(57)【要約】  腫瘍を患う患者の腫瘍細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子の発現レベルの測定に基づく結腸直腸癌の予後方法。前記発現レベルは、患者の癌の再発の可能性のマーカーとして、および５-フルオロウラシルを用いた処置に対して腫瘍が示す感受性の予後マーカーとして使用可能であり、個々の患者により適切な治療計画を設計することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から単離した生体試料中のＥｐｈＢ４遺伝子の発現レベルを測定することを含んでなる、結腸直腸癌の予後方法であって、この遺伝子の発現レベルが予後マーカーおよび５-フルオロウラシルを用いた処置に対する結腸直腸腫瘍の応答性のマーカーとして用いられる方法。
【請求項２】
ＥｐｈＢ４の低レベルな発現が、予後不良と５-フルオロウラシルを用いた処置に対する結腸直腸腫瘍の不十分な感受性と関連しており、そして、高レベルな発現が、予後の良好さと前記処置に対する高い感受性と関連している、請求項１に記載の予後方法。
【請求項３】
前記試料が、バイオプシーまたは他の摘出方法により得られた細胞から単離される、請求項１または２に記載の予後方法。
【請求項４】
前記解析する試料が、ＥｐｈＢ４遺伝子にコードされるＲＮＡまたはその断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予後方法。
【請求項５】
前記測定が、ＰＣＲ、ＳＤＡまたは他の何らかの核酸の増幅方法により行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項６】
前記測定が、いずれかの方法により沈着されたオリゴヌクレオチドで構成されるＤＮＡマイクロアレイにより行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項７】
前記測定が、フォトリソグラフィーまたは他のいずれかの方法によりインサイチュで合成されたオリゴヌクレオチドで構成されるＤＮＡマイクロアレイにより行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項８】
前記測定が、いずれかの標識方法で標識された特異的プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項９】
前記測定が、ゲル電気泳動により行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項１０】
前記測定が、メンブランへの転写と特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションにより行われる、請求項９に記載の予後方法。
【請求項１１】
前記測定が、ＮＭＲまたは他のいずれかの診断用画像化技術により行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項１２】
前記測定が、ＮＭＲ、または画像化技術および抗体若しくは他のいずれかの手段と機能化された検出可能な常磁性ナノ粒子の使用により行われる、請求項４に記載の予後方法。
【請求項１３】
解析される試料が、ＥｐｈＢ４遺伝子にコードされるタンパク質またはその断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予後方法。
【請求項１４】
前記測定が、特異的抗体とのインキュベーションにより行われる、請求項１３に記載の予後方法。
【請求項１５】
前記測定が、ウェスタンブロット法により行われる、請求項１４に記載の予後方法。
【請求項１６】
前記測定が、免疫組織化学的手法により行われる、請求項１４に記載の予後方法。
【請求項１７】
前記測定が、ゲル電気泳動により行われる、請求項１３に記載の予後方法。
【請求項１８】
前記測定が、プロテインチップにより行われる、請求項１３に記載の予後方法。
【請求項１９】
前記測定が、ＥＬＩＳＡまたは他のいずれかの酵素的方法により行われる、請求項１３に記載の予後方法。
【請求項２０】
前記測定が、ＮＭＲまたは他のいずれかの診断用画像化技術により行われる、請求項１３に記載の予後方法。
【請求項２１】
前記測定が、ＮＭＲ、または抗体若しくは他のいずれかの手段と機能化された常磁性ナノ粒子若しくは他のいずれかのナノ粒子を用いた他のいずれかの診断用画像化技術により行われる、請求項１３に記載の予後方法。
【請求項２２】
ＥｐｈＢ４の発現レベルを測定するための試薬および添加剤を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２３】
特異的な抗ＥＰＨＢ４第１抗体、該第１抗体と結合可能な第２抗体、可視化試薬、発色物質並びに組織切片中のＥｐｈＢ４発現量を測定するために必要なその他の試薬および添加剤を含んでなるキット。
【請求項２４】
ＥｐｈＢ４の発現レベルの定量化を可能にするポジティブコントロールとネガティブコントロールを含んでなる、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
結腸直腸癌において治療効能を有する化合物の解析方法であって、これらの化合物のＥｐｈＢ４遺伝子の発現レベルを上昇させる能力を測定することを含んでなる方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法により同定される治療効能を有する１種類または複数種類の化合物の有効量と１または２種類以上の医薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２７】
