(57)【要約】本発明は、SIRT3の最初の細胞性アセチル化基質タンパク質であって、ミトコンドリアマトリックスタンパク質である、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）を開示する。AceCS2は、酵素の活性部位中のリジン642（Lys642）で可逆的にアセチル化される。ミトコンドリアサーチュインSIRT3はAceCS2と相互作用しかつインビトロおよびインビボの両方においてLys642を脱アセチル化する。SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化は、AceCS2のアセチル-CoAシンセターゼ活性を活性化する。したがって、哺乳類サーチュインは、可逆的リジンアセチル化を介して代謝酵素の活性を直接制御する。AceCS2のアセチル化状態または活性の調整剤は、II型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、および肥満などの、病理学的状態の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法：
（a）SIRT3ポリペプチドおよびアセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程；ならびに
（b）該細胞内のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程。
【請求項２】
工程（b）が、アセチル化AceCS2に特異的な抗体を用いる免疫学的アッセイを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が哺乳類細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
哺乳類細胞が、心臓細胞、筋肉細胞、および脳細胞からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
（c）候補薬剤の構造または配列を同定する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法：
（a）NAD+を含むアッセイ混合物中のSIRT3ポリペプチドおよびアセチル化アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドと候補薬剤とを接触させる工程；ならびに
（b）該アッセイ混合物中のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程
ここで、候補薬剤で処理されていないアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2の第二のレベルと比較したアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2の第一のレベルの減少が、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を示している。
【請求項８】
アセチル化AceCS2ポリペプチドが14C標識アセチル基を含み、かつ工程（b）が14C標識アセチル基の放出を測定することによって行なわれる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法：
（a）AceCS2ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程；および
（b）該細胞内のAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法：
（a）アッセイ混合物中のAceCS2ポリペプチドと候補薬剤とを接触させる工程；および
（b）該アッセイ混合物中のAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程。
【請求項１１】
請求項1記載の方法によって同定される、生物学的に活性な薬剤。
【請求項１２】
請求項9記載の方法によって同定される、生物学的に活性な薬剤。
【請求項１３】
アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのアセチル化状態を調整するための方法であって、AceCS2ポリペプチドを発現する細胞と請求項1記載の方法によって得ることができる薬剤とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１４】
アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのアセチル化状態を調整するための方法であって、AceCS2ポリペプチドを発現する細胞と請求項9記載の方法によって得ることができる薬剤とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１５】
SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を個体に投与する工程を含む、個体における病理学的状態の処置のための方法であって、
SIRT3がAceCS2を脱アセチル化し；
病理学的状態が、上昇したアセテートレベルを特徴とし；かつ
病理学的状態が処置される、方法。
【請求項１６】
病理学的状態が、II型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、および肥満からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
個体がヒトまたは非ヒト動物である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
（i）請求項1記載の方法によって得ることができる薬剤；および
（ii）薬学的に許容される担体
を含む、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させるための薬学的組成物。
【請求項１９】
（i）請求項9記載の方法によって得ることができる薬剤；および
（ii）薬学的に許容される担体
を含む、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整するための薬学的組成物。
【請求項２０】
（i）請求項1記載の方法によって得ることができる薬剤を含む容器；ならびに
（ii）該薬剤とSIRT3ポリペプチドおよびアセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドを発現する細胞とを接触させ、かつ該細胞内のアセチル化AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する該薬剤の効果を決定するための取扱説明書
を含む、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させるためのキット。
【請求項２１】
（i）請求項9記載の方法によって得ることができる薬剤を含む容器；ならびに
（ii）AceCS2ポリペプチドを発現する細胞を接触させ、かつAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する該薬剤の効果を決定するための取扱説明書
を含む、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、2006年6月12日に提出された、米国特許仮出願第60/813,275号、および2007年6月11日に提出された、米国特許出願第11/761,198号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、SIRT3の最初の細胞性アセチル化基質タンパク質であって、ミトコンドリアマトリックスタンパク質である、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）を開示する。ミトコンドリアサーチュインSIRT3は、AceCS2と相互作用しかつ可逆的リジンアセチル化を介してこの代謝酵素の活性を直接制御する。AceCS2のアセチル化状態または活性の調整剤は、II型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、および肥満などの、病理学的状態の処置に有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
可逆的リジンアセチル化は、タンパク質デアセチラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼによって制御される、高度に調節された翻訳後タンパク質修飾である（Han and Martinage, 1992, Int J Biochem 24:19-28; Yang, 2004, Bioessays 26:1076-87）。当初は転写およびクロマチン動態と関連付けられたが、可逆的リジンアセチル化は細胞運動性、免疫シナプス形成、プログラム細胞死、およびタンパク質輸送などの細胞機能の調節因子として明らかになりつつある（Hubbert et al., 2002, Nature 417:455-458; Kawaguchi et al., 2003, Cell 115:727-38; Serrador et al., 2004, Immunity 20:417-28; Cohen et al., 2004, Science 305:390-2; Cohen et al., 2004, Mol Cell 13:627-38）。核の非ヒストンタンパク質およびヒストンタンパク質の可逆的リジンアセチル化の重要性は十分に確立されているが、ミトコンドリアでの可逆的リジンアセチル化によるタンパク質修飾の役割は未知である。しかしながら、リン酸化およびADP-リボシル化などのミトコンドリアタンパク質の翻訳後修飾の重要性がますます明らかになりつつあり、ミトコンドリアタンパク質の可逆的アセチル化もまたミトコンドリア機能の調節に重要な役割を果たす可能性が高い。
【０００４】
ニコチンアミド（NAM）アデニンジヌクレオチドNAD+依存的デアセチラーゼサイレント情報調節因子2（Sir2）は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、線虫（Caenorhabditis elegans）、およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）におけるカロリー制限（CR）シグナルに応答した寿命の重要なメディエーターである（Kaeberlein et al., 1999, Genes Dev 13:2570-80; Tissenbaum and Guarente, 2001, Nature 410:227-30; Lin et al., 2000, Science 289:2126-8; Rogina and Helfand, 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 :15998-6003; Lin et al., 2004, Genes Dev 18:12-6; Lin et al., 2002, Nature 418:344-8; Anderson et al., 2003, Nature 423:181-5）。7つの哺乳類Sir2ホモログ（SIRT1〜7）が公知である（Frye, 1999, Biochem Biophys Res Commun 260:273-9; Frye, 2000 Biochem Biophys Res Commun 273:793-8; Blander and Guarente, 2004, Annu Rev Biochem 73:417-35; North and Verdin, 2004, Genome Biol 5:224）。SIRT3、SIRT4、およびSIRT5がミトコンドリアにおいて見出されるという最近の発見（Shi et al., 2005, J Biol Chem 280:13560-7; Michishita et al., 2005, Mol Biol Cell 16:4623-35; Onyango et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99, 13653-8; Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57）により、ミトコンドリアサーチュイン基質タンパク質の存在が示唆されている。
【０００５】
本発明は、SIRT3の最初の細胞性アセチル化基質タンパク質であって、ミトコンドリアのマトリックスタンパク質である、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）の同定を開示する。
【０００６】
AceCSはCoAとアセテートのライゲーションを触媒し、脂肪酸およびコレステロールの合成ならびにトリカルボキシル酸回路を含む様々な代謝経路で利用される必須分子である、アセチル-CoAを産生する（概説については、Fatty Acid Metabolism and Its Regulation（Numa, S.編）、113-154、Elsevier Science Publisher Amsterdam中の Bremer and Osmundsen、1984を参照されたい）。
【０００７】
様々な微生物および高等生物由来のAceCSは、哺乳類長鎖アシル-CoAシンセターゼ、すなわちACS1〜ACS5（Fujino and Yamamoto, 1992, J Biochem 111:197-203；Fujino et al., J Biol Chem 271 :16748-16752；Kang et al., 1997, Proc Natl. Acad Sci USA 94:2880-2884；Suzuki et al., 1990, J Biol Chem 265:8681-8685；Oikawa et al., 1998, J Biochem 124:679-685）を含む、スーパーファミリーを示す（Toh, 1990, Protein Sequences Data Anal 3:517-521；Toh, 1991, Protein Sequences Data Anal 4:111-117）。このスーパーファミリーの全ての酵素は、Ser-Gly-(小さい親水性残基)2-Gly-(任意の残基)-Pro-Lys-Gly（SEQ ID NO:1）という共通配列モチーフを含み、かつ共通の2段階反応：基質のアデニル化およびその後のチオエステル形成を触媒する（Toh, 1990, Protein Sequences Data Anal 3:517-521；Toh, 1991, Protein Sequences Data Anal 4:111-117）。
【０００８】
最近、ウシおよびマウスのAceCS cDNAがクローニングされ、特徴付けられた。2つの機能的に異なるマウスAceCS：心臓AceCSおよび肝臓AceCSが説明された。AceCS1と呼ばれる肝臓型酵素が細胞質酵素であるのに対し、AceCS2と呼ばれる心臓の酵素はミトコンドリアマトリックスに局在する（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276: 11420-11426）。絶食後にAceCS2 mRNAが誘導されるという知見に基づき、AceCS2が、飢餓および糖尿病などのケトン体形成状態下での酸化に主に利用されるアセチル-CoAを提供するということが示唆された（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。この示唆は、ズッカー糖尿病ラットにおけるAceCS2 mRNAのレベルが増加するという知見によって裏付けられている（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。Fujinoらは、ある状態下でのAceCS2の誘導を説明したが、彼らはAceCS2の正確な機能および調節を検討しなかった（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。
【０００９】
AceCS2の基質である、上昇したアセテートレベルを特徴とする、ケトン体形成状態などの病理学的状態を、より良く理解しかつ処置するために、これらの調節機構を解明することが重要である。本発明は、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）を、ミトコンドリア酵素としておよびミトコンドリアサーチュインSIRT3の細胞性アセチル化基質として同定することにより、1つのそのような調節機構を提供する。AceCS2は、酵素の活性部位中のリジン642（Lys642）において可逆的にアセチル化される。SIRT3は、AceCS2と相互作用しかつインビトロおよびインビボ両方でLys642を脱アセチル化する。SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化は、AceCS2のアセチル-CoAシンセターゼ活性を活性化する。
【００１０】
SIRT3のレベルもしくはデアセチラーゼ活性を活性化する薬剤またはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤を同定することは好都合であると考えられる。そのような薬剤は、上昇したアセテートレベルを特徴とする病理学的状態および少なくとも一部はそのような上昇したアセテートレベルによって引き起こされるその他の疾患または障害を処置する際の治療的有用性を有すると考えられる。この点で、本発明は、そのような薬剤の同定のための方法、そのような薬剤を含む組成物、ならびにII型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、および肥満の処置のためのそのような薬剤を用いる方法を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明は、哺乳類サーチュイン、すなわちSIRT3が、可逆的リジンアセチル化を介して、代謝酵素、すなわちアセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）の活性を直接制御するということを開示する。SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法、組成物、およびキットが、本明細書において提供されている。本発明はまた、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法、組成物、およびキットを提供する。本発明はまた、個体におけるアセテートレベルを低下させるための、ならびにII型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、または肥満などの、上昇したアセテートレベルを特徴とする障害の処置のための方法、組成物、およびキットにおける、そのような薬剤の使用に関する。
【００１２】
より具体的には、1つの局面において、本発明は、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）SIRT3ポリペプチドおよびAceCS2ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程、ならびに（b）該細胞内のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。工程（b）は、アセチル化AceCS2に特異的な抗体を用いる免疫学的アッセイを含んでもよい。本方法は、任意で、候補薬剤の構造または配列を同定する工程を含む。
【００１３】
好ましい細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。幾つかの態様において、哺乳類細胞は、心臓細胞、筋肉細胞、および脳細胞からなる群より選択される。
【００１４】
本発明の別の局面において、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法は、（a）NAD+を含むアッセイ混合物中のSIRT3ポリペプチドおよびアセチル化AceCS2ポリペプチドを候補薬剤と接触させる工程、ならびに（b）該アッセイ混合物中のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。候補薬剤で処理されていないアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2の第二のレベルと比較したアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2の第一のレベルの減少は、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を示している。
【００１５】
本方法の好ましい態様において、アセチル化AceCS2ポリペプチドは14C標識アセチル基を含み、かつ工程（b）は14C標識アセチル基の放出を測定することによって行なわれる。
【００１６】
本発明の別の局面において、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程、および（b）該細胞内のAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。
【００１７】
本発明の別の局面において、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法は、（a）アッセイ混合物中のAceCS2ポリペプチドを候補薬剤と接触させる工程、および（b）該アッセイ混合物中のAceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。
【００１８】
本発明のさらなる局面において、本発明の本スクリーニング法の1つによって同定される生物学的に活性な薬剤を提供する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、AceCS2ポリペプチドのアセチル化状態を調整するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、AceCS2ポリペプチドを発現する細胞と、SIRT3ポリペプチドのレベルもしくはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法またはAceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤を同定するための方法などの、本発明の本方法によって得ることができる薬剤とを接触させる工程を含む。
【００２０】
本発明はまた、個体における、上昇したアセテートレベルを特徴とする病理学的状態の処置のための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、AceCS2を脱アセチル化するSIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を個体に投与する工程を含む。その結果、病理学的状態は処置される。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、病理学的状態は、II型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、および肥満からなる群より選択される。
【００２２】
好ましくは、処置される個体は、ヒトまたは非ヒト動物である。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させるための薬学的組成物を提供する。本発明の好ましい態様において、薬学的組成物は、（i）SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法などの、本発明の本方法によって得ることができる薬剤、および（ii）薬学的に許容される担体を含む。
【００２４】
本発明はまた、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整するための薬学的組成物を提供する。本発明の好ましい態様において、薬学的組成物は、（i）AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法などの、本発明の本方法によって得ることができる薬剤、および（ii）薬学的に許容される担体を含む。
【００２５】
本発明のさらに別の局面において、キットを提供する。SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させるための好ましいキットは、（i）SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法などの、本発明の方法によって得ることができる薬剤を含む容器、および（ii）SIRT3ポリペプチドおよびAceCS2ポリペプチドを発現する細胞に薬剤を接触させかつもしあれば、細胞内のアセチル化AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する薬剤の効果を決定するための取扱説明書を含む。
【００２６】
本発明の別の局面において、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整するためのキットを提供する。本発明の好ましい態様において、キットは、（i）AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法などの、本発明の方法によって得ることができる薬剤を含む容器、および（ii）AceCS2ポリペプチドを発現する細胞を接触させかつもしあれば、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する薬剤の効果を決定するための取扱説明書を含む。
【００２７】
薬学的組成物およびキットに含めるべき有用な薬剤は、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤、および AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤である。
【００２８】
本発明の方法、組成物、およびキットは、本明細書に十分記載されたような特性を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒトアセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）は、可溶性ミトコンドリアタンパク質であるということを示す。（A）ヒトAceCS2FlagをHela細胞にトランスフェクトした。細胞を抗Flag抗体および内在性ミトコンドリアマーカータンパク質MnSODに対する抗体で共染色しかつ共焦点レーザー走査顕微鏡で解析した。同じ焦点面におけるAceCS2Flag（左）およびMnSOD（中央）由来の蛍光シグナルを示す。（右）合併した画像は、AceCS2Flagがミトコンドリアに局在するということを示す。（B）細胞成分画分を、AceCS2Flagを安定に発現するHEK293細胞から調製した。等量（30 μg）の全細胞抽出物（全体）、ミトコンドリア、軽膜（LM）、および細胞質のタンパク質を、示された抗体を用いた免疫ブロッティングで解析した。（C）AceCS2Flagのミトコンドリア内局在。AceCS2Flagを発現するHEK293細胞由来のミトコンドリアを、低張膨潤によってミトプラストに変換しかつプロテイナーゼKで処理した。インキュベーション（0℃で20分）後、ミトプラストを遠心分離によって再び単離しかつ示された抗体を用いた免疫ブロッティングによって解析した。外部ミトコンドリア膜の破裂を、膜間空間タンパク質チトクロームc（Cyt. C）に対する免疫ブロッティングによって確認した。内部ミトコンドリア膜の完全性をマトリックスタンパク質マーカーSIRT3およびGDHに対する免疫ブロッティングによって確認した。AceCS2Flagは、抗Flag抗体で検出した。（D）AceCS2Flagは可溶性タンパク質である。ミトコンドリアを、AceCS2Flagを安定に発現するHEK293細胞から調製しかつSDS試料緩衝剤中で直接可溶化するか（T、全体）または炭酸ナトリウム（Na2CO3、pH 11.5）で抽出するかのいずれかにした。アルカリ抽出物を超遠心分離によって膜画分（P、ペレット）および炭酸ナトリウム可溶性タンパク質を含む画分（S、上清）を分離した。十分に特徴付けられたマーカータンパク質であるCOX-IV、MnSOD、およびSIRT3の存在についての異なる画分の免疫ブロッティングによって、アルカリ抽出の効率を追跡調査するかまたはモニタリングした。詳細は実施例3で提示する。
【図２】ヒトAceCS2のN末端配列の同定を示す。（A）ヒトAceCS2のN末端は、両親媒性のα-ヘリックスを含む。コンピュータによる二次構造解析によりα-ヘリックスを形成すると予測されたAceCS2の領域（アミノ酸残基3〜20；SEQ ID NO:2）をヘリックス旋回としてプロットした。R、塩基性残基；T、L、V、およびA、疎水性残基；GおよびS、中性残基。（B）N末端タンパク質シークエンシングおよびLC/MS-MS解析によって決定した場合のミトコンドリアプレ配列およびヒトAceCS2の切断部位の実例。MPP、ミトコンドリアマトリックスプロセッシングペプチダーゼ。詳細は実施例4で提示する。
【図３】AceCS2中の保存されたLys642の変異はAceCS2酵素活性を無効にするということを示す。（A）異なる種（ACS チフス菌、SEQ ID NO:3；ACS2p 出芽酵母、SEQ ID NO:4；ACS 線虫、SEQ ID NO:5；ACS キイロショウジョウバエ、SEQ ID NO:6；AceCS2 ラット（R. norvegicus）、およびAceCS2 マウス（M. musculus）SEQ ID NO:7）由来のアセチル-CoAシンセターゼおよびヒトAceCS2（SEQ ID NO:7）の活性部位領域の多重配列アラインメント。活性部位リジンを白抜き三角で印付けた。（B）Lys642はAceCS2機能に極めて重要である。AceCS2のLys642の変異は酵素を不活性化する。AceCS2HAまたはAceCS2-K642QHA（Lys642がグルタミン（Q）で置き換えられたAceCS2の変異体）をHEK293細胞内で発現させ、免疫沈降し、かつ特異的なアセチル-CoAシンセターゼ（ACS）活性を決定した。データは3回の独立したアセチル-CoAシンセターゼ活性アッセイからの平均±SDである。（C）免疫沈降されたAceCS2HAおよびAceCS2-K642QHAのクマシーブルー染色。AceCS2HAまたはAceCS2-K642QHAはクマシーブルー染色によって区別できずかつ等しいレベルで発現していた。詳細は実施例5で提示する。
【図４】ヒトAceCS2はインビボにおいてLys642でアセチル化されるということを示す。AceCS2Flagを安定に発現するHEK293細胞にSIRT3特異的siRNAをトランスフェクトしかつAceCS2FLAGを5日後に免疫沈降した。免疫沈降されたAceCS2FlagをSDS-PAGEで分離しかつマススペクトロメトリー用に調製した。液体クロマトグラフィーに連結したタンデムマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）をトリプシン消化物に対して行ない、リジンアセチル化部位を同定した。acK、アセチル化リジン。SGacKVoxMR、SEQ ID NO:8。詳細は実施例6で提示する。
【図５】サーチュインCobB遺伝子またはタンパク質を欠く大腸菌で発現したヒトAceCS2は高アセチル化されている。（A）細菌サーチュインCobB の除去または阻害は、細菌におけるヒトAceCS2の活性部位リジンの高アセチル化を結果的にもたらす。ノックアウト変異体または野生型大腸菌K-12を用いて、C末端にmyc-Hisタグが付いた組換えヒトAceCS2（AceCS2:KR）を発現させた。CobB-またはCobB+大腸菌由来の等量の精製された組換えヒトmyc-Hisタグ付きAceCS2（WT）またはAceCS2-K642R（KR）を、アセチル-リジン特異的抗体（Ac-AceCS2myc-His）を用いた免疫ブロッティングによって解析した。AceCS2 (AceCS2myc-His)の全レベルを示すために、ブロットをストリッピングしかつα-myc抗体でリプロービングした。（B）抗アセチル-リジン抗体は、アセチル化Lys642残基（acK642）を含むAceCS2の合成ペプチドを特異的に認識するが、非アセチル化Lys642を含むペプチド（K642）と交差反応しない。合成ペプチド（Elim Biopharmaceuticals社, Hayward, CA）を、ペプチド連結キット（NEB）を用いてキャリアタンパク質CP39に連結した。使用したAceCS2ペプチドは以下であった：NH2-CPKTRSG(ac)KVMRRLL-CONH2(acK642, SEQ ID NO:9)およびNH2-CPKTRSGKVMRRLL-CONH2(K642, SEQ ID NO:10)。N末端システイン残基を連結目的のために付加した。150 ngのCP39連結K642またはacK642をSDS-PAGEで分離しかつポリクローナル抗アセチル-リジン抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）を用いた免疫ブロッティングによって解析した。詳細は実施例7で提示する。
【図６】ニコチンアミド（NAM）によるサーチュイン活性の阻害は組換えヒトAceCS2の高アセチル化を結果的にもたらすということを示す。（A）組換えヒトAceCS2タンパク質の発現の間のニコチンアミドによる細菌サーチュインの阻害は、Lys642でのヒトAceCS2の高アセチル化を引き起こす。大腸菌DH5α細菌を用いてmyc-Hisタグ付きAceCS2:WTまたはAceCS2:KRを発現させた。等量の精製された組換えタンパク質を（5A）と同様に解析した。（B）ニコチンアミド処理した大腸菌から精製した組換えAceCS2:WTのトリプシン消化物の液体クロマトグラフィー連結タンデムマススペクトロメトリーによってLys642のアセチル化（acK）が確認された。m/z 368.1948における二重荷電イオンのタンデムマススペクトルを示す。SGacKVoxMR、SEQ ID NO:8。詳細は実施例8で提示する。
【図７】siRNAを介したノックダウンによる内在性SIRT3レベルの低下はAceCS2Flagのアセチル化レベルを増加させる。ヒトSIRT3に対して向けられた二本鎖siRNA（siSIRT3）またはホタルルシフェラーゼGL3（si対照）を、AceCS2Flagを安定に発現するHEK293細胞にトランスフェクトした。細胞を溶解し、免疫沈降されたAceCS2Flagのアセチル化を、アセチル化リジンに対する抗体を用いた免疫ブロッティングによって解析した（Ac-AceCS2Flag）。膜をストリッピングしかつ全AceCS2量についてリプロービングした（AceCS2Flag）。抗SIRT3および抗アクチン抗体を用いた全細胞抽出物の免疫ブロッティングにより、siRNA処理の有効性および特異性が確認された。詳細は実施例9で提示する。
【図８】SIRT3はインビトロでAceCS2を脱アセチル化するがSIRT5は脱アセチル化しないということを示す。（A）ニコチンアミド処理した大腸菌から精製した組換えヒトAceCS2myc-Hisを、HEK293細胞から免疫沈降したFlagタグ付きSIRT3またはSIRT5とインキュベートした。対照として、pcDNAFlagを発現するHEK293細胞由来の抗Flag免疫沈降物を反応で用いた（左のレーン）。脱アセチル化反応をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+；1 mM）の存在下または非存在下で32℃で3時間インキュベートした。全ての反応をトリコスタチンA（TSA、500 nM）の存在下で実行した。反応をSDS試料緩衝剤の添加によって停止させ、沸騰させ、かつ免疫ブロッティングによって解析した。アセチル化AceCS2myc-Hisをアセチル-リジン特異的抗体を用いて検出した（Ac-AceCS2myc-His）。ブロットをストリッピングしかつα-myc抗体を用いてAceCS2の全レベルをプロービングした（AceCS2myc-His）。Flagタグ付きSIRT3およびSIRT5の存在を、抗Flag抗体を用いた免疫ブロッティングによって検証した（下のパネル；インプット（サーチュイン））。（B）ニコチンアミド処理した大腸菌から精製した組換えヒトAceCS2を、NAD+（1 mM）の存在下または非存在下でおよびTSA（500 nM）の存在下で32℃で3時間、精製された組換えサーチュインとインキュベートしかつ（A）に記載されたように解析した。組換えSIRT3またはSIRT5タンパク質を、抗myc抗体を用いてプロービングすることによって検出した（下のパネル；インプット（サーチュイン））。（C）SIRT3はインビトロでAceCS2を脱アセチル化するが、SIRT3の触媒不活性な変異体はAceCS2を脱アセチル化しない。脱アセチル化アッセイを上記のように行ないかつ解析した。表示した場合には、ニコチンアミド（NAM; 10 mM）をインキュベーションの間に含めた。詳細は実施例10で提示する。
【図９】SIRT3はAceCS2と共免疫沈降しかつ細胞内でAceCS2を脱アセチル化するということを示す。（A）SIRT3の過剰発現は、異所的に発現したAceCS2のアセチル化を減少させる。COS-1細胞にAceCS2HAおよびpcDNAFlag、SIRT3Flag、またはSIRT5Flagのいずれかをコトランスフェクトした。免疫沈降されたAceCS2HAのアセチル化を、アセチル化リジンに対する抗体を用いた免疫ブロッティングによって解析した（Ac-AceCS2HA）。膜をストリッピングしかつ抗HA抗体を用いたプロービングによって全AceCS2量についてリプロービングした（AceCS2HA）。全細胞ライセート中のSIRT3FlagおよびSIRT5F1agの発現を、抗Flag抗体を用いた免疫ブロッティングによって検証した（サーチュイン（Flag））。（B）AceCS2およびSIRT3は細胞から共免疫沈降する。AceCS2Flagまたは空のFlag対照ベクター（pcDNAFlag）を安定に発現するHEK293細胞株由来の抗Flag免疫複合体を、内在性SIRT3の存在について解析した。詳細は実施例11で提示する。
