(57)【要約】  対象における環境毒素、特にアフラトキシンの影響を軽減するための予防療法として使用するための組成物および方法。該対象は、肝細胞癌およびアフラトキシン中毒症の危険にさらされている可能性がある。該組成物は、粉末形態の有効量の単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土を含有し、該単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含み、かつ胃腸管内でアフラトキシンを選択的に結合する能力を有する。
2009542656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓癌およびアフラトキシン中毒症の危険にさらされている系におけるアフラトキシンの影響を軽減するための予防療法として使用するための経口組成物であって、粉末形態の有効量の単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土（ここで、該単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を実質的に含有せず、かつ該アフラトキシンを結合する能力を有する）を含有する経口組成物。
【請求項２】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、約３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有し、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、約８０ミクロンである平均粒子径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
アフラトキシンが、ＣＡＳに選択的に収着される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
系における環境毒素の影響を軽減するための予防療法として使用するための経口組成物であって、粉末形態の有効量の単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土（ここで、該単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を実質的に含有せず、かつ該環境毒素を結合する能力を有する）を含有する経口組成物。
【請求項７】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、約３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有し、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、約８０ミクロンである平均粒子径を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
環境毒素が、ＣＡＳに選択的に収着される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
系における環境毒素の影響を軽減する方法であって、
（ａ）粉末形態の有効量の単離されたアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該単離されたＣＡＳは、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含有し、かつ該環境毒素を選択的に結合する能力を有する）を経口で投与すること、
（ｂ）ある時間待つこと、および
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を該環境毒素の影響が軽減されるまで繰り返すこと
を含む方法。
【請求項１２】
３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有する加工処理されたＣＡＳを選択することをさらに含み、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
約８０ミクロンである平均粒子径を有する単離されたＣＡＳを選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
約５〜約９の範囲のｐＨを有する単離されたＣＡＳを選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
癌になりやすい者であるような系を選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
約２４時間未満であるようなある時間を選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
環境アフラトキシンに曝露される、および肝臓癌およびアフラトキシン中毒症の危険にさらされる系におけるアフラトキシン曝露の危険を軽減する方法であって、
（ａ）粉末形態の有効量の単離されたアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該単離されたＣＡＳは、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含有し、かつ該アフラトキシンを選択的に結合する能力を有する）を経口で投与すること、
（ｂ）ある時間待つこと、および
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を、該系がアフラトキシン曝露の危険から解放されるまで繰り返すこと
を含む方法。
【請求項１８】
３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有する加工処理されたＣＡＳを選択することをさらに含み、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
約８０ミクロンである平均粒子径を有する単離されたＣＡＳを選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
約５〜約９の範囲のｐＨを有する単離されたＣＡＳを選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
肝臓癌およびアフラトキシン中毒症になりやすい者であるような系を選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
約２４時間未満であるようなある時間を選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
高濃度のアフラトキシンに、または長期間にわたって低濃度のアフラトキシンに曝露された対象を治療する方法であって、
（ａ）粉末形態の有効量の単離されたアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該単離されたＣＡＳは、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含有し、かつ該アフラトキシンを選択的に結合する能力を有する）を経口で投与すること、
（ｂ）ある時間待つこと、および
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を、該対象のアフラトキシンへの曝露の影響が、低減または排除されるまで繰り返すこと
を含む方法。
【請求項２４】
３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有する加工処理されたＣＡＳを選択することをさらに含み、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
約８０ミクロンである平均粒子径を有する単離されたＣＡＳを選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
約５〜約９の範囲のｐＨを有する単離されたＣＡＳを選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
肝臓癌およびアフラトキシン中毒症になりやすい者であるような系を選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
約２４時間未満であるようなある時間を選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００６年６月２７日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｅｒｏｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  Ａｃｕｔｅ  Ａｆｌａｔｏｘｉｃｏｓｉｓ」と題する米国特許仮出願第６０／８１６８２４号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府後援の研究の下でなされた発明に対する権利の記述）
本発明の展開には、ＮＩＨ、ＵＳＤＡおよびＵＳＡＩＤからの連邦政府交付金または基金を使用した（ＮＩＨ  Ｐ４２−ＥＳ０４９１７、ＵＳＤＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｒａｎｔ  ９７００５７９、ＵＳＡＩＤ  ＬＡＧ−Ｇ−００−９６−９００１３−００、ＴＡＥＳ  Ｈ６２１５、およびＮＩＨ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｇｒａｎｔ  ＥＳ０９１０６）。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、広くは、系中での毒素、特にアフラトキシンのバイオアベイラビリティーおよび毒性／発癌性を、胃腸管内でこれらの作用物質を封鎖すること（すなわち、腸内収着）によって低下させるための粘土をベースにした収着剤組成物および方法に関する。より具体的には、アフラトキシン中毒症および肝臓癌の危険にさらされているヒト集団における、アフラトキシンの有害な影響（急性および慢性の双方）を軽減するための腸内収着剤療法として使用するための経口組成物が説明される。この高められた危険は、食餌中での頻繁かつ高濃度のアフラトキシン曝露のためである。該組成物は、粉末形態の有効量の加工処理されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土を含有する。この加工処理されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ＥＰＡ、ＪＥＣＦＡおよびＷＨＯの勧告に基づくヒトの１日当たり耐容摂取量未満のテトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）および重要毒性金属汚染物質を保有する。該組成物および方法は、経口治療の一部として使用される。さらに、本発明の粘土は、治療される系または媒体が食餌中に天然に見出される重要なビタミン類およびその他の微量栄養素を利用することを妨害しない。加工処理された本発明の粘土は、胃腸管内でアフラトキシンを高親和性および高吸収力をもって選択的に結合し、曝露の顕著な低下（アフラトキシンに特異的なバイオマーカーに基づく）をもたらす。汚染された食餌に由来するアフラトキシンへの曝露を低下させると、これらの毒物に由来する疾患および死亡の危険が低下する可能性がある。
【０００４】
（アフラトキシン）
序論。動物およびヒトでの消費に向けた食物の品質および安全性に関する懸念は、アフラトキシンとして知られる化学物質に付随する重大な危険に関する増大する認識を呼び起こしてきた。歴史的文脈において、食物におけるアフラトキシンの問題は、長年にわたり、避け難く、かつ一見解決不能なようである。アフラトキシン（Ａｆ）は、カビ増殖の有害副産物であり、ヒトおよび動物にとって潜在的に致命的である。重要なことであるが、アフラトキシンは、熱に安定であり、各種の食物加工処理過程で生き残り、ほとんどの食物（特に、トウモロコシおよびピーナツに由来する食物）の汚染物質として現われる。天然に存在する４種のアフラトキシン（図１）の中で最も毒性のあるアフラトキシンＢ１（ＡｆＢ１）は、直接作用性突然変異誘発物質であり、発癌および腫瘍抑制に関わる遺伝子を攪乱させることが示されている。それは、インビボでＤＮＡと反応して、主要なアフラトキシン−ＤＮＡ付加物としてｔｒａｎｓ−８，９−ジヒドロ−８−（Ｎ７−クアニル）−９−ヒドロキシ−アフラトキシンＢ１を与える。Ｂ型肝炎ウイルス感染に加えて、それは、肝細胞癌（ＨＣＣ）の病因の１因子と指摘されている。アフラトキシンＢ１は、また、免疫毒性があり、かつ栄養分吸収抑制性があることが示されている。米国において、ヒトでの消費に向けた食物中のＡｆに関する作用濃度は、２０ｐｐｂに設定されている。ケニアでの最近のアフラトキシン中毒の大発生は、８０００ｐｐｂもの高い濃度のアフラトキシンを含む食物の消費と関連しており、アフラトキシン中毒症の高い危険にさらされている集団における急性アフラトキシン中毒症を軽減する治療計画に対する緊急の必要性を示している。
【０００５】
発生。物の涸渇が、真菌感染およびアフラトキシン産生増大の一般的原因である。このことは、ヒトおよび動物の食餌中のアフラトキシンが十分に管理されていない発展途上国（赤道から南北４０°）で特に真実である。該問題は、アフラトキシンで汚染された食物をおそらく最も消費し、疾患および急性死亡を含むその結果に苦しみそうな最貧の人々に影響を与える。したがって、ヒトおよび動物におけるアフラトキシン中毒症を軽減するための食餌介入および療法は、高い優先事項であり、アフラトキシンの腸内収着剤としての食餌性モンモリロナイト系粘土の使用は、該問題に対する実際的かつ費用効果の高い取り組みを提供できる。
【０００６】
アフラトキシンの代謝を調節する化学予防戦略。アフラトキシンで汚染された食物の消費を回避することは、系、媒体または対象における急性または慢性アフラトキシン中毒症の危険を有意に低下させるが、発展途上国において、食餌の変更は、通常、実行不能である。この問題に対する１つの取り組みは、高リスク集団における化学予防の戦略である。この戦略は、発癌過程を遮断、遅延、逆転または調節するための天然または合成薬剤の使用を含む。多くの化学予防薬が研究され、いくつかは、果物および野菜中に見出される成分のようにヒトの食餌中の天然成分として存在する。これらのいくつかは、広範な範囲の発癌物質から保護する効力を示しているが、ほとんどは、栄養学的にバランスの取れた食餌中に極めて低濃度で存在し、かつ、それらは、胃腸管内での吸収が不十分である。研究は、中国で、食餌性アフラトキシンに曝露された系または対象における化学予防薬としての抗住血吸虫薬、オルチプラズの使用を調査している。臨床試験で、研究者らは、オプチプラズが、アフラトキシン８，９−エポキシドのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ介在性抱合の程度を高め、かつまた、シトクロムＰ４５０１Ａ２活性の阻害をもたらすことを立証している。他の研究は、オルチプラズが、また、ＨＣＣの化学予防にさらなる寄与を提供するｐ５３の上昇を介してＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の転写を阻害できることを示している。クロロフィリンなどの天然物を使用して、アフラトキシンを収着し、肝臓に到達する毒素量を低減することもできる。クロロフィリンは、いくつかの動物モデルで有効な抗発癌物質であることが見出されている、ヒトの食餌中の成分である。クロロフィリンは、代謝を高め、ＡｆＢ１などの発癌物質と結合することによってインターセプター分子として作用し、それによってビオアベイラビリティーを低下させる。中国での臨床試験において、参加者を不作為に２群に割り振り、該群には４カ月間１日に３回、１００ｍｇのクロロフィリンまたはプラセボを与えた。各食事でクロロフィリンを消費することは、プラセボの消費と比較して、アフラトキシン−Ｎ７−グアニン付加物のメディアン尿中濃度を全体的に５５％低下させることにつながった（Ｅｇｎｅｒら、２００１年）。ヒトにおけるこれらの化合物の長期使用は、酵素調節に関する長期的影響、および食餌からの必須栄養素の取り込みの潜在的妨害を含む慎重な評価を必要とする。緑茶由来ポリフェノールも、ＨＣＣへの高い危険にさらされている集団に対して考え得る介入として調査中である。これらの化合物は、各種動物モデルで種々の器官部位の癌に対して高度に有効な化学予防薬である。研究は、緑茶が、ＡｆＢ１の代謝を調節することによって、ラットにおけるＡｆＢ１誘発性肝臓癌発癌の開始を阻害することを示している。Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを用いたさらなる研究は、緑茶（水中３％）の投与が、ジエルドリンによって誘発される局所性肝臓病変増殖を抑制することを示している。緑茶補助治療は、また、マウスの局所性肝臓病変におけるアポトーシス指数の増加をもたらす。ヒトでは、緑茶消費レベルと、発症の危険および／または癌開始機会との間の反比例関係も観察されている。
【０００７】
アフラトキシンのバイオアベイラビリティーを低下させる食餌性粘土介入。粘土の消費（土食）は、数世紀の間、伝統的なヒト社会から報告されており、アフリカおよび中国では「文化的に許容」される。多様な動物モデルを使用して、本発明者らの研究室はカルシウムモンモリロナイト系粘土が、食餌性アフラトキシンの有害な影響を予防するのに有効であり得ることを示した。食餌中に各種結合剤または収着剤を含めることを介する、マイコトキシンへの食物媒介性曝露を低減する戦略は、かなりの注目を受けている。１９７９年もの早期に、吸着性粘土鉱物は、液体中のアフラトキシンＢ１を結合することが報告された。また、キャノーラ油を処理するのに使用されていた漂白用粘土は、Ｔ−２毒素の影響を少なくすることが見出された。
【０００８】
食餌中のアフラトキシンに対するＨＳＣＡＳ腸内収着剤介入。アフラトキシンでの最初の腸内収着剤研究において、動物飼料用の抗ケーキング添加剤として販売されているカルシウムモンモリロナイト系粘土であるＨＳＣＡＳ（ＨＳＣＡＳ（商標））は、水溶液中でアフラトキシンＢ１を高い親和性および高い吸収力で収着し、ブロイラーおよびレグホン種のニワトリを食餌中７５００ｐｐｂのアフラトキシンの毒性効果から救出することが報告された。これらの初期の研究以来、ＨＳＣＡＳおよびその他類似のモンモリロナイトおよびベントナイト系粘土は、げっ歯類、ニワトリ、シチメンチョウのヒナ、小ガモ、子ヒツジ、ブタ、ミンクおよびマスを含む各種の若い動物におけるアフラトキシンの影響を低減することが報告されている。ＨＳＣＡＳは、また、放射能標識化アフラトキシンのバイオアベイラビリティーを低下させ、家禽類、ラットおよびブタ中でのアフラトキシン残留物を低下させることを示した（図２）。授乳しているウシおよびヤギからの乳中のアフラトキシンＭ１濃度も、食餌中にＨＳＣＡＳを含めることで低下した。
【０００９】
ＨＳＣＡＳへのアフラトキシンの収着に関する分子機構および熱力学：ＨＳＣＡＳ表面へのＡｆＢ１の吸着に関する洞察は、いくつかのアフラトキシン類似体間の立体化学的相違が、結合の堅固性にかなりの影響をもたらす（たとえ、カルボニル官能基が同一でも）という観察から得られた。これらの結果は、また、ＨＳＣＡＳ上へのアフラトキシンの吸着に関する分子機構が、フランを表面から離れて整列させる最適配向を好む可能性があることを示唆した。ＡｆＢ１は、収着の熱力学および推定で−４０ｋＪ／ｍｏｌの収着熱（エンタルピー）に基づいてＨＳＣＡＳに強力に結合される。これらの結果を説明できる潜在的化学反応は、電子供与体受容体（ＥＤＡ）機構である。この機構は、粘土の陰性表面に由来する電子と、部分的に陽性である被吸着分子中の原子との共有を含む。アフラトキシン中のジカルボニル系を構成する炭素は、部分的に陽性（電子に乏しい）であり、吸着過程に必須であることも示されている。各リガンドに関してカルボニル官能基の炭素の部分電荷の総和を、結合強度に対してプロットすると、かなりの相関が存在した。ジヒドロフラン官能基と反対側の分子側で平面でないリガンドを試験化合物集団から除去すると、該相関は、有意に改善された。立体化学的に制限された基を有する化合物からの妨害は、吸着過程で重要な役割を果たす可能性もある。それらをＡｆＢ１に比べてより大きくする官能基を含む類似体の場合、それら類似体の挿入、粘土表面での合体および吸着、層間チャネルの分離が、制限される可能性がある。
【００１０】
アフラトキシンに対するＨＳＣＡＳの特異性。研究は、ＨＳＣＡＳが、０．５％ｗ／ｗ以下（動物飼料中での抗ケーキング活性のために推奨される濃度）の食餌中濃度でアフラトキシンに対して著しい選択性（および吸収能力）を有するという結論を支持している。例えば、家禽類の食餌中０．５％濃度のＨＳＣＡＳは、フィチン酸または無機リンの利用を害さなかった。他の家禽類の栄養研究において、０．５％濃度でのＨＳＣＡＳの添加は、リボフラビン、ビタミンＡ、マンガン、または亜鉛の利用を害さなかった。また、より初期の研究で、ＨＳＣＡＳ（０．５％の含有率）は、若いニワトリを極めて高濃度のアフラトキシン（すなわち、７５００ｐｐｂ）から保護することが示されている。粘土をベースにした介入は、アフラトキシンに対して明らかに効果的であるのに、類似の技術は、他の重要なマイコトキシンに対して今のところ利用できない。たいてい、未修正ＮＳ粘土は、他の構造的に異なるマイコトキシン、例えば、ゼアラレノン、デオキシニバレノール、Ｔ−２毒素、オクラトキシンＡ、シクロピアゾン酸、エルゴタミン、およびフモニシンを「堅固に」結合しないし、動物の食餌中に含めた場合にこれらのマイコトキシンの有害効果を有意には予防しない。例えば、マイコトキシン（アフラトキシン以外の）を用いた家禽類での腸内収着剤研究において、食餌中へＨＳＣＡＳを含めることは、シクロピアゾン酸、Ｔ−２毒素、ジアセトキシスシルペノール、オクラトキシンＡ、およびフモニシンの有害効果を有意には予防しなかった。ゼアラレノンを給餌されたミンクでの粘土の使用は、若干の胎児毒性を軽減するのを助けたが、高エストロゲン効果を低減しなかった。また、食餌に０．５％および１．０％（ｗ／ｗ）の粘土を添加することは、デオキシニバレノールに曝露されたブタの１日当たり平均体重増加に影響を及ぼさなかった。この研究でデオキシニバレノールの毒性を低下させるのに有効な唯一の方法は、汚染されたトウモロコシを非汚染トウモロコシで希釈することであった。家畜の食餌をＨＳＣＡＳで補足してウシノケグサの毒性を防ぐ可能性が調べられた。インビトロでの実験は、水溶液中でのエルゴタミンのモンモリロナイト系粘土への良好な結合を予測したが、ＨＳＣＡＳ（２．０重量％の濃度で）は、ウシノケグサ中毒症からラットまたはヒツジを保護しなかった。ＡｆＢ１に対するＨＳＣＡＳの特異性をさらに確認するために、水晶の表面にＨＳＣＡＳのナノ構造薄膜を構築し、生じた複合体を汚染された媒体中のアフラトキシンに対するアフィニティプローブとして使用するプロトコールを開発した。本発明者らの所見は、この複合媒体が（小さなガラス製浄化用カラムに充填すると）、その選択性においてＶＩＣＡＭ社からのＡｆｌａｔｅｓｔアフィニティカラムに匹敵することを示唆した。
