(57)【要約】【課題】フコース含量が６５％未満であり、インビトロでのアポトーシスを示すモノクローナル抗体組成物の使用に関する。【解決手段】前記抗体組成物を使用して、標的細胞のアポトーシスをインビトロにて誘導する。この方法は、表面にＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、前記抗体組成物を前記標的細胞と接触させることを含み、前記抗体が前記標的細胞に対するものであり、かつ、前記抗体組成物のフコース含量が６５％未満である方法である。また、フコース含量は、３０％未満であってもよい。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体組成物によって標的細胞のアポトーシスをインビトロにて誘導する方法であって、表面にＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、前記抗体組成物を前記標的細胞と接触させることを含み、前記抗体が前記標的細胞に対するものであり、かつ、前記抗体組成物のフコース含量が６５％未満である方法。
【請求項２】
請求項１において、前記フコース含量が３０％未満であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２において、前記フコース含量が２０％〜４５％の間、または２５％〜４０％の間にあることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項において、前記抗体組成物がＹＢ２／０細胞株により産生されることを特徴とする方法。
【請求項５】
強いアポトーシス能力を持つ抗体を産生するための、ＹＢ２／０細胞株の使用。
【請求項６】
ｉ）表面にＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、評価対象の抗体と、この抗体の抗原またはこの抗原を発現している細胞とを接触させる工程と、
ｉｉ）誘導されたアポトーシスを測定する工程と、
ｉｉｉ）前記ＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、陰性対照であるＣＤ１６の非存在下と比較して、少なくとも２０％より多く、さらに５０％より多くのアポトーシスの誘導を示す抗体組成物を選択する工程と
を含む、強いアポトーシス能力を持つ抗体組成物を選択する方法。
【請求項７】
請求項６において、選択された抗体が、抗第ＶIII因子インヒビターに対する抗イディオタイプ抗体、自己抗体に対する抗体、ならびに感染細胞の表面に発現されたウイルスおよび／または細菌タンパク質に対する抗体であることを特徴とする方法。
【請求項８】
免疫エフェクター細胞による細胞傷害性機能を利用せずに、定量的または定性的なＮＫ細胞欠乏（ＡＤＣＣなし）を治療するよう意図される医薬の調製のための、フコース含量が６５％未満であるか、または請求項６もしくは７に記載の方法に従って得られるモノクローナル抗体の組成物の使用。
【請求項９】
請求項８において、前記モノクローナル抗体組成物のフコース含量が３０％未満である使用。
【請求項１０】
請求項８において、前記モノクローナル抗体組成物のフコース含量が２０％〜４５％の間、または２５％〜４０％の間である使用。
【請求項１１】
請求項８において、前記モノクローナル抗体組成物がＹＢ２／０細胞株によって産生される使用。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項において、Ｂ−ＣＬＬを治療するよう意図される医薬の調製のための使用。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか一項において、紅斑性狼瘡、拡張型心筋症、血球貪食性組織球増殖症、ならびにＨＩＶおよびＡ型またはＢ型血友病を治療するよう意図される医薬の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロでアポトーシスを誘導するための、フコース含量が６５％未満の抗体組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、研究における使用が増加しており、従来の治療を代替する方法として、診断および治療に用いられる選択肢の一つとなっている。
【０００３】
血漿由来、またはモノクローナル起源であり、治療用途である多数の抗体は、現在、市販されているか、または臨床開発中である。標的と特異的に結合でき、かつ免疫エフェクター細胞を効率的に動員できる抗体の特性を生かした治療ツールが得られており、このような治療ツールでは、これらの免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能を利用して標的細胞を破壊している。
【０００４】
