(57)【要約】  本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼの部位特異的阻害剤としての構造式Ｉの化合物であって、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ又は‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨ又は‐ＯＡｃである化合物、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉａの化合物を単離する方法、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＡｃである構造式Ｉｂの化合物を製剤する方法、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉｃの化合物を製剤する方法、並びに、癌及び／又は疾患の状態を管理する薬剤の製造のための、構造式Ｉの化合物のそれを必要とする対象における使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンメチルトランスフェラーゼの部位特異的阻害剤としての下記の構造式Ｉの化合物であって、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ又は‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨ又は‐ＯＡｃである化合物。
【化１】
2009542626.tif 000008
【請求項２】
前記化合物はザクロから単離される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼはアルギニンメチルトランスフェラーゼ、好ましくはＣＡＲＭ１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである下記の構造式Ｉａの化合物を単離する方法であって、
（ａ）乾燥及び粉砕の手法でザクロの皮を得る工程と、
（ｂ）粉砕された前記皮を攪拌した後、沈殿物をろ過して半固体状の抽出物としてのろ液を収集する工程と、
（ｃ）カラムに前記半固体状の抽出物を入れて、粗生成物を適切な溶媒系により溶出する工程と、
（ｄ）粗生成物を精製して、前記構造式Ｉａの化合物を含む留分を得る工程と、
を有する方法。
【化２】
2009542626.tif 000009
【請求項５】
前記溶媒系はメタノール：水系である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＡｃである下記の構造式Ｉｂの化合物を製剤する方法であって、
（ａ）前記構造式Ｉａの化合物、無水酢酸及び硫酸を含む反応混合物を攪拌する工程と、
（ｂ）前記反応混合物の温度を上昇させて反応質量が得られるまで攪拌を続ける工程と、
（ｃ）前記反応質量をろ過し、沈殿物を洗浄して残留物を得る工程と、
（ｄ）前記残留物を乾燥及び加水分解して前記構造式Ｉｂの化合物を含む沈殿物を得る工程と、
を有する方法。
【化３】
2009542626.tif 000010
【請求項７】
前記温度はおよそ摂氏１００度から徐々に上昇させられる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記沈殿物は洗浄されて未反応無水酢酸が除去される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記沈殿物は有機溶媒、好ましくはアセトンにより洗浄される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記残留物はピリジン水により加水分解される、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１及びＲ１が‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである下記の構造式Ｉｃの化合物を製剤する方法であって、
（ａ）前記構造式Ｉａの化合物及び水酸化カリウムのメタノール溶液の反応混合物を還流させる工程と、
（ｂ）前記還流反応混合物を冷却して反応質量を得て、有機生成物を得るために酸性化させる工程と、
（ｃ）ジクロロメタンにより前記有機生成物を抽出して前記構造式Ｉｃの化合物を得る工程と、
を有する方法。
【化４】
2009542626.tif 000011
【請求項１２】
癌及び／又は疾患の状態を管理する薬剤の製造のための、構造式Ｉの化合物のそれを必要とする対象における使用。
【請求項１３】
前記化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害剤である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼはアルギニンメチルトランスフェラーゼ、好ましくはＣＡＲＭ１である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記化合物の阻害作用の性質は非競合的である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物は生来、抗増殖性かつ抗血管新生のものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