【００１１】
ＨＳＣＡＳについての長期動物研究：ＨＳＣＡＳについての初期の短期動物研究において、食餌中での粘土摂取に続く、観察し得る有害効果は報告されなかった。スプラーグ−ドーリー（Ｓ−Ｄ）ラットに妊娠中を通してＨＳＣＡＳを２．０％もの高い食餌中濃度で摂取させたより最近の研究は、母体毒性も胎児毒性も示さず、かつ各種組織中で微量金属の有意なバイオアベイラビリティーも示さなかった。また、げっ歯類モデルを使用して、食餌を介するＨＳＣＡＳへの長期曝露の相対的安全性を評価した。研究には、６．５カ月間にわたって０％、０．２５％，０．５％、１．０％および２．０％濃度のＮＳ粘土を含有する糧食を随意で給餌された雄性および雌性スプラーグ−ドーリー・ラットを含めた。この研究の結果は、０．２５〜２％の食餌中ＮＳ粘土で治療されたラットは、体重増加、飼料変換率、相対的器官重量、主要器官の全体的解剖学および組織学的外観、血液学、および血清中生化学パラメーターに対する、用量依存性のまたはＨＳＣＡＳに関連する有害効果を呈示しないことを示した。さらに、ビタミンＡおよびＥ、ＦｅおよびＺｎを含む選択された必須栄養素の濃度は、影響を受けなかった。これらの所見は、ＨＳＣＡＳを用いる腸内収着剤療法または食餌介入が、高い危険にさらされたヒト集団におけるアフラトキシン中毒症を管理するための潜在的選択肢であり得ることを示唆した。
【００１２】
系または対象におけるＨＳＣＡＳについての有害事象試験：げっ歯類での長期研究に続いて、健常なヒト志願者で、ＨＳＣＡＳの２週間短期安全性評価を実施した。この第Ｉ相有害事象試験は、対象におけるＨＳＣＡＳの短期安全性および耐容性を判定するように計画した。カプセル化に先立って、連邦政府および国際標準への準拠を保証するために、ＨＳＣＡＳを、ダイオキシン／フラン類および重金属を含む各種環境汚染物質の濃度について分析した（表１）。例えば、ＨＳＣＡＳの推定用量中の重金属汚染物質量は、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品添加物専門家会議（ＪＥＣＦＡ）の基準未満である。より具体的には、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｓｅ、Ｎｉ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｄ、Ａｓ、およびダイオキシン（ＴＣＤＤおよびＯＣＤＤ）に関して３ｇのＨＳＣＡＳ／日に同等の推定用量は、ＪＥＣＦＡの基準未満であった。
【００１３】
ＨＳＣＡＳは、カプセル中に包装するに先立って１２１℃で滅菌した。ＨＳＣＡＳカプセルは、米国適正製造規範（ＧＭＰ）を使用して無菌条件下で製造した。ヒトでの研究において、全体計画は、不作為化二重盲検第Ｉ相臨床試験のための指針に従った。採用基準に合致した全部で５０名の成人を、自由意志で研究に登録した。彼らを、ランダムに２つの研究群に分割した。低用量群は、１日に３回、３カプセルのＨＳＣＡＳ（０．５ｇ）を２週間服用した。高用量群は、１日に３回、３カプセルのＨＳＣＡＳ（１．０ｇ）を２週間服用した。カプセルは、色および大きさをすべて同一とした。２つの用量水準は、以前に発表された動物研究から外挿した。結果は、この研究で使用したＨＳＣＡＳの双方の用量が、すべての研究参加者に対して耐容性であることを示した。胃腸での有害効果が、若干の対象で、すなわち、１．５ｇ群の２４％（６／２５）および３．０ｇ群の２８％（７／２５）で認められた。症状には、鼓腸、便秘、下痢、膨満、および腹部不快感が含まれた。低用量（１．５ｇのＨＳＣＡＳ）群の２名の参加者は、若干程度の眩暈の経験を報告し、この効果は、高用量（３．０ｇのＮＳ）群では明白でなかった。訴えられた症状は、すべて、ＮＳカプセル服用後の最初の２日間に記録され、その後に症状（または苦情）は記録されなかった。報告されたすべての副作用は、１名の参加者からのものを除いて、軽度であると評価され、２つの治療群間で有意差は観察されなかった。この研究の結果は、健常ヒト対象に対する１４日間の１．５〜３．０ｇ／日でのＨＳＣＡＳカプセルの投与が、生化学および血液学的パラメーターの分析ならびに身体検査によって立証されるように、比較的安全であることを示した。いくつかの粘土鉱物は、ビタミンを収着できることが仮定されているが、この研究で、どちらかの用量のＨＳＣＡＳでの治療後に血清中ビタミンＡおよびＥの濃度に統計的差異は観察されなかった。この証拠は、ＨＳＣＡＳが、ＡＦに対して結合特異性を示し、かつビタミンＡおよびＥとの相互作用を欠くことをさらに裏付ける。２つの例外、すなわち、低用量群でのより低い無機硫黄濃度および両群でのより高いストロンチウム濃度を除いて、分析した主要無機物の濃度に有意差は見出されなかった。これらの所見の臨床的重要性は、未だ不明であり、将来の介入研究で検討されるであろう。
【００１４】
アフラトキシンの発癌性：ヒトの肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中で最も一般的な癌の１つであり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）慢性感染症および食餌中のアフラトキシンへの曝露が、主要病因学的因子と考えられる中国およびアフリカの一部での主要死亡原因である。より発展した国では、食物中のこれらのアフラトキシン濃度を監視する規制と組み合わせた十分な食物供給が、ヒト集団における保護手段および曝露低減を提供する。飢餓がその地方に特有であり、かつ食物の品質規制を利用できない国々では、アフラトキシンへの日常的曝露が、ＨＣＣおよびその他ヒトの健康への有害効果の危険を増大させる。これらの事例の多くで、マイコトキシンで汚染された食材の処分および／または代替は、実現可能な選択肢ではない。残念ながら、このような現実は、２１世紀でもやはり存在し、これらの高い危険にさらされたヒト集団における健康状態および生活の質を改善するために、アフラトキシンに対する食餌性曝露を低減または排除することの重要性を強調する。アフラトキシンは、アスペルギルス・フラバスおよびアスペルギルス・パラシチカスの多くの菌株によって産生されるジフラノクマリン誘導体であり、特に、Ａ．フラバスは、農業における一般的な汚染物質である。これらの毒素産生性真菌種は、世界のいたるところに分布され、温帯環境と比較すれば暖かい気候、亜熱帯気候および熱帯気候でより広く認められる。シリアル穀類、脂肪種子、ナッツ、果実、タバコ、および広範な範囲のその他の一次産品の自然的汚染は、普通に出現する。アスペルギルス種によって産生される４つの主要アフラトキシン同族種（Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１およびＧ２）の中で、アフラトキシンＢ１（ＡｆＢ１）は、最も強力な肝臓癌発癌物質であり、ヒトの健康に最も大きな重要性を有する。肝臓は、摂取されたアフラトキシンの生体内変換の主たる部位である。最初に、ＡｆＢ１は、シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４による酸化を受け、２種のアフラトキシン−８，９−エポキシド立体異性体を産生する。エキソエポキシドは、高度に反応性のある中間体であり、グアニンのＮ７原子と反応して、前変異原性ＤＮＡ付加物、ＡｆＢ１−Ｎ７−グアニンを形成する。このアフラトキシン−ＤＮＡ付加物は、不安定であり、尿中へのその排泄につながる脱プリン化を受ける。エキソエポキシドは、また、血清中アルブミンおよびその他の細胞タンパク質中のリシン残基に結合する能力を有する。ＣＹＰ１Ａ２も、ＡｆＢ１のヒドロキシル化を触媒し、ヒトにおける主なアフラトキシン代謝産物であるＡｆＭ１、およびＡｆＰ１およびＡｆＱ１などのその他の酸化生成物を産生する。これらの代謝産物は、さらなる生体内変換なしに排出されるか、あるいはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって抱合され得るが、ＡｆＭ１は、グルクロニド化のための基質ではない。アフラトキシン−８，９−エポキシド中間体は、また、胆汁中に排泄される安定で無毒性の極性生成物を産生するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのための基質である。アフラトキシン−グルタチオン生成物は、肝臓および腎臓中でさらなる逐次的代謝を受け、尿中にメルカプツール酸（アフラトキシン−Ｎ−アセチルシステイン���として排泄される。アフラトキシンは、１９９３年に、国際癌研究機関によってヒトの発癌物質として初めて分類され、アフラトキシン曝露とＨＣＣとの間の強力な関連の証拠を提供するために、さらなる疫学的および実験的研究が続いている。中華人民共和国だけで、ＨＣＣは、１年に２０万人を超える死亡に責任があり、癌による死亡数の第３主要原因である。特に、ＨＣＣは、中華人民共和国東江蘇省の市、啓東における癌死の主要原因であり、いくつかの田舎町における全成人死亡の最大で１０％を占める。アフラトキシン曝露をＨＣＣに関連付ける初期の証拠は、主として、汚染された食物中で測定されるような、または食餌質問表からのアフラトキシン摂取の評価に基づくものであった。さらなる研究は、アフラトキシン曝露をＨＣＣの発生と相関させるより正確な手段としての尿および血液中の各種バイオマーカーの測定に依拠する。尿中ＡＦＢ−Ｎ７グアニン付加物は、媒体、系、または対象における多くのＡｆＢ１研究で、アフラトキシンに対する曝露の定量的指標として使用されてきた。ＡｆＭ１は、ＡｆＢ１摂取に続いて排泄される主な尿中代謝産物であり、アフラトキシン曝露の直接的バイオマーカーとして使用することもできる。さらに、血清中のアフラトキシン−アルブミン付加物は、より長期曝露を評価するために使用されてきた。これらのアフラトキシンに特異的なバイオマーカーの有用性および適用は、高い危険にさらされている集団におけるヒトのアフラトキシンに対する曝露および感受性をよりよく特徴付けるのに役立ってきた。例えば、１９９０年代の初めに上海で実施された入れ子型症例−対照バイオマーカー研究は、アフラトキシン曝露とＨＣＣとの間の有意な関連、およびアフラトキシン曝露が慢性Ｂ型肝炎感染を随伴する場合に肝臓癌の危険が劇的な６０倍に増大することを示した。その後の台湾および啓東での研究は、これらの所見を確かにした。
【００１５】
「溶液中でのマイコトキシンの選択的固定化および検出（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」と題し、１９９３年１月１２日にＰｈｉｌｌｉｐｓらに付与された米国特許第５１７８８３２号には、特定の鉱物、特に、天然に存在する種々の形態の酸化アルミニウムが、マイコトキシン混合物から選択されたマイコトキシンをどのように結合するかが記載されている。これらの吸着剤は、従来技術による吸着剤との各種組合せおよび／または併用で使用された場合に、溶液中のマイコトキシンを分析することができる検知管の構築を可能にし、飼料または食材サンプル中でのそれらの濃度の半定量的蛍光測定を提供する。該検知管は、選択された鉱物の隔離層を充填した透明管からなる。マイコトキシンで汚染された可能性のあるサンプルからの溶媒抽出物をカラムに通す。マイコトキシン混合物が、検知管を通り、各種の鉱物性吸着剤と接触するにつれて、選択されたマイコトキシンは、特定の鉱物上に固定され、一方、他のマイコトキシンおよび共に抽出された有機化合物は、その相を通過し、次の下流の鉱物層上に固定される。マイコトキシンの存在は、展開された検知管を長波ＵＶ光源下で調べることによって判断される。
【００１６】
「動物飼料添加剤および動物飼料中に存在するマイコトキシンを不活化する方法（Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄｓ）」と題し、１９９２年１１月２４日にＴａｙｌｏｒらに付与された米国特許第５１６５９４６号には、マイコトキシンを不活化する能力を有する乾燥固体状動物飼料組成物が記載されている。飼料が、マイコトキシンで汚染され、かつマイコトキシンを不活化する能力を有するフィロシリケート系鉱物の粒子を含有するマイコトキシン不活化剤と混合された場合に、該複合材料は、フィロシリケートのマイコトキシン不活性化能力を増強した。
【００１７】
（アフラトキシンの処理剤としての粘土）
粘土をベースにした本発明の組成物は、環境毒素に結合し、環境毒素への曝露を処理し、急性アフラトキシン中毒を治療し、アフラトキシン誘発性肝臓癌および慢性アフラトキシン中毒症を予防するのに使用できる。しかし、当業者は、多くの異なるタイプの粘土が存在し、かつ粘土の使用および応用は、人類の歴史を通して広く記録されてきたことを認識するであろう。
【００１８】
粘土は、水和したケイ酸塩粒子の凝集体に対する一般名である。一般に、粘土は、通常、ケイ素およびアルミニウムの酸化物および水酸化物に富む各種のフィロケイ酸塩鉱物からなる。粘土は、シルトなどの土壌中に存在する他の小粒子から、それらの小さな寸法、薄片または層状形状、水に対する親和性および高い塑性指数によって分類される。フィロケイ酸塩系粘土の主な群には、カオリナイト、モンモリロナイト−スメクタイト、イライト、および緑泥石が含まれる。
【００１９】
モンモリロナイト系粘土は、典型的には、低シリカ岩石の風化生成物として形成される。モンモリロナイトは、スメクタイト群の構成員であり、ベントナイトの主要成分である。
【００２０】
バーブ（または年層化粘土）は、肉眼で見える年層を持つ粘土であり、侵食および有機含有物の季節的相違によって形成される。このタイプの堆積物は、氷河時代からの以前の氷湖で一般的である。
【００２１】
クイッククレイは、ノルウェー、カナダおよびスウェーデンの氷河地域に固有の、独特なタイプの海洋性粘土である。それは、数回の破壊的地すべりに巻き込まれると液化する傾向のある、高度に敏感な粘土である。
【００２２】
粘土に対するその他の名称には、ＨＳＣＡＳ、アキプラ（Ａｋｉｐｕｌａ）、ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸アルミニウム、アスキプラ（ａｓｋｉｐｕｌａ）、ｂｅｉｄｅｌｌｉｔｉｃモンモリロナイト、ベンディトス（ｂｅｎｄｉｔｏｓ）、生体電気鉱物、シプラ（ｃｉｐｕｌａ）、チョーク、粘土泥、粘土粉塵、粘土ロゼンジ、粘土懸濁製品、粘土錠剤、コロイド状鉱物、コロイド状微量鉱物、化石花粉、腐植土頁岩、インディアン治療粘土、カオリン、キプラ（ｋｉｐｕｌａ）、山岳食、パニトデルセニョール（ｐａｎｉｔｏ  ｄｅｌ  ｓｅｎｏｒ）、植物由来液状鉱物、ティラサンタ（ｔｉｒｒａ  ｓａｎｔａ）、テラシギラタ（Ｔｅｒｒａ  ｓｉｇｉｌｌａｔａ）、白土、白泥などが含まれる。
【００２３】
粘土の薬物的使用。今日、粘土は、レンガ、料理用ポット、芸術品、皿、点火プラグ本体、セメント製品、および化学薬品用フィルターを製造するための多くの工業過程で使用される。民間伝承によれば、粘土を食べることは、多くの医療目的を有するが、科学文献は、ある種の粘土を摂取することは、摂取者に対して有害である可能性があることを指摘している。粘土の化学的性質は、それらが、各種の潜在的に有害な作用物質を吸収することを可能にする可能性がある。例えば、キャンデー（Ｊａｒｒｉｔｏｓ商標のタマリンドキャンデー）を入れた粘土製ポットは、粘土製ポットに由来するキャンデー中の高濃度鉛のために、米国では食品医薬品局によって回収させられている。粘土製品は、様々な量のアルミニウム、ヒ素、バリウム、鉛、ニッケル、チタン、およびその他の微量金属を含む可能性がある。さらに、高い濃度の２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが、養殖ナマズ、およびミシシッピーの採掘場からのボールクレーを含む食餌を給餌された鶏からの卵中に見出された。さらに、長期の粘土摂食は、微量元素欠乏に関連している可能性がある。しかし、セラミックス工業で主に使用され、系または対象によって消費される粘土の群は、カオリナイト（ボールクレー）であることを指摘すべきである。
【００２４】
したがって、ヒトによって摂取される粘土（特に、カオリナイト）は、高濃度の毒性作用物質を含んではならない。加工処理された本発明の粘土は、アフラトキシンの毒性を治療または予防するのに使用できる。粘土は、数世紀間、アフリカ、インドおよび中国で、ならびにネイティブアメリカンの集団によって薬として使用されてきたが、当業者は、ある種の粘土の長期経口摂取に伴う重篤な有害作用に関する可能性が存在することを理解している。後記のように、科学および医療界は、これらの有害作用は、任意の潜在的利益に対して重すぎる可能性があると考えている。
【００２５】
泥、粘土、またはその他の非栄養物質を食べる習慣は、「異食症」または「土食症」と呼ばれ、初期幼児期でおよび精神的障害のあるまたは精神病の患者で一般的である。鉄欠乏症などのミネラル欠乏症は、異食症につながる可能性があり、有病率は、発展途上国および貧困社会でより高いいくつかの証拠が存在する。長期の粘土摂取は、鉄の吸収不良につながり、かつ、この状態をさらに促進する可能性がある。なんらかの医学的状態に対して粘土の使用を推奨する、または推奨しない十分な化学的証拠は存在しない。粘土の長期経口摂取に伴う有害作用に関する可能性は、なんらかの潜在的利益に対して重すぎる可能性がある。
【００２６】
粘土製品は、種々の量のアルミニウム、ヒ素、バリウム、鉛、ニッケル、チタンおよびその他の微量金属を含む可能性がある。特定のコロイド状ミネラル栄養補助食品は、安全でない濃度の放射性金属を含む可能性もある。特定の粘土の摂取は、妊娠または授乳中の患者に使用すると、または子供に使用すると、安全でない可能性がある。いくつかの粘土は、カリウム結合能力を所持する可能性があり、これらの粘土の長期摂取は、特に腎不全を有する患者における重篤な低カリウム血症と関連していた。カオリン系粘土の習慣的摂食（異食症または土食症）は、鉄の吸収不良および重篤な欠乏につながる可能性があり、かつ貧血症および鉛中毒に関連している可能性がある。
【００２７】
「異食症」または「土食症」と共に、次の生理学的問題が報告されている。
【００２８】
特定の粘土に対するアレルギー／過敏症は、浮腫様外観、拡張型心筋症、多尿、および死亡によって特徴付けることができる。さらに、皮膚乾燥、皮膚潰瘍化が、対象の上部および下部肢にわたって言及された。
【００２９】
神経学／ＣＮＳ：異食症は、子供における鉛中毒の発症と関連しており、中枢神経系の傷害の危険を所持する可能性がある。ある症例報告で、６歳の少女が、施釉された粘土の水差しからのレモネードを摂取した後に、鉛中毒および脳症の合併症で死亡した。ニューロラチリズム、麻痺につながる身体の痙攣性不全対麻痺を引き起こす神経変性、非可逆性障害の危険が、エチオピアでの症例−対照研究において、粘土の台所用品を用いてガラスマメを調理した場合に４倍になることが報告された。
【００３０】
精神医学：精神病性障害を含む精神病を有する患者において、習慣的異食が発生する可能性がある。
【００３１】
肺／呼吸器：１９６０年代に、異食症の病歴を有する子供は、健康な子供と比べてより頻繁で重篤な呼吸器感染症を発症しやすいことが報告された。慢性気管支炎、呼吸困難、および塵肺症は、大型粘土工業での粉塵曝露に関連していた。
【００３２】
心血管：異食症は、拡張型心筋症および死亡と関連していることが報告された。
【００３３】
胃腸：粘土摂食は、便秘または下痢を促進する可能性がある。食後の胸やけ、膨満、食欲喪失および嘔吐も報告されている。粘土摂食は、腸閉塞、および腸穿孔につながる壊死性腸炎とも関連していた。異食症を有する２名の子供で結腸結石が報告されている。土食症は、肝脾腫大とも関連していた。
【００３４】
腎臓：粘土は、カリウム結合能力を所持し、長期の粘土摂取は、特に腎不全を有する患者における重篤な低カリウム血症と関連していたが、血液透析を受けている患者では関連していなかった。
【００３５】
内分泌腺：重篤な低カリウム血症による筋疾患が、大量の粘土摂取を伴う１つの症例報告で報告されている。
【００３６】
尿生殖器：長期粘土摂食は、多尿および急迫制失禁、ならびに性機能低下症と関連している。
【００３７】
血液：異食症は、鉄の吸収不良および重篤な欠乏につながる可能性があり、貧血症と関連している。
【００３８】
筋骨格：筋炎は、長期粘土摂取に関連している。重篤な低カリウム血症による筋疾患が、大量の粘土摂取で報告されている。
【００３９】
感染性疾患：鉤虫感染症は、粘土摂取に関連していた。粘土を食べた幼児、および臍帯を粘土で包んだ新生児において、粘土に由来する破傷風が記載されていた。
【００４０】
鉄、カルシウム、マグネシウム：特定の粘土は、カチオン交換樹脂として作用する。これらの粘土中のカルシウムおよびマグネシウムは、鉄と交換されることができ、不溶性鉄錯体の形成のため、鉄を利用できなくなる。結果として鉄の欠乏が生じる可能性があり、カルシウムまたはマグネシウムの濃度が増加する可能性がある。
【００４１】
カリウム：特定の粘土は、カリウム結合能力を所持し、低カリウム血症と関連していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４２】
当業者は、文献中に、特定の粘土の医療的使用を推奨するためのまたは反対するための十分な科学的および臨床的証拠は存在しないことを理解しているが、最近の医療実例は、アフラトキシン中毒、または素因のある対象での肝臓癌を有する患者における安全な治療として粘土を使用することを避けて教示する傾向がある。本発明の方法および組成物は、典型的には、系／対象によって消費されないか、あるいはセラミック製の食事用および飲料用台所用品の製造で使用されない単離された粘土組成物を利用する。加工処理された本発明の粘土は、経口で投与した場合に（ヒトおよび動物での徹底的な科学的研究に基づいて）有害な健康効果を与えない特定の化学的構成を有する。
【課題を解決するための手段】
【００４３】
本発明の第１態様は、高レベルのアフラトキシン曝露により肝臓癌およびアフラトキシン中毒症を発症する危険にさらされている対象における、環境毒素、特に、アフラトキシンで汚染された食物の影響を軽減するための予防療法として使用するための経口組成物である。該組成物は、粉末形態の有効量の加工処理されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土を含有し、ここで、該加工処理されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ＥＰＡ、ＪＥＣＦＡおよびＷＨＯの勧告に基づくヒトの１日当たり耐容摂取量未満のテトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）および重要毒性金属汚染物質を含有する。また、同粘土は、アフラトキシンに対して高い吸収力および親和性を有する。加工処理されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、３．２％を超えるＣａＯ、４．０〜５．４％の範囲のＭｇＯ、５．４〜６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、０．５０〜０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、０．１０〜０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、０．０１〜０．０３％の範囲のＭｎＯ、１４．８〜１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および６２．４〜７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有し、ここで、該化学組成は、重量％として与えられる。好ましい加工処理されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、８０ミクロン未満である平均粒子径を有し、５〜９の範囲のｐＨを有する。
