(57)【要約】  本発明は、レナラーゼとしても公知であるモノアミンオキシダーゼＣ（ＭＡＯ−Ｃ）の、治療的タンパク質としてのその活性および不活性形態での使用方法を提供する。不活性型レナラーゼタンパク質のレナラーゼレベルの低い個体への投与を、必要に応じて身体により活性されることが可能であるタンパク質の適切なプールをこれらの個体に提供するために用いることが可能である。活性レナラーゼタンパク質は、カテコールアミンレベルの即時の低下が必要である個体へ投与されることが可能である。レナラーゼの阻害剤は、アドレナリン作用を増強するために用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるレナラーゼ媒介性状態、障害または疾病を予防、治療または改善する方法であって、前記哺乳動物に治療的有効量の不活性型レナラーゼを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記不活性型レナラーゼが遺伝子組換えによって産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不活性型レナラーゼに対する補助因子を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記補助因子が、前記不活性型レナラーゼの供給前、供給中または供給後に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記補助因子が、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはその類似体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記不活性型レナラーゼの供給前、供給中、または供給後に、カテコールアミンを該個体に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記カテコールアミンが、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンからなる群から選択される１種または複数種のカテコールアミンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記不活性型レナラーゼが、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤またはビヒクルを含む組成物で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記不活性型レナラーゼが、経口または注射投与用に配合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記不活性型レナラーゼが、活性型レナラーゼの投与前、投与中または投与後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記状態、障害または疾病が、腎臓の状態、障害または疾病；心血管系の状態、障害または疾病；心臓の状態、障害または疾病；中枢神経系（ＣＮＳ）の状態、障害または疾病；子癇前症；およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心血管系の状態、障害または疾病が、高血圧、無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心律動障害、脳卒中、アテローム性動脈硬化およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記高血圧が、慢性高血圧、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、肺高血圧症、急性重症高血圧症およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腎臓の状態、障害または疾病が、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、慢性腎障害およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＮＳの状態、障害または疾病が、鬱、不安、躁病、統合失調症およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
個体の内在性レナラーゼを補助する方法であって、
該個体に外因性の不活性型レナラーゼを供給する工程を含む、方法。
【請求項１８】
個体の内在性レナラーゼを補助する方法であって、
該個体に外因性の活性および不活性型レナラーゼの両方を提供する工程を含む、方法。
【請求項１９】
カテコールアミンを前記個体に投与する工程をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記カテコールアミンが、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンからなる群から選択される１種または複数種のカテコールアミンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記カテコールアミンが、活性および不活性型レナラーゼの供給前、供給中または供給後に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
不活性型レナラーゼである、単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
補助因子をさらに含む、請求項２２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記補助因子が、フラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２２に記載の単離されたポリペプチドと、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤またはビヒクルと、を含む、またはそれらから本質的になる組成物。
【請求項２６】
前記組成物が経口または注射投与用に配合される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が速効性形態または徐放性形態である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが微結晶性形態である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドがナノ粒子中に封入されている、請求項２５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）による、本願明細書においてすべての目的のためにその全体が援用されている、２００５年１１月２１日に出願の米国仮特許出願第６０／７３８，４９４号に基づく優先権を享受する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国政府（米国国立衛生研究所認可番号Ｋ０８  ＤＫ  ０２９１７０２）からの資金提供により支援されており、従って、米国政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
体液の調節および電解質の代謝が腎臓の主な機能である。細胞およびタンパク質をろ過すると共に、糸球体ろ過と呼ばれるプロセスを介してプラズマのイオン組成と同等のイオン組成を有する体液を産生する糸球体を通して、血液は腎臓に進入する。糸球体濾液は、次いで、連続的にその体積およびイオン組成を変更する、一連の個別の管状セグメントを通って移動する。物理的な力や、局所的および循環ホルモンを含む多数の要因が糸球体ろ過を調節することが知られている（Brennerら、１９７６年）。同様に、腎臓の管状再吸収および分泌物は、かなり複雑な調節性プロセスによって修飾される。
【０００４】
腎臓はまた、赤血球前駆細胞および前駆体の増幅および末端分化に必要とされる赤血球質量の主な決定因子であるエリスロポエチンの主なソースであるため、内分泌性器官としても役立つ（Lineら、１９８５年；Jacobsら、１９８５年）。加えて、腎臓は、レニンの放出に対して最も重要な部位であると考えられている。血流の低減、交換神経刺激の増加、または遠位の細管へのナトリウム送達量の減少は、アンギオテンシノーゲンをアンギオテンシンＩに切断する酵素であるレニンの放出を刺激することが可能である。レニン−アンギオテンシン系は、体液および電解質代謝、血圧、および心機能の主要なレギュレータである。
【０００５】
腎臓によって成されるこれらの多くの機能の中で、腎臓内分泌機能を理解することの重要性がエリスロポエチンの発見により強調されている。腎臓が、レニンおよびエリスロポエチンの分泌を超える複雑な内分泌機能を有していることを示唆するエビデンスがある。腎臓により分泌されている未知のタンパク質／ホルモンの同定は、腎臓の生理学のより完全な理解をもたらすのみではなく、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の患者の治療方法をも著しく改善させ得るであろう。
【０００６】
末期腎疾患に発達した患者は、腹膜または血液透析などの腎臓置換治療で治療されるか、あるいは腎臓移植がなされる。末期腎疾患の患者に対する血液透析などの現在の腎臓置換治療のみが、今日までに成功している長期ｅｘ  ｖｉｖｏ器官補充療法である。透析の延命における成功にも関わらず、この治療に係る羅患率および死亡率は不適切に高く、およびほとんどの患者のクオリティ・オブ・ライフが不十分である（Humesら、１９９５年；Wolfeら、１９９９年）。例えば、これらの患者は、中でも最も一般的な死因をもたらす高血圧；無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全およびアテローム性動脈硬化などの心血管系疾患の罹患率が高い。これについての理由は完全には明確ではないが、治療が、自然の器官の重要な機能の再現に失敗していると一般に考えられている。治療は、体外の「人口腎臓」を用いて過剰な水および可溶性の老廃物を血液から取り除くが、自然の器官の重要な吸収、代謝、内分泌および免疫学的機能を再現しない。
【０００７】
ＥＳＲＤの患者は、心血管系疾患を発達させる著しく高いリスク下にあり、リスクは高い酸化的負荷（Obergeら、２００４年）および高い交換神経系の緊張（Koomansら、２００４年；Jolesら、２００４年）と関連しているように考えられることが十分に考証されている。種々のタンパク質／ホルモンがＥＳＲＤに関連しているという事実にも関わらず、ＥＳＲＤに関連する要因はきわめて少数しか特定されおよび特徴づけられていない。それでもなお、このような要因の同定は、ＥＳＲＤおよび関連する血管性疾患または腎臓で分泌されるタンパク質／ホルモンの治療に対する治療学および薬物療法学の開発に重要である。それ故、ＥＳＲＤに関する要因の同定および特徴付けに対する長期の必要性がある。
【０００８】
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）は、生体アミンを対応するアルデヒドに転換するフラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有酵素である。ＭＡＯは、２つのアイソフォーム（ＭＡＯ−Ａ（配列番号１１）およびＭＡＯ−Ｂ（配列番号１３））で存在し、これらは、７０％を超える配列同一性を示すと共に、ドーパミン、セロトニンおよびノルエピネフリン（２，３）などの神経伝達物質の異化反応においてそれぞれ異なるが重複する基質特異性を示す、別々の遺伝子の生成物である。ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの両方は多数の神経学的障害に関連しており、パーキンソン病および鬱に対する薬の標的である（４）。哺乳類ＭＡＯはミトコンドリアの外膜に結合しており、システイン残基への８α−チオエーテルリンケージを介して、タンパク質に共有結合したＦＡＤ分子を有している（５）。これらは組織依存的なおよび年齢依存的に発現され、広範な臨床的および薬理学的研究の対象であった。
【０００９】
ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂは、カルボキシル末端を介してミトコンドリアの外膜にアンカーされている（Bindaら、２００２年）。これらは、重複する基質特異性、エピネフリン、ノルエピネフリン、セロトニンおよびドーパミンなどの異化神経伝達物質を有し、これらは、特異的にパージリンおよびクロルジリンによって阻害されている。他の既知のＦＡＤ含有オキシダーゼであるポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）は、スペルミンおよびスペルミジンを代謝すると共に細胞の成長を調節する細胞内オキシダーゼである（Jalkanenら、２００１年）。ヒトＭＡＯ−Ｂの結晶構造は３．０Ａの解像度で解析されてきており、システイン側鎖（Ｃｙｓ−３９７）に共有結合したＦＡＤ補助因子を有する二量体を明らかにしている（Bindaら、２００２年）。ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂは、７０％を超える配列同一性を示すと共に、神経伝達物質の異化反応においてそれぞれ異なるが重複する基質特異性を示す、近接しているが別々のＸ染色体上の遺伝子によりコードされている。
【００１０】
ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂは、組織分布、構造および基質特異性において異なる。ＭＡＯ−Ａは、セロトニン、オクトパミン、アドレナリンおよびノルアドレナリンに対してより高い親和性を有し；その一方で、ＭＡＯ−Ｂに対する自然基質は、フェニルエチルアミンおよびチラミンである。ドーパミンは、アイソフォームの両方によって酸化されると考えられている。ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂは、脳を含む数々の器官に広く分布している（A. M. CesuraおよびA. Pletscher、「Prog. Drug Research」、１９９２年、３８、ｐ．１７１〜２９７）。脳ＭＡＯ−Ｂ活性は、年齢と共に増加するように考えられている。この増加は、加齢に伴う神経膠症に起因している（C. J. Fowlerら、「J. Neural. Transm.」、１９８０年、４９、ｐ．１〜２０）。さらに、ＭＡＯ−Ｂ活性は、アルツハイマー病の患者の脳において著しく高く（P. Dostertら、「Biochem. Pharmacol.」、１９８９年、３８、ｐ．５５５〜５６１）、老年性プラークの周囲の星状膠細胞において高度に発現されることが見出された（Sauraら、「Neuroscience」、１９９４年、７０、ｐ．７５５〜７７４）。このコンテクストにおいて、第１級モノアミンのＭＡＯによる酸化的脱アミノ化は、確証されたまたは潜在的な毒性を有する薬剤であるＮＨ３、アルデヒドおよびＨ２Ｏ２を産生するため、選択的ＭＡＯ−Ｂ阻害剤を認知症およびパーキンソン病の治療のために用いる理論的根拠があることが提案される。ＭＡＯ−Ｂの阻害はドーパミンの酵素的不活性化の低減をもたらし、それ故、ドーパミン神経における神経伝達物質の有効性の延長をもたらす。年齢に伴う退化プロセスおよびアルツハイマーおよびパーキンソン病はまた、ＭＡＯ活性の増加およびこれに従うＭＡＯ−ＢによるＨ２Ｏ２の形成の増加による、酸化ストレスに起因し得る。従って、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤は、酸素ラジカルの形成を低減すると共に、脳内のモノアミンレベルを増加させる両方により作用し得る。
【００１１】
ＭＡＯ−Ｂの上記の神経学的障害における関連を鑑みて、この酵素的活性の制御が可能となる強力で、かつ、選択的な阻害剤を入手することに対してかなりの関心がもたれている。いくつかの既知のＭＡＯ−Ｂ阻害剤の薬理学が、例えばD. Bentue-Ferrerらによって、「CNS Drugs」、１９９６年、６、ｐ．２１７〜２３６において考察されている。非可逆的で、かつ、非選択的なＭＡＯ阻害剤活性の主な制限は、食事性チラミンが摂取されるときの高血圧緊急症の誘発のリスク、ならびに、他の薬物療法との相互作用に対する可能性により、食事予防を観察する必要があることであるが（D. M. Gardnerら、「J. Clin. Psychiatry」、１９９６年、５７、ｐ．９９〜１０４）、これらの有害事象は、可逆的かつ選択的なＭＡＯ阻害剤、特にＭＡＯ−Ｂでは心配は少ない。
【００１２】
ＭＡＯ活性を阻害することにより、ＭＡＯ阻害剤は、異なる脳領域および身体内におけるモノアミンおよびそれらの神経伝達物質放出のレベルを調節することが可能である（ドーパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンを含む）。それ故、ＭＡＯ阻害剤は、神経内分泌機能、呼吸、気分、運動制御および機能、フォーカスおよび注意、集中、記憶および認知、および物質乱用のメカニズムの調節に影響することが可能である。ＭＡＯの阻害剤は、注意、認知、食欲、物質乱用、記憶、心血管系機能、錐体外路機能、疼痛および胃腸管運動および機能に対する影響を有することが立証されている。脳におけるＭＡＯの分布は広範であり、および基底核、大脳皮質、中脳辺縁系、中脳核および後脳核を含む。末梢組織において、この分布は、筋肉、胃腸管、心血管系、自律神経節、肝臓、および内分泌系を含む。
【００１３】
他の阻害剤によるＭＡＯ阻害は、脳および身体内におけるモノアミン含有量を増加させることが知られている。身体内のモノアミンレベルの調節は、鬱、不安、ストレス障害、記憶機能に関連する疾病、神経内分泌問題、心機能不全、胃腸管系の障害、摂食障害、高血圧、パーキンソン病、記憶障害および禁断症状を含む数多くの疾病状態に効果的であることが知られている。
【００１４】
タバコの煙がモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）に対して不可逆的な阻害効果を有し得ることが示唆されている。Boultonら、「Biogenic Amine Adducts, Monoamine Oxidase Inhibitors, and Smoking」、Lancet、１（８５７７）：ｐ．１１４〜１５５（１９８８年１月１６日）は、タバコの煙のＭＡＯ阻害特性が喫煙のパーキンソン病に対する保護的作用の説明を補助し得ると報告し、および精神的障害を有する極度の愛煙家の患者は喫煙誘起障害の異常な比率を経験しないことをも観察した。ＭＡＯ阻害剤としての喫煙はパーキンソン病をもたらすドーパミン系神経毒性に対して保護的であり得ると共に、喫煙のＭＡＯ阻害特性は精神的患者における抗うつ効果をもたらし得ることが示唆された。
【００１５】
本発明者らは、過去に、ＭＡＯ−Ｃと称した新規のモノアミンオキシダーゼの発見を報告した。あるいは、本発明者らはまた、腎臓によって分泌されるタンパク質であるために、これらを「レナラーゼ」と称した。レナラーゼは、ノルエピネフリン、ドーパミンおよびエピネフリンなどの生体モノアミンを代謝するモノアミンオキシダーゼの分泌形態である。レナラーゼの同定および特徴付けについてのさらなる情報については、例えば、２００５年９月２９日公開の国際公開第２００５／０８９５０５号パンフレット、およびXuら（「J. Clin. Invest.」１１５（５）：ｐ．１２７５〜１２８０（２００５年５月）を参照されたく、これらの各々は、それらの全体が本願明細書において参照により特定的に援用される。
【００１６】
ヒトレナラーゼの核酸配列（配列番号１）は、ヒトＭＡＯ−Ａ（配列番号１０）と２７．７％相同的であると共に、ＭＡＯ−Ｂ（配列番号１２）と３８．２％相同的である。レナラーゼは、アミノ酸レベルで、それぞれ、ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂに対して１３％および１２％同一性を有する。また、ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂとは異なる基質特異性および阻害剤プロファイルを有し、特有のＦＡＤ含有モノアミンオキシダーゼの最新のクラスを表していることを示している。
【００１７】
ヒトレナラーゼ遺伝子は染色体１０に属し、９のエクソンを含有し、および約３００Ｋｂに及ぶ。ヒトレナラーゼ遺伝子は、アミノ−末端シグナル配列、続いてフラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有ドメインおよびアミノオキシダーゼドメインを含有する３１５または３４２アミノ酸タンパク質をコードする。組織ノーザンブロット法での研究は、腎臓におけるレナラーゼの強い発現を示し、分析したすべての他の組織においてはかなり低いレベルを示した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、近位および遠位の細管におけるレナラーゼの高レベルの発現を示した。
【００１８】
レナラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳実験において高度に発現されていた。ヒトレナラーゼｃＤＮＡは、翻訳されておよそ３８ｋＤａの分子量を有するタンパク質を産生し、これは、予測されたタンパク質サイズと一致している。形質移入されたＨＥＫ２９３細胞からの条件培地を用いるウェスタンブロット法での研究は、分泌されたタンパク質がレナラーゼであることを示す。レナラーゼは、健常な個体においては、プラズマ中に５〜１０ｍｇ／ｌの濃度で存在する。
【００１９】
末期腎疾患（ＥＳＲＤ）は高カテコールアミンレベルに関連しており、次いで、例えば無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全およびアテローム性動脈硬化といった無数の状態、疾病および障害を引き起こす。これらの状態、疾病および障害は、ＥＳＲＤ患者の一般的な死因である。
【００２０】
レナラーゼは、以下の順位序列でカテコールアミンを代謝する：ドーパミン＞エピネフリン＞ノルエピネフリン。レナラーゼは、ＥＳＲＤの患者で実質上検出不可能である。それ故、ＥＳＲＤ患者におけるレナラーゼの損失または低下レベルが、少なくとも部分的において高プラズマカテコールアミンレベルに応答性であり、これは、ＥＳＲＤ患者における一般的な死因である高い心血管系疾患をもたらす。
【００２１】
加えて、レナラーゼレベルおよび腎機能の間の相関により、レナラーゼは、集中治療室設定における一般的な出来事である、腎疾患、特に急性尿細管壊死に対する診断マーカの理想的な候補となる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、レナラーゼが、種々の投与形態および種々の投与方法において、治療的タンパク質として役立ち得ることを示す。本発明は、第１に、レナラーゼが、哺乳動物内に、活性および不活性形態の両方で存在することの立証を提供する。本発明者らは、不活性型レナラーゼが血液中を循環し、必要に応じて生体モノアミンを代謝することが可能である活性型レナラーゼに転換されるのを待っていることを発見した。
【００２３】
発明の概要
一実施形態においては、本発明は、不活性型レナラーゼタンパク質を有する患者に、必要に応じて身体によって活性化されることが可能であるタンパク質の適当なプールを提供するよう、これらの患者におけるレナラーゼレベルを補助する組成物および方法を提供する。あるいは、不活性型レナラーゼは、カテコールアミンの投与によって活性化され得る。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、カテコールアミンレベルの低減が所望されるかまたは必要である場合における適切なストラテジーとしての、活性および不活性型レナラーゼタンパク質の両方の投与のための組成物および投与方法を提供する。異なる薬物動態学的特性を有するレナラーゼタンパク質は、このような治療的目標を達成するために用いられ得る。組成物は、高血圧緊急症、心筋梗塞、および子癇前症などの正確な制御が必要とされる状態において用いられるための、速効性の血行力学的効果を有する短時間作用型のレナラーゼを含み得る。長時間作用型のレナラーゼを高血圧、腎障害、および心不全などのより慢性的状態において用いることができる。長時間作用型のレナラーゼは、その後ｉｎ  ｖｉｖｏで活性化されることが可能である不活性型レナラーゼタンパク質であり得る。
【００２５】
さらに他の実施形態において、本発明は、個体における、レナラーゼの異常な活性または発現に関連している疾病の治療方法を提供する。該方法は、レナラーゼの発現および／または活性を調節する、有効量のレナラーゼ調節因子を投与し、これにより個体における疾病を治療する工程を含む。レナラーゼ調節因子は、化合物、低分子阻害剤、抗体、リボザイム、核酸（特にこれらに限定されないが、ｄｓＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡとしても公知である干渉二重鎖ＲＮＡを含む）、アンチセンス核酸分子、および抗体フラグメントに結合されていてもいなくてもよい可溶性受容体からなる群から選択されることが可能である。
【００２６】
一実施形態においては、本発明は、不活性型レナラーゼを活性化し、既成のレナラーゼの分泌を刺激し、またはレナラーゼ遺伝子発現を上方制御することが可能である低分子アゴニストを個体に投与することによる、個体の内在性不活性型レナラーゼを活性化する方法を提供する。
【００２７】
本発明は、哺乳動物におけるレナラーゼ媒介性状態、障害または疾病を、前記哺乳動物に治療的有効量の不活性型レナラーゼを投与することにより、予防し、治療しまたは改善する方法を提供する。一実施形態において、不活性型レナラーゼは遺伝子組換えによって産生される。他の実施形態において、方法は、不活性型レナラーゼに対する補助因子を投与する工程をさらに含み、ここで、補助因子は、不活性型レナラーゼの供給前、供給中、または供給後に投与される。この方法における使用のための例示的な（典型的な）補助因子は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはその類似体である。さらに他の実施形態において、本発明の方法は、カテコールアミンを、不活性型レナラーゼの供給前、供給中、または供給後に、個体に投与する工程をさらに含む。このような方法において用いられるカテコールアミンとしては、これらに限定されないが、ドーパミンおよび／またはノルエピネフリンおよび／またはエピネフリンが挙げられる。本発明の方法は、ヒトを含むいずれかの哺乳動物の治療に用いられることが可能である。いくつかの実施形態において、不活性型レナラーゼは、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤またはビヒクルを伴う組成物で投与される。いくつかの実施形態において、不活性型レナラーゼは、経口または注射投与用に配合される。さらに、本発明は、不活性型レナラーゼが、活性型レナラーゼの投与前、投与中または投与後に投与される、これらの方法のいずれかを提供する。
【００２８】
本発明の方法は、腎臓の状態、障害または疾病；心血管系の状態、障害または疾病；心臓の状態、障害または疾病；中枢神経系（ＣＮＳ）の状態、障害または疾病；子癇前症；およびこれらのいずれかの組み合わせを予防、治療または改善するために用いられることが可能である。本発明の方法によって予防、治療または改善されることが可能である代表的な心血管系の状態、障害または疾病としては、これらに限定されないが、高血圧、無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心律動障害、脳卒中、アテローム性動脈硬化およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。本発明の方法によって予防、治療または改善されることが可能である高血圧の代表的なタイプまたは種類としては、これらに限定されないが、慢性高血圧、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、肺高血圧症、急性重症高血圧症およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。本発明の方法によって予防、治療または改善されることが可能である代表的な腎臓の状態、障害または疾病としては、これらに限定されないが、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、慢性腎障害およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。本発明の方法によって予防、治療または改善されることが可能である代表的なＣＮＳ状態、障害または疾病としては、これらに限定されないが、鬱、不安、躁病、統合失調症およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法は、個体に外因性の不活性型レナラーゼを供給することによる個体の内在性のレナラーゼの補助を提供する。
【００３０】
本発明の方法は、個体に、外因性の活性および不活性型レナラーゼの両方を供給することによる個体の内在性のレナラーゼの補助を提供する。
【００３１】
本発明のいずれかの方法は、カテコールアミンを個体に投与する工程をさらに提供し、ここで、カテコールアミンはドーパミンおよび／またはノルエピネフリンおよび／またはエピネフリンである。このようなカテコールアミンは、活性および不活性型レナラーゼの供給前、供給中または供給後に投与される。
【００３２】
本発明は、単離されたポリペプチドをさらに提供し、ここで、単離されたポリペプチドは不活性型レナラーゼである。本発明は、このような、補助因子をさらに含む単離されたポリペプチドをさらに提供する。例示的な（典型的な）補助因子は、フラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。本発明はまた、これらの単離されたポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤またはビヒクルを含む組成物を提供し、ここで、このような組成物は経口または注射投与用に配合される。本発明の組成物は、速効性または徐放性投与形態に配合されることが可能である。さらに、本発明の組成物は、微結晶性形態で、および／またはナノ粒子中に封入されて提供されることが可能である。
【００３３】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことによって、より良く理解されるであろう。本発明を説明する目的で、本発明の好ましい実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図示された詳細な配置および機器類に限定されないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本願明細書におけるすべての公開公報および特許出願は、個別の公開公報または特許出願の各々が特定的におよび個々に参照により援用されていると示されるごとく同一の範囲で参照により援用されている。
【００３５】
以下の記載は本発明の理解において有用であり得る情報を含む。本願明細書において提供されている情報のいずれもが本願において特許請求されている発明に対する従来技術でありまたは関連しており、または特定的にまたは暗に言及しているいずれかの公開公報が従来技術であることを承認するものではない。
【００３６】
他に定義されていない限りにおいて、本願明細書において用いられているすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通例理解されるものと同一の意味を有する。本願明細書に記載のものに類似の、または同等の方法および材料のいずれも本発明の実施または試験において用いることが可能であるが、好ましい方法および材料が記載されている。
【００３７】
本発明者らによって開示されたデータは既に、レナラーゼが、とりわけ、腎臓、心臓および血管の機能に重要な媒介物であるノルエピネフリン、ドーパミン、およびエピネフリンなどの循環カテコールアミンの分解に関与していることを示している。例えば、２００５年９月２９日公開の国際公開第２００５／０８９５０５号パンフレット、およびXuら（「J. Clin. Invest.」１１５（５）：ｐ．１２７５〜１２８０（２００５年５月）を参照のこと。本願明細書においてより完全に記載されているとおり、レナラーゼはまた、従って、他の組織および／または器官の機能を調節しているという点においてホルモンとしての作用を果たしている。これは、その機能は部分的にカテコールアミンによっても媒介されているため神経系をも含み得る。それ故、レナラーゼは、例えば、十分な量のレナラーゼを産生しない患者に対して提供することが可能である。レナラーゼの同定は、とりわけ、高血圧を治療／予防するための末期腎疾患（ＥＳＲＤ）；無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全およびアテローム性動脈硬化などの心血管系疾患に対する薬物療法学および治療学の発展において重要な意味を有する。
【００３８】
貧血患者の治療に広く用いられている組換え型タンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）と同様に、レナラーゼは、分泌されるタンパク質であり、腎臓で発現される。レナラーゼの他の目立つ特質は、ＥＰＯのように、ＥＳＲＤの患者において事実上検知不可能であるが、その一方で、レナラーゼは健常な個体の血液中で約５〜１０ｍｇ／Ｌの濃度で発現されるということである。レナラーゼレベルが補充されて、過剰なレベルのレナラーゼ基質（すなわちカテコールアミン）を相殺するストラテジーは、ＥＳＲＤの患者の治療に対する論理的なアプローチである。さらに、腎機能の状態に関わりなく、過剰レベルのカテコールアミンによって引き起こされた他の疾病は、補助的なまたは補充量のレナラーゼの添加を介して治療することができる。
【００３９】
あるいは、交換神経系の緊張の低下した患者における循環カテコールアミンレベルを高めて、それ故、一定の心血管系合併症の結果を向上させるために、レナラーゼを薬物標的として用いることが可能である。レナラーゼはまた、現在のＭＡＯ阻害剤は未知的にレナラーゼをも標的とし得、これは好ましくない副作用をもたらし得るため、ＭＡＯ−ＡまたはＭＡＯ−Ｂにより特異的である薬の設計をも許容し得る。
【００４０】
慢性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心律動障害などの心血管系疾患は交換神経刺激を増加させる突発的な情動性ストレスによって誘発され得るため、レナラーゼの同定および特徴付けは、これらの疾病の病態生理学における、レナラーゼおよびその役割のさらなる研究に対してフレームワークを提供する（Wittsteinら、（２００５年）「Neurohumoral features of myocardial stunning due to sudden emotional stress」、「New England Journal of Medicine」、３５２、ｐ．５３９〜５４８）。おそらくより重要なことには、ＭＡＯ−Ａおよび−Ｂのように、レナラーゼは、ヒトにおける交換神経活性の調節のために潜在的に有用な標的を提供し得る。
【００４１】
その潜在的な治療的役割に追加して、レナラーゼは急性腎不全（すなわち急性尿細管壊死、またはＡＴＮ、腎臓における虚血性状態）に対する診断マーカとして用いることが可能である。上述のとおり、適当に機能している腎臓を有さない患者は、低レベルのレナラーゼを有する。
【００４２】
他において既述したとおり（例えば、２００５年９月２９日に公開の国際公開第２００５／０８９５０５号パンフレット、およびXuら（「J. Clin. Invest.」１１５（５）：ｐ．１２７５〜１２８０（２００５年５月）））、心血管系、心臓、腎臓および精神関連状態、障害および疾病対する感受性を診断する方法は、レナラーゼの遺伝子発現および酵素活性の計測に基づくことが可能である。例えば、高血圧、無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心律動障害、およびアテローム性動脈硬化などの心血管系状態、障害および疾病；鬱および不安などの精神状態、障害および疾病；および肺高血圧症などの心臓状態、障害および疾病は、レナラーゼ遺伝子発現レベル、レナラーゼタンパク質レベル、および／またはレナラーゼ酵素活性を測定することにより、すべて診断され、評価されおよび監視されることが可能である。例えば、低減したレナラーゼ遺伝子の発現は、増加した交換神経出力に関連する障害に対する診断マーカであろう。
【００４３】
本発明の方法は、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧および糖尿病性高血圧を含む高血圧を治療、予防、低減または改善するために用いられることが可能である。しかも、同一の有益性が、より珍しい高血圧性障害、肺高血圧症に対して予測される。肺高血圧症は、肺動脈（心臓から肺に伸びる血管）における圧力が通常のレベルを超えて上昇して生命を危うくし得る、肺の珍しい血管障害である。糖尿病性高血圧における全身血圧および孤立性収縮期高血圧における全身血圧の上昇を伴う、肺血管床（肺性床）における上昇した血圧の発達に係る類似点が、同様のメカニズムが伴っていることを示唆している。
【００４４】
定義
本願明細書において用いられるところ、以下の用語の各々は、この段落において関連する意味を有する。
【００４５】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本願明細書においては、１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法的対象を指すために用いられる。一例として、「ａｎ要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００４６】
本願明細書において用いられるところ、「近接した」という用語は、互いに直接的に結合して介在するヌクレオチドを有さないヌクレオチド配列を指すために用いられる。一例として、ペンタヌクレオチド５’−ＡＡＡＡＡ−３’およびトリフクレオチド５’−ＴＴＴ−３’が結合して、それ故：５’−ＡＡＡＡＡＴＴＴ−３’または５’−ＴＴＴＡＡＡＡＡ−３’である場合には、これら２つは近接しており、これら２つが結合して、それ故：５’−ＡＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’である場合には、近接していない。
【００４７】
本願明細書において用いられるところ、アミノ酸は、以下の表に示されているとおり、その完全名称により、対応する３文字コードによりまたは対応する１文字コードにより表記されている：
【００４８】
【表１】
2009516693.tif 000002
【００４９】
本願明細書において用いられるところ、疾病、障害または状態を「緩和させる」とは、疾病、障害または状態の１種または複数種の症状の重症度を低減させることを意味する。これは、特に限定されないが、細胞または組織（例えば、平滑筋細胞、肺組織、動脈）において発現されるレナラーゼのレベルの増加、治療方法等の前または無しでの患者におけるレナラーゼのレベルと比した患者におけるレナラーゼのレベルの低減または増加を含むことが可能である。
【００５０】
「アンチセンス」とは、特に、タンパク質をコードする二重鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、または非コーディング鎖に実質的に相同的である配列を指す。本願明細書において定義されるところ、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二重鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列が、ＤＮＡ分子のコーディング鎖の翻訳部分に対して単に相補的であることは必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上に特定された調節性配列に対して相補的であり得、この調節性配列は、コード配列の発現を制御する。
【００５１】
「アプリケータ」という用語は、本願明細書において用いられる用語として、特にこれらに限定されないが、皮下シリンジ、ピペット、気管支鏡、噴霧器等を含む、レナラーゼ核酸、タンパク質、および／または本発明の組成物を哺乳動物に投与するためのいずれかのデバイスを意味する。
【００５２】
「生物学的サンプル」とは、本願明細書において用いられる用語として、レナラーゼの発現レベル、存在するレナラーゼタンパク質のレベル、または両方を評価するために用いることが可能である動物から得たサンプルを意味する。このようなサンプルとしては、特にこれらに限定されないが、血管（例えば頚動脈、大動脈等）サンプル、肺組織サンプル、およびＳＭＣサンプルが挙げられる。