【図１０】Lys642のアセチル化は、ヒトAceCS2のアセチル-CoAシンセターゼ活性を制御するということを示す。（A）組換えヒトAceCS2をニコチンアミド（NAM）の存在下または非存在下で細菌内で発現させた。AceCS2のアセチル化レベルおよび全体量を、アセチル-リジン特異的抗体または抗myc抗体を用いた免疫ブロッティングによって解析した。（B）NAMの存在下または非存在下で発現した精製AceCS2の特異的活性。データは、3回の独立した実験からの平均±SDである。（C）SIRT3によるがSIRT3-H248Y にはよらないAceCS2のNAD+依存的脱アセチル化。下のパネルは、等量のSIRT3またはSIRT3-H248Yを脱アセチル化反応物に添加したことを示す。（D）SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化はそのアセチル-CoAシンセターゼ活性を活性化する。等量のAceCS2をSIRT3または触媒不活性SIRT3変異体（SIRT3-H248Y）の非存在下または存在下でインキュベートした。表示した場合には、NAD+（1 mM）をインキュベーションの間に添加した。32℃で3時間の後、脱アセチル化反応をニコチンアミド（NAM; 10 mM）の添加によって停止しかつAceCS2の特異的活性を決定した。データは、3回の独立した活性決定からの平均±SDである。（E）SIRT3によるAceCS2の時間依存的活性化。NAM処理した細菌から精製した組換えヒトAceCS2を組換えSIRT3またはSIRT3-H248Yとインキュベートした。試料を32℃に運びかつNAD+（1 mM）を添加した。表示された時点で、反応物のアリコートを除去し、NAMと混合し、かつ氷上でインキュベートした。免疫ブロットは、SIRT3によるAceCS2の漸進的な脱アセチル化を示すが、SIRT3-H248Y による脱アセチル化は示さない。（F）表示された時間の組換えSIRT3またはSIRT3-H248Yとのインキュベーション後のAceCS2の特異的活性を決定した。3回の独立した活性アッセイからの平均±SDを示す。詳細は実施例12で提示する。
【図１１】Lys642の可逆的リジンアセチル化によるAceCS2調節の模式的例証を示す。SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化は、そのアセチル-CoAシンセターゼ活性を活性化する。AceCS2のタンパク質アセチルトランスフェラーゼの同一性は未知であり、それゆえにアセチルトランスフェラーゼXと標識する。詳細は実施例13で提示する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
I. 定義
そうでないように定義されない限り、本明細書で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般に理解される意味を有する。以下の参照は、本発明で用いる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第2版 1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker編, 1988）; The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger et al. (編), Springer Verlag（1991）；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。本明細書で用いる場合、そうでないように明記されない限り、以下の用語はそれらに与えられた意味を有する。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「AceCS2」はアセチルCoAシンセターゼ2を意味する。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「AceCS2」または「アセチルCoAシンセターゼ2」は、哺乳類AceCS2ポリペプチドおよび哺乳類AceCS2ポリペプチドをコードする核酸を指しかつそれらを含む。ある態様において、AceCS2ポリペプチドまたはAceCS2核酸は、酵母、キイロショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、トリパノソーマ、線虫、およびその他に由来する。例示的なAceCS2ポリペプチド配列は、GenBank、例えば、ヒト（GenBankアクセッション番号：Q9NUB1）；マウス（GenBankアクセッション番号：BAB21612）；ウシ（GenBankアクセッション番号：BAB21611）において見出すことができる。例示的なAceCS2核酸配列は、例えば、ヒト（GenBankアクセッション番号：BC039261；マウス（GenBankアクセッション番号：AB046742）、およびウシ（GenBankアクセッション番号：AB046741）において見出すことができる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「アセチル化状態」は、ポリペプチド、好ましくはアセチルCoAシンセターゼ2（AceCS2）ポリペプチド上のアセチル基の有無を示す。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「活性剤」は、例えば、本発明のポリペプチドの発現を誘導もしくは活性化するか、または本発明のポリペプチドに結合するか、本発明のポリペプチドの活性を刺激するか、増加させるか、広げるか、活性化させるか、促進するか、もしくは活性化を増強させるか、増感させるか、もしくは上方調節する薬剤を指す。活性剤には、SIRT3またはAceCS2をコードする核酸だけでなく、天然または合成の化合物または薬剤、小さい化学分子なども含まれる。活性剤についてのアッセイには、例えば、SIRT3またはAceCS2を発現する細胞に候補薬剤を適用する工程および続いて機能的効果を決定する工程が含まれる。潜在的活性剤で処理されるSIRT3またはAceCS2を含む試料またはアッセイと活性剤を含まない対照試料とを比較して効果の程度を調べる。（候補薬剤で処理しない）対照試料に100％の相対活性値を割り当てる。対照と比較したポリペプチド活性値が110％、任意で130％、150％、任意で200％、300％、400％、500％、もしくは1000〜3000％、またはそれより高い場合に、ポリペプチドの活性化は達成される。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「AceCS2の活性」または「AceCS2ポリペプチドの活性」は、（i）ポリペプチドもしくはペプチド、好ましくはSIRT3ポリペプチドへのAceCS2の結合、（ii）ポリペプチドもしくはペプチド、好ましくはSIRT3ポリペプチドとのAceCS2の相互作用、（iii）SIRT3ポリペプチドを含む、多タンパク質複合体へのAceCS2の会合、（iv）ミトコンドリアにおけるAceCS2の局在、または（v）アセテート、ATP、およびCoAの、アセチル-CoAおよびAMP（アデノシン一リン酸）への酵素的変換、すなわち、アセテート、ATP、およびCoAを基質として用いてアセチル-CoAおよびAMPを生成させることを指す。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「SIRT3の活性」または「SIRT3ポリペプチドの活性」は、（i）ポリペプチドもしくはペプチド、好ましくはAceCS2ポリペプチドへのSIRT3の結合、（ii）ポリペプチドもしくはペプチド、好ましくはAceCS2ポリペプチドとのSIRT3の相互作用、（iii）AceCS2ポリペプチドを含む、多タンパク質複合体へのSIRT3の会合、（iv）ミトコンドリアにおけるSIRT3の局在、（v）ポリペプチドもしくはペプチド、好ましくはAceCS2ポリペプチドの脱アセチル化、または（vi）ポリペプチドもしくはペプチド、好ましくはAceCS2ポリペプチドのADP-リボシル化を指す。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「薬剤」または「候補薬剤」は、任意の化学的化合物、例えば、巨大分子または小分子であることができる。候補薬剤は、モル当たり約10,000グラム未満、モル当たり約5,000グラム未満、モル当たり約1,000グラム未満、またはモル当たり約500グラム未満の式量を有することができる。候補薬剤は、天然（例えば、薬草もしくは天然物）か、合成か、または両方であることができる。巨大分子の例は、タンパク質、タンパク質複合体、および糖タンパク質、核酸、例えば、DNA、RNA、およびPNA（ペプチド核酸）である。小分子の例は、ペプチド、ペプチドミメティック（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物または無機化合物、例えば、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物である。候補薬剤は、本明細書に記載された方法によりアッセイされる唯一の基質であることができる。あるいは、候補薬剤の集合を、連続的または同時のいずれかで、本明細書に記載された方法によりアッセイすることができる。
【００３８】
候補薬剤は、数多くの化学的部類、典型的には、合成か、半合成か、もしくは天然の無機または有機の分子を包含する。候補薬剤は、50ダルトンよりも大きくかつ約2,500ダルトンよりも小さい分子量を有する小有機化合物であってもよい。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでもよく、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含んでもよく、官能性化学基のうちの少なくとも2つを含んでもよい。候補薬剤は、上記の官能基の1つまたは複数で置換された環式炭素構造もしくは複素環構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはその組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「アンタゴニスト」は、ポリペプチドの生理学的作用を減弱するか、消滅させるか、またはポリペプチドの生理学的作用に干渉する化学物質を意味する。アンタゴニストは、例えば、化学的アンタゴニスト、薬物動態的アンタゴニスト、非競合的アンタゴニスト、または、例えばペプチドなどの生体分子といった、生理学的アンタゴニストであってもよい。好ましいアンタゴニストは、AceCS2ポリペプチドの生理学的作用を減弱するか、消滅させるか、またはAceCS2ポリペプチドの生理学的作用に干渉する。
【００４０】
具体的に、アンタゴニストは、第一のポリペプチド、例えば、SIRT3ポリペプチドと、第二のポリペプチド、例えば、AceCS2ポリペプチドなどの結合パートナーとの間の相互作用のレベルで作用してもよい。アンタゴニストは、例えば、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの結合を競合的にまたは非競合的に（例えば、アロステリックに）阻害してもよい。「薬物動態的アンタゴニスト」は、例えば、第一のポリペプチドの代謝的分解の速度を増加させることによって、その作用の部位での活性薬物の濃度を効果的に低下させる。「競合的アンタゴニスト」は、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの相互作用に立体的に干渉するやり方で第一のポリペプチドに直接結合する分子である。非競合的拮抗作用は、アンタゴニストは結合と直接競合しないが、その代わりに第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの結合の後でシグナル伝達経路の点を遮断する状況を説明する。生理学的拮抗作用は、体内での反対作用が互いを無効にする傾向がある2つの物質の相互作用を大雑把に説明する。アンタゴニストは、第一のポリペプチドの発現を減弱するまたは消滅させる物質であることもできる。したがって、AceCS2アンタゴニストは、例えば、（i）AceCS2をコードする遺伝子の発現、（ii）AceCS2 mRNAの翻訳、（iii）AceCS2の翻訳後修飾、または（iv）多タンパク質複合体の形成におけるAceCS2のその他のポリペプチドとの相互作用を、減弱するまたは消滅させる物質であることができる。
【００４１】
本明細書で用いる場合の「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的配列に完全に相補的であるヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限りにおいて、1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、AceCS2遺伝子の任意のヌクレオチド配列の全長配列までの少なくとも15の連続したヌクレオチドの全範囲にわたって、少なくとも70％またはそれより高く、好ましくは80％またはそれより高く、より好ましくは90％またはそれより高く、さらにより好ましくは95％またはそれより高い相同性（配列同一性とも称される）を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを用いて相同性を決定することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物を、本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。そのような修飾産物の例として、メチルホスホネート型またはエチルホスホネート型などといった低級アルキルホスホネート修飾、ホスホロチオエート修飾、およびホスホロアミデート修飾が含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「関連する」とは、接触するか、相互作用するか、または結合することを意味する。
【００４３】
本明細書で用いる場合、薬剤に言及する時の「生物学的に活性がある」という用語は、当技術分野において認知されており、それまたは投与される薬剤の量の一部が、それを投与する対象もしくは患者によって吸収されるか、該対象または患者に組み入れられるか、またはさもなければ該対象もしくは患者にとって生理学的に利用可能となることを可能にする薬剤の形態を指す。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「生物学的試料」とは、核酸またはポリペプチドを含む生物学的組織または流動体の試料を意味する。そのような試料は典型的にはヒト由来であるが、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えば、マウスおよびラットから単離された組織を含む。生物学的試料にはまた、生検材料および剖検試料などの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、脳脊髄液、血液、血漿、血清、喀痰、糞便、涙、粘液、毛髪、皮膚などが含まれてもよい。生物学的試料には、患者組織に由来する外植片ならびに初代細胞培養物および／または形質転換細胞培養物も含まれる。「生物学的試料」はまた、動物由来の細胞もしくは細胞の集団または相当な数量の組織もしくは体液も指す。多くの場合、生物学的試料は動物から除去されるが、「生物学的試料」という用語は、インビボで解析される、すなわち動物からの除去を伴わない、細胞または組織も指すことができる。典型的には、「生物学的試料」は動物由来の細胞を含むと考えられるが、本用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定するために用いることができる、血液、血清、唾液、脳脊髄液、または尿の非細胞性画分などの、非細胞性の生物学的材料も指すことができる。組織生検または血液試料を含むがこれらに限定されない数多くの種類の生物学的試料を本発明で用いることができる。本明細書で用いる場合、「組織生検材料」は、動物、好ましくはヒトから診断的解析用に除去された相当な量の組織を指す。「組織生検材料」は、針生検材料、細針生検材料、外科生検材料などのような、任意の種類の生検材料を指すことができる。
【００４５】
「生物学的試料を提供すること」とは、本発明に記載された方法で使用するための生物学的試料を得ることを意味する。多くの場合、これは、対象から細胞の試料を除去することによってなされると考えられるが、以前に単離された（例えば、別の人によって、別の時に、および／もしくは別の目的で単離された）細胞を用いることによって、または本発明の方法をインビボで行なうことによって遂行することもできる。処置履歴または転帰履歴を有する、記録が保管された組織は特に有用であると考えられる。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「CoA」は補酵素Aを意味する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「コンビナトリアル化学ライブラリー」は、試薬などの多数の化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学的合成かまたは生物学的合成かのいずれかで生成された多様な化学的化合物の集合を指す。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの線形コンビナトリアル化学ライブラリーは、1組の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）を、所与の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）についてあらゆる可能性のある方法で組み合わせることによって形成される。化学的ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合を通じて、何百万もの化学的化合物を合成することができる。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「発現の減少」という用語は、より低い遺伝子発現産物のレベルおよび／または遺伝子発現産物の活性の低下を指す。好ましくは、減少は、対照と比較して少なくとも20％であり、より好ましくは、減少は、少なくとも30％か、少なくとも40％か、少なくとも50％か、少なくとも60％か、少なくとも70％か、少なくとも80％か、または少なくとも90％であり、かつ最も好ましくは、減少は少なくとも100％である。
【００４９】
「決定すること」という用語の同義語が、本発明の範囲内で企図されており、かつAceCS2、SIRT3、標識、または本発明の小分子などのような分子の有無、量、または濃度について検出すること、測定すること、アッセイすること、または試験することを含むがこれらに限定されない。本用語は、定性的決定および定量的決定の両方を指す。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「効果を決定すること」または「機能的効果を決定すること」とは、間接的または直接的に薬剤の影響下にあるパラメーター、例えば、機能的効果、酵素的効果、物理的効果、または化学的効果を増加または減少させる薬剤についてアッセイすることを意味する。そのような効果を、当業者に公知の任意の手段、例えば、タンパク質についての分光学的特徴（例えば、蛍光、吸収、屈折率）、流体力学特性（例えば、形状）、クロマトグラフィー特性、または溶解度特性の変化によって、誘導可能マーカー、またはSIRT3もしくはAceCS2などといった、遺伝子の転写活性化を測定し；結合活性、例えば、SIRT3とAceCS2との結合を測定し；SIRT3の脱アセチル化活性についてアッセイし；AceCS2のアセチル化状態を決定し；細胞増殖を測定し、アポトーシスを測定し、SIRT3またはAceCS2などといった、ポリペプチドの細胞内局在を測定し；アセチル-CoAまたはAMPの産生を測定し；アセテートレベル、ATPレベル、またはCoAレベルなどの低下を測定することで、測定することができる。疾患、障害、癌、またはその他の病理に対する薬剤の機能的効果の決定を、インビトロアッセイ、例えば、細胞増殖；成長因子または血清依存性；細胞におけるmRNAおよびタンパク質発現、ならびに細胞のその他の特徴などの当業者に公知のアッセイを用いて行なうこともできる。効果は、当業者に公知の多くの手段、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導可能マーカー、リガンド結合アッセイ、アポトーシスアッセイといった、形態学的特色の変化の定量的または定性的な測定のための顕微鏡検査、RNAまたはタンパク質レベルの変化の測定、RNA安定性の測定、下流遺伝子またはレポーター遺伝子発現（CAT、ルシフェラーゼ、β-gal、GFPなど）の同定などによって、アセチル-CoAおよびAMPの産生を測定することなどで、評価することができる。「機能的効果」には、インビトロ、インビボ、およびエクスビボの活性が含まれる。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「障害」、「疾患」、または「病理学的状態」は包括的に用いられており、体の任意の部分、器官、もしくはシステム（またはその任意の組み合わせ）の正常な構造または機能からの任意の逸脱を指す。特定の疾患は、生物学的、化学的、および物理的な変化を含む、特徴的な症状および兆候によって明らかにされ、かつ多くの場合、人口統計学的要因、環境要因、職業的要因、遺伝的要因、および病歴による要因を含むがこれらに限定されない種々のその他の要因と関連する。重要な診断情報をもたらすために、ある特徴的な兆候、症状、および関連要因を種々の方法を通じて定量することができる。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「有効量」、「有効用量」、「十分量」、「有効である量」、「治療的有効量」、またはその文法的等価物は、所望の結果をもたらすか、症状を改善するかもしくは何らかの方法で低下させるか、または状態の進行を停止させるかもしくは逆行させるのに十分な投薬量を意味する。幾つかの態様において、所望の結果は、ミトコンドリアにおけるSIRT3の局在の増加である。その他の態様において、所望の結果は、ミトコンドリアにおけるAceCS2の局在の増加である。さらにその他の態様において、所望の結果は、SIRT3の脱アセチル化活性の増加である。別の態様において、所望の結果は、AceCS2のアセチル化状態の増加または減少である。さらにその他の態様において、所望の結果は、アセテート、ATP、およびCoAを基質として用いたアセチル-CoAおよびAMPの生成の増加または減少である（図11参照）。さらに別の態様において、所望の結果は、アセテートレベルの減少である。本明細書に記載された、薬学的組成物の投与による特定の状態の症状の改善とは、恒久的であれまたは一時的であれ、持続的であれまたは一過性であれ、薬学的組成物の投与と関連させることができる任意の緩和を指す。「有効量」は、インビボおよびインビトロで投与することができる。
【００５３】
「全長」ポリペプチドまたは核酸とは、1つまたは複数の天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中に通例含まれる要素の全てを含む、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列、またはその変種を指す。「全長」は、オルタナティブスプライシングおよびシグナルペプチド切断を含む翻訳後プロセッシングまたはスプライシングの様々な段階の前でも後でもよい。
【００５４】
核酸の部分に関連して用いられる場合の「異種」という用語は、核酸が、自然界では互いに対して同じ関係性で見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むということを示す。例えば、核酸は典型的には、組換えによって産生され、新たな機能的核酸を作製するように配置された関連のない遺伝子由来の2つまたはそれ以上の配列、例えば、一つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然界では互いに対して同じ関係性で見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むということを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００５５】
「宿主細胞」は、天然の細胞、または発現ベクターを含みかつ発現ベクターの複製もしくは発現を支持する形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、インビボの細胞などであってもよい。宿主細胞は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞、または酵母、昆虫細胞、両生類細胞、もしくはCHO、293、3T3、HeLaなど（例えば、American Type Culture Collectionカタログ参照）のような哺乳類細胞などの真核細胞であってもよい。
【００５６】
本発明の目的のために、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、2つの核酸分子が「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の下でハイブリダイズする能力を指すために用いられる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中の、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしないと考えられる条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的でありかつ異なる状況では異なると考えられる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に見出される。通常、ストリンジェントな条件を、規定のイオン強度pHにおける特異的配列についての温度融解点（Tm）よりも約5〜10℃低くなるように選択する。Tmは、標的に相補的なプローブの50％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする（規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下での）温度である（標的配列が過剰に存在する時、Tmでは、プローブの50％が平衡状態で占められる）。また、ホルムアミドなどの不安定化薬剤の添加によって、ストリンジェントな条件を達成してもよい。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りであることができる：50％ ホルムアミド、5x SSC、および1％ SDS、42℃でインキュベート、または5x SSC、1％ SDS、65℃でインキュベート、0.2x SSC、および0.1％ SDS中で50℃で洗浄。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、その転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害し、それによってタンパク質機能の阻害を結果的にもたらすことによって、例えば、AceCS2遺伝子がコードするタンパク質を産生する細胞に対して作用する。
【００５７】
「高コレステロール血症」という用語は、対象において、血流中のコレステロールのレベルが異常に高い状態を指す。
【００５８】
「高脂血症」という用語は、対象において、血液中の脂肪性物質のレベルが正常よりも高い状態を指す。脂肪性物質には、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、およびトリグリセリドが含まれる。
【００５９】
本明細書で互換的に用いられる、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、マウス、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、哺乳類の家畜動物、哺乳類の競技動物（sport animal）、および哺乳類のペット、ならびにヒトを含むがこれらに限定されない哺乳類を指す。好ましいのはヒトである。ある態様において、本用語には、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、トリパノソーマ、線虫、キイロショウジョウバエ、および酵母も含まれる。
【００６０】
本明細書で用いる場合、「阻害剤」は、例えば、本発明のポリペプチドの発現を抑制するかもしくは不活化するか、または本発明のポリペプチドに結合するか、本発明のポリペプチドの活性を減少させるか、閉鎖するか、不活化するか、妨げるか、もしくは活性化を低下させるか、脱感作するか、もしくは下方調節する薬剤を指す。阻害剤には、例えば、AceCS2の発現に干渉するsiRNA、アンチセンスRNA、およびリボザイムなどの核酸だけでなく、天然および合成の化合物および薬剤、小化学分子なども含まれる。活性化剤用のアッセイ（上記および本明細書中を参照）を阻害剤用のアッセイとして用いることもできる。潜在的阻害剤で処理したAceCS2を含む試料またはアッセイを、阻害剤を含まない対照試料と比較し、効果の程度を検討する。（候補薬剤で処理しない）対照試料に100％の相対活性値を割り当てる。対照と比較した活性値が10％、任意で20％、任意で30％、任意で40％、任意で50％、60％、70％、80％、または90〜100％低下する場合、ポリペプチドの阻害が達成される。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「インビトロ」とは、1つもしくは複数の細胞が得られるかまたは細胞株が単離される生物の体外を意味する。
【００６２】
本明細書で用いる場合、「インビボ」とは、1つもしくは複数の細胞が得られるかまたは細胞株が単離される生物の体内を意味する。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「ケトン体形成状態」という用語は、個体において、相当量のアセテートを血流中に放出する肝臓を特徴とする状態を指す（Buckley and Williamson, 1977, Biochem J 166:539-45; Seufert et al., 1974, Biochem Biophys Res Commun 57:901-9; Yamashita et al., 2001, Biochim Biophys Acta 1532:79-87）。ケトン体形成状態は長期にわたる絶食または糖尿病の影響である可能性がある。さらに、アセテートを産生する、肝臓のアセチル-CoAヒドロラーゼは、ケトン体形成状態の下で活性化される（Matsunaga et al., 1985, Eur J Biochem 152, 331-6）。
【００６４】
「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、またはその他の物理的手段で検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、3H、125I、32P、14C、蛍光色素、電子密度の高い試薬、（例えば、ELISAで一般に用いるような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテンおよびタンパク質、または例えば、SIRT3、AceCS2、SIRT3の基質（例えば、NADもしくはポリペプチド）、もしくはAceCS2の基質（例えば、アセテート）、もしくは小分子化合物中に放射性標識を組み入れることによって、検出可能にすることができるその他の実体が含まれる。好ましい標識は、好ましくはアセチル基中の、14Cである。
【００６５】
本明細書で用いる場合、生物学的試料中の「mRNAのレベル」とは、細胞または生物学的試料中に存在する遺伝子から転写されたmRNAの量を指す。mRNAは通常、機能性タンパク質をコードするが、コードされたタンパク質の機能を変更するかまたは排除する変異が存在する場合がある。「mRNAのレベル」は、定量する必要はないが、例えば、対照試料由来のレベルまたは対照試料の予期されたレベルと比較してまたは比較しないで、ヒトによる主観的な、目視による検出で、簡単に検出することができる。好ましいmRNAは、SIRT3 mRNAまたはAceCS2 mRNAである。
【００６６】
本明細書で用いる場合、生物学的試料中の「ポリペプチドのレベル」とは、細胞または生物学的試料中に存在するmRNAから翻訳されたポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは、タンパク質活性を有してもよくまたは有さなくてもよい。「ポリペプチドのレベル」を定量する必要はないが、例えば、対照試料由来のレベルまたは対照試料の予期されたレベルと比較してまたは比較しないで、ヒトによる主観的な、目視による検出で、簡単に検出することができる。好ましいポリペプチドは、SIRT3ポリペプチドまたはAceCS2ポリペプチドである。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「哺乳類」または「哺乳類の」は、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、ならびに霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類綱を意味するかまたは該哺乳類綱と関連する。
【００６８】
「調整する（modulate）」、「調整（modulation）」、または「調整する（modulating）」という用語は、当技術分野で認知されており、応答の上方調節（すなわち、活性化、刺激、増加）、または下方調節（すなわち、阻害、抑制、低下、もしくは減少）、または2つを組み合わせてもしくは別々に指す。
【００６９】
本明細書で用いる場合、AceCS2などのポリペプチドのレベルまたは活性の「調整剤」は、そのポリペプチドの活性化剤および／または阻害剤を含み、かつポリペプチドの発現のレベルまたはポリペプチドの活性を活性化または阻害する薬剤を指すのに用いられる。好ましいポリペプチドは、AceCS2である。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「多タンパク質複合体」は、2つまたはそれ以上のポリペプチドの互いに対する結合および非共有結合的な付着を指す。
【００７１】
本明細書で用いる場合、「天然の」核酸分子は、自然界で生じるヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を指す。例えば、天然の核酸分子は、天然のタンパク質をコードすることができる。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「天然の」ポリペプチドは、自然界で生じるアミノ酸配列を有するポリペプチド分子を指す。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」またはその文法的等価物は、共有結合で一緒に連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは典型的には、長さ約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50、またはそれより多くのヌクレオチドから長さ約100ヌクレオチドまでである。核酸およびポリヌクレオチドは、例えば、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000などのより長い長さを含む、任意の長さのポリマーである。本発明の核酸は通常、ホスホジエステル結合を含むと考えられるが、場合によっては、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミダイト連結（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照）を含む、代替骨格；ならびにペプチド核酸の骨格および連結を有し得る核酸類似体を含む。その他の類似体核酸には、正に帯電した骨格を持つもの；非イオン性骨格を持つもの、ならびに米国特許第5,235,033号および第5,034,506号、ならびにASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook編, 第6章および第7章に記載されたものを含む、非リボース骨格を持つものが含まれる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も、核酸の1つの定義の中に含まれる。種々の理由のために、例えば、生理的環境でのまたはバイオチップ上のプローブとしてのそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、リボース-リン酸骨格の修飾を行なってもよい。天然の核酸および類似体の混合物を作製することができ；あるいは、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然の核酸および類似体の混合物を作製してもよい。
【００７４】
