(57)【要約】本開示は、高い親和力でCD70に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。本開示の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および本開示の抗体を発現させるための方法もまた、提供される。本開示の抗体を含む、免疫複合体、二重特異性分子、および薬学的組成物もまた、提供される。本開示はまた、癌、自己免疫疾患、炎症、およびウイルス感染症を治療するための方法も提供する。2009509510.tif 000004
2009509510.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトCD70に結合し、かつ、
(b)腎細胞癌腫瘍細胞株に結合する、
単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２】
IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプの完全長抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
抗体断片または単鎖抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
5.5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
3×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項６】
2×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項７】
内部移行される、請求項1記載の抗体。
【請求項８】
腎細胞癌腫瘍細胞株が、786-O細胞株、A-498細胞株、ACHN細胞株、Caki-1細胞株、およびCaki-2細胞株からなる群より選択される、請求項1記載の抗体。
【請求項９】
B細胞腫瘍細胞株に結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項１０】
B細胞腫瘍細胞株が、Daudi細胞株、HuT78細胞株、Raji細胞株、およびGranta519細胞株からなる群より選択される、請求項9記載の抗体。
【請求項１１】
フコース残基を欠く、請求項1記載の抗体。
【請求項１２】
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
該抗体が、CD70に結合する際に参照抗体と交差競合し、
該参照抗体が、
(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトCD70に結合し、かつ、
(b)腎細胞癌腫瘍細胞株に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
参照抗体が以下を含む、請求項12記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１４】
参照抗体が以下を含む、請求項12記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１５】
参照抗体が以下を含む、請求項12記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１６】
参照抗体が以下を含む、請求項12記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１７】
B細胞腫瘍細胞株に結合する、請求項12記載の抗体。
【請求項１８】
B細胞腫瘍細胞株が、Daudi細胞株、HuT78細胞株、Raji細胞株、およびGranta519細胞株からなる群より選択される、請求項17記載の抗体。
【請求項１９】
ヒトVH3-30.3遺伝子もしくはヒトVH3-33遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
ヒトVKL6遺伝子、ヒトVKL18遺伝子、もしくはヒトVKL15遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
ヒトVH3-30.3遺伝子もしくはヒトVH3-33遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する重鎖可変領域をさらに含む、請求項17記載の単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：9を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：21を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：25を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２３】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：10を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：22を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２４】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：23を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２５】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：24を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２６】
以下を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２７】
以下を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２８】
以下を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２９】
以下を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３１】
治療物質に連結された請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
【請求項３２】
請求項31記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３３】
治療物質がサイトトキシンである、請求項31記載の免疫複合体。
【請求項３４】
請求項33記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３５】
治療物質が放射性同位体である、請求項31記載の免疫複合体。
【請求項３６】
請求項35記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３７】
請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３８】
請求項37記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３９】
請求項38記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
抗CD70抗体を調製するための方法であって、
請求項39記載の宿主細胞中で該抗体を発現させる段階、および該宿主細胞から該抗体を単離する段階を含む方法。
【請求項４１】
CD70を発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防する方法であって、
該疾患を治療または予防するのに有効な量の、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法。
【請求項４２】
疾患が癌である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
癌が、腎細胞癌(RCC)、明細胞RCC、グリア芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小型切れ込み核細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心芽細胞性/中心細胞性(cb/cc)濾胞性リンパ腫癌、B細胞性びまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症(AILD)様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔リンパ腫、胎児性癌、上咽頭の未分化癌、シュミンケ腫瘍、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
癌が腎細胞癌である、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
癌がリンパ腫である、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
抗体がフコース残基を欠いている、請求項41記載の抗体。
【請求項４７】
治療を必要とする対象において自己免疫疾患を治療する方法であって、
請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分の治療的有効量を該対象に投与し、それによって、該自己免疫疾患の症状を改善する段階を含む方法。
【請求項４８】
自己免疫疾患が狼瘡である、請求項47記載の抗体。
【請求項４９】
自己免疫疾患を発症するリスクがある対象において自己免疫疾患を予防する方法であって、
請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与し、それによって、該自己免疫疾患の症状の発生を予防するか、または減少させる段階を含む方法。
【請求項５０】
治療を必要とする対象において炎症を治療する方法であって、
請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分の治療的有効量を該対象に投与し、それによって、該炎症を改善する段階を含む方法。
【請求項５１】
フコース残基を欠いている、請求項50記載の抗体。
【請求項５２】
治療を必要とする対象においてウイルス感染症を治療する方法であって、
請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分の治療的有効量を該対象に投与し、それによって、該ウイルス感染症の症状を改善する段階を含む方法。
【請求項５３】
ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、肝炎(A、B、およびC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、およびCMV、エプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス(cornovirus)、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルス、ならびにリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)からなるウイルス群より選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法において使用するための、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５５】
腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬品を調製するための、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項５６】
自己免疫疾患の症状を改善する方法において使用するための、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５７】
自己免疫疾患の症状を改善するための医薬品を調製するための、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項５８】
ウイルス感染症の症状を改善する方法において使用するための、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５９】
ウイルス感染症の症状を改善するための医薬品を調製するための、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づき、先出願日の恩典が本明細書において主張される、2005年9月26日に出願された米国特許仮出願第60/720,600号、2005年10月13日に出願された米国特許仮出願第60/726,695号、および2005年12月8日に出願された米国特許仮出願第60/748,827号の恩典を主張し、これらすべての内容全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
背景
サイトカイン受容体CD27は、細胞の増殖および分化、ならびにアポトーシスまたはプログラム細胞死においてある役割を果たす、腫瘍壊死因子受容体(TFNR)スーパーファミリーのメンバーである。CD27に対するリガンドはCD70であり、これは、腫瘍壊死因子ファミリーのリガンドに属する。CD70は、20アミノ酸の親水性N末端ドメイン、および潜在的なN結合型グリコシル化部位2つを含むC末端ドメインを有する、193アミノ酸のポリペプチドである(Goodwin, R.G. et al. (1993) Cell 73 ：447-56（非特許文献1）; Bowman et al. (1994) Immunol 152：1756-61（非特許文献2）)。これらの特徴に基づき、CD70は、細胞外C末端部分を有するII型膜貫通型タンパク質であると決定された。
【０００３】
CD70は、活性化されたTリンパ球およびBリンパ球ならびに樹状細胞上で一過性に見出されるが、休止中のTリンパ球およびBリンパ球ならびに樹状細胞上では見出されない(Hintzen et al. (1994) J. Immunol. 152：1762-1773（非特許文献3）; Oshima et al. (1998) Int. Immunol. 10：517-26（非特許文献4）; Tesselaar et al. (2003) J. Immunol. 170：33-40（非特許文献5）)。正常細胞での発現の他に、CD70発現は、腎細胞癌、転移性乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、および上咽頭癌を含む様々なタイプの癌において報告されている(Junker et al. (2005) J Urol. 173：2150-3（非特許文献6）; Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164：315-23（非特許文献7）; Held-FeindtおよびMentlein (2002) Int J Cancer 98：352-6（非特許文献8）; Hishima et al. (2000) Am J Surg Pathol. 24：742-6（非特許文献9）; Lens et al. (1999) Br J Haematol. 106：491-503（非特許文献10）)。さらに、CD70は、おそらくは、薬物誘発性かつ特発性の狼瘡をもたらす、DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤またはERK経路阻害剤で処理したT細胞上でも過剰発現されることが見出されている(Oelke et al. (2004) Arthritis Rheum. 50：1850-60（非特許文献11）)。CD70とCD27の相互作用はまた、細胞媒介性自己免疫疾患およびTNF-α 産生の阻害においてある役割を果たしていることも提唱されている(Nakajima et al. (2000) J.Neuroimmunol. 109：188-96（非特許文献12）)。
【０００４】
したがって、CD70は、癌、自己免疫障害、およびCD70発現を特徴とする様々な他の疾患を治療するための価値ある標的となる。
【０００５】
【非特許文献１】Goodwin, R.G. et al. (1993) Cell 73 ：447-56
【非特許文献２】Bowman et al. (1994) Immunol 152：1756-61
【非特許文献３】Hintzen et al. (1994) J. Immunol. 152：1762-1773
【非特許文献４】Oshima et al. (1998) Int. Immunol. 10：517-26
【非特許文献５】Tesselaar et al. (2003) J. Immunol. 170：33-40
【非特許文献６】Junker et al. (2005) J Urol. 173：2150-3
【非特許文献７】Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164：315-23
【非特許文献８】Held-FeindtおよびMentlein (2002) Int J Cancer 98：352-6
【非特許文献９】Hishima et al. (2000) Am J Surg Pathol. 24：742-6
【非特許文献１０】Lens et al. (1999) Br J Haematol. 106：491-503
【非特許文献１１】Oelke et al. (2004) Arthritis Rheum. 50：1850-60
【非特許文献１２】Nakajima et al. (2000) J.Neuroimmunol. 109：188-96
【発明の開示】
【０００６】
概要
本開示は、CD70に結合し、かつ多数の望ましい特性を示す、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性には、ヒトCD70に結合する高親和性が含まれる。また、本開示の抗体および組成物を用いて、CD70の媒介による様々な疾患を治療するための方法も提供される。
【０００７】
1つの局面において、本開示は、(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトCD70に結合し、かつ、(b)腎細胞癌腫瘍細胞株に結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。
【０００８】
好ましくは、抗体は、786-O(ATCCアクセッション番号CRL-1932)、A-498(ATCCアクセッション番号HTB-44)、ACHN(ATCCアクセッション番号CRL-1611)、Caki-1(ATCCアクセッション番号HTB-46)、およびCaki-2(ATCCアクセッション番号HTB-47)からなる群より選択される腎細胞癌腫瘍細胞株に結合する。
【０００９】
好ましくは、抗体はヒト抗体であるが、代替の態様において、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体でもよい。
【００１０】
より好ましい態様において、抗体は、5.5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合するか、または、3×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合するか、または、2×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合するか、または、1.5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合する。
【００１１】
別の態様において、抗体は、786-O腎細胞癌腫瘍細胞上で発現されているCD70に結合した後、それらの細胞によって内在化される。
【００１２】
別の態様において、抗体は、B細胞腫瘍細胞株に結合する。好ましくは、B細胞腫瘍細胞株は、Daudi(ATCCアクセッション番号CCL-213)、HuT78(ATCCアクセッション番号TIB-161)、Raji(ATCCアクセッション番号CCL-86)、およびGranta-519(DSMZアクセッション番号342)からなる群より選択される。
【００１３】
別の態様において、本開示は、CD70に結合する際に参照抗体と交差競合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この参照抗体は、(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトCD70に結合し、かつ、(b)腎細胞癌腫瘍細胞株に結合する。
【００１４】
様々な態様において、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１５】
1つの局面において、本開示は、ヒトVH3-30.3遺伝子の産物であるか、またはヒトVH3-30.3遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。本開示はまた、ヒトVH3-33遺伝子の産物であるか、またはヒトVH3-33遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供する。本開示はまた、ヒトVH4-61遺伝子の産物であるか、またはヒトVH4-61遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供する。本開示はさらにまた、ヒトVKL6遺伝子の産物であるか、またはヒトVKL6遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供する。本開示はさらにまた、ヒトVKL18遺伝子の産物であるか、またはヒトVKL18遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供する。本開示はさらに、ヒトVKL15遺伝子の産物であるか、またはヒトVKL15遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供する。
【００１６】
好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１７】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１８】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１９】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２０】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２１】
本開示の他の好ましい抗体、またはそれらの抗原結合部分は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２２】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２３】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２４】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２５】
別の好ましい組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２６】
本開示の抗体は、例えば完全長抗体、例えばアイソタイプIgG1またはIgG4のものでもよい。あるいは、これらの抗体は、Fab断片もしくはFab'2断片などの抗体断片、または単鎖抗体でもよい。
【００２７】
本開示はまた、サイトトキシンまたは放射性同位体などの治療物質に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。本開示はまた、本開示の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能的部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
【００２８】
本開示の抗体もしくはその抗原結合部分、または免疫複合体もしくは二重特異性分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた、提供される。
【００２９】
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにそのような核酸を含む発現ベクター、そのような発現ベクターを含む宿主細胞、および、そのような宿主細胞を用いて抗CD70抗体を作製するための方法もまた、本開示に包含される。さらに、本開示は、本開示の抗体を発現する、ヒト免疫グロブリンの重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、ならびに、本開示の抗体を産生する、そのようなマウスから調製されるハイブリドーマも提供する。
【００３０】
さらに別の局面において、本開示は、CD70を発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防する方法であって、その疾患を治療または予防するのに有効な量の、本開示の抗CD70ヒト抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。疾患は、癌、例えば、腎細胞癌腫癌またはリンパ腫でもよい。
【００３１】
さらに別の局面において、本開示は、自己免疫障害を治療する方法であって、自己免疫障害を治療するのに有効な量の、本開示の抗CD70ヒト抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【００３２】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになると考えられるが、これらは限定的なものとして解釈されるべきではない。本出願を通して引用されるすべての参考文献、Genbank登録番号、特許、および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【００３３】
詳細な説明
本開示は、高い親和力でCD70に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の態様において、本開示の抗体は、特定の重鎖生殖系列配列および軽鎖生殖系列配列に由来し、かつ/または、特定のアミノ酸配列を含むCDR領域のような特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離された抗体、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫複合体、または二重特異性分子を含む薬学的組成物を提供する。本開示はまた、癌のような疾患を治療するための方法のような、これらの抗体を使用する方法にも関する。
【００３４】
本開示をより容易に理解できるようにするために、いくつかの用語を定義する。その他の定義は、詳細な説明を通して説明する。
【００３５】
「シグナルトランスダクション経路」とは、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達においてある役割を果たす様々なシグナルトランスダクション分子間の生化学的関係を意味する。本明細書において使用される場合、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナルを受け取ること、およびそのようなシグナルを細胞の形質膜を通過して伝達することができる分子および分子の複合体を含む。本開示の「細胞表面受容体」の例は、CD70受容体である。
【００３６】
本明細書において言及される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはその単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結されている少なくとも2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3種のドメイン、すなわちCH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、すなわちCLから構成される。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域と共に散在している、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的な補体系の第1成分(C1q)を含む、宿主細胞または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３７】
抗体(または「抗体部分」)の「抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される場合、ある抗原(例えばCD70)に特異的に結合する能力を保持している、抗体の1つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、(i)Fab断片、すなわち、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる単価の断片;(ii)F(ab')2断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)ヒンジ領域の一部分を含む本質的にFabであるFab'断片(Fundamental Immunology (Paul編、第3版、1993)を参照されたい);(iv)VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片;(v)抗体の単一の腕のVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片;(vi)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341：544-546);ならびに(vii)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインであるVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされているが、VL領域およびVH領域が対になって単価の分子(単鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Bird et al. (1988) Science 242：423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883を参照されたい)を形成している単一のタンパク質鎖としてそれらを作製するのを可能にする合成リンカーにより、組換え法を用いて、これらを連結することができる。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知である従来の技術を用いて得られ、かつこれらの断片は、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
【００３８】
「単離された抗体」とは、本明細書において使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味すると意図される(例えば、CD70に特異的に結合する単離された抗体は、CD70以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、CD70に特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するCD70分子のような他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。特定の態様において、単離された抗体は、ヒトCD70に特異的に結合し、かつ、他の非ヒトCD70抗原と交差反応しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および/または化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００３９】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書において使用される場合、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４０】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むと意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合は、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、天然の修飾または合成の修飾を含む修飾を後で含んでもよい。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異)を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上にグラフティングされている抗体を含むとは意図されない。
【００４１】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。1つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００４２】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるか、もしくは染色体導入された動物(例えばマウス)、またはそれから調製されるハイブリドーマ(下記に詳述する)から単離された抗体、(b)ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体、(c)組換えヒト抗体コンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、および(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列への接合を含む他の任意の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべてのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の態様において、このような組換えヒト抗体は、インビトロの変異誘発(または、ヒトIg配列に関してトランスジェニックな動物が使用される場合は、インビボの体細胞変異誘発)に供されてよく、したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し、かつ関係しているが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子にコードされる抗体クラス(例えば、IgMまたはIgG1)を意味する。
【００４４】
「ある抗原を認識する抗体」および「ある抗原に特異的な抗体」という語句は、「ある抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に本明細書において使用される。
【００４５】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の改変型、例えば、その抗体と別の作用物質または抗体との結合体を意味する。
【００４６】
「ヒト化抗体」という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上にグラフティングされている抗体を意味すると意図される。さらなるフレームワーク領域の改変を、ヒトフレームワーク配列内に起こしてもよい。
【００４７】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、かつ定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体のような、可変領域配列がある種に由来し、かつ定常領域配列が別の種に由来する抗体を意味すると意図される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「ヒトCD70に特異的に結合する」抗体は、5×10-8Mもしくはそれ以下、より好ましくは1×10-8Mもしくはそれ以下、より好ましくは6×10-9Mもしくはそれ以下、より好ましくは3×10-9Mもしくはそれ以下、さらにより好ましくは2×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合する抗体を意味すると意図される。
【００４９】
