(57)【要約】  本発明は、特に医薬業界におけるビタミンＤ誘導体およびその使用に関する。本発明は、ビタミンＤ核受容体（ＶＤＲ）アゴニスト活性をはじめとする様々な興味深い生物学的性質を有する化合物、ならびに詳細には癌、乾癬、自己免疫疾患、骨異栄養症、および骨粗しょう症を処置するための、前記化合物の投与による治療法を開示する。更にそれは、前記化合物を含む医薬組成物およびそれを製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2009510021.tif 000047
［式中、
Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状もしくは分枝状（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルケニル、またはＣ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１４）アリール、および（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシ基から選択される基を表し、前記基は、少なくとも１個のハロゲン原子、ヒドロキシルまたは−ＮＨ２基により場合により置換されており；
Ｒは、
【化２】
2009510021.tif 000048
を表し；
ここで、Ｚは、
【化３】
2009510021.tif 000049
（式中、
−  Ｒ２およびＲ３は、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルケニル、またはＣ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキニル基から選択される基を表し；
−  Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状もしくは分枝状アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルケニル、
またはＣ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキニル基から選択される基を表し；
−  ｍは、０〜５を含む整数を表し；
−  ｎは、０〜５を含む整数を表す）を表す］を表す化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｈ、ハロゲン原子、ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）３ＯＨから選択される基を表す、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが、
【化４】
2009510021.tif 000050
を表す、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
ｍが０または１である、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
ｎが０である、請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２およびＲ３が、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子、およびＣ１〜Ｃ４分枝状もしくは直鎖状アルキルから選択される基を表す、請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４およびＲ５が、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子、およびＣ１〜Ｃ４直鎖状もしくは分枝状アルキルから選択される基を表す、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、以下の式（IV）：
【化５】
2009510021.tif 000051
（式中、Ｒ１およびＲは、請求項１〜７のいずれかに定義されたとおりである）による特定の立体異性体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
Ｒが、
【化６】
2009510021.tif 000052
を表す、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒが、
【化７】
2009510021.tif 000053
を表す、請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の化合物の少なくとも１種および薬学的に許容され得る担体を、場合により別の活性剤と共に含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌、皮膚障害、炎症関連障害、自己免疫疾患、骨異栄養症、または骨粗しょう症の処置のための、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
乳癌、前立腺癌、結腸癌、白血病、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、光老化、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、低骨代謝回転型骨粗しょう症、ステロイド性骨粗しょう症、老人性骨粗しょう症、閉経後骨粗しょう症、骨軟化症、または腎性骨異栄養症の処置のための、請求項１１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に医薬業界におけるビタミンＤ誘導体およびその使用に関する。本発明は、ビタミンＤ核受容体（ＶＤＲ）アゴニスト活性をはじめとする様々な興味深い生物学的性質を有する化合物、ならびに詳細には癌、乾癬、自己免疫疾患、骨異栄養症、および骨粗しょう症を処置するための、前記化合物の投与による治療法を開示する。更にそれは、前記化合物を含む医薬組成物およびそれを製造する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）は、核受容体（ＮＲ）転写因子ファミリーに属するリガンド依存性転写調節物質であり（１）、細胞増殖および分化、ホメオスタシス、発生、ならびに複数の生理学的工程を制御する。ＶＤＲに結合するリガンドは、ＡＦ−２コアモチーフの配向にコンホメーション変化を誘導して、核受容体と基本的な転写機構（basal transcriptional machinery）との相互作用を仲介するコアクチベータとの相互作用を可能にする（２−４）。
【０００３】
様々な生理学的工程における１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３（ＶＤＲの天然リガンド）の多様な作用から、炎症（慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎）、皮膚障害（乾癬、光老化）、骨異栄養症、骨粗しょう症、癌（乳癌、前立腺癌、結腸癌、白血病）、および自己免疫疾患（多発性硬化症、Ｉ型糖尿病）の処置におけるビタミンＤ核受容体ＶＤＲリガンドの広範の臨床応用が示唆された（５−７）。しかし、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３によるカルシウム効果（calcemic effect）は、高カルシウム血症、骨吸収増加、および軟組織石灰化を引き起こすため、これらの臨床応用でのその天然リガンドの使用が限定され、このため副作用の少ない類似体が開発された。
【０００４】
１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の幾つかの合成類似体が、スーパーアゴニストであることが示された。これらの類似体は、トランス活性化において１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも少なくとも１０倍強力であり、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも数桁高い抗増殖活性を示す。
【０００５】
本発明は、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の類似体である新種の化合物を提供する。詳細には、本発明は、ＶＤＲモジュレータ（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）を提供する。興味深いこととして、本発明は、インビトロテストにおけるＶＤＲのスーパーアゴニストも提供する。これらの類似体は、インビボにおいても効果的である。更に本発明は、高カルシウム血症作用の低い１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の類似体も提供する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、脂肪族側鎖内にオキソラン環が存在する１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の新規な類似体に関する。
