(57)【要約】本発明は、癌性疾患の診断及び治療、特にＣＤ４４の表面発現を実証している腫瘍細胞の細胞障害性の仲介に関し、とりわけ、細胞毒性反応を開始する手段として、場合により１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関する。本発明は、更に、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号２８０１０４−０６でＩＤＡＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体。 
【請求項２】
ヒト化されている、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
キメラ化されている、請求項１記載の抗体。 
【請求項４】
受入番号２８０１０４−０６でＩＤＡＣに寄託されている単離クローン。 
【請求項５】
ヒト腫瘍から選択される組織試料において癌性細胞の抗体誘発細胞障害活性を開始する方法であって、 
前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること； 
受入番号２８０１０４−０６でＩＤＡＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体又はその細胞障害活性誘発リガンド（ここでリガンドは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）を提供すること；及び 
前記単離モノクローナル抗体又はその細胞障害活性誘発リガンドと前記組織試料とを接触させること 
を含み、
前記単離モノクローナル抗体又はその細胞障害活性誘発リガンドと前記組織試料との接触が、細胞障害活性を誘発する 
方法。
【請求項６】
請求項１記載の単離モノクローナル抗体のリガンド。
【請求項７】
請求項２記載のヒト化抗体のリガンド。
【請求項８】
請求項３記載のキメラ化抗体のリガンド。 
【請求項９】
細胞毒性部分、酵素、放射性化合物及び血行性細胞からなる群より選択されるメンバーと結合する、請求項１、２、３、６、７又は８のいずれか１項記載の単離抗体又はリガンド。 
【請求項１０】
ヒト腫瘍が、受入番号２８０１０４−０６でＩＤＡＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体又はその細胞障害活性誘発リガンド（ここでリガンドは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原を発現する、哺乳動物において抗体誘発細胞障害活性に感受性のある前記ヒト腫瘍を治療する方法であって、前記哺乳動物に、前記モノクローナル抗体又は前記その細胞障害活性誘発リガンドの、細胞障害活性を誘発するのに有効な量を投与し、それによって前記哺乳動物の腫瘍量を低減することを含む方法。 
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体又はリガンドが細胞毒性部分に結合している、請求項１０記載の方法。 
【請求項１２】
前記細胞毒性部分が放射性同位体である、請求項１１記載の方法。 
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体又はリガンドが補体を活性化する、請求項１０記載の方法。 
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体又はリガンドが抗体依存性細胞障害活性を仲介する、請求項１０記載の方法。 
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１０記載の方法。 
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体がキメラ化されている、請求項１０記載の方法。 
【請求項１７】
モノクローナル抗体又はそのリガンドが、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２から得られる単離モノクローナル抗体と同じ、ヒトＣＤ４４のエピトープ又は複数のエピトープと反応し、前記モノクローナル抗体又はリガンドが、前記単離モノクローナル抗体とその標的ヒトＣＤ４４抗原との結合を競合的に阻害することによって特徴付けられる、ヒトＣＤ４４に特異的に結合することができる前記モノクローナル抗体又はリガンド。 
【請求項１８】
モノクローナル抗体のそのリガンドが、ＩＤＡＣ受入番号２８０１０４−０６を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８から得られる単離モノクローナル抗体と同じ、ヒトＣＤ４４のエピトープ又は複数のエピトープと反応し、前記モノクローナル抗体又はリガンドが、前記単離モノクローナル抗体とその標的ヒトＣＤ４４抗原との結合を競合的に阻害することによって特徴付けられる、ヒトＣＤ４４に特異的に結合することができる前記モノクローナル抗体又はリガンド。 
【請求項１９】
モノクローナル抗体のそのリガンドが、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２及びＩＤＡＣ受入番号２８０１０４−０６を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８からなる群より選択されるハイブリドーマから得られる単離モノクローナル抗体と同じ、ヒトＣＤ４４のエピトープ又は複数のエピトープと反応し、前記モノクローナル抗体又はリガンドが、前記単離モノクローナル抗体とその標的ヒトＣＤ４４抗原との結合を競合的に阻害することによって特徴付けられる、ヒトＣＤ４４に特異的に結合することができる前記モノクローナル抗体又はリガンド。 
【請求項２０】
ヒトＣＤ４４抗原を発現するヒト癌性腫瘍を治療する方法であって、 
前記ヒト癌を罹患する個人に、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２及びＩＤＡＣ受入番号２８０１０４−０６を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８からなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープ又は複数のエピトープを認識する、少なくとも１つのモノクローナル抗体又はリガンドを投与することを含み、 
前記エピトープ又は複数のエピトープの結合が、腫瘍量を低減することに有効である 
方法。
【請求項２１】
ヒトＣＤ４４抗原を発現するヒト癌性腫瘍を治療する方法であって、 
前記ヒト癌を罹患する個人に、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２及びＩＤＡＣ受入番号２８０１０４−０６を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８からなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープ又は複数のエピトープを認識する、少なくとも１つのモノクローナル抗体又はリガンドを、少なくとも１つの化学療法剤と一緒に投与することを含み、 
前記投与が腫瘍量を低減することに有効である 
方法。
【請求項２２】
ヒト腫瘍から選択される組織試料においてＣＤ４４のエピトープ又は複数のエピトープを発現する癌性細胞の存在を決定する結合アッセイであって、 
前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること； 
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２及びＩＤＡＣ受入番号２８０１０４−０６を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８からなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープ又は複数のエピトープを認識する、少なくとも１つのモノクローナル抗体又はリガンドを提供すること； 
前記少なくとも１つのモノクローナル抗体又はそのリガンドと前記組織試料とを接触させること；及び 
前記少なくとも１つのモノクローナル抗体又はそのリガンドと前記組織試料との結合を決定すること 
を含み、
それによって、前記組織試料において前記癌性細胞の存在が示される 
アッセイ。
【請求項２３】
ＣＤ４４と、受入番号ＰＴＡ−４６２１でＡＴＣＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、モノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンド。 
【請求項２４】
ヒト腫瘍から選択される組織試料において癌性細胞の抗体誘発細胞障害活性を開始する方法であって、 
前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること； 
ＣＤ４４と、受入番号ＰＴＡ−４６２１でＡＴＣＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、モノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドを提供すること；及び 
前記モノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドと前記組織試料とを接触させること 
を含む方法。
【請求項２５】
ヒト腫瘍がＣＤ４４を発現する、抗体誘発細胞障害活性に感受性のある前記ヒト腫瘍を治療する方法であって、 
ＣＤ４４と、受入番号ＰＴＡ−４６２１でＡＴＣＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、モノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドの、細胞障害活性を誘発するのに有効な量を投与し、それによって前記哺乳動物の腫瘍量を低減することを含む方法。 
【請求項２６】
ヒトＣＤ４４抗原を発現するヒト癌性腫瘍を治療する方法であって、 
前記ヒト癌に罹患している個人に、ＣＤ４４と、受入番号ＰＴＡ−４６２１でＡＴＣＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、少なくとも１つのモノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドを投与することを含み、 
前記抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドの結合が、腫瘍量を低減することに有効である 
方法。
【請求項２７】
ヒトＣＤ４４抗原を発現するヒト癌性腫瘍を治療する方法であって、 
前記ヒト癌に罹患している個人に、ＣＤ４４と、受入番号ＰＴＡ−４６２１でＡＴＣＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、少なくとも１つのモノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドを投与することを含み、 
前記抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドの前記投与が、腫瘍量を低減することに有効である 
方法。
【請求項２８】
ヒト腫瘍から選択される組織試料においてＣＤ４４抗原を発現する癌性細胞の存在を決定する結合アッセイであって、 
前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること； 
ＣＤ４４と、受入番号ＰＴＡ−４６２１でＡＴＣＣに寄託されているクローンによりコードされる単離モノクローナル抗体との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、少なくとも１つのモノクローナル抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドを提供すること； 
前記少なくとも１つの抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドと前記組織試料とを接触させること；及び 
前記少なくとも１つの抗ＣＤ４４キメラ抗体又はそのリガンドと前記組織試料との結合を決定すること 
を含み、
それによって、前記組織試料において前記癌性細胞の存在が示される
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患の診断及び治療、特に腫瘍細胞の細胞障害性の仲介に関し、とりわけ、細胞毒性反応を開始する手段として、場合により１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関する。本発明は、更に、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌におけるＤＣ４４：ヒト白血球に対してモノクローナル抗体を生じることは、広範囲の正常組織及び全種類の造血細胞に発現する単鎖ヒアルロン酸（ＨＡ）結合糖タンパク質であるＣＤ４４抗原の発見をもたらした。これは、元々、リンパ球活性化及びホーミングに関連していた。現在、その推定される生理学的役割には、炎症性遺伝子の活性化、細胞周期の調節、細胞繁殖の誘発、分化及び発生の誘発、細胞骨格再構築の誘発、細胞移動、並びにアポトーシスに対する細胞生存／抵抗性も含まれる。
【０００３】
ヒトにおいて、ＣＤ４４の単一遺伝子コピーは、染色体１１，１１ｐ１３の短腕に位置している。遺伝子は、１９個のエクソンを含み、最初の５個は定常性であり、次の９個は変異性であり、続く３個は定常性であり、そして最後の２個は変異性である。差次的スプライシングによって、１０００個を超す異なるアイソフォームをもたらすことができる。しかし、現在、僅か数十個の天然の変種が同定されているにすぎない。
【０００４】
ＣＤ４４標準糖タンパク質は、Ｎ末端細胞外（２０ａ．ａ．リーダー配列及び膜近位領域（８５ａ．ａ．）を含む）ドメイン（２７０ａ．ａ．）、膜貫通領域（２１ａ．ａ．）、細胞質末端（７２ａ．ａ．）から構成される。細胞外領域は、また、Ｎ末端にリンクモジュールを含む。この領域は長さが９２ａ．ａ．であり、他のＨＡ結合リンクタンパク質に相同性を示す。マウスとヒト形態のＣＤ４４との間に高い相同性が存在する。タンパク質の変種形態が、エクソン５のカルボキシ末端に挿入されており、発現するときには細胞外に位置する。 
【０００５】
ＣＤ４４の血清可溶性形態も天然に生じ、終止コドン（可変部領域内）から又はタンパク質分解活性から生じることができる。ＴＮＦ−αを含む多様な刺激からの細胞の活性化は、ＣＤ４４レセプターの分断をもたらす。レセプターの分断は、腫瘍細胞においても見られ、ＣＤ４４の１０倍までのヒト血清濃度の増加をもたらすことができる。高ＣＤ４４血清濃度は悪性を示唆する（卵巣癌は例外である）。
【０００６】
ＣＤ４４の標準形態は、およそ３７ｋＤの分子量で存在する。翻訳後修飾は、分子量を８９〜９０ｋＤに増加する。これらの修飾には、アスパラギン残基でのアミノ末端細胞外ドメインＮ結合グリコシル化、細胞外ドメインのカルボキシ末端でのセリン／トレオニン残基におけるＯ結合グリコシル化、及びグリコサミノグリカン付加が含まれる。スプライス変種は、サイズが８０〜２５０ｋＤの範囲であることができる。 
【０００７】
哺乳動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置する多糖類であるＨＡは、主要なＣＤ４４リガンドであると考えられる。しかし、ＣＤ４４は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどのようなタンパク質に結合することも見出されている。ＨＡ結合とグリコシル化との間に相関関係があると思われる。不活性ＣＤ４４（ＨＡに結合しない）は、最も高いグリコシル化レベルを有し、活性ＣＤ４４（ＨＡに結合する）は、最も低いグリコシル化レベルを有し、一方、誘発性ＣＤ４４（サイトカイン、モノクローナル抗体、成長因子などで活性化されなければＨＡに結合しないか又は弱く結合する）は、活性及び不活性形態の間のいずれかのグリコシル化レベルを有する。
【０００８】
ＣＤ４４は、細胞、刺激及び環境の相互作用に依存するシグナル伝達経路を介して、その機能の幾つかを仲介することができる。これらの経路のうちの幾つかには、ＮＦκＢシグナリングカスケード（炎症性反応を伴う）、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達経路（細胞周期及び繁殖の活性化を伴う）、タンパク質のＲｈｏファミリー（細胞骨格再構築及び細胞移動を伴う）、並びにＰＩ３−Ｋ関連シグナリング経路（細胞生存に関わる）が含まれる。上記の機能は、全て、腫瘍疾患の開始及び進行に密接に関連している。ＣＤ４４は、また、多様な追加的な機構を通して癌において役割を果たすことに関わってきた。これらには、悪性に関与するレセプターに対して、ＣＤ４４の細胞表面に存在する細胞表面プロテオグリカンにより成長因子、ケモカイン及びサイトカインを提示することが含まれる。また、ＣＤ４４−ＨＡ複合体の内部移行後のリソソームヒアルロニダーゼによるＨＡの細胞内崩壊が、ＥＣＭを介した腫瘍の侵襲性及び血管形成誘発の可能性を潜在的に増大しうる。加えて、生存又はアポトーシスシグナルの伝達は、標準又は変異ＣＤ４４レセプターのいずれかを介して生じることが示されている。ＣＤ４４は、また、細胞分化及び移動に関わることが示唆されている。これらの機構の全てではないが多くが環境及び細胞依存性であり、幾つかは異なる知見で生じている。したがって、何らかの結論が引き出せるまで更なる研究が必要である。
【０００９】
癌におけるＣＤ４４の潜在的な機能的役割を確認するため、レセプターの異なる発現が疾患進行と相関関係があるかを決定する、ＣＤ４４の発現研究が実施された。しかし、一貫しない知見が大多数の腫瘍型において観察され、これは、おそらく、研究者の間での試薬、技術、病理学的スコアリング及び細胞型の違いの組み合わせに起因する。腎細胞癌及び非ホジキンリンパ腫は、一貫して高ＣＤ４４発現腫瘍を有する患者が、低又は非ＣＤ４４発現の対応者よりも生存期間が短い点において例外であると思われる。
【００１０】
この癌との関連性のために、ＣＤ４４は、抗癌治療の開発の標的となってきた。ＣＤ４４の標準又は変種形態が腫瘍進行にとって必要であるかは、依然として議論の的である。両方の見解を支持するインビボ動物データが存在し、この場合でも、腫瘍型、さらには細胞型に依存しうる。異なる治療手法には、可溶性ＣＤ４４タンパク質、ヒアルロナンシンターゼｃＤＮＡ、ヒアルロニダーゼの注射、ＣＤ４４アンチセンス及びＣＤ４４特異性抗体の使用が含まれていた。それぞれの手法は、ある程度の成功をもたらし、それにより抗ＣＤ４４癌治療への支持を提供した。
【００１１】
変種と標準の両方のＣＤ４４特異性モノクローナル抗体が実験的に生成されたが、大部分は、これらの抗体は固有の生物学的活性を有さず、むしろ、認識するＣＤ４４の型に特異的に結合する。しかし、幾つかはインビトロ又はインビボのいずれかで活性であるが、一般には、両方において活性ではない。幾つかの抗ＣＤ４４抗体は、細胞事情を仲介することが示されている。例えば、ヒト赤血球リュテラン抗原ＣＤ４４標準形態に対して向けられているネズミ抗体Ａ３Ｄ８は、ＣＤ２（９−１抗体）及びＣＤ３（ＯＫＴ３抗体）仲介Ｔ細胞活性化を向上させることが示され、別の抗ＣＤ４４抗体も同様の効果を有した。Ａ３Ｄ８は、また、単球からのＩＬ−１放出及びＴリンパ球からのＩＬ−２放出を誘発した。興味深いことに、ダウノルビシン、ミトキサントロン及びエトポシドのような薬剤と一緒にＡ３Ｄ８を使用することは、第二メッセンジャーセラミドの生成を抑止して、ＨＬ６０及びＮＢ４ＡＭＬにおけるアポトーシス誘発を阻害した。固有の活性を有さず、かつＣＤ４４の同様のエピトープに対して向けられているＪ１７３抗体は、薬剤誘発アポトーシスを阻害しなかった。８５〜１１０ｋＤ及び２００ｋＤ形態のＣＤ４４に対して向けられているＮＩＨ４４−１抗体は、筆者たちがＣＤ４４の架橋又は凝集によると推測している経路を介してＴ細胞繁殖を増大した。まとめると、癌に対して向けられてなく（例えば、リンパ球を活性化する）、細胞繁殖を誘発し、又は細胞毒性剤と使用すると癌細胞の薬剤誘発死を阻害するので、これらのような抗体が癌治療としての使用に適しているという証拠がない。 
【００１２】
インビボで抗腫瘍効果を実証する幾つかの抗ＣＤ４４抗体が記載されている。ＣＤ４４のｖ６変種に向けられているマウスＩｇＧ１である抗体１．１ＡＳＭＬは、リンパ節を減少し、ラット膵臓腺癌ＢＳｐ７３ＡＳＭＬの肺転移を減少することが示されている。処置動物の生存が同時に増加した。抗体は、リンパ節コロニー形成の前に投与された場合にのみ有効であり、リンパ節における細胞繁殖を妨げると仮定された。インビトロにおける腫瘍細胞に対して直接的な細胞障害性はなく、抗体は、補体仲介細胞障害性又は免疫エフェクター細胞機能を向上させなかった。ヒト細胞に対する抗体の有用性は記載されなかった。 
【００１３】
Ｂｒｅｙｅｒらは、ＣＤ４４に対して市販の抗体を使用して、正所移植ラットグリア芽細胞腫の進行を妨害することを記載した。ラットグリア芽細胞腫細胞株Ｃ６を前頭葉に移植し、１週間後、ラットに大脳内注射で抗体による３つの処置を与えた。処置ラットは、腫瘍増殖の減少、及び緩衝剤又はアイソタイプ対照処置ラットよりも多い体重を示した。抗体は、細胞外マトリックス成分で被覆されたカバーガラスへの細胞のインビトロでの接着を阻害することができたが、細胞に対して直接的な細胞毒性効果を有さなかった。この抗体は、ヒト細胞に対して試験されなかった。
【００１４】
ＣＤ４４ｓ（ＩＭ−７．８．１）に対する抗体と、ＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）に対する抗体の効能を比較した研究が実施された。両方のＣＤ４４アイソフォームを発現する転移性の高いネズミ黒色腫株Ｂ１６Ｆ１０を、マウスに静脈内移植した。２日後、抗体を試験の期間中３日目毎に与えた。両方の抗体は、肺転移の数に５０％を超える有意な低減を引き起こし、２つの抗体の間で効能に有意な差はなかった。抗体は、インビトロで繁殖に影響を与えず、著者たち、Ｚａｗａｄｚｋｉらは、腫瘍増殖の阻害は、抗体がＣＤ４４とそのリガンドとの相互作用を遮断したためであると推測した。ＩＭ−７．８．１を使用する別の研究では、Ｚａｗａｄｚｋｉらは、抗体及びそのＦ（ａｂ′）２フラグメントが、ネズミＴ細胞リンパ腫ＬＢによるリンパ節繁殖を阻止できたことを実証した。これはマウスに有意な生存利益を付与した。Ｗａｌｌａｃｈ−Ｄａｙａｎらは、自発的に腫瘍を形成しないＬＢ−ＴＲネズミリンパ腫の、ＣＤ４４ｖ４〜ｖ１０による形質移入が、腫瘍を形成する能力を付与したことを示した。ＩＭ−７．８．１投与は、アイソタイプ対照抗体と比較して、移植された形質移入細胞の腫瘍サイズを減少した。これらの研究のうちで、この抗体のヒトへの有効性を実証したものはなかった。
【００１５】
マウスＩｇＧ２ａであるＧＫＷ．Ａ３はヒトＣＤ４４に対して特異的であり、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト黒色腫異種移植の形成及び転移を防止した。この抗体を転移性ヒト細胞株ＳＭＭＵ−２と混合し、次に皮下注射した。処置は、次に３週間続いた。４週間後、未処置動物の１００％と比較して、１０匹のマウスのうち１匹しか注射部位に腫瘍を発生しなかった。抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントは、腫瘍形成に対して同じ阻害を示し、作用機構は、補体又は抗体依存細胞障害活性に依存しないことを示唆した。腫瘍細胞が最初の抗体注射の１週間前に注射された場合、動物の８０％が原発部位で腫瘍を発生した。しかし、生存期間は依然として有意に増加したことが注目された。遅延抗体投与は原発性腫瘍形成に対して効果がなかったが、未処置動物に存在した、肺、肝臓、副腎、肝臓及び腹膜への転移を完全に防止した。この抗体は、インビトロで細胞株に対して直接的な細胞障害性を有さず、またＳＭＭＵ−２細胞の繁殖も妨げることなく、転移又は増殖に影響を及ぼすことによって腫瘍形成に対して主な効果を有すると思われる。この抗体の注目すべき一つの特徴は、ＣＤ４４の全てのアイソフォームを認識することであり、これは、治療用途における限定された可能性を示唆する。
【００１６】
Ｓｔｒｏｂｅｌらは、抗ＣＤ４４抗体（クローン５１５）を使用して、マウス異種移植モデルにおけるヒト卵巣癌細胞の腹膜移植を阻害することを記載する。ヒト卵巣細胞株３６Ｍ２を、抗ＣＤ４４抗体又は対照抗体の存在下でマウスに腹腔内移植し、次に処置を次の２０日間にわたって投与した。５週間後、抗体処置群の腹腔内では小結節が有意に少なかった。抗ＣＤ４４及び対照処置群の両方の小結節が同じサイズであり、細胞が移植されると、抗体が腫瘍増殖に対して効果を有さないことを示唆した。細胞が皮下に移植される場合、この場合も腫瘍増殖に対して効果を有さず、抗体それ自体は、抗繁殖性又は細胞毒性効果を有さないことを示した。加えて、抗体はインビトロにおいて細胞増殖に対して効果がなかった。
【００１７】
ＢＩＷＡ１とも呼ばれるＶＦＦ−１８は、ポリペプチドの３６０〜３７０領域に対して特異性のあるＣＤ４４のｖ６変種に対して高い親和性のある抗体である。この抗体は、１２人に患者における第１相臨床試験で９９ｍテクネチウム標識複合体と使用された。抗体を、頭部及び頸部に扁平上皮癌を有する患者において、安全性及び標的化の可能性について試験した。注入の４０時間後、注入用量の１４パーセントが腫瘍により取り込まれ、腎臓、脾臓及び骨髄を含む他の臓器に最小限の蓄積を有した。高度に選択的な腫瘍結合は、この抗体の放射線免疫療法における役割を示唆しているが、この抗体の顕著に高い親和性が、腫瘍のより深い層への浸透を妨げた。ＢＩＷＡ１の適用を更に制限しているものは、ネズミ抗体の免疫原性（１２人の患者のうち１１人がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を発生した）、腫瘍全体にわたる不均一な蓄積及び抗体可溶性ＣＤ４４複合体の形成である。ＷＯ０２／０９４８７９は、ＢＩＷＡ４と呼ぶ、ＨＡＭＡ反応を克服するために設計されたヒト化型ＶＦＦ−１８を開示している。ＢＩＷＡ４は、親ＶＦＦ１８抗体よりも有意に低い抗原結合親和性を有することが見出された。驚くべきことに、親和性の低いＢＩＷＡ４抗体が、親和性の高いＢＩＷＡ８ヒト化ＶＦＦ−１８抗体よりも優れた腫瘍取り込み特性を有した。９９ｍテクネチウム標識及び１８６レニウム標識ＢＩＷＡ４抗体は、両方とも、３３人の患者の第１相臨床試験で評価し、１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４抗体の場合では、安全性、耐性、腫瘍蓄積及び最大耐量を決定した。９９ｍＴｃ標識ＢＩＷＡ４には腫瘍関連取り込みがあると思われる。１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の全ての用量において腫瘍反応が見られなかったが、幾つかは安定した疾患を有し、用量制限毒性が６０ｍＣｉ／ｍ２で生じた。３３人に患者のうち１２人に５０〜６５パーセントの比率で、重篤な有害事象（血小板減少、白血球減少及び発熱）を有すると思われる有害事象があり、そのうち、全て１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４で治療されている６人が、処置の期間中又は追跡治療の間に疾患進行のために死亡した。２人の患者は、ヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）を発生した。１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の第１相漸増用量試験が２０人の患者で実施された。口腔粘膜炎、並びに用量制限血小板減少及び白血球減少が観察され、１人の患者はＨＡＨＡ反応を発生した。安定した疾患が、最高用量の６０ｍＣｉ／ｍ２で治療された５人の患者で見られた。達成される効能の安全性及び耐性の両方において許容されると思われるが、これらの研究は、臨床試験における他の非放射性同位体結合生物学的治療と比較して、高い率の有害事象を有する。米国特許出願ＵＳ２００３／０１０３９８５は、腫瘍治療に用いるための、ＢＩＷＩ１と呼ばれる、マイタンシノイドに結合したヒト化型のＶＦＦ−１８を開示する。毒素と結合した場合のヒト化ＶＦＦ１８抗体のＢＩＷＡ４、すなわちＢＩＷＩ１は、ヒト外陰類表皮癌、咽頭扁平上皮癌又は乳癌のマウスモデルにおいて有意な抗腫瘍効果を有することが見出された。非結合型のＢＩＷＡ４は、抗腫瘍効果を有さず、結合型のＢＩＷＩ１は、ヒトにおける安全性又は効能についての証拠を有さない。
【００１８】
ＭａｂＵ３６は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂヒト下咽頭癌細胞免疫化及び癌と組織への特異性についての選択により生成されたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体である。ｃＤＮＡクローニング及び配列分析による抗原特徴決定は、ケラチノサイト特異性ＣＤ４４スプライス変種エピカンのｖ６ドメインをＭａｂＵ３６の標的として同定した。免疫組織化学研究は、エピトープが細胞膜に限定されていることを示す。更に、ＭａｂＵ３６は、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の９４パーセントを強く標識し、これらの腫瘍内では細胞染色が均一であった。１０人の患者での９９ｍＴｃ標識ＭａｂＵ３６研究は、ＨＮＳＣＣ癌への抗体の選択的蓄積を示し（２日間で２０．４＋／−１２．４パーセントの注射用量）、２人の患者がＨＡＭＡを発症した以外は、副作用の報告はなかった。放射性ヨウ素化ネズミＭａｂＵ３６の研究において、１８人の患者で３症例のＨＡＭＡがあり、ＨＮＳＣＣにおいて選択的均一取り込みがあった。ＭａｂＵ３６の抗原性を減少するため及びＨＡＭＡの比率を減少するため、キメラ抗体が作成された。キメラも元のネズミＭａｂＵ３６もＡＤＣＣ活性を有さない。ＭａｂＵ３６の未変性機能活性の証拠はない。１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６を使用して、ＭａｂＵ３６の治療剤としての有用性を決定した。この第１相漸増用量試験において、１３人の患者が調査用量の９９ｍＴｃ標識キメラＭａｂＵ３６を摂取し、続いて１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６を摂取した。急性有害事象の報告はないが、治療の後、３人の患者のうち２人に用量制限骨髄毒性（１．５ＧＢ／ｍ２）が観察され、最大耐量（１．０ＧＢｑ／ｍ２）で治療された１人の患者に血小板減少が観察された。腫瘍サイズにいくらかの効果があったが、これらの効果は、治療の他覚反応の基準を満たさなかった。１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂＵ３６の更なる研究は、果粒球コロニー刺激因子刺激全血液再注入を使用して最大耐性活性を２倍の２．８Ｇｙにする戦略を用いた。この頭部及び頸部に多様な腫瘍を有する９人の患者の研究において、３人には薬剤関連貧血のために輸血が必要であった。他の毒性には、グレード３の骨髄毒性及びグレード２の粘膜炎が含まれる。他覚腫瘍反応は報告されなかったが、安定した疾患が５人の患者で３〜５か月間達成された。したがって、ＭａｂＵ３６は、高度に特異的な抗体であるが、達成される臨床効果に関わる治療に関連する毒性によって、抗癌効果を達成するためには放射性免疫複合体を必要する欠点がその有用性を制限していることが分かる。
【００１９】
まとめると、ＣＤ４４ｖ６（１．１ＡＳＭＬ）及びＣＤ４４ｖ１０（Ｋ９２６）モノクローナル抗体は、転移性膵臓腺癌を注射されたラット及び悪性黒色腫を注射されたマウスのそれぞれにおいて、転移活性を低減することを示した。別の抗ＣＤ４４ｖ６抗体（ＶＦＦ−１８及びその誘導体）は、マイタンシノイド又は放射性同位体と結合した場合にのみ、抗腫瘍効果を有することを示した。抗標準ＣＤ４４モノクローナル抗体も、ラットグリア芽細胞腫（抗ＣＤ４４ｓ）、マウスＴ細胞リンパ腫によるリンパ節侵入（ＩＭ−７．８．１）による大脳内進行を抑制すること、並びにヌードマウスにおけるヒト卵巣癌細胞株の移植（クローン５１５）、マウス黒色腫細胞株の肺移転（ＩＭ−７．８．１）、及びＳＣＩＤマウスにおけるヒト黒色腫細胞株の移転（ＧＫＷ．Ａ３）を阻害することを示した。放射性同位体結合ＭａｂＵ３６抗ＣＤ４４ｖ６抗体及びその誘導体は、有意な毒性を伴って、臨床試験において抗腫瘍活性を有した。これらの結果は、有望であり、かつ抗ＣＤ４４モノクローナル抗体の潜在的な癌治療薬としての開発を支持するが、限定された有用性、安全性及びヒト癌への適用性を示す。
【００２０】
したがって、細胞においてＣＤ４４の細胞表面発現を誘引する機能として、癌性細胞障害活性を仲介する抗体組成物が単離されると、貴重な診断的及び治療的手段が実現するであろう。 
【００２１】
癌治療としてのモノクローナル抗体：癌を示す個人はそれぞれ特有であり、個人の独自性と同じように他の癌と異なる癌を有する。それにも関わらず、現行の治療は、同じ種類で同じ段階の癌を有する全ての患者を、同じように治療する。これらの患者の少なくとも３０％は、第一次治療に失敗し、したがって、更なる一連の治療をもたらし、治療が失敗し、転移し、最終的には死亡する可能性が増大する。治療の優れた手法は、特定の個人における治療の特別仕様である。それ自体特別仕様につながる唯一の現行の治療は、外科手術である。化学療法及び放射線治療は、患者に合わせることができず、外科手術それ自体は、ほとんどの場合において、治癒を生じるには不十分である。
【００２２】
モノクローナル抗体の出現によって、特別仕様の治療の方法を開発する可能性がより現実的になり、それは、それぞれの抗体を単一のエピトープに向かわせることができるからである。更に、特定の個人の腫瘍を独自に定義する一団のエピトープに方向付けられる、抗体の組み合わせを生じることが可能である。
【００２３】
癌性と正常な細胞との有意な差は、癌性細胞が形質移入細胞に特異性のある抗原を含有することであるという認識を持って、科学界は、癌抗原に特異的に結合することによって、形質移入細胞を特異的に標的にするようにモノクローナル抗体を設計することができると長い間考えてきて、それ故、モノクローナル抗体は、癌細胞を排除する「魔法の弾丸」として役立つことができるという信念を生み出した。しかし、癌の全ての場合に役立つことができる単一のモノクローナル抗体はないこと、及びモノクローナル抗体は、標的癌治療としての分類として展開できることが、現在広く認識されている。本発明の開示された教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば腫瘍量を低減することにより患者の利益になる方法で、癌性疾患の過程を修飾することが示されており、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）又は「抗癌」抗体として本明細書でさまざまに参照される。
【００２４】
今のところ、癌患者は、一般に治療の選択肢がほとんどない。癌治療に対する厳格に管理された手法は、世界的な生存率及び罹患率において改善をもたらした。しかし、特定の個人に対しては、これらの改善された統計は、彼らの個人的な状態における改善と必ずしも相関関係がない。
【００２５】
したがって、開業医がそれぞれの腫瘍を同じコホートにおける他の患者とは無関係に治療することができる方法論が提案される場合、それは、ただ１人のために適合された特有の治療手法を許容することになる。理想的にはそのような治療過程が治癒の比率を増加し、より良好な成果を生じるのであれば、それは、長年にわたる切実な要求を満たすであろう。 
【００２６】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒトの癌治療では限られた成果を伴って使用されてきた。リンパ腫及び白血病は、ヒト血漿で治療されてきたが、長期間の寛解又は反応はほとんどなかった。更に、化学療法と比較して、再現性が欠如し、追加的な利益がなかった。乳癌、黒色腫及び腎細胞癌のような固形腫瘍も、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿及びウマ血清により治療され、同様に予測不能で効果のない結果を得た。
【００２７】
固形腫瘍においてモノクローナル抗体の多くの臨床試験が行われてきた。１９８０年代には、特定の抗原に対する抗体を使用するか、又は組織選択性に基づいて、ヒト乳癌において少なくとも４回の臨床試験が行われ、少なくとも４７人の患者のうち１人しか反応しなかった。１９９８年になって、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））をシスプラチンと組み合わせて使用した臨床試験が成功した。この試験では、３７人の患者で反応を評価し、約四分の一が部分的反応率を有し、さらに四分の一が僅かな又は安定した疾患進行を有した。反応者の進行時間の中央値は、８．４か月であり、反応持続時間の中央値は５．３か月であった。
