(57)【要約】  本発明は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子をＩｇＩＶ分子のコレクションから選択するための方法を提供し、該方法ではＩｇＩＶ分子のコレクションをミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させ、該ミスフォールドタンパク質および／またはエピトープと相互作用するアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子を集める。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミスフォールドタンパク質のエピトープおよび／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子を、ＩｇＩＶ分子のコレクションから選択するための方法であって、
ＩｇＩＶ分子のコレクションを、ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させ、上記エピトープと相互作用するアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子を集めることを含んでなる、方法。
【請求項２】
エピトープがタンパク質のクロスβ構造の少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エピトープが、クロスβ構造を含んでなるタンパク質で露出されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質が、固体支持体に結合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと、相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなるＩｇＩＶ分子で富化された、ＩｇＩＶ分子のコレクション。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により選択された、請求項５に記載のＩｇＩＶ分子のコレクション。
【請求項７】
ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる、少なくとも５種、好ましくは少なくとも８種、更に好ましくは少なくとも１０種の単離、合成および／または組換え分子を含んでなる組成物。
【請求項８】
ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子の機能性部分、誘導体および／またはアナログを含んでなる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
分子の少なくとも１種がクロスβ構造結合分子を更に含んでなる、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
分子の少なくとも１種がエフェクター分子を更に含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
エフェクター分子がプロテアーゼまたはそのクロスβ構造結合部分である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
エフェクター分子が免疫増強化合物、好ましくはサイトカインである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
エフェクター分子が補体活性化因子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
エフェクター分子がクリアランスシグナル、好ましくはＦｃドメインの少なくとも一部である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
エフェクター分子が炎症抑制化合物、好ましくは補体阻害因子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
エフェクター分子がクロスβ構造結合増強因子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
エフェクター分子がオプソニン化化合物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
単離、合成および／または組換え分子がオプソニン化化合物である、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子のアフィニティ領域のアミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列を含んでなる単離、合成および／または組換え分子を作製することを含んでなる、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を作製するための方法。
【請求項２０】
請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションまたは請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物から、ミスフォールドタンパク質またはクロスβ構造のエピトープと相互作用する際におよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用する際に、食細胞により該クロスβ構造および／またはタンパク質のオプソニン化を誘導しうるアフィニティ領域を含んでなる分子を選択するための方法であって：
‐請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションまたは請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を、ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させ；
‐ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子に結合されたミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を含んでなる複合体を食細胞と接触させ；および
‐該ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の食細胞による食作用を誘導または増強しうるＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子を集める；
ことを含んでなる、方法。
【請求項２１】
薬剤として用いるための、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクション、および／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係疾患、血液凝固障害、敗血症および／または微生物／病原体／細菌／寄生虫／ウイルス感染症の少なくとも部分的な予防および／または治療のための薬剤の製造のための、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
微生物／病原体／細菌／寄生虫／ウイルス感染症がＨＩＶ関連日和見感染症を含んでなる、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を個体に投与することを含んでなる、個体で細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増強させるための方法。
【請求項２５】
請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を個体へ投与することを含んでなる、個体でミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造媒介効果を少なくとも一部阻害するための方法。
【請求項２６】
請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を個体へ投与することを含んでなる、個体におけるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係疾患、血液凝固障害、敗血症および／または微生物／病原体／細菌／寄生虫／ウイルス感染症の少なくとも部分的な予防および／または治療のための方法。
【請求項２７】
請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を個体へ投与することを含んでなる、個体でＨＩＶ関連日和見感染症の少なくとも部分的な予防および／または治療のための方法。
【請求項２８】
‐請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクション、および／または
‐請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物、および
‐適切なキャリア、希釈物および／または賦形剤
を含んでなる組成物。
【請求項２９】
クロスβ構造結合化合物を更に含んでなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
クロスβ構造結合増強化合物を更に含んでなる、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
補体活性化化合物を更に含んでなる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
免疫増強化合物、炎症抑制化合物および／または補体阻害化合物を更に含んでなる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
タンパク質誘導血小板凝集を阻害するための、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３４】
ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる分子への組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の結合と競合させるための、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
サンプルからミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を少なくとも一部除去するための方法であって、
サンプルを請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子に結合されたミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の複合体を該サンプルから除去することを含んでなる方法。
【請求項３６】
サンプルが流体サンプルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
流体が体液を含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
流体が製薬またはその成分のいずれかを含んでなる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
流体が食品物質を含んでなる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４０】
ＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物が固体支持体へ結合されている、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
‐ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と相互作用しうる、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションの少なくとも１種のアフィニティ領域、および／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１種のアフィニティ領域、および
‐該ミスフォールドタンパク質および／または該クロスβ構造および／または該タンパク質と該アフィニティ領域との相互作用の視覚化の手段、
を含んでなる診断キット。
【請求項４２】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造が疾患関連ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなる、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４３】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質および／またはペプチドが、タンパク質を含んでなる水溶液中に存在しているかどうかを調べるための方法であって：
‐該水溶液を請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、および
‐結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質および／またはペプチドが存在しているかどうかを検出する、
ことを含んでなる方法。
【請求項４４】
水溶液が、洗剤、食物製品、食物サプリメント、細胞培地、リサーチ目的に用いられる市販タンパク質溶液、血液、血液製剤、脳脊髄液、滑液、リンパ液、化粧品、細胞、タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分のいずれか、またはこれらのいずれかの組合せを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分のいずれかからミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を除去するための方法であって：
‐タンパク質を含んでなる該医薬組成物またはその成分のいずれかを請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物と接触させ；
‐該ＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物への該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質および／またはペプチドの結合を行わせ；および
‐タンパク質を含んでなる該医薬組成物またはその成分のいずれかから、クロスβ構造を含んでなる結合タンパク質および／またはペプチドを分離する；
ことを含んでなる、方法。
【請求項４６】
医薬組成物の望ましくない副作用を減少させるおよび／または防止するおよび／またはタンパク質グラム当たりの比活性を増加させるための方法であって、
請求項４５に記載の方法を用いて、該医薬組成物またはその成分のいずれかから、アンフォールドタンパク質、アンフォールドペプチド、ミスフォールドタンパク質、変性タンパク質、凝集タンパク質、凝集ペプチド、マルチマー化タンパク質および／またはマルチマー化ペプチド、および／またはクロスβ構造を含んでなるペプチドを除去することを含んでなる、方法。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載の方法により得られる、タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分。
【請求項４８】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の蓄積を減少させるための、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４９】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造がコンホメーション疾患に関与している、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
疾患が、アミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症および他の炎症疾患、リウマチ様関節炎、伝染性海綿状脳症、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失を伴う疾患またはパーキンソン病および他の神経疾患（癲癇）、脳症および／または関節炎および／またはリウマチ様関節炎である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
好ましくはコンホメーション疾患に関与する、蓄積沈着ミスフォールドタンパク質またはクロスβ構造のタンパク質の存在を調べるための、請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
請求項３５〜４０または４５〜４６のいずれか一項に記載の方法を実施するための分離装置であって、
（循環）流体を輸送するためのシステムを含んでなり、該システムがフロー流体、好ましくは個体の循環へ接続するための、該システムへの流体のエントリーと該システムから好ましくは個体の循環への流体のリターンのための手段を備え、該システムが更に固相を含んでなり、該固相が請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１９のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる装置。
【請求項５３】
透析装置である、請求項５２に記載の分離装置。
【請求項５４】
請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を血液へ供することを含んでなる、血液の凝固を妨げるための方法。
【請求項５５】
組成物中、好ましくは薬剤および／またはワクチン中におけるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の量を調べるための方法であって：
‐該組成物を請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、および
‐結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の量を該組成物中に存在するクロスβ構造の量と関連づける、
ことを含んでなる、方法。
【請求項５６】
タンパク質のクロスβ構造含有率に影響を有すると予想される処理に試験サンプルが付されていた、試験サンプル中タンパク質のクロスβ構造含有率と比較したリファレンスサンプル中タンパク質のクロスβ構造含有率との差異を調べるための方法であって：
‐請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を用いてリファレンスサンプルでタンパク質のクロスβ構造含有率を調べ；
‐該タンパク質のクロスβ構造含有率に影響を有すると予想される処理に該タンパク質を付し、こうして試験サンプルを得；
‐請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物を用いて、得られた試験サンプル中における該タンパク質のクロスβ構造含有率を調べ；および
‐該リファレンスサンプル中該タンパク質のクロスβ構造含有率が該試験サンプル中該タンパク質のクロスβ構造含有率と有意に異なるかどうかを調べる
ことを含んでなる、方法。
【請求項５７】
タンパク質を含んでなるサンプルでミスフォールドタンパク質、クロスβ構造またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の同一性の決定のための方法であって：
‐該サンプルを請求項５または６に記載のＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または請求項７〜１８のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、結合ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質を得、および
‐結合ミスフォールドタンパク質、結合クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質を同定する、
ことを含んでなる、方法。
【請求項５８】
サンプルが、水溶液、好ましくは体液を含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
健康な個体からの体液とクロスβ構造の存在と関連および／または関係する疾患に罹患したまたは罹患していると疑われる個体からの体液が用いられる、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＡＬアミロイドーシスおよび／または関節炎に罹患しているまたは罹患するリスクのある個体からのサンプルが用いられる、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
薬剤として、表９で示された化合物と特異的に結合しうる、および／または表９で示された化合物の量および／または活性を減少させうる、化合物。
【請求項６２】
ミスフォールドタンパク質関連および／または関係疾患、血液凝固障害、敗血症および／または微生物／病原体／細菌／寄生虫／ウイルス感染症に対する薬剤の製造のための、表９で示された化合物と特異的に結合しうる、および／または表９で示された化合物の量および／または活性を減少させうる化合物の使用。
【請求項６３】
疾患がＡＬアミロイドーシスおよび／または関節炎を含んでなる、請求項５１または６２に記載の使用。
【請求項６４】
表９で示された化合物と特異的に結合しうる、および／または表９で示された化合物の量および／または活性を減少させうる化合物を個体へ投与することを含んでなる、ミスフォールドタンパク質関連および／または関係疾患、血液凝固障害、敗血症および／または微生物／病原体／細菌／寄生虫／ウイルス感染症に罹患しているまたは罹患するリスクのある対象者を治療するための方法。
【請求項６５】
疾患がＡＬアミロイドーシスおよび／または関節炎を含んでなる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
エフェクター分子がミスフォールディングのインヒビターである、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、生化学、分子生物学、構造生物学および医学の分野に関する。
【０００２】
免疫グロブリン静脈注射（ＩｇＩＶ）は外見上健康な動物またはヒトの免疫グロブリンであり、該免疫グロブリンはその血清または血液から集められる。ＩｇＩＶは抗体の欠乏を有する動物およびヒトに処方される。該抗体欠乏の原因は、免疫系に罹患する病気、例えばエイズ、あるいは完全または部分無γグロブリン血症または低γグロブリン血症を引き起こす先天性異常、例えば原発性免疫不全症候群または重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤＳ）である。ヒト血清または血液から集められた免疫グロブリンは、例えば“静脈注射ヒト免疫グロブリン”（ＩｇＩＶまたはＩＶＩｇ）のような多くの異なる名称で市販されている。ＩｇＩＶが上記免疫不全者の免疫グロブリン置換療法で１９８１年に初めて導入されて以来、それらは様々な疾患に罹患した患者へもオフラベルで適用され、いくつかの症例では、ＩｇＩＶでの実験的治療が成功に終わった。
【０００３】
作用のメカニズムはこれまでに解明されていなかったため、ＩｇＩＶによるオフラベル治療の多くは試行錯誤実験であり、結末はどちらかというと予測不能であった。
【０００４】
ＩｇＩＶによる治療はリスクなしではない。１９８１年以来、食品医薬品局（ＦＤＡ）はこれら製品の投与に伴う腎機能不全および／または急性腎不全の有害事象報告を世界中で１１４例以上（Ｕ．Ｓ．で約８３例）受けていた。急性腎不全は症例の大多数でうまく管理されたが、死亡が世界において１７例の患者で報告された。死亡した患者の多くは重度の根底状態を有していた。患者でＩｇＩＶの投与に関連して更に報告された副作用に関しては、表１参照。
【０００５】
結論として、ＩｇＩＶによるヒトの治療は特定の病状に明らかに限定されないが、作用様式の明確な理解が欠けており、新疾患自体におけるＩｇＩＶ治療の結末は予測不能である。多量のＩｇＩＶの投与は有害副作用のリスクを伴う。したがって、現行ＩｇＩＶ治療の改善について必要性がある。
【０００６】
ＩｇＩＶ療法を改善するための手段および方法を提供することが、本発明の目的である。疾患または疾患群の治療に適した、ＩｇＩＶと比較して少なくとも１つの改善点、例えば有害副作用のリスク減少および／または治療作用の改善を有する、免疫グロブリンまたはその相当物を得るために、ＩｇＩＶプールから免疫グロブリンのグループの選択および／または精製法と、免疫グロブリンまたはその機能相当物の別な製造方式を提供することが、別な目的である。これまでに、当業者はどのように開始してどれを選択すべきか知らなかった。
【０００７】
本発明は、ミスフォールドタンパク質（ミスホールドタンパク質（misfolded protein））のエピトープ、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるＩｇＩＶ分子で富化されたＩｇＩＶの選択が、現在使用のＩｇＩＶと比較して改善された性質を有している、という洞察を与える。有害副作用が少なくとも一部防止されおよび／または治療作用が改善されることから、上記の選択は現在使用のＩｇＩＶよりとりわけ好ましい。
【０００８】
ミスフォールドタンパク質は、天然、非アミロイド、非クロスβ構造以外の構造をとるタンパク質として、ここでは定義される。そのため、ミスフォールドタンパク質は非天然三次元構造および／またはクロスβ構造および／またはアミロイド構造を有するタンパク質である。タンパク質ミスフォールディングは多数の疾患にとり病因学上重要であり、多くの場合に老化（例えばアミロイド疾患）と関連している。ミスフォールディング疾患はコンホメーション疾患とも称されている。現在、局在性および全身性アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病、透析関連アミロイドーシス、パーキンソン病およびハンチントン病に限定されないが、それらを含めた３０種を超えるミスフォールディング疾患がそのように記載されている。これらの既知ミスフォールディング疾患に加えて、（自己）免疫疾患およびアテローム性動脈硬化症を含めた多くの他の疾患が、そのうちいくつかはなお一部または大部分未知の病因であるが、タンパク質ミスフォールディングと関連している、と我々は以前に開示した（特許ＷＯ２００４／００４６９８（ＥＰ１５３６７７８）および関連特許）。これら疾患の多くで、適切な治療または療法が行われていない。寿命の最後に廃退タンパク質の体からのクリアランス、血液凝固、血小板凝集およびフィブリン溶解のような他のプロセスも、そのうちいくつかは疾患関連であるが、タンパク質ミスフォールディングと関連している、と我々は開示した。
【０００９】
疾患開始および／または疾患進行におけるミスフォールドタンパク質の役割のほかに、タンパク質ミスフォールディングはタンパク質製剤の使用に伴う自己抗体の有害形成、アナフィラキシー応答および他の炎症またはアレルギー反応のような合併症も引き起こす。この理由から、タンパク質ミスフォールディングがタンパク質ベース薬物の生産、保存および使用に際する主要問題である。
【００１０】
最後に、ミスフォールドタンパク質は免疫の導入に寄与し、ミスフォールドタンパク質は、例えばワクチンの使用で、免疫応答を誘発および／または増強するために用いられる。
【００１１】
ミスフォールドタンパク質はマルチマー化しやすく、フィブリル化を始めることがある。これは、サイズが著しく異なる無定形凝集物の形成につながる。ある場合には、ミスフォールドタンパク質の方が性質上規則的でフィブリル性である。アミロイドという用語は、ミスフォールドタンパク質から形成され、包括的にアミロイドーシスと称される様々な既知ミスフォールディング疾患を有する患者の器官および組織でみられる、フィブリルを規定するために当初採り入れられた。通常、アミロイドは不定の長さおよび平均径１０ｎｍのフィブリルとして出現し、細胞外に沈着し、色素コンゴーレッドおよびチオフラビンＴ（ＴｈＴ）で染色すると、コンゴーレッドが結合されたとき偏光下で特徴的な緑色複屈折を示し、β‐シート二次構造を含み、Ｘ線線維回折解析で調べると特徴的クロスベータコンホメーション（下記参照）を含んでいる。しかしながら、タンパク質ミスフォールディングがより一般的な現象であるとわかってきたため、しかもミスフォールドタンパク質の多くの特徴がアミロイドと共有されていることから、アミロイドという用語がより広範囲で用いられてきた。今では、アミロイドという用語は細胞内フィブリルおよびインビトロで形成されたフィブリルを規定するためにも用いられている。しかも、アミロイド様（amyloid-like）およびアミログ（amylog）という用語が、アミロイドと共有される性質を有するが、前記のようなアミロイドに関するすべての基準を満たすわけではない、ミスフォールドタンパク質を示すために用いられている。
【００１２】
結論として、ミスフォールドタンパク質は、モノマーミスフォールドタンパク質から、時々プロトフィブリルと称される小さなオリゴマー種、無定形外形の大きな凝集物、大きな高秩序フィブリルまで、性質上高度に異質であり、それらすべての外形がアミロイドを連想させる構造的特徴を共有しうる。ここで用いられている“ミスフォールドーム”（misfoldome）という用語はミスフォールドタンパク質のあらゆるコレクションを包含している。
【００１３】
アミロイドと同定される上ですべての基準を満たすわけではないアミロイドおよびミスフォールドタンパク質は、アミロイドおよび／または他のミスフォールドタンパク質と構造的および機能的特徴を共有しうる。これらの共通特徴は、様々なミスフォールドタンパク質の中で、それらの多様なアミノ酸配列とは無関係に共有されている。共有される構造的特徴には、例えば色素の蛍光増強を伴うコンゴーレッド、ＴｈＴ、チオフラビンＳのようなある色素との結合性、マルチマー化、および組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、前進性グリケーション終末産物のレセプター（ＲＡＧＥ）およびシャペロン、例えばＢｉＰ（ｇｒｐ７８または免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）などの熱ショックタンパク質のようなあるタンパク質との結合性がある。共有される機能活性には、ｔＰＡの活性化および細胞応答、例えば炎症応答の誘導、および細胞毒性の誘導がある。
【００１４】
例えばアミロイドのようなミスフォールドタンパク質のサブセットに特有のホールマークは、クロスベータコンホメーションまたはクロスベータコンホメーションの前駆体の存在である。
【００１５】
クロスβ構造は、ペプチドおよびタンパク質における二次構造要素である。クロスβ構造（“クロスβ”、“クロス・ベータ”または“クロスベータ”構造とも称される）は、タンパク質またはペプチドの一部、またはペプチドおよび／またはタンパク質のアセンブリーの一部として定義され、それは単一β鎖（段階１）および／またはβ鎖の（ｎ次）グループ（段階２）、および／または典型的にはβ‐シートで配列されたβ鎖のグループ（段階３）、および／または特に“アミロイド”とも称される積重ねβ‐シートのグループ（段階４）を含んでなる。クロスベータ構造は、タンパク質ミスフォールディング、例えば変性、タンパク質分解またはタンパク質のアンフォールディングで、クロスベータ構造前駆体の形成後に形成される。クロスベータ構造前駆体は、クロスベータ構造の前記構造段階のいずれかの形成に先立つ、いずれかのタンパク質コンホメーションとして定義される。クロスベータ構造（前駆体）に存在するこれらの構造要素は、典型的にはタンパク質（の天然部分）の球状領域に不在である。クロスベータ構造の存在は、例えばＸ線線維回折または色素の蛍光増強を伴うチオフラビンＴの結合もしくはコンゴーレッドの結合で証明される。クロスベータ構造前駆体の典型的な形は、部分的または完全ミスフォールドタンパク質である。ミスフォールドタンパク質の典型的な形は、部分的または完全アンフォールドタンパク質、部分的リフォールドタンパク質、部分的または完全凝集タンパク質、オリゴマー化またはマルチマー化タンパク質、または部分的または完全変性タンパク質である。クロスベータ構造またはクロスベータ構造前駆体はモノマー分子、分子のダイマー、トリマー、オリゴマーまでのアセンブリーとして出現したり、分子のマルチマー構造および／またはアセンブリーとして出現したりする。
【００１６】
前記段階のいずれかにおけるクロスベータ構造（前駆体）は、水溶液および／または有機溶媒および／またはいずれか他の溶液中に可溶形で出現しうる。クロスベータ構造（前駆体）は、溶液中固体状態物質として、例えば不溶性凝集物、フィブリル、粒子として、例えば懸濁物としても存在するか、または固体クロスベータ構造相および溶媒相に分離される。
【００１７】
タンパク質ミスフォールディング、クロスベータ構造前駆体の形成、凝集物またはマルチマーおよび／またはクロスベータ構造の形成は、少なくとも２アミノ酸のペプチドおよび／またはタンパク質を含んでなる何らかの組成物で生じうる。“ペプチド”という用語はオリゴペプチドおよびポリペプチドを含めた意味であり、“タンパク質”という用語はグリコシル化およびグリケーションのような翻訳後修飾を受けたおよび受けていない、ペプチドを含めたタンパク質分子を含む。それは、リポタンパク質およびタンパク質部分を含んでなる複合体、例えばタンパク質‐核酸複合体（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、膜‐タンパク質複合体なども含む。ここで用いられている“タンパク質”という用語は、タンパク質分子、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドも包含する。このように、この出願で“タンパク質”または“タンパク質および／またはペプチド”の使用は同じ意味を有する。
【００１８】
積重ねβ‐シートの典型的な形は、β‐シートがフィブリルの軸の方向にまたはフィブリルの軸の方向と垂直に積み重ねられた、フィブリル様構造をとる。クロスβ構造でβ‐シートの積重ねの方向は、長い繊維軸と垂直である。クロスβ構造コンホメーションは、廃退タンパク質またはペプチドのクリアランスおよび分解を誘導する事象のカスケードを誘発するシグナルである。クリアランスが不十分であると、望ましくないタンパク質および／またはペプチドが凝集して、可溶性オリゴマーから沈降フィブリルおよび無定形プラークまでの毒性構造を形成する。凝集物を含んでなるこのようなクロスβ構造コンホメーションが、様々な疾患、例えばハンチントン病、アミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症および他の炎症疾患、リウマチ様関節炎、伝染性海綿状脳症、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失を伴う疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経疾患（癲癇）、脳症および全身性アミロイドーシスの根源にある。
【００１９】
クロスβ構造は、例えばタンパク質およびペプチドのアンフォールディングおよびリフォールディングに際して形成される。ペプチドおよびタンパク質のアンフォールディングは生物内で規則的に生じる。例えば、ペプチドおよびタンパク質はそれらのライフサイクルの最後で多くが自然にアンフォールドおよびリフォールドされる。更に、アンフォールディングおよび／またはリフォールディングは、例えばｐＨ、グリケーション、酸化ストレス、熱、放射線、機械的ストレス、タンパク質分解などのような環境要因で誘導される。ここで用いられている“クロスβ構造”という用語は、たとえミスフォールドタンパク質がクロスベータ構造を必ずしも含んでいないとしても、あらゆるクロスベータ構造前駆体およびあらゆるミスフォールドタンパク質も包含する。“クロスベータ結合分子”または“クロスベータ構造と特異的に結合しうる分子”という用語は、何らかのミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうる分子も包含する。
【００２０】
アンフォールディング（unfolding）、リフォールディング（refolding）およびミスフォールディングという用語は、タンパク質またはペプチドの三次元構造に関する。アンフォールディングとは、タンパク質またはペプチドがその三次元構造の少なくとも一部を失うことを意味する。リフォールディングという用語は、ある種の三次元構造へ戻るラセン化に関する。リフォールディングにより、タンパク質またはペプチドはその天然立体配置を取り戻すか、または不正確なリフォールディングが生じうる。“不正確なリフォールディング”という用語は、天然立体配置以外の三次元構造が形成されるときの状況に関する。不正確なリフォールディングもミスフォールディングと称される。タンパク質およびペプチドのアンフォールディングおよびリフォールディングは、クロスβ構造形成のリスクを伴う。クロスβ構造の形成は、正確にフォールドされたタンパク質中間体なしに、タンパク質合成後も時々は直接生じる。
【００２１】
クロスベータ経路：  ミスフォールドタンパク質への応答
我々は、ミスフォールドタンパク質の出現を感知し、ミスフォールドタンパク質の分解およびクリアランスをもたらす、クロスベータ経路と称される生物学的メカニズムについて以前に開示した（特許ＷＯ２００４／００４６９８）。我々は、クロスベータ構造またはクロスベータ構造前駆体を含んでなるタンパク質と共通した構造的特徴の、ミスフォールドタンパク質を認識する、ｔＰＡおよび密接関連タンパク質因子XII、肝細胞成長因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）およびフィブロネクチンを含めた、いくつかのタンパク質を実験で同定した。我々は、文献の解析に基づき、細胞表面レセプターを含めたいくつかの追加タンパク質が、ミスフォールドタンパク質のクリアランスを含めた、ミスフォールドタンパク質への体の応答に関与し、そのためクロスベータ経路の一部であることも開示した。我々は、これらタンパク質のいくつか、例えばｔＰＡおよびその関連物が、ミスフォールドタンパク質を直接認識しうることを開示した。上記のタンパク質は、３Ｄ構造および／またはアミノ酸配列の点で関連性がないと思われる、多数のリガンドと結合することが知られていた。これらのタンパク質リガンドは多くが疾患と関連しているが、認識の共通構造または配列様式の存在は当初特定されていなかった。包括的に、ミスフォールドタンパク質を認識するｔＰＡ、その関連物および他のタンパク質はそのため、ミスフォールドタンパク質のクリアランスを促進するメカニズム、即ちクロスベータ経路の一部である。クロスベータ経路が関与する生理学的プロセスの例は、長期増強、先天性免疫、適応免疫、血管形成、血液凝固、血栓形成およびフィブリン溶解である。クロスベータ経路の機能不全は、例えばクロスベータコンホメーションの凝集物またはフィブリルのような、アミロイドで通常みられる構造的特徴を伴うまたは伴わない、危険なミスフォールドタンパク質を形成するタンパク質をもたらす。上記と以前に特許出願ＷＯ２００４／００４６９８で述べられているように、ミスフォールドタンパク質は、一部がタンパク質ミスフォールディングと既に関連づけられた様々な健康問題および疾患と、そのようには未だ関連づけられていないその他について、根源に存在している。これらの健康問題および疾患には、ハンチントン病、局在性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症、炎症疾患、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、他の自己免疫疾患、記憶の喪失を伴う疾患、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病および他の神経疾患、例えば癲癇、脳症、脳炎、白内障、全身性アミロイドーシス、伝染性海綿状脳症、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病、および腎不全に罹患した患者で透析に関連したアミロイドーシスがある。
【００２２】
結論として、クロスベータ経路は、ミスフォールドタンパク質の感知、分解および／またはクリアランスに寄与する、クロスベータ構造結合化合物またはクロスベータ結合化合物またはミスフォールドタンパク質結合化合物と称される分子を含んでなり、そのうち一部はミスフォールドタンパク質と直接結合する。クロスベータ経路はタンパク質の非天然３Ｄフォールドを感知し、様々な様式で応答する。クロスベータ経路は、フォールディングおよび／またはリフォールディングを助けるため、ミスフォールドタンパク質の凝集物、フィブリルおよび／または沈降物の蓄積を防ぐために、ミスフォールドタンパク質と相互作用しうる、シャペロンのような分子も含んでなる。
【００２３】
例えば、ｔＰＡはミスフォールドタンパク質との直接結合に応答して活性化されるセリンプロテアーゼである。１つのこのようなミスフォールドタンパク質は、血餅に存在するフィブリンである。活性化で、ｔＰＡはチモーゲンプラスミノーゲンからプラスミンを生成する。セリンプロテアーゼプラスミンは次いで多くの基質、例えばプロコラゲナーゼのようなプロ酵素、およびフィブリンのような細胞外マトリックスタンパク質を開裂する。ｔＰＡ自体は、血餅のようなミスフォールドタンパク質の凝集物を分解させる事象のカスケードを開始させる。
【００２４】
他の例はＲＡＧＥである。このレセプターはグリケート化タンパク質、アミロイドおよびアミロイド性を含んでなる他のリガンドとの結合に関与し、多くの疾患、例えばアミロイドーシス、糖尿病および自己免疫疾患の病理に関係している。このレセプターの可溶形の投与は、前記タンパク質ミスフォールディング疾患のうちいくつかの動物モデルで有益な効果を有する。
【００２５】
クロスベータ経路に関与するミスフォールドタンパク質結合分子の更に他の例は、シャペロン、または熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）またはストレスタンパク質である。例えばハプトグロビンおよびクラスタリンのようなシャペロンがＡＴＰ非依存的にミスフォールドタンパク質の凝集物の形成の防止を助けるという事実は、それらをクロスベータ経路で重要な役割を果たす候補にしている。タンパク質コンホメーションの見本となる一連のタンパク質が協同で作用しているらしい。クロスベータ経路で協同作用するこれらのタンパク質の中には、シャペロン、例えばＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、ＤＮＡＫ、クラスタリン、ハプトグロビン、ｇｐ９６、ＢｉＰ、他の（細胞外局在）ＨＳＰ、プロテアーゼ、例えばＨＧＦＡ、ｔＰＡ、プラスミノーゲン、因子XII、IVIｇおよび細胞表面レセプターがある。クロスベータ経路に関与する細胞表面レセプターには、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ、ＣＤ９１）および関連物、ＣＤ３６、スカベンジャーレセプターＡ、スカベンジャーレセプターＢ‐Ｉ、包括的にマルチリガンドレセプターとも文献で称されているＲＡＧＥがある。
【００２６】
要するに、クロスベータ経路は、例えばアミロイドクロスベータ構造オリゴマーおよびフィブリルのような毒性構造を形成しないようにミスフォールドタンパク質を防止でき、ミスフォールドタンパク質（の凝集物）の分解およびクリアランスをなしうる。クロスベータ経路の一部として、ミスフォールドタンパク質はマルチリガンドミスフォールドタンパク質結合レセプターと結合して、エンドサイトーシスとその後でタンパク質分解を行う。
このように、クロスベータ経路の調節はタンパク質ミスフォールディング疾患の治療機会をもたらす。
【００２７】
ミスフォールディング疾患
上記のように、タンパク質ミスフォールディング疾患、ミスフォールドタンパク質疾患、タンパク質ミスフォールディング障害、コンホメーション疾患、ミスフォールドタンパク質関連および／または関係疾患またはタンパク質フォールディング障害と称されるタンパク質ミスフォールディングと関連した疾患にはアミロイドーシス(amyloidoses)を含み、タンパク質ミスフォールディングは必ずしもアミロイドーシスまたはタンパク質ミスフォールディング障害という用語で規定されない多くの他の疾患および健康問題および生理学的プロセスとも関連しており、そのうちいくつかは前記されている。
【００２８】
本発明によると、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるＩｇＩＶ分子で富化されたＩｇＩＶの選択は、現在使用のＩｇＩＶと比較して少なくとも１つの改善された性質を有している。本発明はしたがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子をＩｇＩＶ分子のコレクションから選択するための方法を提供する。これは、好ましくは、ＩｇＩＶ分子のコレクションをミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させ、該タンパク質および／またはエピトープと相互作用するアフィニティ（親和性）領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子を集めることにより行われる。したがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子をＩｇＩＶ分子のコレクションから集めるための方法が提供され、該方法ではＩｇＩＶ分子のコレクションをミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させ、該エピトープと相互作用するアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子を集める。
【００２９】
アフィニティ（親和性（affinity region））領域はタンパク質またはペプチドがエピトープと結合する親和性に影響を与え、エピトープと特異的に結合しうる抗体の少なくとも一部としてここでは定義される。該アフィニティ領域は、例えば免疫グロブリン（例えばＩｇＩＶ）の少なくとも一部、モノクローナル抗体の少なくとも一部および／またはヒト化抗体の少なくとも一部を含んでなる。該アフィニティ領域は、好ましくは抗体の重鎖の少なくとも一部および／または軽鎖の少なくとも一部を含んでなる。一態様において、該アフィニティ領域は二重Ｆ（ａｂ′）２または単一形Ｆａｂフラグメントを含んでなる。
【００３０】
通常、アフィニティ領域はＴ細胞、Ｂ細胞または他の免疫細胞のような細胞の表面で生じ、その場合にそれらは多くが細胞レセプターの一部である。アフィニティ領域はファージディスプレイライブラリーに合成形でも生じる。
【００３１】
本発明の一態様では、ＩｇＩＶ溶液の免疫グロブリンのコレクションをミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の集合体と、好ましくは所定の選択クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質、好ましくはクロスβ構造を含んでなる所定の選択タンパク質と接触させる。アフィニティ領域により認識されるエピトープは、一態様においてクロスβ構造自体に存在している。したがって、本発明の一態様は、エピトープがタンパク質のクロスβ構造の少なくとも一部である、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子をＩｇＩＶ分子のコレクションから選択するための、本発明による方法を提供する。他の態様において、該エピトープはクロスβ構造を含んでなる該タンパク質で露出されている。該エピトープは該クロスβ構造に必ずしも存在していない。通常、クロスβ構造はタンパク質の異なるフォールディングを誘導し、これは多くがこれまで未知のエピトープの誘導および／または露呈、または該タンパク質の既知エピトープの変化または欠失につながる。したがって、クロスβ構造がミスフォールディングに際して形成されたタンパク質は、クロスβ構造の存在に関連したエピトープを呈示することも可能である。一態様において、このような誘導および／または露呈エピトープと特異的に結合しうるＩｇＩＶ分子が選択される。
【００３２】
前記のように、ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる（ミスフォールド）タンパク質は、多くの疾患の症状の根本原因である。クロスβ構造の存在と関連した該症状は、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションの投与により、少なくとも一部軽減される。本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションは、例えば体液または組織サンプルのようなサンプルから、好ましくは疾患に関連および／または関係した、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドを除去し、それにより（循環）ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドの量を減少させるために特に適している。ここで用いられている“ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドを除去する”という用語は、サンプルから該タンパク質および／またはペプチドを分離し、並びにミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドのいずれか他の部分を結合、被覆、遮蔽および／または中和し、それにより該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドと他の結合分子との相互作用を少なくとも一部妨げることを含んでなる。こうして、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドの存在に関連した有害作用、例えばエイズにおける感染および／または炎症、および／または例えばリウマチ様関節炎および多発性硬化症のような痛くて激烈な疾患の症状は、少なくとも一部軽減される。同原理は、タンパク質がクロスβ構造（体により生成されるまたは病原体により生成および／または誘導されるクロスβ構造）の存在で変えられた炎症状態にも適用される。
【００３３】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と反応する抗体の低濃度および多様性のせいで、ポジティブな結果を達成するためには比較的多量のＩｇＩＶが投与されねばならず、そのことが有害副作用のリスクを増やしている。更に、現行ＩｇＩＶ治療では、それらが投与される疾患で機能を有しない多種のタンパク質の投与により、不必要なストレスが体に加えられる。したがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と特異的に結合しうるＩｇＩＶ分子について、ＩｇＩＶのプールから本発明による方法で選択が行われることは、大きな利点である。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と特異的に結合しうる免疫グロブリンの富化フラクションを含んでなる本発明によるＩｇＩＶ製剤は、クロスβ構造関連疾患に罹患するリスクのあるまたは既に罹患している非ヒト動物またはヒトへの投与に特に適している。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と特異的に反応しうるＩｇＩＶ分子を含んでなるＩｇＩＶの富化セレクションが投与されることから、現行ＩｇＩＶ治療より低い総濃度のＩｇＩＶ分子を用い、現在使用のＩｇＩＶと同様のまたはそれより一層良い治療効果をなお有することが可能になった。
【００３４】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなるＩｇＩＶ分子は、様々な手法でＩｇＩＶ分子のコレクションから選択される。例えば、該ＩｇＩＶ分子はＩｇＩＶ分子のプールをミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させることにより選択される。その後で、結合ＩｇＩＶ分子が集められる。一態様において、該クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質が疾患と関連している。例えば、ミエリン、ミエリン塩基性タンパク質および／またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質が、好ましくは、多発性硬化症を少なくとも一部治療および／または予防する際に使用のＩｇＩＶ分子を選択するために用いられる。同様に、コラーゲンおよび／またはリウマトイド因子が、好ましくは、リウマチ様関節炎を少なくとも一部治療および／または予防する際に使用のＩｇＩＶ分子を選択するために用いられる。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるＩｇＩＶ分子を選択するための様々な代替法が当業界で利用可能であり、それは本発明による方法で使用に適している。
