(57)【要約】  対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定することによって癌または前悪性の病変を診断するための方法およびキットが提供される。ＣＤ２４核酸配列および／またはＡＰＣ核酸配列における同型接合形態または異型接合形態の癌関連遺伝子型の存在または非存在を決定することによって対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定するための方法およびキットもまた提供される。対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定することによって癌治療の有効性を監視するための方法およびキットもまた提供される。【選択図】  図２
2009525041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌または前悪性の病変を診断する方法であって、それを必要とする対象における循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定することを含み、所定の閾値より高い前記循環ＣＤ２４の前記存在および／または前記レベルは、癌または前悪性の病変の指標である、方法。
【請求項２】
前記前悪性の病変は腺腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記決定は生体外で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記決定は生体内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記循環ＣＤ２４は脱け落ちたＣＤ２４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記循環ＣＤ２４は泡状突起中のＣＤ２４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記循環ＣＤ２４は可溶性ＣＤ２４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記前悪性の病変は固形腫瘍に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記前悪性の病変は胃腸管の癌に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌は胃腸管の癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記胃腸管の癌は結腸直腸癌である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記循環ＣＤ２４は、糞便サンプル、血清サンプル、血液サンプル、尿サンプル、および唾液サンプルからなる群から選択される生物学的サンプル中に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記決定はタンパク質レベルで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
包装材、および対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定するための少なくとも１つの試薬を含む、癌または前悪性の病変を診断するためのキット。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの試薬はＣＤ２４特異的抗体を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定する方法であって、対象のＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定することを含み、それによって対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定する、方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの２８０位にチミジンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象のＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子および配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
包装材、および対象のＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定するための少なくとも１つの試薬を含む、対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定するためのキット。
【請求項２４】
前記ＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの２８０位にチミジンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
対象のＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子および配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
癌治療の有効性を監視する方法であって、癌治療後の対象の生物学的サンプルにおける循環ＣＤ２４のレベルを決定することを含み、癌治療後の循環ＣＤ２４のレベルにおける所定の閾値からの低下は癌細胞の低減の指標であり、それによって癌治療の有効性を監視する、方法。
【請求項３０】
前記決定は生体外で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記決定は生体内で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記循環ＣＤ２４は脱け落ちたＣＤ２４を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記循環ＣＤ２４は泡状突起中のＣＤ２４を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記循環ＣＤ２４は可溶性ＣＤ２４を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌は固形腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌は胃腸管の癌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記胃腸管の癌は結腸直腸癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的サンプルは、糞便サンプル、血清サンプル、血液サンプル、尿サンプル、および唾液サンプルからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記決定はタンパク質レベルで行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
癌治療は放射線療法を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
癌治療は化学療法を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
癌治療は抗体療法を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
包装材、および対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定するための少なくとも１つの試薬を含む、癌治療の有効性を監視するためのキット。
【請求項４４】
癌治療の有効性の監視に使用するための指示書をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの試薬はＣＤ２４特異的抗体を含む、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ２４を用いる癌またはその素因を非侵襲的に早期検出するための方法およびキットに関し、より具体的には、生物学的サンプルにおける可溶性ＣＤ２４、脱け落ちた（ｓｈｅｄｄｅｄ）ＣＤ２４および／または泡状突起中の（ｂｌｅｂｂｅｄ）ＣＤ２４の発現レベルを決定することによって癌または前悪性の病変を診断するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、米国およびイスラエルにおいて男性および女性の両方における三番目に最も一般的な癌であるので、西洋諸国における主要な健康上の関心事である。この形態の癌は、数年にわたって獲得される種々の遺伝的および後成的な変化を伴う段階的なプロセスを経て発現し、最終的には正常な上皮の新生物への変換に至る。この疾患は、長い潜伏期間を有するが、疾患検出のための現在利用可能なマーカーは、結腸または胃の内視鏡検査のような侵襲的な試験に限られており、それらはしばしば、疾患が既に広がってから疾患を検出する。
【０００３】
癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における変異、種々の遺伝子における異常な遺伝子発現および遺伝的欠損は、ＣＲＣの発癌に深く関係している。一連の結腸腫瘍の対立形質に基づき、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよび共同研究者らは、ＡＰＣ−βカテニン−Ｔｆｃ経路の活性化の後に起こる分子的段階が、正常な結腸の粘膜から転位性癌への移行に付随する特定の遺伝的変化の非線形蓄積を伴うことを示した。これらは、ｋ−Ｒａｓ癌遺伝子における変異、メチル化パターンの変化、ＤＣＣ（Ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ遺伝子）およびＳＭＡＤ（ショウジョウバエのＭｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＭＡＤ）タンパク質およびＣ．エレガンスのタンパク質であるＳＭＡの相同体）の欠失、およびｐ５３における変異を含む。
【０００４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）のような胃腸管（ＧＩ管）の癌に対する現在利用可能なスクリーニング方法は、糞便の潜血検査（ＦＯＢＴ）を含む。しかしながら、臨床試験は、連続的なＦＯＢＴによるスクリーニングがＣＲＣの死亡率を低減したことを示したが（Ｍａｎｄｅｌ  Ｊら、１９９３）、ＦＯＢＴの感度は制限されている（６０％；ＭｃＭａｈｏｎ  ＰＭら、２００１）。数種のマーカーが、非侵襲的な診断ツールとして最近提案されている。これらは、糞便サンプルにおいて検出されることができるタンパク質（例えば、糞便のカルプロテクチン、ラクトフェリン、リソチーム、アルブミン、α−１−抗トリプシン、癌胚抗原（ＣＥＡ）、崩壊加速因子（ＤＡＦ）、小染色体維持タンパク質（ＭＣＭ２））またはｍＲＮＡ（例えば、糞便のＣＯＸ−２）（Ｋａｎａｏｋａ  Ｓ．ら、２００４）、および血清サンプルにおいて検出されることができるニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）（Ｒｏｅｓｓｌｅｒ  Ｍ．ら、２００５）またはプロテアソーム活性化因子複合体サブユニット３（ＰＳＭＥ３）（Ｒｏｅｓｓｌｅｒ  Ｍ．ら、２００６）のようなタンパク質を含む。しかしながら、それらの低い感度および特異性のために、これらのマーカーは臨床で使用されていない。
【０００５】
マウスの熱安定性抗原（ＨＳＡ）としても知られているＣＤ２４は、高度にグリコシル化された、フォスファチジルイノシトール固定されたムチン様細胞表面タンパク質である。生理学的には、ＣＤ２４タンパク質は、Ｂリンパ球の造血小集団、種々の上皮細胞、筋肉細胞および神経細胞上で主に発現される。ＣＤ２４は、造血時の細胞選択および細胞成熟において重要な役割を果たし、胚期の間に神経細胞および膵臓細胞の発生につれて発現される。さらに、ＣＤ２４は、血小板凝集を高める接着分子として機能するＰ−セレクチンに対する潜在的なリガンドである。
【０００６】
ＣＤ２４の細胞性機能は今でも知られていないが、最近の報告は、細胞内シグナル伝達の開始へのＣＤ２４の関与を強めた。Ｓｃｈａｂａｔｈら（Ｓｃｈａｂａｔｈ  Ｈら、２００６）は、ＣＤ２４の発現を、ＣＸＣＲ−４ケモカインレセプターの下方制御と関連づけた。さらに、ＣＤ２４は、Ｂ細胞リンパ腫、神経膠腫、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、鼻咽腔癌、膀胱癌、子宮癌、上皮卵巣癌、乳癌、前立腺癌および膵癌を含む種々の悪性組織において過剰発現される（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、２００４によって概説される）。そのうえ、ＣＤ２４の発現は、数種の器官に由来する癌細胞株の増大された増殖率、運動性および生存性と相関し（Ｂａｕｍａｎｎ  Ｐら、２００５；Ｓｍｉｔｈ  ＳＣら、２００６）、癌のより攻撃的な経過と相関することが見出された。従って、Ｗｅｉｃｈｅｒｔ  Ｗ．ら（２００５）は、細胞質におけるＣＤ２４の増大された発現がより高い腫瘍の病期、進行度および転移の存在と相関することを見出し、（細胞における過剰生成または分布の妨害の結果としての）細胞質におけるＣＤ２４の過剰発現が悪い予後のマーカーであると結論づけた。さらに、血小板凝集におけるＣＤ２４の役割は、癌の転移およびより悪い予後への関与を説明することができる（Ｓａｍｍａｒ，Ｍ．ら、１９９４；Ａｉｇｎｅｒ，Ｓ．ら、１９９７；Ａｉｇｎｅｒ，Ｓ．ら、１９９８）。
【０００７】
Ｌｉ  Ｊ．らの米国特許出願第２００４０００５５９６号は、前癌状態または癌であると疑われる組織サンプルにおいてその場でのＣＤ２４のレベルを決定することによって癌を診断する方法を開示しており、従ってこの方法もまた、癌の検出のために侵襲的な手順を必要とする。
【０００８】
従って、上記の制限が無い、癌を診断する方法、特に前悪性の段階で癌を診断する方法に対して広く認識された必要性があり、またそれを持つことは非常に有利であろう。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の１つの態様によれば、癌または前悪性の病変を診断する方法が提供され、この方法は、それを必要とする対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定することを含み、所定の閾値より高い循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルは、癌または前悪性の病変の指標である。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、包装材、および対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定するための少なくとも１つの試薬を含む、癌または前悪性の病変を診断するためのキットが提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様によれば、癌治療の有効性を監視する方法が提供され、この方法は、癌治療後の対象の生物学的サンプルにおける循環ＣＤ２４のレベルを決定することを含み、癌治療後の循環ＣＤ２４のレベルにおける所定の閾値からの低下は癌細胞の低減の指標であり、それによって癌治療の有効性を監視する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定する方法が提供され、この方法は、対象のＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定することを含み、それによって対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定する。
【００１３】
本発明のさらなる態様によれば、包装材、および対象のＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定するための少なくとも１つの試薬を含む、対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定するためのキットが提供される。
【００１４】
本発明のなおさらなる態様によれば、包装材、および対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定するための少なくとも１つの試薬を含む、癌治療の有効性を監視するためのキットが提供される。
【００１５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記前悪性の病変は腺腫である。
【００１６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、決定は生体外で行われる。
【００１７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、決定は生体内で行われる。
【００１８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ２４は脱け落ちたＣＤ２４を含む。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ２４は泡状突起中のＣＤ２４を含む。
【００２０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ２４は可溶性ＣＤ２４を含む。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前悪性の病変は固形腫瘍に関連する。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、癌は固形腫瘍である。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、癌は胃腸管の癌である。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前悪性の病変は胃腸管の癌に関連する。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、胃腸管の癌は結腸直腸癌である。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前悪性の病変は、リンパ腫、神経膠腫、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、鼻咽腔癌、膀胱癌、子宮癌、上皮卵巣癌、乳癌、前立腺癌および膵癌からなる群から選択される癌に関連する。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、循環ＣＤ２４は、糞便サンプル、血清サンプル、血液サンプル、尿サンプル、および唾液サンプルからなる群から選択される生物学的サンプルに関連する。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、決定はタンパク質レベルで行われる。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの試薬はＣＤ２４特異的抗体を含む。
【００３０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの試薬は、ＣＤ２４核酸配列に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを含む。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの２８０位にチミジンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法は、対象のＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定することをさらに含む。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットは、対象のＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子および配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、癌治療は放射線療法を含む。
【００３８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、癌治療は化学療法を含む。
【００３９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、癌治療は抗体療法を含む。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットは、癌治療の有効性の監視に使用するための指示書をさらに含む。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットは、癌治療の有効性の監視に使用するための指示書をさらに含む。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットは、対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかの決定に使用するための指示書をさらに含む。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、キットは、対象における癌または前悪性の病変の診断に使用するための指示書をさらに含む。
【００４４】
本発明は、生物学的サンプルにおいて前悪性の病変を診断するための方法およびキットを提供することによって、現在知られている構成の欠点に対処することに成功している。
【００４５】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４６】
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」またはその文法上の変化形は、記述されている特徴、数値、工程または成分を特定しているとみなすべきであるが、１つ以上の追加の特徴、数値、工程、成分またはそれらの群を追加することを妨げない。この用語は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【００４７】
語句「から本質的になる」またはその文法上の変化形は、本明細書中で使用する場合、記述された特徴、数値、工程または成分を特定しているとみなすべきであるが、１つ以上の追加の特徴、数値、工程、成分またはそれらの群を追加することを妨げない。しかし追加の特徴、数値、工程、成分またはそれらの群が、特許請求されている組成物、装置または方法の基本的な新規の特徴を著しく変えない場合だけである。
【００４８】
用語「方法」は、与えられたタスクを達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、限定されないが、バイオテクノロジーの分野の当業者に知られているかまたはその当業者が既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発する方式、手段、技術および手順を含んでいる。
【００４９】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５０】
図１は、ＣＲＣ細胞株のＣＤ２４−免疫沈降（ＩＰ）分析である。（ＣＤ２４を発現しない）ＨＣＴ１１６  ＣＲＣ細胞株または（ＣＤ２４を発現する）ＨＴ２９  ＣＲＣ細胞株の抽出物は、ＣＤ２４ーＩＰに供され、その後ＳＷＡ１１  ＣＤ２４抗体を使用するウェスタンブロット分析に供された。レーン１：ＨＣＴ１１６  ＣＲＣ細胞の全溶解物（ＩＰなし）；レーン２：ＨＴ２９  ＣＲＣ細胞の全溶解物（ＩＰなし）；レーン３〜８：抗マウス結合体化セファロースビース（Ｓｉｇｍａ）を使用する、ＨＣＴ１１６細胞（レーン３〜５）またはＨＴ２９細胞（レーン６〜８）の溶出生成物：ＩＰ抗体（第１結合剤）がない場合（レーン３および６）、またはＭＬ５  Ａｂ（レーン４および７）もしくはＳＷＡ１１  Ａｂ（レーン５および８）を使用するＩＰ後。ＣＤ２４に対するＳＷＡ１１  Ａｂを使用する効果的なＩＰ（レーン８）は、ＳＷＡ１１が、低いバックグラウンドをもたらす好適なＩＰ抗体であることを実証していることに注意されたい。
