(57)【要約】進行糖化終末産物の受容体（ＲＡＧＥ）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの多リガンド細胞表面メンバーであり、多数の異なる組織（肺、心臓、腎臓、骨格筋、および脳が含まれる）中で多数の細胞型（例えば、内皮細胞および平滑筋細胞、マクロファージ、およびリンパ球）によって発現され、その発現は、慢性炎症状態（関節リウマチおよび糖尿病性腎症など）で増加する。本発明は、ＲＡＧＥおよびＲＡＧＥ結合フラグメントの受容体に特異的に結合する抗体を開示する。かかる抗ＲＡＧＥ抗体およびそのＲＡＧＥ結合抗体フラグメントを含む薬学的組成物ならびにＲＡＧＥ関連疾患の治療のためのその使用も開示する。
2009529920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体であって、
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するか、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである、抗体。
【請求項２】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域の少なくとも２つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域の少なくとも２つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域、および
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲおよび重鎖可変領域の３つのＣＤＲをそれぞれ含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトＲＡＧＥと少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲の解離定数（Ｋｄ）で結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がヒトＲＡＧＥのＶドメインに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＡＧＥ発現細胞に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＡＧＥ発現細胞に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がＲＡＧＥに結合して、ＲＡＧＥへのＲＡＧＥ結合パートナー（ＲＡＧＥ−ＢＰ）の結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体であって、
（ａ）
【化１】
2009529920.tif 000017
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含むか、
（ｂ）配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、および配列番号１７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むか、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである、抗体。
【請求項１４】
ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体であって、
（ａ）
【化２】
2009529920.tif 000018
からなる群から選択される重鎖可変領域を含むか、
（ｂ）配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号１６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むか、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである、抗体。
【請求項１５】
（ａ）
【化３】
2009529920.tif 000019
からなる群から選択される重鎖可変領域をさらに含むか、
（ｂ）配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号１６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をさらに含むか、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１６】
ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、ドメイン特異的抗体、ドメイン欠損抗体、融合タンパク質、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、単一ドメイン抗体、ｄＡｂフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
軽鎖可変領域または重鎖可変領域中にグリコシル化部位を除去する少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
キメラ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントであって、ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１７）と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、およびＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）と少なくとも９０％同一の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、ヒト定常領域由来の定常領域をさらに含む、キメラ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント。
【請求項２０】
キメラ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントであって、
ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
ヒトκ軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
を含む、キメラ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント。
【請求項２１】
ヒト化抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントであって、
【化４】
2009529920.tif 000020
からなる群から選択されるヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の少なくとも１つのヒト化軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント。
【請求項２２】
ヒト化抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントであって、
【化５】
2009529920.tif 000021
からなる群から選択されるヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のヒト化重鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント。
【請求項２３】
【化６】
2009529920.tif 000022
からなる群から選択されるヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のヒト化重鎖可変領域をさらに含む、請求項２１に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項２４】
抗体がヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体である、ＲＡＧＥに特異的に結合するヒト化抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント。
【請求項２５】
抗体がヒト化ＸＴ−Ｈ２抗体である、ＲＡＧＥに特異的に結合するヒト化抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント。
【請求項２６】
ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ体パートナーの結合を遮断する抗体であって、該抗体が、少なくとも８つの以下の特徴：
ａ．ＶＨ  ＣＤＲ１中のアミノ酸配列Ｙ−Ｘ−Ｍ（Ｙ３２；Ｘ３３；Ｍ３４）（式中、Ｘは、優先的にＷまたはＮである）、
ｂ．ＶＨ  ＣＤＲ２中のアミノ酸配列  Ｉ−Ｎ−Ｘ−Ｓ（Ｉ５１；Ｎ５２；Ｘ５３、およびＳ５４）（式中、Ｘは、ＰまたはＮである）、
ｃ．ＶＨのＣＤＲ２中のアミノ酸５８位がトレオニンであること、
ｄ．ＶＨのＣＤＲ２中のアミノ酸６０位がチロシンであること、
ｅ．ＶＨのＣＤＲ３中のアミノ酸１０３位がトレオニンであること、
ｆ．ＶＨのＣＤＲ３中の１つまたは複数のチロシン残基、
ｇ．ＶＬのＣＤＲ１中の２４位の正電荷残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）、
ｈ．ＶＬのＣＤＲ１中の２６位の親水性残基（ＴｈｒまたはＳｅｒ）、
ｉ．ＶＬのＣＤＲ１中の２５位の小残基ＳｅｒまたはＡｌａ、
ｊ．ＶＬのＣＤＲ１中の３３位の負電荷残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）、
ｋ．ＶＬのＣＤＲ１中の３７位の芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ）、
ｌ．ＶＬのＣＤＲ２中の５７位の親水性残基（ＳｅｒまたはＴｈｒ）、
ｍ．ＶＬのＣＤＲ３の末端のＰ−Ｘ−Ｔ配列（式中、Ｘは疎水性残基ＬｅｕまたはＴｒｐであり得る）
を有するＣＤＲを有し、
ここで、該アミノ酸位は、それぞれ配列番号２２および配列番号１６中の軽鎖および重鎖アミノ酸配列に示す通りである、抗体。
【請求項２７】
【化７】
2009529920.tif 000023
からなる群から選択される抗ＲＡＧＥ抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項２８】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、
【化８】
2009529920.tif 000024
からなる群から選択される抗ＲＡＧＥ抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列の相補物であるヌクレオチド配列を有する核酸と特異的にハイブリッド形成する単離核酸。
【請求項２９】
【化９】
2009529920.tif 000025
からなる群から選択される抗ＲＡＧＥ抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項３０】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、
【化１０】
2009529920.tif 000026
からなる群から選択される抗ＲＡＧＥ抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列の相補物であるヌクレオチド配列を有する核酸と特異的にハイブリッド形成する単離核酸。
【請求項３１】
単離核酸であって、
（ａ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒヒ、サルまたはウサギのＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）の相補物と特異的にハイブリッド形成する核酸、または  
（ｃ）クエリー範囲（ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）が１００％である場合、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるヒヒ、サル、またはウサギのＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列と９５％同一のヌクレオチド配列
を含む、単離核酸。
【請求項３２】
ＲＡＧＥ関連疾患または障害を有する被験体を治療する方法であって、
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するか、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである、治療有効量の抗体を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記ＲＡＧＥ関連疾患または障害が、敗血症、敗血症性ショック、リステリア症、炎症性疾患、癌、関節炎、クローン病、慢性急性炎症性疾患、心血管疾患、勃起障害、糖尿病、糖尿病の合併症、脈管炎、腎症、網膜症、およびニューロパシーからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
治療すべきＲＡＧＥ関連疾患または障害の治療で有用な１つまたは複数の薬剤と組み合わせて前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを投与する工程を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤が、抗炎症薬、抗酸化剤、β遮断薬、抗血小板薬、ＡＣＥインヒビター、脂質低下薬、抗血管新生薬、および化学療法薬からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ヒト被験体の敗血症または敗血症性ショックを治療する方法であって、ヒト定常領域由来の定常領域を含み、以下：
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するか、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである
治療有効量のキメラまたはヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
ヒト被験体の敗血症または敗血症性ショックを治療する方法であって、  
ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
ヒトκ軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
を含む有効量のキメラ抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３８】
ヒト被験体の全身性リステリア症を治療する方法であって、ヒト定常領域由来の定常領域を含み、以下：
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するか、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである
治療有効量のキメラまたはヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
ヒト被験体のリステリア症を治療する方法であって、
ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
ヒトκ軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
を含む治療有効量のキメラ抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
哺乳動物被験体におけるＲＡＧＥへのＲＡＧＥ結合パートナー（ＲＡＧＥ−ＢＰ）の結合を阻害する方法であって、ヒト定常領域由来の定常領域を含み、以下：
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するか、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである
阻害量のキメラまたはヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
前記抗体が可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４２】
マウスｓＲＡＧＥおよびヒトｓＲＡＧＥからなる群から選択されるｓＲＡＧＥに特異的に結合する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体が、ｓＲＡＧＥと約１×１０−９Ｍ〜約５×１０−９Ｍの範囲の解離定数（Ｋｄ）で特異的に結合する、請求項４２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
２００７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８９５，３０３号および２００６年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／７８４，５７５号に対して米国特許法§１１９（ｅ）のもと優先権が主張され、それらの両方の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、進行糖化終末産物の受容体（ＲＡＧＥ）に特異的に結合する抗体およびそのフラグメント、かかる抗体およびそのフラグメントをヒト患者および非ヒト哺乳動物に投与する、ＲＡＧＥ関連疾患および障害を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
進行糖化終末産物の受容体（ＲＡＧＥ）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの多リガンド細胞表面メンバーである。ＲＡＧＥは、細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、およびサイトゾル側末端からなる。本受容体の細胞外ドメインは、１つのＶ型免疫グロブリンドメインおよびその後の２つのＣ型免疫グロブリンドメインからなる。ＲＡＧＥはまた、可溶性形態（ｓＲＡＧＥ）で存在する。ＲＡＧＥは、多数の異なる組織（肺、心臓、腎臓、骨格筋、および脳が含まれる）中で多数の細胞型（例えば、内皮細胞および平滑筋細胞、マクロファージ、およびリンパ球）によって発現される。発現は、慢性炎症状態（関節リウマチおよび糖尿病性腎症など）で増加する。その生理学的機能が不明であるにもかかわらず、発現は、炎症反応に関与し、多様な発達過程（筋芽細胞の分化および神経の発達が含まれる）で役割を果たし得る。
【０００４】
ＲＡＧＥは、種々の生物応答（サイトカイン分泌、細胞オキシダントストレスの増加、神経突起伸長、および細胞遊走が含まれる）を誘導するいくつかの異なる内因性分子クラスに結合する有用なパターン認識受容体である。ＲＡＧＥのリガンドには、長期高血糖状態を形成する進行糖化終末産物（ＡＧＥ’ｓ）が含まれる。しかし、ＡＧＥ’ｓは、単に偶発的な病原性リガンドであり得る。ＡＧＥＳに加えて、公知のＲＡＧＥリガンドには、アミロイド沈着および炎症誘発性メディエーター（Ｓ１００／カルグラニュリン（例えば、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ａ８−Ａ９）、血清アミロイド（ＳＡＡ）（線維形態）、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）、および高移動度ボックス−１染色体タンパク質１（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ−１  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＨＭＧＢ１、アンフォテリン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ）としても公知）が含まれる）に典型的なβ−シートフィブリルを有するタンパク質が含まれる。ＨＭＧＢ−１は、２つのマウス敗血症モデルにおける死亡率の後期メディエーターであることが示されており、ＲＡＧＥとＨＭＧＢ１などのリガンドとの間の相互作用は、敗血症および他の炎症性疾患の病理発生で重要な役割を果たすと考えられている。
【０００５】
多数の有意なヒト障害は、ＲＡＧＥリガンド産生の増加またはＲＡＧＥ自体の産生の増加に関連する。一貫して有効な治療薬は、これらの多数の障害に利用可能ではない。これらの障害には、例えば、多数の慢性炎症性疾患（リウマトイドおよび乾癬性関節炎が含まれる）、腸疾患（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、癌、糖尿病および糖尿病性腎症、アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ）、心血管疾患、および敗血症が含まれる。かかるＲＡＧＥ関連障害のための安全且つ有効な治療を行うことが有益であろう。
【０００６】
敗血症は、感染に対する全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）であり、以前は正常な患者においてさえ深刻な転帰が残存する。敗血症は、以下の４つの臨床徴候のうちの少なくとも２つの存在によって定義される：低温症または高熱、頻脈、頻呼吸、過換気、または異常な白血球像。１つの臓器機能障害／不全を伴う敗血症を重症敗血症と定義し、難治性低血圧症を伴う重症敗血症は敗血症性ショックである。さらなる敗血症型には、敗血および新生児敗血症が含まれる。米国、欧州、および日本で年間２００万人を超える敗血症が認められ、年間コストは１７０億ドルと予想され、死亡率は２０〜５０％の範囲と予想されている。敗血症から生存する患者において、集中治療室（ＩＣＵ）の滞在期間は、敗血症を罹患しなかったＩＣＵ患者と比較して平均で６５％延長される。
【０００７】
最近の市場参入および改良され続けている病院内治療にもかかわらず、敗血症は、依然として医学的要求が有意に満たされていない。敗血症患者の治療は、時間と資源を消費する。最新の薬剤（ＸＩＧＲＩＳ（登録商標）の導入が含まれる）は、転帰にあまり効果がない。症候群は、死亡率２０〜５０％を示し続けている。初期敗血症から重症敗血症または敗血症性ショックへの進行を軽減し、それにより、生存率を改善することができる安全且つ十分に許容される治療薬は、敗血症療法を飛躍的に進歩させることができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、ＲＡＧＥ関連疾患および障害（例えば、敗血症、糖尿病、および糖尿病関連病変、心血管疾患、および癌）の防止および治療のための新規の免疫学的試薬、特に、ＲＡＧＥに結合する治療抗体試薬を提供する。
【０００９】
本発明の代表的な抗体には、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、またはＸＴ−Ｍ４抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、またはＸＴ−Ｍ４抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するＲＡＧＥに特異的に結合する抗体（すなわち、抗ＲＡＧＥ抗体）が含まれる。さらなる代表的な本発明の抗ＲＡＧＥ抗体は、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。上記抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントをさらに提供する。本発明の抗ＲＡＧＥ抗体は、ＲＡＧＥ体パートナーの結合を遮断することができる。
【００１０】
例えば、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体は、（ａ）ＸＴ−Ｈ１＿ＶＬ（配列番号１９）、ＸＴ−Ｈ２＿ＶＬ（配列番号２２）、ＸＴ−Ｈ３＿ＶＬ（配列番号２５）、ＸＴ−Ｈ５＿ＶＬ（配列番号２３）、ＸＴ−Ｈ７＿ＶＬ（配列番号２７）、またはＸＴ−Ｍ４＿ＶＬ（配列番号１７）の軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、または配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または（ｃ）（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントを含むことができる。別の例として、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体は、（ａ）ＩＸＴ−Ｈ１＿ＶＨ（配列番号１８）、ＸＴ−Ｈ２＿ＶＨ（配列番号２１）、ＸＴ−Ｈ３＿ＶＨ（配列番号２４）、ＸＴ−Ｈ５＿ＶＨ（配列番号２０）、ＸＴ−Ｈ７＿ＶＨ（配列番号２６）、またはＸＴ−Ｍ４＿ＶＨ（配列番号１６）の重鎖可変領域；（ｂ）配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２０、配列番号２６、または配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；または（ｃ）（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントを含むことができる。
【００１１】
本発明は、さらに、上記軽鎖可変領域のいずれか１つおよび上記重鎖可変領域のいずれか１つを有する抗ＲＡＧＥ抗体を提供する。例えば、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体は、ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１７）と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）と少なくとも９０％同一の重鎖可変領域のアミノ酸配列、およびヒト定常領域由来の定常領域を有するキメラ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメント（ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ヒトκ軽鎖定常領域、およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を有する抗体など）であり得る。
【００１２】
さらなる代表的な本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ヒト化抗体（例えば、アミノ酸配列  ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＬ＿Ｖ２．０（配列番号３２）、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＬ＿Ｖ３．０（配列番号３３）、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＬ＿Ｖ４．０（配列番号３４）、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＬ＿Ｖ４．１（配列番号３５）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．４（配列番号３９）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．５（配列番号４０）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．６（配列番号４１）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．７（配列番号４２）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．８（配列番号４３）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．９（配列番号４４）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．１０（配列番号４５）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．１１（配列番号４６）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．１２（配列番号４７）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．１３（配列番号４８）、またはＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＬ＿Ｖ２．１４（配列番号４９）と少なくとも９０％同一のヒト化軽鎖可変領域を有する抗体）が含まれる。別の例として、ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体は、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＨ＿Ｖ２．０（配列番号２８）、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＨ＿Ｖ２．７（配列番号２９）、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＨ＿Ｖ４（配列番号３０）、ＸＴ−Ｈ２＿ｈＶＨ＿Ｖ４．１（配列番号３１）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＨ＿Ｖ１．０（配列番号３６）、ＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＨ＿Ｖ１．１（配列番号３７）、またはＸＴ−Ｍ４＿ｈＶＨ＿Ｖ２．０（配列番号３８）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のヒト化重鎖可変領域を含むことができる。ヒト化抗体は、半ヒト抗体（すなわち、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の一方のみがヒト化されている）または完全ヒト化抗体（すなわち、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方がヒト化されている）であり得る。さらなる代表的な本明細書中に開示のヒト化抗ＲＡＧＥ抗体には、ヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体およびヒト化ＸＴ−Ｈ２抗体が含まれる。
【００１３】
少なくとも８つの以下の特徴：（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１中のアミノ酸配列Ｙ−Ｘ−Ｍ（Ｙ３２；Ｘ３３；Ｍ３４）（式中、Ｘは、優先的にＷまたはＮである）、（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２中のアミノ酸配列Ｉ−Ｎ−Ｘ−Ｓ（Ｉ５１；Ｎ５２；Ｘ５３、およびＳ５４）（式中、Ｘは、ＰまたはＮである）、（ｃ）ＶＨのＣＤＲ２中のアミノ酸５８位がトレオニンであること、（ｄ）ＶＨのＣＤＲ２中のアミノ酸６０位がチロシンであること、（ｅ）ＶＨのＣＤＲ３中のアミノ酸１０３位がトレオニンであること、（ｆ）ＶＨのＣＤＲ３中の１つまたは複数のチロシン残基、（ｇ）ＶＬのＣＤＲ１中の２４位の正電荷残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）、（ｈ）ＶＬのＣＤＲ１中の２６位の親水性残基（ＴｈｒまたはＳｅｒ）、（ｉ）ＶＬのＣＤＲ１中の２５位の小残基ＳｅｒまたはＡｌａ、（ｊ）ＶＬのＣＤＲ１中の３３位の負電荷残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）、（ｋ）ＶＬのＣＤＲ１中の３７位の芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ）、（ｌ）ＶＬのＣＤＲ２中の５７位の親水性残基（ＳｅｒまたはＴｈｒ）、（ｍ）ＶＬのＣＤＲ３の末端のＰ−Ｘ−Ｔ配列（式中、Ｘは疎水性残基ＬｅｕまたはＴｒｐであり得る）を有するＣＤＲを有し、ここで、アミノ酸位は、それぞれ配列番号２２および配列番号１６中の軽鎖および重鎖アミノ酸配列に示す通りである、抗ＲＡＧＥ抗体をなおさらに提供する。
【００１４】
開示の抗ＲＡＧＥ抗体または抗体可変領域のいずれかをコードする単離核酸およびストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、開示の抗ＲＡＧＥ抗体または抗体可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列の相補物であるヌクレオチド配列を有する核酸と特異的にハイブリッド形成する単離核酸も提供する。
【００１５】
本発明の単離核酸には、さらに、（ａ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒヒ、サルまたはウサギのＲＡＧＥをコードする核酸、（ｂ）（ａ）の相補物と特異的にハイブリッド形成する核酸、および（ｃ）クエリー範囲（ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）が１００％である場合、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるヒヒ、サル、またはウサギのＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列と９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、治療有効量の本発明の抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを被験体に投与する工程を含む、ＲＡＧＥ関連疾患または障害を罹患した被験体のＲＡＧＥ関連疾患または障害を防止または治療する方法を含む。
【００１７】
本発明は、敗血症、敗血症性ショック（敗血症性ショックを発症する院外感染性肺炎などの容態が含まれる）、リステリア症、炎症性疾患、癌、関節炎、クローン病、慢性急性炎症性疾患、心血管疾患、勃起障害、糖尿病、糖尿病の合併症、脈管炎、腎症、網膜症、およびニューロパシーからなる群から選択されるＲＡＧＥ関連疾患または障害を防止または治療する方法を含む。かかる本発明の方法は、治療すべきＲＡＧＥ関連疾患または障害の治療で有用な１つまたは複数の薬剤と組み合わせて抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを含む組成物を投与する工程を含むことができる。かかる本発明の薬剤には、抗生物質、抗炎症薬，抗酸化剤、β遮断薬、抗血小板薬、ＡＣＥインヒビター、脂質低下薬、抗血管新生薬、および化学療法薬が含まれる。
【００１８】
本発明は、ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ヒトκ軽鎖定常領域、およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む治療有効量のキメラ抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを被験体に投与する工程を含む、ヒト被験体の敗血症、敗血症性ショック、またはリステリア症（例えば、全身性リステリア症）を治療する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
抗ＲＡＧＥ抗体
本発明は、本明細書中に記載のＲＡＧＥ（可溶性ＲＡＧＥおよび内因性分泌ＲＡＧＥが含まれる）に特異的に結合する抗体を提供する。代表的な抗ＲＡＧＥ抗体は、配列番号１６〜４９に示す抗体可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つを含み得る。
【００２０】
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、配列番号１６〜４９のいずれか１つと同一であるか実質的に同一であるアミノ酸配列を有する抗体が含まれる。実質的に同一の抗ＲＡＧＥ抗体のアミノ酸配列は、配列番号１６〜４９のいずれか１つと少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一のアミノ酸配列である。
【００２１】
ＲＡＧＥに特異的に結合し、（ａ）配列番号１９、２２、２５、２３、２７、および１７からなる群から選択される軽鎖可変領域を含むか、（ｂ）配列番号１９、２２、２５、２３、２７、および１７のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸を有する軽鎖可変領域を含むか、（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである抗体が本発明の抗ＲＡＧＥ抗体に含まれる。
【００２２】
ＲＡＧＥに特異的に結合し、（ａ）配列番号１８、２１、２４、２０、２６、および１６からなる群から選択される重鎖可変領域を含むか、（ｂ）配列番号１８、２１、２４、２０、２６、および１６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むか、（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである抗体も本発明の抗ＲＡＧＥ抗体に含まれる。
【００２３】
ＲＡＧＥに特異的に結合し、
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体とＲＡＧＥへの結合を競合するか、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体によって結合されるＲＡＧＥのエピトープに結合するか、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群から選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合フラグメントである、抗ＲＡＧＥ抗体が本発明に含まれる。
【００２４】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＲＡＧＥ発現細胞に特異的に結合する抗ＲＡＧＥ抗体ならびにヒトＲＡＧＥと少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲の解離定数（Ｋｄ）で結合する抗体を含む。ヒトＲＡＧＥのＶドメインに特異的に結合する本発明の抗ＲＡＧＥ抗体およびＲＡＧＥ結合パートナー（ＲＡＧＥ−ＢＰ）へのＲＡＧＥの結合を遮断する抗ＲＡＧＥ抗体も含む。
【００２５】
ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ結合パートナー（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ（Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が含まれる）、Ｓ１００Ａ４、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５などのリガンド）へのＲＡＧＥの結合を遮断し、以下の特徴（位置のナンバリングは、図６および７中のＶＨおよびＶＬ配列について示すアミノ酸位置に関する）：
１．ＶＨ  ＣＤＲ１中のアミノ酸配列Ｙ−Ｘ−Ｍ（Ｙ３２；Ｘ３３；Ｍ３４）（式中、Ｘは、優先的にＷまたはＮである）、
２．ＶＨ  ＣＤＲ２中のアミノ酸配列Ｉ−Ｎ−Ｘ−Ｓ（Ｉ５１；Ｎ５２；Ｘ５３、およびＳ５４）（式中、Ｘは、ＰまたはＮである）、
３．ＶＨのＣＤＲ２中のアミノ酸５８位がトレオニンであること、
４．ＶＨのＣＤＲ２中のアミノ酸６０位がチロシンであること、
５．ＶＨのＣＤＲ３中のアミノ酸１０３位がトレオニンであること、
６．ＶＨのＣＤＲ３中の１つまたは複数のチロシン残基、
７．ＶＬのＣＤＲ１中の２４位の正電荷残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）、
８．ＶＬのＣＤＲ１中の２６位の親水性残基（ＴｈｒまたはＳｅｒ）、
９．ＶＬのＣＤＲ１中の２５位の小残基ＳｅｒまたはＡｌａ、
１０．ＶＬのＣＤＲ１中の３３位の負電荷残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）、
１１．ＶＬのＣＤＲ１中の３７位の芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ）、
１２．ＶＬのＣＤＲ２中の５７位の親水性残基（ＳｅｒまたはＴｈｒ）、
１３．ＶＬのＣＤＲ３の末端のＰ−Ｘ−Ｔ配列（式中、Ｘは疎水性残基ＬｅｕまたはＴｒｐであり得る）
の４つ以上を有するＣＤＲを有する抗体も本発明に含まれる。
【００２６】
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ヒトＲＡＧＥのＶドメインに特異的に結合して、そのリガンドへのＲＡＧＥの結合を遮断し、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の全ての特徴を有するＣＤＲを有する抗体が含まれる。
【００２７】
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、上記の抗ＲＡＧＥ抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、ドメイン特異的抗体、ドメイン欠損抗体、融合タンパク質、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、単一ドメイン抗体、ｄＡｂフラグメント、およびＦｃ融合タンパク質（すなわち、免疫グロブリン定常領域に融合した抗原結合ドメイン）からなる群から選択されるＲＡＧＥ結合フラグメントが含まれる。これらの抗体を、細胞毒性薬、放射線治療薬、または検出可能な標識とカップリングすることができる。
【００２８】
例えば、ラットＸＴ−Ｍ４抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むＳｃＦｖ抗体（配列番号６３）を調製し、細胞ベースのＥＬＩＳＡ分析によって、キメラおよび野生型ＸＴ−Ｍ４抗体に匹敵するヒヒ、マウス、ウサギ、およびヒトのＲＡＧＥに対する結合親和性を有することが示されている。
【００２９】
本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与される本発明のポリペプチドの１つに対する親和性を有するヘテロ抱合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、二重特異性分子、単鎖分子、キメラ分子、およびヒト化分子が含まれることが意図される。
【００３０】
ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体には、本明細書中に記載の任意の抗体の変異型（ｖａｒｉａｎｔ）も含まれ、これらを、公知の分子生物学技術およびクローニング技術を使用して容易に調製することができる。例えば、米国公開特許公報２００３／０１１８５９２号、同第２００３／０１３３９３９号、同第２００４／００５８４４５号、同第２００５／０１３６０４９号、同第２００５／０１７５６１４号、同第２００５／０１８０９７０号、同第２００５／０１８６２１６号、同第２００５／０２０２０１２号、同第２００５／０２０２０２３号、同第２００５／０２０２０２８号、同第２００５／０２０２５３４号、および同第２００５／０２３８６４６号、ならびにその関連するパテントファミリーのメンバー（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。例えば、本発明の変異抗体は、免疫グロブリンヒンジまたはヒンジ活性領域ポリペプチドに融合しているかそうでなければ結合しており、同様に、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域）由来の１つまたは複数の未変性または操作定常領域を含む領域に融合しているかそうでなければ結合している結合ドメインポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）を含む結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質も含むことができる（例えば、より完全な説明については、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．の米国出願２００５／０１３６０４９号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、ヒンジ領域ポリペプチドに融合しているかそうでなければ結合している未変性または操作免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＣＨ３（ＩｇＥ全体または一部由来の構築物の場合））およびＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＣＨ３（ＩｇＥ全体または一部由来の構築物の場合））に融合しているかそうでなければ結合している未変性または操作免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（またはＣＨ４（ＩｇＥ全体または一部由来の構築物の場合））を含む領域をさらに含むことができる。典型的には、かかる結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、少なくとも１つの免疫学的活性（例えば、ＲＡＧＥへの特異的結合、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ結合パートナーとの間の相互作用の阻害、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の誘導、補体結合の誘導など）が可能である。
【００３１】
本発明の抗体はまた、本発明の抗体に結合して検出することができる標識（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）も含むことができる。
【００３２】
ＲＡＧＥポリペプチド
本発明は、配列番号７、９、１１、または１３に示すアミノ酸配列を有するヒヒ、カニクイザル、およびウサギの単離ＲＡＧＥタンパク質も提供し、さらに、配列番号７、９、１１、または１３のいずれか１つに対してアミノ酸配列が少なくとも少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一という点で、配列番号７、９、１１、または１３に示すアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するＲＡＧＥタンパク質が含まれる。
【００３３】
当該分野で公知の任意の手段による、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体およびそのＲＡＧＥ結合フラグメントの産生方法も本発明に含まれる。
【００３４】
任意の配列番号１、３、７、９、１１、または１３に記載のＲＡＧＥアミノ酸配列の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の精製調製物も含まれる。
【００３５】
定義
便宜上、本明細書中、実施例中、および添付の特許請求の範囲中で使用した一定の用語をここに集めている。他で定義しない限り、本明細書中で使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
【００３６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で、１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）冠詞の文法上の目的語をいうために使用される。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００３７】
用語「または」は、本明細書中で、他で明確に示さない限り、用語「および／または」を意味するために使用され、これと交換可能に使用される。
【００３８】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、「単離抗体」）は、これが天然に存在するよりも安定に精製されている。例えば、「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、「単離抗体」）は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、化学合成した場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。約５０％未満の非抗体タンパク質（本明細書中で、「夾雑タンパク質」ともいう）を有する抗体タンパク質または化学的前駆体の調製物を、「実質的に含まない」と見なす。４０％、３０％、２０％、１０％、より好ましくは５％（乾燥重量）の非抗体タンパク質または化学的前駆体を含まないことを、実質的に含まないと見なす。抗体タンパク質またはその生物活性部分を組換え的に産生する場合、培養培地を実質的に含まないことも好ましい（すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の約３０％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の体積または質量に相当する）。本明細書中で「組換え」と呼ばれるタンパク質またはポリペプチドは、組換え核酸の発現によって産生されたタンパク質またはポリペプチドである。
【００３９】
用語「抗体」は、本明細書中で、用語「免疫グロブリン」と交換可能に使用され、インタクトな抗体、抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）、およびその定常領域および／または可変領域のいずれかを変異した（例えば、キメラ抗体、部分的ヒト化抗体、または完全ヒト化抗体を産生するための変異および所望の形質（例えば、ＩＬ−１３結合の増強および／またはＦｃＲ結合の減少）を有する抗体を産生するための変異）インタクトな抗体およびフラグメントが含まれる。用語「フラグメント」は、インタクトな抗体または完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の部分または一部をいう。フラグメントを、インタクトな抗体または完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理によって得ることができる。フラグメントを、組換え手段によって得ることもできる。例示的フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、およびｓｃＦｖおよび／またはＦｖフラグメントが含まれる。用語「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合するか、抗原結合（すなわち、特異的結合）をインタクトな抗体（すなわち、由来するインタクトな抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントをいう。そのようなものとして、抗体またはフラグメントがＲＡＧＥに特異的に結合して、１つまたは複数のＲＡＧＥ会合活性を中和するか阻害する（例えば、ＲＡＧＥへのＲＡＧＥ結合パートナー（ＲＡＧＥ−ＢＰ）の結合を阻害する）場合、これらの抗体またはそのフラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。
【００４０】
抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結した４つのペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖から構成される分子構造を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中で、ＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中で、ＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域を、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が点在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分類することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で整列した３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００４１】
用語「抗体」が、任意の供給源（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類ならびにげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）から得た任意のＩｇクラスまたは任意のＩｇサブクラス（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラス）を含むことが意図される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｉｇクラス」または「免疫グロブリンクラス」は、ヒトおよび高等哺乳動物で同定された５つの免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）をいう。用語「Ｉｇサブクラス」は、ヒトおよび高等哺乳動物で同定されたＩｇＭの２つのサブクラス（ＨおよびＬ）、ＩｇＡの３つのサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、および分泌型ＩｇＡ）、およびＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）をいう。抗体は、モノマー形態またはポリマー形態で存在することができる（例えば、ＩｇＭ抗体は五量体形態で存在し、ＩｇＡ抗体は単量体、二量体、または多量体形態で存在する）。
【００４３】
用語「ＩｇＧサブクラス」は、ヒトおよび高等哺乳動物で免疫グロブリンのγ重鎖（それぞれ、γ１〜γ４）によって同定された免疫グロブリンクラスＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）をいう。
【００４４】
用語「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」（本明細書中で交換可能に使用される）は、重鎖および軽鎖からなり、これらの鎖が鎖間ペプチドリンカーによって安定化され、抗原に特異的に結合する能力を有する、２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質をいう。用語「ドメイン」は、例えば、βプリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３〜４ペプチドループを含む）重鎖および軽鎖ポリペプチドの球状領域をいう。ドメインは、さらに、本明細書中で、「定常」ドメインの場合、種々のクラスのメンバーのドメイン内の配列変動の相対的欠如または「可変」ドメインの場合、種々のクラスのメンバーのドメインの有意な変動に基づいて、「定常」または「可変」をいう。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、当該分野で交換可能に抗体またはポリペプチド「領域」をいう。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、交換可能に、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域、または「ＣＬ」ドメインをいう。抗体重鎖の「定常」ドメインは、交換可能に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域、または「ＣＨ」ドメインをいう。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、交換可能に、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域、または「ＶＬ」ドメインをいう。抗体重鎖の「可変」ドメインは、交換可能に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域、または「ＶＨ」ドメインをいう。
【００４５】
用語「領域」はまた、抗体鎖または抗体鎖ドメインの部分または一部（例えば、本明細書中に定義の重鎖もしくは軽鎖の部分または一部または定常ドメインもしくは可変ドメインの部分または一部）および前記鎖もしくはドメインのより個別の部分または一部をいうことができる。例えば、軽鎖および重鎖または軽鎖および重鎖の可変ドメインには、本明細書中に定義の「フレームワーク領域」または「ＦＲ」の間に点在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
【００４６】
用語「高次構造」は、タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体、抗体鎖、そのドメイン領域）の三次構造をいう。例えば、句「軽（または重）鎖高次構造」は、軽（または重）鎖の三次構造をいい、句「抗体の高次構造」または「抗体フラグメントの高次構造」は抗体またはそのフラグメントの三次元構造をいう。
【００４７】
抗体の「特異的結合」は、抗体が特定の抗原またはエピトープに対して明らかな親和性を示し、一般に、有意な交差反応性を示さないことを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「抗ＲＡＧＥ抗体」は、ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体をいう。抗体は、交差反応性を示さないかもしれない（例えば、非ＲＡＧＥペプチドまたはＲＡＧＥ上の遠位（ｒｅｍｏｔｅ）エピトープと交差反応しない）。「明らかな」結合には、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性での結合が含まれる。１０７Ｍ−１または１０８Ｍ−１を超える親和性を有する抗体は、典型的に、相当するより高い特異性で結合する。本明細書中に記載の値の中間も本発明の範囲内であることが意図され、本発明の抗体は、例えば、１０６〜１０１０Ｍ−１、１０７〜１０１０Ｍ−１、または１０８〜１０１０Ｍ−１の親和性範囲でＲＡＧＥに結合する。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、その標的以外の実体（例えば、異なるエピトープまたは異なる分子）に明らかに結合しない抗体である。例えば、ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体は、ＲＡＧＥに明らかに結合するが、非ＲＡＧＥタンパク質またはペプチドと有意に反応しない。特定のエピトープに特異的な抗体は、例えば、同一のタンパク質またはペプチド上の遠位エピトープと有意に交差反応しない。特異的結合を、かかる結合を決定するための任意の当該分野で認識されている手段にしたがって決定することができる。好ましくは、特異的結合を、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析および／または競合結合アッセイにしたがって決定する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、単一の抗原組み合わせ部位と抗原決定基との結合の強度をいう。親和性は、抗体組み合わせ部位と抗原決定基との間の立体化学的適合の接近、これらの間の接触領域のサイズ、荷電基および疎水性基の分布などに依存する。抗体親和性を、平衡透析法または速度ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）法によって測定することができる。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）法は、金属／液体接触面で励起される場合に表面プラズモン波が起こる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に依存する。光がサンプルに接触していない表面側に向かってこれから反射され、ＳＰＲは、角度と波長との特定の組み合わせで反射光の強度が減少する。二分子結合事象により、表層での屈折率が変化し、これをＳＰＲシグナルの変化として検出する。
【００４９】
解離定数（Ｋｄ）および結合定数（Ｋａ）は、親和性の定量的測度である。平衡状態では、遊離抗原（Ａｇ）および遊離抗体（Ａｂ）は、抗原−抗体複合体（Ａｇ−Ａｂ）と平衡状態にあり、速度定数（ｋａおよびｋｄ）は、以下の各式の速度を定量する：
【００５０】
【化１１】
2009529920.tif 000003
平衡状態では、ｋａ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｄ［Ａｇ−Ａｂ］。解離定数（Ｋｄ）は、以下によって得られる：Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ−Ａｂ］。Ｋｄは、濃度単位、最も典型的には、Ｍ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ、ｐＭなどを有する。Ｋｄとして示された抗体親和性と比較した場合、ＲＡＧＥに対するより高い親和性はより低い値によって示される。結合定数（Ｋａ）は、以下によって得られる：Ｋａ＝ｋａ／ｋｄ＝［Ａｇ−Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］。Ｋａは、濃度の逆数（ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、最も典型的には、Ｍ−１、ｍＭ−１、μＭ−１、ｎＭ−１、ｐＭ−１などを有する。本明細書中で使用される場合、用語「アビディティ」は、可逆的複合体の形成後の抗原−抗体結合の強度をいう。抗ＲＡＧＥ抗体を、ＲＡＧＥタンパク質へのその結合についてのＫｄに関して（約（より低いＫｄ値）から約（より高いＫｄ値）の範囲の解離定数（Ｋｄ）での結合として）特徴づけることができる。この文脈では、用語「約」は、表示のＫｄ値±２０％（すなわち、約１のＫｄ＝０．８〜１．２の範囲のＫｄ）を意味することが意図される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、構造および抗原特異性が均一な抗体産生細胞（例えば、Ｂ  リンパ球またはＢ細胞）のクローン集団由来の抗体をいう。用語「ポリクローナル抗体」は、構造およびエピトープ特異性が不均一であるが、共通の抗原を認識する抗体産生細胞の異なる集団由来の複数の抗体をいう。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、粗調製物として体液内に存在し得るか、本明細書中に記載のように精製することができる。
【００５２】
用語、抗体の「結合部分」（または「抗体部分」）には、１つまたは複数の完全なドメイン（例えば、完全なドメイン対）およびＲＡＧＥに特異的に結合する能力を保有する抗体のフラグメントが含まれる。抗体の結合機能を全長抗体のフラグメントによって果たすことができることが示されている。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって産生される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、単鎖、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単鎖ドメイン抗体（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，２６：２３０−５）、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でのジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである。ＦｄフラグメントはＶＨおよびＣＨ１ドメインからなり、Ｆｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる。ｄＡｂフラグメントはＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）が個別の遺伝子によってコードされる一方で、これらを組換え法を使用して単一タンパク質鎖として作製することができる合成リンカーによって連結して、ＶＬ領域およびＶＨ領域を対合して１価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成することができる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。かかる単鎖抗体は、用語、抗体の「結合部分」の範囲内に含まれることも意図される。単鎖抗体の他の形態（ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）など）も含まれる。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、短すぎて同一鎖上の２ドメイン間の対合が行えないリンカーを使用し、それにより、ドメインに別の鎖の相補ドメインとの対合を強制して抗原結合部位を作製した２価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。抗体またはその結合部分はまた、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有結合または非共有結合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。かかる免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）および２価でビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの結合フラグメントを、従来の技術（全抗体���パパインまたはペプシン消化など）を使用して全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着分子を、本明細書中に記載されており、当該分野で公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。「二重特異性」または「二重機能性」抗体以外で、抗体は、同一のその各結合部位を有すると理解される。「二重特異性」または「二重機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対およｂ２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、介入定常領域を有する２つの抗原結合領域も含むことができる。二重特異性抗体を、種々の方法（ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結が含まれる）によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１，１９９０；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照のこと。
【００５３】
用語「逆変異」は、ヒト抗体の体細胞変異アミノ酸のいくつかまたは全部が相同性生殖系列抗体配列由来の対応する生殖系列残基に置換される過程をいう。本発明のヒト抗体の重鎖および軽鎖配列を、ＶＢＡＳＥ中の生殖系列配列と個別に整列させて、最も高い相同性を有する配列を同定する。本発明のヒト抗体の相違を、かかる異なるアミノ酸をコードする定義されたヌクレオチド位置の変異によって生殖系列配列に戻す。逆変異の候補としてこのようにして同定された各アミノ酸の役割を、抗原結合における直接または間接的役割について調査すべきであり、変異後にヒト抗体の任意の望ましい特徴に影響を及ぼす任意のアミノ酸を最終ヒト抗体に含めるべきではない。例として、選択的変異誘発アプローチによって同定された活性増強アミノ酸は逆変異に供されない。逆変異に供するアミノ酸数を最少にするために、最も密接な生殖系列配列と異なるが、第２の生殖系列配列中の対応するアミノ酸と同一であることが見出されたアミノ酸位置は、第２の生殖系列配列が本発明のヒト抗体の配列と少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１２アミノ酸同一且つ同一線上に並んでいる（ｃｏｌｉｎｅａｒ）場合、問題のアミノ酸の両側に残存することができる。任意の抗体至適化段階で逆変異を起こすことができ、好ましくは、選択的変異誘発アプローチの前または後に直接的に起こる。より好ましくは、逆変異は、選択的変異誘発アプローチ前に直接起こる。
【００５４】
免疫グロブリンとしても公知のインタクトな抗体は、典型的には、それぞれ約２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖およびそれぞれ約５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。λおよびκと呼ばれる２つの軽鎖型が、抗体中で見出されている。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、５つの主なクラス（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭ）に割り当て、こらのうちのいくつかをサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。各軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン  （ＣＬ）から構成される。各重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域から構成される。ＶＨに最も近位のＣＨドメインを、ＣＨ１と指定する。ＶＨおよびＶＬドメインは、超可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）の３つの領域のための足場を形成するフレームワーク領域と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）からなる。ＣＤＲは、抗体の抗原との特異的相互作用を担うほとんどの残基を含む。ＣＤＲを、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素をＨ１、Ｈ２、およびＨ３という一方で、軽鎖上のＣＤＲをＬ１、Ｌ２、およびＬ３という。ＣＤＲ３は、抗体結合部位内の分子多様性の最も大きな供給源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基と同一の短さであり得るか、２６アミノ酸を超え得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、当該分野で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照のこと。当業者は、各サブユニット構造（例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造）が活性フラグメント（例えば、抗原に結合するＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲサブユニット部分）（すなわち、結合フラグメント）または、例えば、Ｆｃ受容体および／または補体に結合し、そして／または活性化するＣＨサブユニット部分を含むことを認識するであろう。
【００５５】
抗体多様性は、可変領域および種々の体細胞事象をコードする複数の生殖系列遺伝子の使用によってつくられる。体細胞事象には、完全なＶＨ領域を作製するための多様性（Ｄ）遺伝子および結合（Ｊ）遺伝子セグメントでの可変遺伝子セグメントの組換えならびに完全なＶＬ領域を作製するための可変遺伝子セグメントおよび結合遺伝子セグメントの組換えが含まれる。組換え過程自体は不正確であり、それにより、Ｖ（Ｄ）Ｊ連結点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）にアミノ酸が喪失または付加される。これらの多様性機構は、抗原曝露前にＢ細胞の構築で起こる。抗原刺激後、Ｂ細胞中の発現抗体遺伝子は体細胞変異を受ける。推測された生殖系列セグメント数に基づいて、これらのセグメントのランダム組換えおよび１．６×１０７個までの異なる抗体のランダムＶＨ−ＶＬ対合を行うことができる（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．（１９９３），ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。抗体多様性に寄与する他の過程（体細胞変異など）を考慮する場合、１×１０１０個の異なる抗体を生成することができると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９９５），ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。抗体多様性の生成に関与する多数の過程のために、同一の抗原特異性を有する独立して誘導されたモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有する可能性は低い。
【００５６】
用語「二量体化ポリペプチド」または「二量体化ドメイン」には、別のポリペプチドと二量体（または二量体、三量体などのより高次の複合体）を形成する任意のポリペプチドが含まれる。任意選択的に、二量体化ポリペプチドは、他の同一の二量体化ポリペプチドと会合し、それにより、ホモ多量体を形成する。ＩｇＧ  Ｆｃエレメントは、ホモ多量体を形成する傾向のある二量体化ドメインの例である。任意選択的に、二量体化ポリペプチドは他の異なる二量体化ポリペプチドと会合し、それにより、ヘテロ多量体を形成する。Ｊｕｎロイシンジッパードメインは、Ｆｏｓロイシンジッパードメインと二量体を形成する。したがって、ヘテロ多量体を形成する傾向のある二量体化ドメインの例である。二量体化ドメインは、２５のヘテロ多量体およびホモ多量体の両方を形成することができる。
【００５７】
用語「ヒト抗体」には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと）によって記載されたヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中にヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発およびｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を含むことができる。変異は、好ましくは、本明細書中に記載の「選択的変異誘発アプローチ」を使用して導入される。ヒト抗体は、アミノ酸残基（例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない活性増強アミノ酸残基）に置換された少なくとも１つの位置を有することができる。ヒト抗体はヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基に置換された２０個までの位置を有することができる。さらに、１０個まで、５個まで、３個まで、または２個までの位置が置換される。これらの置換は、以下に詳述したＣＤＲ領域の範囲内に含まれ得る。しかし、本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフティングされた抗体を含むことを意図しない。
【００５８】
句「組換えヒト抗体」には、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたヒト抗体（宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現した抗体（以下の第ＩＩ項にさらに記載）、組換え組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離した抗体（以下の第ＩＩＩ項にさらに記載）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体など）が含まれる。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと）。しかし、かかる組換えヒト抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発に供し（または、ヒトＩｇ配列の動物トランスジェニックを使用する場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発を使用する）、それにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列あに由来および関連するにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。しかし、一定の実施形態では、かかる組換え抗体は、選択的変異誘発アプローチまたは逆変異またはその両方の結果であり得る。
【００５９】
「単離抗体」には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる（例えば、ＲＡＧＥに特異的に結合する単離抗体は、ｈＲＡＧＥ以外のＲＡＧＥに特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ＲＡＧＥに特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＲＡＧＥ分子に結合することができる。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないかもしれない。
【００６０】
「中和抗体」（または「ＲＡＧＥ活性を中和した抗体」）には、ｈＲＡＧＥへのその結合によってｈＲＡＧＥの生物活性が調整される抗体が含まれる。ｈＲＡＧＥの生物活性のこの調整を、ｈＲＡＧＥ生物活性の１つまたは複数の指標（ヒトＲＡＧＥ受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害（例えば、実施例６および７を参照のこと）など）によって評価することができる。ｈＲＡＧＥ生物活性のこれらの指標を、当該分野で公知のいくつかの標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのうちの１つまたは複数によって評価することができる（例えば、実施例６および７を参照のこと）。
【００６１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。通例、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロビンのＦＲ残基を、対応する非ヒト残基に置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾を、抗体の性能をさらに洗練するために作製する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００６２】
用語「活性」には、抗原に対する抗体（例えば、ＲＡＧＥに結合する抗ｈＲＡＧＥ抗体）の結合特異性／親和性および／または抗体（例えば、そのｈＲＡＧＥへの結合によってＲＡＧＥの生物活性を阻害する抗ｈＲＡＧＥ抗体）の力価の中和（例えば、ヒトＲＡＧＥ受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害）などの活性が含まれる。
【００６３】
「発現構築物」は、発現可能な核酸および適切な宿主細胞中で発現可能な核酸タンパク質またはポリペプチドの発現を媒介するのに十分な調節エレメントを含む任意の組換え核酸である。
【００６４】
用語「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」は交換可能であり、２つまたはそれを超えるタンパク質由来のアミノ酸配列に対応する部分を有するアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドをいう。２つまたはそれを超えるタンパク質由来の配列は、タンパク質の全部または一部（すなわち、フラグメント）であり得る。融合タンパク質はまた、タンパク質の結合領域に対応する部分の間のアミノ酸の結合領域も有することができる。かかる融合タンパク質を、組換え法によって調製することができ、ここで、対応する核酸は、ヌクレアーゼおよびリガーゼを使用した処理によって連結し、発現ベクターに組み込まれる。融合タンパク質の調製は、一般に、当業者に理解されている。
【００６５】
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および（適切な場合）リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドをいう。この用語は、ヌクレオチドアナログから作製したＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの等価物、アナログ、および（記載の実施形態に適用可能な場合）一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるとも理解すべきである。
【００６６】
用語「％同一な」または「同一率」は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性をいう。同一率を、比較のために整列させることができる各配列中の位置の比較によって決定することができる。同一率という表現は、比較配列を共有する位置での同一のアミノ酸または核酸の数の関数をいう。種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺが含まれる）を使用することができる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として利用可能であり、例えば、デフォルト設定とともに使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄから利用可能である。２つの配列の同一率を、ギャップウェイト１（例えば、２配列間に１つのアミノ酸またはヌクレオチドのミスマッチが存在するかのうように各アミノ酸ギャップを加重する）を使用したＧＣＧプログラムによって決定することができる。
【００６７】
他のアラインメント技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。好ましくは、配列中にギャップを許容するアラインメントプログラムを使用いて、配列を整列させる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにギャップを許容するアルゴリズム型の１つである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌｓ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照のこと。また、Ｎｅｅｄｌｅｎａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を使用したＧＡＰ  Ｉプログラムを使用して、配列を整列させることができる。別の検索ストラテジーは、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で動作するＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、大規模並列処理コンピュータ上で配列５をスコアリングするためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する。このアプローチは、関連の低い適合を選別する能力を改良し、特に、小さなギャップおよびヌクレオチド配列のエラーを許容する。核酸コードアミノ酸配列を使用して、タンパク質データベースおよびＤＮＡデータベースの両方を検索することができる。
【００６８】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」を、本明細書中で交換可能に使用する。
【００６９】
「ＲＡＧＥ」タンパク質は、当該分野で公知の「進行糖化終末産物の受容体」である。代表的なＲＡＧＥタンパク質を、図１Ａ〜１Ｃに示す。ＲＡＧＥタンパク質には、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）および内因性分泌ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）が含まれる。内因性分泌ＲＡＧＥは、細胞外に放出されるＲＡＧＥスプライス変異形であり、これは、ＡＧＥリガンドに結合してＡＧＥ作用を中和することができる。例えば、Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＴＶＥ，２００５；２５：２５８７−２５９３を参照のこと。ヒト血漿ｅｓＲＡＧＥと代謝症候群（ＢＭＩ、インスリン抵抗性、ＢＰ、高トリグリセリド血症、およびＩＧＴ）のいくつかの成分との間で逆の関連が認められている。血漿ｅｓＲＡＧＥレベルはまた、糖尿病を罹患しているか罹患していない被験体において頸動脈および大腿のアテローム性動脈硬化症と逆に関連する（超音波による定量）。さらに、血漿ｅｓＲＡＧＥレベルは、年齢をマッチングした健康なコントロールより血管造影によって証明された冠状動脈疾患を罹患した非糖尿病患者で有意に低い。
【００７０】
「進行糖化終末産物の受容体のリガンド結合エレメント」または「ＲＡＧＥ−ＬＢＥ」（本明細書中で、「ＲＡＧＥ−Ｆｃ」および「ＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐ」ともいう）には、ＲＡＧＥリガンドへの結合能力を保持する膜貫通ＲＡＧＥポリペプチドの細胞外部分およびそのフラグメントが含まれる。この用語は、ＲＡＧＥポリペプチドと少なくとも８５％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、またはより好ましくは少なくとも９５％同一のポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥリガンドまたはＲＡＧＥ−ＢＰが結合するヒトまたはマウスポリペプチド）も含む。
【００７１】
「進行糖化終末産物の受容体の結合パートナー」または「ＲＡＧＥ−ＢＰ」には、生理学的状況でＲＡＧＥタンパク質（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥなどの受容体ポリペプチド）の細胞外部分に結合する任意の物質（例えば、ポリペプチド，小分子，炭水化物構造など）が含まれる。
【００７２】
「ＲＡＧＥ関連障害（ＲＡＧＥ関連障害）」または「ＲＡＧＥ関連障害（ＲＡＧＥ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」には、罹患細胞がＲＡＧＥまたは１つまたは複数のＲＡＧＥリガンドの発現および／または活性の増加または減少を示す任意の障害が含まれる。ＲＡＧＥ関連障害には、ＲＡＧＥ機能の減少（例えば、ＲＡＧＥ：ＲＡＧＥ−ＢＰ相互作用を破壊する薬剤の投与が含まれる）によって治療可能な（すなわち、１つまたは複数の症候群を消失または改善することができる）任意の障害も含まれる。  
【００７３】