【０００７】
本発明は、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の新規な類似体を製造する方法にも関する。
【０００８】
本発明は、薬学的に許容され得る担体中に、本発明の新規な１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３類似体の少なくとも１種を、場合により別の活性剤と共に含む医薬組成物にも関する。
【０００９】
本発明は、ビタミンＤ受容体リガンドに対して応答性の疾患状態（詳細には癌、炎症、皮膚障害、自己免疫疾患、骨異栄養症または骨粗しょう症など）の処置用の医薬を製造するための本発明の化合物の使用にも関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明の一つの態様は、以下の式（Ｉ）：
【００１１】
【化８】
2009510021.tif 000002
【００１２】
［式中、
Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状もしくは分枝状（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルケニル、またはＣ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１４）アリール、および（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシ基から選択される基を表し、前記基は、少なくとも１個のハロゲン原子、ヒドロキシルまたは−ＮＨ２基により場合により置換されており；
Ｒは、
【００１３】
【化９】
2009510021.tif 000003
【００１４】
を表し；
ここで、Ｚは、
【００１５】
【化１０】
2009510021.tif 000004
【００１６】
（式中、
−  Ｒ２およびＲ３は、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルケニル、またはＣ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキニル基から選択される基を表し；Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６直鎖状もしくは分枝状アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルケニル、またはＣ２〜Ｃ１０分枝状もしくは直鎖状アルキニル基から選択される基を表し；
−  ｍは、０〜５を含む整数を表し；
−  ｎは、０〜５を含む整数を表す）を表す］を表す、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の新規な類似体に関する。
【００１７】
本発明は、前記化合物の光学異性体および幾何異性体、そのラセミ体、塩、水和物ならびに混合物も包含する。
【００１８】
本発明の化合物は、複数のキラル中心を有し、このため光学活性形態で存在する場合がある。Ｒ−およびＳ−異性体ならびにそれらの混合物（ラセミ体混合物を含む）が、本発明により考慮される。
【００１９】
追加の不斉炭素原子が、置換基（例えばアルキル基）内に存在してもよい。そのような異性体およびその混合物の全てが、本発明に包含されるものとする。特定の立体異性体が望ましい場合、不斉中心を含み既に分割された出発原料との立体特異的反応を用いることにより、または立体異性体混合物を得て、次に公知の方法により分割することによる、当該技術分野で周知の方法で製造することができる。
【００２０】
アルキル基は、直鎖状または分枝状であってもよい。炭素原子を１〜１０個有するアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、２−エチルヘキシル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、１−メチルヘキシル、３−メチルヘプチル、および他のその異性体形態である。好ましくはアルキル基は、炭素原子が１〜６個存在する。
【００２１】
アルケニル基は、二重結合を１個以上含む直鎖状または分枝状炭化水素官能基、例えばアリル基である。それらは有利には、炭素原子を２〜６個、および好ましくは二重結合を１または２個含む。アルケニル基は、本明細書に定義されたアリール基により置換されていてもよく、その場合、それは、アリールアルケニル基と呼ばれる。
【００２２】
アルキニル基は、三重結合を１個以上含む直鎖状または分枝状炭化水素官能基、例えば３−（ベンジルオキシ）プロパ−１−イニル、フェニルエチニル、プロパ−２−イニルおよびtert−ブチルプロパ−２−イニルカルバマート基である。それらは有利には、炭素原子を２〜６個、および好ましくは三重結合を１または２個含む。アルキニル基は、本明細書に定義されたアリール基により置換されていてもよく、その場合、それは、アリールアルキニル基と呼ばれる。
【００２３】
本願の明細書において、用語：アルコキシは、炭素原子を１〜１０個、好ましくは１〜６個含む直鎖状または分枝状飽和基を示す。アルコキシ基は、特に−Ｏ−アルキル基（式中、アルキル基は、先に定義されたとおりである）である。
【００２４】
用語：アリールは、炭素原子を５〜１４個、好ましくは炭素原子を６〜１４個含み、場合によりＮ、Ｏ、ＳまたはＰから選択されるヘテロ原子１個または数個により中断された芳香族基（より特別にはヘテロアリールと呼ばれる）を包含する。最も好ましいアリール基は、単環または二環式であり、炭素原子を６〜１４個含む（例えばフェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、アントラセニルまたはフルオレニル基）。
【００２５】
用語：アリールオキシは、−Ｏ−アリール基（式中、アリール基は、先に定義されたとおりである）を示す。
【００２６】
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指すものと理解する。
【００２７】
特定の実施形態において、Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン原子、ＣＨ３、（ＣＨ２）３ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）３ＯＨから選択される基を表し、最も好ましくはＲ１は、ＨまたはＣＨ３である。
【００２８】
式（Ｉ）により示されるとおり、Ｒは、
【００２９】
【化１１】
2009510021.tif 000005
【００３０】
のいずれかを表すことができる。
【００３１】
より好ましくは、Ｒは、
【００３２】
【化１２】
2009510021.tif 000006
【００３３】
を表す。
【００３４】
特定の実施形態において、ｍは整数０、１、２、３、４または５を表す。より好ましくは、ｍは０または１である。
【００３５】
特定の実施形態において、ｎは整数０、１、２、３、４または５を表す。より好ましくは、ｎは０である。
【００３６】
特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子およびＣ１〜Ｃ４分枝状もしくは直鎖状アルキルから選択される基を表す。より好ましくは、両者はＨまたはハロゲン原子を表す。
【００３７】
特定の実施形態において、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっており、Ｈ、ハロゲン原子およびＣ１〜Ｃ４直鎖状もしくは分枝状アルキルから選択される基を表す。より好ましくは、Ｒ４およびＲ５の少なくとも一方はＨとは異なり、特に少なくとも一方はＣＨ３である（例えば、一方はＨであり、他方はＣＨ３である）。より特別には、両者はＣＨ３を表す。
【００３８】
上記の式（Ｉ）で表されるとおり、本発明の化合物は、以下の式：
【００３９】
【化１３】
2009510021.tif 000007
【００４０】
を表してもよい。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態は、式（IV）：
【００４２】
【化１４】
2009510021.tif 000008
【００４３】
を有する化合物に関する。
【００４４】