【００５１】
図２ａ〜ｃは、腫瘍の外科的除去の前後、または化学療法の前後にＣＲＣ患者から得られた糞便サンプルのＣＤ２４ウェスタンブロット分析である。結腸直腸腫瘍（腺腫または腺癌（ＣＲＣ））と診断された１２人の患者（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３・・・Ｐ−１２で示される）の糞便サンプルからのタンパク質抽出物（等量）は、ＳＷＡ１１  Ａｂを使用するウェスタンブロット分析に供された。外科的除去前の患者の臨床的徴候は以下の通りである：患者１（Ｐ−１）−ポリープ  １５ｍｍ；患者２（Ｐ−２）−広範囲のポリープ；患者３（Ｐ−３）−ポリープ  ２０ｍｍ；患者４（Ｐ−４）−ポリープ  ５ｍｍ、低度の形成異常；患者５（Ｐ−５）−腺癌；患者７（Ｐ−７）−腺癌；患者８（Ｐ−８）−腺癌；患者９（Ｐ−９）−ポリープ  １５ｍｍ；患者１０（Ｐ−１０）−高度のポリープ；患者１１（Ｐ−１ｌ）−腺癌；患者１２（Ｐ−１２）−腺癌；患者６（Ｐ−６）直腸の癌−この患者のサンプルは、腫瘍除去後であるが放射線療法前（レーン１３）または放射線療法後（レーン１４）の両方で採取された。図２ａ−レーン１〜９：レーン１−ＨＴ２９細胞（ポジティブコントロール）；レーン２〜３−Ｐ−１；レーン４〜５−Ｐ−２；レーン６〜７−Ｐ−３；レーン８〜９−Ｐ−４；図２ｂ−レーン１０〜１８：レーン１０−ＨＴ２９細胞；レーン１１〜１２−Ｐ−５；レーン１３〜１４−Ｐ−６；レーン１５〜１６−Ｐ−７；レーン１７〜１８−Ｐ−８；図２ｃ−レーン１９〜２７：レーン１９−ＨＴ２９細胞；レーン２０〜２１−Ｐ−９；レーン２２〜２３−Ｐ−１０；レーン２４〜２５−Ｐ−１ｌ；レーン２６〜２７−Ｐ−１２。レーン２、４、６、８、１１、１５、１７、２０、２２、２４および２６−サンプルは、腫瘍の外科的除去前に採取された。レーン３、５、７、９、１２、１３、１４、１６、１８、２１、２３、２５および２７−サンプルは、腫瘍の外科的除去後に採取された。１１人の患者のうち少なくとも９人の患者における腫瘍の外科的除去後のＣＤ２４レベルの有意な減少（例えば、レーン３におけるタンパク質バンドの強度をレーン２のタンパク質バンドの強度と比べる）は、糞便におけるＣＤ２４の存在が少なくとも部分的に腫瘍に由来することを実証することに注意されたい。さらに、ポリープまたは腫瘍の外科的除去前に採取された糞便サンプルにおいてＣＤ２４タンパク質種は約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ（例えば、レーン４、１７、２０および２４）のような種々の大きさのタンパク質を含むが、ポリープまたは腫瘍の外科的除去後に採取された糞便サンプルにおいてＣＤ２４タンパク質種は約３７ｋＤａ〜約５０ｋＤａ（例えば、レーン１１、１８、２１）のような高分子量のタンパク質を含むことに注意されたい。また、放射線療法前に得られた糞便サンプル（レーン１３）に比べて、放射線療法後に得られた糞便サンプル（レーン１４）におけるＣＤ２４レベルの有意な減少は、ＣＲＣの悪性細胞に由来する糞便におけるＣＤ２４のレベル、つまり処置後のレベルにおける減少が処置の有効性（例えば、癌細胞の排除）を示すことができることを実証していることに注意されたい。
【００５２】
図３は、血清サンプルにおけるＣＤ２４の免疫沈降分析を示す。進行性のＣＲＣ（レーン３）または非進行性のＣＲＣ（レーン４）を有する患者から採取された血清サンプルは、抗マウス結合体化セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）をＳＷＡ１１  抗ＣＤ２４モノクローナル抗体で予めインキュベートすることによって形成された複合体で免疫沈降された。免疫沈降された複合体は、ＳＷＡ１１  抗ＣＤ２４モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析に供された。レーン１−ＣＤ２４を過剰発現するＨＴ２９細胞；レーン２−非進行性のＣＲＣを有する患者からの血清；レーン３−進行性ＣＲＣを有する患者からの血清。レーン３における〜４０ｋＤａのタンパク質バンドおよびレーン２におけるそのようなタンパク質バンドの非存在は、進行性ＣＲＣを有する患者の血清におけるＣＤ２４の存在および非進行性ＣＲＣを有する患者におけるＣＤ２４の消失を実証することに注意されたい。
【００５３】
図４は、ＣＤ２４タンパク質（配列番号２）におけるＶａｌ５７Ａｌａ多型（配列番号１の２８０位のＣ／Ｔ）のＲＦＬＰ分析である。ゲノムＤＮＡは、フォワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）を使用するＰＣＲ増幅に供され、得られた５２０ｂｐのＰＣＲ産物は、ＢｓｔＸＩ制限酵素を使用して消化された（消化されたものについて「Ｄ」で示す  レーン１、３および５）か、または消化されないままにされ（消化されていないものについて「Ｎ」で示す  レーン２、４および６）、そして１％アガロースゲル上で電気泳動に供された。レーン１および２−高レベルのＣＤ２４を発現するｃｏｌｏ３５７膵癌細胞株のＤＮＡ；レーン３および４−中レベルのＣＤ２４を発現するＰａｎｃ１膵癌細胞株のＤＮＡ；レーン５および６−高レベルのＣＤ２４を発現するＨＴ２９  結腸癌細胞株のＤＮＡ；レーン７−１００ｂｐの分子量マーカー。５２０ｂｐの消化されていないＰＣＲ産物のみの存在によって証明されるように、中レベルのＣＤ２４を発現するＰａｎｃ１細胞は、配列番号１の２８０位（これは配列番号２の５７位のＡｌａ多型に相当する）にＣ／Ｃ遺伝子型を示すが、レーン１（Ｃｏｌｏ３５７）における消化されたＰＣＴ産物と消化されていないＰＣＲ産物の両方の存在およびレーン５（ＨＴ２９）における消化されたＰＣＲ産物のみの存在によって証明されるように、高レベルのＣＤ２４を発現するｃｏｌｏ３５７細胞またはＨＴ２９細胞はそれぞれ、配列番号１の２８０位（５７位のＡｌａ／Ｖａｌ多型またはＶａｌ／Ｖａｌ多型に相当する）にＣ／Ｔ遺伝子型またはＴＴ遺伝子型を示すことに注意されたい。
【００５４】
図５は、ヒト血清からのＣＤ２４の精製を示す。進行性のＣＲＣに罹患する患者からの血清サンプル中のＣＤ２４は、ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２）ミニカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製された。分画の前に、血清は残存する残骸を除くために１２０００×ｇで遠心分離（３０分間、４℃）され、アルブミンは、既に発表されている方法（Ｃｏｌａｎｔｏｎｉｏ  ＤＡら、２００５、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５（１５）：３８３１−５）から改変されたＤＡＣ（アルブミン成分の枯渇）プロトコルを使用して血清から枯渇されられた。アルブミン枯渇の後、血清は１０ｍＭ  ＴｒｉｓーＨＣｌ  ｐＨ７．４中に希釈され、同じ緩衝液で予め平衡にされたＤＥ５２ミニカラムに充填された。透過物（ＦＴ）および沈殿物（Ｗ）は別個に収集され、結合されたタンパク質はＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中のＮａＣｌの濃度を増大させて（０．０５〜０．３Ｍ）溶出された。溶出されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＷＡ１１  モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。レーン１−ＣＤ２４の分子量に対するポジティブコントロールとしてのＨＴ２９細胞株の全溶解物；レーン２−遠心分離後であるがアルブミン枯渇前の血清サンプル；レーン３〜８は、異なる溶出画分である。０．１〜０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する画分において溶出されかつ抗ＣＤ２４抗体によって認識されるレーン６および７における３５〜４０ｋＤａの見掛け分子量を有するタンパク質の存在に注意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、循環ＣＤ２４を用いる癌または前悪性の病変の早期かつ非侵襲的な診断の方法に関する。さらに、本発明は、ＣＤ２４およびＡＰＣ遺伝子における遺伝子型を胃腸癌と高度に関連づけた発明であり、これは胃腸癌に対する素因の検出のために使用されることができる。
【００５６】
本発明による前悪性の病変を診断する方法およびキットの原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００５７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００５８】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）を含む胃腸（ＧＩ）管の癌は、遺伝的および後成的な変化が獲得される段階的なプロセスを経て数年にわたって発現し、最終的には正常な上皮の新生物への変換に至る。例えば、ＣＲＣの発癌は、癌遺伝子（例えば、ｋ−Ｒａｓ）および腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３）における変異、メチル化パターンの変化、およびＤＣＣおよびＳＭＡＤの欠失を伴う。しかしながら、現在の遺伝子に関する知識および現在利用可能な内視鏡検査手順（例えば、結腸内視鏡検査）にもかかわらず、診断時にはＧＩ管に関連する癌の大半はすでに広がっており、処置がより難しい。
【００５９】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）のような胃腸管（ＧＩ管）の癌に対する現在利用可能なスクリーニング方法は、糞便の潜血検査（ＦＯＢＴ）を含む。しかしながら、臨床試験は、連続的なＦＯＢＴによるスクリーニングがＣＲＣの死亡率を低減したことを示したが、ＦＯＢＴの感度は制限されている（６０％；ＭｃＭａｈｏｎ  ＰＭ、２００１（前出））。数種のマーカーが、非侵襲的な診断ツールとして最近提案されている。これらは、糞便サンプルにおいて検出されることができるタンパク質（例えば、糞便のカルプロテクチン、ラクトフェリン、リソチーム、アルブミン、α−１−抗トリプシン、癌胚抗原（ＣＥＡ）、崩壊加速因子（ＤＡＦ）、小染色体維持タンパク質（ＭＣＭ２））またはｍＲＮＡ（例えば、糞便のＣＯＸ−２）、および血清サンプルにおいて検出されることができるニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）またはプロテアソーム活性化因子複合体サブユニット３（ＰＳＭＥ３）のようなタンパク質を含む。しかしながら、それらの低い感度および特異性のために、これらのマーカーは臨床で使用されていない。直腸内触診（ＤＲＥ）、ＰＥＴ−ＣＴ（陽電子放射断層撮影法）、および仮想結腸内視鏡検査のような他の診断方法は、限定された特異性および／または感度を示す。従って今日まで、ＣＲＣの診断は、結腸の内視鏡検査（結腸内視鏡検査またはＳ字結腸内視鏡検査）、その後の腺腫の外科的除去および組織学的染色のような侵襲的な手順に基づく。
【００６０】
ＣＤ２４は、高度にグリコシル化された、フォスファチジルイノシトール固定されたムチン様細胞表面タンパク質であり、それは主にＢリンパ球の造血小集団、種々の上皮細胞、筋肉細胞および神経細胞上で発現される。ＣＤ２４は、Ｂ細胞リンパ腫、神経膠腫、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、鼻咽腔癌、膀胱癌、子宮癌、上皮卵巣癌、乳癌、前立腺癌および膵癌を含む種々の悪性組織において過剰発現される（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、２００４によって概説される）。そのうえ、ＣＤ２４の発現は、数種の器官に由来する癌細胞株の増大された増殖率、運動性および生存性と相関し（Ｂａｕｍａｎｎ  Ｐら、２００５；Ｓｍｉｔｈ  ＳＣら、２００６）、癌のより攻撃的な経過と相関する。さらに、Ｗｅｉｃｈｅｒｔ  Ｗ．ら（２００５）は、細胞質におけるＣＤ２４の増大された発現がより高い腫瘍の病期、進行度および転移の存在と相関することを見出し、（細胞における過剰生成または分布の妨害の結果としての）細胞質におけるＣＤ２４の過剰発現が悪い予後のマーカーであると結論づけた。さらに、血小板凝集におけるＣＤ２４の役割は、癌の転移およびより悪い予後へのその関与を説明することができる（Ｓａｍｍａｒ，Ｍ．ら、１９９４；Ａｉｇｎｅｒ，Ｓ．ら、１９９７；Ａｉｇｎｅｒ，Ｓ．ら、１９９８）。
【００６１】
Ｌｉ  Ｊ．らの米国特許出願第２００４０００５５９６号は、疑わしい前癌組織または癌組織から得られたサンプルにおいてその場でのＣＤ２４のレベルを決定することによって癌を診断する方法を開示しており、従ってこの方法もまた、癌の検出のために侵襲的な手順を必要とする。
【００６２】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、胃腸管の前悪性の病変においてＣＤ２４が過剰発現されていること、および脱け落ちたＣＤ２４、泡状突起中のＣＤ２４、または分泌されたＣＤ２４が前悪性および悪性の病変を有する対象の生物学的サンプルにおいて検出されることができることを発見した。
【００６３】
以下の実施例の節において示されるように、本発明者らは、ＣＤ２４転写物のレベルがｒａｓ変異−形質転換細胞株において上方制御されること（実施例１）、およびそのレベルが、特異的ＣＯＸ−２阻害剤であるＣｅｌｅｃｏｘｉｂでのそのような細胞の処理後に、通常レベルに逆転されることを発見した。さらに、本発明者らは、種々のＣＲＣ細胞株におけるＣＤ２４の発現レベルがＣＤ２４におけるＶａｌ５７Ａｌａ  ＳＮＰの遺伝子型と相関し、従って、高レベルのＣＤ２４タンパク質を発現する細胞はＣＤ２４ｖ／ｖ遺伝子型（Ｖａｌ−５７多型）を担持するが、ＣＤ２４タンパク質をほとんど発現しない細胞はＣＤ２４ａ／ａ遺伝子型（Ａｌａ−５７多型）を担持することを発見した（実施例３）。さらに、本発明者らは、ＣＤ２４がＧＩ管の前悪性の病変において過剰発現され、それが発癌の早期段階と相関することを発見した（表１、実施例２）。そのうえ、以下の実施例の節においてさらに例示されるように、本発明者らは、可溶性のＣＤ２４、脱け落ちたＣＤ２４、泡状突起中のＣＤ２４または分泌されたＣＤ２４が、結腸直腸のＣＲＣ発癌または前悪性の病変に罹患する患者の血清サンプル（図３および５、実施例４）、糞便サンプル（図２ａ〜ｃ、実施例４）、および尿サンプルにおいて検出されることができること、および糞便におけるＣＤ２４のレベルが前悪性または悪性の病変の（例えば手術による）除去後（図２ａ〜ｃ）に、ならびにＣＲＣが非進行性であるとき（例えば、放射線療法後；図２ｂおよび３、実施例４）に減少することを発見した。要するに、これらの結果は、たとえ前悪性の段階でも、ＣＤ２４が癌の早期診断のための優れたマーカーであること、および可溶性ＣＤ２４（例えば、分泌されたもの）、泡状突起中のＣＤ２４および／または脱け落ちたＣＤ２４が糞便、血清、および尿のような生物学的サンプルにおいて検出されることができ、従って、癌の診断において使用されることができることを実証している。
【００６４】
従って、本発明の１つに態様によれば、癌および／または前悪性の病変を診断する方法が提供される。この方法は、それを必要とする対象の循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定することによって行われ、そこでは所定の閾値より高い前記循環ＣＤ２４の存在および／またはレベルは、癌および／または前悪性の病変の指標である。
【００６５】
本明細書において使用される表現「前悪性の病変」は、悪性腫瘍への変換の増大した確率を有する細胞および／または組織の塊を示す。好ましくは、本発明の前悪性の病変において、ＣＤ２４は非悪性の組織または細胞と比べて過剰発現される。前悪性の病変の例は、限定されないが、腺腫様ポリープ、バレット食道、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）、胸部のＤＣＩＳ（非浸潤性乳管癌）、白斑症、および紅板症を含む。従って、本発明のこの態様の方法によって診断される前悪性の病変は、悪性の固形または非固形の（例えば、血液の悪性疾患）ＣＤ２４に関連した癌（または腫瘍）へと変換することができる。好ましくは、本発明のこの態様の方法によって診断される前悪性の病変は、結腸の腺腫様ポリープ、直腸の腺腫様ポリープ、小腸の腺腫様ポリープ、およびバレット食道である。
【００６６】
本発明のこの態様の方法によって診断されることができるＣＤ２４に関連した癌の非限定的な例は、胃腸管の腫瘍（結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、結腸直腸癌、小腸および／または大腸の癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸癌、小腸に起こる腺癌、小腸に起こるカルチノイド腫瘍、小腸に起こるリンパ腫、小腸に起こる間葉性腫瘍、胃腸間質性腫瘍）、胆嚢癌、胆道腫瘍、前立腺癌、腎臓癌（例えば、ウイルム腫瘍）、肝臓癌（例えば、肝芽腫、肝細胞癌）、肝胆道癌、胆道系癌、胆嚢の腫瘍、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、栄養膜の腫瘍、精巣の胚細胞腫瘍、卵巣、子宮、上皮性卵巣の未熟型奇形腫、仙尾部の腫瘍、絨毛癌、胎盤性絨毛腫瘍、成人上皮性腫瘍（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｕｌｔ  ｔｕｍｏｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、膣の癌、陰門の癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、鼻咽腔癌、乳癌、扁平上皮細胞癌（例えば、頭部および頸部）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞性、組織球、リンパ芽球、Ｔ細胞、胸腺、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、神経膠腫、甲状腺髄様癌、睾丸癌、脳腫瘍および頭部／頸部癌、婦人科癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、間葉腫瘍、神経原性腫瘍、膀胱の癌、尿管の癌、腎盂の癌、尿道の癌、陰茎の癌、精巣の癌、子宮体の癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、腹膜癌およびファローピオ管癌、卵巣の胚細胞腫瘍、性索間質腫瘍、内分泌系の癌、甲状腺腫瘍、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫、上皮小体腫瘍、副腎腫瘍、膵内分泌腫瘍、軟組織および骨の肉種、良性および悪性の中皮腫、悪性の腹膜中皮腫、精巣鞘膜の悪性中皮種、心膜の悪性中皮種、皮膚癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系の新生物、髄芽細胞腫、髄膜腫、末梢神経腫瘍、松果体領域腫瘍、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、聴神経腫、頸静脈球腫瘍、脊索腫および軟骨肉腫、血管芽細胞腫、脈絡叢乳頭腫および脈絡叢乳頭癌、脊髄軸腫瘍、白血病および慢性白血病を含む。
【００６７】
本明細書において使用される表現「診断する」は、病状（例えば、ＣＤ２４に関連した癌または前悪性の病変）または症状を分類すること、病状の重篤度を決定すること、病状の経過を監視すること、病状の結果および／または回復の見通しを予測することを示す。
【００６８】
本明細書において使用される表現「必要とする対象」は、癌を有する危険性のあるヒト対象（例えば、遺伝的に素因をもつ対象、癌の病歴をもつ対象およびまたは癌家系の対象、発癌物質、職業上の危険、環境的な危険に曝されていた対象）、および／または疑わしい癌の臨床的症状（例えば、糞便中の血液または下血、原因不明の疼痛、発汗、原因不明の発熱、食欲不振に至るまでの原因不明の体重減少、排便習慣の変化（便秘および／または下痢）、テネスムス（特に、直腸癌に対する、完了していない排便の感覚）、貧血、および／または全体的な衰弱）を示す対象を示す。追加的にまたは代替的に、必要とする対象は、普通の健康診断を受けている健康なヒト対象であることができる。
【００６９】
本明細書において使用される用語「ＣＤ２４」は、染色体６ｑ２１上のゲノム配列によってコードされるフォスファチジルイノシトール固定されたムチン様細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ２４タンパク質−配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３７３６２．１；ＣＤ２４転写物−配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３２３０．２）の少なくとも機能的部分の核酸配列および／またはアミノ酸配列を示す。
【００７０】
表現「循環ＣＤ２４」は、その場で固定されているＣＤ２４ではない、対象の生物学的サンプル中に存在するいかなるＣＤ２４分子も示す。表現「その場で固定されているＣＤ２４」は、本明細書において上に記載されるような前悪性の病変（例えば、腺腫）または癌性の腫瘍の細胞のような、それが生成される場所で（その場で）無傷の細胞に固定される、組織に固定されたＣＤ２４アミノ酸配列または核酸配列を示す。従って、表現「循環ＣＤ２４」は、全身で検出されることができるいかなるＣＤ２４分子も示す。循環ＣＤ２４は、可溶性形態でも非可溶性形態（ＧＰＩ部分によって膜に固定される形態）でも良い。このような循環ＣＤ２４の例は、限定されないが、分泌されたＣＤ２４（例えば、ＣＤ２４スプライス変異体）、（例えば、ＰＩＰＬＣのようなホスホリパーゼの作用によって）膜成分を欠く脱け落ちたＣＤ２４（例えば、配列番号２のアミノ酸配列２７〜８０）、泡状突起中のＣＤ２４（すなわち、基底となる細胞骨格からの原形質膜の破裂後に細胞内液による分離した膜の膨張によって形成される細胞泡状突起中に存在するＣＤ２４）または脱け落ちた細胞（すなわち、組織から分離した細胞）上に存在するＣＤ２４を含む。
【００７１】
従って、本発明の循環ＣＤ２４は、癌性の組織または癌を含まない組織から隔離された生物学的サンプルにおいて存在することができる。例えば、生物学的サンプルは、癌がＣＲＣのようなＧＩ管の癌であるときは、糞便、血清または尿であることができる。
【００７２】
本明細書において使用される表現「生物学的サンプル」は、本明細書において上で記載されるような循環ＣＤ２４を含有することができるいかなる細胞性または非細胞性の生物学的サンプルも示す。その例は、限定されないが、血液サンプル（例えば、血清）、唾液サンプル、糞便サンプル、尿サンプル、パプ塗抹標本、子宮頸管サンプル、骨髄サンプル（特に、マクロファージを含有するもの）、リンパ液、皮膚サンプル、上皮細胞、気道、腸管および尿生殖路の種々の外分泌物、涙、乳液、組織生検、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、精液サンプル、羊水、および絨毛サンプル（ＣＶＳ）、神経細胞のサンプル、樹状細胞、器官を含み、生体内の細胞培養成分のサンプルもまた含む。
【００７３】
好ましくは、本発明のこの態様の方法によって使用される生物学的サンプルは、血液サンプル（例えば、血清）、糞便サンプル、および／または尿サンプルである。
【００７４】
