(57)【要約】  本発明は、一つ以上の標的治療用に一つ以上の薬物を開発するための方法、およびそこから得られる組成物を対象とする。本発明の一態様によれば、小分子のアフィニティーおよび/または活性相互作用を同定するためにハイスループットスクリーニング技法と共に使用されるコンビナトリアルケミストリー技法が、その代わりに、自然の抗原応答機構を利用して抗原に対する天然分子の大規模並列スクリーニングを達成することによって回避される。本発明の他の態様では、そこから得られる組成物ならびにそれらの化合物の治療的使用方法が提供される。
2009525274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット生体分子に関して望ましい医薬活性を持つ分子構造を作り出すための方法であって、
ターゲット生体分子に特異的に結合する少なくとも一つの免疫系タンパク質を用意するステップ；
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部（この場合、それら前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部の、ターゲット生体分子の結合部位との相互作用は、そのターゲット生体分子への結合をもたらす）について、そのアイデンティティおよび空間配向を決定するステップ；および
ファーマコフォア（このファーマコフォアは、ファーマコフォアの構造特徴がターゲット生体分子の結合部位に対して相補的になるように、免疫系タンパク質に特異的に結合する前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子のアイデンティティおよび空間配向の少なくとも一部を近似する少なくとも一つのファーマコフォア特徴のモデルを含む）を構築するステップ
を含む方法。
【請求項２】
アノテーション付きリガンド分子のデータベースのファーマコフォア仮説クエリーによって、候補分子を同定するステップ（この場合、同定される候補化合物は、少なくとも一つのファーマコフォア特徴と実質的に整合する構造を持つ）をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ターゲット生体分子の結合部位に対する候補分子のドッキングアフィニティーを決定するステップをさらに含み、ドッキングアフィニティーは、候補分子がターゲット生体分子と相互作用したときに獲得されるエネルギー、最も低エネルギーのコンフォメーションと比較してドッキングしたコンフォメーションを達成するために要求されるエネルギー、またはその組み合わせによって定量化される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質がターゲット生体分子の活性を変化させる能力を持つ、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質が、ターゲット生体分子の活性を阻害する能力を持つ、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
ターゲット生体分子に特異的に結合し、かつそのターゲット生体分子の活性を変化させる能力を持つ少なくとも一つの免疫系タンパク質を用意するステップが、
ターゲット生体分子がインビボ活性によく似た活性を示すアッセイを用意するステップ；
そのアッセイにおいて、ターゲット生体分子に対して結合アフィニティーを持つ複数の免疫系タンパク質を、ターゲット生体分子に曝露するステップ；および
そのアッセイ内でターゲット生体分子の活性を変化させる能力を持つ少なくとも一つの免疫系タンパク質を選択するステップ
を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
ターゲット生体分子に特異的に結合する前記少なくとも一つの免疫系タンパク質は、ターゲット生体分子とはその一部が異なっている少なくとも一つの関連生体分子にも結合するが、その場合は、ターゲット分子の構造および活性と類似する部分または同一な部分が、前記少なくとも一つの関連生体分子によって保たれている、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質が、主要組織適合抗原、T細胞受容体、β細胞受容体、および抗体からなる群の少なくとも一つである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質が少なくとも一つのモノクローナル抗体である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも一つのモノクローナル抗体の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定することが、前記少なくとも一つのモノクローナル抗体の結合端の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
アイデンティティおよび空間配向が、前記少なくとも一つのモノクローナル抗体の結合端の原子の大部分について決定される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ファーマコフォア特徴が、疎水性、芳香族性、水素結合アクセプター、水素結合ドナー、陽イオン、および陰イオンからなる群より選択される少なくとも一つの特徴を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット生体分子がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
ターゲット生体分子が酵素、シグナリングタンパク質、または受容体タンパク質である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ターゲット生体分子が、口蹄疫、アンギオテンシンII；ErbB2；インフルエンザ凝集素；インフルエンザ血球凝集素；インフルエンザノイラミニダーゼ；γインターフェロン；HER2；髄膜炎菌（Neisseria Meningitidis）；HIV1プロテアーゼ；HIV-1逆転写酵素；ライノウイルス；血小板フィブリノゲン受容体；サルモネラオリゴ糖；TGF-α；トロンボポエチン；組織因子；フォンウィレブラント因子；VEGF；コロナウイルス（SARS）；ライム病、HIV GP120；HIV GP41；ウエストナイルウイルス；ジヒドロ葉酸レダクターゼ；およびEGFRからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
ターゲット生体分子が、EGFR、VEGF、HER2、およびErbB2からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。.
【請求項１７】
ターゲット生体分子がEGFRである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定するステップが、前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の結晶形から得られるX線結晶学データの解析を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
X線結晶学データが、ターゲット生体分子に結合した前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の結晶形から得られる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定するステップが、
前記少なくとも一つの免疫系タンパク質のペプチド配列を決定するステップ；
前記免疫系タンパク質の三次元構造の仮想モデルを作成するステップ；および
ターゲット生体分子の結合部位と相互作用してそのターゲット生体分子への結合をもたらす前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定するために、前記免疫系タンパク質の三次元構造の仮想モデルを解析するステップ
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
ターゲット生体分子に関して望ましい医薬活性を持つ分子状物質を作り出すための方法であって、
（i）少なくとも一つのモノクローナル抗体を用意するステップ（ただし、
前記少なくとも一つのモノクローナル抗体は、ターゲット生体分子に特異的に結合して、そのターゲット生体分子の活性を阻害し、
前記少なくとも一つのモノクローナル抗体は結合端を含み、かつ
前記結合端は、ターゲット生体分子の結合部位と相互作用してそのターゲット生体分子への結合をもたらす複数の原子を含む）；
（ii）ターゲット生体分子の結合部位と相互作用する結合端原子の大部分について、そのアイデンティティおよび空間配向を決定するステップ（ただし、
前記アイデンティティおよび空間配向の決定は、ターゲット生体分子に結合した前記少なくとも一つのモノクローナル抗体の結晶形から得られるX線結晶学データの解析を含む）；
（iii）ファーマコフォアを構築するステップ（ただし、
前記ファーマコフォアは複数のファーマコフォア特徴を含み、
前記複数のファーマコフォア特徴は、ターゲット生体分子の結合部位と相互作用する前記少なくとも一つのモノクローナル抗体結合端の少なくとも約75％のアイデンティティおよび空間配向を近似し、
前記複数のファーマコフォア特徴は、ターゲット生体分子の結合部位に対して相補的であり、かつ
前記複数のファーマコフォア特徴は、疎水性、芳香族性、水素結合アクセプター、水素結合ドナー、陽イオン、および陰イオンからなる群より選択される少なくとも一つの特徴を含む）；および
（iv）アノテーション付きリガンド分子のデータベースのファーマコフォア仮説クエリーによって候補分子を同定するステップ
を含み、
同定される候補化合物が、ファーマコフォアの少なくとも一つの特徴と実質的に整合する構造を持ち、
前記候補分子がターゲット生体分子の活性を阻害し、
ターゲット生体分子が酵素、シグナリングタンパク質、または受容体タンパク質である方法。
【請求項２２】
式（1）、式（7）、式（14）、式（19）、および式（25）（その立体異性体または多型を含む）：
【化１】
2009525274.tif 000090
式（1）、
【化２】
2009525274.tif 000091
式（7）、
【化３】
2009525274.tif 000092
式（14）、
【化４】
2009525274.tif 000093
式（19）、
【化５】
2009525274.tif 000094
式（25）、
［式中、
S1〜S8は、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびアルコキシル（-OR）からなる群より独立して選択され；
Xは、H2、O、S、N-R、N-OH、およびN-NR2からなる群より選択され；
Hetは任意の環位置にある1個以上のN原子であり；
Zは、−COOH、−PO3H2、SO3H、テトラゾール環、スルホンアミド、アシルスルホンアミド、−CONH2、および−CONR2からなる群より選択され；
Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノで適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基である］
からなる群より選択される少なくとも一つのEGFR阻害剤と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む、EGFRを阻害するための医薬組成物。
【請求項２３】
EGFRに関連する疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある哺乳動物に、少なくとも一つの請求項22に記載の医薬組成物の治療有効量を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つのEGFR阻害剤が、式（6）；式（13）；式（18）；式（24）；および式（30）、またはその立体異性体もしくは多型：
【化６】
2009525274.tif 000095
式（6）、
【化７】
2009525274.tif 000096
式（13）、
【化８】
2009525274.tif 000097
式（18）、
【化９】
2009525274.tif 000098
式（24）、および
【化１０】
2009525274.tif 000099
式（30）
から選択される、請求項23に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2006年1月23日に出願された米国仮特許出願第60/761,123号に基づく優先権を主張し、前記仮特許出願は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００２】
コンパクトディスクによる提出物の参照による組み込み
本明細書の一部である配列表には、本発明のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列を含むコンピュータ可読形式および書面による配列表が含まれる。コンピュータ可読形式で記録された配列表情報は書面による配列表と同一である。配列表の内容は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、疾患の処置に使用される新規化学物質の開発に関し、より具体的には、準合理的薬物設計に使用されるリード分子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
現代の薬学界における典型的な薬物開発は、標的生化学機能のモデルまたはアッセイの開発に頼っている。次にこれらのアッセイはさまざまな小分子（それらは自然界から収集されたものであってもよいし、実験室で完全に合成されたものもあってもよい）に曝露される。他にわかっていることがなければ、有望な候補リード化合物が同定されるまでに、文字どおり何千回または何百万回という個別の化学物質曝露が必要になる場合もある。このプロセスは全くランダムであり、実際、ランダムスクリーニングと呼ばれている。見てのとおり、このプロセスは合理的分子設計を伴っていないので、前記アッセイで試験される1万個目の分子が有効である確率が、1個目の分子が有効である確率よりも高いということはない。
【０００５】
この形式のスクリーニングプロセスはランダムであるため、成功に至るまでの平均時間を短縮するには、試験すべきさまざまな化学物質を集めてアッセイに曝露する速度を、例えばハイスループットスクリーニングなどによって加速するしかなく、コンビナトリアルケミストリーが発展した。
【０００６】
このタイプの方法論の原理的欠点は、それが持つ本質的なランダム性の他に、考えうるドラッグライクな化学構造の数が、10の80乗個を超えると見積られていることである。したがって、ハイスループットスクリーニングとコンビナトリアルケミストリーを複合的に利用したとしても、合成される化学物質は10の70乗個に1個もないだろうし、スクリーニングされる化学物質はさらに少なくなるだろう。コンビナトリアルケミストリーは、他の方法では逐次的であるスクリーニングに、ある程度の並列処理を導入することになるので、その概念には依然として価値がある。しかし、1枚のトレイ上の空間には物理的限界があるため、その規模拡大性には、数百個の異なる化学物質をスクリーニングするのにさえ一部逐次的な試験に逆戻りする必要があるというような限界がある。
【０００７】
製薬業者がスクリーニングを必要とせずに新薬を開発し続ける一方法は、既承認薬をリードとして使用して、そのクラスに新たな薬物を追加することである。すなわち、FADが承認した物質を使って、その効力を強化したり、その副作用を軽減したり、それを服用しやすくしたりする目的で、その物質に修飾を施すことができるかどうかを調べる。そのため、あるクラス内の薬物の多くは極めて類似している。そうなるのは、大半の小分子薬は有効な相互作用をするための特異的ターゲット領域（例えばタンパク質）を一つだけ持ち、そのターゲットと係合する部分が保存されている限り、他の分子も類似する活性を示しうるのは当然だからである。
【０００８】
例えば現在、半ダースを超えるβ遮断薬が販売されている。この薬物クラスで最も広く処方されている型のうち六つについて、その化学構造を図1に示す。このグループのメンバー全てに実質上共通する化学的基本骨格（これは一般にファーマコフォアと呼ばれる）を、図2に示す。
【０００９】
類似する基本骨格をめぐる薬物のこの種のグループ分けは珍しいことではなく、不合理でもないが、これらの後続薬でさえ、その開発中に試みられる元の薬物（または「画期的新薬（first-in-class）」）への修飾は、やはりランダムであることが多い。
【００１０】
多種多様な合理的薬物設計技法をもたらしてきたのは、ターゲットタンパク質または他の生化学的構造が、通常は、ある薬物が係合して望ましい作用を生じさせることのできる表面領域を、一つ持っているというこの事実である。合理的薬物開発は、望ましい活性を示す一分子を見つけるという根拠のない希望を持って何千もの分子をランダムにスクリーニングするのではなく、ターゲットの活性部位を推定し、その部位と適当な形で相互作用する化学物質を案出することによって、リード分子を開発するプロセスである。この戦略はまずまずの成功を収めてきたが、化学的相互作用の可能性の複雑さが、このプロセスを並外れて困難なものにしている。しかしこれが成功した場合には、一般に、画期的新薬がもたらされ、競合する製薬業者はその薬物構造が公表されるまでは模造プロセスを開始することができないので、それはしばしば、より長期間にわたって市場を独占することになる。
【００１１】
合理的薬物設計によって生み出された薬物の一例は、チロシンキナーゼ酵素阻害剤のメシル酸イマチニブである。チロシンキナーゼ酵素は、特異的タンパク質中のアミノ酸チロシンをリン酸化する一群の分子構造である。リン酸化は、シグナリングタンパク質（調節されなくなった場合に（とりわけ特定タイプの白血病において）がん細胞の増殖に役割を果たしうるものを含む）が必要とする、決定的に重要な修飾である。ABL-BCR（細胞がサイトカインによる調節を受けずに増殖することを可能にし、その結果として、その細胞ががん性になることを許す、チロシンキナーゼをコードするキメラ遺伝子）におけるチロシンキナーゼ活性の領域を同定し、特徴づけることにより、望ましい阻害活性を持つと思われる小分子が設計された。
【００１２】
合理的薬物開発は、成功すれば画期的新薬をもたらしうるので、極めて前途有望な技法であるものの、極めて知識集約的な戦略である。現在利用できるコンピュータモデリングソフトウェアは、今ようやく、この方法を実行可能とするに足る精度で小分子とタンパク質との相互作用を予測するのに十分になりつつあるところである。
【００１３】
合理的薬物開発では、基本的な望ましい活性に関する分子の簡単なスクリーニングが、かなりの時間と費用を投資した後に初めて可能になることが多いのも事実である。これが、コンピュータ上では望ましい形でターゲットと係合するように見えるが、インビトロでは将来性をほとんど示さない分子をもたらす場合もある。これを回避するために、合理的薬物開発を提唱した多くの法人は、既知の化学物質（既に入手可能な薬物を含む）をモデル化し、それらをモデル化されたターゲットに対してコンピュータ内でスクリーニングするインシリコスクリーニングのような手法を使用するところまで、撤退している。これはもちろん、既知分子寄りのバイアスが存在しないというこの技法の主たる利点の一つを排除することになる。
【００１４】
これらの欠点ゆえに、合理的薬物開発に多額の投資をしてきたいくつかの会社は、過去のランダムスクリーニング技法に立ち返ることを余儀なくされている。実際のところ、多くの会社は、合理的薬物設計を真剣に考えたことさえなく、大学および国立研究所がこの技術を彼らのために前進させてくれるのを待っている状態である。
【００１５】
同様に、ハイスループットスクリーニングとコンビナトリアルケミストリーアプローチの組み合わせの欠点は、明らかに何よりもまず、この技法の資源集約性であり、第2に、企業の現実が、大半の開発を画期的新薬の開発から引き離して、同じ状態を処置するための改良の繰り返しへと追いやっているという事実である。
【００１６】
ハイスループットスクリーニングおよびコンビナトリアルケミストリーの利点、すなわち強く作用する候補を見出すために何千もの化学物質を試験できることと、合理的薬物設計の利点、すなわち少ない費用で画期的新薬を開発できる可能性とを合わせ持つ薬物リードの同定および開発方法は、当技術分野に恩恵をもたらすだろう。
【発明の開示】
【００１７】
発明の概要
本発明のさまざまな態様には、ターゲット（例えばタンパク質または他の大分子）に結合する化学構造を見出すために、文字どおり何兆もの化学構造を、生きているホスト内で試験することができ、標準的なアッセイ技法を使って、ターゲットに結合する化学構造のうちのどれが望ましい活性を与えるかを決定し、かつ/または結合する化学構造に関する既知の事実を使って、小分子リードの構築を導く方法の提供が含まれる。
【００１８】
本発明の一態様は、ターゲット生体分子に関して望ましい医薬活性を持つ分子構造を作り出すための方法を対象とする。そのような方法は、ターゲット生体分子に特異的に結合する少なくとも一つの免疫系タンパク質を用意するステップ；免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部（この場合、前記免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部の、ターゲット生体分子の結合部位との相互作用は、そのターゲット生体分子への結合をもたらす）について、そのアイデンティティおよび空間配向（spatial orientation）を決定するステップ；およびファーマコフォア（このファーマコフォアは、ファーマコフォアの構造特徴がターゲット生体分子の結合部位に対して相補的になるように、免疫系タンパク質に特異的に結合する免疫系タンパク質の原子のアイデンティティおよび空間配向の少なくとも一部を近似する少なくとも一つのファーマコフォア特徴のモデルを含む）を構築するステップを含む。
【００１９】
上述した態様のさまざまな実施形態において、本方法はさらに、アノテーション付きリガンド分子のデータベースのファーマコフォア仮説クエリーによって、候補分子を同定するステップ（この場合、同定される候補化合物は、少なくとも一つのファーマコフォア特徴と実質的に整合する構造を持つ）を含むことができる。上述した態様のさまざまな実施形態において、本方法はさらに、ターゲット生体分子の結合部位に対する候補分子のドッキングアフィニティーを決定するステップを含むことができ、この場合、ドッキングアフィニティーは、候補分子がターゲット生体分子と相互作用したときに獲得されるエネルギー、最も低エネルギーのコンフォメーションと比較してドッキングしたコンフォメーションを達成するために要求されるエネルギー、またはその組み合わせによって定量化される。
【００２０】
さまざまな実施形態において、免疫系タンパク質は、ターゲット生体分子の活性を変化させる能力を持つ。例えば免疫系タンパク質は、ターゲット生体分子の活性を阻害する能力を持つことができる。
【００２１】
さまざまな実施形態において、ターゲット生体分子に特異的に結合し、かつそのターゲット生体分子の活性を変化させる能力を持つ免疫系タンパク質を用意するステップは、ターゲット生体分子がインビボ活性によく似た活性を示すアッセイを用意するステップ；そのアッセイにおいて、ターゲット生体分子に対して結合アフィニティーを持つ複数の免疫系タンパク質を、ターゲット生体分子に曝露するステップ；およびそのアッセイ内でターゲット生体分子の活性を変化させる能力を持つ少なくとも一つの免疫系タンパク質を選択するステップを含む。
【００２２】
さまざまな実施形態において、ターゲット生体分子に特異的に結合する免疫系タンパク質は、ターゲット生体分子とはその一部が異なっている少なくとも一つの関連生体分子にも結合するが、その場合は、ターゲット分子の構造および活性と類似する部分または同一な部分が、その関連生体分子によって保たれている。さまざまな実施形態において、免疫系タンパク質は、主要組織適合抗原、T細胞受容体、β細胞受容体、または抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２３】
さまざまな実施形態において、モノクローナル抗体の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定することには、モノクローナル抗体の結合端の原子の少なくとも一部について、好ましくは少なくとも一つのモノクローナル抗体の結合端の原子の大部分について、そのアイデンティティおよび空間配向を決定することが含まれる。
【００２４】
さまざまな実施形態において、ファーマコフォア特徴には、疎水性、芳香族性、水素結合アクセプター、水素結合ドナー、陽イオン、および陰イオン特徴の群から選択される少なくとも一つの特徴が含まれる。
【００２５】
さまざまな実施形態において、ターゲット生体分子はタンパク質、好ましくは酵素、シグナリングタンパク質、または受容体タンパク質である。
【００２６】
さまざまな実施形態において、ターゲット生体分子は、口蹄疫の原因因子、アンギオテンシンII；ErbB2；インフルエンザ凝集素；インフルエンザ血球凝集素；インフルエンザノイラミニダーゼ；γ-インターフェロン；HER2；髄膜炎菌（Neisseria Meningitidis）；HIV1プロテアーゼ；HIV-1逆転写酵素；ライノウイルス；血小板フィブリノゲン受容体；サルモネラオリゴ糖；ＴＧＦ−α；トロンボポエチン；組織因子；フォンウィレブラント因子；VEGF；コロナウイルス（SARS）；ライム病の原因因子、HIV GP120；HIV GP41；ウエストナイルウイルス；ジヒドロ葉酸レダクターゼ；およびEGFRから選択される。好ましくは、ターゲット生体分子はEGFR、VEGF、HER2、およびErbB2であり、最も好ましくはEGFRである。
【００２７】
さまざまな実施形態において、少なくとも一つの免疫タンパク質の原子の少なくとも一部についてそのアイデンテイティおよび空間配向を決定することには、前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の結晶形、好ましくはターゲット生体分子に結合した前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の結晶形から得られるX線結晶学データの解析が含まれる。
【００２８】