種々の参照が、例えば、ホスホロアミデート（Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993)およびその中の参照；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)；Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81 :579 (1977)；Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986)；Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；ならびにPauwels et al., Chemica Scripta 26:141 (1986)）、ホスホロチオエート（Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991)；および米国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)）、O-メチルホスホロアミダイト連結（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照） 、ならびにペプチド核酸の骨格および連結（全てが参照により組み入れられる、Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)；Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31 :1008 (1992)；Nielsen, Nature 365:566 (1993)；Carlson et al., Nature 380:207 (1996)参照）を含む、そのような核酸類似体を開示している。その他の類似体核酸には、正に帯電した骨格を持つもの（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)）、非イオン性骨格を持つもの（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、および第4,469,863；Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991)；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994)；ASC Symposium Series 580,「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Y.S. Sanghui and P. Dan Cook編, 第2章および第3章； Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)；Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994)；Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)）、ならびに米国特許第5,235,033号および第5,034,506号、ならびにASC Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Y.S. Sanghui and P. Dan Cook編, 第6章および第7章に記載されたものを含む、非リボース骨格を持つものが含まれる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も核酸の1つの定義の中に含まれる（Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. pp 169 176 (1995)参照）。幾つかの核酸類似体が、Rawls, C & E News June 2, 1997, 35ページに記載されている。これらの参照の全てが、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【００７５】
その他の類似体には、ペプチド核酸類似体であるペプチド核酸（PNA）が含まれる。これらの骨格は、天然の核酸の高電荷のホスホジエステル骨格とは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。これは、2つの利点を結果的にもたらす。第一に、PNA骨格はハイブリダイゼーション動力学の改善を示す。PNAは、完全にマッチした塩基対に対してミスマッチした塩基対についての融解温度（Tm）のより大きい変化を有する。DNAおよびRNAは典型的には、内部のミスマッチについて、2〜4℃のTmの下落を示す。非イオン性PNA骨格に関して、下落は7〜9℃に近い。同様に、それらの非イオン性の性質に起因して、これらの骨格に付着した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して相対的に感度が低い。さらに、PNAは、細胞性酵素によって分解されず、したがってより安定でありうる。
【００７６】
核酸は、明記したような、1本鎖もしくは2本鎖であってもよく、または2本鎖配列もしくは1本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。当業者によって理解されるように、1本鎖の叙述は相補鎖の配列も定義し；したがって、本明細書に記載された配列は、配列の相補物も提供する。核酸は、ゲノムおよびcDNA両方のDNA、RNA、または核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む、塩基の組み合わせを含み得るハイブリッドであってもよい。「転写物」は典型的には、天然のRNA、例えば、プレmRNA、hnRNA、またはmRNAを指す。本明細書で用いる場合、「ヌクレオシド」という用語には、ヌクレオチドならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドの類似体、ならびにアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドが含まれる。さらに、「ヌクレオシド」には、非天然の類似体構造が含まれる。したがって、例えば、各々塩基を含むペプチド核酸の個々の単位を本明細書でヌクレオシドと称する。
【００７７】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される」とは、生理的に耐用性があり、かつ典型的には、対象、好ましくはヒト対象に投与した場合に、アレルギー性反応または同様の有害な反応をもたらさない組成物を指す。好ましくは、本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されているかまたは米国薬局方もしくは動物およびより特別にはヒトで使用するためのその他の一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。
【００７８】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指し、本明細書で互換的に用いられる。本用語は、天然のアミノ酸ポリマー、修飾残基を含むアミノ酸ポリマー、および非天然のアミノ酸ポリマーだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。好ましいポリペプチドは、SIRT3およびAceCS2である。
【００７９】
「プロモーター」という用語は、SIRT3遺伝子またはAceCS2遺伝子の転写を制御する1つまたは複数の調節領域を含む核酸配列を指す。幾つかの態様において、プロモーターは、ヒトプロモーターである。
【００８０】
「精製された」もしくは「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、該タンパク質が由来する細胞もしくは組織の供給源に由来する細胞材料もしくはその他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成した場合に化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」は、調製物中の対象となるタンパク質が少なくとも10％純粋であるということを意味する。1つの態様において、タンパク質の調製物は、（乾燥重量で）約30％、20％、10％、およびより好ましくは5％未満の汚染成分（例えば、対象とならないタンパク質、化学的前駆体など）を有する。タンパク質またはその生物学的活性部分を組換えによって産生する場合、それはまた好ましくは培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の少なくとも約20％未満、より好ましくは約10％未満、および最も好ましくは約5％未満に相当する。
【００８１】
細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる場合の「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質の導入もしくはネイティブな核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されているということ、または細胞がそのように修飾された細胞に由来するということを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞では見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現するか、低発現するか、もしくは全く発現しないネイティブな遺伝子を発現する。本明細書での「組換え核酸」という用語によって、一般に、核酸の操作によって、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、自然界で通常見出されない形態で、本来はインビトロで形成された、核酸を意味する。この方法により、異なる配列の機能的連結を達成する。したがって、単離された線形形態の核酸、または通常接続されていないDNA分子をライゲートすることによってインビトロで形成された発現ベクターは両方とも、本発明の目的のための組換え体とみなされる。ひとたび組換え核酸を作製しかつ宿主の細胞または生物に再導入すれば、それは、非組換えによって、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製するということが理解される；しかしながら、そのような核酸は、ひとたび組換えによって産生されれば、その後非組換えによって複製されても、やはり本発明の目的のための組換え体とみなされる。同様に「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、上で叙述したような組換え核酸の発現を通して作製されたタンパク質である。
【００８２】
本明細書で用いる場合、「塩」という用語は、本明細書に記載された化合物に見出される特定の置換に応じて、比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製される、SIRT3活性化剤またはAceCS2調整剤 などといった本発明の活性化合物または薬剤の塩を指す。本発明の化合物、薬剤、または小分子が、比較的酸性の官能性を含む場合、中性形態のそのような化合物を、ニートかまたは好適な不活性溶媒中かのいずれかで、十分量の所望の塩基と接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩、または同様の塩が含まれる。本発明の化合物、薬剤、または小分子が、比較的塩基性の官能性を含む場合、中性形態のそのような化合物を、ニートかまたは好適な不活性溶媒中かのいずれかで、十分量の所望の酸と接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する塩だけでなく、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的無毒性の有機酸に由来する塩も含まれる。アルギネートなどのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge et al., 1977, J Pharm Science 66:1-19を参照されたい）。本発明のある特定の薬剤は、薬剤を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性官能性および酸性官能性の両方を含む。
【００８３】
本発明の中性形態の薬剤または小分子を、塩を塩基または酸と接触させかつ従来の方法でもとの化合物を単離することによって再生してもよい。薬剤または小分子のもとの形態は、極性溶媒中での溶解度などの、ある物理的特性において様々な塩形態とは異なるが、その他の点では、塩は、本発明の目的のための化合物、薬剤、および小分子のもとの形態と等価である。
【００８４】
本明細書で用いる場合、「サーチュイン」という用語は、酵母Sir2（例えば、GenBankアクセッション番号：P53685）、線虫Sir-2.1（例えば、GenBankアクセッション番号：NP_01912）、ならびにヒトSIRT1（例えば、GenBankアクセッション番号：Q96EB6、NP_036370、およびAAD40849）、ならびにヒトSIRT2（例えば、GenBankアクセッション番号：NM_030593、AF083107、AAD40850、CAD43717、ABB72675、NP_085096、AAH03547）タンパク質を含む、サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリーのメンバー、好ましくはSir2ファミリーを指す。その他のファミリーメンバーには、「HST遺伝子」（Sir2のホモログ）と称される4つのさらなる酵母Sir2様遺伝子HST1、HST2、HST3、およびHST4、ならびに5つのその他のヒトホモログhSIRT3（例えば、GenBankアクセッション番号：NP_036371、AAH01042、AAD40851、およびQ9NTG7）、hSIRT4（例えば、GenBankアクセッション番号：NP_036372、AAI09321、AAI09320、AAD40852、およびQ9Y6E7）、hSIRT5（例えば、GenBankアクセッション番号：CAI19838、CAI19837、NP_112534、NP_036373、およびAAH001216）、hSIRT6（例えば、GenBankアクセッション番号：NP_057623、AAH05026、AAH04218、およびAAH28220）、ならびにhSIRT7（例えば、GenBankアクセッション番号：NP_057622、AAH17305、AAI01794、およびAAI01792）が含まれる（Brachmann et al., 1995, Genes Dev 9:2888-902、およびFrye, 1999, Biochem Biophys Res Commun 260(1):273-279；Frye, 2000, Biochem Biophys Res Commun 273(2):793-798）。好ましいサーチュインは、SIRT3、より好ましくはhSIRT3とより多くの類似性を共有するサーチュインである。
【００８５】
本明細書で用いる場合、「SIRT3」という用語は、（1）GenBankアクセッション番号：NP_036371、AAH01042、AAD40851、NM_001017524、またはQ9NTG7の下に寄託されたようなSIRT3配列との、約60％を超えるアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を、少なくとも約25、50、75、100、150、200、250、300、350、もしくは400、またはそれより多くのアミノ酸の領域にわたって有し；（2）GenBankアクセッション番号：NP_036371、AAH01042、AAD40851、NM_001017524、もしくはQ9NTG7の下に寄託されたようなアミノ酸配列、または保存的に修飾されたその変種もしくはその断片を含む免疫原に対して作製された、抗体、例えば、ポリクローナル抗体に結合し；（3）AceCS2ポリペプチドに結合し；（4）アセチル-CoAおよびAMPの産生を少なくとも部分的かつ間接的に調整し；（5）アセチル化AceCS2ポリペプチドを脱アセチル化し、（6）GenBankアクセッション番号：NP_036371、AAH01042、AAD40851、およびQ9NTG7の下に寄託されたような核酸配列、または保存的に修飾されたその変種にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；（7）GenBankアクセッション番号：NM_012239、BC001042、またはAF083108の下に寄託されたような核酸配列との、約90％を超える、好ましくは約96％、97％、98％、99％、またはそれより高いヌクレオチド配列同一性を、好ましくは少なくとも約30、50、100、200、500、1000、1,500、2000、またはそれより多くのヌクレオチドの領域にわたって有し；（8）その配列がGenBankアクセッション番号：NP_036371、AAH01042、AAD40851、もしくはQ9NTG7の下に寄託されている少なくとも25、多くの場合50、75、100、150、200、250、300、350、もしくは400の連続したアミノ酸残基のポリペプチド、ならびに／またはGenBankアクセッション番号：NM_012239、BCOOl042、もしくはAF083108の下に寄託されたような少なくとも25、多くの場合50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1,000、1,200、1,500、2,000、もしくはそれより多くの連続したヌクレオチドの核酸配列を有する：核酸、ポリペプチド、および多型変異体、アレル、変異体、ならびにその種間ホモログ、ならびに本明細書にさらに記載されたようなものを指す。
【００８６】
SIRT3ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト由来であるが、非ヒト霊長類、齧歯類、例えば、ラット、マウス、もしくはハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはその他の哺乳類を含むがこれらに限定されないその他の哺乳類由来であってもよい。ある態様において、酵母、キイロショウジョウバエ、トリパノソーマ、ニワトリ、線虫、またはアフリカツメガエル由来のSIRT3を用いることが望ましい。「SIRT3」ポリペプチドおよびポリヌクレオチドには、天然または組換え両方の形態が含まれる。それゆえに、幾つかの態様において、本明細書に記載されたようなSIRT3ポリペプチドおよびSIRT3サブドメインポリペプチドは、ヒトSIRT3ポリペプチド配列に対応する配列を含むことができる。したがって、例示的なSIRT3ポリペプチド配列は、本明細書で提供されておりかつ当技術分野で公知である。例えば、ヒトSIRT3ポリペプチドについてのGenBankアクセッション番号は、NP_036371、AAH01042、AAD40851、NM_001017524、およびQ9NTG7である。マウスSIRT3ポリペプチドについてのGenBankアクセッション番号は、例えば、CAJ18608、Q8R104、AAH25878、およびNP_071878であり；ラットSIRT3については、XP_215124であり；ウシSIRT3については、XP_869883およびXP_879073であり；イヌSIRT3については、XP_848300、XP_855809、およびXP_856096であり；ゼブラフィッシュSIRT3については、XP_684225およびXP690925である。例示的なSIRT3ポリヌクレオチド配列は、本明細書で提供されておりかつ当技術分野で公知である。例えば、ヒトSIRT3核酸についてのGenBankアクセッション番号は、NM_O12239、BCOO1042、NM_OO1017524、およびAF083108である。マウスSIRT3核酸についてのGenBankアクセッション番号は、例えば、CT010402、BC025878、およびNM_022433であり；ラットSIRT3については、XM_215124であり；ウシSIRT3については、XM_864790およびXM_873980であり；イヌSIRT3については、XM_843207、XM_850716、およびXM_851003であり；かつゼブラフィッシュSIRT3については、XM_679133およびXM_685833である。
【００８７】
幾つかの態様において、SIRT3ポリペプチドは、「全長」SIRT3ポリペプチドであることができる。本明細書で用いる場合の「全長」という用語は、 少なくとも天然のSIRT3ポリペプチドの長さを有するポリペプチドを指す。「全長」SIRT3ポリペプチドまたはその断片は、その他の配列、例えば、（FLAGもしくはHAなどの）精製タグ、または（付着したフルオロフォア、標識、もしくは補因子などの）その他の付着化合物を含むこともできる。
【００８８】
「低分子干渉RNA」、「短い干渉RNA」、または「siRNA」によって、配列特異的なRNA分解を誘発させる際の重要な媒介物として機能する、好ましくは長さが10ヌクレオチドを超える、より好ましくは長さが15ヌクレオチドを超える、および最も好ましくは長さが18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドを超える単離されたRNA分子を意味する。19〜25ヌクレオチドの範囲が、siRNAに最も好ましいサイズである。siRNAは、siRNA二重鎖の両方の鎖が1本のRNA分子中に含まれる短いヘアピンRNA（shRNA）を含むこともできる。二本鎖siRNAは通常、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる。1本鎖siRNAは通常、標的遺伝子またはmRNAに相補的であるアンチセンス鎖のみからなる。siRNAには、任意の形態のRNA、好ましくはdsRNA（タンパク質分解的に切断されたより長いdsRNA、部分精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組み換えによって産生されたRNAの産物）だけでなく、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変によって天然のRNAとは異なる修飾RNAも含まれる。
【００８９】
「小分子」とは、5、2、1、または0.5 kDa未満の分子量を有する分子である。多くの態様において、そのような小分子は、ペプチド結合またはホスホジエステル結合を含まない。例えば、それらは、非ポリマー性であることができる。幾つかの態様において、分子は、少なくとも50、100、200、または400ダルトンの分子量を有する。
【００９０】
SIRT3またはAceCS2などの、タンパク質の文脈における「サブドメイン」、「ドメイン」、「機能ドメイン」という用語またはその文法的等価物は、相互作用、例えば、分子内または分子間相互作用、例えば、結合または触媒相互作用に関与する、SIRT3またはAceCS2の断片などといったタンパク質の断片を指す。分子間相互作用は、特異的な結合相互作用または酵素的相互作用であることができる（例えば、相互作用は一過性であることができかつ共有結合は形成されるかまたは破壊される）。分子間相互作用は、あるタンパク質と別のタンパク質との間、あるタンパク質と別の化合物との間、またはあるタンパク質の第一の分子と第二の分子との間（例えば、二量体化相互作用）であることができる。タンパク質の生物学的活性部分／機能ドメインは、全長の天然タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、かつ天然タンパク質の少なくとも1つの活性を示すタンパク質のアミノ酸配列と十分に相同かまたは該アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。生物学的活性部分／機能ドメインを、切断解析、部位特異的変異誘発、およびタンパク質分解を含む種々の技術で同定することができる。変異体またはタンパク質分解断片を、適当な生化学的または生物学的（例えば、遺伝的）アッセイにより活性についてアッセイすることができる。幾つかの態様において、機能ドメインは独立に折り畳まれる。典型的に、生物学的活性断片は、タンパク質の少なくとも1つの活性を持つドメインまたはモチーフ、例えば、SIRT3またはAceCS2コア触媒ドメインを含む。タンパク質の生物学的活性部分／機能ドメインは、例えば、長さが10、25、50、100、200、またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであることができる。SIRT3などの、タンパク質の生物学的活性部分／機能ドメインは、（i）AceCS2ポリペプチドに結合することができるか、（ii）脱アセチル化活性を有するか、（iii）会合して、例えば、AceCS2を含む多タンパク質複合体になるか、または（iv）AceCS2を脱アセチル化することができる。AceCS2などの、タンパク質の生物学的活性部分／機能ドメインは、（i）SIRT3ポリペプチドに結合することができるか、（ii）酵素活性を有するか、（iii）会合して、例えば、SIRT3を含む多タンパク質複合体になるか、（iv）アセテート、ATP、およびCoAを基質として用いてアセチル-CoAおよびAMPを生成するか、またはミトコンドリアに局在する。
【００９１】
本明細書で用いる場合の「関連」ポリペプチドは、ポリペプチドのホモログ、アイソフォーム、オルソログ、融合タンパク質、もしくは断片、またはその任意の組み合わせを指す。
【００９２】
「SIRT3ホモログ」または「AceCS2ホモログ」は、それぞれ、SIRT3またはAceCS2のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含むが、必ずしもSIRT3またはAceCS2と同様または同一の機能を保有するわけではないポリペプチドを指す。
【００９３】
「SIRT3アイソフォーム」または「AceCS2アイソフォーム」は、それぞれ、同じ遺伝子によってコードされるが、そのpIもしくはMW、または両方が異なる、SIRT3またはAceCS2の変種を指す。そのようなアイソフォームは、（例えば、オルタナティブスプライシングもしくは限定的タンパク質分解の結果として）それらのアミノ酸組成が異なることができ、さらに、または代わりに、差次的な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、もしくはリン酸化）から生じる可能性がある。
【００９４】
本明細書で用いる場合の「SIRT3オルソログ」または「AceCS2オルソログ」は、（i）それぞれ、ヒトSIRT3またはヒトAceCS2のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含み、かつ（ii）それぞれ、ヒトSIRT3またはヒトAceCS2の機能と同様または同一の機能を保有する、非ヒトポリペプチドを指す。
【００９５】
本明細書で用いる場合の「SIRT3融合タンパク質」は、（i）SIRT3、SIRT3断片、SIRT3サブドメインポリペプチド、SIRT3関連ポリペプチド、またはSIRT3関連ポリペプチドの断片のアミノ酸配列、および（ii）異種ポリペプチド（すなわち、非SIRT3、非SIRT3断片、または非SIRT3関連ポリペプチド）のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。同様に、本明細書で用いる場合の「AceCS2融合タンパク質」は、（i）AceCS2、AceCS2断片、AceCS2サブドメインポリペプチド、AceCS2関連ポリペプチド、またはAceCS2関連ポリペプチドの断片のアミノ酸配列および（ii）異種ポリペプチド（すなわち、非AceCS2、非AceCS2断片、または非AceCS2関連ポリペプチド）のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。
【００９６】
本明細書で用いる場合、「溶媒和物」という用語は、溶媒と複合体を形成する本発明の化合物、薬剤、および小分子を指す。本発明の化合物、薬剤、および小分子と溶媒和物を形成することができる溶媒には、アルコール（メタノール、エタノールなど）、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ハロゲン化溶媒（塩化メチレン、クロロホルムなど）、ヘキサン、およびペンタンなどの一般的な有機溶媒が含まれる。さらなる溶媒には、水が含まれる。複合体を形成する溶媒が水である場合、複合体を「水和物」と呼ぶ。
【００９７】
本明細書で用いる場合、本方法によって病理学的状態、障害、または疾患を処置すべき「対象」または「患者」とは、病理学的状態、障害、または疾患に対する処置を必要とするヒトかまたは非ヒトのいずれかの動物を意味する。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシなどの、哺乳類、およびニワトリ、両生類、爬虫類などのような、非哺乳類が含まれる。好ましい態様において、対象はヒトである。別の態様において、対象は、実験動物または疾患モデルとして好適な動物である。
【００９８】
本明細書で用いる場合、「処置する（treat）」、「処置する（treating）」、または「処置（treatment）」という用語には、（1）病理学的状態、障害、もしくは疾患を防ぐこと、すなわち、病理学的状態、障害、もしくは疾患の素因があり得るが、病理学的状態、障害、もしくは疾患の任意の症状をまだ経験していない対象において病理学的な状態、障害、または疾患の臨床症状を発生させないこと；（2）病理学的状態、障害、または疾患を阻害すること、すなわち、病理学的状態、障害、もしくは疾患、もしくはその臨床症状の発生を止めるかもしくは減少させること；または（3）病理学的状態、障害、もしくは疾患を緩和すること、すなわち、病理学的状態、障害、もしくは疾患、もしくはその臨床症状の退行を引き起こすことが含まれる。これらの用語は、予防、治療、および治癒も包含する。処置とは、病理学的状態、障害、もしくは疾患の症状を改善させるかまたはさもなければ有益に変化させる任意の方法を意味する。好ましくは、そのような処置を必要とする対象は、哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００９９】
II. SIRT3の活性化剤およびAceCS2の調整剤の同定および試験
本発明は、SIRT3の最初の細胞標的としてAceCS2を同定した。さらに、本発明は、SIRT3がインビトロおよびインビボでAceCS2を脱アセチル化するということも開示する。さらに、 AceCS2のアセチル化状態が、AceCS2の酵素活性、すなわち、アセテート、ATP、およびCoAを基質として用いて、アセチル-CoAおよびAMPを生成することを決定するということを本明細書に記載する。本明細書に記載された知見に基づき、本発明者らは、SIRT3のレベルまたは活性を増加させる薬剤、およびAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための種々の方法を考案した。
【０１００】
SIRT3を活性化する薬剤またはAceCS2を調整する薬剤を、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載されている方法を用いて同定する。多数の異なるスクリーニングプロトコルを利用して、SIRT3のレベルもしくは活性を増加させる薬剤またはAceCS2のレベルもしくは活性を調整する薬剤を同定することができる。「同定」および「スクリーニング」という用語は、本明細書で互換的に用いられる。
【０１０１】
好ましいのは、本ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を選択的に増加させるか、選択的に活性化するか、または選択的に調整する薬剤である。したがって、ある態様において、本明細書に記載されたような本処置方法での使用に好適であり、かつ（i）SIRT3のレベルもしくは活性を増加させるかまたは（ii）AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤は、それぞれ、SIRT3の選択的活性化剤またはAceCS2の選択的調整剤である。したがって、SIRT3の選択的活性化剤である薬剤は、例えば、その他のサーチュインを含むその他の酵素をSIRT3についてのIC50で実質的に阻害または活性化しない薬剤であり、該薬剤は、別のサーチュインの酵素活性の約5％を上回る、約10％を上回る、または約25％を上回る阻害または活性化を結果的にもたらさない。さらに、AceCS2の選択的調整剤である薬剤は、例えば、その他のAMP形成酵素を含むその他の酵素をAceCS2についてのIC50で実質的に阻害または活性化しない薬剤であり、該薬剤は、その他のAMP形成酵素の約5％を上回る、約10％を上回る、または約25％を上回る阻害または活性化を結果的にもたらさない。
【０１０２】
本発明のある態様において、スクリーニングプロトコルをインビトロで用いる。その他の好ましい態様において、スクリーニングプロトコルを細胞、特に哺乳類細胞で、および好ましくはヒト細胞で用いることができる。本発明のスクリーニング法での使用のために特に好ましい細胞は、心臓細胞、筋肉細胞、または脳細胞である。
【０１０３】
本発明の方法で用いる本ポリペプチドは、天然のポリペプチドまたは組換えポリペプチドであってもよい。ある態様において、本ポリペプチドは、SIRT3関連ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドである。
【０１０４】
本明細書に記載されたように、本方法での使用のためのSIRT3またはAceCS2ポリペプチドは、ヒト、マウス、またはラットを含むがこれらに限定されない様々な種由来であることができる。好ましいSIRT3およびAceCS2ポリペプチドは、ヒトSIRT3およびAceCS2ポリペプチドである。
【０１０５】
本明細書にさらに記載されたように、SIRT3またはAceCS2ポリペプチドは、全長のSIRT3もしくはAceCS2またはその断片もしくはドメインであってもよい。さらに、SIRT3およびAceCS2関連ポリペプチド、SIRT3およびAceCS2ホモログ、SIRT3およびAceCS2アイソフォーム、またはSIRT3およびAceCS2オルソログを、本発明の方法の実施、および組成物に用いることができる。本発明の好ましいAceCS2ポリペプチド断片は、配列
2009542195.tif 000002
を含む（図3A）。その他の好ましい態様において、AceCS2ポリペプチドは、アセチル化リジン（acK642）を有する配列
2009542195.tif 000003
または
2009542195.tif 000004
を含む。
【０１０６】
本発明のアッセイには通常、1つまたは複数の対照が含まれる。したがって、被検試料は候補薬剤を含み、かつ対照試料は、候補薬剤を除く被検試料の全ての構成要素を有する。通常、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度で並行して検査し、様々な濃度に対する差次的な応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの1つが、陰性対照、すなわち、ゼロ濃度のまたは検出レベルより下の対照としての役割を果たす。
【０１０７】
当業者が理解するように、スクリーニングアッセイは、本ポリペプチド以外の、種々の試薬を含んでもよい。これらの試薬には、本明細書中の実施例に記載されかつ当技術分野で公知であるような緩衝剤、塩、安定化剤、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などが含まれる。
【０１０８】
本明細書に記載されたようなSIRT3のレベルもしくは活性を増加させるための候補薬剤、またはAceCS2のレベル、アセチル化、もしくは活性を調整する候補薬剤を、本明細書に記載されたような種々のアッセイを用いて同定、試験、および検証することができる。これらのアッセイには、例えば、（i）ノーザンブロットアッセイ、（ii）インサイチューハイブリダイゼーション、（iii）ウェスタンブロットアッセイ、（iv）免疫沈降アッセイ、（v）免疫組織化学、（vi）細胞に基づくアッセイ、および（vii）インビボアッセイなどが含まれるがこれらに限定されない。インビトロアッセイは、本明細書にさらに記載されたような精製SIRT3および/もしくはAceCS2ポリペプチドまたはSIRT3および/もしくはAceCS2ポリペプチドを含む多タンパク質複合体を用いてもよい。
【０１０９】
本ポリペプチドの活性を所望の程度まで増加または減少させる薬剤をさらなる検討のために選択し、細胞による利用可能性、細胞毒性、生体適合性などについて評価してもよい。
【０１１０】
トリパンブルー色素排除、MTT（[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2H-臭化テトラゾリウム]）アッセイなどのような、周知のアッセイを用いて、アッセイで用いる細胞に対して候補薬剤が示し得る任意の細胞毒性活性について候補薬剤を評価する。細胞毒性活性を示さない薬剤または有意な細胞毒性活性を示さない薬剤が好ましい。
【０１１１】
ひとたび候補薬剤が本発明のスクリーニング法の1つで同定され、かつ本発明の方法、組成物、またはキットで用いられれば、それは、候補薬剤ではなく、薬剤または生物学的に活性な薬剤と典型的に称される。
【０１１２】
幾つかの態様において、特に興味深いのは、（i）SIRT3活性を増加させるか、（ii）細胞内のSIRT3ポリペプチドのレベルを増加させるか、または（iii）細胞内のSIRT3 mRNAのレベルを増加させる薬剤である。同様に特に興味深いのは、（i）AceCS2活性を増加させるか、（ii）細胞内のAceCS2ポリペプチドのレベルを増加させるか、または（iii）細胞内のAceCS2 mRNAのレベルを増加させる薬剤である。そのような薬剤は、異常な高レベルのアセテートまたは異常な低レベルのアセチル-CoAを特徴とする病理学的状態、例えば、II型糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、および肥満を処置するのに有用である。
【０１１３】
幾つかの態様において、特に興味深いのは、（i）AceCS2活性を減少させるか、（ii）細胞内のAceCS2ポリペプチドのレベルを減少させるか、または（iii）細胞内のAceCS2 mRNAのレベルを減少させる薬剤である。そのような薬剤は、異常な高レベルのアセチル-CoAを特徴とする病理学的状態を処置するのに有用である。
【０１１４】
A. SIRT3を活性化する薬剤
一般的に言って、SIRT3のレベルまたは活性、好ましくはSIRT3のデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するためのスクリーニング法は、種々の薬剤をスクリーニングする工程を伴う。スクリーニング法は通常、（a）候補薬剤を（i）SIRT3および/もしくはAceCS2と、（ii）SIRT3および／もしくはAceCS2を含む生物学的試料と、または（iii）SIRT3および／もしくはAceCS2を発現する哺乳類細胞と接触させる工程；ならびに（b）候補薬剤の存在下でSIRT3のレベルもしくは活性および／またはAceCS2のレベルもしくは活性をアッセイする工程を含む。好適な対照（例えば、候補薬剤の非存在下のSIRT3、候補薬剤の非存在下のSIRT3を含む生物学的試料、または候補化合物の非存在下でSIRT3を発現する哺乳類細胞）におけるSIRT3の活性と比較して測定したSIRT3のレベルまたは活性の増加は、候補薬剤がSIRT3の活性を活性化するということを示すものである。
【０１１５】
1つの局面において、スクリーニング法は、候補薬剤をスクリーニングして、SIRT3のレベルまたは活性を増加させる薬剤を同定する工程を伴う。「SIRT3のレベルまたは活性を増加させる」という用語は、好適な対照と比較した場合の、SIRT3ポリペプチド、SIRT3核酸、またはSIRT3活性、例えば、SIRT3デアセチラーゼ活性の測定されたレベルの増加を包含する。