しかしながら、いくつかの病変、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者などにおいて、免疫エフェクター細胞、特にＮＫ細胞の活性が不十分であることが観察されており、このことが、これらの患者における二次的病変の発生率が上昇する原因となっている可能性がある(非特許文献１)。また、これらの患者をＣＬＬについて抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）で治療する場合、この療法はほとんど有効性を示さないように思われるが、これは一部には彼らのＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性が低いことによって説明できる(非特許文献２)。
【０００５】
ＮＫ細胞の欠乏はまた、紅斑性狼瘡を患う患者(非特許文献３)、拡張型心筋症の患者(非特許文献４)、血球貪食性組織球増殖症を患う患者（パーフォリン欠損−非特許文献５)、およびＨＩＶ感染症患者（パーフォリンおよびグランザイム欠損−非特許文献６)においても見られる。従って、ＣＬＬ患者に対する場合との類推から、従来のモノクローナル抗体を用いる治療はほとんどまたは全く有効ではないことが憂慮される。
【非特許文献１】Zieglerら、1981
【非特許文献２】Farag 2003
【非特許文献３】Green 2005
【非特許文献４】Anderson 1982
【非特許文献５】Clementi R, 2005
【非特許文献６】Portales, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、出願人は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能とは独立した活性を有しており、そのために免疫エフェクター細胞の活性が低下した患者に対して投与することができるツール(tool)を提供することを追求した。
【０００７】
出願人は、文献WO01/77181において、ＦｃγＲIII受容体（ＣＤ１６）を介して強いＡＤＣＣ活性を示す抗体を産生するために使用可能な細胞株を選択することの重要性を実証した。その中で、ＹＢ２／０などのラット骨髄腫系統（rat myeloma lines）において産生された抗体のＦｃ領域で修飾されたグリコシル化により、ＡＤＣＣ活性が改善されることが示された。上記抗体組成物のグリカン構造によって、抗体組成物のフコシル化が低くなる。
【０００８】
驚くべきことに、出願人は、この抗体組成物は、強い細胞傷害性活性を有するとともに、表面にＣＤ１６を発現している細胞の存在下では実質的なアポトーシスを誘導すること、しかしその一方で、ＣＨＯで産生された同じ抗体は、かなり低い程度にしかアポトーシスを増強しないことを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って本発明は、インビトロ、エクスビボまたはインビボでのアポトーシスを誘導するための、フコース含量が６５％未満の抗体組成物の使用に関する。
【００１０】
本発明の第一の目的は、特に、抗体組成物を用いて標的細胞のインビトロ、エクスビボまたはインビボでのアポトーシスを誘導する方法に関し、この方法では、表面にＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、抗体組成物と標的細胞とを接触させる工程を含む。そして、前記抗体は、標的細胞に対して作用するとともに、前記抗体組成物のフコース含量は６５％未満である。
【００１１】
抗体は、ジスルフィド架橋によって結合されるＨ鎖（heavy chain）およびＬ鎖（light chain）からなる。それぞれの鎖は、Ｎ末端部位における可変領域（またはドメイン）と、Ｃ末端部位における定常領域とからなる。可変領域は、その抗体を誘導する抗原に対して特異的である。また、定常領域は、Ｌ鎖の単一のＣＬドメインと、Ｈ鎖の複数のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）とで構成される。可変領域ならびにＨ鎖およびＬ鎖のＣＨ１およびＣＬドメインの結合によって、抗体のＦａｂフラグメントが形成され、これは非常に柔軟なヒンジ領域によりＦｃ領域とつながっており、各Ｆａｂが標的抗原に結合することを可能にする。抗体のエフェクター特性を媒介するＦｃ領域は、エフェクター分子、例えばＦｃγＲ受容体（ＦｃγＲ）などに対してアクセス可能な状態を維持している。２つの球形のドメインＣＨ２およびＣＨ３からなるＦｃ領域は、ＣＨ２ドメインにおいて、２本の鎖それぞれの存在下において、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）が結合しているバイアンテナ型Ｎ−グリカンでグリコシル化される。
【００１２】
