(57)【要約】本発明は特異な性質を持つ修飾ＥＰＯミメティックペプチドに関する。本発明の第１の実施形態によれば、以下に示すアミノ酸のコンセンサス配列を含むペプチド（とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの）が提供される。この実施形態には、ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換される、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
2009529509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
・以下に示すアミノ酸のコンセンサス配列を含むペプチド：
【化１】
2009529509.tif 000060
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］、
および
・ＥＰＯミメティック活性を示し、かつ位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換される、上記コンセンサス配列によって定義されるペプチドの機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種、
からなる群より選択される、ＥＰＯ受容体に結合することができるペプチド。
【請求項２】
位置Ｘ６およびＸ１５のアミノ酸が、その側鎖間に共有結合を形成することによってペプチド内で分子内架橋を形成することができるように選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
架橋がジスルフィド架橋またはジセレニド架橋である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ６および／またはＸ１５が、システイン、ホモシステインおよびセレノシステインなどのシステイン誘導体、チオリジン、ＫまたはＥを含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１３がナフチルアラニンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドであって、以下の二つの選択肢から選択されるペプチド：
（ａ）以下に示すアミノ酸の配列を含むペプチド：
【化２】
2009529509.tif 000061
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡであり；
Ｘ１３は、ナフチルアラニンである］
（ｂ）以下に示すアミノ酸の配列を含むペプチド、とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの：
【化３】
2009529509.tif 000062
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷもしくはＹまたはＲ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹもしくはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、１−ｎａｌ、２−ｎａｌであり、
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）である。
ただしＸ６かＸ１５のどちらかはＣまたはｈｏｃであるものとする］
（ｃ）ＥＰＯミメティック活性を示し、かつ位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され、位置Ｘ１３にはナフチルアラニンを持つ、上記コンセンサス配列によって定義されるペプチドの機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種。
【請求項７】
以下に示すアミノ酸のコア配列を含む、請求項６に記載のペプチド：
【化４】
2009529509.tif 000063
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、ナフチルアラニンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］。
【請求項８】
位置Ｘ１０に荷電アミノ酸を示すことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
以下の追加アミノ酸位置を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド：
【化５】
2009529509.tif 000064
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｈａｒから独立して選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９は、任意のアミノ酸から独立して選択される］。
【請求項１０】
Ｘ１７が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘ１９が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項９または１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の荷電アミノ酸が正または負に荷電していて、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９が負荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記負荷電アミノ酸が、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・好ましくは、Ａａｄ、２−アミノヘプタン二酸、Ａｓｕなどの伸長された側鎖を示す、非天然負荷電アミノ酸；
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換するために使用される基が、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記正荷電アミノ酸が、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチン；
・位置Ｘ１０および／またはＸ１７において、好ましくは、例えばホモアルギニンに見られるような伸長された側鎖を示す、非天然正荷電アミノ酸；
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１７】
Ｘ８がＤ−アミノ酸、好ましくはＤ−フェニルアラニンである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１８】
以下のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のペプチド：
【化６】
2009529509.tif 000065
［Ｘ６〜Ｘ１９は上記の意味を持ち、
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの前記誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持し、その電子吸引性置換基は、好ましくは、アミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される）であり（Ｘ４は、好ましくは、４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択される）；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択される］。
【請求項１９】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドであって、
・以下に示すアミノ酸のコア配列の少なくとも一つを含むペプチド：
【化７】
2009529509.tif 000066
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは負荷電アミノ酸であり、
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択される］；
・ＥＰＯミメティック活性を示し、かつ位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つが負荷電アミノ酸である、上記コンセンサス配列によって定義されるペプチドの機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種
からなる群より選択されるペプチド。
【請求項２０】
以下の拡大されたコンセンサス配列を含む、請求項１９に記載のペプチド：
【化８】
2009529509.tif 000067
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０が負荷電アミノ酸でない場合、Ｘ１０はプロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７が負荷電アミノ酸でない場合、Ｘ１７は任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正電荷天然、非天然または誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンから選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９が負荷電アミノ酸でない場合、Ｘ１９は任意のアミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンなどの正荷電アミノ酸から独立して選択される。
ただしＸ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つ、好ましくはＸ１９は、負荷電アミノ酸であるものとする］。
【請求項２１】
前記負荷電アミノ酸が、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・好ましくは、Ａａｄ、２−アミノヘプタン二酸、Ａｓｕなどの伸長された側鎖を示す、非天然負荷電アミノ酸；
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１９または２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つに正荷電アミノ酸が存在する場合、それが、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチン；
・位置Ｘ１０および／またはＸ１７において、好ましくは、例えばホモアルギニンに見られるような伸長された側鎖を示す、非天然正荷電アミノ酸；
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
以下のアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のペプチド：
【化９】
2009529509.tif 000068
［Ｘ６〜Ｘ１９は上記の意味を持ち、
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択される］。
【請求項２４】
前記電子吸引性置換基がアミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択され、Ｘ４が好ましくは４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択される、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
Ｘ１３がナフチルアラニンであることを特徴とする、請求項１９〜２４の少なくとも一つに記載のペプチド。
【請求項２６】
【化１０】
2009529509.tif 000069
【化１１】
2009529509.tif 000070
からなる群より選択される、請求項１９〜２５の少なくとも一つに記載のペプチド。
【請求項２７】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドであって、
・以下に示すアミノ酸のコア配列を特徴とするペプチド：
【化１２】
2009529509.tif 000071
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ８は、Ｄ−アミノ酸であり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］
および
・ＥＰＯミメティック活性を示し、かつ位置Ｘ８にＤ−アミノ酸を持つ、上記コンセンサス配列によって定義されるペプチドの機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種
からなる群より選択されるペプチド。
【請求項２８】
以下のアミノ酸コア配列を含む、請求項２７に記載のペプチド：
【化１３】
2009529509.tif 000072
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｄ−Ｍ、Ｄ−Ｆ、Ｄ−Ｉ、Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｈ、Ｄ−ホモセリンメチルエーテルまたはＤ−ノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］。
【請求項２９】
Ｘ８がＤ−フェニルアラニンであることを特徴とする、請求項２７または２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
位置Ｘ１０に荷電アミノ酸を示すことを特徴とする、請求項２７〜２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
以下のアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３０に記載のペプチド：
【化１４】
2009529509.tif 000073
［Ｘ６〜Ｘ１５は上記の意味を持ち、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正荷電天然、非天然もしくは誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンから独立して選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９は、任意のアミノ酸から独立して選択される］。
【請求項３２】
Ｘ１７が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
Ｘ１９が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項３１または３２に記載のペプチド。
【請求項３４】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の荷電アミノ酸が正または負に荷電していて、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３５】
Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９が負荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記負荷電アミノ酸が
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・好ましくは、Ａａｄ、２−アミノヘプタン二酸、Ａｓｕに見られるように伸長された側鎖を示す、非天然負荷電アミノ酸；
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３７】
正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換するために使用される基が、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記正荷電アミノ酸が
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチン；
・位置Ｘ１０および／またはＸ１７において、好ましくは、例えばホモアルギニンに見られるような伸長された側鎖を示す、非天然正荷電アミノ酸；
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３９】
以下のアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３８のいずれか一項に記載のペプチド：
【化１５】
2009529509.tif 000074
［Ｘ６〜Ｘ１９は上記の意味を持ち、
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択される］。
【請求項４０】
前記電子吸引性置換基がアミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４１】
Ｘ４が４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択される、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４２】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドであって、
・以下に示すアミノ酸のコア配列を特徴とするペプチド：
【化１６】
2009529509.tif 000075
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ４は、Ｆ、またはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］
・ＥＰＯミメティック活性を示し、かつ位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され、位置Ｘ４にはＦ、またはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）を持つ、上記コンセンサス配列によって定義されるペプチドの機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種
からなる群より選択されるペプチド。
【請求項４３】
前記電子吸引性置換基がアミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される、請求項４２に記載のペプチド。
【請求項４４】
Ｘ４が４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択される、請求項４２に記載のペプチド。
【請求項４５】
位置Ｘ１０に荷電アミノ酸を示すことを特徴とする、請求項４２〜４４の少なくとも一つに記載のペプチド。
【請求項４６】
以下のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のペプチド：
【化１７】
2009529509.tif 000076
［Ｘ６〜Ｘ１５は上記の意味を持ち、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、ＰまたはＹから独立して選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９は、任意のアミノ酸から独立して選択される］。
【請求項４７】
Ｘ１７が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項４３に記載のペプチド。
【請求項４８】
Ｘ１９が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項４６または４７に記載のペプチド。
【請求項４９】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の荷電アミノ酸が正または負のいずれかに荷電していて、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５０】
Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９が負荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記負荷電アミノ酸が、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・好ましくは、Ａａｄ、２−アミノヘプタン二酸、Ａｓｕに見られるように伸長された側鎖を示す、非天然負荷電アミノ酸；
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５０に記載のペプチド。
【請求項５２】
正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換するために使用される基が、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸から選択されることを特徴とする、請求項５１に記載のペプチド。
【請求項５３】
前記正荷電アミノ酸が、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン  ヒスチジンおよびオルニチン；
・位置Ｘ１０および／またはＸ１７において、好ましくは、例えばホモアルギニンに見られるような伸長された側鎖を示す、非天然正荷電アミノ酸；
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４９に記載のペプチド。
【請求項５４】
Ｘ８がＤ−アミノ酸、好ましくはＤ−フェニルアラニンである、請求項４２〜５３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５５】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドであって、以下に示すペプチドの群から選択されるペプチド：
（ａ）以下に示すアミノ酸のコア配列を含むペプチド：
【化１８】
2009529509.tif 000077
【化１９】
2009529509.tif 000078
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、ナフチルアラニン、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］
ならびに、ＥＰＯミメティック活性を示す、上記コンセンサス配列によって定義されるペプチドの機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種（位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸を表す）；
（ｂ）以下に示すアミノ酸の配列を含むペプチド、とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの：
【化２０】
2009529509.tif 000079
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、Ｈａｒであり、
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）である。
ただしＸ６かＸ１５のどちらかはＣまたはｈｏｃであるものとする］；
（ｃ）以下のアミノ酸配列を含むペプチド
【化２１】
2009529509.tif 000080
［Ｘ６〜Ｘ１５は、変種（ｂ）の上記の意味を持ち、
Ｘ３は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶから独立して選択され；
Ｘ４は、Ｙであり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから独立して選択され．
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７は、ホモアルギニンであり；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸から独立して選択される］。
【請求項５６】
以下に示すアミノ酸のコア配列を含む、請求項５５に記載のペプチド：
【化２２】
2009529509.tif 000081
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合、Ｘ１０はプロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合、Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合、Ｘ１７は任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正荷電天然、非天然もしくは誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈまたはオルニチンから選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合、Ｘ１９は、任意のアミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈまたはオルニチンなどの正荷電アミノ酸から独立して選択される。
ただしＸ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸であるものとする］。
【請求項５７】
Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つが正荷電アミノ酸であり、その正荷電アミノ酸が、好ましくは、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチン；
・好ましくはリジンと比較して伸長された側鎖を示す、非天然正荷電アミノ酸；
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの；
からなる群より選択される（ただしＸ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つはリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸であるものとする）、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項５８】
前記正荷電アミノ酸の伸長が側鎖の伸長ユニットによってもたらされ、その伸長ユニットが脂肪族基または芳香族基である、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項５９】
前記伸長がＣＨ２ユニットによってもたらされ、ＣＨ２ユニットの数が好ましくは１〜６である、請求項５８に記載のペプチド。
【請求項６０】
リジンと比較して伸長されている前記正荷電非タンパク質構成アミノ酸が非天然アミノ酸である、請求項５５〜５９の少なくとも一つに記載のペプチド。
【請求項６１】
前記非天然アミノ酸がホモアルギニン、アミノフェニルアラニンおよびアミノナフチルアラニンを含む群より選択される、請求項６０に記載のペプチド。
【請求項６２】
Ｘ１０またはＸ１７が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６３】
Ｘ１９が荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６４】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の荷電アミノ酸が正または負に荷電していて、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６５】
Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９が負荷電アミノ酸であることを特徴とする、請求項６４に記載のペプチド。
【請求項６６】
前記負荷電アミノ酸が、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・好ましくは、Ａａｄ、２−アミノヘプタン二酸、Ａｓｕなどの伸長された側鎖を示す、非天然負荷電アミノ酸；