最も好ましい実施形態において、本発明は、上記の式（IV）で表され、一般式（IV）におけるＲが、それぞれ
【００４５】
【化１５】
2009510021.tif 000009
【００４６】
に相当する、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の２種の特定の類似体（化合物ＡおよびＢと呼ばれる）に関する。
【００４７】
化合物ＡおよびＢは、２種のジアステレオ異性体である。化合物Ａは、ＶＤＲスーパーアゴニスト活性を示し、化合物Ｂは、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３と同様に挙動する。
【００４８】
本発明の式（Ｉ）で示される化合物が塩の形態である場合、それは好ましくは薬学的に許容され得る塩である。そのような塩としては、薬学的に許容され得る酸付加塩、薬学的に許容され得る塩基付加塩、薬学的に許容され得る金属塩、アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、無機酸および有機酸の塩が挙げられる。適切な無機酸の代表的な例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸などが挙げられる。適切な有機酸の代表的な例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸などが挙げられる。薬学的に許容され得る無機または有機酸付加塩の更なる例としては、J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2およびHandbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use edited by P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth 2002に列挙された薬学的に許容され得る塩が挙げられる。金属塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基の例としては、リシン、アルギニン、グアニジン、ジエタノールアミンオリン（diethanolamineoline）などが挙げられる。
【００４９】
本発明の別の態様は、先に定義された化合物を製造する方法に関する。本発明の化合物は、市販の製品から、当業者に公知の化学反応の組合せを利用して製造してもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明の化合物ＡおよびＢは、以下の合成経路を実行することにより製造してもよい。
【００５１】
【化１６】
2009510021.tif 000010
2009510021.tif 000011
【００５２】
本願に含まれる案内に従えば、当業者は、この方法を適用して式（Ｉ）で示される他の化合物を製造する方法を認識できる。
【００５３】
本発明は、薬学的に許容され得る担体中に、先に定義された少なくとも１種の化合物を、場合により別の活性剤と共に含む医薬組成物にも関する。
【００５４】
本発明の別の態様は、ビタミンＤ受容体リガンドに応答性の疾患状態を処置するために本発明の化合物を使用することである。
【００５５】
本発明の更に別の態様は、ビタミンＤ受容体リガンドに応答性の疾患状態、詳細には癌、皮膚障害、炎症関連障害、自己免疫疾患、骨異栄養症、または骨粗しょう症の処置に使用される医薬を製造するための、先に定義された化合物の使用に関する。
【００５６】
本発明は、より詳細には、癌（乳癌、前立腺癌、結腸癌、または白血病など）、炎症関連障害（慢性関節リウマチ、または乾癬性関節炎など）、皮膚障害（乾癬または光老化など）、自己免疫疾患（多発性硬化症またはＩ型糖尿病など）、骨異栄養症、または骨粗しょう症、詳細には低骨代謝回転型骨粗しょう症、ステロイド性骨粗しょう症、老人性骨粗しょう症、もしくは閉経後骨粗しょう症、骨軟化症、または腎性骨異栄養症の処置のための医薬組成物に関する。
【００５７】
本発明は、更に、式（Ｉ）で示される化合物または本発明の医薬組成物の効果的な量を、そのような処置を必要とする対象（特にヒト）に投与することを含む、ビタミンＤ受容体リガンドに応答性の疾患状態、例えば詳細には癌（乳癌、前立腺癌、結腸癌、または白血病など）、炎症（慢性関節リウマチ、または乾癬性関節炎など）、皮膚障害（乾癬、または光老化など）、自己免疫疾患（多発性硬化症またはＩ型糖尿病など）、骨異栄養症、または骨粗しょう症（低骨代謝回転型骨粗しょう症、ステロイド性骨粗しょう症、老人性骨粗しょう症、もしくは閉経後骨粗しょう症、骨軟化症、または腎性骨異栄養症など）などの処置方法に関する。
【００５８】
その処置は、局所的、皮下、経口、経直腸、舌下、鼻腔内または非経口であってもよい。該化合物は、注射もしくは静脈内輸注により、または適切な滅菌溶液により、または消化管を介した液体もしくは固体投与の形態で、またはクリーム、軟膏、パッチ、もしくは経皮使用に適した類似の担体の形態で投与することができる。該化合物は、約０．０１μg/g組成物〜約５００μg/g組成物の量で組成物中に存在してもよく、約０．１μg/日〜約５０μg/日、より特別には約０．５μg/日〜約２μg/日の投与量で投与してもよい。
【００５９】
該化合物は、薬学的適合性溶媒中の溶液として、または適切な薬学的溶媒もしくは担体中のエマルジョン、懸濁液もしくは分散液として、または当該技術分野で公知の方法で固体担体を含む丸剤、錠剤もしくはカプセル剤として、製剤化されてもよい。局所使用では、該化合物は、好ましくはクリームもしくは軟膏として、または局所使用に適した類似の医薬形態で製剤化される。局所投与は、液体もしくは半液体製剤（例えばリニメント）、ローション、塗布剤、水中油もしくは油中水エマルジョン（例えばクリーム、軟膏またはペースト）；溶液または懸濁液（例えばドロップ）；あるいはスプレーが挙げられる。経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが所定の量の活性成分を含む分離した単位（例えばカプセル、サシェ、錠剤またはロゼンジ）の形態；粉末もしくは顆粒の形態；水性液もしくは非水性液の溶液もしくは懸濁液の形態；または水中油もしくは油中水エマルジョンの形態であってもよい。経直腸投与用の製剤は、活性成分および担体（例えばココアバター）を混和した坐剤の形態、または浣腸の形態であってもよい。非経口投与に適した製剤は、簡便には、好ましくは受容者の血液と等張である、活性成分の滅菌油性または水性製剤を含む。
【００６０】
そのような各製剤は、他の薬学的適合性で非毒性の補助剤（例えば安定化剤、酸化防止剤、結合剤、着色剤、乳化剤または着香物質）を含むこともできる。本発明の製剤は、それゆえ治療成分を薬学的に許容され得る担体、および場合により他の治療成分と共に含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容され得」なければならず、その受容者に有害であってはならない。
【００６１】
該化合物は、有利には適切な滅菌溶液の注射もしくは静脈内輸注により、または消化管による経口投与で、または局所的にクリーム、軟膏、ローションもしくは適切な経皮膏薬の形態で適用される。
【００６２】
「効果的な量」は、ヒトなどの哺乳類の疾患状態の有害な作用を予防、除去または軽減する、式（Ｉ）に対応する薬剤の量を意味する。投与量が、患者、病状、投与様式などに応じて、当業者により適合され得ることを理解する。
【００６３】
この明細書全体では、「状態または障害の処置」などは、式（Ｉ）で示される化合物に照らして述べられたときは、
ａ）本発明の化合物をそのような処置を必要とする対象に投与することを含む、状態または障害を処置する方法；
ｂ）状態もしくは障害の処置のための本発明の化合物の使用；
ｃ）状態もしくは障害の処置用の医薬製剤を製造するための本発明の化合物の使用；および／または
ｄ）状態もしくは障害の処置に適した本発明の化合物の用量を含む医薬製剤、
を意味する。
【００６４】
本発明の明細書内では、用語：処置は、治療的、対症的および予防的処置を示す。本発明の化合物は、既存の疾患（疾患の進行の初期または後期段階を含む）を有するヒトに用いることができる。本発明の化合物は、疾患を有する患者を必ずしも治癒するのではないが、疾患の進行を遅延もしくは減速させるか、または更なる進行を予防し、それにより患者の状態を軽減する。本発明の化合物は、疾患を有していないが通常ならば疾患を発症するであろう患者、または疾患のリスクの高い患者に投与することもでき、患者はその疾患を発症しない。処置は、最終的に疾患を発症するであろう患者、あるいは年齢、家族歴、遺伝子もしくは染色体異常により、そして／または疾患の生物学的マーカ（例えば組織または体液における公知の遺伝子変異）が１つ以上存在することで疾患のリスクがある患者において、疾患の発症を遅延させることも含む。本発明の化合物は、疾患の開始を遅延させることにより、通常であれば患者が疾患に罹ったはずの期間に疾患に罹るのを防ぐか、または患者が最終的に疾患に罹る以前に本発明の化合物を投与している場合以外では、疾患の発症率またはその影響の一部を低下させる。処置は、疾患に罹り易いと思われる患者に、本発明の化合物を投与することも包含する。上記疾患の処置では、本発明の化合物を治療上効果的な量で投与する。