Ｎ−グリカンは下記の一般的な型（型：「Ｇ０」と示す）で表され、この型に対して他の糖類が結合されていてもよい。
【００１３】
【化１】
2009519302.tif 000002
【００１４】
従って、本発明の抗体組成物において、「フコース」とは、これらのＮ−オリゴ糖により保持されるフコースを意味している。フコース分子は、存在する場合、Ｎ−オリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と結合しており、このＧｌｃＮＡｃ自体はＡｓｎ２９７と結合している。
【００１５】
各抗体の２本のＨ鎖のいずれかにより保持されるＮ−グリカンは、それぞれ、フコース分子を保持する場合も保持しない場合もある。従って、各抗体は、０、１、または２個のフコース分子を含む場合がある。すなわち、Ｎ−グリカンのどちらもフコースを保持しない場合には０個、Ｎ−グリカンの一方のみがフコース分子を保持する場合には１個、または２つのＮ−グリカンがそれぞれフコース分子を保持する場合には２個のフコース分子を有する。
【００１６】
従って、「フコース含量が６５％未満の抗体組成物」とは、組成物中の抗体の各グリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）により保持されるすべてのグリカン構造のうち、６５％未満がフコース分子を含む抗体組成物を意味する。
【００１７】
グリカン構造は、以下の型からさらに特に選択されることが有利である。
【００１８】
【化２】
2009519302.tif 000003
【００１９】
従って、本発明の組成物中の抗体が有する各グリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）により保持されるＧ０型、Ｇ０Ｆ型、Ｇ１型、およびＧ１Ｆ型のグリカン構造の中で、フコース含量が６５％未満であるのが好ましい。
【００２０】
上記抗体組成物およびＡＤＣＣ誘導（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）に関するその有利な特性は、文献WO01/77181に記載されている。
【００２１】
本発明の抗体組成物は、強いアポトーシス反応を誘発する特殊性および利点を有する。アポトーシスは、細胞死の誘発において主要な役割を果たす。多数の因子がアポトーシス誘導に関与しているが、しかし、それらはすべてミトコンドリア、Ｂｃｌ−２タンパク質、およびカスパーゼを通過する共通の経路において行われる。
【００２２】
プログラムされた細胞死を開始させる主な機構としては、ストレス（例えば、低酸化hypo-oxygenation）、細胞傷害性物質またはコルチコイドによる処理、増殖因子の欠乏、ＤＮＡ損傷およびデスシグナル(death signal)の伝達（細胞傷害性リンパ球およびＮＫ細胞のＦａｓ受容体、ならびにＴＮＦ−α壊死因子の受容体）が挙げられる。
【００２３】
細胞デスシグナルに続いて、カスパーゼが活性化され、アポトーシスと関連するタンパク質の活性化を引き起こす。次に、ホスファチジルセリンが細胞膜の内表面から外表面へと移動する。それらは、インビトロにおいてアネキシンＶを細胞表面に固定することにより可視化することができる。次いで、細胞質、コアおよびクロマチンの凝縮、ＤＮＡ断片化、細胞膜のブレブ形成、そして膜非対称性の喪失が観察される。この段階では、細胞がヨウ化プロピジウム（ＤＮＡ挿入剤）によりインビトロで固定化される。そしてアポトーシス体が形成され、これは周囲のマクロファージにより消化される。
【００２４】
本発明の抗体組成物により誘導されるアポトーシスの増強作用は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能によるものではなく、免疫エフェクター細胞の表面に発現されたＣＤ１６受容体を有する抗体のＦｃ領域の強いクラスタリングにより誘導される。
【００２５】
本発明の抗体組成物は、Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型の含量が５０％未満、好ましくは３０％未満であるという条件下で、Ｇ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型の含量が６０％より多いことが有利であり、８０％より多いことが好ましい。
【００２６】
本発明の抗体組成物によるアポトーシス誘導のインビトロにおける実証は、ＮＫ細胞とは異なり、細胞傷害活性を持たないＣＤ１６でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞で実施した。これは、細胞死がアポトーシスによってのみ誘導され得るモデルを形成する。
【００２７】