【０１１６】
1つの局面において、本発明は、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）SIRT3ポリペプチドおよびAceCS2ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程、ならびに（b）該細胞内のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる候補薬剤が同定される。
【０１１７】
本発明の別の局面において、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を同定するための方法は、（a）アッセイ混合物中のSIRT3ポリペプチドおよびアセチル化AceCS2ポリペプチドを候補薬剤と接触させる工程、ならびに（b）該アッセイ混合物中のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる候補薬剤が同定される。候補薬剤で処理していないアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2の第二のレベルと比較したアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2の第一のレベルの減少は、SIRT3ポリペプチドのレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を示している。
【０１１８】
好ましい態様において、アッセイ混合物はNAD+を含む。
【０１１９】
細胞内またはアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果を決定する工程を種々の方法で行なうことができる。好ましい態様において、この工程は、本明細書に記載されたようなアセチル化AceCS2に特異的な抗体を用いる免疫学的アッセイを含む。候補薬剤の存在下でのアセチル化AceCS2ポリペプチドの減少は、SIRT3を活性化する薬剤を示している。
【０１２０】
本発明の別の好ましい態様において、AceCS2は、標識アセチル基、好ましくは14C-標識アセチル基などの、標識を含む。したがって、本態様において、標識AceCS2ポリペプチドからの14C-標識アセチル基の放出を測定することによって、細胞内またはアッセイ混合物中のアセチル化AceCS2のレベルに対する候補薬剤の効果を決定する工程を行なう。放出された14C標識を、例えば、クロマトグラフィー、次いでシンチレーション計数によって、慣例的に測定することができる。候補薬剤の存在下での放出された14C標識の増加は、SIRT3を活性化する薬剤を示している。
【０１２１】
SIRT3のレベルまたは活性を増加させる薬剤を同定するための方法は、任意で、候補薬剤の構造または配列を同定する工程を含む。
【０１２２】
対象となる候補薬剤は、好適な対照、好ましくは候補薬剤の非存在下での対照と比べて、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約500％、またはそれを上回って、SIRT3のレベルまたは活性を増加させる薬剤である。
【０１２３】
B. アセチル-CoAシンセターゼ2を調整する薬剤
本明細書においてAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性の調整剤と称される、阻害剤および活性化剤を、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載された方法を用いて同定する。多数の異なるスクリーニングプロトコルを利用して、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定することができる。「調整する」という用語は、好適な対照と比較した場合のAceCS2の測定されたレベル、アセチル化状態、または活性の増加または減少を包含する。好ましいのは、AceCS2の活性化剤である。しかしながら、ある態様において、AceCS2を阻害することが望ましい場合がある。
【０１２４】
一般的に言って、スクリーニング法は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するために種々の薬剤をスクリーニングする工程を伴う。本方法は通常、（a）候補薬剤を（i）AceCS2と、（ii）AceCS2を含む生物学的試料と、または（iii）AceCS2を発現する哺乳類細胞と接触させる工程；および（b）候補薬剤の存在下でAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性をアッセイする工程を含む。好適な対照（例えば、候補薬剤の非存在下におけるAceCS2、候補薬剤の非存在下におけるAceCS2を含む生物学的試料、または候補化合物の非存在下におけるAceCS2を発現する哺乳類細胞）におけるAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性と比較して測定したレベル、アセチル化状態、または活性の増加または減少は、候補薬剤がAceCS2レベル、アセチル化状態、または活性を調整するということを示すものである。
【０１２５】
1. アセチル-CoAシンセターゼ2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤
本発明の1つの局面において、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程、および（b）該細胞内のアセチル化AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する候補薬剤が同定される。
【０１２６】
本発明の別の局面において、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤を同定するための方法は、（a）アッセイ混合物中のAceCS2ポリペプチドを候補薬剤と接触させる工程、および（b）該アッセイ混合物中のAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、または活性を調整する候補薬剤が同定される。
【０１２７】
好ましい態様において、細胞またはアッセイ混合物は、AceCS2ポリペプチドのための基質を含む。好ましい基質は、標識し得るアセテートである。そのような態様において、AceCS2の活性に対する候補薬剤の効果を決定する工程は、AceCS2によって合成されるアセチル-CoAおよびAMPのレベルを測定する工程を含んでもよい。
【０１２８】
AceCS2の好ましい活性は、アセテート、ATP、およびCoAの、アセチル-CoAおよびAMPへの酵素的変換である。したがって、1つの局面において、本発明は、AceCS2酵素活性を調整する候補薬剤を同定するための方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドを基質の存在下で候補薬剤と接触させる工程、および（b）AceCS2酵素活性をアッセイし、AceCS2酵素活性を調整する候補薬剤を同定する工程を含む。その結果、AceCS2の酵素活性を調整する候補薬剤が同定される。
【０１２９】
好ましい基質は、アセテート、ATP、および/またはCoAである。AceCS2酵素活性を決定するためのアッセイは、本明細書に記載されている。
【０１３０】
AceCS2のレベルを調整する薬剤には、（i）例えば、AceCS2遺伝子発現を活性化または阻害することによって、AceCS2 mRNAレベルを調整する薬剤、および（ii）AceCS2ポリペプチドレベルを調整する薬剤が含まれる。mRNAおよびポリペプチドのレベルを決定するための方法は、本明細書で提供されている。
【０１３１】
2. アセチル-CoAシンセターゼ2に結合する薬剤
本発明はまた、アセチル-CoAシンセターゼ2（AceCS2）に結合する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の1つの局面において、AceCS2ポリペプチドに結合する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドを発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程、および（b）候補薬剤がAceCS2に結合するかどうかを判定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドに結合する候補薬剤が同定される。
【０１３２】
本発明の別の局面において、AceCS2ポリペプチドに結合する薬剤を同定するための方法は、（a）アッセイ混合物中のAceCS2ポリペプチドを候補薬剤と接触させる工程、および（b）候補薬剤がAceCS2に結合するかどうかを判定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドに結合する候補薬剤が同定される。
【０１３３】
本発明の本方法を実施するのに有用なAceCS2ポリペプチドは、天然のAceCS2ポリペプチドまたは組換えによって産生されたAceCS2である。
【０１３４】
候補薬剤とAceCS2ポリペプチドとの結合を、本明細書に記載されておりかつ当技術分野で公知であるような種々の方法を用いて検出することができる。
【０１３５】
AceCS2ポリペプチドを、候補薬剤との接触の前に固体支持体に結合させてもよい。本ポリペプチドと固体支持体とのカップリング、固体支持体、および本発明のこの方法でのそれらの使用は、本明細書に記載されている。
【０１３６】
3. AceCS2とSIRT3との間の相互作用を調整する薬剤
本発明者らは、AceCS2がSIRT3と相互作用するということを示している。したがって、本発明はまた、AceCS2ポリペプチドとSIRT3ポリペプチドとの間の相互作用を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。
【０１３７】
本発明の1つの局面において、AceCS2ポリペプチドとSIRT3ポリペプチドとの間の相互作用を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドおよびSIRT3ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程、ならびに（b）AceCS2とSIRT3ポリペプチドの間の相互作用に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドとSIRT3ポリペプチドの間の相互作用を調整する候補薬剤が同定される。
【０１３８】
本発明の別の態様において、AceCS2ポリペプチドとSIRT3ポリペプチドとの間の相互作用を調整する薬剤を同定するための方法は、（a）AceCS2ポリペプチドおよびSIRT3ポリペプチドを含むアッセイ混合物と候補薬剤とを接触させる工程、ならびに（b）AceCS2とSIRT3ポリペプチドとの間の相互作用に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドとSIRT3ポリペプチドとの間の相互作用を調整する候補薬剤が同定される。
【０１３９】
4. アセチル-CoAシンセターゼ2と多タンパク質複合体との会合を調整する薬剤
本発明者らは、AceCS2がSIRT3を含む多タンパク質複合体を形成するということを示した（例えば、実施例11、図9）。したがって、本発明はまた、AceCS2と多タンパク質複合体との会合を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。好ましくは、多タンパク質複合体はSIRT3ポリペプチドを含む。
【０１４０】
本発明の1つの局面において、AceCS2と多タンパク質複合体との会合を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドおよびSIRT3ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程、ならびに（b）AceCS2とSIRT3ポリペプチドを含む多タンパク質複合体との会合に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、AceCS2ポリペプチドと多タンパク質複合体との会合を調整する候補薬剤が同定される。
【０１４１】
本発明の別の局面において、AceCS2ポリペプチドとAceCS2ポリペプチドおよび少なくとも1つの第二のポリペプチドを含む多タンパク質複合体との会合を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。本方法は、（a）AceCS2ポリペプチドおよび第二のポリペプチドを含むアッセイ混合物と候補薬剤とを接触させる工程、ならびに（b）該アッセイ混合物中のAceCS2ポリペプチドを多タンパク質複合体との会合に対する候補薬剤の効果がある場合、該効果を決定する工程を含む。その結果、多タンパク質複合体へのAceCS2ポリペプチドの会合を調整する候補薬剤が同定される。
【０１４２】
本方法の好ましい態様において、第二のポリペプチドはSIRT3ポリペプチドである。
【０１４３】
本発明の別の好ましい態様において、AceCS2は、本明細書に記載されたような、Flag、ヘマグルチニン（HA）、または6XHis-タグ（SEQ ID NO:13）などの、エピトープタグを含む。その他の態様において、SIRT3ポリペプチドは、エピトープタグを含む。エピトープタグは、これらのタグに付着したポリペプチドの容易な検出および精製を可能にする。検出および精製を、抗Flag抗体、抗HA抗体、または抗6XHis抗体、および当技術分野で公知の慣例的な方法を用いて行なう。
【０１４４】
アッセイ混合物中のAceCS2と多タンパク質複合体との会合に対する候補薬剤の効果を決定する工程は、種々の方法を用いて行なうことができる。好ましい方法は、本明細書に記載されたようなカラムクロマトグラフィーまたは免疫沈降である。本方法において、抗AceCS2などの抗体を用いて、AceCS2およびそれに結合する任意のその他のポリペプチドを免疫沈降する。AceCS2に結合するポリペプチド、したがってAceCS2と多タンパク質複合体を形成するポリペプチドを、例えば、SDS-PAGE、マススペクトロメトリー、または免疫ブロッティングによって可視化することができる。SIRT3ポリペプチドとAceCS2との結合を、抗SIRT3抗体を用いて決定することができる。
【０１４５】
AceCS2と多タンパク質複合体との会合を調整する薬剤を同定するための方法を用いて、AceCS2に結合するSIRT3以外の細胞タンパク質を同定することもできる。例えば、AceCS2またはエピトープタグ付きAceCS2を細胞から免疫沈降する抗体を用いて、AceCS2に結合する細胞ポリペプチドを検出および精製することができる。AceCS2に結合するポリペプチドを、例えば、SDS-PAGEまたはマススペクトロメトリーで検出し、本明細書に記載されておりかつ当技術分野で公知であるようなペプチドフィンガープリンティングでさらに同定してもよい。本方法を用いて同定し得るそのようなポリペプチドの1つは、AceCS2ポリペプチドをアセチル化するアセチルトランスフェラーゼポリペプチドである。
【０１４６】
好ましい態様において、（i）AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整するか、（ii）AceCS2ポリペプチドに結合するか、（iii）AceCS2と多タンパク質複合体との会合を調整するか、または（iv）AceCS2の細胞局在を調整するための薬剤は、SIRT3ポリペプチドである。SIRT3ポリペプチドは、天然のSIRT3ポリペプチドまたはその断片であってもよい。SIRT3ポリペプチドはまた、組換えによって発現されたSIRT3ポリペプチドまたはその断片であってもよい。さらに、SIRT3ポリペプチドは、SIRT3関連ポリペプチドまたはその断片であってもよい。
【０１４７】
5. アセチル-CoAシンセターゼ2の細胞局在を調整する薬剤
本発明者らは、AceCS2およびSIRT3がミトコンドリアに局在するということを本明細書で示している。AceCS2を脱アセチル化する際のSIRT3の重要な役割のゆえに、ミトコンドリアへのAceCS2および/またはSIRT3の局在を調整することは、AceCS2酵素活性を制御するのに重要である可能性がある。
【０１４８】
したがって、本発明の別の局面において、SIRT3ポリペプチドまたはAceCS2ポリペプチドの細胞局在を調整する薬剤を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、（a）SIRT3ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドを発現する細胞と候補薬剤とを接触させる工程、ならびに（b）SIRT3ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドの細胞局在を決定する工程であって、SIRT3ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドの細胞局在を調整する薬剤を同定する、工程を含む。
【０１４９】
好ましい薬剤は、SIRT3ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドのミトコンドリアへの局在を増加させる薬剤である。SIRT3ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドのミトコンドリアへの局在を増加させることは、所望の細胞内位置における、SIRT3ポリペプチドおよび/またはAceCS2ポリペプチドの長期にわたる保持を含む。
【０１５０】
SIRT3またはAceCS2ポリペプチドの細胞局在を当技術分野で公知の種々の方法で決定することができる。好ましい方法は、抗SIRT3抗体および抗AceCS2抗体を用いた免疫組織化学または免疫ブロッティングによるミトコンドリア画分の解析である（例えば、図1および対応する実施例を参照されたい）。
【０１５１】
（i）AceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、もしくは活性、（ii）AceCS2ポリペプチドとの結合、（iii）AceCS2ポリペプチドとSIRT3ポリペプチドとの間の相互作用、（iv）AceCS2ポリペプチドと多タンパク質複合体との会合、または（v）AceCS2ポリペプチドの細胞局在に対する候補薬剤の効果を、本明細書に記載されておりかつ当技術分野で公知であるような種々の方法を用いて決定することができる。
【０１５２】
対象となる候補薬剤は、好適な対照、好ましくは候補薬剤の非存在下の対照と比べて、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約500％、またはそれを上回ってAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤である。
【０１５３】
C. 精製タンパク質または多タンパク質複合体を用いたアッセイ
一般的な活性化剤または阻害剤に対して選択的なSIRT3活性化剤または選択的なAceCS2調整剤（活性化剤もしくは阻害剤）を同定するためのアッセイを、細胞に基づく形式かまたは無細胞形式で実施してもよい。例えば、アッセイは、本ポリペプチドまたは本核酸のレベルまたは活性を活性化することができる条件下で本ポリペプチドまたは本核酸を被検薬剤とインキュベートする（または接触させる）工程、および被検薬剤の非存在下で示される活性化のレベルと比較した被検薬剤の存在下での活性化のレベルをモニタリングするまたは決定する工程を含む。
【０１５４】
AceCS2は、天然のAceCS2または組換えのAceCS2であることができる。また、SIRT3は、天然のSIRT3または組換えのSIRT3であることができる。天然のAceCS2またはSIRT3を、例えば、ヒトもしくはマウスの組織から、または例えば、ヒトもしくはマウスの細胞から精製することができる。組換えのAceCS2およびSIRT3を当技術分野で公知であるような任意の好適な発現システム、例えば、宿主細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞からの組換えタンパク質の精製から精製することができる。
【０１５５】
AceCS2およびSIRT3を、例えば、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法（immunopurification）、硫酸アンモニウムを用いる選択的な沈殿、およびその他を含むがこれらに限定されない標準的な技術で、実質的な純粋にまで精製することができる。
【０１５６】
本発明のある態様において、スクリーニング法および試験アッセイは、（i）少なくともAceCS2およびSIRT3、または（ii）AceCS2および第二のポリペプチド、または（iii）SIRT3および第二のポリペプチドを含む、多タンパク質複合体を用いる工程を含む。単離されたタンパク質に関して、そのような多タンパク質複合体のタンパク質を、例えば、ヒトもしくはマウスの組織、ヒトもしくはマウスの細胞から得ることができるか、または組換えによって調製することができる。組換えによって調製する場合、それらを本方法の1つで用いる前に、本タンパク質を典型的には多タンパク質複合体に会合させる。これは、当技術分野で公知の種々の方法を用いて行なうことができる。 
【０１５７】
インビトロアッセイのために、本ポリペプチドを精製してもよいが、精製は必須ではない。本タンパク質の精製を当技術分野で公知の方法を用いて行なう。細胞または宿主細胞からの本ポリペプチドの精製は、部分的であることができるが、標準的なSDS-PAGEで決定した場合に少なくとも90％純粋である本ポリペプチドが好ましい。
【０１５８】
D. 細胞に基づくアッセイ
SIRT3のレベルまたは活性を活性化するための候補薬剤およびAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤の同定および試験を、細胞に基づくアッセイを用いて行なうこともできる（例えば、実施例5、6、9、および11参照）。さらに、本明細書に記載されたような、大腸菌に基づくアッセイを、候補薬剤を同定および/または試験するのに用いることができる（実施例7、8、および12参照）。
【０１５９】
細胞に基づくアッセイにおいて、典型的には、哺乳類細胞などの真核細胞を用いる。ある態様において、酵母細胞を用いてもよい。細胞は、ドナーの生物学的試料から単離された初代細胞であることができる。あるいは、細胞は、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）によって利用可能にされているような確立された細胞株であることができる。
【０１６０】
本明細書に記載されたように（実施例参照）、細胞は、AceCS2発現コンストラクトまたはSIRT3発現コンストラクトなどの、発現コンストラクトを一過性にかまたは安定にトランスフェクトした細胞であることもできる。 
【０１６１】
E. インビボアッセイ
SIRT3のレベルまたは活性を活性化するための候補薬剤およびAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤の同定および試験を、インビボで行なうこともできる。この方法では、薬剤を動物、好ましくはマウスに投与し、血液試料または組織試料を薬剤の投与後の様々な時に動物から採取して、例えば、（i）アセチル-CoAレベル、（ii）ATPレベル、（iii）AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性、または（iv）SIRT3のレベルもしくは活性の存在について試験する。
【０１６２】
F. mRNAの検出
本明細書に記載された方法により同定された化合物、薬剤、またはアンタゴニストを試験およびアッセイするための方法は、本明細書で提供されており、かつ所与の候補薬剤、または小分子が本発明の方法を実施するのに有用であるかどうかを判定するための種々の承認された試験を伴う。本発明の方法は任意で、mRNAなどの核酸またはポリペプチドを検出する工程を含んでもよい。1つの態様において、そのような方法は、mRNA、好ましくはSIRT3 mRNAまたはAceCS2 mRNAを決定または検出する工程を含む。本明細書に記載された、ポリペプチドをコードするその他のmRNAを、以下の方法を用いて決定することもできる。特定の遺伝子のmRNA発現を評価する方法は当業者に周知であり、かつとりわけ、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイを含む。
【０１６３】
1. 直接的なハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて遺伝子転写物（mRNAまたはそれから作られたcDNA）のレベルを検出および/または定量化する方法は、当業者に公知である。例えば、ポリヌクレオチドの有無または数量を評価するための1つの方法は、ノーザンブロットを伴う。遺伝子発現レベルを、当技術分野で公知の技術、例えば、ドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNアーゼプロテクション、プロービングDNAマイクロチップアレイをプロービングすることなどによって解析することもできる（例えば、Cold Spring Harbor Laboratory Pressによって出版されたSambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, 「Molecular Cloning A Laboratory Manual」第2版, 1989を参照されたい）。
【０１６４】
2. 増幅に基づくアッセイ
別の態様において、増幅に基づくアッセイを用いて遺伝子の発現レベルを測定する。そのようなアッセイにおいて、核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、またはPCR）における鋳型として働く。定量的増幅において、増幅産物の量は、もとの試料中の鋳型の量に比例すると考えられる。適当な対照との比較によって、試料中のmRNAのレベルの測定が提供される。定量的増幅の方法は、当業者に周知である。定量的PCRについての詳細なプロトコルは、例えば、Innis et al., (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.で提供されている。
【０１６５】
1つの態様において、TaqManに基づくアッセイを用いてポリヌクレオチドを定量化する。TaqManに基づくアッセイは、5'蛍光色素および3'消光剤を含む蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いる。プローブは、PCR産物にハイブリダイズするが、3'末端の遮断剤が原因でそれ自体を伸張させることができない。PCR産物がその後のサイクルで増幅された場合、ポリメラーゼ、例えば、AmpliTaq の5'ヌクレアーゼ活性が、TaqManプローブの切断を結果的にもたらす。この切断は、5'蛍光色素と3'消光剤を分離させ、それによって増幅の関数としての蛍光の増加を結果的にもたらす（例えば、Heid et al., 1996, Genome Res 6(10):986-94; Morris et al., 1996, J Clin Microbiol 34(12):2933-6参照）。
【０１６６】
その他の好適な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace, 1989, Genomics 4:560; Landegren et al., 1988, Science 241:1077;およびBarringer et al., 1990, Gene 89:117参照）、転写増幅（Kwoh et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:1173）、自己持続的配列複製（Guatelli et al., 1990, Proc Nat Acad Sci USA 87: 1874）、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCRなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６７】
G. ポリペプチドの検出
上に記載した本発明の方法は、任意で、AceCS2またはSIRT3ポリペプチドなどのポリペプチドを決定または検出する工程を含んでもよい。本明細書に記載されたその他のポリペプチドを、以下の方法を用いて決定することもできる。
【０１６８】
AceCS2、SIRT3、およびその他のものなどのポリペプチドを決定または検出する工程を、生物学的試料、細胞、器官で、またはヒトおよび非ヒト動物を含む動物でそれぞれのポリペプチドを検出する工程を含むがこれらに限定されない種々のやり方で行なってもよい。
【０１６９】
ポリペプチドの発現レベルを、本明細書にさらに記載されているかまたは当業者によって知られているような親和性捕捉（affinity capture）、マススペクトロメトリー、従来の免疫アッセイおよび免疫沈降アッセイ、PAGE、ウェスタンブロッティング、RIA、またはHPLCを含むがこれらに限定されない種々の方法で決定してもよい（例えば、図1、および3〜10ならびに対応する実施例を参照されたい）。
【０１７０】
この目的に利用することができる検出パラダイムには、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリーおよびアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡、ならびに、高周波方法、例えば、多極共鳴スペクトロスコピーが含まれる。共焦点および非共焦点の両方の顕微鏡検査に加えて、光学的方法の実例となるのは、蛍光、発光、化学発光、吸収、反射率、透過率、および複屈折率または屈折率の検出である（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、格子結合器（grating coupler）導波管法、または干渉法）。
【０１７１】
例えば、アセチル化AceCS2ペプチドに対して作製されかつ本明細書に記載された抗AceCS2抗体などの、抗体を用いて、候補薬剤の非存在下または存在下でのAceCS2ポリペプチドのアセチル化状態の調整を評価することができる（例えば、図5Bおよび対応する実施例参照）。本明細書に記載されたその他の抗体は、AceCS2発現のレベルまたはSIRT3発現のレベルを検出するのに有用である。
【０１７２】
H. 酵素活性の検出
1. SIRT3デアセチラーゼ活性の検出
サーチュインデアセチラーゼ活性を検出するための様々なアッセイが説明されている。例えば、Imaiら、およびFryeは、ヒストンを基質として用いる酵母Sir2およびヒトSIRT2のNAD依存的デアセチラーゼ活性を検出するためのアッセイを報告した（Imai et al., 2000, Nature 403(6771):795-800; Frye 1999, Biochem Biophys Res Comm 260:273-279）。しかしながら、ImaiらもFryeも、細胞のポリペプチドに対する、サーチュインデアセチラーゼ活性を試験していない。
【０１７３】
本発明は、SIRT3によってインビトロおよびインビボの両方で脱アセチル化される、最初の細胞性SIRT3標的ポリペプチドである、AceCS2を説明する。本明細書にさらに記載されたように、AceCS2ポリペプチドは、SIRT3と会合している。したがって、本発明の好ましい態様において、本明細書に記載されたように、SIRT3ポリペプチドの酵素活性を、基質AceCS2の存在下で決定する。このアッセイを用いて、候補薬剤の非存在下または存在下でSIRT3デアセチラーゼ活性を評価する。
【０１７４】
SIRT3脱アセチル化によるAceCS2の活性を、例えば、アセチル化AceCS2および脱アセチル化AceCS2の両方を検出する抗AceCS2抗体ならびにアセチル化AceCS2に特異的な抗体を用いた免疫ブロッティングによってモニタリングすることができる。あるいは、SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化活性を、本明細書に記載されたようなAceCS2酵素活性を決定することによってモニタリングすることもできる。また、本明細書に記載されたように、LC-MS/MS解析を用いてAceCS2のアセチル化状態を決定することができる（例えば、図4および6；実施例6および8）。
【０１７５】
2. AceCS2酵素活性の検出
AceCS2の活性を試験するためのアッセイは、本明細書に記載されており（例えば、実施例1参照）、かつ当技術分野で公知である。AceCS2酵素活性を、例えば、同位体法または分光光度法で決定することもできる（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。
【０１７６】
同位体法のための標準的な反応混合物は、0.2 mLの全容量中に100 mM Tris-HCl、pH 8.5、10 mM MgCl2、10 mM ATP、1 mM CoA、および10 mM [l4C]アセテート（940 dpm/nmol）を含む。37℃で1分のプレインキュベーションの後、AceCS2の添加によって反応を開始させる。30分のインキュベーションの後、50 μlの氷冷した氷酢酸を添加することによって反応を終結させる。放射能の測定のために、一片のクロマトグラフィー媒体（ITLC-SG型、Gelman Sciences）の上へのスポッティングおよび水で飽和したエーテル／ギ酸（7:1）による徹底的な洗浄によって、反応産物（[l4C]アセチル-CoA）を単離する（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276: 11420-11426）。
【０１７７】
分光法は、アデニル酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼを用いたAMPの形成に基づく。分光光度法のための標準的な反応混合物は、1mLの全容量中に100 mM Tris-HCl、pH 8.5、1 mM DTT、15 mM MgCl2、10 mM ATP、0.25 mM ホスホエノールピルビン酸カリウム、1 mM アセテート、0.3 mM NADH, 80ユニットのアデニル酸キナーゼ（Roche Molecular Biochemicals）、17ユニットの乳酸デヒドロゲナーゼ（Roche Molecular Biochemicals）、および6ユニットのピルビン酸キナーゼ（Roche Molecular Biochemicals）を含む。37℃で1分のプレインキュベーションの後、24 μLの25 mM CoAを添加することによって反応を開始させる。NADHの酸化を記録分光光度計で340 nmで測定する。1 molのADPの形成は、2 molのNADHの酸化に対応する（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。その他の好適な分光法が当技術分野で公知である（Methods in Enzymology (Academic Press, 第1巻, 585-591ページ)中のJones & Lipmann, 1955; Barak et al., 2004, J Mol Biol 342:383-401）。
【０１７８】
AceCS2酵素活性を検出するための別の有用なアッセイは、[14C]アセテートと細胞のインキュベーション、ならびにそれに続くCO2および脂質に入った14Cおよび脂質の解析である（Fujiino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。
【０１７９】
I. ツーハイブリッドアッセイ
本発明のスクリーニング法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを用いてもよい（「MATCHMAKER Two-Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one-Hybrid system」(Clontech);「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(Stratagene); Dalton and Treisman, 1992, Cell 68: 597-612; Fields and Sternglanz, 1994, Trends Genet 10:286-92も参照されたい）。
【０１８０】
ツーハイブリッドシステムにおいて、例えば、SIRT3、好ましくは、SIRT3ポリペプチドを、SRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させかつ酵母細胞で発現させる。SIRT3ポリペプチドに結合するAceCS2ポリペプチドをVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させかつ同様に被検化合物の存在下で酵母細胞で発現させる。あるいは、SIRT3ポリペプチドに結合するAceCS2ポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させてもよく、かつSIRT3ポリペプチドをVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させてもよい。2つのポリペプチドの結合によって、レポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子として、例えば、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを、HIS3遺伝子の他にさらに用いることができる。
【０１８１】
SIRT3またはAceCS2に結合しない候補薬剤は、レポーター遺伝子の活性化に影響を及ぼさない。しかしながら、SIRT3とAceCS2との結合を増加させる薬剤は、レポーター遺伝子のより強い活性化を結果的にもたらす。逆に、SIRT3とAceCS2の間の結合を阻害する候補薬剤は、レポーター遺伝子のより少ない活性化をもたらすかまたは活性化をもたらさない。
【０１８２】
J. 2分子間の相互作用の検出