前記化合物は、ｐ５３応答性遺伝子の転写活性を調整する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１８】
前記対象は人間を含む動物である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
添付の実施例及び図面を参照して実質的にここに記載される、構造式Ｉの化合物、構造式Ｉａの化合物を単離する方法、構造式Ｉｂ及びＩｃの化合物を製剤する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は小分子調整因子の分野に関する。より詳しくは、本発明は、抗癌及び抗ＨＩＶ治療学を発展させる鉛化合物としての機能を果たしうるヒストン変性エンザイムに関する。これらの分子はインビボのＨＭＴａｓｅの機能を調査にも役立ちうる。
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼの部位特異的阻害剤としての化合物及びその製剤方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核性ゲノムは非常に動的なクロマチン構造に詰め込まれていて、その単位はヌクレオソームであり、１４６ｂｐのＤＮＡが巻き付いた４つの異なる核ヒストン８量体から構成されている。核ヒストンの尾部の翻訳後修飾、すなわち可逆性アセチル化、メチル化、リン酸化反応等は、細胞におけるＤＮＡをテンプレートとした異なる減少において次々に重要な役割を果たす、クロマチンの動的構造機能組織に著しく寄与する。これらの組み換えのうち、ヒストンメチル化及びその細胞機能への最近の重点的な取り組みにより、興味深い広域スペクトルが得られている。ＨＭＴａｓｅが重要な役割を果たす種々の疾患には、まず癌が挙げられ、続いて心疾患、ウイルス病原と、硬化症が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の主要な目的は、ヒストンメチルトランスフェラーゼの部位特異的阻害剤としての構造式Ｉの化合物を得ることである。
【０００４】
本発明の他の主要な目的は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ又は‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨ又は‐ＯＡｃである構造式Ｉの化合物を得ることである。
【０００５】
本発明の他の目的は、アルギニンメチルトランスフェラーゼ、好ましくはＣＡＲＭ１の部位特異的阻害剤としての構造式Ｉの化合物を得ることである。
【０００６】
本発明の更なる他の目的は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉａの化合物を単離する方法を得ることである。
【０００７】
本発明の更なる他の目的は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＡｃである構造式Ｉｂの化合物を製剤する方法を得ることである。
【０００８】
本発明の更なる他の目的は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉｃの化合物を製剤する方法を得ることである。
【０００９】
本発明の更なる他の目的は、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）のポリヒドロキシ誘導体を合成することである。
【００１０】
本発明の更なる他の目的は、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）のより効率的かつ非毒性の誘導体を合成することである。
【００１１】
本発明の更なる他の目的は、ヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害剤である化合物を合成することである。
【００１２】
本発明の更なる他の目的は、抗癌剤又は抗ＨＩＶ剤として機能する化合物を開発することである。
【００１３】
本発明の更なる他の目的は、細胞機能におけるＲＭＴａｓｅの役割を理解することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼの部位特異的阻害剤としての構造式Ｉの化合物であって、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ又は‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨ又は‐ＯＡｃである化合物、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉａの化合物を単離する方法、（ａ）乾燥及び粉砕の手法でザクロの皮を得る工程、（ｂ）粉砕された皮を攪拌した後、沈殿物をろ過して半固体状の抽出物としてのろ液を収集する工程、（ｃ）カラムに半固体状の抽出物を入れて、粗生成物を適切な溶媒系により溶出する工程、及び（ｄ）粗生成物を精製して、構造式Ｉａの化合物を含む留分を得る工程を有する方法、