従って、標的細胞のアポトーシスをインビトロで誘導することを意図した本発明の方法は、エフェクター細胞ではなく、表面にＣＤ１６を発現している細胞により行われる。従ってこれらの細胞は、標的細胞に対して細胞傷害活性を持っていないか、もはや持たない。このような細胞としては、例えば、ＣＤ１６  Ｊｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。
【００２８】
本発明の組成物によるアポトーシスのインビボでの増強作用は、ＣＤ１６を発現している任意のエフェクター細胞、特に、ＣＤ１６を発現している末梢血細胞、例えば単球マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞およびある種のＴ細胞亜集団を用いて得られる。従って、本発明の組成物は、免疫エフェクター細胞（細胞傷害性細胞）集団が定量的または定性的に欠乏している場合（ＡＤＣＣなし）に使用できる。この場合、この増強作用は、表面にＣＤ１６を発現している他の細胞（ＣＤ１６＋細胞）、特に、表面にＣＤ１６を発現しているが、細胞傷害性活性を持たないか、もはや持たない細胞を介して可能である。
【００２９】
上記欠乏は、ＮＫ細胞の活性低下、またはより具体的には、ＮＫ細胞の欠乏が観察されるＢ細胞性ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）の患者(Foa 1986, Ziegler 1981)、特に細胞溶解性分子の欠乏が観察されるＢ細胞性ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）の患者(Katrinakis 1996)や、ＮＫ細胞の欠乏が報告されている紅斑性狼瘡を患う患者(Green 2005)において見受けられる。抗体組成物は、上記病変において、本発明に従って使用できる。
【００３０】
本発明の抗体組成物は、フコース含量が５５％未満であることが有利であり、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、さらに好ましくは２０％未満であることが有利である。
【００３１】
また、特に有利な方法では、抗体組成物のフコース含量は２０％〜４５％の間、または２５％〜４０％の間である。
【００３２】
特に有利な方法では、本発明の抗体組成物はまた、フコース含量／ガラクトース含量比が０．６未満である。この比は好ましくは０．５未満；より好ましくは０．４未満；さらに好ましくは０．２未満が有利であり、特には０．１未満が有利である。本発明の目的上、「フコース含量／ガラクトース含量比」とは、抗体組成物のフコース含量とガラクトース含量との比を意味し、これらの２種の糖は抗体組成物の各グリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）に結合する各グリカン構造により保持され得る。
【００３３】
本発明で使用される抗体組成物は、ＹＢ２／０細胞株、またはＹＢ２／０に由来し、タンパク質の翻訳後の修飾に関して、特にグリコシル化に関して同じ特性を与える任意の細胞株により産生されることが有利である。
【００３４】
この株は、抗体組成物を産生する能力に関して、産生された抗体組成物の一部が低いフコシル化を示す点、および本発明の出願人により実証された、強いアポトーシスの誘導が可能である抗体組成物を産生するという点から選択される。
【００３５】
従って、本発明のさらなる目的は、強力なアポトーシス能力を有する抗体を産生するためのＹＢ２／０細胞株の使用である。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、
１）表面にＣＤ１６受容体を発現している細胞の存在下で、評価対象の抗体とこの抗体の抗原（またはこの抗原を発現している細胞）とを接触させる工程と、
２）誘導されたアポトーシスを測定する工程と、
３）前記ＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、陰性対照と比較して、少なくとも２０％より多く、さらに５０％より多くアポトーシスの誘導を示す抗体組成物を選択する工程と
を含む、強いアポトーシス能力を持つ抗体組成物を選択する方法である。
【００３７】
本方法の工程１）を実施する場合、陰性対照は、例えばＣＤ１６を発現していない細胞の存在下で得ることができる。
【００３８】
工程２）に関して、誘導されたアポトーシスの測定は、アポトーシスを測定するために特異的な従来の技術を用いて行うことができ、例えば、アネキシンＶ（細胞表面に露出したホスファチジルセリンを測定するアポトーシスの初期段階の測定）とともにヨウ化プロピジウム（ＤＮＡ分解を測定するアポトーシスの進行段階の測定）の測定を行う方法、または他のマーカーの測定を行う方法、例えば、ＹＯ  Ｐｒｏ−１（このＤＮＡの断片化を測定するＤＮＡ挿入剤）などの測定を行う方法など、いくつかの方法で行うことができる。
【００３９】