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項６５に記載のペプチド。
【請求項６７】
前記正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換するために使用される基が、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸から選択されることを特徴とする、請求項６６に記載のペプチド。
【請求項６８】
Ｘ８がＤ−アミノ酸、好ましくはＤ−フェニルアラニンである、請求項５５〜６７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６９】
以下のアミノ酸配列を含む、請求項５５〜６８のいずれか一項に記載のペプチド：
【化２３】
2009529509.tif 000082
［Ｘ６〜Ｘ１９は上記の意味を持ち、
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択される］。
【請求項７０】
電子吸引性置換基がアミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される、請求項６９に記載のペプチド。
【請求項７１】
Ｘ４が４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択される、請求項７０に記載のペプチド。
【請求項７２】
少なくとも二つの単量体型ＥＰＯミメティックペプチドコンセンサス配列を含み、その単量体型ペプチドコンセンサス配列の少なくとも一つが、請求項１〜７１の少なくとも一つに記載のペプチドである、ＥＰＯミメティックペプチド。
【請求項７３】
二量体であり、請求項１〜７１の少なくとも一つに記載の少なくとも一つの単量体型ペプチドコンセンサス配列を含む、請求項７２に記載のペプチド。
【請求項７４】
ターゲット分子に結合する化合物であって、
（ｉ）少なくとも二つのペプチドユニットであって、各ペプチドユニットがターゲットへの結合能を持つ少なくとも二つのドメインを含むもの；
（ｉｉ）少なくとも一つポリマー担体ユニット；
を含み、前記ペプチドユニットが前記ポリマー担体ユニットに取り付けられ、少なくとも一つのペプチドユニットの少なくとも一つのドメインが請求項１〜７１の少なくとも一つに記載のペプチドである化合物。
【請求項７５】
少なくとも一つのペプチドユニットが請求項７３に記載のペプチド二量体を含む、請求項７４に記載の化合物。
【請求項７６】
前記担体ユニットが、少なくとも一つの天然もしくは合成の分岐、デンドリティックもしくは線状ポリマーであるか、または少なくとも一つの天然もしくは合成の分岐、デンドリティックもしくは線状ポリマーを含み、好ましくはポリグリセリン、ポリシアル酸、デキストラン、デンプンまたはポリエチレングリコールからなる群より選択されるか、または他の生物学的に不活性な水溶性ポリマーから選択される、請求項７４または７５に記載の化合物。
【請求項７７】
前記ポリマー担体ユニットが分岐ユニットを含む、請求項７４〜７６の少なくとも一つに記載の化合物。
【請求項７８】
前記分岐ユニットがグリセロールまたはポリグリセロールを含む、請求項７７に記載の化合物。
【請求項７９】
前記担体分子が少なくとも５ｋＤの分子量、好ましくは２０〜２００または４０００ｋＤの分子量、ポリエチレングリコールなどの小さい担体を使用する場合には２０〜８０ｋＤの分子量を持つ、請求項７４〜７８の少なくとも一つに記載の化合物。
【請求項８０】
前記担体ユニットが少なくとも二つのポリマーサブユニットから構成され、前記ポリマーサブユニットが少なくとも一つの生分解性共有結合リンカー構造によって接合される、請求項７４〜７９の少なくとも一つに記載の化合物。
【請求項８１】
第１生分解性担体ユニットを含み、ペプチドユニットおよび第２ポリマー担体ユニットが前記第１ポリマー担体ユニットに取り付けられる、上記請求項の少なくとも一つに記載の化合物。
【請求項８２】
前記第２担体ユニットが前記第１担体ユニットよりも低い分子量を持ち、好ましくはＨＥＳである前記第１担体ユニットの取り付け部位の約２０〜５０％が、好ましくは分子量約３〜１０ｋＤのＰＥＧである前記第２担体ユニットで占められる、請求項８１に記載の化合物。
【請求項８３】
修飾ポリマー担体ユニットが使用される、上記請求項の少なくとも一つに記載の化合物。
【請求項８４】
前記ペプチドユニットが共有結合によって前記ポリマー担体ユニットに取り付けられ、取り付けは前記ペプチドユニットの反応性アミノ酸、Ｎ末端アミノ基および／またはＣ末端カルボン酸を介して行われ、前記反応性アミノ酸は好ましくはリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択され、前記ポリマー担体ユニットが適当な反応性カップリング基を持たない場合は、カップリングユニットを使ってポリマー担体ユニットが修飾され、前記カップリングユニットは、好ましくは、前記ペプチドユニットのアミノ基と反応するアシル化基、前記ペプチドユニット上のスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、最も好ましくはタンパク質上のカルボキシル基と反応するマレイミド基、エステルおよびアミド形成基、前記ペプチドユニット上のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、例えば５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）基、オルト−ピリジルジスルフィドおよびアルキルメルカプタン基、ジカルボニル基、例えばシクロヘキサンジオン基、ならびに前記ペプチドユニットのグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基；前記ペプチド上のフェノール性基と反応するジアゾ基；前記ペプチドユニット上のアミノ基と反応する、臭化シアンと前記ポリマー担体ユニットとの反応によって生じる反応性基からなる群より選択される、請求項８３に記載の化合物。
【請求項８５】
前記反応性アミノ酸がシステインであり、前記カップリング基がマレイミドである、請求項８４に記載の化合物。
【請求項８６】
請求項１〜７３のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項８７】
請求項１〜７３の少なくとも一項に記載のペプチド、またはもっぱらＤ−アミノ酸からなる各ペプチドのインベルソペプチドおよび／またはレトロ／インベルソペプチドであることを特徴とするペプチド。
【請求項８８】
単量体型ペプチドユニットを二量体化してＥＰＯミメティックペプチド二量体を形成させるための方法であって、単量体型ペプチドユニット間に共有結合を形成させることによって二量体が作製され、前記結合が第１単量体型ペプチドユニットのＣ末端アミノ酸と第２単量体型ペプチドユニットのＮ末端アミノ酸との間に形成される方法。
【請求項８９】
共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸をＣ末端またはＮ末端に保持する単量体型ペプチドユニットが使用され、共有結合が、第１単量体型ペプチドユニットのＣ末端アミノ酸の側鎖と、第２単量体型ペプチドユニットのＮ末端アミノ酸の側鎖との間に形成される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
二つの単量体型ペプチドユニットを連結して二量体にする共有結合がジスルフィド架橋またはジセレニド架橋である、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
二つの単量体型ＥＰＯミメティックペプチドユニット間に分子間結合を形成するアミノ酸がシステイン、ホモシステインおよびセレノシステインなどのシステイン誘導体、チオリジン、ＫまたはＥを含む群から選択される、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
請求項１〜７３のいずれか一項において定義したＥＰＯミメティックペプチド配列を含むＥＰＯミメティックペプチド二量体。
【請求項９３】
請求項８８〜９１に記載の方法によって製造され、好ましくは請求項１〜７３のいずれか一項において定義したペプチド配列を含む、ＥＰＯミメティックペプチド二量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン受容体に対する結合分子としてのペプチド、その製造方法、それらのペプチドを含有する医薬、および選択された適応症における（好ましくはさまざまな形態の貧血および脳卒中を処置するための）それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンの一種エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、１６５個のアミノ酸によって構成され、四つの糖鎖付加部位を持つ、糖タンパク質である。四つの複合糖質側鎖は、約３５ｋＤという分子量全体の４０パーセントを占める。ＥＰＯは腎臓で形成され、そこから脾臓および骨髄に移動し、そこで赤血球の産生を刺激する。慢性腎臓疾患では、ＥＰＯ産生量の低下が赤血球減少性の貧血をもたらす。遺伝子工学によって製造される組換えＥＰＯを使って、貧血を効果的に処置することができる。ＥＰＯは透析患者の生活の質を改善する。腎性貧血だけでなく、早産新生児における貧血、炎症および腫瘍関連貧血も、組換えＥＰＯで改善させることができる。ＥＰＯを使って、腫瘍患者における高用量化学療法を、よりうまく行うことができる。同様にＥＰＯは、放射線療法の一部として投与された場合に、がん患者の回復を改善する。
【０００３】
タンパク質は体内で比較的迅速に分解されるので、頻繁なまたは持続的な静脈または皮下適用に基づく投薬レジメンが要求されるという点で、ＥＰＯによる処置には課題が存在する。したがって組換えＥＰＯ由来分子の進化は、安定性を増し、よって生物学的半減期を増大させるために、例えば追加の糖鎖付加またはＰＥＧ化などによって、この糖タンパク質を選択的に修飾する方向に向かっている。
【０００４】
組換えＥＰＯによる処置に付随するもう一つの重要な問題は、患者が処置中に組換えＥＰＯに対する抗体を発生させる危険である。これは、組換えＥＰＯが内在性ＥＰＯと完全には同一でないという事実に起因する。ひとたび抗体形成が誘導されると、それは内在性エリスロポエチンの活性も同様に損なう抗体をもたらしうる。これは、多くの場合、処置に必要な組換えＥＰＯの用量を増加させる。とりわけそのような抗体が内在性ＥＰＯの活性を損なう場合は、この作用を処置誘発性自己免疫疾患と解釈することができる。例えば何ヶ月もまたは何年もＥＰＯ処置を受けた後に腎移植を受ける透析患者の場合、これはとりわけ望ましくない。その場合は、抗体が移植物によって産生される内在性ＥＰＯの活性を損ない、よって移植された臓器の赤血球産生活性を損ないうる。生物学的半減期を増大させるために組換えＥＰＯに導入される修飾がこの問題を悪化させるか改善するかという疑問は、現時点ではまだ解決していない。一般的には、甚だしい修飾および半減期の延長は、問題の多いこの性質を悪化させることになると予想されるだろう。
【０００５】
代替戦略は、エリスロポエチンとは配列ホモロジーまたは構造上の関係を共有しない合成ペプチドをアミノ酸から製造することである。ＥＰＯの配列とは無関係なペプチドであって、エリスロポエチンよりもかなり小さなペプチドが、アゴニストとして作用しうることが示されている（非特許文献１）。そのようなペプチドは、依然として活性な１０アミノ酸長の最小ペプチドまで短縮できることが、同じ著者によって示されている。
【０００６】
ＥＰＯの活性を模倣する合成ペプチドは特許文献１の主題である。これには、好ましくは、共通して位置１０および１７と呼ばれる位置に二つのプロリンを含有し、そのうちの一方は必須であると考えられる、独特なコンセンサスの１０〜４０アミノ酸のミメティックペプチドが開示されている。特許文献２には、これらのプロリンをナフチルアラニンと組み合わせてもよいことが開示されている。
【０００７】
このように、現在に至るまで、ＥＰＯ受容体の小ペプチド系アゴニストはいずれも、所定の位置（通常は、非常に活性なエリスロポエチンミメティックペプチドＥＭＰ１（特許文献１；非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）：
【０００８】
【化２４】
2009529509.tif 000003
におけるそれらの位置を参照して位置１０および１７と番号づけられる位置）に、少なくとも一つのプロリン（多くの場合、二つのプロリン）残基を含有する構造を持っていた。
【０００９】
これらのプロリンはペプチドの有効性にとって不可欠であると考えられる。位置１７のプロリンについては受容体との相互作用によってこれが確証されており、一方、位置１０のプロリンは分子の正しいフォールディングに必要であると考えられた（非特許文献１、非特許文献４も参照されたい）。プロリンの特殊な立体化学的性質によって支援される正しいフォールディングは、通常、生物学的活性の不可欠な前提条件である。一般にプロリンは、この例の場合と同様に、多くの場合、ヘアピン構造およびベータ・ターンの形成に関与する構造形成アミノ酸である。なかんずくこの性質ゆえに、これは、プロリン含有ペプチド／タンパク質を破壊するポストプロリン特異的エンドペプチダーゼの高頻度な攻撃点になる。いくつかの内在性ペプチドホルモン（アンギオテンシンＩおよびＩＩ、ウロテンシン類、チレオリベリン（ｔｈｙｒｅｏｌｉｂｅｒｉｎ）、他のリベリン類など）は、そのような「シングルヒット（ｓｉｎｇｌｅ−ｈｉｔ）」ポストプロリン切断によって不活化される。このように、プロリン含有ＥＰＯミメティックペプチドの半減期は、これらの高頻度活性酵素の活性によって短縮される。
【００１０】
そのような短ペプチドは化学的に製造することができ、制御することならびに所定の品質およびアイデンティティを持つ生成物を得ることがはるかに困難な組換え製造を必要としない。そのような小サイズのペプチドの化学的製造は、製造コストの観点からも競争力を持ちうる。さらにまた化学的製造では、糖鎖付加、ＰＥＧ化または他の任意の所定の修飾など、生物学的半減期を増加させる既知の潜在能力を持ちうる分子変異の明確な導入も可能である。しかし今までに既存のＥＰＯミメティックペプチドによる治療法が承認された例はない。
【００１１】
さらにまた、十分に強力な治療用分子を提供するために、ＥＰＯミメティックペプチドのＥＰＯミメティック効力を強化する必要もある。
【００１２】
従来技術に記載のＥＰＯミメティックペプチドは、エリスロポエチン受容体の結合部位を認識する単量体型結合ドメインとみなすことができる。しかし、Ｗｒｉｎｇｔｏｎら（非特許文献４）が指摘したように、ＥＰＯ受容体をホモ二量体化し、シグナル伝達を誘導するには、一般に、これらの結合ドメインが二つ必要である。そこで、二つのこれらＥＰＯミメティックペプチド、それゆえに二つのＥＰＯ受容体結合ドメインを、単一の二量体型分子中で組み合わせたところ、活性がかなり強化された。これは、単一の結合ドメインを持つペプチドも質的には同じ活性パターンを示したが、一つに接合された二つの結合ドメインは、それよりもはるかに低いＥＤ５０（５０％有効量、活性の尺度）を示すという結果につながる。単量体型ＥＰＯミメティックペプチドの力価は、二量体化によって１０００倍まで改善されうる。不活性な単量体型ペプチドの中には、二量体化によってアゴニストに変換されうるものさえある。二つの結合ドメインを内包するペプチドは、二価ペプチドまたは二量体型ペプチドであると特定される。
【００１３】
単量体を二量体化するための技法はいくつか知られている。単量体は、例えばリンカーに共有結合で取り付けることによって、二量体化することができる。リンカーは、本発明のポリペプチドユニット間に共有結合を生成させる接合分子である。ポリペプチドユニットは、ＥＰＯ受容体への結合が改善されるような方法で、リンカーを介して組み合わせることができる（非特許文献２；非特許文献４）。さらにまた、Ｗｒｉｎｇｈｔｏｎら（非特許文献４）が記載したタンパク質担体分子との非共有結合的相互作用による単量体型ビオチン化ペプチドの多量体化にも言及する。ビオチン／ストレプトアビジン系を使用すること、すなわちペプチドのＣ末端をビオチン化した後、そのビオチン化ペプチドをストレプトアビジンと共にインキュベートすることも可能である。あるいは、ジケトピペラジン構造を形成させることによって二量体化を達成することも知られている。当業者に知られるこの方法は、例えばＣａｖｅｌｉｅｒら（非特許文献５）などに詳細に説明されている。先行技術から知られているペプチド二量体を得るためのもう一つの代替方法は、後にリンカーになる部分の反応性前駆体として、Ｎ末端アミノ基と反応することによって最終二量体型ペプチドを形成する二官能性活性化ジカルボン酸誘導体を使用することである（非特許文献２）。単量体は、リンカーに共有結合で取り付けることによって二量体化することもできる。好ましくは、リンカーはＮＨ−Ｒ−ＮＨ（式中、Ｒは、もう一つの分子部分への結合を可能にするカルボキシル基またはアミノ基などの官能基で置換された低級アルキレンである）を含む。リンカーはリジン残基またはリジンアミドを含有するかもしれない。ＰＥＧもリンカーとして使用しうる。リンカーは、二つのカルボン酸を含有する分子（場合によっては一つ以上の原子が一つ以上のＰＥＧ分子に結合することができるアミンなどの官能基で置換されているもの）であることができる。リンカー部分を使ってペプチドをオリゴマー化および二量体化するための考えうるステップの詳細な説明は、特許文献３にも記載されている。ＥＰＯミメティックペプチドのための代替二量体化戦略も認められる。
【００１４】
さらにまた、ＥＰＯおよびＥＰＯミメティックペプチド（単量体型または二量体型）は、ヒト治療目的でのみ関心が持たれているわけではないことにも注意すべきである。ＥＰＯ代用物は、ヒト応用の他に動物健康管理市場でも大いに必要とされている。この点で、乱用を防ぐには、ヒトおよび動物において弁別的な活性パターンを示すＥＰＯミメティックペプチドを提供することが望ましい。しかし、さまざまな動物ＥＰＯ受容体（例えばマウス、ラット、ブタおよびイヌ）の配列はヒトＥＰＯ受容体と極めて似ているので、これは困難な仕事である。異なる種のＥＰＯ受容体を整列すると、異なる種が数アミノ酸しか相違しないことが明白になる。これは高い構造ホモロジーを含意する。さらにまた、ＥＰＯミメティックペプチドへの結合に関係するのは、これらのアミノ酸残基のごく一部に過ぎない。これは、ヒトおよび動物ＥＰＯ受容体に対して異なる活性レベルを示すＥＰＯミメティックペプチドの開発を困難にする。
【特許文献１】国際公開第９６／４０７４９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／３８３４２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／１０１６０６号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ，Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ，Ｃｈａｎｇ  Ｒ，Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ，Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ，Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ，Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ（１９９６）Ｓｍａｌｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：４５８−４６３
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｆ．Ｘ．Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．「Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：９３９−９５０．
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｆ．Ｘ．Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  １３  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｎｄ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＥＭＰ１」．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，３６９９−３７１０．
【非特許文献４】Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｐ，Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ，Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ，Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  Ｌ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ，Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ（１９９７）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１２６１−１２６５
【非特許文献５】「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｈｅ  ｗａｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ」Ｍｉｃｈａｌ  ＬｅｂｌおよびＲｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ編；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ネイティブＥＰＯの生物学的活性の少なくとも本質的部分を示す代替合成ペプチドを提供し、よって効率のよい治療戦略のための代替手段を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
改善された効力を持つＥＰＯミメティックペプチドを提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１７】
代替二量体化戦略によってＥＰＯミメティックペプチドの二量体を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１８】
さらにまた、ヒトおよび動物において互いに異なる活性パターンを示すＥＰＯミメティックペプチドを提供することも、本発明の目的である。
【００１９】
これらの目的に対する解決策の概略を以下に詳述する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の実施形態によれば、以下に示すアミノ酸のコンセンサス配列を含むペプチド（とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの）が提供される：
【００２１】
【化２５】
2009529509.tif 000004
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡである］。
【００２２】
この実施形態には、ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換される、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【００２３】
上記ペプチドコンセンサス配列は、ＥＰＯ受容体に対する単量体型結合ドメインであると理解することができる。これらは、ＥＰＯミメティックペプチドとして、ＥＰＯ受容体に結合することができる。
【００２４】
ペプチドの長さは、好ましくは、１０〜４０または５０または６０アミノ酸である。好ましい実施形態では、ペプチドコンセンサスが少なくとも１０、１５、１８、２０または２５アミノ酸の長さを表す。もちろん、コンセンサスはそれぞれ、より長い配列に埋め込まれ、包含されうる。上記コンセンサスの単量体型ペプチドユニット二つを二量体化することによって、長さを伸ばすこともできる（下記参照）。
【００２５】
ＷｒｉｇｈｔｏｎおよびＪｏｈｎｓｏｎによる既知のＥＰＯミメティックペプチドのプロリンの一方が、さらには一部の実施形態によればその両方が、他の天然アミノ酸または非天然アミノ酸で置き換えられるにもかかわらず、本発明のペプチドがＥＰＯミメティック活性を示すことは、極めて意外だった。実際、本発明のペプチドは、既知のプロリン含有ペプチドの活性に匹敵するか、さらにはそれを上回る活性を持つ。しかし、プロリン残基を置換するアミノ酸が保存的置換物ではなくプロリンの非保存的置換物に相当することは、注目に値する。そのようなプロリンの非保存的置換物の適切な例は、位置１０における正電荷アミノ酸または負電荷アミノ酸である。
【００２６】
好ましくは、塩基性アミノ酸などの正電荷アミノ酸、例えばタンパク質構成アミノ酸Ｋ、ＲおよびＨ、とりわけＫを置換に使用することができる。位置１０にあるプロリンの置換に使用される非保存的アミノ酸は、非タンパク質構成性の天然または非天然アミノ酸であることもでき、好ましくは正荷電側鎖を持つものである。上述したアミノ酸のそれぞれの類似体も含まれる。リジンと比較して伸長された側鎖を持つ非タンパク質構成性の正荷電アミノ酸はとりわけ活性であることが判明した。そのような伸長されたアミノ酸の適切な例は、ホモアルギニンである。ある実施形態によれば、ペプチドは、位置１０に、天然アミノ酸アルギニン以外の正荷電アミノ酸を保持する。この実施形態によれば、プロリン１０は、タンパク質構成アミノ酸ＫまたはＨならびに正荷電非タンパク質構成天然アミノ酸および非天然正荷電アミノ酸（例えばホモアルギニンなど）からなる群より選択される正荷電アミノ酸で置換される。
【００２７】
第１実施形態のコンセンサス配列によれば、Ｘ６およびＸ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸を表す。したがってこれらのアミノ酸は架橋ユニットを形成することができる。ある実施形態によれば、位置Ｘ６およびＸ１５のアミノ酸は、互いの間に共有結合を形成することにより、ペプチド内で分子内架橋を形成することができるように選択される。分子内架橋の形成はペプチドの環化をもたらしうる。適切な架橋ユニットの例はジスルフィド架橋およびジセレニド架橋である。そのような架橋形成官能性を示すアミノ酸の適切な例は、例えばシステインおよびホモシステインまたはセレノシステインなどのシステイン誘導体、さらにはチオリジンである。例えば二つのセレノシステイン残基間でのジセレニド架橋の形成にはシステイン架橋よりも有利な点もある。還元環境下ではセレニド架橋の方が安定だからである。したがって困難な条件下でもペプチドのコンフォメーションが保持される。
【００２８】
しかし位置Ｘ６およびＸ１５には、例えば正荷電側鎖を持つアミノ酸（例：タンパク質構成アミノ酸Ｋ、Ｈ、Ｒ、またはオルニチン、ＤＡＰもしくはＤＡＢ）と負荷電側鎖を持つアミノ酸（例：タンパク質構成アミノ酸ＤまたはＥ）の間のアミド結合などといった異なる共有結合の形成を可能にする官能性を持つ側鎖を示すアミノ酸も適していることは明白である。さらなる例はアミドおよびチオエーテル架橋である。
【００２９】
本発明の第１実施形態のコンセンサス配列に該当するペプチドは、本願の優先日後に公開された出願人による先の出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５（ＷＯ２００６／０５０９５９）に開示されている。一部の国では、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５におけるこの開示が、それぞれの特許法に照らして、先行技術を構成するかもしれない。
【００３０】
これに該当して特許性に疑義が生じうる国に限り、上述のコンセンサス配列は、上記のコンセンサスを満たす配列であってＰＣＴ  ＥＰ２００５  ０１  ２０  ７５に開示されているものを含まないことがありうる。これは以下のコンセンサス配列またはペプチド配列に当てはまりうる：
