(57)【要約】本発明は、サラチンの組成物およびその使用の方法を提供する。本発明の1つの局面は、接着、ケロイド、および瘢痕の発生の予防または軽減の方法である。接着、ケロイド、および瘢痕は、形成外科手術もしくは整形外科手術などの外科手術に起因してもよく、または既存の瘢痕であってもよい。本発明の別の局面は、屈筋腱損傷の処置のための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要がある患者に有効量のサラチン(saratin)を投与する段階を含む、白血球媒介性の炎症状態を処置する方法。
【請求項２】
炎症状態が、急性肺疾患、喘息、内毒素血症、敗血症、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、脳脊髄炎、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、滑液包炎、狼瘡、急性播種性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群(APS)、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、糖尿病(1型)、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群(GBS)、橋本病、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群(OMS)、視神経炎、オード甲状腺炎(ord's thyroiditis)、天疱瘡、多発性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血(warm autoimmune hemolytic anemia)、ウェゲナー肉芽腫症、汎発性脱毛症、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、子宮内膜症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、神経性筋緊張病、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、白斑、外陰部痛、虫垂炎、動脈炎、関節炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、外上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、肝炎、汗腺炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、乳房炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、膣炎、脈管炎、および外陰炎からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
処置が、血小板接着、白血球接着、または白血球移動を阻害することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
白血球が、リンパ球、マクロファージ、単球、または多形核白血球である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
その必要がある患者に有効量のサラチンを投与する段階を含む、白血球移動および／または細胞外マトリクスタンパク質への白血球接着を阻害する方法。
【請求項６】
有効量のサラチンが局所薬剤としてまたはインプラント上のコーティングとして投与される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
インプラントが天然または人工のインプラントである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
人工インプラントが医療用デバイスである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
医療用デバイスが、形成外科手術用インプラント、心臓血管インプラント、または整形外科用インプラントである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
医療用デバイスが、心臓弁、ステント、移植片(graft)、カテーテル、脊椎板(spinal disk)、ロッド、ネジ、プレート、軟骨、または接着バリアである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
天然インプラントが、器官、組織、または細胞インプラントである、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
天然インプラントが血管移植片である、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
細胞外マトリクスタンパク質が、コラーゲン、アルブミン、エラスチン、またはフィブロネクチンである、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
その必要がある患者に有効量のサラチンを投与する段階を含む、外科手術誘発性の合併症を処置する方法。
【請求項１５】
外科手術誘発性の合併症が外科手術誘発性の炎症または外科手術誘発性の接着である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
有効量のサラチンが局所薬剤としてまたはインプラント上のコーティングとして投与される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
インプラントが天然または人工のインプラントである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
人工インプラントが医療用デバイスである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
医療用デバイスが、形成外科手術用インプラント、心臓血管インプラント、または整形外科用インプラントである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
医療用デバイスが、心臓弁、ステント、移植片、カテーテル、脊椎板、ロッド、ネジ、プレート、軟骨、または接着バリアである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
天然インプラントが、器官、組織、または細胞インプラントである、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
天然インプラントが血管移植片である、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
外科手術誘発性の接着が、血小板または白血球の接着を含む、請求項15記載の方法。
【請求項２４】
白血球が、リンパ球、マクロファージ、単球、または多形核白血球である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
外科手術が、整形外科手術、形成外科手術、移植手術、または心臓血管手術である、請求項14記載の方法。
【請求項２６】
外科手術が腱再建手術または心臓手術である、請求項14記載の方法。
【請求項２７】
その必要がある患者に有効量のサラチンを投与する段階を含む、瘢痕および／またはケロイドを処置および／または予防する方法。
【請求項２８】
瘢痕および／またはケロイドが外科手術誘発性であるか、熱傷誘発性であるか、または炎症皮膚疾患に起因する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
瘢痕および／またはケロイドが、形成外科手術、再建手術、および／または移植手術に起因する、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
約0.01mg/mLから約5.0mg/mLのサラチンと、少なくとも1つの治療的に許容される賦形剤とを含む治療用ゲル製剤。
【請求項３１】
少なくとも1つの色素をさらに含む、請求項30記載の製剤。
【請求項３２】
サラチンを含むコーティングと、インプラントとを含むデバイス。
【請求項３３】
インプラントが心臓血管インプラントである、請求項32記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2005年9月28日に提出した米国特許仮出願第60/721,754号に関係し、その優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
損傷への反応は、組織統合性の修復のための生得の宿主免疫反応である。創傷治癒は、外傷、外科手術、微生物、または異物のいずれによって開始されようと、凝血、炎症、上皮形成、肉芽組織の形成、マトリクスおよび組織の再構築を含む事象の重複したパターンを経て進行する。修復のプロセスは、大部分において、炎症および治癒を強調する多種多様の細胞活動を刺激するおよび統合するサイトカインを含む分子シグナルと相互作用することによって媒介される。
【０００３】
最初の損傷は、凝血および急性局所性炎症反応を誘発し、その後間葉細胞の動員、増殖、およびマトリクス合成が続く。炎症を消散させることができないと慢性治癒不全創につながり得るが、無制御なマトリクスの蓄積は、しばしば異常なサイトカイン経路を伴い、過剰な瘢痕化および線維性続発症につながる。
【０００４】
ほとんどの型の損傷は血管を破損し、凝血は止血を開始する反応であって宿主を過剰な血液損失から保護する。脈管壁の損傷は血流成分に対しコラーゲンを露出する。コラーゲンは血栓形成性表面成分であって、血小板の接着、凝集のための、および、この領域へのさらなる血小板の動員を導いて(Ruggeri, Z. M. et al.; Seminars in Hematology, 1994, 31, 229-39(非特許文献1))凝集物または血栓を形成させる血小板顆粒の放出のための刺激物質であることが示されている。血小板の脈管表面への最初の接触は、コラーゲンを結合したフォンウィルブランド因子(vWF)および血小板上の特異的vWF受容体である糖タンパク質Ib-V-IX複合体によって媒介される。この可逆性の接着は、血小板が破損領域の上を転がることを可能にし、次にコラーゲン受容体(α(2)β(1)、GPVI)によって媒介される堅固な接着が続き、さらに血小板活性化がもたらされる。これは、血小板α(IIb)β3受容体のコンフォメーション活性化(conformational activation)、フィブリノゲン結合、および、最終的には血小板凝集につながる。加えて、ADP、エピネフリン、および循環する凝固因子は、血小板のさらなる活性化プロセスを駆動し、一方で同時に、トロンビン活性の増加は、架橋フィブリン凝塊の形成に寄与する。血小板-血小板凝集はこのプロセスを支え、そして糖タンパク質IIb/IIIa受容体を介して細胞を架橋するメディエータとしてのフィブリノゲンによって駆動される。
【０００５】
この正常な生理的反応は、硬化性病変の露出したコラーゲンに血小板が付着する病的プロセスの過程において役割を果たし(Van der Rest M. et al.; FASEB Journal, 1991, 5, 2814-23(非特許文献2))、閉塞を発達させ始める。閉塞の位置および範囲次第で、心筋梗塞、脳卒中、炎症、または肺塞栓症などの合併症はこのプロセスの結果である可能性がある。
【０００６】
直接的に作用する抗血栓剤として、トロンビン活性を阻止することによりフィブリンに富んだ血栓の形成を防ぐヘパリンが、現在のところ抗血栓性介入において使用されている。ヘパリンは、不安定狭心症および急性心筋梗塞などの適応症において使用される。しかしながら、静脈内適用、コファクターとして抗トロンビン-IIIを要求すること、凝塊結合トロンビンに対する低下した親和性、いくつかの血漿タンパク質によるその不活性化、血小板減少症の時折の誘発、およびその生物学的不均質性などの、ヘパリンのいくつかの欠点は、依然として解決していない。
【０００７】
最近の低分子量ヘパリンの開発は、皮下適用向けのバージョンをもたらしたが、標準的なヘパリンを超える治療上の利益はささやかであった。残念なことに、ヒルジン、ヒルログ(hirulog)、およびワルファリンなどの、その他の直接的に作用する抗トロンビンにも同じことがあてはまる。問題のひとつは、抗血栓処置下におけるトロンビンの産生増加に関係すると思われる(Rao, A. K et al., Circulation, 1996, 94, 389-2395(非特許文献3))。
【０００８】
その他の最近の戦略は、それ故に、第Xa因子によって駆動されるプロトロンビン活性化のプロセスを重点的に取り扱ってきた。課題は、この因子を指向する適切な阻害剤の設計である。
【０００９】
別の治療の一団は、血栓溶解レジメンによって代表され、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびアニソイル結合プラスミノーゲン(anisoylated-plasminogen)-ストレプトキナーゼ活性化因子複合体の開発について重点的に取り扱ってきた。再灌流を誘発するのに必要な時間の違いはこれらの抗血栓剤の各々により異なるが、全体の死亡率を減少させるという意味での寄与は全ての製品に関して等しい。加えて、再閉塞および／または長期の出血は、合併症の一部である。これは、これらの化合物のフィブリンに対する比較的低い特異性および短い血漿半減期に起因するかもしれない。
【００１０】
合併症は人工表面が血液に触れたときに起こる。この場合は、血小板の活性化および／または凝血の誘発により、血栓性事象の誘発が増加する傾向がある。これらの影響は、血管移植片、心臓弁、ステント、カテーテル、または任意のその他の血液接触性のデバイスまたは材料の不良を引き起こすことがある。本明細書に開示されているタンパク質は、非血栓形成性表面を作製する能力があり、それ故に、上に記載した材料およびデバイスにこのタンパク質を不動化させることによってさらに有利に利用することができる。そのような処置は、そのような材料またはデバイスに生体適合性および血栓抵抗性を与える。
【００１１】
血小板の接着、活性化、ならびにそれに続く血栓症および内膜肥厚化を制御する試みにおいて現在のところ用いられている2つの系統の療法は、抗血小板剤および抗血栓剤の投与である。アスピリンなどの薬物は、シクロオキシゲナーゼ経路の阻害を介してトロンボキサンA2の合成を有効に阻止するが、それらは、内膜肥厚化の発達を刺激するコラーゲン誘発性の血小板の接着および活性化を防止しない。ヘパリンの抗血栓剤としての使用は、合併症と、予測不能な用量反応性、密接した検査モニタリングの必要性、凝塊結合トロンビンに対する限定された活性、複数の阻害部位、抗トロンビンIII依存性、出血のリスク、および連続的な輸液の必要性を含む制限とに関連する。明らかに、理想的な治療剤は、全身性の分布または広汎性の凝固障害を伴わずに、部位特異的で局部的な効果をもたらすようなものであろう。
【００１２】
入手可能な抗血栓剤に関連した制限に起因して、新しい代替的な戦略および治療に対する現実の必要性が存在する。それ故に、血小板接着の病理生理学における事象を阻害するための新しくそして改善された療法および方法の必要性は明白であり、この技術分野における貢献によって血管形成手技または外科的手技と関連する罹患率および死亡率が減少することが期待される。
【００１３】
【非特許文献１】Ruggeri, Z. M. et al.; Seminars in Hematology, 1994, 31, 229-39
【非特許文献２】Van der Rest M. et al.; FASEB Journal, 1991, 5, 2814-23
【非特許文献３】Rao, A. K et al., Circulation, 1996, 94, 389-2395
【００１４】
参照による組み入れ
本明細書において言及されている全ての出版物および特許出願は、各々の個別の出版物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられると指摘されるかのように、参照により同じ程度に本明細書に組み入れられる。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明の第1の局面は、その必要がある患者に有効量のサラチン(saratin)を投与することによる、白血球媒介性の炎症状態を処置するための方法に関する。1つの態様において、サラチンは、リンパ球、単球、マクロファージ、または多形核白血球などの白血球の接着または細胞移動を阻害する。さらに別の態様において、サラチンは血小板媒介性の炎症の処置のために用いられる。
【００１６】
本発明の別の局面は、細胞移動および／または細胞外マトリクスタンパク質への細胞接着を阻害するための方法に向けられている。1つの態様において、サラチンは細胞が炎症細胞の細胞外マトリクスタンパク質に接着するのを防ぐ。別の態様において、細胞外マトリクスタンパク質は、コラーゲン、アルブミン、エラスチン、またはフィブロネクチンである。
【００１７】
加えて、本発明は外科手術誘発性の合併症をサラチンで処置するための方法に向けられている。外科手術誘発性の合併症は、典型的には外科手術誘発性の炎症と関連する。1つの態様においては、外科手術誘発性の炎症を処置するために、有効量のサラチンが患者に投与される。外科手術誘発性の合併症は外科手術誘発性の接着である可能性もある。別の態様においては、外科手術誘発性の接着を処置するために、有効量のサラチンが患者に投与される。1つの態様において、サラチンは血小板および／または白血球の外科手術誘発性の接着を防ぐ。1つの態様において、サラチンはリンパ球、単球、マクロファージまたは多形核白血球の外科手術誘発性の接着を防ぐ。1つの態様において、サラチンは整形外科または形成外科手術によって誘発された外科手術誘発性の合併症の処置のために用いられる。1つの態様において、サラチンは外科手術によって引き起こされた損傷などの損傷の部位への細胞移動の阻害のために用いられる。
【００１８】
