養した後、産生されたチミジンを採取し、必要な場合には、製薬グレードにまで標準プロトコールに従って精製する（濃縮する）。精製されたチミジンは、その後、薬物、例えば、ＡＺＴなどの医薬組成物の生産に使用されうる。
【００６２】
下記の図を参照して、例としてのみ、本発明を例示する。
【００６３】
詳細な説明
図１は、ＴＭＰアーゼ遺伝子が付加されているイー・コリＫ１２を一例として用いて、チミジン生合成経路および関連する遺伝学の複雑さを図示する。図の右下において、チミジンはＴｄＲであり、２’−デオキシウリジンはＵｄＲである。ＵｄＲは、単一メチル基の不在によってＴｄＲと化学的に相違している。これらの化合物相互の構造類似性によって、精製が困難かつ高価なものとなっている。本発明は、ＵｄＲの産生に代わって、ＴｄＲの優先的生成に影響を与える遺伝子改変を加えることに関する。
【００６４】
本出願人は、例えば、チミジル酸シンターゼ遺伝子（例えばｔｄ、ｔｈｙＡまたはｔｈｙＸ）からのチミジル酸シンターゼの発現によって触媒される、ｄＵＭＰからｄＴＭＰへのプロセス工程に、例えばＣＨ２−ＴＨＦとして、増加供給量の一炭素単位を供給することを保証することによって、ＵｄＲに対するＴｄＲのレベルを効果的に制御できると判定した。
【００６５】
これは主として、ｄＵＭＰからｄＴＭＰへの変換によって生成された使用済み一炭素ドナー分子が、ＣＨ２−ＴＨＦとして、その活性状態に迅速に再生するのを確実にすることによって実現する。図２は、チミジル酸シンターゼの２つの二者択一の機構を示す。それらの機構はそれぞれ、異なった使用済み一炭素ドナーを生成する。チミジル酸シンターゼが、例えばｔｈｙＡまたはｔｄ遺伝子によってコードされたＥＣ２．１．１．４５型のものである場合、使用済みドナーはＤＨＦである。上記酵素が、例えばｔｈｙＸ遺伝子によってコードされたＥＣ２．１．１．１４８型のものである場合、使用済みドナーはＴＨＦである。
【００６６】
ＣＨ２−ＴＨＦの直接的前駆体はＴＨＦであるので、ＥＣ２．１．１．４５チミジル酸シンターゼを用いる生物、例えばイー・コリでは、最初の工程はＤＨＦからＴＨＦへの変換でなければならないことが明らかであろう。実施例６に例示するように、この変換を触媒する酵素をコードするジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をそのような生物に導入することによって、本出願人は、混入しているＵｄＲのレベルを有意に低減させ、さらにチミジンの生産性を増大させることができた。
【００６７】
このアプローチは、米国特許第５２１３９７２号および／または国際公開第０１／０２５８０号によって教示された原則によるチミジン発酵工程の収率のさらなる改善を可能にする。以前なら、総ピリミジンデオキシリボヌクレオシドを増大させる遺伝子改変によって、主としてＵｄＲレベルが増大したと思われる場合に、実施例７によって例示されるように、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を導入することによって、いまではこの追加産物をＴｄＲへ誘導することができる。
【００６８】
実施例８では、このアプローチは、ジヒドロ葉酸還元酵素と、ＴｄＲ産生に必要な他のクローニングされた遺伝子とを保持するプラスミドコンストラクトが、その適切なイー・コリ宿主株中で安定に維持されることを確実にするために、さらなる改変と併用されている。これは、国際公開第０１／０２５８０号に教示されている従来技術の方法に優る現在最良の方式改良を代表するが、本発明から予測しうる改良の限界には全く達していない。
【００６９】
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の導入を介して、ＤＨＦからＴＨＦへの変換を増大させることは、チミジン産生生物におけるＣＨ２−ＴＨＦの再生に望ましい増大を生み出すために加えることのできる遺伝子改変の１つであることが、図２から明らかであろう。しかし、このアプローチは、ＥＣ２．１．１．１４８型のチミジル酸シンターゼを有する生物には適用できない。そのような場合、ＤＨＦからＴＨＦへの変換がＣＨ２−ＴＨＦの再生における律速工程ではないか、もはや律速工程とならない場合のように、ＵｄＲが低レベルとなるＴｄＲ産生の望ましい結果を実現するために適用しうる様々な代替または追加の遺伝子改変がある。