・以下に示すアミノ酸の配列を含むペプチド（とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの）：
【００３１】
【化２６】
2009529509.tif 000005
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）である。
ただしＸ６かＸ１５のどちらかはＣまたはｈｏｃであるものとする］
・以下に示すアミノ酸の配列によって特徴づけられるペプチド：
【００３２】
【化２７】
2009529509.tif 000006
［各アミノ酸は標準の文字略号によって示され、
Ｘ６は、Ｃであり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、ＬまたはＷであり；
Ｘ８は、Ｍ、ＦまたはＩであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であり；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から独立して選択され；
Ｘ１２は、Ｔであり；
Ｘ１３は、Ｗであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５はＣであるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換される］
・ペプチドは以下のアミノ酸配列によって特徴づけられる：
【００３３】
【化２８】
2009529509.tif 000007
［各アミノ酸は標準文字略号によって示され、
Ｘ６は、Ｃであり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、ＬまたはＷであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、またはｈｓｍ（ホモセリンメチルエーテル）であり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であり；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から独立して選択され；
Ｘ１２は、Ｔであり；
Ｘ１３は、Ｗであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶ、１−ｎａｌ（１−ナフチルアラニン）または２−ｎａｌ（２−ナフチルアラニン）であり；
Ｘ１５は、Ｃである］
・ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５に開示されていて、第１実施形態の上記コンセンサスを満たすペプチド（図２１参照）。
【００３４】
先願であって本願出願後に公開されたＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５の開示が特許性に関する問題を引き起こさない場合、上に列挙したコンセンサスおよびペプチド配列は、第１実施形態の広いコンセンサスから除外される必要がなく、したがって上に定義したコンセンサスに包含される。さらにまた、これらのペプチドによって有効性が実証されるので、これらのペプチドはＥＰＯミメティックコンセンサスの的確さを裏付けている。
【００３５】
本発明の第２の実施形態によれば、同様に良好なＥＰＯミメティック特性を示すペプチドが提供される。このペプチドは少なくとも１０アミノ酸を含み、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を、したがってＥＰＯミメティック活性を含む。前記ペプチドは、以下に示すアミノ酸のコア配列を含む：
【００３６】
【化２９】
2009529509.tif 000008
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡであり；
Ｘ１３は、ナフチルアラニンである］。
【００３７】
この実施形態には、ＥＰＯミメティック活性を持ち、Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され、位置Ｘ１３にナフチルアラニンを示す、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【００３８】
この第２実施形態のペプチドは、Ｘ１０がプロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換されるというユニークな特徴を、第１実施形態と共有している。しかし、本発明の第２実施形態によるＥＰＯミメティックペプチドのさらにもう一つの特徴は、位置１３にあるナフチルアラニン（例えば１−Ｎａｌか２−Ｎａｌのどちらか）である。
【００３９】
位置１３におけるナフチルアラニンと位置Ｘ１０におけるプロリンの非保存的アミノ酸置換物との組み合わせは、改善された結合特性を持つＥＰＯミメティックペプチドをもたらす。
【００４０】
ＥＰＯミメティックペプチドはＥＰＯ受容体に二量体の形で結合する。本発明者らは、位置１３へのＮａｌの組み込みによってペプチド単量体間の疎水性相互作用が強められると考えている。これは、単量体型ペプチド鎖の二量体化を潜在的に強化し、おそらくそのペプチド二量体のコンフォメーションを安定化するだろう。プロリンに対して非保存的であるアミノ酸と組み合わせると、おそらくは受容体結合に関与するアミノ酸の有利な配置により、改善されたＥＰＯミメティック特性を持つＥＰＯミメティック分子が生成する。
【００４１】
出願人による先の出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５では、位置１３にナフチルアラニンを示す配列も開示された。一部の国では、この開示が、それぞれの特許法に照らして、先行技術を構成するかもしれない。
【００４２】
これに該当して特許性に疑義が生じうる国では、第２実施形態の第１選択肢のコンセンサス配列が、法的な理由から、コンセンサスを満たす配列であってＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５に開示されているものを含まないことがありうる。これは、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５に開示されている以下の群から選択される以下のコンセンサス配列およびペプチド配列に当てはまりうる：
・以下に示すアミノ酸の配列を含むペプチド（とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの）：
【００４３】
【化３０】
2009529509.tif 000009
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷもしくはＹまたはＲ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹもしくはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、１−ｎａｌ、２−ｎａｌであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）である。
ただしＸ６かＸ１５のどちらかはＣまたはｈｏｃであるものとする］
・以下の群のペプチド：
【００４４】
【化３１】
2009529509.tif 000010
【００４５】
【化３２】
2009529509.tif 000011
［Ｘは１−ナフチルアラニンであり、Ｕは２−ナフチルアラニンである］。
【００４６】
本願出願後に公開されたＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５の開示が特許性に関する問題を引き起こさない場合、上に列挙したコンセンサスおよびペプチド配列は、第２実施形態の第１選択肢の広いコンセンサスから除外される必要がなく、したがって上に定義した広いコンセンサスに包含される。
【００４７】
本発明の第１実施形態および第２実施形態のさらなる有益な側面を、従属請求項に記載する。本発明の第１実施形態と第２実施形態は、位置１０におけるプロリンの非保存的置換物の存在に関して、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換される点で、同じ特徴を共有しているので、これらは実際には互いに強固に関連しあっている。
【００４８】
上記のコア配列を取り巻く位置に関して適切なアミノ酸が定義される第１実施形態および第２実施形態の拡大されたコンセンサスを、従属請求項において定義すると共に、以下に説明する。
【００４９】
本願で使用する番号付け（Ｘ４Ｘ５Ｘ６．．．など）が、本発明のペプチドと従来技術で知られているＥＰＯミメティックぺプチドとの比較を容易にするために行われるに過ぎないことに留意されたい（ＥＭＰ１ペプチドに基づく番号付けについては、例えばＪｏｈｎｓｏｎら、１９９７および１９９８を参照のこと）。しかし、この番号付けはペプチドの全長を指すわけではなく、したがって、全ての位置が占有されることが常に必要であることを含意するわけではないものとする。例えば位置Ｘ１が占有されることは必要でない。例えばＸ６から始まるペプチドも、１０アミノ酸という最小長が与えられる限り、ＥＰＯミメティックとして活性である。したがって、本願で使用するアミノ酸位置の番号付けは、ペプチドの特徴付けおよび先行技術とのペプチドの比較を容易にするものでしかないものとする。
【００５０】
本発明の第１実施形態および第２実施形態のコンセンサス配列は、以下の追加アミノ酸位置も含みうる：
【００５１】
【化３３】
2009529509.tif 000012
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶからなる群より選択され；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡであり；
Ｘ１６は、任意のアミノ酸（好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴ）から独立して選択され；
Ｘ１７は、任意のアミノ酸（好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正荷電もしくは負荷電の天然、非天然もしくは誘導体化アミノ酸、正荷電アミノ酸の場合は好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニン）から選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸（好ましくはＬまたはＱ）から独立して選択され；
Ｘ１９は、任意のアミノ酸（好ましくは正荷電もしくは負荷電アミノ酸、正荷電アミノ酸の場合は、例えばＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンもしくはホモアルギニン、またはグリシンもしくはベータ−アラニンなどといった小さくて柔軟なアミノ酸）から独立して選択される］。
【００５２】
さらにもう一つの改良によれば、ペプチドコンセンサスは以下の追加アミノ酸位置を含む。
【００５３】
【化３４】
2009529509.tif 000013
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンである］。
【００５４】
本発明の第１実施形態および第２実施形態のさらにもう一つの改良によれば、ペプチド中にアミノ酸位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９が存在する場合（ペプチドコンセンサスの長さに依存する）、ペプチドはこれらの位置に荷電アミノ酸を示す。位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９のアミノ酸は正負どちらかに荷電しており、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される。誘導体化アミノ酸は、本願においては、非天然アミノ酸の特殊な実施形態であると理解されることに留意されたい。実際、非天然アミノ酸という用語は総称である。ここでは別途、誘導体化アミノ酸に言及する。というのも、以下に詳述するように、これらは本発明の特殊な実施形態を構成するからである。
【００５５】
Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９のアミノ酸が負荷電アミノ酸である場合、前記負荷電アミノ酸は、好ましくは、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・非天然負荷電アミノ酸、
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【００５６】
非天然負荷電側鎖は伸長された側鎖を示しうる。そのようなアミノ酸の例はアルファ−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、２−アミノヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）またはアルファ−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）である。
【００５７】
一つの理由は、伸長された負荷電人工アミノ酸は、ＥＰＯ受容体の正荷電アミノ酸とより良く接触することができ、それによって結合能を改善することかもしれない。
【００５８】
位置１３にナフチルアラニンも保持する各ペプチドは極めて良好な結合特性を示すことが見出された。
【００５９】
上述のように、正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換することによって負荷電アミノ酸を得ることも可能である。これにより、側鎖を伸長させ、その結果、結合特性を潜在的に強化することも可能である。この新規戦略では、リジン（またはＤａｐ、Ｄａｂもしくはオルニチンのような同族の短いアミノ酸）を、負荷電基をもたらす適切な薬剤で誘導体化する。適切な薬剤は、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸である。例としてグルタル酸、アジピン酸、コハク酸、ピメリン酸およびスベリン酸を挙げることができる。
【００６０】
さらにもう一つの側面によれば、本発明のペプチドは、位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９に正荷電アミノ酸を保持する。正荷電アミノ酸は、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチン；
・非天然正荷電アミノ酸、
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【００６１】
ペプチドの位置Ｘ１０および／またはＸ１７に、リジンと比較して伸長された側鎖を示すアミノ酸が存在すると、非常に強力なＥＰＯミメティックペプチドが生じうることが判明した。このアミノ酸は非タンパク質構成性であってよい。ある実施形態によれば、正荷電アミノ酸の伸長は、伸長させようとするアミノ酸（これがリジンである必要は必ずしもない）の側鎖に伸長ユニットを組み込むことによってもたらされる。より短いアミノ酸を出発物質として使用して、それを適当な日常的化学反応によって伸長することもできる。通常、伸長ユニットは脂肪族基（例えばＣＨ２ユニット）であるか、芳香族基（例えばフェニルまたはナフチルユニット）である。適当な伸長されたアミノ酸の例は、例えばホモアルギニン、アミノフェニルアラニンおよびアミノナフチルアラニンである。
【００６２】
本発明のこの第１実施形態および第２実施形態のさらにもう一つの実施形態によれば、Ｘ８はＤ−アミノ酸、好ましくはＤ−フェニルアラニンである。
【００６３】
第１および第２実施形態のコンセンサスが位置Ｘ５にもアミノ酸を含む場合、Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択してよいが、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである。
【００６４】
ペプチド中にＸ４が存在する場合、それは任意のアミノ酸から選択されうるが、好ましくはＦ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体であり、この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する。この電子吸引性置換基は、好ましくは、アミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される。４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンが、その例である。
【００６５】
コンセンサス中にＸ３が存在する場合、Ｘ３は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶである。
【００６６】
さらにまた、とりわけ単量体ユニット（結合ドメイン）が二量体を形成している場合には、単量体のＮ末端領域（例えば位置Ｘ１およびＸ２）および単量体のＣ末端領域（例えばＸ１９およびＸ２０）にあるアミノ酸は、フレキシブルなコンフォメーションが得られるように、小さくフレキシブルなアミノ酸、例えばグリシンまたはベータ−アラニンであることが好ましい。
【００６７】
本発明の第３の実施形態によれば、同様に良好なＥＰＯミメティック特性を示す異なる構造を持つペプチドが提供される。このペプチドも少なくとも１０個のアミノ酸を含み、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む。このＥＰＯミメティックペプチドの特徴は、以下に示すアミノ酸のコアコンセンサス配列の少なくとも一つによって記述される：
【００６８】
【化３５】
2009529509.tif 000014
これらのコンセンサス配列の各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択される。本発明の第２の側面の本質的特徴によれば、位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、負荷電アミノ酸を表す。ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つに負荷電アミノ酸を持つ、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【００６９】
これらの位置にある負荷電アミノ酸がそのような優れたＥＰＯミメティック特性を示すことは、極めて意外だった。さらなるアミノ酸位置（コンセンサス中に存在する場合）は以下のように定義される：
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択される。
【００７０】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９（これらの位置が存在する場合）の少なくとも一つに負荷電アミノ酸を保持する本発明の第３実施形態によるペプチドは、ヒト系および動物系において弁別的ＥＰＯミメティック特性を示すペプチドの適切な候補である。上で指摘したとおり、異なる種のＥＰＯ受容体のタンパク質配列は種間にわずかな相違しかなく、したがってＥＰＯ受容体は「種間差がごくわずかで高度に保存されている（ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）」と分類される。しかし意外なことに、上述した位置の少なくとも一つに負荷電アミノ酸を持つＥＰＯミメティックペプチドは、ヒトＥＰＯ受容体と動物ＥＰＯ受容体のペプチド結合部位を弁別する能力を持ちうることが明らかになった。動物受容体に対してより高い結合能を持つペプチドは、獣医学的用途に好ましく使用される。
【００７１】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つに負荷電アミノ酸を保持するペプチドは、コンセンサス中に以下の追加アミノ酸を含みうる：
【００７２】
【化３６】
2009529509.tif 000015
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンである］
さらにまた、拡大されたコンセンサスは、以下のアミノ酸によって記述することもできる：
【００７３】
【化３７】
2009529509.tif 000016
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０が負荷電アミノ酸でない場合、Ｘ１０はプロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７が負荷電アミノ酸でない場合、Ｘ１７は任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正電荷天然、非天然または誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンから選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９が負荷電アミノ酸でない場合、Ｘ１９は、任意のアミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンもしくはホモアルギニンなどの正荷電アミノ酸またはグリシンもしくはベータ−アラニンなどの小さくフレキシブルなアミノ酸から独立して選択される。
ただしＸ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは負荷電アミノ酸であるものとする］。
【００７４】
もちろん、本発明のこの実施形態には、ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つに負荷電アミノ酸を持つ、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【００７５】
共有結合の形成を可能にし、よってペプチド内での連結架橋の生成を可能にする側鎖官能性を持つ、位置Ｘ６およびＸ１５のアミノ酸は、それらが互いに共有結合を形成できるように選択されることが好ましい（上記本発明の第１実施形態の説明を参照されたい）。したがって適切なアミノ酸は、ジスルフィド結合を形成するためのＳＨ基を保持するアミノ酸（例えばシステインおよびホモシステインなどのシステイン誘導体）またはチオリジンであるが、これらは適切な候補のほんの一例にすぎない。セレノシステインなどのセレニド架橋形成アミノ酸も適切である。しかし上述のように、アミド結合またはチオエーテル結合などの共有結合の形成を可能にする他のアミノ酸も適切である。したがって、位置Ｘ６およびＸ１５における好ましいアミノ酸の選択には、Ｃ、Ｋ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸、ホモシステイン（ｈｏｃ）、およびシステイン誘導体、例えばセレノシステイン、チオリジンが含まれる。これは本発明の全ての実施形態に当てはまる。
【００７６】
本発明の第３実施形態によるペプチド中に存在する負荷電アミノ酸は、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・非天然負荷電アミノ酸、
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択することができる。
【００７７】
非天然負荷電側鎖は伸長された側鎖を示しうる。伸長された側鎖は、おそらく、ＥＰＯ受容体の正荷電アミノ酸をより効率よく接触させ、それによって結合能を強化することができる。そのようなアミノ酸の例は、アルファ−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、２−アミノヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）またはアルファ−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）である。
【００７８】
略述したように、正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換することによって負荷電アミノ酸を得ることも可能である。これにより、側鎖を伸長させることも可能である。これはＥＰＯ受容体に対する結合特性を改善しうる。この新規戦略では、例えばリジン（またはＤａｐ、Ｄａｂもしくはオルニチンのような同族の短いアミノ酸）などの正荷電アミノ酸を、負荷電基をもたらす適切な薬剤で誘導体化する。適切な薬剤は、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸である。例としてグルタル酸、アジピン酸、コハク酸、ピメリン酸およびスベリン酸を挙げることができる。
【００７９】
グルタル酸を使って伸長され負に荷電されたリジンの適切な例を、以下に記載する：
【００８０】
【化３８】
2009529509.tif 000017
伸長的修飾のためのもう一つの選択肢は、リジンとアジピン酸の組み合わせである：
【００８１】
【化３９】
2009529509.tif 000018
本発明のＥＰＯミメティックペプチドの結合特性を改善するのに極めて有利なこの伸長戦略は、さまざまな分子の特徴を改善するためにも使用することができる。したがってこれは全く独立した技術的思想である。したがって、負荷電基を持つ正荷電アミノ酸が得られるように正荷電アミノ酸が適切な化学基で誘導体化されている修飾アミノ酸も提供される。これにより、元々は正荷電のアミノ酸が負荷電アミノ酸に変換される。化学修飾が結合能をしばしば改善させる側鎖の伸長をももたらすのであれば、これはとりわけ有利である。適切な修飾剤は上述した。
【００８２】
上に略述したように、アミノ酸位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９のうち、二つの位置または全部の位置がそれぞれのアミノ酸を示してもよいのであるが、本発明の第２の側面によれば、これらの位置の一つが負荷電アミノ酸で占められてさえいればよい。ただし、これらの位置の一つ以上が負荷電アミノ酸で占められていない場合は、他の位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９には正荷電残基が存在することが好ましい。
【００８３】
この正荷電アミノ酸は、好ましくは
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチン；
・非天然正荷電アミノ酸、例えばホモアルギニンまたはジアミノ酪酸など；
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【００８４】
位置Ｘ１０および／またはＸ１７に、リジンと比較して伸長された側鎖を示す正荷電アミノ酸が存在すると、極めて強力なＥＰＯミメティックペプチドが生じうることが判明した。ある実施形態によれば、正荷電アミノ酸の伸長は、アミノ酸（これがリジンである必要は必ずしもない）の側鎖に伸長ユニットを組み込むことによってもたらされる。より短いアミノ酸を出発物質として使用して、それを適当な日常的化学反応によって伸長することもできる。通常、伸長ユニットは脂肪族基（例えばＣＨ２ユニット）であるか、芳香族基（例えばフェニルまたはナフチルユニット）である。適当なアミノ酸の例は、例えばホモアルギニン、アミノフェニルアラニンおよびアミノナフチルアラニンである。非タンパク質構成アミノ酸は、多様性に富むので好ましい。この実施形態を、他のアミノ酸位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つにおける負荷電アミノ酸と組み合わせることにより、ヒトおよび動物モデルにおける活性パターンを区別するのに適した候補である強力なＥＰＯミメティックペプチドがもたらされる。
【００８５】
獣医学的用途のためのＥＰＯミメティックペプチドの場合、負荷電アミノ酸は位置１９にあることが好ましい。それぞれの特徴を持つペプチドは、動物ＥＰＯ受容体に対して、より良好な結合能を示すことが、実験的に明らかになった。
【００８６】
獣医学的用途の場合、位置１９の負荷電アミノ酸はＥ、ＤまたはＡａｄから選択されることが、とりわけ好ましい。この特徴を、位置１３のナフチルアラニン（好ましくはＮａｌ−１）と組み合わせると、有益である。さらにまた、正荷電アミノ酸、好ましくはＫまたはＨａｒが、位置１７にあることが好ましい。正荷電アミノ酸、好ましくはリジンが、位置１０に存在することも好ましい。この実施形態のＥＰＯミメティックペプチドのとりわけ好ましい例を図７ｃに示す。特に、獣医学的用途のためのＥＰＯミメティックペプチド配列は、