結腸直腸癌の処置または予防用の医薬の調製のための、請求項２５に記載の方法により同定される治療効能を有する化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｐｈＢ４遺伝子の発現レベルと５-フルオロウラシルを用いた処置に対する腫瘍の感受性との関係に基づいて結腸直腸癌の予後を決定する方法に関する。本方法は、５-フルオロウラシルを用いた処置に対して応答性を示す可能性の低い腫瘍を患う患者の同定を可能にするものであり、これらの腫瘍に対する予後診断基準およびその処置法を選択する手段として使用できる。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌（colorectal cancer）は、欧州連合において、比較的高頻度に認められる癌の１種である。２０００年において、全体で２２００００の新たな症例が確認され、１２００００の死亡例が記録されている。加えて、この種の癌では、発症率と死亡率の両方が上昇している（それぞれ、１９９５年から２０００年にかけて１２.４％および６.１％）。
【０００３】
原発性腫瘍の外科的除去が、ステージＩＩとＩＩＩの結腸直腸癌（遠隔転移を伴わない局所的に発達した腫瘍）を患う患者にもっとも頻繁に用いられる処置法である。この処置により、これらの患者の約４０-５０％が治癒される。しかしながら、残りの５０-６０％の患者は微小転移巣を有しており、この微小転移巣が疾患の再発を招くことになる。この１０年間において、外科切除後の５-フルオロウラシル（５ＦＵ）を用いたアジュバント療法により、再発を示す患者の数が有意に低下し、これらの患者の生存率が上昇することが多数の研究により実証されている（Augenlicht et al., (1997) Low-level c-myc amplification in human colonic carcinoma cell lines and tumors: a frequent, p53-independent mutation associated with improved outcome in a randomized multi-institutional trial. Cancer Res, 57, 1769-75; Moertel et al., (1990) Levamisole and fluorouracil for adjuvant therapy of surgically removed colon carcinoma. N Engl J Med, 322, 352-8; Moertel et al., (1995) Fluorouracil plus levamisole as effective adjuvant therapy after resection of stage III colon carcinoma: a final report. Ann Intern Med, 122, 321-6）。
【０００４】
上記の処置法が有効となりうる患者を同定する方法が存在しないため、ステージＩＩＩの全ての患者とステージＩＩの大部分の患者が、５ＦＵによる治療を受けている。しかしながら、約８０％の患者は、外科手術により既に治癒しているかまたは腫瘍が５-フルオロウラシルに対して抵抗性を示すという理由により、この処置が有効ではなく、従って、前記の基本的な処置法は、これらの患者にとって理想的であるとは言い難い。
【０００５】
４０年以上に渡って結腸直腸癌に対して有効性を示した唯一の化学療法剤が５ＦＵである。近年においては、カンプトテシンやオキサリプラチン等の他の薬剤も結腸直腸癌に対する有効性を示している（Arango & Augenlicht, (2001) New approaches to colorectal cancer treatment. In Recent Research Developments in Cancer, Vol. 3. pp. 385-395. Transworld Research Network: Trivandrum; Cunningham et al., (1998) Randomised trial of irinotecan plus supportive care versus supportive care alone after fluorouracil failure for patients with metastatic colorectal cancer. The Lancet, 352, 1413-1418; de Gramont et al., (1997) Oxaliplatin with high-dose leucovorin and 5-fluorouracil 48-hour continuous infusion in pretreated metastatic colorectal cancer. Eur J Cancer, 33, 214-9）。これらの代替薬剤の利用可能性から、５ＦＵを用いた処置に対する応答の可能性に基づいて患者を同定し、分類する必要があることが明らかである。これにより、局所的に発達した結腸直腸癌を患う化学療法の最適化が可能になり、追加のまたは代替の化学療法剤の投与を通じてこれらの患者の生存率を高めることが可能になる。
【０００６】
レセプターであるＥＰＨ（エリスロポエチン産生肝細胞（erythropoietin- producing hepatocellular）)とそのリガンドであるＥｐｈｒｉｎ（ＥＰＨＮ）は、既知の受容体型チロシンキナーゼの主なファミリーを構成する。ＥＰＨおよびＥｐｈｒｉｎは、細胞外シグナルを伝達し、移動と細胞接着を調節することが可能である（Brantley-Sieders et al., (2004) Eph receptor tyrosine kinases in tumor and tumor microenvironment. Curr Pharm Des, 10, 3431-42）。