【００２８】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と組み合わせた第一次使用として１９９８年に認可された。臨床研究の結果は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独を摂取した群（３．０か月）と比較して、抗体治療＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）を摂取した群（６．９か月）で疾患が進行した時間の中央値が増加したことを示した。生存の中央値で僅かな増加もあり、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）の治療類群対Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独の治療群が、２２か月対１８か月であった。加えて、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独と比較した、抗体＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）組み合わせ群における完全（８パーセント対２パーセント）及び部分的反応者（３４パーセント対１５パーセント）の両方で数が増加した。しかし、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＴａｘｏｌ（登録商標）による治療は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独の治療と比較して、心毒性の高い発生率をもたらした（それぞれ、１３パーセント対１パーセント）。また、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）治療は、現在知られている機能又は生物学的に重要なリガンドを持たないレセプターである、ヒト上皮増殖因子レセプター２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を過剰発現している（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により決定された）患者にしか有効ではなく、転移性乳癌を有する患者のおよそ２５％であった。したがって、乳癌の患者において、依然として満たされていない大きな要求が存在する。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）治療により利益を受けることができる患者でも、依然として化学療法を必要とし、したがって、依然として、少なくともある程度は、この種類の治療の副作用に対処しなければならない。
【００２９】
結腸直腸癌を調査する臨床試験は、糖タンパク質標的と糖脂質標的の両方に対する抗体に関わる。腺癌にいくらかの特異性を有する１７−１Ａのような抗体では、６０人の患者で第２相臨床試験を行い、部分的な反応を有する患者が１人だけであった。別の試験では、１７−１Ａの使用は、追加のシクロホスファミドを使用したプロトコールにおいて、５２人の患者のうち、完全寛解が１人及び僅かな反応が２人だけであった。現在まで、１７−１Ａの第ＩＩＩ相臨床試験は、第ＩＩＩ期結腸癌の補助療法として、改善された効能を実証していない。最初に画像化のために認可されたヒト化ネズミモノクローナル抗体の使用も、腫瘍退縮を生じなかった。
【００３０】
最近になって、モノクローナル抗体の使用による結腸直腸癌臨床研究において肯定的な結果が得られるようになった。２００４年には、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）が、イリノテカンに基づく化学療法に難治性である、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌の患者における第二次治療のために認可された。２群第ＩＩ相臨床試験と単独群研究の両方の結果は、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）が、それぞれ４．１か月と６．５か月の疾患進行時間の中央値で、それぞれ２３パーセントと１５パーセントの反応率を有したことを示した。同じ２群第ＩＩ相臨床試験及び別の単独群研究の結果は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）単独での治療が、それぞれ１．５か月と４．２か月の疾患進行時間の中央値で、それぞれ１１パーセントと９パーセントの反応率をもたらしたことを示した。
【００３１】
したがって、スイスと米国の両方において、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の治療が、そして米国において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）単独の治療が、第一次イリノテカン療法が失敗した結腸癌患者の第二次治療として認可された。したがって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同様に、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体と化学療法の組み合わせとしてのみ認可されている。加えて、スイスと米国の両方における治療は、患者にとって第二次療法としてのみ認可されている。また２００４年には、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）が、転移性結腸直腸癌の第一次治療として、静脈内５−フルオロウラシルに基づく化学療法と組み合わせての使用が認可された。第ＩＩＩ相臨床研究の結果は、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）＋５−フルオロウラシルで治療した患者の生存の中央値が、５−フルオロウラシル単独で治療した患者と比較して延長したことを実証した（それぞれ、２０か月対１６か月）。しかし、この場合もＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と同様に、治療は、モノクローナル抗体と化学療法の組み合わせとしてのみ認可されている。
【００３２】
また、肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺及び胃癌において乏しい結果を生じ続けている。非小型細胞肺ガンの最近の最も有望な結果は、治療が、化学療法剤タキソテールと組み合わせた細胞死滅薬ドキソルビシンと結合するモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）を含む、第ＩＩ相臨床試験からもたらされた。タキソテールは、肺癌の第二次治療のために唯一ＦＤＡにより認可された化学療法である。初期データは、タキソテール単独と比較して全体的に改善された生存を示す。研究のために動員された６２人の患者のうち、三分の二は、ＳＧＮ−１５をタキソテールと組み合わせて摂取し、一方、残りの三分の一は、タキソテール単独を摂取した。タキソテールと組み合わせたＳＧＮ−１５を摂取した患者では、全体的な生存の中央値は、タキソテール単独を摂取した患者の５．９か月と比較して、７．３か月であった。１年と１８か月の全体的な生存は、タキソテール単独を摂取した患者でのそれぞれ２４パーセント及び８パーセントと比較して、ＳＧＮ−１５＋タキソテールを摂取した患者では、それぞれ２９パーセント及び１８パーセントであった。更なる臨床試験が計画されている。
【００３３】
前臨床では、黒色腫におけるモノクローナル抗体の使用でいくらかの限定された成果が得られている。これらの抗体のうちで臨床試験に到達したものはほとんどなく、現在まで、第ＩＩＩ相診療試験で承認されたもの又は好ましい結果を実証したものはない。
【００３４】
疾患を治療する新薬の発見は、疾患の病原に明白に寄与している既知の遺伝子３０、０００個の産物のうちから関連する標的を同定することの欠如によって、妨げられている。腫瘍学研究において、潜在的な薬剤標的は、多くの場合、単に腫瘍細胞で過剰発現しているという事実によって選択される。このように同定された標的は、次に多数の化合物との相互作用のためにスクリーニングされる。潜在的な抗体療法において、これらの候補化合物は、通常、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより定められた基本的な原則（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）に従ったモノクローナル抗体生成の伝統的な方法によって誘導される。脾臓細胞を、抗原（例えば、全細胞、細胞分画、精製抗原）により免疫化したマウスから収集し、不死化ハイブリドーマパートナーと融合する。得られたハイブリドーマを、標的に最も熱心に結合する抗体の分泌のためにスクリーニングし、選択する。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＲＩＴＵＸＩＭＡＢを含む、癌細胞に向けられる多くの治療用及び診断用抗体が、これらの方法を使用して産生され、その親和性に基づいて選択されてきた。この戦略の欠点には、２つの部分がある。第１には、治療用又は診断用抗体結合に適切な標的の選択は、組織特異的発癌性経過を取り巻く知識の不足によって、そしてその結果として得られる、それによりこれらの標的が同定される単純な方法、例えば過剰発現による選択によって、制限される。第２には、最大の親和性を持ってレセプターに結合する薬剤分子が、通常、シグナルを開始する又は阻害する最高の確率を有するという前提は、必ずしもそうであるとは限らない場合がある。
【００３５】
乳癌及び結腸癌の治療でいくらかの進展があるにもかかわらず、有効な抗体療法の確認及び開発は、単独の作用物質又は同時治療のいずれにおいても、全ての種類の癌では不十分である。
【００３６】
従来の特許：
特許文献１は、患者の腫瘍からの細胞を、患者の細胞又は組織からクローン化できるＭＨＣ遺伝子により形質移入するプロセスを開示する。次にこれらの形質移入細胞を使用して患者に予防接種する。 
【００３７】
特許文献２は、哺乳動物の新生細胞及び正常細胞の内部細胞成分に特異性があるが、外部成分にはないモノクローナル抗体を得る工程、モノクローナル抗体を標識する工程、標識抗体と、新生細胞を死滅させる治療を受けた哺乳動物の組織とを接触させる工程、及び縮退新生細胞の内部細胞成分への標識抗体の結合を測定することによって、治療の効果を決定する工程を含むプロセスを開示する。ヒト細胞内抗原へ向かう抗体を調製するためには、特許権所有者は、悪性細胞がそのような抗原の都合のよい供給源を表すことを認識する。 
【００３８】
特許文献３は、新規抗体及びその産生方法を提供する。特に、特許は、ヒト腫瘍、例えば、結腸及び肺の腫瘍に関連するタンパク質抗原に強く結合するが、正常な細胞にかなり低い程度で結合する特性を有するモノクローナル抗体の形成を教示する。 
【００３９】
特許文献４は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に除去すること、腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を得ること、生存しているが非腫瘍形成性である腫瘍細胞を照射すること、これらの細胞を使用して、患者のために、原発性腫瘍の再発を抑制することができ、同時に転位を抑制することができるワクチンを調製することを含む癌治療の方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原に反応性があるモノクローナル抗体の開発を教示する。第４欄４５行目（以下参照）に記載されているように、特許権所有者は、ヒト新生物において活性な特異的免疫療法を発現するモノクローナル抗体の開発に自発性腫瘍細胞を利用する。
【００４０】
特許文献５は、ヒト癌腫の特性を持つが、起源の上皮細胞に依存しない糖タンパク質抗原を教示する。
【００４１】
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞のアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体を使用する癌治療の方法、及び前記抗体を含む医薬組成物を記述する。
【００４２】
特許文献７は、腫瘍及び非腫瘍組織供給源から精製された、ムチン抗原に対するモノクローナル抗体を産生するための新規ハイブリドーマ細胞株を記載する。 
【００４３】
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生成する方法、モノクローナル抗体を産生する方法、並びにこの方法により産生されるモノクローナル抗体を記述する。この特許は、特に、癌の診断及び治療に有用な抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生について記述している。 
【００４４】
特許文献９は、ヒト癌腫細胞に反応性のある、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体及び単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体が機能する機構には２つの部分があり、それは、分子が、ヒト癌腫の表面に存在する細胞膜抗原と反応すること、更には、抗体が、癌腫細胞内に取り入れられ、続いて結合する能力を有することであり、抗体−薬剤及び抗体−毒素複合体を形成するのに特に有用である。非修飾形態において、抗体は、特定の濃度で細胞毒性の特性も表す。
【００４５】
特許文献１０は、腫瘍の治療及び予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、老齢哺乳動物からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見出される天然抗体の一つの種類であると言われている。自己抗体が「老齢哺乳動物」からのものであるため、自己抗体は、実際に治療を受けている患者からのものであるという必要条件がない。加えて、この特許は、老齢哺乳動物からの天然及びモノクローナル抗核自己抗体、並びにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示する。
【００４６】
特許文献１１は、ＣＤ４４遺伝子の変種エクソンｖ６に対して向けられている特異的抗体ＶＦＦ−１８及びその変種を開示する。この抗体は、ラットＣＤ４４ｖ６変種ではなくヒトＣＤ４４ｖ６変種を認識する点において、コンパラトール抗体に比べて改善されている。加えて、この抗体は、ＣＤ４４ｖ６発現についての診断的アッセイを開示する。この抗体についてインビトロ又はインビボ機能の開示は何もなかった。
【００４７】
特許文献１２は、ＣＤ４４遺伝子のヒトエクソン６Ａによりコードされる配列を含む合成ペプチドに対して生じたモノクローナル抗体Ｖａｒ３．１を開示する。具体的には、この抗体は、ヒトＣＤ４４の９０ｋＤ形態に結合せず、Ｈｅｒｍｅｓ−３抗体と区別される。ＣＤ４４のｖ６変種を検出する方法、並びにこの抗原に基づいた悪性転換についてスクリーニング及び分析する方法が提供される。血清中で抗原を検出することに基づいた炎症性疾患をスクリーニングする方法も提供される。
【００４８】
特許文献１３は、４３アミノ酸ペプチドを産生するヒトＣＤ４４変種６の１２９ｂｄエクソンに結合する特異的抗体を開示する。モノクローナル抗体は、多数のハイブリドーマ細胞株：ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６により産生される。この抗体は、新規ＣＤ４４ｖ６アミノ酸配列のヘキサペプチドを少なくとも含む融合タンパク質から生成される。更に、癌診断に使用することができるエクソン６変種の検出のためのイムノアッセイを開示する。有意には、この抗体についてインビトロ又はインビボ機能の開示は何もない。
【００４９】
特許文献１４は、ＣＤ４４様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチド及びその変種を使用する組み換えタンパク質を作製する方法を開示する。これらのポリペプチドに対する抗体が特許請求されているが、特定の例はなく、そのような抗体を分泌する寄託クローンがない。ノーザンブロットは、数種の組織にポリヌクレオチドが表れたことを実証したが、このポリヌクレオチドの翻訳及び発現があるという不随する証拠がない。したがって、このポリヌクレオチドの遺伝子産物に対して作製された抗体が存在する、これらの抗体がインビトロ又はインビボ機能のいずれかを有する、及びこれらがヒト癌性疾患と関連性があるという証拠がない。 
【００５０】
特許文献１５は、ＣＤ４４の変種エピトープと反応する抗体、及びこの抗体の使用を介して変種を同定する方法を開示する。この変種をコードする単離ポリヌクレオチドがラット細胞から単離され、この変種に対して向けられている抗体ｍＡｂ１．１ＡＳＭＬは、分子量１２０ｋＤ、１５０ｋＤ、１８０ｋＤ及び２００ｋＤのタンパク質を認識する。モノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬの投与は、同質遺伝子ラットにおいてラットＢＳｐ７３ＡＳＭＬの増殖及び転移を遅延した。有意には、１．１ＡＳＭＬは、ＬＣＬＣ９７ヒト大型細胞肺癌に対する反応性の欠如によって示されているように、ヒト腫瘍を認識しない。ヒト相同体がＬＣＬＣ９７から単離されたが、この相同体を認識する同等の抗体は産生されなかった。したがって、ラットＣＤ４４の変種に特異的な抗体が産生され、ラット腫瘍の増殖及び転移に対して影響を及ぼすことが示されているが、この抗体のヒト腫瘍に対する効果についての証拠はない。より詳細には、発明者たちは、この抗体は、ヒト癌を認識しないことを指摘している。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号
【特許文献１１】米国特許第５，９１６，５６１号
【特許文献１２】米国特許第５，６１６，４６８号
【特許文献１３】米国特許第５，８７９，８９８９号
【特許文献１４】米国特許第５，９４２，４１７号
【特許文献１５】米国特許第５，８８５，５７５号
【発明の開示】
【００５１】
本発明者たちには、以前に、癌性疾患を治療するのに有用である、個人に合わせて特別仕様された抗癌抗体を選択する方法を対象とする、表題が「個人に合わせた患者特異性抗癌抗体」である米国特許第６，１８０，３５７号が付与されている。一部のアミノ酸配列が、タンパク質の構造又は機能に著しく影響を与えることなく、ポリペプチドにおいて変わることができることは、当該技術でよく認識されている。抗体の分子再構成において、骨格領域の核酸又はアミノ酸配列における修飾は、一般に許容されうる。これには、置換（好ましくは、保存的置換）、欠失又は付加が挙げられるが、これらに限定はされない。更に、標準的な化学療法モダリティー、例えば放射性核種と、本発明のＣＤＭＡＢとを結合し、それによって、前記化学療法剤の使用に焦点を当てることは、本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞毒性部分、酵素、例えばビオチン結合酵素又は血行性細胞と結合することもでき、それによって、抗体複合体を形成することができる。 
【００５２】
本出願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離することに関する第′３５７号特許で教示されている、患者特性抗癌抗体を産生する方法を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍のために特別に作ることができ、したがって、癌治療を特別仕様にすることが可能である。本出願の文脈内で、細胞死滅特性（細胞毒性）又は細胞増殖阻害特性（細胞増殖抑制性）のいずれかを有する抗癌抗体を、本明細書以降では、細胞毒性と呼ぶ。これらの抗体は、癌の病期分類及び診断の助けとして使用することができ、腫瘍転移を治療するために使用できる。これらの抗体を、予防処置の方法で癌予防のために使用することもできる。伝統的な薬剤発見パラダイムに従って生成された抗体と異なり、本方法のようにして生成された抗体は、以前には悪性組織の増殖及び／又は生存と一体として示されていない分子及び経路を標的にすることができる。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強力な親和性相互作用に従わない場合がある細胞毒性事象の開始のための要件に適している。
【００５３】
個人に合わせた抗癌治療の展望は、患者を管理する方法に変化をもたらす。起こりそうな臨床シナリオは、診断時に腫瘍試料を得て、保存するというものである。この試料から、腫瘍を、既に存在している癌性疾患修飾抗体のパネルによって分類することができる。患者は、従来のように病期分類されるが、患者を更に分類するために、利用可能な抗体が役に立つことができる。患者を、現存の抗体により直ぐに治療することができ、腫瘍に特異的な抗体のパネルを、本明細書で開示された方法を使用する、又は本明細書で開示されたスクリーニング方法と併せてファージディスプレーライブラリーを使用する、のいずれかよって産生することができる。生成された抗体は、他の腫瘍が、治療されているものと同じエピトープのうちの幾つかを持ちうる可能性があるので、全て抗癌抗体のライブラリーに加えられる。本発明の方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する何人もの患者において、癌性疾患を治療するのに有用であることができる。 
【００５４】
抗癌抗体に加えて、患者は、治療の多様なレジメンの一部として現行の推奨される治療を受けることを選ぶことができる。本発明の方法論により単離された抗体が非癌性細胞に対して相対的に非毒性であるという事実は、高用量の抗体の組み合わせを単独で、又は従来の治療と一緒に使用することを可能にする。高い治療指数は、治療耐性細胞の発生の可能性を減少するはずである短期間での再治療も可能にする。
【００５５】
患者が治療の初期過程に難治性であるか、又は転移が発生する場合、腫瘍に特異的な抗体を生成する方法を再治療のために繰り返すことができる。更に、抗癌抗体を、患者から得た赤血球と結合して、転移の治療のために再注入することができる。転移性癌に対する有効な治療はほとんどなく、転移は、通常、死亡をもたらす不良転帰の前兆である。しかし、転移性癌は、通常、十分に血管新生化されており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位へ抗体を集中させる効果を有することができる。転移の前でさえも、ほとんどの癌細胞は、その生存を宿主の血液供給に依存し、赤血球と結合した抗癌抗体は、原位置の腫瘍に対しても有効であることができる。あるいは、抗体を、他の血行性細胞、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞などと結合させることができる。
【００５６】
５種類の抗体があり、それぞれその重鎖により付与される機能と関連している。一般に、裸抗体による癌細胞死滅は、抗体依存性細胞障害活性又は補体依存性細胞障害性のいずれかによって仲介されると考えられる。例えば、ネズミＩｇＭ及びＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ１成分の結合によりヒト補体を活性化することができ、それによって、腫瘍溶解をもたらすことができる、補体活性化の古典的経路を活性化することができる。ヒト抗体では、最も効果的な補体活性化抗体は、一般にＩｇＭ及びＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３アイソタイプのネズミ抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及び特定のリンパ球による細胞死滅をもたらすＦｃレセプターを有する細胞毒性細胞を動員するのに有効である。ヒト抗体のＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方のアイソタイプはＡＤＣＣを仲介する。
【００５７】
抗体仲介癌死滅の別の可能な機構は、細胞膜及びその関連する糖タンパク質又は糖脂質における多様な化学的結合の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を介することでありうる。
【００５８】
抗体仲介癌細胞死滅について３つの追加的な機構がある。第１は、癌細胞に存在する推定抗原に対して免疫反応を生じるように体を誘導する、ワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖レセプターを標的にし、その機能を妨害する、又は機能が効果的に失われるようにそのレセプターを下方制御する、抗体の使用である。第３は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１若しくはＴＲＡＩＬ  Ｒ２のような死レセプター又はアルファＶベータ３などのようなインテグリン分子の連結のような、直接の細胞死をもたらしうる細胞表面部分の直接連結に対するそのような抗体の効果である。 
【００５９】
制癌剤の臨床的有用性は、患者の許容されるリスクプロフィール下での薬剤の利益に基づく。癌療法において、生存は、一般に最も追求される利益であるが、延命に加えて他の十分に認識されている利益が多数存在する。治療が生存に有害な影響を与えないこれらの他の利益には、症状緩和、有害事象に対する保護、再発するまでの時間又は無病生存期間の延長、及び進行するまでの時間の延長が含まれる。これらの基準は、一般に受け入れられており、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のような規制機関は、これらの利益を生じる薬剤を認可している（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）。これらの基準に加えて、これらの種類の利益を予感することができる他の終点があることは、十分に認識されている。部分的には、米国ＦＤＡにより許可された加速承認方法は、患者の利益を予測すると思われる代用薬があることを認めている。年末（２００３年）には、この方法により１６種の薬剤が認可され、それらのうち４種が完全に承認され、すなわち、追跡調査が、代用薬終点により予測された直接的な患者の利益を実証した。固形腫瘍における薬剤効果を決定する一つの重要な終点は、処置に対する反応を測定することにより腫瘍量を評価することである（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。そのような評価の臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、国際的な癌専門家のグループであるＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐにより公表されてきた。適切な対照群と比較して、ＲＥＣＩＳＴ基準に従った他覚的反応により示された、腫瘍量に対する効果を実証した薬剤は、最終的に、直接的な患者利益を生じる傾向がある。前臨床設定において、腫瘍量は、一般に評価及び文書化に対してより直接的である。前臨床試験を臨床設定に転換することができるので、前臨床モデルにおいて生存期間の延長を生じる薬剤は、最大の予測臨床的有用性を有する。臨床治療に陽性反応を生じることと同様に、前臨床設定において腫瘍量を低減する薬剤は、疾患に対して著しく直接的な影響を有することもできる。生存期間の延長が制癌剤治療で最も追求される臨床転帰であるが、臨床的有用性を有する他の利益が存在し、疾患進行の遅延、延長した生存期間又はその両方に相関しうる腫瘍量の低減が、直接的な利益をもたらし、臨床的な影響を与えることもできることが明白である（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００３，ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。
【００６０】
実質的に米国特許６，１８０，３５７号の方法を使用して、マウスモノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２を、患者の肺腫瘍生検からの細胞による、以下の、マウスの免疫化に従って得た。Ｈ４６０−１６−２抗原は、異なる組織由来の広範囲なヒト細胞株の細胞表面に発現した。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）及び皮膚癌細胞株Ａ２０５８は、インビトロでＨ４６０−１６−２の細胞毒性効果に感受性があった。
【００６１】
培養中のＭＢ−２３１細胞に対するＨ４６０−１６−２細胞障害性の結果は、マウスに移植されたとき、これらの癌細胞に対するその抗腫瘍活性により更に拡大された（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に開示されている）。前臨床異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予測判断材料であると考えられる。
【００６２】
ヒト乳癌の予防インビボモデルにおいて、Ｈ４６０−１６−２処置は、アイソタイプ対照抗体よりも、処置期間における腫瘍増殖の抑制に有意に（ｐ＜０．０００１）効果的であった。処置段階の終了時には、Ｈ４６０−１６−２を与えられたマウスは、対照群の１．３パーセントしか増殖しなかった腫瘍を有した。処置後の追跡調査期間の間、Ｈ４６０−１６−２の処置効果は持続し、処置群の平均腫瘍容量は、測定段階の終了時まで、対照よりも有意に小型であり続けた。生存を抗体効能の測度として使用して、Ｈ４６０−１６−２処置群で死亡する危険性は、処置後およそ７０日目で抗体緩衝剤対照群の約７１パーセントであった（ｐ＝０．００２８）と推定した。これらのデータは、Ｈ４６０−１６−２処置が、対照処置群と比較して、生存利益を付与したことを実証した。Ｈ４６０−１６−２処置は、体重の低減及び臨床困難を含む毒性の徴候を誘導しなかったので、安全であると思われた。したがって、Ｈ４６０−１６−２処置は、ヒト乳癌の十分に確立したモデルにおいて、対照処置群と比較して腫瘍増殖を遅延し、また生存を向上させたので、有効であった。
【００６３】
加えて、Ｈ４６０−１６−２は、確立したインビボ腫瘍モデルにおいて、ＭＢ−２３１細胞に対して抗腫瘍活性を実証した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００に開示されている）。Ｈ４６０−１６−２による処置を、標準的な化学療法薬シスプラチンと比較し、シスプラチン及びＨ４６０−１６−２処置群は、抗体希釈緩衝剤又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置した群と比較して、有意に（ｐ＜０．００１）小さい平均腫瘍容量を有した。Ｈ４６０−１６−２処置は腫瘍抑制を仲介し、それはシスプラチン化学療法のおよそ三分の二であったが、シスプラチンで観察された有意な（１９．２パーセント）体重減少（ｐ＜０．００３）及び２つの処置関連死亡を含む臨床困難がなかった。Ｈ４６０−１６−２の抗腫瘍活性及びその最小限の毒性は、それを魅力的な抗癌治療剤にする。 
【００６４】
処置後期間において、Ｈ４６０−１６−２は、Ｈ４６０−１６−２群における死亡の危険性が、処置後＞７０日でアイソタイプ対照抗体の約半分であったように、有意な生存利益（ｐ＜０．０２）を示した。観察された生存利益は、処置後１２０日を過ぎても続き、Ｈ４６０−１６−２処置群の６７パーセントと比較して、アイソタイプ対照及びシスプラチン処置マウスの１００パーセントが死亡した。Ｈ４６０−１６−２は、アイソタイプ対照抗体群と比較して、腫瘍増殖を２６パーセント遅延することによって腫瘍抑制を維持した。処置後３１日目に、Ｈ４６０−１６−２は、アイソタイプ対照群と比較して腫瘍増殖を４８パーセント低減することによって、腫瘍のサイズを制限し、これは、処置の終了時で観察される４９パーセントの低減に匹敵する。乳癌の確立した腫瘍モデルにおいて、これらの結果は、処置段階を越えて腫瘍抑制を維持するＨ４６０−１６−２の潜在能力を示し、哺乳動物において腫瘍量を低減し、かつ生存を向上させる抗体の能力を実証した。
【００６５】
乳癌の確立したインビボ腫瘍モデルにおける利益効果に加えて、化学療法薬（シスプラチン）と組み合わせたＨ４６０−１６−２処置は、確立したインビボ前立腺癌モデルにおいてＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を有した（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５で開示されている）。対ｔ−検定を使用して、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチン処置は、緩衝剤対照（ｐ＜０．０００１）、シスプラチン処置単独（ｐ＝０．００４）又はＨ４６０−１６−２処置単独（ｐ＜０．０００１）よりも、処置期間の直ぐ後で腫瘍増殖を抑制するのに有意に有効であった。処置段階の終了時には、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチンを与えられたマウスは、緩衝剤対照群の２８．５パーセントしか増殖しなかった腫瘍を有した。ＰＣ−３  ＳＣＩＤ異種移植モデルでは、体重を疾患進行の代理指標として使用することができる。全ての群においてマウスは重篤な体重の減少を被った。この研究において、全ての群のマウスは、処置期間の終了時までにおよそ２３〜３５パーセントの体重減少を示した。Ｈ４６０−１６−２で処置された群は、最も小さい程度の体重減少（２１．７パーセント）を示した。処置の後、つまり４８日目に、緩衝剤対照と比較して、Ｈ４６０−１６−２及びシスプラチンの処置に関連した体重減少に有意な増加はなかった（ｐ＝０．５０４２）。したがって、Ｈ４６０−１６−２＋シスプラチン処置は、ヒト前立腺癌の十分に確立したモデルにおいて、アイソタイプ対照処置群と比較して腫瘍増殖を遅延したように、有効であった。
【００６６】
薬剤標的としてＨ４６０−１６−２エピトープを確認するために、正常なヒト組織におけるＨ４６０−１６−２抗原の発現を予め決定した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）。この処理を、抗ＣＤ４４抗体；クローンＬ１７８（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８に開示されている）及びクローンＢＵ７５（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５に開示されている）との比較に拡大した。Ｈ４６０−１６−２でＩＨＣ染色すると、肝臓、腎臓（尿細管上皮細胞の辺縁染色を除く）、心臓及び肺のような重要な臓器の細胞を含む大部分の組織は、Ｈ４６０−１６−２抗原を発現しなかった。組織染色の結果は、Ｈ４６０−１６−２が多様な細胞型への限定された結合を示すが、浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞への結合を有したことを示した。ＢＵ７５抗体は同様の染色パターンを示した。しかし、少なくとも１つの注目すべき差があり、リンパ球の染色はＨ４６０−１６−２と比較してＢＵ７５でより強力であった。 
【００６７】
Ｈ４６０−１６−２抗原の局在化、及び乳癌患者のような集団内での蔓延の決定は、Ｈ４６０−１６−２の治療上の使用を評価する及び効果的な臨床試験を設計するのに重要である。癌患者からの乳房腫瘍におけるＨ４６０−１６−２抗原の発現に取り組むため、５０人の乳癌患者の腫瘍組織試料では、予め、Ｈ４６０−１６−２抗原の発現をスクリーニングし（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）、Ｌ１７８（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）、ＢＵ７５（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５）及び抗Ｈｅｒ２抗体ｃ−ｅｒｂＢ−２（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５）と比較した。これらの研究の結果は類似しており、組織試料の６２パーセントがＨ４６０−１６−２抗原で陽性に染色され、一方、乳房腫瘍組織の７３パーセントがＢＵ７５エピトープで陽性であったことを示した。患者の試料内でのＨ４６０−１６−２の発現は、染色が悪性細胞に限定されているので、癌細胞に特異的であると思われた。Ｈ４６０−１６−２は、乳癌患者の正常組織の１０個の試料のうち４個を染色し、一方、ＢＵ７５は８個を染色した。Ｈ４６０−１６−２及びＢＵ７５抗原の乳房腫瘍発現は、主に、悪性細胞の細胞膜に局在化していると思われ、治療においてＣＤ４４が魅力的な標的となる。Ｈ４６０−１６−２発現を、乳房腫瘍の発達、治療及び予後に重要な役割を演じるホルモンであるエストロゲン及びプロゲステロンのためのレセプターの乳房腫瘍発現に基づいて、更に評価した。Ｈ４６０−１６−２抗原と、エストロゲン又はプロゲステロンのいずれかのためのレセプターの発現との間の相関関係は、明白ではなかった。腫瘍をその病期又は癌の進行程度に基づいて分析したとき、この場合でも、Ｈ４６０−１６−２抗原発現と腫瘍の病期との間に明確な相関関係がなかった。ＢＵ７５で同様の結果を得た。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗比較して、Ｈ４６０−１６−２は、Ｈ４６０−１６−２抗原では陽性の乳房腫瘍組織試料の５２パーセントがＨｅｒ２発現では陰性であるという完全に異なる染色プロフィールを示し、乳癌患者にとって標的治療の要求が依然として満たされていないこと示した。また、Ｈ４６０−１６−２とＨｅｒ２の両方で陽性である乳房腫瘍組織切片間の染色強度に差があった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、正常な乳房組織切片のうちの１つを陽性染色した。 
【００６８】
Ｈ４６０−１６−２の潜在的な治療利益を更に広げるために、多様なヒト癌組織内の抗原の頻度及び局在性も、予め決定し（Ｓ．Ｎ．１０／６０３，０００）、クローンＬ１７８と比較した（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）。これらの腫瘍型の大部分は、Ｌ１７８抗原でも陽性である。ヒト乳房腫瘍組織でも、Ｈ４６０−１６−２及びＬ１７８局在化が腫瘍細胞の膜で生じた。しかし、Ｈ４６０−１６−２抗体と比較して、Ｌ１７６による膜局在化のほうが実質的多かった。また、Ｈ４６０−１６−２とＬ１７８の両方で染色された腫瘍型のうち、４３パーセントの組織がＬ１７８抗体によるより高い強度の染色を示した。
【００６９】
文献のＩＨＣデータとの比較に基づいて、本明細書に提示されたＩＨＣデータと正確にマッチするＣＤ４４の形態は存在しないと思われる。ＣＤ４４の標準形態は、通常、ヒト脳に発現し、Ｈ４６０−１６−２抗原は発現しない。パンＣＤ４４アイソフォームに向けられている抗体は、肝臓（クッパー細胞を含む）を染色せず、生殖周期の全段階において子宮内膜腺を陽性染色する。Ｈ４６０−１６−２抗原は、クッパー細胞に明確に存在し、生殖周期の分泌子宮内膜腺にのみ存在する。Ｈ４６０−１６−２抗原は、組織マクロファージに明確に存在し、変種形態Ｖ４／５及びＶ８／９のみが時々マクロファージの染色を示す。類似しているが依然として区別されるパターンが、抗ＣＤ４４  Ｌ１７８と比較してＨ４６０−１６−２により見られ、ここでＢＵ７５は、Ｈ４６０−１６−２抗原がＣＤ４４の独自のエピトープであることを示す。
