(57)【要約】本発明は、ユニバーサル塩基を含むＰＮＡシントンに関連する組成物、ユニバーサル塩基を含むＰＮＡオリゴマーに関連する組成物、および／またはユニバーサル塩基を含むＰＮＡ／ＤＮＡキメラに関連する組成物に関する。本発明はまた、ユニバーサル塩基を含むＰＮＡシントンに関連する方法、ユニバーサル塩基を含むＰＮＡオリゴマーに関連する方法、および／またはユニバーサル塩基を含むＰＮＡ／ＤＮＡキメラに関連する方法に関する。
2009507765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリル化合物を、式：
【化１】
2009507765.tif 000039
のハロアセテート化合物でアルキル化する工程であって、
該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
各Ｗが、独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはｓｅｃ−ブチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が、メチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各Ｘ１が、Ｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反応の生成物のうちの１つが、式：
【化２】
2009507765.tif 000040
の置換型または非置換型の複素環式化合物であり、
該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｒ２は、水素、またはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）式：
【化３】
2009507765.tif 000041
の置換型または非置換型の複素環式化合物を、
式：
【化４】
2009507765.tif 000042
の置換型または非置換型の化合物、あるいは式：
【化５】
2009507765.tif 000043
の置換型または非置換型の化合物と反応させる工程；
を包含する方法であって、
該反応によって、式：
【化６】
2009507765.tif 000044
の置換型または非置換型の複素環式化合物が生成され、該生成される複素環式化合物の式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｗ’は、水素または−ＮＨ２であり；
Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｈ−Ａｃは、ジアミンをプロトン化することができる酸性基であり；
各Ｘ１は、独立して、ＯまたはＳである、方法。
【請求項７】
前記反応のための溶媒が、化合物ＩＶｂ、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、またはｔ−ブタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応が還流させられる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ｂ）前記置換型または非置換型の複素環式化合物Ｖの環外アミンをアミン保護基で保護することにより、式：
【化７】
2009507765.tif 000045
の化合物を生成させる工程；
をさらに包含し、該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｐｇ１は、アミン保護基であり；
Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミン保護基が、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｂ）化合物Ｖのエステル基をカルボン酸基に変換することにより、式：
【化８】
2009507765.tif 000046
の置換型または非置換型の複素環式化合物を生成させる工程；
をさらに包含し、該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ｃ）化合物ＶＩのエステル基をカルボン酸基に変換することにより、式：
【化９】
2009507765.tif 000047
の置換型または非置換型の複素環式化合物を生成させる工程；
をさらに包含し、該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｐｇ１は、アミン保護基であり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
Ｐｇ１が、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）式：
【化１０】
2009507765.tif 000048
の置換型または非置換型の複素環式化合物の活性化カルボン酸基、チオカルボン酸基、または活性型エステル基のカルボニル炭素またはチオカルボニル炭素を、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分の二級窒素と反応させる工程；
を包含し、該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｐｇ１は、アミン保護基であり；
Ｒ２は、−ＳＨ、−ＯＨ、または活性エステル脱離基であり；
Ｘ１は、ＯまたはＳである、
方法。
【請求項１５】
前記置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分が、式：
【化１１】
2009507765.tif 000049
を有し、該式において、
Ｐｇ２は、アミン保護基であり；
各Ｙ１は、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｙ２は、水素、または保護されたアミノ酸側鎖もしくは保護されていないアミノ酸側鎖であり；
Ｒ３は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＲ１、または−ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分が、ＰＮＡオリゴマーのＰＮＡサブユニットまたはＰＮＡ／ＤＮＡキメラのＰＮＡサブユニットである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
Ｐｇ１が、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
Ｐｇ１が、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃであり、Ｐｇ２がＰｇ１とは異なっており、Ｐｇ２は独立して、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、Ｃｙｏｃ、またはトリチルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記活性エステル脱離基が、式：
【化１２】
2009507765.tif 000050
の基であり、該式において、Ｘ１は、ＯまたはＳである、
請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
式：
【化１３】
2009507765.tif 000051
の置換型または非置換型の複素環式化合物であって、
該式において、
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であるが、ただしＲ１はエチルではなく；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、
複素環式化合物。
【請求項２２】
Ｒ１が、メチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
各Ｘ１がＯである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
式：
【化１４】
2009507765.tif 000052
の置換型または非置換型の複素環式化合物であって、
該式において、
Ｐｇ３は、水素またはアミン保護基であり；
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｘ１は、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＲ１、または−ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基である、
複素環式化合物。
【請求項２５】
Ｐｇ３が、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃである、請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルである、請求項２４記載の化合物。
【請求項２７】
Ｘ１がＯである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２８】
式：
【化１５】
2009507765.tif 000053
を有する、請求項２４に記載の化合物であって、
該化合物は、必要に応じて置換されている、化合物。
【請求項２９】
式：
【化１６】
2009507765.tif 000054
のＰＮＡシントンであって、
該式において、
Ｐｇ１は、アミン保護基であり；
Ｐｇ２は、アミン保護基であり；
各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
各Ｙ１は、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
Ｙ２は、水素、または保護されたアミノ酸側鎖もしくは保護されていないアミノ酸側鎖であり；
Ｒ３は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＲ１、または−ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であり；
各Ｘ１は、ＯまたはＳである、
ＰＮＡシントン。
【請求項３０】
Ｐｇ１が、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃであり；
Ｐｇ２が、Ｐｇ１とは異なったアミノ酸保護基であり、該Ｐｇ２は、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、Ｃｙｏｃ、およびトリチルからなる群より選択される、
請求項２９記載のＰＮＡシントン。
【請求項３１】
式：
【化１７】
2009507765.tif 000055
を有する、請求項２９記載のＰＮＡシントン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
本願は、２００５年６月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／６９０，５６９号および２００６年６月１４日に出願された米国特許出願（番号付与待ち）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本明細書で使用される各節の見出しは、構成上のためだけのものであり、如何なる意味においても、記載された内容を制限するものと解してはならない。
【０００３】
１．技術分野
本発明は、核酸塩基を有機合成し、それらをシントンおよびオリゴマーに取り込むという技術分野に関係する。
【背景技術】
【０００４】
２．緒言
ペプチド核酸は、核酸およびその他のポリ核酸塩基鎖に配列特異的にハイブリダイズすることができるオリゴマーを含む合成核酸塩基の仲間である。ポリ核酸塩基鎖の核酸塩基間でのハイブリダイゼーションは、一般的に、水素結合について十分に確立したルールに従う。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合では、一般的に、アデニンがチミンと対合し、シトシンがグアニンと対合する。
【０００５】
核酸塩基８−アザ−７−デアザアデニンを含むヌクレオシドが研究されており、ユニバーサル塩基の性質を示すことが分かっている（非特許文献１）。ユニバーサル塩基という用語は、４種類の標準的なＤＮＡ核酸塩基（すなわち、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン）に対して特異的水素結合を形成するヌクレオシドを意味する。８−アザ−７−デアザアデニンなどのユニバーサル塩基を含むＰＮＡシントンおよびＰＮＡオリゴマーを調製する方法があれば有用であろう。
【非特許文献１】Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（２０００）２８（１７）：３２２４−３２３２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特許文献、特許出願文書、記事、書籍、論文、およびインターネット上のウェッブページなど、本出願で引用されたすべての文献および同様の資料は、それら文献および同様の資料がどのような形式のものであっても、その全文が、あらゆる目的で参照されて本明細書に明示して組み込まれる。