「ＲＡＧＥのＶドメイン」は、Ｎｅｅｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＧＥ：ａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８−１５００４（１９９２）（その内容が本明細書中で参考として援用される）の図５に示す免疫グロブリン様可変ドメインをいう。Ｖドメインは、配列番号１および配列番号３に示す１〜１２０位のアミノ酸を含む。
【００７４】
ＲＡＧＥのヒトｃＤＮＡは１４０６塩基対であり、４０４アミノ酸の成熟タンパク質をコードする。Ｎｅｅｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２の図３を参照のこと。
【００７５】
用語「組換え核酸」には、天然に共存しない少なくとも２つの配列を含む核酸が含まれる。組換え核酸を、例えば、分子生物学的方法の使用によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができるか、例えば、相同組換えまたは非相同組換えによる新規の染色体位置への核酸の挿入によってｉｎ  ｖｉｖｏで生成することができる。
【００７６】
被験体に関する用語、「治療」は、被験体の疾患または障害の少なくとも１つの症状の改善をいう。治療は、疾患または容態の治癒または改善であり得る。
【００７７】
用語「ベクター」は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。１つのベクター型は、エピソーム（すなわち、染色体外複製することができる核酸）である。別のベクター型は、宿主細胞の遺伝物質で組換えるようにデザインされた組み込みベクターである。ベクターは、自律複製ベクターおよび組み込みベクターの両方であり得、ベクターの性質は、細胞の状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）に応じて異なり得る（すなわち、ベクターは、一方の宿主細胞型で自律複製し、別の宿主細胞型に純粋に組み込むことができる）。作動可能に連結された発現可能な核酸の発現を指示することができるベクターを、本明細書中で、「発現ベクター」という。
【００７８】
「特異的免疫反応性」は、抗体が特定のペプチド配列と相互作用する場合の、特定のペプチド配列への化合物（抗体）の優先的結合をいう。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、句「有効量」は、動物中でいくらかの所望の効果を得るのに有効な１つまたは複数の本発明の薬剤を含む１つまたは複数の薬剤、材料、または組成物の量を意味する。薬剤を使用して治療効果が達成される場合、「有効量」を含む実際の用量は、多数の条件（治療を受ける特定の条件、疾患の重症度、患者のサイズおよび健康状態、投与経路などが含まれる）に応じて変化する。当業者は、医学分野で周知の方法を使用して、適切な用量を容易に決定することができる。
【００８０】
句「薬学的に許容可能な」は、本明細書中で、正常な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を起こすことなく、妥当な利点／リスク比と釣り合いの取れたヒトおよび動物と接触して使用するために適切な化合物、材料、組成物、および／または投薬形態をいうために使用される。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、句「薬学的に許容可能なキャリア」は、本発明の薬剤を一方の器官または身体の一部から他方の器官または身体の一部への運搬または輸送に関与する薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクル（液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料など）を意味する。各キャリアは、処方物の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能なキャリアとして役立ち得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）糖類（ラクトース、グルコース、およびスクロースなど）、（２）デンプン（トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど）、（３）セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど）、（４）トラガカント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤（カカオバターおよび座剤用ワックス（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｗａｘ）、（９）オイル（ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油など）、（１０）グリコール（プロピレングリコールなど）、（１１）ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど）、（１２）エステル（オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど）、（１３）寒天、（１４）緩衝剤（水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど）、（１５）アルギン酸、（１６）無発熱物質水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、および（２１）薬学的処方物で使用される他の非毒性適合物質。
【００８２】
モノクローナル抗体の調製
哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、またはウサギなど）を、全長タンパク質またはそのフラグメント、全長タンパク質またはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡ（ペプチドの免疫原性形態）で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、キャリアへの抱合または当該分野で周知の他の技術が含まれる。アジュバントの存在下で、ポリペプチドの免疫原性部分を投与する。免疫化の進行を、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗原として免疫原とともに使用して、抗体レベルを評価することができる。
【００８３】
本発明のポリペプチドの抗原調製物での動物の免疫化後、抗血清を得ることができ、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、免疫化動物から抗体産生細胞（リンパ球）を採取し、骨髄腫細胞などの不死化細胞を使用した標準的な体細胞融合手順によって融合してハイブリドーマ細胞を得ることができる。かかる技術は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ＲＡＧＥポリペプチドのエピトープと特異的反応性を示す抗体およびかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離したモノクローナル抗体の産生のために、ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングすることができる。
ヒト化
キメラ抗体は、少なくとも２つの異なる種由来の配列を含む。一例として、組換えクローニング技術を使用して、非ヒト抗体（すなわち、抗原で免疫化された非ヒト種で調製された抗体）由来の抗原結合部位を含む可変領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を含めることができる。
【００８４】
ヒト化抗体は、抗原結合を担う可変領域残基（すなわち、相補性決定領域残基、省略（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ）相補性決定領域残基、または抗原結合に関与する任意の他の残基）が非ヒト種に由来する一方で、残りの可変領域残基（すなわち、フレームワーク領域の残基）がヒト抗体配列に少なくとも一部が由来するキメラ抗体の１つの型である。フレームワーク領域残基およびヒト化抗体の定常領域残基のサブセットは、非ヒト供給源に由来し得る。ヒト化抗体の可変領域もヒト化と説明される（すなわち、ヒト化軽鎖または重鎖可変領域）。非ヒト種は、典型的には、抗原での免疫化のために使用される（マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、または他の非ヒト哺乳動物種）。ヒト化抗体は、典型的には、伝統的なキメラ抗体よりも免疫原性が低く、ヒトへの投与後に改良された安定性を示す。例えば、Ｂｅｎｉｎｃｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：８１０−６；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ：１８４２−５０；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：１１０−５。
【００８５】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合に関与する抗体可変領域の残基である。ＣＤＲを識別するためのいくつかのナンバリングシステムが常用されている。Ｋａｂａｔの定義は配列変動性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループ領域の位置に基づいている。ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの折衷である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｂＭアルゴリズムによれば、軽鎖可変領域のＣＤＲは、２４位および３４位（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０位および５６位（ＣＤＲ２−Ｌ）、ならびに８９位および９７位（ＣＤＲ３−Ｌ）の残基に境界がある。Ｋａｂａｔの定義によれば、重鎖可変領域のＣＤＲは、３１位および３５Ｂ（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０位および６５位（ＣＤＲ２−Ｈ）、ならびに９５位および１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基に境界がある（Ｋａｂａｔによるナンバリング）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義によれば、重鎖可変領域のＣＤＲは、２６位および３２位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５２位および５６（ＣＤＲ２−Ｈ）、ならびに９５位および１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基に境界がある（Ｃｈｏｔｈｉａによるナンバリング）。ＡｂＭの定義によれば、重鎖可変領域のＣＤＲは、２６位および３５Ｂ位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０位および５８位（ＣＤＲ２−Ｈ）、ならびに９５位および１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基に境界がある（Ｋａｂａｔによるナンバリング）。Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１−１５３；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  １：１２６；ａｎｄ  Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１４１−１７２を参照のこと。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲ」は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａのいずれかによって定義のＣＤＲをいい、さらに、本発明のヒト化抗体可変領域を、Ｋａｂａｔによって定義の１つまたは複数のＣＤＲを含み、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義の１つまたは複数のＣＤＲも含むように構築することができる。
【００８７】
特異性決定領域（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＳＤＲ）は、抗原と直接相互作用するＣＤＲ内の残基である。ＳＤＲは、超可変残基に対応する。（Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９）を参照のこと。
【００８８】
フレームワーク残基は、超可変残基またはＣＤＲ残基以外の抗体可変領域の残基である。フレームワーク残基は、天然に存在するヒト抗体（本発明の抗ＲＡＧＥ抗体のフレームワーク領域に実質的に類似するヒトフレームワークなど）に由来し得る。各配列間のコンセンサスに相当する人工フレームワーク配列も使用することができる。ヒト化のためのフレームワーク領域を選択する場合、ヒト中に広範に相当する配列が少数の配列よりも好ましいかもしれない。ヒトフレームワークアクセプター配列をさらに変異して、抗原接触に関与すると考えられるマウス残基および／または抗原結合部位の構造完全性に関与する残基を修復するか、抗体発現を改良することができる。ペプチド構造予想を使用して、ヒト化可変重鎖配列および軽鎖配列を分析し、ヒト化デザインによって導入された翻訳後タンパク質修飾を同定し、回避することができる。
【００８９】
ヒト化抗体を、種々の方法（下記の相補性決定領域（ＣＤＲ）のベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、グラフティング、省略ＣＤＲのグラフティング、特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティング、およびＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリが含まれる）のいずれか１つを使用して調製することができる。ヒト化抗体には、ＣＤＲに１つまたは複数の変化を導入した超ヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体も含まれる。例えば、ヒト残基にＣＤＲ中の非ヒト残基を置換することができる。これらの一般的アプローチを、標準的な変異誘発技術および合成技術と組み合わせて、任意の所望の配列の抗ＲＡＧＥ抗体を産生することができる。
【００９０】
ベニアリングは、抗体の溶媒接近可能外面をヒトアミノ酸配列でリサーフェシングする（ｒｅｓｕｒｆａｃｅ）ことによってげっ歯類または他の非ヒト抗体中の潜在的に免疫原性を示すアミノ酸配列を減少させる概念に基づく。したがって、ベニアリング抗体は、非修飾非ヒト抗体よりもヒト細胞に対する異質性（ｆｏｒｅｉｇｎ）が低い。Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−９８を参照のこと。非ヒト抗体を、ヒト抗体のフレームワーク領域中の同一の位置のフレームワーク領域残基と異なる非ヒト抗体中の露呈した外面のフレームワーク領域残基を同定し、同定した残基を典型的にはヒト抗体中のこれらの同一の位置を占めるアミノ酸に置換することによってベニアリングする。
【００９１】
ＣＤＲのグラフティングを、アクセプター抗体（例えば、所望のフレームワーク残基を含むヒト抗体または他の抗体）の１つまたは複数のＣＤＲをドナー抗体（例えば、非ヒト抗体）のＣＤＲに置換することによって行う。アクセプター抗体を、候補アクセプター抗体とドナー抗体との間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択することができる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアプローチによれば、ヒトフレームワーク領域は、関連する非ヒト抗体の各フレームワーク領域に対して配列が実質的に相同であると見なされ、非ヒト抗体のＣＤＲを、異なるヒトフレームワーク領域の複合物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）にグラフティングする。関連する方法は、米国公開特許公報２００３／００４０６０６号に記載の本発明の抗体の調製にも有用である。
【００９２】
省略ＣＤＲのグラフティングは、関連アプローチである。省略ＣＤＲは、特異性決定領域および隣接アミノ酸（軽鎖中の２７ｄ〜３４位、５０〜５５位、および８９〜９６位ならびに重鎖中の３１〜３５ｂ位、５０〜５８位、および９５〜１０１位（（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）のナンバリング則）のアミノ酸が含まれる）を含む。（Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−９）を参照のこと。特異性決定残基（ＳＤＲ）のグラフティングは、抗体組み込み部位の結合特異性および親和性が各相補性決定領域（ＣＤＲ）内の最も可変性の高い残基によって決定されるという理解を前提とする。利用可能なアミノ酸配列データの分析と組み合わせた抗体−抗原複合体の三次元構造の分析を使用して、ＣＤＲ内の各位置で起こるアミノ酸残基構造の相違に基づいて配列可変性をモデリングすることができる。ＳＤＲは、定常残基からなる免疫原性が最小のポリペプチド配列として同定される。Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９を参照のこと。
【００９３】
ＣＤＲまたは省略ＣＤＲのグラフティングのためのアクセプターフレームワークをさらに修飾して、所望の残基を導入することができる。例えば、アクセプターフレームワークは、任意選択的に、１位、２８位、４８位、６７位、６９位、７１位、および９３位の１つまたは複数の位置に非ヒト残基を有するヒト亜群Ｉコンセンサス配列の重鎖可変領域を含むことができる。別の例として、ヒトアクセプターフレームワークは、任意選択的に２位、３位、４位、３７位、３８位、４５位、および６０位の１つまたは複数の位置に非ヒトドナー残基を有するヒト亜群Ｉコンセンサス配列の軽鎖可変領域を含むことができる。グラフティング後、ドナー配列および／またはアクセプター配列をさらに変化させて、抗体の結合および機能性を最適にすることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７号を参照のこと。
【００９４】
ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を調製するために使用することができる重鎖可変領域のヒトフレームワークには、ＤＰ−７５、ＤＰ５４、ＤＰ−５４  ＦＷ  ＶＨ  ３  ＪＨ４、ＤＰ−５４  ＶＨ３  ３−０７、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３、ならびにＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）のフレームワーク残基が含まれる。
【００９５】
ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を調製するために使用することができる軽鎖可変領域のヒトフレームワークには、ヒト生殖系列クローンＤＰＫ２４、ＤＰＫ−１２、ＤＰＫ−９  Ｖｋ１、ＤＰＫ−９  Ｊｋ４、ＤＰＫ９  Ｖｋ１  ０２のフレームワーク残基、ならびに生殖系列クローン亜群ＶκＩＩＩおよびＶκＩのフレームワーク残基が含まれる。以下のＤＰＫ２４生殖系列の変異により、抗体発現を増加させることができる：Ｆ１０Ｓ、Ｔ４５Ｋ、１６３Ｓ、Ｙ６７Ｓ、Ｆ７３Ｌ、およびＴ７７Ｓ。
【００９６】
代表的な本発明のヒト化抗ＲＡＧＥ抗体には、配列番号１６〜２７から選択される可変領域アミノ酸配列の１つまたは複数のＣＤＲを有する抗体が含まれる。例えば、ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体は、配列番号１６、１８、２１、２４、２０、および２６のいずれか１つの重鎖可変領域または配列番号１７、１９、２２、２５、２３、および２７のいずれか１つの軽鎖可変領域から選択される２つまたはそれを超えるＣＤＲを含むことができる。ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体はまた、配列番号１６、１８、２１、２４、２０、および２６のいずれか１つの２つまたは３つのＣＤＲを有する可変領域を含む重鎖および配列番号１７、１９、２２、２５、２３、および２７のいずれか１つの２つまたは３つのＣＤＲを有する可変領域を含む軽鎖を含むことができる。
【００９７】
第１の鎖の可変領域（すなわち、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）をヒト化し、第２の鎖の可変領域（すなわち、非ヒト種で産生された抗体の可変領域）をヒト化しない本発明のヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を構築することができる。これらの抗体は、半ヒト化抗体と呼ばれるヒト化抗体型である。
【００９８】
キメラおよびヒト化抗ＲＡＧＥ抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびその任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプ）のいずれか１つの定常領域に由来し得る。多数の抗体定常領域のアミノ酸配列が公知である。ヒトアイソタイプの選択およびアイソタイプ中の特定のアミノ酸の修飾により、宿主の防御機構の活性化を増強または排除し、抗体の生体分布を変化させることができる。（Ｒｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ９：１５２−６６）を参照のこと。免疫グロブリン定常領域をコードする配列のクローニングのために、イントロン配列を欠失することができる。
【００９９】
キメラおよびヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を、当該分野で公知の標準的技術を使用して構築することができる。例えば、可変領域を、可変領域をコードする重複オリゴヌクレオチドを共にアニーリングし、これらをヒト抗体定常領域を含む発現ベクターにライゲーションすることによって調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびに米国特許第４，１９６，２６５号、同第４，９４６，７７８号、同第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、同第５，２６０，２０３号、同第５，６７７，４２７号、同第５，８９２，０１９号、同第５，９８５，２７９号、同第６，０５４，５６１号を参照のこと。２つのインタクトな四量体抗体（ホモ二量体およびヘテロ二量体が含まれる）を含む４価抗体（Ｈ４Ｌ４）を、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０２／０９６９４８号に記載のように調製することができる。抗体二量体を、鎖間ジスルフィド結合形成を促進する抗体定常領域システイン残基の導入またはヘテロ二官能性架橋剤の使用（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−５）、または二重定常領域（ｄｕａｌ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を含めるための組換え産生（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．３：２１９−３０）によって調製することもできる。本発明の抗体の抗原結合フラグメントを、例えば、短縮抗体配列の発現または全長抗体の翻訳後消化によって調製することができる。
【０１００】
種々の変化、置換、挿入、および欠失を含む本発明の本発明の抗ＲＡＧＥ抗体の変異型を容易に調製することができる。例えば、抗体発現のために使用される細胞型のコドン使用頻度のために抗体配列を至適化することができる。抗体の血清半減期を増加させるために、サルベージ受容体結合エピトープを、既に存在していない場合、抗体重鎖配列に組み込むことができる。米国特許第５，７３９，２７７号を参照のこと。抗体安定性を増強するためのさらなる修飾には、２４１位のセリンをプロリンに置換するためのＩｇＧ４の修飾が含まれる。Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８を参照のこと。他の有用な変化には、必要に応じて抗体の薬物との抱合効率を最適にするための置換が含まれる。例えば、抗体を、薬物結合のためのアミノ酸を含めるためにそのカルボキシル末端を修飾することができる（例えば、１つまたは複数のシステイン残基を付加することができる）。定常領域を、炭水化物または他の部分の結合のための部位を導入するために修飾することができる。
【０１０１】
さらなる抗体変異型には、機能特性が改良されたグリコシル化イソ型が含まれる。例えば、Ｆｃグリコシル化の修飾により、エフェクター機能を変化させることができ（例えば、Ｆｃγ受容体への結合の増加およびＡＤＣＣの改良）、そして／またはＣ１ｑ結合およびＣＤＣを減少させることができる（例えば、高マンノースおよびハイブリッド型を形成するための複合体由来のＦｃオリゴサッカリドの変化により、Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣを減少させることができる（例えば、Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７：１７：１０４−１１８）を参照のこと）。細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞のバイオエンジニアリングによって修飾することができる。遺伝子操作された生物中のタンパク質または天然産物のグリコシル化経路の操作によって修飾することもできる。糖結合酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）が広範な異なる基質を許容するライブラリーの活用によって、グリコシル化を変化させることができる。最後に、当業者は、小分子、酵素、タンパク質のライゲーション、代謝バイオエンジニアリング、または全合成を使用した種々の化学的アプローチによってタンパク質および天然産物をグリコシル化することができる。Ｎ−グリカンプロセシングの適切な小分子インヒビターの例には、カスタノスペルミン（ＣＳ）、キフネンシン（ＫＦ）、デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＪ）、スワインソニン（Ｓｗ）、モネンシン（Ｍｎ）が含まれる。
【０１０２】
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体の変異型を、標準的な組換え技術（部位特異的変異誘発または組換えクローニングが含まれる）を使用して産生することができる。抗ＲＡＧＥ抗体の多様化したレパートリーを、トランスジェニック非ヒト動物における遺伝子配置法および遺伝子変換法（米国特許出願公開第２００３／００１７５３４号）によって調製し、次いで、機能アッセイを使用して関連活性について試験することができる。本発明の特定の実施形態では、変異型を、ＣＤＲ変異のための親和性成熟プロトコール（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０：７７９−７８３）、大腸菌の変異誘発株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−７３３）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７−８８）、およびセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１）を使用して得る。免疫療法への適用のために、関連機能アッセイは、下記のように、ヒトＲＡＧＥ抗原への特異的結合、抗体内在化、および腫瘍保有動物に投与した場合の腫瘍部位へのターゲティングを含む。
【０１０３】
本発明は、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体を発現する細胞および細胞株をさらに提供する。代表的な宿主細胞には、哺乳動物細胞およびヒト細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＣＯＳ細胞など）が含まれる。宿主細胞への異種構築物の形質転換後の安定な細胞株の生成方法は、当該分野で公知である。代表的な非哺乳動物宿主細胞には、昆虫細胞（Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２−３）：１０３−１１２）が含まれる。トランスジェニック動物（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６２５−６２９）およびトランスジェニック植物（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０（３）：４３３−４５）中で抗体を産生することもできる。
【０１０４】
上記で考察するように、例えば、抗体の他の部分（定常領域）の欠失、付加、または置換によって修飾したモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、抗体を、以下のように修飾することができる：（ｉ）定常領域の欠失、（ｉｉ）定常領域の別の定常領域（例えば、抗体の半減期、安定性、または親和性を増加させることを意図する定常領域または別の種または抗体クラス由来の定常領域）への置換、または（ｉｉｉ）例えば、特に、グリコシル化部位数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体結合を変化させるための定常領域中の１つまたは複数のアミノ酸の修飾。
【０１０５】
抗体定常領域を変化させる方法は、当該分野で公知である。機能が変化した抗体（例えば、細胞上のＦｃＲなどのエフェクターリガンドまたは補体のＣ１成分に対する親和性の変化）を、抗体の定常部分中の少なくとも１つのアミノ酸残基の異なる残基への置換によって産生することができる（例えば、欧州特許第３８８，１５１  Ａ１号、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号（その全ての内容が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。マウスまたは他の種に適用する場合に免疫グロブリンがこれらの機能を減少または消失する類似の変化型を説明することができる。
【０１０６】
例えば、指定の残基をその側鎖上の適切な機能を有する残基と置換すること、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの荷電官能基、おそらく、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、またはアラニンなどの芳香族無極性残基の導入によって、ＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ１）またはＣ１ｑ結合に対する抗体（例えば、ヒトＩｇＧなどのＩｇＧ）のＦｃ領域の親和性を変化させることが可能である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照のこと）。
【０１０７】
抗体またはその結合フラグメントを、細胞毒素、治療薬、または放射性金属イオンと抱合することができる。１つの実施形態では、抱合されるタンパク質は、抗体またはそのフラグメントである。細胞毒素または細胞毒性薬には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。非限定的な例には、カリチアマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびそのアナログまたはホモログが含まれる。治療薬には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質へのかかる部分の抱合技術は、当該分野で周知である。
【０１０８】
あるいは、現在、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウス中の抗体重鎖結合領域（ＪＭ）遺伝子の均一な欠失によって内因性抗体産生が完全に阻害されることが説明されている。かかる生殖系列変異マウス中のヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入により、抗原攻撃誘発の際にヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Ｊａｃｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ，７：３３（１９８３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにも由来し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０１０９】
一定の実施形態では、本発明の抗体を、併用療法の一部として他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、炎症状態の場合、主題の抗体を、炎症性疾患または炎症状態の治療で有用な１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。心血管疾患、特に、実質的な炎症成分（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を有すると考えられるアテローム斑から生じた心血管疾患の場合、主題の抗体を、心血管疾患の治療で有用な１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。癌の場合、主題の抗体を、１つまたは複数の抗血管新生因子、化学療法薬と組み合わせるか、放射性療法のアジュバントとして投与することができる。主題の抗体の投与が多数の異なる癌療法薬と組み合わせることができる癌治療計画の一部として役立つことがさらに想像される。ＩＢＤの場合、主題の抗体を、１つまたは複数の抗炎症薬と共に投与することができるか、修正された食事計画とさらに組み合わせることができる。
ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害する方法
本発明は、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害するか、ＲＡＧＥ活性を調整する方法を含む。好ましくは、かかる方法を、ＲＡＧＥ関連障害の治療のために使用する。
【０１１０】
かかる方法は、本明細書中に開示のＲＡＧＥに対して惹起された抗体を投与する工程を含む。かかる方法は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＲＡＧＥタンパク質の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する抗体を投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、かかる方法は、１つまたは複数のＲＡＧＥ−ＢＰへのＲＡＧＥの結合を阻害する化合物を投与する工程を含む。かかる化合物を同定する方法の例を、以下で考察する。
【０１１１】
一定の実施形態では、相互作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（精製タンパク質、細胞、生体サンプル、組織、人工組織などを含む反応混合物中などで）阻害される。一定の実施形態では、相互作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、ＲＡＧＥまたはそのＲＡＧＥ結合フラグメントに結合する抗体の投与によって）阻害される。抗体またはそのフラグメントは、ＲＡＧＥに結合し、ＲＡＧＥ−ＢＰの結合を阻害する。
【０１１２】
本発明は、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用の阻害またはＲＡＧＥ活性の調整によってＲＡＧＥ関連障害を防止または治療する方法を含む。かかる方法は、相互作用を阻害するのに有効な量および障害を防止または治療するのに十分な時間ＲＡＧＥに抗体を投与する工程を含む。
【０１１３】
核酸
核酸は、一本鎖、二本鎖、または三重鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーである。特に制限しない限り、核酸は、天然の基準核酸と類似の性質を有する天然のヌクレオチドの公知のアナログを含むことができる。核酸には、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＲＮＡが含まれる。核酸を合成することができるか、任意の生体供給源（任意の生物が含まれる）に由来し得る。
【０１１４】
代表的な本発明の核酸は、ヒヒ、カニクイザル、およびウサギのＲＡＧＥをコードする開示のｃＤＮＡに対応する配列番号６、８、１０、１２のいずれか１つまたはヒヒＲＡＧＥをコードするゲノムＤＮＡ配列に対応する配列番号１５に示すＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸は、配列番号１６〜４９に示す任意の抗体可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も含む。
【０１１５】
本発明の核酸は、配列番号６、８、１０、１２、および１５のいずれか１つと実質的に同一なヌクレオチド配列（配列番号６、８、１０、１２、および１５のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一なヌクレオチド配列が含まれる）も含むことができる。
【０１１６】
本発明の核酸は、配列番号７、９、１１、および１３に示す任意のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するＲＡＧＥタンパク質をコードするヌクレオチド（配列番号７、９、１１、および１３のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一なヌクレオチド配列が含まれる）も含むことができる。
【０１１７】
本発明の核酸は、配列番号１６〜４９に示す任意のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する抗ＲＡＧＥ抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列（任意の配列番号１６〜４９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる）も含むことができる。
【０１１８】
下記のように配列番号１６〜４９のいずれか１つの配列をコードする全長可変領域、クエリー配列としての配列番号１６〜４９に示す配列のいずれか１つを有する全長可変領域をコードするヌクレオチド配列を使用した配列比較アルゴリズムを使用するか、目視検査によって最大一致について配列を比較する。
【０１１９】
実質的に同一の配列は、多型配列（すなわち、集団中の代替配列または対立遺伝子）であり得る。対立遺伝子の相違は、１塩基対の小ささであり得る。実質的に同一の配列は、変異誘発配列（サイレント変異を含む配列が含まれる）も含むことができる。変異は、１つまたは複数の残基の変化、１つまたは複数の残基の欠失、または１つまたは複数のさらなる残基の付加を含むことができる。
【０１２０】
実質的に同一の核酸はまた、配列番号６、８、１０、１２、または１５のいずれか１つの全長または配列番号７、９、１１、および１３に示すＲＡＧＥアミノ酸配列または配列番号１６〜４９に示す抗体可変領域アミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列の全長にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成するか実質的にハイブリッド形成する核酸として同定される。核酸ハイブリッド形成の文脈では、比較される２つの核酸配列を、プローブおよび標的と指定することができる。プローブは基準核酸分子であり、標的は試験核酸分子であり、しばしば、不均一な核酸分子集団内で見出される。標的配列は、試験配列と同義である。
【０１２１】
ハイブリッド形成研究のために、有用なプローブは、本発明の核酸分子の少なくとも１４〜４０ヌクレオチド配列に相補的であるかこれらを模倣する。好ましくは、プローブは、１４〜２０ヌクレオチドを含むか、必要に応じてより長いヌクレオチド（配列番号６、８、１０、１２、または１５のいずれか１つの３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００、または５００ヌクレオチドまたは全長までまたは配列番号７、９、１１、および１３に示すＲＡＧＥアミノ酸配列または配列番号１６〜４９に示す抗体可変領域アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列の全長までなど）を含む。かかるフラグメントを、例えば、フラグメントの化学合成、核酸増幅テクノロジーの適用、または組換え産生のための組換えベクターへの選択された配列の導入によって容易に調製することができる。
【０１２２】
特異的ハイブリッド形成は、配列が複雑な核酸混合物（例えば、総細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリッド形成をいう。特異的ハイブリッド形成は、ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーに応じて、プローブと標的配列との間のミスマッチに順応することができる。
【０１２３】
サザンブロット分析およびノーザンブロット分析などの核酸ハイブリッド形成実験の文脈でのストリンジェントなハイブリッド形成条件およびストリンジェントなハイブリッド形成洗浄条件は、配列および環境の両方に依存する。配列が長いほどより高い温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成についての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に見出される。一般に、高ストリンジェントなハイブリッド形成および洗浄条件は、定義したイオン強度およびｐＨでの特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度を選択する。典型的には、ストリンジェントな条件下で、プローブは、標的サブシーケンスに特異的にハイブリッド形成するが、他の配列にハイブリッド形成しない。
【０１２４】
Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合したプローブにハイブリッド形成する（定義されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。非常にストリンジェントな条件では、特定のプローブのＴｍに等しい温度を選択する。約１００個を超える相補残基を有する相補核酸のサザンブロット分析またはノーザンブロット分析のためのストリンジェントなハイブリッド形成条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミド中での４２℃で一晩のハイブリッド形成である。高ストリンジェント洗浄条件の例は、６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１５分間である。ストリンジェント洗浄条件の例は、６５℃の０．２×ＳＳＣ中で１５分間である。ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を行って、バックグラウンドプローブシグナルを除去する。約１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖のための中ストリンジェンシー洗浄条件の例は、４５℃の１×ＳＳＣ中で１５分間である。約１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖のための低ストリンジェンシー洗浄条件の例は、４０℃の４×〜６×ＳＳＣ中で１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）のために、ストリンジェントな条件は、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で約１Ｍ未満のＮａ＋イオン濃度、典型的には、約０．０１〜１ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）を含み、温度は、典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件を、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。一般に、特定のハイブリッド形成アッセイにおける非関連プローブで認められたシグナル／ノイズ比の２倍（またはそれを超える）のシグナル／ノイズ比は、特異的ハイブリッド形成の検出を示す。
【０１２５】
以下は、本発明の基準ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するために使用することができるハイブリッド形成および洗浄条件の例である：５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でプローブヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列と好んでハイブリッド形成し、その後に５０℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。より好ましくは、５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でプローブと標的配列をハイブリッド形成させ、その後に５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。より好ましくは、５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でプローブと標的配列をハイブリッド形成させ、その後に５０℃の０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。より好ましくは、５０℃の７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でプローブと標的配列をハイブリッド形成させ、その後に５０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。より好ましくは、５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でプローブと標的配列をハイブリッド形成させ、その後に６５℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。
【０１２６】
核酸によってコードされるタンパク質が実質的に同一であるか、三次元構造全体を共有するか、生物学的機能の等価物であることは、２つの核酸配列が実質的に同一であることをさらに示す。これらの用語を、以下にさらに定義する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。例えば、遺伝コードによって許容された２つのヌクレオチド配列が保存的に置換された変異型を含む場合、これが起こる。
【０１２７】
保存的に置換された変異型は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンが混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換された縮重コドン置換を有する核酸配列である。Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８を参照のこと。
【０１２８】
本発明の核酸はまた、配列番号６、８、１０、１２、または１５のいずれか１つに相補的な核酸または配列番号７、９、１１、および１３に示すＲＡＧＥアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１６〜４９に示す抗体可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、およびその相補配列を含む。相補配列は、塩基対間の水素結合の形成の際に互いに対合することができる逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列である。本明細書中で使用される場合、用語「相補配列」は、下記の同一のヌクレオチド比較方法によって評価することができるか、本明細書中に記載の条件などの比較的ストリンジェントな条件下で目的の核酸セグメントにハイブリッド形成することができると定義される場合、実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味する。相補核酸セグメントの特定の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１２９】
サブシーケンス（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、より長い核酸配列の一部を含む核酸の配列である。例示的サブシーケンスは、上記のプローブまたはプライマーである。本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、選択された核酸分子の約８個またはそれを超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは１０〜２０個のヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０個のヌクレオチドを含む連続配列をいう。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子上で重合を開始するのに十分な長さ且つ適切な配列のオリゴヌクレオチドを含む。
【０１３０】
伸長配列は、核酸に組み込まれたさらなるヌクレオチド（または他の類似分子）を含む。例えば、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加することができる。さらに、ヌクレオチド配列を、他のＤＮＡ配列（プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、および他のコードセグメントなど）と組み合わせることができる。したがって、本発明はまた、開示の核酸を含むベクター（本発明の核酸が機能的プロモーターに作動可能に連結された組換え発現用のベクターが含まれる）を提供する。核酸に作動可能に連結された場合、核酸の転写がプロモーター領域によって制御および調節されるように、プロモーターが機能的に核酸と組み合わされる。ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびウイルスベクターなどの宿主細胞で複製することができる核酸をいう。
【０１３１】
本発明の核酸を、クローニング、合成、変化、変異誘発、またはその組み合わせを行うことができる。核酸を単離するために使用される標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は、当該分野で公知である。塩基対の変化、欠失、または小さな挿入を作製するための部位特異的変異誘発も当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ  ＆  Ｈａｍｅｓ（１９９５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅｄ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１３２】
治療方法
本発明は、ＲＡＧＥ関連障害またはＲＡＧＥ関与障害の治療方法に関し、そしてこの方法を含む。ＲＡＧＥ関連障害を、一般に、罹患細胞がＲＡＧＥまたは１つまたは複数のＲＡＧＥリガンドの発現の増加を示す任意の障害が含まれると見なすことができる。ＲＡＧＥ関連障害を、ＲＡＧＥ機能の減少によって治療可能な（すなわち、１つまたは複数の症状を消失または改善することができる）任意の障害と特徴づけることもできる。例えば、ＲＡＧＥ機能を、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰ（ＲＡＧＥに対する抗体など）との間の相互作用を破壊する薬剤の投与によって減少させることができる。
【０１３３】
ＲＡＧＥ発現の減少は、いくつかの病的状態（糖尿病性血管症、腎症、網膜症、ニューロパシー、および他の障害（血管壁の免疫／炎症反応および敗血症が含まれる）など）に関連する。ＲＡＧＥリガンドは、多数の炎症性障害（関節炎（関節リウマチなど）が含まれる）を罹患した組織で産生される。糖尿病組織では、ＲＡＧＥの産生は、進行糖化終末産物の過剰産生によって生じると考えられる。これにより、酸化ストレスおよび内皮細胞機能障害が起こり、それにより、糖尿病性血管疾患が起こる。
【０１３４】
本発明は、有効量の抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントおよび／または抗ＲＡＧＥ抗体またはそのＲＡＧＥ結合フラグメントを含む組成物（例えば、薬学的組成物）を投与する工程を含む、被験体における炎症および炎症性サイトカインカスケードの活性化によって特徴づけられる疾患または容態の治療方法を含む。例えば、Ｓ１００／カルグラニュリンは、Ｃペプチドによって連結された２つのＥＦ−ハンド領域によって特徴づけられる密接に関連するカルシウム結合ポリペプチドファミリーを含むことが示されている（例えば、Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＴＩＢＳ，２１：１３４−１４０；Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，３７：４１７−４２９；Ｒａｍｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：９４９６−９５０２；Ｌｕｇｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２５：６５９−６６４を参照のこと）。これらがシグナルペプチドを欠くにもかかわらず、Ｓ１００／カルグラニュリンが、細胞外空間、特に嚢胞性線維症および関節リウマチのような慢性免疫／炎症応答部位への接近を促進することが長い間公知であった。ＲＡＧＥは、Ｓ１００／カルグラニュリンファミリーの多数のメンバーの受容体であり、リンパ球および単核食細胞などの細胞に対する炎症誘発効果を媒介する。また、遅延型過敏症反応、ＩＬ−１０ヌルマウスにおける大腸炎、コラーゲン誘導性関節炎、および実験自己免疫性脳炎モデルに対する研究により、ＲＡＧＥ−リガンド相互作用（おそらく、Ｓ−１００／カルグラニュリンとの）が炎症カスケードにおける重要な（ｐｒｏｘｉｍａｌ）役割を果たすと示唆される。本明細書中に記載の治療方法に適切な炎症状態は、炎症性サイトカインカスケードが活性化される炎症状態であり得る。
【０１３５】
炎症性サイトカインカスケードにより、敗血症性ショックで起こるような全身反応が起こり得る。本発明の抗ＲＡＧＥ抗体およびそのＲＡＧＥ結合フラグメントを使用して、敗血症、敗血症性ショック、および全身性リステリア症を治療することができる。敗血症は、感染に対する全身性炎症反応であり、臓器機能障害、低潅流、または低血圧に関連する。敗血症性ショックでは、適切な急速輸液を行っても敗血症の重症形態である低血圧が誘導される。リステリア症は、細菌であるリステリア菌に汚染された食品の接種によって引き起こされる重篤感染症である。ＲＡＧＥは、敗血症性ショックの致死効果を媒介することが示されている（Ｌｉｌｉｅｎｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，１１３：１１６４１−５０）。敗血症は、全身性炎症および臓器機能障害（体温の異常、心血管パラメーターおよび白血球数、肝臓酵素の上昇および脳機能の変化が含まれる）によって定義される複雑な生理学を有する。敗血症における反応は、増幅および無調節になる感染または刺激に対するものである。敗血症のマウスＣＬＰモデルにより、腹部膿瘍を伴うか伴わない多微生物性感染が起こり、ヒト疾患で認められる血液動態期および代謝期が再現される。本明細書中に記載の敗血症のマウスＣＬＰモデルを使用して得られた実験結果は、ＲＡＧＥが敗血症の病理発生で重要な役割を果たすことを示す。データはまた、生存率の増加および病理学スコアの改善によって証明されるように、手術時および手術から３６時間後にＲＡＧＥに特異的に結合する抗ＲＡＧＥ抗体を投与することにより、マウスに有意な治療的防御が付与されることを証明する。敗血症、リステリア症、および他のＲＡＧＥ関連疾患の治療のために使用される抗体は、ＲＡＧＥのＶ領域に結合して、ＲＡＧＥリガンドまたは結合パートナーのＲＡＧＥタンパク質への結合を防止する抗体であり得る。
【０１３６】
関節リウマチのような本発明の抗体および方法によって治療または防止される炎症状態を、局在化炎症性サイトカインカスケードによって媒介することができる。本発明の抗ＲＡＧＥ抗体およびそのＲＡＧＥ結合フラグメントおよび／または本発明を使用して通例治療することができる炎症状態の非限定的な例には、例えば、胃腸管および関連組織に関与する疾患（腸閉塞、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性結腸炎、急性大腸炎、および虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、セリアック病、肝炎、クローン病、腸炎、およびホイップル病など）；全身性および局所性炎症性疾患および容態（喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血、内毒素性ショック、悪液質、過高熱症、好中球性肉芽腫、肉芽腫症、およびサルコイドーシスなど）；尿生殖器系および関連組織に関与する疾患（感染流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、および尿道炎など）；呼吸器系および関連組織に関与する疾患（気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺臓炎、成人呼吸急迫症候群、黒色肺（ｐｎｅｕｍｏｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｓｉｌｉｃｏｖｏｌｃａｎｏｃｏｎｉｏｓｉｓ）、肺胞炎（ａｌｖｅａｌｉｔｉｓ）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、および副鼻腔炎など）；種々のウイルス（インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびヘルペスなど）、細菌（播種性菌血症、デング熱など）、糸状菌（カンジダ症など）、ならびに原生動物および多細胞寄生虫（マラリア、フィラリア症、アメーバ症、および包虫嚢など）による感染から惹起される疾患；皮膚病および皮膚の容態（熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、蕁麻疹様疣（ｕｒｔｉｃａｒｉａ  ｗａｒｔ）、および膨疹など）；心血管系および関連組織に関与する疾患（狭窄症、再狭窄、脈管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、鬱血性心不全、心膜炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、およびリウマチ熱など）；中枢神経系または末梢神経系および関連組織に関与する疾患（髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳硬塞、脳塞栓、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｍｅ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、およびブドウ膜炎など）；骨、関節、筋肉、および結合組織の疾患（種々の関節炎症および関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周疾患、関節リウマチ、および滑膜炎など）；他の自己免疫障害および炎症性障害（重症筋無力症、甲状腺炎（ｔｈｒｙｏｉｄｉｔｉｓ）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、同種移植片拒絶、移植片対宿主疾患、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルジェ病、およびライター症候群（Ｒｅｔｉｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）など）；種々の癌、腫瘍、および増殖障害（ホジキン病など）；ならびに任意の場合における任意の原発性疾患に対する炎症反応または宿主の免疫反応が含まれる。
【０１３７】
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体およびそのＲＡＧＥ結合フラグメントを使用して、癌を治療することができる。腫瘍細胞は、ＲＡＧＥリガンド、特に、ＲＡＧＥと相互作用することが示されているアンフォテリン（高移動度Ｉ群非ヒストン染色体ＤＮＡ結合タンパク質（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  Ｉ  ｎｏｎｈｉｓｔｏｎｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ））の発現を増加させることが証明されている（Ｒａｕｖａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１６６２５−１６６３５（１９８７）；Ｐａｒｋｉｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１９７２６−１９７３８（１９９３））。アンフォテリンは、神経突起伸長を促進し、フィブリノゲン分解系におけるプロテアーゼ複合体のアセンブリ表面として役立つ（細胞移動に寄与することも公知）。このことは、癌もＲＡＧＥ関連障害であることを示す。酸化効果および慢性炎症の他の態様も一定の腫瘍発生に対する影響に寄与する。例えば、さらに、ＲＡＧＥ遮断の局所腫瘍成長阻害効果は、原発性腫瘍モデル（Ｃ６グリオーマ）、ルイス肺転移モデル（Ｔａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：３５４−３６０）、およびｖ−Ｈａ−ｒａｓ導入遺伝子を発現するマウスにおける乳頭腫の自発的発症（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９１７８−９１８２）で認められている。
【０１３８】
本発明の抗体またはその結合フラグメントを使用して、糖尿病、糖尿病の合併症、および糖尿病に関連する病的状態を治療または防止することができる。高血糖および全身性または局所性酸化体ストレスに関連する他の容態の存在下で最終的に進行糖化終末産物（ＡＧＥ）が形成される高分子の非酵素的糖酸化反応が腎不全の炎症部位で増強されることが示されている（Ｄｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：２４６３−２４６９（１９９３）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４：１０８７２−１０８７８（１９９５）；Ｄｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１６５４−１１６６０（１９９１）；Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４：１１３９−１１４５（１９９８））。脈管構造中のＡＧＥの蓄積は、透析関連アミロイド症患者で見出されるＡＧＥ−β２−ミクログロブリンから構成される関節アミロイド（Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２：１２４３−１２５２（１９９３）；Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９８：１０８８−１０９４（１９９６））のように限局性に起こり得る（一般に、糖尿病患者の脈管構造および組織（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１：１００２−１００４（１９９５））など）。糖尿病患者における長期にわたるＡＧＥの進行性の蓄積により、内因性クリアランス機構はＡＧＥ沈積部位で有効に機能することができないことが示唆される。かかるＡＧＥの蓄積は、多数の機構によって細胞特性を変化させる能力を有する。ＲＡＧＥは正常な組織および脈管構造で低レベルで発現されるが、受容体のリガンドが蓄積される環境では、ＲＡＧＥは上方制御されるようになることが示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１６４９８−１６５０６（１９９７）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：３０８７０−３０８７８（１９９８）；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２５７８１−２５７９０（２０００））。ＲＡＧＥ発現は、糖尿病脈管構造中の内皮、平滑筋細胞、および浸潤性単核食細胞で増加する。また、細胞培養における研究は、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用によって血管ホメオスタシスで重要な細胞特性が変化することが証明されている。
【０１３９】
抗ＲＡＧＥ抗体またはその結合フラグメントを使用して、勃起障害を治療することもできる。ＲＡＧＥ活性化により、ＮＡＤＨオキシダーゼ様酵素を介してオキシダントが産生され、したがって、陰茎勃起を起こす海綿体平滑筋（ｃａｖｅｒｎｏｓａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ）弛緩の主な刺激因子である一酸化窒素の循環が抑制される。ＲＡＧＥシグナル伝達経路の活性化の阻害により、オキシダントの生成が弱められる。
【０１４０】
本発明の抗体またはその結合フラグメントを使用して、アテローム性動脈硬化症を治療または防止することができる。特に糖尿病患者で虚血性心疾患が高いことが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，１８：５３８−５５１（１９６８）；Ｋａｎｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２４１：２０３５−２０３８（１９７９）；Ｋａｎｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂ．Ｃａｒｅ，２：１２０−１２６（１９７９））。さらに、研究により、糖尿病患者におけるアテローム性動脈硬化症が、糖尿病を罹患していない患者よりも多いことが示されている（例えば、Ｗａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｔ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．６９：４９８−５０６（１９８０）；Ｃｒａｌｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．６４：２２１−２３０（１９７８）；Ｈａｍｂｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ．２：２５１−２５７（１９７６）；およびＰｙｏｒａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｉｂ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，３：４６３−５２４（１９８７）を参照のこと）。糖尿病の罹患状態においてアテローム性動脈硬化症が促進される理由は多数存在するが、ＡＧＥの減少によってプラーク形成を減少させることができることが示されている。
【０１４１】
したがって、本発明の組成物で治療または防止することができるＲＡＧＥ関連障害のリストには、以下が含まれる：急性炎症性疾患（敗血症など）、ショック（例えば、敗血症性ショック、出血性ショック）、慢性炎症性疾患（リウマトイドおよび乾癬性関節炎、骨関節炎、潰瘍性大腸炎、過敏性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、ループス、全身性ループス腎炎、炎症性ループス腎炎、および他の自己免疫疾患など）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、卒中、脆弱性プラーク障害（ｆｒａｇｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、アンギナ、および再狭窄）、糖尿病（特に、糖尿病性心血管疾患）、糖尿病の合併症、勃起障害、癌（例えば、肺癌、扁平上皮癌、前立腺癌、ヒト膵臓癌、腎細胞癌  黒色腫）、脈管炎および他の脈管炎症候群（壊死性脈管炎（ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、腎症、網膜症、およびニューロパシーなど）。
【０１４２】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ＲＡＧＥ抗体およびＲＡＧＥ結合フラグメントの投与を提供する。主題の抗体を、薬学的組成物として投与することができ、１つまたは複数のさらなる薬剤と共に投与することもできる。主題の抗体の投与は、特定の容態を治療するための治療計画の一部であり得る。主題の抗体のみの投与または他の薬剤と組み合わせた主題の抗体の投与によって治療することができる容態には、ＲＡＧＥ関連障害が含まれる。一例として、ＲＡＧＥ関連障害には、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、脈管炎および他の脈管炎症候群（壊死性脈管炎など）、アルツハイマー病、癌、糖尿病の合併症（糖尿病性網膜症など）、自己免疫疾患（乾癬およびループスなど）が含まれるが、これらに限定されない。ＲＡＧＥ関連障害には、さらに、急性炎症性疾患（例えば、敗血症）、慢性炎症性疾患、および炎症によって悪化する他の容態（すなわち、炎症の減少によって改善することができる症状）が含まれる。
【０１４３】
抗体ベースの組成物の投与方法は、当該分野で周知の多数の方法によって行うことができる。これらの方法には局所または全身投与が含まれ、さらに、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、および鼻腔内投与経路（噴霧器および吸入器の使用）が含まれる。さらに、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射が含まれる）によって本発明の薬学的組成物を中枢神経系に導入することが望ましいかもしれない。脳室内注射を、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバなどのリザーバに取り付けた脳室内カテーテルによって容易にすることができる。再充填可能であるか生分解性のデバイス（例えば、デポー）によって導入することもできる。さらに、デバイス、挿入物、ステント、または人工器官によって投与することができることが意図される。
【０１４４】
例えば、関節リウマチおよび骨関節炎などの関節の容態によって重篤に損傷した軟骨の全部または一部を、種々の人工器官に置換することができる。種々の適切な移植可能な材料が存在し、以下に基づいた材料が含まれる：コラーゲン−グリコサミノグリカンテンプレート（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｄ．２５２：１２９）、単離軟骨細胞（Ｇｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ７：２０８；およびＴａｌｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  ２：４４９）、および天然ポリマーまたは合成ポリマーに付着した軟骨細胞（Ｗａｌｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｔ  Ｓｕｒｇ  ７１Ｂ：７４；Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ８８：７５３；ｖｏｎ  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２５：３２９；Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２７：１１；およびＶａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，０４１，１３８号）。例えば、軟骨細胞を、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル、またはポリマー骨格の無害の単量体への加水分解の関数として長期にわたって分解する他のポリマーなどのポリマーから形成された生分解性生体適合性多孔質足場上の培養で成長させることができる。生着するまで細胞に適切な栄養素を与え、ガス交換するようにマトリックスをデザインする。移植すべき細胞について適切な細胞の体積および密度が得られるまで、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。マトリックスの１つの利点は、最終精製物が患者の耳または鼻（一例として）に酷似するように各ベースに対して所望の形状に鋳造または成形することができるか、関節などで移植時に操作可能な可塑性材料を使用することができることである。
【０１４５】
これらおよび他の挿入物および人工器官を、主題の抗体またはその結合フラグメントで処理し、これを使用して投与することができる。例えば、抗体または結合フラグメントを含む組成物を、挿入物または人工器官に適用するかこれらにコーティングすることができる。このような方法で、抗体またはそのフラグメントを、特定の罹患組織（例えば、損傷関節）に直接投与することができる。
【０１４６】
主題の抗体を、他の薬剤との併用療法の一部として投与することができる。併用療法は、第２の化合物を投与する一方で先に投与した治療化合物が依然として体内で有効である（例えば、第２の化合物が患者の体内で同時に有効である（２つの化合物の相乗効果が含まれ得る））ような２つまたはそれを超える異なる治療化合物を組み合わせた任意の投与形態をいう。例えば、異なる治療化合物を、同一の処方物または個別の処方物中で同時または連続的に投与することができる。したがって、かかる治療を受ける個体は、異なる治療化合物の組み合わせた（共同の）効果を得ることができる。
【０１４７】
例えば、炎症状態の場合、主題の抗体を、炎症性疾患または容態の治療で有用な１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。炎症性疾患または容態の治療で有用な薬剤には、抗炎症薬または消炎薬が含まれるが、これらに限定されない。消炎薬には、例えば、糖質コルチコイド（コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルオロコルトロン（ｆｌｕｏｒｃｏｒｔｏｌｏｎｅ）、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニリデン、パラメタゾン、デキサメタゾン、βメタゾン、ベクロメタゾン、フルプレドニリデン（ｆｌｕｐｒｅｄｎｙｌｉｄｅｎ）、デスオキシメタゾン、フルオシノロン、フルメタゾン（ｆｌｕｎｅｔｈａｓｏｎｅ）、ジフルコルトロン、クロコルトロン、クロベタゾール、およびフルコルチンブチルエステルなど）；免疫抑制薬（抗ＴＮＦ薬（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ）、およびＩＬ−１インヒビターなど）；ペニシラミン；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（抗炎症薬、鎮痛薬、および解熱薬（サリチル酸など）、セレコキシブ、ジフニサル（ｄｉｆｕｎｉｓａｌ）、および置換フェニル酢酸塩または２フェニルプロピオン酸塩由来のもの（アルクロフェナク、イブテナク（ｉｂｕｔｅｎａｃ）、イブプロフェン、クリンダナク（ｃｌｉｎｄａｎａｃ）、フェンクロラック、ケトプロフェン、フェノプロフェン、インドプロフェン、フェンクロフェナック、ジクロフェナック、フルルビプロフェン、ピルプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、およびシクロプロフェンなど）を含む）；オキシカン（ｏｘｉｃａｎ）誘導体（ピロキシカン（ｐｉｒｏｘｉｃａｎ）など）；アントラニル酸誘導体（メフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、およびメクロフェナム酸など）、アニリノ置換ニコチン酸誘導体（ミフルミンサンフェナマート（ｆｅｎａｍａｔｅｓ  ｍｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、クロニキシン、フルニキシンなど）；ヘテロアリールが２−インドール−３−イル基またはピロール−２−イル基であるヘテロアリール酢酸（インドメタシン、オキシメタシン（ｏｘｍｅｔａｃｉｎ）、イントラゾール、アセメタジン（ａｃｅｍｅｔａｚｉｎ）、シンメタシン、ゾメピラック、トルメチン、コルピラック（ｃｏｌｐｉｒａｃ）、およびチアプロフェン酸など）；スリンダク型のイデニル酢酸（ｉｄｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）；鎮痛活性ヘテロアリールオキシ酢酸（ベンザダック（ｂｅｎｚａｄａｃ）など）；フェニルブタゾン；エトドラク；ナブネトン（ｎａｂｕｎｅｔｏｎｅ）；ならびに病態修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（メトトレキサート、金塩、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、シクロスポリン、アザチオプリン、およびレフルノミドなど）が含まれる。
【０１４８】
炎症性疾患または容態の治療で有用な他の治療薬には、抗酸化剤が含まれる。抗酸化剤は、天然または合成であり得る。抗酸化剤は、例えば、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）、２１−アミノステロイド／アミノクロマン、ビタミンＣまたはＥなどである。多数の他の抗酸化剤は、当業者に周知である。
【０１４９】
主題の抗体は、炎症状態のための治療計画の一部として役立つことができ、これを、多数の異なる抗炎症薬と組み合わせることができる。例えば、主題の抗体を、１つまたは複数のＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、または免疫抑制薬と組み合わせて投与することができる。適用の１つの実施形態では、主題の抗体またはそのフラグメントを、メトトレキサートと組み合わせて投与することができる。別の実施形態では、主題の抗体を、ＴＮＦ−αインヒビターと組み合わせて投与することができる。
【０１５０】
実質的な炎症成分を有すると考えられる心血管疾患、特にアテローム斑から生じる心血管疾患の場合、主題の抗体を、心血管疾患の治療で有用な１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。心血管疾患の治療で有用な薬剤には、β遮断薬（カルベジロール、メトプロロール、ブシンドロール、ビソプロロール、アテノロール、プロプラノロール、ナドロール、チモロール、ピンドロール、およびラベタロールなど）；抗血小板薬（アスピリンおよびチクロピジンなど）；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のインヒビター（カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ベナゾプリル（ｂｅｎａｚｏｐｒｉｌ）、ホシノプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、およびモエキシプリルなど）；および脂質低下薬（メバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびロスバスタチンなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
癌の場合、主題の抗体を、１つまたは複数の抗血管新生因子、化学療法薬と組み合わせるか、放射線療法のアジュバントとして投与することができる。主題の抗体が癌治療計画の一部として役立ち、多数の異なる癌治療薬と組み合わせることができることがさらに想定される。抗体またはその結合フラグメントを、ＲＡＧＥを発現する癌細胞を死滅させるための細胞毒素または放射線療法薬と連結またはカップリングすることができる。抗体がＲＡＧＥを発現する癌細胞に結合するように、かかる抗体またはそのフラグメントを患者に投与することができる。ＩＢＤの場合、主題の抗体を、１つまたは複数の抗炎症薬と共に投与することができ、さらに、修正された食事計画とさらに組み合わせることができる。
【０１５２】
敗血症および敗血症関連障害または容態（敗血症性ショックなど）の治療ならびに全身性リステリア症の治療のために、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体を、敗血症および敗血症関連障害または容態を治療するか、全身性リステリア症を治療するための他の薬剤および治療計画と組み合わせて投与することができる。例えば、敗血症またはリステリア症を、特定の症状および被験体の状態の標準的ケアである抗生物質および／または他の薬学的組成物と組み合わせた主題の抗体の投与によって治療することができる。
【０１５３】
１つの態様では、本発明はまた、本発明の方法によって同定された治療有効量の化合物を被験体に投与する工程を含む、ＡＧＥのＲＡＧＥとの相互作用を阻害する方法を提供する。治療有効量は、被験体におけるＡＧＥ／ＲＡＧＥの相互作用を防止することができる量である。したがって、この量は、治療を受ける被験体によって変化するであろう。化合物の投与は、１時間に１回、１日１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、１年に１回、または単回事象（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｖｅｎｔ）であり得る。例えば、化合物の有効量は、約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含むことができる。１つの実施形態では、化合物の有効量は、約１μｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重を含むことができる。さらなる実施形態では、化合物の有効量は、約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重を含むことができる。実際の有効量を、当該分野で標準的な方法を使用した用量／応答アッセイによって確立する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４２：１１７９，（１９９３））。したがって、当業者に公知のように、有効量は、化合物の生物学的利用能、生物活性、および生分解性に依存するであろう。
【０１５４】
例えば、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体および組成物を、細胞からの炎症誘発性サイトカインの放出を阻害し、そして／または炎症状態を治療するのに十分な量を必要とする患者に投与する。本発明は、本明細書中に記載の方法または当該分野で公知の他の方法を使用して評価したところ、炎症誘発性サイトカインの放出を、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、または９５％阻害する工程を含むことができる。
【０１５５】
１つの実施形態では、被験体は動物である。１つの実施形態では、被験体はヒトである。１つの実施形態では、被験体は、ＡＧＥ関連疾患（糖尿病、アミロイド症、腎不全、加齢、または炎症など）を罹患している。別の実施形態では、被験体は、アルツハイマー病を罹患した個体を含む。別の実施形態では、被験体は、癌を罹患した個体を含む。さらに別の実施形態では、被験体は、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｍｅｔｏｓｉｓ）、または炎症性ループス腎炎を罹患した個体を含む。
【０１５６】
主題の抗体またはその結合フラグメントを、約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。１つの実施形態では、化合物の有効量は、約１μｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。治療の長さ、頻度は、とりわけ、特定の病状および患者の状態に依存するであろう。
【０１５７】
バイオマーカー
敗血症の疾患活性を測定するバイオマーカー（ＣＲＰ、ＩＬ−６、プロ−カルシトニン、プロ−アドレノメズリン、および凝固パラメーター（Ｄ−二量体、ＰＡＩ−１レベル、プロテイン−Ｃ、フィブリノゲン）など）をモニタリングして、病状ならびに本発明の抗ＲＡＧＥ抗体に対する潜在的および実際の応答に関して被験体を特徴づけることができる。
【０１５８】
さらに、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）は、細胞膜由来の分泌型または切断型のいずれかとして血漿中に見出される。血漿ｓＲＡＧＥレベルの測定のためのアッセイを開発し、これを使用して、被験体を特徴づけることもできる。本発明の抗体がｓＲＡＧＥに結合するので、ｓＲＡＧＥが抗体濃度に近い濃度で存在する場合、被験体の血漿中のｓＲＡＧＥの存在は、本発明の抗体での治療の薬物動態学の影響を受け得る。
【０１５９】
薬物スクリーニングアッセイ
一定の実施形態では、本発明は、受容体ポリペプチド（例えば、上記のＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）へのＲＡＧＥ−ＢＰの結合を阻害する試験抗体（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）の同定アッセイを提供する。
【０１６０】
一定の実施形態では、アッセイは、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５からなる群から選択されるＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導されるＲＡＧＥ受容体のシグナル伝達活性を調整する試験抗体を検出する。かかるシグナル伝達活性には、他の細胞成分への結合、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）などの酵素の活性化、およびＮＦ−κＢ転写活性の活性化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