【００７０】
以前に開示されているように（Ｓ．Ｎ．１０／６４７，８１８）、追加的な生化学データは、Ｈ４６０−１６−２により認識される抗原がＣＤ４４の形態の１つであることも示した。これは、ＣＤ４４に対して反応性のあるモノクローナル抗体（Ｌ１７８）が、免疫沈降によりＨ４６０−１６−２に結合するタンパク質を同定することを示す研究によって支持された。ウエスタンブロッティング研究も、Ｈ４６０−１６−２により認識されるＣＤ４４のエピトープが、ｖ６又はｖ１０に存在しないことを示唆した。Ｈ４６０−１６−２エピトープは、炭水化物であり、立体構造依存性であることによっても区別され、一方、多くの抗ＣＤ４４抗体は、ＣＤ４４のペプチド部分に対して向けられている。これらのＩＨＣ及び生化学的な結果は、Ｈ４６０−１６−２がＣＤ４４抗原の変種に結合することを実証した。したがって、圧倒的な証拠が、Ｈ４６０−１６−２は、ＣＤ４４の変種に存在する特有の炭水化物依存性立体構造エピトープとの連結を介して、抗癌効果を仲介することを示した。本発明の目的において、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−１６−２、その抗原結合フラグメント又はその抗体複合体によりコードされるモノクローナル抗体と結合するその能力によって特徴決定される、「ＣＤ４４抗原部分」と定義される。
【００７１】
Ｈ４６０−１６−２の抗癌効果の背後にある機構を更に解明するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）結合アッセイを実施した（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５に開示されている）。平均濃度１．８７（＋／−１．０１）マイクログラム／ｍＬのＨ４６０−１６−２が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＨＡへの接着を５０パーセント阻害するのに必要であった。この結果は、Ｈ４６０−１６−２が、少なくとも部分的に、ＨＡへの結合に関与し、同時に、血管形成の下方制御を介してその抗癌効果を仲介する又はＥＣＭを介して腫瘍の侵襲性を仲介する可能性のあるＣＤ４４の領域と相互作用することを示した。
【００７２】
ＨＡ結合アッセイに加えて、Ｈ４６０−１６−２のインビトロ及びインビボ抗癌効果が細胞周期の調節に起因するかを決定するために、細胞周期実験を実施した（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５に開示されている）。２４時間後及び２０μｇ／ｍＬのＨ４６０−１６−２により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１アポトーシス細胞の数がアイソタイプ対照と比較して増加した。この効果は、また、用量依存的であると思われた。したがって、Ｈ４６０−１６−２の効能は、全体的に又は部分的に、そのアポトーシス誘発能力にも起因する場合がある。
【００７３】
全体として、このデータは、Ｈ４６０−１６−２抗原が、癌関連抗原であり、ヒトにおいて発現し、病原関連癌標的であることを実証する。更に、このデータは、Ｈ４６０−１６−２抗体のヒト癌組織への結合も実証し、診断的、治療予測的、又は予後的であることができるアッセイのために適切に使用することができる。加えて、この抗原の細胞膜局在性は、ほとんどの非悪性細胞における抗原の発現の欠如によって、細胞の癌状態を示しており、この観察は、診断的、治療予測的又は予後的であることができるアッセイで使用されるこの抗体、その遺伝子又は誘導体、そのタンパク質又はその変種の使用を容認する。
【００７４】
抗ＣＤ４４抗体の使用を伴う他の研究は、Ｈ４６０−１６−２により示されない治療可能性の限界を有する。Ｈ４６０−１６−２は、インビトロとインビボの両方において抗腫瘍活性を実証する。ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−１．１．１２、ＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−２．４２．３及びＭＡＫ＜ＣＤ４４＞Ｍ−４．３．１６のような以前に記載された抗体は、これらに帰するインビトロ又はインビボ細胞障害性を有さず、ＶＦＦ−１８及びＭａｂＵ３６は、固有の腫瘍細胞障害性を示さない。加えて、インビボ腫瘍効果を示す他の抗ＣＤ４４抗体も、Ｈ４６０−１６−２では明らかではない特定の限界を有する。例えば、ＡＳＭＬ１．１、Ｋ９２６、抗ＣＤ４４ｓ及びＩＭ−７８．１は、ラット、ネズミ、異種移植モデルで増殖したラット及びネズミのそれぞれの腫瘍に対するインビボ抗腫瘍活性を示す。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト癌のモデルで抗腫瘍活性を実証する。Ｈ４６０−１６−２は、ヒトＣＤ４４に対しても向けられているが、ＡＳＭＬ１．１のような抗体は、ラットＣＤ４４しか認識しない。クローン５１５抗ＣＤ４４抗体は、ヒト卵巣細胞株の腹膜腫瘍移植を阻害はするが、腫瘍増殖のを防止又は阻害しない。Ｈ４６０−１６−２は、ＳＣＩＤマウス異種移植モデルにおいてヒト乳房腫瘍増殖を阻害することができる。ＧＫＷ．Ａ３は、予防的であるが確立していないモデルにおいてマウスで増殖したヒト転移性黒色腫の腫瘍増殖を阻害することができる抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体である。Ｈ４６０−１６−２は、ヒト乳癌の予防的及び確立したネズミ異種移植モデルの両方において有意な抗腫瘍活性を実証した。したがって、Ｈ４６０−１６−２が、以前に記載された抗ＣＤ４４抗体と比較して優れた抗腫瘍特性を有するのは、全く明白なことである。これは、ＳＣＩＤマウスのヒト乳房腫瘍に対するインビトロとインビボの両方で抗腫瘍活性を実証し、ヒトＣＤ４４に向けられている。また、ヒト乳癌の予防及び確立（臨床的により関連性がある）モデルにおいて活性を示し、ヒト前立腺癌の確立モデルにおいてシスプラチンと共に活性を示す。
【００７５】
全体として、本発明は、投与されたとき、哺乳動物においで抗原を発現している癌の腫瘍量を低減することができ（したがって疾患の進行を遅延する）、かつ治療された哺乳動物の生存期間の延長をもたらすこともできる治療剤の標的としての、Ｈ４６０−１６−２抗原の使用を教示する。本発明は、その抗原を標的にして、哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍量を低減するため、及びこの抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の生存期間を延長するための、ＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−１６−２）及びその誘導体の使用も教示する。加えて、本発明は、その抗原に結合した後、Ｈ４６０−１６−２は、ヒアルロン酸と相互作用する癌細胞の能力を妨げることができ、癌細胞にアポトーシスを引き起こすこともできることを教示する。更に、本発明は、癌性細胞においてＨ４６０−１６−２抗原を検出することの使用も教示し、これは、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の診断、治療予測及び予後のために有用であることができる。
【００７６】
本発明は、米国特許第６，１８０，３５７号で記載された方法により開発され、その効果が、細胞毒性アッセイ、動物モデルの非確立及び確立腫瘍増殖、並びに癌性疾患に罹患しているものでの延長された生存期間において確認された、Ｈ４６０−１６−２の開発及び使用を記載する。本発明は、米国特許第６，１８０，３５７号で記載された方法により開発され、その効果が、細胞毒性アッセイにおいて及び動物モデルの腫瘍増殖の予防的防止において確認された、ＡＲ３７Ａ３３５．８の開発及び使用も記載する。本発明は、標的分子ＣＤ４４に存在するエピトープ又は複数のエピトープに特異的に結合し、かつ悪性腫瘍細胞に対してインビトロ細胞毒性の特性も有するが、正常な細胞には有さず、また、腫瘍増殖の阻害及びヒト癌のインビボモデルにおける生存期間の延長を直接仲介する裸抗体を初めて記載する点において、癌治療の分野における進歩を示す。これは、同様の特性を示すものがなかったので、以前に記載された他のあらゆる抗ＣＤ４４抗体に対する進歩である。特定の種類の腫瘍の増殖及び発達に関連する事象においてＣＤ４４の直接的な関与を明確に、かつ初めて実証したので、この分野における進歩も提供する。ヒトの患者において同様の抗癌特性を示す潜在能力を有するので、癌治療における進歩も示す。更なる進歩は、これらの抗体を抗癌抗体のライブラリーに含めることが、腫瘍の増殖及び発達を標的にし、かつ阻害するのに最も有効なものを発見するため、異なる抗癌抗体の適切な組み合わせを決定することにより、異なる抗原マーカーを発現する腫瘍を標的にする可能性を向上させることである。 
【００７７】
全体として、本発明は、投与されたとき、哺乳動物においで抗原を発現している癌の腫瘍量を低減することができ、かつ治療された哺乳動物の生存期間の延長をもたらすこともできる治療剤の標的としての、Ｈ４６０−１６−２抗原の使用を教示する。本発明は、それらの抗原を標的にして、哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍量を低減するため、及びこの抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の生存期間を延長するための、ＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−１６−２及びＡＲ３７Ａ３３５．８）、それらの誘導体、リガンド、及びそれらの抗原結合フラグメントの使用も教示する。更に、本発明は、癌性細胞においてＨ４６０−１６−２及びＡＲ３７Ａ３３５．８抗原を検出することの使用も教示し、これは、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の診断、治療予測及び予後のために有用であることができる。
【００７８】
したがって、ハイブリドーマ細胞株、並びに対応する単離モノクローナル抗体及び前記ハイブリドーマ細胞株がコードされているその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個人由来の癌性細胞又は１つ以上の特定の癌細胞株に対して生じた癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）（ここでＣＤＭＡＢは、癌細胞に関しては細胞毒性があるが、同時に、非癌性細胞には相対的に非毒性である）を産生する方法を利用することが、本発明の目的である。
【００７９】
癌性疾患修飾抗体、そのリガンド及び抗原結合フラグメントを教示することが、本発明の追加的な目的である。
【００８０】
その細胞障害性が抗体依存性細胞毒性により仲介される癌性疾患修飾抗体及びリガンドを産生することが、本発明の更なる目的である。
【００８１】
その細胞障害性が補体依存性細胞毒性により仲介される癌性疾患修飾抗体及びリガンドを産生することが、本発明のなお追加的な目的である。
【００８２】
その細胞障害性が細胞の化学的結合の加水分解を触媒する能力の機能である癌性疾患修飾抗体及びリガンドを産生することが、本発明のまた更なる目的である。 
【００８３】
本発明のまた更なる目的は、癌の診断、予後及びモニタリングのための結合アッセイに有用である癌性疾患修飾抗体又はリガンドを産生することである。
【００８４】
本発明の他の目的及び利点は、以下の記載によって明らかとなり、例示及び実施例によって、本発明の特定の実施態様が記載される。 
【００８５】
（図面の簡単な説明）
図１は、細胞株ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ及びＣＣＤ−２７ｓｋに対するＡＲ３７Ａ３３５．８ハイブリドーマ上澄みの細胞障害性及び結合レベルの率を比較する。 
図２は、細胞障害性アッセイにおける陽性及び陰性対照と対比したＡＲ３７Ａ３３５．８の比較である。
図３は、癌及び正常細胞株へのＡＲ３７Ａ３３５．８及び抗ＥＧＦＲ対照の結合を表す。データを、アイソタイプ対照を越える増加倍数として平均蛍光強度を表して表にまとめる。 
図４は、癌及び非癌細胞株に対して向けられたＡＲ３７Ａ３３５．８及び抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
図５は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。縦破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図６は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図７は、予防ＳＷ１１１６結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。縦破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図８は、予防ＳＷ１１１６結腸癌モデルにおける体重に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 
図９は、ＡＲ３７Ａ３３５．８及びＨ４６０−１６−２でプローブした、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分（レーン１）及びＰＣ−３の全細胞溶解産物（レーン２）及びＣＣＤ−２７ｓｋ細胞株（レーン３）から得た試料のウエスタンブロットである。
図１０は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、抗ＣＤ４４  Ｈ４６０−１６−２の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。ブロットの個別のレーンを、ＡＲ３７Ａ３３５．８（レーン１）、Ｈ４６０−１６−２（レーン２）又はアイソタイプ対照抗体（レーン３）でプローブした。
図１１は、ヒト前立腺腫瘍及び正常組織マイクロアレイに対するＨ４６０−１６−２結合のまとめである。 
図１２は、ヒト組織マイクロアレイから、Ｈ４６０−１６−２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た前立腺腫瘍組織の結合パターン及びＨ４６０−１６−２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た正常前立腺組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。Ｈ４６０−１６−２は、腫瘍細胞に対して強い陽性染色を示し、正常組織の間質線維芽細胞に対して弱い染色を示した。倍率は２００×である。
図１３は、ヒト肝腫瘍及び正常組織マイクロアレイに対するＨ４６０−１６−２結合のまとめである。
図１４は、ヒト組織マイクロアレイから、Ｈ４６０−１６−２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た肝腫瘍組織の結合パターン及びＨ４６０−１６−２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た非腫瘍性肝臓組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。Ｈ４６０−１６−２は、腫瘍細胞に対して強い陽性染色を示し、非腫瘍性肝臓組織では類洞細胞（黒色矢印）及び浸潤性リンパ球（緑色矢印）の染色に限定された。倍率は２００×である。
図１５は、ＴＵＮＥＬアッセイ又はＨ＆Ｅ染色により決定された、Ｈ４６０−１６−２又は緩衝剤処置後の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植におけるアポトーシス細胞の数のまとめである。
図１６は、Ｈ４６０−１６−２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物である。軽鎖反応（パネルＡ）は、ＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆ（レーン１）又はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃ（レーン２）順方向プライマーを使用して増幅した。重鎖反応（パネルＢ）は、ＭｕＩｇＶＨ５′−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦ順方向プライマーのミックスを使用して増幅した。両方の軽鎖反応（パネルＡ、レーン１及び２）は、４５０ｂｐで強いバンドを示し、また８５０ｂｐで弱いバンドを示す。４５０ｂｐバンドは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子を含む標的バンドである。重鎖反応（パネルＢ、レーン１）は、５００ｂｐで強いバンドを示し、１０００ｂｐで弱いバンドを示す。５００ｂｐのバンドは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する標的バンドである。
図１７は、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）で形質転換された大腸菌から単離したＥｃｏＲ  Ｉ消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。最初の数字は、使用した順方向プライマーを示し（１はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆ、２はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃ）、２番目の数字はクローン番号を示す（１〜５）。分子量マーカーを左側に示す。矢印は、所望のＨ４６０−１６−２Ｖｋ挿入の位置を示す。 
図１８は、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）で形質転換された大腸菌から単離したＥｃｏＲ  Ｉ消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。分子量マーカーを左側に示す。クローン１、２、３、４、５及び８は、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する所望の５００ｂｐバンドを示す。 
図１９は、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
図２０は、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）で形質転換された大腸菌から単離したＥｃｏＲ  Ｉ消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。分子量マーカーを左側に示す。矢印は、所望のＨ４６０−１６−２Ｖｈ挿入の位置を示す。 
図２１は、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）及びｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
図２２は、ｐＨＣ−ｈｕＣｇ１ベクター（ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１とも呼ばれる）の概略プラスミドマップである。ヒトＣγ１の定常部領域は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＸｈｏ  Ｉの制限部位の間にある。細菌（アンピシリン）及び哺乳類細胞（ネオマイシン）の選択マーカーが示されている。このプラスミドは、Ｇ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎらにより提供された。 
図２３はプライマー配列である。
図２４は、現存するテンプレートに適切な制限部位を付加した、ＰＣＲ増幅ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（パネルＡ、レーン１）、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ（パネルＡ、レーン２）、及びＨ４６０−１６−２Ｖｈ（パネルＢ、レーン１）ＰＣＲ増幅である。ＢｓｉＷ  Ｉ部位を、ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１ベクターの現存するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位の直ぐ下流に付加した。１１００ｂｐバンド（レーン１）は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位とＸｂａ  Ｉ部位の間のプラスミドの増幅領域である。Ｎｈｅ  Ｉ部位を、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子の５′末端に付加し、Ｎｏｔ  Ｉ部位を３′末端に付加した。Ｎｈｅ  Ｉ部位を、遺伝子の５′末端に付加し、ＢｓｉＷ  Ｉ部位を３′末端に付加した。得られたＨ４６０−１６−２Ｖｋ（パネルＡ、レーン２）及びＨ４６０−１６−２Ｖｈ（パネルＢ、レーン１）バンドのサイズは、極めて少数のヌクレオチドしか加えなかったので、元の遺伝子のサイズと同様の約４５０ｂｐである。
図２５は、ＩｇＧ１のＰＣＲ産物（レーン１）及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミド（レーン２）のヒト重鎖定常部領域の消化である。パネルＡはＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用する単一消化である。パネルＢは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉを使用する二重消化である。ＰＣＲ産物（レーン１）のサイズは、極めて少数のヌクレオチドしか消化により除去されなかったので、消化間（パネルＡ及びＢ）で変わらず、約１０００ｂｐである。ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミド（レーン２）は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩにより完全に直線化した（パネルＡ）。消化ＰＣＲ産物とサイズが等しいバンドが、およそ１０００ｂｐでプラスミド二重消化（レーン２、パネルＢ）において表れる。これは、新たなＢｓｉＷ  Ｉ部位を含むＰＣＲ産物に代えられたプラスミドの一部である。
図２６は、異なる切断部位でのＢｓｉＷ  Ｉ消化ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１である。ＢｓｉＷ  Ｉ制限部位をｐＣＨ−ｈｕＩｇ１に付加して、Ｈ４６０−１６−２（内部Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有する）のクローニングを促進した。プラスミドを、改変プラスミドで形質転換した大腸菌細胞から単離し、ＢｓｉＷ  Ｉで消化して、切断部位が組み込まれているかを決定した。クローン番号を、未消化対照プラスミド（クローン＃５）であるレーン１１の場合を除いて、それぞれのレーンの上に示す。４及び８を除く全てのクローンは消化されると直線化し、これらが新たな切断部位を含むこことが確認される。クローン４及び８は、未切断対照のレーン１１と同一であると思われ、これらが新たな切断部位を含まないことを示す。
図２７は、ｐＣＬ−ｈｕＣｋベクターの概略プラスミドマップである。ヒトＣｋの定常部領域は、Ｎｏｔ  Ｉ制限部位とＸｈｏ  Ｉ制限部位の間にある。可変部領域は、Ｎｈｅ  Ｉ部位とＮｏｔ  Ｉ部位の間にある。細菌（アンピシリン）及び哺乳類細胞（ピューロマイシン）の選択マーカーが示されている。このプラスミドは、Ｇ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎらにより提供された。
図２８は、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化されたｐＣＬ−ｈｕＣｋ及びＨ４６０−１６−２Ｖｋである。ｐＣＬ−ｈｕＣｋプラスミド（レーン１）及びＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物（レーン２）を、両方ともＢｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化して、クローニングを促進した。消化プラスミド（レーン１）は、プラスミド骨格である大きいバンドとして表れ、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋに代えられている軽鎖可変部領域である約４００ｂｐバンドとして表れる。Ｈ４６０−１６−２ＶｋのＰＣＲ産物（レーン２）も約４００ｂｐで表れ、これは軽鎖可変部領域の予測されるサイズである。
図２９は、ＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉで消化されたＨ４６０−１６−２Ｖｈ及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１である。パネルＡは、４５０ｐｂでＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉにより消化されたＨ４６０−１６−２ＶｈのＰＣＲ産物を示す。パネルＢは、ＢｓｉＷ  Ｉ（レーン１）並びにＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉ（レーン２）で消化されたｐＣＨ−ｈｕＩｇ１を示す。単一ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１消化（パネルＢ、レーン１）は、大きなバンドとして表れ、二重消化では４５０ｂｐ挿入で大きなバンドとして表れ（パネルＢ、レーン２）、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈに代えられている重鎖可変部領域に対応する。 
図３０は、１％アガロースゲルにかけた、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化されたｐＣＬ−ｈｕＣｋ（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）形質転換大腸菌から単離したプラスミドである。レーン上部の番号はクローン番号を示す。＃１を除いた全てのクローンは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子に対応する所望の約４００ｂｐ挿入を示す。 
図３１は、１．２パーセントアガロースゲルにかけた、ＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉで消化されたｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）により形質転換された大腸菌から単離されたプラスミドである。レーン上部の番号はクローン番号を示す。全てのクローンは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する所望の約４５０ｂｐ挿入を有する。 
図３２は、ｐＮＥＦ３８発現ベクター（ＩＣＯＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のプラスミド概略図である。キメラＨ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子を、Ｍｌｕ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉ制限部位を使用して多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローンしたこのプラスミドの選択マーカーは、ネオマイシン耐性（ＮｅｏＲ）遺伝子であり、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８硫酸塩）の存在下で増殖する能力を有する形質移入細胞を提供する。 
図３３は、ｐＤＥＦ３８発現ベクター（ＩＣＯＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のプラスミド概略図である。キメラＨ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子を、Ｍｌｕ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉ制限部位を使用して多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローンしたこのプラスミドの選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子であり、チミジン及びヒポキサンチンの不在下で増殖する能力を有する形質移入ＤＨＦＲ欠損細胞を提供する。
図３４は、それぞれ１．２パーセントと１．０パーセントのアガロースゲルにかけた、制限部位を変えるキメラＨ４６０−１６−２Ｖｋ（パネルＡ）及びＶＨ（パネルＢ）ＰＣＲ産物である。キメラ軽鎖ＰＣＲ反応（パネルＡ、レーン１）は、約８００ｂｐで単一バンドを生じ、これは軽可変部領域（４２０ｂｐ）と定常部領域（３２０ｂｐ）を組み合わせた予測されるサイズに匹敵する。重鎖ＰＣＲ反応（パネルＢ）は、単一の約１５００ｂｐバンドを生じ、これは重可変部領域（４５０ｂｐ）と定常部領域（９９０ｂｐ）の両方を組み合わせた予測されるサイズに匹敵する。
図３５は、Ｘｂａ  Ｉ及びＭｕｌ  Ｉで消化されたｐＮＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）（パネルＡ）及びｐＤＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）（パネルＢ）形質転換大腸菌から単離したプラスミドである。重鎖プラスミド（パネルＢ）は、また、Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｕｌ  Ｉ及びＢｓｉＷ  Ｉ（レーン１Ｂ、２Ｂ、４Ｂ及び６Ｂ）で三重に消化された。軽鎖プラスミド（パネルＡ）では、＃３を除いて全てのクローンが所望の７５０ｂｐ挿入を有し、それは軽鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。重鎖プラスミドではでは、Ｘｂａ  Ｉ及びＭｌｕ  Ｉ消化物（パネルＢ、レーン１Ａ、２Ａ及び６Ａ）は、１５００ｂｐ挿入を示し、これは重鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｕｌ  Ｉ及びＢｓｉＷ  Ｉで消化された重鎖プラスミド（パネルＢ、レーン１Ｂ、２Ｂ及び６Ｂ）は、１０００ｂｐ及び５００ｂｐでバンドを示し、これらはそれぞれ重鎖定常部領域及び可変部領域に対応する。クローン４（パネルＢ）は、全く表れず、反応設定に問題があったことを示した。
図３６は、ｐＮＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）及びｐＤＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。 
図３７は、ｐＭＰＧＣＲ５ＩｇＧ１−Ｖｋ＋ｈＨ４６０のマップである。Ｒ＆ＢポリＡ：ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル；ｐｈＣＭＶ：サイトメガウイルスプロモーター；Ａｄ  Ｔｐｌ；アデノウイルス三者間リーダー；Ｐ２（６）：ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ｃＴＡ）の結合ドメイン；ＩｇＧ１−ＶｈＨ４６０：Ｈ４６０−１６−２の重鎖のコード配列；ＶｋＨ４６０；Ｈ４６０−１６−２軽鎖のコード配列；ＢＫ  Ｔ３′：ＢＫウイルスの大型Ｔ抗原の部分；ＴＫ：チミジンキナーゼ；ｅｎｈ  ＭＰＬ：アデノウイルスの主要な後期プロモーターのエンハンサー。
図３８は、ｐＭＰＧＣＲ５Ｂ４３ｋのマップである。
図３９は、ｐｋＣＲ５Ｂ４３Ｇ３のマップである。
図４０は、異なるクローン（レーン１〜６：それぞれ０、２５、５０、１００、１５０及び２００ｎｇのヒトＩｇＧ；レーン７：クローン１７；レーン８：クローン７１：レーン９：クローン８０；レーン１０：クローン６′；レーン１１：クローン４７′；レーン１２：クローン１４７′；レーン１３：１００ｎｇの純粋なＨ４６０−１６−２；レーン１４：１０マイクロリットルのハイブリドーマ血清）で産生されたＨ４６０−１６−２（ＩｇＧ１アイソタイプ）のウエスタンブロットによる定量化である。
図４１は、異なるクローン（レーン1〜５：それぞれ５０、１００、１５０、２００及び０ｎｇのヒトＩｇＧ；レーン６：クローン１７；レーン７：クローン７１：レーン８：クローン８０；レーン９：クローン６′；レーン１０：クローン４７′；レーン１１：クローン１４７′；レーン１２：１００ｎｇの、細胞上澄みを有するヒトＩｇＧ；レーン１３：１００ｎｇの純粋なＨ４６０−１６−２；レーン１４：１０マイクロリットルのハイブリドーマ血清）で産生されたＨ４６０−１６−２（ＩｇＧ１アイソタイプ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量化である。
図４２は、ｐＭＰＧＣＲ５ＶＫ＋ｈ４６０−ＩｇＧ２のマップである。Ｒ＆ＢポリＡ：ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル；ｐｈＣＭＶ：サイトメガウイルスプロモーター；Ａｄ  Ｔｐｌ；アデノウイルス三者間リーダー；Ｐ２（６）：ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ｃＴＡ）の結合ドメイン；Ｖｈ−Ｈ４６０ＩｇＧ２：Ｈ４６０−１６−２の重鎖のコード配列；Ｖｋ−Ｈ４６０；Ｈ４６０−１６−２軽鎖のコード配列；ＢＫ  Ｔ：ＢＫウイルスの大型Ｔ抗原の部分；ＴＫ：チミジンキナーゼ；ｅｎｈ  ＭＰＬ：アデノウイルスの主要な後期プロモーターのエンハンサー。
図４３は、Ｈ４６０−１６−２のキメラＩｇＧ２アイソタイプを作成するのに使用したプライマーのリストである。 
図４４は、最初の一連のクローニングの後のウエスタンブロットによるＨ４６０−１６−２のＩｇＧ２アイソタイプの発現である。クローンから選択した２５００００個の細胞を、５００マイクロリットルの培地に再懸濁した。３７℃で２４時間後、１０マイクロリットルの上澄みを、ＨＲＰに結合した抗ヒト抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。
図４５は、異なるサブクローンからの細胞を、５．０×１０５細胞／ｍＬ、３７℃で平板培養した。細胞密度が１．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに達したとき、３０℃に移した。３０℃で７日間後、指定量の上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏｒ−Ｏｒａｎｇｅでの染色により分析した。産生された抗体の量（ｎｇ／マイクロリットル）を示す。
図４６は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分に対するウエスタンブロッティングによるキメラ（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１クローンの特徴決定である。
図４７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分に対するウエスタンブロッティングによるキメラ（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２クローンの特徴決定である。 
図４８は、ＣＨＯｃＴＡクローン６′により産生された抗体の抗体濃縮の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色による分析である。
図４９は、クローン４０Ｂ７により産生された抗体の抗体濃縮の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色による分析である。
図５０は、ヒト乳癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＨ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ｌｇＧ１及び（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２による処置の効果を示す。腫瘍容量は、群平均±ＳＥＭとして表す。縦破線は、投与の最初と最後の日を示す。 
図５１は、研究の期間中の体重に対するモノクローナル抗体による処置の効果を示す。体重は、群平均±ＳＥＭとして表す。
図５２は、２つの別々の、アネキシンＶ染色実験で得られたネズミ及びキメラＨ４６０−１６−２抗体の全体的なアポトーシス効果を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
一般に、以下の語又は語句は、発明の開示、記載、実施例及び請求項で使用される場合に、示された定義を有する。 
【００８７】