【００４４】
本発明の第２態様は、ＨＣＣおよび／またはアフラトキシン中毒症の高い危険にさらされている対象における食物媒介性アフラトキシンの影響を軽減する方法である。該方法は、（ａ）加工処理された粉末形態の有効量のアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該ＣＡＳは、許容される濃度のＴＣＤＤおよび重要毒性金属汚染物質を含有し、かつアフラトキシンを結合する能力を有する）を経口で投与すること、（ｂ）急性毒性の場合、ある時間待つこと（例えば、約２４時間未満）、（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を、アフラトキシンの影響が軽減されるまで繰り返すこと、（ｄ）慢性毒性の場合、アフラトキシンに対する曝露の危険が解消されるまでＣＡＳを投与することを含む。好ましいＣＡＳは、３．２％を超えるＣａＯ、４．０〜５．４％の範囲のＭｇＯ、５．４〜６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、０．５０〜０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、０．１０〜０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、０．０１〜０．０３％の範囲のＭｎＯ、１４．８〜１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および６２．４〜７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有し、ここで、該化学組成は、重量％として与えられる。好ましい単離されたＣＡＳは、８０ミクロン未満である平均粒子径、および５〜９の範囲のｐＨを有する。
【００４５】
粘土をベースにした本発明の組成物は、ＣＡＳとも呼ばれ、アフラトキシンと同様に効率的にではないが、任意の環境毒素の影響を軽減する能力を有する。
【００４６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のいくつかの態様をさらに説明するために含められる。これらの図面の１つまたは複数を本明細書中で提供される具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をより良く理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】有力なアフラトキシン同族体の化学構造を示す図である。
【図２】ＨＳＣＡＳを使用したインビボ研究の結果を示す図である。
【図３】正常型対崩壊型ＨＳＣＡＳの等温線を示す図である。
【図４】異なる水準のＣＡＳを摂取している３つの群における異なる時間経過後のビタミンＡ濃度を示す図である。
【図５】異なる水準のＣＡＳを摂取している３つの群における異なる時間経過後のビタミンＥ濃度を示す図である。
【図６】ＮＳ介入試験の全体的研究計画を示す図である。
【図７】血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に対するＮＳ介入の用量効果を示す図である。
【図８】血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に対するＮＳ介入の時間経過効果を示す図である。
【図９】尿中ＡＦＭ１濃度に対するＮＳ介入の用量効果を示す図である。
【図１０】尿中ＡＦＭ１濃度に対するＮＳ介入の時間経過効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、変わり得る特定の組成物または組成物の送達系に限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであり、限定することを意味しないことを理解されたい。さらに、本発明の詳細な実施形態を説明する前に、本発明を説明するのに使用される定義を示すことが有用であろう。示した定義は、それらが本特許中で使用される場合の用語にのみ適用され、他の場所、例えば、科学文献またはその他の特許もしくはこれらの発明者によるあるいは共同所有者に譲渡されたその他の出願を含む出願中で使用されるのと同様の用語に適用できない可能性もある。さらに、実施例が与えられる場合、それらの実施例は、単に例示であり、限定するものではないことを意味する。
【００４９】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する場合、単数形は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「薬理学上活性な薬剤（単数形）」に対する言及は、２種またはそれ以上のこのような化合物の混合物を含み、「塩基（単数形）」に対する言及は、２種またはそれ以上の塩基の混合物を含む、等々。
【００５０】
本発明の説明および特許請求において、次の術語は、以下で述べる定義に従って使用される。
【００５１】
「活性薬剤」、「薬理学上活性な薬剤」、「組成物」および「薬物」は、本明細書中で互換的に使用され、アフラトキシンの害毒およびアフラトキシン誘発性肝臓癌を予防および治療するのに有効である組成物および薬物を指す。該用語は、また、限定はされないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、包接複合体、類似体などを含む、このような薬物の薬学上許容される、薬理学上活性な誘導体および類似体を包含する。したがって、用語「活性薬剤」、「薬理学上活性な薬剤」、または「薬物」を使用する場合、発明者らは、活性組成物自体、および本明細書中で「薬学上許容される誘導体」と集合的に呼ばれる薬学上許容される、薬理学上活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、包接複合体、類似体などを含めることを意図していることを理解されたい。
【００５２】
本発明は、アフラトキシン結合剤または収着剤として有効量の粘土を使用する、アフラトキシン中毒を予防または治療する組成物および方法に関する。アフラトキシンは、主としてアスペルギルス・フラバスおよびアスペルギルス・パラシチカス真菌によって産生される一群の発癌性マイコトキシンであり、しばしば食物および農業一次産品中で検出される。これらの化合物は、熱に安定であり、各種の食物加工処理過程で生き残ることができ、そのため、アフラトキシンは、ほとんどの食物および家畜飼料の「回避できない」汚染物質として現われ得る。天然に存在する４種のアフラトキシン（Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１およびＧ２）の中で、アフラトキシンＢ１が、最も毒性があり、発癌および腫瘍抑制に関わる遺伝子を攪乱させることが示されている。さらに、いくつかの研究は、アフラトキシンに対する低レベルの曝露が、免疫系の抑制および疾患に対する感受性の増大を引き起こす可能性があることを示唆している。
【００５３】
理論によって拘束されることを望むものではないが、各種の農業一次産品中のマイコトキシン汚染を完全に排除するのに利用できる絶対的方法は存在しないが、粘土をベースにした取り組みは、アフラトキシンに対する食餌性曝露を低減するための経済的かつ実際的な解決法を提供する。さらに、アフラトキシン中毒を予防および治療するための食餌性アフラトキシン腸内収着剤および非特異的結合剤の使用を、以下の実施例中で説明する。
【００５４】
本発明は、また、毒素結合剤または収着剤として有効量の粘土を使用する、任意の環境毒素の影響を予防または治療する組成物および方法に関する。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本発明および実施し得る方法をさらに説明するために提供される。しかし、実施例中で与えられる具体的詳細は、単に例示の目的のためであり、本発明を限定するものと解釈すべきでないことが理解されるであろう。
【実施例１】
【００５６】
農業一次産品中のアフラトキシンを管理するには、いくつかの戦略を利用することができ、その中で最も簡単なものは、汚染された供給源の隔離および絶滅である。しかし、この取り組みは、代替食物供給物を利用できないか、あるいは代わりの供給物を経済的に供給できないので、実際的でないことが多い。家畜におけるアフラトキシン中毒症を予防するための最も見込みがあり、かつ十分研究された取り組みは、これらの毒素で汚染された食餌中への粘土または各種の「結合剤」の組み込みを含む。該添加剤は、胃腸管内での毒素のバイオアベイラビリティーを低下させる。すなわち、それらの添加剤は、毒素の封鎖剤（腸内収着剤）として役立ち、そのため、血液および標的器官への取り込みおよび分布を低下させる。
【００５７】
吸着性粘土鉱物は、液中でアフラトキシンＢ１を結合することが報告されている。アフラトキシンに関する最初の腸内収着剤研究において、動物飼料用の抗ケーキング添加剤として普通に使用されているカルシウムモンモリロナイト系粘土は、水溶液中で高い親和性および高い吸収力をもってアフラトキシンＢ１を有意に収着し、食餌中７５００ｐｐｂのアフラトキシンの毒性効果からブロイラーおよびレグホンのヒナを保護することが示されている。この最初の研究以来、カルシウムモンモリロナイト系粘土およびその他類似のモンモリロナイト系粘土が、げっ歯類、ニワトリ、シチメンチョウのヒナ、小ガモ、子ヒツジ、ミンクおよびブタを含む各種の若い動物におけるアフラトキシンの毒性効果を減少させることが報告されている。食餌中の粘土は、乳中のアフラトキシンＭ１濃度を減少させることも示されている。より最近になって、イヌにおけるＡｆＢ１曝露の尿中バイオマーカーが、カルシウムモンモリロナイト系粘土を含めることによって減少した。したがって、飼料中０．５％（ｗ／ｗ）のＣＡＳは、同一飼料中７５００ｐｐｂのアフラトキシンによる有害効果を防護した。この高いアフラトキシン濃度は、食物または飼料中の汚染物質として通常的には見出されず、（かくして）「最悪事例のシナリオ」を意味する。アフラトキシン防護は、食餌中０．２５％（ｗ／ｗ）もの低い濃度で示され得る。ヒトに対して外挿すると、カプセル中のほぼ３ｇ用量のＣＡＳは、ガーナにおける食物摂取量データおよび７０ｋｇの体重を基準にして食物中０．２５％の濃度に近い。
【００５８】
粘土をインビボで使用するためのＧＲＡＳステータスおよび安全性研究。当業者は、科学刊行物が、動物飼料中のアフラトキシン結合剤としてのカルシウムモンモリロナイト系粘土の使用を支持していることを承知しているであろう。多様な動物種でのカルシウムモンモリロナイト系粘土が関わるインビボ研究の各種合併症を本明細書中で説明する（図２参照）。例えば、水和アルミノケイ酸ナトリウムカルシウムは、飼料中での２．０％を超えない濃度での適正な製造または給餌基準に従った使用について一般に安全と認められている。
【００５９】
カルシウムモンモリロナイト系粘土を用いた動物研究において、食餌中２．０％までの濃度で粘土治療に由来する有害作用は、報告されていない。げっ歯類での最近の研究では、モンモリロナイト系粘土を、妊娠したスプラーグ−ドーリー・ラットにおける妊娠期間中の食餌中での高濃度曝露（２．０％ｗ／ｗ）に続く潜在的毒性および微量金属のバイオアベイラビリティーについて評価した。粘土は、妊娠中のスプラーグ−ドーリー・ラットのバランス食中に２．０％（ｗ／ｗ）の濃度で補足した。毒性の評価は、妊娠１６日目に実施され、母体の体重、母体の食餌摂取量、残渣重量、さらには胎児再吸収を含めた。肝臓および腎臓、脛骨、脳、子宮、鬱血胎盤、および鬱血胎児塊を収集し、重量を測定した。組織を凍結乾燥し、次いで中性子放射化分析（ＮＡＡ）を実施した。ＮＡＡで考慮される元素には、Ａｌ、Ｂｒ、Ｃａ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｃｓ、Ｃｕ、Ｄｙ、Ｅｕ、Ｆｅ、Ｈｆ、Ｋ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｍａ、Ｎｄ、Ｎｉ、Ｒｂ、Ｓ、Ｓｂ、Ｓｃ、Ｓｅ、Ｓｍ、Ｓｒ、Ｔａ、Ｔｈ、Ｔｅ、Ｔｈ、Ｔｉ、Ｔｌ、Ｕ、Ｖ、Ｙｂ、Ｚｎ、およびＺｒが含まれる。誘導結合プラズマ質量分光法により、Ａｌは、脳中で検出限界（０．５ｐｐｍ）未満であり、胃腸管内での粘土との相互作用に由来するこの金属の有意なバイオアベイラビリティーを示さないことをさらに確認した。粘土で補足された動物は、粘土補足に続く脳中Ｒｂの減少を除き、毒性評価および金属分析に関して対照と同様であった。総合的に、この研究の結果は、高い食餌中濃度の粘土が、いずれも、妊娠ラットにおいて明白な毒性または影響のあるミネラル摂取または利用をもたらさないことを示唆している。若干の実施形態において、試験用粘土は、ＧＲＡＳステータスおよびその純度的に重要な微量金属およびダイオキシン濃度により選択した。表１参照。
【００６０】
げっ歯類および対象におけるその他の研究により、ヒトの食事での応用に関するカルシウムモンモリロナイト系粘土の安全性を確認した。げっ歯類の研究では、ラットに、約０、０．２５、０．５、１．０、および２．０％濃度のカルシウムモンモリロナイト系粘土を含有する糧食を給餌した。体重、体重増加、器官重量、組織変化、血漿中生体化学物質、血清中ビタミンＡおよびＥ、ならびに微量栄養素（ＦｅおよびＺｎ）を測定、標準化し、比較し、研究終末時点での毒性および粘土と重要な栄養素との任意の相互作用を判定した。粘土に６カ月間曝露した後に、治療群間で病的状態または死亡は、観察されなかった。主要器官、血清中生体化学物質または微量栄養素濃度の変化はなかった。最終体重に対する器官重量の比率は、肝臓、腎臓、肺、心臓、脳、脾臓、および脛骨に関して各性別の治療群間で有意に異なることはなく、肝臓および腎臓の組織病理学的分析は、対照および粘土治療の間で相違を示さなかった。これらの結果は、食餌中に２．０％（ｗ／ｗ）未満の濃度で粘土を包含させることが、明白な毒性をもたらすはずがなく、胃腸管内でのアフラトキシンへの曝露を低減するために安全に使用できることを示唆している。ヒトでの研究では、物質の組成を確認し、かつ汚染物質濃度が低いことを保証するために、まず、カルシウムモンモリロナイト系粘土を微量金属およびダイオキシン含有量について試験した。
【００６１】
次いで、カルシウムモンモリロナイト系粘土を、加熱滅菌し、研究で使用するためのカプセル中に充填した。研究計画は、２つの治療群、すなわち、１）低用量−全部で２週間の間、３×５００ｍｇカプセル×３回／日、および２）高用量−全部で２週間のあいだ、３×１，０００ｍｇカプセル×３回／日をベースにする。２週間の試験は、当初の身体検査、生体液の実験室分析および質問表によって選択された２２〜４０歳の５０名の健常成人からなる。当業者は、上記説明から変更され、用量を異にするカプセルを調製することができる。Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版を参照されたい。次いで、参加者には、食事前に湧水のボトルと共に粘土カプセルを与えた。なんらかの訴えまたは有害作用を監視するために、現場に医療担当者を配置した。２週間の最後に血液および尿の試料を採取し、実験室での分析および身体検査を再度行った。なんらかの有害事象は、ＮＩＨの指針に従って報告した。投与プロトコールに対する応諾性は、２週間の研究期間にわたって１００％に達した。血液、および肝臓および腎臓機能に関する尿パラメーターを監視する副作用に関する臨床および生化学データの解析は、明確な有害作用を何も示さなかった。
【００６２】
作用形態および機構研究。いくつかのインビトロ研究が、水和されたアルミノケイ酸ナトリウムカルシウム系粘土（ＨＳＣＡＳ）の表面へのアフラトキシンの収着を評価している。ＨＳＣＡＳは、水溶液中で、ＡｆＢ１、およびそれらの分子構造中に完全なβ−ジカルボニル系を含むアフラトキシンＢ１（ＡｆＢ１）類似体を堅固かつ選択的に収着することが示されている。ＡｆＢ１のＨＳＣＡＳへの収着に関する等温線の解析は、高い親和性および高い吸収能力特性の双方を示し、かつ、異なる部位および／または作用機構が、粘土表面でのＡｆＢ１収着に関連している可能性もあることを示唆した。ＡｆＢ１収着のエンタルピー（ほぼ約４０ｋＪ／ｍｏｌ）は、若干の変動を示し、異なる熱力学的特性を有するＨＳＣＡＳ上の多様な部位を示唆した。これらの所見は、ＨＳＣＡＳ表面上の多様な部位が、ＡｆＢ１を化学収着するように作用することができること、およびＡｆＢ１分子の最適配向は、おそらく層間粘土表面上で平面であることを示している。アフラトキシン類似体上の官能基は、ＨＳＣＡＳ表面での収着を立体的に妨害する可能性があるか、あるいは層間領域を横切って相互作用することによって収着を遮断する可能性がある。ＨＳＣＡＳ表面へのＡｆＢ１の収着に関するその他の機構は、カルシウムおよびエッジ部位のその他各種金属などの有力な層間カチオンの潜在的キレート化を含む可能性がある。
【００６３】
成分の説明およびプロフィール。アルミノケイ酸カルシウム（ＣＡＳ）系粘土は、暗黄褐色を有する水和アルミノケイ酸ナトリウムカルシウム（ＨＳＣＡＳ）系粘土と組成を異にする。ＣＡＳは、灰白色から灰緑色に着色した自由に流動する粉末の外観を有する。ＣＡＳは、無臭であり、約２．４の比重を有する。単離されたＣＡＳは、水にほとんど不溶であり、約５〜９の範囲のｐＨを有する。シリカおよびケイ酸アルミニウム成分のために、単離されたＣＡＳは、乾燥粒子を吸入すると若干の有害作用を有する可能性があるが、健康上有害な作用は、摂取に由来するとは思われない。典型的な値は次の通りである。すなわち、
典型的な物理的特性
遊離水分（ＬＯＤ）          ９％
粗充填かさ密度              ０．６４ｇ／ｃｃ、４０ｌｂｓ／ｆｔ３
密充填かさ密度              ０．８０ｇ／ｃｃ、５０ｌｂｓ／ｆｔ３
粒子径分布                  ５％＋１００メッシュ
１８％＋２００メッシュ
６０％＋３２５メッシュ
典型的な化学分析
Ｘ線分別（ＸＲＦ）分光法による化学分析（重量％）
％ＣａＯ      ３．２〜４．８
％ＭｇＯ      ４．０〜５．４
％Ｆｅ２Ｏ３    ５．４〜６．５
％Ｋ２Ｏ      ０．５０〜０．９０
％Ｎａ２Ｏ    ０．１０〜０．３０
％ＭｎＯ      ０．０１〜０．０３
％Ａｌ２Ｏ３    １４．８〜１８．２
％ＳｉＯ２      ６２．４〜７３．５
【００６４】
さらに、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ（現在はＢＡＳＦ）、Ｊａｃｋｓｏｎ、ＭＳプラントからの加工処理粘土製品を試験すると、ＣＡＳ中に、低濃度（＜１兆部当たり０．３３部、ｐｐｔ）のＴＣＤＤが確認された。ＴＣＤＤは、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ（ＢＡＳＦ）の仕様書中に食物成分中のダイオキシン存在の指標として与えられている。
【００６５】
分析手順および等温吸着の分析方法。等温吸着分析は、純粋なＡｆＢ１結晶（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）をアセトニトリルに溶解して調製したアフラトキシンＢ１（ＡｆＢ１）原液を使用して実施した。次いで、ある容積の原液を精製（脱イオン）水中に注入し、８μｇ／ｍＬのＡｆＢ１希釈標準溶液を得た。次いで、該希釈標準溶液の濃度を、ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計（λｍａｘ＝３６２ｎｍ、ε＝２１８６５）で確かめた。バッチ式の等温処理は、１００μｇの収着剤を含むサンプルを、増大する濃度（０．４、０．８、１．６、２．４、３．２、４、４．８、６、６．４、７．２、および８μｇ／ｍＬ）の溶質（ＡｆＢ１）に曝露することを必然的に伴う。この研究は、各溶質濃度で３個の反復検体を使用する。溶質濃度は、無菌のポリプロピレン製１７×１００ｍｍ遠心試験管に適切な量のＡｆＢ１希釈標準溶液を添加すること、次いで補足量の精製水を添加して全容量を５ｍＬ／試験管にすることによって達成される。ほぼ１０ｍｇの収着剤をホウケイ酸ガラス製の１６×１２５ｍｍ使い捨て試験管に秤量し、収着剤に精製水を添加して２ｍｇ／ｍＬの懸濁液を作製する。この収着剤／水の懸濁液を３秒間ボルテックスした後、各５０μＬをオートピペッターで各反復検体に移送する。各移送の前に混合を繰り返す。サンプルに加えて、５ｍＬの精製水、５ｍＬの収着剤不含ＡｆＢ１希釈標準溶液、および５ｍＬの最低濃度の収着剤不含ＡｆＢ１からなる３つの対照を存在させる。サンプルおよび対照に蓋をして、１５、２５、または３７℃のインキュベーター中の電動式オービタル・シェーカー上に１０００ｒｐｍで２４時間載せておく。振とう後、サンプルを、振とうを行ったのと同じ温度で１５分間、１００００ｒｐｍで遠心する。サンプルおよび対照から得られた上清液中に残存しているＡｆＢ１のＵＶ−ｖｉｓ吸収を分光計で測定する。吸収の計算は種々の計算に左右されるので、最高のＡｆＢ１濃度水準で、上清液を、任意の分解化合物をチェックするためのＨＰＬＣ分析用に保存する。
【００６６】
データの計算およびカーブ・フィッティング。ＵＶ−ｖｉｓ吸収データを使用して、各データ点に関してＡｆＢ１の溶液中残存量および被吸着量を計算する。ＴａｂｌｅＣｕｒｖｅ  ２Ｄソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）を使用して、これらのデータをラングミュアの等温式にフィットさせる。
【００６７】
【数１】
2009542656.tif 000003
【００６８】
ここで、ｑは吸着されるＡｆＢ１の量であり、Ｑｍａｘは吸着されるＡｆＢ１の最大量であり、Ｃｗは溶液中のＡｆＢ１の平衡濃度であり、Ｋｄは分配定数である。ラングミュアの式は、ＴａｂｌｅＣｕｒｖｅ  ２Ｄプログラムにユーザー定義関数として書き込まれ、可変パラメーターに関する範囲および第１近似を有する。Ｑｍａｘに関するパラメーター範囲は、０から最大１モル／ｋｇの範囲の正数である。Ｋｄに関するパラメーター範囲は、０から１×１０２５の範囲である。パラメーターＱｍａｘおよびＫｄに関する初めの見積もり値は、ＴａｂｌｅＣｕｒｖｅ  ２Ｄによって決定される。これらの値を、ＴａｂｌｅＣｕｒｖｅ  ２Ｄ中のラングミュア・ユーザー定義関数中に入力し、データをフィットさせ、ＱｍａｘおよびＫｄに関する理論値が得られる。式
【００６９】
【数２】
2009542656.tif 000004
により１５、２５、および３７℃での個々のＫｄ値を比較することによって、ΔＨａｄｓ（吸着のエンタルピー）を計算する。Ｋｄの定義は、ラングミュアの式からＫｄを求めることによって誘導され、