さまざまな実施形態において、一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定することには、前記少なくとも一つの免疫系タンパク質のペプチド配列を決定し；前記免疫系タンパク質の三次元構造の仮想モデルを作成し；ターゲット生体分子の結合部位と相互作用してそのターゲット生体分子への結合をもたらす前記少なくとも一つの免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部についてそのアイデンティティおよび空間配向を決定するために、前記免疫系タンパク質の三次元構造の仮想モデルを解析することが含まれる。
【００２９】
ある実施形態において、ターゲット生体分子に関して望ましい医薬活性を持つ分子状物質を作り出すため方法は、（i）少なくとも一つのモノクローナル抗体（ただし、前記モノクローナル抗体は、ターゲット生体分子に特異的に結合して、そのターゲット生体分子の活性を阻害し、このモノクローナル抗体は結合端を含み、かつ、前記結合端はターゲット生体分子の結合部位と相互作用してそのターゲット生体分子への結合をもたらす複数の原子を含む）を用意するステップ；（ii）ターゲット生体分子の結合部位と相互作用する結合端原子の大部分について、そのアイデンティティおよび空間配向を決定するステップ（ただし、前記アイデンティティおよび空間配向の決定は、ターゲット生体分子に結合した前記少なくとも一つのモノクローナル抗体の結晶形から得られるX線結晶学データの解析を含む）；（iii）ファーマコフォアを構築するステップ（ただし、前記ファーマコフォアは複数のファーマコフォア特徴を含み、前記複数のファーマコフォア特徴は、ターゲット生体分子の結合部位と相互作用する前記少なくとも一つのモノクローナル抗体結合端の少なくとも約75％のアイデンティティおよび空間配向を近似し、前記複数のファーマコフォア特徴は、ターゲット生体分子の結合部位に対して相補的であり、前記複数のファーマコフォア特徴は、疎水性、芳香族性、水素結合アクセプター、水素結合ドナー、陽イオン、および陰イオンからなる群より選択される少なくとも一つの特徴を含む）；および（iv）アノテーション付きリガンド分子のデータベースのファーマコフォア仮説クエリーによって候補分子を同定するステップを含み、同定される候補化合物は、ファーマコフォアの少なくとも一つの特徴と実質的に整合する構造を持ち、その候補分子はターゲット生体分子の活性を阻害し、ターゲット生体分子は酵素、シグナリングタンパク質、または受容体タンパク質である。
【００３０】
本発明のもう一つの態様は、EGFRを阻害するための医薬組成物を対象とする。そのような医薬組成物は、式（1）、式（7）、式（14）、式（19）、および式（25）（その立体異性体または多型を含む）からなる群より選択される少なくとも一つのEGFR阻害剤と、薬学的に許容できる担体または希釈剤とを含む。式は以下のとおりである：
【化１】
2009525274.tif 000003
式（1）、
【化２】
2009525274.tif 000004
式（7）、
【化３】
2009525274.tif 000005
式（14）、
【化４】
2009525274.tif 000006
式（19）、
【化５】
2009525274.tif 000007
式（25）
［式中、S1〜S8は、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびアルコキシル（-OR）からなる群より独立して選択され；Xは、H2、O、S、N-R、N-OH、およびN-NR2からなる群より選択され；Hetは任意の環位置にある1個以上のN原子であり：Ｚは、−ＣＯＯＨ、-PO3H2、SO3H、テトラゾール環、スルホンアミド、アシルスルホンアミド、-CONH2、および−ＣＯＮＲ2からなる群より選択され；Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノで適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基である］。
【００３１】
本発明のもう一つの態様は、EGFRに関連する疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある哺乳動物に、治療有効量の本発明の医薬組成物を含む組成物を投与するステップを含む方法を対象とする。そのような組成物は、式（6）；式（13）；式（18）；式（24）；式（30）、またはその立体異性体もしくは多型から選択されるEGFR阻害剤を含む。構造は以下のとおりである：
【化６】
2009525274.tif 000008
式（6）、
【化７】
2009525274.tif 000009
式（13）、
【化８】
2009525274.tif 000010
式（18）、
【化９】
2009525274.tif 000011
式（24）、および
【化１０】
2009525274.tif 000012
式（30）。
【００３２】
他の目的および特徴は、一部は明白であるだろうし、一部は以下に指摘する。
【００３３】
図面の簡単な説明
後述する図面が単なる例示であることは当業者には理解されるだろう。これらの図面は、決して、本明細書が教示する内容の範囲を限定しようとするものではない。
【００３４】
図１A〜Fは、それぞれアテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、ラベタロール、プロプラノロール、およびカルベジロールの化学構造を示す。
図２は、アテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、ラベタロール、プロプラノロール、およびカルベジロールのそれぞれに実質的に組み込まれている共通の化学的バックボーンを表す。
図３は、IgG分子の図である。
図４は、二つのFab抗体フラグメントに結合した二量化VEGFタンパク質のJmol図であり、枠で囲んだ結合領域が拡大されている。
図５は、VEGF二量体のリボンモデルである。
図６は、AおよびBは、VEGFに対して活性を持ちうるリード分子の化学構造である。このリード化合物は、本発明の方法が意図するとおり、VEGFに対して高いアフィニティーを持つ抗体の結合部分に基づいて設計されたものである。
【００３５】
図７は、AおよびBは、血球凝集素に対して活性を持ちうるリード分子の化学構造である。このリード化合物は、本発明の方法が意図するとおり、血球凝集素に対して高いアフィニティーを持つ抗体の結合部分に基づいて設計されたものである。
図８は、アンギオゲニンの分子に結合している、アンギオゲニンに対して高いアフィニティーを持つFabフラグメントのJmol像であり、アンギオゲニン分子とFabフラグメントの結合領域との境界面にある枠で囲った領域が拡大されている。
図９は、AおよびBは、アンギオゲニンに対して活性を持ちうる二つのリード分子の化学構造である。これらのリード分子は、本発明の方法が意図するとおり、アンギオゲニンに対して高いアフィニティーを持つ抗体の二つの密接に関連する結合部分に基づいて設計されたものである。
図１０は、AおよびBは、それぞれ図9Aおよび9Bのリード分子の球棒モデルである。
図１１は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア1_gly54_asp58を、抗体セツキシマブのgly54_asp58領域に重ね合わせた図である。
図１２は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア11_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図である。
図１３は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア21_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図である。
【００３６】
図１４は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア22_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図である。
図１５は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア23_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図である。
図１６は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア24_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図である。
図１７は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア1_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図である。
図１８は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア2_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図である。
図１９は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア3_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図である。
図２０は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア10_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図である。
【００３７】
図２１は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア21_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図である。
図２２は、結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア22_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図である。
図２３は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア1nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
図２４は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア2nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
図２５は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア3nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
図２６は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア4nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
図２７は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア6nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
【００３８】
図２８は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア7nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
図２９は、結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア10bを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図である。
図３０は、結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア1bを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図である。
図３１は、結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア2bを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図である。
図３２は、結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア2nを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図である。
図３３は、結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア3nを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図である。
図３４は、結晶1S78.pdbから導出されたファーマコフォア5nを、抗体の領域asp31_tyr32、asn_52_pro52a_asn53に重ね合わせた図である。
【００３９】
図３５は、結晶1S78.pdbから導出されたファーマコフォア6bを、抗体の領域asp31_tyr32、asn_52_pro52a_asn53に重ね合わせた図である。
図３６は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア3hを、 抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
図３７は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア4hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
図３８は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア5hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
図３９は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア6hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
図４０は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア7hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
図４１は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア8hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
【００４０】
図４２は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア9hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図である。
図４３は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア1Lおよび2L（同じ）を、抗体の軽鎖Asn32_Ile33_Gly34、Tyr49_His50_Gly51、Tyr91、Phe94、およびTrp96領域に重ね合わせた図である。
図４４は、結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア3Lを、抗体の軽鎖Asn32_Ile33_Gly34、Tyr49_His50_Gly51、Tyr91、Phe94、およびTrp96領域に重ね合わせた図である。
図４５は、セツキシマブのタンパク質結晶構造（1YY9.pdb）の残基GLY-54〜ASP-58と重ね合わせたファーマコフォア1_gly54_asp58。EGFRターゲットタンパク質（配列番号1）が占める空間を排除するために体積拘束を使用し、ファーマコフォアクエリー中は、ターゲットタンパク質の原子の位置を占めるように、一群の「ダミー」スフィア（濃い灰色）を配置した。EGFRターゲットタンパク質の表面トポロジーを近似するために、この表現を使用する。
図４６は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1025を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図４７は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1038を、3D棒モデル図（A）または3D接触表面図（B）として表す図である。
図４８は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1010を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
【００４１】
図４９は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1009を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５０は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1016を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５１は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1017を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５２は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1018を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５３は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1020を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５４は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1021を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５５は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1022を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
【００４２】
図５６は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1027を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５７は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1030を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図５８は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1132を、3D棒モデル図（A）または3D接触表面図（B）として表す図である。
図５９は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1132を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
図６０は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1142を、3D棒モデル図（A）または3D接触表面図（B）として表す図である。
図６１は、EGFRにドッキングした化合物AD4-1142を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図である。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、一つ以上の標的治療用に一つ以上の薬物を開発するための方法および装置を対象とする。本発明の一態様によれば、小分子のアフィニティーおよび活性相互作用を同定するためにハイスループットスクリーニング技法と共に使用されるコンビナトリアルケミストリー技法が、その代わりに、自然の抗原応答機構を利用して抗原に対する天然分子の大規模並列スクリーニングを達成することによって回避される。
【００４４】
また、本発明のもう一つの態様によれば、ターゲット構造に対して高いアフィニティーを持つことがわかっている生物学的に合成された分子（例えば免疫グロブリン）の分子サブ構造の模造に基づいて、合理的薬物設計技法を、医薬開発のためのリード分子の創出へと導くことができる。
【００４５】
簡単に述べると、一つ以上の標的治療用の薬物を開発するための方法の好ましい実施形態は、以下のとおりである。ターゲット生体分子（好ましくはタンパク質、より好ましくは酵素）に対して、免疫系タンパク質（例えば抗体、好ましくはモノクローナル抗体）を生じさせる。ターゲット分子と免疫系タンパク質の間の結合相互作用を、例えば結晶学データなどによって特徴づける。結合の特徴づけにより、タンパク質結合ドメインが限定される。タンパク質結合ドメインは、一つ以上のファーマコフォア特徴として表し、かつ/または一つ以上のファーマコフォア特徴を含むファーマコフォアモデルに編集することができる。ファーマコフォア特徴は、一般に、ターゲット生体分子との複合体を形成している免疫系タンパク質の対応する部分から導出することができる。ファーマコフォアの生成は、そのような作業用に設計されたソフトウェアに従って行うことができる。そのファーマコフォアモデルに整合する分子から、候補分子が（例えば一つ以上の化学ライブラリーから）選択される。好ましくは、候補分子を、インシリコで、ターゲット免疫系タンパク質とドッキングさせ、相互作用についてスコアリングする。ここでも、ドッキングおよびスコアリングは、そのような作業用に設計されたソフトウェアに従って行うことができる。一つ以上のファーマコフォアモデルに整合する分子を選択し、適宜、そのような分子をインシリコでドッキングさせ、スコアリングした後に、選択した分子を、例えば化学合成によって、または商業的供給源から入手する。選択した分子は、ターゲット生体分子に関して、結合アフィニティーおよび/または機能に対する作用について測定することができる。そのような評価は、一般に、生物学的アッセイに従って行われる。試験した分子は、望ましい測定パラメーターに従って、さらに選択することができる。選択した分子および/またはさらに選択した分子は、適宜、さらに最適化することができる。
【００４６】
生体分子ターゲットの選択
本発明の方法によって生成されるリード分子にとっての生体分子ターゲットのタイプには、以下の一つ以上を含むことができると理解すべきである：ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（およびその化学的誘導体）、DNA（二本鎖または一本鎖）、全RNA、メッセンジャーRNA、cRNA、ミトコンドリアRNA、人工RNA、アプタマーPNA（ペプチド核酸）ポリクローナル、モノクローナル、組換え抗体、改変抗体、抗原、ハプテン、抗体FABサブユニット（必要ならば修飾）タンパク質、修飾タンパク質、酵素、酵素補因子または酵素阻害因子、タンパク質複合体、レクチン、ヒスチジン標識タンパク質、ヒスチジンタグコンポーネント（HIS-tag）用のキレーター、タグ付きタンパク質、人工抗体、分子インプリント、プラスティボディ（plastibody）膜受容体、全細胞、細胞フラグメントおよび細胞サブ構造、シナプス、アゴニスト/アンタゴニスト、細胞、細胞小器官、例えばミクロソーム、小分子、例えばベンゾジアゼピン、プロスタグランジン、抗生物質、薬物、代謝産物、薬物代謝産物、天然物、糖質および誘導体、天然および人工リガンド、ステロイド、ホルモン、ペプチド、天然または人工ポリマー、分子プローブ、天然および人工受容体ならびにその化学的誘導体、キレート試薬、クラウンエーテル、リガンド、超分子アセンブリ、指示薬（pH、電位、膜電位、酸化還元電位）、ならびに組織試料（組織マイクロアレイ）。ターゲット生体分子は、好ましくはタンパク質、より好ましくは酵素である。
【００４７】
