(57)【要約】【課題】【解決手段】  動物細胞内での２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の取込み及び標的ｍＲＮＡの減少を生じさせるための組成物、方法、並びに動物対象内の腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）関連性の炎症状態の治療用医薬の製造における、両親媒性であって核酸結合性を有するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとｄｓＲＮＡとを具える混合物の使用が記載されている。【選択図】図５
2009507852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具え、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、ＭＷ２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｌｙｓ，Ｔｒｙｐ）４：１、２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｏｒｎ，Ｔｒｐ）４：１、メリチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５９、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９乃至９２、９４乃至１０８、１６４乃至１７８及び１８０乃至１８６から成る群から選択される配列の全て又は一部分を具えることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が、動物細胞内へのｄｓＲＮＡの取り込みを生じさせることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物において、前記動物細胞が、哺乳動物細胞であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、前記組成物が、動物に投与されることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物において、前記動物が、哺乳動物であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端が、アセチル化されていることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端が、ＰＥＧ化されていることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡが、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）遺伝子の一部分に相補的な、約１０乃至約４０塩基対の配列から成る、低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＲＮＡ）であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１０９乃至１６３及び１８７から成る群から選択される、約１０乃至約４０塩基対の配列から成るｓｉＲＮＡであることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡと混和されるか、複合体化されるか又は結合されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡに結合することを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物が、カチオン性脂質を更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物において、前記カチオン性脂質が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（１，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６−ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））、非カチオン性脂質と結合したカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、並びにＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物から成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
動物細胞内に２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の取り込みを生じさせる方法において、前記方法がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと前記ｄｓＲＮＡとを具える混合物と、前記動物細胞をインキュベートするステップを具え、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を備えることを特徴とする方法。
【請求項１６】
動物細胞中の標的遺伝子の発現を変化させる方法において、前記方法がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであって、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが前記標的遺伝子の領域と相補的である２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）とを具える混合物と、前記動物細胞をインキュベートするステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の方法において、前記動物細胞が、哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
対象動物の表現型を変化させる方法において、前記方法がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであって、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、対象内の標的遺伝子の領域に相補的である２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）との混合物を、前記対象動物に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記動物が、哺乳動物であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、分子量２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｙｐ）４：１、２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｏｒｎ、Ｔｒｐ）４：１、メリチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５９、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９乃至９２、９４乃至１０８、１６４乃至１７８及び１８０乃至１８６から成る群から選択される配列の全て又は一部分を有することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端が、アセチル化されていることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端が、ＰＥＧ化されていることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ｄｓＲＮＡが、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）遺伝子の一部分に相補的な、約１０乃至約４０塩基対の配列から成る、低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＲＮＡ）であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１０９乃至１６３及び１８７から成る群から選択される、約１０乃至約４０塩基対の配列から成るｓｉＲＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡと混和されるか、複合体化されるか又は結合されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡに結合することを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１５、１６又は１８のいずれか１項に記載の方法が、カチオン性脂質を更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、前記カチオン性脂質が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）プロピルアミド（１，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６−ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））、非カチオン性脂質と結合したカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、並びにＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物から成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであって、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、対象動物の腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）関連炎症障害の治療用薬物の製造用２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記薬物が、ＴＮＦ−αＲＮＡレベルを低減し、これによってＴＮＦ−α関連炎症障害の１又はそれ以上の症状の発症又は重症度を予防又は低減することができる２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）とを具える混合物の使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、分子量２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｙｐ）４：１、２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｏｒｎ、Ｔｒｐ）４：１、メリチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５９、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９乃至９２、９４乃至１０８、１６４乃至１７８及び１８０乃至１８６から成る群から選択される配列の全て又は一部分を有することを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端がアセチル化されていることを特徴とする使用。
【請求項３２】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端がＰＥＧ化されていることを特徴とする使用。
【請求項３３】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ｄｓＲＮＡが、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）遺伝子の一部分に相補的な、約１０乃至約４０塩基対の配列から成る、低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＲＮＡ）であることを特徴とする使用。
【請求項３４】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１０９乃至１６３及び１８７から成る群から選択される、約１０乃至約４０塩基対の配列から成るｓｉＲＮＡであることを特徴とする使用。
【請求項３５】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡと混和されるか、複合体化されるか又は結合されることを特徴とする使用。
【請求項３６】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡに結合することを特徴とする使用。
【請求項３７】
請求項２９に記載の混合物の使用において、前記対象動物が哺乳動物であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞内へ送達するための方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、２本鎖ポリヌクレオチドを細胞内へ送達して、標的遺伝子の発現を変化させて、細胞の病状又は潜在的能力といった表現型を変えるための方法及び製剤に関する。
【０００２】
本発明の背景
動物細胞及び植物細胞に核酸を送達することは、分子生物学の研究及び開発において、長らく重要な課題とされてきている。遺伝子治療、アンチセンス治療及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）治療の領域における近年の発展に伴い、核酸を細胞内に導入するためのより効果的な方法の開発に対する需要が生じている。
【０００３】
巨大なポリヌクレオチド分子を細胞内に送達するための、多様な数多くのプラスミドや他の核酸「ベクター」が開発されてきた。典型的には、これらのベクターは、標的細胞を形質転換させて、科学的な対象又は治療対象の遺伝子を発現させるための無傷の遺伝子を具える巨大なＤＮＡ分子を取り込むものである。
【０００４】
外来性の核酸が人工的に細胞内へと送達される過程は、一般的にトランスフェクションと呼ばれる。種々の技法と材料を用いて、細胞をトランスフェクトして、外来性の供給源からの機能的核酸を取り込ませることができる。最も広く用いられるトランスフェクション法は、リン酸カルシウムトランスフェクション法とエレクトロポレーション法である。細胞を形質導入させて外来性のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を送達するための種々の別の方法も開発されており、ウィルス媒介性形質導入法、カチオン性脂質送達法又はリポソーム送達法、及び機械的又は生化学的な膜の破壊／透過（例えば、界面活性剤、マイクロインジェクション、若しくはパーティクルガンを用いることよる）を目的とする数多くの方法が含まれる。
【０００５】
ＲＮＡ干渉とは、標的のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部に対する配列が相同的な２本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチド、通常ｄｓＲＮＡにより開始される細胞内での配列特異的な転写後ジーンサイレンシングのプロセスである。細胞内への適切なｄｓＲＮＡの導入により、内在性の、同種のｍＲＮＡ（即ち、導入されるｄｓＲＮＡと実質的な配列同一性を共有するｍＲＮＡ）の破壊が生じる。該ｄｓＲＮＡ分子は、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのヌクレアーゼにより、長さ１９乃至２３個のヌクレオチド（ｎｔ）である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）へと切断される。該ｓｉＲＮＡは、次いで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）又は「ＲＩＳＣ」として知られる、複数成分から成るヌクレアーゼ複合体へと取り込まれる。該ＲＩＳＣは、そのｓｉＲＮＡに対する相同性を介してｍＲＮＡ基質を同定し、該標的ｍＲＮＡに結合して破壊することにより遺伝子発現のサイレンシングを達成する。
【０００６】
ＲＮＡ干渉は、植物細胞及び動物細胞内で特定の遺伝子の発現を変化させるための有望な技術として浮上しており、従って、外来性遺伝子の発現の修飾により治療可能な広範囲の疾患及び障害を治療するための有益なツールを提供するものとして期待されている。
【０００７】
特に、細胞に核酸を送達するための既存の技術が、送達用試薬の乏しい効率及び／又は抗毒性により制限を受けるという事実に鑑みると、細胞内にｓｉＲＮＡ及び他の低分子阻害核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＮＡ）を送達するためのより良いツール及び方法に対する当該技術分野における長年の需要が依然として存在している。また、非毒性の送達媒体を用いて、効果的な量のｓｉＮＡを、活性で耐久性のある状態で、選択した細胞、組織、又は区画に送達して、標的細胞の表現型又は病状を変化させるように遺伝子発現の調節を媒介するための改善された方法と製剤に対する関連した需要も存在している。
【０００８】
発明の概要
本発明の１の態様は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具える組成物であり、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具える。関連する実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、約５乃至約４０個のアミノ酸を含み、分子量２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｙｐ）４：１、２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｏｒｎ、Ｔｒｐ）４：１、メリチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５９、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９乃至９２、９４乃至１０８、１６４乃至１７８及び１８０乃至１８６から成る群から選択される配列の全て又は一部分を有する。
【０００９】
別の実施態様では、前記組成物は、動物細胞内へのｄｓＲＮＡの取り込みを生じさせる。別の実施態様では、前記動物細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施態様では、前記組成物が、動物に投与される。関連する実施態様では、前記動物は、哺乳動物である。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端がアセチル化されている。関連する実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端は、ＰＥＧ化されている。更に別の実施態様では、前記ｄｓＲＮＡは、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）遺伝子の一部分に相補的な、約１０乃至約４０塩基対の配列から成る低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＲＮＡ）である。関連する実施態様では、前記ｄｓＲＮＡは、配列番号１０９乃至１６３及び１８７から成る群から選択される約１０乃至約４０塩基対の配列から成るｓｉＲＮＡである。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、前記ｄｓＲＮＡと混和されるか、複合体化されるか、又は結合される。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、前記ｄｓＲＮＡと結合する。更に別の実施態様では、上記のあらゆる組成物は、カチオン性脂質を更に具える。関連する実施態様では、前記カチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペル��ン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））、非カチオン性脂質と結合したカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、並びにＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物、から成る群から選択される。
【００１０】
本発明の別の態様は、動物細胞内への２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の取り込みを生じ、この方法は、ポリヌクレオチド送達ポリペプチドとｄｓＲＮＡを具える混合物と、動物細胞をインキュベートするステップを具える。このポリヌクレオチド送達ポリペプチドは、両親媒性であり、核酸結合性を具える。
【００１１】
本発明の別の態様は、動物細胞を、両親媒性で核酸結合性を具える動物細胞の標的遺伝子の発現を変化させる方法であり、この方法は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであって、このポリヌクレオチド送達ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えるポリヌクレオチド送達ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、このｄｓＲＮＡが標的遺伝子の領域に対して相補的である２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）とを具える混合物と、動物細胞をインキュベートするステップを具える。
【００１２】
関連する実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記動物細胞は、哺乳動物細胞である。
【００１３】
本発明の別の態様は、対象動物の表現型を変化させる方法であり、この方法は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであって、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、対象内の標的遺伝子の領域に相補的である２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）との混合物を、前記対象動物に投与するステップを具える。関連する実施態様において、前記動物は、哺乳動物であってもよい。
【００１４】
別の実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、分子量２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｙｐ）４：１、２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｏｒｎ、Ｔｒｐ）４：１、メリチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５９、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９乃至９２、９４乃至１０８、１６４乃至１７８及び１８０乃至１８６から成る群から選択される配列の全て又は一部分を有する。関連する実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端がアセチル化されている。別の関連する実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端は、ＰＥＧ化されている。別の実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ｄｓＲＮＡは、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）遺伝子の一部分に相補的な、約１０乃至約４０塩基対の配列から成る低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＲＮＡ）である。関連する実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ｄｓＲＮＡは、配列番号１０９乃至１６３及び１８７から成る群から選択される、約１０乃至約４０塩基対の配列から成るｓｉＲＮＡである。別の実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、前記ｄｓＲＮＡと混和されるか、該ｄｓＲＮＡと複合体化されるか又は結合される。更に別の実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、前記ｄｓＲＮＡと結合する。別の実施態様では、上記のいずれかの方法であり、カチオン性脂質を更に具える方法である。関連する実施態様は、上記のいずれかの方法であり、前記カチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１  ，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、��ＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））、非カチオン性脂質と結合したカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、並びにＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物から成る群から選択される。
【００１５】
本発明の別の態様は、ポリヌクレオチド送達ポリペプチドであって、このポリヌクレオチド送達ポリペプチドが両親媒性であり、核酸結合性を具えるポリヌクレオチド送達ポリペプチドと、対象動物内での腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）関連炎症障害の治療用薬物であり、ＴＮＦ−α  ＲＮＡ濃度を低下させ、これによってＴＮＦ−α関連炎症障害の１種類又はそれ以上の症状の発症又は重症度を予防するか又は軽減させることが可能な薬物の製造のための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）とを具える混合物の使用である。ある実施態様において、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、分子量２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｙｐ）４：１、２０，０００乃至５０，０００のポリ（Ｏｒｎ、Ｔｒｐ）４：１、メリチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５９、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９乃至９２、９４乃至１０８、１６４乃至１７８及び１８０乃至１８６から成る群から選択される配列の全て又は一部分を有する。関連する実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端がアセチル化されている。別の関連する実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端は、ＰＥＧ化されている。別の実施態様では、前記ｄｓＲＮＡは、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）遺伝子の一部分に相補的な、約１０乃至約４０塩基対の配列から成る低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＲＮＡ）である。関連する実施態様では、前記ｄｓＲＮＡは、配列番号１０９乃至１６３及び１８７から成る群から選択される約１０乃至約４０塩基対の配列から成るｓｉＲＮＡである。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、前記ｄｓＲＮＡと混和されるか、複合体化されるか又は結合される。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、前記ｄｓＲＮＡに結合する。別の実施態様では、前記対象動物は、哺乳動物である。
【００１６】
本発明の例示的実施態様の説明
本発明は、低分子干渉核酸（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＮＡ）、又はその前駆体を、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと組み合わせて用いる新規な組成物及び方法を提供することにより、上記の需要を満足し、更なる課題と利点を満たす。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ｓｉＮＡ及びその前駆体を具えるポリヌクレオチドの細胞内送達又は取り込みを促進する能力について選択された天然又は人工のポリペプチドである。
【００１７】
本発明の新規組成物において、ｓｉＮＡは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混和されるか、複合体化されるか又は結合されることで、標的細胞を裸のｓｉＮＡ（即ち、送達促進ポリペプチドが存在しないｓｉＮＡ）と接触させた結果得られる送達と比較して、ｓｉＮＡの細胞内送達を促進する組成物を形成することができる。
【００１８】
本発明の特定の実施態様では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ヒストンタンパク質、又はそのポリペプチド若しくはペプチド断片、誘導体、類似体、若しくは結合体である。これらの実施態様において、ｓｉＮＡは、１種類又はそれ以上の完全長ヒストンタンパク質、又は少なくとも部分的にヒストンタンパク質の部分配列に相当するポリペプチド、例えば、１種類又はそれ以上の以下に示すヒストンと、混和されるか、複合体化されるか又は結合される：ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３若しくはヒストンＨ４、又は、典型的には、天然ヒストンタンパク質の少なくとも５乃至１０個若しくは１０乃至２０個の連続した残基であるヒストンタンパク質の少なくとも部分配列を具える１種類又はそれ以上のヒストンのポリペプチド断片若しくは誘導体。より詳細な実施態様では、ｓｉＲＮＡ／ヒストン混合物、複合体又は結合体は、実質的に両親媒性化合物を含まない。他の詳細な実施態様では、ヒストンタンパク質又はポリペプチドと、混和されるか、複合体化され、又は結合されたｓｉＮＡは、例えば、３０個以下のヌクレオチドを有し、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である２本鎖ＲＮＡ等の２本鎖ＲＮＡを具える。典型的な実施態様では、ヒストンポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、以下に記載するＰＮ７３と名付けられたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドにより例示されるように、ヒストンＨ２Ｂの断片を具える。更なる詳細な実施態様では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、特に、インビボでの投与との関係における安定性及び／又は効率性を向上させるために、ＰＥＧ化されていてもよい。
【００１９】
本発明の更なる実施態様では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、両親媒性のアミノ酸配列を具えるように選択されるか又は合理的に設計される。例えば、両親媒性ペプチドを生じるように、帯電性配列のドメイン又はモチーフを形成する複数の帯電性アミノ酸残基に連結した、疎水性配列のドメイン又はモチーフを形成する複数の非極性若しくは疎水性アミノ酸残基を具える有用なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを選択することができる。
【００２０】
他の実施態様において、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、タンパク質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）又はモチーフ、及び融合ペプチドドメイン又はモチーフを具えるように選択される。タンパク質導入ドメインとは、細胞膜に挿入可能であり、好ましくは細胞膜を通過可能なペプチド配列である。融合ペプチドとは、細胞膜又はエンドソームを包む膜等の脂質膜を不安定化させるペプチドであり、この不安定化は低ｐＨで促進することができる。典型的な融合ドメイン又はモチーフは、多様なウィルス性融合タンパク質及び他のタンパク質に見出され、例えば、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）等がある。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計するためには、細胞膜を介した細胞内への核酸の侵入を容易化するモチーフとしてタンパク質導入ドメインが用いられる。特定の実施態様において、輸送される核酸は、エンドソーム内に封入される。エンドソームの内部のｐＨは低くなっており、その結果、融合ペプチドモチーフが、該エンドソームの膜を不安定化させる。エンドソーム膜の不安定化と破壊により、ｓｉＮＡは、ＲＩＳＣ複合体と結合して、その標的ｍＲＮＡに向かうことが可能な細胞質内へと放出される。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドへ選択的に組み込むためのタンパク質導入ドメインの例には、以下のものが含まれる：
１．ＴＡＴタンパク質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）（ＰＴＤ）（配列番号１）ＫＲＲＱＲＲＲ；
２．ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ＰＴＤ（配列番号２）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；
３．ＶＰ２２  ＰＴＤ（配列番号３）ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤ；
４．カポジＦＧＦシグナル配列（配列番号４）ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ、及び配列番号５）ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ；
５．ヒトインテグリンβ３シグナル配列（配列番号６）ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ；
６．ｇｐ４１融合配列（配列番号７）ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ；
７．カイマンクロコディルス（Ｃａｉｍａｎ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ）Ｉｇ（ｖ）軽鎖（配列番号８）ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡ；
８．ｈＣＴ−誘導ペプチド（配列番号９）ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ；
９．トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）（配列番号１０）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；
１０．ロリゴマー（Ｌｏｌｉｇｏｍｅｒ）（配列番号１１）ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＫ；
１１．アルギニンペプチド（配列番号１２）ＲＲＲＲＲＲＲ；及び
１２．両親媒性モデルペプチド（配列番号１３）ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドへ選択的に組み込むためのウィルス性融合ペプチドの融合ドメインの例には、以下のものが含まれる：
１．インフルエンザＨＡ２（配列番号１４）ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧ；
２．センダイＦ１（配列番号１５）ＦＦＧＡＶＩＧＴＩＡＬＧＶＡＴＡ；
３．呼吸器合胞体ウイルスＦ１（配列番号１６）ＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶ；
４．ＨＴＶ  ｇｐ４１（配列番号１７）ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡＴＡＧＳ；及び
５．エボラＧＰ２（配列番号１８）ＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡ。
【００２４】
本発明の更なる実施態様において、ポリペプチド−ｓｉＮＡ複合体形成を促進し、そして／又は本発明の方法及び組成物の範囲内でｓｉＮＡの送達を向上させるＤＮＡ結合ドメイン又はモチーフが組み込まれたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが提供される。この意味における代表的なＤＮＡ結合ドメインには、下記の表１に同定されるＤＮＡ結合性調節タンパク質及び他のタンパク質について記載されるように、種々の「ジンクフィンガー（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）」ドメインが含まれる（例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７８：２８０１１−２８０１８，２００３を参照）。
【００２５】
表１：
2009507852.tif 000003
【００２６】
＊上記の表には、Ｃ−ｘ（２，４）−Ｃ−ｘ（１２）−Ｈ−ｘ（３）−Ｈのモチーフパターン（配列番号１８８）により特徴づけられる２本鎖ＤＮＡに結合するための保存的なジンクフィンガーが示されており、これを用いて、本発明に係る更なるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを選択及び設計することが可能である。
＊＊表１に示す配列、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＤｒｏｓＢｔｄ、ＤｒｏｓＳｐ、ＣｅＴ２２Ｃ８．５、及びＹ４ｐＢ１Ａ．４については、本明細書において、それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６と定める。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを構成するために有用な代わりのＤＮＡ結合ドメインには、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質配列の一部が含まれる（以下の例を参照）。
【００２８】
本明細書の以下に説明される本発明の代表的な実施態様において、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、前述の構造要素、ドメイン又はモチーフのいずれかを、標的細胞へのｓｉＮＡ送達の向上を効果的に媒介する単一のポリペプチドに組み合わせることにより、合理的に設計して構築することが可能である。例えば、ＴＡＴポリペプチドのタンパク質導入ドメインを、インフルエンザウィルスのＨＡ２と呼ばれるヘマグルチニンタンパク質のＮ末端の２０個のアミノ酸に融合させることにより、本明細書中の１つの代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが得られた。本開示には、種々の別のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド構築物が提示されており、本発明を広く応用して、ｓｉＮＡ送達の促進に効果的な多種多様なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを作り出して、用いることが可能なことが明示されている。