有効量のサラチンは、局所薬剤として、またはインプラントのためのコーティングとして投与されうる。インプラントは天然または人工のインプラントでありうる。人工インプラントは、形成外科手術用インプラント、心臓血管インプラント、または整形外科用インプラントなどの医療用デバイスでありうる。1つの態様において、医療用デバイスは、心臓弁、移植片(graft)、ステント、カテーテル、脊椎板(spinal disk)、ロッド、ネジ、プレート、軟骨、または接着バリアでありうる。天然インプラントは、器官、組織、組織移植片、または細胞インプラントでありうる。1つの態様において、天然インプラントは血管移植片である。好ましくは、サラチンは、局所薬剤として外科手術の部位に適用される。
【００１９】
1つの態様において、サラチンは、移植片、移植体(transplant)、またはデバイスに、移植の前にコーティングするために用いられる。別の態様において、サラチンは、移植片、移植体、またはデバイスに、移植の後に適用される。別の態様において、サラチンは、外科的損傷の部位上に適用される。さらに別の態様において、サラチンは、治癒プロセスの間に瘢痕化を防ぐために傷ついた組織に適用される。組織への損傷は、外科手術、熱傷、または炎症状態に起因するかもしれない。
【００２０】
本発明のさらに別の局面において、サラチンは、瘢痕およびケロイドの形成を予防および／または処置するために用いられる。瘢痕および／またはケロイドは、外科手術誘発性であってもよく、または熱傷もしくは炎症性皮膚疾患に起因していてもよい。1つの態様において、瘢痕および／またはケロイドは、形成外科手術に起因する。1つの態様において、サラチンは、膝、肩、もしくは股関節部の関節切開、あるいは特に膝、股関節部、もしくは肩の置換などの外科用インプラントまたはその他の移植された物による整形外科用デバイスの移植などの外科的手技によってもたらされる瘢痕組織を阻害するために投与される。本発明の別の態様において、サラチンは、瘢痕組織形成を防ぐために、皺の美容上の変化を有する患者の皺に直接的に注入される。
【００２１】
本明細書に記載されている本方法および組成物の特徴および優位性のより良い理解は、説明するための態様を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得ることができる。
【００２２】
発明の詳細な説明
定義および一般的パラメータ
本明細書において使用される場合、以下の単語および句は、それらが用いられている文脈が他の意味を表す範囲を除き、一般的に、以下に示されるような意味を有するように意図される。
【００２３】
「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、以下に定義されているような処置を、そのような処置を必要としている動物対象に投与されたときに、達成するのに十分な、そのサラチンの量を指す。治療的に有効な量は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与のやり方等によって異なると考えられるが、それは当業者によって容易に決定され得る。この用語は、標的細胞における特定の反応、例えば血小板接着および／または細胞移動の減少を誘発すると考えられる用量にもまた適用される。具体的な用量は、選択される特定のサラチン化合物、採用される投薬レジメン、その他の化合物と組み合わせて投与するかどうか、投与のタイミング、投与される組織、および化合物を運ぶ物理的な送達系によって変化すると考えられる。
【００２４】
「処置する」という用語およびその文法上の等価物は、本明細書に用いられる場合、治療上の利益および／または予防的利益を達成することを含む。治療上の利益とは、処置が行われる基礎障害の根絶または改善を意味する。また、治療上の利益は、患者が依然として基礎障害にかかっている可能性があるにもかかわらず患者に改善が観察されるよう、基礎障害と関連する一つまたは複数の生理的症状を根絶または改善することによって達成される。予防的利益のために、特定の疾患を発病するリスクがある患者に、または疾患の一つまたは複数の生理的症状を訴えている患者に、その疾患の診断がなされていない可能性があるにもかかわらず、組成物を投与してもよい。
【００２５】
「治療効果」は、本明細書でその用語が用いられる場合、上に記載されているような治療上の利益および／または予防的利益を包含する。予防的利益には、疾患もしくは状態の出現を遅らせるかもしくは除去すること、疾患もしくは状態の症状の始まりを遅らせるかもしくは除去すること、疾患もしくは状態の進行を遅らせる、中断させる、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００２６】
「治療的に許容される塩」という用語は、当技術分野において周知の様々な有機および無機の対イオンに由来する塩を指し、単なる例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等を含み；かつ、その分子が塩基性の官能性を含む場合は、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸または無機酸の塩を指す。
【００２７】
サラチン
サラチンは、米国特許第6,774,107号および同第6,881,722号に記載されている、薬用のヒルであるヒルド・メディシナリス(Hirudo medicinalis)の唾液から単離された天然に存在するタンパク質である。サラチンは、コラーゲンと結合し、従って血小板のコラーゲンへの自然接着における阻害剤として作用することが示されている。具体的に言えば、サラチンは、vWFがコラーゲンに結合するのを阻止して、亢進した剪断において血小板がコラーゲンに接着するのを有効に防ぐことが示されている。さらに、本明細書の研究に記載されているように、サラチンはケモカイン誘発性の移動を阻害する。
【００２８】
サラチンは配列決定され、H. メディシナリス(H. medicinalis)のcDNAライブラリから遺伝子がクローン化された。サラチンはSEQ ID NO：2の配列に記載されているアミノ酸配列によって特徴づけされ、103個のアミノ酸で構成され、それは約12068ダルトン±1kDaの理論的相対分子量となる。本タンパク質は、その他の以前に記載されている配列と類似性を持たない独特の一次構造を示す。サラチンは、アスパラギン酸およびグルタミン酸に富み、それらはIEF-PAGEで測定したときの分子のpH3.7±0.5の酸性等電点に寄与している。SDS-PAGE解析により、電気泳動前のタンパク質の還元による移動度のシフトが実証され、翻訳後修飾が示された。ポリペプチドの配列決定によって、タンパク質の翻訳後修飾を構成し得る6つのシステイン分子が明らかにされた。サラチンのエレクトロスプレイ質量分析によって、実際の分子量が12061ダルトンであることが明らかにされ、最大3つのジスルフィド結合が、タンパク質の天然形態の二次構造の形成に関与していることが示された。
【００２９】
サラチンは組換え手法などの手技によって産生され得る。本発明において使用するための適した組換えサラチンは、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)で発現し、単離された。組換え体および天然に存在するタンパク質は、コラーゲン依存性血小板接着の強力な阻害剤であり、本明細書に示されるように、細胞移動に必要なマトリクスタンパク質の非特異的阻害剤であり、故に、心疾患、循環系の疾患、および炎症状態に関係する様々な状態の治療処置に有用であり得る。さらに、サラチンは、天然または人工のコラーゲン表面を、それらを細胞に関して非接着性にして細胞の活性化を防ぐために、コーティングするのに有用である。
【００３０】
一般的に、本発明は、外科手術に関連した損傷、熱傷、組織移植または自己免疫疾患を含む、組織損傷に対する望ましくない血栓性反応もしくは望ましくない細胞移動を防ぎかつ阻害するための局所薬剤としてまたは表面上の付着コーティングとしてサラチンが局部的に使用されうるような状態下において、例えば脈管構造または器官などの組織の、内腔の内側または上における選ばれた位置の中または上にサラチンを導入することを含む。サラチンはオンサイト(on-site)送達のための様々な治療剤と組み合わせることができる。
【００３１】
様々な治療的介入が、理想的には速やかかつ局部的に処置されることになる局部損傷を誘発することがこれまでに指摘されている。未処置のままであると、損傷した細胞は、凝固、補体活性化、ならびにサイトカインの放出、増殖の誘導、およびその他の生物学的に活性なプロセスに対する細胞の反応に関係した、一連のプロセスを開始する。操作された組織中にサラチンが直接置かれることは、従って本発明の一部の態様における一局面である。局部適用の別の局面は、介入のために使用される薬剤の全身性の影響に関係する潜在的な問題の最小化である。
【００３２】
本発明は、ヒルであるヒルド・メディシナリスから単離された活性ポリペプチドであるサラチンの製剤および使用方法を含む。このタンパク質は、加圧透析ならびに少なくとも1つの疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)のようなクロマトグラフィの工程および／または少なくとも1つの陰イオン交換クロマトグラフィおよび任意で少なくとも1つの逆相高速クロマトグラフィ(RP-HPLC)の工程の組み合わせによって、唾液から単離することができる。
【００３３】
本発明は同様に、このタンパク質について示されているようなアミノ酸配列を有するヒル由来血小板接着阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたDNAに関する。cDNAクローンに相当するヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：1に示されている。ヌクレオチド配列の1〜63位は、推定上21個のアミノ酸のリーダー配列を表し、64〜372位は、103個のアミノ酸残基のポリペプチドおよびSEQ ID NO：2の成熟タンパク質について示されているアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含む。SEQ ID NO：1および2は、図7Aに記載されている。図7Bおよび図7Cは、SEQ ID NO：3〜12を記載する。SEQ ID NO：3〜12は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許6,774,107号に記載されているような、サラチン遺伝子のPCRによる増幅および単離、大腸菌発現ベクターの構築および発現、バキュロドナープラスミドの構築および発現、ならびに、酵母発現ベクターおよび発現に用いられた、プライマーの配列である。
【００３４】
本発明は、本発明のヒル由来の血小板接着阻害剤をコードする合成遺伝子を含む組換えベクター、およびその組換えベクターを含む宿主細胞にもまた関する。発現したタンパク質を回収し単離する方法は、タグ技術に基づくか、または天然に存在するサラチンのために開発された精製スキームから改作される。適切なベクターで形質転換させた酵母細胞、昆虫細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、および大腸菌細胞における細胞外または細胞内の発現のために使用される個別のプロトコール次第で、上清または沈降物から組換えタンパク質を回収する工程は、当業者に知られた手法によって適宜適応させることができる。適切な発現は、宿主としての大腸菌において見出され、そこではpelBリーダー配列の挿入による周辺質の(periplasmatic)発現がもたらされた。大腸菌(Escherichia coli (E. coli))からの産物回収(約5mg/L)は、浸透圧溶菌(osmolysis)および遠心分離後に達成した。代替酵母選定ベクター(alternative yeast adopted vector)を有する出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae))(＞10mg/L 培養ブロス)を、並行した実験において用いた。分泌した材料は遠心分離法により単離した。精製はクロスフロー濾過およびイオン交換クロマトグラフィによって達成した。COS細胞あるいはCHO細胞を用いたその他の発現アプローチにおいて、産物の発現はおよそ約750ng/mLであった。精製した組換え材料は、電気泳動およびクロマトグラフ解析によって純粋および等質であることが証明され、そしてアミノ酸配列決定および分子量決定によって唾液由来のサラチンと同一であることが実証された。サラチンの産生のための手法は、米国特許第6,774,107号に開示されている。例えば、トランスジェニックマウスまたはその他の哺乳動物を含むその他の生物を、サラチンを発現させるために同様に用いることが可能である。
【００３５】
本発明のタンパク質であるサラチンには、断片またはサブユニット、天然に存在する変異体、対立遺伝子変異体、無作為に生成された人工の突然変異体、ならびに活性を保存したアミノ酸付加、反転ペプチド、およびD-アミノ酸を含むペプチドなどの意図的な配列のバリエーションを含む、開示された配列の活性を保存した変異体が含まれる。断片またはサブユニットとは、完全なタンパク質よりも少ないアミノ酸を含む配列の任意の部分、例えば完全なタンパク質のN末端および／またはC末端の部分を除いた部分的配列を意味する。たとえば、本発明のタンパク質は、SDS PAGE解析による単離プロセスの間に観察される10kDaの分子量を持ったサラチンのタンパク質分解断片を含む。本タンパク質は、一つまたは複数の非天然アミノ酸またはペグ化もしくはグリコシル化などのその他の修飾を有する改変形態をもまた含む。例えば、本タンパク質は酵母由来のグリコシル化産物を含む。
【００３６】
本発明は、融合タンパク質または発現ベクター中の複数遺伝子の発現から生じるタンパク質などのハイブリッドタンパク質をさらに包含し、ペプチド結合によって第二のポリペプチドに連結している、開示されているタンパク質の特異的な活性を有するポリペプチドを含みうる。とりわけ本発明のタンパク質のその他の変異体、特に、単離されたタンパク質とは保存的アミノ酸置換によってのみ異なる任意の変異体が含まれる。そのような保存的アミノ酸置換は、例えば、Taylor et al., J. Mol. Biol, 1986, 188, 233において定義されている。
【００３７】
血小板のvWF依存性結合
本発明は、傷害の後の血小板の接着および蓄積を減少させる、サラチンと呼ばれているポリペプチドの効果に関する。本発明は、さらに、コラーゲンへの血小板のvWF依存性結合の阻害、および血栓症の阻害剤としてのサラチンの医学的使用にもまた関し、そこでは前記ポリペプチドが局所薬剤として局部的に、または生物学的インプラント(器官、細胞、または組織)などのインプラントおよび医療用デバイスのコーティングとして使用される。
【００３８】
血管を含む損傷した組織への血球の接着、特に血小板の接着は、外科的手技において既知の現象である。そのような損傷は、遮断したチャネル、導管、およびその他の内腔を再び開くため、疾患の組織を取り去るため、ならびに代替組織、医療用デバイス、またはそれらの要素を移植するために開発されている、様々な外科的および経皮的療法の間に生じうる。
【００３９】
機械的に誘発された外傷、外科的介入、ステント留置、移植片の留置に対する組織の細胞反応および分子反応は、外傷が生じるとともに生じる炎症、平滑筋細胞移動、増殖、および筋線維芽細胞形質転換の相互作用である(Futura; 1997. p289-317)。介入は、局部の脱内皮化(de-endothelialisation)ならびにコラーゲンおよびエラスチンなどの基底を成す細胞外マトリクス成分の露出を伴うある程度の追加的な損傷をもまた引き起こしうる。一部の患者において、血小板およびフィブリノゲンの動員は、次に急性血栓性閉塞をもたらし得る。
【００４０】
損傷した血管壁への血小板の付着は、内皮細胞から放出されて血漿中を循環し、第VIII因子の担体タンパク質として機能する多量体の糖タンパク質である、フォンウィルブランド因子(vWF)によって、まず第一に媒介される(Annu. Rev. Biochem. 1998; 67:395-424)。同様に循環する高度に多量体形成したvWFは血小板のα顆粒中に含まれ、血小板活性化に続いてそこから放出される(Annu. Rev. Biochem. 1998; 67:395-424)。動脈内においてじゅく状斑または機械的介入の部位で遭遇するような、亢進した剪断の条件下では、vWFはそのA3ドメインを介して、表面に露出されたコラーゲン線維に結合することができる(Biochemistry 1986; 25(26):8357-8361、Blood 1987; 70(5):1577-1583、J. Biol. Chem. 1987; 262(28):13835-13841)。コラーゲン結合vWFは、今度は次に、血小板GPIb/IX/Vと相互作用するvWF-A1ドメインにおけるエピトープの剪断依存性露出を介して、血小板を「繋留」する(Blood 1985; 65(l):85-90、Blood 1985; 65(4):823-831、Br. J. Haematol 1986; 63(4):681-691)。このように、vWFはコラーゲンと血小板との間の架橋として働き、それは出血下における血小板のコラーゲンへの接着に必須である(J. Lab. Clin. Med. 1974; 83(2):296-300)。しかしながら、vWFの上を血小板が転がることは、結局弱い接着に終わり、持続性の血小板の接着、活性化、および凝集を促進するためには、コラーゲンと血小板表面上のその他の受容体との間の追加的な直接的相互作用が必要とされる(Thromb. Haemost 1997; 78(1):434-438、Thromb. Haemost 1997; 78(1):439-444)。血小板上の直接的コラーゲン受容体には、GP VI(Blood 1987; 69(6): 1712-1720、 Thromb. Haemost 1999; 81(5):782-792、J.Clin. Invest. 1989; 84(5):1440-1445)、GP Ia/IIa (α2／β1) (J.Clin. Invest. 1989; 84(5):1440-1445、Nature 1985; 318(6045):470-472)、および、より少ない程度に、GP IV (CD36) (J. Biol. Chem. 1989; 264(13):7576-7583) ならびに、おそらくp65 (J. Clin. Invest. 1997; 100(3):514-521)さえもが含まれる。vWFに補助された血小板結合が欠如した状態では、これらの受容体の、流血状態下におけるコラーゲンへの血小板動員の媒介が弱いことが証明されている(Br. J. Haematol 1986; 63(4):681-691)。最後に、vWFは、フィブリノゲンとの組み合わせで、血小板GP IIb/IIIaへの結合を経た血小板の架橋およびさらなる活性化を促進し(J. Clin. Invest. 2000; 105(6):783-791)、成長中の血栓に安定性および強度を与える。