【００５３】
「レナラーゼをコードする核酸の一部分またはすべてに相補的である」とは、レナラーゼタンパク質をコードしない核酸の配列を意味する。むしろ、細胞内で発現されるこの配列はレナラーゼタンパク質をコードする核酸の非コーディング鎖と同等であり、それ故、レナラーゼタンパク質をコードしない。
【００５４】
「相補的な」および「アンチセンス」という用語は、本願明細書において用いられるところ、完全には同義ではない。「アンチセンス」とは、特に、タンパク質をコードする二重鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、または非コーディング鎖に実質的に相同的である配列を指す。本願明細書において用いられるところ、「相補的な」とは、２つの核酸、例えば、２つのＤＮＡ分子の間の、相補サブユニット配列の広いコンセプトを指す。両方の分子におけるヌクレオチドの位置が通常相互に塩基対形成可能であるヌクレオチドによって占有されている場合、核酸は、この位置で相互に相補的であると見なされる。それ故、２つの核酸は、分子の各々における対応する位置の相当数（少なくとも５０％）が通常相互に塩基対形成するヌクレオチド（例えば、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）によって占有されている場合には、相互に相補的である。本願明細書において定義されるところ、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二重鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖の翻訳部分のみに相補的であることは必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖に特定的な調節性配列に相補的であり得、この調節性配列は、コード配列の発現を制御する。
【００５５】
遺伝子の「翻訳領域」は、それぞれ、遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子の翻訳領域に相同的または相補的である、遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コーディング鎖のヌクレオチドから構成される。
【００５６】
ｍＲＮＡ分子の「翻訳領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳の最中に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域に一致する、または終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基から構成される。翻訳領域は、それ故、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質中のアミノ酸残基排出シグナル配列）に相当するヌクレオチド残基を含み得る。
【００５７】
「コードする」とは、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれか、ならびにそれらからもたらされる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。それ故、遺伝子は、この遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系中にタンパク質を産生する場合にタンパク質をコードする。鎖、そのヌクレオチド配列の両方はｍＲＮＡ配列に同等であり、通常は配列表に提供されており、および、遺伝子またはｃＤＮＡの転写用の鋳型として用いられる非コーディング鎖は、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の生成物をコードするとして称される。
【００５８】
他に規定されていない限りにおいて、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」とは、相互に変性されたものであると共に、同一のアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。
【００５９】
「発現ベクター」とは、発現されるべきヌクレオチド配列に操作的にリンクされた発現制御配列を含む組換え型ポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現のために十分なシス−作用要素を含み；発現のための他の要素は、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において供給されることが可能である。発現ベクターとしては、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含有された）および組換え型ポリヌクレオチドを組み込むウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当該技術分野において公知であるすべてのものが挙げられる。
【００６０】
「複製欠損の」という用語は、本発明のウイルス性遺伝子治療ベクターに関連して本願明細書において用いられており、独立して、そのゲノムをさらに複製およびパッケージすることができないウイルス性ベクターを意味する。例えば、ある細胞がｒＡＡＶウイルス粒子に感染しているとき、異種遺伝子は感染細胞においても発現されるが、感染細胞にはＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子およびアクセサリー機能遺伝子が欠如しているため、ｒＡＡＶは複製することができない。
【００６１】
本願明細書において用いられるところ、「レトロウイルストランスファーベクター」とは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むと共に、ベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列をさらに含む、発現ベクターを指す。好ましくは、レトロウイルストランスファーベクターはまた、細胞における導入遺伝子の発現に必要な配列を含む。
【００６２】
本願明細書において用いられるところ、「パッケージング系」とは、組換え型ウイルスのパッケージングに関与しているウイルス性タンパク質をコードする遺伝子を含む一組のウイルス性構築物を指す。典型的には、パッケージング系の構築物は、究極的にはパッケージング細胞中に組み込まれることとなる。
【００６３】
本願明細書において用いられるところ、「第二世代」レンチウイルスベクター系とは、アクセサリー遺伝子、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失または不活性化されたものなどの機能性アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージング系を指す。例えば、Zuffereyら、１９９７年、「Nat. Biotechnol.」１５：ｐ．８７１〜８７５を参照のこと。
【００６４】
本願明細書において用いられるところ、「第三世代」レンチウイルスベクター系とは、第二世代ベクター系の特徴を有すると共に、さらに、ｔａｔ遺伝子が欠失または不活性化されたものなど機能性ｔａｔ遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージング系を指す。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、個別の発現構築物で提供される。例えば、Dullら、１９９８年、「J. Virol.」７２（１１）：ｐ．８４６３〜８４７１を参照のこと。
【００６５】
本願明細書において用いられるところ、「偽型」とは、未変性エンベロープタンパク質の、非相同的なまたは機能的に修飾されたエンベロープタンパク質での置き換えを指す。
【００６６】
本願明細書において用いられるところ、「ｅｘ  ｖｉｖｏ投与」とは、一次細胞が対象から採取され、この細胞にベクターが投与されて、形質導入、感染または形質移入された組換え型細胞が産生され、かつ、この組換え型細胞が同一のまたは異なる対象に再投与されるプロセスを指す。
【００６７】
オリゴヌクレオチドの第１の領域とオリゴヌクレオチドの第２の領域は、これらの２つの領域が互いに近接している場合、またはこれらの２つの領域が約１０００以下のヌクレオチド残基および好ましくは約１００以下のヌクレオチド残基で分離されている場合に、「隣接」している。
【００６８】
本願明細書において用いられるところ、核酸配列または核酸分子に適用される場合、「フラグメント」という用語は、参照の完全長核酸配列または分子のセグメントまたは部分を指し、ここで、フラグメントは、参照の核酸配列または分子の全長未満である。フラグメント核酸配列または分子の一例は、それぞれ、完全長レナラーゼｃＤＮＡ配列または分子のセグメントまたは部分である。フラグメント核酸配列または分子の他の例は、それぞれ、完全長ゲノムレナラーゼＤＮＡ配列または分子のセグメントまたは部分である。フラグメントは、天然または未変性ｃＤＮＡまたは遺伝子の全長未満のいずれかの長さでもあり得る。フラグメントの例としては、長さが少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５０〜約１００ヌクレオチド、少なくとも約１００〜約２００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、少なくとも約３００〜約３５０、少なくとも約３５０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、少なくとも約５００〜約６００、少なくとも約６００ヌクレオチド〜約６５０ヌクレオチド、少なくとも約６５０〜約８００、または少なくとも８００〜約１０００ヌクレオチドの核酸が挙げられる。
【００６９】
本願明細書において用いられるところ、アミノ酸配列またはアミノ酸分子に適用される場合、「フラグメント」という用語は、参照の完全長アミノ酸配列または分子のセグメントまたは部分を指し、ここで、フラグメントは、参照のアミノ酸配列または分子の全長未満である。フラグメントアミノ酸配列または分子の一例は、それぞれ、完全長レナラーゼｃＤＮＡ配列または分子によってコードされたポリペプチドのセグメントまたは部分である。フラグメントアミノ酸配列または分子の他の例は、それぞれ、完全長ゲノムレナラーゼＤＮＡ配列または分子によってコードされたポリペプチドのセグメントまたは部分である。フラグメントは、天然または未変性ｃＤＮＡまたは遺伝子によってコードされたポリペプチドの全長未満であるいずれかの長さのポリペプチドであり得る。フラグメントの例としては、長さが少なくとも約２０アミノ酸、または少なくとも約３０アミノ酸、または少なくとも約４０、または少なくとも約５０、または少なくとも約６０、または少なくとも約７０、または少なくとも約８０、または少なくとも約９０、または少なくとも約１００、または少なくとも約１１０、または少なくとも約１２０、または少なくとも約１３０、または少なくとも約１３０、または少なくとも約１４０、または少なくとも約１５０、または少なくとも約１６０、または少なくとも約１７０、または少なくとも約１８０、または少なくとも約１９０、または少なくとも約２００、または少なくとも約２１０、または少なくとも約２２０、または少なくとも約２３０、または少なくとも約２４０、または少なくとも約２５０、または少なくとも約２６０、または少なくとも約２７０、または少なくとも約２８０、または少なくとも約２９０、または少なくとも約３００、または少なくとも約３１０、または少なくとも約３２０、または少なくとも約３３０、または少なくとも約３４０アミノ酸のアミノ酸が挙げられる。
【００７０】
「ゲノムＤＮＡ」は、遺伝子と相同的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖である。一例として、哺乳類ｍＲＮＡの逆転写により誘導される、染色体のフラグメントおよびｃＤＮＡのフラグメントの両方がゲノムＤＮＡである。
【００７１】
「相同的」とは、本願明細書において用いられるところ、２つの高分子分子間、例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。これらの２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットによって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占有されている場合には、これらは、その位置で相同的である。２つの配列間のホモロジーは、一致する、または相同的な位置の数の直接的な関数であり、例えば、２つの化合物配列における位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマーにおいて５つの位置）が相同的である場合、これらの２つの配列は５０％相同的であり、位置の９０％、例えば、１０のうち９が一致し、または相同的である場合、これらの２つの配列は９０％ホモロジーを共有する。一例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは、５０％ホモロジーを共有する。
【００７２】
本願明細書において用いられるところ、「ホモロジー」は、「同一性」と同義的に用いられている。さらに、「ホモロジー」または「同一性」という用語が、核酸およびタンパク質を指すために本願明細書において用いられている場合には、核酸およびアミノ酸配列レベルの両方でのホモロジーまたは同一性に適用されると解釈されるべきである。２種のオリゴヌクレオチドが少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、および好ましくは少なくとも約９０％または、より好ましくは、少なくとも約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみが互いにアニールする状態下でアニールする場合には、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと共に、「高い緊縮性」または「高い緊縮性状態下」でアニールする。２種のオリゴヌクレオチドのアニールに用いられる状態の緊縮性は、他の要因の中でも、温度、アニーリング媒体のイオン性強度、インキュベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量、および既知の場合にはこれらの２種のオリゴヌクレオチド間の非ホモロジー性の予期される程度の関数である。アニーリング状態の緊縮性の調整方法は公知である（例えば、Sambrookら、１９８９年：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（New York）を参照のこと）。
【００７３】
２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性割合の判定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することが可能である。例えば、２つの配列の比較に有用である数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschulのアルゴリズム（１９９０年、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」８７：ｐ．２２６４〜２２６８）であって、KarlinおよびAltschul（１９９３年、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」９０：ｐ．５８７３〜５８７７）において修正されたアルゴリズムである。このアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラム（１９９０年、「J. Mol. Biol.」２１５：ｐ．４０３〜４１０）に組み込まれ、および例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトのBLASTサイトで、国立医学図書館（ＮＬＭ）で、国立衛生研究所（ＮＩＨ）でアクセスすることが可能である。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と称されている）で、以下のパラメータを用いて実施して、本願明細書に記載の核酸と相同的なヌクレオチド配列を得ることが可能である：ギャップペナルティ＝５；ギャップ伸長ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチリワード＝１；予期値１０．０；およびワードサイズ＝１１。BLASTタンパク質サーチは、XBLASTプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と称されている）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで以下のパラメータを用いて実施して、本願明細書に記載のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得ることが可能である：予期値１０．０、BLOSUM６２スコアリングマトリックス。
【００７４】
比較目的のためのギャップ配列比較を得るために、Altschulら（１９９７年、「Nucleic Acids Res.」２５：ｐ．３３８９〜３４０２）に記載のとおり、Gapped BLASTを利用することが可能である。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の距離関係（id.）および共通のパターンを共有する分子間の関係を検知する、反復サーチを実施することが可能である。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータは、国立衛生研究所の国立医学図書館の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト上で入手可能であるとおり用いることが可能である。
【００７５】
２つの配列間の同一性割合は、ギャップを許容して、若しくはしないで、上述のものに類似する技術を用いて判定することが可能である。同一性割合の計算において、典型的には完全な一致がカウントされる。
【００７６】
本願明細書において用いられるところ、「遺伝子」および「組換え型遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然対立変種は、典型的には、所与の遺伝子のヌクレオチド配列において、１〜５％の変動をもたらす可能性がある。代替的な対立遺伝子は、多数の異なる個体における興味のある遺伝子を配列決定することにより、同定することが可能である。これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて多様な個体における同一の遺伝座位を同定することにより容易に実施することが可能である。自然の対立変種でもたらされると共に機能活性を変化させない、このようなヌクレオチドのいずれかの、およびすべての変種および得られるアミノ酸多形性または変種が、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００７７】
しかも、本願明細書に記載のマウスタンパク質のものとは異なるヌクレオチド配列を有する他の種（同族体）から本発明のタンパク質をコードする核酸分子が、本発明の範囲内に包含される。本発明のｃＤＮＡの天然突然変異体および同族体に対応する核酸分子は、緊縮性のハイブリダイゼーション状態下での標準的なハイブリダイゼーション技術に準拠し、マウスｃＤＮＡまたはその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、マウス核酸分子に対するそれらの同一性に基づいて単離することが可能である。例えば、本発明のラットレナラーゼタンパク質をコードする核酸の同族体は、高い緊縮性状態下で、ラットおよび／またはヒトレナラーゼのすべてのまたは一部をコードする核酸分子との、そのハイブリダイゼーションに基づいて単離されることが可能である。
【００７８】
「単離された核酸」とは、天然状態では隣接される配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントであって、例えば、通常、このフラグメントに近接している配列、例えば、フラグメントが自然に生じるゲノム中のフラグメントに近接する配列から除去されたＤＮＡフラグメントを指す。用語はまた、例えばＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質といった核酸に自然に伴う他の構成成分から、実質的に精製された核酸にも適用される。用語は、従って、例えば、ベクター中に、自己複製プラスミドまたはウイルス中に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた組換え型ＤＮＡ、または他の配列とは独立して個別の分子として（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化により産生されるｃＤＮＡまたはゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換え型ＤＮＡを含む。これはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え型ＤＮＡを含む。
【００７９】
本発明のコンテクストにおいて、通常生じる核酸塩基に対する以下の略語が用いられている。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、および「Ｕ」はウリジンを指す。
【００８０】
「操作的にリンクされた」として２つのポリヌクレオチドを記載することにより、一本鎖または二重鎖核酸部分が、この２つのポリヌクレオチドの少なくとも一方が、それ自身が他方において特徴付けられる生理学的効果を発揮することが可能であるような方策で、核酸部分内に配置された２つのポリヌクレオチドを含むことを意味している。一例として、遺伝子の翻訳領域に操作的にリンクされたプロモータは、翻訳領域の転写を促進することが可能である。好ましくは、所望のタンパク質をコードする核酸がプロモータ／調節性配列をさらに含む場合、プロモータ／調節性配列は、細胞における所望のタンパク質の発現を生じさせるよう、所望のタンパク質コード配列の５’終端に位置される。併せて、所望のタンパク質をコードする核酸およびそのプロモータ／調節性配列は、「導入遺伝子」を含む。２つのポリペプチドは、操作的にリンクされるために、必ずしも相互に近接している必要はない。
【００８１】
本願明細書において用いられるところ、「プロモータ／調節性配列」という用語は、プロモータ／調節性配列に操作的にリンクされた遺伝子生成物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。いくつかの事例において、この配列はコアプロモータ配列であり得ると共に、他の事例において、この配列はまた、エンハンサー配列および遺伝子生成物の発現に必要とされる他の調節性要素を含み得る。プロモータ／調節性配列は、例えば、組織に特異的な方策で遺伝子生成物を発現するものであり得る。
【００８２】
「構成」プロモータは、遺伝子生成物をコードし、または特定するポリヌクレオチドと操作的にリンクされる場合に、ヒト生細胞中で産生されるべき遺伝子生成物をほとんどのまたはすべての細胞の生理学的状態下で生じさせるヌクレオチド配列である。
【００８３】
「誘導性」プロモータは、遺伝子生成物をコードし、または特定するポリヌクレオチドと操作的にリンクされる場合に、ヒト生細胞中で産生されるべき遺伝子生成物を、実質的に、プロモータに対応するインデューサが細胞中に存在する場合にのみ生じさせるヌクレオチド配列である。
【００８４】
「組織特異的」プロモータは、遺伝子生成物をコードし、または特定するポリヌクレオチドと操作的にリンクされる場合に、ヒト生細胞中で産生されるべき遺伝子生成物を、実質的に、細胞がプロモータに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ生じさせるヌクレオチド配列である。
【００８５】
「ポリアデニル化配列」は、転写メッセンジャーＲＮＡ配列上へのポリＡ末端部の付加を方向付けるポリヌクレオチド配列である。「ポリヌクレオチド」とは、核酸の、一本鎖または平行および逆平行鎖を意味する。それ故、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二重鎖核酸の一方であり得る。
【００８６】
「核酸」という用語は、典型的には、大型のポリヌクレオチドを指す。
【００８７】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、一般に、約５０ヌクレオチド以下の単鎖ポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表されるとき、これはまた、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられたＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解されるであろう。
【００８８】
本願明細書においては、従来の表記法が、ポリヌクレオチド配列を記載するために用いられている：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’−末端；二重鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’−方向として称される。
【００８９】
５’から３’へのヌクレオチドの新生ＲＮＡ転写物への付加方向は、転写方向として称される。ｍＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」として称され；ＤＮＡ上の参照点に対して５’側に位置されるＤＮＡ鎖の配列は「上流配列」として称され；ＤＮＡ上の参照点に対して３’側のＤＮＡ鎖の配列は「下流配列」として称される。
【００９０】
本願明細書において用いられるところ、「治療的有効量」という用語は、状態、障害または疾病の治療に有効である薬剤の量を意味する。
【００９１】
ポリヌクレオチドの「部分」とは、ポリヌクレオチドの少なくとも約２０配列のヌクレオチド残基を意味する。ポリヌクレオチドの部分は、ポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチド残基を含み得ることが理解される。「プライマー」とは、指定のポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリッド形成することが可能であると共に、相補ポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することが可能であるポリヌクレオチドを指す。このような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘起されるような状態下、すなわち、ヌクレオチド、相補ポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合用薬剤の存在下に置かれたときに生じる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二重鎖であってもよい。プライマーは、典型的にはデキシオリボ核酸であるが、広く多様な合成および天然プライマーが多くの用途について有用である。プライマーは、合成開始部位として関与するために、それ自身がハイブリッド形成されるために設計された鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映している必要はない。このような事例において、鋳型へのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション状態の緊縮性に依存する。プライマーは、例えば色素生産性、放射活性、または蛍光性部位で標識化されることが可能であり、検出可能部位として用いられる。
【００９２】
「プローブ」とは、他のポリヌクレオチドの指定の配列に特異的にハイブリッド形成することが可能であるポリヌクレオチドを指す。プローブは、標的相補ポリヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成するが、鋳型の正確な相補配列を反映している必要はない。このような事例において、プローブの標的への特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション状態の緊縮性に依存する。プローブは、例えば、色素生産性、放射活性、または蛍光性部位で標識化されることが可能であり、検出可能部位として用いられる。
【００９３】
「レナラーゼ阻害剤」とは、この化合物が存在しない他の同等の細胞または組織におけるレナラーゼのレベルと比したときに、細胞または組織中のレナラーゼのレベルを検出可能な程度に阻害する化合物を意味する。レナラーゼのレベルとしては、特にこれらに限定されないが、分子をコードする核酸の発現レベル、検出可能なレナラーゼのレベル、および／またはレナラーゼ活性のレベルが挙げられる。レナラーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、化学化合物、補助因子、抗体、リボザイム、アンチセンス分子、核酸等が挙げられる。
【００９４】
「組換え型ポリヌクレオチド」とは、自然に一緒に結合されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅されたまたは集合された組換え型ポリヌクレオチドは好適なベクターに含まれ得、このベクターは、好適な宿主細胞を形質転換するために用いることが可能である。組換え型ポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモータ、複製起点、リボソーム結合部位等）をも果たし得る。
【００９５】
「組換え型ポリペプチド」は、組換え型ポリヌクレオチドの発現で産生されるものである。
【００９６】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基、関連する天然構造変異体、およびペプチド結合を介してリンクされたそれらの合成非天然類似体、関連する天然構造変異体、およびそれらの合成非天然類似体から組成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を用いて合成することが可能である。
【００９７】
「タンパク質」という用語は、典型的には、大型ポリペプチドを指す。
【００９８】
「ペプチド」という用語は、典型的には、単鎖ポリペプチドを指す。本願明細書においては従来の表記法が、ポリペプチド配列の表記に用いられている：ポリペプチド配列の左側末端がアミノ−終端であり；ポリペプチド配列の右側末端がカルボキシル−終端である。
【００９９】
本願明細書において用いられるところ、「レナラーゼ」という用語は、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンなどの生体モノアミンを代謝する腎臓によって分泌されるモノアミンオキシダーゼを指す。レナラーゼは、本願明細書に開示の他のポリペプチドと高いおよび／または顕著な配列同一性を有するものを包含する分子のクラスである。より具体的には、推定上のレナラーゼは、配列番号１の配列を有する核酸と少なくとも約４０％配列同一性を共有するであろう。より好ましくは、レナラーゼをコードする核酸は、本願明細書に開示の配列番号１と、少なくとも約４５％同一性、または少なくとも約５０％同一性、または少なくとも約５５％同一性、または少なくとも約６０％同一性、または少なくとも約６５％同一性、または少なくとも約７０％同一性、または少なくとも約７５％同一性、または少なくとも約８０％同一性、または少なくとも約８５％同一性、または少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性を有する。さらにより好ましくは、核酸は配列番号１である。
【０１００】
本願明細書において用いられるところ、「活性型レナラーゼ」という用語は、カテコールアミンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで代謝することが可能であると共に、計測可能な血行力学的効果を血圧、心拍数、心筋収縮力等に、ｉｎ  ｖｉｖｏで有するレナラーゼタンパク質を指す。
【０１０１】
本願明細書において用いられるところ、「不活性型レナラーゼ」という用語は、カテコールアミンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで代謝することができず、速効性の血行力学的効果をｉｎ  ｖｉｖｏで有さない、組換え型レナラーゼタンパク質（例えば、大腸菌（E. coli）で形成されると共に、いずれかのリフォールディングプロセスに供されていない）または未変性レナラーゼタンパク質（例えば基底状態下で血液から単離された）の一方を示す。「不活性型レナラーゼ」という用語はまた、遅延効果をｉｎ  ｖｉｖｏで有する（すなわち、実質的に必要に応じて活性化されることが可能である）不活性組換え型レナラーゼを指す。不活性組換え型レナラーゼは、タンパク質に共有結合的に組み込まれたＦＡＤを有する。循環しているレナラーゼの大部分が不活性状態にあるため、レナラーゼを慢性的状態のために投与するための最良の方法は、必要なときに活性化されることが可能である不活性型レナラーゼを与えることであり得る。
【０１０２】
「レナラーゼ」という用語はまた、レナラーゼアイソフォームを含む。レナラーゼ遺伝子は、ヒトゲノムの染色体１０における３１０，１８８ｂｐにわたる９エクソンを含有する。本願明細書に開示のレナラーゼクローン（配列番号１、GenBank受入番号：ＢＣ００５３６４）は、エクソン１、２、３、４、５、６、８を含有する遺伝子である。ヒトゲノムデータベースに示されるとおり、少なくとも２種の追加の、交互にスプライスされた形態のレナラーゼタンパク質がある。一方の交互にスプライスされた形態は、GenBank受入番号ＡＫ００２０８０（配列番号３）およびＮＭ０１８３６３（配列番号４）としてヒトゲノムデータベースにおけるクローンによって同定されるエクソン１、２、３、４、５、６、９を含有する。他方の交互にスプライスされた形態は、GenBank受入番号ＢＸ６４８１５４（配列番号５）としてヒトゲノムデータベースにおけるクローンによって同定されるエクソン５、６、７、８を含有する。要約すると、２つの異なるレナラーゼアイソフォーム（３４２ａａおよび３１５ａａ）をコードする少なくとも４つの異なる転写物（すなわち、９４８ｂｐ、１４４７ｂｐ、１０２９ｂｐ、および３３８５ｂｐ）を有する１つのレナラーゼ遺伝子がある。加えて、３７Ｅから３７Ｄへのアミノ酸変化をもたらすヌクレオチド多形性が同定されている。この多形性は、これらの２つのアイソフォームの各々における３７番のアミノ酸で見出されている。約１２０の対象における多形性の有症率の調査では、およそ３５％の対象で変化が存在すると判定された。
【０１０３】
他に示されていない限りにおいて、「レナラーゼ」とは、すべての公知のレナラーゼ（例えば、ラットレナラーゼ、およびヒトレナラーゼ）、および特にこれらに限定されないが、マウスレナラーゼおよびチンパンジーレナラーゼを含む、本願明細書に開示のレナラーゼの特徴および／または物理的特性を有する、発見されるであろうレナラーゼを包含する。
【０１０４】
「制限部位」は、制限エンドヌクレアーゼによって認識される二重鎖核酸の部分である。二重鎖核酸の部分は、核酸およびエンドヌクレアーゼが接触されるときに、エンドヌクレアーゼが両方の核酸の鎖をこの部分で開裂させることが可能である場合に、制限エンドヌクレアーゼによって「認識」される。
【０１０５】
「特異的に結合する」という用語は、本願明細書において用いられるところ、特定の分子を認識および結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない、例えばタンパク質、核酸、抗体等といった化合物を意味する。
【０１０６】
２種のオリゴヌクレオチドが、少なくとも約７０％、または少なくとも約７３％、より好ましくは、少なくとも約７５％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、および最も好ましくは、少なくとも約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみが互いにアニールする状態下でアニールする場合には、第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと共に、「高い緊縮性」でアニールする。２つのオリゴヌクレオチドをアニールするために用いられる状態の緊縮性は、他の要因の中でも、温度、アニーリング媒体のイオン性強度、インキュベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量、および既知の場合にはこれらの２種のオリゴヌクレオチド間の非ホモロジー性の予期される程度の関数である。アニーリング状態の緊縮性の調整方法は公知である（例えば、Sambrookら、１９８９年：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（New York）を参照のこと）。
【０１０７】
本願明細書において用いられるところ、「導入遺伝子」という用語は外因性の核酸配列を意味し、この外因性の核酸は遺伝子組換え細胞または哺乳動物によってコードされる。
【０１０８】
「組換え型細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。このような細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。また、遺伝子組換え細胞は、特にこれらに限定されないが、遺伝子組換えＥＳ細胞由来のキメラ哺乳動物から入手される細胞である、導入遺伝子を含む胚幹細胞を包含し、ここで、細胞は、導入遺伝子、遺伝子組換え哺乳動物から入手される細胞、または胎仔組織またはその胎盤組織、および導入遺伝子を含む原核細胞を含む。
【０１０９】
「外因性の核酸」という用語は、細胞または動物への核酸の導入を促進する目的で開発された技術を用いて、細胞または動物に導入された核酸を意味する。「タグ」ポリペプチドとは、ペプチド結合によって関心のあるタンパク質にリンクされたときに、そのタンパク質を局在化させ、細胞抽出物から精製して、結合アッセイにおいて用いるために固定化する、またはそうでなければその生物学的特性および／または機能を研究するために用いられ得るいずれかのタンパク質を意味する。
【０１１０】
本願明細書において用いられるところ、「遺伝子組換え哺乳動物」という用語は、その細胞が外因性の核酸を含む哺乳動物を意味する。外因性の核酸は、または哺乳動物のゲノムに組み込まれていてもいなくてもよい。
【０１１１】
本願明細書において用いられるところ、「治療する」とは、患者が経験するＥＳＲＤ、高血圧、心血管系疾患、精神障害等の症状の頻度、程度、重症度および／または期間を軽減することを意味する。
【０１１２】
「ベクター」という用語は、本願明細書において用いられるところ、外因性の核酸をコードするいずれかのプラスミドまたはウイルスを意味する。この用語はまた、例えばポリリジン化合物等などの、核酸のウイルス粒子または細胞への転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス性化合物を含むと解釈されるべきである。ベクターは、レナラーゼタンパク質または哺乳類レナラーゼをコードする核酸の患者への送達のための送達ビヒクルとして好適であるウイルス性ベクターであり得、またはこのベクターは、同一の目的に好適である非ウイルス性ベクターであり得る。
【０１１３】
ＤＮＡの細胞および組織への送達のためのウイルス性および非ウイルス性ベクターの例は当該技術分野において周知であり、例えば、Maら（１９９７年、「Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.」９４：ｐ．１２７４４〜１２７４６）に記載されている。ウイルス性ベクターの例としては、これらに限定されないが、組換え型ワクシニアウイルス、組換え型アデノウイルス、組換え型レトロウイルス、組換え型アデノ随伴ウイルス、組換え型鶏痘ウイルス等（Cranageら、１９８６年、「EMBO J.」５：ｐ．３０５７〜３０６３；１９９４年８月１８日公開の国際公開第９４／１７８１０号パンフレット；１９９４年１０月２７日に公開の国際公開第９４／２３７４４号パンフレット）が挙げられる。非ウイルス性ベクターの例としては、これらに限定されないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体等が挙げられる。