【００３５】
本発明の１つの好ましい態様において、対象のいずれか所定のミスフォールドタンパク質および／または対象のいずれか所定のクロスβ構造エピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の対象のいずれか所定のエピトープと相互作用しうるＩｇＩＶ分子は、いずれかの種類のミスフォールドタンパク質、クロスβ構造エピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープを用いて選択される。本発明によると、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質またはアミロイドを含んでなる１種または数種のアフィニティマトリックスの使用で、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質と優先的、選択的にかつ高親和性で結合しうる、選択に用いられる一連のアフィニティ領域に必ずしも含まれていなかったアフィニティ領域が、アフィニティ領域のいずれかの組成物から選択される。選択ミスフォールドタンパク質が固定された固体支持体の使用で、事実上いかなるミスフォールドタンパク質とも親和性を有するアフィニティ領域が単離されることを、実施例が証明している。
【００３６】
加えて、本発明によると、フィブリル外形のミスフォールドタンパク質およびフィブリル特徴を欠くミスフォールドタンパク質凝集物の双方で、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質に広域特異性を示すアフィニティ領域が選択される。例えば、Ａβフィブリル‐アフィニティマトリックスで、例えばミスフォールドＢＳＡ‐ＡＧＥの非フィブリルマルチマー、ＡβおよびｄＯＶＡの凝集物に親和性を示すアフィニティ領域が選択される。他方、非フィブリルＨｂＡＧＥ‐マトリックスまたは非フィブリルミスフォールドＩｇＩＶ‐マトリックスの使用で、Ａβフィブリルと効率的に結合するアフィニティ領域が選択される。
【００３７】
実施例では、ウシ血清アルブミン‐ＡＧＥ‐マトリックスの使用で、ヒトＡβ、ヒトアルブミンおよびニワトリオボアルブミンと親和性をもつアフィニティ領域が選択された。ヒトＡβ‐マトリックスの使用で、グリケート化ウシ血清アルブミンおよびニワトリオボアルブミンと結合しうるアフィニティ領域が選択された。グリケート化ヒトＨｂ‐マトリックスで、ミスフォールドマウスＩｇＧと結合しうるアフィニティ領域が選択された。このように、本発明によると、１種に由来するミスフォールドタンパク質で、他種に由来するミスフォールドタンパク質と親和性を有するアフィニティ領域が選択されうる。
【００３８】
更に、本発明によると、ヒトＩｇＩＶアフィニティ領域のコレクションから、広範囲のタンパク質に結合性を示す、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４イソタイプを産生する少なくとも４種の異なるＢ細胞クローンに由来するアフィニティ領域が選択されるが、ここで該タンパク質は様々な種に由来し、実質的アミノ酸配列相同性も、類似のアミノ酸配列長さも、それらの天然フォールドで重複または類似３Ｄ構造も有する必要がないが、それらはミスフォールドタンパク質と共通した構造的特徴を有している。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質に特異性をもつ選択されたアフィニティ領域は、様々な適用例に有用である。以下では、タンパク質ミスフォールディング疾患に対する療法に用いられる富化アフィニティ領域が更に詳細に記載されている。
【００３９】
本発明による方法は、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患の療法および／または診断で適用しうるアフィニティ領域について、中でも選択を可能にする。本発明による方法の概略的な好ましい態様が図２６で示されている。選択のいかなるミスフォールドタンパク質（ミスフォールドーム(Misfoldome)を表わす図２６のミックスＸおよびＹ）もアフィニティ領域を選択するための使用に適するが、好ましくは疾患に関連したミスフォールドタンパク質（図２６のミックスＡ）が用いられる。ミスフォールドタンパク質は一般的に共通の特性を有しているため、２種以上の特定ミスフォールドタンパク質と結合するアフィニティ領域が選択される。しかしながら、この出願で開示されているように、ミスフォールドタンパク質のサブセットまたは単一タイプと優先的に結合するアフィニティ領域を選択することも可能である。一連のカラムを組み合わせることにより、当業者であれば、一般的にミスフォールディングの療法および／または診断に適用しうる、または選択のミスフォールドタンパク質が関与する特定の疾患または一連の疾患へ優先的に適用しうる、対象のアフィニティ領域を選択することができる。図２６で示されているように、カラムＩ（疾患と必ずしも関連しないミスフォールドタンパク質のミックス）の適用は、一般的なミスフォールドタンパク質、即ちミスフォールドームに親和性をもつアフィニティ領域（調製物１）をもたらす。このようなアフィニティ領域は診断と療法にも適する。しかしながら、疾患関連ミスフォールドタンパク質（望ましい治療効果）のみならず存在する他のミスフォールドタンパク質（療法の予測不能な副作用）とも結合するアフィニティ領域が患者に導入されるという事実のせいで、療法目的にこのようなアフィニティ領域の使用は副作用の潜在的リスクを伴う。カラムＩおよびIII、更に好ましくはカラムIIおよびIVを組み合わせることにより、疾患または一連の疾患に特異的なミスフォールドタンパク質と優先的に相互作用するアフィニティ領域が選択される。カラムIVは、選択の標的疾患と関連しないミスフォールドタンパク質と相互作用するアフィニティ領域を除去するために用いられる。このように、調製物３および４は特定療法目的で優先的に選択される。
【００４０】
このように、対象の疾患と関連したミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域を選択するために、２本のカラムが好ましくは用いられる。１本のカラム（“一般的カラム”）は、該疾患と必ずしも関連しないミスフォールドタンパク質を含んでなる。他のカラム（“特異的カラム”）は、一般的カラムと比較して、該疾患と関連するミスフォールドタンパク質を多く含んでなる。好ましくは、該特異的カラムのミスフォールドタンパク質は、本質的に該疾患と関連するミスフォールドタンパク質からなる。
【００４１】
一態様において、一般的カラムが最初に用いられる。このステップでは、いずれのミスフォールドタンパク質とも特異的に結合しうるアフィニティ領域が単離される。その後で、この態様によると、特異的カラムが用いられる。このステップでは、アフィニティ領域を含んでなる組成物が対象の疾患と関連するミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域で富化される。
【００４２】
他の態様では、上記のカラムが逆の順序で用いられる。最初に、対象の疾患と関連するミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域を単離するために、特異的カラムが用いられる。実際上、得られる組成物は対象の疾患と関連しないミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域も含んでなる。したがって、一般的カラムが好ましくはその後で用いられる。この第二カラムの重要な特性は、それが対象の疾患と関連するミスフォールドタンパク質を含まないかまたは少ない程度で含むにすぎないことである。該第二カラムは対象の疾患と関連しないミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域を結合させるが、それは対象の疾患と関連するミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域を結合させないかまたは少ない程度で結合させるにすぎない。こうして、フロースルーフラクションが対象の疾患と関連するミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域で富化される。
【００４３】
一態様において、選択されたＩｇＩＶ分子は、上記疾患に罹患したヒトまたは動物の体サンプルで、対象の所定タンパク質および／またはペプチドとのそれらの反応性について試験される。体サンプルからの対象の特異的タンパク質と結合しうる、本発明による選択ＩｇＩＶコレクションの能力は、例えば血小板凝集試験、オプソニン食作用試験および／または補体活性化または阻害試験で測定される。
【００４４】
別な一態様は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造であるエピトープまたはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープが、選択の効率を高めるために、例えばラテックス、アガロース、セファロース、ガラス、プラスチック、金属またはいずれか他の適切な材料、化合物、物質または分子の球体、粒子、ビーズ、シートまたはストランドのような支持体、例えば磁気ビーズに付着される、本発明による選択法を提供する。したがって、該ミスフォールドタンパク質および／または該エピトープが固体支持体に結合される、ここで記載されているような方法を本発明は提供する。
【００４５】
本発明は更に、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと特異的に相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなるＩｇＩＶ分子で富化された、ＩｇＩＶ分子のコレクションを提供する。上記のように、ＩｇＩＶ分子の該コレクションは現在使用のＩｇＩＶと比較して少なくとも１つの改善された性質を有している。本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションは、好ましくは、本発明による選択法で現在使用のＩｇＩＶから選択される。本発明の方法で、熟練者であれば、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと特異的に結合しうるアフィニティ領域を含んでなるＩｇＩＶ分子で富化されたＩｇＩＶ分子の小コレクションを、ＩｇＩＶの大コレクションから選択することができる。したがって、一態様は、本発明による方法で選択された、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなるＩｇＩＶ分子で富化された、ＩｇＩＶ分子のコレクションを提供する。本発明によるＩｇＩＶ分子の富化コレクションは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうる上記富化コレクション中におけるアフィニティ領域の相対的増加のおかげで、現在使用のＩｇＩＶ製剤より少量でこのような薬剤の必要な患者への投与に適している。
【００４６】
本発明は更に、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる、少なくとも５種の単離、合成および／または組換え分子を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、該組成物は少なくとも８種、更に好ましくは少なくとも１０種の上記単離、合成および／または組換え分子を含んでなる。１つの好ましい態様では、合成および／または組換え分子が用いられる。合成および／または組換え分子の組成物の利点は、ＩｇＩＶの必要性が除かれるという事実である。とりわけ、ＩｇＩＶの供給および入手が十分でなく、ヒト血液から得られる生物学的製剤の投与に伴いあるリスク（例えば、プリオン疾患および肝炎ウイルスまたはＨＩＶのような病原体に感染のリスク）があることから、これは有利である。本発明は本発明によるＩｇＩＶの富化セレクションを提供していたことから、必ずしも量ではなく、種類の点でＩｇＩＶ分子の該富化セレクションと同様の少なくとも１つの性質を有する合成および／または組換え分子を作製することが可能になった。ＩｇＩＶのある免疫グロブリンの富化セレクションが作製されたら、熟練者であれば該免疫グロブリンのまたは該免疫グロブリンの少なくともアフィニティ領域のアミノ酸配列を当業界で公知の方法（例えば、限定されないが、Maldi-Toff法）により決定することができる。該アミノ酸配列は次いで好ましくは、本発明による選択ＩｇＩＶ分子の少なくとも１種のアフィニティ領域と、必ずしも量ではなく種類の点で同様の結合特性を有する合成または部分的合成分子を選択または作製するために用いられる。合成または部分的合成分子の非制限例は、ペプチド、タンパク質または他の分子の組換えまたは化学合成により得られる生成物である。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質または該タンパク質のエピトープでファージディスプレイライブラリーを選別して、該ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と反応するアフィニティ領域を有する結合分子を選択することでさえ可能である。したがって、一態様は、ミスフォールドタンパク質、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子のアフィニティ領域のアミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列を含んでなる合成および／または組換え分子を作製することを含んでなる、本発明による組成物を作製するための方法を提供する。他の態様において、本発明はミスフォールドタンパク質、クロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる合成または組換え分子も提供し、該分子は前記のような方法に従い作製される。
【００４７】
このように、ＩｇＩＶから単離されたものと相似したアフィニティ領域は、例えば、タンパク質配列解析、、ＤＮＡクローニングおよび発現技術を含めた、当業者に公知の標準技術を適用することにより、組換えまたは合成で作製される。本発明の一態様は下記ステップを含んでなる：（１）少なくとも重および軽鎖双方の可変領域からの、または少なくとも相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ）からの、または少なくとも単離アフィニティ領域の重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３からのアミノ酸配列が、タンパク質配列解析により得られる。（２）特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列が合成で作製される。タンパク質解析で決定された正確な配列の代替物として、改変された親和性、好ましくは増加したおよび／またはより特異的な親和性をもつアフィニティ領域を作製するために、１以上の突然変異が、好ましくはＣＤＲ３、更に一層好ましくは重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３に導入された配列が作製されうる。（３）核酸が適切な発現ベクターへクローニングされる。このようなベクターは、好ましくは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥなどを得るために、望ましいタイプの免疫グロブリンの定常領域をコードする配列を既に含有している。（４）該ベクターが選択の発現系、好ましくは哺乳動物細胞へ何らかの手法で導入される。（５）アフィニティ領域を発現する細胞が選択される。（６）組換え産生アフィニティ領域が該細胞または細胞由来培養上澄から精製される。突然変異が親和性を最適化するように原アフィニティ領域配列へ導入されていれば、新たに作製されたアフィニティ領域が、好ましくは本発明による方法を用いて、場合により再選択される。好ましくは相補性決定領域、好ましくはＣＤＲ３、更に一層好ましくはＨＣのＣＤＲ３における、アフィニティ領域のレパートリーが更に増加した、半合成アフィニティ領域のこのような作製は、好ましくは半合成ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーの作製により行われる（下記参照）。
【００４８】
血液から得られるＩＶＩｇのようなヒト免疫グロブリンのコレクションのほかに、コンビナトリアルライブラリーもいずれか他の一連のアフィニティ領域、好ましくは一連の組換えアフィニティ領域、例えばファージディスプレイライブラリーに存在するものから得られる（Winter et al. 1994；Hoogenboom,1992,1997,2000,2002,2005）。好ましくは、このようなライブラリーは哺乳動物アフィニティ領域、好ましくはヒトアフィニティ領域、例えば免疫グロブリンに関連した配列から構成されている。１つの好ましい態様において、アフィニティ領域のコレクションを含んでなるこのようなファージディスプレイライブラリーは次のように作製される（Winter et al.1994, de Kruif et al,1995a,1995b）：最初に、Ｂ細胞からまたはＢ細胞を含んでなる組織からＲＮＡが抽出される。その後で、ｃＤＮＡが作製される。次いで、可変領域をコードするｃＤＮＡが増幅され、適切なファージミドベクターへクローニングされ、例えばEscherichia coli株のような適切な宿主へトランスフォームされる。こうしてアフィニティ領域が発現され、即ち繊維状バクテリオファージの表面で融合タンパク質としてファージにより呈示される。ファージディスプレイライブラリーは、例えば、健康な哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、ラットまたはラマから、または代わりにミスフォールドタンパク質で免疫された哺乳動物から得られるＢ細胞から作製される。一態様において、ファージディスプレイライブラリーは、特定の疾患、好ましくはミスフォールディング疾患、例えばＲＡに罹患した哺乳動物、好ましくはヒトのＢ細胞から作製される。こうして、アフィニティ領域のコレクションが、ミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域を含むように、特別な目的で作製される。例えば、一態様では、マウスが（実施例２０の場合のように）ミスフォールドタンパク質の１種またはセレクションで１回または数回免疫され、Ｂ細胞が脾臓から単離され、ファージディスプレイライブラリーを作製するために用いられる。他の態様では、Ｂ細胞が特定の疾患、例えば（リウマチ様）関節炎のヒトから単離される。これらのＢ細胞から作製されたｃＤＮＡが次いで、好ましくはファージディスプレイライブラリーを作製するために用いられる。こうして、ファージディスプレイライブラリーが選択ミスフォールディング疾患に関与するミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域を含むように作製される。例えば、ＩｇのＦｃドメインにアフィニティ領域、即ちリウマトイド因子（ＲＦ）のようなアフィニティ領域をもつライブラリーが作製される（van Esch et al.2003,Clin Exp.Immunol）。上記手法で、当業者であれば、特定の疾患または適用例に力点を置いたアフィニティ領域のコレクションをもつファージディスプレイライブラリーをデザインおよび作製することができる。
【００４９】
一態様において、レパートリーが増加したアフィニティ領域のこのようなコレクションをもつファージディスプレイライブラリーが合成で作製される（Hoogenboom, 1992,1997,2000,2002,2005；de Kruif et al,1995a,1995b）。このように、当業者であれば、顕著な追加多様性のアフィニティ領域を含んでなるライブラリーをデザインすることができる。好ましくは、抗原と相互作用するＣＤＲ、超可変領域に追加配列を入れることにより、可変ドメインを作り直して追加のアフィニティ領域が作られる。ヒト配列から得られるアフィニティ領域のほかに、ラマ、ラクダ、アルパカまたはカメリド（camelid）のようないずれか他の種から作製されたアフィニティ領域のコレクションも、これらの種に関連した性質をもつ、ナノボディとも称される、ラマ抗体のようなアフィニティ領域を得るために、一態様として存在する。こうして、ファージディスプレイライブラリーおよび／またはアフィニティ領域のコレクションが多くの手法で、例えば１種または一連のミスフォールドタンパク質で免疫された哺乳動物から作製される。特に好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリーおよび／またはアフィニティ領域のコレクションが、疾患、好ましくはミスフォールディング疾患の哺乳動物から作製される。ミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域は、好ましくはファージを単離するための標準操作と組み合わせて、好ましくは本発明による手段および方法を用いてファージディスプレイライブラリーから選択される。最も率直には、好ましい態様において、好ましくはこの出願で開示された操作のいずれか１つに従い、ミスフォールドタンパク質が作製および固定され、その後でファージと結合させられる。徹底洗浄後、結合ファージが回収され、宿主の再感染により増幅される。特異的ファージのみの回収を行うために、選択操作が好ましくは数回繰り返される。最後に、ミスフォールド標的と特異的に結合しうるファージが単離される。特に好ましい態様において、ミスフォールドタンパク質は疾患の個体または個体の組合せから得られた組織サンプルから単離される。例えば、ミスフォールドタンパク質は、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるタンパク質、例えば（リウマチ様）関節炎の患者の滑液からのｔＰＡ、ＲＡＧＥまたはその機能相当物（表４参照）を用いて単離される。同様に、いずれか他のサンプルも用いられる。
【００５０】
上記のようなアプローチを用いて、ミスフォールドタンパク質に関して組換え産生されたアフィニティ領域が得られる。
【００５１】
適切なファージの選択後、単離アフィニティ領域の可変領域をコードするＤＮＡが、好ましくは完全抗体を作製するためにファージミドＤＮＡから単離される。これは標準操作に従い容易に行われる。該ＤＮＡが、好ましくは重および軽鎖の定常領域をコードするベクターへクローニングされる。いかなるベクターおよびいかなる望ましいタイプの定常領域も用いられる。ベクターは、選択の発現系、好ましくは哺乳動物細胞へ、好ましくはいずれか公知の手法で導入される。アフィニティ領域を発現する細胞が好ましくは選択される。組換え産生されたアフィニティ領域は、好ましくは細胞または細胞由来培養上澄から精製される。こうして、ミスフォールドタンパク質に関するいかなる免疫グロブリンアフィニティ領域も作製される（Bloemendal et al 2004；Huls et al 1999a,1999b；Boel et al 2000）。
【００５２】
ヒトで使用の場合は、“キメラ”または“ヒト化”組換えアフィニティ領域が好ましくは作製される。好ましくは、非ヒト配列が可能であればどこでもヒト配列と置き換えられて、アフィニティ領域の結合性が好ましくは過度に影響されないように、他の種から得られたアフィニティ領域が修飾される。一態様において、好ましくはマウスまたはラットを用いて、更に一層好ましくはヒト免疫グロブリンをコードするトランスジェニックマウスを用いて、アフィニティ領域が古典的免疫化戦略に際して作製される。免疫後、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系が、好ましくは標準操作によりおよび／または上記のファージディスプレイ技術を適用することにより作製される。ミスフォールドタンパク質と特異的に相互作用しうるモノクローナル抗体が好ましくは選択される。このようなアフィニティ領域の“キメラ”または“ヒト化”バージョンは、正常マウスまたはラットを用いて作製されるとき、例えば非ヒト定常領域および関連非ヒト可変領域を関連ヒト相同性領域で置き換えることにより作製される（Morrison et al 1984；Jones et al.1986）。更に、所望であれば異なる定常領域が導入される。
【００５３】
１つの好ましい態様において、本発明による組成物は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用しうるアフィニティ領域を含んでなる少なくとも１種のＩｇＩＶ分子の機能性部分、誘導体および／またはアナログを含んでなる。ＩｇＩＶ分子の機能性部分は、必ずしも量ではなく種類の点で同様の免疫学的結合性を有する化合物として定義される。該機能性部分はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合しうるが、必ずしも該ＩｇＩＶ分子と同程度ではない。ＩｇＩＶ分子の機能性誘導体は、得られる化合物のミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合する能力が必ずしも量ではなく種類の点で本質的に同様であるように改変されたＩｇＩＶ分子として定義される。誘導体は多くの手法で、例えば保存的アミノ酸置換で得られ、それにより全体的機能性がさほど影響されないかまたは変更されないように、通常類似した性質（サイズ、疎水性など）の他の残基でアミノ酸残基が置換される。
【００５４】
当業者であれば、ＩｇＩＶ分子の相似化合物をうまく作製することができる。これは例えばペプチドライブラリーのスクリーニングにより行える。このようなアナログはミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合しうるが、必ずしも該ＩｇＩＶ分子と同程度ではない。
【００５５】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと特異的に結合しうるアフィニティ領域を含んでなる選択ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成または組換え分子は、インビトロでミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と反応および結合させるために用いられる本発明の一態様として存在する。該分子は、好ましくはミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を含んでなる体液または組織、食物、流体または医薬組成物のサンプルと反応して、結合物質が好ましくは除去される。本発明による分子の他の適用例は、インビボでミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と反応および結合させることである。
【００５６】
１つの好ましい態様は、上記分子の少なくとも１種がミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合化合物を更に含んでなる、本発明による組成物を提供する。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合化合物とは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造と特異的に結合しうる化合物である。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合分子は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と特異的に結合しうる本発明による組成物の分子の能力を高めることにより、エフェクター分子として働くことができる。該クロスβ構造結合分子に起因したミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の結合性増強は、例えば、循環および／または体からミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造複合体の形成および除去を高めるために望まれる。一方または加えて、アミロイドプラークに存在するようなミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の局所蓄積が減らされる。
【００５７】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合分子の非制限例は、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、肝細胞成長因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）、因子XII、フィブロネクチンまたはマルチリガンドレセプターファミリーのメンバー、例えば前進性グリケーション終末産物のレセプター（ＲＡＧＥ）、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）またはＣＤ３６のフィンガードメイン（フィブロネクチンＩ型ドメインとも称される）である。このようなミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合分子は、例えば色素（コンゴーレッドまたはチオフラビン）のような非タンパク質分子であってもよい。
【００５８】
一態様において、エフェクター分子が本発明の単離、合成および／または組換え分子および／または本発明の選択ＩｇＩＶ免疫グロブリンに供される。分子の少なくとも１種がエフェクター分子を更に含んでなる、本発明によるＩｇＩＶ分子の組成物およびコレクションも、したがって提供される。１つの好ましい態様において、該エフェクター分子は例えばコンゴーレッドのようなミスフォールディングのインヒビターを含んでなる。他の好ましい態様において、該エフェクター化合物は、望ましくないクロスβ構造（を含んでなるタンパク質）の除去を高めるために、動物（好ましくはヒト）の補体系および／または食細胞系を増強しうる。このように、１つの好ましい態様において、該エフェクター化合物は、限定されないが、例えばいずれかの補体タンパク質、補体活性化サイトカイン、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＰ成分、ペントラキシン-３、免疫グロブリンのＦｃ領域（Ｃ１ｑのリガンド）、補体制御タンパク質、補体制御タンパク質の補体活性化活性を高められる分子、および／または補体制御タンパク質の阻害活性を阻害しうる分子のような補体活性化因子を含んでなる。補体制御タンパク質の非制限例は、Ｃ１‐インヒビター、Ｃ４結合タンパク質、因子Ｈ、因子Ｉ、プロペルジン、Ｓタンパク質、補体レセプターＩ型、膜補因子タンパク質、崩壊促進因子、Ｃ８結合タンパク質およびＣＤ５９である。別な好ましい態様において、該エフェクター化合物はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の分解を促進しうる。該エフェクター化合物の他の好ましい性質は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の細胞取込みを促進させる能力である。一態様は、該単離、合成および／または組換え分子、または該選択ＩｇＩＶ分子が、プロテアーゼまたはそのミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合部分であるエフェクター化合物を含んでなる、本発明による組成物を提供する。該エフェクターは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる望ましくないタンパク質を結合および／または分解させるために特に適している。別な好ましい態様において、該エフェクター化合物は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質に対する免疫応答を高めるために、免疫増強化合物を含んでなる。該免疫増強化合物は好ましくはサイトカインを含んでなる。
【００５９】
別な態様において、該エフェクター化合物はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合増強因子を含んでなる。これは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合する、本発明による分子の能力を高められる因子である。このような因子の非制限例はチオフラビンＴおよびチオフラビンＳである（例えば、実施例４参照）。
【００６０】
別な態様において、該エフェクター化合物は、本発明の分子および／またはＩｇＩＶ分子がミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合した後で、得られる複合体の除去を助けるクリアランスシグナルを含んでなる。クリアランスシグナルは当業界で周知である。クリアランスシグナルの好ましい例は、Ｆｃ領域、更に好ましくはＦｃレセプター（好ましくは、ＦｃγIIｂレセプター）と相互作用しうるＦｃγ領域の少なくとも一部である。該クリアランスシグナルは、動物（好ましくはヒト）の循環および／または体からミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質に結合された本発明による分子を含んでなる複合体の除去を高められる。
【００６１】
補体系の活性化は、炎症、細胞破壊および組織損傷を含めた反応のカスケードをもたらす。一部の環境では、有害副作用を鈍らせるために、補体系に対抗することが望まれる。このような環境の非制限例は、補体系の過剰および／または未制御活性化、または適正に機能する負のフィードバックメカニズムのない補体系の（持続的）活性化、または例えば炎症、アミロイドーシスおよび／またはリウマチ様関節炎のような、例えばアクチベーターの持続的および／または過剰発現レベルによる、補体系の過剰刺激が存在する状況である。一態様において、炎症抑制化合物、好ましくは補体阻害因子、例えば免疫グロブリン、または補体タンパク質の重要な機能性を少なくとも一部阻害または遮蔽しうるおよび／または補体系刺激能力を含んでなる何らかのタンパク質または化合物の重要な機能性を少なくとも一部阻害または遮蔽しうる化合物である、エフェクター化合物がしたがって用いられる。補体阻害因子の非制限例は、可溶性ＴＮＦレセプター、ＩＬ−１レセプターアンタゴニストおよび抗炎症サイトカインである。
【００６２】
更に他の態様において、該エフェクター化合物はオプソニン化化合物を含んでなる。加えてまたは一方、本発明の該単離、合成および／または組換え分子はそれ自体がオプソニン化化合物である。オプソニン化は、マクロファージ、多形核細胞などのような食細胞による物質の食作用を誘導および／または増強するプロセスとして、ここでは定義される。一部の物質は、例えばそれら表面の性質のせいで、食作用を耐えられるおよび／または免れる。このような場合、食作用は、好ましくは、物質へ付着すると、マクロファージ、多形核細胞などのような食細胞による該物質の取込みを促進する、オプソニン化結合化合物により誘導および／または増強される。
【００６３】
一態様において、本発明による選択ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子がオプソニン化能力を有しているかどうかが、食細胞を用いて調べられる。この態様によると、本発明によるＩｇＩＶ分子の富化セレクションが用意されたら、該セレクションがミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と好ましくはインキュベートされ、その後で、ＩｇＩＶ分子が該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の食作用を誘導および／または増強しうるかどうかを調べるために、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質に結合されたＩｇＩＶ分子の複合体が食細胞と接触させられる。もちろん、本発明による単離、合成および／または組換え分子と同種の試験を行うことも可能である。更には、したがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のエピトープと相互作用する際におよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のエピトープと相互作用する際に、食細胞により該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のオプソニン化を誘導しうるアフィニティ領域を含んでなる分子を、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションまたは本発明による組成物から選択するための方法が提供され、該方法では：
‐本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と接触させ；
‐ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子に結合されたミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を含んでなる複合体を食細胞と接触させ；および
‐該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の食細胞による食作用を誘導または増強しうるＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子を集める。
【００６４】
該試験は好ましくはインビトロで行われる。食作用を誘導または増強しうる選択ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子は、好ましくは、食作用を耐えられるおよび／または免れるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質のオプソニン化を誘導および／または増強するために用いられる。食作用を耐えられるおよび／または免れるこのようなミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質は、例えば食作用を誘導または増強しうる分子が低（機能性）レベルで不在または存在する病状、例えばエイズ、ＳＣＩＤＳおよび無γグロブリン血症と、例えばミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の形成が増す病状、例えばＴＳＥ、アミロイドーシス、糖尿病、血栓症および炎症で生じる。
【００６５】
前記のように、ミスフォールドタンパク質および／またはタンパク質中のクロスβ構造は、例えばハンチントン病、アミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症および他の炎症疾患、リウマチ様関節炎、伝染性海綿状脳症、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失を伴う疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経疾患（癲癇）、脳症および全身性アミロイドーシスのような疾患のリスクおよび／または存在と、多くが関連および／または関係している。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と特異的に結合しうる、本発明によるＩｇＩＶ分子の富化コレクションおよび本発明による単離、合成および／または組換え分子のコレクションは、このようなミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係疾患を少なくとも一部予防および／または治療するために特に適している。一態様はしたがって、薬剤および／または予防剤としての使用向けに、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を提供する。本発明は更に、薬剤および／または予防剤の製造のための、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物の使用を提供する。該薬剤および／または予防剤は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の出現と関連および／または関係する疾患、血液凝固障害、敗血症、炎症および／または微生物、病原体、細菌、寄生虫および／またはウイルスによる感染症を少なくとも一部予防、治療および／または安定化するために特に適している。更には、したがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係疾患、血液凝固障害、敗血症、炎症および／または微生物／病原体／寄生虫／細菌／ウイルス感染症の少なくとも部分的な予防および／または治療のための薬剤の製造のための、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物の使用が提供される。本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を個体へ投与する、個体におけるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係疾患、血液凝固障害、敗血症、炎症および／または微生物／病原体／寄生虫／細菌／ウイルス感染症の少なくとも部分的な予防および／または治療のための方法も、合わせて提供される。
【００６６】
１つの好ましい態様において、該微生物／病原体／寄生虫／細菌／ウイルス感染症は日和見感染症を含んでなる。これは、通常疾患を引き起こさないが、ある環境下（例えば免疫系障害）で病原性になる、例えば病原体および／またはウイルスのような生物による感染症である。免疫系障害は、例えば化学療法のような薬物治療で引き起こされる。特に好ましい態様において、該微生物／病原体／寄生虫／細菌／ウイルス感染症はＨＩＶ関連日和見感染症を含んでなる。日和見感染症はＨＩＶ患者で主要な死因であるため、このような感染症に対する薬剤および／または予防剤を提供することが高度に望まれる。多くの日和見感染症はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在を伴う。例えば、アミロイド構造が真菌、酵母および細菌のような微生物の表面で生じる。該アミロイド様構造は、真菌でハイドロフォビン、グラム陽性菌でチャプリン（chaplin）およびグラム陰性菌でカーリ（curli）、タフィ（tafi）または凝集ふさと通常称されている。本発明によるＩｇＩＶ分子の富化コレクションおよび本発明による単離、合成および／または組換え分子のコレクションはこのようなミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合させるために特に適しているため、本発明の該コレクションはＨＩＶ関連日和見感染症に対抗および／またはそれを少なくとも一部予防するために特に適している。本発明はしたがって、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を個体へ投与する、個体でＨＩＶ関連日和見感染症の少なくとも部分的な予防および／または治療のための方法を提供する。
【００６７】
本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と適切なキャリア、希釈物および／または賦形剤を含んでなる組成物も、合わせて提供される。該組成物は好ましくは医薬組成物を含んでなる。治療の必要な患者へ本発明による薬剤を投与しうるために、該薬剤は製薬上許容される処方のための要件を満たさねばならない。これは、医薬グレードであって生理学上許容され異物に関して試験された、本発明によるＩｇＩＶ分子の富化コレクションおよび／または本発明による単離、合成および／または組換え分子のコレクションを、本発明による薬剤が含んでなることを意味する。本発明によるＩｇＩＶ分子の富化コレクションおよび／または本発明による単離、合成および／または組換え分子のコレクションと製薬上許容されるキャリア、希釈物および／または賦形剤を含んでなる医薬組成物も、合わせて提供される。好ましくは、該組成物は、該医薬組成物とミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質との相互作用を高めるために、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合化合物を含んでなる。したがって、本発明はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合化合物を更に含んでなる本発明による組成物を提供する。本発明の別な好ましい態様において、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質への本発明による組成物の結合は、そのミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合増強特性について知られた化合物、例えばチオフラビンＴまたはチオフラビンＳのような色素分子の添加により、更に向上または増強される。したがって、本発明はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造結合増強化合物を更に含んでなる本発明による組成物について開示している。
【００６８】
他の好ましい態様において、体からミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の除去は、補体活性化を高められる補体増強シグナルを本発明による組成物へ加えることにより高められる。したがって、本発明は、更に補体増強化合物を含んでなる、本発明による組成物を提供する。
【００６９】
補体系の活性化は炎症、細胞破壊および組織損傷を含めた反応のカスケードをもたらすため、補体活性化に少なくとも一部対抗することが時には望まれる。一部の場合に、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のクリアランスに関する補体系の活性化は、それ自体が病気を引き起こす。このような場合に、本発明による組成物は補体阻害化合物を好ましくは更に含んでなる。一態様において、本発明による組成物は炎症抑制化合物を含んでなる。
【００７０】
本発明は更に、個体で細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増すための手段および方法を提供する。自然状況において、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の形成は、例えばミスフォールドタンパク質、アポトーシス細胞または更には病原体のような望ましくない分子の除去を取り扱う、事象の生理学的カスケードを開始させるおよび／またはに関与する。この経路は、小胞体での合成に際するタンパク質ミスフォールディング、フィブリン溶解、神経シナプスネットワークの形成、使用済み、望ましくないおよび／または破壊された（変性された）タンパク質のクリアランス、アポトーシスの誘導およびアポトーシス細胞、壊死細胞、老化細胞および／または病原体のクリアランスを含めたいくつかのプロセスに際して、望ましくない生体分子の除去を調節する。本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび本発明による組成物はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造およびクロスβ構造を含んでなるタンパク質と結合させるために特に適しているため、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスが増加される。更には、したがって、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を個体へ投与する、個体で細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させるための方法が提供される。
【００７１】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造およびクロスβ構造を含んでなるタンパク質を結合および除去することにより、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物は、個体でミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造媒介効果に少なくとも一部対抗しうる。更には、したがって、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物の有効量を個体へ投与する、個体でミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造媒介効果を少なくとも一部阻害するための方法が提供される。
【００７２】
好ましい態様において、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質により誘導される血小板凝集を阻害するために用いられる。このような使用の例が実施例２で示されている。したがって、本発明はタンパク質誘導血小板凝集を阻害するための本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物の使用を提供する。
【００７３】
他の好ましい態様において、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質へのセリンプロテアーゼ組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の結合と競合させるために用いられる。ｔＰＡはプラスミノーゲンの開裂でプラスミンの形成を誘導する。プラスミンはフィブリンを開裂し、これは血餅の溶解時に生じる。マウスではフィブリン溶解に必須でないが、ｔＰＡはフィブリン溶解でのその役割についてずっと認識されてきた。ｔＰＡによるプラスミノーゲンの活性化はフィブリンまたはフィブリンフラグメントにより刺激されるが、その前駆体、フィブリノーゲンによるものではない。ｔＰＡはミスフォールドタンパク質およびクロスβ構造結合タンパク質、マルチリガンドレセプターおよびクロスβ構造経路のメンバーである。ｔＰＡはミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造誘導細胞機能障害および／または細胞毒性を媒介する。ｔＰＡはプラスミノーゲンの活性化で細胞機能障害および／または毒性を少なくとも一部媒介する。プラスミノーゲン依存効果は、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物で阻害される。病状に際する過剰または未制御ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化がこうして治療される。このような病状の非制限例はアルツハイマー病、感染症、子癇前症、狭心症、炎症および非炎症関節疾患、糖尿病である。
【００７４】
１つの好ましい態様は、サンプルからミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の少なくとも部分的な除去のための、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物の使用を提供する。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の除去は、様々な適用例で望まれている。例えば、個体がミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在と関連および／または関係する障害に罹患している、または罹患するリスクがあるならば、体からこのようなミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の除去は、このような障害に対抗するおよび／または有害副作用を軽減するために有益である。更に、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の取込みを少なくとも一部避けるためには、（ヒト）消費向けの製品からミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を除去することが有利である。一態様はしたがってサンプルからミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を少なくとも一部除去するための方法を提供し、該方法ではサンプルを本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と接触させ、ＩｇＩＶ分子および／または単離、合成および／または組換え分子に結合されたミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の複合体を該サンプルから除去する。該サンプルは好ましくは流体サンプルを含んでなる。一態様において、該流体は食品物質を含んでなる。