過去において、このチロシンキナーゼファミリーの種々のメンバーの異常発現が腫瘍組織において観察されており、近年の論文において、結腸直腸腫瘍形成におけるこれらの遺伝子の重要性が示唆されている（Alazzouzi et al., (2005) Mechanisms of inactivation of the receptor tyrosine kinase EPHB2 in colorectal tumors. Cancer Research, 65, 10170-10173; Hafner et al., (2004) Differential gene expression of Eph receptors and ephrins in benign human tissues and cancers. Clin Chem, 50, 490-9; Liu et al., (2002) Coexpression of ephrin-Bs and their receptors in colon carcinoma. Cancer, 94, 934-9; Liu et al., (2004) Effects of overexpression of ephrin-B2 on tumour growth in human colorectal cancer. Br J Cancer, 90, 1620-6; Oba et al., (2001) Genomic structure and loss of heterozygosity of EphB2 in colorectal cancer. Cancer Lett, 164, 97-104）。
【０００７】
ＥＰＨレセプターは、重要な膜タンパク質であり、リガンドと高度に保存されたＮ末端ドメインとの結合を媒介する細胞外領域を有し、これに続いて、２量体化および他のタンパク質との相互作用に不可欠なシステインリッチな領域と２つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを有する（Labrador et al., (1997) The N-terminal globular domain of Eph receptors is sufficient for ligand binding and receptor signaling. Embo J, 16, 3889-97）。これらのレセプターの細胞内部分には、膜近傍領域、保存されたキナーゼドメイン、ＳＡＭモチーフおよびＰＤＺへの結合ドメインが含まれる（Kalo & Pasquale, (1999) Signal transfer by eph receptors. Cell Tissue Res, 298, 1-9)。ヒトゲノムは、少なくとも15種類のEPHレセプターを含む(Gale et al., (1996) Eph receptors and ligands comprise two major specificity subclasses and are reciprocally compartmentalized during embryogenesis. Neuron, 17, 9-19）。これらのレセプターのリガンド（ｅｐｈｒｉｎ）は、細胞膜に連結される。これらのタンパク質の命名委員会（Committee, E.N. (1997) Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands, the ephrins. Eph Nomenclature Committee. Cell, 90, 403-4）によれば、ｅｐｈｒｉｎは、膜への固定法に応じて２種類の構造上のサブタイプに分類される；ＧＰＩ（「グリコシルホスファチジルイノシトール」）結合を介して膜に固定可能な種類または膜貫通ドメインを介して膜に固定可能な種類である（それぞれ、サブクラスＡおよびＢ）。現在までに６種類のＡクラスのリガンドと３種類のＢクラスのリガンドが同定されている。
【０００８】
シグナルカスケードは、細胞表面の反対に位置するＥＰＨとＥｐｈｒｉｎの結合により開始する。この開始時の高親和性２量体化により、これら２量体が集合してヘテロ４量体が形成される。この４量体は、より高次元の複合体を形成することができる。ＥＰＨ-Ｅｐｈｒｉｎのヘテロ２量化によりＥＰＨレセプターの種々のチロシン残基の自己リン酸化が生じ、これによってレセプターのキナーゼ活性が増大し、シグナル伝達分子への結合部位が作り出される。ＥＰＨ-Ｅｐｈｒｉｎの２量体化により、自己リン酸化に依存しないこれらのレセプターと他のアダプター分子との結合が促進され、ＲａｓおよびＲｈｏの経路の調節が可能になる。ＥＰＨにより開始されるシグナル伝達に加え、リガンドも逆方向のシグナル伝達を開始することができる。結果として、ＥＰＨレセプターを発現する細胞とこれに適合性を示すＥｐｈｒｉｎを発現する細胞の結合により、両細胞内で双方向性のシグナルを生じさせることが可能になる。
【０００９】
ＥＰＨ-Ｅｐｈｒｉｎ系は種々の重要な細胞プロセスを制御する。ＲａｓおよびＲｈｏファミリーの低分子ＧＴＰａｓｅを介して、ＥＰＨ-Ｅｐｈｒｉｎ系は、細胞骨格の構造を制御している（Noren & Pasquale, (2004) Eph receptor-ephrin bidirectional signals that target Ras and Rho proteins. Cell Signal, 16, 655-66; Zou et al., (1999) An Eph receptor regulates integrin activity through R-Ras. Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 13813-8）。ＥＰＨ-Ｅｐｈｒｉｎ系の活性化の後に放出されるシグナルは、異なる組織の細胞間の吸引力と反発力を制御する。これらのシグナルは、脈管構造と神経系の組織化に重要である（Altick et al., (2005) EphB receptor tyrosine kinases control morphological development of the ventral midbrain. Mech Dev, 122, 501-12; Noren et al., (2004) Interplay between EphB4 on tumor cells and vascular ephrin-B2 regulates tumor growth. Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 5583-8）。
【００１０】