上記ＲＡＧＥ結合タンパク質は、細胞の成長および増殖（癌細胞成長が含まれる）に関与するシグナル伝達経路に関連する。例えば、Ｓ１００Ｐは、カルシウム結合タンパク質のＳ１００ファミリーのメンバー（２０メンバー超）であり、胎盤から最初に単離された９５個のアミノ酸タンパク質である。Ｓ１００Ｐは、全膵臓腫瘍の９０％超で発現および分泌され、この発現は、膵臓癌の進行と共に増加する。Ｓ１００Ｐはまた、肺癌、乳癌、前立腺癌、および結腸癌でも発現され、結腸細胞株での発現は、化学療法耐性と相関し、肺癌では、Ｓ１００Ｐの高発現；は、不良な予後を示す。Ｓ１００Ｐの遺伝子導入または細胞外付加は、腫瘍細胞の増殖、運動性、進入、浸潤、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の生存、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの転移を増加させる一方で、Ｓ１００Ｐ発現のサイレンシングにより、増殖および転移が減少する。Ｓ１００Ｐの唯一公知の受容体はＲＡＧＥであり、その発現は、胃癌および膠腫の浸潤および転移と相関する。ＲＡＧＥのインヒビターは、細胞のシグナル伝達、増殖、および生存に及ぼすＳ１００Ｐ−ＲＡＧＥ相互作用の影響を無効にし、アンフォテリン由来の阻害タンパク質は、Ｓ１００Ｐ−ＲＡＧＥ相互作用のアンタゴニストとして作用する。抗ＲＡＧＥ抗体およびドミナントネガティブＲＡＧＥの発現は、Ｓ１００Ｐの影響を阻害する。
【０１６２】
種々のアッセイ形式は十分であり、本開示を考慮して、本明細書中に明確に記載していないが、当業者に理解されるであろう。タンパク質複合体の形成（酵素活性）などの条件に近づけるアッセイ形式を、多数の異なる形式でもたらすことができ、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解物）に基づいたアッセイおよびインタクトな細胞を使用する細胞ベースのアッセイが含まれる。簡潔な結合アッセイを使用して、ＲＡＧＥ  ＢＰ（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）と受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）との間の相互作用を阻害する化合物を検出することができる。試験すべき化合物を、例えば、細菌、酵母、または他の生物（例えば、天然生成物）、化学的（例えば、小分子（ペプチド模倣物が含まれる））、または組換えによって生成することができる。
【０１６３】
多数の実施形態では、細胞を、候補化合物とのインキュベーション後に操作し、ＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）によって誘導されたＲＡＧＥ受容体のシグナル伝達活性についてアッセイする。一定の実施形態では、かかる活性についてのバイオアッセイには、ＮＦ−κＢ活性アッセイ（例えば、ＮＦ−κＢルシフェラーゼまたはＧＦＰ受容体遺伝子アッセイ）が含まれ得る。
【０１６４】
例示的ＮＦ−κＢルシフェラーゼまたはＧＦＰ受容体遺伝子アッセイを、Ｓｈｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．５１５：１１９−１２６に記載のように行うことができる。簡潔に述べれば、ＲＡＧＥ受容体またはその変異型を発現する細胞を、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ受容体遺伝子でトランスフェクトする。次いで、トランスフェクションした細胞を、候補化合物とインキュベーションする。その後、ＮＦ−κＢ刺激ルシフェラーゼ活性を、化合物で処理しているか処理していない細胞中で測定する。あるいは、細胞を、ＮＦ−κＢ−ＧＦＰ受容体遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でトランスフェクションすることができる。次いで、トランスフェクトした細胞を、候補化合物とインキュベーションする。その後、ＮＦ−κＢ刺激遺伝子活性を、蛍光／可視光顕微鏡設定でのＧＦＰ発現の測定またはＦＡＣＳ分析によってモニタリングする。
【０１６５】
一定の実施形態では、本発明は、再構成したタンパク質（したがって、受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）および１つまたは複数のＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）を含む調製物）を提供する。本発明のアッセイには、標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質−タンパク質結合アッセイおよびタンパク質結合についての免疫アッセイなどが含まれる。精製タンパク質を、分子間相互作用のモデリングのために使用することができる三次元結晶構造の決定のために使用することもできる。精製抗体を、分子間相互作用のモデリングに使用することができる三次元結晶構造の決定のために使用することもできる。
【０１６６】
本発明のアッセイの一定の実施形態では、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）または受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ）は、アッセイを補助するために選択された細胞に対して内因性であり得る。あるいは、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドまたは受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）は、外因性供給源に由来し得る。例えば、ポリペプチドを、組換え技術（発現ベクターの使用など）およびポリペプチド自体またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡの微量注入によって細胞に導入することができる。
【０１６７】
アッセイのさらなる実施形態では、主題のアッセイを補助するための細胞培養技術を活用して、ＲＡＧＥ−ＢＰと受容体ポリペプチドとの複合体を、ホールセル中で生成することができる。例えば、下記のように、複合体を、真核細胞培養系（哺乳動物細胞および酵母細胞が含まれる）中で構築することができる。インタクトな細胞中での主題のアッセイ生成の利点には、化合物の治療的使用環境により類似する環境で機能的な化合物を検出する能力が含まれる。さらに、アッセイの一定のｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態（下記の実施形態など）は、候補化合物の高処理分析に従い得る。
【０１６８】
本発明のアッセイの一定のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実施形態では、再構成した複合体は、少なくとも半精製タンパク質の再構成複合体を含む。半精製は、再構成混合物で使用したタンパク質を事前に他の細胞タンパク質から分離していることを意味する。例えば、細胞溶解物と対照的に、複合体形成に関与するタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質と比較して混合物中に少なくとも純度５０％まで存在し、一つの実施形態では、少なくとも純度９０〜９５％で存在し、さらなる実施形態では、少なくとも純度９５〜９９％で存在する。主題の方法の一定の実施形態では、再構成タンパク質混合物を、再構成混合物が、複合体アセンブリおよび／またはディスアセンブリを測定する能力を妨害するか、そうでなければ変化させ得る他のタンパク質（細胞起源のタンパク質など）を実質的に欠くように構成性タンパク質を混合することによって誘導する。
【０１６９】
一定の実施形態では、候補化合物の存在下および非存在下でのアッセイを、反応物を含めるのに適切な任意の容器中で行うことができる。例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。
【０１７０】
一定の実施形態では、ＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）と受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）との間の複合体のアセンブリ、安定性、または機能を妨害する能力に基づいて試験抗体を検出する薬物スクリーニングアッセイを生み出すことができる。例示的結合アッセイでは、目的の化合物を、ＲＡＧＥ−ＬＢＥポリペプチドおよびＲＡＧＥ−ＢＰ（ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５など）を含む混合物と接触させる。複合体の検出および定量により、複合体の２成分間の相互作用の阻害に対する化合物の効率を決定するための手段が得られる。化合物の有効性を、種々の濃度の試験抗体を使用して得たデータ由来の用量応答曲線の作成によって評価することができる。さらに、コントロールアッセイを実施して、比較のためのベースラインを得ることもできる。コントロールアッセイでは、複合体の形成を、試験抗体の非存在下で定量する。
【０１７１】
一定の実施形態では、複合体中の２つのポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ−ＢＰおよび受容体ポリペプチド）の間の会合を、種々の技術（その多くが上に有効に記載されている）によって検出することができる。例えば、複合体形成の調整を、例えば、免疫アッセイ、２ハイブリッドアッセイ、またはクロマトグラフィ検出によって、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識）を使用して定量することができる。表面プラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から利用可能なものなど）を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することもできる。
【０１７２】
一定の実施形態では、ＲＡＧＥ  ＢＰおよび受容体ポリペプチドを含む複合体中の１つのポリペプチドを、他のポリペプチドの非複合体形成形態からの複合体の分離を容易にし、アッセイの自動化に適合させるために固定することができる。例示的実施形態では、可溶性マトリックスに抗体を結合させるドメインを付加した抗体を提供することができる。例えば、抗体を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着するか、磁性ビーズに直接または間接的に付着させ、次いで、潜在的相互作用タンパク質（例えば、３５Ｓ標識Ｓ１００ポリペプチドまたは他の標識ＲＡＧＥ−ＢＰ）と組み合わせ、試験抗体を複合体形成を誘導する条件下でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して任意の非結合相互作用抗体を除去し、マトリックスビーズ結合放射性標識を直接（例えば、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中に存在するビーズ）または複合体の解離後の上清中で（例えば、マイクロタイタープレートを使用する場合）決定する。あるいは、非結合抗体の洗い流し後、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、マトリックス結合画分中で見出された相互作用ポリペプチドレベルを、標準的な電気泳動技術を使用して、ゲルから定量した。
【０１７３】
別の実施形態では、２ハイブリッドアッセイ（相互作用トラップアッセイともいう）を、ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの複合体中の２つのポリペプチドの相互作用の検出（米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６も参照のこと）およびその後のＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドとの間の結合を阻害する試験抗体の検出のために使用することができる。このアッセイは、宿主細胞（例えば、酵母細胞（好ましい）、哺乳動物細胞、または細菌細胞型）を準備する工程を含む。宿主細胞は、レポーター遺伝子が転写を活性する場合にこの遺伝子が検出可能な遺伝子産物を発現するように、ベイトタンパク質中で使用される転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインの結合部位を有するレポーター遺伝子を含む。宿主細胞中で発現し、「ベイト」ポリペプチドをコードすることができる第１のキメラ遺伝子を提供する。宿主細胞中で発現し、「フィッシュ」ポリペプチドをコードすることができる第２のキメラ遺伝子も提供する。１つの実施形態では、第１および第２のキメラ遺伝子を、プラスミドの形態で宿主に導入する。しかし、好ましくは、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第２のキメラ遺伝子を、プラスミドの一部として宿主細胞に導入する。
【０１７４】
一定の実施形態では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）および受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）の結合を阻害する試験抗体を同定するための２ハイブリッドアッセイを提供する。例示するために、受容体ポリペプチドを含む「ベイト」ポリペプチドおよびＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５など）を含む「フィッシュ」ポリペプチドを、宿主細胞に導入する。１つの実施形態では、ベイトは、ヒトまたはマウスＲＡＧＥのＶドメインまたは依然としてＲＡＧＥ−ＢＰに結合することができるヒトまたはマウスＲＡＧＥのＶドメインと８０〜９９％同一の配列を含む。細胞を、レポーター遺伝子が活性化されるのに十分な量でベイトおよびフィッシュポリペプチドを発現する条件に供する。
【０１７５】
２つの融合ポリペプチドの相互作用により、レポーター遺伝子の発現によって産生された検出可能なシグナルが得られる。したがって、試験抗体の存在下および試験抗体の非存在下での２ポリペプチド間の相互作用レベルを、各場合のレポーター遺伝子の発現レベルの検出によって評価することができる。本発明の方法に従って種々のレポーター構築物を使用することができ、例えば、酵素シグナル、蛍光シグナル、リン光シグナル、および薬物耐性などからなる群から選択される検出可能なシグナルを生成するレポーター遺伝子が含まれる。
【０１７６】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査される化合物数を最大にするための高処理アッセイが望ましい。無細胞系で行われる本発明のアッセイ（精製または半精製タンパク質または溶解物を使用して構築することができるものなど）は、迅速に構築され、試験抗体によって媒介される分子標的の変化を比較的容易に検出されるように生成することができるという点で、しばしば「初期」スクリーニングと呼ばれる。さらに、試験抗体の細胞毒性および／または生物学的利用能を、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で無視することができ、その代わりに、このアッセイは、主に、他のタンパク質との結合親和性の変化または分子標的の酵素特性の変化において出現し得る分子標的に及ぼす薬物の影響に注目する。
【０１７７】
一定の実施形態では、ＲＡＧＥ−ＢＰと受容体との間の複合体形成を、免疫沈降および同時免疫沈降タンパク質の分析または親和性精製および同時精製タンパク質の分析によって評価することができる。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイを使用して、かかる複合体形成を決定することもできる。互いに極めて近接する適切な放射スペクトルおよび励起スペクトルを有する蛍光分子はＦＲＥＴを示すことができる。１つの分子（ドナー分子）の放射スペクトルが他の分子（アクセプター分子）の励起スペクトルと重複するように蛍光分子を選択する。ドナー分子を、ドナー励起スペクトル内の適切な強度の光によって励起する。次いで、ドナーは、吸収エネルギーを蛍光として放出する。生成された蛍光エネルギーを、アクセプター分子によって消光する。ドナーからの蛍光シグナル強度の減少、その励起状態の寿命の減少、および／またはアクセプターに特徴的なより長い波長（より低いエネルギー）での蛍光の再放射としてＦＲＥＴが出現し得る。蛍光タンパク質が物理的に分離した場合、ＦＲＥＴ効果は減少するか消失する（例えば、米国特許第５，９８１，２００号を参照のこと）。
【０１７８】
ＦＲＥＴの発生もドナー蛍光部分の蛍光の寿命を減少させる。この蛍光寿命の変化を、蛍光寿命画像化技術（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＦＬＩＭ）と呼ばれる技術を使用して測定することができる（Ｖｅｒｖｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５６７−１５７０，Ｓｑｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ：Ｍｉｃｒｏｓｃ．１９３：３６；Ｖｅｒｖｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８：２１２７）。ＦＬＩＭデータの分析のための広域（ｇｌｏｂａｌ）分析技術が開発されている。これらのアルゴリズムは、ドナー蛍光部分がそれぞれ異なる蛍光寿命を有する制限された数の状態のみで存在するという理解を使用する。各状態の定量マップ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍａｐ）を、ピクセル単位で作成することができる。
【０１７９】
ＦＲＥＴベースのアッセイを実施するために、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、ＳＬＯＯＰ、Ｓ１００Ａ、Ｓ１００Ａ４、Ａ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５）および受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）の両方を蛍光標識する。適切な蛍光標識は、当該分野で周知である。例を以下に提供するが、特に考察していない適切な蛍光標識も当業者は入手可能であり、使用することができる。蛍光タンパク質（例えば、クラゲ、サンゴ、および他の腔腸動物から単離された蛍光タンパク質）を有するポリペプチドとしてポリペプチドを発現することによって蛍光標識を行うことができる。例示的蛍光タンパク質には、蛍光オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の多数の変異型が含まれる。変異形は、より明るい二量体であり得るか、異なる励起および／または放射スペクトルを有し得る。一定の変異型は、もはや緑色が出現せず、青色、シアン、黄色、または赤色（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、およびＲＥＰと呼ばれる）を出現し得るように変化する。蛍光タンパク質を、種々の共有結合および非共有結合（ペプチド結合（例えば、融合タンパク質としての発現）、化学的架橋、およびビオチン−ストレプトアビジンカップリングが含まれる）によってポリペプチドに安定に結合することができる。蛍光タンパク質の例については、米国特許第５，６２５，０４８号、同第５，７７７，０７９号、同第６，０６６，４７６号、および同第６，１２４，１２８号、Ｐｒａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ，１１１：２２９−２３３；Ｒｅｉｇｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：１２５０１−０４；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３５：８０３−８０８；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７２Ｂ：７７−ｇ５；Ｔｅｒｓｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５８５−８８を参照のこと。
【０１８０】
ＦＲＥＴベースのアッセイを、細胞ベースのアッセイおよび無細胞アッセイで使用することができる。ＦＲＥＴベースのアッセイは、高処理スクリーニング法（蛍光標示式細胞分取およびマイクロタイターアレイの蛍光スキャニングが含まれる）に従い得る。
【０１８１】
一般に、スクリーニングアッセイが結合アッセイ（タンパク質−タンパク質結合、化合物−タンパク質結合など）である場合、１つまたは複数の分子を、標識にカップリングまたは連結することができ、この標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に供給することができる。種々の標識には、放射性同位体、蛍光剤、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、特異的結合分子、および粒子（例えば、磁性粒子）などが含まれる。特異的結合分子には、ビオチンおよびストレプトアビジンならびにジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどの対が含まれる。特異的結合メンバーのために、相補メンバーを、通常、公知の手順に従って、検出される分子で標識するであろう。
【０１８２】
種々の他の試薬を、スクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの至適タンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的またはバトルグラウンド相互作用（ｂａｔｔｌｅｇｒｏｕｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を減少させる試薬が含まれる。アッセイ効率を改良する試薬（プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、および抗菌化合物など）を使用することができる。成分の混合物を、必要な結合が得られる任意の順序で添加する。任意の適切な温度、典型的には、４℃と４０℃との間でインキュベーションを行う。至適活性が得られるインキュベーション期間を選択するが、高処理スクリーニングを容易にするのに最適でもあり得る。
【０１８３】
一定の実施形態では、本発明は、複合体依存性アッセイを提供する。かかるアッセイは、受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）へのＲＡＧＥ−ＢＰの結合の候補インヒビターである試験抗体を同定する工程を含む。
【０１８４】
例示的実施形態では、受容体ポリペプチドに結合する化合物を、受容体ＲＡＧＥ−ＬＢＥポリペプチドの使用によって同定することができる。例示的実施形態では、可溶性マトリックスにタンパク質を結合可能にするさらなるドメインを付加したＲＡＧＥ−ＬＢＥを得ることができる。例えば、ＧＳＴタンパク質と融合したＲＡＧＥ−ＬＢＥを、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着し、次いで、潜在的な標識結合化合物と組み合わせ、結合を誘導する条件下でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して任意の非結合化合物を除去し、マトリックスビーズ結合標識を、直接決定するか、結合化合物を解離した後の上清中で決定する。
【０１８５】
一定の実施形態では、標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供することができる。種々の標識には、放射性同位体、蛍光剤、化学発光物質、酵素、特異的結合分子、および粒子（例えば、磁性粒子）などが含まれる。特異的結合分子には、ビオチンおよびストレプトアビジンならびにジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどの対が含まれる。特異的結合メンバーのために、相補メンバーを、通常、公知の手順に従って、検出される分子で標識するであろう。一定の実施形態では、かかる方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合物を形成する工程を含む。一定の実施形態では、かかる方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの混合物の形成による細胞ベースのアッセイを含む。一定の実施形態では、方法は、受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥ）またはその変異型を発現する細胞を試験抗体と接触させる工程を含む。
【０１８６】
一定の実施形態では、アッセイは、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解物）およびインタクトな細胞を使用する細胞ベースのアッセイに基づく。簡潔な結合アッセイを使用して、受容体ポリペプチドと相互作用する化合物を検出することができる。試験すべき化合物を、例えば、細菌、酵母、または他の生物（例えば、天然生成物）、化学的（例えば、小分子（ペプチド模倣物が含まれる））、または組換えによって生成することができる。
【０１８７】
任意選択的に、これらのアッセイから同定した試験抗体を使用して、ＲＡＧＥ関連障害を治療することができる。
【０１８８】
薬学的調製物
本発明の主題のタンパク質または核酸を、適切な組成物の形態で投与することが最も好ましい。適切な組成物として、薬物の全身または局所投与のために通常使用される全ての組成物を引用することができる。薬学的に許容可能なキャリアは、有効成分と作用しないように実質的に不活性であるべきである。適切な不活性キャリアには、水、アルコール、ポリエチレングリコール、鉱物油または石油ゲル（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  ｇｅｌ）、プロピレングリコール、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、注射用静菌水（ｂａｃｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＢＷＦＩ）、および注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）などが含まれる。前述の薬学的調製物（主題の抗体または主題の抗体をコードする核酸が含まれる）を、ヒトまたは動物用薬物で使用するための任意の都合のよい方法での投与のために処方することができる。
【０１８９】
したがって、本発明の別の態様は、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリア（添加物）および／または希釈剤と共に処方した有効量の抗体を含む薬学的に許容可能な組成物を提供する。以下に詳述するように、本発明の薬学的組成物を、以下のために適合させた固体または液体形態が含まれる固体または液体形態での投与のために特に処方することができる：（１）経口投与（例えば、ドレンチ（ｄｒｅｎｃｈ）（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌への塗布のためのペースト）；（２）非経口投与（例えば、滅菌溶液または懸濁液しての皮下、筋肉内、または静脈内への注射）；（３）局所適用（例えば、皮膚に適用するクローム、軟膏、またはスプレーとして）；または（４）膣内または直腸内（例えば、ペッサリー、クローム、またはフォームとして）。しかし、一定の実施形態では、主題の薬剤を、滅菌水に簡潔に溶解または懸濁することができる。一定の実施形態では、薬学的調製物は、非発熱性である（すなわち、患者の体温を上昇させない）。特定の皮下注射および静脈内注射では、非経口投与は、好ましい投与経路である。
【０１９０】
一定の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、塩基性官能基（アミノまたはアルキルアミノなど）を含むことができ、したがって、薬学的に許容可能な酸と薬学的に許容可能な塩を形成することができる。これに関して、用語「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機および有機酸付加塩をいう。これらの塩を、本発明の化合物の最終単離および精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで調製するか、その遊離塩基形態の本発明の精製化合物と適切な有機酸または無機酸との個別の反応およびこのようにして形成された塩の単離によって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシレート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチラート（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。
【０１９１】
薬剤の薬学的に許容可能な塩には、例えば、非毒性有機酸または無機酸由来の化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、かかる従来の非毒性塩には、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、および硝酸など）由来の塩、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、およびイソチオン酸など）から調製した塩が含まれる。
【０１９２】
他の場合、１つまたは複数の薬剤は、１つまたは複数の酸性官能基を含むことができ、従って、薬学的に許容可能な塩基と薬学的に許容可能な塩を形成することができる。これらの塩を、同様に、化合物の最終単離および精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで調製するか、その遊離酸形態の精製化合物と適切な塩基（薬学的に許容可能な金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩）、アンモニア、または薬学的に許容可能な有機第一級アミン、第二級アミン、もしくは第三級アミンとの個別の反応によって調製することができる。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウムなどが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびピペラジンなどが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【０１９３】
湿潤剤、乳化剤、潤滑剤（ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど）、着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、香味物質、芳香剤（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、防腐剤、および抗酸化剤も組成物中に存在することができる。
【０１９４】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には、以下が含まれる：（１）水溶性抗酸化剤（アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）（２）油溶性抗酸化剤（アスコルビルパルミタート（ａｓｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｐｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、およびα−トコフェロールなど）、および（３）金属キレート剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸など）。
【０１９５】
本発明の処方物には、蛍光、鼻腔内、局所（口腔内および舌下が含まれる）、直腸、膣内、および／または非経口投与に適切な処方物が含まれる。処方物は、単位投薬形態で都合良く存在することができ、薬学分野で周知の任意の方法によって調製することができる。単位投薬形態を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療を受ける宿主、特定の投与様式に応じて変化するであろう。単位投薬形態を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果が得られる化合物の量であろう。一般に、１００％のうち、この量は、約１％から約９９％まで、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の有効成分の範囲であろう。
【０１９６】
これらの処方物または組成物の調製方法は、薬剤をキャリアおよび（任意選択的に）１つまたは複数の副成分に会合させる工程を含む。一般に、処方物を、本発明の薬剤を液体キャリアまたは適時に分割される固体キャリアまたはその両方と均一且つ本質的に会合し、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製する。
【０１９７】
経口投与に適切な本発明の処方物は、カプセル、カシェ、丸薬、錠剤、ロゼンジ（味をつけた基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒、または水性もしくは非水性液体の溶液もしくは懸濁液、水中油滴型もしくは油中水滴型乳濁液、エリキシルもしくはシロップ、パステル剤（ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤またはスクロースおよびアカシアを使用する）、および／または含嗽剤など（それぞれ有効成分として所定量の本発明の化合物を含む）の形態であり得る。本発明の化合物を、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与することもできる。
【０１９８】
経口投与のための本発明の固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸薬、ドラジェ、散剤、および顆粒など）では、有効成分を、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリア（クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなど）および／または以下のいずれかと混合する：（１）充填剤または増量剤（デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール，および／またはケイ酸など）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど）；（３）保湿剤（グリセロールなど）；（４）崩壊剤（寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど）；（５）溶液抑制剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（パラフィンなど）；（６）吸収促進剤（第四級アンモニウム化合物など）；（７）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアラートなど）；（８）吸収剤（カオリンおよびベントナイトクレイなど）；（９）潤滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物など）；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、薬学的組成物は、緩衝剤も含む。ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、類似の型の固体組成物を、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用することもできる。
【０１９９】
錠剤を、任意選択的に１つまたは複数の副成分との圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠を、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングルコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、および分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤を、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物の適切な機械での成形によって作製することができる。
【０２００】
本発明の薬学的組成物の錠剤、および他の固体投薬形態（ドラジェ、カプセル、丸薬、および顆粒など）を、任意選択的に、薬学的処方分野で周知の腸溶コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを使用してスコアリングするか調製することができる。これらを、例えば、所望の放出プロフィールが得られる種々の比率でヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム、および／またはミクロスフィアを使用して、有効成分が遅延放出または制御放出されるように処方することもできる。これらを、例えば、細菌保持フィルターでの濾過または滅菌水に溶解するか使用直前にいくつかの他の滅菌注射用媒質に溶解することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤の組み込みによって滅菌することができる。これらの組成物は、任意選択的に、不透明化剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）も含むことができ、胃腸管の一定部分に遅延様式で有効成分のみまたは有効成分を優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例には、高分子物質およびワックスが含まれる。有効成分はまた、必要に応じて１つまたは複数の上記賦形剤を含むマイクロカプセル化形態であり得る。
【０２０１】
本発明の化合物の経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に許容可能な乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれる。有効成分に加えて、液体投薬形態は、当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒など）、溶解補助剤および乳化剤（エチルアルコール，イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル類（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなど）、およびこれらの混合物を含むことができる。
【０２０２】
不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、アジュバント（湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤など）甘味料、香味物質、着色剤、着香剤（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、および防腐剤も含むことができる。
【０２０３】
活性化合物に加えて、懸濁液は、懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにこれらの混合物を含むことができる。
【０２０４】
直腸または膣内投与のための本発明の薬学的組成物の処方物は、座剤として存在することができ、１つまたは複数の本発明の化合物と１つまたは複数の適切な非刺激性賦形剤またはキャリア（例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、座剤ワックス、またはサリチル酸塩を含む）との混合によって調製することができる。この処方物は、室温で固体であるが、体温で液体になるので、直腸または膣腔で融解して薬剤を放出する。
【０２０５】
膣内投与に適切な本発明の処方物には、当該分野で適切であることが公知のキャリアなどを含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレーの処方物も含まれる。
【０２０６】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための投薬形態には、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が含まれる。活性化合物を、滅菌条件下で薬学的に許容可能なキャリアおよび必要であり得る任意の防腐剤、緩衝液、または噴射剤と混合することができる。
【０２０７】
軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤（動物性脂肪および植物性脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛またはこれらの混合物など）を含むことができる。  
【０２０８】
散剤およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、賦形剤（ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物など）を含むことができる。スプレーは、さらに、慣習的な噴射剤（クロロフルオロ炭化水素など）および揮発性非置換炭化水素（ブタンおよびプロパンなど）を含むことができる。
【０２０９】
経皮パッチは、身体に本発明の化合物を制御送達するというさらなる利点が得られる。かかる投薬形態を、適切な媒質への薬剤のの溶解または分散によって作製することができる。吸収促進剤を使用して、死者（ｔｈｅ  ｓｌａｉｎ）にわたる薬剤の流れを増加させることもできる。かかる流速を、速度制御膜の準備またはポリマーマトリックスまたはゲル中の化合物の分散のいずれかによって制御することができる。
【０２１０】
眼科処方物、眼軟膏、散剤、および溶液なども、本発明の範囲内であることが意図される。
【０２１１】
非経口投与に適切な本発明の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、もしくは乳濁液、または使用直前に滅菌注射液または分散液に再構成することができる滅菌粉末と組み合わせた１つまたは複数の本発明の化合物を含む。この薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁剤、または増粘剤を含むことができる。
【０２１２】
本発明の薬学的組成物で使用することができる適切な水性および非水性キャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、植物油（オリーブ油など）、注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が含まれる。分散液の場合の必要な粒子サイズの維持または界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。
【０２１３】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントも含むことができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸など）を含めることによって微生物作用の防止を確実にすることができる。組成物に等張剤（糖および塩化ナトリウムなど）を含めることも望ましいかもしれない。さらに、吸収を遅延させる薬剤（モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）を含めることによって注射可能な薬学的形態を長期吸収させることができる。