【０００７】
４．定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適当であれば、単数形で使用されている用語は複数形を含み、また逆の場合も然りである。以下に示す定義が、参照されて本明細書に組み込まれる文書など、他の文書におけるその用語の用法と食い違う場合には、以下に示す定義が優先されるべきである。
【０００８】
ａ．本明細書において、「核酸塩基」は、核酸技術を利用して、またはペプチド核酸技術を利用して、核酸およびその他のポリ核酸塩基の鎖に配列特異的に結合することができるポリ核酸塩基鎖を作製する人々に広く知られている天然または非天然の複素環部分を意味する。適当な核酸塩基の非限定的な例には以下のものが含まれる。すなわち、アデニン、システイン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、およびＮ８−（８−アザ−７−デアザアデニン）。適当な核酸塩基の別の非限定的な例には、図１Ａおよび１Ｂに図示した核酸塩基が含まれる（米国特許第６，３５７，１６３号の図２Ａおよび２Ｂ参照）。
【０００９】
ｂ．本明細書において、「核酸塩基配列」は、ポリ核酸塩基鎖の分節、または２つ以上の分節を集合させたもの（すなわち、結合ポリマー）を意味する。適当なポリ核酸塩基鎖の非限定的な例は、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ、核酸アナログ、および／または核酸模倣体などである。
【００１０】
ｃ．本明細書において、「サブユニットを含む核酸塩基」という語句は、核酸塩基を含むポリ核酸塩基鎖のサブユニットを意味する。オリゴヌクレオチドでは、サブユニットを含む核酸塩基はヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドについて、当業者は、別種のポリ核酸塩基鎖と結合したサブユニットの形態を理解しているはずである。
【００１１】
ｄ．本明細書において、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基を含むサブユニットを含む完全な単一ポリマー鎖を意味する。
【００１２】
ｅ．本明細書において、「核酸」は、ヌクレオチドまたはその類似化合物から形成された骨格をもつポリ核酸塩基鎖を意味する。好適な核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）である。疑義を避けるために言うと、ＰＮＡは核酸模倣体であって、核酸または核酸アナログではない。ＰＮＡは、ヌクレオチドから生成されるものではないため核酸ではない。
【００１３】
ｆ．本明細書において、「ペプチド核酸」ないし「ＰＮＡ」は、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３号、第６，１０７，４７０号、および第６，３５７，１６３号においてペプチド核酸と呼ばれるか主張されている何れかのポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントなど、２個またはそれ以上のＰＮＡサブユニットを含む任意のポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントを意味する。
【００１４】
「ペプチド核酸」ないし「ＰＮＡ」という用語は、以下の刊行物に記載された核酸模倣体の２つ以上のサブユニットを含む任意のポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントにも適用されるべきである：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ  ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉ  ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎ  ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚ  ら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ  ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅ  ら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，（１９９７）  １：５３９−５４６；Ｌｏｗｅ  ら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅ  ら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈ  ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈ  ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎ  ら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉ  ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅ  ら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒ  ら，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）；およびＷＯ９６／０４０００に開示されているＳｈａｈ  らの「ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｉｃｓ  （ＰＥＮＡＭｓ）」。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、「ペプチド核酸」ないし「ＰＮＡ」は、以下の化学式の共有結合したサブユニットを２個以上含むポリ核酸塩基鎖またはポリ核酸塩基鎖のセグメントである：
【００１６】
【化１８】
2009507765.tif 000003
ただし、式中、Ｊはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｈ、Ｒ’、ＯＲ′、ＳＲ′、ＮＨＲ′、ＮＲ′２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される。Ｋはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＲ′からなる群から選択される。Ｒ’はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基である。例えば、Ｒ’は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基、メトキシ基、エトキシ基、ベンジル基、フェニル基、ビニル基、またはアリル基である。
【００１７】
Ａはそれぞれ、単結合、−（ＣＪ２）ｓ−という化学式をもつ基、および−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−という化学式をもつ基からなる群から選択されるが、ただし、Ｊは、上記で定義された通りであり、ｓはそれぞれ、１から５までの整数である。ｔはそれぞれ１または２であり、ｕはそれぞれ１または２である。Ｌはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシル、および２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、Ｎ８−（８−アザ−７−デアザアデニン）、その他天然型の核酸塩基アナログおよびその他の非天然型核酸塩基（例えば、図１Ａおよび１Ｂ）からなる群から独立して選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合を介してＮ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシル窒素に結合した、天然型または非天然型の核酸塩基であってもよい。この核酸塩基は、現在、もっとも通常に使用される形態のペプチド核酸サブユニットである。
【００１９】
ｇ．本明細書において、「配列特異的に」とは、水素結合を介した塩基対合によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対合の非限定的な例は、チミンまたはウラシルとアデニンとの塩基対合、およびシトシンとグアニンとの塩基対合などである。塩基対合モチーフのその他の非限定的な例は、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシル、または２−チオチミンのいずれかとアデニンとの塩基対合；５−メチルシトシンまたはシュードイソシトシンのいずれかとグアニンとの塩基対合；ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、またはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかとシトシンとの塩基対合；２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）のいずれかとチミンまたはウラシルとの塩基対合；および、ユニバーサル塩基であるＮ８−（８−アザ−７−デアザアデニン）の、それ以外の核酸塩基、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）のいずれかとの塩基対合などである。
【００２０】
ｈ．本明細書において、「キメラ」または「キメラオリゴマー」という用語は、異なった種類のサブユニットから選択される２個以上の結合サブユニットを含むポリ核酸塩基鎖を意味する。例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、少なくとも１つの２’−デオキシリボ核酸サブユニットに結合した少なくとも１つのＰＮＡサブユニットを含むことが可能である（ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ調製物に関する方法および組成物の例については、米国特許第６，０６３，５６９号参照）。
【００２１】
ｉ．本明細書において、「結合ポリマー」という用語は、リンカーによって結合されている２つ以上のポリマーセグメントを含む核酸塩基鎖を意味する。結合されると結合ポリマーを形成することができるポリマーセグメントは、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド、ポリアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびＰＮＡ／ＤＮＡキメラからなる群から選択することができる。
【００２２】
ｊ．本明細書において、「アルキル」という用語は、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜Ｃ２０炭化水素または完全に飽和した環状のＣ３〜Ｃ２０炭化水素（すなわち、シクロアルキル基）を意味する。本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、置換または非置換の基を意味する。本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、置換または非置換のメチレン基の炭素原子の１個以上がケイ素原子（Ｓｉ）によって置換され得るアルキル基も意味する。いくつかの実施形態において、アルキル基は、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜Ｃ６炭化水素、または完全に飽和した環状のＣ３〜Ｃ６炭化水素であってもよい。
【００２３】
ｋ．本明細書において、「アルキレン」という用語は、少なくとも２つの部分（例えば、−｛ＣＨ２｝−（メチレン）、−｛ＣＨ２ＣＨ２｝−、（エチレン）、
【００２４】
【化１９】
2009507765.tif 000004
など。ただし、式中の括弧は結合点を示す）に対する少なくとも２つの結合点をもつ直鎖状または分枝状のアルキル鎖または環状のアルキル基を意味する。本明細書で使用される場合、「アルキレン」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。いくつかの実施形態において、アルキレン基はＣ１〜Ｃ６炭化水素であってもよい。
【００２５】
