(57)【要約】本発明の核酸構築物は、第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含むベクターを含み、該第１の核酸配列は第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、該第２の核酸配列は第２の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ該第１の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、該第３の核酸配列は該第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子標的配列を含み、そして該第１および第２の転写制御エレメントは反対の方向に向いている。この構築物を用いて、本発明は、宿主の効率的なトランスフェクションを提供し、ならびに目的の移入された配列を有する宿主への修飾因子（例えば、テトラサイクリンなどの抗生物質）の単純な投与によって、目的の移入された配列の発現のタイミングおよびレベルの精巧な制御を提供することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含むベクターを含む単一の核酸構築物であって、該第１の核酸配列は第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、該第２の核酸配列は第２の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ該第１の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、該第３の核酸配列は該第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子標的配列を含み、そして該第１および第２の転写制御エレメントは反対の方向に向いている、核酸構築物。
【請求項２】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記ウイルスベクターが自己不活化している、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記第１または第２の転写制御エレメントが他の転写制御エレメントの活性に影響を与える、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記第１または第２の転写制御エレメントが並列している、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
リンカー配列が前記第１の転写制御エレメントと第２の転写制御エレメントとの間に位置している、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記リンカー配列が染色体インシュレーターである、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸構築物を含む細胞株。
【請求項９】
前記調節因子標的配列が少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記調節因子標的配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記調節因子標的配列が２つのｔｅｔオペレーター配列に隣接したＴＡＴＡボックスを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記調節因子標的配列が配列番号６の配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記第１の核酸配列の発現がＣｒｅの存在に依存する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記調節因子標的配列がＴＡＴＡ配列に隣接した選択マーカーを含み、該ＴＡＴＡ配列が少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結され、該選択マーカーはｌｏｘ  Ｐ部位に隣接し、そして該調節因子配列が前記第１の転写制御エレメントと前記第１の核酸配列の間に位置する、請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記コードされるタンパク質がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写因子である、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記目的の配列が、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡの配列である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記第２の核酸配列がテトラサイクリンリプレッサーをコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記第２の核酸配列が、核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
前記コードされている核局在化シグナルがＳＶ４０核局在化シグナルである、請求項１９に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記第２の核酸配列が配列番号１の配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
前記第２の核酸配列がＶＰ１６をさらに含む、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
前記第２の核酸配列が配列番号２の配列を含む、請求項２２に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
前記第２の核酸配列がテトラサイクリンアクチベーターをコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２５】
前記第２の核酸配列が核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２４に記載の核酸構築物。
【請求項２６】
前記コードされる核局在化シグナルがＳＶ４０核局在化シグナルである、請求項２５に記載の核酸構築物。
【請求項２７】
前記第２の核酸配列が配列番号２の配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２８】
前記第２の核酸配列がＶＰ１６をさらに含む、請求項２４に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
前記第２の核酸配列が配列番号３の配列を含む、請求項２８に記載の核酸構築物。
【請求項３０】
第３の転写制御エレメントに作動可能に連結された第４の核酸配列をさらに含み、該第４の核酸配列は第２の目的の配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３１】
前記第３の転写制御エレメントがプロモーターである、請求項３０に記載の核酸構築物。
【請求項３２】
前記第２の目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項３１に記載の核酸構築物。
【請求項３３】
前記第２の目的の配列が、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである、請求項３１に記載の核酸構築物。
【請求項３４】
前記第３の転写制御エレメントが、マウスＨｉ、ヒトＨ１、またはＵ６プロモーターからなる群より選択される、請求項３３に記載の核酸構築物。
【請求項３５】
選択マーカーをコードする配列を含む第４の核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３６】
前記選択マーカーがＧＦＰまたはＲＦＰからなる群より選択される、請求項３５に記載の核酸構築物。
【請求項３７】
内部リボソーム侵入部位をさらに含む、請求項３５に記載の核酸構築物。
【請求項３８】
前記第１の核酸配列の発現が調節可能である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３９】
前記転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４０】
前記プロモーターが、ｍＨ１プロモーター、ｈＨ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶベースのプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはＥＦ−１αプロモーターからなる群より選択される、請求項３９に記載の核酸構築物。
【請求項４１】
前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項４０に記載の核酸構築物。
【請求項４２】
前記調節因子標的配列に作動可能に連結された、ＧＡＬ−４をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項４３】
少なくとも２つのｔｅｔＯ配列を含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４４】
前記調節因子標的配列が少なくとも１つのｔｅｔ調節因子標的配列を含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４５】
前記調節因子標的配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４６】
前記調節因子標的配列が、２つのｔｅｔオペレーター配列に隣接するＴＡＴＡボックスを含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４７】
前記調節因子標的配列が配列番号６の配列を含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４８】
第２の調節因子配列および第２の目的の配列に作動可能に連結されたＧＡＬ−４をコードする核酸配列をさらに含み、該第２の目的の配列は第３の転写制御エレメントに作動可能に連結され、該第２の目的の配列は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群より選択され、そして該第２の調節因子配列は、該ＧＡＬ−４をコードする核酸配列と、該第２の目的の配列との間に配置されている、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４９】
前記第２の調節因子標的配列が少なくとも１つの調節因子標的配列を含む、請求項４８に記載の核酸構築物。
【請求項５０】
前記第２の調節因子標的配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項４８に記載の核酸構築物。
【請求項５１】
前記第２の調節因子標的配列が、２つのｔｅｔオペレーター配列に隣接するＴＡＴＡボックスを含む、請求項４８に記載の核酸構築物。
【請求項５２】
前記第２の調節因子標的配列が配列番号６の配列を含む、請求項４８に記載の核酸構築物。
【請求項５３】
前記第３の転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項４８に記載の核酸構築物。
【請求項５４】
前記プロモーターが、ｍＨ１プロモーター、ｈＨ１プロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはＥＦ−１αプロモーターからなる群より選択される、請求項５３に記載の核酸構築物。
【請求項５５】
第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含むベクターを含む単一の核酸構築物であって、該第１の核酸配列、該第２の核酸配列、および該第３の核酸配列は、単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、該第１の核酸配列は目的の配列を含み、該第２の核酸配列は該第１の核酸配列の発現を制御可能であるポリペプチドをコードし、該第３の核酸配列は第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子標的配列を含み、そして該第１の転写制御エレメントは該第１の核酸配列および第２の核酸配列の発現を駆動可能である、核酸構築物。
【請求項５６】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項５７】
前記ウイルスベクターが自己不活化している、請求項５６に記載の核酸構築物。
【請求項５８】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む細胞株。
【請求項５９】
前記調節因子標的配列が少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６０】
前記調節因子標的配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６１】
前記調節因子標的配列が２つのｔｅｔオペレーター配列に隣接したＴＡＴＡボックスを含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６２】
前記調節因子標的配列が配列番号６の配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６３】
前記第１の核酸配列の発現がＣｒｅの存在に依存する、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６４】
調節因子配列がＴＡＴＡ配列に隣接した選択マーカーを含み、該ＴＡＴＡ配列が少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に連結され、該選択マーカーはｌｏｘ  Ｐ部位にもまた隣接し、そして該調節因子配列が前記第１の転写制御エレメントと前記第１の核酸配列との間に位置する、請求項６３に記載の核酸構築物。
【請求項６５】
前記目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６６】
前記目的のタンパク質がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写因子である、請求項６５に記載の核酸構築物。
【請求項６７】
前記目的の配列が、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６８】
前記調節因子標的配列に作動可能に連結された、ＧＡＬ−４をコードする核酸配列をさらに含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項６９】
配列番号６の配列を含む、請求項６８に記載の核酸構築物。
【請求項７０】
前記調節因子標的配列が少なくとも１つのｔｅｔ調節因子標的配列を含む、請求項６８に記載の核酸構築物。
【請求項７１】
前記調節因子標的配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項６８に記載の核酸構築物。
【請求項７２】
前記調節因子標的配列が、２つのｔｅｔオペレーター配列に隣接するＴＡＴＡボックスを含む、請求項６８に記載の核酸構築物。
【請求項７３】
前記調節因子標的配列が配列番号６の配列を含む、請求項６８に記載の核酸構築物。
【請求項７４】
前記第２の調節因子標的配列および第２の目的の配列に作動可能に連結されたＧＡＬ−４をコードする核酸配列をさらに含み、該第２の目的の配列は第３の転写制御エレメントに作動可能に連結され、該第２の目的の配列は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群より選択され、そして該第２の調節因子標的配列は、該ＧＡＬ−４をコードする核酸配列と、該第２の目的の配列との間に配置されている、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項７５】
前記第２の調節因子標的配列が少なくとも１つのｔｅｔ調節因子標的配列を含む、請求項７４に記載の核酸構築物。
【請求項７６】
前記第２の調節因子標的配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項７４に記載の核酸構築物。
【請求項７７】
前記第２の調節因子標的配列が、２つのｔｅｔオペレーター配列に隣接するＴＡＴＡボックスを含む、請求項７４に記載の核酸構築物。
【請求項７８】
前記第２の調節因子標的配列が配列番号６の配列を含む、請求項７４に記載の核酸構築物。
【請求項７９】
前記第３の転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項７４に記載の核酸構築物。
【請求項８０】
前記プロモーターが、ｍＨ１プロモーターまたは、ｈＨ１プロモーターからなる群より選択される、請求項７９に記載の核酸構築物。
【請求項８１】
前記第２の核酸配列がテトラサイクリンリプレッサーをコードする核酸配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項８２】
前記第２の核酸配列が、核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項８１に記載の核酸構築物。
【請求項８３】
前記コードされる核局在化シグナルがＳＶ４０核局在化シグナルである、請求項８２に記載の核酸構築物。
【請求項８４】
前記第２の核酸配列が配列番号１の配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項８５】
前記第２の核酸配列がＶＰ１６をさらに含む、請求項８１に記載の核酸構築物。
【請求項８６】
前記第２の核酸配列が配列番号２の配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項８７】
前記第２の核酸配列がテトラサイクリンアクチベーターをコードする核酸配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項８８】
前記第２の核酸配列が、核局在化シグナルをコードする核酸配列をさらに含む、請求項８７に記載の核酸構築物。
【請求項８９】
前記コードされる核局在化シグナル配列がＳＶ４０核局在化シグナルである、請求項８８に記載の核酸構築物。
【請求項９０】
前記第２の核酸配列が配列番号２の配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項９１】
前記第２の核酸配列がＶＰ１６をさらに含む、請求項８７に記載の核酸構築物。
【請求項９２】
前記第２の核酸配列が配列番号３の配列を含む、請求項９１に記載の核酸構築物。
【請求項９３】
第３の転写制御エレメントに作動可能に連結された第４の核酸配列をさらに含み、該第４の核酸配列が第２の目的の配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項９４】
前記第３の転写制御エレメントがプロモーターである、請求項９３に記載の核酸構築物。
【請求項９５】
前記第２の目的の配列が目的のタンパク質をコードする、請求項９３に記載の核酸構築物。
【請求項９６】
前記第３の転写制御エレメントがプロモーターである、請求項９３に記載の核酸構築物。
【請求項９７】
前記第２の目的の配列が、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである、請求項９３に記載の核酸構築物。
【請求項９８】
前記第３の転写制御エレメントが、マウスＨｉプロモーター、ヒトＨ１プロモーター、Ｕ６もしくはユビキチンＣプロモーター、またはＥＦ−１αプロモーターからなる群より選択される、請求項９７に記載の核酸構築物。
【請求項９９】
第４の核酸配列をさらに含み、該第４の核酸配列は選択マーカーをコードする配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１００】
前記選択マーカーがＧＦＰまたはＲＦＰからなる群より選択される、請求項９９の核酸構築物。
【請求項１０１】
内部リボソーム侵入部位をさらに含む、請求項９９に記載の核酸構築物。
【請求項１０２】
前記第１の核酸配列の発現が調節可能である、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０３】
前記転写制御エレメントが、プロモーターまたはエンハンサーからなる群より選択される、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０４】
前記転写制御エレメントが、ＣＭＶプロモーターの３’部分を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０５】
前記転写制御エレメントが、ＣＭＶプロモーターの５’部分を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０６】
前記転写制御エレメントが、β−アクチンプロモーターの一部を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０７】
前記転写制御エレメントがＣＡＧプロモーターを含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０８】
前記転写制御エレメントが、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結された３’ＣＭＶプロモーター配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１０９】
前記転写制御エレメントが、配列番号１２の配列を含む、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項１１０】
前記転写制御エレメントが、マウスＨｉプロモーター、ヒトＨ１プロモーター、Ｕ６ユビキチンＣプロモーター、またはＥＦ−１αプロモーターからなる群より選択される、請求項６７に記載の核酸構築物。
【請求項１１１】
ＣＡＧプロモーターの５’末端に融合されたＣＭＶプロモーターの３’末端を含む、二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１２】
配列番号１２に示される配列を含む、請求項１１１に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１３】
前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項１１１に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１４】
前記二方向性プロモーターが構成的である、請求項１１１に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１５】
ＥＦ−１αプロモーターの５’末端に融合されたＣＭＶプロモーターの３’末端を含む二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１６】
配列番号１３に示される配列を含む、請求項１１５に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１７】
前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項１１５に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１８】
前記二方向性プロモーターが構成的である、請求項１１５に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項１１９】
目的の配列の調節を可能にするのに適切な条件下で、請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、目的の配列の発現を選択的に調節する方法。
【請求項１２０】
組換えタンパク質の発現を可能にするのに適切な条件下で、請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を含む組換えタンパク質を作製する方法であって、目的の配列は、該組換えタンパク質をコードする核酸配列である、方法。
【請求項１２１】
前記標的細胞が糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記標的細胞が、対照細胞と比較してＧｎＴＩ活性が減少している、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記目的の配列の調節を可能にするのに適切な条件下で、請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程によって前記標的細胞が産生される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項１に記載の核酸構築物がインビトロで前記標的細胞に導入される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
免疫応答を誘発するために十分な量で、請求項１２０に記載の方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘発する方法。
【請求項１２６】
請求項１に記載の核酸構築物がインビボで前記標的細胞に導入される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
目的の配列の調節を可能にするのに適切な条件下で、請求項５５に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、目的の配列の発現を選択的に調節する方法。
【請求項１２８】
組換えタンパク質の発現を可能にするのに適切な条件下で、請求項５５に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法であって、目的の配列は、該組換えタンパク質をコードする核酸配列である、方法。
【請求項１２９】
前記標的細胞が糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記標的細胞が、対照細胞と比較してＧｎＴＩ活性が減少している、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
請求項３３１に記載の方法を使用して前記標的細胞が産生される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記核酸構築物がインビトロで前記標的細胞に導入される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
免疫応答を誘発するために十分な量で、請求項１２８に記載の方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘発する方法。
【請求項１３４】
前記核酸構築物がインビボで前記標的細胞に導入される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３５】
トランスジェニック動物を作製する方法であって、
ａ）請求項１に記載の核酸構築物を接合体に導入する工程；
ｂ）該接合体を分娩まで成長させる工程；
ｃ）そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を入手する工程；
ｄ）Ｆ１子孫を得るために、該動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程；および
ｅ）そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１３６】
請求項１に記載の核酸構築物を含む導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物。
【請求項１３７】
トランスジェニック動物を作製する方法であって、
ａ）請求項５５に記載の核酸構築物を接合体に導入する工程；
ｂ）該接合体を分娩まで成長させる工程；
ｃ）そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を入手する工程；
ｄ）Ｆ１子孫を得るために、該動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程；および
ｅ）そのゲノムが該核酸構築物を含む動物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１３８】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物。
【請求項１３９】
Ｋｉｓｓ−１を発現しているトランスジェニック動物。
【請求項１４０】
Ｋｉｓｓ−１の発現が調節可能である、請求項１３９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４１】
請求項１３５に記載の方法を使用して産生される、Ｋｉｓｓ−１を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４２】
請求項１３７に記載の方法を使用して産生される、Ｋｉｓｓ−１を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４３】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、Ｋｉｓｓ−１を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４４】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む、Ｋｉｓｓ−１を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４５】
ＦＯＸ  Ｐ３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４６】
ＦＯＸ  Ｐ３の発現が調節可能である、請求項１４５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４７】
請求項１３５に記載の方法を使用して産生される、ＦＯＸ  Ｐ３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４８】
請求項１３７に記載の方法を使用して産生される、ＦＯＸ  Ｐ３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１４９】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、ＦＯＸ  Ｐ３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５０】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む、ＦＯＸ  Ｐ３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５１】
ＮＦκβを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５２】
ＮＦκβの発現が調節可能である、請求項１５１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５３】
請求項１３５に記載の方法を使用して産生される、ＮＦκβを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５４】
請求項１３７に記載の方法を使用して産生される、ＮＦκβを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５５】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、ＮＦκβを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５６】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む、ＮＦκβを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５７】
マイクロＲＮＡ２２３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５８】
マイクロＲＮＡ２２３の発現が調節可能である、請求項１５７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５９】
請求項１３５に記載の方法を使用して産生される、マイクロＲＮＡ２２３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６０】
請求項１３７に記載の方法を使用して産生される、マイクロＲＮＡ２２３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６１】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、マイクロＲＮＡ２２３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６２】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む、マイクロＲＮＡ２２３を発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６３】
Ｃｒｅを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６４】
Ｃｒｅの発現が調節可能である、請求項１６３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６５】
請求項４４７に記載の方法を使用して産生される、請求項１６３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６６】
請求項４４８に記載の方法を使用して産生される、請求項１６３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６７】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、Ｃｒｅを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６８】
請求項５５に記載の核酸構築物を含む、Ｃｒｅを発現するトランスジェニック動物。
【請求項１６９】
請求項１に記載の核酸構築物を含むワクチン。
【請求項１７０】
請求項５５に記載の核酸構築物を含むワクチン。
【請求項１７１】
請求項１６９に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を産生する方法。
【請求項１７２】
請求項１７０に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を産生する方法。
【請求項１７３】
被験体における免疫応答を産生する方法であって、該免疫応答がＨＩＶに対する免疫応答であり、該方法は請求項１６９に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７４】
被験体における免疫応答を産生する方法であって、該免疫応答がＨＩＶに対する免疫応答であり、該方法は請求項１７０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７５】
組換えタンパク質を作製する方法であって、
ａ．少なくとも１つのＶＰ１６配列に作動可能に連結された調節配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第１の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；
ｂ．該第１の核酸配列の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；
ｃ．工程（ｂ）の細胞に、目的の配列に作動可能に連結された調節因子標的配列を含む第２の核酸構築物を導入する工程であって、
該目的の配列は組換えタンパク質をコードする核酸配列である、工程；および
ｄ．組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で、工程（ｃ）の細胞を維持する工程
を包含する、方法。
【請求項１７６】
前記第１の核酸構築物が配列番号４４の配列を含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記第２の核酸構築物が、調節因子標的配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結されている目的の配列を含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたＩＲＥＳ配列に作動可能に連結されている、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７９】
前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたＩＲＥＳ様配列に作動可能に連結されている、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８０】
組換えタンパク質を作製する方法であって、
ａ．少なくとも１つのＶＰ１６配列に作動可能に連結された調節因子配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第１の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；
ｂ．目的の配列に作動可能に連結されている調節因子標的配列を含む第２の核酸構築物を、工程（ａ）の同じ標的細胞に導入する工程であって、該目的の配列は組換えタンパク質をコード可能な核酸配列である、工程；ならびに
ｃ．該標的細胞のゲノムへの該第１の核酸配列および第２の核酸配列の組み込みを可能にする条件下に該標的細胞を維持する工程；ならびに
ｄ．該組換えタンパク質の発現を可能にする条件下に工程（ｃ）の細胞を維持する工程
を包含する、方法。
【請求項１８１】
前記第１の核酸構築物が配列番号４４の配列を含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記第２の核酸構築物が、調節因子標的配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結されている目的の配列を含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８３】
前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたＩＲＥＳ配列に作動可能に連結されている、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８４】
前記目的の配列が、選択マーカーに作動可能に連結されたＩＲＥＳ様配列に作動可能に連結されている、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８５】
被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
ａ．請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；および
ｃ．免疫応答を誘発するために十分な量で、該被験体に工程（ｂ）の標的細胞を導入する工程
を包含する、方法。
【請求項１８６】
請求項１に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
ａ．請求項５５に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；および
ｃ．免疫応答を誘発するために十分な量で、該被験体に工程（ｂ）の標的細胞を導入する工程
を包含する、方法。
【請求項１８８】
請求項５５に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
ａ．請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項１に記載の核酸構築物の転写制御エレメントが調節可能である、工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；および
ｃ．工程（ｂ）の標的細胞を該被験体に導入する工程；および
ｄ．目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項１に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現される、工程
を包含する、方法。
【請求項１９０】
請求項１に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
被験体における免疫応答を誘発する方法であって、
ａ．請求項５５に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；および
ｃ．工程（ｂ）の標的細胞を該被験体に導入する工程；および
ｄ．目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項５５に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現される、工程
を包含する、方法。
【請求項１９２】
請求項５５に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
ａ．請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項１に記載の核酸構築物の転写制御エレメントは調節可能であり、
目的の配列は、目的のタンパク質をコード可能である、工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；
ｃ．工程（ｂ）の細胞を該被験体に導入する工程；
ｄ．該目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項１に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、そして
該免疫応答が、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程
を包含する、方法。
【請求項１９４】
前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
請求項１に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
ａ．請求項５５に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項５５に記載の核酸構築物の転写制御エレメントは調節可能であり、
目的の配列は、目的のタンパク質をコード可能である、工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；
ｃ．工程（ｂ）の標的細胞を該被験体に導入する工程；
ｄ．該目的の配列の発現を誘導するために十分な量で、請求項５５に記載の核酸構築物の転写制御エレメントを調節可能である物質の有効量を該被験体に投与する工程であって、
該目的の配列は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、そして
該免疫応答が、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程
を包含する、方法。
【請求項１９７】
前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
請求項５５に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９９】
目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
ａ．請求項１に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
目的の配列は、目的のタンパク質をコードすることが可能である、工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；および
ｃ．工程（ｂ）の細胞を該被験体に導入する工程であって、
該細胞は、免疫応答を誘導するために十分な量で該目的の配列を発現し、
該免疫応答は、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２００】
前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
請求項１に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０２】
目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
ａ．請求項５５に記載の核酸構築物を標的細胞に導入する工程であって、
請求項５５に記載の核酸構築物の転写制御エレメントは調節可能であり、
目的の配列は、目的のタンパク質をコードすることが可能である、工程；
ｂ．工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；
ｃ．工程（ｂ）の細胞を該被験体に導入する工程であって、
該細胞は、免疫応答を誘導するために十分な量で該目的の配列を発現し、
該免疫応答は、該目的のタンパク質に対する抗体を生成する、工程；
を包含する、方法。
【請求項２０３】
前記方法によって産生される前記抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
請求項５５に記載の核酸構築物の目的の配列が膜タンパク質をコードすることが可能である、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０５】
ｅｆ１αプロモーターの５’末端に融合されたＣＭＶプロモーターの５’末端を含む、二方向性転写制御エレメント。
【請求項２０６】
前記ＣＭＶプロモーターの３’末端に作動可能に連結された調節因子標的配列をさらに含む、請求項２０５に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項２０７】
配列番号５１に記載の配列を含む、請求項２０５に記載の二方向性転写制御エレメント。
【請求項２０８】
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むパッケージング構築物であって、該第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、該第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードし、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を各々含み、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物。
【請求項２０９】
ｒｅｖ応答エレメントを含む第３の核酸配列をさらに含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１０】
請求項２０８に記載のパッケージング構築物を含む細胞株。
【請求項２１１】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該第１の核酸配列と該第２の核酸配列の示差的発現を提供する、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１２】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間の前記エレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項２１１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１３】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項２１２に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１４】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項２１２に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１５】
前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項２１２に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１６】
少なくとも１つの転写制御エレメントが調節可能である、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１７】
少なくとも１つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１８】
少なくとも１つの転写制御エレメントが少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２１９】
標的である少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２０】
標的である少なくとも１つの転写制御エレメントが配列番号６の配列を含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２１】
少なくとも１つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２２】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項２２１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２３】
少なくとも１つの転写制御エレメントが構成的である、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２４】
少なくとも１つの前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項２２３に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２５】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項２２４に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２６】
前記第１の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ配列中の少なくとも１つの点変異を含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２７】
前記第１の核酸配列が配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２８】
前記第２の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ−ｐｏｌ配列における単一ヌクレオチド挿入および少なくとも１つの点変異を含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２２９】
前記第１の核酸配列が配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３０】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の１つ以上は最適化されたコドンである、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３１】
Ｔａｔをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３２】
Ｒｅｖをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３３】
約９９：１〜約８０：２０の比率でＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌを発現することが可能である、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３４】
複製可能でない組換え体を生成することが可能である、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３５】
前記第１の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第２の核酸配列が第２の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３６】
前記第１の転写制御エレメントが前記第２の転写制御エレメントよりも強力である、請求項２３５に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３７】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が反対の方向で発現される、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３８】
少なくとも１つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２３９】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項２０８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２４０】
前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項２３９に記載のパッケージング構築物。
【請求項２４１】
前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項２３９に記載のパッケージング構築物。
【請求項２４２】
前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項２４１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２４３】
請求項２０８に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
【請求項２４４】
請求項２０９に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
【請求項２４５】
請求項２４３に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
【請求項２４６】
請求項２４４に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
【請求項２４７】
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むパッケージング構築物であって、該第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、該第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質をコードし、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を含み、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物。
【請求項２４８】
ｒｅｖ応答エレメントを含む第３の核酸配列をさらに含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２４９】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該２つの核酸配列の示差的発現を提供する、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５０】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の間の前記エレメントが内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項２４９に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５１】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項２５０に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５２】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項２５０に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５３】
前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項２５０に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５４】
少なくとも１つの転写制御エレメントが調節可能である、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５５】
少なくとも１つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５６】
少なくとも１つの転写制御エレメントが少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５７】
少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項２５６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５８】
少なくとも１つの転写制御エレメントが配列番号６の配列を含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２５９】
少なくとも１つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６０】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項２５９に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６１】
１つ以上の前記転写制御エレメントが構成的である、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６２】
前記第１の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ配列中の少なくとも１つの点変異を含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６３】
前記第１の核酸配列が配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６４】
前記第２の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ−ｐｏｌ配列における単一ヌクレオチド挿入および少なくとも１つの点変異を含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６５】
前記第２の核酸配列が配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６６】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の１つ以上は最適化されたコドンである、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６７】
Ｔａｔをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６８】
Ｒｅｖをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２６９】
約９９：１〜約８０：２０の比率でＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌを発現することが可能である、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７０】
複製可能でない組換え体を生成することが可能である、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７１】
前記第１の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第２の核酸配列が第２の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７２】
前記第１の転写制御エレメントが前記第２の転写制御エレメントよりも強力である、請求項２７１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７３】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が反対の方向で発現される、請求項２７１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７４】
前記第１の転写制御エレメントおよび前記第２の転写制御エレメントが同じである、請求項２７１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７５】
前記第１の転写制御エレメントおよび前記第２の転写制御エレメントが異なる、請求項２７１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７６】
少なくとも１つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項２７１に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７７】
前記標的である第１の核酸配列および第２の核酸配列が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項２４７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７８】
前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項２７７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２７９】
前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項２７７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２８０】
前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項２７９に記載のパッケージング構築物。
【請求項２８１】
請求項２４７に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
【請求項２８２】
請求項２４８に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
【請求項２８３】
請求項２８１に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
【請求項２８４】
請求項２８２に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
【請求項２８５】
請求項２４７に記載の標的パッケージング構築物を含む細胞株。
【請求項２８６】
第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含むパッケージング構築物であって、該第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、該第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質をコードし、該第３の核酸配列はＶｐｒ−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードし、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列はフレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を含み、該第１の核酸配列、該第２の核酸配列、および該第３の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第１の核酸配列、該第２の核酸配列、および該第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物。
【請求項２８７】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列の示差的発現を提供する、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２８８】
示差的発現を提供する、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の間の前記エレメントが内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項２８７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２８９】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項２８８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９０】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項２８８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９１】
前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項２８８に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９２】
少なくとも１つの転写制御エレメントが調節可能である、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９３】
少なくとも１つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９４】
少なくとも１つの転写制御エレメントが少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９５】
少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列がＴＡＴＡボックスに作動可能に連結されている、請求項２９４に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９６】
少なくとも１つの転写制御エレメントが配列番号６の配列を含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９７】
少なくとも１つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９８】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項２９７に記載のパッケージング構築物。
【請求項２９９】
１つ以上の前記転写制御エレメントが構成的である、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３００】
少なくとも１つの前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項２９９に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０１】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項３００に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０２】
前記第１の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ配列中の少なくとも１つの点変異を含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０３】
前記第１の核酸配列が配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０４】
前記第２の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ−ｐｏｌ配列における単一ヌクレオチド挿入および少なくとも１つの点変異を含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０５】
前記第２の核酸配列が配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０６】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の１つ以上は最適化されたコドンである、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０７】
Ｔａｔをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０８】
Ｒｅｖをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３０９】
約９９：１〜約８０：２０の比率でＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌを発現することが可能である、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１０】
複製可能でない組換え体を生成することが可能である、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１１】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第３の核酸配列が第２の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１２】
前記第１の転写制御エレメントが前記第２の転写制御エレメントよりも強力である、請求項３１１に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１３】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列または前記第３の核酸配列が反対の方向で発現される、請求項２８６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１４】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記第３の核酸配列が第２の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３１３に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１５】
少なくとも１つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項３１４に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１６】
前記第１の核酸配列、前記第２の核酸配列、および前記第３の核酸配列が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３１３に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１７】
前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項３１６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１８】
前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項３１６に記載のパッケージング構築物。
【請求項３１９】
前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項３１８に記載のパッケージング構築物。
【請求項３２０】
前記第１の核酸配列または前記第２の核酸配列と前記第３の核酸配列との間のエレメントをさらに含む、請求項２８６に記載のパッケージング構築物であって、該第３の核酸配列は、該第１の核酸配列と該第２の核酸配列の間に配置されず、該エレメントは、該第１の核酸配列または該第２の核酸配列と、該第３の核酸配列との間の示差的発現を提供する、構築物。
【請求項３２１】
前記エレメントが内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項３２０に記載のパッケージング構築物。
【請求項３２２】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項３２１に記載のパッケージング構築物。
【請求項３２３】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項３２１に記載のパッケージング構築物。
【請求項３２４】
前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項３２１に記載のパッケージング構築物。
【請求項３２５】
請求項２８６に記載のパッケージング構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含む、パッケージング系。
【請求項３２６】
請求項３２５に記載のパッケージング系を使用してウイルス様粒子を作製する方法。
【請求項３２７】
発現系であって、
ａ．請求項２０８、２４７、または２８６に記載のパッケージング構築物；
ｂ．エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ核酸構築物であって、該エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物；および
ｃ．１つ以上の目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物
を含む、発現系。
【請求項３２８】
テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された、核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含む、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３２９】
前記核局在化シグナルをコードする構築物が転写制御エレメントをさらに含む、請求項３２８に記載の発現系。
【請求項３３０】
前記転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーである、請求項３２９に記載の発現系。
【請求項３３１】
前記核局在化シグナルをコードする核酸配列が少なくとも１つのリンカー配列と隣接している、請求項３２８に記載の発現系。
【請求項３３２】
前記リンカー配列が配列番号１５をコードする、請求項３３１に記載の発現系。
【請求項３３３】
前記核局在化シグナルをコードする構築物が、５’から３’へサイトメガロウイルスプロモーター、第１のリンカーをコードする配列、第２の核局在化シグナル、第２のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列を含み、該コードされるリンカーが配列番号１５である、請求項３２８に記載の発現系。
【請求項３３４】
前記エンベロープ糖タンパク質が細胞への侵入を促進する、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３３５】
前記エンベロープ糖タンパク質がウイルスエンベロープ糖タンパク質である、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３３６】
前記ウイルスエンベロープ糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）である、請求項３３５に記載の発現系。
【請求項３３７】
前記遺伝子移入構築物がマーカーをコードする配列をさらに含み、前記目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３３８】
前記遺伝子移入構築物が２つの目的の配列を含む、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３３９】
前記遺伝子移入構築物が前記目的の遺伝子の３’に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントをさらに含む、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３４０】
前記遺伝子移入構築物が１つ以上の長い末端反復配列を含む、請求項３２７に記載の発現系。
【請求項３４１】
前記遺伝子移入構築物が３’の長い末端反復配列に変異を含む、請求項３４０に記載の発現系。
【請求項３４２】
プロモーター配列が５’または３’の長い末端反復配列の代わりに置換されている、請求項３４０に記載の発現系。
【請求項３４３】
前記遺伝子移入構築物の少なくとも１つの転写制御エレメントがプロモーターである、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３４４】
前記遺伝子移入構築物の前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３４５】
前記遺伝子移入構築物の前記転写制御エレメントが調節因子構築物をさらに含み、該調節因子構築物が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結された調節可能エレメントを含む、請求項３４４に記載の発現系。
【請求項３４６】
前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントが、該目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列の示差的発現を提供する、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３４７】
前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間の前記エレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項３４６に記載の発現系。
【請求項３４８】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項３４７に記載の発現系。
【請求項３４９】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項３４７に記載の発現系。
【請求項３５０】
前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項３４７に記載の発現系。
【請求項３５１】
前記遺伝子移入構築物が少なくとも１つの転写制御エレメントを含む、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３５２】
前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３５３】
前記転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３５４】
少なくとも１つの転写制御エレメントが少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３５５】
少なくとも１つの転写制御エレメントが配列番号６の配列を含む、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３５６】
前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項３５１に記載の発現系。
【請求項３５７】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項３５６に記載の発現系。
【請求項３５８】
前記遺伝子移入構築物の少なくとも１つの転写制御エレメントが構成的である、請求項３５１に記載の発現系。
【請求項３５９】
前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項３５８に記載の発現系。
【請求項３６０】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項３５９に記載の発現系。
【請求項３６１】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が異なる転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３６２】
前記マーカーをコードする配列に作動可能に連結された前記転写制御エレメントが、前記目的の遺伝子に作動可能に連結された前記転写制御エレメントよりも強力である、請求項３６１に記載の発現系。
【請求項３６３】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が反対の方向で発現される、請求項３３７に記載の発現系。
【請求項３６４】
少なくとも１つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項３６３に記載の発現系。
【請求項３６５】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３６３に記載の発現系。
【請求項３６６】
前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項３６５に記載の発現系。
【請求項３６７】
前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項３６６に記載の発現系。
【請求項３６８】
請求項３２７に記載の発現系を含む細胞株。
【請求項３６９】
発現系であって、
ａ．Ｇａｇポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第１の核酸構築物を含む第１のパッケージング構築物であって、該Ｇａｇをコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を含み、かつ少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物；
ｂ．Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第２の核酸構築物を含む第２のパッケージング構築物であって、該Ｇａｇ−Ｐｏｌをコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を含み、かつ少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物；
ｃ．エンベロープ糖タンパク質をコードする第３の核酸配列を含む第３の核酸構築物であって、該第３の核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物；および
ｄ．少なくとも１つの目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物
を含む、発現系。
【請求項３７０】
請求項３６９に記載の発現系を含む細胞株。
【請求項３７１】
テトラサイクリントランス活性化因子コーディングに作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする第４の核酸配列を含む第４の核酸構築物をさらに含む、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３７２】
前記第４の核酸構築物が転写制御エレメントをさらに含む、請求項３７１に記載の発現系。
【請求項３７３】
前記核局在化シグナルをコードする配列が少なくとも１つのリンカー配列と隣接している、請求項３７１に記載の発現系。
【請求項３７４】
前記リンカー配列が配列番号１５をコードする、請求項３７３に記載の発現系。
【請求項３７５】
前記第４の核酸配列が、５’から３’へ、サイトメガロウイルスプロモーター、配列番号１５をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号１５をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸配列を含む、請求項３７１に記載の発現系。
【請求項３７６】
前記ウイルスエンベロープ糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）である、請求項３７１に記載の発現系。
【請求項３７７】
前記遺伝子移入構築物がマーカーをコードする配列をさらに含み、前記目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３７８】
前記遺伝子移入構築物が第２の目的の遺伝子をさらに含む、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３７９】
前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントは、該目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列の示差的発現を提供する、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３８０】
前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項３７９に記載の発現系。
【請求項３８１】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項３８０に記載の発現系。
【請求項３８２】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項３８０に記載の発現系。
【請求項３８３】
前記内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項３８０に記載の発現系。
【請求項３８４】
前記遺伝子移入構築物が少なくとも１つの転写制御エレメントを含む、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３８５】
前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３８６】
前記転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３８７】
少なくとも１つの転写制御エレメントが少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３８８】
少なくとも１つの転写制御エレメントが配列番号６の配列を含む、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３８９】
前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３９０】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項３８９に記載の発現系。
【請求項３９１】
少なくとも１つの転写制御エレメントが構成的である、請求項３６９に記載の発現系。
【請求項３９２】
前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項３９１に記載の発現系。
【請求項３９３】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項３９２に記載の発現系。
【請求項３９４】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が異なる転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３７７に記載の発現系。
【請求項３９５】
前記マーカーをコードする配列に作動可能に連結された前記転写制御エレメントが、前記目的の遺伝子に作動可能に連結された前記転写制御エレメントよりも強力である、請求項３９４に記載の発現系。
【請求項３９６】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が反対の方向で発現される、請求項３７７に記載の発現系。
【請求項３９７】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が２つの異なる転写制御エレメントに作動可能に連結される、請求項３９６に記載の発現系。
【請求項３９８】
少なくとも１つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項３９７に記載の発現系。
【請求項３９９】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項３９６に記載の発現系。
【請求項４００】
前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項３９９に記載の発現系。
【請求項４０１】
前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項３９９に記載の発現系。
【請求項４０２】
ウイルス様粒子を作製する方法であって、
ａ．請求項２０８、２４７、または２８６に記載のパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程；および
ｂ．エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を該細胞に導入し、該エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、工程；および
ｃ．ウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に該細胞を維持する工程
を包含する、方法。
【請求項４０３】
遺伝子移入方法であって
ａ．請求項２０８、２４７、または２８６に記載のパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程；および
ｂ．エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を該細胞に導入し、該エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、工程；
ｃ．１つ以上の目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物を該細胞に導入する工程；および
ｄ．ウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に該細胞を維持する工程
を包含する、方法。
【請求項４０４】
前記遺伝子移入構築物がマーカーをコードする核酸配列をさらに含み、前記目的の遺伝子および該マーカーをコードする核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項４０３に記載の方法。
【請求項４０５】
前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子の３’に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントをさらに含む、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０６】
前記遺伝子移入構築物の前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０７】
前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０８】
前記遺伝子移入構築物が、前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間のエレメントをさらに含み、該エレメントが、該目的の遺伝子および該マーカーをコードする配列の示差的発現を提供する、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０９】
前記目的の遺伝子と前記マーカーをコードする配列との間の前記エレメントが、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントである、請求項４０８に記載の方法。
【請求項４１０】
前記内部リボソーム侵入部位または前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項４０９に記載の方法。
【請求項４１１】
前記内部リボソーム侵入部位も前記内部リボソーム侵入部位様エレメントも天然に存在しない、請求項４０９に記載の方法。
【請求項４１２】
前記内部リボソーム侵入部位がＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳである、請求項４０９に記載の方法。
【請求項４１３】
前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが天然に存在する、請求項４０９に記載の方法。
【請求項４１４】
前記内部リボソーム侵入部位または前記内部リボソーム侵入部位様エレメントが変異している、請求項４０９に記載の遺伝子移入構築物。
【請求項４１５】
前記遺伝子移入構築物が少なくとも１つの転写制御エレメントを含む、請求項４０３に記載の方法。
【請求項４１６】
前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１７】
少なくとも１つの転写制御エレメントがテトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能である、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１８】
少なくとも１つの転写制御エレメントが少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を含む、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１９】
少なくとも１つの転写制御エレメントが配列番号６の配列を含む、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４２０】
前記転写制御エレメントがプロモーターである、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４２１】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２２】
少なくとも１つの転写制御エレメントが構成的である、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４２３】
前記構成的転写制御エレメントがプロモーターである、請求項４２２に記載の方法。
【請求項４２４】
前記プロモーターがＣＭＶベース、ＣＡＧ、ＳＶ４０ベース、熱ショックタンパク質ベース、ｍＨ１ベース、ｈＨ１ベース、ニワトリβアクチンベース、Ｕ６ベース、ユビキチンＣベース、またはＥＦ−１αベースのプロモーターである、請求項４２３に記載の方法。
【請求項４２５】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が異なる転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４２６】
前記目的の遺伝子に作動可能に連結された前記転写制御エレメントが、前記マーカーをコードする配列に作動可能に連結された前記転写制御エレメントよりも強力である、請求項４２５に記載の方法。
【請求項４２７】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が反対の方向で発現される、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４２８】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が２つの異なる転写制御エレメントに作動可能に連結される、請求項４２７に記載の方法。
【請求項４２９】
少なくとも１つの前記転写制御エレメントが調節可能である、請求項４２８に記載の方法。
【請求項４３０】
前記マーカーをコードする配列および前記目的の遺伝子が単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３１】
前記単一の転写制御エレメントが調節可能である、請求項４３０に記載の方法。
【請求項４３２】
前記単一の転写制御エレメントが二方向性プロモーターである、請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３３】
前記二方向性プロモーターが調節可能である、請求項４３０に記載の方法。
【請求項４３４】
テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸配列に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む核局在化シグナルをコードする構築物を前記細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３５】
前記核局在化シグナルをコードする構築物が転写制御エレメントをさらに含む、請求項４３４に記載の方法。
【請求項４３６】
前記転写制御エレメントがプロモーターまたはエンハンサーである、請求項４３５に記載の方法。
【請求項４３７】
前記核局在化シグナルをコードする配列が少なくとも１つのリンカー配列と隣接している、請求項４３４に記載の方法。
【請求項４３８】
前記リンカー配列が配列番号１５をコードする、請求項４３７に記載の方法。
【請求項４３９】
前記核局在化シグナルをコードする構築物が、５’から３’へ、サイトメガロウイルスプロモーター、配列番号１５をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号１５をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸配列を含む、請求項４３４に記載の方法。
【請求項４４０】
目的の外因性遺伝子を含む細胞であって、該目的の遺伝子が、請求項４０３に記載の方法によって該細胞に移入される、細胞。
【請求項４４１】
細胞による組換えタンパク質の発現を可能にするのに適切な条件下で、請求項４０２に記載の方法によって作製されたウイルス粒子と標的細胞を接触させる工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法。
【請求項４４２】
免疫応答を誘発するために十分な量で、請求項４４１に記載の方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘導する方法。
【請求項４４３】
前記標的細胞が糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成する、請求項４４２に記載の方法。
【請求項４４４】
前記標的細胞は、対照細胞と比較してＧｎＴＩ活性が減少している、請求項４４３に記載の方法。
【請求項４４５】
請求項４４３の方法によって作製されたタンパク質を被験体に投与する工程を包含する、選択されたタンパク質で被験体を治療する方法。
【請求項４４６】
ウイルス粒子形成を調節する因子をスクリーニングする方法であって
ａ．第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程であって、該第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、該第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードし、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を含み、該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして該第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、スクリーニングされる該因子に作動可能に連結されている、工程；
ｂ．エンベロープ糖タンパク質をコードする第３の核酸配列を含むエンベロープ構築物を該細胞に導入する工程であって、該第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、工程；
ｃ．ウイルス粒子の形成を可能にするのに適切な条件下で該細胞を培養する工程；
ｄ．該ウイルス粒子を検出する工程；
ｅ．対照培養物と比較した場合に、スクリーニングされる該培養物中でのウイルス粒子の数の増加または減少は、該因子がウイルス粒子形成を調節することを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４４７】
トランスジェニック動物を作製する方法であって、
ａ．請求項４０２に記載の方法によって作製したウイルス粒子を接合体に導入する工程；
ｂ．該接合体を分娩まで成長させる工程；
ｃ．そのゲノムが、目的の遺伝子を発現可能である核酸構築物を含む動物を入手する工程；
ｄ．Ｆ１子孫を得るために、該動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程；および
ｅ．そのゲノムが、該目的の遺伝子を発現可能である該核酸構築物を含む動物を選択する工程であって、該動物が、選択された目的の遺伝子を発現する、工程
を包含する、方法。
【請求項４４８】
請求項４４７に記載の方法によって作製されたトランスジェニック動物。
【請求項４４９】
パッケージング系であって
ａ．Ｇａｇポリタンパク質をコードする第１の変異した核酸を含む第１の核酸構築物であって、該第１の変異した核酸は転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物；および
ｂ．Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする第２の変異した核酸を含む第２の核酸構築物であって、該第２の変異した核酸は転写制御エレメントに作動可能に連結されている、構築物；
を含み、
ｃ．該第１の核酸構築物および該第２の核酸構築物の変異は、ウイルス粒子形成を可能にするＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質の発現の比率を生じる、パッケージング系。
【請求項４５０】
