(57)【要約】  本発明は、ローソニアイントラセルラリス感染に関連する臨床症状の重症度を軽減するために又は当該感染の影響を受けやすい動物へ防御免疫を与えるために有効なワクチン若しくは免疫原性組成物の免疫原性一部分として有用な塩基配列及びアミノ酸配列を提供する。好ましいアミノ酸配列は、１）配列番号：1〜455、配列番号：466又は配列番号：456、配列番号：457若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；２）１）のポリペプチドと少なくとも 85 % の配列相同性、より好ましくは少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは少なくとも約 98 % の配列相同性、またさらにより好ましくは少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；３）１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；４）配列番号：1〜455、配列番号：456又は配列番号：457若しくは配列番号：466にコードされるアミノ酸配列の配列に包含される少なくとも300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは少なくとも９個の連続するアミノ酸を含む３）の免疫原性一部分；及び/又は５）配列番号：1〜455又は配列番号：466の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド、からなる群より選択される。従って、当該タンパクをコードする塩基配列又はそれらのタンパク自身がワクチン組成物中に獣医学的に許容されるキャリアと共に含まれ、それを必要とする動物へ投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）配列番号：1〜455、配列番号：466又は配列番号：456若しくは配列番号：457によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：466又は配列番号：456若しくは配列番号：457によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び
５）配列番号：1〜455又は配列番号：466のいずれか１つの配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
の群より選択される単離型又は組み換え型の免疫学的タンパク。
【請求項２】
１）配列番号：1〜455、配列番号：466又は配列番号：456若しくは配列番号：457によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：466又は配列番号：456若しくは配列番号：457によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び
５）配列番号：1〜455又は配列番号：466のいずれか１つの配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
からなる群より選択される免疫学的タンパクをコードするヌクレオチド配列を含む単離型又は組み換え型のＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡ分子又は請求項１記載のタンパクを含むベクター。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡ分子又は請求項１記載のタンパクを含む免疫学的組成物。
【請求項５】
獣医学的に許容されるキャリアをさらに含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
動物に請求項１記載の免疫学的タンパク、請求項２記載のＤＮＡ分子、請求項３記載のベクター又は請求項４記載の免疫学的組成物からなる群より選択される生産物を接種することを含む、ローソニアイントラセルラリス感染に対する前記動物の予防方法又は治療方法。
【請求項７】
前記接種が筋肉内に、経口的に又は鼻腔内に行われる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ローソニアイントラセルラリス感染に対する動物の予防又は治療のための医薬の製造のための請求項１記載の免疫学的タンパク、請求項２記載のＤＮＡ分子、請求項３記載のベクター又は請求項４記載の免疫学的組成物の使用。
【請求項９】
１）ローソニアイントラセルラリス細菌に対する抗体を含むサンプルを請求項１記載のタンパクと接触させること；
２）請求項１記載のタンパクが前記サンプルのローソニア特異的抗体へ結合することを可能にしかつローソニア特異的抗体及び請求項１記載のタンパクの複合体を生成することを可能にする条件下で前記１）の混合物をインキュベートすること；及び、
３）前記２）の複合体の存在を検出すること：
