(57)【要約】  本発明は、形質転換成長因子ベータ、またはその機能的アナログを、二量体の生物活性型に折り畳むための方法に関する。該方法は、２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、またはその機能的アナログ、および低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系を含有する溶液に、可溶化した折り畳まれていない単量体成長因子を添加するステップを伴う。その後該溶液を、二量体の生物活性のある形質転換成長因子ベータの生成に適した条件下でインキュベートする。
2009529571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、またはその機能的アナログと、
（ｉｉ）低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系と、
を含む溶液に、可溶化した折り畳まれていない単量体成長因子を添加するステップと、
二量体の生物活性のある成長因子が形成されるまで、前記溶液中で前記成長因子をインキュベートするステップと、を備える、
形質転換成長因子ベータ、またはその機能的アナログを、二量体の生物活性型に折り畳むための方法。
【請求項２】
ＣＨＥＳは、約１００ｍＭ〜１．０Ｍの濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約０．７ＭのＣＨＥＳが使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＨＥＳの前記機能的アナログは、式：
2009529571.tif 000019
（Ｉ）
で定義され、式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じまたは異なり、水素、置換または非置換Ｃ１−１４アルキル基、置換または非置換Ｃ３−８シクロアルキル基、あるいは置換または非置換芳香核から成る群より選択され、またはＲ１およびＲ２は、最大で１０個の原子を有する環系をともに形成し、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＲ３−、−ＣＨＲ４−、および−ＣＨＲ５−より独立して選択され、式中、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同じまたは異なり、置換または非置換Ｃ１−１４アルキル基、置換または非置換Ｃ３−８シクロアルキル基、または置換または非置換芳香核から成る群より選択され、またはＲ３、Ｒ４、およびＲ５のうちのいずれか２つは、Ｘ１およびＸ２のうちの少なくとも１つが−ＣＨＲ４−または−ＣＨＲ５−であるという条件で、最大で６個の炭素原子を有する環系をともに形成することができ、
Ｘ３は、Ｃ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、またはＰ−ＯＨより選択される、
いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＨＥＳの前記機能的アナログは、式：
2009529571.tif 000020
（Ｉａ）
で定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＨＥＳの前記機能的アナログは、式：
2009529571.tif 000021
（Ｉｂ）
で定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＣＨＥＳの前記機能的アナログは、式：
2009529571.tif 000022
（Ｉｃ）
で定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、その酸化および還元型でグルタチオンである、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、約２００μＭ〜２０ｍＭの還元グルタチオン、および４０μＭ〜４ｍＭの酸化グルタチオンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換成長因子ベータは、８〜１０のｐＨでインキュベートされる、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換成長因子ベータは、約８．５から９．５の間のｐＨでインキュベートされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換成長因子ベータは、０℃〜３７℃の温度でインキュベートされる、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項１３】
前記形質転換成長因子ベータは、０．１から０．５ｍｇ／ｍＬの間の濃度の前記溶液に添加される、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項１４】
前記形質転換成長因子ベータは、形質転換成長因子ベータ３である、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質転換成長因子ベータ３は、０．１２から０．２５ｍｇ／ｍＬの間の濃度の前記溶液に添加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
折り畳みは、０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５といった条件下で行われる、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項１７】
折り畳みは、０．７ＭのＣＨＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．２５ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃／室温でｐＨ９．５といった条件下で行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
タウロデオキシコール酸塩も、前記溶液に添加される、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換成長因子は、１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度のタウロデオキシコール酸塩でインキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
形質転換成長因子は、約３０ｍＭの濃度のタウロデオキシコール酸塩でインキュベートされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
折り畳みは、３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５といった条件下で行われる、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項２２】
折り畳みは、３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．２５ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５といった条件下で行われる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換成長因子ベータは、前記溶液中のタンパク質の５０％以上を表す、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項２４】
前記低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、前記形質転換成長因子ベータが前記体系を含有する前記溶液に添加される前に、約７時間にわたって構成および熟成される、いずれの前請求項に記載の方法。
【請求項２５】
原核生物宿主から活性形質転換成長因子を産生する方法であって、
（Ａ）前記形質転換成長因子ベータスーパーファミリの構成要素を発現するように形質転換された原核生物の発酵と、
（Ｂ）封入体の分離および前記封入体からの発現タンパク質の回復と、
（Ｃ）本発明の第１の側面により、前記形質転換成長因子スーパーファミリの前記構成要素を折り畳み直すステップと、
（Ｄ）前記形質転換成長因子スーパーファミリの前記折り畳み直した構成要素の精製と、
を備える方法。
【請求項２６】
ステップ（Ａ）では、前記原核生物宿主は、形質転換成長因子を符号化する発現ベクタで形質転換された細菌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（Ｃ）では、前記成長因子は、請求項１〜２４のいずれか１項により折り畳み直される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
形質転換成長因子ベータは、ステップ（Ｄ）により、限外ろ過およびイオン交換クロマトグラフィによって精製される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記イオン交換クロマトグラフィは、その後に陽イオン交換クロマトグラフィを行う、疎水性相互作用クロマトグラフィを備え、前記形質転換成長因子ベータ成長因子は、溶液中で所望の濃度で配合されてバイアルに入れられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法は、前記成長因子が、溶液中で所望の濃度で配合されてバイアルに入れられる、更なるステップ（Ｅ）を備える、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は、図１０で定義されるような前記ステップ（Ａ）〜（Ｅ）を原則的に備える、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、タンパク質を活性型に折り畳む、または折り畳み直すための方法に関する。本発明は、具体的には、形質転換成長因子ベータスーパーファミリの構成要素の折り畳みに関する。
【０００２】
成長因子の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリは、細胞外タンパク質の増殖、移動、アポトーシス、付着、分化、炎症、免疫抑制、および発現を含む多くの細胞過程の調節に関与する。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、骨形成タンパク質（ＢＭＰ１〜１６）、成長および分化因子（ＧＤＦ１〜１６）、およびアクチビン／インヒビンを含む。
【０００３】
ＴＧＦ−ベータ１、２、および３と呼ばれるＴＧＦ−ベータの３つの哺乳類イソ型がある。ＴＧＦ−ベータは、実質的に全ての細胞型（例えば、上皮、内皮、造血、神経、および結合組織細胞）によって産生される。ＴＧＦ−ベータは、１００ｋＤａ潜伏不活性前駆体分子（ＬＴＧＦ−ベータ）として分泌される。ＬＴＧＦ−ベータ分子は、（ａ）Ｃ末端２５ｋＤａ二量体シグナルペプチド（活性フラグメント）および（ｂ）潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）から成る。ＬＴＧＦ−ベータは、フリン、プラスミン、トロンビンなどのエンドペプチダーゼ、および細胞周囲空間の酸性化による、活性フラグメントからのＬＡＰの分裂によって活性化される。解放された活性ＴＧＦ−ベータ二量体フラグメントは、疎水性相互作用およびサブユニット間ジスルフィド架橋によって安定化される。さらに、各単量体は、４つのジスルフィド内結合のうちの３つによって連結されるいくつかの延長ベータ鎖を備え、「システイン節」として知られる堅固な構造を形成する。