前記ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質の発現の比率が約９９：１〜約８０：２０である、請求項４４９に記載のパッケージング系。
【請求項４５１】
前記第１の変異した核酸が最小ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、前記第２の変異した核酸が熱ショックタンパク質プロモーターに作動可能に連結されている、請求項４４９に記載のパッケージング系。
【請求項４５２】
目的の抗原を結合する抗体を同定する方法であって、該方法は
ａ．目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプル、および該目的の抗原を発現する標的細胞を接触させる工程であって、
該標的細胞は、請求項１、５５、２０８、２４７、および２８６に記載の核酸構築物の１つ以上を含む、工程；ならびに
ｂ．該サンプル中の抗体が、該標的細胞によって発現された該目的の抗原に結合するか否かを決定し、それによって、該目的の抗原に結合する該抗体が、該目的の抗原を結合する抗体として同定される、工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００５年１２月１６日に出願された米国仮出願第６０／７５１，４０７号および、また２００５年１２月１６日に出願された米国仮出願第６０／７５１，１１７号の利益を主張する。２００５年１２月１６日に出願された米国仮出願第６０／７５１，４０７号および、また２００５年１２月１６日に出願された米国仮出願第６０／７５１，１１７号は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
謝辞
本発明は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）および米国国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）からの補助金Ｒ０１  ＡＩ４７７１７およびＲ０１  ＡＩ４８８５２の下での政府の支援を用いてなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
被験体が、培養中の細胞であるか、または治療遺伝子を受け取る必要がある動物モデルもしくはヒト被験体などの生物であるかに関わらず、細胞または生物における目的の配列の発現を移入かつ制御することがしばしば望ましい。ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターが、目的の配列を移入および／または発現するモードとして使用される場合、ウイルスはＡＩＤＳのための病原因子であるので、これらのベクターの使用の安全性に関する懸念が生じる。さらなる懸念には、細胞の癌遺伝子の挿入的活性化の可能性、ベクターまたは構築物が首尾よくかつ効果的にリボソームと結合する能力、およびベクターまたは構築物が核移入のために首尾よくシグナル伝達する能力が含まれる。今日まで、哺乳動物宿主または細胞において目的の配列を移入および／または発現する際の使用のために安全かつ有効であり、そして移入された目的の遺伝子または配列の発現の誘導と逆転の両方を行う重要な能力を提供するレンチウイルスベクターは作製されていなかった。
【０００４】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、これらは、これらの高いレベルの複雑性に基づき、増殖していない細胞のゲノムに組み込み、潜在性感染の過程として、それらの生活環を調節することができる。これらのウイルスには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶが含まれる。他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を有し、これらは、２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接されている。これらの遺伝子の各々は、最初に１つの前駆体ポリタンパク質として発現される複数のタンパク質をコードする。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックスキャプシドおよびヌクレオキャプシド）タンパク質をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、インテグラーゼ、およびプロテアーゼ）をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードし、加えて、ウイルスＲＮＡの核外移行の原因であるシス作用性エレメント（ＲＲＥ）を含む。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するために働く。ＬＴＲは、ウイルス複製のために必要なすべての他のシス作用性配列を含む。ゲノムの逆転写のために必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なキャプシド形成のために必要な配列（Ｐｓｉ部位）は、５’ＬＴＲに隣接している。キャプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）のために必要な配列がウイルスゲノムから失われている場合、結果は、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成を妨害するシス欠損である。しかし、得られる変異体は、すべてのビリオンタンパク質の合成をなお方向付けることが可能である。ＨＩＶなどのレンチウイルスの包括的な概説は、例えば、Ｆｉｅｌｄ’ｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編（１９９６）において提供される。
【０００５】
レンチウイルスベクターは種々の適用のために非常に有用であるが、遺伝子組換えを通して複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）が生成する可能性により、安全性の懸念を生じる。このような問題点を克服するために研究者達が試みてきた１つの方法は、ｇａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌを２つの部分：すなわち、１つはｇａｇ／ｇａｇ−ｐｒｏを発現するもの、およびもう１つはウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）の融合パートナーとして逆転写酵素およびインテグラーゼを発現するものに分割する、ＨＩＶに基づくパッケージング系（トランス−レンチウイルス）を構築することである。しかし、このような方法は、感染性ウイルスベクター粒子を産生する効率が理想よりもはるかに低かったので、欠点を有することが判明した。
【０００６】
組換えレトロウイルスを生成しない、効率的なレトロウイルスパッケージング細胞株、特に、レンチウイルスパッケージング細胞株を産生するためのさらなる方法および系は、大きな価値がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
細胞および生物への遺伝子の効率的な送達および制御された発現のために、遺伝子移入構築物または他の発現系、および遺伝子調節系を組み合わせることにより、上記に列挙した問題点に対する解決法が本発明において提供される。したがって、本発明は、例えば、高度に効率的なレンチベクター送達系を通して、宿主の効率的なトランスフェクションを提供し、ならびに目的の移入された配列を有する宿主への修飾因子（例えば、テトラサイクリンなどの抗生物質）の単純な投与によって、目的の移入された配列の発現のタイミングおよびレベルの精巧な制御を提供する。本発明は、齧歯類、霊長類、およびイヌなどのいくつかの種の宿主における分裂していない細胞のこの効率的なトランスフェクションおよび調節を達成するというさらなる利点を提供する。
【０００８】
本発明において、遺伝子移入構築物および発現系が提供される。本発明の遺伝子移入構築物および発現系はレンチウイルスベクターであり得る。これらの構築物は、哺乳動物宿主細胞に目的の配列を移入するために、これらの構築物を安全かつ有効にする種々の成分を含み、そしてさらに、誘導性かつ可逆的な遺伝子移入構築物を含む細胞または被験体への適切な修飾因子の投与によって、哺乳動物宿主細胞中に移入された目的の配列の発現に対して、大きな制御を発揮する極度に重要な能力を提供する。本発明の遺伝子移入構築物は以下の１つ以上を含み得る：自己不活化５’ＬＴＲ、調節因子応答性プロモーター、核内移行シグナル、調節因子応答性受容体をコードしている核酸と作動可能に結合されたプロモーター、ＲＮＡ安定化エレメント、または自己不活化３’ＬＴＲ。開示される遺伝子移入構築物は、分裂している細胞と分裂していない細胞の両方にＤＮＡをパッケージングおよび送達するのに有用である。本明細書に開示されるパッケージング構築物および移入構築物は、互いとの組み合わせにおいて使用することができ、そしてまた、他のパッケージング構築物および遺伝子移入構築物、系、および当該分野において公知である方法、ならびに本明細書に開示される系および方法と組み合わせて使用することができる。
【０００９】
本明細書において、標的細胞中の目的の配列を誘導性かつ可逆的に発現するための特異的遺伝子移入構築物、およびこれらの構築物を使用するための方法もまた提供される。哺乳動物被験体を治療するための発現系として、開示される遺伝子移入構築物を利用するエキソビボ方法がさらに提供される。目的の配列の発現の動物モデルを作製する方法もまた提供される。さらに、本発明は、本明細書に開示される遺伝子移入構築物または発現系を組み込むか、またはこれを含む細胞を提供する。したがって、偽型レンチベクターが、標準的なＤＮＡトランスフェクション技術に対して抵抗性である多くの細胞型を形質導入できるため、開示される遺伝子移入構築物は、安定な、誘導性／可逆性細胞株の構築を容易にする。
【００１０】
反対の方向で少なくとも２つの別々の配列の発現を駆動することができる二方向性プロモーターもまた提供される。開示される二方向性プロモーターは、本明細書に開示されるパッケージング構築物および遺伝子移入構築物とともに使用することもできる。
【００１１】
本明細書に記載される種々の遺伝子移入構築物を含む細胞株もまた提供される。
【００１２】
複製可能でない組換え体を生成可能である遺伝子移入構築物もまた、本明細書に開示される。
【００１３】
本明細書に記載される種々の遺伝子移入構築物を含む発現系もまた、本明細書に提供される。本明細書に記載される遺伝子移入構築物または発現系を含む細胞株、および本明細書に記載される方法によって作製された細胞もまた、提供される。
【００１４】
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程を含む、目的の遺伝子の発現を選択的に調節する方法もまた、提供される。
【００１５】
組換えタンパク質、抗体、およびトランスジェニック動物を作製する方法もまた、提供される。
【００１６】
ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージング構築物もまた、本発明で提供される。これらの構築物は安全であるが、本発明より前に利用可能であった構築物と比較して、パッケージング効率の改善を提供する。Ｇａｇ−ＰｒｏおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質の合成に必要とされる、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列における１つ以上の変異をさらに含む、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージング構築物もまた、本発明で提供される。
【００１７】
第１および第２の核酸配列を含むパッケージング構築物もまた本発明で提供され、第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質をコードし、第１および第２の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、第１および第２の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、そして第１および第２の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。
【００１８】
第１、第２、および第３の核酸配列を含むパッケージング構築物もまた本発明で提供され、第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質をコードし、そして第３の核酸配列はＶｐｒ−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードする。
【００１９】
ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌがトランスであるパッケージング構築物もまた本発明で提供され、Ｇａｇポリタンパク質をコードする核酸配列およびＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列が、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、Ｇａｇポリタンパク質をコードする核酸配列およびＧａｇ−Ｐｒｏポリタンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。
【００２０】
本明細書に記載される種々のパッケージング構築物を含む細胞株、パッケージング系、および発現系もまた提供される。本明細書に記載される発現系を含む細胞株もまた提供される。
【００２１】
選択的に、本明細書に記載されるパッケージング構築物は、複製可能でない組換え体を生成することが可能である。
【００２２】
ウイルス様粒子を作製する方法もまた提供される。
【００２３】
本明細書に記載される細胞株、パッケージング構築物、遺伝子移入構築物、パッケージング系、および発現系の作製方法および使用方法が、本発明でさらに提供される。
【００２４】
ウイルス粒子形成を調節する因子をスクリーニングする方法もまた、本発明で提供される。
【００２５】
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を含むワクチン、および本明細書に開示されるワクチンを被験体に投与する工程を含む、被験体における免疫応答を誘導する方法がさらに提供される。
【００２６】
したがって、本発明は、密接に調節された目的の配列の発現系と、効率的な目的の配列の送達系を首尾よく組み合わせ、そして、目的の配列の送達および発現の技術における顕著な進歩を表す。
【００２７】
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本明細書に記載するいくつかの局面を例証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および記載される前に、以下に記載される局面は、特定の合成方法または特定の投与方法に限定されず、そのようなものとして、当然、変化し得ることが理解される。本明細書で使用される命名法は特定の局面を記載する目的のみのためであり、限定であることを意図しないこともまた理解される。
【００２９】
明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、状況が明確に反対の意味を指示していない限り、複数形の言及を含むことを注記しなければならない。
【００３０】
全体を通して、「被験体」は個体を意味する。したがって、「被験体」は、ネコ、イヌなどの飼育されている動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験用動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、および鳥類を含み得る。１つの局面において、被験体は、霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。
【００３１】
「選択的な」または「選択的に」とは、引き続いて記載される事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、ならびにこの記載が、事象または状況が起こる場合、およびこれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「選択的に、組成物は１つの組み合わせを含み得る」という語句は、この組成物が、異なる分子の組み合わせを含み得るか、または１つの組み合わせを含まなくてもよいことを意味し、その結果、この記載は、組み合わせと組み合わせの非存在の両方を含む（すなわち、組み合わせの個々のメンバーを含む）。
【００３２】
「パッケージング細胞株」または「パッケージング細胞」という語句は、ウイルスＲＮＡをパッケージングし、複製可能なヘルパーウイルスを産生する能力が欠損しているウイルス粒子またはウイルス様粒子を産生するために必要なコーディング配列を含む細胞（代表的には、哺乳動物細胞株）をいう。パッケージング機能が細胞内で提供される場合、パッケージング細胞株またはパッケージング細胞は組換えレトロウイルスを産生し、それによって、「レトロウイルス産生細胞株」または「レトロウイルス産生細胞」となる。
【００３３】
「レトロウイルス」という用語は、任意の既知のレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのｃ型レトロウイルス）をいう。本発明の「レトロウイルス」には、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ならびにレトロウイルスのレンチウイルスファミリー、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）、および他のクラスのレトロウイルスもまた含まれる。
【００３４】
「Ｇａｇポリタンパク質」または「Ｇａｇタンパク質」、「Ｐｒｏポリタンパク質」または「Ｐｒｏタンパク質」、および「Ｐｏｌポリタンパク質」または「Ｐｏｌタンパク質」という用語は、代表的には、単一の前駆体「ポリタンパク質」として発現されるレトロウイルスのｇａｇ、ｐｒｏ、およびｐｏｌ遺伝子によってコードされる複数のタンパク質をいう。例えば、ＨＩＶ  ｇａｇは、他のタンパク質の中でも、ｐ１７、ｐ２４、ｐ７、およびｐ６をコードする。ＨＩＶ  ｐｒｏはウイルスプロテアーゼをコードする。ＨＩＶ  ｐｏｌは、他のタンパク質の中でも、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする。本明細書で使用される場合、「ポリタンパク質」という用語は、ｇａｇ、ｐｒｏ、またはｐｏｌポリタンパク質のすべてまたは一部を含むべきである。
【００３５】
「ベクター」または「構築物」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞の中に輸送することが可能である核酸配列をいう。「発現ベクター」という用語には、細胞による発現のために適切な型である（例えば、転写制御エレメントに連結されている）遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）が含まれる。プラスミドは一般的に使用されるベクターの型であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用される。さらに、本発明は、等価な機能を働かせる他のベクターを含むことが意図される。
【００３６】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、部分的にまたは完全に異種である、すなわち、それが導入される細胞に対して外来性である核酸配列（例えば、治療遺伝子）を意味し得る。
【００３７】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、それが導入される細胞の内因性遺伝子に対して部分的にまたは完全に同種であるが、ゲノムを変化させるような方法で細胞のゲノムに挿入されるように設計されている（例えば、これは、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入され、つまり、その挿入は「ノックアウト」となる）核酸配列もまた意味し得る。例えば、目的の配列は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡであり得る。
【００３８】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、それが導入される細胞の内因性遺伝子に対して部分的にまたは完全に相補的である核酸配列もまた意味し得る。例えば、目的の配列は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであり得る。
【００３９】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」は、選択された核酸の最適な発現のために必要であり得る１つ以上の転写調節配列および任意の他の核酸、例えば、イントロンもまた含み得る。「目的のタンパク質」は、目的の配列または目的の遺伝子から発現されるペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、治療タンパク質）を意味する。
【００４０】
「遺伝子移入構築物」とは、例えば、次いで、ウイルス粒子が目的の標的細胞を形質導入できるように、ウイルス粒子を産生するために他のレンチウイルスまたはトランス−レンチウイルスベクター系ベクターとともに代表的に使用される核酸配列をいう。
【００４１】
「に作動可能に連結される」という用語は、別の核酸配列との核酸の機能的関連性をいう。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、転写制御エレメントへのＤＮＡの作動可能な連結は、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、および転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的かつ機能的な関連性をいう。
【００４２】
「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、上記細胞の染色体ＤＮＡへの核酸の導入を含む、レシピエント細胞への核酸、例えば、発現ベクターの導入を意味する。
【００４３】
「ＲＮＡ搬出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質までのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントをいう。ＲＮＡ搬出エレメントの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ５８：４２３−４２６）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（例えば、Ｈｕａｎｇら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（７）：３８６４−３８６９；Ｈｕａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（５）：３１９３−３１９９；Ｈｕａｎｇら（１９９３）Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １３（１２）：７４７６−７４８６、および米国特許第５，７４４，３２６号を参照のこと、これらはすべて、ＲＮＡ搬出エレメントに関連するそれらの全体が参照により本明細書に援用される）。一般的に、ＲＮＡ搬出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１コピーまたは複数コピーとして挿入することができる。ＲＮＡ搬出エレメントは、本発明のパッケージング細胞株を生成する別々のベクターのいずれかまたはすべてに挿入することができる。
【００４４】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または、「約」別の特定の値までとして本明細書では表現することができる。このような範囲が表現される場合、別の実施形態には、１つの特定の値から、および／または、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する語「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。各々の範囲の終点は、他の終点と関連において、および他の終点とは独立しての両方で有意であることがさらに理解される。本発明に開示される多数の値が存在すること、および各値が、値それ自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書で開示されることもまた理解される。例えば、「１０」という値が開示されるならば、「約１０」という値もまた開示される。１つの値が開示される場合、その値「以下」、その値「以上」、および値の間の可能な範囲もまた開示されることもまた、当業者によって適切に理解されるように、理解される。例えば、「１０」という値が開示されるならば、「１０以下」ならびに「１０以上」もまた開示される。本願を通して、データは多数の異なる形式で提供されること、およびこのデータは、終点および出発点を表し、ならびにデータの点の任意の組み合わせの範囲を表すこともまた理解される。例えば、特定のデータ点である「１０」および特定のデータ点である「１５」が開示される場合、１０および１５よりも大きい、１０および１５以上、１０および１５より小さい、１０および１５以下、ならびに１０および１５に等しいことが、１０と１５の間と同様に開示されると見なされることが理解される。
【００４５】
「ウイルス様粒子」または「ウイルス粒子」とは、宿主細胞中で、以下のウイルス遺伝子、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｒｔ、ｉｎ、およびｅｎｖの少なくとも１つの発現によって産生されるタンパク質性のキャプシド様ビリオンをいう。産生される粒子は、好ましくは、遺伝子移入ベクターのｍＲＮＡ等価物をさらに含み、かつ感染性であり、または、形質導入される所定の細胞型にとって感染性になるように作製することができる。
【００４６】
組成物
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、前駆体ポリタンパク質ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌとして最初に発現される。出芽の間またはその後、これらのタンパク質は、ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によってそれらの成熟型にプロセスされる。５５ｋＤａ  Ｇａｇ前駆体は、マトリックス（ＭＡ）、キャプシド（ＣＡ）、スペーサーペプチドｐ２、ヌクレオキャプシド（ＮＣ）、スペーサーペプチドｐ１、およびｐ６を生成する。１６０ｋＤａ  Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質は、ＭＡ、ＣＡ、ｐ２、ＮＣ、ｐ６、ＰＲ、逆転写酵素（ＲＴ）、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を生成する。ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質は同じｍＲＮＡによってコードされるが、同じ速度では合成されない。頻繁でないリボソームフレームシフト事象は、およそ２０：１の比率のＧａｇ対Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌ産生を生じる。この比率の維持は、ウイルス粒子の形成および感染性のために決定的である。
【００４７】
Ｇａｇ単独の細胞内発現は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生するために十分である。さらに、ＲＮＡ−Ｇａｇ相互作用を経由して主に起こるゲノムＲＮＡのパッケージングおよび二量体形成との、アセンブリプロセスにおける、ＧａｇおよびウイルスゲノムＲＮＡ相互作用のための重要な役割が存在する。ＧａｇのＮＣドメインはウイルスＲＮＡに結合し、ＲＮＡパッケージングプロセスと二量体形成プロセスの両方を容易にすることが示されている。欠損性ウイルスＰＲを有するＨＩＶ−１はなおＲＮＡをパッケージングするので、ゲノムＲＮＡとＨＩＶ−１  Ｇａｇの間の初期の相互作用は、Ｇａｇ前駆体中のＮＣ配列を介して起こるらしい。さらに、野生型（ＷＴ）とＰＲ欠損性（ＰＲ−）のビリオンの分析により、ＨＩＶ−１の中でのゲノムＲＮＡの二量体形成はタンパク質分解性プロセシングの前に開始することが明らかにされており、このことは、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌ前駆体タンパク質が、タンパク質プロセシングとは独立して、ＲＮＡ二量体形成を補助し得ることを示す。
【００４８】
他のレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節的または構造的機能を有するいくつかの「アクセサリー」遺伝子を有する。具体的には、ＨＩＶ−１は、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆを含む、少なくとも６種のこのような遺伝子を保有する。密接に関連するＨＩＶ−２はＶｐｕをコードしないが、ＨＩＶ−１においては発見されていない、関連性のない別のタンパク質、Ｖｐｘをコードする。
【００４９】
ＨＩＶ−１  Ｖｐｒ遺伝子は１４ｋＤタンパク質（９６アミノ酸）をコードする（Ｍｙｅｒｓら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｍ．）。Ｖｐｒオープンリーディングフレームは、大部分のＨＩＶ−２ウイルスおよびＳＩＶウイルスにもまた存在する。ＨＩＶ−２  ＶｐｒとＶｐｘの間のアミノ酸比較は高い相同性の領域を示し、ＶｐｘがＶｐｒ遺伝子の二量体形成によって生じ得ることを示唆する。ＶｐｒおよびＶｐｘは、成熟ウイルス粒子中に複数コピーで存在し、ウイルスアセンブリに関与するｇａｇをコードする前駆体ポリタンパク質の一部であるｐ６タンパク質に結合することが示されてきた（ＷＯ  ９６／０７７４１；ＷＯ  ９６／３２４９４）。したがって、ウイルス粒子へのＶｐｒおよびＶｐｘの組み込みは、ｐ６との相互作用を経由して起こる（Ｌａｖａｌｌｅｅら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１９２６−１９３４；およびＷｕら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６１６１）。Ｖｐｒは、特に、ｐ６のカルボキシ末端領域と結合することがさらに示されてきた。ＨＩＶゲノムに関してトランスで発現されたＶｐｒおよびＶｐｘは、ＨＩＶウイルスに対する異種タンパク質を標的とするために使用し得る（ＷＯ  ９６／０７７４１；ＷＯ  ９６／３２４９４）。これらのタンパク質の全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびにそれらの結合ドメインを含む、ＶｐｒおよびＶｐｘの構造および機能の記載は、ＷＯ  ９６／０７７４１において、ならびにＺｈａｏら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９（２２）：１５７７（Ｖｐｒ）；Ｍａｈａｌｉｎｇｈａｍら、９１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０７：２９７（Ｖｐｒ）；およびＨｕら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３：６２４）（Ｖｐｘ）においてもまた提供される。Ｖｐｒに関連する他の関連参考文献には、例えば、Ｋｏｎｄｏら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６９：２７５９；Ｌａｖａｌｌｅｅら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１９２６；およびＬｅｖｙら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：５４１が含まれる。Ｖｐｘに関連する他の関連参考文献には、例えば、Ｗｕら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６１６１が含まれる。これらの参考文献は、ＶｐｒおよびＶｐｘの構造および機能のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００５０】
レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）タンパク質はプロウイルスの組み込みを触媒し、インビボでの感染状態の持続のために必須である。この決定的な酵素の理解、とりわけ、そのタンパク質構造および触媒的組み込み反応の生化学的メカニズムにおいて、顕著な進歩がなされてきた（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．１９９７．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，１６１−２０４頁．Ｊ．Ｍ．Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ．Ｈ．ＨｕｇｈｅｓおよびＨ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ（編），Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｙｄａ，Ｆ．，Ａ．Ｂ．Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｔ．Ｍ．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ａ．Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｒ．ＣｒａｉｇｉｅおよびＤ．Ｒ．Ｄａｖｉｅｓ．１９９４．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ：ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９８１−１９８６；Ｋａｔｚ，Ｒ．Ａ．およびＡ．Ｍ．Ｓｋａｌｋａ．１９９４．Ｔｈｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：１３３−１７３。これらのすべての参考文献は、ＩＮのタンパク質構造および触媒的組み込み反応の生化学的メカニズムのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。ＨＩＶ−１  ＩＮは、発現され、他のＧａｇ（マトリックス、キャプシド、ヌクレオキャプシド、およびｐ６）およびＰｏｌ（プロテアーゼ、逆転写酵素［ＲＴ］、およびＩＮ）成分を含むより大きな１６０ｋＤａ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体ポリタンパク質（Ｐｒ１６０Ｇａｇ−Ｐｏｌ）の一部としてウイルス粒子にアセンブルされる。アセンブリ後、Ｐｒ１６０Ｇａｇ−Ｐｏｌは、ウイルスプロテアーゼによってタンパク質分解的にプロセスされ、３２ｋＤａ  ＩＮタンパク質を含む個々のＧａｇおよびＰｏｌ成分を遊離する。複製しているウイルスを使用するＩＮ機能の研究は、ウイルスｃＤＮＡの組み込みを触媒することに加えて、ＩＮがウイルス複製に対して他の効果を有し得ることを示唆してきた（Ｇａｌｌａｙ，Ｐ．，Ｓ．Ｓｗｉｎｇｌｅｒ，Ｊ．Ｓｏｎｇ，Ｆ．ＢｕｓｈｍａｎおよびＤ．Ｔｒｏｎｏ．１９９５．ＨＩＶ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｓ  ｇｏｖｅｒｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ．Ｃｅｌｌ  ８３：５６９−５７６；Ｌｅａｖｉｔｔ，Ａ．Ｄ．，Ｇ．Ｒｏｂｌｅｓ，Ｎ．ＡｌｅｓａｎｄｒｏおよびＨ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ．１９９６．Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｒｅｔａｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｙｅｔ  ｆａｉｌ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７２１−７２８；Ｍａｓｕｄａ，Ｔ．，Ｖ．Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ，Ｐ．ＫｒｏｇｓｔａｄおよびＩ．Ｓ．Ｙ．Ｃｈｅｎ．１９９５．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕ３  ａｔｔ  ｓｉｔｅ：ｕｎｕｓｕａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６６８７−６６９６。これらのすべての参考文献は、ＩＮのタンパク質構造および触媒的組み込み反応の生化学的メカニズムのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。プロウイルスクローンを用いる研究において、ＩＮ遺伝子変異が複数のレベルでウイルス複製に影響を与え得ることが示されてきた。ＩＮ遺伝子の変異は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体タンパク質に影響を与えることができ、ならびに、アセンブリ、成熟、および他の引き続くウイルス事象を変化させることができる。ＩＮ遺伝子は、ウイルス粒子およびヌクレオタンパク質組み込み前複合体の中の成熟ＩＮタンパク質およびその組織化に影響を与えることもできる。それゆえに、このような変異は多面的であり、様々なメカニズムを通して、およびウイルス生活環の中の異なる段階において、ウイルス複製を変化させることができる。
【００５１】
逆転写はＲＴによって触媒され、逆転写はインビトロで組換えＲＴ、鋳型、およびプライマーを用いて起こり得るが、このプロセスはインビボではより複雑である。複製しているウイルスの状況において、ウイルスｃＤＮＡの完全な合成は、異なるタンパク質および核酸を寄せ集めることと同様に単純なものではない；むしろ、これは、多数の一過性構造を含む複雑な多段階プロセスである。感染細胞の中で、逆転写は、他のウイルス因子および細胞因子を含む核酸−タンパク質（ヌクレオタンパク質）複合体の状況で起こる。さらに、ウイルスｃＤＮＡの合成は、逆転写に先行する多数の分子事象の適切な実行に多くを依存している。
【００５２】
パッケージング構築物および遺伝子移入構築物が本明細書で開示される。組換えレトロウイルスベクターを産生するためのプロトコール、およびパッケージング細胞株を形質転換するためのプロトコールは当該分野において周知である［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４および他の標準的な実験用マニュアル；Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願  ＷＯ  ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願  ＷＯ  ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願  ＷＯ  ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願  ＷＯ  ９２／０７５７３。これらのすべての参考文献は、組換えレトロウイルス構築物およびベクターを産生するため、ならびに細胞株を形質転換するためのプロトコールのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、本発明において使用することができる適切なレトロウイルス配列は、商業的に利用可能な供給源から入手することができる。例えば、このような配列は、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭなどのレトロウイルスプラスミドの型で購入することができる。本発明のベクターの中で利用することができる適切なパッケージング配列もまた使用されており、これには、例えば、プラスミド、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、およびΨＡｍが含まれる。したがって、本発明は特定の実施形態（例えば、特定のレンチウイルスベクター）に関して記載されるべきであるが、本発明における使用のための他のレトロウイルスベクターが、本明細書に記載される指針に従って調製することができる。加えて、本明細書に開示される遺伝子移入ベクターは、本明細書に開示されるパッケージング系および発現系とともに使用することができる。
【００５３】
具体的には、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌをコードする核酸配列を含むパッケージング構築物が開示される。選択的に、このパッケージング構築物は第１および第２の核酸配列を含み、ここで、第１の核酸配列がＧａｇタンパク質をコードし、第２の核酸配列がＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌタンパク質をコードし、第１および第２の核酸配列が、各々、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、第１および第２の核酸配列が同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、第１および第２の核酸配列が、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。
【００５４】
第１の核酸配列がＧａｇタンパク質をコードし、第２の核酸配列がＧａｇ−Ｐｒｏタンパク質をコードし、第１および第２の核酸配列が、各々、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、第１および第２の核酸配列が同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、第１および第２の核酸配列が、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される、パッケージング構築物もまた開示される。この構築物中で、ポリＲＴおよびＩＮを通常コードする核酸配列が除去または変異され、その結果、ＰｏｌまたはＲＴ−ＩＮタンパク質は発現されない。Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を除去または変異させることは、遺伝子組換えを通して複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）を生成する可能性をさらに減少する。次いで、ＲＴおよびＩＮは、別個の構築物から（トランスで）発現させ得る。例えば、逆転写酵素およびインテグラーゼは、ウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）の融合パートナーとして発現させ得る。
【００５５】
第１、第２、および第３の核酸配列を含み、ここで、第１の核酸配列がＧａｇタンパク質をコードし、第２の核酸配列がＧａｇ−Ｐｒｏタンパク質をコードし、第３の核酸配列がＶｐｒ逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードする、パッケージング構築物もまた本明細書で開示される。さらに、第１および第２の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み得、第１、第２、および第３の核酸配列が同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現され、第１、第２、および第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。この構築物中で、Ｐｏｌタンパク質をコード可能である核酸配列を除去または変異することができ、その結果、Ｐｏｌタンパク質は発現されない。逆転写酵素およびインテグラーゼは、Ｖｐｒ逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質をコードする核酸配列によってトランスで供給することができる。
【００５６】
Ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮを制御するためにさらに下流に配置されているＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ様エレメントもまた、本明細書で開示される。ＩＲＥＳおよびＩＲＥＳ様エレメントは以下に記載される。例えば、第１または第２の核酸配列と、第３の核酸配列の間のエレメントをさらに含み、第３の核酸配列が第１の核酸配列と第２の核酸配列の間に配置されておらず、このエレメントが、第１または第２の核酸配列と、第３の核酸配列の間の示差的発現を提供する、パッケージング構築物が開示される。例には、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントが含まれる。この方法とともに有用であるＩＲＥＳおよびＩＲＥＳ様エレメントが本明細書に記載される。ＩＲＥＳは、例えば、ＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳ、ＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳ、または異なる起源のＩＲＥＳであり得る。使用することができるＩＲＥＳの他の例には、ｈｔｔｐ：／／ｉｆｒ３１ｗ３．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ／ＩＲＥＳｄａｔａｂａｓｅ／におけるＩＲＥＳデータベース中に存在するＩＲＥＳが含まれるがこれに限定されない。
【００５７】
ｒｅｖ応答性エレメントを含む核酸配列をさらに含むパッケージング構築物もまた開示される。
【００５８】
事実上、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質は、部分的に重複するオープンリーディングフレームによってコードされる。Ｇａｇはそれ自体の開始コドンおよび終止コドンを有するのに対して、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体の合成は、Ｇａｇの翻訳のそれの約５〜１０％の頻度で起こるフレームシフト事象に起因する。他のレトロウイルスもまた、Ｇａｇ−ＰｏｌまたはＧａｇ−Ｐｒｏタンパク質の発現を調節するために、同様のフレームシフトメカニズムまたはリードスルー抑制メカニズムを使用する。したがって、細胞内Ｇａｇ／Ｇａｇ−Ｐｏｌ比率は、すべてのレトロウイルスの複製の間に調節される。ＨＩＶフレームシフト部位（ヘプタヌクレオチドＡＵ−リッチ配列）は、ヌクレオキャプシド（ＮＣ）コード配列の３’末端に見い出される。すぐ下流のこの部位およびステム構造は、Ｇａｇの合成の間にリボソームを失速させ、リボソームが１ヌクレオチド逆流して、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質の頻繁でない（Ｇａｇと比較して）合成を可能にさせる。
【００５９】
Ｇａｇタンパク質の多量体形成はウイルス粒子を生じるのに対して、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体タンパク質の発現は、ウイルス酵素が、ウイルスアセンブリの間にウイルス粒子に組み込まれることを確実にする。細胞からのビリオンの放出の間および放出後、Ｇａｇ前駆体タンパク質は、ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によって、成熟タンパク質：マトリックス、キャプシド（ＣＡ）、ＮＣ、ｐ６、ならびに２つのスペーサーペプチド、ｐ２およびｐ１に切断され、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合物は切断されて、マトリックス、ＣＡ、ｐ２、およびＮＣ、ならびにトランスフレームタンパク質，ＰＲ、逆転写酵素（ＲＴ）、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を生じる。
【００６０】
Ｇａｇ前駆体タンパク質単独の合成は、ウイルス様粒子のアセンブリおよび放出のために十分であることが報告されてきた。Ｇａｇ−Ｐｏｌまたはその成熟産物のビリオンへの組み込みは、感染した細胞におけるウイルスｃＤＮＡの合成および組み込みをそれらが媒介するので、感染性のために必要である。加えて、ＰＲによる前駆体タンパク質の切断は、ビリオンコアの形態学的成熟および感染性ウイルス粒子の生成のために必要である。ウイルスゲノムＲＮＡもまた、アセンブリの間にビリオンにパッケージされ、ゲノムの５’末端の近傍で見い出されるゲノムＲＮＡパッケージング配列、およびＧａｇのＮＣドメインとの相互作用によって駆動される。
【００６１】
他のレトロウイルスと同様に、ＨＩＶ−１は、例えば、二量体ＲＮＡゲノムを有する。ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡのインビトロ二量体分析は、二量体開始配列を名付けられた５０〜６０ヌクレオチド配列にマッピングされ、これは、二量体ＲＮＡ複合体の形成のために重要である。二量体開示配列中の変異は、ゲノムＲＮＡ二量体形成およびビリオンＲＮＡパッケージングを妨害し、非感染性ウイルス粒子の産生を生じる。ＲＮＡ二量体形成は、ＨＩＶ−１におけるＲＮＡパッケージングのために必須であり、ゲノムＲＮＡのビリオンパッケージングおよびＲＮＡ二量体形成もまた他のレトロウイルスと関連していると考えられている。ＰＲ欠損性ＨＩＶ−１ビリオンからのＲＮＡ二量体は、野生型成熟ＨＩＶ−１からの二量体よりも熱安定性が低い。モロニーマウス白血病ウイルスに関する同様の観察もまた報告されている。
【００６２】
Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体単独の発現は感染性レトロウイルス粒子の産生のためには不十分であるが、ウイルス複製サイクルに関するＧａｇ／Ｇａｇ−Ｐｏｌ比率およびＲＮＡ二量体形成の影響は決定的な因子である。ビリオン産生細胞におけるＧａｇ／Ｇａｇ−Ｐｏｌ比率が、感染性ウイルス粒子の生成およびビリオンＲＮＡ二量体の安定性のために重要であることが示されてきた（Ｘｈｉｌａｇａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１，１８３４−１８４１頁．Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．４）。
【００６３】
Ｇａｇタンパク質およびＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質の比率が、約９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１，６  ８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、６０：４０、または任意の介在する比率であるパッケージング系が本明細書で開示される。
【００６４】
加えて、Ｐｏｌタンパク質を発現可能である核酸配列を欠く、レンチウイルスベースのパッケージング構築物は、Ｖｐｒ−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を（シスで）発現可能である核酸配列を選択的に含み得る。代替として、Ｐｏｌタンパク質を発現可能である核酸配列を欠くパッケージング構築物を含む、レンチウイルスベースのパッケージング系はまた、Ｖｐｒ−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を（トランスで）発現可能である別個の核酸配列を含み得る。