望ましいターゲット酵素として、タンパク質-抗体結晶学データが存在するものが挙げられる。本発明のさまざまな方法を使って、以下に挙げる（ただしこれらに限るわけではない）さまざまなタンパク質ターゲット（リガンド共に結晶化されたもの）について、ファーマコフォアモデルを作成することができる：口蹄疫（1QGC.pdb）；アンギオテンシンII（1CK0.pdb、3CK0.pdb、2CK0.pdb）；ペルツズマブ抗体との複合体を形成したErbB2（1L7I.pdb、1S78.pdb、2GJJ.pdb）；インフルエンザ凝集素（1DN0.pdb、1OSP.pdb）；インフルエンザ血球凝集素（1EO8.pdb、1QFU.pdb、2VIR.pdb、2VIS.pdb、2VIT.pdb、1KEN.pdb、1FRG.pdb、1HIM.pdb、1HIN.pdb、1IFH.pdb）；インフルエンザノイラミニダーゼ（NC10.pdb、1AI4.pdb、1NMB.pdb、1NMC.pdb、1NMA.pdb、1NCA.pdb、1NCD.pdb、2AEQ.pdb、1NCB.pdb、1NCC.pdb、2AEP.pdb）；γインターフェロン（HuZAF.pdb、1T3F.pdb、1B2W.pdb、1B4J.pdb、1T04.pdb）；ハーセプチンとの複合体を形成したHER2（1N8Z.pdb、1FVC.pdb）；髄膜炎菌（Neisseria Meningitidis）（1MNU.pdb、1MPA.pdb、2MPA.pdb、1UWX.pdb）；HIV1プロテアーゼ（1JP5.pdb、1CL7.pdb、1MF2.pdb、2HRP.pdb、1SVZ.pdb）；HIV-1逆転写酵素（2HMI.pdb、1J5O.pdb、1N5Y.pdb、1N6Q.pdb、1HYS.pdb、1C9R.pdb、1HYS.pdb、1R08.pdb、1T04.pdb、2HRP.pdb）；ライノウイルス（1FOR.pdb、1RVF.pdb、1BBD.pdb、1A3R.pdb、1A6T.pdb）；血小板フィブリノゲン受容体（1TXV.pdb、1TY3.pdb、1TY5.pdb、1TY6.pdb、1TY7.pdb）；サルモネラオリゴ糖（1MFB.pdb、1MFC.pdb、1MFE.pdb）；TGF-α（1E4W.pdb、1E4X.pdb）；TN1との複合体を形成したトロンボポエチン（1V7M.pdb、1V7N.pdb）；5G9との複合体を形成した組織因子（1FGN.pdb、1AHW.pdb、1JPS.pdb、1UJ3.pdb）；NMC-4との複合体を形成したフォンウィレブラント因子（1OAK.pdb、2ADF.pdb、1FE8.pdb、1FNS.pdb、2ADF.pdb）；B20-4との複合体を形成したVEGF（2FJH.pdb、2FJF.pdb、2FJG.pdb、1TZH.pdb、1TZI.pdb、1CZ8.pdb、1BJ1.pdb）；コロナウイルス-SARS（2DD8.pdb、2G75.pdb）；ライム病（1P4P.pdb、1RJL.pdb）；HIV GP120（1ACY.pdb、1F58.pdb、1G9M.pdb、1G9N.pdb、1GC1.pdb、1Q1J.pdb、1QNZ.pdb、1RZ7.pdb、1RZ8.pdb、1RZF.pdb、1RZG.pdb、1RZI, 1RZJ.pdb、1RZK.pdb、1YYL.pdb、1YYM.pdb、2B4C.pdb、2F58.pdb、2F5A.pdb）；HIV GP41（1TJG.pdb、1TJH.pdb、1TJI.pdb、1U92.pdb、1U93.pdb、1U95.pdb、1U8H.pdb、1U8I.pdb、1U8J.pdb、1U8K.pdb、1U8P.pdb、1U8Q.pdb、1U91.pdb、1U8L.pdb、1U8M.pdb、1U8N.pdb、1U8O.pdb、2F5B）；ウエストナイルウイルス（米国特許出願公開第2006/0115837号に定義されているもの）；マラリア（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）（Acta Crystallographia (2004), D60(11), 2054-2057に定義されているもの）；およびEGFR（1I8I.pdb、1I8K.pdb、1YY8.pdb、1YY9.pdb、2EXP.pdb、2EXQ.pdb）。
【００４８】
免疫系タンパク質の構造および機能
ターゲット生体分子に結合することが確認された免疫系タンパク質は、ターゲット生体分子の小有機分子阻害剤またはそのファーマコフォアの選択および/または構築を方向付けるためのテンプレートとして使用される。一般に免疫系タンパク質は、非自己タンパク質に結合するものである。さまざまな実施形態では、ターゲット生体分子に対して免疫系タンパク質を生じさせる。免疫系で産生される多様な構造が、対応する分子構造に対して高いアフィニティーを選択的に発現させることは、理解されている。これらには、例えば主要組織適合抗原、さまざまなT細胞受容体およびβ細胞受容体、ならびに抗体が含まれる。これらの構造はいずれも本発明のステップに利用することができるのであるが、その好ましい実施形態を説明する目的で、抗体に言及することにする。以下の議論が他の免疫系タンパク質にも同様に当てはまることは、当業者には理解されるだろう。
【００４９】
好ましくは、免疫系タンパク質は、例えば誘導適合などによって引き起こされる構造ひずみをほとんどまたは全く伴わずに、非自己タンパク質を結合する。本明細書に記載する方法においてこの種の分子が望ましい理由は、少なくとも一つには、さまざまな免疫系タンパク質が持つこの性質にある。さまざまな実施形態において、免疫系タンパク質は結合前後で構造が少なくとも約95％は一定であり、より好ましくは少なくとも約98％は一定である。言い換えると、好ましい免疫系タンパク質は、非自己タンパク質ターゲットへの結合時に、原子の空間位置で測定して約5％未満または約2％未満のコンフォメーション変化しか起こさない。例えばさまざまな実施形態の免疫系タンパク質は、生体分子ターゲットに結合した後に起こす平均原子空間移動が約3Å未満または約2Å未満である。
【００５０】
本発明の好ましい方法の一態様である免疫グロブリンの場合、健常な哺乳動物はそれぞれ個々に、異なる抗原にそれぞれ応答して10の10乗個以上の独特な抗体を産生することができる。種を超えて、さらには動物界全体にわたって考えると、種内遺伝コード（特に抗体の相補性決定領域（CDR）コンポーネントに関するコード）の変異性および抗体の形状（全体的構造が単量体（例えばラクダ）であるか二量体（例えばヒトおよびマウス）であるか）により、考えうる抗体応答の数は10の20乗以上にまで増加する。また、健常な免疫系を持つ個々の動物は、ほとんどどんな抗原に対しても、複数の抗体を生じさせることができる。
【００５１】
外来分子、例えば別の種に固有の酵素が、健常な免疫系を持つ動物の体内に注入されると、その構造に対して、その系の応答が生じるだろう。この応答中に、最終的にそのβ細胞が産生することになるものと同一の抗体を反映する独特な受容体をそれぞれ発現させる何百万という新生β細胞が分子に曝露される。外来分子に強固に結合する受容体を発現させるβ細胞は増殖させられ、その結果、ターゲットに特異的な同じ抗体をそれぞれが産生する細胞のコロニーをもたらす。これらのβ細胞の一部は外来物質を駆除するために体内に放出され、他のメンバーはリンパ節、脾臓および胸腺内に留まって、将来その外来分子がその系に提示された場合に大量の抗体をもって応答するために準備される。外来分子の将来の提示に備えて待機するこの能力を、外来物質の初回提示がなければ将来的に応答する能力を獲得することができない場合に限り、「獲得免疫」という。
【００５２】
特異的分子構造、例えばタンパク質、より具体的には酵素が、ある疾患の病理発生の一因である場合、その分子に高い特異性で結合し、その分子の活性を阻害する医薬剤は、その疾患の（治癒法ではないとしても）意味ある治療法を発見する一経路である。そのような酵素の例は、HIVの逆転写酵素、一定タイプの白血病のABL-BCRチロシンキナーゼ、および腫瘍血管新生に関係するものを含む血管内皮増殖因子（VEGF）など、数多くある。
【００５３】
「発明の背景」で説明したように、この活性を正確に発揮するリード小分子を同定する際によく選択される方法は、何千という小分子（合成されたもの、または他の方法でこの目的のために用意されたもの）を、それら小分子の一つが望ましい機能的性質を示すだろうという希望を持って、ターゲット分子に対してランダムにスクリーニングすることである。適切な特徴を持つ（1または複数の）分子をリードと呼び、これには、薬物が発見されるまでに、さらなる改良が加えられる。このスクリーニングとそれに続く最適化の方法は多大な労力を要し、ターゲット分子に関する知見またはそれに結合しそうな構造に関する知見を活用することから始められるものではない。
【００５４】
これに対し、本発明では、ハイスループットアフィニティースクリーニングプロセスが得られるように、免疫系タンパク質の結合アフィニティー特性を利用する。免疫系に対するターゲット分子の初回提示は免疫系による抗体産生をもたらし、そこでは、多くの独特な免疫グロブリンの産生が、大規模並列ハイスループットアフィニティースクリーニングプロセスとして働く。ターゲットに結合する受容体を発現させる細胞だけが選択されて増殖する。これはクローン選択と呼ばれ、ちょうどスクリーニングが医薬リード発見プロセスの正に核心であるのと同じように、ターゲット特異的な分子を産生するという免疫系の能力の核心である。
【００５５】
実際には、ターゲットに結合する抗体を産生する能力を持つβ細胞の増殖がひとたび推進されると、突然変異（親和性成熟）をかすかに促進する機構が誘発されるので、免疫系がターゲット分子の提示に応答して起こす抗体の産生とのこの対比は、ターゲット提示/クローン選択とハイスループットスクリーニングの間の類似性には留まらず、それ以上のものを含んでいる。このプロセスは、次世代のβ細胞が微妙に異なる抗体を生成することを可能にし、その中には、ターゲットにより強固に結合するものもあるだろうし、ターゲットへの結合が弱くなるものもあるだろう。より強固に結合するものは、より多く増殖され、弱く結合するものは、より遅く増殖する。より高い結合アフィニティーへと向かうこの遅い進化は、リード最適化のサイクルによる薬物の医薬開発に反映されている。
【００５６】
本発明の範囲に包含される抗体には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体フラグメントが含まれる。ターゲットタンパク質/酵素に対して生じさせた抗体の生産、精製、および/または断片化を行うための数多くの方法が、当技術分野ではよく知られている（一般論については、Carter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357；Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Supp. 1) S15-27；Subramanian編 (2004) Antibodies: Volume 1: Production and Purification, Springer, ISBN 0306482452；Lo編 (2003) Antibody Engineering Methods and Protocols, Humana Press, ISBN 1588290921；Ausubelら編 (2002) Short Protocols in Molecular Biology（第5版）Current Protocols, ISBN 0471250929；Brentら編 (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN 047150338X；Coligan (2005) Short Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, ISBN 0471715786；Sidhu (2005) Phage Display In Biotechnology and Drug discovery, CRC, ISBN-10: 0824754662を参照されたい）。
【００５７】
ポリクローナル抗体は、免疫した動物（通常は血清）から得られる抗体分子の不均一な集団である。当技術分野ではよく知られているとおり、また上に挙げた数多くの参考文献に記載されているように、当業者は、さまざまな温血動物から、ポリクローナル抗体を容易に生成させることができる。さらにまた、ポリクローナル抗体は、さまざまな商業的供給源から入手することもできる。
【００５８】
モノクローナル抗体は特定の抗原に対する抗体の均一な集団である。ある抗原の数個のエピトープに対して特異的でありうるポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は通常、単一のエピトープに対して特異的である。一般に、モノクローナル抗体は、抗原投与した動物の脾臓からβ細胞を取り出し（この場合、抗原は本明細書に記載のタンパク質を含む）、次にそれらのβ細胞を、培養下で無限に成長することができる骨髄腫腫瘍細胞と融合することによって生産される。融合されたハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマは、迅速かつ無限に増殖し、大量の抗体を産生することができる。ハイブリドーマは、それぞれが1タイプの抗体だけを産生するいくつかの異なるコロニーが得られるように、十分に希釈して成長させることができる。次に、異なるコロニーから得た抗体を、抗原へのその結合能力について試験し、続いて最も有効なものを選択することができる。
【００５９】
特に、モノクローナル抗体は、例えば上に挙げた文献に記載されているような、培養下の連続細胞株による抗体分子の生産に対応できる任意の技法によって入手することができる。好ましくは、ターゲット抗体を希釈しないように、自分自身の抗体を産生する能力を失っている骨髄腫細胞株を使用する。好ましくは、特定の酵素（例えばヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRT）を失っていて、そのために一定の条件下（すなわちHAT培地の存在下）では成長できない骨髄腫細胞を使用する。そのような好ましい実施形態では、健常なパートナーが必要な酵素を供給して融合細胞がHAT培地中で生き残ることができるという、健常なβ細胞と骨髄腫細胞との融合の成功を検出することができる。
【００６０】
モノクローナル抗体はファージディスプレイなどの他の方法によって生成させることもできる（例えばSidhu (2005) Phage Display In Biotechnology and Drug Discovery, CRC, ISBN-10: 0824754662を参照されたい）。
【００６１】
そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスに属することができる。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。インビボでは高力価のモノクローナル抗体を生産することができるので、これは、とりわけ有用な生産方法である。モノクローナル抗体は一般に、多くの抗体フラグメントより長い終末相半減期を持ち、これは、さまざまな応用例にとって望ましいであろう取り込み量の増大につながる。
【００６２】
好ましくは、抗体は、IgG免疫グロブリンクラスに属する。以下の解説は、その好ましいIgGクラスに向けられるが、その議論が他の実施形態のクラスにも同様に当てはまることは、当業者には理解されるだろう。
【００６３】
各IgG分子は、2種類の異なるポリペプチド鎖、すなわち重鎖および軽鎖からなる。これらの重鎖および軽鎖はさらに、定常セグメントと可変セグメントとに細分される。IgG分子100の全体的構造は図3に示すように「Y」字状であり、「Y」の基部102は2対の定常重鎖セグメント104、106（並列した二つのセグメントCH2-CH3）によって形成される。この基部構造の上側のセグメントのそれぞれは「Y」の二つの分枝108、110の一方に連結され、具体的にはそれぞれが、もう一つの定常重鎖セグメントCH1 109に結合される。これら二つの重鎖セグメントCH1のそれぞれは、定常軽鎖セグメントCL1 112と対を為す。定常重鎖セグメントと定常軽鎖セグメントの遠位端は、可変重鎖セグメントおよび可変軽鎖セグメントVH1 114およびVL1 116（1分枝につき1対の可変セグメント）に結合される。これらの対を為した可変セグメントは「Y」構造の遠位端を形成し、前述の高い抗原特異性を持って形成される結合端を含む。抗体結合部位のトポグラフィーは、例えばLeeら (2006) J Org Chem 71, 5082-5092などに概説されている。
【００６４】
種を超えて考えると定常セグメントの構造には変異性が存在し、種内でも多少の変異が報告されてはいるものの、哺乳動物における定常重鎖セグメントCH1、CH2およびCH3は、一般的には、極めて高度に保存された110〜120アミノ酸配列からなる。同様に定常軽鎖セグメントも、一般的には、極めて高度に保存された100〜110アミノ酸配列からなる。
【００６５】
軽鎖および重鎖可変セグメントVH1およびVL1は定常セグメントに非常に良く似たペプチド配列を含むが、約5〜15アミノ酸長の三つの小さなペプチドストレッチは別である。これらの短いストレッチは高度に可変であり、一般に、超可変領域または相補性決定領域（CDR）118と呼ばれる。この超可変性は、免疫グロブリン産生細胞の成熟時に起こる遺伝子スプライシングおよび遺伝子シャフリングの結果である。成熟した免疫グロブリン産生細胞は（それが抗体産生細胞である場合には）それぞれ1タイプの抗体だけを産生し、異なる細胞は異なる免疫グロブリンを産生することになる。したがって、この遺伝的プロセスは、単一の動物内で、広範囲にわたるさまざまな抗体を産生させる。
【００６６】
各可変セグメントの三つの短い超可変ペプチド配列は、抗体の各遠位端で束ねられた六つのアミノ酸群からなる複合体を形成する（二つの遠位端は互いに同一である）。したがって抗体分子自体は、小さなアミノ酸群であるCDRを、それらが極めて高いアフィニティーで極めて特異的なターゲット構造に結合しうるように、単に安定な配置で保持し、提示することを目的とする大きな構造を含むと考えることができる。
【００６７】
可変鎖セグメントの残りの区間は、超可変ペプチドストレッチと比較して高度に保存されているので、CDRを形成する特異的アミノ酸は、配列決定法によって同定することができる。可変軽鎖セグメントの超可変領域は、例えばペプチドストレッチ24〜34、50〜56、および89〜97（KabatとWuが使用した番号付与システムによる）に見出される。同様に、可変重鎖セグメントの超可変領域は、例えば31〜35、50〜65、および95〜102に見出される。個々のCDRは、利用可能な数字だけに基づいて考えうる数よりも多くのペプチドを含む場合があることを理解すべきである。すなわち、CHR H3は8ペプチドちょうどよりも大きいことがしばしばあり、そのような場合は、配列コンポーネントを一意的に記述するために、例えば100A、100Bなどの英数字が使用される。
【００６８】
免疫系タンパク質の選択
免疫系タンパク質は、一般に、生体分子ターゲットを結合するというその能力に関して選択される。好ましくは、免疫系タンパク質は生体分子ターゲットを比較的高いアフィニティーで結合する。例えば、好ましい免疫系タンパク質は、少なくとも約1mM、より一般的には少なくとも約300μM、典型的には少なくとも約10μM、より典型的には少なくとも約30μM、好ましくは少なくとも約10μM、より好ましくは少なくとも約3μMまたはそれより良いKDで、生体分子ターゲットを結合することができる。好ましくは、高アフィニティー免疫系タンパク質は、高アフィニティーモノクローナル抗体である。以下の議論では抗体、より具体的にはモノクローナル抗体を参照するが、その議論が上で論じた他のタイプの免疫系タンパク質にも当てはまることは、当業者には理解されるだろう。
【００６９】
一般に、活性部位における結合、活性部位内での結合、または活性部位近くでの結合は、そのような結合の方がターゲット生体分子の活性を阻害する可能性が高いことを考えると、好ましい実施形態である。しかし、ターゲット生体分子の領域への免疫系タンパク質の結合が、例えばアロステリック結合（例えば不活性コンフォメーションの安定化）などによって活性の阻害をもたらしうるような、他の実施形態も考えられる。結合部位の限定および部位に基づいて免疫系タンパク質結合クラスを同定するためのアルゴリズムが、当技術分野では知られている（Leeら (2006) J Org Chem 71, 5082-5092参照）。Leeらの用語によれば、さまざまな実施形態において、免疫系タンパク質はケーブ（cave）、クレーター（crater）、キャニオン（canyon）、バレー（valley）、またはプレイン（plain）の結合トポグラフィーを持ちうる。好ましくは、免疫系タンパク質はキャニオン、バレー、またはプレイン、より好ましくはキャニオンまたはプレインの結合トポグラフィーを持つ。
【００７０】
高アフィニティー抗体構造が同定され、それらのモノクローナル抗体産生細胞株が作出されたら、本発明の実施形態の方法における後続のステップは、活性部位で結合するか、活性部位内で結合するか、活性部位近くで結合する高アフィニティー結合抗体を、複数の抗体（例えばモノクローナル抗体）のなかから選択することである。モノクローナル抗体は、例えばその特異性、高結合アフィニティー、アイソタイプ、および/または安定性などに基づいて選択することができる。モノクローナル抗体は、ウェスタンブロット法（Koren, E.ら, Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（Korenら, Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)）を含むさまざまな標準的技法のうちの任意の技法を使って、特異性についてスクリーニングまたは試験することができる。
【００７１】
活性部位高アフィニティー結合抗体を選択する方法は、分子ファミリーに他のメンバーが存在して、その活性領域と同じサブ構造を共有している場合に、利用することができる。本発明の一態様には、ある高アフィニティー抗体が活性部位高アフィニティー抗体でもあるかどうかを、その抗体が、活性領域が保存されている類似タンパク質のファミリーの他のメンバーにも結合するかどうかを決定することによって、同定するための方法が含まれる。ターゲット分子（例えばVEGF-A）に対して生じさせた高アフィニティー抗体がそのファミリーの他のメンバーにも同様に結合するということがないのであれば、それは活性領域には結合していない可能性が高い。あるいは、ターゲット分子（例えばVEGF-A）に対する接種によって培養された高アフィニティー抗体が、そのファミリーの他のいくつかのメンバー（例えばVEGF-B、VEGF-Cなど）に対してスクリーニングされ、それらについても高いアフィニティーを示すのであれば、それは活性部位高アフィニティー抗体でもある可能性が高い。
【００７２】
類似するファミリー分子を持たない分子の場合には、結合部位の性質を決定する代替的手段を使用することができる。この決定を行う方法の一例は、ターゲットの機能アッセイを作り、そのアッセイに抗体を曝露して、そのアッセイが機能するのをその抗体が阻害するかどうかを決定することによる方法である。
【００７３】
完全にインシリコで、高アフィニティー抗体の群から活性部位高アフィニティー抗体を選択するもう一つの典型的方法は、各抗体を配列決定し、結合表面の構造をモデル化し、それをターゲットの活性表面のモデルと突き合わせて、それら二つが適合するかどうかを見ることである。この方法は、特異的ターゲットに関する知識、および抗体の表面組成を推定するために利用することができるいくつかのプログラムの一つへのアクセスを必要としうる。活性表面ターゲットに結合する抗体から非活性部位高アフィニティー抗体を取り除くこの代替方法は、ターゲット構造がより完全に特徴づけられるにつれて、ますます効率的になり、配列情報のみからの抗体モデリングの精度は、本明細書に開示するさまざまな方法または他の方法に従って高められると考えられる。抗体のCDRが抗体内で軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドに沿って具体的に列挙されたストレッチに存在することが知られているという事実は、このプロセスの信頼性を増大させる。このインシリコ技法は本発明の方法の他のステップ（例えば抗体の結合部分の原子の特異的空間位置の決定）にも関係しうる。
【００７４】
構造空間位置の決定
免疫系タンパク質（例えば活性部位高アフィニティーモノクローナル抗体）を選択した後、3Dタンパク質結合ドメインを限定する。タンパク質結合ドメインの限定は、一般に、ターゲット生体分子と相互作用する免疫系タンパク質の結合部分の原子の特異的空間位置の決定を伴う。
【００７５】
結合部分の空間位置の決定は、さまざまなインシリコ技法を利用して達成することができる。例えば、結合表面の構造をモデル化し、それをターゲットの活性表面のモデルと突き合わせて、適合性のレベルを評価するソフトウェアパッケージを使用することができる。そのようなソフトウェアとしてCAMALが挙げられる。また、結合部位の限定および部位に基づいて免疫系タンパク質結合クラスを同定するためのアルゴリズムもある（Leeら (2006) J Org Chem 71, 5082-5092参照）。
【００７６】
もう一つの選択肢として、ターゲット分子（とりわけ抗体のような大きな分子）内での原子の三次元位置は、その分子を類似構造の長いアレイへと結晶化し、その結晶をX線回折に曝露することによって決定することができる。X線回折の技法は、一般に、分子の結晶化から始まる。なぜなら、一電子によって回折された一光子を確実に検出することはできないからである。しかし、結晶構造は規則的であるため、光子は、多くの対称的に配列された分子中の対応する電子によって回折される。一致するピークを持つ同じ周波数の波は互いに増強しあうので、シグナルが検出可能になる。X線結晶学では、2オングストローム以下までの解像度を得ることができる。構造決定のためにX線結晶学を使用する技法は当技術分野では知られている（例えばMesserschmidt (2007) X-Ray Crystallography of Biomacromolecules: A Practical Guide, John Wiley & Sons, ISBN-10: 3527313966；Woolfson (2003) An Introduction to X-ray Crystallography, 第2版, Cambridge University Press, ISBN-10: 0521423597を参照されたい）。
【００７７】
X線結晶学は、ターゲット分子の活性部位に高いアフィニティーで結合することがわかっている構造内の原子の構造を決定し、次にその構造情報を利用してその抗体と同じアフィニティーおよび/または活性を保持する合成分子を構築するために、使用することができる。
【００７８】
X結晶学による構造決定には、関心対象分子の結晶が必要である。免疫系タンパク質のそのような結晶を作成するための技法は、当技術分野ではいくつか知られている。例えばWallの米国特許第6,931,325号に記載の技法や、Segelkeの米国特許第6,916,455号に記載の技法などがあり、その明細書、教示内容、および参考文献は、すべて参照により本明細書に組み込まれる。抗体の結晶化に伴う困難および起こりうる結合端の歪みを克服するために、抗体をターゲット生体分子と共に結晶化して、適正な結合構造が確実に捕捉されるようにすることができる（例えば親和性成熟抗体との複合体を形成した血管内皮増殖因子である、RCSB Protein Data Bankのエントリー1CZ8を参照されたい）。
【００７９】
結晶が作製されたら、それを収集し、適宜、窒素ガスまたは液体窒素で冷凍機冷却（cryocool）する。冷凍機冷却下の結晶は、データ収集中に被る放射線損傷を減少させることができ、かつ/または結晶内の熱運動を減少させる。X線ビームを放射する機械と接続した回折計に結晶を設置する。X線は結晶中の電子によって回折され、その回折パターンをフィルムまたは固体検出器で記録し、スキャンしてコンピュータに保存する。これらの回折像を合わせ、それらを使って、結晶化した分子の電子密度マップを構築する。次に原子を電子密度マップに当てはめ、位置などのさまざまなパラメーターを精密化して、観測された回折データに最も適合させる。X線結晶学観測回折データから得られるパラメーターには、例えば水素結合体、無極性疎水性接触、塩橋相互作用、ドメインの極性表面領域、ドメインの無極性表面領域、抗体-ターゲット複合体に関する形状相補性スコア、および明示的に置かれた水分子などがあるが、これらに限るわけではない。原子間の結合の特徴づけも有用である。単結合している二つの原子の間の距離は約1.45〜約1.55Åの範囲にある。互いに二重結合している原子は、典型的には、約1.2〜約1.25Å離れている。単結合と二重結合とが共鳴している結合は、約1.30〜約1.35Åの隔たりを持つ。