【００７０】
そのような代替の改変は、ＴＨＦがそれによってＣＨ２−ＴＨＦに生物学的に変換される経路、例えば図３に示すＬ−セリンおよびグリシンを介した経路または図４に示すギ酸を介した経路を考慮することによって明らかとなろう。様々な解決法を図５に要約する。概して、適した改変は、ＣＨ２−ＴＨＦの合成の総合的速度を増大させるもの、またはＴＨＦをＣＨ２−ＴＨＦに変換するための一炭素単位の供給速度を改善するものであろう。
【００７１】
本出願人は、これらのアプローチのいくつかの例を試験した。実施例９では、Ｌ−セリンからグリシンへの変換を介して、ＴＨＦをＣＨ２−ＴＨＦに変換できる酵素を過剰発現させる。実施例１０では、図３に示すセリン／グリシン経路への代謝産物の流入を増大させることによって、ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦに変換するための一炭素単位の供給を改善する目的で、別の酵素を過剰発現する。実施例１１および１２は、一炭素ドナーとしてギ酸を使用して、ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦに変換するための非天然の経路をイー・コリに導入する異なった方法を用いる。
【００７２】
それぞれの場合で、ｉ）ＵｄＲレベルの小幅な低減、ｉｉ）ＵｄＲの相対的増大のない、ＴｄＲの小幅な増大、またはｉｉｉ）両方の組合せのいずれかが起こる。実施例６、７、および８に示すジヒドロ葉酸還元酵素添加の効果と比較して、改善は比較的小さいが、それぞれの改善は、代替の、またはさらに改良されたチミジン産生生物においてはより顕著となりうるものであり、したがって本発明の妥当な一例であることが理解されよう。
【実施例】
【００７３】
実施例１（比較）
従来技術のコンストラクト／株
本発明の利点は、国際公開第０１／０２５８０号に開示された従来技術のコンストラクト／株を比較として用いて実証されるであろう。図６はｐＣＧ５３２コンストラクトを図示し、表１はイー・コリ宿主株ＣＭＧ２４５１の遺伝子型を示す。しかし、チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｄ、プラスミド上）およびＴＭＰアーゼ（染色体内に組み込まれている）の存在は本発明の好ましい実施形態に重要であるが、そこに開示された遺伝子のすべてが本発明の必須部分を形成しているわけではないことが理解されよう。
【００７４】
【表１】
2009525738.tif 000003
【００７５】
実施例２
チミジン産生の振とうフラスコ試験
実施例１で言及したコンストラクトおよび株を、以下の方法論に従って培地（表２）中で培養した。ＴｄＲ産生の速度とＵｄＲ不純物の相対量（ＴｄＲのパーセントとして表される）との両方に関する比較を目的としてデータを得た。
【００７６】
試験株１株あたり７〜１２本のフラスコを用いて、２５０ｍＬバッフル付き振とうフラスコ中ですべての実験を行った。１フラスコあたり２０ｍＬの培地に約２．５％容量を接種するために、ＬＢ培地中で増殖させた新鮮種培養を用いた。培養物は、ＯＤ６００ｎｍ＝５まで、３１℃で増殖させた。その後、フラスコを別のシェーカーに移動させることによって、温度を３５．７℃から３６．８℃に変化させた。温度誘導の４から６時間後に、試料を分析用に採取した。
【００７７】
【表２】
2009525738.tif 000004
【００７８】