ＴＧＦ−ベータファミリタンパク質は、多数の医療目的に対して提案されている。これらは、瘢痕化の減少、創傷治癒の推進、および種々の部位の損傷または病変組織の置換の刺激を含む。このような部位は、皮膚、骨、軟骨、神経組織、結合組織（例えば、腱および靱帯）、眼組織、肝臓、および血管などを含む。ＴＧＦ−ベータ１およびＴＧＦ−ベータ２は、実験動物モデルにおいて創傷治癒を加速することが示されており、一方でその阻害は後の瘢痕形成を軽減する。ＴＧＦ−ベータ３も、動物モデルおよびヒトの両方において瘢痕化を有意に減少させ、２００６年に、薬剤としての使用に対する規制認可の取得に最も近いスーパーファミリの構成要素の１つを代表している。
【０００４】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリの構成要素のそのような臨床用途は、有意量の活性成長因子を産生するための効率的な方法が利用可能となることを必要とすることが、十分理解されるであろう。
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリの構成要素は、長年にわたって組み換え手段によって分離または産生されている。一例として、ＴＧＦ−ベータ３は、１９８０年代に、ヒト血小板、ヒト胎盤、およびウシ腎臓から最初は精製された。ＴＧＦ−ベータ３の治療可能性を考慮して、組み換え方法によってこのタンパク質を産生するために、多数の試行が行われてきた。それらは、天然の生物活性のあるＴＧＦ−ベータ分子（８つの鎖内ジスルフィド結合および１つの鎖間ジスルフィド結合があるホモ二量体タンパク質）の複雑性のために、最初は真核生物で発現した（例えば、ＥＰ０２００３４１Ｂ１を参照）。しかし、真核生物発現は、比較的低い発現レベルを結果としてもたらし、高い加工費にも関連した。
したがって、原核生物宿主を調査した。しかし、微生物宿主は、活性型に折り畳むために成長因子に必要な複数のジスルフィド結合を正しく形成することができないことが分かった。異常な折り畳み構造のタンパク質は、宿主細胞内の不溶性封入体として形成し、このような封入体は、その後に再生を行う可溶化を必要とし、タンパク質がその天然生物活性立体構造に折り畳むことを可能にした。
【０００５】
原核生物宿主からの活性成長因子の形成と関連する問題を克服するために、多数の試行が行われてきた。例えば、米国５，９２２，８４６、米国５，６５０，４９４、およびＥＰ−Ｂ−０４３３  ２２５は、封入体からのＴＧＦ−ベータファミリタンパク質の再生のための方法を提案している。しかし、これらの方法のいずれも、臨床等級成長因子の産生のための迅速かつ効率的な方法を提供しない。例えば、本発明者らは、上記の特許で検討された従来技術の折り畳み直しの方法の多くが無効であることを見出している。さらに、本発明者らは、最も好ましい従来技術の畳み直しの条件（例えば、０．０５Ｍのトリス、１ＭのＮＤＳＢ−２０１、２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、２％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、１ＭのＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）のＧＳＨ、０．２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．３）でさえも、成長因子を折り畳み直すのに約７日かかり得ることを見出している。この折り畳みの時間は、ｃＧＭＰ製造の許容できない遅延を表し、大量の成長因子が必要な場合に望ましくない高い運用費を結果としてもたらす。
したがって、形質転換成長因子ベータスーパーファミリの構成要素を折り畳む、または折り畳み直すための従来技術の方法と関連する問題を克服することが、本発明の目的である。
【０００６】
本発明の第１の側面によれば、
（ｉ）２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）またはその機能的アナログと、
（ｉｉ）低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系と、
を含む溶液に、可溶化した折り畳まれていない単量体成長因子を添加するステップと、
二量体の生物活性のある成長因子が形成されるまで、溶液中で成長因子をインキュベートするステップとを備える、
形質転換成長因子ベータ、またはその機能的アナログを、二量体の生物活性型に折り畳むための方法が提供される。
本発明は、従来技術の折り畳みの方法を改良するための試行で行われた、本発明者らによって行われた実験に基づく。
【０００７】
形質転換成長因子（ＴＧＦ−ベータ）は、任意のＴＧＦ−ベータ（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３）であってよい。しかし、ＴＧＦ−ベータはＴＧＦ−ベータ３（ＴＧＦ−β３）であることが好ましい。
「その機能的アナログ」とは、野生型成長因子の生物活性を保持するＴＧＦ−ベータの変異体を意味する。機能的アナログは、好ましくはタンパク質であり、成熟形態では、長さが約１１２個のアミノ酸の２つの単量体ポリペプチドの二量体を備えることができるが、機能的アナログは、野生型と比較すると、切断型または伸長型であってよいことが十分理解されるであろう。該用語は、野生型と比較すると、活性を保持する、または向上さえした、野生型ＴＧＦ−ベータ、特にＴＧＦ−ベータ３の突然変異体も包含する。本発明者らは、本発明の方法は、そのような突然変異体の折り畳みまたは折り畳み直しにも適用できることを見出した。
本発明で定義されるような「折り畳み」は、以前に折り畳まれたタンパク質の「折り畳み直し」を包含し、タンパク質のこの折り畳み直しは、本発明によって包含されるより広範の折り畳みの好ましい一部を構成することが、十分理解されるであろう。
【０００８】
ＥＰ  ０  ４３３  ２２５は、変性単量体が二量体化し、生物活性型を取ることを可能にすると言われている、多種多様の「折り畳み直しの条件」を検討している。ＥＰ  ０  ４３３  ２２５は、そのような条件が、「可溶化剤」およびチオール／ジスルフィドの対の継続的な酸化および還元を可能にする酸化還元系の存在を含むべきであることを開示している。それは、洗剤、有機水混和性溶媒、およびリン脂質、または２つ以上のそのような薬剤の混合物を含む、そのような可溶化剤の長いリストをさらに検討している。明細書で検討されている洗剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴｒｉｔｏｎまたはＴｗｅｅｎ、非イオン中性洗剤（例えばジギトニン）、陽イオン中性洗剤（例えば、Ｎ−［２，３−（ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）、陰イオン中性洗剤（例えば、コール酸塩ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、および両性イオン中性洗剤（例えば、スルホベタイン（両性洗浄剤）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルホン酸塩（Ｃｈａｐｓ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホン酸塩（Ｃｈａｐｓｏ）などの表面活性化合物を含む。
本発明者らは、ＥＰ  ０  ４３３  ２２５で検討されているものを含む種々の洗剤を試すことを決定し、試した洗剤のほとんどが、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリの構成要素を折り畳む、または折り畳み直すのに無効であったが、機能したものは、有用な量の活性成長因子を産出するのに受け入れられない時間がかかったことを見出して驚いた。実施例の表１および２は、無効であったそのような多数の洗剤を解説している。しかし、本発明者らが驚いたことには、本発明の第１の側面に従った、低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系と組み合わせた、２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、およびそのアナログの使用は、正しく折り畳まれた二量体成長因子を産生するのに特に有効であったことを見出した。
【０００９】
本発明者らは、本発明の第１の側面による方法は、従来技術の方法よりも有意な改良を表すことを見出した。該方法は、文献中で以前に開示された方法と比較して、過程のスピードの有意な向上を結果としてもたらす。本発明の方法の好ましい実施形態では、成長因子の折り畳みは、５日以内、好ましくは３日以内、より好ましくは２日以内、最も好ましくは折り畳み過程の開始約２４時間後に、完了することができる。
「２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸またはそのアナログ」という用語とは、洗剤ＣＨＥＳ、およびＣＨＥＳの折り畳み直し特性を保持するその化学アナログを意味する。
【００１０】
本発明の方法に従って使用することができるＣＨＥＳの適切なアナログは、式：
2009529571.tif 000003
（Ｉ）
で定義され、式中、
Ｒ１およびＲ２は、同じまたは異なり、水素、置換または非置換Ｃ１−４アルキル基、置換または非置換Ｃ３−８シクロアルキル基、あるいは置換または非置換芳香核から成る群より選択され、またはＲ１およびＲ２は、最大で１０個の原子を有する環系をともに形成し、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ２）−、−ＮＲ３−、−ＣＨＲ４−、およびＣＨＲ５より独立して選択され、式中、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同じまたは異なり、置換または非置換Ｃ１−４アルキル基、置換または非置換Ｃ３−８シクロアルキル基、または置換または非置換芳香核から成る群より選択され、またはＲ３、Ｒ４、およびＲ５のうちのいずれか２つは、Ｘ１およびＸ２のうちの少なくとも１つが−ＣＨＲ４−または−ＣＨＲ５−であるという条件で、最大で６個の炭素原子を有する環系をともに形成することができ、
Ｘ３は、Ｃ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、またはＰ−ＯＨより選択される。
【００１１】
Ｒ１−５のうちの１つ以上がアルキル基である場合、含有する炭素原子の数により、それらは正常、二次、三次、またはイソ基であってよい。Ｒ１−５に対する適切なアルキル基の例は、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ｎ−Ｂｕ、ｓｅｃ−Ｂｕ、およびＥ−Ｂｕ基である。
Ｒ１−５のうちの１つ以上が脂環式である場合、それらは好ましくは、置換または非置換シクロヘキシル基で、最も好ましくは非置換である。
【００１２】
Ｒ１−５のうちの１つ以上が芳香族である場合、それらは好ましくは、置換または非置換フェニル基である。
好ましくは、Ｒ１は水素で、Ｒ２はシクロヘキシルである。代わりに、または加えて、Ｘ１およびＸ２は好ましくは、−ＣＨ２−であり、代わりに、または加えて、Ｘ３は−Ｓ＝Ｏである。
【００１３】
本発明で採用することができる化学式（Ｉ）の化合物の好ましい例は、
2009529571.tif 000004
（Ｉａ）
（つまり、Ｘ１およびＸ２がともに−ＣＨ２−であり、Ｘ３がＳ＝Ｏである、化学式（Ｉ）の化合物）、
2009529571.tif 000005
（Ｉｂ）