【００８０】
例えば、親和性成熟抗体（そのFabフラグメント）に結合したVEGF（配列番号2）は既に結晶化され、ChenらによってRCSBデータベースに1CZ8として公開されている。より具体的には、彼らの結晶化データには、VEGF二量体のメンバーであるVおよびW領域、ならびにFab分子の抗体軽鎖および抗体重鎖を表すL、H、X、およびY領域が含まれる（さらに具体的に述べると、LおよびH領域は、各鎖の可変領域と定常領域の両方を含むFab分子の一方の分枝を含む。同様に、XおよびYは、Fab分子の他方の分枝の軽鎖および重鎖である）。この結晶構造の8000を超える非水素原子の空間配置を幾何学的に解析することにより、ある構造の原子であって、もう一つの構造の原子から指定された距離内にあるものを、同定することができる。このフィルターは、考えうる全ての組み合わせにまたがる直接的な幾何学的比較により、それら二つの分子間で会合しているペプチドを決定する。最大隔離距離（例えば4Å）を使って、VEGF二量体のWコンポーネントの原子からそのような短距離内にある可変重鎖（H）の原子を決定することができ、それらの原子はおそらくFabフラグメントのCDR中の原子であるだろう（例えば実施例1を参照されたい）。
【００８１】
ファーマコフォアの構築
原子位置の限定を含む免疫系タンパク質構造情報は、類似する位置に類似する原子を持つ小分子を同定するために用いられるファーマコフォアモデルを構築するために使用することができる。免疫系タンパク質と類似する特徴を持つ小分子は、ターゲットタンパク質と類似する相互作用を示し、それゆえに類似する治療用途を持つ類似の生物学的活性を示す可能性がある。
【００８２】
免疫系タンパク質の結合領域（例えば活性部位高アフィニティーモノクローナル抗体の結合端）中の原子（好ましくは実質上全ての原子、より好ましくは全ての原子）の空間配向の同定が達成されたたら、本発明のさまざまな実施形態における後続のステップは、生体分子ターゲットへの結合を（少なくとも部分的に）担っている免疫系タンパク質の原子の少なくとも一部を近似する（好ましくは実質的に近似する）構造を持つファーマコフォアの生成である。例えば、ファーマコフォアは、生体分子ターゲットへの結合を（少なくとも部分的に）担う免疫系タンパク質の原子の少なくとも約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％を近似することができる。このデノボ化学構造の合成は、合理的薬物設計のソフトウェアおよび技法を使って達成することができる。
【００８３】
しかし、いくつかの実施形態の重要な特徴の一つは、ただ単に新しい化学構造をターゲット表面に合致させることによってリード分子を構築するのではなく、望ましい作用をもたらすような形で生体分子ターゲットに結合する既知構造（すなわち免疫系タンパク質）をガイドとして利用することによってリード分子を構築することにある。免疫系タンパク質はガイドとしてとりわけ適している。なぜなら、それらのCDR領域は、小さな有機分子に比較的容易に再現することができる比較的簡単な有機構造で構成されているからである。
【００８４】
さまざまな実施形態において、デノボ構造設計には、コンタクト・スタティスティクス（contact statistics）を使用するフラグメントベースのアプローチ、3D表面モデル、およびテンプレートとしてのドッキングしたリガンドを用いるインシリコアプローチを使用することができる。空間位置情報から、かつ/または上述した他のパラメーターから、3Dリガンド-受容体モデル（例えば相互作用パターン、ファーマコフォアスキーム）、表面マップ（例えばトポグラフィー/形状、静電気的プロファイル、疎水性、タンパク質可撓性）、およびドッキングモデル（例えばリガンド結合に関するスコアリングシステム、最小エネルギー計算）を引き出すことができる。
【００８５】
ファーマコフォアモデルまたはファーマコフォアスキームは一般に、受容体部位におけるリガンドの認識およびその生物学的活性に関係する（好ましくは直接関係する）リガンド中の一組の構造特徴である。ファーマコフォア特徴は、結晶構造から取得された対応する免疫系タンパク質（その受容体との複合体を形成しているもの）の対応するドナー、アクセプター、芳香族性、疎水性、および/または酸性もしくは塩基性部分から導出することができる。単に原子の空間位置だけでなく、ファーマコフォアスキームに使用される免疫系タンパク質中の原子（例えば活性部位高アフィニティーモノクローナル抗体の結合端中の原子）の性質に関する追加情報が、この新しいリード化合物のモデル化プロセスに役立ちうることを理解すべきである。これらの特徴には、例えば原子のpKa値、その原子をその場に保持している結合の回転剛性、結合自体の性質（単結合性、二重結合性、共鳴、その他）、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの投射指向性などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８６】
ファーマコフォアスキームを作成するのに役立つ典型的な特徴コンポーネントには、例えば原子位置；原子半径；水素結合ドナー特徴；水素結合アクセプター特徴；芳香族性特徴；ドナー特徴；アクセプター特徴；陰イオン特徴；陽イオン特徴；アクセプターおよび陰イオン特徴;ドナーおよび陽イオン特徴；ドナーおよびアクセプター特徴；酸および陰イオン特徴；疎水性特徴、水素結合指向性、および金属リガンドなどがあるが、これらに限るわけではない（例えば実施例4参照）。そのような特徴は、例えば、単一の原子にあるか、複数原子の重心にあるか、空間における投射方向位置にあることができる。
【００８７】
任意の与えられた免疫系タンパク質-ターゲット生体分子複合体に関して、数多くのファーマコフォアクエリーを設計することができると考えられる。さらにまた、これらのファーマコフォアクエリーは、その免疫系タンパク質によって認識される部位でターゲット生体分子と相互作用する小分子リガンドを同定するために役立つと考えられる。
【００８８】
そのようなモデリングおよびクエリーを達成するためのリソースの典型例には、例えばMOE（CGG）（ファーマコフォアクエリーおよび視覚化を提供）、Glide（Schrodinger）（ドッキングおよびスコアリングを提供）、Accord for Excel（Accelrys）（化学構造および化学式を含む分子情報の体系化を提供）、およびZINCデータベース（UCSF）（市販化合物のライブラリーを提供）などがあるが、これらに限るわけではない。免疫系タンパク質-ターゲット生体分子構造結合特徴からファーマコフォアを作成するための設計ツールの一つはMOE、すなわちMolecular Operating Environment（Chemical Computing Group）である。モデル作成では、幾何学的拘束および電子的拘束を使って、免疫系タンパク質に対応する特徴の3D位置を決定する。これらの実施形態のモデルは、3D空間におけるスフィア状特徴からなる。スフィアの直径は調節することができる（例えば約0.5〜約3.0Å）。そのようなモデルでは特徴のマッチおよび/または部分マッチが許される。
【００８９】
ファーマコフォア構造特徴は、空間中の標識点によって表すことができる。各リガンドには、そのリガンドのファーマコフォアに寄与しうる一組の構造特徴であるアノテーションを割り当てることができる（例えば実施例4参照）。さまざまな実施形態では、アノテーション付きリガンドのデータベースを、ファーマコフォア仮説を表現するクエリーで検索することができる（例えば実施例5参照）。そのような検索の結果は、クエリーのファーマコフォア特徴を、検索したデータベースのリガンド中に存在するファーマコフォア特徴に整合させる、一組のマッチである（例えば実施例5、表23〜28参照）。データベース内のヒットの数は、少なくとも一つには、データベースのサイズおよびファーマコフォアクエリーの限定性（例えば部分マッチ、特徴の数など）に依存する。一例として、実施例4のファーマコフォアクエリーは、ZINCデータベースに対して約1,000〜約3,000ヒットを生成した。検索データベース内に存在する分子の性質およびパラメーターを使って、クエリーの結果を絞る。例えば、化合物のライブライリーデータベースの検索区画には、所定の範囲の分子量（MW）または親油性（logP）を持つ化合物が存在しうる。
【００９０】
候補分子
本方法は、多種多様な候補分子（例えば治療に役立つ可能性がある候補分子）のスクリーニングに使用することができる。上述のように、候補分子はファーマコフォアクエリーを使って検索することができる。候補分子は数多くの化学クラスを包含するが、典型的には有機分子、好ましくは50ダルトンより大きく約2,500ダルトンより小さい分子量を持つ小有機化合物である。候補分子は、タンパク質との構造相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基（好ましくは少なくとも二つの化学官能基）を含む。候補分子は、しばしば、上記官能基の一つ以上で置換された炭素環もしくは複素環構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。
【００９１】
好ましい実施形態では、候補分子が、化合物のライブラリーデータベース中の化合物である。当業者は、一般に、例えばスクリーニング用の市販化合物のデータベースを、数多く熟知しているだろう（例えば12種類の分子サブセットにわたって270万の化合物を含むZINCデータベース、UCSF；IrwinおよびShoichet (2005) J Chem Inf Model 45, 177-182を参照されたい）。当業者は、さらなる試験のために商業的供給源または望ましい化合物および化合物クラスを同定するためのさまざまな検索エンジンにも精通しているだろう（例えばZINCデータベース；eMolecules.co；および例えばChembridge、Princeton BioMolecular、Ambinter SARL、Enamine、SDI、Life Chemicalsなどのベンダーが提供している市販化合物の電子ライブラリーを参照されたい）。
【００９２】
本明細書に記載する方法によるスクリーニングのための候補分子には、リードライク（lead-like）な化合物とドラッグライク（drug-like）な化合物の両方が含まれる。リードライクな化合物は、比較的少ない特徴（例えば約3個未満の水素ドナーおよび/または約6個未満の水素アクセプター；約-2〜約4の疎水性特徴xlogP）を有する比較的小さな基本骨格様構造（例えば約150〜約350kDの分子）を持つと、一般に理解される（例えばAngewante (1999) Chemie Int. ed. Engl. 24, 3943-3948参照）。対称的に、ドラッグライクな化合物は、比較的多くの特徴（例えば約10個未満の水素アクセプターおよび/または約8個未満の回転可能結合；約5未満の疎水性特長xlogP）を伴う比較的大きな基本骨格（例えば約150〜約500kDの分子量）を持つと、一般に理解される（例えばLipinski (2000) J. Pharm. Tox. Methods 44, 235-249）。好ましくは、一次スクリーニングをリードライクな化合物で行う。
【００９３】
空間配向データからリードを設計する場合は、一定の分子構造が「ドラッグライク」であると特徴づけられることを理解することが役に立ちうる。そのような特徴づけは、薬局方内の既知化合物全体にわたって類似性を比較することによって導かれる経験的に認識された一組の性質に基づいて行うことができる。薬物が、これらの特徴づけの全てを満たす必要はなく、これらの特徴づけのいずれかを満たす必要さえないが、薬物候補は、それがドラッグライクである場合には、臨床的に成功する可能性がはるかに高くなる。
【００９４】
これら「ドラッグライクな」特徴のいくつかは、Lipinskiの四法則（5という数字が頻繁に出てくるので一般に「ルール・オブ・ファイブ（5の法則：rules of fives）」と呼ばれている）に要約されている。これらの法則は一般に経口吸収に関し、リード最適化中に化合物の生物学的利用率を予測するために使用されるが、本発明の方法を使って達成されうるような合理的薬物設計の取り組みにおいてリード分子を構築するための効果的な指針としても役立ちうる。
【００９５】
これら四つの「ルール・オブ・ファイブ」では、候補ドラッグライク化合物は、以下の特徴のうち少なくとも三つを持つべきであるとされる：（i）500ダルトン未満の重量；（ii）5未満であるPの対数；（iii）5個を超えない水素結合ドナー（OH基とNH基の和として表される）；および（iv）10個を超えない水素結合アクセプター（N原子とO原子の和）。
【００９６】
またドラッグライクな分子は、典型的には、約8Å〜約15Åのスパン（幅）を持つ。結合に関与する原子のサブグループであって、十分に密集していてリード分子へと体系化されうるものの一例については、実施例1の表3を参照されたい。
【００９７】
上で説明したように、ファーマコフォアに対するヒットとして同定される分子の数は、少なくとも一つには、データベースのサイズおよびファーマコフォアクエリーの限定性に依存する。ファーマコフォアクエリーからヒットとして同定される分子の数は、ターゲット生体分子の結合部位へのフィットのさらなるモデリングによって減らすことできる。そのようなモデリングは、以下に説明するドッキングおよびスコアリング法によって行うことができる。
【００９８】
ドッキングおよびスコアリング
（例えば上述のようなファーマコフォアクエリーによって）ファーマコフォアモデルと比較して類似する原子を類似する位置に持ちかつ/または類似する特徴を類似する位置に持つと同定された候補分子を、ターゲット生体分子に対するドッキングアフィニティーに従って、さらに選択することができる（例えば実施例5参照）。データベースクエリー用のファーマコフォアモデルの作成に加えて、化合物を同定および設計するための第2の逐次的かつ相補的方法を使用することができる。ファーマコフォアクエリーは化合物を迅速に取り出すことができ、ドッキングおよびスコアリングは、リガンド-ターゲット生体分子結合をより正確に評価することができる。タンパク質または酵素ターゲット生体分子の場合、抗体接触に関与するターゲットタンパク質または酵素のアミノ酸残基を使って、ドッキング部位を限定することができる。
【００９９】
さまざまな実施形態では、ファーマコフォアクエリーで選択した化合物を、ターゲットタンパク質/酵素結合部位に、ドッキング解析用に設計されたソフトウェア、例えばGlide（Schrodinger, NY）を使って、ドッキングさせる。ドッキングアフィニティーは、例えば分子がタンパク質と相互作用した時に獲得するエネルギー（例えば「g_スコア（g_score）」）および/または最も低エネルギーのコンフォメーションと比較してドッキングしたコンフォメーションを達成するために要求されるエネルギー（例えば「e_モデル（e_model）」）などに基づいて、数値（例えば「Glideスコア」）として算出することができる（例えば実施例5参照）。これらの具体例では、スコアが負であるほど、ドッキングは良好である。好ましくは、g_スコアは約-5未満である。好ましくは、e_モデルスコアは約-30未満である。ドッキングの望ましい数値定量化は、ターゲット生体分子間で異なりうると考えられる。さまざまな実施形態では、取得されさらに試験される分子の数が管理されるように、閾ドッキングスコア（例えばg_スコアおよび/またはe_モデルスコア）を選択することができる。例えば、VEGF（Pdb：1cz8）に関して本明細書に記載するさまざまなドッキング研究では、-5.0（または負の方向にそれより大きい絶対値）のg-スコアを望ましいドッキングスコアであるとみなし、カットオフを相応に調節した。また、ErbB2（pdb：1s78）の場合は、-7.5（またはそれ以上の絶対値）のg_スコアを望ましいドッキングスコアとみなした。これらの研究では、g_スコアの絶対値を使って、ヒットの数を、取得して試験することができるであろう扱いやすい数に調節した。一例として、あるファーマコフォアクエリーから同定される化合物の総数が約1,000〜約3,000である場合、さらなる試験のために約100〜約200個が選択されるように、ドッキングスコアを使って、それらの化合物をランク付けすることができる。さらなる試験のために選択すべき化合物の数は、これらの推定値より少なくても、多くてもよいと考えられる。好ましくは、選択基準としてg_スコアの絶対値を使用するが、（e_モデルスコアの絶対値が小さい場合には特に）e_モデルスコアも同様に使用することができると考えられる。さらに、選択基準はg_スコアとe_モデルスコアの両方（好ましくはg_スコアに重みを付ける）に基づくこともできる。
【０１００】
ドッキングおよびスコアリングは、複数のコンフォーマーを含む化合物群をもたらしうる。適切なモデリングソフトウェア（例えばMOE）を使って、3D構造を2Dに変換し、それによって重複を除去することができる。その結果得られる好ましい化学構造のリストは、例えばそのような作業用に設計された検索エンジン（例えばeMolecules.com）等を使って商業的ベンダーを検索するのに使用することができる。
【０１０１】
ターゲット生体分子に対する作用
ファーマコフォアクエリーに従って選択され、かつ/またはドッキング解析に従ってさらに選択された候補分子は、ターゲット生体分子に対する作用について試験することができる。ある分子が生体分子機能に及ぼす作用（例えば酵素活性の阻害）は、当技術分野で知られるさまざまな方法によって評価することができる（例えば実施例6参照）。例えば、ターゲット酵素の触媒活性に対する候補分子の阻害作用は、ターゲット酵素に特異的な既知の活性アッセイによって評価することができる（例えばReymond編 (2006) Enzyme Assays: High-throughput Screening, Genetic Selection and Fingerprinting, John Wiley & Sons, 386p., ISBN-10: 3527310959；EisenthallおよびDanson編, (2002) Enzyme Assays, 第2版, Oxford University Press, 384p., ISBN-10: 0199638209参照）。
【０１０２】
さらなる精密化
選択した候補分子をさらに精密化するためのいくつかの方法。リードライクな分子および/またはドラッグライクな分子をさらに精密化するために、生物学的アッセイから得られるデータを、ドッキングモデルと相関させることができる。デノボ設計による修飾に適したテンプレート上の部位を同定するために、さまざまなソフトウェアパッケージ（例えばMOE）を利用して、ターゲット生体分子の結合部位中の活性化合物を視覚化することができる。類似性検索およびサブ構造検索を使って、活性化合物の類似体を同定することができる（例えばSciFinder；eModel参照）。利用可能な類似体は上述のドッキングおよびスコアリング手法に従って解析することができる。望ましいドッキングスコアを持つ類似体を取得し、上述の方法に従ってターゲット生体分子に対する生物学的作用について、さらに試験することができる。本明細書に記載する方法によって同定された候補分子を精密化し、さらに発展させるこれらの方法および他の方法は、当業者には理解されるだろう。
【０１０３】
分子
本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載の方法によって同定された化合物であって、それらを同定する際の拠り所としたターゲット生体分子に関係する疾患、障害、または状態の処置に有用な化合物を包含する。例えば、成長因子タンパク質の阻害が腫瘍学において一定の状態の処置に有益であることは、よく知られている。もう一つの例として、
【０１０４】
AD4-1025
AD4-1025は、上皮成長因子の受容体に対する上皮成長因子結合の阻害剤であると同定される（例えば実施例7参照）。そのような化合物は腫瘍学において処置薬として有用である。AD4-1038の類似体および誘導体は同じ阻害作用および同じ有用性を持つと予想される。ファーマコフォアモデルを設計するために1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使って、ファーマコフォアモデルPharm1_gly54_asp58を設計した。（例えば実施例4参照）。Pharm1_gly54_asp58モデルを利用して、EGFR（配列番号1）に結合する小分子を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm1_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。具体的に述べると、この領域は、セツキシマブの抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。このファーマコフォアモデルから、以下の化合物が導出される：
【化１１】
2009525274.tif 000013
式（1）
［式中、S1〜S8は以下に挙げるタイプの独立した置換基を表す：ハロゲン（F、Cl、Br、I）；ヒドロキシル（-OH）；スルフヒドリル（-SH）；カルボキシレート（-COOH）；アルキル（C1-C4炭素、直鎖、分岐、または適宜、不飽和を含有するもの）；シクロアルキル（適宜不飽和を含有するC1-C6）；フェニルを含むアリールまたは1〜4個のN、O、およびS原子を含有するヘテロアリール；またはアルコキシル（-OR、この場合、Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノーＮＨ２、置換アミノ−ＮＲ２、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノ基で適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基と定義される）；Xは、H2、O、S、N-R、N-OH、またはN-NR2と定義される；Hetは、任意の環位置にある1個以上のN原子と定義される；そしてZは、−ＣＯＯＨ、-PO3H2；SO3H、テトラゾール環、スルホンアミド、アシルスルホンアミド、-CONH2または-CONR2と定義される］。
【０１０５】
他の類似体には、窒素原子の一つ以上が無置換炭素原子または1個もしくは2個の独立した置換基を含有する炭素原子で置き換えられているものがあり、この場合、S9〜S11は上記S1〜S8と同意義である：
【化１２】
2009525274.tif 000014
式（2）                  式（3）                    式（4）
【０１０６】
また、エナンチオマー異性体にも同じ有用性があると予想される：
【化１３】
2009525274.tif 000015
式（5）
［式中、S1〜S8、X、HetおよびZは上記と同意義である］
【０１０７】
ある実施形態では、上皮成長因子受容体（EGFR）に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤が、AD4-1025（(N1-(4-クロロフェニル)-N2-(3-ピリジニルメチル)-α-アスパラギン；式：C16H16ClN3O3；分子量：333.78）である（例えば実施例7参照）。EGFRに対するAD4-1025の結合の典型的描写を図46に示す。AD4-1025の構造は以下のとおりである：
【化１４】
2009525274.tif 000016
式（6）
【０１０８】
AD4-1025は濃度25μMで、EGFRに対するEGFの結合を75.7％阻害する（例えば実施例6参照）。
【０１０９】
AD4-1038
AD4-1038は、上皮成長因子の受容体に対する上皮成長因子結合の阻害剤である（例えば実施例8参照）。そのような化合物は腫瘍学において処置薬として有用である。AD4-1038の類似体および誘導体は、同じ阻害作用および同じ有用性を持つと予想される。ファーマコフォアモデルを設計するために1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使って、ファーマコフォアモデルPharm1_thr100_glu105を設計した（例えば実施例4；表17；図17参照）。Pharm1_thr100_glu105モデルを利用して、EGFRに結合する小分子を同定した。EGFR（配列番号1）タンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基THR-100〜GLU-58によって認識される。Pharm1_thr100_glu105は残基THR-100〜GLU-58を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。このファーマコフォアモデルから、以下の化合物が導出される：
【化１５】
2009525274.tif 000017
式（7）
［式中、S1〜S4は以下に挙げるタイプの独立した置換基を表す：ハロゲン（F、Cl、Br、またはI）；ヒドロキシル（-OH）；スルフヒドリル（-SH）；カルボキシレート（-COOH）；アルキル（C1-C4炭素、直鎖、分岐、または適宜、不飽和を含有するもの）；シクロアルキル（適宜不飽和を含有するC1-C6）；フェニルを含むアリールまたは1〜4個のN、O、およびS原子を含有するヘテロアリール；アルコキシル（-OR、この場合、Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノ−ＮＨ２、置換アミノ−ＮＲ２、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノ基で適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基と定義される）；Xは、O、S、N-R、N-OH、またはN-NR2と定義される；Hetは、環の任意の位置にある1個以上のN原子と定義される；Zは、−ＣＯＯＨ、-PO3H2、SO3H、テトラゾール環、スルホンアミド、アシルスルホンアミド基、-CONH2、または-CONR2と定義される］。
【０１１０】
他の類似体には、中心窒素原子が無置換炭素原子または1個もしくは2個の独立した置換基を含有する炭素原子で置き換えられているもの（この場合、S2およびS6は上記S1-S4と同意義である）、または中心炭素原子が上述の官能基Xを持つものがある：