【００７５】
１つの好ましい態様において、該サンプルは体液を含んでなる。この態様は、動物、好ましくはヒト個体のミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係障害を少なくとも一部予防および／または治療するために特に適している。１つの好ましい態様では、体外透析が適用される。例えば、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造関連および／または関係障害に罹患した患者が血液の透析に付される。本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物は、例えば、透析に用いられるキャリアまたは支持体および／またはチューブの内側にカップリングされる。こうして、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造およびクロスβ構造を含んでなるタンパク質が患者の血流から除去され、それにより該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と関連および／または関係するネガティブ効果の患者を少なくとも一部救済する。他の例として、このような使用は腎臓患者の血液透析で適用される。本発明による方法を実施するための分離装置も提供される。一態様はこうして本発明による方法を実施するための分離装置を提供し、該装置は（循環）流体を輸送するためのシステムを含んでなり、該システムはフロー流体、好ましくは個体の循環へ接続するための手段、該システムへの流体のエントリーと該システムから好ましくは個体の循環への流体のリターンのための手段を備え、該システムは更に固相を含んでなり、該固相は本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を含んでなる。該分離装置は好ましくは透析装置を含んでなる。
【００７６】
他の好ましい態様は、製薬またはその成分のいずれかからミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の少なくとも部分的な除去のための、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび組成物の使用を提供する。活性物質としてタンパク質またはタンパク質化合物を含んでなる現今医薬組成物の重要なカテゴリーとして、ホルモン、酵素、ワクチンおよび抗原、サイトカインおよび抗体があるが、それらに限定されない。上記タンパク質医薬組成物に加えて、多数の医薬組成物がタンパク質を含んでなる生産および／または精製ステップの助けで製造されている。例えば、多くの医薬組成物は安定剤として１種以上のタンパク質を含んでなる。医薬組成物の使用と関連した健康問題は、例えば血液学、フィブリン溶解および免疫学の分野に関する。医薬組成物の投与後に観察される副作用の不完全リストは、例えば、致死性のこともある、発熱、アナフィラキシー応答、（自己）免疫応答、止血の障害、炎症、フィブリン溶解問題、例えば敗血症および汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）を含んでなる。該副作用は、例えば、該医薬組成物に存在するタンパク質またはタンパク質化合物の変化により、あるいは該医薬組成物の追加希釈物またはキャリア物質により引き起こされる。医薬組成物のタンパク質化合物の変化は、例えば変性、マルチマー化、タンパク質分解、アセチル化、グリケーション、酸化、タンパク質のアンフォールディングまたはミスフォールディングを含んでなる。最初適正にフォールドされた天然タンパク質のアンフォールディングまたはミスフォールディングは、該タンパク質で毒性構造の形成に至る。医薬組成物の毒性構造は、多くがミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなる。該毒性構造は、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物で少なくとも一部除去される。
【００７７】
したがって、タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分のいずれかからミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を除去するための方法が提供され、該方法では：
‐タンパク質を含んでなる該医薬組成物またはその成分のいずれかを本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と接触させ；
‐該ＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または組成物への該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の結合を行わせ；および
‐タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分のいずれかから、結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質を分離する。
【００７８】
医薬組成物からミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を除去することにより、望ましくない副作用が少なくとも一部減少および／または防止される。したがって、医薬組成物の望ましくない副作用を減少させるおよび／または防止するおよび／またはタンパク質グラム当たりの比活性を増加させるための方法も提供され、該方法では、本発明による方法を用いて、該医薬組成物またはその成分のいずれかから、アンフォールドタンパク質、アンフォールドペプチド、ミスフォールドタンパク質、変性タンパク質、凝集タンパク質、凝集ペプチド、マルチマー化タンパク質および／またはマルチマー化ペプチド、および／またはクロスβ構造を含んでなるペプチドを除去する。
【００７９】
本発明による方法で得られる、タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分のいずれかも、合わせて提供される。該医薬組成物は、未処理医薬組成物と比較して、望ましくない副作用のリスクが低下している。
【００８０】
一態様において、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質は、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または単離、合成および／または組換え分子の組成物を用いてサンプルから除去され、ここで該コレクションおよび／または組成物は固体支持体に結合されている。これは連続プロセスが可能となる利点を呈し、ここでは該固体支持体がサンプルとインキュベートされる。その後で、該サンプルおよび該固体支持体は互いに容易に分離され、該固体支持体は（間接的に）結合されたミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を含んでなり、一方得られたサンプルはミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の低下濃度を有している。
【００８１】
更に他の態様では、本発明による選択ＩｇＩＶ免疫グロブリンおよび／または単離、合成および／または組換え分子が診断キットを作製するために用いられる。該診断キットは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在と関連および／または関係する疾患の診断に特に適している。該キットは、好ましくは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と相互作用しうる、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションの少なくとも１種のアフィニティ領域、および／または本発明による組成物の少なくとも１種のアフィニティ領域と、該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／または該タンパク質と該アフィニティ領域との相互作用の視覚化の手段を含んでなる。
【００８２】
このような診断キットでは、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在と通常関連および／または関係する疾患のみならず、より詳しい診断も、キットにおけるアフィニティ領域の特異性に応じて可能である。障害の１種を特異的に診断しうる診断キットは、例えば、該障害の１種に特異的な所定のミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる所定のタンパク質、例えばリウマチ様関節炎、ＳＬＥまたは他の自己免疫疾患、または炎症反応に関連するタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域を該キットに備えることにより作製される。したがって、一態様において、本発明は、該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造が疾患関連ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造である、上記のような診断キットを提供する。
【００８３】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造およびクロスβ構造を含んでなるタンパク質は本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と効果的に結合されるため、それらはサンプルおよび／または動物またはヒトの体から効果的に分離および／または単離され、その後で同定される。更に他の態様では、したがって、本発明による選択ＩｇＩＶ免疫グロブリンおよび／または単離、合成および／または組換え分子がミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を単離するために用いられる。好ましくは、例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液、滑液、痰および／または尿のような体液に存在するミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質が同定される。例えば、健康な個体のミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の存在および／または同一性が、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と関連および／または関係する疾患のある個体からのミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の存在および／または同一性と比較される。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の同一性および相対濃度が、限定されないが、例えば２Ｄゲル電気泳動および／または質量スペクトル分析のような、当業者に知られたいずれかの方法を用いて調べられる。健康な個体からのサンプルと患者からのサンプルとの結果が、好ましくは比較される。こうして、例えば特定の病状時にミスフォールドするおよび／またはクロスβ構造コンホメーションをとる傾向があるタンパク質の同一性および／または感受性に関する情報が得られる。この得られた情報はその後で、例えば病状をモニターする、療法の有効性をモニターする、疾患の発生をモニターするための診断ツールとして役立ち、好ましくは特定の疾患に特異的なミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を標的とする療法の開発のために有益な手がかりを提供する。
【００８４】
本発明はしたがって、タンパク質を含んでなるサンプル中におけるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の同一性の決定のための方法を提供し、該方法では：
‐該サンプルを本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と接触させて、結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質を得、および
‐結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質を同定する。該結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質は、好ましくは、当業界で知られているいずれかの方法を用いて、該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を解析することにより同定される。該サンプルは好ましくは水溶液、更に好ましくは体液を含んでなる。１つの好ましい態様において、健康な個体（好ましくはヒト）からの体液とミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在と関連および／または関係する疾患に罹患したまたは罹患していると疑われる個体からの体液が、健康状態を病状（または疾患のリスクが高められた状態）と比較するために用いられる。
【００８５】
本発明は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質と相互作用しうるアフィニティ領域を有した免疫グロブリンをＩｇＩＶ分子のコレクションから選択する手法を提供することから、熟練者であれば、ミスフォールドされたおよび／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質またはペプチドがサンプル中に存在しているかどうかを調べるために、本発明による該ＩｇＩＶおよび／または単離、合成および／または組換え分子を用いることもできる。したがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質および／またはペプチドがタンパク質を含んでなる水溶液中に存在しているかどうかを調べるための方法が提供され、該方法では：
‐該水溶液を本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と接触させ、および
‐結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質および／またはペプチドが存在しているかどうかを検出する。該タンパク質および／またはペプチドは、好ましくは、該水溶液を本発明のコレクションおよび／または組成物と接触させ、結合ペプチドおよび／またはタンパク質を検出することにより、水溶液で検出される。このように、タンパク質を含んでなる水溶液でミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質および／またはペプチドを検出するための方法が提供され、該方法では、該水溶液を本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と接触させて、結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造またはクロスβ構造を含んでなる結合タンパク質および／またはペプチドを得、結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質および／またはペプチドを検出する。本発明の該コレクションおよび／または組成物とミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造との結合は、好ましくは、例えば蛍光染色または酵素もしくは比色検出によるような視覚化反応で、または熟練者に利用されるいずれか他の視覚化系で検出される。
【００８６】
該水溶液は、好ましくは、洗剤、食物製品、食物サプリメント、細胞培地、リサーチ目的に用いられる市販タンパク質溶液、血液、血液製剤、体液、例えば尿、脳脊髄液、滑液、リンパ液および／または痰、化粧品、細胞、タンパク質を含んでなる医薬組成物またはその成分のいずれか、またはこれらのいずれかの組合せを含んでなる。
【００８７】
蓄積沈着ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造のタンパク質の存在を調べるための、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物の使用も、合わせて提供される。好ましくは、コンホメーション疾患に関与するミスフォールドタンパク質の存在が検出される。コンホメーション疾患は、タンパク質のミスフォールディングおよび／またはタンパク質のコンホメーション変化に関連および／または関係して引き起こされる疾患として定義される。
【００８８】
一態様は更に、組成物中におけるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の量の検出を含んでなる。これは例えば、疾患の経過を調べるために行われる。更には、したがって、組成物を本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物と接触させ、結合ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の量を該組成物中に存在するクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の量と関連づけることを含んでなる、組成物中、好ましくは薬剤および／またはワクチン中におけるミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の量を調べるための方法が提供される。
【００８９】
ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質は本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび本発明による組成物と効果的に結合されることから、それらはサンプルおよび／または動物の体（好ましくは、ヒトの体）から効果的に除去される。こうして、ミスフォールドタンパク質の蓄積が減らされる。更には、したがって、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質の蓄積を減少させるための、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物の使用が提供される。該ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質は、好ましくはコンホメーション疾患に関与している。このようなタンパク質の蓄積減少は、該コンホメーション疾患の症状の軽減および／または疾患の少なくとも部分的な治療および／または進行の防止をもたらす。このようなコンホメーション疾患は、好ましくはアミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症および他の炎症疾患、リウマチ様関節炎、伝染性海綿状脳症、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失を伴う疾患またはパーキンソン病および他の神経疾患（癲癇）、脳症および／またはリウマチを含んでなる。
【００９０】
血液の凝固および血小板凝塊形成もミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造の存在を伴う。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造を含んでなる（ミスフォールド）タンパク質の役割の例は、血小板の活性化、血小板凝集および凝結の誘導、組織因子発現および血液への暴露をもたらす、血液凝固をもたらす内皮の活性化、および因子XIIの活性化による血液凝固の接触系の活性化である。加えて、血液凝固に際して、クロスβ構造コンホメーションのフィブリンポリマーが形成される。フィブリンネットワークのクロスβ構造ビルディングブロックはその後で、フィブリン溶解活性が必要とされる部位にｔＰＡを局在させる、ｔＰＡの結合部位として働く。本発明によるコレクションおよび組成物はミスフォールドタンパク質および／またはクロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質を特異的に結合および／または除去しうることから、該コレクションおよび組成物は血液の凝固および／または血餅形成および／または組織因子の活性化を妨げるために特に適している。更には、したがって、本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を血液に供することを含んでなる、血液の凝固および／または血餅形成を妨げるための方法が提供される。
【００９１】
タンパク質のクロスβ構造含有率に影響を有すると予想される処理に試験サンプルが付されていた、試験サンプル中タンパク質のクロスβ構造含有率と比較したリファレンスサンプル中タンパク質のクロスβ構造含有率の差異を調べるための方法も提供され、該方法では：
‐本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を用いてリファレンスサンプルでタンパク質のクロスβ構造含有率を調べ；
‐該タンパク質のクロスβ構造含有率に影響を有すると予想される処理に該タンパク質を付し、こうして試験サンプルを得；
‐本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物を用いて、得られた試験サンプル中における該タンパク質のクロスβ構造含有率を調べ；および
‐該リファレンスサンプル中該タンパク質のクロスβ構造含有率が該試験サンプル中該タンパク質のクロスβ構造含有率と有意に異なるかどうかを調べる。
【００９２】
この態様は、ある環境および／または処理がタンパク質のクロスβ構造含有率に影響を有するかどうかを調べるために特に適している。これが調べられたら、クロスβ構造コンホメーションを誘導および／または増強する低い能力を有した環境および／または処理を選択することが可能である。もちろん、具体的適用例に応じて、クロスβ構造コンホメーションをよく誘導および／または増強しうる環境および／または処理を選択することも可能である。
【００９３】
本発明は下記実施例で更に説明されているが、それらに限定されることはない。
【実施例】
【００９４】
材料および方法
材料
‘静脈注射Ｉｇ’（‘ＩＶＩｇ’または‘ＩｇＩＶ’）、‘ガンマグロブリン’、‘静脈注射用免疫グロブリン’、‘静脈注射イムノグロブリン’またはその他と称されるヒト広域免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を地元のUniversity Medical Center Utrecht調剤部から得た。OctapharmaからのOctagam（Octapharma International Services N.V.,Brussel,Belgium；５０ｍＬ中用量２．５ｇ，ロット４２７０５６８４３１，期限０５‐２００６，以下ＩｇＩＶ‘製造業者Ｉ’、ＩｇＩＶ（Ｉ）またはＩｇＩＶ‐Ｉと称される）およびBaxterからのHyland Immuno Gammagard S/D ＩＶＩｇ（Baxter B.V.,Utrecht,オランダ；９６ｍＬ再調製溶液で用量５ｇ，ロットＬＥ０８Ｅ０４４ＡＬ，期限０４‐２００７，以下ＩｇＩＶ‘製造業者II’、ＩｇＩＶ（II）またはＩｇＩＶ‐IIと称される）を用いた。９６ｍＬ給水を加え、室温でローラー装置上に該溶液を３０分間置くことにより、Gammagardを無菌条件下で再調製した（最終ＩｇＧ濃度５２ｍｇ／ｍＬ）。透明溶液を泡形成なしで得た。再調製溶液を等分し、−２０℃で保存した。再調製後、Gammagard溶液は０．０６ｇ低温殺菌ヒトアルブミン、０．４５ｇグリシン、０．１７５ｇ ＮａＣｌ、０．４３ｇグルコース一水和物および０．０４ｇポリエチレングリコール３，３５０を含有している。Octagamは、５０ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶを含んでなる即使用溶液として供給されている。他の成分は１００ｍｇ／ｍＬマルトースおよび５μｇ／ｍＬ未満Triton Ｘ‐１００および１μｇ／ｍＬ未満トリ‐ｎ‐ブチルホスフェートである。それは４℃で保存する。製造業者によると、Octagamは主ＩｇＧ（≧９５％）と副ＩｇＡフラクション（≦０．４％）からなる。４種のＩｇＧイソタイプの分布は：ＩｇＧ１，６２．６％；ＩｇＧ２，３０．１％；ＩｇＧ３，６．１％；ＩｇＧ４，１．２％である。GammagardおよびOctagamは室温で用いる。溶液を使用前に少なくとも３０分間室温で保った。Gammagardの凍結アリコートを最初に約０℃へ急速解凍し、次いで室温で置いた。第三のヒト免疫グロブリン源はUniversity Medical Center Utrechtで調製された、外見上健康なドナー約４０例の正常プール加クエン酸血漿であった。この血漿を採血後に直接混ぜ、直接等分し、−８０℃で凍結した。使用前、アリコートを３７℃水浴中で１０分間解凍し、室温で３０分間保った。ピペットで攪拌および／または再懸濁することにより血漿を混ぜた；用いられたＩｇＩＶ調製物およびその他すべてのタンパク質溶液で行われていたため、ボルテックスは避けた。
【００９５】
ＥＬＩＳＡでは、Microlon高結合性プレート（Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany；カタログ番号６５５０９２，ロット０５１３０１０３，期限０３‐２００９）を用いた。用いられた抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ‐アルカリ性ホスファターゼ（Biosource Int.,Camarillo,ＣＡ,ＵＳＡ；カタログ番号ＡＨＩ０３０５，ロット７６０２）、ヤギ抗ヒトＩｇＭ‐アルカリ性ホスファターゼ（Biosource Int.；カタログ番号ＡＨＩ０６０５，ロット３９０３）、ペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＲＡＭＰＯ,カタログ番号Ｐ０２６０,ＤＡＫＯCytomation,Glostrup,Denmark）、ペルオキシダーゼ複合化ブタ抗ウサギ免疫グロブリン（ＳＷＡＲＰＯ,カタログ番号Ｐ０２１７,ＤＡＫＯCytomation）、ウサギポリクローナル抗ヒトアルブミン抗体Ａ‐０００１（ＤＡＫＯCytomation）、ウサギポリクローナル抗ヒトヘモグロビン抗体Ａ‐０１１８（ＤＡＫＯCytomation；ロット１２２（０２１））、マウスモノクローナル抗ヒトアミロイド‐β抗体Ｍ０８７２（ＤＡＫＯCytomation；クローン６Ｆ／３Ｄ, ロット００００３５０３，期限０８‐２００６）、ウサギポリクローナル抗ヒトフィブリノーゲン抗体Ａ００８０（ＤＡＫＯCytomation；ロット０９７（７０１），期限０８‐２００６）およびネズミモノクローナルハイブリドーマ抗グルコース‐６‐リン酸グリケート化ヒトフィブロネクチン抗体４Ｂ５（ロット２，コード１００９０１ＢＢ，ｒｅｆ．(Bouma et al.,2003)）であった。ＥＬＩＳＡにおいて、アルカリ性ホスファターゼ複合化抗体の結合性はｐ‐ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩６＊Ｈ２Ｏ（Sigma-Aldrich,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ；ホスファターゼ基質カタログ番号１０４,ロット１２０Ｋ６００８）を用いて評価し、ペルオキシダーゼ複合化抗体の結合性は１，２‐フェニレンジアミン（‘ＯＰＤ’,Merck,Darmstadt,Germany；カタログ番号１．０７２４３．００５０,ロットＬ９３７５４３‐８４４）を用いて評価した。
【００９６】
ＥＬＩＳＡセッアップを用いた阻害研究は、コンゴーレッド（Aldrich,Milwaukee,ＷＩ,ＵＳＡ；カタログ番号８６，０９５‐６）、チオフラビンＴ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ；カタログ番号Ｔ３５１６,ロット８０Ｋ３４４４）、チオフラビンＳ（Sigma,カタログ番号Ｔ１８９２）、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ,Actilyse,Boehringer-Ingelheim,Alkmaar,オランダ）、またはフィブロネクチンＩ型ドメインを含む、または代わりにフィンガー（Ｆ）ドメインとも表示される、３つのアミノ末端ドメインを欠くｔＰＡのトランケート形（Ｋ２Ｐ ｔＰＡ,Rapilysin,Boehringer-Ingelheim,Alkmaar,オランダ）の濃度シリーズを用いて行った。
【００９７】
ＩｇＩＶ結合ＥＬＩＳＡで用いられた抗原は、Ｋ１５７Ｇ突然変異を有する合成ヒトフィブリンペプチド１４８‐ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＧＩＲＳ‐１６０（配列番号１）、合成ヒトアミロイド‐βペプチド１‐ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ‐４０（配列番号２）（Ａβ（１‐４０））、合成ヒトＡβ（１‐４０）Ｅ２２Ｑ Dutch１型‐ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＱＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ‐４０（配列番号３）（Peptide facility,Dutch Cancer Institute,Amsterdam,オランダ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ,フラクションＶ,カタログ番号Ａ‐７９０６，熱ショックによる初期分画，純度≧９８％（電気泳動），残部はほぼグロブリン,Sigma-Aldrich,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）、ヒトヘモグロビン（Ｈｂ,Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｈ７３７９）およびそれらの前進性グリケート化終末産物修飾対応物ＢＳＡ‐ＡＧＥおよびＨｂ‐ＡＧＥ（下記参照）であった。
【００９８】
方法
タンパク質のグリケーション
アルブミンおよびＨｂのグリケーション(glycation)を次のように行った。ＢＳＡ‐ＡＧＥの調製の場合、１００ｍｇ／ｍＬのアルブミンを、１ＭのＤ‐グルコース‐６‐リン酸二ナトリウム塩水和物（無水）（ｇ６ｐ,ＩＣＮ,Aurora,Ohio,ＵＳＡ）および０．０５％ｍ／ｖ ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ，１４０ｍＭ塩化ナトリウム，２．７ｍＭ塩化カリウム，１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム，１．８ｍＭリン酸二水素カリウム，ｐＨ７．３）と暗所中３７℃でインキュベートした。溶液を７０週間にわたりグリケート化させた。１０ｍｇ／ｍＬのヒトＨｂを、１Ｍのｇ６ｐおよび０．０５％ｍ／ｖ ＮａＮ３を含有するＰＢＳと３７℃で７５週間インキュベートした。インキュベート後、アルブミンおよびＨｂ溶液を蒸留水に対して徹底透析し、その後で等分し、−２０℃で保存した。タンパク質濃度をAdvancedタンパク質アッセイ試薬ＡＤＶ０１（Cytoskeleton,Denver,ＣＯ,ＵＳＡ）で調べた。
【００９９】
熱変性タンパク質の調製
熱変性ミスフォールドタンパク質を次のように調製した。６７ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍＬのエンドスタチン（組換え産生コラーゲンXVIIIフラグメント,EntreMed,Inc.,Rockville,ＭＤ；溶液）、ＢＳＡ（Sigma-Aldrich；凍結乾燥，カタログ番号Ａ７９０６）、ネズミ血清アルブミン（ＭＳＡ,Calbiochem,ＥＭＤ Biosciences,Inc.,San Diego,ＣＡ；凍結乾燥，カタログ番号１２６６７４）、ニワトリ卵白リゾチーム（ＩＣＮ,Irvine,ＣＡ,ＵＳＡ；凍結乾燥，カタログ番号１００８３１）、ヒトグルカゴン（Glucagon,Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark；凍結乾燥，カタログ番号ＰＷ６０１２６）、精製ニワトリオボアルミブン（ＯＶＡ,Sigma；カタログ番号Ａ７６４１，ロット０７１ｋ７０９４）またはヒトβ２‐糖タンパク質Ｉ（β２ｇｐｉ，インハウス精製，新鮮血漿から，ｒｅｆ．（Horbach et al.,1996））をＰＴＣ‐２００サーマルサイクラー（ＭＪ Research,Inc.,Waltham,ＭＡ,ＵＳＡ）でＰＣＲカップ中５サイクルにわたり加熱した。各サイクルにおいて、タンパク質を３０から８５℃へ５℃／ｍｉｎの割合で加熱した。加えて、エンドスタチン、ＭＳＡ、オボアルミブンおよびリゾチームを、１回のみの熱インキュベートサイクルを用いて、同様に１ｍｇ／ｍＬで熱変性させた。７．９ｍｇ／ｍＬのエンドスタチンをＨ２Ｏで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＭＳＡおよびオボアルミブンをＰＢＳ ｐＨ７．４で１ｍｇ／ｍＬとし、リゾチームを１０μＭ ＨＣｌ添加のＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解させた。コントロールタンパク質は熱サイクリング操作に付されない。アミロイド様構造へのタンパク質のミスフォールディングを確認するために、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の増強を熱処理タンパク質およびコントロールタンパク質で評価した。ＴｈＴ‐アミロイド様タンパク質／ペプチド付加物の蛍光を次のように測定した。２５μｇ／ｍＬのタンパク質またはペプチド調製物の溶液を２５μＭ ＴｈＴ含有の５０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ９．０で調製した。蛍光を４３５ｎｍで励起時に４８５ｎｍで測定した。緩衝液、ＴｈＴ含有緩衝液および無ＴｈＴのタンパク質／ペプチド溶液のバックグラウンドシグナルを、ＴｈＴとインキュベートされたタンパク質溶液での対応測定値から差し引いた。規定どおりに、Ａβの蛍光を陽性コントロールとして用い、合成ヒトフィブリンフラグメントＦＰ１０（１４８‐ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫ‐１５７（配列番号４）；Peptide Facility,Dutch Cancer Institute,Amsterdam,オランダ）、非アミロイドフィブリンフラグメント（Kranenburg et al.,2002）および緩衝液の蛍光を陰性コントロールとして用いた。蛍光をHitachi Ｆ‐４５００蛍光分光光度計（Hitachi,Ltd.,Tokyo,Japan）で三重に測定した。一方、コンゴーレッド蛍光も同様に解析した。今回は、励起および発光波長は５５０および５９０ｎｍであった。再び、２５μｇ／ｍＬの試験タンパク質を２５μＭコンゴーレッド溶液で解析した。
【０１００】
一方、熱変性アミロイドペプチドを次のように調製した。ヒトフィブリンペプチドＮＨ２‐ＩＤＩＫＩＲ‐ＣＯＯＨ（配列番号６，ＦＰ６）を１：１容量比の１，１，１，３，３，３‐ヘキサフルオロ‐２‐プロパノールおよびトリフルオロ酢酸に約１０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。有機溶媒を気流下で蒸発させた。ＦＰ６を蒸留水に１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで溶解し、３７℃で７２時間保った。溶液をその後で室温で保存した。クロスベータ構造コンホメーションの存在をアミロイド特異的色素ＴｈＴおよびコンゴーレッドの蛍光の増強測定とＸ線線維回折解析（パーソナルコミュニケーション,L.Kroon-Batenburg,Bijvoet Center for Biomolecular Research,Dept.of Crystal & Structural Chemistry,University of Utrecht,オランダ）により確認した。更に、プラスミノーゲン／プラスミン／クロモゲン基質変換アッセイでｔＰＡを活性化するＦＰ６の性質を評価したところ、陽性であることがわかった（他所で示されたデータ）。
【０１０１】
アミロイド様コンホメーションをとる酵母プリオンペプチドオリゴマーの調製
酵母プリオンタンパク質のペプチドフラグメントＮＨ２‐ＧＮＮＱＱＮＹ‐ＣＯＯＨ（配列番号５）をthe Peptide Facility of the Netherlands Cancer Institute（H.Hilkmann,ＮＫＩ-Amsterdam,オランダ；ロット５ＬＫＢ１‐２０８１）から購入した。該ペプチドの純度は逆相ＨＰＬＣを行い解析したところ、〜９０％であった。該ペプチドをＨ２Ｏで１および１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで溶解させた。透明溶液をローラーバンクにて４℃で７２時間または無運動下室温で５時間インキュベートした。コンゴーレッド蛍光の増強をアミロイド様コンホメーションの存在に関する尺度として調べた（前記参照）。加えて、このバッチのペプチドでクロスベータ構造の形成が、Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬの溶液を用いてＸ線線維回折解析で確認された（パーソナルコミュニケーション,L.Kroon-Batenburg,Bijvoet Center for Biomolecular Research,Dept.of Crystal & Structural Chemistry,University of Utrecht,The Netherlands）（ここではデータ示さず）。
【０１０２】
酸化タンパク質の調製
ＣｕＳＯ４への溶液中タンパク質の長期暴露を用いてタンパク質の酸化を行った。用いられたタンパク質は、外見上健康者のヒト正常プール加クエン酸血漿、調合エンドスタチン（EntreMed,Inc.,Rockville,ＭＤ；７．９ｍｇ／ｍＬ溶液）、ニワトリ卵白リゾチーム（ＩＣＮ,カタログ番号１００８３１，ロット９８０３２）、ヒトヘモグロビン（Sigma-Aldrich；カタログ番号Ｈ７３７９，ロット０３９Ｈ７６０５）、ヒトグルカゴン（Novo Nordisk Farma B.V.のGlucagen，ロットＲＷ６００３８）、ウシアルブミン（Sigma-Aldrich，Ａ７９０６，ロット８１Ｋ１８１３）、ヒトγ‐グロブリン（Sigma-Aldrich，Ｇ４３８６，ロット２１Ｋ７６００）、ニワトリ卵白オボアルミブン（Sigma-Aldrich，Ａ７６４１，ロット０７１Ｋ７０９４）であった。凍結乾燥タンパク質をＰＢＳに２ｍｇ／ｍＬで溶解し、血漿を４０倍希釈し、エンドスタチンをＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈した。２％ｍ／ｖのＮａＮ３ストック溶液を０．０２％の最終濃度まで加えた。Ｈ２Ｏ中１ＭのＣｕＳＯ４ストック溶液を１０ｍＭの最終濃度まで加えた。コントロールタンパク質溶液では、Ｈ２ＯをＣｕＳＯ４の代わりに加えた。すべてのタンパク質溶液を攪拌により混ぜ、ボルテックスは避けた。溶液をローラーバンクにて４℃で７２時間保った。ＴｈＴの増強を測定した（前記参照）。
【０１０３】
一方、溶液に１０μＭ ＣｕＳＯ４を導入することによりタンパク質を酸化させた。こうして、オボアルミブン、アルミブン、エンドスタチン、リゾチーム、γ‐グロブリンをすべて２．５ｍｇ／ｍＬおよびグルカゴンを１ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ中３７℃で１４４時間インキュベートした。コントロールタンパク質溶液では、ＣｕＳＯ４を省いた。チオフラビンＴ蛍光をクロスベータ構造コンホメーションをもつミスフォールドタンパク質の存在に関する尺度として調べた。ＴｈＴ蛍光増強を示したタンパク質溶液とそれらの非酸化コントロールをＰＢＳに対して透析した。
【０１０４】
オランダ血液バンクから得られた、１０℃で保たれた新鮮（＜２４時間）ヒト血漿から低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を単離した。ＬＤＬを本質的に先に記載されたように単離した（４）。血漿を続く３サイクルにわたり超遠心機で遠心した。ＬＤＬフラクションを単離し、Ｎ２下４℃で保存した。実験前、天然ＬＤＬ（ｎＬＤＬ）を０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌに対して４℃で一夜透析した。様々な酸化の程度で酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）を得るために、天然ＬＤＬを最初に４℃で一夜１ｍＭ ＮａＮＯ３を含有する０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液に対して透析した。次いで、ｎＬＤＬを３〜５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＣｕＳＯ４を２５μＭの最終濃度まで加え、３７℃でインキュベートした。同様に、ＣｕＳＯ４の代わりにＦｅＳＯ４を用いてＬＤＬを酸化した。ＦｅＳＯ４での酸化も透析ステップで先行させた。次いで、ＬＤＬを１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＮａＮ３，ｐＨ７．２添加のＰＢＳ中５μＭ ＦｅＳＯ４に対して透析した。酸化の程度は、ある回数の酸化緩衝液リフレッシュサイクルを選択することにより制御する。緩衝液中ＦｅＳＯ４が１０〜１２時間毎に多く入れ換えられるほど、酸化の程度は高くなる。酸化を止めるために、ＬＤＬサンプルを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＮ３、１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液に対して４℃で４時間透析する。酸化の程度をλ＝２３４ｎｍでジエン形成の測定により追跡した（Ultrospec 3000 Spectrophotometer(Pharmacia Biotech)）。酸化反応を止めるために、ＬＤＬを０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＮＯ３および１ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析した。ＬＤＬ溶液をＮ２下４℃で保存した。ＬＤＬのＡｐｏＢタンパク質部分におけるクロスベータ構造コンホメーションの存在を、チオフラビンＴ蛍光アッセイを用いて解析した（前記参照）。
【０１０５】
変性表面を用いるミスフォールドタンパク質の調製
マルチマー分子から構成される表面への暴露でミスフォールドタンパク質を調製するために、２１．４μｇ／ｍＬでＣｐＧ‐ＯＤＮ（Coley Pharmaceutical Group,ＭＡ,ＵＳＡ）または６００μｇ／ｍＬでリポ多糖（ＬＰＳ，Escherichia coli血清型０１１：Ｂ４から，＃Ｌ２６３０，ロット１０４Ｋ４１０９，Sigma-Aldrich）を１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチーム（凍結乾燥，Fluka,Sigma-Aldrich；カタログ番号６２９７１）、ＢＳＡ、エンドスタチンおよびオボアルミブンと混ぜ、ローラーバンクにて４℃でｏ／ｎインキュベートまたは室温で１時間インキュベートした。この目的のために、凍結乾燥タンパク質をＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＢＳ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４ｍＭ ＫＣｌ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）に２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで溶解させ、７．９ｍｇ／ｍＬのエンドスタチンをＨＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈した。タンパク質をローラーバンクにて室温で１０分間、３７℃および室温で１０分間かけて穏やかに溶解させた。２ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を次いで使用前に１００，０００＊ｇで１時間超遠心し、その後で４２．９μｇ／ｍＬ ＣｐＧ‐ＯＤＮまたは１２００μｇ／ｍＬ ＬＰＳ含有のＨＢＳで１：１希釈した。アミロイド様クロスベータ構造の形成を、変性表面が省かれたコントロールタンパク質溶液に対するチオフラビンＴ蛍光の増強を測定することにより評価した。この目的のために、タンパク質を２５μｇ／ｍＬに希釈し、アッセイ用緩衝液またはアッセイ用緩衝液中２５μＭチオフラビンＴとインキュベートした（アッセイ詳細に関しては前記参照）。
【０１０６】
一方、（負電荷）（リン）脂質、例えばホスファチジルセリンおよびカルジオリピン、デキストラン硫酸（５００，０００Ｄａ）、ミョウバン、エラグ酸、ガラスまたはカオリンのような変性分子へのタンパク質の暴露後にミスフォールドタンパク質を得る。ＩｇＩＶ作用の作動メカニズムを解明するために行われる試験に、これらのミスフォールドタンパク質を含める。
【０１０７】
ミスフォールドタンパク質へのＩｇＩＶ結合性の試験のための酵素結合イムノソルベントアッセイ
正常プール血漿中ＩｇＩＶまたは免疫グロブリンの結合性を酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）セットアップを用いて調べた。この目的のためには５０μＬ／ウェルのポテンシャルリガンドを指示濃度で、またはコントロールおよびバックグラウンド測定目的には被覆用緩衝液のみを、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．６中運動下４℃で一夜被覆した。グリケート化アルブミンおよびＨｂ（ＢＳＡ‐ＡＧＥおよびＨｂ‐ＡＧＥ）、コントロールＢＳＡおよびコントロールＨｂは５μｇ／ｍＬで被覆した。ＡβおよびＦＰ１３は２５μｇ／ｍＬで被覆した。ピペッティングに続いてローラーバンクにて室温で３０分間にわたる再懸濁で、ＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬで凍結乾燥タンパク質を溶解させることにより、ＢＳＡおよびＨｂコントロールを新たに調製した。タンパク質溶液を１６，０００＊ｇで１０分間遠心し、被覆用緩衝液で希釈した。被覆コントロールは抗グリケート化タンパク質抗体、抗アルブミン抗体、抗Ｈｂ抗体および抗Ａβ抗体で行った。ＦＰ１３はポリクローナル抗フィブリノーゲン抗体で認識されなかった。ＩｇＩＶを被覆し、それらを二次抗体で覆うことにより、アルカリ性ホスファターゼ複合化抗ヒトＩｇ抗体を制御した。被覆後、プレートを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄し、運動下室温で１時間かけて１７５μＬ／ウェル遮蔽試薬（Roche Diagnostics,Almere,オランダ；カタログ番号１１１１２５８９０００１）で遮蔽した。プレートを２回洗浄し、結合用緩衝液；ＰＢＳ／０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０中５０μＬ／ウェルで推定インヒビターの不在または存在下、指定の抗体希釈シリーズ、血漿希釈シリーズまたは結合用緩衝液のみを含むコントロールと三重に室温で１時間一定運動下にてインキュベートした。４洗浄サイクル後に、二次抗体を運動下室温で４５分間かけて５０μＬ／ウェルでウェルへ加えた。ＲＡＭＰＯおよびＳＷＡＲＰＯを２０００倍希釈で用い、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を３０００倍で希釈し、ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体を１０００倍で希釈した。洗浄緩衝液で５回洗浄、次いでＰＢＳで２回洗浄後、抗体の結合性を評価した。アルカリ性ホスファターゼ複合化二次抗体の場合、ＤＥＡ緩衝液ｐＨ９．８（ＨＣｌでｐＨ調整された、２４０μＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ含有の、Ｈ２Ｏ中１０％ｖ／ｖジエタノールアミン）中ｐ‐ニトロフェニルホスフェート（６００μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで〜５分間用いた。５０μＬ／ウェルのＨ２Ｏ中２．４Ｍ ＮａＯＨを加えることにより反応を止めた。５分間後、吸光度を４０５ｎｍで読んだ。ペルオキシダーゼ複合化ＲＡＭＰＯおよびＳＷＡＲＰＯの場合は、５０ｍＭクエン酸／１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／０．０６％ｖ／ｖ Ｈ２Ｏ２  ｐＨ５中ＯＰＤ（１．３ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルで〜５分間用いた。５０μＬ／ウェルのＨ２Ｏ中２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を止めた。５分間後、吸光度を４９０ｎｍで読んだ。各実験を少なくとも２回行った。アミロイド様クロスベータ構造結合化合物およびコントロール（ｒｅｆ．(Bouma et al.,2003)および特許出願Ｐ５７７１６ＥＰ００）がクロスベータ構造リガンドと結合するＩｇＩＶを妨げ��かどうかを試験するために、ポテンシャルインヒビターの濃度シリーズを準最適ＩｇＩＶ濃度の存在下で試験した。この目的のために、ｔＰＡ、Ｋ２Ｐ ｔＰＡ、コンゴーレッド、チオフラビンＳ（ＴｈＳ）およびチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の用いられたストック溶液は各々３．７ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ、１０ｍＭおよび１０ｍＭであった。リシン‐およびアルギニン残基へのｔＰＡおよびＫ２Ｐ ｔＰＡのクリングル２ドメインの結合を避けるために、ｔＰＡおよびＫ２Ｐ ｔＰＡの影響を１０ｍＭ ε‐アミノカプロン酸の存在下で試験した（アミロイド様構造へのｔＰＡ結合は、トランケートＫ２Ｐ ｔＰＡで欠くそのフィンガードメインにより媒介される；クリングル２ドメインはリシンおよびアルギニンの露出側鎖と結合する）。結合用緩衝液およびＫ２Ｐ ｔＰＡはこれらの阻害研究でネガティブコントロールとして働く。別に、同様の阻害研究を固定ＡβまたはＢＳＡ‐ＡＧＥ、準最適濃度のｔＰＡ（ｒｅｆ．(Bouma et al.,2003；Kranenburg et al.,2002)）および濃度シリーズのコンゴーレッドまたはＴｈＴで行った。データ処理は次のように行った。三重データを平均化し、標準偏差を計算した。緩衝液被覆ウェルで得られたバックグラウンドシグナル（空ウェルへの一次抗体の結合）、および一次抗体が省かれたウェルで得られたバックグラウンドシグナル（被覆リガンドへの二次抗体の結合）を差し引いた。
【０１０８】
別シリーズの実験では、酵母プリオンペプチドＮＨ２‐ＧＮＮＱＱＮＹ‐ＣＯＯＨ（配列番号５）を２５μｇ／ｍＬの濃度でＥＬＩＳＡプレートへ被覆した。４℃で７３時間インキュベートされた１ｍｇ／ｍＬのストック溶液を用いた。コントロールウェルでは、５μｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥまたは被覆用緩衝液を被覆した。希釈シリーズＩｇＩＶ（Ｉ）の結合性を解析し、濃度シリーズのｔＰＡおよびＫ２Ｐ ｔＰＡの結合性と比較した。加えて、ミスフォールドタンパク質に親和性を有する５種モノクローナル抗体の混合物も、固定リガンドとの結合性に関して試験した（モノクローナル詳細に関しては下記参照）。この目的のため、５種抗体の各々３３６μｇ／ｍＬを含んでなる混合物をＰＢＳで調製し、１．８３ｍｇ／ｍＬ総抗体のストック溶液を得た。
【０１０９】
ネズミモノクローナル抗ミスフォールドタンパク質抗体の調製