【０１１４】
「ノックアウト標的指向化ベクター」とは、本願明細書において用いられる用語として、その各々が、欠失および／または他の核酸配列によって置き換えられるべき関心のある標的配列に隣接する核酸領域に相補的である、２つの核酸配列を含むベクターを意味する。これらの２つの核酸配列は、従って、相同的組換えプロセスによって除去されるべきである標的配列に隣接する。
【０１１５】
本願明細書において用いられるところ、「慢性腎疾患」という用語は、糸球体ろ過速度（ＧＦＲ）の低下、または６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２以下のＧＦＲを伴うまたは伴わない、腎障害を伴うまたは伴わない構造または機能異常によって定義されるとおり、３月間にわたる腎障害を指す。ＧＦＲは、連続的なスケールで表記されることが可能である血液をろ過する腎臓の能力の目安である。ＧＦＲは、血清クレアチニン、体重および年齢を用いて推測することが可能である。
【０１１６】
本願明細書において用いられるところ、「末期腎疾患（ＥＳＲＤ）」という用語は、腎臓の、老廃物を排出し、尿を濃縮し、および電解質を調節する機能が完全にまたはほぼ完全に不全であることを指す。末期腎疾患（ＥＳＲＤ）は、慢性腎不全が、腎臓が永久的にその能力の１０％未満でしか機能しなくなるまで進行した場合に生じる。この時点においては、腎機能は、透析または腎臓移植無しでは、合併症が多発して重症であり、体液および身体中の老廃物の蓄積により死に至ることとなるほどに低い。
【０１１７】
説明
Ｉ．単離された核酸
Ａ．核酸の検出
本発明は、哺乳類腎臓発現分子、レナラーゼ、またはそれらのフラグメントをコードする単離された核酸を利用し、ここで、核酸は、（配列番号１）の配列を有する少なくとも１種の核酸と少なくとも約４０％同一性を共有する。あるいは、核酸は、本願明細書に開示の配列番号１と、少なくとも約４５％相同的、または少なくとも約５０％相同的、または少なくとも約５５％相同的、または少なくとも約６０％相同的、または少なくとも約６５％相同的、または少なくとも約７０％相同的、または少なくとも約７５％相同的、または少なくとも約８０％相同的、または少なくとも約８５％相同的、または少なくとも約９０％相同的、または少なくとも約９５％相同的、または少なくとも約９８％相同的、または少なくとも約９９％相同的である。
【０１１８】
他の態様においては、本発明は、哺乳類レナラーゼ、またはそれらのフラグメントをコードする単離された核酸を用いる方法を含み、ここで、タンパク質は、約１５％を超えるホモロジーを配列番号２のアミノ酸配列と共有する核酸によってコードされる。配列研究が、レナラーゼは１３．２％アミノ酸同一性をモノアミンオキシダーゼＡと有することを明らかにした。
【０１１９】
好ましくは、レナラーゼをコードする単離された核酸によりコードされたタンパク質は、配列番号２に、少なくとも約１５％相同的、または少なくとも約２０％相同的、または少なくとも約２５％相同的、または少なくとも約３０％相同的、または少なくとも約３５％相同的、または少なくとも約４０％相同的、または少なくとも約４５％相同的、または少なくとも約５０％相同的、または少なくとも約５５％相同的、または少なくとも約６０％相同的、または少なくとも約６５％相同的、または少なくとも約７０％相同的、または少なくとも約７５％相同的、または少なくとも約８０％相同的、または少なくとも約８５％相同的、または少なくとも約９０％相同的、または少なくとも約９５％相同的、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％相同的である。本発明者らによって他に既に開示されているとおり、配列番号１の核酸は、翻訳されて、３７．８ｋＤａの算出分子量を有する、３４２アミノ酸を含むヒトレナラーゼタンパク質を産生することが可能である。
【０１２０】
本発明は、本願明細書に開示した特定のレナラーゼ核酸およびアミノ酸配列を用いる方法にのみ制限されるとして解釈されるべきではない。哺乳動物の他の種（例えば、類人猿、テナガザル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等）に存在するものなどのレナラーゼポリペプチドをコードする他の核酸を、以下の、本願明細書に開示のレナラーゼポリペプチドをコードするラット、およびヒトレナラーゼ核酸の単離のための、実験の詳細のセクションにおいて本願明細書に記載の手法（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）、および当該技術分野において周知である（例えば、ｍＲＮＡサンプルを用いる逆転写ＰＣＲ）または開発されるであろう手法によって入手することが可能であることが当業者には自明である。
【０１２１】
さらに、例えば、Sambrookら（１９８９年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press」、ニューヨーク（New York））およびAusubelら（１９９７年、「Current Protocols in Molecular Biology」、Green & Wiley、ニューヨーク（New York））に記載のものなどの、当該技術分野において周知である組換え型ＤＮＡ法を用いるレナラーゼの変異体、誘導体または変異体形態の産生のために、いずれの数の手法を用いても良い。
【０１２２】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させることによりアミノ酸変化をタンパク質またはポリペプチド中に導入する手法は当該技術分野において周知であり、Sambrookら（１９８９年、上記を参照）；Ausubelら（１９９７年、上記を参照）にも記載されている。
【０１２３】
本発明は、哺乳類レナラーゼをコードする核酸を用いる方法をさらに含み、ここで、タグポリペプチドをコードする核酸は、これに共有結合されている。すなわち、本発明はキメラ核酸の使用を包含し、ここで、タグポリペプチドをコードする核酸配列は、少なくとも１つのヒトレナラーゼをコードする核酸に共有結合されている。このようなタグポリペプチドは当該技術分野において周知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＦＬＡＧ  タグポリペプチド、ＨＡ  タグポリペプチド、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグポリペプチドが挙げられる。しかしながら、本発明は、決して、上記のタグポリペプチドをコードする核酸を用いることに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらのタグポリペプチドに実質的に類似する方策で機能し得るポリペプチドをコードするいずれの核酸配列も、本発明において有用であるとして包含されると解釈されるべきである。
【０１２４】
タグポリペプチドをコードする核酸を含む核酸は、レナラーゼを細胞、組織（例えば、血管、骨等）、および／または生物全体（例えば、両生類および／または哺乳類胎仔等）内に固定し、細胞から分泌された場合にはレナラーゼを検出し、およびレナラーゼの細胞内での役割を研究するために用いることが可能である。さらに、タグポリペプチドの付加は、本発明のタンパク質が産生され、容易に生成されることが可能であるように、「タグ化」タンパク質の単離および精製を促進する。
【０１２５】
Ｂ．アンチセンス核酸
一定の状況においては、レナラーゼの発現を阻害することが所望され得、本発明は、従って、レナラーゼ発現の阻害に有用である組成物を含む。それ故、本発明は、哺乳類レナラーゼをコードする核酸の部分または全長に相補的な単離された核酸を使用する方法に特徴を有し、この核酸は、転写に関してアンチセンス配向にある。アンチセンス核酸は、配列番号１と少なくとも約４０％ホモロジーを有する核酸、またはそのフラグメントに相補的である。他の実施形態において、アンチセンス核酸は、配列番号１の配列を有する哺乳類レナラーゼをコードする核酸の部分または全長に相補的な核酸、またはそのフラグメントであって、転写に関してアンチセンス配向にあるものに、少なくとも約４５％相同的、または少なくとも約５０％相同的、または少なくとも約５５％相同的、または少なくとも約６０％相同的、または少なくとも約６５％相同的、または少なくとも約７０％相同的、または少なくとも約７５％相同的、または少なくとも約８０％相同的、または少なくとも約８５％相同的、または少なくとも約９０％相同的、または少なくとも約９５％相同的、または少なくとも約９９％相同的である。最も好ましくは、核酸は、配列番号１である核酸の部分または全長、またはそのフラグメントに相補的である。このようなアンチセンス核酸は、腎臓発現（レナラーゼ）分子の発現、機能、または両方の阻害に役立つ。
【０１２６】
さらに、レナラーゼをコードする核酸のすべてまたは部分に相補的なアンチセンス核酸は、例えば特にこれらに限定されないが、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる細胞、組織、および／または生物におけるレナラーゼｍＲＮＡの発現の検出に用いることが可能である。それ故、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明は、レナラーゼ発現を評価するプローブとして用いられることが可能であるアンチセンス核酸を包含することを理解するであろう。
【０１２７】
本発明の方法において用いられるアンチセンス分子は合成的に形成され得、次いで細胞に提供される。容易に合成されると共に標的細胞に導入されるために、約１０〜約３０、およびより好ましくは約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。本発明により予期される合成アンチセンス分子は、未修飾オリゴヌクレオチドと比して向上した生物活性を有する、当該技術分野において公知であるオリゴヌクレオチド誘導体を含む（Cohen、上記を参照；Tullis、１９９１年、参照により本願明細書においてその全体が援用される米国特許第５，０２３，２４３号明細書を参照のこと）。
【０１２８】
ＩＩ．単離したポリペプチド
Ａ．ポリペプチド、それらの類似体および改良
本発明はまた、哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドを使用する方法を含む。哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも約１５％相同的である。代替的方法において、哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドは、ラットレナラーゼに、少なくとも約２０％相同的、または少なくとも約２５％相同的、または少なくとも約３０％相同的、または少なくとも約３５％相同的、または少なくとも約４０％相同的、または少なくとも約４５％相同的、または少なくとも約５０％相同的、または少なくとも約５５％相同的、または少なくとも約６０％相同的、または少なくとも約６５％相同的、または少なくとも約７０％相同的、または少なくとも約７５％相同的、または少なくとも約８０％相同的、または少なくとも約８５％相同的、または少なくとも約９０％相同的、または少なくとも約９５％相同的、または少なくとも約９８％相同的、または少なくとも約９９％相同的である。
【０１２９】
本発明はまた、本願明細書に開示のレナラーゼを含むタンパク質またはペプチドの類似体を使用する方法を提供する。類似体は、天然タンパク質またはペプチドとは、保存的アミノ酸配列差により、または配列に影響しない改良により、または両方により異なっていてもよい。例えば、保存的アミノ酸変化は形成され得るが、これはタンパク質またはペプチドの一次配列を変化させるが、その機能は変化させない。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、スレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１３０】
改良（通常は一次配列を変化させない）としては、例えばアセチル化またはカルボキシ化といった、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、化学的誘導体化が挙げられる。また、グリコシル化の改良が含まれ、例えば、その合成中、および処理中、またはさらなる処理工程での、ポリペプチドのグリコシル化パターンの、修飾により形成されるもの；例えば、ポリペプチドを、例えば、哺乳類グリコシル化または脱グリコシル化酵素といったグリコシル化に作用する酵素に露出させることによるものが含まれる。例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはリン酸化スレオニンといった、リン酸化アミノ酸残基を有する配列が包含される。
【０１３１】
タンパク質分解対する耐性を向上し、または溶解度特性を最適化し、または治療剤としてより好適とするよう、通常の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドを使用する方法もまた含まれる。このようなポリペプチドの類似体としては、天然Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然合成アミノ酸以外の残基を含有するものが挙げられる。本発明のペプチドは、本願明細書に列挙した特定の例示的な（典型的な）プロセスのいずれかによる生成物に限定されない。
【０１３２】
本発明の方法はまた、本発明のペプチドの「変異体」、「誘導体」および「変異体」（または、これをコードするＤＮＡ）を包含すると解釈されるべきであり、これらの変異体、誘導体および変異体は、得られるペプチド（またはＤＮＡ）が本願明細書に列挙した配列と同等ではないが、ペプチドが本発明のレナラーゼペプチドの生物学的／生化学的特性を有するという点において、本願明細書に開示のペプチドと同一の生物学的特性を有するよう、１つまたは複数のアミノ酸が変更されている（または、これをコードするヌクレオチド配列を指す場合には、１つまたは複数の塩基対が変更されている）レナラーゼペプチドである。
【０１３３】
さらに、本発明は、レナラーゼ配列のレナラーゼアイソフォーム、および天然変異体または組み替え的に誘導された変異体を用いる方法を含むと解釈されるべきであり、これらの変異体または変異体は、これによりコードされたタンパク質にレナラーゼの完全長クローンを超える、未満の、または同等の生体活性を付与する。
【０１３４】
Ｂ．細胞からのポリペプチドの産生および単離
本発明はまた、産生され、およびレナラーゼを産生する細胞ならびにこのような細胞が増殖する細胞媒体から単離されたレナラーゼポリペプチドを用いる方法に関する。
【０１３５】
このような方法において用いることが可能である細胞は、レナラーゼを自然に産生する細胞および、レナラーゼを産生するよう変異導入され、変質され、または処理された細胞のいずれかを含む。このような細胞は、そのタイプの細胞に典型的な量のレナラーゼを産生するもの、およびレナラーゼを過剰産生する細胞を含む。レナラーゼを自然に産生しない細胞、またはレナラーゼを低量で産生する細胞は、このような細胞および増殖されている媒体からのその単離のために物理的におよび／または経済的に実用的な量でレナラーゼを産生するよう、産生するよう変異導入され、変質され、または処理され得る。
【０１３６】
一旦細胞によって産生されると、レナラーゼは、タンパク質単離の当業者に周知であるタンパク質単離技術を用いて、これらの細胞および／またはそれらの増殖媒体から単離されることが可能である。所望の場合にはまたは必要な場合には、単離されたレナラーゼは、タンパク質精製の当業者に周知である精製技術を用いてさらに精製され得る。
【０１３７】
Ｃ．体液からのポリペプチドの精製
本発明は、特に哺乳動物といった動物の体液からのレナラーゼポリペプチドの精製方法の使用を含む。レナラーゼを産生するいずれの動物も、その体液からのレナラーゼの精製のために用いることが可能である。好適な動物の例としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、ウマ、ブタ、イヌ、サル、雌ウシ、およびヒトが挙げられる。
【０１３８】
フラグメント、相同的ポリペプチド、ムテイン、類似体、誘導体および融合タンパク質を含むポリペプチドの精製は周知であり、当業者の技能の範囲内である。例えば、Scopes、「Protein Purification」、第２版（１９８７年）を参照のこと。化学合成されたペプチドの精製は、例えば、ＨＰＬＣにより容易に達成することが可能である。従って、本発明は、レナラーゼポリペプチドを少なくとも１種の体液から精製する方法を提供する。体液としては、これらに限定されないが、血液、血清、プラズマ、唾液、尿、リンパ液、全血、髄液組織培養液、および細胞抽出液が挙げられる。レナラーゼの体液からの精製は、これらに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、リガンド結合親和性クロマトグラフィおよびゲルパーミエーションクロマトグラフィーの手法を、単独でまたは組み合わせで含む、当該技術分野において公知であるいずれかのタンパク質精製により実施し得る。
【０１３９】
本発明の方法において用いられる単離されたタンパク質は、安定化剤の存在下または不在下で、純粋または実質的に純粋な形態であることが可能である。安定化剤は、タンパク質性または非タンパク質性材料の両方を含み、当該技術分野において周知である。アルブミンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの安定化剤が公知であり、市販されている。
【０１４０】
本発明の単離されたタンパク質が、ワクチンなどの治療剤および置換治療として用いられる場合には高レベルの純度が好ましいが、本発明の単離されたタンパク質はまた、低純度で本開示の方法において有用である。例えば、部分的に精製された本発明のタンパク質は、実験用動物において抗体を産生させるために免疫原として用いられることが可能である。
【０１４１】
Ｄ．ポリペプチドの活性
本発明は、酵素活性化に対する補助因子を含む医薬品組成物の使用を含む方法をさらに包含し得る。レナラーゼは、その官能基のために補助因子ＦＡＤを必要とするフラビン−アデノシン−ジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有酵素である。ＦＡＤと実質的に同様の方策で機能し得るもの、および当該技術分野において周知であるものなどの他の酵素補助因子が、レナラーゼ活性を活性化または不活性化させるために用いられることが可能であることが当業者には容易に明らかであろう。これらの補助因子としては、これらに限定されないが、ＦＡＤ類似体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チアミンピロリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、リン酸ピリドキサール、コエンザイムＡ、テトラヒドロ葉酸、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、金属イオン、金属ポルフィリン、例えばヘム基、ビオチン、α２−ミクログロブリン、チアミンピロリン酸、コエンザイムＡ、リン酸ピリドキサール、コエンザイムＢ１２、ビオシチン、テトラヒドロ葉酸、およびリポ酸が挙げられる。
【０１４２】
レナラーゼ活性はまた、ホモ多量体またはヘテロ多量体の形成によっても調節され得る。ホモ多量体は、３つ以上の同等のサブユニットからなるポリペプチドであり得る。他方では、多量体ポリペプチドはヘテロ二量体、すなわち２つの異なるサブユニットからなるポリペプチド、または３つ以上のサブユニットからなるヘテロ多量体（ここで、これらのサブユニットの少なくとも２つが異なる）であり得る。例えば、多量体ポリペプチドは、「単一の」多量体ポリペプチドまたは、換言すると単量体および／または多量体ポリペプチドであり得る複数の機能的に関連しているポリペプチドの錯体を形成する複数のサブユニットから構成される。
【０１４３】
ホモ二量体またはホモ多量体は、数々の同等のポリペプチドサブユニットの自然発生的な結合により形成され得る。ヘテロ二量体またはヘテロ多量体は、種々の異なるポリペプチドサブユニットの自然発生的な結合により形成され得る。レナラーゼが、二量体またはマルチ二量体（multidimer）錯体を形成するエビデンスがある。レナラーゼの二量体化または多量体化は、ポジティブに、またはネガティブに酵素活性に作用し得ると考えられている。従って、レナラーゼの二量体または多量体錯体の破壊または安定化は、種々の治療的目的について特に有用であり得ることが予期される。
【０１４４】
Ｅ．ポリペプチドの使用
核酸、およびこれによりコードされるペプチドは、レナラーゼ分子の細胞における機能を解明するために有用なツールである。さらに、哺乳類レナラーゼ分子を含む核酸およびアミノ酸は、例えばレナラーゼ発現等に作用する化合物を同定するために用いられることが可能である有用などの標的であり、および高血圧、腎疾患、心臓疾患等に対する潜在的な治療薬物候補である。核酸、これによりコードされたタンパク質、または両方は、哺乳動物に投与されて、レナラーゼの哺乳動物における発現または活性を高め、または軽減することが可能である。これは、哺乳動物におけるレナラーゼの過少または過剰発現が、健常な哺乳動物におけるレナラーゼの通常の発現と比してレナラーゼの変化した発現に関連する疾病または状態を媒介する状態では、哺乳動物に有益であることが可能である。レナラーゼ発現または活性の調節によって作用され、これにより治療的有益性を提供するこのような状態としては、これらに限定されないが、高血圧、腎疾患、心臓疾患等が挙げられる。これは、本願明細書にの他の箇所においてより完全に開示されているとおり、ラットへのレナラーゼの注入は、血圧および心拍数の低下を示したためである。
【０１４５】
さらに、本発明の方法は、レナラーゼ作用の研究、新規な診断の同定および治療についての薬物療法学、およびとりわけ、レナラーゼの細胞的役割の解明に有用なツールである、組換え型細胞および遺伝子組換え非ヒト哺乳動物の産生に用いることが可能である。例えば、遺伝子組換え動物を、腎臓および血管性疾病関連状態の研究に用いることが可能である。
【０１４６】
さらに、本発明の方法は、遺伝子発現のレベルのまたはタンパク質発現のレベルを査定して、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓疾患、腎疾患、心血管系疾患等の重症度および生命予後を査定するものなどの、種々の診断上のテストの一部として用いることが可能である。本発明の方法はまた、ＥＳＲＤ、高血圧、心血管系疾患等の予防のための治療の効力を査定するアッセイの開発に有用である。すなわち、本発明の方法は、レナラーゼ発現への種々の治療の効果を検出するために用いることが可能であり、これにより、特にこれらに限定されないが、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓疾患、腎疾患、および心血管系疾患に効果的な治療の査定などの治療の効果を確認することが可能である。
【０１４７】
Ｆ．ポリペプチドの低分子阻害剤
本願明細書に開示の抗体、リボザイム、干渉ＲＮＡ（すなわち、ＲＮＡｉ）、およびアンチセンス核酸分子に追加して、本発明は、低分子を用いてレナラーゼ活性を調節する方法をさらに含む。本願明細書において用いられるところ、「潜在的に低分子阻害剤」という用語は、選択されたタンパク質に結合しているが、酵素の生物活性（例えば、酵素の触媒速度を低減させる）の阻害能はまだテストされていない低分子を指す。このような阻害性特徴の確認に続いて、低分子は、「低分子阻害剤」または、より一般的に「阻害剤」として称されることが可能である。
【０１４８】
「低分子」という用語は、約５０００ダルトン（５ｋＤ）以下、または約３ｋＤ未満、または約２ｋＤ未満、または約１ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。いくつかの場合において、低分子は約７００Ｄａ以下の分子量を有することが好ましい。
【０１４９】
レナラーゼは、カテコールアミン代謝に関与している。タンパク質の発現を調節、または下方制御する低分子または、タンパク質の少なくとも１つの活性のアゴニストまたはアンタゴニストなどの薬剤が、タンパク質の機能および活性に関連する生物学的および病理学的プロセスの調節に用いられ得る。
【０１５０】
病理学的プロセスとは、有害な効果をもたらす生物学的プロセスのカテゴリーを指す。例えば、本発明のタンパク質の発現欠乏または発現の下方制御は、ＥＳＲＤなどの一定の疾病に関連している可能性がある。本願明細書において用いられるところ、低分子阻害剤は、薬剤がプロセスの程度または重症度を低減する場合には、病理学的プロセスを調節すると考えられている。例えば、疾病は、本発明のタンパク質の発現または少なくとも１つ活性を何らかの方法で低減または調節する薬剤の投与によって、予防されまたは疾病の進行が調節され得る。
【０１５１】
本発明の方法において用いられる低分子阻害剤は、単独で、または特定の病理学的プロセスを調節する他の薬剤と組み合わせて提供することが可能である。本願明細書において用いられるところ、２つの低分子は、これらの２つの低分子が同時に投与される場合、またはこれらの薬剤が同時に作用することとなるような方法で独立してして投与される場合に、組み合わせて投与されたと言われる。
【０１５２】
本発明の方法において用いられる低分子阻害剤は、非経口的な、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、または口腔経路を介して投与されることが可能である。あるいは、または同時に、投与は、経口経路により得る。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および重量、存在する場合には併行する治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の性質に応じることとなる。
【０１５３】
ＩＩＩ．ベクター
Ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現用ベクター
他の関連する態様において、本発明は、核酸が、好ましくは核酸によりコードされたタンパク質の発現を指向させることが可能であるように、プロモータ／調節性配列を含む核酸に操作的にリンクされた哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸の使用方法を包含する。それ故、本発明は、発現ベクターを使用する方法、および例えば、Sambrookら（１９８９年、上記を参照）、およびAusubelら（１９９７年、上記を参照）に記載のものなどの、外因性のＤＮＡの細胞における同時発現を伴う、外因性のＤＮＡの細胞への導入方法を包含する。
【０１５４】
通常はレナラーゼを発現しない、またはタグポリペプチドに融合したレナラーゼを発現しない細胞における、単独で、または検出可能なタグポリペプチドに融合したレナラーゼの発現は、プラスミド、ウイルス性、またはタグありでまたは無しで、このベクターが導入される細胞においてタンパク質の発現を生じさせるのに役立つプロモータ／調節性配列に操作的にリンクされた所望の核酸を含む他のタイプのベクターを産生することにより達成され得る。遺伝子の恒常的発現を生じさせるために有用である多くのプロモータ／調節性配列は当該技術分野において入手可能であり、およびこれらに限定されないが、例えば、共に本願明細書に開示の実験において用いられたサイトメガロウイルス最初期プロモータエンハンサー配列、ＳＶ４０初期プロモータ、ならびにラウス肉腫ウイルスプロモータ等を含む。しかも、レナラーゼをコードする核酸の誘導性および組織特異的発現は、タグを有するかまたは有さないレナラーゼをコードする核酸を、誘導性または組織特異的プロモータ／調節性配列の制御下に置くことにより達成され得る。この目的のために有用である組織特異的または誘導性プロモータ／調節性配列の例としては、これらに限定されないが、ＭＭＴＶＬＴＲ誘導性プロモータ、およびＳＶ４０遅発エンハンサー／プロモータが挙げられる。加えて、金属、グルココルチコイド等などの誘導薬剤に応答して誘導される、当該技術分野において周知であるプロモータがまた、本発明において予期される。それ故、本発明の方法は、公知または公知ではなく、これに操作的にリンクされた所望のタンパク質の発現を生じさせることが可能であるいずれかのプロモータ／調節性配列の使用を包含することが認識されるであろう。
【０１５５】
ベクターを用いるレナラーゼの発現は、大量の遺伝子組換えによって産生されるタンパク質の単離を許容する。さらに、欠乏または低いレベルのレナラーゼ発現が、このような発現に関連する疾病、障害、または状態を生じさせている場合には、プロモータ／調節性配列によって生じさせられるレナラーゼの発現は、特にこれらに限定されないが、レナラーゼが提供される遺伝子治療を含む有用な薬物療法学を提供することが可能である。高いレベルの発現、レベルのタンパク質、またはタンパク質の低い活性に関連する疾病、障害または状態については、レナラーゼの投与が、特にこれらに限定されないが、レナラーゼが提供される遺伝子治療を含む有用な薬物療法であることが可能である。従って、本発明は、レナラーゼ発現および／または活性を低減および増加させることは、共に効果的な薬物療法学の提供に有用であることが可能であるために、レナラーゼ発現、翻訳、および／または活性を阻害する方法だけではなく、レナラーゼ発現、タンパク質レベル、および／または活性の増加に関する方法をも含む。
【０１５６】
本発明の方法において用いるためのいすれかの特定のプラスミドベクターまたは他のＤＮＡベクターの選択は本発明における制限的な要因ではなく、および広く多様なベクターが当該技術分野において周知である。さらに、特定のプロモータ／調節性配列を選択し、およびこれらのプロモータ／調節性配列を、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に操作的にリンクすることは、当業者の技能の範囲内である。このような技術は当該技術分野において周知であると共に、例えば、Sambrook（上記を参照）、およびAusubel（上記を参照）に記載されている。
【０１５７】
本発明は、それ故、哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含むベクターを用いる方法を含む。所望の核酸のベクターの組み込み、およびベクターの選択肢は、例えば、Sambrookら（上記を参照）、およびAusubelら（上記を参照）に記載のとおり当該技術分野において周知である。
【０１５８】
本発明はまた、このようなベクターを含有する細胞、ウイルス、プロウイルス等を用いる方法を含む。ベクターおよび／または外因性の核酸を含む細胞を産生する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrookら（上記を参照）；Ausubelら（上記を参照）を参照のこと。
【０１５９】
レナラーゼをコードする核酸は、種々のプラスミドベクター中にクローンされることが可能である。しかしながら、本発明は、いずれかの特定のプラスミドを用いる方法、またはいずれかの特定のベクターを用いる方法に限定されると解釈されるべきではない。代わりに、本発明は、容易に入手可能である、および／または当該技術分野において周知であるベクターを利用する幅広い多くの方法、およびベクターをまったく利用しない方法を包含すると解釈されるべきである。
【０１６０】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ発現用ベクター
レナラーゼポリペプチドはまた、「遺伝子治療」として度々称される、このようなポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現による本発明による方法において利用され得る。
【０１６１】
それ故、例えば、患者からの細胞は、ポリペプチドをｅｘ  ｖｉｖｏでコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作され得、この操作された細胞が、次いで、ポリペプチドで治療されるべき患者に提供される。このような方法は当該技術分野において周知であると共に、本願明細書における教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いることにより操作され得る。
【０１６２】
同様に、細胞は、例えば、当該技術分野において公知である手法によりポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のためにｉｎ  ｖｉｖｏで操作され得る。例えば、パッケージング細胞は、パッケージング細胞が、この時点で、関心のある遺伝子を含有する感染性ウイルス性粒子を産生するよう、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターと共に形質導入される。これらの産生細胞は、患者に、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで操作するために、およびポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のために投与され得る。このような方法によりポリペプチドを投与するこれらのおよび他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかであるべきである。
【０１６３】
本発明は、タンパク質発現がもたらされるように、２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質についてのコード配列および自己プロセシング切断配列を含む構築物の細胞への導入のための多様なベクターのいずれかの使用を考慮する。発現ベクターの数多くの例が当該技術分野において公知であり、ウイルス性または非ウイルス性起源であり得る。本発明の実施において利用され得る非ウイルス性遺伝子送達方法としては、これらに限定されないが、プラスミド、リポソーム、核酸／リポソーム錯体、カチオン性脂質等が挙げられる。
【０１６４】
ウイルス性ベクターは、細胞を効率的に形質導入して、それら自身のＤＮＡを宿主細胞に導入することが可能である。組換え型ウイルス性ベクターの産生において、非必須遺伝子は、関心のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子で置換される。例示的な（典型的な）ベクターとしては、これらに限定されないが、その転写競合、転写欠損およびガットレス形態を含むレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター；サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター；ウシパピローマベクター；エプスタイン・バーベクター；ヘルペスベクター；ワクシニアベクター；モロニーマウス白血病ベクター；ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター；マウスの乳癌ウイルスベクター；ラウス肉腫ウイルスベクターおよび非ウイルス性プラスミドなどのウイルス性および非ウイルス性ベクターが挙げられる。
【０１６５】
ベクターは、典型的には複製起点を含み、およびこのベクターは、これによりベクターが同定され、および選択されることが可能である「マーカ」または「選択マーカ」機能をさらに含んでいても、いなくてもよい。いずれの選択マーカを用いることも可能である一方で、組換え型ベクターにおいて用いるための選択マーカは一般に当該技術分野において公知であり、適切な選択マーカの選択は、宿主細胞に依存することとなる。抗生物質または他の毒素に対する耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカ遺伝子の例としては、これらに限定されないが、アンピシリン、メトトレキセート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Southernら、「J., J Mol Appl Genet.」、１９８２年；１（４）：ｐ．３２７〜４１（１９８２年））、ミコフェノール酸（Mulliganら、「Science」、２０９：ｐ．１４２２〜７（１９８０年））、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Sugdenら、「Mol Cell Biol.」５（２）：ｐ．４１０〜３（１９８５年））およびＧ４１８が挙げられる。当業者によって理解されるであろうとおり、発現ベクターは、典型的には、発現されるコード配列に応じて、複製起点、コード配列または発現されるべき配列に操作的にリンクされたプロモータ、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ配列を含む。
【０１６６】
「組換え型」としてのベクターまたは他のＤＮＡ配列に対する言及は、単に、単離されまたは自然に見出されるとおり典型的には操作的にリンクされていないＤＮＡ配列の操作可能なリンケージを認める。制御（発現および／または調節）配列は、発現および／または制御配列が、核酸配列の転写および、必要に応じて翻訳を調節する場合に核酸コード配列に操作的にリンクされている。それ故、発現および／または制御配列は、プロモータ、エンハンサー、転写ターミネータ、コード配列に対する開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）５’、イントロンに対するスプライシングシグナルおよび終止コドンを含むことが可能である。
【０１６７】
アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、強い過渡的発現、優れた力価、および分裂および非分裂細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入する能力を示すことが知られている（Hittら、「Adv in Virus Res」５５：ｐ．４７９〜５０５、２０００年）。本発明の組換え型Ａｄベクターは：（１）ベクターを複製欠損Ａｄウイルス粒子に組み込むことが可能であるパッケージング部位；（２）関心のある２つ以上のタンパク質またはポリペプチドに対するコード配列、および（３）自己プロセシング切断部位を単独で、または追加のタンパク質切断部位との組み合わせでコードする配列を含む。感染性ウイルス粒子への組み込みに必要であるかまたは役に立つ他の要素としては、５’および３’Ａｄ  ＩＴＲ、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子および任意によりＥ３遺伝子の一部が挙げられる。
【０１６８】
本発明の組換え型Ａｄベクターを被包する複製欠損Ａｄウイルス粒子は、Ａｄパッケージング細胞およびパッケージング技術を用いる当該技術分野において公知である標準的な技術によって形成される。これらの方法の例が、例えば、米国特許第５，８７２，００５号明細書に見出され得る。関心のある２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質についてのコード配列は、通例、ウイルスゲノムの欠失されたＥ３領域において、アデノウイルスに挿入される。本発明の実施に用いるために好ましいアデノウイルスベクターは、１種または複数種の野生型Ａｄ遺伝子生成物、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４を発現しない。好ましい実施形態は、典型的には、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および任意によりＥ３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング株細胞と一緒に用いられる、ウイルス粒子である。例えば米国特許第５，８７２，００５号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第６，１３３，０２８号明細書および米国特許第６，１２７，１７５号明細書を参照のこと。それ故、本願明細書において用いられるところ、「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」とは、ウイルス自体またはそれらの誘導体を指し、そうでないと記載がない限り、すべての血清型およびサブタイプおよび天然および組換え型形態の両方をカバーする。このようなアデノウイルスは、野生型であり得、また当該技術分野において公知の、または本願明細書に開示の種々の方法で修飾され得る。このような改良は、感染性ウイルスを形成するために粒子中にパッケージされたアデノウイルスゲノムに対する改良を含む。このような改良は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、またはＥ４翻訳領域の１つまたは複数の欠失などの当該技術分野において公知である欠失を含む。例示的な（典型的な）パッケージングおよび産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来する。アデノウイルスベクターは精製され、および当該技術分野において公知である標準的な技術を用いて配合される。