最近では、腸陰窩の構造の維持と細胞移動における種々のＥＰＨおよびＥｐｈｒｉｎの重要な役割が実証されている（Batlle et al., (2002) Beta-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell, 111, 251-63; van de Wetering et al., (2002) The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell, 111, 241-50）。
【００１１】
腫瘍抑制遺伝子ＡＰＣ内の変異は、結腸直腸癌において最も頻繁に認められる遺伝的変異である。ＡＰＣの正常な機能は、ＧＳＫ３-βおよびＡｘｉｎを含む多タンパク質複合体における分解のためのβ-カテニンの標識を促進することである。しかしながら、ＡＰＣ（または前記複合体の他のメンバー）の変異により、β-カテニンの蓄積と核転座が起こる。核内では、β-カテニンは、ＴＣＦファミリーの転写因子に結合して、多数の遺伝子の転写を活性化させ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄや転写因子ｃ-Ｍｙｃ等、これらの遺伝子のうちのいくつかは強力な発癌活性を示す（He et al., (1998) Identification of c-MYC as a target of the APC pathway. Science, 281, 1509-12）。Ｃｌｅｖｅｒｓ博士のグループによる最近の研究（Batlle et al., (2002) Beta-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell, 111, 251-63）では、β-カテニン/ＴＣＦ系が種々のＥＰＨ/Ｅｐｈｒｉｎ系メンバー（ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３およびＥｐｈｉｎ-Ｂ１）の発現レベルを調節することが示されている。ＥＰＨＢ２および/またはＥＰＨＢ３が欠損した動物は、腸陰窩における異常な細胞移動パターンを示し、マウスモデルのＡＰＣ変異により生じた腸の腫瘍では、高レベルのＥＰＨＢ２発現が示されている（Batlle et al., (2002) Beta- catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell, 111, 251-63）。加えて、最近の研究により、動物モデルとヒトの腫瘍の両方において、ＥＰＨＢ２の欠損が、ＡＰＣの変異により生じる胃腸の腫瘍の進行に重要であることが示されている（Batlle et al., (2005) EphB receptor activity suppresses colorectal cancer progression. Nature, 435, 1126-30）。
【００１２】
結腸直腸癌において重要な部分は、ミスマッチ塩基の修復システムが欠損していることであり、これによって腫瘍細胞内の変異の数が増大する。この効果は、マイクロサテライトと呼ばれるモノヌクレオチドまたはジヌクレオチドの配列を有するゲノム領域において特に顕著である。この表現型は、ＭＳＩ（「不安定なマイクロサテライト（microsatellite instable）」）として知られており、例えば、ＴＧＦ-βレセプターＩＩまたはＢＡＸのような腫瘍の開始と進行に重要な遺伝子のコーディング配列中のマイクロサテライトに変異を獲得した腫瘍を選別する。先の研究では、結腸直腸癌腫の５２.２％（７１/１３６）に、腸管上皮内での細胞の位置を調節するレセプターの１つであるＥＰＨＢ２のエキソン１７のマイクロサテライトＡ９におけるＭＳＩ表現型が確認されており、結腸直腸腫瘍の進行におけるその機能の重要性も最近において実証されている。また、塩基の修復システムに欠陥を有しないタイプ（ＭＳＳ：安定なマイクロサテライト（microsatellite stable））の腫瘍では、５２.５％（２１/４１）が、ＥＰＨＢ２プロモーターのＣｐＧアイランドの過剰メチル化を示し、４０％（８/２１）が、ＥＰＨＢ２が位置するゲノム領域である染色体１ｐ３６におけるヘテロ接合性の喪失（loss of heterozigosity：ＬＯＨ）を患っている。これらの過剰メチル化と染色体の欠失は、正常な上皮と比べて結腸直腸腫瘍に認められたＥＰＨＢ２の低下を説明する、エピジェネティックな機構である。また、最近の研究では、ＥＰＨＢ２が低レベルであることが、鋸歯状の組織学的特徴を有する新しいタイプの結腸直腸腫瘍（「鋸歯状腫瘍」）を同定する分子的因子の１つであることが示されている。
【００１３】
ＥＰＨとＥｐｈｒｉｎは、ＲａｓおよびＲｈｏ等のシグナルカスケードを通じて粘着性と細胞移動を制御している（Elowe et al., (2001) Downregulation of the Ras-mitogen- activated protein kinase pathway by the EphB2 receptor tyrosine kinase is required for ephrin-induced neurite retraction. Mol Cell Biol, 21, 7429-41 ; Tanaka et al., (2003). Association of Dishevelled with Eph tyrosine kinase receptor and ephrin mediates cell repulsion. Embo J, 22, 847-58; Zou et al., (1999) An Eph receptor regulates integrin activity through R-Ras. Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 13813-8）。上記の知見と同様に、最近では、結腸直腸腫瘍におけるＲＨＯＡの低レベルな発現が、結腸直腸癌患者の生存率の有意な低下（ｐ＝０.０１）と関連付けられている（Arango et al., (2005) Utilization of microarray analysis to predict prognosis of Dukes C colorectal cancer patients. Gastroenterology, 129, 874-884）。
【００１４】