（つまり、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がシクロヘキシルであり、Ｘ３がＳ＝Ｏである、化学式（Ｉ）の化合物）、および、
2009529571.tif 000006
（Ｉｃ）
（つまり、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がシクロヘキシルであり、Ｘ１およびＸ２がともに−ＣＨ２−である、化学式（Ｉ）の化合物）である。
化学式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）のそれぞれの好ましい実施例はＣＨＥＳ、つまり、
2009529571.tif 000007
である。
【００１４】
本発明者らは、ＣＨＥＳ、および低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、成長因子を折り畳むために単独で使用してよいことを確立している。しかし、本発明の一部の実施形態では、本発明者らは、ＣＨＥＳは、洗剤／折り畳み活性を有する他の薬剤と有利に組み合わせてもよいことを見出している。そのような薬剤は、タウロデオキシコール酸塩、イソプロピルアルコール、アルギニンＨＣｌ、非洗剤Ｓｕｌｐｈｏｂｅａｔｉｎｅ−２０１、および非洗剤Ｓｕｌｐｈｏｂｅａｔｉｎｅ−２１１を含む。
該溶液は、約１０ｍＭから２．０ＭのＣＨＥＳの濃度、より好ましくは１００ｍＭ〜１．０Ｍ、最も好ましくは約０．７ＭのＣＨＥＳを備えることが好ましい。
【００１５】
ＣＨＥＳの上記の濃度はまた、ＣＨＥＳを他の薬剤と組み合わせる場合にも使用してもよい。例えば、折り畳み直しを推進する薬剤の好ましい組み合わせは、約３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩および０．７ＭのＣＨＥＳである。
「低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系」という用語は、溶液中のジスルフィド結合の形成を可能にする体系を意味する。適切な体系は、その酸化および還元型でのグルタチオン、その酸化および還元型でのジチオトレイトール、その酸化および還元型でのベータ−メルカプトエタノールまたはベータ−メルカプトメタノール、その還元型でのシステイン、およびその還元型でのシスタミンなどの試薬の組み合わせを含む。これらの試薬は、約１μＭから２５０ｍＭ、特に約１００μＭから１０ｍＭの濃度で使用してよい。酸化および還元型に対するそのような体系のモル比は、１００：１から１：１００の間、特に６：１から１：６の間であってよい。
【００１６】
低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、その還元（ＧＳＨ）および酸化（ＧＳＳＧ）型でのグルタチオンの使用を備える。好ましくは、溶液は、約２０μＭ〜２００ｍＭの還元グルタチオン、より好ましくは約２００μＭ〜２０ｍＭの還元グルタチオン、最も好ましくは約２ｍＭの還元グルタチオンを含有する。溶液はまた、約４μＭ〜４０ｍＭの酸化グルタチオン、より好ましくは約４０μＭ〜４ｍＭの酸化グルタチオン、最も好ましくは約４００μＭの酸化グルタチオンを含有してもよい。
従って、好ましい低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、２００μＭ〜２０ｍＭの還元グルタチオン、および４０μＭ〜４ｍＭの酸化グルタチオンを備えてよい。ＧＳＨ：ＧＳＳＨの正確な比は、どの成長因子が折り畳まれているか、溶液のｐＨ、および本発明の方法で採用されるＣＨＥＳのアナログを含む、多数の要因に左右される。一例として、ＴＧＦ−ベータ３を折り畳むための好ましい低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、約２ｍＭの還元グルタチオンおよび約４００μＭまたは約２ｍＭどちらかの還元グルタチオンを備える。
【００１７】
下記でより詳細に説明されるように、本発明の好ましい実施形態では、低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系は、ＴＧＦ−ベータを折り畳み直すために使用する前に、「熟成」することができる。
成長因子を折り畳むための好ましい方法は、低分子量スルフヒドリル／ジスルフィド酸化還元系としての、ＧＳＨおよびＧＳＳＧと組み合わせたＣＨＥＳの使用を伴う。好ましい条件の例は、折り畳まれていない成長因子を、
（ａ）０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、および０．４ｍＭのＧＳＳＧ、
（ｂ）３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、および０．４ｍＭのＧＳＳＧ、または、
（ｃ）３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、および２ｍＭのＧＳＳＧに、
に触れさせるステップを含む。
【００１８】
上記の薬剤は、本発明による溶液を作るために水に溶解してよいことが十分理解されるであろう。しかし、該薬剤は、多数の他の化合物を備える溶液に溶解してもよいこともまた十分理解されるであろう。例えば、該溶液は塩をさらに備えてもよい。該溶液で使用することが可能な塩は、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩などを伴うナトリウム、カリウム、およびカルシウムの塩を含む。該溶液は、０．５から２Ｍの濃度の塩化ナトリウム溶液であることが好ましい。該溶液は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってよい。
調査中、本発明者らは、折り畳みの条件は、折り畳みの進行が促進されるｐＨおよび温度を調整することによって最適化することが可能であることも確立した。
【００１９】
最適温度は、使用した洗剤、ｐＨ、および折り畳まれる成長因子の量にも左右された。ほとんどの条件下で、約１５℃以下の温度が好ましい（例えば、２〜８℃または約１０℃）。しかし、より高い温度（例えば室温）も、一部の条件にとっては有効であった。
本発明者らは、アルカリ性ｐＨで本発明の方法を実行することが概して好ましかったことを発見した。ｐＨは好ましくは約ｐＨ８．０以上、より好ましくは約ｐＨ８．５のｐＨ以上である。該溶液に対して最も好ましいｐＨは、約９．５のｐＨである。
【００２０】
溶液に添加した折り畳まれていない成長因子の量も、折り畳みの効率に影響することが分かった。一般に、０．００５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの成長因子、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１２〜０．２５ｍｇ／ｍＬの成長因子、最も好ましくは約０．２５ｍｇ／ｍＬ（つまり２５０μｇ／ｍｌ）を溶液に添加してよい。
本発明の方法は、形質転換成長因子スーパーファミリの任意の単量体を、二量体の生物活性型に折り畳むために採用することができる。該方法は、ＴＧＦ−ベータ自体（例えば、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、またはＴＧＦ−ベータ３）を折り畳むために使用されることが好ましい。
【００２１】
該方法が、成長因子を発現するように形質転換された原核生物宿主において産生された単量体前駆対を（活性な二量体成長因子に）折り畳むために使用されることも好ましい。例えば、該方法は、組み換え成長因子を符号化する発現ベクタで形質転換された細菌の封入体内に位置する成長因子を折り畳むのに特に有用である。
本発明の方法は、ＴＧＦ−ベータ３発現ベクタ（例えば、実施例１で説明されるような、または当技術分野で周知のような）で形質転換される細菌の封入体の中に位置する単量体ＴＧＦ−ベータ３を折り畳むために使用されることが、最も好ましい。ＴＧＦ−ベータ３は、ヒトＴＧＦ−ベータ３、組み換えヒトＴＧＦ−ベータ３、またはヒトでの臨床用途に対して成長因子を最適化する突然変異体を含有するヒトＴＧＦ−ベータ３であることが、最も好ましい。
【００２２】
ＴＧＦ−ベータ３を折り畳むために採用される最も好ましい条件の例は、
（ａ）０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５、
（ｂ）３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５、
（ｃ）３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５、または、
（ｄ）０．７ＭのＣＨＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．２５ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃／室温でｐＨ９．５、を含む。
【００２３】
本発明者らは、実験室での発明により（実施例１で説明されるような）折り畳みの方法を開発し、そして続けて実施例２に説明されるような方法論を拡大した。方法の拡大は、本発明の重要な特徴を表すことが十分理解されるであろう。したがって、本発明の第２の側面によれば、原核生物宿主から形質転換成長因子ベータスーパーファミリの活性構成要素を産生する方法であって、
（ａ） 前記形質転換成長因子ベータスーパーファミリの構成要素を発現するように形質転換された原核生物の発酵と、
（ｂ） 封入体の分離および封入体からの発現タンパク質の回復と、
（ｃ） 本発明の第１の側面により、形質転換成長因子スーパーファミリの構成要素を折り畳み直すステップと、
（ｄ） 形質転換成長因子スーパーファミリの折り畳み直した構成要素の精製と、
を備える方法が提供される。
【００２４】
ステップ（ａ）は、形質転換成長因子ベータスーパーファミリの構成要素を符号化する発現ベクタで形質転換された細菌の発酵を伴うことが好ましい。該ベクタは、好ましくはＴＧＦ−ベータ、最も好ましくはヒトＴＧＦ−ベータ３またはその機能的アナログを符号化する。形質転換された細菌は、当技術分野で周知の分子生物学技法を使用して生成してよいことが、十分理解されるであろう。そのような細菌の例は実施例１で挙げられる。
生物は、従来の技法により発酵されることが好ましい。このことは、細胞ペーストの発酵、および発酵から試料を抽出し、試料を遠心分離にかけて有機体を分離することによる、細胞の収穫を伴ってよい。
【００２５】
本発明の第２の側面による方法のステップ（ｂ）は、遠心分離によって回収される有機体の溶解を伴ってよい。そして封入体（ＩＢ）は、さらなる遠心分離および洗浄ステップによって回収することができる。好ましくは、ＩＢは、ＩＢ内のタンパク質を可溶化するステップを講じ、そしてそれらを浄化することによって、さらに加工される。
そして分離したＩＢからのタンパク質（つまり、折り畳まれていない成長因子）は、本発明の第２の側面の方法のステップ（ｃ）により、本発明の第１の側面の折り畳みの方法の対象となる。
【００２６】
そして折り畳み直した成長因子は、ステップ（ｄ）によりさらに精製されるべきである。精製は、限外ろ過およびクロマトグラフィなどの多数の生化学的精製ステップを伴ってよい。好ましい精製手順は、実施例１の１．１５、１．１６、および１．１７で解説する。好ましい実施形態では、成長因子はまずろ過され、疎水性相互作用クロマトグラフィによってさらに精製され、そして陽イオン交換クロマトグラフィによって最終的に精製される。
任意で、本発明の第２の側面による方法は、成長因子が溶液中の所望の濃度で配合されてバイアルに入れられる、ステップ（ｅ）をさらに備えてよい。この溶液は、臨床用途に対する最終製剤であってよく、または保管用に配合および／または輸送してもよい。そして成長因子は、後日、最終的な臨床製品を形成するように仕上げてよい。