を含む、サンプル中の抗体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ローソニアイントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）の抗原及びそれらの使用に関係する。よりとりわけ、本出願は、免疫学的に関連するタンパクである抗原及びそれらのタンパクをコードする塩基配列又はＤＮＡ分子及びローソニアイントラセルラリスの免疫学的タンパクをコードするＤＮＡ分子を含むベクターに関係する。さらによりとりわけ、本発明は、当該タンパク及び塩基配列の同定に関係する。さらによりとりわけ、本発明は、当該タンパク又は塩基配列がサブユニットワクチンでの使用のための優れた候補であるかどうかをそれらの位置によって判定することに関係する。さらによりとりわけ、本発明は、宿主動物における免疫応答を発動することのできる当該タンパク及び塩基配列に関係する。さらによりとりわけ、本出願は、当該タンパク及び塩基配列及びそれらの免疫原性組成物への組み込みそしてそれに引き続く当該組成物の宿主動物への投与に関係する。当該タンパク及び/又は塩基配列はワクチン中の構成成分として用いることができ、当該ワクチンはローソニアイントラセルラリスによる感染に対する防御免疫の地位及び/又はローソニアイントラセルラリスによる感染に関連する臨床症状を軽減することを提供するために用いられる。本出願はまた、当該塩基配列又はそれによってコードされる当該タンパクを含むワクチンの製造方法及び投与方法にも関係する。最終的に、本出願は、当該ローソニアイントラセルラリス抗原を組み込むワクチンの製造方法及び投与法法だけでなく、ローソニアイントラセルラリスの検出のための診断検査にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本出願は、2005年４月28日に出願された仮出願シリアル番号：60/675,806 の利益を主張し、その教示及び内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
（配列表）
本出願は、コンピュータ可読フォーマットの配列表を含み、その教示及び内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
（従来技術の説明）
ローソニアイントラセルラリスはブタの増殖性腸疾患（interopathy）（“ＰＰＥ”）の病原因子であり、ヒト、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ及びダチョウとエミュー位に多様性のある他の動物を含む実質的に全ての動物に作用する。ＰＰＥは、回腸及び結腸の過形成及び炎症を特徴とする肥育ブタ（growing-finishing pigs）及び種子ブタ（young breeding pigs）の一般的な下痢性疾患である。それは多くの場合軽度かつ自己限定的であるが、時々、下痢、鬱状態、食欲不振、動きたがらないこと、遅れた成長及び上昇したＦＣＲ、重症の壊死性腸炎又は高い死亡率を伴う出血性腸炎を引き起こす。当該細菌それ自身は、必須の細胞内細菌である。
【０００３】
ＰＰＥに関連する当該細菌は、“カンピロバクター様生物体”として言及されてきた（S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1989)）。その後、当該病原細菌は、俗名イレアルシムビオント（Illeal symbiont）（ＩＳ）イントラセルラリス（intracellularis）と称される新たな分類学的な属及び種として、同定された（C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No.3, 533-538 (1993) )。つい最近、これらの新たな細菌は、ローソニア（Ｌ.）イントラセルラリスという分類学的名称を与えられた（S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No.4, 820-825 (1995) )。これらの３つの名称は、さらに同定されるとおり及び本明細書に記載されるとおり、同一の生物体について言及するために互換的に用いられてきた。コッホの仮説は、従来法で飼育されたブタへの Ｌイントラセルラリスの純粋培養物の接種によって満たされた；当該疾患の典型的な病変を引き起こし、Ｌイントラセルラリスを当該病変から再単離した。当該疾患のより一般的な非出血型は、多くの場合 18 kg 〜 36 kg のブタに影響を及ぼし、突然の下痢の発症を特徴とする。当該糞便は、水性から粥状で、茶色がかっている又はかすかに血液染色されている。〜２日後に、ブタは、回腸で形成された黄色の繊維素壊死性（fibrinonecrotic）の円柱（casts）を経過するかもしれない。ほとんどの影響されたブタは自然に回復するが、かなりの数が進行性の衰弱を伴う慢性的な壊死性腸炎を進展させる。出血型は、皮膚蒼白、脱力及び出血性若しくは黒色のタール状糞便の経過を特徴とする。妊娠中のメスブタは、流産するかもしれない。病変は、小腸、盲腸若しくは血漿の下側半分のどこにでも起こり得るが、回腸において最も頻発しかつ明らかである。腸壁は厚くなり、腸間膜は水腫状になるかもしれない。腸間膜リンパ節は、拡張される。腸粘膜は、厚くしわが多いように見え、茶色がかった若しくは黄色の繊維素壊死性膜で覆われているのかもしれず、時々点状出血を有する。黄色の壊死性円柱が、回腸中又は結腸の全体を通して発見されるかもしれない。慢性的な症例における広範性の完全な壊死は、小腸をガーデンホースに似た硬い状態にする。増殖性粘膜病変は、多くの場合結腸中にあるが、死体解剖時の入念な検査によってのみ検出される。過度の出血性型においては、結腸中に赤色若しくは黒色のタール状糞便が存在し、回腸中に血餅が存在する。つまるところ、L. イントラセルラリスは、アメリカ合衆国におけるのと同様にヨーロッパにおけるブタの群れの損失のとりわけ重大な原因である。
【０００４】