本発明の目的上、「強いアポトーシス能力」とは、ＣＤ１６を発現している細胞の存在下で、陰性対照と比較して、少なくとも２０％より多く、さらに５０％より多くのアポトーシスを誘導する能力を意味する。
【００４０】
この方法を実施するために、表面にＣＤ１６を発現している細胞は、ＣＤ１６がトランスフェクトされた細胞、特に、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＤ１６を発現している末梢血細胞、例えば単球マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞およびＴ細胞の一部の亜集団であってよいが、このリストは制限的なものではない。表面にＣＤ１６を発現している細胞は、細胞傷害性活性を持たないか、もはや持っていない細胞であることが好ましい。
【００４１】
本発明の方法はまた、選択された抗体組成物のフコース含量を測定する工程を含むことが有利である。この測定は、評価対象の抗体と抗原とを接触させる工程より前に行ってもよいし、陰性対照よりも多くアポトーシスの誘導を示す抗体組成物を選択した後に行ってもよい。
【００４２】
抗体組成物のフコース含量の測定が、評価対象の抗体と抗原とを接触させる工程より前に行われる場合、フコース含量が６５％未満の抗体組成物を選択するのが有利である。選択された抗体組成物のフコース含量は３０％未満、または２０％〜４５％の間、または２５％〜４０％の間であることが好ましい。
【００４３】
選択される抗体は、排除を誘導するため、抗第ＶIII因子インヒビターの抗イディオタイプ抗体、記憶Ｂリンパ球を標的とする自己抗体に対する抗体、および感染細胞の表面に発現されたウイルスおよび／または細菌タンパク質に対する抗体であることが有利である。好ましくは、造血系の異常増殖(haematopoietic proliferations)を含む腫瘍細胞の表面に発現された抗原を認識する任意の抗体を選択することも可能である。
【００４４】
本発明のさらなる目的は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能を利用せずに、定量的または定性的ＮＫ細胞の欠乏（ＡＤＣＣなし）を治療するよう意図される医薬品を調製するための、その中でも特にＢ−ＣＬＬ（Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病）、紅斑性狼瘡、拡張型心筋症、血球貪食性組織球増殖症、ならびにＨＩＶおよびＡ型またはＢ型血友病から選択される定量的または定性的ＮＫ細胞の欠乏（ＡＤＣＣなし）を治療するよう意図される医薬品を調製するための、フコース含量が６５％未満、好ましくは３０％未満、さらに好ましくは２０％〜４５％の間、または２５％〜４０％の間のモノクローナル抗体組成物の使用、または上記の選択方法を用いて選択される抗体組成物の使用に関する。
【００４５】
抗体組成物は、治療用抗体であるリツキサンよりも少なくとも２倍強い、さらに有利には１０倍強いＣＤ１６との相互作用を示す。
【００４６】
抗体のＦｃ領域とＣＤ１６受容体との間の相互作用は、ＣＤ１６陽性細胞上において、抗体のＦｃ部分の認識部位と結合する３Ｇ８型の抗ＣＤ１６モノクローナル抗体との競合により、直接的または間接的結合を介して測定することができる。
【００４７】
本発明にしたがって使用される抗体組成物は、Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型の含量が５０％未満、好ましくは３０％未満であるという条件下で、Ｇ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型の含量が６０％より多いことが有利であり、８０％より多いことが好ましい。
【００４８】
特に有利な方法においては、本発明にしたがって使用される抗体組成物はまた、フコース含量／ガラクトース含量の比が０．６未満である。この比は、０．５未満；０．４未満；０．２未満であることが有利であり、さらに０．１未満であることが有利である。
【００４９】
このような抗体組成物の使用は、医薬の調製に用いることが意図され、好ましくは、１以上のエフェクター細胞集団が減少しているかまたはさらにゼロであり、従って、上記細胞のＡＤＣＣにより誘導される細胞傷害性活性が低い病状を治療するための医薬の調製に用いることが意図される。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能を利用することができず、Ｂ−ＣＬＬを患い、ＮＫ細胞の溶解機能が低下している患者を治療するための医薬を調製すべく、本発明の方法により選択されたＣＤ１６と強い相互作用を有する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を使用すること、または上記のフコシル化特性を満たす抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を使用することに関する。