【００８７】
【化４０】
2009529509.tif 000019
【００８８】
【化４１】
2009529509.tif 000020
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８９】
本発明のこの第３の実施形態は、Ｘ８がＤ−アミノ酸、好ましくはＤ−フェニルアラニンであるという特徴と組み合わせることもできる。
【００９０】
この実施形態の拡大されたコンセンサス配列は以下の追加アミノ酸を含む。
【００９１】
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体であることができ、この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する。第２の実施形態に関連して既に上述したように、電子吸引性置換基は、好ましくは、アミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される。適切な例は、４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンである。
【００９２】
Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択してよいが、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである。
【００９３】
また、Ｘ３が存在してもよく、Ｘ３は任意のアミノ酸（好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶ）から独立して選択されうる。
【００９４】
さらにまた、とりわけ単量体ユニットが二量体を形成している場合には、単量体の最初（例えば位置Ｘ１およびＸ２）および単量体の最後（例えばＸ１９およびＸ２０）にあるアミノ酸は、フレキシブルなコンフォメーションが得られるように、小さくフレキシブルなアミノ酸、例えばグリシンまたはベータ−アラニンを表すことが好ましい。
【００９５】
本発明の第２実施形態に関連して既に述べたように、位置Ｘ１３にナフチルアラニン（ｎａｌ−１またはｎａｌ−２）を設けると有利である。位置１３にＮａｌを組み込むことにより、上述のようにペプチド単量体間の疎水性相互作用が強くなり、その結果、単量体型ペプチド鎖の二量体化が潜在的に強化され、おそらくそのペプチド二量体のコンフォメーションが安定化されることになり、その結果、ＥＰＯミメティック活性が改善される。両実施形態（第２および第３）の組み合わせは極めて好ましい。
【００９６】
ナフチルアラニンを含む適切なペプチド配列の例を図７ａに記載する。
【００９７】
本発明の第４の実施形態によれば、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含み、以下に示すアミノ酸のコア配列を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドが提供される：
【００９８】
【化４２】
2009529509.tif 000021
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ８は、Ｄ−アミノ酸であり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］。
【００９９】
ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置８にＤ−アミノ酸を持つ、第４実施形態によるペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【０１００】
本発明の第４実施形態の顕著な特徴は、位置Ｘ８にＤ−アミノ酸が存在することである。Ｄ−フェニルアラニンは好ましい。この実施形態は、動物ＥＰＯ受容体とヒトＥＰＯ受容体とを区別するのに良い候補であると思われる。位置８におけるアルファ−Ｃ原子を反転させると、フェニル基の幾何学的位置が異なることになり、その幾何学的位置は、動物受容体、特にイヌＥＰＯＲには、より良く適合しうる。
【０１０１】
本発明のこの第４の側面は、以下に述べるように、さらに他の有利な実施形態と組み合わせることもできる。
【０１０２】
本発明の第４実施形態によるペプチドは、以下の拡大されたアミノ酸コア配列によって記述することもできる。
【０１０３】
【化４３】
2009529509.tif 000022
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｄ−Ｍ、Ｄ−Ｆ、Ｄ−Ｉ、Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｈ、Ｄ−ホモセリンメチルエーテルまたはＤ−ノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリン、プロリンの保存的置換物またはプロリンの非保存的置換物であるか；
または、Ｘ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］。
【０１０４】
本発明の第４実施形態のさらにもう一つの実施形態は、以下のアミノ酸配列によって記述することができる：
【０１０５】
【化４４】
2009529509.tif 000023
［Ｘ６〜Ｘ１５は、本発明の第４実施形態に関連して説明した上記の意味を持ち、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７は、任意のアミノ酸、例えばＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは荷電天然、非天然もしくは誘導体化アミノ酸、正荷電アミノ酸であれば、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンから独立して選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９は、任意のアミノ酸から独立して選択される］。
【０１０６】
本発明の第４実施形態の場合も、位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９には、荷電アミノ酸が存在することが好ましい。荷電アミノ酸により、極めて良好なＥＰＯミメティック活性率（ＥＰＯ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）が達成されることが、実験によって示された。しかし、一般に、これらの位置では、非荷電であるが極性のアミノ酸（例えばセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミンなど）も、他の位置における正しいアミノ酸と組み合わせれば、良好な結果を与える。
【０１０７】
位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の荷電アミノ酸は正に荷電しているか、負に荷電しており、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される。
【０１０８】
ある側面によれば、Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９は負荷電アミノ酸である。前記負荷電アミノ酸は、好ましくは、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・非天然負荷電アミノ酸、
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【０１０９】
非天然負荷電側鎖は伸長された側鎖を表しうる。そのようなアミノ酸の例は、アルファ−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、２−アミノヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）またはアルファ−アミノスベリン酸である（上記参照）。
【０１１０】
略述したように、正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換することによって、負荷電アミノ酸を得ることも可能である。これにより、側鎖を伸長させ、その結果、結合特性を強化することも可能である。この新規戦略（詳細については上記参照）では、リジン（またはＤａｐ、Ｄａｂもしくはオルニチンのような同族の短いアミノ酸）を、負荷電基をもたらす適切な薬剤で誘導体化する。適切な薬剤は、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸である。例としてグルタル酸、アジピン酸、コハク酸、ピメリン酸およびスベリン酸を挙げることができる。
【０１１１】
さらにもう一つの側面によれば、ペプチドは位置Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９に正荷電アミノ酸を保持する。正荷電アミノ酸は、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチン；
・非天然正荷電アミノ酸、
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【０１１２】
ペプチドの位置Ｘ１０および／またはＸ１７に、リジンと比較して伸長された側鎖を示すアミノ酸が存在すると、非常に強力なＥＰＯミメティックペプチドが生じうることが判明した。ある実施形態によれば、正荷電アミノ酸の伸長は、アミノ酸（これがリジンである必要は必ずしもない）の側鎖に伸長ユニットを組み込むことによってもたらされる。より短いアミノ酸を出発物質として使用して、それを適当な日常的化学反応によって伸長することもできる（上記参照）。通常、伸長ユニットは脂肪族基（例えばＣＨ２ユニット）であるか、芳香族基（例えばフェニルまたはナフチルユニット）である。適当なアミノ酸の例は、例えばホモアルギニン、アミノフェニルアラニンおよびアミノナフチルアラニンである。非タンパク質構成アミノ酸は、多様性に富むので好ましい。代替法は、電荷を（正電荷に）反転させるだけでなく、分子を容易に伸長する方法にもなる正荷電基によるアミノ酸の誘導体化である。
【０１１３】
この実施形態のさらにもう一つの展開によれば、ペプチドは以下の拡大されたアミノ酸コア配列によって定義される：
【０１１４】
【化４５】
2009529509.tif 000024
［Ｘ６〜Ｘ１９は、本発明の第４の側面に関連して説明した上記の意味を持ち、
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択される］
電子吸引性置換基は、好ましくは、アミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択される。Ｘ４は、４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択することもできる。
【０１１５】
また、Ｘ３が存在してもよく、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶから独立して選択することができる。
【０１１６】
さらにまた、単量体ユニットが二量体を形成している場合には、単量体の最初（例えば位置Ｘ１およびＸ２）および単量体の最後（例えばＸ１９およびＸ２０）にあるアミノ酸位置は、フレキシブルなコンフォメーションが得られるように、小さくフレキシブルなアミノ酸、例えばグリシンまたはベータ−アラニンを表すことが好ましい。
【０１１７】
本発明の第２実施形態に関連して既に述べたように、位置Ｘ１３にナフチルアラニンを設けると有利である。位置１３にＮａｌを組み込むことにより、上述のようにペプチド単量体間の疎水性相互作用が強くなり、その結果、単量体型ペプチド鎖の二量体化が潜在的に強化され、おそらくそのペプチド二量体のコンフォメーションが安定化されることになり、その結果、ＥＰＯミメティック活性が改善される。
【０１１８】
本発明の第５の実施形態によれば、やはり種弁別活性を示すＥＰＯミメティックペプチドの良い候補であるペプチドが提供される。このペプチドは少なくとも１０アミノ酸を含み、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む。このＥＰＯミメティックペプチドは、以下に示すアミノ酸のコア配列を含む：
【０１１９】
【化４６】
2009529509.tif 000025
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ４は、Ｆ、またはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である］。
【０１２０】
ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置Ｘ４にＦまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）から選択されるアミノ酸を持つ、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【０１２１】
電子吸引性置換基は、アミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択されうる。Ｘ４は、好ましくは、４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンからなる群より選択される。
【０１２２】
本発明のこの第５実施形態とさらなる実施形態のさらなる有利な組み合わせを、従属請求項に記載する。各特徴の詳細については、各実施形態に関して特徴を詳細に説明している上記の説明も参照されたい。Ｘ４突然変異とＤ−フェニルアラニン突然変異の組み合わせはとりわけ適切である。
【０１２３】
本発明のさらにもう一つの実施形態によれば、改善されたＥＰＯミメティックペプチドを提供するために、いくつかの代替ペプチドが提供される。本発明のこの第６実施形態によれば、ＥＰＯ受容体に結合することができ、かつアゴニスト活性を含む、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドが提供される。
【０１２４】
この第６実施形態の選択肢（ａ）は、以下に示すアミノ酸のコア配列の少なくとも一つを含む：
【０１２５】
【化４７】
2009529509.tif 000026
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、ナフチルアラニン、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であって；
位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸を表す］。
【０１２６】
ＥＰＯミメティック活性を持ち、かつ位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つに、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸を表すアミノ酸を持つ、上記ペプチドコンセンサス配列の機能的に等価なフラグメント、誘導体および変種からなる群より選択されるペプチドも包含される。
【０１２７】
本発明のこの第６実施形態は、位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つにおいてＥＰＯミメティックペプチドの正荷電側鎖を伸長させることによってヒト受容体と動物受容体とを潜在的に弁別するという選択肢も可能な代替戦略を表している。この実施形態は、弁別的ペプチドの適切な候補になる。というのも、マウスおよびイヌＥＰＯ受容体の方が負荷電ドッキングポイントが少なく、これらのドッキングポイントには短い正荷電側鎖（例えばリジン）では届き難いからである。したがって、長い側鎖を持つ正荷電残基の組み込みは、ＥＰＯ受容体に対するペプチドの親和性を増加させる高い潜在能力を持つ。
【０１２８】
位置Ｘ１０および／またはＸ１７にホモアルギニンを示す配列は、出願人による先の出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５に既に開示されている。一部の国の特許法では、この開示が先行技術を構成するかもしれない。
【０１２９】
これに該当して上記コンセンサスの特許性に疑義が生じうる場合、本発明の第６実施形態の第１選択肢のコンセンサス配列は、法的理由から、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５に開示されている配列を含まないことがありうる。これは以下の群から選択されるコンセンサス配列に当てはまりうる：
・以下に示すアミノ酸の配列を含むペプチド、とりわけＥＰＯ受容体に結合することができるもの：
【０１３０】
【化４８】
2009529509.tif 000027
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０は、Ｈａｒであり、
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）である。
ただしＸ６かＸ１５のどちらかはＣまたはｈｏｃであるものとする］
または
・以下のアミノ酸配列を含むペプチド
【０１３１】
【化４９】
2009529509.tif 000028
［Ｘ６〜Ｘ１５は上記の意味を持ち、
Ｘ３は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶから独立して選択され；
Ｘ４は、Ｙであり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくは  Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから独立して選択され、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７は、ホモアルギニンであり；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸から独立して選択される］
または
【０１３２】
【化５０】
2009529509.tif 000029
これらの配列は、出願人の先のＰＣＴ出願ＰＣＴ  ＥＰ＿２００５−０１  ２０  ７５に既に記載されている。
【０１３３】
本願出願後に公開されたＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５の開示が特許性に関する問題を構成しない国では、上に列挙したコンセンサスおよびペプチド配列は、第６実施形態の第１選択肢の広いコンセンサスから除外される必要がない。
【０１３４】
本発明の第６実施形態のさらにもう一つの展開によれば、ペプチドは以下に示すアミノ酸の拡大されたコア配列を含む：
【０１３５】
【化５１】
2009529509.tif 000030
［各アミノ酸は天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的置換物であり；
Ｘ１０がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合は、Ｘ１０がプロリン、プロリンの保存的置換物もしくはプロリンの非保存的置換物であるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され；
Ｘ１１は、任意のアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非荷電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはスレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成することができる側鎖官能性を持つアミノ酸またはＡもしくはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合は、Ｘ１６が任意のアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴから独立して選択され；
Ｘ１７がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合は、Ｘ１７が任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正荷電天然、非天然または誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈまたはオルニチンから選択され；
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＬまたはＱから独立して選択され；
Ｘ１９がリジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸でない場合は、Ｘ１９が任意のアミノ酸、好ましくは荷電アミノ酸、例えばＫ、Ｒ、Ｈもしくはオルニチンなどの正荷電アミノ酸、またはＤ、ＥもしくはＡａｄなどの負荷電アミノ酸から独立して選択される。
ただしＸ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸であるものとする］。
【０１３６】
さらにもう一つの実施形態によれば、Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは正荷電アミノ酸であって、その正荷電アミノ酸は、好ましくは、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチン；
・非天然正荷電アミノ酸、
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの；
からなる群より選択される（ただし、Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸であるものとする）。
【０１３７】
上述のように、正荷電アミノ酸の伸長は側鎖の伸長ユニットによってもたらすことができ、その伸長ユニットは脂肪族基であるか芳香族基であることができる。伸長は、例えばＣＨ２ユニットによってもたらすことができ、その場合、ＣＨ２ユニットの数は、好ましくは１〜６である。
【０１３８】
もう一つの選択肢として、伸長は、例えばフェニルまたはナフチルユニットなどの芳香族基を使って達成することもできる。
【０１３９】
リジンと比較して伸長されている正荷電非タンパク質構成アミノ酸は、好ましくは非天然アミノ酸である。非天然アミノ酸の方が選択の幅が広いので、完全に適合する伸長されたアミノ酸が見つかる可能性が高くなる。適切な非天然の伸長されたアミノ酸の例は、例えばホモアルギニン、アミノフェニルアラニンおよびアミノナフチルアラニンである。
【０１４０】
位置Ｘ１７にある伸長された正荷電側鎖は、マウス／イヌＥＰＯ受容体と、より良く相互作用するようである。とりわけ、人工的な伸長された同族アルギニンであるホモアルギニンは、適切であることがわかった。このアミノ酸はリジンより遠くまで届き、マウス／イヌＥＰＯ受容体中のより遠くの負荷電アミノ酸（動物ＥＰＯ受容体中のＧｌｕ６０およびＧｌｕ６２）と相互作用することができる。
【０１４１】
位置Ｘ１０にある伸長された正荷電側鎖は、上述した位置Ｘ１７における突然変異と類似する作用を持つ。この場合も、伸長によって、より遠くの負荷電アミノ酸（マウス／イヌＥＰＯ受容体中のＧｌｕ３４）まで到達することができるだろう。
【０１４２】
位置Ｘ１０およびＸ１７における突然変異／特徴を組み合わせることが望ましい。両方の位置に伸長された正荷電アミノ酸（例えばホモアルギニン）を保持するペプチドの幾何学的配置は、ＥＰＯ受容体と強い相互作用を示す。上述のように、このアミノ酸は、好ましくは非タンパク質構成性である。与えられる静電相互作用の強さは、各ホモアルギニン残基からの複数の水素結合によって、さらに増強される。
【０１４３】
本発明の第６実施形態によれば、Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つが、非タンパク質構成性の伸長された正荷電アミノ酸を表す。Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７および／またはＸ１９の他の位置も、正に荷電しているか負に荷電していて、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および誘導体化アミノ酸からなる群より選択される荷電アミノ酸を表すことができる。
【０１４４】
ある代替形態によれば、Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つは、負荷電アミノ酸である。
【０１４５】
Ｘ１０、Ｘ１７および／またはＸ１９が負荷電アミノ酸である場合、前記負荷電アミノ酸は、好ましくは、
・天然負荷電アミノ酸、とりわけＤまたはＥ；
・非天然負荷電アミノ酸、
・元々は正荷電アミノ酸であるが、負荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【０１４６】
非天然負荷電側鎖は伸長された側鎖を示しうる。そのようなアミノ酸の例は、アルファ−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、２−アミノヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）またはアルファ−アミノスベリン酸である。
【０１４７】
略述したように、正荷電アミノ酸を負荷電アミノ酸に変換することによって負荷電アミノ酸を得ることも可能である。これにより、側鎖を伸長させ、その結果、結合特性を強化することも可能である。この新規戦略では、リジン（またはＤａｐ、Ｄａｂもしくはオルニチンのような同族の短いアミノ酸）を、負荷電基をもたらす適切な薬剤で誘導体化する。適切な薬剤は、例えばジカルボン酸またはジスルホン酸などの二酸である。例としてグルタル酸、アジピン酸、コハク酸、ピメリン酸およびスベリン酸を挙げることができる。この実施形態に関して我々が行った上記の詳細な議論を参照されたい。
【０１４８】
位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７および／またはＸ１９の少なくとも一つは伸長された正荷電非タンパク質構成アミノ酸を表すという条件の下で、本ペプチドは位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７および／またはＸ１９に「正常（ｎｏｒｍａｌ）」正荷電アミノ酸を持つこともできる。正荷電アミノ酸は、
・天然正荷電アミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチン；
・非天然正荷電アミノ酸、
・元々は負荷電アミノ酸であるが、正荷電基が付与されるように適切な化学基で誘導体化されたもの
からなる群より選択される。
【０１４９】
本発明の第６実施形態のさらにもう一つの展開では、Ｘ８にＤ−アミノ酸、好ましくはＤ−フェニルアラニンが設けられる。
【０１５０】
第６実施形態のさらにもう一つの展開によれば、ペプチドが、以下の拡大されたアミノ酸コア配列を含む：
【０１５１】
【化５２】
2009529509.tif 000031
［Ｘ６〜Ｘ１９は上記の意味を持ち、
Ｘ４は、Ｆ、ＹまたはＦもしくはＹの誘導体（この場合、ＦまたはＹの誘導体は少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する）であり；
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩから選択される］。
【０１５２】
上述のように、電子吸引性置換基はアミノ基、ニトロ基およびハロゲンからなる群より選択することができる。４−アミノ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、３−ヨード−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３，５−ジブロモ−チロシン、３，５−ジニトロ−チロシン、３，５−ジヨード−チロシンが、その例である。
【０１５３】
また、Ｘ３が存在してもよく、Ｘ３は任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶから独立して選択されうる。
【０１５４】