【００６５】
上記化合物、それを含む組成物、または処置は、単独で、または他の活性成分、組成物もしくは処置と組み合わせて実行することができる。該化合物は、適切には、単独で、または異なる度合いの骨ミネラル動員およびカルシウム輸送刺激が有利であることが見出されている状況では、漸変的な量の他の活性成分（例えばビタミンＤ化合物、例えば１α−ヒドロキシビタミンＤ２もしくはＤ３、または１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）と共に投与してもよい。その上それは、慢性または急性障害の処置に対応することができる。
【００６６】
本発明の更なる態様および利点を、以下の実施例に開示するが、それは例示とみなし、本願の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【００６７】
実施例
１．化合物ＡおよびＢの合成
酸素感受性または水分感受性の化合物を含む反応は全て、乾燥Ａｒ雰囲気下で実施した。反応温度は、外部の浴温度を参照した。乾燥溶媒は全て、使用の直前にＡｒ下で蒸留した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、Ｎａ／ベンゾフェノンから蒸留し；ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、Ｐ２Ｏ５から蒸留し；アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、ｉ−Ｐｒ２ＮＨ、Ｅｔ３Ｎおよびｉ−Ｐｒ２ＮＥｔは、ＣａＨ２から蒸留した。液状試薬または試薬の溶液を、シリンジまたはカニューレにより添加した。有機抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、アスピレータの圧力（２０〜３０mmHg）でロータリーエバポレータを用いて濃縮した。アルミニウムを裏打ちしたMerk60シリカゲルプレート（０．２mm厚）を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、反応をモニタリングした。最初は紫外線（２５４nm）を用い、その後、ＥｔＯＨ中のホスホモリブデンン酸の溶液（５％）に浸し、次に加熱することにより、クロマトグラムを視覚化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Merk60（２３０〜４００メッシュ）シリカゲルを用いて実施した。他に断りがなければ、ＮＭＲスペクトルは全て、ＣＤＣｌ３中の溶液で測定した。δ＝７．２６ppm（１Ｈ）またはδ＝７７ppm（１３Ｃ）の残留溶媒シグナルを内部標準として用い、化学シフトは、テトラメチルシラン（δ＝０．０ppm）から下流領域のδスケール（ppm）で報告し：カップリング定数は、Hzで報告した。分極移動による無歪み増強（Distortionless Enhancement by Polarization Transfer）（ＤＥＰＴ）を用いて、炭素の型を割当てた。
【００６８】
［（２Ｚ）−２−［（３Ｓ，５Ｒ）−５−ビス［トリエチルシリル］−２−メチレンシクロヘキシリデン］−エチル］ジフェニルホスフィン酸化物）（２）
【００６９】
【化１７】
2009510021.tif 000012
【００７０】
乾燥ＴＨＦ（２０mL）中の４の溶液（２．２３ｇ、３．８２mmol）をｎＢｕ４ＮＦ（３．２ｇ、１０mmol）で処理した。濃縮後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０mL）で抽出した。有機層を乾燥し、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物を乾燥ピリジン（１０mL）で溶解して、ＣｌＳｉＥｔ３（１．５ｇ、９．９mmol）とＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン、２０mg）で処理した。１５分後、反応をＮａＨＣＯ３の飽和溶液（２０mL）を加えて急冷した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２×３０ml）で抽出した。有機層を乾燥し、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１０cm、１５％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して２（１．７８ｇ、８０％、無色の油状物）を得た。
【００７１】
【表１】
2009510021.tif 000013
【００７２】
（Ｓ）−４−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−２−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）ペンタ−４−エン−２−オール（７）
【００７３】
【化１８】
2009510021.tif 000014
【００７４】
ＴＢＳは、「tert−ブチルジメチルシリル」を表す。
リチウム（３３０mg、４７．５５mmol）を少ない量に分けて、アルゴン下、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、４０mL）中の４，４’−ジ−tert−ブチル−ビフェニル溶液（ＤＴＢＢ、１．３ｇ、４．８８mmol）を加えた。４０分間の超音波処理後、緑色が観察された。混合物を−７８℃に冷却した。乾燥ＴＨＦ（１５mL）中の３（B. Fernandez, J.A. Martinez-Perez, J.R. Granja, L. Castedo,およびA. Mourino J. Org. Chem. 1992, 57, 3173-3178）（０．７mg、２．２５mmol）と６（M. SworinおよびK.-C. Lin, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 1815）（２．９ｇ、１１．３６mmol）の溶液をゆっくり加えた。緑色が赤色に変化する。反応をメタノール（１mL）を加えて急冷した。Ｅｔ２Ｏ（３０mL）とＨ２Ｏ（３０mL）を引き続いて加えた。有機層をＥｔ２Ｏ（２×３０mL）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５×１１cm、ヘキサン類）により精製して７（１．３ｇ、９５％、無色の油状物）を得た。
【００７５】
【表２】
2009510021.tif 000015
【００７６】
（Ｓ）−４−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−２−メチレンペンタン−１，４−ジオール（８）
【００７７】
【化１９】
2009510021.tif 000016
【００７８】
乾燥ＴＨＦ（６mL）中の７の溶液（１．３ｇ、２．６mmol）をｎＢｕ４ＮＦ（１．６ｇ、５mmol）で処理した。１時間後、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（３０mL）を加えた。混合物をＥｔＯＡｃ（３×３０mL）で抽出した。有機層を乾燥し、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１０cm、２５％  Ｅｔ２Ｏ−ヘキサン類）により精製して８（０．８６ｇ、８６％、白色の固体、融点：９５℃）、元素分析：Ｃ＝６８．１２％、Ｈ＝１１．１８％を得た。
【００７９】
【表３】
2009510021.tif 000017
【００８０】
（Ｓ）−４−（クロロメチル）−２−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）ペンタ−４−エン−２−オール（９）
【００８１】
【化２０】
2009510021.tif 000018
【００８２】
８（８２mg、０．２mmol）、Ｐｈ３Ｐ（８５mg、３．３２mmol）、ＣＣｌ４（５４mg、０．３５mmol、ＣａＣｌ２を用いて乾燥した）、およびＣＨ３ＣＮ（２mL、ＣａＨ２を用いて乾燥した）の混合物を３０分間、アルゴン下で撹拌した。混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５×５cm、５％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）に付して、９（７０mg、７７％）を得た。この不安定な化合物を直ちに次工程で使用した。