【００５１】
一般に、本発明の抗体は、任意の造血系の異常増殖を治療するために使用できる。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能を利用することができないＮＫ細胞が欠乏した患者であって、細胞傷害性がもっぱらＮＫ細胞によって発現される抗体により治療不可能な患者を治療するための医薬を製造するための、モノクローナル抗体組成物の使用である。
【００５３】
例えば、このような患者としては、紅斑性狼瘡を患う患者(Green 2005)、拡張型心筋症の患者(Anderson 1982)、血球貪食性組織球増殖症を患う患者(パーフォリン欠損)(Clementi R, 2005)、およびＨＩＶ感染症患者(パーフォリンおよびグランザイム欠損)(Portales, 2003)が挙げられる。
【００５４】
２１トリソミーの患者(Nurmi 1982)、および移植を受けている患者であって、関連する治療がＮＫ細胞の欠乏を引き起こし、腫瘍の発症リスクが高まっている患者(Alamartine 1997)も含めることができる。造血性病変において、Ｂ−ＣＬＬ患者に加え、急性骨髄性白血病(Nasrallah, 1983)および毛様細胞白血病(Trentin 1990)を患う患者におけるＮＫ細胞に関連する細胞傷害性の欠損が記載されている。より一般的には、喫煙集団(Takeuchi 2001)は、非喫煙者と比較してＮＫ活性の低下を示す。加えて、本発明の抗体は、Ａ型またはＢ型血友病を患う患者の治療に特に有利であり得、これは必要に応じて記憶Ｂリンパ球を標的としていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明の他の態様および利点は、以下の実施例に記載されているが、これは例示として解釈されるべきであり、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【実施例】
【００５６】
抗体
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いて試験モデルを設計した。これは、可変ドメインがネズミ起源であるが、定常部分はヒト起源である組換え抗体である。
【００５７】
同じ配列が、ＣＨＯ株およびＹＢ２／０株において発現された（ＹＢ２／０において発現された抗体を「ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体」と呼ぶ）。
【００５８】
細胞
クローンＥ６．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）から入手した。これらの同じ細胞を、ガンマ鎖（γ）をコードする発現ベクターによって、およびＦｃγＲIIIａ（Ｌ４８Ｆ１５８ハプロタイプ）をコードするベクターによってトランスフェクトした。ＣＤ１６を発現するためにＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトされたこれらの細胞は、ＡＤＣＣ機構による細胞傷害性を誘導することができない。
【００５９】
Ｄａｕｄｉ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ−ＡＴＣＣ）から入手した。
【００６０】
ＮＫ細胞（ナチュラルキラー）は、Ｍｙｌｔｅｎｙｉ磁性ビーズ上でのネガティブ選択により末梢血サンプルから精製する。
【００６１】
アポトーシスの誘導
条件１：Ｄａｕｄｉ細胞（２．５×１０５個細胞）を、抗ＨＬＡ−ＤＲ（１μｇ／ｍｌ）と共に２４ウェルプレート（Ｐ２４）中で、３７℃にて２４時間インキュベートする。
【００６２】
条件２：Ｄａｕｄｉ細胞（２．５×１０５個細胞）を、抗ヒトＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）存在下、抗ＨＬＡ−ＤＲ（１μｇ／ｍｌ）と共に２４ウェルプレート（Ｐ２４）中で３７℃にて２４時間インキュベートする。
【００６３】
条件３：Ｄａｕｄｉ細胞（２．５×１０５個細胞）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（２．５×１０５個細胞）の存在下、抗ＨＬＡ−ＤＲ（１μｇ／ｍｌ）と共に２４ウェルプレート（Ｐ２４）中で３７℃にて２４時間インキュベートする。
【００６４】
条件４：Ｄａｕｄｉ細胞（２．５×１０５個細胞）を、ＣＤ１６でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（２．５×１０５個）の存在下、抗ＨＬＡ−ＤＲ（１μｇ／ｍｌ）と共に２４ウェルプレート（Ｐ２４）中で３７℃にて２４時間インキュベートする（図３）。
【００６５】