Ｋｄ＝ｑ／（Ｑｍａｘ−ｑ）Ｃｗとなる。
Ｑｍａｘは、１５、２５、および３７℃での吸着データに対するラングミュアの式のフィッティングから得られる。
【００７０】
ＣＯＬＥ指数のための方法。膨張特性の尺度、直線伸長性係数（ＣＯＬＥ）指数は、湿潤化前土壌体積に対する湿潤化後土壌体積の比率−１である。ＣＯＬＥ＝（湿潤化後粘土体積／湿潤化前粘土体積）−１。０．０３を超えるＣＯＬＥ指数値は、該試料中にかなりのスメクタイト（膨張性粘土）が存在することを示す。一般的な手順は次のように要約できる。
１．２５ｍＬのメスシリンダーに５ｍＬ（５ｃｍ３）の乾燥粘土を入れる。
２．粘土に蒸留水を添加して全容積を２５ｍＬにする。
３．懸濁液を激しく振とうまたは撹拌して粘土の完全湿潤化を確実にする。
４．懸濁液を室温で２４時間放置する。
５．沈降した粘土の膨張体積を測定する。
【００７１】
収縮−膨張性は、粘土の種類および量と密接に相関している。最大の収縮−膨張性は、スメクタイトのように大きな量の２：１格子の粘土を有する土壌で発生する。イライト系粘土は、中間であり、カオリナイト系粘土は、水分変化量としての体積変化によって最も少なく影響される。２５℃での正常型対熱崩壊型ＨＳＣＡＳの吸着等温線を図３に示す。
【実施例２】
【００７２】
原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）は、おそらく特定の病因学的因子（すなわち、肝炎およびアフラトキシン曝露）によって決められる独特の地理、性別、および年齢的分布を有する。ＨＣＣの発生率は、地理的位置により大きく異なる。ＨＣＣの分布は、同一国内の人種間、および同一国内の地域間でも相違する。
【００７３】
高発生地域（１年に１０万人の集団につき１５を超える症例）には、サハラ以南のアフリカ、中華人民共和国、香港、および台湾が含まれる。ＨＣＣの全症例の４０％以上は、１３万７千症例の年間発生率を有する中華人民共和国で発生する。対照的に、北米および南米、ヨーロッパの大部分、オーストラリア、および中東の一部は、１年に１０万人の集団につき報告される症例が３未満である低発生地域である。しかし、米国での発生率は、長年にわたる慢性Ｃ型肝炎を有する人々の大きな集積によるものであろうが、過去２０年間増加している。
【００７４】
男性は、女性と比べて、はるかに多くＨＣＣを発症すると思われ、その差は、高発生地域でより著しく、そこでは、男性は、女性より２．１〜５．７倍（平均で３．７：１）より頻繁に冒される。該比率は、中間発生率の地域で２．４：１の平均に低下し、低発生率の地域ではより小さい。完全には判っていないが、性別分布におけるこれらの差異は、肝炎キャリア状態、環境毒素への曝露、および男性ホルモンの栄養効果の変化によるものと考えられる。
【００７５】
大多数のＨＣＣは、慢性肝疾患または肝硬変を有する患者で起こる。したがって、長年にわたる肝疾患を有する高齢の患者は、よりＨＣＣを発症すると思われる。アジアおよび西ヨーロッパの双方で実施されたいくつかの大規模な前向き研究は、５０〜６０歳の平均発症年齢を示した。しかし、サハラ以南のアフリカでは、ＨＣＣの平均発症年齢は、低下し、３３歳の平均発症年齢であった。
【００７６】
ＨＣＣの独特な分布を理解する努力は、この疾患の発症に対する危険因子に関する我々の理解を高めた。したがって、ＨＣＣの発症に対する重要な各種の危険因子が明らかにされた。これらには、Ｂ型肝炎のキャリア状態、アフラトキシン、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、遺伝性血色素症、およびほとんど任意原因の肝硬変が含まれる。しかし、ＨＣＣは、既知の危険因子を有さない患者で発生する場合もある。これらの障害のいずれかにおける調査の役割を、個々に考察する。
【００７７】
Ｂ型肝炎のキャリア状態。Ｂ型肝炎のキャリア状態と肝細胞癌との間の関連は、大規模集団をベースにしたいくつかの研究中で、およびその他の報告書中で立証されている。ある報告書中では、例えば、その１５％がＨＢＶキャリア（Ｂ型肝炎表面抗原陽性）である台湾の２２，７０７名の男性公務員を、１９７５〜１９７８年の間追跡した。これらのＨＢｓＡｇキャリアにおけるＨＣＣの相対的リスクは、非キャリアのそれの２２３倍であった。別の系列で、肝硬変または慢性肝炎を有する９１７名の日本人患者の中で、ＨＢｓＡｇの相対的リスクは、６．９であった。
【００７８】
アフラトキシン。アフラトキシンは、ＨＣＣ発病の一因となる可能性がある。アフラトキシンは、一般に、トウモロコシ、およびピーナツを汚染するカビ毒である。高い比率での食餌性アフラトキシン摂取は、ＨＣＣと関連している。例として、台湾の澎湖島は、ＨＢＶキャリア状態によって完全には説明されない極度に高いＨＣＣ発生率を有する。この地域からのＨＣＣを有する２０名の患者を、８６名の年齢を合わせた対照と比較した研究において、患者は、アフラトキシンＢ１−アルブミン付加物をより多く有すると思われ（６５％対３７％、調整オッズ比５．５）、患者の９４％は、ＨＢｓＡｇキャリアであった。上海からの別の研究において、ＨＢＶを有しかつアフラトキシンに曝露された個体群中でのＨＣＣを発症するオッズは、正常集団の発生率の５９．４倍であった。
【００７９】
ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異は、アフラトキシンに慢性的に曝露された肝細胞癌を有する患者で立証されている。同様の所見が、肝臓癌形成のための動物モデルでも立証されており、そこでは、ｐ５３の突然変異が、ＨＢＶおよびアフラトキシンに曝露された実験動物において観察されている。これらの危険因子の増強効果は、また、Ｂ型肝炎表面抗原を発現しているトランスジェニック・マウスでも立証されており、ある研究では、これらのマウスの若干は、ｐ５３対立遺伝子の一方を欠くように繁殖され、かつ／またはアフラトキシンに曝露された。１３月齢で、３種の危険因子のそれぞれを有する７尾すべてのマウスで発症した高進行度のＨＣＣは、アフラトキシンに曝露されたがｐ５３対立遺伝子の双方を有するマウスの６２％に、ｐ５３対立遺伝子の一方を欠くがアフラトキシンに曝露されていないマウスの２５％に匹敵した。
【００８０】
ＨＣＣの確立された原因薬物であるアフラトキシンを消費することは、危険である。しかし、社会経済的資力が低い世界の多くの市民は、被汚染食物を摂取すること、またはまったく摂食しないことの中の１つを選択するのが通常である。この選択を考慮すれば、起こり得るＨＣＣの危険は、飢餓および確かな死を補って余りある。
【００８１】
本発明の１つの態様は、有効量の単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土を粉末形態、錠剤、またはカプセルで１日に少なくとも１回、好ましくは各食事の前に、間に、または後に経口で投与することによって、ＨＣＣになりやすい人々におけるアフラトキシンの影響を軽減する方法である。単離された低ナトリウムアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ダイオキシンおよび毒性重金属汚染物質を含有せず、かつアフラトキシンを結合する能力を有する。好ましい実施形態において、単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、重量パーセントとして３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜５．４％のＭｇＯ、約５．４〜６．５のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜０．９０％のＫ２Ｏ、約０．１０〜０．３０％のＮａ２Ｏ、約０．０１〜０．０３％のＭｎＯ、約１４．８〜１８．２％のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜７３．５％のＳｉＯ２を含む化学組成を有する。さらに、好ましい実施形態において、単離されたアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、約８０ミクロン未満である平均粒子径を有する。しかし、均一性および純度のため、名目上２００メッシュの粒子径を選択した。これらの特徴は、多様な粘土の表面へのアフラトキシンの収着を調べて比較するために、および過程の熱力学および速度論を詳細に描写するために望ましかった。当業者は、粘土鉱物が、構造的および化学的に多様であることを認識しているであろう。多くは、アフラトキシンに対して効果が無くかつ／または非選択的である。本発明のＣＡＳは、（ａ）リガンド収着に関する許容される熱力学的特徴、（ｂ）許容される濃度の重要金属およびダイオキシン／フラン類、（ｃ）多様な動物種での効力、（ｄ）長期研究での安全性、および（ｅ）ビタミン類および微量栄養素との無視し得る相互作用を含むと評価されている。
【実施例３】
【００８２】
アフラトキシン（ＡＦ）は、主として真菌であるアスペルギルス・フラバスおよびＡ．パラシチカスによって産生されるカビ増殖の有害な副産物である。天然に存在するＡＦ（例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、およびＧ２）は、ヒトおよび動物によって消費される各種食物中に別個にまたは同時に発生する有害汚染物質として特徴付けられている。アフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）は、遺伝毒性、免疫毒性および肝臓癌発癌性として特徴付けられている。急性アフラトキシン中毒症を有するヒトおよび動物は、概して、黄疸、軽度の発熱、ＧＩ出血、浮腫、抑鬱症、食欲不振、下痢、脂肪肝、腹水、腹部痛、ならびに潜在的には服用に基づく肝不全および死亡を含む症状を経験する。以前の報告は、西アフリカのベニンおよびトーゴの子供の間に認められるような、ＡＦと、成長障害、特に発育阻害（栄養不良の反映）および体重不足（急性栄養不良の指標）との間の強い用量−応答関係を明らかにしている。
【００８３】
急性ＡＦ中毒の最も激しい大発生の１つは、最近、ケニア（東アフリカ）で発生し、その地方で育てられ、しかも粗末に貯蔵され、８０００ｐｐｂもの高い濃度のＡＦで汚染されたトウモロコシから調製された食事の消費に関連付けられた。この大発生は、２００４年の１月から７月２０日までに報告された３１７名の患者の約３９．４％である１２５名の生命を奪った。以前の報告は、ヒトに向けた食物、特にトウモロコシおよびラッカセイのＡＦ汚染が、粗末な取扱いおよび貯蔵のため、ガーナにおける重要な食物安全性の問題を構成していることを示している。例えば、ＡｗｕａｈおよびＫｐｏｄｏは（１９９６年）、ガーナで上市されているラッカセイ検体での５．７〜２２１６８ｐｐｂの範囲のＡＦ濃度を報告した。ガーナでの別の研究は、「ケンケイ（ｋｅｎｋｅｙ）」（トウモロコシをベースにした一般的な食事）中の総ＡＦ濃度が、集めた標本の９４％で、６．２〜１９６．１ｐｐｂの範囲に及び、平均値は５０．９ｐｐｂであることを示した。
【００８４】
長期のＡＦＢ１曝露に関連する最も一般的な影響は、肝細胞癌（ＨＣＣ）発生率の増大である。ＡＦＢ１は、特に、アフリカのサハラ以南地域、東南アジアおよび南アメリカの熱帯地域で、ＨＣＣの病因における主要危険因子として指摘されている。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に陽性の個体におけるＡＦＢ１の発癌力は、ＨＢｓＡｇに陰性である個体に比較して約３０倍高い。したがって、特に、アフラトキシン中毒症への高い危険、またはＨＢＶに由来するＨＣＣなどのＡＦとの相乗的危険にさらされているヒトのために、食餌中のＡＦに対して効果的である介入戦略を開発し、実行することが肝要である。ＨＣＣ患者の８０％が、発展途上国で発生するという推定を考慮すれば、予防戦略は、経済的に実施可能で、文化的に受け入れられ、かつ持続可能でなければならない。
【００８５】
ＡＦが、どこにでも存在し各種の食物製品中に天然に存在する汚染物質であり、ヒトおよび動物の疾患および死亡に関連していることは、現存する科学文献中に広く記録されている。この問題は、先進国に重大な脅威を与える可能性は無いが、食物製品のＡＦ汚染は、汚染されていない食物の供給不足および貧困が重大かつ持続的な難題をもたらしている発展途上国において、相変わらず深刻な重荷である。ＡＦで汚染された食物の消費を回避することは、ヒトにおけるアフラトキシン中毒症の危険を低減するための最も基本的な取り組みの１つである。しかし、このことは、発展途上国の多くの国々にとって実行不可能であり、アフラトキシンで汚染された食餌をなんとかうまく処理し、かつアフラトキシン中毒症を治療するための実現可能な介入戦略の必要性を強調している。
【００８６】
１つの取り組みが、化学的予防である。この戦略は、ＡＦの発癌過程を遮断、遅延、逆転または調節するための天然または合成薬剤の使用を含む。多くの化学的予防薬が研究され、いくつかは、ヒトの食餌中の天然成分として存在する。多くの臨床試験で、研究者らは、オルチプラズ、クロロフィリン、および緑茶由来ポリフェノールなどの化学予防性化学物質が、各種の動物モデルおよびヒトにおいてＡＦに対して有効であることを立証している。これらの化合物は、胃腸管によって吸収され、細胞の代謝に影響を及ぼすので、それらをヒトで長期に使用するには、酵素調節の長期的影響および食餌からの必須栄養素の取り込み妨害を含む極めて慎重な評価を必要とする。この実施例では、研究を、胃腸管内で吸収されず、かつＡＦを選択的に結合し、血液、肝臓およびその他の器官に対する毒素のバイオアベイラビリティーを低下させることのできるアルミノケイ酸カルシウム系粘土を食餌に含めることに関して実施する。
【００８７】
ＮｏｖａＳｉｌ（登録商標）（ＮＳ）（Ｅｎｇｌｅｈａｒｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｓｅｌｉｎ、ニュージャージー州）は、抗ケーキング剤として使用される天然由来の加工処理されたカルシウムモンモリロナイト系粘土である。平衡吸着等温線および分子モデリング研究は、ＮＳが、平らなケトラクトン系を含むＡＦを選択的に結合することを示している。げっ歯類、ニワトリ、シチメンチョウのヒナ、ブタ、子ヒツジ、搾乳ヤギおよびウシでの以前の短期研究は、ＮＳを食餌に含めることが、ＡＦからのかなり保護をもたらすことを確認した。これらすべての研究において、ＮＳ粘土の食餌性摂取に続く観察可能な有害効果は、報告されなかった。妊娠中に２％（ｗ／ｗ）もの高い濃度で食餌性ＮＳを給餌されたスプラーグ−ドーリー（Ｓ−Ｄ）ラットでの発生毒性研究において、ＮＳに関連する母体または胎児毒性は検出されず、かつ各種の母体および胎児組織中での微量金属のバイオアベイラビリティーに関する有意な変化は現われなかった。０．２５〜２％（ｗ／ｗ）の食餌性ＮＳ粘土で治療されたＳ−Ｄラットでの最近の長期研究（６．５カ月）において、体重増加、相対的器官重量、主要器官の全体的および組織学的外観、または血液学的および血清生化学パラメーターに対する用量依存性またはＮＳ関連性の有害効果は存在しなかった。さらに、ビタミンＡおよびＥ、ならびに微量栄養素ＦｅおよびＺｎの濃度は、影響を受けなかった。
【００８８】
この実施例中で説明される臨床研究を開始するのに先立って、１）国際および連邦政府基準への準拠、および（２）ＪＥＣＦＡ基準に基づく食物のＴＤＩ（１日当たり耐容摂取量）未満の濃度を保証するために、ＮＳ粘土を、潜在的に毒性のある金属およびダイオキシン汚染物質について分析した。下表１に示す結果は、ＮＳ粘土が、義務付けられた基準を超えるいかなる汚染物質も含有しないことを示している。
【００８９】
【表１】
2009542656.tif 000005
【００９０】
各種の動物モデルで示されたようなＮＳの安全性および効力を考慮して、ＮＳをベースにした介入は、高濃度のアフラトキシンに頻繁に曝露され、アフラトキシン中毒症の危険にさらされているヒトを治療するのに有益であるとの仮説が設定された。ガーナでのＮＳを用いるヒトの臨床試験に対する先駆けとして、短期（２週間）の二重盲検第Ｉ相研究が、（１）５０名の健常ヒト志願者でのＮＳカプセルの安全性および耐容性を評価するため、および（２）ヒトでの介入研究のための最適プロトコールを確立するために実施された。ＮＳ摂取（１．５および３．０ｇ／日）の１４日後で、参加者のコンプライアンス（９９．１％）は非常によく、身体検査結果、尿検査、血清の生化学的および血液学的パラメーターは、影響を受けず、血清中の無機物ならびにビタミンＡおよびＥの濃度は、ベースライン値から有意に異なることはなかった（Ｗａｎｇら、２００５年）。その立証された安全性に加えて、食餌中０．２５％のＮＳが、ＡＦの毒性からニワトリを保護する最小有効用量であることを示しているＰｉｍｐｕｋｄｅｅら（２００４）を含む以前のインビトロおよびインビボ研究から、臨床介入試験に使用する１日当たり３．０ｇのＮＳ用量を外挿した。この研究は、西アフリカ、ガーナ国アシャンティ（Ａｓｈａｎｔｉ）州のＥｊｕｒａ−Ｓｅｋｙｅｄｕｍａｓｅ郡（ＥＳＤ）での最近の第ＩＩａ相ヒト介入研究に対する基礎を提供した。
【００９１】
アシャンティ州のＥＳＤは、ＡＦＢ１−アルブミン付加物およびアフラトキシンＭ１代謝産物が、該地域の研究参加者から採取された１４０の血清サンプルの１００％で、９１の尿サンプルの９１．２％で検出されたという報告（Ｊｏｌｌｙら、２００６年）に基づいて、介入研究現場として選択された。これらの所見は、東および西アフリカ諸国からの人々の大多数（７５〜１００％）が、血中ＡＦＢ１−アルブミン付加物に関して陽性と判定されるＷｉｌｄら（１９９２年）によって支持される。この報告で、本研究者らの主な目的は、アフラトキシン中毒症の管理のためにヒトに投与した場合のＮＳの安全性を、（１）３カ月間にわたってヒト対象におけるＮＳの潜在的有害効果を判定すること、および（２）ヒト対象における長期（第ＩＩｂ相または第ＩＩＩ相）研究のための根拠および薬量決定を確立することによって評価することであった。
【００９２】
Ｅｊｕｒａ−Ｓｅｋｙｅｄｕｍａｓｅ郡（ＥＳＤ）は、ガーナ国アシャンティ州の２１郡中の１つである。その気候条件および土壌肥沃度は、作物の作付けに都合がよく、全住民のほぼ７６％が農業に従事している。この地域で生産され消費される主要作物には、トウモロコシ、ラッカセイ、ヤムイモ、キャッサバ、綿およびタバコである（ＡｄｕおよびＭｅｎｓａｈ−Ａｎｓａｈ  １９９５年、郡保健部（Ｄｉｓｔｒｉｃｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ）、Ｅｊｕｒａ／Ｓｅｋｙｅｄｕｍａｓｅ  ２００５年）。郡保健部長およびその他の保健職員が、コミュニティーへの立入りを調整し、研究チームを郡の住民の半分以上を構成する６つのコミュニティーの指導者および居住者に紹介した。研究に先立って、これらのコミュニティー中の４つが、ＡＦのベースライン・データおよび人口統計情報を確立していた（Ｊｏｌｌｙら、２００６年）。残りの２つのコミュニティーは、全地域で最も多い人口を有するＥｊｕｒａサブ郡（ｓｕｂ−ｄｉｓｔｒｉｃｔ）にある。
【００９３】
各コミュニティーの指導者は、調査員のための会合を組織し、目的、継続期間、時間枠、参加予定者および監視員の責任、ならびに研究のその他の態様を明確にし、住民に質疑応答の時間を与えた。コミュニティーへの立入りおよび敏感化過程の後に、６つのコミュニティーから全部で５０７名の住民が、研究に参加することを志願した。インフォームドコンセント文書の説明に続き、志願者は、その文書に署名し、健康履歴および食物頻度質問表を含む調査書類を完成した。次いで、対象に、コード化した識別番号を付与し、彼らの朝一番の尿標本を採取するための滅菌され包装されたカップを提供した。サンプル採取日に、志願者は、現地医師によって実施される身体検査を受けた。また、志願者は、尿検査および妊娠状態を判定するためのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）試験のための尿標本を提出し、かつＡＦ曝露分析、肝および腎機能、および血液学のために２本の試験管に全部で１５ｍＬ（一方の試験管に５ｍＬ、別の１本に１０ｍＬ）の血液を提供した。血液標本の５ｍＬアリコートを、血液学的分析（主として、白血球数、ヘモグロビンおよびヘマトクリット）のためにガーナ国アシャンティ州、Ｅｊｕｒａ郡立病院に送付した。１０ｍＬの血液標本から集めた血清のアリコートを、アクラ市レゴン（Ｌｅｇｏｎ）地区のガーナ大学野口記念医学研究所（ＮＭＩＭＲ）での肝および腎機能検査に使用した。残りの血清サンプルは、−２０℃で貯蔵し、後にテキサス工科大学（ＴＴＵ）に送付し、各志願者のＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度を測定した。
【００９４】
研究対象として適格であった個体（男性および女性）は、次の基準、すなわち、身体検査の結果に基づく健康状態、１８〜５８歳の年齢、１週間に少なくとも４回のトウモロコシおよび／またはラッカセイをベースにした食物の摂取、０．５ｐｍｏｌＡＦＢ１−アルブミン（ｍｇ）を超える血中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度（ＬＯＤ＝０．０５ｐｍｏｌＡＦＢ１／アルブミン（ｍｇ））、慢性疾患歴がない、慢性または急性疾病に対する投薬処方がない、非妊娠および／または非授乳女性、正常範囲の血液学的パラメーター、肝および腎機能指数（血液および尿パラメーター）、および署名された同意書に合致した。異常な肝機能値（ＡＬＴ）を有する対象は、研究から除外した。したがって、急性肝炎患者は、彼らのＨＢＶ状態（ＨＢｓＡｇ陽性またはＨＢｓＡｇ陰性）にかかわらず研究に含めなかった。５０７名の志願者の中で、ＡＦ−Ａｌｂ付加物濃度以外のすべての組み込み基準に合致した３０２名の対象が存在した。その付加物濃度が合致しないものを除外したこの群から１８０名の標的集団を選択した。ＮＳが有効であるかどうかを判定し、さらにその安全性を評価するために、全部で１８０名の対象のサンプルサイズ（治療群毎に６０名）が、第ＩＩ相臨床研究のための米国ＮＩＨガイドライン（２００６年）によって要求される１００〜３００名の対象の基準に基づいて選択された。試験開始の時点で、２名の女性および１名の男性が脱落し、１７７名（男性１０１名、女性７６名）が残り、研究参加者として最終的に採用された。
【００９５】