生物学的サンプルは、針付の注射器、外科用メス、細針吸引（ＦＮＡ）、カテーテル、胃腸内視鏡検査（例えば、結腸直腸内視鏡検査、胃内視鏡検査）などを使用するような、当該分野で公知の方法を使用して得られることができる。好ましくは、本発明の生物学的サンプルは、血液のサンプリング、糞便の収集または尿の収集によって得られることができる。可溶性ＣＤ２４のレベルおよび／または存在の決定は、生体外（対象に由来するサンプル）で、ならびに生体内（対象内）で行われることができる。
【００７５】
本明細書において使用される表現「循環ＣＤ２４の存在および／またはレベル」は、生物学的サンプルにおけるＣＤ２４遺伝子の遺伝子発現および／または遺伝子産物活性の程度を示す。従って、ＣＤ２４の存在および／またはレベルは、タンパク質検出方法を使用してアミノ酸レベルで決定されることができる。
【００７６】
従って、ＣＤ２４アミノ酸配列（ＣＤ２４タンパク質）の存在および／またはレベルは、免疫複合体（すなわち、生物学的サンプル中に存在するＣＤ２４抗原（ＣＤ２４アミノ酸配列）とＣＤ２４特異的抗体との間で形成される複合体）の形成によってＣＤ２４特異的抗体を使用して決定されることができる。
【００７７】
本発明の免疫複合体は、使用される方法および生物学的サンプルに依存して変化しうる種々の温度、塩濃度、およびｐＨ値で形成されることができ、当業者は各免疫複合体の形成に好適な条件を調整することができる。
【００７８】
本発明において使用される用語「抗体」は、無傷の分子、ならびに、その機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単一ドメイン分子（例えば、抗原のエピトープに対するＶＨおよびＶＬなど）を含む。これらの機能的な抗体フラグメントは、下記のように定義される：（１）Ｆａｂ、これは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントであり、全長抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、１つの重鎖の一部分とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’、これは、全長抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部分とを生じさせることによって得ることができる、抗体分子のフラグメントである；１分子の抗体分子につき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、これは、全長抗体を、その後の還元を伴うことなく、酵素ペプシンで処理することによって得ることができる、抗体のフラグメントである；（Ｆａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によってつながれる２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；（４）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、これは、遺伝子融合された単鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；および（６）単一ドメイン抗体は、抗原に対する十分な親和性を示す１種だけのＶＨドメインまたはＶＬドメインから構成される。
【００７９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを製造する様々な方法が、当該分野でよく知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８（これは参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。
【００８０】
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）における発現によって調製されることができる。抗体フラグメントは、従来の方法による全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得られることができる。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを提供するためにペプシンによる抗体の酵素的切断によって製造されることができる。このフラグメントはさらに、チオール還元剤、および、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のための保護基を使用して切断して、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを生じさせることができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により、２つの一価のＦａｂ’フラグメントと、１つのＦｃフラグメントとが直接に生じる。これらの方法が、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、それらに含まれる参考文献に記載される（これらの特許は本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９）］もまた参照のこと。フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは、他の酵素的技術、化学的技術または遺伝学的技術などもまた使用することができる。
【００８１】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２（１９７２）］に記載されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドのような化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。このような単鎖の抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによってつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。そのような構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて、発現ベクターが宿主細胞（例えば、大腸菌など）に導入される。組換え宿主細胞により、リンカーペプチドが２つのＶドメインを架橋する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓｃＦｖを製造する方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９７−１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７（１９９３）；および米国特許第４９４６７７８号によって記載される（これらは本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。
【００８２】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得られることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して可変領域を抗体産生細胞のＲＮＡから合成することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ［Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６−１０（１９９１）］を参照のこと。
【００８３】
抗体はまた、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して製造することができ、そのような技術には、ファージ呈示ライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］が含まれる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用することができる（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）に導入することによって作製されることができる。抗原による攻撃を受けたとき、ヒト抗体の産生が認められ、これは、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて見られ得る抗体産生と非常に類似する。この方法が、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号および同第５６６１０１６号において、また、下記の科学的刊行物において記載される：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０；７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３、６５−９３（１９９５）。
【００８４】
本発明のこの態様の方法によれば、免疫複合体形態の検出は、癌または前悪性の病変の診断の指標である。種々の方法が、本発明のＣＤ２４免疫複合体の形成を検出するために使用されることができ、当業者らは免疫複合体および／または診断のために使用される細胞のタイプの各々について好適な方法を決定することができる。
【００８５】
本発明の免疫複合体において使用されるＣＤ２４抗体は、当該分野において公知の方法で標識されることができる。標識された抗体は、一次抗体（すなわち、特異的な抗原、例えば、ＣＤ２４特異的抗原に結合する抗体）、または一次抗体に結合する二次抗体（例えば、標識されたヤギ抗ウサギ抗体、標識されたマウス抗ヒト抗体）のいずれかであることができることを理解されたい。抗体は、標識に直接的に結合体化されることができるか、または酵素に結合体化されることができる。
【００８６】
本発明の抗体は、（抗体に結合体化した蛍光色素を使用して）蛍光標識されるか、（放射能標識された抗体、例えば、１２５Ｉで標識された抗体を使用して）放射能標識されるか、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に結合体化されて発色性基質とともに使用されて比色反応を生成することができる。本発明の酵素−結合体化抗体によって利用される発色性基質は、限定されないが、アルカリホスファターゼ酵素については、ＡＥＣ、Ｆａｓｔ  ｒｅｄ、ＥＬＦ−９７基質［２−（５’−クロロ−２−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン］、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、フェノールフタレイン二リン酸、およびＥＬＦ  ３９−リン酸、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ（ＶＲ）、サーモンおよびマゼンタリン酸（ｓａｌｍｏｎ  ａｎｄ  ｍａｇｅｎｔａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ａｖｉｖｉ  Ｃら、１９９４，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９９４；４２：５５１−４）、および、ペルオキシダーゼ酵素については、Ｎｏｖａ  Ｒｅｄ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｖｅｃｔｏｒ（Ｒ）  ＳＧ基質、ルミノールベースの化学発光基質を含む。これらの酵素基質は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｄｅｎｍａｒｋ）から市販されている。
【００８７】
循環ＣＤ２４を含有しうる血清、糞便、または尿のような生物学的サンプルにおけるＣＤ２４免疫複合体の検出は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロットおよび放射性免疫測定（ＲＩＡ）分析、免疫沈降（ＩＰ）、または分子量に基づく方法を使用して行われることができる。
【００８８】
ウェスタンブロットのために、タンパク質は、細胞サンプルから抽出され、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および膜（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に対するブロッティングに供される。次いで膜は、直接的に標識されるか、またはさらに標識された二次抗体に供されることができるＣＤ２４抗体と相互作用させられる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応、または化学発光によるものであることができる。この方法は、基質の量の定量、および電気泳動時のアクリルアミドゲルにおける移動距離の指標である膜上の相対位置による基質の正体の決定の両方を可能にする。
【００８９】
生物学的サンプルにおける抗原の濃度が低い場合、抗原（ＣＤ２４アミノ酸配列）の検出は、以下の実施例の節において本質的に記載されるように、免疫沈降（ＩＰ）によって行われることができる。免疫沈降分析のために、ＣＤ２４抗体は、ＣＤ２４を含むサンプル（例えば、細胞溶解物）と直接的に相互作用し、形成された複合体はさらに、ビーズに結合体化された二次抗体（例えば、もしＣＤ２４抗体がマウスモノクローナル抗体であれば、二次抗体は、例えばセファロースビーズに結合体化された抗マウス抗体であることができる）を使用して検出されることができる。ビーズは次いで、遠心分離によって沈降され、続いて沈降されたタンパク質（例えば、ＣＤ２４および抗ＣＤ２４抗体）は、（例えば、９５℃での変性を使用して）ビーズから分離されることができ、さらにＣＤ２４特異的抗体を使用するウェスタンブロット分析に供されることができる。あるいは、抗ＣＤ２４抗体およびビーズと結合体化された二次抗体は、抗原（ＣＤ２４）を含有する生物学的サンプルに添加され、それによって免疫複合体を形成することができる。あるいは、ＣＤ２４は高度にグリコシル化されたタンパク質であるので、それはまた、ビーズと結合体化することができるコンカナバリンＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のような、グリコシル化されたポリペプチドに結合することができる基質を使用して沈降されることができ、その後に抗ＣＤ２４抗体でのウェスタンブロット分析に供されることができる。
【００９０】
ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ２４のような細胞膜上に存在する抗原の検出を可能にする。簡単に記載すると、ＣＤ２４特異的抗体はフルオロフォアに連結され、検出は、それぞれの細胞が光ビームを通過する際にそれぞれの細胞から放出される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【００９１】
ＣＤ２４の存在および／またはレベルはまた、ＥＬＩＳＡを使用して決定されることができる。簡単に記載すると、ＣＤ２４抗原を含有するサンプルは、マイクロタイタープレートのウエルのような表面に固定される。酵素に結合された抗原特異的抗体（ＣＤ２４抗体）が適用され、抗原に結合される。抗体の存在は次いで、抗体に結合された酵素を利用する比色反応によって検出および定量される。この方法において一般に用いられる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。十分に校正され、かつ、反応の直線範囲に含まれるならば、サンプルに存在する基質の量は、生じた色の量に比例する。量的精度を改善するために、基質標準物が一般に用いられる。
【００９２】
ＣＤ２４の存在および／またはレベルはまた、放射性免疫測定（ＲＩＡ）を使用して決定されることができる。１つの方式では、この方法は、特異的抗体およびアガロースビーズのような沈降性キャリア上に固定化された放射能標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）による所望の抗原（ＣＤ２４）の沈降を含む。沈降されたペレットのカウント数は抗原の量に比例する。
【００９３】
ＲＩＡの代替方式では、標識された抗原および標識されていない抗体結合タンパク質が用いられる。未知量の抗原を含有するサンプルが様々な量で加えられる。標識された抗原からの沈降されたカウント数の減少は、添加されたサンプルにおける抗原の量に比例する。
【００９４】
ＣＤ２４の存在および／またはレベルはまた、分子量に基づく方法を使用して決定されることができる。免疫複合体は、その成分よりも大きい分子量を示すので、分子量におけるそのような変化を検出することができる方法もまた用いることができる。例えば、免疫複合体は、ゲル遅延アッセイによって検出されることができる。簡単に記載すると、非変性アクリルアミドゲルは、サンプルを負荷される。タンパク質生成物のサイズ（分子量）におけるその成分と比較したシフトが、免疫複合体の存在の指標である。高分子量へのそのようなシフトは、非特異的なタンパク質染色（例えば、銀染色またはクーマシーブルー染色）を使用して調べられることができる。
【００９５】
脱け落ちた細胞またはそのフラグメント（泡状突起中の細胞としても示される）はまたｍＲＮＡ分子を含むかもしれないので、生物学的サンプルにおける循環ＣＤ２４の検出はまた、ＣＤ２４の過剰発現を検出することができるｍＲＮＡ検出方法を使用して行われることができることが理解される。遺伝子のＤＮＡ増幅の場合、循環ＣＤ２４の検出はまた、生物学的サンプルにおいてＤＮＡレベルで行われることができる。
【００９６】
ＲＮＡまたはＤＮＡの検出方法は、配列番号１またはその一部によって記載されるＣＤ２４転写物のようなＣＤ２４核酸配列にハイブリダイズすることができる単離されたポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプローブ／プライマー）を使用して行われることができる。そのようなポリヌクレオチドは、任意の大きさ、例えば短いポリヌクレオチド（例えば、１５〜２００塩基のもの）、１００〜２０００塩基の中間のポリヌクレオチド、および２０００塩基より多い長いポリヌクレオチドであることができる。
【００９７】
本発明によって使用される単離されたポリヌクレオチドプローブは、いかなる直接的または間接的に標識された、ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、１７〜５０塩基のもの）、生体外で転写されたＲＮＡ分子）、ＤＮＡ分子（例えば、１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、ゲノム分子）および／または本発明のＣＤ２４  ＲＮＡ転写物に特異的なそれらの類似体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））であることもできる。
【００９８】
本発明の教示によって設計されるオリゴヌクレオチドは、酵素合成または固相合成のような当該分野で公知のいかなるオリゴヌクレオチド合成方法によっても生成されることができる。固相合成を行うための装置および試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための他のいかなる方法もまた利用されることができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内であり、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，バルチモア、メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）および「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）に詳しく記載されるような確立された方法論によって成し遂げることができ、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、それに続く脱保護、脱塩および精製（例えば、自動化されたトリチル−オン法またはＨＰＬＣによる精製）を利用して成し遂げることができる。
【００９９】
本発明によって使用される単離されたポリヌクレオチドは、タグまたは標識分子を使用して直接的にかまたは間接的にかのいずれかで標識されることができる。そのような標識は、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセインまたはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、放射性分子（例えば、３２Ｐ−γ−ＡＴＰまたは３２Ｐ−α−ＡＴＰ）および発色性基質（例えば、（ＡＢＣＡＭ，ケンブリッジ，ＭＡ）から市販されているＦａｓｔ  Ｒｅｄ、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）であることができる。直接的な標識付けは、（例えば、固相合成を使用して）標識分子をポリヌクレオチドに共有結合することによって、または（例えば、生体外転写反応またはランダムに起こる標識付けを使用して）重合化によって組み込むことによって達成されることができる。間接的な標識付けは、非標識タグ分子（例えば、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎまたはビオチン）をポリヌクレオチドへ共有結合するか、または非標識タグ分子をポリヌクレオチドへ組み込み、続いて、ポリヌクレオチドを、非標識のタグを特異的に認識することができる標識された分子（例えば、抗Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体またはストレプトアビジン）に供することによって達成されることができる。
【０１００】
上に記載されるポリヌクレオチドは、以下のような種々のＲＮＡ検出方法で利用されることができる：ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（例えば、Ｌｉｇｈｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）を使用する半定量的ＲＴ−ＰＣＴ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡのインシトゥハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）、インシトゥＲＴ−ＰＣＲ染色（例えば、Ｎｕｏｖｏ  ＧＪら、１９９３、「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅されたＣ型肝炎ｃＤＮＡの細胞内局在」Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．１７：６８３−９０およびＫｏｍｍｉｎｏｔｈ  Ｐら、１９９４，「保存用肝生検におけるＣ型肝炎ウイルス検出方法の評価。組織学、免疫組織化学、インシトゥハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびインシトゥＲＴ−ＰＣＲの比較」Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．，１９０：１０１７−２５に記載されるようなもの）、および（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標），サンタクララ，ＣＡ）を使用する）オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析。
【０１０１】
本発明と共に使用されることができるＤＮＡ検出方法は、限定されないが、サザンブロット分析、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、および制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む。
【０１０２】