【００４１】
血小板GP IIb/IIIaおよびADP受容体アンタゴニストの出現により、近年、抗凝集療法における大股の前進がなされた(Coronary Art Dis 1999; 10(8):553-560、 J. Am. Coll. Surg. 2000; 191(l):76-92)。しかしながら、これらの戦略は、露出されたコラーゲン線維への血小板の最初の接着を阻害するようには設計されておらず、血小板-血小板相互作用を弱めるGP IIb/IIIaアンタゴニストの有効性にもかかわらず、血小板は依然として損傷した脈管壁に付着する(Blood 1993; 81(5):1263-1276、Circulation 1995; 91(5):1354-1362)。さらに、血小板活性化は、ほとんど必ず凝集を超えて拡大し、急性血栓症、亜急性および慢性の内膜肥厚化の進展は、血小板の活性化によって放出される血小板由来増殖因子(PDGF)などのマイトジェンメディエータによって少なくとも部分的に影響を受ける。実際、PDGFの阻害は、様々な動物種において、内膜肥厚化を減ずることが実証されている(Science 1991; 253(5024):1129-1132、Circulation 1999; 99(25):3292-3299)。
【００４２】
いくつかのヒル由来物質は、コラーゲン-血小板相互作用を阻害することが報告されている(Blood 1995; 85(3):705-711、Platelets 2000; 11(2):83-86、 J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6893-6898、J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6899-6904、 Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1):179-184)。ヒルド・メディシナリスから単離された、フィブリンを解重合する活性を持ったイソペプチダーゼ(isopeptidase)である、デスタビラーゼ(destabilase)は、コラーゲンを含む様々なアゴニストによって誘発された血小板凝集を阻害することが報告されているが、血小板膜に直接結合すると考えられている(Platelets 2000; 11(2):83-86)。ヘメンテリア・オフィシナリス(Haementeria officinalis)の唾液由来の〜13 kDaのタンパク質である、ヒル抗血小板タンパク質(LAPP)は、静的状態(J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6899-6904、 Thromb. Haemost 1999, 82(3):1160-1163)および高まった出血(Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 1995, 15(9): 1424-1431)の下におけるコラーゲンへの血小板接着を、vWF媒介性および血小板GP Ia/IIa媒介性のコラーゲン結合の両方に対する効果によって、阻害する(Thromb. Haemost 1999, 82(3):1160-1163)。カリン(calin)は、それに関して同様のプロファイルが明らかになっている、ヒルド・メディシナリス由来の〜65 kDaのタンパク質である。カリンもまた、静的および出血状態の両方の下において、コラーゲン-血小板相互作用を阻害する(Blood 1995; 85(3):705-711, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1):179-184, Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163)。さらに、LAPPおよびカリンの両者は、コラーゲン誘発性の血小板凝集の阻害剤であり、コラーゲンへのvWF結合を阻止する濃度と類似の濃度において凝集を阻害する(J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6893-6898、Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1):179-184、Blood 1995, 85(3):712-719)。
【００４３】
炎症
本発明は、サラチンの炎症に対する効果にもまた関する。本発明は、さらに、細胞移動の阻害、およびまたサラチンの炎症阻害剤としての医学的使用に関し、その場合、該ポリペプチドは局所薬剤として局部的に、または器官、細胞、もしくは組織などの生物的インプラントおよび医療用デバイスのためのコーティングとして用いられる。
【００４４】
炎症は、感染または刺激に対する免疫系の最初の反応であり、生来のカスケードと呼ばれうる。炎症は、(i)細胞性、および(ii)滲出性の2つの要素を有する。
【００４５】
滲出性の要素は、液体の動きを伴い、通常、フィブリンおよび免疫グロブリンなどの多数の重要なタンパク質を含む。血管は、感染の上流において拡張し、下流において収縮する一方、冒された組織への毛細血管の透過性が増加し、組織内への血漿の正味の損失をもたらし、水腫または腫脹を生じる。
【００４６】
細胞性の要素は、血管から炎症性組織内への白血球の動きを伴う。白血球(white blood cells)、すなわち白血球(leukocytes)が、炎症における役割を担う；それらは毛細血管から組織内へ溢出し、食細胞として作用し、細菌および細胞残屑を捕捉する。例えば、いかなる理論にも限定されることなく、炎症性組織に動員されたリンパ球および単球ならびにまたマクロファージは、ケモカインを放出し、それはさらに多形核白血球を動員する。白血球はまた、感染を囲み込み(wall-off)、その広がりを防ぐことによって補助を行うことができる。
【００４７】
細胞移動は、細胞がL-セレクチン結合を介して内皮の表面上に繋留し始めたときに生じる。次に、細胞の表面に存在するLFA-1などの接着分子の、内皮細胞上に存在するそれらのリガンド分子(例えばVCAMおよびICAM)への相互作用によって補助されて、堅固な接着が起こる。このプロセスは、この相互作用の親和性を制御するケモカインによって増強される。この移行が起こった後、段階には、細胞の陥入および細胞外マトリクスタンパク質(ECM)へのそれらの結合が必要とされる。最終的には、細胞はケモカインの濃度勾配に向かって移動し始める。それ故に、細胞のECMへの結合は、炎症部位に向けたそれらの移動において役割を果たす。本明細書に記載された研究において、単球およびTリンパ球の、ケモカインの濃度勾配に向かって移動する能力が検討されている。しかしながら、最初に細胞は、それらの移動に先んじて、ECMに結合しなければならない。
【００４８】
好ましくは、サラチンは、外科手術の間、血管内の表面に適用されるように設計され、そこでサラチンは露出されたコラーゲンをコーティングし、血小板の、動脈壁コラーゲンへのvWF依存性のα2β1インテグリン結合を阻害する。破損した脈管への血小板の接着を防ぐ場面において、サラチンは血小板の凝集および活性化を伴う一連の事象における最初の段階を阻止し、それによって、血管外科手技および血管内手技の範囲において生じる、その後の血栓形成および内膜肥厚化を防ぐことができる。サラチンのコラーゲンに対する特異性は、本明細書に記載の研究における検討事項であった。加えて、細胞のインビボの蓄積、および炎症の間の炎症誘発性サイトカインおよび炎症性サイトカインの分泌に対するサラチンの有効性が検討された。
【００４９】
この目的のために、走化性のために用いられたフィルターは、ECM、すなわちIV型コラーゲン、ウシ血清アルブミン(BSA)、およびフィブロネクチンによって、1mg/mLでコーティングされた。その結果は、インビトロのBoydenチャンバーアッセイによって求めたところによると、サラチンが、MCP-Iに向かうヒト単球の、またはMIP-1αに向かうTリンパ球の走化性を阻害することを示す(図1〜4を参照のこと)。インビトロの走化性は、インビボの細胞移動を検討するための必須条件である。フィルターを0.01または1mg/mLのECMでコーティングしたとき、単球およびTリンパ球のMCP-1およびMIP-1αに対するインビトロの走化性の、サラチンによる阻害が実証された(図1〜4を参照のこと)。IV型コラーゲンでコーティングしたフィルターを通って細胞が移動するときに阻害が最も顕著であったが、フィルターをBSAまたはフィブロネクチンなどの別の細胞外マトリクスタンパク質でコーティングしたときも阻害が観察された。表1は、図1〜4において行われた実験に関するIC50の結果を要約している。1mg/mLの基質上に置いたときの、どちらかの細胞型を阻害する強さの順位は、コラーゲン＞フィブロネクチン＞BSAであった。細胞は、動いたり移動するためにECMタンパク質を区別して使用する傾向があり、従って、いかなる理論にも限定されることなく、サラチンで観察された阻害濃度(IC50)における違いは、サラチンの相互作用がマトリクス上であり、そのようにすることでサラチンが炎症細胞とマトリクスの相互作用を防ぐこと、そしてサラチンが炎症細胞それ自体とは相互作用を有さないことを示唆しうる。これらの結果は、コラーゲンが用いられた場合のみならず、その他のECMタンパク質が用いられた場合にも、サラチンがその阻害効果を発揮することを示す。いかなる理論にも限定されることなく、サラチンがいくつものタンパク質に無差別に結合するかもしれないということは真実味がある。露出したコラーゲン上における血小板のα2β1インテグリン結合部位を阻止するサラチンの既知の効果に起因して、その他のマトリクスタンパク質上のその他のインテグリン認識部位が同様に影響を受ける可能性があることが想定される。
【００５０】
（表１）図1〜4のIC50の結果のまとめ
2009510105.tif 000002
【００５１】
サラチンがインビトロで単球およびTリンパ球の走化性を阻害する能力に加えて、この化合物がインビボの細胞の移動に影響を及ぼすかどうかを検討した。この理由で、炎症反応は、炎症性サイトカインMCP-1を注射するマウスにおいて空気嚢を作製することによって模倣された。このサイトカインは、単球を動員することが知られており、それはこれらの細胞がMCP-1の受容体であるCCR2を発現するためである(Expert Opin. Ther. Targets 7:35 (2003))。結果は、MCP-1がマウスの空気嚢内への細胞の移動を誘発したことを示し、サラチンはこの空気嚢モデルにおいて、MCP-1に向かうインビボの細胞移動を阻害した(図5)。空気嚢内へ動員された細胞型は検討しなかったが、発明者らは、浸潤細胞の数をカウントする前のほんの2時間の間、単球特異的なケモカインであるMCP-1を使用したことから、ほとんどの細胞が単球系列であると想定した。単球の動員は、通常、様々な炎症誘発性および炎症性のサイトカインおよびケモカインの放出を伴う。本明細書に記載されている研究の結果は、空気嚢内へのMCP-1の投与によって、IL-8、TNF-α、およびIL-1βの蓄積が基線値に比べて増大したことを示すが、これらの増大は統計的有意性に達しなかった(図6)。サラチンの投与は、MCP-1によって誘発された同じサイトカインの蓄積を減少させたが、これらの減少は、この研究に用いられた動物の数におそらく起因して、統計的有意性に達しなかった。
【００５２】
空気嚢におけるFGFの分泌に対するMCP-1の効果は観察されなかった。同様に、未処置のマウスまたはMCP-1を注射したマウスにおいて見出されたFGFのレベルに対するサラチンの効果は実証できなかった。これは、小疱の吸引前に2.5時間しかゆとりのないモデルのタイミングの結果であった可能性がある。サラチンは、MCP-1で刺激した動物において見出されるTGF-βのレベルを減じることができた。このサイトカインは多面性であり、数ある細胞型の中でも、マスト細胞(J. Immunol. 1994, 152:5860)、マウスランゲルハンス細胞(J. Immunol. 174:2778 (2005))、白血球(Gastroenterology. 122:1122 (2002))、破骨細胞(J. Bone Miner. Res. 2001, 16:1237)、ヒト単球および樹状細胞(J. Immunol. 2000, 164:2285)、骨髄間葉細胞(Exp. Cell Res. 1999, 250:485)、好中球(J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 1998, 8:346)、ならびにNK細胞(Int. Immunol. 1993, 5:825)の動員を誘発することが以前に示されている。比較群(刺激あり、サラチンなし)の変動に起因し、発明者らはTGF-βの減少がMCP-1、サラチン、またはその両方に起因するかどうかを確定することができなかった。インサイチューでの細胞移動を阻害するサラチンの能力が、TGF-βのレベルを減じることに起因するかどうかは、現時点では明らかでない。示唆されるように、サラチンは、様々な細胞型の動員において役割を果たすその他のサイトカインおよびケモカインのレベルもまた減じる。これらには、IL-8、TNF-α、およびIL-1βが含まれる。
【００５３】
1つの態様において、サラチンの製剤は、損傷した組織などの炎症部位を含む組織への細胞移動を防ぐ。別の態様において、サラチンの製剤は、損傷した組織などの炎症部位を含む組織へのTリンパ球移動を防ぐ。さらに別の態様において、サラチンの製剤は、損傷した組織などの炎症部位を含む組織への単球移動を防ぐ。さらに別の態様において、サラチンの製剤は、炎症に伴うサイトカインの産生を防ぐ。いかなる理論にも限定されることなく、本明細書に記載されている結果は、サラチンが炎症部位への細胞移動を減少させる能力を有する可能性があり、その結果として組織損傷に対する免疫反応に影響を与えることを示唆する。例えば、炎症部位上のサイトカイン産生を減少させるサラチンの能力は、サラチンがその部位の免疫反応を減じることによって炎症を減少させ得ることを示唆する。
【００５４】
腱の損傷
本発明の1つの局面は、腱の損傷を処置するためのサラチンの使用である。好ましくは、サラチンは外科手術の間または後に、損傷した腱を処置するために適用される。腱は、筋肉をそれらの骨の起点および着点に連結する。腱修復は、局部麻酔(外科手術に隣接した領域が無痛)、局所麻酔(外科手術近辺の局部的な領域および周囲の領域が無痛)、または全身麻酔(患者は意識消失し無痛)を使用して行うことが出来る。損傷した腱の上に切開を作る。腱の破損したまたは引き裂かれた末端部が縫い合わされる。もし腱が激しく傷ついている場合は、腱移植片が必要とされうる(足もしくは趾または体の別の部分由来の腱の一部がしばしば用いられる)。必要であれば、腱は周囲の結合組織に再付着される。その領域は、神経および血管への傷害について調べられ、そして切開は閉じられる。腱修復の目標は、腱裂傷に続いた関節または周囲の組織の正常な機能の復旧にある。腱修復手術のリスクには瘢痕組織の形成が含まれ、それは滑らかな動き、例えば適切な腱の滑走を妨げる。1つの態様において、サラチンは、使用に伴い機能の減退または痛みの増大を引き起こし得る滑走の減退を防ぐために用いられると考えられる。
【００５５】
引き裂かれた、または切断された腱および靱帯(「結合索」または「索」)のための修復手法は、損傷の性質および影響の及んだ特定の索によって大きく変化する。しばしば損傷した索の例には、手の屈筋腱および膝の前十字靭帯(ACL)が含まれる。
【００５６】
切断された長屈筋腱の修復は、典型的には、切断された腱の末端を向かい合わせに縫合することによって達成される。1つの態様において、サラチンは、瘢痕化および／または接着形成を防ぐために、外科手術に続く固定化の間、腱の全長に沿って投与される。損傷した屈筋腱が外科手術で処置されないケースにおいては、サラチンは治癒プロセスの間、瘢痕化を防ぐために用いられる。1つの態様において、サラチンは露出された腱の全長上に適用される。別の態様において、サラチンは縫合が位置する接合点で適用される。
【００５７】
前十字靱帯のケース(大腿骨の下端および脛骨の上端の接続)においては、適用される力に起因するストレスがより重大であり、周囲の組織および骨との相互作用がより少なく、索の可動域がより少なく、そして治癒の傾向は大いに異なる。サラチンは、骨-腱-骨移植片を用いるとき、ACLの再建を促進するために用いられる。サラチンは、上に記載されている手技のうちの任意のものにおいて使用されうる。
【００５８】
関節鏡手術およびその他の外科手術
関節鏡は、遠隔光源およびビデオモニタに取り付けられたカメラが、覆っている皮膚および関節包における小さな門脈切開を介して、解剖学的な関節(例えば、膝、肩など)に挿入される外科的手技である。同様の門脈切開を介して、外科用デバイスが関節内に置かれ、それらの使用は関節鏡視下で誘導される。そのような手技には、例えば、部分半月板切除術および膝における靱帯再建、肩峰形成術および回旋筋腱板挫滅組織切除法、ならびに肘滑膜切除術が含まれる。拡大する外科的適応症および小径の関節鏡の開発の結果として、手首およびくるぶしの関節鏡検査もまた日常的になった。
【００５９】
1つの態様において、サラチンの製剤は、関節鏡手術の間、手術に際して(peri-operatively)適用される。適用には、連続適用、頻繁な間隔での反復適用(例えば、手技内における頻繁な間隔での反復的血管内大量瞬時投与)、および、創傷または手術の部位で実質的に一定の所定の濃度が局部的に維持されるよう、製品もしくは薬剤または手技用の機材の導入を可能にするためなどの短時間の停止を除いて連続している適用が包含される。別の態様において、サラチンは、閉鎖前の、手技の最後における、全ての外科手術的に損傷した組織の浴コート(bathing coat)として用いられる。一部の態様において、サラチンは外科手術の間の反復した洗浄、または閉鎖前の最後の1回洗浄を介して投与される。
【００６０】
関節鏡検査に加えて、サラチンの製剤は、任意のヒトの体腔もしくは通路、手術創、外傷性創傷(例えば、熱傷)に、または任意の手術の／介入性の手技において、局部的に適用されうる。これらの手技には、限定されないが、泌尿器科学的手技、婦人科学的手技、心臓血管および全身脈管の診断および治療的手技、内視鏡的手技、ならびに口腔、歯科、および歯周の手技が含まれる。好ましい態様において、サラチンは、移植されることが意図された移植片およびデバイスと共に用いられる。例えばサラチンは、移植の前に組織移植片または血液非含有デバイスをコーティングするために用いられる。また、サラチンは、移植の後に移植片またはデバイスに、および／または外科的損傷の部位にも適用され得る。