【０１６９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、染色体結合により細胞を潜在的に感染させることが可能であるヘルパー依存ヒトパルボウイルスである。染色体性に結合するその能力およびその非病原性性質のために、ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療ベクターとして顕著な可能性を有する。本発明の実施に用いるために、ｒＡＡＶウイルス粒子は、当業者に公知である標準的な方法を用いて産生され、および、転写方向に操作的にリンクされた構成成分、転写開始点を含む制御配列および停止配列、および関心のあるコード配列を含むよう構築される。より具体的には、本発明の組換え型ＡＡＶベクターは：（１）ベクターを複製欠損ＡＡＶウイルス粒子に組み込むことが可能であるパッケージング部位；（２）関心のある２つ以上のタンパク質またはポリペプチドについてのコード配列；（３）自己プロセシング切断部位を単独で、または追加のタンパク質切断部位との組み合わせでコードする配列を含む。本発明の実施における使用のためのＡＡＶベクターは、転写方向に操作的にリンクされた構成成分、転写開始点を含む制御配列および停止配列をも含むよう構築される。これらの構成成分は、機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列により、５’および３’端部に隣接される。「機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列」とは、ＡＡＶウイルス粒子の救出、複製およびパッケージングのために目的どおり機能するＩＴＲ配列を意味する。
【０１７０】
組換え型ＡＡＶベクターはまた、関心のある選択された組換え型タンパク質またはポリペプチドの標的細胞での発現および産生を指向させることが可能である点で特徴付けられる。それ故、組換え型ベクターは、キャプシド形成に必須なＡＡＶの配列および組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子の感染のための物理的構造の少なくともすべてを含む。従って、本発明のベクターにおける使用のためのＡＡＶ  ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有している必要はなく（例えば、Kotin, Hum.「Gene Ther.」、５：ｐ．７９３〜８０１、１９９４年に記載のとおり）、およびヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変化され得、またはＡＡＶ  ＩＴＲは、数々のＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。一般に、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターであり、特にこれらに限定されないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８等が挙げられる。好ましいｒＡＡＶ発現ベクターは、野生型ＲＥＰを有すると共に、ＣＡＰ遺伝子が完全にまたは部分的に欠失されているが、機能性隣接ＩＴＲ配列を維持する。
【０１７１】
典型的には、ＡＡＶ発現ベクターは、産生細胞に導入され、続いて、ＡＡＶヘルパー構築物が導入され、ここで、ヘルパー構築物は、産生細胞中に発現されることが可能であると共に、ＡＡＶ発現ベクターに存在しないＡＡＶヘルパー機能を補完するＡＡＶ翻訳領域を含む。本願明細書において用いられるところ、「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、宿主細胞中に発現されて、ｒＡＡＶベクターから損なわれているＡＡＶウイルス性機能を補完することが可能であるＡＡＶ翻訳領域を指す。典型的には、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ  ｒｅｐ翻訳領域およびＡＡＶ  ｃａｐ翻訳領域を含む。ヘルパー構築物は、米国特許第６，５４８，２８６号明細書に記載のとおり、典型的にはｐ５に次ぐＡＴＧからＡＣＧへの開始コドンの変異により、大型Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現を下方制御するよう設計され得る。
【０１７２】
ＡＡＶ発現ベクターの産生細胞への導入は、典型的には、その後、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターの細胞への導入が続き、ここで、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持することが可能である付属の機能を提供する。
【０１７３】
「付属の機能」とは、複製のためにＡＡＶによって要求されるが、ＡＡＶウイルス粒子自身によっては提供されない機能を指す。それ故、これらの付属の機能および要因は、宿主細胞、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルスまたはワクシニアウイルス）によって、または同一の細胞内において共発現される発現ベクターによって提供されなければならない。一般に、アデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ翻訳領域は、ＡＡＶ複製およびパッケージングのために要求される必要な付属の機能を供給するために用いられる（Matsushitaら、「Gene Therapy」５：９３８［１９９８年］）。
【０１７４】
次いで、産生細胞は、培養されてｒＡＡＶを産生する。これらの工程は、標準的な方法を用いて実施される。本発明の組換え型ＡＡＶベクターを被包する複製欠損ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を用いる当該技術分野において公知である標準的な技術によって形成される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号明細書；同５，７５３，５００号明細書、同６，０４０，１８３号明細書、同６，０９３，５７０号明細書および同６，５４８，２８６号明細書に見出され得る。パッケージングのためのさらなる組成物および方法がWangら（米国特許出願公開第２００２／０１６８３４２号明細書）に記載され、および当業者の知識に包含される技術が含まれる。ＡＡＶベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物の両方が、１つまたは複数の任意選択の選択マーカ遺伝子を含有するよう構築物されることが可能である。抗生物質耐性または感応性を適切な選択的な媒体に付与する選択マーカ遺伝子は、一般に当該技術分野において公知である。
【０１７５】
「ＡＡＶウイルス粒子」という用語は、「野生型」（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシッドタンパク膜に関連する直鎖、一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）などの完全なウイルス粒子を指す。対照的に、「組換え型ＡＡＶウイルス粒子」、および「ｒＡＡＶウイルス粒子」とは、ＡＡＶ  ＩＴＲによって両側方で隣接される、関心のある非相同的ＤＮＡ配列を含有する感染性ウイルス性粒子を指す。
【０１７６】
本発明の方法の実施において、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するための宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物およびイースト菌が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶベクターゲノムが安定に維持されると共にパッケージされた宿主細胞または産生細胞中に、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が安定的に維持されるパッケージング細胞であることが可能である。例示的な（典型的な）パッケージングおよび産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは精製され、および当該技術分野において公知である標準的な技術を用いて配合される。
【０１７７】
レトロウイルスベクターはまた、遺伝子送達のための普通のツールである（Miller、「Nature」３５７：ｐ．４５５〜４６０、１９９２年）。レトロウイルスベクター、およびより特定的にはレンチウイルスベクターが、本発明の方法の実施に用いられ得る。従って、「レトロウイルス」という用語は、または「レトロウイルスベクター」とは、本願明細書において用いられるところ、「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」をそれぞれ含むことを意味する。レトロウイルスベクターはテストされて、関心のある遺伝子の幅広い範囲の標的細胞のゲノムへの安定な導入に好適な送達ビヒクルであると見出されている。未再編成、単一コピー導入遺伝子を細胞に送達するレトロウイルスベクターの能力は、レトロウイルスベクターを、遺伝子の細胞への移行にかなり適切としている。さらに、レトロウイルスは、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の宿主細胞上の特定の細胞表面受容体への結合により、宿主細胞に進入する。結果的に、コードされた未変性エンベロープタンパク質が、未変性エンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する非相同的エンベロープタンパク質（例えば、未変性エンベロープタンパク質と比して異なる細胞表面受容体への結合）で置き換えられた偽型レトロウイルスベクターはまた、本発明の実施において実用性を見出され得る。１つまたは複数の標的タンパク質コード配列をコードするレトロウイルスベクターの特定の標的細胞へ送達を指向させる能力は、本発明の実施において望ましい。
【０１７８】
本発明は、例えば、１つまたは複数の導入遺伝子配列を含むレトロウイルストランスファーベクターおよび１つまたは複数のパッケージング要素を含むレトロウイルスパッケージングベクターを含む、レトロウイルスベクターを使用する方法を提供する。特に、本発明は、偽型レトロウイルスを産生するための、非相同的または機能的に修飾されたエンベロープタンパク質をコードする偽型レトロウイルスベクターを用いる方法を提供する。
【０１７９】
本発明の方法において用いられるレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤタイプレトロウイルスならびにスプーマウイルスおよびレンチウイルスを含む広く多様なレトロウイルスから容易に誘導され得る（「RNA Tumor Viruses」、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、１９８５年）。本発明の組成物および方法における使用に好適なレトロウイルスの一例としては、特にこれらに限定されないが、レンチウイルスが挙げられる。本発明の組成物および方法における使用に好適な他のレトロウイルスとしては、これらに限定されないが、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが挙げられる。好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（HartleyおよびRowe、「J. Virol.」１９：ｐ．１９〜２５、１９７６年）、Abelson（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Friend（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Graffi、Gross（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Kirsten、ハーベイ肉腫ウイルスおよびRauscher（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレトロウイルスは、American Type Culture Collection（「ＡＴＣＣ」；メリーランド州ロックビル（Rockville, Md.））などの供託所または収集所から容易に入手し得、または公知のソースから通例利用可能な技術を用いて単離され得る。
【０１８０】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルスから誘導される。好ましいレンチウイルスは、例えば、タイプ１または２（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であって、ここで、ＨＩＶ−１は、以前、リンパ節腫付随ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）−関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた）、またはＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患と同定され、およびに付随するＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に関連する他のウイルスといった、ヒト免疫不全症ウイルスである。他のレンチウイルスとしては、ヒツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。
【０１８１】
組成物および方法における使用について好適なレトロウイルスの種々の属および菌株は当該技術分野において周知である（例えば、「Fields Virology」、第３版、B. N. Fieldsら編、Lippincott-Raven Publishers（１９９６年）を参照し、例えば、チャプター５８、「Retroviridae: The Viruses and Their Replication, Classification」、ｐ．１７６８〜１７７１を参照のこと）。
【０１８２】
本発明のパッケージング系は少なくとも２種のパッケージングベクターを含み、第１のパッケージングベクターがｇａｇ、ｐｏｌ、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含むと共に、第２のパッケージングベクターが非相同的または機能的に修飾されたエンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、レトロウイルス性要素は、ＨＩＶなどのレンチウイルスから誘導される。好ましくは、ベクターは、機能性ｔａｔ遺伝子および／または機能性アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）に欠ける。さらに好ましい実施形態において、この系は、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む第３のパッケージングベクターをさらに含む。パッケージング系は、第１、第２および任意により第３のヌクレオチド配列を含有するパッケージング細胞の形態で提供されることが可能である。
【０１８３】
本発明の方法は、多様な系に適用可能であり、および当業者はレトロウイルスの異なる群にわたって共有される共通の要素を理解するであろう。本願明細書における記載は、レンチウイルス系を代表的な例として用いている。しかしながら、すべてのレトロウイルスは、表面突起でのエンベロープイルス粒子の機構を共有し、および１分子の、直鎖の、プラスセンス単鎖のＲＮＡ、二量体を含有するゲノム、および共通のタンパク質ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。
【０１８４】
レンチウイルスは、数々の構造ウイルス粒子タンパク質を共通に共有し、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質ＳＵ（ｇｐｌ２０）およびＴＭ（ｇｐ４１）；ｇａｇ遺伝子によってコードされるＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）およびＮＣ（ｐ７〜１１）；およびｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＴ、ＰＲおよびＩＮを含む。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、付随性のおよび、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングおよび他の複製機能の調節に関与する他のタンパク質を含有する。ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ、およびｎｅｆ遺伝子によってコードされる付随タンパク質は、組換え型系から省略（または不活性化）されることが可能である。加えて、ｔａｔおよびｒｅｖは、例えば、突然変異または欠失によって省略または不活性化されることが可能である。
【０１８５】
第一世代レンチウイルスベクターパッケージング系はｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖに対する個別のパッケージング構築物を提供し、および典型的には、安全上の理由のために、非相同的または機能的修飾エンベロープタンパク質を利用する。第二世代レンチウイルスベクター系において、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆは欠失または不活性化される。第３世代レンチウイルスベクター系は、本発明の実施において用いるために好ましく、ｔａｔ遺伝子が欠失され、またはそうでなければ不活性化されたもの（例えば、突然変異を介して）を含む。
【０１８６】
通常ｔａｔにより提供される転写の制御に対する補償は、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモータなどの強い構成プロモータの使用により提供されることが可能である。他のプロモータ／エンハンサーは、構成プロモータ活性の強度、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓−特異的プロモータ）、または当該技術分野において理解されている発現に対する所望の制御に関連する他の要因に基づいて選択されることが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、ｔｅｔなどの誘導性プロモータを制御発現を達成するために利用することが望ましい。ｒｅｖをコードする遺伝子は、典型的な第三世代レンチウイルス性ベクター系が４種のプラスミド（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープおよび転移ベクターの各々について１種づつ）を含むこととなるよう、個別の発現構築物で提供されることが好ましい。利用されるパッケージング系の世代に関わらず、ｇａｇおよびｐｏｌは、単一の構築物または個別の構築物で提供されることが可能である。
【０１８７】
典型的には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、および形質移入、形質導入または感染を介して細胞に導入される。形質移入、形質導入または感染のための方法は、当業者によって周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス転移ベクターは、パッケージング株細胞に、形質移入、形質導入または感染を介して導入されて、産生細胞または株細胞を産生することが可能である。
【０１８８】
本発明のパッケージングベクターは、ヒト細胞または株細胞に、例えば、カルシウムリン酸形質移入、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む標準的な方法により導入されることが可能である。いくつかの実施形態において、パッケージングベクターは、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＧｉｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの優位な選択マーカと一緒に細胞に導入され、続いて適切な薬物の存在下での選択およびクローンの単離が成される。選択マーカ遺伝子は、物理的にコードする遺伝子にパッケージングベクターによってリンクされることが可能である。
【０１８９】
パッケージング機能が好適なパッケージング細胞によって発現されるよう形成された安定な株細胞は公知である。例えば、米国特許第５，６８６，２７９号明細書；および、パッケージング細胞を記載するOryら、「Proc. Natl. Acad. Sci.」（１９９６年）９３：ｐ．１１４００〜１１４０６を参照のこと。安定な株細胞産生のさらなる記載は、Dullら、１９９８年、「J. Virology」７２（１１）：ｐ．８４６３〜８４７１；およびZuffereyら、１９９８年、「J. Virology」７２（１２）：ｐ．９８７３〜９８８０に見出すことが可能である。
【０１９０】
Zuffereyら、１９９７年、「Nature Biotechnology」１５：ｐ．８７１〜８７５は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの配列３’が欠失されているレンチウイルスパッケージングプラスミドを教示する。この構築物はｔａｔおよびｒｅｖ配列を含み、３’ＬＴＲは、ポリＡ配列で置き換えられている。５’ＬＴＲおよびｐｓｉ配列は、誘導性であるものなどの他のプロモータにより置き換えられている。例えば、ＣＭＶプロモータまたはその誘導体を用いることが可能である。
【０１９１】
好ましいパッケージングベクターは、パッケージング機能に対する追加の変化を含有して、レンチウイルスタンパク質発現を強化すると共に、安全性を強化し得る。例えば、ｇａｇの上流のＨＩＶ配列のすべてを除去することが可能である。また、エンベロープの下流の配列を除去することが可能である。しかも、工程は、ベクターを変性させて、ＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を強化するために行うことが可能である。
【０１９２】
任意により、Dullら、「J. Virology」７２（１１）：ｐ．８４６３〜８４７１、１９９８年によって記載されたものなどの条件的パッケージング系が用いられる。例えば、Zuffereyら、１９９８年、「J. Virology」７２（１２）：ｐ．９８７３〜９８８０に記載のとおり、ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）の欠失によりベクターのバイオセイフティーを工場させる自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）の使用もまた好ましい。ｔｅｔ−誘導性ＬＴＲを介するものなどの誘導性ベクターもまた用いることが可能である。
【０１９３】
ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）は、その神経細胞に対するトロピズムにより神経系障害の治療においてかなりの関心を形成したが、このベクターはまた、その広い宿主範囲で他の組織について活用されることが可能である。ＨＳＶを魅力的なベクターとする他の要因は、ゲノムのサイズおよび組織である。ＨＳＶは大きいために、複数の遺伝子または発現カセットの導入は、他のより小さいウイルス系における場合よりも問題が少ない。加えて、多種の性能（一時的な、強度等）を有する異なるウイルス性制御配列の有効性は、他の系における場合を超える程度で発現を制御することを可能とする。ウイルスが比較的少ないスプライスメッセージを有することもまた利点であり、さらに遺伝子操作を容易とする。
【０１９４】
ＨＳＶも操作が比較的容易であり、および高い力価に増殖させることが可能である。それ故、十分なＭＯＩを達成するために必要な体積および反復的投薬に対する必要性の低下という観点の両方で送達は問題性が低い。遺伝子治療ベクターとしてのＨＳＶのレビューについては、Gloriosoら（１９９５年）を参照のこと。当業者は、ＨＳＶをベクターとして用いる周知の技術に熟知しているであろう。
【０１９５】
それらの構築が容易で、比較的高レベルな発現が得られ、宿主範囲が広くおよびＤＮＡを担持する能力が大きいためにワクシニアウイルスベクターが広範に用いられてきた。ワクシニアは、顕著な「Ａ〜Ｔ」優先度を示す、約１８６ｋｂの直鎖、二重鎖ＤＮＡゲノムを含有する。約１０．５ｋｂの逆方向末端反復がゲノムに隣接する。必須遺伝子の大部分は、ポックスウイルスの間で最も高度に保存された中央領域内で地図に現れる。ワクシニアウイルスにおける推定されるオープンリーディングフレームは１５０〜２００の数である。両方の鎖翻訳領域であるが、リーディングフレームの広範な重複は異例である。
【０１９６】
他のウイルス性ベクターを本発明における構築物として利用し得る。例えば、ポックスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが利用され得る。ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの分子的にクローン化した菌株が、非相同的ウイルス性タンパク質の発現のための転写競合ワクチンベクターとして遺伝的に精製されてきた（Davisら、１９９６年）。研究は、ＶＥＥ感染症が強力なＣＴＬ応答を刺激することを示すと共に、ＶＥＥが、免疫化のために非常に有用なベクターであり得ることを示唆している（Caleyら、１９９７年）。ＶＥＥウイルスは樹状細胞の標的化に有用であり得ることが本発明において予期される。
【０１９７】
ポリヌクレオチドは、特定の結合リガンドを発現するよう操作されたウイルス性ベクター内に収容され得る。ウイルス粒子は、それ故、標的細胞の同族受容体に特異的に結合すると共に、含有量を細胞に送達することとなる。レトロウイルスベクターの特異的な標的化を許容するよう設計された新規なアプローチを、ラクトース残基のウイルス性エンベロープへの化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて開発した。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞の特定の感染症を許容することが可能である。
【０１９８】
組換え型レトロウイルスの標的化に対する他のアプローチを設計し、ここでは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対する、および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いた。この抗体を、ビオチン構成成分を介して、ストレプトアビジンを用いることにより共役化した（Rouxら、１９８９年）。主な組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いることで、これらの表面抗原を狭宿主性ウイルスで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで穿孔する多様なヒト細胞の感染が示された（Rouxら、１９８９年）。
【０１９９】
本発明の方法の実施に用いるためのいずれかのベクターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、およびＰＧＫプロモータといった構成プロモータ；ｍＴＴＲ、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴを含む組織または細胞タイプ特異的プロモータ、制御性または誘導性プロモータ、エンハンサー等などの非相同的制御配列が挙げられる。好ましいプロモータとしては、ＬＳＰプロモータ（ＩＩＩら、「Blood Coagul. Fibrinolysis」８Ｓ２：ｐ．２３〜３０、１９９７年）、ＥＦ１−αプロモータ（Kimら、「Gene」９１（２）：ｐ．２１７〜２３、１９９０年）およびGuoら、「Gene Ther.」３（９）：ｐ．８０２〜１０、１９９６年）が挙げられる。最も好ましいプロモータとしては、伸長因子１−α（ＥＦ１ａ）プロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモータ、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモータ、キメラ肝臓−特異的プロモータ（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモータ、テトラサイクリン応答性プロモータ（ＴＲＥ）、トランスチレチンプロモータ（ＴＴＲ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータおよびＣＫ６プロモータが挙げられる。これらのおよび数多くの追加のプロモータの配列は当該技術分野において公知である。関連する配列は、公共のデータベースから容易に入手し、および本発明の実施に用いるためにベクターに組み込まれ得る。
【０２００】
本発明の方法はまた、関心のある２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質のためのコード配列の制御された発現についての遺伝子制御系の包含を考慮する。遺伝子制御系は、特定の遺伝子または遺伝子の調節された発現において有用である。１つの例示的な（典型的な）アプローチにおいて、遺伝子制御系またはスイッチは、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有するキメラ転写制御要因を含む。ドメインは、実質的にいずれのソースからも入手し得、および多数の方法のいずれかで組み合わせて新規なタンパク質を得てもよい。制御性遺伝子系はまた、キメラ転写制御要因と相互作用するＤＮＡ応答要素を含む。この要素は、調節されるべき遺伝子に近接して位置される。
【０２０１】
本発明の実施において利用し得る例示的な（典型的な）遺伝子制御系としては、ショウジョウバエエクジソン系（Yaoら、「Proc. Nat. Acad. Sci.」、９３：３３４６（１９９６年））、カイコエクジソン系（Suhrら、「Proc. Nat. Acad. Sci.」、９５：７９９９（１９９８年））、ＲＵ４８６をインデューサとして利用する、Valentis製GeneSwitch. RTM.合成プロゲステロン受容体系（Osterwalderら、「Proc Natl Acad Sci」９８（２２）」：ｐ．１２５９６〜６０１（２００１年））；テトラサイクリン（Ｔｃ）または類似体、例えばドキシサイクリンなどの低分子を利用して標的の転写を調節する（オンまたはオフ）Tet.TM. & RevTet.TM.系（BD Biosciences Clontech）（Knottら、「Biotechniques」３２（４）：７９６、７９８、８００（２００２年））；その各々が転写活性化因子またはＤＮＡ結合タンパク質の一方にリンクしている２つの細胞内分子を一緒にするための低分子の使用に基づくARIAD Regulation Technologyが挙げられる。これらの構成成分が一緒になるとき、関心のある遺伝子の転写が活性化される。Ariadは、ホモ二量体化に基づく系およびヘテロ二量体化に基づく系の２つの主な系を有し（Riveraら、「Nature Med」、２（９）：ｐ．１０２８〜１０３２（１９９６年）；Yeら、「Science」２８３：ｐ．８８〜９１（２０００年））、これらのいずれも本発明のベクターに組み込まれ得る。
【０２０２】
本発明の実施に用いるために好ましい遺伝子制御系は、ARIAD Regulation TechnologyおよびTet.TM. & RevTet.TM.系である。
【０２０３】
Ｃ．非ウイルス性ベクター
細胞への発現ベクターの転移のための数々の非ウイルス性方法もまた、本発明の方法において使用されると予期される。これらとしては、リン酸カルシウム沈殿物（GrahamおよびVan Der Eb、１９７３年；ChenおよびOkayama、１９８７年；Rippeら、１９９０年）ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal、１９８５年）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspaら、１９８６年；Potterら、１９８４年）、直接微量注入（HarlandおよびWeintraub、１９８５年）、ＤＮＡ充填リポソーム（NicolauおよびSene、１９８２年；Fraleyら、１９７９年）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ錯体、細胞超音波治療（Fechheimerら、１９８７年）、高速微粒子銃を用いる遺伝子照射（Yangら、１９９０年）、ポリカチオン（Bousssifら、１９９５年）および受容体媒介形質移入（WuおよびWu、１９８７年；WuおよびWu、１９８８年）が挙げられる。これらの技術のいくつかは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの使用にうまく適合し得る。当業者は、非ウイルス性ベクターの使用に関する技術に精通していると共に、本願明細書に開示のもの以外のタイプの非ウイルス性ベクターが本発明によって予期されることを理解するであろう。
【０２０４】
本発明の方法のさらなる実施形態においては、発現カセットがリポソームまたは脂質配合物中に捕捉されていてもよい。リポソームは、リン脂質二重層メンブランおよび内側水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰な水溶液中に懸濁している場合に自然に形成される。脂質構成成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成を経て、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に捕捉する（GhoshおよびBachhawat、１９９１年）。リポフェクタミンと錯化した遺伝子構築物がまた予期される（Gibco BRL）。当業者は、リポソームおよび脂質配合物を用いる技術に精通しているであろう。
【０２０５】
脂質ベースの非ウイルス性配合物は、アデノウイルス遺伝子治療に対する代替を提供する。多くの細胞培養研究が脂質ベースの非ウイルス性遺伝子転移を考証してきたが、脂質ベースの配合物を介した全身的な遺伝子送達は制限的であった。非ウイルス性脂質ベースの遺伝子送達の主な制限は、非ウイルス性送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子転移結果間の矛盾を部分的に説明する。この矛盾するデータに寄与する他の要因は、血清タンパク質の存在下および不在下におけるリポソーム安定性における差である。リポソームおよび血清タンパク質の間の相互作用は、劇的な影響をリポソームの安定性特徴に有する（YangおよびHuang、１９９７年）。カチオン性リポソームは、負電荷の血清タンパク質を誘引すると共に結合する。血清タンパク質によって被覆されたリポソームは、溶解されるか、またはマクロファージによって吸収され、循環からの除去がもたらされる。現在のｉｎ  ｖｉｖｏリポソーム送達方法は、皮下、皮内、または頭蓋内注射を用いて、カチオン性脂質に関連する循環における毒性および安定性問題を回避している。リポソームおよびプラズマタンパク質の相互作用が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Feignerら、１９８７年）およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子転移（Zhuら、１９９３年；Solodinら、１９９５年；Thierryら、１９９５年；Tsukamotoら、１９９５年；Aksentijevichら、１９９６年）の効率間の相違の原因である。
【０２０６】
脂質配合物の産生は、度々、超音波治療または、（Ｉ）逆相蒸発（ＩＩ）脱水−再脱水（ＩＩＩ）界面活性剤透析および（ＩＶ）薄膜水和後のリポソーム混合物の一連の放出により達成される。一旦生産されると、脂質構造は、循環にあるときに、有害な（化学療法薬）または易動性（核酸）の化合物を被包するために用いられることが可能である。リポソーム被包は、このような化合物について、より低い毒性およびより長い血清半減期をもたらす（Gabizonら、１９９０年）。数多くの疾病治療は、従来の治療を増強し、または新規な治療を確立するために（特に過剰増殖性疾患を処置するための治療）、脂質ベースの遺伝子転移ストラテジーを用いている。
【０２０７】
Ｄ．タンパク質またはポリペプチドコード配列の核酸構築物の細胞への送達
非相同的タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに、自己プロセシング切断部位を単独でまたは追加のタンパク質切断部位をコードする配列との組み合わせで含む、本発明の方法において利用され得るベクター構築物は、細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞による非相同的コード配列の発現のために導入され得る（例えば、体細胞性細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで、またはベクター−形質導入細胞による組換え型ポリペプチドの産生のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）。
【０２０８】
本発明において用いられるベクター構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、当該技術分野において公知である標準的な方法を用いて細胞に導入され得る。このような技術は、リン酸カルシウムを用いる形質移入、培養された細胞への微量注入（Capecchi、細胞２２：ｐ．４７９〜４８８（１９８０年））、エレクトロポレーション（Shigekawaら、「BioTechn.」、６：ｐ．７４２〜７５１（１９８８年））、リポソーム媒介遺伝子転移（Manninoら、「BioTechn.」、６：ｐ．６８２〜６９０（１９８８年））、脂質媒介形質導入（Felgnerら、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」８４：ｐ．７４１３〜７４１７（１９８７年））、および高速微粒子銃を用いる核酸送達（Kleinら、性質３２７：ｐ．７０〜７３（１９８７年））が挙げられる。
【０２０９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ発現について、機能性タンパク質の発現に有効であるいずれかの細胞が利用され得る。タンパク質発現に用いられる細胞および株細胞の数多くの例が当該技術分野において公知である。例えば、原核細胞および昆虫細胞が、発現に用いられ得る。加えて、イースト菌などの真核微生物が用いられ得る。原核生物、昆虫およびイースト菌系における組換え型タンパク質の発現は、一般に当該技術分野において公知であると共に、本発明の組成物および方法を用いるタンパク質またはポリペプチド発現について適合され得る。
【０２１０】
発現に有用である例示的な（典型的な）宿主細胞としては、線維芽細胞細胞などの哺乳類細胞、ヒツジ、ブタ、マウスのおよびウシ細胞などの非ヒト哺乳動物からの細胞、昆虫細胞等がさらに挙げられる。哺乳類細胞の特定の例としては、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３線維芽細胞細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞およびＭＤＣＫ細胞が挙げられる。
【０２１１】