用語「抗体」は、最も広範囲な意味で使用され、具体的には、例えば単一モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体、脱免疫化、ネズミ、キメラ化又はヒト化抗体を含む）、ポリエピトープ的特異性を有する抗体組成物、単鎖抗体、免疫複合体及び抗体のフラグメントを網羅する（下記を参照すること）。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質の抗体の個体群から得られる抗体を意味し、すなわち、個体群に含まれる個別の抗体は、少量で存在しうる天然に生じる突然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられる。更に、異なる決定要因（エピトープ）に向けられている異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に向けられている。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体で汚染されることなく合成することができる点において有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質の抗体個体群から得られる抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法により抗体を産生する必要性があると考慮されるべきでない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ（ネズミ又はヒト）法により作製することができるか、又は組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照すること）により作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。 
【００８９】
「抗体フラグメント」は、無処置抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合又は可変部領域を含む。抗体フラグメントの例には、完全長に満たない抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖフラグメント；二特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；単鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組み換えタンパク質、並びに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００９０】
「無処置」抗体は、抗原結合可変部領域を含み、またさらに、軽鎖定常部ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常部ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常部ドメインは、未変性配列定常部ドメイン（例えば、ヒト未変性配列定常部ドメイン）又はアミノ酸配列可変部ドメインであることができる。好ましくは、無処置抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００９１】
重鎖の定常部ドメインのアミノ酸配列に応じて、無処置抗体を異なる「部類」に指定することができる。これらは、無処置抗体の５つの主要な部類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、これらのうちの幾つかは、更に「下位分類」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なる部類に対応する重鎖定常部ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なる部類のサブユニット構造及び三次元配置がよく知られている。
【００９２】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（未変性配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列可変部Ｆｃ領域）に寄与する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞障害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）；食菌作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。
【００９３】
「抗体依存性細胞仲介細胞障害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞仲介反応を意味する。ＡＤＣＣを仲介する一次細胞である、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現をまとめたものが、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の第４６４頁、表３である。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は追加的には、目的分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。 
【００９４】
「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、その未変性供給源から、例えば、本明細書に記載されている血液又はＰＢＭＣから単離することができる。
【００９５】
用語「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｅ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好ましいＦｃＲは、未変性配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）に結合するものであり、これらのレセプターの対立変種及び代替的なスプライス型を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ下位分類のレセプターが含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が含まれ、主に細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）の論評を参照すること）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｈ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において検討されている。将来的に同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語には、母親ＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児レセプターＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【００９６】
「補体依存性細胞障害性」又は「ＣＤＣ］は、分子が補体の存在下で標的を溶解する能力を意味する。補体活性化経路は、補体系（Ｃｌｑ）の最初の成分と、同族抗原と複合体を形成している分子（例えば、抗体）との結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実行することができる。
【００９７】
用語「可変部」は、抗体のうちで可変部ドメインの特定の部分が、配列において大きく異なり、特定の抗原に対するそれぞれ特定の抗体の結合及び特異性のために使用される、という事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変部ドメインの全体にわたって均一に分布されてはいない。軽鎖と重鎖の両方の可変部ドメインにおいて超可変部領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変部ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。未変性重及び軽鎖の可変部ドメインは、それぞれ、＞シート構造に結合しているループを形成しており、幾つかの場合ではその一部分を形成している、３つの超可変部領域により結合しているほぼβシート形状をしている４つのＦＲを含む。それぞれの鎖における超可変部領域は、ＦＲにより近接して一緒に保持され、他の鎖の超可変部領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照すること）。定常部ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関わらないが、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）における抗体の参加のような、種々のエフェクター機能を示す。 
【００９８】
本明細書で使用されるとき、用語「超可変部領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変部領域は、一般に「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変部ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、重鎖可変部ドメインにおける残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））並びに／又は「超可変部ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変部ドメインにおける残基２６３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、重鎖可変部ドメインにおける残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ］残基は、本明細書で定義されている超可変部領域残基以外の可変部ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを産生し、それぞれ単一の抗原結合部位と、その名称が容易に結晶化する能力を反映している残基「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ′）２フラグメントが生じる。
【００９９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有的関連がある１つの重鎖と１つの軽鎖の可変部ドメインの二量体から構成される。それぞれの可変部ドメインの３つの超可変部領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定するのが、この配置である。集合的には、６つの超可変部領域が抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、単一の可変部ドメイン（又は抗原に特異性のある３つの超可変部領域しか含まない半分のＦｖ）でさえも、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は低い。Ｆａｂフラグメントも、軽鎖の定常部ドメインと重鎖の第１定常部ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ′フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基を付加することによって、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、定常部ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ′の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントは、元々、その間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ′フラグメントとして産生された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。 
【０１００】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」を、その定常部ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、明確に区別される２つの型のうちの１つに割り当てることができる。
【０１０１】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のためにｓｃＦｖを所望の構造に形成することができる、ＶＨとＶＬのドメインの間にあるポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖについての検討は、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照すること。 
【０１０２】
用語「二特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであり、フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において可変部軽ドメイン（ＶＬ）に結合している可変部重ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖で２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補ドメインと対を形成して、２つの抗原結合部位を作り出すことが強要される。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に記載されている。
【０１０３】
「単離」抗体は、自然環境の成分から同定、分離及び／又は回収されたものである。自然環境の汚染成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。単離抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分も存在しないので、組み換え細胞内原位置の抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【０１０４】
目的の抗原、例えばＣＤ４４抗原部位に「結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞を標的にする治療剤として有用であるように、十分な親和性を持って抗原部位に結合することができるものである。抗体がＣＤ４４抗原部分に結合するものである場合、通常は、他のレセプターではなくてＣＤ４４抗原部分に優先的に結合し、非特異性Ｆｃ接触のような偶発的に結合するもの又は他の抗原では一般的である翻訳後修飾へ結合するものは含まれず、他のタンパク質と有意に交差反応しないものでありうる。目的の抗原に結合する抗体を検出する方法は、当該技術において周知であり、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットのようなアッセイが含まれうるが、これらに限定はされない。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」は交換可能に使用され、そのような名称には全て子孫が含まれる。全ての子孫は、意図的な又は偶然の突然変異のために、ＤＮＡ含有が正確に同一ではない場合があることも理解される。元の形質転換細胞でスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。明確な名称が意図されることが文脈から明らかとなる。
【０１０６】
「治療」は、治療処置と、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を意味し、目的は、標的とする病理的状態又は障害を予防又は遅延（軽減）することである。治療の必要なものには、既に障害を有しているもの、並びに障害を有する傾向のあるもの又は障害が予防されなければならないものが含まれる。したがって、本明細書における治療される哺乳動物は、障害を有していると診断される場合があるか、又は障害に罹患しやすくなっているか若しくは敏感になっている場合がある。
【０１０７】
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には無調節細胞増殖又は死により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を意味するか又はそれを記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。より詳細には、そのような癌の例には、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小型細胞肺癌、非小型細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃又は腹部の癌、膵癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎性癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、並びに頭部及び頸部の癌が挙げられる。 
【０１０８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロースホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドーパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチローロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロメタミン、酸化メクロエタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カムルスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸のような葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファアミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；
２，２′，２″−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバントロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。また、この定義に含まれるものは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンのような抗アンドロゲン、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤である。
【０１０９】
治療目的の「哺乳動物」は、ヒト、マウス、ＳＣＩＤ又はヌードマウス又はマウスの系統、家畜、動物園の動物、競技用の動物又は愛玩動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
【０１１０】
「オリゴヌクレオチド」は、１９８８年５月４日に公開されたＥＰ２６６，０３２に記載された固相技術を使用して、又はＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６に記載されているデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して、既知の方法（例えば、ホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホラミダイト化学）によって化学的に合成された長さが短い一本又は二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。次にこれらはポリアクリルアミドゲルで精製される。
【０１１１】
特に指示のない限り、本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ４４抗原部分」は、単鎖ヒアルロン酸（ＨＡ）結合糖タンパク質を意味し、ヒアルロネートレセプター、Ｈ−ＣＡＭ、ｇｐ８５及びＨｅｒｍｅｓとも呼ばれる。
【０１１２】
「アポトーシス」を誘発する抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡ断片化、細胞縮化、小胞体の拡張、細胞断片化及び／又は膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成により決定されるプログラム細胞死を誘発するものである。 
【０１１３】
本明細書のモノクローナル抗体は、特に、所望の生物学的活性を示す限り、その重及び／又は軽鎖の部分が、特定の種から誘導されるか又は特定の抗体の部類若しくは下位分類に属している抗体における対応する配列と同一であるか又は相同性があり、一方、残りの鎖が、別の種から誘導されるか又は別の抗体の部類若しくは下位分類に属している抗体、またそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか又は相同性がある「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１１４】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最低限の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２又は抗体の他の抗原結合部分配列）である。大部分の場合において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基に代えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基に代えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも外来ＣＤＲ又はＦＲ配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、更に精製され、抗体性能が最適化される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変部ドメインを実質的に全て含み、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常部領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。
【０１１５】
「脱免疫化」抗体は、所定の種に対して非免疫原性であるか又は免疫原性が低い免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体に対する構造改変によって達成することができる。当業者に既知のあらゆる脱免疫化技術を用いることができる。抗体を脱免疫化する一つの適切な技術が、例えば、２０００年６月１５日公開のＷＯ００／３４３１７に記載されている。 
【０１１６】
「相同性」は、配列を並置し、必要であればギャップを導入して最大相同率を達成した後に同一である、アミノ酸配列可変部における残基の率として定義される。並置の方法及びそのためのコンピュータープログラムは、当該技術でよく知られている。 
【０１１７】
本明細書の全体を通して、ハイブリドーマ細胞株、並びにそれから産生される単離モノクローナル抗体は、内部名称であるＨ４６０−１６−２及びＡＲ３７Ａ３３５．８又は寄託名称であるＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６とそれぞれ代替的に呼ばれる。 
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、「リガンド」には、標的抗原に特異的な結合を示す部分が含まれ、無処置抗体分子及び少なくとも抗原結合領域又はその部分（すなわち、抗体分子の可変部部分）を有する任意の分子、例えばＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ′分子、Ｆ（ａｂ′）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、又はＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６と称されるハイブリドーマ細胞株により産生された単離モノクローナル抗体に結合している抗原（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗原）を特異的に認識し結合する任意の遺伝子操作された分子であることができる。
【０１１９】
本明細書で使用されるとき、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する分子の部分を意味する。 
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、「競合的に阻害する」は、従来の相互抗体競合アッセイを使用して、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６と呼ばれるハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体（ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗体）が向けられる決定基を認識し、それに結合することができることを意味する。（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｃ．ａｎｄ  Ｄｕｆｏｕｒ  Ｄ．（１９７３），Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ  ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８，１５）。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、「標的抗原」は、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗原又はその部分である。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、「免疫複合体」は、細胞毒素、放射性作用物質、酵素、毒素、抗腫瘍薬又は治療剤に化学的又は生物学的に結合している抗体のような任意の分子又はリガンドを意味する。抗体は、細胞毒素、放射性作用物質、抗腫瘍薬又は治療剤に、その標的に結合することができる限り、分子に沿って任意の位置に結合することができる。免疫複合体の例には、抗体毒素化学複合体及び抗体毒素融合タンパク質が挙げられる。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、抗原結合領域が、生物学的に活性な分子、例えば、毒素、酵素又はタンパク質薬物に結合している任意のキメラタンパク質を意味する。
【０１２４】
本明細書に記載される発明がより完全に理解できるために、下記の説明を記載する。
【０１２５】
本発明は、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗原を特異的に認識し、それに結合するリガンド（すなわち、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６リガンド）を提供する。
【０１２６】
本発明のリガンドは、ハイブリドーマＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６により産生されたモノクローナル抗体のその標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態であることができる。したがって、ＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗体と同じ結合特異性を有するあらゆる組み換えタンパク質（例えば、抗体がリンホカイン又は腫瘍阻害性増殖因子のような第２タンパク質と組み合わされた融合タンパク質）が、本発明の範囲内に入る。
【０１２７】
本発明の一つの実施態様において、リガンドは、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗体である。 
【０１２８】
別の実施態様において、リガンドは抗原結合フラグメントであり、それは、Ｆｖ分子（例えば、単鎖Ｆｖ分子）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ′分子、Ｆ（ａｂ′）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、異種抗体、又はＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗体の抗原結合領域を有する任意の組み換え分子であることができる。本発明のリガンドは、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６モノクローナル抗体が向けられているエピトープに向けられている。
【０１２９】
本発明のリガンドは、誘導体分子を産生するように修飾されることができ、すなわち、分子内のアミノ酸修飾によって修飾されることができる。化学修飾も可能でありうる。
【０１３０】
誘導体分子は、ポリペプチドの機能特性を保持し、すなわち、そのような置換を有する分子は、ポリペプチドの、ＰＴＡ−４６２１又はＩＤＡＣ２８０１０４−０６抗原又はその部分への結合を依然として許容する。
【０１３１】
これらのアミノ酸置換には、当該技術において「保存的」として知られているアミノ酸置換が含まれるが、これに限定される必要はない。 
【０１３２】
例えば、「保存的アミノ酸置換」と称される特定のアミノ酸置換は、タンパク質においてタンパク質の立体配座又は機能のいずれかを改変することなく頻繁に行うことができる、十分に確立されたタンパク質化学の原理である。 
【０１３３】
そのような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかで他の疎水性アミノ酸のいずれかを、アスパラギン酸（Ｄ）でグルタミン酸（Ｅ）を（及びその逆を）、グルタミン（Ｑ）でアスパラギン（Ｎ）を（及びその逆を）、並びにセリン（Ｓ）でトレオニン（Ｔ）を（及びその逆を）置換することが含まれる。他の置換を、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、保存的であると考慮することもできる。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、頻繁に交換可能であることができ、アラニン及びバリン（Ｖ）も同様である。相対的に疎水性であるメチオニン（Ｍ）を、ロイシン及びイソロイシンと頻繁に、バリンとは時々交換することができる。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、位置を頻繁に交換することができ、それは、アミノ酸残基の有意な特徴はその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基のｐＫが異なることは有意ではないからである。さらに他の変化も特定の環境下では「保存的」であると考慮することができる。
【０１３４】
抗体を得ると、個別の当業者は、競合的に阻害するリガンド、例えば競合抗体を生成することができ、これは同じエピトープを認識するものである（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）。一つの方法は、抗体により認識される抗原を発現する免疫原により免疫化することを伴うことができる。試料には、組織、単離タンパク質又は細胞株が含まれうるが、これらに限定はされない。得られたハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又は免疫沈降のような、試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するものである競合アッセイを使用して、スクリーニングすることができる。別の方法は、ファージディスプレーライブラリーを使用し、前記抗原を認識する抗体をパニングすることによって行うことができる（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。どちらの場合でも、バイブリドーマは、最初の抗体とその標的抗原の結合に打ち勝つ能力に基づいて選択される。したがって、そのようなハイブリドーマは、最初の抗体と同じ抗原を認識する特性を有し、より詳細には、同じエピトープを認識する。 
【０１３５】
実施例１
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８
ハイブリドーマ細胞株ＡＲ３７Ａ３３５．８を、ブダペスト条約に従って、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ（ＩＤＡＣ），Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃａｎａｄａ，Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２に、受入番号２８０１０４−０６で２００４年１月２８日に寄託した。３７  ＣＦＲ  １．８０８に従って、寄託者は、寄託物質の公共利用性に対して課せられている全ての制限が、特許の付与にあたって変更不能に解除されることを確認する。 
【０１３６】
抗癌抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８を産生するハイブリドーマを産生するために、ＳＣＩＤマウスにおいて固形腫瘍として増殖したＰＣ−３前立腺癌細胞株の新たな単一細胞懸濁液をＰＢＳで調製した。ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）アジュバントを、穏やかに混合することによって使用のために調製した。５〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０マイクロリットルの抗原アジュバント中の２百万の細胞を皮下注射することにより免疫化した。最近調製した抗原アジュバントを使用して、最初の免疫化の２及び５週間後に、５０マイクロリットル中の２百万細胞により腹腔内で免疫化マウスを追加免疫した。最後の免疫化の３日後に、脾臓を融合のために使用した。ハイブリドーマは、単離脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合することによって調製した。融合体の上澄みを、ハイブリドーマのサブクローンで試験した。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞により分泌された抗体がＩｇＧ又はＩｇＭアイソタイプであるかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。１００マイクロリットル／ウエルの、４℃の被覆緩衝剤（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝剤、ｐＨ９．２〜９．６）中の濃度２．４マイクログラム／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を、ＥＬＩＳＡプレートに一晩加えた。プレートを洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルの遮断緩衝剤（洗浄緩衝剤中５％ミルク）をプレートに室温で1時間加え、次に洗浄緩衝剤で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのハイブリドーマ上澄みを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝剤で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルの、ヤギ抗マウスＩｇＧ又はＩｇＭのホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体いずれかの１／１００，０００希釈（５％ミルクを含有するＰＢＳで希釈した）を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ溶液を、室温で１〜３分間インキュベートした。呈色反応を、１００マイクロリットル／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により終了させ、プレートをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレート読み取り機により４５０ｎｍで読み取った。図１に示されているように、ＡＲ３７Ａ３３５．８ハイブリドーマは、主にＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌した。
【０１３８】
ハイブリドーマ細胞により分泌された抗体の下位分類を決定するために、アイソタイプ化実験を、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して実施した。抗体含有ハイブリドーマ上澄みを、異なる種類のペプチド鎖に特異的なヤギ抗体を担持するアイソタイプ化ストリップを有する試験管（ＴＢＳ−Ｔによる１：１０希釈溶液中）に加えた。管を１５分間撹拌した。次にストリップを、撹拌しながら５分間ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識種特異的抗マウス抗体を、試験管（ＴＢＳ−Ｔによる１：５００希釈液中）に１５分間加えて、スティック上のヤギ抗体に結合しているモノクローナル抗体を検出した。ストリップを、再び、撹拌しながら５分間ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次にストリップに結合したペルオキシダーゼ標識抗体を、ペルオキシダーゼ基質系を使用して検出した。４−クロロ−１−ナフトールの錠剤３０ｍｇを、１０ｍＬの冷エタノールに溶解し、１滴の過酸化水素溶液（３０％ｖ／ｖ）を５０ｍＬのＴＢＳで希釈した。２つの溶液を使用直前に合わせ、３ｍＬをアイソタイプ化ストリップに撹拌しながら１５分間加えた。次に基質溶液を廃棄し、ストリップを５ｍＬの蒸留水で撹拌しながら３回洗浄した。次にタイプ化スティックを試験管から取り出し、結果を分析した。抗癌抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８はＩｇＧ２ｂ、ラムダアイソタイプのものである。