「Kassoc」または「Ka」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度を意味すると意図されるのに対し、「Kdis」または「Kd」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を意味すると意図される。「KD」という用語は、本明細書において使用される場合、Kaに対するKdの比率(すなわちKd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される、解離定数を意味すると意図される。抗体のKD値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いること、好ましくはBiacore(登録商標)システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによる。
【００５０】
本明細書において使用される場合、IgG抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対するKDが10-7Mもしくはそれ以下、より好ましくは10-8Mもしくはそれ以下、より好ましくは10-9Mもしくはそれ以下、およびさらにより好ましくは10-10Mもしくはそれ以下である抗体を意味する。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対しては異なり得る。例えば、IgMアイソタイプに対する「高親和性」結合とは、KDが10-7Mもしくはそれ以下、より好ましくは10-8Mもしくはそれ以下、さらにより好ましくは10-9Mもしくはそれ以下である抗体を意味する。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、魚類、爬虫類などの、哺乳動物および非哺乳動物を含む。
【００５２】
本開示の様々な局面を、以下の小節においてより詳細に説明する。
【００５３】
抗CD70抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性を特徴とする。例えば、これらの抗体は、ヒトCD70に特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高親和性で、例えば、5×10-7Mもしくはそれ以下、さらにより好ましくは5.5×10-9Mもしくはそれ以下、さらにより好ましくは3×10-9Mもしくはそれ以下、さらにより好ましくは2×10-9Mもしくはそれ以下、または、さらにより好ましくは1.5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでCD70に結合する。例えば、ELISA、ウェスタンブロット、およびRIAを含む、CD70に対する抗体の結合能力を評価するための標準的アッセイ法は、当技術分野において公知である。適切なアッセイ法は、実施例において詳細に説明される。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)もまた、ELISA、スキャッチャード解析、およびBiacore解析によってなど、当技術分野において公知の標準的アッセイ法によって評価することができる。別の例として、本開示の抗体は、腎癌腫瘍細胞株、例えば、786-O細胞株、A-498細胞株、ACHN細胞株、Caki-1細胞株、またはCaki-2細胞株に結合し得る。さらに別の例として、本開示の抗体は、B細胞腫瘍細胞株、例えば、Daudi細胞株、HuT78細胞株、Raji細胞株、またはGranta-519細胞株に結合し得る。
【００５４】
モノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7
本開示の例示的な抗体には、実施例1および実施例2で説明されるように単離され、かつ構造的に特徴付けられる、ヒトモノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7が含まれる。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVHアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVLアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10において示される。
【００５５】
これらの各抗体はCD70に結合できる場合には、VH配列およびVL配列を「混合およびマッチさせて」、本開示の他の抗CD70結合分子を作製することができる。このような「混合およびマッチさせた」抗体のCD70結合は、前述および実施例で説明する結合アッセイ法(例えば、FACSまたはELISA)を用いて試験することができる。好ましくは、VH鎖およびVL鎖が混合およびマッチされる場合、個々のVH/VLペアに由来するVH配列は、構造的に類似したVH配列で置換される。同様に、好ましくは、個々のVH/VLペアに由来するVL配列は、構造的に類似したVL配列で置換される。
【００５６】
したがって、1つの局面において、本開示は、以下を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;ならびに、
(b) SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００５７】
好ましい重鎖および軽鎖の組合せには、以下のものが含まれる：
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００５８】
別の局面において、本開示は、2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7の重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3、またはそれらの組合せを含む抗体を提供する。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVH CDR1のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVH CDR2のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVH CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVk CDR1のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVk CDR2のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVk CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40において示される。CDR領域には、Kabatシステム(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を用いて、線を引いている。
【００５９】
これらの各抗体はCD70に結合でき、かつ、抗原結合特異性は、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域によって主として提供される場合には、VHのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列、ならびにVkのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を「混合およびマッチさせて」(すなわち、異なる抗体に由来するCDRを混合およびマッチさせることができる。ただし、各抗体は、VHのCDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにVkのCDR1、CDR2、およびCDR3を含んでいなければならない)、本開示の他の抗CD70結合分子を作製することができる。このような「混合およびマッチさせた」抗体のCD70結合は、前述および実施例で説明する結合アッセイ法(例えば、FACS、ELISA、Biacore解析)を用いて試験することができる。好ましくは、VHCDR配列が混合およびマッチされる場合、個々のVH配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列は、構造的に類似したCDR配列で置換される。同様に、VkCDR配列が混合およびマッチされる場合、個々のVk配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列は、好ましくは、構造的に類似したCDR配列で置換される。1つまたは複数のVHCDR領域配列および/またはVLCDR領域配列を、モノクローナル抗体である抗体2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7に関して本明細書において開示するCDR配列に由来する構造的に類似した配列で置換することにより、新規なVH配列および/またはVL配列を作製できることは、当業者には容易に明らかになると考えられる。
【００６０】
したがって、別の局面において、本開示は、以下を含む、CD70、好ましくはヒトCD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
(a)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のCDR1;
(b)SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のCDR2;
(c)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のCDR3;
(d)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のCDR1;
(e)SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のCDR2;ならびに、
(f)SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のCDR3。
【００６１】
好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６２】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６３】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６４】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６５】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６６】
CDR3ドメインは、CDR1ドメインおよび/またはCDR2ドメインから独立して、同系の抗原に対する抗体の結合特異性を単独で決定できること、ならびに共通のCDR3配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体を予想されるように作製できることは、当技術分野において周知である。例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2)：252-260(2000)(マウスの抗CD30抗体Ki-4の重鎖可変ドメインCDR3のみを用いた、ヒト化抗CD30抗体の作製を記載している); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296：833-849(2000)(マウスMOC-31抗EGP-2親抗体の重鎖CDR3配列のみを用いた、上皮糖タンパク質-2(EGP-2)組換え抗体を記載している);Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95：8910-8915(1998)(マウスの抗インテグリンαvβ3抗体LM609の重鎖および軽鎖の可変CDR3ドメインを用いたヒト化抗インテグリンαvβ3抗体のパネルであって、各抗体メンバーが、CDR3ドメインの外側であり、かつマウス親抗体と同じくらい高いか、またはそれより高い親和性で、マウス親抗体と同じエピトープに結合することができる、独特な配列を含む、パネルを記載している);Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116：2161-2162(1994)(CDR3ドメインが、最も顕著に抗原結合に寄与することを開示している);Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92：2529-2533(1995)(ヒト胎盤DNAに対する3種のFab(SI-1、SI-40、およびSI-32)の重鎖CDR3配列を、抗破傷風トキソイドFabの重鎖にグラフティングし、それにより、既存の重鎖CDR3を置換することを記載し、かつ、CDR3ドメインが単独で結合特異性を与えたことを実証している);ならびにDitzel et al., J. Immunol. 157：739-749(1996)(グラフティング研究を記載しており、これは多特異性の親Fab LNA3の重鎖CDR3のみを、単特異性のIgG破傷風トキソイド結合Fab p313抗体の重鎖に導入することは、親Fabの結合特異性を保持するのに十分であった)。これらの各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物に由来する抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含み、CD70に特異的に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。特定の局面において、本開示は、マウス抗体またはラット抗体などの非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含み、CD70に特異的に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含む、このような本発明の抗体は、対応する非ヒト親抗体と、(a)結合の際に競合することができるか、(b)機能的特徴を保持しているか、(c)同じエピトープに結合するか、かつ/または、(d)同様の結合親和性を有する。
【００６８】
他の局面において、本開示は、CD70に特異的に結合することができる、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体のようなヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供する。他の局面において、本開示は、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体のような第1のヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体であって、第1のヒト抗体が、CD70に特異的に結合することができ、かつ第1のヒト抗体に由来するCDR3ドメインが、CD70に対する結合特異性を欠いているヒト抗体中のCDR3ドメインを置換して、CD70に特異的に結合することができる第2のヒト抗体を生成する、モノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、第1のヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含む、このような本発明の抗体は、対応する第1のヒト親抗体と、(a)結合の際に競合することができるか、(b)機能的特徴を保持しているか、(c)同じエピトープに結合するか、かつ/または、(d)同様の結合親和性を有する。
【００６９】
特定の生殖系列配列を有する抗体
特定の態様において、本開示の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む。
【００７０】
例えば、好ましい態様において、本開示は、ヒトVH3-30.3遺伝子の産物であるか、またはヒトVH3-30.3遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、ヒトVH3-33遺伝子の産物であるか、またはヒトVH3-33遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、ヒトVH4-61遺伝子の産物であるか、またはヒトVH4-61遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、ヒトVKL6遺伝子の産物であるか、またはヒトVKL6遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、ヒトVKL18遺伝子の産物であるか、またはヒトVKL18遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、ヒトVKL15遺伝子の産物であるか、またはヒトVKL15遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、CD70に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００７１】
さらに別の好ましい態様において、本開示は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体は、
(a)(SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、およびSEQ ID NO：53において示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする)ヒトVH3-30.3遺伝子、ヒトVH3-33遺伝子、またはヒトVH4-61遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する重鎖可変領域を含み、
(b)(SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、およびSEQ ID NO：56において示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする)ヒトVKL6遺伝子、ヒトVKL18遺伝子、またはヒトVKL15遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する軽鎖可変領域を含み、かつ、
(c)CD70に特異的に結合する。
【００７２】
VH3-30.3およびVKL6のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、2H5である。VH3-30.3およびVKL18のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、10B4である。VH3-33およびVKL15のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、8B5および18E7である。VH4-61およびVKL6のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、69A7である。
【００７３】
本明細書において使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から抗体の可変領域が得られる場合、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを関心対象の抗原で免疫化する段階、またはファージ上にティスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを、関心対象の抗原を用いてスクリーニングする段階を含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、かつヒト抗体の配列に最も配列が近い(すなわち、一致率(％)が最大である)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、それとして同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然の体細胞変異または部位特異的変異の意図的な導入が原因で、生殖系列配列と比べてアミノ酸に差異を含む場合がある。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも90％同一であり、かつ、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えばマウスの生殖系列配列)と比べた場合に、ヒト抗体をヒト由来と特定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも95％、またはさらに少なくとも96％、97％、98％、もしくは99％同一である場合がある。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比べて10個以下のアミノ酸差異を示すと考えられる。特定の態様において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比べて、5個以下、またはさらに4個、3個、2個、もしくは1個以下のアミノ酸差異を示す場合がある。
【００７４】
相同な抗体
さらに別の態様において、本開示の抗体は、本明細書において説明する好ましい抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、かつ、これらの抗体は、本開示の抗CD70抗体の望ましい機能特性を保持している。
【００７５】
例えば、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、
(a)重鎖可変領域は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含み;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含み;
(c)抗体は、CD70に特異的に結合する。
【００７６】
他の態様において、VHアミノ酸配列および/またはVLアミノ酸配列は、前述の配列に85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％相同である場合がある。前述の配列のVH領域およびVL領域に高い(すなわち80％またはそれ以上の)相同性を有するVH領域およびVL領域を有する抗体は、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50をコードする核酸分子の変異を誘発し(例えば、部位特異的変異誘発またはPCR法による変異誘発)、続いて、本明細書において説明する機能アッセイ法を用いて、保持されている機能(すなわち、5×10-8Mもしくはそれ以下のKDでヒトCD70に結合する)に関して、コードされる改変抗体を試験することによって、得ることができる。
【００７７】
本明細書において使用される場合、2つのアミノ酸配列間の相同率(％)は、2つの配列間の一致率(％)に等しい。2配列間の一致率(％)は、2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列に共通である同一な位置の数の関数である(すなわち、相同率(％)=同一な位置の数/位置の総数×100)。配列の比較および2配列間の一致率(％)の決定は、下記の非限定的な実施例において説明するように、数学アルゴリズムを用いて遂行することができる。
【００７８】
2つのアミノ酸配列間の一致率(％)は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられたE. MeyersおよびW.Miller(Comput. Appl. Biosci., 4：11-17(1988))のアルゴリズムを用い、PAM120残基ウェイトテーブル、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用して、決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の一致率(％)は、GCGソフトウェアパッケージ(http：//www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み入れられたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48：444-453(1970))のアルゴリズムを用い、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイト、および1、2、3、4、5、または6の長さウェイト(length weight)を使用して、決定することもできる。
【００７９】
さらに、またはあるいは、本開示のタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」としてさらに使用することもできる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215：403-10のXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施することができる。XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いてBLASTタンパク質検索を実施して、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップありアライメントを得るには、Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17)：3389-3402に記載されているようにGapped BLASTを使用することができる。BLASTプログラムおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメーターを使用することができる。http：//www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００８０】
保存的に改変された抗体
特定の態様において、本開示の抗体は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、これらのCDR配列のうち1つまたは複数は、本明細書において説明する好ましい抗体(例えば、2H5、10B4、8B5、18E7、もしくは69A7)をベースとする指定されたアミノ酸配列またはそれらの保存的改変体を含み、かつこれらの抗体は、本開示の抗CD70抗体の望ましい機能的特性を保持する。したがって、本開示は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、
(a)重鎖可変領域のCDR3配列が、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み;
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列が、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み;
(c)抗体がCD70に特異的に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００８１】
好ましい態様において、重鎖可変領域のCDR2配列は、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR2配列は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖可変領域のCDR1配列は、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1配列は、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼすことも、結合特徴を有意に変更することもない、アミノ酸改変を意味すると意図される。このような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発およびPCR法による変異誘発など当技術分野において公知の標準的技術によって、本開示の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、本開示の抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置換することができ、かつ、改変された抗体を、本明細書において説明する機能アッセイ法を用いて、保持されている機能(すなわち、(c)に示した機能)に関して試験することができる。
【００８３】
本開示の抗CD70抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様において、本開示は、本開示のCD70モノクローナル抗体のいずれかと同じヒトCD70上のエピトープに結合する抗体(すなわち、CD70に結合する際に、本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体)を提供する。好ましい態様において、交差競合研究のための参照抗体は、モノクローナル抗体2H5 (SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：6においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体10B4(SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：7においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体8B5(SEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：8においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体18E7 (SEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：9においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体69A7 (SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：10においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)でもよい。このような交差競合する抗体は、標準的なCD70 結合アッセイ法において、2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7と交差競合する能力に基づいて同定することができる。例えば、BIAcore解析、ELISAアッセイ法、またはフローサイトメトリーを使用して、本開示の抗体との交差競合を実証することができる。ある試験抗体が、例えば、2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7のヒトCD70への結合を阻害できる場合、その試験抗体は、ヒトCD70への結合に際して2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7と競合することができ、したがって、2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7と同じヒトCD70上のエピトープに結合することが実証される。好ましい態様において、2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7と同じヒトCD70上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例において説明するようにして調製および単離することができる。
【００８４】
設計および改変された抗体
本開示の抗体はさらに、本明細書において開示される1つまたは複数のVH配列および/またはVL配列を有する抗体を、改変抗体を設計するための出発材料として用いて調製することもでき、この改変抗体は、出発抗体から変化した特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内および/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基を改変することによって設計することができる。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を改変することによって設計することもできる。
【００８５】
実施することができる1つのタイプの可変領域設計は、CDRグラフティングである。抗体は、重鎖および軽鎖の6つの相補性決定領域(CDR)中に位置しているアミノ酸残基を主に介して、標的抗原と相互作用する。このため、CDR内のアミノ酸配列の方が、CDRの外側の配列よりも、個々の抗体間で多様である。CDR配列は、大半の抗体-抗原相互作用を担っているため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフティングされた、特定の天然抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332：323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321：522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86：10029-10033; Winterの米国特許第5,225,539号ならびにQueenらの米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい)。
【００８６】
したがって、本開示の別の態様は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、それぞれ、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20、ならびにSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35、ならびに、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7のVHCDR配列およびVLCDR配列を含むが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含み得る。
【００８７】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースまたは出版されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース(インターネットでwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseから入手可能)において、ならびに、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227：776-798;およびCox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24：827-836において、確認することができ、各文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。別の例として、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、Genbankデータベースにおいて確認することができる。例えば、HCo7 HuMAbマウス中に存在する以下の重鎖生殖系列配列が、添付のGenbankアクセッション番号：1-69(NG_0010109、NT_024637、およびBC070333)、3-33(NG_0010109およびNT_024637)、ならびに3-7(NG_0010109およびNT_024637)において入手可能である。別の例として、HCo12 HuMAbマウス中に存在する以下の重鎖生殖系列配列が、添付のGenbankアクセッション番号：1-69(NG_0010109、NT_024637、およびBC070333)、5-51(NG_0010109およびNT_024637)、4-34(NG_0010109およびNT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、ならびに3-23(AJ406678)において入手可能である。
【００８８】
本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似しているもの、例えば、本開示の好ましいモノクローナル抗体によって使用される、VH3-30.3フレームワーク配列(SEQ ID NO：51)および/もしくはVH3-33フレームワーク配列(SEQ ID NO：52)および/もしくはVH 4-61フレームワーク配列(SEQ ID NO：53)、ならびに/またはVKL6フレームワーク配列(SEQ ID NO：54)および/もしくはVK L18フレームワーク配列(SEQ ID NO：55)および/もしくはVKL15フレームワーク配列(SEQ ID NO：56)に類似しているものである。VHのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列、ならびにVKのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中に存在する配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上にグラフティングすることができるか、または、CDR配列を、生殖系列配列と比べて1つもしくは複数の変異を含むフレームワーク領域上にグラフティングすることができる。例えば、いくつかの場合において、抗体の抗原結合能力を維持または増強するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている(例えば、Queenらによる米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい)。