免疫化をＡＢＣ-Hybridoma facility（P.van Kooten & M.Smits,Utrecht University,オランダ）で行った。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を１００μＬ Ｈ２Ｏおよび１００μＬ完全フロイントアジュバント中１００μｇ Ａβで免疫した。３週間後、Ｈ２Ｏ-Specol（ＩＤ‐ＤＬＯ，Lelystad，オランダ）中５０μｇ Ａβの一次ブースト、一次ブースト後３０日目に二次ブーストを行った。二次ブースト後３６および３７日目に、マウスをＰＢＳ中５０μｇ Ａβで２回（静脈内）追加ブーストした。Ａβで免疫化の開始後約４４週〜４８週目に、マウスは病気になったが、回復した。４９週後、マウスをＨ２Ｏ-Specol中５０μｇ組換えニワトリ血清アミロイドＡで免疫した。この抗原はDr.H.Toussaint（Dept.of Veterinary Medicine,University of Utrecht,The Netherlands）の贈与であった。４週間後、マウスを５０μｇ Ｈｂ‐ＡＧＥで免疫した。最後に、３１および３２日後、マウスをＰＢＳ中５０μｇ ＦＰ６（配列番号６）で２回静脈内ブーストした。最終ブースト後３日目に、マウスを屠殺し、ハイブリドーマを作製するために脾臓を用いた。融合用培地をＰＥＧ４０００（Merck,カタログ番号９７２７）で富化させた。脾臓は比較的高い存在量の浸潤線維芽細胞と共に例外的に高い数の細胞、即ち７＊１０８細胞からなっていた。２＊１０８細胞を融合用の４＊１０７Ｓｐ２／０形質細胞腫細胞と混ぜた。融合後、１０％Fetalclone１（Hyclone）、４μＭアミノプテリンおよび１％Glutamax Ｉ含有のOptiMEM Ｉからなる選択ハイブリドーマ培地を用いた。脾臓Ｂ細胞と形質細胞腫細胞との融合を可能にするインキュベート時間後、Accudropソフトウェア装備のFacsVantage装置を用いて、細胞を１細胞／ウェルで９６ウェルプレートに移した。約２週間後、ハイブリドーマを抗クロスβ構造抗体の推定産生についてスクリーニングした。最初に、９６ウェルプレート中７６８クローンを免疫化ＦＰ１３Ｋ１５７Ｇアミロイドおよびアミロイドγ‐グロブリンと結合する抗体の存在についてスクリーニングした。この目的のために、ＦＰ１３Ｋ１５７Ｇおよびアミロイドγ‐グロブリンをＨ２Ｏ中で一緒に各ポリペプチド５μｇ／ｍＬに希釈した。Microlon高結合性ＥＬＩＳＡプレート（Greiner,Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany）をこの溶液５０μＬで満たし、３７℃で一夜風乾した。プレートを遮蔽試薬（カタログ＃１１１１２５８９００１，Roche Applied Science,Basel,Switzerland）で遮蔽し、水道水で洗浄した。１０％ｖ／ｖ胎児ウシ血清を含有する１００μＬのハイブリドーマ細胞培養上澄を被覆プレートへ移し、振盪しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０（洗浄緩衝液）含有のＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．３（ＴＢＳ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、その後で振盪しながらＲＴで３０分間にわたりＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０中２０００×希釈ペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＲＡＭＰＯ,＃Ｐ０２６０,ＤＡＫＯ,Denmark）で覆った。徹底洗浄後、結合ＲＡＭＰＯをテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，＃４５．０１．２０／＃４５．０１４．０１，Biosource,Nivelles,Belgium）で視覚化した。反応を５分後にＨ２Ｏ中１％Ｈ２ＳＯ４で止めた。プレートを４５０ｎｍで読んだ。シグナルが少なくとも１．５×バックグラウンドレベルに達したとき、クローンを更なるスクリーニング試験に含めた。再び、推定抗クロスβ構造抗体の存在を免疫化ＦＰ１３Ｋ１５７Ｇおよびアミロイドγ‐グロブリンで解析した。そのとき、３５クローンが陽性であった。それらのクローンを細胞培養フラスコへ移し、更なる解析に付した。この目的のため、再び、今回は別々にＦＰ１３Ｋ１５７Ｇおよびアミロイドγ‐グロブリンと、ＡβおよびＨｂ‐ＡＧＥをＥＬＩＳＡプレートに固定した。加えて、新鮮溶解Ａβ、ＦＰ１３Ｋ１５７Ｇ、Ｈｂおよびγ‐グロブリンをImmobilizerプレート（Exiqon,Vedbaek,Denmark）に被覆した。これらの新鮮溶解コントロールを振盪しながらＲＴで１時間かけてＰＢＳ中２０、１２．５、５０および５０μｇ／ｍＬで各々被覆した。存在しうる不溶性凝集物を除去するために、各々２０、１２．５、５０および５０μｇ／ｍＬのＡβ、ＦＰ１３Ｋ１５７Ｇ、Ｈｂおよびγ‐グロブリンストック溶液を最初に２３８＊１０３×ｇで３０分間遠心した。緩衝液を追加陰性コントロールとしてGreiner（Ｈ２Ｏ）およびExiqon（ＰＢＳ）プレートに被覆した。Greinerプレートは７６８クローンで初回スクリーン時に遮蔽しなかった。細胞培地中１０％ＦＣＳがＥＬＩＳＡプレートで細胞上澄のインキュベート時における効果的遮蔽剤である。細胞上澄を加える前に、１０μＬのＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ‐２０をExiqonプレートのウェルに加えた。濃度０．１％のＴｗｅｅｎ‐２０がImmobilizerプレート用の効果的即席遮蔽剤である。１００μＬのハイブリドーマ上澄をプレートへ移した。培地を陰性コントロールとして用いた。シグナルは、１０％ＦＣＳ含有の新鮮培地が様々な固定抗原およびコントロールでインキュベートされたときに得られたシグナルの倍数として計算した。シグナルは、新鮮培地で得られたバックグラウンド値×２．０を超えたときに、陽性とみなした。その後で３５クローン中２１のスクリーニングを上記のように調製されたGreinerプレートで行った。プレートを今回は最初に遮蔽試薬で遮蔽し、洗浄した。５０μＬの各ハイブリドーマクローン上澄を配列非依存性だが構造特異的な抗体の存在について二重に試験し、新鮮培地をコントロールとして四重に試験した。モノクローナルハイブリドーマを得るために、原２１クローンから６つを更なる単一細胞サブクローニング用に選択した。６クローンを１細胞／９６ウェル培養プレートのウェルに接種し、１０％ｖ／ｖＦＣＳで富化された培地で培養した。クローンを２種の被覆アミロイドとの結合性についてすべて試験した。６クローンの各々について、後に２５ｃｍ２培養フラスコで培養するために、２種のアミロイドと結合した５サブクローンを特定した。蛍光標識されたイソタイプ特異的抗体を用いる３０サブクローンのイソタイプ分類は製造業者（Luminex,Austin,ＴＸ,ＵＳＡ）の推奨に従いＡＢＣ-Hybridoma facility（M.Smits）により行われた。通常のクロマトグラフィー精製技術を用いて抗体を細胞培地から精製した。Econoカラム（Biorad,Veenendaal,The Neterlands）にＡＦＦＩ‐Ｔゲルマトリックス（KemEnTEC,Biozym,Landgraaf,The Neterlands）を用いて、サンプルを親チオ性クロマトグラフィーに付した。精製抗体をＰＢＳ中−２０℃で保存した。
【０１１０】
モノクローナル抗体を得るために、マウスをその後でヒトアミロイドＡβ（１‐４０）Ｅ２２Ｑ、組換えニワトリ血清アミロイドＡおよびアミロイド様性質のグリケート化ヒトヘモグロビンで免疫し、次いでアミロイドヒトフィブリンペプチドＦＰ６で最終ブーストした。ハイブリドーマが形成されたら、免疫に用いられた抗原と無関係なアミノ酸組成のいずれかのポリペプチドにクロスβ構造コンホメーションが存在するときのみ認識されるエピトープを特異的に認識する抗体の存在についてそれらの細胞培養上澄をスクリーニングした。７６８クローンのうち、免疫に用いられた抗原以外で広範囲のアミロイド様凝集物に親和性を示す６クローン、２Ｅ２、４Ｆ４、７Ｈ１、７Ｈ２、７Ｈ９および８Ｆ２を選択した。数ラウンドの選択およびサブクローニング後、最後に下記５種のモノクローナル抗体がクロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質と不変的結合性を示した：２Ｅ２Ｂ３Ｄ１２、７Ｈ２Ｈ２、７Ｈ１Ｃ６Ａ７、７Ｈ９Ｂ９、８Ｆ２Ｇ７Ｈ７。７Ｈ２Ｈ２クローンのみが様々なミスフォールド形の免疫グロブリンと特異的に結合したため、我々はこのクローンを‘リウマトイド因子様抗体’と分類した。個別抗体の最終濃度が２Ｅ２Ｂ３Ｄ１２、７Ｈ２Ｈ２、７Ｈ１Ｃ６Ａ７、７Ｈ９Ｂ９および８Ｆ２Ｇ７Ｈ７について各々１．５、０．３７、０．４、０．４５および０．４７ｍｇ／ｍＬであり、３．２ｍｇ／ｍＬの全抗体濃度を示す５種の掲載モノクローナル抗体の混合物を調製した。一方、すべての抗体をＰＢＳで１．８３ｍｇ／ｍＬに希釈し、１：１：１：１：１で混合して、３３６μｇ／ｍＬの個別抗体で１．８３ｍｇ／ｍＬの全抗体濃度とした。ネズミ抗ミスフォールドタンパク質抗体のこれら混合物を更なる血小板凝集アッセイにストック溶液として用いた（実施例参照）。
【０１１１】
血小板凝集
アミロイド様クロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドグリケート化Ｈｂの凝集物により誘導された血小板凝集に及ぼすＩｇＩＶの影響を凝集測定アッセイにおいて洗浄血小板で試験した。凝固を避けるために、新鮮採取ヒトアスピリンフリー血液をクエン酸緩衝液と穏やかに混ぜた。血液を２０℃にて１５０＊ｇで１５分間スピンさせ、上澄を集めた；多血小板血漿（ＰＲＰ）。２．５％クエン酸三ナトリウム、１．５％クエン酸および２％グルコース含有のｐＨ６．５緩衝液を１：１０（緩衝液‐ＰＲＰ）の最終容量比まで加えた。２０℃にて３３０＊ｇで１５分間の遠心で血小板を沈降させた後、ペレットをＨＥＰＥＳ-Tyrode緩衝液ｐＨ６．５に再懸濁した。プロスタサイクリンを１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、溶液をソフトブレーキ下２０℃にて３３０＊ｇで１５分間遠心した。最終血小板数が２００，０００〜２５０，０００血小板／μＬに調整されるように、ペレットをＨＥＰＥＳ-Tyrode緩衝液ｐＨ７．２に再懸濁した。血小板が静止状態にあるよう保証するために、アッセイで使用前、それらを３７℃で少なくとも３０分間保った。ドナー５例の血小板を異なる３日間（２，２，１）で別々に単離した。
【０１１２】
凝集測定アッセイのために、２７０、２８０または３００μＬ血小板溶液をガラス管へ加え、３７℃に予熱した。攪拌磁石を加え、回転を９００ｒｐｍに設定し、装置（全血凝集計,Chrono-log,Havertown,ＰＡ,ＵＳＡ）をブランクにした。ＨＥＰＥＳ-Tyrode緩衝液ｐＨ７．２で前希釈された対象のアゴニストおよび／または対象のプレミックスアンタゴニストを含有する３０、３０または３３．３μＬの最終容量を加えた。血小板凝集で経時的に減少する溶液の吸光度を測定することにより、凝集を経時的に追跡した。陽性コントロールとして、１０μｇ／ｍＬのコラーゲン（Kollagenreagens Horm,NYCOMED Pharma GmbH,Linz,Austria；ロット５０２９４０）または５μＭの合成トロンビンレセプター活性化ペプチドＴＲＡＰ（ＮＨ２‐ＳＦＬＬＲＮ‐ＣＯＯＨ，配列番号７）を用いた。凝集を１５分間記録し、透過光のパーセンテージ（０〜１００％）として表示した。
【０１１３】
ミスフォールドタンパク質と結合するタンパク質を捕捉するためのクロスベータ構造アフィニティマトリックスの調製
ＩｇＩＶ中Ｉｇのサブセットがミスフォールドタンパク質と結合するかどうかを更に調べられるように、我々はミスフォールドタンパク質結合のアフィニティマトリックスを調製した。この目的のために、我々は製造業者の推奨に従いＣＮＢｒ-セファロース（ＧＥ Healthcare-Amersham,Roosendaal,The Neterlands）へグリケート化Ｈｂをカップリングさせた。ローラーバンクにて４℃で一夜カップリングのために、２５０μｇのＨＣｌ洗浄およびカップリング用緩衝液洗浄された吸引ビーズ（乾燥重量）を１２５μＬカップリング用緩衝液のみ（コントロールビーズ）（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＮａＣｌ）または３．３３ｍｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥ含有のカップリング用緩衝液とインキュベートした。徹底洗浄後、我々はＨｂ‐ＡＧＥがセファロースとカップリングされたかどうかと、調製されたアフィニティマトリックスがクロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質に親和性を有するタンパク質を実際に捕捉しうるかどうかを調べた。Ｈｂ‐ＡＧＥ出発物質の濃度をカップリング反応後のＨｂ‐ＡＧＥ上澄と比較することにより、カップリング効率を調べた。希釈シリーズをＡＤＶ０１タンパク質染色剤（Cytoskelton）で調製し、吸光度を５９０ｎｍで読んだ。吸光シグナルの比較から、Ｈｂ‐ＡＧＥの５０％が２５０μｇビーズ（乾燥重量）でセファロース、即ち約２００μｇ Ｈｂ‐ＡＧＥと結合していることがわかった。
【０１１４】
以前に、我々は、組織型プラスミノーゲンアクチベーターが、グリケート化タンパク質を含めたクロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質に親和性をもつ酵素であることを証明した（Bouma et al.,2003；Kranenburg et al.,2002）。ｔＰＡと結合しうるＨｂ‐ＡＧＥ‐アフィニティマトリックスの能力を試験するために、ＨＢＳ中Ｈｂ‐ＡＧＥ セファロースまたはコントロールセファロースの１：１懸濁物２０μＬを、二重に、ローラーバンクにて４℃で一夜のインキュベートにより、６μＭ ｔＰＡ（０〜１０μＭ濃度シリーズを試験した後の最適化濃度）とインキュベートした。８０００＊ｇで２分間遠心して上澄の廃棄後、ビーズをＨＢＳで５回洗浄した。２０μＬ溶出用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４,１１４０ｍＭ ＮａＣｌ,１０ｍＭ ε‐アミノカプロン酸，４．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）と共にマトリックスを室温で１時間インキュベートすることにより、結合ｔＰＡを溶出させた。溶出物をｔＰＡ含有率について解析し、これをＨｂ‐ＡＧＥ セファロースまたはコントロールセファロースとの接触前および後におけるインキュベート混合液のｔＰＡ含有率と比較した。クロモゲンｔＰＡ基質Ｓ２７６５（Chromogenix,Instrumentation Laboratory SpA,Milano,Italy）を用いて相対ｔＰＡ濃度を調べた。この目的のため、１〜５μＬの試験サンプル（ｔＰＡ出発溶液，Ｈｂ‐ＡＧＥ セファロースと接触後の上澄，溶出用緩衝液とのＨｂ‐ＡＧＥ セファロースのインキュベート後における溶出物）を１０μＬ ５ｍＭ Ｓ２７６５および５μＬの１０倍ＨＢＳストック溶液と混ぜ、Ｈ２Ｏで５０μＬの最終容量に調整した。無色剤から黄色基質へのｔＰＡによる基質の変換を吸光度測定９６ウェルカイネティックプレートリーダーで３７℃にて経時的に記録した。
【０１１５】
次いで、１２０μＬまたは２０μＬの親和性Ｈｂ‐ＡＧＥ セファロースマトリックスあるいは１２０μＬまたは２０μＬの無カップリングタンパク質のコントロールセファロースを２００μＬの５０ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Octagam）ストック溶液とインキュベートした（室温で４時間）。次いで、インキュベート用緩衝液で徹底洗浄後に溶液に残留したＩｇＩＶの濃度およびマトリックスへの結合ＩｇＩＶの量を調べた。ＩｇＩＶ標準希釈シリーズを用いて２８０ｎｍで吸光度を測定することにより、およびＡＤＶ０１（Cytoskelton）で染色後にＩｇＩＶサンプルの５９０ｎｍにおける吸光度をＩｇＩＶ標準希釈シリーズの染色と比較することにより、タンパク質濃度を調べた。Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースまたはコントロール‐セファロースと結合したＩｇＩＶを約２倍容量のＨＢＳ（結合用緩衝液）で６回洗浄した。次いで、結合ＩｇＩＶを１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ε‐アミノカプロン酸含有の２００μＬ ＨＢＳで溶出させた（室温で３０分間，攪拌下）。ＥＬＩＳＡプレートに固定されたＨｂ‐ＡＧＥとの結合性を、未処理ＩｇＩＶの希釈シリーズ、Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースと接触後のＩｇＩＶ、コントロール‐セファロースと接触後のＩｇＩＶ、Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースからの溶出ＩｇＩＶ、コントロール‐セファロースからの溶出ＩｇＩＶで解析した。この目的のために、５μｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥまたは熱変性ＢＳＡを攪拌しながら室温で１時間被覆した（Greiner Microlon高結合性プレート）。プレートを遮蔽試薬（Roche）で遮蔽した。ＩｇＩＶ調製物の希釈シリーズの結合性を前記のように評価した。Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースからの溶出ＩｇＩＶおよびコントロール‐セファロースからの溶出ＩｇＩＶ中におけるＩｇＩＶの相対量をＩｇＩＶストックに関して計算した。この目的のために、Ｈｂ‐ＡＧＥと結合したまたは熱変性ＢＳＡと結合したＩｇＩＶの希釈シリーズの標準曲線を作製した。被覆Ｈｂ‐ＡＧＥとの結合性に関するＨｂ‐ＡＧＥ‐セファロースからの溶出ＩｇＩＶの富化は、１２０μＬ セファロースとインキュベートされたＩｇＩＶを用いて評価した。熱変性ＢＳＡとの結合性に関する富化は、２０μＬ セファロースとインキュベートされたＩｇＩＶで評価した。
【０１１６】
ＩｇＩＶおよびモノクローナル抗ミスフォールドタンパク質抗体の混合物による故クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳切片の免疫組織化学染色
散発性ＣＪＤまたは新変種ＣＪＤの故クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）患者の脳切片の免疫組織化学染色のために、パラフィン切片を作製した（Dept.of Pathology,University Medical Center Utrecht,The Netherlands）。切片を次のステップからなる標準染色操作に適用した：１．固定切片を遮蔽緩衝液で遮蔽し、２．クロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質に親和性をもつＩｇＩＶまたはモノクローナル抗体とインキュベートし、結合用緩衝液で希釈し、３．洗浄し、４．抗ヒトＩｇＧ抗体および抗ネズミＩｇＧ／ＩｇＭ抗体と各々インキュベートし、５．洗浄し、６．Powervisionとインキュベートし、７．洗浄し、８．ＤＡＢで染色し、および９．封入およびマウントし、顕微鏡検査およびスコアリング前に酸処理で除染した。ＵＭＣ Utrecht（オランダ）に所在の、ＴＳＥ汚染物質の作業用に整備された公認カテゴリーIII研究所で、有資格者により操作が行われた。コントロールとして、切片をｔＰＡ、ネズミモノクローナル抗ｔＰＡ抗体およびPowervisionと連続インキュベートし、次いでＤＡＢ染色した。染色操作用のコントロールとして、故アルツハイマー病患者の脳切片もＩｇＩＶまたはｔＰＡとインキュベートし、次いで同操作を上記のように行った。
【０１１７】
結果＆考察
実施例１：ＩｇＩＶ（ヒト免疫グロブリンＩｇＧ抗体）はクロスベータ構造コンホメーションを含んでなるミスフォールドタンパク質と結合する
炭水化物によるタンパク質の非酵素修飾、グリケーションと称されるプロセスは、アミロイドクロスベータ構造の形成に伴いタンパク質ミスフォールディングを誘導する（Bouma et al.,2003）。固定グリケート化タンパク質Ｈｂ‐ＡＧＥおよびＢＳＡ‐ＡＧＥと非グリケート化ＨｂおよびＢＳＡへのＩｇＩＶの結合性を、ＥＬＩＳＡセットアップを用いて確かめた（図１Ａ〜Ｃ）。アルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を用いてＩｇＩＶの結合を検出した。ＩｇＩＶ（Ｉ）およびＩｇＩＶ（II）は双方ともクロスベータ構造を含んでなるグリケート化タンパク質と高親和性で結合したが、一方それらは固定天然アルブミンおよび天然ヘモグロビンとは弱く結合した（図１Ａ〜Ｃ）。固定タンパク質へのＩｇＩＶ（Ｉ）の親和性はＩｇＩＶ（II）より高かった。Ｈｂ‐ＡＧＥへのＩｇＩＶ（Ｉ）の親和性はＢＳＡ‐ＡＧＥの場合より高かった。アルブミンまたはヘモグロビン調製物に応じて、おそらくミスフォールドタンパク質に親和性をもつＩｇＩＶ抗体に結合部位を曝す非天然コンホメーションの分子の量が様々であるため、やや変動量のＩｇＩＶがこれらの‘天然’タンパク質と結合したのであろう。
【０１１８】
組織型プラスミノーゲンアクチベーターは、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質と特異的に相互作用する、フィンガードメインと称されるモジュールを含有したセリンプロテアーゼである(Kranenburg et al.,2002；Gebbink et al.,2005）。被覆グリケート化タンパク質へ１５μｇ／ｍＬの準最適濃度でのＩｇＩＶ（Ｉ）の結合性はｔＰＡの濃度シリーズで効果的に減少するが、一方トランケートＫ２Ｐ ｔＰＡはＩｇＩＶ（Ｉ）結合性に影響を有しない（図１Ｄ）。ｔＰＡは、グリケート化タンパク質と比較的高い親和性（約５００ｐＭのｋＤ）で、およびクロスベータ構造を含んでなるアミロイド様タンパク質コンホメーションの他の多くのミスフォールドタンパク質とやや低い親和性で、おそらくＫ２Ｐ ｔＰＡで欠いているそのフィブロネクチンＩ型ドメインを介して結合することが知られている。ｔＰＡと同様に、アミロイド特異的色素コンゴーレッドも被覆グリケート化タンパク質への１５μｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）の結合を効果的に遮蔽する（図４Ａ）。
【０１１９】
クロスベータ構造をもつタンパク質のアミノ酸配列に限定されることなく、いかなるミスフォールドタンパク質ともＩｇＩＶが広範囲特異性を有するかどうかを評価するために、熱変性ＭＳＡ、オボアルブミンおよびグルカゴンと、酸化オボアルブミン、グルカゴン、ヘモグロビンおよびＬＤＬ、およびコントロール非酸化または非熱変性対応物をＩｇＩＶ結合性について解析した。この目的のために、すべてのタンパク質を５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３中２５μｇ／ｍＬ濃度（グルカゴン：１２．５μｇ／ｍＬ）でGreiner microlon高結合性プレートに固定させ、ＩｇＩＶ（Ｉ）の濃度シリーズ、ＰＢＳ／０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０中０／１／３／９／２７／８１／２４３／７２９μｇ／ｍＬで覆った。
【０１２０】
結論として、これらの結果は、クロスベータ構造コンホメーションを含んでなる固定ミスフォールドタンパク質とＩｇＩＶが結合することを証明している。これらの発見を更に確証するために、一連のミスフォールドタンパク質との結合性を評価する。例えば、酸化タンパク質、熱変性タンパク質、（生体適合性）表面、例えば体外循環装置へ暴露時に変性されたタンパク質、疾患関連ミスフォールドタンパク質（例えば、アミロイド‐β（アルツハイマー病）；β２‐ミクログロブリン（透析））へのＩｇＩＶの結合性を取り扱う。
【０１２１】
実施例２：血小板凝集はアミロイド様ミスフォールドタンパク質により誘導され、ヒトＩｇＩＶおよびネズミモノクローナル抗体により阻害される
外見上健康なヒトボランティアの新鮮採取加クエン酸血液から単離された血小板は、Ｈｂ‐ＡＧＥで異なる個体３例（ドナー‘Ａ’、‘Ｂ’、‘Ｃ’）からの血小板について示されているように、ミスフォールドグリケート化タンパク質へ曝されたとき直ちに凝集する（図２）。ミスフォールドタンパク質Ｈｂ‐ＡＧＥまたはＢＳＡ‐ＡＧＥを、ＩｇＩＶ（Ｉ）（図２Ａ，Ｃ）またはクロスベータ構造コンホメーションを含んでなるミスフォールドタンパク質に親和性をもつ５種モノクローナル抗体の混合物（２Ｅ２Ｂ３Ｄ１２、７Ｈ２Ｈ２、７Ｈ１Ｃ６Ａ７、７Ｈ９Ｂ９、８Ｆ２Ｇ７Ｈ７）（図２Ｅ，Ｆ）とプレインキュベートしたとき、血小板凝集が阻害される。コラーゲンまたはＴＲＡＰによる血小板凝集の誘導はＩｇＩＶ（Ｉ）または混合モノクローナル抗体によりほとんど影響されず（図２Ｂ，Ｄ）、このことはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質により媒介される効果をモノクローナル抗体が特異的に阻害することを示している。
【０１２２】
ヒトドナーＤおよびＥの血小板を用いた別シリーズの実験において、血小板凝集を５０μｇ／ｍＬ Ａβにより誘導した（図３）。アミロイド誘導凝集に及ぼす２．５ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）またはモノクローナル抗体混合物の影響を取り扱った（図３）。ＩｇＩＶ（Ｉ）およびモノクローナル混合物は双方とも、異なるドナー２例（ＤおよびＥ）の血小板でアミロイド誘導血小板凝集を阻害する。ドナーＤはＡβによる刺激でドナーＥより高い最終凝集％を示す。両ドナーで、ＩｇＩＶ（Ｉ）は血小板凝集の開始を約２分間遅らせる。ＡβおよびＩｇＩＶ双方とインキュベートされたドナーＤの血小板は、Ａβとのインキュベートと比較したとき、最終的に同程度で凝集する。ドナーＥの血小板では、ＡβへのＩｇＩＶの添加が血小板凝集の強い阻害をもたらす。４μＭ ＴＲＡＰを陽性コントロールとして適用した。コントロール実験では、血小板のＴＲＡＰ活性化に及ぼすＩｇＩＶまたはモノクローナル抗体の影響を、ＴＲＡＰストックをモノクローナル抗体の混合物とプレインキュベートすることにより解析した。これらの凝集実験は、ＩｇＩＶまたはモノクローナル抗体がＴＲＡＰ誘導性凝集に影響を与えないことを示した（示さず）。
【０１２３】
これらの結果は、グリケート化タンパク質およびクロスベータ構造を含んでなるＡβにより誘導される血小板凝集を阻害する抗体をヒトＩｇＩＶが含有していることを示している。モノクローナル抗ミスフォールドタンパク質抗体の混合物は、ヒトＩｇＩＶ治療溶液中で抗ミスフォールドタンパク質抗体の存在を示唆する類似阻害活性を示す。様々なミスフォールドタンパク質が、血小板凝集を誘導しうるそれらの能力に関して今回は試験される。その後で、ヒトＩｇＩＶまたはネズミ抗ミスフォールドタンパク質抗体の影響が、現発見を確証するために取り扱われる。血小板凝集を誘導するために用いられる別なミスフォールドタンパク質は、酸化タンパク質、（熱）変性タンパク質、グリケート化タンパク質、変性表面または変性分子、例えばＣｐＧ‐ＯＤＮに曝されたタンパク質、リポ多糖、デキストラン硫酸、カオリン、ガラス、脂質、またはアミロイドペプチド、例えばＦＰ６、アミロイド‐β、ＦＰ１３であるが、それらに限定されない。
【０１２４】
実施例３：チオフラビンＴおよびチオフラビンＳによる、ミスフォールドタンパク質へのＩｇＩＶおよびｔＰＡの結合性の増強
２種のアミロイド特異的色素、チオフラビンＴおよびチオフラビンＳは比較的低い色素濃度でＩｇＩＶ‐グリケート化タンパク質相互作用をある程度阻害し、一方比較的高い色素濃度では両色素は固定ミスフォールドタンパク質へのＩｇＩＶの結合を促進するようである（図４Ｂ，Ｃ）。これは、ミスフォールドタンパク質へのアミロイド特異的色素の結合がミスフォールドタンパク質への結合に親和性をもつタンパク質のそれに続く結合を促進している、という事実により説明される。チオフラビンＴおよびチオフラビンＳ結合は、ＩｇＩＶとの結合部位を表象するクロスベータ構造コンホメーションの周辺分子または分子の一部を比較的固定された状態で安定化させる。低色素濃度のとき、これらの力は、クロスベータ構造を曝すより均一なＩｇＩＶ結合部位への固定化を引き起こすにはまだ弱すぎる。今回は、色素結合がＩｇＩＶ結合部位と直接競合する。高色素濃度では、結合色素分子は協同して周辺クロスベータ構造へそれらの安定化力を発揮し、それによりＩｇＩＶへの易アクセス性結合部位を生み出している。固定ＢＳＡ‐ＡＧＥまたはＡβへの準最適濃度のｔＰＡの結合が考えられるとき、コンゴーレッドおよびチオフラビンＴの類似効果がみられる（図４Ｄ〜Ｇ）。ある条件下でクロスベータ構造へのアミロイド特異的分子の結合がミスフォールドタンパク質に特異的のある他の分子の結合を促進するという観察は、抗体のような薬物の効力を改善し、アミロイドーシスのようなタンパク質ミスフォールディング疾患を治療するために用いられる。
【０１２５】
実施例４：アミロイド様クロスベータ構造コンホメーションのリガンドに親和性をもつタンパク質と結合するためのミスフォールドタンパク質‐セファロースアフィニティマトリックス
ＣＮＢｒ‐セファロースマトリックスへの徹底グルコース‐６‐リン酸グリケート化ヘモグロビン、Ｈｂ‐ＡＧＥの固定化は、溶液からｔＰＡを捕捉するために効率的なアフィニティマトリックスをもたらした（図５）。ｔＰＡはミスフォールドタンパク質アフィニティマトリックスと特異的に結合することが示されている（図５Ａ）。ｔＰＡインキュベートＨｂ‐ＡＧＥミスフォールドタンパク質親和性セファロースマトリックスまたはカップリングタンパク質のないｔＰＡインキュベートコントロールマトリックスとの洗浄緩衝液のインキュベート後に洗浄緩衝液のｔＰＡ含有率を解析することにより、これは更に解明される（図５Ｂ）。ｔＰＡセリンプロテアーゼ活性はＨｂ‐ＡＧＥ セファロース洗浄後に洗浄緩衝液でほとんど回収されず、少しのｔＰＡ活性がｔＰＡインキュベートコントロールビーズ洗浄後に洗浄緩衝液でみられる。溶出用緩衝液とのｔＰＡインキュベートアフィニティマトリックスとコントロールマトリックスのインキュベート後、溶出用緩衝液中ｔＰＡ活性の回収の解析ではＨｂ‐ＡＧＥ セファロースがｔＰＡの効率的および選択的アフィニティマトリックスであることを示している（図５Ｃ）。
【０１２６】
次シリーズの実験では、ミスフォールドタンパク質と結合するタンパク質用のＨｂ‐ＡＧＥ セファロースアフィニティマトリックスを、ミスフォールドタンパク質と特異的に結合するＩｇＩＶ中のフラクションを捕捉するために用いた。Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースと特異的に結合したＩｇＩＶを固定Ｈｂ‐ＡＧＥおよび熱変性ＢＳＡとの結合性についてＥＬＩＳＡで試験した。最初に、希釈シリーズのＩｇＩＶストックの標準曲線を、タンパク質染色剤ＡＤＶ０１を用いて作製した（図５Ｄ）。アフィニティマトリックスと接触後およびアフィニティマトリックスから結合タンパク質の溶出後におけるＩｇＩＶ濃度を、ＩｇＩＶ標準曲線を用いて調べた。同様に、固定Ｈｂ‐ＡＧＥまたは熱変性ＢＳＡへの希釈シリーズのＩｇＩＶストックの結合性に関する標準曲線を作製した（図５Ｅ，Ｈ）。アフィニティマトリックスまたはコントロールマトリックスと接触後のＩｇＩＶおよび溶出物中における相対ＩｇＩＶ濃度を、標準曲線を用いてＩｇＩＶ濃度を計算することにより調べた。これらの計算ＩｇＩＶ濃度を、ＡＤＶ０１染色剤を用いて直接調べられたＩｇＩＶ濃度と比較した。これらの値で、ミスフォールドタンパク質へのＩｇＩＶの特異的結合性に関する富化ファクターを計算する。
【０１２７】
図５Ｆでは、被覆Ｈｂ‐ＡＧＥへの１０００倍希釈ＩｇＩＶストック（５０μｇ／ｍＬ）およびＨｂ‐ＡＧＥ‐セファロースまたはコントロール‐セファロースと接触させたＩｇＩＶの結合性が示されている。Ｈｂ‐ＡＧＥ結合性はＩｇＩＶをＨｂ‐ＡＧＥマトリックスと接触させた後で約５０％減少し、一方ＩｇＩＶをコントロールマトリックスと接触させた後でシグナルの減少は観察されない。Ｈｂ‐ＡＧＥマトリックスまたはコントロールマトリックスと接触後の全タンパク質濃度は５５および６０ｍｇ／ｍＬであった。５０ｍｇ／ｍＬの最大予測値（出発物質）からのこれら偏差は、標準曲線の非直線性に起因している。Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースおよびコントロールマトリックスから溶出したＩｇＩＶフラクションには、ＡＤＶ０１タンパク質染色剤で調べると、各々１２０および７μｇ／ｍＬ ＩｇＩＶが存在していた。固定Ｈｂ‐ＡＧＥへの１００倍希釈溶出物の結合性を評価したとき、観察されたシグナルは約７５および０．３ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶストックの結合後に得られたシグナルに相当した（図５Ｇ）。したがって、結論として、１２０μｇ／ｍＬのＨｂ‐ＡＧＥ‐セファロースアフィニティマトリックス富化ＩｇＩＶは、約７５ｍｇ／ｍＬの原ＩｇＩＶストックに相当する効力でＨｂ‐ＡＧＥと結合する。これは約７５，０００／１２０＝６００倍の富化ファクターに相当する。図Ｉでは、ＩｇＩＶとＨｂ‐ＡＧＥ‐セファロースまたはコントロールマトリックスとの接触が、出発物質と比較したとき、固定熱変性ＢＳＡへのＩｇＩＶ結合性の評価後に得られたシグナルを減少させていないことがわかる。しかしながら、Ｈｂ‐ＡＧＥマトリックスから溶出された１２０μｇ／ｍＬ ＩｇＩＶが熱変性ＢＳＡとの結合性に関して試験されたとき、シグナルが１．７ｍｇ／ｍＬ出発物質（原ＩｇＩＶストック）の結合後に得られたシグナルに相当した（図５Ｊ）。これは、ＩｇＩＶとミスフォールドタンパク質アフィニティマトリックスとの接触が熱変性ＢＳＡへの親和性を約１７００／１２０＝１４倍で増加させていることを示している。
【０１２８】
アフィニティマトリックスの選択性、親和性、能力および／または安定性を改善するために、Ｈｂ‐ＡＧＥに代わる他のミスフォールドタンパク質がマトリックスへ固定される。固定される代わりのミスフォールドタンパク質は、酸化タンパク質、（熱）変性タンパク質、グリケート化タンパク質、変性表面または変性分子、例えばＣｐＧ‐ＯＤＮに曝されたタンパク質、リポ多糖、デキストラン硫酸、カオリン、ガラス、脂質、またはアミロイドペプチド、例えばＦＰ６、アミロイド‐β、ＦＰ１３であるが、それらに限定されない。ＣＮＢｒ‐セファロースの代わりに、他のマトリックスまたは固体支持体がミスフォールドタンパク質リガンドの固定化に適用される。好ましくは、固体支持体はgood manufacturer practice（ＧＭＰ）条件下で作製され、好ましくは、ヒトの医療用に適合したマトリックスの安全面に関して、マトリックスは‘バイオプロセス培地’と表示されている。他のマトリックス／固体支持体は、ＮＨＳ‐セファロース、ストレプトアビジン‐セファロース、ラテックスビーズ、エポキシ活性化固体支持体、例えば架橋ポリメタクリレート、活性化チオールセファロース、カルボキシリンク、プロフィニティエポキシドであるが、それらに限定されない。
【０１２９】
特定疾患に関与するミスフォールドタンパク質を用いてアフィニティマトリックスが作製される。このアフィニティマトリックスで、クロスベータ構造コンホメーションの疾患関連ミスフォールドタンパク質と結合するＩｇが選択的に単離される。このＩｇフラクションの回収後、ミスフォールディング疾患用療法として用いられたときに、疾患特異的ＩｇＩＶが高度に特異的な有益的成果で得られる。ＩｇＧを単独で含んでなるＩｇＩＶがこの操作に適用されるのみならず、あらゆるＩｇフラクションが有益サブセットの抗体、例えばＩｇＭサブクラスの抗体の存在について試験される。ＩｇＩＶ富化アフィニティマトリックスの作製に適用される、病状と関連した数例のミスフォールドタンパク質は、アミロイド‐β（アルツハイマー病）、グリケート化タンパク質（透析，糖尿病）、β２‐ミクログロブリン（透析）、トランスチレチン（全身性アミロイドーシス）である。ミスフォールドクロスベータ構造リッチ分子を形成し、疾患特異的富化操作に用いられるタンパク質の別な例に関しては、表４および５参照。
【０１３０】
ミスフォールドタンパク質への高特異性および親和性をクリアランスシグナル：ミスフォールドタンパク質結合タンパク質とＩｇのＦｃドメインとのキメラと組み合わせた新規構築物
ＩｇＩＶ中のＩｇＧ分子とネズミモノクローナルＩｇＧ１／ＩｇＭ／ＩｇＧ２ａ抗体がクロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質と結合するという発見に基づき、Ｆｃレセプターとの相互作用でクリアランスしやすい能力と組み合わされた、ミスフォールドタンパク質に更に高い特異性および／または親和性を有する新規分子がデザインされる。この目的のために、クロスベータ構造に親和性をもつフィンガードメイン（Ｆ）またはいずれか他のタンパク質ドメイン、例えば前進性グリケーション終末産物のレセプターのＩｇドメイン、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（のクラスターII、クラスターIV）のドメイン、スカベンジャーレセプターＡ、‐Ｂ‐ＩまたはＣＤ３６のドメインが、Ｉｇ分子のＦｃ部分とＤＮＡレベルまたはアミノ酸レベルで融合される。事実、ミスフォールドタンパク質に親和性を有するタンパク質はいずれも、Ｆｃドメインをもつ複合体構築物にクロスベータ構造親和性を導入する上で適したドメインを供する（表４、５）。ｔＰＡ、因子XII、肝細胞成長因子アクチベーターおよびフィブロネクチンのフィンガードメインはすべてクロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質と結合し、したがってキメラ構築物のデザインにすべて用いられる。フィンガードメインのいずれかの組合せまたはマルチフィンガードメインのストレッチまたはフィンガードメインおよび他のミスフォールドタンパク質結合ドメインの組合せも、Ｆｃドメインのあるキメラ構築物の開発に適用される。キメラ遺伝子は融合および合成され、例えば酵母細胞、植物細胞、細菌、真核細胞、例えばヒト胚腎臓細胞、ベビーハムスター腎臓細胞へ発現目的に適した発現ベクターでクローニングされる。例えば組換えＦ‐Ｆｃキメラタンパク質の精製後、それはＩｇＩＶが用いられてきた疾患のいずれかで治療剤として適用される。一方、クロスベータ構造またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質に親和性をもつアフィニティ領域または合成分子またはタンパク質（の一部）が、タンパク質（フラグメント）の（非）共有結合について当業者に知られたいずれかの方法で、例えばＦｃ領域に融合される。更に、クロスベータ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなる分子に親和をもつ非タンパク質分子（表３）も、同様にＦｃ領域へ融合される。
【０１３１】
実施例５
ＩｇＩＶ、アフィニティ精製富化ＩｇＩＶまたはミスフォールドタンパク質結合タンパク質または分子とＦｃドメインとのキメラ構造物を投与する防御および／または有益効果を試験するためのモデル
ＩｇＩＶ、ミスフォールドタンパク質カップリングマトリックスでアフィニティ精製後の富化ＩｇＩＶフラクション、（ヒト化）抗ミスフォールドタンパク質抗体、または例えばフィンガードメインとＩｇＧ分子のＦｃドメインとのキメラ構造物の有益効果を試験するために、病状のいくつかのインビトロ細胞ベースモデルおよびインビボ動物またはヒトモデルが、このようなモダリティが全ＩｇＩＶの投与よりまたは現標準療法より顕著な有益効果を有するかどうかを調べるために適用される。
【０１３２】
インビトロネズミ樹状細胞アッセイ
（自己）免疫は、樹状細胞のような抗原提示細胞による（自己）抗原の提示に依存する。培養ネズミ樹状細胞（ＤＣ）がそのため（自己）免疫原性のモデルとして適用される。この目的のため、ＤＣを例えば８〜１２週齢Black-６マウスの後肢から単離する。骨を摘出し、７０％エタノールでリンスし、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％胎児ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ‐１６４０培地でリンスする。次いで骨をこの緩衝液で両方向にフラッシングする。（地元のＵＭＣ Utrecht Pharmacy Dept.から得られた,カタログ番号９７９３２３２９）赤血球特異的溶解用緩衝液を加えることにより、赤血球から溶出物を回収する。溶出物を細胞培養プレートで培養することにより、それらを生存細胞について解析する。この段階で、培地を１０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ‐ＣＳＦで富化させる。ＤＣをマクロファージ細胞の懸濁液または層で増殖させる。ＦＡＣＳおよび特異的抗体を用いて、ＤＣが存在して活性化されるかどうか調べる。好ましくは、いわゆる補助刺激分子、例えばＢ７．１、Ｂ７．２、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６のレベルを、好ましくはＣＤ１１ｃ陽性細胞で調べる。一方、ＮＦ‐κＢの活性化および／またはサイトカインの発現を、免疫原に関与する細胞、例えばＡＰＣおよびＤＣの活性化の指標として用いる。好ましくは、次のサイトカインを定量する：ＴＮＦα、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６および／またはＩＦＮγ。好ましくは、サイトカインレベルをＥＬＩＳＡで定量する。一方、ｍＲＮＡレベルを定量する。当業者であれば、ＡＰＣおよびＤＣの機能も試験されることが明らかである。
【０１３３】
一方、クロスベータ構造のミスフォールドタンパク質の枯渇または中和の有益効果を試験するために、安定ＤＣ系、ヒト血液から集められた単球から得られた培養樹状細胞または他の抗原提示細胞が用いられる（Citterio et al.,1999）。
【０１３４】
ＤＣで行われる更なる実験は、リポ多糖（ＬＰＳ）への細胞の暴露、次いで前記活性化マーカーのレベルの読み取りである。ＤＣへのＬＰＳの暴露前または中におけるＬＰＳと（富化）ＩｇＩＶおよび／または他のアフィニティ領域とのプレ‐および／またはコ‐インキュベートの効果も試験する。これらの実験はヒトで細菌感染症および敗血症のモデルとしてみられる。
【０１３５】
インビトロヒト臍静脈内皮細胞アッセイ
クロスベータ構造を含んでなるグリケート化タンパク質は、糖尿病性ネフロパシーを含めたある疾患の発病に関与すると考えられている、炎症応答を誘導する。一般的に、ミスフォールドタンパク質は炎症シグナルの高発現または活性化で細胞機能障害を誘導する。内皮細胞機能（障害）に及ぼすミスフォールドタンパク質の効果は、例えばミスフォールドタンパク質に応答した反応性酸素種のレベルを調べることにより測定される。標準プロトコールに従い単離および培養されたヒト臍静脈内皮細胞、または他の内皮細胞、例えばｂＥｎｄ．３内皮細胞を用いる。反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルはＣＭ‐Ｈ２ＤＣＦ‐ＤＡのような蛍光プローブを用いてモニターする。一方、細胞生存はＭＴＴアッセイによりモニターする。培養一次細胞は、ある病状のモデル系として研究界で受け入れられたインビトロ細胞アッセイを行う機会を提供する。再度、ＩｇＩＶ、その単離フラクション、機能的相当物または我々の抗クロスベータ抗体の能力がこれらの系に適用される。
【０１３６】
汎発性血管内凝固のインビボネズミモデル
クロスベータ構造は汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）を誘導する。ＤＩＣのモデルとして、雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスで全身性シュワルツマン反応を誘発させる。この目的のため、マウスを０日目に足蹠で５μｇリポ多糖（ＬＰＳ）およびｔ＝２４ｈで静脈内に３００μｇＬＰＳで注射する。経時的に、タンパク質、例えばサイトカインのいくつかの血漿レベルと一緒に、生存をモニターする。
【０１３７】
インビボマウス／ラット実験的自己免疫脳脊髄炎モデル
抗ミスフォールドタンパク質抗体が多発性硬化症（ＭＳ）再発時に有益効果を発揮するかどうかを試験するために、ＭＳのインビボマウスモデル、実験的自己免疫（またはアレルギー）脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いる。この目的のため、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５‐５５（ＭＯＧ３５‐５５）をマイコバクテリア含有の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させる。チオフラビンＴおよびコンゴーレッド蛍光アッセイ並びにｔＰＡ結合および活性化アッセイを用いて、ミスフォールドタンパク質の存在を調べる。乳化ＭＢＰまたはＭＯＧ３５‐５５へのＩｇＩＶまたはアフィニティ精製後ＩｇＩＶの富化フラクションの結合性を評価する。マウスまたはラットでＥＡＥを誘導するために、乳化ＭＢＰまたはＭＯＧ３５‐５５を例えば後足蹠に注射する。マウスでは、皮下注射量のＭＯＧ３５‐５５に好ましくはBordetella pertussis毒素の腹腔内注射を付随させ、これを４８時間後に繰り返す。例えば、Lewis雌性ラットまたは雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いる。臨床疾患の尺度は例えば次のようにスコアリングする：０，正常；１，だらんとした尾；２，立直り反射の障害；３，後肢の不全麻痺；４，後肢の完全麻痺；５，死亡。ＥＡＥ誘導後に１以上の時点で薬物を投与することにより、あらゆる（キメラ）抗体調製物の効果を解析する。試験される調製物の１つは、固定変性／ミスフォールドＭＢＰまたはＭＯＧ３５‐５５含有のアフィニティマトリックスでアフィニティ精製されたＩｇＩＶであり、それに応じて２種のタンパク質が疾患を誘導するために用いられる。
【０１３８】
インビボコラーゲン誘導関節炎モデル
インビボコラーゲン誘導関節炎モデルでは、酢酸に溶解されてＩＦＡで乳化されたII型（ウシ）コラーゲンでラットの尾の付け根および各肢の裏側に皮下注射する。腫脹および紅斑をモニターすることにより、徴候についてラットを毎日検査する。試験される調製物の１つは、ＩＦＡ中固定変性／ミスフォールドコラーゲン含有のアフィニティマトリックスでアフィニティ精製されたＩｇＩＶである。
【０１３９】
インビボマウス敗血症モデル
敗血症はクロスベータ構造により媒介される。ＩｇＩＶ、モノクローナル抗体または関連薬物の効果を試験するために適用されるインビボマウス敗血症モデルの１つは、‘盲腸結紮および穿刺’モデルである。この目的のために、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを麻酔してから、盲腸を腹部外に取り出すために腹部切開を行う。盲腸を穿刺した後、ある量の管腔内容物を穿孔から外に移してから、盲腸を腹部に戻し、開口部を閉じる。体温を測定し、マウスの動きをスコアリングすることにより、感染の進行をモニターする。マウスが低体温（Ｔ＜３３℃）であるとき、およびマウスが自ら立直りできないときは、マウスを致死的に感染したとみなす。クロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質に親和性の抗体を投与する効果は、盲腸の穿刺後に、未処置マウスのグループと（富化）ＩｇＩＶ、モノクローナル抗体またはキメラ構築物を受けたマウスのグループをモニターすることにより評価する。
【０１４０】
インビボラット敗血症モデル
マウス敗血症モデルの代わりとして、ラット敗血症モデルを用いる。例えば、１５ｍｇ／ｋｇ Escherichia coli内毒素の静脈内注射により、約１５０ｇのFischerラットで内毒素ショックを誘導する。疾患進行の尺度として、ＥＬＩＳＡで血中組織壊死因子およびインターロイキン‐１のレベルをモニターする。アンフォールドタンパク質に親和性をもつＩｇＩＶまたは抗体またはキメラ構築物のいずれかの調製物による治療の効果をこうして評価する。
【０１４１】
インビボマウス再活性化Streptococcus細胞壁誘導関節炎モデル
再活性化Streptococcus細胞壁誘導関節炎のインビボマウスモデルでは、Streptococcus pyogenes Ｔ１２生物の細胞壁の膝関節における関節内注射で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを誘導する。注射は１週間隔で５回繰り返す。疾患進行は、例えば注射膝関節の腫脹を測定することで、約４０日間追跡する。マウスを殺した後、膝関節から皮膚を切除した後で、関節炎の程度を肉眼でスコアリングする。抗クロスベータ構造抗体またはキメラを投与した効果は、治療を受けなかったコントロール、および緩衝液で注射されたコントロールマウスと比較する。
【０１４２】
インビボマウス実験的リウマチ様関節炎モデル
実験的コラーゲン誘導リウマチ様関節炎のインビボマウスモデルにおいて、例えばＤＢＡ／１株の雄性マウスおよび／またはＣ５７ＢＬ／６株の雄性マウスを天然ウシコラーゲンII型で侵襲する。Mycobacterium tuberculosis含有の完全フロイントアジュバントで乳化されたコラーゲンを尾の付け根で皮下注射することにより、関節炎を誘導する。ＩＦＡで乳化されたコラーゲンで２１日目にマウスをブーストする。マウスを関節炎の徴候についてモニターし、標準スコアリング操作を用いて疾患の程度をスコアリングする。関節炎のコントロールマウスおよび緩衝液のみで２回注射されたコントロースマウスを関節炎誘導後のＩｇＩＶ／モノクローナル抗体／キメラ構築物処置マウスと比較することにより、抗体ベース療法の効果を評価する。
【０１４３】
インビボヒト炎症／免疫原性モデル：グリケート化タンパク質＋／−ＩｇＩＶの投与
クロスベータ構造を含んでなるグリケート化タンパク質は、糖尿病性ネフロパシーを含めたある疾患の発病に関与する、炎症応答を誘導する。一般的に、ミスフォールドタンパク質は炎症シグナルの高発現または活性化で細胞機能障害を誘導する。ミスフォールドタンパク質の炎症効果および抗クロスベータ構造試薬、例えばＩｇＩＶ、そのフラクション、または機能相当炎症をマウスおよびヒトで研究する。クロスベータ構造を含んでなるタンパク質を静脈内投与により注入する。異なる時間間隔で、急性期タンパク質、例えばＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）または補体因子３（Ｃ３）のレベルに及ぼす効果を測定する。一方、炎症の他のマーカー、例えばＩＬ‐６、ＩＬ‐８、Ｄ‐ダイマーまたはプロトロンビンＦ１＋２レベルに及ぼす効果を調べる。最後に、（自己）抗体形成のレベルをＥＬＩＳＡで調べる。
【０１４４】
化合物の炎症性または免疫原性の測定のための全血アッセイ
クロスベータ構造コンホメーションのタンパク質による免疫系の細胞の活性化がクロスベータ構造結合化合物、例えばＩｇＩＶ、モノクローナル抗クロスベータ構造抗体、キメラ構築物を用いて遮蔽されるかどうかを評価する１手法は、‘全血’アッセイの使用による。この目的のため、１日目に新鮮採血ヒトＥＤＴＡ‐血液を３７℃で予熱されたＲＰＭＩ‐１６４０培地（ＨＥＰＥＳ緩衝化，Ｌ‐グルタミン，Gibco,Invitrogen,Breda,オランダ）へ１：１比で加える。その後で、クロスベータ構造コンホメーションを含んでなるタンパク質を、クロスベータ構造結合化合物と共にまたはそれなしで加える。好ましくは、陽性コントロール、好ましくはＬＰＳを含める。ＬＰＳに用いられるインヒビターは、５μｇ／ｍＬ最終濃度のポリミキシンＢである。試験される標準クロスベータ構造コンホメーションリッチポリペプチドは、Ａβ、アミロイドγ‐グロブリン、グリケート化タンパク質、ＦＰ１３、熱変性ＯＶＡ、熱変性ＢＳＡ、熱変性ＭＳＡ、熱変性リゾチームおよびカルジオリピンに曝されたβ２ｇｐｉである。陰性コントロールは、天然γ‐グロブリン、天然アルブミン、天然Ｈｂ、新鮮溶解ＡβまたはＦＰ１３、天然ＯＶＡ、他の天然タンパク質である。コントロールとして、推定内毒素汚染のせいでみられる効果を排除するために、すべてのタンパク質サンプルを５μｇ／ｍＬポリミキシンＢの不在または存在下で試験する。加えて、単独のまたは変性アジュバント、例えばＬＰＳおよびＣｐＧ‐ＯＤＮ、または他の変性化合物または変性条件（例えば、Ｃｕ２＋酸化）に事前暴露された天然タンパク質を、免疫原活性について試験する。すべての前記試験化合物を炎症または免疫原性応答のポテンシャルインヒビター、例えばＩｇＩＶ、モノクローナル抗クロスベータ抗体の濃度シリーズの不在および存在下で試験する。血液‐培地混合物へ加えられるアクチベーター、コントロールおよびポテンシャルインヒビターの最終容量は全容量の約１／２００である。より高濃度のアクチベーターおよび推定インヒビターは、前希釈ステップに濃縮ＲＰＭＩ‐１６４０培地（ＲＰＭＩ‐１６４０ Medium粉末，Gibco,Invitrogen；カタログ番号５１８００‐０３５）を用いることで得られる。血液および培地を慎重に混ぜ、ＣＯ２の取込みを行う蓋付きのＣＯ２インキュベータで一夜インキュベートする。２日目に培地を室温にて１０００＊ｇで１０分間のスピニング後に集める。細胞ペレットを凍結保存する。培地を再び室温にて２０００＊ｇで２０分間スピンさせる。免疫応答のマーカー、例えば組織壊死因子‐α（ＴＮＦα）、サイトカイン、ケモカインの濃度に関してはＥＬＩＳＡを用いて上澄を解析する。例えば、市販ＴＮＦアルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ ＥＬＩＳＡ（R&D Systems,Minneapolis,ＭＮ,ＵＳＡ；Human ＴＮＦアルファ Quantikine ＨＳ PharmPak）を用いることにより、試験化合物への全血の暴露後におけるＴＮＦαレベルを評価する。陽性および陰性コントロールと信頼しうる滴定曲線が確立されたら、免疫原性のマーカーの濃度に及ぼすクロスベータ構造負荷に関していずれの溶液も試験する。更に、免疫応答の推定インヒビターを試験する。例えば、ＩｇＩＶおよびモノクローナル抗クロスベータ抗体はミスフォールドタンパク質溶液���の添加で免疫応答を妨げる。