本明細書において使用される表現「所定の閾値」は、サンプル中の循環ＣＤ２４の既知のレベルを示す。そのようなレベルは、正常なサンプル（例えば、健康な対象から得られたサンプル）を、ＣＲＣのような癌を発症していることが知られている対象に由来するサンプルと比べることによって実験的に決定されることができる（例えば、表１および以下の実施例の節の実施例２を参照のこと）。あるいは、そのようなレベルは、科学文献から得られることができる。
【０１０３】
従って、所定の閾値より高い、生物学的サンプルにおけるＣＤ２４の存在および／またはレベルは、癌または前悪性の病変の指標である。
【０１０４】
癌または前悪性の病変の存在は、さらなるアッセイを使用してさらに確認されることができることが理解される。例えば、対象の糞便において検出されるＣＤ２４のレベルが所定の閾値より高い場合、結腸内視鏡検査の後の組織学的な評価（ＣＤ２４の免疫染色を含む）のようなさらなるアッセイが（腺腫が存在する場合）同定された腺腫に対して行なわれることができる。
【０１０５】
従って、本発明の教示は、初めて、血清、尿および糞便のような生物学的サンプルを使用して胃腸管の前悪性または悪性の病変を診断する信頼性の高い（８０％より高い精度）、非侵襲的な方法を提供する。
【０１０６】
本発明の教示は、癌治療の有効性または疾患の進行／緩解を監視するためにさらに使用されることができることが理解される。図２ｂおよび以下の実施例の節の実施例４において示されるように、糞便におけるＣＤ２４のレベルは、ＣＲＣに罹患している対象において放射線療法後に、おそらく対象における癌細胞の有意な低減の結果として、減少した。
【０１０７】
従って、本発明の別の態様によれば、癌治療の有効性を監視する方法が提供される。この方法は、癌治療後の対象の生物学サンプルにおける循環ＣＤ２４のレベルを決定することによって行なわれ、癌治療後の循環ＣＤ２４のレベルにおける所定の閾値からの低下は癌細胞の低減の指標であり、それによって癌治療の有効性を監視する。
【０１０８】
本発明のこの態様の方法によって有効性が監視される癌治療は、放射線療法、化学療法（例えば、ＣＨＯＰ、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ビンカアルカロイド、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシド、およびダクチノマイシン）、抗体療法（例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ））または上記のいずれかの組み合わせであることができる。
【０１０９】
従って、循環ＣＤ２４のレベルにおける所定の閾値からの低下は、癌治療が有効であることの指標である。他方では、低下がない場合、または処置後に循環ＣＤ２４のレベルにおける所定の閾値からの増加がある場合、その癌治療は処置される対象から癌細胞を除くこと（例えば、癌細胞を死なせること、癌細胞を激減させること）においては有効でなく、追加のおよび／または代替的な治療（例えば、処置計画）が使用されることができる。
【０１１０】
所定の閾値は、治療の結果が判明している一部の対象において決定されることができることが理解される。
【０１１１】
好ましくは、癌治療後の循環ＣＤ２４のレベルにおける所定の閾値からの低下は、少なくとも１０倍、より好ましくは１５倍、好ましくは２０倍、好ましくは５０倍、または少なくとも１００倍（例えば、少なくとも１０００倍）である。
【０１１２】
本発明をさらに実施に移しているとき、本発明者らは、ＣＤ２４遺伝子における多型が胃腸癌に対する対象の素因についてのマーカーとして使用されることができることを発見した。
【０１１３】
表２、図４において示され、以下の実施例の節の実施例３において記載されるように、ＣＤ２４タンパク質（配列番号２）の５７位にＶａｌ多型を担持する個体は、胃腸癌を発症する危険の素因を増大した。さらに、以下の実施例の節の実施例３においてさらに例示されるように、ＣＤ２４タンパク質（配列番号２）の５７位にＶａｌ多型を担持する個体、ならびにＡＰＣ（配列番号８）の１３１７Ｑおよび／または１３０７Ｋ多型を担持する個体は、胃腸癌を発症する危険の素因を増大した。これらの結果は、胃腸癌の素因を決定するための、ＣＤ２４タンパク質の５７位におけるＶａｌ／Ａｌａ多型と、ＡＰＣタンパク質のＥ１３１７Ｑおよび／またはＩ１３０７Ｋの組合せの使用を示唆する。
【０１１４】
従って、本発明の別の態様によって、対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定する方法が提供される。この方法は、対象のＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定することによって行われ、それによって対象が胃腸癌の素因をもっているかどうかを決定する。
【０１１５】
本明細書において使用される用語「素因をもつ」は、胃腸癌に関して使用される場合、素因をもたない対象よりも胃腸癌を発症しやすい対象を示す。
【０１１６】
用語「同型接合」または「異型接合」はそれぞれ、特定の多型の２つの同一の対立遺伝子または２つの異なる対立遺伝子を示す。
【０１１７】
用語「多型」は、より稀な（または最も稀な）形態が反復突然変異のみによっては維持されることができない頻度での特定の核酸の２つ以上の遺伝的に決定された異型（対立遺伝子）の発生を示す。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、同じ遺伝子座での関連する対立遺伝子間の単一塩基の違いから生じる。多型の非限定的な例は、ＣＤ２４ポリペプチド（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３７３６２．１）の５７位にＡｌａ／Ｖａｌの非同義的ミスセンス変異を生じるＣＤ２４コード配列（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３２３０．２）の２８０位におけるシトシンヌクレオチドまたはチミジンヌクレオチドの存在である。
【０１１８】
本明細書において遺伝子型に関して使用される用語「非存在」は、特定の遺伝子型決定試験の否定的な結果を記載する。例えば、もし遺伝子型決定試験が配列番号１の２８０位にチミジンヌクレオチドを含有する対立遺伝子の同定に適しており、そして試験が行われる対象が配列番号１の２８０位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子について同型接合であるなら、試験結果は「遺伝子型の非存在」となるだろう。
【０１１９】
好ましくは、ＣＤ２４核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの２８０位にチミジンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【０１２０】
以下の実施例の節の実施例３においてさらに示されるように、本発明者らは、（ＣＤ２４のＶａｌ−５７多型をコードする）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの２８０位にチミジンヌクレオチドを含有する対立遺伝子、および（ＡＰＣのＬｙｓ（Ｋ）−１３０７多型をコードする）配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子および／または（ＡＰＣのＧｌｎ（Ｑ）−１３１７多型をコードする）配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子の両方を担持する個体が、胃腸癌に対する素因を増大することを発見した（ｐ値は、Ｖａｌ−５７とＬｙｓ（Ｋ）−１３０７について０．０２４、Ｖａｌ−５７とＧｌｎ（Ｑ）−１３１７について０．０２８である）。
【０１２１】
従って、本発明の好ましい実施形態によって、対象が胃腸癌の素因をもっているかどうか決定する方法は、対象のＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型の同型接合形態または異型接合形態での存在または非存在を決定することをさらに含む。
【０１２２】
好ましくは、ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、（配列番号８に記載のＡＰＣポリペプチドのリジン−１３０７多型をコードする）配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【０１２３】
好ましくは、ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、（配列番号８に記載のポリペプチドのグルタミン−１３１７多型をコードする）配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【０１２４】
好ましくは、ＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つの癌関連遺伝子型は、配列番号７に記載のポリヌクレオチドの３９７７位にアデノシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子および配列番号７に記載のポリヌクレオチドの４００６位にシトシンヌクレオチドを含有する対立遺伝子である。
【０１２５】
胃腸癌に対する素因は、遺伝子型相対危険（ＧＲＲ）値を生成して使用することによって定量化されることができる。ＧＲＲは、特定の遺伝子型を有する個体が疾患を発症する増大された可能性である。従って、保護遺伝子型Ｇ０に関して、危険遺伝子型ＧのＧＲＲは、遺伝子型Ｇを担持する個体が疾患を発症する危険と遺伝子型Ｇ０を担持する個体が疾患（例えば、ＣＲＣ）を発症する危険との間の比率である。本明細書において使用されるＧＲＲは、ケースおよびコントロールにおけるＧ対Ｇ０適正なオッズ比（ＯＲ）の観点から表される。そのうえ、ハプロタイプのＧＲＲの計算は、同型接合個体のＧＲＲが異型接合個体のＧＲＲの二乗である乗法モデルに基づく。さらに詳細については、ＲｉｓｃｈおよびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ、１９９６（「複雑なヒト疾患の遺伝学研究の未来」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：１５１６−１５１７）を参照のこと。
【０１２６】
いったん計算されると、ＧＲＲは、ＣＤ２４核酸配列および／またはＡＰＣ核酸配列において特定の癌関連遺伝子型を有する個体の、胃腸癌を発症する危険の増大された素因を反映することができる。
【０１２７】
従って、本発明は、ＣＤ２４およびＡＰＣの遺伝子および／またはタンパク質において特定の遺伝子型を検出することによって、胃腸癌に対する対照の素因を予測する方法を提供する。そのような遺伝子型はＤＮＡレベルで、ならびに特定のタンパク質多型を検出することができる抗体を用いてタンパク質レベルで検出されることができることが理解される。
【０１２８】
ＤＮＡサンプルまたはタンパク質サンプルは、対象の細胞または細胞含有物のいかなる供給源からも得ることができ、そのような供給源は、限定されないが、末梢血液細胞（注射器を使用して得られる；例えば、白血球）、皮膚細胞（皮膚生検から得られる）、口腔上皮細胞（口腔洗浄から得られる）、脳脊髄液、尿、リンパ液、呼吸器、腸管および尿生殖路の種々の外分泌物、涙、唾液、および乳汁、ならびに悪性組織、羊水、および絨毛膜、組織切片（例えば、凍結切片またはパラフィン包埋切片）などを含む。
【０１２９】
いったんサンプルが得られると、ＤＮＡは好ましくは、当該分野で周知の方法を使用して抽出され、そのような方法は、組織を刻むこと、細胞溶解、タンパク質抽出、および２〜３容量部の１００％エタノールを使用するＤＮＡ析出、７０％エタノールでのすすぎ、ペレット化、乾燥、および水または任意の他の好適な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）における再懸濁を含む。好ましくは、そのような手順の後に、例えば、２６０ｎｍでサンプルの光学濃度（ＯＤ）を測定することによってＤＮＡの濃度が決定される（ここで、１単位ＯＤ＝５０μｇ／ｍｌ  ＤＮＡ）。あるいは、ＤＮＡは、タンパク質消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）を添加した後、変性（例えば、５〜１０分間の９５℃での煮沸）によって得られることができる。さらに代替的には、ＤＮＡは、既に記載されるように（Ａｒｂｅｒ  Ｎ，Ｓｈａｐｉｒａ  Ｉら、２０００，「ヒトの胃腸管腫瘍におけるｃ−Ｋ−ｒａｓ変異の活性化」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１８：１０４５−５０）、組織切片（例えば、保存用のパラフィン包埋切片）から単離されることができる。
【０１３０】
好ましくは、ＤＮＡサンプルは、末梢血液サンプルから得られる。血液サンプルからＤＮＡを抽出する方法は当該分野において周知である。
【０１３１】
いったん得られると、ＤＮＡサンプルは好ましくは、本発明のＣＤ２４および／またはＡＰＣ核酸配列における少なくとも１つ以上の癌関連遺伝子型の存在または非存在について特徴付けられる。
【０１３２】
本発明のＳＮＰは、配列改変を同定するのに好適な種々の方法を使用して同定されることができる。１つの選択肢は、ＰＣＲ反応産物の全遺伝子配列を決定することである。あるいは、核酸の所定のセグメントは、いくつかの他のレベルで特徴付けられることができる。最も低い分解能では、分子の大きさが、電気泳動によって同じゲル上で泳動させた既知の標準物との比較によって決定されることができる。分子のより詳細な像は、電気泳動の前に制限酵素の組合せで切断し、順序づけられたマップの構築を可能にすることによって得られることができる。フラグメント内の特定の配列の存在は、標識されたプローブのハイブリダイゼーションによって検出されることができるか、または正確なヌクレオチド配列は、部分的な化学消化によってか、または連鎖停止ヌクレオチドアナログの存在下でのプライマー伸長によって決定されることができる。
【０１３３】
多くの遺伝子型決定方法が目的の配列改変を担持するＤＮＡ領域の増幅を必要とするので、ＤＮＡサンプルは好ましくは、配列改変を決定する前に増幅される。
【０１３４】
いずれの場合においても、ＣＤ２４遺伝子またはＡＰＣ遺伝子における配列改変（例えば、ＳＮＰ）の存在は、本明細書において上で記載されるような、ＣＤ２４遺伝子またはＡＰＣ遺伝子における核酸配列の改変と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用を典型的に伴う方法を使用して決定される。
【０１３５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語は、天然に存在する塩基、糖および共有結合性ヌクレオチド間連結（例えば、バックボーン）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、天然に存在するそれぞれの部分と同様に機能する、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１３６】
本発明の教示に従って設計されるオリゴヌクレオチドは、酵素的合成または固相合成のような、この分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成方法に従って作製されることができる。固相合成を実行するための設備および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる：オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、バルチモア、メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）および「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）に詳しく記載されるような確立された方法論によって成し遂げることができ、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、それに続く脱保護、脱塩および精製（例えば、自動化されたトリチル−オン法またはＨＰＬＣによる精製）を利用して成し遂げることができる。
【０１３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書において上に記載される配列改変と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基または少なくとも４０塩基のものである。
【０１３８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プリン塩基およびピリミジン塩基からなり、３’→５’ホスホジエステル結合中に結合された複素環式ヌクレオシドを含むことができる。
【０１３９】
好ましくは、使用されるオリゴヌクレオチドは、当該分野において知られているように、バックボーン、ヌクレオシド間結合、または塩基のいずれかにおいて変化させられるオリゴヌクレオチドである。
【０１４０】
以下は、上で記載されたＳＮＰの１つまたは複数を同定するために使用されることができるＳＮＰ検出方法の非限定的な列挙である。
【０１４１】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）：この方法は、ＲＦＬＰの生成または破壊をもたらす、制限酵素のための認識部位を変化させる単一ヌクレオチド（ＳＮＰヌクレオチド）での変化を使用する。ＤＮＡヘテロ二重鎖における単一ヌクレオチドのミスマッチはまた、いくつかの化学物質によって認識および切断され、「ミスマッチ化学的切断」（ＭＣＣ）と一般に呼ばれる、単一塩基置換を検出する代わりの方法を提供する（Ｇｏｇｏｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９０）「テトラアルキルアンモニウム塩の存在下の、過マンガン酸カリウムおよびヒドロキシルアミンによるチミン残基およびシトシン残基の単一塩基ミスマッチの検出」Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：６８０７−６８１４）。しかしながら、この方法は、四酸化オスミウムおよびピペリジン（臨床研究室での使用には適さない２つの非常に有害な化学物質）の使用を必要とする。
【０１４２】
配列決定分析−単離されたＤＮＡは、色素−ターミネーター（標識されていないプライマーおよび標識されたジデオキシヌクレオチド）または色素−プライマー（標識されたプライマーおよび標識されていないジデオキシヌクレオチド）サイクルの配列決定プロトコルを使用して、自動化されたジデオキシターミネーター配列決定反応に供される。色素−ターミネーター反応のために、ＰＣＲ反応は、標識されていないＰＣＲプライマーを使用して行われ、その後に、プライマー、デオキシヌクレオチド、および標識されたジデオキシヌクレオチド混合物のうちの１つの存在下での配列決定反応が行われる。色素−プライマー反応のために、ユニバーサルプライマーまたはリバースプライマー（各方向において１つ）に結合体化されたＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ反応が行われ、その後に、各々がユニバーサル配列またはリバース配列に特異的な標識されたプライマーおよび対応する標識されていないジデオキシヌクレオチドを含有する４つの別個の混合物（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴヌクレオチドに対応する）の存在下での配列決定反応が行われる。
【０１４３】
マイクロ配列決定分析−この分析は、本明細書において上記で言及されるように、増幅反応（ＰＣＲ）によって得られることができるＣＤ２４遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の特定の領域でマイクロ配列決定反応を実施することによって行われることができる。ゲノムＤＮＡ増幅産物またはｃＤＮＡ増幅産物は次いで、（各々のｄｄＮＴＰに対して特異的な蛍光発光を使用する）ｄｄＮＴＰ、および目的の改変部位のすぐ上流にハイブリダイズすることができる適当なオリゴヌクレオチドマイクロ配列決定用プライマーを使用して、自動化されたマイクロ配列決定反応に供される。いったん相補的な蛍光ジデオキシヌクレオチドアナログを使用するＤＮＡポリメラーゼによって（例えば、熱サイクルによって）３’端で特異的に伸長されると、プライマーは、組み込まれていない蛍光ｄｄＮＴPを除去するために沈降される。蛍光ｄｄＮＴＰが中に組み込まれた反応生成物は、次いで、組み込まれた塩基の正体を決定するために配列決定機（例えば、ＡＢＩ３７７）上で電気泳動によって分析され、それによって本発明のＣＤ２４遺伝子またはＡＰＣ遺伝子における配列改変を同定する。
【０１４４】
伸長されたプライマーが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によっても分析できることが理解される。この場合、改変部位の塩基は、マイクロ配列決定用プライマー上に加えられた質量によって同定される（Ｈａｆｆ，Ｌ．Ａ．およびＳｍｉｒｎｏｖ，Ｉ．Ｐ．（１９９７）「質量タグで標識されたプライマーによるＰＣＲ産物の多重遺伝子型決定」Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５（１８），３７４９−３７５０を参照のこと）。
【０１４５】
最近開発された固相マイクロ配列決定反応は、本明細書において上に記載されるマイクロ配列決定方法に代わるものとして使用されることができる。固相マイクロ配列決定反応は、オリゴヌクレオチドマイクロ配列決定用プライマー、または目的のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅産物を利用し、これらは固定されている。固定化は、例えば、ビオチニル化ＤＮＡと、ストレプトアビジンで覆われたマイクロタイターウエルまたはアビジンで覆われたポリスチレン粒子との間の相互作用によって実行されることができる。
【０１４６】
固相マイクロ配列決定反応において、組み込まれたｄｄＮＴＰは、放射能標識されるか（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．Ｃ．（１９９４）「固相ミニ配列決定法によるヒト遺伝子における点変異の検出」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２２６，２２５−２３６）またはフルオレセインに連結されるか（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．およびＨａｉｎｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９４）「アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の決定および希少な対立遺伝子の発見のためのマイクロタイタープレートアッセイ」Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３（４），３７９−３８５）のいずれかであることができる。放射能標識されたｄｄＮＴＰの検出は、シンチレーションに基づく技術によって達成されることができる。フルオロセインに連結したｄｄＮＴＰの検出は、アルカリホスファターゼと結合体化した抗フルオロセイン抗体の結合と、その後の発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート）でのインキュベーションに基づく。
【０１４７】
他のリポーター検出結合体は、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に連結されたｄｄＮＴＰおよび抗ＤＮＰアルカリホスファターゼの結合体（Ｈａｒｊｕ，Ｌ．ら（１９９３）「α−１−抗トリプトシンＺ変異の検出のための比色固相ミニ配列決定アッセイ」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３９（２），２２８２−２２８７を参照のこと）、およびビオチニル化ｄｄＮＴＰと基質としてｏ−フェニレンジアミンを有する西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化されたストレプトアビジンを含む（ＷＯ  ９２／１５７１２を参照のこと）。