【００２７】
本発明者らは、ＷＯ９９／１８１９６が、骨形成因子（ＢＭＰ）を折り畳み直すためのＣＨＥＳの使用を開示していることを認識している。しかし、ＷＯ９９／１８１９６で開示されている技法は、当業者であれば、本発明の第１または第２の側面の方法によれば、ＴＧＦ−ベータ、特にＴＧＦ−ベータ３を折り畳み直すのに有用と考えられないであろう。当業者であれば、多数の理由により、この結論に達するであろう。これらは、
（ａ）ＷＯ９９／１８１９６は、ＢＭＰ封入体の可溶化のための方法は、グアニジン−ＨＣＬなどの、または酢酸などの酸を用いた酸性化による変性剤を使用するべきであると開示している。本発明者らは、酸性化が、封入体からのＴＧＦ−ベータ３の低回復を結果としてもたらしたことを見出している。ＴＧＦ−ベータ３が酸で可溶化され、そしてｐＨが９．５（本発明による折り畳み直しのための好ましいｐＨ）に滴定されると、酸性からアルカリ性ｐＨへのこの変化は、ＴＧＦ−ベータ３の不可逆凝集を結果としてもたらす（その等電点（ｐＨ６．４）を交差するＴＧＦ−ベータ３のため）ことが分かった。このことは、非常に低いＴＧＦ−ベータ３収率を結果としてもたらした。グアニジン−ＨＣＬもまた、可溶化剤として調査し、封入体からのＴＧＦ−ベータ３の非常に良好な回復をもたらしたが、強力すぎる変性剤であり、ＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しを妨害した。従って、本発明者らは、従来技術の可溶化ステップが不適当であることを見出した。実験は、６Ｍの尿素および０．１ＭのＤＴＴを使用した封入体の可溶化が、ＴＧＦ−ベータ３の良好な回復をもたらし、ＴＧＦ−ベータ３が折り畳み直し緩衝液で希釈されると折り畳み直しを可能にしたことを、確立した。従って、ＴＧＦ−ベータ３は、尿素およびＤＴＴを使用して封入体から可溶化されることが好ましい。
【００２８】
（ｂ）ＷＯ９９／１８１９６もまた、ＢＭＰは、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）または逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して浄化することが可能であることを記載している。これらいずれの方法も、ＴＧＦ−ベータ３の工業規模の製造に不適当となる。ＳＥＣでは、試料の量が試料の分解能に影響する（試料の量が小さいほど、精製分解能が良好になる）。本発明の第２の側面による工業規模の方法は、約５０Ｌの可溶化封入体を産生することができる。単回の運転においてこの量を加工すると、７２４Ｌの単一／複合床量のカラム（または複数のカラム）を必要とするため、そのような量にＳＥＣを使用することは実用的ではない。ＲＰ−ＨＰＬＣは概して、少ないカラム体積のため、分析ツールとして使用され、再度、同じ理由により、ＴＧＦ−ベータ３の工業規模の製造で使用することは実用的ではない。本発明の第２の側面の方法は、７０％以上のＴＧＦ−β３純度をもたらす接線流ろ過（ＴＦＦ）を使用することが好ましい。
（ｃ）発現タンパク質の純度は、折り畳み直しの収率に影響することが知られている。一般的な法則として、発現タンパク質の純度が高いほど、折り畳み直しの収率が高くなる。本発明者らは、（総タンパク量の）７０％以上のＴＧＦ−β３純度が、高い折り畳み直しの収率をもたらし、低いＴＧＦ−β３純度（総タンパク質の５０％未満）が低い折り畳みの収率をもたらしたことを見出している。従って、本発明の方法で使用されるＴＧＦ−β３は、５０％以上純粋であり、より好ましくは約７０％（以上）純粋であることが好ましい。この純度は、封入体の洗浄ステップ、およびＴＦＦを使用した可溶化ＴＧＦ−β３の浄化を含むことによって、達成することができる（例えば、実施例２を参照）。
【００２９】
（ｄ）ＴＧＦ−ベータ３は、異なるｐＨでの立体構造（二次構造）および可溶度の有意な変化を受ける。溶液を含有するＴＧＦ−ベータ３のｐＨが酸性（ｐＨ３．８未満）からアルカリ性ｐＨ（ｐＨ８．０未満）に移動すると、ｐＨ６．５からｐＨ８．５の間で発生する凝集最大限とともに、凝集体が現れる。ＷＯ９９／１８１９６は、ＢＭＰの折り畳み直しの好ましいｐＨは、約８．５であると記載している。しかし、このことにより、ＴＧＦ−ベータ３が凝集し、したがって折り畳み直しの効率および収率を有意に減少させるため、これは、ＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しには不適当となる。従って、本発明の方法は、８．５以上のｐＨ、好ましくはｐＨ９．０以上、最も好ましくは約９．５のｐＨで折り畳み直し緩衝液を利用することが好ましい。
（ｅ）本発明者らは、折り畳み直し緩衝液中の酸化還元対（例えば、還元および酸化グルタチオン）の最適濃度は、ＢＭＰおよびＴＧＦ−ベータ３に対して異なり得ることも見出している。本発明によるＴＧＦ−ベータ３の製造で使用される還元グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）の好ましい濃度は、それぞれ２ｍＭおよび０．４ｍＭである。さらに、本発明者らは、酸化還元対が溶液中で溶解すると、緩衝液を少なくとも２時間、好ましくは少なくとも３〜５時間、最も好ましくは約７時間熟成することが最も好ましいことを見出している。本発明者らは、酸化還元対の「熟成」の利得に関していかなる仮説にも制約されないことを望み、水溶液中で、ＧＳＨはすぐに酸化してＧＳＳＧを産生し、生理学的ｐＨでＧＳＨの半減期が約４時間であることを記載している。さらに、本発明者らは、好ましいＴＧＦ−ベータ折り畳み直し緩衝液（ｐＨ９．５）におけるＧＳＨの半減期が有意に低下するのではないかと疑っている（アルカリ性ｐＨでは、産生された非反応性チオールに対し、ＧＳＨ中の反応性チオラート基をプロトン化する水素イオンが少ない）。ｐＨ９．５でのＧＳＨの半減期の保守的推定は３時間となる。したがって、緩衝液成熟の７時間後、酸化還元対の濃度は、約０．５ｍＭのＧＳＨおよび１．１５ｍＭのＧＳＳＧとなる。従って、これらの濃度は、ＴＧＦ−ベータ３を折り畳み直すために好ましい濃度である。ＷＯ９９／１８１９６は、酸化還元対の好ましい濃度が２ｍＭのＧＳＨおよび１ｍＭのＧＳＳＧ（ＢＭＰの折り畳みに対して）であると記載している。ＧＳＨのこの濃度の増加は、ＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しを有意に延長し、収率を減少することがある（ＧＳＨがタンパク質におけるジスルフィド結合を破壊するため）。なお、ＷＯ９９／１８１９６は、折り畳み直し緩衝液中の５ｍＭのＥＤＴＡという要件を記載している。折り畳み直し緩衝液中のＥＤＴＡなどのキレート剤の存在は、ＧＳＨを安定化し（つまり、ＧＳＨの半減期を増加させる）、このことは、ＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しの時間をさらに増加し、収率を減少することがある。
【００３０】
（ｆ）ＷＯ９９／１８１９６は、折り畳み直し緩衝液中のＢＭＰの好ましい濃度が１〜１００μｇ／ｍＬであると記載しており、これは、本発明者らがＴＧＦ−ベータ３の製造において有用であると見出した濃度（最適には２５０μｇ／ｍＬ）よりも有意に低い。２５０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３は、１００μｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３よりも高い折り畳み直しの効率をもたらした。したがって、本発明の方法は、折り畳み直しステップで１００μｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、好ましくは約２５０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３を利用することが望ましい。
（ｇ）ＷＯ９９／１８１９６は、ＢＭＰの折り畳み直しの好ましい温度は、２０℃であると記載している。本発明者らは、室温（２２℃）で行われたＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しは、ＴＧＦ−ベータ３の凝集を結果としてもたらし、ＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しは、１５℃未満（好ましくは２〜８℃または約１０℃）で発生し、ＴＧＦ−ベータ３の生産的な折り畳み経路および疎水性相互作用の抑制を支援すべきであると観察している。
【００３１】
本発明の第２の側面による最も好ましい方法を、図１０に図示する。図１０で図示される好ましい方法での使用に適切な条件およびプロトコルの詳細は、図１１から２６に提示する。当業者であれば、これらの図で提示される条件およびプロトコルは、好ましくは図１０で図示される方法で使用してよいが、特に文脈が必要とする場合を除いて、本発明に従った任意の適切な折り畳みの方法を達成するために使用してもよいことが十分理解されるであろう。
本発明を、実施例によって、かつ次の図面を参照してさらに解説する。
【実施例】
【００３２】
実施例１
本発明者らは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリの構成要素を折り畳み直す改良された方法を確立することが可能であるかどうか調査した。下記の実施例は、ＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しへの本発明の方法の適用を例証する。
まず、折り畳み直しの試薬を最初に選別するために研究を設定した（１．１３を参照）。主要選別で折り畳み直しの補助をすることが分かった試薬は、収率を最大限化して折り畳み直しの時間を短縮するためのさらなる最適化のため、本願で説明されるように進めた（１．１４を参照）。最後に、折り畳み直した成長因子を精製する方法を調査した（１．１５〜１．１７）。
【００３３】
ＴＧＦ−ベータ３の生物活性を検査するために採用された方法を１．１８に記載する。
これらの研究により、本発明者らは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリの構成要素を活性型に折り畳む改良された方法は、本発明の第１の側面によって定義される方法に従うことによって確立することができることを認識する。
【００３４】
実験：
１．１  ヌクレオチド配列
ＴＧＦ−ベータ３活性フラグメントを符号化するヌクレオチド配列は下記の通りである。
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
（配列ＩＤ１番）
【００３５】
１．１  ｃＤＮＡ生成
ヒト切開創傷からの総ＲＮＡ（損傷後第５日に採取）をＤＮＡ−Ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、あらゆる汚染ＤＮＡを除去した。テンプレートとして総ＲＮＡを使用し、ＴＧＦ−ベータ３  ｃＤＮＡを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって生成した。ＲＴ−ＰＣＲマスター混合は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＱＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，１−Ｓｔｅｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から調製した。１ミクログラムのＲＮＡを、１ステップＱＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＬのＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニット、０．４μＭの感覚プライマ（５’ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣ  ３’）（配列ＩＤ２番）、０．４μＭの感覚プライマ（５’−ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  Ｃ  ３’）（配列ＩＤ３番）を含有する５０μＬの溶液に加えた。反応物は熱サイクラ（Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）に入れ、４５℃で３０分、９５℃で１０分、そして９５℃の４０サイクルを３０秒、６５℃で１分、および７２℃で１分といった条件下で運転した。１０分間の７２℃の最終ステップでは、ＰＣＲ試料を２％（ｗ／ｗ）アガロースゲル上で実行して帯域サイズを検証し、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