宿主細胞は、プロモータの誘発、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために必要に応じて修飾された、従来の栄養媒体において培養される。哺乳類宿主細胞は、多様な媒体中に培養され得る。ハムＦ１０（Sigma）、基礎培地（ＭＥＭ）、Sigma）、ＲＰＭＩ１６４０（Sigma）、およびダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Sigma）などの市販されている媒体が、典型的には、宿主細胞の培養に好適である。所与の培地は、一般に、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、微量元素、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で、必要に応じて補足される。いずれかの他の必要な補足もまた、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等などの特定の株細胞についての適切な培養状態は、一般に当該技術分野において公知であり、例えばウェブ上でオンラインで入手可能なＡＴＣＣカタログにおいて数多くの株細胞の培養についての培養状態が提案されている。
【０２１２】
本発明において用いられるベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、種々の経路（例えば、脳へ、皮内、静脈内、腫瘍内的に、膀胱へ門脈内、腹腔内、筋肉内的等）を介して投与されて、自己プロセシング切断配列を介して結合された複数の遺伝子を送達して、動物モデルまたはヒト対象において２種以上のタンパク質またはポリペプチドを発現させ得る。投与経路に応じて、治療的タンパク質は、効果を局所的に（例えば、脳または膀胱において）または全身的に（他の投与経路）誘発する。本発明のベクターにおけるタンパク質またはポリペプチドのための、組織特異的プロモータ５’のオープンリーディングフレームへの使用は、ベクターによりコードされた２つ以上のタンパク質またはポリペプチドの組織特異的発現を発揮させるために用いられ得る。
【０２１３】
導入遺伝子を担持する組換え型ベクターを、標的細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで導入する種々の方法が既に記載されており、当該技術分野において周知である。本発明は、標的細胞を本発明の方法において用いられる組換え型ベクターで形質導入することによる、治療的方法、ワクチン、および癌治療を提供する。
【０２１４】
例えば、本発明の組換え型ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、特にこれらに限定されないが、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺および皮膚を含む広く多様な器官タイプに標的化され得る。
【０２１５】
ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子転移の場合には、標的細胞が宿主から除去され、および本発明の組換え型ベクターおよび当該技術分野において周知である方法を用いて実験室で遺伝的に修飾される。
【０２１６】
本発明の方法において用いられる組換え型ベクターは、特にこれらに限定されないが、上述のモードを含む従来の投与モードを用いて投与されることが可能である。本発明において用いられる組換え型ベクターは、液体溶液および懸濁液、微小胞、リポソームおよび注射用または不融性溶液などの多様な配合物のいずれかで提供され得る。好ましい形態は、投与モードおよび治療用途に依存する。送達経路に適切な形態は、関連技術分野の当業者に一般に利用可能な知識を用いて、容易に判定し得る。
【０２１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え型タンパク質およびポリペプチド産出における、本発明の方法における組換え型ベクター構築物の使用で理解されるべき多くの利点は、患者における２種以上の組換え型タンパク質またはポリペプチドＯＲＦの長期のおよび持続性の発現のための単一ベクターの投与；生物活性を有する２種以上の組換え型タンパク質またはポリペプチドＯＲＦのｉｎ  ｖｉｖｏ発現；およびヒト細胞で産生された組換え型タンパク質またはポリペプチドの天然翻訳後改良を含む。
【０２１８】
好ましい一態様は、組換え型タンパク質およびポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のための、本発明の組換え型ベクター構築物の使用である。組換え型タンパク質産生方法は当該技術分野において周知であると共に、本発明の自己プロセシング切断部位含有ベクター構築物は、このような標準的な方法を用いる組換え型タンパク質およびポリペプチドの発現のために利用され得る。
【０２１９】
本発明の例示的な（典型的な）一態様において、細胞へのベクター導入または投与（形質移入）の後、１つまたは複数の以下の工程が続く：
（１）形質移入された細胞を、組換え型タンパク質またはポリペプチドを発現する細胞を選択する条件下で培養する工程；
（２）組換え型タンパク質またはポリペプチドの発現を評価する工程；および
（３）組換え型タンパク質またはポリペプチドを回収する工程。
【０２２０】
本願明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが誘導されるレトロウイルスとしては、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス；脾臓ネクロシスウイルス；ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスが挙げられる。一実施形態においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから誘導される。
【０２２１】
ベクターは１つまたは複数のプロモータを含む。利用され得る好適なプロモータとしては、これらに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ；およびMillerら、「Biotechniques」、第７巻、９号、ｐ．９８０〜９９０（１９８９年）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、またはいずれかの他のプロモータ（例えば、特にこれらに限定されないが、ヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩ、および．β−アクチンプロモータを含む真核細胞プロモータなどの細胞プロモータ）が挙げられる。利用され得る他のウイルス性プロモータとしては、これらに限定されないが、アデノウイルスプロモータ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、およびＢ１９パルボウイルスプロモータが挙げられる。好適なプロモータの選択肢は、本願明細書に包含される教示から、当業者には明らかであろう。
【０２２２】
レナラーゼをコードする核酸配列は、好適なプロモータの制御下にあり得る。利用され得る好適なプロモータとしては、これらに限定されないが、アデノウイルス性の主な遅発性プロモータなどのアデノウイルスプロモータ；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータなどの非相同的プロモータ；呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ；ＭＭＴプロモータ、メタロチオネインプロモータなどの誘導性プロモータ；熱ショックプロモータ；アルブミンプロモータ；ＡｐｏＡＩプロモータ；ヒトグロビンプロモータ；ヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼプロモータなどのウイルス性チミジンキナーゼプロモータ；レトロウイルスＬＴＲ（本願明細書中上述の修飾レトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモータ；およびヒト成長ホルモンプロモータが挙げられる。プロモータはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する未変性プロモータであり得る。
【０２２３】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング株細胞を形質導入して、産生株細胞を形成するために利用される。形質移入され得るパッケージング細胞の例としては、これらに限定されないが、本願明細書において参照によりその全体が援用されるMiller、「Human Gene Therapy」、第１巻、ｐ．５〜１４（１９９０年）に記載のとおり、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ，．ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ株細胞が挙げられる。ベクターは、パッケージング細胞を、当該技術分野において公知であるいずれかの手段を通じて形質導入し得る。このような手段としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられる。一代替においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム被包され、または脂質に結合され、および次いで宿主に投与され得る。
【０２２４】
産生株細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクター粒子を、次いで、真核細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入するために利用し得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現することとなる。形質導入され得る真核細胞としては、これらに限定されないが、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支の上皮性細胞が挙げられる。
【０２２５】
ＩＶ．外因的に補充された翻訳領域核酸分子を含有する宿主細胞
本発明は、レナラーゼタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を利用する方法をさらに提供する。宿主細胞は、原核または真核であることが可能である。本発明のタンパク質の発現に有用な真核細胞は、株細胞が、細胞培養方法に適合すると共に、発現ベクターおよび遺伝子生成物の発現の伝播に適合する限りにおいて、制限されない。好ましい真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、イースト菌、昆虫および哺乳類細胞、好ましくは、マウス、ラット、サルまたはヒト株細胞に由来するものなどの脊椎動物細胞、および他の不死化株細胞が挙げられる。好ましい真核宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能であるＮＩＨスイスマウス胎仔細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ベビーハムスター腎臓細胞細胞（ＢＨＫ）等、真核組織培養株細胞、および他の不死化株細胞が挙げられる。
【０２２６】
いずれの原核宿主も、本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を発現するために用いることが可能である。好ましい原核宿主は、大腸菌（E. coli）である。
【０２２７】
適切な細胞宿主の、本発明のｒＤＮＡ分子での形質転換は、典型的には用いられるベクターのタイプおよび利用される宿主系に依存する周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーションおよび塩治療方法が典型的には利用され、例えば、Cohenら、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」６９：２１１０、１９７２年；およびManiatisら、「Molecular Cloning, A Laboratory Mammal」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor, NY）（１９８２年）を参照のこと。脊椎動物細胞の、ｒＤＮＡｓを含有するベクターでの形質転換に関して、エレクトロポレーション、カチオン性脂質または塩治療方法が典型的には利用され、例えば、Grahamら、「Virol.」５２：４５６、１９７３年；Wiglerら、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」７６：ｐ．１３７３〜７６、１９７９年を参照のこと。
【０２２８】
うまく形質転換された細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含有する細胞は、選択マーカ用の選択を含む周知の技術によって同定されることが可能である。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入から得られる細胞は、クローン化されて、単一のコロニーを形成することが可能である。これらのコロニーからの細胞を、収集し、溶解して、それらのＤＮＡ含有量を、Southern、「J Mol. Biol.」９８：５０３、１９７５年、またはBerentら、「Biotech.」３：２０８、１９８５年によって記載されたものなどの方法を用いてｒＤＮＡの存在について、または免疫学的方法でアッセイした細胞から産生されたタンパク質の存在についてテストすることが可能である。
【０２２９】
Ｖ．アンチセンス分子、リボザイム、および干渉ＲＮＡ
さらに、本発明は、アンチセンス核酸を含む組換え型細胞を用いる方法を含み、この細胞は、細胞プロセスにおけるレナラーゼの役割を解明するために有用なモデルである。すなわち、バルーン損傷容器および、より具体的には、その外膜におけるレナラーゼの発現の増加は、レナラーゼが、負の再構築および動脈再狭窄に関連する細胞増殖に関与していることを示す。従って、アンチセンス配向にではあるがレナラーゼに相補的なアンチセンス核酸を含む遺伝子組換え細胞は、レナラーゼの作用のメカニズムおよび細胞におけるその役割の研究のため、ならびに、レナラーゼ発現の効果を改善する薬物療法学の同定のための有用なツールである。
【０２３０】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、レナラーゼをコードする核酸に対して相補的なアンチセンス核酸は、細胞を形質移入するために用いられることが可能であると共に、この細胞は、レナラーゼの機能を研究し、および有用な薬物療法学および診断を同定するために、レナラーゼの異なった発現の効果を判定するために研究することが可能であることを認識することが可能である。
【０２３１】
さらに、レナラーゼ発現および／または細胞における活性を低減させる方法は、レナラーゼ発現の増加、細胞におけるレナラーゼタンパク質レベルまたはこれからの分泌物レベルの増加、および／またはレナラーゼ活性の増加により媒介されるか、または関連する疾病、障害または状態についての有用な診断学および／または薬物療法学を提供することが可能である。
【０２３２】
当業者は、細胞におけるレナラーゼｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを低減させる１つの方法は、タンパク質をコードする核酸の発現を抑制することであることを認識するであろう。レナラーゼの発現は、例えば、アンチセンス分子を用いて、および、また、例えば、WiannyおよびKernicka-Goetz（２０００年、「Nature Cell Biol.」２：ｐ．７０〜７５）に記載のとおり、リボザイムまたは二重鎖ＲＮＡを用いることにより抑制され得る。
【０２３３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の多様な範囲の生物および細胞タイプへの導入が相補的なｍＲＮＡの分解を生じる現象である。細胞において、長鎖ｄｓＲＮＡは、短鎖２１〜２５ヌクレオチド低分子干渉ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡに、ダイサーとして公知のリボヌクレアーゼによって切断される。ｓｉＲＮＡは、その後、タンパク質構成成分とＲＮＡ誘起サイレンシング錯体（ＲＩＳＣ）に集合して、プロセスにおいて巻き戻される。活性化ＲＩＳＣは、次いで、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖およびｍＲＮＡ間の塩基対形成相互作用により相補的な転写物に結合する。この結合されたｍＲＮＡは切断され、およびｍＲＮＡの配列特異的分解が遺伝子サイレンシングにおいてもたらされる。例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書；Fireら、「Nature」（１９９８年）３９１（１９）：ｐ．３０６〜３１１；Timmonsら、「Nature」（１９９８年）３９５：８５４；Montgomeryら、「TIG」（１９９８年）１４（７）：ｐ．２５５〜２５８；David R. Engelke編、「RNA Interference (RNAi) Nuts & Bolts of RNAi Technology」、DNA Press（２００３年）；およびGregory J. Hannon編、「RNAi A Guide to Gene Silencing」、Cold Spring Harbor Laboratory Press（２００３年）を参照のこと。従って、本発明はまた、ＲＮＡｉ技術を用いることによるレナラーゼをコードする遺伝子のサイレンシング方法を含む。
【０２３４】
遺伝子発現を抑制するためのアンチセンス分子およびそれらの使用は、当該技術分野において周知である（例えば、Cohen、１９８９年、「Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression」、CRC Pressを参照のこと）。アンチセンス核酸は、本願明細書において他の箇所に用語が定義されているとおり、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Weintraub、１９９０年、「Scientific American」２６２：４０）。細胞において、アンチセンス核酸は、関連するｍＲＮＡにハイブリッド形成されて、二重鎖分子を形成し、これにより遺伝子の翻訳を抑制する。
【０２３５】
遺伝子の翻訳を抑制するためのアンチセンス法の使用は当該技術分野において公知であり、および、例えば、Marcus-Sakura（１９８８年、「Anal. Biochem.」１７２：２８９）に記載されている。このようなアンチセンス分子は、Inoue（１９９３年、米国特許第５，１９０，９３１号明細書）により教示されるとおり、アンチセンス分子をコードするＤＮＡを用いて、遺伝子発現を介して細胞に提供され得る。
【０２３６】
あるいは、本発明のアンチセンス分子は合成的に形成され得、および次いで細胞に提供される。容易に合成されると共に、標的細胞に導入されるため、約１０〜約３０、およびより好ましくは約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。本発明により予期される合成アンチセンス分子は当該技術分野において公知であるオリゴヌクレオチド誘導体を含み、これは未修飾オリゴヌクレオチドに比して向上した生物活性を有する（Cohen、（上記を参照）；参照により本願明細書においてその全体が援用される、Tullis、１９９１年、米国特許第５，０２３，２４３号明細書を参照のこと、）。
【０２３７】
リボザイムおよび遺伝子発現を抑制するためのこれらの使用はまた当該技術分野において周知である（例えば、Cechら、１９９２年、「J. Biol. Chem.」２６７：ｐ．１７４７９〜１７４８２；Hampelら、１９８９年、「Biochemistry」２８：ｐ．４９２９〜４９３３；参照により本願明細書においてその全体が援用されるEcksteinら、国際公開第９２／０７０６５号パンフレット；Altmanら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書を参照のこと）。リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡを、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した方策で特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を介して、分子は、ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチド配列を認識して、これを切断するよう操作されることが可能である（Cech、１９８８年、「J. Amer. Med. Assn.」２６０：３０３０）。このアプローチの主な利点は、これらは配列特異的であるため、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
【０２３８】
２種類の基本的なタイプのリボザイムがあり、すなわち、テトラヒメナ−タイプ（Hasselhoff、１９８８年、「Nature」３３４：５８５）およびハンマーヘッド型がある。テトラヒメナ−タイプリボザイムは４塩基の長さである配列を認識する一方で、ハンマーヘッド型リボザイムは１１〜１８塩基の長さの塩基配列を認識する。配列が長いほど、配列が標的ｍＲＮＡ種中に排他的に生じることとなる可能性が大きい。結果的に、ハンマーヘッド型リボザイムは、テトラヒメナ−タイプリボザイムより特定のｍＲＮＡ種の不活性化に好ましく、および１８−塩基認識配列が、種々の非関連ｍＲＮＡ分子中に不作為に生じ得るより短い認識配列より好ましい。
【０２３９】
レナラーゼの発現の抑制に有用であるリボザイムは、レナラーゼによってコードされたレナラーゼのｍＲＮＡ配列に相補的である、または少なくとも約３３％ホモロジーを配列番号１に有する基本的なリボザイム構造への標的配列の組み込みによって設計されることが可能である。好ましくは、この配列は、配列番号１に、少なくとも約３５％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約４０％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約４５％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約５０％相同的、より好ましくは、少なくとも約５５％相同的、より好ましくは、少なくとも約６０％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約６５％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％相同的、より好ましくは、少なくとも約７５％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％相同的、より好ましくは、少なくとも約９０％相同的、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％相同的、および最も好ましくは、少なくとも約９９％相同的である。レナラーゼを標的化するリボザイムは、市販されている試薬を用いて合成され得（Applied Biosystems, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティー（Foster City, CA））、または、これらをコードするＤＮＡから遺伝的に発現され得る。
【０２４０】
Ｖ．組換え型細胞および遺伝子組換え非ヒト哺乳動物
本発明は、とりわけ、レナラーゼをコードする単離された核酸、これらに相補的なアンチセンス核酸、レナラーゼに特異的に結合する抗体をコードする核酸等を含む組換え型細胞を利用する方法を含む。一態様においては、組換え型細胞は、レナラーゼをコードする核酸の部分をコードするベクター（例えばプラスミド等）で過渡的に形質移入されることが可能である。核酸は細胞ゲノムに組み込まれる必要はなく、また、細胞において発現される必要もない。しかも、細胞は原核または真核細胞であり得、および本発明は、いずれかの特定の株細胞または細胞タイプに制限されると解釈されるべきではない。このような細胞としては、これらに限定されないが、線維芽細胞、マウス幹細胞、両生類卵母細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞等が挙げられる。
【０２４１】
一態様においては、哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む組換え型細胞が用いられて、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物が作成される。すなわち、外因性の核酸、または本願明細書においても称されているとおり「導入遺伝子」は細胞に導入され、および細胞は、次いで、非ヒト遺伝子組換え哺乳動物の作成に用いられる。導入遺伝子が導入される細胞は、好ましくは胚性幹（ＥＳ）細胞である。しかしながら、本発明は、単に、本発明の導入遺伝子を含むＥＳ細胞または遺伝子組換え動物の作成に用いられる細胞を利用する方法に制限されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明において用いられる遺伝子組換え細胞は、特にこれらに限定されないが、導入遺伝子を含む遺伝子組換え動物由来のいずれかの細胞、遺伝子組換えＥＳ細胞から誘導されたキメラ動物由来の導入遺伝子を含む細胞、および非ヒト遺伝子組換え哺乳動物の作成に用いられても用いられなくてもよい導入遺伝子を含むいずれかの他のものを含む。
【０２４２】
さらに、導入遺伝子含有、すなわち、組換え型、細胞の目的は、遺伝子組換え哺乳動物の作成に制限されると解釈されるべきではないことに注目することが重要である。むしろ、本発明は、特に制限されないが、哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む原核細胞および真核細胞を含む、哺乳類レナラーゼをコードする核酸が導入されているいずれかの細胞タイプの使用を含むと解釈されるべきである。
【０２４３】
細胞が真核細胞であるとき、細胞は、本発明の導入遺伝子がその中に導入されるときに、および所望の遺伝子によってコードされたタンパク質がこれ以上発現発現されないときに、有益性が得られるいずれかの真核細胞であり得る。このような有益性は、所望の遺伝子の発現の欠乏が、実験室またはこの細胞が属する哺乳動物において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究されることが可能である系と、導入遺伝子欠失を含む細胞がリサーチ、診断上のおよび治療的ツールとして利用される系と、ＥＳＲＤおよび高血圧を含む哺乳動物における選択された疾病状態のための新たな診断上のおよび治療的ツールの開発のために有用である動物モデルが作成される系とが提供されてきたという事実を含み得る。
【０２４４】
あるいは、本発明は真核細胞を用いる方法を含み、ここで、本発明の導入遺伝子がその中に導入されているときに、および所望の遺伝子によってコードされたタンパク質がそれから発現されているときに、細胞中に既に存在していなかったまたは発現されていなかった場合、または現在では導入遺伝子が導入される前とはことなるレベルまたは環境下で発現されている場合に、有益性が得られる。このような有益性は、所望の遺伝子の発現が、実験室またはこの細胞が属する哺乳動物において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究されることが可能である系と、導入された遺伝子を含む細胞がリサーチ、診断上のおよび治療的ツールとして利用される系と、哺乳動物における選択された疾病状態のための新たな診断上のおよび治療的ツールの開発のために有用である動物モデルが作成される系とが提供されてきたという事実を含み得る。
【０２４５】
レナラーゼをコードする単離された核酸を発現するこのような細胞は、レナラーゼを、細胞、組織、または動物全体に提供するために用いられることが可能であり、ここで、より高いレベルのレナラーゼが、低レベルのレナラーゼ発現および／または活性に関連する疾病、障害または状態を治療しまたは緩和させるために有用であることが可能である。このような疾病、障害または状態は、限定されないが、ＥＳＲＤ、高血圧、心血管系疾患を含むことが可能である。レナラーゼの追加の発現は、それ故、より低い血圧をもたらすことが可能である。従って、本発明は、レナラーゼを発現させて、レナラーゼ発現、翻訳、および／または活性を増加させ、または誘発させる細胞を含み、ここで、レナラーゼ発現、タンパク質レベル、および／または活性の増加は、疾病、障害または状態を治療しまたは緩和させるために有用であることが可能である。
【０２４６】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明の「ノックイン」または「ノックアウト」ベクターは、それぞれ、置き換えられ、または欠失されるべき核酸の２つの部分に相同的な少なくとも２つの配列を含むことを、認識するであろう。これらの２つの配列は、遺伝子に隣接する配列に相同的である；すなわち、一方の配列は、レナラーゼをコードする核酸のコード配列の５’部分での、またはこれに近い領域に相同的であると共に、他方の配列は、第１のものよりさらに下流である。当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明はいずれかの特定の隣接する核酸配列に制限されないことを認識するであろう。その代わり、標的指向化ベクターは、哺乳類ゲノムから、またはこれに、それぞれ、レナラーゼをコードする核酸、またはそのフラグメントのいくつかまたはすべてを除去する（すなわち、「ノックアウト」ベクター）、または挿入する（すなわち、「ノックイン」ベクター）２つの配列を含み得る。標的指向化ベクターの重大な機構は、逆方向、すなわち、「ノックアウト」ベクターの場合にはレナラーゼオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’および３’末端に位置された２つの配列の十分な部分を含んで、レナラーゼをコードする核酸のすべてまたは一部が、哺乳類染色体上の位置から欠失され、またはに挿入されるよう、相同的組換えによる欠失／挿入を生じさせる。
【０２４７】
導入遺伝子およびノックインおよびノックアウト標的指向化ベクターの設計は、当該技術分野において周知であり、Sambrookら（１９８９年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（New York））などの標準的な論文、およびAusubelら（１９９７年、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、ニューヨーク（New York））等に記載されている。標的指向化ベクターにおいて用いられるべきレナラーゼ翻訳領域に隣接するかまたは内の上流および下流部分は、公知の方法に基づいて、およびラットおよびヒトレナラーゼの核酸およびアミノ酸配列の両方を含む本願明細書に提供する開示に基づいて本願明細書に開示の教示に従って、容易に選択され得る。これらの配列を備えることで、当業者は、本発明の導入遺伝子およびノックアウトベクターを構築することが可能となろう。
【０２４８】
本発明は、例えばｎｅｏＲ遺伝子をコードする核酸などの選択マーカをコードする核酸を含むノックアウト標的指向化ベクターを用い、これにより、遺伝子組換え細胞の選択を許容する方法をさらに含み、ここで、レナラーゼをコードする核酸、またはその一部は、欠失されていると共に、Ｇ４１８の存在下に増殖する細胞の能力によりネオマイシン耐性遺伝子で置き換えられている。しかしながら、本発明は、選択マーカとしてネオマイシン耐性に制限されると解釈されるべきではない。むしろ、当該技術分野において周知である他の選択マーカが、組換え型細胞の選択を許容するためにノックアウト標的指向化ベクターにおいて用いられ得、ここで、レナラーゼ遺伝子は、欠失されているか、および／または不活性化され、および好みの選択マーカをコードする核酸によって置き換えられている。選択マーカをベクター中に選択するおよび導入する方法は当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら（１９８９年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（New York））、およびAusubelら（１９９７年、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、ニューヨーク（New York））に記載されている。
【０２４９】
本願明細書において用いられるところ、本発明は、そのゲノム内の所望の部位に挿入された外因性の核酸を含む非ヒト遺伝子組換え哺乳動物を用いて、これにより、所望の内在性の標的遺伝子の翻訳領域を欠失させたもの、すなわち、ノックアウト遺伝子組換え哺乳動物を用いる方法を含む。さらに、本発明は、レナラーゼをコードする外因性の核酸は、ゲノム部位に導入されている遺伝子組換え非ヒト哺乳動物、すなわち、「ノックイン」遺伝子組換え哺乳動物を用いる方法を含む。挿入されたノックイン導入遺伝子は、例えば、タグポリペプチド、細胞中に通常は存在しない、または典型的にはレナラーゼに操作的にリンクされていないレナラーゼをコードする核酸に操作的にリンクされたプロモータ／調節性領域をコードする種々の核酸を含み得る。
【０２５０】
非ヒト遺伝子組換え哺乳動物の作成は、好ましくは、ここに記載される方法を用いて達成される。しかしながら、本発明は、この方法の使用のみに限定されるとどのようにも解釈されるべきではなく、すなわち、他の方法を用いて所望のノックアウト哺乳動物を作成することが可能である。
【０２５１】
非ヒト遺伝子組換え哺乳動物を作成させる好ましい方法において、導入遺伝子を含むＥＳ細胞が産生され、およびこの細胞が、次いで、基本的にNagyおよびRossant１９９３年、「Gene Targeting, A Practical Approach」、ｐ．１４６〜１７９、Joyner編、IRL Press）に記載のとおり、ノックアウト動物の作成に用いられる。ＥＳ細胞は、宿主胚盤胞または分割球ステージ胎仔との凝集体への注入により胚性環境に戻された場合には、通常の胚性細胞として振る舞う。このように戻された場合には、細胞は、すべての胎仔の系列に沿って発生する可能性を十分に有する。それ故、ＥＳ細胞を得、その中に所望のＤＮＡを導入し、次いで、細胞を成熟哺乳類細胞への発育のために胚性環境に戻すことが可能であるが、ここで、所望のＤＮＡが発現され得る。
【０２５２】
遺伝子組換えマウスの作成のための正確なプロトコルはNagyおよびRossant（１９９３年、「Gene Targeting, A Practical Approach」、Joyner編、IRL Press、ｐ．１４６〜１７９）に記載されており、従って、本願明細書においては繰り返さない。その中に所望のＤＮＡを導入するためのＥＳ細胞の形質移入または形質導入は、例えば、Sambrookら（１９８９年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（New York））、およびAusubelら（１９９７年、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、ニューヨーク（New York））に記載のものなどの標準的なプロトコルを用いて達成される。好ましくは、本発明の導入遺伝子内に含有された所望のＤＮＡはＥＳ細胞中に電気穿孔され、この細胞が、Sorianoら（１９９１年、「Cell」６４：ｐ．６９３〜７０２）に記載のとおり増殖される。
【０２５３】
単離された核酸の哺乳動物の受精卵への導入は、遺伝子組換え技術におけるいずれかの数の標準的な技術によって達成される（Hoganら、１９８６年、「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（NY））。最も通例的には、核酸は、微量注入法により胎仔に導入される。
【０２５４】
例えば、Hoganら（１９８６年、「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（NY））に記載のとおり、一旦核酸が卵中に導入されると、卵は短時間の間培養され、次いで、記述のとおり卵を得たものと同一種の偽妊娠哺乳動物に移植される。典型的には、多くの卵が一回の実験で注入され、およびおよそ三分の二の卵がこの方法で生存する。約２０個の生存可能な卵が、次いで、偽妊娠動物に移植され、およびこのように移植された通常４〜１０個の生存可能な卵が生きた子に発育することとなる。
【０２５５】
いずれかの哺乳類レナラーゼ遺伝子が、本願明細書に記載の方法において用いられて、哺乳類レナラーゼ遺伝子のすべてまたは一部が削除された導入遺伝子を宿する遺伝子組換え哺乳動物または遺伝子組換え細胞を作成し得る。
【０２５６】
本発明の遺伝子組換え哺乳動物は、哺乳動物のいずれかの種であることも可能である。それ故、本発明は、キメラ核酸をコードする遺伝子組換え哺乳動物の作成を含むと解釈されるべきであり、これらの哺乳動物としては、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジおよびウシが挙げられる。本願明細書に記載の遺伝子組換えマウスの作成方法は、いずれかの哺乳類種を用いて同様に適用されることが可能である。好ましくは、本発明の遺伝子組換え哺乳動物はげっ歯類であり、およびさらにより好ましくは、本発明の遺伝子組換え哺乳動物はマウスである。一例として、Lukkarinenら（１９９７年、「Stroke」２８：ｐ．６３９〜６４５）は、遺伝子組換えマウスの作成を可能とする遺伝子構築物はまた、ラットを含む他の遺伝子組換えげっ歯類の作成を可能とすることを教示する。同様に、１つの種の動物の遺伝座位におけるヌル欠損突然変異は、この第１の種に高度に相同的である遺伝座位を有する他の種の動物において複製されることが可能である。
【０２５７】
本発明の遺伝子組換え哺乳動物を同定するために、子は、サザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、および／またはＲＴ−ＰＣＲなどの標準的な技術を用いて、単離された核酸の存在について試験される。哺乳動物の細胞および組織における核酸の発現がまた、本願明細書に記載の通常の技術を用いて評価される。さらに、遺伝子組換え動物の循環している血液中におけるレナラーゼの存在または不在は、タンパク質が分泌されている場合には、当該技術分野において周知である、例えば、ウェスタンブロット法分析を用いることにより、またはタンパク質検出について標準的な方法を用いることにより、判定されることが可能である。
【０２５８】
本発明の遺伝子組換え哺乳動物から得られる細胞（この用語が本願明細書において用いられるところ「遺伝子組換え細胞」ともみなされる）は、本願明細書の他の箇所に記載のレナラーゼ（＋／−）および（−／−）遺伝子組換え非ヒト哺乳動物から得られるものといった細胞などを包含し、ＥＳＲＤ、高血圧、心血管系疾患などの異常なレベルのレナラーゼ発現に関連していると考えられている哺乳動物の疾病および症状、ならびに、異常なレベルのレナラーゼ発現に関連しているいずれかの他の疾病、障害または状態をモデルするために有用な系である。
【０２５９】
本願明細書に記載の非ヒトノックアウトまたはノックイン遺伝子組換え哺乳動物の組織に由来する細胞が特に好適であり、ここで、レナラーゼ遺伝子を含む導入遺伝子は、種々の組織におけるレナラーゼの発現を発現または抑制する。一例として、このような細胞が由来する細胞タイプとしては、（１）レナラーゼ（＋／＋）、（＋／−）および（−／−）非ヒト遺伝子組換え生産哺乳動物、（２）レナラーゼ（＋／＋）、（−／−）または（＋／−）胎児動物、および（３）レナラーゼ（＋／＋）、（−／−）および（＋／−）胎児および生産哺乳動物から得られる胎盤株細胞の線維芽細胞および線維芽様細胞が挙げられる。
【０２６０】
当業者は、この開示に基づいて、低レベルのレナラーゼタンパク質、低レベルのレナラーゼ活性、または両方を含む細胞は、これらに限定されないが、レナラーゼ発現の阻害剤を発現する細胞（例えば、アンチセンスまたはリボザイム分子）を含むことを認識するであろう。
【０２６１】
哺乳類細胞を培養中に維持するために有用である方法および組成物は当該技術分野において周知であり、ここで、哺乳類細胞は、特にこれらに限定されないが、本願明細書に記載の遺伝子組換えマウスなどのマウスから得られる細胞を含む哺乳動物から得られる。
【０２６２】
あるいは、レナラーゼを発現する組換え型細胞はｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ治療で投与されることが可能であり、組換え型細胞の投与は、これにより、タンパク質を細胞、組織、および／または動物に投与する。さらに、組換え型細胞は、レナラーゼリガンドおよびレナラーゼシグナル経路の発見に有用である。
【０２６３】