AceCS2およびSIRT3、AceCS2および候補薬剤、またはSIRT3および候補薬剤などの、2分子間の相互作用を、例えば、少なくとも1つの分子が蛍光標識されている蛍光アッセイを用いて検出することもできる。そのようなアッセイの1つの例として、蛍光エネルギー転移（蛍光共鳴エネルギー転移を表すFETまたはFRET）が含まれる（例えば、Lakowicz et al., 米国特許第5,631,169号; Stavrianopoulos et al., 米国特許第4,868,103号を参照）。放出された蛍光エネルギーが第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、それが今度は吸収されたエネルギーが原因で蛍光を発することができるように、第一の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識を選択する。代替的に、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の自然蛍光エネルギーを単に利用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」の分子標識と区別され得るように、異なる波長の光を放出する標識を選ぶ。標識間のエネルギー転移の効率は分子を隔てる距離に関連するので、分子間の空間的関係性を評価することができる。分子間で結合が起こる状況において、アッセイでの「アクセプター」分子標識の蛍光放出は最大であるべきである。FET結合事象を、当技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段によって（例えば、蛍光計を用いて）好都合に測定することができる。
【０１８３】
蛍光アッセイの別の例は、蛍光偏光（FP）である。FPのためには、わずか1つの構成要素が標識される必要があるだけである。結合相互作用を、標識された構成要素の分子サイズの変化によって検出する。サイズの変化は、溶液中の構成要素の回転速度を変化させ、かつFPの変化として検出される（例えば、Nasir et al., 1999, Comb Chem HTS 2:177-190; Jameson et al., 1995, Methods Enzymol 246:283; Seethala et al., 1998, Anal Biochem 255:257を参照）。蛍光偏光をマルチウェルプレートで、例えば、Tecan Polarion（商標）読み取り装置を用いてモニタリングすることができる（例えば、Parker et al., 2000, J Biomol Screen 5:77-88;およびShoeman, et al., 1999, Biochemistry 38:16802-16809参照）。
【０１８４】
別の態様において、タンパク質が標的分子に結合する能力または候補薬剤が本ポリペプチドに結合する能力を決定する工程を、リアルタイム生体分子相互作用解析（BIA）を用いて遂行することができる（例えば、Sjolander and Urbaniczky, 1991, Anal Chem 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:699-705参照）。「表面プラズモン共鳴」または「BIA」は、相互作用物のいずれも標識することなく、生体特異的な相互作用をリアルタイムで検出する（例えば、BIAcore）。（結合事象を示す）結合表面での質量の変化は、表面付近の光の屈折率（表面プラズモン共鳴（SPR）の光学的現象）の変化を結果的にもたらし、生物学的分子間のリアルタイムの反応の表示として用いることができる検出可能なシグナルを結果的にもたらす。
【０１８５】
K. コンピュータに基づくアッセイ
構造-活性相関（SAR）および構造に基づく設計原則を用いて、SIRT3のレベルもしくは活性を増加させるかまたはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤を同定することも可能である。SARは、少なくとも1つの関連性のあるアッセイにおいて、関連薬剤の活性に関する情報を提供する。対象となる薬剤の構造的特色と活性との間の相関を作成する。例えば、SIRT3ポリペプチドおよび／またはAceCS2ポリペプチドと相互作用する薬剤のファミリーについてSARを評価することによって、活性に必要とされる1つまたは複数の構造的特色を同定することが可能である場合もある。その後、これらの特色を変化させる薬剤のライブラリーを生成することができ、その後、ライブラリーをスクリーニングする。構造に基づく設計は、薬剤とSIRT3ポリペプチドおよび／またはAceCS2ポリペプチドなどといったその標的との物理的相互作用の構造モデルを決定する工程を含むことができる。構造モデルは、標的のアンタゴニストをどのようにして作製することができるかということを示すことができる。そのようなアンタゴニストは、寿命調節（lifespan regulation）を変化させる際に有用である可能性がある。
【０１８６】
SARおよび構造に基づく設計アプローチの両方を用いて、ファーマコフォアを同定することができる。ファーマコフォアは、薬物の発見および薬物リードの最適化において極めて有益でかつ有用な概念である。ファーマコフォアは、生物学的活性に不可欠な化学基の明確な3次元（3D）配置として定義される。薬学的活性分子は、有効であるために対象の体内で1つまたは複数の分子構造と相互作用しなければならず、かつ分子の所望の機能的特性はこれらの相互作用に由来するので、各々の活性化合物は、この相互作用が起こるのを可能にする化学基の明確な配置を含まなければならない。一般に記述子中心（descriptor center）と呼ばれる化学基を、（a）原子または原子の群；（b）疑似原子、例えば、環の中心、または分子の質量の中心；（c）ベクトル、例えば、原子対、孤立電子対方向、または定位から平面によって表すことができる。ひとたび製剤化されれば、ファーマコフォアを用いて、化学化合物のデータベースを、例えば、ファーマコフォアと適合する構造を有する化学化合物について検索することができる（例えば、米国特許第6,343,257号; Martin, 1992, J Med Chem 35, 2145-54参照）。データベース検索クエリーは、化学特性情報だけでなく、正確な幾何学的情報にも基づく。
【０１８７】
コンピュータに基づくアプローチは、データベース検索を用いて、一致する鋳型を見出すことができる（参照により本明細書に組み入れられる、Martin, 1992, J Med Chem 35:2145-54）。化合物の2-Dおよび3-Dデータベースを検索するための既存の方法が適用可能である。American Cyanamid（Pearl River, N.Y.）のLederleは、データベースの分子形状検索、3D検索、およびトレンドベクトル（trend-vector）を開発した。商業的販売業者およびその他の研究グループもまた、検索可能性を提供している（MACSS-3D, Molecular Design社 (San Leandro, Calif.); CAVEAT, Lauri, Gら, University of California (Berkeley, Calif.); CHEM-X, Chemical Design社 (Mahwah, N.J.)）。これらの検索用のソフトウェアを用いて、有意な化学的および幾何学的構造によって索引が付けられた潜在的な薬物化合物のデータベースを解析することができる（例えば、Standard Drugs File (Derwent Publications社, London, England)、Bielsteinデータベース (Bielstein Information, Frankfurt, GermanyまたはChicago)、およびChemical Registryデータベース (CAS, Columbus, Ohio)）。
【０１８８】
ひとたびファーマコフォアに一致する化合物が同定されれば、それを活性について、例えば、ポリペプチドとの結合についてならびに／またはポリペプチドの生物学的活性を調整すること、例えば、SIRT3ポリペプチドおよび／もしくはAceCS2ポリペプチドの酵素活性を増加させることについて、試験することができる。
【０１８９】
さらに、構造が、3つのクラスIII酵素、すなわち、大腸菌CobB（Zhao et al. 2004, J Mol Biol 337:731-741）、ならびに硫酸還元古細菌（A. fulgidus）サーチュインであるSir2-Af1（Min et al., 2001, Cell 105:269-279）およびSir2-Af2（Avalos, 2002, Mol Cell 10:523-535）の両方について決定されている。SIRT5に関して、結晶構造情報が、GenBankアクセッション番号：2FZQA、2FZQB、2B4YA、2B4YB、2B4YC、および2B4YDに寄託されている。その他の構造データが、Sir2-P53ペプチド-ニコチンアミド（GenBankアクセッション番号：1YC5）、Sir2af2-NAD-ADPリボース-ニコチンアミド（GenBankアクセッション番号：1YC2）、NAD+依存的なSir2ヒストンタンパク質デアセチラーゼ（GenBankアクセッション番号：1SZDおよび1SZC）によるニコチンアミド切断およびADP-リボース転移についての構造的基盤；Sir2酵素（GenBankアクセッション番号：1S7G）の機構および調節についての構造的基盤；ならびにヒトSIRT2ヒストンデアセチラーゼ（1J8F）について利用可能である。ロスマンフォールドの変種である、NAD結合ドメインならびにらせんモジュールおよび亜鉛結合モジュールから構成されたより小さいドメインを露出している、ヒトSIRT2の323アミノ酸触媒コアの1.7Å結晶構造が、Finninら（Finnin et al., 2001, Nat Struct Biol 8(7):621-5）によって報告された。Finninらはまた、2つのドメインの境界面での保存された大きい溝を説明し、これが触媒作用の部位である可能性が高いと示唆した。この大きい溝を横断して、らせんモジュールによって形成されるポケットがある。このポケットは、疎水性残基で満たされ、それは興味深いことに5つのSir2クラスの各々で保存されており、それがクラス特異的なタンパク質結合部位であるということを示唆している（Finnin et al. 2001, Nat Struct Biol 8(7):621-5）。
【０１９０】
Sir3と相互作用する、酵母Sir4のコイルドコイル二量体化モチーフの結晶構造が、GenBankアクセッション番号：1NYH_Aで提供されている。さらに、Changらは、Sir4のC末端内のコイルドコイル二量体化モチーフのX線構造を報告し、かつそれがSir3の二量体断片（残基464〜978）との安定な1:1複合体を形成するということを示した（その全体が参照により本明細書に組み入れられる；Chang et al., 2003, Structure 11(6):637-649）。さらに、Murphyらは、72残基のホモ二量体の平行コイルドコイルを露出しているSir4 CT断片（Sir4p 1217〜1358）の2.5Å解像度のX線結晶構造を提供した（GenBankアクセッション番号：1PL5Sおよび1PL5A;その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Murphy et al., 2003, J Mol Biol 334(4):769-80）。このデータの組を用いて、SIRT3ポリペプチドおよび／もしくはAceCS2ポリペプチドに結合するか、SIRT3ポリペプチドおよび／もしくはAceCS2ポリペプチドと相互作用するか、またはSIRT3ポリペプチドのレベルもしくは活性を増加させるかまたはAceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤を設計することができる。
【０１９１】
したがって、本発明の1つの局面において、SIRT3ポリペプチドおよび／もしくはAceCS2ポリペプチドの構造または1つもしくは複数のドメイン内にSIRT3および／もしくはAceCS2に対する相同性を示す別のサーチュインもしくはAceCS2ポリペプチドの構造を利用することによって、SIRT3ポリペプチドおよび／もしくはAceCS2ポリペプチドと相互作用するかまたはSIRT3ポリペプチドおよび／もしくはAceCS2ポリペプチドに結合する薬剤を同定する。
【０１９２】
したがって、重複する活性化のパターンを有する構造的に規定されたクラスIII酵素の同定は、哺乳類サーチュイン、特にSIRT3のための活性化剤を同定するための有用なツールを提供する。例えば、SIRT3はSIRT3活性化剤と共結晶化することができ、かつ複合体の3次元構造を決定することができる。その後、SIRT3活性化剤とSIRT3アミノ酸残基との間の相互作用および／または調整剤の結合部位の形状に関する情報をコンピュータモデリングプログラムに入力し、新規であってかつ潜在的により強力なSIRT3の調整剤を設計することができる。本開示を読んだ時に当業者によって理解されると考えられるように、AceCS2活性化剤および阻害剤をそのようなやり方で設計することができる。
【０１９３】
したがって、SIRT3ポリペプチドのレベルもしくは活性を活性化する候補薬剤のためのまたはAceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤のための別のアッセイは、コンピュータシステムを用いて、そのアミノ酸配列によってコードされた構造情報に基づいてSIRT3またはAceCS2の3次元構造を作成する、コンピュータ援用薬物設計を伴う。入力されたアミノ酸配列は、コンピュータプログラム中の予め確立されたアルゴリズムと直接的かつ能動的に相互作用し、タンパク質の二次、三次、および四次構造モデルを生み出す。その後、タンパク質構造のモデルを検討し、別のポリペプチドまたは候補薬剤に結合する能力を有する構造の領域を同定する。その後、これらの領域を用いて、SIRT3のレベルもしくは活性を活性化する活性化剤、またはAceCS2ポリペプチドのレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する調整剤を同定する。
【０１９４】
タンパク質の3次元構造モデルを、少なくとも10アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列またはSIRT3もしくはAceCS2をコードする対応する核酸配列をコンピュータシステムに入力することによって作成する。本明細書で提供した核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードする、タンパク質の一次配列またはサブ配列を表す。アミノ酸配列の少なくとも10残基（または10アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピュータキーボード、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスケット、磁気テープ、磁気カートリッジ、および磁気チップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）を含むがこれらに限定されない、コンピュータ読み取り可能基板、インターネットサイトによって配布される情報から、ならびにRAMにより、コンピュータシステムに入力する。その後、タンパク質の3次元構造モデルを、当業者に公知のソフトウェアを用いて、アミノ酸配列とコンピュータシステムの相互作用によって作成する。
【０１９５】
アミノ酸配列は、対象となるタンパク質の二次、三次、および四次構造を形成するのに必要な情報をコードする一次構造を表す。ソフトウェアは、一次配列がコードするあるパラメーターをもとに構造モデルを作成する。これらのパラメーターは「エネルギー項」と称され、主として静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接近可能表面、および水素結合を含む。二次エネルギー項には、ファンデルワールスポテンシャルが含まれる。生物学的分子は、累積的な様式でエネルギー項を最小化する構造を形成する。それゆえに、コンピュータプログラムは、二次構造モデルを創り出すために、一次構造またはアミノ酸配列によってコードされるこれらの項を用いている。
【０１９６】
その後、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造を、二次構造のエネルギー項に基づいて形成する。この時点の使用者は、タンパク質が膜結合型であるかまたは可溶型であるか、体内でのその位置、および例えば、細胞質、表面、または核といったその細胞内位置などの、さらなる変数を入力することができる。二次構造のエネルギー項に伴うこれらの変数を用いて三次構造のモデルを形成する。三次構造をモデリングする際、コンピュータプログラムは、二次構造の疎水性表面を同様のものと一致させ、かつ二次構造の親水性表面を同様のものと一致させる。
【０１９７】
ひとたび構造が作製されれば、潜在的な調整剤結合領域がコンピュータシステムによって同定される。潜在的な調整剤についての三次元構造を、本明細書に記載のように、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列または化合物の化学式を入力することによって生成する。その後、潜在的なリガンドの三次元構造をSIRT3またはAceCS2の三次元構造と比較して、SIRT3またはAceCS2上の結合部位を同定する。タンパク質と調整剤との間の結合親和性を、エネルギー項を用いて決定し、どの調整剤がタンパク質に対する結合を増強する可能性を有するかということを決定する。
【０１９８】
また、コンピュータシステムを用いて、本発明のSIRT3またはAceCS2ポリペプチドをコードする遺伝子の変異体、多型変異体、アレル、および種間ホモログをスクリーニングする。そのような変異を疾患状態または遺伝形質と関連させることができる。さらに、GeneChip（商標）および関連技術を用いて、変異体、多型変異体、アレル、および種間ホモログをスクリーニングすることもできる。ひとたび変種を同定すれば、診断アッセイを用いて、そのような変異した遺伝子またはアレル変異体遺伝子を有する患者、例えば、糖尿病患者または糖尿病、高コレステロール血症、高脂血症、もしくは肥満のリスクがある個体を同定することができる。そのようなSIRT3および／またはAceCS2遺伝子の同定は、SIRT3もしくはAceCS2の（またはSIRT3もしくAceCS2をコードする第一の核酸配列の）第一のアミノ酸配列の入力を受信する工程を伴う。配列を上記のようなコンピュータシステムに入力する。その後、第一の核酸またはアミノ酸配列を、第一の配列との実質的な同一性を有する第二の核酸またはアミノ酸配列と比較する。第二の配列を上記の方法でコンピュータシステムに入力する。ひとたび第一および第二の配列が比較されれば、配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸の相違が同定される。そのような配列は、様々なSIRT3またはAceCS2遺伝子におけるアレルの相違、ならびに疾患状態および遺伝形質と関連する変異を表す可能性がある。
【０１９９】
L. ハイスループットアッセイ
1つの好ましい態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的な治療化合物（潜在的な調整剤またはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドライブラリーを伴う。その後、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、本明細書に記載のような、1つまたは複数のアッセイでスクリーニングし、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このように同定される薬剤は、従来の「リード薬剤」としての役割を果たすことができるかまたはそれら自体潜在的な治療薬もしくは実際の治療薬として用いることができる。
【０２００】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当技術分野で周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175, Furka, 1991, Int J Pept Prot Res 37:487-493 (1991)、およびHoughton et al., 1991, Nature 354:84-88参照）が含まれるがこれらに限定されない。化学的多様性ライブラリーを作製するためのその他の化学的性質を用いることもできる。そのような化学的性質には、ペプトイド（例えば、PCT刊行物国際公開公報第91/19735号）、コードされたペプチド（PCT刊行物国際公開公報第93/20242号）、ランダムなバイオオリゴマー（例えば、PCT刊行物国際公開公報第92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド（Hobbs et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:6909-6913）などのダイバーソマー（diversomer）、ビニル性ポリペプチド（Hagihara et al., 1992, J Amer Chem Soc 114:6568）、グルコース骨格を持つ非ペプチド性ペプチドミメティック（Hirschmann et al., 1992, J Amer Chem Soc 114:9217-9218）、小化合物ライブラリーの類似有機合成物（Chen et al., 1994, J Amer Chem Soc 116:2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., 1993, Science 261:1303）、ならびに／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., 1994, J Org Chem 59:658）、核酸ライブラリー（Ausubel, Berger and Sambrook参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology 14(3):309-314およびPCT/US96/10287参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liang et al., 1996, Science, 274:1520-1522および米国特許第5,593,853号参照）、小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, January 18, 1993, 33ページ; イソプレノイド、米国特許第5,569,588号; チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号; ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号; モルフォリノ化合物、米国特許第5,506,337号; ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号など参照）が含まれるがこれらに限定されない。分子ライブラリーの合成のための方法のさらなる例は、当技術分野において、例えば、DeWitt et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91 :11422; Zuckemmann et al., 1994, J Med Chem 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261 : 1303; Carrell et al., 1994, Angew Chem Int Ed Engl 33:2059; Carell et al., 1994, Angew Chem Int Ed Engl. 33:2061; およびGallop et al., 1994, J Med. Chem 37:1233に見出すことができる。
【０２０１】
ハイスループットアッセイは多くの場合、調整剤のスクリーニングで用いられる。したがって、（i）SIRT3の活性化剤および（ii）AceCS2の調整剤を同定するためのハイスループットアッセイにおいて、1日に数千までの異なる候補薬剤またはリガンドをスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択した潜在的薬剤に対する別々のアッセイを行なうことができるか、または濃度もしくはインキュベーション時間効果を観測しようとする場合、5〜10ウェル毎に1つの薬剤を試験することができる。したがって、1つの標準的マイクロタイタープレートは、約100（例えば、96）の薬剤をアッセイすることができる。1536ウェルプレートを用いた場合、1つのプレートは、約100〜約1500の異なる薬剤を容易にアッセイすることができる。1日に数枚の異なるプレートをアッセイすることが可能であり；本発明の統合システムを用いて、約6,000〜20,000までの異なる薬剤についてのアッセイスクリーニングが可能である。つい最近、試薬操作に対するマイクロ流体アプローチが開発された。
【０２０２】
対象となる分子を、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合によって、例えば、タグによって、固体状態の成分に結合させることができる。タグは、種々の成分のいずれかであることができる。一般に、タグに結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、かつタグの付いた対象となる分子（例えば、SIRT3またはAceCS2）を、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に付着させる。
【０２０３】
文献で十分に説明された公知の分子相互作用に基づいて、多くのタグおよびタグ結合剤を用いることができる。例えば、タグが、天然の結合剤、例えば、ビオチン、プロテインA、またはプロテインGを有する場合、それを適当なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニューロアビジン、免疫グロブリンのFc領域など）と併せて用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤および適当なタグ結合剤を持つ分子に対する抗体も広く入手可能である（SIGMA Immunochemicals 1998カタログ SIGMA, St. Louis Mo参照）。
【０２０４】
同様に、任意のハプテン性または抗原性の化合物を適当な抗体と組み合わせて用いて、タグ／タグ結合剤対を形成することができる。何千もの特異的抗体が市販されており、かつ多くのさらなる抗体が文献で説明されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは一次抗体でありかつタグ結合剤は一次抗体を認識する二次抗体である。抗体-抗原相互作用に加えて、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどのような細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)参照）のアゴニストおよびアンタゴニストなどの、受容体-リガンド相互作用も、タグ／タグ結合剤対として適当である。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド、およびビタミンD；ペプチドを含む、様々な小さいリガンドの効果を仲介する）、薬物、レクチン、糖、核酸（直線状および環状両方のポリマー配置）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、ならびに抗体は、様々な細胞受容体と全て相互作用することができる。
【０２０５】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカルボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートなどといった合成ポリマーも、適当なタグまたはタグ結合剤を形成することができる。本開示を再検討する時に当業者にとって明白であると考えられるように、多くのその他のタグ／タグ結合剤対も、本明細書に記載されたアッセイシステムで有用である。
【０２０６】
ペプチド、ポリエーテルなどのような一般的なリンカーも、タグとしての機能を果たすことができ、かつ約5〜200アミノ酸のポリGly配列（SEQ ID NO:14）などのポリペプチド配列を含む。そのような柔軟性のあるリンカーは当業者に公知である。例えば、ポリ(エチレングリコール)リンカーが、Shearwater Polymers社, Huntsville, Alaから入手可能である。これらのリンカーは任意で、アミド連結、スルフヒドリル連結、またはヘテロ官能性連結を有する。
【０２０７】
タグ結合剤を、現在利用可能な種々の方法のいずれかを用いて固体基板に固定する。固体基板を一般に、タグ結合剤の一部と反応する表面に化学基を固定する化学試薬に該基板の全部または一部を曝露させることによって誘導体化または官能化する。例えば、より長い鎖部分への付着に好適である基には、アミン基、ヒロドキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が含まれると考えられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いて、ガラス表面などの種々の表面を官能化することができる。そのような固相バイオポリマーアレイの構築は文献で十分に説明されている（例えば、Merrifield, 1965, Endeavour 24:3-7; Merrifield, 1964, Biochemistry 3:1385-90; Merrifield and Stewart, 1965, Nature 207(996):522-3; Merrifield, 1965, Science 150(693): 178-85（例えば、ペプチドの固相合成を説明）; Geysen et al., 1987, J Immun Meth 102:259-274（ピン上での固相成分の合成を説明）; Frank and Doring, 1988, Tetrahedron 44:6031-6040（セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成を説明）; Fodor et al., 1991, Science 251 :767-777; Sheldon et al., 1993, Clinical Chemistry 39(4):718-719;およびKozal et al., 1996, Nature Medicine 2(7):753-759（全て固体基板に固定されたバイオポリマーのアレイを説明））。タグ結合剤を基板に固定するための非化学的アプローチには、熱、UV照射による架橋などのような、その他の一般的方法が含まれる。
【０２０８】
本発明は、ハイスループット形式で、SIRT3のレベルもしくは活性を増加させることができる薬剤またはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤を同定するためのインビトロアッセイを提供する。アッセイが極めて均一であるので、潜在的な活性化剤／調整剤を含まない反応でSIRT3のレベルもしくは活性またはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を測定する対照反応は任意である。そのような任意の対照反応は適切でありかつアッセイの信頼度を増加させる。したがって、幾つかの態様において、本発明の方法は、そのような対照反応を含む。記載したアッセイ形式の各々について、SIRT3の活性化剤またはAceCS2の調整剤を含まない「活性剤なし」または「調整剤なし」の対照反応は、結合活性のバックグラウンドレベルを提供する。
【０２０９】
III. SIRT3の活性化剤およびAceCS2の調整剤
任意の候補薬剤、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、核酸、糖類、脂質、合成微小分子化合物、および天然化合物などを、本発明のスクリーニング法で用いることができる。本発明の候補薬剤を、本明細書に記載されたコンビナトリアルライブラリー検索における数々のアプローチならびに（1）生物学的ライブラリー、（2）空間的に扱うことが可能な平行固相または溶液相のライブラリー、（3）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、（4）「1ビーズ 1化合物」ライブラリー法、および（5）親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知の方法のいずれかを用いて得ることもできる。親和性クロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されているのに対し、その他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０２１０】
分子ライブラリーの合成のための方法の例を当技術分野で見出すことができる（DeWitt et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 6909; Erb et al., 1994, Pro. Natl Acad Sci USA 91: 11422; Zuckermann et al., 1994, J Med Chem 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carell et al., 1994, Angew Chem Int. Ed Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew Chem Int Ed.Engl.33:2061 ; Gallop et al., 1994, J Med Chem 37:1233）。コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.参照）。さらに、数々のコンビナトリアルライブラリーそれ自体が市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N. J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos社, St. Louis, Mo., ChemStar社, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md.などを参照）。
【０２１１】
化合物のライブラリーを、溶液中で（Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412参照）またはビーズ（Lam, 1991, Nature 354: 82）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571, 698号；第5,403,484号、および第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865）もしくはファージ（Scott and Smith, 1990, Science 249:386; Devlin, 1990, Science 249:404; Cwirla et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:6378; Felici, 1991, J Mol Biol 222 301; 米国特許出願第20020103360号）上で提示してもよい。本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される候補薬剤は、単一の薬剤かまたは薬剤の組み合わせであってもよい。薬剤の組み合わせを本発明のスクリーニング法で用いる場合、薬剤を連続的にまたは同時に細胞またはタンパク質に接触させてもよい。
【０２１２】
本発明のスクリーニング法で単離される薬剤は、SIRT3のレベルもしくは活性を活性化する薬物の候補であるかまたはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整するための候補薬物である。候補薬物は、本明細書に記載されたような病理学的状態、障害、または疾患を処置または防止するのに有用である。本発明のスクリーニング法で得られる薬剤の構造の一部を付加、欠失、および／または置換によって変換する薬剤が、本発明のスクリーニング法で得られる薬物に含まれる。SIRT3のレベルもしくは活性を活性化するのに有効な薬剤またはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する薬剤を、動物モデルまたは被検対象における障害、疾患、または病理学的状態を処置または防止するその能力についてさらに試験することができる。
【０２１３】
本明細書に記載された本方法のいずれかにより同定される薬剤は、生物学的に活性な薬剤として有用である。好ましい態様において、生物学的に活性な薬剤は、本明細書に記載されたようなSIRT3のレベルまたは活性を活性化する。別の好ましい態様において、生物学的に活性な薬剤は、本明細書に記載されたような、AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する。
【０２１４】
さらに、プロドラッグも本発明の文脈内に含まれる。プロドラッグは、そのようなプロドラッグを患者に投与した場合に、本発明の薬剤をインビボで放出する任意の共有結合担体である。プロドラッグを通常、慣例的な操作によるかまたはインビボでかのいずれかで、修飾を切断し、親薬剤を生じさせるような方法で、官能基を修飾することによって調製する。
【０２１５】
本明細書に記載されたような、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性の1つまたは複数を調整する種々の薬剤を用いることができる。それらには、siRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、小分子、およびドミナントネガティブタンパク質が含まれる。小分子は、SIRT3のレベルまたは活性の活性化のための薬剤としても有用である。
【０２１６】