【００６５】
本明細書に開示される遺伝子移入構築物は目的の配列を含み得る。この遺伝子移入構築物は、マーカーをコードする配列も含み得る。例えば、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。選択的に、この遺伝子移入構築物は、２つ、３つ、４つ、５つなどの目的の配列を含み得る。目的の配列は、同じまたは異なることが可能であり、別個の転写制御エレメントに作動可能に連結することが可能であり、または、別の目的の配列、マーカーコード配列、もしくは調節因子配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結することが可能である。例えば、本明細書に開示される発現系において、遺伝子移入構築物は、第３、第４、第５、またはより高度な順番の選択された目的の核酸配列を含むことができ、ここで、第７の核酸配列は、第３、第４、第５、またはより高度な順番の選択された目的のタンパク質をコードすることができる。
【００６６】
遺伝子移入構築物は、目的の配列の３’に位置するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントをさらに含み得る。これらの遺伝子移入構築物は、本明細書の他の箇所で議論される１つ以上の長末端反復（ＬＴＲ）配列もまた含み得る。
【００６７】
これらの遺伝子移入構築物、ならびに本明細書に開示される他の構築物もまた、自己不活化（ＳＩＮ）であり得る。ＳＩＮベクターは、組み込まれた移入ベクタープロウイルスＤＮＡのいくつかのシス作用性配列を不活性にするために、ウイルス逆転写酵素の独特な特性を利用する新世代のレトロウイルスベクターである。これらの配列は、ＬＴＲ中で見い出されるウイルスプロモーターならびに組み込まれたベクタープロウイルスＤＮＡ中に存在する任意のパッケージング配列を含み得る。ＳＩＮベクターを作製するためのいくつかのストラテジーが利用可能であり、当該分野で周知である。例えば、スプリットイントロンストラテジーのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＨｕｍａｎＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｒａｂ  Ｗｏｒｌｄ：Ｕｎｉｔｅｄ  Ａｒａｂ  Ｅｍｉｒａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｇｓ．ｏｒｇ．ａｅ／ｃｂｃ１０１ｖ．ｐｄｆにおいて利用可能である）においてＴａｈｉｒ  Ａ  Ｒｉｚｖｉによって記載されているような「スプリットイントロン」ストラテジーを使用することができる。「スプリットイントロン」ストラテジーは、効率的な真核生物スプライス部位の組み込みを使用して、組み込まれるベクタープロウイルスＤＮＡからパッケージング配列を欠失させ、ウイルスタンパク質によってさらにパッケージングおよび増殖され得るＲＮＡを生成することを不可能にする。このことは、偶発的にまたはさもなくばレトロウイルスベクター形質導入細胞中に存在し得る任意の内因性または外因性ウイルスとの、ベクターＲＮＡの任意の潜在的な組換えの可能性を除外する。さらに、遺伝子移入構築物は、３’の長い末端反復配列中に選択的に変異を含み得る。プロモーター配列もまた、５’または３’の長い末端反復配列の代わりに置換することができる。
【００６８】
加えて、本明細書に開示される発現系は、目的の配列とマーカーをコードする配列の間のエレメントを有する、目的の配列およびマーカーをコードする配列を含む遺伝子移入構築物を含み得、ここで、このエレメントは、目的の配列およびマーカーをコードする配列の示差的発現を提供する。目的の配列とマーカーをコードする配列の間のエレメントは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または内部リボソーム侵入部位様エレメント（ＩＲＥＳ様）であり得る。ＩＲＥＳおよびＩＲＥＳ様エレメントは、本明細書の他の箇所で議論される。遺伝子移入構築物はまた、少なくとも１つの転写制御エレメントを含み得、これは本明細書の他の箇所で議論される。遺伝子移入構築物中に存在する転写制御エレメントはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、調節可能でもあり得る。遺伝子移入構築物はまた、調節因子配列を含み得、または調節因子配列は、本明細書に記載されるような別個の調節因子構築物によって供給することができる。
【００６９】
さらに、遺伝子移入構築物は、マーカーをコードする配列および目的の配列を含み得、ここで、マーカーをコードする配列および目的の配列は、同じまたは異なる転写制御エレメント（ＴＣＥ）に作動可能に連結される。例えば、目的の配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結され、マーカーをコードする配列が第２の転写制御エレメントに作動可能に連結されている遺伝子移入構築物が本明細書で開示される。１つの例において、第１の転写制御エレメントは、第２の転写制御エレメントよりもより強力であり得る。このような配置において、第２のＴＣＥに作動可能に連結された、マーカーをコードする配列の発現は、第２のＴＣＥに作動可能に連結された、目的の配列の発現よりも高い。例えば、第１のＴＣＥに連結された、マーカーをコードする配列と、第２のＴＣＥに作動可能に連結された、目的の配列の間の発現の比率は、９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１，６  ８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、または６０：４０であり得る。
【００７０】
さらに、反対の方向である２つのプロモーター、ならびに二方向性プロモーターを含む遺伝子移入構築物が開示される。例えば、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、反対の方向で発現させることができる。別の例において、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、反対の方向で発現させることができる。さらに、目的の配列は、第１の転写制御エレメントに作動可能に連結することができ、マーカーをコードする配列は、第２の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。第１の転写制御エレメントおよび第２の転写制御エレメントは同じであり得、または異なり得る。さらに、少なくとも１つの転写制御エレメントは調節可能であり得る。また、目的の配列およびマーカーをコードする配列は、調節可能であり得る、単一の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。単一の転写制御エレメントは、調節可能である二方向性プロモーターであり得る。
【００７１】
第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含むベクターを含み、ここで、第１の核酸配列が、第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、第２の核酸配列が、第２の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ第１の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、第３の核酸配列が、第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子配列を含み、第１および第２の転写制御エレメントが反対の方向に配向している、遺伝子移入構築物が具体的に開示される。
【００７２】
第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列を含むベクターを含み、ここで、第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列が、単一の転写制御エレメントに作動可能に連結されており、第１の核酸配列が目的の配列を含み、第２の核酸配列が、第１の核酸配列の発現を制御可能であるポリペプチドをコードし、第３の核酸配列が、第１の転写制御エレメントに作動可能に連結されている調節因子配列を含み、転写制御エレメントが第１および第２の核酸配列の発現を駆動可能である、遺伝子移入構築物もまた開示される。
【００７３】
遺伝子移入構築物のベクターはウイルスベクターであり得、ウイルスベクターは、選択的に、自己不活化ベクターであり得る。さらに、遺伝子移入ベクターの第１の核酸配列の発現は、調節可能であり得る。
【００７４】
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を含む細胞および細胞株もまた開示される。
【００７５】
ＲＮＡ搬出エレメントを選択的に含む構築物もまた開示される。「ＲＮＡ搬出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質までのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントをいう。ＲＮＡ搬出エレメントの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ５８：４２３−４２６）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（例えば、Ｈｕａｎｇら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（７）：３８６４−３８６９；Ｈｕａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（５）：３１９３−３１９９；Ｈｕａｎｇら（１９９３）Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １３（１２）：７４７６−７４８６、および米国特許第５，７４４，３２６号を参照のこと。これらの参考文献は、ＲＮＡ搬出エレメントのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。一般的に、ＲＮＡ搬出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１コピーまたは複数コピーとして挿入することができる。ＲＮＡ搬出エレメントは、本発明のパッケージング細胞株を生成する別個のベクターのいずれかまたはすべてに挿入することができる。
【００７６】
本明細書に開示される構築物は、Ｔａｔをコードする核酸配列を選択的に含み得る。Ｒｅｖをコードする核酸配列を選択的に含み得る構築物もまた開示される。上記ＴａｔおよびＲｅｖをコードする核酸配列は、上記ＧａｇまたはＧａｇ−Ｐｏｌをコードする核酸配列の一部、またはそれとは別個であるかのいずれかであり得る。ＴａｔおよびＲｅｖをコードする核酸配列は、それぞれ、転写レベルおよび翻訳レベルで、ＨＩＶ遺伝子発現を調節する。例えば、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）の弱い基礎転写活性に起因して、プロウイルスの発現は、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆタンパク質をコードする、少量の多重スプライシング転写物を生じる。Ｔａｔは、新生ＲＮＡの中のステム−ループ構造（トランス活性化応答性エレメント［ＴＡＲ］）に結合することによって、ＨＩＶ転写を劇的に増加し、それによって、ポリメラーゼＩＩ複合体による転写伸長を刺激するサイクリン−キナーゼ複合体を補充する。
【００７７】
具体的には、Ｒｅｖは、すべてスプライスされていないウイルスｍＲＮＡおよび不完全にスプライスされているウイルスｍＲＮＡの一部である、そのＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）ＲＮＡ標的配列に直接的に結合する、核細胞質シャトルタンパク質である。多量体形成および引き続く細胞補因子との相互作用に際して、Ｒｅｖは、核エンベロープを横切るこれらのｍＲＮＡの移行を促進し、後期ウイルスタンパク質の産生に導く。
【００７８】
Ｒｅｖは、ＨＩＶ転写物のエンベロープコード領域において天然に見い出されるＲＮＡモチーフ（ＲＲＥ）と、細胞核搬出機構の成分との間の接続因子として働くことによってこの効果を達成する。Ｒｅｖ結合配列は、インビトロもしくはインビボでＲｅｖに（典型的にはＲＮＡに）特異的に結合する核酸、またはインビトロもしくはインビボでＲｅｖに（すなわち、ＲＮＡもしくはＤＮＡに）特異的に結合する核酸である。いくつかの学術論文が、Ｒｅｖ結合をモニターするためのインビトロ結合アッセイを記載しており、これには、Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら（１９９１）Ｖｉｒａｌ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ（Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ編；ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  ＡＩＤＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １），３１１−３２２頁、および、ヒト血液を含む生物学的サンプル中でのＲｅｖの検出のためのゲル移動度シフトアッセイおよびフットプリントアッセイを記載する、この論文中で引用されている参考文献が含まれる。これらの参考文献は、Ｒｅｖ結合をモニターするための結合アッセイのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００７９】
本明細書に開示される構築物は、ＲＲＥを含む核酸配列を選択的に含み得る。ＲＲＥは、ＨＩＶ転写物のエンベロープコード領域において見出され、細胞核搬出機構の成分である。上記に議論したように、ＲＲＥおよびＲｅｖの多量体形成および引き続く複数の細胞補因子との相互作用に際して、核エンベロープを横切るこれらのウイルスｍＲＮＡの移行が起こり得る。
【００８０】
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および内部リボソーム侵入部位様エレメントもまた開示される。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、翻訳開始コドンの上流にあるいくつかの真核生物およびウイルスのメッセンジャーＲＮＡ上への４０Ｓリボソームサブユニットの内部侵入を媒介することが可能であるシス作用性ＲＮＡ配列である。ＩＲＥＳの配列は非常に多様であり、かつｍＲＮＡの増えつつあるリストに存在しているが、ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳ機能のために必須であるらしい保存性Ｙｎ−Ｘｍ−ＡＵＧ単位（Ｙ、ピリミジン；Ｘ、ヌクレオチド）を含む。新規なＩＲＥＳ配列は、毎年、公的なデータベースに継続して加え続けられており、未知のＩＲＥＳ配列のリストは、確実にさらにより大きい。
【００８１】
ＩＲＥＳ様エレメントもまた、翻訳開始コドンの上流にあるいくつかの真核生物およびウイルスのメッセンジャーＲＮＡ上への４０Ｓリボソームサブユニットの内部侵入を媒介することが可能であるシス作用性配列である。ＩＲＥＳエレメントとは異なり、ＩＲＥＳ様エレメントにおいては、ＩＲＥＳ機能のために必須であるらしいＹｎ−Ｘｍ−ＡＵＧ単位（Ｙ、ピリミジン；Ｘ、ヌクレオチド）は必要とされない。
【００８２】
本明細書に開示される構築物は、選択的に、ＩＲＥＳおよびＩＲＥＳ様エレメントを含み得る。例えば、本明細書に開示されるパッケージング構築物は、第１の核酸配列と第２の核酸配列の間のエレメントをさらに含み得、ここで、このエレメントは、第１の核酸配列および第２の核酸配列の示差的発現を提供する。さらなる例において、第１の核酸配列と第２の核酸配列の間のエレメントは、内部リボソーム侵入部位または内部リボソーム侵入部位様エレメントであり得る。さらなる例において、本明細書に開示されるパッケージング構築物は、第１の核酸配列または第２の核酸配列と、第３の核酸配列の間のエレメントをさらに含み得、ここで、第３の核酸配列は、第１の核酸配列と第２の核酸配列の間に位置せず、このエレメントは、第１の核酸配列または第２の核酸配列と、第３の核酸配列の間の示差的発現を提供する。
【００８３】
ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ様エレメントは、天然に存在し得るかまたは天然に存在し得ない。ＩＲＥＳの例には、ｈｔｔｐ：／／ｉｆｒ３１ｗ３．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ／ＩＲＥＳｄａｔａｂａｓｅ／におけるＩＲＥＳデータベース中に存在するＩＲＥＳが含まれるがこれに限定されない。ＩＲＥＳの例には、ＥＭＣ−ウイルスＩＲＥＳまたはＨＣＶ−ウイルスＩＲＥＳもまた含まれるがこれらに限定されない。加えて、ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ様エレメントは変異させることができ、ここで、ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ様エレメントの機能は保持される。
【００８４】
転写制御エレメント（ＴＣＥ）もまた開示される。ＴＣＥは、それらに作動可能に連結された核酸配列の発現を駆動可能であるエレメントである。本明細書に開示される構築物は、少なくとも１つのＴＣＥを含む。ＴＣＥは、選択的に、構成的または調節可能であり得る。
【００８５】
反対方向に配向されている第１および第２の転写制御エレメントを含み、ここで、１つの転写制御エレメントの活性が、他の転写制御エレメントの活性に影響を与えることができる構築物もまた開示される。選択的に、２つの転写制御エレメントは並列させることができ、またはリンカー配列は、第１の転写制御エレメントと第２の転写制御エレメントとの間に配置することができる。例えば、リンカー配列は染色体インシュレーター（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）であり得る。
【００８６】
調節可能なＴＣＥは、調節因子構築物から発現される融合タンパク質の結合ドメインに結合されることが可能である核酸配列を含み得、その結果、転写抑制ドメインは、調節可能なＴＣＥの中に含まれる核酸配列の転写を抑制するように作用する。
【００８７】
調節因子構築物および調節因子配列もまた開示される。調節因子構築物は、調節因子配列を含む構築物であり得る。調節因子配列は、調節因子標的配列に作動可能に連結された配列の発現を制御可能である配列であり得る。例えば、調節因子配列は、本明細書の他の箇所に記載される核酸構築物中の調節因子標的配列に作動可能に連結された核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコード可能である配列であり得る。例えば、調節因子構築物は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写抑制ドメインを含む、薬物制御可能な（例えば、薬物誘導可能な）抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列を含む構築物であり得る。代替として、調節可能なＴＣＥを含む構築物は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写抑制ドメインを含む、薬物制御可能な（例えば、薬物誘導可能な）抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列をさらに含むことができる。このような配置において、薬物制御可能な（例えば、薬物誘導可能な）抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列は、抑制因子融合タンパク質が結合する調節可能なＴＣＥと同じ構築物上にある。例えば、パッケージング構築物および遺伝子移入構築物は、薬物制御可能な（例えば、薬物誘導可能な）抑制因子融合タンパク質をコード可能な核酸配列と、抑制因子融合タンパク質が結合する調節可能なＴＣＥの両方を含み得る。
【００８８】
本明細書を通して議論されるように、本明細書に開示される構築物は、調節因子配列、調節因子標的配列を含む調節可能なＴＣＥ、またはその両方を含み得る。調節因子構築物は、テトラサイクリン抑制因子（ｔｅｔＲ）またはｔｅｔＯ配列に結合できるテトラサイクリン活性化因子（ｔｅｔＡ）（さもなくば、リバースｔｅｔＲ−ＶＰ１６として知られる）タンパク質をコード可能である調節因子配列を含み得る。ｔｅｔＯ配列はＴＣＥの中にあり得る。調節因子構築物は、ＳＶ４０核局在化シグナルなどの核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。例えば、制御因子構築物は、配列番号１の配列を含み得る。さらに、調節因子構築物は、１つ以上のＶＰ１６最小トランス活性化ドメインを選択的に含み得る。例えば、制御因子構築物は、配列番号２または配列番号３の配列を含み得る。ｔｅｔＲ−ＶＰ１６はまた、「ｔｅｔ−オフ」と呼ぶことができる。リバースｔｅｔＲ−ＶＰ１６はまた、「ｔｅｔ−オン」と呼ぶことができる。
【００８９】
調節因子構築物は、ｔｅｔＲタンパク質とｔｅｔＡタンパク質の間のヘテロ二量体の形成を妨害するための、ｔｅｔＲとｔｅｔＡの変更バージョンを選択的に含み得る。ｔｅｔＲとｔｅｔＡの変更バージョンは、独立しているかまたは組み合わせたかのいずれかである、ＥおよびＢｔｅｔオペレーターＤＮＡ結合ドメインを含み得る。例えば、調節因子構築物は、配列番号４または配列番号５の配列を含み得る。
【００９０】
調節可能なＴＣＥは、調節因子標的配列を選択的に含み得る。調節因子標的配列は、調節因子構築物から発現される融合タンパク質の結合ドメインに結合可能である核酸配列を含むことができ、その結果、転写抑制ドメインは、調節可能なＴＣＥの中に含まれる核酸配列の転写を抑制するように働く。調節因子標的配列は、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得る。調節因子標的配列は、ＴＡＴＡボックスまたはＧＡＬ−４をコードする核酸配列を含むがこれらに限定されない他の配列に作動可能に連結することができる。
【００９１】
本明細書に記載される遺伝子移入構築物は、第２の調節因子配列を選択的に含み得る。例えば、本明細書に記載するような遺伝子移入構築物は、第２の調節因子配列および第２の目的の配列に作動可能に連結された第２のＧＡＬ−４をコードする核酸配列を選択的に含み得、ここで、第２の目的の配列は第３の転写制御エレメントに作動可能に連結され、第２の目的の配列は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群より選択され、第２の調節因子配列は、第２のＧＡＬ−４をコードする核酸配列と、第２の目的の配列の間に位置する。
【００９２】
調節可能なＴＣＥおよび調節因子配列の存在は、これらが同じ構築物上にあるか、または異なる構築物上にあるかに関わらず、調節可能なＴＣＥに作動可能に連結された配列の誘導性かつ可逆的発現を可能にする。このようなものとして、調節可能なＴＣＥは、目的の配列の発現を選択的に誘導および逆転するための手段を提供する。
【００９３】
調節可能なＴＣＥは、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンによって調節可能であり得る。さらに、ＴＣＥは、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列を選択的に含み得る。１つの例において、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスに作動可能に連結することができる。
【００９４】
さらに、ＴＣＥは、本明細書の他の箇所に記載されるように、プロモーターであり得る。本明細書に開示されるパッケージング構築物とともに有用であるプロモーターの例は、本明細書を通して与えられる。例えば、プロモーターには、ＣＭＶベースのプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０ベースのプロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、ｍＨ１プロモーター、ｈＨ１プロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、Ｕ６プロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはＥＦ−１αプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【００９５】
加えて、本明細書に開示されるＴＣＥは、互いに作動可能に連結される１つ以上のプロモーター、プロモーターの一部、または互いに作動可能に連結されるプロモーターの一部を含み得る。例えば、転写制御エレメントは、ＣＭＶプロモーターの３’部分、ＣＭＶプロモーターの５’部分、β−アクチンプロモーターの一部、またはＣＡＧプロモーターに作動可能に連結された３’ＣＭＶプロモーターを含み得るがこれらに限定されない。
【００９６】
哺乳動物宿主細胞中でベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ウイルスのゲノム、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および大部分の好ましいサイトメガロウイルスから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーターから入手することができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に入手することができる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８）、これは、ウイルスプロモーターについてその全体が参照により本明細書に援用される）。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして好都合に入手することができる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５  ３６０（１９８２）これは、ウイルスプロモーターについてその全体が参照により本明細書に援用される）。当然、宿主細胞または関連する種からのプロモーターもまた本明細書で有用であり、組織特異的遺伝子発現および組織特異的に調節される遺伝子発現のために使用することができる。引用される参考文献は、プロモーターのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００９７】
「エンハンサー」とは、一般的には、転写開始部位から固定されていない距離で機能するＤＮＡの配列をいい、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得る。引用される参考文献の各々は、エンハンサーのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。さらに、エンハンサーは、イントロンの中に（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））、ならびにコード配列それ自体の中に（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））あり得る。引用された参考文献の各々は、エンハンサーの潜在的な位置のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。これらのエンハンサーは通常１０から３００ｂｐ長の間であり、これらはシスで機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答性エレメントを含む。プロモーターはまた、転写の調節を媒介する応答性エレメントを含み得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。今日、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られているが、代表的には、一般的な発現のために真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００  ２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【００９８】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能の引き金を引く、光または特異的化学的事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。γ照射などの照射、またはアルキル化化学療法薬物への曝露によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強するための方法もまた存在する。
【００９９】
特定の実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、発現される転写単位の領域の発現を最大化するために、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物において、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、たとえそれが特定の時点で特定の型の細胞において発現されるのみであるにしても、すべての真核生物細胞型で活性である。この型の好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーターである（６５０塩基）。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０１００】
二方向性制御エレメントもまた開示される。例えば、ＣＡＧプロモーターの５’末端に融合されたＣＭＶプロモーターの３’末端を含む二方向性転写制御エレメントが本明細書に開示される。ヒトＥＦ−１αプロモーターの５’末端に誘導されたＣＭＶプロモーターの３’末端を含む二方向性転写制御エレメントもまた本明細書に開示される。ＣＡＧプロモーターの５’末端に融合されたマウスＨ１プロモーターの５’を含む二方向性転写制御エレメントもまた本明細書に開示される。ＳＶ４０プロモーターの５’末端に融合されたＣＭＶプロモーターの３’末端を含む二方向性転写制御エレメントもまた本明細書に開示される。本明細書の他の箇所に開示される転写制御エレメントとしての二方向性転写制御エレメントは、調製可能または構成的であり得る。ｅｆ１αプロモーターの５’末端に融合されたＣＭＶプロモーターの５’末端を含む二方向性転写制御エレメントもまた開示される。
【０１０１】
二方向性転写制御エレメントは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号５１に示される配列を含み得る。二方向性転写制御エレメントはまた、調節因子標的配列を含み得、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの抗生物質によって調節することができる。
【０１０２】
すべての特異的調節エレメントは、クローニングし、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用できることが示されてきた。グリア細胞繊維性酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア細胞起源の遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。
【０１０３】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）において使用される発現ベクターもまた、ｍＲＮＡ発現に影響を与えることができる転写の終結のために必要である配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。この３’非翻訳領域もまた、転写終結部位を含む。転写単位もまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、ｍＲＮＡのように転写単位がプロセスされ、かつ輸送される可能性をこれが増加させることである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物中で使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約４００塩基からなる。転写単位は、構築物からの発現、またはその安定性を改善するために、単独で、または上記の配列と組み合わせた、他の標準的な配列を含むこともまた好ましい。
【０１０４】
Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒する、バクテリオファージＰ１からのＩ型トポイソメラーゼである（Ａｂｒｅｍｓｋｉ，Ｋ．およびＨｏｅｓｓ，Ｒ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１５０９−１５１４、これは、Ｃｒｅリコンビナーゼの構造および機能のその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される）。この酵素はエネルギー補因子を必要とせず、Ｃｒｅ媒介性組換えは、基質と反応生成物の間の平衡に達する（Ａｂｒｅｍｓｋｉ，Ｋ．ら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３２，１３０１−１３１１、これは、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用のメカニズムの教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される）。ｌｏｘＰ認識エレメントは、方向性を付与する８ｂｐスペーサー領域に隣接する２つの１３ｂｐ逆反復から構成される、３４塩基対（ｂｐ）配列である（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄ．およびＦｅｉｌ，Ｒ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，４７０−４７６、これは、ｌｏｘＰ認識エレメントおよびＣｒｅリコンビナーゼの作用におけるそれらの役割のその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される）。組換え生成物は、ｌｏｘＰ部位の位置および相対的配向に依存する。単一のｌｏｘＰ部位を含む２つのＤＮＡ種は融合させることができる。直接的に反復するｌｏｘＰ部位の間のＤＮＡは環状型で切除されるのに対して、対向するｌｏｘＰ部位間のＤＮＡは、外部配列に関して反転される。
【０１０５】
本明細書に記載される遺伝子移入構築物の転写制御エレメントに作動可能に連結された核酸配列の発現もまた、Ｃｒｅリコンビナーゼによって調節することができる。例えば、遺伝子移入構築物は、第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列、および選択マーカーをコード可能である核酸配列を含む調節因子標的配列を含み、第１の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された目的の配列を含み、第２の核酸配列が第２の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ第１の核酸配列の発現を制御するポリペプチドをコードし、第３の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結された調節因子配列を含み、調節因子標的配列もまた、第１の転写制御エレメントに作動可能に連結され、かつ第１の転写制御エレメントと第１の核酸配列の間に位置している、ベクターを含み得る。このような配置において、調節因子標的配列は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列にさらに連結することができる、ＴＡＴＡ配列によって隣接させることができる。付随する配列を有する調節因子標的配列は、ｌｏｘＰ部位によってさらに隣接させることができ、その結果、Ｃｒｅ媒介性組換えの際に、調節因子標的配列は切除され、目的の配列は、第１の転写制御エレメントと融合させることができ、目的の配列の発現を可能にする。
【０１０６】
第１の核酸配列が第１の転写制御配列に作動可能に連結され、第２の核酸配列が第２の転写制御配列に作動可能に連結されているパッケージング構築物もまた本明細書に開示される。第１の核酸配列および第２の核酸配列が第１の転写制御エレメントに作動可能に連結され、第３の核酸配列が第２の制御エレメントに作動可能に連結されているパッケージング構築物もまた開示される。
【０１０７】
選択的に、第１の制御エレメントは第２の転写制御エレメントよりも強力であり得る。このような配置において、第１のＴＣＥに作動可能に連結された配列の発現は、第２のＴＣＥに作動可能に連結された配列の発現よりも高い。例えば、第１のＴＣＥに作動可能に連結された配列と、第２のＴＣＥに作動可能に連結された配列の間の発現の比率は、約９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１，６  ８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、６０：４０、または任意の介在する比率であり得る。
【０１０８】
反対の方向である２つのプロモーター、および二方向性プロモーターを含むパッケージング構築物がさらに開示される。例えば、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、反対の方向で発現させることができる。別の例において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、第３の核酸配列の反対の方向で発現させることができる。選択的に、マーカーをコードする配列および目的の遺伝子は、反対の方向で発現させることができる。さらに、第１の核酸配列は第１の転写制御エレメントに作動可能に連結することができ、第２の核酸配列は第２の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。さらに、第１の核酸配列および第２の核酸配列は第１の転写制御エレメントおよび第３の核酸配列に作動可能に連結することができ、第３の核酸配列は第２の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。第１および第２の転写制御エレメントは同じであり得、または異なり得る。さらに、少なくとも１つの転写制御エレメントは調節可能であり得る。また、第１および第２の核酸配列は、調節可能であり得る単一の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。さらに、第１の核酸配列、第２の核酸配列、および第３の核酸配列は、調節可能であり得る単一の転写制御エレメントに作動可能に連結することができる。単一の転写制御エレメントはまた、これもまた調節可能であり得る二方向性プロモーターであり得る。
【０１０９】
代表的なプロモーターは、最小プロモーターおよび他の上流シスエレメントからなる。Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．  Ｇｅｎｅ  ＶＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７），Ｏｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．，Ｎａｇｙ，Ｆ．＆  Ｃｈｕａ，Ｎ．−Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，８１０−８１２（１９９０）、およびＢｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．＆  Ｃｈｕａ，Ｎ．−Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，９５９−９６６（１９９０）。最小プロモーターは、本質的に、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するために結合するが、それ自体、転写活性を有さないＴＡＴＡボックス領域である。Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．＆  Ｃｈｕａ，Ｎ．−Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，９５９−９６６（１９９０）。シスエレメントは、特定の転写因子による結合の際に、個々にまたは組み合わせて、プロモーターの空間的−時間的発現パターンを決定する（Ｂｅｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ．＆  Ｃｈｕａ，Ｎ．−Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，９５９−９６６（１９９０））。米国特許第５，８１４，６１８号は、複数のｔｅｔオペレーター配列（エンハンサーまたはリプレッサーとして本明細書中で定義される）および最小プロモーターを有する二方向性プロモーターを開示している。米国特許第５，９５５，６４６号は、二方向性異種構築物を開示している。米国特許第５，３６８，８５５号は、天然に存在する二方向性プロモーターを開示している。米国特許第５，３５９，１４２号は、遺伝子発現の増強におけるバリエーションを許容するために操作された構築物を開示している。米国特許第５，６２７，０４６号は、天然に存在する二方向性プロモーターを開示している。米国特許第５，８２７，６９３号は、修飾ヘモグロビンプロモーターを開示している。これらのすべての参考文献は、二方向性プロモーターのそれらの教示に関して、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１０】
Ｇａｇ−Ｐｒｏタンパク質およびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌタンパク質の合成のために必要とされる、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する、Ｇａｇタンパク質およびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列中の１つ以上の変異を含むパッケージング構築物もまた本明細書に開示される。Ｇａｇ−Ｐｒｏタンパク質およびＧａｇ−Ｐｒｏタンパク質の合成のために必要とされる、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する、１つ以上の変異を含むパッケージング構築物もまた開示される。
【０１１１】
ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌは、１型ＨＩＶ（ＨＩＶ−１）およびＳＩＶ感染細胞中で、約２０：１のモル比で、同じｍＲＮＡ転写物から天然に作製される。この比率は、ｇａｇとｐｏｌのリーディングフレームの間、またはｇａｇとｐｒｏのリーディングフレームの間の重複の領域におけるリボソームのフレームシフトまたはリードスルーによって達成される（Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ，Ｒ．，およびＪ．Ｗ．Ｗｉｌｌｓ．１９９７．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２６３−３３４頁．Ｊ．Ｍ．Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ，およびＨ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ（編），Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、これは、フレームシフトのその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。成熟ビリオンの触媒サブユニットへの前駆体として、Ｐｏｌはビリオン成熟および感染性のために必須であり、アセンブルしているウイルス粒子へのその組み込みは、Ｇａｇとのその結合に依存する（同上）。ｇａｇ−ｐｏｌフレームシフト部位は、ＲＮＡ二次構造の領域がすぐ下流に続く保存性７ヌクレオチド滑り配列（ＵＵＵＵＵＵＡ）配列番号７からなる（Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ，Ｒ．，およびＪ．Ｗ．Ｗｉｌｌｓ．１９９７．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２６３−３３４頁．Ｊ．Ｍ．Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ，およびＨ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ（編），Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。リボソームフレームシフトは、フェニルアラニンおよびロイシンについてのｔＲＮＡ（コドンＵＵＵ  ＵＵＡ；配列番号８がｇａｇフレームと比較して１ヌクレオチド（−１）逆流して、ｐｏｌリーディングフレーム中で翻訳が継続するときに（ＵＵＵ  ＵＵＡ；配列番号８）−＞ＵＵＵ  ＵＵＵ（配列番号９））、滑り配列中で物理的に起こる（Ｊａｃｋｓ，Ｔ．，Ｍ．Ｄ．Ｐｏｗｅｒ，Ｆ．Ｒ．Ｍａｓｉａｒｚ，Ｐ．Ａ．Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｒ，およびＨ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ．１９８８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ＨＩＶ−Ｉ  ｇａｇ−ｐｏｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：２８０−２８３、これは、ＨＩＶ−１におけるリボソームフレームシフトのその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、変異は、フレームシフトのために必要とされるループ構造を破壊することができる。このことは、ループ構造を破壊するために個々のヌクレオチドを変化または除去することによって達成することができる。
【０１１２】
例えば、図３は、フレームシフトのために必要とされるＨＩＶ  ｇａｇおよびＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌのループ構造を示す。図４は、フレームシフトのために必要とされるループ構造の破壊を生じる、フレームシフトのために必要とされるＨＩＶ  ｇａｇおよびＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌのループ構造の配列の変化を示す。第１の核酸配列が、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ配列およびｇａｇ−ｐｏｌ配列の変異を含むパッケージング構築物が開示される。選択的に、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ配列は、点変異を含み得る。例えば、フレームシフトのために必要とされるｇａｇ配列は、図１に提示されるような点変異を含み得る。選択的に、第１の核酸配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、第２の核酸配列は、図２に提示されるような単一のヌクレオチド挿入ならびにいくつかの点変異を含み得る。選択的に、第２の核酸配列は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１３】
異なる種間でのコドン優先度は劇的に異なり得る。特定の発現系（大腸菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞）における外来性タンパク質の発現レベルを増強するために、宿主発現系のコドン頻度と一致するように外来性タンパク質のコドン頻度を調整することが非常に重要であり得る。このプロセスはコドン最適化として知られている。コドン最適化とは、コドン使用頻度を、目的の細胞／種の中で利用可能なｔＲＮＡプールと一致させるための遺伝子配列の変更をいう。コドン最適化は、重複しているリーディングフレームならびにコード領域中に埋め込まれている構造エレメントを一般的に含み；これらの特徴は大きなＤＮＡウイルス間では広範ではない、小さなＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスからの遺伝子によるタンパク質発現を増加させるための強力なツールとして出現した。
【０１１４】
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のコドン最適化ｅｎｖ遺伝子（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，Ｂ．Ｓｅｅｄ，Ｊ．Ｅｂｅｒｌｅ，Ｗ．Ｓｃｈｒａｕｔ，Ａ．Ｂｕｌｔｍａｎｎ，およびＪ．Ｈａａｓ．１９９８．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐｌ２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−１５０３）およびｇａｇ遺伝子（Ｄｅｍｌ，Ｌ．，Ａ．Ｂｏｊａｋ，Ｓ．Ｓｔｅｃｋ，Ｍ．Ｇｒａｆ，Ｊ．Ｗｉｌｄ，Ｒ．Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ，Ｈ．Ｗｏｌｆ，およびＲ．Ｗａｇｎｅｒ．２００１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９１−１１００１；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．，Ｍ．Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｄｏｅ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｃ．Ｅ．Ｇｒｅｅｒ，．Ｍ．Ｓｅｌｂｙ，Ｇ．Ｒ．Ｏｔｔｅｎ，およびＳ．Ｗ．Ｂａｒｎｅｔｔ．２０００．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇａｇ  ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）を用いる免疫は、遺伝子の発現の増強および抗原に対する免疫応答の改善に導く。Ｌｉｓｔｅｒｉａ（Ｎａｇａｔａ，Ｔ．，Ｍ．Ｕｃｈｉｊｉｍａ，Ａ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ，およびＹ．Ｋｏｉｄｅ．１９９９．Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６１：４４５−４５１）、細菌が産生する破傷風毒素（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ，Ｒ．，Ｇ．Ｄｏｕｃｅ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ−Ｂａｒｂｅｒ，Ｎ．Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｅｓｋｏｌａ，およびＧ．Ｄｏｕｇａｎ．２０００．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｅｔａｎｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：８１０−８１５）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｎａｇａｔａ，Ｔ．，Ｍ．Ｕｃｈｉｊｉｍａ，Ａ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ，およびＹ．Ｋｏｉｄｅ．１９９９．Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６１：４４５−４５１）、ヒトパピローマウイルス（Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ，Ａ．，Ｖ．Ｊｕａｒｅｚ，およびＨ．ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ．２００３．Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅ７  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｔｈａｔ  ｙｉｅｌｄｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８−４９３７；Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｆ．Ｇａｏ，Ｋ．Ｚｈａｏ，Ｗ．Ｚｈａｏ，Ｇ．Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ，およびＩ．Ｆｒａｚｅｒ．２００２．Ｃｏｄｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  Ｅ７  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０１：４３−５２）、およびその他（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｄ．Ｍ．Ｋｌｉｎｍａｎ，およびＲ．Ａ．Ｓｅｄｅｒ．２０００．ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：９２７−９７４）などの種々の他の病原性生物を用いて実施された同様の研究は、ＤＮＡワクチンの効力を増強するためのコドン最適化の潜在能力を確認した。コドン最適化は、当業者によって公知である種々の技術を使用して実施することができる。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｌ，Ａｎａｎｄ  ＫＫ，Ｍｏｈａｎｋｕｍａｒ  ＫＭ，Ｒａｎｇａ  Ｕ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｓｅｐ；７８（ｌ７）：９１７４−８９に記載される方法を使用することができる。引用される参考文献のすべては、コドン最適化のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１５】