【００６１】
瘢痕／ケロイド形成
本発明の別の局面において、サラチンは、瘢痕およびケロイド形成を防ぎ、および／または処置するために用いられる。1つの態様において、サラチンは、膝、肩、もしくは股関節部の関節切開、あるいは特に膝、股関節部、もしくは肩の置換などの外科用インプラントまたはその他の移植物による整形外科用デバイスの移植などの外科的手技に起因する瘢痕組織を阻害するために投与される。本発明の別の態様において、サラチンは、皺の美容上の変化を有している患者の皺の中に直接注射されるか、または瘢痕組織形成を防ぐために外部から適用される。別の態様において、サラチンは熱傷に起因する瘢痕組織を阻害するために投与される。さらに別の態様において、サラチンは瘢痕およびケロイド形成を防ぐかまたは処置するために、形成外科手術、再建手術の後に用いられる。例えば、サラチンは、頭部または頚部強化手術、より良い美容上の結果のために胸を豊かにまたは小さくすることなどの、選択性外科手術の後で用いられ得る。
【００６２】
本明細書に使用される場合、「瘢痕組織」および「瘢痕組織形成」という用語には、ケロイド症、線維嚢胞性状態、および関節硬直を含む線維症に起因する任意の病理学的状態が含まれる。本用語には、手術後の接着もしくは拘縮、ケロイド、外傷に続いて形成される過形成性もしくは肥大性塊、熱傷、座瘡を含む炎症性反応に由来する陥没瘢痕、皺、湿疹、セルライト形成、腫瘍性線維形成、および、体の局部的な領域での繊維芽細胞増殖および代謝を伴うその他の線維症性状態もまた含まれる。そのような局部的な領域は、本明細書において、部位、位置、または生物学的な組織とも呼ばれうる。それゆえに、瘢痕組織形成の予防および減少のためのサラチンの使用に向けられている本発明の方法は、これらの病理を伴う状態の処置もまた企図している。
【００６３】
さらに別の態様において、手術後の接着は、腹部手術または骨盤手術の後などに、サラチンで処置される。腹膜腔における損傷または炎症は、線維性の滲出液を産生する。結果として、漿膜表面がつながりあう。線維性の滲出液は、線維芽細胞によって吸収されるかまたは浸潤され、持続性の線維性接着を形成しうる。
【００６４】
さらに、サラチンは産科学的、婦人科学的手技の後の炎症および／または接着の処置および／または予防に適する。また、サラチンは胃または腸管手術に起因する一般的な外科手術上の炎症性接着、および形成外科手術における炎症媒介性の瘢痕形成の処置および／または予防に適する。サラチンはケロイド患者および皮膚に高いレベルの色素を持った患者の瘢痕修正に有用である。これは、瘢痕化の懸念に起因して以前には禁忌であった、完全に新しい群の患者に対する形成外科手術を切り開く。サラチンによる炎症の予防は、血管新生をもまた防ぐ可能性があり、影響を受けた領域に残った「休止状態」の癌組織の可能性のある刺激をもまた防ぐ。
【００６５】
心臓血管手技において、サラチンは、心臓弁、たとえばブタ心臓弁などのデバイスのためのコーティングとして有用である。さらに、サラチンは合成のまたは機械的な心臓弁上に、コーティングステントまたは薬剤溶出ステントによる直接的な適用によって、適用することができる。サラチンは、血栓症を防ぐために、留置カテーテルおよびポート上に使用することもできる。
【００６６】
本発明の別の局面において、血小板媒介性の炎症の処置および／または予防に加え、サラチンは、白血球媒介性の炎症の処置および／または予防にもまた用いることができる。作用の1つのメカニズムに限定することを意図するものではないが、露出されたコラーゲン、フィブロネクチン原線維、または細胞マトリクスのその他の構成要素に結合することにより、サラチンは白血球(例えば、好中球、リンパ球、および単球)の認識部位をマスクすることができる。炎症性組織への白血球移動を阻止することによって、サラチンは炎症細胞をさらに動員するケモカインの供給源の1つを防ぐことができる。加えて、サラチンは、損傷した部位への白血球移動を直接阻止し、および／またはその動員を、損傷した部位でのサイトカイン産生を減少させることによって、防ぐことができる。さらに、作用の1つのメカニズムに限定することを意図するものではないが、サラチンは線維芽細胞の移動をも阻害し、こうしてフィブロネクチンネットワーク形成のプロセスを減速させ、瘢痕形成を減少または防止する。
【００６７】
炎症状態
1つの局面において、サラチンは、炎症状態を処置するために使用される。作用のいかなるメカニズムに限定するものでもないが、サラチンは急性炎症の重症度を減少させ、その間に新しい組織を築くことを可能にし、こうして治癒が進行することを可能にする。炎症は、様々な深刻な状態の発生において役割を果たすことがある。炎症は、それによって私たちの体が細菌およびウイルスのような有害な物質から自身を保護する、プロセスである。それは、感染および損傷に対する体の最初の防御であり、そしてそれはしばしば熱、発赤、腫脹、および痛みを伴う。炎症は、身体の種々の場所；関節、器官、または動脈で生じうる。
【００６８】
時々、私たちの免疫系は、感染の当座のリスクが存在しないときでさえ、誤って炎症反応を誘発する。
【００６９】
ケモカインおよびサイトカインの炎症作用における役割は、非常に多くの研究によって実証されている。ケモカイン、例えばIL-8の皮下注射による局部的投与は、好中球浸潤に支配される急性炎症作用をもたらす。より遅延性の単核球浸潤は、MCP-1、ランテス、およびMIP-1αなどのBケモカインに反応して生じる。他方において、中和抗体の処置によるケモカインの抑制が、炎症反応を減じることが示されている。IL-8に対する中和抗体は、再潅流障害に起因する急性炎症反応、内毒素によって誘発された関節炎、内毒素によって引き起こされた皮下炎症、および急性糸球体腎炎を抑制する(J. Leuk. Biol. 1994; 56: 559-564)。抗IL-8はまた、遅延型過敏性反応を減じることが示されている(J.Immunol. 1995; 155: 2141-2157)。MIP-1αに対する抗体は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の重症度を減じる。加えて、マウスにおけるMIP-1α遺伝子遺伝子の欠失は、コクサッキー後に誘発される心筋症の重症度を減じるが、そのようなマウスのインフルエンザ感染に対する抵抗性もまた減少させ(J. Leuk. Biol. 1996; 59: 61-67)、MIP-1αが抗ウイルス宿主防御を促進しうることを暗示する。
【００７０】
ケモカインは、表2に示されているような広範囲の炎症状態において、免疫組織化学的または酵素結合免疫学的検定手法により、局部組織または体液においてそれぞれ検出されている。CNSにおけるMIP-1αおよびMCP-1の産生は、ラット(J Immunol 1993; 150: 2525-2533)およびマウス(J Neuroimmunol 1995; 60:143-150、J Immunol. 1995; 155:5003-5010、FASEB J 1993; 7:592-600)の両方のEAEモデルにおいて、急性臨床性疾患症状の発生と相互に関係づけられてきた。加えて、MIP-1αの発現は、MS患者の脳脊髄液において、その他の神経疾患を持った対照患者と比較して上昇しており、上昇したレベルは増加したCSF白血球数と相互に関係していることが示されている(J. Neurol. Sci. 1995; 129:223-227)。さらに、最近の研究は、MIP-1αが急性疾患の間にEAEの免疫病原性を制御し、MCP-1が疾患の再発期を制御することを示している。この差次的制御は、MIP-1αが主に浸潤マクロファージおよびTリンパ球によって産生され、一方、MCP-1が主にCNS常在性星状細胞によって産生されることに起因すると思われる(ILAR Journal 1999; 40(4))。
【００７１】
炎症状態におけるサイトカインの役割の別の例において、最近の結果は、ランテス、MIP-1α、およびMCP-1が、アレルゲン曝露に応答した喘息において、細胞内輸送を制御する可能性があることを示唆する(Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997; 156 (5), 1377-1383)。 
【００７２】
（表２）病態において検出されるケモカイン
2009510105.tif 000003
【００７３】
一部の態様において、サラチンは炎症状態の処置のために用いられる。例えば、サラチンは脳脊髄炎を処置するために用いることができる。脳脊髄炎は、脳および脊髄の炎症に対する一般的用語であり、多くの障害を記述する：(i)おそらくワクチン接種またはウイルス感染によって誘発された脳および脊髄の脱髄疾患である、急性播種性脳脊髄炎または感染後脳脊髄炎、(ii)ミエリン損失および続発性の軸索破損に起因する減少した神経機能によって特徴づけられる中枢神経系(脳および脊髄)の障害である、多発性硬化症の同義語である、播種性脳脊髄炎、(iii)ウマおよびヒトに感染する潜在的に致命的な蚊媒介性ウイルス疾患である、ウマ脳脊髄炎、(iv)筋肉痛および疲労の症状を持った中枢神経系の炎症を伴う症候群である、筋肉痛性脳脊髄炎；この用語は時々、慢性疲労症候群と区別なく用いられている；および(v)脳炎症の動物モデルである、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)。一部の態様において、サラチンは、髄腔内または硬膜外注射によって、局部的に適用される。
【００７４】
さらに、その他の態様において、サラチンは閉塞性肺疾患の処置のために用いられる。これは完全には可逆性ではない気流制限によって特徴づけられる病態である。気流制限は、通常、進行性でもあり、有害な粒子またはガスに対する肺の異常な炎症反応とも関連している。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、気流閉塞または気流制限によって特徴づけられる一群の気道疾患に対する包括的な用語である。この包括的な用語に含まれる状態は、慢性気管支炎、気腫、および気管支拡張症である。
【００７５】
別の態様において、サラチンは喘息の処置のために用いられる。喘息は、しばしば、環境刺激物質(またはアレルゲン)、冷気、運動、または情動ストレスへの曝露などの一つまたは複数の誘因に反応して、気道が狭窄し、炎症をおこし、そして過剰な量の粘液で満たされる、呼吸系の疾患である。
【００７６】
また、サラチンは、内毒素血症および敗血症の処置のために用いられうる。敗血症は、感染に対する免疫反応に起因する医学的状態である。内毒素血症は、血流に細菌が存在する菌血症によって引き起こされる、血流の敗血症である。敗血症(septicemia)という用語もまた一般的に敗血症(sepsis)を意味するために用いられる。敗血症を引き起こす免疫反応は、広範囲に及ぶ炎症および凝血経路の活性化を引き起こす全身性の炎症反応である。内毒素血症は、血液中における内毒素の存在によって引き起こされ、それが、グラム陰性桿菌に由来する場合は、出血、腎臓の壊死、およびショックを引き起こす可能性がある。
【００７７】
1つの態様において、サラチンは関節リウマチ(RA)の処置のために用いられる。RAは、身体の免疫系の骨関節への攻撃を引き起こす自己免疫障害である。別の態様において、サラチンは、迅速に増殖する皮膚細胞が皮膚上に痒く落屑性の炎症性パッチを産生する皮膚の障害である乾癬の処置のために用いられる。さらに別の態様において、サラチンは接触またはアトピー性皮膚炎の処置のために用いられる。接触皮膚炎は、皮膚の炎症であり、それは皮膚が、その皮膚が感受性かまたはアレルギー性である物質に接触したときに生じる。アレルギー性接触皮膚炎は、刺激原への最初のまたは長期の曝露の後に現れ得る。接触皮膚炎には、刺激性皮膚炎、光毒性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、光アレルギー性皮膚炎、接触蕁麻疹、全身性接触型皮膚炎等が含まれる。刺激性皮膚炎は、皮膚がある物質に感受性であり、あまりに多すぎる物質が皮膚上に使用されたときに生じ得る。アトピー性皮膚炎は、時々湿疹と呼ばれるが、皮膚炎の一種、アトピー性の皮膚疾患である。
【００７８】
加えて、サラチンは座瘡を処置するために使用されうる。
【００７９】
加えて、サラチンは、アテローム性動脈硬化症を含む動脈硬化症の処置のために使用されうる。動脈硬化症は、中型または大型の動脈の任意の硬化を記述する一般的用語である。アテローム性動脈硬化症は、じゅく状斑に具体的に起因する動脈の硬化である。
【００８０】
さらに、サラチンは糸球体腎炎の治療のために使用されうる。糸球体腎炎は、糸球体の炎症によって特徴づけられる、原発性または続発性の自己免疫性腎疾患である。それは、無症候性か、または血尿および／または蛋白尿を示すことがある。多くの認められた型が存在し、急性、亜急性、または慢性糸球体腎炎に分類される。原因は、感染性(細菌性、ウイルス性、または寄生虫性病原体)、自己免疫性、または腫瘍随伴性である。
【００８１】
加えて、サラチンは、滑液包炎、狼瘡、急性播種性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群(APS)、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、糖尿病(1型)、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群(GBS)、橋本病、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群(OMS)、視神経炎、オード甲状腺炎(ord's thyroiditis)、変形性関節症、網膜ぶどう膜炎、天疱瘡、多発性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血(warm autoimmune hemolytic anemia)、ウェゲナー肉芽腫症、汎発性脱毛症、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、子宮内膜症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、神経性筋緊張病、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、白斑、外陰部痛、虫垂炎、動脈炎、関節炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、外上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、肝炎、汗腺炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、乳房炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、膣炎、脈管炎、または外陰炎の処置のために用いられうる。
【００８２】
併用療法
サラチンは、開示された方法において、その他の適切な薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、サラチンは、本明細書に記載されている薬剤と共に使用し得る。血小板接着を防ぐいくつかの阻害剤は、vWFを標的としたモノクローナル抗体である。糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤が、血小板接着を阻害するのに有益な可能性があることが同じように示唆されている。モノクローナル抗体c7E3のようなこれらの阻害剤の一部は、既に臨床的に試験されている一方、KGDおよびRGDF阻害剤のようなその他のものは、まだ研究中である。
【００８３】
コラーゲンに誘導される血小板接着を妨害する新しい化合物をスクリーニングするための供給源は、吸血動物を介して天然に得られる。いくつかの阻害剤は、文献に記載されているように、天然から単離されている：カリンと呼ばれる65kDaのタンパク質は、ヒルド・メディシナリスから単離されており(米国特許第5,587,360号、国際特許出願第92/07005号)(Munro, R. et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184)、16kDa(LAPP)タンパク質は、ヒルであるヘメンテリア・オフィシナリスの唾液腺から単離されている(米国特許第5,324,715号)。両タンパク質は、コラーゲン依存性血小板凝集の静的アッセイにおいて試験されたため、凝集阻害剤として記載されている。
【００８４】
ヒメダニであるオルニトドロス・モウバタ(Ornithodoros moubata)もまた、コラーゲン刺激性の血小板凝集を防ぐ活性のある抗血小板タンパク質(モウバチン(Moubatin))を含んでいる(Waxman, L. et al.; J. Biol. Chem, 1993, 268, 5445-49)。吸血虫からの別の血小板凝集の阻害剤は、Noeske-Jungblut Cらによって、国際特許出願第9309137号に開示されている。50kDaタンパク質がヘビ毒から単離され、19kDaタンパク質が吸血虫であるトリアトマ・パリジペンニス(Triatoma pallidipennis)の唾液から単離された。そのタンパク質は、コラーゲン誘発性の血小板凝集を特異的に阻害する因子を含むことが見出された。パリジピン(pallidipin)と命名された19kDaタンパク質は、血漿におけるコラーゲン媒介性の血小板の凝集を阻害する。Ganらは、エキスタチン(Echistatin)を、フィブリノゲン受容体GP IIa/IIIbに結合する阻害剤として記載している(J. Biol. Chem, 1988, 263, 19827-32)。
【００８５】