ｌ．本明細書において、「アルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合を有する直鎖状もしくは分枝状のＣ２〜Ｃ２０炭化水素または環状のＣ３〜Ｃ２０炭化水素を意味する。本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。本明細書の目的にとって、「アルケニル」は、置換または非置換のメチレン基の炭素原子の１個以上がケイ素原子（Ｓｉ）によって置換されているアルケニル基も意味し得る。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、１つ以上の二重結合を有する直鎖状もしくは分枝状のＣ２〜Ｃ６炭化水素または環状のＣ３〜Ｃ６炭化水素であってもよい。
【００２６】
ｍ．本明細書において、「アルキニル」という用語は、１つ以上の三重結合を有する直鎖状もしくは分枝状のＣ２〜Ｃ２０炭化水素または環状のＣ３〜Ｃ２０炭化水素を意味する。本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。本明細書の目的にとって、「アルキニル」は、置換または非置換のメチレン基の炭素原子の１個以上がケイ素原子（Ｓｉ）によって置換されているアルキニル基も意味する。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、１つ以上の三重結合を有する直鎖状もしくは分枝状のＣ２〜Ｃ６炭化水素または環状のＣ３〜Ｃ６炭化水素であってもよい。
【００２７】
ｎ．本明細書において、「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル鎖の中の１個以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、または−ＮＲ”−（ただし、Ｒ”は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはアリールアルキルであり得る）などのヘテロ原子によって置換されるアルキル基を意味する。本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００２８】
ｏ．本明細書において、「ヘテロアルケニル」という用語は、１個以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、または−ＮＲ”−（ただし、Ｒ”は、上記定義のとおり）などのヘテロ原子によって置換されるアルケニル基を意味する。本明細書で使用される場合、「ヘテロアルケニル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００２９】
ｐ．本明細書において、「ヘテロアルキニル」という用語は、１個以上のメチレン基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、または−ＮＲ”−（ただし、Ｒ”は、上記定義のとおり）などのヘテロ原子によって置換されるアルキニル基を意味する。本明細書で使用される場合、「ヘテロアルケニル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００３０】
ｑ．本明細書において、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、１個以上の酸素原子、窒素原子、または硫黄原子を含む非芳香族環（例えば、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリドン、およびチオモルホリン）を意味する。本明細書において、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００３１】
ｒ．本明細書において、「アリール」という用語は、単独または、別の成分（例えば、アリールアルキルなど）の一部のいずれかで、フェニル基などの炭素環芳香族基を意味する。アリール基は、炭素環芳香族環が別の炭素環芳香族環（例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、２−アントラシルなど）に融合しているか、炭素環芳香族環が１つ以上の炭素環非芳香族環（例えば、テトラヒドロナフチレン、インダンなど）に融合している縮合多環芳香族環系も含む。本明細書において、「アリール」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００３２】
ｓ．本明細書において、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、硫黄、および酸素から個別に選択される１個、２個、３個、または４個のヘテロ原子を含む芳香族ヘテロ環を意味する。本明細書において、「ヘテロアリール」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。ヘテロアリールは、１個または２個の環、例えば、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールに融合することができる。ある分子に対するヘテロアリールの結合点は、ヘテロアリール上、シクロアルキル上、ヘテロシクロアルキル上、またはアリール環上にあり得、ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して結合させることができる。ヘテロアリール基は、置換型でも非置換型でもよい。ヘテロアリール基の例は、イミダゾリル、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、キノリル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、インドリジニル、イミダゾピリジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、テトラゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンズオキサジアゾリル、インドリル、テトラヒドロインドリル、アザインドリル、イミダゾピリジル、キナゾリニル、プリニル、ピロロ［２，３］ピリミジル、ピラゾロ［３，４］ピリミジル、またはベンゾ（ｂ）チエニルなどであるが、これらはそれぞれ任意で置換型であってもよい。
【００３３】
ｔ．本明細書において、「アリールアルキル」という用語は、アルキレンリンカーを介して別の部分に結合しているアリール基を意味する。本明細書において、「アリールアルキル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００３４】
ｕ．本明細書において、「ヘテロアリールアルキル」という用語は、アルキレンリンカーを介して別の部分（例えば、アルキル基またはヘテロアルキル基）に結合しているヘテロアリール基を意味する。本明細書において、「ヘテロアリールアルキル」という用語は、置換型または非置換型の基を意味する。
【００３５】
任意のアルキル基、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基に対する適当な置換基には、本発明の実施形態において用いられる反応条件下で安定している任意の置換基が含まれる。適当な置換基の非限定的な例は、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基など）、ハロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基）、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、アリール基（例えば、フェニル基）、アリールアルキル基（例えば、ベンジル基）、ニトロ基、シアノ基、四級化窒素原子、またはハロ基（例えば、フッ素基、塩素基、臭素基、およびヨウ素基など）などである。
【００３６】
なお、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基の任意の飽和部位を、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ”（但し、Ｒ”は前記で定義されている）により置換することも可能である。
【００３７】
ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、またはヘテロアリールアルキル基が窒素原子を含む場合、置換型でも非置換型でもよい。ヘテロアリール基の芳香環内の窒素原子が置換基を有する場合、窒素は四級化窒素原子でもよい。
【００３８】
ｖ．本明細書において、「アミノ酸」は、Ｒ”’−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ””）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”’（但し、式中、Ｒ”’は独立して、水素、脂肪族基、置換脂肪族基、芳香族基、別のアミノ酸、ペプチド、または置換芳香族基である）と表示される基を意味する。「天然型アミノ酸」とは、自然界に存在するアミノ酸のことである。それらの例には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン、オルニチン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、およびヒスチジンが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｒ””は、水素、または天然型アミノ酸の側鎖でもよい。天然型アミノ酸の側鎖の例には、メチル基（アラニン）、イソプロピル基（バリン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）、−ＣＨ２ＣＨ（−ＣＨ３）２（ロイシン）、ベンジル基（フェニルアラニン）、ｐ−ヒドロキシベンジル基（チロシン）、−ＣＨ２−ＯＨ（セリン）、−ＣＨＯＨＣＨ３（スレオニン）、−ＣＨ２−３−インドイル基（トリプトファン）、−ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（グルタミン酸）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（グルタミン）、−ＣＨ２ＳＨ（システイン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニン）、−（ＣＨ２）４ＮＨ２（リジン）、−（ＣＨ２）３ＮＨ２（オルニチン）、−｛（ＣＨ）２｝４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２（アルギニン）、および−ＣＨ２−３−イミダゾイル基（ヒスチジン）が含まれる。
【００３９】
ヘテロ原子含有官能基を含むアミノ酸の側鎖、例えば、アルコール基（セリン、チロシン、ヒドロキシプロリン、およびスレオニン）、アミン基（リジン、オルニチン、ヒスチジン、およびアルギニン）などは、本明細書で検討する反応を促進するためには保護基を必要とするかもしれない。ヘテロ原子含有官能基を修飾して保護基を含ませる場合、側鎖は、アミノ酸の「保護側鎖」と呼ばれる。保護基は、ペプチド合成法において一般的に使用されており、当業者に周知され、しばしば使用されている。例えば、多数の適当な保護基、および保護アミノ酸を調製する方法が、Ｇｒｅｅｎ  ら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されていよう。
【００４０】
ｗ．本明細書において、「塩型」という用語は、ある化合物の塩、またはある化合物の塩の混合物を意味する。化合物の双性イオン型も、「塩型」という用語に含まれる。アミン基、またはその他の塩基性基をもつ化合物の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸など、適当な有機酸または無機酸と反応させることによって得ることができる。四級アンモニウム基をもつ化合物は、塩素、臭素、ヨード、酢酸、過塩素酸などの対アニオンを含むことも可能である。カルボン酸、またはその他の酸性官能基を有する化合物の塩は、化合物を適当な塩基、例えば、水酸化塩基などと反応させることによって調製することができる。したがって、酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの対カチオンをもつかもしれない。
【００４１】
５．説明
Ｉ．一般的説明
当然ながら、この「一般的説明」の節に記載した以下の考察は、本明細書記載の発明の多様な実施形態の一部またはすべてに関連し得る。
【００４２】
ＰＮＡ合成
ＰＮＡを化学的に組み立てる方法は既知である（例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３号および第６，１０７，４７０号参照）。ＰＮＡ合成法に関する一般的な参考文献としては、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ら，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）を参照されたい。
【００４３】