【０１３９】
一連の限界希釈の後、ハイブリドーマ上澄みを、細胞ＥＬＩＳＡアッセイにより標的細胞に結合する抗体について試験した。２つのヒト前立腺癌細胞株及び１つのヒト正常皮膚細胞株を試験し、それぞれＰＣ−３、ＬｎＣａｐ及びＣＣＤ−２７ｓｋであった。平板培養細胞は、使用する前に固定した。プレートを、ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＰＢＳにより室温で３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２％パラホルムアルデヒドの１００マイクロリットルを、それぞれのウエルに室温で１０分間加え、次に廃棄した。プレートを、再び、ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＰＢＳにより室温で３回洗浄した。遮断を、洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中の５％ミルクの１００マイクロリットル／ウエルにより室温で1時間実施した。プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄し、ハイブリドーマ上澄みを、１００マイクロリットル／ウエルにより室温で１時間加えた。プレートを、洗浄緩衝剤で３回洗浄し、１００マイクリットル／ウエルの、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の１／２５，０００希釈（５％ミルクを含有するＰＢＳで希釈した）を加えた。室温での１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ基質を、室温で１〜３分間インキュベートした。反応を、１００マイクロリットル／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により終了させ、プレートをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレート読み取り機により４５０ｎｍで読み取った。図１で表にまとめた結果を、試験した細胞株に結合しないことを以前に示している社内ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、バックグラウンドを越える倍数として表した。ハイブリドーマＡＲ３７Ａ３３５．８からの抗体は、前立腺癌細胞株ＰＣ−３に実質的な結合を示し、皮膚細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋに結合を示した。ＡＲ３７Ａ３３５．８は、別の前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐには検出可能な結合を何も示さなかった。
【０１４０】
抗体結合についての試験と共に、ハイブリドーマ上澄みの細胞毒性効果を、同じ細胞株ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ及びＣＣＤ−２７ｓｋで試験した。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得た。アッセイを、製造会社の使用説明書に従い、下記に概説するように変えて実施した。細胞を、アッセイの前に、所定の適切な密度で平板培養した。２日後、ハイブリドーママイクロタイタープレートの上澄みの１００μｌを、細胞プレートに移し、５パーセントＣＯ２インキュベーターで５日間インキュベートした。陽性対照としての役割を果たすウエルを空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）又はシクロヘキシミドを加えた。処理の５日後、プレートを逆さにして空にし、吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する室温ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）を、多チャンネルスクイーズボトルからそれぞれのウエルに分配し、３回軽く叩き、反転して空にし、次に吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで稀釈した蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルをそれぞれのウエルに加え、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００蛍光プレート読み取り機で読み取り、データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで分析した。結果を図１で表にまとめる。ＡＲ３７Ａ３３５．８ハイブリドーマは、ＬｎＣａｐ細胞の１６パーセントで特異的に細胞障害性を生じ、これは、陽性対照のアジ化ナトリウム及びシクロヘキシミドそれぞれにより得られた細胞障害性の２１パーセント及び３０パーセントであった。図１の結果は、ＡＲ３７Ａ３３５．８の細胞毒性効果が、癌細胞型への結合レベルに比例しないことを実証した。ＰＣ−３細胞と比較して、ＬｎＣａｐ細胞においてより大きなレベルの細胞障害性が生じたが、ＰＣ−３細胞での結合レベルはより高かった。したがって、結合は、抗体のその同族抗原との連結の結果を必ずしも予測するものではなく、明白な知見ではなかった。これは、異なる細胞における抗体連結の脈絡が、単に抗体結合ではなく細胞毒性を決定することを示唆した。図１で表にまとめたように、ＡＲ３７Ａ３３５．８はＣＣＤ−２７ｓｋ正常細胞株において細胞障害性を生じなかった。既知の非特異的細胞毒性剤のシクロヘキシミド及びＮａＮ３は、予測されたように一般的な細胞障害性を生じた。
【０１４１】
実施例２
抗体産生： 
ＡＲ３７Ａ３３５．８モノクローナル抗体は、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）中でハイブリドーマを培養し、収集及び再接種を週に２回することによって産生した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ＱＣ）による標準的な抗体精製手順に従った。ヒト、脱免疫化されている、ヒト化されている、キメラ化されている又はマウスのモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。
【０１４２】
ＡＲ３７Ａ３３５．８は、細胞障害性アッセイにおいて、多数の陽性（抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５マイクログラム／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｈｏｒｎｂｙ，ＯＮ）、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．５マイクロモル、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）及びＮａＮ３（０．１％、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ））と陰性（ＭＰＣ−１１（抗原特異性は不明、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ））の対照の両方、並びに緩衝剤希釈対照を比較した（図２）。結腸（ＤＬＤ−１及びＬｏｖｏ）と卵巣（ＯＶＣＡＲ−３）の癌、並びに非癌肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）細胞株を試験した（全て、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡからのもの）。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得た。アッセイを、製造会社の使用説明書に従い、下記に概説するように変えて実施した。細胞を、アッセイの前に、所定の適切な密度で平板培養した。２日後、１００マイクロリットルの精製抗体又は対照を培地で希釈し、次に細胞プレートに移し、５パーセントＣＯ２インキュベーターで５日間インキュベートした。次にプレートを反転して空にし、吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する室温ＤＰＢＳを、多チャンネルスクイーズボトルからそれぞれのウエルに分配し、３回軽く叩き、反転して空にし、次に吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで稀釈した蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルをそれぞれのウエルに加え、５パーセントＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００蛍光平板読み取り機で読み取り、データをマイクロソフトのエクセルで分析し、結果を図２において作表した。それぞれの抗体は、三重に試験した４つの実験で観察された平均細胞障害性に基づいて５〜５０のスコアを得て、アッセイ間で観察されたばらつきに基づいて２５〜１００のスコアを得た。これらの２つのスコアの合計（細胞障害性スコア）を、図２に提示する。５５以上の細胞障害性スコアは、試験された細胞株に対して陽性であると見なした。ＡＲ３７Ａ３３５．８抗体は、アイソタイプ及び緩衝剤陰性対照の両方と比べて、Ｌｏｖｏ及びＤＬＤ−１結腸癌細胞株において細胞障害性を生じた。ＡＲ３７Ａ３３５．８抗体は、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞株には細胞障害性を生じなかった。重要なことは、ＡＲ３７Ａ３３５．８が非癌細胞株Ｈｓ８８８．Ｌｕに対して特異的な細胞障害性を生じておらず、この抗体は癌細胞に特異的であることが示された。化学細胞毒性剤は、これらに予測される非特異的細胞障害性を誘発した。
【０１４３】
ＡＲ３７Ａ３３５．８の、上記の癌及び正常ヒト細胞株のパネルへの結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価した。  細胞は、最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を有さない）で洗浄することによって、ＦＡＣＳのために調製した。次に細胞解離緩衝剤（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して、３７℃で細胞培養プレートから細胞を取り出した。遠心分離及び収集した後、細胞を、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及び２パーセントウシ胎児血清を４℃で含有するＤＰＢＳ（染色媒質）に再懸濁し、カウントし、適切な細胞密度にアリコートし、遠心沈殿して細胞をペレットにし、試験抗体（ＡＲ３７Ａ３３５．８）又は対照抗体（アイソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ）の存在下、４℃で２０マイクログラム／ｍＬの染色培地に氷上で３０分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体の添加の前に、細胞を染色培地で１回洗浄した。次に染色培地中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗体を、３０分間加えた。次に細胞を最終的に洗浄し、固定培地（１．５％パラホルムアルデヒドを含有する染色培地）に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリー取得を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を使用したＦＡＣＳｃａｎに試料をかけて評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）及び側面散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣ及びＳＳＣ検出器の電圧及び振幅利得を調整して設定した。蛍光（ＦＩＴＣ）チャンネル用の検出器を、細胞がおよそ１〜５単位の蛍光強度中央値の均一ピークを有するように、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体でのみ染色された細胞をかけて調整した。それぞれの試料では、およそ１０，０００個の染色固定細胞を分析のために得て、結果を図３に表す。
【０１４４】
図３は、アイソタイプ対照を越える蛍光強度増加倍数の平均値を表す。ＡＲ３７Ａ３３５．８抗体の代表的なヒストグラムを図４にまとめた。ＡＲ３７Ａ３３５．８は、試験された全ての細胞株に結合を示した。これらのデータは、試験された全ての癌型への明確な結合が存在するが、Ｌｏｖｏ及びＤＬＤ−１結腸癌細胞と関連する細胞毒性しか存在しないという点で、ＡＲ３７Ａ３３５．８が機能的特異性を示すことを実証した。
【０１４５】
実施例３
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるインビボ腫瘍実験
図５及び６を参照すると、４〜６週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの食塩水中の５百万のヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に５匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ３７Ａ３３５．８試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、１週間に１回、試験の期間中、合計８用量で同じ方法により投与した。腫瘍増殖を、約７日毎にカリパスで測定した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。 
【０１４６】
ＡＲ３７Ａ３３５．８は、ヒト乳癌のＭＤＡ−ＭＢ−２３１インビボ予防モデルにおいて腫瘍増殖を著しく低減した。移植後の５５日目、つまり最終処置投与の５日後では、ＡＲ３７Ａ３３５．８Ａ処置群の平均腫瘍容量は、緩衝剤対照処置群の腫瘍容量よりも９８．８パーセント少なかった（図５）。研究の終了時の腫瘍容量は、対照と有意に異なっていた（ｐ＝０．００６４、ｔ−試験）。
【０１４７】
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、健康及び生育失敗の代用であった。図６で見られるように、対照及びＡＲ３７Ａ３３５．８処置群の両方の体重は、研究期間の間増加した。
【０１４８】
結論として、ＡＲ３７Ａ３３５．８は、耐性が十分であり、このヒト乳癌異種移植モデルで腫瘍量を減少した。
【０１４９】
実施例４
ＳＷ１１１６細胞によるインビボ腫瘍実験
図７及び８を参照すると、４〜６週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの食塩水中の５百万のヒト結腸癌細胞（ＳＷ１１１６）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に５匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ３７Ａ３３５．８試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、１週間に１回、試験の期間中、合計８用量で同じ方法により投与した。腫瘍増殖を、約７日毎にカリパスで測定した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
【０１５０】
ＡＲ３７Ａ３３５．８による処置は、ヒト結腸癌のインビボ予防モデルにおいてＳＷ１１１６で腫瘍増殖の阻害をもたらした。移植後の５５日目、つまり最終処置投与の５日後では、ＡＲ３７Ａ３３５．８Ａ処置群の平均腫瘍容量は、緩衝剤対照処置群の腫瘍容量よりも４８．７パーセント少なかった（図７）。ＡＲ３７Ａ３３５．８による処置は、対照よりも有意に少ない腫瘍容量をもたらした（ｐ＝０．００５５）。 
【０１５１】
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、健康及び生育失敗の代用であった。図８で見られるように、対照又はＡＲ３７Ａ３３５．８処置群の体重は、研究期間の間減少しなかった。また、処置期間の終了時（４８日目）又は処置後の追跡調査期間の終了時（６３日目）に、２群の間に体重の差はなかった。
【０１５２】
したがって、ＡＲ３７Ａ３３５．８は、耐性が十分であり、このヒト結腸癌異種移植モデルで腫瘍量を減少した。
【０１５３】
実施例５
ＡＲ３７Ａ３３５．８と抗ＣＤ４４  Ｈ４６０−１６−２の交差反応性の決定 
全膜画分及び全細胞溶解質のウエスタンブロットを、モノクローナル抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８と、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２でプローブした。簡潔には、培養で増殖したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から単離した２０マイクログラムの全膜画分と、ＰＣ−３及びＣＣＤ−２７ｓｋ細胞から調製した４０マイクログラムの全細胞溶解質とを、非還元条件下で、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分析した。ＰＶＤＦ膜へ電気移動した後、ブロットを、ウエスタンブロットの標準プロトコールに従って、抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８及びＨ４６０−１６−２でプローブした。モノクローナル抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８でプローブされたウエスタンブロットによる結果は、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体Ｈ４６０−１６−２で得られたものと強く類似していることを明らかにし（図９）、両方の抗体が同じ抗原、すなわちＣＤ４４を認識している可能性があることを示唆した。ＡＲ３７Ａ３３５．８がＣＤ４４分子と公差反応するかを決定するために、これを培養で増殖した細胞の全膜画分からの抗ＣＤ４４  Ｈ４６０−１６−２により得られた免疫沈降複合体のウエスタンブロットでプローブとして使用した。簡潔には、３００マイクログラムのＭＤＡ−ＭＢ−２３１全膜画分（１ｍｇ／ｍＬ最終タンパク質濃度）を、Ｈ４６０−１６−２結合タンパク質Ｇセファロースビーズと４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後、ビーズを１×非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤中で沸騰させ、試料を、１０％分離用ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分析した。ＰＶＤＦ膜へ電気移動させた後、ブロットの個別のレーンを、標準ウエスタンブロットプロトコールに従って、抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８、Ｈ４６０−１６−２及びＩｇＧ１アイソタイプ対照でプローブした。一次抗体は、全て５マイクログラム／ｍＬの濃度で使用した。得られたブロットの画像（図１０）は、ＡＲ３７Ａ３３５．８とＨ４６０−１６−２の両方が同じ抗原と交差反応することを示し、したがって、抗体ＡＲ３７Ａ３３５．８もＣＤ４４分子内に含まれるエピトープを認識することを実証した。
【０１５４】
実施例６ 
ヒト前立腺腫瘍組織の染色
ＩＨＣ研究を実施して、ヒト前立腺腫瘍組織へのＨ４６０−１６−２の結合を更に評価した。更なる実験の条件を決定するために、ＩＨＣ最適化研究を予め実施した。Ｈ４６０−１６−２モノクローナル抗体を、上記に記載したように産生及び精製した。
【０１５５】
５３個のヒト前立腺腫瘍及び３個の正常な前立腺組織への抗体の結合を、ヒト前立腺の正常及び腫瘍組織マイクロアレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施した。組織切片をオーブンにより５８℃で１時間乾燥して脱パラフィン処理し、Ｃｏｐｌｉｎジャー中のキシレンにそれぞれ４分間で５回浸漬して脱ロウした。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％から７５％）による処置の後、切片を水中で再水和した。スライドを、ｐＨ６のクエン酸緩衝剤（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）１０ｍＭに浸漬し、次に高、中及び低設定でそれぞれ５分間マイクロ波照射し、最後に冷ＰＢＳに浸漬した。次にスライドを３％過酸化水素溶液に６分間浸漬し、ＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、乾燥し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ遮断溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）と共に室温で５分間インキュベートした。Ｈ４６０−１６−２、モノクローナルマウス抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ；クローン１Ｄ１１、Ｎｏｒｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）又はアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼに向けられている;Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で、処理濃度（２マイクログラム／ｍＬに希釈された抗ＰＳＭＡを除いて、それぞれの抗体では５マイクログラム／ｍＬ）に希釈し、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。この工程の後、スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のために、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温で１０分間加えて、呈色反応を起こした。スライドを水道水で洗浄して、発色反応を止めた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）による対比染色の後、スライドを段階的なエタノール（７５から１００％）で脱水し、キシレンで清澄にした。装填培地（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドをカバーガラスで覆った。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して微視的に調べ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して、デジタル画像を得て、保存した。結果を、組織病理学者が読み取り、評価し、解釈した。 
【０１５６】
図１１は、ヒト正常及び腫瘍前立腺組織のアレイのＨ４６０−１６−２染色の結果のまとめを表す。表では、試験した腫瘍の１９／５３個（３６％）がＨ４６０−１６−２に陽性であった。Ｈ４６０−１６−２は、腫瘍細胞及び間質線維芽細胞に特異的であった。細胞局在化は、管腔局在化するか又はしないで、ほとんど膜及び細胞質膜においてであった。陽性細胞の率は、＜１０％〜＞５０％の範囲であり、抗体の腫瘍細胞への不均一な結合を示した。抗体結合と腫瘍の病期との関係は、異なる腫瘍病期の腫瘍の数に差があったので正確に評価することができなかった（それぞれ、病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶで１／１個（１００％）、４／１２個（３３％）、０／２個（０％）及び１１／３３個（３３％））。
【０１５７】
グリーソンスコアＧ１〜Ｇ２（２５％）よりもＧ３〜Ｇ４（３６％）において高い結合が存在した。グリーソンスコアは、前立腺癌を等級付けするシステムである。グリーソン等級付システムは、組織試料における癌の２つの最大領域のそれぞれに等級を割り当てる。等級は、１〜５の範囲であり、１が攻撃性が最も少なく、５が最も攻撃的である。等級３の腫瘍は、例えば、転移性をほとんど有さないが、転移性は等級４又は等級５では一般的である。次に２つの等級を合計して、グリーソンスコアを生成する。スコア２〜４は低い等級、５〜７は中程度の等級、８〜１０は高い等級と考慮される。低いグリーソンスコアを有する腫瘍は、典型的には、患者の寿命には有意な脅威をもたらさない可能性があるほどゆっくりと増殖する。
【０１５８】
３個の正常な前立腺組織切片は、全て、抗体に対して陽性であった。しかし、組織特異性が、筋上皮及び間質線維芽細胞にあり、腺上皮にはなかった。図１２は、Ｈ４６０−１６−２の、試験した前立腺組織への結合の不均一性を示し、１０／５３個、６／５３個、３／５３個の陽性腫瘍が、それぞれ＜１０〜１０％、＜５０〜５０％及び＞５０％に分類される。前立腺癌細胞へのその結合の結果、Ｈ４６０−１６−２の治療利益を、潜在的に前立腺癌の治療に拡大することができる。
【０１５９】
実施例７
ヒト肝腫瘍組織の染色 
Ｈ４６０−１６−２のヒト肝腫瘍組織への結合を更に評価するために、抗体を肝腫瘍組織アレイ（ｌｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で試験した。次の情報をそれぞれの患者から得た：年齢、性別、臓器及び診断。使用された染色手順は実施例６で開示されたものと同一であった。上記に記載したものと同じ陰性対照抗体を使用した。使用した陽性対照抗体は、抗ＡＦＰ（アルファ１フェトプロテイン；クローンＡＦＰ−１１、Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）であった。抗体は、１０マイクログラム／ｍＬの処理濃度で使用した抗ＡＦＰ以外は、全て５マイクログラム／ｍＬの処理濃度で使用した。
【０１６０】
図１３に開示されているように、Ｈ４６０−１６−２抗体は、１１／３７個（３０％）の原発性、７／８個（８８％）の転移性肝細胞癌、１／２個（５０％）の原発性、２／２個（１００％）の転移性胆管癌を含む、試験した肝癌の２１／４９個（４３％）に結合を示した。抗体は、初期の病期Ｉ及びＩＩ（ｐ＝０．０３）と比較して進行腫瘍の病期ＩＩＩ及びＩＶに有意に高い結合を示した〔病期Ｉ、０／２個（０％）；病期ＩＩ、２／１７個（１２％）；病期ＩＩＩ、８／１６個（５０％）及び病期ＩＶ、６／８個（７５％）〕。Ｈ４６０−１６−２は、腫瘍細胞及び浸潤性炎症性細胞に特異的であった。細胞局在は、主に膜であった。幾つかの腫瘍は、核酸細胞質染色パターンも示した。抗体は、９／９個の非腫瘍性肝臓組織に結合した（図１４）。しかし、結合は、類洞細胞及び浸潤性リンパ球に限定されていた。Ｈ４６０−１６−２抗原は、進行肝腫瘍組織に特異的に発現しているように思われる。したがって、ＡＨ４６０−１６−２は、肝癌の治療における治療薬として潜在能力を有する。
【０１６１】
実施例８ 
Ｈ４６０−１６−２で処置したＳＣＩＤマウス由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍組織に対するアポトーシス研究
Ｈ４６０−１６−２は、予防及び確立ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍増殖の抑制を生じる能力を示した（Ｓ．Ｎ．１０／６０３．０００に開示されている）。ＦＡＣＳを使用して、Ｈ４６０−１６−２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞周期に対する効果も実証し、この効果は、多数のアポトーシス細胞の用量依存的増加をもたらした（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，１６５に開示されている）。Ｈ４６０−１６−２の作用機構を更に解明するために、乳癌の異種移植モデルにおいてインビボで増殖したＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるアポトーシスに対するＨ４６０−１６−２処置の効果を調査した。 
【０１６２】
ヒト乳癌のＭＤＡ−ＭＢ−２３１確立モデルによる処置期間の終了時に、Ｈ４６０−１６−２群のマウスは、緩衝剤対照処置群の容量の６８．８％の平均腫瘍容量を示した（実施例１０において同様のプロセスが開示されている）。処置終了の２日後、群あたり４匹のマウスを無作為に選択し、腫瘍を採取した。採取した腫瘍を、半分に分け、１０％緩衝ホルマリンで固定した。固定した後、組織を更に切り取って、パラフィン踏め込みのためにおよそ２ｍｍの腫瘍片にした。腫瘍の全断面が表れるように、妥当な努力が払われた。組織を、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）の臨床研究実験室で染色するために、パラフィンに埋め込み、切片にし、スライドに載せた。
【０１６３】
アポトーシスを、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）からのＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓ７１０１）を使用して組織切片で評価した。ＡｐｏｐＴａｇ  Ｋｉｔは、ＴＵＮＥＬアッセイに基づき、ＤＮＡ断片化を評価することによりアポトーシスを検査する。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用して、ジゴキシゲニン−ｄＮＴＰで断片を末端標識する。組み込まれたジゴキシゲニン−ｄＮＴＰは、抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼ試薬を使用して検出した。従ったプロトコールは、キットに備えられたマニュアルに概説されていた。ＡｐｏｐＴａｇ染色及び細胞形態学は、光学顕微鏡検査法を使用して可視化した。それぞれの切片では、腫瘍の生存区域からの４つの別々の領域を使用して、染色細胞をカウントした。腫瘍の壊死領域に集中しないように注意した。４つの別々の領域からのカウントを合計して、この切片を表す合計カウントとした。カウントをそれぞれの切片毎に３回繰り返した（毎回、４つの領域に集中した）。３回のカウントから得た合計を使用して、切片の平均を得た。続いて、異なる治療群の平均カウントを計算した。図１５に示されているように、緩衝剤対照群は、３１．５細胞（±１４．６２）の平均総スコアを生じ、一方、Ｈ４６０−１６−２処置群は、４２．５細胞（±３．７０）の平均総スコアを生じた。したがって、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して決定されたように、Ｈ４６０−１６−２処置によりアポトーシスが増加する傾向がある。 
【０１６４】
ＡｐｏＴａｇ染色腫瘍の一連の切片を、続いてＨ＆Ｅ染色し、単細胞、細胞縮化及びクロマチンの高密度質量への圧縮などの形態学的基準を使用して、アポトーシス細胞について検査した。これらの基準を満たす細胞のカウントを上記のセクションに記載されているように実施して、処置分の平均カウントを得た。陽性対照スライド（正常齧歯類乳腺の授乳の３〜５日後の組織）をキットに含め、試験スライドと共に染色した。図１５に示されているように、緩衝剤対照群は、１７細胞（±５．２９）の平均総スコアを生じ、一方、Ｈ４６０−１６−２処置群は、２２．５細胞（±４．２０）の平均総スコアを生じた。したがって、細胞形態学を使用して決定されたように、Ｈ４６０−１６−２処置によりアポトーシスが増加する傾向がある。
【０１６５】
実施例９
Ｈ４６０−１６−２のキメラ化 
１．０  可変部領域遺伝子を配列決定ベクターにクローニングする
抗体キメラの産生を促進するために、重鎖と軽鎖の両方の可変部領域をコードする遺伝子を、別々に、市販の配列決定ベクターｐＣＲ２．１にクローンした。
【０１６６】
１．１  ｍＲＮＡの単離 
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（商標）Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、コンフルエントＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  Ｈ４６０−１６−２ハイブリドーマ細胞の培養から単離した。ｍＮＡを、更なる使用が必要となるまで−８０℃で保存した。
【０１６７】
１．２  可変部領域遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅 
別々の反応を実施して、軽及び重鎖可変部領域を増幅した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ｍＲＮＡテンプレートから相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を合成し、次に、標的遺伝子を特異的に増幅した。
【０１６８】
軽鎖では、１マイクロリットルのｍＲＮＡを６５℃で１０分間加熱し、次に氷で冷却した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１２．５マイクロリットルの２×ＲＴ−ＰＣＲ反応ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、１マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇκＶＬ３′−１プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、０．５マイクロリットルのＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、０．４マイクロリットルの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２５マイクロリットルまでの水の、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを使用して調製した。反応の第２のセットも、使用した順方向プライマーがＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆの代わりにＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）であったことを除いて、上記の通りに調製した。反応を熱循環器により５０℃で４０分間、続いて９４℃で２分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を、９４℃で３０秒間分、５５℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクルで実施した。最後に、ＰＣＲ産物を７２℃で１０分間加熱し、次に４℃で保存した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。
【０１６９】
重鎖では、１マイクロリットルのｍＲＮＡを６５℃で１０分間加熱し、次に氷で冷却した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１２．５マイクロリットルの２×ＲＴ−ＰＣＲ反応ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ａプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの１０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ｂプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、ＭｕＩｇＶＨ５′−Ｃプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ｄプライマー、（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ｆプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＧＶＨ３′−２プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、０．５マイクロリットルのＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、０．４マイクロリットルの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＯＮ）及び２５マイクロリットルまでの水の、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを使用して調製した。反応を熱循環器により５０℃で４０分間、続いて９４℃で２分間加熱した。ＰＣＲ反応を、９４℃で３０秒間分、５５℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクルで実施した。最後に、ＰＣＲ産物を７２℃で１０分間加熱し、次に４℃で保存した。
【０１７０】
図１６は、ＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を示す。軽鎖反応（パネルＡ）は、ＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆ（レーン１）又はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃ（レーン２）順方向プライマーを使用して増幅した。重鎖反応（パネルＢ）は、ＭｕＩｇＶＨ５′−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦ順方向プライマーのミックスを使用して増幅した。両方の軽鎖反応（パネルＡ、レーン１及び２）は、４５０ｂｐで強いバンドを示し、また８５０ｂｐで弱いバンドを示す。４５０ｂｐバンドは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子を含む標的バンドである。重鎖反応（パネルＢ、レーン１）は、５００ｂｐで強いバンドを示し、１０００ｂｐで弱いバンドを示す。５００ｂｐのバンドは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する標的バンドである。ＰＣＲ産物は、全てＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。