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＡｃである構造式Ｉｂの化合物を製剤する方法、（ａ）構造式Ｉａの化合物、無水酢酸及び硫酸を含む反応混合物を攪拌する工程、（ｂ）反応混合物の温度を上昇させて反応質量が得られるまで攪拌を続ける工程、（ｃ）反応質量をろ過し、沈殿物を洗浄して残留物を得る工程、及び（ｄ）残留物を乾燥及び加水分解して構造式Ｉｂの化合物を含む沈殿物を得る工程を有する方法、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉｃの化合物を製剤する方法、（ａ）構造式Ｉａの化合物及び水酸化カリウムのメタノール溶液の反応混合物を還流させる工程、（ｂ）還流反応混合物を冷却して反応質量を得て、有機生成物を得るために酸性化させる工程、及び（ｃ）ジクロロメタンにより有機生成物を抽出して構造式Ｉｃの化合物を得る工程を有する方法、並びに、それを必要とする対象における癌及び／又は疾患の状態を管理する薬剤の製造のための構造式Ｉの化合物の使用に関する。
【００１５】
【化１】
2009542626.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】図１ａは、ヒストン変性エンザイムにおけるＬＴＫ２０の効果（フィルタ結合アッセイ）である。
【図１ｂ】図１ｂは、ヒストン変性エンザイムにおけるＬＴＫ２０の効果（透視撮影法）である。
【図２】図２は、ＬＴＫ２０によるヒストンＨ３の結合等温線である。
【図３ａ】図３ａは、ＣＡＲＭ１媒介メチル化の選択的阻害である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＣＡＲＭ１媒介メチル化の選択的阻害である。
【図３ｃ】図３ｃは、ＬＴＫ２０処理されたＨｅＬａ細胞の免疫蛍光分析である。
【図３ｄ】図３ｄは、ＬＴＫ２０処理されたＨｅＬａ細胞の免疫蛍光分析である。
【図４】図４は、ｐ２１抗体によるイムノブロット解析である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼの部位特異的阻害剤としての構造式Ｉの化合物であって、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ又は‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨ又は‐ＯＡｃである化合物に関する。
【００１８】
【化２】
2009542626.tif 000003
【００１９】
本発明の他の実施形態では、前記化合物はザクロから単離される。
【００２０】
本発明の更に他の実施形態では、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼはアルギニンメチルトランスフェラーゼ、好ましくはＣＡＲＭ１である。
【００２１】
また、本発明は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉａの化合物を単離する方法であって、（ａ）乾燥及び粉砕の手法でザクロの皮を得る工程、（ｂ）粉砕された皮を攪拌した後、沈殿物をろ過して半固体状の抽出物としてのろ液を収集する工程、（ｃ）カラムに半固体状の抽出物を入れて、粗生成物を適切な溶媒系により溶出する工程、及び（ｄ）粗生成物を精製して、構造式Ｉａの化合物を含む留分を得る工程を有する方法に関する。
【００２２】
【化３】
2009542626.tif 000004
【００２３】
本発明の更に他の実施形態では、前記溶媒系はメタノール：水系である。
【００２４】
また、本発明は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＣＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＡｃである構造式Ｉｂの化合物を製剤する方法であって、（ａ）構造式Ｉａの化合物、無水酢酸及び硫酸を含む反応混合物を攪拌する工程、（ｂ）反応混合物の温度を上昇させて反応質量が得られるまで攪拌を続ける工程、（ｃ）反応質量をろ過し、沈殿物を洗浄して残留物を得る工程、及び（ｄ）残留物を乾燥及び加水分解して構造式Ｉｂの化合物を含む沈殿物を得る工程を有する方法に関する。
【００２５】
【化４】
2009542626.tif 000005
【００２６】
本発明の更に他の実施形態では、前記温度はおよそ摂氏１００度から徐々に上昇する。
【００２７】
本発明の更に他の実施形態では、前記沈殿物から洗浄により未反応無水酢酸が除去される。
【００２８】
本発明の更に他の実施形態では、前記沈殿物は有機溶媒、好ましくはアセトンにより洗浄される。
【００２９】
本発明の更に他の実施形態では、前記残留物はピリジン水により加水分解される。
【００３０】
また、本発明は、Ｒ１及びＲ１が‐ＯＨ、Ｒ２及びＲ２が‐ＯＨである構造式Ｉｃの化合物を製剤する方法であって、（ａ）構造式Ｉａの化合物及び水酸化カリウムのメタノール溶液の反応混合物を還流させる工程、（ｂ）還流反応混合物を冷却して反応質量を得て、有機生成物を得るために酸性化させる工程、及び（ｃ）ジクロロメタンにより有機生成物を抽出して構造式Ｉｃの化合物を得る工程を有する方法に関する。
【００３１】
【化５】
2009542626.tif 000006