【００２９】
本発明の範囲内にある更なる代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、以下のペプチドから選択することができる：
ＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ（配列番号２７）；
ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号２９）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３０）、ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ（配列番号３１）、分子量２０，０００乃至５０，０００のポリＬｙｓ−Ｔｒｐ、４：１；及び分子量２０，０００乃至５０，０００のポリＯｒｎ−Ｔｒｐ、４：１。本明細書中の組成物及び方法の範囲内にある更なる有用なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドには、メリチンタンパク質配列の全部または一部が含まれる。
【００３０】
更なる別の代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、以下の実施例で同定されている。これらのペプチドのいずれか１つ又は組み合わせを選択するか、又は組み合わせることで、本発明の方法及び組成物の範囲内で効果的に細胞内でのｓｉＮＡの送達を誘導又は促進するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド試薬を得ることができる。
【００３１】
本発明の更に詳細な態様において、ｓｉＲＮＡ及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを具える混合物、複合体又は結合体は、選択的に、リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）のようなカチオン性脂質と組み合わされ（例えば、混和又は複合体化され）ていてもよい。この意味において、本明細書には、予想外なことに、ｓｉＲＮＡのみと複合体化又は結合したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ＲＮＡｉによるジーンサイレンシングを媒介するのに十分なｓｉＮＡの送達を達成するであろうことが開示されている。しかしながら、本明細書には、更に予想外なことに、ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの複合体又は結合体が、リポフェクチン等のカチオン性脂質と混和又は複合体化された場合に、ｓｉＮＡ送達及びジーンサイレンシングを媒介するより強力な活性を示すであろうことも開示されている。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ及びカチオン性脂質から構成されるこれらの組成物を作り出すためには、最初に該ｓｉＲＮＡ及びペプチドが、細胞培養培地等の適切な培地に一緒に混合されてもよく、その後、前記カチオン性脂質が前記混合物に添加されて、ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質の組成物が形成される。選択的に、最初に前記ペプチドとカチオン性脂質が、細胞培養培地等の適切な培地に一緒に混合され、その後、前記ｓｉＲＮＡが添加されて、ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質の組成物が形成されてもよい。
【００３２】
本発明の実施態様の範囲内にある有用なカチオン性脂質の例には、以下のものが含まれる：Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、又はＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）。多価カチオン性脂質には、リポスペルミンが含まれ、具体的には、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）及びＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、並びにジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミンが含まれ、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）及びＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））も含まれるが、これらに限定されるものではない。その他の有用なカチオン性脂質は、例えば、米国特許第６，７３３，７７７号；米国特許第６，３７６，２４８号；米国特許第５，７３６，３９２号；米国特許第５，６８６，９５８号；米国特許第５，３３４，７６１号；及び米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。
【００３３】
カチオン性脂質は、非カチオン性脂質、特に中性脂質、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロールのような脂質と選択的に組み合わされてもよい。ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、又はＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物（リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から構成されるカチオン性脂質組成物は、一般的に、本発明の組成物をトランスフェクションするのに有用である。好ましいトランスフェクション用組成物は、高等真核生物のセルラインで相当なトランスフェクションを促進する組成物である。
【００３４】
代表的な実施態様において、本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混和されるか、又は複合体化されるか、又は結合された、低分子干渉核酸（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のような、低分子量の核酸分子を具える組成物を特徴とする。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「低分子干渉核酸（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、又は「化学修飾低分子干渉核酸分子（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、例えば、配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又はジーンサイレンシングを媒介することにより、遺伝子発現又はウィルス複製を阻害又は下方制御可能なあらゆる核酸分子を指す。代表的な実施態様において、ｓｉＮＡは、自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なセンス領域とアンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が、発現の下方制御の標的となる核酸分子内のヌクレオチド配列又はその一部に相補的な核酸配列を含み、該センス領域が、標的の核酸配列又はその一部に相当する（即ち、標的の核酸分子と、配列において実質的に同一な）ヌクレオチド配列を具えるような領域、を具える２本鎖ポリヌクレオチド分子である。
【００３６】
「ｓｉＮＡ」は、短い２本鎖核酸（ｓｈｏｒｔ−ｌｅｎｇｔｈ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）であり（より長いその前駆体であってもよい）、標的細胞内で許容できない程の毒性を示さない、例えば、ｓｉＲＮＡ等の低分子干渉核酸を意味する。本発明の範囲内にある有用なｓｉＮＡの長さは、特定の実施態様においては、約２１乃至２３ｂｐの長さで最適化されるであろう。しかしながら、ｓｉＲＮＡを具える有用なｓｉＮＡの長さには、特定の制限が存在しない。例えば、ｓｉＮＡは、最初は、標的細胞内への送達時又は送達後に存在してジーンサイレンシング活性を発揮する最終的な形態、若しくはプロセッシングを受けた形態のｓｉＮＡとは大きく異なる前駆体の形態で細胞に提供することができる。前駆体の形態のｓｉＮＡには、例えば、細胞内でジーンサイレンシングを媒介する活性を示すｓｉＮＡを生じさせるために、送達時又は送達後に、プロセッシングを受け、分解され、変化され、又は切断される前駆体配列要素が含まれていてもよい。従って、特定の実施態様では、本発明の範囲内にある有用なｓｉＮＡは、例えば、標的細胞内で、活性なプロセッシングを受けたｓｉＮＡを生じる約１００乃至２００塩基対、５０乃至１００塩基対、又は約５０塩基対未満の前駆体の長さを有することになる。他の実施態様においては、有用なｓｉＮＡ又はｓｉＮＡ前駆体は、約１０乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂｐの長さになるであろう。
【００３７】
本発明の特定の実施態様では、上で述べたように、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いることで、ｓｉＮＡの巨大核酸前駆体を具える従来のｓｉＮＡよりも大きな核酸分子の送達が促進される。例えば、本明細書中の方法及び組成物は、所望のｓｉＮＡへの「前駆体」を代表する巨大核酸の送達の促進のために用いることが可能であり、該前駆体アミノ酸は、標的細胞への送達前、送達中又は送達後に切断されるか、又はさもなければプロセッシングを受けて標的細胞内で遺伝子発現を調節するための活性なｓｉＮＡを形成することが可能である。例えば、ｓｉＮＡ前駆体ポリペプチドは、２又は３個以上のループ構造、及び、自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なセンス領域とアンチセンス領域であって、該アンチセンス領域が、発現の下方制御の標的となる核酸分子内のヌクレオチド配列又はその一部に相補的な核酸配列を含み、該センス領域が、標的の核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を具えるような領域を具えるステム（ｓｔｅｍ）を有する環状の１本鎖ポリヌクレオチドであって、該環状ポリヌクレオチドが、インビボ又はインビトロでプロセッシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介可能な活性ｓｉＮＡ分子を生じるような、環状の１本鎖ポリヌクレオチドとして選択することができる。
【００３８】
哺乳動物細胞内では、３０塩基対を超えるｄｓＲＮＡは、通常、インターフェロンにより誘起されるｄｓＲＮＡ依存性キナーゼＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ＰＫＲ）と、２’−５’−オリゴアデニレートシンセターゼ（２’−５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を活性化することができる。活性化されたＰＫＲは、翻訳因子である真核細胞翻訳開始因子２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２α）（ｅＩＦ２α）のリン酸化により翻訳全般を阻害し、一方で、２’−５’−オリゴアデニレートシンセターゼは、ＲＮａｓｅ  Ｌの活性化を介して、非特異的なｍＲＮＡ分解を起こさせる。通常３０塩基対未満であり、最も一般的には、約１７乃至１９、１９乃至２１、又は２１乃至２３塩基対の間にある、その小さなサイズにより（特に、非前駆体の形態について言及する）、本発明のｓｉＮＡは、インターフェロン応答の活性化を回避する。
【００３９】
長鎖のｄｓＲＮＡによる非特異的な効果とは対照的に、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物系において選択的なジーンサイレンシングを媒介することが可能である。短いループとステム内に１９乃至２７塩基対を有するヘアピンＲＮＡも、該２本鎖ステム内の配列に相同的な遺伝子の発現を、選択的にサイレンシングすることができる。哺乳動物細胞は、ショートヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換して、選択的なジーンサイレンシングを媒介させることができる。
【００４０】
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中心で起こる。研究により、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを具える場合に、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖が最も活性であることが証明されている。更に、２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換は、ＲＮＡｉ活性を消失させ、一方で、デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）によるｓｉＲＮＡの３’末端側のオーバーハングのヌクレオチドの置換は、許容されることが報告されている。
【００４１】
デオキシリボヌクレオチドによる２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖の３’オーバーハングセグメントの置換は、ＲＮＡｉ活性に悪影響を及ぼさないことが、研究により証明されている。デオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡの各末端の４ヌクレオチド以下の置換は、十分に許容されることが報告されているが、デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換は、結果として、ＲＮＡｉ活性を失わせる。
【００４２】
これに代わるものとして、ｓｉＮＡは、単一又は複数のｓｉＮＡをコードして標的細胞内でのこれらｓｉＮＡを発現させるポリヌクレオチドベクターにより発現される、単一又は複数の転写産物として送達することができる。これらの実施態様においては、標的細胞内で発現されるｓｉＲＮＡの最終転写産物の２本鎖部分は、例えば、１５乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂｐの長さとなるであろう。代表的な実施態様において、ｓｉＮＡの２本の鎖がペアを組んだ２本鎖部分は、完全にペアを組むヌクレオチドセグメントに限定されるものではなく、ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）（対応するヌクレオチドが相補的でない）、バルジ（ｂｕｌｇｅ）（一方の鎖状に対応する相補的ヌクレオチドが欠けている）、オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）等による非ペア形成部分を含んでいてもよい。非ペア形成部分は、これらがｓｉＮＡ形成を干渉しない程度において含まれていてもよい。より詳細な実施態様では、「バルジ」には、１乃至２個の非ペア形成ヌクレオチドが含まれていてもよく、ｓｉＲＮＡの２本鎖がペアを組む２本鎖領域には、約１乃至７個所、又は約１乃至５個所のバルジが含まれていてもよい。加えて、ｓｉＮＡの２本鎖領域内に含まれる「ミスマッチ」部分は、合計で、約１乃至７個所、又は約１乃至５個所存在していてもよい。最も高頻度なミスマッチの場合は、ヌクレオチドの一方がグアニンであり、他方がウラシルの場合である。このようなミスマッチは、例えば、センスＲＮＡをコードする対応ＤＮＡ内での、ＣからＴ、ＧからＡへの変異、又はこれらの混合に起因するものであるが、他の要因も考えられる。更にまた、本発明においては、ｓｉＮＡの２本の鎖がペアを組んだ２本鎖領域には、前記の特定された数値範囲と近い範囲で、バルジ部分とミスマッチ部分の両方が含まれていてもよい。
【００４３】
本発明のｓｉＮＡの末端構造は、ｓｉＮＡがその活性を保持して標的遺伝子の発現をサイレンシングする限りは、平滑又は付着性（オーバーハングを有する）のいずれであってもよい。付着性（オーバーハングを有する）末端構造は、他者によって報告されるように、３’オーバーハングだけに限定されるものではない。それどころか、ＲＮＡｉ等によるジーンサイレンシング作用を誘起可能な限り、５’オーバーハング構造が含まれていてもよい。加えて、オーバーハングするヌクレオチドの数は、報告されるような２又は３個のヌクレオチドの限界に制限されるものではなく、該オーバーハングがｓｉＮＡのジーンサイレンシング活性を損なわない限り、いずれの個数であってもよい。例えば、オーバーハングは、約１乃至８個のヌクレオチド、より多くの場合では約２乃至４個のヌクレオチドを含んでいてもよい。付着末端構造を有するｓｉＮＡの全長は、ペアを成す２本鎖部分の長さと両端にオーバーハングする１本鎖を具えるペアの長さの合計として表される。例えば、両端に４ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９ｂｐの２本鎖ＲＮＡの代表例においては、全長は２３ｂｐと表される。更に、オーバーハングする配列は、標的遺伝子に対して低い特異性を示すものであってもよいので、該配列は、標的遺伝子配列と相補的（アンチセンス）又は同一（センス）である必要はない。更に、ｓｉＮＡが、その標的遺伝子に対するジーンサイレンシング作用を維持できる限りは、該ｓｉＮＡは、例えば、一端のオーバーハング部分内に、低分子量の構造（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ若しくはウィルスＲＮＡ等の天然ＲＮＡ分子、又は人工のＲＮＡ分子）を含んでいてもよい。
【００４４】
更に、ｓｉＮＡの末端構造は、２本鎖核酸の一方の末端が、例えばリンカーＲＮＡ等のリンカー核酸により連結されたステム‐ループ構造を有していてもよい。２本鎖領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば、１５乃至４９ｂｐ、しばしば、１５乃至３５ｂｐ、そしてより一般的には約２１乃至３０ｂｐの長さであってもよい。また、上記に代わり、標的細胞内で発現されるｓｉＮＡの最終転写産物である２本鎖領域の長さは、例えば、約１５乃至４９ｂｐ、１５乃至３５ｂｐ、又は約２１乃至３０ｂｐの長さであってもよい。リンカーセグメントを用いる場合、該リンカーが、ステム部のペア形成を妨害しない限りにおいては、該リンカーの長さには特に制限がない。例えば、ステム部の安定なペア形成と、該ステム部をコードするＤＮＡ間の組換えの抑制のために、前記リンカー部分は、クローバー葉ｔＲＮＡ構造を有していてもよい。リンカーが、ステム部のペア形成を妨害する長さを有する場合であっても、例えば、イントロンを具えるようにリンカー部分を構築することが可能であり、従って、イントロンは、前駆体ＲＮＡから成熟ＲＮＡに向けたプロセッシング中に切除され、これによってステム部のペア形成が可能になる。ステム−ループｓｉＲＮＡの場合、ＲＮＡのループ構造を有しないいずれの末端（頭部又は尾部）も、低分子量のＲＮＡを有していてもよい。上述したように、これらの低分子量ＲＮＡには、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ若しくはウィルスＲＮＡ等の天然ＲＮＡ分子、又は人工のＲＮＡ分子が含まれていてもよい。
【００４５】
また、ｓｉＮＡは、標的核酸分子又はその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば、このようなｓｉＮＡ分子が、該ｓｉＮＡ分子内に標的核酸配列又はその一部分に相当するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合）、この場合、前記１本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら．，Ｃｅｌｌ．１１０：５６３−５７４，２００２、及び、Ｓｃｈｗａｒｚら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １０：５３７−５６８，２００２を参照）又は５’，３’−２リン酸のような、末端リン酸基を更に含んでいてもよい。
【００４６】
本明細書で用いる場合、ｓｉＮＡ分子という用語は、天然のＲＮＡ又はＤＮＡだけを具える分子に限定されるものではなく、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをも包含する。特定の実施態様では、本発明の低分子干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。特定の実施態様では、低分子干渉核酸は、ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要とせず、従って、本発明の低分子干渉核酸分子は、それ自体が、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を全く含まなくてもよい。しかしながら、ＲＮＡｉを補助するためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないｓｉＮＡ分子は、結合したリンカー若しくはリンカー、又は他の結合した若しくは会合した基、部分、若しくは２’−ＯＨを有する１若しくは２個以上のヌクレオチドを具える鎖を有していてもよい。また、ｓｉＮＡ分子は、選択的に、５、１０、２０、３０、４０、又は５０％のヌクレオチド位置にリボヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４７】
本明細書で用いる場合、ｓｉＮＡという用語は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ショートヘアピン（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、低分子干渉核酸（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後ジーンサイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、及びその他等の、配列特異的なＲＮＡｉを媒介可能な核酸分子を説明するために用いられる他の用語と同等であることが意図されている。
【００４８】
他の実施態様では、本発明の範囲内で使用するｓｉＮＡ分子は、個別のセンス及びアンチセンスの配列又は領域を含んでいてもよく、この場合、前記センス及びアンチセンスの領域は、ヌクレオチド若しくは非ヌクレオチドのリンカー分子により共有結合されているか、又はこれに代わって、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び／若しくはスタッキング相互作用により非共有結合的に結合している。
【００４９】
「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な配列を有し、該標的遺伝子のｍＲＮＡに結合してＲＮＡｉを誘起すると考えられるＲＮＡ鎖である。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有し、その相補的なアンチセンスＲＮＡにアニールしてｓｉＲＮＡを形成する。これらのアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡは、従来よりＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されてきた。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「ＲＮＡｉ構築物」という用語は、本明細書を通して用いられる一般用語であり、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）、ヘアピンＲＮＡ、及びインビボで切断されてｓｉＲＮＡを形成可能なその他のＲＮＡ種を具える。本明細書中で、ＲＮＡｉ構築物は、細胞内でｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを形成する転写物、及び／又はインビボでｓｉＲＮＡを作り出せる転写物を生じさせることが可能な発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも呼ばれる）をも具える。ｓｉＲＮＡは、選択的に、ｓｉＲＮＡの１本鎖又は２本鎖を含んでもよい。
【００５１】
ｓｉハイブリッド分子（ｓｉＨｙｂｒｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、ｓｉＲＮＡと類似する機能を有する２本鎖の核酸である。２本鎖ＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉハイブリッドは、１本のＲＮＡ鎖と１本のＤＮＡ鎖から構成される。アンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡに結合する鎖であるので、好ましくは、該ＲＮＡ鎖は、アンチセンス鎖である。ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションによって作り出されるｓｉハイブリッドは、ハイブリダイズされた相補的部分と、好ましくは少なくとも１つの３’オーバーハング末端を有する。
【００５２】
本発明の範囲内で用いるｓｉＮＡは、１つの鎖がセンス鎖で、他方の鎖がアンチセンス鎖である２つの個別のオリゴヌクレオチドから組み立てることが可能であり、この場合、前記アンチセンス鎖とセンス鎖は、自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）である（即ち、各鎖が、他方の鎖内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；アンチセンス鎖とセンス鎖が、２重鎖又は２本鎖構造を形成し、例えば、この場合、前記２本鎖領域は、約１９塩基対である）。アンチセンス鎖は、標的核酸分子又はその一部分内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいてもよく、そしてセンス鎖は、標的核酸配列又はその一部分に相当するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、これに代わるものとして、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることも可能であり、この場合、該ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸ベース又は非核酸ベースのリンカーにより連結されている。
【００５３】
更なる実施態様では、本発明の方法及び組成物に係る細胞内送達用のｓｉＮＡは、自己相補的センス領域とアンチセンス領域を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく、この場合、前記アンチセンス領域は、個別の標的核酸分子又はその一部分内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして前記センス領域は、前記標的核酸配列又はその一部分に相当するヌクレオチド配列を具える。
【００５４】
ｓｉＮＡ内で行うことが可能な化学修飾の非限定的な例には、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び末端のグリセリル及び／又は逆位デオキシ無塩基残基の組み込みが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの化学修飾は、種々のｓｉＮＡ構築物中に用いられた場合、細胞内でＲＮＡｉ活性を保護すると同時に、これら化合物の血清中での安定性を劇的に向上させることが証明されている。
【００５５】
非限定的な例において、核酸分子内への化学修飾ヌクレオチドの導入は、体外から送達される天然ＲＮＡ分子に特有のインビボでの安定性とバイオアベイラビリティの潜在的な限界を克服する強力なツールを提供する。化学修飾された核酸分子は、血清中でより長い半減期を有する傾向があるので、例えば、化学修飾された核酸分子を使用することで、任意の治療効果のために、特定の核酸分子よる比較的少量の投与量が可能になる。また更に、特定の化学修飾により、標的の特定の細胞若しくは組織による核酸分子のバイオアベイラビリティを向上させることが可能であり、そして／又は細胞による該核酸分子の取り込みを向上させる。従って、化学修飾された核酸分子の活性が、例えば、全てのＲＮＡ核酸分子と比較した場合のように、天然の核酸分子と比較して低下している場合であっても、該修飾された核酸分子全体の活性は、その向上した安定性及び／又は分子の送達により、天然の分子の活性を超える場合がある。天然の非修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾ｓｉＮＡは、ヒトの体内でインターフェロン活性を活性化させる可能性を最小化することも可能である。
【００５６】
本明細書に記載するｓｉＮＡ分子は、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域が、該アンチセンス領域の３’末端に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を具えることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の実施態様のいずれかにおいて、アンチセンス領域は、該アンチセンス領域の５’末端に、約１乃至約５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を具えることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の実施態様のいずれかにおいて、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、又は骨格が化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを具えることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の実施態様のいずれかにおいて、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１個又はそれ以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを具えることができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の実施態様のいずれかにおいて、３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１個又はそれ以上の非環式ヌクレオチドを具えることができる。
【００５７】
例えば、非限定的な例において、本発明は、１本の分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）鎖内に１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。更に別の実施態様では、本発明は、両方の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）鎖内に１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を独立して有する、化学修飾低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二重鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖内に存在していてもよく、例えば、センス鎖内、アンチセンス鎖内、又は両方の鎖内に存在していてもよい。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に、１個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。例えば、本発明の代表的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に、約１乃至約５又は６個以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の連続するホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。別の非限定的な例では、本発明の代表的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖内に、１個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。更に別の非限定的な例では、本発明の代表的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖内に、１個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。
【００５８】
ｓｉＮＡ分子は、環状核酸分子から構成されていてもよく、この場合、該ｓｉＮＡは、約３８乃至約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）のヌクレオチドの長さにあって、約１８乃至約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）の塩基対を有し、ここで、該環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対と２つのループを有するダンベル型構造を形成する。
【００５９】
環状ｓｉＮＡ分子は、２つのループモチーフを具えるが、該ｓｉＮＡ分子の一方又は両方のループ部分は、生分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、インビボでの該ｓｉＮＡ分子のループ部分の分解により、約２個のヌクレオチドを含んだ３’末端ヌクレオチドオーバーハングのような、３’末端オーバーハングを有する２本鎖ｓｉＮＡ分子を生じさせることが可能なように設計される。
【００６０】
ｓｉＮＡ分子内、好ましくは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖内、のみならず選択的にセンス鎖内、及び／又はアンチセンス及びセンスの両鎖内に存在する修飾ヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチドに類似した特性又は特徴を有する修飾ヌクレオチドを具える。例えば、本発明は、ノーザン配位（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する修飾ヌクレオチドを具える（例えば、ノーザン偽回転周期（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐｓｅｕｄｏｒｏｔａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ）等、例として、Ｓａｅｎｇｅｒ，「核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編集．，１９８４年、を参照）ｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明のｓｉＮＡ分子内、好ましくは、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖内、のみならず選択的にセンス鎖内、及び／又はアンチセンス及びセンスの両鎖内に存在する化学修飾ヌクレオチドは、それ自体が、ヌクレアーゼによる分解に耐性を有しており、それと同時に、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持する。ノーザン配置（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有するヌクレオチドの非限定的な例には、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチルチオエチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。
【００６１】
２本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、該センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に、逆位デオキシ塩基性部分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）のような、末端キャップ部分（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｐ  ｍｏｉｅｔｙ）を有していてもよい。
【００６２】
結合体の非限定的な例には、２００３年４月３０日に提出されたＶａｒｇｅｅｓｅら．，米国特許出願番号第１０／４２７，１６０号に記載される結合体とリガンドが含まれ、該文献は、図面を含むその全てが参照により本明細書に取り込まれている。別の実施態様では、結合体は、生分解性のリンカーを介して化学修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合している。１の実施態様において、結合体分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はこれら両鎖のいずれかの３’末端に結合する。別の実施態様では、結合体分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又はこれら両鎖のいずれかの５’末端に結合する。更に別の実施態様では、結合体分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、若しくはこれら両鎖のいずれか、又はこれらのいずれかの組み合わせの３’末端と５’末端の両方に結合する。１の実施態様において、本発明の結合体分子は、細胞のような生体系内への化学修飾ｓｉＮＡ分子の送達を促進する分子を具える。別の実施態様では、化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合する結合体分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は細胞の取り込みを媒介可能な細胞レセプターのリガンドである。化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合可能な本発明で意図される具体的な結合体分子の例は、２００３年７月１０日に公開されたＶａｒｇｅｅｓｅら．，米国特許公開公報第２００３０１３０１８６号、及び２００４年６月１０日に公開された米国特許公開公報第２００４０１１０２９６号に記載されている。使用される結合体の種類及び本発明のｓｉＮＡ分子の結合体の範囲は、ｓｉＮＡのＲＮＡｉ活性を媒介する能力を同時に維持しながら、向上したｓｉＮＡ構築物の薬物動態特性、バイオアベイラビリティ、及び／又は安定性に関して評価することが可能である。当業者であれば、例えば、当該技術分野で一般的に知られる動物モデル内で、種々の結合体により修飾されたｓｉＮＡ構築物をスクリーニングして、ｓｉＮＡ結合体複合体が、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながらも、向上した特性を保持しているかどうかを決定することができる。
【００６３】