ＮｏｖａＳｉｌ（ＮＳ）粘土は、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｓｅｌｉｎ、ニュージャージー州、米国）から入手した。初めに、ヒトでの研究に使用されるＮＳ粘土を、ポリクロル化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン／フラン類（ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ）および重金属を含む潜在的環境汚染物質について評価した。米国環境保護庁（ＵＳＥＰＡ）の重要ダイオキシン／フラン（１７品目）についてのＮＳの評価は、コロンビア・アナリチカル・サービス（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（ＣＡＳ）社（Ｈｏｕｓｔｏｎ、テキサス州、米国）によって実施された。サンプルの調製、後処理、および高分解能キャピラリーカラムガスクロマトグラフィー／高分解能質量分光法を用いる分析には、ＵＳＥＰＡ法の標準化された手順を使用した（ＵＳＥＰＡ  Ｍｅｔｈｏｄ  １６１３Ｂ）。また、ＮＳ粘土は、ＣＡＳ，Ｉｎｃ．（Ｋｅｌｓｏ、ワシントン州、米国）によって重金属（例えば、Ａｓ、Ｃｄ、ＨｇおよびＰｂ）について分析された。金属の分析手順は、標準的なＵＳＥＰＡプロトコール（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ  ６０１０Ｂおよび７４７１Ａ）に従った。ＮＳ粘土（許容される濃度の汚染物質を含む）を、適正製造規範で設定された無菌条件下でカプセル化するため、カレッジ・ファーマシー（Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）社（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、コロラド州、米国）に送付した。前の薬量測定プロトコール（Ｗａｎｇら、２００５年）に基づいて５００ｍｇのＮＳ、２５０ｍｇのＮＳまたはプラセボを含有するように、大きさ、形状および色調が同一のカプセルを製剤した。次いで、カプセルを、ほぼ１８０カプセル／容器の密封プラスチック容器中で電子ビーム照射（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、テキサスＡ＆Ｍ大学）によって滅菌した。米国でヒトの食物を滅菌するのに使用されるものと同様のプロトコールに従って、８．２〜９．４ＫＧｙの範囲の標的線量を印加した。使用されるその他すべての化学薬品、試薬および溶媒は、入手可能な最高純度で商業的に入手した。
【００９６】
全体的な研究計画は、不作為化二重盲検プラセボ対照第ＩＩ相臨床試験のためのガイドラインに従った。研究プロトコールは、ＴＡＭＵ施設内審査委員会（ＩＲＢ）およびガーナでの倫理審査のためのＮＭＩＭＲ−ＩＲＢの双方によって承認された。志願者の選抜は、２００５年９月に開始した。試験は、２００５年１２月に開始し、２００６年４月に完了した（１カ月間の試験後追跡調査を含む）。採用基準に合致した対象を、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に基づいて３つの研究群（６０名／群）にランダムに分割した。ＡＦ曝露度が最も高い最初の３名の対象を３つの群にランダムに分割し、続いて、ＡＦ曝露度が次に最も高い３名の参加者を、等々、１８０名すべての対象を分割した。二重盲検研究なので、参加者、現地の医師、看護師、およびその他すべての現場作業者は、カプセルの内容物に関する情報を有さなかった。定められた治療計画への最高のコンプライアンスを確実にし、ＮＳカプセルの重量および参加者の満足状態に対する目隠しを維持するために、訓練された研究監視者が、カプセルを毎日配達し、摂取に立会い、対象が経験した可能性のある任意の症状を記録した。身体検査を毎月実施して、研究対象の一般的健康状態を評価した。ＮＳ摂取の開始（時刻０）時点、１、２、および３カ月の時点で各参加者から尿および血液サンプルを採取した。３カ月間のカプセル摂取の後に、ＮＳ治療なしでもう１カ月間対象を観察した。４カ月間の最後に、患者は、最終の身体検査を受け、血液および尿標本を採取した。ＥＤＴＡ−血液サンプルを、自動分析計Ｓｙｓｍｅｘ  ＫＸ−２１（シスメックス株式会社、神戸、日本）を利用する血液学的分析のために、ガーナ国クマシ市のコンフォ・アノチェ・ティーチング・ホスピタル（ＫＡＴＨ）に送付した。血清の生化学的分析は、化学自動分析計（Ｅｏｓ  Ｂｒａｖｏ  Ｐｌｕｓ、Ｈｏｓｐｉｔｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、イタリア）を用いＮＭＩＭＲで実施した。ＮＭＩＭＲでの電解質分析には、電解質（Ｎａ／Ｋ）自動分析計（Ｈｕｍａｌｙｔｅ、Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ドイツ）を使用した。尿および血清サンプルの一部を、効力評価のためＴＡＭＵおよびＴＴＵに発送した。簡潔には、Ｇｒｏｏｐｍａｎら（１９９２年）によって報告され、Ｓａｒｒら（１９９５年）およびＷａｎｇら（１９９９年）が修正したプロトコールに従って、尿サンプルを、ＡＦ曝露の急性バイオマーカーであるＡＦＭ１について分析した。ＡＦへの長期曝露を示すもう１つのバイオマーカーである血清中のＡＦＢ１−アルブミン付加物を、Ｗａｎｇら（１９９６年）によって報告されたプロトコールを使用して測定した。
【００９７】
参加者は、ＩＤ番号を与えられ、次の３つの治療群、すなわち、高用量（ＨＤ）、低用量（ＬＤ）またはプラセボ（ＰＬ）の１つにランダムに割り振られた。これは、彼らは、３カ月間にわたって１日に３回（食事前に少なくとも１００ｍＬの水と一緒に）、５００ｍｇのＮＳ、２５０ｍｇのＮＳ、および２５０ｍｇのプラセボを含有するカプセルを２つ服用することを意味する。全部で、ＨＤおよびＬＤ群は、１日にそれぞれ３．０ｇ、および１．５ｇのＮＳを受け入れた。安全措置として、最も多い用量として３．０ｇのＮＳを選択した。なぜなら、その用量は、以前の動物研究に基づいてＡＦに対するＮＳのＭＥＤ（最小有効用量）に相当するからである。この研究に関する用量の選択は、また、動物モデルで以前に発表された薬量決定データ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、１９９９年、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００２年、２００６年）からの外挿、および米国での短期ヒト研究に使用されたＮＳ濃度（Ｗａｎｇら、２００５年）に基づいた。ＨＤ（１日に３．０ｇのＮＳ）は、平均的なガーナ人によって１日に消費される推定食物量のほぼ０．２５％のＮＳ（ｗ／ｗ）に相当する。さらに、この研究のＨＤ濃度に比べて８倍高い２％（ｗ／ｗ）までの食餌中ＮＳは、げっ歯類で６．５カ月間の曝露に続く有意な有害効果を示さなかった（Ａｆｒｉｙｉｅ−Ｇｙａｗｕら、２００５年）。
【００９８】
ＮＳ摂取の潜在的毒性を監視するために、症状チェックリストを開発し、評価ツールとして日々の日誌式ワークシート（ＤＤＷ）を含めた。研究監視者は、どんな有害事象でも記録し、健康上のどんな問題でも監督者および／または現地医師に報告することを求められた。調査チームの医師は、２週間毎にＤＤＷを吟味した。症状は、次の基準に基づいて評価した。すなわち、
軽度（グレード１）：わずかに厄介で、対症治療で軽減される、
中度（グレード２）：厄介で、活動を妨害し、対症治療で部分的にのみ軽減される、
重度（グレード３）：通常活動を妨げ、対症治療では軽減されない。
【００９９】
研究中に症状（群）が報告されたらいつでも、必要な場合、研究中に確認のために身体検査および実験室での分析を実施した。対象は、現地医師によって治療され、症状がＮＳ摂取に関連しているとは認められない場合、研究継続を許された。症状がＮＳカプセルと関連している場合、参加者は、治療され、カプセル摂取を中止することを求められた。現地医師は、調査員およびＮＭＩＭＲおよびＴＡＭＵのＩＲＢにどんな有害効果でも報告するために、米国ＮＩＨのガイドライン下で開発された有害事象報告文書にアクセスした。
【０１００】
ＮＭＩＭＲのデータ管理チームは、コード化された対象の識別番号を使用して、すべてのデータを入力した。調査員以外の職員は、参加者の氏名にアクセス不能であった。質問表、臨床報告、摂取および毒性監視のためのＤＤＷ、ならびに有害事象発現からのすべてのデータを入力し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌのソフトウェアを使用して管理した。データ入力過程を完結したら、２名の調査員が、記録されたデータを独立に見直して、正確性を確保した。
【０１０１】
ＮＳカプセル摂取の安全性を示すために、統計的評価は、異なる治療濃度および異なる時点間での比較に焦点を合わせた。各パラメーターについて、平均、標準偏差およびメディアンを計算し、該パラメーターの値を、特記しない限り、平均±ＳＤとして表現した。正規分布であったパラメーターに対して、二元配置のＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ法を使用して、異なる治療アームおよび時間経過での平均間の有意差を比較した。アドヒアレンスおよび副作用／毒性データの比率の分析にはカイ二乗検定を使用した。正規分布でなかったパラメーターに対しては、クラスカル−ウォリスの検定またはウィルコクソンの順位和検定を使用して、異なる治療群および異なる時点間での相違を比較した。０．０５未満のＰ値（両側）を有意と見なした。すべての解析は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．１．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ノースカロナイナ州、米国）を用いて行った。
【０１０２】
ＮＳ粘土中のダイオキシン／フラン類および金属の量を分析した。１７種のＵＳＥＰＡ重要ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦの中で、ＮＳ中に検出限界（ＬＯＤ＝ＨｐＣＤＤで１兆分の１．１１部（ｐｐｔ）、ＯＣＤＤで１．９１ｐｐｔ）を超えて存在するのは、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＨｐＣＤＤ）およびオクタクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＯＣＤＤ）の２つだけであった。ＮＳ粘土中のＨｐＣＤＤおよびＯＣＤＤの平均濃度は、それぞれ、４．４２および２３．７４ｐｐｔであった。毒性等価係数（ＴＥＦ）（ＷＨＯ  １９９８年）を適用すると、これらのダイオキシンの毒性（またはＴＣＤＤ）等量（ＴＥＱ）値は、ＨｐＣＤＤおよびＯＣＤＤに対して、それぞれ０．０４４２および０．００２３７ｐｐｔと計算され、ＮＳ中の合わせたＴＥＱは０．０４６６ｐｐｔであった。ＨＤ治療において、３．０ｇのＮＳは、１日に０．１３９７ｐｇのＴＥＱを提供した。ＷＨＯの基準によれば、ＴＣＤＤのヒト耐容摂取量（ＴＨＩ）は、１日に体重ｋｇ当たり２．３ｐｇであり、換算すれば、７０ｋｇの男性に対して１日に１６１ｐｇ、６０ｋｇの女性に対して１日に１３８ｐｇとなる。これらの値に基づいて、１日に３．０ｇのＮＳに由来するＴＥＱは、平均的な女性および男性に対して、１日のＷＨＯ−ＴＨＩ基準に比べそれぞれほぼ１０００分の１および１１００分の１であった。Ａｓ、ＣｄおよびＰｂなどの重金属は、１日３ｇのＮＳ中に、基準勧告値（ＪＥＣＦＡ、１９９８年）に比較して７分の１〜８０分の１の範囲である濃度（データは示さない）を有した。Ｈｇは、使用した分析方法による検出限界（ＬＯＤ＝０．００９ｍｇ／ＮＳ（ｋｇ））未満であることが見出された。
【０１０３】
審査された５０７名すべての志願者は、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物に関して陽性（範囲：０．１〜４．７ｐｍｏｌＡＦＢ１／アルブミン（ｍｇ））であった。下表２は、研究に登録された対象の人工統計学的特徴を示す。初めに、本発明者らは、規定された組み込み基準に基づき全部で１８０名の研究集団を選択し、参加者の血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に基づいて、彼らをランダムに３群（１群６０名）−ＨＤ、ＬＤおよびＰＬ−に分割した。治療日が始まって直ぐに、３名の対象（ＬＤ群から１名、ＰＬ群から２名、２名の女性が妊娠し、１名の男性が新しい仕事のため辞退）を除外した。３カ月間のＮＳ摂取の後に、年齢、体重および拡張期血圧などの身体パラメーターは、有意には影響を受けなかった。試験終末の時点で、収縮期血圧（ＳＢＰ）の平均値は、臨床的に重要ではないが、ＬＤの１２１．９±２３．１およびＰＬの１２９．９±２４．５ｍｍＨｇのベースライン値に比較して、それぞれ１１２．７±１５．０ｍｍＨｇおよび１１７．４±１９．８ｍｍＨｇに有意に低下した（Ｐ＜０．０１）。ＨＤ群のＳＢＰは、変化していなかった。
【０１０４】
【表２】
2009542656.tif 000006
【０１０５】
３カ月間全部の試験を完了した研究参加者の割合は、ＨＤ、ＬＤおよびＰＬで、それぞれ９０．０％、８９．８％、および９４．８％であり、研究を完了した対象の総数は、９１．５％となった。１７７名の研究対象中、全部で１５名（ＨＤから６名、ＬＤから６名、ＰＬから３名）が、研究を完了しなかった。コンプライアンスに関して、ＨＤ、ＬＤおよびＰＬ群のそれぞれ９７．４％、９６．４％および９８．６％の参加者が、研究プロトコールによるＮＳ−治療計画を支持、厳守した。参加者の間での総合的なアドヒアレンス（カプセル服用回数）は、彼らが研究を完了したかどうかにかかわらず、９７％以上であった。参加者のコンプライアンスおよび研究完了を示すデータを、下表３に要約する。
【０１０６】
【表３】
2009542656.tif 000007
【０１０７】
参加者が研究監視員に報告した症状を、下表４に示す。ＮＳの用量水準（１日に１．５または３．０ｇ）は、ＨＤおよびＬＤ群の参加者に対して耐容性があった。報告された症状には、吐き気、嘔吐、下痢、腹部不快感、胸やけおよび眩暈が含まれていた。報告された症状の５０％超が、研究の最初の２週間中に発生し、残りは、その後研究の終末までに間欠的に報告された。４５名の参加者（ほぼ５６％が男性、４４％が女性）が、３つのすべての群にわたって−ＨＤ群から１７件（３７．８％）、ＬＤ群から１３件（２８．９％）およびＰＬ群から１５件（３３．３％）、これらの症状の少なくとも１つを報告した。吐き気の症状発現を除き、これらの効果のいずれも、用量依存性またはＮＳ関連性であるとは思われなかった。これらの症状の大部分は、３名を超える人々によって報告されたが特に用量依存的傾向のない嘔吐、下痢、胸やけおよび眩暈を除いて、いずれかの群の１〜３名の対象によって報告された。例えば、ＨＤ群のたった１人の４４歳の女性の対象は、報告された２８回の眩暈（表ＩＩＩ）中の２０回に責任があった。胸やけの発生も、ＬＤ群で高いと思われるが、たった２名の対象が、該効果を報告し−１名の対象が、記録された２２回中の１８回を報告している。症状のほとんどは、「軽度」と、それらのほんの少しが「中度」と等級付けられ、それらのどれも「重度」の範囲ではなかった。期間の９９％超で、参加者は、研究中、健康に有害な結果を報告しなかった。
【０１０８】
【表４】
2009542656.tif 000008
【０１０９】
下表５に示す血液学的分析において、３カ月間の試験の前後で３治療群間のいずれのパラメーターでも有意で用量依存性のある影響はなかった（データは示さない）。時間経過効果に関して、白血球細胞（ＷＢＣ）の差異分析で、％単球のみが、ＨＤ群ではベースライン値（３．２±２．１％）に比較して、試験終末時点（２．２±１．７％、平均±ＳＤ）（Ｐ＜０．０５）で、ＰＬ対照群ではベースライン値（３．４±１．７％）に比較して、試験終末時点（２．５±２．１％）（Ｐ＜０．０１）で有意な低下を示した（表ＩＶ）。この効果は、ＬＤ群では観察されなかった。他のすべてのパラメーターは、影響を受けなかった。さらに、ＮＳ−治療群（ＨＤおよびＬＤ）およびプラセボ（ＰＬ）群の間で、評価したすべてのパラメーターに関して有意差は観察されなかった。
【０１１０】
【表５】
2009542656.tif 000009
【０１１１】
血清の生化学分析は、下表６に示すように、ほんの少しのパラメーターで単発的な統計的有意差を示した。アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度は、ＰＬ群でのみベースライン値に比較して試験終末の時点で有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。総ビリルビン（Ｔ−ＢＩＬＩ）含有量は、３カ月間のＮＳ摂取の後にＨＤ群（Ｐ＜０．０１）およびＰＬ群（Ｐ＜０．０５）でわずかに減少した。この効果は、ＬＤ群では現われなかった。また、血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度は、ベースライン値に比較して研究終末の時点ですべての治療群で有意に低下した。血清中クレアチニン（ＣＲＥＡＴ）濃度は、試験終末の時点ですべての群でわずかに増加した（Ｐ＜０．０１）。ナトリウム濃度は、ベースライン値に比較して試験終末の時点でＨＤ群およびＬＤ群で有意に増加した。この効果は、ＰＬ群では現われなかった。ＰＬ群のカリウム濃度は、ベースライン値に比較して試験終末の時点でわずかに低下した（Ｐ＜０．０１）。これらすべての生化学的効果に関して、試験終末の時点でＮＳ治療群とプラセボ群との間で統計的有意差は観察されなかった。評価したその他すべての血清生化学パラメーターは、影響を受けなかった。２名の医師（１人は、ガーナで臨床医を開業し、１人は米国で非開業）が、研究で評価されたすべてのパラメーターの結果を検証した。
【０１１２】
【表６】
2009542656.tif 000010
【０１１３】
この研究の結果は、３カ月間にわたるＮＳカプセルの投与（１日に１．５ｇおよび３．０ｇ）は、身体検査、血液学および生化学パラメーターによって証明されるように、明らかに安全であった。不作為化二重盲検およびプラセボ−対照計画に加え、潜在的な交絡変数を最小にするためにかなりの努力を行った。例えば、ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦの分析は、ＨＤ群およびＬＤ群が、ＷＨＯ−ＴＨＩの基準に比べて１０００分の１および２０００分の１のカプセル化ＮＳ中のダイオキシンを受け入れたことを示した。ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ同族体が、脂肪組織中に蓄積し、ヒトに対して高毒性になる場合があるので、このことは重要である（Ｓｔａｒｔｉｎら、１９９０年、Ｊｅｎｓｅｎ、２００１年）。
【０１１４】
研究参加者は、あらかじめ定めた組み込み基準に基づいて選択したが、不作為化過程は、彼らの血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に基づいて厳密に実施した。この意図的な計画の特徴は、性別およびコミュニティー代表に関して（グループごとの）参加者数の不均衡につながった。体重および血圧値は、用量依存式での影響を受けなかった。治療計画に対する参加者のアドヒアレンスは、優秀であり（９７％超）、９０％を超える研究対象が研究を完了したが、このことは、３カ月間の研究にとって注目すべきである（表ＩＩ）。ＮＳの用量水準は、参加者に対して耐容性があった。報告されたほんの少数の症状のいずれも、吐き気を除いてＮＳ関連性であるとは思われなかった。しかし、３カ月間の試験中に、ＨＤおよびＬＤ群で、それぞれ、たった１人が吐き気を６回報告し、１人が吐き気を４回報告した。
【０１１５】
血液学的分析は、試験終末の時点でＮＳ治療群とＰＬ対照群との間で用量依存性の有意差はなかった。ＨＤおよびＰＬ群において、白血球差異分析は、ベースラインと試験終末との間で％単球の有意な低下を示した。しかし、この効果は、十分に臨床基準範囲内にあり、ＬＤ群では観察されなかった（表４）。その他すべてのパラメーターは、ＮＳ治療群とプラセボ対照群との間で統計的に同等であった。このことは、食餌性ＮＳが、炎症過程を促進し、免疫を障害し、骨髄変化を引き起こし、あるいは感染性疾患発生率の増大につながるとは思われないことを示唆している。
【０１１６】
血清の生化学的分析は、ほんの少数のパラメーターで単発的な統計的有意差を示し、関連または用量依存性の特別な傾向はなかった（表５）。さらに、測定されたすべてのパラメーターは、正常な生理学的範囲に包含された。全体的に見て、これらのパラメーターの効果は、用量依存性を欠き、そのため、ＮＳは、これらの標準的な生化学パラメーターの生理学的濃度に対して有意な有害効果を示さなかったことを示唆している。
【０１１７】
この第ＩＩａ相臨床介入試験は、ヒト対象における食餌性ＡＦを防ぐためのＮＳ粘土の安全性および効力を評価する。ほんの少数のパラメーターの有意な変化が観察されたが、その効果は、ＮＳ関連性または用量依存性であるとは思われず、すべては、正常な生理学的境界線内にあった。この証拠は、０．２５％（ｗ／ｗ）最小有効用量（ＭＥＤ）でのＮＳの短期組み込みは、ヒトでの明らかな毒性をおそらく生み出さないことを示唆している。重要なことに、これらの所見は、高濃度の食餌性ＡＦへ急性的に曝露されるヒトを救出および保護するためにＮＳを使用することの有望性を支持している。さらなる研究は、ＮＳの薬量決定および送達方法を最適にするため正当化される。第ＩＩｂ相および第ＩＩＩ相介入および疫学的研究は、長期療法、ならびにＨＢＶの高い発生率／罹患率を有する地域のおよびアフラトキシン中毒症の高い危険にさらされているヒトのための食物中への潜在的組み込みに向けて、ＮＳの安全性および効力を確認するためにも必要とされる。
【実施例４】
【０１１８】
アフラトキシン（ＡＦ）への食餌性曝露は、肝傷害を引き起こすことに加え、血清および組織中のビタミンＡおよびＥの濃度を低下させる。ヒトにおけるこれら２種のビタミンの利用に対するＮＳの影響をさらに評価するため、上記実施例３で実施された第ＩＩａ相臨床試験で、３カ月間、１．５ｇＮＳ／日（低用量）、３．０ｇＮＳ／日（高用量）、またはプラセボを受け入れた１７７名の健常ガーナ人志願者を含む個体から０、１、および３カ月の時点で採取した６５５の血清サンプルで、ビタミンＡおよびＥの濃度をＨＰＬＣ法により測定した。各参加者からの血液サンプルを、開始時点（期間０、ベースライン、ＢＬ）、１カ月（４週、Ｗ４）、３カ月（１２週、Ｗ１２）、および試験完了後１カ月の時点（１６週、Ｗ１６）で採取した。
【０１１９】
血清中ビタミンＡおよびＥを、液液抽出法を使用して抽出し、続いて、ＵＶ検出器を具備したＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ（Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州）ＨＰＬＣ装置を用いて分析した。グラジエントは、ビタミンＡ（３２５ｎｍで検出）およびビタミンＥ（２９２ｎｍで検出）を同時的に溶離するように調整した。サンプル定量のための標準曲線を作製した。ビタミンＡおよびＥの濃度を、血清サンプルの容積によって調整した。
【０１２０】