【０２１４】
いくつかの場合、薬剤の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅延させることが望ましい。水溶性の低い結晶または無定形物質の液体懸濁液の使用によってこれを達成することができる。薬剤の吸収率は、その溶解速度に依存し、同様に、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与した薬剤の吸収を、オイルビヒクルへの薬剤の溶解または懸濁によって遅延させる。
【０２１５】
注射可能なデポー形態を、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中での主題の化合物のマイクロカプセルマトリックスの形成によって作製する。薬物：ポリマー比および使用した特定のポリマーの性質に応じて、薬剤の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射処方物を、身体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンへの薬剤の捕捉によっても調製する。
【０２１６】
本発明の化合物を医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）としてヒトおよび動物に投与する場合、化合物自体を投与するか、例えば、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の有効成分を含む薬学的組成物として投与することができる。
【０２１７】
上記組成物とは別に、適量の治療薬を含むカバー（例えば、プラスター、包帯、包帯剤、およびガーゼパッドなど）を使用することができる。上記で詳述するように、治療組成物を、ステム、デバイス、人工器官、および挿入物で投与／送達することができる。
【０２１８】
分析用の組織サンプルは、患者由来の典型的には、血液、血漿、血清、粘液、または脳脊髄液である。サンプルを、例えば、ＲＡＧＥペプチドに対する抗体のレベルまたはプロフィール（ヒト化抗体のレベルまたはプロフィール）について分析する。ＲＡＧＥに特異的な抗体のＥＬＩＳＡ検出方法を、実施例に記載する。
【０２１９】
受動免疫法後の抗体プロフィールは、抗体濃度の即時ピークおよびその後の指数関数的減衰を示す。さらなる投薬を行わない場合、減衰は、投与した抗体の半減期に応じて、数日から数ヵ月の期間内に処置前のレベルに近づく。
【０２２０】
いくつかの方法では、患者中のＲＡＧＥに対する抗体のベースラインを、投与前に測定し、ピーク抗体レベルを決定するためにその直後に第２の測定を行い、抗体レベルの減衰をモニタリングするために周期的に１回または複数回のさらなる測定を行う。抗体レベルがベースラインまたはピークより小さい所定の比率（例えば、５０％、２５％、または１０％）に減少した場合、さらなる投薬量の抗体を投与する。いくつかの方法では、ピークまたはその後のバックグラウンドより小さい測定レベルを、以前に決定した基準レベルと比較して、他の患者における有利な予防的または治療的治用計画を構成する。測定した抗体レベルが基準レベルより有意に低い場合（例えば、平均−治療から恩恵を受けた患者集団の基準値の１標準偏差未満）、さらなる投薬量の抗体を投与する。
【実施例】
【０２２１】
（実施例）
本発明をここに一般的に説明しているが、以下の実施例を参照してより容易に理解される。実施例は、本発明の一定の態様および実施形態の例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【０２２２】
（実施例１）
ＲＡＧＥ構築物の調製
マウスＲＡＧＥ（ｍＲＡＧＥ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−０３１４５１；配列番号３）およびヒトＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−００１２７．１；配列番号１）のアミノ酸配列を、図１Ａ〜１Ｃに示す。ｍＲＡＧＥ（受入番号ＮＭ−００７４２５．１；配列番号４）およびｈＲＡＧＥ（受入番号ＮＭ−００１１３６；配列番号２）をコードする全長ｃＤＮＡを、Ａｄｏｒｉ１−２発現ベクターに挿入する。このベクターは、ｃＤＮＡ配列の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含み、ウイルス生成のためのアデノウイルスエレメントを含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインへのヒトＲＡＧＥのアミノ酸１〜３４４の付加によって形成されたヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、Ａｄｏｒｉ発現ベクターを使用した培養培地中での融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の発現によって調製した。ヒトＩｇＧのＦｃドメインへのヒトＲＡＧＥのアミノ酸１〜１１８の付加によって形成されたヒトＲＡＧＥ  Ｖ領域−Ｆｃ融合タンパク質を、同様に調製した。ヒトまたはマウスＲＡＧＥのアミノ酸１〜３４４へのストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ）タグ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号５）の付加によって形成されたヒトおよびマウスＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質を、Ａｄｏｒｉ発現ベクターを使用したＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の発現によって調製した。全構築物を、広範囲の制限消化分析およびプラスミド内のｃＤＮＡインサートの配列分析によって検証した。
【０２２３】
全長ＲＡＧＥ、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃ、およびｈＲＡＧＥ  Ｖドメイン−Ｆｃを発現する組換えアデノウイルス（Ａｄ５  Ｅ１ａ／Ｅ３欠失）を、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ＭＤ）における相同組換えによって生成した。組換えアデノウイルスウイルスを単離し、その後にＨＥＫ２９３細胞中で増幅させた。ウイルスは、３サイクルの凍結融解によって、感染ＨＥＫ２９３細胞から放出した。ウイルスを、２回の塩化セシウム遠心分離勾配によってさらに精製し、４℃のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）に対して透析した。透析後、濃度１０％までグリセロールを添加し、使用するまでウイルスを−８０℃で保存した。ウイルス構築物を、感染性（２９３細胞におけるプラーク形成単位）、ウイルスのＰＣＲ分析、コード領域の配列分析、導入遺伝子の発現、および内毒素測定について特徴づけた。
【０２２４】
ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ、ヒトＲＡＧＥ−Ｖ領域−Ｆｃ、ならびにヒトおよびマウスＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むＡｄｏｒｉ発現ベクターを、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを、２０ｎＭおよび５０ｎＭのメトトレキサート中で選択した。各クローンから馴化培地を採取し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティングを使用して分析して、ＲＡＧＥ発現を確認した。（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５３７−６６；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：４８７−５１１；Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２２：２３６−２３７）。
【０２２５】
可溶性ＲＡＧＥ  融合タンパク質を発現するＣＨＯまたは形質導入したＨＥＫ２９３細胞を培養し、タンパク質精製のために馴化培地を採取した。表示のアフィニティ−タグ法を使用して、タンパク質を精製した。精製タンパク質を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブルー染色（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）によって視覚化し、推定分子量を示した。
【０２２６】
（実施例２）
マウス抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体の生成
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）を、ＧｅｎｅＧｕｎデバイス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して皮下で免疫化した。全長ヒトＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡを含むｐＡｄｏｒｉ発現ベクターを、皮下投与前にコロイド状金粒子（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に予め吸収させた。マウスを、３ｕｇのベクターで１週間に２回、２週間にわたって免疫化した。最後の免疫化から１週間後にマウスを交配し、抗体力価を評価した。最も高いＲＡＧＥ−抗体力価を有するマウスに、細胞融合の３日前に１０μｇの組換えヒトＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタンパク質をさらに１回注射した。
【０２２７】
５０％ポリエチレングリコール（ＭＷ１５００）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と４：１の比率で融合した。融合後、細胞を、２０％ＦＢＳ、５％Ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０選択培地を含む９６ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで播種し、培養した。
【０２２８】
（実施例３）
ラット抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体の生成
ＬＯＵラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｈａｒｌａｎ，ＭＡ）を、ＧｅｎｅＧｕｎ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して皮下で免疫化した。全長マウスＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡを含むｐＡｄｏｒｉ発現ベクターを、皮下投与前にコロイド状金粒子（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に予め吸収させた。ラットを、３ｕｇのベクターで２週間毎に１回、合計４回免疫化した。最後の免疫化から１週間後にラットを交配し、抗体力価を評価した。最も高いＲＡＧＥ−抗体力価を有するマウスに、細胞融合の３日前に１０μｇの組換えマウスＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタンパク質をさらに１回注射した。
【０２２９】
５０％ポリエチレングリコール（ＭＷ１５００）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と４：１の比率で融合した。融合後、細胞を、２０％ＦＢＳ、５％Ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０選択培地を含む９６ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで播種し、培養した。
【０２３０】
（実施例４）
ハイブリドーマスクリーニング
ラット抗マウスＲＡＧＥおよびマウス抗ヒトＲＡＧＥ  ｍＡｂのパネルを、ＧｅｎｅＧｕｎ、マウスまたはヒトＲＡＧＥの全長コード領域を発現するＡｄｏｒｉ発現プラスミドを使用したｃＤＮＡ免疫化によって生成した。ＲＡＧＥを一過性に発現するヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）に対するＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によって、ハイブリドーマ上清を組換えヒトまたはマウスＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合についてスクリーニングした。陽性上清を、リガンドＨＭＧＢ１へのＲＡＧＥ結合を中和する能力についてさらに試験した。７つのラットモノクローナル抗体（ＸＴ−Ｍ系列）および７つのマウスモノクローナル抗体（ＸＴ−Ｈ系列）を同定した。選択したハイブリドーマを、連続希釈によって４回およびＦＡＣＳ分取によって１回サブクローニングした。安定なハイブリドーマ培養物から馴化培地を採取し、プロテインＡ抗体精製カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して免疫グロブリンを精製した。各ｍＡｂのＩｇクラスを、表示のマウスｍＡｂアイソタイピングキットまたはラットｍＡｂアイソタイピングキット（ＩｓｏＳｔｒｉｐ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．）を使用して決定した。選択したラットおよびマウスのモノクローナル抗体のアイソタイプを、表１に示す（以下）。
【０２３１】
【表１】
2009529920.tif 000004
（実施例５）
ＦＡＣＳ分析
ヒト２９３細胞に、ヒトおよびマウスＲＡＧＥアデノウイルスを感染させた。感染細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中にて４×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁した。細胞を、１００ｕｌのサンプル（希釈免疫血清、ハイブリドーマ上清、または精製抗体）と４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄後、細胞を、ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＧｌｏｓｔｒｕｐＤｅｎｍａｒｋ）と、暗所にて４℃で３０分間インキュベーションした。細胞関連蛍光シグナルを、５０００細胞／処理を使用して、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトフルオロメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって測定した。プロピジウムヨージドを使用して死細胞を同定し、分析から排除した。７つのマウスモノクローナル抗体ＸＴ−Ｈ１〜ＸＴ−Ｈ７および７つのマウスモノクローナル抗体ＸＴ−Ｍ１〜ＸＴ−Ｍ７は、ＦＡＣＳ分析によって、細胞表面ｈＲＡＧＥに結合することが示された（表２）。
【０２３２】
（実施例６）
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
標準的な手順を使用して、ハイブリドーマ上清から抗体を精製した。精製抗体を、ＥＬＩＳＡを使用して、ＲＡＧＥの可溶性形態への結合について評価した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、１００ｕｌの組換えヒトＲＡＧＥ−Ｆｃまたは組換えヒトＲＡＧＥ  Ｖ領域Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベーションした。洗浄および１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでのブロッキング後、１００ｕｌのサンプル（サンプルは以下のいくつかの形態であった：表示の希釈免疫血清、ハイブリドーマ上清、または精製抗体）を添加し、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、結合した抗ＲＡＧＥ抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＩｇＧ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して検出し、その後、基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションした。分光光度計にて４５０ｎｍの吸光度を決定した。モノクローナル抗体の濃度を、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して決定し、精製したアイソタイプ適合マウスＩｇＧによって検量線を作成した。７つのマウス抗体ＸＴ−Ｈ１〜ＸＴ−Ｈ７および７つのラット抗体ＸＴ−Ｍ１〜ＸＴ−Ｍ７がｈＲＡＧＥ−Ｆｃ、ｈＲＡＧＥ  Ｖ領域Ｆｃ、ｍＲＡＧＥ−Ｆｃ、およびｍＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐに結合する能力についてのＥＬＩＳＡの結果を、表２にまとめている。図２および３に示すように、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ２は共に、ヒトＲＡＧＥ−ＦｃおよびｈＲＡＧＥのＶドメインに結合する。ヒトＲＡＧＥおよびヒトＲＡＧＥ  ＶドメインへのＸＴ−Ｍ４の結合についてのＥＣ５０値は、それぞれ、３００ｐＭおよび１００ｐＭであった。ヒトＲＡＧＥおよびヒトＲＡＧＥ  ＶドメインへのＸＴ−Ｈ２の結合についてのＥＣ５０は、それぞれ、９０ｐＭおよび１００ｐＭであった。
【０２３３】
【表２】
2009529920.tif 000005
（実施例７）
ＲＡＧＥリガンドおよび抗体のＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ＲＡＧＥ  モノクローナル抗体がＲＡＧＥへのＲＡＧＥリガンド（ＨＭＧＢ１；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の結合に影響を及ぼすかどうかを決定するために、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのＨＭＧＢ１にて４℃一晩コーティングした。上記のようにウェルを洗浄およびブロッキングし、１００μｌのプレインキュベーションしたＲＡＧＥ−ＦｃまたはＴｒｋＢ−Ｆｃの混合物（非特異的Ｆｃコントロール）および０．１μｇ／ｍｌの表示の抗体調製物の種々の形態（免疫血清の希釈物、ハイブリドーマ上清、または精製抗体）に室温で１時間曝露した。プレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、リガンド結合組換えヒトＲＡＧＥ−Ｆｃを、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して検出し、その後、基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）とインキュベーションした。いかなる抗体も使用しないか、希釈免疫前血清を使用したリガンドへの組換えヒトＲＡＧＥ−Ｆｃの結合をコントロールとして使用し、これを１００％結合と定義した。競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、７つのマウス抗体ＸＴ−Ｈ１〜ＸＴ−Ｈ７および７つのラット抗体ＸＴ−Ｍ１〜ＸＴ−Ｍ７がｈＲＡＧＥ−ＦｃへのＨＭＧＢ１の結合を遮断する能力を、表３に示す。表３は、類似の競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、マウス抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、およびＸＴ−Ｈ５がｈＲＡＧＥの異なるリガンド（アミロイドβ１−４２ペプチド）のＲＡＧＥへの結合を遮断する能力ならびにラット抗体ＸＴ−Ｍ１〜ＸＴ−Ｍ７がマウスＲＡＧＥ−ＦｃへのＨＭＧＢ１の結合を遮断する能力をもまとめている。図４に示すように、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ２が共にヒトＲＡＧＥへのＨＭＧＢ１の結合を遮断する。
【０２３４】
【表３】
2009529920.tif 000006
類似の競合アプローチを使用して、抗体対間の相対的結合エピトープを決定した。第１に、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＲＡＧＥ−Ｆｃで９６ウェルプレートを４℃で一晩コーティングした。洗浄およびブロッキング後（上記を参照のこと）、ウェルを、１００μｌのビオチン化標的抗体と競合抗体の希釈物とのプレインキュベーション混合物に室温で１時間曝露した。結合したビオチン化抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。類似の競合アプローチを使用して、抗体対間の相対結合エピトープを決定した。第１に、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＲＡＧＥ−Ｆｃで９６ウェルプレートを４℃で一晩コーティングした。洗浄およびブロッキング後（上記を参照のこと）、ウェルを、１００μｌのビオチン化標的抗体と競合抗体の希釈物とのプレインキュベーション混合物に室温で１時間曝露した。結合したビオチン化抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して検出し、その後に基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションした。いかなる競合抗体も含まない組換えヒトＲＡＧＥ−Ｆｃへのビオチン化抗体の結合をコントロールとして使用し、これを１００％結合と定義した。ｈＲＡＧＥへの結合についてのラット抗体とマウス抗体との間の競合を分析した競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を、表３に示す。図５は、ｈＲＡＧＥへの結合についてのラットＸＴ−Ｍ４と抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｍ２、ＸＴ−Ｍ４、ＸＴ−Ｍ６、およびＸＴ−Ｍ７との間の競合を分析した競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ由来のデータのグラフを示す。図５に示す競合ＥＬＩＳＡ結合データは、ＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２がヒトＲＡＧＥ上の重複部位に結合するを証明している。
【０２３５】
（実施例８）
ヒトおよびマウスＲＡＧＥ−Ｆｃへのマウスおよびラット抗ＲＡＧＥ抗体の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイ結合アッセイ
Ａ．ヒトおよびマウスＲＡＧＥへの結合
ヒトおよびマウスＲＡＧＥおよびヒトおよびマウスＲＡＧＥのＶドメインへの選択されたマウスおよびラット抗ＲＡＧＥ抗体の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイによって分析した。標準的なアミンカップリングを使用して高密度（２０００ＲＵ）でＣＭ５チップ上にコーティングしたヒトまたはマウスＲＡＧＥ−Ｆｃを使用してアッセイを行った。２つの濃度（５０ｎｍおよび１００ｎｍ）の抗ＲＡＧＥ抗体溶液を、固定ＲＡＧＥ−Ｆｃタンパク質に二連で流した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）テクノロジーは、固定化ＲＡＧＥ抗原へのＲＡＧＥ抗体の結合の際の表層の屈折率の変化を利用する。表面から屈折したレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって結合を検出する。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）直接結合アッセイの結果を、表４にまとめる。
【０２３６】
【表４】
2009529920.tif 000007
ヒトおよびマウスＲＡＧＥへのマウスおよびラット抗ＲＡＧＥ抗体の結合についての運動速度定数（ｋａおよびｋｄ）ならびに結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）直接結合アッセイによって決定した。オンレートおよびオフレートについてのシグナル運動速度データの分析により、非特異的相互作用と特異的相互作用とを識別可能である。ｈＲＡＧＥ−ＦｃへのマウスＸＴ−Ｈ２抗体およびラットＸＴ−Ｍ４抗体の結合についてのＢＩＡＣＯＲＥ（商標）直接結合アッセイによって決定された運動速度定数および平衡定数を、表５に示す。
【０２３７】
【表５】
2009529920.tif 000008
Ｂ．ヒトＲＡＧＥ  Ｖドメインへの結合
ヒトＲＡＧＥ  Ｖドメインへのマウスおよびラット抗ＲＡＧＥ抗体の結合についての運動速度定数ならびに結合定数および解離定数も、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）直接結合アッセイによって決定した。ヒトＲＡＧＥ  Ｖドメイン−Ｆｃを、ＣＭ５チップ上にコーティングした抗ヒトＦｃ抗体によって捕捉し、固定化ｈＲＡＧＥ  Ｖドメイン−Ｆｃへのマウスおよびラット抗ＲＡＧＥ抗体の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）直接結合アッセイを、全長ＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合のアッセイについて上記のように行った。
【０２３８】
（実施例９）
抗ＲＡＧＥ抗体可変領域のアミノ酸配列
マウス抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、およびＸＴ−Ｈ７ならびにラット抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４の軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列クローニングおよび配列決定し、可変領域のアミノ酸配列を決定した。これらの６つの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを図６に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを図７に示す。
【０２３９】
（実施例１０）
ＲＡＧＥをコードするウサギ、ヒヒ、およびカニクイザルのｃＤＮＡ配列の単離
ＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡ配列を単離し、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用してクローニングした。製造者のプロトコールにしたがってＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、肺組織からＲＮＡを抽出し、精製した。ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および製造者のプロトコールを使用して、ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成した。カニクイザル（マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））およびヒヒ（パピオ・シアノセファルス（Ｐａｐｉｏ  ｃｙａｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ））のＲＡＧＥ配列を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）、プロトコール、およびＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶ  制限部位を付加したオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧ（配列番号５９）および５’−ＧＧＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣ）（配列番号６０）を使用してｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅産物を、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、プラスミドｐＡｄｏｒｉ１−３中の対応する部位にクローニングした。ウサギＲＡＧＥを、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ部位を付加したオリゴヌクレオチド：５’−ＡＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡ（配列番号６１）および５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＴＣＴＣ（配列番号６２）を使用した上記のＲＴ−ＰＣＲを使用してクローニングし、ｐＡｄｏｒｉ１−３中の対応する部位にクローニングした。ヒヒＲＡＧＥ、サルＲＡＧＥ、およびウサギＲＡＧＥの２つのイソ型をコードするクローニングしたｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定した。ヒヒＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列を図８に示し（配列番号６）、カニクイザルＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列を図９に示す（配列番号８）。ウサギＲＡＧＥの２つのイソ型をコードするヌクレオチド配列を図１０（配列番号１０）および図１１（配列番号１２）に示す。
【０２４０】
（実施例１１）
ヒヒＲＡＧＥをコードするゲノムＤＮＡ配列の単離
ＲＡＧＥをコードするヒヒゲノムＤＮＡ配列を、標準的なゲノムクローニング技術を使用して単離した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。λＤＡＳＨ  ＩＩベクター中のヒヒ（パピオ・シアノセファルス）λゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃ）を、３２ＰランダムプライミングヒトＲＡＧＥｃＤＮＡを使用してスクリーニングした。陽性ファージプラークを単離し、さらなる２ラウンドのスクリーニングに供して、単一単離物を得た。一般的な手順を使用してλＤＮＡを調製し、ＮｏｔＩで消化し、サイズ分画して、λゲノムアームからインサートＤＮＡを単離した。ＮｏｔＩフラグメントを、ＮｏｔＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋にライゲーションし、ＲＡＧＥ特異的プライマーを使用してインサートを配列決定した。得られたクローンを、クローン１８．２と命名した。ヒヒＲＡＧＥをコードするクローニングしたヒヒゲノムＤＮＡを、図１２Ａ〜１２Ｅに示す（配列番号１５）。
【０２４１】
（実施例１２）
キメラＸＴ−Ｍ４抗体
ヒトκ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖定常領域へのラット抗マウスＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のそれぞれの融合によってキメラＸＴ−Ｍ４を生成した。抗体の潜在的なＦｃ媒介エフェクター活性を減少させるために、キメラ変異体Ｌ２３４ＡおよびＧ２３７Ａを、ヒトヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域中のＸＴ−Ｍ４に導入した。キメラ抗体は、所与の分子メンバーＸＴ−Ｍ４−Ａ−１である。キメラＸＴ−Ｍ４抗体は、９３．８３％のヒトアミノ酸配列および６．１８％のラットアミノ酸配列を含む。
【０２４２】
（実施例１３）
ＲＡＧＥへのキメラＸＴ−Ｍ４結合の評価
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４および選択したラットおよびマウス抗ＲＡＧＥ抗体がヒトＲＡＧＥおよび他の種のＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥリガンドの結合を遮断する能力を、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイによって測定した。
Ａ．ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイによって測定した可溶性ヒトＲＡＧＥへの結合
可溶性ヒトＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）へのキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４、親ラット抗体ＸＴ−Ｍ４、ならびにマウス抗体ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｈ５の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）捕捉結合アッセイによって測定した。ＣＭ５  ＢＩＡチップ上の抗体の５０００−７０００ＲＵでのコーティングによってアッセイを行った。１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、１．５６ｎＭ、および０ｎＭの濃度の精製した可溶性ヒトストレプトアビジンタグ化ＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）を固定化抗体に三連で流し、ｈＲＡＧＥ−ＳＡへの結合についての運動速度定数（ｋａおよびｋｄ）ならびに結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を決定した。結果を、表６に示す。
【０２４３】
【表６】
2009529920.tif 000009
ＸＴ−Ｍ４抗体およびキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４は、類似の速度で単量体可溶性ヒトＲＡＧＥに結合する。ヒト可溶性単量体ＲＡＧＥに対するキメラＸＴ−Ｍ４の親和性は約５．５ｎＭである。
Ｂ．ＲＡＧＥリガンド競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４抗体およびラット抗体ＸＴ−Ｍ４がｈＲＡＧＥ−ＦｃへのＲＡＧＥリガンドであるＨＭＧＢ１、アミロイドβ１−４２ペプチド、Ｓ１００−Ａ、およびＳ１００−Ｂの結合を遮断する能力を、実施例７に記載のリガンド競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した。図１３に示すように、キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｍ４は、ヒトＲＡＧＥへのＨＭＧＢ１、アミロイドβ１−４２ペプチド、Ｓ１００−Ａ、およびＳ１００−Ｂの結合遮断する能力がほぼ同一である。
Ｃ．抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ  
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４抗体がラット抗体ＸＴ−Ｍ４およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ２とｈＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合を競合する能力を、実施例７に記載の様式でのビオチン結合ＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２抗体を使用した抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した。図１４に示すように、キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４は、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ２とｈＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合を競合する。
【０２４４】
（実施例１４）
異なる種のＲＡＧＥへの抗体結合を細胞ベースのＥＬＩＳＡによって決定した
細胞トランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０ｃｍ２の組織培養プレートあたり５×１０６細胞でプレートし、３７℃で一晩培養した。翌日、製造者のプロトコールを使用し、４：１の試薬：プラスミドＤＮＡ比でＬＦ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して、ＲＡＧＥ発現プラスミド（マウス、ヒト、ヒヒ、カニクイザル、またはウサギのＲＡＧＥをコードするｐＡｄｏｒｉ１−３ベクター）で細胞をトランスフェクションした。トリプシンを使用してトランスフェクション４８時間後に細胞を採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで、血清を含まない成長培地中に２×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。
【０２４５】
細胞ベースのＥＬＩＳＡ  
１μｇ／ｍｌの一次抗体を、９６ウェルプレート中で１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で２倍または３倍に連続希釈した。２×１０６細胞のＲＡＧＥトランスフェクション２９３細胞またはコントロール胎盤２９３細胞（５０μｌ）を含む無血清成長培地を、Ｕ底９６ウェルプレートに最終濃度１×１０５細胞／ウェルで添加した。細胞を、１６００ｒｐｍで２分間遠心分離した。一度揺らす手作業によって上清を穏やかに破棄し、プレートを穏やかにパッティングして細胞ペレットをほぐした。希釈した一次抗ＲＡＧＥ抗体またはアイソタイプ適合コントロール抗体（１００μｌ）を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有冷ＰＢＳを細胞に添加し、氷上で１時間インキュベーションした。細胞を、１００μｌの希釈した二次抗ＩｇＧ抗体ＨＲＰ抱合体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にて氷上で１時間染色した。一次抗体および二次抗体の各インキュベーション工程後、細胞を、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌの基質ＴＭＢ１成分（ＢＩＯ  ＦＸ，ＴＭＢＷ−０１００−０１）をプレートに添加し、室温で５〜３０分間インキュベーションした。１００μｌの０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって発色を停止させた。細胞を遠心分離し、上清を新たなプレートに移し、４５０ｎｍで読み取った（Ｓｏｆｔ  ＭＡＸ  ｐｒｏ  ４．０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）。
【０２４６】
細胞ベースのＥＬＩＳＡによって決定した、抗体キメラＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｍ４がヒトおよびヒヒＲＡＧＥに結合する能力を図１４に示す。細胞ベースのＥＬＩＳＡによって決定した、２９３細胞によって発現された細胞表面ヒト、ヒヒ、サル、マウス、およびウサギＲＡＧＥへのキメラ抗体  ＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｍ４の結合についてのＥＣ５０値を表７に示す。
【０２４７】
【表７】
2009529920.tif 000010
（実施例１５）
免疫組織化学染色によって決定した異なる種のＲＡＧＥへの結合
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４、ラットＸＴ−Ｍ４抗体、およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、およびＸＴ−Ｈ５がヒト、カニクイザル、ヒヒ、およびウサギの肺組織中の内因性細胞表面ＲＡＧＥに結合する能力を、肺組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって決定した。
【０２４８】
安定にトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、マウスおよびヒトＲＡＧＥ全長タンパク質を発現するように操作した。マウスおよびヒトＲＡＧＥのｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、線状化し、リポフェクチンを使用してＣＨＯにトランスフェクションした（方法（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７−６６；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１；Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２２：２３６）。２０ｎＭメトトレキサート中で細胞をさらに選択し、細胞抽出物を各クローンから採取し、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティングによって分析して、発現を確認した。
【０２４９】
ヒヒ、カニクイザル、ウサギから単離したＲＡＧＥ肺組織、またはヒトＲＡＧＥを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞、またはコントロールＣＨＯ細胞の免疫組織化学を、標準的な技術を使用して行った。１〜１５ｍｇのＲＡＧＥ抗体およびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール、またはマウスアイソタイプコントロールを使用した。キメラＸＴ−Ｍ４、ＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１０、ＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１１、ＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１４をビオチン化し、０．２、１、５および１０μｇ／ｍｌのＳｉｇｍａ  ＩｇＧ１ビオチン化コントロール抗体を使用した。ＨＲＰおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８またはＦＩＴＣと抱合した抗ビオチンでの検出後、切片を、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）でも染色した。
【０２５０】