更に、ｓｉＮＡは、該ｓｉＮＡのセンス領域を、該ｓｉＮＡのアンチセンス領域と連結させるヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカー、又はヌクレオチド／非ヌクレオチド混合リンカーから構成されていてもよい。１の実施態様において、ヌクレオチドリンカーは、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドの長さ等、２個を超えるヌクレオチドの長さにあってもよい。別の実施態様では、ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってもよい。本明細書で用いられる「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子であって、その自然環境下にある標的分子により認識される配列を具える配列を有する核酸分子を意味する。これに代わり、アプタマーは、標的分子が自然状態では核酸に結合しない場合でも、標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は、あらゆる対象の分子でよい。例えば、アプタマーを用いてタンパク質のリガンド結合ドメインに結合させ、それによって、天然のリガンドによる該タンパク質との相互作用を防ぐことが可能である。しかし、これは非限定的な例であり、当業者であれば、当該技術分野で一般的に知られる技術を用いることで他の実施態様を直ちに作り上げることが可能なことを認識するであろう。例えば、Ｇｏｌｄら．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３，１９９５；Ｂｒｏｄｙ及びＧｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５，２０００；Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１００，２０００；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７，２０００；Ｈｅｒｍａｎｎ及びＰａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２０，２０００；並びに、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１６２８，１９９９を参照。
【００６４】
非ヌクレオチドリンカーは、無塩基ヌクレオチド、ポリエステル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリヒドロカーボン（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、又は他のポリマー化合物（例えば、２乃至１００個のエチレングリコール単位を有するようなポリエチレングリコール）から構成されていてもよい。具体的な例には、Ｓｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０、及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１１３，１９８７；Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４，１９９１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９，１９９１；Ｍａら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２５８５，１９９３，及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１７５１，１９９３；Ｄｕｒａｎｄら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０；ＭｃＣｕｒｄｙら．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １０：２８１，１９９１；Ｊｓｃｈｋｅら．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１，１９９３；Ｏｎｏら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９９１４，１９９１；Ａｒｎｏｌｄら．，国際公開公報第ＷＯ８９／０２４３９号；Ｕｓｍａｎら．，国際公開公報第ＷＯ９５／０６７３１号；Ｄｕｄｙｃｚら．，国際公開公報第ＷＯ９５／１１９１０号、並びにＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４０００，１９９１、に記載される非ヌクレオチドリンカーが含まれる。「非ヌクレオチド」は、糖及び／又はリン酸置換のいずれかを具える、１個又はそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖内に取り込むことが可能な基又は化合物であって、残存する塩基にその酵素活性を示すことを許容する、あらゆる基又は化合物を意味する。前記の基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミジンのような一般的に認識されたヌクレオチド塩基を、例えば糖のＣ１の位置等に含まないという点で、無塩基性のものであってもよい。
【００６５】
化学的に修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子の合成は：（ａ）該ｓｉＮＡ分子の２本の相補的な鎖の合成；（ｂ）２本鎖ｓｉＮＡ分子を得るために適切な条件下で、前記２本の相補的な鎖を一緒にアニールさせることを具える。別の実施態様では、ｓｉＮＡ分子の２本の相補的な鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成によって行われる。更に別の実施態様では、ｓｉＮＡ分子の２本の相補的な鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成によって行われる。
【００６６】
オリゴヌクレオチド（例えば、特定の修飾されたオリゴヌクレオチド、又はリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、以下に記載されるような、当該技術分野で知られるプロトコルを用いて合成される：Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１：３−１９，１９９２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら．，国際公開公報第ＷＯ９９／５４４５９号；Ｗｉｎｃｏｔｔら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５；Ｗｉｎｃｏｔｔら．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７；Ｂｒｅｎｎａｎら．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．６１：３３−４５，１９９８；及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号。本発明の特定のｓｉＮＡ分子を具えるＲＮＡの合成は、例えば、以下に記載される一般的方法に従う：Ｕｓｍａｎら．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５，１９８７；Ｓｃａｒｉｎｇｅら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５４３３，１９９０；及びＷｉｎｃｏｔｔら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５；Ｗｉｎｃｏｔｔら．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７。
【００６７】
本発明の範囲内で用いるための核酸分子の、追加的又は補足的な送達方法は、例えば、以下に記載されている：Ａｋｈｔａｒら．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９，１９９２；「アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の送達手段（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，Ａｋｈｔａｒ編集，１９９５年；Ｍａｕｒｅｒら．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−１４０，１９９９；Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５−１９２，１９９９；及びＬｅｅら．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２，２０００。Ｓｕｌｌｉｖａｎら．，国際公開公報第ＷＯ９４／０２５９５号には、更に酵素的核酸分子の一般的な送達方法が記載されている。これらのプロトコルは、実質的に本発明の範囲内に意図されるあらゆる核酸分子の、追加的又は補足的な送達方法に利用することが可能である。
【００６８】
核酸分子及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、当業者に知られる種々の方法により、細胞へ投与することが可能であり、その方法には、ｓｉＮＡとポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドだけを具える製剤、又は、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、バッファー、安定剤、保存剤等の１種類又はそれ以上の追加的成分を更に具える製剤での投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様では、ｓｉＮＡ及び／又はポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、リポソーム内に封入でき、イオントフォレーシスにより投与でき、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア、若しくはタンパク質ベクター（例えば、Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ，国際公開公報第ＷＯ００／５３７２２号を参照）等の他の媒体内に取り込むことができる。これに代わり、核酸／ペプチド／媒体の組み合わせを、直接注射又は注入ポンプの使用により局所的に送達することも可能である。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、又は皮内であっても、標準的な注射針とシリンジによる方法を用いるか、又はＣｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：２３３０−２３３７，１９９９、及びＢａｒｒｙら，国際公開公報第ＷＯ９９／３１２６２号に記載されるような、無針技術（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により行うことが可能である。
【００６９】
本発明の組成物は、医薬品として効果的に用いることができる。医薬品は、患者内の病状又は他の有害な状態の発症又は重症度を防いで、和らげるか、又は該病状を治療する（１又はそれ以上の症状を、検出又は測定可能な程度に軽減させる）。
【００７０】
従って、更なる実施態様において、本発明は、希釈剤、安定剤、バッファー等の医薬的に許容可能な担体と選択的に製剤されてもよいポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混和されるか、複合体化又は結合された、１種類又はそれ以上のポリ核酸、典型的には、１種類又はそれ以上のｓｉＮＡの存在又は投与を特徴とする医薬組成物及び方法を提供する。
【００７１】
本発明は、対象内の特定の病状又は他の有害な状態と関連する遺伝子の発現を調節する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供することにより、更なる課題と利点を満足する。典型的には、ｓｉＮＡは、対象の病状又は有害な状態と関連する原因因子又は寄与因子として高レベルで発現する遺伝子を標的とする。この文脈において、ｓｉＮＡは、１種類又はそれ以上の関連疾患症状の重症度又は再発を防止し、緩和し、又は軽減するレベルまで前記遺伝子の発現を効果的に下方制御するであろう。これに代わり、疾患又は他の有害な状態の結果又は続きとして、標的遺伝子の発現が必ずしも上昇しない種々の異なる疾患モデルについては、標的遺伝子の下方制御は、それでも遺伝子発現を低下させること（即ち、選択されたｍＲＮＡ及び／又は該標的遺伝子のタンパク質産物の濃度を低下させること）で治療上の結果を生じるであろう。これに代わり、本発明のｓｉＮＡは、１の遺伝子の発現を低下させるための標的とされてもよく、これによって、標的遺伝子の産物又は活性により、その発現が負の制御を受ける「下流」の遺伝子の上方制御を生じさせることも可能である。
【００７２】
代表的な実施態様において、本発明の組成物及び方法は、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の発現を調節して慢性関節リウマチ（ＲＡ）の症状を治療するか又は予防するための治療用ツールとして有用である。この文脈において、本発明は、低分子量核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＴＮＦ−αの発現と活性の調節に有用な化合物、組成物及び方法を更に提供する。より詳細な実施態様では、本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の低分子量核酸分子と、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−α遺伝子の発現を調節して、哺乳動物対象内でのＲＡの症状を予防するか又は緩和するのに効果的な関連する方法とを提供する。これら及び関連する治療用組成物及び方法において、化学修飾ｓｉＮＡの使用は、例えば、インビボでのヌクレアーゼによる分解に対する向上した耐性を提供することにより、そして／又は向上した細胞取込みを通じて、天然ｓｉＮＡ分子の特性と比較して、修飾ｓｉＮＡの特性をしばしば向上させることになる。本明細書の開示に従って直ちに決定可能なように、複数の化学的修飾を有する有用なｓｉＮＡは、そのＲＮＡｉ活性を保持することになる。従って、本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の治療、診断、標的確認（ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ゲノムの発見（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、遺伝子工学、及びファーマコゲノミクス上の用途に有用な試薬及び方法を提供する。
【００７３】
本発明の上記ｓｉＮＡは、例えば、経皮的投与又は局所注射（例えば、乾癬を治療するための乾癬プラークの部位における局所注射、又は乾癬性関節炎若しくはＲＡを患う患者の関節内への局所注射）等、あらゆる形態で投与することができる。より詳細な実施態様において、本発明は、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡを標的とし、効果的にＴＮＦ−αのＲＮＡを下方制御することにより、１又はそれ以上のＴＮＦ−α関連炎症状態を軽減するか又は予防する、治療上効果的な量のｓｉＮＡを投与するための製剤及び方法を提供する。動物対象内の選択された病状と関連し、前記選択された病状と関連する原因因子又は寄与因子として、その遺伝子の発現が異常に上昇することが知られる数多くの遺伝子のいずれかを具える、１種類又はそれ以上の異なる遺伝子の発現を標的とした、同様の方法と組成物も提供される。
【００７４】
本発明のｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物は、標的の病状の他の標準的治療法と併せて投与可能であり、例えば、ＲＡ又は乾癬のような炎症性疾患に対して効果的な治療薬と共に投与することができる。この文脈において組み合わせて有用で効果的な薬剤の例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキサート、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア剤、スルファサラジン、グルココルチコイド、並びに、インフリキシマブ及びエントラセプト（ｅｎｔｒａｃｅｐｔ）のような他のＴＮＦ−α中和剤が含まれる。
【００７５】
本発明の負に帯電したポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、医薬組成物を形成するための安定剤、バッファー等の存在又は不存在下で、あらゆる標準的手法により患者に投与することができる。リポソーム送達機構の使用が所望される場合、リポソームを形成するための標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、経口投与用の錠剤、カプセル剤又はエリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射による投与用の滅菌溶液、懸濁液、及び当該技術分野で知られる他の組成物として製剤して用いることができる。
【００７６】
また、本発明は、本明細書に記載される組成物の医薬的に許容可能な製剤も包含する。これらの製剤は、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩等の酸付加塩のような、上記化合物の塩を具える。
【００７７】
薬理組成物又は製剤は、細胞、又は、例えば、ヒトを具える患者に、例えば、全身投与等の投与に適切な形態にある組成物又は製剤を指す。適切な形態は、使用法、又は、例えば経口、経皮、若しくは注射による等の進入経路に部分的に依存する。このような形態は、前記組成物又は製剤が標的細胞（即ち、前記負に帯電した核酸が送達されることが望まれる細胞）に到達することを妨げない。例えば、血流に注射される薬理組成物は、可溶性でなければならない。他の因子は、当該技術分野において知られており、毒性等の検討が含まれる。
【００７８】
「全身投与」は、血流における、インビボでの薬物の全身での吸収又は貯留とこれに続く全身を巡る分散を意味する。全身吸収に至る投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、吸引、経口、肺内及び筋内が含まれるが、これに限定されるものではない。これらの各投与経路は、例えば、核酸などの所望の負に帯電したポリマーを、到達可能な疾患組織へと暴露する。循環系への薬物の侵入の速度は、分子量又は大きさの関数であることが示されている。本発明の化合物を具えるリポソーム又は他の薬物担体の使用により、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織等の特定の種類の組織内へ、薬物を潜在的に局在させることが可能になる。例えば、リンパ球及びマクロファージ等の細胞の表面への薬物の会合を促進可能なリポソーム製剤も有用である。このアプローチは、マクロファージ及びリンパ球による癌細胞などの異常細胞の免疫認識の特異性を利用することにより、標的細胞への向上した薬物送達を提供することができる。
【００７９】
「医薬的に許容可能な製剤」は、本発明の核酸分子を、その所望の活性に最も適した身体部位内で効果的に分散させることを可能にする組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子との製剤に適した薬剤の非限定的な例には、以下のものが含まれる：薬物の中枢神経系への進入を促進可能な、Ｐ糖タンパク質阻害剤（プルロニックＰ８５（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５）等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ及びＴｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３：１６−２６，１９９９）；大脳内移植後の徐放性送達用のポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド（ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））マイクロスフェアのような、生分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．Ｆ．ら．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８：４７−５８，１９９９）（アルカームス社（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）；並びに、血液脳関門間の薬物の送達が可能であり、神経の取込み機構を変化させることができる、ポリブチルシアノアクリレートで作られた、充填されたナノ粒子（ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２３：９４１−９４９，１９９９）。本発明の核酸分子のための送達手段のその他の非限定的な例には、以下に記載される材料が含まれる：Ｂｏａｄｏら．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１３０８−１３１５，１９９８；Ｔｙｌｅｒら．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２１：２８０−２８４，１９９９；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．９２：５５９２−５５９６，１９９５；Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１５：７３−１０７，１９９５；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：４９１０−４９１６，１９９８；及びＴｙｌｅｒら．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．．９６：７０５３−７０５８，１９９９。
【００８０】
本発明は、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤中に、医薬的に効果的な量の所望の化合物を具える、保存又は投与用に調製された組成物も包含する。治療上の使用に許容可能な担体又は希釈剤は、製薬の技術分野においてよく知られており、例えば、以下に記載されている：「レミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．），Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集，１９８５年。例えば、保存剤、安定剤、着色料及び芳香剤が提供されてもよい。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。上記に加え、抗酸化剤と懸濁剤を用いることもできる。
【００８１】
医薬的に効果的な投与量は、病状の発症を予防し、阻害し、又は治療（ある症状、好ましくは全ての症状を一定の程度まで緩和する）するために必要とされる投与量である。医薬的に効果的な投与量は、疾患の種類、使用する組成物、投与経路、治療される哺乳動物の種類、検討対象の特定の哺乳動物の身体的特徴、併用する薬物、並びに医学分野の当業者が認めるその他の要因に依存する。負に帯電したポリマーの作用強度にもよるが、一般的に、１日に体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの量の有効成分が投与される。
【００８２】
水性の懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混和された作用物質を含有する。このような賦形剤は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴム等の懸濁剤である；分散剤又は湿潤剤は、レシチン、又はステアリン酸ポリオキシエチレン等のアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、又はヘプタデカエチレンオキシセタノール等のエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、又はポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）のような、エチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合物、又はポリエチレンソルビタンモノオレエート等の、エチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合物等の、天然ホスファチドであってもよい。前記水性懸濁液は、例えば、エチル、又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート等の、１種類又はそれ以上の保存剤、１種類又はそれ以上の着色剤、１種類又はそれ以上の芳香剤、並びにスクロース又はサッカリン等の１種類又はそれ以上の甘味剤も含んでいてよい。
【００８３】
例えば、落花生油、オリーブ油、ごま油若しくはココナッツ油等の植物油、又は流動パラフィンのような鉱油中に有効成分を懸濁することにより、油性の懸濁液を製剤することができる。該油性懸濁液には、例えば、蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコール等の増粘剤が含まれていてもよい。甘味剤及び芳香剤を添加して、口当たりの良い経口用製剤を提供することも可能である。アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により、これらの組成物を保存することができる。
【００８４】
水の添加により水性懸濁液を調製することに適した分散性の粉末及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１又は２種類上の保存剤との混合物中に有効成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤又は懸濁剤は、既に上記で言及されて例示されている。甘味剤、芳香剤及び着色剤等の更なる賦形剤が存在していてもよい。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態を取ることもできる。油層は、植物油若しくは鉱油又はこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、例えば、アカシアゴム若しくはトラガカントゴム等の天然ゴム、例えば、大豆、レシチン等の天然のリン脂質、並びに、例えばソルビタンモノオレアート等の、脂肪酸とヘキシトール無水物から得られるエステル若しくは部分エステル、並びに、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート等の前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物であろう。エマルジョンには、甘味剤及び芳香剤が含まれていてもよい。
【００８６】
前記医薬組成物は、滅菌された注射可能な水性又は油性懸濁液の形態を取ることもできる。この懸濁液は、上記で指摘した適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の技術に従って製剤することが可能である。前記滅菌された注射可能な製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の、滅菌された注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。許容可能な媒体及び溶媒の中でも、とりわけ水、リンガー溶液及び等張性の塩化ナトリウム溶液が使用可能である。更に、滅菌された不揮発性油が、従来から溶媒又は懸濁媒体として用いられている。この目的のためには、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含むあらゆる無菌の（ｂｌａｎｄ）不揮発性油を用いることが可能である。更に、オレイン酸等の脂肪酸も、注射可能な製剤に用いることができる。
【００８７】
ｓｉＮＡは、例えば、薬物の直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内で融解して該薬物を放出する、適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製できる。このような物質には、カカオ脂及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００８８】
ｓｉＮＡを、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ等のヌクレアーゼ耐性基を用いた修飾により大規模に修飾して安定性を向上させることが可能である。概説に関しては、以下を参照：Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ  １７：３４，１９９２；Ｕｓｍａｎら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４。ｓｉＮＡ構築物は、一般的方法を用いたゲル電気泳動により精製可能であり、又は高圧液体クロマトグラフィーと水中への再懸濁により精製可能である。
【００８９】
修飾を伴う（塩基、糖及び／又はリン酸）化学合成された核酸分子は、血清中のリボヌクレアーゼによる分解から保護されるので、その作用強度を増大させることができる。例として、以下を参照：Ｅｃｋｓｔｅｉｎら．，国際公開公報第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５，１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４，１９９１；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４，１９９２；Ｕｓｍａｎら．，国際公開公報第ＷＯ９３／１５１８７号；及びＲｏｓｓｉら．，国際公開公報第ＷＯ９１／０３１６２号；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄら．，米国特許第６，３００，０７４号。上記の文献の全てには、本明細書中に記載する核酸分子の塩基、リン酸及び／又は糖の部分に対して行うことが可能な種々の化学修飾法が記載されている。
【００９０】
核酸分子に導入することにより、該核酸分子のヌクレアーゼに対する安定性及び効果を有意に向上させることが可能な、糖、塩基及びリン酸の修飾について記載した複数の例が、当該技術分野において存在する。例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ等のヌクレアーゼ耐性基による修飾、ヌクレオチド塩基修飾により、オリゴヌクレオチドを修飾することにより安定性が向上され、そして／又は生物活性が向上される。概説に関しては、以下を参照：Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ  １７：３４，１９９２；Ｕｓｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４；Ｂｕｒｇｉｎら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６。また、核酸分子の糖の修飾は、当該技術分野で既に多岐に亘って記載されている。以下を参照：Ｅｃｋｓｔｅｉｎら．，国際公開公報第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５−５６８，１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−３１７，１９９１；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４−３３９，１９９２；Ｕｓｍａｎら．国際公開公報第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２，１９９５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら．，国際公開公報第ＷＯ９７／２６２７０号；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら．，米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎら．，米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆら．，国際公開公報第ＷＯ９８／１３５２６号；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら．，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：１１３１，１９９８；Ｅａｒｎｓｈａｗ及びＧａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５，１９９８；Ｖｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８；及びＢｕｒｌｉｎａら．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９乃至２０１０，１９９７。これらの刊行物には、触媒作用を変化させることなく、核酸分子内への糖、塩基及び／又はリン酸の修飾等を組み込ませる位置を決定するための一般方法及び手段が記載されている。これらの技術を参照することで、同様の修飾を、本明細書中に記載するように用いて、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を、ｓｉＮＡが細胞内でＲＮＡｉを促進する能力を著しく阻害しない限りにおいて修飾することが可能である。
【００９１】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及び／又は５’−メチルホスホナート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間の結合の化学修飾は安定性を向上させるが、一方で、過度の修飾は、一定の毒性又は活性の低下を招く恐れがある。従って、核酸分子を設計する際には、これらのヌクレオチド間結合の量は最小に抑えられるべきである。これらの結合の濃度の低下は毒性を低下させ、結果としてこれらの分子の効果を向上させて特異性を高めることになるであろう。
【００９２】
１の実施態様において、本発明は、１種類又はそれ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホナート、リン酸トリエステル、モルホリノ、アミデート（ａｍｉｄａｔｅ）、  カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、及び／又はアルキルシリル置換を具えるリン酸骨格の修飾を有する、修飾ｓｉＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については、以下を参照：Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＬｅｕｍａｎｎ，「核酸類似体：最新の合成方法における合成及び特性（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」，ＶＣＨ，１９９５年，第３３１−４１７頁、及びＭｅｓｍａｅｋｅｒら．，「アンチセンス研究における糖修飾での、オリゴヌクレオチドの新規な骨格置換（Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，ＡＣＳ，１９９４年，第２４−３９頁。
【００９３】
核酸分子の送達方法は、以下に記載されている：Ａｋｈｔａｒら．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９，１９９２；「アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の送達手段（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，Ａｋｈｔａｒ編集，１９９５年；Ｍａｕｒｅｒら．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−１４０，１９９９；Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５−１９２，１９９９；及びＬｅｅら．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２，２０００。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら．，米国特許第６，３９５，７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎら．，国際公開公報第ＷＯ９４／０２５９５号には更に核酸分子の一般的な送達方法が記載されている。これらのプロトコルは、事実上あらゆる核酸分子の送達のために利用することができる。核酸分子は、以下に限定されるものではないが、リポソーム内への封入、イオントフォレーシス、又は生分解性のポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリン（例として、Ｇｏｎｚａｌｅｚら．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−１０７４，１９９９；Ｗａｎｇら．，国際公開公報第ＷＯ０３／４７５１８号及び同第ＷＯ０３／４６１８５号を参照）、ポリ（乳酸共グリコール酸）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡマイクロスフェア（例として、米国特許第６，４４７，７９６号及び米国特許公開公報第ＵＳ  ２００２１３０４３０号、を参照）、生分解性ナノカプセル、及び生体接着性マイクロスフェアのような、他の媒体への取込み、又はタンパク質ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ，国際公開公報第ＷＯ００／５３７２２号）を具える、当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することが可能である。また、上記に代わる場合では、前記核酸／媒体の組み合わせは、直接注射又は注入ポンプの使用により、局所的に送達される。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、又は皮内であっても、標準的な注射針とシリンジによる方法を用いるか、又はＣｏｎｒｙら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：２３３０乃至２３３７，１９９９、及びＢａｒｒｙら，国際公開公報第ＷＯ９９／３１２６２号に記載されるような、無針技術（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により行うことが可能である。本発明の分子は、医薬品として使用することができる。医薬品は、患者内の病状の発症を予防して、和らげるか、又は該病状を治療する（ある症状、好ましくは全ての症状を一定の程度まで緩和する）。
【００９４】
「リガンド」という用語は、薬物、ペプチド、ホルモン、又は神経伝達物質のような、あらゆる化合物又は分子であって、レセプターのような別の化合物と、直接又は間接的に相互作用することのできる化合物又は分子を指す。リガンドと相互作用するレセプターは、細胞の表面に存在していてもよく、又はこれに代わる場合には、細胞内レセプターであってもよい。リガンドによるレセプターとの相互作用は、生化学反応を引き起こす可能性もあるが、又は単なる物理的な相互作用若しくは会合の場合もある。
【００９５】