条件５：Ｄａｕｄｉ細胞（２．５×１０５個細胞）を、ＮＫ細胞（２．５×１０５個細胞）および４ｍＭのＥＧＴＡ／２ｍＭのＭｇＣｌ２混合物の存在下、抗ＨＬＡ−ＤＲ（１μｇ／ｍｌ）と共に２４ウェルプレート（Ｐ２４）中で３７℃にて２４時間インキュベートする。
【００６６】
アネキシンＶ／ＰＩ技術を用いたアポトーシスの測定
次に細胞を回収し、２回洗浄する。そして、製造業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用説明書に従って、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にインキュベートした。細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＥｘｐｏ３２ソフトウェアを用いてフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ血球計算器、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析する。アネキシンＶの結合はアポトーシスの初期シグナルに相当するのに対し、ＰＩの結合は後期シグナル（ＤＮＡ断片化）に相当し、いわゆるアポトーシス細胞のパーセンテージは、アネキシンＶ陽性細胞およびアネキシンＶ／ＰＩ二重陽性細胞の合計として任意に定義される。
【００６７】
（実施例１）
抗ヒトＩｇＧ抗体（架橋剤）によるアポトーシスの増強作用
抗体の非存在下で観察されるＤａｕｄｉ細胞のアポトーシス（自然死）は、ほぼ１０％程度である。この基礎値は、種々の実験の間に得られた結果から推論され、従って任意に０％に設定される。
【００６８】
表１（図１参照）において、結果はアポトーシス細胞のパーセンテージとして表されている（アネキシンＶおよびＰＩ陽性）。１μｇ／ｍｌの濃度で単独で（条件１）使用された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に関するＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体およびＣＨＯ抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞においてほとんどアポトーシスを誘導しない（＜３％）。一方、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上で抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を集合させるヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に対する抗体が存在する場合（条件２）、アポトーシスは、両方の抗体について同一の様式で増強され、３％未満から１９％へと増大した。
【００６９】
図４Ａにおいて、結果は観察されたアポトーシス細胞のパーセンテージとして表されており、ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体は試験された各条件に対して任意に１００％を表している。これらの条件下において、統計的研究では、ＣＨＯにおいて発現された抗体（ＤＲ  ＣＨＯ）と、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体（ＤＲ  ＹＢ２／０）との間で、誘導されたアポトーシスの増強作用に有意差は示されない（ｐ＝０．８５）。
【００７０】
アポトーシス細胞のパーセンテージを示す図４Ｂは、末梢血由来のＢ細胞のアポトーシスが抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でのみ得られることを示す。これらの条件下、本試験はＣＨＯにおいて発現された抗体（ＤＲ  ＣＨＯ）と、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体（ＤＲ  ＹＢ２／０）との間で、誘導されたアポトーシスの増強作用に有意差がないことを示す。
【００７１】
（実施例２）
ＣＤ１６  Ｊｕｒｋａｔによるアポトーシスの増強作用