【０１４８】
アルカリホスファターゼと結合体化した抗フルオレセイン抗体でフルオレセインに連結されたｄｄＮＴＰに基づく診断キットは、ＧａｍｉｄａＧｅｎ  Ｌｔｄ（ＰＲＯＮＴＯ）から市販されている。
【０１４９】
マイクロ配列決定プロトコルの他の変更は、Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．Ｂ．ら（１９９３）「酵素的照度測定無機ピロリン酸検出アッセイによる固相ＤＮＡミニ配列決定」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０８（１），１７１−１７５；およびＰａｓｔｉｎｅｎ，Ｔ．ら（１９９７）「ミニ配列決定：ＤＮＡ分析およびオリゴヌクレオチドアレイでの診断のための特異的ツール」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，６０６−６１４によって記載される。
【０１５０】
ポリメラーゼおよびリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイ−オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、標的分子の一本鎖の隣接する配列にハイブリダイズすることができるように設計される２つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドのうちの一方はビオチニル化され、他方は検出可能に標識される。もし標的分子において正確な相補配列が見つけられたなら、オリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接し、捕捉かつ検出されることができるライゲーション基質を作るように標的にハイブリダイズするだろう。ＯＬＡは、単一ヌクレオチド多型を検出することができ、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら（１９９０）「ＥＬＩＳＡに基づくオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを使用する自動化ＤＮＡ診断」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８９２３−８９２７によって記載されるように、ＰＣＲと有利に組み合わせられることができる。この方法において、ＰＣＲは、標的ＤＮＡの指数関数的な増幅を達成するために使用され、それは次いで、ＯＬＡを使用して検出される。
【０１５１】
単一ヌクレオチド多型の検出のために特に好適な他の増幅方法は、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、およびＧａｐ  ＬＣＲ（ＧＬＣＲ）を含む。ＬＣＲは、特定の標的を指数関数的に増幅するための２対のプローブを使用する。オリゴヌクレオチドの各対の配列は、その対が標的の同じ鎖の隣接する配列にハイブリダイズすることを可能にするように選択される。このようなハイブリダイゼーションは、テンプレート依存性リガーゼのための基質を形成する。本発明に従って、ＬＣＲは、２対立遺伝子マーカー部位の同じ鎖の近位配列および遠位配列を有するオリゴヌクレオチドで行われることができる。１つの実施形態において、いずれのオリゴヌクレオチドも２対立遺伝子マーカー部位を含むように設計される。そのような実施形態において、反応条件は、標的分子がオリゴヌクレオチド上の２対立遺伝子マーカーに相補的な特異的ヌクレオチドを含有するかまたは欠いているかのいずれかの場合にのみ、オリゴヌクレオチドがともにライゲーションされることができるように選択される。代替的な実施形態において、ＷＯ  ９０／０１０６９に記載されるように、オリゴヌクレオチドは２対立遺伝子マーカーを含まず、従って、それらが標的分子にハイブリダイズするときに「ギャップ」が作られる。このギャップは、次いで、（ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される）相補的ｄＮＴＰで、またはオリゴヌクレオチドのさらなる対によって「満たされる」。従って、各サイクルの終わりに、各々の一本鎖は、次の増幅サイクル時に標的として作用することができる相補体を有し、所望の配列の指数関数的な対立遺伝子特異的増幅が得られる。
【０１５２】
リガーゼ／ポリメラーゼ媒介Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  ＡｎａｌｙｓｉｓＴＭ−これは、核酸分子において予め選択された部位でヌクレオチドの正体を決定するための別の方法である（ＷＯ  ９５／２１２７１）。この方法は、予め選択された部位に存在するヌクレオチドに相補的なヌクレオシド三リン酸の、プライマー分子の末端上への組み込み、および第２のオリゴヌクレオチドへのそれらの続くライゲーションを含む。反応は、溶液中の検出によって、または反応の固相に結合された特定の標識を検出することによって監視される。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションアッセイ方法−単一塩基の改変の検出を可能にするハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、オリゴヌクレオチドの使用に依存し、そのようなオリゴヌクレオチドは、１０、１５、２０、または３０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１０〜５０のヌクレオチド長、より好ましくは４０〜５０ヌクレオチド長であることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、ＣＤ２４遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の多型部位に相補的な中心ヌクレオチド、および多型部位の各々の端をつなぐＣＤ２４遺伝子またはＡＰＣ遺伝子のヌクレオチド配列に実質的に相補的な中心ヌクレオチドの各々の端をつなぐフランキングヌクレオチド配列を含む。配列改変は、本発明のオリゴヌクレオチドのストリンジェントなハイブリダイゼーション反応下でのテンプレート配列へのハイブリダイゼーションによって検出されることができる。
【０１５４】
例として、短い核酸（２００ｂｐより短い長さ、例えば、１７〜４０ｂｐ長）のハイブリダイゼーションは、所望のストリンジェンシーに依存して、以下のハイブリダイゼーションプロトコルのいずれかによって行うことができる：（ｉ）６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション溶液、Ｔｍを１〜１．５℃下回るハイブリダイゼーション温度、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）および０．５％  ＳＤＳのＴｍを１〜１．５℃下回る温度の最終洗浄溶液；（ｉｉ）６×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション溶液、Ｔｍを２〜２．５℃下回るハイブリダイゼーション温度、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）および０．５％  ＳＤＳのＴｍを１〜１．５℃下回る温度の洗浄溶液、および２２℃の６×ＳＳＣの最終洗浄溶液；ならびに（ｉｉｉ）６×ＳＳＣおよび１％  ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション溶液、ハイブリダイゼーション温度。
【０１５５】
ハイブリッド二本鎖の検出は、多くの方法によって実行されることができる。典型的には、ハイブリダイゼーション二本鎖は、ハイブリダイズしていない核酸から分離され、次いで二本鎖に結合された標識が検出される。そのような標識は、放射能標識、蛍光標識、生物学的標識、酵素タグ、または当該分野において標準的に使用される標識を示す。標識は、生物学的サンプル（標的）に由来するオリゴヌクレオチドプローブまたは核酸のいずれかと結合体化されることができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、合成後、ビオチニル化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組み込むことによって、または類似の手段（例えば、ビオチンのソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋すること）によって、その後の標識されたストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリン結合体化ストレプトアビジン）またはその等価物の添加によって標識されることができる。あるいは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが使用されるとき、フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および／または他のもの（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｊ．Ｄ．（１９９２）、「Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照のこと）がオリゴヌクレオチドに結合されることができる。
【０１５６】
伝統的なハイブリダイゼーションアッセイは、ＰＣＲ分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析、ＲNａｓｅ保護分析、インシトゥハイブリダイゼーション分析、プライマー伸長分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、およびドットブロット分析を含む。
【０１５７】
当業者は、洗浄工程が、過剰な標的ＤＮＡまたはプローブ、ならびに結合していない結合体を洗い流すために使用されることができることを理解するだろう。さらに、標準的な異種アッセイ形式は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ上に存在する標識を使用するハイブリッドの検出のために好適である。
【０１５８】
２つの最近開発されたアッセイは、分離または洗浄の必要が無く、ハイブリダイゼーションに基づく対立遺伝子の識別を可能にする（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら（１９９８）「少量の遺伝情報の読み取り：単一ヌクレオチド多型分析のための方法」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８（８），７６９−７７６を参照のこと）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性をうまく利用して、累積する増幅産物に特異的にアニーリングしたＤＮＡプローブを消化する。ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光エネルギー移行によって相互作用する供与体−受容体色素対で標識される。増幅時に進むポリメラーゼによるＴａｑＭａｎプローブのＣ１切断は、クエンチする受容体色素から供与体色素を分離し、供与体の蛍光を大いに増大させる。２つの対立遺伝子の変異体を検出するために必要な全ての試薬は、反応の開始時に集められることができ、結果は実時間で監視される（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．およびＨａｉｎｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９４）「アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の決定および希少対立遺伝子の発見のためのマイクロタイタープレートアッセイ」Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３（４），３７９−３８５を参照のこと）。代替的な同種ハイブリダイゼーションに基づく手順において、分子ビーコンは、対立遺伝子を識別するために使用される。分子ビーコンは、ヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブであり、それは同種溶液における特定の核酸の存在を報告する。分子ビーコンがそれらの標的に結合したとき、分子ビーコンは、内部でクエンチされたフルオロフォアの蛍光を回復させる構造の再編成を経験する（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．ら（１９９８）「対立遺伝子識別のための多色分子ビーコン」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６（１），４９−５３）。
【０１５９】
ハイブリダイゼーションアッセイの精度を改善するために、種々のコントロールが有用に利用されることができることが理解される。例えば、サンプルは、誤ったハイブリダイゼーションを評価するために、不適切なプローブにハイブリダイゼーションさせられ、ハイブリダイゼーションの前にＲＮａｓｅ  Ａで処理されることができる。
【０１６０】
米国特許第５４５１５０３号は、テンプレートＤＮＡまたはＲＮＡにおいてＳＮＰを検出するために利用されることができるオリゴヌクレオチド構造のいくつかの例を提供する。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーション−チップ／アレイ技術は、既に多数のケースにおいて成功裏に適用された。例えば、変異のスクリーニングは、Ｓ．セレビシアエ変異株におけるＢＲＣＡ１遺伝子およびＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子において行なわれた（Ｈａｃｉａ，ＪＧら（１９９６）「高密度オリゴヌクレオチドアレイおよび二色蛍光分析を用いるＢＲＣＡ１における異型接合変異の検出」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １４（４），４４１−４４７；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｄ．Ｄ．ら（１９９６）「高度に類似している分子バーコード戦略を用いる酵母の欠失変異体の定量的表現形分析」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １４（４），４５０−４５６；およびＫｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）「高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いてＨＩＶ−１クレードＢプロテアーゼ遺伝子において観察される広範囲の多型」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２（7），７５３−７５９を参照のこと）。
【０１６２】
分析される候補領域を含む核酸サンプルは、単離され、増幅され、そしてリポーター基で標識される。このリポーター基は、フィコエリトリンのような蛍光基であることができる。標識された核酸は、次いで、Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎを用いてチップ上に固定されたプローブでインキュベートされる。例えば、Ｍａｎｚらは、シリコン基板およびガラス基板における、流体工学装置と特定のマイクロキャピラリー装置の組み立てを記載する（Ｍａｎｚ，Ａ．ら（１９９３）「分離システムの小型化のための平面チップ技術」Ａｄｖ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ３３，１−６６）。
【０１６３】
いったん反応が完了すると、チップはスキャナ中に挿入され、ハイブリダイゼーションのパターンが検出される。ハイブリダイゼーションのデータは、核酸中に既に組み込まれ、今はチップに付着されたプローブに結合されたリポーター基から放射されるシグナルから集められる。核酸サンプルの配列に完全にマッチするプローブは一般的に、ミスマッチを有するプローブよりも強いシグナルを生成する。チップ上に固定化される各々のプローブの配列および位置は既知であるので、所定のプローブにハイブリダイズした核酸の正体は決定されることができる。
【０１６４】
単一ヌクレオチド多型分析のために、４個のオリゴヌクレオチドプローブ（各塩基型について１個）のセット、好ましくは２個のオリゴヌクレオチドプローブ（２対立遺伝子マーカーの各塩基型について１個）のセットは一般的に、核酸サンプルにおいて見出される候補領域の一部分の各位置にわたり、多型塩基の正体においてのみ異なるように設計される。特定の位置での各々の一連のプローブに対するハイブリダイゼーションの相対的な強度は、プローブの多型塩基に対応する塩基の同定を可能にする。
【０１６５】
直接電場コントロールの使用が単一塩基変異の決定を改善することが理解される（Ｎａｎｏｇｅｎ）。正の電場は、負に荷電された核酸の移動速度を増大し、ハイブリダイゼーション速度の１０倍の増大を生じる。この技術を使用すると、単一塩基対ミスマッチは、１５秒未満で検出される（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９７）「直接電場コントロールによるＤＮＡハイブリッドにおける単一塩基ミスマッチの迅速な決定」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（４），１１１９−１１２３を参照のこと）。
【０１６６】
統合システム−配列改変を分析するために使用されることができる別の技術は、多成分統合システムを含み、それは単一機能装置においてＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応のようなプロセスを小型化かつ区分化する。このような技術の一例は、米国特許第５５８９１３６号に開示されており、それはチップにおけるＰＣＲ増幅とキャピラリー電気泳動の統合を記載する。
【０１６７】
統合システムは好ましくは、マイクロ流体工学システムと共に使用される。これらのシステムは、マイクロチップ上に含まれるガラス、シリコン、石英、またはプラスチックのウエハ上に設計されるマイクロチャネルのパターンを含む。サンプルの移動は、部品を動かすことなく機能的微細弁およびポンプを作成するために、電気的に、電気−浸透圧的に、またはマイクロチップの異なる領域を横切って適用される静水力によって制御される。電圧を変えることは、微細に機械加工されたチャネル間の交差部分での流体の流れを制御し、マイクロチップの異なる区域を横切ってポンプ輸送するための流体の流速を変える。
【０１６８】
配列の改変を同定するとき、マイクロ流体工学システムは、核酸増幅、マイクロ配列決定、キャピラリー電気泳動、およびレーザー誘導蛍光検出のような検出方法を統合することができる。最初の工程において。ＤＮＡサンプルは、好ましくはＰＣＲによって増幅される。増幅産物は次いで、（各ｄｄＮＴＰについて特定の蛍光を有する）ｄｄＮＴＰ、および標的多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズする適切なオリゴヌクレオチドマイクロ配列決定用プライマーを使用する自動化マイクロ配列決定反応に供される。いったん３’端での伸長が完了すると、プライマーは、キャピラリー電気泳動によって、組み込まれていない蛍光ｄｄＮＴＰから分離される。キャピラリー電気泳動において使用される分離媒体は、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはデキストランであることができる。単一ヌクレオチドプライマー伸長産物において組み込まれたｄｄＮＴＰは、蛍光検出によって同定される。このマイクロチップは、９６〜３８４個のサンプルを並列に処理するために使用されることができる。それは、ｄｄＮＴＰの典型的な４色のレーザー誘導蛍光検出を使用することができる。
【０１６９】
自動化された機器と共に使用されるとき、上記の検出方法が、本発明のＣＤ２４またはＡＰＣ改変について複数のサンプルをスクリーニングするために迅速かつ容易に使用されることが理解される。
【０１７０】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）−この方法では、プライマー伸長またはライゲーション事象がマッチまたはミスマッチの指標として使用されることができるように、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、多型ヌクレオチドの近くでハイブリダイズするように設計される。放射能標識されたＡＳＯとのハイブリダイゼーションはまた、特定のＳＮＰの検出にも適用された（Ｃｏｎｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．ら（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８０，２７８−２８２）。この方法は、単一ヌクレオチドだけ異なる短いＤＮＡフラグメントの融解温度が異なることに基づいている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件により、変異型対立遺伝子と野生型対立遺伝子を識別することができる。
【０１７１】
変性／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）−２つの他の方法は、小さな配列変化に対する応答における電気泳動移動度の変化を検出することに依る。これらの方法の１つは「変性勾配ゲル電気泳動」（ＤＧＧＥ）と呼ばれており、これは、わずかに異なる配列が、勾配ゲルで電気泳動により分離されたとき、局所的融解の異なるパターンを示すという観察結果に基づいている。このように、ホモ二重鎖に対する単一ヌクレオチドが異なるヘテロ二重鎖の融解特性の違いは、対応する電気泳動移動度の変化によって標的配列におけるＳＮＰの存在を検出するために使用されることができるので、変異体は区別されることができる。分析されるフラグメント（通常の場合にはＰＣＲ産物）は、鎖の完全な解離を伴うことなく目的とする配列の完全な変性を可能にするために長い領域のＧ−Ｃ塩基対（３０〜８０）によって一方の端部で「固定」される。ＤＮＡフラグメントへのＧＣ「クランプ」の結合は、ＤＧＧＥによって認識されうる変異の割合を増大させる（Ａｂｒａｍｓ，Ｅ．Ｓ．ら（１９９０）「変性勾配ゲル電気泳動およびＧＣクランプを使用する、ヒトゲノムＤＮＡにおける単一塩基変化の総合的検出」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７：４６３−４７５）。ＧＣクランプを１つのプライマーに結合することは、増幅された配列が低い解離温度を有すること確保するために重要である（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．ら（１９８９）「ポリメラーゼ連鎖反応によるゲノムＤＮＡフラグメントへの４０塩基対のＧ＋Ｃリッチ配列（ＧＣ−クランプ）の付着は、単一塩基変化の改善された検出をもたらす」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６，２３２−２３６；ならびにＬｅｒｍａｎ，Ｌ，Ｓ．およびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｋ，（１９８７）「ＤＮＡ融解の計算シミュレーションおよび変性勾配ゲル電気泳動へのその適用」Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５５：４８２−５０１）。この技術の改変が、温度勾配を使用して開発されており（Ｗａｒｔｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９０）「温度勾配ゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメントにおける塩基対置換の検出」Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１８（９）：２６９９−２７０５）、この方法はまた、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖にも適用されることができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．Ｉ．ら（１９８８）「溶液中の融解挙動の差異によってＲＮＡ分子における単一塩基の置換を検出する新規な方法」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３（３）：２１７−２２３）。