【０１４５】
クロスβ構造含有部分の食作用
クロスβ構造含有タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドと細胞または細胞粒子の取込み、並びにＩｇＩＶまたはその機能相当物の効果を、培養細胞、好ましくは単球、樹状細胞、マクロファージまたは類似細胞、例えばＵ９３７またはＴＨＰ‐１細胞を用いてインビトロで研究する。好ましくは、クロスβ構造含有分子を、好ましくは１２５Ｉまたは蛍光標識、好ましくはリンカー分子、好ましくはＵＬＳ（universal Linkage system）または類似カップリング方法で分子に共有結合されたＦＩＴＣで標識する。細胞は、好ましくはメパクリンまたは他の蛍光標識、例えばローダミンで標識する。食細胞を標識クロスβ構造含有分子の存在下で、または細胞をクロスβ構造結合化合物、例えばＩｇＩＶまたはその機能相当物の存在または不在下でインキュベートする。インキュベート後、好ましくは数時間中に、好ましくはシンチレーションカウンター（１２５Ｉの場合）を用いてまたはＦＡＣＳ解析（蛍光プローブで）または免疫蛍光顕微鏡検査により、標識分子または細胞の取込みを測定する。細胞の取込みは、細胞の目視染色により光学顕微鏡下でもカウントされる。
【０１４６】
実施例６〜２０
実施例６〜２０の一般的物質および方法
クロスベータ構造をもつミスフォールドタンパク質の調製
ヒトＩｇＩＶのミスフォールディング
ＩｇＩＶ Gammmagard ＲＦ（ＩｇＩＶ ＲＦ）
リウマトイド因子（ＲＦ）の抗原を調製するために用いられた操作に従い、ＩｇＩＶ Gammmagard（天然ＩｇＩＶ）をミスフォールドさせた。ＩｇＩＶ Gammmagardを無菌条件下でグリシン緩衝液（１００ｍＭグリシン，１７ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．２）中１ｍｇ／ｍＬに溶解させた。それを６５℃で５分間加熱し、−８０℃で保存した。
【０１４７】
ＩｇＩＶ Gammmagardの熱変性（ＩｇＩＶ６５,ＩｇＩＶ６９,ＩｇＩＶ７６など）
ＩｇＩＶ Gammmagardを無菌条件下２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．０で５ｍｇ／ｍＬに溶解し、２５℃から指示温度まで５℃／ｍｉｎの温度ステップで熱変性させた。最終温度は６５℃、６９℃、７６℃、８０℃、８３℃および８６℃であった。熱変性後、タンパク質を−８０℃で直ちに保存し、下記のような様々なアッセイを用いてそれらの構造を解析した。天然コントロールとして、新鮮溶解ＩｇＩＶ Gammmagardを２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．０中５ｍｇ／ｍＬの濃度で室温にて１０分間保ち、−８０℃で保存した。
【０１４８】
ＩｇＩＶ GammmagardのＨＦＩＰ／ＴＦＡ変性（ＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡ）
ＩｇＩＶ Gammmagardを無菌条件下１，１，１，３，３，３‐ヘキサフルオロ‐２‐プロパノール（ＨＦＩＰ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の１：１（ｖ／ｖ)混合液で５ｍｇ／ｍＬに溶解した。その後で、それをボルテックスにて室温で５分間よく混ぜた。有機溶媒をＮ２ガス下で蒸発させ、乾燥物質をＨ２Ｏで１ｍｇ／ｍＬに溶解し、３７℃で７日間インキュベートし、−２０℃で保存した。
【０１４９】
ＩｇＩＶ Gammmagardの酸または塩基変性（ＩｇＩＶ酸，ＩｇＩＶ塩基）
ＩｇＩＶ GammmagardをＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに溶解し、ローラー装置にて室温で１０分間インキュベートした。次いで、ｐＨをＨ２Ｏ中１５％ＨＣｌストックのある容量の添加によりｐＨ２へ下げ（酸変性）、またはＨ２Ｏ中５Ｍ ＮａＯＨストックのある容量でｐＨ１１へ上げ（塩基変性）、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ｐＨを各々５Ｍ ＮａＯＨまたは１５％ＨＣｌの添加でその初期生理的値に調整し、−８０℃で保存した。
【０１５０】
Octagam ＩｇＩＶのミスフォールディング
Octagam ＩｇＩＶ（Octapharma,Brussel,Belgium，ロット５０２４０１８４３４，期限１２／２００６）を用いた。ＩｇＩＶ中の内毒素濃度は低く、即ち標準化Limulus Amebocyte Lysate（ＬＡＬ）アッセイ（Cambrex）を用いて調べると５０ｍｇ／ｍＬ Octagamストック中０．１３Ｅ．Ｕ．／ｍＬであった。ＩｇＩＶを１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ８．１）で１、２．５、５、１０および２０ｍｇ／ｍＬに希釈し、２５℃から６５℃へ段階的に加熱し（０．５℃／ｍｉｎ）、室温で１時間４０分保ち、その後で−８０℃で保存した。一方、ＩｇＩＶを１０ｍＭ ＨＣｌ ｐＨ２．０で希釈し、６５℃で６時間インキュベートした。このインキュベート後に、ｐＨをＮａＯＨで７．３に調整した。
【０１５１】
マウスＩｇＧの組成物の酸または塩基変性（ｄｍＩｇＧ酸，ｄｍＩｇＧ塩基）
マウスＩｇＧ（ｍγ‐グロブリン，cohn画分II,III約９９％から，Sigma，ロット０９０ｋ７６８０）をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに溶解し、ローラー装置にて室温で２０分間インキュベートした。ＩｇＩＶ酸およびＩｇＩＶ塩基に関して前記された方法に従いＩｇＧをミスフォールドさせた。ミスフォールドｍγ‐グロブリンはｄｍＩｇＧまたはｄｍγ‐グロブリンと称される。
【０１５２】
熱によるマウスＩｇＧのミスフォールディング（ｄｍＩｇＧ８５℃）
マウスＩｇＧ組成物をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに溶解し、ローラー装置にて室温で２０分間インキュベートした。次いで、それを２５℃から８５℃へ５℃／ｍｉｎのステップで加熱し、その後で−８０℃で保存した。
【０１５３】
ヒトＩｇＧの組成物のミスフォールディング
ヒトＩｇＧ（γ‐グロブリン，Sigma，Ｇ４３８６）をＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ ＣａＣｌ２）で５ｍｇ／ｍＬに溶解した。次いで、ｐＨを５Ｍ ＮａＯＨストックからある容量を加えることにより上げ、３７℃で４０分間保った。次いでｐＨをその初期値へ調整するために５Ｍ ＨＣｌストックから等量を加え、−８０℃で保存した。大凝集物を色素で観察した。
【０１５４】
アポリポタンパク質Ａ‐Ｉの酸および熱変性
１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３および１００ｍＭまで加えられたＨＣｌ中アポリポタンパク質Ａ‐Ｉ（ＡｐｏＡ‐Ｉ，２．１５ｍｇ／ｍＬ，ヒト血漿から，Sigma，Ａ０７２２，ロット１１６Ｋ１４０８）を３７℃、７５℃または１００℃で３０分間加熱することにより変性させた。その後で、ｐＨを初期値へ変えるために相当量のＮａＯＨ（１００ｍＭ最終濃度）を加えた。
【０１５５】
塩基および熱変性アポリポタンパク質Ａ‐Ｉ
再び、今回は１００ｍＭまで加えられたＮａＯＨ含有の１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中２．１５ｍｇ／ｍＬアポリポタンパク質Ａ‐Ｉを３７℃、７５℃または１００℃で３０分間加熱することにより変性させた。その後で、ｐＨを初期値へ変えるために相当量のＨＣｌ（１００ｍＭ最終濃度）を加えた。
【０１５６】
熱変性アポリポタンパク質Ａ‐Ｉ
１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中２．１５ｍｇ／ｍＬアポリポタンパク質Ａ‐Ｉ（ＡｐｏＡ‐Ｉ）ストックを７５℃または１００℃で３０分間かけて熱変性させた。
【０１５７】
オボアルブミンの熱変性（ｄＯＶＡ ｓｔｄ）
オボアルブミン（ＯＶＡ，ニワトリ卵白から，Sigma，Ａ５５０３グレード，ロット０７１４７０９４）を１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解し、ＰＣＲマシンにおいて５℃／ｍｉｎの温度ステップで３０℃から８５℃へ５サイクル加熱した。このミスフォールドＯＶＡはｄＯＶＡまたはｄＯＶＡ標準（ｓｔｄ）と称される。
【０１５８】
フィブリルアミロイドベータ１‐４２（ｆＡβ４２）の調製
凍結乾燥合成ヒトアミロイド‐β（１‐４２）ペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ；ＮＫＩ Amsterdam,オランダ；配列番号９）（Ａβ１‐４２）を最初にＨＦＩＰ中１ｍＭで溶解することによりモノマー化し、無菌ミクロ遠心管に等分した。ＨＦＩＰを窒素ガスで除去し、ペプチドフィルムを５ｍＭの濃度まで乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Pierce，２０６８４）に再懸濁し、液体窒素でスナップ凍結させ、−８０℃で保存した（モノマー化Ａβ１‐４２ストック）。ＤＭＳＯ中解凍モノマー化Ａβ１‐４２ストックを４００μｇ／ｍＬの最終濃度で１０ｍＭ ＨＣｌに溶解し、３７℃で２４時間インキュベートし、その後で−８０℃で保存した。
【０１５９】
ＰＢＳに溶解されてｔ＝０で−８０℃に直接凍結されたＡβ１‐４２（Ａβ４２ｔ＝０）
ＤＭＳＯ中解凍モノマー化Ａβ１‐４２ストックをフィルター滅菌（０．２２μｍ）されたＰＢＳで１００μＭの濃度に溶解し、−８０℃で保存した。
【０１６０】
ＨＢＳに溶解されて４℃で２４時間インキュベートされたＡβ１‐４２（Ａβ４２ＨＢＳ）
ＤＭＳＯ中解凍モノマー化Ａβ１‐４２ストックをＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝液，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３）で１００μＭの濃度に溶解した。緩衝液は使用前に０．２２μｍシリンジフィルターで濾過する。サンプルを調製後−８０℃で保存した。
【０１６１】
フィブリルアミロイドベータ１‐４０（ｆＡβ４０）の調製
Ａβ１‐４２と同様に、モノマー化合成ヒトＡβ１‐４０ペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ，ＮＫＩ Amsterdam,オランダ）のストックを調製し、−８０℃で保存した。ＤＭＳＯ中解凍モノマー化Ａβ１‐４０をＰＢＳで１００μＭの濃度に溶解し、室温で１６８時間インキュベートし、その後で−８０℃で保存した。
【０１６２】
ＰＢＳに溶解されてｔ＝０で−８０℃に直接凍結されたＡβ１‐４０（Ａβ４０ｔ＝０）
ＤＭＳＯ中解凍モノマー化Ａβ１‐４０をＰＢＳで１００μＭの濃度に溶解し、直接−８０℃で保存した。
【０１６３】
１０ｍＭ ＨＣｌに溶解されて３７℃で２４時間インキュベートされたＡβ１‐４０（Ａβ４０ＨＣｌ）
ＤＭＳＯ中解凍モノマー化Ａβ１‐４０を１０ｍＭ ＨＣｌで１００μＭの濃度に溶解し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後で、それを過剰ＰＢＳ１（１４０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４；ＰＢＳ１は使用前に０．２２μｍシリンジフィルターを用いて濾過する）で中和し、−８０℃で保存した。
【０１６４】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Cealb，Sanquin，オランダ，ロット０５Ｃ２９Ｈ１２０Ａ）のミスフォールディング
１、２．５、５、１０および２０ｍｇ／ｍＬ、（５Ｍ ＨＣｌストックからある容量で下げた）ｐＨ２のＨＳＡを６５℃で６時間加熱し、次いで５Ｍ ＮａＯＨストックからある容量で中和し、その後−８０℃で保存した。
【０１６５】
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）
Jeol １２００ ＥＸ透過型電子顕微鏡（Jeol Ltd.,Tokyo,Japan）を用いて８０ｋＶの励起電圧でＴＥＭ像を集めた。各サンプルについて、formvarと１００メッシュ銅またはニッケルグリッドの炭素被覆サイドを５μＬ滴のタンパク質溶液に５分間置いた。その後で、それを１００μＬ滴のＰＢＳに２分間置き、次いで１００μＬ滴の蒸留水と２分間インキュベートを３回行った。グリッドを次いで０．４％酢酸ウラニルｐＨ４含有の２％（ｍ／ｖ）メチルセルロースの１００μＬ滴で２分間染色した。グリッドのサイドを濾紙にストリークすることにより過剰の流体を除去し、グリッドをその後ランプ下で乾燥させた。サンプルを１０Ｋの倍率で解析した。
【０１６６】
コンゴーレッド（ＣＲ）蛍光アッセイ
コンゴーレッド蛍光の増強は、クロスベータコンホメーションのタンパク質に共通した構造的特徴を含んでなる、ミスフォールドタンパク質の特性である。コンゴーレッド（ＣＲ）（Aldrich Chemical Company Inc.,Milwaukee,ＷＩ,ＵＳＡ,８６，０９５‐６）の蛍光をブラック９６ウェルプレートにおいてThermo Fluoroskan Ascent 2.5マイクロプレート蛍光光度計（Vantaa,Finland）で５９０ｎｍの発光波長および５４４ｎｍの励起波長にてデュプロ(in duplo)測定した。タンパク質およびペプチドストックをＰＢＳ中２５μＭ ＣＲでｄＯＶＡおよびＩｇＩＶサンプルの場合１００μｇ／ｍＬに、Ａβサンプルの場合４０μｇ／ｍＬに希釈し、室温で５分間インキュベートした。ＣＲなしの緩衝液およびタンパク質溶液と緩衝液中ＣＲからのバックグラウンド蛍光を、ＣＲとインキュベートされたタンパク質溶液の対応測定値から差し引いた。測定の陽性コントロールは１００μｇ／ｍＬ ｄＯＶＡであった（ｄＯＶＡ ｓｔｄ）。
【０１６７】
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光増強アッセイ
ＴｈＴ蛍光の増強は、クロスベータコンホメーションのミスフォールドタンパク質に共通した構造的特徴を含んでなる、ミスフォールドタンパク質の特性である。チオフラビンＴ（ＴｈＴ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ,Ｔ‐３５１６）の蛍光をＣＲに関して記載された操作と同様に測定した。発光波長は今回４８５ｎｍおよび励起波長は４３５ｎｍであった。タンパク質およびペプチドストックを５０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ９．０中２５μＭ ＴｈＴで希釈した。
【０１６８】
８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）蛍光アッセイ
疎水性アミノ‐アシル残基のクラスターへ結合されたとき、ＡＮＳ蛍光は高められる。タンパク質の溶媒暴露疎水性領域への結合で、発光波長（λＥＭ）は３８０ｎｍの波長（λＥＸ）で励起されたとき５１４ｎｍから４６０ｎｍにシフトし、蛍光強度の劇的増強を伴う。ＡＮＳ（Sigma,Ａ１０２８）の蛍光を４６０ｎｍの発光波長および３８０ｎｍの励起波長で測定した。様々な試験タンパク質およびペプチドストック溶液をＰＢＳ中４０μＭ ＡＮＳに溶解し、室温で５分間インキュベートした。ＡＮＳなしの緩衝液およびタンパク質溶液からのおよび緩衝液中ＡＮＳのバックグラウンド蛍光を、ＡＮＳとインキュベートされたタンパク質溶液の対応測定値から差し引いた。測定の陽性コントロールは１００μｇ／ｍＬ ｄＯＶＡ（ｄＯＶＡ ｓｔｄ）であった。
【０１６９】
４，４′‐ジアニリノ‐１，１′‐ビナフチル‐５，５′‐ジスルホン酸二カリウム塩（Ｂｉｓ‐ＡＮＳ）蛍光増強アッセイ
ＣＲ、ＴｈＴおよびＡＮＳと同様に、Ｂｉｓ‐ＡＮＳ（Sigma）蛍光の増強を測定した。発光波長は４８５ｎｍおよび励起波長は４３５ｎｍであった。タンパク質およびペプチドストックをＰＢＳ中２５μＭ Ｂｉｓ‐ＡＮＳで希釈した。
【０１７０】
チオフラビンＳ（ＴｈＳ）蛍光増強アッセイ
ＴｈＳ蛍光の増強は、クロスベータコンホメーションのタンパク質に共通した構造的特徴を含んでなる、ミスフォールドタンパク質の特性である。ＴｈＳ（Sigma,０３３ｋ１０７６）の蛍光をＣＲおよびＴｈＴに関して記載された操作に従い測定した。発光波長は５４２ｎｍおよび励起波長は４３５ｎｍであった。タンパク質およびペプチドストックをＰＢＳ中２５μＭ ＴｈＳで希釈した。
【０１７１】
内在トリプトファン蛍光アッセイ
内在トリプトファン（Ｔｒｐ）蛍光測定を、ブラック９６ウェルプレート中の１００μＬサンプルについて、２８３ｎｍの励起波長で、Softmax pro ｖ５．０１ソフトウェアを用いてGemini Spectramax ＸＰＳ（Molecular Devices）で行った。発光スペクトルを３６０〜８５０ｎｍ範囲で室温にて集めた。天然フォールドタンパク質は、そのミスフォールド対応物と比較して、増加または減少した蛍光を示す。ＴｒＰ蛍光強度の絶対値はさほど情報性のあるものではない。しかしながら、大きさの変化はタンパク質フォールドの摂動をモニターするためのプロービングパラメーターとして働く。蛍光発光波長のシフトは、Ｔｒｐ発蛍光団の環境中における局所変化の良い指標である。溶媒暴露Ｔｒｐ残基は３４０〜３５０ｎｍで最大蛍光を示し、一方全体的に埋蔵された残基は約３３０ｎｍで蛍光を発する。
【０１７２】
ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイ
ミスフォールドタンパク質への２種セリンプロテアーゼの暴露によるｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化の増強を、標準化クロモゲンアッセイ（例えば、特許出願ＷＯ２００６１０１３８７、パラグラフ〔０１９５〕およびKranenburg et al.,2002,Curr.Biology 12(22),pp.1833参照）を用いて調べた。ｔＰＡおよびプラスミノーゲンは双方ともクロスベータ経路で作用する（表４参照）。クロスベータ結合プロテアーゼの活性の増強は、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質の存在に関する尺度である。
【０１７３】
ミスフォールドタンパク質と結合する組換えフィブロネクチンフィンガードメイン
今回はＣ末端ＦＬＡＧ‐タグおよびＨｉｓ‐タグ付きの、組換えヒトフィブロネクチンフィンガードメイン４‐５（Ｆｎ Ｆ４‐５）のクローニング、発現および精製の記載に関して、特許出願ＷＯ２００６１０１３８７（パラグラフ〔０１３７〕‐〔０１６５〕および〔０１９２‐０１９４〕）参照。ヒト胚腎臓細胞のタンパク質発現および精製をＡＢＣ-Expression Facility（University of Utrecht,オランダ）の助けで行った。５％グリセロールを含有するＰＢＳ中２８８μｇ／ｍＬの精製Ｆｎ Ｆ４‐５を−８０℃で保存する。
【０１７４】
ｔＰＡおよびフィブロネクチンフィンガー４‐５ＥＬＩＳＡ
様々なヒト血漿ＡｐｏＡ‐Ｉ調製物へのＦｎ Ｆ４‐５およびｔＰＡの結合性の解析のために、標準ＥＬＩＳＡを上記のように適用した。ｔＰＡ結合性の解析では、１０ｍＭ ε‐アミノカプロン酸を結合用緩衝液（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に含有させた。Ｆｎ Ｆ４‐５‐ＦＬＡＧ‐Ｈｉｓの結合性は抗ＦＬＡＧ抗体（マウス抗体，Ｍ２，ペルオキシダーゼ複合体；Sigma,Ａ‐８５９２）を用いて調べた。
【０１７５】
結果
ｄＯＶＡ標準のＴＥＭ解析
指定のアッセイで標準ミスフォールドタンパク質として用いられる熱変性オボアルブミン（ｄＯＶＡ ｓｔｄ）のＴＥＭ解析では、ミスフォールドタンパク質が非フィブリルマルチマーに凝集することを示している（示さず）。上記の全蛍光増強アッセイおよびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイで、最大蛍光増強または最大ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化を各々呈するｄＯＶＡ ｓｔｄ濃度が特定された。蛍光増強アッセイでは、この濃度が１００μｇ／ｍＬに設定された。ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイでは、４０μｇ／ｍＬ ｄＯＶＡ ｓｔｄがリファレンスとして用いられる。適宜に、ｄＯＶＡ ｓｔｄにより誘導される蛍光増強およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化が、比較目的のため任意に１００％に設定された。
【０１７６】
グリケート化ＢＳＡおよびＨｂのＴＥＭ解析
図６は、グリケーションによるＢＳＡおよびヘモグロビンのミスフォールディングが非フィブリル無定形凝集物を誘導することを示している。
【０１７７】
ＩｇＩＶ Octagram
図７は、Octagram(オクタグラム) ＩｇＩＶの変性がクロスベータ構造を誘導することを示している。様々なミスフォールディング条件がＴＥＭおよびチオフラビンＴ特性の変化したミスフォールドタンパク質をもたらすことがわかる。フィブリルは観察されない。ミスフォールディングに際して比較的高いＩｇＩＶ濃度のときＩｇＩＶ分子のアセンブリーのサイズが増加する、と結論づけられる。これはＴｈＴ蛍光と相関しない。
【０１７８】
ＩｇＩＶ Gammagard
チオフラビンＴ、コンゴーレッド、ＡＮＳ、Ｂｉｓ‐ＡＮＳおよびチオフラビンＳの蛍光増強が、天然ＩｇＩＶと比較して、様々なミスフォールドＩｇＩＶ Gammagard（ガンマガード）サンプルで観察された（図８Ａ〜Ｅ）。一般的に、様々な蛍光色素での蛍光の増加が変性に際する温度の増加に比例して観察される。Ｔｒｐ蛍光が測定されるときに類似の特性が観察された（図８Ｆ）。天然ＩｇＩＶ Gammagardと比較したとき、蛍光の上昇が塩基および酸変性ＩｇＩＶ Gammagardでも観察される。ＩｇＧでＲＦのエピトープを作製するための条件は、クロスベータマーカーで比較的小さな増加を導くことがわかった。ｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃で、ＴｈＴ、ＣＲおよびＴｒｐ蛍光を測定した。天然ＩｇＩＶおよび別な処理でミスフォールドされたＩｇＧと比較して、ＴｈＴ蛍光の増加は中度であるが、ＣＲおよびＴｒｐ蛍光の増加は高い。
【０１７９】
１０Ｋの倍率のときＴＥＭ像は、天然ＩｇＩＶ Gammagardが凝集物をほとんど保有せず、存在する凝集物が無定形でかつサイズが小さいことを示している（図９）。変性温度が高まると、凝集物の凝集サイズおよび存在量が増す。ＴＥＭ像における酸変性ＩｇＩＶ Gammagardの外観は、７６℃の温度における熱変性ＩｇＩＶ Gammagardと最も類似性を有している。塩基変性ＩｇＩＶ Gammagardは５００ｎｍの平均径の無定形凝集物を示す（図９Ｊ）。ミスフォールドＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡおよび塩基変性ヒトγ‐グロブリンは、ＩｇＩＶ塩基でみられるような類似特徴をもつ凝集物として出現する（図９Ｋ，Ｌ）。ＩｇＩＶ塩基と比較して、凝集物の数はしかしながら多く、マルチマーアセンブリーの平均径はやや大きい。特に塩基変性ヒトγ‐グロブリン（ｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃）では、ＩｇＩＶ塩基と比較してマルチマーの平均径が約２倍である。ＩｇＩＶ ＲＦは低密度でゆるいアセンブリーとして出現する（図９Ｂ）。
【０１８０】
ｔＰＡ媒介プラスミン生成アッセイでｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化しうるＩｇＩＶ Gammagardのミスフォールド調製物の効力を試験した（図９Ｍ）。ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化は天然ＩｇＩＶ Gammagardで観察されなかった。様々な変性ＩｇＩＶ Gammagard調製物のｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化効力に基づき、３つのグループ、即ち中度アクチベーター（ＩｇＩＶ ＲＦ、ＩｇＩＶ６５、ＩｇＩＶ６９およびＩｇＩＶ塩基）、強度アクチベーター（ＩｇＩＶ７６、ＩｇＩＶ８０、ＩｇＩＶ８３およびＩｇＩＶ８６）および非常に強度なアクチベーター（ＩｇＩＶ酸およびＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡ）に分類される。ミスフォールディング温度が６９℃から７６℃に上げられたとき、ＩｇＩＶ構造の顕著な差異がみられる。ＴＥＭ像は、６９℃のときいくつかの緻密な凝集物が形成され（図９Ｄ）、一方７６℃のとき比較的大きく非常に緻密なアセンブリーがみられ、ミスフォールディング温度が更に上がるとサイズが増すことを示している（図９Ｅ〜Ｈ）。これは、６９℃および７６℃のミスフォールディングが比較したとき、ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化の増加に伴い、ＩｇＩＶアセンブリーのサイズを増加させているのである（図９Ｍ）。
【０１８１】
Ａβ調製物
様々なＡβ４２およびＡβ４０調製物が高いＴｈＴ、ＣＲおよびＡＮＳ蛍光レベルを示す（図１０）。Ａβ４２ＨＣｌおよびＡβ４０ＰＢＳ１はＴＥＭ像でフィブリル凝集物として出現する（図１１Ｃ，Ｆ）。Ａβ４０ｔ＝０、Ａβ４２ｔ＝０、Ａβ４０ＨＣｌおよびＡβ４２ＰＢＳは無定形凝集物として出現する（図１１Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ）。注目すべきことに、Ａβ４０ＰＢＳ１フィブリルはＡβ４０ＨＣｌおよびＡβ４０ｔ＝０と比較したときに類似のＴｈＴ蛍光レベルを呈し、一方Ａβ４２ＨＣｌはＴｈＴおよびＣＲ蛍光を強く増加させている。
【０１８２】
ヒト血清アルブミン
図１２Ａでみられるように、変性ＨＳＡは２０ｍｇ／ｍＬの濃度のときＴｈＴ蛍光を強く高め、一方他の濃度では天然ＨＳＡと比較して増加がみられない。天然ＨＳＡまたは１ｍｇ／ｍＬで変性されたＨＳＡのＴＥＭ解析によると凝集物は観察されなかった（図１２Ｂ，Ｃ）。サイズ約５００ｎｍの無定形凝集物が２．５、５および１０ｍｇ／ｍＬのとき変性ＨＳＡで観察された（図１２Ｄ〜Ｆ）。凝集物サイズおよび凝集物の相対数は、ＨＳＡが２０ｍｇ／ｍＬで変性されたとき大きく増加する（図１２Ｇ）。
【０１８３】
マウスＩｇＧ
天然マウスＩｇＧと比較して、様々な方法を用いてミスフォールドされたマウスＩｇＧ調製物でＴｈＴおよびＣＲの蛍光増強が観察された(図１３)。チオフラビンＴおよびコンゴーレッド蛍光が次の順序で高められている：
ＴｈＴ：        天然ＩｇＧ＜ＩｇＧ塩基＜ＩｇＧ酸≒ＩｇＧ８５℃
コンゴーレッド：天然ＩｇＧ＜＜ＩｇＧ塩基＜ＩｇＧ酸＜ＩｇＧ８５℃
ＴｈＴシグナルに関してＩｇＧ８５℃と比較したＩｇＧ塩基およびＩｇＧ酸との差異は、コンゴーレッド蛍光シグナルより顕著である。全部で３つのミスフォールディング方法がクロスベータ構造の形成を伴うＩｇＧのミスフォールディングをもたらした、と結論づけられる。
【０１８４】
アポリポタンパク質Ａ‐Ｉ
１００ｍＭ ＮａＯＨ含有の緩衝液中１００℃で熱変性されたＡｐｏＡ‐Ｉは、天然ＡｐｏＡ‐Ｉと比較したとき、ＴｈＴ蛍光シグナルおよびＣＲ蛍光シグナルでやや減少を呈した（図１４ＡおよびＢ）。ＴｈＴおよびＣＲ蛍光で観察される減少は、Ａ２８０ｎｍで測定したところ、タンパク質の喪失のせいではなかった（図１４Ｃ）。図１４Ｂは、１００ｍＭ ＮａＯＨ含有の緩衝液（高ｐＨ）中３７℃変性ＡｐｏＡ‐ＩのＣＲ蛍光が天然ＡｐｏＡ‐Ｉと比較してやや増加したことを示している。明確に知覚しうる差異はＴｈＴまたはＣＲ蛍光強度で観察されないが、ｔＰＡ媒介プラスミノーゲン活性化アッセイでｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化しうるミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉ調製物の効力には有意差が観察される。３７℃または７５℃で加熱されたＡｐｏＡ‐Ｉ調製物は、ｔＰＡ／プラスミノーゲンの比較的中度〜強度アクチベーターである（図１４Ｄ）。１００℃のミスフォールドＡｐｏＡ‐ＩはｔＰＡ／プラスミノーゲンの非常に強度なアクチベーターである。図１４ＥおよびＦでは、ヒト血漿ＡｐｏＡ‐Ｉの様々な調製物におけるクロスベータ構造および／またはクロスベータ誘導コンホメーションの存在の測定に関するＥＬＩＳＡ研究の結果が示されている。天然ＡｐｏＡ‐Ｉと、１００ｍＭ ＮａＯＨを天然ＡｐｏＡ‐Ｉストックへ加えて３７℃、７５℃または１００℃に３０分間加熱したＡｐｏＡ‐Ｉが、研究に含まれている。Ｆｎ Ｆ４‐５の半最大結合へは、１１０μｇ／ｍＬ（天然ＡｐｏＡ‐Ｉ）、７３μｇ／ｍＬ（７５℃ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉ）、４８μｇ／ｍＬ（１００℃ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉ）および５．２μｇ／ｍＬ（ＨｂＡＧＥ）で達した。３７℃ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉの場合、飽和結合が計算されなかった。これらの数値および曲線は、ＡｐｏＡ‐Ｉのミスフォールディングにより、結合部位の総数（Ｍｍａｘ）の増加と共に、Ｆｎ Ｆ４‐５結合への親和性が７５または１００℃でミスフォールドされたＡｐｏＡ‐Ｉで増加することを示している。加えて、ＡｐｏＡ‐Ｉ調製物へのｔＰＡの結合性を評価する。ｔＰＡへの結合部位の最高数（Ｍｍａｘ）が、ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉ調製物と比較して、天然ＡｐｏＡ‐Ｉに存在する。ｔＰＡは高ｐＨで１００℃に加熱されたＡｐｏＡ‐Ｉとほとんど結合しない（飽和結合検出せず）。天然ＡｐｏＡ‐Ｉ、３７℃ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉ、７５℃ミスフォールドＡｐｏＡ‐ＩおよびＨｂＡＧＥの場合、半最大結合へは各々４．３、３．１、１．６および３．５ｎＭのｔＰＡ濃度で達し、このことは天然ＡｐｏＡ‐Ｉと比較してｔＰＡが高親和性で相互作用するｔＰＡ結合部位の露出を塩基性条件下３７または７５℃のミスフォールディングがもたらしていることを示している。ｔＰＡが比較的高い親和性で天然ＡｐｏＡ‐Ｉと結合するという観察は、ＨｂＡＧＥでも匹敵する測定がみられることから、クロスベータ構造および／またはクロスベータ誘導コンホメーションの分子が天然ＡｐｏＡ‐Ｉで既に存在していることを示している。この発見は、天然ＡｐｏＡ‐Ｉが高いコンゴーレッド蛍光およびチオフラビンＴ蛍光を示すという観察で更に確証される。
【０１８５】
実施例で用いられたサンプル中の内毒素レベル
実施例６〜２０で記載された実験に用いられた様々な溶液中の内毒素レベルをLimulus Amebocyte Lysate（ＬＡＬ）キット（Cammmbrex，ＱＣＬ‐１０００）で調べた。キットは製造業者のプロトコールに従い用いたが、但し今回の測定は記載されたアッセイ容量の半分を用いて行った。リファレンスとして、リポ多糖（ＬＰＳ，Sigma，２．５ｍｇ／ｍＬ Ｌ‐２６３０クローン０１１：Ｂ４）を数回の測定に含めた。ＬＰＳ標準曲線で得られたシグナルから、質量／容量で内毒素含有量の概算値を未知サンプルで得られた内毒素単位（ＥＵ）のシグナルで計算した。表６では、ＥＵの内毒素レベルがストック溶液について掲載されている。
【０１８６】
実施例６
‘クロス富化’：クロスベータタンパク質‘Ａ’への高親和性に向けたヒトＩｇＩＶの富化はクロスベータタンパク質‘Ｂ’、‘Ｃ’、‘Ｄ’、…にも高親和性の富化ＩｇＩＶをもたらす
ＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスで富化されたOctagam ＩｇＩＶもＡβ４０、Ｈｂ‐ＡＧＥおよびｄＯＶＡのような他のミスフォールドタンパク質に高親和性を有することを、我々は先に示した（実施例４参照）。今回、我々はＡβ４０／Ａβ４２フィブリル‐マトリックス、ＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックス、ｄＩｇＩＶ‐マトリックスまたはｄＨＳＡ‐マトリックスでＩｇＩＶを富化させ、様々なミスフォールドクロスベータタンパク質への富化ＩｇＩＶの結合性を試験することにより、この実験を拡張させた。ミスフォールドタンパク質をＮＨＳ‐セファロースへ固定させた。アフィニティマトリックスの各々からの溶出ＩｇＩＶの富化ファクターを、ＥＬＩＳＡでＡβ４０／Ａβ４２フィブリル、Ａβ凝集物、ＨＳＡ、ｄＨＳＡ、ＢＳＡ‐ＡＧＥ、ｄＯＶＡ、ｍγ‐グロブリンおよびｄｍγ‐グロブリンとの結合性について特に調べた。
【０１８７】
材料および方法
ＮＨＳ‐セファロース（ＧＥ-Healthcare）で固定前に、ＨＳＡ（Cealb，Sanquin，オランダ，ロット０５Ｃ２９Ｈ１２０Ａ）およびＩｇＩＶ（Octagam，Octapharma,ロット５０２４４０１８４３２）を１、２．５、５、１０または２０ｍｇ／ｍＬでミスフォールドさせた。ＨＳＡは、ｐＨ２（ＨＣｌ）にて６５℃で６時間加熱し、次いでＮａＯＨで中和することによりミスフォールドさせた。ＩｇＩＶは、１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ８．１）中で２５℃から６５℃へ段階的に加熱（０．５℃／ｍｉｎ）することによりミスフォールドさせた。ＮＨＳ‐セファロースを使用前にAmiconフィルターカップ（Millipore，ＵＦＣ３０ＳＶ００）中１ｍＭ ＨＣｌで１２回洗浄した。固定化目的で、５種のミスフォールドＨＳＡ調製物またはＩｇＩＶ調製物を混ぜ（５：４：３：２：１（Ｖ：Ｖ：Ｖ：Ｖ：Ｖ）の比率で１：２．５：５：１０：２０ｍｇ／ｍＬ）、固定用緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３）で３×希釈した。ＢＳＡ‐ＡＧＥ（１０．２５ｍｇ／ｍＬ）およびＡβ４０／Ａβ４２フィブリル（０．２８ｍｇ／ｍＬ）を同様に固定させた。フィブリルは物質セクションで記載されているように作製した。簡単に言えば、Ａβ４０を３７℃で１８６時間インキュベートし、Ａβ４２をＨＣｌ中で２４時間インキュベートした。これらのフィブリルを固定用緩衝液中１：１で混ぜた。マトリックスを固定用緩衝液中で一夜インキュベートし、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で遮蔽した。マトリックスを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で３回および０．１Ｍ ＮａＯＡｃ；０．５Ｍ ＮａＣｌで３回洗浄した。これらの洗浄ステップを４回繰り返した。マトリックスをOctagam ＩｇＩＶ（５０ｍｇ／ｍＬ）と４時間または一夜インキュベートした。ＩｇＩＶフロースルー（‘ＦＴ’）を集め、マトリックスを溶出（１．１４０Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４で２×１時間；‘溶出物’）前にＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝液，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）で１２回洗浄した。更なる解析前に溶出物をＨＢＳに対して透析した。
【０１８８】
ＥＬＩＳＡを用いて様々な固定タンパク質：Ａβ４０／Ａβ４２フィブリル、Ａβ４０／Ａβ４２非フィブリル凝集物、ＨＳＡ、ｄＨＳＡ、ＢＳＡ‐ＡＧＥ、ｎＯＶＡおよびｄＯＶＡとの結合性についてＦＴおよび溶出物を試験した。４種の異なるＡβ４０／Ａβ４２非フィブリル凝集物を物質セクションで記載されたように作製し、４００μｇ／ｍＬの濃度で１：１：１：１混合した。簡単に言えば、Ａβ４０をＰＢＳ１に溶解し、−８０℃で直接凍結し、Ａβ４０をＨＣｌ溶液中で２４時間インキュベートし、Ａβ４２をＰＢＳ１に溶解し、−８０℃で直接凍結し、Ａβ４２をＨＢＳに溶解し、３７℃で２４時間インキュベートした。富化ファクターを実施例４で記載されたように計算した。ＢＣＡアッセイキット（Pierce，カタログ番号２３２２３）を用い、標準曲線にOctagam ＩｇＩＶを用いて、ＦＴおよび溶出物中のタンパク質濃度を調べた。
【０１８９】
結果
図１５は、ミスフォールドクロスベータタンパク質アフィニティマトリックスを用いたＩｇＩＶ富化実験の典型的結果を示している。以下で記載され、表７で要約されているように、ミスフォールドタンパク質Ｘおよび固定タンパク質Ｙ、Ｚ、…含有のマトリックスを用いて、富化ＩｇＩＶの別な組合せについて類似データを得た。実例では、Ａβフィブリルアフィニティマトリックスを用いて選択されたアフィニティ領域が、異なるアミノ酸配列および配列長さの様々な他のミスフォールドタンパク質、例えばＢＳＡ‐ＡＧＥと結合することが示されている（図１５）。加えて、ＢＳＡ‐ＡＧＥ‐マトリックスで富化されたＩｇＩＶは、出発物質（Octagam ＩｇＩＶ）と比較して、Ａβ４０／Ａβ４２フィブリルとの結合性に関して約６の富化ファクターを有している。２つの類似実験で、我々はＡβ４０／Ａβ４２フィブリルへのＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックス富化ＩｇＩＶの結合性に関してより高い富化ファクター（２５および５３）を得た。Ａβ４０／Ａβ４２フィブリルマトリックスで富化されたＩｇＩＶは、Ａβ４０／Ａβ４２フィブリルとの結合性に関して３の富化ファクターを有している。ＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスでは、Ａβ４０／Ａβ４２フィブリルマトリックスで観察される富化と比較し、ＩｇＩＶはＡβ４０／Ａβ４２との結合性に関して効率的に富化されている。
【０１９０】
ＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性に関する富化ファクターは、ＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースで富化されたＩｇＩＶの場合に平均して最高である。ＢＳＡ‐ＡＧＥへのＡβ４０／Ａβ４２フィブリルマトリックスで富化されたＩｇＩＶの結合性に関する富化ファクターは、３回の別々な実験で調べたところ約５である（図１５）。ＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースのＩｇＩＶ溶出物はｄＯＶＡとの結合性に関しても富化される（富化ファクター３）。類似実験では、ｄＩｇＩＶ‐セファロースおよびＡβ４０／Ａβ４２フィブリル‐セファロースのＩｇＩＶ溶出物も各々富化ファクター１．５および６でｄＯＶＡとの結合性に関して富化された。この後者の富化ファクターは３回の連続研究のうち１回でみられなかった。富化はｎＯＶＡとの結合性に関して観察されなかったが、このことはタンパク質のミスフォールド対応物と特異的に結合するＩｇＩＶサブ集団が富化操作で得られることを示している。
【０１９１】
追加ミスフォールドタンパク質の富化ファクターを調べた。Octagam ＩｇＩＶ出発物質の濃度シリーズは固定ＨＳＡ、ｍγ‐グロブリンおよびｄｍγ‐グロブリンとほとんど結合しない。ｄＨＳＡへのOctagam ＩｇＩＶの結合性増加が、ＨＳＡとの結合性と比較したときみられる。全ミスフォールドタンパク質マトリックスのＩｇＩＶ溶出物がｄＨＳＡとの結合性に関して富化された。Ａβ４０／Ａβ４２ミスフォールド非フィブリル凝集物との結合性が、Ａβ４０／Ａβ４２フィブリルマトリックスおよびＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースで富化されたＩｇＩＶの場合に最も富化された(約１０の富化ファクター)。ＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースのＩｇＩＶ溶出物はミスフォールドマウスγ‐グロブリン（ｄｍγ‐グロブリン）との結合性に関して富化される。
【０１９２】
一緒にすると、ミスフォールドクロスベータタンパク質‘Ａ’を含んでなるアフィニティマトリックスで富化されたOctagam ＩｇＩＶがミスフォールドクロスベータタンパク質‘Ｂ’、‘Ｃ’などとの結合性に関しても富化されていることを我々は示した。Ａβ４０／Ａβ４２フィブリルまたはＢＳＡ‐ＡＧＥを含んでなるアフィニティマトリックスでは、ミスフォールドクロスベータタンパク質に対して、比較的最高の富化ファクターとして表現される、最広域特異性の富化ＩｇＩＶが得られた（表７）。最も面白いことに、アフィニティマトリックスの調製のために３種の非フィブリルミスフォールドクロスベータタンパク質、即ちＢＳＡ‐ＡＧＥ、ｄＨＳＡおよびｄＩｇＩＶが研究に含まれている（ＴＥＭ像に関する一般的物質および方法セクションで図６、７、１２参照）。
【０１９３】
ここで記載された結果に基づき、ある疾患の病理へ特に関与するクロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質と特異的に結合するアフィニティ領域をアフィニティ領域の組成物から選択するための操作が提供される（図２６も参照）。このために、一態様では、ミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域に親和性をもつ２種の別々なクロスベータマトリックスの組合せが連続適用される。以下で更に詳細に記載されているように、２つの可能な順序で、クロスベータ構造および／または非天然３Ｄ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質および／またはアミロイド、即ちミスフォールドームと特異的に相互作用しうるアフィニティ領域を選択するためのマトリックスＩと、治療用アフィニティ領域が治療目的のものであり、疾患関連ミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域を選択するための、対象の疾患の病理に関与する１種以上の選択ミスフォールドタンパク質をもつマトリックスIIが用いられる。マトリックスが順序Ｉ→IIで適用されるとき、クロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションの広範囲な可能な出現を含み、および／または標的タンパク質ミスフォールディング疾患の病理に関与するミスフォールドタンパク質を含んでなるまたは含まない完全ミスフォールドームを表象するタンパク質の何らかのセットが、アフィニティマトリックスＩの作製に用いられる。マトリックスが順序II→Ｉで適用されるとき、クロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションの広範囲な可能な出現を含んでなるタンパク質、および／または完全ミスフォールドームを表象するタンパク質のセットは、アフィニティマトリックスIIのデザインに含意された標的タンパク質ミスフォールディング疾患の病理に関与するミスフォールドタンパク質を含まない。もちろん、熟練者であれば別な態様もデザインしうる。
【０１９４】
実施例７
様々なミスフォールドクロスベータタンパク質のアフィニティマトリックスを用いたミスフォールドクロスベータタンパク質に親和性のＩｇＩＶの特異的かつ飽和性富化
実施例４では、Octagam ＩｇＩＶからミスフォールドクロスベータタンパク質に親和性をもつ免疫グロブリン（Ｉｇ）のサブ集団の単離にＨｂＡＧＥ‐マトリックスを用いた。我々は、様々なクロスベータタンパク質との結合性に関して、富化Octagam ＩｇＩＶおよび‘フロースルー’（ＦＴ）と称される枯渇残留物の結合性について試験した。我々は、アフィニティマトリックスから溶出されたＩｇＩＶがＨｂＡＧＥとの結合性に関して実際に富化され（６００の富化ファクター）、ＦＴがＨｂＡＧＥとの結合性に関して枯渇されている（０．５の富化ファクターまたはそれとは別に２．０の枯渇ファクター）ことを観察した。マトリックスにではなく、ミスフォールドクロスベータタンパク質（前記実施例ではＨｂＡＧＥ）に特異的親和性をもつＩｇ分子のサブ集団についてＩｇＩＶがミスフォールドクロスベータタンパク質‐セファロースで特異的に富化されるかどうかを試験するために、本実験ではＩｇＩＶとＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスとのインキュベート後におけるＦＴをＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスの新たな部分と再び接触させ、これを３連続ステップで繰り返した。ＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスへのＩｇＩＶの結合性が非特異的であれば、ＩｇＩＶは各連続ステップで飽和せずに枯渇され、最終的にはもはやＦＴ中にＩｇが存在せずに終わる。結合性が特異的であれば、ＦＴと新たな量のＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスとのインキュベートでますます非富化されたＩｇＩＶが得られる。
【０１９５】
材料および方法
ＢＳＡ‐ＡＧＥの被覆前に、１０ｍＬ ＮＨＳ‐セファロースマトリックスを１０ｍＬ １ｍＭ ＨＣｌで１２回洗浄した。２．５ｍＬ固定用溶液（５．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ‐ＡＧＥ，０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）を加えてローラー装置にて４℃で一夜、次いで０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で４時間の遮蔽ステップにより被覆を行った。未被覆タンパク質を除去するために、数回の洗浄ステップを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で３回、次いで酸性緩衝液（０．１Ｍ酢酸，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ４．２）で３回行った。これらの洗浄ステップを４回繰り返した。０．１％アジ化ナトリウムで補充されたＨＢＳ中でビーズを保存した。Octagam（チャージ５０２４０１８４３４）の結合前に、アジドを除去するためにマトリックスをＨＢＳで６回洗浄した。２２００μＬビーズの一部へ、１１００μＬ Octagam ＩｇＩＶ（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。ビーズをOctagamと１時間インキュベートし、ＦＴフラクション（ＦＴ１）を集めた。このＦＴの２００μＬを保管し、残留容量をＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスの新鮮部分へ適用した。アフィニティマトリックスの量をＦＴの残留容量に調整したが、新鮮マトリックスの量は今回１８００μＬであった。再び、第二ＦＴフラクション（ＦＴ２）を集めるための遠心前にマトリックスをＦＴ１と１時間インキュベートした。これを４回繰返し、４つのＦＴフラクション（ＦＴ１‐ＦＴ４）を得た。連続ＦＴとインキュベートされた全マトリックスサンプルを洗浄し、結合Ｉｇを高塩（１．１４Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）とインキュベートして１時間に２回溶出させ、４つの溶出フラクション（Ｅ１‐Ｅ４）を得た。ＡβおよびｄＯＶＡも上記と同様にＮＨＳ‐セファロースマトリックスへカップリングさせた。Dutch型突然変異Ｅ２２ＱのＡβ１‐４０を１ｍｇ／ｍＬの濃度にＰＢＳで溶解させ、ホイルで光から防御しながらローラー装置にて室温で２時間インキュベートした。Ａβ１‐４０ Ｅ２２Ｑを固定用溶液中０．６６ｍｇ／ｍＬの濃度でマトリックスとインキュベートさせた。ｄＯＶＡ‐セファロースアフィニティマトリックスの調製では、オボアルブミンをＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬの濃度で１００℃にて１時間かけて変性させ、固定用緩衝液中３．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＨＳ‐セファロースに固定させた。チオフラビンＴおよびコンゴーレッド測定から、１００℃で加熱時のミスフォールドｄＯＶＡサンプルにおけるクロスベータ構造の形成を確認した。４ＦＴフラクションおよび４溶出物の富化ファクターを前記（実施例４）のようにＥＬＩＳＡで調べた。固定されたミスフォールドクロスベータタンパク質はｄＯＶＡ、Ｈｂ‐ＡＧＥ、ＢＳＡ‐ＡＧＥおよびＡβ４０であった。
【０１９６】
結果および考察
ＮＨＳ‐セファロースマトリックスへの徹底グルコース‐６‐リン酸グリケート化ウシ血清アルブミン、ミスフォールドクロスベータＢＳＡ‐ＡＧＥの固定化で、OctagamからＢＳＡ‐ＡＧＥ結合ＩｇＩＶを捕捉するための効率的アフィニティマトリックスを得た（図１６ＡおよびＢ）。Octagam ＩｇＩＶのフラクションはＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースと特異的に結合することが示されている。ＦＴ１はＢＳＡ‐ＡＧＥに親和性をもつＩｇ分子について８５％まで枯渇されている（富化ファクター０．１５）。この数値は後のフラクションＦＴ２‐４で９４．６％（富化ファクター０．０５４）から９５％（富化ファクター０．０５０）および９６．２％（富化ファクター０．０３８）に増加している。ＢＳＡ‐ＡＧＥに親和性をもつ分子についてＩｇＩＶの効率的枯渇がＩｇＩＶとＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースとの初回接触後に達成されていることを、データは示している。Ｉｇ分子がマトリックスでＢＳＡ‐ＡＧＥと特異的に結合したかどうかを更に試験するために、溶出物（Ｅ１‐４）をＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性に関してＥＬＩＳＡで試験し、富化ファクターを調べた。Ｅ１は予想通りにＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性に関して最高の親和性を示している。後のＦＴがＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスと再び接触された後の結合ステップにおいて、富化ファクターはＥ１の４１．３からＥ２の１３．７およびＥ３の１１．８、Ｅ４の８．７へと減少している。これは、ＢＳＡ‐ＡＧＥに親和性をもつＦＴ中Ｉｇ分子の量が、アフィニティマトリックスとの初回接触後、既に劇的に減少していることを明らかに示している。これはＦＴフラクションが新たなアフィニティマトリックスへ６回適用された類似実験で更に一層明らかになった。この実験では、ＦＴの富化ファクターが０．０３１もの低さになり、そのため基本的にＢＳＡ‐ＡＧＥ結合性は残されていなかった（示さず）。溶出物Ｅ１‐４中におけるＩｇＩＶの絶対および相対量は、各々８９μｇ（０．１６％）、３６μｇ（０．２３％）、１８μｇ（０．２８％）および１７μｇ（０．５３％）であった。
【０１９７】