ペプチド核酸を支持体に結合させて自動で化学的に組み立てるための化学物質および装置を利用することができる。標識されたＰＮＡオリゴマーも非標識のＰＮＡオリゴマーも、同じように、特注ＰＮＡオリゴマーの販売業者から入手することができる。ＰＮＡの化学的組み立ては、固相ペプチド合成と同様であるが、ただし、組み立ての各サイクルにおいて、オリゴマーは成長しているポリマーに付加される次のシントンと縮合することができる反応性アルキルアミノ末端を有する。標準的なペプチド化学法を利用することができるため、天然型および非天然型のアミノ酸を普通にＰＮＡオリゴマーの中に取り込ませることができる。ＰＮＡはポリアミドであるため、Ｃ末端（カルボキシル末端）とＮ末端（アミノ末端）を有する。標的配列に逆平行（好適な方向）に結合させるのに適したハイブリダイゼーション用プローブを設計するためには、ＰＮＡプローブのプローブ用核酸塩基配列のＮ末端を、同等のＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基末端と同じにする。しかし、ＰＮＡオリゴマーは、核酸にも別のＰＮＡオリゴマーにも平行方向に結合することも知られているため、ハイブリダイゼーションの方向は限定的なものではない。
【００４４】
ＰＮＡ標識：
ＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、第６，３５５，４２１号、第６，３６１，９４２号、および第６，４８５，９０１号に記載されているか、またはＰＮＡ合成の技術分野において知られている。ＰＮＡオリゴマーを標識するための別の非限定的な例が、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ら，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）においても考察されている。ＰＮＡオリゴマーおよびオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９７，５１３号に記載されているように、タンパク質（例えば、酵素）およびペプチドにより標識することができる。このように、さまざまな標識ＰＮＡオリゴマーを調製するか、または販売業者から購入することができる。
【００４５】
核酸の合成および修飾
核酸オリゴマー（オリゴヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチド）合成は日常的なものになっている。核酸合成の詳細な説明については、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄを参照されたい。当業者は、標識オリゴヌクレオチドおよび非標識オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの合成アナログ）を容易に利用できることを認識しているはずである。これらは、市販の機器および試薬を用いて合成するか、あるいは特注製造されるオリゴヌクレオチドの販売業者から購入することができる。
【００４６】
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの合成および修飾
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、核酸およびペプチド核酸のサブユニットを組み合わせたものである。ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの合成、標識および修飾についての適当な参考文献は、米国特許第６，０６３，５６９号の中に見出すことができる。さらに、ＰＮＡを合成および標識するための上記方法は、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラのＰＮＡ部分を修飾するためにしばしば用いることができる。加えて、核酸を合成および標識するための既知の方法を、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの核酸部分を修飾するためにしばしば用いることができる。したがって、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラを合成、標識、および修飾するには、当業者に周知の方法、ならびに上記で説明された方法、または上記で言及された方法を利用することができる。
【００４７】
標識
ＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラは標識を含むことができる。ポリ核酸塩基鎖（例えば、ＰＮＡオリゴマー）を標識するために用いることができる検出可能な成分（標識）の非限定的な例には、デキストラン結合体、分枝状核酸検出系、発色団、フルオロフォア、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、または化学発光性化合物などがある。その他の適当な標識試薬および好適な結合法は、ＰＮＡ、ペプチド、または核酸の合成法の技術分野の当業者によって認識されているであろう。
【００４８】
ハプテンの非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンなどである。
【００４９】
蛍光色素（フルオロフォア）の非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）色素、シアニン３（Ｃｙ３）色素、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）色素、シアニン５（Ｃｙ５）色素、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）色素、シアニン７（Ｃｙ７）色素、シアニン９（Ｃｙ９）色素（シアニン色素２、３、３．５、５および５．５はＡｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ．からＮＨＳエステルとして入手可能）、またはＡｌｅｘａ色素シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．）などである。
【００５０】
酵素の非限定的な例は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ））、リボヌクレアーゼ、およびプロテアーゼなどである。
【００５１】
スペーサー／リンカー部分
ＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、スペーサーおよび／またはリンカー部分を含むことができる。通常、スペーサーを用いて、大量の標識試薬がプローブのハイブリダイゼーション特性に与え得る有害作用を最小化する。リンカーは、一般的には、ポリ核酸塩基鎖に柔軟性および無秩序（ｒａｎｄｏｍｎｅｓｓ）を生じさせ、あるいはポリ核酸塩基鎖の２つ以上の核酸塩基配列を結びつける。本明細書に記載されたポリ核酸塩基鎖の好適なスペーサー／リンカー部分は、１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖）、天然アミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）、またはアルキルジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）を含むことができる。ポリ核酸塩基鎖の可溶性が改善されるよう、スペーサー／リンカー部分を偶発的または意図的に構築することもできる（例えば、Ｇｉｌｄｅａ  ら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５−７２５８（１９９８）ならびに米国特許第６，３２６，４７９号および第６，７７０，４４２号参照）。
【００５２】
例えば、スペーサー／リンカー部分は、化学式：−Ｑ−（Ｏｍ−（ＣＭ２）ｎ）ｏ−Ｔ−をもつ１つ以上の連結化合物を含むことができる。Ｑ基は、単結合、−（ＣＭ２）ｐ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＭ２）ｐ−、−Ｃ（Ｓ）（ＣＭ２）ｐ−、および−Ｓ（Ｏ２）（ＣＭ２）ｐ-からなる群から選択することができる。Ｔ基は化学式ＮＨ、ＮＲ″″′、Ｓ、−ＳＯ２−、またはＯをもつことができる。Ｍはそれぞれ独立して、Ｈ、Ｒ″″′、−ＯＲ″″′、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩでありえるが、ただし、Ｒ″″′はそれぞれ独立して、−ＣＶ３、−ＣＶ２ＣＶ３、−ＣＶ２ＣＶ２ＣＶ３、−ＣＶ２ＣＶ（ＣＶ３）２および−Ｃ（ＣＶ３）３からなる群から選択することができ、ただし、ここで、Ｖはそれぞれ独立して、水素（Ｈ）、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）であってもよい。ｍはそれぞれ独立して、０または１であってもよい。ｎ、ｏおよびｐはそれぞれ独立して、０から１０までの整数であってもよい。いくつかの実施形態において、ｎ、ｏおよびｐはそれぞれ独立して、０から３までの整数であってもよい。
【００５３】
ＩＩ．本発明のさまざまな実施形態
ａ．方法
ｉ）アルキル化
本発明の方法は、全般には８−アザ−７−デアザアデニンを含む組成物を製造することに関し、該組成物を製造するための中間体を含む。これらの方法は、８−アザ−７−デアザアデニンを含むＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーを製造する際に有用である。該ＰＮＡオリゴマーにおいて、８−アザ−７−デアザアデニンはユニバーサル塩基として機能することができる。ユニバーサル塩基とは、８−アザ−７−デアザアデニンが、他のポリ核酸塩基鎖において、核酸塩基であるアデニン、チミン、グアニンまたはシトシンと特異的に水素結合を形成することができることを意味する。したがって、核酸塩基８−アザ−７−デアザアデニンを含むＰＮＡオリゴマーは、相補的なポリ核酸塩基鎖において、アデニン、チミン、グアニンまたはシトシンのいずれかが、この８−アザ−７−デアザアデニンの反対側にある相補的なポリ核酸塩基鎖に配列特異的にハイブリダイズすることができる。
【００５４】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリル化合物をアルキル化する方法に関する。置換型３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルとは、ピラゾール環の５位の炭素において、水素原子が置換されていることを意味する。水素原子を置換した５位の炭素の置換基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であってもよいが、ただし、この置換基は、アルキル化反応の過程で反応性をもつ１つ以上の基を含まない。Ｇｒｅｅｎ  ら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されているように、反応基の可能性があるものは、保護基により保護し、その後、必要に応じて脱保護することができる。
【００５５】
図２に関して、３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルの２つの互変異性体が存在することが知られている。これらは、ピラゾール環の番号に基づいて、Ｎ−１およびＮ−２の互変異性体として知られている。アルキル化は、２つの環窒素原子の一方で進行することがあるが、いくつかの実施形態においては、選好なしに窒素原子の両方で生じてもよい。２つの互変異性型が存在するせいで、３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルをアルキル化すると、２つの異なる生成物（すなわち、それぞれ化合物１Ａおよび１Ｂとして、図２の中で同定されているＮ−１アルキル化型またはＮ−２アルキル化型）が形成される。Ｎ−１アルキル化３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルは、８−アザ−７−デアザアデニンのＮ−８アルキル化型を調製するために使用することができる。本出願人らは、図２に示された具体的組成物（すなわち、１Ａおよび１Ｂ）は結晶化技術によって分離することができることを測定したが、クロマトグラフィーまたはその他の分離法を適用して、結晶化によっては分離できない他のアルキル化化合物の分離をもたらすことができる。適当な分離法は、有機化学分野の当業者に周知されていよう。
【００５６】
数多くのハロアセテート誘導体およびハロアセテートのさまざまなエステルが市販されている。置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルをアルキル化するのに有用なアルキル化試薬は、以下の化学式をもつハロアセテート化合物であってもよい：
【００５７】
【化２０】
2009507765.tif 000005