【化１６】
2009525274.tif 000018
式（8）                      式（9）
【０１１１】
図示するように短いリンカー部分を持つ化合物も、同じEGFR阻害をもたらすと予想される：
【化１７】
2009525274.tif 000019
式（10）
［式中、Lは、C、N、O、およびSを含む1〜4個の線状に結合された原子からなるリンカーと定義される］。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができる。
【０１１２】
また、ラセミ体およびエナンチオマー異性体を含む立体化学的組成が異なる化合物も、EGFR阻害剤として有用であると予想される：
【化１８】
2009525274.tif 000020
式（11）                式（12）
［式中、S1〜S4、X、Het、およびZは上記と同意義である］
【０１１３】
ある実施形態では、上皮成長因子受容体（EGFR）に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤がAD4-1038（({2-[(4-ヒドロキシ-フェニル)-メチル-アミノ]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-チアゾール-5-イル}-酢酸；式：C12H12N2O4S；分子量：280.30）である（例えば実施例8参照）。EGFRに対するAD4-1038の結合の典型的描写を図47に示す。AD4-1038の構造は以下のとおりである：
【化１９】
2009525274.tif 000021
式（13）
【０１１４】
AD4-1038は25μMの濃度で、EGFRに対するEGFの結合を70.7％阻害する（例えば実施例6参照）。
【０１１５】
AD4-1020
AD4-1020は、上皮成長因子の受容体に対する上皮成長因子結合の阻害剤と同定される（例えば実施例10参照）。そのような化合物は腫瘍学において処置薬として有用である。AD4-1020の類似体および誘導体は、同じ阻害作用および同じ有用性を持つと予想される。ファーマコフォアモデルを設計するために1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使って、ファーマコフォアモデルPharm1_gly54_asp58を設計した（例えば実施例4参照）。Pharm1_gly54_asp58モデルを利用して、EGFR（配列番号1）に結合する小分子を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm1_gly54_asp58は残基GLY-54 to ASP-58を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。具体的に述べると、この領域は、セツキシマブの抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。このファーマコフォアモデルから、以下の化合物が導出される：
【化２０】
2009525274.tif 000022
式（14）
［式中、S1〜S6は以下に挙げるタイプの独立した置換基を表す：ハロゲン（F、Cl、Br、I）；ヒドロキシル（-OH）；スルフヒドリル（-SH）；カルボキシレート（-COOH）；アルキル（C1-C4炭素、直鎖、分岐、または適宜、不飽和を含有するもの）；シクロアルキル（適宜不飽和を含有するC1-C6）；フェニルを含むアリールまたは1〜4個のN、O、およびS原子を含有するヘテロアリール；またはアルコキシル（-OR、この場合、Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノ−ＮＨ２、置換アミノ−ＮＲ２、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノ基で適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基と定義される）］。
【０１１６】
他の類似体には、フェニル環の一方または両方が複素環式環で置き換えられているものがあり、この場合、Xは、O、S、N-R、N-OH、またはN-NR2と定義され；Hetは、環の任意の位置にある1個以上のN原子と定義され；Zは、−ＣＯＯＨ、-PO3H2；SO3H、テトラゾール環、スルホンアミド、アシルスルホンアミド、-CONH2、または−ＣＯＮＲ2と定義される。
【化２１】
2009525274.tif 000023
式（15）
【０１１７】
他の類似体には、図示するように短いリンカー部分を持つ化合物がやはり同じEGFR阻害をもたらすと予想されるものがあり、この場合、Lは、C、N、O、およびSを含む1〜4個の線状に結合された原子からなるリンカーと定義される。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができる。
【化２２】
2009525274.tif 000024
式（16）
【０１１８】
他の類似体には、図示するようにテトラゾール環が他の5員複素環式環で置き換えられている化合物がある。
【化２３】
2009525274.tif 000025
式（17）
［式中、Aは、C、N、O、およびSを含む群から独立して選択される原子である］。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができる。
【０１１９】
ある実施形態では、上皮成長因子受容体（EGFR）に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤がAD4-1020（({5-[4-(ベンジルオキシ)フェニル]-2H-テトラゾール-2-イル}酢酸）；式：C16H14N4O3；分子量：310.31）である（例えば実施例10参照）。EGFRに対するAD4-1020の結合の典型的描写を図53に示す。AD4-1020の構造は以下のとおりである：
【化２４】
2009525274.tif 000026
式（18）
【０１２０】
AD4-1020は25μMの濃度で、EGFRに対するEGFの結合を47.8％阻害する（例えば実施例6参照）。
【０１２１】
AD4-1132
AD4-1132は、上皮成長因子の受容体に対する上皮成長因子結合の阻害剤である（例えば実施例11参照）。そのような化合物は腫瘍学において処置薬として有用である。AD4-1132の類似体および誘導体は同じ阻害作用および同じ有用性を持つと予想される。ファーマコフォアモデルを設計するために1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使って、ファーマコフォアモデルPharm23_gly54_asp58を設計した（例えば実施例4；表17；図15参照）。Pharm23_gly54_asp58モデルを利用して、EGFR（配列番号1）に結合する小分子を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm23_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。このファーマコフォアモデルから、以下の化合物が導出される：
【化２５】
2009525274.tif 000027
式（19）
［式中、S1-S6は以下に挙げるタイプの独立した置換基を表す：ハロゲン（F、Cl、Br、I）；ヒドロキシル（-OH）；スルフヒドリル（-SH）；カルボキシレート（-COOH）；アルキル（C1-C4炭素、直鎖、分岐、または適宜、不飽和を含有するもの）；シクロアルキル（適宜不飽和を含有するC1-C6）；フェニルを含むアリールまたは1〜4個のN、O、およびS原子を含有するヘテロアリール；またはアルコキシル（-OR、この場合、Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノ−ＮＨ２、置換アミノ−ＮＲ２、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノ基で適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基と定義される）；Zは、−ＣＯＯＨ、-PO3H2；SO3H、テトラゾール環、スルホンアミドまたはアシルスルホンアミド基、-CONH2または−ＣＯＮＲ2と定義される］。
【０１２２】
他の類似体には、フェノールエーテル酸素がタイプYの原子［この場合、Yは、CH2、O、S、N-R、N-OH、またはN-NR2と定義される。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができる］で置き換えられ、一方または両方のフェニル環が適宜、複素環式環で置き換えられているものがある［この場合、Hetは、環の任意の位置にある1個以上のN原子と定義される］：
【化２６】
2009525274.tif 000028
（式20）
【０１２３】
他の類似体には、図示するように短いリンカー部分を持つ化合物がやはり同じEGFR阻害をもたらすと予想されるものがあり、この場合、Lは、図示するように、C、N、O、およびSを含む1〜4個の線状に結合された原子からなるリンカーと定義される：
【化２７】
2009525274.tif 000029
式（21）
【０１２４】
他の類似体には、図示するように、アミド窒素が別のA基で置き換えられていて、アミドカルボニルが適宜、X基で置き換えられている化合物がある：
【化２８】
2009525274.tif 000030
式（22）
［式中、Aは、CH2、N、O、およびSを含む群から独立して選択される原子である］。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができ、XはH2、O、S、N-R、N-OH、またはN-NR2と定義される。
【０１２５】
図示するように、他の類似体では、例えばレトロアミドに見られるように（ただしレトロアミドに限るわけではない）A基とC=X基とが並置される：
【化２９】
2009525274.tif 000031
式（23）
【０１２６】
ある実施形態では、上皮成長因子受容体（EGFR）に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤が、AD4-1132（(2-{[(2,4-ジメチルフェノキシ)アセチル]アミノ}-5-ヒドロキシ安息香酸）；式：C17H17NO5；分子量：315.32）である（例えば実施例11参照）。AD4-1132の構造は以下のとおりである：
【化３０】
2009525274.tif 000032
式（24）
【０１２７】
AD4-1132は25μMの濃度で、EGFRに対するEGFの結合を59.6％阻害する（例えば実施例6参照）。
【０１２８】
AD4-1142
AD4-1142は、上皮成長因子の受容体に対する上皮成長因子結合の阻害剤と同定される（例えば実施例12参照）。そのような化合物は腫瘍学において処置薬として有用である。AD4-1142の類似体および誘導体は同じ阻害作用および同じ有用性を持つと予想される。ファーマコフォアモデルを設計するために1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使って、ファーマコフォアモデルPharm23_gly54_asp58を設計した（例えば実施例4参照）。Pharm23_gly54_asp58モデルを利用して、EGFR（配列番号1）に結合する小分子を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm23_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。具体的に述べると、この領域はセツキシマブの抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。このファーマコフォアモデルから、以下の化合物が導出される：
【化３１】
2009525274.tif 000033
式（25）
［式中、S1-S6は以下に挙げるタイプの独立した置換基を表す：水素（-H）；ハロゲン（F、Cl、Br、I）；ヒドロキシル（-OH）；スルフヒドリル（-SH）；カルボキシレート（-COOH）；アルキル（C1-C4炭素、直鎖、分岐、または適宜、不飽和を含有するもの）；シクロアルキル（適宜不飽和を含有するC1-C6）；フェニルを含むアリールまたは1〜4個のN、O、およびS原子を含有するヘテロアリール環；またはアルコキシル（-OR、この場合、Rは、ハロゲン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート、アリール、ヘテロアリール、アミノ−ＮＨ2、置換アミノ−ＮＲ２、または5員環もしくは6員環中に1、2、もしくは3個のN原子を含有するシクロアミノ基で適宜置換されたC1-C6直鎖または分岐アルキル基と定義される）；また、Zは−ＣＯＯＨ、-PO3H2；SO3H、テトラゾール環、スルホンアミド、アシルスルホンアミド、-CONH2、または−ＣＯＮＲ2と定義される］。
【０１２９】
他の類似体には、スルホナンアミドNHが適宜、タイプYの原子［この場合、YはCH2、O、S、N-R、N-OH、またはN-NR2と定義される］で置き換えられ、一方または両方のフェニル環が適宜、複素環式環で置き換えられているものがある［この場合、Hetは、環の任意の位置にある1個または2個のN原子と定義される］。
【化３２】
2009525274.tif 000034
式（26）
【０１３０】
他の類似体には、図示するように短いリンカー部分を持つ化合物がやはり同じEGFR阻害をもたらすと予想されるものがあり、この場合、Lは、C、N、O、およびSを含む1〜4個の線状に結合された原子からなるリンカーと定義される。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができる。
【化３３】
2009525274.tif 000035
式（27）
【０１３１】
他の類似体には、図示するように芳香族基がA基およびY基によって結合されているものものがあり、これには、A基およびY基が適宜、単結合、二重結合および三重結合によって結合されている類似体が含まれる。
【化３４】
2009525274.tif 000036
式（28）
［式中、Yは上記と同意義であり、AはCH2、N、O、およびSを含む群から独立して選択される原子である］。CおよびSの場合、その原子の酸化状態は、単結合または二重結合によって取付けられた1個または2個の酸素を持つことができる。CまたはNの場合、その原子は、上に定義したS1〜S6基から独立して選択される1個または2個の追加置換基を持つことができる。
【０１３２】
他の類似体では、図示するようにA基とY基が並置され、これには、A基およびY基が適宜、単結合、二重結合および三重結合によって結合されている類似体が含まれる。
【化３５】
2009525274.tif 000037
式（29）
【０１３３】
ある実施形態では、上皮成長因子受容体（EGFR）に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤がAD4-1142（(5-{[(4-エチルフェニル)スルホニル]アミノ}-2-ヒドロキシ安息香酸）；式：C15H15NO5S；分子量：321.35）である（例えば実施例12参照）。AD4-1142の構造は以下のとおりである：
【化３６】
2009525274.tif 000038
式（30）
【０１３４】
AD4-1142は25μMの濃度で、EGFRに対するEGFの結合を49.8％阻害する（例えば実施例6参照）。
【０１３５】
医薬製剤
本発明の組成物の実施形態には、本明細書に記載するさまざまな化合物の医薬製剤が包含される。本明細書に記載の化合物は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（A.R. Gennaro編）第2版, ISBN: 0781746736 (2005）に記載されているように、一つ以上の薬学的に許容できる担体および/または賦形剤を使って、任意の従来法で製剤化することができる。そのような製剤は、対象に適切に投与するための剤形が得られるように、（好ましくは精製された形の）治療有効量の薬剤を、適当量の担体と一緒に含有するだろう。製剤は投与方法に適合すべきである。本発明において役に立つ薬剤は、例えば非経口、肺、経口、局所外用、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼、口腔粘膜、および直腸経路を含む（ただしこれらに限るわけではない）いくつかの経路を使って対象に投与するために、既知の方法で製剤化することができる。個々の薬剤は、本発明の一つ以上の追加薬剤と組み合わせて、かつ/または他の生物学的に活性なもしくは生物学的に不活性な薬剤と一緒に投与することもできる。そのような生物活性または生物不活性剤は、薬剤と流体連通もしくは機械連通（mechanical communication）しうるか、イオン性、共有結合性、ファンデルワールス、疎水性、親水性、または他の物理力によって、薬剤に結合しうる。
【０１３６】
薬剤の活性を引き延ばし、投薬頻度を減らすために、放出制御（または徐放性）調製物を製剤化することができる。放出制御調製物は、作用または他の特徴（例えば薬剤の血中レベル）の発現時期に影響を及ぼし、その結果として、副作用の発生に影響を及ぼすために使用することができる。
【０１３７】
本発明の方法で使用する場合、本明細書に記載する薬剤の一つの治療有効量を純粋な形で、または薬学的に許容できる塩型が存在する場合には、そのような塩型で、薬学的に許容できる賦形剤と共に、または薬学的に許容できる賦形剤を伴わずに、使用することができる。例えば本発明の薬剤は、適用可能な適度の利益/リスク比で、ターゲット生体分子に関連する疾患、障害、または状態を処置または予防するために、その化合物が特異性を示すターゲット生体分子を阻害するのに足りる十分量で投与することができる。
【０１３８】
そのような化合物およびその医薬製剤の毒性および治療有効性は、LD50（集団の50％にとって致死的である用量）およびED50（集団の50％で治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養物および/または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が、比LD50/ED50として表すことのできる治療係数であり、この場合、大きい治療係数が好ましい。
【０１３９】
薬学的に許容できる担体と組み合わせて単一の剤形にすることができる本発明化合物の量は、処置されるホストおよびその投与様式に応じてさまざまであるだろう。各剤形の個々の用量に含まれる薬剤の単位含量それ自体が治療有効量を構成する必要はないことは、当業者には理解されるだろう。必要な治療有効量には、個々の用量をいくつか投与することによって到達できるからである。薬剤投与は単回のイベントとして行うか、処置の時間経過に沿って行うことができる。例えば、1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、または月に1回、薬剤を投与することができる。一部の状態については、処置が数週間から数ヶ月、さらには1年以上に及ぶ場合もあるだろう。
【０１４０】
どの特定対象についても、具体的な治療有効量レベルは、例えば処置される状態、その状態の重症度；使用する具体的薬剤の活性；使用する具体的組成物；患者の年齢、体重、全体的健康状態、性別および食餌；投与時間；投与経路；使用する具体的薬剤の排泄速度；処置の継続期間；使用する具体的薬剤と組み合わせてまたは同時に使用される薬物などといった医学分野で周知の因子を含む、さまざまな因子に依存するだろう。本発明で使用される化合物の総1日量が、理に適った医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることは、当業者には理解されるだろう。
【０１４１】
ターゲット生体分子を阻害する本発明の化合物は、他の治療モダリティと組み合わせて使用することもできる。したがって、本明細書に記載する治療に加えて、ターゲット生体分子に関連する特定の状態に対して有効であることが知られている他の治療も、対象に提供することができる。
【０１４２】
本発明を詳細に説明したので、本願特許請求の範囲に定義する発明の範囲から逸脱することなく、変更、改変、および等価な実施形態が考えられることは、明らかだろう。さらにまた、本明細書における実施例はいずれも限定でない実施例として記載されることを理解すべきである。
【実施例】
【０１４３】
本発明をさらに例示するために、以下に限定でない実施例を記載する。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施にあたって支障なく機能することを本発明者らが見出したアプローチに相当し、したがって、本発明を実施するための形態の例を構成するとみなすことができる。しかし、開示する具体的実施形態には、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更を加えることができ、それでもなお同様の結果または類似する結果が得られることを、当業者は、本明細書の開示に照らして理解すべきである。
【０１４４】
実施例１
血管内皮増殖因子
以下の実施例は、ターゲット分子（この実施例ではヒト血管内皮増殖因子（VEGF-A）（配列番号2））に対して生じた抗体に少なくとも部分的に基づく、一つ以上のファーマコフォアの作成に関する。手短に言うと、ヒト血管内皮増殖因子（VEGF-A）をいくつかの動物（例えば遺伝的に異なる一群のマウス）に提示する。VEGF-Aの接種および反復提示により、この分子に対するさまざまなIgG抗体（ポリクローナル高アフィニティー抗体）が、動物内で生じることになる。動物は抗体産生に関してそれぞれ独特な遺伝的潜在能力を持つ（可能なCDRの組み合わせが異なる）ので、これらの抗体は動物間で異なる。抗体は、その変異ゆえに、VEGF-A分子に、その分子の異なる表面領域で結合することになる。それらの抗体の少なくとも一つはVEGF-A分子の活性領域に結合すると予想される。
【０１４５】
説明しておくと、VEGFファミリーには現在、七つのメンバー、すなわちVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、およびPIGFが含まれている。全てのメンバーが、共通のVEGFホモロジードメインを持つ。このVEGFホモロジードメインはシステインノットモチーフを含み、八つの不変システイン残基が、逆平行サイドバイサイド配向で二量化する各モノマー内の保存された中心四本鎖βシートの一端で、分子間および分子内ジスルフィド結合に関与している。
【０１４６】
MAbの作製：結晶化、X線回折；空間位置
親和性成熟抗体（そのFabフラグメント）に結合したVEGF分子は、既に結晶化され、ChenらによってRCSBデータベースに1CZ8として公表されている。より具体的には、彼らの結晶化データには、VEGF二量体のメンバーであるVおよびW領域、ならびにFab分子の抗体軽鎖および抗体重鎖を表すL、H、X、およびY領域が含まれる（さらに具体的に述べると、LおよびH領域は、各鎖の可変領域と定常領域の両方を含むFab分子の一方の分枝を含む。同様に、XおよびYは、Fab分子の他方の分枝の軽鎖および重鎖である）。
【０１４７】
VEGF-Aの結晶構造の8000を超える非水素原子の空間配置を幾何学的に解析することにより、ある構造の原子であって、もう一つの構造の原子から指定された距離内にあるものを、同定することができる。このフィルターは、考えうる全ての組み合わせにまたがる直接的な幾何学的比較により、それら二つの分子間で会合しているペプチドを決定する。4オングストロームという最大隔離距離を使って、VEGF二量体のWコンポーネントの原子からそのような短距離内にある可変重鎖（H）の原子が決定される。それらの原子はおそらくFabフラグメントのCDR中の原子であるだろう。
【０１４８】
この例では、この解析により、抗体フラグメントのH領域およびVEGF分子のW領域にある以下のアミノ酸が、互いに4オングストローム以内にある側鎖原子を含むことが明らかになった（表では、この範囲内にある二残基間の側鎖原子の総数で説明する）。
【表１】
2009525274.tif 000039
【０１４９】
この解析により、ターゲットタンパク質への抗体結合は正しく同定されていたことが、さらに確認される。というのも、可変重鎖上のCDRの位置には30〜33、50〜55、および100〜110の範囲のペプチドが含まれるので、これには抗体のCDRとの相互作用が関わっているからである。より具体的には、Fab 204、206に結合したVEGF 202のコンピュータシミュレーションである図4に示すように、ターゲットタンパク質は二量化した分子W 208およびV 210で構成される。この抗体は親和性成熟型であるという事実にもかかわらず、分子モデル全体の右側にある拡大図では、下側のFab 204との相互作用は重鎖の可変領域216のCDRのうちの二つ212、214に限られていることがわかる。
【０１５０】
図5は二量化したVEGF分子のリボンモデルであり、抗体によって係合されるペプチド302の範囲は80〜100の範囲にあることを、やはり上記の表に要約した解析によって裏付けている。
【０１５１】
Chenらによると、この親和性成熟抗体はVEGF依存的細胞増殖の阻害に有意な効力をもたらしたことが、細胞に基づくインビトロアッセイによって示される。本発明の一態様は、合成リード分子を作成するためのガイドとしてこの抗体の結合界面の構造を使用することの可能性を認識することである。
【０１５２】
このレベルの正確さは、ターゲットへの結合に関与すると考えられるペプチドが実際にCDRのメンバーであり、原子の接近が結晶化プロセスの単なる人工産物ではないことを確認するのに役立つ。しかし、結合に関与する最も重要な原子を単離して、それらをリード分子を合成するためのモデルとして使用するには、原子間相互作用の数を、最も密接に会合している数個にまで絞ることが必要である。これは、フィルターにおける許容隔離距離を3オングストロームまで下げることによって達成することができる。さらに焦点を絞ったこの解析の結果を、以下の表2に示す。
【表２】
2009525274.tif 000040
【０１５３】
これら12個の原子の相対位置をさらに詳しく見ると、より具体的には、ターゲットの原子と結合する抗体の6原子の方をさらに詳しく見ると、リード分子を構築することができる。これらの各原子間相互の相対距離を以下の表に示す。
【表３】
2009525274.tif 000041
【０１５４】