冠動脈の適用における使用のための例は、例えばプロスタサイクリンおよびサリチレートなどの抗血栓剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)およびアニソイル結合プラスミノーゲン-ストレプトキナーゼ活性化因子複合体(APSAC)などの血栓溶解剤、例えばアセチルサリチル酸(ASA)およびクロピドグレルなどの抗血小板剤、例えば硝酸塩、カルシウムチャンネル遮断剤などの血管拡張剤、例えばコルヒチン、アルキル化剤、挿入剤、などの抗増殖性剤、インターロイキン、トランスフォーミング増殖因子β、および血小板由来増殖因子の同類物などの増殖調節因子、増殖因子を標的としたモノクローナル抗体、ステロイド性および非ステロイド性両方の抗炎症剤、ならびに、血管の緊張、機能、動脈硬化、および介入後の脈管または器官損傷に対する治癒反応を調節することのできるその他の薬剤である。抗体もまた、本発明によって含まれる組み合わせまたはコーティングに包含することができる。さらに、コーティングは、脈管壁内部に限局的に治療的送達を行うために使用し得る。膨潤可能なポリマー中への活性剤の組み込みにより、活性剤はポリマーの膨潤の際に放出される。
【００８６】
サラチンは、脳脊髄炎、喘息、および本明細書に記載されているその他の疾患などの炎症状態の症状を軽減するために働くその他の薬剤と共に製剤化または投与されうる。これらの薬剤には、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、ナブメトン、トルメチンなどが含まれる。コルチコステロイドは、炎症を減じ、免疫系の活性を抑制するために用いられる。最も一般に処方されるこの型の薬物は、プレドニゾンである。クロロキン(アラレン(Aralen))または硫酸ヒドロキシクロロキン(プラキニル(Plaquenil))もまた狼瘡を持った一部の個体に非常に有用でありうる。それらは、狼瘡の皮膚および関節症状のために最もしばしば処方される。アザチオプリン(イムラン(Imuran))およびシクロホスファミド(サイトキサン(Cytoxan))は、炎症を抑制し、免疫系を抑制する傾向がある。その他の薬剤、例えばメトトレキサートおよびシクロスポリンは、狼瘡の症状を制御するために用いられる。血液が急速に凝固するのを防ぐために、抗凝血剤が使用される。それらは、血小板が固着するのを防ぐ非常に低い用量のアスピリンから、ヘパリン／クマジン(coumadin)にまで及ぶ。
【００８７】
サラチンは、潤滑剤としても知られる、液体または固体の組織バリアと共に製剤化または投与されうる。組織バリアの例には、これらに限定されないが、多糖類、ポリグリカン、セプラフィルム(seprafilm)、インターシード(interceed)およびヒアルロン酸が含まれる。
【００８８】
サラチンと共に投与されうる薬には、吸入によって有用に送達される任意の適当な薬物、例えば、鎮痛薬、例えばコデイン、ジヒドロモルヒネ、エルゴタミン、フェンタニル、またはモルヒネ；狭心症用調製物、例えばジルチアゼム；抗アレルギー薬、例えばクロモグリケート、ケトチフェン、またはネドクロミル；抗感染症薬、例えばセファロスポリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、またはペンタミジン；抗ヒスタミン剤、例えばメタピリレン；抗炎症薬、例えばベクロメタゾン、フルニソリド、ブデソニド、チプレダン(tipredane)、トリアムシノロンアセトニド、またはフルチカゾン；鎮咳薬、例えばノスカピン；気管支拡張薬、例えばエフェドリン、アドレナリン、フェノテロール、フォルモテロール、イソプレナリン、メタプロテレノール、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、ピルブテロール、レプロテロール、リミテロール、サルブタモール、サルメテロール、テルブタリン、イソエタリン、ツロブテロール、オルシプレナリン、または(-)-4-アミノ-3,5-ジクロロ-α-[[[6-[2-(2-ピリジニル)エトキシ]ヘキシル]-アミノ]メチル]ベンゼンメタノール；利尿薬、例えばアミロライド；抗コリン作用薬、例えばイプラトロピウム、アトロピン、またはオキシトロピウム；ホルモン、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、またはプレドニゾロン；キサンチン、例えばアミノフィリン、コリンテオフィリネート、リジンテオフィリネート、またはテオフィリン；ならびに、治療的タンパク質およびペプチド、例えばインスリンまたはグルカゴンが含まれる。適切な場合には、薬の活性および／または能力を最適化するために、塩の形において(例えば、アルカリ金属もしくはアミン塩として、または酸付加塩として)、またはエステル(例えば、低アルキルエステル)として、または溶媒和化合物(例えば、水和物)として、薬が用いられうることは、当業者に明らかであろう。
【００８９】
サラチンは、処置を受ける状態次第で、本明細書に開示された薬剤またはその他の適当な薬剤と組み合わせて使用できる。併用慮法において用いられる場合、サラチンは第2の薬剤と同時に投与されても、または別々に投与されてもよい。この組み合わせ投与には、同じ剤形における2つの薬剤の同時投与、別々の剤形における同時投与、および別々の投与が含まれ得る。すなわち、サラチンおよび上に記載の薬剤のうちの任意のものは、同じ剤形に一緒に製剤化し、同時に投与することができる。または、サラチンおよび上に記載の薬剤のうちの任意のものは、両方の薬剤が別々の製剤に存在する状態において、同時に投与することができる。別の選択肢において、サラチンは、上に記載の薬剤のうちの任意のものに単に続けて投与してもよく、逆もまた同様である。別々に投与するプロトコールにおいて、サラチンおよび上に記載の薬剤のうちの任意のものは、数分離して、数時間離して、または数日離して投与してもよい。
【００９０】
製剤およびコーティング
本明細書に記載されているサラチン化合物は、通常、治療組成物の形で投与される。本発明のサラチン化合物は、ヒトへの投与に適した治療組成物中に組み込むことができる。本発明は、それゆえに、活性成分として、一つまたは複数のサラチン化合物もしくは本明細書に記載されているような改変体、またはその治療的に許容される塩および／または配位複合体、ならびに一つまたは複数の治療的に許容される賦形剤、不活性な固体希釈剤および充填剤を含む担体、滅菌水溶液および様々な有機溶媒を含む希釈剤、浸透促進剤、可溶化剤、および佐剤を含有する治療組成物を提供する。そのような組成物は、当技術分野における周知の方法で調製される。
【００９１】
本発明によるサラチンポリペプチドは、任意の無毒性の有機酸または無機酸とともに、治療的に許容される塩を形成することができる。無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの金属塩である。有機酸の例には、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、およびメタンスルホン酸のようなスルホン酸などの、モノ、ジ、およびトリカルボン酸がある。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩には、任意の適した無機塩基または有機塩基によって形成された無毒性カルボン酸塩が含まれる。これらの塩には、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むIIIA群の軽金属、ならびに、トリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、1-エテンアミン(ethenamine)、N,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、およびN-アルキルピペリジンを含むトリアルキルアミンなどの有機一級、二級、および三級アミンが含まれる。
【００９２】
本発明によるサラチンポリペプチドは、共有結合性に修飾されていてもよい。これらの共有結合性修飾は、例えば、本明細書に記載されている治療組成物中で、または投与後インビボで、本発明のサラチンポリペプチドを安定化するのに有用である。共有結合性修飾の1つの型は、本発明のペプチドを、様々な非タンパク質性のポリマー、たとえばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの1つと、当技術分野における公知の方法で連結させることを含む。
【００９３】
その他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N末端アミンのアセチル化、ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。別の型の修飾には、チロシン残基のアミノチロシンへの転換またはリジン残基中へのカルボキシル基の付加による、ペプチドの表面領域の人工的親水化が含まれる。その他の修飾には、サラチンペプチド-オリゴアミン複合体の形成が含まれる。本発明のペプチドの別の型の共有結合性修飾には、グリコシル化部位の付加が含まれる。本明細書に記載されている修飾を行うための方法は、当技術分野において周知である。
【００９４】
本発明の治療組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、これらに限定されないが、経口、口腔、静脈内、非経口、吸入、直腸、皮内、皮下、経粘膜、経皮、経肺、関節内、気管内、筋肉内、胸骨内、経鼻、または局所投与が含まれる。局所投与は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスなどの経皮的投与の使用を伴うことがある。本発明は、局部送達デバイス／カテーテルによる、または、ステントおよびステントコーティングならびに血管移植片および移植片コーティング技術による、本発明のサラチンペプチドの使用をさらに提供する。
【００９５】
投与経路は、投与される化合物、処置される患者および疾患の状態に基づいて選択されると考えられる。化合物は、疾患の重症度または治療的介入の型に応じて異なる経路を介して投与されてもよく、例えば、緊急の状況では静脈内投与が必要とされる可能性があり、急性だが重篤でない状況では経口的に投与される可能性があり、一方、外科的手技後の処置では、ステントまたはカテーテルをベースとしたデバイスによって投与され得る。
【００９６】
治療組成物は、活性化合物を治療的に用いることのできる調製物に加工するのを容易にする賦形剤および助剤を含む一つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いて、従来のやり方において製剤化されうる。適切な製剤は、選択される投与経路および標準的な治療の実践次第である。本明細書において使用される場合、「治療的に許容される担体」という用語は、活性化合物と、または患者と悪い方向に反応しない、不活性な、無毒な、固体または液体の充填剤、希釈剤、または被包材料を意味する。滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖液、糖溶液、エタノール、グリコール、ならびに、例えば落花生油、ダイズ油、鉱物油などの、石油、動物、野菜、または合成起源のものを含む油などの、適当な液体担体は、当技術分野において周知である。
【００９７】
本発明のサラチンペプチドは、それらが治療的に製剤化される一環として、その他の薬剤とともに複合されうる。治療組成物は、従来の手段によって、結合剤(例えば、アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン(ポビドン(Povidone))、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、デンプン、およびエチルセルロース)；充填剤(例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、乳糖、アカシア、ショ糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、またはアルギン酸)；潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン溶液、タルク、蝋、油、およびコロイドシリカ)；および崩壊薬(例えば、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、グリコール酸デンプンナトリウム(sodium starch glycolate)、およびアルギン酸)などの、治療的に許容される賦形剤と共に調製された、例えば錠剤またはカプセルの形をとっていてもよい。水溶性である場合、そのような製剤化された複合体は、次に、適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水またはその他の生理学的に適合性の溶液の中に製剤化されうる。または、結果として生じる複合体が水性溶媒において低い溶解度を有する場合には、TWEEN(商標)などの非イオン性界面活性剤、またはポリエチレングリコールと共に製剤化されうる。従って、化合物およびそれらの生理学的に許容される溶媒和物が、投与のために製剤化されうる。
【００９８】
非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、下記の成分を含み得る：注射のための水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの張度調整ための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入し得る。
【００９９】
注射用使用に適した治療組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散物(dispersion)、および滅菌注射用溶液または分散物の即時的調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適した担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォア(Cremophor)EL.TM.(BASF, Parsippany, ニュージャージー州)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれる。組成物は、好ましくは無菌あり、容易な注射可能性(syringability)が存在する程度に流動性でなければならない。組成物は、適宜、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、例えば細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散物のケースでは求められる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成し得る。多くのケースにおいては、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１００】
滅菌注射用溶液は、活性化合物(例えばサラチン化合物)を、治療上有効なまたは利益のある量において、適切な溶媒中に、上に列挙されている成分の1つまたは組み合わせとともに必要に応じて組み込み、引き続きフィルター滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散物は、滅菌媒体中への活性化合物の組み込みによって調製され、基本的な分散媒および上に列挙されているものから必要とされるその他の成分を含有する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末のケースにおいて、調製の好ましい方法は、活性成分およびそれに加えて任意の付加的な望ましい成分の粉末を、前もって滅菌フィルターをかけたそれらの溶液から取得する、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０１】
本発明は、例えば、局部送達デバイス／カテーテルによる、またはステントおよびステントコーティングならびに血管移植片および移植片コーティング技術による、サラチンおよび誘導体の使用をさらに提供する。本発明は、局部的な領域において長期にわたり制御された量のサラチンを溶出する組成物においてサラチンを投与する方法もまた提供する。
【０１０２】
特に、本発明の1つの態様は、サラチンを局部的に送達するためのカテーテルをベースとしたデバイスの使用に関する。サラチンはまた、カテーテルを用いて体組織中に入れ込んだポリマーマトリクスから、その他の治療剤とともにまたはその他の治療剤は伴わずに適用されうる。本発明の方法において使用されるポリマー材料に関する基本的な要件は、生体適合性、および、特定の適用に適応させ得る薬剤放出性である。
【０１０３】
局部的に制御されたサラチンの放出は、浸透のみ、イオン導入のみ、電気穿孔法のみによって達成されてもよく、または、イオン導入および電気穿孔法の組み合わせを使用して脈管内腔の内側にサラチンを有効に放出および組み込んでもよい。好ましくは、カテーテルは、サラチン単独で、または付加的な処置剤と共に、改善された脈管コーティングを結果として生じさせるよう、選択された脈管スペース中に高濃度の治療剤を維持するように設計された手技を行うことができる。
【０１０４】
本発明は、血管形成術およびステント移植および動脈内膜切除術などの介入性の心臓病学的手技の間および後の、サラチンの局部送達に特に適用可能である。
【０１０５】
好ましい局面において、本発明は、サラチンでコーティングされたインプラントである。インプラントは、サラチンで部分的または完全にコーティングされうる。典型的には、インプラントは、医療用デバイスである。インプラントは、器官、組織、または細胞移植体などの生物学的インプラントもまた含み得る。サラチンは、外科手術の部位にもまた適用されうる。ステントまたはカテーテルをベースとしたデバイスをポリマーを含む組成物で少なくとも部分的にコーティングすることにより、ステントまたはカテーテルをベースとしたデバイスに本発明によるサラチンペプチドが提供されるのは、本発明の態様である。本発明によるポリマーとは、ステントまたはカテーテルをベースとしたデバイスへのサラチンペプチドの付着を容易にし、および／またはサラチンの制御された放出を容易にする任意のものである。ポリマーは、例えば、吸収性または非吸収性のフィルム形成ポリマーでありうる。ポリマーは、望ましい放出の速度または望ましいポリマー安定性の程度に依存して、生物学的安定性(biostable)か、または生物吸収性(bioabsorbable)でありうる。
【０１０６】