ただし、式中、各Ｗは、独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であってもよい。Ｒ１基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基またはヘテロアリールアルキニル基であってもよい。Ｈａｌは、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、またはヨウ素（Ｉ）であってもよい。各Ｘ１は、独立して、ＯまたはＳであってもよい。各Ｘ１はＯであってもよい。
【００５８】
置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルのアルキル化は、ハロアセテートまたはハロアセテートのエステルを使用して、塩基性条件下、極性非プロトン性有機溶媒の中で行うことができる。置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルをアルキル化するために用いられる条件は、ＰＮＡモノマーの製造に適用されるように、核酸塩基をアルキル化するために用いられる条件と実質的に同じであってもよい（米国特許第５，５３９，０８２号、第６，３５７，１６３号、第６，７１０，１６３号、第６，２６５，５５９号および第６，１３３，４４４号参照）。
【００５９】
置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルからプロトンを除去するのに十分強い非求核性塩基を用いることができる。アルキル化剤がカルボン酸（例えば、化合物Ｉ）であって、そのカルボン酸のエステル（例えば、化合物ＩＩ）でない場合には、１当量のカルボン酸につき少なくとも２当量の塩基をアルキル化反応において使用しなければならない。塩基は有機物または無機物であってもよい。そのような非求核性塩基の非限定的な例は、水素化ナトリウム、水素化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、トリエチルアミン、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどである。
【００６０】
溶媒は、置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルが少なくともやや溶けにくくなるように、溶媒を選択することができる。溶解性が高まると、より早い反応が容易になるため、３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルが、より可溶性になる可能性がある。この溶媒は非プロトン性でなければならず、そのことによって、塩基性条件下において置換型または非置換型３−アミノピラゾール４−カルボニトリルの脱プロトン化よりも溶媒の脱プロトン化が優先されるのを回避する。極性非プロトン性溶媒の非限定的な例には、Ｎ−メチル−ピロリジノン（ＮＭＰ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が含まれる。別の極性非プロトン性溶媒が当業者に知られている。適当な溶媒を、日常的な実験法または本明細書の記述を適用して、当業者が選択することができる。
【００６１】
このように、いくつかの実施形態において、本発明は、以下の化学式のハロアセテート部分によって、置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルをアルキル化することを包含する方法に関する：
【００６２】
【化２１】
2009507765.tif 000006
ただし、式中、Ｗ基、Ｈａｌ基、Ｘ１基およびＲ１基は上記で定義されている。いくつかの実施形態において、各Ｗは、独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はイソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルまたはフェニルであってもよい。
【００６３】
この方法に従えば、アルキル化反応の生成物の少なくとも１つは、以下の化学式の置換型または非置換型の複素環式化合物であり得る：
【００６４】
【化２２】
2009507765.tif 000007
ただし、式中、ＷおよびＸ１は上記で定義されている。Ｒ２は水素またはＲ１であってもよいが、ただし、Ｒ１は上記で定義されている。いくつかの実施形態において、置換型または非置換型の複素環式化合物（化合物ＩＩＩ）は、結晶化によるか、またはクロマトグラフィーによるなど、別の方法によって、この反応の別のアルキル化産物から単離することができる。
【００６５】
ハロアセテート（例えば、化合物Ｉ）を用いてアルキル化を実施する場合、生成物を塩基性塩の形態で単離するか、または生成物を酸性化して、双性イオンの形態またはアミンプロトン化カルボン酸の形態を再生させることができる。
【００６６】
ハロアセテートによってアルキル化された化合物（例えば、化合物Ｉ）では、既知のエステル化法を用いて、カルボン酸基をエステルに変換することができる。例えば、エステルを形成させるさまざまな方法が、Ｇｒｅｅｎ  ら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９の中に記載されている。
【００６７】
一般化学式ＩＩＩをもつ、いくつかの具体的な化合物を作成する方法が、下記の実施例の節および図の中に記載されている。
【００６８】
ｉｉ）核酸塩基の生成
Ｎ−１アルキル化された置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリル化合物のエステル（例えば、化合物ＩＩＩ）を、Ｎ−８アルキル化された置換型または非置換型の８−アザ−７−デアザアデニンに変換させることについて、以下の方法を考察する。ピラゾールの該エステルは、「アルキル化」という標題で上記したように調製することができる。
【００６９】
以下の化学式をもつアルキル化された置換型または非置換型の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリル化合物のエステル（チオエステルを含む）を、
【００７０】
【化２３】
2009507765.tif 000008
以下の化学式の置換型または非置換型のジアミンと反応させるか、
【００７１】
【化２４】
2009507765.tif 000009
または以下の化学式の置換型または非置換型の化合物と反応させて、
【００７２】
【化２５】
2009507765.tif 000010
Ｎ−８アルキル化された置換型または非置換型の８−アザ−７デアザアデニン化合物を生成することができる。このＮ−８アルキル化された置換型または非置換型の８−アザ−７デアザアデニン化合物を保護し、必要に応じて脱保護してから、置換型または非置換型の８−アザ−７デアザアデニン核酸塩基を含むＰＮＡオリゴマーの製造に使用することができる。上に示した３つの構造について、Ｗ基、Ｘ１基およびＲ１基は、上記で定義されている。Ｗ′基は水素または−ＮＨ２であってもよい。
【００７３】
ジアミン（すなわち、化合物ＩＶａ）について置換型または非置換型というのは、Ｗ基が水素（非置換型）または別の置換基（置換型）であることを意味する。Ｈ−Ａｃ基は、ジアミンをプロトン化することができる酸性基である。化合物ＶＩａは、１当量の酸をジアミンに加えることによって、ジアミンから生成させることができる。この酸性基は酢酸であってもよい。この酸性基はＨＣｌでもＨＢｒであってもよい。この酸性基は、アミンをプロトン化するのに適したｐＫをもつ別の酸性基であってもよい。
【００７４】
化合物ＩＶａを使用する場合、反応は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールまたはｔｅｒｔ−ブタノールなどのアルコール性溶媒の中で進行させることができる。反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など、他の極性溶媒の中で進行させることができる。
【００７５】
化合物ＩＶｂを使用する場合、反応は、いくつかの実施形態において、化合物ＩＶｂを溶媒として用いて進行させることができる。いくつかの実施形態において、極性溶媒（例えば、アルコール）を使用してもよい。
【００７６】
化合物ＩＶａまたはＩＶｂのいずれを使用するにしても、化合物ＩＩＩは、少なくとも、反応条件下において難溶性でなければならないが、選択された溶媒の中では非常に溶けやすいか、完全に可溶性であってもよい。可溶性が高いほど、反応が早く進行する。反応液を加熱して、溶媒中での化合物ＩＩＩの反応速度および溶解度を増大させてもよい。いくつかの実施形態において、反応液を選択された溶媒の中で還流させる。具体的な反応条件は、使用される出発物質に応じて、当業者が、本明細書に示された指針に従って、通常の実験を実施して決定することができる。
【００７７】
このように、いくつかの実施形態において、本発明は、以下の化学式の置換型または非置換型の複素環式化合物を
【００７８】
【化２６】
2009507765.tif 000011
以下の化学式の置換型または非置換型のジアミン：
【００７９】
【化２７】
2009507765.tif 000012
または以下の化学式の置換型または非置換型の化合物：
【００８０】
【化２８】
2009507765.tif 000013
と反応させることを包含する方法に関するが、
ただし、式中、Ｗ、Ｗ′、Ｘ１、Ｒ１およびＨ−Ａｃは上記で定義されている。いくつかの実施形態において、前記方法を還流状態で行うことも可能である。いくつかの実施形態において、溶媒は、化合物ＩＶｂ、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＤＭＦ、またはＤＭＳＯであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はイソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。いくつかの実施形態において、各Ｘ１は、Ｏである。
【００８１】
いくつかの実施形態において、この反応は、以下の化学式の置換型または非置換型の複素環式化合物を生成させる：
【００８２】
【化２９】
2009507765.tif 000014
ただし、式中、Ｗ、Ｘ１およびＲ１は上記で定義されている。
【００８３】
いくつかの実施形態において、この方法は、置換型または非置換型の複素環式化合物の環外アミンをアミン保護基で保護することをさらに含むことができる。この保護された置換型または非置換型の複素環式化合物は以下の化学式をもつことができる：
【００８４】
【化３０】
2009507765.tif 000015
ただし、式中、Ｗ基、Ｘ１基、Ｒ１基およびＰｇ１基は上記で定義されている。
【００８５】
保護基、および保護アミン基を作出する方法は、当技術分野において周知されており、この作出法の例はＧｒｅｅｎ  ら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００８６】
前記の置換型または非置換型の複素環式化合物の環外アミン基を保護するのにも適用することができる、核酸塩基の環外アミン基を保護するためのその他の既知の方法は、米国特許第６，０６３，５６９号、第６，１７２，２２６号および第６，１３３，４４４号に記載されている。本明細書に記載されているように、一般的には、環外アミンはカルボニル等価体（例えば、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ホスゲン、ジホスゲンまたはトリホスゲン）と反応させることができ、次に、イミダゾリドまたはイソシアネートを、アルコール（例えば、置換型または非置換型の９−フルオレンメタノール、ジフェニルメタノール（ベンズヒドロール）、ベンジルアルコール、ｔｅｒｔ−ブタノール、または３−ヒドロキシプロピオニトリル）と反応させて、カルバメートとして保護されたアミンを生成することができる。
【００８７】
例えば、アミノ保護基は、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃであってもよく、ただし、このＦｍｏｃ保護基、Ｂｈｏｃ保護基、Ｚ保護基、ｔ−ｂｏｃ保護基、またはＣｙｏｃ保護基は置換型でも非置換型でもよい。したがって、本明細書において、Ｆｍｏｃ保護基、Ｂｈｏｃ保護基、Ｚ保護基、ｔ−ｂｏｃ保護基またはＣｙｏｃ保護基は以下の一般式をもち得る：
【００８８】
【化３１】
2009507765.tif 000016
ただし、式中、Ａ′はそれぞれ独立して、水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、メチル、エチル、メトキシ、またはエトキシである。Ｂ′はそれぞれ独立して、水素、メチル、またはエチルである。Ｄ′はそれぞれ独立して、メチル、トリフルオロメチル、またはエチルである。Ｅ′はそれぞれ独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである。Ｈは水素であり、Ｇ′は電子求引基である。例えば、Ｇ′は−ＣＮまたは−ＮＯ２であってもよい。図示したように、括弧「｝」は、保護基が、核酸塩基の環外アミン（例えば、化合物ＶＩのＰｇ１）に結合する箇所を示している。
【００８９】