本明細書に記載されたように、AceCS2の調整剤には、AceCS2の活性化剤および阻害剤（例えば、アンタゴニスト）が含まれる。siRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、およびドミナントネガティブタンパク質は、核酸またはポリペプチドの活性を阻害するのに特に有用である。したがって、1つの態様において、本発明は、AceCS2核酸またはAceCS2ポリペプチドを阻害するためのsiRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、およびドミナントネガティブタンパク質を含む組成物ならびにAceCS2核酸またはAceCS2ポリペプチドの活性をインビトロおよびインビボの両方で阻害するためのsiRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、およびドミナントネガティブタンパク質を用いるための方法を提供する。これらの方法および組成物は、病理学的状態、障害、または疾患の処置に、かつAceCS2活性を干渉するのに有用である。好ましい病理学的状態、障害、または疾患は、正常と比較したアセチル-CoAの上昇レベルによって特徴付けられるか、該レベルによって引き起こされるか、または該レベルと関連する。そのような病理学的状態、障害、または疾患を有する個体に対する本明細書に記載されたようなAceCS2核酸またはAceCS2ポリペプチドを阻害するためのsiRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、およびドミナントネガティブタンパク質の投与時に、個体におけるアセチル-CoAの上昇レベルは減少し、好ましくは正常レベルまで減少する。
【０２１７】
A. 小分子
好ましい態様において、薬剤は、本明細書に記載されたように同定することができる小分子である。有用な小分子およびそれらを含むコンビナトリアルライブラリーを本明細書に記載する。特に有用なのは、本明細書に記載されたようなSIRT3のレベルもしくは活性を活性化するかまたはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する小分子薬剤である。
【０２１８】
B. siRNA
本発明の好ましい態様において、本明細書に記載されたようなAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性の1つまたは複数を調整する薬剤は、短い干渉RNA（siRNA）である。siRNA技術の説明については、例えば、PCT出願国際公開公報第0O/44895号、第99/32619号、第01/75164号、第01/92513号、第01/29058号、第01/89304号、第02/16620号、および第02/29858号；ならびに米国特許公報第20040023390号を参照されたい。
【０２１９】
好ましい態様において、薬剤は、AceCS2 mRNAに対して向けられたsiRNAである。
【０２２０】
したがって、本発明の方法を実施するのに有用である本発明の薬剤にはAceCS2のsiRNAが含まれるがこれらに限定されない。典型的には、そのような薬剤は、（i）AceCS2 mRNAに結合するか、（ii）AceCS2 mRNAの翻訳に干渉するか、または（iii）AceCS2 mRNA の分解を引き起こすことができる。本発明は、RNA干渉を用いてAceCS2発現を調整する組成物および方法を提供する。
【０２２１】
多くの種において、本明細書で低分子干渉RNA（siRNA）と代替的に称される場合がある、二本鎖RNA（dsRNA）の導入は、強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングである、RNA干渉またはRNAiと呼ばれる現象を誘導する。この現象は、線虫類のC.エレガンスで広範に実証されているが（Fire et al., 1998, Nature, 391 :806-811）、トリパノソーマからマウスまでの範囲に及ぶ、その他の生物に広く行き渡っている。議論されている生物に応じて、RNA干渉は、「共抑制」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「センス抑制」、および「クエリング」と称されている。RNAiは、特異的な遺伝子の活性をノックアウトするための手段を提供するので、バイオテクノロジーにおける魅力的なツールである。それは、遺伝子の解析または操作がし易いと以前はみなされなかった種において遺伝子発現をノックアウトするのに特に有用である。
【０２２２】
RNAiは通常、dsRNAが細胞質中の相同なmRNAの分解を誘発する転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）現象として説明される。基本過程は、相同なメッセンジャーRNA（mRNA）の認識および標的切断を導く（短い干渉RNAまたは低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる）より短い単位にプロセッシングされるdsRNAを伴う。（プロセッシング後に）RNAi/PTGSを誘発するdsRNAを、多くの方法で核または細胞質で作ることができる。次にはmRNAを分解する、dsRNAのsiRNAへのプロセッシングは、2段階のRNA分解過程である。第一の段階は、dsRNAを、21〜25ヌクレオチド（nt）長であるセンスおよびアンチセンスRNA（すなわち、siRNA）へとプロセッシングするdsRNAエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼIII様；RNアーゼIII様）活性を伴う。キイロショウジョウバエにおいて、このRNアーゼIII型タンパク質はダイサーと呼ばれる。第二の段階において、産生されたアンチセンスsiRNAは、相同な一本鎖mRNAを切断する、RNA誘導型サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれる異なるリボヌクアーゼ複合体と組み合わさり、かつ該複合体のガイドとしての役割を果たす。RISCは、アンチセンスsiRNAと対を形成する領域のほぼ中央でmRNAを切断し、その後mRNAがさらに分解される。異なる供給源由来のdsRNAがプロセッシング経路に侵入し、RNAi/PTGSを引き起こすことができる。
【０２２３】
したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の方法で使用するための薬剤は、AceCS2のsiRNAである。siRNAを用いて、AceCS2の発現レベルを低下させることができる。AceCS2のsiRNAは、AceCS2 mRNAにハイブリダイズし、それによってAceCS2ポリペプチドの産生を減少させるかまたは阻害する。
【０２２４】
RNAi実験を設計する際に、siRNAの性質、サイレンシング効果の持続可能性、および送達システムの選択などの考慮される必要がある幾つかの因子がある。RNAi効果を生み出すために、生物中に導入されたsiRNAは、好ましくはエクソンの配列を含むべきである。しかしながら、例えば、エクソン／イントロンスプライス配列に対して向けられたsiRNAをさらに選んでもよい。さらに、RNAi過程は相同性依存的であるので、相同ではあるが、遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性を最小化しつつ、遺伝子特異性を最大化するよう、配列を注意深く選択しなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAの配列と阻害されるべき遺伝子の間の90％を超える同一性かまたは100％の同一性さえも示す。標的遺伝子に対する約80％未満の同一性の配列は、実質的にあまり有効でない。したがって、AceCS2のsiRNAと発現を阻害すべきAceCS2遺伝子の間の相同性が大きければ大きいほど、関連のない遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低くなると考えられる。
【０２２５】
さらに、siRNAのサイズが重要である。一般に、本発明は、二本鎖または一本鎖でかつ少なくとも約19〜25ヌクレオチドを含み、AceCS2の遺伝子発現を調整することができる、AceCS2のsiRNA分子に関する。本発明の文脈において、siRNAは好ましくは、長さ500、200、100、50、または25ヌクレオチド未満である。より好ましくは、siRNAは、長さ約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドである。
【０２２６】
1つの局面において、本発明は通常、10以上30以下のAceCS2の連続するヌクレオチドと実質的に相補的でありかつAceCS2遺伝子またはタンパク質の発現を低下させる少なくとも1つの鎖を有する、少なくとも19ヌクレオチドの単離されたsiRNA分子を特色とする。
【０２２７】
それゆえに、本明細書に記載されたようなsiRNAを含む組成物は、哺乳類細胞におけるAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整するための方法、または本明細書に記載のような病理学的状態、障害、もしくは疾患の処置のための方法において有用である。
【０２２８】
1. siRNA標的部位の選択
AceCS2をコードする核酸配列は、当技術分野で説明されておりかつGenBankで入手可能である。例えば、AceCS2についてのヒト核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：BC039261で見出すことができ;マウスAceCS2核酸配列を例えば、GenBankアクセッション番号：AB046742で見出すことができ；かつウシAceCS2核酸配列を例えば、GenBankアクセッション番号：AB046741で見出すことができる。
【０２２９】
SIRT3についてのヒト核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：NM_001017524、NM_O12239、BCOO1042、およびAF083108で見出すことができ；マウスSIRT3核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：CTO10402、BC025878、およびNM_022433で見出すことができ；ラットSIRT3核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：XM_215124で見出すことができ；ウシSIRT3核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：XM_864790およびXM_873980で見出すことができ；イヌSIRT3核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：XM_843207、XM_850716、およびXM_851003で見出すことができ；かつゼブラフィッシュSIRT3核酸配列を、例えば、GenBankアクセッション番号：XM_679133およびXM_685833で見出すことができる。
【０２３０】
これらの配列が手近にあるので、当業者は、必要以上の実験を伴わず、例えば、本明細書で提供した開示を用いることによって、本発明の方法および組成物を実施するためのsiRNAを容易に同定することができる。
【０２３１】
本発明の好ましい態様において、siRNA分子は、10以上30以下のAceCS2の連続するヌクレオチドと実質的に相補的である少なくとも1つの鎖を有する。そのようなオリゴヌクレオチドを用いて、AceCS2の発現を大幅に低下させることができる。本発明のその他の態様において、AceCS2 mRNAからのAceCS2発現を阻害するためのsiRNAは、本明細書で開示したAceCS2配列（本明細書で提供したGenBankアクセッション番号を参照）のいずれか1つから得られるsiRNAを含む。
【０２３２】
必要以上の実験を伴うことなくかつ本発明の開示を用いて、AceCS2発現を調整するAceCS2のさらなるsiRNAを設計および使用し、本発明の方法を実施することができるということが理解される。
【０２３３】
本発明で用いる好ましいsiRNAは、一般式：
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]は、AceCS2遺伝子の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり；[B]は、約3〜約23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり；かつ[A']は、[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。本明細書において、「AceCS2遺伝子の標的配列」という語句は、哺乳類細胞に導入した場合に、AceCS2 mRNAの翻訳を阻害するかまたは低下させるのに有効である配列を指す。
【０２３４】
本明細書で開示したsiRNA以外に、本発明の方法を実施するのに有用なsiRNAを以下のように同定することができる。転写物（例えば、AceCS2 mRNA）のAUG開始コドンから始めて、転写物をAAジヌクレオチド配列について下流にスキャニングする。各々のAAおよび3'に隣接する19ヌクレオチドの出現を潜在的なsiRNA標的部位として記録する。これらは調節タンパク質結合部位がより豊富である可能性があり、したがってエンドヌクレアーゼおよびこれらの領域に対して設計されたsiRNAの複合体がUTR結合タンパク質および／または翻訳開始複合体の結合に干渉する可能性があるので、5'および3'非翻訳領域（UTR）ならびに開始コドン付近（75塩基以内）の領域に対するsiRNAを設計することは推奨されない場合がある（Tuschl, et al. 1999, Genes Dev 13(24):3191-7）。続いて、AceCS2の発現が調整されるべき種に応じて、潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースまたはその他の哺乳類配列と比較する。その他のコード配列との有意な相同性を持つ任意の標的配列は考慮から排除する。相同性検索を、BLASTを用いて行なうことができる（Altschul et. al., 1997, Nucleic Acids Res 25:3389- 402; Altschul et. al., 1990, J Mol Biol 215:403-10）。次に、適格な標的配列を合成用に選択する。Ambionのウェブサイト上で、幾つかの好ましい標的配列を、遺伝子の長さに沿って評価用に選択することができる。
【０２３５】
本発明の二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖はAceCS2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖はセンス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ二本鎖分子はAceCS2遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、遺伝子の発現を阻害する。
【０２３６】
本発明の二本鎖分子は、その本来の環境（すなわち、それが天然の分子である場合、天然の環境）に由来するか、その天然状態から物理的もしくは化学的に改変されたか、または化学的に合成されたポリヌクレオチドであってもよい。本発明に従って、そのような二本鎖分子は、DNA、RNA、またはその誘導体から構成される二本鎖分子を含む。DNAは好適には、A、T、C、およびGなどの塩基から構成され、かつTはRNAではUに置き換えられている。
【０２３７】
siRNAをベクターから発現させてもよい。ベクターは好ましくは、適切な細胞内で分子の発現を導く該二本鎖分子をコードする領域に隣接する調節配列を含む。例えば、本発明の二本鎖分子を、例えば、小核RNA（snRNA）U6またはヒトH1 RNAプロモーター由来のRNAポリメラーゼIII転写単位を含むベクターにそれらのコード配列をクローニングすることによって細胞内で転写させる。
【０２３８】
あるいは、対象配列が、その発現（DNA分子の転写）を可能にする様式でベクターの調節配列に機能的に連結されるように、本ベクターを、例えば、標的配列を発現ベクターにクローニングすることによって産生する（Lee et al., 2002, Nature Biotechnology 20:500-505）。例えば、標的配列に対するアンチセンス配列を有するRNA分子の転写を第一のプロモーター（例えば、クローニングしたDNAの3'末端に連結されたプロモーター配列）によって、および標的配列に対するセンス鎖を有するRNA分子の転写を第二のプロモーター（例えば、クローニングしたDNAの5'末端に連結されたプロモーター配列）によって推進する。発現したセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いにインビボでハイブリダイズし、標的配列を含む遺伝子をサイレンシングするためのsiRNAコンストラクトを作製する。さらに、2つのコンストラクト（ベクター）を利用して、それぞれsiRNAコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖を産生してもよい。
【０２３９】
ベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤を用いることができる。FuGENE6（Roche Diagnostics）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）、Oligofectamine（Invitrogen）、およびNucleofector（Wako pure Chemical）は、トランスフェクション増強剤として有用である。本発明のsiRNAポリヌクレオチドを発現するベクターのトランスフェクションを用いて、哺乳類細胞内でAceCS2を阻害することができる。したがって、分子がAceCS2のsiRNAとして機能するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子、ならびに二本鎖分子をコードするベクターを提供することは、本発明の別の局面である。
【０２４０】
siRNAはまた、1つまたは複数のヌクレオチドの改変を含んでもよい。そのような改変は、19〜25ヌクレオチドRNAの末端へのまたは（RNAの1つもしくは複数のヌクレオチドの）内部でのような、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。好ましい態様において、RNA分子は3'水酸基を含む。本発明のRNA分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準的なヌクレオチドを含むこともできる。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野で公知のその他の修飾骨格を含んでもよく、または非天然のヌクレオチド間連結を含んでもよい。siRNAのさらなる修飾（例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基（universal base）」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および逆向きデオキシ非塩基残基の組み入れ）を、（参照により組み入れられる）米国特許出願第20040019001号および米国特許第6,673,611号に見出すことができる。上記の全てのそのような改変されたRNAをまとめて修飾siRNAと称する。
【０２４１】
好ましくは、RNAiは、細胞内でのAceCS2の発現を、少なくとも10％、20％、30％、または40％、より好ましくは少なくとも50％、60％、または70％、および最も好ましくは少なくとも75％、80％、90％、95％、またはそれを上回って減少させることができる。
【０２４２】
siRNAの細胞への導入を、例えば、siRNAを転写することができる核酸を含むベクターのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはトランスフェクションを含む、当技術分野で公知でありかつ本明細書で開示された方法で達成することができる。 あるいは、AceCS2のsiRNAを、AceCS2 mRNA転写物に結合することができる形態で細胞に直接導入することができる。持続可能性および膜透過性を増加させるために、siRNAを、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、もしくはその誘導体と組み合わせるかまたはリポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、もしくはその誘導体で修飾してもよい。好ましいのは、コレステロールがコンジュゲートされたAceCS2のsiRNAである（Song et al., Nature Med. 9:347-351 (2003)参照）。
【０２４３】
siRNAおよびsiRNA核酸配列を含むベクターならびに同じ物を調製および使用するための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書と共に組み入れられる、米国特許出願第20060051815号に記載されている。
【０２４４】
C. アンチセンスRNAおよびリボザイム
種々の薬剤を用いて、本明細書に記載されたようなAceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整することができる。例えば、AceCS2遺伝子の発現を阻害するかまたはAceCS2遺伝子の発現に拮抗する核酸を細胞または対象に投与することによって、AceCS2の発現を調整し、好ましくは阻害することができる。上に記載されたsiRNAに加えて、AceCS2遺伝子の発現を混乱させるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、AceCS2のレベルまたは活性を調整するのに用いることができる。好ましい態様において、調整剤、好ましくは阻害剤は、本明細書に記載されたように同定することができる、アンチセンスRNAである。
【０２４５】
上で特筆したように、AceCS2遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかに対応するアンチセンス-オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現レベルを低下させることができる。具体的には、AceCS2遺伝子に対するアンチセンス-オリゴヌクレオチドは、AceCS2 mRNAのいずれかに結合することによって作用し、その結果AceCS2遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、AceCS2 mRNAの分解を促進し、および／またはAceCS2遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、最終的にAceCS2タンパク質の機能を阻害する可能性がある。
【０２４６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAを、本明細書で開示した遺伝子由来のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズするそれらの能力によって定義することもできる。
【０２４７】
アンチセンス-オリゴヌクレオチドおよびその誘導体を、誘導体に対して不活性である好適な基材材料と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用調製物にすることができる。
【０２４８】
本発明のアンチセンス-オリゴヌクレオチドは、AceCS2遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、したがってAceCS2またはAceCS2もしくはSIRT3ポリペプチドのうちの1つを含む多タンパク質複合体の生物学的活性を抑制するのに有用である。
【０２４９】
通常、リボザイムは、大きいリボザイムおよび小さいリボザイムに分類される。大きいリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断する酵素として公知である。大きいリボザイムとの反応後、反応した部位は、5'-リン酸および3'-水酸基からなる。大きいリボザイムは、（1）グアノシンによる5'-スプライス部位でのトランスエステル化を触媒するグループIイントロンRNA；（2）RNAラリアット構造を介した2段階反応を通じた自己スプライシングを触媒するグループIIイントロン；および（3）加水分解を通じて5'部位でtRNA前駆体を切断するリボヌクレアーゼPのRNA成分にさらに分類される。他方、小さいリボザイムは、大きいリボザイムと比較してより小さいサイズ（約40 bp）を有し、かつRNAを切断して5'-水酸基および2'-3'環状リン酸を生成する。小さいリボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイム（Koizumi et al., 1988, FEBS Lett. 228:225）およびヘアピン型リボザイム（Buzayan,1986, Nature 323:349; Kikuchi and Sasaki, 1991, Nucleic Acids Res. 19: 6751）が含まれる。リボザイムを設計および構築するための方法は、当技術分野で公知であり（Koizumi et al., 1988, FEBS Lett. 228:225; Koizumi et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:7059; Kikuchi and Sasaki, 1991, Nucleic Acids Res. 19: 6751参照）、AceCS2ポリペプチドの発現を阻害するリボザイムを、リボザイムを産生するための従来法に従ってAceCS2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列情報に基づいて構築することができる。
【０２５０】
D. ドミナントネガティブタンパク質
種々の薬剤を用いて、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を阻害することができる。好ましい態様において、阻害剤は、本明細書に記載されたように同定することができるドミナントネガティブタンパク質である。
【０２５１】
本発明者らによって記載されたように、AceCS2ポリペプチドは、会合して多タンパク質複合体になる。したがって、好ましい態様において、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を阻害するドミナントネガティブタンパク質またはAceCS2ポリペプチドと生物学的に活性のある多タンパク質複合体との会合を調整し、好ましくは阻害するその活性断片。生物学的に活性のある複合体の会合の阻害によって、アセテート、ATP、およびCoAをアセチル-CoAおよびAMPに変換する酵素活性またはミトコンドリアへの局在などの、AceCS2ポリペプチドの1つまたは複数の活性を阻害するかまたは低下させてもよい。
【０２５２】
AceCS2のその他のドミナントネガティブタンパク質を、当技術分野で公知の方法および本明細書で開示したアッセイを用いて同定してもよい。
【０２５３】
候補化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、配列に基づいてオリゴDNAを合成し、かつオリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングし、タンパク質をコードするDNAを得る。
【０２５４】
IV. 薬剤を用いるための方法
本明細書で同定した薬剤は、種々の方法での使用が見出され、例えば、薬剤は、（i）SIRT3のレベルもしくは活性を活性化すること、（ii）AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整すること、または（iii）病理学的状態、障害、もしくは疾患の処置のために用いることができる。これらの方法は、インビトロおよびインビボで実施することができる。好ましくは、本方法のいずれか1つによって処置される患者は、ヒトおよび非ヒト動物である。
【０２５５】
A. SIRT3のレベルまたは活性の増加
本発明のスクリーニング法によって同定されるかまたは同定可能である薬剤を用いて、インビトロまたはインビボで、SIRT3のレベルまたは活性を増加させる、すなわち刺激または活性化することができる。したがって、本発明の1つの局面において、SIRT3のレベルまたは活性を増加させるための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、SIRT3のレベルまたは活性を増加させる、本発明のスクリーニング法によって得るかまたは得ることができる薬剤とSIRT3とを接触させる工程を含む。
【０２５６】
SIRT3は、細胞、好ましくは哺乳類細胞およびより好ましくはヒト細胞の中にあってもよい。SIRT3の好ましい活性は、SIRT3のデアセチラーゼ活性、好ましくはAceCS2の脱アセチル化である。
【０２５７】
インビトロまたはインビボでの薬剤の効果を、本明細書に記載されたようにアッセイすることができる。
【０２５８】
B. アセチル-CoAシンセターゼ2のレベル、アセチル化状態、または活性の調整
さらに別の局面において、本発明は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整するための方法を提供する。本発明の好ましい態様において、本方法は、調整される、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤を同定するための方法などの、本発明のスクリーニング法によって得るかまたは得ることができる薬剤とAceCS2ポリペプチドとを接触させる工程を含む。
【０２５９】
AceCS2は、細胞、好ましくは哺乳類細胞およびより好ましくはヒト細胞の中にあってもよい。AceCS2の好ましい活性は、酵素活性、好ましくは本明細書に記載されたようなアセチル-CoAの生成である。
【０２６０】
インビトロまたはインビボでの薬剤の効果を、本明細書に記載されたようにアッセイすることができる。
【０２６１】
C. 病理学的状態の処置
本発明はまた、病理学的状態、障害、または疾患の処置のための方法を提供する。
【０２６２】
哺乳類における幾つかの状況下で、アセチル-CoAシンセターゼによって活性化される必要のある大量のアセテートが産生される。例えば、長期にわたる絶食または糖尿病などのケトン体形成状態下では、肝臓は、相当量のアセテートを血流中に放出する（Buckley and Williamson, 1977, Biochem J 166:539-45; Seufert et al., 1974, Biochem Biophys Res Commun 57:901-9; Yamashita et al., 2001, Biochim Biophys Acta 1532:79-87）。さらに、アセテートを産生する肝臓のアセチル-CoAヒドロラーゼは、ケトン体形成状態下で活性化される（Matsunaga et al., 1985, Eur J Biochem 152, 331-6）。放出されたアセテートの肝外組織での利用は、アセチル-CoAシンセターゼの作用を必要とする。AceCS2は、心臓および骨格筋には豊富にあるが、肝臓にはなくかつケトン体形成状態下で誘導されるという知見は、AceCS2が、ケトン体形成状態下でのエネルギー産生のためのアセテート変換において重要な役割を果たしているということを示唆している（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276, 11420-6）。したがって、本発明によって処置することができる好ましい病理学的状態、障害、または症状は、ケトン体形成状態である。さらに、ケトン体形成状態に関する障害、ケトン体形成状態と関連した障害、またはケトン体形成状態によって（直接的にもしくは間接的に）引き起こされる障害も、本発明による方法を用いた処置で律することができる。
【０２６３】
したがって、1つの局面において、本発明は、ケトン体形成状態を有する個体の処置のための方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、ケトン体形成状態を有する個体に投与する工程を含み、SIRT3は AceCS2を脱アセチル化し、ケトン体形成状態を有する個体が処置される。SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２６４】
本発明の別の態様において、ケトン体形成状態を有する個体の処置のための方法は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、処置される、ケトン体形成状態を有する個体に投与する工程を含む。AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２６５】
別の好ましい態様において、ケトン体形成状態を有する個体の処置のための方法は、薬学的組成物を個体に投与する工程を含み；ここで、該薬学的組成物は、そのような薬剤を同定するための本方法によって得ることができる生物学的に活性な薬剤を含み、ケトン体形成状態を有する個体が処置される。
【０２６６】
ケトン体形成状態の処置のための、および特に個体の血液中の正常よりも高いレベルのアセテートを低下させるための好ましい薬剤は、AceCS2のアセテートに対する親和性を増加させる薬剤、すなわち、Kmを下げる薬剤である。
【０２６７】
理論に束縛されるわけではないが、増加したミトコンドリアAceCS2活性は、アセテートを酸化の方向へと導きかつ細胞質AceCS1から引き離すことができ、それゆえにAceCS1を介する脂質およびコレステロールの合成を低下させ、その結果高コレステロール血症、高脂血症、肥満、および場合によってはII型糖尿病を含むがこれらに限定されない状態を改善する可能性がある。
【０２６８】
本明細書に記載されたようなケトン体形成状態の処置は、個体の血流中のより低いレベルのアセテートを結果的にもたらす可能性がある。したがって、本明細書に記載されたようなケトン体形成状態の処置を、本発明によって処置された個体の血液中のアセテートレベルを測定することによってモニタリングすることができる。
【０２６９】
好ましくは、ケトン体形成状態を持つと診断されている個体の血液中の上昇したアセテートレベルを、処置前の個体における上昇したアセテートレベルと比べて少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、またはそれを上回って低下させる。好ましくは、患者における上昇したアセテートレベルを、健常個体の血液中のアセテートのレベルまで低下させる。
【０２７０】
1. II型糖尿病
II型糖尿病は通常、成人期に生じかつ血液中の増加したグルコースレベルをもたらす正常よりも低い血中インスリンレベルを特徴とする。BuckleyおよびWilliamsonは、糖尿病ラットもまた、上昇した血液アセテート濃度を有するということを報告した（Buckley and Williamson, 1977, Biochem J 166:5239-545）。さらに、Fujinoらは、ズッカー糖尿病ラットにおいてAceCS2 mRNAのレベルが増加するということを報告した（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276:11420-11426）。
【０２７１】
したがって、1つの局面において、本発明は、II型糖尿病の処置のための方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、II型糖尿病を有する個体に投与する工程を含み、ここでSIRT3は AceCS2を脱アセチル化し、II型糖尿病を有する個体が処置される。SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２７２】
本発明の別の態様において、II型糖尿病の処置のための方法は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、処置される、II型糖尿病を有する個体に投与する工程を含む。AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２７３】
任意で、糖尿病を処置するための方法は、既存の低血糖剤、すなわち、循環グルコース濃度を下げる薬剤を個体に投与する工程を含む。2型糖尿病を処置するための現在の薬剤は、本疾患における根本的な生化学的欠陥を直すことなく、血液グルコースレベルを下げる可能性があるが、本明細書で同定した薬剤を現存する低血糖剤と組み合わせることが場合によって望ましい場合がある。そのような薬剤は、当技術分野で公知でありかつ、例えば、（i）スルホニル尿素クラスの薬剤、（ii）つい最近開発されたカリウム／ATPチャネルを閉じる薬剤の非スルホニル尿素クラスの薬剤、（iii）ミトコンドリア代謝用の基質（例えば、KCl、α-ケトイソカプロン酸、もしくはロイシン）、インスリン増感剤（例えば、チアゾリジンジオン）、肝臓グルコース出力の阻害剤（例えば、メトフォルミン）を供給する薬剤、または（iv）グルコース摂取遮断薬（例えば、アカルボス）を含む。
【０２７４】
2. 高コレステロール血症
高コレステロール血症とは、血流中の異常に高い濃度のコレステロールを指す。高コレステロール血症に罹患している個体において、高レベルのコレステロールは、心臓疾患、動脈の硬化、心臓発作、および脳梗塞をもたらす可能性がある。総コレステロールについて、240 mg/dLを上回る血液コレステロールレベルが異常に高いと考えられる。200〜239 mg/dLの血液コレステロールレベルがボーダーライン高であると考えられる。200 mg/dL未満の血液コレステロールレベルが望ましい。
【０２７５】
また、家族性の高コレステロール血症を有する個体を、本明細書で同定した薬剤によって処置することができる。罹患した人は、冠状動脈の早期のアテローム性動脈硬化症をもたらす、一貫して高いレベルの低密度リポタンパク質（LDLまたは「悪玉」コレステロール）を有する。典型的に、罹患した男性では、心臓発作は40〜50代に起こり、かつこの障害を持つ男性の85％は、60歳までに心臓発作を経験している。この障害を持つ女性における心臓発作の発生率もまた増加するが、男性よりも10年遅れて起こる。
【０２７６】