【００８３】
【表４】
2009510021.tif 000019
【００８４】
（Ｓ）−テトラヒドロ−２−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−２−メチル−４−メチレンフラン（１０）
【００８５】
【化２１】
2009510021.tif 000020
【００８６】
乾燥ジオキサン（５mL）中の９の溶液（０．５ｇ、１．３２mmol）を、ＫＨ（０．３ｇ、７．５mmol）で処理した。混合物を加熱還流した。３０分後、反応をメタノール（１mL）とＨ２Ｏ（１０mL）を加えて急冷した。混合物をＥｔ２Ｏ（３×１５mL）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５×７cm、ヘキサン類）により精製して、１０（０．４ｇ、８６％、無色の油状物）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ―――１３Ｃ−ＮＭＲ．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）
【００８７】
【表５】
2009510021.tif 000021
【００８８】
（Ｓ）−ジヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３（２Ｈ）−オン（１１）
【００８９】
【化２２】
2009510021.tif 000022
【００９０】
ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（４０mL、１:１）中のアルケン１０（１４０mg、０．３８mmol）を過ヨウ素酸ナトリウム（４１５mg、１．８mmol）およびＨ２Ｏ中の四酸化オスミウムの溶液（０．２mL、４％）で処理して、一晩、室温で放置した。反応混合物をＮａＣｌの飽和溶液（４０mL）で処理した。混合物をＥｔ２Ｏ（３×５０mL）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５×８cm、５％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、１１（１３０mg、９１％、白色の固体、融点：５２℃）を得た。
【００９１】
【表６】
2009510021.tif 000023
【００９２】
（Ｚ）−エチル  ２−（（Ｓ）−ジヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３（２Ｈ）−イリデン）アセタート（１２Ｚ）
および
（Ｅ）−エチル  ２−（（Ｓ）−ジヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３（２Ｈ）−イリデン）アセタート（１２Ｅ）
【００９３】
【化２３】
2009510021.tif 000024
【００９４】
乾燥トリエチルホスホノアセタート（２．０４mL、１０．２mmol）を乾燥ＴＨＦ（１０mL）中のカリウムtert−ブトキシドの撹拌した溶液（１．４ｇ、１０．２mmol）に滴下した。混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を−８℃に冷却して、次に乾燥ＴＨＦ（５mL）中の溶液１１（０．６ｇ、１．５７mmol）を加えた。−８℃で１時間後、塩化アンモニウム（１０mL）とＨ２Ｏ（２５mL）の飽和溶液を加えた。混合物をＥｔ２Ｏ（４×５０mL）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５×９cm、５％  Ｅｔ２Ｏ−ヘキサン類）により精製して、１２（６８０mg、９４％、白色の固体、融点：１０１℃）を得た。
【００９５】
小さな極性を有する化合物：
【００９６】
【表７】
2009510021.tif 000025
【００９７】
主な極性を有する化合物：
【００９８】
【表８】
2009510021.tif 000026
【００９９】
１−（（３Ｓ，５Ｓ）−テトラヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３−イル）−２−メチルプロパン−２−オール（１３）
【０１００】
１−（（３Ｒ，５Ｓ）−テトラヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｓ，７ａＲ）−オクタヒドロ−７−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３−イル）−２−メチルプロパン−２−オール（１４）
【０１０１】
【化２４】
2009510021.tif 000027
【０１０２】
ＥｔＯＡｃ（２０mL）中の１２（６８０mg、１．５６mmol）と５％  Ｐｄ／Ｃ（１５mg、０．１５mmol）の懸濁液を、Ｈ２大気中（１atm）１２時間撹拌した。混合物を濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５×６．５cm、ヘキサン類）により精製して、１２ａ（６６０mg、９６％、無色の油状物）を得た。
【０１０３】
ＴＨＦ中のＭｅＬｉ溶液（１０mL、１０mmol、１Ｍ）を、乾燥ＴＨＦ（５mL）中の１２ａの溶液（６６０mg、１．５mmol）に加えた。混合物を３０分間撹拌して、次に０℃まで１時間以上温めた。ＭｅＯＨ（０．５mL）と飽和ＮＨ４Ｃｌ（４mL）をゆっくり加えた。水層をエーテル（４×３０mL）で抽出して、合わせた有機層を乾燥して（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧の状態で濃縮した。残留物をＨＰＬＣ（columna Phenomenex  ２５０×１０mm、５Ф−ヘキサン−Ｅｔ２Ｏ）により精製して、１３（３３０mg、２工程において４９％）と１４（２８０mg、２工程において４２％）を得た。
【０１０４】
【表９】
2009510021.tif 000028
【０１０５】
小さな極性を有する化合物：
【０１０６】
【表１０】
2009510021.tif 000029
【０１０７】
主な極性を有する化合物：
【０１０８】
【表１１】
2009510021.tif 000030
【０１０９】
（１Ｓ，３ａＲ，７ａＲ）−オクタヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチルインデン−４−オン（１Ｓ）
【０１１０】
【化２５】
2009510021.tif 000031
【０１１１】
（１Ｓ，３ａＲ，４Ｓ，７ａＳ）−オクタヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチル−１Ｈ−インデン−４−オール（１３ａ）
【０１１２】
乾燥ＴＨＦ（４mL）中の溶液１３（３３０mg、０．７８mmol）を、ｎＢｕ４ＮＦ（１．０２ｇ、３．２５mmol）で処理した。混合物を９０分間加熱還流した。Ｈ２Ｏ（２０mL）とＥｔＯＡｃ（２０mL）を加えた。水層をＥｔＯＡｃ（４×２０mL）で抽出して、合わせた有機層を乾燥して（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２×５．５cm、３０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、１３ａ（２２４mg、９３％、白色の固体、融点：９８℃）を得た。
【０１１３】
【表１２】
2009510021.tif 000032
【０１１４】
（１Ｓ，３ａＲ，７ａＲ）−オクタヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチルインデン−４−オン（１Ｓ）
【０１１５】
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０mL）中の溶液１３ａ（１２３mg、０．４mmol）を、ＰＤＣ（二クロム酸ピリジニウム、０．６ｇ、１．６mmol）で処理した。混合物を室温で２０時間撹拌した。混合物を濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×５．５cm、２０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、１Ｓ（１２０mg、９８％、白色の固体、融点：８７℃）を得た。元素分析  Ｃ＝７３．８０％、Ｈ＝１０．５１％。
【０１１６】
【表１３】
2009510021.tif 000033
【０１１７】