本明細書で用いる「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドを含んでいてもよいループ部分と、センス領域とを具える直線状のｓｉＮＡ分子であって、該センス領域が、前記アンチセンス領域と塩基対を形成して前記ループと二重鎖を形成するのに十分な程の相補的ヌクレオチドを有する範囲内で、前記アンチセンス領域より少ないヌクレオチドを具えるｓｉＮＡ分子を意味する。例としては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、例えば、約１９乃至約２２（例えば、約１９、２０、２１、又は２２）ヌクレオチド等の、Ｔ細胞内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域、及び約４乃至約８（例えば、約４、５、６、７、又は８）ヌクレオチドを具えるループ領域、及び前記アンチセンス領域に相補的な約３乃至約１８（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８）ヌクレオチドを有するセンス領域を具えることが可能である。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学的に修飾可能な５’末端リン酸基を具えることもできる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載する、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、又は結合体分子を具えることができる。
【００９６】
本明細書中で用いる「非対称二重鎖」とは、センス領域とアンチセンス領域を具える２本の別個の鎖を有するｓｉＮＡ分子を指しており、この場合、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対を形成して二重鎖を形成するのに十分な程の相補的ヌクレオチドを有する範囲内で、前記アンチセンス領域より少ないヌクレオチドを具える。例としては、本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は、例えば、約１９乃至約２２（例えば、約１９、２０、２１、又は２２）ヌクレオチド等の、Ｔ細胞内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域、及び前記アンチセンス領域に相補的な約３乃至約１８（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８）ヌクレオチドを有するセンス領域を具えることが可能である。
【００９７】
「遺伝子発現を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、標的遺伝子の発現が上方制御又は下方制御されることを意味しており、細胞内のｍＲＮＡ濃度、又はｍＲＮＡの翻訳、又は標的遺伝子にコードされるタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの合成の上方制御又は下方制御が含まれる。遺伝子発現の調節は、上方制御又は下方制御される標的遺伝子にコードされる１種類又はそれ以上のタンパク質又はタンパク質サブユニットの発現、濃度又は活性が、調節剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の非存在下で観測された場合と比べて高い又は低いかという具合に、前記対象タンパク質又はサブユニットの存在、量又は活性により測定することも可能である。例えば、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」ことを意味する場合があるが、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という単語の使用法は、この定義に限定されるものではない。
【００９８】
発現を「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「下方制御する（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）」、又は「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」ことは、遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは１種類又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子の濃度、又は標的遺伝子にコードされる１種類又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの濃度若しくは活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で観察された場合よりも低下していることを意味する。１の実施態様において、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は低下は、不活性分子又は弱力化された分子の存在下で観察されるレベルを下回る。別の実施態様では、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は低下は、例えば、滅茶苦茶な配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子等の存在下で観察されるレベルを下回る。別の実施態様では、本発明の核酸分子を用いた遺伝子発現の阻害、下方制御又は低下は、該核酸分子の存在下では、非存在下と比べて、これを上回る。
【００９９】
遺伝子の「サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」は、細胞内での遺伝子発現を標的とした阻害による、部分的又は完全な機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を指し、「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）」と呼ばれる場合もある。その状況と、取り組むべき生物学的課題にもよるが、遺伝子発現を部分的に低下させることが望ましい場合がある。これに代わる場合には、可能な限り遺伝子発現を低下させることが望まれるであろう。サイレンシングの程度は、当該技術分野で知られる方法により測定することが可能であり、そのいくつかは国際公開公報第ＷＯ９９／３２６１９号にまとめられている。アッセイ法にもよるが、遺伝子発現の定量化により、本発明の特定の実施態様で望まれる種々の阻害の量の検出が可能となるが、これらの実施態様には、ｍＲＮＡ濃度又はタンパク質濃度若しくは活性について、例えばベースライン（即ち、正常値）、又は治療対象の特定の病状又は他の障害と関連する可能性のある高発現レベルを具える他の対照のレベル、と同等か又はこれらの値の１０％、３０％、５０％、７５％  ９０％、９５％若しくは９９％を超える程に、標的遺伝子の発現をノックダウン可能な予防法及び治療法が含まれる。
【０１００】
「標的遺伝子の発現を阻害すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）」という語句は、本発明のｓｉＮＡが有する、標的遺伝子のジーンサイレンシングを開始させる能力を指す。ジーンサイレンシングの程度を検討するためには、特定の構築物を発現する培養中の細胞又は対象の生命体のサンプル又はアッセイは、前記構築物を発現しない対照サンプルと比較される。対照サンプル（構築物を発現しない）は、１００％の相対値として定められる。該対照と相対的な試験値が、約９０％、多くの場合５０％、そして特定の実施態様では２５−０％である場合には、標的遺伝子の発現の阻害が達成されている。適切なアッセイには、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、酵素機能法のような当業者に公知の技法、並びに当業者に公知の表現型分析法によるタンパク質又はｍＲＮＡ濃度の試験等が含まれる。
【０１０１】
「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、対象、又は移植される細胞のドナー若しくはレシピエントとしての生命体、又はそれ自体がｓｉＮＡ送達の対象である細胞を具えるであろう、生命体、組織、又は細胞を意味する。従って、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、本発明の核酸分子を投与して、本明細書に記載されるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによりその中で該核酸分子を強化できるような、インビトロ又は生体外の器官、組織又は細胞の対象を具える、生命体、器官、組織、又は細胞を指す場合がある。代表的な対象には、例えば、ヒトである患者又は細胞等の、哺乳動物の個体又は細胞が含まれる。
【０１０２】
本明細書中で用いる「細胞」は、その通常の生物学上の意味において使用されており、多細胞生物全体を指すものではなく、例えば、具体的にヒトを指したりするものではない。前記細胞は、鳥類、植物、並びに、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコのような哺乳物等の生命体中に存在するものでよい。また、前記細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）、又は真核細胞（例えば、哺乳動物細胞又は植物細胞）であってもよい。また、前記細胞は、体細胞系由来細胞又は生殖細胞系由来細胞、全能性細胞又は他脳性細胞、分裂細胞又は非分裂細胞であってもよい。前記細胞は、配偶子又は胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞から誘導される細胞、又はこれらを具える細胞であってもよい。
【０１０３】
「ベクター」とは、所望の核酸を送達するために用いる、あらゆる核酸及び／又はウィルスに基づく技法を意味する。
【０１０４】
「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語に続くものを何でも包含するが、これに限定される訳ではないことを意味する。従って、「具える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の使用は、列挙される要素は、必要又は必須であるが、他の要素は、自由選択されるものであり、存在していても存在していなくてもよいことを示す。「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句に続くあらゆるものを包含し、かつこれに限定されることを意味する。従って、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、列挙される要素は、必要又は必須であり、かつその他の要素は、存在してはならないことを示す。「実質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ  〜）」は、該語句の後に列挙されるあらゆる要素を具えるが、該列挙される要素の記載に特定される活性又は作用を妨げず、又はこれに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「実質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ  〜）」という語句は、列挙される要素は必要又は必須であるが、他の要素は自由選択されるものであり、前記列挙される要素の活性又は作用に影響するか否かに依存して、存在していても存在していなくてもよいことを示す。
【０１０５】
「ＲＮＡ」は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を具える分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’の位置にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語には、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡのような単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え技術で作製されたＲＮＡ、並びに天然のＲＮＡとは異なる、１個又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変による改変ＲＮＡが含まれる。このような変更には、例えば、ｓｉＮＡの末端、又は前記ＲＮＡ内部の１個又はそれ以上のヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加が含まれる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのような非標準的ヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの改変ＲＮＡは、類似体又は天然ＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。
【０１０６】
「高度に保存された配列領域（ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、標的遺伝子中の１又は２箇所以上の領域のヌクレオチド配列が、１の世代から次の世代にかけて、又は１の生体系から他の生体系に亘って、有意に変化していないことを意味する。
【０１０７】
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域との相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含んでいてもよい。
【０１０８】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列との相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、選択的に、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域との相補性を有する核酸配列を含んでいてもよい。
【０１０９】
「標的核酸」とは、その発現又は活性が調節を受けるあらゆる核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
【０１１０】
「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」とは、核酸が、別の核酸配列と、従来のワトソン−クリック型又は他の非従来型による水素結合を形成できることを意味する。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子のその相補的な配列との結合自由エネルギーは、例えば、ＲＮＡｉ活性等の、該核酸の適切な機能を始動させるために十分なものである。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、当該技術分野においてよく知られている（例として、以下を参照：Ｔｕｒｎｅｒら．，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，ＬＩＩ，１９８７，ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７，１９８６；Ｔｕｒｎｅｒら．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５，１９８７）。相補性の百分率は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成することが可能な核酸分子中の連続した残基のパーセンテージを示す（例えば、第１のオリゴヌクレオチド中の全部で１０個のヌクレオチドのうち、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドが、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対を形成することは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を表すことになる）。「完全に相補的（Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。
【０１１１】
本明細書中で用いる「ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」という用語は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡの塩基のそれぞれと、これらを殆ど識別することなく塩基対を形成するヌクレオチド塩基の類似体を指す。ユニバーサル塩基の非限定的な例には、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾール、カルボキサミド、並びに当該技術分野において知られる３−ニトロピロール，４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールのようなニトロアゾール誘導体が含まれる（例として、以下を参照：Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：２４３７−２４４７，２００１）。
【０１１２】
本明細書中で用いる「非環式ヌクレオチド（ａｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、例えば、リボース炭素のいずれか（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５）が独立して又は組み合わさってヌクレオチドに存在していないような、非環式リボース糖を有するあらゆるヌクレオチドを指す。
【０１１３】
本明細書中で用いる「生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）」という用語は、例えば、酵素による分解又は化学分解などの生体系内での分解を指す。
【０１１４】
本明細書中で用いる「生物活性分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、系において、生物学的反応を誘起するか又は変化させることのできる化合物又は分子を指す。単独又は本発明の意図する他の分子との組み合わせにおける生物活性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例には、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａ  キメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ、及びこれらの類似体のような治療活性分子が含まれる。本発明の生物活性分子には、他の生物活性分子、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及びその他のポリエーテルのような脂質並びにポリマー等の薬物動態及び／又は薬力学を変化させることが可能な分子も含まれる。
【０１１５】
本明細書中で用いる「リン脂質」という用語は、少なくとも１個のリン基を具える疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基及び飽和若しくは不飽和アルキル基を含み、そして選択的に、ＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミンで置換されていてもよく、又はアリール基で置換されていても若しくは置換されていなくてもよい。
【０１１６】
「キャップ構造（ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する（例えば、参照により本明細書に取り込まれている、Ａｄａｍｉｃら．，米国特許第５，９９８，２０３号を参照）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、そして細胞内への送達及び／又は局在化を手助けすることができる。前記キャップは、５’末端（５’キャップ）若しくは３’末端（３’キャップ）に存在していてもよく、又は両端に存在していてもよい。非限定的な例において、５’キャップには、以下のものが含まれるが、これらに限定される訳ではない：グリセリル、逆位デオキシ無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位無塩基部分；３’−２’−逆位ヌクレオチド部分；３’−２’−逆位無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスファート；３’−ホスホロアミダート（３’−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）；ヘキシルホスファート；アミノヘキシルホスファート；３’−ホスファート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部位。
【０１１７】
３’キャップの非限定的な例には、以下のものが含まれるが、これらに限定される訳ではない：グリセリル、逆位デオキシ無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式  ヌクレオチド；５’−アミノアルキルホスファート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスファート；３−アミノプロピルホスファート；６−アミノヘキシルホスファート；１，２−アミノドデシルホスファート；ヒドロキシプロピルホスファート；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆位無塩基部分；５’−ホスホロアミダート（５’−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスファート；５’−アミノ；架橋及び／若しくは非架橋５’−ホスホロアミダート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホナート、及び５’メルカプト部分（詳細については、参照により本明細書に取り込まれる、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＬｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５、１９９３、を参照）。
【０１１８】
「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び／又はリン酸による置換のいずれかを具えるような、１個又はそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に取り込まれることが可能であり、残った塩基がその酵素活性を示すことが可能な、あらゆる基又は化合物を指す。前記基及び化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンのような一般的に認識されたヌクレオチド塩基を含まず、そのため１’の位置に塩基を欠くという点で、無塩基性である。
【０１１９】
本明細書中で用いる「ヌクレオチド」という用語は、当該技術分野で認識されるように、天然塩基（標準）、及び当該技術分野でよく知られる修飾塩基を具える。このような塩基は、一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’の位置に存在する。一般的に、ヌクレオチドは、塩基、糖及びリン酸基を具える。該ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基部分が修飾されていなくても又は修飾されていてもよい（ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド及びその他のものと交互に呼ばれる：例として、以下を参照：Ｕｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上述；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら．，国際公開公報第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら．，国際公開公報第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、上述：これらの文献は全て参照により本明細書に取り込まれている）。当該技術分野には、複数の修飾核酸塩基の例が知られており、これらは、以下にまとめられている：Ｌｉｍｂａｃｈら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３、１９９４。核酸分子に導入可能な塩基修飾の非限定的な例には、以下のものが含まれる：イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン若しくは６−アルキルピリジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、及びその他のもの（Ｂｕｒｇｉｎら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０、１９９６；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、上述）。この実施態様における「修飾塩基（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｓｅ）」は、１’の位置のアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル、又はこれらの同等物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１２０】
「標的部位」は、そのアンチセンス領域内に、標的となる配列と相補的な配列を具えるｓｉＮＡ構築物により媒介される切断の「標的」である標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
【０１２１】
「検出可能なレベルの切断（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｃｌｅａｖａｇｅ）」は、標的ＲＮＡのランダムな分解により作り出されるＲＮＡのバックグラウンドを超える分解産物を十分に確認できる程度の標的ＲＮＡの分解（及び切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。殆どの検出法において、標的ＲＮＡの１−５％の分解産物が生産されると、十分にバックグラウンドを超えて検出される。
【０１２２】
「生体系（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）」は、ヒト、動物、植物、昆虫、細菌、ウィルス又は他の供給源を具えるが、これらに限定されない生物学的供給源由来の、精製又は非精製形態にある物質を意味するものであり、この場合、前記系は、ＲＮＡｉ活性に必要な成分を具える。「生体系」という用語には、例えば、細胞、組織、若しくは生命体、又はこれらの抽出物が含まれる。生体系という用語には、インビトロ環境で使用可能な再構成されたＲＮＡｉ系も含まれる。
【０１２３】
本明細書中で用いる「生分解性リンカー（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」という用語は、例えば、生物活性分子を本発明のｓｉＮＡ分子に連結させるか、又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖を連結させるような１の分子を他の分子に連結させるための生分解性リンカーとして設計された核酸性又は非核酸性のリンカー分子を指す。前記生分解性リンカーは、特定の種類の組織又は細胞への送達といった特別の目的のためにその安定性を調節できるように設計される。核酸ベースの生分解性リンカー分子の安定性は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、並びに２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及び他の２’−修飾又は塩基修飾ヌクレオチドのような化学修飾ヌクレオチドの組み合わせ等の種々の化学的性質を用いて調節することが可能である。前記生分解性核酸リンカー分子は、２量体、３量体、４量体、又はより長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド等であってもよく、又は、例えば、ホスホロアミダート又はホスホジエステル結合等のリンに基づく結合を有する単一のヌクレオチドを含んでいてもよい。また、生分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖、又は核酸に基づく修飾を含んでいてもよい。
【０１２４】
「無塩基（ａｂａｓｉｃ）」は、塩基を欠くか、又は１’の位置に塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を意味する：例として、Ａｄａｍｉｃら．，米国特許第５，９９８，２０３号を参照。
【０１２５】
「非修飾ヌクレオシド（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」は、β−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に結合した、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルの塩基の１つを意味する。
【０１２６】
「修飾ヌクレオシド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」は、非修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を具えるあらゆるヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、化学式Ｉ−ＶＩＩ及び／又は本明細書中に記載される他の修飾によって示されている。
【０１２７】
本発明について記載される２’修飾ヌクレオチドとの関連において、「アミノ」とは、修飾されていても又は修飾されていなくてもよい、２’−ＮＨ２  又は２’−０−−ＮＨ２を意味する。このような修飾基は、例えば、以下に記載されている：Ｅｃｋｓｔｅｉｎら．，米国特許第５，６７２，６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら．，米国特許第６，２４８，８７８号。
【０１２８】
ｓｉＮＡ分子は、カチオン性脂質と複合体化させるか、リポソーム内に封入するか、又は他の方法で標的細胞若しくは組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、生体高分子中に取り込まれているか又は取り込まれていない状態で、注射、注入ポンプ又はステントを通じて局所的に投与することができる。別の実施態様では、本発明のｓｉＮＡ化合物、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、又はこれらの両方にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合させることができる。該結合するＰＥＧは、いかなる分子量にあってもよいが、好ましくは約２，０００乃至約５０，０００ダルトン（Ｄａ）にある。
【０１２９】
センス領域は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子を介してアンチセンス領域に連結させることができる。
【０１３０】
「逆位反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）」とは、該反復が転写された際に、センス要素とアンチセンス要素が、２本鎖ｓｉＲＮＡを形成可能なように配置された該センス要素とアンチセンス要素を具える核酸配列を指す。逆位反復には、該反復の前記２つの要素の間に、リンカー又は自己切断性リボザイムのような異種配列が選択的に含まれていてもよい。逆位反復の前記要素は、２本鎖ＲＮＡを形成するために十分な長さを有する。典型的には、逆位反復の各要素は、約１５乃至約１００ヌクレオチドの長さにあり、好ましくは、約２０乃至３０塩基のヌクレオチドであり、好ましくは、約２０乃至２５ヌクレオチドの長さにあり、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドの長さにある。
【０１３１】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチド、及び１本鎖又は２本鎖の形態にあるこれらのポリマーを指す。前記用語には、既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基又は結合を具える、合成、天然、及び非天然の核酸であって、基準となる核酸と類似する結合特性を有し、そして基準となるヌクレオチドと同様に代謝される核酸が包含される。このような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
「巨大２本鎖ＲＮＡ（ｌａｒｇｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）」とは、約４０塩基対（ｂｐ）を超える大きさを有するあらゆる２本鎖ＲＮＡを指し、例えば、１００ｂｐを超えるか、又はより詳細には、３００ｂｐを超える２本鎖ＲＮＡを指す。巨大ｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメント又はｍＲＮＡ全体を表す場合がある。巨大ｄｓＲＮＡの最大サイズは、ここでは限定されることはない。２本鎖ＲＮＡには、修飾塩基が含まれていてもよく、この場合、該修飾は、リン酸糖骨格又はヌクレオシドに対するものであってもよい。このような修飾には、窒素若しくは硫黄ヘテロ原子、又は当該技術分野で知られるあらゆる他の修飾が含まれていてもよい。
【０１３３】
２本鎖構造は、ヘアピンＲＮＡ若しくはマイクロＲＮＡに見られるような自己相補的ＲＮＡ鎖により、又は２本の異なる相補的なＲＮＡ鎖のアニーリングにより形成することができる。
【０１３４】
「オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」は、２本のＲＮＡ断片が、１の鎖上で複数のヌクレオチドが重複する配列を有する場合を指し、例えば、この場合、前記複数のヌクレオチド（ｎｔ）の個数は、２乃至５ヌクレオチドだけ、又は５乃至１０ヌクレオチド又はそれ以上である。
【０１３５】
「１種類又はそれ以上のｄｓＲＮＡ」とは、配列において相互に異なるｄｓＲＮＡを指す。
【０１３６】
「標的遺伝子又はｍＲＮＡ」とは、目的のあらゆる遺伝子又はｍＲＮＡを指す。実際に、遺伝学又はシーケンシングにより先に同定された遺伝子のあらゆるものが標的の代表となり得る。標的遺伝子又はｍＲＮＡには、発生に関与する遺伝子及び制御遺伝子、並びに代謝遺伝子若しくは構造遺伝子、又は酵素をコードする遺伝子が含まれ得る。標的遺伝子は、表現型が研究対象である細胞内で発現されてもよく、又は表現型の特徴に直接的若しくは間接的に影響するように生命体内で発現されていてもよい。標的遺伝子は、内在性又は外来性のものでもよい。このような細胞には、成体若しくは胚である動物又は植物の体の中の配偶子を具えるあらゆる細胞、又は不死化したセルライン若しくは初代細胞培養に見られるような、あらゆる単離細胞が含まれる。
【０１３７】
本明細書と添付するクレームにおいて、単数形の「１の（ａ）」，「１の（ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」には、文脈上明確に指示されない限りは、複数形の対象も包含される。
【０１３８】
実施例
上記開示は、本発明を一般的に説明するものであるが、本発明は、以下の実施例により更に例示される。これらの実施例は、例示の目的のためだけに記載されるものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。本実施例では具体的な用語と数値が用いられてはいるが、このような用語と数値についても、同様に、本発明の範囲を限定するものとしてではなく、典型的なものとして理解されるべきである。
【０１３９】
実施例１
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡを具える組成物の作製及びキャラクタリゼーション
候補のｓｉＲＮＡと本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとの間で複合体を形成させるため、例えば、オプティＭＥＭ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）（登録商標）細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の中で、適量のｓｉＲＮＡを、所定の量のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、既定の比率で混和して、室温で約１０乃至３０分間インキュベートする。続いて、例えば、約５０μｌ等の選択した体積の上記混合物を標的細胞と接触させ、該細胞を所定のインキュベーション時間インキュベートするが、本実施例では約２時間であった。該ｓｉＲＮＡ／ペプチド混合物には、細胞培養培地又はウシ胎児血清等の他の添加物が選択的に含まれていてもよい。Ｈ３、Ｈ４及びＨ２ｂに関しては、一連の実験を行って、これらのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを、異なる比率でｓｉＲＮＡと複合体化させた。通常、この複合体化を、１：０．０１乃至１：５０のｓｉＲＮＡ／ヒストン比率で開始した。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、４０ｐｍのｓｉＲＮＡを添加した。各ウェルには、５０％の密集度のβ−ｇａｌ細胞が含まれていた。トランスフェクション効率に関して最適化された典型的な比率が、以下の表２に示されている。
【０１４０】
標準ｓｉＲＮＡ又は上記で同定されたヒストンタンパク質の１つと複合体化したｓｉＲＮＡを用いて、９Ｌ／β−ｇａｌ細胞に対してトランスフェクションを行った。該ｓｉＲＮＡは、β−ガラクトシダーゼｍＲＮＡを特異的にノックダウンするように設計されており、活性は、対照からのβ−ｇａｌ活性のパーセンテージとして表されている（対照細胞は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを含まないリポフェクタミンを用いてトランスフェクションした）。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡ送達の効率の検出アッセイ及び／又は定量アッセイは、例えば、β−ガラクトシダーゼアッセイ又はフローサイトメトリー法等の、従来からの方法により行う。
【０１４２】
β−ガラクトシダーゼアッセイには、恒常的にβ−ガラクトシダーゼを発現するセルラインである９Ｌ／ＬａｃＺ細胞を用いた。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞は、恒常的にＬａｃＺを発現するラットの神経膠肉腫線維芽細胞であり、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−２２００）から入手した。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞を、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び２０％ウシ胎児血清が補充されたダルベッコ改変必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）の培地中で増殖させた。１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び０．２５ｍｇ／ｍｌのファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有する抗生物質混合物を補充して、３７℃にて５％  ＣＯ２で細胞を培養した。β−ｇａｌのｍＲＮＡに対して設計されたｓｉＲＮＡ二重鎖を化学的に合成して、送達用試薬と共に用いてノックダウン効率を評価した。