【００３６】
１．２  ベクタのクローン作成および宿主細胞の形質転換
ｐＥＴ−２４ｄベクタは、ｐＢＲ３２２ベクタに由来し、ＬａｃＵＶ５制御下のＴ７プロモータおよびカナマイシン耐性マーカ遺伝子を含有する。
ＴＧＦ−ベータ３  ｃＤＮＡフラグメント（１．１項で生成された）を、３７℃で４時間、１５μＬの反応物（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ，Ｎｏｖａｇｅｎ）中で１  Ｘ  ＢａｍＨ１緩衝液とともに０．７５μＬのＮｃｏｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および０．７５μＬのＢａｍＨ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。１マイクロリットルのｐＥＴ−２４ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）を同じ方法で消化した。消化したｃＤＮＡおよび大型プラスミドフラグメントを、アガロースゲル精製し、ＳｐｉｎＰｒｅｐ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ抽出キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して回収した。
精製ｃＤＮＡおよびプラスミドフラグメントを、Ｔ４リガーゼキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して結紮した。結紮ｃＤＮＡ／プラスミドを、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）に形質転換した（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）形質転換キット）。形質転換細胞は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＬｕｒｉａ液（ＬＢ）寒天プレートでプレート作成することによって選択した。３つのクローンを、制限消化および／または発現に対して選択した。
【００３７】
１．３  製品発現に対するクローン選別
クローンを、半強度の「Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ」（６ｇ／Ｌのファイトンペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１２ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２ｇ／Ｌグリセロール（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、１．１６ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、６．２５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、蒸留水で１リットルまでＱＳ）の振盪フラスコ培養中で育成し、１ｍＭのイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、０．６５から０．８５の間のＯＤ６００で指数増殖期に誘導した。誘導後の試料は、ＩＰＴＧの添加の３時間後に採取し、製品誘導および発現に対して、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。クローン１〜４の誘導前／後の試料アリコートおよびＭａｒｋ１２分子量基準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−分子量範囲は２．５〜２００ｋＤａ）を、１２０ミリアンペアおよび２００ボルトで約４０〜５０分間、１．０ｍｍのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で実行し、クマシーブルーで染色した。サイズが６から１４．４ｋＤａの間のタンパク質（つまり、ＴＧＦ−ベータ３単量体）は、これらの培養物のそれぞれにおいて明確に誘導され（図１を参照）、クローン２が最大量のＴＧＦ−ベータ３タンパク質を発現する。
【００３８】
１．４  凍結細胞原液
クローン１〜４を、約１のＯＤ６００まで、半強度Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈにおいて振盪フラスコ中で育成し、２０％（ｖ／ｖ）までグリセロールを添加することによってグリセロール原液として保存した。１．２ｍＬの液を、（０．３ｍＬのグリセロールを含有する）１２×２ｍＬのｃｒｙｏｖｉａｌに等分し、そして−７０℃で保存した。
【００３９】
１．５  ＴＧＦ−ベータ３遺伝子の配列確定
グリセロールの添加の前に、凍結細胞原液に使用される培養物の試料を採取し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを使用してプラスミド分離に使用した。分離プラスミドは、Ｔ７プロモータプライマ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’）（配列ＩＤ４番）およびＴ７ターミネータプライマ（５’−ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３’）（配列ＩＤ５番）を使用して、配列を決定して検証した。
【００４０】
１．６  種培養
クローン２が最高量のＴＧＦ−Ｂｅｔａ３タンパク質を発現したため、凍結原液（１．４項より）のアンプルを回復し、５００ｍＬのＨｙＳｏｙ培地（１２ｇ／ＬのＨｙ−Ｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、２４ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、および１０ｇ／Ｌのグリセロール（Ｓｉｇｍａ）および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２リットルのバッフル付きエルレンマイヤフラスコ内に接種した。フラスコは３７℃および２００ｒｐｍでの振盪でインキュベートし、周期的に試料を抽出してＯＤ５００を測定した。培養物のＯＤが３．２１Ｕ／ｍＬ（７時間後）に達すると、細胞液は、１５０Ｌの発酵槽（１００Ｌの機能量）を播種するために使用した。
【００４１】
１．７  発酵
９００ミリリットルの細胞液（１．６項より）を、９０Ｌのバッチ培地（０．６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＫＨ２ＨＰＯ４、１．２５ｇ／ＬのＮＨ４ＳＯ４、１２ｇ／ＬのＨＹ−Ｓｏｙ、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、および１０ｇ／Ｌのグリセロール）を含有する１５０Ｌの発酵槽を植菌するために使用した。発酵運転パラメータを、温度セットポイント３７℃、ｐＨセットポイント７．０（４Ｎの水酸化アンモニウムおよび４Ｎのリン酸を使用して維持）、および最初に１００％に較正した溶存酸素というように、制御した。容器の上部圧力は７ｐｓｉで、攪拌および気流はそれぞれ、１分あたりの培地の体積あたりの空気の一体積（ｖｖｍまたはｓｌｐｍ）で２００〜４００ｒｐｍであった。ＤＯは、発酵セットポイントパラメータを、攪拌（最大４００ｒｐｍ）、通気（最大１．５ｖｖｍ）、酸素補給（最大３３．３Ｉｐｍ）、および背圧（最大１２ｐｓｉ）という優先度で調整することによって、２０％以上に維持した。泡立ちはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−６１（２５％ｖ／ｖ）で制御した。培養物のＯＤが１０Ｕ／ｍＬに達すると、グリセロール供給（５０％ｖ／ｖ）を４５ｍＬ／分の流速で開始した。ＯＤが４０Ｕ／ｍＬに達すると、細胞を０．２ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧの添加で誘導した。
【００４２】
１．８  収穫
誘導後の４時間後、発酵槽を１０℃まで冷却し、気流および攪拌をそれぞれ、０．３ｖｖｍおよび１００ｒｐｍまで低減した。泡およびｐＨ制御を終了し、背圧を３ｐｓｉに調整した。培養物は、１０℃でＷｅｓｔｆａｌｉａ  ＣＳＡ８連続遠心分離を用いた連続遠心分離によって収穫した。遠心分離機は、１５，０００ｒｐｍおよび毎分３リットルの流速で運転し、細胞スラリを収集した。
【００４３】
１．９  細胞溶解およびＩＢ回復
発酵細胞ペースト（１．８項より）を、溶解緩衝液（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｚｍａＢａｓｅ（トリス）、３．７ｇ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５８．４４ｇ／ＬのＮａＣｌおよび１０ｇ／ＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０）で１：５に希釈し、手持ちホモジナイザを使用して再懸濁した。再懸濁細胞ペーストを、高圧ホモジナイザに２度通過させた（パラメータ：圧力１０，０００ｐｓｉｇ、流速４５０ｍＬ／分、および温度１５℃）。そして均質化細胞溶解物を、４℃で２０分間、５，０００ｘｇで遠心分離にかけた（バケット遠心分離機、固定角回転子）。浮遊物は、不溶性（封入体）ＴＧＦ−ベータ３を残して廃棄した。封入体（ＩＢ）沈殿物は、手持ちホモジナイザを使用して洗浄緩衝液（６．１ｇ／Ｌのトリスおよび３．７２ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再懸濁し、遠心分離にかけた（５，０００ｘｇを４℃で２０分間）。
【００４４】
１．１０  封入体の可溶化
１．９項からの堆積物を、可溶化緩衝液（６．１ｇ／Ｌのトリス、１５．４ｇ／ＬのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３６０．４ｇ／Ｌの尿素、ｐＨ８．０）で１：１０に希釈し、手持ちホモジナイザを使用して再懸濁した。懸濁液は、覆いをして室温で６０〜７５分間攪拌したままにし、封入体を可溶化してＴＧＦ−ベータ３をその単量体型まで還元した。再懸濁沈殿物のｐＨは、２回目の６０〜７５分間のインキュベーションの前に、ＮａＯＨ／酢酸でｐＨ９．４〜９．６に調整した。
【００４５】
１．１１  浄化／限外ろ過および透析ろ過