環外アミンが保護されると否とにかかわらず、エステルは、保護型または非保護型の核酸塩基をＰＮＡシントンまたはＰＮＡオリゴマーに結合させるために用いることができるカルボン酸基に変換することができる。エステルをカルボン酸基に変えることは、エステルと、核酸塩基上の任意の保護基との性質に応じて、塩基性条件下または酸性条件下で行うことができる。エステルは保護基と考えることができるため、あるエステルをカルボン酸基に塩基性下または酸性下で変換する方法を、Ｇｒｅｅｎ  ら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に見出すことができる。
【００９０】
このように、いくつかの実施形態において、この方法は、非保護型化合物（Ｖ）のエステルをカルボン酸基またはチオカルボン酸基に変換し、それによって、以下の化学式をもつ保護されていない置換型または非置換型の複素環式化合物を生成させることをさらに含むことができる。
【００９１】
【化３２】
2009507765.tif 000017
ただし、式中、ＷおよびＸ１は上記で定義されている。この保護されていない置換型または非置換型の複素環式化合物（ＶＩＩ）は、８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含む。８−アザ−７−デアザアデニンの環外アミンは、アミン保護基によって保護することができ、部分的に保護された複素環を用いて、ＰＮＡオリゴマーの合成に用いることができるＰＮＡシントン（モノマー）を生成させることができる。部分的に保護された複素環を、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分がＰＮＡオリゴマーのＰＮＡサブユニットまたはＰＮＡ／ＤＮＡキメラのＰＮＡサブユニットであるＰＮＡオリゴマーの骨格に直接結合させることができる（実施例１１を参照）。
【００９２】
さらに、いくつかの実施形態において、この方法は、保護された置換型または非置換型の複素環式化合物（ＶＩ）のエステルをカルボン酸基またはチオカルボン酸基に変換し、それによって、以下の化学式をもつ部分的に保護された置換型または非置換型の複素環式化合物を生成させることをさらに含むことができる。
【００９３】
【化３３】
2009507765.tif 000018
ただし、式中、Ｗ、Ｐｇ１およびＸ１は上記で定義されている。いくつかの実施形態において、Ｐｇ１は、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃである。これらの部分的に保護された複素環式化合物は、８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含み、ＰＮＡオリゴマーを合成する際に使用することができるＰＮＡシントン（モノマー）を製造するのに適している。部分的に保護された複素環式化合物を、ＰＮＡオリゴマーの骨格に直接結合させることも可能である（実施例１１を参照）。
【００９４】
一般化学式Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、またはＶＩＩＩをもつ具体的な化合物を生成させる方法が、以下の実施例の節および図の中に記載されている。
【００９５】
ｉｉｉ）ＰＮＡシントンの製造
ＰＮＡシントン（ＰＮＡモノマーと呼ばれることもある）は、ＰＮＡオリゴマーを組み立てるために用いられる基本的な構成単位である。ＰＮＡオリゴマーを組み立てる方法、組成物、および機器類は市販されている。
【００９６】
８−アザー７−デアザアデニン核酸塩基を含む、上記した部分的に保護された置換型または非置換型の複素環式化合物（例えば、化合物ＶＩＩＩ）のさまざまなものを、ユニバーサル塩基として１つ以上の８−アザ−７−デアザアデニンを含むＰＮＡオリゴマーを組み立てるのに適したユニークなＰＮＡモノマーを製造するために使用することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、上記の部分的に保護された置換型または非置換型の複素環式化合物（すなわち、化合物ＶＩＩＩ）のカルボン酸基またはチオカルボン酸基を活性化させてから、そのカルボニル基またはチオカルボニル基を、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分の二級窒素と反応させることができる。このようにして、核酸塩基を含む部分を、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン骨格部分に結合させることができる。アミン基と反応させるためにカルボン酸基およびチオカルボン酸基を活性化する方法は周知されており、ペプチド合成の分野においてもしばしば実施されている。
【００９８】
例えば、カルボン酸基またはチオカルボン酸基のカルボニル炭素またはチオカルボニル炭素を、混合無水物を形成することによって、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンの骨格部分の二級アミン基（または別の求核基）と反応させるために活性化させることができる（例えば、米国特許第６，１３３，４４４号、第６，１７２，２２６号、第６，２６５，５５９号および第６，４５１，９６８号、ならびに実施例７および１０参照）。カルボニル炭素またはチオカルボニル炭素も、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）と組み合わせて、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ｔｉｒｓ−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＢＯＰ）などの既知のペプチド結合試薬と反応させるために、またはＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）または２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＡＴＵ）と直接反応させることによって、活性化させることができる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、前記した部分的に保護された置換型または非置換型の複素環式化合物（例えば、化合物ＶＩＩＩ）のカルボン酸基またはチオカルボン酸基は、活性エステルに変換することができる。活性エステルはペプチド合成において知られており、ペプチド合成で一般に用いられる条件下で容易にアミノ酸のアミンと反応する一定のエステルを意味する（活性エステルについて検討するには、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｏｇｅｒ  Ｅｐｔｏｎ，ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，１９９０を参照されたい）。活性エステルの一般に用いられる形態はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。活性エステルを、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分の二級窒素（すなわち、Ｎ−グリシル窒素）と反応させることができる。このようにして、核酸塩基を含む部分をＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格部分と結合させることができる。
【０１００】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、式：
【０１０１】
【化３４】
2009507765.tif 000019
の置換型または非置換型の複素環式化合物のカルボン酸基、チオカルボン酸基、または活性エステル基（チオール化活性エステルを含む）のカルボニル炭素またはチオカルボニル炭素を、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分の二級窒素と反応させることを包含する方法に関するが、ただし、上記式中、Ｗ基、Ｐｇ１基、およびＸ１基は上記で定義されている。Ｒ２基は−ＯＨ、−ＳＨ、または活性エステル脱離基であってもよい。例えば、この活性エステル脱離基は以下のものであってもよい：
【０１０２】
【化３５】
2009507765.tif 000020
ただし、式中、Ｘ１はＯまたはＳである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分は以下の化学式を有することが可能である：
【０１０４】
【化３６】
2009507765.tif 000021
ただし、式中、Ｐｇ２はアミン保護基であり、Ｙ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、またはヘテロアリールアルキル基であってもよい。置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分は、Ｙ１および／またはＹ２として同定された基における水素の置換を意味する。Ｙ１基はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基またはヘテロアリールアルキル基であってもよい。Ｙ２基は水素、または保護されているか保護されていないアミノ酸側鎖であってもよい。Ｒ３基は−ＯＨ、−ＳＨ、ＳＲ１、または−ＯＲ１であってもよいが、ただし、Ｒ１は上記で定義された通りである。例えば、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。
【０１０５】
Ｐｇ２は、Ｐｇ１とは異なるアミン保護基であってもよい。Ｐｇ２は、Ｐｇ１とは独立して、Ｆｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃであってもよい。トリチル基も、ＰＮＡオリゴマー合成で用いられるＰＮＡモノマーの骨格の一級アミンを保護するためにも用いられているため（Ｖｉｎａｙａｎｋ  ら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６（７−９）：１６５３−１６５６（１９９７）参照）、Ｐｇ２は以下の化学式の置換型または非置換型のトリチル基であってもよい：
【０１０６】
【化３７】
2009507765.tif 000022
ただし、式中、Ａ′は上記で定義されている。括弧「｝」は結合点を示す。
【０１０７】
置換型または非置換型の複素環式化合物（例えば、化合物ＶＩＩＩ）のカルボニル炭素またはチオカルボニル炭素を、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分の二級窒素と反応させると、部分的に保護された置換型または非置換型の核酸塩基部分を、置換型または非置換型のＮ−（２−アミノエチル）グリシン部分の性質に応じて、ＰＮＡモノマー、ＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡ／ＤＮＡキメラの骨格部分に結合する。
【０１０８】
部分的に保護されたアルキル化核酸塩基が部分的に保護された骨格サブユニットと結合している、ＰＮＡシントンを製造する一般的な手順が知られている（米国特許第５，５３９，０８２号、第６，０６３，５６９号、第６，１７２，２２６号、および第６，１３３，４４４号参照）。さまざまな溶媒および条件を使用して、この方法によってＰＮＡモノマーが製造されてきた。以下の実施例の節に示されているように（例えば、実施例７および１０）、適当な一部保護された核酸塩基（例えば、化合物ＩＸ）が利用可能ならば、本明細書の開示内容と組み合わせて日常的な実験を行うことによって、８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含むＰＮＡシントンの製造に、これらの条件を適用することができる。
【０１０９】
その結果、いくつかの実施形態において、この方法を実施して製造されたＰＮＡシントンは以下の一般化学式をもつことができる：
【０１１０】
【化３８】
2009507765.tif 000023
ただし、式中、Ｙ１、Ｙ２、Ｗ、Ｒ３、Ｐｇ１およびＰｇ２は上記で定義されている。各Ｘ１は、独立して、ＯまたはＳである。
【０１１１】
一般化学式ＸＩを有する特定のＰＮＡモノマーを製造する方法は、以下の実施例の節、および図の中に記載されている。
【０１１２】
ｉｖ）組み合わせ
いくつかの実施形態において、本発明は、上記の方法を２つ以上組み合わせて実施することに関する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、上記した「アルキル化」法の一部または全部の態様を、上記した「核酸塩基の生成」法の一部または全部の態様と組み合わせて実施することに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、上記した「核酸塩基の生成」法の一部または全部の態様を、上記した「ＰＮＡシントンの製造」法の一部または全部の態様と組み合わせて実施することに関する。さまざまな実施形態において、本発明は、上記した「アルキル化」法の一部または全部の態様を、上記した「核酸塩基の生成」法の一部または全部の態様と組み合わせ、さらに、上記した「ＰＮＡシントンの製造」法の一部または全部の態様と組み合わせて実施することにも関する。