培地はＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、その後、１２１℃で２５分間オートクレーブで処理した。冷却した後、必要に応じたオプションの抗生物質であるアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、クロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（１５ｍｇ／Ｌ）、およびテトラサイクリン（２５ｍｇ／Ｌ）と共に、ビオチン（最終濃度１ｍｇ／Ｌ）、チアミン（１０ｍｇ／Ｌ）、およびニコチン酸（１０ｍｇ／Ｌ）を添加した。結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2009525738.tif 000005
【００８０】
実施例３
ＣＭＧ２４５１からの改良宿主イー・コリ株ＣＭＧ２５７６の開発
下記表４に示す一連の工程を介して宿主株を改変した。全体として３つの顕著な変化があった。但し、これらのうちどれも本発明の必須部分を構成しないことが理解されよう。以下の実施例では、最終株のＣＭＧ２５７６と共に、中間株のＣＭＧ２５４９およびＣＭＧ２５６０も、本発明の態様を明らかにするために使用されている。
【００８１】
ＣＭＧ２５４９株は、挿入により不活性化されているｎｄｋ：：ｋａｎで染色体ｎｄｋ遺伝子が置換されていることによってノックアウトされている点でＣＭＧ２４５１と異なっている。この変化は、米国特許第５２１３９７２号によって教示された原則に従ってピリミジンヌクレオシドの総生産を改善するために加えられたものであり、実施例７に詳述する本発明の有用性の実証に重要である。
【００８２】
ＣＭＧ２５６０は、染色体からラムダプロファージを欠失させ、同時に、ビオチンおよびニコチン酸の要求性を引き起こす変異を修復することによって構築した。この変化は、ラムダｃＩ８５７温度感受性リプレッサーを保持するプラスミドの存在下で加えた。このリプレッサーがなければ、染色体に挿入されており、ラムダＰＬプロモーターから発現されるｄＴＭＰアーゼ遺伝子が活性化されるであろう。そして、その生物はｄＴＭＰを分解し、ＤＮＡを生成できずに、死滅するであろう。
【００８３】
最後に、ＣＭＧ２５７６は、挿入により不活性化されているｔｈｙＡ７４８：：Ｔｎ１０で染色体ｔｈｙＡ遺伝子が置換されている点でＣＭＧ２５６０と異なっている。この変化は、ラムダｃＩ８７５リプレッサーと、クローニングされたｔｈｙＡとの両方を保持するプラスミドの存在下で加えられた。プラスミドが有するｔｈｙＡ遺伝子がなければ、その生物は、ｄＴＭＰを合成できず、したがってＤＮＡを生成できず、死滅する。
【００８４】
染色体に位置するラムダリプレッサーを除去し、宿主ｔｈｙＡ遺伝子を不活性化させるために加えた変化の理由は実施例８に示す。
【００８５】
【表４】
2009525738.tif 000006
【００８６】
実施例４
ｐＣＧ５３２からの改良コンストラクトｐＣＧ６０９の開発
このコンストラクトは、下記に概略を示す一連の工程を介して改変した。
【００８７】
【化１】
2009525738.tif 000007
【００８８】
より詳細には、上記遺伝子は下記表５に示す通り由来した。プラスミドｐＣＧ５３２およびｐＣＧ６０９は、それぞれ図６および７によって図示されており、主な特徴は図中で比較することができる。
【００８９】
このコンストラクト加えられた３つの変化のうち、Ｔ４  ｆｒｄ遺伝子のみが本発明の一実施形態の必須部分を形成する。この改変の効果は、下記実施例６および７によって例示される。残りの変化は、下記実施例８に詳述する通り、宿主株からのプラスミドの喪失を防止するために加えられた。
【００９０】
【表５】
2009525738.tif 000008
【００９１】
実施例５
ｐＣＧ３７６からの試験コンストラクトの開発
確立されている宿主株／プラスミドの組合せに追加遺伝子を付加する効果を、第２のプラスミド上にこれらを導入することによって試験した。第２のプラスミドは、ｐＣＧ５３２およびその派生物と適合するように設計し、それによって両者を単一のイー・コリ宿主中で安定に維持しうる。ｐＣＧ５３２は、最終的には、天然プラスミドＣｏｌＥ１に由来する。ＣｏｌＥ１の詳細な歴史は国際公開第０１／０２５８０号に開示されている。第２のプラスミドは、クローニングベクターであるｐＡＣＹＣ１７７（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６、１９７８年）をベースにしたものである。ｐＡＣＹＣ１７７は天然プラスミドｐ１５Ａに由来し、ＣｏｌＥ１と適合性がある。