【０１４３】
ペプチド合成
ペプチドは、レイニンシンフォニーシンセサイザー（Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてＣＬＥＡＲ−アミド樹脂上で固相Ｆｍｏｃ化学（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｆｍｏｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって合成した。５当量のＨＣＴＵとＦｍｏｃアミノ酸を、過剰量のＮ−メチルモルホリンと共に用いて、４０分間かけてカップリング工程を行った。前記ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて１０分間の周期で２回処理して、Ｆｍｏｃの脱離を達成した。ペプチド全体の完成の後、ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を脱離させ、ＤＭＦで十分に洗浄した。６当量のＮ−メチルモルホリンの存在下で、３．０当量の３−マレイミドプロピオン酸とＨＣＴＵをペプチド樹脂のＮ末端にカップリングさせることにより、マレイミド修飾ペプチドを調製した。カップリングの程度は、カイザーテストでモニターした。２．５％の水と２．５トリイソプロピルシランを具えるＴＦＡ１０ｍＬの添加により樹脂からペプチドを切断し、次いで、室温で２時間緩やかに撹拌した。得られた粗ペプチドを、エーテルによる粉砕と、これに続くろ過により回収した。該粗製産物をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製の水に溶解して、凍結乾燥した。該粗ペプチドを、０．０５％のＴＦＡを含有する１５ｍＬの水と３ｍＬの酢酸に溶解して、５ｍＬの注入ループを通じて５ｍＬ／分の流速で、逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＲＸ−Ｃ８（２２ｍｍ直径×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）上に充填した。溶媒Ａが水中の０．０５％  ＴＦＡであり、そして溶媒Ｂがアセトニトリル中の０．０５％  ＴＦＡである０．１％  Ｂ／分の直線ＡＢ勾配によって精製を達成した。精製したペプチドをＨＰＬＣとＥＳＭＳで分析した。
【０１４４】
ｓｉＲＮＡの合成及び調製
オリゴヌクレオチドの合成は、最適の５’−Ｏ−ジメチルトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−スクシニルリボヌクレオシド、又は適用可能な場合には５’−Ｏ−ジメチルトリチル−２’−デオキシ−３’−０−スクシニルチミジン支持体から誘導体化される長鎖アルキルアミンのコントロールド多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）上で、標準的な２−シアノエチルホスホロアミダイト法により行った。全てのオリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ  ３４００  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて、０．２又は１μｍｏｌいずれかのスケールで合成し、濃縮ＮＨ４ＯＨを用いて固相支持体から切断し、ＮＨ４ＯＨ：ＥｔＯＨの３：１混合物を用いて５５℃で脱保護した。２’−ＴＢＤＭＳ保護基の脱保護は、塩基脱保護ＲＮＡ（ｂａｓｅ−ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ）を、６５℃でＮ−メチルピロリドン／トリエチルアミン／トリエチルアミントリス（ヒドロフルオリド）（体積比で６：３：４）の溶液（１μｍｏｌ当たり６００μＬ）と２．５時間インキュベートすることにより達成した。Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧに対応する構成要素、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−（ｔａｃ）−２’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト（コロラド州ボルダー所在のＰｒｏｌｉｇｏ社）、並びに修飾ホスホロアミダイトの５’ＤＭＴｒ−５−メチル−Ｕ−ＴＯＭ−ＣＥ−ホスホロアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ａｃ−Ｃ−ＣＥホスホロアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥホスホロアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＣＥホスホロアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ａ−ＣＥホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）は、供給業者から直接購入した。トリエチルアミントリヒドロフルオリド、Ｎ−メチルピロリジノン及び濃縮水酸化アンモニウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。全てのＨＰＬＣ分析と精製は、エクステラ（Ｘｔｅｒｒａ）（商標）カラムを備えたウォーターズ２６９０（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０）を用いて行った。他の全ての試薬は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．社から購入した。オリゴヌクレオチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣでの測定によると９７％を超える純度にまで精製されていた。マウス注射用のｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社から購入し、該ｓｉＲＮＡをアニーリングさせた後に、インビボでの注射に許容可能なエンドトキシン濃度にまでＨＰＬＣで精製した。
【０１４５】
細胞培養
初代ヒト単球：
健康なドナー由来の新鮮なヒト血液サンプルを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から購入した。単球を単離するために、受け取り後直ちに、血液サンプルをＰＢＳで１：１の比率に希釈した。末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、最初に全血からフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の勾配により単離した。ミルテニイＣＤ１４陽性選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ１４  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）と供給されたプロトコル（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ社）を用いて、ＰＢＭＣから更に単球を精製した。単球試料の純度を評価するため、細胞を抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とインキュベートし、次いでフローサイトメトリー法によりソーティングした。前記単球試料の純度は、９５％を超えていた。
【０１４６】
０．１乃至１．０ｎｇ／ｍｌのリポサッカリド（ＬＰＳ）（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社）を細胞培養に添加して腫瘍壊死因子−±（ＴＮＦ−±）の産生を促すことにより、ヒト単球の活性化を行った。ＬＰＳとのインキュベーションの３時間後の細胞を回収し、ｍＲＮＡ濃度を、クオンティジーンアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ）（カルフォルニア州フレモント所在のＧｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社）を用いて、製造元の指示に従って測定した。
【０１４７】
マウス尾の線維芽細胞：
マウス尾の線維芽細胞（ＭＴＦ）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾から得た。尾を切り離して７０％エタノールに浸し、次いで剃刀の刃で小さな断片へと切り刻んだ。断片をＰＢＳで３回洗浄し、３７℃にて０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと共にシェーカー中でインキュベートすることで組織を破壊した。次いで、細胞が樹立するまで尾の断片を完全培地（２０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを具えるダルベッコ改変必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ））中で培養した。細胞は、上記で略述した完全培地中にて、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。
【０１４８】
トランスフェクションの手順
手順の最初の日に、Ｔ７５フラスコから飽和した９Ｌ／ＬａｃＺ培養液を取り出し、細胞を剥離して、１０ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１×ＰＳ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＮＥＡＡ）中に希釈する。細胞を更に１：１５にまで希釈し、この試料のうち１００μｌを９６ウェルプレートに分注するが、通常、これによりトランスフェクションのために、翌日には約５０％の細胞密集度が得られことになる。プレートの周縁部のウェルは空のままにして、２５０μｌの水で満たし、そしてプレートをインキュベーター中に３７℃（５％  ＣＯ２インキュベーター）で一晩、積み重ねずに静置する。
【０１４９】
２日目に、１ウェル当たり５０μｌのオプティＭＥＭ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中でトランスフェクション複合体を調製する。プレートから培地を取り除いて、各ウェルを２００μｌのＰＢＳ又はオプティＭＥＭで１回洗浄する。プレートを逆さにして、ティッシュペーパーを用いて水分を吸い取り、完全に乾燥させる。次いでトランスフェクション混合物を各ウェルに添加し（５０μｌ／ウェル）、これらを乾燥から防ぐために周縁部のウェルに２５０μｌの水を添加する。次いで細胞を、３７℃（５％  ＣＯ２インキュベーター）で少なくとも３時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を取り除き、１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１×ＰＳ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＮＥＡＡ）と交換する。細胞を、所定の長さの時間培養し、次いで酵素アッセイ用に回収する。
【０１５０】
細胞生存率（ＭＴＴアッセイ）
細胞の生存率は、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ−１００、マットテックキット（ＭａｔＴｅｋ  ｋｉｔ））により評価されることになる。このキットによりテトラゾリウム塩の取込み及びホルマザン色素への変化が測定される。投与時間の終了時の１時間前に、２ｍＬのＭＴＴ濃縮物を８ｍＬのＭＴＴ希釈剤と混合して、脂質を用いて、融解希釈ＭＴＴ濃縮物を調製する。各細胞培養インサートを、Ｃａ＋２及びＭｇ＋２含有ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１ウェル当たり１００μＬの混合ＭＴＴ溶液を具える新たな９６ウェルトランスポートプレートに移す。次いで、この９６ウェルトランスポートプレートを３７℃、５％  ＣＯ２で３時間インキュベートする。３時間のインキュベーションの後、ＭＴＴ溶液を取り除き、該培養物を、１ウェル当たり２５０μＬのＭＴＴ抽出用溶液を具える第２の９６ウェルフィーダートレイに移す。各培養ウェルの表面に、更に１５０μＬのＭＴＴ抽出用溶液を添加し、このサンプルを、室温にて最短２時間から最長２４時間、暗室中に静置した。次いでインサートの膜にピペットチップで穴を開けて、ウェルの上部と下部の溶液が混ざるようにした。抽出したブランク（陰性対照）と共に、２００マイクロリットルの混合した抽出用溶液を、マイクロプレートリーダーで測定するための９６ウェルプレートに移した。プレートリーダーを用いて、６５０ｎｍでのバックグラウンド減算法により、サンプルの吸光度（ＯＤ）を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、パーセンテージで表され、処理したインサートのＯＤ測定値を、ＰＢＳ処理したインサートのＯＤ測定値で割って、これに１００を掛けることで計算した。このアッセイにおいては、ＰＢＳは細胞生存率に対して影響を持たず、従って１００％の細胞生存率を示したものと仮定した。
【０１５１】
酵素アッセイ
酵素アッセイ用の試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（β−Ｇａｌアッセイキット（β−Ｇａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ））とＦｉｓｈｅｒ社（ピアスマイクロＢＣＡプロテインアッセイリエージェントキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）、カタログ）から購入した。
Ａ：細胞溶解
・培地を除去し、２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、プレートを逆さにして水分を吸い取って乾燥させる。
・β−Ｇａｌキットの溶解用バッファー３０μｌを各ウェルに添加する。
・細胞を２回凍結融解して溶解物を作り出す。
Ｂ：β−Ｇａｌアッセイ
・アッセイ用混合物（各ウェルに５０μｌの１×バッファー、１７μｌのＯＮＰＧ）を調製する。
・新しいプレートを取り出し、各ウェルに６５μｌのアッセイ混合物を添加する。
・各ウェルに１０μｌの細胞溶解物を添加する。バックグラウンド活性の減算用にブランクのウェルを設けなければならない。
・３７℃で約２０分間インキュベートするが、長時間のインキュベーションは、ＯＮＰＧを使いつくして高発現にバイアスがかかるので避けなければならない。
・１００μｌの停止溶液を添加する。
・４２０ｎｍでＯＤを測定する。
Ｃ：ＢＣＡアッセイ
・ＢＳＡスタンダード（各ウェルに１５０  ｕｌ）を調製するが、各プレートで、それぞれの点を重複してとらなければならない。
・１４５μｌの水を各ウェルに入れ、５μｌの細胞溶解物を各ウェルに添加する。
・製造元の指示に従って、最終アッセイ試薬（Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を調製する。
・１５０μｌのアッセイ試薬（Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を各ウェルに添加する。
・３７℃で約２０分間インキュベートする。
・５６２ｎｍでＯＤを測定する。
Ｄ：比活性の計算
比活性は、加水分解されたＯＮＰＧのｎｍｏｌ／ｔ／ｍｇタンパク質で表され、ここでｔは、３７℃での分単位でのインキュベーション時間であり；ｍｇタンパク質は、ＢＣＡ法で測定されるアッセイ対象のタンパク質である。
【０１５２】
ＦＩＴＣ／ＦＡＭ結合ｓｉＲＮＡのフローサイトメトリーによる測定
べックマンクールターＦＣ５００セルアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ）（カルフォルニア州フラートン所在）を用いて、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析を行った。該機器は、使用する蛍光プローブ（ｓｉＲＮＡについてはＦＡＭ又はＣｙ５、そしてＣＤ１４についてはＦＩＴＣ及びＰＥ）に応じて調節した。ヨウ化プロピジウム（ミズーリ州セントルイス所在のＦｌｕｋａ社）とアネキシンＶ（ＡｎｎｅｘｉｎＶ）（ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、細胞生存率と細胞毒性の指標として用いた。簡潔な段階的プロトコルを以下に詳述する。
ａ）ｓｉＲＮＡ／ペプチドの複合体への暴露の後、細胞を少なくとも３時間インキュベートした。
ｂ）細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄する。
ｃ）細胞を１５μｌのＴＥで剥離して、３７℃でインキュベートする。
ｄ）細胞を、５つのウェルの中で３０μｌのＦＡＣＳ溶液（０．５％のＢＳＡ、及び０．１％のアジ化ナトリウムを具えるＰＢＳ）で再懸濁する。
ｅ）５つの全てのウェルを一本のチューブにまとめる。
ｆ）各チューブに５μｌのＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を添加する。
ｇ）製造元の指示に従って、細胞を蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）により分析する。
【０１５３】
β−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングに用いたｓｉＲＮＡ配列は、以下の通り：
Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．ＤＴ．ＤＴ（センス）（配列番号３２）
Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（アンチセンス）（配列番号３３）
【０１５４】
本実施例のデータを、表２に示す。トランスフェクション効率は、細胞溶解物から測定されるβ−ガラクトシダーゼ活性の量と負の相関がある。トランスフェクション後に測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性の低下は、トランスフェクションの成功を示すものである。従って、トランスフェクションが起こらなかった場合には、測定されるβ−ガラクトシダーゼ活性は１００％であり、そしてトランスフェクション効率は０％である。β−ガラクトシダーゼ活性が低下する程、トランスフェクション効率は高いことになる。例えば、表２において、ヒストンＨ２ＢとｓｉＲＮＡでは、６２．０３％のトランスフェクション効率が生じており、測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性は３７．９７％にまで低下したことが示される。表３に示すデータについても、同様のトランスフェクション効率の測定方法を用いた。
【０１５５】
表２：
2009507852.tif 000004
【０１５６】
ｓｉＲＮＡ／ペプチド／脂質
ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物、複合体又は結合体へのカチオン性脂質の付加の効率を評価するため、製造元の指示に従ってｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達配合物に一定濃度でリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した（０．２μｌ／オプティＭＥＭ１００μｌ）点を除いて、上記の手順に従った。
【０１５７】
ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）、ｓｉＲＮＡ及びリポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を具える組成物を作製するため、最初に室温でオプティＭＥＭ細胞培養培地中でｓｉＲＮＡとペプチドを一緒に混合し、その後、該混合物に室温でリポフェクチン（登録商標）を添加してｓｉＲＮＡ／ペプチド／カチオン性脂質組成物の組成物を形成させた。
【０１５８】
ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ及びリポフェクチン（登録商標）を具える組成物を作製するため、最初にオプティＭＥＭ細胞培養培地中でペプチドとリポフェクチン（登録商標）を一緒に混合し、この混合物にｓｉＲＮＡを添加してｓｉＲＮＡ／ペプチド／リポフェクチン（登録商標）の組成物を形成させた。
【０１５９】
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３０）又はＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ（配列番号３１）を用いたｓｉＲＮＡ／ペプチド／カチオン性脂質組成物の作製においては、いずれの順序で成分を一緒に添加してｓｉＲＮＡ／ペプチド／カチオン性脂質組成物を作製するかは問題ではない。
【０１６０】
ｓｉＲＮＡ／メリチン／リポフェクチン（登録商標）を作製するため、最初にオプティＭＥＭ細胞培養培地中でｓｉＲＮＡとメリチンを一緒に混合し、次いでこの混合物にリポフェクチン（登録商標）を添加した。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡ／ヒストンＨ１／リポフェクチン（登録商標）の組成物を作製するため、最初にオプティＭＥＭ細胞培養培地にヒストンＨ１とリポフェクチン（登録商標）を一緒に添加して十分に混合し、次いでｓｉＲＮＡを添加して十分にヒストン−リポフェクチン（登録商標）混合物と混合して、ｓｉＲＮＡ／ヒストンＨ１／リポフェクチン（登録商標）の組成物を形成させた。
【０１６２】
表３：
2009507852.tif 000005
【０１６３】
先の結果に基づけば、本発明の代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、ｓｉＲＮＡの細胞への取込みを著しく促進できる一方で、本発明の特定のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物への任意のカチオン性脂質の添加は、実質的にｓｉＲＮＡ送達効率を向上できることが明らかである。
【０１６４】
実施例２
ＴＡＴ−ＨＡポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと結合したｓｉＲＮＡを具える組成物の作製及びキャラクタリゼーション
本実施例では、ｓｉＲＮＡ二重鎖の１つの鎖に共有結合により結合した特別なペプチドの合成及び取り込み活性について記載する。これらの結合体は、ｓｉＲＮＡを効率的に細胞質へと送達する。
【０１６５】
ペプチド合成
ペプチドは、レイニンシンフォニーシンセサイザー（Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてＣＬＥＡＲ−アミド樹脂上で固相Ｆｍｏｃ化学（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｆｍｏｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって合成した。５当量のＨＣＴＵとＦｍｏｃアミノ酸を、過剰量のＮ−メチルモルホリンと共に用いて、４０分間かけてカップリング工程を行った。前記ペプチド樹脂を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて１０分間の周期で２回処理することでＦｍｏｃの脱離を達成した。ペプチド全体の完成の後、ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を脱離させ、ＤＭＦで十分に洗浄した。６当量のＮ−メチルモルホリンの存在下で、３．０当量の３−マレイミドプロピオン酸とＨＣＴＵをペプチド樹脂のＮ末端にカップリングさせることにより、マレイミド修飾ペプチドを調製した。カップリングの程度は、カイザーテストでモニターした。２．５％の水と２．５トリイソプロピルシランを具えるＴＦＡ１０ｍＬの添加により樹脂からペプチドを切断し、次いで、室温で２時間緩やかに撹拌した。得られた粗製のペプチドを、エーテルによる粉砕と、これに続くろ過により回収した。該粗製産物をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製の水に溶解して、凍結乾燥した。該粗ペプチドを、０．０５％のＴＦＡを含有する１５ｍＬの水と３ｍＬの酢酸に溶解して、５ｍＬの注入ループを通じて５ｍＬ／分の流速で、逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＲＸ−Ｃ８（２２ｍｍ直径×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）上に充填した。溶媒Ａが水中の０．０５％  ＴＦＡであり、そして溶媒Ｂがアセトニトリル中の０．０５％  ＴＦＡである０．１％  Ｂ／分の直線ＡＢ勾配によって精製を達成した。精製したペプチドをＨＰＬＣとＥＳＭＳで分析した。
【０１６６】
結合体の合成
ペプチドとＲＮＡの両方は、標準的な固相合成法により調製する。ペプチドとＲＮＡ分子は、相互の共有結合を可能にするため、特別な部分により官能化されていなければならない。ペプチドに関しては、例えば、３−マレイミドプロピオン酸でＮ末端が官能化されている。しかしながら、ブロモ又はヨードアセチル部分のような他の官能基でも機能することが認められる。ＲＮＡ分子については、センス鎖の５’末端、又はアンチセンス鎖の３’末端が、例えば、以下の合成法に従って、１−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキシルジスルフィドリンカーによって官能化されている。
【０１６７】
０．３ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミンアセタート（ＴＥＡＡ）バッファー（ｐＨ７．０）中の０．３９３ｍｇ（３当量）のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて、室温で３時間かけて５’修飾Ｃ６ＳＳオリゴヌクレオチド（ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ（配列番号３４）；３．４６７ｍｇ；０．４５８２μｍｏｌ）を遊離チオール基へと還元した。還元したオリゴヌクレオチドは、２０分間以内での、０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７）中の０−３０％のＣＨ３ＣＮ直線勾配（ｔｒ＝５．９３１分）を用いたエクステラ（ＸＴｅｒｒａ）（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ４．６×５０ｍｍカラム上でのＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。
【０１６８】
精製した還元オリゴヌクレオチド（１．３６１ｍｇ，０．１９０８５μｍｏｌ）を、０．２ｍｌの０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ＝７）に溶解し、次いで、Ｎ末端にマレイミド部分が結合したペプチド（０．７９ｍｇ、１．５当量）を該オリゴヌクレオチド溶液に添加した。ペプチドの添加の後に直ちに沈澱が形成されたが、１５０μｌの７５％  ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡを添加すると消失した。室温で一晩撹拌した後、得られた結合体を、２０分間以内での、０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７）中の０乃至３０％のＣＨ３ＣＮ直線勾配とこれに続く５分以内での１００％  Ｃ（ｔｒ＝２１．００７分）を用いたエクステラ（ＸＴｅｒｒａ）（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ４．６×５０ｍｍカラム上でのＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。結合体の量は、λ＝２６０ｎｍで計算したモル吸光係数に基づく分光光度法により測定した。ＭＡＬＤＩ質量分析により、結合体に観測されたピーク（１０  ５８５．３ａｍｕ）は、算出された質量と一致することが示された。収量：０．５０９ｍｇ、０．０４８１５μｍｏｌ、２５．２％。
【０１６９】
５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭの酢酸マグネシウム及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中にて、９０℃で２分間加熱し、次いで３７℃で１時間インキュベートすることによりペプチド結合体のセンス鎖と相補的なアンチセンス鎖をアニーリングさせた。非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続くエチジウムブロマイド染色により２本鎖ＲＮＡ結合体の形成が確認された。
【０１７０】
ペプチド−ｓｉＲＮＡ結合体の構造（配列番号３４及び３５）
2009507852.tif 000006
【０１７１】
取り込み実験
トランスフェクション時に細胞が〜５０乃至８０％の密集度になるように、前日に細胞を２４ウェルプレートに播種した。複合体については、ｓｉＲＮＡとペプチドをオプティＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に希釈し、次いでＰＢＳで洗浄した細胞に添加する５乃至１０分前に混和して複合体化させた。各ペプチド濃度（２乃至５０μＭ）において、ｓｉＲＮＡの終濃度は５０ＯｎＭであった。同じくオプティＭＥＭ（登録商標）培地中に希釈された結合体を、６２．５ｎＭ乃至５００ｎＭの範囲の終濃度で細胞に添加した。５０ＯｎＭの濃度においては、洗浄した細胞に添加する直前に２０％  ＦＢＳとも混合した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で３時間かけてトランスフェクションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理して、次いでフローサイトメトリーにより分析した。Ｃｙ５の蛍光強度によってｓｉＲＮＡ取り込みを測定し、ヨウ化プロピジウムの添加により細胞生存率を評価した。
【０１７２】
図１に示すように、ペプチド／ｓｉＲＮＡ結合体は、マウスの尾の線維芽細胞において、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体より高い取り込みパーセントを達成する。更に、ペプチド／ｓｉＲＮＡ結合体は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体よりも高い平均蛍光強度（ＭＦＩ；図２）を示す。従って、これらのデータは、特定の実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子にポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを結合させることが望ましいことを示す。
【０１７３】
実施例３
ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド複合体のスクリーニングにより、合理的に設計された多様なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによる９Ｌ／ＬａｃＺ細胞内でのｓｉＲＮＡ取り込みの効果的な誘導が立証される
本実施例は、合理的に設計された本発明の多種多様なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、ｓｉＲＮＡと複合体を形成した場合に、ｓｉＲＮＡの取り込みを促進することの更なる証拠を提供する。
【０１７４】
翌日のトランスフェクション時に〜５０％の密集度になるように、ウェルあたり約１０，０００個の９Ｌ／ｌａｃＺ細胞を平底の９６ウェルプレートに播種した。ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡとペプチドを、終濃度が１／２になるようにオプティＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に希釈した。等量のｓｉＲＮＡとペプチドを混合して、室温で５乃至１０分間複合体化させて、あらかじめＰＢＳで洗浄した細胞に５０μＬ添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３時間かけてトランスフェクションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理して、次いでフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＭ蛍光の強度によってｓｉＲＮＡ取り込みを測定し、ヨウ化プロピジウムの添加により細胞生存率を評価した。以下の表４に、種々の合理的に設計されたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドについての９Ｌ／ＬａｃＺ細胞における細胞取込みパーセントのデータをまとめる。表４には、使用したペプチドとｓｉＲＮＡの濃度も含まれている。
【０１７５】
表４：
2009507852.tif 000007
【０１７６】
2009507852.tif 000008
【０１７７】
実施例４
ｓｉＲＮＡ送達は、インビトロでポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドにより促進される
本実施例では、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによる、ＬａｃＺ細胞、マウス初代線維芽細胞及びヒト単球でのｓｉＲＮＡ取り込みの促進を例示する。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞とマウス線維芽細胞で行う実験に用いる材料と方法は、マウスの実験に関して、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞がマウスの尾の線維芽細胞（ＭＴＦ）に置き換わっている点を除けば、全般的に上記と同様である。ヒト単球で行う実験に用いる材料と方法は後述する。ＭＴＦ細胞を用いて行ったトランスフェクションの結果を表５にまとめる。表５には、使用したペプチドのアミノ酸配列と、該ペプチド及びｅＧＦＰ  ｓｉＲＮＡに結合したＣｙ５標識の濃度も含まれている。ＭＴＦと９Ｌ／ＬａｃＺ細胞の両方を用いて行ったトランスフェクションの結果を表６にまとめる。表６に示されるデータにより、異なる細胞種における、複数のペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体についてのトランスフェクション効率の比較が提供される。
【０１７８】
表５：
2009507852.tif 000009
【０１７９】
表６：
2009507852.tif 000010
【０１８０】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが培養中の細胞にトランスフェクトする能力を更に特徴付けるため、ヒト単球を、種々の濃度のＰＮ７３，ＰＮ２５０，ＰＮ１８２，ＰＮ５８及びＰＮ１５８と複合体化した２００ｎＭのＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡと共にインキュベートした。ヒト単球は、慢性関節リウマチの治療における標的細胞種であるので、ＬａｃＺ細胞及びマウス線維芽細胞に加えてヒト単球を用いた。
【０１８１】
健康なドナー由来の新鮮なヒト血液サンプルを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から購入した。単球を単離するために、受け取り後直ちに、血液サンプルをＰＢＳで１：１の比率に希釈した。末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、最初に全血からフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の勾配により単離した。ミルテニイＣＤ１４陽性選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ１４  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）と供給されたプロトコル（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ社）を用いて、ＰＢＭＣから更に単球を精製した。単球試料の純度を評価するため、細胞を抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とインキュベートし、次いでフローサイトメトリー法によりソーティングした。前記単球試料の純度は、９５％を超えていた。
【０１８２】
以下の記載は、本実施例で用いたトランスフェクション用プロトコルの簡潔な概要である。接着性のセルラインについては７０〜９０％の密集度で細胞を播種し、懸濁細胞については各ウェルに１００，０００個の細胞を播種した。ｓｉＲＮＡ／トランスフェクション試薬複合体については、Ｃｙ５−又はＦＡＭ−結合したｓｉＲＮＡとペプチドを、終濃度が１／２になるようにオプティＭＥＭ（登録商標）培地中に別々に希釈した。等量のｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬を混合して、室温で５乃至１０分間複合体化させた。ｓｉＲＮＡ−ペプチド結合体については、該結合体を、オプティＭＥＭ（登録商標）培地中に直接希釈した。トランスフェクション混合物をあらかじめＰＢＳで洗浄した細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で３時間かけて細胞をトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ取り込みの分析のため、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理して（接着細胞のみ）、次いでフローサイトメトリーにより分析した。細胞内のＣｙ５又はＦＡＭ蛍光の強度によってｓｉＲＮＡ取り込みを測定した。細胞生存率については、ヨウ化プロピジウム（取り込み）又はアネキシンＶ−ＰＥ（染色）より測定した。
【０１８３】
先の実験から、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであるＰＮ７３は、慢性関節リウマチの治療に理想的な候補であることが示されている。図３には、複数の異なるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの、培養中のヒト単球でのｓｉＲＮＡ取り込みを促進する能力が図示されている。比較対象としてリポフェクタミンによるトランスフェクションを用いた。各ペプチドについて、細胞生存率も評価した（図４）。これらのデータにより、ＰＮ７３ペプチドが、高い効率と低い毒性でヒト単球にトランスフェクトしており、該ペプチドがインビボでの慢性関節リウマチの治療に理想的な候補であることが示されるという驚くべき予期せぬ発見が示される。
【０１８４】
実施例５
ｓｉＲＮＡ送達は、ｓｉＲＮＡをポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに結合させることで促進される
本実施例では、９Ｌ／ＬａｃＺ培養セルラインとマウスの尾由来の初代線維芽細胞内でのｓｉＲＮＡ取り込みを誘導又は促進するためのｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド結合体の活性を評価するスクリーニングの結果を提供する。これらの試験に用いる材料と方法は、ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体の作製に必要とされるｓｉＲＮＡ／ペプチドの混合が不要である点を除いては、全般的に上記と同様である。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞を用いて行ったトランスフェクションについての取込みパーセントを表７にまとめる。表７には、使用したペプチドと、ペプチド／ｓｉＲＮＡ結合体の濃度も含まれている。ｓｉＲＮＡ分子に結合したＦＡＭ−β−ｇａｌ標識を用いた。ＭＴＦを用いて行ったトランスフェクションについての結果を表８にまとめる。表８には、使用したペプチド／ｓｉＲＮＡ結合体とｅＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ分子に結合したＣｙ５標識の濃度も含まれている。