実際に、新たな予後マーカーと結腸直腸癌患者の処置に対する応答性を予測する新たなマーカーを見つける必要性が大いに存在する。研究において有用性を示した、ますます増加する多数のマーカーは、未だにルーチンな臨床用途に転用されておらず（Alazzouzi et al., (2005) SMAD4 as a prognostic marker in colorectal cancer. Clin Cancer Res, 11, 2606-2611 ; Alhopuro et al., (2005) SMAD4 levels and response to 5-fluorouracil in colorectal cancer. Clin Cancer Res. Sep 1;11 (17):6311-6; Arango et al., (2001) c-myc/p53 interaction determines sensitivity of human colon carcinoma cells to 5-fluorouracil in vitro and in vivo. Cancer Res, 61, 4910-5; Arango et al., (2005) Utilization of microarray analysis to predict prognosis of Dukes C colorectal cancer patients. Gastroenterology, 129, 874-884; Arango et al., (2003) c-Myc overexpression sensitizes colon cancer cells to camptothecin-induced apoptosis. British Journal of Cancer, 89, 1757-65）、結腸直腸癌患者は、その予後と処置に対する応答性に示される高い不均一性にもかかわらず、共通の基本的な処置を受け続けている。また、先の研究では、ＥＰＨレセプターファミリーの他のメンバーの発現レベルの非制御が確認されている（Martiny-Baron et al., (2004) Inhibition of tumor growth and angiogenesis by soluble EphB4. Neoplasia, 6, 248-57; Wu et al., (2004) Expression of Ephb2 and Ephb4 in breast carcinoma. Pathol Oncol Res, 10, 26-33; Xia et al., (2005) EphB4 expression and biological significance in prostate cancer. Cancer Res, 65, 4623-32）。
【発明の開示】
【００１５】
本発明によれば、ＥＰＨＢ４は、結腸直腸腫瘍中のＥＰＨＢ４の発現レベルにより結腸直腸癌患者の再発と生存の可能性を予測することができるという点で、良好な予後マーカーであり、かつ結腸直腸癌患者の５ＦＵを用いた処置に対する応答性のマーカーでもある。ＥＰＨＢ４が低レベルで発現している場合には、平均余命が１.８年の患者グループが同定でき、これに対して、ＥＰＨＢ４が高レベルなグループは、９年を超える平均余命を有することになる。これらの結果は２つの独立した研究のデータから得られたことを強調する必要がある。ＥＰＨＢ４のレベルが低い腫瘍患者は、予後が悪く、５ＦＵ処置に対する応答性が低い。その結果、バイオプシー中または腫瘍の外科的切除後のＥＰＨＢ４レベルの解析を行うことにより、基本的な処置（外科手術＋５ＦＵ）に対する応答性を示す可能性の低い患者が同定可能であり、これらの患者については、オキサリプラチンおよび/またはカンプトテシンを用いた化学療法を含む、より強力な処置法が示唆されることになる。
【００１６】
本発明の目的は、患者から単離した生体試料中のＥｐｈＢ４の発現レベルを測定することを含む結腸直腸癌の予後方法であって、ここで、該発現レベルが予後マーカーおよび５-フルオロウラシルを用いた処置に対する結腸直腸腫瘍の応答性のマーカーとして用いられる方法に関する。
【００１７】
特に、上記遺伝子の低レベルな発現は、予後不良と５-フルオロウラシルを用いた処置に対する結腸直腸腫瘍の低い感受性を示しており、一方で高レベルな発現は、良好な予後と処置に対する感受性の高さを示す。
【００１８】
本発明のある態様では、解析する試料は、ＥｐｈＢ４をコードするＲＮＡまたはこのＲＮＡの断片であってもよく、バイオプシーまたは他の摘出方法により得られた細胞から単離できる。好ましくは、測定は、ＰＣＲ、ＳＤＡまたは他の何らかの核酸の増幅方法による増幅を通じて行うことができる。これに代わり、測定は、オリゴの沈着またはフォトリソグラフィー若しくは他の機構によるインサイチュ（in situ）での合成を通じて調製したＤＮＡマイクロアレイを用いて行うこともできる。これに代わり、測定は、あらゆる種類の標識方法で標識されたプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションを通じて行うこともできる。これに代わる場合には、測定はゲル電気泳動により行われ、この場合、電気泳動は、任意にメンブランへの転写と特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより行うこともできる。これに代わる場合、測定は、ＮＭＲまたは画像解析を介した他のいずれかの診断技術により行われる。これに代わる場合、測定は、ＮＭＲまたは画像解析と常磁性ナノ粒子若しくは別の種類の抗体と機能化された検出可能なナノ粒子の使用を介した他のいずれかの診断技術またはその他の手段により行われる。
【００１９】
本発明のある態様では、解析する試料は、前記遺伝子にコードされるタンパク質またはその断片であってもよい。好ましくは、測定は、特異的な抗体とのインキュベーションにより行われる。測定は、随意に、ウェスタンブロット法または免疫組織化学的手法により行うことも可能である。これに代わる場合、測定は、タンパク質ゲル電気泳動により行われる。これに代わる場合、測定は、プロテインマクロアレイにより行われる。これに代わる場合、測定は、ＥＬＩＳＡまたは他のいずれかの酵素的方法により行われる。これに代わる場合、測定は、ＮＭＲまたは画像解析を介した他のいずれかの診断技術により行われる。これに代わる場合、測定は、ＮＭＲまたは常磁性ナノ粒子若しくは別の種類の抗体若しくは他のいずれかの手段と機能化された検出可能なナノ粒子を使用した画像解析を介した他のいずれかの技術により行われる。