したがって、1つの局面において、本発明は、高コレステロール血症の処置のための方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、高コレステロール血症を有する個体に投与する工程を含み、ここで、SIRT3は AceCS2を脱アセチル化し、高コレステロール血症を有する個体が処置される。SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２７７】
本発明の別の態様において、高コレステロール血症の処置のための方法は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、処置される、高コレステロール血症を有する個体に投与する工程を含む。AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２７８】
本明細書に記載されたような高コレステロール血症の処置は、個体の血流中のより低いレベルのコレステロールを結果的にもたらす。好ましくは血液コレステロールレベルを、240 mg/dLを上回るレベルから200〜239 mg/dLのレベルまで、より好ましくは、200 mg/dL未満のレベルまで低下させる。
【０２７９】
3. 高脂血症
高脂質タンパク質症としても公知の、高脂血症は、血液中の、コレステロールおよびトリグリセリドなどの、高レベルの脂肪物質を特徴とする脂質障害である。高脂血症に罹患している個体は、アテローム性動脈硬化および心臓疾患を発症する可能性がより高い。例えば、150 mg/dL未満のトリグリセリドレベルが正常と考えられ、150〜199 mg/dLのトリグリセリドレベルがボーダーライン高であると考えられ、200〜499 mg/dLのトリグリセリドレベルが高いと考えられ、かつ500 mg/dLまたはそれを超えるトリグリセリドレベルが非常に高いと考えられる。
【０２８０】
したがって、さらなる局面において、本発明は、高脂血症の処置のための方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、高脂血症を有する個体に投与する工程を含み、ここで、SIRT3は AceCS2を脱アセチル化し、高脂血症を有する個体が処置される。SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２８１】
本発明の別の態様において、高脂血症の処置のための方法は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、処置される、高脂血症を有する個体に投与する工程を含む。AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２８２】
本明細書に記載されたような高脂血症の処置は、個体の血流中のより低いレベルのトリグリセリドを結果的にもたらす。好ましくは血液コレステロールレベルを、500 mg/dL超のレベルから200〜499 mg/dLのレベルまで、より好ましくは、150〜199 mg/dL未満のレベル、および最も好ましくは150 mg/dL未満のレベルまで低下させる。
【０２８３】
4. 肥満
肥満は、30 kg/m2を超えるBMI（体質量指数）と定義される。25〜29.9のBMIを持つ患者は太り過ぎと考えられるが、肥満ではない。18.5〜24.9のBMIは正常と考えられ、18.5またはそれ未満のBMIはやせ過ぎであると考えられる。米国人口の半分よりも多くが太り過ぎでかつ肥満の割合が上昇している。肥満は、糖尿病、脳梗塞、冠状動脈疾患、高血圧、高コレステロール、ならびに腎臓および胆嚢障害に起因する病気および死亡のリスクを増加させる。肥満は、幾つかの癌に対するリスクを増加させる可能性がありかつ変形性関節炎および睡眠時無呼吸の発症に対するリスク因子でもある。
【０２８４】
したがって、別の局面において、本発明は、肥満の処置のための方法を提供する。好ましい態様において、本方法は、SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、肥満を持つと診断されている個体に投与する工程を含み、ここでSIRT3は AceCS2を脱アセチル化し、肥満を持つと診断されている個体が処置される。SIRT3のレベルまたはデアセチラーゼ活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２８５】
本発明の別の態様において、肥満の処置のための方法は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる治療的有効量の薬剤を、処置される、肥満を持つと診断されている個体に投与する工程を含む。AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を増加させる薬剤を、本発明のスクリーニング法を用いて得るかまたは得ることができる。
【０２８６】
本明細書に記載されたような肥満の処置は、より低いBMIを結果的にもたらす。好ましくはBMIを、30 kg/m2超のレベルから25〜29.9 kg/m2のレベルまで、より好ましくは18.5〜24.9 kg/m2のレベルまで低下させる。
【０２８７】
V. 薬学的組成物
1つの局面において、本発明は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する少なくとも1つの薬剤および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物または医薬物を提供する。好ましい態様において、薬剤は、AceCS2のレベル、もしくは活性を増加させるか、またはAceCS2のアセチル化状態を低下させる。
【０２８８】
別の局面において、本発明は、SIRT3のレベルまたは活性、好ましくはデアセチラーゼ活性を増加させる少なくとも1つの薬剤および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物または医薬物を提供する。
【０２８９】
薬学的組成物または医薬物を、例えば、本明細書に記載されたような病理学的状態または疾患の処置のために対象に投与することができる。
【０２９０】
A. 製剤化および投与
本発明の方法で同定される化合物、薬剤、および小分子は、経腸での適用または非経口での適用のいずれかに好適な賦形剤または担体と併用または混合したその有効量を含む薬学的組成物または医薬物の製造において有用である。
【０２９１】
（i）SIRT3のレベルもしくは活性を増加させるかまたは（ii）AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整するための好ましい薬学的組成物は、（i）本明細書に記載された本スクリーニング法によって得るかまたは得ることができる薬剤、および（ii）薬学的に許容される担体を含む。本明細書に記載されたような処置のための方法で使用するための治療的有効用量で該薬剤を提供してもよい。
【０２９２】
本発明で使用するための薬学的組成物または医薬物を、1つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いる標準的な技術で製剤化することができる。好適な薬学的担体は、本明細書およびE.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。本発明の化合物、薬剤、および小分子ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、吸入、局所、経鼻、経口、非経口、または直腸経由を含む、任意の好適な経路による投与のために製剤化することができる。したがって、薬学的組成物の投与を、注射器またはその他の装置を用いた、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、脳内、気道内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠状動脈内、または腫瘍内の注射によって行なってもよい。経皮投与もまた、吸入またはエアロゾル投与と同様に、企図される。錠剤およびカプセルを、口、直腸、または膣に投与することができる。
【０２９３】
経口投与のために、薬学的組成物または医薬物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段で調製される錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。好ましいのは、活性成分、すなわち、以下と共に、本発明の小分子化合物を含む錠剤およびゼラチンカプセルである：（a）希釈剤もしくは充填剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（例えば、エチルセルロース、ミクロクリスタリンセルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレート、および／もしくはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（b）潤滑剤、例えば、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、金属ステアレート、コロイド二酸化ケイ素、水素化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および／もしくはポリエチレングリコール；錠剤については同様に（c）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、スターチペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、および／もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース；望ましい場合（d）崩壊剤、例えば、スターチ（例えば、ジャガイモスターチもしくはスターチナトリウム）、グリコレート、寒天、アルギン酸、もしくはそのナトリウム塩、もしくは発泡性混合物；（e）湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびに／または（f）吸収剤、着色剤、香料、および人工甘味料。
【０２９４】
錠剤は、当技術分野で公知の方法によってフィルムコーティングされているかまたは溶腸性コーティングされているかのいずれかであってもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態を取ることができるか、またはそれらは、使用前に水もしくはその他の好適なビヒクルで構成するための乾燥製品として提示することができる。そのような液体調製物を、薬学的に許容される添加物、例えば、懸濁剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化された食用脂肪；乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシア；非水性ビヒクル、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画された植物油；および防腐剤、例えば、メチル-p-ヒドロキシ安息香酸もしくはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸、またはソルビン酸を用いて、従来の手段で調製することができる。調製物はまた、適当な場合に緩衝剤塩、香味剤、着色剤、および／または甘味剤を含むことができる。望ましい場合、経口投与用の調製物を好適に製剤化し、活性化合物の制御された放出をもたらすことができる。
【０２９５】
本発明の化合物、薬剤、および小化合物を、注射による、例えば、ボーラス注射かまたは連続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤を、単位投薬形態で、例えば、アンプルでまたは多用量容器で、添加された防腐剤と共に提示することができる。注射可能な組成物は、好ましくは水性で等張の溶液または懸濁液であり、座薬は、好ましくは脂肪のエマルジョンまたは懸濁液から調製する。組成物は、滅菌されていてもよくならびに／または防腐剤、安定化剤、湿潤剤、もしくは乳化剤などのアジュバント、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／もしくは緩衝剤を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌したパイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であることができる。さらに、それらはまた、その他の治療的に価値のある物質を含んでもよい。組成物は、それぞれ、従来の混合法、粒状化法、またはコーティング法によって調製され、かつ活性成分の約0.1〜75％、好ましくは約1〜50％を含む。
【０２９６】
吸入による投与のために、化合物、薬剤、および小化合物を、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示で、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の好適なガスの使用と共に、好都合に送達してもよい。加圧エアロゾルの場合には、バルブを提供することによって投薬単位を決定し、計量された量を送達することができる。化合物と好適な粉末基材、例えば、ラクトースまたはスターチなどの粉末混合物とを含む、例えば、吸入器または散布器で使用するためのゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【０２９７】
経皮適用に好適な製剤には、担体を伴う有効量の本発明の化合物、薬剤、および小分子が含まれる。好ましい担体には、宿主の皮膚の通過を手助けするための吸収可能で薬理学的に許容される溶媒が含まれる。例えば、経皮装置は、バッキング部材、任意で担体を伴う化合物を含む貯留層、任意で制御されかつ予め決められた速度で長期にわたって宿主の皮膚に化合物を送達する速度制御バリアー、および装置を皮膚に固定する手段を含む、包帯の形態である。また、マトリックス経皮製剤を用いてもよい。
【０２９８】
例えば、皮膚および目への局所適用に好適な製剤は、好ましくは、当技術分野で周知の水性溶液、軟膏、クリーム、またはジェルである。そのようなものは、可溶化剤、安定化剤、張性増強剤、緩衝剤、および防腐剤を含んでもよい。
【０２９９】
化合物、薬剤、および小分子を、直腸組成物、例として、例えば、従来の座薬基材、例えば、ココアバターまたはその他のグリセリドを含む、座薬または停留浣腸の中に製剤化することができる。
【０３００】
さらに、化合物、薬剤、および小分子をデポー調製物として製剤化することができる。そのような長時間作用性の製剤をインプランテーションによって（例えば、皮下にもしくは筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、好適なポリマー性もしくは疎水性の材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂と共に、または難溶性の誘導体として、例えば、難溶性の塩として、化合物を製剤化することができる。
【０３０１】
組成物は、望ましい場合、活性成分を含む1つまたは複数の単位投薬形態を含むことができる包装またはディスペンサー装置中に提示することができる。包装は、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含むことができる。包装またはディスペンサー装置には、投与についての取扱説明書が付随されている可能性がある。
【０３０２】
本発明の1つの態様において、薬学的組成物または医薬物は、本明細書に記載されたような（i）SIRT3のレベルもしくは活性を増加させるかまたは（ii）AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する治療的有効量の薬剤、および別の治療薬剤を含む。本発明の化合物、薬剤、または小分子と共に用いる場合、そのような治療薬剤を、個別的に、連続的に、または1つもしくは複数のその他のそのような治療薬剤と組み合わせて（例えば、第一の治療薬剤、第二の治療薬剤、および本発明の化合物）用いてもよい。投与は、同じもしくは異なる投与経路によるものであってもよく、または同じ薬学的製剤中で一緒であってもよい。
【０３０３】
B. 治療的有効量および投薬
本発明の1つの態様において、薬学的組成物または医薬物を、対象、好ましくはヒトまたは非ヒト動物に、治療的有効用量で投与し、本明細書に記載されたような病理学的状態または疾患を防止するか、処置するか、または制御する。薬学的組成物または医薬物を、対象における有効な治療応答を誘発するのに十分な量で対象に投与する。有効な治療応答とは、病理学的状態、障害、もしくは疾患の症状または合併症を少なくとも部分的に停止または遅延させる応答である。これを遂行するのに十分な量を、「治療的有効量」とも称する「治療的有効用量」と定義する。
【０３０４】
投与される活性薬剤の投薬量は、温血動物（哺乳類）の種、体重、年齢、個体の状態、処置すべき部分の表面積または体積、および投与の形態に依存する。用量のサイズはまた、特定の対象における特定の小分子化合物の投与に伴う任意の有害作用の存在、性質、および程度によって決定されると考えられる。約50〜70 kgの哺乳類への経口投与用の単位投薬量は、約5〜500 mgの活性成分を含んでもよい。典型的に、本発明の活性化合物の投薬量は、所望の効果を達成するのに十分である投薬量である。最適な投薬スケジュールを、対象の体内での薬剤蓄積の測定から算出することができる。一般に、投薬は、1日に1回もしくは複数回、1週間に1回もしくは複数回、または1か月に1回もしくは複数回行なわれてもよい。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論、および反復速度を容易に決定することができる。
【０３０５】
投与される活性薬剤の投薬量は、薬剤の性質にも依存する。例えば、タンパク質またはポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効投薬量）は、約0.001〜30 mg/kg体重、好ましくは約0.01〜25 mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜20 mg/kg体重、およびさらにより好ましくは約1〜10 mg/kg、2〜9 mg/kg、3〜8 mg/kg、4〜7 mg/kg、または5〜6 mg/kg体重の範囲に及ぶ。タンパク質またはポリペプチドを、週に1回、約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは3〜7週間、およびさらにより好ましくは約4、5、または6週間、投与することができる。
【０３０６】
小分子の例示的な用量として、対象または試料の重さのキログラム当たりミリグラムまたはマイクログラム量の小分子（例えば、キログラム当たり約1マイクログラム〜キログラム当たり約500ミリグラム、キログラム当たり約100マイクログラム〜キログラム当たり約5ミリグラム、またはキログラム当たり約1マイクログラム〜キログラム当たり約50マイクログラム）が含まれる。小分子の適当な用量は、調整されるべき発現または活性に関する小分子の効能に依存するということがさらに理解される。AceCS2ポリペプチドもしくは核酸のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整するためにまたはSIRT3ポリペプチドもしくは核酸のレベルもしくは活性を活性化するために、これらの小分子のうちの1つまたは複数を動物（例えば、ヒト）に投与しようとする場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初に比較的低い用量を指示し、その後適当な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、任意の特定の動物対象についての特異的な用量レベルは、利用される具体的な化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食事、投与時間、投与経路、排出の速度、任意の薬物組み合わせ、ならびに調整されるべき発現または活性の程度を含む、種々の因子に依存するということが理解される。
【０３０７】
本発明の1つの態様において、本発明の化合物、薬剤、または小分子を含む薬学的組成物または医薬物を、対象の体重1 kg当たり約1 mgの各化合物（1 mg/kg）〜約1 g/kgの範囲の日用量で、複数日の間投与する。別の態様において、日用量は、約5 mg/kg〜約500 mg/kgの範囲の用量である。さらに別の態様において、日用量は、約10 mg/kg〜約250 mg/kgである。別の態様において、日用量は、約25 mg/kg〜約150 mg/kgである。好ましい用量は、約10 mg/kgである。日用量は、1日に1回投与するかまたは部分用量（subdose）に分割して複数用量で、例えば、1日に2回、3回、もしくは4回投与することができる。しかしながら、当業者によって理解されるように、本発明の方法で同定した化合物、薬剤、または小分子を、異なる量でかつ異なる時間に投与してもよい。当業者はまた、対象の疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、全般的な健康、および／または年齢、ならびに存在するその他の疾患を含むがこれらに限定されないある因子が、対象を有効に処置するのに必要とされる投薬量およびタイミングに影響を与え得るということを理解すると考えられる。さらに、治療的有効量の化合物による対象の処置は、単一の処置を含むことができるかまたは、好ましくは、一連の処置を含むことができる。
【０３０８】
所望の治療効果を達成するために、化合物、薬剤、または小分子を、複数日の間、治療的に有効な日用量で投与してもよい。したがって、本明細書に記載された、対象における病理学的状態または疾患を処置するための化合物の治療的に有効な投与は、3日〜2週間またはそれより長くの範囲に及ぶ期間継続される周期的な（例えば、毎日の）投与を必要とする。典型的には、薬剤は、少なくとも3連続日の間、多くの場合少なくとも5連続日の間、より多くの場合少なくとも10連続日の間、および時に20、30、40、またはそれより多くの連続日の間、投与されると考えられる。連続日用量は、治療的有効用量を達成するための好ましい方法であるが、薬剤が毎日投与されない場合でも、対象における薬剤の治療的有効濃度を維持するのに十分高い頻度で投与が繰り返される限り、治療的に有益な効果を達成することができる。例えば、1日おきに、3日毎に、または、より高い用量範囲が利用されかつ対象が耐えられる場合には、1週間に1回、薬剤を投与することができる。
【０３０９】
そのような化合物、薬剤、および小分子の最適な投薬量、毒性、および治療有効性は、個々の化合物、薬剤、または小分子の相対的効能に応じて様々に異なる可能性がありかつ細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、LD50（集団の50％にとって致死である用量）およびED50（集団の50％で治療的に有効である用量）を決定することによって明らかにすることができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、かつLD50/ED50という比率として表すことができる。大きい治療指数を示す薬剤が好ましい。有毒な副作用を示す薬剤を用いることができるが、そのような薬剤を罹患組織の部位に標的化して正常細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それによって副作用を低下させる送達システムを設計するよう注意を払わなければならない。
【０３１０】
例えば、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを用いて、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を定式化することができる。そのような小分子薬剤の投薬量は好ましくは、毒性がほとんどないかまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される投薬形態および投与経路に応じてこの範囲内で様々に異なることができる。本発明の方法で用いる任意の薬剤について、治療的有効用量を細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量を動物モデルで定式化し、細胞培養で決定したようなIC50（症状の最大限の阻害の半分を達成する薬剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルを、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって測定することができる。一般に、薬剤の用量当量は、典型的な対象について、約1 ng/kg〜100 mg/kgである。
【０３１１】
成功した処置の後、対象に維持治療を受けさせて、処置した状態または疾患の再発を防止することが望ましい場合がある。
【０３１２】
C. 食品、飲料、および食料
さらに、本発明は、AceCS2のレベル、アセチル化、もしくは活性を調整する活性を持つかまたはSIRT3のレベルもしくは活性を増加させる活性を持つ食品、飲料、または食料に関する。そのような食品、飲料、または食料を、活性薬剤、例えば、AceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性またはSIRT3のレベルもしくは活性を調整する薬剤を、食品、飲料、または食料の原材料または調理済み材料に添加することによって、食品および飲料または食料を生産するための一般的な方法で生産することができる。食品、飲料、または食料に一般に用いられるのと同じやり方で、本発明による食品、飲料、または食料を成形しかつ粒状にすることができる。
【０３１３】
活性薬剤の濃度は好ましくは、そのような活性薬剤を含む食品、飲料、または食料の0.001〜10重量％、より好ましくは0.01〜10重量％、および最も好ましくは0.1〜10重量％である。
【０３１４】
活性薬剤を添加する具体的な食品または飲料には、例えば、ジュース、清涼飲料、スープ、紅茶、乳酸飲料、発酵乳、アイス、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、およびスキムミルクなどの乳製品、ハム、ソーセージ、およびハンバーガーなどの肉製品、魚肉、シリアル、ふすま、ケーキ製品、味付けエッグロールおよび卵豆腐（egg curd）などの卵製品、クッキー、ゼリー、スナック、およびチューイングガムなどの菓子類、パン、麺類、漬物、薫製品、魚の干物、醤油で味付けした煮物、ならびに調味料が含まれる。
【０３１５】
AceCS2のレベル、アセチル化、もしくは活性を調整する活性を持つかまたはSIRT3のレベルもしくは活性を増加させる活性を持つ食品、飲料、および食料を、栄養のある組成物（タンパク質、脂質、糖類、ビタミン、および／またはミネラル）でさらに補ってもよい。
【０３１６】
VI. キット
上に記載した診断、研究、および治療用途で用いるために、キットもまた本発明によって提供される。診断および研究用途において、そのようなキットには、以下のいずれかまたは全てが含まれてもよい：アッセイ試薬、緩衝剤、本発明の化合物、薬剤、または小分子、SIRT3ポリペプチド、AceCS2ポリペプチド、または本明細書に記載された任意のその他のポリペプチド、SIRT3核酸、AceCS2核酸、または本明細書に記載された任意のその他の核酸、抗SIRT3抗体、抗AceCS2抗体、抗アセチル-リジン抗体、または本明細書に記載された任意のその他の抗体、SIRT3核酸、AceCS2核酸、または本明細書に記載された任意のその他の核酸を検出するハイブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマー、SIRT3発現コンストラクト、AceCS2発現コンストラクト、または本明細書に記載された任意のその他のポリペプチドのための発現コンストラクト、アセテート、NAD、または本明細書に記載された任意のその他の化合物もしくは組成物など。治療製品には、滅菌食塩水または別の薬学的に許容されるエマルジョンおよび懸濁基剤が含まれてもよい。
【０３１７】
特定の緩衝剤、培地、試薬、細胞、培養条件などへの、またはそれらの幾つかの部分集合への言及は、限定的であるよう意図されるのではなく、それらが提示される特定の文脈において興味深いかまたは価値があると当業者が認識すると考えられる全てのそのような関連材料を含むよう読まれるべきである。例えば、別の公知の方法を用いて、示唆された方法、材料、または組成物の使用が目指す目的と同じ目的を達成するように、1つの緩衝剤システムまたは培養培地を別のものの代替物にすることが、多くの場合可能である。
【０３１８】
典型的には、キットの構成要素を容器中に提供する。本発明の好ましい態様において、SIRT3のレベルもしくは活性を増加させるためのキットまたはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整するためのキットは、本スクリーニング法によって得るかまたは得ることができる薬剤を含む容器を含む。
【０３１９】
さらに、キットには、本発明の方法の実施のための使用説明書（すなわち、プロトコル）を含む取扱説明材料が含まれてもよい。取扱説明書は、種々の形態で本キット中に存在してもよく、そのうちの1つまたは複数が、キット中に存在してもよい。取扱説明物は典型的には、文書によるかまたは印刷された物を含むが、それらはそのようなものに限定されない。そのような取扱説明書を保存しかつそれらを最終使用者に伝達することができる任意の媒体は、本発明によって企図されている。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、磁気テープ、磁気カートリッジ、磁気チップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）などが含まれるがこれらに限定されない。そのような媒体には、そのような取扱説明材料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれてもよい。
【０３２０】
本発明の好ましい態様において、キットは、SIRT3のレベルもしくは活性を増加させるために哺乳類細胞と薬剤とを接触させるための取扱説明書、またはAceCS2のレベル、アセチル化状態、もしくは活性を調整する哺乳類細胞と薬剤とを接触させるための取扱説明書を含む。好ましい態様において、薬剤は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を刺激する。別の態様において、薬剤は、AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を阻害する。
【０３２１】
任意で、取扱説明書は、起こり得る副作用および薬物-薬物または薬物-食品相互作用の警告を含む。
【０３２２】
本発明によって、多種多様なキットおよび構成要素を、キットの意図された使用者および該使用者の特定の必要性に応じて、調製することができる。
【０３２３】
本発明の好ましい態様において、キットは、薬学的キットであり、かつ（i）SIRT3のレベルまたは活性を増加させる薬剤、および（ii）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。本発明の別の態様において、キットは、薬学的キットであり、かつ（i）AceCS2のレベル、アセチル化状態、または活性を調整する薬剤、および（ii）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。薬学的キットは任意で、病理学的状態、障害、もしくは疾患を処置するために薬学的組成物を用いることができるかもしくは用いるべきであるということまたは本明細書に記載された任意のその他の本方法を記述している取扱説明書を含む。
【０３２４】
本発明のキットのさらなる態様は、当業者が本明細書に記載された方法の変形のいずれかを実施するのを可能にすると考えられる、任意の機能的構成要素を含む。
【０３２５】
前述の発明は、明瞭性および理解のために例証および実施例によって幾分詳細に説明されているが、等価物のある種の変形、変化、改変、および置換が、本発明の精神および範囲から必ずしも逸脱することなく、それらに対してなされ得るということが、本発明の教示に照らして当業者に容易に明白になると考えられる。結果として、本明細書に記載された態様は、本明細書に添付の特許請求の範囲への参照によってのみ決定されている本発明の範囲で、様々な改変、変化などを受ける。当業者は、本質的に同様の結果を生み出すように変化させるか、変更するか、または改変することができる種々の重大でないパラメーターを容易に認識すると考えられる。
【０３２６】
本発明の要素の各々は、複数の態様を含むものとして本明細書に記載されているが、そうでないよう示されない限り、本発明の所与の要素の態様の各々は、本発明のその他の要素の態様の各々と共に用いることができかつ各々のそのような使用は、本発明の別個の態様を形成することが意図されているということが理解されるべきである。
【０３２７】
本明細書で参照された、GenBankデータベース配列に対するアクセッション番号を含む、参照された特許、特許出願、および科学文献は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられるように具体的にかつ個別的に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用した任意の参照と本明細書の具体的な教示との間の任意の矛盾は、後者に有利になるように解決されるものとする。同様に、語または語句の当技術分野で理解されている定義と本明細書で具体的に教示されたような語または語句の定義との間の任意の矛盾は、後者に有利になるように解決されるものとする。
【０３２８】
上記の開示から理解することができるように、本発明は、多種多様な用途を有する。本発明を、例証的であるに過ぎずかつ決して本発明の定義および範囲を限定することが意図されない、以下の実施例でさらに例証する。
【０３２９】
VII. 実施例
実施例1：一般的方法
A. 細胞培養およびトランスフェクション
HEK293、COS-1、およびHeLa細胞を、10％ FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、および100 μg/mL ストレプトマイシンが補充されたDMEM中で培養し、5％ CO2中で37℃で成長させた。リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてHEK293細胞をトランスフェクトした（Chen & Okayama, 1987, Mol Cell Biol 7:2745-52）。HeLaおよびCos-1細胞をFugene 6（Roche）を用いてトランスフェクトした。AceCS2Flag、SIRT3Flag、SIRT3-H248YFlag、もしくはSIRT5Flag を安定に発現するかまたはemptyFlag-対照ベクターpcDNAFlagを含むHEK293細胞株を、800 μg/mLジェネティシン（Invitrogen）を含む完全DME成長培地中での選択によって作製した。
【０３３０】
B. プラスミドおよび変異誘発
全ての発現コンストラクトをPCRに基づく標準的なクローニング戦略を用いて作製しかつ全ての発現コンストラクトをDNAシークエンシングによって確認した。ヒトAceCS2コード配列を、ヒト全長哺乳類遺伝子コレクション（MGC）cDNA（GenBankアクセッション番号：BC039261；Open Biosystemsを通じて入手）から（各々EcoRI制限部位（下線）を含む）PCRプライマー
2009542195.tif 000005
を用いてPCR増幅した。その後、PCR産物を、pcDNA3.1+（Invitrogen）に由来するベクターpcDNAFlagまたはpcDNAHAにクローニングし、C末端Flag-またはヘマグルチニン（HA）-タグ付きのAceCS2を産出した。N末端タンパク質シークエンシング結果に基づいて、成熟AceCS2（アミノ酸残基38〜689）に対応するオープンリーディングフレームをpTrcHis2C（Invitrogen）にクローニングした。成熟ヒトSIRT3（アミノ酸残基102〜399、(Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57)）またはSIRT5（アミノ酸残基12〜310もしくはアミノ酸残基39〜310）をコードする組換え発現ベクターをPCR増幅で構築しかつpTrcHis2C にクローニングした。SIRT3およびSIRT5コード配列のPCR増幅に用いた鋳型は説明された通りであった（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57; North et al., 2003, Mol Cell 11437-44）。本明細書に記載されたプライマー以外のPCR増幅用プライマーは、GenBankに寄託されかつ本明細書に記載された対応する核酸配列から当業者によって推定されることができる。
【０３３１】
部位特異的変異誘発（QuickChange（商標）変異誘発キット；Stratagene）を用いて、AceCS2-K642Q-HA、pTrcHis2C-AceCS2-K642R、およびpTrcHis2C-SIRT3-H248Y（102〜399）を構築した。
【０３３２】
C. 組換えタンパク質の発現および精製
例えば、pTrcHis2C-SIRT3（102〜399）、pTrcHis2C-SIRT3-H248Y（102〜399）、pTrcHis2C-SIRT5（12〜310）、pTrcHis2C-SIRT5（39〜310）、またはpTrcHis2C-AceCS2（38〜689）のいずれかを形質転換した大腸菌DH5α細菌（Invitrogen）を、A600 nm = 0.4まで成長させ、0.5 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて25℃で16時間誘導した。6X Hisタグ付きタンパク質を、Ni-NTAアガロース（Qiagen, Valencia, CA）を用いてネイティブな条件下で4℃で精製した。精製タンパク質を（例えば、サーチュイン保存緩衝剤[50 mM Tris-HCl（pH 9.0）、4 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.5 mM DTT、5％ グリセロール（v/v）]またはAceCS2保存緩衝剤[50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、4 mM MgCl2、10％ グリセロール（v/v）]に対して）透析し、0.5 g/Lに合わせ、-80℃で凍結保存した。組換えAceCS2のアセチル化を誘導するために、タンパク質発現の間、ニコチンアミド（50 mM）を添加した（16時間、25℃）。 