【０１８５】
表７：
2009507852.tif 000011
【０１８６】
表８：
2009507852.tif 000012
【０１８７】
先のデータにより、本発明に係る多様なｓｉＲＮＡ／ペプチド結合体が、異なる細胞種へのｓｉＲＮＡの送達を高効率で媒介することが証明される。
【０１８８】
実施例６
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のノックダウンは、ｓｉＲＮＡに複合体化したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドにより促進される
本実施例では、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体による標的遺伝子の発現の効率的なノックダウンを実証する。本試験においては、ヒト及び他の哺乳動物対象内で過剰発現された場合にＲＡの発症又は進行の媒介と関連すると考えられているヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現をペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が調節する能力について試験した。
【０１８９】
健康なヒトの血液を、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（カルフォルニア州所在）から購入し、該血液から、末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコールペーグプラス（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ  ｐｌｕｓ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の勾配により精製した。次いで、ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ社の磁気マイクロビーズを用いてＰＢＭＣフラクションからヒト単球を精製した。単離したヒト単球を、４ｍＭのグルタミン、１０％  ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸と１×ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＩＭＤＭ中に再懸濁し、使用まで４℃で保存した。
【０１９０】
オプティＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に、ヒト単球を、各ウェルに、１００μｌ当たり１００，０００個で、平底の９６ウェルプレート内に播種した。トランスフェクション用試薬とｓｉＲＮＡをオプティＭＥＭ培地中に所望の濃度で、室温で２０分間（リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）用）、又は５分間（ペプチド用）かけて混合した。インキュベーションの終了時に、該混合物にＦＢＳを添加し（終濃度３％）、そして該混合物のうち５０μｌを細胞に添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。トランスフェクションの後、細胞をＶ字底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間かけて細胞をペレット化した。細胞を増殖培地（グルタミン、非必須アミノ酸、及びペニシリン−ストレプトマイシンを具えるＩＭＤＭ）中に再懸濁した。一晩インキュベーションした後に、細胞を、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）で３時間かけて刺激した。インキュベーション後、ｍＲＮＡ定量のために細胞を上記のように回収し、タンパク質定量のために上清を保存した。
【０１９１】
ｍＲＮＡの測定については、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社（カルフォルニア州所在）のブランチＤＮＡテクノロジー（ｂｒａｎｃｈ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造元の使用説明書に従って用いた。細胞内のｍＲＮＡ濃度を定量するため、ハウスキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）及び標的遺伝子（ＴＮＦ−α）の両方のｍＲＮＡを測定し、ＴＮＦ−αについての実測値をｃｙｐＢに対して標準化することで相対発光ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）が得られた。タンパク質濃度を定量するために、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡを製造元の使用説明書に従って用いた。
【０１９２】
以下の表９に例示するように、ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの異なる領域を標的とするように方向付けられた。表９に列挙する各オリゴについて、３’オーバーハング（例えば、Ｎがいずれかのヌクレオチドを表すｄＮｄＮ等）は表示されていない
【０１９３】
表９：
2009507852.tif 000013
【０１９４】
2009507852.tif 000014
【０１９５】
表１０、１１及び１２には、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに複合体化した特定のオリゴが、ヒト単球内でのＴＮＦ−α遺伝子発現レベルを標的としてノックダウンする効率が図示されている。
【０１９６】
表１０：
2009507852.tif 000015
【０１９７】
表１１：
2009507852.tif 000016
【０１９８】
表１２：
2009507852.tif 000017
【０１９９】
先の結果（表１０、１１及び１２）により、本発明の新規なｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物を用いることで、哺乳動物細胞内でＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウンが効果的なレベルで達成可能なことが証明される。
【０２００】
スクリーニングとキャラクタリゼーション
ＬＰＳで処理したヒト単球（ＣＤ１４＋）では、ＴＮＦ−α特異的ｍＲＮＡが約２時間以内に誘導され、これから２時間後にＴＮＦ−αタンパク質のピーク濃度が続く。リポフェクタミン２０００を用いてｓｉＲＮＡ候補配列を単球にトランスフェクションし、感染させた細胞をＬＰＳで処理し、そして約１６時間後にＴＮＦ−αのｍＲＮＡ濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡをノックダウン活性についてスクリーニングした。５６種類のｓｉＲＮＡ配列を設計し、これらのｓｉＲＮＡが活性化されたヒト初代単球内でＴＮＦ−αのｍＲＮＡとタンパク質の濃度をノックダウンする能力についてスクリーニングを行った。代表的な組の２７種類のｓｉＲＮＡ配列の活性は、８０％のｍＲＮＡノックダウン活性から、検出不可能な活性の範囲で変化した。一般的に、ＴＮＦ−αタンパク質濃度は、ｍＲＮＡ濃度よりも低下しており、例えば、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ（ＴＮＦ−α−１）における５０％のノックダウンでは、ＴＮＦ−αタンパク質濃度で７５％の低下を生じさせた。３０％乃至６０％のノックダウンレベルを示した、選択されたｓｉＲＮＡの用量−反応曲線が得られた。算出されたＩＣ５０値は、１０ｐＭｏｌａｒ乃至２００ｐＭｏｌａｒの範囲内にあった。評価したｓｉＲＮＡ配列は、ＴＮＦ−α転写物全体に分布するものであったが、同定された最も強力なｓｉＲＮＡは、２つの領域内に位置していた：コーディング領域の中央部と３’−ＵＴＲである。
【０２０１】
実施例７
ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のノックダウンは、ｓｉＲＮＡに結合したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドにより促進される
本実施例では、本発明のペプチド−ｓｉＲＮＡ結合体による標的遺伝子の発現のノックダウンを実証する。これらの試験のための材料と方法は、ｓｉＲＮＡとペプチドの混合が不要であるという点を除いては、上記のものと同様である。この一連の試験において、ノックダウンの実験には、リポフェクタミン有り又は無しの場合での、ペプチド／ｓｉＲＮＡに媒介されるノックダウンの比較が含まれる。本実施例の結果を、以下の表１３に図示する。
【０２０２】
表１３：
2009507852.tif 000018
【０２０３】
先のデータ（表１３）により、ｓｉＲＮＡに結合した本発明の多様なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、哺乳動物対象内でのＴＮＦ−α遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを促進する機能を有することが証明される。
【０２０４】
実施例８
ｓｉＲＮＡ遺伝子発現ノックダウンの経時変化
本実施例は、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現ノックダウンの経時変化に関する試験を提供する。ｓｉＲＮＡ効果の持続時間を試験するため、ｅＧＦＰ発現マウス由来の線維芽細胞を用いた点を除いては、上記で述べたｓｉＲＮＡトランスフェクション手順を採用した。本実施例で使用したトランスフェクション試薬は、リポフェクタミンであった。細胞は、過剰増殖のために１８日目に再播種した。２度目のトランスフェクションを、１度目のトランスフェクション後１９日目に行った。１９日目に、トランスフェクションの後にｅＧＦＰ濃度を測定した。ＧＦＰＩ  ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰＩ）及びヘアピンｓｉＲＮＡ（Ｄ＃２１）と共に、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ）又はナンセンスｓｉＲＮＡ（ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｉＲＮＡ）（Ｑｉａｇｅｎ社）を対照として用いた。ノックダウン活性は、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社対照）で基準化した。より高い値は、より高いノックダウン活性を示す。
【０２０５】
表１４：
2009507852.tif 000019
【０２０６】
先の試験（表１４）により、ｓｉＲＮＡのノックダウン活性が、３日目前後で明らかになり、そして９日目まで持続して、その後、１７日目あたりで標的遺伝子の発現がベースラインのレベルにまで回復したことが示される。１８日目の２回目のトランスフェクションの後に再度のｅＧＦＰ発現の低下が生じており、該試薬を細胞に繰り返し投与して、反復的又は持続的な遺伝子発現ノックダウンを生じさせることが可能なことを示している。
【０２０７】
実施例９
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡにより媒介されるＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウンの用量依存
本実施例は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＰＮ７３と複合体化したｓｉＲＮＡにより媒介される活性化したヒト単球内でのノックダウン活性が、ペプチド−ｓｉＲＮＡ複合体の投与濃度に依存することを実証する。
【０２０８】
ＰＮ７３／ｓｉＲＮＡ複合体は、ＰＮ７３とｓｉＲＮＡ間で、約ＰＮ７３：ｓｉＲＮＡ＝８２：１の一定の比率で提供した（表１５）。４００ナノモーラーのｓｉＲＮＡを、オプティＭＥＭ培地中で５分間かけて３３μＭのＰＮ７３と複合体化させた。複合体化の後、オプティＭＥＭを用いて該複合体を段階希釈した（１：２の比率）。トランスフェクションのために該複合体をヒト単球に添加した。上記に従って、以下の誘導とｍＲＮＡ定量を行った。
【０２０９】
表１５：
2009507852.tif 000020
【０２１０】
関連する一連の実験では、ｓｉＲＮＡを段階希釈して、一定量のＰＮ７３（１．６７μＭ）と混和した。言い換えるならば、ＰＮ７３ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを、滴定量のｓｉＲＮＡと複合体化させた。ＰＮ７３（１．６７μＭ）を、オプティＭＥＭ培地中で各滴定量のＬＣ２０  ｓｉＲＮＡと室温で５分間かけて複合体化させた。複合体化の後、トランスフェクションのために、該複合体をヒト単球に添加した。以下の表１６に提示される誘導とｍＲＮＡ定量のデータは、上記の方法によって得られたものである。
【０２１１】
表１６：
2009507852.tif 000021
【０２１２】
実施例１０
哺乳動物細胞内でのｓｉＲＮＡによるノックダウン効果を延長させる多重投与プロトコル
本実施例は、多重投与計画が、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物により媒介される、哺乳動物細胞内での遺伝子発現ノックダウン効果を効果的に延長させることを実証する。これらの試験に用いた材料と方法は、表示した時刻に繰り返しトランスフェクションを行った点を除いては、上記と同様である。スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）を、並行する対照として用いた。ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を用いた多重トランスフェクションのデータを表１７にまとめる。ＴＮＦ−α遺伝子のノックダウン活性のパーセントは、全遺伝子発現のパーセントを表す。
【０２１３】
表１７：
2009507852.tif 000022
【０２１４】
先の結果（表１７）は、適時に多重トランスフェクションを行った場合（本実施例の場合では、１回目のトランスフェクション後の約５日目乃至７日目）には、哺乳動物細胞内のＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウン効果を維持又は再誘起できることを示す。
【０２１５】
実施例１１
インビボでのｓｉＲＮＡ／ペプチド媒介性ＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウン活性
本実施例では、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物が全身送達を媒介し、そして、標的遺伝子の発現を調節して治療用に細胞の表現型を変化させるのに効果的なｓｉＲＮＡによる治療用の遺伝子ノックダウンを媒介する効力を実証するインビボでのデータを提供する。
【０２１６】
ヒトＴＮＦ−α発現マウスを、ヘレニックパスツール研究所（Ｈｅｌｌｅｎｉｃ  Ｐａｓｔｕｒｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ギリシャ共和国所在）から生後５週間で購入した。マウスには、静脈内（ＩＶ）経路で、３００μｌの食塩水を週２回（４匹のマウス）、ＲＡ薬のレミケード（５ｍｇ／ｋｇ）を週１回（２匹のマウス）、又は１：５のモル比でＰＮ７３と混合したＬＣ２０  ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）を週２回（２匹のマウス）投与した。注射の期間中に、ＥＬＩＳＡ試験（Ｒ＆Ｄシステムズ）用に血漿サンプルを回収し、ＲＡ疾患の進行と治療効果について一般的に承認された指標として、足スコア（ｐａｗ  ｓｃｏｒｅ）を週に２回採った。処理したマウスのＴＮＦ−αタンパク質の血漿濃度を以下の表１８に示す。
【０２１７】
表１８：
2009507852.tif 000023
【０２１８】
先の結果により、レミケード又は食塩水（対照）で処理したマウスとの比較における、ペプチド／ｓｉＲＮＡ処理したマウスの循環血液中のＴＮＦ−αタンパク質濃度の効果的な低下が実証される。本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物及び方法のインビボでの効果の更なる証拠が、上記の対象マウスから、ＲＡの病状と治療効果について一般的に承認された表現型指標である足スコア（ｐａｗ  ｓｃｏｒｅ）を用いて得られた。
【０２１９】
開始点の違いにより（動物によっては、より早期の点でのスコアを提示する）、本実験では全ての動物についてスコアを０に合わせた。各足について０乃至３のスコアを提示するが、以下の採点指標に従えば、最高スコアは１２となる。
０：正常
１：足又は足関節の浮腫又は歪曲
２：足又は足関節の歪曲
３：手首又は足関節の強直
【０２２０】
これらの足スコア評価の結果を、図５に図示する。これらのデータは、８週目での遅延したＲＡ進行に示されるように、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３は、動物に注射した場合に、治療量のｓｉＲＮＡ（例えば、ＬＣ２０、ＴＮＦ−α２、及びＴＮＦ−α９（ＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡＧＣＡＡＡ（配列番号１８７）））を送達できることを実証している。ＰＮ７３／ｓｉＲＮＡで処置したマウスは、レミケードで処置したマウスとくらべて、８週目での足採点指標において、より良好に回復していた。足スコア評価を処置後１１週目に行った場合、ＰＮ７３／ＬＣ２０複合体は、レミケード処置したマウスと同程度の足スコア評価を達成した。１：５の比率のＰＮ７３ペプチド／ＬＣ２０  ｓｉＲＮＡにおいて、２ｍｇ／ｋｇのＬＣ２０では、試験したより低投与量のＬＣ２０と比較して、ＲＡ進行における相対的な観察で最大の遅延が達成された。ＰＮ７３とｓｉＲＮＡで処置した後に評価した５種類の異なるグループに関する、複数のｓｉＲＮＡの相対的効果を以下表１９にまとめる。
【０２２１】
表１９：
2009507852.tif 000024
【０２２２】
先の結果は、ｓｉＲＮＡと本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの組成物により、遺伝子発現を調節して疾患を治療及び管理するための有望な新たな治療手段が提供されることを示している。本発明のｓｉＲＮＡ、例えば、分解のためにヒトＴＮＦ−α特異的ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ等は、現行の低分子、可溶性レセプター、又は抗体によるＲＡの治療と比べて、高い特異性、低い免疫原性及び高い疾患の緩和をもたらす。ｈＴＮＦ−αを標的として、１回の投与により３０乃至８５％のノックダウンを生じる、５０種類を超える候補ｓｉＲＮＡ配列をスクリーニングした。コンピューターで設計した２０種類を超えるペプチド複合体及び／又は共有結合分子を単球による蛍光ＲＮＡの取込みについて比較したところ、多くがリポフェクタミン又はコレステロールと結合したｓｉＲＮＡよりも著しく良好な取り込みを示し、１０ｐＭ未満のＩＣ５０値を有することが判明した。前記ペプチド−ｓｉＲＮＡ製剤は、インビトロの活性化されたヒト単球内で、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡとタンパク質の濃度を効果的にノックダウンする。
【０２２３】
１種類の代表的な候補の送達ペプチド／ｓｉＲＮＡ製剤を、２種類の恒常的にヒトＴＮＦ−αを発現する慢性関節リウマチ（ＲＡ）のトランスジェニックマウスモデル内で評価した。生後６週間目から週２回ＩＶ注射による２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ又はインフリキシマブで処置した動物は、生後７週間目からＲＡスコアの安定化（足と関節の炎症）を示したが、これと比較される対照ではこれらの病状が１０週目まで持続した。生後９週目において、ｓｉＲＮＡで処置した動物は、インフリキシマブで処理した動物と比べて同程度のＲＡスコアの低下を示したが、有意に低い血漿ＴＮＦ−αタンパク質濃度を示した。
【０２２４】
本明細書の開示に基づけば、炎症等の病理状態で重要な役割を果たすＴＮＦ−αのようなサイトカイン等の標的遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡの使用により、哺乳動物対象内のＲＡに例証される疾患の症状を緩和するか又は予防するための効果的な治療が提供される。本発明の方法及び組成物の範囲内で用いる代用的なペプチド／ｓｉＲＮＡ組成物は、抗体又は可溶性レセプターの場合のように、標的遺伝子の産物、例えばＴＮＦ−αとの複合体化によるのではなく、該組成物がＴＮＦ−α発現等の標的遺伝子発現を低下又は消去する能力と関連した利点を提供する。
【０２２５】
本発明の教示に係る核酸の全身送達を向上させることにより、ｓｉＲＮＡを薬物として開発するための更なる利点が提供される。この文脈における具体的な課題には、組織バリアーを通過しての標的細胞又は組織への送達、ｓｉＲＮＡの安定性の維持、及び十分な効果を発揮する量のｓｉＲＮＡを細胞膜を通って細胞内へ入れる細胞内送達が含まれる。本開示により、ＲＡのモデルマウスを用いた試験により例証されるように、標的疾患を予想させるトランスジェニックモデル動物内の疾患活性を緩和する、ヒトＴＮＦ−α発現等の特定の遺伝子発現を標的とした新規なペプチド／ｓｉＲＮＡ組成物を具えるインビボでの効果的な送達系が初めて示される。関連する試験では、本発明の組成物と方法は、ＲＡ患者由来の活性化された単球内でＴＮＦ−α発現を効果的に阻害する。これらの結果により、ＲＮＡｉ経路が、ＴＮＦ経路に対する細胞内効果を通じて細胞の表現型及び疾患の進行の変化を効果的に媒介し、さらに、現行の抗体を用いたＲＡ治療に特徴的な、残存免疫反応性を有する抗体／ＴＮＦ−α複合体の循環に起因する有毒な作用を回避することが示される。特に、これらの実施例に示されるｓｉＮＡとポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの投与量が、少なくとも８０−９０％又はこれを超える細胞生存率のレベルといつも相関するように、ここでの全試験は、付随する有毒効果を最小化して行った。
【０２２６】
実施例１２
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの合理的設計の最適化
本実施例では、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを最適化するための代表的な設計とデータを提供する。対象となる合理的設計操作は、ヒストンＨ２Ｂから誘導したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに対して行った。
【０２２７】
表２０：
2009507852.tif 000025
【０２２８】
表２０は、ＰＮ７３と、ＰＮ７３を基本とするポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの合理的設計を最適化するために作製されたＰＮ７３誘導体の一次構造の図解を提示する。各ペプチドのグレイに着色されたＣ末端は、該ペプチドの疎水性ドメインを表し、各ペプチドの黒色のＮ末端は親水性ドメインを表す。元となるペプチドのＰＮ７３は、細胞へのｓｉＲＮＡ送達を誘導又は促進するためのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの例として上記に示されている。
【０２２９】
このポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと他のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの機能−構造活性の関係をよりよく理解するため、Ｃ末端及びＮ末端の機能、並びにＰＮ７３及び他の化学的部分との結合体の活性を特徴づけることにより、１次構造試験を行った。
【０２３０】
ヒトのヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０２３１】
ＰＮ７３、ＰＮ３６０及びＰＮ３６１は、Ｈ２Ｂのペプチド断片であり、これらが相当するＨ２Ｂタンパク質の部分は、以下のペプチドの名称の後の括弧内に特定される。以下に列挙するＰＮ３６０及びＰＮ３６１のアミノ酸配列が、ＰＮ７３中に見られる対応するアミノ酸配列とアラインメントされている。ＰＮ７３ペプチド断片は、Ｈ２Ｂアミノ酸配列中に下線で示されており、Ｈ２Ｂのアミノ酸１３乃至４８に相当する。該ＰＮ７３ペプチド断片は、Ｈ２Ｂのアミノ酸１２乃至４８に相当する場合もある。ＰＮ３６０はＰＮ７３とＮ末端を共有するが、ＰＮ７３のＣ末端を欠いており、一方で、ＰＮ３６１はＰＮ７３とＣ末端を共有するが、ＰＮ７３のＮ−末端を欠く。ＰＮ７３結合体は、単一のｓｉＲＮＡ鎖（例えば、センス鎖）に共有結合したＰＮ７３である。ＰＮ４０４は、全てのリジンがアルギニンで置換されたバージョンのＰＮ７３であり、ＰＮ５０９は、Ｎ末端がＰＥＧ化された、ペグ化ＰＮ７３（ＰＥＧ分子量１ｋダルトン）誘導体である。
Ｈ２Ｂ（ヒストン２Ｂ）アミノ酸配列
ＭＰＥＰＡＫＳＡＰＡＰＫＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＳＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＶＨＰＤＴＧＩＳＳＫＡＭＧＩＭＮＳＦＶＮＤＩＦＥＲＩＡＧＥＡＳＲＬＡＨＹＮＫＲＳＴＩＴＳＲＥＩＱＴＡＶＲＬＬＬＰＧＥＬＡＫＨＡＶＳＥＧＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫ（配列番号１６４）
ＰＮ７３（１３−４８）
ＮＨ２−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−アミド（配列番号５９）
ＰＮ３６０（１３−３５；ＰＮ７３のＮ末端）
ＮＨ２−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫ−アミド（配列番号５７）
ＰＮ３６１（２４−４８；ＰＮ７３のＣ末端）
ＮＨ２−ＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−アミド（配列番号５８）
ＰＮ７３（１３−４８）−ｓｉＲＮＡ（センス鎖）結合体
ｓｉＲＮＡ−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−アミド（配列番号５９）
ＰＮ４０４（全てのリジンがアルギニンで置換されたＰＮ７３）
ＮＨ２−ＲＧＳＲＲＡＶＴＲＡＱＲＲＤＧＲＲＲＲＲＳＲＲＥＳＹＳＶＹＶＹＲＶＬＲＱ−アミド（配列番号９１）
ＰＮ５０９（ＰＥＧ化ＰＮ７３）
ＰＥＧ−ＲＧＳＲＲＡＶＴＲＡＱＲＲＤＧＲＲＲＲＲＳＲＲＥＳＹＳＶＹＶＹＲＶＬＲＱ−アミド（配列番号９０）
【０２３２】
図６には、先のＰＮ７３の合理的に設計された誘導体であるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドについての、マウスの尾の線維芽細胞内での取り込み効率と生存率の試験の結果が提示されている。マウスの尾の線維芽細胞内での修飾ＰＮ７３の活性の変化が図で示されている。ＰＮ４０４と異なり、ＰＮ５０９は、毒性を高めることなく取り込みを増大させる。ＰＮ７３のＮ末端の一部の欠失は、活性を低下させるが、Ｃ末端残基の除去では、活性が消失した。ＰＮ７３とＰＮ５０９は両方とも、初代細胞内でリポフェクタミン（カルフォルニア州所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）よりも高い活性を示す。
【０２３３】
実施例１３
アセチル化したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは血漿中で高い安定性を示す
本実施例の目的は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の修飾により、該ペプチドに向上した安定性が提供されて、結果としてそのトランスフェクション活性が促進されるかどうかを決定することにあった。非修飾型ＰＮ７３、Ｎ末端ＰＥＧ化型ＰＮ７３及びＮ末端アセチル化型ＰＮ７３の血漿中での安定性を比較した。ＰＮ７３のＣ末端はアミド化されている。紫外線検出器と連結したサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、非修飾型と修飾型のＰＮ７３の安定性を血漿中でのインキュベーションの前後で特徴付けした。
【０２３４】
血漿の非存在下では、非修飾型、ＰＥＧ化型及びアセチル化型のＰＮ７３は、約９分で、異なってはいるが重複するＵＶ軌跡を示した。しかしながら、血漿に４時間暴露した後では、非修飾ＰＮ７３とＰＥＧ化ＰＮ７３に特異的なＵＶ軌跡は存在しておらず、著しい分解が示唆された。対照的に、アセチル化ＰＮ７３に独特のＵＶ軌跡は残っており、この修飾により、非修飾ＰＮ７３型及びＰＥＧ化ＰＮ７３型と比較して、血漿中でのＰＮ７３の安定性が顕著に増大したことが示された。
【０２３５】
これらのデータにより、血漿中のＰＮ７３の安定性は、ＰＮ７３ペプチドのＮ末端のアセチル化により向上できるという驚くべき予期せぬ発見が示される。アセチル化したＰＮ７３ペプチドの１次構造は以下の通りである：
Ａｃ−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−アミド（配列番号５９）
【０２３６】
実施例１４
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドはインターフェロン反応を誘起しない
本実施例の目的は、リポソーム試薬とｓｉＲＮＡ、又は代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＰＮ７３ペプチドとｓｉＲＮＡのいずれかによりトランスフェクトされた細胞のインターフェロン反応を比較することでにあった。インターフェロンの反応性は、ＥＬＩＳＡ（タンパク質）及びｂＤＮＡ（ｍＲＮＡレベル）により評価した。
【０２３７】
従来では、ｓｉＲＮＡ分子は、リポソーム媒介性のトランスフェクションにより細胞内に送達される。しかしながら、これでは概して低効率の送達に終わり、インビボでの炎症反応、及び結果的に細胞増殖を阻害するインターフェロン遺伝子発現の上方制御が生じることになる。その結果、標的遺伝子発現レベルの低下に限界があり、従って、ｓｉＲＮＡを、治療法及び遺伝子発現の研究手段として非効果的なものにしてしまっている。ＰＮ７３によるｓｉＲＮＡ送達がこの課題を克服する。
【０２３８】
図７には、リポフェクタミン対ＰＮ７３ペプチドによる複数の異なるｓｉＲＮＡのトランスフェクションのｂＤＮＡアッセイの結果が示されている。ｓｉＲＮＡは、リポフェクタミン又はＰＮ７３のいずれかと、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ又は２００ｎＭの濃度で複合体化させた。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）は、インターフェロン反応性を測定するための分子マーカーとして機能し、Ｑｎｅｇを陰性対照として用いた。図７に示すように、１００ｎＭ又は２００ｎＭのＴＮＦ−α９  ｓｉＲＮＡと複合体化したリポフェクタミンでは、ＩＬ−１βｍＲＮＡ濃度の著しい増大が生じた。更に、試験した他の全てのｓｉＲＮＡでも、ＩＬ−１βｍＲＮＡ濃度の緩やかな増大が生じた。対照的に、ＰＮ７３ペプチドと複合体化した同一のｓｉＲＮＡは、ＩＬ−１βｍＲＮＡ濃度の増大を生じなかった。
【０２３９】
リポフェクタミン及びＰＮ７３トランスフェクションのいずれかによりトランスフェクトされた細胞間で観察されるインターフェロン反応性の差異を更に特徴付けするため、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、以下の分子マーカーのタンパク質発現レベルを測定した：インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターフェロンα（ＩＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ＭＩＰ−１α、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）。ｓｉＲＮＡと複合体化したリポフェクタミン又はｓｉＲＮＡと複合体化したＰＮ７３によりトランスフェクトされた細胞の相対的なタンパク質発現レベルを表２１にまとめる。
【０２４０】
表２１：
2009507852.tif 000026
【０２４１】
表２１に示すように、ＬＣ２０とＬＣ１７の両ｓｉＲＮＡは、どのトランスフェクション試薬を用いたかに関係なく、インターフェロン反応を示さなかった。しかしながら、リポフェクタミンによるＩＦＮ−１又はＴＮＦ−α９のトランスフェクションは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＭＩＰ−１αのタンパク質発現レベルの増大を生じさせた。対照的に、試験した全てのＰＮ７３によるｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、試験したあらゆるインターフェロン反応マーカーのタンパク質発現についても、観察可能な程に誘導しなかった。
【０２４２】
ＥＬＩＳＡアッセイのこれらのデータは、ＰＮ７３により媒介されるｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、インターフェロン反応を誘起しないという驚くべき予期せぬ発見を示すものである。
【０２４３】
実施例１５
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと結合したｓｉＲＮＡは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡよりも高いノックダウン活性を示す
本実施例の目的は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３に結合するか又は複合体化したＬＣ１３及びＬＣ２０のｓｉＲＮＡの、ヒト単球内でのノックダウン活性を比較することにある。ヒト単球の単離及びトランスフェクション、並びにノックダウン活性の測定に用いた方法は、先に議論されている。Ｑｎｅｇは、ランダムなｓｉＲＮＡ配列を表し、これらの実験において陰性対照として機能する。観察されたＱｎｅｇのノックダウン活性を、１００％（１００％の遺伝子発現レベル）に標準化し、ＬＣ２０とＬＣ１３の活性を陰性対照の相対パーセンテージとして表す。ＬＣ２０及びＬＣ１３は、ヒトＴＮＦ−α遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである。図８は、ＰＮ７３無しのＬＣ２０及びＬＣ１３のｓｉＲＮＡ（図８−Ｃ）、ＰＮ７３と複合体化したＬＣ２０及びＬＣ１３のｓｉＲＮＡ（図８−Ｂ）又はＰＮ７３と結合したＬＣ２０及びＬＣ１３のｓｉＲＮＡ（図８−Ａ）のノックダウン活性を示す。ＬＣ２０及びＬＣ１３は、０ｎＭ乃至２．５ｎＭの濃度範囲に亘って試験した。ＰＮ７３は、複合体及び結合体の両方の実験において１：１の比率に保った。
【０２４４】
予想されたとおり、ＰＮ７３の不存在下では、ＬＣ１３及びＬＣ２０は、殆どノックダウン活性を示さなかった（図８−Ｃ）。ＬＣ１３及びＬＣ２０の両者は、ＰＮ７３と複合体化した場合に、Ｑｎｅｇ対照と比較して、約１５％と３０％のＴＮＦ−α遺伝子発現の低下を生じた（図８−Ｂ）。しかしながら、ＴＮＦ−αに関してのノックダウン活性は、ｓｉＲＮＡがＰＮ７３と結合した場合に６０％未満にまで低下した（図８−Ａ）。これは、ＰＮ７３／ｓｉＲＮＡ複合体との比較において、ｓｉＲＮＡによるノックダウン活性の顕著な増大である。従って、これらのデータは、ｓｉＲＮＡノックダウン活性は、ｓｉＲＮＡが代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３と結合した場合に、顕著に向上されるという驚くべき予期せぬ発見を示すものである。
【０２４５】
実施例１６
コレステロール促進性のｓｉＲＮＡの取込みの血清による阻害はポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドにより救済される
本実施例では、コレステロール部分に結合したｓｉＲＮＡを具える送達製剤への透過性ペプチドの添加により、コレステロール−ｓｉＲＮＡの取込みに対する血清による阻害作用が濃度依存的に低下することを実証する。ｓｉＲＮＡ取り込みの分析のために細胞をＰＢＳで洗浄して、トリプシンで処理し（接着細胞のみ）、次いでフローサイトメトリーで分析した。ＢＡと規定されるｓｉＲＮＡの取り込みは、上記に記載されるように、細胞内のＣｙ５又はＦＡＭの蛍光強度によっても測定し、細胞生存率はヨウ化プロピジウム又はアネキシンＶ−ＰＥの添加により評価した。蛍光標識したｓｉＲＮＡの膜への挿入から細胞取込みを区別するために、トリパンブルーを用いて細胞膜表面上の蛍光を消光させた。
【０２４６】
表２２：
2009507852.tif 000027
【０２４７】
表２２中のデータは、血清の存在により、本発明に係るコレステロール部分に結合したｓｉＲＮＡの細胞取込みが著しく低下することを示している。しかしながら、結合していないｓｉＲＮＡの細胞取込みは、代表的な送達促進ペプチド、ＰＮ７３の存在下で救済されている。
【０２４８】
透過性ペプチド送達促進剤、ＰＮ７３と複合体を形成した、本発明に係るコレステロールに結合したｓｉＲＮＡ（コレステロールｓｉＲＮＡ＋ＰＮ７３）と、ＰＮ７３と複合体を形成した、非結合ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＋ＰＮ７３）の細胞取込みの比較を行った。図９に示すように、同等の細胞取込み活性は、非結合ｓｉＲＮＡ又はコレステロールに結合したｓｉＲＮＡのいずれかにより、高濃度のＰＮ７３で達成することが可能である。これらのアッセイと関連する取り込みアッセイのため、コレステロールに結合したｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３複合体を、一定濃度又は種々の濃度で血清が添加されたオプティＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中のマウスの尾の線維芽細胞（ＭＴＦ）内に、上記のようにトランスフェクトした。コレステロール及び複合体の両方に関して、ｓｉＲＮＡの終濃度は０．２μＭであった。取り込み効率と平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって評価した。
【０２４９】
ＰＮ７３と更にＰＮ２５０が、コレステロールに結合したｓｉＲＮＡの細胞取込みの血清による阻害を救済する能力について、マウスの尾の線維芽細胞（ＭＴＦ）中で更に特徴付けを行った。図１０には、ｓｉＲＮＡの細胞取込みに対する高濃度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響が図示されている。ＰＮ７３又はＰＮ２５０のいずれもの非存在下において、コレステロールに結合したｓｉＲＮＡの細胞取込みは、僅か５％のＦＢＳでも大幅に弱められている。しかしながら、４０μＭのＰＮ７３又は８０μＭのＰＮ２５０のいずれかの存在下においては、ｓｉＲＮＡ取り込みは救済される。
【０２５０】
先のデータ（表２２及び図１０）は、ｓｉＲＮＡのコレステロールへの結合が、ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みを著しく促進することを示している。しかしながら、コレステロールに結合したｓｉＲＮＡの取込みは、血清の存在により大いに減少するか又は消失してしまう可能性がある。これは、恐らく、コレステロール部分の、コレステロール結合ｓｉＲＮＡが標的細胞へ進入する能力を阻害する血清タンパク質との結合によるものと考えられる。しかしながら、透過性ペプチドＰＮ７３及びＰＮ２５０に例示される送達促進剤の存在下では、血清による細胞取込みの阻害は救済することが可能である。更に具体的には、コレステロール部分に結合したｓｉＲＮＡを具える送達製剤への透過性ペプチドの付加は、コレステロール−ｓｉＲＮＡの取込みに対する血清による阻害効果を濃度依存的に減少させる。