用いられうる適した生物吸収性ポリマーには、これらに限定されないが、脂肪族ポリエステル、ポリ(アミノ酸)、コポリ(エーテル-エステル)、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリ(イミノカーボネート)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、ポリ乳酸(PLA)、ポリエチレンオキシド(PEO)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリヒドロキシブチレートバレレート、アミド基を含むポリオキサエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、シリコーン、ヒドロゲル、生体分子、およびそれらの混合物からなる群より選択されるポリマーが含まれる。
【０１０７】
本発明の目的のためのその他の重合体生体分子であって、好ましくはサラチンの標的ではないそれらには、ゼラチン、グリコサミノグリカン、ならびに、キトサン、デンプン、脂肪酸(およびそのエステル)、グルコソ-グリカン(glucoso-glycan)およびヒアルロン酸などの吸収性生体適合性多糖などの、ヒトの体内で酵素的に分解されるかまたはヒトの体内で加水分解的に不安定でありうる天然に存在する材料が含まれる。
【０１０８】
ポリウレタン、シリコーン、ポリ(メト)アクリレート、ポリエステル、ポリアルキルオキシド(ポリエチレンオキシド)、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリビニルピロリドン、ならびに、架橋されたポリビニルピロリドンおよびポリエステルから形成されたもののようなヒドロゲルなどの、比較的低い慢性組織反応を持った、適した生物学的安定性ポリマーもまた用いられうる。その他のポリマーもまた、それらがステントまたはカテーテルをベースとしたデバイス上に溶解、硬化(cure)、または重合され得る場合には、用いられうる。これらには、ポリオレフィン、ポリイソブチレン、およびエチレンαオレフィンコポリマー；アクリルポリマー(メタクリレートを含む)およびコポリマー、ポリ塩化ビニルなどのビニルハライドポリマーおよびコポリマー；ポリビニルメチルエーテルなどのポリビニルエーテル；ポリビニリデンフルオライドおよびポリビニリデンクロライドなどのポリビニリデンハライド；ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン；ポリスチレンなどのポリビニル芳香族；ポリビニルアセテートなどのポリビニルエステル；エチレン-メタクリル酸メチルコポリマー、アクリロニトリル-スチレンコポリマー、ABS樹脂、およびエチレン-酢酸ビニルコポリマーなどの、ビニルモノマー同士およびオレフィンとのコポリマー；ナイロン66およびポリカプロラクタムなどのポリアミド；アルキド樹脂；ポリカーボネート；ポリオキシメチレン；ポリイミド；ポリエーテル；エポキシ樹脂；ポリウレタン；レーヨン；レーヨントリアセテート；セルロース；酢酸セルロース；酢酸酪酸セルロース；セロファン；ニトロセルロース；プロピオン酸セルロース；セルロースエーテル(例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロシキアルキルセルロース)；ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【０１０９】
本発明における使用に適したその他のポリマーは、生物吸収性エラストマー、例えば脂肪族ポリエステルエラストマーである。適切な比率において、脂肪族ポリエステルコポリマーは、エラストマーである。エラストマーは、それらが金属ステントによく付着する傾向があり、著しい変形にも亀裂を生じずに抵抗できるという優位性を示す。
【０１１０】
適したコーティング材料の例には、これらに限定されないが、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースポリマー；酢酸フタル酸ポリビニル、アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、ならびにEUDRAGIT(登録商標)(Roth Pharma, Westerstadt, ドイツ) という商標名のもとで市販されているメタクリル酸樹脂、ゼイン、シェラック、および多糖が含まれる。
【０１１１】
加えて、コーティング材料には、可塑剤、色素、着色剤、流動促進剤、安定剤、孔形成剤および界面活性剤などの従来の担体が含まれうる。
【０１１２】
1つの態様において、コーティングは、ポリエチレンオキシド、アルブミン、親水性ポリメタクリレートおよび親水性ポリウレタンなどのヒドロゲルから作製される。
【０１１３】
抗血栓症および抗再狭窄コーティングは、一般的に、局部的薬剤送達のための貯蔵所としての役目を果たしうる生体適合性のコーティングである。コーティングは主にヒドロゲルをベースとし、様々な型のヒドロゲルを調製して医療用デバイスをコーティングするための方法の特許文献における例としては、国際特許出願第9211896号、国際特許出願第9811828号、国際特許出願第0147572号、欧州特許出願第0887369号、および国際特許出願第0139811号が挙げられる。
【０１１４】
コーティング中に含まれる治療物質の放出プロファイルは、例えばポリマー層の厚さを変えるか、または選択された物理化学的特性(電荷、疎水性、親水性など)を与える特定の重合体コーティングを選択するか、またはコーティングを異なる層として調製することによって、調整することができる。ポリマーの選択および放出速度の最適化のための判断基準は、当業者によって理解される。その他のコーティングは、Fischell(Circulation, 1996, 94:1494-95)、Topolら(Circulation, 1998, 98:1802-20)、およびMcNairら(device Technology, 1996, 16-22)によって記載されている。
【０１１５】
理想的には、サラチン処置は、適切な治療的介入と同時に投与されてよく、それは外科用デバイスのコーティング中へのサラチンの組み込みによって達成されうる。別の局面は、サラチンによる損傷した組織の直接的コーティングを伴う可能性もある。
【０１１６】
加えて、その他の治療剤との組み合わせを含む自由な液体形態などの、標準的なサラチン送達手段が本発明において同様に用いられうる。好ましくは、ポリマー／ヒドロゲルマトリクスが用いられる。医療用デバイス上への、あるいは損傷した組織へのコーティングとしての、サラチンの局部適用に対する一般的な技術的解決法は、例えば、ポリマーまたはヒドロゲルコーティング中へのサラチンの組み込みである。
【０１１７】
ポリマーの組成に関して、「ヒドロゲル」という用語は、本明細書において使用される場合、異なるサイズおよび受容能力の孔または間隙を持ち、かつ特にコーティングまたはコーティングされたデバイスの製造の間に導入されうるゲルマトリクスの電荷または親水性／疎水性の性質に関して様々な物理化学的特性を持った、合成ポリマーを含む。様々な合成エラストマーおよび天然に存在する重合体材料が当業者に知られている。サラチンは、ポリマー産生の間にマトリクスに組み込むか、あるいはコーティングもしくは望ましい形状へのポリマーの成形の後に加えることができる。加えて、多くの異なる重合体材料および製造の方法のうちの多くが、本発明で用いられるポリマーマトリクスを形成するために使用されうる。適したポリマー材料または組み合わせの例には、これらに限定されないが、生体適合性および／または生物分解性のポリマーが含まれる。いくつかのアルキルアルキルアクリレートおよびシアノアクリレートが外科的使用のために検討されてきており、一定のイソブチルシアノアクリレートがとりわけ適することが見出されている。
【０１１８】
典型的なヒドロゲルポリマーは、1つのオレフィン二重結合を有するヒドロキシアルキルアルキルアクリレートの精製したモノエステルを40〜60重量部、1つのオレフィン二重結合を含有するメタクリルモノマーを40〜60重量部、および重合開始剤を0.001〜5重量部含むモノマー混合物から産生されうる。重合は、従来のバルク重合、溶液重合、懸濁重合、または乳化重合の手法によって達成されうる。使用される重合手法は、必要とされるポリマーの容積および産生される最終産物の性質次第である。典型的なヒドロゲル産物は、メタクリルモノマーに対するモノエステルのモル比によって表わされることになり、1：1から2.3：1の範囲、好ましくは1.5：1であり、その場合ポリマーの孔径は90オングストロームより大きい。1つのオレフィン二重結合を有するヒドロキシアルキルアクリレートのモノマーとして、許容される化合物には、これらに限定されないが、メタクリル酸2-ヒドロキシエチル、メタクリル酸グリセリル、メタクリル酸2-ヒドロキシプロピル、メタクリル酸グリシジル、アクリル酸2-ヒドロキシエチル、およびアクリル酸2-ヒドロキシプロピルが含まれる。許容されるメタクリルモノマーは、メタクリル酸、メタクリルアミド5、およびメタクリロニトリルである。重合開始剤は、重合の方法またはポリマーの最終使用目的に依存しうる。例えば、ポリマーが固体として形成される場合は、フリーラジカル開始剤が使用されうる。その型の好ましい開始剤には、2,5-ジメチル-2,5-ビス(2エチルヘキソイルペロキシ)ヘキサン(2,5-Dimethyl-2,5-bis(2ethylhexoylperoxy)hexane)または三級ブチルペロキシピビレート(tertiarybutyl peroxypivilate)などの二官能性ポリエステルが含まれる。または、ポリマーの最終使用目的が、モノマー混合物の形で適用されてインサイチューで重合されるコーティングとしてである場合、開始剤は、UV触媒である2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)またはアゾビスブチロニトリル(AIBN)などのように照射で活性化されうる。開始剤は、特定の重合方法における使用または特定の最終産物のための使用に限定されない。例えば、フリーラジカル開始剤は、コーティングに使用することができ、かつ照射開始剤は、固体物品の形成に使用することができる。実質的に同様の割合のモノエステルおよびメタクリルモノマーに加え、モノマー混合物は、メタクリル酸シクロヘキシル、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、またはジメタクリル酸エチレングリコールなどの、微量の長鎖アルキルアクリレートまたはメタクリレートエステルコモノマーによって増強されうる。そのような追加的なコモノマーは、追加的なポリマー強度が要求される状況に際して、ポリマー架橋を増強する。微量のこれらのコモノマーは、一般的に全体のモノマー混合物の0.1重量%未満である。本発明において使用されるヒドロゲルポリマーは、内在的な作用によって十分に架橋され、結果として生じる物品が追加的な架橋モノマーを必要としないような物品を産生するために、形成されうる。生物分解性のポリマーに関する追加的な例は、ポリ(ラクチド)、ポリグリコライド、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリアクタル(polyactal)、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびこれらのコポリマーならびにポリエチレングリコールである。これらは、重合化の間に、あるいは一定のヒドロゲルのケースにおいては続いての負荷により、増強された局部送達のための薬剤をその中に組み込み得る、コポリマーヒドロゲルまたは架橋ポリマーネットワークの形をとり得る。好ましいマトリクスは、外に向けた自由拡散を制御するために、薬剤の分子的特徴に合わせて作られると考えられる。
【０１１９】
遅延放出および持続放出組成物を調製することができる。遅延放出／持続放出治療組成物は、本発明のサラチンペプチドの徐放を容易にするために、薬剤を許容されるイオン交換樹脂と複合してからそのような複合体をコーティングすることによって、または、1つもしくは複数の徐放薬剤を組成物中に含有させることによって、得ることができる。徐放薬剤の例には、これらに限定されないが、マグネシウム合金、ポリ(グリコール)酸、ポリ(乳酸)、もしくは一般的にグリコール酸および乳酸をベースとしたポリマー、コポリマー、ポリカプロラクトン、および一般的に、ポリヒドロキシアルカノエート ポリ(ヒドロキシアルカノン酸(alcanoic acid))、ポリ(エチレングリコール)、ポリビニルアルコール、ポリ(オルトエステル)、ポリ(酸無水物)、ポリ(カーボネート)、ポリアミド、ポリイミド、ポリイミン、ポリ(イミノカーボネート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリジオキサン、ポリオキシエチレン(ポリエチレンオキサイド)、ポリ(ホスファゼン)、ポリスルホン、脂質、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル(ポリシアノアクリレート)、ポリHEMA、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエーテルケトン、ポリ塩化ビニル、ポリフルオライド、シリコーン、ポリシリケート(生体活性ガラス)、シロキサン(ポリジメチルシロキサン)、ヒドロキシアパタイト、ラクチド-カプロノラクトン(lactide-capronolactone)、天然および非天然ポリアミノ酸、ポリb-アミノエステル、アルブミン、アルジネート、セルロース／セルロースアセテート、キチン／キトサン、コラーゲン、フィブリン／フィブリノゲン、ゼラチン、リグニン、タンパク質をベースとしたポリマー、ポリ(リジン)、ポリ(グルタミン)、ポリ(マロネート)、ポリ(ヒアルロン酸)、ポリ核酸、多糖、ポリ(ヒドロキシアルカノエート)、ポリイソプレノイド、デンプンをベースとしたポリマー、それらのコポリマー、それらの線状の、分枝した、高度に分枝した(hyperbranched)、デンドリマーの、架橋した、官能性をもたせた誘導体、またはアルカリ加水分解した動物性もしくは植物性タンパク質と組み合わせた活性ポリエチレングリコールをベースとしたヒドロゲルが含まれる。
【０１２０】
加えて、即時放出組成物および遅延放出／持続放出組成物の組み合わせが一緒に製剤化されてもよい。
【０１２１】
経口液体調製物は、活性化合物とともに湿潤剤、甘味料、ならびに着色および香味剤を含有する、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、またはエリキシル剤の形であってもよく、または、使用前に水または別の適した媒体と再構成するための乾燥産物として与えられてもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体、および保存剤のような、従来の添加物を含有しうる。水またはその他の水性媒体中に調製される経口投与のための液体製剤は、メチルセルロース、アルジネート、トラガカント、ペクチン、ケルジン(kelgin)、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルアルコールなどの様々な懸濁剤を含んでいてもよい。様々な液体および粉末の製剤は、患者による吸入に向けた従来の方法によって調製することができる。
【０１２２】
経口組成物は、一般に不活性な希釈担体または食用の担体を含む。適した経口組成物は、例えばゼラチンカプセルに封入されていてもよく、または錠剤に圧縮されていてもよい。経口投与のための錠剤、トローチ、およびカプセルは、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤成形剤、潤滑剤、崩壊剤、および湿潤剤などの従来の賦形剤を含有する。錠剤は、当技術分野における周知の方法によってコーティングされうる。経口組成物は、うがい薬として用いるための液体担体を用いて調製することもでき、そこでは液体担体中の化合物は、経口的に適用され、うがいされて(swished)吐き出されるか、または飲み込まれる。治療的に適合した結合剤および／または佐剤材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分または同様の性質の化合物のうちの任意のものを含有し得る：微結晶性セルロース、トラガントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート(Sterote)などの潤滑剤；コロイドシリコーンジオキシドなどの流動促進剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味剤；または、ハッカ、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味料などの香味剤。吸入による投与のために、化合物は、適した噴霧剤、例えば二酸化炭素などのガスを収容した加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧機から、エアゾールスプレーの形で送達される。
【０１２３】
局所適用は、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、ゼリー、またはエマルジョン軟膏の形であってもよい。局所組成物は、治療用形態でありうるが、そうである必要はない。例えば、それは化粧品であり得る。本発明の1つの態様において、局部的に投与可能な局所組成物が提供される。局部的に投与可能な局所組成物には、局所担体が含まれる。局所担体は、一般的に局所薬剤の投与にふさわしいものであり、当技術分野における公知の任意のそのような材料を含む。局所担体は、望ましい形、たとえば液体、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、または軟膏として、組成物を提供するように選択され、天然に存在する材料あるいは合成起源の材料を含んでもよい。選択された担体が局所製剤の活性剤またはその他の成分に悪影響を及ぼさないことが不可欠である。本明細書における使用のための適した局所担体の例には、水、アルコール、およびその他の無毒性の有機溶媒、グリセリン、鉱物油、シリコーン、石油ゼリー、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、蝋等が含まれる。
【０１２４】
本発明によるサラチンポリペプチドは、治療用の組成物および組み合わせ中の治療上有効な化合物として適切である。本発明による治療上の製剤は、任意で、アスピリン、ヒルジンもしくはヘパリンなどの抗凝固剤、またはプラスミノーゲン活性化因子もしくはストレプトキナーゼなどの血栓溶解剤、または本明細書に記載されているものを含む任意のその他の薬剤のような、追加的な活性成分を含んでもよい。
【０１２５】
本発明による製剤は、従来の無毒の治療的に許容される担体、希釈剤、佐剤、および、選択された投与経路に関して典型的な媒体を含有する、単位用量として投与されうる。