項１．１０からの可溶化物質を、接線流ろ過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において浄化、濃縮、および透析ろ過した。初期浄化および濃縮は、前処理浄化ＴＦＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  １０００ｋＤａ、再生セルロース、スクリーンＶ）で達成した。浄化ＴＧＦ−ベータ３は浸透物中で収集した。限界ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ５ｋＤａ、再生セルロース、スクリーンＣ）に切り替えて、ＴＧＦ−ベータ３を６透析量の可溶化緩衝液（６．１ｇ／Ｌのトリス、１５．４ｇ／ＬのＤＴＴ、および３６０．４ｇ／Ｌの尿素、ｐＨ９．５）中で洗浄した。
【００４６】
１．１２  折り畳み直しの選別マトリクス１
１．１２．１  方法論
１．１１項からの浄化物質中のＴＧＦ−ベータ３タンパク質含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーブルー染色、およびデンシトメトリと併用してＲＣ  ＤＣＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して定量化した。ＴＧＦ−ベータ３物質は、一連の折り畳み直し緩衝液中へ希釈した（表１および２を参照）。１ｍＬの試料を６日の期間にわたって毎日採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して非還元条件下で分析した。試料アリコートおよびＭａｒｋ１２分子量基準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−分子量範囲は２．５〜２００ｋＤａ）を、１２０ミリアンペアおよび２００ボルトで約４０〜５０分間、１．０ｍｍのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で実行した。そしてタンパク質試料を、Ｎｏｖｅｘ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ニトロセルロース膜へと電気泳動的に移動した。該膜は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、１％（ｖ／ｖ）のポリオキシルエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ）で封鎖した。該膜は、洗浄し（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）、一次抗体において１時間インキュベートした（抗ＴＧＦ−ベータ３、ＭＡＢ６４３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＢＳおよび０．１（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で１：５００に希釈）。一次抗体によるインキュベーション後、ニトロセルロースを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。そしてニトロセルロースを二次抗体においてさらに１時間インキュベートした（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で１：２０００に希釈した、アルカリ性ホスファターゼ（Ａｂｃａｍ  ＰＯ３９７）に抱合されたヤギ抗マウスＩｇＧ）。膜は再び洗浄した（ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、アルカリ性ホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対するウエスタンブルー安定化基質で展開する前）。
ＭＡＢ６４３抗体は、正しく折り畳み直した単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３種を検出する。
【００４７】
１．１２．２  結果
表１および２は、結果が５０の異なる実験条件下でＴＧＦ−ベータ３の試験折り畳み直しを得たことを要約している。
本発明者らは、下記の条件（つまり、実験条件１２、１９、および４４）が正しく折り畳み直されたＴＧＦ−ベータ３を産生したことを確立した。
１．  ０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験条件１２）。
２．  ３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験条件１９）。
３．  ３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験条件４４）。
【００４８】
一例として、図２は、実験条件１２の有効性を図示する。
表１．折り畳み直しの選別マトリクスおよび結果
2009529571.tif 000008
2009529571.tif 000009
2009529571.tif 000010
【００４９】
表２．折り畳み直しの選別マトリクスおよび結果
2009529571.tif 000011
2009529571.tif 000012
2009529571.tif 000013
【００５０】
１．１３  折り畳み直しの最適化
実施例１２からの条件（０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５）は、特に良好に折り畳まれたＴＧＦ−ベータ３を結果としてもたらした。したがってこれらの条件は、さらなる最適化のために選択した。
調査したパラメータ：
・ＴＧＦ−ベータ３濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、および０．５ｍｇ／ｍＬ）
・ｐＨ（８．０、９．０、および９．５）
・温度（２〜８℃および室温）
・１ＭのＮａＣｌの添加
【００５１】
１．１２項からのＴＧＦ−ベータ３物質は、一連の折り畳み直し緩衝液中へ希釈した（表３および４を参照）。１ｍｌの試料を６日の期間で毎日採取した。第６日目の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して非還元条件下で還元し、ウエスタンブロットを行った（方法論については１．１３項を参照）。正しく折り畳み直されたＴＧＦ−ベータ３単量体は、あらゆる折り畳み直し条件でウエスタンブロットによって検出された。正しく折り畳み直されたＴＧＦ−ベータ３二量体は、１．０ＭのＮａＣＬを含有するあらゆる実験でウエスタンブロットによって検出された（図３および４を参照）。
最大量のＴＧＦ−ベータ３が二量体型に折り畳み直された条件は、実験条件３４であった（０．７ＭのＣＨＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．２５ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃／室温でｐＨ９．５）。
実験条件３４からの第０、１、２、および３日の試料は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行し、ウエスタンブロットを行い、正しく折り畳まれたＴＧＦ−ベータ３が産生された時点を決定した。図５に示されるように、初期開始物質および第１日の試料は、少量の正しく折り畳まれた単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３を含有した。折り畳み直しの第２および３日までに、正しく折り畳まれたＴＧＦ−ベータ３の量に有意な増加がある。
【００５２】
図６は、米国５，９２２，８４６、米国５，６５０，４９４、およびＥＰ  ０  ４３３  ２２５（０．０５Ｍのトリス、１ＭのＮＤＳＢ−２０１、２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、２％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、１ＭのＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）のＧＳＨ、０．２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．３）で検討されている従来技術の折り畳み直しの条件によって達成される折り畳み直しを図示する。折り畳み直されたＴＧＦ−ベータ３の量は、７日の処理後になおも増加している（図６の対照レーン４および５）が、対照的に、成長因子は、本発明による方法が採用された２日の処理後に完全に折り畳まれた（図５のレーン３および４を比較）ことが分かる。
実験条件３４でのＴＧＦ−ベータ３の折り畳み直しもまた、イオン交換（ＣＥＸ）ＨＰＬＣを使用して監視した。ポリスルフォエチル−Ａ  ＨＰＬＣカラム（ＰｏｌｙＬＣ  Ｉｎｃ．からの２００×４．６ｍｍ、５μｍ、１０００Ａ）を、移動相Ａ（１０％（ｖ／ｖ）酢酸、３０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコール）で平衡化した。折り畳み直しの試料は、２０％酢酸、６０％イソプロピルアルコールで１：１に混合することによって酸性化した。１００μＬの酸性化した折り畳み直しの試料は、０．５ｍＬ／分の流速でカラム上に装填した（この流速は手順の全体を通して使用した）。カラムは移動相Ａで５分間洗浄した。直線勾配を１０分間実行し、６０％移動相Ａおよび４０％移動相Ｂ（１０％（ｖ／ｖ）酢酸、３０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコール、および１ＭのＮａＣｌ）の混合物で終了した。この緩衝液の適用はさらに５分間保留した。第２の直線勾配を１０分間適用し、１００％移動相Ｂで終了して５分間維持した。図７は、第０日に少量の正しく折り畳み直された二量体ＴＧＦ−ベータ３（７（ａ）を参照）があるが、第１日までに、正しく折り畳まれたＴＧＦ−ベータ３タンパク質の濃度に有意な増加がある（７（ｂ）を参照）ことを図示する。第２日の二量体ＴＧＦ−ベータ３の濃度は第１日と同様であり、２４時間後に折り畳み直しが完了していることを示す（７（ｃ）を参照）。２４時間後の折り畳み直しの完了は、従来技術の技法よりも有意に速い（図６を参照）。
【００５３】
表３．折り畳み直しの最適化マトリクスおよび結果（実験条件１〜１８）
2009529571.tif 000014
2009529571.tif 000015
注：ＲＴ＝室温
２〜８℃／ＲＴ＝２〜８℃で３日、および室温で３日
【００５４】
表４．折り畳み直しの最適化マトリクスおよび結果（実験条件１９〜３６）
2009529571.tif 000016
2009529571.tif 000017
2009529571.tif 000018
注：ＲＴ＝室温
２〜８℃／ＲＴ＝２〜８℃で３日、および室温で３日
【００５５】
１．１４〜１．１６項は、どのようにして本発明の第１の側面により折り畳み直されたＴＧＦ−ベータ３を精製することができるかを確立するために行われた実験を説明している。
【００５６】
１．１４  限外ろ過／疎水性相互作用クロマトグラフィ