さらにまた、単量体ユニットが連続するペプチドリンカーを介して二量体を形成している場合には、単量体のＮ末端領域（例えば位置Ｘ１およびＸ２）および単量体のＣ末端領域（例えばＸ１９およびＸ２０）にあるアミノ酸は、フレキシブルなコンフォメーションが得られるように、小さくフレキシブルなアミノ酸、例えばグリシンまたはベータ−アラニンを表すことが好ましい。
【０１５５】
本願は、ＥＰＯミメティックペプチド全般の他に、ＥＰＯミメティック活性を改善するためおよび／またはヒトＥＰＯ−Ｒと動物ＥＰＯ−Ｒの弁別を可能にするためのさまざまな手段および戦略も記述する。上述のように、所望の特性を示す「テーラード（ｔａｉｌｏｒｅｄ）」ＥＰＯミメティックペプチドが得られるように、本発明の異なる戦略および側面を互いに組み合わせることができる。したがって、ここに記述する戦略は、所望の性質を持つＥＰＯミメティックペプチドに到達するために互いに独立して組み合わせることができる設計単位であると理解できることを理解することが重要である。例えば、第２実施形態の特徴（位置Ｘ１３のナフチルアラニン）を、Ｘ１０、Ｘ１７およびＸ１９の少なくとも一つが負に荷電しているという第３実施形態の特徴と組み合わせることができる。
【０１５６】
上述した実施形態１〜６によるペプチドの長さは、好ましくは、１０〜４０または５０または６０アミノ酸である。好ましい実施形態では、ペプチドコンセンサスが少なくとも１０、１５、１８、２０または２５アミノ酸の長さを示す。もちろん、ここに記述するコンセンサス配列はそれぞれ、より長い配列に埋め込まれ、包含されうる。ここに記述するペプチドコンセンサス配列は、ＥＰＯ受容体に対する結合ドメインを形成すると理解することができる。上述し、以下にも記述するように、単量体型ペプチドユニット（結合ドメイン）を組み合わせて、ペプチド二量体、さらにはペプチド多量体にすることも可能である。ペプチドリンカーを使って二量体または多量体を生成させる場合は、二量体化および／または多量体化によって、さらに長いペプチドも生成する。それらは、ＥＰＯミメティックペプチドとして、ＥＰＯ受容体に結合することができる。
【０１５７】
本発明のＥＰＯミメティックペプチド配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端アセチル化およびアミド化を持つことができる。一部のアミノ酸はリン酸化も受けうる。
【０１５８】
本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸またはその立体異性体Ｄ−アミノ酸の他に、非天然／非通常アミノ酸、例えばアルファ，アルファ−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸または乳酸、例えば１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、ホモセリン−メチルエーテル、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルグリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ノル−リジン、５−アミノレブリン酸またはアミノ吉草酸なども含みうる。Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧ）およびＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）の使用は、特に末端位置においては、とりわけ好ましい。ここに定義したペプチドのレトロペプチド、インベルソペプチド、レトロ／インベルソペプチドであるペプチド、およびもっぱらＤ−アミノ酸からなるペプチドも、本発明の範囲に含まれる。
【０１５９】
本発明はペプチドの誘導体、例えばメチオニンの酸化生成物、または脱アミド化されたグルタミン、アルギニンおよびＣ−末端アミドにも関する。
【０１６０】
本発明の実施形態の一つの展開によれば、ペプチドは、アミノ酸残基Ｘ９およびＸ１０を置換する単一のアミノ酸を持つ。この実施形態では、両方の残基が、一つの非天然アミノ酸、例えば５−アミノレブリン酸またはアミノ吉草酸で置換されうる。
【０１６１】
さらにもう一つの展開によれば、第１〜第６実施形態で述べたペプチドは、Ｘ６および／またはＸ１５に、架橋形成機能性を持つアミノ酸として、Ｃ、セレノシステインなどのシステイン誘導体、Ｅ、Ｋ、もしくはｈｏｃを含み、かつ／またはＲ、ＨもしくはＹもしくはＳであるＸ７、および／またはＦもしくはＭであるＸ８、および／またはＧもしくはＡ（好ましくはＧ）であるＸ９、および／またはＫもしくはＨａｒであるＸ１０、および／またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｅ、Ａ、ＴもしくはノルイソロイシンであるＸ１１、および／またはＴであるＸ１２、および／またはＷもしくはナフチルアラニンであるＸ１３、および／またはＤもしくはＶであるＸ１４、および／またはＰ、ＹもしくはＡもしくは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であるＸ１７を含む。しかし、上述のように、Ｘ１７がＫまたは正荷電側鎖を持つ非天然アミノ酸、例えばホモアルギンなどであることも好ましい。
【０１６２】
本発明によるフラグメント、誘導体および変種ポリペプチドは、本明細書に記載する個々の実施形態によるペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保っている。それらを従来技術から適正に弁別するために、フラグメント、誘導体または変種は、各実施形態と同じ特徴を持つ。すなわち、
・実施形態１に関して、それらは、位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換される；
・実施形態２に関して、それらは、位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され、かつ位置Ｘ１３にナフチルアラニンを持つ；
・実施形態３に関して、位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは負荷電アミノ酸である；
・実施形態４に関して、それらは、位置Ｘ８にＤ−アミノ酸を持つ；
・実施形態５に関して、それらは、位置Ｘ１０にプロリンの非保存的置換物を構成するアミノ酸を持つか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸で置換され、かつ位置Ｘ４にＦ、またはＦもしくはＹの誘導体を持ち、この場合、ＦまたはＹの誘導体は、少なくとも一つの電子吸引性置換基を保持する；
・実施形態６に関して、位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも一つは、リジンと比較して伸長された側鎖を持つ正荷電非タンパク質構成アミノ酸を表す。
【０１６３】
「フラグメント」は、完全長ペプチド（またはポリペプチド、本明細書で使用する用語ペプチドには何のサイズ制限も含まれない）より短く、実質的に類似する機能的活性を保っている。
【０１６４】
「誘導体」には、追加構造および／または追加機能を与えるために化学修飾されたペプチドが含まれる。
【０１６５】
誘導体は、自然のプロセスによって修飾されるか、または化学修飾技法によって修飾することができ、それらはどちらも当技術分野において周知である。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチド内のどこでも行うことができる。
【０１６６】
他の化学修飾には、例えばアセチル化、アシル化、アミド化、異なる化学部分の共有結合による取り付け、橋かけ、環化、ジスルフィド結合または他の架橋形成、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ＰＥＧ化、セレノイル化などが含まれる。
【０１６７】
本発明によるペプチドの「変種」には、コンセンサス中に定義されるアミノ酸に関して一つ以上のアミノ酸配列置換物を持つポリペプチドが包含される。もちろん、それらは天然アミノ酸以外のアミノ酸も含有しうる。
【０１６８】
例えば、上述したように本発明の異なる実施形態の機能的変種を得るために、一つ以上の保存的アミノ酸置換を、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内で行うことができる。置換は、例えば無極性側鎖を持つアミノ酸内、極性側鎖を持つ天然または非天然非荷電Ｄ−またはＬ−アミノ酸内、芳香族側鎖を持つアミノ酸内、天然または非天然正荷電Ｄ−またはＬ−アミノ酸内、天然または非天然負荷電Ｄ−またはＬ−アミノ酸内、ならびに類似するサイズおよび分子量を持つ任意のアミノ酸内（この場合、元のアミノ酸の分子量は、元のアミノ酸の分子量の約±２５％を超えて逸脱してはならず、ホルモン・エリスロポエチンの受容体に対する結合能はアゴニスト作用と共に維持される）で行われる（。好ましくは１、２、または３個を超えないアミノ酸が置換される。位置１０および１７にプロリンが導入されない配列変種が好ましい。
【０１６９】
本明細書に記載するペプチド配列は、ＥＰＯ受容体に対する結合ドメインを構成する適切な単量体型ペプチドユニットとして使用することができる。それらは、ＥＰＯ受容体に結合するので、単量体の形で使用することができる。本明細書に記載するように、それらは、好ましくは二量体として使用される。というのも、二量体はＥＰＯ受容体の二量体化を誘導する能力を持ち、それゆえに生物学的活性が、単量体型結合ユニットの二量体化によって強化されるからである。
【０１７０】
このように多くの異なるペプチドが本発明の範囲に包含されることは明白である。しかし、配列Ａｃ−ＶＬＰＬＹＲＣＲＭＧＲＥＴＷＥＣＭＲＡＡＧＶＴＫ−ＮＨ２には一定の欠点があり、したがって本発明によれば好ましくないことがわかっている。
【０１７１】
ここに記載する個々のペプチド配列の最初（Ｎ末端）および最後（Ｃ末端）では、５個までのアミノ酸を除去および／または付加することができる。ペプチド機能が保存される限り、サイズが重要でないことは自明である。さらにまた、短すぎて単量体としてはその活性を持つことができないかもしれない個々のペプチド配列が、二量体化されると、通常はアゴニストして機能することにも留意されたい。したがってそのようなペプチドは、好ましくは、二量体の形で使用される。したがって、それぞれの短縮および／または伸長された実施形態も、本発明の要旨に含まれる。
【０１７２】
本発明では、大文字である一文字表記の略号は、非天然アミノ酸の追加によって拡大された標準的ポリペプチド命名法の略号である。
【０１７３】
【表１−１】
2009529509.tif 000032
【０１７４】
【表１−２】
2009529509.tif 000033
上述のように、本発明は、単一アミノ酸の保存的置換物によるペプチドおよび定義されたペプチドコンセンサスの修飾も包含する。そのような置換物は、結合分子の構造および機能を変化させるが、ほとんどの場合、それはわずかな変化にすぎない。保存的置換物では、一つのアミノ酸が、類似する性質を持つ群内のもう一つの別のアミノ酸で置き換えられる。
【０１７５】
対応する群の例は、
・無極性側鎖を持つアミノ酸：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｍ
・極性側鎖を持つ非荷電アミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
・芳香族側鎖を持つアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ
・正荷電アミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ
・負荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ
・類似するサイズまたは分子量を持つアミノ酸であって、置換アミノ酸の分子量の逸脱が元のアミノ酸の分子量の最大±２５％（または±２０％、±１５％、±１０％）であるもの
である。
【０１７６】
これらの群が、それぞれの側鎖プロファイルを持つ非タンパク質構成性の天然または非天然アミノ酸、例えば正荷電側鎖を示す群の場合はホモアルギニンなども包含することは自明である。例えば非天然アミノ酸などのプロリン１０置換分子を、その側鎖の性質によって特徴づけられる上記の群の一つに明確には割り当てることができない場合、それは、通常は、本発明にいうプロリンの非保存的置換であると理解されるべきである。これらの異常アミノ酸を類別するには、分子量による分類補助が役立つかもしれない。
【０１７７】
より具体的に述べると、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（米国特許第５，７７３，５６９号および関連特許）は、ファージディスプレイ技法を使って、活性を維持したままどのアミノ酸を置き換えることができるかを、詳細に検討した。彼らは可能な短縮（すなわち与えられたＥＰＯミメティックペプチドの最小長）に関するデータを調査し、公表した。しかし、中央Ｇｌｙ残基近くのプロリンは、活性ペプチドを得るには、他の選択肢がないようだった。
【０１７８】
好ましくは、記載されたペプチドを、Ｎ末端でＡｃＧに修飾し、Ｃ末端でＭｅＧに修飾する。
【０１７９】
上述のように、ペプチドは、二つのＥＰＯミメティックコンセンサス配列、したがって二つの単量体型結合ユニットを含み、その結果、二量体（または、アミノ酸リンカーを二量体化に使用する場合は、連続する二価ペプチド）を形成することが好ましい。単量体型ＥＰＯミメティックペプチドユニットは、二量体を形成させるために、上述の実施形態の全てから選択することができる。本発明の単量体型結合ユニットは、従来技術で知られるＥＰＯミメティックペプチドの単量体型結合ユニットと組み合わせることもできる。
【０１８０】
本発明のＥＰＯミメティックペプチド単量体または二量体は、さらに、少なくとも一つのスペーサー部分を含みうる。好ましくは、そのようなスペーサーは、単量体または二量体のリンカーを、水溶性ポリマー部分または保護基（例えばＰＥＧを挙げることができる）に接合する。ＰＥＧは、少なくとも３ｋＤ、好ましくは２０〜６０ｋＤの好ましい分子量を持つ。スペーサーは、−ＮＨ−結合またはＣＯＯＨ基を末端に持ち、場合によっては一つ以上の利用可能な炭素原子において低級アルキル置換基で置換されている、Ｃ１−１２部分であることができる。特に好ましいスペーサーはＷＯ２００４／１００９９７に開示されている。全ての文書−ＷＯ２００４／１００９９７およびＷＯ２００４／１０１６０６−は参照により本明細書に組み入れられる。ペプチドのＰＥＧ修飾はＷＯ２００４／１０１６００に開示されており、この文献も参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８１】
二量体または多量体を得るために、二本のペプチド鎖間の共有結合的リンカーを設計するには、いくつかの選択肢が考えられる。ペプチドはアミノ酸側鎖を介して、または主鎖伸長によって連結することができる。二つのＥＰＯミメティックペプチド部分を共有結合で接合するための四つの異なる主要二量体化戦略を、適切な戦略の例として、以下に略述する。
【０１８２】
１．Ｃ末からＣ末への末端二量体化
【０１８３】
【化５３】
2009529509.tif 000034
二量体化は、各ペプチドのＣ末端にあるジケトピペラジン構造を使って達成することができる。ジケトペラジンリンカーは、Ｃ末端アミノ酸、好ましくはグリシンを活性化することによって得ることができる。以下の図は適切な例を示す。
【０１８４】
【化５４】
2009529509.tif 000035
【０１８５】
【化５５】
2009529509.tif 000036
本発明の第２の実施形態によれば、位置１３にはトリプトファンの代りにナフチルアラニンが存在するであろうことに注意されたい。上記の配列は、二量体化の原理／概念を説明するために使用されるに過ぎず、その原理／概念は本発明に記載する他のペプチドにも機能する。
【０１８６】
２．Ｎ末からＮ末への末端二量体化
【０１８７】
【化５６】
2009529509.tif 000037
以下の例は、前記単量体型ペプチドの一方のＮ末端が、他方のペプチドのＮ末端に共有結合的に結合される二量体型ペプチドを表し、この場合、スペーサーユニットは、好ましくは、ジカルボン酸構成単位を含有している。
例ａ：
リンカー／スペーサーとしてヘキサンジオイル（Ｃ６）ユニットを含有する二量体の例：
【０１８８】
【化５７】
2009529509.tif 000038
この二量体構造における連結架橋は、生物活性コンフォメーションの歪みを避けるために、分子モデリングによってカスタムメイドされる。
【０１８９】
例ｂ：
リンカー／スペーサーとしてオクタンジオイル（Ｃ８）ユニットを含有するテーラード二量体の例：
【０１９０】
【化５８】
2009529509.tif 000039
３．側鎖を介した二量体化
さらにまた、二量体化は、二量体を形成させようと考えている単量体型ペプチドの側鎖間に形成される共有結合によって行うこともできる。
【０１９１】
【化５９】
2009529509.tif 000040
いくつかの選択肢が存在する。ある実施形態によれば、位置Ｘ１８にあるアミノ酸（例えばＧｌｎ）の側鎖は、ＥＰＯミメティックペプチド−ＥＰＯＲ複合体中で互いに隣接する。これらのＧｌｎ１８側鎖を共有結合的架橋で置き換えることができる。以下の式は、位置１８にあるアミノ酸の側鎖を介して連結されたペプチド二量体の例を示す。
【０１９２】
【化６０】
2009529509.tif 000041
妥当なリンカーの設計においては、正しい距離および幾何学的配置を考慮する必要がある。
【０１９３】
以下の式を持つペプチドの幾何学的配置が最適化されると、その構造はネイティブのペプチド二量体と比較して収縮され、変形される。
【０１９４】
【化６１】
2009529509.tif 000042
先の構造とは対照的に、位置１８におけるチオリジンを介した二量体化では、二量体が実質的に歪まない。
【０１９５】
【化６２】
2009529509.tif 000043
異なる戦略によれば、ペプチド単量体を互いに連結し、よって二量体を形成させる共有結合的架橋は、第１単量体型ペプチドユニットのＣ末端アミノ酸と第２ペプチド単量体のＮ末端アミノ酸の側鎖間に形成される。したがって、この二量体化戦略によれば、二量体化されるべきＥＰＯミメティックペプチドは、架橋形成官能性を持つアミノ酸をＮ末端またはＣ末端に保持し、それにより、第１ペプチドの最後のアミノ酸と第２ペプチドの最初のアミノ酸の間に共有結合を形成させることができるようになっていることが好ましい。二量体を生じさせる結合は好ましくは共有結合性である。各架橋の適切な例は、例えばジスルフィド架橋およびジセレニド架橋である。しかし、例えば正荷電アミノ酸と負荷電アミノ酸の間のアミド結合またはチオエーテル結合などの他の共有結合的連結結合も、連結部分として適切である（実施形態１に関する上記を参照）。
【０１９６】
それぞれの接合架橋を形成するのに適した好ましいアミノ酸は、本発明の第１実施形態に関連して略述した。それらは例えばシステイン、システイン誘導体、例えばホモシステインもしくはセレノシステイン、またはチオリジンである。それらはジスルフィド架橋を形成するか、含セレンアミノ酸の場合は、ジセレニド架橋を形成する。
【０１９７】
それぞれに生成される二量体の適切な例を以下に示す。
【０１９８】
【化６３】
2009529509.tif 000044
【０１９９】
【化６４】
2009529509.tif 000045
さらにもう一つの展開によれば、ペプチド二量体の（したがって二量体の最初または最後に位置する各単量体型ペプチドユニットの）Ｎ末端またはＣ末端は、ＨＥＳなどの担体のカップリングを可能にする余分なアミノ酸を含む。したがって導入されるアミノ酸は、それぞれに、例えばＳＨ基などのカップリング官能性を保持する。そのようなアミノ酸のよくある一例はシステインである。しかし、共有結合の形成を可能にする官能基を持つ他のアミノ酸（例えば全ての負荷電アミノ酸および正荷電アミノ酸）も、適切である。
【０２００】
【化６５】
2009529509.tif 000046
ペプチド単量体上の線は共有結合的分子内架橋（この例ではジスルフィド架橋）を表す。
【０２０１】
さらにもう一つの展開によれば、単量体ユニットを二量体へと接合するための共有結合的架橋の形成に関与するＣおよび／またはＮ末端のアミノ酸が、例えばＣＯＯ−基またはＮＨ３＋基などの荷電基を示す。この特徴は、分子間架橋構造の有利な安定化につながる。
【０２０２】
【化６６】
2009529509.tif 000047
４．連続的二価ペプチド
【０２０３】
【化６７】
2009529509.tif 000048
この戦略の中心概念では、二量体化または多量体化に先だって単量体型ペプチドユニットを別々の反応で合成することを避け、最終的な二価または多価ペプチドを、単一の連続するペプチドとして一段階で、例えば１回の固相反応で合成する。したがって、別個の二量体化または多量体化ステップは、もはや使用されない。この側面により、大きな利点、すなわち最終ペプチドユニットにおける各配列位置に対する完全かつ独立した制御が得られる。この方法では、各配列位置に対する独立した制御により、少なくとも二つの異なる受容体特異的結合ドメインを、一つの連続したペプチドユニット中に容易に内包することができる。
【０２０４】
この実施形態によれば、結合ドメイン間の最終ペプチド（これは「リンカー領域」である）の配列は、アミノ酸だけから構成されるので、単一の連続した二量体型または多量体型ＥＰＯミメティックペプチドがもたらされる。本発明の好ましい実施形態では、前記ペプチドリンカーが、高いコンフォメーションフレキシビリティを許す天然または非天然アミノ酸から構成される。この点において、ねじれに対して高いフレキシビリティを持つことで知られるグリシン残基を連結アミノ酸として使用することは、有利になりうる。しかし、アラニンもしくはベータ−アラニンなどの他のアミノ酸またはそれらの混合物も、ペプチドリンカーの作製に使用することができる。使用されるアミノ酸の数および選択は、それぞれの立体事情に依存する。本発明のこの実施形態は、生物活性コンフォメーションの歪みを避けるために、分子モデリングによる適切なリンカーのカスタムメイド設計を可能にする。３〜５個のアミノ酸から構成されるリンカーはとりわけ好ましい。
【０２０５】
最終二価または多価ペプチドの機能ドメイン（または単量体ユニット）間のリンカーは、ペプチドの独特な部分であるか、単量体型機能ドメインの一部であるアミノ酸から−完全にまたは部分的に−構成されることができる。例えば、連続的二価ペプチドの場合、フレキシブルなリンカーを形成させるには、ペプチド単量体の最初（例えば位置Ｘ１およびＸ２）およびペプチド単量体の最後（例えば位置Ｘ１９およびＸ２０）には小さくてフレキシブルなアミノ酸が好ましい。これらの位置における好ましいアミノ酸は、例えばグリシンまたはベータ−アラニン残基である。配列１１〜１４に例を示す。このように、あるアミノ酸はリンカーの一部を形成すると共に、単量体サブユニットの一部をも形成するかもしれないので、「リンカー」という用語は、構造によって定義されるのではなく、このように、機能によって定義される。
【０２０６】
上述のように、二価／多価ペプチドの合成時に最終ペプチド内での各配列位置は制御され、したがって正確に決定することができるので、ペプチドまたはその特異的領域もしくはドメイン（リンカーを含む）を特製することまたは適合させることが可能である。これには独自の利点がある。というのも、これにより、不利な分子内相互作用による最終二価ペプチドの生物活性コンフォメーションの歪みを避けることができるからである。歪みのリスクは、分子モデルリングによって、合成前に評価することができる。これはとりわけ単量体ドメイン間のリンカーの設計に当てはまる。
【０２０７】
二量体化用のペプチドリンカーを持つ連続的二価／多価ペプチドは、対応する単量体型ペプチドよりもはるかに高い活性を示すので、二価ペプチド概念には効力の増加が付随するという他の二量体型ペプチドから知られている知見が裏付けられる。
【０２０８】
連続的二価／多価ペプチドは、例えばアセチル化またはアミド化によって修飾するか、Ｃ末端位置またはＮ末端位置を伸長することができる。上述した単量体型ペプチド（単量体）に関する先行技術の修飾は、ＰＥＧ、デンプンまたはデキストランなどの可溶性部分の取り付けを含めて、本発明の多価または二価ペプチドにも応用することができる。
【０２０９】
考えうる全ての修飾はリンカーの修飾にも適用される。特に、例えばＰＥＧ、デンプンまたはデキストランなどの可溶性ポリマー部分をリンカーに取り付けると有利であるかもしれない。
【０２１０】
本発明の最終多価または二価ペプチドの合成には、引き続いて各結合ドメイン内で二つのジスルフィド結合または他の分子内結合を独立して形成させることも、有利に含めることができる。その結果として、ペプチドを環化させることもできる。
【０２１１】
本発明の二価構造は、本明細書に報告するペプチド単量体に基づいて、有利に形成される。
【０２１２】
ペプチドの反応性側鎖は、例えばさらなる修飾のための連結ひもとして役立ちうる。二量体型ペプチドは、さらに、場合によっては、例えばシステインなどの架橋形成側鎖官能性を持つ第１アミノ酸と第２アミノ酸および／または第３アミノ酸と第４アミノ酸（Ｘ６およびＸ１５）の間に分子内架橋を含む。
【０２１３】
ペプチドは、例えばアセチル化またはアミド化によって修飾するか、Ｃ末端位置またはＮ末端位置を伸長することができる。例えばポリマー用の取り付け部位を調製するためにの、二つの末端のうちの一方（ＮまたはＣ）を一つ以上のアミノ酸で伸長すると、多くの場合、ヘテロ二量体型二価ペプチドがもたらされ、これは連続的ペプチドとして最もうまく製造することができる。
【０２１４】
従来技術では、担体をタンパク質およびペプチドにカップリングするために、いくつかの反応性アミノ酸が知られている。好ましいカップリングアミノ酸は、Ｎ末端かＣ末端にカップリングすることができるシステインである。しかし、カップリングの向きは、かなりの相違を生じうるので、各ペプチドについて注意深く選択すべきである。以下に例を挙げてこれを説明することにする。
【０２１５】
使用するのは以下の二つの二量体である。
【０２１６】
【化６８】
2009529509.tif 000049
１−Ｎａｌ：１−ナフチルアラニン
Ｃｙｓ（ｔＢｕ）：Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル保護Ｌ−システイン
４１マーＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４およびＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４は同じコア配列を持っている。ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４のアミノ酸１〜４０はＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４のアミノ酸２〜４１に匹敵する。唯一の相違点はｔＢｕ保護システインの位置である。このアミノ酸は受容体薬物相互作用には関与しないが、最終コンジュゲート中でポリマー担体への連結基として機能することが予定されている。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の場合、ｔＢｕ保護システインはＣ末に取り付けられ、ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の場合はＮ末に取り付けられる。接続線はシステイン架橋を表す。
【０２１７】
ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４にはＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４と比較して二つの利点がある。
【０２１８】
第１の利点はその合成上の利便性である。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４はＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４より高い総収率で単離することができる。ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の線状配列を合成する場合、ＣｌＺ−２２マー（ＣｌＺ−ＲＧＧＧＴＹＳＣＨＦＧＫＬＴ−１−Ｎａｌ−ＶＣＫＫＱＲＧ−ＮＨ２、ＣｌＺ：２−クロロベンジルオキシカルボニル基）が副生成物として観察される。これは、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるその線状配列の精製中に、ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の線状前駆体と類似するクロマトグラフィー挙動を示すので、そこから分離することが難しくなり、所望の生成物の総収率の低下をもたらす。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の場合、類似する化合物は見出されない。