【００９２】
この系は、上記実施例４に記載の既に複雑なコンストラクトを改変する必要性なしに、遺伝子付加を試験できるという利点を有する。しかし、この系は、選択的抗生物質なしには不安定でありうると認識されており、したがって、工業的発酵法での大規模使用には適さない。
【００９３】
第２のプラスミドを用いて試験された遺伝子は、それらの全ヌクレオチド配列を報告している参考文献と共に表６に示す。すべてが、詳細に特徴付けられている遺伝子であり、標準プロトコールに従ったＰＣＲによってクローニングされた。それぞれが、第１のプラスミド上にクローニングされた遺伝子および宿主イー・コリ染色体に組み入れられたｄＴＭＰアーゼと共にｃＩ８５７温度感受性リプレッサーで制御できるように、バクテリオファージラムダＰＬプロモーターから発現された。
【００９４】
【表６】
2009525738.tif 000009
【００９５】
実施例６
クローニングされたＴ４  ｆｒｄ遺伝子を従来技術の宿主株／コンストラクトに付加することの効果
実施例４に記載のｐＣＧ５９０は、バクテリオファージＴ４からのｆｒｄ遺伝子が付加されている点のみで、従来技術のコンストラクトであるｐＣＧ５３２と異なっている。上記ｆｒｄ遺伝子はＴ４ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする。上記Ｔ４酵素は詳細に特徴付けられており、イー・コリで容易に発現される（Ｐｕｒｏｈｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：９１２１−９１２５、１９８１年）。
【００９６】
この遺伝子は、ラムダＰＬプロモーターから発現される「オペロン」に付加されており、したがって、温度が上昇し、ラムダｃＩ８５７リプレッサーが不活性化された際に、ｄＴＭＰアーゼ（染色体内）ならびにＴ４遺伝子ｎｒｄＣ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、およびｔｄ（プラスミド上）と共に誘導される。
【００９７】
実施例２に記載した方法を用いて、プラスミドｐＣＧ５９０を宿す従来技術の宿主株ＣＭＧ２４５１の振とうフラスコデータを取得し、その結果を、同一宿主および従来技術のプラスミドであるｐＣＧ５３２を用いて実施例２で得たものと比較した。結果を下記表７に示す。
【００９８】
【表７】
2009525738.tif 000010
【００９９】
明らかなことは、Ｔ４  ｆｒｄ遺伝子の付加によって、産生されたＵｄＲのレベルが大幅に低減され、それによって、発酵による実質的に純粋なＴｄＲの産生が単純化されたことである。ＵｄＲにではなく、ｄＵＭＰからｄＴＭＰへの、改良された変換は、ＵｄＲの低減と共に、追加のチミジンをもたらすべきであると予測され、この場合それは正しいようである。
【０１００】
実施例７
クローニングされたＴ４  ｆｒｄ遺伝子をｎｄｋ変異体宿主株に付加したことの効果
実施例３に記載の宿主株ＣＭＧ２５４９は、ヌクレオシドニリン酸キナーゼをコードするｎｄｋ遺伝子内の変異によって、従来技術の宿主株であるＣＭＧ２４５１と異なっている。この遺伝子の変異は、イー・コリでｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの細胞内プールを増大させると報告されている（Ｌｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３３７−３４１、１９９５年）。米国特許第５２１３９７２号に教示された原則によると、ピリミジンデオキシリボヌクレオシド生合成経路におけるそのような変異の導入は、適切に改変された生物におけるＴｄＲおよびＵｄＲの総合成量を増大させるのに使用できる。
【０１０１】