【００８９】
別のタイプの可変領域改変は、VHおよび/またはVKのCDR1領域、CDR2領域、および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させて、それによって関心対象の抗体の1種または複数種の結合特性(例えば親和性)を改善させるものである。部位特異的変異誘発またはPCR法による変異誘発を実施して、変異を導入することができ、かつ、抗体結合または関心対象の他の機能特性に対する影響を、本明細書において説明し、かつ実施例において提供するインビトロまたはインビボのアッセイ法において評価することができる。好ましくは、(前述のような)保存的改変が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失でもよいが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の1個、2個、3個、4個、または5個以下の残基が変更される。
【００９０】
したがって、別の態様において、本開示は、以下を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗CD70モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
(a)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VHCDR1領域;
(b)SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VHCDR2領域;
(c)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VHCDR3領域;
(d)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VKCDR1領域;
(e)SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VKCDR2領域;ならびに
(f)SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含む、VKCDR3領域。
【００９１】
本開示の設計された抗体には、例えば、抗体の特性を改善するために、VHおよび/またはVK内のフレームワーク残基が改変されたものが含まれる。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を低減させるために実施される。例えば、1つのアプローチは、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異させる」ものである。より具体的には、体細胞変異を経験した抗体は、その抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含む場合がある。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、その抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって、同定することができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。例えば、10B4の場合、VHの(FR1内の)アミノ酸2番残基はイソロイシンであるのに対し、対応するVH3-30.3生殖系列配列中のこの残基はバリンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、部位特異的変異誘発またはPCR法による変異誘発によって、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」させることができる(例えば、10B4のVHのFR1の2番残基)をイソロイシンからバリンに「復帰変異」させることができる)。
【００９２】
別の例として、10B4の場合、VHの(FR1内の)アミノ酸30番残基はグリシンであるのに対し、対応するVH3-30.3生殖系列配列中のこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、10B4のVHのFR1の30番残基をグリシンからセリンに「復帰変異」させることができる。
【００９３】
別の例として、8B5の場合、VHの(FR1内の)アミノ酸24番残基はトレオニンであるのに対し、対応するVH3-33生殖系列配列中のこの残基はアラニンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、8B5のVHのFR1の24番残基をトレオニンからアラニンに「復帰変異」させることができる。
【００９４】
別の例として、8B5の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸77番残基はリシンであるのに対し、対応するVH3-33生殖系列配列中のこの残基はアスパラギンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、8B5のVHのFR3の11番残基をリシンからアスパラギンに「復帰変異」させることができる。
【００９５】
別の例として、8B5の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸80番残基はセリンであるのに対し、対応するVH3-33生殖系列配列中のこの残基はチロシンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、8B5のVHのFR3の14番残基をセリンからチロシンに「復帰変異」させることができる。
【００９６】
別の例として、69A7の場合、VHの(FR2内の)アミノ酸50番残基はロイシンであるのに対し、対応するVH4-61生殖系列配列中のこの残基はイソロイシンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、69A7のVHのFR2の13番残基をロイシンからイソロイシンに「復帰変異」させることができる。
【００９７】
別の例として、69A7の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸85番残基はアルギニンであるのに対し、対応するVH4-61生殖系列配列中のこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、69A7のVHのFR3の18番残基をアルギニンからセリンに「復帰変異」させることができる。
【００９８】
別の例として、69A7の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸89番残基はトレオニンであるのに対し、対応するVH4-61生殖系列配列中のこの残基はアラニンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、69A7のVHのFR3の22番残基をトレオニンからアラニンに「復帰変異」させることができる。
【００９９】
別の例として、10B4の場合、VLの(FR2内の)アミノ酸46番残基はフェニルアラニンであるのに対し、対応するVLL18生殖系列配列中のこの残基はロイシンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、10B4のVLのFR2の12番残基をフェニルアラニンからロイシンに「復帰変異」させることができる。
【０１００】
別の例として、69A7の場合、VLの(FR2内の)アミノ酸49番残基はフェニルアラニンであるのに対し、対応するVLL6生殖系列配列中のこの残基はチロシンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、69A7のVLのFR2の15番残基をフェニルアラニンからチロシンに「復帰変異」させることができる。
【０１０１】
別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、またはさらに1つもしくは複数のCDR領域内の1つまたは複数の残基を変異させて、T細胞エピトープを除去し、それにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、かつ、Carrらによる米国特許出願公開第20030153043号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０２】
本開示の設計された抗体には、抗体上のT細胞エピトープの相互作用を変更するアミノ酸改変を介して、免疫原性応答を増大または低減させるために、アミノ酸残基が改変されたものも含まれる(例えば、米国特許第6,835,550号、同第6,897,049号、および同第6,936249号を参照されたい)。
【０１０３】
フレームワーク領域またはCDR領域内に起こされる改変に加えて、またはその代わりに、典型的には、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性の細胞障害活性など抗体の1種または複数種の機能特性を変更するために、本開示の抗体を、Fc領域内に改変を含むように設計することができる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾してもよく(例えば、1つもしくは複数の化学的部分を抗体に結合することができる)、または、やはり抗体の1種もしくは複数種の機能特性を変更するために、そのグリコシル化を変更するように修飾してもよい。これらの各態様は、下記にさらに詳細に説明する。Fc領域中の残基の番号付けは、KabatのEU指数のものである。
【０１０４】
1つの態様において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加もしくは減少されるように、改変される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号においてさらに記載されている。CH1のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするためか、または抗体の安定性を上昇もしくは低下させるために、変更される。
【０１０５】
別の態様において、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を短縮させるために変異させられる。より具体的には、1つまたは複数のアミノ酸変異が、CH2-CH3ドメインの境界領域であるFcヒンジ断片中に導入され、その結果、その抗体は、天然のFcヒンジドメインのブドウ球菌(Staphylococcyl)プロテインA(SpA)結合に比べて、SpA結合が障害される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０６】
別の態様において、抗体は、生物学的半減期を延長するために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardによる米国特許第6,277,375号に記載されているように、1つまたは複数の以下の変異を導入することができる：T252L、T254S、T256F。あるいは、生物学的半減期を延長するために、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および同第6,121,022号において記載されているように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ(salvage)受容体結合エピトープを含むように、抗体のCH1領域またはCL領域内を改変することができる。
【０１０７】
さらに別の態様において、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって、改変される。例えば、アミノ酸残基234番、235番、236番、237番、297番、318番、320番、および322番から選択される1つまたは複数のアミノ酸は、その抗体が、エフェクターリガンドに対する親和性は変更されているが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変更される対象のエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体、または補体のC1成分でもよい。このアプローチは、いずれもWinterらによる米国特許第5,624,821号および同第5,648,260号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０８】
別の実施例において、アミノ酸残基329番、331番、および322番より選択される1つまたは複数のアミノ酸は、抗体のC1q結合が変化し、かつ/または補体依存性細胞障害(CDC)が低減もしくは消滅するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０９】
別の実施例において、アミノ酸231位から239位までの範囲内の1つまたは複数のアミノ酸残基が変更されて、それにより、抗体が補体に結合する能力が変更される。このアプローチは、BodmerらによるPCT公報WO 94/29351においてさらに記載されている。
【０１１０】
さらに別の実施例において、Fc領域は、以下の位置の1つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体が抗体依存性細胞障害(ADCC)を媒介する能力を増大させるように、かつ/またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるように、改変される：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、または439。このアプローチは、PrestaによるPCT公報WO 00/42072においてさらに記載されている。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIII、およびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位は、マッピングされており、かつ結合の改善された変種が説明されている(Shields, R.L.et al. (2001) J. Biol. Chem. 276：6591-6604を参照されたい)。256位、290位、298位、333位、334位、および339位の特定の変異は、FcγRIIIへの結合を改善することが示された。さらに、以下の組合せ変異体は、FcγRIII結合を改善することが示された：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、およびS298A/E333A/K334A。
【０１１１】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、アグリコシル化(aglycoslated)抗体を作製することができる(すなわち、この抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化を変更して、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。このような炭水化物変更は、例えば、抗体配列内の1つまたは複数の部位のグリコシル化を変更することによって、達成することができる。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を消失させ、それによってその部位のグリコシル化を無くす、1つまたは複数のアミノ酸置換を実施することができる。このようなアグリコシル化(aglycosylation)は、抗原に対する抗体の親和性を増大させ得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号においてさらに詳細に記載されている。
【０１１２】
さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化(hypofucosylated)抗体または分岐GlcNac構造の増加した抗体など、変更されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増大させることが実証された。このような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞において抗体を発現させることによって、達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は、当技術分野において説明されており、かつ、本開示の組換え抗体を発現させて、それにより、グリコシル化が変更された抗体を産生させる場となる宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705、およびMs709は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のFUT8(α(1,6)フコシルトランスフェラーゼ)を欠き、その結果、Ms704、Ms705、およびMs709細胞株において発現される抗体は、炭水化物上のフコースを欠いている。Ms704、Ms705、およびMs709 FUT8-/-細胞株は、2つの置換ベクターを用いて、CHO/DG44細胞中のFUT8遺伝子を標的として破壊することによって、作製された(Yamaneらによる米国特許出願公開第20040110704号およびYamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87：614-22を参照されたい)。別の例として、HanaiらによるEP1,176,195では、α1,6結合に関連した酵素を減少させるか、または排除することにより、そのような細胞株において発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子を機能的に破壊した細胞株を記載している。Hanaiらはまた、抗体のFc領域に結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか、またはその酵素活性を有さない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)も説明している。PrestaによるPCT公報WO 03/035835では、Asn(297)結合型炭水化物にフコースを結合させる能力が低減され、また、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらす、変種CHO細胞株のLec13細胞を記載している(Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277：26733-26740も参照されたい)。UmanaらによるPCT公報WO 99/54342では、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体のADCC活性の増大をもたらす分岐GlcNac構造の増加を示すように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現させるように操作された細胞株を記載している(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17：176-180も参照されたい)。あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断して除いてもよい。例えば、フコシダーゼのα-L-フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14：5516-23)。
【０１１３】
本開示によって企図される、本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。例えば、抗体の生物学的(例えば血清)半減期を延長するために、抗体をペグ化することができる。抗体をペグ化するには、抗体またはその断片を、典型的には、抗体または抗体断片に1つまたは複数のPEG基が結合される条件下で、ポリエチレングリコール(PEG)の反応性のエステル誘導体またはアルデヒド誘導体などのPEGと反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似した反応性の水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本明細書において使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1-C10)アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用された任意の形態のPEGを包含すると意図される。特定の態様において、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野において公知であり、かつ本開示の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるEP 0154316およびIshikawaらによるEP 0401384を参照されたい。
【０１１４】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗CD19抗体の様々な物理的特性によってさらに特徴付けすることができる。様々なアッセイ法が、これらの物理的特性に基づいて様々なクラスの抗体を検出および/または区別するのに使用され得る。
【０１１５】
いくつかの態様において、本開示の抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のいずれかに、1つまたは複数のグリコシル化部位を含み得る。可変領域中に1つまたは複数のグリコシル化部位が存在することにより、抗原結合が変わるため、抗体の免疫原性の上昇または抗体のpKの変化が起こり得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41：673-702; Gala FAおよびMorrison SL (2004) J Immunol 172：5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168：1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12：43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316：452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37：697-706)。グリコシル化は、N-X-S/T配列を含むモチーフに存在することが公知である。可変領域のグリコシル化は、Glycoblotアッセイ法を用いて試験することができる。このアッセイ法では、抗体を切断してFabを生成させ、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイ法を用いてグリコシル化に関して試験する。あるいは、可変領域のグリコシル化は、Fab由来の糖類を単糖に切断し、かつ個々の糖類含有量を解析するDionex光クロマトグラフィー(Dionex-LC)を用いて試験することもできる。場合により、可変領域グリコシル化を含まない抗CD19抗体を有することが好ましい。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、または当技術分野において周知の標準的技術を用いてグリコシル化モチーフ内の残基を変異させることによって、実現することができる。
【０１１６】
好ましい態様において、本開示の抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸作用(effect)は、それぞれN-G配列またはD-G配列上で起こり得る。脱アミドまたはイソアスパラギン酸作用は、イソアスパラギン酸の生成をもたらし、これは、主鎖ではなく側鎖カルボキシ末端から離れたねじれた構造を作り出すことによって、抗体の安定性を低下させる。イソアスパラギン酸の生成は、逆相HPLCを使用してイソアスパラギン酸について試験する、等量(iso-quant)アッセイ法を用いて測定することができる。
【０１１７】
各抗体は、特有の等電点(pI)を有すると考えられるが、一般に、抗体は、6〜9.5の間のpH範囲に入ると考えられる。IgG1抗体のpIは、典型的には7〜9.5のpH範囲内に入り、IgG4抗体のpIは、典型的には6〜8のpH範囲内に入る。抗体は、この範囲から外れるpIを有することがある。これらの作用は一般に知られていないが、正常範囲から外れたpIを有する抗体が、インビボ条件下でアンフォールディングおよび不安定さをいくらか示す場合があるという推測がある。等電点は、pH勾配を作り出し、かつ精度を高めるためにレーザー集光を利用し得る、キャピラリー等電点電気泳動アッセイ法を用いて試験することができる(Janini et al (2002) Electrophoresis 23：1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53：S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800：355-67)。場合により、正常範囲に入るpI値を有する抗CD19抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のpIを有する抗体を選択することによって、または、当技術分野において周知の標準的技術を用いて表面の荷電残基を変異させることによって、実現することができる。
【０１１８】
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有する(Krishnamurthy RおよびManning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。熱安定性が高いほど、インビボでの総合的な抗体安定性がより高いことが示される。抗体の融点は、示差走査熱量測定のような技術を用いて測定することができる(Chen et al (2003) Pharm Res 20：1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68：47-52)。TM1は、抗体が最初にアンフォールディングする温度を示す。TM2は、抗体が完全にアンフォールディングする温度を示す。一般に、本開示の抗体のTM1は、60℃より高く、好ましくは65℃より高く、さらにより好ましくは70℃より高いことが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は、円二色性を用いて測定することもできる(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40：343-9)。
【０１１９】
好ましい態様において、急速に分解しない抗体が選択される。抗CD19抗体の断片化は、当技術分野において十分に理解されているように、キャピラリー電気泳動(CE)およびMALDI-MSを用いて測定することができる(Alexander AJおよびHughes DE (1995) Anal Chem 67：3626-32)。
【０１２０】
別の好ましい態様において、凝集作用が最小限である抗体が選択される。凝集は、望まれない免疫応答の誘発および/または薬物動態学的特性の変化もしくは好ましくない薬物動態学的特性をもたらし得る。一般に、凝集が25％またはそれ以下、好ましくは20％またはそれ以下、さらにより好ましくは15％またはそれ以下、さらにより好ましくは10％またはそれ以下、およびさらにより好ましくは5％またはそれ以下の抗体が許容される。凝集は、単量体、2量体、3量体、または多量体を同定するためのサイズ排除カラム(SEC)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、および光散乱を含む、当技術分野において周知のいくつかの技術によって測定することができる。
【０１２１】
抗体を設計する方法
前述したように、本明細書において開示するVH配列およびVK配列を有する抗CD70抗体を使用して、VH配列および/もしくはVK配列、またはそれに結合している定常領域を改変することにより、新しい抗CD70抗体を作製することができる。したがって、本開示の別の局面において、本開示の抗CD70抗体、例えば、2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7の構造的特徴を使用して、ヒトCD70への結合のような本開示の抗体の少なくとも1種の機能特性を保持している、構造的に関連した抗CD70抗体を作製する。例えば、2H5、10B4、8B5、18E7、もしくは69A7、またはそれらの変異体の1つまたは複数のCDR領域を、前述したように、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組換えによって組み合わせて、組換えによって設計されたさらなる本開示の抗CD70抗体を作製することができる。他のタイプの改変には、以前のセクションにおいて説明したものが含まれる。設計方法のための出発材料は、本明細書において提供される1つもしくは複数のVH配列および/もしくはVK配列、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域である。設計された抗体を作製するためには、本明細書において提供される1つもしくは複数のVH配列および/もしくはVK配列、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タンパク質として発現させる)ことは必要ではない。より正確に言えば、配列中に含まれる情報は、元の配列に由来する「第2世代」配列を作製するための出発材料として使用され、次いで、その「第2世代」配列が、タンパク質として調製および発現される。
【０１２２】
したがって、別の態様において、本開示は、以下の段階を含む、抗CD70抗体を調製するための方法を提供する：
(a)(i)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20からなる群より選択されるCDR2配列、ならびに/もしくはSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列;ならびに/または(ii)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35からなる群より選択されるCDR2配列、ならびに/もしくはSEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する段階;
(b)重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも1つの改変抗体配列を作製する段階;ならびに
(c)改変抗体配列をタンパク質として発現させる段階。
【０１２３】
標準的な分子生物学技術を使用して、改変抗体配列を調製し、かつ発現させることができる。
【０１２４】
好ましくは、改変抗体配列にコードされる抗体は、本明細書において説明する抗CD70抗体の機能特性の1種、いくつか、またはすべてを保持しているものであり、これらの機能特性には、CD70への特異的結合が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１２５】
改変抗体の機能特性は、実施例において説明するもののような(例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ法)、当技術分野において利用可能であり、かつ/または本明細書において説明する、標準的なアッセイ法を用いて評価することができる。
【０１２６】
本開示の抗体を設計する方法の特定の態様において、抗CD70抗体コード配列の全体または一部分に沿ってランダムにまたは選択的に変異を導入することができ、かつ、結果として生じる改変抗CD70抗体を、結合活性および/または本明細書において説明する他の機能特性に関してスクリーニングすることができる。変異の方法は、当技術分野において説明されている。例えば、ShortによるPCT公報WO 02/092780では、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはそれらの組合せを用いて、抗体変異体を作製およびスクリーニングするための方法を記載している。あるいは、LazarらによるPCT公報WO 03/074679では、抗体の生理化学特性を最適化するために計算的スクリーニング方法を使用する方法を記載している。
【０１２７】
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の局面は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在してよい。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞構成要素または他の混在物、例えば他の細胞の核酸もしくはタンパク質から離れるように精製された場合、「単離」されているか、または「実質的に純粋にされて」いる。F. Ausubel, et al.編、(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本開示の核酸は、例えば、DNAまたはRNAでもよく、かつイントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい態様において、核酸はcDNA分子である。
【０１２８】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、さらに後述するようなヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ)によって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって産生される抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅技術またはcDNAクローニング技術によって得ることができる。(例えばファージディスプレイ技術を使用する)免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる抗体の場合、抗体をコードする核酸は、そのライブラリーから回収することができる。
【０１２９】
本開示の好ましい核酸分子は、モノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、18E7、または69A7のVH配列およびVL配列をコードするものである。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVH配列をコードするDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、およびSEQ ID NO：45において示される。2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7のVL配列をコードするDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50において示される。
【０１３０】
VHセグメントおよびVLセグメントをコードするDNA断片を得た後、これらのDNA断片を、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、またはscFv遺伝子に変換するために、標準的な組換えDNA技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、VLまたはVHをコードするDNA断片は、抗体定常領域または柔軟なリンカーなど別のタンパク質をコードする別のDNA断片に機能的に連結される。この文脈において使用される「機能的に連結される」という用語は、2つのDNA断片が、それら2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように結合されることを意味すると意図される。
【０１３１】
VHをコードするDNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2、およびCH3)をコードする別のDNA分子に機能的に連結することによって、VH領域をコードする単離されたDNAを完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)、かつ、これらの領域を含むDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgDの定常領域でもよいが、最も好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4の定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子の場合、VHをコードするDNAを、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に機能的に連結することができる。
【０１３２】
VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に機能的に連結することによって、VL領域をコードする単離されたDNAを完全長の軽鎖遺伝子(ならびにFab軽鎖遺伝子)に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)、かつ、これらの領域を含むDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκ定常領域またはλ定常領域でもよいが、最も好ましくはκ定常領域である。
【０１３３】
scFv遺伝子を作製するためには、VH配列およびVL配列が、柔軟なリンカーによって結合されたVL領域およびVH領域を有する連続的な単鎖のタンパク質として発現され得るように、VHおよびVLをコードするDNA断片を、柔軟なリンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする断片に機能的に連結させる(例えば、Bird et al. (1988) Science 242：423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883; McCafferty et al.,(1990) Nature 348：552-554を参照されたい)。
【０１３４】
本開示のモノクローナル抗体の作製
本開示のモノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えばKohlerおよびMilstein (1975) Nature 256：495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則としては、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばBリンパ球のウイルス性形質転換または癌性形質転換を使用することができる。
【０１３５】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物の系はマウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、十分に確立された手順である。融合用の免疫脾細胞を単離するための免疫化のプロトコールおよび技術は、当技術分野において公知である。融合相手(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順もまた、公知である。
【０１３６】
本開示のキメラ抗体またはヒト化抗体は、前述したようにして調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、標準的な分子生物学技術を用いて、関心対象のマウスハイブリドーマから得、かつ、非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスの可変領域をヒト定常領域に連結することができる(例えば、Cabillyらによる米国特許第4,816,567号を参照されたい)。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスのCDR領域をヒトフレームワーク中に挿入することができる(Winterによる米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらによる米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい)。
【０１３７】
好ましい態様において、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。CD70に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系の代わりに、ヒト免疫系の一部分を有するトランスジェニックマウスまたは、染色体導入されたマウスを用いて生成させることができる。これらのトランスジェニックマウスおよび染色体導入されたマウスには、それぞれHuMAbマウス(登録商標)およびKMマウス(登録商標)と本明細書において呼ばれるマウスが含まれ、本明細書において、まとめて「ヒトIgマウス」と呼ばれる。
【０１３８】
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内因性のμ鎖およびκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的化された変異と共に、再配列されてないヒト重鎖(μおよびγ)ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474)： 856-859を参照されたい)。したがって、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の低減を示し、かつ免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を経験して、高親和性のヒトIgGκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al. (1994)、前記; Lonberg, N.(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101に総説がある; Lonberg, N.およびHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13：65-93、ならびにHarding, F.およびLonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764：536-546)。HuMabマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスが有するゲノム改変は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20：6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5：647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4：117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12：821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152：2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6：579-591; およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14：845-851においてさらに説明されており、これらの全文献の内容は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。さらに、米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,789,650号、同第5,877,397号、同第5,661,016号、同第5,814,318号、同第5,874,299号、および同第5,770,429号(すべてLonbergおよびKayによる);米国特許第5,545,807号(Suraniらによる);PCT公報WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、およびWO 99/45962(すべてLonbergおよびKayによる);ならびにPCT公報WO 01/14424(Kormanらによる)を参照されたい。
【０１３９】
別の態様において、本開示のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスのような、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを用いて、産生させることができる。本明細書において「KMマウス(登録商標)」と呼ばれるこのようなマウスは、IshidaらによるPCT公報WO 02/43478に詳細に記載されている。
【０１４０】
さらになお、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系も当技術分野において利用可能であり、本開示の抗CD70抗体を産生させるために使用することができる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と呼ばれる代替のトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号、同第6,075,181号、同第6,114,598号、同第6,150,584号、および同第6,162,963号に記載されている。
【０１４１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体導入された動物系も当技術分野において利用可能であり、本開示の抗CD70抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「TCマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を有するマウスを使用することができる。このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：722-727に記載されている。別の例として、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体を有する雌ウシが当技術分野において説明されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology, 20：889-894)、本開示の抗CD70抗体を産生させるために使用することができる。
【０１４２】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ladnerらによる米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、および同第5,571,698号;Dowerらによる米国特許第5,427,908号および同第5,580,717号;McCaffertyらによる米国特許第5,969,108号および同第6,172,197号;ならびにGriffithsらによる米国特許第5,885,793号、同第6,521,404号、同第6,544,731号、同第6,555,313号、同第6,582,915号、および同第6,593,081号を参照されたい。
【０１４３】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化した際にヒト抗体応答を生じさせることができるようにヒト免疫細胞を再構成されたSCIDマウスを用いて調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilsonらによる米国特許第5,476,996号および同第5,698,767号に記載されている。
【０１４４】
ヒトIgマウスの免疫化
本開示のヒト抗体を産生させるためにヒトIgマウスが使用される場合、このようなマウスは、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474)：856-859、Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14：845-851、ならびにPCT公報WO 98/24884およびWO 01/14424に記載されているように、CD70を発現する細胞株、CD70抗原および/もしくは組換えCD70の精製調製物もしくは濃縮調製物、またはCD70融合タンパク質で免疫化することができる。好ましくは、マウスは、最初の免疫化の際に6〜16週齢である。例えば、CD70抗原の精製調製物または組換え調製物(5μg〜50μg)を使用して、腹腔内経由でヒトIgマウスを免疫化することができる。
【０１４５】
CD70に対する完全なヒトモノクローナル抗体を生成させるための詳細な手順は以下の実施例1において説明する。様々な抗原を用いた累積的な経験により、完全フロイントアジュバント中の抗原で最初に腹腔内経由(IP)で免疫化し、続いて、不完全フロイントアジュバント中の抗原で1週間おきに腹腔内経由で免疫化(最長で合計6回)した場合、トランスジェニックマウスが応答することが示された。しかしながら、フロイントアジュバント以外のアジュバントも、効果的であることが判明している。さらに、アジュバント不在下の全細胞も、免疫原性が高いことが判明している。免疫応答は、例えば眼窩後からの採血によって得られる血漿試料を用いて、免疫化プロトコールの過程を通して、モニターすることができる。血漿は、(実施例1で説明するように)ELISAによってスクリーニングすることができ、かつ十分な力価の抗CD70ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合用に使用することができる。屠殺および膵臓切除の3日前に、静脈内経由でマウスに抗原を追加免疫してよい。各免疫化に対して2回〜3回の融合を実施する必要があり得ると予想される。典型的には、各抗原に対して6匹〜24匹の間のマウスが免疫化される。通常、HCo7系統およびHCo12系統の両方が使用される。HCo7マウス系統およびHCo12マウス系統の作製は、それぞれ、米国特許第5,770,429号およびPCT公報WO 01/09187の実施例2に説明されている。さらに、HCo7導入遺伝子およびHCo12導入遺伝子の両方を一緒に導入して、2種の異なるヒト重鎖導入遺伝子(HCo7/HCo 12)を有する1匹のマウスを育てることもできる。あるいは、またはさらに、PCT公報WO 02/43478で説明するように、KMマウス(登録商標)系統を使用することもできる。
【０１４６】
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化マウス由来の脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、かつ、マウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合させることができる。結果として生じるハイブリドーマを、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、50％PEGを用いて、6分の1の数のP3X63-Ag8.653非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1580)に融合させてよい。あるいは、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Cyto Pulse大チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を用いて、電場に基づく電気融合法によって融合させることもできる。約2×105個の細胞を平底マイクロタイタープレート中に播種し、続いて、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含み、かつ、20％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、18％ P388DI馴化培地、5％Origen Hybridomaクローニング因子 (BioVeris, Gaithersburg, VA)、4mM L-グルタミン、5mM HEPES、0.055mM β-メルカプトエタノール、50ユニット/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン、および1×ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン (HAT)培地(Sigma; HATは融合後24時間目に添加する)をさらに含む高グルコースDMEM培地(Mediatech, Inc., Herndon, VA) 中で1週間インキュベーションする。1週間後、細胞を、使用されるHATをHTに交換した培地中で培養した。次いで、個々のウェルを、ELISAにより、ヒトモノクローナルIgM抗体およびIgG抗体についてスクリーニングすることができる。ハイブリドーマ増殖は、通常10日〜14日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種し、再びスクリーニングしてよく、かつ、ヒトIgGについて依然として陽性である場合は、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングすることができる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地中で少量の抗体を生成させることができる。
【０１４７】
ヒトモノクローナル抗体を精製するには、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の2リットルスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後、プロテインAセファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)を用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけることができる。溶出されたIgGは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックして純度を保証することができる。緩衝液はPBSに交換することができ、かつ濃度は、吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は、等分し、かつ-80℃で保存することができる。
【０１４８】
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本開示の抗体はまた、例えば、当技術分野において周知の組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せ(例えば、Morrison, S.(1985) Science 229：1202)を用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させることもできる。
【０１４９】
例えば、抗体またはそれらの抗体断片を発現させるために、軽鎖および重鎖の一部分または完全長をコードするDNAを、標準的な分子生物学技術(例えば、関心対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いたPCR増幅またはcDNAクローニング)によって得ることができ、かつそれらのDNAを、それらの遺伝子が転写制御配列および翻訳制御配列に機能的に連結されるように発現ベクター中に挿入することができる。この文脈において、「機能的に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、その抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターに連結されることを意味すると意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入されてよく、またはより典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的な制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション)によって、発現ベクター中に挿入される。本明細書において説明する抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに機能的に連結され、かつVKセグメントがベクター内のCLセグメントに機能的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するのに使用することができる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)でもよい。
【０１５０】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント(例えばポリアデニル化シグナル)を含むと意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990))に記載されている。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者には理解されると考えられる。哺乳動物宿主細胞発現のために好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス(CMV)、サルウイルス(Simian Virus)40(SV40)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、およびポリオーマウイルスに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなど、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列も使用され得る。さらになお、調節エレメントは、SV40初期プロモーターおよびヒトT細胞白血病ウイルス1型の末端反復配列に由来する配列を含むSRαプロモーター系のように、異なる供給源に由来する配列から構成された(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8：466-472)。
【０１５１】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)および選択マーカー遺伝子など付加的な配列を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、いずれもAxelらによる米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号、および同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、(メトトレキサート選択/増幅と共にdhfr-宿主細胞において使用するための)ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子および(G418選択のための)neo遺伝子が含まれる。
【０１５２】
軽鎖および重鎖を発現させるために、軽鎖および重鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術によって宿主細胞中にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核宿主細胞または真核宿主細胞中に外因性DNAを導入するために一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、およびDEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含すると意図される。原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現させることが理論的に可能であるが、真核細胞、および最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。これは、そのような真核細胞、および特に哺乳動物細胞の方が、原核細胞よりも、正しくフォールディングされ、かつ免疫学的に活性な抗体を構築し、かつ分泌しやすいからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収量の活性抗体を産生させるのに効果的ではないことが報告されている(Boss, M. A.およびWood, C. R.(1985) Immunology Today 6：12-13)。
【０１５３】
本開示の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えば、R. J. Kaufmanおよび P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159：601-621で記載されているように、DHFR選択マーカーと共に使用される、UrlaubおよびChasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216-4220に記載されているdhfr-CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞、およびSP2細胞が含まれる。特に、NSO骨髄腫細胞と共に使用する場合、別の好ましい発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036、およびEP 338,841において開示されているGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培地中への抗体の分泌を可能にさせるのに十分な期間、それらの宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。
【０１５４】
抗原に対する抗体結合の特徴付け
本開示の抗体は、例えば、フローサイトメトリーによって、CD70に対する結合について試験することができる。手短に言えば、CD70を発現する細胞を組織培養フラスコから新しく採取し、かつ、単細胞懸濁液を調製する。CD70を発現する細胞懸濁液を、直接、またはPBS中1％パラホルムアルデヒドで固定した後に、1次抗体で染色する。約100万個の細胞を、0.5％ BSAおよび50μg/ml〜200μg/mlの1次抗体を含むPBS中に再懸濁し、かつ、氷上で30分間インキュベートする。これらの細胞を、0.1％BSA、0.01％NaN3を含むPBSで2回洗浄し、1：100で希釈したFITC結合ヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)100μl中に再懸濁し、かつ、氷上でさらに30分間インキュベートする。これらの細胞をさらに2回洗浄し、洗浄緩衝液0.5ml中に再懸濁し、かつ、FACSCaliburサイトメーター(Becton-Dickinson, San Jose, CA)において蛍光染色を解析する。
【０１５５】
あるいは、本開示の抗体は、標準的なELISAによって、CD70への結合について試験することもできる。手短に言えば、マイクロタイタープレートを0.25μg/mlのPBS中精製CD70でコーティングし、次いでPBS中5％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈物(例えば、CD70で免疫化したマウスに由来する血漿の希釈物)を各ウェルに添加し、かつ37℃で1時間〜2時間インキュベートする。これらのプレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いで、アルカリ性ホスファターゼに結合させた二次反応物(例えば、ヒト抗体に対しては、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル反応物)と共に、37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、これらのプレートをpNPP基質(1mg/ml)を用いて発色させ、かつ405〜650のODで解析する。好ましくは、最も高い力価を示すマウスが、融合に使用される。
【０１５６】
前述のELISAアッセイ法はまた、CD70免疫原に対して陽性の反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングするために使用することもできる。高い結合力でCD70に結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴付ける。-140℃で保存される5〜10バイアルの細胞バンクを作製し、かつ抗体を精製するために、親細胞の反応性を保持している(EILSAによる)、各ハイブリドーマに由来する1つのクローンを選択することができる。
【０１５７】
抗CD70抗体を精製するには、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の2リットルスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後、プロテインAセファロース(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけることができる。溶出されたIgGは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックして純度を保証することができる。緩衝液はPBSに交換することができ、かつ濃度は、吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は、等分し、かつ-80℃で保存することができる。
【０１５８】
選択された抗CD70モノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか判定するために、市販されている試薬(Pierce, Rockford, IL)を用いて、各抗体をビオチン標識することができる。非標識のモノクローナル抗体およびビオチン標識モノクローナル抗体を用いた競合研究は、前述したようにCD70でコーティングしたELISAプレートを用いて実施することができる。ビオチン標識mAbの結合は、ストレプトアビジン(strep-avidin)-アルカリ性ホスファターゼプローブを用いて検出することができる。あるいは、下記の実施例においてさらに説明するように、放射性標識抗体を用いて競合調査を実施することができ、かつ、標識されていない競合抗体をスキャッチャード解析において検出することもできる。
【０１５９】
精製した抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて、アイソタイプELISAを実施することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、1μg/mlの抗ヒト免疫グロブリンで、4℃で一晩コーティングすることができる。1％BSAでブロッキングした後、これらのプレートを、周囲温度で1時間〜2時間、1μg/mlまたはそれより低濃度の試験モノクローナル抗体または精製したアイソタイプ対照と反応させる。次いで、これらのウェルを、ヒトIgG1またはヒトIgMに特異的なアルカリ性ホスファターゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。前述したように、プレートを発色させ、かつ解析する。
【０１６０】
抗CD70ヒトIgGは、ウェスタンブロット法によって、CD70抗原との反応性に関してさらに試験することができる。手短に言えば、CD70を調製し、かつドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、10％ウシ胎児血清でブロッキングし、かつ試験すべきモノクローナル抗体でプローブする。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリ性ホスファターゼを用いて検出し、かつBCIP/NBT基質タブレット(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)を用いて発色させることができる。
【０１６１】
免疫複合体
別の局面において、本開示は、サイトトキシン、薬物(例えば免疫抑制薬)、または放射性毒素などの治療的部分に結合された、抗CD70抗体またはその断片を特徴とする。このような複合体は、本明細書において「免疫複合体」と呼ばれる。1種または複数種のサイトトキシンを含む免疫複合体は、「免疫毒素」と呼ばれる。サイトトキシンまたは細胞障害性物質には、細胞に有害である(例えば死滅させる)任意の作用物質が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログが含まれる。治療物質には、例えば、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis-ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに抗有糸分裂物質(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)も含まれる。
【０１６２】
本開示の抗体に結合され得る治療的サイトトキシンの他の好ましい例には、デュオカルマイシン、カリケアミシン、メイタンシン、およびアウリスタチン、ならびにそれらの誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体複合体の例は、市販されている(Mylotarg(商標)、Wyeth-Ayerst)。
【０１６３】
サイトキシン(Cytoxin)は、当技術分野において利用可能なリンカー技術を用いて、本開示の抗体に結合させることができる。サイトトキシンを抗体に結合させるのに使用されたリンカータイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチドを含むリンカーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、リソソーム区画内の低pHによる切断の影響を受けやすいか、またはカテプシン(例えば、カテプシンB、C、D)のような腫瘍組織中で優先的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる切断の影響を受けやすいリンカーを選択することができる。
【０１６４】
サイトトキシンのタイプ、リンカー、および治療物質を抗体に結合させるための方法のさらなる考察については、Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55：199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52：328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3：207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2：750-763; Pastan, I. およびKreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3：1089-1091; Senter, P.D.およびSpringer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53：247-264も参照されたい。
【０１６５】
本開示の抗体はまた、放射性同位体に結合させて、放射性免疫複合体とも呼ばれる細胞障害性放射性医薬品を作製することもできる。診断的または治療的に使用するために抗体に結合させることができる放射性同位体の例には、ヨウ素131、ヨウ素125、インジウム111、イットリウム90、およびルテチウム177が含まれるが、これらに限定されるわけではない。放射性免疫複合体を調製するための方法は、当技術分野において確立されている。Zevalin(商標)(IDEC Pharmaceuticals)およびBexxar(商標)(Corixa Pharmaceuticals)を含む、放射性免疫複合体の例は市販されており、かつ、同様の方法が、本開示の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製するのに使用され得る。
【０１６６】
本開示の抗体複合体は、所与の生物学的応答を変更するために使用され得、かつ薬物部分は、従来の化学治療物質に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでもよい。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシン、もしくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素またはそれらの活性断片;腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン-γなどのタンパク質;または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)などの生体応答調節物質、または他の増殖因子が含まれ得る。