Ａβ４０、ｄＯＶＡおよびＨｂＡＧＥへのＢＳＡ‐ＡＧＥ富化ＩｇＩＶおよび付随フロースルーの結合性も調べた。ＦＴフラクションはＡβ４０ともｄＯＶＡとも結合性に関して枯渇されておらず、即ち富化ファクターは１に留まった（図１６Ｃ，Ｅ）。理論に拘束されることなく、この観察の可能な説明は、ＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスとの富化で、ＢＳＡ‐ＡＧＥとＡβ４０およびｄＯＶＡに広範囲親和性を含んでなるアフィニティ領域のみが選択されていることである。外見上、Ａβ４０またはｄＯＶＡに比較的高い親和性だがＢＳＡ‐ＡＧＥに低親和性の多くのＩｇ分子がＦＴフラクションに留まり、このことがほどほどな枯渇を説明している。図１６ＣおよびＤは、しかしながら、ＢＳＡ‐ＡＧＥへの親和性に基づき選択されているにもかかわらず、ＩｇＩＶとＢＳＡ‐ＡＧＥセファロースとの接触後の溶出物がＡβ４０に親和性をもつＩｇ分子でなおも富化されていることを示している。ｄＯＶＡの場合、１．８の富化ファクターがＥ１で観察される（図１６ＥおよびＦ）。富化ファクターは後の溶出物の場合に低いが、連続溶出物でＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性に関する富化ファクターの減少とはパラレルでない。外見上、ＢＳＡ‐ＡＧＥとｄＯＶＡへ二重親和性をもつOctagam ＩｇＩＶ中Ｉｇ分子のフラクションは比較的少なく、そのためＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスでの富化はｄＯＶＡとの結合性に関してほんのわずかな富化に留まる。ＨｂＡＧＥへのＦＴフラクションおよび溶出フラクションの結合性はＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性でみられるものと類似のパターンをたどり、このことは双方のミスフォールドクロスベータタンパク質で重複するエピトープを示している（図１６ＧおよびＨ）。連続ＦＴフラクションでは、ＨｂＡＧＥと結合するＩｇ分子のフラクションが劇的に減少する。それと並行して、ＨｂＡＧＥへのＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックス富化ＩｇＩＶ溶出物の結合性に関する富化ファクターも、連続溶出物と比較したときに減少している。
【０１９８】
結論として、これらの実験は、ＢＳＡ‐ＡＧＥアフィニティマトリックスで、Octagam ＩｇＩＶがＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性のみならず、Ａβ４０、ＨｂＡＧＥおよびｄＯＶＡのような他のミスフォールドクロスベータタンパク質との結合性に関しても富化されることを示している。これは、ミスフォールド非フィブリルクロスベータＢＳＡ‐ＡＧＥが他の３種のミスフォールドクロスベータタンパク質でも露出されているエピトープを含んでいることを示している。Ａβ４０またはｄＯＶＡに親和性をもつＩｇ分子のサブ集団と大きな重複を有しない、ＢＳＡ‐ＡＧＥに親和性をもつアフィニティ領域のフラクションを、ＩｇＩＶが含んでいるらしい。
【０１９９】
クロスベータタンパク質‐セファロースの準最適量を用いる１つの利点は、初回インキュベートで、比較的高親和性をもつアフィニティ領域のみが選択されることである。これは、高親和性をもつアフィニティ領域のみが用いられる目的のときに利点である。
【０２００】
後の類似実験では、Ａβ４０‐セファロースおよびｄＯＶＡ‐セファロースをＦＴの６連続インキュベートに用いた（示さず）。Ａβ４０マトリックスでは、ＦＴがＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性に関して枯渇され、例えば新鮮量のＡβ４０‐マトリックスへの連続ＦＴフラクションの６ラウンドの結合後、‘富化’ファクターは０．４５であった。ｄＯＶＡへのＡβ４０‐マトリックスとのインキュベート後ＦＴの結合性はさほど影響されず、‘富化’ファクターは６回の結合ステップ後に０．８３である。Ａβ４０‐マトリックスの溶出物は、１７、４、５、３、８および４の富化ファクターということで、ＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性に関して富化されている。これらの溶出物はｄＯＶＡと全く結合しない。これは、Ａβ４０と結合するＩｇＩＶ中アフィニティ領域のサブ集団が、ｄＯＶＡと結合するＩｇ分子のサブ集団とではなく、ＢＳＡ‐ＡＧＥと結合するＩｇ分子のサブ集団と重複していることを示している。
【０２０１】
ｄＯＶＡ‐セファロースでは、ｄＯＶＡとの結合性に関するOctagam ＩｇＩＶ ＦＴの枯渇がアフィニティマトリックスおよびＩｇＩＶのその適用比で既に準最適（８３％）にあり、即ちＦＴとｄＯＶＡ‐マトリックスとの連続インキュベートでｄＯＶＡとのＦＴの結合性に関して更なる減少が得られないのである。ＢＳＡ‐ＡＧＥまたはＡβ４０へのＦＴフラクションの結合性に関する、実際には‘枯渇’ファクターと解される富化ファクターは影響をうけず、ＢＳＡ‐ＡＧＥで約０．８およびＡβ４０で１に留まる。溶出物は、しかしながら、ＢＳＡ‐ＡＧＥおよびＡβ４０との結合性に関して富化される（富化ファクターは各々５および１４である）。富化ファクターは、連続ＦＴを用いた連続結合ステップに際して得られる溶出物で、減少していない。
【０２０２】
再び、実験では、ミスフォールドクロスベータタンパク質‘Ａ’のアフィニティマトリックスを用いて富化されたＩｇＩＶがミスフォールドクロスベータタンパク質‘Ｂ’との結合性に関しても富化されていることを示している。これらの実験は、用いられた実験セッティングで、Ａβ‐セファロースと結合するOctagam ＩｇＩＶ中Ｉｇ分子のサブ集団がｄＯＶＡと結合するOctagam ＩｇＩＶ中アフィニティ領域のサブ集団と重複していないことも示している。ＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースの場合、溶出物Ｅ１‐６中富化ＩｇＩＶの絶対および相対量は各々３１．５μｇ（０．０８４％）、１１．２（０．０６２）、９．５（０．０９８）、７．２（０．１６）、４．１（０．１４５）および０．２７μｇ（０．０３２％）であった。Ａβ４０の場合、これらの数値は各々３３．９（０．０９）、２９．４（０．１７）、１１．２（０．１１）、９．４５（０．２１）、９．８（０．３５）および３．８μｇ（０．２２％）であった。ｄＯＶＡマトリックスの場合、これらの数値は２７．６（０．０７）、２２．４（０．０７）、２１．８（０．１２）、１７．１（０．１５）、１１．５（０．１３）および２．８μｇ（０．０６％）であった。
【０２０３】
結果は、ミスフォールドクロスベータタンパク質に親和性をもつアフィニティ領域が固定ミスフォールドクロスベータタンパク質のアフィニティマトリックスを用いて特異的に選択されることも示している。ＩｇＩＶの量の枯渇は飽和であり、即ち、ミスフォールドタンパク質に特異性をもつサブ集団からＩｇＩＶの枯渇はミスフォールドタンパク質マトリックスを用いることにより達成される。
【０２０４】
ＢＳＡ、Ｈｂ、Ａβ４０およびＯＶＡは配列相同性を欠き、それらの天然状態では３Ｄ構造相同性を欠くが、ＢＳＡ‐ＡＧＥ、ＨｂＡＧＥ、Ａβ４０およびｄＯＶＡはクロスベータコンホメーションをもつアミノ酸のストレッチの存在を共有している。したがって、我々の結果は、天然形で３Ｄ構造相同性を欠くおよび／または配列相同性を欠く様々なタンパク質でクロスベータコンホメーションまたはクロスベータ誘導コンホメーションに広域親和性をもつアフィニティ領域のサブ集団をＩｇＩＶが含んでなることを示している。更に、Ａβ‐セファロースとそれに続くｄＯＶＡ ＥＬＩＳＡでの結果は、ＩｇＩＶの異なるサブ集団と、但し同様のクロスベータ色素、即ちコンゴーレッド、ＴｈＴと結合する、構造的詳細の異なるクロスベータ構造が出現することを示している（‘実施例６〜２０の一般的物質および方法’参照）。
【０２０５】
実施例８
フィブリン、Ａβ凝集物およびミスフォールドオボアルブミンへの、Octagam ＩｇＩＶおよびＨｂＡＧＥアフィニティマトリックスを用いることで得られた富化ＩｇＩＶの結合性
材料および方法
クロスベータ構造を含んでなるポリマーであるフィブリンに親和性のＩｇ分子をOctagam ＩｇＩＶが含んでなるかどうかを試験するために（特許出願ＵＳ２００７００３５５２、パラグラフ〔１８７，１８８〕参照）、ＥＬＩＳＡプレートのウェルでフィブリノーゲンをトロンビン／因子IIａとインキュベートすることによりフィブリンがその場で形成されるＥＬＩＳＡを行う。加えて、比較のために、クロスベータ構造のタンパク質の特性をもつ固定ミスフォールドオボアルブミン（ｄＯＶＡ）（物質セクション参照）およびアミロイド‐β凝集物とのＩｇＩＶの結合性を評価する。
【０２０６】
オボアルブミン（Sigma，Ａ５５０３グレードＶ）をＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度で穏やかに溶解させ、ローラー装置にて３７℃で２０分間、その後室温で１０分間インキュベートし、−８０℃で保存した→ｎＯＶＡと称される。ｎＯＶＡを３０℃から８５℃へ５℃／ｍｉｎで加熱した。このステップを４回繰返し、変性ＯＶＡをその後−８０℃で保存した→ｄＯＶＡ ｓｔｄと称される。ｄＯＶＡ ｓｔｄとの結合性研究のために、５μｇ／ｍＬ ｄＯＶＡ ｓｔｄを被覆した。固定ＡβへのOctagam ＩｇＩＶの親和性を解析するために、Ａβ４０ｔ＝０およびＡβ４２ｔ＝０ストックを結合研究に含めた。両Ａβ調製物を５μｇ／ｍＬで被覆する。ＨｂＡＧＥも５μｇ／ｍＬで被覆し、このクロスベータタンパク質との結合性の解析を陽性コントロールとして調べる。クロスベータコンホメーションの固定フィブリンへのＩｇＩＶおよびｔＰＡの結合性を試験する際に、固定フィブリン含有の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを得るために下記プロトコールを適用した：
１．  標準因子IIａ／トロンビンストック（ヒト血漿，高活性，Calbiochem,Germany，製品番号６０５１９５）からＨ２Ｏ中２Ｕ／ｍＬ因子IIａストックを調製する。
２．  使用前に１６，０００＊ｇで１０分間遠心されたストック溶液からＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬフィブリノーゲン溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム‐ＨＣｌ ｐＨ７．０中Ｆｉｂ３Ｌ ２１７０Ｌ，Kordia，オランダ）を調製する。
３．  ５μＬの因子IIａ溶液をウェルへピペッティングし、１００μＬのフィブリノーゲン溶液を加え、または１００μＬ ＰＢＳをコントロールウェルへ加える。最終濃度：〔因子IIａ〕≒０．１Ｕ／ｍＬ、〔フィブリノーゲン〕≒４７．５μｇ／ｍＬ
４．  穏やかに攪拌しながら室温で２時間インキュベートする。抗ヒトフィブリノーゲン抗体（ＤＡＫＯ-Cytomation，Ｐ０４５５）を用いて被覆コントロールを行う。
５．  空のウェルをＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＴＢＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ含有のＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．３で２回洗浄する。
【０２０７】
最初に、Ａβ、ｄＯＶＡ、フィブリンまたはコントロール被覆用緩衝液で被覆されたウェルを、穏やかに攪拌しながら室温で１時間かけて、ＩｇＩＶまたはｔＰＡの濃度シリーズの５０μＬ／ウェルで三重に覆う。ｔＰＡシリーズでは、フィブリンの露出リシンおよびアルギニン残基へのクリングルドメインの結合を避けるため、および露出クロスベータ構造コンホメーションへのｔＰＡフィンガードメインの結合を導くために、１０ｍＭ εＡＣＡを結合用緩衝液に含有させる。濃度シリーズｔＰＡまたはＩｇＩＶで覆われた無フィブリノーゲンのｆIIａ被覆コントロールウェルで得られたシグナルを固定フィブリンの対応ウェルから差し引く。クロスベータ構造の固定タンパク質で得られた全シグナルについて、被覆用緩衝液被覆ウェルで得られた対応シグナルをバックグラウンドとして差し引く。
【０２０８】
第二シリーズの実験では、フィブリンへの、Octagam ＩｇＩＶとのＨｂＡＧＥ‐アフィニティマトリックスのインキュベートで得られた富化ＩｇＩＶの結合性を評価した。
【０２０９】
結果＆考察／結論
クロスベータ特異的色素コンゴーレッドおよびチオフラビンＴの結合性とｔＰＡおよびプラスミノーゲンの活性化のようなアミロイド様性質をもつタンパク質を連想させる特徴をフィブリンポリマーが示すことを、我々は以前に調べた。我々は、Octagam ＩｇＩＶがクロスベータ構造のタンパク質に親和性を示すＩｇのサブ集団を含んでなることも調べた。我々はしたがって、ＩｇＩＶがＥＬＩＳＡでフィブリンと結合するかどうかを取り扱った。図１７では、確かにＩｇＩＶが先に評価されたように陽性コントロールＨｂＡＧＥ（例えば図１参照）並びにｄＯＶＡ、Ａβ４０およびＡβ４２調製物と結合することが示されている。ＨｂＡＧＥへの親和性は比較的高く、一方後の３種ミスフォールドタンパク質への親和性は類似してやや低い。フィブリンが考えられたとき、ｔＰＡおよびＩｇＩＶは双方とも飽和状態で結合する。フィブリンとのＩｇＩＶの半最大結合性は２００μｇ／ｍＬ（約１．３μＭ）で達し、この値はｄＯＶＡおよびＡβ調製物で得られた値に匹敵する。これらの発見は、Octagam ＩｇＩＶがクロスベータ構造を含んでなる常用タンパク質、即ちＨｂＡＧＥ、ｄＯＶＡ、Ａβとだけではなく、最近同定されたフィブリン中クロスベータ含有分子とも結合することを示している。
【０２１０】
これらの結果は、Octagam ＩｇＩＶがフィブリンに親和性のＩｇのサブ集団を含んでなることを示している。そのため、このサブ集団の使用は、フィブリン結合ＩｇＩＶとｔＰＡとの競合によるフィブリンの寿命延長が症状または健康問題の減少に寄与する障害、またはフィブリンモノマーの重合を妨げるフィブリン結合ＩｇＩＶを導入することにより達成されるフィブリンの形成阻止が有益である障害に有益である。
【０２１１】
実施例９
ミスフォールドヒト血漿アポリポタンパク質Ａ‐ＩへのＩｇＩＶアフィニティ領域の結合性
背景
膝関節の半月板におけるアミロイドは局在性アミロイドーシスで最も一般的な形の１つであり、特に老人で次第に増えてくる。アミロイド沈着は、最後には外科処置を要する関節問題になることがある。アポリポタンパク質Ａ‐Ｉ（ＡｐｏＡ‐Ｉ）は膝関節で検出され、アミロイドを形成し、関節問題を含めたいくつかの疾患および健康問題に関与している。ＡｐｏＡ‐Ｉは高密度リポタンパク質の主タンパク質成分である。アミロイドＡｐｏＡ‐Ｉはアテローム性動脈硬化症患者のアテローム硬化斑と動脈でもみられる。そのため体内の循環またはその他からミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉの除去は、アミロイドＡｐｏＡ‐Ｉ関連の疾患に罹患した患者にとり有益である。我々は、アフィニティ領域がミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉと結合しうるかどうか、および開示された手段および方法がＡｐｏＡ‐Ｉと結合するそれらのアフィニティ領域について富化されたアフィニティ領域を選択しうるかどうかを試験した。以下で示された結果は、確かにアフィニティ領域がＡｐｏＡ‐Ｉを認識し、開示された方法および手段がＡｐｏＡ‐Ｉと結合しうるアフィニティ領域の単離に適していることを示している。ＡｐｏＡ‐Ｉはここでは、アフィニティ領域が単離された疾患関連タンパク質の別な例として働いている。
【０２１２】
材料および方法
ヒト血漿ＡｐｏＡ‐Ｉに向けた、Octagam ＩｇＩＶとインキュベートされたＨｂＡＧＥ‐セファロースを用いるアフィニティ領域の選択で得られた富化ＩｇＩＶの結合性の解析のために、直接ＥＬＩＳＡを固定ＡｐｏＡ‐Ｉ調製物で行う。研究には天然ＡｐｏＡ‐Ｉと、３７℃、７５℃または１００℃で３０分間加熱されて５Ｍ ＮａＯＨで生理的ｐＨにｐＨ調整された１００ｍＭ ＮａＯＨ中ＡｐｏＡ‐Ｉを含める。図１４でみられるように、選択クロスベータマーカー、即ちコンゴーレッド蛍光の増強、ＴｈＴ蛍光の増強、ｔＰＡ／プラスミノーゲンの活性化、フィブロネクチンフィンガー４‐５の結合性およびｔＰＡの結合性に関する相対的陽性度について、下記順序が観察される：
コンゴーレッド：        １００℃＜天然＜３７℃＜７５℃
ＴｈＴ：                １００℃＜天然＜７５℃＜３７℃
ｔＰＡ／Ｐｌｇ活性化：  バックグラウンド＝天然＜３７℃＜７５℃＜＜１００℃
Ｆｎ Ｆ４／５結合性：   天然＝３７℃＜７５℃＜１００℃
ｔＰＡ結合性：          バックグラウンド＝１００℃＜天然≒３７℃≒７５℃
【０２１３】
これらの比較から、既に天然ＡｐｏＡ‐Ｉがクロスベータ構造のミスフォールドタンパク質の特徴を有することは明らかであり、即ちそれはコンゴーレッドおよびＴｈＴの蛍光を高め、それはｔＰＡと結合する。一般的に、塩基性条件下３７℃または７５℃で加熱することにより得られたＡｐｏＡ‐Ｉ調製物は比較的高いクロスベータ構造含有率の組成物として作用する。しかしながら、セリンプロテアーゼ（ｔＰＡ／プラスミノーゲン）を活性化しうる効力のみが考えられたとき、明らかに１００℃に加熱されたＡｐｏＡ‐Ｉが最高‘生物活性’クロスベータ含有率の組成物として示されている。
【０２１４】
結果および考察
図１８では、天然ＡｐｏＡ‐Ｉおよび３種の熱／塩基ミスフォールド調製物への富化ＩｇＩＶの結合性に関する結合曲線が示されている。富化ＩｇＩＶが考えられたとき、ｋＤは増加順にＡｐｏＡ‐Ｉ ７５℃、ＡｐｏＡ‐Ｉ ３７℃、天然ＡｐｏＡ‐ＩおよびＡｐｏＡ‐Ｉ １００℃で各々１．３、１．６、２．０および２．８μｇ／ｍＬである。結合部位の数は天然ＡｐｏＡ‐ＩとＡｐｏＡ‐Ｉ ７５℃で類似し、ＡｐｏＡ‐Ｉ ３７℃でやや多く、ＡｐｏＡ‐Ｉ １００℃でかなり少ない。Ａ２８０測定から、４種調製物中のタンパク質含有率は類似していると結論づけられた。結合部位の最大数に関する差異は被覆効率の差異で反映される。しかしながら、Ｆｎ Ｆ４／５に最大結合部位を曝しているのはＡｐｏＡ‐Ｉ １００℃である（図１４Ｅ）。４種ＡｐｏＡ‐Ｉ調製物への富化ＩｇＩＶの親和性が、富化ＩｇＩＶが選択されたOctagam ＩｇＩＶの親和性と比較されたとき、Octagam ＩｇＩＶで得られたｋＤを富化ＩｇＩＶで得られたｋＤで割ることにより計算された富化ファクターは天然ＡｐｏＡ‐ＩおよびＡｐｏＡ‐Ｉ ７５℃の双方で４．８であり、一方ＡｐｏＡ‐Ｉ ３７℃の場合は富化ファクターが１２．８である。ＡｐｏＡ‐Ｉ １００℃では富化ファクターが調べられず、Octagam ＩｇＩＶの無結合性と富化ＩｇＩＶのわずかな結合性が検出された。しかしながら、ＡｐｏＡ‐Ｉ １００℃との結合性に関する富化は、図１８Ｃで示されているような結合特性で反映されている。
【０２１５】
結論として、クロスベータマーカーに関して‘天然’ＡｐｏＡ‐Ｉで得られるシグナルは（富化）ＩｇＩＶの結合特性で反映され、それが製造業者から購入されていることから、そのことは天然ＡｐｏＡ‐Ｉがクロスベータ構造を含んでなるという結論を更に確証させる。更に、ＡｐｏＡ‐Ｉ調製物との接触に際するコンゴーレッドおよびＴｈＴ蛍光双方の相対的増強が（富化）ＩｇＩＶの予想結合特性に関する予知力を有していると結論付けられ、ＴｈＴ蛍光が最強の相関を示している。富化ＩｇＩＶと３７℃に加熱されたＡｐｏＡ‐ＩとのＥＬＩＳＡデータから、このＡｐｏＡ‐Ｉ調製物は、ＩｇＩＶの富化に用いられたＨｂＡＧＥのタンパク質コンホメーションと最相似性、および／または富化ＩｇＩＶに対してＡｐｏＡ‐Ｉで結合部位として働く露出クロスベータ構造エピトープの最匹敵数を有する、クロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導タンパク質コンホメーションを含んでなる、と結論づけられる。一般的に、適切なクロスベータフィニティマトリックスを適用することにより、ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉと結合するアフィニティ領域が選択されることを、データは示している。こうして、例えば膝関節アミロイドーシスで生じる痛みの治療、動脈におけるアミロイド沈着の溶解、およびプラークでＡｐｏＡ‐Ｉアミロイド蓄積を伴うアテローム性動脈硬化症の治療のような、ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉの存在に関連する疾患または健康問題の治療法で使用上、最有力な治療向けアフィニティ領域組成物が得られる。
【０２１６】
実施例１０
ミスフォールドＩｇＧ分子は、リウマチ様関節炎患者の７０〜８０％に存在する自己抗体、リウマトイド因子の標的エピトープを含んでなる
材料＆方法
ＩｇＧミスフォールディングおよび構造解析
我々は、リウマチ様関節炎(ＲＡ)患者の７０〜８０％に存在する自己抗体、ヒトリウマトイド因子（ＲＦ）が、ＩｇＧ自己抗原におけるクロスベータまたはクロスベータ誘導タンパク質コンホメーションと結合する、とする我々の仮説を試験した。６５℃で熱変性時にＩｇＧの凝集が要件であることは、おそらく主にその標的自己抗原のＦｃドメインへの、（ＩｇＧおよびＩｇＡ ＲＦも生じるが）主にＩｇＭサブクラスのものであるＲＦによるＩｇＧ結合の検出にとり常識である、と我々は理解している。我々は実施例６〜２０の一般的物質および方法セクションで記載された操作に従い精製ヒトＩｇＧ（Octagam ＩｇＩＶ）を６５℃に加温し、コンゴーレッド蛍光、チオフラビンＴ蛍光、ＡＮＳ蛍光とｔＰＡの結合性および活性化の解析により構造を解析した。コンゴーレッドおよびチオフラビンＴ蛍光の増強を１００μｇ／ｍＬに希釈されたＩｇＩＶ溶液で調べた。その後で、（特許出願ＷＯ２００６１０１３８７、パラグラフ〔０１９５〕で記載されているような）標準化クロモゲンアッセイを用いてｔＰＡ／プラスミノーゲン活性の増強を調べた。ミスフォールドＩｇＩＶへの１０ｍＭ ε‐アミノカプロン酸の存在下におけるｔＰＡの結合性を、前記のような標準ＥＬＩＳＡにおいて、ｔＰＡ結合性の陽性コントロールとして固定Ａβ４０ｔ＝０で評価した。
【０２１７】
結果
変性ＩｇＧによるコンゴーレッドおよびチオフラビンＴ蛍光の増強
コンゴーレッド蛍光およびチオフラビンＴ蛍光の増強を熱変性ミスフォールドＩｇＩＶで測定した。コントロールＩｇＩＶと比較した相対シグナルに基づき、クロスベータコンホメーションをもつミスフォールドタンパク質の添付ホールマークで加熱ＩｇＩＶがミスフォールドされている（図１９Ａ，Ｂ）。
【０２１８】
ミスフォールドＩｇＧとのｔＰＡ結合性
我々は、クロスベータ経路の成分であるｔＰＡがｄＩｇＩＶと結合することを観察した（図１９Ｅ）。この観察は、クロスベータ経路の成分が新たに導入された構造的特徴を認識するように、ｄＩｇＩＶがミスフォールドされていることを更に証明している。
【０２１９】
ミスフォールドＩｇＧによるｔＰＡ／Ｐｌｇ活性化
我々はｄＩｇＩＶとのｔＰＡの結合性を観察したことから、ｄＩｇＩＶがｔＰＡ／プラスミノーゲンクロモゲンアッセイでｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化するかどうかを我々は試験した。天然ＩｇＩＶはｔＰＡ媒介プラスミノーゲン活性化を誘導しない（図１９Ｄ）。しかしながら、熱変性ミスフォールドＩｇＩＶサンプル、即ちｐＨ２の緩衝液中６５℃で変性されたＩｇＩＶ（示さず）およびＮａＰｉ緩衝液中で熱変性されたＩｇＩＶの双方はｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化する。
【０２２０】
考察
ＩｇＧにクロスベータ構造でミスフォールディングの導入はＲＦの自己抗原でエピトープを露呈させる
６５℃に加熱されたヒトＩｇＧは、クロスベータ構造のアミロイド様ミスフォールドタンパク質で通常見られる一連の構造的特性を示す。適用温度は、以前に他の研究者により記載された示差走査熱量測定によるとコンホメーション変化が誘導される、６１℃の温度よりやや高い。ミスフォールドＩｇＧはコンゴーレッドおよびチオフラビンＴ蛍光を増強させ、ｔＰＡと結合し、ｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化する。我々の知る限りでは、ＲＦに対するミスフォールドＩｇＧ自己抗原が、クロスベータコンホメーションのアミロイドを連想させる構造性を含んでなるネオ‐エピトープを露出すると報告したのは、我々が最初である。我々の観察と一致するように、クロスベータ構造を含んでなるタンパク質と結合して活性化される２種のセリンプロテアーゼ、ｔＰＡおよび因子XIIのプロテアーゼ活性がＲＡ患者で増すと報告された事実が、ここでやっと解明されている。
【０２２１】
我々の観察は、タンパク質でクロスベータ構造および／またはクロスベータ構造誘導コンホメーションに特異性を有するＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭクラスのヒト抗体の有用供給源として、ＲＦを指し示している。ＩｇＩＶ中Ｉｇ分子のサブ集団がミスフォールドＩｇＩＶ分子（表７参照）および／またはミスフォールドマウスγ‐グロブリン（実施例１９参照）と結合するという我々の観察と合わせると、実際上ミスフォールドＩｇまたはミスフォールドタンパク質に親和性をもつＩｇＩＶ中の単離サブ集団が一般的にＲＦを連想させる、と我々は結論づけた。ミスフォールドＩｇＧ自己抗原に親和性をもつアフィニティ領域の両供給源は、ミスフォールドＩｇＧの出現に伴う疾患または健康問題の治療のためのアフィニティ領域ベース療法の開発に有益である。
【０２２２】
実施例１１
アフィニティ領域の様々な調製物における免疫グロブリンサブクラスおよびＩｇＧイソタイプの相対的出現率の測定
方法
ＨｂＡＧＥアフィニティマトリックスからの溶出物として得られた富化ＩｇＩＶに存在するＩｇＧイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の相対含有率を調べるために、我々はNanosep １０ｋ遠心装置（Pall life science）を用いて５５０μＬのサンプルを濃縮した。濃縮富化ＩｇＩＶの最終濃度は、ＰＢＳ中Octagam ＩｇＩＶ希釈物で調べられた標準曲線と２８０ｎｍの吸光度を比較することで調べてみると、８９０μｇ／ｍＬであった。Ｉｇサブクラスのイソタイプ分類および相対的存在量をLaboratory for Medical Immunology（ＵＭＣ Utrecht,オランダ）の標準方法を用いてImage Immunochemistry比濁計（Beckman,Coulter）で調べた。比較のために、富化ＩｇＩＶが抽出されたOctagam ＩｇＩＶもＩｇＧイソタイプの相対的存在量について解析した。加えて、Ｉｇサブクラスの出現を調べた。濃縮富化ＩｇＩＶサンプルとは別に、ＰＢＳ中１０３μｇ／ｍＬの非濃縮物質もイソタイプ分類およびサブクラス決定に付した。製造業者によると、３５００例に及ぶヒトドナーのＩｇフラクションから調製されたOctagam ＩｇＩＶは、ＩｇＧ（≧９５％）と、少量のＩｇＡフラクション（≦０．４％）および微量の≦０．２％ＩｇＭからなる。４種ＩｇＧイソタイプの分布は：ＩｇＧ１，６２．６％；ＩｇＧ２，３０．１％；ＩｇＧ３，６．１％；ＩｇＧ４，１．２％である。製造業者によると、ＩｇＩＶではＩｇ分子の≦３％が凝集し、９０％超の分子がモノマーおよびダイマーである。
【０２２３】
結果＆考察
Octagam ＩｇＩＶに関して、ＩｇＧのサブクラス決定およびイソタイプ分類で全７回の測定が表８に掲載されている。Octagam ＩｇＩＶでは、確かにＩｇの大部分がＩｇＧサブクラスのもので、即ち約９９．５％であることが確認された。４種ＩｇＧイソタイプの分布は（方法セクションで記載されたような）Octagam ＩｇＩＶデータシートで報告されているものにまさしく近い。非濃縮富化ＩｇＩＶでは、サブクラス分布がImage Immunochemistry比濁計の検出下限のせいで調べられなかった。ＩｇＧ２の相対的存在の測定も検出限界のせいで阻まれた。ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の濃度は調べられた（表８）。富化ＩｇＩＶ中の全Ｉｇ濃度は、ＢＣＡタンパク質濃度測定技術を用いたところ、１０３μｇ／ｍＬであることがわかった。比濁計では、全Ｉｇ濃度が１０８μｇ／ｍＬであると計算された。濃縮富化ＩｇＩＶでは、全４種ＩｇＧイソタイプの濃度と全ＩｇＧ含有量が調べられた。ＩｇＡおよびＩｇＭレベルは検出限界より低かった。富化ＩｇＩＶフラクションでは、ＩｇＧ３の相対的存在量が、リファレンスとしてＩｇＧ１と比較すると、富化ＩｇＩＶがＨｂＡＧＥアフィニティマトリックスで選択されたOctagam ＩｇＩＶ出発物質と比べて約２倍に増えている。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の相対的存在量は、ＩｇＧ１の量と比較したとき、富化でほとんど変化していない。そのため、結論として、ＩｇＧ３のサブ集団は他のイソタイプよりＨｂＡＧＥ‐セファロースに比較的高い親和性を有している。
【０２２４】
全４種ＩｇＧイソタイプが富化ＩｇＩＶフラクションで調べられた結果に基づき、Ｉｇフラクションは少なくとも４種の異なるヒト抗体の混合物からなると結論づけられる。非還元条件下の等電点電気泳動ゲルでスミアとして富化ＩｇＩＶの出現も、２種以上のモノクローナル抗体が富化ＩｇＩＶセレクションに存在していることを示している（示さず）。富化アフィニティ領域集団中におけるＩｇＡおよびＩｇＭ抗体の濃度は確認できなかったが、微量の１種以上ＩｇＡおよびＩｇＭクローンの存在は結果に基づけば排除できない。
【０２２５】
実施例１２
ミスフォールド低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）により誘導される血小板凝集に及ぼすＩｇＩＶアフィニティ領域の影響の解析、およびｏｘＬＤＬへの、ＨｂＡＧＥアフィニティマトリックスを適用することでOctagam ＩｇＩＶから得られた富化ＩｇＩＶの結合性の解析
例えば酸化によるミスフォールドＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）は、例えばアテローム性動脈硬化症のような破壊的な疾患および健康問題で重要な役割を果たす。酸化で、アミロイドクロスベータコンホメーションを連想させる構造的特徴が、ＬＤＬのタンパク質部分、即ちＡｐｏＢ‐１００に導入されることを、我々は最近証明した（特許出願ＷＯ２００３ＮＬ００５０１参照）。ヒトｏｘＬＤＬ、更に一層好ましくはＡｐｏＢ‐１００のクロスベータコンホメーションまたはクロスベータ誘導コンホメーションに対するアフィニティ領域をＩｇＩＶが含んでなる可能性を、我々は今回取り扱った。この研究では、固定ミスフォールドタンパク質と特異的に結合するOctagamヒトＩｇＩＶからのアフィニティ領域をＨｂＡＧＥ‐セファロースで抽出することにより得られた富化ＩｇＩＶが用いられる（実施例６，７参照）。加えて、Octagam ＩｇＩＶが研究に含まれる。
【０２２６】
材料および方法
ｏｘＬＤＬまたはＴＲＡＰ（トロンビンレセプター活性化ペプチド，アミノ酸：ＳＦＬＬＲＮ）によるヒト血小板の活性化に及ぼすOctagam ＩｇＩＶの影響を評価した。ヒト血液から精製されたＬＤＬをＦｅＳＯ４含有の緩衝液とインキュベートすることによりｏｘＬＤＬを調製した（詳細に関しては実施例２の物質＆方法セクション参照）。ジエン含有率を測定することで酸化度５６％とわかった。以前に調べたように（特許出願ＷＯ２００３ＮＬ００５０１）、酸化でｏｘＬＤＬはチオフラビンＴ蛍光を増強する（データ示さず，例えば特許出願ＵＳ２００７００３５５２参照）。血小板凝集を３７℃にて９００ｒｐｍで１５分間にわたり凝集計（Chrono-Log Corporation,Havertown,ＰＡ,ＵＳＡ）で経時的に追跡した。ある容量の２７０μＬ血小板懸濁物（２００，０００／μＬ）を指示濃度で解析のためにサンプル含有の３０μＬ溶液とインキュベートした。ＩｇＩＶでの阻害実験のために、２７０μＬ血小板懸濁物を０．３ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン（プラスミノーゲン、フィブロネクチンおよびフォンビルブラント因子枯渇，Enzyme Research Laboratories，Lafayette，ＩＮ，ＵＳＡ）、２５μＬ酸化ＬＤＬ、天然ＬＤＬ（ｎＬＤＬ）またはＴＲＡＰ溶液およびＩｇＩＶ含有の５μＬ溶液とインキュベートした。インヒビターとの実験では、ｏｘＬＤＬ、ｎＬＤＬまたはＴＲＡＰを２２℃で１０分間にわたり漸増濃度のＩｇＩＶとプレインキュベートした。最大凝集は、任意に１００％に設定された、８μＭ ＴＲＡＰにより誘導される応答のパーセンテージとして表示した。
【０２２７】
ｏｘＬＤＬへのOctagam ＩｇＩＶ、枯渇ＩｇＩＶ（ＩｇＩＶをＨｂＡＧＥ‐セファロースと接触させた後のフロースルー）および富化ＩｇＩＶの結合性をＥＬＩＳＡで評価した。陽性コントロールとして、アフィニティ領域調製物の結合性を固定ＢＳＡ‐ＡＧＥで試験した。
【０２２８】
結果および考察
図２０Ａでは、Octagam ＩｇＩＶがｏｘＬＤＬ誘導血小板活性化および凝集を用量依存的に阻害することがわかる。ＩｇＩＶは、ＴＲＡＰでの活性化に際して、血小板の凝集に影響を与えない。天然ＬＤＬへの血小板の暴露時にみられる低レベルの凝集は、天然ＬＤＬが濃度シリーズのＩｇＩＶとプレインキュベートされたときに変化しない。
【０２２９】
直接ＥＬＩＳＡセッティングでは、酸化ＬＤＬへのＩｇＩＶアフィニティ領域の結合性を評価し、ミスフォールドＨｂＡＧＥ‐アフィニティマトリックスを用いて富化されたＩｇＩＶのｏｘＬＤＬへの相対的親和性を、アフィニティマトリックスのフロースルーとして回収された枯渇ＩｇＩＶ、およびミスフォールドクロスベータタンパク質に親和性をもつアフィニティ領域を選択するための供給源として用いられるOctagam ＩｇＩＶ出発物質の親和性と比較した。他のミスフォールドタンパク質、ＢＳＡ‐ＡＧＥで得られたものと結合特性を比較してみる。図２０で、結合性研究の結果が示されている。ＢＳＡ‐ＡＧＥおよびｏｘＬＤＬに対する富化ＩｇＩＶおよび出発物質の結合性の比較では、ＨｂＡＧＥ‐マトリックスを用いたアフィニティ領域の選択が両ミスフォールドタンパク質への富化ＩｇＩＶの親和性増加をもたらすことを示している。出発ＩｇＩＶサンプルの結合性に関して得られたｋＤ値と富化ＩｇＩＶで得られたｋＤ値との比率として表示される、グリケート化アルブミンまたはｏｘＬＤＬの結合性に関する富化ファクターを計算した。ＢＳＡ‐ＡＧＥの場合、富化ファクターは４５である。ｏｘＬＤＬの場合、富化ファクターは２７である。フロースルーは両ミスフォールドタンパク質とほとんど結合せず、このことはＨｂＡＧＥ‐セファロースを用いたミスフォールドタンパク質に特異性のアフィニティ領域からのＩｇＩＶの枯渇がむしろ効率的に再び生じ、実施例７で記載されたものを連想させることを示している。
【０２３０】
受動的に投与されたまたは接種により誘導された抗体は、増えつつある疾患の治療に良い療法として一般的に考えられる。酸化ＬＤＬを含めた修飾ＬＤＬは、修飾ＬＤＬの形成および沈着増加を伴う疾患、特にアテローム性動脈硬化症の治療で候補標的である。これらの結果は、開示された方法が、クロスベータ構造的特性を含んでなる修飾タンパク質、例えば酸化ＬＤＬと優先的に結合するヒト抗体のようなアフィニティ領域を選択しうることを証明している。このような抗体は、好ましくは、酸化のような修飾の結果として、ミスフォールドタンパク質、好ましくはミスフォールドＬＤＬの形成を伴う、アテローム性動脈硬化症のような疾患の検出および好ましくは治療に用いられる。加えて、それらの選択アフィニティ領域は、合成アフィニティ領域のデザインのために、ミスフォールドタンパク質に親和性をもつアフィニティ領域のアミノ酸配列および３Ｄ構造的特性を示すモデル分子として、好ましくは用いられる（実施例２０参照）。
【０２３１】
図２０Ｅでは、血小板の活性化に用いられたｏｘＬＤＬとＩｇＩＶが飽和結合することが示されている。図２０Ｇでは、ミスフォールドＨｂ‐ＡＧＥへの親和性に基づき選択されたアフィニティ領域も、富化ＩｇＩＶが選択されたOctagam ＩｇＩＶと比較したときに、ｏｘＬＤＬと高親和性で結合することが示されている。ｏｘＬＤＬ誘導血小板凝集に及ぼすＩｇＩＶの観察阻害効果と一緒にすると、我々の結果は、ＩｇＩＶがミスフォールドＡｐｏＢ１００に特異性のアフィニティ領域を含んでなり、アフィニティ領域がミスフォールドタンパク質への細胞の応答、即ちこの実施例１２では例えばアテローム性動脈硬化症に関係するミスフォールドタンパク質、ｏｘＬＤＬへの暴露に際する血小板の凝集を妨げられることを示している。
【０２３２】
実施例１３
マウス尾切除実験で出血時におけるクロスベータ構造結合化合物  静脈注射用免疫グロブリンおよび肝細胞成長因子アクチベーターフィンガードメインの役割
材料および方法
インビボ凝固および／または血小板凝集に及ぼすクロスベータ構造結合化合物の影響の解析のために、マウス尾切除アッセイを行いて出血時間を調べた。このアプローチのために、１１〜１３週齢雄性black six Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウス５０匹を動物実験について地元の倫理委員会（Utrecht University,オランダ）により承認されたプロトコールに従い用いた。マウスに１００μＬ緩衝液（ＰＢＳ，コントロール群，ｎ＝１４）または試験化合物もしくはヘパリン（陽性コントロール，出血を延ばすことが知られている）含有の緩衝液を尾静脈で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。５〜２０分間後、マウスをチャンバーで５％ Isofluran（誘導）で麻酔し、次いで実験の過程でマスクを用いて２〜２．５％ Isofluran（維持）で麻酔した。尾をテーブルに垂れ下げさせてマウスを加温ブランケット（３７℃）で保った。ハサミで尾から５ｍｍの箇所を切り、血をカップに集めた。注射と尾切除との時間間隔と出血の開始と出血の停止との時間間隔を記録した。出血の終点を抑えて、出血時間を２０分間以上に延ばし、創傷を焼灼により閉じることで能動的に止めたところ、速い出血のせいで２００μＬを超える出血容量に達した。２０分間を超える長時間出血と比較的過剰な出血は、双方とも２０分間の出血時間へ任意に設定した。予想される長時間出血の陽性コントロールとして、我々は１００μＬ０．９％ＮａＣｌ（ｎ＝８）中１０Ｉ．Ｅ．／マウスヘパリン（Leo Pharmaceutical Products B.V.,５０００ ＩＥ／ｍＬ）ｉ．ｖ．を用いた。肝細胞成長因子アクチベーター(ＨＧＦＡ)フィンガー／フィブロネクチンＩ型ドメインを４．７ｍｇ／ｍＬで用いた。２ｍＬ／マウスの推定血液容量に基づくとほぼ２３４μｇ／ｍＬの最終濃度となる１００μＬをｉ．ｖ．注射した（ｎ＝１４）。製造業者により供給される５０ｍｇ／ｍＬストックからのヒト静脈注射用免疫グロブリン（ＩｇＩＶ,Octagam,OctaPharma）を２０倍希釈で用いた（ｎ＝１４）。
【０２３３】
研究のために、標準操作に従い化学的に合成された合成ＨＧＦＡフィンガードメインを用いた（Dr.T.Hackeng,Academic Hospital Maastricht,オランダ；Hackeng,T.et al.(2001)Protein Sci.10,864-870；Hackeng,T.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94,7845-7850）。ＨＧＦＡの場合、残基２００‐２４０（Swiss-Prot entry Ｑ０４７５６）を採用した。ＨＧＦＡ Ｆドメインはクロスベータ構造のミスフォールドタンパク質と結合しうる（例えば、特許出願ＷＯ２００３ＮＬ００５０１参照）。
【０２３４】
結果
緩衝液処置、ＨＧＦＡ Ｆ処置およびＩｇＩＶ処置のマウス１４匹の、尾の約０．５ｃｍの箇所を切った後における尾創傷からの出血の平均時間を調べた（図２１）。出血時間は５人の異なる人々によりランダムにスコアリングした。長い出血時間を誘導するための陽性コントロールは、用量１０ ＩＥ／マウスのヘパリンであった（ｎ＝８）。リファレンス群ではＰＢＳを注射した（ｎ＝１４）。平均出血時間はＰＢＳ注射コントロールマウスで３６８秒間、ヘパリン注射コントロールマウスで１０５６秒間である。ＨＧＦＡ ＦおよびＩｇＩＶは出血時間を平均で７０６および７６５秒間に延ばした。両側Ｐ値の不対ｔ検定によると、ＨＧＦＡ Ｆ注射マウスおよびＩｇＩＶ注射マウスの出血時間はＰＢＳ注射マウスで観察された出血時間と有意に異なる（図２１参照）。Ｐ値は、ＰＢＳ注射コントロール群と比較したとき、各々ＨＧＦＡ Ｆで０．０１３およびＩｇＩＶで０．００４５である。これらの観察は、血小板栓の凝固および形成をもたらす、カスケードにおけるクロスベータ構造のミスフォールドタンパク質の役割について実証している。以前に我々により示されたように（例えば、特許出願ＷＯ２００３ＮＬ００５０１参照）、フィブリン重合にはクロスベータ構造形成を要し、ｔＰＡおよびプラスミノーゲンによるフィブリン塊溶解がクロスベータ構造結合化合物により阻害されている。更に、血小板はクロスベータ構造のミスフォールドタンパク質により活性化され、活性化された血小板自体がクロスベータ構造を露出させる。実施例２および１２において、我々はＩｇＩＶがクロスベータ誘導血小板凝集を妨げることを示している。実施例８において、ＩｇＩＶ富化に用いられた出発物質と比較して、ＨｂＡＧＥ‐セファロースで富化されたＩｇＩＶがフィブリンとより強く特異的に結合することを、我々は証明している。尾切除出血アッセイにおいてＨＧＦＡ ＦおよびＩｇＩＶで今回得られたデータは、これらのクロスベータ結合分子が、クロスベータ構造結合化合物に基づく、または凝固および血小板活性化に際してクロスベータ構造と結合することで凝固および／または血栓形成を促す分子と結合する化合物に基づく、抗凝固剤療法の開発に有益な出発点であることを示している。示唆された療法の一態様では、凝固および血小板凝集に関与するクロスベータ構造のタンパク質に特異性をもつアフィニティ領域が選択され、それにより凝固および／または血栓形成の基礎をなすクロスベータ構造のタンパク質へより特異的に治療作用を向けられるようになる。
【０２３５】
実施例１４
ミスフォールドタンパク質へのアフィニティ領域をもつマトリックスを用いた、全身性アミロイドーシス患者の血漿とＲＡ患者の血清および滑液からのタンパク質の単離および同定
クロスベータ構造およびクロスベータ構造を含んでなるタンパク質は本発明によるＩｇＩＶ分子のコレクションおよび／または本発明による組成物へ効果的に結合されるため、それらはサンプルおよび／または動物またはヒトの体から効果的に分離および／または単離され、その後で同定される。クロスベータアフィニティマトリックスを用いた富化後のＩｇＩＶを、クロスベータ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質および／またはタンパク質中のクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションと特異的に結合しうるタンパク質を単離するために用いた。タンパク質中のクロスベータ構造および／またはクロスベータ誘導コンホメーションと特異的に結合しうるタンパク質は、クロスベータ構造および／またはクロスベータ誘導コンホメーションのタンパク質と不飽和状態で結合されているときに、富化ＩｇＩＶマトリックスがクロスベータおよび／またはクロスベータ誘導コンホメーションのタンパク質の遊離結合部位と結合し、それによりクロスベータ構造および／またはクロスベータ誘導コンホメーションへ結合されたクロスベータ構造またはクロスベータ誘導コンホメーションと結合するタンパク質と間接的に結合する、という事実により同定される。健康な個体のクロスベータ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質および／またはタンパク質中のクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションと特異的に結合しうるタンパク質の存在および／または同一性を、クロスベータ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質および／またはタンパク質中のクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションと特異的に結合しうるタンパク質と関連および／または関係する疾患または健康問題のある個体、例えば原発性ＡＬアミロイドーシスまたはリウマチ様関節炎（ＲＡ）の個体からのクロスベータ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質および／またはタンパク質中のクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションと特異的に結合しうるタンパク質の存在および／または同一性と比較した。アフィニティ領域のマトリックスで単離されたタンパク質の同一性を質量スペクトル分析により特定した。健康な個体からのサンプルと患者からのサンプルとの結果を比較した。更に、富化ＩｇＩＶ‐マトリックスと接触させた患者または健康な個体からのサンプルで得られた結果を、固定アフィニティ領域なしで同サンプルをコントロールマトリックスと接触させた後に得られた結果と比較した。こうして、特定の病状時にミスフォールドするおよびクロスベータ構造コンホメーションを取る傾向があるタンパク質の同一性および／または感受性に関する、およびそれらのミスフォールドタンパク質と優先的に結合するタンパク質に関する情報を得た。これは、例えば病状をモニターする、療法の有効性をモニターする、疾患の発生をモニターするための、疾患特異的な診断ツールの開発のために重要な情報を提供し、好ましくは例示の障害に特異的なクロスベータ構造および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質および／またはタンパク質中のクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションと特異的に結合しうるタンパク質を標的とした療法の開発のために有益な手がかりを提供する。該療法は例えばその場でミスフォールドタンパク質を除去するか、または透析時に例えばアフィニティマトリックスを用いて体外にミスフォールドタンパク質を除去する。
【０２３６】
材料および方法
Octagam ＩｇＩＶ（Octapharma,ロット５０２４０１８４３４）を、この出願の他の箇所で記載されたように、Ａβ‐セファロース、ＨｂＡＧＥ‐セファロースおよびｄＩｇＩＶ‐セファロースで富化させた。これらマトリックスの溶出物をＰＢＳ（２ｈ，１：２０００，４℃）に対して透析し、プールし、ＣＮＢｒ‐セファロース（ＧＥ-Healthcare,Amersham Biosciences）に被覆した。富化ＩｇＩＶの固定化を本質的にＮＨＳ‐セファロースに関してこの出願の他の箇所で記載されたように行った。ＣＮＢｒ‐マトリックスを１ｍＭ ＨＣｌに２００ｍｇ／ｍＬで溶解し、ＮＨＳ‐マトリックスと同様に処理したが、但しこの緩衝液で洗浄前にローラー装置にて１ｍＭ ＨＣｌ中で５分間の活性化ステップを加えた。プールされた富化フラクションを固定用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌおよび４０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）で１５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。コントロールマトリックスは固定用緩衝液のみに曝した。一夜後に固定マトリックスをＴｒｉｓで遮蔽し、洗浄した。
【０２３７】
６サンプルをＩｇＩＶ‐セファロースおよびコントロール‐セファロースとインキュベートした：正常プール血漿、ＡＬアミロイドーシスをもつ患者Ｉまたは患者IIの血漿、ＲＡ（リウマトイド因子，ＲＦ力価６８２）をもつ患者IIIの血清、コントロール血清およびＲＡ（ＲＦ力価２３）をもつ患者IVの滑液。全サンプルをＨＢＳで２０×希釈し、５００μＬの２容量で２００μＬビーズへ適用した。１つの容量をＲＴで４時間インキュベートし、上澄を遠心（１４００ｒｐｍで２分間）後に捨てた。その後で、第二の容量を同マトリックスへ適用し、ローラー装置にて４℃で一夜インキュベートした。アフィニティマトリックスまたはコントロールマトリックスをＨＢＳで１２回洗浄し、結合タンパク質をＰＢＳ中８Ｍ尿素５０μＬで２回溶出させ、その後各１時間で２回のインキュベートステップに付した。溶出物を集めるためにマトリックスを遠心し、２溶出物を各サンプルについてプールした。
【０２３８】
サンプルコード：
Ａ１正常プール血漿
Ｃ１正常プール血漿
Ａ２ＡＬアミロイドーシス患者Ｉ
Ｃ２ＡＬアミロイドーシス患者Ｉ
Ａ３ＡＬアミロイドーシス患者II
Ｃ３ＡＬアミロイドーシス患者II
Ａ４ＲＡ（ＲＦ力価６８２）をもつ患者IIIの血清
Ｃ４ＲＡ（ＲＦ力価６８２）をもつ患者IIIの血清
Ａ５コントロール血清
Ｃ５コントロール血清
Ａ６ＲＡ（ＲＦ力価２３）をもつ患者IVの滑液
Ｃ６ＲＡ（ＲＦ力価２３）をもつ患者IVの滑液
Ａ‐シリーズ：富化ＩｇＩＶ‐セファロースのアフィニティマトリックス
Ｃ‐シリーズ：コントロールマトリックス（活性化／不活化セファロース）
【０２３９】
溶出タンパク質をジチオスレイトール（ＤＴＴ）（６０分間，最終濃度６．５ｍＭ）で還元し、次いでヨードアセトアミド（３０分間，最終濃度５４ｍＭ）でアルキル化し、その後で一夜トリプシン消化（１０ｎｇ／μＬ）に付した。タンパク質消化物を記載されたように脱塩し（Rappsilber et al.,2003,Anal.Chem.75,663-670）、真空乾燥させ、２．５％ギ酸に溶解した。
【０２４０】
ペプチド混合物の解析のために、Thermo Finnigan ＬＴＱ‐ＭＳ（Thermo Electron,Bremen,Germany）に接続されたAgilent １１００ＨＰＬＳシステム（Agilent Technologies）を用いた。タンパク質消化物をトラップカラム（Reprosil Ｃ１８ＲＰ（Dr,Maisch,Germany）,２０ｍｍ×１００μｍ Ｉ．Ｄ．）に５μＬ／ｍｉｎで注入した。その後で、ペプチドを解析カラム（Reprosil Ｃ１８ＲＰ,２０ｃｍ×５０μｍ Ｉ．Ｄ．）へ１００ｎＬ／ｍｉｎ  溶媒Ａ（０．１Ｍ酢酸）の低スプリット流速で移した。ペプチドの溶出は０〜４０％Ｂ（８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中０．１Ｍ酢酸）の直線勾配により４０分間で行った。カラム溶出物を突合せ接続ナノＥＳＩエミッター（New Objectives,Woburn,ＭＡ）からマススペクトロメーターのＥＳＩ源へ直接導入した。マススペクトロメーターを陽イオンモードで操作し、親イオンをデータ依存モードでフラグメント化のために選択した。質量スペクトル測定後、BioWorksソフトウェア（Thermo Electron,Bremen,Germany）を用いてピークリストを作製した。タンパク質同定は、下記セッティング：完全トリプシン処理ペプチド，ペプチドトレランス０．８Ｄａ，ＭＳ／ＭＳトレランス０．９Ｄａ，許容ミス開裂１回，固定および可変修飾として各々カルバミドメチル(Ｃｙｓ)および酸化（Ｍｅｔ）を用いて、ＩＰＩhumanデータベース（バージョン３．２４，ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/IPI/currentからダウンロード）をサーチすることにより、Mascotソフトウェア（www.matrixscience.com）を用いて行った。データを解析し、９５％の信頼レベルでペプチドをフィルターにかけ、少なくとも２種のペプチドで同定されるタンパク質同定のみを行うために、Scaffoldソフトウェアパッケージ（www.proteomesoftware.com）を用いた。
【０２４１】
結果および考察
表９では、異なるサンプルについて結果が示されている。アミロイドーシス患者では、ヒトプール血漿をコントロールとして用いた。ＲＡ患者では、健康な対象者からの血清をコントロールとして用いた。コントロール血清および正常プール血漿に関する結果は、患者サンプルで得られたペプチド組成物で特有に存在するペプチドの同定に用いられる。示されるタンパク質は、コントロール血清または血漿と比較して、患者血清または血漿からの特異的に結合したタンパク質またはタンパク質フラグメントである。健康な対象者からの滑液が利用できなかったため、コントロール‐マトリックスのみがＲＡ患者からの滑液用の陰性コントロールとして用いられた。前記のように、タンパク質同定はＩＰＩhumanデータベースをサーチすることにより行った。ＩＰＩは’International Protein Index’の略であり、Swiss-Prot、ＴｒＥＭＢＬおよびＰＩＲのような異なるデータベース（これらのデータベースはすべてUniProtでつながれている）でタンパク質、タンパク質前駆体およびタンパク質フラグメントを同定するために用いられる。UniProtで掲載された（未だされていない）予想タンパク質配列には多数あるが、ゲノム配列が完全に調べられた限定数の高等真核生物種については、ＩＰＩタンパク質セットが作られている。ＩＰＩはUniProtと予想を含んでなるソースからもデータをとっており、各種についてそれらを非リダンダントに包括的プロテオームセットに組み合わせている。この情報はすべて、www.ebi.au.ukからアクセスしうるEuropean Bioinformatics Institute（ＥＢＩ）のウェブサイトからアクセスした。
【０２４２】