【０１７１】
１．３  配列決定ベクターへのクローニング 
軽及び重鎖精製ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して、ｐＣＲ２．１ベクターに別々にクローンした。軽及び重鎖反応は両方とも２マイクロリットルの適切な精製ＰＣＲ産物を含んだ。プラスミドを、製造者の使用説明書に従って、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）に形質転換した。軽及び重鎖形質転換では、両方において、２マイクロリットルの連結反応を使用した。
【０１７２】
それぞれの反応からの３０マイクロリットルの形質転換細胞を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｃａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＯＮ）中の５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）及び４０マイクロリットルの４０ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ，Ｃａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＯＮ）を含有する、予め温めたＬｅｎｎｏｘ  Ｌブロス（ＬＢ）アガー（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）プレートで平板培養した。プレートを逆さまにし、３７℃で一晩インキュベートした。 
【０１７３】
それぞれのＨ４６０−１６−２Ｖｋ形質転換プレートから５個の単一白色クローン及びＨ４６０−１６−２Ｖｈ形質転換プレートから１０個の単一白色クローンを選択し、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する４ｍＬのＬＢブロス（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）への接種に使用した。培養を、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用してそれぞれの培養から単離した。
【０１７４】
回収したプラスミドをＥｃｏＲ  Ｉで消化して、挿入のサイズを決定した。Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ消化物は、５マイクロリットルのプラスミド、０．０２マイクロリットルの５０Ｕ／マイクロリットルＥｃｏＲ  Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、１．５マイクロリットルの１０×緩衝剤Ｈ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、１．５マイクロリットルの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び６．９８ミリリットルの水を含有した。Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ消化物は、５マイクロリットルのプラスミド、０．０４マイクロリットルの５０Ｕ／マイクロリットルＥｃｏＲ  Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、１．５マイクロリットルの１０×緩衝剤Ｈ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、１．５マイクロリットルの０．１％ＢＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）及び６．９６マイクロリットルの水を含有した。プラスミドを、３７℃で１時間消化した。それぞれの消化プラスミドの５マイクロリットルを１．０％アガロースゲルにかけた。
【０１７５】
図１７は、ＥｃｏＲ  Ｉで消化されたｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）プラスミドを示す。クローン番号を上側に示す。最初の数字は、使用した順方向プライマーを意味し（１はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆ、２はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃ）、２番目の数字はクローン番号を意味する（１〜５）。およそ５０００ｂｐの大きいバンドは、ｐＣＲ２．１ベクター骨格である。２〜４を除く全てのクローンは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ挿入の予測されるサイズである５００ｂｐでバンドを有する（矢印により示す）。 
【０１７６】
図１８は、ＥｃｏＲ  Ｉで消化されたｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）プラスミドを示す。クローン１、２、３、４、５及び８は、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する所望の５００ｂｐバンドを示す。
【０１７７】
適切なサイズの挿入（Ｖｋ１−１、Ｖｋ１−２、Ｖｋ１−３、Ｖｋ２−１、Ｖｋ２−２、Ｖｋ２−３、Ｖｈ１、Ｖｈ４及びＶｈ５）を含有するプラスミドのうちの幾つかを、Ｙｏｒｋ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｏｒｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）で配列決定した。配列を図１９に提示する。正確なＨ４６０−１６−２Ｖｋ配列がクローン１−１、１−２及び１−３で見出された。残りのＶｋクローンは、異常免疫グロブリン遺伝子を含んでいた。クローン１−１（ｐＶｋＨ４６０−１６−２＃１−１）を、キメラＨ４６０−１６−２  ＩｇＧ２プラスミドの構築のために使用した。全てのＨ４６０−１６−２Ｖｈクローンは、正確なＨ４６０−１６−２Ｖｈ配列を含んでいた。正確な配列を有するプラスミドを、更なる適用のために−３０℃で保存した。
【０１７８】
１．４  Ｈ４６０−１６−２ＶＨを配列決定ベクターにクローニングする（キメラＩｇＧ２の構築のため） 
上記のｍＲＮＡを使用して、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子を増幅した。重鎖では、１マイクロリットルのｍＲＮＡを６５℃で１０分間加熱し、次に氷で２分間冷却した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１２．５マイクロリットルの２×ＲＴ−ＰＣＲ反応ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ａプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの１０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ｂプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ｄプライマー、（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＶＨ５′−Ｆプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、１マイクロリットルの５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＭｕＩｇＧＶＨ３′−２プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）、０．５マイクロリットルのＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、０．４マイクロリットルの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＯＮ）及び２５マイクロリットルまでの水の、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを使用して調製した。反応を熱循環器により５０℃で４０分間、続いて９４℃で２分間加熱した。ＰＣＲ反応を、９４℃で３０秒間分、５５℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクルで実施した。最後に、ＰＣＲ産物を７２℃で１０分間加熱し、次に４℃で保存した。ＰＣＲ産物を、製造者の使用説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。
【０１７９】
重鎖精製ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローンした。反応は１マイクロリットルの精製ＰＣＲ産物を含んだ。２マイクロリットルの連結反応を使用して、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）ＤＨ５α（登録商標）−１Ｒ大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を形質転換した。３０マイクロリットルの形質転換細胞を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｃａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＯＮ）中の５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）及び４０マイクロリットルの４０ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ，Ｃａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＯＮ）を含有する、予め温めたＬｅｎｎｏｘ  Ｌブロス（ＬＢ）アガー（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）プレートで平板培養した。プレートを逆さまにし、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８０】
Ｈ４６０−１６−２ＶＨ形質転換プレートから１０個の単一クローンを選択し、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシンを含有する４ｍＬのＬＢブロスへの接種に使用した。培養を、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。プラスミドを、製造者の使用説明書に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用してそれぞれの培養から単離した。
【０１８１】
回収したプラスミドをＥｃｏＲ  Ｉで消化して、挿入のサイズを決定した。Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ消化物は、５マイクロリットルのプラスミド、０．０４マイクロリットルの５０Ｕ／マイクロリットルＥｃｏＲ  Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、１．５マイクロリットルの１０×緩衝剤Ｈ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、１．５マイクロリットルの０．１％ＢＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）及び６．９６マイクロリットルの水を含有した。プラスミドを、３７℃で１時間消化した。それぞれの消化プラスミドの５マイクロリットルを１．０％アガロースゲルにかけた。 
【０１８２】
クローン＃３及び＃１は、予測された５００ｂｐ挿入を有すると思われた。正確な挿入を有するクローンを更に得るために、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２ＶＨ）形質転換大腸菌プレートから更に１０個のクローンを選択した。上記に記載したように、クローンをＬＢブロスの接種に使用した。プラスミドを上記に記載したように培養から単離し、次に上記に記載したようにＥｃｏＲ  Ｉで消化した。 
【０１８３】
図２０は、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）プラスミドのＥｃｏＲ  Ｉ消化物を示す。およそ５０００ｂｐの大きいバンドは、ｐＣＲ２．１ベクター骨格である。クローン＃１７は、Ｈ４６０−１６−２ＶＨ挿入の予測されるサイズである５００ｂｐでバンドを有する（矢印により示す）。
【０１８４】
適切なサイズの挿入（Ｖｈ＃１、Ｖｈ＃３及びＶｈ＃１７）を含有するプラスミドを、Ｙｏｒｋ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｏｒｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）で配列決定した。配列を図２１に提示する。正確なＨ４６０−１６−２Ｖｈ配列がクローン３及び１７で見出された。クローン３（ｐＶｈＨ４６０−１６−２＃３）を、キメラＨ４６０−１６−２  ＩｇＧ２プラスミドの構築のために使用した。正確な配列を有するプラスミドを、更なる適用のために−３０℃で保存した。 
【０１８５】
２．０  ヒト定常部領域遺伝子を含むＣＭＶプロモーターベクターにネズミＨ４６０−１６−２遺伝子をクローニングする
ネズミ−ヒトＩｇＧ１キメラ抗体作成物を作り出すために、ネズミＨ４６０−１６−２可変部領域遺伝子を、ヒト定常部領域遺伝子を含むプラスミドにクローンした。これらのＣＭＶプロモーターベクターをＧ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎらから得た。ベクターは、最初はｐＨＣ−ｈｕＣｇ１及びｐＬＣ−ｈｕＣｋと呼ばれた。本明細書では、ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１及びｐＣＬ−ｈｕＣｋと呼ぶ。
【０１８６】
２．１  ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１の制限酵素部位を変える
重鎖ＣＭＶプロモーターベクター（ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１）のプラスミドマップを図２２に提示する。Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ可変部遺伝子を、Ｎｈｅ  Ｉ制限部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位の間にクローンした。Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子内の内部Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位のため、ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位はＢｓｉＷ  Ｉに変わった。
【０１８７】
ＰＣＲプライマーは、このクローニングを促進するために社内で設計し、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｂｉｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）により合成した。プライマー配列を図２３に提示する。１マイクロリットルの精製ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミド（Ｇ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎ，Ｂｒｏｎｘ，ＮＹ）を、１マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットルｐＣＨ−ｈｕＢｓｉＷ  Ｉプライマー、１マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＢＧＨプライマー、０．２マイクロリットルの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２２マイクロリットルのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）と合わせた。反応を、熱循環器により、９４℃で５分間、続いて３０サイクルの９４℃で１分間、５８℃で１分間、そして７２℃で１分間によりインキュベートした。最後に、反応を７２℃で１０分間インキュベートし、次に４℃で保存した。
【０１８８】
４マイクロリットルのＰＣＲ産物を、図２４に示されているように、１．０パーセントアガロースゲルにかけた。パネルＡ、レーン１は、ＩｇＧ１のヒト重鎖定常部領域を含むｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミドのＰＣＲ増幅領域である。バンドが約１１００ｂｐで表れ、これは予測されたサイズである。残りのＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。
【０１８９】
精製ＰＣＲ産物と精製ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミドの両方を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉで消化して連結を促進した。ＰＣＲ産物消化は、４６マイクロリットルの精製ＰＣＲ産物、６マイクロリットルの１０×緩衝剤Ｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、６マイクロリットルの０．１％ＢＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）及び２マイクロリットルの１５Ｕ／マイクロリットルＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）を含んだ。プラスミド消化は、４マイクロリットルの１．４マイクログラム／マイクロリットルｐＣＨ−ｈｕＩｇ１、６マイクロリットルの１０×緩衝剤Ｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、６マイクロリットルの１パーセントＢＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）、４２マイクロリットルの水及び２マイクロリットルの１５Ｕ／マイクロリットルＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅｄ′Ｕｒｆｅ，ＱＣ）を含んだ。消化物を、３７℃で２時間インキュベートした。少量のアリコート（２マイクロリットルのＰＣＲ産物反応及び３マイクロリットルのプラスミド反応）を取り出し、アガロースゲルにより消化の進行を調べるために保存した。残りの消化物に、３．２マイクロリットルの１Ｍ  ＮａＣｌ、２．５マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び３マイクロリットルの８Ｕ／マイクロリットルＸｈｏ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を加えた。反応を、３７℃で２時間更にインキュベートした。それぞれの消化物から別の少量のアリコートを取り出して、アガロースゲルにかけるために保存した。
【０１９０】
図２５は、消化ＰＣＲ産物及びプラスミドを示す。消化後でＰＣＲ産物のサイズにほとんど変化がなく（レーン１、パネルＡ及びＢ）、これは、それぞれの末端から極めて少数の塩基対が除去されたので予測されたことである。プラスミドの単一Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化（パネルＡ、レーン２）は、直線化プラスミドのサイズを示す（分子量マーカーより大きい）。二重Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉ消化（パネルＢ）は、大きなプラスミド骨格を示し、消化され、消化ＰＣＲ産物に代えられる約１０００ｂｐの切片を示す。残りの消化ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製し、残りのプラスミド骨格を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して１％アガロースゲルで精製した。
【０１９１】
消化ＰＣＲ産物及びプラスミド骨格を、４：１のモル比で一緒に連結した。反応は、２３３ｎｇの消化プラスミド骨格、１６２ｎｇの消化ＰＣＲ産物、４マイクロリットルの５×連結緩衝剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、４マイクロリットルの１Ｕ／マイクロリットルＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び９．３３マイクロリットルの水を含んだ。反応を、１６℃で一晩、次に７０℃で１５分間インキュベートして、酵素を不活性化した。２マイクロリットルの連結反応を、氷上で３０分間、４２℃で２分間、再び氷上で５分間インキュベートすることによって、５０マイクロリットルのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）に形質転換した。２５０マイクロリットルのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を加え、形質転換細胞を３７℃で１時間インキュベートした。１００マイクロリットルの細胞を、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する予め温めたＬＢアガープレート（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１９２】
１０個の単一クローンを、形質転換細胞から選択し、５０μｇ／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する４ｍＬのＬＢブロス（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）への接種に使用し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して一晩培養から単離した。単離プラスミドを、ＢｓｉＷ  Ｉで消化して、どのクローンが新たな切断部位を組み込んだかを同定した。消化物は、３マイクロリットルの精製プラスミド、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、１マイクロリットルの３Ｕ／マイクロリットルＢｓｉＷ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び２０マイクロリットルまでの水を含有した。消化物を３７℃で２時間インキュベートし、５マイクロリットルの消化プラスミドを、図２６で示されているように、１％アガロースゲルにかけた。４及び８を除く全てのクローンは消化されると直線化し、これらが新たなＢｓｉＷ  Ｉ切断部位を組み込んだことを示した。レーン１１は、対照環状プラスミドとしてのクローン５の未消化アリコートを示す。クローン１、２、５及び７をＹｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）で配列決定した。６個のクローンは全て所望の配列を有し、更なる使用のために−３０℃で保存した。
【０１９３】
２．２  ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖκ及びＶＨ遺伝子のｐＣＬ−ｈｕＣｋ及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１への挿入
Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ及びＶｈ遺伝子のｐＣＬ−ｈｕＣｋ及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１それぞれへのクローニングを促進するために、制限部位を遺伝子のいずれのかの末端に付加する必要があった。軽鎖では、Ｂｇｌ  ＩＩ部位を５′末端に付加し、Ｈｉｎｇ  ＩＩＩ部位を３′末端に付加した。重鎖では、Ｎｈｅ  Ｉ部位を５′末端に付加し、ＢｓｉＷ  Ｉ部位を３′末端に付加した。これらのＰＣＲ反応に使用したプライマーの配列を図２３に提示する。ｐＣＬ−ｈｕＣｋ（ｐＬＣ−ｈｕＣｋとも呼ばれる）のプラスミドマップを図２７に提示する。図には表れないが、ｐＣＬ−ｈｕＣｋベクターにおけるリーダー領域と可変部領域の間にＢｇｌ  ＩＩ部位が存在する。
【０１９４】
軽鎖では、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）Ｍ＃１−１（上記を参照すること、ＭはＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋを意味する）から精製された１５０ｎｇ／マイクロリットルのプラスミドの１マイクロリットルを、１マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＨ４６０−１６−２Ｖｋ５′プライマー、１マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットルＶｋ３′ＮｏｔＩ、０．２マイクロリットルの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２２マイクロリットルのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）と合わせた。重鎖では、ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）＃１（上記を参照すること）から精製された４０ｎｇ／マイクロリットルのプラスミドの１マイクロリットルを、１マイクロリットルの２５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＨ４６０−１６−２Ｖｈ５′ＮｈｅＩプライマー、１マイクロリットルの２５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＶｈ３′ＢｓｉＷ  Ｉプライマー及び４７マイクロリットルのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）と合わせた。軽鎖反応を、９４℃で５分間、続いて３０サイクルの９４℃で１分間、５８℃で１分間、そして７２℃で１分間、続いて７２℃で７分間によりインキュベートした。重鎖反応を、同様にインキュベートしたが、アニーリング温度は（５８℃の代わりに）５５℃であった。
【０１９５】
図２４は、１．０％アガロースゲルにかけたそれぞれのＰＣＲ反応のアリコートを示す。Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子（パネルＡ、レーン２）は４００ｂｐで表れ、これは軽鎖可変部領域の予測されるサイズである。Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子（パネルＢ、レーン１）は４５０ｂｐ近くで表れ、これは重鎖可変部領域の予測されるサイズである。残りのＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製し、次に適切な酵素で消化して、プラスミドへの連結を促進した。
【０１９６】
軽鎖では、ｐＣＬ−ｈｕＣｋとＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物の両方を、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化して、クローニングを促進した。４０マイクロリットルのＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物を、６マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．６マイクロリットルの１００×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＢｇｌ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＮｏｔ  Ｉ及び６０マイクロリットルまでの水と合わせた。軽鎖プラスミドでは、ＰＣＲ産物の代わりに８マイクロリットルのｐＣＬ−ｈｕＣｋ（Ｇ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎ，Ｂｒｏｎｘ，ＮＹ）を含む同様の反応を調製した。両方の反応を、３７℃で３時間インキュベートした。消化ベクター及び挿入のアリコートを、図２８に示されているように、１．２％アガロースゲルにかけた。直線化ｐＣＬ−ｈｕＣｋベクター骨格（レーン１）が大きなバンドで表れ、一方、ベクターから除去された軽鎖可変部領域は、４００ｂｐバンドで表れる。消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ（レーン２）遺伝子も４００ｂｐで表れる。残りの直線化ｐＣＬ−ｈｕＣｋプラスミドを１．０パーセントゲルにかけ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。残りの消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。 
【０１９７】
重鎖では、ＢｓｉＷ  Ｉ部位が付加されたｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミド（上記を参照すること）とＨ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物の両方を、ＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉで消化して、クローニングを促進した。プラスミド反応は、０．７マイクロリットルのｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（ＢｓｉＷ  Ｉ）＃１ＤＮＡ、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．４マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＢｓｉＷ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び２０マイクロリットルまでの水を含んだ。プラスミドの代わりに１２．１マイクロリットルのＨ４６０−１６−２Ｖｈ精製ＰＣＲ産物を含む同様の反応も設定した。反応を５５℃で一晩インキュベートし、５マイクロリットルのアリコートをプラスミド消化から取り出し、ゲルで調べた。０．２マイクロリットルの１００×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び１マイクロリットルの５Ｕ／マイクロリットルＮｈｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を、両方の反応に加え、これらを３７℃で一晩更にインキュベートした。別の５マイクロリットルを取り出し、ゲルにかけて消化を調べることに使用した。
【０１９８】
図２９は、１．２パーセントゲルにかけた消化の結果を示す。単一ＢｓｉＷ  Ｉ消化（パネルＢ、レーン１）は、直線化プラスミドを示す。二重ＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉ消化（パネルＢ、レーン２）は、大きなバンドでプラスミド骨格を示し、重鎖可変部領域を４５０ｐｂに示す。この小さなバンドは、４５０ｂｐの消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物により代えられる（パネルＡ、レーン１）。残りの消化プラスミドは、１．２パーセントゲルにかけ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。残りの消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。
【０１９９】
消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物を、直線化ｐＣＬ−ｈｕＣｋプラスミドと連結した。２２０ｎｇの消化ｐＣＬ−ｈｕＣｋを、６６ｎｇの消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ、４マイクロリットルの５×連結緩衝剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、４マイクロリットルの１Ｕ／マイクロリットルＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２０マイクロリットルまでの水と合わせた。反応を、１６℃で一晩インキュベートし、次に７０℃で１０分間インキュベートして、酵素を熱不活性化した。２マイクロリットルの連結反応を、氷上で３０分間、４２℃で２分間、再び氷上で５分間インキュベートすることによって、５０マイクロリットルのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）に形質転換した。２５０マイクロリットルのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を加え、形質転換細胞を３７℃で１時間インキュベートした。３０マイクロリットルの細胞を、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する予め温めたＬＢアガー（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）プレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２００】
重鎖連結反応は、２５０ｎｇの消化ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１、８４ｎｇび消化Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物、４マイクロリットルの５×連結緩衝剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、１マイクロリットルの１Ｕ／マイクロリットルＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２０マイクロリットルまでの水を含んで設定した。反応を、１６℃で一晩、次に６５℃で１０分間インキュベートして、酵素を熱不活性化した。１マイクロリットルの連結反応を、氷上で３０分間、４２℃で２分間、再び氷上で５分間インキュベートすることによって、２５マイクロリットルのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）に形質転換した。２５０マイクロリットルのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を加え、形質転換細胞を３７℃で１時間インキュベートした。３０マイクロリットルの細胞を、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する予め温めたＬＢアガー（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）プレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２０１】
形質転換ｐＣＬ−ｈｕＣｋ（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）プレートから８個の単一クローン及び形質転換ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）プレートから６個の単一クローンを選択し、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する４ｍＬの２−ＹＴブロス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）への接種に使用した。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して一晩培養から単離し、消化して、正確なサイズの挿入を確認した。軽鎖反応を、３マイクロリットルのプラスミド、１．５マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．１５マイクロリットルの１００×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＢｇｌ  ＩＩ、２マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＮｏｔ  Ｉ及び９．６５マイクロリットルの水により調製し、３７℃で３時間インキュベートした。重鎖反応は、２マイクロリットルのプラスミドを、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．４マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＢｓｉＷ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び２０マイクロリットルまでの水と組み合わせることのよって設定した。これらを５５℃２時間インキュベートし、次に２マイクロリットルの１０×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び０．８マイクロリットルの５Ｕ／マイクロリットルＮｈｅ  Ｉを加えた。反応を、３７℃で２時間更にインキュベートした。