実施例２の方法を用いて、２株の宿主株、すなわちＣＭＧ２４５１およびＣＭＧ２５４９に関して、それぞれｐＣＧ５３２またはｐＣＧ５９０のいずれかと組み合わせて振とうフラスコデータを得た。このようにして、ｎｄｋ変異およびＴ４  ｆｒｄの付加の効果を、別々組合せの両方で比較した。結果を下記表８に示す。
【０１０２】
【表８】
2009525738.tif 000011
【０１０３】
驚いたことに、Ｔ４  ｆｒｄの付加は、ｎｄｋ変異を保持するイー・コリ宿主内に導入した場合、ＵｄＲレベルの低減にさらにより効果的になる。
【０１０４】
ｎｄｋ変異は、従来技術によるイー・コリ株のデオキシリボヌクレオシド合成能力を明確に増大させるが、純粋なチミジンの費用対効果に優れた産生で利用されるためのような改良にはＵｄＲ含量が高過ぎる。ｎｄｋ変異体によって産生された追加のｄＵＭＰは、本発明に従ってＣＨ２−ＴＨＦを適切に供給することによってｄＴＭＰへと誘導することができ、それによって、ＵｄＲに変換されるのではなくチミジンに変換される。結果は、チミジンの生産率と、ＵｄＲ含量の低さの両方に関して、従来技術に優る極めて実質的な改良となっている。
【０１０５】
実施例８
チミジン産生へのプラスミド安定化の効果
宿主株ＣＭＧ２４５１またはそのｎｄｋ変異体派生物であるＣＭＧ２５４９でｐＣＧ５９０を試験した際、本出願人は、この結果得られたイー・コリ株が培養されたときに、プラスミド喪失を観測した。この明らかな不安定性には、まず、ラムダファージｃＩ８５７温度感受性リプレッサーを染色体（宿主株ＣＭＧ２４５１およびその前駆体の中）からプラスミド（コンストラクトｐＣＧ５９６およびその派生物の中）へと再配置することによって対処した。
【０１０６】
３１℃以下の温度では、ｃＩ８５７リプレッサーは、ラムダＰＬプロモーターと共にクローニングされた、染色体に組み入れられているｄＴＭＰアーゼ遺伝子の発現を防止する作用をする。リプレッサーがプラスミド上に位置している場合、そのプラスミドの喪失は、ｄＴＭＰアーゼの発現と、その結果であるｄＴＭＰの分解とをもたらし、その結果、無プラスミド細胞の生存が失われる。この原則を用いて、実施例４に記載の通りｐＣＧ５９６を構築し、実施例３の通りに、その宿主株であるＣＭＧ２５６０を構築した。この結果得られた株であるＣＭＧ２５６０／ｐＣＧ５９６を実施例２の振とうフラスコプロトコールに従って試験したところ、表９に示す通り、ＣＭＧ２４５１／ｐＣＧ５９０株と比較して、チミジン合成速度の小幅な増大が観測された。
【０１０７】
しかし、本出願人は、この機構がプラスミドの喪失を防止するのに完全に有効であったわけではないと判断した。ｄＴＭＰアーゼ遺伝子を不活性化する同時変異を伴うプラスミド喪失は、生存可能な無プラスミド細胞の選択をもたらすことが発見された。プラスミドの安定保持を確実にするためには、追加または代替の機構が必要であった。
【０１０８】
ラクトースプロモータから発現されるイー・コリのｔｈｙＡ遺伝子がｐＣＧ５９６に付加され、ｐＣＧ６０９を形成した。その後、このプラスミドを宿す宿主株で、染色体ｔｈｙＡ遺伝子を除去することができた。ｔｈｙＡからのチミジル酸シンターゼの発現は、その細胞がｄＴＭＰを合成できる他の手段がないので、増殖および生存に必須である。ｄＴＭＰ自体は、細胞壁を通り抜けることができず、プラスミドを有するｔｈｙＡ＋細胞から、プラスミドを失ったｔｈｙＡ細胞に「交差供給」されない。遺伝子は容易に変異して酵素活性を不活性化しうるが、欠失した活性を再生するのははるかに困難であるので、必須遺伝子および交差供給されない代謝産物を用いたそのような機構は特に有効である。
【０１０９】
ｐＣＧ６０９の構築は実施例４に記載されており、ｔｈｙＡ−宿主株ＣＭＧ２５７６の構築は実施例３に記載されている。この結果得られた組合せである、ＣＭＧ２５７６／ｐＣＧ６０９株を、実施例２の振とうフラスコ発酵プロトコールに従って試験し、表９に示す通り、ＣＭＧ２５６０／ｐＣＧ５９６と比較して、チミジン生産率のさらなる小幅な増大が観測された。
【０１１０】
【表９】
2009525738.tif 000012
【０１１１】