【０１６７】
このような治療的部分を抗体に結合させるための技術は周知であり、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery",  Controlled Drug Delivery(第2版), Robinson et al. (編), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review" 、Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (編), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (編), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62：119-58(1982)を参照されたい。
【０１６８】
二重特異性分子
別の局面において、本開示は、本開示の抗CD70抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質(例えば別の抗体もしくは受容体に対するリガンド)に連結させて、少なくとも2種の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を作製することができる。本開示の抗体を実際に誘導体化するか、または他の複数の機能的分子に連結させて、2種より多い異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異性分子を作製することができる。このような多重特異性分子もまた、本明細書において使用される「二重特異性分子」という用語に包含されると意図される。本開示の二重特異性分子を作製するために、本開示の抗体を、二重特異性分子が結果として生じるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合ミメティックなど1種または複数種の他の結合分子に(例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、または別の方法によって)機能的に連結させることができる。
【０１６９】
したがって、本開示は、CD70に対する少なくとも1種の第1の結合特異性および第2の標的エピトープに対する第2の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示のある特定の態様において、第2の標的エピトープはFc受容体、例えばヒトFcγRI(CD64)またはヒトFcα受容体(CD89)である。したがって、本開示は、FcγRまたはFcαRを発現するエフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージ、または多形核細胞(PMN))、およびCD70を発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、CD70を発現する細胞をエフェクター細胞に導き、かつ、CD70を発現する細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成などFc受容体を介したエフェクター細胞活性を誘発する。
【０１７０】
二重特異性分子が多重特異性である本開示の態様において、この分子は、抗Fc結合特異性および抗CD70結合特異性に加えて、第3の結合特異性をさらに含み得る。1つの態様において、第3の結合特異性部分は、抗増強因子(EF)部分、例えば、細胞障害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原もしくは受容体に結合し、それによって、Fc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定基の作用の増強をもたらす、抗体、機能的な抗体断片、またはリガンドでもよい。「抗増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第1の結合特異性部分および第2の結合特異性部分が結合する単位とは異なる単位に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、(例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、または標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらす他の免疫細胞を介して)細胞障害性T細胞に結合することができる。
【０１７１】
1つの態様において、本開示の二重特異性分子は、結合特異性部分として、少なくとも1つの抗体、または、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、もしくは単鎖Fvを含む、その抗体断片を含む。抗体はまた、その内容が参照により明確に組み入れられるLadnerらによる米国特許第4,946,778号に記載されているように、軽鎖2量体もしくは重鎖2量体、またはFvもしくは単鎖構築物などそれらの任意の微小な断片でもよい。
【０１７２】
1つの態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性は、モノクローナル抗体によって提供され、その結合は、ヒト免疫グロブリンG(IgG)によって妨害されない。本明細書において使用される場合、「IgG受容体」という用語は、第1染色体上に位置する8つのγ鎖遺伝子のいずれかを意味する。これらの遺伝子は、3つのFcγ受容体クラス、すなわちFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)に分類される合計12種の膜貫通型受容体アイソフォームまたは可溶性受容体アイソフォームをコードする。1つの好ましい態様において、Fcγ受容体は、ヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは、72kDaの分子であり、単量体IgGに対して高親和性を示す(108M-1〜109M-1)。
【０１７３】
いくつかの好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の作製および特徴付けが、PCT公報WO 88/00052および米国特許第4,954,617号においてFangerらによって説明されており、これらの教示は、参照により本明細書に完全に組み入れられる。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位で、FcγRI、FcγRII、またはFcγRIIIのエピトープに結合し、したがって、それらの結合は、生理学的レベルのIgGによって実質的に妨害されない。本開示において有用な特異的抗FcγRI抗体は、mAb22、mAb32、mAb44、mAb62、およびmAb197である。mAb32を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection(アメリカ培養細胞系統保存機関)ATCCアクセッション番号HB9469から入手可能である。他の態様において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22のヒト化型(H22)である。H22抗体の作製および特徴付けは、Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155(10)：4996-5002およびPCT公報WO 94/10332に記載されている。H22抗体を産生する細胞株は、HA022CL1という呼称でAmerican Type Culture Collectionに寄託されており、アクセッション番号はCRL 11177である。
【０１７４】
さらに別の好ましい態様において、Fc受容体に対する結合特異性は、ヒトIgA受容体、例えばFcα受容体(FcαRI(CD89))に結合する抗体によって提供され、その結合は、好ましくは、ヒト免疫グロブリンA(IgA)によって妨害されない。「IgA受容体」という用語は、第19染色体上に位置する1つのα遺伝子(FcαRI)の遺伝子産物を含むと意図される。この遺伝子は、別の様式で(alternatively)スプライシングされたいくつかの55kDa〜110kDaの膜貫通型アイソフォームをコードすることが公知である。FcαRI(CD89)は、単球/マクロファージ、好酸性顆粒球および好中性顆粒球上で構成的に発現されるが、エフェクター細胞ではない細胞集団上では発現されない。FcαRIはIgA1およびIgA2の両方に対して中程度の親和性(約5×107M-1)を有し、これは、G-CSFまたはGM-CSFなどのサイトカインに曝露されると増加する(Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。IgAリガンド結合ドメインの外側でFcαRIに結合する、A3、A59、A62、およびA77として同定される4種のFcαRI特異的モノクローナル抗体が説明されている(Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148：1764)。
【０１７５】
FcαRIおよびFcγRIは、(1)免疫エフェクター細胞、例えば、単球、PMN、マクロファージ、および樹状細胞上で主として発現され、(2)高レベルで発現され(例えば細胞当たり5,000個〜100,000個)、(3)細胞障害活性(例えば、ADCC、食作用)の媒介物であり、(4)それらを標的とする、自己抗原を含む抗原の抗原提示の亢進を媒介するため、本開示の二重特異性分子中で使用するのに好ましい誘発(trigger)受容体である。
【０１７６】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本開示の二重特異性分子中で使用され得る他の抗体には、例えば、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【０１７７】
本開示の二重特異性分子は、当技術分野において公知の方法を用いて、構成要素の結合特異性部分、例えば、抗FcR結合特異性部分および抗CD70結合特異性部分を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性部分を別々に作製し、次いで互いに結合させることができる。結合特異性部分がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合させるために、様々なカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセタート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン(cyclohaxane)-1-カルボキシラート(スルホ-SMCC)が含まれる(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160：1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：8648を参照されたい)。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229：81-83およびGlennie et al. (1987) J . Immunol. 139：2367-2375に記載されているものが含まれる。好ましい結合剤は、SATAおよびスルホ-SMCCであり、いずれも、Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
【０１７８】
結合特異性部分が抗体である場合、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してそれらを結合させることができる。特に好ましい態様において、ヒンジ領域は、結合の前に、奇数、好ましくは1個のスルフヒドリル残基を含むように改変される。
【０１７９】
あるいは、両方の結合特異性部分を同じベクター中でコードし、かつ、同じ宿主細胞中で発現させ、構築することもできる。この方法は、二重特異性分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2、またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合、特に有用である。本開示の二重特異性分子は、1つの単鎖抗体および1つの結合決定基を含む単鎖分子、または2つの結合決定基を含む単鎖の二重特異性分子でもよい。二重特異性分子は、少なくとも2つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,455,030号、米国特許第4,881,175号、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,476,786号、米国特許第5,013,653号、米国特許第5,258,498号、および米国特許第5,482,858号に記載されている。
【０１８０】
特異的標的に対する二重特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ法(RIA)、FACS解析、バイオアッセイ法(例えば増殖阻害)、またはウェスタンブロットアッセイ法によって確認することができる。これらの各アッセイ法は、一般に、関心対象の複合体に対して特異的な標識された反応物(例えば抗体)を使用することによって、具体的な関心対象のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えば、FcR-抗体複合体は、例えば、抗体-FcR複合体を認識し、かつ特異的に結合する、酵素を結合させた抗体または抗体断片を用いて検出することができる。あるいは、これらの複合体は、様々な他のイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出することもできる。例えば、抗体は、放射標識し、かつラジオイムノアッセイ法(RIA)において使用することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられるWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい)。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１８１】
薬学的組成物
別の局面において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に調剤された、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の1つまたは組合せを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。このような組成物には、1つまたは組合せの(例えば2つもしくはそれ以上の異なる)本開示の抗体、または免疫複合体もしくは二重特異性分子が含まれ得る。例えば、本開示の薬学的組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体(または免疫複合体もしくは二重特異性物質)の組合せを含み得る。
【０１８２】
本開示の薬学的組成物はまた、併用療法において、すなわち他の作用物質と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも1種の他の抗炎症性物質または免疫抑制物質と組み合わせられた、本開示の抗CD70抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療物質の例は、下記の本開示の抗体の用途に関するセクションにおいてより詳細に説明する。
【０１８３】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与(例えば、注射もしくは輸注による)に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体、または二重特異性分子は、化合物を不活性化する場合がある酸作用および他の天然の条件から化合物を保護するための材料でコーティングしてよい。
【０１８４】
本開示の薬学的化合物には、1種または複数種の薬学的に許容される塩が含まれ得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持しており、かついかなる望まれない毒物学的作用も与えない塩を意味する(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66：1-19を参照されたい)。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、および亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、ならびに、脂肪族のモノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、ならびに脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびに、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが含まれる。
【０１８５】
本開示の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤も含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例には以下のものが含まれる：(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤;(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、およびα-トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤;ならびに(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などの金属キレート剤。
【０１８６】
本開示の薬学的組成物中で使用され得る適切な水性担体および非水性担体の例には、水、エタノール、(グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなどの)ポリオール、ならびにそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射剤用の有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用によって、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０１８７】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤も含んでもよい。微生物の存在の防止は、前記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸などを含めることの両方によって徹底することができる。糖および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることもまた、望ましい場合がある。さらに、注射用の薬剤形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる作用物質を含めることによって、実現することができる。
【０１８８】
薬学的に許容される担体には、無菌の注射用溶液または注射用分散液を用時調製するための、無菌の水溶液または水性分散液および無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と適合しない場合を除いて、本開示の薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に混合することができる。
【０１８９】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則構造体として調製され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)、ならびにそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒でもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用によって、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
【０１９０】
無菌注射用溶液は、必要に応じて、前述の成分の1種または組合せと共に、適切な溶媒中で必要な量の活性化合物を混合し、続いて滅菌精密ろ過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本となる分散媒および前述したもののうち必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製する。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ法(凍結乾燥)である。
【０１９１】
単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、治療される対象および個々の投与様式に応じて変わると考えられる。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、一般に、治療的効果をもたらす組成物の量であると考えられる。一般に、100パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、約0.01パーセント〜約99パーセントの活性成分、好ましくは約0.1パーセント〜約70パーセント、最も好ましくは約1パーセント〜約30パーセントの活性成分の範囲であると考えられる。
【０１９２】
投与計画は、最適な所望の応答(例えば治療応答)を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してよく、いくつかに分割した用量を、時間をかけて投与してよく、または、治療状況の緊急性によって必要とされるように、用量を比例的に減少または増加させてよい。投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、単位剤形の非経口組成物を調剤することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療すべき対象に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を意味する。各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療的効果をもたらすように計算された、所定の量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の独特の特徴および実現すべき個々の治療的効果、ならびに(b)個体の感受性を治療するためにこのような活性化合物を調剤する技術に特有の制約によって決定され、かつこれらに直接依存する。
【０１９３】
抗体の投与の場合、投薬量は、約0.0001mg/kg〜100mg/kg(受容者体重)、およびより普通には、0.01mg/kg〜25mg/kg(受容者体重)の範囲にわたる。例えば、投薬量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、もしくは10mg/kg体重、または1mg/kg〜10mg/kgの範囲内でもよい。より多い投薬量、例えば、15mg/kg体重、20mg/kg体重、または25mg/kg体重を必要に応じて使用することができる。例示的な治療計画は、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、1ヶ月に1回、3ヶ月毎に1回、または3〜6ヶ月毎に1回の投与を伴う。本開示の抗CD70抗体の特定の投与計画は、静脈内投与を介した、1mg/kg体重または3mg/kg体重を含み、抗体は以下の投薬スケジュールのうち1つを用いて与えられる：(i)4週間毎に6回投薬、次いで3ヶ月毎;(ii)3週間毎;(iii)3mg/kg体重を1回、次いで3週間毎に1mg/kg体重。
【０１９４】
いくつかの方法において、結合特異性が異なる2種またはそれ以上の本開示の抗CD70モノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は、指示された範囲内に収まる。抗体は、通常、複数の機会に投与される。1回の投薬の間の間隔は、例えば、毎週、毎月、3ヶ月毎、または毎年でもよい。間隔は、患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則でもよい。いくつかの方法において、投薬量は、約1μg/ml〜1000μg/mlの血漿抗体濃度を実現するように調整され、かつ、いくつかの方法においては、約25μg/ml〜300μg/mlの血漿抗体濃度を実現するように調整される。
【０１９５】
あるいは、抗体は、徐放製剤として投与することができ、この場合、必要とされる投与頻度は少なくなる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、続いて、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投薬量および投与頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変動し得る。予防的適用では、比較的少ない投薬量が、長期間に渡って比較的頻度の低い間隔で投与される。一部の患者は、その後一生、治療を受け続ける。治療的適用では、比較的短い間隔で比較的多い投薬量が、疾患の進行が緩和または終結されるまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的または全面的な改善を示すまで、必要とされることがある。その後、予防的治療計画を患者に施すことができる。
【０１９６】
本開示の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、個々の患者、組成物、および投与様式に対して、患者に有毒とならずに、所望の治療応答を実現するのに効果的である活性成分の量を得るために、変更してよい。選択される投薬量レベルは、使用される本開示の個々の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排泄速度、治療期間、使用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および以前の病歴、ならびに医薬分野において周知である同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
【０１９７】
本開示の抗CD70抗体の「治療的に有効な投薬量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状の無い期間の頻度および持続期間の増大、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは能力障害の予防をもたらす。例えば、CD70+腫瘍の治療の場合、「治療的に有効な投薬量」は、好ましくは、未治療の対象に比べて、少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、および、さらにより好ましくは少なくとも約80％、細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。ある化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測に役立つ動物モデル系において評価することができる。あるいは、ある組成物のこの特性は、その化合物の阻害能力、インビトロでのそのような阻害を、当業者に公知のアッセイ法によって検査することによって評価することができる。治療的有効量の治療的化合物は、腫瘍サイズを縮小し得るか、またはそうでなければ対象の症状を改善し得る。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択される個々の組成物または投与経路のような因子に基づいてそのような量を決定できると思われる。
【０１９８】
本開示の組成物は、当技術分野において公知である1種または複数種の様々な方法を用いて、1種または複数種の投与経路を介して投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。本開示の抗体の好ましい投与経路には、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、脊髄投与、または例えば注射もしくは輸注による他の非経口投与経路が含まれる。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および輸注が含まれる。
【０１９９】
あるいは、本開示の抗体は、局所、表皮、または粘膜の投与経路など非経口ではない経路を介して、例えば、鼻腔内に、経口的に、腟経由、直腸経由、舌下、または局所的に投与することができる。
【０２００】
活性化合物は、埋め込み剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、急速な放出から化合物を保護すると考えられる担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許権を与えられているか、または、一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０２０１】
治療的組成物は、当技術分野において公知の医療器具を用いて投与することができる。例えば、好ましい態様において、本開示の治療的組成物は、米国特許第5,399,163号、同第5,383,851号、同第5,312,335号、同第5,064,413号、同第4,941,880号、同第4,790,824号、または同第4,596,556号に開示されている器具のような、針無しの皮下注入器具を用いて投与することができる。本開示において有用な周知の埋め込み剤および構成単位(module)の例には、以下が含まれる：制御された速度で医用薬剤を投与するための埋め込み可能なマイクロインフュージョンポンプを開示している米国特許第4,487,603号;皮膚を介して医薬品を投与するための治療用器具を開示している米国特許第4,486,194号;正確な輸注速度で医用薬剤を送達するための医用薬剤注入ポンプを開示している米国特許第4,447,233号;持続的な薬物送達用の流量可変な埋め込み可能輸注装置を開示している米国特許第4,447,224号;複数のチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第4,439,196号;および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第4,475,196号。これらの特許は、参照により本明細書に組み入れられる。多数の他のこのような埋め込み剤、送達系、および構成単位が、当業者に公知である。
【０２０２】
特定の態様において、本開示のヒトモノクローナル抗体を、インビボでの適切な分布を確実にするように調剤することができる。例えば、血液脳関門(BBB)は、多くの親水性の高い化合物を排除する。(所望の場合は)本開示の治療的化合物がBBBを通過するよう徹底するために、例えばリポソーム中にそれらを調剤することができる。リポソームを製造する方法に関しては、例えば、米国特許第4,522,811号、同第5,374,548号、および同第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官中に選択的に輸送され、それによって標的化された薬物送達を向上させる1種または複数種の部分を含んでもよい(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29：685を参照されたい)。例示的なターゲティング部分には、葉酸またはビオチン(例えば、Lowらによる米国特許第5,416,016号を参照されたい)、マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153：1038)、抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357：140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39：180)、サーファクタントタンパク質A受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233：134)、p120(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269：9090)が含まれる。K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346：123; J.J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4：273も参照されたい。
【０２０３】
本開示の用途および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物、および方法は、CD70の媒介による障害の診断および治療を含む、インビトロおよびインビボでの多数の診断的有用性および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養状態の細胞に、インビトロもしくはエクスビボで投与することができ、または、ヒト対象に、例えばインビボで投与して、様々な障害を治療、予防、および診断することができる。本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むと意図される。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの、哺乳動物および非哺乳動物を含む。好ましい対象には、CD70活性によって媒介される障害を有しているヒト患者が含まれる。これらの方法は、異常なCD70発現に関連した障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。CD70に対する抗体が別の作用物質と共に投与される場合、これら2つは、順番に、または同時に投与され得る。
【０２０４】
CD70に対する本開示の抗体の特異的結合を考慮すれば、本開示の抗体は、細胞表面上でのCD70発現を特異的に検出するのに使用することができ、かつさらに、イムノアフィニティー精製によってCD70を精製するのに使用することもできる。
【０２０５】
CD70は、腎細胞癌、転移性乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、および上咽頭癌を含む様々なヒト癌において発現される(Junker et al. (2005) J Urol. 173：2150-3; Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164：315-23; Held-FeindtおよびMentlein (2002) Int J Cancer 98：352-6; Hishima et al. (2000) Am J Surg Pathol. 24：742-6; Lens et al. (1999) Br J Haematol. 106：491-503)。抗CD70抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために、単独で使用され得る。あるいは、抗CD70抗体は、後述するように、他の免疫原性物質、標準的な癌治療薬、または他の抗体と組み合わせて使用され得る。
【０２０６】
本開示の抗体を用いて増殖を阻害することができる好ましい癌には、典型的に免疫療法に応答性の癌が含まれる。治療するのに好ましい癌の非限定的な例には、腎癌(例えば腎細胞癌)、乳癌、脳腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性の白血病、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、T細胞リンパ腫)、および上咽頭癌が含まれる。本開示の方法を用いて治療することができる他の癌の例には、黒色腫(例えば、転移性の悪性黒色腫)、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、幼児期の固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎う癌、中枢神経系(CNS)の新生物、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発される癌、例えば中皮腫、および前記癌の組合せが含まれる。
【０２０７】