【００２０】
本発明の更なる目的は、ＥｐｈＢ４遺伝子の発現レベルの測定に適した試薬と添加剤とを含んでなる、結腸直腸癌の予後方法に適用されるキットに関する。
【００２１】
また、本発明が有する目的としては、特異的な抗ＥＰＨＢ４抗体、該１次抗体に結合可能な２次抗体、可視化用試薬、発色物質並びに組織切片中のＥｐｈＢ４遺伝子の発現の測定に必要な他の試薬および添加剤を含んでなるキットがある。
【００２２】
ある態様では、前記キットは、ＥｐｈＢ４の発現レベルの定量化を可能にするポジティブコントロールとネガティブコントロールを含む。この定量化は、手作業または自動化された態様で行うことができる。
【００２３】
本発明の別の目的は、結腸直腸癌において治療効能を有する化合物の解析方法であって、これらの化合物のＥｐｈＢ４遺伝子の発現レベルを上昇させる能力を測定することを含んでなる方法に関する。
【００２４】
また、本発明は、上記の方法において治療効能を有する化合物の有効量と１または２種類以上の医薬的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００２５】
一方で、本発明は、結腸直腸癌またはその前癌状態の処置若しくは予防のための医薬の調製のための、上記の方法により得られる治療効能を有する化合物の使用に関する。本明細書で用いる場合、「処置」という用語は、このような状態の処置および管理、並びに新たな腫瘍に対する予防も含む。
【００２６】
本発明では、高レベルと低レベルを区別する閾値の評価は、ＥｐｈＢ４の発現レベルの測定に用いる技術に依存する。従って、例えば、免疫組織化学的手法を用いた半定量的な解析を採用する場合、０ないし４の等級において、２という閾値を用いた。
【００２７】
特異的な抗ＥＰＨＢ抗体を用いた結腸直腸癌の組織切片の免疫組織化学的手法（ＩＨＱ）により行った試験では、結腸直腸上皮内でのＥＰＨＢ４の発現に明確な勾配が示され、発現は、陰窩の深部において最大であり、管腔領域において低下していた（図１、１-２）。結腸直腸腫瘍内でのＥＰＨＢ４の発現レベルには、大きな差異が認められた（図１、４-８）。
【００２８】
加えて、１３７種類のヒト結腸直腸腫瘍のコレクションにおけるＥＰＨＢ４の発現レベルを、組織マイクロアレイの切片でのＩＨＱにより試験した（表１）。ＥＰＨＢ４の発現レベルが低い患者は、有意に短い余命を有することが確認された（ｐ＝０.００９）（図２ａ）。ＥＰＨＢ４を独立変数として考慮した場合、低レベルのＥＰＨＢ４と全体的な生存率または無症候時間との間に有意な関連性が認められた（Ｃｏｘ回帰 ｐ＜０.０５）。また、性別、年齢、腫瘍の位置（結腸または直腸）、組織学的グレードおよびＥＰＨＢ４のレベルを含む多変量解析においても、これらは依然として全体の生存率と無症候時間の強力な予後マーカーであり続けた（Ｃｏｘ回帰はそれぞれｐ＝０.００５およびｐ＝０.００９）。これらの結果については、１２５種類の結腸直腸腫瘍から成る第２のコレクションを用いることで独立して確認した（表２および図２ｂ）。これに加え、別の１６名の結腸直腸癌患者の１６種類の転移細胞とリンパ節におけるＥＰＨＢ４の発現レベルも試験した；これらの転移細胞では、原発腫瘍よりも低いＥＰＨＢ４レベルが検出され（ｔ-検定；ｐ＝０,０２７）、低いＥＰＨＢ４レベルが結腸直腸癌患者の予後不良の指標であるという考えが支持される結果となった。ＥＰＨＢ４レベルと他の臨床病理学的変数との間に関連性は認められなかった（表１および２）。
【００２９】
表１：本試験における１３７名のDuke分類Cの患者の臨床病理学的因子
【表１】
2009540813.tif 000002
【００３０】
表２：第２確認試験における１２５名のDuke分類Cの患者の臨床病理学的因子
【表２】
2009540813.tif 000003
【００３１】
これらのデータをまとめると、ＥＰＨＢ４レベルが、予後マーカーおよび結腸直腸癌患者の標準的処置に対する応答性を予測するマーカーとして使用可能なことが示される。このマーカーを臨床的に用いることで、標準的治療法で処置した場合に予後が悪く、より強力な処置が有益である患者を同定することができる。
【００３２】
結腸直腸腫瘍におけるＥＰＨＢ４の可能な機能を実証するため、この遺伝子を発現しない結腸直腸癌セルライン（ＳＷ８３７；３Ａ）にＥＰＨＢ４を再導入した。これらの細胞への発現ベクターの安定なトランスフェクションにより、空ベクターでトランスフェクトした培養細胞と比べて長期間のコロニー形成能を有する細胞の数が有意に減少した（図３Ｂ）。これらの実験により、ＥＰＨＢ４が結腸直腸癌患者の予後マーカーとして使用できることが実証されただけでなく、ＥＰＨＢ４が、この器官内での癌の進行に重要な役割を有することも示されている。
【００３３】
結果として、本発明により、発達段階に関わらず、ＥＰＨＢ４のレベルと結腸直腸癌患者（５-フルオロウラシルによる処置を受けていても受けていなくても）の再発の可能性との相関性が示されており、このことは、結腸直腸癌の予後を判断してその患者に最も適切な処置を選択すること（先に利用可能であった方法では不可能であった）を可能にする新規な分子ツールが得られたことを意味している。
【００３４】
また、本発明により、治療効能を有する有効量の化合物を含む医薬組成物が提示される。具体的には、ＥｐｈＢ４が、結腸直腸癌細胞において高頻度でメチル化を受けていること；および５-ａｚａ-シチジンがこのメチル化を減少させてＥｐｈＢ４の発現を促進することが示された。ＥｐｈＢ４の発現レベルと予後の間に相関性があることから、５-ａｚａ-シチジンまたはこの遺伝子の発現を上昇させることが可能な他の化合物を用いた処置により、結腸直腸癌の予後と５-フルオロウラシルを用いた処置に対する腫瘍の応答性を変化させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】結腸直腸組織中でのＥＰＨＢ４発現レベル。抗ＥＰＨＢ４抗体を用いた免疫組織化学染色では、正常な結腸直腸上皮における、陰窩の中央部に最大レベルを有する発現の勾配が示されている（１-２）。ＥＰＨＢ４は、解析した大部分の腫瘍の細胞膜に主として位置する（３）。調べた１３７種類の結腸直腸腫瘍において、ＥＰＨＢ４の発現レベルは大きく異なっていることが観察された（４-８）。