Ｄａｕｄｉ細胞（表２、すなわち図２参照）の結果が、アポトーシス細胞（アネキシンＶおよびＰＩ陽性）のパーセンテージとして表されている。対照Ｊｕｒｋａｔ細胞（非トランスフェクト）存在下で１μｇ／ｍｌの濃度で用いられた抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体およびＣＨＯ抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞（条件３）に対し、それぞれ３％、および２％のアポトーシスを誘導する。しかし、Ｄａｕｄｉ細胞の表面に固定された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＦｃ部分とともにＣＤ１６を介して相互作用し得るＣＤ１６  Ｊｕｒｋａｔ細胞（条件４）存在下では、アポトーシスが増強される。ＣＨＯおよびＹＢ２／０株により産生された抗体（ＤＲ  ＣＨＯ）および（ＤＲ  ＹＢ２／０）の存在下において、最終的なアポトーシスのパーセンテージはそれぞれ８％および１９％である。従って、ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体の存在下でのアポトーシスの増強作用は、ＣＨＯにおいて産生された抗体により誘導された場合と比較して、約１００％大きい。図５Ａにおいて、結果が、観察されたアポトーシス細胞のパーセンテージとして表され、ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体は、調べられた各条件に対して任意に１００％を表している。これらの条件下において、アポトーシスの増強作用における差が、統計学的に２種の抗体間で極めて有意に異なり（ｐ＜０．０００ｌ）、ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体に有利であることを示す。
【００７２】
また、抗ヒトＩｇＧ抗体（架橋剤）をＣＤ１６でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞で置き換えた場合について、末梢血由来のＢ細胞のアポトーシスを調査する。野生型非トランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞（ＷＴ）を陰性対照として用いる。アポトーシス細胞のパーセンテージとして表される結果（図５Ｂ）は、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）（ＤＲ  ＹＢ２／０）により誘導されたアポトーシスが、ＣＨＯにおいて産生された抗体（ＤＲ  ＣＨＯ）により誘導された場合と比較して、より強力に増強されることを示す。この特性は、おそらく抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＨＯ（ＤＲ  ＣＨＯ）と比較して抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）（ＤＲ−ＹＢ２／０）のほうがＣＤ１６上により良好に固定されるためである。
【００７３】
ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体とＣＤ１６の強力な相互作用は、ＡＤＣＣおよびサイトカイン分泌の増加だけではなく（文献EP1537419参照）、アポトーシスの増強作用をも生み出す。このことは、ＣＨＯにおいて産生された同じ抗体と比較して、ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体に大きな付加的、機能的な利点を与える。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】表１を示す。
【図２】表２を示す。
【図３】ＣＤ１６によるアポトーシス増強作用を示す概念図である。
【図４Ａ】抗ヒトＩｇＧ抗体によるＤａｕｄｉ細胞のアポトーシスの増強を示すグラフである。
【図４Ｂ】抗ヒトＩｇＧ抗体によるＢ細胞のアポトーシスの増強を示すグラフである。架橋剤（ヒトＩｇのＦ（ａｂ’）２抗Ｆｃフラグメント）の存在下または非存在下、２４時間の間に、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体（ＤＲ  ＹＢ２／０）および抗ＨＬＡ  ＤＲ  ＣＨＯ（ＤＲ  ＣＨＯ）抗体により誘導された、末梢血から精製されたＢ細胞のアポトーシスを示す。
【図５Ａ】ＣＤ１６  ＪｕｒｋａｔによるＤａｕｄｉ細胞のアポトーシスの増強を示すグラフである。
【図５Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ１６によるＢ細胞のアポトーシスの増強を示すグラフである。ＣＤ１６分子によりトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ１６  Ｊｕｒｋａｔ）、または非トランスフェクトＪｕｋａｔ細胞（ＷＴ  Ｊｕｒｋａｔ）の存在下、２４時間の間に、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）抗体（ＤＲ  ＹＢ２／０）および抗ＨＬＡ  ＤＲ  ＣＨＯ抗体（ＤＲ  ＣＨＯ）により誘導された、末梢血から精製されたＢ細胞のアポトーシスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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