【０３３３】
もとの大腸菌K-12 BW25113および同じ株のCobB欠損単一遺伝子ノックアウト（KO）変異体（JW1106）（Datsenko & Wanner, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-5）を、GenoBaseのSystematic Knock Out Strains of E. coli K-12 Collectionから入手した。CobB欠損KO変異体を一旦非選択的に37℃でコロニー精製し、その後単一遺伝子ノックアウト手順（Datsenko & Wanner, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-5）で用いるアンピシリン耐性を付与するヘルパープラスミドの損失を検査するためにアンピシリン感受性を検査した。アンピシリン感受性コロニーを拡大し、化学的にコンピテントにし（Molecular Cloning: A Laboratory Manual中のSambrock and Russell, 2001 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor), 第1巻, 1.116-1.118ページ）、アンピシリン耐性遺伝子を含む、pTrcHis2C-AceCS2（38〜689）またはpTrcHis2C-AceCS2-K642R（38〜689）を形質転換した。6X Hisタグ付きタンパク質を、上記のように発現させかつ精製した。
【０３３４】
D. 抗体
免疫ブロッティングおよび免疫沈降に用いた抗体は、抗mtHsp70（クローンJG1；Affinity Bioreagents, Neshanic Station, NJ）、抗Hsp90α（StressGen）、および抗マンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（MnSOD）（StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada）、抗チトクロムcオキシダーゼサブユニットIV（クローン20E8-C12；Molecular Probes）、抗Flag M2、またはウサギポリクローナル抗Flag（Sigma-Aldrich）、抗HA（12CA5および3F10；Roche Diagnostics）、アセチル化リジンポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）、抗アクチンC4（ICN Biomedicals）、抗チトクロムc（クローン7H8.2C12；Pharmingen）、抗BRG-1（H88；Santa Cruz Biotechnology）、および抗c-myc（9E10；Santa Cruz Biotechnology）であった。SIRT3抗血清を、記載されたように作製した （Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57）。
【０３３５】
E. SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング
免疫ブロットを増強化学発光（Amersham Pharmacia Biosciences）またはWest SuperSignal試薬（Pierce）で現像した。膜は、ニトロセルロースかまたはポリフッ化ビニリデン（PVDF）（Immun-Blot; Bio-Rad Laboratories）のいずれかであった。
【０３３６】
F. 免疫沈降
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含む氷冷したNP1緩衝剤（1％ NP-40、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で細胞を溶解した。ライセートを16,200 x gで10分間4℃で遠心分離し、アガロースに共有結合した抗FLAGモノクローナル抗体M2を添加した。Flagタグ付きタンパク質を免疫沈降しかつNP1緩衝剤中で4回洗浄した。
【０３３７】
共免疫沈降実験では、300mM NaClを含むNP1緩衝剤を用いた。脱アセチル化アッセイで用いられるべき免疫沈降されたFlagタグ付きサーチュインを500mM NaClを含むNP1緩衝剤中で3回洗浄し、サーチュインデアセチラーゼ緩衝剤（SDAC）（50 mM Tris-HCl (pH 9.0)、4 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 0.5 mM DTT）で2回洗浄した。Flagタグ付きタンパク質を、Flagペプチド（Sigma）を用いて4℃で1時間ビーズからSDAC緩衝剤中に溶出した。
【０３３８】
G. 共焦点顕微鏡
HeLa細胞をカバーガラス上で成長させ、Fugene 6（Roche）を用いてトランスフェクトし、48時間後に3.7％ ホルムアルデヒド/PBS中で固定した。細胞を0.5％ Triton X-100/PBSを用いて5分間室温で透過処理した（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57）。細胞を1％ ウシ血清アルブミンでブロッキングし、モノクローナル抗Flag M2（1:500）およびポリクローナル抗MnSOD（1:300）抗体で共染色し、次いで多重標識実験に好適な抗マウスCy2コンジュゲート抗マウス免疫グロブリンGおよびCy5コンジュゲート抗ウサギ免疫グロブリンG二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）とインキュベートした。カバーガラスをスライドガラス上に載せ、Olympus Bx60顕微鏡およびOlympus PlanApo 60x/1.40油浸対物を備え付けたBioRad Radiance 2000レーザー走査顕微鏡で画像を取得した。
【０３３９】
H. 細胞成分分画およびミトコンドリア内局在
細胞成分分画を、記載されたように行なった（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57; Yang et al., 1997, Science 275:1129-32）。全ての工程を4℃で行なった。簡潔に述べると、細胞を氷冷した緩衝剤A（250 mM スクロース、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM ジチオスレイトール、0.1 mM フェニルメチルフッ化スルホニル、20 mM Hepes-KOH、pH 7.5）中でホモジナイズし、Dounceホモジナイザー（Wheaton）中でホモジナイズした。ホモジナイゼーションを位相差顕微鏡で調べた。ホモジネートを5分間960 x gで2回遠心分離し、核および破壊されていない細胞を全て除去した。ミトコンドリアを遠心分離（7,000 x g、15分）で単離し、緩衝剤Aで2回洗浄し、最後にプロテアーゼ阻害剤が補充されたNP1/150緩衝剤（1％ NP-40 (v/v)、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で溶解した。ミトコンドリア単離後の上清を、100,000 x gで30分間の超遠心分離によって軽い膜画分（LM、ペレット）および細胞質画分（S-100、上清）に分画した。各画分のタンパク質濃度を決定し（DC Protein Assay Bio-Rad Laboratoroies）、等量の各画分を免疫ブロッティングによって解析した。
【０３４０】
ミトプラスト形成およびプロテアーゼ接近可能実験を出版されているプロトコルに従って行なった（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57; Mitochondria, Pon & Schon編中の、Ryan et al., 2001 (Academic Press, 第65巻, 190-213ページ)）。ミトプラストを、プロテイナーゼK（150 μg/mL）を用いて15分間0℃で処理した。2 mM PMSFを添加することによってプロテアーゼ消化を停止させ、ミトプラストを遠心分離によって再び単離し、洗浄し、試料緩衝剤中で溶解した。
【０３４１】
アルカリ処理によるミトコンドリアタンパク質の分画を、記載されたように行なった（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57; Fujiki et al., 1982, J Cell Biol 93:97-102）。洗浄したミトコンドリアのペレットを、新鮮に調製した250 μg/mLの0.1 M 炭酸ナトリウム（pH 11.5）中で再懸濁し、0℃で30分間インキュベートした。ミトコンドリア膜を超遠心分離（100,000 x g、30分、4℃）で沈降させた。ペレットをSDS試料緩衝剤中で再懸濁し、上清中の可溶性タンパク質をトリクロロ酢酸沈殿で濃縮し、SDS試料緩衝剤中で再懸濁した（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57; Fujiki et al., 1982, J Cell Biol 93:97-102）。
【０３４２】
I. N末端タンパク質シークエンシング
AceCS2Flagを安定に発現するHEK293細胞を溶解し、抗Flag免疫沈降に供した。洗浄後、免疫沈降されたAceCS2FlagをSDS-PAGEに供し、ポリ(二フッ化ビニリデン)（PVDF）膜に転写し、ポンソーS染色（Sigma）で可視化し、切断し、かつ標準的プロトコルによるエドマン分解によるN末端シークエンシングのためにStanford PAN Facilityに提出した。
【０３４３】
J. タンパク質酵素アッセイ
1. インビトロ脱アセチル化アッセイ
等モル量の精製した組換えAceCS2および精製した組換えサーチュインを、SDAC脱アセチル化緩衝剤（50 mM Tris-HCl (pH 9.0)、4 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.5 mM DTT）中でNAD+（1 mM）の存在下または非存在下で、ニコチンアミド（NAM、10 mM）の存在下または非存在化で、トリコスタチンA（500 nM）の存在下で32℃で3時間インキュベートした。経時的脱アセチル化実験のために、脱アセチル化反応物のアリコートを示された時点で除去し、10 mM ニコンチンアミドと混合し、さらなる解析まで氷上でインキュベートした。反応物をSDS-PAGEおよび免疫ブロッティングで解析した。
【０３４４】
2. アセチル-CoAシンセターゼ活性
精製したAceCS2の活性を、記載されたように測定した（Methods in Enzymology 中のJones & Lipmann, 1955（Academic Press, 第1巻, 585-591ページ）; Barak et al., 2004, J Mol Biol 342:383-401）。各反応物（0.5 mL）は、100 mM ヒドロキシルアミン（KOHで予め中和した）、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、20 mM 酢酸カリウム、10 mM MgCl2、10 mM ATP、2 mM DTT、および1 mM CoAを含んでいた。化学物質（Sigma）は全て、入手可能な最高純度のものであった。精製したAceCS2（6 μg）の添加前に反応物を35℃で5分間プレインキュベートした。インキュベーションの30分後、0.5 mL 停止溶液（2 N HCl中の10％(w/v) FeCl3、3.3％(w/v)トリクロロ酢酸）を添加し、反応物を氷上で2分間インキュベートした。試料を2分間16,200 x gで遠心分離して濁りを除去し、発生した色を540 nmで測定した。AceCS2を含まない試料はブランクとしての役割を果たし、アセチルリン酸（Sigma）によるアセチルヒドロキサム酸の形成は標準としての役割を果たした（Barak et al., 2004, J Mol Biol 342:383-401）。アセチル-CoAシンセターゼ活性は、CoAの非存在下では検出されなかった。
【０３４５】
K. siRNA阻害 - SIRT3の枯渇
ヒトSIRT3に向けられた二本鎖siRNA（100 nM; Dharmacon; Individual siGENOME duplex D-004827-04-0050、ヒトSIRT3、NM_012239）またはホタルルシフェラーゼGL3対照siRNAを、製造業者の奨めに従ってオリゴフェクトアミン（Invitrogen）を用いてHEK293にトランスフェクトした。トランスフェクション5日後、プロテアーゼ阻害剤、1 μM TSA、および10 mM ニコチンアミドを含むNP1/300緩衝剤中で細胞を溶解した。AceCS2Flagを免疫沈降しかつマススペクトロメトリー用に調製した。
【０３４６】
SIRT3 siRNA二重鎖の配列は以下の通りであった。
センス配列：
2009542195.tif 000006
アンチセンス配列：
2009542195.tif 000007
。
siRNA実験で用いられるオリゴヌクレオチドは、それらの5'末端でリン酸化されていてもよい。
【０３４７】
ルシフェラーゼGL3二重鎖D-001400-01-20は、Elbashir et al.,「Duplexes of 21 -nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.」Nature 411: 494-498 (2001)に記載されている。
【０３４８】
L. ナノスケール液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー
免疫沈降物をSDS-PAGEで分離し、ゲル内消化を本質的に、記載されたように行なった（Hojrup, 2004, Methods Mol Biol 251: 227-44）。トリプシン消化物をAgilent 1100ナノフローシステム（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）を用いた逆相クロマトグラフィーで分離し、直接電子を吹付けてナノエレクトロスプレーイオン源（Proxeon Biosystems, Odense, Denmark）を備え付けた7-tesla Finnigan LTQ-FTマススペクトロメーター（Thermo Electron, Breme, Germany）の中に入れた。ReproSil-Pur C18-AQ 3 μm 樹脂（Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany）を充填した15cmホームプルド（home-pulled）融合シリカエミッター（75 μm内部直径）は逆相カラムとしての役割を果たした。タンパク質消化物を500 nl/分の流量でカラム上に注射し、その後250 nl/分の流量で0.5％酢酸中の5〜40％ MeCNの勾配で溶出した。初期解析のために、マススペクトロメーターを、本質的に記載されたようにデータ依存的様式で開いた（Olson and Mann, 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101:13417-22）。簡潔に述べると、質量範囲m/z 300〜1600の調査MSスペクトルをフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FTICR；m/z 400で解像度50,000）で取得しかつ3つの最も強度の大きいイオンを、FTICRでの選択イオンモニタリング（SIM）走査を用いた正確な質量決定用に選択する一方で、線形イオントラップを用いてMS/MSおよびMS/MS/MSを行なった。
【０３４９】
選択されたイオンの方向付けられた実験を、対象となるm/z範囲で FTICR SIMスキャンを用いて行ない、次いで所定のm/z値のMS2およびMS3を行なった。セントロイド処理され（centroided）かつ合併されたMS/MSスペクトルを、5 ppmのペプチド質量許容誤差および0.6 Daの断片イオン許容誤差でMASCOT検索エンジン（Matrix Science, Boston）を用いてUniprotデータベースに対して検索した。システインのカルバミドメチル化を固定された修飾として設定したのに対し、N末端タンパク質アセチル化、メチオニン酸化、およびリジンアセチル化を可変修飾として許容した。ペプチドは、トリプシン消化性で、切断されない部位が最大限でも3つであることが要求された。同定されたペプチドは全て、MS2およびMS3スペクトルの両方を用いて手作業でバリデーションした。
【０３５０】
実施例2：SIRT3の細胞性標的としてのアセチル-CoAシンセターゼ（AceCS2）の同定
SIRT3、4、または5によって標的され得るリジンがアセチル化されたミトコンドリアタンパク質を同定するための戦略として、チフス菌（Salmonella enterica）由来のアセチル-CoAシンセターゼ（ACS）に見出されるアセチル化リジン残基周囲の領域に対する配列類似性を持つヒトタンパク質の検索を行なった。サーチュインCobBの公知の基質である（Starai et al., 2003, Genetics 163:545-55; Starai et al., 2002, Science 298:2390-2）ので、チフス菌ACSのアセチルリジン含有領域を選んだ。第二の工程で、高い類似性を持つヒトタンパク質を、MITOPROT IIおよびPREDOTAR第1.03版 亜細胞予測ソフトウェア（Small et al., 2004, Proteomics 4:1581-90; Claros and Vincens, 1996, Eur J Biochem 241 :779-86）を用いてそれらのミトコンドリアにおける局在の確率について解析した。検索によって、マウスアセチル-CoAシンセターゼ、AceCS2（Claros and Vincens, 1996, Eur J Biochem 241:779-86）に対する高い配列類似性を示す、ミトコンドリアに局在する確率が高い（MITOPROT II: 0.997; PREDOTAR: 0.94; 最大スコア = 1）ヒトアセチル-CoAシンセターゼタンパク質が得られた。
【０３５１】
実施例3：ミトコンドリアにおけるAceCS2の局在の同定
ヒトAceCS2酵素がミトコンドリアタンパク質であるかどうかを検査するために、ヒトAceCS2のオープンリーディングフレームをクローニングし、HeLa細胞内でFlagタグ付きタンパク質として発現させた。共焦点レーザー走査顕微鏡により、内在性ミトコンドリアマトリックスタンパク質マンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（MnSOD；図1A）について観察された染色パターンと重複するAceCS2Flagのミトコンドリア染色パターンが示された。
【０３５２】
ミトコンドリアにおけるヒトAceCS2の局在をさらに検証するために、AceCS2Flagを安定に発現するヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞から細胞成分画分を調製した。予期した通りに、AceCS2Flagは、SIRT3およびMnSODと共にミトコンドリア画分中で検出された（図1B）。各画分の核マーカータンパク質BRG-1および細胞質マーカータンパク質Hsp90αについての免疫ブロッティングにより、画分の純度が確認された（図1B）。
【０３５３】
AceCS2のミトコンドリア内局在をさらに規定するために、AceCS2Flagを含むミトコンドリアからミトプラストを調製した。ミトプラスト調製によって、外部ミトコンドリア膜が破裂しかつ膜間空間がプロテイナーゼKに接近しやすくなる。ミトプラストのプロテイナーゼKによる処理は、膜間空間タンパク質チトクロームc（Cyt. c）の損失を引き起こしたが、それはミトコンドリアマトリックスタンパク質グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）およびSIRT3に影響を及ぼさなかった（図1C）。AceCS2FlagもミトプラストのプロテイナーゼK処理によって影響を受けず、それがGDHおよびSIRT3と同様、ミトコンドリアマトリックスに局在することを示唆した（図1C）。プロテイナーゼKとミトプラストのインキュベーションの間に非イオン性界面活性剤TX-100を添加した場合、全てのタンパク質がプロテイナーゼKで完全に消化された。（図1C；左のレーン）。
【０３５４】
AceCS2が内部ミトコンドリア膜の内側に一体となって付着しているのかまたはミトコンドリアマトリックス中で可溶性であるのかを明らかにするために、ミトコンドリアを炭酸ナトリウム（pH 11.5）で抽出した。この処理によって、可溶性タンパク質は放出されるが、表在性膜タンパク質は放出されない。AceCS2は炭酸ナトリウム処理で完全に放出されかつ可溶性マトリックスタンパク質SIRT3およびMnSODの様な分布パターンを示した（図1D）。使用した条件下では、表在性膜タンパク質COX-IVは膜と会合したままであった（図1D）。 
【０３５５】
実施例4：AceCS2のN末端シークエンシング
ミトコンドリアマトリックスに行くことになっている核コードタンパク質は多くの場合、ミトコンドリアの外膜のトランスロカーゼ（TOM）複合体によって認識されかつマトリックスへの移入後に切り離される、N末端プレ配列を持つ（Rehling et al., 2004, Nat Rev Mol Cell Biol 5:519-30）。このN末端プレ配列は多くの場合、α-ヘリックスおよび数個の塩基性残基を含む。これらの特徴は、数個のアルギニン残基を含む、ヒトAceCS2のN末端で見出される（図2A）。
【０３５６】
免疫沈降されたAceCS2Flagのエドマン分解によるN末端シークエンシングによって、ミトコンドリアマトリックスでのAceCS2のN末端プロセッシングと一致して、オープンリーディングフレームの最初の37アミノ酸残基がタンパク質から失われているということが明らかとなった。液体クロマトグラフィーが連結されたタンデムマススペクトロメトリー（LC-MS/MS）による免疫沈降されたAceCS2FlagのN末端アミノ酸としてのアラニン38の同定によって、タンパク質シークエンシング結果が確認された（データ示さず）。成熟AceCS2タンパク質のN末端のすぐ上流のミトコンドリアマトリックスプロセッシングペプチダーゼ（MPP）R-2モチーフの存在により、AceCS2がミトコンドリアマトリックスでMPPによってプロセッシングされるということが示唆される（図2；Ito, 1999, Biochem Biophys Res Commun 265:611-6）。これらの知見により、ミトコンドリアマトリックスにあるヒトミトコンドリアアセチル-CoAシンセターゼの存在が確認される。
【０３５７】
実施例5：保存されたLys642アミノ酸残基の変異はAceCS2酵素活性を無効にする
ヒトおよびマウスAceCS2ならびにその他の種由来のアセチル-CoAシンセターゼとチフス菌ACSの活性部位領域の保存性に基づいて（図3A）、Lys642の変異が、HEK293細胞から免疫沈降した過剰発現されたヒトAceCS2のアセチル-CoAシンセターゼ活性に影響を及ぼすかどうかということを検査した。構成的にアセチル化されたリジン残基を模倣する、Lys642のグルタミンとの交換によって、完全に不活性なAceCS2タンパク質が産出され（図3B）、Lys642がAceCS2機能にとって決定的に重要であるということが示された。野生型AceCS2および変異体AceCS2-K642Q両方とも、同様のレベルで発現した（図3C）。
【０３５８】
実施例6：ヒトAceCS2はインビボでアセチル化されている
ヒトAceCS2がインビボでアセチル化されているかどうかを明らかにするために、低分子干渉RNA（siRNA）を介したSIRT3のノックダウンの後でAceCS2Flagを細胞から免疫沈降しかつマススペクトロメトリー用に調製した。トリプシン消化物のLC-MS/MS解析により、AceCS2の位置642におけるアセチル化リジン残基（acK）の存在が示された（図4）。
【０３５９】
実施例7：サーチュインCobBを欠く大腸菌で発現されたヒトAceCS2の高アセチル化
チフス菌と同様に、大腸菌はサーチュインCobBを含む。進化の全体を通じたアセチル-CoAシンセターゼタンパク質の制御におけるサーチュインを介した脱アセチル化の潜在的に保存された役割を仮定して、サーチュインCobBを欠く大腸菌K-12株におけるヒトAceCS2の発現がAceCS2の高アセチル化を誘導するかどうかを検査した。CobBノックアウト株から精製したヒトAceCS2は、もとのCobB野生株から精製したヒトAceCS2よりも強くアセチル-リジン特異的抗体と反応した（図5A）。アセチル化され得ない、Lys642のアルギニンへの変異によって抗アセチル-リジン抗体との反応性が無効になったので、このアセチル化はAceCS2 Lys642に特異的であった（図5A；右のレーン）。アセチル-リジン特異的抗体の特異性を、キャリアタンパク質に連結した合成ペプチドの免疫ブロット解析によってさらに確認した（図5B）。アセチル-リジン特異的抗体はアセチル化K642残基を含むペプチドとのみ反応しかつ非アセチル化K642を含むペプチドとの反応性を何ら示さなかった（図5B）。
【０３６０】
実施例8：ニコチンアミドによるサーチュイン活性の阻害は組換えヒトAceCS2の高アセチル化を結果的にもたらす
サーチュイン活性を阻害することのヒトAceCS2のアセチル化状態に対する効果を調べた。野生型大腸菌株（DH5α；Invitrogen）のサーチュイン阻害剤ニコチンアミドによる処理によって、組換えヒトAceCS2の高アセチル化が結果的にもたらされた（図6A）。ニコチンアミド処理は位置642にアルギニン残基を持つ変異体AceCS2タンパク質のアセチル化を誘導しなかったので、このアセチル化の増加は、AceCS2のLys642に特異的であった（図6A；右のレーン）。ニコチンアミド処理した細菌由来の精製された組換えAceCS2のLC/MS-MSによる解析によって、AceCS2の活性部位中の1つのリジン、Lys642のアセチル化が検証された（図6B）。
【０３６１】
実施例9：内在性SIRT3レベルの低下はAceCS2のアセチル化を増加させる
SIRT3が細胞内でAceCS2を脱アセチル化する際に役割を有するかどうかということをさらに検討するために、AceCS2Flag発現HEK293細胞をSIRT3に対するsiRNAまたは対照siRNAで処理しかつ免疫沈降したAceCS2Flagのアセチル化状態を、アセチル化リジンに対する抗体を用いた免疫ブロッティングによって調べた（図7）。内在性SIRT3のノックダウン後、AceCS2Flagのアセチル化は増加しており、SIRT3がインビボでAceCS2Flagアセチル化に影響を及ぼすということが示唆された（図7）。
【０３６２】
実施例10：SIRT3はAceCS2を脱アセチル化し、SIRT4およびSIRT5はAceCS2を脱アセチル化しない
チフス菌ACSにおける活性部位リジンのアセチル化は、酵素を不活性化する（Starai et al., 2002, Science 298:2390-2）。ACSを脱アセチル化する、チフス菌CobBは、ヒトSIRT5と最も密接に関連するクラスIIIサーチュインである。SIRT5はミトコンドリアに局在しかつN末端プロセッシングを受ける（Michishita et al., 2005, Mol Biol Cell 16:4623-35）。SIRT5がAceCS2を脱アセチル化することができるかどうかを検査するために、インビトロ脱アセチル化アッセイを行なった。HEK293細胞から免疫沈降されたFlagタグ付きサーチュインを、Northらによって説明されたように調製した（North et al., 2003, Mol Cell 11:437-44）。免疫沈降されたFlagタグ付きSIRT5は、化学的にアセチル化されたH4ペプチドに対して低いが検出可能な活性を有する（North et al., 2003, Mol Cell 11:437-44）が、それはAceCS2を脱アセチル化できなかった（図8A）。対照的に、免疫沈降したFlagタグ付きSIRT3は、NAD+依存的な様式でAceCS2を脱アセチル化した（図8A）。何ら報告された脱アセチル化活性を持たない別のミトコンドリアサーチュインである（North et al., 2003, Mol Cell 11:437-44）、Flagタグ付きSIRT4は、AceCS2を脱アセチル化しなかった（データ示さず）。
【０３６３】
SIRT3およびSIRT5に関する知見を確認するために、組換えサーチュインを発現させかつ精製した。SIRT5はN末端で切断されるという知見（Michishita et al., 2005, Mol Biol Cell 16:4623-35）およびそのN末端における2つの推定MPP R-2モチーフの存在に基づいて、それぞれ、最初の11個のアミノ酸残基（Δ11-SIRT5myc-His）かまたは38個のアミノ酸残基（Δ38-SIRT5myc-His）のいずれかを欠く、2つの異なる組換えSIRT5タンパク質を用いた。この場合もやはり、組換えSIRT3がAceCS2を効果的に脱アセチル化したのに対し、両組換えSIRT5タンパク質はそうすることができなかった（図8B）。予期した通り、SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化はNAD+の存在に厳密に依存していた（図8B）。また、サーチュイン阻害剤ニコチンアミドは、 SIRT3によるAceCS2の脱アセチル化を完全に妨害しかつ触媒不活性なSIRT3-H248Y変異体（Schwer et al., 2002, J Cell Biol 158:647-57）は、NAD+の存在にもかかわらず、AceCS2を脱アセチル化しなかった（図8C）。
【０３６４】
実施例11：SIRT3はAceCS2と共免疫沈降しかつ細胞内でAceCS2を脱アセチル化する
SIRT5が細胞内でAceCS2を脱アセチル化するかどうかを明らかにするために、AceCS2HAおよびSIRT3FlagまたはSIRT5Flag をCOS-1細胞で共発現させた。AceCS2HAを免疫沈降しかつ免疫複合体をアセチル化リジンに対する抗体で解析した（図9A）。SIRT3の過剰発現は異所的に発現したAceCS2のアセチル化レベルを減少させたが、ずっとより高い発現レベルにも関わらず、SIRT5は何ら効果を有しなかった（図9A）。
【０３６５】
興味深いことに、内在性SIRT3はHEK293細胞からAceCS2Flagと共免疫沈降する（図9B）。上記の知見と合わせると、これにより、SIRT3はミトコンドリアAceCS2の正真正銘のデアセチラーゼであるということが示唆される。
【０３６６】
実施例12：AceCS2のアセチル化はその酵素活性を低下させる
ヒトAceCS2の発現の間の大腸菌のニコチンアミド処理がそのアセチル化のレベルを著しく増加させるという知見に基づいて、Lys642でのAceCS2のアセチル化がそのアセチル-CoAシンセターゼ活性を制御するかどうかを調べた（図10A）。ニコチンアミドで処理したかまたは処理していない、大腸菌から精製したAceCS2の特異的活性の測定により、高アセチル化AceCS2は有意により低い特異的活性を有するということが示された（図10B）。これらの観察により、AceCS2のアセチル化は、ACSについて細菌で示されていること（Starai et al., 2002, Science 298:2390-2）と一致して、その酵素活性を阻害するということが示唆された。
【０３６７】
この仮説をさらに検査するために、ニコチンアミド処理した大腸菌から精製した高アセチル化AceCS2をNAD+の存在下でSIRT3とインキュベートした。この処理によって、AceCS2の完全な脱アセチル化が引き起こされた（図10C）。NAD+を反応から除いた場合、または触媒不活性なSIRT3変異体（H248Y）を用いた場合、AceCS2の脱アセチル化は観察されなかった（図10C）。
【０３６８】
さらに、上記のような、異なるレベルのアセチル化があるAceCS2の酵素活性の測定により、SIRT3による脱アセチル化が酵素活性の著しい増加と関連することが示された（図10D）。
【０３６９】
さらなる実験において、AceCS2のSIRT3およびNAD+とのインキュベーションは、経時的にAceCS2の漸進的な脱アセチル化を引き起こし、それは不活性なSIRT3-H248Y変異体では観察することができないということが分かった（図10E）。この場合もやはり、AceCS2の脱アセチル化は、酵素活性の漸進的な増加と関連していた（図10F）。本明細書で提示したデータに基づき、Lys642のアセチル化状態がヒトミトコンドリアAceCS2の活性を制御すると結論付けられる。
【０３７０】
実施例13：まとめおよび考察
チフス菌では、タンパク質アセチルトランスフェラーゼPatによるACSのアセチル化が酵素を不活性化し、その一方でサーチュインCobBによる脱アセチル化がそれを再活性化する（Starai et al., 2002, Science 298:2390-2; Starai et al., 2004, J Mol Biol 340:1005-12）。アセテート、ATP、およびCoAからのアセチル-CoAの形成を結果的にもたらす、アセチル-CoAシンセターゼ反応は2段階で進行する。第一段階では、アセテートがアセチルアデノシン一リン酸（アセチル-AMP）へと活性化される。第二段階では、アセチル-AMPがACSのチオエステル形成活性によってアセチル-CoAに変換されかつアセチル-CoAおよびAMPが連続的に放出される（Starai et al., 2004, Cell Mol Life Sci 61:2020-30で概説されている）。細菌ACSの活性部位リジン（Lys609）のリジンアセチル化がアセテートのアセチル-AMPへのATP依存的アデニル化を特異的に阻害するのに対し、ACS反応の第二段階は影響を受けないままであるということが示されている（Starai, et al., 2002, Science 298:2390-2）。図3Aで例証したように、AceCS2のLys642は、チフス菌由来のACSの活性部位リジンLys609に対応する。ACSとヒトAceCS2の間の活性部位領域の保存性を考慮すると、AceCS2のLys642のアセチル化は、アセテートのアセチル-AMPへの活性化を伴う第一の反応段階と干渉するということが提案される。
【０３７１】
AceCS2は、可逆的リジンアセチル化によって制御されているミトコンドリアタンパク質の最初の例でありかつミトコンドリアサーチュインデアセチラーゼの最初の標的タンパク質である。可逆的リジンアセチル化によるAceCS2の調節の図式的概観を図11に示す。本明細書で提示したデータは、SIRT3によるAceCS2の活性化が進化的に保存された代謝制御機構であるというモデルを支持する。「アセテートスイッチ」と称される、アセチル-CoA（昔は「活性化アセテート」として知られた）とアセテートの相互変換が、古細菌、真正細菌、および真核生物に存在し、かつNAD+を回収し、ATPを産生し、かつ補酵素A貯蔵を補充する機会を細胞に提供する（Wolfe, 2005, Microbiol Mol Biol Rev 69: 12-50で概説されている）。アセテートスイッチは、アセテート除去酵素アセチル-CoAシンセターゼによって制御される。TCA回路ならびにコレステロールおよび脂肪酸生合成におけるエネルギー産生などの代謝経路は、アセチル-CoAを中間体として必要とする。
【０３７２】
酵母は、成長のためにアセチル-CoAシンセターゼを決定的に必要とするが、これは哺乳類細胞については当てはまらない。哺乳類細胞内のアセチル-CoA の大部分は、アセチル-CoA シンセターゼ活性に依存していない経路で産生される。これらは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびβ-酸化によるピルピン酸のアセチル-CoAへの変換であり、それが最終産物としてのアセチル-CoAの形成を結果的にもたらす。しかしながら、哺乳類では、幾つかの状況下において、アセチル-CoAシンセターゼによって活性化される必要がある大量のアセテートが産生される。例えば、長期にわたる絶食または糖尿病などのケトン体形成状態下において、肝臓は相当量のアセテートを血流中に放出する（Buckley and Williamson, 1977, Biochem J 166:539-45; Seufert et al., 1974, Biochem Biophys Res Commun 57:901-9; Yamashita et al., 2001, Biochim Biophys Acta 1532:79-87）。さらに、アセテートを産生する、肝臓のアセチル-CoAヒドロラーゼが、ケトン体形成状態下で活性化される（Matsunaga et al., 1985, Eur J Biochem 152, 331-6）。肝外組織での放出されたアセテートの利用は、アセチル-CoAシンセターゼの作用を必要とする。AceCS2は、心臓および骨格筋に豊富にあるが肝臓にはなくかつケトン体形成状態下で誘導されるという知見により、AceCS2はケトン体形成状態下でのエネルギー産生のためのアセテート変換に重要な役割を果たしているということが示唆される（Fujino et al., 2001, J Biol Chem 276, 11420-6）。細菌サーチュインがチフス菌でアセチル-CoAシンセターゼの活性を制御するという知見および3界全てにおけるサーチュインの存在に基づいて、中枢代謝とサーチュインの間の普遍的関係が提案されている（Starai et al., 2003, Genetics 163, 545-55; Starai et al., 2002, Science 298, 2390-2）。AceCS2をその活性部位リジンのアセチル化によって不活性化しかつミトコンドリアサーチュインによって再活性化することができるということを示す本明細書に記載された知見は、これらの主張を支持しかつ細菌から哺乳類までのミトコンドリアのこれらの経路の保存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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