さらに、様々な腫瘍細胞におけるCD70の発現を考慮すれば、本開示のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、腫瘍形成性障害、例えば、CD70を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害、これは例えば、明細胞RCCのような腎細胞癌(RCC)、グリア芽細胞腫、乳癌、脳腫瘍、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小型切れ込み核細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心芽細胞性/中心細胞性(cb/cc)濾胞性リンパ腫癌、B細胞性びまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症(AILD)様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔リンパ腫、胎児性癌、上咽頭の未分化癌(例えばシュミンケ腫瘍)、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および他のB細胞リンパ腫を含むがこの障害を有する対象を治療するのに使用することができる。
【０２０８】
したがって、1つの態様において、本開示は、対象において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、治療的有効量の抗CD70抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体は、(本明細書において説明するヒト抗ヒトCD70抗体のいずれかのような)ヒト抗CD70抗体である。さらに、またはあるいは、抗体は、キメラ抗CD70抗体またはヒト化抗CD70抗体でもよい。
【０２０９】
さらに、CD70とCD27との相互作用は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のような細胞媒介性自己免疫疾患においてある役割を果たしていることも提唱されている(Nakajima et al.(2000) J.Neuroimmunol. 109：188-96)。この作用は、TNF-α 産生の阻害によって部分的に媒介されていると考えられた。さらに、CD70シグナル伝達を妨害すると、CD40の媒介によるCD8+T細胞のクローン増殖が阻害され、かつ、CD8+記憶T細胞の生成が減少する(Taraban et al. (2004) J. Immunol. 173：6542-6)。したがって、本開示のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、自己免疫障害、例えば、CD70を発現するB細胞の存在を特徴とする障害、これは例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎を含むが、この障害を有する対象を治療するのに使用することができる。本開示の抗体が使用され得るその他の自己免疫障害には、全身性エリテマトーデス(SLE)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)(クローン病、潰瘍性大腸炎、およびセリアック病を含む)、多発性硬化症(MS)、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ(RA)、および糸球体腎炎が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに、本開示の抗体組成物は、移植拒絶を抑制もしくは予防するため、または、移植片対宿主疾患(GVHD)の治療において使用され得る。
【０２１０】
さらに、CD70とCD27との相互作用は、CD4+T細胞上でのシグナル伝達においてある役割を果たしていることも提唱されている。いくつかのウイルスが、CD27経路にシグナル伝達をして、中和抗体の応答を破壊することが示された(Matter et al. (2006) J Exp Med 203：2145-55)。したがって、本開示のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、肝炎(A、B、およびC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、およびCMV、エプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス(cornovirus)、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルス、ならびにリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)に起因する感染症を含む、ウイルス感染症に罹患した対象を治療するのに使用することができ、または、HIV感染症/AIDSの治療において使用することができる。さらに、本開示のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、TNF-α産生を阻害するために使用することもできる。
【０２１１】
1つの態様において、本開示の抗体(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに組成物)を用いて、CD70のレベル、または膜表面にCD70を含む細胞のレベルを検出することができ、これらのレベルは、次いで、特定の疾患症状に関係付けることができる。あるいは、これらの抗体を用いて、CD70機能を阻害または妨害することもできる。CD70機能は、次いで、特定の疾患症状の予防または改善に関係付けることができ、その結果、CD70が疾患の媒介物として示唆される。これは、抗体とCD70との複合体形成を可能にする条件下で、実験試料および対照試料を抗CD70抗体と接触させることによって実現することができる。実験試料および対照試料において、抗体とCD70との間で形成された任意の複合体を検出し、かつ、比較する。
【０２１２】
別の態様において、本開示の抗体(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに組成物)を、治療的用途または診断的用途に関連する結合活性について、インビトロで最初に試験することができる。
例えば、本開示の組成物は、下記の実施例において説明するフローサイトメトリーアッセイ法を用いて試験することができる。
【０２１３】
本開示の抗体(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、免疫複合体、ならびに組成物)は、CD70に関係した疾患の治療法および診断においてさらなる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子または二重特異性分子、および免疫複合体を用いて、以下の1種または複数腫の生物活性をインビボまたはインビトロで誘発することができる：CD70を発現する細胞の増殖を阻害すること、および/もしくはそのような細胞を死滅させること;ヒトエフェクター細胞の存在下で、CD70を発現する細胞の食作用もしくはADCCを媒介すること;またはCD70へのCD70リガンドの結合を妨害すること。
【０２１４】
特定の態様において、抗体(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに組成物)は、CD70に関係した様々な疾患をインビボで治療、予防、または診断するのに使用される。CD70に関係した疾患の例には、とりわけ、自己免疫障害、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、癌、明細胞RCCのような腎細胞癌(RCC)、グリア芽細胞腫、乳癌、脳腫瘍、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小型切れ込み核細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心芽細胞性/中心細胞性(cb/cc)濾胞性リンパ腫癌、B細胞性びまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症(AILD)様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔リンパ腫、胎児性癌、上咽頭の未分化癌(例えばシュミンケ腫瘍)、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および他のB細胞リンパ腫が含まれる。
【０２１５】
本開示の抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに免疫複合体)をインビボおよびインビトロで投与するのに適した経路は当技術分野において周知であり、かつ当業者によって選択され得る。例えば、抗体組成物は、注射(例えば、静脈内または皮下)によって投与することができる。使用する分子の適切な投薬量は、対象の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および/または配合に依存する。
【０２１６】
前述したように、本開示のヒト抗CD70抗体は、1種または複数種の他の治療物質、例えば、細胞障害性物質、放射毒性物質、または免疫抑制物質と同時投与してよい。抗体は、(イムノコンプレックスとして)作用物質に連結させてよく、または作用物質とは別に投与してよい。後者の場合(個別投与)、抗体は、作用物質の前、後、もしくは同時に投与してよく、または、他の公知の療法、例えば、抗癌療法、例えば、放射線療法と同時に投与してよい。このような治療物質には、とりわけ、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラスチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗腫瘍剤が含まれ、これらは、それら自体では、患者に毒性または準毒性のレベルでのみ有効である。シスプラスチンは、4週毎に1回、100mg/用量として静脈内投与され、アドリアマイシンは、21日毎に1回、60mg/ml〜75mg/mlの用量として静脈内投与される。本開示のヒト抗CD70抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法物質との同時投与により、ヒト腫瘍細胞に細胞障害作用をもたらす異なるメカニズムを介して機能する2種の抗癌物質が提供される。このような同時投与により、薬物耐性の発生、または抗体との反応性を低下させると考えられる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【０２１７】
標的特異的なエフェクター細胞、例えば、本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子、および二重特異性分子) に連結されたエフェクター細胞もまた、治療物質として使用することができる。ターゲティング用のエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球、または単球などのヒト白血球でもよい。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞、および他のIgG受容体またはIgA受容体を有する細胞が含まれる。望ましいならば、エフェクター細胞は、治療しようとする対象から得ることができる。標的特異的なエフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液中の細胞懸濁液として投与することができる。投与する細胞の数は、108個〜109個程度でもよいが、治療目的に応じて変動すると考えられる。一般に、この量は、標的細胞、例えば、CD70を発現する腫瘍細胞での局在化を実現し、かつ、例えば食作用による細胞死滅化をもたらすのに十分であると考えられる。投与経路もまた、様々でもよい。
【０２１８】
標的特異的なエフェクター細胞を用いた治療法は、標的とされた細胞を除去するための他の技術と組み合わせて実施することができる。例えば、本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子、および二重特異性分子)ならびに/または、これらの組成物を備えたエフェクター細胞を使用する抗腫瘍療法は、化学療法と組み合わせて使用することができる。さらに、組合せ免疫療法を用いて、2種の異なる細胞障害性エフェクター集団を、腫瘍細胞拒絶に対して誘導することもできる。例えば、抗Fc-γRIまたは抗CD3に連結された抗CD70抗体は、IgG受容体またはIgA受容体に特異的な結合物質と組み合わせて使用することができる。
【０２１９】
本開示の二重特異性分子および多重特異性分子はまた、例えば、細胞表面上の受容体のキャッピングおよび脱離によって、エフェクター細胞上のFcγRまたはFcγRレベルを調節するのに使用することもできる。抗Fc受容体の混合物もまた、この目的のために使用することができる。
【０２２０】
補体に結合するIgG1、IgG-2、もしくはIgG-3、またはIgM由来の部分のような、補体結合部位を有する本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに免疫複合体)もまた、補体の存在下で使用することができる。1つの態様において、本開示の結合物質を有する標的細胞および適切なエフェクター細胞を含む細胞集団のエクスビボでの処置は、補体または補体を含む血清の添加によって補完することができる。本開示の結合物質でコーティングされた標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善することができる。別の態様において、本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子)でコーティングされた標的細胞を、補体によって溶解させることもできる。さらに別の態様において、本開示の組成物は、補体を活性化しない。
【０２２１】
本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに免疫複合体)はまた、補体と共に投与することもできる。したがって、ヒト抗体、多重特異性分子もしくは二重特異性分子、および血清、または補体を含む組成物は、本開示の範囲内である。これらの組成物は、補体が、ヒト抗体、多重特異性分子、または二重特異性分子の極めて近くに位置しているという点で、有利である。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性分子、または二重特異性分子、および補体または血清は、別々に投与することもできる。
【０２２２】
本開示の抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性分子もしくは多重特異性分子、または免疫複合体)および使用するための取扱い説明書を含むキットもまた、本開示の範囲内である。キットは、免疫抑制反応物、細胞障害性物質、もしくは放射毒性物質など1種もしくは複数種の付加的な反応物、または、1種もしくは複数種の付加的な本開示のヒト抗体(例えば、第1のヒト抗体とは異なるCD70抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体)をさらに含んでもよい。
【０２２３】
したがって、本開示の抗体組成物で治療する患者に、ヒト抗体の治療的効果を向上させるか、または増強する細胞障害性物質または放射毒性物質など別の治療物質を、(本開示のヒト抗体の投与の前、同時、または後に)さらに投与することができる。
【０２２４】
他の態様において、例えば、対象をサイトカインで処置することによって、FcγまたはFcγ受容体の発現または活性を調節する、例えば、増強または阻害する作用物質で、対象をさらに処置することができる。多重特異性分子を用いた治療期間中に投与するための好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、および腫瘍壊死因子(TNF)が含まれる。
【０２２５】
本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子、および二重特異性分子)は、FcγRまたはCD70を発現する細胞を標的とするために、例えば、そのような細胞を標識するために使用することもできる。このような用途のために、結合物質を、検出できる分子に連結することができる。したがって、本開示は、FcγRのようなFc受容体またはCD70を発現する細胞をエクスビボまたはインビトロで位置決定するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子でもよい。
【０２２６】
特定の態様において、本開示は、試料中のCD70抗原の存在を検出するか、またはCD70抗原の量を測定するための方法であって、抗体またはその一部分とCD70との複合体の形成を可能にさせる条件下で、試料および対照試料を、CD70に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる段階を含む方法を提供する。次いで、複合体の形成を検出し、その際、試料との複合体形成が対照試料と比べて異なる場合、試料中にCD70抗原が存在することが暗示される。
【０２２７】
さらに別の態様において、本開示の免疫複合体は、標的化合物(例えば、治療物質、標識、サイトトキシン、放射性毒素、免疫抑制薬など)を、それらの化合物を抗体に連結することによって、CD70の細胞表面受容体を有する細胞に導くために使用することができる。例えば、抗CD70抗体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,281,354号および同第6,548,530号、米国特許出願公開第20030050331号、同第20030064984号、同第20030073852号、および同第20040087497号において説明されているか、または、WO 03/022806において公開されている、毒素化合物のいずれかに結合させることができる。したがって、本開示は、(例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子など検出可能な標識を用いて)、CD70を発現する細胞をエクスビボまたはインビトロで位置決定するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体は、サイトトキシンまたは放射性毒素をCD70に導くことによって、CD70の細胞表面受容体を有する細胞を死滅させるのに使用することもできる。
【０２２８】
本開示は、さらに限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本出願の全体にわたって引用されるすべての図面、ならびにすべての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【０２２９】
実施例
実施例1：CD70に対するヒトモノクローナル抗体の作製
抗原
免疫化プロトコールは、2つのmyc-Hisタグと融合させた組換えヒトCD70を抗原として使用した。あるいは、腎癌細胞株786-O(ATCCアクセッション番号CRL-1932)を使用し、腎癌細胞株A-498(ATCCアクセッション番号HTB-44)で追加免疫する全細胞免疫化を、いくつかの免疫化において使用した。
【０２３０】
トランスジェニックHuMAb Mouse(登録商標)およびKM Mouse(登録商標)
CD70に対する完全なヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子をそれぞれ発現する、HuMabトランスジェニックマウスのHCo7系統、HCo12系統、およびHCo17系統、ならびに染色体導入されたトランスジェニックマウスのKM系統を用いて調製した。これらのマウス系統において、内因性のマウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993) EMBO J. 12：811-820で説明されているように、ホモ接合性に破壊されており、かつ内因性のマウス重鎖遺伝子は、PCT公報WO 01/09187の実施例1で説明されているように、ホモ接合性に破壊されている。さらに、このマウス系統は、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14：845-851に記載されているヒトκ軽鎖導入遺伝子のKCo5、およびPCT公報WO 01/09187の実施例2に記載されているヒト重鎖導入遺伝子のHCo7、HCo12、またはHCo17を有する。KM Mouse(登録商標)系統は、PCT公報WO 02/43478に記載されているSC20導入染色体を含む。
【０２３１】
HuMabおよびKM免疫化：
CD70に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するために、HuMAb Mouse(登録商標)およびKM Mouse(登録商標)のマウスを、抗原としての組換えヒトCD70または細胞表面でCD70を発現する全細胞で免疫化した。HuMabマウスに対する一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474)：856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14：845-851、およびPCT公報WO 98/24884に記載されている。マウスは、抗原の初回注入時に6〜16週齢であった。5〜10×106個の細胞を用いて、腹腔内(IP)経由、皮下(Sc)経由、または足蹠注射によって、HuMabマウスを免疫化した。
【０２３２】
トランスジェニックマウスを、完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバント中の抗原で、腹腔内経由で2回免疫化し、続いて、不完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバント中の抗原で、腹腔内経由で3日〜21日(最多で合計11回の免疫化)免疫化した。免疫応答は、眼窩後からの採血によってモニターした。(後述のように)ELISAおよびFACSによって血漿をスクリーニングし、かつ、十分な力価の抗CD70ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用した。屠殺および膵臓切除の3日前に、静脈内経由でマウスに抗原を追加免疫した。典型的には、各抗原に対して10回〜35回の融合を実施した。数十匹のマウスを各抗原に対して免疫化した。
【０２３３】
抗CD70抗体を産生するHuMab Mouse(登録商標)またはKM Mouse(登録商標)の選択
CD70に結合した抗体を産生するHuMab Mouse(登録商標)またはKM Mouse(登録商標)を選択するために、免疫化したマウスに由来する血清を、組換えヒトCD70を発現する細胞株に結合するが、CD70を発現しない対照細胞株には結合しないかに関して、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。さらに、786-O細胞またはA-498細胞への結合に関して、フローサイトメトリーによって血清をスクリーニングした。手短に言えば、CD70を発現するCHO細胞、786-O細胞、またはA498細胞を1：20で希釈した抗CD70抗体と共にインキュベートすることによって、抗CD70抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。CD70を発現するCHO細胞に結合したが、CD70を発現しない親CHO細胞に結合しなかった抗体を、Fishwild, D. et al. (1996)によって説明されているように、ELISAによって、CD70への結合に関してさらに試験した。手短に言えば、マイクロタイタープレートを、PBS中に1μg/ml〜2μg/mlで溶かしたトランスフェクトCHO細胞由来の精製組換えCD70融合タンパク質100μl/ウェルでコーティングし、4℃で一晩インキュベートし、次いで、200μl/ウェルのPBS/Tween(0.05％)中5％ニワトリ血清でブロッキングした。CD70免疫化マウス由来の血清の希釈物を各ウェルに添加し、かつ周囲温度で1時間〜2時間インキュベートした。これらのプレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合させたヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体と共に、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、これらのプレートをABTS基質(Sigma, A-1888, 0.22mg/ml)を用いて発色させ、かつ分光光度計により、OD415〜495で解析した。最も高力価の抗CD70抗体を示したマウスを融合に使用した。後述するように融合を実施し、かつ、ハイブリドーマ上清の抗CD70活性をELISAによって試験した。
【０２３４】
CD70に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
HuMabマウス(登録商標)および/またはKMマウス(登録商標)から単離したマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに基づいたPEG、またはCyto Pulse大チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を使用する電場に基づく電気融合法のいずれかを用いて、マウス骨髄腫細胞株に融合させた。次いで、結果として生じるハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。免疫化マウス由来の脾細胞の単細胞懸濁液を、50％PEG(Sigma)を用いて、4分の1の数のSP2/0非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1581)に融合させた。細胞を約1×105個/ウェルで平底マイクロタイタープレート中に播種し、続いて、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含み、かつ、10％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、18％ P388DI馴化培地、5％Origen Hybridomaクローニング因子(BioVeris, Gaithersburg, VA)、4mM L-グルタミン、5mM HEPES、0.055mM β-メルカプトエタノール、50ユニット/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン、および1×ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(HAT)培地(Sigma;HATは融合後24時間目に添加する)をさらに含む高グルコースDMEM培地(Mediatech, Inc., Herndon, VA)中で1週間インキュベーションした。1週間後、細胞を、使用されるHATをHTに交換した培地中で培養した。次いで、個々のウェルを、(前述の)FACSまたはELISAにより、ヒト抗CD70モノクローナルIgG抗体についてスクリーニングした。大規模なハイブリドーマ増殖が一度起こったら、通常10日〜14日後に培地を観察した。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種し、再びスクリーニングし、かつ、ヒトIgGについて依然として陽性である場合は、抗CD70モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングした。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらに特徴付けするために組織培養培地中で少量の抗体を生成させた。
【０２３５】
ハイブリドーマクローン2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7を、さらに解析するために選択した。
【０２３６】
実施例2
ヒトモノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7の構造的特徴付け
2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードしているcDNA配列を、標準的なPCR技術を用いて、それぞれ、2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7ハイブリドーマから獲得し、かつ、標準的なDNA配列決定技術を用いて配列決定した。
【０２３７】
2H5の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図1A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：41およびSEQ ID NO：1に示す。
【０２３８】
2H5の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図1B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：46およびSEQ ID NO：6に示す。
【０２３９】
2H5重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、2H5重鎖が、ヒト生殖系列VH3-30.3由来のVHセグメント、未決定のDセグメント、およびヒト生殖系列JH4b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH3-30.3配列に対する2H5 VH配列のアライメントを図6に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて2H5 VH配列をさらに解析して、図1Aおよび図6、ならびに、それぞれSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、およびSEQ ID NO：21に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２４０】
2H5軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、2H5軽鎖が、ヒト生殖系列VK L6由来のVLセグメントおよびヒト生殖系列JK4由来のJKセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK L6配列に対する2H5 VL配列のアライメントを図9に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて2H5 VL 配列をさらに解析して、図1Bおよび図9、ならびに、それぞれSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、およびSEQ ID NO：36に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２４１】
10B4の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図2A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：2に示す。
【０２４２】
10B4の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図2B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：47およびSEQ ID NO：7に示す。
【０２４３】
10B4重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、10B4重鎖が、ヒト生殖系列VH 3-30.3由来のVHセグメント、ヒト生殖系列4-11由来のDセグメント、およびヒト生殖系列JH4b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH3-30.3配列に対する10B4 VH配列のアライメントを図6に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて10B4 VH配列をさらに解析して、図2Aおよび図6、ならびに、それぞれSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、およびSEQ ID NO：22に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２４４】
10B4軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、10B4軽鎖が、ヒト生殖系列VK L18由来のVLセグメントおよびヒト生殖系列JK3由来のJKセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK L18配列に対する10B4 VL配列のアライメントを図10に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて10B4 VL配列をさらに解析して、図2Bおよび図10、ならびに、それぞれSEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32、およびSEQ ID NO：37に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２４５】
8B5の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図3A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：43およびSEQ ID NO：3に示す。
【０２４６】
8B5の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図3B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：48およびSEQ ID NO：8に示す。
【０２４７】
8B5重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、8B5重鎖が、ヒト生殖系列VH 3-33由来のVHセグメント、ヒト生殖系列3-10由来のDセグメント、およびヒト生殖系列JH4b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH 3-33配列に対する8B5 VH配列のアライメントを図7に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて8B5 VH配列をさらに解析して、図3Aおよび図7、ならびに、それぞれSEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：23に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２４８】
8B5軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、8B5軽鎖が、ヒト生殖系列VK L15由来のVLセグメントおよびヒト生殖系列JK4由来のJKセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK L15配列に対する8B5 VL配列のアライメントを図11に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて8B5 VL配列をさらに解析して、図3Bおよび図11、ならびに、それぞれSEQ ID NO：28、SEQ ID NO：33、およびSEQ ID NO：38に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２４９】
18E7の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図4A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：44およびSEQ ID NO：4に示す。
【０２５０】
18E7の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図4B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：49およびSEQ ID NO：9に示す。
【０２５１】
18E7重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、18E7重鎖が、ヒト生殖系列VH 3-33由来のVHセグメント、ヒト生殖系列3-10由来のDセグメント、およびヒト生殖系列JH4b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH 3-33配列に対する18E7 VH配列のアライメントを図7に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて18E7 VH配列をさらに解析して、図4Aおよび図7、ならびに、それぞれSEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：24に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２５２】