これらの結果は、図９で、従来技術の株であるＣＭＧ２４５１／ｐＣＧ５３２およびそのｎｄｋ変異体派生物と比較されている。その生物を培養する際に安定に維持されると見込まれる形態で追加の遺伝物質を与えたときのチミジン収率の改善によって、ＵｄＲが低レベルとなるチミジン生産における本発明の利点が強化されることが見て取れる。
【０１１２】
実施例９
クローニングされたｇｌｙＡ遺伝子の付加の効果
この実施例は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするクローニングされたイー・コリｇｌｙＡ遺伝子を、従来技術のコンストラクトおよび宿主株に付加する効果を例示する。この酵素は、ＴＨＦからのＣＨ２−ＴＨＦの再生に共役した、セリンからグリシンへの変換を触媒する（図３を参照）。上記宿主株はｇｌｙＡ遺伝子を既に保持および発現すること、ならびにこの遺伝子改変の効果は、単純に、プラスミドが有する遺伝子が温度誘導中に発現された際に、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのレベルを高めることであることが認識されよう。
【０１１３】
ｇｌｙＡ遺伝子は、上記実施例５で論じた通り、ｐＣＧ５３２と適合性があるプラスミドベクターであるｐＣＧ３７６にクローニングされた。この結果得られたプラスミドｐＣＧ６０１は、ラムダＰＬプロモーターと共にｇｌｙＡ遺伝子を保持する。実施例２で記載の振とうフラスコ試験を用いて、ｐＣＧ５３２およびｐＣＧ６０１の両方を宿すＣＭＧ２４５１を、ｐＣＧ５３２のみを宿す従来技術のＣＭＧ２４５１と比較した。
【０１１４】
結果を表１０に示す。結果は、従来技術の宿主株およびコンストラクトにＴ４  ｆｒｄを付加したことの効果を示す実施例６に記載の結果と比較することができる。過剰発現されるｇｌｙＡ遺伝子の付加によって、ＵｄＲが有意に低減していることが明らかである。しかし、低減の程度は、Ｔ４  ｆｒｄで観測されたものにおよばず、ＴｄＲの有意の増大がなかった。
【０１１５】
【表１０】
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【０１１６】
本発明を実証するのに用いられたイー・コリ系に関しては、ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦへの変換速度ではなく、ＤＨＦからＴＨＦへの変換速度によって、ｄＵＭＰからｄＴＭＰに変換するためのＣＨ２−ＴＨＦの供給が制限されると結論することができた。これは、何故、ＵｄＲを低減するのに、Ｔ４  ｆｒｄがｇｌｙＡよりはるかに有効であるかを説明するであろう。しかし、本発明の目標を実現するための異なったアプローチの相対的有効性、すなわちチミジル酸シンターゼに利用可能なＣＨ２−ＴＨＦの供給量増大は、本発明を適用するチミジン産生生物の遺伝的背景に強く依存することが予測される。
【０１１７】
異なった、またはさらに別の追加の遺伝子および変異を有するイー・コリ株、ならびに他のチミジン産生生物では、ＣＨ２−ＴＨＦ合成の律速工程が他の場所でありうることが理解されよう。実際、米国特許第５２１３９７２号および国際公開第０１／０２５８０号に教示された原則に従って、チミジン産生生物の改良を続けたならば、律速工程がセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ反応に移行し、クローニングされたｇｌｙＡ遺伝子の付加は、本発明の原則に従ってチミジン中のＵｄＲのレベルを低減するのに、より劇的な利点を示しうる。
【０１１８】
実施例１０
クローニングされたｓｅｒＡ遺伝子の付加の効果
この実施例は、セリン−グリシン経路の酵素の発現を増強することによって、ＴＨＦからのＣＨ２−ＴＨＦの再生を改善することの効果を例示する（図３）。３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素は、イー・コリを含めた多くの生物におけるＣＨ２−ＴＨＦの主要な供給源となっているこの経路の最初の工程を触媒する酵素である。ＣＨ２−ＴＨＦは２つの連続した反応、すなわち、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによって触媒されるＬ−セリンからグリシンへの変換、ならびにグリシン開裂酵素複合体によって触媒されるグリシンから二酸化炭素および水への変換によって生成される。