上記からわかるように、ターゲットと抗体の結合領域において最も密接に会合している原子は酸素原子である。窒素原子もこれらの高アフィニティー部位の中では非常に優勢である。水素アクセプターまたは水素ドナーが必要な場合、酸素原子および窒素原子はしばしば交換可能である。
【０１５５】
同定された結合領域原子間の距離を示す表3において、アスタリスクを付けた数字は、リード分子を構成させるのに十分な近さにある、結合に関与する原子の理想的なサブグループを表す。プロリン100、チロシン101および102、ならびにセリン106の4個の酸素原子は十分に近い（隔たりは＜13Å）ので、ドラッグライクなサイズを持つ適切な分子を構築することができる。これらの基準を満たすリード分子構造を、図6Aおよび6Bに示す。以下の表に、（i）リード分子の妥当なコンフォメーションにおける原子の隔離距離、および（ii）結晶化した抗体のx線回折解析から得たデータと比較したリード中の原子の位置間の差を示す。
【表４】
2009525274.tif 000042
【表５】
2009525274.tif 000043
【０１５６】
上記の表が示すとおり、本発明の方法によって作成されたこのリード分子案は、抗体の結合端におけるそれらの相対位置から平均0.18Åの偏位（かつ0.42Åを超えない偏位）で位置する重要原子を与える。
【０１５７】
上述のように、四つの「ルール・オブ・ファイブ」では、候補ドラッグライク化合物は、以下の特徴のうち少なくとも三つを持つべきであるとされる：（i）500ダルトン未満の重量；（ii）5より大きいPの対数を持つ；（iii）5個を超えない水素結合ドナー（OH基とNH基の和として表される）を持つ；および（iv）10個を超えない水素結合アクセプター（N原子とO原子の和）を持つ。ここに記載するリードC21H20O4は、以下の特徴を持つ：（i）336の分子量；（ii）2個の水素結合ドナー；および（iii）4個の水素結合アクセプター。
実施例２
【０１５８】
インフルエンザ糖タンパク質
もう一つの望ましいターゲットはウイルス感染に関係するタンパク質、例えば血球凝集素であるかもしれない。血球凝集素は、インフルエンザウイルスの表面に見出される抗原性糖タンパク質であり、感染を受ける細胞にウイルスを結合させる原因になる。
【０１５９】
ワクチン製造者、医師会、および公衆衛生に関係する政府機関による積極的なメディアキャンペーンにも関わらず、米国では何百万という人々（一部の推定値は米国在住者の10〜20％にも及ぶ）が、毎年インフルエンザに感染する。インフルエンザに罹った人々の大半は1〜2週間で回復するが、生命を脅かす合併症（肺炎など）を発症する人もある。通例、多くの人々がインフルエンザを単にひどい風邪だとみなしているが、インフルエンザは（特に弱者、高齢者、または慢性疾患を持つ人々にとっては）命に関わる場合もある。米国では毎年平均約36,000人がインフルエンザで死亡し、毎年114,000人がインフルエンザの結果として入院する。世界保健機構の推定によれば、全世界では毎年250,000人〜500,000人が、インフルエンザ感染によって死亡する。1918年〜1920年に5000万人を超える人々が死亡した最も致死的な大流行を含めて、幾度かのインフルエンザ汎流行では、何百万人という人々が死亡している。
【０１６０】
多くの患者がインフルエンザに対するワクチンをうまく利用することができないのは、ウイルスコートに見出される糖タンパク質の突然変異が、年1回のワクチン接種を、最新型のウイルスから個体を完全に防御するための必要条件にしているという事実の結果であると言えるだろう。ホストの細胞に結合するというウイルスの能力を遮断する能力を持つ医薬は、たとえその有効性が不完全であったとしても、感染個体の免疫系が臨床的に重大な症状が現われる前に感染を打ち破る可能性を、劇的に増加させるだろう。その医薬がそのような症状の開始後に利用できるようになるのであれば、感染の重症度および継続時間の軽減が同様に可能である。
【０１６１】
Fleuryらは、中和抗体との複合体を形成した血球凝集素を結晶化し、その結果を公表している。彼らのx線結晶化研究によって得られたデータはプロテインデータバンクに登録されており、本発明者らは、VEGFに関して上に開示した方法（実施例1参照）と同様の方法で、それを解析した。
【０１６２】
より具体的には、中和抗体との複合体を形成した血球凝集素の結晶構造の8000を超える非水素原子の空間配置を幾何学的に解析することにより、血球凝集素に結合する部分でありうるほど十分にターゲットタンパク質に近い抗体フラグメント（可変重鎖および可変軽鎖）の原子を決定した。使用したフィルター（直接的な幾何学的方法を含む）により、可変重鎖CDR領域、特にCDR1およびCDR3内のペプチド（特にKabatとWuの番号付与法によればペプチド26〜32および99〜102）は、血球凝集素タンパク質に対する抗体の最も密な結合をもたらすものであることが確認された。
【０１６３】
4オングストロームという最大隔離距離を使って、互いに係合しているこれらCDR内の原子ならびにターゲット糖タンパク質内の具体的原子を決定した。それらを以下の表に記載する。
【表６】
2009525274.tif 000044
【０１６４】
これら18個の原子の相対位置をさらに詳しく見ると、より具体的には、ターゲットの原子と結合する抗体の9原子の方をさらに詳しく見ると、リード分子を構築することができる。これらの各原子間相互の相対距離を以下の表に示す。
【表７】
2009525274.tif 000045
【０１６５】
アスタリスクを付けた数字は、リード分子を構成させるのに十分な近さにある、結合に関与する原子の理想的なサブグループを表す。より具体的には、ドラッグライクな分子は、通例、8〜15Åのスパンと500ダルトン未満の分子量を持つ。チロシン32、アルギニン94、トリプトファン100、およびフェニルアラニン100Aの5原子は十分に近い（隔たりは＜12Å）ので、ドラッグライクなサイズを持つ適切な分子を構築することができる。これらの基準を満たすリード分子構造を、図7Aおよび7Bに示す。以下の表に、（i）リード分子の妥当なコンフォメーションにおける原子の隔離距離、および（ii）結晶化した抗体のx線回折解析から得たデータと比較したリード中の原子の位置間の差を示す。
【表８】
2009525274.tif 000046
【表９】
2009525274.tif 000047
【０１６６】
上記の表が示すとおり、本発明の方法によって作成されたこのリード分子案は、抗体の結合端におけるそれらの相対位置から平均0.33Åの偏位（かつ0.66Åを超えない偏位）で位置する重要原子を与える。
【０１６７】
先に述べたように、四つの「ルール・オブ・ファイブ」では、候補ドラッグライク化合物は、以下の特徴のうち少なくとも三つを持つべきであるとされる：（i）500ダルトン未満の重量；（ii）5未満であるPの対数を持つ；（iii）5個を超えない水素結合ドナー（OH基とNH基の和として表される）を持つ；および（iv）10個を超えない水素結合アクセプター（N原子とO原子の和）を持つ。ここに記載するリードC22H18N4Oは、以下の特徴を持つ：（i）354の分子量；（ii）3個の水素結合ドナー；および（iii）5個の水素結合アクセプター。
実施例３
【０１６８】
アンギオゲニン
胎児および小児では、成長中にその循環系が伸びるので、血管新生（既存の脈管構造からの新しい毛細血管の発芽）は、発育の重要な態様である。成人の場合は、通常の組織修復中、および女性生殖器のリモデリング（排卵および胎盤発育）に、血管新生が要求される。しかし、一定の病理学的状態、例えば腫瘍成長および糖尿病性網膜症も、血管新生を必要とする。血管新生に関与する既知の因子はアンギオゲニンであり、これは123アミノ酸の単一ポリペプチド鎖である。
【０１６９】
アンギオゲニンは、がんがその迅速な成長を補助するために徴用する正常サイトカインの一つである。この場合、腫瘍細胞は、腫瘍により多くの血流を動員するために、アンギオゲニンを分泌する。したがって、アンギオゲニンの産生または活性を阻害することができる薬物を発見することは、極めて有益であるだろう。
【０１７０】
Chavaliらは、中和抗体との複合体を形成したアンギオゲニンを結晶化し、その結果を公表している。彼らのx線結晶化研究によって得られたデータはプロテインデータバンクに登録されており、本発明者らは、VEGFと血球凝集素の両方に関して上に開示した方法と同様の方法で、それを解析した。
【０１７１】
より具体的には、その結晶構造の非水素原子の空間配置を幾何学的に解析することにより、アンギオゲニン分子に結合する部分でありうるほど十分にアンギオゲニン分子に近い抗体フラグメント（可変重鎖および可変軽鎖）の原子を決定した。使用したフィルター（直接的な幾何学的方法を含む）により、図8に見られること、つまり、可変軽鎖および可変重鎖の両方、特に軽鎖のCDR1内のペプチド、ならびに重鎖のCDR2およびCDR3内のペプチドは、アンギオゲニンに対する抗体の最も密な結合をもたらすものであることが確認された。
【０１７２】
4オングストロームという最大隔離距離を使って、互いに係合しているこれらCDR内の原子ならびにターゲット糖タンパク質内の具体的原子を決定した。それらを以下の表に記載する。
【表１０】
2009525274.tif 000048
【０１７３】
これら18個の原子の相対位置をさらに詳しく見ると、より具体的には、ターゲットの原子と結合する抗体の9原子の方をさらに詳しく見ると、二つの別個の潜在的ターゲット部位がアンギオゲニン上に同定される。これは、（表11および表12に示すように）二つの別個のリード分子をアンギオゲニンと結合するように構築しうることを意味する。これらの各原子間相互の相対距離を以下の表に示す。
【表１１】
2009525274.tif 000049
【表１２】
2009525274.tif 000050
【０１７４】
先に述べたように、ドラッグライクな分子は、通例、8〜15Åのスパンと500ダルトン未満の分子量を持つ。表11では、チロシン30BのOH、アスパラギン30Aの窒素、チロシン98の共鳴炭素CD2,およびチロシン100BのOHが十分に近い（隔たりは＜11Å）ので、ドラッグライクなサイズを持つ適切な分子を構築できることがわかる。同様に、表12に関して言うと、スレオニン33の酸素、チロシン58のOH、ならびにセリン90およびアスパラギン56の酸素は十分に近い（隔たりは14Å）ので、もう一つの適切な分子を構築することができる。アンギオゲニン分子のそれぞれ第1領域および第2領域について、基準を満たす二つのリード分子構造を、図9Aおよび9Bに示す。
【０１７５】
以下の表に、（i）第1リード分子の妥当なコンフォメーションにおける原子の隔離距離、および（ii）結晶化した抗体のx線回折解析から得たデータと比較した第1リード中の原子の位置間の差を示す。
【表１３】
2009525274.tif 000051
【表１４】
2009525274.tif 000052
【０１７６】
同様に、以下の表には、（i）第2リード分子の妥当なコンフォメーションにおける原子の隔離距離、および（ii）結晶化した抗体のx線回折解析から得たデータと比較した第2リード中の原子の位置間の差を示す。
【表１５】
2009525274.tif 000053
【表１６】
2009525274.tif 000054
【０１７７】
上記の表が示すとおり、本発明の方法によって作成されたこのリード分子案は、抗体の結合端におけるそれらの相対位置から平均0.05Åの偏位（かつ0.15Åを超えない偏位）で位置する重要原子を与える。
【０１７８】
先に述べたように、四つの「ルール・オブ・ファイブ」では、候補ドラッグライク化合物は、以下の特徴のうち少なくとも三つを持つべきであるとされる：（i）500ダルトン未満の重量；（ii）5未満であるPの対数を持つ；（iii）5個を超えない水素結合ドナー（OH基とNH基の和として表される）を持つ；および（iv）10個を超えない水素結合アクセプター（N原子とO原子の和）を持つ。第1リード候補C22H19NO2は、以下の特徴を持つ：（i）329の分子量；（ii）4個の水素結合ドナー；および（iii）4個の水素結合アクセプター。第2リード候補C22H20O4は、以下の特徴を持つ：（i）348の分子量；（ii）4個の水素結合ドナー；および（iii）4個の水素結合アクセプター。
実施例４
【０１７９】
ターゲット阻害のためのファーマコフォアの作成
以下の実施例では、EGFR、HER2、およびErbB2結合を阻害する分子を同定するためのターゲットタンパク質-抗体結晶構造複合体の解析とファーマコフォアの作成とを説明する。
【０１８０】
EGFRとの複合体を形成したセツキシマブのタンパク質結晶構造は、Fergusonら（Cancer Cell, 2005, 7, 301-311）によって報告され、その結晶学データはProtein Data BankにPDBコード1YY9として登録されている。セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）の原子の位置を規定する構造情報を利用して、類似する位置に対応する原子を持つ小分子を同定するために用いられるファーマコフォアモデルを構築した。抗体と類似する特徴を持つ小分子は、類似する生物学的活性を示すことができ、したがって類似する治療的有用性を持つことができる。
【０１８１】
以下に記載するファーマコフォア定義には、Chemical Computing Group（CCG）（カナダ、ケベック州モントリオール）のMolecular Operating Environment（MOE）ソフトウェアのファーマコフォア特徴作成およびファーマコフォア仮想スクリーニングモジュールを使用した。MOEのファーマコフォアアプリケーションでは、受容体部位におけるリガンドの認識に（したがってその生物学的活性に）直接関係するリガンド中の一組の構造特徴であるというファーマコフォアの一般概念を使用する。
【０１８２】
MOEでは、ファーマコフォア構造特徴が空間中の標識点によって表される。各リガンドには、そのリガンドのファーマコフォアに寄与しうる一組の構造特徴であるアノテーションが割り当てられる。アノテーション付きリガンドのデータベースは、ファーマコフォア仮説を表すクエリーで検索することができる。そのような検索の結果は、クエリーのファーマコフォア特徴を、検索したデータベースのリガンド中に存在するファーマコフォア特徴に整合させる、一組のマッチである。MOEソフトウェアスイートは、対話式変更（位置、半径、ならびにファーマコフォアクエリーの他の特徴を、対話式に調節することができる）；体系的マッチング（リガンドとクエリーの考えうる全てのマッチを体系的に調べる）；部分マッチング（この検索アルゴリズムは、クエリーの一部としかマッチしないリガンドを見つけることができる）；および体積フィルタリング（マッチするリガンドの形状に対して、一組の体積という形で拘束を加えることにより、クエリーを絞ることができる）に対応している。
【０１８３】
この実施例のファーマコフォア特徴は、MOEに含まれるPharmacophore Query Editorを使って作成した。水素結合ドナー特徴は全て半径1.2オングストロームのスフィアであり、紫色に彩色される。水素結合アクセプター特徴は全て半径1.2オングストロームのスフィアであり、シアン色に彩色される。芳香族性特徴は全て半径1.2オングストロームのスフィアであり、緑色に彩色される。複合アクセプター-陰イオンファーマコフォア特徴は全て半径1.2オングストロームのスフィアであり、灰色に彩色される。複合ドナー-アクセプター特徴は全て半径1.2オングストロームのスフィアであり、桃色に彩色される。複合ドナー-陽イオン特徴は全て1.2オングストロームのスフィアであり、赤色に彩色される。ドナー、アクセプター、芳香族性、複合酸-陰イオン、および複合ドナー-アクセプター指向性特徴は全て半径1.5オングストロームのスフィアであり、ドナーについては濃い灰色、アクセプターについては濃いシアン色、芳香族については濃い緑色、複合酸-陰イオンについては濃いシアン色、そして複合ドナー-アクセプターについては濃い灰色に彩色される。ファーマコフォアクエリーにおいて必須（essential）の印が付けられている特徴は、リガンドがヒットとなるために、そのリガンドに含まれていなければならない。
【０１８４】
ファーマコフォア特徴は全て、二つの例外を除いてプロテインデータバンクに登録された結晶構造（PDB：1YY9）から採用した対応する抗体（その受容体との複合体を形成しているもの）（例えばEGFrとの複合体を形成したセツキシマブ、pdbアクセッション番号1YY9）の対応するドナー、アクセプター、芳香族性および酸部分から導出した。一部の例では、MOEソフトウェアが提供する二つの方法を使って、ファーマコフォア特徴を配置した。それらを以下に説明する。
【０１８５】
コンタクト・スタティスティクスが、受容体の3D原子座標を使って、疎水性および親水性リガンド原子にとって好ましい位置を、統計的方法を使って計算した。この方法を使って、個々のファーマコフォア定義で注記するように、疎水性-芳香族性およびH結合特徴を配置した。
【０１８６】
MultiFragment Searchは、基本的に、あるフラグメントの比較的多数のコピー（例えば200コピーのエタン）を受容体の活性部位に配置する。フラグメントは活性部位原子の周りにランダムに配置され、互いに相互作用しないと仮定される。また、フラグメントの重なりには注意を払わない。次に、特別なエネルギー最小化プロトコールを使って、初期配置が精密化される：受容体原子はフラグメントの平均力（average froce）を感じ、一方、各フラグメントは、受容体の全力（full force）を感じるが、他のフラグメントの力は感じない。この技法を使って、疎水性、H結合ドナー、アクセプターならびに陰イオンおよび陽イオンを、MOEファーマコフォア特徴として使用するために受容体内の好ましい位置に配置することができた。
【０１８７】
表示した場合を除き、以下に定義するファーマコフォアについては、排除体積を生成させた。これらは抗体結合部位の近くにある受容体原子の位置から導出した。排除体積は、受容体への衝突を避けるためにリガンド原子が排除されなければならない空間中の位置である。それらは、抗体から5オングストローム以内にある受容体残基を選択し、MOEにおいてファーマコフクエリーエディターから「union」を選択することによって、MOEで生成させた。
【０１８８】
以下に記載する個別のファーマコフォア定義では、次の略号を使用した：F＝ファーマコフォア特徴；ドナー＝Don、アクセプター＝Acc、陰イオン＝Ani、陽イオン＝Cat、アクセプターおよび陰イオン＝Acc&Ani、ドナーおよび陽イオン＝Don&Cat、ドナーおよびアクセプター＝Don&Acc、芳香族性＝Aro、疎水性基＝Hyd。
【０１８９】
抗体セツキシマブとの複合体を形成したEGFR（1YY9.pdb）
抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）との複合体を形成したタンパク質EGFR（配列番号1）の結晶（1YY9.pdb）を、上述した手法に従って解析した。その結果、抗体セツキシマブの二組の残基が受容体と接触することが明らかになった。これらはGly54〜Asp58およびThr100〜Glu105である。これらの抗体残基セットは、互いに近接していないので、これらを使って、領域gly54_asp58およびthr100_glu105について、以下の表17に記載し図11〜22に図示する2グループのファーマコフォアモデルを作成した。
【表１７】
2009525274.tif 000055
【表１８】
2009525274.tif 000056
【表１９】
2009525274.tif 000057
【表２０】
2009525274.tif 000058
【表２１】
2009525274.tif 000059
【０１９０】
抗体セツキシマブとの複合体を形成したVEGF（1CZ8）
タンパク質VEGF（配列番号2）の結晶（1CZ8）を、上記の手法に従って解析した。その結果、抗体の一組の6残基が受容体と接触することが明らかになった。これはTyr101〜Ser106である。抗体のこの区間を使って、以下の表18に記載し図23〜29に図示するファーマコフォアモデルが作成される。
【表２２】
2009525274.tif 000060
【表２３】
2009525274.tif 000061
【表２４】
2009525274.tif 000062
【表２５】
2009525274.tif 000063
【０１９１】
抗体との複合体を形成したHER2（1N8Z.pdb）
抗体トラスツズマブ（配列番号7および配列番号8）との複合体を形成したタンパク質HER2（配列番号3）の結晶（1N8Z.pdb）を、上記の手法に従って解析した。その結果、抗体の5残基が受容体と接触することが明らかになった。それらはArg50、Tyr92〜Thr94、およびGly103である。抗体のこれらの残基は互いに近接している。これらを使って、以下の表19および図30〜33に記載する一群のファーマコフォアモデルを作成した。
【表２６】
2009525274.tif 000064
【表２７】
2009525274.tif 000065
【０１９２】
抗体との複合体を形成したErbB2（1S78.pdb）
抗体ペルツズマブ（配列番号9および配列番号10）との複合体を形成したタンパク質ERBB2（配列番号4）の結晶（1S78.pdb）を、上記の手法に従って解析した。その結果、抗体の5残基が受容体と接触することが明らかになった。それらはAsp31〜Tyr32およびAsn52〜Pro52A〜Asn53である。抗体のこれらの残基は互いに近接している。これらを使って、以下の表20および図34〜35に記載する二つのファーマコフォアモデルを作成した。
【表２８】
2009525274.tif 000066
【０１９３】
抗体セツキシマブの重鎖との複合体を形成したEGFR（2EXQ.pdb）
抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）の重鎖との複合体を形成したタンパク質EGFR（配列番号1）の結晶（2EXQ.pdb）を、上記の手法に従って解析した。その結果、一組目のファーマコフォアモデルでは、抗体重鎖の8残基が受容体と接触することが明らかになった。それらはTyr50_Thr57である。これらを使って、以下の表21および図36〜42に記載する7つのファーマコフォアモデルを作成した。
【表２９】
2009525274.tif 000067
【表３０】
2009525274.tif 000068
【表３１】
2009525274.tif 000069
【０１９４】
抗体セツキシマブの軽鎖との複合体を形成したEGFr（2EXQ.pdb）
抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）の軽鎖との複合体を形成したタンパク質EGFR（配列番号1）の結晶（2EXQ.pdb）を、上記の手法に従って解析した。その結果、一組目のファーマコフォアモデルでは、抗体軽鎖の9残基が受容体と接触することが明らかになった。それらはAsn32_Ile33_Gly34、Tyr49_His50_Gly51、Tyr91、Phe94、およびTrp96である。これらを使って、以下の表22および図43〜44に記載する6個のファーマコフォアモデルを作成した。
【表３２】
2009525274.tif 000070
【表３３】
2009525274.tif 000071
【０１９５】
上述の方法論を使用することにより、以下に挙げるような（ただしこれらに限るわけではない）さまざまなタンパク質ターゲット（リガンドと共に結晶化したもの）について、ファーマコフォアを作成することができる：口蹄疫（1QGC.pdb）；アンギオテンシンII（1CK0.pdb、3CK0.pdb、2CK0.pdb）；ペルツズマブ抗体との複合体を形成したErbB2（1L7I.pdb、1S78.pdb、2GJJ.pdb）；インフルエンザ凝集素（1DN0.pdb、1OSP.pdb）；インフルエンザ血球凝集素（1EO8.pdb、1QFU.pdb、2VIR.pdb、2VIS.pdb、2VIT.pdb、1KEN.pdb、1FRG.pdb、1HIM.pdb、1HIN.pdb、1IFH.pdb）；インフルエンザノイラミニダーゼ（NC10.pdb、1AI4.pdb、1NMB.pdb、1NMC.pdb、1NMA.pdb、1NCA.pdb、1NCD.pdb、2AEQ.pdb、1NCB.pdb、1NCC.pdb、2AEP.pdb）；γインターフェロン（HuZAF.pdb、1T3F.pdb、1B2W.pdb、1B4J.pdb、1T04.pdb）；ハーセプチンとの複合体を形成したHER2（1N8Z.pdb、1FVC.pdb）；髄膜炎菌（Neisseria Meningitidis）（1MNU.pdb、1MPA.pdb、2MPA.pdb、1UWX.pdb）；HIV1プロテアーゼ（1JP5.pdb、1CL7.pdb、1MF2.pdb、2HRP.pdb、1SVZ.pdb）；HIV-1逆転写酵素（2HMI.pdb、1J5O.pdb、1N5Y.pdb、1N6Q.pdb、1HYS.pdb、1C9R.pdb、1HYS.pdb、1R08.pdb、1T04.pdb、2HRP.pdb）；ライノウイルス（1FOR.pdb、1RVF.pdb、1BBD.pdb、1A3R.pdb、1A6T.pdb）；血小板フィブリノゲン受容体（1TXV.pdb、1TY3.pdb、1TY5.pdb、1TY6.pdb、1TY7.pdb）；サルモネラオリゴ糖（1MFB.pdb、1MFC.pdb、1MFE.pdb）；TGF-α（1E4W.pdb、1E4X.pdb）；TN1との複合体を形成したトロンボポエチン（1V7M.pdb、1V7N.pdb）；5G9との複合体を形成した組織因子（1FGN.pdb、1AHW.pdb、1JPS.pdb、1UJ3.pdb）；NMC-4との複合体を形成したフォンウィレブラント因子（1OAK.pdb、2ADF.pdb、1FE8.pdb、1FNS.pdb、2ADF.pdb）；B20-4との複合体を形成したVEG（2FJH.pdb、2FJF.pdb、2FJG.pdb、1TZH.pdb、1TZI.pdb、1CZ8.pdb、1BJ1.pdb）；コロナウイルス-SARS（2DD8.pdb、2G75.pdb）；ライム病（1P4P.pdb、1RJL.pdb）；HIV GP120（1ACY.pdb、1F58.pdb、1G9M.pdb、1G9N.pdb、1GC1.pdb、1Q1J.pdb、1QNZ.pdb、1RZ7.pdb、1RZ8.pdb、1RZF.pdb、1RZG.pdb、1RZI, 1RZJ.pdb、1RZK.pdb、1YYL.pdb、1YYM.pdb、2B4C.pdb、2F58.pdb、2F5A.pdb）；HIV GP41（1TJG.pdb、1TJH.pdb、1TJI.pdb、1U92.pdb、1U93.pdb、1U95.pdb、1U8H.pdb、1U8I.pdb、1U8J.pdb、1U8K.pdb、1U8P.pdb、1U8Q.pdb、1U91.pdb、1U8L.pdb、1U8M.pdb、1U8N.pdb、1U8O.pdb、2F5B）；ウエストナイルウイルス（米国特許出願公開第2006/0115837号に定義されているもの）；マラリア（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）（Acta Crystallographia (2004), D60(11), 2054-2057に定義されているもの）；およびEGFR（1I8I.pdb、1I8K.pdb、1YY8.pdb、1YY9.pdb、2EXP.pdb、2EXQ.pdb）。