【０２１９】
ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４と比較したＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の第２の利点は、脱保護したペプチドとポリマー担体との最終コンジュゲートを容易に分析できることにある。ペプチドコンジュゲートを分析するための一つの戦略は、エンドプロテアーゼによる切断を使ったコンジュゲートの選択的分解である。理想的には酵素的加水分解時にペプチド全体がポリマー担体から放出される。これらのペプチドフラグメントは、例えばＵＶまたはＭＳ検出を使ったＨＰＬＣのような標準的分析技法で同定し、定量することができる。
【０２２０】
ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の場合、切断はトリプシン−荷電アミノ酸アルギニンおよびリジンのＣ末端側にあるペプチド結合を高度に選択的に切断することが知られているエンドプロテアーゼ−で達成することができる（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ、Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ（Ｈｒｓｇ．）「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルク、ベルリン、１９９８）。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４のコンジュゲートに適用すると、これは、担体分子に結合された元のペプチドの４１アミノ酸中３８アミノ酸をカバーするフラグメントを遊離させることになる。ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の場合は、４１アミノ酸中２１アミノ酸しかないフラグメントがトリプシン消化によって放出される：
【０２２１】
【化６９】
2009529509.tif 000050
遊離され、追跡分析によって検出することができるフラグメントを、灰色の背景で示している。
【０２２２】
活性医薬成分の分析はその開発時に重要な問題であるので、ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４はＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４と比較して明確な利点を持っている。
【０２２３】
このように、正荷電アミノ酸がそれぞれの位置にある場合は、連結アミノ酸（ここではシステイン）をＣ末端に組み込むことが非常に好ましい。なぜなら、単量体の位置Ｘ１９にあるアルギニンゆえに切断部位がほとんどポリマーの直前にくるので、ほぼ完全なペプチドフラグメントを生成させることが可能だからである。
【０２２４】
本発明の化合物はヒトおよび／または獣医医薬組成物の製造に有利に使用することができる。したがってこれらはヒト治療および獣医治療における使用に適している。これらは、ＥＰＯミメティックとして、エリスロポエチンと基本的に同じ定性的活性パターンを示す。したがってこれらは概してエリスロポエチンと同じ適応症に適している。
【０２２５】
エリスロポエチンはサイトカインスーパーファミリーのメンバーである。序論で説明した刺激作用の他に、エリスロポエチンは幹細胞を刺激することも見出された。したがって本明細書に記載するＥＰＯミメティックは、幹細胞関連作用によって引き起こされる全ての適応症に適している。限定でない例は、神経系に関連する疾患の予防および／または処置である。例として、神経損傷、神経疾患または神経障害、例えばパーキンソニズム、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ゴーシェ病、テイ・サックス病、ニューロパシー、末梢神経損傷、脳腫瘍、脳損傷、脊髄損傷または脳卒中損傷などが挙げられる。本発明のＥＰＯミメティックペプチドは、心不全を患っている患者または心不全を患う危険がある患者の予防的および／または治療的処置にも使用することができる。例として、心筋梗塞、冠状動脈疾患、心筋炎、化学療法処置、アルコール依存症、心筋症、高血圧、僧帽弁閉鎖不全または大動脈狭窄を含む心臓弁膜症、および甲状腺の障害、慢性および／または急性冠症候群が挙げられる。
【０２２６】
さらにまたＥＰＯミメティックは、内皮前駆細胞の生理学的動員、増殖および分化の刺激、脈管形成の刺激、内皮前駆細胞の機能障害に関係する疾患の処置、ならびにそのような疾患を処置するための医薬組成物および前記ペプチドと内皮前駆細胞の刺激に適した他の薬剤とを含む医薬組成物の製造にも使用することができる。そのような疾患の例は、高コレステロール血症、真性糖尿病、内皮介在性慢性炎症性疾患、細網内皮症を含む内皮症、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患、心筋虚血、狭心症、加齢性心血管疾患、レイノー病、妊娠誘発性緊張亢進、慢性または急性腎不全、心不全、創傷治癒および続発症である。
【０２２７】
さらにまた、本発明のペプチドは、血液脳関門を横切って薬剤を送達するための適切な担体でもあり、血液脳関門を通過することができる各治療用コンジュゲーション剤のそれぞれの目的および／またはその製造に使用することができる。
【０２２８】
本明細書に記載するペプチドは、エリスロポエチンの欠乏または低赤血球集団もしくは欠陥赤血球集団を特徴とする障害の処置、とりわけあらゆるタイプの貧血および脳卒中の処置に、とりわけ適している。これらのペプチドは、哺乳動物におけるヘマトクリットを増加させ、かつ／または維持するのにも適している。そのような医薬組成物は、その組成物を意図する投与手法に適合させるために、場合によっては、薬学的に許容できる担体を含みうる。適切な送達方法ならびに担体および添加剤は、例えばＷＯ２００４／１０１６１１およびＷＯ２００４／１００９９７に記載されている。
【０２２９】
上に略述したように、単量体型ペプチドを二量体化して二量体、さらには多量体にすると、通常は、各単量体型ペプチドと比較して、ＥＰＯミメティックアゴニスト活性が改善される。しかし活性をさらに強化することが望ましい。例えば、二量体型ＥＰＯミメティックペプチドでさえ、細胞機構の活性化については、ＥＰＯほど強力でない。
【０２３０】
より強力な候補を同定するべく、先行技術では、ペプチドの活性を増加させるために、例えばアミノ酸配列の変異などによるいくつかのアプローチがなされた。しかし、今のところ、生物学的活性を改善するために、ペプチドの活性、とりわけＥＰＯミメティックペプチドの活性をさらに強化させることが、依然として望ましい。
【０２３１】
本発明のさらにもう一つの実施形態はこの課題に対する解決策を提供する。ここでは、ターゲット分子を結合する化合物であって、
ｉ）少なくとも二つのペプチドユニットであって、各ペプチドユニットがターゲットへの結合能を持つ少なくとも二つのドメインを含むもの、
ｉｉ）少なくとも一つのポリマー担体ユニット
を含み、前記ペプチドユニットが前記ポリマー担体ユニットに結合している化合物が提供される。
【０２３２】
驚いたことに、ポリマー支持体上で本発明の二価または多価ペプチドを二つ以上組み合わせると、その結合受容体に対する二価（さらには多価）ペプチドの効力が、相加的な増加にとどまらず、超相加的に著しく増加していることが見出された。したがって相乗的な作用が観察される。
【０２３３】
本発明に関して使用する「二価」という用語は、ターゲット（ここでは特にＥＰＯ受容体）への結合能を持つドメインを二つ含んでいるペプチドと定義される。これは「二量体型」という用語と可換的に使用される。したがって、「多価」または「多量体型」ＥＰＯミメティックペプチドは、ＥＰＯ受容体に対する各結合ドメインを数個持っている。「ペプチド」および「ペプチドユニット」という用語が、サイズに関して何の制限も含んでいないこと、オリゴペプチドおよびポリペプチドならびにタンパク質を包含することは、自明である。
【０２３４】
ポリマー担体ユニットに取り付けられた二つ以上の二価または多価ペプチドユニットを含む化合物は、この実施形態においては、「超結合価（ｓｕｐｒａｖａｌｅｎｔ）」と名付けられる。これらの超結合価分子は、従来技術で知られている二量体型または多量体型分子とは著しく異なる。従来技術では、二量体を作製するために単量体型ＥＰＯミメティックペプチドを組み合わせるに過ぎない。これに対して、超結合価分子は、既に（少なくとも）二価であるペプチドユニットをポリマー担体に接合し、その結果、超結合価分子を作製することによって生成する（例を図面に示す）。これにより、ペプチドの総合活性および総合効力は著しく強化され、よってＥＣ５０用量は減少する。
【０２３５】
今のところ、従来技術で知られている分子と比較して超結合価分子が強い力価を持つ理由は完全にはわかっていない。それは、従来技術で知られている二量体型分子が、二量体一つにつき一つの各ターゲット受容体結合ユニットしか提供しないという事実によるのかもしれない。したがって、二量体型化合物が結合すると、受容体複合体が一つだけ生成し、その結果、シグナル伝達プロセスが一つだけ誘発される。例えば、ペプチド二量体を形成させるためにＰＥＧを介して二つの単量体型ＥＰＯミメティックペプチドを接合すると、結果として、シグナル伝達に必要な受容体単量体の二量体化が助長される（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７）。これに対して、本発明の超結合価化合物は、既に二量体または多量体である各受容体結合ユニットを数個含む。これが、化合物分子一つにつき細胞表面上で数個の受容体複合体の生成を可能にし、その結果、数個のシグナル伝達が誘発され、その結果、超相加作用的に、ペプチドユニットの活性が増強されるのかもしれない。超結合価化合物の結合は、細胞表面における受容体複合体のクラスター化をもたらすのかもしれない。
【０２３６】
この実施形態で使用されるＥＰＯミメティックペプチドユニットは同型であっても、異型であってもよい。つまり、同一のペプチドユニットまたは異なるペプチドユニットが使用される。ペプチドユニットの結合ドメイン（上述した単量体型ペプチド）にも同じ事が言え、それらも同型または異型であることができる。担体ユニットに結合した二価または多価ペプチドユニットは、同じ受容体ターゲットを結合する。しかし、それでもなお、それらはもちろん、そのアミノ酸配列が異なりうる。二価または多価ペプチドユニットの単量体型結合ドメインは線状であっても、環状であってもよい。環状分子は例えば分子内システイン架橋の形成によって作製することができる（上記参照）。
【０２３７】
ポリマー担体ユニットは、少なくとも一つの天然または合成分岐、線状またはデンドリティックポリマーを含む。ポリマー担体ユニットは好ましくは水および体液に可溶であり、好ましくは薬学的に許容できるポリマーである。水溶性ポリマー部分には、例えばポリアルキレングリコールおよびその誘導体、例えばＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー（この場合、前記ホモポリマーおよびコポリマーは無置換であるか、一端が例えばアシル基で置換される）；ポリグリセリンまたはポリシアル酸；セルロースおよびセルロース誘導体、例えばメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース；デンプン（例：ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、とりわけヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ））およびデキストリン、ならびにその誘導体；デキストランおよびデキストラン誘導体、例えばデキストラン硫酸、架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリン；キトサン（線状多糖）、ヘパリンおよびヘパリンのフラグメント；ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル；ポリビニルピロリドン；アルファ，ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド；ならびにポリオキシエチル化ポリオールなどがあるが、これらに限るわけではない。担体ユニットの一例は、例えばポリエチレングリコールなどのホモ二官能性ポリマー（ビス−マレイミド、ビス−カルボキシ、ビス−アミノなど）である。
【０２３８】
本発明の単量体型コンセンサス配列を含む少なくとも二つの二量体型ＥＰＯミメティックペプチドにカップリングされるポリマー担体ユニットは、本発明に関して適切な種々のポリマーがさまざまな性質を持つため、広範囲にわたる分子量を持つことができる。したがってサイズ制限はない。しかし、分子量は少なくとも３ｋＤ、好ましくは少なくとも１０ｋＤかつおよそ２０〜５００ｋＤ付近、より好ましくは３０〜１５０または６０または８０ｋＤ付近である。担体ユニットのサイズは選択したポリマーに依存するので、さまざまでありうる。例えば、とりわけヒドロキシエチルデンプンなどのデンプンを使用する場合は、分子量がかなり高くなるかもしれない。その場合、平均分子量は１００〜４０００ｋＤ付近、さらにはそれ以上になるかもしれない。しかし、ＨＥＳ分子の分子量は５０〜５００ｋＤ付近、または１００〜３００ｋＤ付近、好ましくは２００ｋＤ付近にあることが好ましい。担体ユニットのサイズは、好ましくは、各ペプチドユニットが各受容体分子を結合するのに最適に配置されるように、選択される。
【０２３９】
これを容易にするために、本発明の一実施形態では、分岐ユニットを含む担体ユニットを使用する。この実施形態によれば、例えばＰＥＧなどのポリマーが、分岐ユニットに取り付けられて、数多くのペプチドユニットを組み込むことが可能な大きい担体分子が得られる。適当な分岐ユニットの例はグリセロールまたはポリグリセロールである。例えば参照により本明細書に組み入れられるＨａａｇ  ２０００に教示されているように、デンドリティック分岐ユニットも使用することができる。分岐型のＨＥＳ担体も使用することができる。これは例えばアミロペクチンから高率に得られる。
【０２４０】
好ましくは、単量体型結合ユニットを組み合わせて（頭−頭、頭−尾、または尾−尾型の）ペプチドユニットにすることによってペプチドユニットを作製してから、ポリマー担体ユニットをペプチドユニットに接合する。ポリマー担体ユニットは、共有結合または非共有（例えば配位）結合によって、ペプチドユニットに接合／カップリングされる。ただし共有結合の使用が好ましい。取り付けは、例えばペプチドユニットの反応性アミノ酸、例えばリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシンを介して行うか、またはＮ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸を介して行うことができる。ペプチドが反応性アミノ酸を保持していない場合は、そのようなアミノ酸をアミノ酸配列中に導入することができる。カップリングは、ターゲットへの結合が妨害されないように、または少なくとも可能な限り妨害が少なくなるように、選択されるべきである。ペプチドユニットのコンフォメーションに依存して、反応性アミノ酸はペプチド配列の最初、最後または内部に存在する。
【０２４１】
ポリマー担体ユニットが適当なカップリング基を持っていない場合は、ポリマーがペプチドユニット上の少なくとも一つの反応性基と反応して超結合価化合物を形成することができるように、ポリマーを適当に修飾するために、いくつかのカップリング物質／リンカーを使用することができる。ポリマーを修飾するために使用することができる適切な化学基は、例えば以下のとおりである：
タンパク質のアミノ基と反応するアシル化基、例えば酸無水物基、Ｎ−アシルイミダゾール基、アジド基、Ｎ−カルボキシ無水物基、ジケテン基、ジアルキルピロカーボネート基、イミドエステル基、およびカルボジイミド活性化カルボキシル基。上述の基はすべて、タンパク質／ペプチド上のアミノ基と反応して、アシル結合または類似の結合を伴う共有結合を形成することが知られている；
ペプチドユニット上のスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、例えばハロ−カルボキシル基、マレイミド基、活性化ビニル基、エチレンイミン基、アリールハライド基、２−ヒドロキシ５−ニトロ−ベンジルブロミド基；ならびにペプチドのアミノ基と反応する脂肪族アルデヒドおよびケトン基と還元剤の組み合わせ；
ペプチドのカルボキシル基と反応するエステル形成基およびアミド形成基、例えばジアゾカルボキシレート基、およびカルボジイミド基とアミン基の組み合わせ；
タンパク質上のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、例えば５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）基、オルト−ピリジルジスルフィドおよびアルキルメルカプタン基（これらはヨウ素などの酸化剤の存在下でタンパク質のスルフヒドリル基と反応する）；
ペプチドのグアニジン部分と反応するジカルボニル基、例えばシクロヘキサンジオン基、および他の１，２−ジケトン基；
ペプチド上のフェノール性基と反応するジアゾ基；
ペプチド上のアミノ基と反応する、臭化シアンと多糖との反応によって生じる反応性基。
【０２４２】
したがって要約すると、本発明の化合物は、場合によっては、まずポリマー担体を化学的に修飾することによって、ペプチドユニット上の利用可能な化学基またはペプチドユニット上に導入された化学基と反応することができる少なくとも一つの化学基をその上に持っているポリマー担体を製造し、次にその−場合によっては−修飾されたポリマーとペプチドユニットとを反応させて、必要であれば修飾されたポリマーの化学基を利用して、その共有結合した複合体を形成させることによって、製造することができる。
【０２４３】
カップリングがペプチドの（例えばシステイン基の）遊離ＳＨ基を介して行われる場合は、ポリマー中のマレイミド基を使用することが好ましい。
【０２４４】
明確な分子を生成させるために、ペプチドユニットをポリマー担体ユニットに取り付けるには、的を絞った（ｔａｒｇｅｔｅｄ）アプローチを使用することが好ましい。適当なアミノ酸が所望する取り付け部位に存在しない場合は、適当なアミノ酸を二量体型ＥＰＯミメティックペプチドユニットに組み込むことができる。部位特異的にポリマーを取り付けるには、ペプチドの至る所で制御されないカップリングが起こって、いくつかの異なるポリマー分子の集団を含む不均一な混合物がもたらされるのを避けるために、ユニークな反応基、例えばペプチドユニットの最後にある特異的アミノ酸が好ましい。
【０２４５】
ポリマー担体ユニット、例えばＰＥＧまたはＨＥＳへの、ペプチドユニットのカップリングは、広く当業者に知られている反応を使って行われる。例えば当業者は、いくつものＰＥＧおよびＨＥＳ取り付け方法を利用することができる（例えばＷＯ２００４／１００９９７とその参考文献、Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２；ＵＳ４，０６４，１１８；ＥＰ１３９８３２２；ＥＰ１３９８３２７；ＥＰ１３９８３２８；ＷＯ２００４／０２４７６１；これらは全て参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２４６】
本明細書に記載する超結合価（ｓｕｐｒａｖａｌｅｎｃｙ）という概念は、ＰＥＧ化またはＨＥＳ化という既知の概念とは異なることを理解することが重要である。従来技術では、ＰＥＧ化が、ペプチド二量体を製造するためだけに、または一つ以上のＰＥＧユニットをペプチドに取り付けることによって薬物動態パラメータを改善するためだけに用いられる。しかし上に略述したように、二つ以上の少なくとも二価であるペプチドユニットを、例えばポリマー担体ユニットとしてのＰＥＧまたはＨＥＳに取り付けることにより、効力も著しく強化される（したがってＥＣ５０用量が低下する）。したがって本発明の概念は、従来技術で知られているＰＥＧ化またはＨＥＳ化概念の場合がそうであるように薬物動態パラメータに対して強い作用を持つだけでなく、薬力学パラメータに対しても強い作用を持つ。しかしもちろん、例えばポリマー担体ユニットとしてのＰＥＧまたはＨＥＳの組み込みは、薬物動態に関する既知の利点も持つ。
【０２４７】
ＰＥＧ化は通常、ペプチドの生物製剤的性質を改善するために企てられる。ＰＥＧコンジュゲーション後に起こるタンパク質分子の最も重要な変化はサイズ拡大、タンパク質表面および糖鎖付加機能のマスキング、電荷修飾およびエピトープ遮蔽である。特に、サイズ拡大は腎限外濾過を減速させ、受動的な透過性亢進および滞留機構による透過性組織への蓄積を促進する。タンパク質遮蔽は、重要な排除経路であるタンパク質分解および免疫系認識を減少させる。タンパク質の物理化学的および生物学的性質に対するＰＥＧ化の具体的作用は、タンパク質およびポリマーの性質ならびに採用したＰＥＧ化戦略によって厳密に決まる。
【０２４８】
しかし、ＰＥＧまたは他の非生分解性ポリマーの使用は、新しい問題を引き起こすかもしれない。
【０２４９】
インビボ適用に際して、臨床的状況における投薬間隔は、薬物作用の喪失によってトリガされる。日常的な投薬量および投薬間隔は、作用が投薬間隔中に失われないように、適合される。非生分解性の大きなポリマーユニット（例えばＰＥＧ部分）に取り付けられたペプチドは支持体分子が身体によって除去されるであろう速度よりも速く分解されうるという事実ゆえに、担体ユニットが蓄積するという危険が生じうる。薬物の実効半減期は薬物そのものまたはその成分／代謝産物の一つの消失半減期よりも短いので、そのような蓄積の危険は常に生じる。したがって、担体分子の蓄積は、とりわけ長期処置においては、回避されるべきである。なぜなら、ペプチドは通常、非常に大きくそれゆえに遅い腎排出を示すＰＥＧ部分（約２０〜４０ｋＤ）でＰＥＧ化されるからである。ペプチド部分そのものは酵素的分解を受け、部分的切断でさえ、そのペプチドを失活させるには十分であるかもしれない。
【０２５０】
この潜在的問題に対する解決策を見出すために、本発明の一実施形態は、少なくとも二つのサブユニットから構成されるポリマー担体ユニットの使用を教示する。これらのポリマーサブユニットは生分解性共有結合リンカー構造によって接合される。この実施形態によれば、大きな担体分子（例えば４０ｋＤ）の分子量が、生分解性リンカーによって接合された数個の小サイズまたは中サイズのサブユニット（例えば５〜１０ｋＤの分子量を持つ各サブユニット）によって作製される。モジュールサブユニットの分子量が合計されることにより、担体分子の所望の分子量が生じる。しかし、生分解性リンカー構造は体内で分解され、それにより、小さな担体サブユニット（例えば５〜１０ｋＤ）を放出することができる。小さい担体サブユニットは、総分子量（例えば４０ｋＤ）を持つポリマー分子よりも良好な腎クリアランスを示す。その実例を図１６に示す。
【０２５１】
リンカー構造は、体液における既知の分解特性および分解の時間尺度に従って選択される。分解可能な構造は、例えば、加水分解によって切断することができるアミド／ペプチド結合またはエステルの形をしたカルボン酸誘導体のような切断可能基を含有することができる（例えば参照により本明細書に組み入れられるＲｏｂｅｒｔｓ、２００２を参照されたい）。生理的ｐＨにおける分解速度を制御するために、ＰＥＧ主鎖にさまざまなエステル結合を持つＰＥＧスクシンイミジルエステルを合成することもできる（参照により本明細書に組み入れられるＺｈａｏ、１９９７）。ベンジルウレタンのジスルフィドのような他の分解可能構造も、細胞のエンドソーム区画に見られるような穏和な還元環境下で切断することができるので（Ｚａｌｉｐｓｋｙ、１９９９）、同様に適切である。適当なリンカーを選択するための他の基準は、速い（しばしば酵素的）分解か、遅い分解（しばしば非酵素的分解）かの選択である。体液におけるこれら二つの機構の組み合わせも実現可能である。この著しく有利な概念が本明細書に説明し言及した特定ペプチドユニットに限定されず、ＰＥＧ分子などの大きなポリマーユニットに取り付けられて蓄積という同じ問題が生じる他の医薬分子にも当てはまることは、明白である。
【０２５２】
ある実施形態によれば、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはＨＥＳが、ポリマー担体ユニットとして使用される。ＨＥＳは重要な利点をいくつか持っている。何よりもまず、ＨＥＳは生分解性である。さらにまた、ＨＥＳの生分解性は、ヒドロキシエチル基の比率によって制御することができ、そうすることで支配することができる。０．４〜０．８というグルコースユニットのモル置換度（平均してグルコースユニットの４０〜８０％がヒドロキシエチル基を含有する）は、本発明の目的には十分に適している。生分解性ゆえに、ＰＥＧに関連して上述した蓄積問題は、通常は起こらない。さらにまた、ＨＥＳは医学的処置に例えば血漿増量剤の形で長年にわたって使用されてきた。したがってその無害性は是認されている。
【０２５３】
さらにまた、ＨＥＳの加水分解産物の誘導体は、ガスクロマトグラフィーで検出することができる。ＨＥＳ−ペプチドコンジュゲートは、ペプチドユニットが依然として安定であるような条件下で加水分解されうる。これは、分解産物の定量およびモニタリングを可能にし、活性ペプチドの評価および規格化を可能にする。
【０２５４】
さらにもう一つの実施形態によれば、第１タイプのポリマー担体ユニットを使用して、そこにペプチドユニットを負荷する。この第１担体は、好ましくは、例えばＨＥＳがそうであるように、易生分解性である。しかし、第１担体の全ての取り付けスポットがペプチドユニットで占有されるわけではなく、例えば２０〜５０％ぐらいが占有されるに過ぎない。使用するポリマーのサイズに依存して、一般的には、数百個のペプチドユニットを担体分子にカップリングすることができるだろう。しかし通常は、それより少ない、例えば２〜５０または２〜２０個のペプチドユニットが使用される。ＥＰＯミメティックペプチドの場合、２〜１５、２〜１０、２〜８および３〜６個のペプチドが好ましい。第１担体の残存取り付け部位の残り（または少なくとも一部）は、異なる担体、例えば第１担体より低い分子量を持つ小さなＰＥＧユニットで占有される。この実施形態は、第１担体によって超結合価組成物が作製されるが、好ましくは３〜５または１０ｋＤのＰＥＧユニットによって構成される第２担体の存在ゆえに、その耐久性は極めて高いという利点を持つ。しかし全体としては十分に分解性である。なぜなら、第１担体（例えばＨＥＳ）およびペプチドユニットは生分解性であり、ＰＥＧなどの第２担体は身体から容易に除去されるほど十分に小さいからである。
【０２５５】
ペプチドユニットの結合ドメインを構成する単量体はホモ二量体型エリスロポエチンを認識する。ホモ二量体型受容体であるというこの性質により、ＥＰＯ受容体は他の多くのサイトカイン受容体と区別される。上述のように少なくとも二つのＥＰＯミメティック単量体型結合ドメインを含むペプチドユニットはＥＰＯ受容体に結合し、好ましくはそのターゲットを二量体化または多量体化し、かつ／またはそれを相応に安定化することができ、それにより、シグナル伝達を誘発する複合体を生じさせる。
【０２５６】
本発明は、各化合物の製造方法であって、ペプチドユニットが各担体ユニットに接合される方法も含む。さらに本発明は、各化合物の製造方法であって、ペプチドユニットが各ポリマー担体ユニットに接合される方法も含む。本発明の化合物は、ヒトおよび／または獣医医薬組成物の製造に、有利に使用することができる。それらは、エリスロポエチンの欠乏または低赤血球集団もしくは欠陥赤血球集団を特徴とする障害の処置に、とりわけあらゆるタイプの貧血および脳卒中の処置に、とりわけ適しうる。それらは上述の全ての適応症にも使用することができる。そのような医薬組成物は、意図する投与手法にその組成物を適合させるために、場合によっては、薬学的に許容できる担体を含みうる。適切な送達方法ならびに担体および添加剤は、例えば参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２００４／１００９９７およびＷＯ２００４／１０１６１１に記載されている。
【実施例】
【０２５７】