コドン最適化が利用されているパッケージング構築物もまた開示される。例えば、第１の核酸配列がコドン最適化されるように、本明細書に記載のパッケージング構築物を修飾することができる。別の実施形態において、第２の核酸配列をコドン最適化することができる。また、第１の核酸と第２の核酸の両方をコドン最適化することができる。
【０１１６】
複製可能でない組換え体を生成可能であるパッケージング構築物もまた開示される。複製可能な組換え体を生成可能でないパッケージング構築物もまた本明細書に開示される。上記に議論されたように、レトロウイルスベクター、特に、分裂していない細胞を感染させることが可能であるレンチウイルスに付随する利点の観点において、複製可能でないヘルパーウイルスを含まない組換えウイルスの純粋なストックを生成するための方法の改善は、多くの研究の対象であった。組換えレトロウイルスは、一般的に、所望の組換えＲＮＡのキャプシド形成のために必要なウイルスタンパク質を産生するが、しかしウイルスＲＮＡをパッケージングするためのシグナル（Ψ配列）を欠く哺乳動物細胞（「パッケージング細胞」）に、適切なプロウイルスＤＮＡベクターを導入することによって産生される。したがって、レトロウイルスの必要とされるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子がインタクトであるのに対して、これらのパッケージング株による野生型ヘルパーウイルスの放出は存在しない。しかし、パッケージングのために必要とされるΨ配列を含む別個のベクターで細胞がトランスフェクトされる場合に、野生型レトロウイルスは組換えによって生じ得る（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３）。このことは、特に、ＨＩＶなどのレンチウイルスの場合において、および遺伝子治療などのベクターの特定の適用のために、顕著な安全性の危険を表し得る。
【０１１７】
複製可能なヘルパーウイルスの産生に導く組換えに付随する危険を回避するための現在のアプローチには、パッケージング株を作製するために使用されるウイルス構築物におけるさらなる変異（例えば、ＬＴＲ欠失）を作製すること、およびビリオンを別個のプラスミドに産生するために必要なウイルス遺伝子を分離することが含まれる。例えば、検出可能なヘルパーウイルスを含まない、組換えモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）は、パッケージング細胞中で、ｅｎｖ遺伝子からｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を分離することによって産生することができることが最近示されてきた（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（４）：１１２０）。これらのパッケージング細胞は、ビリオン産生のために必要なウイルスタンパク質を集合的にコードする２つの別個のプラスミドを含み、Ψパッケージングシグナルを含む第３のベクターで同時トランスフェクトされたときに、インタクトなレトロウイルスを産生するために必要な組換え事象（すなわち、３つのプラスミドベクター間）が起こる可能性を減少した。
【０１１８】
本明細書に開示される構築物は、核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。加えて、本明細書に開示される構築物は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された、核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。例えば、本明細書に開示される構築物は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸、例えば、ｔｅｔ−ｏｎに作動可能に連結された、核局在化シグナルをコードする核酸配列を選択的に含み得る。核局在化配列は、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。核局在化シグナルをコードする核酸は、転写制御エレメントをさらに含み得る。転写制御エレメントは本明細書の他の箇所で開示される。核局在化シグナルをコードする核酸配列には、例えば、４個のグリシン残基を含み、セリン残基が続く配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードし得る少なくとも１つのリンカー配列もまた隣接することができる。リンカー配列は染色体インシュレーターであり、一般的配列でもあり得る。一般的に、リンカー配列は、融合タンパク質の各機能的ドメインの干渉を減少するように働く。例えば、リンカー配列は、ｔｅｔ  ＲもしくはｔｅｔＡタンパク質、ＳＶ４０  ＮＬＳ、ＶＰ１６、またはＺＮＦ１０サイレンシングタンパク質への干渉を減少することができる。染色体インシュレーターであるリンカーは、誘導性プロモーターと、本明細書に開示される構築物の構成的プロモーターの間の干渉を減少することができ、それによって、誘導性プロモーターの漏出を減少する。
【０１１９】
本明細書に開示されるパッケージング構築物を含む細胞株もまた開示される。細胞株を産生するための方法もまた、本明細書の他の箇所に記載される。
【０１２０】
上記および下記に記載される実施形態は、本明細書に開示される組成物および方法のいずれかとともに有用である。
【０１２１】
系
上記に議論されたパッケージング構築物とともに有用であるパッケージング構築物もまた開示される。例えば、パッケージング系は、本明細書の他の箇所で議論されるように、本発明の核酸構築物、およびエンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含み得る。パッケージング細胞株もまた開示される。ウイルス様粒子を産生するためのパッケージング細胞株は、標的細胞、および本明細書に開示される１つのパッケージング構築物を含む。パッケージング細胞株はまた、本明細書の別の箇所で議論されるように、エンベロープ糖タンパク質を発現する核酸構築物を含み得る。本明細書で使用される場合、エンベロープ糖タンパク質は、パッケージング構築物によって生成される粒子の偽型決定を許容する。エンベロープ糖タンパク質を発現可能である核酸配列を含む構築物は本明細書に記載される。例えば、エンベロープ構築物は、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ  Ｇ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープを含み得る。
【０１２２】
パッケージング構築物が、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌについての核酸をトランスで含むパッケージングおよび発現系もまた本明細書で開示される。例えば、第１、第２、および第３のパッケージング構築物を含む発現系が開示される。第１のパッケージング構築物は、Ｇａｇポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第１の核酸構築物を含み、ここで、Ｇａｇをコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。第２のパッケージング構築物は、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含む第２の核酸構築物を含み、ここで、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。第３の核酸構築物は、エンベロープ糖タンパク質をコードする第３の核酸配列を含み、ここで、第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。これらの構築物を含むパッケージングおよび発現系はまた、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む遺伝子移入構築物もまた含み得る。
【０１２３】
第１の変異した核酸が転写制御エレメントに作動可能に連結される、Ｇａｇポリタンパク質をコードする第１の変異した核酸を含む第１の核酸構築物；および第２の変異した核酸は転写制御エレメントに作動可能に連結される、Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする第２の変異した核酸を含む第２の核酸構築物を含むパッケージング系もまた開示される。第１の核酸構築物および第２の核酸構築物中での変異は、ウイルス粒子形成を可能にするＧａｇおよびＰｏｌポリタンパク質の発現の比率を生じる。選択的に、パッケージング系の第１の核酸は、最小ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結することができ、第２の変異した核酸は、熱ショックタンパク質プロモーターに作動可能に連結することができる。パッケージング系の構築物との使用のために適切な他のプロモーターは、本明細書の他の箇所に記載される。
【０１２４】
本発明の構築物およびウイルス粒子は、標的細胞（例えば、真核生物細胞）または哺乳動物（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物もしくは脊椎動物）に目的の配列を導入するために、インビトロ、インビボ、およびエキソビボで使用することができる。細胞は、商業的にもしくは寄託機関から入手することができ、または生検などにより、哺乳動物から直接的に入手することができる。細胞は、それらが戻される哺乳動物から、または同じもしくは異なる種の別の／異なる哺乳動物から、入手することができる。例えば、本発明のパッケージング細胞株またはウイルス粒子を使用して、目的のＤＮＡは、ブタ細胞などの非ヒト細胞に導入することができ、次いで、これはヒトに導入される。代替として、細胞は哺乳動物から単離される必要はなく、ここで、例えば、遺伝子治療において哺乳動物に本発明のウイルス粒子を送達することが所望される。
【０１２５】
エキソビボ治療は、例えば、Ｋａｓｉｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４７３（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３：５７０（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：４７６（１９８４）；Ｄｉｃｋら、Ｃｅｌｌ，４２：７１（１９８５）；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１８：１４９（１９８５）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号において記載されており、エキソビボ治療のそれらの教示のためのそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
哺乳動物に直接的にウイルス粒子を投与する（導入する）ための方法は、一般的に当業者に公知である。例えば、投与の様式には、非経口、注射、粘膜、全身性、移植、腹腔内、経口、皮内、経皮（例えば、徐放ポリマー中）、筋肉内、注入および／またはボーラス注射を含む静脈内、皮下、局所的、硬膜外などが含まれる。本発明のウイルス粒子は、好ましくは、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液などの薬学的に許容されるキャリア中で投与することができる。
【０１２７】
投与の頻度を含む、哺乳動物に投与される本発明のウイルス粒子の投薬量は、投与の様式および経路；レシピエント哺乳動物のサイズ、齢、性別、健康、体重、および食事；治療される疾患または状態の徴候の性質および程度；同時治療の種類、治療の頻度、ならびに所望される効果を含む種々の要因に依存して変化する。
【０１２８】
本明細書に記載されるようなパッケージング構築物を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ核酸構築物もまた含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結され；目的の１つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む発現系が開示される。エンベロープ糖タンパク質が細胞への侵入を促進する発現系もまた開示される。選択的に、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧタンパク質、または細胞への侵入を媒介するための当該分野において公知であるいくつかの他のウイルス糖タンパク質の１つなどのウイルスエンベロープ糖タンパク質であり得る。
【０１２９】
選択的に、発現系は、上記のように、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化配列は上記に開示される。例えば、核局在化シグナルをコードする構築物は、５’から３’のサイトメガロウイルスプロモーター、第１のリンカーをコードする配列、第２の核局在化シグナル、第２のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含み、ここで、コードされるリンカーはＧＧＧＳ（配列番号１５）である。
【０１３０】
第１のパッケージング構築物を含み、第１のパッケージング構築物がＧａｇポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第１の核酸構築物を含み、Ｇａｇをコードする核酸配列が、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、かつ少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結され、Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第２の核酸構築物を含む第２のパッケージング構築物もまた含み、Ｇａｇ−Ｐｏｌをコードする核酸配列は、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、かつ少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結された発現系もまた開示される。発現系はまた、エンベロープ糖タンパク質をコードする第３の核酸配列を含む第３の核酸構築物を含み、第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。発現系は、目的の１つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む。選択的に、発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化シグナルは、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。
【０１３１】
上記に開示される発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする第４の核酸配列を含む第４の核酸構築物もまた含み得る。第４の核酸構築物は、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントをさらに含み得る。核局在化シグナルをコードする配列はまた、少なくとも１つのリンカー配列に隣接することができる。第４の核酸配列は、５’から３’のサイトメガロウイルスプロモーター、配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含む。
【０１３２】
本明細書の他の箇所に開示される発現系を含む細胞株もまた開示される。
【０１３３】
エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている、エンベロープ核酸構築物もまた開示される。エンベロープ糖タンパク質は細胞への侵入を促進することができる。エンベロープ糖タンパク質は選択的にウイルス性であり得る。１つの例において、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧタンパク質であり得る。
【０１３４】
シス作用性エレメントがキャプシド形成、逆転写、および組み込みのために必要とされる実施形態もまた開示される。シス作用性エレメントは、本明細書に記載される構築物を用いて、トランスまたはシスで提供することができる。例えば、Ｐｏｌタンパク質を発現可能である核酸配列を欠くパッケージング構築物は、Ｖｐｒ−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を（シスで）発現可能である核酸配列を選択的に含み得る。代替的には、Ｐｏｌタンパク質を発現可能である核酸配列を欠くパッケージング構築物は、Ｖｐｒ−逆転写酵素−インテグラーゼタンパク質を（トランスで）発現可能である別個の核酸配列を含み得る。
【０１３５】
本明細書の他の箇所に記載されるパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程、およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程、および目的の１つ以上の配列を含む、本明細書の他の箇所に記載される遺伝子移入構築物を細胞に導入する工程、およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持し、このウイルス様粒子は目的の遺伝子または配列を含む、工程を包含する遺伝子移入方法もまた開示される。
【０１３６】
目的の外因性配列を含む細胞もまた開示され、ここで、目的の配列は、上記に記載される遺伝子移入方法を使用して細胞に移入される。
【０１３７】
本明細書に記載される構築物は、マーカー生成物をコードする核酸配列を選択的に含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されたか、一回送達されると発現されるか否かを決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、βガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
【０１３８】
ある実施形態において、マーカーは選択マーカーであり得る。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入されるとき、選択圧下に配置されるならば、形質転換された哺乳動物宿主細胞は生存できる。２つの広範に使用される別個の選択レジメのカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充した培地と独立して増殖する能力を欠く変異体細胞株の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の付加なしで増殖する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路のために必要とされる特定の遺伝子を欠くので、失われたヌクレオチドが補充培地中に提供されない限り、これらは生存できない。培地を補充することに対する代替は、それぞれの遺伝子を欠く細胞にインタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入し、それにより、それらの増殖要求性を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった個々の細胞は、補充していない培地中で生存可能ではない。
【０１３９】
第２のカテゴリーは優性選択であり、これは、任意の細胞型中で使用される選択スキームをいい、変異型細胞型の使用を必要としない。これらのスキームは、代表的には、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を使用する。新規の遺伝子を有するこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、選択で生き残る。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０  ４１３  （１９８５．Ｔｈｅｓｅ））を使用する。引用される参考文献は、優性選択の例のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。これらの３つの例は、適切な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性をそれぞれ付与するために、真核生物の制御下で細菌遺伝子を利用する。他の例には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンが含まれる。
【０１４０】
エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される、エンベロープ核酸構築物もまた開示される。エンベロープ糖タンパク質は細胞への侵入を促進できる。エンベロープ糖タンパク質は選択的にウイルス性であり得る。１つの例において、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）であり得る。
【０１４１】
方法
ウイルス様粒子を作製する方法が本明細書に開示される。例えば、ウイルス様粒子を作製する方法は、本明細書のパッケージング構築物を使用する工程を包含する。細胞に上記のパッケージング核酸構築物のいずれかを導入する工程；およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程；およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、ウイルス様粒子を作製する方法もまた開示される。
【０１４２】
細胞に上記のパッケージング核酸構築物のいずれかを導入する工程；およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ構築物を細胞に導入し、ここで、核酸配列をコードするエンベロープ糖タンパク質は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される工程；およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、ウイルス様粒子を作製する方法が本明細書にさらに開示される。
【０１４３】
ウイルス様粒子は、選択されたレンチウイルス配列を適切なベクター（例えば、適切な調節エレメント（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）、クローニングのための制限部位、マーカー遺伝子などを含む市販の発現プラスミド）に挿入することによって調製することができる。これは、当該分野において周知であるように、ＰＣＲを含む標準的なクローニング技術を使用して達成することができる。このようなベクターにクローニングされるレンチウイルス配列は、レンチウイルスゲノムＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含む任意の既知の供給源から入手することができる。レンチウイルスゲノムＲＮＡに対応する適切なｃＤＮＡは市販されており、これには例えば、ＨＩＶ−１のゲノム配列を含むｐＮＬＥＮＶ−１（Ｍａｌｄａｒｅｌｌｉら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７３２）が含まれ、これは、レンチウイルスゲノムＲＮＡに対応する適切なｃＤＮＡのその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ｃＤＮＡの他の供給源には、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄが含まれる。これらの参照は、現在利用可能であるレンチウイルスゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡの例のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用され、これらのクローンは、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができるレトロウイルスｃＤＮＡの例のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１４４】
適切なベクター（例えば、発現ベクター）に一旦クローニングされると、レトロウイルス配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ＬＴＲ、およびシス作用性配列）は、本明細書に記載されるように修飾することができる。１つの実施形態において、ｐＮＬＥＮＶ−１などのプラスミドから増幅されたレンチウイルス配列は、ｐＵＣベクター（例えば、ｐＵＣ１９）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ｐＢＲ３２２、またはｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの適切なバックボーンベクターにクローニングし、次いで、欠失（制限酵素を使用する）、置換（例えば、部位特異的変異誘発を使用する）、または他の（例えば、化学的）修飾によって修飾して、選択したレンチウイルス配列の発現または機能を妨害することができる。本明細書に記載されるように、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、選択したアクセサリー遺伝子とともに、除去または変異させることができる。例えば、１つの実施形態において、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列は、Ｇａｇ−ＰｒｏおよびＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質の合成のために必要とされるフレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少するように変異される。
【０１４５】
本発明の各ベクターは、所望のレンチウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）をコードするため、または所望のレンチウイルスの機能（例えば、ＲＮＡのパッケージング）を方向付けるために必要な最小レンチウイルス配列を含み得る。すなわち、ベクターの残りは、好ましくは、非ウイルス起源であり、またはレンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）以外のウイルスからである。１つの実施形態において、本発明のレトロウイルスベクターに含まれるレンチウイルスＬＴＲは、別のウイルスからの機能的に類似の配列でＬＴＲの一部を置き換え、ハイブリッドＬＴＲを作製することによって修飾される。例えば、プロモーターとして働くレンチウイルス５’ＬＴＲは、ＣＭＶプロモーターまたは異なるレトロウイルス（例えば、ＭｕＬＶまたはＭｕＳＶ）からのＬＴＲによって部分的に置き換えることができる。代替的に、またはそれに加えて、レンチウイルス３’ＬＴＲは、別の遺伝子またはレトロウイルスからのポリアデニル化によって部分的に置き換えることができる。選択的に、ＨＩＶ−１  ３’ＬＴＲは、ウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化配列によって置き換えられる。この様式で本発明のベクター中の全体のレンチウイルス配列を最小化することによって、複製可能なヘルパーレンチウイルスに導く、ベクター間の組換えの機会は大きく減少する。
【０１４６】
任意の適切な発現ベクターが本発明において利用できる。本明細書に記載されるように、適切な発現構築物は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター構築物を含み得る。サイトメガロウイルスプロモーターは、任意の適切な供給源から入手することができる。例えば、完全なサイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）から得ることができる。ＣＭＶを得るための他の適切な供給源には、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの商業的な供給源が含まれる。ＣＭＶプロモーターの一部またはすべてを本発明において使用することができる。本発明を実施するために使用することができる構築物の他の例には、ＭｕＬＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ワクシニア  Ｐ７．５プロモーター、熱ショックプロモーター、およびラットβ−アクチンプロモーターを使用する構築物が含まれる。ＲＳＶおよびＭｕＬＶなどのある場合において、これらのプロモーター−エンハンサーエレメントは、ＬＴＲ配列の中に、またはそれに隣接して配置される。
【０１４７】
遺伝子の転写、翻訳、プロセシング、および選択のために必要とされる適切な調節配列は当該分野において認識されており、適切な細胞中での所望のタンパク質の発現を指向するように選択される。したがって、「調節配列」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子の翻訳領域の５’（上流）または３’（下流）に存在し、その遺伝子の発現を制御またはそれに影響を与える任意の遺伝子エレメント、例えば、エンハンサーおよびプロモーター配列を含む。このような調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において議論されており、これは、調節配列のその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。調節配列は、本発明における使用のために、当業者が選択することができる。
【０１４８】
１つの実施形態において、本発明は、選択した遺伝子の転写をオンおよびオフに切り換えることができるように、本明細書に開示された構築物中で誘導性プロモーターを利用する。このことは、細胞毒性ウイルスタンパク質の発現によって引き起こされる細胞毒性を最小化し、ベクターを含むパッケージング細胞の安定性を増加する。例えば、ＶＳＶ−Ｇ（エンベロープタンパク質）およびＶｐｒの高レベルの発現は細胞毒性であり得（Ｙｅｅ，Ｊ．−Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９１：９６５４−９５６８（１９９４））、それゆえに、本発明のパッケージング細胞中でのこれらのタンパク質の発現は、誘導性Ｔｅｔオペレーター系（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの誘導性オペレーター系によって制御することができ、培養培地中のテトラサイクリンの濃度による遺伝子発現（すなわち、レトロウイルス粒子の生成）の強固な調節を可能にする。すなわち、Ｔｅｔオペレーター系を用いると、テトラサイクリンの存在下で、テトラサイクリンは、Ｔｅｔトランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）に結合し、Ｔｅｔオペレーター配列へのｔＴＡの結合を妨害し、Ｔｅｔオペレーター配列の制御下での遺伝子の発現を可能にする（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：５５４７−５５５１、これは、ｔＴＡおよびＴｅｔオペレーター配列の制御下での発現を可能にすることのその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡはＴｅｔオペレーター配列に結合し、Ｔｅｔオペレーターの制御下での遺伝子の発現を妨害する。
【０１４９】
偽型決定されたエンベロープを提供するタンパク質の発現の制御のために使用できる他の誘導性オペレーター系の例は、１）金属イオンに応答性である誘導性真核生物プロモーター（例えば、メタロシチオネインプロモーター）または糖質コルチコイドに応答性である誘導性真核生物プロモーターおよび２）大腸菌のＬａｃＳｗｉｔｃｈ（商標）誘導性哺乳動物発現系（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。手短に述べると、大腸菌ラクトースオペロンにおいて、Ｌａｃリプレッサーはホモ四量体としてｌａｃオペレーターに結合して、ｌａｃ２遺伝子の転写を遮断する。アロラクトース（生理学的誘導因子）またはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、合成誘導因子）はＬａｃリプレッサーに結合し、コンホメーションの変化を引き起こし、オペレーターのリプレッサーの親和性を効果的に減少する。リプレッサーがオペレーターから除去されるときには、ラクトースオペロンからの転写は再開する。
【０１５０】
目的の配列の調節を可能にするために適切な条件下で、本明細書に記載されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程を包含する、目的の配列の発現を選択的に調節する方法もまた本明細書に開示される。本明細書に開示される方法は、組織特異的な様式で目的の配列の発現を指向するために使用することもできる。例えば、遺伝子移入構築物は、特定の組織における目的の配列の発現を駆動するために使用できる組織特異的なＴＣＥを含み得る。このような遺伝子移入ベクターは、本明細書に記載されるようなウイルス粒子を作製するためにパッケージング構築物と組み合わせて使用することができる。次いで、ウイルス粒子は接合体に導入することができる。選択的に、組織特異的発現は、トランスジェニック動物の生成のために、本明細書に開示される方法を使用して達成することができ、ここで、目的の配列の発現は、誘導性／可逆的ＴＣＥの制御下にある。このような動物において、目的の配列の発現は、例えば、ＤＯＸが投与される部位に限定することができる。このようなものとして、目的の配列の発現は、ＤＯＸ投与の部位においてのみ起こる。
【０１５１】
本発明の方法を使用して産生されるウイルス粒子を被験体に投与する方法もまた本明細書に開示される。本発明の構築物およびウイルス粒子は、標的細胞（例えば、哺乳動物細胞）または哺乳動物（例えば、ヒト）に目的の配列を導入するために、インビトロ、インビボ、およびエキソビボで使用することができる。細胞は、商業的にもしくは寄託機関から入手することができ、または生検などにより、哺乳動物から直接的に入手することができる。細胞は、それらが戻される哺乳動物から、または同じもしくは異なる種の別の／異なる哺乳動物から、入手することができる。例えば、本発明のパッケージング細胞株またはウイルス粒子を使用して、目的のＤＮＡは、ブタ細胞などの非ヒト細胞に導入することができ、次いで、これはヒトに導入される。代替として、細胞は哺乳動物から単離される必要はなく、ここで、例えば、遺伝子治療において哺乳動物に本発明のウイルス粒子を送達することが所望される。
【０１５２】
エキソビボ治療は、例えば、Ｋａｓｉｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４７３（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３：５７０（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：４７６（１９８４）；Ｄｉｃｋら、Ｃｅｌｌ，４２：７１（１９８５）；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１８：１４９（１９８５）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号において記載されており、エキソビボ治療のそれらの教示のためのそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１５３】
本発明の方法を使用して生成されたウイルス粒子を被験体に投与する方法もまた本明細書に開示される。伝統的に、成功した抗ウイルスワクチンは、大部分が生弱毒化ウイルスに依存してきた。生弱毒化ＨＩＶワクチン候補は、復帰、組換え、または変異のリスクを有しているので、理想的ではない。他の現在のＨＩＶワクチン候補は、広範に有効な中和抗体、および一次ＨＩＶ単離物に対する細胞毒性Ｔ細胞免疫応答を生成する困難さを示す。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、動物およびヒト患者に投与するために安全であること、ならびに細胞性および体液性免疫応答の強力かつ効率的な刺激因子であることが実証されてきた。それゆえに、ＶＬＰはＨＩＶワクチンとして有用である。ＨＩＶまたはＳＩＶキャプシドタンパク質のいずれかおよびＨＩＶ免疫エピトープを用いて構築したキメラＨＩＶ−１  ＶＬＰ、ならびに免疫刺激分子は、初期のＶＬＰ設計に対してさらに改善され、免疫刺激の増強に導いた。粘膜表面を介するＶＬＰワクチンの投与もまた、粘膜性および全身体液性および細胞性の免疫応答を誘発するために有望なストラテジーとして出現してきた。加えて、樹状細胞（ＤＣ）による抗原のプロセシングおよび特定の抗原の提示に関する情報は、ＶＬＰワクチン候補のための新規なストラテジーを作製してきた。
【０１５４】
哺乳動物に直接的にウイルス粒子を投与する（導入する）ための方法は、当業者に一般的に公知である。例えば、投与の様式には、非経口、注射、粘膜、全身性、移植、腹腔内、経口、皮内、経皮（例えば、徐放ポリマー中）、筋肉内、注入および／またはボーラス注射を含む静脈内、皮下、局所的、硬膜外などが含まれる。本発明のウイルス粒子は、好ましくは、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液などの薬学的に許容されるキャリア中で投与することができる。
【０１５５】
投与の頻度を含む、哺乳動物に投与される本発明のウイルス粒子の投薬量は、投与の様式および経路；レシピエント哺乳動物のサイズ、齢、性別、健康、体重、および食事；治療される疾患または状態の徴候の性質および程度；同時治療の種類、治療の頻度、ならびに所望される効果を含む種々の要因に依存して変化する。
【０１５６】
本明細書に記載されるようなパッケージング構築物を含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベロープ核酸構築物もまた含み、エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結され；目的の１つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む発現系が開示される。エンベロープ糖タンパク質が細胞への侵入を促進する発現系もまた開示される。選択的に、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧタンパク質などのウイルスエンベロープ糖タンパク質であり得る。
【０１５７】
選択的に、発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸、例えば、ｔｅｔ−ｏｎに作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化シグナルは、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。核局在化シグナルをコードする核酸は転写制御エレメントをさらに含み得る。核局在化シグナルをコードする核酸配列には、例えば、配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードし得る少なくとも１つのリンカー配列が隣接し得る。リンカー配列は一般的配列であり得る。核局在化シグナルをコードする構築物は、５’から３’のサイトメガロウイルスプロモーター、第１のリンカーをコードする配列、第２の核局在化シグナル、第２のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含み、ここで、コードされるリンカーは配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）である。
【０１５８】
第１および第２のパッケージング構築物、第３の核酸構築物、および遺伝子移入構築物を含む発現系もまた開示される。第１のパッケージング構築物はＧａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む第１の核酸構築物を含み、Ｇａｇをコードする核酸配列は、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、かつ少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。第２のパッケージング構築物は、Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む第２の核酸構築物を含み、Ｇａｇ−Ｐｏｌをコードする核酸配列は、フレームシフトおよび翻訳リードスルーを減少する１つ以上の変異を含み、かつ少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。この発現系は、エンベロープ糖タンパク質をコードする第３の核酸配列を含む第３の核酸構築物もまた含み、第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結される。この発現系は、目的の１つ以上の配列を含む遺伝子移入構築物もまた含む。選択的に、この発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子をコードする核酸に作動可能に連結された上記の核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む、核局在化シグナルをコードする構築物をさらに含み得る。核局在化配列は、細胞質から核膜、それゆえに核までポリペプチドを方向付けるものである。
【０１５９】
さらに、核局在化シグナルをコードする核酸は転写制御エレメントをさらに含み得る。転写制御エレメントは本明細書の他の箇所に開示される。核局在化シグナルをコードする核酸配列には、例えば、配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードし得る少なくとも１つのリンカー配列が隣接し得る。核局在化シグナルをコードする構築物は、５’から３’のサイトメガロウイルスプロモーター、第１のリンカーをコードする配列、第２の核局在化シグナル、第２のリンカー配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含み、ここで、コードされるリンカーは配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）である。
【０１６０】
上記に開示される発現系は、テトラサイクリントランス活性化因子に作動可能に連結された核局在化シグナルをコードする第４の核酸配列を含む第４の核酸構築物もまた含み得る。第４の核酸構築物は、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントをさらに含み得る。核局在化シグナルをコードする配列はまた、少なくとも１つのリンカー配列に隣接することができる。第４の核酸配列は、５’から３’のサイトメガロウイルスプロモーター、配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸配列、核局在化シグナルをコードする核酸配列、配列番号１５（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸配列、およびテトラサイクリントランス活性化因子をコードする配列もまた含む。
【０１６１】
本明細書の他の箇所に開示される発現系を含む細胞株もまた開示される。
【０１６２】
本明細書の他の箇所に記載されるパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程、およびエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含み、このエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列が少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されているエンベロープ核酸構築物を導入する工程、および目的の１つ以上の配列を含む本明細書の他の箇所に記載の遺伝子移入構築物を細胞に導入する工程；およびウイルス様粒子の形成を可能にする条件下に細胞を維持する工程を包含する、遺伝子移入方法もまた開示される。このウイルス様粒子は、目的の遺伝子または配列を含む。
【０１６３】
目的の外因性配列を含む細胞もまた開示され、目的の配列は、上記の遺伝子移入方法を使用して細胞に移入される。
【０１６４】
細胞による組換えタンパク質の発現を可能にするために適切な条件下で、本明細書の他の箇所に開示されるような目的の遺伝子を含むウイルス粒子と、標的細胞を接触させる工程を包含する、目的の遺伝子から組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。例えば、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス粒子を接触させることができる。
【０１６５】
組換えタンパク質の発現を可能にするために適切な条件下で、本明細書の他の箇所に開示されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入し、ここで、目的の配列は組換えタンパク質をコードする核酸配列である工程を包含する、目的の遺伝子または配列から組換えタンパク質を作製する方法もまた開示される。本明細書の他の箇所に開示されるように、組換えタンパク質の発現は調節可能であり得る。例えば、組換えタンパク質の発現は、誘導性かつ可逆性であり得る。
【０１６６】
細胞による組換えタンパク質の発現を可能にするために適切な条件下で、本明細書の他の箇所に開示されるような、組換えタンパク質をコードする目的の遺伝子または配列を含むウイルス粒子と標的細胞を接触させる工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。例えば、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス粒子と接触させることができる。
【０１６７】
少なくとも１つのＶＰ１６配列に作動可能に連結された調節因子配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第１の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；第１の核酸配列の組み込みを可能にする条件下に細胞を維持して、標的細胞のゲノムに組み込む工程、および修飾標的細胞を形成する工程；目的の配列に作動可能に連結された調節因子標的配列を含む第２の核酸構築物を、工程（ｂ）の修飾標的細胞に導入する工程であって、ここで、目的の配列は、組換えタンパク質をコードする核酸配列である工程；および組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で、修飾標的細胞を維持する工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。
【０１６８】
少なくとも１つのＶＰ１６配列に作動可能に連結された調節因子配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む第１の核酸構築物を標的細胞に導入する工程；目的の配列に作動可能に連結された調節因子標的配列を含む第２の核酸構築物を、工程（ａ）の同じ修飾標的細胞に導入する工程であって、ここで、目的の配列は、組換えタンパク質をコード可能である核酸配列である工程；ならびに第１および第２の核酸配列の組み込みを可能にする条件下で標的細胞を維持して、標的細胞のゲノムに組み込む工程、ならびに修飾標的細胞を形成する工程；ならびに組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で、修飾標的細胞を維持する工程を包含する、組換えタンパク質を作製する方法もまた本明細書に開示される。
【０１６９】
例えば、第１の核酸構築物は配列番号４４の配列を含み得る。第２の核酸配列は、本明細書の別の箇所に記載される遺伝子移入ベクターのいずれかであり得る。例えば、第２の核酸は、調節因子標的配列に作動可能に連結された転写制御エレメントに作動可能に連結されている目的の配列を含み得る。第１の核酸構築物は、ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ様配列もまた含み得る。例えば、目的の配列は、選択マーカーに作動可能に連結されたＩＲＥＳまたはＩＲＥＳ様配列に作動可能に連結することができる。
【０１７０】
任意の公知の細胞トランスフェクション技術を、組換えタンパク質を作製する方法のために利用することができる。ウイルス粒子と細胞を接触させるための他の方法が本明細書の他の箇所に開示される。一般的に、インビトロ方法について、当該分野において周知であるように、細胞は、適切なトランスフェクション条件下で、適切な培地中で、構築物またはベクターとともにインキュベートする（すなわち、培養する）。例えば、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム沈殿などの方法（Ｏ’Ｍａｈｏｎｅｙら（１９９４）ＤＮＡ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３（１２）：１２２７−１２３２）を使用することができる。