（１Ｓ，３ａＲ，７ａＲ）−オクタヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチルインデン−４−オン（１Ｒ）
【０１１８】
【化２６】
2009510021.tif 000034
【０１１９】
（１Ｓ，３ａＲ，４Ｓ，７ａＳ）−オクタヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチル−１Ｈ−インデン−４−オール  １４ａ
【０１２０】
乾燥ＴＨＦ（４mL）中の溶液１４（２８０mg、０．７８mmol）を、ｎＢｕ４ＮＦ（１．０５ｇ、３．３mmol）で処理した。混合物を加熱還流した。１１５時間後、Ｈ２Ｏ（２０mL）とＥｔＯＡｃ（２０mL）を加えた。水層をＥｔＯＡｃ（４×２０mL）で抽出して、合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２×５．５cm、３０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、対応するジオール１４ａ（１８０mg、８８％、白色の固体、融点：６７℃）を得た。
【０１２１】
（１Ｓ，３ａＲ，７ａＲ）−オクタヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチルインデン−４−オン（１Ｒ）
【０１２２】
乾燥ＣＨ２ＣＩ２（１０mL）中の溶液１４ａ（１００mg、０．３２mmol）を、ＰＤＣ（二クロム酸ピリジニウム、０．５ｇ、１．３mmol）で処理した。混合物を室温で２０時間撹拌し、混合物を濾過して減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×５．５cm、２０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、１Ｒ（９０mg、９１％、白色の固体、融点：８２℃）を得た。
【０１２３】
【表１４】
2009510021.tif 000035
【０１２４】
１−（（３Ｒ，５Ｓ）−テトラヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｅ，７ａＳ）−オクタヒドロ−７−（（Ｚ）−２−（（３Ｓ，５Ｒ）−３，５−ビス（トリエチルシリルオキシ）−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３−イル）−２−メチルプロパン−２−オール（１６）
【０１２５】
【化２７】
2009510021.tif 000036
【０１２６】
ヘキサン中のｎ−ＢｕＬｉ溶液（０．７４mL、１．６８mmol、２．２５Ｍ）を、−７８℃で乾燥ＴＨＦ中の、ホスフィン酸化物２の溶液（１．０４５ｇ、１．８mmol、４．６当量）に加えた。濃赤色溶液を１時間撹拌した。乾燥ＴＨＦ中の、ケトン１Ｓ溶液（１２０mg、０．３９mmol、１当量）を滴下した。反応混合物を暗所中で、５時間−７８℃そして−５５℃１時間で撹拌した。反応をＨ２Ｏ（８mL）とＥｔＯＡｃ（１５mL）を加えて急冷した。混合物の濃縮物はＥｔ２Ｏ（１００mL）に溶解した残留物を得た。合わせた層を飽和ＮａＨＣＯ３（３×２５mL）、飽和ＮａＣｌ（５０mL）とＨ２Ｏ（５０mL）を用いて洗浄し、乾燥し、濾過して、減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５cm、４０％  Ｅｔ２Ｏ−ヘキサン類）により精製して、保護された類似物１６［１５０mg、９１％、（Ｒｆ＝０．７、５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類）、無色の油状物］を得た。
【０１２７】
【表１５】
2009510021.tif 000037
【０１２８】
１−（（３Ｓ，５Ｓ）−テトラヒドロ−５−（（３Ｓ，３ａＳ，７Ｅ，７ａＳ）−オクタヒドロ−７−（（Ｚ）−２−（（３Ｓ，５Ｒ）−３，５−ビス（トリエチルシリルオキシ）−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−３ａ−メチル−１Ｈ−インデン−３−イル）−５−メチルフラン−３−イル）−２−メチルプロパン−２−オール（１７）
【０１２９】
【化２８】
2009510021.tif 000038
【０１３０】
ヘキサン中のｎ−ＢｕＬｉ溶液（０．５５mL、１．２３mmol、２．２５Ｍ）を、−７８℃で乾燥ＴＨＦ中の、ホスフィン酸化物１５の溶液（７８５mg、１．３mmol、４．６当量）に加えた。濃赤色溶液を１時間撹拌した。乾燥ＴＨＦ中の、ケトン１Ｒ溶液（８８mg、０．２８mmol、１当量）を滴下した。反応混合物を暗所中で、５時間−７８℃および−５５℃１時間撹拌した。反応をＨ２Ｏ（８mL）とＥｔＯＡｃ（１５mL）を加えて急冷した。混合物の濃縮物はＥｔ２Ｏ（１００mL）に溶解した残留物を得た。合わせた層を飽和ＮａＨＣＯ３（３×２５mL）、飽和ＮａＣｌ（５０mL）とＨ２Ｏ（５０mL）を用いて洗浄し、乾燥し、濾過して、減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５cm、４０％  Ｅｔ２Ｏ−ヘキサン類）により精製して、保護された類似物１７［１２０mg、８１％、（Ｒｆ＝０．７、５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類）、無色の油状物］および回収された１Ｒ（２０mg）を得た。
【０１３１】
【表１６】
2009510021.tif 000039
【０１３２】
（１Ｒ，３Ｓ，５Ｚ）−５−（（Ｅ）−２−（（１Ｓ，３ａＳ，７ａＳ）−ヘキサヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチル−１Ｈ−インデン−４（７ａＨ）−イリデン）エチリデン）−４−メチレンシクロへキサン−１，３−ジオール（Ａ）
【０１３３】
【化２９】
2009510021.tif 000040
【０１３４】
ＨＦ−Ｐｙ（０．４mL）をＣＨ３ＣＮ（２．５mL）とＥｔ３Ｎ（１．５mL）中の、化合物１６の溶液（１３４mg、０．２mmol）に加えた。１０分後、反応を飽和ＮａＨＣＯ３（５mL）を加えて急冷した。混合物をＥｔ２Ｏ（２×２０mL）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ（２５mL）とＨ２Ｏ（２５mL）を用いて洗浄し、乾燥し、濾過して、減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１．５×９．５cm、５０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、化合物Ａ（８０mg、８８％、白色の固体、融点：１２８℃）を得た。
【０１３５】
【表１７】
2009510021.tif 000041
【０１３６】
（１Ｒ，３Ｓ，５Ｚ）−５−（（Ｅ）−２−（（１Ｓ，３ａＳ，７ａＳ）−ヘキサヒドロ−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチルフラン−２−イル）−７ａ−メチル−１Ｈ−インデン−４（７ａＨ）−イリデン）エチリデン）−４−メチレンシクロへキサン−１，３−ジオール（Ｂ）
【０１３７】
【化３０】
2009510021.tif 000042
【０１３８】
ＨＦ−Ｐｙ（０．４mL）をＣＨ３ＣＮ（２．５mL）とＥｔ３Ｎ（１．５mL）中の化合物１７の溶液（１１７mg、０．１７mmol）に加えた。１０分後、反応を飽和ＮａＨＣＯ３（５mL）を加えて急冷した。混合物をＥｔ２Ｏ（２×２０mL）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ（２５mL）とＨ２Ｏ（２５mL）を用いて洗浄し、乾燥し、濾過して、減圧の状態で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、１．５×１１cm、５０％  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン類）により精製して、化合物Ｂ（６０mg、８５％、白色の固体、融点：９６℃）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ―――１３Ｃ−ＮＭＲ．ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）
【０１３９】
【表１８】
2009510021.tif 000043
【０１４０】
II  インビトロアッセイ
材料と方法
精製および結晶化