実施例５
【０１９６】
リガンドドッキングおよびスコアリング
ターゲットタンパク質へのドッキングのために選択した化合物は、MOEモデリングソフトウェアで作成したファーマコフォアモデルと整合することが見出されたものである（実施例4参照）。これらの化合物をZINCデータベースからMOEデータベースフォーマットで入手した（IrwinおよびShoichet (2005) J Chem Inf Model 45, 177-182参照）。これらの化合物の3次元原子座標を、MOEデータベースウィンドウのエクスポートコマンドを使って、水素を付加せずに、構造データフォーマット（*.sdf）ファイルに書き出した。
【０１９７】
次に、Maestroモデリングソフトウェア（Schrodinger LLC、ニューヨーク州ニューヨーク）のLigPrepソフトウェアモジュールを使って、ドッキング用の化合物を調製した。LigPrepを使って*.sdfファイルをMaestroフォーマットに変換した。次に水素を付加し、全ての荷電基を中和した。7.0±1.0pH単位でリガンドのイオン化状態を生成した。その後、必要であれば互変異性体を生成し、代替キラリティを生成し、低エネルギー環コンフォメーションを作成した。次に、問題がある構造を取り除き、MacroModelソフトウェアモジュールを使って、得られたリガンドをエネルギー最小化した。最後に、リガンドのMaestroファイル（*.mae）を書き出して、ドッキングの準備を完了した。これらのステップは全て、Schrodinger, LLCによって供給されたphytonスクリプトによって自動化した。
【０１９８】
タンパク質調製を以下に説明する。まず、タンパク質をPDBフォーマットでMestroにインポートした。水素を付加し、不完全な残基など、全てのエラーを修復した。タンパク質構造を金属イオンおよび補因子についてチェックした。必要に応じ、金属イオンおよび補因子について、電荷および原子タイプを設定した。必要であればリガンド結合次数および形式電荷を調節した。Maestro（Glide）でリガンド（1YY9の場合、それは、抗体のThr100-Tyr101-Tyr102-Asp103-Tyr104-Glu105断片またはGly54-Gly55-Asn56-Thr57-Asp58断片である）を選ぶことによって結合部位を決定した。このプログラムは、選ばれたリガンドの重心を決定し、20オングストロームの枠を描く。この枠はデフォルト設定を表し、枠の中心にリガンドの重心が置かれる。この枠を、リガンドをドッキングさせるための結合部位とした。Glideで自動化されているタンパク質調製機能は、二つのコンポーネント、すなわち調製および精密化からなる。調製コンポーネントでは、水素が付加され、結合部位の近くにはなく塩橋に関与しない側鎖が中和された。精密化コンポーネントでは、共結晶化複合体の拘束最小化が行われ、これにより、側鎖ヒドロキシル基が再配向され、潜在的立体衝突が軽減された。
【０１９９】
受容体グリッド生成を以下に説明する。Glideは、一つ以上のリガンド分子と受容体分子（通常はタンパク質）の間の有利な相互作用を検索する。受容体の形状および性質は、リガンドとタンパク質との水素結合、クーロン（すなわち電荷-電荷）相互作用、疎水性相互作用、および立体衝突を含む数種類のフィールドセットによって、グリッド上に表現される。第1ステップでは受容体を定義しなければならない。これはリガンドを選ぶことによって行った。構造のうち選ばれなかった部分を受容体とした。リガンドはグリッド計算には含まれなかったが、上述のように結合部位を定義するために使用した。受容体の無極性原子のスケーリングはこのドッキング作業には含めなかった。グリッド自体は、取り囲む枠の空間内で計算した。これは上述の枠であり、リガンド原子の全てが、この枠内に含まれていなければならない。ファーマコフォア拘束は使用しなかった。なぜなら、Glideのエクストラ・プリシジョン（extra precision）スコア関数は、これらの拘束がない方がより良く機能するからである。
【０２００】
Glideを使用するには、各リガンドは単一の分子でなければならいが、受容体は二つ以上の分子（例えばタンパク質と補因子）を含みうる。Glideは、リジッド（rigid）ドッキングモードまたはフレキシブル（flexible）ドッキングモードで作動させることができ、後者は各インプットリガンドについて自動的にコンフォメーションを生成する。受容体に対するリガンドの位置および配向の組み合わせを、フレキシブルドッキングにおけるそのコンフォメーションと合わせて、リガンドポーズ（ligand pose）という。全てのドッキング作業をフレキシブルドッキングモードを使って行う。Glideが生成するリガンドポーズは、そのリガンドと受容体との相互作用を評価する一連の階層的フィルターを通過する。初期フィルターでは、定義された活性部位へのリガンドの空間フィットが試験され、グリッドベースの方法を使ってリガンド-受容体相互作用の相補性が検討される。これらの初期スクリーンを通ったポーズは、アルゴリズムの最終段階に進み、ここでは、OPLS-AA非結合リガンド-受容体相互作用エネルギーに対するグリッド近似の評価および最小化が行われる。次に、エネルギー最小化がなされたポーズに対して、最終的なスコアリングが行われる。デフォルトでは、Schroedinger独自のGlideScoreマルチリガンドスコア関数を使って、ポーズがスコアリングされる。GlideScoreをスコア関数として選択した場合は、次に、コンポジットEmodelスコアを使って、各リガンドのポーズが格付けされ、ユーザーに報告すべきポーズが選択される。Emodelでは、GlideScore、非結合相互作用エネルギー、およびフレキシブルドッキングの場合は、生成されたリガンドコンフォメーションの過剰な内部エネルギーが組み合わされる。コンフォメーションフレキシビリティは、Glideでは、広範なコンフォメーション検索によって取り扱われ、長距離内部水素結合を持つコンフォメーションなどの不適切なコンフォメーションを迅速に除去する発見的（heuristic）スクリーンによって強化される。
【０２０１】
この実施例のドッキング作業で使用した設定は以下の通りである。グリッドファイルを読み込んだ。エクストラ・プリシジョン（XP）スコア関数を使用した。コンフォメーションフレキシビリティを使ってドッキングさせた。初期Glideスクリーンでは1リガンドあたり5000ポーズをキープした（デフォルト）。初期ポーズをキープするためのスコアリングウインドウ（scoring window）は100.0とした（デフォルト）。エネルギー最小化のために1リガンドあたり最良の800ポーズをキープした（デフォルト）。エネルギー最小化には、2.0の距離依存性誘電率を使用し、共役勾配ステップの最大数を100とした（デフォルト）。次にリガンドファイルをロードした。＞120個の原子かつ/または＞20個の回転可能結合を持つ分子はドッキングさせなかった（デフォルト）。＜0.15の部分電荷を持つリガンド原子のファンデルワールス半径には0.80倍のスケーリングを施した。これは、受容体フレキシビリティを模倣するために行った。拘束および類似性は使用しなかった。クーロンエネルギー＋ファンデルワールスエネルギー＞0.0のポーズは却下した。各分子のポーズがコンフォメーション的に異なることを保証するために、RMS偏位＜0.5かつ/または最大原子変位1.3オングストロームのポーズは廃棄した。
【０２０２】
Glideスコアリングを以下に説明する。各リガンドに関する最適ドッキング構造の選択は、エネルギーグリッドスコア、GlideScoreによって予測される結合アフィニティー、そして（フレキシブルドッキングの場合は）コンフォメーション検索アルゴリズムを方向付けるために使用したモデルポテンシャルに関する内部歪みエネルギーを組み合わせるモデルエネルギースコア（Emodel）を使って行った。電荷-双極子相互作用および双極子-双極子相互作用を犠牲にして電荷-電荷相互作用に過度な報酬が与えられることを回避するために案出された特製のクーロン-ファンデルワールス相互作用エネルギースコア（CvdW）も、Glideによって算出された。このスコアは、異なるリガンドの結合アフィニティーを比較するのに、「生」のクーロン-ファンデルワールス相互作用エネルギーよりも好適になるように考えられたものである。最終データ処理では、算出されたGlideScore値と「変形」クーロン-ファンデルワールススコア値とを組み合わせることにより、データベーススクリーニング応用において濃縮係数を改善するのに役立ちうるコンポジットスコアを得ることができる。Glideスコアの数式は：
GScore＝0.065×EvdW＋0.130×Coul＋Lipo＋Hbond＋Metal＋BuryP＋RotB＋Site
である［式中、EvdWはファンデルワールスエネルギーである（金属、カルボキシレート、およびグアニジニウムなどの形式電荷を持つ基上の換算実効イオン電荷（reduced net ionic charge）で算出したもの）；Coulはクーロンエネルギーである（金属、カルボキシレート、およびグアニジニウムなどの形式電荷を持つ基上の換算実効イオン電荷で算出したもの）；Lipoは親油性接触項である（有利な疎水性相互作用に報酬を与える）；HBondは水素結合項である（ドナーおよびアクセプターが中性であるか、一方が中性でありかつ他方が荷電しているか、両方が荷電しているかに依存して、重み付けが異なるコンポーネントに分離される）；metalは金属結合項である（陰イオン性アクセプター原子との相互作用だけが含まれる；アポタンパク質中の実効金属電荷が正である場合は、陰イオン性リガンドに対する選好が含まれる；実効電荷がゼロである場合は、選好が抑制される）；BuryPは埋没した極性基に対するペナルティである；RotBは回転可能結合の凍結に対するペナルティである；Siteは活性部位における極性相互作用である（疎水領域中の極性かつ非水素結合性である原子に報酬が与えられる）］。
【０２０３】
スクリーニングした仮想化合物ライブラリーの生成を、以下に説明する。市販化合物の無料仮想データベース中のリードライクな化合物を、ZINCデータベースから構造データフォーマット（sdf，Molecular Design Limited）でダウンロードした（IrwinおよびShoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1), 177-182）。このリードライクデータベースは、33のセグメントに分割された約890,000化合物から構成される。これを使って、MOEによるスクリーニング用のデータベースを生成した。次に水素を付加した。ファーマコフォア検索のために、低エネルギーコンフォーマーのデータベースを生成させなければならない。Conformation Importコマンドを上記sdfファイルに適用した。コンフォーマーを生成させた後、コンフォーマーデータベースの前処理を適用した。特徴アノテーションと呼ばれるこのステップでは、各分子/コンフォメーション中のファーマコフォア特徴のタイプおよびそれらの幾何学的関係を決定した。次にこれをクエリーと比較し、所定の許容範囲内でクエリーと一致した分子/コンフォメーションをヒットとしてセーブした。
【０２０４】
EGFR
抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）との複合体を形成したタンパク質EGFR（配列番号1）の1YY9.pdb結晶から同定されたファーマコフォア（例えば実施例4；表17参照）に対してZINCデータベースからの化合物を解析することにより、183個の類似化合物が同定された。これらの化合物を上述のドッキングおよびスコアリング法に従って解析した。ドッキングおよびスコアリング試験の典型的な結果を表23に示す。
【表３４】
2009525274.tif 000072
【表３５】
2009525274.tif 000073
【表３６】
2009525274.tif 000074
【表３７】
2009525274.tif 000075
【０２０５】
EGFRへの化合物AD4-1009のドッキングを、例えば図49に図示する。EGFRへの化合物AD4-1010のドッキングを、例えば図48に図示する。EGFRへの化合物AD4-1016のドッキングを、例えば図50に図示する。EGFRへの化合物AD4-1017のドッキングを、例えば図51に図示する。EGFRへの化合物AD4-1018のドッキングを、例えば図52に図示する。EGFRへの化合物AD4-1025のドッキングを、例えば図46に図示する。EGFRへの化合物AD4-1038のドッキングを、例えば図47に図示する。
【０２０６】
VEGF
上述の方法に従って、抗体ペルツズマブとの複合体を形成したタンパク質VEGF（配列番号2）の1CZ8.pdb結晶から同定されたファーマコフォア（実施例4；表18参照）に対してZINCデータベースからの化合物を解析することにより、表24の化合物を含む化合物が同定された。上述のファーマコフォアクエリーからのヒットに対してGlideスコアを生成させた。その結果得られたデータをGlideスコアに従って配列し、-5.0（またはそれ以上の絶対値）のg_スコアを持つことに基づいて13個のAD4化合物と、ファーマコフォア6nを使って同定される化合物を代表してZINC02338377（AD4-2008）（g_スコア＝-4.9156を持つ）とを選択した。
【表３８】
2009525274.tif 000076
【０２０７】
HER2
上述の方法に従って、抗体トラスツズマブ（配列番号7および配列番号8）との複合体を形成したタンパク質HER2（配列番号3）の1N8Z.pdb結晶から同定されたファーマコフォア（実施例4；表19参照）に対してZINCデータベースからの化合物を解析することにより、表25に記載するもの含む化合物が同定された。上述のファーマコフォアクエリーからのヒットに対してGlideスコアを生成させた。その結果得られたデータをGlideスコアに従って配列し、-6.0（またはそれ以上の絶対値）のg_スコアを持つことに基づいて18個のAD4化合物と、ファーマコフォア3nを使って同定される化合物を代表してZINC00177228（AD4-3006）（g_スコア＝-5.8263を持つ）とを選択した。
【表３９】
2009525274.tif 000077
【０２０８】
ErbB2
上述の方法に従って、抗体ペルツズマブ（配列番号9および配列番号10）との複合体を形成したタンパク質ERBB2（配列番号4）の1S78.pdb結晶から同定されたファーマコフォア（実施例4；表19参照）に対してZINCデータベースからの化合物を解析することにより、表26に記載するものを含む化合物が同定された。上述のファーマコフォアクエリーからのヒットに対してGlideスコアを生成させた。その結果得られたデータをGlideスコアに従って配列し、-7.5（またはそれ以上の絶対値）のg_スコアを持つことに基づいて17個のAD4化合物と、ファーマコフォア5nを使って同定される化合物を代表してZINC01800927（AD4-3044）（g_スコア＝-7.3143を持つ）とを選択した。
【表４０】
2009525274.tif 000078
実施例６
【０２０９】
ファーマコフォアから同定された化合物のEGFR阻害に関する試験
さまざまなファーマコフォアモデルを代表する同定された化合物を、25μMでEGFRを阻害する能力について試験した。
【０２１０】
ファーマコフォアモデル（実施例4参照）を使ってAD4化合物を同定し、セツキシマブの確定されたCDRによって認識されるEGFR（配列番号1）の結合部位とドッキングさせた。次に、AD4化合物による上皮成長因子結合の阻害を決定した（NovaScreen BioSciences、メリーランド州ハノーバー）。EGF結合の阻害は25μM濃度で決定した。
【０２１１】
この阻害アッセイに関して、KD（結合アフィニティー）は1.04nMであり、Bmax（受容体数）は43.0fmol/mg組織（湿重量）だった。受容体源はラット肝膜とした。放射性リガンドは、最終リガンド濃度0.36nMの[125I]EGF（150〜200Ci/g）とした。非特異的決定因子（non-specific determinant）をEGF-［100nM］として使用した。参照化合物および陽性対照をEGFとした。反応は、0.1％BSAを含有する10mM HEPES（pH7.4）中、25℃で60分間行った。ガラス繊維フィルターへの急速真空濾過によって反応を停止させた。フィルター上に捕捉された放射能を決定し、試験化合物とEGF結合部位との相互作用を確認するために対照値と比較した。このEGF阻害剤アッセイは、例えばMukku (1984) J. Biol. Chem. 259, 6543-6546；Duhら (1990) World J. Surgery 14, 410-418；Lokeshwarら (1989) J. Biol. Chem. 264(32), 19318-19326に変更を加えたものである。
【０２１２】
さまざまなファーマコフォアモデルを代表する同定された化合物について、EGFR阻害アッセイの結果を、表27に示す。
【表４１】
2009525274.tif 000079
【表４２】
2009525274.tif 000080
【表４３】
2009525274.tif 000081
【表４４】
2009525274.tif 000082
【表４５】
2009525274.tif 000083
実施例７
【０２１３】
AD4-1025化合物
AD4-1025（N1-(4-クロロフェニル)-N2-(3-ピリジニルメチル)-α-アスパラギン；式：C16H16ClN3O3；分子量：333.78）は、上皮成長因子受容体（EGFR（配列番号1））に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤である。
【化３７】
2009525274.tif 000084
式（6）
【０２１４】
AD4-1025は25μMの濃度で、EGFR（配列番号1）に対するEGFの結合を75.7％阻害する（例えば実施例6参照）。EGFRとの複合体を形成したセツキシマブのタンパク質結晶構造は、Fergusonらによって報告されており（(2005) Cancer Cell 7, 301-311）、その結晶学データはProtein Data BankにPDBコード1YY9として登録されている（「1YY9.pdb」）。
【０２１５】
1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使ってファーマコフォアモデルを設計することにより、AD4-1025が同定された（例えば実施例4参照）。このモデルPharm1_gly54_asp58を利用して、EGFRに結合する小分子を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm1_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。具体的に述べると、この領域は、セツキシマブの抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。
【０２１６】
Pharm1_gly54_asp58のファーマコフォア特徴（F）およびコンポーネントには、F1：Aro−EGFRのARG353と相互作用する位置にある球面半径1.2オングストロームの芳香環中心コンポーネント；F2：Aro2−EGFRのAGR353と相互作用するような投射指向性をモデル化した位置にある球面半径1.5オングストロームの芳香環中心コンポーネント；F3：Acc&Ani−セツキシマブのGLY-54のカルボニルをモデル化した位置にある球面半径1.2オングストロームの水素結合アクセプターおよび陰イオンコンポーネント；F4：Acc2−タンパク質結晶構造PDB：1YY9ではEGFRのARG353と水素結合していることがわかるセツキシマブのGLY54のカルボニル基の孤立電子対の指向性をモデル化した位置にある球面半径1.5オングストロームの水素結合アクセプターコンポーネント；F5：Acc&Ani−セツキシマブのASP-58のカルボキシレート酸素原子をモデル化した位置にある球面半径1.4オングストロームの水素結合アクセプターおよび陰イオンコンポーネント；およびF6：Acc−THR57のアミドカルボニルの孤立電子対の指向性をモデル化した位置にある球面半径1.2オングストロームの水素結合アクセプターコンポーネントが含まれる（例えば表17；図11参照）。
【０２１７】
ファーマコフォア10にとって、全てのコンポーネントが同時に必須なわけではない。ファーマコフォアモデルPharm1_gly54_asp58では、6個の特徴およびコンポーネントのうちの5個という部分マッチが許される。また、排除体積拘束として知られる特徴も、Pharm1_gly54_asp58には組み入れられる。排除体積拘束は、ターゲットタンパク質（この例ではEGFR）によって占められる空間を排除するために用いられる。ファーマコフォアクエリー中に同定される小分子の幾何学的配置を制限するために、ターゲットタンパク質原子の位置を占めるように一群の「ダミー」スフィアを配置した。これらは、図45に濃い灰色のスフィアとして見ることができる。この表示を使って、ターゲットタンパク質EGFRの表面トポロジーを近似する（例えば図45参照）。
【０２１８】
ファーマコフォアを使用し、市販化合物850,000個のデータベースの検索に基づいて、小分子を同定した（例えば実施例4参照）。次に、Pharm1_gly54_asp58よって同定された化合物を、EGFRの結合部位のアミノ酸残基（例えば図46参照）に、インシリコでドッキングさせて（例えば実施例5参照）、標的阻害剤のリストを得た。
【０２１９】
Pharm1_glu54_asp58と呼ばれるファーマコフォアを使ってセツキシマブのアミノ酸GLY54〜ASP58をモデル化することにより、化合物AD4-1025が同定された。さらなる試験により、化合物AD4-1025は25μMでEGFRを76％阻害することが証明された。AD4-1025とEGFRの結合部位のアミノ酸残基とのドッキングの典型的描写を図46に示す。
【０２２０】
Pharm1_glu54_asp58を使って同定された他の小分子EGFR阻害剤には以下に挙げるものが含まれる：AD4-1020（25μMで48％阻害）；AD4-1021（25μMで43％阻害）；AD4-1027（25μMで39％阻害）；AD4-1022（25μMで39％阻害）；AD4-1030（25μMで38％阻害）；およびAD4-1039（25μMで32％阻害）。
実施例８
【０２２１】
AD4-1038化合物
AD4-1038（{2-[(4-ヒドロキシ-フェニル)-メチル-アミノ]-4-オキソ-4,5-ジヒドロ-チアゾール-5-イル}-酢酸；式：C12H12N2O4S；分子量：280.30）は、上皮成長因子受容体（EGFR（配列番号1））に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤である。
【化３８】
2009525274.tif 000085
式（13）
【０２２２】
AD4-1038は25μMの濃度で、EGFRに対するEGFの結合を70.7％阻害した（例えば実施例6参照）。モデルPharm1_thr100_glu105を利用して、EGFRに結合する小分子を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基THR-100〜GLU-105によって認識される。Pharm1_thr100_glu105はセツキシマブアミノ酸残基THR-100〜GLU-105を模して作成され、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するためのツールとして設計されている。具体的に述べると、この領域は、セツキシマブの抗体重鎖上に位置するH3 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルを作成した。
【０２２３】
Pharm1_thr100_glu105のファーマコフォア特徴（F）およびコンポーネントには、F1〜F8が含まれる（例えば表17；図17参照）。AD4-1038とEGFRの結合部位のアミノ酸残基とのドッキングの典型的描写を図47に示す。Pharm 1_thr100_glu105を使って同定されたもう一つの小分子EGFR阻害剤は、AD4-1009（25μMで35.01％阻害）だった。
実施例９
【０２２４】
AD4-1010化合物
AD4-1010（4-(4-ヒドロキシフェニル)-6-メチル-N-(3-メチルフェニル)-2-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-5-ピリミジンカルボキサミド；式：C19H19N3O3；分子量：337.37）は、上皮成長因子受容体（EGFR（配列番号1））に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤である。
【化３９】
2009525274.tif 000086
式（31）
【０２２５】
AD4-101は25μMの濃度でEGFRに対するEGFの結合を39.40％阻害する（例えば実施例6参照）。EGFRとの複合体を形成したセツキシマブのタンパク質結晶構造はFergusonらによって報告され（(2005) Cancer Cell 7, 301-311）、その結晶学データはProtein Data BankにPDBコード1YY9（「1YY9.pdb」）として登録されている。
【０２２６】
1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使ってもう一つのファーマコフォアモデルを設計することにより、AD4-1010が同定された。このモデルを使ってもう一組のEGFR阻害剤を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基TYR-101〜TYR-104によって認識される。Pharm 2_thr100_glu105は残基TYR101〜TYR104を模して作成されたものであり、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するために使用される（例えば実施例4参照）。具体的に述べると、この領域は抗体重鎖のH3 CDRと同定される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルPharm 2_thr100_glu105を作成した（例えば実施例4参照）。