以下に実施例を挙げて超結合価分子の概念を説明することにする。本発明の簡単な超原子価分子の例を図１に示す。二つの連続的二価ペプチドが、マレイミド基を持つ二官能性ＰＥＧ部分により、そのＮ末端で接合される。ＰＥＧ担体ユニットに対する反応性取り付け部位としてシステインを選択した。
【０２５８】
しかし超結合価分子は三つ以上の連続的二価または多価ペプチドユニットを含むことができる。分岐ユニットとして中央グリセロールユニットを持つ担体ユニットに基づき、三つの連続的二価ペプチドを含む実施例を、図２に示す。ここでも取り付けにはシステインを使用した。ポリマー担体ユニットとしてＨＥＳを使用する実施例を、図３に示す。ペプチドユニットのＳＨ基と反応するマレイミド基を保持するように、ＨＥＳを修飾した。この実施例では、全ての取り付け部位（この場合は４個）がペプチドユニットに結合される。しかし、小さいＰＥＧユニット（例えば３〜１０ｋＤ）が、取り付け部位の少なくとも一部を占有してもよい。
【０２５９】
上に説明したように、超結合価概念は、デンドリティックおよび／またはポリマー担体ユニットが多数の連続的二価ペプチドに接合されている多価デンドリティックポリマーに拡大することもできる。例えばデンドリティック分岐ユニットは、ポリグリセロールに基づくことができる（参照により本明細書に組み入れられるＨａａｇ、２０００を参照されたい）。
【０２６０】
６個の連続的二価ペプチドを含有するデンドリティック分岐ユニットを持つ担体ユニットに基づく超結合価分の例を、図４に示す。
【０２６１】
超結合価分子の別の例は、例えば過ヨウ素酸を使って酸化することによって多数のアルデヒド官能基を内包するようになるデンプンまたはデキストランを持つ担体ユニットを含む。第２ステップでは、多くの二価ペプチドが担体ユニットに取り付けられ、全体として最終分子を形成する。例えばＨＥＳである担体分子には、数百（例えば５０〜１０００、好ましくは１５０〜８００、さらに好ましくは２５０〜７００）個のペプチドユニットをカップリングすることさえ可能であることに留意されたい。しかし、ＥＰＯミメティックペプチドをカップリングする場合は特に、図に示すように、はるかに少ないペプチドユニットをＨＥＳ分子に結合させてもよい。カップリングされるペプチドユニットの平均数は、そのペプチドおよび結合されるべき受容体に依存して、２〜１０００個、２〜５００個、２〜１００個、２〜５０個、好ましくは２〜２０個、最も好ましくは２〜１０個程度から選択することができる。
【０２６２】
簡単な生分解性超結合価分子の概念を図５に図解する。二つの連続的二価ペプチドが、中間切断位置を持つ生分解性リンカーを介して接合された二つの二官能性ＰＥＧ部分により、そのＮ末端で接合される。これらのリンカーは、大きなＰＥＧユニットをサブユニットに分解することを可能にし、結果として腎クリアランスを容易にする。
【０２６３】
超結合価作用に関係する利点は、極めて驚くべきものであり、予想外だった。最初は、高分子へのコンジュゲーションによって効力が低下するかもしれないと懸念された。この予想は、大きな分子では拡散速度が低下するので、結合速度には不利であると考えられたことに基づく。もう一つの予想は、担体に結合された数個のペプチドＡＰＩからは、その全てが受容体に結合することはできないだろうというものだった。その理由は、潜在的に、同時に結合した時の立体問題、または高分子担体の伸長部分が到達することのできる受容体の数が限られ、おそらくはペプチドＡＰＩの数よりも少ないからというものである。したがって、本発明の超結合価概念に見られるようなペプチドＡＰＩ（活性医薬成分）の力価の増加は、予想外だった。
【０２６４】
一方、高分子担体によって導入されうる著しい薬物動態変化により、ペプチド／担体複合体全体の半減期が延びたことに起因して、インビボ力価を改善させることができた。この現象は超結合価作用をインビボで決定することが困難になるという作用も持つ。というのも、それは別個に決定する必要がある薬力学的実体だからである。したがってインビトロアッセイは十分であるばかりでなく、超結合価作用を明確に実証する唯一有用な方法であるかもしれない。
【０２６５】
本発明に記載する超結合価作用は、ペプチドＡＰＩのモル量の比較（担体にコンジュゲートされたもの対コンジュゲートされていないもの）によって実証することができる。
【０２６６】
実験は、ＥＰＯ様活性のインビトロ決定に関する欧州薬局方の勧告どおり、標準ＴＦ−１細胞アッセイで行った（下記も参照されたい）。基本的には、さまざまな濃度のＥＰＯまたはＥＰＯミメティック物質の存在下でＴＦ−１細胞（その増殖はＥＰＯ様活性の存在に依存する）を培養する。その結果得られる細胞数を比色ＭＴＴアッセイおよび測光測定法を使って定量する。これらのデータに基づいて、与えられた各物質について規格化された用量応答関係を決定することができる。
【０２６７】
このアッセイでは、ＥＰＯと、ＥＰＯミメティック活性を持つ連続的二価ペプチドであるペプチドＡＧＥＭ４０（下記参照）とを使用した。
【０２６８】
ＡＧＥＭ４０は、非コンジュゲートペプチドとして、および高分子担体（この場合は平均分子量１３０ｋＤのヒドロキシエチルデンプン）にコンジュゲートされたペプチドとして、使用した。このコンジュゲートの構成単位サイズはほぼ４０ｋＤであり、これは平均的ＨＥＳ分子が約２〜５個、好ましくは２〜４個のペプチド部分を持つことを意味する。ＨＥＳ２００／０．５も使用することができる。１３０ｋＤ  ＨＥＳの修飾後は、約４個のペプチドがコンジュゲートされた。２００ｋＤの分子量を持つＨＥＳを使用した場合、全部で約５個のペプチドユニットがＨＥＳにコンジュゲートされることになる。
【０２６９】
図６に示す比較は、ペプチドがコンジュゲートされていても、コンジュゲートされていなくても、ペプチド濃度のモル比較に基づいている。予想に反して力価は増加しており（ＥＣ５０は減少しており、用量反応曲線は非コンジュゲートペプチドより左側に位置する）、それにより、高分子担体へのオリゴ結合価コンジュゲーションが持つ正の薬力学的影響を実証している。
【０２７０】
このように、本発明のコンジュゲーション概念は−予想される薬物動態の改善とは別に−総活性医薬成分の力価を明確に増加させる。
【０２７１】
これは、ＥＰＯ受容体を対象とするペプチドには間違いなく使用することができるが、潜在的には他の膜結合型薬理学的ターゲット、とりわけ他のサイトカイン受容体、例えばトロンボポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキンなどの受容体にも使用することができる新しい機序である。
【０２７２】
（実施例１）
Ｉ．単量体のペプチド合成
マニュアル合成
合成は、ＰＬ−Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（置換率０．４ｍｍｏｌ／ｇ）またはプレロード（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ）Ｗａｎｇ−Ｒｅｓｉｎを０．４ｍｍｏｌの規模で使用し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロウェーブシステム（ＣＥＭ）を使って行われる。Ｆｍｏｃ基の除去は、３０ｍｌのピペリジン／ＤＭＦ（１：３）を加え、１００Ｗで３×３０秒間照射することによって達成される。アミノ酸のカップリングは、カップリング添加剤であるＤＭＦ  ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の５倍過剰量のアミノ酸を加え、５０Ｗで５×３０秒間照射することによって達成される。全ての照射サイクル間に、氷浴の助けを借りて溶液を手作業で冷却する。脱保護およびカップリング後に、樹脂を３０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄する。最後のアミノ酸を脱保護した後、一部のペプチドについては、１．２６８ｍｌのキャッピング溶液（ＤＭＳＯ  １００ｍｌ中の無水酢酸４．７３ｍｌおよびＤＩＥＡ  ８．７３ｍｌ）と共に５分間インキュベートすることにより、アセチル化する。次に、切断に先だって、樹脂を３０ｍｌのＤＭＦで６回、３０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄する。粗ペプチドの切断は、不活性雰囲気下に５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間処理することによって達成される。この溶液を４０ｍｌの冷エーテル中に濾過する。沈殿物をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８１０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で精製する。
【０２７３】
自動合成
合成は、ＰＬ−Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（置換率０．４ｍｍｏｌ／ｇ）またはプレロードＷａｎｇ−Ｒｅｓｉｎを０．２５ｍｍｏｌ規模で使用し、Ｏｄｙｓｓｅｙマイクロウェーブシステム（ＣＥＭ）を使って行われる。Ｆｍｏｃ基の除去は、１０ｍｌのピペリジン／ＤＭＦ（１：３）を加え、１００Ｗで１０×１０秒間照射することによって達成される。アミノ酸のカップリングは、カップリング添加剤であるＤＭＦ  ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の５倍過剰量のアミノ酸を加え、５０Ｗで５×３０秒間照射することによって達成される。全ての照射サイクル間に、反応混合物を通して窒素をバブリングすることにより、溶液を冷却する。脱保護およびカップリング後に、樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄する。最後のアミノ酸を脱保護した後、一部のペプチドについては、０．７９３ｍｌのキャッピング溶液（ＤＭＳＯ  １００ｍｌ中の無水酢酸４．７３ｍｌおよびＤＩＥＡ  ８．７３ｍｌ）と共に５分間インキュベートすることにより、アセチル化する。次に、切断に先だって、樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回、１０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄する。粗ペプチドの切断は、不活性雰囲気下に５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間処理することによって達成される。この溶液を４０ｍｌの冷エーテル中に濾過し、沈殿物をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で精製する。
【０２７４】
精製
ペプチドは全てＮｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳ−システム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使って精製した。全てのペプチドの粗物質をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で精製した。流量は２０ｍｌ／分、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００とした。
【０２７５】
ＩＩ．分子内ジスルフィド架橋の形成
Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）による環化
溶液１：１０ｍｇのペプチドを０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルに溶解し、濃度が０．５ｍｇ／ｍｌに達するまで水で希釈する。重炭酸アンモニウム固体を加えてｐＨを約８にする。
溶液２：二つ目のバイアルにおいて、１０ｍｌの０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを１０ｍｌの水で希釈する。重炭酸アンモニウム固体をｐＨが８に達するまで加え、Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）］の０．１Ｍ溶液を１滴加える。
【０２７６】
溶液１および２を、アセトニトリル／水（１／１；ｐＨ＝８）の混合物に３時間かけて滴下する。その混合物を室温で終夜インキュベートし、混合物を濃縮し、ＬＣＭＳで精製する。
【０２７７】
ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂による環化
１００ｍｌのアセトニトリル／水（１／１；０．１％ＴＦＡ）に、重炭酸アンモニウム固体をｐＨが８に達するまで加える。アルゴンを３０分間バブリングすることによって、この溶液を脱気する。１０分後に１０ｍｇのペプチドを固体として加える。２時間インキュベートした後、その溶液を濾過し、濃縮し、ＬＣＭＳで精製する。
【０２７８】
環状ペプチドの精製
ペプチドは全てＮｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳシステム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使って精製した。全てのペプチドの粗物質をアセトニトリル／水（１／１）またはＤＭＳＯに溶解し、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８またはＣ８  １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で精製した。流量は２０ｍｌ／分、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００とした。
【０２７９】
分子内ジスルフィド架橋の形成に極めて適した他の技術は、参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２５２６に開示されている。
【０２８０】
ＩＩＩ．単量体を用いるインビトロアッセイ
ＢｒｄＵ取り込みによるＴＦ−１細胞を使った増殖アッセイ
対数増殖期のＴＦ−１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ；ＲＰＭＩ培地；２０％ウシ胎仔血清；ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを補足；０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３）を洗浄し（１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＩＬ３を欠くＲＰＭＩ完全培地に５００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁）、アッセイ開始前にＩＬ−３なしで２４時間、前培養する。翌日、通常は試験すべき薬剤に一つにつき少なくとも６個の濃度および少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含有する一濃度あたり４個のウェルを使って、細胞を２４穴または９６穴プレートに播種する。各実験には、陽性対照として組換えＥＰＯを含む対照と、陰性対照剤としてサイトカインを添加していないウェルが含まれる。ペプチドおよびＥＰＯ対照を培地に所望の濃度まで事前希釈し、それを細胞に加えて、標準培養条件下（３７℃、気相に５％二酸化炭素、水で飽和した雰囲気）で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この３日間の培養期間中のウェルにおける薬剤の最終濃度を指す。この培養期間の最後に、８ｎｇ／ｍｌ培養培地の最終濃度でＦｄＵを加え、培養を６時間続ける。次にＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）およびｄＣｄ（２−デオキシシチジン）をそれぞれの最終濃度（１０ｎｇ／ｍｌ  ＢｒｄＵ；８ｎｇ／ｍｌ  ｄＣＤ；培養培地中の最終濃度）になるように加え、培養をさらに２時間続ける。
【０２８１】
このインキュベーションおよび培養期間の最後に、細胞を、１．５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水中で１回洗浄し、最少量の液体に再懸濁する。この懸濁液から、細胞を−２０℃の７０％エタノールに滴下する。ここからは、細胞を氷上で１０分間インキュベートしてから直接分析するか、または分析前に４℃で保存することができる。
【０２８２】
分析に先だって、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を捨て、細胞を最少量の残存液に再懸濁する。次に細胞を懸濁し、０．５ｍｌの２Ｍ  ＨＣｌ／０．５％トリトンＸ−１００中で１０分間インキュベートする。次に、それを再びペレット化して最少量の残存液に再懸濁し、それを０．５ｍｌの０．１Ｎ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、ｐＨ８．５で希釈してから、直ちに細胞をペレット化する。最後に、細胞を４０μｌのリン酸緩衝食塩水（１．５％ＢＳＡ）に再懸濁し、それぞれ２０μｌの細胞懸濁液を含有する２本の反応チューブに分割する。一本のチューブには２μｌの抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ、クローンＢｕ２０ａ）を加え、もう一本のチューブには２μｌのｍＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を加えて、室温で３０分間のインキュベーション期間を開始する。次に、０．４ｍｌのリン酸緩衝食塩水および１０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（最終濃度）を加える。フローサイトメーターにおける分析は、４Ｃ細胞またはそれ以上の倍数性を持つ細胞の分率およびＢｒｄＵ陽性細胞の分率を指し、したがって細胞周期の関連ステージにある細胞の分率が決定される。
【０２８３】
ＭＴＴによるＴＦ−１細胞を使った増殖アッセイ
対数増殖期のＴＦ−１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ；ＲＰＭＩ培地；２０％ウシ胎仔血清；ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを補足；０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３）を洗浄し（１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＩＬ３を欠くＲＰＭＩ完全培地に５００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁）、アッセイ開始前にＩＬ−３なしで２４時間、前培養する。翌日、通常は試験すべき薬剤に一つにつき少なくとも６個の濃度および少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含有する一濃度あたり４個のウェルを使って、細胞を２４穴または９６穴プレートに播種する。各実験には、陽性対照として組換えＥＰＯを含む対照と、陰性対照剤としてサイトカインを添加していないウェルとが含まれる。ペプチドおよびＥＰＯ対照を培地に所望の濃度まで事前希釈し、それを細胞に加えて、標準培養条件下（３７℃、気相に５％二酸化炭素、水で飽和した雰囲気）で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この４日間の培養期間中のウェルにおける薬剤の最終濃度を指す。
【０２８４】
４日目に、分析の開始に先だって、既知数のＴＦ−１細胞の希釈系列を、いくつかのウェルに調製する（培地１００μｌ中に０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェル）。これらのウェルは試験ウェルと同じ方法で処理され、後に較正曲線を与える。細胞数はこの較正曲線から決定することができる。これらの参照ウェルを設定した上で、ＭＴＴ増殖キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ）のＭＴＳおよびＰＭＳを３７℃の水浴で融解し、１００μｌのＰＭＳ溶液を２ｍｌのＭＴＳ溶液に加える。この混合物２０μｌをアッセイプレートの各ウェルに加え、３７℃で３〜４時間インキュベートする。２５μｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウムを各ウェルに加えてから、ＥＬＩＳＡリーダーでＥ４９２を測定する。
【０２８５】
ＩＶ．二価  ＥＰＯミメティックペプチドユニットの合成
合成は、Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−Ｒｅｓｉｎ（置換率０．１９ｍｍｏｌ／ｇ）を０．２５ｍｍｏｌの規模で使用し、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロウェーブシステム（ＣＥＭ）を使って行われる。Ｆｍｏｃ基の除去は、１０ｍｌのピペリジン／ＤＭＦ（１：３）および５０Ｗで１０×１０秒間の照射による処理を二重に行うことによって達成される。アミノ酸のカップリングは、カップリング添加剤であるＤＭＦ  ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の４倍過剰量のアミノ酸および５０Ｗで５×３０秒間の照射による処理を二重に行うことによって達成される。全ての照射サイクル間に、反応混合物を通して窒素をバブリングすることにより、溶液を冷却する。脱保護およびカップリング後に、樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄する。二重カップリングサイクル後に、１０倍過剰量のＮ−（２−クロロベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＤＭＦ中の０．２Ｍ溶液）および５０Ｗで３×３０秒間の照射による処理を行うことによって、全ての未反応アミノ基をブロックする。最後のアミノ酸を脱保護した後、０．７９３ｍｌのキャッピング溶液（ＤＭＳＯ  １００ｍｌ中の無水酢酸４．７３ｍｌおよびＤＩＥＡ  ８．７３ｍｌ）と共に５分間インキュベートすることにより、ペプチドをアセチル化する。次に、切断に先だって、樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回、１０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄する。粗ペプチドの切断は、不活性雰囲気下に５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間処理することによって達成される。この溶液を４０ｍｌの冷エーテル中に濾過し、沈殿物をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で精製する。
【０２８６】
環化反応
３０ｍｇの線状ペプチドを６０ｍｌの溶液Ａに溶解する。この溶液および６０ｍｌのＤＭＳＯを６０ｍｌの溶液Ａに滴下する（添加の合計時間：３時間）。４８時間後に溶媒をエバポレーションによって除去し、残った残渣を３０ｍｌのＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解する。３０ｍｌの酢酸および１７ｍｇのヨウ素（ＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解したもの）を加え、その溶液を室温で９０分間混合する。その後、２０ｍｇのアスコルビン酸を加え、溶媒をエバポレーションによって除去する。その粗混合物をアセトニトリル／水（２／１）に溶解し、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で精製する。
溶液Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水（１／１）。重炭酸アンモニウムの添加によってｐＨを８．０に調節する。
精製スキーム：環状ペプチドの精製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ、５０分で５％→３５％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の勾配。
【０２８７】
Ｖ．ＥＰＯ活性を決定するためのインビトロ増殖アッセイ
対数増殖期のＴＦ−１細胞（２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３を含むＲＰＭＩ培地で成長させた２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ）を計数し、アッセイを行うのに必要な数の細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍで５分間）し、５％ＦＣＳを含みＩＬ−３を含まないＲＰＭＩに３０００００細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ＩＬ−３を含まないこの（飢餓）培地中で細胞を４８時間、前培養した。アッセイを開始する前に細胞を再び計数した。
【０２８８】
アッセイを開始する直前に、ペプチドおよびＥＰＯの原液を調製した。ペプチドを計量し、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに、１ｍＭ、４６７μＭまたは２００μＭの濃度になるまで溶解した。ＥＰＯ原液は１０ｎＭまたは２０ｎＭとした。これらの原液２９２μｌを９６穴培養プレートの１ウェルにピペッティングした。この場合、試験すべき各物質につき１枚のプレートを使用した。５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ２００μｌを各プレート中の他の１７個のウェルにピペッティングした。２００μｌの培地を含有するウェルには９２μｌの原液をピペッティングした。内容物を混合し、そのウェルから９２μｌを次のウェルに移し、以下同様にした。このようにして、連続する各ウェルでは濃度がその前のウェルにおける濃度の１：√１０になるように、各物質の希釈系列（１８希釈液）を調製した。各ウェルから３×５０μｌを３つの空ウェルに移した。このようにして、各濃度の物質を四重に測定した。各プレートの最も上の行と最も下の行は空のままであったことに留意されたい。
【０２８９】
前処理（飢餓）細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍで５分間）し、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに１ｍｌあたり２０００００細胞の濃度で再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液（１００００細胞を含有）を各ウェルに加えた。細胞の添加により、ウェル内の物質の最終濃度が元の希釈範囲の半分になったことに留意されたい。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０２９０】
評価を開始する前に、既知量のＴＦ−１細胞をある希釈範囲でウェル中に調製した：０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェルを四重にピペッティングした（１００μｌのＲＰＭＩ＋５％ＦＣＳ中）。
【０２９１】
１ウェルあたりの生細胞数を測定するために、調製済み（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）ＭＴＴ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｉｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を３７℃の水浴で融解した。１ウェルにつき２０μｌのＭＴＴ試薬を加え、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃でさらに１〜２時間インキュベートした。２５μｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え、プレートをＥＬＩＳＡリーダー（Ｇｅｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ）で測定した。データをスプレッドシート（Ｅｘｃｅｌ）で処理し、Ｇｒａｐｈｐａｄでプロットした。
【０２９２】
ＶＩ．拡大ペプチドアッセイ