【００３２】
また、本発明は、それを必要とする対象における癌及び／又は病状を管理する薬剤の製造のための構造式Ｉの化合物の使用に関する。
【００３３】
本発明の更に他の実施形態では、前記化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害剤である。
【００３４】
本発明の更に他の実施形態では、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼはアルギニンメチルトランスフェラーゼ、好ましくはＣＡＲＭ１である。
【００３５】
本発明の更に他の実施形態では、前記化合物の阻害作用の性質は非競合的である。
【００３６】
本発明の更に他の実施形態では、前記化合物は生来、抗増殖性かつ抗血管新生のものである。
【００３７】
本発明の更に他の実施形態では、前記化合物は、ｐ５３応答性遺伝子の転写活性を調整する。
【００３８】
本発明の更に他の実施形態では、前記対象は人間を含む動物である。
【００３９】
図１ａは、ヒストン変性エンザイムにおけるＬＴＫ２０の効果（フィルタ結合アッセイ）である。ＬＴＫ２０のフィルタ結合アッセイは、ヒストン  アセチルトランスフェラーゼ  ｐ３００、ＰＣＡＦ及びヒストン  メチルトランスフェラーゼ  ＣＡＲＭ１，Ｇ９ａにより実行された。レーン１はヒストンのみ、レーン２はエンザイム制御、レーン３はＤＭＳＯ制御、レーン４〜５は増加する濃度中のＬＴＫ２０である。ＬＴＫ２０はＣＡＲＭ１活性を阻害するが、他のエンザイムには機能しない。
【００４０】
図１ｂは、ヒストン変性エンザイムにおけるＬＴＫ２０の効果（透視撮影法）である。ＬＴＫ２０のゲルアッセイは、ヒストン  アセチルトランスフェラーゼ  ｐ３００、ＰＣＡＦ及びヒストン  メチルトランスフェラーゼ  ＣＡＲＭ１，Ｇ９ａにより実行された。レーン１はヒストンのみ、レーン２はエンザイム制御、レーン３はＤＭＳＯ制御、レーン４〜５は増加する濃度中のＬＴＫ２０である。ＬＴＫ２０はＣＡＲＭ１活性を阻害するが、他のエンザイムには機能しない。
【００４１】
図２は、ＬＴＫ２０によるヒストンＨ３の結合等温線である。等温線熱量滴定は、タンパク質ヒストンＨ３及び阻害剤であるリガンドＬＴＫ２０により実行された。結合等温線は、２つの連続的結合部位モデルに適合する。
【００４２】
図３ａ及び３ｂは、ＣＡＲＭ１媒介メチル化の選択的阻害である。ヒストンＨ３のアルギニンメチル化の部位特異的阻害は、インビトロ及びインビボの双方において、ＬＴＫ２０の存在下で観察された。Ｈ３Ｒ１７及びＨ３Ｒ２６は共にヒストンＨ３のＣＡＲＭ１メチル化部位である。他の部位がメチル化されたのに対し、Ｈ３Ｒ１７のメチル化は阻害剤ＬＴＫ２０の存在下で阻害された。
【００４３】
図３ｃ及び３ｄは、ＬＴＫ２０処理されたＨｅＬａ細胞の免疫蛍光分析である。
【００４４】
図４は、ｐ２１抗体によるイムノブロット解析である。ＵＶが照射されたＵ２ＯＳ細胞が阻害剤により又は阻害剤を用いずに処理された。ｐ２１に対する抗体により溶解物が精査された。ｐ２１レベルは、ＤＭＳＯ制御と比較して、ＬＴＫ２０の存在下で増加した。
【００４５】
本発明は、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）化合物のポリヒドロキシ誘導体に関する。
【００４６】
また、本発明は、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）化合物のポリヒドロキシ誘導体の製剤方法に関する。
【００４７】
更に、本発明は、それを必要とする対象において、癌、心臓肥大、エイズ（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む群から選択される病状を治療する方法であって、医薬的に有効な量の（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）化合物のポリヒドロキシ誘導体を投与する工程を含む方法に関する。
【００４８】
我々は腫瘍抑制機能に影響を及ぼすＨＭＴａｓｅの阻害剤についてレポートする。この阻害剤は、２０μｍのＩＣ５０でアルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＲＭＴａｓｅ）に非常に特効があったが、リジンメチルトランスフェラーゼＧ９ａには最小の効果しかなかった。特に、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００及びＰＣＡＦには効果がなかった。この阻害剤は、１００μｍの濃度でインビボでも活性だった。我々の研究は、この阻害剤が、３つの既知のＣＡＲＭ１メチル化部位のうちの１つにより特効を有する可能性を示す。したがって、この阻害剤及びその誘導体は、多くの疾患のための重要な鉛化合物であることがわかる。なお、ＲＭＴａｓｅ阻害剤は強力な抗増殖剤及び抗血管新生化合物である。更に、この化合物は癌細胞に対して毒性を有するが、通常の細胞には影響を及ぼさないことがわかっている。この化合物及びその誘導体は、細胞機能におけるＲＭＴａｓｅの役割を理解するための生物学的調査として有用である。特に、我々は、天然源から単離された化合物が化学合成品よりも効能があることを発見した。