18E7軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、18E7軽鎖が、ヒト生殖系列VK L15由来のVLセグメントおよびヒト生殖系列JK4由来のJKセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK L15配列に対する18E7 VL配列のアライメントを図11に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて18E7 VL配列をさらに解析して、図4Bおよび図11、ならびに、それぞれSEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：39に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２５３】
69A7の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図5A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：45およびSEQ ID NO：5に示す。
【０２５４】
69A7の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図5B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：50およびSEQ ID NO：10に示す。
【０２５５】
69A7重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、69A7重鎖が、ヒト生殖系列VH 4-61由来のVHセグメント、ヒト生殖系列4-23由来のDセグメント、およびヒト生殖系列JH 4b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH 4-61配列に対する69A7 VH配列のアライメントを図8に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて69A7 VH配列をさらに解析して、図5Aおよび図9、ならびに、それぞれSEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、およびSEQ ID NO：25に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２５６】
69A7軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、69A7軽鎖が、ヒト生殖系列VK L6由来のVLセグメントおよびヒト生殖系列JK4由来のJKセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK L6配列に対する69A7 VL配列のアライメントを図12に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて69A7 VL配列をさらに解析して、図5Bおよび図12、ならびに、それぞれSEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、およびSEQ ID NO：40に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域に線を引いた。
【０２５７】
実施例3
抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合特異性の特徴付け
免疫精製したCD70に結合する際の抗CD70抗体の比較を標準的なELISAによって実施して、CD70に対する結合の特異性を検査した。
【０２５８】
mycタグ付き組換えCD70でプレートを一晩コーティングし、次いで、抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、18E7、および69A7に対する結合に関して試験した。標準的なELISA手順を実施した。抗CD70ヒトモノクローナル抗体を1μg/mlの濃度で添加し、かつ、1：2の段階希釈で減量した(titrated down)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合させたヤギ抗ヒトIgG(Fcまたはκ鎖に特異的な)ポリクローナル抗体を二次抗体として使用した。これらの結果を図13に示す。抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5、10B4、8B5、および18E7は、高い特異性でCD70に結合した。
【０２５９】
実施例4
腎癌癌細胞株の表面で発現されるCD70に結合する抗CD70抗体の特徴付け
抗CD70抗体を、細胞表面でCD70を発現する腎細胞癌細胞への結合に関して、フローサイトメトリーによって試験した。
【０２６０】
腎細胞癌細胞株A-498 (ATCCアクセッション番号HTB-44)、786-O (ATCCアクセッション番号CRL-1932)、ACHN (ATCCアクセッション番号CRL-1611)、Caki-1(ATCCアクセッション番号HTB-46)およびCaki-2(ATCCアクセッション番号HTB-47)を、抗体結合に関してそれぞれ試験した。1×105個の細胞を濃度1μg/mlの2H5と共にインキュベートすることによって、HuMAb 2H5抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図14に示す。抗CD70モノクローナル抗体2H5は、腎癌細胞株A-498、786-O、ACHN、Caki-1、およびCaki-2に結合した。
【０２６１】
腎細胞癌細胞株786-OおよびA-498を、様々な濃度のHuMAb抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5、8B5、10B4、および18E7の結合に関して試験した。5×105個の細胞を開始濃度50μg/mlの抗体と共にインキュベートし、かつ、1：3の希釈率で抗体を連続的に希釈することによって、抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、PE標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図15A(786-O)および図15B(A-498)に示す。抗CD70モノクローナル抗体2H5、8B5、10B4、および18E7は、染色の平均蛍光強度(MFI)によって測定されるように、濃度依存的な様式で腎癌細胞株786-OおよびA-498に結合した。抗CD70モノクローナル抗体のEC50値は、786-O細胞株の場合は1.844nM〜6.669nMの範囲であり、A-498細胞株の場合は3.984nM〜11.84nMの範囲であった。
【０２６２】
2×105個の細胞を濃度10μg/mlの2H5または69A7のいずれかと共にインキュベートすることによって、HuMAb 2H5抗CD70ヒトモノクローナル抗体およびHuMAb 69A7抗CD70ヒトモノクローナル抗体の腎細胞癌細胞株786-Oへの結合を評価した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図15Cに示す。どちらの抗CD70モノクローナル抗体も、腎癌細胞株786-Oに結合した。
【０２６３】
腎細胞癌細胞株786-Oを、様々な濃度のHuMAb抗CD70ヒトモノクローナル抗体69A7の結合に関して試験した。5×105個の細胞を開始濃度10μg/mlの抗体と共にインキュベートし、かつ、1：3の希釈率で抗体を連続的に希釈することによって、抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、PE標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図15Dに示す。抗CD70モノクローナル抗体69A7は、染色の平均蛍光強度(MFI)によって測定されるように、濃度依存的な様式で腎癌細胞株786-Oに結合した。786-O細胞に対する抗CD70モノクローナル抗体69A7結合のEC50値は、6.927nMであった。
【０２６４】
これらのデータにより、抗CD70HuMAbが腎細胞癌細胞株に結合することが実証される。
【０２６５】
実施例5
リンパ腫細胞株の表面で発現されるCD70に結合する抗CD70抗体の特徴付け
抗CD70抗体を、細胞表面でCD70を発現するリンパ腫細胞への結合に関して、フローサイトメトリーによって試験した。
【０２６６】
リンパ腫細胞株Daudi(ATCCアクセッション番号CCL-213)、HuT78(ATCCアクセッション番号TIB-161)、およびRaji(ATCCアクセッション番号CCL-86)を、抗体結合に関してそれぞれ試験した。1×105個の細胞を濃度1μg/mlの2H5と共にインキュベートすることによって、HuMAb 2H5抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。細胞表面でCD70を発現しないジャーカット細胞株を陰性対照として使用した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図16に示す。抗CD70モノクローナル抗体2H5は、染色の平均蛍光強度(MFI)によって測定されるように、リンパ腫細胞株Daudi、HuT78、およびRajiに結合した。
【０２６７】
リンパ腫細胞株RajiおよびGranta519(DSMZアクセッション番号342)を、様々な濃度のHuMAb抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5の結合に関して試験した。5×105個の細胞を開始濃度50μg/mlの抗体と共にインキュベートし、かつ、1：3の希釈率で抗体を連続的に希釈することによって、抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。これらの細胞を洗浄し、かつ、PE標識抗ヒトIgGAbを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図17A (Raji)および図17B(Granta 519)に示す。抗CD70モノクローナル抗体2H5は、染色の平均蛍光強度(MFI)によって測定されるように、濃度依存的な様式でリンパ腫細胞株RajiおよびGranta519に結合した。抗CD70抗体のEC50値は、Raji細胞の場合は1.332 nMであり、Granta 519細胞の場合は1.330nMであった。
【０２６８】
2×105個の細胞を濃度10μg/mlのHuMAbと共にインキュベートすることによって、HuMAb 2H5抗CD70ヒトモノクローナル抗体およびHuMAb 69A7抗CD70ヒトモノクローナル抗体のRajiリンパ腫細胞株への結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独を陰性対照として使用した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図17Cに示す。どちらの抗CD70モノクローナル抗体も、染色の平均蛍光強度(MFI)によって測定されるように、Rajiリンパ腫細胞株に結合した。
【０２６９】
2H5に対する69A7の結合特異性を解明するために、競合FACSアッセイ法を実施した。Raji細胞を、濃度10μg/mlの裸の69A7、2H5、アイソタイプ対照抗体と共に、または抗体無しでインキュベートした。洗浄後、これらの細胞を、濃度10μg/mlのFITC結合69A7と共にインキュベートした。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図17Dに示す。抗CD70抗体69A7および2H5の両方とも、FITC標識69A7の結合を妨害したことから、2H5および69A7の両方とも同様の結合エピトープを共有することが示唆された。
【０２７０】
Daudiリンパ腫細胞株および786-O腎癌細胞を、抗体結合に関してさらに試験した。2×105個の細胞を濃度1μg/mlの69A7と共にインキュベートすることによって、HuMAb 69A7抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。細胞表面でCD70を発現しないジャーカット細胞株を陰性対照として使用した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図17Eに示す。抗CD70モノクローナル抗体69A7は、染色の平均蛍光強度(MFI)によって測定されるように、Daudiリンパ腫細胞株および786-O腎癌細胞株に結合した。
【０２７１】
これらのデータにより、抗CD70HuMAbがリンパ腫細胞株に結合することが実証される。
【０２７２】
実施例6
抗CD70モノクローナル抗体の結合親和性のスキャッチャード解析
モノクローナル抗体2H5、8B5、10B4、および18E7の結合親和性を、CD70をトランスフェクトしたCHO細胞株に対する結合親和性に関して、スキャッチャード解析を用いて試験した。
【０２７３】
標準的な技術を用いて、CHO細胞に完全長CD70をトランスフェクトし、かつ、10％ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI培地中でそれらの細胞を増殖させた。細胞をトリプシン処理し、Trisベースの結合緩衝液(24mM Tris pH7.2、137mM NaCl、2.7mM KCl、2mMグルコース、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1％BSA)中で1回洗浄し、かつ、これらの細胞を結合緩衝液中で2×106細胞/mlに調整した。Milliporeプレート(MAFB NOB)を、水に溶かした1％脱脂乾燥乳でコーティングし、かつ、4℃で一晩保存した。プレートを、結合緩衝液0.2mlで3回洗浄した。50マイクロリットルの緩衝液のみを、最大結合ウェルに添加した(全結合量)。25マイクロリットルの緩衝液のみを、対照ウェルに添加した(非特異的結合)。様々な濃度の125I抗CD70抗体を、体積25μlで、すべてのウェルに添加した。100倍過剰な様々な濃度の非標識抗体を、体積25μlで、対照ウェルに添加し、かつ、結合緩衝液中のCD70をトランスフェクトさせたCHO細胞25μl(2×106細胞/ml)をすべてのウェルに添加した。これらのプレートを、200RPM、4℃で2時間、振とう機上でインキュベートした。インキュベーションの完了時に、Milliporeプレートを、冷洗浄緩衝液(24mM Tris pH 7.2、500mM NaCl、2.7mM KCl、2mMグルコース、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1％ BSA)0.2 mlで3回洗浄した。フィルターを取り出し、ガンマカウンター中で計数した。Prismソフトウェア(San Diego、CA)により、単一部位結合パラメーターを用いて、平衡結合の評価を実施した。
【０２７４】
前述のスキャッチャード結合アッセイ法を用いると、CD70をトランスフェクトさせたCHO細胞に対する抗体のKDは、2H5の場合は約2.1nM、8B5の場合は約5.1nM、10B4の場合は約1.6nM、および18E7の場合は約1.5nMであった。
【０２７５】
実施例7
抗CD70モノクローナル抗体の内部移行
Hum-Zap内部移行アッセイ法を用いて、抗CD70HuMAbが、CD70を発現する腎癌細胞中に内部移行する能力に関して試験した。Hum-Zapアッセイ法では、毒素サポリンに結合されたヒトIgGに対する親和性を有する二次抗体の結合を介した、ヒト一次抗体の内部移行に関して試験する。
【０２７６】
CD70を発現する腎癌癌細胞株786-Oを、100μlウェル中に1.25×104細胞/ウェルで一晩播種した。抗CD70HuMAb抗体2H5、8B5、10B4、または18E7を、開始濃度30nMでウェルに添加し、かつ、1：3の段階希釈で減量した。CD70に対して非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。Hum-Zap(Advanced Targeting Systems、San Diego、CA、IT-22-25)を濃度11nMで添加し、かつ、プレートを72時間インキュベートさせた。次いで、これらのプレートを1.0μCiの3H-チミジンで24時間パルス標識し、回収し、かつ、Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments、Meriden、CT)で読み取った。これらの結果を図18に示す。抗CD70抗体2H5、8B5、10B4、および18E7は、CD70を発現する786-O腎癌癌細胞において、3H-チミジン取込みの抗体濃度に依存的な減少を示した。抗CD70抗体2H5のEC50値は、0.9424nMであった。このデータにより、抗CD70抗体2H5、8B5、10B4、および18E7が、腎癌癌細胞株に内部移行することが実証される。
【０２７７】
実施例8
腎細胞癌細胞株に対する、毒素を結合させた抗CD70抗体の細胞死滅化の評価
本実施例では、毒素に結合させた抗CD70モノクローナル抗体がCD70+腎細胞癌細胞株を死滅させる能力に関して、細胞増殖アッセイ法において試験した。
【０２７８】
抗CD70HuMAb抗体2H5、8B5、10B4、または18E7を、ペプチジルリンカー、ヒドラゾンリンカー、またはジスルフィドリンカーなどのリンカーを介して、毒素に結合させた。CD70を発現する腎癌癌細胞株ACHNおよびCaki-2を2.5×104細胞/ウェルで播種し、かつ、CD70を発現する腎癌癌細胞株786-Oを1.25×104細胞/ウェルで、100μlウェル中に3時間、播種した。抗CD70抗体-毒素結合体を、開始濃度30nMでウェルに添加し、かつ、1：3の段階希釈で減量した。CD70に対して非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。プレートを69時間インキュベートさせた。次いで、これらのプレートを1.0μCiの3H-チミジンで24時間パルス標識し、回収し、かつ、Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments、Meriden、CT)で読み取った。これらの結果を図19A(Caki-2)、図19B(786-O)、および図19C(ACHN)に示す。抗CD70抗体2H5、8B5、10B4、および18E7は、CD70を発現するCaki-2、786-O、およびACHN腎癌癌細胞において、3H-チミジン取込みの抗体-毒素濃度に依存的な減少を示した。抗CD70抗体のEC50値は、CAKI-2細胞の場合は6.728nM〜76.05nMの範囲であり、786-O細胞の場合は1.635nM〜3.940nMの範囲であり、ACHN細胞の場合は9.406nM〜108.5nMの範囲であった。このデータにより、抗CD70抗体2H5、8B5、10B4、および18E7が、毒素に結合された場合に、腎癌癌細胞に対して細胞障害性であることが実証される。
【０２７９】
実施例9
抗CD70抗体のADCC活性の評価
本実施例では、抗CD70モノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存性細胞障害(ADCC)によってCD70+細胞株を死滅させる能力に関して、蛍光細胞障害性アッセイ法において試験した。
【０２８０】
ヒトエフェクター細胞は、以下のようにして、全血から調製した。標準的なフィコールパック(Ficoll-paque)分離法によって、ヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製した。これらの細胞を、10％FBSおよび200U/mlヒトIL-2を含有するRPMI1640培地中に再懸濁し、かつ、37℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を採取し、培地中で4回洗浄し、かつ、2×107細胞/mlで再懸濁した。標的のCD70+細胞を、1×106標的細胞/mL当たりBATDA 2.5μlのBATDA試薬(Perkin Elmer、Wellesley、MA)と共に、37℃で20分間インキュベートした。標的細胞を4回洗浄し、遠心沈殿させ、かつ、最終体積を1×105細胞/mlに調整した。
【０２８１】
以下のようにDelfia蛍光発光解析を用いて、CD70+細胞株ARH-77(ヒトBリンパ芽球白血病;ATCCアクセッション番号CRL-1621)、HuT78(ヒト皮膚リンパ球リンパ腫;ATCCアクセッション番号TIB-161)、Raji(ヒトBリンパ球バーキットリンパ腫;ATCCアクセッション番号CCL-86)、および陰性対照細胞株L540(ヒトホジキンリンパ腫;DSMZデポジット番号ACC72)を、ヒト抗CD70モノクローナル抗体に対する抗体特異的なADCCに関して試験した。各標的細胞株(標識した標的細胞100μl)を、エフェクター細胞50μlおよび抗体50μlと共にインキュベートした。標的とエフェクターの比1：50を、実験の全体を通して使用した。すべての研究において、ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。2000rpmでのパルススピンおよび37℃で1時間のインキュベーションの後、上清を採取し、再び高速で遠心し、かつ、上清20μlを平底プレートに移し、そこへEu溶液180μl(Perkin Elmer、Wellesley、MA)を添加し、RubyStarリーダー(BMG Labtech)中で読み取った。溶解率(％)を以下のようにして算出した：(試料からの放出量−自発的放出量*100)/(最大放出量−自発的放出量)。式中、自発的放出量は、標的細胞のみを含むウェルからの蛍光であり、最大放出量は、標的細胞を含み、2％ Triton-Xで処理されたウェルからの蛍光である。ARH-77細胞株、HuT78細胞株、Raji細胞株、およびL-540細胞株に対する細胞障害性の溶解率(％)を、図20A〜図20Dにそれぞれ示す。CD70+を発現する細胞株ARH-77、HuT78、およびRajiはそれぞれ、HuMAb抗CD70抗体である2H5および18E7を用いた、抗体を介した細胞障害性を示したが、陰性対照の細胞株L-540は、抗CD70抗体の存在下で、感知できる細胞障害性を有していなかった。このデータにより、HuMAb抗CD70抗体が、CD70+を発現する細胞に対して特異的な細胞障害性を示すことが実証される。
【０２８２】
実施例10
ヒトリンパ腫細胞株に対する、毒素を結合させた抗CD70抗体の細胞死滅化の評価
本実施例では、毒素に結合させた抗CD70モノクローナル抗体がCD70+ヒトリンパ腫細胞株を死滅させる能力に関して、細胞増殖アッセイ法において試験した。
【０２８３】
抗CD70HuMAb抗体2H5を、ペプチジルリンカー、ヒドラゾンリンカー、またはジスルフィドリンカーなどのリンカーを介して、毒素に結合させた。本開示の抗体に結合させることができる毒素化合物の例は、2005年9月26日に出願した、代理人整理番号04280/100M629US3の同時出願において説明している。CD70を発現するヒトリンパ腫癌細胞株Daudi、HuT78、Granta519、およびRajiを、100μlウェル中に105細胞/ウェルで3時間播種した。抗CD70抗体-毒素結合体を、開始濃度30nMでウェルに添加し、かつ、1：2の段階希釈で減量した。HuMAb抗体2H5-毒素結合体は、細胞表面でCD70を発現しない陰性対照細胞株であるジャーカット細胞においても試験した。プレートを72時間インキュベートさせた。次いで、これらのプレートを0.5μCiの3H-チミジンで8時間パルス標識した後、培養を終了し、培養物を回収し、かつ、Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments)で読み取った。図21は、Daudi細胞、HuT78細胞、Granta519細胞、およびジャーカット細胞に対する2H5結合体の効果を示した。抗CD70抗体2H5は、CD70を発現するB細胞リンパ腫癌細胞のDaudi、HuT78、およびGranta519において、3H-チミジン取込みの抗体-毒素濃度に依存的な減少を示したが、ジャーカット細胞においては示さなかった。
【０２８４】
別のアッセイ法において、CD70を発現するヒトリンパ腫癌細胞株Rajiを、100μlウェル中に104細胞/ウェルで3時間播種した。抗CD70抗体-毒素結合体を、開始濃度30nMでウェルに添加し、かつ、1：3の段階希釈で減量した。毒素を結合させたアイソタイプ対照抗体を対照として使用した。プレートを72時間インキュベートし、その際、3時間目に洗浄するか、または連続的に洗浄した。次いで、これらのプレートを0.5μCiの3H-チミジンで8時間パルス標識した後、培養を終了し、培養物を回収し、かつ、Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments)で読み取った。図22Aおよび図22Bは、それぞれ、3時間目に洗浄するか、または連続的に洗浄したRaji細胞における、3H-チミジン取込みの抗体-毒素濃度に依存的な減少を示した。
【０２８５】
このデータにより、毒素に結合された抗CD70抗体が、ヒトリンパ腫癌細胞に対して特異的な細胞障害性を示すことが実証される。
【０２８６】
実施例11
裸の抗CD70抗体およびサイトトキシン結合抗CD70抗体を用いた、インビボの腫瘍異種移植モデルの治療
腎細胞癌腫瘍を移植されたマウスを、毒素を結合させた抗CD70抗体を用いてインビボで治療して、腫瘍増殖に対する抗体のインビボでの効果を検査した。
【０２８７】
標準的な実験室手順を用いて、A-498細胞(ATCCアクセッション番号HTB-44)およびACHN細胞(ATCCアクセッション番号CRL-1611)をインビトロで増殖させた。6週齢〜8週齢の間の雄のNcr無胸腺ヌードマウス(Taconic、Hudson、NY)の右側腹部に、マウス1匹当たりPBS/Matrigel(1：1)0.2mlに溶かした7.5×106個のACHN細胞またはA-498細胞を皮下移植した。移植後、毎週2回、マウスを計量し、かつ、電気式カリパスを用いて、腫瘍の3寸法を測定した。高さ×幅×長さとして、腫瘍体積を算出した。平均270mm3のACHN腫瘍または平均110mm3のA498腫瘍を有するマウスを無作為に処置群に分けた。これらのマウスに、PBS溶媒、毒素を結合させたアイソタイプ対照抗体、または毒素を結合させた抗CD70HuMAb 2H5を0日目に腹腔内投与した。本開示の抗体に結合させることができる毒素化合物の例は、参照番号MEDX-0034US4の同時出願において説明している。A-498試料群のマウスを、3種の異なる毒素化合物を用いて試験した。投与後60日間、マウスの腫瘍増殖をモニターした。腫瘍が腫瘍の終点(2000mm3)に達したら、マウスを安楽死させた。これらの結果を図23A(A-498腫瘍)および図23B(ACHN腫瘍)に示す。毒素に結合された抗CD70抗体2H5は、腫瘍の終点体積(2000mm3)に達するまでの平均時間を延長させ、かつ、腫瘍増殖の進行を遅らせた。したがって、抗CD70抗体-毒素結合体を用いた処置は、腫瘍増殖に対してインビボでの直接的な阻害効果を有する。
【０２８８】
実施例12
2H5を用いた免疫組織化学
抗CD70 HuMAb 2H5が免疫組織化学によってCD70を認識する能力を、明細胞腎細胞癌(ccRCC)、リンパ腫、およびグリア芽細胞腫の患者に由来する臨床的生検材料を用いて検査した。
【０２８９】
免疫組織化学のために、5μmの凍結切片を使用した(Ardais Inc、USA)。30分間乾燥させた後、切片をアセトンで(室温で10分間)固定し、かつ、5分間風乾させた。スライドをPBS中でゆすぎ、次いで、PBS中10％正常ヤギ血清と共に20分間プレインキュベートし、続いて、10％正常ヤギ血清を含むPBS中の10μg/mlのFITC化(fitcylated)2H5と共に室温で30分間インキュベートした。次に、スライドをPBSで3回洗浄し、かつ、マウス抗FITC(10μg/ml DAKO)と共に室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSで再び洗浄し、かつ、ヤギ抗マウスHRP結合体(DAKO)と共に室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSでさらに3回洗浄した。茶色の染色をもたらすジアミノベンジジン(Sigma)を基質として使用した。蒸留水で洗浄した後、スライドをヘマトキシリンで1分間対比染色した。続いて、スライドを蒸留水の流水中で10秒間洗浄し、かつ、グリセルゲル(glycergel)(DAKO)中に封入した。臨床的な生検免疫組織化学染色では、非ホジキンリンパ腫、プラズマ細胞腫、ccRcc、およびグリア芽細胞腫の切片において陽性染色が示された。悪性細胞のみが各場合において陽性であり、隣接した正常組織は染色されなかった。
【０２９０】
実施例13
脱フコシル化HuMAbの作製
フコシル残基の量を減らした抗体は、抗体のADCC能力が増大していることが実証されている。本実施例では、フコシル残基を欠いている2H5HuMAbを作製した。
【０２９１】
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8を欠くCHO細胞株Ms704-PF(Biowa, Inc.、Princeton、NJ)を、抗体2H5の重鎖および軽鎖を発現するベクターと共にエレクトロポレーションした。6mM L-グルタミンおよび500μg/ml G418(Invitrogen、Carlsbad、CA)を含むEx-Cell 325-PF CHO培地(JRH Biosciences、Lenexa、KS)中で増殖させることによって、薬物耐性クローンを選択した。標準的なELISAアッセイ法によって、クローンをIgG発現に関してスクリーニングした。2種の別々のクローン、すなわちB8A6およびB8C11を作製した。作製速度は、1日当たり細胞当たり1.0ピコグラム〜3.8ピコグラムの範囲であった。
【０２９２】
実施例14
脱フコシル化抗CD70抗体のADCC活性の評価
本実施例では、脱フコシル化抗CD70モノクローナル抗体および非脱フコシル化抗CD70モノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存性細胞障害(ADCC)によってCD70+細胞を死滅させる能力に関して、蛍光細胞障害性アッセイ法において試験した。
【０２９３】
ヒト抗CD70モノクローナル抗体2H5を前述したように脱フコシル化した。ヒトエフェクター細胞は、以下のようにして、全血から調製した。標準的なフィコールパック分離法によって、ヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製した。これらの細胞を、10％ FBS(培地)および200U/mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地中に再懸濁し、かつ、37℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を採取し、培地中で1回洗浄し、かつ、2×107細胞/mlで再懸濁した。標的のCD70+細胞を、2.5mMプロベネシドを添加した培地(アッセイ用培地)中で1×106標的細胞/mL当たりBATDA 2.5μlのBATDA試薬 (Perkin Elmer、Wellesley、MA)と共に、37℃で20分間インキュベートした。標的細胞を、20mM HEPESおよび2.5mMプロベネシドを含むPBS中で4回洗浄し、遠心沈殿させ、かつ、最終体積をアッセイ培地中1×105細胞/mlに調整した。
【０２９４】
以下のようにDelfia蛍光発光解析を用いて、CD70+細胞株ARH-77(ヒトBリンパ芽球白血病;ATCCアクセッション番号CRL-1621)、MEC-1(ヒト慢性B細胞白血病;DSMZアクセッション番号ACC497)、SU-DHL-6(ヒトB細胞リンパ腫、DSMZアクセッション番号Acc572)、IM-9(ヒトBリンパ芽球;ATCCアクセッション番号CCL-159)、およびHuT78(ヒト皮膚リンパ球リンパ腫;ATCCアクセッション番号TIB-161)を、脱フコシル化ヒト抗CD70モノクローナル抗体2H5および非脱フコシル化ヒト抗CD70モノクローナル抗体2H5に対する抗体特異的なADCCに関して試験した。標的細胞株ARH77(標識した標的細胞100μl)を、エフェクター細胞50μlおよび2H5抗体または脱フコシル化2H5抗体のいずれか50μlと共にインキュベートした。標的とエフェクターの比1：50を、実験の全体を通して使用した。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。2100rpmでのパルススピンおよび37℃で1時間のインキュベーションの後、上清を採取し、再び高速で遠心し、かつ、上清20μlを平底プレートに移し、そこへEu溶液180μl(Perkin Elmer、Wellesley、MA)を添加し、Fusion Alpha TRFプレートリーダー (Perkin Elmer)中で読み取った。溶解率(％)を以下のようにして算出した：(試料からの放出量−自発的放出量*100)/(最大放出量−自発的放出量)。式中、自発的放出量は、標的細胞のみを含むウェルからの蛍光であり、最大放出量は、標的細胞を含み、3％ Lysolで処理されたウェルからの蛍光である。ARH-77細胞株に対する細胞障害性の特異的溶解率(％)を図24に示す。CD70+を発現する細胞株ARH-77、MEC-1、SU-DHL-6、IM-9、およびHuT78は、HuMAb抗CD70抗体2H5と共に、抗体を介した細胞障害性を示し、かつ、抗CD70抗体2H5の脱フコシル型に関連した特異的溶解率の増大を示した。さらに、抗CD16抗体は、MEC-1細胞株においてADCC作用を妨害することも示された。このデータにより、脱フコシル化HuMAb抗CD70抗体が、CD70+を発現する細胞に対して特異的な細胞障害性の増大を示すことが実証される。
【０２９５】
実施例15：51Cr放出アッセイ法を用いた、抗CD70抗体のADCC活性の評価
本実施例では、抗CD70モノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存性細胞障害(ADCC)によってCD70+RajiBリンパ球細胞を死滅させる能力に関して、51Cr放出アッセイ法において試験した。
【０２９６】
標準的なフィコールパック分離法によって、ヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞(エフェクター細胞)を精製した。これらの細胞を、10％ FBSおよび200U/mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地中に2×106/mLで再懸濁し、かつ、37℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を採取し、培地中で1回洗浄し、かつ、2×107細胞/mlで再懸濁した。標的のRaji細胞(ヒトBリンパ球バーキットリンパ腫;ATCCアクセッション番号CCL-86)200万個を、総体積1ml中の200μCi51Crと共に37℃で1時間インキュベートした。標的細胞を1回洗浄し、培地1ml中に再懸濁し、かつ、37℃でさらに30分間インキュベートした。最終のインキュベーションの後、標的細胞を1回洗浄し、かつ最終体積を1×105細胞/mlにした。最終のADCCアッセイ法のために、標識したRaji細胞100μlを、エフェクター細胞50μlおよび抗体50μlと共にインキュベートした。標的とエフェクターの比1：100を、実験の全体を通して使用した。すべての研究において、ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。一部の研究において、PBMC培養物を、20μg/mLの抗ヒトCD16抗体を含むか、無関係なマウスIgG1抗体を含むか、または抗体を含まないチューブ中に等量ずつ分けた後、アッセイ用プレートにPBMCを添加した。27℃で15分間インキュベーションした後、洗浄せずに、前述したように血液細胞を使用した。37℃で4時間インキュベーションした後、上清を採取し、かつ、240〜400keVの読取領域を有するCobra IIオートガンマカウンター(Packard Instruments)を用いて計数した。抗体濃度の関数としてカウント毎分をプロットし、かつこのデータを、Prismソフトウェア(San Diego、CA)を用いた非線形回帰、すなわちS字形用量反応(可変勾配)によって解析した。溶解率は以下の式、すなわち、溶解率(％)＝(試料のCPM−抗体無しのCPM)/(TritonX CPM−抗体無しのCPM)×100によって決定した。Raji細胞株に対する細胞障害性の特異的溶解率(％)に関する抗体滴定曲線を図25に示す。このデータにより、抗CD70抗体がRaji細胞株に対してADCC作用を有することが実証される。Raji細胞に対する抗CD70抗体のEC50値は、36.61nMであった。抗CD16抗体の存在下でのRaji細胞に対する細胞障害性のグラフを図26に示す。このデータにより、Raji細胞に対する抗CD70抗体のADCC作用がCD16に依存することが実証される。
【０２９７】
実施例16