本発明の方法において用いられる組換え型細胞は、レナラーゼは細胞移動、外膜線維症、動脈再狭窄、負の再構築等に関与すると仮定されてきているため、細胞ホメオスタシスおよび細胞増殖および／または移動への高いまたは低いレナラーゼレベルの効果を研究するために用いられ得る。
【０２６４】
本発明の方法において用いられる組換え型細胞であって、レナラーゼを発現しないよう、または低量のまたは異常なレナラーゼ欠乏生物活性を発現するよう操作された細胞がまた、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞治療において用いられることが可能であり、ここで、動物自身の細胞（例えば、線維芽細胞等）、または同系間で適合したドナーのものの一方が、本願明細書の他の箇所に記載のとおり組み換え的に操作され（例えば、レナラーゼ発現および／またはタンパク質レベルがこれにより組換え型細胞において低減されるようなアンチセンス核酸またはノックアウトベクターの挿入により）、および組換え型細胞が、レシピエント動物に投与される。このように、レナラーゼを低いレベルで発現する組換え型細胞は、自身の細胞が高レベルのレナラーゼを発現する動物に投与されることが可能であり、これにより、本願明細書の他の箇所に記載のとおり増加したレナラーゼ発現に関連する、またはに媒介される疾病、障害または状態が治療または緩和される。
【０２６５】
本発明の方法において用いられる、例えばレナラーゼノックアウトマウスなどの外膜線維症、動脈再狭窄等に対する感受性が付与された遺伝子組換え哺乳動物は、これらの疾病の病変形成および、これにおけるレナラーゼの潜在的な役割を研究するために用いられることが可能である。
【０２６６】
さらに、本発明の方法において用いられる遺伝子組換え哺乳動物および／または細胞は、レナラーゼの細胞内局在をさらに研究するために用いられ得る。また、本発明の方法において用いられる遺伝子組換え哺乳動物（＋／−および−／−生産および胎児の両方）および／または細胞は、レナラーゼのカテコールアミン循環における役割を研究して、レナラーゼ作用ならびに、レナラーゼと結合して細胞においてその効果を媒介するいずれかの受容体および／またはリガンドの標的を明らかにするために用いられ得る。
【０２６７】
ＶＩ．抗体
本発明はまた、特異的にレナラーゼ、またはそのフラグメントに結合する抗体を使用する方法を含む。当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、特異的にレナラーゼに結合する抗体は、特にこれらに限定されないが、ヒトレナラーゼまたはその免疫原性部分などの本発明のタンパク質に結合することを理解するであろう。一実施形態においては、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むラットレナラーゼに向けられる。
【０２６８】
ポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知である標準的な免疫学的技術に準拠してウサギを免疫化することにより産生される（例えば、Harlowら、１９８８年、「Antibodies, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（NY）を参照のこと）。このような技術は、レナラーゼ部分に免疫原性が付与されるよう、マルトース結合タンパク質またはグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分、および／または部位などの他のタンパク質の部分（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨと複合化したレナラーゼ）およびげっ歯類および／またはヒトレナラーゼアミノ酸残基の各々を含む部分を含むキメラタンパク質での動物の免疫化を包含する。キメラタンパク質は、レナラーゼをコードする適切な核酸（例えば、配列番号１）を、特にこれらに限定されないが、ｐＭＡＬ−２またはｐＣＭＸなどのこの目的に好適なプラスミドベクターにクローン化させることにより産生される。
【０２６９】
しかしながら、本発明は、これらの抗体またはタンパク質抗原のこれらの部分にのみ限定されるとして理解されるべきではない。むしろ、本発明は、他の抗体（この用語は本願明細書の他の箇所において定義されているとおり）は、ラットおよびヒトレナラーゼ、またはこれらの部分を含むと解釈されるべきである。さらに、本発明は、抗体、とりわけ、レナラーゼと結合する抗体を包含すると解釈されるべきであり、および、これらは、組織の免疫組織化学的染色においてウェスタンブロット法で存在するレナラーゼに結合することが可能であり、これにより、レナラーゼを、組織、およびレナラーゼの少なくとも一部分をコードする核酸で過渡的に形質移入された細胞の免疫蛍光顕微鏡に局在化させる。
【０２７０】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、抗体は、タンパク質のいずれかの部分に特異的に結合することが可能であると共に、完全長タンパク質は、従って、抗体を特異的に産生するために用いられることが可能であることを認識するであろう。しかしながら、本発明は、完全長タンパク質を免疫原として用いることに限定されていない。むしろ、本発明は、哺乳類レナラーゼと特異的に結合する抗体の産生に、タンパク質の免疫原性部分を使用することを含む。すなわち、本発明は、レナラーゼタンパク質の免疫原性部分、または抗原決定基を用いる動物の免疫化を含む。これらの抗体は、特にこれらに限定されないが、ウサギまたはマウスなどの動物を、本発明のタンパク質、またはその一部で免疫化することにより、または例えば、適切なレナラーゼアミノ酸残基を含む部分に共有結合したマルトース結合タンパク質タグポリペプチド部分を含むタグポリペプチド部分を含む、レナラーゼ、または融合タンパク質の少なくとも部分を含むタンパク質を用いて動物を免疫化することにより、産生されることが可能である。当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、これらのタンパク質のより小さいフラグメントもまた、レナラーゼに特異的に結合する抗体の産生に用いることが可能であることを認識するであろう。
【０２７１】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、単離されたレナラーゼポリペプチドの種々の部分もまた、レナラーゼの高度な保存領域またはポリペプチドの非保存領域の一方に抗体を産生させるために用いることが可能であることを認識するであろう。本願明細書の他の箇所に記載のとおり、レナラーゼは、特にこれらに限定されないが、Ｎ終端からの推定シグナルペプチド、ＦＡＤ結合ドメイン（約４〜３５のアミノ酸残基）；アミンオキシダーゼドメイン（約７５〜３３９のアミノ酸残基）を含む種々の保存ドメインを含む。
【０２７２】
一旦、レナラーゼの配列を備えると共に、およびタンパク質の種々の保存および非保存ドメインを局在化する詳細な分析をすると、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、当該技術分野において周知であるかまたは開発されるであろう方法、ならびに本願明細書に開示の方法を用いて、哺乳類レナラーゼポリペプチドの種々の部分に特異的な抗体をどのように得るかを理解するであろう。
【０２７３】
さらに、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、関心のあるタンパク質の非保存領域は、種々の生物間で保存された高度な保存領域より免疫原性であることが可能であることを認識するであろう。さらに、非保存免疫原性部分を用いる免疫化は非保存領域について特異的な抗体を産生することが可能であり、これにより、１つまたは複数の保存部分を共有することが可能である他のタンパク質と交差反応しない抗体を産生することが可能である。それ故、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、各レナラーゼ分子の非保存領域を、そのレナラーゼのみに特異的であると共に、他のレナラーゼまたは他のタンパク質と非特異的に交差反応しない抗体の産生に用いることが可能であることを認識するであろう。
【０２７４】
あるいは、当業者はまた、本願明細書に既定の開示に基づいて、１つまたは複数のレナラーゼ分子間で保存された領域を用いて発生された抗体を用いて、１つまたは複数のレナラーゼ分子と特異的に反応する抗体を産生することが可能であることを理解するであろう。そうでなければこのタンパク質の他の部分より免疫原性に劣り得る保存タンパク質ドメインに特異的に結合する抗体を産生する方法は当該技術分野において周知であり、および、これらに限定されないが、関心のあるタンパク質フラグメントを分子（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン等）に共役化して、これによりタンパク質ドメイン免疫原性を付与する方法、または補助剤（例えば、フロイント完全および／または不完全アジュバント等）を用いることによる方法、または両方を含む。それ故、本発明は、すべてのレナラーゼに特異的に結合する抗体を含む、２つ以上のレナラーゼに特異的に結合するレナラーゼおよび抗体の少なくとも１つを認識する抗体の使用を放散する。
【０２７５】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、レナラーゼの部分が保存ドメインを共有する他のタンパク質との相同性に劣るかを認識するであろう。しかしながら、本発明は、いずれかの特定のドメインの使用に限定されず；代わりに、当業者は、本発明のレナラーゼタンパク質の他の非保存領域を用いて、本願明細書に開示の本発明の方法において用いられる抗体を産生することが可能であることを理解するであろう。
【０２７６】
従って、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明は、レナラーゼ活性を中和および／または抑制する（例えば、必要なレナラーゼ受容体／リガンド相互作用を抑制することにより）抗体の使用を包含し、これらの抗体は、特にこれらに限定されないが、ヒトレナラーゼ、ならびに種々の種に由来するレナラーゼ（例えば、マウスレナラーゼ）を含む１つまたは複数のレナラーゼを認識することが可能であることを認識するであろう。
【０２７７】
本発明は、単に、本願明細書に開示の抗体または本発明のタンパク質のいずれかの特定の免疫原性部分の使用に限定されると理解されるべきではない。むしろ、本発明は、レナラーゼに対する他の抗体（この用語が本願明細書のたの箇所に定義されているとおり）またはその部分、または配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも約１５％ホモロジーを共有するタンパク質に対する他の抗体の使用を含むと解釈されるべきである。他の実施形態において、ポリペプチドは、ヒトレナラーゼに対して、少なくとも約２０％相同的、または少なくとも約２５％相同的、または少なくとも約３０％相同的、または少なくとも約３５％相同的、または少なくとも約４０％相同的、または少なくとも約４５％相同的、または少なくとも約５０％相同的、または少なくとも約５５％相同的、または少なくとも約６０％相同的、または少なくとも約６５％相同的、または少なくとも約７０％相同的、または少なくとも約７５％相同的、または少なくとも約８０％相同的、または少なくとも約８５％相同的、または少なくとも約９０％相同的、または少なくとも約９５％相同的、または少なくとも約９９％相同的である。他の実施形態において、哺乳類レナラーゼに対して特異的な抗体と特異的に結合するポリペプチドがヒトレナラーゼである。
【０２７８】
本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、合成抗体等の使用を包含する。当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明の抗体の重大な性質は、抗体がレナラーゼと特異的に結合することであることを理解するであろう。すなわち、本発明の方法において用いられる抗体は、当該技術分野において周知である標準的な方法を用いる、細胞の免疫染色、および／またはレナラーゼの免疫沈降におけるウェスタンブロット法での抗体結合レナラーゼにより示されるとおり、レナラーゼ、またはそのフラグメント（例えば、その免疫原性部分または抗原決定基）を認識する。
【０２７９】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、抗体を、関連するタンパク質を細胞中に局在化するため、およびこれにより認識される抗原の細胞プロセスにおける役割を研究するために用いることが可能であることを認識するであろう。しかも、抗体は、特にこれらに限定されないが、ウェスタンブロット法および酵素−酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの周知の方法を用いて、生物学サンプル中に存在するタンパク質の量を検出しおよび、または計測するために用いられることが可能である。しかも、抗体は、それらの同族抗原を、当該技術分野において周知である方法を用いて免疫沈降および／または免疫親和性精製するために用いられることが可能である。
【０２８０】
加えて、抗体は、細胞中のレナラーゼのレベルを低減させ、これにより細胞におけるレナラーゼの効果を抑制するために用いられることが可能である。それ故、抗体を、動物の細胞または組織または動物自体に投与することにより、必要なレナラーゼ受容体／リガンド相互作用が、従って、レナラーゼ媒介性シグナル伝達の効果もまた抑制されるよう抑制される。当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、抗レナラーゼ抗体を用いるレナラーゼリガンド／受容体相互作用の抑制で検出可能な効果としては、これらに限定されないが、細胞の増殖の低減、細胞移動の低減、負のモデリングの低減、外膜線維症の低減、動脈再狭窄の低減、いずれかの器官または組織における線維症の低減、骨化または骨形成の低減等を挙げることが可能であることを理解するであろう。
【０２８１】
ポリクローナル抗体の産生は、所望の動物を、それからの抗原に特異的に結合する抗原および単離された抗体で、例えば、Harlowら（１９８８年、「Antibodies, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（NY））に記載のものなどの標準的な抗体産生方法を用いて播種することにより達成される。
【０２８２】
タンパク質またはペプチドの完全長またはペプチドフラグメントに向けられたモノクローナル抗体は、例えば、Harlowら（１９８８年、「Antibodies, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（NY））およびTuszynskiら（１９８８年、「Blood」、７２：ｐ．１０９〜１１５）に記載のものなどのいずれかの周知のモノクローナル抗体調製手法を用いて調製し得る。所望のペプチドの量を、化学合成技術を用いて合成し得る。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡは、大量のペプチドの産生に好適な細胞において適切なプロモータ配列からクローン化され、および発現され得る。ペプチドに向けられたモノクローナル抗体は、本願明細書において参照された標準的な手法を用いてペプチドで免疫化されたマウスから産生される。
【０２８３】
本願明細書に記載の手法を用いて得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該技術分野において利用可能であり、例えば、Wrightら（１９９２年、「Critical Rev. Immunol.」１２：ｐ．１２５〜１６８）、およびこの中で援用されている文献に記載の技術を用いてクローン化および配列化され得る。
【０２８４】
さらに、本発明の抗体は、例えば、Wrightら（上記を参照）、およびこの中で援用されている文献、およびGuら（１９９７年、「Thrombosis and Hematocyst」７７：ｐ．７５５〜７５９）に記載の技術、および当該技術分野において周知である、または開発されるであろう抗体をヒト化する他の方法を用いて「ヒト化」され得る。
【０２８５】
ファージ抗体ライブラリを産生するために、ｃＤＮＡライブラリが、先ず、例えば所望の抗体といったファージ表面上に発現されるべき所望のタンパク質を発現する、例えばハイブリドーマといった細胞から単離されるｍＲＮＡから得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーは、逆転写酵素を用いて産生される。免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡはＰＣＲにより得られ、および得られたＤＮＡが、好適なバクテリオファージベクターにクローン化されて、免疫グロブリン遺伝子を特定するＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリが作成される。非相同的ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリを形成するための手法は当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら、（上記を参照）に記載されている。
【０２８６】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、タンパク質が、その関連する結合タンパク質（例えば、抗体が向けられる抗原）への結合に利用可能であるような方策でその表面に現されるように、操作され得る。それ故、特定の抗体を発現するバクテリオファージが、関連する抗原を発現する細胞の存在下にインキュベートされるとき、バクテリオファージは細胞に結合することとなる。抗体を発現しないバクテリオファージは、細胞に結合しないであろう。このようなパニング技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Wrightら（上記を参照）に記載されている。
【０２８７】
上述のものなどのプロセスは、Ｍ１３バクテリオファージディスプレイを用いるヒト抗体の産生のために開発されてきた（Burtonら、１９９４年、「Adv. Immunol.」５７：ｐ．１９１〜２８０）。基本的に、ｃＤＮＡライブラリは、抗体産生細胞の固体群から得られるｍＲＮＡから作成される。ｍＲＮＡは、再編成された免疫グロブリン遺伝子をコードし、およびそれ故、ｃＤＮＡは同一のものをコードする。増幅されたｃＤＮＡはＭ１３発現ベクターにクローン化されて、ヒトＦａｂフラグメントをそれらの表面上に発現するファージのライブラリを形成する。関心のある抗体をディスプレイするファージは抗原結合により選択され、および細菌中に増殖して、可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを産生する。それ故、従来のモノクローナル抗体合成とは対照的に、この手法は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなく、ヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０２８８】
上記の手法は抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの産生を説明する。しかしながら、本発明は、単に、Ｆａｂ抗体をコードするファージの産生に制限されると解釈されるべきではない。むしろ、単鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）もまた本発明に包含される。Ｆａｂ分子はＩｇ軽鎖の全体を含み、すなわち、これらは、軽鎖の可変部および定常部の両方を含むが、重鎖の可変部および第１の定常部ドメイン（ＣＨ１）のみを含む。単鎖抗体分子は、Ｉｇ  Ｆｖフラグメントを含む単鎖のタンパク質を含む。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは、その中に含有される定常部を有さない抗体の重鎖および軽鎖の可変部のみを含む。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含むファージライブラリーは、Marksら（１９９１年、「J. Mol. Biol.」２２２：ｐ．５８１〜５９７）に記載の手法に従って作成され得る。所望の抗体の単離のためのこのように産生されたファージのパニングは、Ｆａｂ  ＤＮＡを含むファージライブラリーについて記載されたものと類似の方策で実施される。
【０２８９】
本発明はまた、重鎖および軽鎖可変部がほとんどすべての可能な特異性を含むよう合成されていてもよい合成ファージディスプレイライブラリーの使用を含むと解釈されるべきである（Barbas、１９９５年、「Nature Medicine」１：ｐ．８３７〜８３９；de Kruifら１９９５、「J. Mol. Biol.」２４８：ｐ．９７〜１０５）。
【０２９０】
ＶＩＩ．組成物
本発明は、転写に関してアンチセンス配向にある哺乳類レナラーゼをコードする、核酸、またはその部分に相補的な単離された核酸を含む組成物の使用を含む。好ましくは、この組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【０２９１】
本発明は、本願明細書に記載の単離された哺乳類レナラーゼポリペプチドを含む組成物の使用を含む。好ましくは、この組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【０２９２】
本発明はまた、レナラーゼに特異的に結合する抗体を含む組成物の使用を含む。好ましくは、組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【０２９３】
本発明は、哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む組成物の使用をさらに含む。好ましくは、この組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【０２９４】
組成物は、細胞、組織、または動物へのレナラーゼの投与、または、細胞、組織、または動物におけるレナラーゼの発現の抑制のために用いられることが可能である。組成物は、その動物に対して有益であるよう細胞、組織、または動物におけるレナラーゼ発現またはタンパク質のレベルを低減しまたは増加するよう、レナラーゼの異常な発現によって媒介された疾病、障害または状態を処置するために有用である。すなわち、動物における疾病、障害または状態がレナラーゼ発現またはタンパク質レベルの異常なレベルにより媒介され、またはに関連する場合、組成物は、レナラーゼのこのような発現またはタンパク質レベルを調節するために用いられることが可能である。
【０２９５】
哺乳動物への投与について、ポリペプチド、またはこれをコードする核酸、および／またはそのすべてまたは一部分に相補的なアンチセンス核酸は、いずれかの薬学的に許容可能なキャリア、例えば約７．８のｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中に懸濁されていることが可能である。
【０２９６】
有用である他の薬学的に許容可能なキャリアとしては、これらに限定されないが、グリセロール、水、生理食塩水、エタノールおよび有機酸のリン酸塩および塩などの他の薬学的に許容可能な塩溶液が挙げられる。これらおよび当業者に公知である他の薬学的に許容可能なキャリアの例が、Remington's Pharmaceutical Sciences（１９９１年、Mack Publication Co.、ニュージャージー（New Jersey））に記載されている。
【０２９７】
医薬品組成物は、無菌注入用水性または油性懸濁液または溶液の形態で調製され、梱包され、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に準拠して配合され得、および活性処方成分に追加して、本願明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などの追加の要素を含み得る。このような無菌注入用配合物は、例えば水または１，３−ブタンジオールなどの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤を用いて調製され得る。他の許容可能な希釈剤および溶剤としては、これらに限定されないが、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油が挙げられる。
【０２９８】
本発明の方法において有用である医薬品組成物は、経口、肛門直腸の、膣の、非経口的な、局所的、肺性、鼻腔内、口腔、点眼、または投与の他の経路に好適な配合物で投与され、調製され、梱包され、および／または販売され得る。他の予期される配合物としては、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性処方成分を含有する再封入赤血球、および免疫学的ベースの配合物が挙げられる。
【０２９９】
本願明細書において用いられるところ、「ナノ粒子」は、１〜１０００ナノメートルの直径を有する、いずれかのサイズ、形状または形態学を有する粒子として定義される。ナノ粒子は、１つまたは複数の導電性シェル層で囲まれた個別の誘電性または半導体コアセクションを有するナノ粒子である「ナノシェル」でもあり得る。「ナノシェル」は、個別のコア／シェル構造により特徴付けられるナノ粒子の亜種である。ナノシェルおよびナノ粒子の両方は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等などの負電荷分子に結合するためのドーパントを含有し得る。通例用いられる、正電荷ドーパントの例としては、Ｐｒ３、Ｅｒ３、およびＮｄ３が挙げられる。本願明細書において用いられるところ、「シェル」とは、一般に、１つのコアの少なくとも一部分を囲むこととなる１つまたは複数のシェルを意味する。数々のコアが、より大きなナノシェルに組み込まれてもよい。一実施形態においては、ナノ粒子は、標準的な方法を用いて動物に投与される。
【０３００】
本願明細書において用いられるところ、ナノ粒子を「送達する」という用語は、標的箇所で細胞に接触することが可能となる粒子の数を最大とするために、例えば静脈内といった標的箇所に結合する、隣接する、または十分に近いナノ粒子の配置を説明するために用いられる。
【０３０１】
本発明において用いられる組成物はナノ粒子に、に対して、またはについて結合する核酸配列、ならびに、これらの使用方法を含む。結合されたナノ粒子は、内皮細胞などの核酸配列の多様な生物学的標的への送達に用いられることが可能である。一実施形態においては、例えば遺伝子発現のためにプロモータの制御下にある核酸遺伝子といった核酸が、正にドープされたナノコアに結合され、これが、次いで、例えば、関心のある細胞上のリガンド標的に特異的である標的化リガンドを含むシェルによって囲まれる。
【０３０２】
本発明の一実施形態は、ナノ粒子内に／に対して結合した核酸配列の使用に関する。ナノ粒子は、「ナノ粒子前駆体」のアセンブリによって調製される。核酸配列は、一般に、生物学的標的への送達のために選択されたいずれかの核酸配列であることが可能である。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または他の合成または修飾された核酸配列であることが可能である。一実施形態においては、核酸配列は、ヒトレナラーゼをコードするＤＮＡ配列である（GenBank受入番号ＢＣ００５３６４）。ＤＮＡ配列は、天然配列、天然配列の修飾された版、または合成配列であり得る。一実施形態において、核酸は、標的宿主のコドン使用割合を最大化するために修飾されている。天然配列は、ヒト、サル、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、クマ、ウサギ、ムース、魚、ヒツジ、または他の動物配列であり得る。配列は、修飾されて、特定の配列を付加または削除し得る。例えば、ＤＮＡ配列は、修飾されて、例えば制限部位を除去し、共通の開裂または突然変異部位を排除し、ナノコアへの結合を最大化することが可能である。配列は、さらに修飾されて、タンパク質切断部位の転写、翻訳、局在化、排除；開裂および／またはプロセシング部位の付加、ならびにグリコシル化部位の付加または除去を補助する追加の配列を含み得る。
【０３０３】
一実施形態において、ナノ粒子前駆体は、ナノ粒子ポリマーに結合した核酸配列を含む。ナノ粒子前駆体および核酸の間の結合は、非共有結合または共有結合であり得る。ナノ粒子ポリマーは、ナノ粒子に集合することが可能であるいずれかのポリマーであり得る。例えば、核酸配列は、第１のポリマーに非共有結合していることが可能である。この第１のポリマーは、ポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）などのＤＮＡ結合カチオン性ポリマーであることが可能である。第１のポリマーは、第２のポリマーに共有結合していることが可能である。第２のポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーであることが可能である。例えば、第２のポリマーは、ＰＥＩの第１級アミンの画分に共役されることが可能である。
【０３０４】
親水性ポリマーは、抗体などのリガンドに結合されることが可能である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることが可能であり、モノクローナル抗体が本件では好ましい。抗体は、生物学的受容体または他の細胞性発現タンパク質について特異的であることが可能である。例えば、抗体は、レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体−１、Ｌｏｘ−１を結合することが可能である。抗体は魅力的な結合能を提供するが、比較的高い立体容積を有する。より小さい抗体フラグメントまたは他の結合ペプチドまたは分子は、本発明の種々の実施形態においてリガンドとして用いられ得る。
【０３０５】
ナノ粒子前駆体が自己集合するとき、核酸分子は、形成されたナノ粒子内に被包され、および抗体またはリガンドがナノ粒子の表面上に存在する。被包された核酸分子は、環境、酵素、加水分解、または他の分解力による分解から部分的にまたは完全に保護されている。
【０３０６】
集合したナノ粒子は、一般に、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの平均直径を有することが可能である。直径のより狭い範囲は、約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、および約４０ｎｍ〜約１００ｎｍを含む。
【０３０７】
本発明の追加の実施形態は、集合したナノ粒子に関する。集合したナノ粒子は、溶液中に集合したナノ粒子前駆体を含む。集合したナノ粒子は、好ましくは、ナノ粒子の内部容積内に核酸配列を含有し、および抗体または他の結合ペプチドが、ナノ粒子の外面上に存在していた。ナノ粒子は、一般に、いずれかの形状であることも可能であり、約球状が本件では好ましい。抗体は、好ましくは、それらの自然な立体構造を維持して、自身の自然の標的への結合を許容する。
【０３０８】
集合したナノ粒子は、溶液、乾燥、リポソーム等を含む多様な配合物で存在することが可能である。配合物の特定の例としては、フラーレンナノ粒子、逆電荷ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および安定化剤として亜鉛を有する硫酸デキストラン（ＤＳ）、リン酸カルシウムナノ粒子、ヒドロ−またはフルオロカーボン末端部の一方を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから誘導される末端封止オリゴマーから構成される水性ナノ粒子；共役ポリ（アミノポリ（エチレングリコール）シアノアクリレート−コ−ヘキサデシルシアノアクリレート（ポリ（Ｈ（２）ＮＰＥＧＣＡ−コ−ＨＤＣＡ）ナノ粒子、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から配合された生分解性ナノ粒子、および水溶性、生分解性ポリホスホエステル、ポリ（２−アミノエチルプロピレンリン酸）（ＰＰＥ−ＥＡ）ナノ粒子が挙げられる。
【０３０９】
本発明の態様はまた、集合したナノ粒子を調製する方法に関する。この方法は、ポリマー共役体の形成、およびポリマー共役体を核酸と接触させてナノ粒子を形成する工程を含むことが可能である。ポリマー共役体は、第１のポリマー、第２のポリマー、およびリガンドを含む。第１のポリマーは、好ましくは、非共有結合的な方策で核酸に結合する。本件で好ましい第１のポリマーは、ポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）などのＤＮＡ結合カチオン性ポリマーである。第２のポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの親水性ポリマーであることが可能である。リガンドは本件では、抗体であることが好ましい。
【０３１０】
ポリマー共役体の部分が共有結合により結合されていることが本件では好ましい。ポリマー共役体のアセンブリの特定の順番は異なることが可能である。例えば、第１のポリマーおよび第２のポリマーが結合されることが可能であり、次いでリガンドが結合されることが可能である。あるいは、第２のポリマーおよびリガンドが結合されることが可能であり、次いで第１のポリマーが結合されることが可能である。この方法は、接触させる工程の後に実施されるべき単離または精製工程をさらに含むことが可能である。記載の集合したナノ粒子は、多様な用途で用いられることが可能である。ナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ用途で用いられることが可能である。
【０３１１】
本発明はまた、微結晶性形態におけるレナラーゼの医薬品組成物の使用を提供する。タンパク質結晶を得るための種々の方法が開発されてきており、自由界面拡散法（Salemme,F. R.（１９７２年）「Arch. Biochem. Biophys.」１５１：ｐ．５３３〜５３９）、懸滴またはsitting drop法での蒸気拡散（McPherson, A.（１９８２年）「Preparation and Analysis of Protein Crystals」、John Wiley and Son、ニューヨーク（New York）、ｐ．８２〜１２７）、および液体透析法（Bailey, K.（１９４０年）「Nature」１４５：ｐ．９３４〜９３５）が挙げられる。非結晶性タンパク質と比して、結晶性タンパク質は、タンパク質の安定性および濃度に顕著な向上を提供し、これは、タンパク質の経口および非経口的な送達に対する機会をもたらす。いくつかの事例においては、分子の特定の結晶性形態は、より生理活性を有し、より速く溶解し、分解の容易さがより低く、および／または精製がより容易であり得る。
【０３１２】
タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモンおよびペプチド結晶または結晶性配合物は、ヒトおよび動物への生物学的送達のために組成物内に被包されることが可能である。タンパク質を結晶化させる方法、医薬品要素または賦形物を用いて安定化された配合物を調製する方法、および任意により、高分子キャリア中にこれらを被包して組成物を産生する方法、ならびに、このようなタンパク質結晶配合物および組成物を、治療的タンパク質およびワクチンの送達を含む生物医学的用途用のために用いる方法は当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第６，５４１，６０６号明細書は、タンパク質結晶または結晶配合物は、高分子キャリアを含むマトリックス内に被包されて組成物が形成されることが開示されている。この配合物および組成物は、タンパク質の未変性生体活性第３級構造の保存性を強め、および活性タンパク質を、必要な場所および時に徐々に放出することが可能である蓄積を形成する。このような高分子キャリアは生体適合性および生分解性ポリマーを含む。生体活性タンパク質は、その後、制御された方策で、特定の被包技術、ポリマー配合物、結晶幾何学的形状、結晶溶解度、結晶架橋性および用いられる配合物状態によって決定される期間にわたって放出される。
【０３１３】
本発明の組成物は、特にこれらに限定されないが、経口、肛門直腸の、膣の、非経口的な、局所的、肺性、鼻腔内、口腔、または点眼投与経路を含む数多くの経路を介して投与され得る。投与経路は、当業者には容易に明らかであり、処置されている疾病のタイプおよび重症度、処置されている獣医学的またはヒト患者のタイプおよび年齢等を含む要因のいずれかの数で依存することとなる。
【０３１４】
本発明の方法において有用である医薬品組成物は、全身的に、経口固体配合物、点眼、座薬、エアロゾル、局所的または他の類似の配合物で投与され得る。ヘパラン硫酸、またはその生物学的均等物などの化合物に追加して、このような医薬品組成物は、薬学的に許容可能なキャリアおよび薬物投与を増強し、および促進すると知られている他の要素を含有し得る。ナノ粒子、リポソーム、再封入赤血球、および免疫学的ベースの系などの他の可能な配合物がまた用いられて、本発明の方法により、レナラーゼおよび／またはこれをコードする核酸を投与し得る。
【０３１５】
本願明細書に記載の方法のいずれかを用いて同定され、配合され得、および動脈再狭窄、外膜線維症、いずれかの器官または組織における線維症、負の再構築、過剰な骨形成、過剰な骨化等の治療のために哺乳動物に投与され得る化合物が、ここに記載される。
【０３１６】
本発明は、動脈再狭窄、外膜線維症、負の再構築等の治療に、活性処方成分として有用な化合物を含む医薬品組成物の調製および使用を包含する。このような医薬品組成物は活性処方成分単独から、対象への投与に好適な形態で構成され得、またはこの医薬品組成物は、活性処方成分および１種または複数種の薬学的に許容可能なキャリア、１種または複数種の追加の要素、またはこれらの組み合わせのいくつかを含み得る。活性処方成分は、薬品組成物中に、当該技術分野において周知であるように、生理学的に許容可能なカチオンまたはアニオンとの組み合わせなどの、生理学的に許容可能なエステルまたは塩の形態で存在し得る。
【０３１７】
本願明細書において用いられるところ、「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、活性処方成分が一緒に組み合わされ得るものであって、組み合わせに続いて、対象への活性処方成分の投与に用いられることが可能である化学組成物を意味する。本願明細書において用いられるところ、「生理学的に許容可能な」エステルまたは塩という用語は、医薬品組成物のいずれかの他の要素と適合性であり、この組成物が投与されるべき対象に対して有害ではない活性処方成分のエステルまたは塩形態を意味する。
【０３１８】
本願明細書に記載の医薬品組成物の配合物は、公知であるかまたは薬理学の当該技術分野において将来に開発されるいずれかの方法によって調製され得る。普通、このような調製方法は、活性処方成分をキャリアまたは１種または複数種の他の補助要素と関連させる工程と、および次いで、必要なまたは所望の場合には、生成物を所望の単一または複数投与量単位に成形またはパッケージングする工程とを含む。
【０３１９】
本願明細書に提供される医薬品組成物の記載は、主にヒトへの倫理的投与に好適である医薬品組成物に向けられているが、このような組成物は、一般に、すべての種類の動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。種々の動物への投与に組成物を好適とするための、への投与に好適である医薬品組成物の修飾はよく理解されており、および通常の通常の知識を有する獣医学薬理学者は、必要であっても、単に通常の実験でこのような修飾を設計し、および実施することが可能である。本発明の医薬品組成物の投与が予期される対象としては、これらに限定されないが、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなどの商業的に関連性のある哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられる。
【０３２０】
本発明の方法において有用である医薬品組成物は、経口、肛門直腸の、膣の、非経口的な、局所的、肺性、鼻腔内、口腔、点眼、髄腔内または他の経路の投与に好適な配合物で調製され、梱包され、または販売され得る。他の予期される配合物としては、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性処方成分を含有する再封入赤血球、および免疫学的ベースの配合物が挙げられる。
【０３２１】