【０２５１】
実施例１７
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの欠失解析
本実施例では、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３によるｓｉＲＮＡの細胞取込みとｓｉＲＮＡ媒介性標的遺伝子ノックダウン活性を最適化するために用いる実験の設計を例示する。
【０２５２】
以下の表２３には、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３とその切断型の誘導体が示されている。以下に列挙するＰＮ３６０とＰＮ３６１のアミノ酸配列をＰＮ７３の対応アミノ酸配列とアライメントさせている。ＰＮ３６０は、ＰＮ７３とＮ末端を共有するが、ＰＮ７３のＣ末端を欠いており、一方でＰＮ３６１はＰＮ７３とＣ末端を共有するが、ＰＮ７３のＮ末端を欠く。ＰＮ７６６は、ＰＮ７３のＣ末端の１５個のアミノ酸に相当する。ＰＮ７３、ＰＮ３６０、ＰＮ３６１及びＰＮ７６６は、Ｃ末端側がＦＩＴＣ（フルオレセイン−５−イソチオシアナート）（即ち、−ＧＫ［イプシロン］Ｇ−アミド）によりタグ化されていない。更に、表２３には、ＰＮ７６８以外は、ペプチドのＮ末端から１度に３残基を段階的に欠失させることで作り出された、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の１１種類の切断型が示されている。これら全てのペプチドは、Ｃ末端側がＦＩＴＣ（フルオレセイン−５−イソチオシアナート）標識（即ち、−ＧＫ［イプシロン］Ｇ−アミド）によりタグ化されており、該ペプチドを具える細胞は、蛍光顕微鏡で検出でき、そして／又はフローサイトメトリーによりソーティングすることができる。注目すべきことは、ＰＮ７６６とＰＮ７０８は、同一のアミノ酸配列を有するが、ＰＮ７０８がＣ末端にＦＩＴＣタグを有する点で異なっていることである。以下は、ＰＮ７３と切断型の１次構造の説明であり、該切断型については、更にトランスフェクション活性が試験されることになる。
【０２５３】
表２３：
2009507852.tif 000028
【０２５４】
実施例１８
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの欠失解析
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の機能ドメインは、該ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが細胞内にｓｉＲＮＡを効率的に送達する能力にとって決定的なものである。これらの機能ドメインには、膜結合領域、融合領域及びヌクレオチド結合領域が含まれる。簡潔には、膜結合とは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、細胞膜に結合する能力を表す。融合特性は、細胞膜から離脱して、細胞質へと進入する能力を表す。前記ペプチドの膜結合ドメインと融合ドメインは、機構上近接しており（即ち、ペプチドが細胞に進入する能力）、従って、実験上で識別することは困難な場合がある。故に、これら２種類の特性（ペプチドのドメイン）は、単一の分析に併合されることになる。最後に、ヌクレオチド結合は、ペプチドがヌクレオチドに結合する能力を表す。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの上記に説明する各ドメインを決定するために用いる方法を、以下で一層詳細に論じる。代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の膜結合／融合ドメイン及びヌクレオチド結合ドメインを決定するためのデータを表２４にまとめる（試験した全ての濃度に関するデータは表示されていない）。
【０２５５】
表２４：
2009507852.tif 000029
【０２５６】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの膜結合及び融合ドメイン
初代マウス尾線維芽細胞（ＭＴＦ）を用いた細胞取込みアッセイにより、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の完全長型又は切断型が細胞に進入する効力をインビトロで試験した。ＦＩＴＣ標識ペプチドを受け取る培養中の細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。ペプチドの細胞取込みのパーセンテージを、培養中に存在する細胞の総数と相対して表した。加えて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて、細胞内に見られるＦＩＴＣ標識ペプチドの量を評価した。ＭＦＩは、細胞内のＦＩＴＣ標識ペプチド量と正の相関関係を有する：高い相対ＭＦＩ値は、より多くの細胞内ＦＩＴＣ標識ペプチド量と相関する。表２３中のペプチドは、０．６３μＭ、２．５μＭ及び１０μＭの濃度にあると判断した；ＰＮ７６８を、２μＭ、１０μＭ及び５０μＭで試験した。
【０２５７】
トランスフェクションの前日に、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の完全長型又は切断型を細胞に暴露した。ＦＩＴＣ標識タグを付けたペプチドを、室温で約５分間かけてオプティＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に希釈し、次いで細胞に添加した。細胞を３時間かけてトランスフェクトし、そしてＰＢＳで洗浄してトリプシンで処理し、次いでフローサイトメトリーで分析した。細胞生存率は上記と同様に測定した。細胞取込みは、トリパンブルーを用いて、細胞膜表面上のあらゆる蛍光を消光することで膜挿入から区別した。
【０２５８】
細胞取込みアッセイでは、完全長ＦＩＴＣ標識ＰＮ７３ペプチド（ＰＮ６９０）が、試験した全ての濃度において殆ど１００％の細胞取込みを達成した（表２４の「ペプチドの細胞取込み％」と表題された列には１０μＭでの結果が示されている）。他のＰＮ７３の切断型は、５０μＭを要したＰＮ７６８以外、１０μＭの濃度でＰＮ６９０と同程度の細胞取込みパーセント（括弧内の数値）を達成しており、ＰＮ７３のＮ末端残基は、該ペプチドが細胞に進入する能力に必要とされないことが示唆された。ＰＮ７６８として同定された、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の５つのＣ末端残基は、ペプチドの細胞取込みに十分なものであった。しかしながら、表２４に示されてはいないが、注目すべきことに、ＰＮ７３の切断型は、０．６３μＭにおいて、ペプチドの長さに比例した細胞取込み活性の低下を示した。換言するならば、０．６３μＭの濃度で試験したペプチドについての一般的な観察は、ＰＮ７３ペプチドの長さが減少するにつれて、その細胞取込み活性も低下するというものであり、故にペプチドの細胞取込み活性は、用量依存的であることが示唆される。
【０２５９】
これらの結果は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの全ての切断型は、培養中の細胞に高いパーセンテージで進入する能力を保持することを示した。
【０２６０】
細胞取込みアッセイでは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の切断型が同程度の細胞取込み活性を有することが示されたが、ＭＦＩ測定では、ＰＮ７３ペプチドの切断型は、細胞に進入したＦＩＴＣ標識ペプチドの平均量に基づいて識別できることが示された。表２４の「ペプチドのＦＩＴＣのＭＩＦ」と表題された列中に示されるように、完全長のＦＩＴＣ標識ＰＮ７３ペプチド（ＰＮ６９０）は、ＭＦＩの用量依存的な増大を示したが、１０μＭにおいて、約１２５ユニットの最高ＭＦＩを達成している。ＰＮ６６１、ＰＮ６８５及びＰＮ６６０は、完全長ＰＮ７３（ＰＮ６９０）と同程度のＭＦＩレベルを示した。しかしながら、ＰＮ７３５とＰＮ６５５は、それぞれ約８０ＭＦＩユニットと６０ＭＦＩユニットの、低いＭＦＩレベルを示した。更に、ＰＮ６５４、ＰＮ７０８、ＰＮ６５３、ＰＮ６５２、ＰＮ６５１及びＰＮ７６８で、ＭＦＩ検出性の著しい低下が観察されており、ＰＮ７３の１８個のＮ末端残基の欠失により、細胞によるペプチドの効率的な取り込みが除去されることが示唆されている。
【０２６１】
これらの結果は、ＰＮ７３の全ての切断型は、培養中の細胞に高いパーセンテージで進入可能であり、特に、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の最初の１８個のＮ末端残基は、培養中の細胞によるペプチドの効率的な取り込みに必須であることを示している。これらの結果は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の切断型誘導体（（ＰＮ６６１；ＰＮ６８５；ＰＮ６６０；ＰＮ７３５；及びＰＮ６５５）が、培養細胞に効率的に進入できることも示している。
【０２６２】
以上をまとめると、ペプチドの細胞取込みのデータは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３のＣ末端の５つの残基が、細胞への侵入に十分なものであることを示しており、該ペプチドの膜結合／融合ドメインがＣ末端に位置していることを示唆するものである。しかしながら、ペプチドのＦＩＴＣのＭＦＩのデータは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３のＮ末端の１８個の残基の除去により、該ペプチドが細胞に進入する効率を制限することを示しており、該ペプチドのＮ末端が、膜結合／融合ドメインの効果的な取り込み特性に必要とされていることを示唆するものである。
【０２６３】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのヌクレオチド結合ドメイン：
前記一連の欠失を有する各ペプチドについて、ｓｉＲＮＡと複合体化してｓｉＲＮＡを初代ＭＴＦ細胞に送達する能力を、細胞取込みアッセイとＭＦＩによって測定した。前記一連の欠失を有する種々のペプチドによるｓｉＲＮＡの細胞取込みの相対量を比較することによって、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３のヌクレオチド結合ドメインの特徴付けを行った。ペプチドは、いずれもヌクレオチド結合領域の存在と相関した高いパーセンテージ（４０％以上）のｓｉＲＮＡ細胞取込みを示した。低いパーセンテージのｓｉＲＮＡ細胞取込み（３０％未満）は、ヌクレオチド結合ドメインの不存在を表す。
【０２６４】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の完全長型と切断型を試験するため、上記のＣｙ５又はＦＡＭに結合したｓｉＲＮＡ及びペプチドでＭＴＦ細胞を処理した。洗浄の後、細胞をトリプシンで処理し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを、細胞内のＣｙ５蛍光強度により測定した；トリパンブルーを用いて細胞膜表面上のあらゆる蛍光を消光させた。取り込みは、細胞の総数に相対して表した。
【０２６５】
表２４には、０．５μＭのＣｙ５結合ｓｉＲＮＡを用いた場合の、ペプチドによるｓｉＲＮＡの細胞取込みのパーセントが結果として示されている。非ＦＩＴＣ標識ＰＮ７３（ＰＮ６４３）ペプチドは、１０μＭの濃度で約１００％のｓｉＲＮＡ取り込みを達成した（データは未表示）。しかしながら、ＰＮ７３ペプチドをＦＩＴＣタグで標識した場合（ＰＮ６９０）、２．５μＭで観察されたその最大細胞取込み活性は、約６０％にまで低下しており、ＦＩＴＣ標識の付加により、ペプチドの細胞取込み機能が干渉を受けることが示唆される。従って、このアッセイで観察された各ペプチドの細胞取込み活性は、ペプチドの真のｓｉＲＮＡ細胞取込み活性を反映していない可能性がある。それにも関わらず、ＰＮ６６１に代表されるように、ＰＮ７３（ＰＮ６９０）ペプチドの最もＮ末端側の３つの残基の除去により、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性の僅かな低下が観察された。同様に、ＰＮ６６０とＰＮ７０８の両者も、完全長ＰＮ７３（ＰＮ６９０）と比べて、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性に穏やかな低下を示した。
【０２６６】
これらのデータは、Ｎ６６１、ＰＮ６６０及びＰＮ７０８を具える、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、核酸に結合することを示している。対照的に、ＰＮ６８５、ＰＮ７３５、ＰＮ６５５及びＰＮ６５４で、ｓｉＲＮＡ取り込み活性の低下が観察された。ＰＮ６５３、ＰＮ６５２又はＰＮ６５１では、有意なｓｉＲＮＡ取り込み活性は観察されず、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＣ末端の１２アミノ酸（Ｈ２Ｂタンパク質の第３７乃至４８番目の残基）には、ヌクレオチド結合ドメインが含まれていないことが示唆されている。更に、ペプチドＰＮ６６１、ＰＮ６６０及びＰＮ７０８は、完全長ペプチド（ＰＮ６９０）の３残基欠失を含んでいないので、ｓｉＲＮＡ結合活性を保持していることが推定される。これらのデータは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのＮ末端に存在するヌクレオチド結合ドメインの核酸に結合する能力が、該Ｎ末端中の特定の残基の存在に対する感受性を有することを示唆している。
【０２６７】
一般的に、ＰＮ７３欠失系列のｓｉＲＮＡ細胞取込み活性は、ＰＮ７０８（第３４−４８番目の残基）がｓｉＲＮＡ細胞取込み活性に必要なＰＮ７３ペプチドの最小Ｃ末端断片に相当することを示すことが、これらのデータによって示されている。このことは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３のヌクレオチド結合ドメインが最初の２４個のＮ末端残基内に位置することと一致している。
【０２６８】
ＰＮ７３ペプチド欠失系列のｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトする能力に関して、ＭＦＩにより、細胞に進入したＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの相対平均量を測定することで、更にＰＮ７３ペプチド欠失系列の特徴付けを行った。完全長ＦＩＴＣ標識ＰＮ７３ペプチド（ＰＮ６９０）によるＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの送達は、約５０相対ユニットのＭＦＩを達成した。ＰＮ７３欠失系列のペプチドＰＮ７３５、ＰＮ６５５、ＰＮ６５４及びＰＮ７０８は、約３４ユニット乃至４４ユニットの範囲内にある低いＭＦＩを示した。ＰＮ７３欠失系列のＰＮ６６１、ＰＮ６８５及びＰＮ６６０は、完全長ＰＮ７３（ＰＮ６９０）ペプチドを僅かに上回るＭＦＩレベルを示した。対照的に、ＰＮ６５４、ＰＮ６５３、ＰＮ６５２及びＰＮ６５１は、相対的に皆無かそれに近いＭＦＩ（３乃至１４ユニット）しか示しておらず、これらのペプチドによるトランスフェクション後に皆無かそれに近い程度のＣｙ５結合ｓｉＲＮＡしか細胞に進入しなかったことを示している。ＰＮ６５３、ＰＮ６５２及びＰＮ６５１について観察された低いＭＦＩ値は、ＰＮ６５４、ＰＮ６５３、ＰＮ６５２及びＰＮ６５１が、ｓｉＲＮＡと複合体化せず、又は細胞へのｓｉＲＮＡの進入を促進しないことを示した前記ｓｉＲＮＡ細胞取込みデータと相関していた。
【０２６９】
蛍光顕微鏡画像を用いて、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３と複合体化したＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの細胞局在を、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でトランスフェクトしたｓｉＲＮＡの細胞局在と比較した。リポフェクタミンにより送達されたｓｉＲＮＡの局在は、より点状の染色によって特徴づけられ、潜在的なエンドソーム内での局在が示唆されるが、一方でＰＮ７３の場合には、より一様な核周辺の染色を示す。エンドソーム内に局在するｓｉＲＮＡは、細胞質内のＲＩＳＣ複合体に近づくことができず、標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができない。対照的に、ＰＮ７３に媒介された送達の場合に観察されたｓｉＲＮＡの一様な細胞質内での分布は、ＲＩＳＣ複合体へのアクセス、そして標的遺伝子の発現の低下に必須のものである。これらの結果は、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、カチオン性脂質と比べて十分にｓｉＲＮＡ送達を向上させ、そして標的遺伝子のサイレンシング（ノックダウン）を十分に向上させることを示している。
【０２７０】
これらのデータは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３が細胞内へのｓｉＲＮＡの高効率な送達を促進する能力が、該ペプチドの最もＮ末端側の２４個の残基に依存することを示す。また、これらのデータは、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の短縮された誘導体（ＰＮ６６１；ＰＮ６８５  ＰＮ６６０；ＰＮ７３５；ＰＮ６５５；及びＰＮ７０８）が、効率的にｓｉＲＮＡと複合体化して細胞内へｓｉＲＮＡを送達できることを示す。
【０２７１】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの切断型ＰＮ３６０とＰＮ３６１の分析：
上記のようにして行ったｓｉＲＮＡ細胞取込みアッセイにてＰＮ３６０（Ｃ末端）及びＰＮ３６１（Ｎ末端）の特徴付けを行うことにより、ＰＮ７３のＣ末端領域とＮ末端領域の機能‐構造活性の関係を示した。
【０２７２】
表２４には、ＰＮ７３のＮ末端の欠失部分（ＰＮ３６１参照）が、ｓｉＲＮＡの細胞取込み活性を５０％低下させ；Ｃ末端残基の除去により（ＰＮ３６０参照）、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性が完全に消失したことが示されている。これらのデータにより、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３のＣ末端ドメインが、該ペプチドによるヌクレオチドの細胞取込み活性に必要とされることが示される。
【０２７３】
共有結合した積み荷の細胞内への送達を促進したペプチド‐ｓｉＲＮＡ結合体：
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの切断型によるペプチドの細胞取込み活性とＭＦＩ測定は、これらのペプチドが、種々の分子積み荷（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｒｇｏ）の送達媒体として機能できるかもしれないことを示唆している。これには、核酸とペプチドを具える所望のエフェクター分子を、完全長ＰＮ７３又はその誘導体に共有結合させることが含まれる。特定の細胞種及び／又は細胞内の細胞小器官へのエフェクター分子の限定的な送達は、送達ペプチドを特定の部分（脂質、ペプチド及び／又は糖の基）で修飾することにより達成可能となるであろう。
【０２７４】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの欠失解析により、ペプチドがヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）と結合して、細胞内へと送達する能力にはＮ末端が決定的なものであることが示唆される。しかしながら、Ｎ末端残基が存在しない場合であっても、これらの非ヌクレオチド結合性ペプチド及び著しく弱体化したヌクレオチド結合性ペプチドは、その膜結合ドメインと融合ドメインを保持している（例えば、ＰＮ３６１；ＰＮ７３５；ＰＮ６５５；ＰＮ６５４；ＰＮ６５３；ＰＮ６５２及びＰＮ６５１、並びにこれらの誘導体）。ペプチドがヌクレオチドに結合できないことに照らしても、これらのペプチドは、依然として、ｓｉＲＮＡを該ペプチドの膜結合ドメイン及び／又は融合ドメインに共有結合させることによる細胞内へのｓｉＮＡ送達を目的として使用することが可能である。従って、ｓｉＲＮＡの共有結合により、ペプチドがヌクレオチドに結合できないことが救済され、細胞内へのｓｉＲＮＡの効果的なペプチド介在性送達が可能になる。更にまた、ｓｉＮＡ／ペプチド結合体は、代表的ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの切断型の選択に限定される必要はなく、完全長ＰＮ７３及びその誘導体を具えるものであってもよい。
【０２７５】
以下は、ｓｉＮＡ／ペプチドの共有結合を作り出すために用いる方法の非限定的な例である。ペプチドとＲＮＡ分子の両方とも、相互の共有結合を可能にするため、特別な部分により官能化されていなければならない。ペプチドに関しては、例えば、３−マレイミドプロピオン酸等でＮ末端が官能化される。しかしながら、ブロモ又はヨードアセチル部分のような他の官能基でも同様に機能することが認められる。ＲＮＡ分子については、センス鎖の５’末端、又はアンチセンス鎖の３’末端が、例えば、以下の合成法に従って、１−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキシルジスルフィドリンカーによって官能化されている。
【０２７６】
０．３ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミンアセタート（ＴＥＡＡ）バッファー（ｐＨ７．０）中の０．３９３ｍｇ（３当量）のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて、室温で３時間かけて５’修飾ｓｉＮＡを遊離チオール基へと還元する。還元したオリゴヌクレオチドは、２０分間未満での、０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７）中の０乃至３０％のＣＨ３ＣＮ直線勾配（ｔｒ＝５．９３１分）を用いたエクステラ（ＸＴｅｒｒａ）（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ４．６×５０ｍｍカラム上でのＲＰ  ＨＰＬＣにより精製する。
【０２７７】
上記のような結合体を調製した。精製した還元ｓｉＮＡ（１．３６１ｍｇ、０．１９０８５μｍｏｌ）を、０．２ｍｌの０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ＝７）に溶解し、次いで、マレイミド部分を有するペプチドを該ペプチドのＮ末端に結合させて（０．７９ｍｇ、１．５当量）、ｓｉＮＡ溶液に添加した。ペプチドの添加の後、１５０μｌの７５％  ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡの添加により沈殿を溶解させた。室温で一晩撹拌した後、得られた結合体を、２０分間未満での、０．１Ｍ  ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７）中の０乃至３０％のＣＨ３ＣＮ直線勾配と、これに続く５分未満での１００％  Ｃ（ｔｒ＝２１．００７分）を用いたエクステラ（ＸＴｅｒｒａ）（登録商標）ＭＳ  Ｃ１８  ４．６×５０ｍｍカラム上でのＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。結合体の量は、λ＝２６０ｎｍで計算したモル吸光係数に基づく分光光度法により測定した。ＭＡＬＤＩ質量分析により、結合体に観測されたピーク（１０５８５．３ａｍｕ）は、算出された質量と一致することが示される。
【０２７８】
５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭの酢酸マグネシウム及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中にて、９０℃で２分間加熱し、次いで３７℃で１時間インキュベートすることによりペプチド結合体のセンス鎖と相補的なアンチセンス鎖をアニーリングさせた。非変性（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続くエチジウムブロマイド染色により２本鎖ＲＮＡ結合体の形成が確認された。
【０２７９】
細胞取込み活性の結果を、以下の表２５に示す。
【０２８０】
表２５：
2009507852.tif 000030
【０２８１】
表２５中の結果は、ＰＮ６５１−ｓｉＲＮＡ結合体が、細胞内へのｓｉＲＮＡの取り込みを促進することを示す。次にＭＦＩを測定した。結果を表２６に示す。
【０２８２】
表２６：
2009507852.tif 000031
【０２８３】
表２６に示すＭＦＩの結果は、表２５に示すｓｉＲＮＡ取り込みパーセントのデータと一致している。これらの結果は、ＰＮ６５１−ｓｉＲＮＡ結合体が細胞内へのｓｉＲＮＡの取り込みを促進したことを示す。
【０２８４】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの選択した切断型の遺伝子標的ノックダウン活性：
本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体による標的遺伝子発現の効果的なノックダウンを実証した。特にｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体が、ヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を調節する能力について評価を行った。ｈＴＮＦ−α遺伝子を標的とすることの意味は、ｈＴＮＦ−α遺伝子が、ヒト及び他の哺乳動物対象内で過剰発現された場合に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の発症又は進行の媒介に関与すると考えられていることにある。
【０２８５】
ｈＴＮＦ−α遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体の作用を測定するためのモデルシステムとしてヒト単球を用いた。Ｑｎｅｇは、ランダムなｓｉＲＮＡ配列を表し、陰性対照として機能した。観察されたＱｎｅｇのノックダウン活性を、１００％（１００％の遺伝子発現レベル）に標準化するが、次のＡ１９Ｓ２１、２１／２１及びＬＣ２０の各ｓｉＲＮＡのノックダウン活性は、陰性対照の相対パーセンテージとして表した。Ａ１９Ｓ２１、２１／２１及びＬＣ２０は、ｈＴＮＦ−αのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６４３（完全長ＰＮ７３からＣ末端の標識を除去したもの）、ＰＮ６９０（Ｃ末端にＦＩＴＣ標識を有する完全長ＰＮ７３）、並びに前記欠失系列に含まれるＰＮ７３の切断型ＰＮ６６０、ＰＮ７３５、ＰＮ６５４及びＰＮ７０８をＡ１９Ｓ２１、２１／２１及びＬＣ２０のｓｉＲＮＡと複合体化させて、各ｓｉＲＮＡがヒト単球内でｈＴＮＦ−α遺伝子発現レベルを低下させる能力に対するこれら複合体の効果を測定した。
【０２８６】
実験は、以下のように行った：平底の９６ウェルプレートにおいて、オプティＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に１００Ｋ／ウェル／１００μｌで、ヒト単球を播種した。オプティＭＥＭ培地中で、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを２０ｎＭのｓｉＲＮＡと、１乃至５のモル比にて、室温で５分間かけて混合した。インキュベーションの終了時に、該混合物にＦＢＳを添加し（終濃度３％）、そして該混合物のうち５０μｌを細胞に添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をＶ字底プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間かけて細胞をペレット化した。細胞を増殖培地（グルタミン、非必須アミノ酸、及びペニシリン−ストレプトマイシンを具えるＩＭＤＭ）中に再懸濁した。一晩インキュベーションした後に、単球を、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）の適用により、３時間かけて刺激して、ＴＮＦ−α発現レベルを増大させた。ＬＰＳによる誘導の後、ｍＲＮＡ定量のために細胞を上記のように回収し、タンパク質定量が所望される場合のために上清を保存した。
【０２８７】
ｍＲＮＡの測定については、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社のブランチＤＮＡテクノロジー（ｂｒａｎｃｈ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造元の使用説明書に従って用いた。細胞内のｍＲＮＡ濃度を定量するため、ハウスキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）及び標的遺伝子（ＴＮＦ−α）の両方のｍＲＮＡを測定し、ＴＮＦ−αについての実測値をｃｙｐＢに対して標準化することで相対発光ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）が得られた。
【０２８８】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の完全長型及び切断型のノックダウン活性が表２４にまとめられている。「ノックダウン活性」の列内の「＋」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が、Ｑｎｅｇ陰性対照ｓｉＲＮＡの８０％のノックダウン活性（Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、ｍＲＮＡ濃度の２０％の低下）を示したことを表す。「＋／−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が、Ｑｎｅｇ陰性対照ｓｉＲＮＡの約９０％のノックダウン活性（Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、ｍＲＮＡ濃度の１０％の低下）を示したことを表す。最後に、「−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が、Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、有意なノックダウン活性を示さなかったことを表す。
【０２８９】
一般的に、ＰＮ６４３（ＦＩＴＣで標識されていない完全長ＰＮ７３）及びＰＮ６９０（ＦＩＴＣで標識された完全長ＰＮ７３）は、「ノックダウン活性」の列中の「＋」（結果は表２４中に示されている）によって表されるように、試験した全てのｓｉＲＮＡについて、同程度のｓｉＲＮＡノックダウン活性を示した。加えて、ＰＮ６６０は、試験した全てのｓｉＲＮＡについて、ＰＮ６４３及びＰＮ６９０と同程度のｓｉＲＮＡノックダウン活性を示したが、このことは、ＰＮ７３ペプチドの最もＮ末端側の９個の残基の除去により、標的とされたＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡにより介在されるノックダウン活性が影響されなかったことを示している。ＰＮ６５４は、Ａ１９Ｓ２１と２１／２１の両者のｓｉＲＮＡに関しては穏やかなノックダウン活性を示したが、ＬＣ２０  ｓｉＲＮＡに関しては示さなかった（ノックダウン活性は、ノックダウン活性の列内に「±」で示されている）。しかしながら、ＰＮ７０８又はＰＮ７３５のいずれかに複合体化したｓｉＲＮＡでは、いずれのｓｉＲＮＡについても観察可能なノックダウン活性を生じなかった。
【０２９０】
これらの結果は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３の切断型、特にＰＮ６６０とＰＮ６５４により、標的遺伝子のｍＲＮＡ濃度を低下させるｓｉＲＮＡの能力が干渉を受けず、ＲＡのようなヒトの疾患の治療ための治療用ｓｉＲＮＡの送達を向上させる新たな方法が提供されることを示した。
【０２９１】
実施例１９
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７０８のキャラクタリゼーション
本実施例では、ＰＮ７０８ペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡの、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性、ＭＦＩ測定及びノックダウン活性を更に探索する。ＰＮ７３欠失系列中に列挙される入手可能なペプチドである（実施例１７中の表２３を参照）。
【０２９２】
上に記載するように、細胞取込みアッセイでは、ペプチドに複合体化した場合には、Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡを受容した細胞の数を測定する。ｓｉＲＮＡ細胞取込みは、フローサイトメトリーにより測定した。取り込みは、Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡを含有する細胞の数を、培養中のトランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされなかった細胞の総数で割ることで算出されるパーセンテージとして表した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより測定し、細胞内に見られるＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの量を測定した。ＭＦＩ値は、細胞内のＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの量と正の相関関係を有しており、従って、より高いＭＦＩ値は、より多くの細胞内Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡの数を表す。
【０２９３】
本実施例では、先の実施例と比べて広範囲のペプチド濃度を用いて、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性の効率とＭＩＦ測定を決定した。更に、細胞生存率も評価した。本実施例では、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであるＰＮ６４３（完全長ＰＮ７３からＣ末端の標識を除去したもの）、ＰＮ６９０（Ｃ末端にＦＩＴＣ標識を有する完全長ＰＮ７３）及びＰＮ７０８（ＰＮ７３の２１個のＮ末端残基の欠失により得られた１５−ｍｅｒ）を、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び４０μＭで試験した。ＰＮ６４３及びＰＮ６９０についても２．５μＭで試験し、そしてＰＮ６９０も追加的に１．２５μＭで試験した。ＰＮ６４３及びＰＮ７０８は、両方とも８０μＭで試験した。
【０２９４】
以下の表２７に示すように、非ＦＩＴＣ標識ＰＮ７３（ＰＮ６４３）ペプチドでは、１０μＭの濃度で殆ど１００％のｓｉＲＮＡの取込みが達成された。しかしながら、ＰＮ７３ペプチドをＦＩＴＣタグで標識した場合には（ＰＮ６９０）、その最大細胞取込み活性は約７０％にまで低下した。ＰＮ７０８は、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性の用量依存的な増加を示した。ＰＮ７０８は、８０μＭにおいて、９５％の最大ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性を達成した。完全長ＰＮ７３ペプチドに関しては、ペプチドの濃度が増加するにつれて細胞生存率が低下した。対照的に、ＰＮ７０８ペプチドとインキュベートした細胞は、試験した全ての濃度の存在下において、９０％を超える細胞生存率を維持した。Ｃｙ５−ＭＦＩ測定により、切断されたペプチドＰＮ７０８は、これが細胞に送達したＣｙ５−ｓｉＲＮＡの量を、完全長ＰＮ７３（ＰＮ６９０）ペプチドとの比較において、事実上２倍にしたことが更に示された。
【０２９５】
表２７：
2009507852.tif 000032
【０２９６】
これらの結果は、切断された代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７６８（Ｈ２Ｂの第３４−３８番目の残基）が、細胞生存率に有害な影響を与えることなく、細胞内へのｓｉＲＮＡの高効率な送達を促進する能力を有することを示した。
【０２９７】
切断された代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７０８について、ｓｉＲＮＡに媒介される標的遺伝子発現の低下に対するその影響を測定することにより、更なる特徴付けを行った。本実施例のこのセクションにおいては、ＰＮ７０８のｓｉＲＮＡと複合体化した場合に標的遺伝子発現の低下を促進する能力を評価する前に、ＰＮ７０８ペプチドのＣ末端のＦＩＴＣ標識を除去した。ＦＩＴＣ標識の非存在下において、前記切断された代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドをＰＮ７６６と名付けた（実施例１７中の表２３を参照）。ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体がヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を調節する能力を評価した。本実施例においては、ランダムなｓｉＲＮＡ配列のＱｎｅｇが陰性対照として機能し、そしてＬＣ２０及びＬＣ１７のｓｉＲＮＡを用いてヒト単球内のｈＴＮＦ−αのｍＲＮＡをターゲッティングした。試験したペプチドに対するｓｉＲＮＡのモル比は、１：５；１：１０；１：２５；１：５０；１：７５及び１：１００であった。ＬＣ２０とＬＣ１７は、両方とも２０ｎＭの濃度で用いた。
【０２９８】
ノックダウンの結果は、１：５；１：１０；及び１：２５にあるＬＣ２０／ＰＮ７６６及びＬＣ１７／ＰＮ７６６の両ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体は、ｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ濃度を、Ｑｎｅｇ  ｓｉＲＮＡ陰性対照の約７０％−８０％にまで低下させた（即ち、Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、ｍＲＮＡ濃度の２０％−３０％の低下）。１：５０；１：７５及び１：１００のｓｉＲＮＡ／ペプチド比では、Ｑｎｅｇ対照との比較において、ｈＴＮＦ−αのｍＲＮＡ濃度に対して有意な影響を示さなかった。ＰＮ７６６ペプチドの存在下において、ヒト単球では細胞毒性効果が観察されなかった。
【０２９９】
これらのデータは、切断された代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７６６が、ｓｉＲＮＡと複合体化した場合に、標的遺伝子のｍＲＮＡ濃度を著しく低下させることを証明しており、ＰＮ７６６が、哺乳動物対象内のＲＡの治療における治療用ｓｉＲＮＡのための理想的なｓｉＲＮＡ送達ペプチドであることが示されている。
【０３００】
実施例２０
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド内でのアミノ酸の置換及び欠失はペプチドに媒介されるｓｉＲＮＡの細胞取込みに影響しない