【０１７１】
本明細書に開示される遺伝子移入構築物を含むワクチンもまた開示される。本明細書に開示される遺伝子移入構築物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を産生する方法もまた開示される。
【０１７２】
加えて、被験体における免疫応答を産生する方法が開示され、ここで、免疫応答はＨＩＶに対する免疫応答であり、上記方法は、本明細書に開示される遺伝子移入構築物を被験体に投与する工程を含み、目的の配列は、ＨＩＶ抗原を発現可能である配列である。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、特定の病原体に特異的な「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」とは、被験体に投与されたときに、被験体における免疫原性応答に導く調製物を意味する。本明細書で使用される場合、「免疫原性」応答は、病原体に対する防御免疫を被験体に付与するものである。理論によって束縛されることを望まないが、免疫原性応答は、中和抗体の生成から（すなわち、体液性免疫応答）、または免疫系の細胞毒性細胞（すなわち、細胞性免疫応答）から、または両方から生じ得ると考えられている。本明細書で使用される場合、「免疫原性抗原」は、被験体に導入されるときに、または宿主もしくは被験体の細胞中で合成されるときに、免疫原性応答を誘導する抗原である。本明細書で使用される場合、ワクチンまたはワクチン接種組成物の「有効量」は、被験体に投与されるときに、被験体に防御免疫を付与するために十分である量である。歴史的には、ワクチンは、病原体、とりわけ、その表面を含む１つ以上の特異的な分子成分または構造を活性成分として含むことが理解されてきた。このような構造は、病原性生物において共通して見出される、タンパク質、複合糖質、および／または複合脂質などの表面成分を含み得る。
【０１７４】
しかし、本明細書で使用される場合、「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」という用語は、先の段落において要約された従来的な意味を拡張することが強調される。本明細書で使用される場合、これらの用語はまた、本発明の目的の配列または目的の配列を含む組成物もいう。目的の配列は、被験体の細胞内で目的の配列によってコードされる１つ以上の特定の遺伝子産物の生合成を誘導し、ここで、遺伝子産物は、病原体の特定の抗原である。次いで、生合成抗原は免疫原として働く。すでに注記されたように、目的の配列、およびそれゆえにワクチンは、特定の免疫原性抗原をコードする任意の核酸であり得る。本発明の好ましい実施形態において、ワクチンの目的の配列はＤＮＡである。目的の配列は、分子生物学、細胞生物学、およびウイルス免疫学の分野の当業者の便宜のために、さらなる遺伝子または特定の配列を組み込んでいるプラスミドまたはベクターを含み得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７（年４回アップデート）を参照のこと。これらは、プラスミドまたはベクターの例または使用のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１７５】
いくつかの組換えサブユニットおよびウイルスワクチンが近年考案されてきた。組換えサブユニットおよびウイルスワクチンのその教示のために、その内容がその全体として参照により本明細書に援用される米国特許第４，８１０，４９２号は、ワクチン中での抗原としての使用のための日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のＥ糖タンパク質の産生を記載する。対応するＤＮＡは、大腸菌、酵母、または高等生物の細胞培養物などの適切な宿主細胞中で抗原タンパク質を発現するために発現系にクローニングされる。抗原タンパク質を発現する発現系にＤＮＡをクローニングするための方法のその教示のために、その内容がその全体として参照により本明細書に援用される、米国特許第５，２２９，２９３号は、ＪＥＶ  Ｅタンパク質の遺伝子を保有する組換えバキュロウイルスを開示する。このウイルスは、Ｅタンパク質がワクチンとしての使用のために製造されかつ回収されるように、培養中で昆虫細胞に感染させるために使用される。
【０１７６】
米国特許第５，０２１，３４７号は、ＪＥＶ  Ｅタンパク質が組み込まれる組換えワクシニアウイルスゲノムを開示する。この生組換えワクシニアウイルスは、ＪＥＶに対して免疫するためのワクチンとして使用される。デング血清型２、デング血清型４、およびＪＥＶのＥタンパク質のＣ末端短縮型の遺伝子を組み込んでいる、組換えワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスは米国特許第５，４９４，６７１号に開示される。米国特許第５，５１４，３７５号は、ｐｒＭからＮＳ２Ｂまで広がるＪＥＶオープンリーディングフレームの部分を発現する種々の組換えワクシニアウイルスを開示する。これらのポックスウイルスは、プロセシングしたＭタンパク質およびＥタンパク質を含む細胞外粒子の形成を誘導した。これらのＪＥＶタンパク質をコードする２つの組換えウイルスは、マウスにおいて、高力価の中和およびヘマグルチニン阻害抗体、ならびに防御免疫を生じた。これらの効果の程度は、１回の免疫治療よりも、２回の免疫治療後により高かった。ＪＥＶのｐｒＭ／ＭおよびＥタンパク質の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、マウスに投与された場合、防御免疫を付与した（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：４０１−４１０（１９９１））。ＪＥＶからのｐｒＭおよびＥの遺伝子を保有する組換えワクシニアウイルスで感染させたＨｅＬａ細胞は、サブウイルス粒子を産生することが示された（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８：７１４−７２０（１９９２））。Ｄｍｉｔｒｉｅｖらは、ダニ媒介性脳炎ウイルスからの構造タンパク質および特定の非構造タンパク質をコードする組換えワクシニアウイルスを用いるマウスの免疫を報告した（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４４：９７−１０３（１９９６））。これらの参考文献の各々は、組換えワクシニアウイルスのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１７７】
組換えウイルスベクターはまた、デング熱のためのウイルスワクチンとして役立たせるために調製されてきた。Ｚｈａｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：４０１９−４０２２（１９８７））は、デング血清型４からワクシニアウイルスが保有する構造タンパク質およびＮＳ１を調製し、組換えウイルスを用いる哺乳動物細胞の感染後に発現を達成した。同様の発現は、標的昆虫細胞に感染させるために組換えバキュロウイルスを使用して得られた（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３０２７−３０３１（１９８８））。Ｂｒａｙら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２８５３−２８５６（１９８９））もまた、チャレンジされたときに、デング脳炎に対してマウスに防御免疫を付与する、Ｅタンパク質遺伝子に基づく組換えワクシニアデングワクチンを報告した。Ｆａｌｇｏｕｔら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６３：１８５２−１８６０（１９８９））およびＦａｌｇｏｕｔら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４３５６−４３６３（１９９０））は同様の結果を報告した。Ｚｈａｎｇら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６２：３０２７−３０３１（１９８８））は、デングＥタンパク質およびＮＳ１タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスが、チャレンジされたときに、デング脳炎に対して同様にマウスを防御することを示した。構造遺伝子および非構造遺伝子が組換えウイルスワクチンに組み込まれた他の組み合わせは、有意な免疫を生じることに失敗した（（Ｂｒａｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２８５３−２８５６（１９８９））。また、サルは、Ｅタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスで免疫したときに、デングウイルスチャレンジに対して完全な防御免疫を発生することに失敗した（Ｌａｉら（１９９０）１１９−１２４頁  Ｆ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｃｏｃｋ，Ｈ．Ｓ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ（編）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０：Ｍｏｄｅｒｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。これらの参考文献の各々は、組換えウイルスワクチンに遺伝子を組み込む方法の組成物らの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用され、構造遺伝子および非構造遺伝子の例は、組換えウイルスワクチンに組み込まれた。
【０１７８】
組換えＤＮＡ調製物を使用する免疫は、離乳マウスをモデルとして使用して、ＳＬＥＶおよびデング−２ウイルスについて報告された（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：７４３−７４９（１９９６）；Ｋｏｃｈｅｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５４７−５５２（１９９７））。ＳＬＥＶのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子をコードしているプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ免疫の単回または二重用量を用いるＳＬＥＶチャレンジに対する部分的防御を提供した。これらの実験において、対照マウスは約２５％の生存を示し、防御抗体はＤＮＡ免疫マウスにおいて検出されなかった（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：７４３−７４９（１９９６））。ｐｒＭを含む組換えデング−２プラスミドＤＮＡの３回の皮内注射を受容したマウスにおいて、１００％がデング−２中和抗体を発生し、対応するＥ遺伝子を受容しているマウスの９２％は、同様に中和抗体を発生した（Ｋｏｃｈｅｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５４７−５５２（１９９７））。しかし、２回用量スケジュールを使用するチャレンジ実験は、致死的なデング−２ウイルスチャレンジに対してマウスを防御することに失敗した。抗原の引き続く精製または処理を伴って、細胞培養中の生合成的発現によって産生された、ＪＥＶなどのフラビウイルスの特定のタンパク質のみの使用に基づく組換えワクチンは、高い抗体力価を誘導しない。また、全体のウイルス調製物と同様に、これらのワクチンは、宿主からの抗原またはベクターへの有害なアレルギー反応のリスクを有する。デングウイルスおよびＷＮＶに対するワクチン開発はより進歩が少なく、このようなウイルスベースのワクチンまたは組換えタンパク質ベースのワクチンは、上記に暗示したものと同様の問題に直面する。これらの参考文献の各々は、組換えウイルスワクチンに遺伝子を組み込む方法のそれらの教示のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用され、構造遺伝子および非構造遺伝子の例は、組換えウイルスワクチン、ならびに組換えＤＮＡ調製物を使用する免疫の方法に組み込まれた。
【０１７９】
抗体を作製するための方法もまた本明細書に開示される。例えば、被験体における免疫応答を誘導することによって、抗体産生を誘導するインビボ方法が開示される。このインビボ方法は、本明細書の他の箇所に開示される方法によって作製される組換えタンパク質を、免疫応答を誘導するために十分な量で導入する工程を包含する。例えば、標的細胞は、本明細書に開示される遺伝子移入構築物またはウイルス粒子と、インビトロまたはインビボで接触させることができる。
【０１８０】
（ａ）遺伝子移入構築物の転写制御エレメントが調節可能または構成的であり、目的の配列が目的のタンパク質をコード可能である、本明細書の他の箇所に開示されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程；（ｂ）標的細胞のゲノムへの工程（ａ）の核酸構築物の組み込み、および修飾標的細胞の形成を可能にする条件下で、細胞を維持する工程；（ｃ）工程（ｂ）の修飾標的細胞を被験体に導入する工程；（ｄ）目的の配列が免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、免疫応答が目的のタンパク質に対する抗体を生成する、目的の配列の発現を誘導するために十分な量で遺伝子移入構築物の転写制御エレメントを調節可能である有効量の基質を被験体に投与する工程を包含する、目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法もまた開示される。加えて、本明細書に記載される方法から生成される抗体は単離することができる。
【０１８１】
目的の抗原を結合する抗体を同定する方法もまた開示され、この方法は、目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプルと、目的の抗原を発現する標的細胞とを接触させる工程、およびサンプル中の抗体が標的細胞によって発現される目的の抗原に結合するか否かを決定し、それによって、目的の抗原に結合する抗体が、目的の抗原を結合する抗体として同定される工程を包含する。目的の抗原を発現する標的細胞は、本明細書に記載される方法によって生成される標的細胞であり得る。目的の抗原を結合する抗体を同定する開示される方法において使用される標的細胞は、本明細書の他の箇所に記載される遺伝子移入構築物を含む標的細胞であり得る。例えば、目的の抗原を結合する抗体を同定する方法もまた開示され、この方法は、標的細胞が請求項１、５５、２０８、２４７、および２８６に記載の核酸構築物の１つ以上を含む、目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプルと、目的の抗原を発現する標的細胞を接触させる工程；ならびにサンプル中の抗体が標的細胞によって発現される目的の抗原に結合するか否かを決定し、それによって、目的の抗原に結合する抗体が、目的の抗原を結合する抗体として同定される工程を包含する。
【０１８２】
（ａ）遺伝子移入構築物の転写制御エレメントが調節可能または構成的であり、目的の配列が目的のタンパク質をコード可能である、本明細書の他の箇所に開示されるような遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程；（ｂ）標的細胞のゲノムへの工程（ａ）の核酸構築物の組み込み、および修飾標的細胞の形成を可能にする条件下で、細胞を維持する工程；（ｃ）工程（ｂ）の修飾標的細胞を被験体に導入する工程；（ｄ）目的の配列が免疫応答を誘導するために十分な量で発現され、免疫応答が目的のタンパク質に対する抗体を生成する、目的の配列の発現を誘導するために十分な量で遺伝子移入構築物の転写制御エレメントを調節可能である有効量の基質を被験体に投与する工程を包含する、目的のタンパク質に対する抗体を生成する方法もまた開示される。
【０１８３】
加えて、目的の抗原を結合する抗体を含まない、目的の抗原を結合する抗体を含むことが疑われるサンプルが、目的の抗原を結合する抗体として同定されないように、目的の抗原を発現しないこの方法において、対照を使用することができる。目的の抗原を結合する抗体を同定する開示される方法はまた、中和抗体を同定するために使用することができる。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、任意のクラスの全体の免疫グロブリン（すなわち、インタクトな抗体）を含むがこれに限定されない。未変性の抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。代表的には、各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているのに対して、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔の空いた鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））およびその他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインとともに整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとともに整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に識別可能な型の１つに割り当てることができる。それらの定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分けてもよい。当業者は、マウスについての比較し得るクラスを認識する。異なるクラスの免疫グロブリンに一致する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
【０１８５】
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なり、かつその特定の抗原についての各特定の抗体の結合および特異性において使用される、可変ドメインの特定の部分を説明するために本明細書で使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して通常は均一に分布されてはいない。これは、代表的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）または軽鎖および重鎖の両方の可変ドメイン中にある超可変領域と呼ばれる３つのセグメント中に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、４つのＦＲを含み、このＦＲは、大部分がβシート配置を採用し、３つのＣＤＲによって接続され、このＣＤＲは、βシート構造を接続し、ある場合においては、その一部を形成するループを形成する。各鎖の中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって密接な近位に一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的に関与しないが、しかし、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「抗体またはそのフラグメント」という用語には、二重または複数の抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどのフラグメントが含まれる。したがって、それらの特異的抗原に結合する能力を保持している抗体のフラグメントが提供される。例えば、目的のタンパク質の結合活性を維持する抗体のフラグメントは、「抗体またはそのフラグメント」という用語の意味の中に含まれる。このような抗体およびフラグメントは当該分野において公知である技術によって作製することができ、実施例に示される方法、ならびに抗体を産生するため、および特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的方法（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照のこと。この内容は、抗体を産生するため、および特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的方法のその教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）に従って、特異性および活性についてスクリーニングすることができる。
【０１８７】
例えば、その内容が抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質単鎖抗体の結合体のその教示のためにその全体として参照により本明細書に援用される米国特許第４，７０４，６９２号において記載されるような、抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質（単鎖抗体）の結合体もまた、「抗体またはそのフラグメント」の意味の中に含まれる。
【０１８８】
選択的に、抗体は他の種において生成され、ヒトにおける投与のために「ヒト化される」。非ヒト抗体（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）からの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体の中にも、移入されたＣＤＲ配列中またはフレームワーク配列中にも見い出されない残基もまた含む。一般的に、ヒト化抗体は、実質的にすべて、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンの領域に一致し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）、これらは、ヒト化抗体のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１８９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野において公知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒトではない供給源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入残基」と呼ばれ、これは、代表的には、「移入」可変ドメインから取られる。
【０１９０】
ヒト化は、ヒト化抗体の対応する配列の代わりに齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることによって、本質的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１．５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、これらは、抗体のヒト化のそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される）に従って実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、これは、ヒト化抗体およびキメラ抗体のその教示のために、その全体が参照により援用され、ここで、実質的に、インタクトなヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されてきた。実務上、ヒト化抗体は、代表的には、あるＣＤＲ残基およびおそらくＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換される。
【０１９１】
ヒト化抗体を作製する際に使用される、軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少するために非常に重要である。「ベスト−フィット」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）、これは、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）としての齧歯類の配列に最も近いヒト配列を使用することのそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、いくつかのヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）、これはまた、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として齧歯類の配列と最も近いヒト配列を使用するそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される）。
【０１９２】
抗原についての高い親和性の保持および他の好ましい生物学的特性を有する抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親の配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親の配列および種々の概念的ヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例証および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のあり得る役割の分析、すなわち、その抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようなやり方で、標的抗原への親和性の増加などの所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基は、コンセンサス配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ配列は、直接的にかつ最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する（１９９４年３月３日に公開されたＷＯ  ９４／０４６７９を参照のこと。これは、抗原結合に対するＣＤＲ残基およびそれらの影響のその教示のために、その全体が参照により援用される）。
【０１９３】
免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーの産生が可能であるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を利用することができる。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されてきた。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。これらは、抗原チャレンジの際のヒト抗体の産生のそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーの中で産生することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。これらは、ファージディスプレイライブラリーにおいてヒト抗体を産生することのそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される）。ＣｏｔｅらおよびＢｏｅｒａｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１）。これらは、ヒトモノクローナル抗体を調製することのそれらの教示のために、それらの全体が参照により援用される）。
【０１９４】
モノクローナル抗体を産生する細胞もまた開示される。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体をいい、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異以外は同一である。本発明のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるはまたは相同であるキメラ抗体を含むが、鎖の残りは、これらが所望の活性を示す限り、別の種由来または別の抗体もしくは所望の活性に属する抗体における対応する配列、ならびにこのような抗体のフラグメントと同一であるかまたは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと。これらは、キメラ抗体を具体的に含むモノクローナル抗体のそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１９５】
モノクローナル抗体はまた、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）またはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）によって記載されるものなどの、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウスおよび他の適切な宿主動物は、代表的には、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能であるリンパ球を誘発可能である免疫因子で免疫される。代替として、リンパ球はインビトロで免疫することができる。好ましくは、免疫因子は、遺伝子移入構築物中に存在する目的の配列を含む。伝統的には、モノクローナル抗体の生成は、免疫原としての使用のための精製タンパク質またはペプチドの利用可能性に依存してきた。このようなものとして、本明細書に開示される方法は、宿主動物に注入することができるウイルス粒子の中に大量の目的のタンパク質を提供することによって、強力な免疫応答を誘発し、かつモノクローナル抗体を生成するための方法を提供する。
【０１９６】
この系の利点には、哺乳動物系において見られるものと高度に類似した、生成の容易さ、高レベルの発現、および翻訳後修飾が含まれる。この系の用途には、融合タンパク質としての目的の抗体のタンパク質のドメインを発現することが含まれる。抗原はまた、シグナル配列と、目的のタンパク質の成熟タンパク質ドメインの抗体ヌクレオチド配列の間にインフレームで遺伝子フラグメントを挿入することによっても産生することができる。このことは、ビリオンの表面上での外来性タンパク質のディスプレイを生じる。この方法は、全体のウイルスを用いる免疫を可能にし、標的抗原の精製の必要性を除外する。
【０１９７】
一般的に、モノクローナル抗体を作製するときには、ヒト起源の細胞が所望される場合には、いずれかの末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を、モノクローナル抗体を産生する方法において使用することができ、または非ヒト哺乳動物供給源が使用されるときには、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、不死化細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９−１０３頁）。不死化細胞株は、齧歯類、ウシ、ウマ、およびヒト起源のミエローマ細胞を含む、形質転換哺乳動物細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞が利用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を好ましく含む、適切な培養培地中で培養することができる。例えば、親の細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を補助し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である。より好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株であり、これは、例えば、ｔｈｅ  ＳａＩｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．から入手することができる。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されてきた（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）５１−６３頁）。次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、目的のタンパク質に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈殿またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。このような技術およびアッセイは当該分野において公知であり、本明細書またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）においてさらに記載される。
【０１９８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈またはＦＡＣＳ分別手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖することができる。この目的のための適切な培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。代替的には、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖させることができる。
【０１９９】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来的な免疫グロブリン精製手樹によって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
【０２００】
インビトロ方法もまた、一価抗体を調製するために適切である。抗体のフラグメント、特に，Ｆａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該分野において公知である日常的な技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ  ９４／２９３４８、米国特許第４，３４２，５６６号、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）において記載される。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位および残りのＦｃフラグメントを有する、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを産生する。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれるフラグメントを生じ、これは、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがなお可能である。
【０２０１】
抗体消化において産生されるＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメインもまた含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価抗体である。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における命名である。抗体フラグメントは、もともとは、それらの間のヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの一部として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた知られている。
【０２０２】
抗体の単離された免疫学的に特異的なパラトープまたはフラグメントもまた提供される。抗体の特異的免疫原性エピトープは、分子の化学的または機械的破壊によって、全体の抗体から単離することができる。このようにして得られる精製フラグメントは、本明細書に教示される方法によって、それらの免疫原性および特異性を決定するために試験される。抗体の免疫反応性パラトープは、選択的に、直接的に合成される。免疫反応性フラグメントは、抗体アミノ酸配列由来の少なくとも約２〜５個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列として定義される。
【０２０３】
生物活性を有する抗体のフラグメントもまた開示される。ポリペプチドフラグメントは、ポリペプチドをコードする核酸を、ポリペプチドフラグメントを産生可能である発現系、例えば、本明細書に開示される発現系の中にクローニングすることによって得られる組換えタンパク質であり得る。例えば、目的のタンパク質との抗体の相互作用に関連する生物学的効果を引き起こし得る特定のハイブリドーマから、抗体の活性ドメインを区別することができる。例えば、抗体の活性または結合特異性または親和性のいずれかに寄与しないことが見い出されているアミノ酸は、それぞれの活性の喪失を伴うことなく欠失させることができる。例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸は、未変性もしくは修飾非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子のいずれかから連続的に除去され、それぞれの活性は、多くの利用可能なアッセイの１つにおいてアッセイされる。別の例において、抗体のフラグメントは修飾抗体を含み、ここで、少なくとも１つのアミノ酸が特定の位置に天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されており、、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかの部分、または抗体の内部領域さえもが、ポリペプチドフラグメントまたは修飾抗体の精製を容易にすることができる、ビオチンなどの他の部分で置き換えられている。例えば、修飾抗体は、コード領域がハイブリッドポリペプチドを生じるように、ペプチド化学または２つのポリペプチドフラグメントをコードするそれぞれの核酸を発現ベクターにクローニングすることのいずれかを通して、マルトース結合タンパク質に融合することができる。ハイブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティーカラムにそれを通すことによってアフィニティー精製することができ、次いで、修飾抗体受容体は、特異的プロテアーゼＸａ因子でハイブリッドポリペプチドを切断することによって、マルトース結合領域から分離することができる（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ，１９９６，１６４頁を参照のこと）。類似の精製手順は、真核生物細胞からハイブリッドタンパク質を単離するために同様に利用可能である。
【０２０４】
フラグメントは、他の配列に結合されているか否かに関わらず、フラグメントの活性が非修飾の抗体または抗体フラグメントと比較して、有意に変化されないかまたは損なわれないならば、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含む。これらの修飾は、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を除去または付加するため、その生物学的な寿命を増加するため、その分泌特性を変化させるためなどのために、ある付加的な特性を提供することができる。ある場合において、フラグメントは、結合活性、結合ドメインにおける結合の調節などのような生物活性特性を有さなければならない。抗体の機能的または活性な領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発、続いて、発現、および発現されたポリペプチドの試験によって同定することができる。このような方法は当業者に容易に明らかであり、抗原をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００（１９８２））。
【０２０５】
種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質、改変体、またはフラグメントと選択的に結合する抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質、タンパク質改変体、またはそのフラグメントと選択的に免疫活性である抗体を選択するために日常的に使用される。選択的結合を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明のためには、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照のこと。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
【０２０６】
モノクローナル抗体またはそのフラグメント、および目的のタンパク質へのの抗体またはそのフラグメントの結合を検出するための１種以上の試薬の容器を含む抗体試薬キットもまた提供される。これらの試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、または他のタグを含み得る。これらの試薬は、二次もしくは三次抗体、または酵素反応のための試薬もまた含み得、ここで、酵素反応は、可視化され得る生成物を産生する。
【０２０７】
免疫応答を誘発するために十分な量で、本明細書の他の箇所に開示される方法によって作製された組換えタンパク質を被験体に導入する工程を含む、被験体における免疫応答を誘発する方法もまた開示される。例えば、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス粒子と接触させることができる。
【０２０８】
（ａ）遺伝子移入構築物を標的細胞に導入する工程；（ｂ）工程（ａ）における核酸構築物の組み込みを可能にする条件下に該細胞を維持して、該標的細胞のゲノムに組み込む工程；および（ｃ）免疫応答を誘発するために十分な量で、工程（ｂ）の標的細胞を該被験体に導入する工程を包含する、被験体における免疫応答を誘発する方法もまた開示される。例えば、目的の配列は、膜タンパク質（例えば、ＨＩＶ膜タンパク質）をコード可能であり得る。加えて、目的の配列を発現することは、誘導可能、可逆性、または誘導可能かつ可逆性であり得る。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」とは、抗体を作製すること、免疫を発生すること、抗原に対する過感受性を発生すること、および耐性を発生することを含む、抗原の存在に対する身体の全体としての反応をいう。それゆえに、抗原に対する免疫応答は、目的の抗原に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の被験体における発生もまた含む。「体液性免疫応答」は、形質細胞によって産生される抗体によって媒介される。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球細胞によって媒介されるものである。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体によって認識され、および／または個体における免疫応答を誘発し得る任意の因子（例えば、任意の物質、化合物、分子、タンパク質、または他の部分）をいう。
【０２１１】
本明細書に開示される方法は、任意の細胞型とともに使用することができる。換言すれば、任意の細胞型が、本明細書に開示される方法のために標的細胞として働くことができる。真核生物宿主細胞には、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、および有核細胞が含まれ得るがこれらに限定されない。哺乳動物細胞もまた、本明細書に開示される方法とともに使用することができる。標的細胞は、本明細書に記載される核酸構築物のいずれかもまた含み得る。例えば、標的細胞は、１種以上の遺伝子移入構築物および／または本明細書に記載される１種以上のパッケージング構築物を含み得る。
【０２１２】
「哺乳動物」および「哺乳動物の」という用語は、本明細書で使用される場合、子供に乳を飲ませ、生きた子供を出産するか（真獣類哺乳動物もしくは有胎盤哺乳動物）または産卵する（後獣類もしくは非胎盤哺乳動物）、単孔類動物、有袋動物、および有胎盤哺乳動物を含む任意の脊椎動物をいう。哺乳動物種の例には、ヒトおよび他の霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、モルモット）、および反芻動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ）が含まれる。
【０２１３】
哺乳動物細胞の例には、ヒト細胞（ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、マウス細胞（例えば、胚性幹細胞）、ウサギ細胞、およびサル細胞（例えば、ＣＯＳｌ細胞）が含まれる。細胞は、分裂していない細胞（肝細胞、筋原線維、造血幹細胞、神経細胞）または分裂している細胞であり得る。細胞は、胚性細胞、骨髄幹細胞、または他の前駆細胞であり得る。細胞が体細胞である場合、細胞は、例えば、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、血液細胞（造血細胞、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、樹状細胞、神経細胞（例えば、グリア細胞または星状細胞）、または病原体感染細胞（例えば、細菌、ウイルス、ウイルソイド、寄生生物、またはプリオンに感染した細胞）であり得る。
【０２１４】
代表的には、特定の組織（例えば、上皮、線維芽細胞、または造血細胞）から単離された細胞は、「細胞型」として分類される。細胞は、商業的にそしくは寄託機関から、または生検などによって、動物から直接的に得ることができる。代替的には、例えば、遺伝子治療においてウイルスを動物に送達することが所望される場合には、細胞は動物から単離される必要は全くない。
【０２１５】
任意の細胞型が、例えば、本明細書の他の箇所に記載される組換えタンパク質または抗体を作製するために使用することができるが、細胞表面上のオリゴサッカリドの存在は、結晶化および抗体の発生の困難さを提示し得る。抗体産生を刺激する際に使用できる、タンパク質のグリコシル化に関与する１種以上の酵素が欠損している標的細胞を使用して組換えタンパク質および抗体を作製する方法が本明細書に開示される。タンパク質のグリコシル化に関与する１つのこのような酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：−Ｄ−マンノシド−ｌ，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）である。
【０２１６】
多くの分泌タンパク質、ならびに分泌系のタンパク質の内在性膜タンパク質は糖タンパク質であり、すなわち、これらは、アスパラギンにＮ連結され、またはセリン、スレオニン、もしくはヒポキサンチンにＯ連結されたグリカン（オリゴサッカリド）によって修飾される。Ｎグリコシル化は、タンパク質の正確なフォールディング、タンパク質分解の妨害、タンパク質のコンホメーションおよび認識、タンパク質の溶解性、細胞外空間へのタンパク質の分泌、およびタンパク質の生物学的活性の原因であり得る。
【０２１７】
ＧｎＴＩはＩＩ型内在性膜タンパク質であり、内側ゴルジ槽に局在され、これは、高マンノースＮグリカンの複合およびハイブリッド構造への転換における第１段階を触媒する。機能的ＧｎＴＩ遺伝子を欠いているマウスは誕生前に死亡するので、複合Ｎグリカンは胚発生の生存能力のために決定的である。しかし、ＧｎＴＩ活性を欠く多数の変異体が単離されているので、複合Ｎグリカンは、インビトロで培養される細胞の生存能力のためには必須ではない。
【０２１８】
精製糖タンパク質上の異種Ｎグリカンを取り扱うことの例は、すべてのグリコシル化を除外するためにツニカマイシン処理を使用することである。したがって、テトラサイクリン誘導性発現を伴うツニカマイシン処理は、ミリグラム量のグリコシル化されていないロドプシンの精製のために使用されてきた。しかし、Ｎグリカンを除去することは、扱われる糖タンパク質の構造および機能におけるそれらの役割を許容しないので、このアプローチは理想的ではない。例えば、ロドプシンの構造および機能におけるグリコシル化の正確な役割は完全に理解されているわけではないが、これは明白に重要な役割を有する。光受容体のグリコシル化の非存在から生じるシグナル伝達特性の顕著な欠損は以前に報告されている。また、３つのアミノ酸の変化を伴うロドプシン変異体（Ｅｌ１３Ｑ／Ｅ１３４Ｑ／Ｍ２５７Ｙ）は、ツニカマイシンの存在下で発現されたときには精製することができなかった。変異した他の細胞株は、Ｐｕｔｈａｌａｋａｔｈら、Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  Ｌｅｃ！  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｍｕｔａｎｔ  ｉｓ  Ｄｕｅ  ｔｏ  ａ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｇｅｎｅ，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７１，２７８１８−２７８２２（１９９６）に記載されており、これは、ＧｎＴＩ活性を欠く細胞株のその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
【０２１９】
異種Ｎグリカンを取り扱う別の例は、Ｎグリカン合成に関与する種々の酵素のうちの１つ、例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩが欠損している細胞中で、タンパク質を産生することである。このアプローチは、Ｎグリカン合成に関与する種々の酵素の欠損から生じる種々のレクチンに抵抗性であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株の多様なコレクションの単離のために以前に使用されている。均一なグリコシル化パターンを生成するために変異された細胞株は、ＵＳ  ２００４／００２９２２９に記載されており、これは、均一なＮグリカンを保証するために変異されている細胞株のその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。Ｒｅｅｖｅｓらもまた、均一なグリコシル化パターンを生成するために変異された細胞株を記載している（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ：ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＨＥＫ２９３Ｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；ＰＮＡＳ  ２００２  Ｏｃｔ  １５；９９（２１）：１３４１９−２４．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｏｃｔ  ７）。ＧｎＴＩ遺伝子はまた、ｇｎｔＩ遺伝子を破壊するために変異されている細胞株のその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｏｐｒｉｖｏｖａら、Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｓｓ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ  ｉｓ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  Ｓｉｍｉｌａｒｌｙ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（２００３）：５８２−５９１によって記載されるように、植物中で破壊されてきた。
【０２２０】