図１５は、キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４がカニクイザル、ウサギ、およびヒヒの肺組織中でＲＡＧＥに結合することを示す。陽性ＩＨＣ染色パターンは、ＲＡＧＥ産生細胞をキメラＸＴ−Ｍ４と接触させたサンプル中で視覚可能であるが、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ結合抗体のいずれかが存在しないサンプル中で視覚可能でない。図１６は、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４が正常なヒト肺および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を罹患したヒトの肺中でＲＡＧＥに結合することを示す。肺組織切片のＩＨＣ染色によって決定した、敗血症ヒヒの肺および正常なカニクイザル肺中の内因性細胞表面ＲＡＧＥへのラットＸＴ−Ｍ４抗体ならびにマウス抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、およびＸＴ−Ｈ５の結合を、表８にまとめている。ｈＲＡＧＥをコードするＤＮＡを発現する発現ベクターで安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、ポジティブコントロールとして使用する。
【０２５１】
【表８】
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（実施例１６）
マウス抗ヒトＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ２のヒト化のための分子モデリング
マウス抗ヒトＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ２のＨＶドメインの分子モデリング
マウスＸＴ−Ｈ２重鎖のモデリングのための抗体構造テンプレートを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）配列データベースに対するＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて選択した。マウスＸＴ−Ｈ２の分子モデルを、Ｉｎｓｉｇｈｔｉｌのホモロジーモジュール（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、６つのテンプレート構造（１ＳＹ６（抗ＣＤ３抗体）、１ＭＲＦ（抗ＲＮＡ抗体）、および１ＲＩＨ（抗腫瘍抗体））に基づいて構築した。テンプレートの構造保存領域（ＳＣＲ）を、各分子のＣα距離行列に基づいて決定し、テンプレート構造を、ＳＣＲ中の対応する原子の最小ＲＭＳ偏差に基づいて重ね合わせた。標的タンパク質であるラットＸＴ−Ｈ２  ＶＨの配列を、重ね合わせたテンプレートタンパク質配列と整列させ、ＳＣＲの原子座標を、標的タンパク質の対応する残基に割り当てた。各ＳＣＲ中の標的とテンプレートとの間の配列類似度に基づいて、異なるテンプレート由来の座標を異なるＳＣＲに使用した。ＳＣＲ中に含まれないループおよび可変領域の座標を、ホモロジーモジュールで実行したＳｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐ法またはＧｅｎｅｒａｔｅ  Ｌｏｏｐ法によって作成した。
【０２５２】
簡潔に述べれば、Ｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐ法は、隣接するＳＣＲ残基のＣα距離行列を同数の隣接残基および所与の長さの介在ペプチドセグメントを有するタンパク質構造由来の予め計算した行列と比較することによって、２つのＳＣＲ間の領域を模倣するタンパク質構造をスキャンする。Ｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐ法の出力を評価して、隣接ＳＣＲ残基中の最小ＲＭＳ偏差および最大配列同一性を有するマッチを最初に見出した。次いで、潜在的マッチと標的ループ配列との間の配列類似性の評価に着手した。Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｌｏｏｐ法は原子座標をｄｅ  ｎｏｖｏで作成し、この座標はＳｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐで最適なマッチが見出されなかった場合に使用される。アミノ酸残基がテンプレートおよび標的と同一であった場合、アミノ酸側鎖の高次構造はテンプレート中の高次構造との同一性を保持した。しかし、回転異性体の高次構造検索を行い、テンプレートおよび標的中の残基と同一でない残基についてエネルギー的に最も好ましい高次構造が保持されていた。その座標を異なるテンプレートに適合した２つの隣接するＳＣＲ間のスプライスジャンクションおよびＳＣＲとループとの間のスプライスジャンクションを至適化するために、ホモロジーモジュールのＳｐｌｉｃｅ  Ｒｅｐａｉｒ機能を使用した。Ｓｐｌｉｃｅ  Ｒｅｐａｉｒは、分子力学のシミュレーションを、２ＳＣＲ間またはＳＣＲと可変領域との間のジャンクションにおける至適な結合長および結合角を導くように設定する。最後に、５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または５００サイクルの最大微分（ｍａｘｉｍｕｍ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）まで最急降下アルゴリズムを使用し、５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または２０００サイクルの最大微分まで共役勾配アルゴリズムを使用して、モデルをエネルギー最小化に供した。モデルの質を、ホモロジーモジュールのＰｒｏＳｔａｔ／Ｓｔｒｕｃｔ＿Ｃｈｅｃｋユーティリティを使用して評価した。
【０２５３】
ヒト化抗ＲＡＧＥ  ＸＴ−Ｈ２  ＨＶドメインの分子モデリング
ヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗ＲＡＧＥ抗体  ＸＴ−Ｈ２重鎖の分子モデリングを、使用テンプレートが異なることを除き、マウスＸＴ  Ｈ２抗体重鎖のモデリングに記載の手順に従って、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩを使用して構築した。この場合に使用した構造テンプレートは、１Ｌ７Ｉ（抗Ｅｒｂ  Ｂ２抗体）、１ＦＧＶ（抗ＣＤ１８抗体）、１ＪＰＳ（抗組織因子抗体）、および１Ｎ８Ｚ（抗Ｈｅｒ２抗体）であった。
【０２５４】
フレームワーク逆変異−ヒト化のモデル分析および予想
親マウス抗体モデルを、１つまたは複数の以下の特徴の類似点および相違点に関して、ＣＤＲグラフト化ヒト化バージョンモデルと比較した：ＣＤＲ−フレームワーク接触、ＣＤＲの高次構造に影響を及ぼす潜在的な水素結合、ならびにフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４、および３ＣＤＲなどの種々の領域におけるＲＭＳ偏差。
【０２５５】
単独または組み合わせた以下の逆変異は、ＣＤＲグラフティングによる首尾のよいヒト化に重要であると予想された：Ｅ４６Ｙ、Ｒ７２Ａ、Ｎ７７Ｓ、Ｎ７４Ｋ、Ｒ６７Ｋ、Ｋ７６Ｓ、Ａ２３Ｋ、Ｆ６８Ａ、Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ。
【０２５６】
（実施例１７）
ラット抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４のヒト化のための分子モデリング
ラット抗マウスＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４のＨＶドメインの分子モデリング
ラットＸＴ−Ｍ４重鎖のモデリングのための抗体構造テンプレートを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）配列データベースに対するＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて選択した。ラットＸＴ−Ｍ４の分子モデルを、Ｉｎｓｉｇｈｔｉｌのホモロジーモジュール（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、６つのテンプレート構造（１ＱＫＺ（抗ペプチド抗体）、１ＩＧＴ（抗イヌリンパ腫モノクローナル抗体）、８ＦＡＢ（抗ｐ−アゾフェニルアルソナート抗体）、１ＭＱＫ（抗シトクロムＣオキシダーゼ抗体）、１Ｈ０Ｄ（抗アンギオジェニン抗体）、および１ＭＨＰ（抗α１β１抗体））に基づいて構築した。テンプレートの構造保存領域（ＳＣＲ）を、各分子のＣα距離行列に基づいて決定し、テンプレート構造を、ＳＣＲ中の対応する原子の最小ＲＭＳ偏差に基づいて重ね合わせた。標的タンパク質であるラットラットＸＴ−Ｍ４  ＶＨの配列を、重ね合わせたテンプレートタンパク質配列と整列させ、ＳＣＲの原子座標を、標的タンパク質の対応する残基に割り当てた。各ＳＣＲ中の標的とテンプレートとの間の配列類似度に基づいて、異なるテンプレート由来の座標を異なるＳＣＲに使用した。ＳＣＲ中に含まれないループおよび可変領域の座標を、ホモロジーモジュールで実行したＳｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐ法またはＧｅｎｅｒａｔｅ  Ｌｏｏｐ法によって作成した。
【０２５７】
簡潔に述べれば、Ｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐ法は、隣接するＳＣＲ残基のＣα距離行列を同数の隣接残基および所与の長さの介在ペプチドセグメントを有するタンパク質構造由来の予め計算した行列と比較することによって、２つのＳＣＲ間の領域を模倣するタンパク質構造をスキャンする。Ｓｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐ法の出力を評価して、隣接ＳＣＲ残基中の最小ＲＭＳ偏差および最大配列同一性を有するマッチを最初に見出した。次いで、潜在的マッチと標的ループ配列との間の配列類似性の評価に着手した。Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｌｏｏｐ法は原子座標をｄｅ  ｎｏｖｏで作成し、この座標はＳｅａｒｃｈ  Ｌｏｏｐで最適なマッチが見出されなかった場合に使用される。アミノ酸残基がテンプレートおよび標的と同一であった場合、アミノ酸側鎖の高次構造はテンプレート中の高次構造との同一性を保持した。しかし、回転異性体の高次構造検索を行い、テンプレートおよび標的中の残基と同一でない残基についてエネルギー的に最も好ましい高次構造が保持されていた。その座標を異なるテンプレートに適合した２つの隣接するＳＣＲ間のスプライスジャンクションおよびＳＣＲとループとの間のスプライスジャンクションを至適化するために、ホモロジーモジュールのＳｐｌｉｃｅ  Ｒｅｐａｉｒ機能を使用した。Ｓｐｌｉｃｅ  Ｒｅｐａｉｒは、分子力学のシミュレーションを、２ＳＣＲ間またはＳＣＲと可変領域との間のジャンクションにおける至適な結合長および結合角を導くように設定する。最後に、５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または５００サイクルの最大微分（ｍａｘｉｍｕｍ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）まで最急降下アルゴリズムを使用し、５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または２０００サイクルの最大微分まで共役勾配アルゴリズムを使用して、モデルをエネルギー最小化に供した。モデルの質を、ホモロジーモジュールのＰｒｏＳｔａｔ／Ｓｔｒｕｃｔ＿Ｃｈｅｃｋユーティリティを使用して評価した。
【０２５８】
ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変ドメイン
ＸＴ  Ｍ４軽鎖可変ドメインの構造モデルを、テンプレートとして１Ｋ６Ｑ（抗組織因子抗体）、１ＷＴＬ、１Ｄ５Ｂ（抗体ＡＺ−２８）、および１ＢＯＧ（抗ｐ２４抗体）を使用して、Ｍｏｄｅｌｅｒ  ８ｖ２によって作成した。各標的について、１００個の初期モデルのうち、分子確率密度関数によって定義された最低の制約妨害（ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  ｖｉｏｌａｔｉｏｎ）を有する１つのモデルをさらなる至適化のために選択した。モデル至適化のために、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  １．６（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）で実行されるＣｈａｒｍｍ２７力場（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）およびＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ  ｉｍｐｌｉｃｉｔ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎを使用してＲＭＳ勾配０．０１が満たされるまで、最急降下法、共役勾配法、およびニュートン・ラフソン法（Ａｄｏｐｔｅｄ  Ｂａｓｉｓ  Ｎｅｗｔｏｎ  Ｒａｐｈｓｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）からなるエネルギー最小化カスケードを行った。エネルギー最小化中に、１０  ｍａｓｓ  ｆｏｒｃｅの調和制約（ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を使用して骨格原子の移動を制限した。
【０２５９】
ヒト化抗ＲＡＧＥ  ＸＴ−Ｍ４のＶＨドメインの分子モデリング
ヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗ＲＡＧＥ  ＸＴ  Ｍ４抗体重鎖の分子モデリングを、使用テンプレートが異なることを除き、ラットＸＴ  Ｍ４抗体重鎖のモデリングに記載の手順に従って、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩを使用して構築した。この場合に使用した構造テンプレートは、１ＭＨＰ（抗α１β１抗体）、１ＩＧＴ（抗イヌリンパ腫モノクローナル抗体）、８ＦＡＢ（抗ｐ−アゾフェニルアルソナート抗体）、１ＭＱＫ（抗シトクロムＣオキシダーゼ抗体）、および１ＨＯＤ（抗アンギオジェニン抗体）であった。
【０２６０】
ヒト化ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変ドメイン
ヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗ＲＡＧＥ  ＸＴ  Ｍ４抗体軽鎖の分子モデルを、使用テンプレートが異なることを除き、ラットＸＴ  Ｍ４抗体軽鎖のモデリングに記載の手順に従って、Ｍｏｄｅｌｅｒ  ８ｖ２を使用して構築した。この場合に使用した構造テンプレートは、テンプレートとしての１Ｂ６Ｄ、１ＦＧＶ（抗ＣＤ１８抗体）、１ＵＪ３（抗組織因子抗体）、および１ＷＴＬであった。
【０２６１】
フレームワーク逆変異−ヒト化のモデル分析および予想
親ラット抗体モデルを、１つまたは複数の以下の特徴の類似点および相違点に関して、ＣＤＲグラフト化ヒト化バージョンモデルと比較した：ＣＤＲ−フレームワーク接触、ＣＤＲの高次構造に影響を及ぼす潜在的な水素結合、およびフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４、および３ＣＤＲなどの種々の領域におけるＲＭＳ偏差、および残基−残基相互作用のエネルギーの計算値。同定された潜在的な逆変異を、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩまたはＭｏｄｅｌｅｒ  ８ｖ２のいずれかを使用した別ラウンドのモデルに単独または組み合わせて組み込み、変異体モデルを親ラット抗体モデルと比較して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの変異体の安定性を評価した。
【０２６２】
単独または組み合わせた以下の逆変異は、ＣＤＲグラフティングによる首尾のよいヒト化に重要であると予想された。
重鎖：Ｌ１１４Ｍ、Ｔ１１３Ｖ、およびＡ８８Ｓ；
軽鎖：Ｋ４５Ｒ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｍ、Ｄ７０Ｉ、Ｇ６６Ｒ、Ｔ８５Ｄ、Ｙ８７Ｈ、Ｔ６９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ７１Ｙ。
【０２６３】
（実施例１８）
マウスＸＴ−Ｈ２抗体およびラットＸＴ−Ｍ４抗体のＣＤＲを有するヒト化可変領域
ヒト化重鎖可変領域を、表９に示すヒト生殖系列フレームワーク配列へのマウスＸＴ−Ｈ２抗体およびラットＸＴ−Ｍ４抗体のＣＤＲのグラフト化ならびに選択した逆変異の導入によって調製した。
【０２６４】
【表９】
2009529920.tif 000012
ヒト化マウスＸＴ−Ｈ２重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、図１７（配列番号２８〜３１）および図１８（配列番号３２〜３５）にそれぞれ示す。
【０２６５】
ヒト化ラットＸＴ−Ｍ４重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、図１９（配列番号３６〜３８）および図２０Ａ〜２０Ｂ（配列番号３９〜４９）にそれぞれ示す。
【０２６６】
フレームワーク配列が由来する生殖系列配列およびヒト化可変領域中の特異的逆変異を、表１０で確認する。
【０２６７】
標準的手順を使用して、ヒト化可変領域をコードするＤＮＡ配列ヒト免疫グロブリン定常領域をコードする配列を含む発現ベクターにサブクローニングし、全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列をＣＯＳ細胞中で発現させた。重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ｐＳＭＥＤ２ｈＩｇＧ１ｍ＿（Ｌ２３４、Ｌ２３７）ｃＤＮＡベクターにサブクローニングして、ヒト化ＩｇＧ１抗体重鎖を産生した。軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ｐＳＭＥＮ２ｈκベクターにサブクローニングして、ヒト化κ抗体軽鎖を産生した。図２１を参照のこと。
【０２６８】
【表１０】
2009529920.tif 000013
（実施例１９）
競合ＥＬＩＳＡプロトコール
ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃへのヒト化ＸＴ−Ｈ２抗体およびＸＴ−Ｍ４抗体ならびにキメラＸＴ−Ｍ４の結合を、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって特徴づけた。競合物を生成するために、親ラットＸＴ−Ｍ４抗体をビオチン化した。ＥＬＩＳＡプレートを、１ｕｇ／ｍｌヒトＲＡＧＥ−Ｆｃで一晩コーティングした。種々の濃度のビオチン化ＸＴ−Ｍ４をウェルに二連で添加し（０．１１〜２５０ｎｇ／ｍｌ）、インキュベーションし、洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。ビオチン化親ラットＸＴ−Ｍ４のＥＤ５０計算値は、５ｎｇ／ｍｌであった。１２．５ｎｇ／ｍｌビオチン化親ＸＴ−Ｍ４抗体と競合する場合、キメラおよび各ヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体のＩＣ５０を計算した。簡潔に述べれば、プレートを、１ｕｇ／ｍｌヒトＲＡＧＥ−Ｆｃで一晩コーティングした。１２．５ｎｇ／ｍｌビオチン化親ラットＸＴ−Ｍ４と混合した種々の濃度のキメラ抗体またはヒト化抗体を、ウェルに二連で添加した（９ｎｇ／ｍｌ〜２０ｕｇ／ｍｌの範囲）。ビオチン化親ラットＸＴ−Ｍ４抗体をストレプトアビジン−ＨＲＰで検出し、ＩＣ５０値を計算した。競合ＥＬＩＳＡ分析によってヒト化抗体について決定したＩＣ５０値を、表１１に示す。
【０２６９】
【表１１】
2009529920.tif 000014
ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃへのヒト化ＸＴ−Ｈ２抗体結合についてのＥＤ５０値を、競合ＥＬＩＳＡによって同様に決定し、図２２に示す。
【０２７０】
（実施例２０）
他の細胞表面受容体へのキメラおよびヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体の交差反応
ヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体であるＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１０およびＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１１を、キメラＸＴ−Ｍ４と共に、他のＲＡＧＥ様受容体との交差反応性について試験した。これらがＲＡＧＥのように細胞表面に発現し、リガンドとのその相互作用が同様に電荷に依存するので、これらの受容体を選択した。試験した受容体は、ｒｈＶＣＡＭ−１、ｒｈＩＣＡＭ−１−Ｆｃ、ｒｈＴＬＲ４（Ｃ末端Ｈｉｓタグ）、ｒｈＮＣＡＭ−１、ｒｈＢ７−Ｈ１−Ｆｃ  ｍＬｏｘ１−Ｆｃ、ｈＬｏｘ１−Ｆｃ、およびｈＲＡＧＥ−Ｆｃ（ポジティブコントロールとして）であった。ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌの列挙した受容体タンパク質で一晩コーティングした。種々の濃度の上記列挙のヒト化およびキメラＸＴ−Ｍ４抗体をウェルに二連で添加し（０．０３〜２０μｇ／ｍｌ）、インキュベーションし、洗浄し、抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰで検出した。表１２は、ヒトおよびマウス細胞表面タンパク質へのキメラおよびヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体の結合の直接結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。示したデータは、２０μｇ／ｍｌ（最も高い試験濃度）での受容体と抗体との間で検出された結合についてのＯＤ４５０値である。
【０２７１】
【表１２】
2009529920.tif 000015
（実施例２１）
可溶性ヒトＲＡＧＥへの結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイ
可溶性ヒトＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）および可溶性マウスＲＡＧＥ（ｍＲＡＧＥ−ＳＡ）へのキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４およびヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）捕捉結合アッセイによって測定した。フローセル１〜４中の５０００ＲＵでのＣＭ５  ＢＩＡチップ上の抗ヒトＦｃ抗体のコーティング（ｐＨ５．０、７分）によってアッセイを行った。各抗体を、フローセル２〜４（フローセル１は基準として使用した）中での２．０μｇ／ｍｌの抗Ｆｃ抗体のフローイングによって捕捉した。１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、および０ｎＭの濃度の精製可溶性ヒトストレプトアビジンタグ化ＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）の溶液を、固定化抗体に二連で流し、ｈＲＡＧＥ−ＳＡへの結合についての５分間の解離、運動速度定数（ｋａおよびｋｄ）、ならびに結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を決定した。ｈＲＡＧＥ−ＳＡおよびｍＲＡＧＥ−ＳＡへのキメラＸＴ−Ｍ４およびヒト化抗体ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１０、ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１１、およびＸＴ−Ｍ４−Ｖ１４の結合についての結果を、図２３および２４にそれぞれ示す。
【０２７２】
（実施例２２）
リード抗体ＸＴ−Ｈ２の種交差反応性（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の至適化
ＸＴ−Ｈ２抗体のランダム変異、タンパク質変異型ライブラリーの生成、およびマウス−ヒトＲＡＧＥ交差反応性が得られる変異を獲得した分子の選択的富化過程によって種交差反応性を操作する。リボゾームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２８：４０４−３０）およびファージディスプレイ（ＭｃＡｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−４）テクノロジーを使用する。
【０２７３】
抗体ＸＴ−Ｈ２およびＨＴ−Ｍ４に基づいたＳｃＦｖ抗体の調製
Ａ．ＸＴ−Ｈ２に基づいたＳｃＦｖ抗体
ＸＴ−Ｈ２のＶ領域を含む２つのＳｃＦｖ構築物を、ＤＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号５０）の可動性リンカーによって連結されたＶＨ／ＶＬ形式またはＶＬ／ＶＨ形式のいずれかで合成した。ＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬとして構成されたＳｃＦｖ構築物の配列を、図２５（配列番号５１）および図２６（配列番号５２）にそれぞれ示す。
Ｂ．ＸＴ−Ｍ４に基づいたＳｃＦｖ抗体
ＸＴ−Ｍ４のＶ領域を含む２つのＳｃＦｖ構築物を、ＤＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号５０）の可動性リンカーによって連結されたＶＨ／ＶＬ形式またはＶＬ／ＶＨ形式のいずれかで合成した。ＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬとして構成されたＳｃＦｖ構築物の配列を、図２７（配列番号５４）および図２８（配列番号５３）にそれぞれ示す。
【０２７４】
図２９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳したＭ４およびＨ２構築物を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ（５ｕｇ／ｍｌ）またはＢＳＡ（２００ｕｇ／ｍｌ）を含む重炭酸緩衝液にて４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄し、２％粉乳ＰＢＳにて室温で１時間ブロッキングした。プレートを、翻訳されたＳｃＦｖとｉｎ  ｖｉｔｒｏにて室温で２時間インキュベーションした。プレートをブロッキングし、抗Ｆｌａｇ抗体（１０００倍希釈）およびその後のウサギ抗マウスＨＲＰ（１０００倍希釈）で検出した。データは、ＶＨ／ＶＬ立体配置またはＶＬ／ＶＨ立体配置のいずれかのＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４抗ＲＡＧＥ抗体の可変領域のＳｃＦｖによってヒトＲＡＧＥに特異的に結合する機能的な折り畳まれたタンパク質を産生することができることを示す。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定した両形式のＳｃＦｖのＫｄの値を使用して、選択実験のための至適抗原濃度を決定する。
Ｃ．マウス／ヒトＲＡＧＥ架橋反応性が改良された変異体を回収するための選択およびスクリーニングストラテジー
変異型のライブラリーを、誤りがちなＰＣＲによって作製する（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−８０）。この変異誘発ストラテジーにより、ＳｃＦｖ遺伝子全体にランダム変異が導入される。次いで、ライブラリーを、確立された手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳する（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２８：４０４−３０）。このライブラリーを、ヒト−ＲＡＧＥ−Ｆｃに対する選択のラウンド１に供し、非結合リボゾーム複合体を洗い流し、抗原結合リボゾーム複合体を溶離する。ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡに変換し、マウスＲＡＧＥ−Ｆｃに対する選択のラウンド２に供する。この交互選択ストラテジーは、ヒトおよびマウスＲＡＧＥ−Ｆｃの両方に結合するクローンを優先的に富化する。次いで、この選択由来のアウトプットを、誤りがちなＰＣＲのラウンド２に供する。次いで、生成されたライブラリーを、ヒト−ＲＡＧＥ−ＦｃおよびマウスＲＡＧＥ−Ｆｃに対するラウンド３およびラウンド選択にそれぞれ供する。必要に応じて、この過程を繰り返す。各選択工程由来のＲＮＡのアウトプットプールをｃＤＮＡに変換し、タンパク質発現ベクターｐＷＲＩＬ−１にクローニングして、変異ＳｃＦｖの種交差反応性を評価する。多様なプールも配列決定して多様性を評価し、選択が種交差反応性を有する優性クローンに向かって移動するかどうかを決定する。
【０２７５】
（実施例２３）
リード抗体ＸＴ−Ｍ４の親和性成熟化
親和性の改良により、用量または投薬頻度の減少および／または効力の増加という潜在的利点が得られる。無作為な誤りがちなＰＣＲ変異誘発と組み合わせたＶＨ−ＣＤＲ３に対する標的指向化変異誘発過程の組み合わせを使用した親和性成熟化によって、ｈＲＡＧＥの親和性を改良する（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−８０）。これにより、マウスＲＡＧＥ−Ｆｃについての種交差反応性を保持しながらヒトＲＡＧＥに体する親和性が改良された分子が回収される抗体変異型ライブラリーが生成される。リボゾームディスプレイテクノロジー（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，ｓｕｐｒａ）およびファージディスプレイテクノロジー（ＭｃＡｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａ）を使用する。
【０２７６】
図３０は、大腸菌中で可溶性タンパク質として発現し、ヒトＲＡＧＥ−ＦｃおよびＢＳＡに対する結合について試験したＶＬ−ＶＨ形式のｐＷＲＩＬ−１中のＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２  ＳｃＦｖ構築物のＥＬＩＳＡ結合データを示す。ＡｃｔＲＩＩｂは、ネガティブコントロールとして同一のベクターから発現される非結合タンパク質に相当する。ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ（５ｕｇ／ｍｌ）またはＢＳＡ（２００ｕｇ／ｍｌ）を含む重炭酸緩衝液にて４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄し、２％粉乳ＰＢＳにて室温で１時間ブロッキングした。２０ｍｌ大腸菌培養物の周辺質調製物を、標準的手順を使用して作製した。非精製ＳｃＦｖ抗体の周辺質調製物の最終体積は１ｍｌであり、そのうちの５０ｕｌを、２％粉乳ＰＢＳを含む１０００倍希釈の抗Ｈｉｓ抗体と１００ｕｌの総体積にて室温で１時間プレインキュベーションした。架橋周辺質調製物をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温でさらに２時間インキュベーションした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎで２回およびＰＢＳで２回洗浄し、１０００倍希釈のウサギ抗マウスＨＲＰを含む２％粉乳ＰＢＳとインキュベーションした。プレートを上記のように洗浄し、標準的なＴＭＢ試薬を使用して検出した。データは、ＶＬ／ＶＨ立体配置のＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２抗体のＳｃＦｖ構築物が大腸菌中でヒトＲＡＧＥに特異的に結合する機能的な折り畳まれた可溶性タンパク質を産生することができることを示す。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定された両形式のＳｃＦｖの出発Ｋｄ値を使用して、親和性選択のための至適抗原濃度を決定する。
【０２７７】
（実施例２４）
種交差反応性を維持しながらｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する親和性が改良された変異型を回収するための選択およびスクリーニングストラテジー
ＰＣＲを使用したＸＴ−Ｍ４のＶＨ−ＣＤＲ３のスパイク化（ｓｐｉｋｅｄ）変異誘発によって変異型ライブラリーを作製する。図３１は、どのようにしてＰＣＲを使用してＸＴ−Ｍ４のＣＤＲにスパイク化変異を導入するのかを概略的に示す。（１）ＣＤＲ長にわたって多様性領域を保有するスパイク化オリゴヌクレオチドをデザインし、ＦＲ３およびＦＲ４中の標的Ｖ遺伝子と相同な領域を括弧で囲む。（２）オリゴヌクレオチドを、標的Ｖ遺伝子の５’末端にアニーリングし、ＦＲ１領域と相同な特異的プロモーターを使用したＰＣＲ反応で使用する。図３２は、ＸＴ−Ｍ４  ＶＬ−ＶＨ  ＳｃＦｖ構築物のＣ末端のヌクレオチド配列を示す（配列番号５６）。ＶＨ−ＣＤＲ３に下線を引いている。２つのスパイク化オリゴヌクレオチド（配列番号５７〜５８）も示し、各変異部位にこの部位での変異のために使用したスパイク化比（ｓｐｉｋｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）を識別する番号を付けた。数に対応するスパイク化比のヌクレオチド組成物も同定する。
【０２７８】
ＸＴ−Ｍ４−ＶＨＣＤＲ３スパイク化ＰＣＲ産物をＳｆｉ１フラグメントとしてリボゾームディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−３にクローニングして、ライブラリーを生成する。このライブラリーを、リボゾームディスプレイを使用したヒトビオチン化ＲＡＧＥに対する選択に供する（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．，２０００）。ビオチン標識抗原よってこの過程よりも速度支配が可能な溶液ベースの選択が可能であり、より親和性の高いクローンが優先的に富化される可能性が増大するので、ビオチン標識抗原を使用する。出発親和性と比較して抗原濃度が減少する平衡様式または経験的に決定した時間枠にわたる非標識抗原との競合の使用のために改良されたオフレートが特に選択される速度様式のいずれかで選択を行う。非結合リボゾーム複合体を洗い流し、抗原結合リボゾーム複合体を溶離し、ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡに変換し、ビオチン化マウス−ＲＡＧＥ−Ｆｃに対する選択の第２ラウンドを行い、種交差反応性を維持する。次いで、ＶＨ−ＣＤＲ３が変異したＳｃＦｖ変異型を含むこの選択工程由来のアウトプットを、変異誘発のサイクル２工程に供する。この変異誘発工程は、誤りがちなＰＣＲを使用したランダム変異の生成を含む。次いで、生成されたライブラリーを、１／１０の抗原濃度のビオチン化ヒト−ＲＡＧＥ−Ｆｃに対するラウンド３選択に供する。必要に応じて、この過程を繰り返す。各選択工程由来のＲＮＡのアウトプットプールをｃＤＮＡに変換し、タンパク質発現ベクターｐＷＲＩＬ−１にクローニングして、変異ＳｃＦｖの親和性および種交差反応性をランク付けする。多様なプールも配列決定して多様性を評価し、選択が優性クローンに向かって移動するかどうかを決定する。
【０２７９】
（実施例２５）
ファージディスプレイを使用したＸＴ−Ｍ４の親和性成熟化
ＶＨ−ＣＤＲ３スパイク化ライブラリーを、ビオチン化ｈＲＡＧＥ選択のための図３４に示すファージディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−１にクローニングする。この形式が溶液中の親和性駆動選択とより適合するので、ビオチン標識抗原を使用する。出発親和性と比較して抗原濃度が減少する平衡様式または経験的に決定した時間枠にわたる非標識抗原との競合の使用のために改良されたオフレートが特に選択される速度様式のいずれかで選択を行う。ファージディスプレイのための標準的な手順を使用する。
【０２８０】
ＳｃＦｖは二量体化し得るので、選択およびスクリーニング手順を複雑にする。二量体化ＳｃＦｖは、アビディティベースの結合を潜在的に示し、この結合活性の増加が選択を支配し得る。親和性の任意の固有の改良よりもむしろかかるＳｃＦｖが二量体化する能力の改良は、一般にＩｇＧである最終治療抗体にほとんど関与しない。二量体化能力の変化に起因する人為産物を回避するために、Ｆａｂ抗体形式は一般的に二量体化しないので、Ｆａｂ抗体形式を使用する。ＸＴ−Ｍ４をＦａｂ抗体として再フォーマットし、新規のファージディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−６にクローニングした。このベクターは、ＶＨ領域およびＶＬ領域の両方にわたる制限部位を有し、ヒト生殖系列Ｖ遺伝子中で頻繁に切断されない。これらの制限部位を、ＶＬおよびＶＨレパートリーのシャフリングおよび組み合わせアセンブリのために使用することができる。１つのストラテジーでは、図３４に示すようにＶＨ−ＣＤＲ３およびＶＬ−ＣＤＲ３スパイク化ライブラリーの両方をＦａｂディスプレイベクター中にアセンブリし、改良された親和性について選択する。
【０２８１】
（実施例２６）
キメラ抗体  ＸＴ−Ｍ４の物理的特徴づけ
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）／質量分析（ＭＳ）ペプチドマッピングおよびオンラインＭＳ検出を使用したサブユニット分析による予備特徴づけは、アミノ酸配列がキメラＸＴ−Ｍ４のＤＮＡ配列から予想されることを確認した。これらのＭＳデータは、予想されるＮ結合オリゴサッカリド配列コンセンサス部位がＡｓｎ２９９ＳｅｒＴｈｒを占め、２つの主な種が０または１つの末端ガラクトース残基をそれぞれ含む複雑なＮ結合二分岐コアフコシル化グリカンであることも示した。分子のＦｃ領域中に存在する予想されるＮ結合オリゴサッカリドに加えて、Ｎ結合オリゴサッカリドがキメラＸＴ−Ｍ４の重鎖のＣＤＲ２領域中の配列コンセンサス部位（Ａｓｎ５２ＡｓｎＳｅｒ）で認められた。主にたった１つの重鎖上に余分なＮ結合オリゴサッカリドが見出され、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって決定したところ、分子の約３８％を含む（一次構造によって識別することができない他の酸性種であり得、これは、総酸性種率に寄与し得る）。主な種は、２つのシアル酸を有するコアフコシル化二分岐構造である。吸収率を使用して、Ａ２８０の測定によって濃度を計算する。キメラＸＴ−Ｍ４の理論吸収率は、１．３５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１と算出された。
【０２８２】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したキメラＸＴ−Ｍ４の見かけ上の分子量は、約２００ｋＤａである。抗体は、その配列から予想されるよりもゆっくり移動する。この現象は、今日まで分析された全ての組換え抗体について認められている。還元条件下で、キメラＸＴ−Ｍ４は、約５０ｋＤａに移動する単一の重鎖バンドおよび約２５ｋＤａに移動する単一の軽鎖を有する。重鎖バンドのすぐ上を移動するさらなるバンドも存在する。このバンドは、自動化エドマン分解によって特徴づけられ、キメラＸＴ−Ｍ４の重鎖に相当するＮＨ２末端を有すると割り出された。これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって認められた分子量の増加と共に、さらなるバンドがＣＤＲ２領域中の余剰Ｎ結合オリゴサッカリドを有する重鎖と一致することを示す。
【０２８３】
アミノ酸配列（重鎖中のＣＯＯＨ末端Ｌｙｓを含まない）に基づいたキメラＸＴ−Ｍ４の推定等電点（ｐＩ）は７．２である。ＩＥＦにより、キメラＸＴ−Ｍ４は、約７．４〜８．３のｐＩ範囲内で移動する約１０個のバンドに分離され、約ｐＩ７．８に移動する主なバンドが存在する。キャピラリー等電点電気泳動によって決定されたｐＩは、約７．７であった。
【０２８４】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）による展開材料の分析により、分子電荷の異なるキメラＸＴ−Ｍ４種をさらに分析する。認められた不均一な電荷の大部分は、重鎖のＣＤＲ２領域中に存在するさらなるＮ結合オリゴサッカリド上で見出されるシアル酸に起因する可能性が最も高い。認められた小さい不均一な電荷は、ＣＯＯＨ末端リジンの不均一性に寄与し得る。
（実施例２７）
グリコシル化部位の除去
図３６に示すように、抗体ＸＴ−Ｍ４の重鎖可変領域中の５２位（Ｋａｂａｔナンバリングによる）でアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変換する変異により、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃへの直接結合のＥＬＩＳＡ分析によって決定したところ、ヒトＲＡＧＥへのＸＴ−Ｍ４抗体の結合が改良される。Ｎ５２Ｄ変異は、抗体ＸＴ−Ｍ４の重鎖可変領域のＣＤＲ２中に存在する。
（実施例２８）
敗血症およびリステリア症の治療
抗ＲＡＧＥ抗体は、複数菌による腹腔内敗血症の標準的マウスモデルで有意な治療上の利点が得られることを示した。結果は、野生型動物と比較したホモ接合性ＲＡＧＥノックアウトおよびヘテロ接合体で認められた顕著な生存上の利点によって証明されるように、ＲＡＧＥ発現がリステリア菌で全身攻撃誘発された動物に非常に有害であることも示した。
Ａ．材料と方法
他で言及しない限り、全ての試薬および化学物質を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ラットモノクローナル抗体ＸＴ−Ｍ４  ＩｇＧ（マウス二量体ＲＡＧＥに対する親和性定数０．３ｎＭ）を上に記載する。抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）モノクローナル抗体ＴＮ３．１９１２は、マウスＴＮＦへの結合親和性が高いハムスター由来の中和ＩｇＧ抗体である。リステリア菌の攻撃誘発株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＡＴＣＣ番号１９１１５，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。これらの実験で使用した全てのマウス系統は２〜６月齢であり、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙレベル２条件下で維持された特定の病原体を含まない動物であった。ＢＡＬＢ／ｃ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）野生型雄マウス、ホモ接合性ＲＡＧＥ−／−１２９ＳｖＥｖＢｒｄ雄マウス、ヘテロ接合性ＲＡＧＥ＋／−１２９ＳｖＥｖＢｒｄ雄マウス、および野生型１２９ＳｖＥｖＢｒｄ雄マウス（Ｗｙｅｔｈの研究所内で交配）。Ｃｒｅリコンビナーゼがエクソン２、３、および４を切り出す１２９ＳｖＥｖ−Ｂｒｄマウスにおける遺伝子ターゲティングされた条件ノックアウトとしてＷｙｅｔｈ  ＲｅｓｅａｒｃｈでＲＡＧＥノックアウトマウスをデザインした（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）。得られた欠失によってＲＡＧＥタンパク質のフレームシフトが短縮され、タンパク質は産生されない。ＲＡＧＥは、マウスの生存に不可欠ではない。ＲＡＧＥヌルマウスは、明確な表現型を持たず、正常に繁殖する。マウスを、ＣＬＰまたはＬ．モノサイトゲネス攻撃誘発から７日後までの生存について評価した。
【０２８５】