【００４９】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明される。しかしながら、これらの実施例は発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５０】
実施例１：ザクロからの（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）の精製
【００５１】
ザクロは洗浄され、余分なものが取り除かれて、種及び果汁から皮が単離された。皮は日光で乾燥され、ミキサーで粉砕された。ザクロ皮粉（２５０グラム）は、磁気攪拌棒を備えた４ネック１リットルフラスコに入れられ、１リットルの水を加えた後２４時間攪拌された。沈殿物はブフナー漏斗を用いてろ過され、収集されたろ過物は完全に蒸留されて半固体状の褐色の化合物が得られた。この半固体状の抽出物は１０個に分けられた。２つは、溶剤系としての水：メタノールと共に、１８０〜２００ｍｅｓｈのシリカゲルカラムに加えられた。カラムは、シュガリー淡黄色溶出液の色が明らかになるまで、蒸留水により流出された。粗生成物は２：１  メタノール：水系により溶出された。このメタノール及び水は、回転蒸発により完全に蒸留された。
【００５２】
セファデックスＬＨ２０による粗生成物の精製
セファデックスＬＨ２０カラムは、水：メタノール（８：２）系により予め平衡化された。粗生成物（３グラム）がカラムに加えられた。カラムはメタノールの量を増やすことにより溶出された。異なる留分が収集され、ＴＬＣ上にスポットされた。同様の留分は結合された。５つの異なる留分が収集され、留分Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅと名付けられた。留分Ａは、ヒストンメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１に対する阻害活性を有する分子として特徴づけられた。
【００５３】
実施例２：（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）の誘導体化
【００５４】
（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）が、磁気攪拌棒、オイルバス及びサーモポケットを備えた３ネックフラスコに入れられて、無水酢酸（３ｍｌ）が加えられ、硫酸が滴下された。反応混合物は１０分攪拌され、温度は摂氏１００度から徐々に上げられ、１時間攪拌された。反応質量は摂氏２０〜２５度まで冷却されて、ろ過された。沈殿物は１０ｍｌのアセトンで洗浄され、未反応無水酢酸が除去された。残留物は乾燥され、摂氏１１５度で一時的に加熱することにより２ｍｌのピリジン‐水で加水分解された。反応混合物を冷却した後、沈殿物は収集され、５００ｍｌの水及び３ｍｌのアセトンで洗浄されて乾燥させられた。これはＲ２‐ＯＡｃが得られる誘電体を与えた。
【００５５】
（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）（１グラム）が、磁気攪拌棒及びオイルバスを１００ｍｃネックフラスコに入れられて、水酸化物カリウムのメタノール溶液（５Ｍ）（２０ｍｌ）を追加した。反応物は８〜１０時間還流された。反応物は室温で冷却された。メタノールは完全に蒸留され、反応質量は２Ｎ  ＨＣＩ溶液で酸化された。有機生成物はジクロロメタンにより抽出され、完全に除去されて乾燥させられた。これは親化合物のＲ１‐ＯＨ誘導体を与えた。
【００５６】
一般式：Ｒ１‐ＯＣＨ（ＬＴＫ２０），‐ＯＨ（ＬＴＫ５４）  Ｒ２‐ＯＨ（ＬＴＫ２０），ＯＡｃ（ＬＴＫ５１）のとき、Ｃ１４Ｈ１８Ｏ４Ｒ１Ｒ２
【化６】
2009542626.tif 000007
Ｌ‐Ｌｉｎｇｕ及びＴＫ‐Ｔａｐａｓ  Ｋｕｎｄｕに対する指定ＬＹＫストランドである。ＬＴＫ２０は親化合物（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）であり、したがって、一般的構造によればＲ１，Ｒ１‐ＯＣＨ及びＲ２及びＲ２‐ＯＨが与えられる。
【００５７】
実施例３：（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）及びその誘電体のインビトロ特性
【００５８】
―ＣＡＲＭ１／Ｇ９ａ／ｐ３００／ＰＣＡＦに対する（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）のフィルタ結合
（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）分子の阻害活性が、標準ＨＡＴアッセイ及びＨＭＴａｓｅアッセイに従い、基質としてのＨｅＬａコアヒストンを用いて、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００及びＰＣＡＦ、リジンメチルトランスフェラーゼＧ９ａ、アルギニンメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１について検査された。（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）は、フィルタ結合（図１ａ）及びＸ線蛍光撮影（図１ｂ）の双方により、２０μＭのＩＣ５０でアルギニンメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１に対して効能を有することが確認された。