滑液と接触させたコントロールマトリックスの溶出物で１つのペプチドが同定された１種のタンパク質（ＩＰＩ００８０７４２８）が掲載されているが、その理由はこのタンパク質の７つのペプチドが富化ＩｇＩＶマトリックスの溶出物で同定されていたからである。みられるように、７種の‘仮想’タンパク質と検出タンパク質の分子量で示されるタンパク質がある。比較的短いアミノ酸配列は、免疫グロブリンの中で特にみられる特定のタンパク質へ常に唯一属するとはいえないため、多数の結果が同定されるタンパク質フラグメントのあるものにとり可能である。ある他のケースにおいて、仮想タンパク質のＩＰＩ番号は既に同定されたタンパク質に関するものである。
【０２４３】
サンプル２／３、ＡＬアミロイドーシス患者ＩおよびIIの血清において、１つの同定タンパク質は‘ダイニン重鎖ドメイン３’であった。ダイニンは、細胞内カーゴを細胞膜から細胞へ動かす‘モータータンパク質’である。これは例えば自食作用および軸索輸送に関する場合である。ダイニンはタンパク質凝集物の輸送に関与している。そのためそれが血漿中のタンパク質凝集物とある理由で結合されると、それは最終的に富化ＩＶＩｇ‐マトリックスと結合することになる。したがって、ダイニンはクロスベータ結合タンパク質として同定される。加えてサンプル２／３では、１種の仮想タンパク質、２種の２５ｋＤａタンパク質および１種の免疫グロブリンラムダ定常１領域を同定した。ＩＰＩ番号ＩＰＩ００７４７７５２の２５ｋＤａタンパク質はデータベースのいずれにもリファレンスを有しなかった。しかしながら、それは免疫グロブリンのすべての構造的特性を有していた。他の２５ｋＤａタンパク質は免疫グロブリンラムダ座に遺伝子リファレンスを有していた。仮想タンパク質は免疫グロブリンラムダ可変４‐３の遺伝子およびタンパク質リファレンスを有していた。免疫グロブリンは、各々が定常領域と抗原結合可変領域を有する２本の重鎖と、各々が定常領域と抗原結合可変領域を有する２本の軽鎖からなる。
患者は原発性ＡＬアミロイドーシスに罹患しているため、同定された軽鎖はおそらく疾患の病理に関与するミスフォールド免疫グロブリン軽鎖である。
【０２４４】
サンプル４、ＲＡ患者IIIからの血清では、いくつか特有のタンパク質を同定した。この患者は６００超のＲＦ力価を有し、これはこの患者が重度ＲＡに罹患していることを示す。同定されたタンパク質の４種は仮想タンパク質であり、その１つ（ＩＰＩ００７６０６７８）は免疫グロブリンラムダ座に遺伝子リファレンスおよび免疫グロブリンラムダ定常領域にタンパク質リファレンスを有していた。他の３種は免疫グロブリンのすべての構造的特性を有していた。２５ｋＤａタンパク質として同定された２種のタンパク質は双方とも、免疫グロブリンラムダ座に遺伝子リファレンスを有していた。１種は、リウマトイド因子に外見上特異的なラムダ可変３領域、リウマトイド因子Ｇ９軽鎖に特異的タンパク質リファレンスを有していた。したがって、このフラグメントはクロスベータ結合免疫グロブリンの一部である、と結論づけられる。免疫グロブリンラムダ定常１として同定された２種のタンパク質（ＩＰＩ００６５８１３０、ＩＰＩ００７１９３７３）と免疫グロブリンラムダ定常２として同定された２種のタンパク質（ＩＰＩ００５５５９４５、ＩＰＩ００４５０３０９）があった。免疫グロブリン領域として同定された１種の他のタンパク質、即ち免疫グロブリンラムダ可変３‐２５があった。このフラグメントは、ミスフォールドタンパク質に親和性を示すアミノ酸配列を含んでなる、と結論づけられる。
【０２４５】
異なる研究では、リウマトイド因子は多くの場合に特異的ラムダ領域を含むことが示され、その１つがこの実験で外見上同定された。同定された他のラムダ領域もリウマトイド因子の一部だったのであろう。これらの領域もミスフォールド免疫グロブリン分子の一部であったのか、またはそれらは、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質の特性を示す、免疫グロブリンのＦｃ領域であるＲＦ自己抗原の一部であった（実施例１０参照）。
【０２４６】
３種の他のタンパク質を同定した。１種は中心体タンパク質Ｃｅｐ２９０のイソ型Ｉとして同定された（ＩＰＩ００７８４２０１）。中心体‐および繊毛関連タンパク質は、有糸分裂後細胞で極性を確立して細胞内輸送を調節する上で重要な役割を果たす。その細胞内局在性のために、その存在は溶解細胞の内容物が患者サンプルに存在することを示している。第二の種がフィブリノーゲンガンマ鎖前駆体のイソ型ガンマ‐Ｂとして同定された（ＩＰＩ０００２１８９１）。異なる形のフィブリノーゲンが、リウマチ様関節炎では自己抗体に対する抗原である。脱イミノ化形のフィブリノーゲンがこれら抗原の１種であり、それはリウマチ様関節炎患者の滑膜で豊富にみられる。
【０２４７】
同定された最終タンパク質（ＩＰＩ００００４２３３）はモノクローナル抗体Ｋｉ‐６７に対する抗原であった。この抗原は増殖マーカーとして用いられる。一部の場合に、それは腫瘍成長のマーカーとして用いられる。最も興味深いことに、滑膜で炎症細胞タイプの増殖を評価するために、それはリウマチ様関節炎でも増殖マーカーとして記載されていた。
【０２４８】
サンプル６、リウマチ様関節炎患者IVの滑液には、特有に同定された数種のタンパク質もあった。これらタンパク質のうち３種は仮想タンパク質であった。１種（ＩＰＩ００８０７４２８）は遺伝子またはタンパク質リファレンスを有しなかったが、免疫グロブリンの全特性を有していた。１種（ＩＰＩ００７６０６７８）は免疫グロブリンラムダ座（定常２）に遺伝子データベースリファレンスおよび免疫グロブリンラムダ座定常領域にタンパク質データベースリファレンスと、可変２‐１４領域および仮想タンパク質にもタンパク質リファレンスを有していた。最後の１種（ＩＰＩ００００３３６２）は実際に熱ショックタンパク質ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）であった。ＢｉＰはクロスベータ経路の成分の１つであり、ミスフォールドタンパク質と結合する（表４および５参照）。ＢｉＰがおそらく患者サンプルで同定されるが、その理由はそれがミスフォールドタンパク質に結合されていたからである。ＢｉＰはＲＡ患者でそれ自体が標的自己抗原としても同定された。
【０２４９】
仮想タンパク質以外に、３種の他の無名タンパク質が同定された；２５ｋＤａタンパク質２種および２６ｋＤａタンパク質１種。両２５ｋＤａタンパク質は免疫グロブリンラムダ座に遺伝子リファレンスを有していた（ＩＰＩ００７４７７５２，ＩＰＩ００１５４７４２）。これらのうち１種（ＩＰＩ００１５４７４２）も、前記された、リウマトイド因子に特異的なラムダ可変３領域、リウマトイド因子Ｇ９軽鎖にタンパク質リファレンスを有していた。２６ｋＤａタンパク質は免疫グロブリンカッパ可変１‐５に遺伝子リファレンスを有していた。
【０２５０】
同定された他の免疫グロブリン領域も数種あった。１種は免疫グロブリンカッパ定常（ＩＰＩ００８０７４１３）、１種（ＩＰＩ００１６６８６６）は免疫グロブリン重定常アルファ１、１種（ＩＰＩ００７４８９９８）は免疫グロブリン一本鎖Ｆｖフラグメント（重鎖可変領域）であり、最後の１種（ＩＰＩ００６５８１３０）は免疫グロブリン軽鎖定常１として同定された。
【０２５１】
滑液は補体系の一部成分、即ち補体Ｃ１ｑ副成分サブユニットＣ（ＩＰＩ０００２２３９４）、補体Ｃ１ｒ副成分（ＩＰＩ００２９６１６５）および補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＩＰＩ０００１１２６４）も含有していた。リウマチ様関節炎患者の滑液では、Ｃ１ｑ、Ｃ４および／またはＣ３結合のミクロ粒子が、リウマチ様関節炎患者および健康なコントロール双方の血清と比較して、豊富にみられることが示された。Ｃ１ｑがアミロイドベータプラークに蓄積することもわかった。最後に、Ｃ１ｑはサーファクタントプロテインＡ（ＳＰ‐Ａ）と構造的に類似し、双方とも球状ヘッド領域とコラーゲン様テールを有している。ＳＰ‐Ａは滑膜にある層板小体と会合されて、ＳＰ‐Ａに対する抗体がリウマチ様関節炎患者の滑液に存在している。これらの自己抗体はＣ１ｑと一部交差反応性を有している。Ｃ１ｑはクロスベータ経路で作用している（表４および５参照）。ＳＰ‐ＡとＣ１ｑに対する自己抗体との交差反応性から判断して、それも自己抗原であると考えられる。特に、コラーゲンはリウマチ様関節炎における共通自己抗原だからである。
【０２５２】
補体Ｃ１ｒは、Ｃ１ｑと会合しうるセリンプロテアーゼである。Ｃ１ｒは他の補体因子を活性化しうる。リウマチ様関節炎またはタンパク質ミスフォールディングとの明確な関連性はこれまでのところみられなかった。補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＦＨＲ‐１）は５つのショートコンセンサスリピート（因子Ｈでもみられる）からなり、その機能はこれまでのところ未知である。ＦＨＲ‐１はあるリポタンパク質粒子の一部としてヒト血漿でみられる。ＦＨＲ‐１は血漿中でリン脂質および他のタンパク質のリポタンパク質複合体と会合され、この複合体はリポ多糖（ＬＰＳ）への細胞の応答を媒介することが示された。我々は、ＬＰＳがタンパク質でクロスベータコンホメーションを誘導することを証明した。我々は、ＡｐｏＡ‐Ｉがクロスベータコンホメーションをとりうることも確かめた。加えて、ＡｐｏＡ‐Ｉはクロスベータコンホメーションを含んでなる他のタンパク質と結合しうる。該複合体のリポタンパク質は、リン脂質、アポリポタンパク質（ａｐｏＡＩ）、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）および因子Ｈ関連タンパク質（ＦＨＲ）からなる。ＦＨＲ‐１はＬＢＰの機能を伝達および／または調節する上で役割を果たす、と結論づけられる。ＦＨＲ‐１がこれら粒子の優位タンパク質成分であるため、ＦＨＲ‐１はＡｐｏＡ‐ＩまたはＬＢＰより数倍豊富に出現する。以前に、ベータ２‐糖タンパク質Ｉ（アポリポタンパク質Ｈとも称される）として知られる６つのショートコンセンサスリピートから構成される関連タンパク質がＨＤＬ粒子およびリン脂質の双方と会合することが示されていた。
【０２５３】
ベータ２‐糖タンパク質Ｉ（ＩＰＩ００２９８８２８）も滑液サンプルで同定された。ベータ２‐糖タンパク質Ｉはアテローム性動脈硬化症および抗リン脂質症候群、血栓のリスクが大きい状態で公知の自己抗原である。ベータ２‐糖タンパク質Ｉの機能は不明のままである。しかしながら、それがリン脂質依存性凝固反応、例えばプロトロンビナーゼ‐テナーゼ複合体の活性および因子XII活性化を阻害することが示されていた。それは因子XIとも結合し、その活性化を阻害する。対照的に、それは活性化プロテイン質Ｃの抗凝固活性を阻害し、それはインビボでトロンビン生成に寄与している。ベータ２‐糖タンパク質Ｉがプラスミンにより開裂されると、それはプラスミノーゲンと結合して、プラスミン生成を抑制する。我々は、カルジオリピンと接触させたときまたはアルキル化させたときにβ２ｇｐｉがクロスベータコンホメーションを含んでなり、こうしてそれを免疫原性ポテンシャルにさせることを示した。
【０２５４】
滑液サンプルでは３種の他のタンパク質、即ちカルモジュリン様タンパク質５（ＩＰＩ０００２１５３６）（カルモジュリン様皮膚タンパク質とも称される）、デスモプラキンのイソ型Ｉ（ＤＰＩ）（ＩＰＩ０００１３９３３）およびゲルゾリンのイソ型Ｉ（ＩＰＩ０００２６３１４）が同定された。カルモジュリン様タンパク質５は皮膚特異的カルシウム結合タンパク質であり、その発現は顆粒層と角質層の下層に限定される。それは細胞分化に際して発現される。このタンパク質はおそらく汚染物（皮膚細胞）として滑液に存在している。デスモプラキンは表皮における微小管組織のレギュレーターであり、それは表皮のケラチンと会合している。このタンパク質もおそらく汚染物である。ゲルゾリンはアクチンフィラメントにキャップし、ゲルゾリンの分泌形は血漿に存在し、そこではそれがおそらくアクチン‐スカベンジャーとして作用している。ゲルゾリンはアミロイド沈着物も形成でき、脳アミロイド血管障害を引き起こすタンパク質の１種である。ゲルゾリン遺伝子の突然変異はゲルゾリン関連家族性アミロイドーシスのFinnish型を招く。ゲルゾリンが凝集するかまたはミスフォールドゲルゾリンが滑液サンプルに存在していたとき、それが富化ＩＶＩｇ‐マトリックスと結合したことは意外ではない。
【０２５５】
本実施例で記載されているように、富化ＩｇＩＶ‐アフィニティマトリックスの使用により、我々はアミロイドーシス患者に特有のタンパク質数種を同定し、一連のタンパク質がリウマチ様関節炎の患者から得られたサンプルで特有に同定された。これらのタンパク質はクロスベータ構造を含有するか、またはクロスベータ結合タンパク質そのものである。これらのタンパク質は疾患特異的診断ツールの開発のための基礎を形成し、および／またはインビボ（例えば、薬物を投与することによる）および／または半ビボ（例えば、体外装置）で疾患関連ミスフォールドタンパク質を患者から枯渇させることを目ざす療法の開発のために新たに特定された標的である。更に、研究では外見上疾患と関連した数種の同定クロスベータ結合分子への洞察もみせた。Ｉｇの同定された可変領域は、合成アフィニティ領域の開発にとり良い出発点として役立つ（下記実施例２０参照）。
【０２５６】
実施例１５
アフィニティ領域によるミスフォールドタンパク質と細胞との相互作用の調節
クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質は細胞と結合して、炎症応答および細胞成長またはアポトーシスの変化に限定されないが、それらを含めた細胞応答を誘起しうる。我々は、アフィニティ領域がこのようなミスフォールドタンパク質と細胞との相互作用を調節しうるかどうかについて取り扱った。我々は臍静脈から単離されたヒト一次内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた。
【０２５７】
材料および方法
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単離、培養および解析
単離および培養
ＨＵＶＥＣは、当業者に公知の汎用標準操作に従い、０．１％コラゲナーゼ（Sigma，Ｃ０１３０，１００ｍｇ，１０％ＦＣＳ（Gibco １０１０６‐１６９）およびペニシリン‐ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ,Gibco,１５１４０‐１２２）で補充された１００ｍＬ Ｍ１９９培地に溶解）を用いて臍帯から単離された一次内皮細胞（ＥＣ）である。ＨＵＶＥＣはＥＣの典型的特徴、例えば丸石形態およびWeibel-Palade体中フォンビルブラント因子貯蔵を有している。ＨＵＶＥＣは継代５まで規則的に培養できる；継代５を超えるとＨＵＶＥＣは典型的ＥＣマーカーを放出する。単離法はここでは簡単に記載されている。臍帯をエタノールに続きＰＢＳで３分以内に洗浄する。血管をカニューレへつなぎ、１０ｍＬ ＰＢＳでフラッシングし、次いで０．１％コラゲナーゼ溶液で負荷する。３７℃で１５分間インキュベート後、後でコラゲナーゼ溶液に加えられる１０ｍＬ培地で血管をフラッシングすることにより、離れた内皮細胞懸濁物を回収する。ＥＣ懸濁物を室温にて低ｇ力で５分間遠心する。上澄を捨て、細胞ペレットを５ｍＬ‘富培地’（ＥＧＭ‐２；内皮基礎培地（ＥＢＭ‐２,Cambrex,ＣＣ‐３１５６）および内皮細胞用サプリメント含有のSinglequot（Cambrex,ＣＣ‐４１７６））に再懸濁する。細胞（継代０,Ｐ０）を０．５％ゼラチン（Sigma，Ｇ１３９３）で被覆された培養フラスコに接種する。内皮細胞の接着を促すため、ヒトフィブロネクチンを２μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞培養物へ加える。ＥＣを５％ＣＯ２下３７℃で培養する。細胞培地を密集的になるまで２〜３日毎に入れ替える。次いで、トリプシン‐ＥＤＴＡの添加で、細胞をフラスコから離し、低ｇ力で遠心し、富培地に再懸濁し、大きな０．５％ゼラチン前被覆細胞培養フラスコに接種する。
【０２５８】
ＲＡＧＥの発現および精製
組換えヒトｓＲＡＧＥクローニング、発現および精製の記載に関しては、特許出願ＷＯ２００６１０１３８７（パラグラフ〔０３０３〕）参照。精製ｓＲＡＧＥ‐ＦＬＡＧ‐ＨｉｓストックはＰＢＳ中２８４μｇ／ｍＬであり、−８０℃で保存した。
【０２５９】
ミスフォールドタンパク質への細胞の接着
９６ウェルプレート（Immulon １Ｂ Thermo Labsystems ３３５５）に、タンパク質、即ちＢＳＡ‐ＡＧＥ（５μｇ／ｍＬ）、１０μｇ／ｍＬ天然ＩＶＩｇ（Octagamチャージ＃５０２４０１８４３４）、１０μｇ／ｍＬ富化ＩＶＩｇ（Octagam ＩｇＩＶをＨｂ‐ＡＧＥ‐セファロースと接触させることで富化〔記載に関しては本出願の他の箇所参照〕）またはゼラチン（Sigma，Ｇ１３９３，Ｈ２ＯまたはＰＢＳ中２％溶液，ＥＣへの接着に関する陽性コントロール）を１００μＬ溶液で被覆させた。３７℃で２時間インキュベート後、溶液を捨て、ウェルをフィルター（０．２２μｍ）滅菌されたＰＢＳ中０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ，Sigma Ｐ５２８８）の１００μＬ／ウェルで３７℃にて１時間かけて遮蔽した。ＰＶＰは細胞接着をサポートしない不活性ポリマーである。その後で、ＰＶＰ含有溶液を捨てた。次いで、プレートを４０μＬ ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco５２４００）および１０μＬのポテンシャルインヒビター、例えばアフィニティ領域とインキュベートした。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理により得た。遠心後、細胞をＰ／Ｓ含有のＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、８０，０００〜１００，０００細胞／ｍＬに希釈した。各ウェルを１００μＬの細胞懸濁物で接種した。細胞を３７℃で１時間かけて接着させた。プレートをＰ／Ｓ含有のＲＰＭＩ１６４０培地で穏やかに洗浄した。ウェルの壁に沿うピペッティングにより培地を除去した。ブランクウェルがほとんど細胞を含有しなくなるまで、即ち１〜３回プレートを洗浄した。その後で、５０μＬ ＲＰＭＩ培地を各ウェルへ加え、次いで５μＬ／ウェルのＰＢＳ中１０％Triton‐Ｘ１００を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、５０μＬのラクトデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ，Roche Applied Science，１１６４４７９３００１）溶液を製造業者の指示に従い加えた。プレートを暗所中室温で０．５〜３時間インキュベートした。４９０ｎｍの吸光度をVersamaxマイクロプレートリーダーにより様々な時点で測定した。
【０２６０】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析により評価された細胞へのミスフォールドタンパク質の結合性
これらの実験のために、ＨＵＶＥＣをトリプシン処理により単離した。トリプシン処理後、細胞をＰ／Ｓおよび１０％ＦＣＳ含有のＲＰＭＩ１６４０で集め、遠心した。遠心後、細胞を２５０，０００細胞／２５０μＬの濃度で無ＦＣＳのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。２５０μＬ細胞懸濁物を含有する個別４ｍＬチューブ（ポリプロピレン，Greiner）を作製した。各チューブに、緩衝液（ＰＢＳ）のみ含有のサンプル７５μＬ、２５μＬ ｏｘＬＤＬ（１ｍｇ／ｍｇ）含有の５０μＬ緩衝液または１μＬ ＢＳＡ‐ＡＧＥ（２５ｍｇ／ｍｇ）含有の７４μＬ緩衝液を加えた。その後で、細胞を４℃で約３．５時間にわたりサンプルとインキュベートした。次いで細胞を遠心によりペレット化し、上澄を捨てた。細胞をその後４℃にてＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％ｍ／ｖ ＮａＮ３）で洗浄し、後の解析のために約１×１０５細胞／１００μＬでＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。３μＬ ７‐アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）溶液（標準操作に従い調製）を加えることにより細胞死を調べた。サンプルＢＳＡ‐ＡＧＥ（調製の詳細に関しては本出願の他の箇所参照）の結合性を抗ＡＧＥモノクローナル抗体４Ｂ５（１０μｇ／ｍＬ）、洗浄後にヤギ抗マウスＰＥ二次抗体（Jackson Immunoresearch,West Grove,ＵＳＡ）で調べた。ＢＳＡ‐ＡＧＥの結合性はＰＥチャンネルでＢＳＡ‐ＡＧＥの固有蛍光を用いることでも評価した。酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ，ＦｅＳＯ４でインキュベート後に５６％酸化；チオフラビンＴ蛍光の特異的増強）の結合性を、１６０μｇ／ｍＬの濃度で、抗ＡｐｏＢ１００ポリクローナル抗体（Data Behring,Newark,ＤＥ,ＵＳＡ，ロット１５３６７０）含有の、細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ抗体（１：２００,Jackson）含有のウサギ血清により調べた。
【０２６１】
結果および結論
ミスフォールドタンパク質への細胞の接着
ＨＵＶＥＣがミスフォールドタンパク質と、即ちここで示されているように、ゼラチンよりもやや大きい程度、約１２５％でＢＳＡ‐ＡＧＥと接着することがわかった（図２２Ａ，バー１ vs.３）。漸増濃度のアフィニティ領域、即ちＩｇＩＶがＢＳＡ‐ＡＧＥへのＥＣの接着を阻害した（バー７〜９ vs.バー３）。これらのデータは、アフィニティ領域がミスフォールドタンパク質と細胞との相互作用を妨げることを示している。
【０２６２】
図２２Ｂは、細胞がアフィニティ領域（ＩＶＩｇ，Octagam）、最も効率的には富化アフィニティ領域（富化ＩＶＩｇ，OctagamをＨｂ‐ＡＧＥ‐セファロースと接触させることによる富化後，記載に関しては本出願の他の箇所参照）とも結合することを示している。Ｆｃドメインを含んでなる固定アフィニティ領域へのＥＣの結合は古典的Ｆｃレセプターにより媒介されず、このようなレセプター、即ちＣＤ１６、ＣＤ３２ａおよびｂとＣＤ６４がＦＡＣＳ解析を用いて調べられるように細胞に存在しないからであった（示さず）。アフィニティ領域はミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるため、アフィニティ領域と細胞とのこの相互作用はアフィニティ領域への細胞上ミスフォールドタンパク質の特異的な結合により説明される。確かに、細胞の約１〜２％はＦＡＣＳ解析で調べられるように生存力が低い（示さず）。
【０２６３】
フローサイトメトリーにより調べられた細胞へのミスフォールドタンパク質の結合性
２方法を用いて、ＢＳＡ‐ＡＧＥは１３．９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）でＥＣの９６％と効率的に結合することがわかった。ｏｘＬＤＬはインキュベートされたＥＣの１８％と結合し、１．６のＭＦＩを示した。ＢＳＡ‐ＡＧＥと懸濁状態でインキュベートされたＥＣで得られた結合特性は、ＢＳＡ‐ＡＧＥで被覆された細胞培養プレートのウェルとＥＣが効率的に結合するという観察と一致する（図２２参照）。
【０２６４】
一緒にすると、これらの結果は、細胞がクロスベータ構造のミスフォールドタンパク質と特異的に結合でき、アフィニティ領域、好ましくは富化アフィニティ領域がこのようなミスフォールドタンパク質と細胞との相互作用を調節することを証明している。この実施例で、我々はOctagam ＩｇＩＶに存在するＩｇＩＶアフィニティ領域が固定ミスフォールドＢＳＡ‐ＡＧＥへのＥＣの接着を効率的に遮蔽することを観察した。固定ミスフォールドタンパク質に対するアフィニティ領域はミスフォールドタンパク質と結合して、ＥＣ表面レセプターとの相互作用からそれを遮断している、と結論づけられる。
【０２６５】
実施例１６
富化ＩｇＩＶを用いたミスフォールドタンパク質から溶液の枯渇
我々は、クロスベータ構造を含んでなる固定ミスフォールドタンパク質のマトリックスと結合するアフィニティ領域の選択後に得られた富化ＩｇＩＶが、クロスベータ構造から溶液を枯渇させるための適しているかどうかを解析した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡアプローチにおいて、実施例６で記載されたようにＡβフィブリル‐セファロース、ｄＩｇＩＶ‐セファロース、ｄＨＳＡ‐セファロースおよびＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースを用いて富化されたＩｇＩＶの混合物を固定し、ミスフォールドＨｂＡＧＥおよびｄＯＶＡのスパイク溶液へ曝し、その後で富化ＩｇＩＶへのミスフォールドタンパク質の結合性を評価した。
【０２６６】
材料および方法
実施例６で記載されたように、Ａβフィブリル‐セファロース、ｄＩｇＩＶ‐セファロース、ｄＨＳＡ‐セファロースおよびＢＳＡ‐ＡＧＥ‐セファロースを用いることによりOctagam ＩｇＩＶ（ロット５０２４０１８４３４）を富化させた。Ｉｇ濃度は約３０μｇ／ｍＬであった。本実験では、アフィニティマトリックスからの４溶出物を容量ベースで１：１：１：１混合し、運動下室温で１時間かけてGreiner Microlon高結合性プレートに５μｇ／ｍＬの濃度で被覆した。陰性コントロールとして、コントロール緩衝液のみまたは天然ＨＳＡ（ＣＥＡＬＢ,Sanquin,オランダ）を被覆した。ＥＬＩＳＡを本質的に前記のように行った。富化ＩｇＩＶまたはＨＳＡまたは被覆用緩衝液で被覆された遮蔽（Roche遮蔽試薬）ウェルを０、１、１０または１００μｇ／ｍＬのｄＯＶＡまたはＨｂＡＧＥで二重に覆った。ｄＯＶＡの結合性はモノクローナル抗ニワトリ卵アルブミン（Sigma，Ａ６０７５，１：１０，０００）およびＲＡＭＰＯ（Dako Cytomation,Ｐ０２６０,１：３０００）を用いて評価した。ＨｂＡＧＥはグルコース‐６‐リン酸グリケート化ヒトフィブロネクチンに対するＡＧＥ特異的マウスハイブリドーマＩｇＧ４Ｂ５およびＲＡＭＰＯを用いて検出した。後にタンパク質溶液で覆われる緩衝液被覆ウェルで得られたバックグラウンドシグナル（下記参照）を、被覆富化ＩｇＩＶまたはＨＳＡのウェルで得られたシグナルから差し引いた。加えて、ｄＯＶＡまたはＨｂＡＧＥが加えられなかったウェルとの一次および二次抗体インキュベートで得られたバックグラウンドシグナル（結合の緩衝液コントロール）を１、１０および１００μｇ／ｍＬミスフォールドタンパク質で得られたシグナルから差し引いた。
【０２６７】
結果および考察
図２３は、ｄＯＶＡが固定富化ＩｇＩＶにより溶液から抽出され、一方ＨＳＡへの付着がほとんど生じなかったことを示す。同様に、ＨｂＡＧＥも富化ＩｇＩＶにより特異的に抽出された。これらの結果は、適切な固体支持体に固定されたクロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質に増加した親和性をもつ富化ＩｇＩＶが、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質、例えばｄＯＶＡおよびＨｂＡＧＥから溶液の枯渇に適用される上で適していることを示す。
【０２６８】
ミスフォールドタンパク質からタンパク質溶液を枯渇させるために開示されたこの方法の適用例は、例えば、ｉ）タンパク質ミスフォールディング疾患、例えば腎不全、全身性アミロイドーシス、例えばＡＬ‐、ＡＡ‐またはＡＴＴＲアミロイドーシス、またはＲＡの診断、ii）例えば生物薬剤およびワクチンのようなタンパク質溶液の品質コントロール、iii)タンパク質ミスフォールディング疾患、例えば腎不全、全身性アミロイドーシス、例えばＡＬ‐、ＡＡ‐またはＡＴＴＲアミロイドーシス、またはＲＡに罹患した患者の、例えば体外装置を用いた透析、およびiv）（免疫原性）副作用の誘導リスクをもつミスフォールドタンパク質から生物薬剤のクリアランスの分野であるが、それらに限定されない。上記適用例のすべてにおいて、ミスフォールドタンパク質への優先的および特異的結合に関する適用アフィニティ領域の詳細はニーズに合わせて調整される。１つの好ましい態様において、実施例６および７と以下の“実施例１〜２０に基づく要旨”で記載された方法および手段により、それらの特異的アフィニティ領域は、例えば前記のようなある目的に要されるアフィニティ領域の組成物から選択される。
【０２６９】
実施例１７
富化アフィニティ領域によるミスフォールドタンパク質への細胞応答の免疫調節
ミスフォールドタンパク質から体を浄化するために、免疫細胞が様々な手法でミスフォールドタンパク質に応答する。応答には、ミスフォールドタンパク質のオプソニン化、免疫系の他の細胞を活性化および誘起するためのサイトカインおよびケモカインの産生、および他の細胞を活性化するための細胞表面マーカーの発現がある。特に、ミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域のような抗体は、このような免疫細胞を活性化するために、免疫細胞と相互作用する。我々は、グリケート化ＢＳＡのようなミスフォールドタンパク質を認識する抗体で富化されたアフィニティ領域が、ミスフォールドタンパク質への応答を高められたかどうかについて試験した。我々は健康なボランティアの末梢血から単離された一次ヒト樹状細胞（ＤＣ）を用いた。我々はサイトカインインターロイキン‐６（ＩＬ‐６）およびケモカインＩＬ‐８の産生、細胞表面マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ４０）の発現と、細胞生存率および残存率（７ＡＡＤの結合）を調べた。
【０２７０】
材料＆方法
末梢血ヒト単球由来樹状細胞のインビトロ作製および活性化の解析
本質的に公表された方法（Sallustro and Lanzavecchia[1994], J.Exp.Med.179, 1109-1118）により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から選択された非増殖前駆体からヒトＤＣを作製する。ＣＤ１ａ、ＣＤ３２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＨＬＡ‐ＤＲおよびＣＤ２０６の相対的に豊富な存在量とＣＤ１４陽性、ＣＤ１６陽性、ＣＤ６４陽性、ＣＤ８０陽性、ＣＤ８３陽性およびＣＤ１６３陽性細胞の比較的低い含有量が、未成熟ＤＣの品質尺度として働く。ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４の刺激で未成熟ＤＣを得た後、１ｍＬの細胞懸濁物を、５０μＬの下記化合物（最終濃度）、ｉ）ＰＢＳ、ii）５０μｇ／ｍＬポリ‐ＩＣと１００ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα、iii)５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ‐ＡＧＥ、iv）ＢＳＡ‐ＡＧＥ＋４．４μｇ／ｍＬ富化ＩｇＩＶ、ｖ）iv）と同様だが、細胞が飽和濃度の遮蔽抗ＣＤ３２ａ抗体とプレインキュベートされたもの、vi）ＢＳＡ‐ＡＧＥ＋６６０μｇ／ｍＬ Octagam ＩｇＩＶ、vii) vi）と同様だが、細胞が飽和濃度の遮蔽抗ＣＤ３２ａ抗体とプレインキュベートされたものと、２２時間インキュベートする。Octagam ＩｇＩＶをＨｂＡＧＥ‐セファロースと接触させ、その後でミスフォールドタンパク質‐マトリックスと結合したアフィニティ領域を単離することにより、富化ＩｇＩＶを得る。
【０２７１】
下記パラメーター：ＦＡＣＳを用いて測定されるＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ４０の表面密度（平均蛍光強度，ＭＦＩまたは％陽性細胞）と、アポトーシスマーカー７‐アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）結合性で調べられるような細胞死／細胞生存率に関して、ＤＣを解析した。加えて、ＩＬ‐６ではPelipair ＥＬＩＳＡ（Ｍ９３１６，Sanquin Reagents，Amsterdam,オランダ）およびＩＬ‐８ではCytosets ＣＨＣ１３０４キット（Biosource）を用いて、ＩＬ‐６分泌およびＩＬ‐８分泌の程度を細胞培養上澄で調べる。
【０２７２】
結果および考察
表１０は解析からの結果を示している。ＤＣはコントロール刺激（ＴＮＦアルファの存在下ポリＩ‐Ｃ）に強く応答していることがわかる。データは、富化ＩｇＩＶがＢＳＡ‐ＡＧＥの存在下でＤＣを刺激しうることを証明している。対照的に、非富化ＩｇＩＶは１５０倍高濃度のときでもＤＣをほとんど増強できない。例えば、ＩＬ‐６（４４３３ｐｇ／ｍＬ）およびＩＬ‐８（１９３１６ｐｇ／ｍＬ）の発現は富化ＩｇＩＶにより強く刺激されるが、非富化ＩｇＩＶでは限定的にすぎない（各々１９１ｐｇ／ｍＬおよび４６８２ｐｇ／ｍＬ）。加えて、富化ＩｇＩＶはＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ４０のような補助刺激分子の発現も刺激する。応答はＦｃγＲIIａに対する抗体（抗ＣＤ３２ａ）により阻害され、このことは効果がこのＦｃレセプターにより媒介されていることを示す。
【０２７３】
一緒にすると、これらの結果は、アフィニティ領域、好ましくは富化アフィニティ領域が、特にＦｃＲを介して、ミスフォールドタンパク質を除去するために免疫系を増強する役割を果たしていることを示す。このように、開示された方法により、当業者であれば、ミスフォールドタンパク質を除去するため、疾患の病理におけるミスフォールドタンパク質の関与を減らすために、好ましくは疾患の治療で用いられるアフィニティ領域を選択することができる。
【０２７４】
実施例１８
富化ＩｇＩＶアフィニティ領域と、ＨｂＡＧＥ‐セファロースミスフォールドタンパク質アフィニティマトリックスを用いて富化ＩｇＩＶが選択されたＩｇＩＶにおける、抗環式シトルリン化ペプチド抗体の存在に関する解析
実施例１および３〜９において、アフィニティ領域、即ちヒトＩｇＩＶの様々な調製物がクロスベータ構造のミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうることを我々は証明した。実施例１０では、ＩｇＧ分子のＦｃドメインに対する自己抗体、リウマトイド因子（ＲＦ）力価の解析に関するアッセイで使用のヒトＩｇＧの調製のために６５℃で加熱することにより凝集させる広く許容された方法が、ＩｇＧ分子でクロスベータ構造を誘導することを我々は証明した。ＲＦ力価は全リウマチ様関節炎患者の７０〜８０％でみられる。加えて、外見上健康な集団の約５％もＲＦに陽性である。我々は、クロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導タンパク質コンホメーションと特異的に結合しうるＩｇＩＶ中のＩｇサブ集団が、環式シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）に親和性を有する可能性について、今回は取り扱った。
【０２７５】
リウマチ様関節炎患者の８０％超でみられる自己抗体の集団が、フィブリノーゲン、フィラグリンおよびビメンチンのようなあるタンパク質の脱イミノ化形を標的とすることが、広く記載されていた。最近、抗合成シトルリン化フィラグリン配列抗体は実際に患者でシトルリン化フィブリンと結合することが記載されていた。我々は以前に、フィブリンがクロスベータ構造コンホメーションを有することを示した。脱イミノ化で、アミノ酸アルギニンがアミノ酸シトルリンに変換される。したがって、このプロセスはシトルリン化と称され、シトルリン化タンパク質を生じる。シトルリン化タンパク質へのこれら抗シトルリン化タンパク質自己抗体の結合に基づくリウマチ様関節炎の診断試験、例えば抗環式シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）ＥＬＩＳＡ試験（抗ＣＣＰ ＥＬＩＳＡ）が、ルーチンで用いられている。タンパク質のシトルリン化がどのようにＲＡ患者で自己免疫応答を誘起するかが大いに未知であったのは、本発明までのことであった。我々は、タンパク質のシトルリン化の引証結果がタンパク質のアンフォールディング／リフォールディングであることに気付いた。本発明によると、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼによるアルギニン残基のシトルリン化は、アルギニン残基を含んでなるタンパク質のミスフォールディングを誘導する。アルギニンシトルリン化の結果は、タンパク質における正電荷の正味喪失である。正電荷のこの正味喪失は、タンパク質三次元構造の安定性および完全性に関与する、イオン相互作用および水素結合の調節によるミスフォールディングに寄与する。我々は以前に、クロスベータコンホメーションの出現によるタンパク質のミスフォールディングが、タンパク質を免疫原性体へ変えることを証明した（特許出願“クロスベータアジュベーション”，ＷＯ２００７００８０７０参照）。我々はしたがって、タンパク質のシトルリン化およびこのタンパク質で生じるミスフォールディングがクロスベータ構造の形成を伴い、そのことがこれらシトルリン化タンパク質の（自己）免疫原性特徴を説明している、とここでは結論づけている。この結論を確証するために、我々はＮＨＳ‐セファロースに固定されたミスフォールドグリケート化ヘモグロビンとOctagam ＩｇＩＶを接触させることにより回収された我々の富化ＩｇＩＶアフィニティ領域集団中における抗ＣＣＰ抗体の存在について試験した。
【０２７６】
材料および方法
下記アフィニティ領域調製物を抗ＣＣＰ抗体力価の出現について解析した：
１．  Octagam ＩｇＩＶ（Octapharma，チャージ番号：５０２４０１８４３４，５０ｍｇ／ｍＬ）
２．  １０ｍｇ／ｍＬ ヒトγ‐グロブリン（Sigma Ｇ４３８６，ロット２１ｋ７６００）。ＰＢＳに溶解し、ローラー装置にて室温で１０分間、その後３７℃で１０分間、および再びローラー装置にて室温で１０分間インキュベートする。
３．  Gammagard ＩｇＩＶ（Baxter Hyland Immuno Gammagard S/D５ｇ，ロットＬＥ０８Ｅ０４４ＡＬ，５２ｍｇ／ｍＬ，供給溶液に溶解し、等分し、−２０℃で保存する）
４．  ＰＢＳ中１０３μｇ／ｍＬ 富化ＩｇＩＶ。実施例６、７で記載されているように、ＨｂＡＧＥ‐セファロースを用いてOctagam ＩｇＩＶ（チャージ番号：５０２４０１８４３４）から富化する。
【０２７７】
ルーチン力価測定は、抗ＣＣＰ抗体力価測定のためにＥｌｉＡシステム（Phadia GmbH）を用いて、Laboratory for Medical Immunology（ＵＭＣ Utrecht,オランダ）で行った。サンプル１〜４を、患者の血清に関してルーチンに行われる１００×希釈の代わりに、解析のために１０×希釈した。
【０２７８】
結果＆考察
様々なアフィニティ領域調製物における抗ＣＣＰ抗体力価を、ＥｌｉＡシステムを用いて地元のLaboratory for Medical Immunology（ＵＭＣ Utrecht,オランダ）で測定した。測定された力価に関しては表１１参照。ＩｇＩＶおよびγ‐グロブリン調製物で得られた値は、疾患を診断する目的に照らし陰性として血清中抗ＣＣＰ力価を判断する限界範囲、即ち＜７Ｕ／ｍＬに属する。実際に、測定された力価は外見上健康な個体の血清で規則的にみられる。富化ＩｇＩＶでは、得られた力価２．７Ｕ／ｍＬが、富化ＩｇＩＶが単離されたOctagam ＩｇＩＶで測定されたものに匹敵する。富化ＩｇＩＶの濃度はしかしながら４８５倍低く、このことは抗ＣＣＰ抗体に関して富化ＩｇＩＶアフィニティ領域調製物の４３７倍富化を示唆している。このことから、ミスフォールドＨｂへのそれらの親和性に基づき選択されたアフィニティ領域もシトルリン化ペプチドに親和性を示す、と我々は結論づけている。
【０２７９】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼは様々な組織および細胞にタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで局在していたが、赤血球にはない。更に、赤血球プロテオームにおけるペプチジルアルギニンデイミナーゼの存在はプロテオミクスアプローチで検出されなかった。したがって、これらの発見に基づき、リシンおよびアルギニン残基の徹底グリケーションに用いられたヒトヘモグロビン（Ｈｂ）はシトルリン化されていない、と我々は結論づけている。加えて、抗ＣＣＰ力価解析で用いられた環式シトルリン化ペプチドはヒトフィラグリンに基づく修飾配列であり、したがってＨｂアミノ酸配列を含まない。ヒトフィラグリンアミノ酸配列とヒトＨｂ α‐鎖またはβ‐鎖アミノ酸配列との配列アライメントでは、約１９アミノ酸残基、即ち解析に用いられた第二世代のＣＣＰの長さのペプチド鎖間で、低〜無配列相同性（即ち、約２０〜３５％）を呈する。前記のように、シトルリン化はタンパク質リフォールディングの誘導について周知である。したがって、我々の結果は、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質、即ちＨｂＡＧＥの使用で、我々がヒトＨｂと無関係なアミノ酸配列を有するＣＣＰに特異的な一連のアフィニティ領域をＩｇＩＶアフィニティ領域のコレクションから選択しえたことを証明している。この発見で、グリケーションで誘導された、シトルリン化で誘導された、またはタンパク質ミスフォールディングのためのいずれか他の手段もしくは方法により誘導されたミスフォールディングが、アミノ酸配列と無関係な、タンパク質に共通の構造的特徴、即ちクロスベータ構造および／またはクロスベータ構造誘導コンホメーションの獲得を招く、という我々の結論を我々は確証した。これは抗ＣＣＰ力価データの解釈にとり重要な示唆を有している。シトルリン化タンパク質と特異的に結合しうるアフィニティ領域が、タンパク質のシトルリン化で誘導されるアミノ酸配列非依存性構造的特徴に特異性をもつアフィニティ領域の集団を実際に含んでなることが開示されていたため、特定抗ＣＣＰ力価の患者が罹患している疾患の病理におけるタンパク質ミスフォールディングの示唆は明らかに無視しえないのである。シトルリン化で形成されたミスフォールドタンパク質は、したがって、例えばＲＡ特異的療法の開発で行われるリサーチに向けて新たに特定された標的である。我々の結果は、ミスフォールドタンパク質‐マトリックスを用いて得られた富化ＩｇＩＶアフィニティ領域が、ＲＡ関連ミスフォールドタンパク質に対する薬物開発のためにこのように新たに特定されたリード化合物であることを証明している。
【０２８０】
実施例１９
ミスフォールドマウスγ‐グロブリンに特異性をもつヒト富化ＩｇＩＶアフィニティ領域
背景
リウマトイド因子（ＲＦ）は、熱への暴露によるＩｇＧのミスフォールディングで露出される自己ＩｇＧ分子のＦｃドメインにおけるエピトープに対するＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ自己抗体の組成物である。ＲＦはリウマチ様関節炎（ＲＡ）患者の７０〜８０％で生じ、比較的高いＲＦ力価が重度の疾患進行と相関している。実施例１０において、我々は、クロスベータ構造が形成されるように、ＲＦエピトープを暴露させる方法が実際にＩｇＧをミスフォールドさせ、こうしてＲＦがＩｇＧでクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションに親和性をもつアフィニティ領域であるという結論に至ることを証明している。我々は、クロスベータ構造をもつ４種の異なるタンパク質、即ち合成ヒトＡβ１‐４０、ニワトリ血清アミロイドＡ、グリケート化ヒトヘモグロビンおよびヒトフィブリンα‐鎖の合成フラグメントでのマウスの免疫化が免疫応答を誘起し、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドヒトＩｇＧに特異性をもつハイブリドーマＩｇＭクローンをもたらすことをみつけた。無関係のアミノ酸配列をもつが、クロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションの存在が共通する、４種のタンパク質抗原のうち１種以上は、ミスフォールドヒトＩｇＧのクロスベータ特徴を偶然にも近密に連想させるクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導構造的特徴を含んでなる。別な説明は、４種抗原のうち１種以上における構造的クロスベータ特徴が、マウス自己Ｉｇ分子におけるクロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションと似ていることである。交差反応性は、Ｂ細胞によるＩｇの過剰産生を伴う、免疫系の高活性時に生じたのかもしれない。マウス免疫系の異常反応性は、多数の浸潤線維芽細胞を伴う、極めて大きな脾臓（細胞数７倍増加）から結論づけられる。更に、マウスは免疫化試験時にしばらく重症であった。これらの観察は、ミスフォールドヒトＩｇＧへのハイブリドーマＩｇＭの親和性観察で反映される、自己ＩｇＧに対する自己免疫応答の帰結かもしれない。第三のもっともな説明は、マウスがレパートリーでＲＦと共通した性質の一般的クロスベータ結合ＩｇＭクローンをまさに有し、それがクロスベータアフィニティマトリックスを適用することでヒトＩｇＩＶから選択されるＩｇＧと似ていることである。我々は、ＨｂＡＧＥ‐マトリックスで選択時にミスフォールドタンパク質に親和性をもつアフィニティ領域について富化されたヒトＩｇＩＶが、ミスフォールドマウスＩｇＧに親和性をもつアフィニティ領域を含んでなるかどうかについて今回は評価した。これは、一般的にミスフォールドタンパク質に親和性をもつ自己免疫グロブリンの集団の存在に関する我々の知識を更に確証させることになる。
【０２８１】
材料および方法
クロスベータ構造と結合するアフィニティ領域の選択のためのプールとして用いられるOctagam ＩｇＩＶ出発物質と富化ヒトＩｇＩＶが、クロスベータ構造のミスフォールドマウスＩｇＧに親和性をもつアフィニティ領域の集団を含んでなるかどうかについて試験するために、我々はマウスＩｇＧの様々なミスフォールド形へのOctagam ＩｇＩＶおよび富化ＩｇＩＶの結合性を解析し、天然マウスＩｇＧとの結合性の結果と比較した。天然マウスＩｇＧ、高ｐＨに曝されたマウスＩｇＧ（ｄｍＩｇＧ塩基）、低ｐＨに曝されたマウスＩｇＧ（ｄｍＩｇＧ酸）およびＰＢＳ中８５℃に加熱されたマウスＩｇＧ（ｄｍＩｇＧ８５℃）でＴｈＴ蛍光およびコンゴーレッド蛍光を測定すると、クロスベータ構造が様々なミスフォールディング方法で誘導されることを明らかにした。ＥＬＳＡを２つの異なる手法で行った。１アプローチでは、マウスＩｇＧをウェルに直接被覆し、富化ＩｇＩＶの濃度シリーズで覆った。それとは別に、第一のウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＲＡＭＰＯ,Dako Cytomation,Denmark）をウェルに被覆した。ウェルを（Roche遮蔽試薬）遮蔽し、その後でマウスＩｇＧ調製物を固定抗体へ結合させてから、OctagamヒトＩｇＩＶの濃度シリーズを三重にウェルへ適用した。
【０２８２】
結果＆考察
図２４では、２つの別なＥＬＩＳＡアプローチの結果がまとめられている。両実験アプローチにおいて、ヒトアフィニティ領域はマウスＩｇＧの様々なミスフォールド形と優先的に結合する。天然マウスＩｇＧへの富化ＩｇＩＶの結合はほとんど検出されず、Octagam ＩｇＩＶは天然マウスＩｇＧと全く結合しなかった。Octagam ＩｇＩＶおよび富化ＩｇＩＶは双方とも、各々約２００μｇ／ｍＬおよび４．４μｇ／ｍＬ ＩｇＩＶの半最大結合性を示す濃度で、ｄｍＩｇＧ塩基と最高親和性で結合した。富化ＩｇＩＶで天然マウスＩｇＧへの一部結合性がみられ、一方結合性がOctagam ＩｇＩＶで検出されなかったという事実は、富化ＩｇＩＶが高親和性を有するマウスＩｇＧ組成物中におけるミスフォールドＩｇＧ分子のあるフラクションの存在を示している。これらの数値から、富化ＩｇＩＶはミスフォールドマウスＩｇＧとの結合性に関して約５０倍富化されている、と導かれる。
【０２８３】
結論として、３つの異なる形のミスフォールドマウスＩｇＧは、富化ヒトＩｇＩＶおよび富化ＩｇＩＶが選択されるOctagam ＩｇＩＶとの結合部位を含んでなる。ｄｍＩｇＧ塩基は、Octagam ＩｇＩＶおよび富化ＩｇＩＶの双方が最高親和性を呈するミスフォールドタンパク質コンホメーションを曝している。これらのデータは、ミスフォールドグリケート化ヘモグロビンから構成されるアフィニティマトリックスを用いることにより、ミスフォールドマウスＩｇＧに親和性を示すＩｇＧ分子の組成物、即ちOctagam ＩｇＩＶからアフィニティ領域の集団が選択されることを示している。これは、選択された富化ＩｇＩＶフラクション、ひいてはOctagam ＩｇＩＶ中におけるＲＦ様アフィニティ領域、即ちクロスベータ構造のミスフォールドアフィニティ領域と優先的に結合するアフィニティ領域の出現を示している。
【０２８４】
実施例２０
リウマトイド因子を連想させる結合性のハイブリドーマＩｇＭ
背景
実施例１〜５の物質および方法セクションで前記されたように、マウスハイブリドーマＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２はヒト免疫グロブリンの一部ミスフォールド形と特異的に結合する。我々はしたがって７Ｈ２Ｈ２をリウマトイド因子様抗体と命名した。マウスを合成ヒトＡβ１‐４０、ニワトリ血清アミロイドＡ、グリケート化ヒトヘモグロビンおよびヒトフィブリンα‐鎖の合成ペプチドで連続免疫してから、脾臓をハイブリドーマの調製用に摘出した。注目すべきことに、脾臓が摘出されたとき、それは例外的に多数の細胞、７＊１０８を含んでいた（正常数は１＊１０８細胞である）。加えて、脾臓は例外的に多数の浸潤線維芽細胞を含んでいた。これらの観察は、マウス免疫系の高活性に起因する、高活性脾臓を示している。注目すべきことに、Ａβで初回免疫化後約４０週目に、第二、第三または第四ミスフォールド抗原で免疫化前に、マウスは病気になったが、数週間以内で、第二抗原、即ちニワトリＳＡＡで免疫化前に回復した。７Ｈ２Ｈ２がγ‐免疫グロブリンおよびミスフォールドＩｇＩＶを認識し、一方無関係のアミノ酸配列を含んでなる４種の抗原が免疫化に用いられ、（外来）免疫グロブリンが抗原として用いられていないという事実は、免疫化操作に際するある時点の高活性化免疫系とマウスの病気の観察と合わせると、マウスが自己抗体に対する自己免疫応答を起こしたと我々に結論づけさせた。７Ｈ２Ｈ２へエピトープを曝すためのヒトＩｇＧの構造的要件を更に解析する上で、我々は異なる方法で得られたミスフォールド抗体を含んでなる一連のヒトＩｇＧ調製物で結合実験を行った。
【０２８５】
材料および方法
ヒトＩｇＧの様々な構造外形へのハイブリドーマクローン７Ｈ２Ｈ２ ＩｇＭの結合性の解析のために、希釈シリーズの精製７Ｈ２Ｈ２（ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬ；P.van Kooten,ＡＢＣ-Hybridoma facility,University of Utrecht/ＵＭＣ Utrecht,オランダ）または固定濃度の１２．５μｇ／ｍＬ ＩｇＭを固定ヒトＩｇＧでＥＬＩＳＡに用いた。陰性コントロールとして、ハイブリドーマＩｇＭ ２Ｇ１０を用いた。解析に用いられたヒトＩｇＧのミスフォールド形および天然コントロールが図２５で示されており、１）ＩｇＩＶ６５℃で５分間（‘ＲＦ’法）、２）ＩｇＩＶ６５℃、３）ＩｇＩＶ６９、４）ＩｇＩＶ７６、５）ＩｇＩＶ８０、６）ＩｇＩＶ８３、７）ＩｇＩＶ８６、８）ＩｇＩＶ酸／塩基コントロール、９）ＩｇＩＶ酸、１０）ＩｇＩＶ塩基、１１）天然Gammagard ＩｇＩＶ、１２）ＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡ、１３）ＩｇＩＶ ＮａＰｉ５ｍｇ／ｍＬ、１４）ＩｇＩＶ ＮａＰｉ２０ｍｇ／ｍＬ、および１５）ＩｇＧ塩基変性，３７℃である。構造詳細に関しては、クロスベータ標準の調製および構造決定で‘実施例６〜２０の一般的物質および方法’セクション参照。図８および９では、１５形のヒトＩｇＧの構造的特徴が示されている。ＮａＯＨを加えた後３７℃で３０分間加温されたヒトγ‐グロブリン（ｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃）は、懸濁状態で大きな微粒子として現れ（図９Ｌ）、天然ＩｇＩＶと比較したときＴｒｐ蛍光の増加を示し（図８Ｆ）、調製物はＴｈＴおよびＣＲ蛍光を増強させる（図８Ａ，Ｂ）。
【０２８６】