【０１２６】
本発明による単位用量は、本発明による日々必要とされる量のサラチンペプチド、または望ましい用量に整えるためのその分割量(sub-multiple)を含有しうる。所与の患者(ヒトを含む哺乳動物)に対する最適な、治療的に許容される投薬量および用量率は、使用される特定の活性材料の活性、年齢、体重、全般的な健康、性別、食事、投与の時間および経路、クリアランスの速度、例えば療法または予防法といった処置の目的、ならびに処置される血栓性疾患の性質などの、様々な因子に依存する。本発明による用量は、一定にとどめる必要はなく、当業者によく知られたパラメータに従って調整することができる。加えて、本発明による用量は、治療量以下または以上であり得る。
【０１２７】
1つの態様において、本発明のペプチドの治療上有効な用量は、約0.001〜100mg/kg体重の間であり、好ましくは0.01〜10mg/kg体重の間である。1つの態様において、本発明のペプチドの用量は、0.33mg/kg体重である。
【０１２８】
1つの態様において、脈管適用のために、製剤は、約0.1mg/mLから約30mg/mLのサラチンを含む。別の態様において、脈管適用のための製剤は、約0.1mg/mLから約1mg/mLのサラチン、約1mg/mLから約5mg/mLのサラチン、約5mg/mLから約10mg/mLのサラチン、約10mg/mLから約15mg/mLのサラチン、約15mg/mLから20mg/mLのサラチン、約20mg/mLから約25mg/mLのサラチン、または約25mg/mLから約30mg/mLのサラチンを含む。好ましい態様において、脈管適用のための製剤は、約1mg/mLから約5mg/mLのサラチンを含む。非脈管適用のために、製剤は約0.01mg/mLから約20mg/mLのサラチンを含む。1つの態様において、非脈管適用のための製剤は、約0.01mg/mLから約0.1mg/mLのサラチン、約0.1mg/mLから約1mg/mLのサラチン、約1mg/mLから約5mg/mLのサラチン、約5mg/mLから約10mg/mLのサラチン、約10mg/mLから約15mg/mLのサラチン、または約15mg/mLから20mg/mLのサラチンを含む。好ましい態様において、非脈管適用のための製剤は、約0.1mg/mLから約1mg/mLのサラチンを含む。典型的には、使用される製剤の量は、適用の部位で望まれる用量次第である。医師は、過剰量の製剤を適用し、その後スポンジの吸い取りまたは洗浄によって過剰量を除いて、望ましい濃度に到達させてもよい。
【０１２９】
別の態様において、0.1mg/mLから20mg/mLのサラチンが、意図された領域を覆うのに十分な容積において、脈管使用のために適用される。1つの態様において、1mg/mLから5mg/mL、5mg/mLから10mg/mL、または10mg/mLから20mg/mLのサラチンが、意図された領域を覆うのに十分な量において、脈管使用のために適用される。好ましい態様において、1mg/mLから5mg/mLのサラチンが、意図された領域を覆うのに十分な量において、脈管使用のために適用される。別の態様において、0.01mg/mLから10mg/mLのサラチンが、意図された領域を覆うのに十分な量において、非脈管使用のために適用される。1つの態様において、0.01mg/mLから5mg/mL、または5mg/mLから10mg/mLのサラチンが、意図された領域を覆うのに十分な量において、脈管使用のために適用される。好ましい態様において、0.01mg/mLから5mg/mLのサラチンが、意図された領域を覆うのに十分な量において、非脈管使用のために適用される。当業者は、一部の態様において、例えばフラッシュまたはスポンジによる除去に起因して治療剤の一部が失われることがあるので、有効な濃度に達するために、より高い局部濃度が適用される必要がありうることを理解するであろう。加えて、使用がトロンビン阻害剤または抗凝固剤などのその他の治療剤との組み合わせである場合、治療上有効な用量のサラチンは変化しうる。
【０１３０】
デバイス表面を実質的に血栓抵抗性にするために、上記および特許請求の範囲において明らかにされているような固定化されたポリペプチドでコーティングした、デバイス表面を体液と触れさせて使用するための移植可能な医療用デバイスまたは体外の医療用デバイスを提供することもまた本発明の目的である。本発明によるポリペプチドは、医療用デバイス上に、その表面を生体適合性および抗凝固性にするために、固定化されている。そのようなデバイスは、典型的に血小板凝集を誘発する表面特性を時々有しており、それは血液またはその他の体液に触れる移植可能なおよび体外のデバイスにおけるそれらの意図された使用において不都合である。一般にプラスチック材料および合成繊維から作られるそのようなデバイスの例は、義肢(protheses)、人工器官、眼レンズ(ocular lens)、縫合糸、人工脈管セグメント、カテーテル、透析装置、チューブ、および血液を運ぶ脈管である。
【０１３１】
好ましい製剤は、単純なリン酸緩衝生理食塩水であり、整形外科的適用では、ヒドロゲルを有する製剤などの、より大きな粘度を持った製剤を用いる。適した製剤は、PBSもしくはヒドロゲルまたはその他の適した媒体中において、約0.01mg/mLから約0.1mg/mLのサラチン、約0.1mg/mLから約1mg/mLのサラチン、約1mg/mLから約5mg/mLのサラチン、約5mg/mLから約10mg/mLのサラチン、約10mg/mLから約15mg/mLのサラチン、約15mg/mLから20mg/mLのサラチン、約20mg/mLから約25mg/mLのサラチン、約25mg/mLから約30mg/mLのサラチン、約30mg/mLから約40mg/mLのサラチン、または約40mg/mLから約50mg/mLのサラチンであり得る。材料は凍結して、冷蔵して、または凍結乾燥粉末として貯蔵されうる。
【０１３２】
実施例
実施例1：イヌ屈筋腱修復モデルにおけるサラチンの使用
指における腱損傷は、手の外科医にとって依然として臨床的課題のままである。腱損傷およびそれらの処置の生物学的効果を研究するために、イヌのモデルが一般に用いられる。
【０１３３】
この研究の目的は、インビボのイヌモデルにおける屈筋腱修復に続く成果に対するサラチンの効果を評価することにある。イヌの屈筋腱修復モデルにおける腱損傷に続いて、サラチンをゲル製剤においてまたは単純な液体として損傷の部位に適用する。対照群において、ゲルまたは液体対照(サラチンなし)を適用する。手術後10日目に屠殺した犬における、腱の裂傷および修復に続く屈曲の働き(WOF)および腱強度を評価する。サラチンで処置した犬において、WOFおよび腱強度がより大きく、瘢痕化の軽減が存在することが期待される。
【０１３４】
実施例2：創傷治癒および瘢痕形成を促進するサラチン
マウスモデル
サラチンの創傷治癒に対する効果が、マウスにおいて決定される。創傷は、細密な外科はさみによって作製し、4mmの完全な厚さの皮膚切開からなる。各々の切開を覆うために滅菌絆創膏を用いる。創傷の形成に続き、サラチンを切開に適用する。損傷後0、1、2、3、および5日目に、磁気共鳴マイクロイメージング(MRI)を用いて、各々の創傷部位における新しい脈管形成を査定する。サラチンによる処置は、損傷後1〜2日の創傷を取り囲む大量の新生血管形成を減少させ、創傷治癒を加速し、瘢痕化を最小限にすると考えられる。
【０１３５】
創傷の視覚的観察も、サラチン処置の利益の証拠を提供する。サラチンで処置された動物は、後の時点において、対照動物と比較して瘢痕化の証拠をほとんど示さないと考えられる。
【０１３６】
創傷破壊強度、または創傷をまたぐ組織引っ張り強度を、マウスにおいて評価する。右腰部領域に完全な厚さの皮膚切開を作り、創傷上へのサラチンの局所適用がこれに続く。創傷を破壊するのに必要な力は、切開後40時間目および7日目に測定する。サラチンで処置された動物は、治癒創傷の強度において対照と比較して有意な増大を実証すると考えられる。
【０１３７】
ユカタンブタモデル
創傷治癒および瘢痕形成におけるサラチンの効果は、ユカタンブタを用いてもまた決定することができる。ブタの皮膚はヒトの皮膚に生理的に類似すると見られている。
【０１３８】
各々の動物に4セットの外科的創傷を生じさせることができる。各々のセットは、3つの病変：(1)不完全な厚さの病変(1cm2)、(2)完全な厚さの病変(1cm2)、および(3)切開創傷(4cm)から成ることができる。これらの外科的創傷は、急性の表在性創傷(例えば、擦過傷、完全な厚さの褥瘡、潰瘍)および手術後の切開または裂傷をシミュレートする。各々の創傷を覆うために滅菌絆創膏を用いる。
【０１３９】
創傷形成に続いて、サラチンを切開上に適用する。各々の創傷部位での新しい脈管形成は、損傷後0、1、2、3、および5日目に、磁気共鳴マイクロイメージング(MRI)を用いて査定する。サラチンによる処置は、損傷後1〜2日の創傷を取り囲む大量の新生血管形成を減少させ、創傷治癒を加速し、瘢痕化を最小限にすると考えられる。
【０１４０】
創傷の視覚的観察も、サラチン処置の利益の証拠を提供する。サラチンで処置された動物は、後の時点において、対照動物と比較して瘢痕化の証拠をほとんど示さないと考えられる。
【０１４１】
創傷破壊強度、または創傷をまたぐ組織引っ張り強度を、ブタにおいて評価する。右腰部領域に完全な厚さの皮膚切開を作り、創傷上へのサラチンの局所適用がこれに続く。創傷を破壊するのに必要な力は、切開後40時間目および7日目に測定する。サラチンで処置された動物は、治癒創傷の強度において対照と比較して有意な増大を実証すると考えられる。
【０１４２】
実施例3：インビトロでMCP-1誘発性のヒト単球移動を阻害するサラチン
単球細胞の単離：単球は、末梢血単核細胞(PBMC)から単離される。PBMCは、Ficoll-Paque勾配遠心分離法によって、バフィーコート(San Diego Blood Bank)から単離した。単球は、1×107細胞/mLのPBMCを100mmペトリ皿において2時間インキュベートし、付着細胞を回収することによって単離した。
【０１４３】
単球の走化性：単球移動は、ブラインドウェルBoydenチャンバー法によって定量化した。単球は、0.5% BSAを加えたRPMI1640中に1×106細胞/mLで懸濁した。様々な濃度の化合物(サラチン)を含む200μLのウェルをBoydenチャンバーの上側ウェルの中に収納した。チャンバーの下側ウェルには、100ng/mL MCP-1を負荷した。8μm孔ポリカーボネートフィルターを上側ウェルと下側ウェルとの間に置いた。ポリカーボネートフィルターは、アッセイで使用する前に、10μg/mL IV型コラーゲン、1mg/mL IV型コラーゲン、0.01mg/mLフィブロネクチン、あるいは1mg/mLフィブロネクチンのいずれかで、それぞれ4℃で一晩コーティングした。フィルターは、10μg/mLまたは1mg/mL BSAによってもまたコーティングした。チャンバーは37℃、5% CO2で2時間、インキュベートした。インキュベーションの後、上側ウェル中の細胞を除き、次にフィルターをメタノールで固定し、ギムザ染色で染色した。細胞の動きは、フィルターを通り抜けて移動した細胞の総数を数えることによって定量化した。
【０１４４】
結果：サラチンは高い親和性でコラーゲンに結合することが知られていた。それがその他の細胞外マトリクスタンパク質(ECM)またはウシ血清アルブミン(BSA)などの一般的なタンパク質にも結合するかどうかは、知られていなかった。この課題は、本研究において探求された。最初に、走化性フィルターを10μg/mLコラーゲンまたはBSAでコーティングし、化学誘引物質に向かう単球の移動を検討した。図1Aにおける結果は、100ng/mLのMCP-1がヒト単球の走化性を有意に誘発したことを実証する(MCP-1の非存在下において移動した細胞と比較して、P＜0.0026)。100、10、1、および0.1μg/mLのサラチンの添加は、コラーゲンでコーティングしたフィルターを通り抜けるMCP-1誘発性の単球移動を阻害した。この阻害のIC50は、172pMであった(図1B)。サラチンは、0.01mg/mL BSAでコーティングしたフィルターを通り抜けるMCP-1誘発性の単球走化性をもまた、1.1nMのIC50で阻害した(図1C)。
【０１４５】
サラチンの阻害効果が、使用したタンパク質の量に起因しうることはもっともらしい。例えば、10μg/mL濃度のコラーゲンまたはBSAでは低すぎる可能性があり、それが、特にBSAでコーティングしたフィルター上で、サラチンの阻害効果を促進した可能性がある。それゆえ、発明者らは、フィルターを1mg/mLのコラーゲンまたはBSAでコーティングし、別の細胞外マトリクスであるフィブロネクチンもまた加えた。図1の結果と同様に、MCP-1(100ng/mL)は、コラーゲン、BSAまたはフィブロネクチンでコーティングしたフィルターを通り抜けるヒト単球移動のための成功した化学誘引物であった。MCP-1のこの活性は、その3つの基質上においてサラチンによって阻害された。この阻害のIC50は、コラーゲン、BSA、およびフィブロネクチン上を移動する細胞に関してそれぞれ62.3pM、37nM、および19.4nMであった(図2A、B、およびC)。これらの結果は、サラチンが免疫細胞流入の阻害剤であり、サラチンが組織破損に対する免疫細胞反応に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０１４６】
実施例4：インビトロでMIP-1α誘発性のヒトTリンパ球移動を阻害するサラチン
Tリンパ球の単離：Tリンパ球集団は、末梢血単核細胞(PBMC)から単離される。PBMCは、Ficoll-Paque勾配遠心分離法によって、バフィーコート(San Diego Blood Bank)から単離した。単球は、1×107細胞/mLのPBMCを100mmペトリ皿において2時間インキュベートし、付着細胞を回収することによって単離した。Tリンパ球は、ナイロンウールカラムの使用によってPBMCから単離した。手短には、PBMCをナイロンウールカラム上で37℃ 1時間インキュベートし、非付着細胞を、RPMI完全増殖培地によってナイロンウールカラムからすすぎ洗いした。これらの細胞は、約95%のTリンパ球を含む。
【０１４７】
Tリンパ球走化性：Tリンパ球移動は、ブラインドウェルBoydenチャンバー法によって定量化した。Tリンパ球は、0.5%BSAを加えたRPMI1640において1×106細胞/mLで懸濁した。様々な濃度の化合物(サラチン)を含む200μLのウェルをBoydenチャンバーの上側ウェルの中に収納した。チャンバーの下側ウェルには、100ng/mL MIP-1αを負荷した。8μm孔ポリカーボネートフィルターを上側ウェルと下側ウェルとの間に置いた。ポリカーボネートフィルターは、アッセイで使用する前に、10μg/mL IV型コラーゲン、1mg/mL IV型コラーゲン、0.01mg/mLフィブロネクチン、あるいは1mg/mLフィブロネクチンのいずれかで、それぞれ4℃で一晩コーティングした。フィルターは、10μg/mLまたは1mg/mL BSAによってもまたコーティングした。チャンバーは37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、上側ウェル中の細胞を除き、次にフィルターをメタノールで固定し、ギムザ染色で染色した。細胞の動きは、フィルターを通り抜けて移動した細胞の総数を数えることによって定量化した。
【０１４８】
結果：100ng/mLで用いた場合、MIP-1αは、10μg/mLのコラーゲンでコーティングしたフィルター上に置いたTリンパ球の走化性を有意に(P＜0.02)誘発した(図3A)。細胞と共にフィルターの上側のウェル中に置いた場合、いくつかの濃度のサラチンは、MIP-1αで誘発されたTリンパ球走化性を阻害した。10μg/mLのコラーゲンでコーティングしたフィルター上の走化性を阻害することに関するIC50は、6.863nMである(図3B)。しかしながら、10μg/mL BSAを基質として使用した場合は、はっきりした阻害は観察することができなかった(図3C)。
【０１４９】
発明者らは、1mg/mLのコラーゲン、BSA、またはフィブロネクチンでコーティングしたフィルター上に置いたTリンパ球の走化性に対するサラチンの効果もまた検討した。サラチンは、これらの細胞のMIP-1α誘発性の走化性を阻害した。この効果に関するIC50は、1mg/mLのコラーゲン、BSAまたはフィブロネクチンでコーティングしたフィルターを通り抜けて移動する細胞に対し、それぞれ7.9pM、184.9nM、および3.69nMであった(図4A、B、およびC)。
【０１５０】
実施例5：インビボにおけるMCP-1誘発性の移動に対するサラチンの効果を決定するための研究
マウス空気嚢モデルを用いてインビボにおけるMCP-1誘発性の移動およびサイトカイン産生に対するサラチンの効果が決定される。
【０１５１】
材料：マウスTNF-αのためのELISAキット(Biosource、カタログ番号CMC3013)、マウスTGF-βのためのELISAキット(Biosource、カタログ番号CHC1683)、マウスIL-1βのためのELISAキット(Biosource、カタログ番号CMC0813)、マウスIL-8のためのELISAキット(Biosource、カタログ番号CMC1063)、ヒト塩基性FGFのためのDuoset ELISAキット(R&D、カタログ番号DY233)、組換えヒトMCP-1(Peprotech Inc.、カタログ番号300-04)、PBS(Mediatech、カタログ番号21-031-CV)。
【０１５２】
方法：メスBALB/cマウスに6mLの滅菌空気を0日目に皮下的に注射し、続いて3日後に3mLの滅菌空気の第2の注射をすることによって、背側の空気嚢を作り出した。6日目に、100μLの滅菌PBS中、1μgのMCP-1を空気嚢の中に注射し、または別個の注射において、100μL PBSを対照として使用した。2分後、900μL PBS中100μgのサラチン、対照として900μL PBSを、空気嚢の中に注射した。2時間後、空気嚢に1mL PBSを流し、回収した容積を測定し、回収した細胞の数を血球計の計数により求めた。滲出液の上清は、製造者の説明書に従い、TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-βおよび塩基性FGFの分泌を査定するために用いた。
【０１５３】