ＣＬＰおよびリステリア症実験後のマウス由来の剖検で得た臓器サンプルから定量微生物学を行った。血液サンプルを屠殺時に生存する動物から採取し、血清を回収し、その直後にサイトカイン決定のために氷上に置いた。血清サイトカインを、特注のプレートおよびＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって提供されたプロトコールを使用した酵素結合免疫吸着多重アッセイによって測定した。アッセイしたサイトカインは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、インターフェロンγ、およびＩＬ−６であった。組織サンプルを、肺、肝臓、および脾臓から回収した。５ｍｌの滅菌生理食塩水での腹膜腔の洗浄および流動物の引き抜きによって腹水を得た。臓器組織を秤量および粉砕して、組織のＴＳＢ懸濁液を生成した。検体を連続希釈し、ＴＳＢ（グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌用）およびＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（グラム陰性細菌用）にて３７℃で好気的に培養して、臓器重量１ｇあたりの定量的細菌数に標準化するか、１ｍｌの腹腔洗浄液あたりのＣＦＵに標準化した。
【０２８６】
動物組織（肺、遠位回腸）も、各動物の処置割り当てに対して盲検化した病理学者によって組織学的に分析し、０（正常）から４（拡散および拡大した組織の壊死）までに悪性度分類した定義の病理学スコアによってスコアリングした。肺浮腫液の基準としての総肺水分を、胚細胞の湿乾重量比から計算した。
【０２８７】
統計デザインおよびデータ分析。各実験における主なエンドポイントは生存であった。研究終了まで調査官を動物の遺伝子型または抗体治療（血清コントロールに対する）に対して盲検化した数字コードシステムを使用して、動物実験を行った。数値データを、平均（＋／−ＳＥＭ）として示す。生存の相違を、カプラン・マイヤー生存プロットおよびログランク統計法によって分析した。ノンパラメトリック一元配置分散分析（複数の群）またはマン・ホイットニーＵ検定（２群）を使用して、群間の相違を分析した。ダンの多重比較事後検定を利用して、複数の群を含む比較対象を分析する場合の相違を確認した。０．０５未満の両側Ｐ値を有意と見なした。
Ｂ．盲腸結紮および穿刺モデル  
ＣＬＰ手順は以前に詳述されている（Ｅｃｈｔｅｎａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：３７６２−６）。簡潔に述べれば、動物を、２００μｌのケタミン（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｃｏ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＯＨ）（９ｍｇ／ｍｌ）とキシラジン（Ｐｈｏｅｎｉｘ，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈｓ，ＭＯ）（１ｍｇ／ｍｌ）との混合物の腹腔内注射を使用して麻酔した。長さ約１ｃｍの正中線腹部切開によって盲腸を露出させた。次いで、盲腸を、５．０モノフィラメントを使用して、回盲部のすぐ遠位のレベルで結紮した（結紮した盲腸の９０％超）。２３ゲージのニードルを使用して、盲腸の前腸間膜側を完全に穿刺した。次いで、少量の管腔内容物を両穿刺部位から絞り出して、開通性を確保した。盲腸を腹腔に戻し、筋膜および皮膚切開を６．０モノフィラメントおよび外科用ステープルを使用してで閉じた。典型的な１％リドカインおよびバシトラシンを、術後に手術部位に適用した。手術直後に２０ｍｇ／ｋｇのトロバフロキサシン（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を全動物に適用し、１．０ｍｌの通常の生理食塩水の皮下注射によって標準的な急速輸液を行った。次いで、試験動物をその各ケージに戻し、正常な状態および移動性に回復するまでヒートランプを使用して再度暖めた。
【０２８８】
７．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ（または血清コントロール）の用量の抗ＲＡＧＥｍＡｂ  ＸＴ−Ｍ４を、ＣＬＰの３０〜６０分前またはＣＬＰ後（６、１２、２４、または３６時間）に野生型マウスに静脈内に１回投与した。さらなるコントロールとして、５匹の動物に、偽手術（授動術および露出を使用した開腹術を行うが、結紮および穿刺を行わない）を行った。
【０２８９】
結果
Ａ．ＣＬＰ後のホモ接合性ＲＡＧＥノックアウト、ＲＡＧＥヘテロ接合体、および野生型動物の生存
図３７は、野生型動物（ｎ＝１５）と比較して、ホモ接合性ＲＡＧＥノックアウト（ｎ＝１５）およびＲＡＧＥヘテロ接合体（ｎ＝２３）の両方に有意な生存上の利点が得られた（Ｐ＜０．００１）ことを示す。ＲＡＧＥヘテロ接合体およびホモ接合性ＲＡＧＥノックアウトは、致死性複数菌敗血症からほぼ防御された（ＲＡＧＥ−／−対ＲＡＧＥ＋／−、Ｐ＝ｎｓ）。予想通り、偽手術動物（ｎ＝５）は全て生存した。さらなる１５匹の野生型１２９ＳｖＥｖＢｒｄ動物群に、ＣＬＰの３０分前に抗ＲＡＧＥｍＡｂを投与し、野生型の血清処置コントロール動物と比較した場合、ＲＡＧＥノックアウトと類似の生存上の利点が得られた。
【０２９０】
図３８は、ＣＬＰ後の好気性グラム溶性およびグラム陰性の腸内細菌についての組織コロニー数を示す。肝臓組織、脾臓組織、および腹水中の組織濃度は、３つの全ての群（Ｐ＝ｎｓ）で類似していたが、全て偽手術動物より有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。ホモ接合性ＲＡＧＥノックアウトは、他の群と比較して肺水分量が最も低かったが、これは、有意性に到達しなかった（湿乾重量比：４．８±０．２−ＲＡＧＥ−／−対５．０±０．４−ＲＡＧＥ＋／−対５．３±０．３−ｗｔ；Ｐ＝ｎｓ）。
【０２９１】
図３９は、ＣＬＰの３０〜６０分前にコントロール血清を投与したＢＡＬＢ／ｃ動物（ｎ＝１５）および抗ＲＡＧＥ抗体を投与した動物（７．５ｍｇ／ｋｇ群（ｎ＝１５）または１５ｍｇ／ｋｇ群（ｎ＝１５））における生存に有意差があったことを示す。至適防御効果は、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＲＡＧＥｍＡｂで達成され（Ｐ＜０．０５対７．５ｍｇ／ｋｇ群；Ｐ＜０．００１対血清コントロール）、したがって、この用量を、ＣＬＰ後に遅延ｍＡｂ処置を使用したその後の実験で使用した。抗ＲＡＧＥ抗体を投与した動物は、コントロール動物と比較して臓器細菌負荷が有意に増加しなかったが、両群は、偽処置コントロール（ｎ＝５）動物よりも脾臓および肝臓のコロニー形成（ＣＦＵ）／ｇｍが有意に高かった。表１を参照のこと。剖検実験での肺組織および小腸粘膜の組織病理学は、血清コントロール群で顕著に異常である一方で、病理学的所見は、抗ＲＡＧＥｍＡｂ群および偽手術群で有意に減少した（表１３）。
【０２９２】
【表１３】
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図４０は、用量１５ｍｇ／ｋｇの抗ＲＡＧＥ抗体の各時間間隔での遅延単回投与の効果がＣＬＰ後３６時間もの長さまで延長されたことを示す。遅延モノクローナル抗体治療により、ＣＬＰから２４時間後まで致死性を有意に防御した（Ｐ＜０．０１）。ＣＬＰから３６時間後までの遅延ｍＡｂ投与は、好ましい生存傾向を示したが、血清処置コントロール群と比較して、差はもはや有意ではなかった（Ｐ＝０．１２）。好気性グラム陰性およびグラム陽性腸内細菌の組織濃度は、治療群間で相違しなかった（Ｐ＝ｎｓ）。敗血症患者における誘発事象（ｉｎｃｉｔｉｎｇ  ｅｖｅｎｔ）直後に抗ＲＡＧＥ抗体治療などの介入を行うことができないので、抗ＲＡＧＥ抗体の遅延投与後の生存上の利点の所見は、臨床上重要な意義を有する。これらのデータは、確立された重症敗血症患者の救済療法としての抗ＲＡＧＥｍＡｂの使用を支持する。
Ｃ．マウスリステリア症攻撃誘発モデル
ＢＡＬＢ／ｃ野生型メスマウス、野生型雄、ヘテロ接合性ＲＡＧＥ＋／−−１２９ＳｖＥｖＢｒｄ雄、およびホモ接合性ＲＡＧＥ−／−−１２９ＳｖＥｖＢｒｄ雄を、これらの実験で使用した。Ｌ．モノサイトゲネスの標準的接種材料を、トリプチカーゼ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズブロス（ＴＳＢ）（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｓｅｙｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中にて３７℃で１８時間成長させた培養物から調製した。細菌を、１０，０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。細菌濃度を分光光度法で調整し、５％ヒツジＲＢＣ（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｓｅｙｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むトリプチカーゼダイズ寒天プレート上での定量的希釈プレート数によってチェックした。１０３〜１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲のＬ．モノサイトゲネスの連続希釈物を静脈内投与して、細菌攻撃誘発の１時間前に１５ｍｇ／ｋｇの抗ＲＡＧＥｍＡｂをｉｖ投与した野生型マウス、ホモ接合性ＲＡＧＥ−／−ノックアウト、ＲＡＧＥ＋／−ヘテロ接合体、および野生型マウスのＬＤ５０を決定した。Ｌ．モノサイトゲネスでの静脈内攻撃誘発から７日間動物を追跡し、組織分析および微生物学研究のために生存動物を安楽死させた。
【０２９３】
詳細な差分定量微生物学およびサイトカイン決定のために、抗ＲＡＧＥｍＡｂ（１５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＴＮＦｍＡｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）、またはコントロールとしての同体積の１％自家マウス血清の静脈内注入から１時間後に、１０４ＣＦＵの標準的な接種材料を腹腔内投与した。この標準的な接種材料から４８時間後にも、野生型、ＲＡＧＥ＋／−、およびＲＡＧＥ−／−を研究した（ｎ＝５／群）。Ｌ．モノサイトゲネス攻撃誘発から４８時間後に動物を安楽死させ、組織サンプルの粉砕および血液寒天プレート上での連続希釈によって、肝臓および脾臓組織から定量的微生物学を行った。
【０２９４】
結果
野生型マウスのＬＤ５０は、（ｌｏｇ１０）３．３１±０．２ＣＦＵであった一方で、ヘテロ接合性ＲＡＧＥノックアウトのＬＤ５０は５．９８±０．３９であり、ホモ接合性  ＲＡＧＥノックアウトのＬＤ５０は５．１０±０．４７であった。野生型マウスと比較したＲＡＧＥヘテロ接合体およびホモ接合体の療法についての全身性リステリア症由来のＬＤ５０における２桁を超える相違は、統計的に有意であった（Ｐ＜．０１）。単回用量のＸＹ−Ｍ４抗ＲＡＧＥ抗体により、野生型マウスが４．６９±０．５５のＬＤ５０で致死性全身性リステリア症から有意に防御された（Ｐ＜０．０５対野生型コントロール）。抗ＲＡＧＥｍＡｂによって得られたリステリア症からの防御レベルは、ＲＡＧＥ−／−動物で認められたレベルに類似していたが、提示のＲＡＧＥ＋／−動物ほど高くなかった（Ｐ＜０．０５）。
【０２９５】
野生型コントロール動物、抗ＲＡＧＥ抗体を投与した動物、ホモ接合性ＲＡＧＥノックアウト、またはＲＡＧＥヘテロ接合体の群（ｎ＝１０／群）の間の１０４ＣＦＵの標準的全身攻撃誘発後の肝臓組織および脾臓組織中の単離されたＬ．モノサイトゲネスの定量レベルに統計的有意差は認められなかった。図４１を参照のこと。しかし、抗ＴＮＦ抗体の投与後のＬ．モノサイトゲネスの同一接種材料を投与した動物における臓器細菌濃度は、統計的に高く有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。
【０２９６】
図４２は、治療後の血清インターフェロンγレベルを示す。リステリア攻撃誘発後のサイトカイン決定により、コントロールＢＡＬＢ／ｃ動物と比較して、ホモ接合性ＲＡＧＥノックアウトで有意に低レベルのインターフェロンγが示された。抗ＴＮＦｍＡｂを投与したＢＡＬＢ／ｃ動物は、ＢＡＬＢ／ｃコントロールと比較して有意により高いレベルのインターフェロンγを示したのに対して、抗ＲＡＧＥｍＡｂを投与した動物は、コントロール動物と統計的に相違しないインターフェロンγレベルを示した。ＩＬ−６（抗ＴＮＦｍＡｂ群−４５９±１２１ｐｇ／ｍｌ対コントロール群−３８±１４ｐｇ／ｍｌ；Ｐ＜０．０１）およびＭＣＰ−１（抗ＴＮＦｍＡｂ−１３６３±４８０ｐｇ／ｍｌ対コントロール群５６６±７０ｐｇ／ｍｌ；Ｐ＜０．０５）で類似の結果が認められた。ＲＡＧＥ欠損動物または抗ＲＡＧＥ抗体処置群は、コントロール群と比較して、ＩＬ−６またはＭＣＰ−１レベルにおいて有意さは見出されなかった。他のサイトカイン決定により、有意差は示されなかった。
【０２９７】
全身性リステリア菌攻撃誘発は、マウスにおける先天性および後天性免疫応答研究の古典的モデルである。リステリア攻撃誘発実験は、ホモ接合性ＲＡＧＥノックアウト動物およびヘテロ接合体が野生型動物よりも良好にこの感染を顕著に許容することを示し、ＲＡＧＥの悪影響が同時発症する複数菌による敗血症以外の炎症状態で認められることを示す。抗ＲＡＧＥｍＡｂおよびＲＡＧＥノックアウト動物を投与した野生型動物は、野生型動物と同様に、Ｌ．モノサイトゲネスを浄化するようである。これは、組織サンプル中のＬ．モノサイトゲネスコロニー数が顕著に増加した抗ＴＮＦ抗体を投与した動物と対照的である。同様に、サイトカインレベルは、抗ＴＮＦｍＡｂを投与した動物におけるリステリア攻撃誘発後に増加したが、このレベルは、抗ＲＡＧＥｍＡｂを投与した動物におけるコントロールのレベルに類似していた。
【０２９８】
これらの所見は、ＲＡＧＥが敗血症の病理発生で重要な役割を果たすことを証明する。２つの個別のＣＬＰ研究では、ＸＴ−Ｍ４の単回投与（ＣＬＰから１〜６時間後に７．５ｍｇ／ｋｇ）は、１．０％自家マウス血清を注射したマウス（２０％生存）と比較して、７日目で有意な防御を示した（６５％生存）。ＸＴ−Ｍ４（ＣＬＰから６時間後および１２時間後に７ｍｇ／ｋｇ）の２回の投与により、希釈ＢＡＬＢ／ｃ血清を投与したマウスにおける約２５％生存と比較して、７日目に約８５％のマウスを防御された。ＣＬＰから２４時間後の単回用量の抗ＲＡＧＥ  ＸＴ−Ｍ４の投与も、コントロール動物と比較して防御した。上記実験は、ＲＡＧＥが敗血症の病理発生で重要な役割を果たすことを証明し、抗ＲＡＧＥ抗体が敗血症治療のための有用な治療薬であり得ることが示唆される。
【０２９９】
（実施例２９）
マウスＣＬＰモデルにおける抗ＲＡＧＥ抗体のさらなる評価
敗血症のマウスＣＬＰモデルによって異常な腫瘍および菌血症を伴う複数菌感染を起こし、ヒト疾患で認められる血液動態期および代謝期が再現される。このモデルでは、長さ約１ｃｍの正中線腹部切開によって盲腸を露出させ、次いで、結紮し、盲腸の腸間膜反対側を２３ゲージニードルを賞して穿刺する。盲腸を腹腔に戻し、筋膜および皮膚切開を閉じる。動物に、トロバフロキサシン（２０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射を１回行い、１．０ｍｌの通常の生理食塩水の皮下注射を使用した標準液での蘇生を行う。ＣＬＰから７日間動物を追跡し、１日を通した間隔チェックで認められた死亡を記録した。さらなるコントロールとして、動物を、盲腸の受動術および露出を使用した開腹術からなるが、結紮および穿刺を行わない偽手術を行った。生存結果を、カプラン・マイヤー生存プロットによって比較し、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ検定を使用して分析した。予防投与および治療投与におけるＲＡＧＥ抗体の有効性およびＲＡＧＥ遺伝子修飾マウスを、マウスＣＬＰモデルで評価した。
【０３００】
図４３に示すように、ホモ接合性ＲＡＧＥヌルマウス（ＲＡＧＥ−／−）は、親野生型マウスと比較した場合、盲腸結紮および穿刺の致死効果からの有意な程度の防御を示した。ＣＬＰから８日後までに、野生型マウスの３５％と比較して、８０％のＲＡＧＥ−／−マウスがＣＬＰに対して生存した。ＲＡＧＥ−／＋動物は、ＲＡＧＥ−／−動物と同様に挙動する。生存期間分析で認められるように、ＲＡＧＥ−／−動物は、ＣＬＰ後の野生型動物よりも有意な生存上の利点を示した。これらの所見は、ＲＡＧＥが敗血症の病理発生で重要な役割を果たすことを証明する。ＲＡＧＥは、マウスの生存に不可欠ではない。
【０３０１】
ホモ接合性ＲＡＧＥ欠失マウスは、明確な表現型を持たない。ＲＡＧＥ−／−、ＲＡＧＥ＋／−、およびＲＡＧＥ＋／＋は、１２９ＳｖＥｖＢｒｄバックグラウンド株で起こる。  
【０３０２】
腹腔内（ＩＰ）投与した放射性標識ＸＴ−Ｍ４（４ｍｇ／ｋｇ）の薬物動態学分析は、７３時間のＴ１／２および６時間のＴｍａｘを示した。ＸＴ−Ｍ４は、いくつかのマウス株で好ましい薬物動態学も示した。ＢＡＬＢ／ｃマウスへの５ｍｇ／ｋｇのＸＴ−Ｍ４の静脈内投与は、非常に低い血清クリアランスおよび４〜５日のＴ１／２を示した。雄ｄｂ／ｄｂマウスへの５ｍｇ／ｋｇのＸＴ−Ｍ４の腹腔内投与も類似の薬物動態学を示した。
【０３０３】
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの２つの個別のＣＬＰ研究では、単回投与（ＣＬＰから０〜６時間後の７．５ｍｇ／ｋｇのＸＴ−Ｍ４）は、１．０％自家マウス血清を注射したマウス（１５％〜２０％生存）と比較した場合、７日目にＣＬＰの影響からの有意な防御を示した（５０％超生存）。図４４および４５を参照のこと。２回投与（ＣＬＰから６時間後および１２時間後の７．５ｍｇ／ｋｇのＸＴ−Ｍ４）（最終用量１５ｍｇ／ｋｇ）（図４５）は、コントロール群の１５％生存と比較して、ＣＬＰから７日後に９０％のマウスを防御した。１５ｍｇ／ｋｇのＸＴ−Ｍ４で、至適防御が認められた。
【０３０４】
ＣＬＰを用いたマウス由来の病理学スコアは、抗ＲＡＧＥ抗体処置動物で減少する
８日目まで生存した全動物を屠殺し、臓器損傷の組織学的証拠ならびに肺および小腸の病理学スコアリングのために剖検実験を行った。０（正常）から４（拡散および拡大した組織の壊死）までに悪性度分類した定義の病理学スコアを適用した。剖検実験での肺組織および小腸粘膜の組織病理学は、血清コントロール群で顕著に異常である一方で、病理学的所見は、抗ＲＡＧＥ  ＸＴ−Ｍ４処置群（１５ｍｇ／ｋｇ）および偽手術群で有意に減少した。図４６を参照のこと。組織病理学の減少は、生存の増加と一致する。
【０３０５】
好気性グラム陰性およびグラム陽性腸内細菌の組織濃度は、治療群間で異ならなかった。ＣＬＰ後に生存したマウス由来の剖検で得た臓器サンプルから定量的微生物学を行った。組織サンプルを、肺、肝臓、および脾臓から回収した。腹膜腔の洗浄によって腹水を得た。１ｇの臓器重量あたりの定量的細菌数に標準化するか、１ｍｌの腹腔洗浄液あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）に標準化する。ＸＴ−Ｍ４抗体またはＲＡＧＥ−／−を投与した動物は、コントロール動物と比較して臓器細菌負荷が有意に増加しなかったが（ｐ＝ｎｓ）、両群は、偽処置コントロール（ｎ＝５）動物よりも脾臓および肝臓のコロニー形成（ＣＦＵ）／ｇｍが有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【０３０６】
抗ＲＡＧＥ抗体は、抗生物質を使用したマウスＣＬＰモデルにおいて防御性を示す
抗生物質の存在下または非存在下での３０ｍｇ／ｋｇ  ＸＴ−Ｍ４の静脈内投与により、動物がＣＬＰの致死効果から防御された。図４７を参照のこと。マウスを、０時間でＣＬＰに供した。マウスに、３０ｍｇ／ｋｇ  ＸＴ−Ｍ４または同体積の１％自家マウス血清を静脈内注射した。全群に、時間０に一定用量のトロバフロキサシン（２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）を投与した。さらに、ＣＬＰの２４時間後および４８時間後にトロバフロキサシン（２０ｍｇ／ｋｇ筋肉内）を投与するか、０、１２、２４、３６、および２４時間後にバンコマイシン（２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）を投与した。バンコマイシンのみの注射により、生存率が減少した。図４８を参照のこと。バンコマイシンまたはトロバフロキサシンを投与した場合、さらなる効果は認められなかった。
【０３０７】
抗ＲＡＧＥ抗体は、遅延投与を使用したマウスＣＬＰモデルにおいて防御性を示す  
抗ＲＡＧＥｍＡｂでの遅延治療対血清コントロール治療を使用した動物における盲腸の結紮および穿刺後のカプラン・マイヤー生存分析を、ＣＬＰ後の種々の間隔で行った（図４９）。ＣＬＰから６、１２、または２４時間後の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスへの１５ｍｇ／ｋｇのＸＴ−Ｍ４の遅延静脈内投与によっても、動物が有意に生存した（Ｎ＝１５、コントロール；ｎ＝１４）。遅延モノクローナル抗体治療により、ＣＬＰから２４時間後までの致死性を有意に防御した（ｐ＜０．０１）。ＣＬＰから３６時間後までの遅延投与は、好ましい生存傾向を示したが（９／１５動物生存）、血清処置コントロール群と比較して、差はもはや有意ではなかった（Ｐ＝０．１２）。好気性グラム陰性およびグラム陽性腸内細菌の組織濃度は、治療群間で相違しなかった（Ｐ＝ｎｓ）。
【０３０８】
（実施例３０）
ＲＡＧＥ調整は全身性リステリア菌感染を悪化させない
ＲＡＧＥの阻害または欠失は、宿主の機構または微生物病原体のクリアランスを破壊しない。リステリア菌攻撃誘発は、マウスにおける先天性および後天性免疫応答研究のための周知のモデルである。野生型マウスのＬＤ５０は、（ｌｏｇ１０）３．３１±０．２ＣＦＵであった一方で、ヘテロ接合性ＲＡＧＥ＋／−のＬＤ５０は５．９８±０．３９であり、ホモ接合性ＲＡＧＥ−／−のＬＤ５０は５．１０±０．４７であった。野生型マウスと比較したＲＡＧＥヘテロ接合体およびホモ接合体の両方についての全身性リステリア症由来のＬＤ５０における２桁を超える相違は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１）。抗体またはコントロール血清の投与から１時間後に、マウスを、リステリア菌（１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ））の全身投与を使用して攻撃誘発した。抗ＲＡＧＥ  ＸＴ−Ｍ４を投与した野生型動物およびＲＡＧＥ−／−動物は、Ｌ．モノサイトゲネスおよび野生型動物を浄化するようである。コントロール群と比較した場合、ＲＡＧＥヌルおよびＲＡＧＥヘテロ接合性動物における肝臓組織および脾臓組織中の定量的レベル（ＣＦＵ／ｇｍ）のＬ．モノサイトゲネスは、ＸＴ−Ｍ４抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）の投与によって脱負荷された（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）。対照的に、このレベルは、抗ＴＮＦ−α抗体（モノクローナル抗体  ＴＮ３．１９１２、２０ｍｇ／ｋｇ）の投与によって増加した。図５０を参照のこと。予想通り、抗ＴＮＦモノクローナル抗体は、リステリア症に対するマウスの感受性を有意に増加させた。ＲＡＧＥの欠失または阻害は、このモデルの感染を悪化させなかった。
【０３０９】
（実施例３１）
キメラ抗ＲＡＧＥ抗体の有効性についてのｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床アッセイ
Ａ．薬物動態学（ＰＫ）
雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）への５ｍｇ／ｋｇのＩＶ単回投与後のキメラ抗体であるキメラＸＴ−Ｍ４の血清濃度を、キメラＸＴ−Ｍ４について評価した。長期にわたる抗体の血清濃度を、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。キメラＸＴ−Ｍ４の平均血清曝露は（２３，２３５ｇ・ｈｒ／ｍＬ）であり、半減期は約１週間（１５２時間）である。図５１を参照のこと。
Ｂ．ＣＬＰ後の異なる用量のキメラＸＴ−Ｍ４の防御効果の評価
血清コントロール動物と比較したキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４および親ラットＸＴ−Ｍ４抗体がＣＬＰ後の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの生存を延長させる能力を、手術時の３．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇでの静脈内投与後に決定した。生存プロットを図５２に示す。キメラＸＴ−Ｍ４の単回静脈投与（ＣＬＰから０時間後で７．５ｍｇ／ｋｇ）は、７日目の１．０％自家マウス血清を注射したマウス（２０％生存）と比較した場合、ＣＬＰから７日後のマウスの約９０％を防御した（ｐ＜０．０５）。３．５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの用量のキメラＸＴ−Ｍ４はまた、ＣＬＰから７日後のマウスを有意に防御した（コントロールと比較して約７０％、ｐ＜０．０５）
Ｃ．ＣＬＰから２４時間後に投与したキメラＸＴ−Ｍ４によって得られた防御の評価
生存の相違を、遅延治療を使用した動物における盲腸の結紮および穿刺後のカプラン・マイヤー生存プロットによって分析した（血清コントロールと比較した両抗体処置群についてｐ＜０．０１）。ＣＬＰから２４時間後に１５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した場合のラット抗ＲＡＧＥ  ＸＴ−Ｍ４に対するキメラの比較を図５３に示す。ＣＬＰから２４時間後に治療的に投与した場合、ＣＬＰモデルにおけるキメラＸＴ−Ｍ４によって得られた防御レベルは、親ラットＸＴ−Ｍ４抗体によって得られた防御レベルに類似する。
【０３１０】
（結果のまとめ）
ＲＡＧＥが存在しないことにより、ＣＬＰ誘導性敗血症の致死効果からマウスが防御される。ＸＴ−Ｍ４の単回投与により、ＣＬＰの致死効果からマウスが防御される。ＲＡＧＥ−／−または抗体処置マウスにおいて全身リステリア攻撃誘発から４８時間後のリステリア菌の組織濃度に有意な相違が認められず、全体が免疫抑制されるわけではないことが示唆される。データは、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４の定常領域のヒト定常領域との置換が抗体の結合活性に影響及ぼさなかったことを示す。さらに、キメラＸＴ−Ｍ４を予防的に投与したＣＬＰモデルの有効性は、９０％の動物が７．５ｍｇ／ｋｇの用量で防御されることを示した。キメラＸＴ−Ｍ４および親ＸＴ−Ｍ４抗体により、ＣＬＰから２４時間後に治療的に投与したＣＬＰモデルの類似の防御レベルが得られる。
【０３１１】
本明細書中に言及した全ての刊行物および特許は、各刊行物または特許が具体的且つ個別に参考として援用されるかのうように、その全体が本明細書中で参考として援用される。矛盾する場合、本出願（本明細書中の定義が含まれる）に従う。
【０３１２】
本発明の特定の実施形態を考察しているが、上記明細書は、例示であり、本発明を制限しない。本発明の多数の変形形態は、本明細書および以下の特許請求の範囲を再検討した際に当業者に明らかとなるであろう。本発明の全範囲を、特許請求の範囲およびその等価物の全範囲ならびに明細書およびかかる変形形態を参照して判断すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３１３】
【図１−Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、マウス、ラット、ウサギ（２イソ型）、ヒヒ、カニクイザル、およびヒトのＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３、１４、１１、１３、７、９、１）のアラインメントを示す。
【図１−Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、マウス、ラット、ウサギ（２イソ型）、ヒヒ、カニクイザル、およびヒトのＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３、１４、１１、１３、７、９、１）のアラインメントを示す。
【図１−Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、マウス、ラット、ウサギ（２イソ型）、ヒヒ、カニクイザル、およびヒトのＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３、１４、１１、１３、７、９、１）のアラインメントを示す。
【図２】図２は、ＥＣ５０が９０ｐＭであるｈＲＡＧＥへのＸＴ−Ｈ２の結合およびＥＣ５０が３００ｐＭであるｈＲＡＧＥ−ＦｃへのＸＴ−Ｍ４の結合を証明する直接結合ＥＬＩＳＡ由来のデータのグラフである。
【図３】図３は、ＥＣ５０が１００ｐＭであるｈＲＡＧＥ  Ｖ−ドメイン−Ｆｃへの抗体ＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２の結合を証明する直接結合ＥＬＩＳＡ分析由来のデータのグラフである。
【図４】図４は、ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４がｈＲＡＧＥ−ＦｃへのＨＭＧ１の結合を遮断する能力を示すリガンド競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ由来のデータのグラフである。
【図５】図５は、ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４が類似のエピトープを共有し、ヒトＲＡＧＥの重複部位に結合することを示す抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ由来のデータのグラフである。
【図６】図６は、マウス抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、およびＸＴ−Ｈ７ならびにラット抗ＲＡＧＥ抗体  ＸＴ−Ｍ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す（配列番号：１８、２１、２４、２０、２６、１６）。
【図７】図７は、マウス抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、およびＸＴ−Ｈ７ならびにラット抗ＲＡＧＥ抗体  ＸＴ−Ｍ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す（配列番号１９、２２、２５、２３、２７、１７）。
【図８】図８は、ヒヒＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図９】図９は、カニクイザルＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。
【図１０】図１０は、ウサギＲＡＧＥイソ型１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図１１】図１１は、ウサギＲＡＧＥイソ型２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
【図１２−Ａ】図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒヒＲＡＧＥをコードするクローン化ヒヒゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図１２−Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒヒＲＡＧＥをコードするクローン化ヒヒゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図１２−Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒヒＲＡＧＥをコードするクローン化ヒヒゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図１２−Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒヒＲＡＧＥをコードするクローン化ヒヒゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図１２−Ｅ】図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒヒＲＡＧＥをコードするクローン化ヒヒゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図１３】図１３は、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、キメラＸＴ−Ｍ４抗体およびラット抗体ＸＴ−Ｍ４がｈＲＡＧＥ−ＦｃへのＲＡＧＥリガンドＨＭＧＢ１、アミロイドβ１−４２ペプチド、Ｓ１００−Ａ、およびＳ１００−Ｂの結合を遮断する能力を示す４つのグラフを示す。
【図１４】図１４は、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、キメラＸＴ−Ｍ４が抗体ＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２とｈＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合を競合する能力を示すグラフを示す。
【図１５】図１５は、ＸＴ−Ｍ４がカニクイザル、ウサギ、およびヒヒの肺組織中の内因性細胞表面ＲＡＧＥに結合することを示す、カニクイザル、ウサギ、およびヒヒの肺組織のＩＨＣ染色を示す。コントロールサンプルは、ＸＴ−Ｍ４によって接触されたｈＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞、ＲＡＧＥを発現しないＣＨＯ細胞、ＲＡＧＥを発現しないＮＧＢＣＨＯ細胞、コントロールＩｇＧ抗体によって接触されたｈＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞である。
【図１６】図１６は、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４が正常ヒト肺および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を罹患したヒトの肺中でＲＡＧＥに結合することを示す。
【図１７】図１７は、ヒト化マウスＸＴ−Ｈ２  ＨＶ領域のアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ヒト化マウスＸＴ−Ｈ２  ＨＬ領域のアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９は、ヒト化ラットＸＴ−Ｍ４  ＨＶ領域のアミノ酸配列を示す。
【図２０−Ａ】図２０Ａ〜２０Ｂは、ヒト化ラットＸＴ−Ｈ２  ＨＬ領域のアミノ酸配列を示す。
【図２０−Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｂは、ヒト化ラットＸＴ−Ｈ２  ＨＬ領域のアミノ酸配列を示す。
【図２１】図２１は、ヒト化軽鎖および重鎖ポリペプチドを産生するために使用した発現ベクターを示す。
【図２２】図２２は、競合ＥＬＩＳＡによって決定した、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃへのヒト化ＸＴ−Ｈ２抗体の結合についてのＥＤ５０値を示す。
【図２３】図２３は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイによって決定した、ｈＲＡＧＥ−ＳＡへのＸＴ−Ｍ４ならびにヒト化抗体ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１０、ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１１、およびＸＴ−Ｍ４−Ｖ１４の結合についての運動速度定数（ｋａおよびｋｄ）ならびに結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を示す。
【図２４】図２４は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイによって決定した、ｍＲＡＧＥ−ＳＡへのＸＴ−Ｍ４ならびにヒト化抗体  ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１０、ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１１、およびＸＴ−Ｍ４−Ｖ１４の結合についての運動速度定数（ｋａおよびｋｄ）ならびに結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を示す。
【図２５】図２５は、マウスＸＴ−Ｈ２  ＶＬ−ＶＨ  ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。
【図２６】図２６は、マウスＸＴ−Ｈ２  ＶＨ−ＶＬ  ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。
【図２７】図２７は、ラット  ＸＴ−Ｍ４  ＶＬ−ＶＨ  ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す。
【図２８】図２８は、ラット  ＸＴ−Ｍ４  ＶＨ−ＶＬ  ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す。
【図２９】図２９は、ＶＬ／ＶＨまたはＶＨ／ＶＬ立体配置のいずれかのＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４  抗ＲＡＧＥ抗体のＳｃＦｖ構築物によるヒトＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合を示すＥＬＩＳＡデータのグラフである。
【図３０】図３０は、大腸菌中で可溶性タンパク質として発現されたＶＬ／ＶＨまたはＶＨ／ＶＬ立体配置のＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４  抗ＲＡＧＥ抗体のＳｃＦｖ構築物によるヒトＲＡＧＥ−ＦｃおよびＢＳＡの結合を示すＥＬＩＳＡデータのグラフである。ＡｃｔＲＩＩｂは、ネガティブコントロールと同一のベクターから発現した非結合タンパク質である。
【図３１】図３１は、ＸＴ−Ｍ４のＣＤＲにスパイク化（ｓｐｉｋｅｄ）変異を導入するためのＰＣＲの使用を概略的に示す。
【図３２】図３２は、ＸＴ−Ｍ４  ＶＬ−ＶＨ  ＳｃＦｖ構築物のＣ末端のヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。ＶＨ−ＣＤＲ３に下線を引いている。その部位で変異のために使用したスパイク化比を識別する各変異部位での数字と共に２つのスパイク化オリゴヌクレオチド（配列番号５７〜５８）も示す。数字に対応するスパイク化比のヌクレオチド組成物も識別する。
【図３３】図３３は、リボゾームディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−３を概略的に示す。「Ｔ７」はＴ７プロモーターを示し、「ＲＢＳ」は、リボゾーム結合部位であり、「スペーサーポリペプチド」はリボゾームに折り畳まれたタンパク質が結合するスペーサーポリペプチドであり、「Ｆｌａｇタグ」はタンパク質欠失のためのＦｌａｇエピトープタグである。
【図３４】図３４は、ファージディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−１を概略的に示す。
【図３５】図３５は、ＦａｂディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−６を使用したＶＬおよびＶＨスパイク化ライブラリーの組み合わせアセンブリを概略的に示す。
【図３６】図３６は、５２位のグリコシル化部位を除去する変異後のｈＲＡＧＥのＸＴ−Ｍ４抗体の親和性の増加を示す抗体競合ＥＬＩＳＡデータのグラフである。
【図３７】図３７は、野生型コントロールマウスと比較したホモ接合性およびヘテロ接合性ＲＡＧＥノックアウトマウスならびに抗ＲＡＧＥ抗体を投与したマウスのＣＬＰ後の生存における利点を示す生存プロットである。
【図３８】図３８は、ＣＬＰ後の腸内細菌についての組織コロニー数を示すグラフである。
【図３９】図３９は、ＣＬＰ後のマウスの生存に及ぼす抗ＲＡＧＥ抗体の２つの異なる用量の影響を示す生存プロットである。
【図４０】図４０は、ＣＬＰから３６時間後までの単回用量の抗ＲＡＧＥ抗体の遅延の影響を示す生存プロットである。
【図４１】図４１は、野生型コントロール動物と比較した、感染ホモ接合性およびヘテロ接合性ＲＡＧＥノックアウトマウスならびに抗ＲＡＧＥｍＡｂを投与した感染マウスの肝臓および脾臓から単離したＬ．モノサイトゲネスのレベルを示す。
【図４２】図４２は、野生型コントロールマウスと比較した、感染ホモ接合性およびヘテロ接合性ＲＡＧＥノックアウトマウスならびに抗ＲＡＧＥ抗体を投与した感染マウスのインターフェロンγの血清レベルを示すグラフである。
【図４３】図４３は、野生型コントロールマウスと比較した、ホモ接合性およびヘテロ接合性ＲＡＧＥノックアウトマウスのＣＬＰ後の生存における利点を示す生存プロットである。
【図４４】図４４は、野生型コントロールマウスと比較した、抗ＲＡＧＥ抗体の単回注射を行ったマウスのＣＬＰ後の生存における利点を示す生存プロットである。
【図４５】図４５は、ＣＬＰから６時間後および１２時間後の単回用量の抗ＲＡＧＥ抗体の遅延の影響を示す生存プロットである。
【図４６】図４６は、抗ＲＡＧＥ抗体を投与したマウスがコントロール動物と比較して病理学スコア（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ）が改良されることを示すグラフである。
【図４７】図４７は、抗生物質と組み合わせて抗ＲＡＧＥ抗体を投与したマウスのＣＬＰ後の生存を示す生存プロットである。
【図４８】図４８は、抗生物質のみを投与したマウスのＣＬＰ後の生存を示す生存プロットである。
【図４９】図４９は、カプランマイヤー生存分析を示す。
【図５０】図５０は、感染ホモ接合性およびヘテロ接合性ＲＡＧＥノックアウトマウスおよび抗ＲＡＧＥ抗体を投与したマウスの肝臓および脾臓中のＬ．モノサイトゲネスを示すグラフである。
【図５１】図５１は、マウスへの単回ｉｖ投与後のキメラＸＴ−Ｍ４の血清濃度を示すグラフである。
【図５２】図５２は、キメラＸＴ−Ｍ４抗体がＣＬＰモデルにおいて防御的であることを示す。
【図５３】図５３は、キメラＸＴ−Ｍ４抗体が術後２４時間までＣＬＰモデルで防御的であることを示す。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−Ａ】
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【図１２−Ｂ】
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【図１２−Ｃ】
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【図１２−Ｄ】
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【図１２−Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−Ａ】
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【図２０−Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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