【図２】腫瘍における低レベルのＥＰＨＢ４は、結腸直腸癌患者の予後不良と関連性を有する。Ａ）全生存率を示す曲線（Ｋａｐｌａｎ-Ｍａｙｅｒ）およびＤｕｋｅｓ分類Ｃにある１３７名の結腸直腸癌患者における再発を伴わない生存率。低レベルのＥＰＨＢ４を示す患者は、高レベルのＥＰＨＢ４を示す腫瘍患者と比べて有意に短い余命を有する（ログランク検定  ｐ＜０.０１）。Ｂ）この結果は、Ｄｕｋｅｓ分類Ａ-Ｄにある別の１２５名の結腸直腸癌患者からなるグループでも独立して確認された。腫瘍細胞中のＥＰＨＢ４発現レベルが低い患者は、高いＥＰＨＢ４レベルを示す腫瘍患者よりも予後が悪い（ログランク検定  ｐ＝０.０２）。
【図３】無疾患の時間を表す生存曲線（Ｋａｐｌａｎ Ｍａｙｅｒ）。ＥＰＨＢ４レベルは、抗ＥＰＨＢ４抗体を用いた組織染色後に画像解析により定量化した。分画化した領域を算出し、分画化した領域が５０％を超える場合にＥＰＨＢ４発現が高いものと定義した。腫瘍細胞中のＥＰＨＢ４発現レベルが低い患者は、高いＥＰＨＢ４レベルを示す腫瘍患者よりも高い統計学的有意性を以て予後が悪い（Ｐ値、０.００６５）。
【図４】結腸直腸腫瘍細胞内へのＥＰＨＢ４の再導入により、コロニー形成能が低下する。Ａ）結腸直腸腫瘍セルラインにおいて、ウェスタンブロッティングで測定したところＥＰＨＢ４のレベルに大きな違いが認められた。β-アクチンのレベルをローディングコントロールとして用いた。ＥＰＨＢ４の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ-ＥＰＨＢ４）を用いたＳＷ８３７細胞のトランスフェクションにより、１４日間のセレクションの後にネオマイシン耐性を示すコロニー数が有意に減少した。クリスタルバイオレットを用いたコロニー染色の代表的な結果を下部のパネルに示す。上の部分のヒストグラムには、３つの系の独立した実験で観察されたコロニー数の定量の結果が示されている（平均値±標準偏差；＊ｔ検定  ｐ＝０.０００８）。
【図５】結腸直腸癌セルラインＳＷ６２０を５-ａｚａ-シチジンで処理すると、ＥｐｈＢ４プロモーターのメチル化が減少し、その遺伝子発現が促進される。パネル上部：ＲＴ-ＰＣＲで測定した遺伝子発現の変化。パネル下部：亜硫酸水素塩処理したＤＮＡに対するメチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲにより測定したメチル化の変化。
【実施例】
【００３６】
以下において、本発明の非限定的な実施例を記載する。
【００３７】
実施例１：免疫組織化学的手法による結腸直腸腫瘍細胞内のＥｐｈＢ４レベルの測定
本実験において、１３７名の患者に由来する結腸直腸の腫瘍試料と正常試料のペアからなる組織マイクロアレイを用いた。各組織は、３つの系に用意した。試料は、フィンランド南部の複数の医学研究所において、全ての患者とのインフォームドコンセントの後に採取した。ＥＰＨＢ４の発現レベルは、ヒトＥＰＨＢ４のＣ末端領域に対する抗体（Ｃｌｏｎｅ ３Ｄ７Ｇ８；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）を用いた免疫組織化学的手法により測定した。この抗体の特異性は、既に、ホルマリン固定してパラフィン包埋した組織において実証されている（Berclaz et al., (2003) Activation of the receptor protein tyrosine kinase EphB4 in endometrial hyperplasia and endometrial carcinoma. Ann Oncol, 14, 220-6）。免疫組織化学染色においては、市販のＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ Ｐｏｌｙ-ＨＲＰ ＩＨＣキット （ＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｓ社、ブリズベン、カリフォルニア州、米国）を製造元の推奨方法に従って用いた。ＥＰＨＢ４発現レベルの定量には、０（染色無し）ないし４（その組織マトリックス中に認められる最も高い染色レベル）からなる半定量的スケールを用いた。図１に認められるように、正常組織の腸陰窩の中央部では、発現レベルは４に達している。腫瘍におけるＥＰＨＢ４の発現レベルと生存率との潜在的な相関関係に関する試験では、マトリックス中の３つの重複する系の平均値を用いた。生存率の解析では、Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｙｅｒ表示とログランク検定、並びにＣｏｘ回帰モデルを用いた。ＥＰＨＢ４のレベルを離散変数として考慮した場合、腫瘍中のＥＰＨＢ４発現レベルが低い患者群を定義する域値として２未満の発現を用いた。
【００３８】
実施例２：免疫組織化学的染色後の画像解析による結腸直腸腫瘍中のＥＰＨＢ４レベルの測定
実施例１で用いたペア試料であって実施例１で記載された染色に用いたのと同一の組織マイクロアレイを用いて画像解析を行った。異常（悪性状態の組織）を伴わない全ての切片を定量化した。全部で、結腸直腸癌患者由来の８６種類の組織試料を解析した。全ての試料は、３つの重複する系で用い、腫瘍組織に相当する切片を解析した。
【００３９】
上記マイクロアレイ中に存在する各切片に対応する画像を、ＡｎａｌｙＳＩＳ、Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＧＭＢＨソフトウェアを用いて光学顕微鏡により獲得した。画像解析も同一のソフトウェアを用いて行った。
【００４０】