【０１７２】
ＤＧＧＥの有用性に対する制限は、変性条件が、試験されるＤＮＡの各タイプについて最適化されなければならない要件を含む。さらに、この方法は、ゲルを調製し、かつ、必要となる高い温度を電気泳動期間中に維持するための特別な設備を要求する。試験されるそれぞれの配列のための１つのオリゴヌクレオチドでの固定用テールの合成に関連する費用もまた、大きな検討事項である。さらに、長い泳動時間がＤＧＧＥのために要求される。ＤＧＧＥの長い泳動時間は、「定常変性ゲル電気泳動」（ＣＤＧＥ）と呼ばれるＤＧＧＥの改変法では短縮された（Ｂｏｒｒｅｎｓｅｎ，Ａ．ら（１９９１）「ｐ５３変異についての迅速なスクリーニング技術としての定常変性ゲル電気泳動」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８（１９）：８４０５−８４０９）。ＣＤＧＥは、ＳＮＰの検出のための高い効率を達成するために、ゲルが種々の変性条件のもとで電気泳動されることを要求する。
【０１７３】
「温度勾配ゲル電気泳動」（ＴＧＧＥ）と呼ばれる、ＤＧＧＥに類似する技術は、化学的な変性勾配ではなく、温度勾配を使用する（Ｓｃｈｏｌｚ，Ｒ．Ｂ．ら（１９９３）「温度勾配ゲル電気泳動によるＴｐ５３変異についての迅速なスクリーニング：ＳＳＣＰ分析との比較」Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２（１２），２１５５−２１５８）。ＴＧＧＥは、電場に対して直交的に配向する温度勾配を生じさせることができる特別な設備を使用することを要求する。ＴＧＧＥは、ＤＮＡの比較的小さいフラグメントにおいて変異を検出することができ、従って、大きい遺伝子セグメントを走査することは、ゲルを泳動する前に、多数のＰＣＲ産物の使用を要求する。
【０１７４】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）−「一本鎖高次構造多型」（ＳＳＣＰ）と呼ばれる別の一般的な方法が、Ｈａｙａｓｈｉ、Ｓｅｋｙａおよび共同研究者らによって開発され（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ（１９９１）「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ：ゲノムＤＮＡにおける変異を検出するための、単純で感度の高い方法」ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ  Ａｐｐｌ  １，３４−３８）によって総説される）、これは、核酸の一本鎖が非変性条件では特徴的な立体配座をとることができ、このような立体配座が電気泳動度に影響を及ぼすという観察結果に基づいている。相補的な鎖は、一方の鎖が反対側の鎖から分離しうるような十分に異なる構造をとる。フラグメント内の配列の変化は立体配座をも変化させ、その結果として、移動度を変化させ、かつ、このことを配列変化についてのアッセイとして使用することを可能にする（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら（１９８９ａ）「ポリメラーゼ連鎖反応を使用する点変異およびＤＮＡ多型の迅速かつ感度の高い検出」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：８７４−８７９；Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら（１９８９ｂ）「一本鎖高次構造多型としてのゲル電気泳動によるヒトＤＮＡの多型の検出」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２７６６−２７７０）。
【０１７５】
ＳＳＣＰプロセスは、両方の鎖において標識されるＤＮＡセグメント（例えば、ＰＣＲ産物）を変性させること、その後、分子内相互作用が泳動期間中に形成され、かつ、破壊され得ないように非変性ポリアクリルアミドゲルでのゆっくりとした電気泳動分離を行うことを含む。この技術は、ゲルの組成および温度における変動に対して極めて敏感である。この方法の一連の制限は、明らかに類似する条件のもとでも、異なる研究室で得られたデータを比較する際に直面する相対的な困難である。
【０１７６】
ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）−ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）は、変異の存在について遺伝子を走査するために開発された別の技術である（Ｌｉｕ，Ｑ．およびＳｏｍｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．（１９９４）「ジデオキシフィンガープリンティングおよびＳＳＣＰの感度に影響するパラメータ」ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  ４：９７−１０８）。ｄｄＦ技術は、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ配列決定の構成要素をＳＳＣＰと組み合わせたものである。まず、ジデオキシ配列決定反応が、１つのジデオキシターミネーターを使用して行われ、次に、反応生成物が、ＳＳＣＰ分析でのように停止セグメントの移動度の変化を検出するために非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動される。ｄｄＦは、増大した感度の点でＳＳＣＰを上回る改善である一方で、ｄｄＦは、高価なジデオキシヌクレオチドの使用を要求し、また、この技術は依然として、変異の最適な検出のためには、ＳＳＣＰのために好適なサイズのフラグメント（すなわち、２００塩基〜３００塩基のフラグメント）の分析に限定されている。
【０１７７】
上記の制限に加えて、単一変異を検出するためのこれらの方法のすべては、分析することができる核酸フラグメントのサイズに関して制限される。直接的な配列決定法については、６００塩基対を超える配列は、フラグメント全体を覆うために、クローン化を必要とし、その結果としての遅延、および、欠失サブクローニングまたはプライマーウォーキングのいずれかの負担を伴う。ＳＳＣＰおよびＤＧＧＥは、さらに一層厳しいサイズ制限を有する。配列変化に対する低下した感度のために、これらの方法は、より大きなフラグメントには適していないと考えられる。ＳＳＣＰは、報告によれば、２００塩基対のフラグメントにおいて９０％の一塩基置換を検出することができるが、その検出は４００塩基対のフラグメントについては５０％未満に低下する。同様に、ＤＧＧＥの感度は、フラグメントの長さが５００塩基対に達するにつれて低下する。ｄｄＦ技術は、直接的な配列決定およびＳＳＣＰの組合せとして、スクリーニングされることができるＤＮＡの比較的小さいサイズによっても制限される。
【０１７８】
ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ分析−この技術（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼの各酵素ならびにアデノシン５’ホスホスルファート（ＡＰＳ）およびルシフェリン基質の存在下での一本鎖のＰＣＲ増幅されたＤＮＡテンプレートに対する配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションに基づいている。第２工程において、４つのうちの最初のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が反応に加えられ、そのデオキシヌクレオチド三リン酸がテンプレート鎖において塩基に対して相補的であるならば、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖内へのそのデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒する。それぞれの取り込み事象には、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量でのピロリン酸（ＰＰｉ）の放出が付随する。最後の工程において、ＡＴＰスルフリラーゼは、アデノシン５’ホスホスルファートの存在下でＰＰｉをＡＴＰに定量的に変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生じさせるオキシルシフェリンへのルシフェリンのルシフェラーゼ媒介の変換を行わせる。ルシフェラーゼにより触媒される反応で生じた光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、ｐｙｒｏｇｒａｍＴＭにおけるピークとして見られる。それぞれの光シグナルの強さは、取り込まれたヌクレオチドの数に比例している。
【０１７９】
ＡｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅＴＭ分析−この技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）は、蛍光分極化（ＦＰ）検出に基づいている。目的のＳＮＰを含有する配列のＰＣＲ増幅後、過剰なプライマーおよびｄＮＴＰは、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩでのインキュベーションにより除かれる。いったんこれらの酵素が熱により不活化されると、Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ−ＦＰプロセスは、熱安定ポリメラーゼを、２つの蛍光ターミネーターの一方を、ＳＮＰ部位のすぐ上流側で停止するプライマーに付加するために使用する。添加されたターミネーターは、その増大したＦＰによって同定され、元のＤＮＡサンプルに存在する対立遺伝子を表す。Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅプロセスでは、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌＴＭ（Ａｒｃｈｅｏｎ科から得られる新規な変異型熱安定ポリメラーゼ）、ならびに、目的のＳＮＰについての可能性のある対立遺伝子を表す、Ｒ１１０およびＴＡＭＲＡで標識された１対のＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓＴＭが使用される。ＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ非ヌクレオチドアナログは、種々のＤＮＡポリメラーゼとともに生物学的に活性である。２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸と同様に、非環状アナログは鎖ターミネーターとして機能する。このアナログは、ＤＮＡ鎖の３’末端に塩基特異的な様式でＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ、そして、３’−ヒドロキシルが存在しないので、ポリメラーゼは鎖のさらなる伸張において機能することができない。ＡｃｙｃｌｏＰｏｌは、種々のＴａｑ変異体が誘導体化２’，３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対して有するよりも、誘導体化されたＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒに対する大きな親和性および特異性を有することが見出されている。
【０１８０】
リバースドットブロット−この技術は、標識された配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、標識されていない核酸サンプルとを使用する。活性化された第一級アミン結合体化オリゴヌクレオチドは、カルボキシル化ナイロン膜に共有結合される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、標識されたプローブまたはプローブの標識されたフラグメントは、オリゴマー制限（すなわち、制限酵素による二重鎖ハイブリッドの消化）を使用して放出されることができる。円形のスポットまたは線が、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼでのインキュベーション、それに続く、テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を使用する発色によって、または、アビジンアルカリホスファターゼ結合体と、酵素活性化に敏感な発光性基質（例えば、ＣＳＰＤなど）でのインキュベーションの後での化学発光、それに続く、Ｘ線フィルムへの感光によって、インキュベーションの後で比色的に可視化される。
【０１８１】
ＳＮＰ検出の分野における進歩により、下記のようなさらに正確で、容易で、かつ、費用のかからない大規模なＳＮＰ遺伝子型決定技術が提供されていることが理解される：例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）（Ｈｏｗｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．ら（１９９９）「動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：８７−８８）；マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）（Ｄａｙ，Ｉ．Ｎ．ら（１９９５）「マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）のために配置されたウエルを伴う水平ポリアクリルアミドゲルを使用するハイスループット遺伝子型決定」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９，８３０−８３５）；ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ら（１９９１）「Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用することによる特異的なポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０）；種々のＤＮＡ「チップ」技術、例えば、米国特許第６３０００６３号（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、２００１）（これは参照として全てが本明細書中に組み込まれる）に開示されるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ（例えば、ＳＮＰチップ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）；Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）によって記載されるＧｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＢＡ（登録商標））；ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ（Ｒｅｎ，Ｂ．ら（２００４）「エキソヌクレアーゼ  ＩＩＩ／ヌクレアーゼ  Ｓ１／ＰＮＡシステムを使用することによる二重鎖ＤＮＡにおけるＳＮＰの直接的な検出」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（４），ｅ４２）およびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ（Ｌａｔｏｒｒａ，Ｄ．ら（２００３）「３’ロックド核酸（ＬＮＡ）プライマーを使用するＳＮＰ遺伝子型決定における増強された対立遺伝子特異的ＰＣＲ識別」Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２２（１），７９−８５）；分子ビーコン（Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら（２００３）「診断ツールとしての分子ビーコン；技術および応用」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４１，４６８−４７４）；インターカレーション色素（Ｇｅｒｍｅｒ，Ｓ．およびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．（１９９９）「オリゴヌクレオチドプローブを用いないシングルチューブでの遺伝子型決定」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ９，７２−７８）；ＦＲＥＴプライマー（Ｓｏｌｉｎａｓ，Ａ．ら（２００１）「ＳＮＰ分析およびＦＲＥＴ適用における二重スコーピオンプライマー」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（２０），Ｅ９６）；ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（Ｂｅａｕｄｅｔ，Ｌ．ら（２００１）「ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを使用する単一ヌクレオチド多型タイプ決定のための同種アッセイ」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １１（４），６００−６０８）；ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（登録商標）（Ｂｅｌｌ，Ｐ．Ａ．ら（２００２）「ＳＮＰｓｔｒｅａｍ  ＵＨＴ：薬理ゲノム学および薬物発見のための、超高スループットＳＮＰ遺伝子型決定」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｕｐｐｌｅ��ｅｎｔ  ７０−７２，７４，７６−７７）；多重ミニ配列決定（Ｃｕｒｃｉｏ，Ｍ．ら（２００２）「キャピラリー電気泳動および液体コア蛍光検出による、多重高スループット固相ミニ配列決定」Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３（１０），１４６７−１４７２）；ＳｎａＰｓｈｏｔＴＭ多重システム（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．ら（２００２）「ＳＮａＰｓｈｏｔを用いるサイトカインおよびレセプター遺伝子における複数の単一ヌクレオチド多型のタイプ決定」Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６３（６），５０８−５１３）；ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤＴＭ（Ｃａｓｈｍａｎ，Ｊ．Ｒ．ら（２００１）「ヒトのフラビンを含有するモノオキシゲナーゼ形態の個体群分布３：遺伝子多型」Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２９，１６２９−１６３７）；ＧＯＯＤアッセイ（Ｓａｕｅｒ，Ｓ．およびＧｕｔ，Ｉ．Ｇ．（２００３）「マトリックス支援レーザー脱着／イオン化質量分析による単一ヌクレオチド多型を遺伝子型決定するためのＧＯＯＤアッセイの拡張」Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １７，１２６５−１２７２）；マイクロアレイミニ配列決定（Ｌｉｌｊｅｄａｈｌ，Ｕ．ら（２００３）「抗高血圧薬物応答の薬理遺伝学的プロファイリングのためのマイクロアレイミニ配列決定システム」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３，７−１７）；アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）（Ｔｏｎｉｓｓｏｎ，Ｎ．ら（２０００）「アレイ型プライマー伸張による遺伝的データの解明」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ３８，１６５−１７０）；マイクロアレイプライマー伸長（Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｄ．ら（２００２）「ＤＮＡマイクロアレイ上でのアピラーゼ媒介対立遺伝子特異的プライマー伸長によるＳＮＰ型決定」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０，ｅ７５）；Ｔａｇアレイ（Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．ら（２０００）「遺伝的高密度オリゴヌクレオチドタグアレイを使用するヒトＳＮＰの平行遺伝子型決定」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０（６），８５３−８６０）；テンプレート誘導取り込み（ＴＤＩ）（Ａｋｕｌａ，Ｎ．ら（２００２）「単一ヌクレオチド多型を検出するための、蛍光分極化検出を伴うテンプレート誘導色素−ターミネーター取り込みの有用性および精度」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３２，１０７２−１０７６，１０７８）；蛍光分極化（Ｈｓｕ，Ｔ．Ｍ．ら（２００１）「蛍光分極化検出を用いる汎用ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１，５６０，５６２，５６４−５６８、各所）；比色法オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら（１９９０）「ＥＬＩＳＡベースのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを使用する自動化ＤＮＡ診断」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７，８９２３−８９２７）；配列コード化ＯＬＡ（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，Ｐ．ら（１９９９）「嚢胞性線維症についての４４７６人の新生児のパイロットスクリーニングにおける、ポリメラーゼ連鎖反応／オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイによる３１  ＣＦＴＲ変異の分析」Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎ  ６，６７−６９）；マイクロアレイライゲーション；リガーゼ連鎖反応；Ｐａｄｌｏ���ｋプローブ；ローリングサークル増幅；Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ（Ｓｈｉ，Ｍ．Ｍ．（２００１）「ハイスループットな変異検出技術および遺伝子型決定技術による大規模な薬理遺伝学研究が可能になる」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７，１６４−１７２）；コード化マイクロスフェア（Ｒａｏ，Ｋ．Ｖ．ら（２００３）「マイクロスフェア上での侵襲的切断反応による、ゲノムＤＮＡからの直接的な単一ヌクレオチド多型の遺伝子型決定」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，ｅ６６）；ＭａｓｓＡＲＲＡＹＴＭ（Ｌｅｕｓｈｎｅｒ，Ｊ．およびＣｈｉｕ，Ｎ．Ｈ．（２０００）「自動化質量分析：臨床診断のための革命的技術」Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ５，３４１−３４８）；ヘテロ二本鎖分析；ミスマッチ切断検出；エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体（米国特許第４６５６１２７号）；および以下に記載されるような他の慣例的技術：Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら（１９８９）；Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｂ．ら（１９９２）「ヘテロ二本鎖多型としての単一ヌクレオチド置換の検出」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２，３０１−３０６；Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ．ら（１９８９）「化学的ミスマッチ切断による、ヒトオルニチントランスカルバモイラーゼにおける変異の走査検出」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６（１５），５８８８−５８９２；およびＧｒｏｍｐｅ，Ｍ．（１９９３）「核酸における未知の変異の迅速な検出」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ５，１１１−１１７など。