より具体的には、ヒト血清中ビタミンＡ（ＶＡ）およびＥ（ＶＥ）を、以前に発表されている手順（Ｒｕｐｅｒｅｚら、２００４年）に従って、弱められた赤色灯下で抽出した。簡潔には、ヒト血清サンプル（５０ｍＬ）を１５０ｍＬのエタノール：クロロホルム（３：１、ｖ／ｖ、０．０１％のＢＨＴ酸化防止剤を含む）と混合し、タンパク質を沈殿させ、１．５ｍＬのミクロ遠心管中、３００ｍＬのヘキサンでさらに抽出した。遠心後、ヘキサン層を除去し、Ｃｅｎｔｒｉｖａｐ（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ、ミシシッピー州）で乾燥した。残留物を、Ｂｕｒｒｉら（２００３年）の手順に従って、３００ｍＬの移動相を用いてＨＰＬＣ分析用に再構成した。分析は、Ｐ４０００ポンプ、１００ｍＬループ付きＡＳ３０００オートサンプラー、およびＵＶ６０００ＬＰフォトダイオードアレイ検出器を具備したＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇｅｎ液体クロマトグラフ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｉｖｉｅｒａ  Ｂｅａｃｈ、フロリダ州）を使用して実施した。クロマトグラフィー分離は、長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒子径５ｍｍのＭｉｃｒｏｓｏｒｂ  １００−５  Ｃ１８カラム（Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）を用い、５０ｍＬの注入容積、１ｍＬ／分の流速下で移動相Ａ（８５：５：５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖのＡＣＮ：ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：ＡＡ）および移動相Ｂ（５５：３５：５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖのＡＣＮ：ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：ＡＡ）を使用して達成した。溶離プロフィールは、最初の５分間は９５％Ａ＋５％Ｂ、続いて、１３分にわたる５％Ａ＋９５％Ｂまでのグラジエントから構成した。その後、条件を２分間維持し、次いで、カラムを９５％Ａ＋５％Ｂで８分間洗浄した。総分析時間は２８分であった。両ビタミンの定量は、ピーク面積および保持時間の参照標準との比較に基づいた。
【０１２１】
血清中ビタミンＡおよびＥの濃度について平均、メディアン、および標準偏差（ＳＤ）を計算し、値を平均±ＳＤとして表した。３つの治療群の異なる時点での血清中ビタミンＡおよびＥ濃度の比較は、ＡＮＯＶＡまたはクルスカル−ウォリスの検定を使用して実施した。ビタミンＡおよびＥの濃度に対するＮＳ治療の用量および時間経過効果を、ノンパラメトリック混合モデルを使用して解析した。０．０５未満のＰ値（両側）を統計的に有意と見なした。すべてのデータは、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．１．３．（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ノースカロライナ州）を使用して解析した。
【０１２２】
研究対象の血清中ビタミンＡ濃度に関する結果を下表７に示す。ビタミンＡの血清中ベースライン濃度は、プラセボ群（２．０９±０．５６μｍｏｌ／Ｌ）、低用量群（２．１５±０．７４μｍｏｌ／Ｌ）、および高用量群（２．１４±０．９２μｍｏｌ／Ｌ）に関して同等であった（Ｐ＝０．８７０２）（図４ａ）。１カ月目のサンプルで、低用量群（２．２８±０．８５μｍｏｌ／Ｌ）、高用量群（２．２１±０．９５μｍｏｌ／Ｌ）およびプラセボ群（２．２１±０．５７μｍｏｌ／Ｌ）の間で有意性は見出されなかった（Ｐ＝０．７３２４）（図４ｂ）。３カ月目のサンプルで、低用量群（２．２２±０．８７μｍｏｌ／Ｌ）、高用量群（２．３０±０．７１μｍｏｌ／Ｌ）およびプラセボ群（２．３２±０．８３μｍｏｌ／Ｌ）の間で有意性は見出されなかった（Ｐ＝０．７３０５）（図４ｃ）。さらに、ビタミンＡ濃度は、試験後１カ月の時点で採取したサンプル中での治療群およびプラセボ群の間で統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．３６６５）（図４ｄ）。
【０１２３】
【表７】
2009542656.tif 000011
【０１２４】
研究対象の血清中ビタミンＥ濃度に関する結果を下表８に示す。ビタミンＥの血清中ベースライン濃度も、プラセボ群（１６．０７±４．７４μｍｏｌ／Ｌ）、低用量群（１６．４０±５．０８μｍｏｌ／Ｌ）、および高用量群（１５．６４±４．９７μｍｏｌ／Ｌ）に関して同等であった（Ｐ＝０．６７９８）（図５ａ）。１カ月目のサンプルで、低用量群（１７．９±４．９９μｍｏｌ／Ｌ）、高用量群（１７．０８±４．８３μｍｏｌ／Ｌ）およびプラセボ群（１７．３２±４．９７μｍｏｌ／Ｌ）の間で有意性は見出されなかった（Ｐ＝０．５８６８）（図５ｂ）。３カ月目のサンプルで、低用量群（１７．０３±４．７１μｍｏｌ／Ｌ）、高用量群（１７．３３±４．２１μｍｏｌ／Ｌ）およびプラセボ群（１８．０１±６．２９μｍｏｌ／Ｌ）の間で有意性は見出されなかった（Ｐ＝０．７６１８）（図５ｃ）。さらに、ビタミンＥ濃度は、試験後１カ月の時点で採取したサンプル中での治療群およびプラセボ群の間で統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．１５４３）（図５ｄ）。
【０１２５】
【表８】
2009542656.tif 000012
【０１２６】
結果は、３カ月間にわたるＮＳ粘土での食餌性介入が、研究参加者の血清中ビタミンＡおよびＥ濃度に有意な影響を及ぼさなかったことを示している。これらの結果は、アフラトキシン中毒症（および潜在的栄養不良）の高い危険にさらされている集団におけるＮＳ介入が、これらの重要な微量栄養素の利用を妨害しないことを示している。
【実施例５】
【０１２７】
ＮＳのヒトへの影響をさらに評価するために、前記実施例３で実施された第ＩＩａ相臨床試験において、研究の開始および終末時点で対象の血清サンプル中の無機物（栄養素および非栄養素として分類される）濃度を測定した。栄養性無機物には、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ、Ｎａ、Ｐ、Ｓ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、およびＳｅを含めた。非栄養性無機物には、Ａｇ、Ａｌ、Ａｓ、Ｂａ、Ｂｅ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｌｉ、Ｐｂ、Ｓｂ、Ｓｒ、Ｔｉ、Ｔｌ、Ｕ、およびＶを含めた。研究の個体には、１７７名の健康なガーナ人志願者を含め、彼らは、１．５ｇＮＳ／日（低用量）、３．０ｇＮＳ／日（高用量）、またはプラセボを３カ月間受け入れた。
【０１２８】
ヒト血清サンプル中の微量無機物の分析は、次のように測定した。血清サンプル（ほぼ０．４５ｇ）を、１５ｍＬの遠心管中で２００ｍＬの濃硝酸と混合し、９０℃で一夜加熱し、冷却した。次いで、１００ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２を添加し、サンプルを７０℃で１時間加熱し、冷却し、次いで、５０ｍＬの濃塩酸を添加し、サンプルを７０℃で１時間加熱し、冷却し、次いで、サンプルを精製水で１０ｍＬの最終容積にした。水銀（Ｈｇ）濃度は、還元剤として塩化第一錫を用い、Ｍ−７５００（Ｃｅｔａｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｍａｈａ、ネブラスカ州）を使用する冷却蒸気原子吸光法（ＣＶＡＡ）で測定した。アルミニウム（Ａｌ）、ホウ素（Ｂ）、バリウム（Ｂａ）、ベリリウム（Ｂｅ）、カルシウム（Ｃａ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、モリブデン（Ｍｏ）、ナトリウム（Ｎａ）、リン（Ｐ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、および亜鉛（Ｚｎ）は、軸方向観測を備えたＣｉｒＯＳ（Ｓｐｅｃｔｒｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、マサチューセッツ州）および内部標準としてのイッテルビウム（Ｙｂ）を使用する誘導結合プラズマ−発光分光計（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を用いて測定した。銀（Ａｇ）、ヒ素（Ａｓ）、カドミウム（Ｃｄ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉛（Ｐｂ）、セレン（Ｓｅ）、およびタリウム（Ｔｌ）は、Ａｓ、Ｃｒ、Ｍｎ、およびＳｅをＤＲＣ方式で結合するＥｌａｎ  ６１００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、マサチューセッツ州）および内部標準としてのビスマス（Ｂｉ）、ガリウム（Ｇａ）、およびロジウム（Ｒｈ）を使用する誘導結合プラズマ−質量分光計（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて測定した。ブランク、スパイク・ブランク、２組のサンプル、およびスパイク・サンプルに加え、標準参照材料（Ｓｅｒｏｎｏｒｍ、Ｂｉｌｌｉｎｇｓｔａｄ、ノルウェー）を調製し、サンプルの各バッチと一緒に分析し、結果を検証した。結果を下表９および１０に示す。
【０１２９】
【表９】
2009542656.tif 000013
【０１３０】
【表１０】
2009542656.tif 000014
【０１３１】
カルシウム、カリウムおよびモリブデンを除いて、分析した無機物のほとんどの濃度に有意差は見出されなかった。血清中ＣａおよびＫ濃度は、正常範囲内であった。Ｍｏに関する正常範囲値は、入手できなかった。血清中バリウムおよびストロンチウムだけが、研究終末の時点で有意に増加した非栄養性金属であった。これらの二価カチオンの上昇を評価することは、臨床基準値を入手できないので、困難である。ストロンチウムおよびバリウムは、双方とも、食物および水中に天然に存在し、３ｇ（高）用量のＮＳ粘土中に含まれるＳｒおよびＢａの濃度は、食物に対して外挿されたＴＤＩを十分に下回る。結論として、これらの研究の結果は、ＡＦへの曝露を遮断または有意に減少させるため、かつＡＦで汚染された穀類を消費するヒトにおけるＡＦの有害効果を予防するために、ヒトの食餌中でＮＳ粘土を使用することの有望性を支持している。さらに、Ａｌなどのフレームワーク・ミネラルは、胃および腸管から有意には生物学的に利用できない。ＮＳ粘土への曝露により有意に増加した無機物は、ＢａおよびＳｒだけであり、これらの金属に関する臨床基準値の正常範囲は、入手できない。
【実施例６】
【０１３２】
各種の粒子径を含むＣＡＳＡＤ粘土中に存在するダイオキシンの量、および８０ミクロン未満の粒子のみを含むように分粒された後のＣＡＳＡＤ粘土中に存在するダイオキシンの量を前述のように測定した。分粒の前に、ＣＡＳＡＤ粘土は、下表１１に示す量のダイオキシンを含んでいた。
【０１３３】
【表１１】
2009542656.tif 000015
【０１３４】
表１１に示したように、分粒前のＣＡＳＡＤ粘土は、０．１２１ｐｇ／Ｌのヘプタ−クロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（１，２，３，４，６，７，８−ＨｐＣＤＤ）および１．２４３ｐｇ／Ｌのオクタ−クロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＯＣＤＤ）を含んでいた。さらに、全テトラ−ダイオキシンは１．２８４ｐｇ／Ｌと測定され、全ペンタ−ダイオキシンは１．８２０ｐｇ／Ｌと測定され、全ヘキサ−ダイオキシンは１．９９４ｐｇ／Ｌと測定された。試験したその他のダイオキシンは、存在しないか、あるいは試験装置の検出限界未満の濃度であった。次いで、ＣＡＳＡＤ粘土を、大きさが８０ミクロン未満の粒子だけを含むように分粒した。ダイオキシン含有量について同様の分析を実施した。結果を下表１２に示す。
【０１３５】
【表１２】
2009542656.tif 000016
【０１３６】
結果は、８０ミクロン未満の粒子径を有するＣＡＳＡＤ粘土で、ダイオキシン含有量が大きく低下していることを示している。検出される残留ダイオキシンは、オクタクロル化ダイオキシン（ＯＣＤＤ）だけであり、量は０．３６２ｐｇ／Ｌに低下した。
【実施例７】
【０１３７】
主としてアスペルギルス・フラバスおよびアスペルギルス・パラシチカスによって産生されるアフラトキシン（ＡＦ）は、食物の危険な汚染物質として長く認識されてきた一群の天然に存在する真菌代謝産物（マイコトキシン）を代表する。アフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）は、肝毒性および遺伝毒性があり、既知のヒト発癌性物質（グループＩ）として分類されている。食餌を介する高濃度ＡＦＢ１への急性曝露は、ケニアでの最近の大発生を含む多数の報告によって証明されるように、ヒトでの疾患（アフラトキシン中毒症）および死亡を引き起こす。低濃度ＡＦへの長期曝露は、アフリカおよび東南アジアのいくつかの地域でのヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の病因における主要危険因子の１つである。重要なことに、ＡＦＢ１は、動物およびヒトにおける強力な免疫毒性物質であることも示されている。したがって、アフラトキシン中毒症のための実際的で高度に有効な介入戦略および療法の開発および適用は、特に、高い危険にさらされている集団でのヒトの健康を改善するために決定的に重要である。
【０１３８】
ヒトおよび動物は（数世紀の間、およびほとんどの世紀）、粘土鉱物を食してきたことが報告されている（土食症）。この行動の理由は、概して不明確に定義されているが、粘土摂食は、通常、有益かつ安全であると考えられている。例えば、自然と密接な接触状態にある人々による粘土摂食は、極めて普通であり、南米およびアフリカの多くの部分で、食餌での粘土の使用は、文化的に許容される。ＮｏｖａＳｉｌ粘土（ＮＳ）は、動物飼料の抗ケーキング添加剤として一般的に使用される、天然に由来し、かつ熱処理されたカルシウムモンモリロナイトである。以前の研究は、ＮＳが、動物モデルで食餌中に０．５％（ｗ／ｗ）までの濃度で含められた場合に、アフラトキシンに対する選択的腸内収着剤であることを示している。ＮＳは、ニワトリ、シチメンチョウのヒナ、ブタ、子ヒツジ、およびげっ歯類を含む各種の若い動物をアフラトキシン中毒症から有意に保護した。さらに、ＮＳは、また、げっ歯類におけるＡＦ曝露のバイオマーカーに加え、搾乳ウシおよびヤギからの乳中のＡＦ残留を低下させた。機構的には、ＮＳは、胃腸管内でのＡＦの取り込みを低下させ、有意に低下したＡＦ曝露および結果としての毒性をもたらす。平衡吸着等温線および分子モデリング研究から得られる情報は、ＮＳが、平らなケトラクトン系を含むＡＦに対して好みを有することを示している。
【０１３９】
食餌へのＮＳの添加に続く短期動物研究で、観察できる有害効果は報告されていない。妊娠中に２．０％もの高い食餌中濃度でＮＳを摂取しているスプラーグ−ドーリー（Ｓ−Ｄ）ラットで、母体または胎児毒性は見出されなかった。さらに、各種の母体または胎児組織中で、微量金属のバイオアベイラビリティーの有意な変化は見出されなかった。長期研究で、６カ月間にわたって食餌中０．２５〜２．０％のＮＳ粘土で治療されたＳ−Ｄラットは、体重増加、飼料変換率、相対的器官重量、主要器官の全体的および組織学的外観、および血液学的および血清生化学パラメーターに対して用量依存性の有害効果を示さなかった。また、ビタミンＡおよびＥ、Ｆｅ、ならびにＺｎを含む必須栄養素濃度は、影響を受けなかった。
【０１４０】
多様な動物モデルにおけるＮＳの安全性および効力、さらにはその低い費用を考慮すると、発展途上国でアフラトキシン中毒症の高い危険にさらされているヒトの食餌中にＮＳを含めることは、特に有益である可能性がある。初めに、健康な志願者における２週間の第Ｉ相臨床試験は、３ｇ／日までの１日当たりＮＳ摂取量が、ヒト対象に対して有意な有害効果を有さないことを示した。この研究からの所見に基づいて、３カ月間の不作為化二重盲検プラセボ対照第ＩＩａ相介入試験を、彼らの食餌に由来するＡＦに曝露された１８０名のガーナ人で実施した。この実施例で、ＮＳ介入の効力は、研究前（ベースライン）、介入１カ月および３カ月、および介入終了後１カ月の時点で採取された血清および尿サンプル中のバイオマーカーを分析することによって評価した。この研究の結果は、ＡＦへの曝露を遮断または有意に減少させるため、かつＡＦで汚染された食物を消費するヒトにおけるＡＦの有害効果を予防するために、ヒトの食餌中でＮＳを使用することの有望性を支持している。
【０１４１】
［３Ｈ］−ＡＦＢ１（２８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｒｅａ、カリフォルニア州、米国）から購入した。標準ＡＦＢ１、Ｍ１およびラジオイムノアッセイ試薬は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）から入手した。モノクロナール抗体２Ｂ１１は、親切にも、ＭＩＴのＧ．Ｎ．Ｗｏｇａｎ博士から提供された。イムノアフィニティ・カラムは、ＶＩＣＡＭ社（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。ＮＳ粘土は、初めに、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｓｅｌｉｎ、ニュージャージー州、米国）から入手し、さらに、連邦政府および国際基準への準拠を保証するために、前に詳細に発表されているように（Ａｆｒｉｙｉｅ−Ｇｙａｗｕら、２００７年、Ｗａｎｇら、２００５年）、ポリクロル化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン／フラン類（ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ）および重金属を含む潜在的環境汚染物質についてさらに調べた。ＮＳカプセルは、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｈａｒｍａｃｙ社（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、コロラド州）で適正製造規範（ＧＭＰ）に従った無菌条件下で調製した。組み合わせるプラセボを含むすべてのカプセルは、同一の大きさ、形状および色調とした。使用するその他すべての化学物質および試薬は、特記しない限り、入手し得る最高純度で商業的に入手した。
【０１４２】
Ｅｊｕｒａ−Ｓｅｋｙｅｄｕｍａｓｅ郡（ＥＳＤ）からの４つのコミュニティーおよびＥｊｕｒａサブ郡からの２つのコミュニティーが、研究対象の選抜ために選択された。これらの２つの郡は、その全住民のほぼ７６％が主として農業に従事している、ガーナのアシャンティ州に属する。この地域で主として栽培される作物には、トウモロコシ、ラッカセイ、ヤムイモ、キャッサバ、綿、およびタバコが含まれる。ＡＦ曝露データ、および人口統計学的情報は、これらの４つのコミュニティーで、この研究に先立って確立された（Ｊｏｌｌｙら、２００６年）。
【０１４３】
試験は、２００５年９月に開始され、２００６年４月に完了した。全体的な研究計画は、前に前記実施例中で説明したように、不作為化二重盲検プラセボ対照第ＩＩ相臨床試験に対するガイドラインに従った。研究プロトコールは、テキサスＡ＆Ｍ大学の施設内審査委員会、およびガーナでの倫理審査のための野口記念医学研究所施設内審査委員会によって承認された。図６は、全体的な研究計画およびサンプル採取手順の流れ図を示す。簡潔には、次の基準、すなわち、インフォームドコンセント、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度＞０．５ｐｍｏｌＡＦＢ１／アルブミン（ｍｇ）、年齢１８〜５８歳、身体検査結果に基づく健康状態、血液学的パラメーター、肝および腎機能指数、慢性疾患病歴の不在、慢性または急性疾病のための処方薬の不使用、および女性の場合は非妊娠および／または非授乳に合致する全部で５０７名の選抜された志願者から、１８０名の対象を採用した。これらの参加者は、３つの群、すなわち、３．０ｇ、１．５ｇ、およびプラセボの中の１つにランダムに割り当てられ、３カ月間にわたって１日に３回（食前に少なくとも１００ｍＬの水と一緒に）５００ｍｇのＮＳ、２５０ｍｇのＮＳ、または２５０ｍｇのプラセボを含有するカプセルを２つ服用した。用量の選択は、以前の動物研究（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９９年、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００２年、２００６年）および米国での短期ヒト研究からの薬量決定データ（Ｗａｎｇら、２００５年）中で示されたＮＳの効力および安全性に基づいた。研究開始時（ベースライン）、介入１カ月および３カ月の時点、および試験終了後１カ月の時点で各研究参加者から血液および尿サンプルを採取した。血清、血漿、赤血球を直ちに分離し、−２０℃で貯蔵した。朝の尿サンプルを採取し、容積を測定し、５０ｍＬのアリコートを−２０℃で貯蔵した。各サンプルのアリコートを、バイオマーカーの分析のため凍結してテキサスＡ＆Ｍ大学およびテキサス工科大学に発送した。分析を実施した実験室職員には、サンプル供給源を隠した。
【０１４４】
血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物は、定量的ＲＩＡ法（Ｗａｎｇら、１９９６年）によって測定した。簡潔には、血清サンプルを、濃縮し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。ブロモクレゾールパープル染料結合法（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）で血清アルブミンを定量し、ブラッドフォード法（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｐｏｒｔ、イリノイ州、米国）を使用して総タンパク量を測定した。続いて、全タンパク質をプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国）で消化し、消化物をアセトンで抽出した。それぞれ２ｍｇのタンパク質を含有する２組の血清タンパク質消化物中のＡＦＢ１−アルブミン付加物をＲＩＡ法で定量した。合わせた正常ヒト血清標準（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）を使用して、アッセイにおける非特異的阻害を測定した。非線型回帰法（Ｇａｎｇｅら、１９９６年）を使用して、ＲＩＡのための標準曲線を確立した。ＡＦＢ１−アルブミン付加物の濃度は、アルブミン１ｍｇ当たりのＡＦＢ１量として表した。アッセイの検出限界は、０．０１ｐｍｏｌ／アルブミン（ｍｇ）であった。
【０１４５】