以下のフィルターを用いてオリジナル画像を処理した：ＤＣＥ（微分コントラスト増強（Differential Contrast Enhancement））コントラストフィルター。帯域幅のパラメーターを６０に固定し、増強度を４０に固定した；エッジ増強フィルター、粒系を３ピクセルに固定し、増強度を３０％に固定した；グレースケールへ転換し、ヘマトキシリンエオジンによるカウンター染色で染色された細胞核を除去するため、９００ピクセルの最小サイズで粒子をフィルターにかけた。測定したパラメーターは以下の通り：分画化した領域面積、対象領域中のグレースケールの積分平均値；グレースケールの平均値と分散。
【００４１】
これらの変数を半自動的に測定するためマクロを用いて記載した。使用したマクロは以下の通り：
'open document
docRestore();
Op.Activate(); 
docMaximize();
'define analiysis area
DefineROIs$();
'DCE Filter
DefineDCEFilter$(File:=NULL);
DCEFilter(File:=NULL);
'Edge filter
DefineEdgeEnhance(Size:=3, Percent:=30);
EdgeEnhance();
'Color separation
ColorSeparationIntensity();
'Detection parameters
SetGrayThresholds$(Thresholds:=NULL, AutoName:=NULL);
DefineDetection(ROIs:=1, Border:=ANA_BORDER_CUT,
Inclusions:=TRUE, MinPixel:=900, Min:=0, Max:=DBL_MAX,
Unit:="μm", Connectivity:=ANA_CON_INCLDIAGONALS,
UseRanges:=TRUE);
'Detection and copy results
Detect();
FrameROIResults();
shSetSelection (0, SH_SEL_ROW, 1);
Copy();
Close(AskForSave:=TRUE); 
【００４２】
図３では、マトリックス中の３か所の平均値を用いた。生存率を解析するため、Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｙｅｒ表示とログランク（Ｍａｎｔｅｌ-Ｃｏｘ）検定表示を用いた。ＥＰＨＢ４のレベルは、離散変数として処理した。ＥＰＨＢ４のレベルが低い患者群は、分画領域面積（前腫瘍面積に対して、カットオフレベルを超える抗ＥＰＨＢ４抗体が認められる領域）が５０％未満の組織を有する者として定義した。
【００４３】
画像解析による免疫組織化学的結果の定量は、手作業による解剖病理学的検証よりも高い有意差を示しており、無疾患時間に対するＥＰＨＢ４レベルの予後値が確認される（手作業による測定ではｐ＝０.００９、画像解析ソフトウェアを用いた自動測定ではｐ＝０.００６５）。
【００４４】
実施例３：ウェスタンブロットによる結腸直腸癌セルライン中のＥｐｈＢ４レベルの測定
１００マイクログラムの結腸直腸癌セルライン由来タンパク質抽出物の分画を７％ ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルで分離した。このタンパク質をニトロセルロースメンブランに転写し、先の論文（Arango et al., (2003) c-Myc overexpression sensitizes colon cancer cells to camptothecin-induced apoptosis. British Journal of Cancer, 89, 1757-65）に記載されたように抗ＥＰＨＢ４抗体（希釈率１/２００；クローン３Ｄ７Ｇ８；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、サンフランシスコ、カリフォルニア州）で染色した。その後、このメンブランを抗アクチン抗体（クローンＡＣ７４、１/１０００；Ｓｉｇｍａ社）で染色し、各レーンに等量がローディングされていることを確認した（Arango et al., (2003) c-Myc overexpression sensitizes colon cancer cells to camptothecin-induced apoptosis. British Journal of Cancer, 89, 1757-65）。
【００４５】
実施例４：コロニー形成アッセイ
ＳＷ８３７培養細胞を、ＥＰＨＢ４の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ-ＥＰＨＢ４）またはこれに対応する空ベクター（ｐｃＤＮＡ３.１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州、米国）でトランスフェクトした。２４時間後に細胞をトリプシン処理し、１/１０の希釈率で継代した。５００ μｇ/ｍｌのネオマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州、米国）で２週間セレクションした後、生存するコロニーを４％パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。
【００４６】
実施例５：結腸直腸癌セルラインの処理
低い発現レベルとＥｐｈＢ４プロモーターのメチル化を特徴とする結腸直腸癌セルラインＳＷ６２０の培養細胞を、異なる濃度の５-ａｚａ-シチジンで７２時間処理した。細胞は、ＲＴ-ＰＣＲで測定したところ、遺伝子発現量の上昇により応答を示し、最も効果的な用量は１０μＭであった。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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2009540813.tif 000008
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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