結果：インビトロで観察された活性がインビボに変換(translate)できるかどうかを実証するために、インビボにおける細胞の移動に対するサラチンの効果を検討した。空気嚢モデルは、細胞移動の検討のための確立した手法である。この研究のために、1μg MCP-1を空気嚢中に注射し、2時間後に細胞を吸引によって回収した。図5は、マウス空気嚢中への1μg MCP-1の投与が、これらの嚢中への有意な細胞の動員をもたらしたことを実証する(媒体で処置した動物と比較して、P＜0.0037)。しかしながら、MCP-1の注射の2分後におけるサラチン(0.1mg)の投与は、空気嚢中への細胞のMCP-1動員を有意に阻害した(P＜0.0028)。
【０１５４】
次に、発明者らは、マウスの空気嚢中に蓄積するサイトカインのレベルに対するサラチンの効果を検討した。炎症誘発性サイトカインおよび炎症性サイトカイン、ならびにケモカインIL-8、TGF-β、TNF-α、IL-1β、および塩基性FGFのレベルを測定した。IL-8、TNF-α、およびIL-1βのレベルが嚢中へのMCP-1の投与後に増大したのに対して、対照とMCP-1処置動物との間でTGF-βまたは塩基性FGFのレベルにおける違いは観察することができなかった(図6)。結果は、0.1mgサラチンの投与がIL-8、TNF-α、およびIL-1βのレベルを減らして刺激前のレベルに戻すことも示すが、この減少は統計的に有意ではなかった(図6)。塩基性FGFに対するサラチン投与の効果を実証することができなかった一方で、サラチン投与は、非刺激媒体群において、TGF-βのレベルが基礎レベルより下に下がる有意な減少に関連していた(媒体で処置した動物とサラチンで処置した動物との間で比較したとき、P＜0.001)。しかしながら、刺激した比較群における変動では、この減少がMCP-1投与、サラチンの投与、または両方に起因するかどうかを決定することができなかった。
【０１５５】
実施例6：炎症状態におけるサラチンの効果を決定する研究
多発性硬化症に対するサラチンの効果
脳脊髄炎、具体的には多発性硬化症に対するサラチンの効果を試験するために、本明細書に記載されている化合物のうちの1つまたは複数を、CD4+ヘルパーT(Thl)媒介性の枢神経系(CNS)の炎症性脱髄疾患であり、多発性硬化症のモデルとしての機能を果たす、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のマウスモデルに投与することができる。
【０１５６】
方法および材料
動物
メスSJLマウス(H-2s)は、Harlan Sprague Dawley(Indianapolis, インディアナ州)から購入できる。マウスは通常、実験開始時は6〜7週齢である。
【０１５７】
抗原および抗体
PLP 139-151ペプチド(HSLGKWLGHPDKF)は、Peptides International(Louisville, ケンタッキー州)より購入できる。アミノ酸組成は質量分析によって検証され、純度(＞98%)は高速液体クロマトグラフィによって査定される。MIP-1α、MCP-1、MIP-2、TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β、FGF-2、ランテス、IL-1α、IL-2、IL-6、MIP-1β、およびENA-78のELISA検出において使用するための抗体は市販されている。
【０１５８】
ドナーリンパ球の準備刺激、細胞培養、およびEAEの移入
ドナーリンパ球は、4mg/mLのマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)(Difco, Detroit, ミシガン州)を含むCFA中25μgのPLP139-151で、正常SJL/Jマウスの皮下免疫化によって準備刺激した。7日後、排出するリンパ節細胞をプールして、72時間、50μg/mLのPLP 139-151の存在下、6×10-6細胞/mLの濃度で、5×10-5M 2-ME(GIBCO)、2mM L-グルタミン(GIBCO)、100U/mLのペニシリン(GIBCO)、100μg/mLのストレプトマイシン(GIBCO)、0.1mM非必須アミノ酸(GIBCO)、および5%ウシ胎児血清(Hy-Clone)を含有する完全ダルベッコ最小必須培地(Biowhitaker, Bethesda, メリーランド州)中においてインビトロで培養する。細胞を収集して洗浄し、3×10-6個の生存Tリンパ芽球を、正常SJL/Jレシピエントに腹腔内移入する。細胞移入の後、マウスをEAEの発病に関して評価する。
【０１５９】
サイトカインELISA
MIP-1α、MCP-1、MIP-2、TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β、FGF-2、ランテス、IL-1α、IL-2、IL-6、MIP-1β、およびENA-78、同じくその他のケモカインの査定は、ELISAを用いて組織試料および培養上清から定量化し得る。脊髄試料は1mLのリン酸緩衝生理食塩水中でホモジナイズし、10分間、遠心分離(400×g)によって清澄にする。ELISAプレートは、PBS中に希釈した2μg/mLの捕捉用抗体でコーティングし、4℃で一晩コーティングする。試料はブロッキング緩衝液中に希釈し、室温で2時間、ELISAプレート中でインキュベートする。アルカリホスファターゼ結合2次抗体を検出試薬として用いる。サイトカイン濃度は、既知の値の標準曲線を作成し、試料中のケモカインのピコグラム／ミリリットルを計算することによって求められる。
【０１６０】
臨床的評価
養子(adoptive)R-EAEは、PLP 139-151ペプチド準備刺激マウスからの3×106個のインビトロ刺激PLP139-151特異的Tリンパ芽球の移入によって誘発される。個々の動物は日々観察され、それらの臨床的重症度に従って以下のように等級づけされる：0 = 異常性なし；1 = 力のない尾部(limp tail)；2 = 力のない尾部および部分的な後肢の脱力(よたついた歩行)、3 = 完全な後肢の麻痺；および4 = 死亡。ほとんどの実験において、最大重症度の範囲はグレード1から3までにある。マウスはまれにしかEAEがもとで死なない；しかしながら、死亡をその他のケースに帰することができないときは4のスコアが用いられる。安定化または改善の期間の後にマウスが追加的な神経障害を発病したときには再発がスコアされる(少なくとも1臨床グレードの増加)。
【０１６１】
上に記載されている方法を用いて、サラチンによる処置が、マウスにおけるEAEを阻止するかもしくは改善するか、または試料における産生されたサイトカイン濃度を変えるかどうかを決定することができる。これは、この疾患の処置におけるサラチンの有効性を実証し得る。
【０１６２】
喘息に対するサラチンの効果
喘息に対するサラチンの効果を試験するために、本明細書に記載されている1つまたは複数の化合物を、喘息のマウスモデル、例えばOVAで免疫化したBALB/cマウス、またはα-GalCerで誘発した気道過敏症(AHR)に投与することができる。
【０１６３】
材料および方法
動物：BALB/cByJマウスは、Jackson Laboratory、Bar Harbor、メイン州から得ることができる。
【０１６４】
モノクローナル抗体：モノクローナル抗体は、硫安塩析およびイオン交換クロマトグラフィによって腹水から精製することができる。以下のハイブリドーマを用いることが出来る：R46A2(抗IFN-γmAb)XMGl.2(抗IFN-γ抗体)；BVD4-1D11、BVD6-24G2(抗IL-4 mAb)。これらのハイブリドーマは、ATCC(American Type Culture Collection, Rockville、メリーランド州)から得ることができる。抗38C13イディオタイプmAb 4G10(ラットIgG2a)をアイソタイプ対照として使用することができる。
【０１６５】
免疫化：BALB/cマウスは、200μgのミョウバン(Al[OH]3)に吸着させたOVA(100μg／マウス)によって、足蹠中に準備刺激することができる。7、8、および9日後、マウスに、50μlの0.9% NaCl中50μgのOVAを鼻腔内曝露することができる。OVAを最後に鼻腔内曝露した1日後、全身プレチスモグラフにおいて、増加する濃度のメタコリンを吸入後の意識のあるマウスから、気道過敏性を測定することができる。α-GalCerによる免疫化は、記載されているように行うことができる。
【０１６６】
抗原の鼻腔内投与の間における肺吸引を容易にするため、マウスを0.25mLの標準生理食塩水中におけるケタミン(0.44mg/mL)／キシラジン(6.3mg/mL)の腹腔内(i.p.)注射によって、軽く麻酔することができる。通常、鼻腔内投与した抗原の75%が肺においてその後検出することができる(J. Exp. Med. 1997; 185:1671-9)。
【０１６７】
サイトカインELISA：ELISAは、既に上に記載したとおりに行うことができる。用いる抗体ペアは以下のとおりであってよく、捕捉／ビオチン化検出で列挙するとIL-4、BVD4-1D11／BVD6-24G2；IFN-γ、R4-6A2／XMG1.2である。組換えサイトカインは標準として用いることができ、曲線はIL-4に関しては1：2希釈において500から39pg/mLで、IFN-γに関しては20-2、156ng/mLで作成される。
【０１６８】
抗OVA抗体アイソタイプの測定：マウスは屠殺時に出血させることができ、改変抗体特異的ELISAを用いてOVA特異的抗体を測定することができる。OVA特異的IgGの測定のために、プレートは5μg/mL OVAで一晩コーティングすることができる。洗浄およびブロッキングの後、連続希釈血清をプレートに加えることができる。一晩のインキュベーションに続いて、プレートはHRPO結合ヤギ抗IgGサブクラス特異的抗体(Southern Biotechnology Associates, Birmingham、アラバマ州)を用いて顕色(develop)させることができる。追加的な洗浄の後、OPD基質を加えることができ、プレートを顕色させて492nmでODを求めることができる。抗OVA IgG1 mAb 6C1および抗OVA IgG2a mAb 3A11を、各々のIgGサブクラスの定量化のための標準として使用することができる。OVA特異的IgEの決定は、ラット抗マウスIgE mAb EM95(5.0μg/ml)を用いてプレートをコーティングし、ELISAによって行うことができる。試料を適用して一晩インキュベートした後、プレートを洗浄して、ビオチン化OVA(10μg/mL)を加えることができる。2時間後、プレートを洗浄し、HRPO結合ストレプトアビジン(Southern Biotechnology Associates)を加えることができる。プレートはOPD基質で顕色させ、492nmでODを求めることができる。ミョウバン中のOVAによって高度免疫化した(hyperimmunized)マウスの血清は、IgEに関して定量化し、OVA特異的IgE ELISAのための標準として用いることができる。
【０１６９】
気道反応性の測定：気道反応性は、全身プレチスモグラフ(モデルPLY 3211, Buxco Electronics Inc., Troy, ニューヨーク州)の中に置かれた意識のあるマウスからメタコリン誘発性気流閉塞によって査定することができる。肺気流閉塞は、以下の式を用いてPenhによって測定することができる：
2009510105.tif 000004
式中、Penh=増大した休止期(無次元(dimensionless))、Te=呼気時間、RT=弛緩時間、PEF=最大呼気流量(mL/s)、およびPIF=最大吸気流量(mL/s)(Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997; 156:766-75)。増大した休止期(Penh)、分時拍出量(minute volume)、一回換気量、および呼吸頻度は、チャンバー圧から得ることができ、プリアンプモジュール(モデルMAX2270)に接続したトランスデューサ(モデルTRD5100)によって測定し、XA系ソフトウェア(モデルSFT 1810)によって解析することができる。メタコリン反応性の測定は、マウスを0.9% NaClに2分間曝露することによって得ることができる。
【０１７０】
BAL液の収集および肺組織診断：動物は、致死用量のフェノバルビタール(450mg/kg)を腹腔内注射することができる。気管にカニューレを挿入し、次に肺を0.8mLのPBSで3回洗浄し、液体をプールする。洗浄液中の細胞は、血球計を用いて計数することができ、Hansel染色(Lide Laboratories、Florissant、ミズーリ州)で染色したスライドプレパラート上でBAL細胞の差異を求めることができる。少なくとも200個の細胞を、従来の形態学的診断基準に基づいて光学顕微鏡によって区別できる。いくつかの動物においては、BALを行わずに肺を取り除き、PBSで洗浄し、10%ホルマリンで固定して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
【０１７１】
上に記載されている方法を用いて、サラチンの処置がα-GalCer誘発性AHRを阻止するか、OVA／ミョウバン誘発性AHRを減じるか、またはα-GalCer誘発性AHRに続いて産生された血清中のサイトカイン濃度を変えるかどうかを決定することができる。これは、この疾患の処置におけるサラチンの効果を実証することができる。
【０１７２】
実施例7：サラチンの製造
サラチンの製造に関する例は、米国特許第6,774,107号および同第6,881,722号に記載されている。本明細書に記載されている研究において、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)が、表3に記載されているような、培養上清中に存在するタンパク質分解活性を減じる代替工程として記載されている。この手技において、種培養工程において、酵母の試料は振盪フラスコ中で増殖させ、培養は汚染について観察される。次に、米国特許第6,774,107号および同第6,881,722号に記載されているような主発酵工程を行う。上清を取り除き、表3の細胞分離工程に記載されているように細胞から分離する。さらに微粒子および細胞残屑を上清から取り除くため、上清を表3の濾過工程に記載されているように濾過する。濾過工程の後、上清は直接HIC中に負荷する(緩衝液を交換する必要なし)。HICによって上清中に存在するプロテアーゼが取り除かれ、米国特許第6,774,107号および同第6,881,722号に記載されているような熱ショックタンパク質の添加がもはや必要なくなる。HICからのフロースルーは、次にDEAE負荷緩衝液で1：1に希釈し、次にDEAEカラム中に負荷する。DEAEカラムを洗浄し、次に米国特許第6,774,107号および同第6,881,722号に記載されているように直線的勾配によって溶出する。少なくとも90%の純度の捕捉した分画を再度合わせ、表3のダイアフィルトレーションおよび濾過工程において記載されているように濾過する。サラチンは次に適切な媒体中に希釈し、望ましい濃度にする。
【０１７３】
（表３）サラチンに関する計画したGMPプロセスの概略
2009510105.tif 000005
【０１７４】
本発明の好ましい態様を本明細書に示し、記載してきたが、そのような態様がほんの一例として提供されていることは当業者に明らかであろう。これより、非常に多くのバリエーション、変更、および置換を、本発明から逸脱することなく当業者は思いつくであろう。本発明の実行においては、本明細書に記載の本発明の態様の様々な代替が用いられうることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲が発明の範囲を定義すること、それによってこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造物ならびにそれらの等価物が包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】10μg/mLのIV型コラーゲンおよびBSAでコーティングしたフィルターにおけるMCP-1誘発性のヒト単球移動に対するサラチンの効果を示す。
【図２】1mg/mL BSA、1mg/mLコラーゲン、または1mg/mLフィブロネクチンでコーティングしたフィルターにおけるMCP-1誘発性のヒト単球移動に対するサラチンの効果を示す。
【図３】10μg/mLのIV型コラーゲンおよびBSAでコーティングしたフィルターにおけるMIP-1α誘発性のヒトTリンパ球移動に対するサラチンの効果を示す。
【図４】1mg/mL BSA、1mg/mL IV型コラーゲン、または1mg/mLフィブロネクチンでコーティングしたフィルターにおけるMIP-1α誘発性のヒトTリンパ球移動に対するサラチンの効果を示す。
【図５】マウス空気嚢モデルにおける、生理食塩水対照を注射した動物と比較したMCP-1(JE)誘発性の細胞移動に対するサラチンの効果を示す。サラチン投与を示すラベルを付けた群は、MCP-1(JE)によっても誘発された。
【図６】マウス空気嚢モデルにおける、生理食塩水対照を注射した動物と比較したMCP-1(JE)誘発性のサイトカイン産生に対するサラチンの効果を示す。サラチン投与を示すラベルを付けた群は、おのおののケースにおいて、MCP-1(JE)によっても誘発された。
【図７】配列リストを示す。
【図１】
2009510105.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2009510105.tif 000012
【図７Ｂ】
2009510105.tif 000013
【図７Ｃ】
2009510105.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月30日(2008.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
抗原および抗体
PLP 139-151ペプチド(HSLGKWLGHPDKF)(SEQ ID NO:13)は、Peptides International(Louisville, ケンタッキー州)より購入できる。アミノ酸組成は質量分析によって検証され、純度(＞98%)は高速液体クロマトグラフィによって査定される。MIP-1α、MCP-1、MIP-2、TNF-α、IL-1β、IL-8、TGF-β、FGF-2、ランテス、IL-1α、IL-2、IL-6、MIP-1β、およびENA-78のELISA検出において使用するための抗体は市販されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009510105000001.app
【国際調査報告】
2009510105.tif 000015