尿サンプル中のＡＦＭ１濃度は、Ｇｒｏｏｐｍａｎら（Ｇｒｏｏｐｍａｎら、１９９２年）が発表し、Ｓａｒｒら（Ｓａｒｒら、１９９５年）およびＷａｎｇら（Ｗａｎｇら、１９９９年）が修正した、イムノアフィニティ・カラムによる精製、それに続くＨＰＬＣ−蛍光検出を用いて分析した。簡潔には、尿サンプル（５．０ｍＬ）のそれぞれを、０．５ｍＬの１．０Ｍギ酸アンモニウムを用いて酸性ｐＨに調節（ｐＨ４．５）し、水で容積を１０ｍＬに増やし、ボルテックスした。次いで、サンプルを、前述（Ｗａｎｇら、１９９９年）のように、１ｍＬの分取Ａｆｌａｔｅｓｔ  Ｐイムノアフィニティ・カラム（ＶｉｃａｍＬＰ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、マサチューセッツ州、米国）にほぼ０．３ｍＬ／分の流速で負荷した。洗浄後、精製されたＡＦ画分を、８０％メタノールで溶出させ、蛍光検出能を備えたＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を使用する分析のためにＮ２下で乾燥した。エンドキャップされ、細孔径が１００Åで粒子径が５μｍの２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ＬｉＣｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ−１８カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、イリノイ州、米国）を使用してＡＦ代謝産物を分離した。移動相は、２０ｍＭのギ酸アンモニウムで緩衝化された２２％エタノール水（ｐＨ３．０）から構成した。ＡＦのクロマトグラフィー分離は、該移動相の２０分間のイソクラティック溶離によって達成された。サンプル（１００μＬ）をカラムに注入し、溶出速度は１．０ｍＬ／分とした。ＡＦＭ１のピークは、ほぼ１５．４分の保持時間で検出された。この方法での検出限界は、ＡＦＭ１に関して尿中１０ｐｇ／ｍＬであった。ＡＦＭ１の尿中濃度は、個々のサンプル間での尿希釈の変動について補正するため、ｐｇ／クレアチニン（ｍｇ）として表現した。
【０１４６】
引き出したすべてのデータを、Ｅｘｃｅｌのデータベース中に記憶させ、ＳＡＳソフトウェア・バージョン９．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ノースカロライナ州）を用いて解析した。メディアン、平均、標準偏差（ＳＤ）および範囲を、ＡＦＢ１−アルブミン付加物およびＡＦＭ１の濃度について計算し、値は、特記しない限り、メディアンおよび平均±ＳＤとして表現した。ＮＳ介入の効力を評価するために、統計的評価は、異なる治療濃度および異なる時点の間での比較に焦点をあてた。正規分布であったパラメーターに対しては、二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ法を使用して、異なる治療アームの平均および時点間での有意差を比較した。正規分布でなかったパラメーターに対しては、クルスカル−ウォリスの検定またはウィルコクスンの順位和検定を使用して、異なる治療群および異なる時点間での差異を比較した。用量および時間経過のＮＳ治療に対する相互作用の効果を評価するために、以前に発表されている（Ｂｒｕｎｎｅｒら、２００２年）ような、ノンパラメトリック混合効果モデルを適用した。０．０５未満（両側）のＰ値を有意と見なした。
【０１４７】
ＮＳを用いるこの介入試験のために、全部で１８０名の対象を採用し、１７７名の対象で治療を開始した。参加者中での全体的アドヒアレンスおよびバイオマーカー分析のためのサンプルの有効性は、満足のいくものであった。全部で１６２名の対象（９１．５％）が、３カ月間の試験を完了した。血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物および尿中ＡＦＭ１濃度の分析のための、各採取時点でのサンプル数に関する詳細な情報を下表１３に挙げる。４つの時点でのサンプル採取中で、参加者から９５％を超える血液および９０％以上の尿サンプルを採取し、このことは、ＮＳの効力を示すために、我々が曝露に関するＡＦＢ１バイオマーカーを使用することの有効性を実証した。
【０１４８】
【表１３】
2009542656.tif 000017
【０１４９】
４カ月の研究期間にわたって採取した全部で６５６の血清サンプルを、ＡＦＢ１−アルブミン付加物について分析した。３つの研究群（プラセボ、１．５ｇＮＳ、および３ｇＮＳ）の異なる時点での血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物の平均濃度（平均±ＳＤ）および範囲を下表１４に示す。研究継続期間を通したこれらの３つの群における全体のＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の分布を図７および８に示す。箱型図は、各群の各時点でのＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の分布を示す。ボックス値は、全サンプルの２５〜７５パーセンタイルを網羅し、その中の線は、メディアン値を示す。箱の上下の棒は、それぞれ、５〜２５パーセンタイルおよび７５〜９５パーセンタイルを網羅する値を表す。ベースラインのサンプルでは、高いＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度が観察され、群間で有意差はなかった（Ｐ＝０．２３５４）。ＮＳ介入後１カ月の時点で３つの研究群間でのＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に統計的有意差は観察されなかった（Ｐ＝０．３６４５）。しかし、介入後３カ月の時点で、１．５ｇＮＳおよび３ｇＮＳ群の双方で、プラセボ群に比較してＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の統計的に有意な低下が観察された（Ｐ＜０．０００１）。介入終了後１カ月である４カ月の時点で３群間にＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の統計的有意差は見出されなかった。図８に示すように、４カ月の研究期間にわたり３つのすべての群で付加物濃度の有意な低下が認められ、ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度に対する有意な時間経過効果を示している。しかし、時間経過効果のパターンは、ＮＳ治療群とプラセボ群との間で異なった。プラセボ群の場合、介入後１カ月および３カ月の時点でのＡＦＢ１−アルブミン付加物の低下率は、１６．１および１９．９％であった。１．５ｇＮＳおよび３．０ｇＮＳ群の場合、ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の低下率は、介入後１カ月の時点でそれぞれ２２．３％および２２．４％、介入後３カ月の時点でそれぞれ４２．８％および４０．２％であった。プラセボ群において３カ月と４カ月との間ではっきりした変化はなかったが、２つの介入群では、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度が有意に増加し、４カ月の時点では、プラセボ群のそれと同等の濃度まで戻った。ノンパラメトリック混合効果モデルでの解析は、さらに、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の低下に対する、用量、時間経過効果、および用量−時間経過の相互作用の有意な効果を示し、この低下は、ＮＳ介入に帰すことができた（下表１６）。
【０１５０】
【表１４】
2009542656.tif 000018
【０１５１】
４カ月の研究期間にわたる全部で６２４の尿サンプルを、ＡＦＭ１について分析した。異なる時点での３つの研究群（プラセボ、１．５ｇＮＳ、および３ｇＮＳ）のＡＦＭ１の平均濃度および範囲を下表１５に示す。研究継続期間中でのこれら３群の尿中ＡＦＭ１濃度の分布を図９および１０に示す。箱型図は、各群の各時点でのＡＦＭ１濃度の分布を示す。ボックス値は、全サンプルの２５〜７５パーセンタイルを網羅し、その中の線は、メディアン値を示す。箱の上下の棒は、それぞれ５〜２５パーセンタイルおよび７５〜９５パーセンタイルを網羅する値を表す。ＡＦＭ１データは、高度に非対称なので、すべての統計的評価にノンパラメトリック解析を適用した。ベースラインでのメディアンＡＦＭ１濃度に関して３つの研究群間で有意差はなかった（Ｐ＝０．２４８５）。ＮＳ介入後１カ月の時点での３群間でメディアンＡＦＭ１濃度に関して有意差は見出されなかった（Ｐ＝０．３３４２）。しかし、ＮＳ介入後３カ月の時点でメディアンＡＦＭ１濃度の統計的に有意な低下が観察された（Ｐ＝０．０４４５）。メディアンＡＦＭ１濃度は、プラセボ群と１．５ｇＮＳ群の間で同等であった（Ｐ＝０．３９５１）が、３ｇＮＳ群とプラセボ群との間で、メディアンＡＦＭ１濃度の５８．７％の低下率が見出された（Ｐ＝０．０３９１）。３ｇＮＳ群と１．５ｇＮＳ群との間でも、メディアンＡＦＭ１濃度の５７．８％の低下率が見出された（Ｐ＝０．０２１９）。メディアンＡＦＭ１濃度の有意差（Ｐ＝０．００２４）は、主として１．５ｇＮＳ群でのより高いＡＦＭ１濃度によるものである介入後４カ月の時点での３つの研究群間でも見出された。図１０に示すように、４カ月間の研究期間にわたって、３．０ｇＮＳ群でＡＦＭ１濃度の有意な低下が認められ、有意な時間経過効果を示している（Ｐ＝０．００９）。有意な時間経過効果は、プラセボ群でも認められたが（Ｐ＝０．００２）、ベースラインおよび３カ月の時点でのより高いメディアン濃度、および１カ月および４カ月の時点でのより低いメディアン濃度によって示されるように、ＡＦＭ１の濃度は、極めて変化しやすかった。ＡＦＭ１濃度に対する有意な時間経過効果が、４カ月の研究期間にわたって１．５ｇＮＳ群で見出された（Ｐ＝０．３２７７）。ノンパラメトリック混合効果モデルの解析は、また、尿中ＡＦＭ１濃度の低下に関する有意な用量−時間経過の相互作用を示し、この相互作用は、ＮＳ介入に帰すことができた（表４）。
【０１５２】
【表１５】
2009542656.tif 000019
【０１５３】
安全性および効力は、潜在的治療薬および／または臨床介入薬を評価するための２つの最も重要な判定基準である。ＮＳの安全性（および薬量決定）は、ガーナでの３カ月間の試験を含む、動物および人での研究で詳しく記録されている（Ａｆｒｉｙｉｅ−Ｇｙａｗｕら、２００７年）。この研究の主目的は、ヒトでのＮＳの効力を判定することである。ＮＳが、胃および腸内でＡＦを選択的に収着してＡＦのバイオアベイラビリティーおよび毒性の低下をもたらす能力は、各種の動物モデルで明らかに立証されている。この研究から得られた結果は、動物での本発明者らの研究を確かにし、３カ月間のＮＳ投与が、ヒト対象における血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度および尿中ＡＦＭ１濃度を有意に低下させることを示した。本発明者らの知る限りでは、これは、アフラトキシン中毒症の危険にさらされているヒト集団でのＡＦ−特異的バイオマーカーを観察することによって、ＮＳを食餌に含めることの効力および健康上の利益を探求した最初の研究である。
【０１５４】
ヒトおよび動物研究で現在使用されているＡＦ−特異的バイオマーカーには、ＡＦＢ１代謝産物およびＡＦＢ１−高分子付加物、すなわち尿中のＡＦＭ１および血清中のＡＦＢ１−アルブミン付加物が含まれる。ＡＦＢ１−アルブミン付加物は、（尿中ＡＦ代謝産物に比較して）そのより長いインビボ半減期が、より長期にわたって積分された曝露を反映できるので、極めて重要なバイオマーカーとして役立つ。疫学的研究に直接関係のある実際的観点から、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物の測定は、極めて大きな数の人々、例えば５０７名の人々を選抜するのに使用できる迅速かつ容易な取り組み（Ａｆｒｉｙｉｅ−Ｇｙａｗｕら、２００７年）、およびその他の介入研究を提供する。ＡＦＢ１−アルブミン付加物は、また、ヒトのＡＦに対する曝露を研究するための最も信頼度の高い分子バイオマーカーである。ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度とＡＦＢ１摂取量との間の高度に有意な関連が、世界のいくつかの地域からのヒト集団中で見出された。さらに、摂取されたＡＦＢ１の約２％が、血清アルブミンに共有結合で結合されることが報告されており、値は、ラットにＡＦＢ１を投与した場合に観察される値に極めて類似している。各種の分析技術を使用して、ＡＦＢ１−アルブミン付加物が、中国およびいくつかのアフリカ諸国の成人からの血清のほぼ１００％で、子供からの血清の１２〜１００％で検出できた。ＡＦ曝露を研究することに加え、ＡＦＢ１−アルブミン付加物は、アフリカでの急性および慢性アフラトキシン中毒症、台湾、中国、およびアフリカでのＨＣＣの危険、ならびに感染性疾患に関連した免疫抑制の生物学的応答指標として使用されている。さらに、ＡＦＢ１−アルブミン付加物は、ヒトでの介入試験で種々の薬剤および技術を評価するための代用効力バイオマーカーとして決まって使用されている。
【０１５５】
この研究で、高濃度の血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物が、ＮＳ介入前のベースライン時点の参加者で観察された（１．５２±０．３４ｐｍｏｌ／アルブミン（ｍｇ）、範囲：０．９６〜２．９３ｐｍｏｌ／アルブミン（ｍｇ））。これらの濃度は、ガンビア、ベニンおよび英国から報告されたものよりも高く、肝臓癌への高い危険にさらされている中国の集団中で見出された濃度と同等であった。したがって、ガーナの研究参加者は、ＡＦ曝露に対する高い危険にさらされている集団を代表していた。この研究で、毎日のＮＳカプセル投与は、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物の低減における有意な用量効果および時間経過効果を生み出すことが見出された（表１４）。３カ月の時点に１．５ｇＮＳおよび３ｇＮＳ介入群の双方で、プラセボ群に比較した有意性（ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の４０％を超える低下）が観察された（表１４および図８）。このバイオマーカー濃度の低下は、介入後１カ月の時点で２つのＮＳ治療群でも観察されたが、プラセボ群での付加物濃度の低下のため、有意差は見出されなかった。この研究で認められた付加物低下の遅延は、血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の有意な低下が治療５週後にようやく観察された、中国、啓東でのオルチプラズを用いた以前の化学的予防試験に類似していた。この遅延は、おそらく、正常かつ健康な人々でほぼ３週間であると判断される、アルブミンの長い半減期に帰することができる。重要なことであるが、アルブミンに結合したＡＦＢ１（ＡＦＢ１−アルブミン付加物）は、数年間安定である可能性もある。類似の所見が、オルチプラズで報告され、そこでは、ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度が、アルブミンの代謝回転が半減期の３倍を過ぎるまで検出された。プラセボ群での低下を含むこの研究で観察される有意な時間経過効果は、また、オルチプラズ試験での以前の所見および最近の飼育介入研究と一致している。本発明者らのこの研究において、１．５ｇＮＳおよび３ｇＮＳ群の双方でＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度は、介入を終えて１カ月後の４カ月の時点で、上昇し、プラセボ群の濃度まで戻った。このことは、食餌に由来するＡＦＢ１曝露を低下させることにおけるＮＳの効力をさらに確かにした。
【０１５６】
ＡＦＭ１は、尿および乳中に広く認められるＡＦＢ１の代謝産物であり、親であるＡＦＢ１からのその形成は、ヒトの肝臓内ＣＹＰ１Ａ２によって主として触媒される。尿中へのＡＦＭ１の排泄は、直近のＡＦＢ１曝露（すなわち、２４または４８時間以内）を象徴する。そのため、尿中ＡＦＭ１濃度は、ＡＦＢ１曝露の短期バイオマーカーとして使用される。血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物および尿中ＡＦＭ１の双方は、多くのヒト集団におけるＡＦＢ１曝露に関するバイオマーカーとして徹底的に特徴付けられ、かつ検証されている。血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物およびヒトの尿中に排泄されるＡＦＭ１の濃度は、食餌性ＡＦ摂取との、およびヒトＨＣＣの危険との有意な相関を示している。介入後３カ月の時点での血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物濃度の低下と同時に、尿中ＡＦＭ１濃度も、この研究のその他の治療アームと比較して、３ｇＮＳ群で有意に低下した（表１５および図９）。３ｇＮＳ治療群で見出されたメディアンＡＦＭ１濃度の５８．７％までの低下率は、１００ｍｇクロロフィリンを用いた介入３カ月後におけるメディアンＡＦＢ１−Ｎ７−グアニン濃度の５５％の低下率と同等である。ＡＦＢ１−Ｎ７−グアニン生成物も、ＡＦＭ１と同様の短期バイオマーカーである。この研究で、尿中ＡＦＭ１濃度における有意な効果は、１．５ｇＮＳ群で観察されなかったが、これは、潜在的に、短期バイオマーカーの測定における著しい個体内および個体間変動によるものである。ＡＦＭ１濃度の有意な時間経過効果は、毎日の食餌性ＡＦ曝露濃度の変動を反映する可能性のあるプラセボ群を含むすべての研究群でも観察された（図１０）。尿中ＡＦＭ１濃度の変動は、ガーナの類似集団（Ｊｏｌｌｙら、２００６年）およびその他の集団（Ｗａｎｇら、２００１年）での以前の選抜研究でも見出された。本研究の参加者で観察された極めて広範囲のＡＦＭ１濃度（検知不可から１３．３ｎｇ／クレアチニン（ｍｇ）まで）は、ＡＦ代謝酵素、例えば、ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子型および表現型変動が、ＡＦ曝露に対する個体の感受性に関して役割を果たす可能性があることを示唆している。それにもかかわらず、この研究で、低下した尿中ＡＦＭ１濃度（および血清中ＡＦＢ１−アルブミン付加物）と関連した有意な用量−時間経過の相互作用効果（下表１６）は、カプセルによるＮＳ投与の効力を確証した。
【０１５７】
【表１６】
2009542656.tif 000020
【０１５８】
要約すると、この研究の結果は、ＮＳ粘土を用いる介入が、血液および尿中のＡＦ−特異的バイオマーカー、すなわち、ＡＦＢ１−アルブミン付加物およびＡＦＭ１で示されるように、汚染された食餌に由来するＡＦ曝露を効果的に低下させることを示唆している。急性アフラトキシン中毒症のための、およびアフラトキシン誘発性慢性疾患の予防のための腸内収着剤療法として、高い危険にさらされた集団の食餌中に含めた場合のＮＳ介入の効果をさらに評価するためには、最終的に長期（第ＩＩｂ相または第ＩＩＩ相）研究を必要とする。
【０１５９】
当業者は、本発明が、目的を遂行し、言及した結果および利点ならびに本明細書中に内在するそれらを獲得するように適切に構成されることを容易に認識する。したがって、カプセル形態および錠剤形態のＣＡＳ組成物は、同じではなく、これらの異なる形態の経口投与は、中毒を予防または治療するための、およびアフラトキシン関連性肝臓癌を予防するための方法として使用できる。さらに、組成物および方法の変形形態は、本発明に包含される。例えば、大量の組成物を製造することが必要な場合には、技術を変更することができ、組成物生産のこのような工業化は、本発明の精神に包含されると理解される。本明細書中に記載の材料、方法、手順および技術は、好ましい実施形態の目下の典型であり、例示的と解釈され、範囲の制限とは解釈されない。製薬化学の当業者は、組成物のための処方および本発明の方法を修正および変更することを可能にするＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルヴェニア州１８０４２などの、多くの製薬参考書を利用できることがわかっている。かくして、本明細書中での変更および別の使用は、当業者に見出されるのであり、それらは、本発明の精神に包含されるか、あるいは係属中の特許請求の範囲によって規定される。
【０１６０】
（引用文献）
以下の文献は、それらが、本明細書中に示したことを補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
米国特許文献
United States Patent 5,178,832, issued to
Phillips, et al., on January 12, 1993, and titled "Selective
Immobilization and Detection of Mycotoxins in Solution."
United States Patent 5,165,946 issued to Taylor, et al., on November 24, 1992, titled "Animal Feed Additive and Method for
Inactivating Mycotoxins Present in Animal Feeds."
その他の刊行物
Remmington's Pharmaceutical Sciences 17th
Edition. Alfonso Gennaro editor, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania
18042, Entire Book, pages 1-1983.
Remmington's Pharmaceutical Sciences 17th
Edition. Alfonso Gennaro editor, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania
18042, Chapter 68, pages 1278-1321.
Remmington's Pharmaceutical Sciences 17th
Edition. Alfonso Gennaro editor, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania  18042, Chapter 84, pages 1492-1517.
Harvey, R.B., D.E.
Clark, W.E. Huff, L.F. Kubena, D.E. Corrier and T.D. Phillips: 1988.
Suppression of serum iron binding capacity and bone marrow cellularity in pigs
fed aflatoxin. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40:576 583.
Harvey, R.B., W.E.
Huff, L.F. Kubena, D.E. Corrier and T.D. Phillips: 1988. Progession of
aflatoxicosis in growing pigs. Am. J. Vet. Res. 49(4):482 487.