【００５９】
―ＣＡＲＭ１／Ｇ９ａに対するＬＴＫ５１及びＬＴＫ５４（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）フィルタ結合アッセイ
誘電体ＬＴＫ５１及びＬＴＫ５４の阻害活性が、標準ＨＭＴａｓｅアッセイに従って、基質としてのＨｅＬａコアヒストンを用いて、リジンメチルトランスファーゼＧ９ａ及びアルギニンメチルトランスファーゼＣＡＲＭ１についてアッセイされた。Ｒ１‐ＯＨ及びＲ２‐ＯＡｃグループを含む誘導体は活性でないことがわかり、Ｒ１‐ＯＣＨ及びＲ２‐ＯＨグループは阻害活性に極めて重要であることが示された。
【００６０】
実施例４：
阻害パターンの動態解析
阻害剤は、ヒストンＨ３を対象とするヒストンのＣＡＲＭ１媒介メチル化に効能を有するため、ヒストンＨ３は動態解析の基質として用いられた。初めに、阻害剤は、基質として組み換え型ヒストンを用いて確認された。ＣＡＲＭ１メチル化反応は、ヒストンＨ３及びメチルグループドナーの濃度の増加を用いて実行され、トリチウム化したＳＡＭがエンザイムの濃度を一定に保った。２つの異なる阻害剤濃度がアッセイされた。動態解析は、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）媒介ＣＡＲＭ１メチル化阻害が非競合的であることを明らかにした。
【００６１】
ＩＴＣ実験による基質結合データ
阻害パターンが非競合的であることは、阻害モードがエンザイム‐基質複合体を介することを示し、阻害剤の結合は、基質（ヒストンＨ３）又はエンザイム（ＣＡＲＭ１）のいずれかが細胞に取り込まれて阻害剤（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）に対して滴定される、等温線熱量滴定によって特徴づけられている。データは、分子のエンザイムへの結合はなく、分子は２つの連続する結合部位において基質に結合することを明確に示している（図２）。
【００６２】
ウエスタン分析により示される部位特異的阻害
インビトロＣＡＲＭ１メチル化反応は、阻害剤の存在下又は不存在下で実行され、ヒストンＨ１３，Ｒ１７及びＲ２６の特定ＣＡＲＭ１メチル化部位に対する抗体によって調査された。Ｈ３Ｒ１７の部位特異的阻害が観察され、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）が新たな部位特異的阻害剤であることを示した（図３ａ）。
【００６３】
実施例５：（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）インビボ特性の細胞効果
【００６４】
ウエスタン分析により示される部位特異的阻害
インビボ特性解析は、ＨｅＬａ細胞を５０μＭ濃度の分子で２４時間処理することによって実行され、酸抽出ヒストンは、ヒストンＨ３，Ｒ１７及びＲ２６のＣＡＲＭ１メチル化部位に対する抗体を用いて調査された。Ｈ３Ｒ１７の部位特異的阻害が観察され、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）は、インビボ環境においても新たな部位特異的阻害剤であることを示した（図３ｂ）。
【００６５】
免疫蛍光分析により示される部位特異的阻害
インビボ特性解析は、ＨｅＬａ細胞を、５０μＭ濃度の分子で２４時間処理することによって実行され、細胞は、ヒストンＨ３，Ｒ１７及びＲ２６のＣＡＲＭ１メチル化部位に対する抗体を用いて調査され、抗ウサギ４８８蛍光標識抗体により視覚化された。Ｈ３Ｒ１７の部位特異的阻害が観察され、（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）は、インビボ環境においても新たな部位特異的阻害剤であることを示した（図３ｃ及び３ｄ）。
【００６６】
実施例６：
ウエスタン分析によるＵ２ＯＳ細胞におけるｐ５３及びｐ２１タンパク質レベルの調整
ＣＡＲＭ１媒介ヒストンメチル化は、ｐ５３反応遺伝子の転写活性を共同して増進することが知られているため、阻害剤の生理的効果はｐ５３系の選択により特徴づけられる。（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）の抗酸化特性により、発光酵素レポーターアッセイは機能しなかった。ｐ５３陽性細胞系であるＵ２ＯＳがアッセイに使用され、５０μＭ濃度の分子による２４時間の処理において、ｐ５３レベルは変化した。したがって、ｐ５３反応遺伝子はアッセイされなければならないので、Ｐ２１が選択された（アポトーシスはないので、アポトーシス遺伝子は選択されなかった）。ＵＶ照射細胞は（２，３，７，８‐テトラヒドロキシ[１]  ベンゾピラノ  （５，４，３（ｄｅ）[１]ベンゾピラン５，１０‐ジオン）により２４時間処理され、溶解物がｐ２１に対する抗体を用いて調べられた。処理されるｐ２１レベルに増加がある（図４）。これはこの分子が腫瘍抑制遺伝子ｐ５３媒介転写活性に関与する可能性を明らかに示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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