【０１８２】
本明細書において上で言及されるように、配列改変（例えば、配列番号２に記載のＣＤ２４ポリペプチドの５７位のＶａｌ／Ａｌａ、配列番号８に記載のＡＰＣポリペプチドの１３０７位のＩｌｅ／Ｌｙｓ、および／または配列番号８に記載のＡＰＣポリペプチドの１３１７位のＧｌｕ／Ｇｌｎ）はまた、タンパク質レベルで決定されることができる。
【０１８３】
簡単に記載すると、タンパク質は、（本明細書において上で記載されるように）対象の細胞または細胞含有物のいかなる供給源のサンプルからでも抽出され、ＣＤ２４タンパク質およびＡＰＣタンパク質の特定の多型の存在が検出される。ＣＤ２４またはＡＰＣの配列改変から生成された切断されたＣＤ２４タンパク質またはＡＰＣタンパク質の検出のような、ＣＤ２４の分子量における大きな変化を検出するためには、クロマトグラフィー法および電気泳動法が使用されることが好ましいが、点変異および分子量におけるわずかな変化を検出するためには、ＣＤ２４またはＡＰＣの配列改変に特異的な抗体を使用して行われうる免疫検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析）、免疫組織化学などが使用されることが好ましい。
【０１８４】
従って、本発明はまた、タンパク質レベルの配列改変（例えば、配列番号２に記載のＣＤ２４ポリペプチドの５７位のＶａｌ／Ａｌａ多型；および／または配列番号８に記載のＡＰＣポリペプチドの１３０７位のＩｌｅ／Ｌｙｓ；および／または配列番号８に記載のＡＰＣポリペプチドの１３１７位のＧｌｕ／Ｇｌｎ）を検出するための、血清免疫グロブリン、ポリクローナル抗体またはそのフラグメント（すなわち、その免疫反応性の誘導体）、モノクローナル抗体または（本明細書において下に記載されるフラグメントを含む）少なくとも抗原結合領域の一部を有するそのフラグメント、キメラ抗体またはヒト化抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）の使用を考慮する。
【０１８５】
（例えば、生物学的サンプルにおいてＣＤ２４の存在および／またはレベルを決定するための）免疫複合体形成または（例えば、対象の特定のＣＤ２４遺伝子型（例えば、配列番号１の２８０位のチミジンヌクレオチド）またはＡＰＣ遺伝子型（例えば、配列番号７の３９７７位のアデノシンヌクレオチドおよび／または配列番号７の４００６位のシトシンヌクレオチド）を検出するための）オリゴヌクレオチドが使用されるときのハイブリダイゼーションを検出するための本明細書において上に記載される試薬は、好ましくは、使用についての適切な指示書、および癌または前悪性の病変の診断における使用、癌治療の有効性を監視すること、および／または胃腸癌に対する対象の素因を決定することについてＦＤＡの承認を示すラベルと共に診断キット／製品に含まれることができる。
【０１８６】
このようなキットは、例えば上記の診断用薬剤（例えば、ＣＤ２４特異的抗体、特定のＣＤ２４多型にハイブリダイズすることができるＣＤ２４オリゴヌクレオチド）のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの容器、および別の容器に詰められた造影試薬（例えば、酵素、二次抗体、緩衝液、発色性基質、蛍光発光材料）を含むことができる。キットはまた、キットの保管期限を改善するための適切な緩衝液および保存剤も含むことができる。
【０１８７】
本明細書において使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１８８】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１８９】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１９０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技術が広く含まれている。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，バルチモア，メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」Ｉ��Ｌ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用されるものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１９１】
実施例１
ｒａｓ変異形質転換細胞株においてＣＤ２４発現が調節される
マイクロアレイを用いる示差的遺伝子発現分析は、相対的なｍＲＮＡレベルの総合的なプロファイルを提供し、従って、疾患の病因、進行、および治療に対する反応に関与する種々の生物学的経路への新しい見識を提供している。この技術は、組織学的に類似の腫瘍を、個々の患者における臨床的な結果を予測しうる分子学的に特定の亜類型へと分類するための価値のある潜在的なツールとして浮上している。マイクロアレイ技術は、ＣＲＣを含む多くの悪性腫瘍の研究において成功裏に適用された（１２〜１６）。
【０１９２】
ＣＲＣの進行に関与する遺伝子を同定するために、本発明者らは、正常な腸細胞を種々の癌遺伝子で形質導入し、以下のように、ラットのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを用いて、特異的ＣＯＸ−２阻害剤であるＣｅｌｅｃｏｘｉｂ（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）への曝露の前後に、形質転換された細胞の遺伝子発現パターンを評価した。
【０１９３】
材料および実験方法
生体外細胞モデル−本発明者らは、種々の正常および形質転換された腸の細胞株からなる生体外モデルを開発した。ラット回腸に由来する正常な腸細胞（ＩＥＣ  １８細胞）は、種々の癌遺伝子を形質導入された。それらのうち、ｒａｓ形質転換された変異腸細胞（Ｒ１細胞で示す）は、非常に攻撃的な表現型を有する。これらの細胞は、薬物耐性選択可能マーカーｔｋ−ｎｅｏおよびプラスミドｐＭＩＫｃｙｓを同時に形質導入することによって産生され、このプラスミドは、コドン１２にシステイン変異を含有するミニヒトｃ−Ｋ−ｒａｓ遺伝子（１５ｋｂ）をコードする。ｒａｓ変異は、ＣＲＣ患者の大部分において見出される。この細胞株に基づくシステムは、発現マイクロアレイの新しい技術の適用が望まれるときに、より整合性がありかつ有用である。なぜなら、それは正常細胞および悪性細胞のみからなっており、悪性の形質転換の真の効果を妨げたり覆い隠したりしてしまうかもしれない炎症細胞、壊死細胞、および間質性細胞を欠いているからである。
【０１９４】
遺伝子発現研究は、生体外細胞モデルからのＲＮＡを使用して、製造者の指示書に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘラット（ＲＧ−Ｕ３４）Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）を使用して行われた。
【０１９５】
実験結果
ＣＤ２４は、Ｒａｓ変異で形質転換された腸の細胞において上方制御され、その発現レベルはＣｅｌｅｃｏｘｉｂでの処理後に逆転する−腸の上皮細胞における悪性の形質転換後の改変された遺伝子発現パターンを特徴付けるために、種々の癌遺伝子で形質転換された腸の細胞株から抽出されたＲＮＡは、ラットの発現アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘラット（ＲＧ−Ｕ３４）Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標））を使用する分析に供された。具体的には、特異的ＣＯＸ−２阻害剤であり、かつ結腸における化学的予防薬であると確認されているＣｅｌｅｃｏｘｉｂ（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）への短い持続時間および長い持続時間の曝露の前後に、ＩＥＣ−１８とＲ１細胞を比較するために示差的遺伝子発現が分析された（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｔ，Ｍｉｙａｋｅ  Ｍ，Ｋａｈｎ  ＳＭ，Ｖｅｎｋａｔｒａｊ  ＶＳ，Ｓｏｂｒｉｎｏ  Ａ，Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ  Ｄ，Ｈｏｌｔ  ＰＲ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＩＢ「ｃ−Ｋ−ｒａｓ形質転換されたラット腸細胞におけるサイクリンＤ１およびＲｂ腫瘍抑制遺伝子の増大された発現」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２；１２（９）：１９０３−８，１９９６）。走査された出力ファイルが分析され、各遺伝子の発現値が決定された。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上に存在する約２００００個の遺伝子のうち、１０８１個の遺伝子が腫瘍細胞において示差的に発現（＞２倍）された（Ｓａｇｉｖ  Ｅ．ら、２００６、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３１：６３０−６３９；データは示されていない）。これらのうち、７１個の遺伝子のクラスターはＣｅｌｅｃｏｘｉｂでの短期および長期の処理後に正常な発現レベルへの逆転を示した。正常な発現への逆転を示す遺伝子の１つは、ＣＤ２４をコードする遺伝子である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３２３０；配列番号１）。
【０１９６】
実施例２
ＣＤ２４はＣＲＣ発癌の早期事象で過剰発現される
本明細書において上記の背景技術の節に記載されるように、Ｗｅｉｃｈｅｒｔ  Ｗ．ら（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，１１：６５７４−６５８１）は、１４６個の結腸直腸癌（ＣＲＣ）においてＣＤ２４の発現パターンを試験し、そして腫瘍の６８．７％においてＣＤ２４が膜性の染色を示すのに対し、腫瘍の８４．４％においてＣＤ２４が細胞質中で発現されることを見出した。さらに、症例の１０％において、例外的に強い細胞質性のＣＤ２４発現が観察され、それはより進んだ腫瘍の病期およびより不良な予後と相関した。しかしながら、現在まで、ＧＩ管の前悪性腫瘍におけるＣＤ２４の発現レベルは一度も試験されてこなかった。
【０１９７】
ｒａｓ変異で形質転換された細胞株におけるＣＤ２４の調節された発現パターン（上記の実施例１を参照のこと）に基づき、そしてＧＩ管の発癌に至る早期事象におけるＣＤ２４の関与を決定するために、以下のように、ＧＩ管全体の正常組織、前悪性腫瘍、および悪性腫瘍を含む３９８個のサンプルの幅広い群において、免疫組織学的分析が行われた。
【０１９８】
材料および実験方法
免疫組織学的分析−免疫組織学的分析は、アビジン−ビオチン複合体免疫ペルオキシダーゼ技術（Ｕｍａｎｓｋｙ  Ｍ．，Ｒａｔｔａｎ  Ｊ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１；２０：７９８７−７９９１）を使用して行われた。４μｍの組織切片が、ポリ−Ｌ−リジン被覆されたスライドにマウントされた。Ａｍｅｒｉｃｌｅａｒ（Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧａｗ  Ｐａｒｌ，ＩＬ）および無水エタノールにおける脱パラフィン処理の後に、切片は一連の段階的なアルコール、蒸留水、およびｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）によって水和された。スライドは次いで、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）に浸漬され、合計１０分間７５０Ｗでレンジ加熱された。ヤギ血清での２０分間のブロッキングの後に、一次抗体である抗ＣＤ２４モノクローナル抗体（Ａｂ−２、クローン２４Ｃｏ２；Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、フレモント、ＣＡ）が適用され、高湿度チャンバにおいて４℃で一晩インキュベートされた。全ての濃度の一次抗体は良好な膜性の染色を生じたが、最小のバックグラウンドを有する理想的な濃度は２０μｇ／ｍｌであった。ネガティブコントロールとして、選択された組織サンプルの二重切片が一次抗体の非存在下で免疫染色された。それに続く工程は、製造者の指示書に従ってＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，バーリンゲーム，ＣＡ）を使用した。顕色は、０．０００３％の過酸化水素を含有する０．３７５ｍｇ／ｄＬの３，３’−ジアミノベンジジン  テトラヒドロクロライド溶液（Ｓｉｇｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｏ，セントルイス，ＭＯ）で達成された。スライドは、ヘマトキシリンで対比染色され、そして脱水され、カバーグラスはＡｃｒｙｔｏｌ封入剤（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，リッチモンド，ＩＬ）を用いて適用された。
【０１９９】
実験結果
ＣＤ２４は、結腸、直腸およびＧＩ管全体の種々の腺腫および癌において過剰発現される−以下の表１に示されるように、免疫組織化学的分析は、細胞のタンパク質環境に対するこの遺伝子（ＣＤ２４）の過剰発現に関するアレイ結果、ならびにヒトＣＲＣ組織へのラットモデルから得られた結果の投影を実証した。この目的のために、ＣＤ２４発現は、ＧＩ管全体に及ぶ３９８個のサンプル（良性および悪性）において決定され、それらのうちの６６個はＣＲＣサンプルであった。
【０２００】
ＣＤ２４についての陽性の管腔膜染色が、５４個の結腸直腸の腺腫様ポリープ（前悪性腫瘍）のうち４９個（９０．７％）で見られ、６６個の腺癌のうち５７個（８６．３％）で見られた（表１）。前悪性の腫瘍（腺腫）における陽性の膜染色が、悪性腫瘍における陽性の膜染色と同程度であったことに注意されたい。他方、膜染色は、ＣＲＣサンプルに隣接する５４個の正常に見える粘膜のうちわずかに９個（１６．６％）において陽性であった。陽性の膜染色は、患者の性別または年齢に関連せず、腺腫様ポリープにおける形成異常の大きさまたは程度にも関連しなかった（データは示されていない）。さらに、陽性の膜染色は、ＧＩ管全体の前悪性の腺腫の７７．９％、およびＧＩ管全体の癌の７１．２％で見られた（表１）。
2009525041.tif 000003
表１：正常な隣接した粘膜およびＧＩ管全体（食道、胃、膵臓、小腸および大腸）の腫瘍から得られた３９８個の正常試料および腫瘍試料は、モノクローナル抗ＣＤ２４抗体（Ａｂ−２，クローン  ２４Ｃ０２；Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，フレモント，ＣＡ）を用いてＣＤ２４について染色され、そして膜の染色は、０、１、２および３の増大する強度の尺度の強度スコアに従って記録された。示されるのは、（結腸および直腸を含む）ＧＩ管全体ならびに別の群としての結腸および直腸の、正常組織、腺腫（前悪性の病変）、および癌における（「１」より高い強度スコアの）陽性の膜染色の頻度である。
【０２０１】
ＣＤ２４が、腺腫（癌の前悪性の段階）ならびにＣＲＣまたはＧＩ管全体の癌の全ての病期において同程度発現されたという事実は、ＣＤ２４の発現が、ＣＲＣ発癌の多工程プロセスにおける早期事象であることを示す。従って、癌（ＣＲＣおよびＧＩ管全体）だけではなく、例えば腺腫様ポリープのような前悪性の病変においてもＣＤ２４が発現されることは、ＧＩ管全体の発癌プロセスの早期マーカーとしてのＣＤ２４の使用を示唆する。
【０２０２】
実施例３
ＣＤ２４遺伝子の多型は臨床的に重要である
ＣＤ２４遺伝子の多型についてはほとんど知られていない。Ｚｈｏｕ  Ｑ．ら、２００３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：１５０４１−１５０４６）は、ヒトＣＤ２４遺伝子における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３２３０；配列番号１の２８０位でのＣ→Ｔ置換）が、ＧＰＩアンカーの推定上の切断部位の直後にミスセンス変異（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３７３６２に記載のＣＤ２４タンパク質の５７位でのＧＣＣ（Ａｌａ）→ＧＴＧ（Ｖａｌ））を生じ、それが多発性硬化症の増大された危険およびより急速な進行と関連することを記載する。
【０２０３】
ＡＰＣ遺伝子（タンパク質−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００２９．２（配列番号８）、ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００３８．３（配列番号７））は腫瘍抑制タンパク質をコードしており、結腸および直腸の発癌プロセスにおける最初の事象として広く変異される。Ｌａｋｅｎら（Ｌａｋｅｎ  ＳＪ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＧＭ，Ｇｒｕｂｅｒ  ＳＢ，Ｏｄｄｏｕｘ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．「ＡＰＣの超変異可能な域に起因するＡｓｈｋｅｎａｚｉｍにおける家族性の結腸癌」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １７：７９−８３，１９９７）は、タンパク質のコドン１３０７においてイソロイシン（Ｉ）のリジン（Ｋ）への置換を生じるＩ１３７０Ｋを同定した。その変化は、タンパク質の機能性には影響を及ぼさないが、遺伝子中に連続する８個のアデノシンを作り、それはＤＮＡポリメラーゼ活動において誤りの危険性を増大し、従って易変性の危険性が高い５００ｂｐの領域が作られる（Ｌａｋｅｎ  ＳＪら、１９９７）。本発明者らによって行われたこれまでの研究（Ｈ．Ｓｔｒｕｌら、２００３）は、この多型がＣＲＣに対する危険の評価に寄与しないことを実証した。
【０２０４】
ＡＰＣタンパク質におけるＥ１３１７Ｑ多型は、既知の機能または表現型の影響を有さないが、それは、ミスマッチ修復活性を引き起こし、結腸直腸の腫瘍形成に対して高い危険に関連する。
【０２０５】
材料および実験方法
遺伝子型決定−ゲノムＤＮＡは、末梢血リンパ球から抽出された。約２００ｎｇのＤＮＡが、以下のように、（ＡＰＣ  ＳＮＰについての）実時間ＰＣＲ反応、または（ＣＤ２４  ＳＮＰについての）ＲＦＬＰ分析のために採取された。
【０２０６】
ＣＤ２４タンパク質の５７位でのＡｌａ／Ｖａｌ多型の決定−５０℃のアニーリング温度で、ゲノムＤＮＡは、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅された：フォワード：５’−ＴＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＡＧＧＣ（配列番号３）およびリバース：５’−ＧＧＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡ（配列番号４）。生じたＣＤ２４  ＰＣＲ産物は、５２０ｂｐである。配列番号１の２８０位でのＣ→Ｔ変化は、ＰＣＲ産物のヌクレオチド３２７にＢｓｔＸＩ制限酵素部位をもたらし、それは制限フラグメント長分析による２つのＣＤ２４対立遺伝子の区別を可能にする。従って、Ｖａｌ−５７多型をコードするＤＮＡは、ＢｓｔＸＩによって３２０ｂｐおよび２００ｂｐに消化され、Ａｌａ−５７多型をコードするＤＮＡは、ＢｓｔＸＩによって消化されないので、５２０ｂｐである。
【０２０７】
ＡＰＣ遺伝子におけるＩ１３０７Ｋ多型の決定−Ｉ１３０７多型は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００２９．２；配列番号８の１３０７位でのイソロイシン（Ｉ）（一般的対立遺伝子）のリジン（Ｋ）（希少対立遺伝子）での置換であり、それはＮＭ＿００００３８．３；配列番号７のヌクレオチド３９７７でのＴ→Ａ置換から生じる。簡単に記載すると、ゲノムＤＮＡは、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅された：フォワード５’−ＧＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＣＡ−３’（配列番号５）プライマーおよびリバース５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号６）プライマー。実時間ＰＣＲのために、センサープライマーが野生型対立遺伝子に従って設計され、その下流にアンカープライマーが設計される。センサープライマーがＤＮＡに結合しかつアンカープライマーと会合する温度によって、明反応は変化する；温度は時間とともに上昇し、反応時間は測定される。特定の多型性ヌクレオチド（配列番号７の３９７７位のＴ／Ａ）の検出のために、アンカープライマーは：ＬＣ−Ｒｅｄ６４０−ＴＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧ−ｐｈ（配列番号９）であり、そしてセンサープライマーは：ＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴ−ＦＬ（配列番号１０）であった。
【０２０８】
ＡＰＣ遺伝子におけるＥ１３１７Ｑ多型の決定−Ｅ１３１７Ｑ多型は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００２９．２；配列番号８の１３１７位でのグルタミン酸（Ｅ）（一般的対立遺伝子）のグルタミン（Ｑ）（希少対立遺伝子）での置換であり、それはＮＭ＿００００３８．３；配列番号７のヌクレオチド４００６でのＧ→Ｃ置換から生じる。簡単に記載すると、ゲノムＤＮＡは、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅された：フォワード５’−ＧＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＣＡ−３’（配列番号５）プライマーおよびリバース５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号６）プライマー。そして特定の多型性ヌクレオチド（配列番号７の４００６位のＧ／Ｃ）の検出は、アンカープライマー：ＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＣ−ＦＬ（配列番号１１）およびセンサープライマー：ｐｈ−ＬＣ−Ｒｅｄ７０５−ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧ（配列番号１２）を使用して実時間ＰＣＲによって行われた。