【０１１３】
ｂ．組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、８−アザ−７−デアザアデニンを含む一定の組成物に関し、該組成物を製造するための中間体などを含む。
【０１１４】
すなわち、いくつかの実施形態において、本発明は、以下の化学式の置換型または非置換型の複素環式化合物に関する：
【０１１５】
【化３９】
2009507765.tif 000024
ただし、式中、Ｗ、Ｒ１およびＸ１基は上記で定義されているが、ただし、Ｒ１はエチルではない。例えば、Ｒ１は、メチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はイソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。いくつかの実施形態において、各Ｘ１は、Ｏであってもよい。前記した置換型または非置換型の複素環式化合物は、「アルキル化」という副標題の下、本明細書で上述されている３−アミノピラゾール−４−カルボニトリルのアルキル化によって製造することができる。
【０１１６】
さまざまな実施形態において、本発明は、以下の化学式の置換型または非置換型の複素環式化合物にも関する：
【０１１７】
【化４０】
2009507765.tif 000025
ただし、式中、Ｗ基、Ｘ１基およびＲ３基は上記で定義されている。Ｐｇ３基は水素基またはアミン保護基であってもよい。例えば、アミン保護基はＦｍｏｃ、Ｂｈｏｃ、Ｚ、ｔ−ｂｏｃ、またはＣｙｏｃであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ３は−ＳＲ１または−ＯＲ１であってもよい（ただし、Ｒ１は上記で定義されている）。例えば、Ｒ１はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、アリル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はイソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、またはフェニルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＯであってもよい。
【０１１８】
前記の置換型または非置換型の複素環式化合物は、アルキル化３−アミノピラゾール−４−カルボニトリル（すなわち、化合物ＩＩＩａ）を、「核酸塩基の生成」という副標題下で既述されているジアミン（すなわち、化合物ＩＶａ）、または化学式ＩＶｂをもつ化合物と反応させて製造することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、この置換型または非置換型の複素環式化合物は、以下の化学式をもち得る：
【０１２０】
【化４１】
2009507765.tif 000026
【０１２１】
【化４２】
2009507765.tif 000027
ただし、この化合物は任意で置換されている。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の化学式をもつＰＮＡシントンにも関する：
【０１２３】
【化４３】
2009507765.tif 000028
ただし、式中、Ｙ１、Ｙ２、Ｗ、Ｒ３、Ｐｇ１およびＰｇ２は上記で定義されている。各Ｘ１は、独立して、ＯまたはＳである。該ＰＮＡシントンは、「ＰＮＡシントンの製造」という副標題下で既述されているようにして製造することができる。目的とするＰＮＡシントンの非限定的な例は、図７Ａおよび７Ｂに記載されている。
【実施例】
【０１２４】
６．実施例
本教示の態様は、以下の実施例に照らせば、さらに理解することができるが、これらの実施例は、如何なる意味においても、本教示の範囲を制限するものと解してはならない。
【０１２５】
実施例１：３−アミノ−４−シアノ−ピラゾロ−Ｎ１−酢酸ｔ−ブチル（１Ａ）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１５０ｍＬ）中の３−アミノピラゾール−４−カルボニトリル溶液（２５．００ｇ、０．２３モル、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  ７０８６）に、炭酸カリウム（４８．３９ｇ、０．３５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  ３４７８２）を加えた。この反応混合液を３０分間室温で攪拌してから、ブロモ−第三級ブチルアセテート（４１．４ｍＬ、モル、Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  １２４２３０）をゆっくり加えた。この反応混合液を、さらに２時間室温で攪拌した。次に、反応混合物を濾過してから蒸発乾固した。この粗混合物をジクロロメタン（１．５Ｌ）に溶解し、有機層を水（１．０Ｌ）、次いで５％ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機層を、硫酸ナトリウムで分離乾燥させ、蒸発させた。この粗混合物をジクロロメタンによって結晶化させて、３−アミノ−４−シアノ−ピラゾール−Ｎ２−酢酸ｔ−ブチル（１Ｂ）が得られたが、母液からは、３−アミノ−４−シアノピラゾール−Ｎ１−酢酸ｔ−ブチル（１Ａ）が得られた。化合物１Ａの収量は２０．６５ｇ（４１％）であった。
化合物１Ａの１Ｈ−ＮＭＲ
【０１２６】
【化４４】
2009507765.tif 000029
実施例２：６−アミノ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−酢酸ｔ−ブチル（２）の合成
３−アミノ−４−シアノピラゾール−Ｎ１−酢酸ｔ−ブチル（１Ａ）（３．０ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）を無水エタノール（１５０ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に溶解してから、酢酸ホルムアミジン（４．０ｇ、２０．１８ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  １５８０３）を加えた。この反応混合液を１４時間加熱して還流し、濾過してから蒸発乾固した。残留物をフラッシュシリカゲルカラムによって精製した。生成物を、ジクロロメタン中２〜６％のメタノールで溶出した。適当な画分を集め、蒸発させた。収量は１．５３ｇ（７５％）であった。
【０１２７】
【化４５】
2009507765.tif 000030
実施例３：Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン−Ｎ８−イル−酢酸ｔ−ブチル（３）の合成
６−アミノ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル−酢酸ｔＢｕ（２）（８．５２ｇ、３２．０２ｍｍｏｌ）を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、８５ｍＬ）に懸濁し、混合液をアルゴン下で攪拌した。この混合液に、１，１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、７．８ｇ、４８．４ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  １１５５３３）を加え、反応混合液を９５〜１０３℃の温度で攪拌した。２時間後、温度を７５℃に低下させ、ベンジルアルコール（５．０ｍＬ、４４．４５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  ３０５１９７）を加えてから、オイルバスを取り除いた。この混合液を一晩室温で攪拌してから、蒸発乾固した。粗残留物を酢酸エチル（１．２Ｌ）に溶解し、水（１．５Ｌ）、および５％（ｗｔ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で分離、乾燥させ、濾過してから乾燥させた。生成物を、ジクロロメタンとアセトニトリルの混合液（９：１ｖ／ｖ）から晶出させた。収量は８．２５ｇ（６３％）であった。
【０１２８】
【化４６】
2009507765.tif 000031
実施例４：Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−酢酸（４）の合成
Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル−酢酸ｔＢｕ（３）（２．６５ｇ、１０．６３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（６５ｍＬ）に溶解し、トリエチルシラン（１３．７３ｇ、１１８ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  ２３０１９７）で処理した。反応混合液を氷浴で０℃まで冷却してから、１５分間にわたってトリフルオ酢酸（３０ｍＬ）を加えた。反応混合液を０℃で１０分間攪拌し、温度をゆっくりと２５℃に上げ、８時間攪拌した。この反応混合液を蒸発乾固し、残留物をジクロロメタン（３×３０ｍＬ）と一緒に蒸発させた。生成物を、ジクロロメタンとエーテルの混合物（９：１ｖ／ｖ）から晶出させた。収量は１．９８ｇ（９７％）であった。
【０１２９】
【化４７】
2009507765.tif 000032
実施例５：Ｎ′−（［６−［Ｎ−ベンジルオキシカルボニル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−アセチル−Ｎ″−（２−［ｔ−ブチルオキシカルボニル］−２−アミノエチル）グリシンエチルエステル（５）の合成
Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−酢酸（４）（３．６０ｇ、１０．９９ｍｍｏｌ）に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、４５．０ｍＬ）を加え、アルゴン下で混合液を攪拌した。この混合液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）中のＮ１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ４−（２−アミノエチル）−グリシンエチルエステル（２．７１ｇ、１０．９８ｍｍｏｌ）溶液を加えた。この反応混合液に、ＢＯＰ（１２．１６ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｐ／Ｎ  Ａ３１８４ａ）、ＨＯＢＴ（３．７２ｇ、２７．４７ｍｍｏｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｐ／Ｎ  ０１−６２−００８）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．５ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｐ／Ｎ  ３８７６４９）を加えた。この反応混合液を室温で８時間攪拌してから蒸発させた。残留物をジクロロメタン（６００ｍＬ）に溶解させ、重炭酸ナトリウム溶液（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、蒸発させ、トルエン（３×２５ｍＬ）と同時蒸発させた。生成物をフラッシュシリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン中約５〜１２％（ｖ／ｖ）の酢酸エチルで溶出させた。収量は４．６５ｇ（７６％）であった。
【０１３０】
【化４８】
2009507765.tif 000033
実施例６：Ｎ′−（［６−［Ｎ−ベンジルオキシカルボニル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−アセチル）−Ｎ″−（２−［ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル］−２−アミノエチル）−グリシン（６）の合成
Ｎ′−（［６［Ｎ−ベンジルオキシカルボニル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−アセチル）−Ｎ″−（２−［ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル］−２−アミノエチル）−グリシンエチルエステル（６）（２．０ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（３０ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）の混合液に溶解し、この反応混合液を氷浴で０℃に冷却した。この混合液に、水酸化リチウムの２Ｍ溶液（１０ｍＬ）を加え、反応混合液を０℃で攪拌した。２０分後、２Ｎ塩酸溶液（１０ｍＬ）を加えた。最終ｐＨは３以下であった。溶媒を真空中で完全に蒸発させ、トルエン（２×２５ｍＬ）と同時に蒸発させてから、アセトニトリル（２×２５ｍＬ）と同時蒸発させた。生成物を水から晶出させた。冷水（１０ｍＬ）を残留物に加え、固形物を濾過よって集めた。収量は１．９２ｇ（９５％）であった。