本発明の医薬品組成物は、単一単位投与量として、または複数の単一単位投与量としてのバルクで調製され、梱包され、または販売され得る。本願明細書において用いられるところ、「単位投与量」とは、予め定められた量の活性処方成分を含む医薬品組成物の個別の量である。活性処方成分のこの量は、一般に、対象に投与されることとなる活性処方成分の投与量、または例えば、このような投与量の半分または三分の一などのこのような投与量の簡便な画分に等しい。
【０３２２】
本発明の医薬品組成物における活性処方成分、薬学的に許容可能なキャリア、およびいずれかの追加の要素の相対量は、同一性、サイズ、および処置される対象の状態に応じて、および組成物が投与される経路にさらに応じて異なることとなる。一例として、組成物は、０．１％および１００％（ｗ／ｗ）の間の活性処方成分を含み得る。
【０３２３】
活性処方成分に追加して、本発明の医薬品組成物は、１種または複数種の追加の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。特に予期される追加の薬剤としては、シアン化物およびシアン酸捕捉剤などの抗催吐剤および捕捉剤が挙げられる。
【０３２４】
本発明の医薬品組成物の放出制御性または徐放性配合物は、従来の技術を用いて形成され得る。経口投与に好適である本発明の医薬品組成物の配合物は、特にこれらに限定されないが、各々予め定められた量の活性処方成分を含有する、錠剤、硬質または軟質カプセル、カシェ剤、トローチ、または舐剤を含む個別の固体投与量単位の形態で調製され、梱包され、または販売され得る。経口投与に好適な他の配合物としては、これらに限定されないが、粉末または顆粒状配合物、水性または油性懸濁液、水性または油性溶液、またはエマルジョンが挙げられる。
【０３２５】
本願明細書において用いられるところ、「油性」液体は、炭素含有液体分子を含むと共に、水より劣った極性特徴を示すものである。活性処方成分を含む錠剤は、例えば、任意により１種または複数種の追加の要素と共に、活性処方成分を圧縮しまたは成形することにより形成され得る。圧縮された錠剤は、好適なデバイスにおいて、粉末または顆粒状調製物などの易流動性形態の活性処方成分を、任意により、１種または複数種のバインダ、潤滑剤、賦形剤、表面活性剤、および分散剤と混合して圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、好適なデバイスにおいて、活性処方成分、薬学的に許容可能なキャリア、およびこの混合物を湿らすに少なくとも十分な液体の混合物を成形することにより形成され得る。錠剤の生産において用いられる薬学的に許容可能な賦形物としては、これらに限定されないが、不活性希釈剤、造粒および崩壊薬、結合剤、および潤滑剤が挙げられる。公知の分散剤としては、これらに限定されないが、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられる。公知の表面活性剤としては、これらに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。公知の希釈剤としては、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、およびリン酸ナトリウムが挙げられる。公知の造粒および崩壊薬としては、これらに限定されないが、コーンスターチおよびアルギン酸が挙げられる。公知の結合剤としては、これらに限定されないが、膠、アカシア、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。公知の潤滑剤としては、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、およびタルクが挙げられる。
【０３２６】
錠剤は、未被覆であり得、またはこれらは、公知の方法を用いて被覆されて、対象の胃腸管において遅延型の分解を達成し、これにより、活性処方成分の持続的な放出および吸収を提供し得る。一例として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料が、錠剤の被覆に用いられ得る。さらなる一例として、錠剤は、米国特許第４，２５６，１０８号明細書；同４，１６０，４５２号明細書；および同４，２６５，８７４号明細書に記載の方法を用いて被覆されて、浸透圧的に徐放性の錠剤を形成し得る。錠剤は、薬学的に上品でおよび美味な調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、防腐剤、またはこれらの組み合わせのいくつかをさらに含み得る。
【０３２７】
活性処方成分を含む硬質カプセルは、膠などの生理学的に分解性の組成物を用いて形成され得る。このような硬質カプセルは活性処方成分を含み、および例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性固体希釈剤を含む追加の要素をさらに含み得る。活性処方成分を含む軟質膠カプセルは、膠などの生理学的に分解性の組成物を用いて形成され得る。このような軟質カプセルは、水または落花生油、液体パラフィン、またはオリーブ油などの油培地と懇望され得る活性処方成分を含む。
【０３２８】
経口投与に好適である本発明の医薬品組成物の液体配合物は、液体形態または水または他の好適なビヒクルで使用前にもどすことを意図する乾燥生成物の形態で調製され、梱包され、および販売され得る。
【０３２９】
液体懸濁液は、従来の方法を用いて、活性処方成分の水性または油性ビヒクル中での懸濁を達成して調製され得る。水性ビヒクルとしては、例えば、水および等張性生理食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ、オリーヴ、ゴマ、またはココナッツ油などの植物油、分画植物油、および液体パラフィンなどの鉱物油が挙げられる。液体懸濁液は、１種または複数種の追加の要素をさらに含み得、特にこれらに限定されないが、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑薬、防腐剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、および甘味剤が挙げられる。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含み得る。公知の懸濁剤としては、これらに限定されないが、ソルビトールシロップ剤、水素化食用脂肪、ナトリウムアルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ガムアカシア、およびナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が挙げられる。公知の分散剤または湿潤剤としては、これらに限定されないが、レシチンなどの天然のホスファチド；脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステル、または脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステル（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアリン酸、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）とのアルキレンオキシドの縮合物が挙げられる。公知の乳化剤としては、これらに限定されないが、レシチンおよびアカシアが挙げられる。公知の防腐剤としては、これらに限定されないが、ヒドロキシ安息香酸−メチル、−エチル、またはＮ−プロピル−パラ−、アスコルビン酸、およびソルビン酸。公知の甘味剤としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンが挙げられる。油性懸濁液用の公知の増粘剤としては、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、およびセチルアルコールが挙げられる。
【０３３０】
活性処方成分の水性または油性溶剤中の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同一の方策で調製され得るが、主な差は、活性処方成分が、溶剤中に懸濁されるのではなく溶解されることである。本発明の医薬品組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載した構成成分の各々を含み得るが、懸濁剤は必ずしも溶剤中での活性処方成分の溶解を補助しないであろうことは理解される。水性溶剤としては、例えば、水および等張性生理食塩水が挙げられる。油性溶剤としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール；ラッカセイ、オリーヴ、ゴマ、またはココナッツ油などの植物油、分画植物油、および液体パラフィンなどの鉱物油が挙げられる。
【０３３１】
本発明の医薬品調製物の粉末化および顆粒状配合物は、公知の方法を用いて調製され得る。このような配合物は、対象に直接的に投与され得、例えば、錠剤の形成、カプセルの充填、または水性または油性ビヒクルの添加による水性または油性懸濁液または溶液の調製のために用いられ得る。これらの配合物の各々は、１種または複数種の分散剤または湿潤剤、懸濁剤、および防腐剤をさらに含み得る。充填材などの追加の賦形物および甘味剤、香味剤、または着色剤もまたこれらの配合物中に含まれてもよい。
【０３３２】
本発明の医薬品組成物はまた、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンの形態で調製され、梱包され、または販売され得る。油性相は、オリーヴまたはラッカセイ油などの植物油、液体パラフィンなどの鉱物油、またはこれらの組み合わせであり得る。このような組成物は、ガムアカシアまたはトラガカントゴムなどの天然ガム、ダイズまたはレシチンホスファチドなどの天然ホスファチド、ソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸およびヘキシトール無水物の組み合わせに由来するエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどのエチレンオキシドとのこのような部分エステルの縮合物などの１種または複数種の乳化剤をさらに含み得る。これらのエマルジョンはまた、例えば、甘味剤または香味剤を含む追加の要素を含有し得る。
【０３３３】
本発明の医薬品組成物は、肛門直腸の投与に好適な配合物で調製され、梱包され、または販売され得る。このような組成物は、例えば、座薬、保留浣腸調製物、および肛門直腸のまたは大腸洗浄用溶液の形態であり得る。
【０３３４】
座薬配合物は、活性処方成分を、通常の室温（すなわち、約２０℃）で固体であると共に、対象の肛門直腸の温度（すなわち、健常なヒトで約３７℃）で液体である、非刺激性の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることにより形成され得る。好適な薬学的に許容可能な賦形物としては、これらに限定されないが、カカオバター、ポリエチレングリコール、および種々のグリセリドが挙げられる。坐薬配合物は、特にこれらに限定されないが、酸化防止剤および防腐剤を含む種々の追加の要素をさらに含み得る。
【０３３５】
保留浣腸調製物または肛門直腸または大腸洗浄用溶液は、活性処方成分を、薬学的に許容可能な液体キャリアと組み合わせることにより形成され得る。当該技術分野において周知であるとおり、浣腸調製物は、対象の肛門直腸解剖学に適合した送達デバイスを用いて投与され得、および内に梱包され得る。浣腸調製物は、特にこれらに限定されないが、酸化防止剤および防腐剤を含む種々の追加の要素をさらに含み得る。
【０３３６】
本発明の医薬品組成物は、膣の投与に好適な配合物で調製され、梱包され、または販売され得る。このような組成物は、例えば、座薬、タンポンなどの膣内に挿入可能な含浸または被覆材料、圧注調製物、またはゲルまたはクリームまたは膣洗浄用溶液の形態であり得る。
【０３３７】
材料を化学組成物で含浸させるかまたはコーティングする方法は当該技術分野において公知であると共に、これらに限定されないが、化学組成物を表面上に沈着させまたは結合させる方法、材料の合成の最中に化学組成物を材料の構造に組み込む方法（すなわち、生理学的に分解性材料と、など）、および、その後の乾燥ありまたは無しで、水性または油性溶液または懸濁液を吸収剤材料に吸収させる方法が挙げられる。
【０３３８】
膣洗浄用圧注調製物または溶液は、活性処方成分を薬学的に許容可能な液体キャリアと組み合わせることにより形成され得る。当該技術分野において周知であるとおり、圧注調製物は、対象の膣解剖学に適合された送達デバイスを用いて投与され得ると共に、内に梱包され得る。圧注調製物は、特にこれらに限定されないが、酸化防止剤、抗生物質、抗真菌性薬剤、および防腐剤を含む種々の追加の要素をさらに含み得る。
【０３３９】
本願明細書において用いられるところ、医薬品組成物の「非経口的な投与」は、対象の組織の物理的破壊により特徴付けられるいずれかの投与経路および組織における破壊を介する医薬品組成物の投与経路を含む。非経口的な投与としては、それ故、特にこれらに限定されないが、組成物の注入による、外科的な切開を介した組成物の適用による、組織穿通性非外科的創傷等を介した組成物の適用による医薬品組成物の投与が挙げられる。特に、非経口的な投与は、特にこれらに限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎臓透析注入技術を含むと予期される。
【０３４０】
非経口的な投与に好適な医薬品組成物の配合物は、無菌水または無菌等張性生理食塩水などの薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされる活性処方成分を含む。このような配合物は、ボーラス投与または連続投与に好適な形態で調製され、梱包され、または販売され得る。注入可能な配合物は、防腐剤を含有するアンプルまたは多投与量コンテナなどの単位投与形態で調製され、梱包され、または販売され得る。非経口的な投与用配合物としては、これらに限定されないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、および埋め込み式の徐放性または生分解性配合物が挙げられる。このような配合物は、特にこれらに限定されないが、懸濁剤、安定化剤または分散剤を含む１種または複数種の追加の要素をさらに含み得る。非経口的な投与用の配合物の一実施形態において、活性処方成分は、戻した組成物の非経口的な投与の前に好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンを含まない水）で戻すための乾燥（すなわち粉末または顆粒状）形態で提供される。
【０３４１】
医薬品組成物は、無菌注入用水性または油性懸濁液または溶液の形態で調製され、梱包され、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って配合され得ると共に、活性処方成分に追加して、本願明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などの追加の要素を含み得る。このような無菌注入用配合物は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤を用いて調製され得る。他の許容可能な希釈剤および溶剤としては、これらに限定されないが、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノ−またはジ−グリセリドなどの不揮発性油が挙げられる。有用である他の非経口的に投与可能な配合物としては、活性処方成分を、微結晶性形態、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の構成成分として含むものが挙げられる。徐放または移植用の組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩などの薬学的に許容可能な高分子または疎水性材料を含み得る。
【０３４２】
局所的投与に好適である配合物としては、これらに限定されないが、リニメント、ローション；クリームなどの水中油型または油中水型エマルジョン、軟膏剤またはペースト、および溶液または懸濁液などの液体または半液体調製物が挙げられる。局所的に投与可能な配合物は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）活性処方成分を含むが、活性処方成分の濃度は、活性処方成分の溶剤における溶解限度と同等に高くてもよい。局所的投与のための配合物は、本願明細書に記載の１種または複数種の追加の要素をさらに含み得る。
【０３４３】
本発明の医薬品組成物は、口腔を介する肺性投与に好適な配合物で調製され、梱包され、または販売され得る。このような配合物は、活性処方成分を含むと共に、約０．５〜約７ナノメートル、および好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲で直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、簡便には、噴射剤の流れが向けられて粉末が分散され得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用いる、または閉鎖コンテナ中の低沸点噴射剤中に溶解または懸濁された活性処方成分を含むデバイスなどの自己推進性溶剤／粉末分散コンテナを用いる、投与のための乾燥粉末の形態である。好ましくは、このような粉末は粒子を含み、ここで、少なくとも９８重量％の粒子が０．５ナノメートルを超える直径を有し、および少なくとも９５数％の粒子が７ナノメートル未満の直径を有する。より好ましくは、少なくとも９５重量％の粒子は、１ナノメートルを超える直径を有し、および少なくとも９０数％の粒子が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖質などの固体微粉末希釈剤を含み、および簡便には単位投与形態で提供される。
【０３４４】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に噴射剤は、５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）の組成物から構成され得、および活性処方成分は、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の組成物から構成され得る。噴射剤は、液体ノニオン性または固体アニオン性界面活性剤または固体希釈剤（好ましくは活性処方成分を含む粒子と同程度の粒径を有する）などの追加の要素をさらに含み得る。
【０３４５】
肺性送達用に配合された本発明の医薬品組成物はまた、小滴の溶液または懸濁液の形態で活性処方成分を提供し得る。このような配合物は、任意により無菌の、活性処方成分を含む水性または希釈アルコール性溶液または懸濁液として調製され、梱包され、または販売され得、および簡便には、いずれかの噴霧または微粒化デバイスを用いて投与され得る。このような配合物は、特にこれらに限定されないが、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝材、表面活性剤、またはヒドロキシ安息香酸メチルなどの防腐剤を含む１種または複数種の追加の要素をさらに含み得る。この投与経路によって提供される小滴は、好ましくは、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲に平均直径を有する。
【０３４６】
肺性送達に有用であるとして本願明細書に記載の配合物はまた、本発明の医薬品組成物の鼻腔内送達のために有用である。
【０３４７】
鼻腔内投与に好適である他の配合物は、活性処方成分を含む、約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い粉末である。このような配合物は、嗅ぎタバコを吸う方策で、すなわち、外鼻孔の近くに保持した粉末のコンテナからの鼻の流路を介した急な吸入により配合される。
【０３４８】
経鼻投与に好適である配合物は、例えば、およそわずかに０．１％（ｗ／ｗ）〜１００％（ｗ／ｗ）もの量の活性処方成分を含み得、本願明細書に記載の１種または複種の追加の要素をさらに含み得る。
【０３４９】
本発明の医薬品組成物は、口腔投与に好適な配合物で調製され、梱包され、または販売され得る。このような配合物は、例えば、従来の方法用いて形成される錠剤または舐剤の形態であり得、および例えば、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）活性処方成分であり得、残りが、経口的に溶解可能なまたは分解性組成物、任意により、本願明細書に記載の１種または複数種の追加の要素を含む。あるいは、口腔投与に好適な配合物は、活性処方成分を含む粉末またはエアロゾル化または微粒子化溶液または懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、またはエアロゾル化配合物は、分散されたとき、好ましくは、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲で平均粒子または小滴サイズを有し、および本願明細書に記載の１種または複数種の追加の要素をさらに含み得る。
【０３５０】
本発明の医薬品組成物は、点眼投与に好適な配合物で調製され、梱包され、または販売され得る。このような配合物は、例えば、活性処方成分の水性または油性液体キャリア中の０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）溶液または懸濁液を含む点眼薬の形態であり得る。このような液滴は、緩衝材、塩、または本願明細書に記載の１種または複数種の他の追加の要素をさらに含み得る。有用である他の眼球投与可能な配合物としては、活性処方成分を微結晶性形態またはリポソーム調製物中に含むものが挙げられる。
【０３５１】
本願明細書において用いられるところ、「追加の要素」としては、これらに限定されないが、以下の１つまたは複数が挙げられる：賦形物；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒および崩壊薬；結合剤；潤滑剤；甘味剤；香味剤；着色剤；防腐剤；膠などの生理学的に分解性の組成物；水性ビヒクルおよび溶剤；油性ビヒクルおよび溶剤；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑薬；緩衝剤；塩；増粘剤；充填材；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌性薬剤；安定化剤；および薬学的に許容可能な高分子または疎水性材料。本発明の医薬品組成物中に含まれ得る他の「追加の要素」は当該技術分野において公知であると共に、本願明細書において参照により援用される、例えばGenaro編（１９８５年、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン（Easton, PA））に記載されている。
【０３５２】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与され得る本発明の化合物の投与量は、特にこれらに限定されないが、動物のタイプおよび処置される疾病状態のタイプ、動物の年齢および投与経路を含むいずれかの数の要因に依存して異なることとなる。
【０３５３】
化合物は、１日に数々の回数もの頻度で動物に投与されることが可能であり、または１日１回、週１回、２週に１回、月１回、または数ヶ月に１回または年１回またはそれ未満といったさらに少ない頻度などの少ない頻度で投与され得る。投与量の頻度は当業者には容易に明らかであり、特にこれらに限定されないが、処置される疾病のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢等などのいずれかの数の要因に依存することとなる。
【０３５４】
本発明の実施に用いられるベクター
ＶＩＩＩ．方法
Ａ．レナラーゼ発現に関連する、またはによって媒介される疾病、障害または状態を治療または緩和させる方法
本発明の一態様においては、哺乳類レナラーゼに関連する、またはによって媒介される疾病、障害、および状態を治療する方法が提供されている。このような疾病、障害および状態としては、これらに限定されないが、ＥＳＲＤ、慢性高血圧、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、肺高血圧症、急性重症高血圧症、無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心律動障害、脳卒中、アテローム性動脈硬化、鬱、不安、躁病および統合失調症等が挙げられる。
【０３５５】
レナラーゼの過剰発現、レナラーゼの過少発現、過剰活性型レナラーゼ、および不活性型レナラーゼが種々の疾病、障害または状態に関連しており、レナラーゼレベルを低減させる、レナラーゼレベルを増加させる、レナラーゼの活性を低減させる、およびレナラーゼの活性を増加させる方法は潜在的に有益性をもたらすことが可能であり、ここで、選択される方法は、検討中の特定の障害、状態および／または疾病に応じる。従って、レナラーゼレベルに影響を及ぼして、疾病、障害、または状態を治療／緩和させる幅広い多くの方法が本願明細書に開示されており、レナラーゼレベルは、治療前の細胞におけるレナラーゼレベルと比して、または異常なレベルのレナラーゼに関連するかまたはそれによって媒介される疾病、障害または状態で苦しんでいないことがわかっている哺乳動物から得られる他の同等の細胞におけるレナラーゼレベルと比して、低減または増加されている。
【０３５６】
レナラーゼの発現、ポリペプチドのレベル、またはその活性が増加または低減されようと、当業者は、本開示に基づいて、レナラーゼを低減させまたは増加させる方法は、天然または非天然レナラーゼ、レナラーゼ阻害剤、またはレナラーゼを発現するかまたはその発現に欠ける組換え型細胞の投与を包含することを認識するであろう。それ故、当業者は、本願明細書に提供の開示に基づいて、本発明は、レナラーゼ発現のレベルまたは哺乳動物における活性で検出可能な増加または低減をもたらすための、当該技術分野において公知である治療方法を包含することを認識するであろう。
【０３５７】
本発明の組成物は、レナラーゼを細胞、組織、または動物に投与するために、またはレナラーゼの発現を細胞、組織、または動物において促進するために用いられることが可能である。組成物は、細胞、組織、または動物におけるレナラーゼ発現またはタンパク質レベルの低減または増加が、この動物に対して有益であるよう、レナラーゼの異常な発現によって媒介された疾病、障害または状態を治療するために有用である。すなわち、動物における疾病、障害または状態が異常なレベルのレナラーゼ発現またはタンパク質レベルによって媒介され、またはに関連する場合、この組成物は、このようなレナラーゼの発現またはタンパク質レベルを調節するために用いられることが可能である。
【０３５８】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、細胞におけるレナラーゼのレベルまたは活性を増加させることが有用であり得ることを理解するであろう。すなわち、レナラーゼ発現および高血圧間の関連性を実証する本願明細書に開示のデータは、過剰発現またはレナラーゼ活性の増加は血圧を低下させることが可能であることを示している。これは、天然または非天然レナラーゼを投与することにより、このような疾病、障害または状態を患っていない他の同等の細胞、組織、または動物におけるレナラーゼの発現、レベルまたは活性と比したときに、低いレナラーゼの発現、レベルまたは活性（例えば高血圧）に関連するかまたはそれによって媒介された状態の疾病、障害を治療または緩和させるために有用であることが可能である。このような疾病、障害または状態としては、これらに限定されないが、ＥＳＲＤ、高血圧、心血管系障害、または精神障害が挙げられる。
【０３５９】
本願明細書に開示したデータは、レナラーゼは、全身的な血圧を調節することが可能であることを実証する。それ故、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、レナラーゼは、カテコールアミンを代謝することにより、心血管系疾患の治療に用いられることが可能であることを認識するであろう。従って、本発明は、循環におけるレナラーゼの活性または細胞におけるレナラーゼの発現の増加を含むカテコールアミン代謝を増加させる方法を包含する。例えば、ＥＳＲＤは、哺乳動物に、有効量のレナラーゼを投与することにより治療されることが可能である。これは、本願明細書に開示したデータが、レナラーゼがＥＳＲＤと関連していることを実証しているからである。すなわち、データは、レナラーゼの発現の欠乏がＥＳＲＤと相関していることを実証する。さらに、本願明細書に開示したデータは、組換え型レナラーゼのラットへの注入はラットの血圧の低下をもたらすことを実証し、レナラーゼがＥＳＲＤ誘起高血圧および他の心血管系疾患の治療に用いられることが可能であることを示唆している。
【０３６０】
さらに他の実施形態において、本発明は、レナラーゼの異常な発現または活性により媒介された疾病、障害または状態の、哺乳動物への、レナラーゼ発現および／または活性を抑制する阻害剤の投与による緩和方法を含む。ＭＡＯ阻害剤と同様に、レナラーゼ阻害剤は、気分障害などのＣＮＳ障害の治療において有用であると判明している可能性がある。従って、レナラーゼを抑制する、例えば化学化合物、ペプチド模倣薬、低分子、リボザイム、アンチセンス核酸、抗体、および細胞内抗体でのレナラーゼ発現の低減またはレナラーゼの活性の低減は、脳におけるモノアミン含有量を増加し、これらの障害の症状の緩和をもたらすこととなる。それ故、当業者は、本願明細書の他の箇所により完全に記載されている多様な方法によって達成されることが可能であるレナラーゼの抑制は、ＣＮＳ障害、特に気分障害に対する有用な治療であることを理解するであろう。
【０３６１】
ＣＮＳ障害としては、特にこれらに限定されないが、認知症、アルツハイマー病、統合失調症、精神病、鬱、頭痛、および偏頭痛が挙げられる。本願明細書において用いられるところ、「鬱」という用語は、うつ病性障害、例えば、単発の突発性または反復的な大うつ病性障害、および気分変調性障害、抑うつ神経症および神経症うつ病；摂食障害、体重減少、不眠症および早朝の目覚めおよび精神運動発達遅滞を含むメランコリー型うつ病；食欲増加、過眠症、精神運動性激越または易刺激性、不安および恐怖症を含む非定型うつ病（または反応性うつ病）；季節性感情障害；または双極性障害または躁うつ病、例えば、双極Ｉ型障害、双極ＩＩ型障害および気分循環性障害を含む。
【０３６２】
「鬱」という用語に包含される他の気分障害としては、早発性または遅発性の、および非定型特性を有するかまたは有さない気分変調性障害；早発性または遅発性の、抑うつ気分を伴うアルツハイマータイプの認知症；抑うつ気分を伴う血管性認知症；アルコール、アンフェタミン、コカイン、幻覚剤、吸入薬、オピオイド、フェンシクリジン、鎮静薬、睡眠薬、抗不安薬および他の物質により誘起される気分障害；抑うつタイプの統合失調感情障害；および抑うつ気分を伴う適応障害が挙げられる。
【０３６３】
本発明の組成物は不安の治療に有用である。本願明細書において用いられるところ、「不安」という用語は、広場恐怖症を伴うまたは伴わないパニック障害、パニック障害の履歴を有さない広場恐怖症、特定の恐怖症、例えば、特定の動物恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害；外傷後ストレス障害および急性ストレス障害を含むストレス障害、ならびに全般性不安障害などの不安障害を含む。
【０３６４】
「全般性不安」は、典型的には、その期間のほとんどの日で症状を伴う長期間（例えば少なくとも６ヶ月）の過剰な不安または心配として定義される。不安および心配は制御することが困難であり、不穏状態が付随し、容易に疲労し、集中が困難であり、易刺激性、筋肉張力、および睡眠障害になり得る。
【０３６５】
「パニック障害」は、反復的なパニック発作の存在と、これに続く、少なくとも１ヶ月の、さらなるパニック発作を有することについての持続的な懸念として定義される。「パニック発作」は、強い憂慮、恐怖感または恐れの突然の発症がある個別の期間である。パニック発作の間、個体は、動悸、発汗、震え、息切れ、胸痛、嘔気および眩暈を含む多様な症状を経験し得る。パニック障害は、広場恐怖症を伴ってまたは伴わずに発症し得る。「恐怖症」は、広場恐怖症、特定の恐怖症および社会恐怖症を含む。「広場恐怖症」は、逃避が困難であり得るかまたは邪魔され得る、あるいはパニック発作の際に助けが得られないかもしれない場所または状況にいることについての不安によって特徴付けられる。広場恐怖症は、パニック発作の履歴なしで発症し得る。「特定の恐怖症」は、特定の不安対象または状況への露出により誘発される臨床的に顕著な不安によって特徴付けられる。特定の恐怖症は以下のサブタイプを含む：動物タイプ（動物または昆虫をきっかけとする）；自然環境タイプ（例えば嵐、高さまたは水といった自然環境中の物体をきっかけとする）；血液−注射−外傷タイプ（血液または外傷の光景または注射または他の観血的な医学的手法を見または受けることをきっかけとする）；状況タイプ（公共輸送機関、トンネル、橋、エレベータ、飛行、運転または閉鎖空間などの特定の状況をきっかけとする）；および恐れが他の刺激をきっかけとする他のタイプ。特定の恐怖症はまた、単純な恐怖症としても称され得る。「社会恐怖症」は、一定のタイプの社会的なまたはパフォーマンス状況に露出されることにより誘発される臨床的に顕著な不安によって特徴付けられる。社会恐怖症はまた、社会不安障害としても称される。
【０３６６】
「不安」という用語に包含される他の不安障害としては、アルコール、アンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入薬、フェンシクリジン、鎮静薬、睡眠薬、抗不安薬および他の物質によって誘発される不安障害、および不安を伴うまたは不安および鬱の混ざった適応障害が挙げられる。
【０３６７】
不安は、不安およびうつ病性障害が混じった鬱などの他の障害を伴ってまたは伴わずに存在し得る。本発明の組成物は、従って、付随する鬱を伴うまたは伴わない不安の治療に有用である。
【０３６８】
本発明は、他の同等であるが正常な組織、すなわち、治療または緩和されている疾病、障害または状態に関連するいずれかの検出可能な臨床的パラメータも示さない組織におけるレナラーゼ発現のレベルと比して高いレナラーゼ発現によって媒介される疾病、障害または状態で苦しむ患者に、レナラーゼをコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を投与することによる、レナラーゼの異常な発現によって媒介される疾病、障害または状態を緩和する方法をさらに提供する。これは、結果的に、レナラーゼ発現の低減を媒介し、これにより、レナラーゼの異常発現により媒介された疾病、障害または状態を緩和する。
【０３６９】
レナラーゼの抑制は、アンチセンスを細胞に投与し、これにより、細胞におけるレナラーゼの発現を抑制することにより例示されるが、当業者は、細胞におけるタンパク質発現および／または活性を抑制するための幅広い多くの方法があることを認識するであろう。このような方法としては、これらに限定されないが、リボザイムを用いてレナラーゼの発現を抑制する方法、および例えば、例として細胞内で抗体が発現され、それ故、抗体が細胞サイトゾルに送達されるように抗体をコードする核酸を細胞に投与することにより、抗体を細胞に投与することにより細胞におけるタンパク質の活性を抑制する方法が挙げられる。これらの「細胞内抗体」を使用して、タンパク質の細胞内活動を抑制することは当該技術分野において周知である。例えば、Vermaら（１９９７年、「Nature」３８９：ｐ．２３９〜２４２；Benhar & Pastan、１９９５年、「J. Biol. Chem.」２７０：ｐ．２３３７３〜２３３８０；Willudaら、１９９９年、「Cancer Res.」５９：ｐ．５７５８〜５７６７；およびWornら、２０００年、「J. Biol. Chem.」２７５：ｐ．２７９５〜２８０３）を参照のこと。従って、本発明は、当該技術分野において公知であるかまたは将来開発されるであろうこのような方法を用いる、細胞における関心のあるタンパク質の活性を抑制するいずれかの方法を包含する。
【０３７０】
本発明の他の実施形態において、レナラーゼ発現に関連するかまたはそれによって媒介された疾病、障害または状態を患う個体は、レナラーゼ発現に欠く細胞で、欠陥性の細胞を補助し、増強しおよび／または交換することにより治療されることが可能である。細胞は、正常な同系の適合したドナーから得られた細胞または治療されるべき個体から得られた細胞から誘導されることが可能である。細胞は、レナラーゼ発現を抑制するために遺伝的に修飾されていてもよい。あるいは、細胞は、レナラーゼ発現を増加させるために、当該技術分野において周知である組換え法を用いて、修飾されていることが可能である。また、本発明は、異常なレナラーゼ発現に関連するいずれかの疾病または障害を患っていない他の同等のドナーから得られた正常な細胞を使用することを包含し、これらの細胞は、これを必要とする哺乳動物に投与されることが可能である。
【０３７１】
さらに、本発明は、細胞が哺乳動物から得られ、増加または低減されたレベルのレナラーゼを発現するよう修飾され、およびこの哺乳動物に再導入されるｅｘ  ｖｉｖｏ技術を含む。しかも、異常なレナラーゼ発現に関連するいずれかの状態を患っていない同様の哺乳動物から得られた他の同等の細胞におけるレナラーゼ発現のレベルと比して正常なレベルのレナラーゼを発現する哺乳動物からの細胞は、増殖されおよび拡大されることが可能であり、有効数の細胞が哺乳動物に再導入されることが可能である。このような方法は、骨髄間質細胞の使用に関連する細胞および遺伝子治療技術を含み、これらの方法は当該技術分野において周知である。それ故、当業者は、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される、検出可能なレナラーゼ発現を有するかまたは有さない細胞に関連する細胞治療および遺伝子治療が本発明に包含されることを認識するであろう。
【０３７２】
欠陥性の細胞を、修復した細胞または同系の、免疫学的に適合したドナー正常な細胞で交換する方法に追加して、本発明の方法はまた、動物内で分泌されたときに有利な効果を有する所望のタンパク質の発現を促進するために用いられ得る。すなわち、細胞は、単離され、レナラーゼをコードする遺伝子で備えられ、およびドナーにまたは同系的に適合したレシピエントに導入され得、ここ、外因性のレナラーゼの発現は治療的効果を発揮する。
【０３７３】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、細胞からのレナラーゼの分泌は本発明において予期されることを理解するであろう。すなわち、日常業務に携わる者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、細胞からのレナラーゼの分泌は有用な治療的方法であることが可能であり、および本発明は細胞からのレナラーゼの分泌を包含することを認識するであろう。細胞からのレナラーゼの分泌は、当該技術分野において周知である標準的な方法および将来に開発されるであろう方法に従って実行されることが可能である。このような方法としては、これらに限定されないが、分泌された分子のシグナルペプチドをコードする核酸を、レナラーゼをコードする単離された核酸の５’末端に共有結合する方法が挙げられる。細胞からのタンパク質の分泌を媒介するために用いられることが可能である幅広い多くのシグナル配列は、当該技術分野において利用可能であると共に周知であり、および本発明は、これらならびに、細胞からタンパク質を分泌させる将来に開発されるであろう配列を含む。
【０３７４】
本発明のこの態様は、治療的量のレナラーゼが個体に投与される遺伝子治療に関する。すなわち、本発明のいくつかの態様によれば、レナラーゼをコードする核酸、アンチセンス核酸、または本発明のノックアウト標的指向化ベクターのいずれかで形質移入された組換え型細胞は、レナラーゼの発現の欠如を含む、レナラーゼの異常な発現によって特徴付けられる疾病、障害または状態を治療する細胞薬物療法として用いられることが可能である。
【０３７５】
特に、レナラーゼをコードする非相同的遺伝子を含む遺伝子構築物が、細胞に導入される。これらの組換え型細胞が単離されたレナラーゼの精製に用いられ、これが動物に投与される。当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、単離されたレナラーゼポリペプチドを投与する代わりに、レナラーゼは、哺乳動物に組換え型細胞自体を投与することにより、それを必要とする哺乳動物に投与されることが可能であることを理解するであろう。このタンパク質が、レシピエントの系に組換え型細胞によって発現されおよび分泌される場合に有益であろうレシピエント個体には有益であろう。