ループ結合らせんＨ１およびＨ３中の５０残基を欠失した変異体を用いて、化合物ＡおよびＢとの錯体の中のｈＶＤＲリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の結晶を得、それを用いて１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３および複数の合成リガンドに結合したＶＤＲ  ＬＢＤの構造を解明した（１０−１２）。この変異体は、ＶＤＲ  ＬＢＤ野生型と同じ生物学的性質（結合、複数の細胞系でのトランス活性化、ヘテロ二量体形成）を有する（１１）。記載された手順を用いて、新しいリガンドとのヒトＶＤＲ  ＬＢＤ錯体の精製および結晶化を実施した（１１）。ヒトＶＤＲのＬＢＤ（残基１１８−４２７  Δ１６５−２１５）を、ｐＥＴ２８ｂ発現ベクターにクローニングして、Ｎ末端ヘキサヒスチジン・タグ融合蛋白質を得、E.coli BL21（ＤＥ３)で過剰に産生させた。細胞をＬＢ培地で増殖させ、次に１mM  イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドで２０℃で６時間誘導した。蛋白質精製には、コバルトキレート樹脂での金属アフィニティークロマトグラフィーステップが含まれた。トロンビン消化によりタグを除去した後、蛋白質をゲルろ過により更に精製した。最終的な蛋白質緩衝液は、１０mM  Tris、pH７．５、１００mM  ＮａＣｌ、および５mM  ジチオトレイトールであった。蛋白質を１０mg/mLに濃縮し、５倍過剰のリガンドの存在下でインキュベートした。蛋白質の純度および均質性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびNative−ＰＡＧＥで評価した。錯体の結晶を、ハンギングドロップ法による４℃での水蒸気拡散により得た。ＶＤＲ  ＬＢＤ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３錯体の結晶を、ミクロシーディングに用いた。希釈系列からのシードを、新たに調製したドロップに誘導した。貯蔵溶液には、１００mM  Ｍｅｓ−ＫＯＨおよび１．４Ｍ  硫酸アンモニウム、pH６．０が含まれた。
【０１４１】
Ｘ線データの回収および構造決定
結晶を貯蔵溶液＋３０％グリセリンおよび５％ＰＥＧ４００を含む溶液と共に凍結保護し、ファイバーループ中に入れて、液体Ｎ２温度の液体エタンで瞬間冷却した。一つの凍結結晶からのデータ回収を、ＥＳＲＦ（Grenoble, フランス）のビームラインＢＭ３０で約−１７３℃（１００Ｋ）で実施した。結晶は同形であり、表１に明記した単位セルパラメータの斜方晶系の空間群：Ｐ２１２１２１に属した。データを統合し、HKL2000プログラムパッケージを用いて基準化した（１３）。
【０１４２】
【表１９】
2009510021.tif 000044
【０１４３】
化合物Ａおよび化合物ＢとのＶＤＲ  ＬＢＤ錯体の結晶構造を、公知のヒトＶＤＲ  ＬＢＤ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３構造を出発モデルとして用いた分子置換により解明し、それぞれ分解能：２．０および１．８Åで精密化した。ＶＤＲ  ＬＢＤの精密化した原子モデルからの省略地図を用いて、リガンドをそれらの電子密度に適合させた。異方的スケーリングおよびバルク溶媒の修正（bulk solvent correction）、ならびに拘束的な等方性原子Ｂ因子精密化を用いた。リガンドに関する平均温度因子（化合物ＡおよびＢで、それぞれ１４．３Å２および１４．１Å２）は、蛋白質のそれ（化合物ＡおよびＢで、それぞれ２３．２Å２および１８．３Å２）よりも低かった。
【０１４４】
次に、最尤法精密化およびモデル適合の別のサイクルを実施して、錯体の最終モデルを作成した。データの全を、精密化に含めた（δ−カットオフなし）。PROCHECKによれば、精密化モデルは全て、リガンドに関して明白なキラリティーを示し、Ramachandranプロットの異常値は示されなかった。ＶＤＲ−ＡおよびＶＤＲ−Ｂ錯体の最終モデルは、２５５個の残基を含み、最初の２個のＮ末端残基および最後の４個のＣ−末端残基では明確な電子密度はなく、ループ結合Ｈ９〜Ｈ１０中の残基３７５−３７７の電子密度は低かった。結晶学的データを、表１に要約した。プログラムＭＯＬＲＥＰ（１４）、ＣＮＳ−ＳＯＬＶＥ（１５）、およびＯ（１６）を、分子置換、構造精密化、およびモデル構築に用いた。構造比較では、Ｏのｌｓｑコマンドおよびデフォルトパラメータを用いて、モデルのＣαトレースを重ね合わせた。図は、Pymolにより作成した（１７）。
【０１４５】
トランスフェクションおよびトランス活性化アッセイ
ヒトＶＤＲ  ＬＢＤを、Ｇａｌ融合蛋白質としてのｐＧ４Ｍ誘導プラスミドにサブクローニングした。ＶＤＲ活性化の分析のための一過性トランスフェクション実験を、記載された標準的リン酸カルシウム共沈法を用いて、４８穴プレートで実施した（１１）。２９３ＥＢＮＡ細胞を播種し（６．０×１０４細胞／ウェル）、Dulbecco培地（ＤＭＥＭ＋１g/L  グルコース）、１０％ＦＣＳ、ゲンタマイシンおよび１mg/ml  Ｇ４１８（ジェネティシン）を含む培地中、３７℃で２４時間インキュベートした。２９３ＥＢＮＡ細胞を、Ｇａｌ４−ＶＤＲ  ＬＢＤプラスミド１２．５ng、ＵＡＳ−ＴＡＴＡルシフェラーゼレポータプラスミド１０ng、およびＰＣＨ１１０内部対照組換え体発現β−ガラクトシドプラスミド３７．５ngで一過性にトランスフェクトした。細胞を３７℃で８時間インキュベートした後、培地を交換して、最適化した希釈系列に化合物を添加した。３７℃で２０時間経った後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、Passiv溶解緩衝液（Promega）に回収した。細胞溶解液をルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。各試料のルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。細胞を１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、化合物Ａ、および化合物Ｂで処理した。実験は全て、二重測定で実施した。
【０１４６】
結果と考察
新規な側鎖類似体
複数のリガンド（１０−１２）と錯体形成したＶＤＲの結晶構造において、リガンドは、Ａ−、Seco  Ｂ−、Ｃ−およびＤ−環の周りの受容体にしっかりと結合している。逆に、脂肪族側鎖は結合が緩く、このため１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３では側鎖の別のコンホメーションが可能である。
【０１４７】
オキソラン部分のＣ２３で逆の立体化学を備えた２種のエピマー（化合物Ａおよび化合物Ｂ）を、上記のとおり合成した（図１）。予備的なドッキング実験では、化合物Ａおよび１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３が、類似のコンホメーションを採用する可能性があり、更なるＯ２１およびＣ２８原子が、リガンド結合ポケット（ＬＢＰ）と新たなVan der Waals接触を作ることが示された。その一方で、化合物Ｂは、異なるコンホメーションを採用しなければならず、蛋白質構造の変換を誘導することが可能である。実験データは、両方のポイントについて取り扱う必要があった。
【０１４８】
それらの生物学的活性のテストから、予測された差異が明確になった。細胞トランスフェクション実験でのトランス活性化の結果を、図２に示す。
【０１４９】
１０−１０Ｍの化合物Ａは、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３よりも１２倍効率的なヒトＶＤＲの転写活性を誘導した。その一方で、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３および化合物Ｂは、ヒトＶＤＲの転写活性を同様の効率で誘導した。
【０１５０】
リガンド−蛋白質相互作用
２種の錯体は、アゴニストリガンドに結合する、ＶＤＲのこれまで報告された構造全ての標準コンホメーションを採用した。変動は、蛋白質の表面にある幾つかの側鎖のみに関連した。ＶＤＲ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３錯体と比較すると、原子モデルはＶＤＲ−ＡおよびＶＤＲ−Ｂ錯体でＣα原子についてのｒｍｓｄが、それぞれ０．２３Åおよび０．２４Åであった。
【０１５１】
化合物ＡおよびＢは、ＶＤＲ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３錯体でも観察された、細長いコンホメーションを採用していた。３種の錯体の全てで、１−ＯＨと２５−ＯＨの間の距離が、１２．８Å〜１３．１Åで変動した。蛋白質とＡ−、Seco Ｂ−、Ｃ−、およびＤ−環との相互作用は、同一であった。ヒドロキシル基は、同様の水素結合（Ser-237およびArg-274と１−ＯＨ、Tyr-143およびSer-278と３−ＯＨ、ならびにHis-305およびHis-397と２５−ＯＨ）を作っていた。