第二実験では、マウスγ‐グロブリンの様々な調製物への精製マウスハイブリドーマＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２の濃度シリーズの結合性をｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃およびコントロール天然ＩｇＩＶ Gammagardとの結合性と比較し、同シリーズのＩｇＧ調製物へのコントロールマウスハイブリドーマＩｇＭ ２Ｇ１０との結合性と比較した。実施例１９の場合と同様のマウスＩｇＧ調製物、即ち天然ｍＩｇＧ、ｄｍＩｇＧ酸、ｄｍＩｇＧ塩基、ｄｍＩｇＧ８５℃を研究に含めた。５μｇ／ｍＬのマウスおよびヒトＩｇＧ調製物またはコントロール緩衝液をMicrolon高結合性ＥＬＩＳＡプレート（Greiner）に被覆させ、被覆後それを遮蔽試薬（Roche）で遮蔽した。ＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２およびＩｇＭ ２Ｇ１０（陰性コントロール）をＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中０／１／１０／１００μｇ／ｍＬで三重にウェルへ適用した。洗浄後、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１：５０００希釈された二次ヤギ抗マウスＩｇＭ‐ＰＯ抗体（Jackson）を用いてＩｇＭの結合性を検出した。吸光度を４５０ｎｍで読んだ。濃度シリーズのＩｇＭで非被覆ウェルについて測定されたバックグラウンドシグナル、および０μｇ／ｍＬ ＩｇＭ、但し二次抗体でＩｇＧ被覆ウェルについて得られたバックグラウンドシグナルを、ＩｇＭで覆われたＩｇＧ被覆ウェルの対応シグナルから差し引いた。
【０２８７】
結果＆考察
図２５Ａにおいて、１２．５μｇ／ｍＬのマウスハイブリドーマＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２はヒトＩｇＧ調製物１、２、３、９、１０、１１、１３および１４と全くまたはほとんど結合せず、調製物４および５と少ない程度で結合し、６、７、８および１２と中程度に結合し、ヒトＩｇＧ調製物１５（γ‐グロブリン，塩基性条件，３７℃で３０分間処理、次いでＨＣｌで生理的ｐＨへ逆にｐＨ調整）と最も良く結合することが示されている。精製７Ｈ２Ｈ２の結合性が調製物１、６、１１、１４および１５で解析されたとき、天然Octagam ＩｇＩＶ、１）ＩｇＩＶ６５℃で５分間（‘ＲＦ’法）、１１）天然Gammagard ＩｇＩＶまたは１４）ＩｇＩＶ ＮａＰｉ２０ｍｇ／ｍＬとの結合性は検出されない（図２５Ｂ）。同様に、高親和性結合がヒトＩｇＧ調製物６）２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．０中５ｍｇ／ｍＬで８３℃に加熱されたGammagard ＩｇＩＶ、および１５）３７℃で５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ塩基変性，３７℃でみられる。結合部位の数（Ｂｍａｘは各々０．６５および０．５９ａ．ｕ．である）と、結合部位の半分が占有される濃度７Ｈ２Ｈ２、即ち３．３μｇ／ｍＬ ７Ｈ２Ｈ２は双方とも、両固定ミスフォールドＩｇＧ調製物について匹敵している。調製物１５）は、ＩｇＩＶ塩基（サンプル１０）およびＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡ（サンプル１２）と類似した凝集物構造として、ＴＥＭ像で現れた。固定ヒトＩｇＧとのＩｇＭ結合性に関する陰性コントロール、ハイブリドーマＩｇＭ ２Ｇ１０は、ヒトＩｇＧ調製物といかなる親和性も示さなかった（データ示さず）。調製物６）の場合、すべての蛍光プローブが、他の全調製物と比較して、比較的高程度に、コンゴーレッドおよびチオフラビンＳの場合は最高程度に結合することが、図９からわかる。しかしながら、サンプル６）はｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化を中度に高め、一方９）および１２）はプロテアーゼ活性を強く増強する（図９Ｍ）。ＴＥＭ像の解析では、色素の蛍光増加がマルチマーサイズの増加とある程度正相関することを示した。６つの蛍光データポイント（ＣＲ、ＴｈＴ、ＴｈＳ、Ｔｒｐ、ビスＡＮＳおよびＡＮＳ）は一緒にすると７Ｈ２Ｈ２の予想結合性に関する予測力を強化する、と結論づけられる。各ＩｇＧ調製物に関するシグナルを掛け合わせてみると、サンプル６）がハイブリドーマクローンに最適のリガンドとして顕在化することを確かに予測している。ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化も考慮すると、サンプル９）および１２）への７Ｈ２Ｈ２のやや高い結合性が予想される。結論として、クロスベータ構造に親和性をもつ一連の蛍光色素、即ちＣＲ、ＴｈＴおよびＴｈＳの結合性の大きさ増加、またはタンパク質構造、即ちビスＡＮＳおよびＡＮＳ中における疎水性パッチのプローブ溶媒暴露、および蛍光強度の増加として示されるＴｒｐ残基の局所環境下における変化は、ハイブリドーマＩｇＭクローン７Ｈ２Ｈ２が高親和性で結合するかどうかを予測しうるらしい。これらの結果は明らかに、マウスがある時点で、先天性免疫応答としてまたは免疫化に用いられる４種外来クロスベータ抗原の１種以上への暴露時における適応応答として、天然フォールドＩｇＧに隠されたまたは存在しないエピトープ、即ち露出クロスベータ構造またはクロスベータ構造誘導コンホメーションに対して免疫応答を起こしたことを証明している。要約すると、我々の結果は、あるミスフォールドタンパク質または一連のミスフォールドタンパク質を選択することにより、特定のミスフォールドタンパク質に明白な特異性をもつアフィニティ領域をもたらし、クロスベータ構造またはクロスベータ媒介暴露コンホメーションのある外形と優先的に結合するように、免疫応答がマウスで誘導されることを示している。
【０２８８】
図２５Ｃでは、図２５ＡおよびＢで証明されてきたことと一致して、７Ｈ２Ｈ２が全試験濃度でｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃と結合することが示されている。１００μｇ／ｍＬでは、天然ＩｇＩＶ Gammagardとの一部結合性もみられる。これはGammagard中である割合のＩｇＩＶ凝集物の存在を反映しているか、またはこれは使用ＥＬＩＳＡプレートの変性状態を示しているのかもしれない。陰性コントロールＩｇＭ ２Ｇ１０は全く結合しなかった。図２５Ｄでは、既に１μｇ／ｍＬで７Ｈ２Ｈ２が酸変性マウスγ‐グロブリン（ｄｍＩｇＧ酸）と結合することがわかる。１０および１００μｇ／ｍＬでハイブリドーマＩｇＭが全３形のミスフォールド自己ＩｇＧと結合し、最大シグナルがｄｍＩｇＧ酸およびｄｍＩｇＧ塩基の場合１００μｇ／ｍＬで得られる。１００μｇ／ｍＬでは天然ｍＩｇＧとの一部結合性も生じる。陰性コントロールＩｇＭ ２Ｇ１０はマウスＩｇＧ調製物のいずれとも全く結合しなかった（示さず）。これらの結果から、ハイブリドーママウスＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２がミスフォールド形のヒトＩｇＧのみでなく、ミスフォールド形のマウス自己ＩｇＧとも特異的に結合することが、明らかに証明されている。これは、ハイブリドーマクローン７Ｈ２Ｈ２が選択されたマウスが、自己ＩｇＧに対する自己免疫応答を起こしたことを示している。これは、４種の異なる非ＩｇＧ、非自己ミスフォールドタンパク質、即ちヒト合成Ａβ、ニワトリＳＡＡ、ヒトＨｂＡＧＥおよび合成ヒトフィブリンフラグメントでの免疫化試験に際して生じていたのかもしれない。７Ｈ２Ｈ２がクロスベータ構造のミスフォールドマウス自己ＩｇＧと結合するという観察から、このハイブリドーマＩｇＭはリウマトイド因子抗体と命名されている。免疫化実験に際するマウスの病気および異常に多量の浸潤線維芽細胞をもつ異常肥大脾臓は、クロスベータ構造を含んでなる異なるミスフォールドタンパク質で免疫された際に誘発された自己免疫応答と関連している。
【０２８９】
組換え／合成アフィニティ領域
富化ＩｇＩＶから得られる組換え／合成アフィニティ領域の作製
本発明は、タンパク質ミスフォールディングおよびタンパク質ミスフォールディング疾患の診断および治療向けでミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域の選択のための方法および手段について開示している。アフィニティ領域は、例えば天然ヒト免疫グロブリン（即ちヒトＩＶＩｇまたはＩｇＩＶ）のような、アフィニティ領域のコンビナトリアルライブラリーから選択される。こうして得られたものに相似するアフィニティ領域は、例えば、タンパク質配列解析、ＤＮＡクローニングおよび発現技術を含めた、当業者に知られている標準技術を適用することにより、組換えまたは合成で作製される。この実施例は一態様を記載している。続くステップでは、（１）少なくとも重および軽両鎖の可変領域からまたは少なくとも相補性決定領域１‐３（ＣＤＲ）からまたは少なくとも個別単離アフィニティ領域の重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３からのアミノ酸配列を、タンパク質配列解析により得る。（２）特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を合成で作製する。タンパク質解析により決定された正確な配列の代わりとして、変化した親和性、好ましくは増加したおよび／またはより特異的な親和性をもつアフィニティ領域を作製するために、好ましくはＣＤＲ３、更に好ましくは重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３に１以上の突然変異が導入された配列も用いうる。（３）ＤＮＡを適切な発現ベクターへクローニングする。このようなベクターは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥなどを得るために、好ましくは所望型の免疫グロブリンの定常領域をコードする配列を既に含有している。（４）ベクターを選択の発現系、好ましくは哺乳動物細胞へ何らかの手法で導入する。（５）アフィニティ領域を発現する細胞を選択する。（６）組換え産生アフィニティ領域を細胞または細胞由来培養上澄から精製する。親和性を最適化するために突然変異が原アフィニティ領域配列へ導入されると、新たに作製されたアフィニティ領域が開示された方法および手段を用いて再選択されうる。好ましくは相補性決定領域、好ましくはＣＤＲ３、更に一層好ましくはＨＣのＣＤＲ３における、アフィニティ領域のレパートリーが更に増加した、半合成アフィニティ領域のこのような作製が、好ましくは半合成ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーの作製により行われる（下記参照）。
【０２９０】
組換え／合成アフィニティ領域の作製
血液から得られるＩＶＩｇのようなヒト免疫グロブリンのコレクションのほかに、コンビナトリアルライブラリーもいずれか他の一連のアフィニティ領域、好ましくは一連の組換えアフィニティ領域、例えばファージディスプレイライブラリーに存在するものから得られる（Winter et al.1994；Hoogenboom,1992,1997,2000,2002,2005）。好ましくは、このようなライブラリーは哺乳動物アフィニティ領域、好ましくはヒトアフィニティ領域、例えば免疫グロブリンに関連した配列から構成されている。好ましくは、アフィニティ領域のコレクションを含んでなるこのようなファージディスプレイライブラリーは次のように作製される（Winter et al.1994,de Kruif et al,1995a,1995b）。最初に、Ｂ細胞またはＢ細胞を含んでなる組織からＲＮＡを抽出する。その後で、ｃＤＮＡを作製する。次いで、可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅させ、適切なプラスミドベクターへクローニングし、例えばEscherichia coliの株のような適切な宿主へトランスフォームする。こうしてアフィニティ領域が発現され、即ち繊維状バクテリオファージの表面で融合タンパク質としてファージにより呈示される。ファージディスプレイライブラリーは、例えば、健康な哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、ラットまたはラマから、または代わりにミスフォールドタンパク質で免疫された哺乳動物から得られるＢ細胞から作製する。一態様において、ファージディスプレイライブラリーは、特定の疾患、好ましくはミスフォールディング疾患、例えばＲＡに罹患した哺乳動物、好ましくはヒトのＢ細胞から作製する。こうして、アフィニティ領域のコレクションが、ミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域を含むように、特別な目的で作製される。例えば、マウスを（この実施例２０の場合のように）ミスフォールドタンパク質の１種またはセレクションで１回または数回免疫し、Ｂ細胞を脾臓から単離して、ファージディスプレイライブラリーを作製するために用いる。他の例では、Ｂ細胞を特定の疾患、例えば（リウマチ様）関節炎のヒトから単離する。これらのＢ細胞から作製されたｃＤＮＡを次いで、ファージディスプレイライブラリーを作製するために用いる。こうして、ファージディスプレイライブラリーが選択ミスフォールディング疾患に関与するミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域を含むように作製される。例えば、ＩｇのＦｃドメインに関するアフィニティ領域、即ちリウマトイド因子（ＲＦ）のようなアフィニティ領域を含むライブラリーが作製される（van Esch et al.2003,Clin Exp.Immunol）。上記手法で、当業者であれば、特定の疾患または適用例に力点を置いたアフィニティ領域のコレクションを含むファージディスプレイライブラリーをデザインおよび作製することができる。
【０２９１】
レパートリーが増加したアフィニティ領域のこのようなコレクションを含むファージディスプレイライブラリーは合成でも作製される（Hoogenboom,1992,1997,2000,2002,2005；de Kruif et al,1995a,1995b）。このように、当業者であれば、顕著な追加多様性のアフィニティ領域を含んでなるライブラリーをデザインすることができる。最も顕著には、抗原と相互作用するＣＤＲ、超可変領域に追加配列を入れることにより、可変ドメインを作り直して追加のアフィニティ領域が作られる。ヒト配列から得られるアフィニティ領域のほかに、当業者であれば、ラマ、ラクダ、アルパカまたはカメリドのようないずれか他の種からアフィニティ領域のコレクションを作製して、これらの種に関連した性質を有する、ナノボディとも称される、ラマ抗体のようなアフィニティ領域を得ることができる。こうして、ファージディスプレイライブラリーおよび／またはアフィニティ領域のコレクションが多くの手法で、好ましくは１種または一連のミスフォールドタンパク質で免疫された哺乳動物から作製される。特に好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリーおよび／またはアフィニティ領域のコレクションが、疾患、好ましくはミスフォールディング疾患の哺乳動物から作製される。ミスフォールドタンパク質に特異的なアフィニティ領域は、ファージを単離するための標準操作と組み合わせて、開示された手段および方法を用いてファージディスプレイライブラリーから選択される。最も率直には、好ましい態様において、好ましくはこの出願で開示された操作のいずれか１つに従い、ミスフォールドタンパク質を作製および固定し、その後でファージと結合させる。徹底洗浄後、結合ファージを回収し、宿主の再感染により増幅させる。特異的ファージのみの回収を行うために、選択操作を好ましくは数回繰り返す。最後に、ミスフォールド標的と特異的に結合しうるファージを単離する。一方、ミスフォールドタンパク質を疾患の個体または個体の組合せから得られた組織サンプルから単離する。例えば、ミスフォールドタンパク質は、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質と特異的に結合しうるタンパク質、例えば（リウマチ様）関節炎の患者の滑液からのｔＰＡ、ＲＡＧＥまたはその機能相当物（表４参照）を用いて単離する。同様に、いずれか他のサンプルもとりうる。
【０２９２】
上記のようなアプローチを用いて、ミスフォールドタンパク質に関して組換え産生されたアフィニティ領域が得られる。
【０２９３】
適切なファージの選択後、単離アフィニティ領域の可変領域をコードするＤＮＡを、好ましくは完全抗体を作製するためにファージミドＤＮＡから単離する。これは標準操作に従い当業者により容易に行われる。好ましくは重および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡへベクターをクローニングする。いかなるベクターおよびいかなる望ましいタイプの定常領域も用いられる。ベクターを選択の発現系、好ましくは哺乳動物細胞へいずれか公知の手法で導入する。アフィニティ領域を発現する細胞を選択する。組換え産生されたアフィニティ領域を、好ましくは細胞または細胞由来培養上澄から精製する。こうして、ミスフォールドタンパク質に関するいかなる免疫グロブリンアフィニティ領域も作製される（Bloemendal et al 2004；Huls et al 1999a,1999b；Boel et al 2000）。
【０２９４】
“キメラ”または“ヒト化”組換えアフィニティ領域の作製
ヒトで使用の場合は、非ヒト配列が可能であればどこでもヒト配列と置き換えられ、アフィニティ領域の結合性が好ましくは過度に影響されないように、他の種から得られたアフィニティ領域を好ましくは修飾する。好ましくはマウスまたはラットを用いる、更に一層好ましくはヒト免疫グロブリンをコードするトランスジェニックマウスを用いる、古典的免疫化戦略に際してもアフィニティ領域が作製される。免疫化後、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系が、標準操作により、または上記のファージディスプレイ技術を適用することにより作製される。ミスフォールドタンパク質と特異的に相互作用しうるモノクローナル抗体が選択される。このようなアフィニティ領域の“キメラ”または“ヒト化”バージョンは、正常マウスまたはラットを用いて作製されるとき、例えば非ヒト定常領域および関連非ヒト可変領域を関連ヒト相同性領域で置き換えることにより作製される（Morrison et al 1984；Jones et al.1986）。更に、所望であれば異なる定常領域が導入される。
【０２９５】
実施例１〜２０に基づく要旨
好ましくはミスフォールドタンパク質または一連のミスフォールドタンパク質と関連する特定の疾患または健康問題に特異的な、１種または一連のミスフォールドタンパク質に関して富化されたアフィニティ領域を選択するための操作
実施例１〜９において、我々は、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質を含有したアフィニティマトリックスの使用で、ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質と優先的、選択的にかつ高親和性で結合しうる、選択に用いられる一連のアフィニティ領域に必ずしも含まれていなかったアフィニティ領域が、アフィニティ領域のいずれかの組成物から選択されることを証明した。クロスベータ構造を含んでなる選択ミスフォールドタンパク質が固定された固体支持体の使用で、我々が事実上いかなるミスフォールドタンパク質とも親和性を有するアフィニティ領域をアフィニティ領域のコレクションから単離しうることを、実施例は証明した。ＨｂＡＧＥ‐、ｄＨＳＡ‐、Ａβフィブリル‐およびｄＩｇＩＶ‐マトリックスで、我々はｄＨＳＡ、Ａβフィブリル、Ａβ非フィブリル凝集物、ｄＯＶＡ、ＢＳＡ‐ＡＧＥ、Ｈｂ‐ＡＧＥ、ミスフォールドマウスＩｇＧ、シトルリン化ペプチド／タンパク質、ＡｐｏＡ‐ＩおよびｏｘＬＤＬと結合するアフィニティ領域を選択した。富化ＩｇＩＶ組成物に関するリガンドのこのリストの多数メンバーが、例えばＡβ（アルツハイマー病）、ｏｘＬＤＬおよびＡｐｏＡ‐Ｉ（アテローム性動脈硬化症、アミロイドーシス）、グリケート化タンパク質（アミロイドーシス、最終段階腎臓疾患、糖尿病、ＲＡ）、ミスフォールドＩｇＧ、シトルリン化タンパク質（ＡＬアミロイドーシス、ＲＡ）のようなタンパク質ミスフォールディング疾患の病理に関与している。
【０２９６】
加えて、フィブリル外形のミスフォールドタンパク質およびフィブリル特徴を欠くミスフォールドタンパク質凝集物の双方で、クロスベータ構造を含んでなるミスフォールドタンパク質に広範囲特異性を示すアフィニティ領域が選択されることを、我々は示した。Ａβフィブリル‐アフィニティマトリックスで、例えばミスフォールドＢＳＡ‐ＡＧＥの非フィブリルマルチマー、ＡβおよびｄＯＶＡの凝集物に特異性を示すアフィニティ領域が選択された。他方、非フィブリルＨｂＡＧＥ‐マトリックスまたは非フィブリルミスフォールドＩｇＩＶ‐マトリックスの使用で、Ａβフィブリルと効率的に結合するアフィニティ領域が選択された。
【０２９７】
ウシ血清アルブミン‐ＡＧＥ‐マトリックスの使用で、ヒトＡβ、ヒトアルブミンおよびニワトリオボアルブミンと親和性をもつアフィニティ領域が証明された。ヒトＡβ‐マトリックスの使用で、グリケート化ウシ血清アルブミンおよびニワトリオボアルブミンと結合するアフィニティ領域が選択された。グリケート化ヒトＨｂ‐マトリックスで、ミスフォールドマウスＩｇＧと結合するアフィニティ領域が選択された。これらのデータは、１種に由来するミスフォールドタンパク質で、他種に由来するミスフォールドタンパク質に親和性を有するヒトアフィニティ領域が選択されることを示している。
【０２９８】
結論として、我々は、ヒトＩｇＩＶアフィニティ領域のコレクションから、様々な種に由来する広範囲のタンパク質に結合性を示す、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４イソタイプを産生する少なくとも４種の異なるＢ細胞クローンに由来するアフィニティ領域の選択が行われたことを証明したが、ここで該タンパク質は実質的アミノ酸配列相同性も、類似のアミノ酸配列長さも、それらの天然フォールドで重複または類似３Ｄ構造も有しないが、それらはミスフォールドタンパク質と共通した構造的特徴を有する。この構造的特徴は、リシンおよびアルギニン残基のグリケーション、アルギニンのシトルリン化、アミノ酸側鎖の酸化と、すべて様々なタンパク質濃度における低ｐＨ、高ｐＨ、熱、炭水化物への暴露の組合せに決して限定されないが、例えばそれらのような様々な手段により、タンパク質構造へ導入される。ミスフォールドタンパク質および／またはクロスベータ構造を含んでなるタンパク質に特異性を有する選択されたアフィニティ領域は、様々な適用例に有用である。以下では、タンパク質ミスフォールディング疾患に対する療法に用いられる富化アフィニティ領域が更に詳細に記載されている。
【０２９９】
開示された手段および方法によれば、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患の療法および／または診断で適用しうるアフィニティ領域の選択を可能にする。好ましい操作の一般的特徴の概略が図２６で示されている。選択のいかなるミスフォールドタンパク質（ミスフォールドームを表わす図２６のミックスＸおよびＹ）もアフィニティ領域を選択するために用いられる上で適するが、好ましくは疾患に関連したミスフォールドタンパク質（図２６のミックスＡ）が用いられる。ミスフォールドタンパク質は一般的に共通特性を有しているため、２種以上の特定ミスフォールドタンパク質と結合するアフィニティ領域が選択されることになる。しかしながら、この出願で開示されているように、ミスフォールドタンパク質のサブセットまたはまさに単一タイプと優先的に結合するアフィニティ領域も選択しうる。一連のカラムを組み合わせることにより、当業者であれば、一般的にミスフォールディングの療法および／または診断に適用しうる、または選択のミスフォールドタンパク質が関与する特定の疾患または一連の疾患へ優先的に適用しうる、アフィニティ領域を選択することができる。図２６で示されているように、カラムＩ（疾患と必ずしも関連しないミスフォールドタンパク質のミックス）の適用は、一般的なミスフォールドタンパク質、即ちミスフォールドームに親和性をもつアフィニティ領域（調製物１）をもたらす。このようなアフィニティ領域は診断と療法でも使用に適する。しかしながら、疾患関連ミスフォールドタンパク質（望ましい治療効果）のみならず存在する他のミスフォールドタンパク質（療法の予測不能な副作用）とも結合するアフィニティ領域が患者に導入されるという事実のせいで、療法目的にこのようなアフィニティ領域の使用は副作用の潜在的リスクを伴う。カラムＩおよびIII、更に好ましくはカラムIIおよびIVを組み合わせることにより、疾患または一連の疾患に特異的なミスフォールドタンパク質と優先的に相互作用するアフィニティ領域を当業者は選択する。カラムIVは、選択の標的疾患と関連しないミスフォールドタンパク質と相互作用しうるアフィニティ領域を除去するために用いられる。このように、調製物３および４は特定療法目的に優先的に選択される。
【０３００】
【表１】
2009529657.tif 000002
【０３０１】
【表２】
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【０３０２】
【表３】
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【０３０３】
【表４】
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【０３０４】
【表５】
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【０３０５】
【表６】
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【０３０６】
【表７】
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【０３０７】
【表８】
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【０３０８】
【表９】
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【０３０９】
【表１０】
2009529657.tif 000013
【０３１０】
【表１１】
2009529657.tif 000014
【０３１１】
参考文献
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【０３１２】
【図１】ヒトＩｇＩＶはミスフォールドグリケート化タンパク質と特異的に結合する  ＥＬＩＳＡセッアップにおいて、２製造業者ＩおよびIIから得られた治療向けヒトＩｇＩＶの結合性が、固定グリケート化タンパク質で評価された。Ａ．被覆グリケート化ヒトヘモグロビン（Ｈｂ‐ＡＧＥ）、新鮮溶解Ｈｂおよび凝集アミロイド‐βペプチド（Ａβ）への製造業者ＩからのＩｇＩＶ（ＩｇＩＶ（Ｉ））の結合性が試験された。Ｂ．被覆Ｈｂ‐ＡＧＥ、新鮮溶解Ｈｂおよび凝集Ａβへの製造業者IIからのＩｇＩＶ（ＩｇＩＶ（II））の結合性が試験された。Ｃ．被覆グリケート化アルブミン(ＢＳＡ‐ＡＧＥ)、新鮮溶解コントロールアルブミンおよびＦＰ１３Ｋ１５７ＧアミロイドへのＩｇＩＶ（Ｉ）の結合性が解析された。Ｄ．被覆Ｈｂ‐ＡＧＥへの１５μｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）の結合性に及ぼすｔＰＡおよびＫ２Ｐ ｔＰＡの影響が、濃度シリーズのｔＰＡまたはＫ２Ｐ ｔＰＡをＩｇＩＶ（Ｉ）インキュベート混合物へ加えることにより取り扱われた。露出リシンまたはアルギニン側鎖へのｔＰＡの結合を避けるために、結合１０ｍＭのεＡＣＡが混合物へ加えられた。
【図２】アミロイド様コンホメーションのミスフォールドグリケート化タンパク質により誘導される血小板凝集はＩｇＩＶおよびモノクローナル抗体の混合物により阻害される  コラーゲンまたはＴＲＡＰ（陽性コントロール）、緩衝液（陰性コントロール）またはミスフォールドアミロイド様グリケート化アルブミンまたはヘモグロビンの導入後における血小板凝集が、ＨＥＰＥＳ‐Tyrode緩衝液中の新鮮採取加クエン酸血漿からの単離血小板を用いて、凝集計で追跡された。血小板凝集に及ぼす、ヒトＩｇＩＶおよび４種の異なるアミロイド構造に対するネズミモノクローナル抗体の提示阻害性が評価された。Ａ．製造業者Ｉから購入されたＩｇＩＶは、ヒトドナー‘Ａ’の血小板のグリケート化ヘモグロビン誘導凝集を効果的に阻害する。ＩｇＩＶ（Ｉ）自体は血小板に影響を有しない、即ちＩｇＩＶ（Ｉ）を血小板へ加えても凝集が誘導されない。用いられたＩｇＩＶ（Ｉ）濃度は４．７ｍｇ／ｍＬであり、Ｈｂ‐ＡＧＥ濃度は１８μｇ／ｍＬであり、コラーゲンは１０μｇ／ｍＬの濃度で用いられた。Ｂ．ドナーＡの血小板の凝集に及ぼす、１０μｇ／ｍＬコラーゲン、１８μｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥ、４．７ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）および４．７ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）とプレインキュベートされた１８μｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥの影響が調べられた。Ｃ．ドナーＡの血小板で行われた実験（Ａ．）と同様に、ドナー‘Ｂ’の血小板による血小板凝集が経時的に追跡された。今回は、１０μｇ／ｍＬコラーゲン、９０μｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥ、４．７ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）および４．７ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）とプレインキュベートされた９０μｇ／ｍＬ Ｈｂ‐ＡＧＥが用いられた。Ｄ．ドナー‘Ｃ’の血小板でのコントロール実験では、５μＭ ＴＲＡＰを陽性コントロールとして用いた。クロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質に親和性をもつ５種モノクローナル抗体の混合物１００μｇ／ｍＬの影響が、凝集のアクチベーターとしてＴＲＡＰまたはＨＥＰＥＳ‐Tyrode緩衝液コントロールで調べられた。Ｅ．、Ｆ．血小板凝集（ドナーＣ）が２５μｇ／ｍＬグリケート化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ‐ＡＧＥ，Ｅ．）またはグリケート化ヒトヘモグロビン（Ｈｂ‐ＡＧＥ，Ｆ．）により誘導された。クロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質に親和性をもつ５種モノクローナル抗体の２５または１００μｇ／ｍＬ混合物によるこの凝集の影響が調べられた。
【図３】血小板凝集はアミロイド‐βにより誘導され、ＩｇＩＶまたはモノクローナル抗体により阻害される  Ａ．、Ｂ．５０μｇ／ｍＬアミロイド‐βによる血小板凝集の誘導は、２．５ｍｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）がアミロイド‐βとプレインキュベートされたとき（Ａ．）、またはミスフォールドタンパク質と結合する５種モノクローナル抗体の１６０μｇ／ｍＬ混合物がアミロイド‐βとプレインキュベートされたとき（Ｂ．）に阻害される。ドナーＤおよびＥ２例の血小板が別々に解析されている。
【図４】アミロイド特異的小化合物は固定ミスフォールドタンパク質へのＩｇＩＶまたはｔＰＡの結合性に異なる影響を及ぼす  ＥＬＩＳＡセッアップにおいて、クロスベータ構造三次／四次フォールドを含んでなるミスフォールドタンパク質に親和性をもつマルチリガンド結合タンパク質、ＩｇＩＶまたはｔＰＡの結合性が、アミロイド特異的色素コンゴーレッドおよびチオフラビンＴの濃度シリーズの影響下で解析された。Ａ‐Ｃ．固定Ｈｂ‐ＡＧＥへの１５μｇ／ｍＬ ＩｇＩＶ（Ｉ）の結合性に及ぼすアミロイド特異的色素コンゴーレッド（Ａ．）、チオフラビンＴ（Ｂ．）およびチオフラビンＳ（Ｃ．）の影響が、溶液をＥＬＩＳＡプレートへ加える前に３種色素の濃度シリーズとＩｇＩＶ（Ｉ）をプレインキュベートすることにより取り扱われた。Ｄ．、Ｆ．被覆ＢＳＡ‐ＡＧＥ（Ｄ.）またはＡβ（Ｆ.）への準最適濃度のｔＰＡの結合性に及ぼすコンゴーレッドの影響。Ｅ．、Ｇ．被覆ＢＳＡ‐ＡＧＥ（Ｅ.）またはＡβ（Ｇ.）への準最適濃度のｔＰＡの結合性に及ぼすチオフラビンＴの影響。
【図５】クロスベータ構造コンホメーションのミスフォールドタンパク質と結合するタンパク質と結合しうる能力をもつアフィニティマトリックス  グリケート化およびミスフォールドヒトヘモグロビンがＣＮＢｒ‐セファロースへ結合され、クロスベータ構造フォールドを含んでなるミスフォールドタンパク質に親和性をもつタンパク質と結合しうる能力がｔＰＡ結合性を解析することにより調べられた。次いで、クロスβ構造および／またはクロスβ構造を含んでなるタンパク質へのアフィニティ領域を含んでなるＩｇＩＶ‐Ｉからの免疫グロブリン分子のサブセットを単離するために、アフィニティマトリックスが適用された。Ａ．Ｈｂ‐ＡＧＥセファロースおよび空のコントロールビーズが６μＭ ｔＰＡ溶液とインキュベートされ、その後でｔＰＡクロモゲン基質Ｓ２７６５を加えることによりｔＰＡ活性の存在について上澄が解析された。Ｂ．ｔＰＡとのインキュベート後、Ｈｂ‐ＡＧＥセファロースおよびコントロールビーズが洗浄緩衝液で数回洗浄された。第一洗浄溶出物中ｔＰＡの存在が再び３７℃で経時的にｔＰＡ基質Ｓ２７６５変換を追跡することにより解析された。Ｃ．徹底洗浄後、結合ｔＰＡが空のコントロールセファロースビーズおよびＨｂ‐ＡＧＥセファロースから高塩で溶出された。Ｓ２７６５を加えることによりｔＰＡの存在について１０倍希釈溶出物が解析された。Ｄ．ＡＤＶ０１で染色された希釈ＩｇＩＶストック（Octagam）の５９０ｎｍにおける吸光度の標準曲線。Ｅ．ＥＬＩＳＡで調べられるような、Ｈｂ‐ＡＧＥへのＩｇＩＶストック（Octagam）の希釈シリーズの結合性の標準曲線。Ｆ．ＥＬＩＳＡで評価されるような、１０００倍希釈ＩｇＩＶストック、Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースと接触後のＩｇＩＶおよびコントロールマトリックスと接触後のＩｇＩＶの固定Ｈｂ‐ＡＧＥとの結合性。Ｇ．ＥＬＩＳＡで評価されるような、Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースから溶出されたＩｇＩＶおよびコントロールマトリックスから溶出されたＩｇＩＶの固定Ｈｂ‐ＡＧＥとの結合性。ＩｇＩＶストック結合曲線から計算されるような、相対数としてシグナルが示されている（図Ｅ参照）。Ｈ．ＥＬＩＳＡで調べられるような、熱変性ＢＳＡへの希釈シリーズのＩｇＩＶストック（Octagam）の結合性の標準曲線。Ｉ．ＥＬＩＳＡで評価されるような、１０００倍希釈ＩｇＩＶストック、Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースと接触後のＩｇＩＶおよびコントロールマトリックスと接触後のＩｇＩＶの固定熱変性ＢＳＡとの結合性。Ｊ．ＥＬＩＳＡで評価されるような、Ｈｂ‐ＡＧＥ‐セファロースから溶出されたＩｇＩＶおよびコントロールマトリックスから溶出されたＩｇＩＶの固定熱変性ＢＳＡとの結合性。ＩｇＩＶストック結合曲線から計算されるような、相対数としてシグナルが示されている（図Ｈ参照）。
【図６】グリケーションによるミスフォールドアルブミン（ＢＳＡ‐ＡＧＥ）およびヘモグロビン（ＨｂＡＧＥ）のＴＥＭ解析  像は、ＢＳＡ‐ＡＧＥ（Ａ．）およびＨｂＡＧＥ（Ｂ．）が非フィブリル無定形凝集物を形成することを示している。
【図７】Octagram ＩｇＩＶのミスフォールディングはクロスベータ構造を誘導する  Ａ‐Ｅ．１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ８．１中１ｍｇ／ｍＬ（Ａ）、２．５ｍｇ／ｍＬ（Ｂ）、５ｍｇ／ｍＬ（Ｃ）、１０ｍｇ／ｍＬ（Ｄ）および２０ｍｇ／ｍＬ（Ｅ）におけるミスフォールドＩｇＩＶ OctagramのＴＥＭ解析。Ｆ．ミスフォールドOctagram ＩｇＩＶのチオフラビンＴ解析。変性の異なる条件が異なるＴＥＭおよびチオフラビンＴ特性のミスフォールドタンパク質をもたらすことがわかる。
【図８】Gammagard ＩｇＩＶのミスフォールディングはクロスベータ構造を誘導する  様々なミスフォールドＩｇＩＶ Gammagard調製物のチオフラビンＴ（Ａ）、コンゴーレッド（Ｂ）、ＡＮＳ（Ｃ）、Ｂｉｓ‐ＡＮＳ（Ｄ）およびチオフラビンＳ（Ｅ）蛍光。Ｆ．３７５ｎｍの蛍光強度が２８３ｎｍで励起時に測定されたときの、様々なミスフォールドＩｇＩＶ Gammagard調製物のトリプトファン蛍光。
【図９Ａ】Gammagard ＩｇＩＶのミスフォールディングは、ｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化しうる能力に伴い、凝集を誘導する  Ａ．天然ＩｇＩＶ Gammagardと、様々な形のミスフォールドＩｇＩＶ Gammagard、即ちＢ．ＩｇＩＶ ＲＦ、Ｃ．ＩｇＩＶ６５、Ｄ．ＩｇＩＶ６９、Ｅ．ＩｇＩＶ７６、Ｆ．ＩｇＩＶ８０、Ｇ．ＩｇＩＶ８３Gammagard、Ｈ．ＩｇＩＶ８６、Ｉ．ＩｇＩＶ酸およびＪ．ＩｇＩＶ塩基、Ｋ．ＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡ、Ｌ．ｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃のＴＥＭ解析、Ｍ．１００μｇ／ｍＬの最終濃度で様々な変性ＩｇＩＶ Gammagard調製物への暴露時におけるｔＰＡ媒介プラスミン生成。４０μｇ／ｍＬにおけるｄＯＶＡの補因子刺激が任意に１００％に設定された。
【図９Ｂ】Gammagard ＩｇＩＶのミスフォールディングは、ｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化しうる能力に伴い、凝集を誘導する  Ａ．天然ＩｇＩＶ Gammagardと、様々な形のミスフォールドＩｇＩＶ Gammagard、即ちＢ．ＩｇＩＶ ＲＦ、Ｃ．ＩｇＩＶ６５、Ｄ．ＩｇＩＶ６９、Ｅ．ＩｇＩＶ７６、Ｆ．ＩｇＩＶ８０、Ｇ．ＩｇＩＶ８３Gammagard、Ｈ．ＩｇＩＶ８６、Ｉ．ＩｇＩＶ酸およびＪ．ＩｇＩＶ塩基、Ｋ．ＩｇＩＶ ＨＦＩＰ／ＴＦＡ、Ｌ．ｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃のＴＥＭ解析、Ｍ．１００μｇ／ｍＬの最終濃度で様々な変性ＩｇＩＶ Gammagard調製物への暴露時におけるｔＰＡ媒介プラスミン生成。４０μｇ／ｍＬにおけるｄＯＶＡの補因子刺激が任意に１００％に設定された。
【図１０】Ａβ調製物のＴｈＴ、コンゴーレッドおよびＡＮＳ解析
【図１１】ＡβのＴＥＭ解析  Ａ．Ａβ４０ｔ＝０、Ｂ．Ａβ４０ＨＣｌ、Ｃ．ｆＡβ４０（即ち、１６８時間保存）、Ｄ．Ａβ４２ｔ＝０、Ｅ．Ａβ４２ＨＢＳおよびＦ．ｆＡβ４２（即ち、３７℃で２４時間ＨＣｌ処理）
【図１２】ＨＳＡ構造の解析  天然および変性ＨＳＡのチオフラビンＴ蛍光（Ａ）と、天然ＨＳＡ（Ｂ）および１ｍｇ／ｍＬ（Ｃ）、２．５ｍｇ／ｍＬ（Ｄ）、５ｍｇ／ｍＬ（Ｅ）、１０ｍｇ／ｍＬ（Ｆ）または２０ｍｇ／ｍＬ（Ｇ）で変性されたＨＳＡのＴＥＭ解析
【図１３】ミスフォールドマウスＩｇＧによるＴｈＴおよびＣＲの蛍光増強  熱変性マウスＩｇＧ（ｄｍＩｇＧ８５℃）、酸変性マウスＩｇＧ（ｄｍＩｇＧ酸）、塩基変性マウスＩｇＧ（ｄｍＩｇＧ塩基）および天然マウスＩｇＧ（ｎｍＩｇＧ）のチオフラビンＴ（Ａ）およびコンゴーレッド（Ｂ）蛍光。用いられたマウスＩｇＧ調製物はマウスγ‐グロブリンの組成物である。
【図１４】ヒトＡｐｏＡ‐Ｉの構造解析  （Ａ）ＴｈＴ蛍光、（Ｂ）コンゴーレッド蛍光、（Ｃ）Ａ２８０ｎｍタンパク質測定、（Ｄ）ｔＰＡ／プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）活性化アッセイおよび（Ｅ）固定ＡｐｏＡ‐ＩおよびＨｂＡＧＥへのフィブロネクチンＦ４‐５‐ＦＬＡＧ‐Ｈｉｓの結合性（陽性コントロール）。コントロール緩衝液被覆ウェルで得られたバックグラウンドシグナルが、固定タンパク質において対応Ｆｎ Ｆ４‐５希釈シリーズで得られたシグナルから差し引かれる。ミスフォールドＡｐｏＡ‐Ｉ ａ〜ｃ：ａ＝天然ＡｐｏＡ‐Ｉストックへ１００ｍＭの最終濃度までＮａＯＨを加えた後３７℃で３０分間インキュベート；加温後１００ｍＭの最終濃度までＨＣｌの添加；ｂ＝ａと同様だが、７５℃に加熱；ｃ＝ａ、ｂと同様だが、今回は１００℃に加熱。（Ｆ）。Ａと同様に、ＡｐｏＡ‐Ｉ調製物およびＨｂＡＧＥへのｔＰＡ結合性。明確化のために、２セグメントｙ軸が示されているが、ｔＰＡおよびＡｐｏＡ‐Ｉ調製物で得られた絶対シグナルがＨｂＡＧＥで得られたシグナルより実質的に低いからである。
【図１５】マトリックスへカップリングされた指定のミスフォールドクロスベータタンパク質を用いて富化されたアフィニティ領域のミスフォールドＢＳＡ‐ＡＧＥとの増強結合性  図中、マトリックスに固定されたミスフォールドタンパク質が示されている。‘ＦＴ’，アフィニティマトリックスフロースルー；‘ＥＬ’，アフィニティマトリックス溶出物、または指定のミスフォールドタンパク質に結合されたアフィニティ領域の溶出後における回収フラクション。１の富化ファクター箇所における実線は、例えばこの実例では、ＢＳＡ‐ＡＧＥへのアフィニティ領域の結合性に関する枯渇または富化間の境界を示している。
【図１６】ＩｇＩＶをミスフォールドクロスベータＢＳＡ‐ＡＧＥアフィニティマトリックスと接触させた後におけるミスフォールドクロスベータタンパク質への富化および枯渇ＩｇＩＶの結合性  Octagam ＩｇＩＶがＢＳＡ‐ＡＧＥセファロースとインキュベートされた。フロースルー（ＦＴ）フラクションの一部がＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性についてＥＬＩＳＡで試験され、残留ＦＴが新鮮量のＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスへ再び適用された（Ａ）。溶出物フラクションＥが集められ、ＢＳＡ‐ＡＧＥとの結合性についてＥＬＩＳＡで同様に試験された（Ｂ）。富化ファクターが、Octagam ＩｇＩＶ出発物質と比較した、ミスフォールドタンパク質への結合性／質量単位として示されている。連続結合ステップに際してＢＳＡ‐ＡＧＥ結合Ｉｇ分子がOctagamプールから更に単離され、連続ＦＴフラクションで富化ファクターの減少をもたらす。ＢＳＡ‐ＡＧＥマトリックスへ特異的に結合されたＩｇ分子がアフィニティマトリックスから溶出される（溶出物，Ｅ）。ＦＴおよび溶出物フラクションの富化ファクターがＡβ（ＣおよびＤ）、ｄＯＶＡ（ＥおよびＦ）およびＨｂＡＧＥ（ＧおよびＨ）でも調べられた。
【図１７】ＥＬＩＳＡで解析された、フィブリンを含めたクロスベータコンホメーションの様々なタンパク質へのOctagam ＩｇＩＶの結合性  Ａ‐Ｄ．固定Ｈｂ‐ＡＧＥ（Ａ．，陽性コントロール）、ｄＯＶＡ（Ｂ．）、フィブリン（Ｃ．）とＡβ１‐４０およびＡβ１‐４２（Ｄ．）へのOctagam ＩｇＩＶの結合性を示すＥＬＩＳＡ。Ｅ．フィブリンへのｔＰＡの結合性（Ｃ．の陽性コントロール）
【図１８】様々なミスフォールドヒト血漿アポリポタンパク質Ａ‐Ｉ調製物への様々なＩｇＩＶ調製物の結合性  Ａ．ＥＬＩＳＡにおいて、固定天然ＡｐｏＡ‐Ｉと、ＮａＯＨを１００ｍＭの最終濃度まで加えてから３７℃、７５℃または１００℃で３０分間のインキュベートによりミスフォールドされたＡｐｏＡ‐ＩへのOctagam ＩｇＩＶの結合性が評価された。１００℃で加熱されたＡｐｏＡ‐Ｉでは結合性がみられない。Ｂ．Ａと同様のＥＬＩＳＡ，マトリックスをOctagam ＩｇＩＶと接触させた後にＨｂＡＧＥ‐アフィニティマトリックスから回収された枯渇ＩｇＩＶフロースルー。再び、１００℃で加熱されたＡｐｏＡ‐Ｉでは結合性がみられない。Ｃ．Ａ．およびＢ．と同様のＥＬＩＳＡ，ＨｂＡＧＥ‐アフィニティマトリックスをOctagam ＩｇＩＶと接触させた後における富化ＩｇＩＶ溶出物
【図１９】ミスフォールドＩｇＩＶによるコンゴーレッドおよびチオフラビンＴ蛍光増強、ｔＰＡ結合性およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化  ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ８．１中６５℃またはＨＣｌ ｐＨ２中６５℃で６時間にわたり、ＩｇＩＶが漸増濃度で熱変性された。コンゴーレッド（Ａ）およびチオフラビンＴ蛍光増強（Ｂ）が測定された。コンゴーレッド蛍光は１ｍｇ／ｍＬで変性されたＩｇＩＶで試験されなかった。天然ＩｇＩＶと、１ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬで加熱された熱変性ミスフォールドＩｇＩＶによるｔＰＡ／プラスミノーゲンの活性化が、プラスミンのクロモゲン基質を用いて調べられる、Ｃ．最大プラスミン活性が、指示濃度でミスフォールドされた加熱ＩｇＩＶで調べられた。Ｄ．ＮａＰｉ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬでミスフォールドされたＩｇＩＶにより誘導されたプラスミン活性を示す代表的グラフ。Ｅ．Ａβ４０ｔ＝０およびミスフォールドＩｇＩＶへのｔＰＡの結合性
【図２０】ｏｘＬＤＬによるヒト血小板の凝集がＩｇＩＶにより阻害される；非富化出発物質およびミスフォールドＨｂＡＧＥ‐アフィニティマトリックスへのＩｇＩＶの暴露後にフロースルーとして集められた枯渇ＩｇＩＶと比較された、ｏｘＬＤＬへの富化ＩｇＩＶの親和性  Ａ．ｏｘＬＤＬ誘導血小板凝集に及ぼすＩｇＩＶの影響。ＴＲＡＰにより誘導される凝集が最大であり、任意に１００％に設定される。濃度シリーズのＩｇＩＶの影響が、血小板懸濁物への添加および凝集実験の開始前に、天然ＬＤＬコントロールまたはｏｘＬＤＬをＩｇＩＶとプレインキュベートすることにより評価される。Ｂ．〜Ｄ．ＥＬＩＳＡ：Octagam ＩｇＩＶ（Ｂ．）、ＨｂＡＧＥ‐マトリックスへ固定されたアフィニティ領域から枯渇されたＩｇＩＶ（Ｃ．）、およびＨｂＡＧＥ‐アフィニティマトリックスを適用することにより富化されたＩｇＩＶ（Ｄ．）の固定ＢＳＡ‐ＡＧＥへの結合性。Ｅ．〜Ｇ．は同様の３種指定アフィニティ領域ストックのｏｘＬＤＬとの結合性を示す。Ｅ．出発物質，Octagam ＩｇＩＶ、Ｆ．クロスベータタンパク質および／またはタンパク質中クロスベータ誘導コンホメーションに親和性をもつアフィニティ領域から枯渇されたＩｇＩＶ、およびＧ．ｏｘＬＤＬへの富化ＩｇＩＶの結合性。可能であれば、実験で比較可能な品質尺度を得るためにｋＤ値が計算される。ミスフォールドＨｂＡＧＥマトリックスを用いて、ｏｘＬＤＬへのＩｇＩＶの結合性および富化ＩｇＩＶの結合性に関して得られたｋＤ間の比率は２７であり、これは指定の操作で得られた富化ファクターがミスフォールドＡｐｏＢ１００へのアフィニティ領域の結合性に関して２７であることを示している。
【図２１】インビボマウス出血時間アッセイにおいて出血時間に及ぼすクロスベータ構造結合化合物ＩｇＩＶおよびＨＧＦＡ Ｆの影響  Ａ．マウス尾切除アッセイにおいて、ＨＧＦＡ Ｆ（約２３４μｇ／ｍＬ最終濃度）およびＩｇＩＶ（約２．５ｍｇ／ｍＬ最終濃度）は双方とも出血時間を有意に延ばす。緩衝液（ＰＢＳ）が出血時間のリファレンスとして用いられた。１０ ＩＥヘパリン／マウスが長時間出血時間の陽性コントロール群に用いられた。計算平均出血時間およびエラーバーが示されている。Ｂ．Ａ．で示されているような平均データが、測定出血時間の分布に関する洞察を与えるために、今回は分散プロットで示されている。注記：２０分間を超える出血時間は２０分間に設定され、出血が能動的に止められ、加えて、２００μＬ超の失血をもたらす過剰出血も２０分間の出血時間に設定され、出血が能動的に止められた（両操作は地元の倫理委員会により承認されたプロトコールに従っている）。
【図２２】ミスフォールドタンパク質への細胞の接着および富化アフィニティ領域での調節  Ａ．ＥＣはゼラチン（任意に１００％に設定）またはＢＳＡ‐ＡＧＥで前被覆された培養プレートのウェルと結合する。Octagam ＩｇＩＶが細胞懸濁物で滴定されたとき、グリケート化アルブミンへの接着が用量依存的に阻害される。接着の同様な阻害がヒトＲＡＧＥの組換え可溶性フラグメントでみられる。Ｂ．ＥＣは同濃度で被覆された天然ＩｇＩＶよりも優先的に富化ＩｇＩＶと結合する。接着の陽性コントロールはゼラチン（１００％に結合性設定）またはＢＳＡ‐ＡＧＥである。陰性コントロールはタンパク質で全く被覆されなかった細胞培養プレートへの細胞の接着である（０％接着）。
【図２３】富化ＩｇＩＶを用いたミスフォールドタンパク質から溶液の枯渇  Ａ〜Ｂ．固体支持体、即ちＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定された富化ＩｇＩＶアフィニティ領域を用いることによる、タンパク質溶液からミスフォールドｄＯＶＡ（Ａ.）およびＨｂＡＧＥ（Ｂ.）の抽出。陰性コントロール：固体支持体に固定されたＨＳＡ
【図２４】様々な形のミスフォールドマウスＩｇＧへの富化ヒトＩｇＩＶおよびOctagam ＩｇＩＶの結合性  Ａ．ミスフォールドマウスＩｇＧへの富化ヒトＩｇＩＶの結合性が固定マウスＩｇＧ調製物での直接ＥＬＩＳＡで評価された。Ｂ．第二アプローチでは、第一の抗マウスＩｇＧ抗体が９６ウェルプレートのウェルに被覆され、次いで様々なマウスＩｇＧ調製物と結合され、濃度シリーズのOctagamヒトＩｇＩＶで覆われた。
【図２５】様々な形のミスフォールドヒトγ‐免疫グロブリンおよびマウス自己γ‐グロブリンへのマウスハイブリドーマＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２の結合性  様々な形のミスフォールドヒトＩｇＧ調製物へのマウスハイブリドーマＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２の結合性がＥＬＩＳＡで評価された。Ａ．ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中１２．５μｇ／ｍＬの７Ｈ２Ｈ２ ＩｇＭが、‘実施例６〜２０の一般的物質および方法’セクションで示されているように、１５種の異なるヒトＩｇＧ調製物との結合性について試験された。Ｂ．第二の実験では、精製ハイブリドーマクローン７Ｈ２Ｈ２ ＩｇＭが指示濃度で５種ヒトＩｇＧ調製物との結合性について再び解析された。コントロール天然ＩｇＧはGammagard ＩｇＩＶおよびOctagam ＩｇＩＶである。ＩｇＩＶ調製物の番号はＡで用いられたＩｇＩＶ調製物に関する（テキストも参照）。Ｃ．ｈＩｇＧ‐塩基‐３７℃および天然ＩｇＩＶ GammagardへのマウスハイブリドーマＩｇＭ ７Ｈ２Ｈ２の結合性。Ｄ．ミスフォールドマウスＩｇＧおよび天然マウスγ‐グロブリンの様々な調製物への７Ｈ２Ｈ２の結合性。
【図２６】タンパク質ミスフォールディング疾患特異的診断および療法のためのアフィニティ領域を選択するために好ましい操作の要旨  一連のミスフォールドタンパク質に対するアフィニティ領域は、アフィニティ領域を含んでなる組成物をミスフォールドタンパク質のアフィニティマトリックスへ適用することにより選択しうる。このようなマトリックスが１種または一連のミスフォールドタンパク質（ミックスＸ，カラムＩ）を含有しているとき、一般的なミスフォールドタンパク質に対するアフィニティ領域（調製物１）が得られる。このようなアフィニティ領域はすべてのミスフォールディング疾患に適用しうるが、それらは全く疾患特異的ではないため副作用を生じるかもしれない。疾患特異的アフィニティ領域は、１種または一連の疾患特異的ミスフォールドタンパク質含有のカラム（ミックスＡ，カラムII）へアフィニティ領域の組成物を適用することにより単離しうる。こうして得られたアフィニティ領域（調製物２）は疾患特異的アフィニティ領域を含有しているが、一般的なミスフォールドタンパク質と相互作用するアフィニティ領域も含有している。後者は、カラムＩから得られるアフィニティ領域と類似しているため、場合により存在するミスフォールドタンパク質と結合しうるアフィニティ領域の存在のせいで、特定の疾患へ適用されたときに副作用をなお生じるかもしれない。このように、更に好ましくは、アフィニティ領域（調製物３）は、アフィニティ領域を含んでなる組成物をミスフォールドタンパク質のカラム（カラムＩ）、その後で１種または一連の疾患特異的ミスフォールドタンパク質含有のカラム（カラムIII，カラムIIと類似または同一）へ適用することにより製造される。更に一層好ましくは、疾患の病理に関与するミスフォールドタンパク質と高度に特異的なアフィニティ領域（調製物４）は、アフィニティ領域を含んでなる組成物が１種または一連の疾患特異的ミスフォールドタンパク質のカラム（カラムII）含有のカラム、次いで通常ミスフォールドタンパク質と相互作用するものからカラムIIで集められたアフィニティ領域の混合物を枯渇させるために用いられる、カラムIIに固定された標的疾患の病理に関与するミスフォールドタンパク質を除く一連のミスフォールドタンパク質を含んでなるカラム（カラムIV）へ適用されたときに得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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