【０１３１】
【化４９】
2009507765.tif 000034
実施例７：Ｎ−［Ｎ″−フルオレニルメチルオキシカルボニル−（２″−アミノエチル）］−Ｎ−［２−Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−アセチル］グリシン（７）の合成
２０ｍＬのアセトニトリル中０．５ｇ（１．５３ｍｍｏｌ）のＮ６−ベンジルオキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−酢酸（４）に、３００μＬ（３．１３ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリンの一部を室温にて加え、得られた混合液を室温で１０分間攪拌した。この混合液を０℃に冷却して、アルゴン下で塩化ピバロイル（２１０μＬ、１．６８ｍｍｏｌ）を一滴ずつ加えた。反応混合液を室温で２０分間攪拌した。別のフラスコの中で、０．５ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）の細かく破砕したＮ−［Ｎ′−フルオレニルメチルオキシカルボニル−（２′−アミノエチル）］グリシンを、２０ｍＬのアセトニトリル／水（１：１）の混合液に懸濁した。炭酸ナトリウム（１００ｍｇ）を加え、得られた混合液を１０分間攪拌した。次に、これら２つの溶液を混合し、得られた混合液を室温で３０分間攪拌した。溶媒を蒸発させて取り除き、残留物をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解して、塩化ナトリウム溶液（３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で蒸発乾固した。１０〜１５％のメタノール−ジクロロメタンを溶出剤として用いて、粗生成物をフラッシュシリカゲルカラムで精製した。
【０１３２】
【化５０】
2009507765.tif 000035
実施例８：Ｎ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酢酸ｔ−ブチル（８）の合成
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）中の６−アミンピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンーＮ８−酢酸ｔ−ブチル（２）（５．０ｇ、２０．０５ｍｍｏｌ）に、１，１−カルボニルジイミダゾール（５．０ｇ、３０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合液を、アルゴン下でゆっくりと１０３℃に加熱してから、２時間この温度を維持した。オイルバスの温度を７５℃に低下させてから、反応混合液にベンズヒドロール（６．２５ｇ、３３．９２ｍｍｏｌ）を加えた。熱をすべて取り除き、この反応液を室温で一晩攪拌した。この反応混合液を真空中で蒸発させ、この粗混合物をジクロロメタン（１Ｌ）に溶解させて５％塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で分離、乾燥させ、濾過してから蒸発乾固した。生成物をフラッシュシリカゲルカラムによって精製した。ジクロロメタン中６〜１０［％ｖ／ｖ］の酢酸エチルを用いて、生成物を溶出させた。適当な画分を集めて蒸発させた。収量は６．８９ｇ（７４．７％）であった。
【０１３３】
【化５１】
2009507765.tif 000036
実施例９：Ｎ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酢酸（９）の合成
２．００ｇ（４．３５ｍｍｏｌ）のＮ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酢酸ｔ−ブチル（８）に、エタノール（６０ｍＬ）およびアセトニトリルを加えた。反応混合液を氷浴で５℃以下に冷却した。この反応混合液に、２０ｍＬの水に溶解した１．９３ｇの水酸化リチウムを加え、温度を２５℃に上げた。反応混合液を１５分間攪拌し、０℃に冷却してから、クエン酸の２Ｍ水溶液（ｐＨ３以下）を加えた。この反応混合液を蒸発乾固し、冷水で残留物を粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）した。生成物をメタノールから晶出させた。収量は１．６５（８２．６２％）であった。
【０１３４】
【化５２】
2009507765.tif 000037
実施例１０：Ｎ−［Ｎ″−フルオレニルメチルオキシカルボニル−（２″−アミノエチル）］−Ｎ−［２−Ｎ６−ベンズヒドロキシカルボニル−Ｎ８−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）］アセチル］グリシンまたはＮ−［Ｎ″−Ｆｍｏｃ−（２″−アミノエチル）］−Ｎ−［２−［Ｎ６−Ｂｈｏｃ−（ピラゾロ［３，４−ｄ］ピラミジン−Ｎ８−イル）］アセチルグリシン（１０）の合成
１０ｍＬの乾燥アセトニトリル中１．０ｇ（２．４７ｍｍｏｌ）のＮ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酢酸（９）に、５６０μＬのＮ−メチルモルホリンを加えた。この反応混合液を室温で１０分間攪拌した。次に、この反応混合液を０℃に冷却して、塩化ピバロイル（３１０μＬ、２．５９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で３０分間加えた。別のフラスコの中で、０．８７ｇ（２．４５ｍｍｏｌ）のＮ−［Ｎ′−フルオレニルメチルオキシカルボニル−（２′−アミノエチル）］グリシンを、アセトニトリル（１０ｍＬ）、水（５ｍＬ）、炭酸ナトリウム（０．７６ｇ）、および炭酸カリウム（０．６５ｇ）の混合液に懸濁した。この懸濁液を、透明な溶液が得られるまで攪拌した。次に、Ｎ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酸のビバロイル活性化エステルの反応混合液を、Ｎ−［Ｎ′−フルオレニルメチルオキシカルボニル−（２′−アミノエチル）］グリシンの溶液に加え、反応液を室温で３０分間攪拌した。この反応混合液を蒸発乾固し、トルエン（２×２０ｍＬ）と同時蒸発させ、フラッシュシリカゲルカラムで精製した。このカラムを、ジクロロメタン中１０〜１５％メタノールで溶出した。収量は２８０ｍｇ（１０％）であった。
【０１３５】
実施例１１：Ｎ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酢酸（９）のＰＮＡオリゴマーへの固相結合
図８Ａでは、Ｎ−［ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル］−［Ｎ′−フレオニルメチルオキシカルボニル−（２′−アミノエチル）］グリシン（２０）を、図示された塩基配列（２１）をもつ支持体結合型ＰＮＡオリゴマー（２１）と結合させて、それにより完全に保護された支持体結合型ＰＮＡオリゴマー（２２）を形成させた。図８Ｂでは、次に、完全に保護された支持体結合型ＰＮＡオリゴマー（２２）のＦｍｏｃ基を取り除いて、部分的に脱保護された支持体結合型ＰＮＡオリゴマー（２３）を形成させた。次いで、Ｎ６−ベンズヒドロキシカルボニル−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−Ｎ８−イル酢酸（９）を、支持体結合型ＰＮＡオリゴマー（２３）の末端ＰＮＡ骨格部分の二級窒素（Ｎ−グリシル窒素）によって縮合し、それにより、完全に保護された、細長い支持体結合型ＰＮＡオリゴマー（２４）を形成させた。次に、通常の方法を用いて、このＰＮＡオリゴマーを支持体から切断し、脱保護および精製して、ユニバーサル塩基用のＵとして図示されているＮ８−８−アザ−７デアザアデニン核酸塩基を含む、完全に脱保護されたＰＮＡオリゴマー（２５）を生成させた。
【０１３６】
新規の部分的に保護されたＮ８−８−アザ−７デアザアデニン核酸塩基を用いる場合を除いて、本ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｓｅｉｔｚ  ら，Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｇ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐｓ  ｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｎ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１），７（１８），  ３９１１−３９２５またはＳｅｉｔｚ  ら，Ａ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｎｏｖｅｌ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＮＡ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９９），３８（１５），２２０３−２２０６に記載されている通りに実質的に進められた。
【０１３７】
本開示は、さまざまな実施形態とともに説明されているが、本開示を、それらの実施形態に限定しようとするものではない。それどころか、本開示は、当業者が認識できるような、改変、変更および等価物も包含する。
【０１３８】
（７．参考文献）
【０１３９】
【化５３】
2009507765.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
当業者には、以下に説明する図面が例示のためだけのものであることを理解できる。う。これらの図面は、どのような意味においても、本開示の範囲を制限しようとするものではない。
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、核酸、ＰＮＡオリゴマー、およびＰＮＡ／ＤＮＡキメラの中に取り込ませることができる核酸塩基をいくつか図示したものである。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、核酸、ＰＮＡオリゴマー、およびＰＮＡ／ＤＮＡキメラの中に取り込ませることができる核酸塩基をいくつか図示したものである。
【図２】図２は、Ｚ保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン化合物の合成経路を図示したものである。
【図３】図３は、Ｚ保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニンを含むｔ−ｂｏｃＰＮＡモノマーの合成経路を図示したものである。
【図４】図４は、保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含むＦｍｏｃ／Ｚ  ＰＮＡモノマーの合成経路を図示する。
【図５】図５は、Ｂｈｏｃ保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基の合成経路を図示したものである。
【図６】図６は、保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含むＦｍｏｃ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーの合成経路を図示する。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含む、さまざまなＰＮＡシントンを図示する。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、保護Ｎ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基を含む、さまざまなＰＮＡシントンを図示する。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、部分的に保護されたＮ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基が、支持体に結合したＰＮＡオリゴマーの骨格に直接結合することを図示している。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、部分的に保護されたＮ８アルキル化８−アザ−７−デアザアデニン核酸塩基が、支持体に結合したＰＮＡオリゴマーの骨格に直接結合することを図示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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