活性化T細胞に対する抗CD70抗体のADCC活性の評価
本実施例では、脱フコシル化抗CD70モノクローナル抗体および非脱フコシル化抗CD70モノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存性細胞障害(ADCC)によって活性化T細胞を死滅させる能力に関して、蛍光細胞障害性アッセイ法において試験した。
【０２９８】
ヒト抗CD70モノクローナル抗体2H5を前述したように脱フコシル化した。ヒトエフェクター細胞を前述したように調製した。抗CD3コーティング磁性ビーズを用いて、ヒト脾臓T細胞を陽性選択した(純度>90％)。これらの細胞を、抗CD3コーティング磁性ビーズおよび抗CD28コーティング磁性ビーズ、ならびに、イスコフ培地＋10％加熱不活性化FCS中の25ng/ml IL-2で、6日間刺激した。細胞を採取し、ヨウ化プロピジウム取込みによって生存率を分析し(60％生存)、かつ、生細胞にゲートをかけ、CD70発現について解析した(生細胞において約65％がCD70+)後、ADCCアッセイ法に含めた。
【０２９９】
以下のようにDelfia蛍光発光解析を用いて、活性化T細胞を、脱フコシル化ヒト抗CD70モノクローナル抗体2H5および非脱フコシル化ヒト抗CD70モノクローナル抗体2H5に対する抗体特異的なADCCに関して試験した。標的の活性化T細胞(標識した標的細胞100μl)を、エフェクター細胞50μlおよび2H5抗体または脱フコシル化2H5抗体のいずれか50μlと共にインキュベートした。標的とエフェクターの比1：50を、実験の全体を通して使用した。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。2100rpmでのパルススピンおよび37℃で1時間のインキュベーションの後、上清を採取し、再び高速で遠心し、かつ、上清20μlを平底プレートに移し、そこへEu溶液180μl(Perkin Elmer、Wellesley、MA)を添加し、Fusion Alpha TRFプレートリーダー(Perkin Elmer)中で読み取った。溶解率(％)を以下のようにして算出した：(試料からの放出量−自発的放出量*100)/(最大放出量−自発的放出量)。式中、自発的放出量は、標的細胞のみを含むウェルからの蛍光であり、最大放出量は、標的細胞を含み、3％ Lysolで処理されたウェルからの蛍光である。活性化T細胞に対する細胞障害性の特異的溶解率(％)を図27に示す。活性化T細胞は、HuMAb抗CD70抗体2H5と共に、抗体を介した細胞障害性を示し、かつ、抗CD70抗体2H5の脱フコシル型に関連した特異的溶解率の増大を示した。抗体を介した細胞障害性は、抗CD70抗体の脱フコシル型および非脱フコシル化型の両方において、抗CD16抗体の添加によって妨害された。対照IgGは、細胞障害性に対する効果を有していなかった。このデータにより、脱フコシル化HuMAb抗CD抗体が、活性化T細胞に対して特異的な細胞障害性の増大を示すことが実証される。
【０３００】
実施例17
受容体-リガンドCD70-CD27結合に関するブロッキングアッセイ法
本実施例では、ブロッキングアッセイ法を用いて、抗CD70モノクローナル抗体を、CD70とリガンドCD27との相互作用を妨害する能力に関して試験した。
【０３０１】
2μg/mlの抗IgG抗体(Fc-sp.)をウェル当たり100μl用いて、4℃で一晩、ウェルをコーティングした。これらのウェルを、200μl/ウェルの1％ BSA/PBSを用いて、室温で1時間ブロッキングした。振とうしながら、37℃で1時間、0.16μg/mlのCD27-Fc-hisをウェル当たり100μl、各ウェルに添加した。200μl/ウェルのPBS/Tween20(0.05％(体積：体積))で各ウェルを5回洗浄した。抗CD70抗体を10％NHS+1％BSA/PBS中に希釈し、かつ、0.05μg/mlのCD70-myc-hisと混合し、室温で1時間インキュベートし、200μl/ウェルのPBS/Tween20(0.05％(体積：体積))で5回洗浄した。CD70/CD27相互作用を妨害する公知の抗体を陽性対照として使用し、かつ、アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。CD70および抗CD70抗体の混合物を抗Fc抗体でブロッキングし、かつ、100μl/ウェルのCD70-myc-his+抗体を、CD27-Fc-hisを含むウェルに添加した。この混合物を37℃で1時間、振とうしながらインキュベートした。この混合物に、100μl/ウェルの抗myc-HRP(10％NHS+1％BSA/PBS中に1：1000で希釈)を添加し、かつ、37℃で1時間、振とうしながらインキュベートした。TMB基質100μlを添加することによってシグナルを検出し、室温で5分〜10分間インキュベートし、次いで、0.25M H2SO4 75μlを添加し、かつ、結果をA450nmで読み取った。これらの結果を図28に示す。このデータにより、2H5、8B5、および18E7を含むいくつかの抗CD70抗体が、CD27へのCD70の結合を妨害するのに対し、他の抗体は、CD70とCD27の相互作用に影響を及ぼさないことが実証される。
【０３０２】
実施例18
裸の抗CD70抗体を用いた、インビボの腫瘍異種移植モデルの治療
リンパ腫腫瘍を移植されたマウスを、裸の抗CD70抗体を用いてインビボで治療して、腫瘍増殖に対する抗体のインビボでの効果を検査した。
【０３０３】
標準的な実験室手順を用いて、ARH-77細胞(ヒトBリンパ芽球白血病;ATCCアクセッション番号CRL-1621)およびRaji細胞(ヒトBリンパ球バーキットリンパ腫;ATCCアクセッション番号CCL-86)をインビトロで増殖させた。6週齢〜8週齢の間の雄のNcr無胸腺ヌードマウス(Taconic、Hudson、NY)の右側腹部に、マウス1匹当たりPBS/Matrigel(1：1)0.2mlに溶かした5×106個のARH-77細胞またはRaji細胞を皮下移植した。移植後、毎週2回、マウスを計量し、かつ、電気式カリパスを用いて、腫瘍の3寸法を測定した。高さ×幅×長さ/2として、腫瘍体積を算出した。平均80mm3のARH-77腫瘍または平均170mm3のRaji腫瘍を有するマウスを無作為に処置群に分けた。これらのマウスに、PBS溶媒、アイソタイプ対照抗体、または裸の抗CD70 HuMAb 2H5を0日目に腹腔内投与した。腫瘍が腫瘍の終点(2000mm3)に達したら、マウスを安楽死させた。これらの結果を図29A(Raji腫瘍)および図29B(ARH-77腫瘍)に示す。裸の抗CD70抗体2H5は、腫瘍の終点体積(2000mm3)に達するまでの平均時間を延長させ、かつ、腫瘍増殖の進行を遅らせた。したがって、抗CD70抗体のみを用いた処置は、腫瘍増殖に対してインビボでの直接的な阻害効果を有する。
【０３０４】
実施例19
サイトトキシン結合抗CD70抗体を用いた、インビボのリンパ腫腫瘍異種移植モデルの治療
リンパ腫腫瘍を移植されたマウスを、毒素を結合させた抗CD70抗体を用いてインビボで治療して、腫瘍増殖に対する抗体のインビボでの効果を検査した。
【０３０５】
標準的な実験室手順を用いて、ARH-77細胞(ヒトBリンパ芽球白血病;ATCCアクセッション番号CRL-1621)、Granta519細胞(DSMZアクセッション番号342)、およびRaji細胞(ヒトBリンパ球バーキットリンパ腫;ATCCアクセッション番号CCL-86)をインビトロで増殖させた。6週齢〜8週齢の間の雄のNcr無胸腺ヌードマウス(Taconic、Hudson、NY)の右側腹部に、マウス1匹当たりPBS/Matrigel(1：1)0.2mlに溶かした5×106個のARH-77細胞、10×106個のGranta519細胞、または5×106個のRaji細胞を皮下移植した。移植後、毎週2回、マウスを計量し、かつ、電気式カリパスを用いて、腫瘍の3寸法を測定した。高さ×幅×長さ/2として、腫瘍体積を算出した。平均80mm3(ARH-77)、220mm3(Granta519)、または170mm3(Raji)の腫瘍を有するマウスを無作為に処置群に分けた。これらのマウスに、PBS溶媒、毒素を結合させたアイソタイプ対照抗体、または毒素を結合させた抗CD70 HuMAb 2H5を0日目に腹腔内投与した。本開示の抗体に結合させることができる毒素化合物の例は、2005年9月26日に出願された米国特許仮出願第60/720,499号において説明している。腫瘍が腫瘍の終点(2000mm3)に達したら、マウスを安楽死させた。これらの結果を図30A(ARH-77)、および図30B(Granta519)、および図30C(Raji腫瘍)に示す。毒素に結合された抗CD70抗体2H5は、腫瘍の終点体積(2000mm3)に達するまでの平均時間を延長させ、かつ、腫瘍増殖の進行を遅らせた。したがって、抗CD70抗体-毒素結合体を用いた処置は、リンパ腫腫瘍増殖に対してインビボでの直接的な阻害効果を有する。
【０３０６】
実施例20
抗CD70抗体とアカゲザルBリンパ腫細胞との交差反応性
抗CD70抗体69A7がアカゲザルCD70+Bリンパ腫細胞株LCL8664(ATCC番号：CRL-1805)と交差反応する能力を利用(access)するために、FACS解析も実施した。1×105個の細胞を濃度1μg/mlの69A7と共にインキュベートすることによって、HuMAb 69A7抗CD70ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図31に示す。この結果により、抗CD70抗体69A7がサルのCD70+Bリンパ腫細胞と交差反応することが実証された。
【０３０７】
実施例21
786-O腎癌細胞に結合する際の、抗CD70抗体の内部移行
786-Oヒト腎癌細胞株を用いて、細胞に結合する際のHuMab抗CD70抗体69A7および2H5の内部移行を免疫蛍光染色によって試験した。786-O細胞(96ウェルプレート中ウェル当たり100μl当たり1×104細胞)を、0.25％トリプシン/EDTAを用いた処理によって組織培養フラスコから回収し、次いで、FACS緩衝液(PBS+5％FBS、培地)中の5μg/mlの各HuMab抗CD70抗体と共に氷上で30分間インキュベートした。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。培地で2回洗浄した後、細胞を培地(ウェル当たり100μl)中に再懸濁し、次いで、1：100で希釈した、PEと結合させたヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson ImmunoResearch Lab)と共に氷上で30分間インキュベートした。これらの細胞を、0分に、蛍光顕微鏡(Nikon)下で、形態および免疫蛍光強度を直ちに画像化するか、または、様々な期間、37℃でインキュベートした。蛍光は、HuMab抗CD70抗体で染色した細胞では観察されたが、対照抗体で染色した細胞では観察されなかった。これらのアッセイ法において、FITCを直接結合させたHuMab抗CD70抗体を用いた場合も同様の結果が得られた。これらの結果により、どちらの抗CD70HuMabの場合も、0分に細胞表面膜で蛍光が出現することが示された。30分間のインキュベーションの後、膜の蛍光強度は有意に減少したのに対し、内部の蛍光は増加した。120分の時点で、膜の蛍光は明らかではなかったが、代わりに、細胞内区画中に存在するようであった。このデータにより、HuMab抗CD70抗体が、CD70を発現する内因性腫瘍細胞に結合する際に特異的に内部移行され得ることが実証される。
【０３０８】
実施例22
HuMAb抗CD70は、公知のマウス抗CD70抗体の結合を妨害する
本実施例では、HuMAb抗CD70抗体69A7を、CD70+腎癌786-O細胞への公知のマウス抗CD70抗体の結合を妨害する能力に関して試験した。786-O細胞を、1μg/mlのマウス抗CD70抗体BU-69(Ancell、Bayport、MN)および1μg/ml、5μg/ml、または10μg/mlのHuMAb 69A7と共に、氷上で20分間インキュベートした。IgG1アイソタイプ対照抗体およびIgG2アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。これらの細胞を2回洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACSCaliburフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図32に示す。抗CD70 HuMAb 69A7は、濃度依存的な様式で、マウス抗CD70抗体の結合を妨害する。
【０３０９】
実施例23
HuMAb抗CD70は、炎症応答を阻害する
本実験では、HuMAb抗CD70抗体2H5を、炎症応答の阻害に関して試験した。マウスCD32を安定にトランスフェクトさせたCHO-S細胞(CHO-S/mCD32細胞)に、完全長ヒトCD70構築物を一過性にトランスフェクトさせた(CHO-S/mCD32/CD70細胞)。表面での発現を、2A5およびPEを結合させた抗ヒトIgG二次Abを用いて、フローサイトメトリーによって確認した(データ不掲載)。RosetteSep(登録商標)Human T Cell Enrichment Kit (カタログ番号15061; StemCell Technologies Inc)で精製したヒト末梢血CD3+T細胞を、96ウェルプレートのトリプリケートなウェル中で、1 ×105個のCHO-S/mCD32細胞/ウェルまたはCHO-S/mCD32/CD70細胞/ウェル、1μg/ml抗hCD3(クローンOKT3; BD Bioscience)、およびHuMAb2H5または非フコシル化2H5(2H5NF)のいずれかの段階希釈物で、1×106/ウェルでインビトロで刺激した。3日後、上清分取物を採取し、かつ、定量的ELISAキット(BD Biosciences)によって、インターフェロン-γ(INF-γ)分泌を測定した。これらのプレートを1μCi/mlの3H-チミジンでパルス標識し、8時間インキュベートし、細胞を回収し、かつ、3H-チミジン取込みをTrilux(登録商標)1450 Microbeta Counter (Wallac, Inc.)で読み取った。IgG1アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。これらの結果を図33に示す。2H5および2H5NFの両方とも、CD70で同時刺激された増殖を用量依存的な様式で完全に阻害した(図33A)。データにより、2H5は、抗CD3+CHO-S/mCD32を介した増殖に対する効果を有していなかったため、2H5阻害がCD70同時刺激に特異的であることも示される。同様に、2H5および2H5NFの両方とも、CD70で同時刺激されたINF-γ分泌を用量依存的な様式で完全に阻害した(図33B)。データにより、2H5は、抗CD3+CHO-S/mCD32を介したINF-γ分泌に対する効果を有していなかったため、2H5阻害がCD70同時刺激に特異的であることも示される。まとめると、データにより、2H5および2H5NFがCD70ヒトT細胞同時刺激を機能的に妨害することが示される。
【０３１０】
サイトメガロウイルス(CMV)に特異的なT細胞応答に関して予めスクリーニングされたヒトMHCクラスIハプロタイプB*3501+末梢血単核細胞(PBMC)(Astarte, Inc)を、25ng/mlのB*3501結合CMVペプチドIPSINVHHY(ProImmune, Oxford, UK)およびHuMAb 2H5の段階希釈物の存在下で11日間培養した。培養物をフローサイトメトリーによって解析した。PEを結合させた抗CD8による染色(クローンRPA-T8、BD Biosciences)によってCD8+T細胞を解析し、APC標識ペプチド-MHCクラスI 5量体オリゴマー染色(F114-4B; ProImmune)によってペプチド特異的CD8+T細胞を解析し、ヨウ化プロピジウム染色の欠如によって生存率を解析した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。これらの結果を図34に示す。2H5は、ペプチド特異的なCD8+T細胞の増殖を部分的に阻害し、2H5NFおよび陽性対照抗のMHCクラスI Ab(クローンW6/32; BD Bioscience)は、ペプチド特異的CD8+T細胞の増殖を完全に阻害した(図34A)。観察される細胞生存率全体の有意な減少はなかった(図34B)。観察されるCD8+細胞総数の有意な減少はなかった(図34C)。まとめると、データにより、2H5および2H5NFの作用が、ペプチドで刺激されたCD8+T細胞に特異的であったことが示される。データは、同じドナーを用いて実施された1回の追加実験を表す。
【０３１１】
サイトメガロウイルス(CMV)に特異的なT細胞応答に関して予めスクリーニングされたヒトMHCクラスIハプロタイプB*3501+PBMC(Astarte, Inc)を、25ng/mlのB*3501結合CMVペプチドIPSINVHHY(Pro Immune)および20μg/mlのHuMAb 2H5の存在下、抗ヒトCD16(FcRγIII)機能ブロッキング抗体(クローン3G8;BD Biosciences)の段階希釈物の存在下または不在下で、11日間培養し、次いで、前述したように、ペプチド特異的なCD8+細胞の数をフローサイトメトリーによって解析した。これらの結果を図35に示す。抗CD16によって、ペプチド特異的CD8+T細胞の増殖の2H5および2H5NFを介した阻害が用量依存的に逆転されることから、2H5および2H5NFによる阻害が、2H5および2H5NFとCD16+エフェクター細胞との相互作用によって媒介されていることが示される。2H5 NFを介した阻害を逆転させるには、2H5と比べて、約1000倍多くの3G8が必要とされた。3G8の濃度とは無関係に、アイソタイプ陰性対照によるペプチド特異的CD8+T細胞の増殖の阻害はなく、かつ、機能ブロッキング陽性対照W6/32による、ペプチド特異的CD8+T細胞の増殖の阻害に対する3G8の効果はほとんどないか、全くなかった。
【０３１２】
実施例24
サイトトキシンを結合させた抗CD70抗体を用いた、インビボの腎癌腫瘍異種移植モデルの治療
腎癌腫瘍を移植されたマウスを、毒素を結合させた抗CD70抗体を用いてインビボで治療して、腫瘍増殖に対する抗体のインビボでの効果を検査した。
【０３１３】
標準的な実験室手順を用いて、786-O細胞(ATCCアクセッション番号CRL-1932)およびCaki-1細胞(ATCCアクセッション番号HTB-46)をインビトロで増殖させた。6週齢〜8週齢の間の雄のCB17.SCIDマウス(Taconic、Hudson、NY)の右側腹部に、マウス1匹当たりPBS/Matrigel(1：1)0.2mlに溶かした250万個の786-O細胞またはCaki-1細胞を皮下移植した。移植後、毎週2回、マウスを計量し、かつ、電気式カリパスを用いて、腫瘍の3寸法を測定した。高さ×幅×長さとして、腫瘍体積を算出した。平均200mm3の腫瘍を有するマウスを無作為に処置群に分けた。これらのマウスに、PBS溶媒、毒素を結合させたアイソタイプ対照抗体、または毒素を結合させた抗CD70 HuMAb 2H5を0日目に腹腔内投与した。本開示の抗体に結合させることができる毒素化合物の例は、2005年9月26日に出願された米国特許仮出願第60/720,499号において説明している。腫瘍が腫瘍の終点(2000mm3)に達したら、マウスを安楽死させた。これらの結果を図36A(786-O)および図36B(Caki-1)に示す。毒素に結合された抗CD70抗体2H5は、腫瘍の終点体積(2000mm3)に達するまでの平均時間を延長させ、かつ、腫瘍増殖の進行を遅らせた。処置した動物において、10％未満の体重変化があった。したがって、抗CD70抗体-毒素結合体を用いた処置は、リンパ腫腫瘍増殖に対してインビボでの直接的な阻害効果を有する。
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【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１Ａ】2H5ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：41)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：1)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：11)、CDR2領域(SEQ ID NO：16)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：21)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図１Ｂ】2H5ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO： 46)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO： 6)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：26)、CDR2領域(SEQ ID NO：31)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：36)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図２Ａ】10B4ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：42)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：2)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO： 12)、CDR2領域(SEQ ID NO： 17)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：22)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図２Ｂ】10B4ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：47)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：7)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：27)、CDR2領域(SEQ ID NO：32)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：37)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図３Ａ】8B5ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：43)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：3)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO： 13)、CDR2領域(SEQ ID NO： 18)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：23)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図３Ｂ】8B5ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：48)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：8)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：28)、CDR2領域(SEQ ID NO：33)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：38)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図４Ａ】18E7ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：44)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：4)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO： 14)、CDR2領域(SEQ ID NO： 19)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：24)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図４Ｂ】18E7ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：49)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：9)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：29)、CDR2領域(SEQ ID NO：34)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：39)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図５Ａ】69A7ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：45)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：5)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：15)、CDR2領域(SEQ ID NO：20)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：25)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図５Ｂ】69A7ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO： 50)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：10)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：30)、CDR2領域(SEQ ID NO：35)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：40)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図６】2H5および10B4の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH3-30.3アミノ酸配列(SEQ ID NO：51)とのアライメントを示す。
【図７】8B5および18E7の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH3-33アミノ酸配列(SEQ ID NO：52)とのアライメントを示す。
【図８】69A7の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH4-61アミノ酸配列(SEQ ID NO：53 )とのアライメントを示す。
【図９】2H5の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VkL6アミノ酸配列(SEQ ID NO：54)とのアライメントを示す。
【図１０】10B4の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VkL18アミノ酸配列(SEQ ID NO：55 )とのアライメントを示す。
【図１１】8B5および18E7の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VkL15アミノ酸配列(SEQ ID NO：56)とのアライメントを示す。
【図１２】69A7の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VkL6アミノ酸配列(SEQ ID NO：54)とのアライメントを示す。
【図１３】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体がCD70に特異的に結合することを実証する、ELISA実験の結果を示す。
【図１４】抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5が腎癌細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１５Ａ】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体が、濃度依存的な様式で腎細胞癌(RCC)細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。(A)786-O RCC細胞株。
【図１５Ｂ】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体が、濃度依存的な様式で腎細胞癌(RCC)細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。(B)A498 RCC細胞株。
【図１５Ｃ】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体が、腎癌細胞株786-Oに結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１５Ｄ】ヒトCD70に対するHuMAb 69A7抗体が、濃度依存的な様式で腎細胞癌(RCC)細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１６】抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5がヒトリンパ腫細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１７Ａ】抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5が、濃度依存的な様式でヒトリンパ腫細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。(A)Rajiリンパ腫細胞株。
【図１７Ｂ】抗CD70ヒトモノクローナル抗体2H5が、濃度依存的な様式でヒトリンパ腫細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。(B)Granta-519リンパ腫細胞株。
【図１７Ｃ】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体がRajiリンパ腫細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１７Ｄ】HuMAb 2H5および69A7が、類似した結合エピトープを共有することを実証する競合フローサイトメトリーアッセイ法の結果を示す。
【図１７Ｅ】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体が、Daudiリンパ腫細胞株および786-O腎癌細胞株に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１８】ヒトCD70に対するヒトモノクローナル抗体が、CD70+細胞中に内部移行できることを実証するHum-Zap内部移行実験の結果を示す。
【図１９】毒素を結合させたヒトモノクローナル抗CD70抗体が、腎細胞癌細胞(RCC)株を死滅させることを実証する細胞増殖アッセイ法の結果を示す。(A)Caki-2 RCC、(B)786-O RCC、(C)ACHN RCC。
【図２０】ヒトモノクローナル抗CD70抗体が、ADCCに依存的な様式で、ヒト白血病細胞株およびヒトリンパ腫細胞株を死滅させることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。(A)ARH-77白血病細胞株、(B)HuT 78リンパ腫細胞株、(C)Rajiリンパ腫細胞株、および(D)CD70を発現しないL-540細胞株。
【図２１】毒素を結合させたヒトモノクローナル抗CD70抗体が、ヒトリンパ腫細胞株を死滅させることを実証する細胞増殖アッセイ法の結果を示す。
【図２２】毒素を結合させたヒトモノクローナル抗CD70抗体が、(A)3時間洗浄したRaji細胞および(B)連続的に洗浄したRaji細胞に対する細胞障害性を示すことを実証する細胞増殖アッセイ法の結果を示す。
【図２３】毒素を結合させた抗CD70抗体2H5による処置が、腎細胞癌(RCC)腫瘍に対する直接的な阻害効果をインビボで有することを実証する、インビボのマウス腫瘍モデル研究の結果を示す。(A)A-498 RCC腫瘍、(B)ACHN RCC腫瘍。
【図２４】脱フコシル化ヒトモノクローナル抗CD70抗体が、ADCCに依存的な様式で、ヒト白血病細胞に対する高い細胞障害性を有することを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。(A)ARH-77細胞、(B)MEC-1細胞、(C)抗CD16抗体で処理したMEC-1細胞、(D)SU-DHL-6細胞、(E)IM-9細胞、(F)HuT78細胞。
【図２５】ヒトモノクローナル抗CD70抗体が、ADCC濃度に依存的な様式で、ヒト白血病細胞を死滅させることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。
【図２６】ヒトモノクローナル抗CD70抗体が、ADCCに依存的な様式で、ヒト白血病細胞を死滅させるが、細胞障害性が、CD16に依存性であることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。
【図２７】ヒトモノクローナル抗CD70抗体が、活性化されたヒトT細胞を死滅させ、かつ、その作用が、抗CD16抗体を添加することにより逆転されることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。
【図２８】一部のヒトモノクローナル抗CD70抗体が、CD27へのCD70の結合を妨害し、かつ、他のヒトモノクローナル抗CD70抗体が、CD27へのCD70の結合を妨害しないことを実証する、ブロッキングアッセイ法の結果を示す。
【図２９】裸の抗CD70抗体2H5による処置が、リンパ腫腫瘍に対する直接的な阻害効果をインビボで有することを実証する、インビボのマウス腫瘍モデル研究の結果を示す。(A)Raji腫瘍、(B)ARH-77腫瘍。
【図３０】毒素を結合させた抗CD70抗体2H5による処置が、リンパ腫腫瘍に対する直接的な阻害効果をインビボで有することを実証する、インビボのマウス腫瘍モデル研究の結果を示す。(A)ARH-77腫瘍、(B)Granta519腫瘍、(C)Raji腫瘍。
【図３１】抗CD70抗体69A7が、アカゲザルのCD70+Bリンパ腫細胞株上で発現されるCD70と交差反応することを示す研究の結果を示す。
【図３２】ヒト抗CD70抗体が、公知のマウス抗ヒトCD70抗体の結合を妨害することを実証する、ブロッキングアッセイ法の結果を示す。
【図３３】抗CD70抗体またはこの抗体の非フコシル化型のいずれかによる処置の結果を示す。(A)抗CD70抗体は、CD70で同時刺激される細胞増殖を用量依存的な様式で阻害する。(B)抗CD70抗体は、CD70で同時刺激されるIFN-γ分泌を用量依存的な様式で阻害する。
【図３４】ペプチド刺激した細胞に対する、抗CD70抗体またはこの抗体の非フコシル化型のいずれかによる処置の結果を示す。(A)抗CD70抗体は、ペプチド特異的なCD8+T細胞増殖を阻害する。(B)観察される細胞生存率全体の有意な減少はなかった。(C)観察されるCD8+細胞の総数の有意な減少はなかった。
【図３５】ペプチド特異的なCD8+T細胞増殖に対する抗CD70抗体の作用が、抗CD16抗体の添加によって妨害されることを示す。
【図３６】毒素を結合させた抗CD70抗体2H5による処置が、腎癌腫瘍に対する直接的な阻害効果をインビボで有することを実証する、インビボのマウス腫瘍モデル研究の結果を示す。(A)786-O腫瘍、(B)Caki-1腫瘍。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【図３６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月27日(2008.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009509510000001.app
【国際調査報告】
2009509510.tif 000066
2009509510.tif 000067
2009509510.tif 000068
2009509510.tif 000069
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2009509510.tif 000071