Phillips, T.D., L.F. Kubena, R.B. Harvey,
D.R. Taylor and N.D. Heidelbaugh: 1988. Hydrated sodium calcium
aluminosilicate: High affinity sorbent for aflatoxin. Poult. Sci. 67:243 247.
Harvey, R.B., W.E.
Huff, L.F. Kubena, and T.D. Phillips: 1989. Evaluation of diets co-contaminated
with aflatoxin and ochratoxin fed to growing pigs. Am. J. Vet Res.
50:1400-1405.
Harvey, R.B., L.F.
Kubena, W.E. Huff, D.E. Corrier D.E. Clark and T.D. Phillips: 1989. Effects of
aflatoxin, deoxynivalenol, and their combinations in the diets of growing pigs.
Am J Vet Res, 50(4):602 607.
Harvey, RB., L.F. Kubena, T.D. Phillips,
W.E. Huff and D.E. Corrier: 1989. Prevention of aflatoxicosis by addition of
hydrated sodium calcium aluminosilicate to the diets of growing barrows. Am. J.
Vet. Res. 50(3):416 420.
Harvey, R.B., L.F.
Kubena, W.E. Huff, D.E. Corrier, G.E. Rottinghaus, and T.D. Phillips: 1990.
Effects of treatment of growing swine with aflatoxin and T-2 toxin. Am. J. Vet.
Res. 51:1688-1693.
Kubena, L., R. Harvey, W. Huff, D. Corrier,
T. Phillips and G. Rottinghaus: 1990. Ameliorating properties of a hydrated
sodium calcium aluminosilicate on the toxicity of aflatoxin and T-2 toxin.
Poult. Sci. 69:1078-1086.
Kubena, L.F., R.B. Harvey, T.D. Phillips,
D.E. Corrier and W.E. Huff: 1990. Diminution of aflatoxicosis in growing
chickens by the dietary addition of a hydrated, sodium calcium aluminosilicate.
Poult. Sci. 69:727-735.
Phillips, T.D., Afriyie-Gyawu, E., Wang,
J.-S., Williams, J., Huebner, H. 2006. The potential of aflatoxin sequestering
clay, D. Barug, D. Bhatnagar, H.P. van Egmond, J.W. van der Kamp, W.A. van
Osenbruggen, A. Visconti, eds, In: The Mycotoxin Factbook, Wageningen Academic
Publishers, The Netherlands, pp. 329-46.
Phillips, T.D., B.A. Sarr, B.A. Clement,
L.F. Kubena and R.B. Harvey: 1990. Prevention of aflatoxicosis in farm animals
via selective chemisorption of aflatoxin. In Mycotoxins, Cancer and Health (Pennington Center Nutrition Series, Vol. 1), pp. 223-228, Louisiana State University Press, Baton Rouge and London.
Phillips, T.D., B.A. Clement, L.F. Kubena
and R.B. Harvey: 1991. Prevention of aflatoxicosis and aflatoxin residues with
HSCAS. Vet. Human Toxicol. 32:15-19.
Harvey, R.B., L.F.
Kubena, T.D. Phillips, D.E. Corrier, M.H. Elissalde and W.E. Huff: 1991.
Diminution of aflatoxin toxicity to growing lambs by dietary supplementation
with hydrated sodium calcium aluminosilicate. Am. J. Vet. Res. 52:152-156.
Harvey, R.B., T.D.
Phillips, J.A. Ellis, L.F. Kubena, W.E. Huff and D.V. Peterson: 1991. Effects
of aflatoxin M1 residues in milk by addition of hydrated sodium calcium
alumi-nosilicate to aflatoxin-contaminated diets of dairy cows. Am. J. Vet.
Res. 52:1556-1559.
Kubena, L.F., W. Huff, R.B. Harvey, A.
Yersin, M. Elissalde, D. Witzel, L. Giroir, T.D. Phillips and H. Peterson:
1991. Effects of hydrated sodium calcium alumino-silicate on growing turkey
poults during aflatoxicosis. Poult. Sci. 70:1823-1830.
Huff, W.E., L.F. Kubena, R.B. Harvey and
T.D. Phillips: 1991. Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate to
reduce the combined toxicity of aflatoxin and ochratoxin A. Poult. Sci.
Kubena, L.F., R.B. Harvey, W.E. Huff, M.H.
Elissalde, A.G. Yersin, T.D. Phillips and G.E. Rottinghaus: 1993. Efficacy of
HSCAS to reduce the toxicity of aflatoxin and diacetoxy-scirpenol. Poult. Sci.
72:51-59.
Harvey, R.B., L.F.
Kubena, M.H. Elissalde and T.D. Phillips. 1993. Efficacy of zeolitic ore
compounds on the toxicity of aflatoxin to growing broiler chickens. Avian
Diseases 37:67-73.
Kubena, L.F., R.B. Harvey, T.D. Phillips
and B.A. Clement. 1993. Effect of hydrated sodium calcium aluminosilicates on
aflatoxicosis in broiler chicks. Poult. Sci. 72:651-657.
Phillips, T.D., B.A. Clement, and D.L. Park. 1994. Approaches to reduction of aflatoxins in foods and feeds. In: The
Toxicology of Aflatoxins: Human Health, Veterinary, and Agricultural Significance
(D. Eaton and J. Groopman, eds), pp. 383-406, A. Press, NY.
Harvey, R., L. Kubena, M. Elissalde, D.
Corrier, and T.D. Phillips. 1994. Comparison of two hydrated sodium calcium
aluminosilicate compounds to experimentally protect growing barrows from
aflatoxicosis. J. Vet. Diagn Invest 6:88-92.
Smith, E.E., T.D. Phillips, J.A. Ellis, RB.
Harvey, L.F. Kubena, J. Thompson, and G. Newton: 1994. Dietary hydrated sodium
calcium aluminosilicate reduction of aflatoxin M1 residue in dairy goat milk
and effects on milk production and components. J. Anim. Sci. 72:677-682.
Sarr, A.B., K. Mayura, and T.D. Phillips:
1994. Effects of hydrated sodium calcium aluminosilicate on the metabolic
profile of AFB1 in Fischer-344 rats. Toxicol. Lett. 75:145-151.
Phillips, T.D., A.B. Sarr, and P.G. Grant.
1995. Selective chemisorption and detoxification of aflatoxins by
phyllosilicate clay. Natural Toxins. 3:204-213.
Washburn, K.S. and T.D. Phillips. 1995.
Development of a field-practical assay for water-solvated chlorophenols. J.
Hazard. Mat. 41:371-381.
Abo-Norag, M., T.S. Edrington, L.F. Kubena,
R. B. Harvey, and T.D. 1995. Phillips. Influence of hydrated sodium calcium
aluminosilicate and virginiamycin on aflatoxicosis in broiler chicks. Poult.
Sci. 74:626-632.
Safe, S., K. Washburn, T. Zacharewski and
T. Phillips. 1995. Synthesis and charac-terization of hydroxylated
polychlorinated biphenyls (PCBs) identified in human serum. Chemo-sphere.
31:3017-3023.
Ramu, J., Clark, K., Woode, G.N., Sarr,
A.B. and T.D. Phillips. 1997. Adsorption of cholera and heat-labile Escherichia
coli enterotoxins by various adsorbents: An in vitro study. J. Fd. Protect.
60:1-5.
Grant, P.G., and T.D. Phillips. 1998.
Isothermal adsorption of aflatoxin B1 on HSCAS. J. Ag. Fd. Chem. 46:599-605.
Clark, K.J., A.B.
Sarr, P.G. Grant, T.D. Phillips and G.N. Woode. 1998. In vitro studies on the
use of clay, clay minerals and charcoal to adsorb bovine rotavirus and bovine
coronavirus. Vet. Microbiol. 63:137-146.
Grant, P.G., S.L Lemke, M.R. Dwyer and T.D.
Phillips. 1998. Modified Langmuir equation for S-shaped and multisite isotherm
plots. J. Langmuir 14(15):4292-4299.
Lemke, S.L., P.G. Grant and T.D. Phillips.
1998. Adsorption of zearalenone by organophilic montmorillonite clay. J. Ag.
Fd. Chem. 46:3789-3796.
Lopez, Y., N.P. Keller, B. Sarr, T.D.
Phillips, R.G. Cuero and O.D. Smith. 1998. Visual estimation of aflatoxin
production in peanut with Aspergillus norsolorinic acid mutants. Peanut Sci.
25:92-99.
Huebner, H.J., Lemke, S.L. , Ottinger,
S.E., Mayura, K., and Phillips, T.D. 1999. Molecular characterization of high
affinity, high capacity clays for the equilibrium sorption of ergotamine. Food
Additives and Contam. 16:159-171.
Phillips, T.D. 1999. Dietary clay in the
chemoprevention of aflatoxin-induced disease. Toxicological Sciences
52:118-126.
Lemke, S.L. Mayura, K., Reeves, W.R., Wang,
N., Fickey, C. and Phillips, T.D. 2001. Investigation of organophilic
montmorillonite clay inclusion in zearalenone-contaminated diets using the
mouse uterine weight bioassay. J. Toxicol. Environ. Hlth. :62:243-258.
Lemke, S.L., Ottinger, S.E., Mayura, K.,
Ake, C.L., Pimpukdee, K., Wang, N. and Phillips, T.D. 2001. Development of a
multi-tiered approach to the in vitro prescreening of clay-based enterosorbents.
Animal Feed Sci. Technol. 93:17-29
Phillips, T.D., Lemke, S.L. and Grant, P.
2002. Characterization of clay-based enterosorbents for the prevention of
aflatoxicosis. Advances in Experimental Medicine and Biology (Eds, J.W.
DeVries, M.W. Trucksess, and L.S. Jackson), Vol. 504, pp. 157-173, Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York.
Bingham A.K., Phillips T.D., Bauer J.E.
2003. Potential for dietary protection against the effects of aflatoxins in
animals. J Am Vet Med Assoc. 222(5): 591-6.
Pimpukdee, K., Kubena, L.F., Bailey, C.A., Huebner, H.J., Afriyie-Gyawu, E., and Phillips, T.D. 2004. Aflatoxin-induced
toxicity and depletion of hepatic vitamin A in young broiler chicks: Protection
of chicks in the presence of low levels of NOVASIL PLUS□ in the diet, Poult. Sci. 83: 737-744.
Herrera, P., Burghardt, R., Huebner, H.J.
and Phillips, T.D., 2004. The efficacy of sand-immobilized organoclays as
filtration bed materials for bacteria. Food Microbiol. 21: 1-10.
Wiles, M. W., Huebner, H. J.,
Afriyie-Gyawu, E., Taylor, R. J., Bratton, G. R., and Phillips, T. D., 2004.
Toxicological evaluation and metal bioavailability in pregnant rats following
exposure to clay minerals in the diet. J. Toxicol Environ. Hlth. Part A. 67
(11): 863-874.
Huebner, H.J., Herrera, P., and Phillips,
T.D. 2004. Clay-based interventions for the control of chemical and microbial
hazards in food and water. In: Preharvest and Postharvest Food Safety-
Contemporary Issues and Future Directions (Eds, R.C. Beier, S.D. Pillai, and
T.D. Phillips), IFT Press and Blackwell Publishing, Ames, Iowa
Bingham, A. K., Huebner, H. J., Phillips,
T. D., and Bauer, J. E. 2004. Identification and reduction of urinary aflatoxin
metabolites in dogs. Food and Chemical Toxicology, 42, 1851-1858.
Williams, J.H., Phillips, T.D., Jolly,
P.E., Stiles, J.K., Jolly, C.M. and Aggarwal, D. 2004. Human aflatoxicosis in
developing countries: A review of toxicology, exposure, potential health
consequences and interventions. Am. J. Clin Nutr 80: 1106-22.
Cizmas L, McDonald TJ, Phillips TD,
Gillespie AM, Lingenfelter RA, Kubena LF, Phillips TD, Donnelly KC. 2004.
Toxicity characterization of complex mixtures using biological and chemical
analysis in preparation for assessment of mixture similarity. Environ Sci
Technol. 38(19):5127-33.
Afriyie-Gyawu, E., Mayura, K., Wiles, M.
C., Huebner, H. J., Julian, J., Fickey, C. and Phillips, T. D., 2005.
Prevention of zearalenone-induced hyperestrogenism in prepubertal mice. J.
Toxicol Environ. Hlth. Part A. 68: 353-368.
Wiles, M. C., Ake, C. L., Donnelly, K. C.,
McDonald, T. J., Huebner, H. J., Burghardt, R. C., and Phillips, T. D., 2005.
Matrix-immobilized organoclay for the removal of toxic contaminants from
groundwater. Chemosphere (In Press).
Jolly, P., Jiang, Y., Ellis, W., Awuah, R.,
Nnedu, O., Phillips, T., Wang, J. S., Afriyie-Gyawu, E., Tang, L., Person, S.,
Williams, J., Jolly, C. 2006. Determinants of aflatoxin levels in Ghanaians:
sociodemographic factors, knowledge of aflatoxin and food handling and
consumption practices. Int J Hyg Environ Health 209: 345-58.
Phillips, T.D., Afriyie-Gyawu, E., Wang,
J.-S., Williams, J., Huebner, H. 2006. The potential of aflatoxin sequestering
clay, D. Barug, D. Bhatnagar, H.P. van Egmond, J.W. van der Kamp, W.A. van
Osenbruggen, A. Visconti, eds, In: The Mycotoxin Factbook, Wageningen Academic
Publishers, The Netherlands, pp. 329-46.
Wang, J.-S., Luo, H., Billam, M., Wang, Z.,
Guan, H., Tang, L., Goldston, T., Afriyie-Gyawu, E., Lovett, C., Griswold, J.,
Brattin, B., Taylor, R. J., Huebner. H. J., Phillips, T. D. 2005. Short-term
safety evaluation of processed calcium montmorillonite clay (NovaSil) in
humans. Food Addit Contam 22: 270-9.
Wang, J.-S., Qian, G. S., Zarba, A., He,
X., Zhu, Y. R., Zhang, B. C., Jacobson, L., Gange, S. J., Munoz, A., Kensler,
T. W., et al. 1996. Temporal patterns of aflatoxin-albumin adducts in hepatitis
B surface antigen-positive and antigen-negative residents of Daxin, Qidong County, People's Republic of China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 5: 253-61.
Wang, J.-S., Shen, X., He, X., Zhu, Y. R.,
Zhang, B. C., Wang, J. B., Qian, G. S., Kuang, S. Y., Zarba, A., Egner, P. A.,
Jacobson, L. P., Munoz, A., Helzlsouer, K. J., Groopman, J. D., Kensler, T. W.
1999. Protective alterations in phase 1 and 2 metabolism of aflatoxin B1 by
oltipraz in residents of Qidong, People's Republic of China. J Natl- Cancer Inst 91: 347-54.
Wang, L. Y., Hatch, M., Chen, C.J., Levin,
B., You, S. L., Lu, S. N., Wu, M. H., Wu, W. P., Wang, L. W., Wang, Q., Huang,
G. T., Yang, P. M., Lee, H. S., Santella, R. M. 1996. Aflatoxin exposure and
risk of hepatocellular carcinoma in Taiwan. Int J Cancer 67: 620-5.
Wang, J.-S., Abubaker, S., He, X., Sun, G.,
Strickland, P. T., Groopman, J. D. 2001. Development of aflatoxin B(l)-lysine
adduct monoclonal antibody for human exposure studies. Appl Environ Microbiol
67: 2712-2717.
Wang, J.-S., Groopman, J. D. 1999. DNA
damage by mycotoxins. Mutat Res 424: 167-81.
Wang, J.-S., Huang, T., Su, J., Liang, F.,
Wei, Z., Liang, Y., Luo, H., Kuang, S. Y., Qian, G. S., Sun, G., He, X.,
Kensler, T. W., Groopman, J. D. 2001. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin
exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People's Republic of China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10: 143-6.
Gange, S. J., Munoz, A., Wang, J. S.,
Groopman, J. D. 1996. Variability of molecular biomarker measurements from
nonlinear calibration curves. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 5: 57-61.
Groopman, J. D., Hasler, J. A., Trudel, L.
J., Pikul, A., Donahue, P. R., Wogan, G. N. 1992. Molecular dosimetry in rat
urine of aflatoxin-N7-guanine and other aflatoxin metabolites by multiple
monoclonal antibody affinity chromatography and immunoaffinity/high performance
liquid chromatography. Cancer Res 52: 267-74.
Sarr, A. B., Mayura, K., Kubena, L. F.,
Harvey, R. B., Phillips, T. D. 1995. Effects of phyllosilicate clay on the
metabolic profile of aflatoxin B1 in Fischer-344 rats. Toxicol Lett 75: 145-51.
Afriyie-Gyawu, E., Ankrah, N.-A., Huebner,
H., Ofosuhene, M., Kurth, J., Johnson, N., Tang, L., Xu, L., Jolly, P., Ellis,
W., Ofori-Adjei, D., Williams, J., Wang, J.-S., Phillips, T. 2007. NovaSil clay
intervention in Ghanaians at high risk for aflatoxicosis: I. Study design and
clinical outcomes. Food Additives and Contaminants 24
Brunner, E., Domhof, S., Langer, F.
"Nonparametric analysis of longitudinal data in factorial
experiments" John.Wiley, New York, NY (2002).
【図１】
2009542656.tif 000021
【図２】
2009542656.tif 000022
【図３】
2009542656.tif 000023
【図４】
2009542656.tif 000024
【図５】
2009542656.tif 000025
【図６】
2009542656.tif 000026
【図７】
2009542656.tif 000027
【図８】
2009542656.tif 000028
【図９】
2009542656.tif 000029
【図１０】
2009542656.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月23日(2009.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓癌およびアフラトキシン中毒症の危険にさらされている系におけるアフラトキシンの影響を軽減するための予防療法として使用するための経口組成物であって、粉末形態の有効量の単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土（ここで、該単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を実質的に含有せず、かつ該アフラトキシンを結合する能力を有し、単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、約８０ミクロンである平均粒子径を有し、かつ溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す）を含有する経口組成物。
【請求項２】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、約３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有し、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
アフラトキシンが、ＣＡＳに選択的に収着される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
系における環境毒素の影響を軽減するための予防療法として使用するための経口組成物であって、粉末形態の有効量の単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土（ここで、該単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、ダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を実質的に含有せず、かつ該環境毒素を結合する能力を有し、単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土は、約８０ミクロンである平均粒子径を有し、かつ溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す）を含有する経口組成物。
【請求項７】
単離された低ナトリウムのアルミノケイ酸カルシウム系粘土が、約３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有し、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
環境毒素が、ＣＡＳに選択的に収着される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
系における環境毒素の影響を軽減する方法であって、
（ａ）粉末形態の有効量の単離されたアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該単離されたＣＡＳは、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含有し、かつ該環境毒素を選択的に結合する能力を有し、該単離されたＣＡＳは、約８０ミクロンである平均粒子径を有し、溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す）を経口で投与すること、
（ｂ）ある時間待つこと、および
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を該環境毒素の影響が軽減されるまで繰り返すこと
を含む方法。
【請求項１２】
３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有する加工処理されたＣＡＳを選択することをさらに含み、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
癌になりやすい者であるような系を選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
約２４時間未満であるようなある時間を選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
環境アフラトキシンに曝露される、および肝臓癌およびアフラトキシン中毒症の危険にさらされる系におけるアフラトキシン曝露の危険を軽減する方法であって、
（ａ）粉末形態の有効量の単離されたアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該単離されたＣＡＳは、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含有し、かつ該アフラトキシンを選択的に結合する能力を有し、該単離されたＣＡＳは、約８０ミクロンである平均粒子径を有し、かつ溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す）を経口で投与すること、
（ｂ）ある時間待つこと、および
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を、該系がアフラトキシン曝露の危険から解放されるまで繰り返すこと
を含む方法。
【請求項１８】
３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有する加工処理されたＣＡＳを選択することをさらに含み、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
肝臓癌およびアフラトキシン中毒症になりやすい者であるような系を選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
約２４時間未満であるようなある時間を選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
高濃度のアフラトキシンに、または長期間にわたって低濃度のアフラトキシンに曝露された対象を治療する方法であって、
（ａ）粉末形態の有効量の単離されたアルミノケイ酸カルシウム（「ＣＡＳ」）（ここで、該単離されたＣＡＳは、許容される濃度のダイオキシンおよび重要毒性重金属汚染物質を含有し、かつ該アフラトキシンを選択的に結合する能力を有し、該単離されたＣＡＳは、約８０ミクロンである平均粒子径を有し、かつ溶液の状態で約５〜約９の範囲のｐＨを示す）を経口で投与すること、
（ｂ）ある時間待つこと、および
（ｃ）ステップ（ａ）〜（ｂ）を、該対象のアフラトキシンへの曝露の影響が、低減または排除されるまで繰り返すこと
を含む方法。
【請求項２４】
３．２％を超えるＣａＯ、約４．０〜約５．４％の範囲のＭｇＯ、約５．４〜約６．５の範囲のＦｅ２Ｏ３、約０．５０〜約０．９０％の範囲のＫ２Ｏ、約０．１０〜約０．３０％の範囲のＮａ２Ｏ、約０．０１〜約０．０３％の範囲のＭｎＯ、約１４．８〜約１８．２％の範囲のＡｌ２Ｏ３、および約６２．４〜約７３．５％の範囲のＳｉＯ２を含む化学組成を有する加工処理されたＣＡＳを選択することをさらに含み、ここで、該化学組成は、重量パーセントとして与えられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
肝臓癌およびアフラトキシン中毒症になりやすい者であるような系を選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
約２４時間未満であるようなある時間を選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
2009542656.tif 000031
2009542656.tif 000032