【０１１９】
天然の３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素のレベルを増大させるために、実施例５で詳述した第２のプラスミド試験系を用いて、クローニングされたイー・コリｓｅｒＡ遺伝子を付加した。この新規の遺伝子改変の出発点は、ｎｄｋ変異、Ｔ４  ｆｒｄ遺伝子、および遺伝的に安定なコンストラクトを含めた最良の形態の宿主株およびコンストラクトであるＣＭＧ２５７６／ｐＣＧ６０９であった。ＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦを合成する能力を増大させることの利点は、ＤＨＦからＴＨＦに変換する能力が改善されているこのバックグランドで試験するのが最良であろうと推論された。
【０１２０】
実施例５で論じた通りに、ｓｅｒＡ遺伝子をプラスミドベクターｐＣＧ３７６にクローニングした。この結果得られたプラスミドｐＣＧ８４４は、ｓｅｒＡ遺伝子をラムダＰＬプロモーターと共に保持する。実施例２に記載の振とうフラスコ試験を用いて、ｐＣＧ３７６またはｐＣＧ８４４のいずれかと併せてｐＣＧ６０９を宿すＣＭＧ２５７６派生物を比較した。結果を表１１に示す。
【０１２１】
既に非常に低くなっているＵｄＲ対ＴｄＲの比率には明らかな変化はなかったが、ＴｄＲの産生速度にわずかな増大があった。実施例６によって例示されたＴ４  ｆｒｄ遺伝子の効果と比較して、この改善は比較的小幅なものである。しかし、より高いレベルのＵｄＲを産生する異なった遺伝的背景を有する生物では、過剰発現されるｓｅｒＡ遺伝子を付加することの効果が、より劇的となりうることが理解されよう。
【０１２２】
Ｌ−セリンの蓄積は、３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を阻害することが知られている。しかし、この実施例では、これが妥当しているとは思われない。しかし、これが妥当するとしたら、アミノ酸配列中の単一変化（ａｓｎ３４６からａｌａ）によって阻害が失われる（Ａｌ−Ｒａｂｉｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３２３５、１９９７年）ので、クローニングされたｓｅｒＡ遺伝子を改変することが好ましいであろう。
【０１２３】
【表１１】
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【０１２４】
実施例１１
クローニングされた酵母ＡＤＥ３遺伝子の付加の効果
この実施例は、ＣＨ２−ＴＨＦの再生を提供する追加の経路をチミジン産生生物に付加することの効果を例示する。本発明を例示するのに選択されたイー・コリ系では、必要な一炭素単位の供給源としてギ酸を用いたＣＨ２−ＴＨＦの再生は正常な代謝経路ではない。しかしこの機構は、酵母サッカロミセス・セレビジエを含めた原核生物には存在している。それらの生物では、この経路によってＴＨＦをＣＨ２−ＴＨＦに変換するのに必要な３種の酵素活性を発現する３機能タンパク質を単一遺伝子がコードしうる（図４参照）。
【０１２５】
本出願人は、Ｔ４  ｆｒｄを含有する遺伝学的に安定なコンストラクトとのそれらのｎｄｋ変異体イー・コリ宿主株の組合せに、この３機能タンパク質をコードする酵母由来のＡＤＥ３遺伝子を付加することの効果を試験した。実施例５に記載の通り、ＡＤＥ３をラムダＰＬプロモーターと共にｐＣＧ３７６にクローニングし、コンストラクトｐＣＧ８７０を作製した。
【０１２６】