【０２０９】
実験結果
ＣＤ２４発現は、５７位でのＣＤ２４遺伝子型（Ａｌａ／Ｖａｌ５７）に依存している−ＣＤ２４  ＲＦＬＰ試験を使用して、本発明者らは、高レベルのＣＤ２４タンパク質を発現するＨＴ２９細胞がＣＤ２４ｖ／ｖ（ＣＤ２４タンパク質の５７位でのＶａｌ／Ｖａｌ）遺伝子型を示し、一方、ＣＤ２４タンパク質をほとんど発現しないＰａｎｃ１細胞およびＨＣＴ１１６細胞がＣＤ２４ａ／ａ（ＣＤ２４タンパク質の５７位でのＡｌａ／Ａｌａ）遺伝子型を担持することを見出した。これらの結果は、ＣＤ２４タンパク質の過剰発現がＣＤ２４タンパク質のＶａｌ−５７多型と関連することを示唆する。さらに、ＣＲＣを生じるＣＤ２４の大部分は、ａ／ａ遺伝子型を有さない。この仮説を確認するために、ＣＤ２４遺伝子型が末梢血ＤＮＡから分析され、そして３つの遺伝子型の頻度が決定された。
【０２１０】
図４は、ＢｓｔＸＩ制限酵素を使用する、ＣＤ２４遺伝子のＡｌａ５７Ｖａｌ多型の制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を使用して行われた遺伝子型分析の例を示す。
【０２１１】
Ｖａｌ−５７多型は、ＣＲＣ発癌に対する増大した危険と関連する−平均年齢５８．６８歳（標準偏差：１４．７８）の１０６４個体（正常な健康な対象およびＣＲＣ患者）のデータセットは、母集団の６１．７５％がイスラエルのアシュケナジ系ユダヤ人であり、２５．４７％がイスラエルのセファルディ系ユダヤ人であることを示した（残りは混血または他の人種の個体である）。試験された母集団の中で、セファルディ系ユダヤ人は一般的なＡ／Ａ（Ａｌａ）遺伝子型を持つことに対する有意な関連を示した：ＯＲ１．３（１．０〜１．８）ｐ＝０．０４。セファルディ系ユダヤ人におけるＣＲＣの罹患率が、アシュケナジ系ユダヤ人における罹患率よりも低いことに注意されたい（Ｄａｒｗｉｓｈ  Ｈ，Ｔｒｅｊｏ  ＩＥら、２００２「結腸直腸癌と闘う：アシュケナジ系ユダヤ人、セファルディ系ユダヤ人、およびパレスチナ人の間で異なる分子的疫学」Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．，１３：１４９７−５０１；Ｒｏｚｅｎ  Ｐ，Ｌｙｎｃｈ  ＨＴ，Ｆｉｇｅｒ  Ａら  Ｉｓｒａｅｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，１９８７「テル−アビブ地域における家族性の結腸癌および民族的起源の影響」Ｃａｎｃｅｒ；６０：２３５５−２３６２）。従って、これらの結果は、ＣＤ２４タンパク質の５７位でのＡｌａ多型が、特にその同型接合状態においてＣＲＣに対する保護的遺伝子型であり、他方ＣＤ２４タンパク質のＶａｌ−５７多型が、ＣＲＣに対する危険遺伝子型であることを示唆する。
【０２１２】
下記の表２および表３にさらに示されるように、３９２人がＣＲＣと診断され、４９８人が健康な対象であった８９０人の対象のスクリーニングは、Ｖａｌ／Ｖａｌ遺伝子型（表２）およびＶａｌ対立遺伝子（表３）がＣＲＣに罹患する対象において健康なコントロールにおけるよりも多く見られることを示し、従ってＶａｌ−５７多型とＣＲＣとの関連を示唆する。
2009525041.tif 000004
2009525041.tif 000005
【０２１３】
ＣＤ２４遺伝子およびＡＰＣ遺伝子における組み合わせた遺伝子型は、結腸直腸の腫瘍形成または癌に対する増大された危険と高度に関連する−ＣＤ２４遺伝子およびＡＰＣ遺伝子における組み合わせた遺伝子型の関連をさらに試験するために、ＣＤ２４タンパク質の（５７位に）Ａ／Ｖ遺伝子型を有する３７５人の対象は、ＡＰＣタンパク質におけるＥ１３１７Ｑ多型の存在について試験された。３７５人の対象のうち７人は、Ｅ１３１７Ｑ多型について陽性であった（すなわち、ＡＰＣタンパク質における１３１７Ｑ多型の１つの対立遺伝子を示した）。ＣＤ２４  Ａ／ＶおよびＡＰＣ  Ｅ１３１７Ｑである、７人のうち６人の対象（８５．７％）は、結腸直腸の腫瘍形成を有した。他方、３６８人の対象は、ＡＰＣタンパク質における１３１７Ｑ多型について陰性であった（すなわち、Ｅ１３１７のみを示した）。３６８人のうち１６２人の対象（４４％）は、結腸直腸の腫瘍形成を有し、それは７．６２９６３のオッズ比（ＯＲ）（カイ２乗＝４．８３、ｐ値＝０．０２８）を生じる。従って、これらの結果は、ＡＰＣ  Ｅ１３１７Ｑのような発癌開始遺伝子における変異を担持する個体の中で、ＣＤ２４タンパク質のＶａｌ−５７多型の存在が結腸直腸癌に対する増大された素因の危険の指標となることを実証する。
【０２１４】
ＣＤ２４タンパク質の（５７位に）Ａ／Ｖ遺伝子型を有する４０５人の対象は、ＡＰＣタンパク質におけるＩ１３０７Ｋ多型の存在について試験された。４０５人の対象のうち３１人は陽性であった（すなわち、ＡＰＣタンパク質における１３０７Ｋ多型の少なくとも１つの対立遺伝子を示した）。ＣＤ２４  Ａ／ＶおよびＡＰＣ  Ｉ１３０７Ｋである、３１人のうち２１人の対象（６７．７％）は、結腸直腸の腫瘍形成を有した。他方、ＡＰＣタンパク質におけるＩ１３０７Ｋ多型について陰性である（すなわち、ＡＰＣタンパク質におけるＩ１３０７多型のみを示した）３７４人の対象のうち、１７５人（４６％）は、腫瘍形成を有し、それは２．３８８のＯＲ（カイ２乗＝５．０３、ｐ値＝０．０２４９）を生じる。従って、これらの結果は、ＡＰＣ  Ｉ１３０７Ｋのような発癌開始遺伝子における変異を担持する個体の中で、ＣＤ２４タンパク質のＶａｌ−５７多型の存在が結腸直腸癌に対する増大された素因の危険の指標となることを実証する。
【０２１５】
実施例４
ＧＩ管悪性腫瘍についての早期マーカーとしての、糞便、血清、または尿におけるＣＤ２４検出
本明細書において上記の実施例２において記載されたように、ＣＤ２４は、ＧＩ管の前悪性腫瘍（例えば、結腸直腸の腺腫様ポリープおよびＧＩ管全体の腺腫様ポリープ）において有意に過剰発現された。これらの結果は、ＣＤ２４発現が前悪性の腺腫の悪性腺癌への変換に先行しうることを示唆する。もしＣＤ２４が細胞表面で発現されて、ＧＰＩアンカーによって結合体化されるとするならば、本発明者らは、脱け落ちたか、または細胞泡状突起または死細胞からの膜残留物において見出されるＣＤ２４が、前悪性の腫瘍を有する対象に由来する種々の生物学的サンプルにおいて検出されることができ、そしてその検出がＧＩ管の発癌の早期マーカーとして作用することができると仮説を立てた。
【０２１６】
非侵襲的方法を使用して得られた生物学的サンプル（例えば、糞便、尿および血清）におけるＣＤ２４の存在を決定するために、本発明者らは、以下のようにＣＤ２４免疫沈降の実験条件を設定した。
【０２１７】
材料および実験方法
血清（ならびに糞便または尿）サンプルの免疫沈降（ＩＰ）分析−血清サンプル（５００μｌ）は、等量（５００μｌ）の溶解緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，４ｍＭ  ＥＤＴＡ，２％  ＮＰ４０，０．２％  ＳＤＳ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合された。抗マウス結合体化セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ６５３１）（２０μｌ）は、〜２−５μｇのモノクローナル抗ＣＤ２４抗体（ＳＷＡ１１）で１時間インキュベートされ、ビーズ−抗体複合体のアリコート（２０μｌ）は、次いで、溶解された血清サンプルと混合され、そして回転させられながら冷温室において一晩インキュベートされた。血清サンプルのＣＤ２４タンパク質を含む、得られたビーズ−免疫複合体は、（短い遠心分離によって）回収され、Ｈｅｐｅｓ生理食塩水緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎおよび１０％グリセロール）で６回洗浄され、次いで、ＣＤ２４免疫沈降物が、４×タンパク質サンプル緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４０％グリセロール，８％ＳＤＳ，０．２％ブロモフェノールブルー，１００ｍＭ  ＤＴＴ）によって９０〜９５℃で（５分間）溶出され、その後、ＣＤ２４タンパク質および抗ＣＤ２４抗体からビーズを分離するために短い遠心分離に供された。溶出物は次いで、ＳＷＡ１１抗ＣＤ２４抗体を使用するウェスタンブロット分析に供された。
【０２１８】
あるいは、血清サンプルは、溶解緩衝液または（本明細書において上記に記載されるような）ＰＢＳでインキュベートされ、免疫沈降は、グリコシル化されたタンパク質に結合するコンカナバリンＡに結合体化したビーズで実行された。ビーズ−免疫複合体は、次いで、（短い遠心分離によって）サンプルから分離され、その後、９０〜９５℃の溶出に供された。（ＣＤ２４タンパク質を含有する）溶出物は、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、その後、ＳＷＡ１１  ＣＤ２４抗体を使用するウェスタンブロット分析に供された。
【０２１９】
ウェスタンブロット分析−以下の溶解緩衝液を使用して調製された細胞溶解物に対して実行した：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ４０，０．１％ＳＤＳ、またはＩＰ分析の後に実行されるウェスタンブロット分析と同様にＳＷＡ１１抗体を使用してＰＢＳの存在下で実行した。簡単に記載すると、細胞抽出物中のタンパク質の量は、（例えば、ブラッドフォード分析を使用して）決定され、そして全タンパク質のうちの１６μｇが各ウエルに充填される。
【０２２０】
実験結果
ＣＤ２４  ＩＰアッセイの校正−ＣＤ２４抗体であるＭＬ５およびＳＷＡ１１（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｄ，Ｗａｉｂｅｌ  Ｒ，Ｗｅｂｅｒ  Ｅ，Ｂｅｌｌ  Ｊ，Ｓｔａｈｅｌ  ＲＡ．「ヒトＢ細胞上で発現されるシグナル伝達分子であるＣＤ２４は、小細胞肺癌上の主要な表面抗原である」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９２；５２：５２６４−７）は、ＩＰアッセイを校正するために使用された。（ＣＤ２４を発現しない）ＨＣＴ１１６または（ＣＤ２４を発現する）ＨＴ２９  ＣＲＣ細胞株の抽出物は、（抗マウスセファロースビーズを使用する）ＣＤ２４−ＩＰに供され、その後、ＭＬ５またはＳＷＡ１１抗体のいずれかを使用するウェスタンブロット分析に供された。図１に示されるように、ＳＷＡ１１抗体は、低いバックグラウンドをもたらす、ＩＰ分析のために有効な抗体であることが見出された。
【０２２１】
ＣＤ２４  ＩＰ分析の感度の決定−方法の感度について知るために、ＣＤ２４を発現するＨＴ２９細胞からの溶解物が、正常な血清の増大する濃度で均質化され、その後、ＩＰ分析に供された。ＣＤ２４タンパク質は、１ｍｇ、１００μｇ、および１０μｇの溶解物が１ｍｌの血清中に混合されている場合は認識できたが、１μｇおよびそれより少ない場合は認識できなかった（データは示されていない）。感度を増大させ、かつバックグラウンド信号を低減するために、サンプルとのビーズ−Ａｂ複合体のインキュベーション時間を各回で変えて、実験は２回繰り返された。
【０２２２】
血清サンプルにおけるＣＤ２４  ＩＰ分析−ＧＩ腫瘍（前悪性および悪性）におけるＣＤ２４の過剰発現が血清におけるＣＤ２４の存在と関連するかどうかを決定するために、腫瘍生検が先にＣＤ２４  ＩＨＣによって陽性に染色されている患者からの血清のサンプルが、ＣＤ２４モノクローナル抗体またはコンカナバリンＡ結合体化ビーズ（コンカナバリンＡはグリコシル化タンパク質に結合する）を使用するＩＰ分析に供された。簡単に記載すると、血清サンプル（０．５ｍｌ）は、ＳＷＡ１１抗ＣＤ２４モノクローナル抗体と共に抗マウス結合体化セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）を予めインキュベートすることによって調製された沈降ビーズで一晩インキュベートされた。ＣＲＣが進行性のときに血清が採取された患者において、患者のＣＤ２４タンパク質に対応する３５〜４０ｋＤａタンパク質のシグナルが観察された。他方、ＣＲＣが非進行性（寛解）のときに血清が採取された患者において、ＣＤ２４の発現は見られないか、または有意に低減されているかのいずれかであった（図３、データは示されていない）。ＣＤ２４はまた、ＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２）ミニカラムおよびアルブミン枯渇を使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、それに続くＳＷＡ１１モノクローナル抗ＣＤ２４抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、進行性のＣＲＣを有する患者の血清サンプルから精製された（図５）。これらの結果は、進行性のＣＲＣを有する患者の血清におけるＣＤ２４タンパク質の存在を実証し、そしてＧＩ悪性腫瘍についてのマーカーとしての血清におけるＣＤ２４タンパク質の検出を示唆している。
【０２２３】
糞便サンプルおよび尿サンプルにおけるＣＤ２４ウェスタンブロット分析−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓｏｒａｓｋｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ）に所属しているＣＲＣ患者および健康な対象からの９０個を超える糞便および尿のサンプルが収集され、−８０℃で保存された。全ての対象は、病院のＩＲＢおよび厚生省の承認の下でインフォームド・コンセントに署名し、適合する内視鏡的な報告が記録された。糞便サンプルにおけるＣＤ２４の存在を分析するために、少量（０．３〜０．５ｍｌ）が凍結サンプルから折り取られ、プロテアーゼ阻害剤と共に１ｍｌのタンパク質溶解緩衝液で均質化された。ホモジェネートの遠心分離（２０分、１４，０００ｒｐｍ）後に、上清相から溶解物が収集された。結腸内視鏡検査を受けて、良性または悪性の腫瘍と診断された２６人の対象のうちの２１人において、糞便中にＣＤ２４が見出された（データは示されていない）。
【０２２４】
（膜の成分を除去する）溶解緩衝液または（膜の成分には影響すべきでない）ＰＢＳのいずれかを使用することによって、ＩＰ分析またはウェスタンブロット分析によって検出されたＣＤ２４のレベルにおける有意な差は無く（データは示されていない）、従って、血清において検出されたＣＤ２４の大部分は膜に固定されていないことを示唆していることに注意されたい。
【０２２５】
糞便におけるＣＤ２４のレベルは、腫瘍の除去後に減少する−少なくとも部分的に、糞便サンプルにおいて検出されるタンパク質が腫瘍に由来することを確認するために、腫瘍の外科的／内視鏡的な除去の前後で、１１人の患者から糞便サンプルが収集された。ＣＤ２４発現レベルにおける差は、対にされたサンプルの間で明らかであり（図２ａ〜ｃ；繰り返された実験からのデータは示されていない）、糞便におけるＣＤ２４の存在が少なくとも部分的に腫瘍に由来することを実証している。
【０２２６】
糞便におけるＣＤ２４のレベルは、放射線療法後に減少する−糞便におけるＣＤ２４と癌細胞（進行性ＣＲＣ疾患）の存在との間の関係をさらに実証するために、ＣＤ２４のレベルは、腫瘍の外科的除去後であるが放射線療法前または放射線療法後にＣＲＣ患者において検出された。図２ｂ（レーン１３および１４）において示されるように、ＣＤ２４のレベルにおける有意な減少が処置前に比較して放射線療法後にみられた。従って、これらの結果は、糞便におけるＣＤ２４のレベルが癌細胞の存在と相関し、処置の有効性を監視するために使用されることができることを実証する。
【０２２７】
低分子量ＣＤ２４タンパク質種の存在は、前癌性または癌性の結腸直腸病変の指標である−図２ａ〜ｃにおいて示されるように、腫瘍またはポリープの外科的除去の前に患者から採取された糞便サンプルにおいて、約２５〜３７ｋＤａの種々の低分子量ＣＤ２４反応性バンドが存在し、それらはポリープまたは腫瘍の外科的除去の後に同じ患者から採取された糞便サンプルには存在しない。理論に縛られることなく、これらの結果は、前悪性または悪性の病変を有する対象の糞便、尿、または血清サンプル中に存在する循環ＣＤ２４が、ＣＤ２４アミノ酸配列の一部分のみを含むか、またはよりグリコシル化されていない形態（従って、より少ない分子量のタンパク質種）のＣＤ２４を表すかのいずれかであることを示すことができる。
【０２２８】
結局、これらの結果は、生物学的サンプルにおける循環ＣＤ２４の検出が、ＧＩ悪性腫瘍のような癌の早期検出マーカーとして、および／または癌の処置有効性を監視するために使用可能であることを実証する。さらに、ＣＤ２４の低分子量種（例えば、２５〜３７ｋＤａ）の存在、および／または（２５〜６０ｋＤａの範囲のどのような大きさからでもよい）所定の閾値より高い、高レベルのＣＤ２４の存在は、前悪性または悪性の腫瘍の指標である。
【０２２９】
分析および議論
本研究の知見は、結腸／直腸の腺腫および消化管の残部（小腸および上部ＧＩ管）を含む、ＧＩ管の前悪性および悪性腫瘍の明らかに高い割合の細胞の膜上でＣＤ２４が発現されることを示す。正常組織上にはめったに現れないが、腫瘍の進行の早期段階で発現される表面タンパク質として、本発明者らは、癌細胞に対する新規の、極めて信頼性の高いバイオマーカーとしてＣＤ２４を提案する。さらに、ＧＩ管の前悪性または悪性の病変を有する対象における、血清、糞便、および尿のような生物学的サンプルにおけるＣＤ２４の発見は、可溶性のＣＤ２４、抜け落ちたＣＤ２４、または泡状突起中のＣＤ２４（循環ＣＤ２４）が前悪性および悪性の病変の診断において使用されることができることを初めて実証する。
【０２３０】
もしＣＤ２４が、細胞の外側にありかつ膜貫通ドメインを有さないがＧＰＩに対するアンカーのみを有する短いペプチドであるとすると、生体外において示されるように、タンパク質の一部が、発現されるときに過剰に生成され、腫瘍細胞から絶えず分泌されて血流に到達するか、または細胞外マトリクスにおいてリパーゼによって切断されると考えられることが適当である。さらに、壊死性腫瘍細胞、それらのフラグメント、または腫瘍細胞の泡状突起産物も、同様に血流に到達し、それらの中にＧＰＩ固定されたＣＤ２４タンパク質を含有するかもしれない。
【０２３１】
抗ＣＤ２４モノクローナル抗体の１つであるＳＷＡ１１は、（抗マウス結合体化ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に）ＩＰ分析を使用してまたは免疫ブロッティング抗体（例えば、図１に示される細胞溶解物）としてのいずれかで生物学的サンプルにおいてＣＤ２４を効果的に検出することが本発明者らによって見出された。従って、ＣＤ２４を過剰発現する細胞（例えば、前悪性の腺腫細胞または悪性のＣＲＣ腫瘍細胞）から脱け落ちたＣＤ２４は、血清サンプルにおけるＩＰ、その後のウェスタンブロット分析によって検出されることができる。さらに、ＣＤ２４はまた、超遠心分離またはスクロース勾配分離によってそれらの媒質から分離される、より大きな非溶解物質（小胞および細胞フラグメント）の相において追跡されることができる。もしＣＤ２４が膜に固定されており、そのため細胞の泡状突起の産物である膜フラグメントまたは小胞に一体化されながら血流に存在するかもしれないとすると、これらの大きな本体はそれらの高い分子量のために言及されているように濃縮され、そして溶解緩衝液によって膜が溶解され、ＩＰが記載されたように実行される。さらに、タンパク質に対する抗体もまた、高レベルのＣＤ２４を発現する対象の血清中に存在するかもしれない。それらの存在は、精製されたタンパク質で被覆されるか、または高レベルのＣＤ２４を発現する細胞で固定されたプレートを用いるＥＬＩＳＡ法を使用して検出可能であるだろう。高レベルのＣＤ２４を発現するＨＴ２９細胞は、５％ホルムアルデヒドで９６ウェルタイタープレートに固定される。２時間のインキュベーションの間、血清がウエルに添加され、３回の洗浄後、抗ヒトＨＲＰ抗体がウエルに添加され、５回洗浄され、次いで、５分間ＨＲＰに基質を添加することによって呈色反応が実行される（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），Ｓｉｇｍａ）。反応は硫酸で停止され、色強度（これは、血清中の抗ＣＤ２４抗体の量を表す）が４５０ｎｍでＥＬＩＳＡ読み取り機によって測定される。腫瘍細胞から血流に脱け落ちたかもしれないＣＤ２４  ＤＮＡは、末梢血からＲＴ−ＰＣＴを実行することによって検出されることができる。探索される変異および多型は、このように検出されることができ、定量的ＰＣＲ反応、腫瘍細胞内に現れるＣＤ２４遺伝子の増幅によっても見られることができる。
【０２３２】
癌の早期診断のためのツールとして、対象の血清でＣＤ２４を検出するための方法は、ＣＤ２４を過剰発現する傾向を有すると従来報告された全ての腫瘍に対して適用されることができる。これは、以下の腫瘍、ならびにそれらの前悪性の病変、およびＣＤ２４を過剰発現することが将来発見される他の腫瘍の全てを含む。これまでに報告されているＣＤ２４を過剰発現するリンパ腫の種類の大半は以下の通りである：急性白血病、ヴァルダイアー輪リンパ腫、共通急性リンパ芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞性白血病。また、ＣＤ２４を発現する固形腫瘍は以下のようなものである：透明細胞肉腫、腎芽細胞腫、腎細胞癌、成人中胚葉性腎腫、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、神経節芽細胞腫、肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌および結腸直腸癌、鼻咽腔癌、膀胱癌、乳癌、神経膠腫、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌前立腺癌、メルケル細胞癌、および膵癌など。
【０２３３】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２３４】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
2009525041.tif 000006
2009525041.tif 000007
【配列表フリーテキスト】
【０２３５】
配列番号３〜６および９〜１２は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】ＣＲＣ細胞株のＣＤ２４−免疫沈降（ＩＰ）分析である。
【図２】腫瘍の外科的除去の前後、または化学療法の前後にＣＲＣ患者から得られた糞便サンプルのＣＤ２４ウェスタンブロット分析である。
【図３】血清サンプルにおけるＣＤ２４の免疫沈降分析を示す。
【図４】ＣＤ２４タンパク質（配列番号２）におけるＶａｌ５７Ａｌａ多型（配列番号１の２８０位のＣ／Ｔ）のＲＦＬＰ分析である。
【図５】ヒト血清からのＣＤ２４の精製を示す。
【図１】
2009525041.tif 000008
【図２】
2009525041.tif 000009
【図３】
2009525041.tif 000010
【図４】
2009525041.tif 000011
【図５】
2009525041.tif 000012
【配列表】
2009525041000001.xml
【国際調査報告】
2009525041.tif 000032
2009525041.tif 000033
2009525041.tif 000034
2009525041.tif 000035
2009525041.tif 000036