１．１３項からの実験条件として識別されたＣＨＥＳ折り畳み直し溶液は、限外ろ過によって５倍に濃縮した（膜は平板Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ５ｋＤａ、０．１ｍ２、再生セルロース、スクリーンであった）。そして折り畳み直し物質のｐＨは、希釈緩衝液（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、２６４．２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１００ｇ／Ｌの酢酸、および２１０．７ｇ／Ｌの塩酸アルギニン、ｐＨ３．３）中で１：１に希釈される前に、氷酢酸を使用して２．５〜２．８のｐＨに調整した。ブチルセファロース４高速流カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１６ｃｍ床高さ）は、４カラム体積の緩衝液Ａ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１３２．１４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、および１００ｇ／Ｌの酢酸、ｐＨ３．３）で平衡化した。折り畳み直し物質は、１００ｃｍ／時間の流速（この流速は手順の全体を通して使用した）でブチル・セファロースカラム上に装填される前に、０．２２μＭの膜を通してろ過した。そしてカラムは、４カラム体積に対して緩衝液Ａで洗浄した。ＴＧＦ−ベータ３タンパク質は、緩衝液Ｂ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、および３００ｇ／Ｌの酢酸、ｐＨ３．３）を使用してカラムから溶出した。単量体および二量体の両方の型でＴＧＦ−ベータ３タンパク質を含有する第１のピークを集積した（図８を参照）。
【００５７】
１．１５  陽イオン交換クロマトグラフィ
陽イオン交換クロマトグラフィは、単量体タンパク質から二量体ＴＧＦ−ベータ３タンパク質を分離するために使用した。１．１４項からの集積ＴＧＦ−ベータ３画分は、ＳＰ装填希釈緩衝液（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、および３００ｇ／Ｌの酢酸、ｐＨ４．０）中で５倍に希釈した。ＳＰセファロース高速流カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）は、４カラム体積の緩衝液Ａ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、３００ｇ／Ｌのエタノール、および１．４６ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）で平衡化した。希釈ＴＧＦ−ベータ３物質は、１６９ｃｍ／時間の流速（この流速は手順の全体を通して使用した）でＳＰセファロースカラム上に装填した。そしてカラムは、４カラム体積に対して緩衝液Ｂ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、３００ｇ／Ｌのエタノール、および２．９２ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）で洗浄した。ＴＧＦ−ベータ３タンパク質は、緩衝液Ｃ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、３００ｇ／Ｌのエタノール、および１１．６９ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）を使用してカラムから溶出した。溶出される第１のピークは単量体ＴＧＦ−ベータ３であり、その次が二量体ＴＧＦ−ベータ３である。ＴＧＦ−ベータ３二量体を含有する画分を集積した（図９を参照）。
【００５８】
１．１６  限外ろ過／透析ろ過
１．１５項からの精製二量体ＴＧＦ−ベータ３分子を含有する部分は、限外ろ過／透析ろ過を受けて、緩衝液を２０ｍＭの酢酸、２０％（ｖ／ｖ）のエタノールに交換し、試料を１０ｍｇ／ｍＬまでに濃縮した（ＴＧＦ−ベータ３の濃度は紫外分光法によって決定した）。
【００５９】
１．１７  生物活性の分析
細胞増殖分析（Ａ  Ｍｅａｇｅｒ，１９９１−Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；１４１；ｐａｇｅｓ１  ｔｏ  １４）を、ＴＧＦ−ベータ分子に対するインビトロ生物活性試験として使用した。比色分析は、ミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）の増殖に対するＴＧＦ−ベータ分子の抑制効果に基づく。５０μＬの希釈媒体（Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉを伴うＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。５０μＬの連続希釈（５０００ｐｇ／ｍＬから９．７５ｐｇ／ｍＬ）のＴＧＦ−ベータ３参照基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）、５０μＬの連続希釈の（５０００ｐｇ／ｍＬから９．７５ｐｇ／ｍＬ）のＴＧＦ−ベータ３（米国５，９２２，８４６、米国５，６５０，４９４、およびＥＰ−Ｂ−０４３３  ２２５といった特許で開示されている方法によって産生）、および５０μＬの連続希釈の（５０００ｐｇ／ｍＬから９．７５ｐｇ／ｍＬ）ＴＧＦ−ベータ３（１．１７項により精製されたＣＨＥＳ折り畳み直し成長因子）タンパク質を、プレートに添加した。完全培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉを伴うＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１×１０５ＭＬＥＣ細胞／ｍＬ、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、および１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０μＬの細胞懸濁液を、各ウェルに添加した。プレートは５％  ＣＯ２中の３７℃で７２時間インキュベートした。各ウェルの内容物は、吸引して２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３度洗浄した。１００μＬの基質溶液（１Ｍの酢酸ナトリウム、１０４ホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ）、および１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を各ウェルに添加し、３７℃でインキュベートした。２時間後、反応物は１Ｎの水酸化ナトリウムを使用して急冷した。プレートは、４０５ｎｍのマルチチャネルリーダおよび４９２ｎｍの基準フィルタを使用して読み取った。
ＴＧＦ−ベータ３参照基準（ＮＩＢＳＣ）およびＴＧＦ−ベータ３（米国５，９２２，８４６、米国５，６５０，４９４、およびＥＰ−Ｂ−０４３３  ２２５といった特許で開示されている方法によって産生）のＩＣ５０値はそれぞれ、２４２．３３ｐｇ／ｍＬおよび９０ｐｇ／ｍＬであり、以前に分析された基準と同様であった。本発明により折り畳み直された物質は、８５．５７３ｐｇ／ｍＬのＩＣ５０を有することが分かり、このことは、本発明により折り畳み直されたＴＧＦ−ベータ３には、少なくとも従来技術の方法で産生されたＴＧＦ−ベータ３と同等の有効性（生物活性）を有することを示す。
【００６０】
結論
表１および２に説明される条件の折り畳み直し選別マトリクスより、３つの条件が正しく折り畳み直された二量体ＴＧＦ−ベータ３を産生した。
１．０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
２．３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３．３０ｍＭのタウロデオキシコール酸塩、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
ＣＨＥＳを含有する折り畳み直しの実験条件をさらに最適化し、収率を最大限化して時間を短縮した。最適な折り畳み直しの条件は、０．７ＭのＣＨＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．２５ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、およびｐＨ９．５を含み、２４〜４８時間で折り畳み直しを完了した。これは、米国５，９２２，８４６、米国５，６５０，４９４、およびＥＰ−Ｂ−０４３３  ２２５といった特許で開示されている方法を使用した７日よりも有意に速い。
最適化したＣＨＥＳの折り畳み直しは、さらに精製され、ＴＧＦ−ベータ３基準（ＮＤＢＳＣ）および従来技術で開示されている方法論を使用して生成されるＴＧＦ−ベータ３と同程度の生物活性を有することが分かった。
【００６１】
実施例２
産業過程は、本発明の第２の側面により開発した。
図１０は、過程の概観を提供するが、図１１〜２９は、図１０で説明される個々のステップのフロー図という形態でさらなる詳細を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例１の１．４に参照される振盪フラスコからの誘導後試料の例示的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真であり、図中、レーン１および６は、Ｍａｒｋ１２基準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、レーン２〜５は、それぞれ３μＬのクローン１〜４を搭載している（導入後３時間）。
【図２】例示的ウエスタンブロットの写真であり、図中、第１レーンは、非還元ＴＧＦ−ベータ３の基準であり、レーン２〜１２は表１の実験条件２〜１２に対応し、条件１２は正しく折り畳まれた二量体ＴＧＦ−ベータ３の産生に成功したことを実証している。
【図３】実施例１の１．１４で論じられるような、単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３の折り畳みを実証する例示的ウエスタンブロットの写真であり、図中、レーン１〜１８は、７日間のインキュベーション後の実施例１の表３の実験条件１〜１８に対応する。
【図４】実施例１の１．１４で論じられるような、単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３の折り畳みを実証する例示的ウエスタンブロットの写真であり、図中、レーン１９〜３６は、７日間のインキュベーション後の実施例１の表４の実験条件１９〜３６に対応する。
【図５】実施例１の１．１４で論じられるような、本発明による最も好ましい折り畳み直しの条件に対する、単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３の折り畳みを実証する例示的ウエスタンブロットの写真であり、図中、レーン１は、第０日目の折り畳み直しを表し、レーン２は１日後の折り畳み直しを表し、レーン３は２日後の折り畳み直しを表し、レーン４は３日後の折り畳み直しを表し、レーン５は非還元ＴＧＦ−ベータ３の基準である。
【図６】実施例１の１．１４で論じられるような、従来技術の折り畳み直しの技法を利用した、単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３の折り畳みを実証する例示的ウエスタンブロットの写真であり、図中、レーン１は、１日後の折り畳み直しを表し、レーン２は２日後の折り畳み直しを表し、レーン３は３日後の折り畳み直しを表し、レーン５は７日間の処理の後の折り畳み直しを表す。
【図７】（ａ）第０日目、（ｂ）１日後、および（ｃ）２日後の、折り畳み直したＴＧＦ−ベータ３の陽イオン交換ＨＰＬＣによる精製後の、実施例１の１．１４で論じられるような、本発明による最も好ましい折り畳み直しの条件によって産生された二量体ＴＧＦ−ベータ３の量を図示するクロマトグラムを表す。
【図８】限外ろ過、およびブチル・セファロースカラム上の疎水性相互作用クロマトグラフィによる精製後の、実施例１の１．１５で論じられるような、本発明による最も好ましい折り畳み直しの条件によって産生された単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３の量を図示するクロマトグラムを表す。