例えば、本明細書に記載される標的細胞は、糖タンパク質上で均一なグリコシル化パターンを生成することができる。標的細胞は、対照細胞と比較して，ＧｎＴＩ活性が減少している。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、およびｓｉＲＮＡ分子は、発現を破壊するために利用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、およびｓｉＲＮＡ分子は、単独でまたは抗ウイルス化合物などの他の治療剤と組み合わせて使用することができる。このような方法はまた、本明細書に開示される構築物および方法とともに使用することもできる。例えば、標的細胞はまた、ＧｎＴＩ  ｓｉＲＮＡを発現可能な遺伝子移入ベクターを含むことができ、ここで、ＧｎＴＩ  ｓｉＲＮＡの発現は、構成的または調節可能であり得る。
【０２２１】
本明細書に開示される方法によって作製されるタンパク質を被験体に投与する工程を包含する、選択されたタンパク質で被験体を治療する方法もまた開示される。選択されたタンパク質の投与の方法には、注射（皮下、表皮、皮内）、粘膜内（例えば、鼻、直腸、および膣）、腹腔内、静脈内、経口、または筋肉内が含まれるがこれらに限定されない。投与の他の様式には、経口および肺投与、坐剤、経皮適用が含まれる。投薬量処理は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。
【０２２２】
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝導入またはトランスフェクション）を含む、本明細書に記載される方法において、開示される核酸は、当業者によって十分に理解されるように、細胞への核酸の送達のためにベクターの型であり得、それによって、抗体をコードするＤＮＡフラグメントは、プロモーターの転写調節下にある。ベクターは、本明細書に開示されるベクターのいずれかであり得る。核酸またはベクターの細胞への送達は、種々のメカニズムを経由してであり得る。１つの例として、送達はリポソームを介してであり得、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，ＩｎｃＨｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの市販のリポソーム調製剤、ならびに当該分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用する。加えて、開示される核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能である技術であるエレクトロポレーションによって、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ｍａｃｈｉｎｅ（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて、インビボで送達することができる。
【０２２３】
１つの例において、本明細書に開示される組換えレトロウイルスは、感染させ、それによって広範な中和抗体をコードする核酸を感染細胞に送達するために使用することができる。
【０２２４】
核酸またはベクターの非経口投与は、使用される場合、一般的には、注射によって特徴付けられる。注射液は、従来的な型で、液体溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中の懸濁液の溶液のために適切な固体型、またはエマルジョンとしてのいずれかで調製することができる。非経口投与のためのより最近に修正されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるように、遅延放出系または持続放出系の使用を含む。例えば、非経口投与方法のためのアプローチのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。治療化合物の適切な製剤および種々の投与の経路のさらなる議論については、例えば、治療化合物の適切な製剤および種々の投与の経路のその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）を参照のこと。
【０２２５】
ウイルス粒子形成を調節する因子についてのスクリーニングする方法もまた、本明細書に開示される。例えば、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むパッケージング核酸構築物を細胞に導入する工程であって、ここで、第１の核酸配列はＧａｇポリタンパク質をコードし、第２の核酸配列はＧａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードし、第１の核酸配列および該第２の核酸配列は、フレームシフトまたは翻訳リードスルーを減少する１個以上の変異を含む、工程を包含する、ウイルス粒子形成を調節する因子をスクリーニングする方法が開示される。さらに、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、同じヌクレオチド配列の異なるコード領域から発現させることができ、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、スクリーニングされる因子に作動可能に連結することができる。次に、エンベロープ構築物を細胞に導入することができ、このエンベロープ構築物は、エンベロープ糖タンパク質をコードする第３の核酸配列を含むことができ、ここで、この第３の核酸配列は、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。次いで、細胞は、ウイルス粒子の形成を可能にするために適切な条件下で培養することができる。次いで、ウイルス粒子を検出することができ、対照と比較した、スクリーニングされた薬剤の存在下でのウイルス粒子の数の増加または減少は、その因子がウイルス粒子形成を調節することを示す。対照培養は別個の培養であり得、またはその因子の投与の前もしくは後の同じ培養であり得る。調節可能な配列を含む調節因子構築物もまた細胞に導入することができ、ここで、調節可能なエレメントは、少なくとも１つの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。種々の調節可能な転写制御因子および調節因子配列が、本明細書の全体を通して議論される。例えば、転写制御エレメントはＣＭＶプロモーターであり得、そして調節可能エレメントはｔｅｔＲまたはｔｅｔＡであり得る。
【０２２６】
陽性パッケージング細胞形質転換体（すなわち、取り上げられ、レトロウイルスベクターを組み込まれた細胞）は、当該分野で周知である種々の選択マーカーを使用するためにスクリーニングすることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）などのマーカー遺伝子は、構築物中に含めることができ、例えば、酵素活性または薬物耐性アッセイを使用してアッセイすることができる。代替液には、細胞は、ウイルスタンパク質産生の尺度として、Ｇｏｆｆら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３８：２３９に記載されるように、逆転写酵素（ＲＴ）活性についてのアッセイすることができる。
【０２２７】
同様のアッセイは、望ましくない複製可能なヘルパーウイルスの細胞をパッケージングすることによって、産生について試験するために使用することができる。例えば、本明細書に記載されるものなどのマーカー遺伝子は、これもまた本明細書に開示される構築物の中に含めることができる。本明細書に記載されるパッケージング構築物を用いる標的細胞の一過性トランスフェクション後、パッケージング細胞（本明細書に開示されるパッケージング構築物を少なくとも含む細胞）は、他の非パッケージング細胞とともにサブ培養することができる。これらの非パッケージング細胞は、マーカー遺伝子を有する本発明の組換え複製欠損構築物で感染させることができる。しかし、これらの非パッケージング細胞はウイルス粒子を産生するために必要な遺伝子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子）を含まないので、これらは、次には、これらの他の細胞とともにサブ培養したときに他の細胞に感染しないはずである。これらの他の細胞が、非パッケージング細胞とともにサブ培養したときにマーカー遺伝子の存在について陽性であるならば、望ましくない複製可能なウイルスが産生される。
【０２２８】
したがって、望ましくないヘルパーウイルスの産生について試験するために、本発明のパッケージング細胞は、第１の細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３）とともにサブ培養することができ、これは、次には、マーカー遺伝子またはＲＴ活性の存在について試験され、複製可能なヘルパーレトロウイルスの存在を示す。マーカー遺伝子は、当該分野において周知であるように、例えば、ＦＡＣＳ、染色、および酵素活性アッセイを使用するためにアッセイすることができる。
【０２２９】
トランスジェニック動物を作製するための方法もまた、本明細書に開示される。具体的には、本明細書に開示される方法によって作製したウイルス粒子を接合体に導入する工程；この接合体を分娩まで成長させる工程；そのゲノムが、目的の遺伝子を発現可能である核酸構築物を含む動物を入手する工程；Ｆ１子孫を得るために、この動物を非トランスジェニック動物と交配させる工程；および、そのゲノムが、目的の遺伝子を発現可能であるかまたはその遺伝子を含むことが可能である核酸構築物を含む動物を選択する工程であって、ここで、この動物が、選択された目的の配列を発現するか、またはその配列を含む、工程を包含する、トランスジェニック動物を作製するための方法が開示される。本明細書に開示される方法によって作製されたトランスジェニック動物もまた開示される。
【０２３０】
本明細書のウイルス粒子は、本発明の方法を実施する目的のために、トランスジェニック非ヒト動物を産生するために動物のゲノムに導入することができる。選択マーカーはまた、目的の配列を含むこれらの動物を同定するためのレポーターとして使用することもできる。例えば、光生成タンパク質をレポーターとして使用することができ、画像化は、代表的には、インタクトな生きている非ヒトトランスジェニック動物、例えば、生きているトランスジェニック齧歯類（例えば、マウスまたはラット）を使用して実行される。選択した動物細胞に核酸を導入するために使用することができる任意の技術が利用可能である（「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｃａｒｌ  Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ（編）第１版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０１２５５７１６５８；「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｂｒｉｇｉｄ  Ｈｏｇａｎら，ＩＳＢＮ：０８７９６９３８４３，出版社：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，刊行日：１９９９年９月，第２版、これらは、核酸を動物細胞に導入するために使用することができる技術の教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。種々の形質転換技術が当該分野において周知である。選択した動物細胞に核酸を導入するために使用することができる方法には以下が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３１】
（ｉ）核への直接的マイクロインジェクション：ウイルス粒子は、組換えＤＮＡを機械的に移入するために、マイクロピペットを使用して、動物の細胞核に直接的にマイクロインジェクションすることができる。この方法は、核以外の細胞内区画に露出せず、高頻度で安定な組換え体を生じるという利点を有する。動物細胞核への直接的マイクロインジェクションのその技術の教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８（１９８０）を参照のこと。
【０２３２】
例えば、雄性前核膜の形成後可能な限り初期に、および接合体雌性前核によってそれがプロセスされる前に、ウイルス粒子は、接合体の初期雄性前核にマイクロインジェクションすることができる。したがって、この方法に従うマイクロインジェクションは、雄性および雌性の前核が十分に分かれており、両方が細胞膜に近接して位置しているときに着手するべきである。例えば、Ｗａｇｎｅｒらへの米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９年１０月１０日発行）；およびＲｉｃｈａ，Ｊ．，（２００１）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２６１−８を参照のこと。これらは、接合体の初期雄性前核への直接的マイクロインジェクションのそれらの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３３】
（ｉｉ）ＥＳ細胞トランスフェクション：本発明のウイルス粒子はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することもできる。標的ベクターとの相同組換えを受けるＥＳ細胞クローンが同定され、次いで、ＥＳ細胞−マウスキメラが産生される。ホモ接合性動物は、ヘミ接合性キメラ動物を交配させることによって産生される。手順は、例えば、Ｒｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｈ．およびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．，（１９９２）「Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」Ａｎｎ．Ｒ．Ｉｍｍ  １０：７０５−３０において記載されている。
【０２３４】
（ｉｉｉ）エレクトロポレーション：本発明のウイルス粒子はまた、エレクトロポレーションによって動物細胞に導入することもできる。この技術において、動物細胞は、ウイルス粒子の存在下で電気穿孔される。高電界強度の電気パルスが生体膜を可逆的に浸透可能にし、核酸の導入を可能にする。エレクトロポレーションの間に作製された孔は、核酸などの高分子の取り込みを可能にする。手順は、例えば、Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：７１６１−７１６５（１９８４）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，第１６章において記載されており、これらは、エレクトロポレーションによって動物細胞に核酸またはウイルス粒子を導入することのそれらの教示のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３５】
（ｉｖ）リン酸カルシウム沈殿：ウイルス粒子はまた、直接的取り込みの他の方法によって、例えば、リン酸カルシウムを使用して、細胞に移入することができる。例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．およびＡ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，第１６章において記載されており、これらは、リン酸カルシウム沈殿によって動物細胞に核酸またはウイルス粒子を導入することのそれらの教示のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３６】
（ｖ）リポソーム：人工膜ベシクル（リポソーム）中への核酸のカプセル化、続いて標的細胞膜とのリポソームの融合もまた、動物細胞に核酸を導入するために使用することができる。Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．およびＳ．Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照のこと。これは、動物細胞に核酸を導入するためにリポソームを使用することのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３７】
（ｖｉ）ポリブレンおよびＤＥＡＥ−デキストランを使用するトランスフェクション：これらの技術はＳａｍｂｒｏｏｋ，第１６章において記載されており、これは、動物細胞に核酸を導入するためにポリブレンおよびＤＥＡＥ−デキストランを使用するトランスフェクションを使用することのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３８】
（ｖｉｉ）プロトプラスト融合：プロトプラスト融合は、代表的には、培養動物細胞との、高コピー数の目的のプラスミドを有する細菌プロトプラストの融合を含み、通常はポリエチレングリコールを用いる処理によって媒介される（Ｒａｓｓｏｕｌｚａｄｅｇａｎ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２９５：２５７（１９８２）、これは、動物細胞に核酸を導入するためにプロトプラスト融合を使用することのその教示のためにその全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２３９】
（ｉｉｘ）弾道穿通：核酸セグメントの導入のための別の方法は、小さなビーズもしくは粒子のマトリックス中、または表面上のいずれかでの、核酸を有する小さな粒子による高速弾道穿通である。Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７。これは、動物細胞に核酸を導入するために弾道穿通を使用することのその教示のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０２４０】
エレクトロポレーションは容易さの利点を有し、広範に適用可能であることが見い出されているが、標的細胞の実質的な画分がエレクトロポレーションの間に殺傷される可能性がある。それゆえに、感受性が高い細胞および少量でのみ入手可能な細胞にとっては、核への直接的なマイクロインジェクションが好ましくあり得る。また、高い効率の核酸の組み込みがとりわけ重要である場合、例えば、選択マーカーの使用を伴わない形質転換（上記に議論されるようなもの）などの場合は、核への直接的マイクロインジェクションが有利な方法である。なぜなら、代表的には５〜２５％の標的細胞が、マイクロインジェクションされた核酸を安定に組み込んだからである。
【０２４１】
目的の配列を含むトランスジェニック動物もまた、本明細書に開示される。例えば、ＫＩＳＳ−１、ＦＯＸ  Ｐ３、ＮＦ  Ｋβ、マイクロＲＮＡ  ２２３、またはＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物が本明細書に開示される。
【０２４２】
本明細書に記載される遺伝子移入構築物を含むトランスジェニック動物もまた本明細書に開示される。本明細書に開示される方法によって作製されるトランスジェニック動物もまた開示される。
【０２４３】
本願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書に記載される化合物、組成物、および方法をより完全に説明するために、それらの全体が参照により本願に援用される。
【０２４４】
種々の修飾およびバリエーションを、本明細書に記載される化合物、組成物、および方法に対して作製することができる。本明細書に記載される化合物、組成物、および方法の他の局面は、本明細書に開示される化合物、組成物、および方法の詳細および実施の考慮から明らかである。詳細な説明および実施例は例示として見なされることが意図される。
【実施例】
【０２４５】
以下の実施例は、本明細書に記載され、かつ特許請求される化合物、組成物、物品、装置、および／または方法がいかにして作製および評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、純粋に例示的であることを意図しており、発明者らが彼らの発明であると見なしていることの範囲を限定することを意図しない。数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力は行われてきたが、ある程度の誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃または大気温度であり、圧力は大気圧またはその周辺である。記載されるプロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するために使用できる、反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに他の反応範囲、および条件の数値のバリエーションおよび組み合わせが存在する。合理的かつ日常的な実験のみが、このようなプロセス条件を最適化するために必要である。
【０２４６】
実施例１
テトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的レンチベクターの構築
テトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的レンチベクターを、目的の配列、ｅＧＦＰの配列の発現を駆動するために構築した。最初に、１．２ｋｂのヒトＥＦｌ−ａプロモーターをＰＣＲによってｐＥＦ４／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使用してｐＨＲＣＭＶｅＧＦＰ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターはｐＨＲＥＦｅＧＦＰ／ｂｌａｓと称した。次に、テトラサイクリンリプレッサーをコード可能な配列はコドン最適化し、ＳＶ４０核局在化シグナルに連結した。次いで、ＳＶ４０核局在化シグナルに連結された、コードされた最適化テトラサイクリンリプレッサー遺伝子は、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を使用して、ｅＧＦＰを置き換えたｐＨＲＥＦｅＧＦＰ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターはｐＨＲＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。次いで、５００ｂｐのヒトＣＭＶプロモーターをＰＣＲによって増幅し、３’ＣＭＶプロモーターに２つのｔｅｔオペレーター配列を導入した。このＰＣＲフラグメントは、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を使用して、ｐＨＲＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターはｐＨＲＣＭＶＯ２（Ｒ）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。次いで、ＣＭＶプロモーターの方向を逆転した。次いで、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含むＥＧＦＰフラグメントを、ｐＨＲＣＭＶＯ２（Ｒ）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングし、これは、次いで、ＣＭＶプロモーターによって制御された。得られたベクターはｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。次に、１．２ｋｂのヒトユビキチン６プロモーターをＰＣＲによってｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を使用してｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターはｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＵＢ６ｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。この段階後、３００ｂｐの５’ヒトＣＭＶプロモーター配列を含む１．６ｋｂのＣＡＧプロモーター、および１．２ｋｂのニワトリβ−アクチンプロモーターを、ｐＤＲＩＶＥ−ＣＡＧ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）から得て、ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓはＳｎａＢＩおよびＮｃｏＩ制限酵素によって切断し、５’ＣＭＶ配列およびＥＦプロモーターを除去し、ＣＡＧプロモーターで置き換えた。得られた構築物はｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。
【０２４７】
実施例２
高力価のテトラサイクリンベースの単一の誘導性可逆的ウイルス粒子の生成
２９３Ｙ細胞を、ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓ、ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓ；ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＵＢ６ｔｅｔ／ｂｌａｓおよびｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓを含む、パッケージング構築物、エンベロープ構築物、および異なる遺伝子移入構築物とともに同時トランスフェクトし、異なるバージョンの誘導性ウイルス粒子を産生した。これらの同時トランスフェクションから得られたウイルス粒子力価は、ＨｅＬａ細胞中でのｅＧＦＰ発現を決定するための蛍光顕微鏡法を使用して測定した。トランスフェクト細胞由来の上清の力価は１〜４×１０６／ｍｌであったのに対し、濃縮上清（４００倍高い）の力価は２〜１０×１０８／ｍｌであった。
【０２４８】
実施例３
堅固に調節される誘導性単一レンチベクター
マウスＴ細胞株（４×１０４）は、ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓ（力価２．５×１０６／ｍｌ）由来の１００μｌのウイルス粒子上清で感染させた。翌日、感染細胞は以下の群に分けた：群１、これは、０．１μｇ  ＤＯＸ／ｍｌを含む培地中でインキュベートした、および群２、これは、ＤＯＸを含まない培地中でインキュベートした。感染の３日後、細胞はＦＡＣＳ分析によって分析し、ＧＦＰ発現のレベルを決定した。群１の分析は、１６，１９５のＧＦＰ発現シグナル平均強度を示し、これは、群２と比較して４４．２倍の増加であった。
【０２４９】
実施例４
単一レンチベクターはＤＯＸに高度に感受性であり、遺伝子発現を迅速に誘導した
単一ベクター系において遺伝子発現を誘導するために必要とされるＤＯＸ濃度を決定するために、ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓ（力価２．５×１０６／ｍｌ）由来のウイルス粒子で感染させた細胞に、異なる濃度のＤＯＸを加えた。ＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡法によってモニターした。図４Ａは、１５ｎｇのＤＯＸが、４８時間以内にＧＦＰ発現を誘導するために十分であったことを示す。
【０２５０】
実施例５
構成的プロモーター活性は、単一の誘導性レンチベクターの誘導可能なプロモーター活性に有意な影響を与える
テトラサイクリンリプレッサーの発現レベルが遺伝子移入ベクターの誘導可能な能力に影響を与えたか否かを決定するために、異なるプロモーターを遺伝子移入ベクターにクローニングして、テトラサイクリンリプレッサーの発現を駆動した。使用したプロモーターは、ヒトＥＦ−１ａプロモーター（ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦ−ｌａ／ｂｌａｓ）、ＣＡＧプロモーター（ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓ）、およびヒトユビキチン６プロモーター（ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＵＢ６ｔｅｔ／ｂｌａｓ）であった。ＥＦ−１ａは３つの中では最強のプロモーターであったのに対して、ヒトユビキチン６プロモーターが最弱であった。２９３Ｔ細胞由来のウイルス粒子は、マウスＴ細胞株に感染させた。陽性感染細胞は、ブラストサイジン抗生物質を使用して選択した。３日間の選択後、感染細胞を２つの群に分けた：群１、これは、ＤＯＸを含む培地中でインキュベートした、および群２、これは、ＤＯＸを含まない培地中でインキュベートした。表１は、異なるベクターを使用したＧＦＰの発現レベルの誘導を示す。
【０２５１】
【表１】
2009519715.tif 000003
ＥＦ−１ａプロモーターを含む構築物は、最低の基底レベルのｅＧＦＰ発現を生じたが、しかし、これはまた、最高の誘導レベルのｅＧＦＰ発現を生じた。ｅＧＦＰ発現の誘導レベルは、ＥＦ−１ａプロモーター構築物については１００倍を超えていた。ヒトユビキチン６プロモーターは、最高の基底レベルのｅＧＦＰ発現、および最低の誘導レベルのｅＧＦＰ発現を生じた。ｅＧＦＰ発現の誘導レベルは、ヒトユビキチン６プロモーター構築物については約１７倍であった。
【０２５２】
構成的プロモーターの効果は２つのレベルで見ることができ、最初にプロモーターは基底の漏出レベルに効果を与え、２番目には、構成的プロモーターは、目的の遺伝子（ここではｅＧＦＰ）の最大発現レベルに影響を与える。強力な構成的プロモーターは、高レベルのテトラサイクリンリプレッサー発現を駆動でき、これは、ＤＯＸの非存在下で基底の漏出レベルを促進および制御する．ＣＭＶプロモーターベースの誘導性プロモーターは、しばしば、ＨａＬａ細胞などの他の細胞型との比較において、Ｔ細胞中で活性がより低い。
【０２５３】
強力な構成的プロモーターが調節因子構築物に連結される場合、例えば、ｔｅｔＲに作動可能に連結されたＥＦ−１αは、誘導性系に適用され、このような強力な構成的プロモーターは、ＣＭＶベースの誘導性プロモーター活性を刺激することができる。目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターが、調節因子構築物の発現を駆動する強力な構成的プロモーターにさらに作動可能に連結される場合、目的の遺伝子の発現は、Ｔ細胞中で非常に活性になる。
【０２５４】
実施例６
単一の誘導性レンチベクターを使用するｅＧＦＰトランスジェニックマウスの生成
２２から２４日齢の間の雌性マウス（Ｂ６株）を、以前に記載されたように（Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｒ．ＵＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｆ．ＵＣｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｅ．ＵＬａｃｙ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９４）、妊馬血清（ＰＭＳ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の組み合わせを用いて過剰排卵させた。ドナー胚は、Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｅ．  Ｌａｃｙ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９４）によって記載されるように、後で収集した。以前に記載された方法を使用して作製された濃縮ウイルス粒子（力価約２×１０８／ｍｌ）を、マイクロインジェクション系（ＣｅｌｌＴｒａｍ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、収集と同じ日に単細胞段階の胚に送達した。ピペットをガイドするためのマイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットは、透明帯を通して囲卵腔に押し出し、１０ｐｌから１００ｐｌのウイルスストックを胚に送達した。感染した胚は、ＫＳＯＭ−ＡＡ（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｍｅｄｉａ，ＮＪ）中で一晩培養し、これらの２細胞段階の胚は、トランスジェニック動物を作製する方法のその教示のためにその全体が本明細書に参照により援用される、Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｅ．Ｌａｃｙ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９９４）によって記載されるように、偽妊娠雌（１０週齢ＣＤ１）に移した。ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔ由来の１１例のファウンダー（本明細書ではＥＦ−ファウンダーという）およびｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔ由来の８例のファウンダー（本明細書ではＣＡＧ−ファウンダーという）を同定した。
【０２５５】
ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＥＦｔｅｔおよびｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔの２つのバージョンは、トランスジェニックマウスに対する有害な効果の可能性を回避するために、ブラスチシジン遺伝子を除去することによって、ｐＨＲｅＧＦＰＯ２／Ｅｆｔｅｔ／ｂｌａｓおよびｐＨＲｅＧＦＰＯ２／ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓから生成した。ゲノムＤＮＡは、３週間齢のファウンダーから抽出し、ＰＣＲおよびノーザンブロット分析によって分析して、陽性トランスジェニックマウスの存在および組み込み構築物のコピー数を決定した。表２は陽性トランスジェニックマウスの数を示す。
【０２５６】
【表２】
2009519715.tif 000004
陽性トランスジェニックマウスは、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子に標的化されたプライマーの対を使用するＰＣＲ分析を用いて同定した。配列番号１６および配列番号１７の両方の構築物が２×１０８／ｍｌのおよその力価を有していたので、両方の構築物が同様の陽性割合のトランスジェニックマウスを生成した。ノーザン分析は、ＥＦ−ファウンダー群において３つの単一コピーファウンダーが存在し、２つの単一コピーファウンダーはＣＡＧ−ファウンダー群において存在することを明らかにした。陽性トランスジェニックマウスの半分が、両方の群において２つ以上のコピーを有した（１から４までの範囲）。以前の報告と比較すると、他の報告は、両方の群における２つ以上のコピーを有するファウンダーマウスを生成するためには、５倍高い力価（１０×１０８／ｍｌ）を使用しなくてはならなかった。したがって、本発明の方法は、より効率的なプロセスを提供する。
【０２５７】
実施例７
ＤＯＸを含む飲料水を使用する、トランスジェニックマウスにおけるｅＧＦＰの誘導
誘導性構築物がインビボでｅＧＦＰ発現を誘導し得るか否かを決定するために、トランスジェニックマウスに、１００μｇ／ｍｌ  ＤＯＸを含む飲料水を供給した。身体（足）およびＰＢＭＣにおけるＧＦＰ発現は、トランスジェニックマウスがＤＯＸを供給される前後で、蛍光顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析によって分析した。１２例の陽性マウスのすべてが、ＰＢＭＣと身体（足）の両方でｅＧＦＰの発現を誘導することが可能であったが、誘導可能なレベルはこれらのマウス間で変動した。ｅＧＦＰ発現は、ＤＯＸ前のすべてのトランスジェニックマウスにおいて検出されたが、そのレベルはマウスにわたって変動した。ｅＧＦＰ発現は、トランスジェニックマウスがＤＯＸを供給された後で有意に増加した。ＣＡＧプロモーターを含む構築物由来のウイルス粒子で感染されたトランスジェニックマウスは、ＥＦ−１ａプロモーターを含む構築物由来のウイルス粒子で感染されたトランスジェニックマウスと比較して、最高レベルの誘導を生じた。これらのデータは、上記のインビトロの結果と異なっていた。
【０２５８】
実施例８
トランスジェニックマウスの身体（指）におけるｅＧＦＰ発現の可視化は誘導性かつ可逆的であった
遺伝子移入構築物中に含まれる導入遺伝子が全身を通って発現できるか否かを決定するために、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰを含む、上記のような遺伝子移入構築物を使用して、上記のようなトランスジェニック動物を生成した。ＣＡＧプロモーターの制御下にあるｅＧＦＰを用いると、ｅＧＦＰは全身を通って発現できることが可能である。上記の遺伝子移入構築物を含むトランスジェニック動物の全身を通ってＧＦＰが発現したか否かを決定するために、トランスジェニックマウスの指を蛍光顕微鏡法によって分析した。この研究のために、上記のＣＡＧファウンダーのうちの４つ（ＣＡＧファウンダー１＃、２＃、６＃、および７＃と名付けた）を分析のために選択した。ｅＧＦＰの発現は、ＤＯＸの添加後２＃および６＃で見られ、これらの２例のマウスにおけるＧＦＰ発現がＤＯＸによって堅固に制御できることを示唆した。ＣＡＧファウンダー１＃におけるｅＧＦＰ発現は、試験したトランスジェニックファウンダーの間でＤＯＸの添加後に最も高い発現を示したのに対し、その指は、ＤＯＸ誘導なしでは最低レベルでｅＧＦＰを発現した。ＣＡＧファウンダー７＃は、ＤＯＸの添加に応答したｅＧＦＰ発現のある程度の遅れを示し、全体の発現強度は、他のＣＡＧファウンダーの発現強度と比較して弱かった。
【０２５９】
ＣＡＧファウンダーからのＤＯＸの除去の１２日後、マウスの指を再度蛍光顕微鏡法によって分析した。ＣＡＧファウンダー１＃を例外として、指におけるＧＦＰ発現の強度は、誘導前の発現レベルと類似の発現レベルまで、劇的に低下した。これらの結果は、これらのトランスジェニックマウスにおけるＧＦＰマウスが、ＤＯＸの存在または非存在に依存して、誘導性かつ可逆的であり得ることを示す。
【０２６０】
実施例９
トランスジェニックマウスの血液細胞におけるＧＦＰ発現は、ＤＯＸによって誘導性かつ可逆的であった
ＣＡＧファウンダーマウス由来のＧＦＰ発現は、４つの異なる時点でモニターした：（１）マウスが、それらの飲料水中のＤＯＸ（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＸ）を供給される前、（２）マウスが、それらの飲料水中のＤＯＸ（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＸ）を供給された１２日後、（３）（２）の時点より、飲料水中からのＤＯＸの除去の１２日後、および、次いで、（３）の時点のマウスに、１日および２日の間、それらの飲料水中のＤＯＸ（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＯＸ）を供給した後である。ＣＡＧファウンダー１＃マウスとＣＡＧファウンダー２＃マウスの両方の血液細胞のＧＦＰ発現は、ＣＯＸによって堅固に制御された。加えて、ＧＦＰ発現は、ＤＯＸの中止の際に逆転できた。さらに、試験した血液細胞中のＧＦＰ発現レベルは、バックグラウンドレベル（ＤＯＸの添加前のレベル）に戻ることができた。このデータは、単一のレンチウイルス系が、遺伝子移入構築物の中で、配列の発現を誘導および逆転できることを示す。
【０２６１】
実施例１０
ＤＯＸによる複数器官におけるＧＦＰ発現の誘導
上記のレンチウイルス系が、動物の全身を通って目的の配列を発現可能であるか否かを決定するために、ＧＦＰの発現を試験した。一旦、ＣＡＧファウンダー２＃が生成されると、動物を解剖し、蛍光顕微鏡法を使用して、器官を個々に分析した。高ＧＦＰ発現は、Ｔｇマウス（ＣＡＧファウンダー２＃）の骨および筋肉において見られたが、ＧＦＰ発現は正常マウスにおいては見られなかった。Ｔｇマウスにおいては、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および腸で高ＧＦＰ発現が観察されたのに対して、Ｔｇマウスの脳ではＧＦＰ発現はより弱かった。このデータは、トランスジェニックマウスにおけるｅＧＦＰ発現が、全身を通してＤＯＸによって誘導できるが、誘導レベルは異なる器官の間で変動し得ることを示す。
【０２６２】
実施例１１
誘導性ＧＦＰ発現のために必要とされる飲料水中のＤＯＸの濃度の決定
以前の研究は、ｔｅｔ調節可能な系を含むトランスジェニックマウスの飲料水中の０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＸ濃度が、動物の中で誘導性遺伝子発現のために必要とされると報告した。上記のトランスジェニックマウスにおけるＧＦＰの誘導性発現のために必要とされるＤＯＸの濃度を決定するために、０μｇ／ｍｌ（群１）、４μｇ／ｍｌ（群２）、２０μｇ／ｍｌ（群３）、および１００μｇ／ｍｌ（群４）を含む、異なる濃度のＤＯＸを含む飲料水を供給した４つの群に、ＣＡＧファウンダー６＃からのＦ１マウスを分けた。ＧＦＰ発現は、マウスＤＯＸの供給の０、１、２、３、５、および１８日後に、ＵＶ光下で、トランスジェニックマウスの指のＧＦＰ発現を可視化することによってモニターした。実験の過程にわたって試験したマウスの指の蛍光シグナルの強度を観察した。群３および群４のマウスは、ＤＯＸ供給の１日後にＧＦＰを発現し始め、このことは、水を飲むことに通して、ＤＯＸが迅速に遺伝子発現を誘導できることを示した。群３および４の蛍光シグナルの強度は、ＤＯＸ供給の５日後にそれらの最高レベルのＧＦＰ発現を発現した。加えて、群２のマウスに供給した４μｇ／ｍｌのＤＯＸは、ＧＦＰ発現を誘導するために十分であったが、しかし、その誘導は遅れ、強度は群３および４のマウスと比較して相対的に低かった。蛍光シグナルの強度が用量依存的な様式で現れることもまた注目される。
【０２６３】
ＦＡＣＳを使用して，ＧＦＰを発現する陽性血液細胞を単離および定量した。図５は、マウスＤＯＸの供給前およびその１８日後の血液細胞中でのＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析の結果を示す。群２、３、および４のすべてのマウスについて、ＧＦＰ発現細胞の数と強度の両方が、マウスにＤＯＸを供給した後で増加した。
【０２６４】
ＤＯＸの薬物動態学を決定するために、群４マウスからの４３％の血液細胞がＧＦＰを発現し（ＤＯＸ供給の１８日後）、このレベルを、１００パーセント誘導の閾値を設定するために使用した。図６は、群２、３、および４のマウスの間の血液細胞中でのＧＦＰ発現の誘導動力学を示す。このデータは、ＤＯＸが、開示されたトランスジェニックマウスの血液および指におけるＧＦＰ発現を誘導できること、および誘導レベルが用量依存性であることを明らかにする。
【０２６５】
実施例１２
ｓｈＲＮＡを発現するためのテトラサイクリンベースの単一の誘導性で可逆的なレンチベクターの構築
ヒトＨ１プロモーターを、ＮｏｔＩを含むセンスプライマー
【０２６６】
【化１】
2009519715.tif 000005
（配列番号１８）ならびに、ＴＡＴＡボックスの上流の１つの最小１９ｂｐ  ｔｅｔＯ配列、およびＴＡＴＡボックスの下流の別のｔｅｔＯ配列を含むアンチセンスプライマー
【０２６７】
【化２】
2009519715.tif 000006
（配列番号１９）を使用するＰＣＲによって、Ｈｅｌａ細胞から増幅した。次いで、ヒトＨ１プロモーターを含むＰＣＲフラグメントを、ｐＨＲＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターをｐＨＲｈＨｌｔｅｔＯＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと称する。
【０２６８】
マウスＨ１プロモーターを、ＮｏｔＩを含むセンスプライマー
【０２６９】
【化３】
2009519715.tif 000007
（配列番号２０）ならびに、ＴＡＴＡボックスの上流の１つの最小１９ｂｐ  ｔｅｔＯ配列、およびＴＡＴＡボックスの下流の別のｔｅｔＯ配列を含むアンチセンスプライマー
【０２７０】
【化４】
2009519715.tif 000008
（配列番号２１）を使用するＰＣＲによって、３Ｔ３細胞から増幅した。次いで、マウスＨ１プロモーターを含むＰＣＲフラグメントを、ｐＨＲＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターをｐＨＲｍＨｌｔｅｔＯＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと称する。
【０２７１】
これらの実験のために使用した目的の配列は、ｅＧＦＰコード領域（ｎｔ１２６から１４４まで）を標的とするように設計されたｓｈＲＮＡであった。ｓｈＲＮＡは、互いにアニールさせたセンスプライマー
【０２７２】
【化５】
2009519715.tif 000009
（配列番号２２）およびアンチセンスプライマー
【０２７３】
【化６】
2009519715.tif 000010
（配列番号２３）を使用して生成し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で事前に消化した、ｐＨＲｈＨｌｔｅｔＯＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓおよびｐＨＲｍＨｌｔｅｔＯＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターは、それぞれ、ｐＨＲｈＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓおよびｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。
【０２７４】
実施例１３
マウスＨ１誘導性プロモーターによる遺伝子発現の効率的サイレンシング
ｅＧＦＰを発現可能である異なる細胞株［ＨｅＬａ細胞、ＣＥＭ−ＳＳ細胞（ヒトＴ細胞株）およびマウスＴ細胞株］を、ｐＨＲｈＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓおよびｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓ由来のウイルス粒子で感染させた。感染の２日後、レンチベクターを含む細胞は、ブラスチシジンに細胞を３日間曝露することによって、抗生物質（１０μｇ／ｍｌのブラスチシジン）を用いて選択した。陽性細胞は、２つの群、０．５μｇ／ｍｌ  ＤＯＸを含む培地中で培養した群１、およびＤＯＸを欠く培地中で培養した群２に分けた。ＤＯＸ誘導の７日後、群１および２からの細胞を、ＦＡＣＳを使用して分析した。図７は、ヒトとマウスの両方のＨ１プロモーターがｓｈＲＮＡを発現可能であり、これは、次には、ＨｅＬａ細胞におけるｅＧＦＰ発現を効率的にサイレンシングできることを示す。ｅＧＦＰ発現の抑制は５０倍までであった。
【０２７５】
ヒトＨ１プロモーターは、ヒトＴ細胞株におけるｅＧＦＰ発現をサイレンシングする際により効率的ではない（１〜２倍）のに対して、マウスＨ１プロモーターはｅＧＦＰ発現を１０倍まで減少した（図８）こともまた注目される。マウスＴ細胞株においては、ｅＧＦＰ発現は、マウスＨ１プロモーターによってバックグラウンドレベルまで減少したが、ヒトＨ１プロモーターは、ｅＧＦＰ発現を４倍まで減少した。このデータは、上記のウイルス粒子で感染した細胞中のｅＧＦＰ発現レベルが、ＤＯＸによって堅固に制御されることを示す。
【０２７６】
実施例１４
単一のレンチベクターによる内因性タンパク質ＣＸＣＲ４の誘導性サイレンシング
単一の誘導性レンチベクターが内因性タンパク質発現を減少できるか否かを決定するために、マウスＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡを含む単一のレンチベクターを構築した。ｓｈＲＮＡは、互いにアニールさせたセンスプライマー
【０２７７】
【化７】
2009519715.tif 000011
（配列番号２４）およびアンチセンスプライマー
【０２７８】
【化８】
2009519715.tif 000012
（配列番号２５）を使用して、ＣＸＣＲ４コード領域（ｎｔ６２８から７０２）を標的とするように設計し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で事前に切断し、かつブラスチシジン耐性マーカーがｅＧＦＰによって置き換えられている、ｐＨＲｍＨｌｔｅｔＯＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓにクローニングした。得られたベクターは、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（６８２）ＥＦｔｅｔ／ＧＦＰと称した。
【０２７９】
マウスＴ細胞株の２つの群を、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（６８２）ＥＦｔｅｔ／ＧＦＰ由来のウイルス粒子で感染させた。群１は５×１０６ＩＵ／ｍｌの力価で感染させ、群２は５×１０７ＩＵ／ｍｌの力価で感染させた。感染の３日後、各群の細胞を、２つのさらなる群に下位分割した。さらなる群は、０．５μｇ／ｍｌのＤＯＸを含む培地（群１ａおよび２ａ）またはＤＯＸを含まない培地（群１ｂおよび２ｂ）のいずれかで培養した。培養の５日後、すべての細胞を、ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｇｅｎ）と結合体化した抗ＣＸＣＲ４抗体で染色した。次いで、これらの染色した細胞をＦＡＣＳによって分析した。ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（６８２）ＥＦｔｅｔ／ＧＦＰ由来のウイルス粒子の５×１０６ＩＵ／ｍｌで感染させたこれらの細胞は８５％の細胞でＧＦＰを発現するのに対して、５×１０７ＩＵ／ｍｌのウイルス粒子で感染させた細胞は９８％の細胞においてＧＦＰを発現した（図９）。ＤＯＸの存在下では、群１ａの細胞はＣＸＣＲ４の強度を６０％減少したのに対して、群２ａの細胞はＣＸＣＲ４の強度を８５％減少した。これらのデータは、レンチウイルスがｓｈＲＮＡ活性を誘導でき、これが次には、内因性タンパク質発現を減少できることを示す。加えて、これらのデータは、複数コピーの組み込んだベクターが、高レベルの遺伝子サイレンシングを誘発できることを示す。
【０２８０】
実施例１５
単一のレンチベクターは、トランスジェニックマウスにおいて遺伝子発現をサイレンシングするために、誘導性にｓｈＲＮＡを発現できる
単一のレンチベクターが動物においてタンパク質発現を減少するためにｓｈＲＮＡを発現できるか否かを決定するために、Ｊａｃｋｓｏｎ研究室からのｅＧＦＰトランスジェニックマウスの同種系統を標的として選択した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスの同種系統を使用して、ｅＧＦＰタンパク質発現に対するｓｈＲＮＡの効果を測定することができる。この実験のためのレンチウイルスを生成するために、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓプラスミドのＥＦ−１ａプロモーターをＣＡＧプロモーターで置き換えて、トランスジェニックマウスにおける単一のレンチベクターの遺伝子発現の能力を改善した。得られたベクターは、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓと称した。細胞培養において、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓ由来のベクターは、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓと同様に、ＧＦＰ発現を誘導性にサイレンシングすることが可能であるｓｈＲＮＡを発現した。
【０２８１】
ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓまたはｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓ構築物由来の２×１０８ＩＵ／ｍｌのウイルス粒子を、マイクロインジェクション系（上記）を使用して，ＧＦＰマウスのホモ接合性株の単細胞段階の胚に送達した。得られたトランスジェニックマウスは、本明細書では、ＧＦＰ／ＣＡＧファウンダーマウスという。翌日、２細胞段階の胚をＣＤ１乳母に移植した。ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓ由来のウイルス粒子を注入した１１例のマウスの内の５例が、ＰＣＲ分析によって確認されたように、導入遺伝子について陽性であったのに対し、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓ由来のレンチベクターを注入した９例のマウスの内の４例が、ＰＣＲ分析によって確認されたように、導入遺伝子について陽性であった。このようなものとして、ＰＣＲ分析によって導き出されるような導入遺伝子マウスの割合は、２つのレンチベクターの各々についておよそ４０％であった。
【０２８２】
導入遺伝子発現について陽性であると同定された２例のマウス、ＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー６＃およびＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー９＃は、４週間飼育した。次いで、４週齢トランスジェニックマウスの尾静脈からの血液を収集し、血液細胞中のＧＦＰ発現のレベルをＦＡＣＳ分析によって分析した。次いで、ｓｈＲＮＡの発現を誘導するために、同じマウスに、それらの飲料水を介してＤＯＸを供給した。再度、ＤＯＸ供給の５日後および１０日後に、４週齢トランスジェニックマウスの尾静脈から血液を収集した。前回と同様に、血液細胞中のＧＦＰ発現のレベルはＦＡＣＳによって分析した。ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＣＡＧｔｅｔ／ｂｌａｓ由来の４例の陽性トランスジェニックマウスのうちの２例が、ＤＯＸの供給後にＧＦＰ発現のレベルを減少した（図１２のＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー６＃およびＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー９＃を参照のこと）。ある細胞は１０倍までのＧＦＰ発現のレベルの減少を示した一方、ある細胞は変化を示さなかったので、血液細胞中のＧＦＰ発現のレベルの減少は均一ではなかった。加えて、ｐＨＲｍＨｌＧＦＰｉ（１２６）ＥＦｔｅｔ／ｂｌａｓ構築物由来のウイルス粒子で感染させた５例の陽性トランスジェニックマウスのうちの５例が、ＧＦＰ発現のレベルの変化を示さなかった。しかし、誘導前のＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー６＃とＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー９＃の両方についてのＧＦＰ発現のレベルは、非トランスジェニックマウス（ｓｈＲＮＡベクターなし）と同じであり、このことは、トランスジェニック動物におけるＨ１誘導性プロモーターがＤＯＸによって堅固に制御できることを示す（図１１）。
【０２８３】
実施例１６
単一のレンチベクターは、ｓｈＲＮＡを誘導性に発現でき、トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現をサイレンシングする
単一の誘導性レンチベクターが、生殖細胞系伝達を通して機能的なままδあり得るか否かを決定するために、ＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー６＃（雌性）およびＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー９＃（雄性）を交尾させた。すべてのＦ１マウスは、レンチベクター組み込みコピーの数を決定するために、サザンブロット分析によって分析した。１１例のＦ１マウスのうちの２例が、２つの組み込みレンチベクターのコピーを有した。他のＦ１マウスは、１つの組み込みコピーを有するか（５例のマウス）または陰性（４例のマウス）のいずれかであった。
【０２８４】
レンチベクターを含むＦ１マウスがＤＯＸ調節を介してＧＦＰ発現のレベルを誘導性に減少できるか否かを決定するために、レンチベクターの２つの組み込みコピーを含むＦ１マウス（Ｆ１−６＃およびＦ１−９＃）を分析した。マウスがＤＯＸを供給される前、およびマウスがＤＯＸを供給された１０日後、１７日後、２７日後に、４週齢のＦ１−６＃およびＦ１−９＃トランスジェニックマウスからの血液を収集した。血液細胞中のＧＦＰの発現レベルを、ＦＡＣＳ分析によって分析した。図１３は、マウスがＤＯＸを供給された後の、血液細胞中のＧＦＰの発現レベルを示す。両方のトランスジェニックマウス（Ｆ１−６＃およびＦ１−９＃）のＧＦＰの発現レベルは、非トランスジェニックマウスのそれと同様であった。図１４は、マウスがＤＯＸを供給された１０日後、１７日後、２７日後のトランスジェニックマウス血液細胞中のＧＦＰの発現レベルを示す。マウスがＤＯＸを供給された後に、血液細胞中で減少した。ある細胞はＧＦＰの発現レベルを３０倍まで減少し、ある細胞中のＧＦＰの発現レベルは変化しないままであったので、血液細胞中のＧＦＰの発現レベルの減少は均一ではなかった。ＤＯＸの供給の１７日後、７５％の血液細胞はＧＦＰの発現レベルの２０倍の減少を示した。ＤＯＸの供給の２７日後、８５％の血液細胞はＧＦＰの発現レベルの３０倍の減少を示した。これらのデータは、誘導性レンチベクターが、Ｆ１マウスにおけるＧＦＰの発現をサイレンシングするために十分なｓｈＲＮＡを発現したことを示し、このことは、単一の誘導性レンチベクターが生殖細胞系伝達後に機能的であったことを示す。
【０２８５】
実施例１７
ｓｈＲＮＡを発現するための単一の誘導性レンチベクターは、生殖細胞系伝達を通して機能的であった
単一の誘導性レンチベクターが生殖細胞系伝達を通して機能的であったか否かを決定するために、２例の陽性トランスジェニックマウス（ＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー６＃は雌性であり、ＧＦＰ／ＣＡＧファウンダー９＃は雄性であった）を交尾させた。互いに交尾させるための２つのファウンダーを使用して、本発明者らは、ＧＦＰレベルを有意にサイレンシングするために、ｓｈＲＮＡの発現を増加させることを希望する。すべてのＦ１マウスは、レンチベクター組み込みコピーの数を決定するために、サザンブロットによって分析した。１１例のＦ１マウスのうちの２例が、２つの組み込みレンチベクターのコピーを有した。他のＦ１マウスは、レンチベクターの１つの組み込みコピーを有するか（５例のマウス）または陰性（４例のマウス）のいずれかであった。
【０２８６】
レンチベクターを含むＦ１マウスがＤＯＸによってＧＦＰを誘導性に減少できるか否かを決定するために、ベクターの２つの組み込みコピーを含むＦ１マウス（Ｆ１−６＃およびＦ１−９＃）を分析した。マウスがＤＯＸを供給される前、およびマウスがＤＯＸを供給された１０日後、１７日後、２７日後に、４週齢のトランスジェニックマウスの血液を収集した。血液細胞中のＧＦＰレベルを、ＦＡＣＳ分析によって分析した。図１３は、ＤＯＸ前の、血液細胞中のＧＦＰの発現レベルを示す。両方のトランスジェニックマウス（Ｆ１−６＃およびＦ１−９＃）のＧＦＰの発現レベルは、非トランスジェニックマウスのそれと同様であった。図１４は、ＤＯＸの１０日後、１７日後、２７日後に分析した血液細胞中のＧＦＰレベルを示す。血液細胞のＧＦＰレベルは、ＤＯＸ後により少ない。血液細胞中のＧＦＰの発現レベルの減少は均一ではなく、ある細胞はＧＦＰの発現レベルを３０倍まで減少したのに対し、他の細胞のＧＦＰの発現レベルは変化しなかった。ＤＯＸの供給の１７日後、７５％の血液細胞はＧＦＰの発現レベルの約２０倍の減少を示したのに対し、ＤＯＸの供給の２７日後、８５％の血液細胞はＧＦＰの発現レベルの約３０倍の減少を示した。これらのデータは、誘導性レンチベクターが、Ｆ１マウスにおけるＧＦＰタンパク質をサイレンシングするためのｓｈＲＮＡを発現したことを示し、このことは、生殖細胞系伝達を通した単一の誘導性レンチベクターが機能的であったことを示す。
【０２８７】
実施例１８
単一の誘導性レンチベクターは、ＩＩ型ポリメラーゼを使用して遺伝子発現をサイレンシングするために、マイクロＲＮＡベースのｓｈＲＮＡを発現する
以前に、他の研究者らは、Ｈ．Ｂｕｊａｒｄおよび共同研究者らによって開発されたテトラサイクリン（ｔｅｔ）調節系を使用する、単一の誘導性レンチベクターを報告した。このようなベクターは、単一のベクター中の誘導性プロモーターおよびヒトＣＭＶプロモーターの制御下で、ＧＦＰレポーター遺伝子およびテトラサイクリントランス活性化因子を発現する。誘導性プロモーターと構成的プロモーターの両方が、５’−ＬＴＲから３’−ＬＴＲまでの同じ方向に配置される。この型の単一ベクターは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現し、これは、おそらく、非特異的なＲＮＡ配列にハイブリダイズする。これらの非特異的配列は、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの効率および機能を減少することができる。
【０２８８】
このような問題点を克服するために、反対の方向に配向されている、二シストロン性の誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターを有する、単一の誘導性レンチベクターを生成した。プロモーターの干渉および誘導性プロモーターの基底レベルの漏出を減少させるために、１．２ｋｂのニワトリインシュレーターを、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの間に挿入した。ＣＡＧプロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子（ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質）の発現を駆動するため、およびインビボでの誘導性遺伝子発現を改善するために選択した。加えて、改善したｔｅｔ−ｏｎ系をこのベクターのために使用し、これには、Ｍ２と呼ばれるｔｅｔ−ｏｎからの変異体、および単一の全長Ｖｐ１６ドメインを置き換えた、４コピーの最小Ｖｐ１６トランス活性化因子ドメインが含まれる。また、ＤｓＲｅｄ−ｅｘｐ遺伝子がテトラサイクリントランス活性化因子遺伝子の下流に挿入され、その発現はＣＡＧプロモーターによって駆動され、ＩＲＥＳによって発現される。最終構築物は、ｐＨＲｐＡＴＲＥ／ＣＡＧＭ２Ｒｅｄと称する。
【０２８９】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｉＲＮＡキットを使用して、２１ｂｐのｍｉＲＮＡ標的化配列（４８０から５００、
【０２９０】
【化９】
2009519715.tif 000013
）（配列番号２６）を、ＧＦＰタンパク質発現を効率的にサイレンシングするために同定した。１５７塩基対のｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）をＰＣＲによって増幅し、ｐＨＲｐＡＴＲＥ／ＣＡＧＭ２Ｒｅｄにクローニングした。加えて、ＤｓＲｅｄ−ｅｘｐ遺伝子は、テトラサイクリントランス活性化因子遺伝子の下流に挿入され、その発現は、ＣＡＧプロモーターによって駆動され、ＩＲＥＳによって発現される。誘導性プロモーターにおける転写の終結を容易にするために、二重ｐＡシグナルエレメントを導入した（ｐＡ−ＢＧＨおよびｐＡ−ＴＫ）。得られた構築物は、ｐＨＲ  ｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）／ＣＡＧＭ２Ｒｅｄ（配列番号３７）と称した。ｐＨＲｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）／ＣＡＧＭ２Ｒｅｄ由来のウイルス粒子は、ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞に感染させるために使用した。次いで、ＧＦＰを発現する感染したＨｅＬａ細胞を２つの群に分け、群１は０．５μｇ／ｍｌのＤＯＸを含む培地中で培養し、群２はＤＯＸを欠く培地中で培養した。感染の７日後、細胞は蛍光顕微鏡法によって分析した。このデータは、ＰｏｌＩＩベースの単一のレンチベクターが、誘導性かつ可逆的な様式で、その標的タンパク質の発現を減少可能である機能的ｓｈＲＮＡを発現できることを示す。
【０２９１】
実施例１９
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系の開発
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系を、トランスジェニック動物において生成および適用した。この系を生成するために、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐ系をテトラサイクリン誘導性系と組み合わせて、組織特異的、誘導性、可逆的な様式で遺伝子を発現した。ｐＨＲｐＡＴＲＥ／ＣＡＧＭ２ＲｅｄにおけるＭ２遺伝子の上流に８５０ｂｐのｌｏｘｐ−ＤｓＲｅｄ−ｌｏｘｐを挿入することによって構築物を生成し、Ｍ２の下流のＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄフラグメントを欠失させた。得られた構築物は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰベースの条件付き、誘導性、可逆的なレンチベクター系であり、ｐＨＲｐＡＴＲＥ／ＣＡＧｌｏｘＲｅｄＭ２と称した。次に、ｐＨＲ  ｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）／ＣＡＧＭ２ＲｅｄからのｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）フラグメントをｐＨＲｐＡＴＲＥ／ＣＡＧｌｏｘＲｅｄＭ２にクローニングし、それによって、ｐＨＲｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）／ＣＡＧｌｏｘＲｅｄＭ２と称する構築物を生成した。ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質は、Ｃｒｅ−ｌｏｘｐの機能をモニターするための手段を提供する。
【０２９２】
Ｃｒｅ遺伝子を、下線を付したＢｇｌ  ＩＩ制限酵素およびＳＶ４０  ＮＬＳを含むセンスプライマー
【０２９３】
【化１０】
2009519715.tif 000014
配列番号３９およびＸｈｏｌ  Ｉ制限酵素を含むアンチセンスプライマー
【０２９４】
【化１１】
2009519715.tif 000015
配列番号４０を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物はＢｇｌ  ＩＩおよびＸｈｏｌ  Ｉ制限酵素によって消化し、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＸｈｏ制限酵素を使用してｐＨＲＥＦＧＦＰｂｌａｓにクローニングし、これは、ｐＨＲＥＦｌａ／ＣｒｅＮＬＳ／ｂｌａｓと称した。ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞は、Ｃｒｅ酵素を構成的に発現するために、ｐＨＲＥＦｌａ／ＣｒｅＮＬＳ／ｂｌａｓ構築物由来のレンチベクター粒子で感染させた。この感染させた細胞はブラスチシジンによって選択した。得られた細胞は、本明細書ではＧＦＰ／Ｃｒｅ  ＨｅＬａ細胞と称する。ｐＨＲ  ｍｉＲＮＡ−ＧＦＰ（４８０）／ＣＡＧｌｏｘＲｅｄＭ２由来の構築物ウイルス粒子は、ＧＦＰまたはＧＦＰ／Ｃｒｅ  ＨｅＬａ細胞とともに、またはこの細胞に感染させる。感染の３日後、細胞を２つの群に分けた。群１はＤＯＸ（０．５μｇ／ｍｌ）に曝露し、群２はＤＯＸなしである。感染の７日後、細胞は蛍光顕微鏡法によって分析した。ＧＦＰ発現のレベルは、ＤＯＸの非存在下でインキュベートした細胞と比較して、ＤＯＸに曝露したＧＦＰ／Ｃｒｅ  ＨｅＬａ細胞において劇的に減少した。ＤｓＲｅｄ発現は、ＧＦＰ／Ｃｒｅ  ＨｅＬａ細胞において検出されず、したがって、Ｃｒｅ酵素は、Ｌｏｘｐ−ＤｓＲｅｄ−Ｌｏｘｐフラグメントを除去することができ、Ｍ２はＣｒｅ酵素によって条件付きで発現させることができる。加えて、これらの結果は、Ｍ２が、テトラサイクリン制御様式で、標的としたタンパク質発現を減少するために、機能的なｓｈＲＮＡの発現を誘導できることを示す。
【０２９５】
実施例２０
ｐＴＲＥＧａｇ−ＨＣＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌパッケージング構築物の構築
ｐＴＲＥプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入）からのテトラサイクリン誘導性プロモーターフラグメントを、上記のようにＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ  ３．１にクローニングしてＣＭＶプロモーターを置き換え、本明細書ではｐＴＲＥ−ｎｅｏと称するテトラサイクリン誘導性プラスミドを生成した。
【０２９６】
次に、ＭＡ（ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｉｓ）、ＣＡ、およびＮＣをコードする配列を含む１３５７ｂｐのＨＩＶ−１  ｇａｇフラグメントを、ＥｃｏＲＩ制限部位を含むセンスプライマー
【０２９７】
【化１２】
2009519715.tif 000016
配列番号２７、ならびにＭｓｃＩ制限部位および７塩基変異を含むアンチセンスプライマー
【０２９８】
【化１３】
2009519715.tif 000017
配列番号２８を使用するＰＣＲによって増幅した。７個の点変異は、フレームシフトのために必要とされるＰＣＲ産物の二次構造（ループ構造）を破壊するためにアンチセンスプライマーに導入した。これらの変異は、ｇａｇアミノ酸配列を変化させなかった。
【０２９９】
次に、Ｐ２およびＰ６コード配列を含む１９４ｂｐ  ＨＩＶ−１  ｇａｇフラグメントを、ＭｓｃＩ制限部位を含むセンスプライマー
【０３００】
【化１４】
2009519715.tif 000018
配列番号２９、ならびにＸｈｏＩおよびＭｌｕＩ制限部位、および３塩基変異を含むアンチセンスプライマー
【０３０１】
【化１５】
2009519715.tif 000019
配列番号３０を使用するＰＣＲによって増幅した。３個の点変異は、フレームシフトのために必要とされるＰＣＲ産物の二次構造（ループ構造）を破壊するためにセンスプライマーに導入した。これらの変異は、ｇａｇアミノ酸配列を変化させなかった。ｌ３５７ｂｐのＨＩＶ−１  ｇａｇフラグメントは、ＥｃｏＲＩおよびＭｓｃＩ制限酵素によって消化した。加えて、ｌ９４ｂｐのＨＩＶ−１  ｇａｇフラグメントはＭｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。
【０３０２】
ｐＴＲＥ−ｎｅｏベクターはまた、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素でも消化した。次いで、ＰＣＲ産物の２つのフラグメントをｐＴＲＥ−ｎｅｏにクローニングした。得られたプラスミドはｐＴＲＥ−Ｇａｇプラスミドと称した。
【０３０３】
次に、ＭＡ、ＣＡ、およびＮＣをコードする配列を含む１３１３ｂｐ  ＨＩＶ−１  ｇａｇフラグメントを、ＥｃｏＲＩ、ＭｌｕＩ、およびＢｓｓＨＩＩ制限酵素を含むセンスプライマー
【０３０４】
【化１６】
2009519715.tif 000020
配列番号３１、ならびにＢｇｌＩＩ制限部位および点変異およびさらなる塩基対挿入を含むアンチセンスプライマー
【０３０５】
【化１７】
2009519715.tif 000021
配列番号３２を使用するＰＣＲによって増幅した。点変異および塩基対挿入は、ＰＣＲ産物の二次構造（ループ構造）を破壊するため、およびＧａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質を生成するためにセンスプライマーに導入した。
【０３０６】
次いで、Ｐ２、ＴＦ、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、ｖｉｆおよびｖｐｒを含む、３６９５ｂｐ  ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｐｏｌフラグメントを、ＢｇｌＩＩ制限部位を含むセンスプライマー
【０３０７】
【化１８】
2009519715.tif 000022
配列番号３３、ならびにＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限部位を含むアンチセンスプライマー
【０３０８】
【化１９】
2009519715.tif 000023
配列番号３４を使用するＰＣＲによって増幅した。１３１３ｂｐＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ  ＩＩ制限酵素で消化するのに対して、３６９５ｂｐ  ＰＣＲ産物は、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。
【０３０９】
次いで、ｐＴＲＥ−ｎｅｏをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。次いで、２つのＰＣＲ産物フラグメントをｐＴＲＥ−ｎｅｏにクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＴＲＥ−Ｇａｇ−Ｐｏｌ／ｄＴａｔ／ｄＲｅｖと称した。
【０３１０】
ｐＣＭＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌは、ＸｈｏＩおよびＳａｌ  Ｉ制限酵素によって消化し、ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、およびＲＲＥを含む１７１０ｂｐフラグメントを得た。次いで、このフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＳａｌ  Ｉ制限酵素を使用してｐＴＲＥ−Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミドにクローニングし、ｐＴＲＥ−Ｇａｇ−Ｐｏｌと称するプラスミドを生成した。
【０３１１】
３４０ｂｐ  ＨＣＶ  ＩＲＥＳフラグメントを、ＭｌｕＩ制限酵素を含むセンスプライマー
【０３１２】
【化２０】
2009519715.tif 000024
配列番号３５、およびＢｓｓＨ  ＩＩを含むアンチセンスプライマー
【０３１３】
【化２１】
2009519715.tif 000025
配列番号３６を使用するＰＣＲによって増幅した。次いで、このＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩおよびＢｓｓＨ  ＩＩ制限酵素で消化し、ＭｌｕＩおよびＢｓｓＨ  ＩＩ制限酵素を使用して、ｐＴＲＥ−Ｇａｇ−Ｐｏｌプラスミドにクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＴＲＥ−ＨＣＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌと称した。
【０３１４】
ｐＴＲＥ  Ｇａｇは、ＭｌｕＩおよびＢｓｓＨ  ＩＩ制限酵素を使用して消化し、１６４６ｂｐ  Ｇａｇを得て、ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を使用して、ｐＴＲＥ−ＨＣＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌにサブクローニングした。最終プラスミドは、ｐＴＲＥＧａｇ−ＨＣＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌと称した。得られたプラスミドは、保存性フレームシフト形成ループ構造を欠いている。第２に、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質の発現は、ＨＣＶ  ＩＲＥＳによって調節される。
【０３１５】
実施例２１
ＫＩＳＳ−１トランスジェニックマウスの生成および分析
メタスタチンは、癌細胞中でＫＩＳＳ−１によってコードされる抗転移ペプチドである。最近の研究は、メタスタチンが、視床下部および海馬の一部などの特定の脳の領域において高度に発現されるオーファンＧタンパク質共役受容体ＧＰＲ５４のリガンドであることを発見した。キスペプチンは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の分泌を調整する際に極めて重要な役割を果たす。新たな証拠は、キスペプチンが、ＧＰＲ５４を通して、ＧｎＲＨ分泌を刺激するように作用することを確認した。キスペプチンおよびＧＰＲ５４は、霊長類における思春期成熟のために決定的である。しかし、ＫｉＳＳ−１トランスジェニックマウスは今日まで報告されていなかった。以下に記載する実験は、ヒトＫｉＳＳ−１遺伝子を誘導性かつ可逆的に発現する、単一の誘導性レンチベクターベースのトランスジェニックマウスの産生を記載する。
【０３１６】
ヒトＫｉＳＳ−１遺伝子を、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含むセンスプライマー
【０３１７】
【化２２】
2009519715.tif 000026
配列番号４１、およびＸｈｏＩ制限酵素部位を含むアンチセンスプライマー
【０３１８】
【化２３】
2009519715.tif 000027
配列番号４２を使用するＰＣＲによって増幅した。次いで、このＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を使用して、ｐＨＲｐＡｔｅｔＯＣＭＶＣＡＧｔｅｔＧＦＰにクローニングした。最終構築物は、ｐＨＲＫｉＳＳＯ２ＣＡＧｔｅｔＧＦＰ（配列番号４３）と称した。
【０３１９】
ｐＨＲＫｉＳＳＯ２ＣＡＧｔｅｔＧＦＰ由来の高力価レンチベクター感染性粒子を使用して、上記のように単細胞段階胚に感染させた。感染性粒子の力価は、蛍光顕微鏡法を使用して、ＧＦＰ陽性細胞によって決定した。感染の翌日、２細胞段階胚を、乳母に移した（ＣＤ１）。陽性トランスジェニックマウスを、ＧＦＰ発現に基づいて選択した（マウスは緑色の身体を有していた）。試験した７例のマウスの中で、７例の陽性トランスジェニックマウスが存在していた。４週齢ファウンダートランスジェニックマウス（２例の雌性および２例の雄性）に、５００μｇ／ｍｌのＤＯＸを含む水を供給し、ＫｉＳＳ遺伝子発現を誘導した。ＫｉＳＳトランスジェニックマウスの表現型を測定するために、膣口（雌性マウスについて）および雄性マウスについてペニスをモニターした。ＤＯＸ誘導の５日後、５週齢雌性マウスの膣は開いた。加えて、５週齢マウスのペニスは、色およびサイズが変化した。ＫｉＳＳ  Ｔｇマウスのペニスは、対照マウスのペニスよりもサイズがより大きく、かつより発達していた。
【０３２０】
実施例２２
レンチベクターを使用する、Ｍ２トランス活性化タンパク質を発現するＧＮＴｌ−細胞株の生成
改変Ｍ２遺伝子（ＶＰ１６に作動可能に連結されたｔｅｔＯＮを含む）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを使用して、ｐＨＲＥＦ−ｌａｂｌａｓベクター（配列番号５２）にクローニングした。得られたベクターは、ＰＳ８３９ｐＨＲＥＦＭ２ｂｌａｓ（配列番号４４）と称した。ＰＳ８３９ｐＨＲＥＦＭ２ｂｌａｓを含む感染性粒子は、ＰＳ８３９ｐＨＲＥＦＭ２ｂｌａｓ、パッケージング構築物（ｐ８．９１，Ｔｒｏｎｏ  ｌａｂ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（ｐＭＤ−Ｇ，Ｔｒｏｎｏ  ｌａｂ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用する同時トランスフェクションによって生成した。感染性粒子は、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞（ＧｎＴｌ＋）およびＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ細胞（ＨＥＫ２９３Ｓ細胞（ＧｎＴｌ＋）およびＧｎＴＦ  ＨＥＫ２９３Ｓ細胞ｔｈｅ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供された）に感染させるために使用した。形質導入細胞は、１週間にわたりブラスチシジン（２０μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。得られた（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）細胞株は、ＧｎＴｌ＋ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞およびＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞と称した。これらの細胞株は、上記のＭ２構築物を含む。
【０３２１】
ＣＣＲ１を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
今日まで、ＣＣケモカイン受容体ファミリーの少なくとも１０個のメンバーが記載されている。記載されたメンバーは、ケモカイン命名に関するＩＵＩＳ／ＷＨＯ小委員会に従い、ＣＣＲ１からＣＣＲ１０まで命名されている。ＣＣＲ１は同定された最初のＣＣケモカイン受容体であって、複数の炎症性／誘導性のＣＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ４−６およびＣＣＬｌ４−１６）を結合する。ヒトにおいては、この受容体は、末梢血リンパ球および単球上で見い出すことができる。この受容体はまた、分化マーカーＣＤ１９１の指定クラスターである。
【０３２２】
ヒトＣＣＲ１を含むレンチウイルスベクターの構築
ヒトＣＣＲｌ  ｃＤＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ番号：ＢＣ０５１３０６）は（Ｈｕｎｔｓ  ｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から入手し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｅキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ｐＣＲ−２．１ベクターにクローニングした。得られた構築物はｐＣＲ−ｈＣＣＲｌと称した。ＣＣＲｌ遺伝子の終結コドンは、Ｔａｇ遺伝子（ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓ）と融合させるために変異させた（図１６Ｂを参照のこと）。ｈＥＰ２Ｒ遺伝子は制限酵素で消化し、ｐＨＴＲＥ−ｐｕｒｏ（Ｌ４９４ｐＨＲＴＲＥｐｕｒｏとしても知られる；配列番号４５）にクローニングした。得られたベクターはｐＨＴＲＥ−ｈＣＣＲｌ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓ（ＰＴ８３４ｐＨＲＴＲＥ−ｈＣＣＲｌＴＥＶｐｕｒとしても知られる；配列番号４６）と称した。このベクターの代表的なマップは図１６Ａに示すことができる。図１６に示すことができるように、ｈＣＣＲ１発現を駆動するプロモーターはｔｅｔ調節エレメント（ＴＲＥ）であり、直後にｈＣＣＲコード領域がある。組み込まれたベクターは、二シストロン性ｍＲＮＡを転写し、ピューロマイシン耐性遺伝子をｈＣＣＲ１とシスに配置する。
【０３２３】
ｈＣＣＲ１を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の構築
ｐＨＴＲＥ−ｈＣＣＲｌ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓ由来の感染性粒子を生成するために、ｐＨＴＲＥ−ｈＣＣＲｌ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓプラスミドを、ｐ８．９１パッケージング構築物（Ｔｒｏｎｏ  ｌａｂ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（ｐＭＤ−Ｇ；Ｔｒｏｎｏ  ｌａｂ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とともに、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。ｐＨＴＲＥ−ｈＣＣＲｌ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓを含むウイルス粒子は、ＧｎＴＩ活性が減少しており、およびテトラサイクリントランス活性化因子を発現する、ＧｎＴＩ  ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞に感染させるために使用した。感染細胞は、高レベルのＣＦＴＲタンパク質（３〜５ｍｇ／１０９細胞）を産生することが見い出され、これは、膜タンパク質の発現のために使用される他の公知の系よりも１ログ高い。形質導入した細胞はピューロマイシン（１．０〜
４．０μｇ／ｍｌ）によって選択され、ｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌと称された安定な細胞株を樹立した。
【０３２４】
テトラサイクリン誘導性細胞株におけるｈＣＣＲ１発現の分析
ｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌ（これは、０、１、２、おおび４μｇピューロマイシンとともに選択した）を６ウェルプレート中で増殖させ、培養培地に加えた。翌日、誘導したｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌを収集し、一次抗体（Ｍ２フラグ抗体）および二次抗体（ＨＲＰ−結合体化抗マウス抗体）を使用してウェスタンブロッティングによって分析した。このブロットをまた、対照として働く抗チューブリンによって同時染色した。５２ｋＤａバンドがｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌ中のＭ２フラグ抗体によって検出されたが、ＨＥＲＫ細胞からは検出されず、一方５５ｋＤａバンドはすべての細胞で検出された。
【０３２５】
高レベルの表面発現ＣＣＲ１
抗ＣＣＲ１特異的抗体がｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌにおけるＣＣＲ１の細胞表面発現を検出するか否かを決定するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合体化マウス抗ヒトＣＣＲｌモノクローナル抗体（ＣＡＴ＃５５７９１４，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、ＤＯＸを用いる誘導（２４時間）のありなしの両方で、ｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌを染色するために使用した。対照として、非形質導入２９３細胞を含めた。結果は、ＤＯＸ誘導された細胞株が、非常に高い細胞表面レベルのＣＣＲ１を発現することを示した。誘導レベルは、非誘導ｈＣＣＲ１−ｍＣｅｌｌと比較して、誘導ｈＣＣＲ１−ｍＣｅｌｌにおいて約１０倍であった。
【０３２６】
細胞増殖を停止し、および／またはアポトーシスを引き起こすためのＣＣＲ１の誘導
ｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌは、１μｇ／ｍｌのＤＯＸの存在下または非存在下で、６ウェルプレート上で増殖させた。細胞増殖は顕微鏡法によってモニターした。ＤＯＸを用いる誘導の２４時間後、ｈＣＣＲｌ−ｍＣｅｌｌは増殖を停止したのに対し、誘導したｈＣＣＲｌ−  ｍＣｅｌｌの大部分はプレートから脱離した。このデータは、高レベルのｈＣＣＲｌ発現が、リガンドなしでｈＣＣＲｌシグナルの活性化を引き起こしたことを示す。
【０３２７】
実施例２３
ＣＦＴＲ（Ｃｌ−アニオン膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒｉｎｅ）チャネル）を発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
ＣＦＴＲ  Ｈｉｓ（１０×）レンチウイルスベクターの構築
ＣＦＴＲ  Ｈｉｓ（６×）レンチウイルスベクター（ＰＴ７６４ｐＨＲＴＲＥＣＦＴＲ−Ｈｉｓ６ｐｕｒｏ；配列番号４７としても知られる）ＤＮＡを、ＢｓｔＸＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｃ末端６×Ｈｉｓ含有ＤＮＡフラグメントを除去した。野生型ＣＦＴＲプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し。ＰＣＲを使用して、１０×Ｈｉｓ含有Ｃ末端ＣＦＴＲ  ＢｓｔＸＩ／ＸｈｏＩ  ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＢｓｔＸＩおよびＸｈｏＩを用いる消化後、このフラグメントをクローニングし、エンドヌクレアーゼ制限分析およびヌクレオチド配列分析によって確認した。得られたベクターは、ＣＦＴＲ  Ｈｉｓ（１０×）（ＰＴ８２３ｐＨＲＴＲＥＣＦＴＲ−Ｈｉｓｌ０ｐｕｒ；配列番号４８としても知られる）と称した。
【０３２８】
ＧｎＴ１＋および−ＨＥＫ２９３Ｓ（ＧｎＴ１−）の形質導入（ＣＦＴＲ  Ｈｉｓ（６×）およびＣＦＴＲ  Ｈｉｓ（１０×）レンチウイルスベクターを有する細胞）
各レンチウイルスベクターを、本明細書の他の箇所に記載されるようにパッケージングし、そしてこれを使用して、ＧｎＴｌ＋ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞およびＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞に形質導入した。ｍｌあたり２５μｇのピューロマイシンを用いる２日間の培地の補充後、高度にＣＦＴＲを発現した細胞株を選択した。４日間の選択後、生存している細胞を、ピューロマイシンを含まない培地中で拡大した。
【０３２９】
イムノブロット分析
各型の３００万個の細胞（形質導入ＧｎＴｌ＋ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞およびＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞）を収集し、イムノブロット分析のために膜画分を調製した。加えて、ＣＦＴＲ＋対照（ＣＦＴＲ−ＦＬＡＧ）を分析した。ブロットしたタンパク質は、Ｒｌ１０４抗ＣＦＴＲ  ＭＡｂを用いて検出した、結果は、形質導入されたＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞中での６×と１０×の両方のタグ化ＣＦＴＲタンパク質の発現を示した。ポリアクリルアミドゲルにおける形質導入ＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞からのバンドの移動度は、形質導入ＧｎＴｌ＋ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｗ２細胞において発現された同じタンパク質からのバンドよりも速かったことが観察された。
【０３３０】
ＣＦＴＲ−Ｈｉｓ（１０×）を発現するＧｎＴ１−ＨＥＫ２９３Ｓ細胞におけるイオンチャネル機能の分析
発現されたＣＦＴＲ−Ｈｉｓ（１０×）タンパク質が活性であるか否かを決定するために、ハロゲン化物クエンチ色素６−ヒドロキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、ハロゲン化物流入をＧｎＴ１＋およびＧｎＴ１−細胞株において測定した。比較のために、野生型ＣＦＴＲを発現するＧｎＴ１＋細胞を並行して分析した。手短に述べると、形質導入したＨＥＫ２９３ｓ  ｗｔ−ＣＦＴＲ、ＨＥＫ２９３Ｓ  ＣＦＴＲ−Ｈｉｓ（１０×）、ＨＥＫ２９３Ｓ  ＧｎＴ１−ＣＦＴＲ−Ｈｉｓ（１０×）細胞株を、カバーガラス上に播種し、〜５０％コンフルエントまで増殖させた。次いで、細胞を低浸透圧で１０ｍＭ  ＳＰＱに１０分間ロードし、クエンチＮａＩ緩衝液中に配置した。単一の細胞の蛍光は、Ｚｅｉｓｓ倒立顕微鏡、ＰＴＩ画像処理システム、およびＨａｍａｍａｔｓｕカメラを用いて測定した。励起は３４０ｎｍであり、発光は４１０ｎｍで測定した。実験の開始時に、細胞をクエンチ緩衝液（ＮａＩ）中に浸漬し、安定なベースラインの確立後、ハロゲン化物を含まないデクエンチ緩衝液に２００秒間交換した。細胞は、アゴニスト（２０μＭ  フォルスコリン）を用いて６２０秒間刺激し、次いで、クエンチＮａＩ緩衝液に戻した。蛍光は、各細胞についてベースライン値に標準化し、蛍光の変化は、ベース蛍光の上のパーセント増加として示した。各時点において分析された細胞の総数（少なくとも３０個）の平均をプロットした。得られた結果は、細胞株の各々について、ハロゲン化物の流入の有意な活性化を実証する。ＨＥＫ２９３Ｓ  ＣＦＴＲ−Ｈｉｓ（１０×）、およびＧｎＴｌ−ＨＥＫ２９３Ｓ  ＣＦＴＲ−Ｈｉｓ（１０×）細胞株は、両方が、ＨＥＫ２９３Ｓ  ｗｔ−ＣＦＴＲと比較して、蛍光のより大きな変化を生じた。
【０３３１】
実施例２４
ヒトＥＰ２Ｒを発現するためのテトラサイクリン誘導性細胞株の生成
ＥＰ２を含むレンチウイルスベクターの構築
ｈＥＰ２  ｃＤＮＡをＳｃｈｅｒｉｎｇ  Ａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ＰＣＲによって増幅し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｅキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してｐＣＲ−２．１ベクターにクローニングした。この得られた構築物をｐＣＲ−ｈＥＰ２Ｒ（配列番号４９）と称した。ＥＰ２遺伝子の終結コドンを、Ｔａｇ遺伝子と融合させるために変異させた（ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓ）（図１７）。ｈＥＰ２Ｒ遺伝子は制限酵素で消化し、ｐＨＴＲＥ−ｐｕｒｏ（配列番号４５）にクローニングした。得られたベクターは、ｐＨＴＲＥ−ｈＥＰ２Ｒ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓ（配列番号５０）と称した。このベクターの代表的なマップは図１７において見ることができる。図１７において見ることができるように、ｈＥＰ２Ｒ発現を駆動するプロモーターは、ｔｅｔ調節エレメント（ＴＲＥ）であり、直後にｈＥＰ２Ｒコード領域がある。組み込まれたベクターは二シストロン性ｍＲＮＡを転写し、ピューロマイシン耐性遺伝子を、ｈＥＰ２Ｒとシスに配置する。
【０３３２】
ｈＥＰ２Ｒを発現するためのテトラサイクリン誘導性細部株の構築
ｐＨＴＲＥ−ｈＥＰ２Ｒ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓ（配列番号５０）由来の感染性粒子を生成するために、ｐＨＴＲＥ−ｈＥＰ２Ｒ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓプラスミド（配列番号５０）を、ｐ８．９１パッケージング構築物（Ｔｒｏｎｏ  ｌａｂ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（ｐＭＤ−Ｇ；Ｔｒｏｎｏ  ｌａｂ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とともに、２９３Ｔに同時トランスフェクトした。ｐＨＴＲＥ−ｈＥＰ２Ｒ−ＴＥＶ−Ｆｌａｇ−１０Ｈｉｓを含むウイルス粒子を使用して、テトラサイクリントランス活性化因子もまた発現する、ＧｎＴＩ活性が減少している遺伝子改変細胞株に感染させた。感染細胞は、高レベルのｈＥＰ２Ｒタンパク質（３〜５ｍｇ／１０９細胞）を産生することが見い出され、これは、膜タンパク質の発現のために使用される他の既知の系よりも、１ログ高い。形質導入された細胞はピューロマイシン（１．０から４．０μｇ／ｍｌまで）によって選択して、ｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌと称された安定な細胞株を樹立した。
【０３３３】
テトラサイクリン誘導性細胞株におけるｈＥＰ２Ｒ発現の分析
ｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌ（これは、０μｇまたは２μｇのピューロマイシン／ｍｌを用いて選択した）を６ウェルプレート中で増殖させ、１μｇ／ｍｌのＤＯＸを培養培地に加えた。翌日、誘導されたｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌを収集し、一次抗体（Ｍ２フラグ抗体）および二次抗体（ＨＲＰ結合体化抗マウス抗体）を使用して、ウェスタンブロットによって分析した。このブロットは、対照として役立つ抗チューブリンによって同時染色した。ｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌにおいてＭ２フラグ抗体によって３本のバンドが検出されたが、ＨＥＲＫ細胞では検出されなかった。３本のバンドのサイズは、４５から５３ｋＤａまでであり、これらはチューブリンのサイズ（５５ｋＤａ）よりも小さかった。ｈＥＰ２Ｒのサイズは５３ｋＤａと予測される。
【０３３４】
細胞増殖を停止し、および／またはアポトーシスを引き起こすｈＥＰ２Ｒの誘導
ｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌは、１μｇ／ｍｌのＤＯＸの存在下または非存在下で、６ウェルプレート中で増幅させた。細胞増殖は顕微鏡法によってモニターした。誘導の２４時間後、ｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌは増殖を停止したのに対して、誘導されたｈＥＰ２Ｒ−ｍＣｅｌｌの大部分がプレートから脱離した。このデータは、高レベルのｈＥＰ２Ｒ発現が、リガンドなしでｈＥＰ２Ｒシグナルの活性化を起こしたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１】図１は、点変異を含む、フレームシフトのために必要とされる変異型ｇａｇ配列と野生型ｇａｇ配列の間の比較を示す。
【図２】図２は、点変異を含む、フレームシフトのために必要とされる変異型ｇａｇ−ｐｏｌ配列と野生型ｇａｇ−ｐｏｌ配列の間の比較を示す。
【図３】図３は、フレームシフトのために必要とされるＨＩＶ  ｇａｇおよびＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌにおけるループ構造を示す。
【図４】図４は、フレームシフトのために必要とされるループ構造の破壊を生じる、フレームシフトのために必要とされるＨＩＶ  ｇａｇおよびＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌのループ構造の配列の変化を示す。
【図５】図５は、マウスＤＯＸの摂取の前および１８日後のトランスジェニックＣＡＧファウンダーの血液細胞中でのＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図６】図６は、トランスジェニックＣＡＧファウンダーの血液細胞中でのＧＦＰ発現の誘導動力学を示す。
【図７】図７は、ヒトとマウスの両方のＨ１プロモーターが、ｅＧＦＰを標的とするように設計されたｓｈＲＮＡを発現可能であり、次には、このｅＧＦＰが、ＨｅＬａ細胞におけるｅＧＦＰ発現を効率的にサイレンシングできることを示す。
【図８】図８は、ヒトとマウスの両方のＨ１プロモーターが、ｅＧＦＰを標的とするように設計されたｓｈＲＮＡを発現可能であり、次には、このｅＧＦＰが、ヒトＴ細胞におけるｅＧＦＰ発現を効率的にサイレンシングできることを示す。
【図９】図９は、マウスＣＸＣＲ４を標的とするｓｈＲＮＡを含む単一の誘導性レンチベクターが、マウス内因性ＣＸＣＲ４タンパク質の発現を誘導性に減少できたことを示す。
【図１０】図１０は、マウスＣＸＣＲ４を標的とするｓｈＲＮＡを含む複数コピーの組み込んだ単一の誘導性レンチベクターが、高レベルの遺伝子サイレンシングを誘発できることを示す。
【図１１】図１１は、トランスジェニックマウスの血液細胞においてＧＦＰを減少するためのＤＯＸによるｓｉＲＮＡ発現の誘導を示す。
【図１２】図１２は、トランスジェニックマウスの血液細胞においてＧＦＰを減少するためのＤＯＸによるｓｉＲＮＡ発現の誘導を示す。
【図１３】図１３は、マウスがＤＯＸを摂取される前の、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックＣＡＧ−ファウンダーＦ１−６＃およびＦ１−９＃の血液細胞におけるＧＦＰの発現レベルを示す。
【図１４】図１４は、マウスがＤＯＸを摂取された１０日後、１７日後、２７日後の、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックＣＡＧ−ファウンダーＦ１−４＃およびＦ１−１１＃の血液細胞におけるＧＦＰの発現レベルを示す。
【図１５−１】図１５は、本明細書に開示されるような遺伝子移入構築物の例を示す。
【図１５−２】図１５は、本明細書に開示されるような遺伝子移入構築物の例を示す。
【図１６】図１６は、Ａ）ヒトＣＣＲ１遺伝子を誘導性かつ可逆的に発現できる細胞株を生成するために使用し得るｈＣＣＲ１−ｍを含むＨＩＶベースのレンチウイルスベクターを示し、Ｂ）ＣＣＲ１−ｍのＣ末端アミノ酸配列を示す。ＣＣＲ１の終止コドンは変異され、ＴＥＶプロテアーゼ部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）で置き換えられている。Ｍ２フラグは、タンパク質（ＣＣＲ１−ｍ）発現および精製を分析するために、ＴＥＶと１０ヒスチンアミノ酸の間に挿入されている。１０Ｈｉｓタグは、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用するＣＣＲ１−ｍの精製として役立つ。
【図１７】図１７は、Ａ）ヒトＥＰ２遺伝子を誘導性かつ可逆的に発現できる細胞株を生成するために使用し得るｈＥＰ２Ｒを含むＨＩＶベースのレンチウイルスベクターを示し、Ｂ）ｈＥＰ２Ｒ−ｍのＣ末端アミノ酸配列を示す。終止コドンは変異され、ＴＥＶプロテアーゼ部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）で置き換えられている。Ｍ２フラグは、タンパク質（ｈＥＰ２Ｒ−ｍ）発現および精製を分析するために、ＴＥＶと１０ヒスチンアミノ酸の間に挿入されている。１０Ｈｉｓタグは、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用するｈＥＰ２Ｒの精製として役立つ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009519715.tif 000034
【図８】
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【図９】
2009519715.tif 000036
【図１０】
2009519715.tif 000037
【図１１】
2009519715.tif 000038
【図１２】
2009519715.tif 000039
【図１３】
2009519715.tif 000040
【図１４】
2009519715.tif 000041
【図１５−１】
2009519715.tif 000042
【図１５−２】
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【図１６】
2009519715.tif 000044
【図１７】
2009519715.tif 000045
【配列表】
2009519715000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月24日(2008.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009519715000001.app
【国際調査報告】
2009519715.tif 000084
2009519715.tif 000085
2009519715.tif 000086