【０２２７】
ファーマコフォア特徴（F）およびコンポーネントには、F1：Don&Acc−セツキシマブのTYR-102のヒドロキシルをモデル化した位置にある球面半径0.8オングストロームの水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターコンポーネント；F2：Aro−セツキシマブのTYR-102のフェニル環をモデル化した位置にある球面半径1.2オングストロームの芳香環コンポーネント；F3：Acc−TYR-102のカルボニル酸素をモデル化した位置にある球面半径0.8オングストロームの水素結合アクセプターコンポーネント；F4およびF5：Acc&Ani−それぞれセツキシマブのASP-103のカルボキシレート酸素原子をモデル化した位置にある球面半径0.8オングストロームの水素結合アクセプターおよび陰イオンコンポーネント；F6：Don&Acc−セツキシマブのTYR-104のヒドロキシルをモデル化した位置にある球面半径0.8オングストロームの水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターコンポーネント；およびF7：Aro−セツキシマブのTYR-104のフェニル環をモデル化した位置にある球面半径1.2オングストロームの芳香環コンポーネンが含まれる（例えば表17；図18参照）。
【０２２８】
ファーマコフォアにとって、全てのコンポーネントが同時に必須なわけではない。上記7個の特徴およびコンポーネントのうちの5個という部分マッチが許される。セツキシマブのタンパク質結晶構造から得られる残基TYR-100〜TYR-104と重ね合わせたPharm 2_thr100_glu105の表示を、例えば図18に示す。
【０２２９】
Pharm 2_thr100_glu105を使って市販化合物を検索することにより、AD4-1010が同定された。AD4-1010とEGFRの結合部位のアミノ酸残基とのドッキングの典型的描写を図48に示す。
実施例１０
【０２３０】
AD4-1020
AD4-1020（{5-[4-(ベンジルオキシ)フェニル]-2H-テトラゾール-2-イル}酢酸；式：C16H14N4O3；分子量：310.31）は、上皮成長因子の受容体（EGFR（配列番号1））に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤である。
【化４０】
2009525274.tif 000087
式（28）
【０２３１】
AD4-1020は25μMの濃度でEGFRに対するEGFの結合を47.8％阻害する（例えば実施例6参照）。EGFRとの複合体を形成したセツキシマブのタンパク質結晶構造はFergusonらによって報告され（(2005) Cancer Cell 7, 301-311）、その結晶学データはProtein Data BankにPDBコード1YY9（「1YY9.pdb」）として登録されている。
【０２３２】
1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使ってもう一つのファーマコフォアモデルを設計することにより、AD4-1020が同定された。このモデルを使って、もう一組のEGFR阻害剤を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm1_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成されたものであり、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するために使用される（例えば実施例4参照）。具体的に述べると、この領域は抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルPharm1_gly54_asp58を作成した（例えば実施例4参照）。
【０２３３】
ファーマコフォア特徴（F）およびコンポーネントには、F1 Aro−疎水性コンタクト・スタティスティクスから導出，受容体のArg353のグアニジンと有利なクーロン相互作用；F2 Aro2−Arg353のグアニジンに対するF1の指向性；F3 Acc&Ani−抗体セツキシマブのGly54主鎖カルボニルから導出。アクセプターが受容体Arg353のグアニジンからのH結合を受容するか、陰イオンが受容体Arg353のグアニジンへの塩橋を形成する；F4 Acc2−Arg353のグアニジンに対するF3の指向性；F5 Acc&Ani−Asp58側鎖カルボキシレートから導出。アクセプターが受容体のLys443側鎖のNH3+からのH結合を受容するか、陰イオンが受容体のLys443側鎖のNH3+への塩橋を形成する；F6 Acc−親水性コンタクト・スタティスティクスから導出，受容体のSer448の側鎖OHからのH結合を受容；V1−排除体積（理解しやすいように示していない）が含まれる。
【０２３４】
ファーマコフォアにとって、全てのコンポーネントが同時に必須なわけではない。上記6個の特徴およびコンポーネントのうちの5個という部分マッチが許される。セツキシマブのタンパク質結晶構造から得られる残基GLY-54〜ASP-58と重ね合わせたPharm1_gly54_asp58の表示を、例えば図11に示す。
【０２３５】
Pharm1_gly54_asp58を使って市販化合物を検索することにより、AD4-1020が同定された。AD4-1020とEGFRの結合部位のアミノ酸残基とのドッキングの典型的描写を図53に示す。
実施例１１
【０２３６】
AD4-1132
AD4-1132（(2-{[(2,4-ジメチルフェノキシ)アセチル]アミノ}-5-ヒドロキシ安息香酸）；式：C17H17NO5；分子量：315.32）は、上皮成長因子の受容体（EGFR（配列番号1））に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤である。
【化４１】
2009525274.tif 000088
式（24）
【０２３７】
AD4-1132は25μMの濃度でEGFRに対するEGFの結合を59.6％阻害する（例えば実施例6参照）。EGFRとの複合体を形成したセツキシマブのタンパク質結晶構造はFergusonらによって報告され（(2005) Cancer Cell 7, 301-311）、その結晶学データはProtein Data BankにPDBコード1YY9（「1YY9.pdb」）として登録されている。
【０２３８】
1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使ってもう一つのファーマコフォアモデルを設計することにより、AD4-1132が同定された。このモデルを使って、もう一組のEGFR阻害剤を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm23_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成されたものであり、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するために使用される（例えば実施例4参照）。具体的に述べると、この領域は抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルPharm23_gly54_asp58を作成した（例えば実施例4参照）。
【０２３９】
ファーマコフォア特徴（F）およびコンポーネントには、F1 Don−Asn56の抗体側鎖NH2から導出。受容体Ser418側鎖OHとH結合を形成する；F2 Acc&Ani−抗体セツキシマブのGly54主鎖カルボニルから導出。アクセプターが受容体Arg353のグアニジンからのH結合を受容するか、陰イオンが受容体Arg353のグアニジンへの塩橋を形成する；F3 Acc2−Arg353のグアニジンに対するF3の指向性；F4 Acc&Ani−受容体Lys443のNH3+からのH結合を受容するまたは受容体Lys443のNH3+への塩橋を形成する抗体Asp58側鎖カルボキシレートから導出；F5 Don−受容体Gln384の側鎖カルボニルとH結合を形成する抗体Gly54主鎖NHから導出；F6 Aro−疎水性コンタクト・スタティスティクスから導出，受容体のArg353のグアニジンと有利なクーロン相互作用，必須；およびF7 Aro2−Arg353のグアニジンに対するF6の指向性が含まれる。
【０２４０】
ファーマコフォアにとって、全てのコンポーネントが同時に必須なわけではない。上記7個の特徴およびコンポーネントのうちの5個という部分マッチが許される。セツキシマブのタンパク質結晶構造から得られる残基GLY-54〜ASP-58と重ね合わせたPharm23_gly54_asp58の表示を、例えば図15に示す。
【０２４１】
Pharm23_gly54_asp58を使って市販化合物を検索することにより、AD4-1132が同定された。AD4-1132とEGFRの結合部位のアミノ酸残基とのドッキングの典型的描写を図58〜39に示す。
実施例１２
【０２４２】
AD4-1142
AD4-1142（(5-{[(4-エチルフェニル)スルホニル]アミノ}-2-ヒドロキシ安息香酸）；式：C15H15NO5S；分子量：321.35）は、上皮成長因子の受容体（EGFR（配列番号1））に対する上皮成長因子（EGF）結合の阻害剤である。AD4-1142の構造は以下のとおりである：
【化４２】
2009525274.tif 000089
式（30）
【０２４３】
AD4-1142は25μMの濃度でEGFRに対するEGFの結合を49.8％阻害する（例えば実施例6参照）。EGFRとの複合体を形成したセツキシマブのタンパク質結晶構造はFergusonらによって報告され（(2005) Cancer Cell 7, 301-311）、その結晶学データはProtein Data BankにPDBコード1YY9（「1YY9.pdb」）として登録されている。
【０２４４】
1YY9タンパク質結晶構造から得られる情報を使ってもう一つのファーマコフォアモデルを設計することにより、AD4-1142が同定された。このモデルを使って、もう一組のEGFR阻害剤を同定した。EGFRタンパク質上の部位が、抗体セツキシマブ（配列番号5および配列番号6）（Erbitux）のアミノ酸残基GLY-54〜ASP-58によって認識される。Pharm23_gly54_asp58は残基GLY-54〜ASP-58を模して作成されたものであり、抗体セツキシマブの特徴およびコンポーネントを持つ小分子を同定するために使用される（例えば実施例4参照）。具体的に述べると、この領域は抗体重鎖のH2 CDRと定義される。セツキシマブのこれらのアミノ酸残基の特徴およびコンポーネントを使って、ファーマコフォアモデルPharm23_gly54_asp58を作成した（例えば実施例4参照）。
【０２４５】
ファーマコフォア特徴（F）およびコンポーネントには、F1 Don−Asn56の抗体側鎖NH2から導出。受容体Ser418側鎖OHとH結合を形成；F2 Acc&Ani−抗体セツキシマブのGly54主鎖カルボニルから導出。アクセプターが受容体Arg353のグアニジンからのH結合を受容するか、陰イオンが受容体Arg353のグアニジンへの塩橋を形成する。；F3 Acc2−Arg353のグアニジンに対するF3の指向性；F4 Acc&Ani−受容体Lys 443のNH3+からのH結合を受容するまたは受容体Lys 443のNH3+への塩橋を形成する抗体Asp58側鎖カルボキシレートから導出；F5 Don−受容体Gln384の側鎖カルボニルとH結合を形成する抗体Gly54主鎖NHから導出；F6 Aro−疎水性コンタクト・スタティスティクスから導出，受容体のArg353のグアニジンと有利なクーロン相互作用，必須；およびF7 Aro2−Arg353のグアニジンに対するF6の指向性が含まれる。
【０２４６】
ファーマコフォアにとって、全てのコンポーネントが同時に必須なわけではない。上記7個の特徴およびコンポーネントのうちの5個という部分マッチが許される。セツキシマブのタンパク質結晶構造から得られる残基GLY-54〜ASP-58と重ね合わせたPharm23_gly54_asp58の表示を、例えば図15に示す。
【０２４７】
Pharm23_gly54_asp58を使って市販化合物を検索することにより、AD4-1142が同定された。AD4-1142とEGFRの結合部位のアミノ酸残基とのドッキングの典型的描写を図60〜61に示す。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】A〜Fは、それぞれアテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、ラベタロール、プロプラノロール、およびカルベジロールの化学構造を示す。
【図２】アテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、ラベタロール、プロプラノロール、およびカルベジロールのそれぞれに実質的に組み込まれている共通の化学的バックボーンを表す。
【図３】IgG分子の図である。
【図４】二つのFab抗体フラグメントに結合した二量化VEGFタンパク質のJmol図であり、枠で囲んだ結合領域が拡大されている。
【図５】VEGF二量体のリボンモデルである。
【図６】AおよびBは、VEGFに対して活性を持ちうるリード分子の化学構造である。このリード化合物は、本発明の方法が意図するとおり、VEGFに対して高いアフィニティーを持つ抗体の結合部分に基づいて設計されたものである。
【図７】AおよびBは、血球凝集素に対して活性を持ちうるリード分子の化学構造である。このリード化合物は、本発明の方法が意図するとおり、血球凝集素に対して高いアフィニティーを持つ抗体の結合部分に基づいて設計されたものである。
【図８】アンギオゲニンの分子に結合している、アンギオゲニンに対して高いアフィニティーを持つFabフラグメントのJmol像であり、アンギオゲニン分子とFabフラグメントの結合領域との境界面にある枠で囲った領域が拡大されている。
【図９】AおよびBは、アンギオゲニンに対して活性を持ちうる二つのリード分子の化学構造である。これらのリード分子は、本発明の方法が意図するとおり、アンギオゲニンに対して高いアフィニティーを持つ抗体の二つの密接に関連する結合部分に基づいて設計されたものである。
【図１０】AおよびBは、それぞれ図9Aおよび9Bのリード分子の球棒モデルである。
【図１１】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア1_gly54_asp58を、抗体セツキシマブのgly54_asp58領域に重ね合わせた図。
【図１２】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア11_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図。
【図１３】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア21_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図。
【図１４】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア22_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図。
【図１５】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア23_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図。
【図１６】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア24_gly54_asp58を、抗体セツキシマブの領域gly54_asp58に重ね合わせた図。
【図１７】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア1_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図。
【図１８】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア2_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図。
【図１９】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア3_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図。
【図２０】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア10_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図。
【図２１】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア21_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図。
【図２２】結晶1YY9.pdbから導出されたファーマコフォア22_thr100_glu105を、抗体セツキシマブの領域thr100_glu105に重ね合わせた図。
【図２３】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア1nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図２４】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア2nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図２５】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア3nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図２６】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア4nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図２７】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア6nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図２８】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア7nを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図２９】結晶1CZ8.pdbから導出されたファーマコフォア10bを、抗体セツキシマブの領域tyr101_ser106に重ね合わせた図。
【図３０】結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア1bを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図。
【図３１】結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア2bを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図。
【図３２】結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア2nを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図。
【図３３】結晶1N8Z.pdbから導出されたファーマコフォア3nを、抗体のarg50、tyr92-thr94、gly103に重ね合わせた図。
【図３４】結晶1S78.pdbから導出されたファーマコフォア5nを、抗体の領域asp31_tyr32、asn_52_pro52a_asn53に重ね合わせた図。
【図３５】結晶1S78.pdbから導出されたファーマコフォア6bを、抗体の領域asp31_tyr32、asn_52_pro52a_asn53に重ね合わせた図。
【図３６】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア3hを、 抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図３７】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア4hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図３８】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア5hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図３９】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア6hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図４０】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア7hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図４１】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア8hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図４２】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア9hを、抗体の重鎖tyr50_thr57領域に重ね合わせた図。
【図４３】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア1Lおよび2L（同じ）を、抗体の軽鎖Asn32_Ile33_Gly34、Tyr49_His50_Gly51、Tyr91、Phe94、およびTrp96領域に重ね合わせた図。
【図４４】結晶2EXQ.pdbから導出されたファーマコフォア3Lを、抗体の軽鎖Asn32_Ile33_Gly34、Tyr49_His50_Gly51、Tyr91、Phe94、およびTrp96領域に重ね合わせた図。
【図４５】セツキシマブのタンパク質結晶構造（1YY9.pdb）の残基GLY-54〜ASP-58と重ね合わせたファーマコフォア1_gly54_asp58。EGFRターゲットタンパク質（配列番号1）が占める空間を排除するために体積拘束を使用し、ファーマコフォアクエリー中は、ターゲットタンパク質の原子の位置を占めるように、一群の「ダミー」スフィア（濃い灰色）を配置した。EGFRターゲットタンパク質の表面トポロジーを近似するために、この表現を使用する。
【図４６】EGFRにドッキングした化合物AD4-1025を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図４７】EGFRにドッキングした化合物AD4-1038を、3D棒モデル図（A）または3D接触表面図（B）として表す図。
【図４８】EGFRにドッキングした化合物AD4-1010を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図４９】EGFRにドッキングした化合物AD4-1009を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５０】EGFRにドッキングした化合物AD4-1016を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５１】EGFRにドッキングした化合物AD4-1017を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５２】EGFRにドッキングした化合物AD4-1018を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５３】EGFRにドッキングした化合物AD4-1020を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５４】EGFRにドッキングした化合物AD4-1021を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５５】EGFRにドッキングした化合物AD4-1022を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５６】EGFRにドッキングした化合物AD4-1027を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５７】EGFRにドッキングした化合物AD4-1030を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図５８】EGFRにドッキングした化合物AD4-1132を、3D棒モデル図（A）または3D接触表面図（B）として表す図。
【図５９】EGFRにドッキングした化合物AD4-1132を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図６０】EGFRにドッキングした化合物AD4-1142を、3D棒モデル図（A）または3D接触表面図（B）として表す図。
【図６１】EGFRにドッキングした化合物AD4-1142を、EGFRのアミノ酸残基にアノテーションを付けた2Dモデルとして表す図。
【図１】
2009525274.tif 000100
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月19日(2008.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009525274000001.app
【国際調査報告】
2009525274.tif 000164
2009525274.tif 000165