本実施例は、残基の置換及び／又は欠失により作り出した、以下の表２８に列挙される代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの変異体が、修飾されていない代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３との比較において、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性又はＭＦＩ測定に影響しなかったことを実証する。以下の表２８には、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３内に行った残基の置換が表されている。灰色で強調されたアミノ酸は、非修飾残基、置換及び／又は欠失した残基を表す。灰色の強調により、ペプチドＰＮ７３内の非修飾残基を容易に同定することができ、該非修飾残基を、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの変異体ＰＮ６４４、ＰＮ６４５、ＰＮ６４６、ＰＮ６４７及びＰＮ７２９内の置換及び／又は欠失した残基と容易に比較することができる。代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの変異体内の置換された残基は、太字化されて下線が引かれている。更に、太字にされて下線が引かれた記号「＾」は、ＰＮ７２９内で欠失した残基を表す。
【０３０１】
残基の置換又は欠失によって代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの変異体を作製する目的は、ｓｉＲＮＡ細胞取込み活性とｓｉＲＮＡが細胞に進入する効率に対するこれらの修飾による効果を評価するためであった。
【０３０２】
表２８：
2009507852.tif 000033
【０３０３】
代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３内の特定の残基の置換及び／又は欠失には、芳香族アミノ酸の数の変更若しくは増加、及び／又は負に帯電したアミノ酸の数の減少が含まれる。芳香族官能基を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びこれらの誘導体）は、その比較的非極性（疎水性）な特性とタンパク質の細胞膜の透過を促進する能力により、典型的には、タンパク質の膜貫通ドメイン内に見出される。負に帯電したアミノ酸は、核酸の負に帯電したホスホジエステル骨格を拒絶するので、従って、タンパク質が核酸に結合する能力を損なわしめる。従って、ＰＮ７３ペプチド内の芳香族アミノ酸の置換の根拠には、該ペプチドの細胞透過機能を促進することが含まれ、そして／又は負に帯電したアミノ酸の除去は、該タンパク質の核酸との結合を促進するためである。該ペプチドの核酸への結合能は、単に負に帯電したアミノ酸を欠失させるか、又は負に帯電したアミノ酸を正に帯電したアミノ酸若しくは中性アミノ酸で置換することによっても促進することができる。
【０３０４】
上記と同様にｓｉＲＮＡ細胞取込みアッセイとＭＦＩ測定を行った。データは、以下の表２９にまとめる。各ペプチドを、０．６３μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ及び５μＭの濃度で試験した。結果は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３内での残基の置換及び／又は欠失にも関わらず、変異体ペプチドのｓｉＲＮＡ細胞取込み活性とＭＦＩ測定は、非修飾ＰＮ７３のものと同等のままであったことを示している。これらのデータは、残基の置換及び／又は欠失が、そのペプチドの核酸へ結合して細胞膜を透過する能力に影響しなかったことを示す。更に、細胞生存率は、代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３内における置換された残基及び／又は欠失された残基の存在によって影響を受けなかった。
【０３０５】
表２９：
2009507852.tif 000034
【０３０６】
これらの結果は、例えば、アミノ酸の置換若しくは欠失又はこれらの組み合わせによって作り出された代表的なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの修飾が、大部分の細胞に高い効率でｓｉＲＮＡを送達することを示した。
【０３０７】
実施例２１
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドはｓｉＲＮＡ細胞取込み活性を媒介した
本実施例は、表３０中の、ｓｉＲＮＡと複合体化したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのｓｉＲＮＡ細胞取込み活性の効果を示す。表３１には、各ペプチドについての、ｓｉＲＮＡ細胞取込みのデータ、平均蛍光強度（ＭＦＩ）測定値及び細胞生存率のデータがまとめてある。７５％以上のｓｉＲＮＡ細胞取込みパーセントを達成したポリペプチドは、「処理」の列内にて灰色で強調されている。これらの強調された各ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体に特有のｓｉＲＮＡ細胞取込みパーセントも、「ｓｉＲＮＡ細胞取込み％」の列内にて灰色で強調されている。
【０３０８】
表３０：
2009507852.tif 000035
【０３０９】
本実施例におけるｓｉＲＮＡ細胞取込みアッセイでは、ペプチドの存在下でＣｙ５結合ＬＣ２０のｓｉＲＮＡを受容した細胞の数を測定する。ＬＣ２０は、ヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ｈＴＮＦ−α）のｍＲＮＡのｓｉＲＮＡによるターゲッティングに用いられるオリゴである。細胞によるｓｉＲＮＡの取り込みは、フローサイトメトリーによって評価した。取り込みは、Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡを含有する細胞の数を、培養中のトランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされなかった細胞の総数で割ることで算出されるパーセンテージとして表した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより測定し、細胞内に見られるＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの量を測定した。ＭＦＩ値は、細胞内のＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの量と正の相関関係を有しており、従って、より高いＭＦＩ値は、より多くの細胞内  Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡの数を表す。
【０３１０】
以下のプロトコルを用いて、表３０中に列挙するポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを試験した。トランスフェクションの前日に、完全培地中にて、１ウェル当たり約８０，０００個のマウス尾由来線維芽細胞（ＭＴＦ）を２４ウェルプレート中に播種した。０．５μＭのＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの存在下で、陽性対照を除く各送達ペプチドを０．６３μＭ、２．５μＭ、１０μＭ及び４０μＭの濃度で試験した。ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体については、Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡとペプチドを、終濃度が１／２になるようにオプティＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に別々に希釈した。等量のｓｉＲＮＡとペプチドを混合して、室温で５分間かけて複合体化させた。次いで、事前にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄しておいた細胞にｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体を添加した。３７℃、５％ＣＯ２で３時間かけて細胞をトランスフェクションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理して、次いでフローサイトメトリーにより分析した。細胞内のＣｙ５蛍光の強度によってｓｉＲＮＡ細胞取り込みを測定した。細胞生存率については、ヨウ化プロピジウムの取込み又はアネキシンＶ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の染色により測定した。標識ｓｉＲＮＡ（又はフルオレセイン標識されたペプチド）の膜への挿入から細胞取込みを区別するために、トリパンブルーを用いて細胞膜表面上の蛍光を消光させた。トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ社）を、０．０４％の終濃度になるまで細胞に添加し、再度フローサイトメーターに流して、細胞膜に局在する蛍光を示す蛍光強度に何らかの変化があるかどうかを評価した。
【０３１１】
表３１：
2009507852.tif 000036
【０３１２】
表３１の「ｓｉＲＮＡ細胞取込み％」と表題される列内に示すように、「非処理」陰性対照はｓｉＲＮＡの細胞取込みを示さなかったが、一方で陽性対照ペプチドでは、９５％のｓｉＲＮＡ細胞取込み活性パーセントが達成された。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０；ＰＮ６８１；ＰＮ７０９；ＰＮ７６０；ＰＮ７５９又はＰＮ６８２と複合体化したＣｙ５結合ＬＣ２０のｓｉＲＮＡは、７５％以上を上回るｓｉＲＮＡ細胞取込み活性パーセントを達成した。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６９４及びＰＮ７１４は、それぞれ５４％及び４３％の中程度のｓｉＲＮＡ細胞取込み活性を示した。対照的に、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６６５及びＰＮ７３４は、有意なｓｉＲＮＡ細胞取込み活性を示さなかった（５％未満）。
【０３１３】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドについて、そのｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトさせる能力に関して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を解析することにより更なる特徴付けを行った。細胞取込みアッセイでは、Ｃｙ５結合ｓｉＲＮＡを含有する細胞のパーセンテージを測定したが、ＭＦＩ測定では、細胞に進入したＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの相対平均量を測定した。表３１の「ｓｉＲＮＡ  Ｃｙ５  ＭＦＩ」と表題された列に示すように、陽性対照のペプチドＰＮ６４３によるＣｙ５結合ｓｉＲＮＡの送達では、約７ユニットのＭＦＩが達成された。予想された通り、「非処理」陰性対照では、測定可能な程度のＭＦＩが示されていない。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６６５については、ＭＦＩでは試験を行わなかった。ＰＮ７４３、ＰＮ６９４及びＰＮ７１４は、陽性対照と比べて有意に低いＭＦＩ測定値を示した。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０、ＰＮ７０９及びＰＮ６８２は、ＰＮ６４３の陽性対照と同程度のＭＦＩ測定値を示したが、ＰＮ６８１は、陽性対照の２倍のＭＦＩを示した。驚くべきことに、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７６０及びＰＮ７５９は、陽性対照と比べて、それぞれ約１３倍及び６倍も高いＭＦＩ測定値を示した。
【０３１４】
これらのデータは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０；ＰＮ６８１；ＰＮ７０９；ＰＮ７６０；ＰＮ７５９及びＰＮ６８２が、ｓｉＲＮＡと複合体化した場合に、効率よくｓｉＲＮＡを細胞内に送達することを示す。
【０３１５】
実施例２２
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いて細胞内にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡの遺伝子発現ノックダウン活性
本実施例では、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を効果的にノックダウンすることを実証する。具体的には、ｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体がヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を調節する能力について評価を行った。ｈＴＮＦ−α遺伝子を標的とすることの意味は、ｈＴＮＦ−α遺伝子が、ヒト及び他の哺乳動物対象内で過剰発現された場合に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の発症又は進行の媒介に関与すると考えれていることにある。
【０３１６】
ｈＴＮＦ−α遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体の作用を測定するためのモデルシステムとしてヒト単球を用いた。Ｑｎｅｇは、ランダムなｓｉＲＮＡ配列を表し、陰性対照として機能した。観察されたＱｎｅｇのノックダウン活性を、１００％（１００％の遺伝子発現レベル）に標準化するが、次のＡ１９Ｓ２１  ＭＤ８、２１／２１  ＭＤ８及びＬＣ２０の各ｓｉＲＮＡのノックダウン活性は、陰性対照の相対パーセンテージとして表した。Ａ１９Ｓ２１  ＭＤ８、２１／２１  ＭＤ８及びＬＣ２０は、ｈＴＮＦ−αのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。
【０３１７】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６０２は、先の実施例で用いた陽性対照のアセチル化型に相当し、本実施例においても、ヒト単球へのｓｉＲＮＡの効果的な送達及びｓｉＲＮＡに媒介されるｈＴＮＦ−αのｍＲＮＡ濃度の許容できるノックダウン活性の両方において陽性対照として用いる。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０及びＰＮ６８１を上記に列挙するｓｉＲＮＡと複合体化させて、各ｓｉＲＮＡがヒト単球内でｈＴＮＦ−α遺伝子発現のレベルを低下させる能力に対するこれら複合体の作用を測定した。これら３種類全てのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのノックダウン活性を以下の表３２に中にまとめる。「ノックダウン活性」の列内の「＋」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が、Ｑｎｅｇ陰性対照ｓｉＲＮＡの８０％のノックダウン活性（Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、ｍＲＮＡ濃度の２０％の低下）を示したことを表す。「＋／−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が、Ｑｎｅｇ陰性対照ｓｉＲＮＡの約９０％のノックダウン活性（Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、ｍＲＮＡ濃度の１０％の低下）を示したことを表す。最後に、「−」は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体が、Ｑｎｅｇ陰性対照との比較において、有意なノックダウン活性を示さなかったことを表す。
【０３１８】
本実施例において、ヒト単球内でのトランスフェクションは、先に記載したプロトコルに従って行った。
【０３１９】
ｍＲＮＡの測定については、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社（カルフォルニア州所在）のブランチＤＮＡテクノロジーを製造元の使用説明書に従って用いた。細胞内のｍＲＮＡ濃度を定量するため、ハウスキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）及び標的遺伝子（ＴＮＦ−α）の両方のｍＲＮＡを測定し、ＴＮＦ−αについての実測値をｃｙｐＢに対して標準化することで相対発光ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）を得た。
【０３２０】
表３２：
2009507852.tif 000037
【０３２１】
表３２に示す結果は、陽性対照のＰＮ６０２ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに１：５及び１：１０の比率で複合体化した３種類のｓｉＲＮＡ全てが、同一のポリペプチドと複合体化したＱｎｅｇ陰性対照との比較において、ｈＴＮＦ−α遺伝子発現レベルを緩やかに低下させたことを示す。しかしながら、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８１と１：５及び１：１０で複合体化した同一のｓｉＲＮＡでは、Ｑｎｅｇ陰性対照ｓｉＲＮＡ／ＰＮ６８１複合体と比較して、皆無かそれに等しいノックダウン活性を示した。対照的に、ｈＴＮＦ−α  特異的ｓｉＲＮＡいずれかと１：５の比率で複合体化したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０は、Ｑｎｅｇ／ＰＮ６８０対照複合体に対して、有意なｈＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのノックダウン活性を示した。更に、１：１０の比率にあるＬＣ２０／ＰＮ６８０複合体も、Ｑｎｅｇ／ＰＮ６８０対照複合体との比較において、有意なノックダウン活性を示した。
【０３２２】
これらのデータは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ６８０が、細胞内にｓｉＲＮＡを送達してｓｉＲＮＡ媒介性の効果的なジーンサイレンシングを可能にすることを示す。
【０３２３】
先の発明は、明確な理解を目的として、実施例により詳細に説明されているが、当業者にとっては限定ではなく例示として表される添付の請求項の範囲内において、特定の変更又は改変を実行できることは明らかであろう。この文脈において、種々の刊行物及びその他の引用文献が、記載の節約のために先の開示内に引用されている。これらの各引用文献は、全ての目的において、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。しかしながら、本明細書で論じた種々の刊行物は、本出願の出願日に先行するその開示のためだけに組み込まれており、先の発明に基づき、このような開示内容が本出願に先行する権利は発明者に留保されることに注意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３２４】
【図１】図１には、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド（配列番号３５）と複合体化又は結合したｓｉＲＮＡによる、ペプチド媒介性取込み、及び細胞の生存率に対する影響が図示されている。細胞の取り込みと細胞の生存率は、百分率で表されている。
【図２】図２には、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド（配列番号３５）と複合体化又は結合したｓｉＲＮＡによる、ペプチド媒介性取込みが図示されている。細胞の取り込みは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されている。
【図３】図３には、複数の異なるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによる、ヒト単球中のｓｉＲＮＡのペプチド媒介性取込みが示されている。
【図４】図４には、複数の異なるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡへの暴露後の、ヒト単球の生存率に対する影響が図示されている。
【図５】図５には、ｓｉＲＮＡ／ペプチドを注射したマウスが、レミケード処理した対象が示すＲＡ進行と比較して、遅いＲＡ進行を示すことが示されている。ＲＡ進行は、足採点指標（ｐａｗ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）により測定した。
【図６】図６には、ＰＮ７３から合理的に設計した誘導体である本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドについての、マウス尾線維芽細胞内での取り込み効率と生存率の試験の結果が提供されている。
【図７】図７には、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡのペプチド媒介性取込みは、リポフェクタミン媒介性のｓｉＲＮＡ送達と比較して、インターフェロン反応を引き起こさないことが図示されている。（Ａ）：リポフェクタミンと複合体化したｓｉＲＮＡ（Ｂ）：ＰＮ７３と複合体化したｓｉＲＮＡ（１：５）
【図８】図８には、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと結合したｓｉＮＡが、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合体化したｓｉＲＮＡよりも、インビトロでより強力なノックダウン活性を示すことが示されている。
【図９】図９には、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いた、コレステロールと結合したｓｉＲＮＡと結合していないｓｉＮＡ間での細胞取込みの比較が示されている。
【図１０】図１０には、コレステロールと結合したｓｉＲＮＡの細胞取込みの血清による阻害は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドにより救済できることが示されている。
【図１】
2009507852.tif 000038
【図２】
2009507852.tif 000039
【図３】
2009507852.tif 000040
【図４】
2009507852.tif 000041
【図５】
2009507852.tif 000042
【図６】
2009507852.tif 000043
【図７】
2009507852.tif 000044
【図８】
2009507852.tif 000045
【図９】
2009507852.tif 000046
【図１０】
2009507852.tif 000047
【配列表】
2009507852000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月12日(2008.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したペプチドにおいて、当該単離したペプチドが、ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（配列番号１７０）のアミノ酸を具え、４０個以下のアミノ酸残基を有することを特徴とするペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドが、３６個以下のアミノ酸残基を有することを特徴とするペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドが、配列番号５９、５８、９０、９９乃至１０１、及び１６５乃至１７７から選択される配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号５９に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号５８に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号９０に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号９９に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１００に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１６５に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１６６に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１６７に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１６８に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１６９に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７０に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７１に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７２に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７３に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７４に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７５に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７６に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のペプチドにおいて、当該ペプチドが、配列番号１７７に示すアミノ酸配列を具えることを特徴とするペプチド。
【請求項２３】
請求項１に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドのＮ末端がアセチル化されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドのＣ末端がアミド化されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２５】
請求項１に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドがＰＥＧ化されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２６】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドの１個又はそれ以上のアミノ酸残基が、保存アミノ酸置換残基により置換されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２７】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドの１個又はそれ以上のセリン残基が、グリシン残基により置換されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２８】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載のペプチドにおいて、前記ペプチドの１個又はそれ以上のリジン残基が、アルギニン残基により置換されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２９】
組成物において、当該組成物がポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）とを具え、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３及びヒストンＨ４の群から選択されるタンパク質の配列の一部分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３０】
医薬組成物において、当該医薬組成物が、約１０乃至約４０塩基対の２本鎖領域を有する２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と混和されるか、又は複合体化されるか或いは結合された請求項１乃至２５のいずれか１項に記載のペプチドを具えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の医薬組成物において、前記ペプチドが、約１０乃至約４０塩基対の２本鎖領域を有する２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と混和されるか、又は複合体化されるか或いは結合されており、前記ｄｓＲＮＡが、ヒトＴＮＦ−アルファ遺伝子の配列と相同的な配列を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の医薬組成物において、前記ペプチドが、約１０乃至約４０塩基対の２本鎖領域を有する２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と混和されるか、又は複合体化されるか或いは結合されており、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１０９乃至１６３及び配列番号１８７の群から選択される配列を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３３】
請求項３０に記載の医薬組成物において、前記ペプチドが、約１０乃至約４０塩基対の２本鎖領域を有する２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と混和されるか、又は複合体化されるか或いは結合されており、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１３５、配列番号１２９、配列番号１１０、及び配列番号１３２から選択される配列を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３０に記載の医薬組成物において、前記ペプチドが、約１０乃至約４０塩基対の２本鎖領域を有する２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と混和されるか、又は複合体化されるか或いは結合されており、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１３５に示す配列を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３０に記載の医薬組成物において、前記ｄｓＲＮＡが配列番号１３５に示す配列を有し、前記ペプチドが配列番号５９に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３６】
請求項３０に記載の医薬組成物が、カチオン性脂質を更に具えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３７】
請求項３０に記載の医薬組成物において、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（１，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６−ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））、非カチオン性脂質と結合したカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、並びにＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物の群から選択されるカチオン性脂質を更に具えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３８】
組成物において、当該組成物が、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具え、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、メリチンタンパク質の配列の一部分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３９】
組成物において、当該組成物が、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具え、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、配列番号２７乃至３１、３５乃至４２、４５、４７、５０乃至５７、６２、６３、６７、６８、７３、７４、７６、７８乃至８７、８９、９１、９２、９４乃至９６、１０２、１０４乃至１０８、１６４、及び１７８乃至１８６の群から選択される配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４０】
組成物において、当該組成物が、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具え、前記ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが約５乃至約４０個のアミノ酸を具え、ポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｙｐ）４：１又はポリ（Ｏｒｎ、Ｔｒｐ）４：１の配列を具えることを特徴とする組成物。
【請求項４１】
請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の組成物において、前記ポリペプチドのＮ末端がアセチル化されていることを特徴とする組成物。
【請求項４２】
請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の組成物において、前記ポリペプチドのＣ末端がアミド化されていることを特徴とする組成物。
【請求項４３】
請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の組成物において、前記ポリペプチドがＰＥＧ化されていることを特徴とする組成物。
【請求項４４】
請求項３８乃至４３のいずれか１項に記載の組成物において、前記ポリペプチドが、前記２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と混和されるか、又は複合体化されるか或いは結合されることを特徴とする組成物。
【請求項４５】
請求項３８乃至４３のいずれか１項に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡが、ヒトＴＮＦ−アルファ遺伝子の配列と相同的な配列を有することを特徴とする組成物。
【請求項４６】
請求項３８乃至４３のいずれか１項に記載の組成物において、前記ｄｓＲＮＡが、配列番号１０９乃至１６３及び配列番号１８７の群から選択される配列を有することを特徴とする組成物。
【請求項４７】
請求項３８乃至４３のいずれか１項に記載の組成物が、カチオン性脂質を更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項４８】
請求項３８乃至４３のいずれか１項に記載の組成物が、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）プロピルアミド（１，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６−ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン及びテトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、多価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）プロピルアミド）（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、ジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（トランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標））、非カチオン性脂質と結合したカチオン性脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物から成るカチオン性脂質組成物、並びにＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）混合物の群から選択されるカチオン性脂質を更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項４９】
ヒトの炎症状態を治療する方法において、当該方法が、請求項３０に記載の医薬組成物の有効量をヒトに投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５０】
ヒトの慢性関節リウマチを治療する方法において、当該方法が、請求項３０に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５１】
２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）をヒト細胞に送達する方法において、当該方法が、請求項３０に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５２】
ヒト細胞内の腫瘍壊死因子−アルファ遺伝子の発現を調節する方法において、当該方法が、請求項３０に記載の医薬組成物とヒト細胞を接触させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５３】
ヒトの炎症状態の治療用薬物の製造用の請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５４】
ヒトの慢性関節リウマチの治療用薬物の製造用の請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５５】
ヒトの炎症状態を治療する方法において、当該方法が、請求項３９乃至４１のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量をヒトに投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５６】
ヒトの慢性関節リウマチを治療する方法において、当該方法が、請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を前記ヒトに投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５７】
ヒト細胞内へ２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を送達する方法において、請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量と前記細胞を接触させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５８】
ヒト細胞内の腫瘍壊死因子−アルファ遺伝子発現を調節する方法において、請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項５９】
ヒトの炎症状態の治療用薬物の製造用の請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６０】
ヒトの慢性関節リウマチの治療用薬物の製造用の請求項３８乃至４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【国際調査報告】
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