実施例２のプロトコールを用いた振とうフラスコ発酵試験で、ｐＣＧ６０９のみ、またはｐＣＧ６０９およびｐＣＧ８７０の両方のいずれかを宿すＣＭＧ２５７６派生物を比較した。第２のプラスミドの効果の対照として、ｐＧＣ６０９およびベクターｐＣＧ３７６の両方を宿すＣＧＭ２５７６も試験に含めた。結果を下記表１２に示す。ＴｄＲ生産率への有意な効果はなかったが、ＵｄＲ含量は、既に非常に低いレベルからさらになお低減した。この実施例の遺伝的背景では利点が劇的でないが、異なった、またはさらに別の追加の遺伝子および変異を有するイー・コリ株、または実際、他のチミジン産生生物では、利点がよりよく実現されうることが理解されよう。
【０１２７】
イー・コリなどの原核生物では、ギ酸はＣＨ２−ＴＨＦのための一炭素単位の正常な供給源ではなく、したがって、最大の効果を有するためには、本発明のこの態様はさらなる遺伝子操作を必要としうることがさらに認識されよう。例えば、ＴＨＦをメチル化するためのギ酸の利用性を増大させるために、ピルビン酸からギ酸を生成するピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素を過剰発現することができるであろう（図５参照）。
【０１２８】
【表１２】
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【０１２９】
実施例１２
クローニングされたクロストリジウム・アシジウリシｆｈｓ遺伝子を付加することの効果
この実施例は、ギ酸を用いてＣＨ２−ＴＨＦを再生するイー・コリ経路に導入する代替機構を例示する。図４に示す通り、この反応を触媒するには３種の酵素が必要である。イー・コリは、これらの酵素の最初のものである、フォルミルテトラヒドロフォレートシンテターゼ（ＥＣ６．３．４．３）を欠失しているので、この経路を用いることができない。残りの２種の酵素は、ｆｏｌＤ遺伝子によってコードされている２機能性タンパク質として存在している。
【０１３０】
これら３種の酵素活性すべてをコードする酵母ＡＤＥ３遺伝子に代わる手段として、本出願人は、フォルミルテトラヒドロフォレートシンテターゼのみをコードするシー・アシジウリシｆｈｓ遺伝子をイー・コリのチミジン産生菌に導入し、ギ酸経路に必要な酵素のセットを完成させた。ＡＤＥ３の場合と同様に、第２のプラスミドベクターを用いて、宿主株ＣＭＧ２５７６およびコンストラクトｐＣＧ６０９という最良の形態の組合せで、この遺伝的変化を試験した。
【０１３１】
実施例５に記載の通り、ｆｈｓをラムダＰＬプロモーターと共にｐＣＧ３７６にクローニングし、コンストラクトｐＣＧ８８１を作製した。実施例２のプロトコールを用いた振とうフラスコ発酵試験で、ｐＣＧ８８１またはｐＣＧ３７６のいずれかと共にｐＣＧ６０９を宿すＣＭＧ２５７６派生物を比較した。結果を下記表１３に示す。
【０１３２】
上記ＡＤＥ３の実施例と比較して、この最良の形態の株およびコンストラクトにおける既に低レベルのＵｄＲは低減しなかった。しかし、ＴｄＲ生産率には明らかにわずかな増大があった。前の実施例と同様に、これは、異なった遺伝的背景を有するチミジン産生生物で、またはＴＨＦからＣＨ２−ＴＨＦに変換するためのギ酸の利用性に影響を与える他の変化と組み合わせて、よりよく実現されうる本発明の一態様であることが理解されよう。
【０１３３】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】チミジン生合成経路を示す図である。
【図２】チミジル酸シンターゼ反応（ｄＵＭＰからｄＴＭＰに変換する）を示す図である。
【図３】Ｌ−セリンおよびグリシンからのＣＨ２−ＴＨＦの再生を示す図である。
【図４】ギ酸からのＣＨ２−ＴＨＦの再生を示す図である。
【図５】ＣＨ２−ＴＨＦの再生を改良するアプローチの概要を示す図である。
【図６】プラスミドｐＣＧ５３２（従来技術の教示）のマップを示す図である。
【図７】プラスミドｐＣＧ６０９のマップを示す図である。
【図８】プラスミドｐＣＧ３７６のマップを示す図である。
【図９】いくつかの宿主／プラスミドにおけるチミジン産生を比較する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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