【０３７６】
本発明によれば、本発明のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が細胞に導入される。すなわち、本願明細書において「組換え型細胞」として称される細胞は、レナラーゼをコードする核酸または組換え型細胞によってレナラーゼ発現および／または分泌を抑制する核酸（例えば、アンチセンスレナラーゼ核酸、抗レナラーゼ抗体をコードする核酸等）を導入するために遺伝的に改変されており、これにより、組換え型細胞が投与されるレシピエントに有利な効果を媒介する。本発明のいくつかの態様によれば、治療されるべき同一の個体からまたは他の個体から、または非ヒト動物から得られる細胞は、遺伝的に改変されて、欠損レナラーゼ遺伝子を置き換えおよび／またはその発現がその個体に有利な効果を有するレナラーゼ遺伝子を導入し、またはその個体に有利な効果を有することが可能であるレナラーゼ発現を抑制することが可能である。
【０３７７】
本発明のいくつかの態様において、疾病、障害または状態をわずらっている個体は、レナラーゼをコードする核酸の正常な、機能性複製物を含む遺伝子構築物を含有する単離された組換え型細胞を提供することにより、レナラーゼをコードする欠陥性または欠損性の核酸を補助し、増強しおよび／または交換することにより治療されることが可能である。本発明のこの態様は、個体に、存在および／または機能に欠けるレナラーゼをコードする核酸が提供される遺伝子治療に関する。この細胞により提供されたレナラーゼをコードする単離された核酸は、核酸が個体内で発現されるとき、個体において疾病、障害または状態を緩和させるかまたはそうでなければ治療するために役立つタンパク質が産生されるため、個体の不完全なレナラーゼ発現を補償する。このような核酸は、好ましくは、組換え型細胞から分泌されるレナラーゼポリペプチドをコードする。
【０３７８】
レナラーゼをコードする遺伝子構築物が細胞に形質移入されるすべての場合において、核酸は、組換え型細胞における核酸の発現を達成するために必要である適切なプロモータ／調節性配列に操作的にリンクされている。このようなプロモータ／調節性配列としては、これらに限定されないが、構成的および誘導性および／または組織特異的および分化特異的プロモータが挙げられ、本願明細書の他の箇所において考察されている。構成的プロモータとしては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス最初期プロモータおよびラウス肉腫ウイルスプロモータが挙げられる。加えて、ハウスキーピング遺伝子の発現を調節するものなどのハウスキーピングプロモータもまた用いられ得る。他のプロモータとしては、特に限定されないが、グリア線維性酸性タンパク質をコードする遺伝子のためのプロモータなどの中枢神経系細胞において優先的に発現されるものが挙げられる。加えて、プロモータ／調節性要素は、遺伝子発現が誘導されるよう選択され得る。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモータが用いられ得る（Freundlichら、１９９７年、「Meth. Enzymol.」２８３：ｐ．１５９〜１７３）。
【０３７９】
遺伝子構築物は、好ましくは、ベクターが細胞に形質移入されるときに、コード配列が細胞によって発現されるよう、必須プロモータ／調節性配列に操作的にリンクされた本発明の哺乳類レナラーゼのコード配列を含む発現ベクターとして提供される。コード配列は、この細胞における配列の発現のために必須であるプロモータ／調節性要素に操作的にリンクされた。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそのハイブリッドまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。プロモータ／調節性要素に操作的にリンクされたレナラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、機能性エピゾーム分子として細胞中にそのまま存在し得、または細胞の染色体性ＤＮＡに統合され得る。遺伝子材料は細胞中に導入され、ここで、プラスミドの形態の個別の遺伝子材料として残留し得る。あるいは、宿主細胞染色体に統合されることが可能である直鎖ＤＮＡが細胞に導入され得る。ＤＮＡを細胞中に導入するとき、ＤＮＡの染色体への統合を促進する試薬が添加され得る。統合を促進するために有用であるＤＮＡ配列はまた、ＤＮＡ分子中に含まれ得る。あるいは、ＲＮＡは、細胞中に導入され得る。
【０３８０】
発現ベクター中の遺伝子材料が発現されるために、プロモータ／調節性要素は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作的にリンクされていなければならない。タンパク質産生を最大限とするために、プロモータ／調節性配列は、所望の細胞における遺伝子発現のためにどれが良好に適しているか選択され得る。しかも、コドンは、どれが細胞において最も効率的に転写されるか選択され得る。当業者は、組換え型遺伝子材料を、所望の細胞において機能性である発現ベクターとして生成することが可能である。
【０３８１】
プロモータ／調節性要素は、タンパク質の組織特異的発現を促進するよう選択され得ることもまた予期される。それ故、例えば、特定のプロモータ／調節性配列は、組換え型細胞が移植されている組織においてのみ非相同的遺伝子が発現されることとなるよう、提供され得る。さらに、当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、レナラーゼプロモータは、関心のある核酸に操作的にリンクされることが可能であり、これにより、核酸の発現を組織または器官の部位に向けることが可能であることを認識するであろう。同様に、レナラーゼプロモータは関心のある核酸を発現させることが可能であり、ここで、このような発現は、高カテコールアミン循環が問題である場合に有益である。
【０３８２】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、レナラーゼの発現または発現の欠如が標的化されるべき好ましい組織としては、これらに限定されないが、皮膚の潰瘍、骨折等が挙げられることを理解するであろう。加えて、プロモータ／調節性要素は、遺伝子発現が誘導性であるよう選択され得る。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモータが用いられ得る（Freundlichら、１９９７年、「Meth. Enzymol.」２８３：ｐ．１５９〜１７３）。
【０３８３】
いずれかの特定の理論によって束縛されることは望まないが、レナラーゼをコードする核酸は、好ましくは、本願明細書の他の箇所に記載のとおり推定上のシグナル配列（例えば、ヒトレナラーゼのＮ終端のアミノ酸）を含み、これは、単離された核酸によってコードされたレナラーゼの輸送および分泌を組換え型細胞中に指向し得る。シグナル配列は、成熟レナラーゼタンパク質の細胞からの分泌で、処理されおよび除去されると考えられる。あるいは、いずれかの特定の理論によって束縛されることは望まないが、推定上のシグナル配列は切断されず、代わりに、膜貫通型ドメインであってもよい。
【０３８４】
細胞における遺伝的欠陥を補正する、遺伝子材料が個体における遺伝的欠陥を補正するよう、そうでなければ十分な量および／または機能性状態で存在しないタンパク質をコードする、および／またはこれに関連する特定の疾病、障害または状態の治療または予防において有利であるとして有用なタンパク質をコードする、および細胞におけるレナラーゼの発現を抑制する（例えば、ノックアウト標的指向化ベクター、アンチセンス核酸等）組換え型遺伝子材料を有する細胞の提供に追加して、遺伝子材料はまた、本発明において用いられる組換え型細胞に導入されて、このような終結が所望となるべきこのような細胞を選択的に終結させるための手段を提供することが可能である。破壊のために組換え型細胞を標的化するこのような手段が組換え型細胞に導入され得る。
【０３８５】
本発明によれば、組換え型細胞は、破壊に対する特異的な感受性を付与する遺伝子材料で備えられることが可能である。例えば、組換え型細胞は、細胞障害性薬剤で特異的に標的化されることが可能である受容体をコードする遺伝子が提供されていてもよい。選択的な細胞死を誘起するために用いられることが可能である遺伝子の発現可能な形態が組換え型細胞に導入されることが可能である。このような系において、遺伝子によりコードされたタンパク質を発現する細胞は、特定の条件下または特定の薬剤の存在下あるいは不在下での標的化された死滅に対して感受性である。例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ヘルペスｔｋ）遺伝子の発現可能な形態は、組換え型細胞に導入されることが可能であり、選択的な細胞死を誘導するために用いられることが可能である。ヘルペスｔｋ遺伝子を含む導入された遺伝子材料が個体に導入されるとき、ヘルペスｔｋが産生されることとなる。移植された組換え型細胞を死滅させることが望ましいまたは必要である場合には、薬物ガングシクロビルを個体に投与することが可能であり、これは、ヘルペスｔｋを産生するいずれかの細胞の選択的な死滅を生じさせることとなる。それ故、系は、移植された組換え型細胞の選択的な破壊を許容するものが提供されていることが可能である。
【０３８６】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明は、哺乳動物にレナラーゼを提供するため、またはにおけるレナラーゼ発現を抑制するための組換え型細胞の産生を包含することを理解するであろう。すなわち、細胞は、レナラーゼを動物に投与するために、または分子を（例えば、ノックアウト標的指向化ベクター、アンチセンス核酸、リボザイム、およびレナラーゼと特異的に結合する抗体等）送達するために用いられることが可能である。
【０３８７】
レナラーゼの動物への投与は、レナラーゼの作用のメカニズムを研究するための、またはレナラーゼ発現に関連する疾病、障害または状態に対する診断および／または薬物療法学の発展のために有用なモデル系を開発するための研究のためのモデル系として用いられることが可能である。
【０３８８】
さらに、レナラーゼを発現しおよび分泌する組換え型細胞の投与により媒介されるレナラーゼの動物への送達はまた、レナラーゼレベルの増加が治療的効果を媒介する、疾病、障害または状態の治療または緩和に用いられることが可能である。より具体的には、レナラーゼをコードする核酸を発現する組換え型細胞を投与することによるレナラーゼの動物に対する投与は、とりわけ、ＥＳＲＤ、高血圧、心血管系疾患の治療に有用であることが可能である。
【０３８９】
あるいは、その発現が細胞からのレナラーゼ発現、活性、および／または分泌を抑制または低減させる、核酸を含む組換え型細胞の投与は、レナラーゼ発現、活性、および／または分泌に関連するかまたはそれによって媒介された疾病、障害または状態に有用な診断および／または薬物療法学を開発するためのモデルとして用いられることが可能である。本発明は、組換え型細胞はレナラーゼ発現を抑制する分子を産生することが可能であり、これにより、このような分子を動物に提供することを包含する。あるいは、いずれかの特定の理論によって束縛されることは望まないが、レナラーゼの発現には無力であることを除いてそうでなければ機能性細胞である組換え型細胞自体は、レナラーゼシグナル経路を受けることなく、他の同等であるが非組換え型細胞の機能を発揮することが可能である。
【０３９０】
動物から得られた細胞、市販されているかまたは開発されるべき確立された株細胞から得られた細胞、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された一次細胞から得られた細胞は、共に、当業者には容易に利用可能な周知技術を用いて形質移入されることが可能である。それ故、本発明は、ドナー動物からまたは患者動物自体から細胞を得ることに限定されない。むしろ、本発明は、組換え型細胞がレナラーゼを発現（操作される前にレナラーゼを発現しなかった場合、または細胞が、核酸の細胞への導入の前に、異なるレベルでレナラーゼを産生していた場合）するか、または組換え型細胞がレナラーゼを発現せず、またはより低いレベルで発現する（以前にレナラーゼを発現していたまたは核酸の細胞への導入の前にレナラーゼを異なるレベルで発現していた場合）よう、本発明の核酸を用いて操作されることが可能であるいずれかの細胞の使用を含む。
【０３９１】
核酸は、遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する、またはレナラーゼ発現を抑制する分子を発現する細胞に、遺伝子構築物を導入するために利用される、標準的な方法を用いて細胞に導入されることが可能である。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸カルシウム沈殿形質移入、ＤＥＡＥデキストラン形質移入、エレクトロポレーション、微量注入、リポソーム−媒介転移、化学的媒介転移、リガンド媒介転移または組換え型ウイルス性ベクター転移によって形質移入される。
【０３９２】
いくつかの実施形態において、組換え型アデノウイルスベクターは、所望の配列を有するＤＮＡを細胞に導入するために用いられる。いくつかの実施形態において、組換え型レトロウイルスベクターは、所望の配列を有するＤＮＡを細胞に導入するために用いられる。いくつかの実施形態において、標準的なリン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは脂質キャリア媒介移入技術は、所望のＤＮＡを、分裂細胞に組み込むために利用される。標準的な抗生物質耐性選択技術は、形質移入された細胞を同定し、および選択するために用いられることが可能である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、直接的に、微量注入により細胞に導入される。同様に、周知のエレクトロポレーションまたは粒子照射技術を、外来性ＤＮＡを細胞に導入するために用いることが可能である。第２の遺伝子が、通常は、レナラーゼをコードする核酸、またはノックアウト標的指向化ベクターまたはこれに対するアンチセンス分子に、同時形質移入され、および／またはに共有結合されている。この第２の遺伝子は、頻繁に選択可能な抗生物質−耐性遺伝子である。形質移入された組換え型細胞は、選択可能な遺伝子を吸収しない細胞を死滅させる抗生物質中に、細胞を増殖させることにより、選択されることが可能である。２つの遺伝子が連結されておらず、および同時形質移入されているほとんどの場合において、抗生物質処置で残存する細胞は、両方の遺伝子を含有すると共に発現する。
【０３９３】
レナラーゼレベルを評価する方法（例えば、ウェスタンブロット法での抗レナラーゼ抗体の使用またはＥＬＩＳＡなどの他の免疫ベースの分析）および／または細胞および／または組織におけるレナラーゼ発現のレベルを評価する方法（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の使用）が本願明細書に開示されており、または当業者に周知である。このようなアッセイは、レナラーゼレベルを所望のレベルに低減し、または増加させるために、動物に投与するレナラーゼの「有効量」を判定するために用いられることが可能である（単離された核酸、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、組換え型細胞等の使用にかかわらず）。
【０３９４】
Ｂ．有用な化合物の同定方法
本発明は、細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性に影響する化合物を同定する方法をさらに含む。方法は、細胞をテスト化合物と接触させる工程および、このように接触させられた細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルと化合物と接触していない他の同等の細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルとを比較する工程を含む。テスト化合物と接触していない他の同等の細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルと比して、テスト化合物と接触した細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルがより高いまたは低い場合には、これは、テスト化合物が細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性に影響していることを示している。
【０３９５】
同様に、本発明は、細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性を低減する化合物を同定する方法を含む。この方法は、細胞をテスト化合物と接触させる工程および、化合物と接触した細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルと化合物と接触していない他の同等の細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルとを比較する工程を含む。化合物に接触しなかった細胞におけるレベルと比して、化合物に接触した細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルがより低い場合には、それは、テスト化合物が細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性を低減させるよう影響していることの兆候である。
【０３９６】
当業者は、本願明細書に提供の開示に基づいて、細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルは、レナラーゼをコードするｍＲＮＡの発現および／または活性のレベルを判定することにより、計測することが可能であることを認識するであろう。あるいは、レナラーゼをコードするｍＲＮＡの発現およびまたは活性のレベルは、本願明細書において例示されるとおり、本発明の抗レナラーゼ抗体を用いるウェスタンブロット法分析を用いて、免疫学的方法を用いて、このようなｍＲＮＡからのレナラーゼ産生を評価することにより判定されることが可能である。さらに、ノーザンブロットおよびＰＣＲアッセイ等などの核酸ベースの検出方法もまた用いられることが可能である。加えて、細胞におけるレナラーゼ活性のレベルはまた、例えば、腎臓、心臓、骨格筋、および小腸管等におけるレナラーゼ発現および／または活性レベルなどの、レナラーゼ活性によって影響されることが可能である種々のパラメータのレベルを測定することにより評価することが可能である。あるいは、レナラーゼ活性のレベルは、アミンオキシダーゼアッセイにおいて評価されることが可能である。それ故、当業者は、本願明細書に提供されている詳細な開示および実施への縮図に基づいて、本願明細書に開示のこれらの方法、当該技術分野において周知である方法、および将来に開発されるであろう他の方法を含む、細胞におけるレナラーゼの発現および／または活性レベルを評価するために用いられることが可能である多くの方法があることを認識するであろう。
【０３９７】
さらに、当業者は、本願明細書に提供の開示に基づいて、以下の実施例に開示されているとおり、内在性のレナラーゼ発現および／または活性に欠く細胞は、レナラーゼをコードする単離された核酸を含むベクターで形質移入されることが可能であり、これにより、レナラーゼの発現および／または活性が、細胞内で影響されることを認識するであろう。形質移入された細胞は、次いで、テスト化合物と接触させられ、これにより、化合物がレナラーゼの発現および／または活性に影響するかどうかの判定が許容される。従って、本発明を備える当業者は、検出可能なレベルのレナラーゼに欠く細胞を、レナラーゼ−発現ベクターを用いて選択的に形質移入することにより、レナラーゼ発現および／または活性に選択的に影響する化合物を同定することが可能であろう。
【０３９８】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、検出可能なレナラーゼが細胞によって産生されるよう、レナラーゼをコードする単離された核酸が内在性の検出可能なレベルのレナラーゼ発現および／または活性に欠く細胞に投与される場合、単離された核酸は、例えば、共有結合されたタグポリペプチドをコードする追加の核酸を含むことが可能であることをさらに認識するであろう。これは、タグポリペプチドの発現および／または活性を検出することによるレナラーゼ発現および／または活性の検出を許容する。それ故、本発明は、レナラーゼと共発現される他の分子の発現および／または活性を検出することにより、レナラーゼ発現および／または活性を検出する方法を包含する。
【０３９９】
本発明は、レナラーゼに特異的に結合するタンパク質同定する方法を含む。レナラーゼは少なくとも１種の他のタンパク質に結合し、これにより、他のタンパク質とのこのような相互作用がレナラーゼの生物学的機能に影響し得る。それ故、本発明は、レナラーゼに特異的に結合するおよび／またはに関連するタンパク質を同定するための、当該技術分野において周知であるかまたは開発される方法を包含する。このような方法としては、これらに限定されないが、標的タンパク質、すなわち、レナラーゼを適切な担体上に固定化すると共に、レナラーゼ関連タンパク質とのレナラーゼ結合を許容する状態下でインキュベートするタンパク質結合アッセイが挙げられる。レナラーゼは、特にこれらに限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、またはＨｉｓ６−タグを含むレナラーゼの産生などの標準的な方法を用いて担体上に固定化されることが可能であり、ここで、融合タンパク質は、次いで、それぞれ、グルタチオン−セファロースビーズ、マルトース−カラム、またはニッケルキレート化樹脂（例えば、His-Bind樹脂、Novagen、ウィスコンシン州マジソン（Madison, WI））に結合される。固体担体は非特異的にこれに結合し得るタンパク質を除去するために洗浄され、次いで、レナラーゼ関連タンパク質のいずれもがマトリックスから解離されて、これにより、レナラーゼ関連タンパク質は同定されることが可能である。
【０４００】
加えて、レナラーゼに特異的に結合するタンパク質、例えば、受容体、リガンド、および／または他のレナラーゼ関連タンパク質は、例えば、酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて同定されることが可能である。酵母ツーハイブリッドアッセイ法は当該技術分野において周知であると共に、標準的な方法に従って、市販されているキットを用いて実施することが可能である（例えば、MATCHMAKER（商標）系、Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト（Palo Alto, CA）、および他のこのようなキット）。従って、本願明細書に提供の教示を一旦備えると（例えば、完全アミノおよび「ベイト」タンパク質の核酸配列、レナラーゼ）、当業者は、特にこれらに限定されないが、レナラーゼ受容体タンパク質、レナラーゼリガンド等などのレナラーゼに特異的に結合するタンパク質を容易に同定することが可能である。
【０４０１】
当業者は、本願明細書に既定の開示に基づいて、本発明は、本願明細書の他の箇所に開示の方法を用いて同定されたいずれかの分子を包含することを理解するであろう。すなわち、特にこれらに限定されないが、レナラーゼ受容体タンパク質、レナラーゼリガンドタンパク質、または両方などのレナラーゼと関連する分子は、ＥＳＲＤ、高血圧、心血管系疾患等などの、レナラーゼ関連タンパク質とのレナラーゼ相互作用によって媒介される疾病、障害または状態についての薬物療法学および診断を開発するために用いられることが可能である。すなわち、当業者は、レナラーゼに特異的に結合する抗体の考察において本願明細書の他の箇所により完全に記載のとおり、レナラーゼ関連タンパク質は、レナラーゼ活性のために必要とされる、必須レナラーゼ受容体／リガンド相互作用および他のレナラーゼ結合相互作用を抑制することにより、細胞におけるレナラーゼ活性を抑制する薬物療法学を開発するために用いられることが可能であることを認識するであろう。
【０４０２】
上記に開示の方法によって同定されるレナラーゼ関連タンパク質は、細胞をレナラーゼ関連タンパク質、またはその部分と接触させることによりレナラーゼ相互作用を抑制するために直接的に用いられることが可能であり、またはこれらは、レナラーゼとのレナラーゼ関連相互作用を抑制することが可能である抗体および／またはペプチド模倣薬の開発のために用いられることが可能であり、これにより、レナラーゼ機能および活性を抑制する。それ故、レナラーゼ受容体／リガンドタンパク質を含むレナラーゼ関連タンパク質は、有用であると共に、本発明によって包含される。
【０４０３】
Ｃ．治療の診断および評価方法
本発明は、特にこれらに限定されないが、ＥＳＲＤ、慢性腎疾患、高血圧；無症候性左室機能障害、慢性うっ血性心不全およびアテローム性動脈硬化などの心血管系疾患などの、一定の疾病、障害、または状態を診断する方法を含む。レナラーゼはまた、急性腎不全（すなわち急性尿細管壊死、またはＡＴＮ）等に対する診断マーカとして用いられることが可能である。
【０４０４】
この方法は、哺乳動物から生物学的サンプルを入手する工程およびこのサンプルにおけるレナラーゼレベル（発現、量、活性）と、腎疾患を患っていない個人からのサンプルにおけるレナラーゼレベルとを比較する工程を含む。ＥＳＲＤ、ＡＮＴ、または高血圧を患っていない個人からのサンプルにおけるレナラーゼレベルと比して、患者からのサンプルにおけるレナラーゼの低いレベルは、この患者は、ＥＳＲＤ、ＡＮＴ、または高血圧を患っていることの兆候である。
【０４０５】
本発明は、哺乳動物におけるＥＳＲＤに対する治療の有効性を評価する方法を含む。この方法は、ＥＳＲＤは低レナラーゼ発現に関連しているため、ＥＳＲＤに対する治療の特定の過程の前、最中および後に、レナラーゼ発現、量、および／または活性のレベルを評価する工程を含む。これは、他の箇所において既述されていると共に、本願明細書に開示したデータにより実証されているとおり、レナラーゼ発現、量および／または活性は一定の疾病状態（例えば、ＥＳＲＤおよび高血圧）の特性である高いカテコールアミン循環に関連しているからである。それ故、レナラーゼ発現／量／活性への治療の課程の効果の査定はこの治療の効力を示し、高レベルのレナラーゼ発現、量、または活性は治療方法が成功していることを示す。
【０４０６】
さらなる記載なしで、当業者は、上記記載および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を形成しおよび利用し、ならびに特許請求の範囲に記載の方法を実施することが可能である。以下の作業実施例は、従って、本発明の好ましい実施形態を特定的に指摘すると共に、どのようにも限定的であるとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０４０７】
実施例
前述の詳細な説明は、あくまでも理解を明確にするために提供され、かつ改良は当業者に自明であろうため、この説明から不当な制限はないものと理解されるべきである。
【０４０８】
本発明はその特定の実施形態と関連して記載されてきたが、さらなる改良が可能であり、およびこの出願は、一般的に本発明の原理に従う本発明のいずれかの変形、使用、または適合を網羅すると共に、本発明が属する技術分野内で公知のまたは習慣的な実施に付随するものなど、および本願明細書中上記に記載の必須の特性に適応され得るものなど、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲において記載のものなどの本開示からの逸脱を包含することを意図することが理解されるであろう。
【０４０９】
実施例１．腎機能と相関するレナラーゼレベル。
ＥＳＲＤ患者は、高い循環カテコールアミンレベルを有し、より高い心血管系死亡率の一因となっていることは周知である。他において、本発明者らは、ヒトにおいて、カテコールアミンを代謝するレナラーゼのプラズマ濃度が、ＥＳＲＤ患者において顕著に低減されることを示した。例えば、参照により本願明細書において特定的におよび完全に援用されている、国際公開第２００５／０８９５０５号パンフレットとして、２００５年９月２９日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／００９２４８号明細書を参照のこと。
【０４１０】
本発明者らの知見をさらに拡張するために、本発明者らは、異なる程度の腎機能（０〜１２０ｍｌ／分ＧＦＲ（糸球体ろ過速度））を有する２９０人の患者を募集した。異なる程度の腎不全を有する１３人の患者の予備的な分析は、レナラーゼレベルが、それぞれのＧＦＲによく相関していることを示していた。図１を参照のこと。２７人の患者の追加の試験は、同一の結果を示した。図２を参照のこと。
【０４１１】
実施例２．レナラーゼ活性。
本発明者らは、血液および尿から単離されたレナラーゼをテストした。基底状態下で、ヒト血液から単離されたタンパク質は、顕著なアミンオキシダーゼ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで有していなかった。対照的に、ヒト尿から単離されたレナラーゼは、カテコールアミンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで代謝していた。図３を参照のこと。
【０４１２】
レナラーゼ活性化のメカニズムは完全には定義されないが、本発明者らは、ここで、大腸菌（E. Coli）において形成した不活性組換え型レナラーゼは、タンパク質に共有結合的に組み込まれたＦＡＤを有することを知った。ＦＡＤのレナラーゼへの共有結合的に組み込みは必要であるが、レナラーゼ活性化には十分ではない可能性がある。本発明者らが、ＦＡＤの存在下にリフォールディングプロセスを用いて活性酵素を産生することが可能である事実は、活性型レナラーゼは異なる立体構造を有すると共に、追加のＦＡＤ結合部位は非共有相互作用を介して占有されていなければならないことを示唆している。
【０４１３】
実施例３．レナラーゼ調節のメカニズム。
レナラーゼの病態生理学をさらに理解するために、本発明者らは、その活性化のメカニズムを判明するために設計した研究を開始した。本発明者らは、不活性形態で血液中を循環するタンパク質を確立すると共に、本発明者らは、レナラーゼはカテコールアミンを代謝するため、これは基質−調節される可能性があると仮定した。
【０４１４】
この仮説をテストするために、本発明者らは、カテコールアミンをラットに注入し、および注入前および後にレナラーゼ活性を計測した。図４および５に示されているとおり、本発明者らは、ドーパミンまたはエピネフリン注入から開始して数分以内に血液レナラーゼ活性の３〜４倍の増加を観察した。この刺激性効果を、ポリクローナルレナラーゼ抗体を添加することにより無効にした。図６は、動物におけるこのレナラーゼ活性の増加と、収縮期血圧とを比較する。
【０４１５】
追加の実験は、レナラーゼタンパク質血液レベルがカテコールアミン血液レベルによって影響されることを実証した。図７に示されているとおり、血中のレナラーゼタンパク質レベルは、エピネフリンの最初の注入の後直ぐに著しく低下した（図の上部の第１の水平な線を参照のこと）。１０分間以内に、しかしながら、レナラーゼレベルは回復し、および初期タンパク質レベルを超えた。３０分間後の２回目の投与で（図の上部の第２の水平な線を参照のこと）、わずかに中程度の減少がレナラーゼタンパク質レベルに生じている。本発明者らは、レナラーゼは、循環カテコールアミンレベルの制御に関与すると考えられ、および逆もまた同様であると結論づけた。
【０４１６】
実施例４．レナラーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ効果。
本発明者らはまた、意識のあるマウスにおける血圧および心拍数に対するレナラーゼの効果をテストした。組換え型レナラーゼを、参照により本願明細書において特定的におよび完全に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／００９２４８号パンフレットの実施例３に記載の方法を用いて、調製した。そこにより詳細に説明されているとおり、本願明細書における実施例で用いた、大腸菌（E. coli）中で形成した組換え型タンパク質が投与前にリフォールドされる。それゆえ、本願明細書において用いられるところ、組換え型レナラーゼタンパク質は、活性形態にある（すなわち、上記に定義したとおり、活性型レナラーゼである）。
【０４１７】
組換え型タンパク質を尾静脈注入（１００μｇ）または後眼窩注入（１ｍｇ）で与え、および携帯式血圧および心拍数を２４時間連続的に計測した。
【０４１８】
図８Ａおよび８Ｂに示すとおり、尾注入によって与えた１００μｇのレナラーゼは、分刻みの可変性で血圧低減させ、および心拍数を数時間の間著しく増加した。注目すべきは、心拍数の大きな増加にもかかわらず平均血圧は変化しなかったことであり、心筋収縮力の低下の可能性を示している。対照的に、後眼窩注入による１ｍｇのレナラーゼは、血圧および心拍数の両方に顕著なおよび持続的な低下をもたらした。図９を参照のこと。
【０４１９】
図１０に示されているとおり、２０μｇ／分の速度での尾静脈による連続的な注入は、注入時間の間の血圧の低下をもたらした。
【０４２０】
実施例５．慢性腎疾患（ＣＫＤ）のラットモデルにおけるレナラーゼ欠乏
先行する研究は、およそ８５％の腎臓組織（５／６ＮＰＹ；ＮＰＹ＝ニューロペプチドＹ）を除去したラットおよびマウスは進行性の腎不全を発症し、交換神経活性化の増加、高血圧および左心室肥大を含む関連する異常を多く発症したことを記録した。本発明者らは、５／６ＮＰＹラットが重篤なレナラーゼ欠乏を手術から２〜３週後に発症したことを見出した。図１１を参照のこと。
【０４２１】
ラットＣＫＤモデルにおいて、本発明者らはまた、免疫細胞化学およびウェスタンブロット法により試験した腎臓および心臓組織におけるレナラーゼレベルの顕著な低下を記録した。図１２を参照のこと。
【０４２２】
ラットにおけるＣＫＤは、合計循環レナラーゼの低減だけではく、活性型レナラーゼの欠乏にも関連している。これは、正常なラットとＣＫＤラットにおけるレナラーゼ活性化に対するエピネフリン注入の効果を比較することにより判定した。図１３に示されているとおり、エピネフリン注入はＣＫＤラットにおける血液レナラーゼを活性化することが可能であるが、活性化の規模および期間は、対照ラットにおいて観察されたものより著しく低い。
【０４２３】
実施例６．レナラーゼによる虚血−再灌流マウスモデルにおける心機能の保存
カテコールアミンレベルは、徐脈性虚血の動物モデルにおいて著しく高まることが公知である。Lameris, T. W.ら（「Circulation」２０００；１０１：ｐ．２６４５〜２６５０）は、ブタにおける冠動脈虚血の最中に、心筋間質液中のノルエピネフリンの６００倍の増加を記録した。カテコールアミンレベルの増加は、神経細胞の吸収における欠陥によるものであり、および心筋損傷を増加すると共に、致死的な心臓不整脈の発症を促進すると考えられている。
【０４２４】
レナラーゼはカテコールアミンを代謝することが可能であるため、本発明者らは、虚血心筋損傷に対する保護であることが可能であるかをテストした。本発明者らは、単離された灌流マウス心臓モデルを用いて、１５分の全虚血の１０分前に開始し、再灌流後２時間継続したレナラーゼ注入は、心筋機能を、対照タンパク質（グルタチオンシンテターゼ）より著しく良好に保存したことを見出した。さらに、これはまた、心筋壊死を５４％で低減させた。図１４を参照のこと。
【０４２５】
文献：
直下にリストした文献を含み、これに限定される本願明細書で引用した特許、特許出願、および公報の各々およびすべての開示は、参照によりその全体が本願明細書においてここに援用される。
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【図面の簡単な説明】
【０４２６】
図面の複数の図についての簡単な説明
【図１】糸球体ろ過速度（ＧＦＲ）（ｙ軸、ｍｌ／分）と相関するレナラーゼレベル（Ｘ軸、任意単位）を示す。Ｙ＝４０．０７２＋１５．０４４；Ｒ２＝０．７５４１。
【図２】糸球体ろ過速度（ＧＦＲ）（ｘ軸、ｍｌ／分）と相関するレナラーゼレベル（ｙ軸、任意単位）を示す他のグラフである。Ｙ＝０．００６３ｘ１．２８６７；Ｒ２＝０．７４８６。
【図３】ヒト血液（すなわち血清）および尿から単離されたレナラーゼタンパク質の基礎レナラーゼ活性を示す。
【図４】内在性のレナラーゼ活性のドーパミン活性化を示す。ドーパミンの注入は、モノアミンオキシダーゼＣ活性の増加（ｙ軸、任意単位）をもたらす。抗レナラーゼ抗体の添加は、しかしながら、この活性化を否定する。
【図５】内在性のレナラーゼ活性のエピネフリン活性化を示す。エピネフリン注入は、モノアミンオキシダーゼＣ活性の増加（ｙ軸、任意単位）をもたらす。抗レナラーゼ抗体の添加は、しかしながら、この活性化を打ち消す。
【図６】エピネフリン投与が、内在性のレナラーゼ活性の増加をもたらしていることを示す。エピネフリンを、１０分および４０分で２回投与した。収縮期血圧に得られた変化もまた示されている。
【図７】エピネフリン注入が血液レナラーゼレベルに影響していることを示す。図の上部の水平のバーが５分間のエピネフリン注入時間を示している。ウェスタンブロット法アッセイが活性型レナラーゼと不活性型レナラーゼとを区別しないため、本願明細書に示す血液レナラーゼレベルは、これらの２つの形態の両方を含む。
【図８Ａ】血圧がレナラーゼ投与によって影響されていることを示している。上方のパネルの上部左側隅にある矢印は、レナラーゼの投与時間を示している。下方のパネルは、シャム注入した対照マウスにおける血圧を示す。
【図８Ｂ】心拍数がレナラーゼ投与によって影響されていることを示している。上方のパネルは対照心拍数を示す。下方のパネルは、レナラーゼ投与後の心拍数を示す。
【図９】矢印によって示されている、レナラーゼ投与後の血圧（９Ａ）および心拍数（９Ｂ）を示す。
【図１０】血圧がレナラーゼの投与によって影響されていることを示している。レナラーゼは、示されているとおりきわめて低投与量での連続的なＩＶ注入により投与される。レナラーゼ注入は、急激に血圧を低下させる。注入の停止で、この効果は可逆的である。両方のトレースは同一の実験に由来する。下方のパネル（１０Ｂ）（上方のパネル１０Ａより約５分遅い）は、レナラーゼの血行力学的効果は、再現可能であり、および急速耐性を受けないことを示している。
【図１１】慢性腎疾患（ＣＫＤ）のラットモデルにおいて低減した総血液レナラーゼレベル（ウェスタンブロット法により計測した）を示す。抗体は活性および不活性型レナラーゼを区別しない。
【図１２】ＣＫＤの、ラットにおけるレナラーゼ発現への効果を示す。左方のパネル（１２Ａ）：抗レナラーゼポリクローナル抗体を用いる免疫細胞化学により評価した腎臓および心臓におけるレナラーゼ発現。ＣＫＤラット（５／６ＮＰＹ）由来の組織は、対照ラットより著しく少ないレナラーゼを発現する。右方のパネル（１２Ｂ）：抗レナラーゼポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット法により確認される、ＣＫＤラットの腎臓および心臓における低減したレナラーゼ発現。
【図１３】エピネフリンの、ＣＫＤラットにおけるレナラーゼ活性化への効果を示す。エピネフリン注入が時間０で開始した。レナラーゼ活性は、ベースラインでは、ＣＫＤラットで著しく低い。エピネフリンによる活性化の規模はＣＫＤでは低く、持続時間は著しく短い。
【図１４】虚血−再灌流のマウスモデルにおけるレナラーゼによる心機能の保存を示す。
【図１４Ａ】レナラーゼは、１５分間の全虚血（ｎ＝３；ｐ＜０．００１）に供した、短離された灌流マウス心臓の左心室（ＬＶ）機能を保存することを示している。
【図１４Ｂ】レナラーゼは、虚血性−再灌流（Ｉ−Ｒ）（ｎ＝３；ｐ＜０．００１）のマウスモデルにおいて心筋壊死を５４％低減させることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2009516693.tif 000014
【図１０Ｂ】
2009516693.tif 000015
【図１１】
2009516693.tif 000016
【図１２Ａ】
2009516693.tif 000017
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2009516693.tif 000019
【図１４Ａ】
2009516693.tif 000020
【図１４Ｂ】
2009516693.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
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