【０２０２】
図３０及び３１は、ｐＣＬ−ｈｕＣｋ（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）それぞれの上記の消化の結果を示す。＃１を除く全ての軽鎖クローン（図３０）は、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子に対応する所望の４００ｂｐ挿入を含んだ。全ての重鎖クローン（図３１）は、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する所望の４５０ｂｐ挿入を含んだ。これらの結果に基づき、ｐＣＬ−ｈｕＣｋ（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）クローン３、４、６、７及び８、並びにｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローン４及び６を、Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）で配列決定した。クローンは全て所望の配列を有し、更なる使用のために−８０℃で保存した。
【０２０３】
３．０  キメラ化軽及び重鎖ＡＲＨ４６０−１６−２をＣＨＥＦ１発現ベクターにクローニングする。 
次に、軽鎖（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）のネズミ可変部領域及びヒト定常部領域をＣＨＥＦ１発現ベクターｐＮＥＦ３８にクローンし、重鎖（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）のネズミ可変部領域及びヒト定常部領域をＣＨＥＦ１発現ベクターｐＤＥＦ３８にクローンした。プラスミドマップを図３２及び３３に提示する。 
【０２０４】
この報告の残りの部分において、用語Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋは、ｐＣＬ−ｈｕＣｋプラスミドから誘導される、軽鎖可変部Ｈ４６０−１６−２遺伝子とヒト軽鎖定常部領域の組み合わせを意味する。用語Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈは、ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミドから誘導される、重鎖可変部Ｈ４６０−１６−２遺伝子とヒト重鎖ＩｇＧ１領域の組み合わせを意味する。 
【０２０５】
３．１  ＣＨＥＦ１ベクターにクローンするために制限部位を変える
ＣＭＶプロモーターベクターにおいてＣｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２遺伝子をフランキングする制限部位は、ＣＨＥＦ１発現ベクターへのサブクローニングを促進するために、変える必要があった。ＣＭＶプロモーター作成物におけるリーダー、可変部及び定常部領域を、所望の制限部位に導入されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。プライマー配列を図２３に提示する。
【０２０６】
軽鎖では、ＰＣＲ反応は、１．４マイクロリットルの７３ｎｇ／マイクロリットルｐＣＬ−ｈｕＣｋ（ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋ）＃３ＤＮＡ（上記を参照すること）、１．０マイクロリットルの２５ｐｍｏｌ／マイクロリットルｐＣＬ−ｈｕＣＫ  ５′ＭｌｕＩプライマー、１．７マイクロリットルの１５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＢＧＨプライマー及び２０．９マイクロリットルのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して調製した。重鎖では、ＰＣＲ反応は、０．５マイクロリットルの０．２７マイクログラム／マイクロリットルｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈ）＃４ＤＮＡ（上記を参照すること）、１．７マイクロリットルの１５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＶｈ  ５′Ｎｈｅ  Ｉ／Ｍｌｕ  Ｉプライマー、１．７マイクロリットルの１５ｐｍｏｌ／マイクロリットルＢＧＨプライマー及び２１．１マイクロリットルのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して調製した。重及び軽鎖反応を、９４℃で２分間、続いて２５又は３０サイクルの９４℃で３０分間、５５℃で３０分間、そして６８℃で２分間によりそれぞれインキュベートした。それぞれの反応のアリコートを、図３４で示されているように、アガロースゲルにかけた。Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物（パネルＡ、レーン１）は、８００ｂｐバンドで表れ、これは軽鎖ネズミＨ４６０−１６−２Ｖｋ可変部領域及びヒト定常部領域の予測されるサイズである。Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物（パネルＢ、レーン１）は、１５００ｂｐバンドで表れ、これは重鎖ネズミＨ４６０−１６−２Ｖｈ可変部領域及びヒト定常部領域の予測されるサイズである。 
【０２０７】
３．２  キメラＨ４６０−１６−２遺伝子をＣＨＥＦ１ベクターにクローニングする
残りのＰＣＲ産物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製し、クローニングのために適切な制限酵素によりＣＨＥＦ１ベクターと共に消化した。反応は、１マイクログラムのＤＮＡ（精製Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物、精製Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物、ｐＮＥＦ３８（ＩＣＯＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）又はｐＤＥＦ３８（ＩＣＯＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ））、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２マイクロリットルの１０×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．２マイクロリットルの２０Ｕ／マイクロリットルＸｂａ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び２０マイクロリットルまでの水を含んだ。反応を、３７℃で一晩インキュベートし、次に０．８マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．０マイクロリットルの１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．４マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＭｕｌ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を加え、３７℃で６時間更にインキュベートした。消化ＰＣＲ産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製し、消化ベクターを、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）で精製した。 
【０２０８】
Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋを、５：１のモル比でｐＮＥＦ３８に連結した。２５ｎｇの消化ｐＮＥＦ３８を、６９ｎｇの消化Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物、４マイクロリットルの５×リガーゼ反応緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、０．５マイクロリットルの１Ｕ／マイクロリットルＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２０マイクロリットルまでの水と合わせた。同等の重鎖反応を、２５ｎｇの消化ｐＤＥＦ３８及び６６ｎｇの消化Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈ  ＰＣＲ産物を使用して調製した。反応を、１６℃で一晩インキュベートし、次に６５℃で１０分間インキュベートして、酵素を不活性化した。重鎖連結反応を、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して精製した。
【０２０９】
連結反応は、３マイクロリットルの希釈塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）及び２マイクロリットルの連結反応を、５０マイクロリットルのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）に加えることによって、大腸菌に形質転換した。細胞を、予め冷やした１ｍｍのキュベットに移し、１７００Ｖにより５ミリセカンドで電気穿孔器に投入した。１ｍＬのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を直ぐに加え、次に細胞を、２００ｒｐｍで浸透しながら、３７℃で１時間インキュベートした。細胞の２００マイクロリットルのアリコートを、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシンを含有する予め温めたＬＢアガープレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。 
【０２１０】
６個の単一クローンを、それぞれのプレートから選択し、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を含有する４ｍＬの２ＹＴブロス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）への接種に使用し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して得られた一晩培養から単離した。軽鎖プラスミドをＸｂａ  Ｉ及びＭｌｕ  Ｉで消化して、どのクローンが正確なサイズの挿入を含有するかを確認した。消化物は、１マイクログラムのプラスミドＤＮＡ、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２マイクロリットルの１０×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．２マイクロリットルの２０Ｕ／マイクロリットルＸｂａ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び２０マイクロリットルまでの水を含有した。反応を、３７℃で一晩インキュベートし、次に０．８マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．０マイクロリットルの１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．４マイクロリットルの１０Ｕ／マイクロリットルＭｕｌ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を加え、３７℃で６時間更にインキュベートした。重鎖プラスミドを、Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、２マイクロリットルの１０×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．２マイクロリットルの２０Ｕ／μＬ  Ｘｂａ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）及び２０マイクロリットルまでの水と組み合わせた。反応を、３７℃で一晩インキュベートし、次に０．８マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．０マイクロリットルの1Ｍ  ＮａＣｌ及び０．４マイクロリットルの１０Ｕ／μＬ  Ｍｕｌ  Ｉを加え、３７℃で６時間更に消化した。消化物の少量のアリコートを取り出してゲルにかけ、２マイクロリットルの１０×ＮＥ緩衝剤２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．３マイクロリットルの１５Ｕ／マイクロリットルＨｉｎｄ  ＩＩＩ及び７．７マイクロリットルの水を加えた。反応を、３７℃で６時間インキュベートした。
【０２１１】
消化プラスミドを、図３５で見られるように、１．２パーセントアガロースゲルにかけた。軽鎖プラスミド（パネルＡ）では、＃３を除いて全てのクローンが所望の７５０ｂｐ挿入を有し、それは軽鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。重鎖プラスミドでは、Ｘｂａ  Ｉ及びＭｌｕ  Ｉ消化物（パネルＢ、レーン１Ａ、２Ａ及び６Ａ）は、１５００ｂｐ挿入を示し、これは重鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｕｌ  Ｉ及びＢｓｉＷ  Ｉで消化された重鎖プラスミド（パネルＢ、レーン１Ｂ、２Ｂ及び６Ｂ）は、１０００ｂｐ及び５００ｂｐでバンドを示し、これらはそれぞれ重鎖定常部領域及び可変部領域に対応する。クローン４（パネルＢ）は、全く表れず、反応設定に問題があったことを示した。
【０２１２】
これらの結果に基づき、軽鎖クローン１、２及び４と重鎖クローン１、２及び６を、Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）で配列決定した。配列を図３６に提示する。軽鎖クローンｐＮＥＦ３８（Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋ）＃４及び重鎖クローンｐＤＥＦ３８（Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈ）＃２は、正確な配列を有し、キメラＨ４６０−１６−２作成物の構築に使用した。
【０２１３】
４．０  （ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１を産生するための初期クローニング 
４．１  ｐＭＰＧＣＲ５ＩｇＧ１−Ｖｋ＋ｈＨ４６０の構築
このプラスミドは、ｃｕｍａｔｅ誘発性プロモーター（ＣＲ５）により調節されるＨ４６０−１６−２（Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｈ及びＣｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖｋ）のキメラＩｇＧ１アイソタイプの重鎖及び軽鎖を含有する。加えて、このプラスミドは、安定したクローンの選択のためにハイグロマイシンに対する耐性を含む（図３７）。このプラスミドは、下記に記載するように、最初に２つの中間体プラスミドを構築することにより産生した。
【０２１４】
Ａ）ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０ＡｓｃＩｄの構築
抗体Ｂ４３の軽鎖をコードするＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩで消化することによって、ｐＭＰＧＣＲ５Ｂ４３ｋ（図３８）から除去した。末端を平滑化した後、子ウシ腸管ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、ベクターＤＮＡを、ｐＮＥＦ３８（Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２Ｖκ）＃４をＸｂａ  Ｉ及びＢｓｉＷ  Ｉにより消化し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより処理して末端を平滑化することによって得られた、軽鎖をコードするＤＮＡフラグメントと連結した。
【０２１５】
Ｂ）ｐＣＲ５ＩｇＧｌＶｈＨ４６０ＡｓｃＩの構築
Ｂ４３の重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化することによって、ｐＫＣＲ５Ｂ４３Ｇ３（図３９）から除去した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端を平滑化し、ＣＩＰで処理した後、ベクターＤＮＡを、ｐＤＥＦ３８（Ｃｈ−ＡＲＨ４６０−１６−２ＶＨ）＃２をＸｂａ  Ｉ及びＰａｃ  Ｉで消化することによって単離された、重鎖をコードするＤＮＡフラグメントと連結した。連結の前に、ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。 
【０２１６】
Ｃ）最終組み立て
重鎖発現カセット（プロモーター、コード配列、ポリＡシグナル）を、ＡｓｃＩで消化することによりｐＣＲ５ＩｇＧｌＶｈＨ４６０ＡｓｃＩから切断し、ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０ＡｓｃＩｄのＡｓｃＩ部位に挿入し、それを、連結する前にＣＩＰで処理することによって脱リン酸化した。得られた作成物（ｐＭＰＧＣＲ５ＩｇＧ１−Ｖｋ＋ｈＨ４６０）のマップを図３７に表す。
【０２１７】
５．０  クローン発現キメラＨ４６０−１６−１２の産生
ＣＨＯ−ＳＦ（ａ）のバイアルをＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）から得て、４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）において２０００年５月に解凍した。細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＣＤ−ＣＨＯ培地で１０日間増殖させ、９０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び１０％ＤＭＳＯで冷凍保存液を作成した。ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ｃＴＡ）を安定して発現するＣＨＯｃＴＡ細胞は、ＣＨＯ−ＳＦ（ａ）細胞を、製造者の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して直線化ｐＭＰＧ−ＢＦＰ／ＣＭＶ−ｃＴＡ／ｔｋ−ｎｅｏで形質移入することによって、生成した。３日後、形質移入細胞を、Ｇ４１８（１．２ｍｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベートし、４週間後、Ｇ４１８耐性細胞のプールをｐＡｄＣＲ５ＧＦＰｑで形質移入した。２日後、ＧＦＰを最も多く発現している細胞を、ＥＰＩＣＳ  ＴＭ  Ｖ（Ｍｏｄｅｌ  ７５２；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）マルチパラメーターレーザーフローサイトメーター及び細胞分類装置で分類し、１．２ｍｇ／ｍLのＧ４１８の存在下で１ウエルあたり１個の細胞の密度で９６ウエルプレートに移した。コンフルエントクローンを取り出し、拡大し、細胞により合成されたｃＴＡの量を、ＣＲ５プロモーターにより調節されているアデノウイルスベクター発現ＧＦＰ（ＡｄＣＲ５ＧＦＰｑ）で感染した２４時間後、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  Ｔｍ  ＸＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を使用したフローサイトメトリーによりＧＦＰの強度を測定することによって、間接的に決定した。２回目のクローニングは、ＡｄＣＲ５ＧＦＰｑにより形質導入した後で最も蛍光性があったクローンからの個別の細胞を、細胞マイクロマニピュレーターを使用して９６ウエルプレートに移動することによって実施した（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。細胞をＧ４１８の不在下で増殖させ、コンフルエントコロニーを取り出し、拡大した。これらの細胞により産生されたｃＴＡの量を、ＡｄＣＲ５ＧＦＰｑで感染した後に産生されたＧＦＰｑの強度を測定するフローサイトメトリーにより、間接的に評価した。最も生産的なサブクローンのうちの１つ（ＣＨＯｃＴＡ−５Ｆ−１）を拡大した。小規模の細胞バンクを生成し、液体窒素に冷凍して保持した。 
【０２１８】
ＣＨＯ−ＳＦ（ｂ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を解凍し、１×ＨＴサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を補充した５０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）において３７℃で増殖した。３世代後、２２個の冷凍バイアルのバンクを、下記に記載するように１０％ＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して作製した。細胞バンクを、ＩＮＲＳ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣにおいてマイコプラズマの存在について試験した。マイコプラズマは検出されなかった。ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ｃＴＡ）を安定して発現するＣＨＯｃＴＡ細胞は、ＣＨＯ−ＳＦ（ｂ）細胞を、製造者の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して直線化ｐＭＰＧ−／ｔｋ−ｎｅｏ／ｃｙｍＲ＿ＶＰ１６−ｎｌｓで形質移入することによって生成した。翌日、細胞を、Ｇ４１８（１．２ｍｇ／ｍＬ）の存在下、１ウエルあたり１００００又は５０００個の細胞の濃度で９６ウエル／プレートに分けた。３〜４週間後、耐性コロニーを取り出し、拡大した。細胞により合成されたｃＴＡの量は、ＣＲ５プロモーターにより調節されているアデノウイルスベクター発現ＧＦＰ（ＡｄＣＲ５ＧＦＰｑ）で感染した２４時間後、フローサイトメトリーによりＧＦＰの強度を測定することによって、間接的に決定した。最初の形質移入の１か月と３週間後、２回目のクローニングは、ＡｄＣＲ５ＧＦＰｑ（ＣＨＯｓ  ｃＴＡ  ＃１０）により形質導入した後で最も蛍光性があったクローンのうちの１つから個別の細胞を、細胞マイクロマニピュレーターを使用して９６ウエルプレートに移動することによって実施した（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。細胞をＧ４１８の不在下で増殖させ、コンフルエントコロニーを（３〜４週間後）取り出し、拡大した。これらの細胞により産生されたｃＴＡの量を、ＡｄＣＲ５ＧＦＰｑで感染した後に生じたＧＦＰｑの強度を測定するフローサイトメトリーにより、間接的に評価した。最も生産的なサブクローンのうちの１つ（ＣＨＯｃＴＡ−１０−９）を拡大した。小規模の細胞バンクを生成し、液体窒素に冷凍して保持した。細胞バンクを、ＩＮＲＳ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒにおいてマイコプラズマの存在について試験した。マイコプラズマは検出されなかった。
【０２１９】
ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ＣＨＯｃＴＡ，クローン１０−９及び５Ｆ−１）を発現するＣＨＯ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用して、直線化ｐＭＰＧＣＲ５ＩｇＧ１−Ｖｋ＋ｈＨ４６０（ＳｓｐＩ消化）により形質移入した。翌日、細胞を異なる濃度（１００００又は５０００細胞／ウエル）で９６ウエルプレートに移した。この時点で、６００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを培地に加えた。２〜３週間後、耐性コロニー（３７８個のクローン）の上澄みを、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ１抗体の存在について分析した（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットにより決定された定量化は、定量化に使用した標準（精製ヒトＩｇＧ）が、細胞により産生されたＨ４６０−１６−２のキメラＩｇＧ１と異なるため、概算の抗体産生でしかない）。合計１０４個のコロニーが、検出可能な量の抗体を産生した。 
【０２２０】
次に１２個のクローンを増幅し、２４時間生産性試験を使用して、ウエスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抗体の発現について試験した。抗体の産生は、また、バッチ培養により３０℃で６〜１３日間評価した（図４０及び４１）。産生を３０℃で実施し、それはＣＲ５プロモーターがこの温度でより強力だからである。
【０２２１】
６個のクローンは、１７、７１、８０、６′、４７′及び１４７′であった。クローン１７、７１及び８０は、ＣＨＯｃＴＡ−１０−９を使用して生成し、クローン６′、４７′及び１４７′は、ＣＨＯｃＴＡ−５Ｆ１を使用して生成した。これらの６個のクローンは、ヒトＩｇＧを標準として使用するＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色により推定したように、３７℃で４〜６ｐｇ／細胞／日を分泌した、 
【０２２２】
６．０  （ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２を産生するための初期クローニング 
６．１  ｐＭＰＧＣＲ５ＶＫ＋ｈ４６０−ＩｇＧ２の構築
このプラスミドは、ｃｕｍａｔｅ誘発性プロモーター（ＣＲ５）により調節されるＨ４６０−１６−２のキメラＩｇＧ２アイソタイプの重鎖及び軽鎖を含有する。加えて、このプラスミドは、安定したクローンの選択のためにハイグロマイシンに対する耐性を含む（図４２）。このプラスミドは、下記に記載する、幾つかのＰＣＲ及びサブクローニング工程を介して産生した。
【０２２３】
Ａ）軽鎖のキメラ化（ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０の構築）
Ｈ４６０−１６−２の軽鎖の可変部領域をコードするＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ｂ）は、プラスミドｐＶｋＨ４６０−１６−２＃１−１と、プライマーＡＲｖａｒｌｃ及びｊｃｔｖａｒ−ｋ＃３（図４３）とを使用して、ＰＣＲにより単離した。ＩｇＧのヒトカッパ軽鎖の定常部領域をコードするＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ａ）は、プラスミドｐＭＰＧＢ４３ｋと、プライマーＡＲｋａｐｐａ及びｊｃｔｋ−ｖａｒ＃３（図４３）とを使用して、ＰＣＲにより単離した。可変部領域は、テンプレートとしてフラグメントＰＣＲ  Ｂ及びＰＣＲ  Ａと、プライマーＡｒｖａｒｌｃ及びＡＲカッパとを使用して、ＰＣＲにより定常部領域を用いて組み立てた。得られたＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ｃ）を、ＢａｍＨ  Ｉで消化し、Ｂ４３軽鎖を除去するためにＢａｍＨ  Ｉで予め消化されているｐＭＰＧＣＲ５Ｂ４３ｋ（図３８）に連結した。連結する前に、直線化ベクターを、子ウシ腸管ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理することにより脱リン酸化した。得られたベクターを、ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０ｋｏｚと呼んだ。完全軽鎖を配列決定のために送った。コザック配列内の突然変異を除いて、予測されるヌクレオチド配列が得られた。この突然変異は、両方のプラスミドをＫｐｎＩにより消化し、正常なＤＮＡフラグメントを一緒に連結することによって、ｐＭＰＧＣＲ５ｖＫＨ４６０ｋｏｚの可変部領域をｐＭＰＧＣＲ５ｋＨ４６０ｗｒｏｎｇｊｃｔ（下記を参照すること）の可変部領域に取り替えることで修正した。得られたプラスミドを、ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０と呼び、軽鎖のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
【０２２４】
Ｂ）ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０ｗｒｏｒｔｇｊｃｔの構築
このプラスミドは、可変部領域と定常部領域の間に異なる接合部を有するＨ４６０−１６−２のキメラ軽鎖を含有する。このプラスミドを構築するために、Ｈ４６０−１６−２の軽鎖の可変部領域をコードするＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ｂ１）は、プラスミドｐＶｋＨ４６０−１６−２＃１−１と、プライマーＡＲｖａｒｌｃ及びＡＲｊｃｔｖａｒ−ｋ（図３０）とを使用して、ＰＣＲにより単離した。ＩｇＧのヒトカッパ軽鎖の定常部領域をコードするＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ａ１）は、プラスミドｐＭＰＧＢ４３ｋと、プライマーＡＲｋａｐｐａ及びＡＲｊｃｔｖａｒ−ｋ（図４３）とを使用して、ＰｃＲにより単離した。可変部領域は、テンプレートとしてフラグメントＰＣＲ  Ｂ１及びＰＣＲ  Ａ１と、プライマーＡｒｖａｒｌｃ及びＡＲカッパとを使用して、ＰＣＲにより定常部領域を用いて組み立てた。次に、得られたＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ｃ１）を、ＢａｍＨ  Ｉで消化し、Ｂ４３軽鎖を除去するためにＢａｍＨ  Ｉで予め消化されているｐＭＰＧＣＲ５Ｂ４３ｋ（図３８）に連結した。連結する前に、ベクターをＣＩＰで処理することにより脱リン酸化した。得られたベクターを、ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０ｗｒｏｎｇｊｃｔｋｏｚと呼んだ。軽鎖のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
【０２２５】
Ｃ）重鎖のキメラ化（ｐＫＣＲ５ＩｇＧ２ＶｈＨ４６０の構築）
Ｈ４６０−１６−２の重鎖の可変部領域をコードするＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ  Ｄ）は、プラスミドｐＶｈＨ４６０−１６−２＃３と、プライマーＡＲｉｇｇ２ｖａｒｌｃ及びＡＲｈｖａｒｓｗａ（図４３）とを使用して、ＰＣＲにより単離した。ＰＣＲ産物をＡｐａＩで消化し、ヒトＩｇＧ２の定常部領域をコードする４．６ｋｂ  ＤＮＡフラグメントに連結した。このベクターは、ｐｋＨｃ（ＢＲＩ，ＮＲＣ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｑｃ）をＡｐａＩで消化し、続いてＣＩＰで処理することによって得た。得られたプラスミドを、ｐＫＩｇＧ２−ＶｈＨ４６０と呼んだ。
【０２２６】
ｐＫＩｇＧ２−ＶｈＨ４６０でコードされる完全重鎖を、ＳｗａＩによる消化で放出し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによる消化でＢ４３重鎖を予め除去したｐＫＣＲ５Ｂ４３Ｇ３（図３９）にクローンした。連結する前に、プラスミドを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる処理で平滑化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。得られたプラスミドを、ｐＫＣＲ５ＩｇＧ２ＶｈＨ４６０ｗｒｏｎｇｊｃｔと呼び、完全重鎖のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。キメラＩｇＧ２の可変部と軽鎖の間の接合部は異常であった。このため、修飾することにした。正常な接合部を含むＤＮＡフラグメントを、プライマーＡｐａＩＣＲ５及びＩｇＧ２ＴＶＳＳＡＳＴＫ（図４３）を使用するｐＫＣＲ５ＩｇＧ２ＶｈＨ４６０ｗｒｏｎｇｊｃｔのＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲフラグメントをＡｐａＩで消化し、ＡｐａＩで予め消化されたｐＫＣＲ５ＩｇＧ２ＶｈＨ４６０ｗｒｏｎｇｊｃｔにクローンした。連結する前に、４．６ｋｂフラグメントをＣＩＰで処理することにより脱リン酸化した。得られたプラスミドを、ｐＫＣＲ５ＩｇＧ２ＶｈＨ４６０呼び、キメラＩｇＧ２のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
【０２２７】
Ｄ）ＩｇＧ２発現ベクターの最終組み立て
重鎖発現カセット（プロモーター、コード配列、ポリＡシグナル）を、ＡｓｃＩで消化することによりｐＫＣＲ５ＩｇＧ２ＶｈＨ４６０から切断し、ｐＭＰＧＣＲ５ＶｋＨ４６０のＡｓｃＩ部位に挿入し、それを、連結する前にＣＩＰで処理することによって脱リン酸化した。重鎖及び軽鎖の完全ヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。得られた作成物（ｐＭＰＧＣＲ５ＶＫ＋ｈ４６０−ＩｇＧ２）のマップを図４２に表す。
【０２２８】
７．０  初期クローンの産生
血清無含有既知組成培地で増殖させたＣＨＯ−ｃＴＡ（クローン１０−９）細胞を、キメラＩｇＧ２抗体ｐＭＰＧＣＲ５ＶＫ＋ｈ４６０−ＩｇＧ２（図４２）を発現するプラスミドで形質移入し、安定したクローンを、ハイグロマイシンの存在下で生成した。３７４個のクローンをＥＬＩＳＡによりＩｇＧ２抗体の発現について分析した。８０個のクローンが抗体の発現において陽性であった。５８個の最も生産的なクローンにより分泌された抗体の量を、ウエスタンブロット又はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図４４）。最も生産的なクローンは、３７℃で５〜１０ｐｇ／細胞／日を産生した。６個のクローンは、クローン４０、５０、５１、５２、５４及び５６であった。
【０２２９】
８．０  高生産性クローンの選択
クローン４０、５０、５１、５４及び５６を、選択圧の不在下でマイクロマニピュレーターを使用してサブクローンした（クローン１個あたり約５０個の細胞）。５１個のサブクローンの産生レベルを、ウエスタンブロット分析又はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色により試験した（図４５）最も生産的なサブクローンは以下であり、３７℃で産生された抗体の量を括弧内に示す：４０Ｆ８（１１）、４０Ｂ７（７）、５６Ｂ９（７）、４０Ｆ７（７）、５６Ｅ９（５）、４０Ｅ１１（５）、４０Ｄ９（６）、５６Ｂ８（６）、５６Ｆ１１（４）及び５４Ｅ１０（３）。
【０２３０】
９．０  上澄みの試験
キメラＩｇＧ１及びＩｇＧ２クローンのそれぞれの上澄みを、ウエスタンブロットプローブとして使用して、ネズミ抗体Ｈ４６０−１６−２の標的抗原（ＣＤ４４）を検出することができるＩｇＧが存在するかを決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の全膜画分の３００マイクログラムを含む試料を、沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（分取ゲル、１０％アクリルアミド）／ウエスタンイムノブロッティングにより分析した。ウエスタンブロットを、ウエスタンブロッティングの標準的手順に従って、細胞培養上澄み（ＴＢＳＴ中の１０％スキムミルクを有する）の１：２希釈によりプローブした。
【０２３１】
結果は、全ての上澄み（キメラＩｇＧ１及びキメラＩｇＧ２分泌クローン）が、ネズミ親ＢＡｂで得られたものと同様である信号により、同様の（計算）濃度（５マイクログラム／ｍＬ；図４６及び４７）でＣＤ４４を検出することができることを示す。
【０２３２】
１０．０  選択したクローンのバイオリアクターにおける産生
キメラＩｇＧ１クローン６′は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると最も多く分泌するクローンであると思われ、ウエスタンブロットにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の膜調製物に対するネズミＨ４６０−１６−２と同様に結合すると思われる。したがって、クローン６′を、３０℃で振とうフラスコ中のバッチ培養に抗体を産生するために使用した。バッチ中の抗体濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色により評価した（図４８）。異なるバッチの容量及び抗体濃度は以下である：バッチｓｕｐｅｒ２２Ｎｏｖ：１．６Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ；バッチＮ３：．６５Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ；バッチＮ４：．６５Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、並びにバッチＮ５及びＮ６：．８Ｌ、２００  ｍｇ／Ｌ。クローン６′を今後のキメラＩｇＧ１研究の全てにおいて使用し、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１と呼ぶ。