【図９】ＳＰ−セファロースカラム上の陽イオン交換クロマトグラフィによる精製後の、実施例１の１．１６で論じられるような、本発明による最も好ましい折り畳み直しの条件によって産生された単量体および二量体ＴＧＦ−ベータ３の量を図示するクロマトグラムを表す。
【図１０】本発明の第２の側面による好ましい方法を図示する略フロー図であり、図中、（Ａ）は、発酵および封入体（ＩＢ）回復ステップを表し、（Ｂ）は、ＩＢ可溶化および浄化ステップを表し、（Ｃ）は、本発明の第１の側面による折り畳み直しのステップを表し、（Ｄ）は、精製ステップを表し、（Ｅ）は、製剤の作成および仕上げに対するステップを表す。
【図１１】図１０（Ａ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な発酵に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１２】図１０（Ａ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な収穫および遠心分離に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１３】図１０（Ａ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な細胞溶解およびＩＢ回復に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１４】図１０（Ｂ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な封入体可溶化に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１５】本発明の方法での使用に適切な（Ａ）浄化膜画分（図１０（Ｂ）（ｉｉ））、および（Ｂ）折り畳み直し前ＵＦ／ＤＦ膜画分（図１０（Ｂ）（ｉｉｉ））に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１６Ａ】図１０（Ｂ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な封入体浄化に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１６Ｂ】図１０（Ｂ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な封入体浄化に対する別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１７Ａ】図１０（Ｂ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な折り畳み直し前ＵＦ／ＤＦに対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１７Ｂ】図１０（Ｂ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な折り畳み直し前ＵＦ／ＤＦに対する別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１８Ａ】図１０（Ｃ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切なタンパク質の折り畳み直しに対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１８Ｂ】図１０（Ｃ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切なタンパク質の折り畳み直しに対する別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１９】図１０（Ｄ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な折り畳み直し後の限外ろ過膜画分に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２０Ａ】図１０（Ｄ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な折り畳み直し後の限外ろ過およびブチル装填調製に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２０Ｂ】図１０（Ｄ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な折り畳み直し後の限外ろ過およびブチル装填調製に対する別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２１Ａ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切なブチルセファロース４高速流樹脂を詰めるための、好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２１Ｂａ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切なブチルセファロース４高速流樹脂を詰めるための、別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２１Ｂｂ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切なブチルセファロース４高速流樹脂を詰めるための、別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２２Ａａ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な方法で、ブチルセファロース４高速流樹脂を使用するための、好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２２Ａｂ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な方法で、ブチルセファロース４高速流樹脂を使用するための、好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２２Ｂａ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な方法で、ブチルセファロース４高速流樹脂を使用するための、別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２２Ｂｂ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な方法で、ブチルセファロース４高速流樹脂を使用するための、別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２３Ａ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用後の、ブチルセファロース４高速流樹脂の清浄および再生に対する、好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２３Ｂ】図１０（Ｄ）（ｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用後の、ブチルセファロース４高速流樹脂の清浄および再生に対する、別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２４】図１０（Ｄ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用前の、ＳＰセファロース高速流樹脂を清浄するための好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２５ａ】図１０（Ｄ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用前の、ＳＰセファロース高速流樹脂を詰めるための好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２５ｂ】図１０（Ｄ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用前の、ＳＰセファロース高速流樹脂を詰めるための好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２６Ａ】図１０（Ｄ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な方法で、ＳＰセファロース高速流樹脂を使用するための、好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２６Ｂ】図１０（Ｄ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な方法で、ＳＰセファロース高速流樹脂を使用するための、別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２７】図１０（Ｄ）（ｉｉｉ）で提示されるもののような、（Ａ）使用後、および（Ｂ）使用／再生前に、ＳＰセファロース高速流樹脂を清浄するための好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２８Ａ】図１０（Ｅ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な最終ＵＦ／ＤＦ膜画分に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２８Ｂ】図１０（Ｅ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な最終ＵＦ／ＤＦ膜画分に対する別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２９Ａ】図１０（Ｅ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な、ＳＰセファロース溶出精製ＴＧＦ−β３溶液のＵＦ／ＤＦ、および最終充填に対する好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図２９Ｂ】図１０（Ｅ）（ｉ）で提示されるもののような、本発明の方法での使用に適切な、ＳＰセファロース溶出精製ＴＧＦ−β３溶液のＵＦ／ＤＦ、および最終充填に対する別の好ましい条件およびプロトコルを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂａ】
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【図２１Ｂｂ】
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【図２２Ａａ】
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【図２２Ａｂ】
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【図２２Ｂａ】
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【図２２Ｂｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【国際調査報告】
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