【０１５２】
結晶構造において、化合物Ａの側鎖は、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３のそれと類似のコンホメーションを採用しており、こうしてこれまで観察された接触の全てを形成することで、より固いリガンド−蛋白質接触に寄与する。１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較すると、新規な特徴は、Ｏ２１とVal-300との更なるvan der Waals接触であり、それはＶＤＲ−Ｂ錯体でも存在するが、より弱い。立体異性体Ｂは、Ｃ２３では逆の配置であるため異なる側鎖コンホメーションを採用する。Ｃ２３およびＣ２４は、各接触に影響を与える化合物Ａ錯体中のそれぞれの位置から０．６Åおよび１．２Å離れている。その結果、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７および２５−ＯＨの位置も異なっており、そのため化合物Ｂと活性化ヘリックス−１２との直接の相互作用は弱くなる（Ｃ２７とVal-418の間は４．６Å）。
【０１５３】
構造−活性関連性
２種の結晶構造により、一方のジアステレオマー（化合物Ａ）がより高いトランス活性能であることの説明が得られた。化合物Ａの場合、オキソラン環が、天然リガンドの結合形態に似たコンホメーションを安定化させている。それは、エネルギー的に好適なハーフボート型コンホメーションを採用しているため、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１２１°）と類似のＣ２３−Ｃ２４−Ｃ２５の観察された結合角（１１８°）で示されるとおり、更なる張力を用いずに側鎖を適合させることができる。Ｏ２１とVal-300との更なるvan der Waals接触により、更なる安定性も得られる。
【０１５４】
化合物Ｂに関しては、オキソラン環のエネルギー上好適でない平面コンホメーション（Ｏ２１−Ｃ２０−Ｃ２２−Ｃ２３およびＣ２０−Ｃ２２−Ｃ２３−Ｃ２８のねじれ角が、それぞれ−９°および−３°である）、より大きなＣ２３−Ｃ２４−Ｃ２５結合角（１２４°）、およびより弱いＣ２７とＶａｌ−４１８との相互作用により、ＬＢＰとの更なるvan der Waals接触が補足される。
【０１５５】
新しい環は、２つの機能を満たし、つまり（ｉ）より大きなＬＢＰ部分をリガンドが占めているため、接触が更に安定化し、（ii）結合リガンドの活性形態は、リングパッカー（ring pucker）に好ましい。この最後の特徴は、リガンドのコンホメーション集団をより少数の標本に拘束して、結合方法をより効率的にする識別因子に相当する（６）。エネルギー的に好適な結合コンホメーションを安定化することは、一つの集団内で最適なコンフォーマを選択することに等しく、導入した適合方法にとって明らかなエントロピー的利点を有する（１８）。これは、リガンドの特異性および結合速度に影響を与えるはずである。
【０１５６】
この分析から、リガンドの能力および特異性をさらに改善する可能性が示唆された。錯体の安定性を向上させる容易な方法は、リガンド結合ポケットをより多く充填し、それにより蛋白質とリガンドとの接触数を増加させることである。１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３との錯体中のＶＤＲの結晶構造がこの位置で空洞であることを示すため、例えばＣ２位置でのメチル化は、要件に適うであろう。事実、Ｃ２α化合物上でメチル基が合成され、より高い結合親和力を示す（１９）。化合物ＡおよびＢのＣ２α位置でのメチル化は、リガンドのスーパーアゴニスト性を高めるはずである。
【０１５７】
III．インビボ実験
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６〜７週齢）を、Charles River Laboratories France (l'Arbresle, France)から得た。マウスは全て、温度制御された（２３℃）施設で、１２時間の明暗周期で飼育され、飼料および水に自由に接触することができた。マウスは、蛋白質１６．８％、炭水化物７３．５％および脂質４．８％を含むＵＡＲ（Villemoison sur Orge, フランス）のＥＱ１２３１０飼料を摂取した。異なるＶＤＲアゴニストをゴマ油に溶解し、示した用量で経口胃管栄養法で投与した。採血の前に、マウスを４時間絶食し、次にカルシウム測定を記載されたとおり実施した（１）。
【０１５８】
初期の実験では、雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１２匹に、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３  ２μg/kg、化合物Ａ  ２μg/kg、および化合物Ｂ  ２μg/kgのいずれかで７日間胃管栄養法を施した。この用量では、導入された化合物の全てが、血清カルシウムレベルを上昇させたが、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３および化合物Ａではより顕著であった（図３．１）。その後、詳細な用量反応（０．２、０．５、１および２μg/kg）を、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３および化合物Ａの両方で実施した（図３．２）。この試験では、化合物で４日連続して胃管栄養法を施した。興味深いこととして、そしてトランスフェクション試験と一致して、化合物Ａは、血清カルシウムレベルへの影響がより弱く、用量２μg/kgでしか有意にならず、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３のそれは、用量１μg/kgで既に高カルシウム血症を引き起こした。
【０１５９】
これらの新規な化合物は、インビボで有意に低いカルシウム活性を有する、有望なＶＤＲアゴニストである。
【０１６０】
【表２０】
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2009510021.tif 000046
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】公知のリガンド：１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３および新規なリガンド（化合物ＡおよびＢ）の化学構造。
【図２】１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、化合物Ａおよび化合物ＢによるＶＤＲの転写活性化。ＥＢＮＡ細胞にＵＡＳ−ＴＡＴＡルシフェラーゼレポータプラスミドおよびＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＶＤＲ  ＬＢＤの発現プラスミドを一過性にトランスフェクトし、その後、１０−１０および１０−９Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、化合物Ａ（Ａ）および化合物Ｂ（Ｂ）で処置した。各試料のルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に標準化させた。データは、アゴニスト誘発ルシフェラーゼ活性を担体のルシフェラーゼ活性で割った誘発比として示す。
【図３】血清中のカルシウムレベルに対する１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３および新規なリガンド（化合物ＡおよびＢ）の影響。（図３−１）マウスに、担体（ゴマ油）、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３  ２μg/kg、化合物Ａ  ２μg/kg、または化合物Ｂ  ２μg/kgのいずれかを７日間摂取させた。（図３−２）マウスに、担体（Ｖｅｈ）１α，２５（ＯＨ）２（Ｄ３）または化合物Ａのいずれかを４日間摂取させた。データは、平均±ＳＥＭとして表した。有意差は、＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．０１と標識した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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