【０２３３】
キメラＩｇＧ２クローン４０Ｂ７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると最も多く分泌するクローンであると思われ、ウエスタンブロットにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の膜調製物に対するネズミＨ４６０−１６−２と同様に結合すると思われる。したがって、クローン４０Ｂ７を大量に産生した（図４９）。約１４０ｍｇ／リットルの抗体を含有する２０リットルの培地を製造した。培地中の抗体の濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅを使用する染色により決定した。クローン４０Ｂ７を今後のキメラＩｇＧ２研究の全てにおいて使用し、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２と呼ぶ。
【０２３４】
実施例１０
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるインビボ腫瘍実験
図５０及び５１を参照すると、４〜６週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの食塩水中の５百万のヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。腫瘍の増殖をカリパスで毎週測定した。コホートの大部分が移植後３５日目に９１ｍｍ３（５５〜１４３のｍｍ３範囲）の平均腫瘍容量に達したとき、マウスを腫瘍サイズによってブロックに分けた。ブロックのマウスを、それぞれの群における平均腫瘍容量が互いに有意に異ならないように、４つの処置群（１群あたり１０匹）に無作為に割り当てた。Ｈ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後の３００マイクロリットルの容量の１５ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することによって、それぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体を、１週間に３回で合計１０用量を同じ方法により移植後５７日目まで投与した。腫瘍増殖を、約７日毎で移植後６２日目まで又は個々の動物がＣＣＡＣ終点に達するまで、カリパスにより測定した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
【０２３５】
図５０で示されているように、ネズミＨ４６０−１６−２及び（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１は、両方とも、ヒト乳癌の確立ＭＤＡ−ＭＢ−２３１インビボモデルにおいて腫瘍増殖を低減した。６２日目、つまり最終用量が投与された５日後、Ｈ４６０−１６−２による処置は、３９％の腫瘍増殖阻害をもたらした（平均Ｔ／Ｃ＝５７％）。腫瘍増殖におけるこの低減は、対照と有意に異なっていた（ｐ＝０．００３７）。キメラ抗体（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ｌｇＧ１は、６４％の増強した腫瘍増殖阻害をもたらした（平均Ｔ／Ｃ＝２６．９％；ｐ＝＜０，０００１）。対照的に、ＩｇＧ２型のキメラ抗体（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ｌｇＧ２は、緩衝剤対照と比較したとき、腫瘍増殖に対して阻害を示さなかった（ＴＧＩ＝０％；平均Ｔ／Ｃ＝１２２％；ｐ＝０．７２６４）。
【０２３６】
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、健康及び生育失敗の代用であった。図５１は、研究の期間にわたるそれぞれの処置群の体重の結果を表す。Ｈ４６０−１６−２又は（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２処置群のいずれかのマウスにおいて、緩衝剤対照群と比較したとき、体重に有意な変化はなかった。しかし、緩衝剤対照処置群と（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１処置群の間では、体重に有意な減少（ｐ＝０．０００５）があった。 
【０２３７】
まとめると、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌モデルにおいて、ネズミ抗体と比較して同一か又はそれ以上の効能を示す。対照的に、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２キメラ抗体は、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌のモデルにおいて腫瘍増殖を低減しなかった。
【０２３８】
実施例１１
Ｈ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１及び（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２ＩｇＧ２で処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のアネキシン−Ｖ染色
アネキシン−Ｖ染色は、キメラ型のＨ４６０−１６−２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞株においてネズミの対応物と同様にアポトーシスを誘発することができるかを決定するために実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｈ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１又は（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２により、０．２５、２．５及び２０マイクログラム／ｍＬで２４時間処理した。各抗体を、同一の濃度で試験した適切なアイソタイプ対照（１Ｂ７．１１、抗−ＴＮＰ、ネズミＩｇＧ１、カッパ、社内で産生；ヒト骨髄腫ＩｇＧ１、ｋ、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ；ヒト骨髄腫ＩｇＧ２、ｋ、Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）と共に三重に試験した。未処理試料を陰性対照として含め、カンプトテシン（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ；Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）を陽性対照として含めた。蛍光測定ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を使用して、ＦＡＣＳ器具を蛍光複合体の光学的こぼれについて補正した。次に、細胞をアネキシン−Ｖ及び７ＡＡＤで染色し、ＦＡＣＳＡｒｒａｙに１時間以内にかけた。
【０２３９】
２つの独立した実験において、ネズミと２つのキメラＨ４６０−１６−２抗体の両方を、互いに、そして適切なアイソタイプ対照抗体と比較した（図５２）。図５２は、２つの実験の平均も示す。アイソタイプ対照で処理された細胞の自発的なアポトーシス効果は、ビヒクルだけで処理された細胞と同様であることが見出された。ネズミ及びヒトのキメラＩｇＧ１及びＩｇＧ２  Ｈ４６０−１６−２抗体は、全て、それぞれの実験において用量依存的に乳癌細胞株にアポトーシスを誘発することが見出され、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２  ＩｇＧ１とＩｇＧ２の両方の抗体でより大きなアポトーシス効果が見られた。結果は、インビトロで、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２抗体は、キメラＩｇＧ１抗体と比較すると、最も大きいアポトーシス効果を有することを示す。
【０２４０】
３つの抗体は、全て、これらの予想されるアイソタイプ対照に対して壊死の率及び壊死／アポトーシス個体群の増加を示した。  壊死の率及び壊死／アポトーシス個体群の最大の増加が、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２において、次に（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１において、そして次にＨ４６０−１６−２において見られた。
【０２４１】
圧倒的な証拠が、Ｈ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１及びＡＲ３７Ａ３３５．８がＣＤ４４に存在するエピトープとの連結を介して抗癌効果を仲介することを示している。Ｈ４６０−１６−２及びＡＲ３７Ａ３３５．８抗体を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のような発現細胞から同族抗原を免疫沈降できることが、実施例５において示されている。更に、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ又はＩＨＣにより示されるがこれらに限定されない技術を利用して、特異的に結合するＣＤ４４抗原部分を発現する細胞及び／又は組織の検出に、Ｈ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１及びＡＲ３７Ａ３３５．８抗体を使用できることを示すことができる。
【０２４２】
したがって、免疫沈降したＨ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１及びＡＲ３７Ａ３３５．８抗原が、いずれかの抗体とそのような細胞又は組織との結合を阻害できることを、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ又はＩＨＣアッセイを使用して示すことができる。  更に、Ｈ４６０−１６−２,（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２,（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１及びＡＲ３７Ａ３３５．８抗体と同様に、他の抗ＣＤ４４抗体も、他の形態のＣＤ４４抗原を免疫沈降及び単離するのに使用することができ、抗原は、また、同じ種類のアッセイを使用して、抗原を発現する細胞又は組織へのこれらの抗体の結合を阻害することに使用できる。
【０２４３】
本明細書で記述されている全ての特許及び出版物は、本発明が関わる当業者のレベルを示している。全ての特許及び出版物は、それぞれ個別の出版物が明確かつ個別に参照として組み込まれることを示すかのように、同じ程度で参照として本明細書に組み込まれる。 
【０２４４】
本発明の特定の形態が例示されているが、本明細書に記載され、示されている部分の特定の形態又は配置に限定されないことを理解するべきである。本発明の範囲から逸脱することなく多様な変更を行うことができ、本発明を、明細書に示され、記載されているものに限定することが考慮されないことは、当業者には明白である。当業者は、本発明が目的を実行するために十分に適合されることを容易に理解し、記述される目的と利点、並びにそれらに固有のものを容易に得るであろう。本明細書で記載されているオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技術のいずれも、好ましい実施態様の現在の代表例であり、例示的であることが意図され、範囲を制限するものとして意図されてはいない。本明細書の変更及び他の使用を当業者は考えつき、それは本発明の精神の範囲内に包含され、添付の請求項の範囲によって定義される。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施例に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、本発明を実施するために記載された様式の多様な修正は、当業者には明白であり、請求項の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】細胞株ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ及びＣＣＤ−２７ｓｋに対するＡＲ３７Ａ３３５．８ハイブリドーマ上澄みの細胞障害性及び結合レベルの率を比較する。
【図２】細胞障害性アッセイにおける陽性及び陰性対照と対比したＡＲ３７Ａ３３５．８の比較である。
【図３】癌及び正常細胞株へのＡＲ３７Ａ３３５．８及び抗ＥＧＦＲ対照の結合を表す。データを、アイソタイプ対照を越える増加倍数のとして平均蛍光強度を表して表にまとめる。
【図４】癌及び非癌細胞株に対して向けられたＡＲ３７Ａ３３５．８及び抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
【図５】予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。縦破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図６】予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図７】予防ＳＷ１１１６結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。縦破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図８】予防ＳＷ１１１６結腸癌モデルにおける体重に対するＡＲ３７Ａ３３５．８の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図９】ＡＲ３７Ａ３３５．８及びＨ４６０−１６−２でプローブした、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分（レーン１）及びＰＣ−３の全細胞溶解産物（レーン２）及びＣＣＤ−２７ｓｋ細胞株（レーン３）から得た試料のウエスタンブロットである。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、抗ＣＤ４４  Ｈ４６０−１６−２の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。ブロットの個別のレーンを、ＡＲ３７Ａ３３５．８（レーン１）、Ｈ４６０−１６−２（レーン２）又はアイソタイプ対照抗体（レーン３）でプローブした。
【図１１】ヒト前立腺腫瘍及び正常組織マイクロアレイに対するＨ４６０−１６−２結合のまとめである。
【図１２】ヒト組織マイクロアレイから、Ｈ４６０−１６−２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た前立腺腫瘍組織の結合パターン及びＨ４６０−１６−２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た正常前立腺組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。Ｈ４６０−１６−２は、腫瘍細胞に対して強い陽性染色を示し、正常組織の間質線維芽細胞に対して弱い染色を示した。倍率は２００×である。
【図１３】ヒト肝腫瘍及び正常組織マイクロアレイに対するＨ４６０−１６−２結合のまとめである。
【図１４】ヒト組織マイクロアレイから、Ｈ４６０−１６−２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た肝腫瘍組織の結合パターン及びＨ４６０−１６−２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た非腫瘍性肝臓組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。Ｈ４６０−１６−２は、腫瘍細胞に対して強い陽性染色を示し、非腫瘍性肝臓組織では類洞細胞（黒色矢印）及び浸潤性リンパ球（緑色矢印）の染色に限定された。倍率は２００×である。
【図１５】ＴＵＮＥＬアッセイ又はＨ＆Ｅ染色により決定された、Ｈ４６０−１６−２又は緩衝剤処置後の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植におけるアポトーシス細胞の数のまとめである。
【図１６】Ｈ４６０−１６−２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物である。軽鎖反応（パネルＡ）は、ＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆ（レーン１）又はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃ（レーン２）順方向プライマーを使用して増幅した。重鎖反応（パネルＢ）は、ＭｕＩｇＶＨ５′−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦ順方向プライマーのミックスを使用して増幅した。両方の軽鎖反応（パネルＡ、レーン１及び２）は、４５０ｂｐで強いバンドを示し、また８５０ｂｐで弱いバンドを示す。４５０ｂｐバンドは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子を含む標的バンドである。重鎖反応（パネルＢ、レーン１）は、５００ｂｐで強いバンドを示し、１０００ｂｐで弱いバンドを示す。５００ｂｐのバンドは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する標的バンドである。
【図１７】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）で形質転換された大腸菌から単離したＥｃｏＲ  Ｉ消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。最初の数字は、使用した順方向プライマーを示し（１はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｆ、２はＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｃ）、２番目の数字はクローン番号を示す（１〜５）。分子量マーカーを左側に示す。矢印は、所望のＨ４６０−１６−２Ｖｋ挿入の位置を示す。
【図１８】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）で形質転換された大腸菌から単離したＥｃｏＲ  Ｉ消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。分子量マーカーを左側に示す。クローン１、２、３、４、５及び８は、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する所望の５００ｂｐバンドを示す。
【図１９−１】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
【図１９−２】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
【図１９−３】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
【図２０】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）で形質転換された大腸菌から単離したＥｃｏＲ  Ｉ消化プラスミドである。クローン番号を上側に示す。分子量マーカーを左側に示す。矢印は、所望のＨ４６０−１６−２Ｖｈ挿入の位置を示す。
【図２１】ｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）及びｐＣＲ２．１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
【図２２】ｐＨＣ−ｈｕＣｇ１ベクター（ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１とも呼ばれる）の概略プラスミドマップである。ヒトＣγ１の定常部領域は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＸｈｏ  Ｉの制限部位の間にある。細菌（アンピシリン）及び哺乳類細胞（ネオマイシン）の選択マーカーが示されている。このプラスミドは、Ｇ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎらにより提供された。
【図２３】プライマー配列である。
【図２４】現存するテンプレートに適切な制限部位を付加した、ＰＣＲ増幅ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（パネルＡ、レーン１）、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ（パネルＡ、レーン２）、及びＨ４６０−１６−２Ｖｈ（パネルＢ、レーン１）ＰＣＲ増幅である。ＢｓｉＷ  Ｉ部位を、ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１ベクターの現存するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位の直ぐ下流に付加した。１１００ｂｐバンド（レーン１）は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位とＸｂａ  Ｉ部位の間のプラスミドの増幅領域である。Ｎｈｅ  Ｉ部位を、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子の５′末端に付加し、Ｎｏｔ  Ｉ部位を３′末端に付加した。Ｎｈｅ  Ｉ部位を、遺伝子の５′末端に付加し、ＢｓｉＷ  Ｉ部位を３′末端に付加した。得られたＨ４６０−１６−２Ｖｋ（パネルＡ、レーン２）及びＨ４６０−１６−２Ｖｈ（パネルＢ、レーン１）バンドのサイズは、極めて少数のヌクレオチドしか加えなかったので、元の遺伝子のサイズと同様の約４５０ｂｐである。
【図２５】ＩｇＧ１のＰＣＲ産物（レーン１）及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミド（レーン２）のヒト重鎖定常部領域の消化である。パネルＡはＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用する単一消化である。パネルＢは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉを使用する二重消化である。ＰＣＲ産物（レーン１）のサイズは、極めて少数のヌクレオチドしか消化により除去されなかったので、消化間（パネルＡ及びＢ）で変わらず、約１０００ｂｐである。ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１プラスミド（レーン２）は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩにより完全に直線化した（パネルＡ）。消化ＰＣＲ産物とサイズが等しいバンドが、およそ１０００ｂｐでプラスミド二重消化（レーン２、パネルＢ）において表れる。これは、新たなＢｓｉＷ  Ｉ部位を含むＰＣＲ産物に代えられたプラスミドの一部である。
【図２６】異なる切断部位でのＢｓｉＷ  Ｉ消化ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１である。ＢｓｉＷ  Ｉ制限部位をｐＣＨ−ｈｕＩｇ１に付加して、Ｈ４６０−１６−２（内部Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有する）のクローニングを促進した。プラスミドを、改変プラスミドで形質転換した大腸菌細胞から単離し、ＢｓｉＷ  Ｉで消化して、切断部位が組み込まれているかを決定した。クローン番号を、未消化対照プラスミド（クローン＃５）であるレーン１１の場合を除いて、それぞれのレーンの上に示す。４及び８を除く全てのクローンは消化されると直線化し、これらが新たな切断部位を含むこことが確認される。クローン４及び８は、未切断対照のレーン１１と同一であると思われ、これらが新たな切断部位を含まないことを示す。
【図２７】ｐＣＬ−ｈｕＣｋベクターの概略プラスミドマップである。ヒトＣｋの定常部領域は、Ｎｏｔ  Ｉ制限部位とＸｈｏ  Ｉ制限部位の間にある。可変部領域は、Ｎｈｅ  Ｉ部位とＮｏｔ  Ｉ部位の間にある。細菌（アンピシリン）及び哺乳類細胞（ピューロマイシン）の選択マーカーが示されている。このプラスミドは、Ｇ．Ｒ．ＭｃＬｅａｎらにより提供された。
【図２８】Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化されたｐＣＬ−ｈｕＣｋ及びＨ４６０−１６−２Ｖｋである。ｐＣＬ−ｈｕＣｋプラスミド（レーン１）及びＨ４６０−１６−２Ｖｋ  ＰＣＲ産物（レーン２）を、両方ともＢｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化して、クローニングを促進した。消化プラスミド（レーン１）は、プラスミド骨格である大きいバンドとして表れ、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋに代えられている軽鎖可変部領域である約４００ｂｐバンドとして表れる。Ｈ４６０−１６−２ＶｋのＰＣＲ産物（レーン２）も約４００ｂｐで表れ、これは軽鎖可変部領域の予測されるサイズである。
【図２９】ＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉで消化されたＨ４６０−１６−２Ｖｈ及びｐＣＨ−ｈｕＩｇ１である。パネルＡは、４５０ｐｂでＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉにより消化されたＨ４６０−１６−２ＶｈのＰＣＲ産物を示す。パネルＢは、ＢｓｉＷ  Ｉ（レーン１）並びにＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉ（レーン２）で消化されたｐＣＨ−ｈｕＩｇ１を示す。単一ｐＣＨ−ｈｕＩｇ１消化（パネルＢ、レーン１）は、大きなバンドとして表れ、二重消化では４５０ｂｐ挿入で大きなバンドとして表れ（パネルＢ、レーン２）、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈに代えられている重鎖可変部領域に対応する。
【図３０】１％アガロースゲルにかけた、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｏｔ  Ｉで消化されたｐＣＬ−ｈｕＣｋ（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）形質転換大腸菌から単離したプラスミドである。レーン上部の番号はクローン番号を示す。＃１を除いた全てのクローンは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子に対応する所望の約４００ｂｐ挿入を示す。
【図３１】１．２パーセントアガロースゲルにかけた、ＢｓｉＷ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉで消化されたｐＣＨ−ｈｕＩｇ１（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）により形質転換された大腸菌から単離されたプラスミドである。レーン上部の番号はクローン番号を示す。全てのクローンは、Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子に対応する所望の約４５０ｂｐ挿入を有する。
【図３２】ｐＮＥＦ３８発現ベクター（ＩＣＯＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のプラスミド概略図である。キメラＨ４６０−１６−２Ｖｋ遺伝子を、Ｍｌｕ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉ制限部位を使用して多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローンしたこのプラスミドの選択マーカーは、ネオマイシン耐性（ＮｅｏＲ）遺伝子であり、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８硫酸塩）の存在下で増殖する能力を有する形質移入細胞を提供する。
【図３３】ｐＤＥＦ３８発現ベクター（ＩＣＯＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のプラスミド概略図である。キメラＨ４６０−１６−２Ｖｈ遺伝子を、Ｍｌｕ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉ制限部位を使用して多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローンしたこのプラスミドの選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子であり、チミジン及びヒポキサンチンの不在下で増殖する能力を有する形質移入ＤＨＦＲ欠損細胞を提供する。
【図３４】それぞれ１．２パーセントと１．０パーセントのアガロースゲルにかけた、制限部位を変えるキメラＨ４６０−１６−２Ｖｋ（パネルＡ）及びＶＨ（パネルＢ）ＰＣＲ産物である。キメラ軽鎖ＰＣＲ反応（パネルＡ、レーン１）は、約８００ｂｐで単一バンドを生じ、これは軽可変部領域（４２０ｂｐ）と定常部領域（３２０ｂｐ）を組み合わせた予測されるサイズに匹敵する。重鎖ＰＣＲ反応（パネルＢ）は、単一の約１５００ｂｐバンドを生じ、これは重可変部領域（４５０ｂｐ）と定常部領域（９９０ｂｐ）の両方を組み合わせた予測されるサイズに匹敵する。
【図３５】Ｘｂａ  Ｉ及びＭｕｌ  Ｉで消化されたｐＮＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）（パネルＡ）及びｐＤＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）（パネルＢ）形質転換大腸菌から単離したプラスミドである。重鎖プラスミド（パネルＢ）は、また、Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｕｌ  Ｉ及びＢｓｉＷ  Ｉ（レーン１Ｂ、２Ｂ、４Ｂ及び６Ｂ）で三重に消化された。軽鎖プラスミド（パネルＡ）では、＃３を除いて全てのクローンが所望の７５０ｂｐ挿入を有し、それは軽鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。重鎖プラスミドではでは、Ｘｂａ  Ｉ及びＭｌｕ  Ｉ消化物（パネルＢ、レーン１Ａ、２Ａ及び６Ａ）は、１５００ｂｐ挿入を示し、これは重鎖可変部領域及び定常部領域に対応する。Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｕｌ  Ｉ及びＢｓｉＷ  Ｉで消化された重鎖プラスミド（パネルＢ、レーン１Ｂ、２Ｂ及び６Ｂ）は、１０００ｂｐ及び５００ｂｐでバンドを示し、これらはそれぞれ重鎖定常部領域及び可変部領域に対応する。クローン４（パネルＢ）は、全く表れず、反応設定に問題があったことを示した。
【図３６−１】ｐＮＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）及びｐＤＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
【図３６−２】ｐＮＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｋ）及びｐＤＥＦ３８（Ｈ４６０−１６−２Ｖｈ）クローンの生配列データである。
【図３７】ｐＭＰＧＣＲ５ＩｇＧ１−Ｖｋ＋ｈＨ４６０のマップである。Ｒ＆ＢポリＡ：ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル；ｐｈＣＭＶ：サイトメガウイルスプロモーター；Ａｄ  Ｔｐｌ；アデノウイルス三者間リーダー；Ｐ２（６）：ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ｃＴＡ）の結合ドメイン；ＩｇＧ１−ＶｈＨ４６０：Ｈ４６０−１６−２の重鎖のコード配列；ＶｋＨ４６０；Ｈ４６０−１６−２軽鎖のコード配列；ＢＫ  Ｔ３′：ＢＫウイルスの大型Ｔ抗原の部分；ＴＫ：チミジンキナーゼ；ｅｎｈ  ＭＰＬ：アデノウイルスの主要な後期プロモーターのエンハンサー。
【図３８】ｐＭＰＧＣＲ５Ｂ４３ｋのマップである。
【図３９】ｐｋＣＲ５Ｂ４３Ｇ３のマップである。
【図４０】異なるクローン（レーン１〜６：それぞれ０、２５、５０、１００、１５０及び２００ｎｇのヒトＩｇＧ；レーン７：クローン１７；レーン８：クローン７１：レーン９：クローン８０；レーン１０：クローン６′；レーン１１：クローン４７′；レーン１２：クローン１４７′；レーン１３：１００ｎｇの純粋なＨ４６０−１６−２；レーン１４：１０マイクロリットルのハイブリドーマ血清）で産生されたＨ４６０−１６−２（ＩｇＧ１アイソタイプ）のウエスタンブロットによる定量化である。
【図４１】異なるクローン（レーン1〜５：それぞれ５０、１００、１５０、２００及び０ｎｇのヒトＩｇＧ；レーン６：クローン１７；レーン７：クローン７１：レーン８：クローン８０；レーン９：クローン６′；レーン１０：クローン４７′；レーン１１：クローン１４７′；レーン１２：１００ｎｇの、細胞上澄みを有するヒトＩｇＧ；レーン１３：１００ｎｇの純粋なＨ４６０−１６−２；レーン１４：１０マイクロリットルのハイブリドーマ血清）で産生されたＨ４６０−１６−２（ＩｇＧ１アイソタイプ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量化である。
【図４２】ｐＭＰＧＣＲ５ＶＫ＋ｈ４６０−ＩｇＧ２のマップである。Ｒ＆ＢポリＡ：ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル；ｐｈＣＭＶ：サイトメガウイルスプロモーター；Ａｄ  Ｔｐｌ；アデノウイルス三者間リーダー；Ｐ２（６）：ｃｕｍａｔｅトランスアクチベーター（ｃＴＡ）の結合ドメイン；Ｖｈ−Ｈ４６０ＩｇＧ２：Ｈ４６０−１６−２の重鎖のコード配列；Ｖｋ−Ｈ４６０；Ｈ４６０−１６−２軽鎖のコード配列；ＢＫ  Ｔ：ＢＫウイルスの大型Ｔ抗原の部分；ＴＫ：チミジンキナーゼ；ｅｎｈ  ＭＰＬ：アデノウイルスの主要な後期プロモーターのエンハンサー。
【図４３】Ｈ４６０−１６−２のキメラＩｇＧ２アイソタイプを作成するのに使用したプライマーのリストである。
【図４４】最初の一連のクローニングの後のウエスタンブロットによるＨ４６０−１６−２のＩｇＧ２アイソタイプの発現である。クローンから選択した２５００００個の細胞を、５００マイクロリットルの培地に再懸濁した。３７℃で２４時間後、１０マイクロリットルの上澄みを、ＨＲＰに結合した抗ヒト抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。
【図４５】異なるサブクローンからの細胞を、５．０×１０５細胞／ｍＬ、３７℃で平板培養した。細胞密度が１．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに達したとき、３０℃に移した。３０℃で７日間後、指定量の上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏｒ−Ｏｒａｎｇｅでの染色により分析した。産生された抗体の量（ｎｇ／マイクロリットル）を示す。
【図４６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分に対するウエスタンブロッティングによるキメラ（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ１クローンの特徴決定である。
【図４７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分に対するウエスタンブロッティングによるキメラ（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２クローンの特徴決定である。
【図４８】ＣＨＯｃＴＡクローン６′により産生された抗体の抗体濃縮の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色による分析である。
【図４９】クローン４０Ｂ７により産生された抗体の抗体濃縮の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色による分析である。
【図５０】ヒト乳癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＨ４６０−１６−２、（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ｌｇＧ１及び（ｃｈ）ＡＲＨ４６０−１６−２−ＩｇＧ２による処置の効果を示す。腫瘍容量は、群平均±ＳＥＭとして表す。縦破線は、投与の最初と最後の日を示す。
【図５１】研究の期間中の体重に対するモノクローナル抗体による処置の効果を示す。体重は、群平均±ＳＥＭとして表す。
【図５２】２つの別々の、アネキシンＶ染色実験で得られたネズミ及びキメラＨ４６０−１６−２抗体の全体的なアポトーシス効果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【国際調査報告】
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