拡大アッセイでは、数個のペプチド配列をそのＥＰＯミメティック活性について試験した。
【０２９３】
ペプチドは、ＬＩＰＳ−Ｖａｒｉｏシンセサイザーシステム上でペプチドアミドとして合成した。合成は特別なＭＴＰ合成プレートで行い、規模はペプチドあたり２μｍｏｌとした。合成はＨＯＢＴを活性化試薬として使用する標準Ｆｍｏｃプロトコールに従った。カップリングステップは４回カップリングとして行った。各カップリングステップは２５分を要し、１ステップあたりのアミノ酸の過剰倍率は２．８とした。ペプチドの切断および脱保護は、９０％ＴＦＡ、５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％ＤＤＴを含有する切断溶液で行った。樹脂に取り付けられた完成ペプチドを含有する合成プレートを９６穴深底プレートの上で保存した。５０μｌの切断溶液を各ウェルに加え、切断を１０分間行い、この手順を３回繰り返した。切断されたペプチドを、深底ウェルプレートへの重量流により、２００μｌの切断溶液で溶出させた。側鎖官能基の脱保護は、深底ウェルプレート内でさらに２．５時間行った。その後、ペプチドを氷冷エーテル／ヘキサンで沈殿させ、遠心分離した。ペプチドを中性水溶液に溶解し、環化反応を４℃で終夜インキュベートした。ペプチドを凍結乾燥した。
【０２９４】
合成され試験されたペプチド単量体の一部について、その概要を図７に示す。
【０２９５】
ペプチドをそのＥＰＯミメティック活性についてインビトロ増殖アッセイで試験した。アッセイはＶで説明したように行った。各アッセイ日に、３８試験ペプチド、１参照例、およびＥＰＯのインビトロ活性をパラレルに測定するために、４０枚のマイクロタイタープレートを用意した。ＥＰＯ原液は２０ｎＭだった。
【０２９６】
ＶＩＩ．ペプチドＨＥＳ−コンジュゲートの合成
基本反応スキームを図８に図示する。二量体型ペプチドを担体にカップリングするための代替戦略は、ＷＯ２００６／１３６４５０に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２９７】
ここに開示する方法の目的は、穏和な水性反応条件下でチオール基と選択的に反応するデンプンの誘導体（この実施例によればＨＥＳ）の製造である。この選択性はマレイミド基で達成される。
【０２９８】
ＨＥＳはまずアミノ基で官能化された後、各マレイミド誘導体に変換される。反応バッチからは限外濾過によって低分子量反応物が取り除かれる。生成物、中間体生成物ならびに遊離体は全て多分散性である。
【０２９９】
アミノ−ＨＥＳ（ＡＨＥＳ）の合成
ヒドロキシエチルデンプン（すなわちＨＥＳ１３０／０．４またはＨＥＳ２００／０．５）をダイアフィルトレーションとその後の凍結乾燥とによって取得した。それぞれ、平均分子量は約１３０ｋＤでモル置換度は０．４、２００ｋＤでＭＳ＝０．５だった。
【０３００】
合成は、Ｊａｃｏｂ  Ｐｉｅｈｌｅｒの博士論文「Ｍｏｄｉｆｉｚｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｏｂｅｒｆｌａｅｃｈｅｎ  ｆｕｅｒ  ｄｉｅ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｓｃｈｅ  ｕｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｓｃｈｅ  Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｒ  Ｅｒｋｅｎｎｕｎｇ  ｍｉｔ  ｏｐｔｉｓｃｈｅｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｎ」（１９９７、参照により本明細書に組み入れられる）にアミノデキストランについて説明されている合成に従って行った。Ｆｌｏｏｒら（１９８９）に記載されているように、過ヨウ素酸ナトリウムを使って、ジオール性ヒドロキシル基をアルデヒド基に選択的に部分酸化することにより、ＨＥＳを活性化した。そのアルデヒド基を、アンモニアの存在下にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｎａ［Ｂ（ＣＮ）Ｈ３］）で、還元的アミノ化を行うことによって、アミノ基に変換した（ＹａｌｐａｎｉおよびＢｒｏｏｋｓ、１９９５）。
【０３０１】
過ヨウ素酸開環
水中で過ヨウ素酸ナトリウムによる糖類中の１，２−ジオールの穏和な酸化を行うことにより、アルデヒド基が導入される。異なるモル濃度の酸化剤を使用することにより、利用可能なアンカー基の数を、したがって担体上のペプチド薬物の量を、制御することができる。このプロトコールを最適化するために、アルデヒドとのみ紫色の付加物を形成する試薬Ｐｕｒｐａｌｄを使って酸化を監視した。反応時間は８〜１８時間に短縮することができる。過ヨウ素酸塩の使用量は、グルコース構成単位の数の２０％に相当する（１８０ｇ／ｍｏｌのグルコース構成単位質量、ＤＳ＝０．４を適用）。後処理は限外濾過および凍結乾燥によって行った。各ポリマー生成物の精製は、さまざまな分子量カットオフのＰＥＳ膜を用いる限外濾過技法と、それに続く凍結乾燥によって行った。最適化されたＨＥＳ誘導体から、１００ｋＤより大きい分子質量範囲のみを使用した。
【０３０２】
アルデヒド分析
定性／半定量：利用可能なアルデヒド基のＰｕｒｐａｌｄ反応
塩化アンモニウムによる還元的アミノ化
以下のステップでは、導入されたアルデヒド基を、塩化アンモニウムの飽和溶液中、弱酸性のｐＨ値で、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使った還元的アミノ化によって、アミンに変換した。
【０３０３】
このプロトコールを最適化するために、出発物質のアルデヒド基をＰｕｒｐａｌｄ試薬で追跡し、形成されたアミンをＴＮＢＳで追跡した。これらの実験により、イミン中間体の形成は出発期間後は平衡にあり、添加された還元剤はアルデヒドよりもイミンに有利であることが示された。したがって最適な反応は、２４時間の総反応時間で、還元剤を数回添加することによって行われることを見出すことができた。
【０３０４】
生成物の沈殿およびダイアフィルトレーションまたは限外濾過によって後処理を行う。
【０３０５】
アミン分析
定性：ニンヒドリン反応（カイザー試験）
半定量：アミノデキストランとの比較で２，４，６−トリニトロベンゾールスルホン酸（ＴＮＢＳ）による。
達成された置換グレードは約２．８％だった。この結果から、一つのアミノ基を保持する一つの構成単位の分子量は、約６４００ｇ／ｍｏｌになる。
【０３０６】
マレイミドプロピオニル−アミノ−ヒドロキシエチルデンプン（「ＭａＩＰＡ−ＨＥＳ」）の合成
アミノ基の導入後に、アンカーマレイミド基をω−マレイミドアルキル（またはアリール）酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使って導入する。
【０３０７】
合成
ＨＥＳへのマレイミド基の最終的導入は、３−マレイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭａＩＰＡ−ＯＳｕ）を使って行われる。弱酸性緩衝液中で過剰量（５〜１０倍）を使用した場合、変換は定量的である（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７、２０％ＤＭＦ、終夜）。限外濾過および凍結乾燥した生成物を−１８℃で保存する。
【０３０８】
分析
アミノ基の反応はニンヒドリンおよびＴＮＢＳで検証した。導入されたマレイミド基の数は、グルタチオン（ＧＳＨ）の反応およびエルマン試薬６，６’−ジニトロ−３，３’−ジチオジ安息香酸（ＤＴＮＢ）による過剰なチオール基の検出、ならびに７００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ分光法によって証明される。
【０３０９】
達成された置換グレードは約２％だった。これはマレイミド構成単位あたり８５００ｇ／ｍｏｌ（１８０ｇ／ｍｏｌグルコース構成単位質量、ＭＳ＝０．４）に相当する。
【０３１０】
マレイミド修飾ＨＥＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、７００ＭＨｚ）を図９に示す。マレイミドプロトン（６．８ｐｐｍ）とアノマーＣ−Ｈ（４．８〜５．６ｐｐｍ）の比から、約６，９００ｇ／ｍｏｌという構成単位サイズが得られる（これに対し、ＧＳＨ／ＤＴＮＢ試験では７，３００ｇ／ｍｏｌになった）。
【０３１１】
マレイミド基の数、したがって構成単位サイズは、ＧＳＨによる飽和およびＤＴＮＢとの反応によって測定することができる。形成される黄色は著しく、容易に定量することができる。これらの値は、使用した出発物質、酸化ステップにおける過ヨウ素酸塩の量にそれぞれ依存して、５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の信頼できる構成単位サイズを与える。この方法は生成物の１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって確証された。ＮＭＲでは、マレイミド基の含量を、全アノマーＣ−Ｈシグナルとマレイミド環プロトンの比から定量することができる。
【０３１２】
以下の範囲が好ましい。
【０３１３】
【表２】
2009529509.tif 000051
表１：過ヨウ素酸酸化によって達成することができるＨＥＳ主鎖中のアンカー基の仮想構成単位サイズの例。
【０３１４】
ペプチド−ヒドロキシエチルデンプンコンジュゲート（Ｐｅｐ−ＡＨＥＳ）。
合成
遊離Ｎ末端（Ｐｅｐ−ＩＡ）またはビオチン化Ｎ末端（Ｐｅｐ−ＩＢ）を持っているシステイン含有ペプチドを使用した。Ｐｅｐ−ＩＡ／Ｂの４：１混合物を過剰（約６等量）に使用し、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）／ＤＭＦ  ８０：２０中のＭａｌＰＡ−ＨＥＳにより、一晩変換した。後処理は限外濾過および凍結乾燥によって行った。
【０３１５】
分析
ＵＶ吸収を２８０ｎｍで決定し、ＧＳＨ／ＤＴＮＢでマレイミド基の残存含量を決定した。ペプチド収量はほとんど定量的だった。検出可能な遊離のマレイミド基はほとんどなかった。
【０３１６】
ペプチド薬物のコンジュゲーションを行うために、ペプチドドメイン：
【０３１７】
【化７０】
2009529509.tif 000052
を使って、遊離のチオール基を導入することにより（例えばＮ末端にシステイン残基を導入することにより）、ペプチドユニットを作製する。例えば
【０３１８】
【化７１】
2009529509.tif 000053
では、１０〜５０％過剰量の脱保護されたペプチドを、弱酸性緩衝液中で１〜２時間コンジュゲートする。一方では、ＨＥＳ主鎖、マレイミド基およびジスルフィド架橋が安定であるように、また他方では、定量的変換が観察されるように、条件を最適化した。さまざまなマレイミド官能化ＨＥＳ化合物を使用することにより、インビトロで超結合価作用を示す超結合価ＥＰＯミメティックペプチドをいくつか合成した。以下にいくつかの例を挙げる。
【０３１９】
【表３】
2009529509.tif 000054
表２：異なるペプチド含量を持つＡＧＥＭ４０の超結合価ＥＰＯミメティックペプチドコンジュゲート
超結合価ＥＰＯミメティックペプチドコンジュゲートの容易な化学分析が二段階で実現した。まず最初に、ペプチドの含量をＨＥＳ主鎖の穏やかな加水分解後にＨＰＬＣで定量し、第二に、多糖の量を硫酸による完全加水分解後にフェノールを使った比色試験で測定した。
【０３２０】
超結合価ＥＰＯミメティックペプチドコンジュゲートＡＧＥＭ４０−ＡＨＥＳ  Ａ２のＴＦＡ／水加水分解のＨＰＬＣクロマトグラム（島津ＨＰＬＣ）を図１０に示す。一定時間後は全てのペプチド含有分子種のＵＶ吸光度が最大値において一定であり、遊離のペプチドと比較することにより、３７％というペプチド含量を算出することができる（理論値：３９％）。
【０３２１】
ＶＩＩＩ．さらなるインビトロ実験
以下の述べる実験の多くは既に上で説明した。しかし、以下の詳細により、ここに記載する試験および結果の全体像をつかむことができる。主としてヒト細胞培養および骨髄アッセイについて議論する。
【０３２２】
一つには、細胞株に基づく迅速なアッセイを使用し、最適化の初期段階の全体にわたって、最適化されたペプチド配列の力価をチェックした。これらの細胞培養アッセイは新しいペプチドまたは新しいバッチの効力の迅速試験として、依然として有効である。細胞株ＴＦ−１（ヒト細胞）に関して使用した二つのエンドポイントは増殖（ここでは通常、所定の時点における生細胞の数として決定した）およびＴＦ−１細胞における標識ヘモグロビン産生としての分化である。
【０３２３】
また、初代細胞（ヒト骨髄幹細胞）を使って、インビボ状況に極めて近いＣＦＵアッセイを行った。それらは、ペプチドユニットとしてＥＰＯミメティックペプチドを使用した場合に、はるかにインビボに近い形で、赤血球産生活性に対する応答を与える。しかしそれらは、細胞培養アッセイよりも操作が複雑になり、１アッセイあたりの所要時間も多くなる。
【０３２４】
ヒトＴＦ−１細胞を用いるアッセイ
ＴＦ−１は、ＩＬ３またはＥＰＯなどといった一定のサイトカインにだけ応答して増殖するヒト赤白血病細胞株である。また、ＴＦ−１細胞はＥＰＯに応答して赤血球表現型へと分化することができる。ＴＦ−１細胞はＤＳＭＺ（ドイツ・ブラウンシュワイク）から入手した。製品情報はＤＳＭＺウェブサイトｄｓｍｚ．ｄｅで入手することができる。ＴＦ−１は、ＥＰＯ活性評価用として、欧州薬局方によって勧告されている細胞株である。
【０３２５】
維持培養のための本発明者らの社内培養プロトコール：
培地：ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ＋ＡｍｐｈｏＢ＋Ｌ−Ｇｌｕｔ．＋２０％ＦＣＳ＋ｈ−ＩＬ−３
１．−５００ｍｌ  ＲＰＭＩ＋５ｍｌ  Ｐ／Ｓ＋５ｍｌ  ＡｍｐｈｏＢ
２．−２００ｍｌ  ＲＰＭＩ＋ＰＳ／ＡｍｐｈｏＢ＋２．５ｍｌ  Ｌ−グルタミン＋５０ｍｌ  ＦＣＳ＝完全培地（４℃１ヶ月）
３．−４５ｍｌ完全培地＋２２．５μｌ  ｈ−ＩＬ−３（４℃１週間）
培養：２００，０００〜１，０００，０００細胞／ｍｌに維持
・３日間の場合、２×１０５／ｍｌ
・２日間の場合、３×１０５／ｍｌ
・１日間の場合、５×１０５／ｍｌ。
【０３２６】
ＴＦ−１増殖アッセイの設計
ＴＦ−１増殖アッセイでは、マルチウェルプレートにＴＦ−１細胞を播種し、さまざまな濃度のＥＰＯまたはＥＰＯミメティックペプチド中で、数日間培養する。
【０３２７】
最適な結果を得るために、ＴＦ−１細胞は、アッセイの開始前に、サイトカインが何も存在しない（飢餓）状態で、２日間培養すべきである。アッセイ開始の３日後に、生細胞の数をアッセイすることにより、細胞増殖を間接的に測定する。
【０３２８】
ＭＴＳと呼ばれるテトラゾリウム試薬を加える。これは還元されると有色のホルマザンになる。この反応はＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに依存し、言い換えるとミトコンドリア活性に依存する。ホルマザンの量は分光光度法で測定される。ある範囲の既知細胞数を使って較正を行うことにより、各条件下で存在する生細胞の絶対数を決定することができる。主要設計を図１１にも図解する。
【０３２９】
このアッセイにおける一定の薬剤の活性は、
１．その薬剤が、一定の濃度で生細胞数の増加を引き起こすかどうかを評価すること、および
２．その薬剤が半値（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ）作用を発揮する濃度を決定すること（ＥＣ５０の決定）
によって決定される。
【０３３０】
ＴＦ−１増殖アッセイの結果
一般論として、このアッセイでは、全てのＥＰＯミメティックペプチド（ＥＭＰ１および上述の修飾ペプチド）がその単量体型では部分アゴニストとして挙動したことに言及する必要がある。すなわち最大応答はＥＰＯで見られる応答よりも弱い。それでもなお、このアッセイを使って、規格化されたプロットにおける右／左シフトを決定することができ、したがって最適化の結果を決定することができる。二量体化した場合は、アゴニスト活性はかなり増加することがわかっているので、特にそうであると言える。
【０３３１】
最初のグラフはこの作用を規格化なしの絶対的応答で表している。他のグラフは全て規格化されたプロットを示し、その曲線からは、ＥＣ５０値を決定することができる。
【０３３２】
これらのアッセイでは、以下の二つの基準物質を使用した：
１）ＥＭＰ１、既知のＥＰＯミメティック特性を持つ公表されたペプチド配列（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７）
２）組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈの製品Ｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａエポエチンα（ドイツにおける商標：Ｅｒｙｐｏ（登録商標））として、薬局で購入した。
【０３３３】
これらの物質のプロットを黒い線（ＥＰＯについては実線、ＥＭＰ１については点線）で示す。
【０３３４】
プロリン修飾ＥＰＯミメティックペプチドを次の図に示す。これらの修飾ペプチドは以下の配列を示す：
１）ＢＢ４９
【０３３５】
【化７２】
2009529509.tif 000055
はＥＭＰ１と同じ範囲の効力および力価を示す。
２）ＢＢ６８
【０３３６】
【化７３】
2009529509.tif 000056
は、ＥＭＰ１およびＢＢ４９よりもさらに有効である。
３）ＡＧＥＭ４０
【０３３７】
【化７４】
2009529509.tif 000057
これは、改善された特徴を示すＢＢ６８の配列に基づいて設計された二価連続ペプチドである。
４）ＡＧＥＭ４０＿ＨＥＳ、これは、本発明の超結合価原理に従ってＨＥＳ化された、改良型の著しく有効かつ強力なペプチド（ＡＧＥＭ４０）である。
【０３３８】
これらの配列は、なかんずく、超結合価原理の利益を例証するための例として使用した。
【０３３９】
図１２は、ＥＰＯと比較した単量体型ＥＰＯミメティックペプチドの結果を表す。図１２にはこのアッセイにおけるペプチド全般とＥＰＯの間の絶対的相違を実証する実際の吸光度データのプロットが含まれる。
【０３４０】
図１３は、あてはめを行った規格化プロットから算出されるＥＣ５０値を示す。
【０３４１】
図１４は、ＢＢ４９と比較して改善されたＢＢ６８の作用を示す。本発明に従ってペプチドユニットを作製するための構成単位として最適化されたＢＢ６８を使用すると、作用がさらに二桁改善された。このことは、図１４およびそれに対応する図１５の表で実証されている。
【０３４２】
次に、二量体型ペプチドユニットを、最適化された密度で高分子担体ＨＥＳにカップリングした。その結果得られたＡＰＩは、モル比較でＥＰＯと少なくとも等力であり、質量比較でＥＰＯに極めて近い（後述の図１６および図１７参照）。
【０３４３】
図１６ならびに前記の図および表は、超結合価概念の強い潜在能力を明確に証明している。細胞培養アッセイで達成することができる正確度を考慮すると、達成されたＡＰＩはインビトロでＥＰＯと少なくとも等力である。したがってこれは、超結合価概念を使用しない既知のどのＥＰＯミメティックペプチドＡＰＩよりも優れている。
【０３４４】
骨髄アッセイ
骨髄は、自己再生能およびあらゆるタイプの血球へと発生する潜在能力を持つ造血幹細胞を含有している。また骨髄は、一つまたはいくつかの血球系統へと発生することができる分化拘束された前駆細胞を含有している。それらの前駆細胞のうち一部は赤血球へと発生する（赤血球前駆細胞）。
【０３４５】
前駆細胞は、メチルセルロースに基づく半固形培地に骨髄細胞を播種することによって証明することができる。適当なサイトカインカクテルの存在下で、前駆細胞は増殖し、分化して、ある一定の系統の細胞のコロニーを与える。骨髄系前駆細胞は顆粒球コロニー（ＣＦＵ−Ｇ由来）、単球コロニー（ＣＦＵ−Ｍ由来）、または混合顆粒球単球コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ由来）へと発生する。赤血球前駆細胞は赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ／ｒｅｄ  ｃｅｌｌ）のコロニーへと発生する。赤血球コロニーのサイズに応じて、前駆細胞はＢＦＵ−Ｅ（２００細胞以上のコロニーを与える）またはＣＦＵ−Ｅ（２００細胞未満のコロニーを与える）と呼ばれる。分化拘束の初期段階にある前駆細胞は、混合顆粒球−赤血球−単球−巨核球コロニーへと発生することができる。これらの初期前駆細胞はＣＦＵ−ＧＥＭＭと呼ばれる。
【０３４６】
ＥＰＯは、一定の異なるサイトカインが同様に存在する場合に、ＢＦＵ−ＥまたはＣＦＵ−Ｅからの赤血球コロニーの発生を刺激する。ＥＰＯなしでは赤血球コロニーは発生することができない。したがってメチルセルロースにおける骨髄細胞の均一バッチからの赤血球コロニーの成長はＥＰＯ活性の尺度である。
【０３４７】
上述のプロセスは、インビボで骨髄において起こるプロセスと、同一ではないとしても極めて似ているので、これらはＥＰＯ様活性の優れた予測因子である。
【０３４８】
骨髄アッセイの設計
ヒト骨髄細胞（Ｃｒｙｏｓｙｓｔｅｍｓから市販、血清学的検査を受けたもの）をクライオバイアルから融解し、サイトカイン（ただしＥＰＯを除く）のバックグラウンドが与えられたメチルセルロース培地に、固定された細胞密度で播種する。ＥＰＯまたはＥＰＯミメティックペプチドをさまざまな濃度で加える。培養物を３７℃で１２〜１４日間インキュベートする。次に骨髄コロニーおよび赤血球コロニーの数を顕微鏡検査によって数え上げる。
【０３４９】
骨髄アッセイのエンドポイント：
１．前提：ＥＰＯなしの培養物は骨髄（白）コロニーしか与えず、赤血球（赤）コロニーを与えてはならない。ＥＰＯを含む培養物は赤血球コロニーの濃度依存的増加および赤血球コロニーサイズの濃度依存的増加をもたらすべきである。
２．ペプチドは、それが赤血球コロニーの濃度依存的増加および赤血球コロニーサイズの濃度依存的増加を引き起こすのであれば、ＥＰＯミメティック活性を示す。しかしペプチドは得られる骨髄コロニーの数とは干渉してはならない。
【０３５０】
骨髄アッセイの結果
上述のプロリン修飾ＥＰＯミメティックペプチドは骨髄コロニーの形成を刺激しなかったが、赤色コロニーの形成には著しい活性を示した。これを、培養プレートの写真として図１８に定性的に示し、コロニーの集計を図１９に記載する。
【０３５１】
ＩＸ．抗体交差反応性アッセイ
本願の序論で述べたように、患者はｒｈｕＥＰＯに対する抗体を発生させる場合がある。これは序論で述べた重大な帰結につながる。
【０３５２】
本発明のペプチドの性質をさらに調べるために、これらのペプチドが抗ＥＰＯ抗体と実際に交差反応するかどうか分析した。
【０３５３】
試験には抗ＥＰＯ抗体を含有するウサギおよびヒト血清を使用した。これらの血清をＥＰＯか、または以下のＥＰＯミメティックペプチドで前処理した。
【０３５４】
【化７５】
2009529509.tif 000058
Ａｃ＝アセチル化されたＮ末端
Ａｍ＝アミド化されたＣ末端
１ｎａｌ＝１−ナフチルアラニン。
【０３５５】
この分析ではさまざまな濃度のエリスロポエチンおよびＥＰＯミメティックペプチドを使用した。血清中に存在する抗ＥＰＯ抗体を吸着するために血清を試験物質で前処理した後、血清を放射標識エリスロポエチンで処理した。前吸着ステップ後に血清に残存している抗体はこのエリスロポエチンによって結合され、再び免疫沈降される。この試験に使用するプロトコールは、参照により本明細書に組み入れられるＴａｃｅｙら、２００３に記述されている。
【０３５６】
ＥＰＯまたは本発明のＥＰＯミメティックペプチドを使って抗ＥＰＯ抗体含有血清で行った前吸着の結果を、図２０に開示する。
【０３５７】
血清をＥＰＯミメティックペプチドで前処理した場合、その後、放射標識エリスロポエチンと接触させた時に、血清は陽性の検査結果を示した。このように、前処理にもかかわらず、血清には抗ＥＰＯ抗体が検出された。これは、ＥＰＯミメティックペプチドが前処理時に抗ＥＰＯ抗体に結合できなかったことを意味する。結合活性が存在しない場合、抗ＥＰＯ抗体はＥＰＯミメティックペプチドと共に血清から除去されず、したがって血清中に残った。抗ＥＰＯ抗体はＥＰＯミメティックペプチドを認識することができず、したがってＥＰＯミメティックペプチドに結合することができなかった。
【０３５８】
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈｕＥＰＯ）を対照として使用した。血清をエリスロポエチンで前処理した場合は、放射標識エリスロポエチンを組み込んだその後のアッセイにおいて検出可能な抗体はほとんどなかった。エリスロポエチンを使った前処理によって抗体は既に結合され、除去されているからである。
【０３５９】
図２０に記載の数値は、使用した総カウント数に対するＩＰ中の％ｃｐｍを表す。％ｃｐｍ値が＞０．９である場合に、血清は陽性と評価される。１００％ｃｐｍは、総使用カウント（放射性トレーサー）、ここでは放射標識ＥＰＯを表す。
【０３６０】
このアッセイは、本発明のＥＰＯミメティックペプチドが、有利なことに、抗ＥＰＯ抗体に対して交差反応性を示さないことを証明している。したがって、本明細書に記載するＥＰＯミメティックペプチドは、ｒｈｕＥＰＯに対する抗体を発生させた患者でさえ、治療作用を示すはずである。さらにまた、ＥＰＯミメティックペプチドに対する抗体はエリスロポエチンを結合しないはずであると予想される。したがって本発明のＥＰＯミメティックペプチドは、好ましくは、それらが抗ＥＰＯ抗体と有意な交差反応性を示さないことも特徴とする。
【０３６１】
Ｘ．霊長類における効力
本発明のＥＰＯミメティックペプチドの効力は、７頭の非ナイーブサル（カニクイザル）を使って試験を行う動物試験でも証明された。試験ペプチドはＡＧＥＭ４００ＨＥＳ（上記参照）であり、これを、リンゲル液に溶解した凍結乾燥粉末として使用した。０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量を試験した（静脈内投与）。動物実験により、ＥＰＯミメティックペプチドは低用量でも良好なＥＰＯミメティック作用を示し、長時間持続する作用を持つことが示された。また、毒性の徴候は観察されなかった。
【０３６２】
参考文献：
【０３６３】
【表４】
2009529509.tif 000059
【図面の簡単な説明】
【０３６４】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【図３】図３である。
【図４】図４である。
【図５】図５である。
【図６】図６である。
【図７−１】図７−１である。
【図７−２】図７−２である。
【図７−３】図７−３である。
【図７−４】図７−４である。
【図７−５】図７−５である。
【図７−６】図７−６である。
【図７−７】図７−７である。
【図７−８】図７−８である。
【図７−９】図７−９である。
【図８−１】図８−１である。
【図８−２】図８−２である。
【図９】図９である。
【図１０】図１０である。
【図１１】図１１である。
【図１２−１】図１２−１である。
【図１２−２】図１２−２である。
【図１３】図１３である。
【図１４−１】図１４−１である。
【図１４−２】図１４−２である。
【図１５】図１５である。
【図１６−１】図１６−１である。
【図１６−２】図１６−２である。
【図１７】図１７である。
【図１８】図１８である。
【図１９】図１９である。
【図２０】図２０である。
【図２１−１】図２１−１である。
【図２１−２】図２１−２である。
【図２１−３】図２１−３である。
【図２１−４】図２１−４である。
【図２１−５】図２１−５である。
【図２１−６】図２１−６である。
【図２１−７】図２１−７である。
【図２１−８】図２１−８である。
【図２１−９】図２１−９である。
【図２１−１０】図２１−１０である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
2009529509.tif 000123
【図２１−１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月15日(2009.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009529509000001.app
【国際調査報告】
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2009529509.tif 000127
2009529509.tif 000128
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