L. イントラセルラリスは、従来の無細胞培地上で標準的な細菌学的方法によって培養することができない必須の細胞内細菌であり、増殖のために細胞を必要とすると考えられてきた。S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 19, 4286-4292(1993) 及び G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, No.5, 1136-1142 (1993) は、従来の組織培養フラスコ中でＩＥＣ−１８ラット腸上皮細胞の単層を用いる L. イントラセルラリスの培養を明らかにする。その両方が参照によって完全に本明細書に取り込まれる米国特許Nos. 5,714,375 及び 5,885,823 では、浮遊させた宿主細胞での L. イントラセルラリスの培養が記載された。
【０００５】
L. イントラセルラリスの病原性細菌株及び非病原性の弱毒化した細菌株は、最新技術においてよく知られる。例えば、WO96/39629 及び WO05/011731 は、L. イントラセルラリスの非病原性の弱毒化株を記載する。L. イントラセルラリスのさらに弱毒化した細菌株は、WO02/26250 及び WO03/00665 から知られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当業界で必要とされるものは、ローソニアイントラセルラリス感染に対して有効なワクチンであり、当該ワクチンは、動物に防御免疫を提供する若しくは与える及び/又はローソニアイントラセルラリス感染に関連する臨床症状の重症度を軽減する。さらに必要とされることは、当該ワクチンの製造方法及び投与方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、従来技術に内在する課題を克服し、最新技術における注目すべき進歩を提供する。とりわけ、本発明は、ローソニアイントラセルラリスに由来する免疫学的タンパクを含む抗原及びローソニアイントラセルラリスによる感染に対するブタのワクチン接種におけるそれらの使用に関する。好ましくは、当該タンパクは、ブタでの感染の標準的な経過の間に体液性免疫応答を誘発する。これらのタンパクは、両方共単独で及び組み合わせて、免疫応答を引き起こしローソニアイントラセルラリス感染に対する防御免疫又はローソニアイントラセルラリス感染に関連する臨床症状の軽減を提供するタンパクサブユニットワクチン中の構成成分として有用である。当該同定されたタンパクはその後、いかなる従来法によっても生成することができ、ワクチン中で用いることができる。
【０００８】
ローソニアイントラセルラリスDK15540のゲノムのヌクレオチド配列を、300個のアミノ酸の最小長さを有するタンパクをコードするヌクレオチド配列の存在に関して解析した。つまるところ、少なくとも300個のアミノ酸を有する456個のタンパク配列を同定した。これらの配列は、配列番号：1〜455 及び配列番号：466 に一致した。これらのタンパク配列を、２つの別個のコンピュータープログラムであるPSORT及びCELLOを用いてさらに解析した。当該解析の目的は、300個以上のアミノ酸である所定のタンパクを同定し、ローソニアイントラセルラリスにおけるそれらの位置を見出す又は予測することであった。タンパクの当該位置の知見は、当業者へサブユニットワクチンでの使用に関するタンパクの適合性を示唆する。当該PSORTプログラムは、細胞内局在を予測するために用い、サイモンフレーザー大学（Simon Fraser University）のブリンクマン研究所（Brinkman Laboratory）によって主催され、psort.org.で見つけることができる。当該CELLOプログラムは、グラム陰性タンパクを細胞質、内膜、周辺質、外膜又は細胞外空間へ割り当てるためにｎ-ペプチド組成物を基盤とするSupport Vector Machineを用い、cello.life.nctu.edu.tw.で見つけることができる。概して、サブユニットワクチン中の構成成分としてのタンパクの適合性は、適合性の低い順に、細胞質内、内膜、周辺質、外膜及び細胞外である。つまり、細胞質タンパクが最小の適合性の見込みを提供する一方で、細胞外タンパクはワクチンに関する有効性の最大の見込みを提供する。これは、当該タンパクがより曝露され免疫応答の誘導のために利用しやすいからである。CELLOを用いて、細胞外タンパクは、配列番号：. 6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284 及び 340 又はそれらの免疫原性一部分（portion）を含んでおり；外膜タンパクは、配列番号：355, 11, 378, 50, 35, 231, 4, 328,  313, 27, 172, 275, 387, 134, 201, 256, 2, 12, 404, 388, 327, 306, 415, 343, 373, 214, 330, 316, 428, 190, 129, 320, 381, 9, 292, 158, 270, 336, 423, 211, 178, 430, 77, 186, 264, 140, 193, 192, 208, 183, 108, 109, 87, 253, 379,  243, 364, 51, 99, 419, 278, 295, 349, 219, 127, 389, 254, 263, 294, 315, 257, 443, 403, 76, 75, 73, 344, 74 及び 238 又はそれらの免疫原性一部分を含んでおり；周辺質タンパクは、配列番号：6, 132, 421, 112, 110, 310, 247, 205 及び 7 又はそれらの免疫原性一部分を含んでおり；内膜タンパクは、配列番号：. 228, 452, 144, 323, 305, 357, 360, 95, 130, 34, 405, 118, 451, 299, 48, 376, 358, 377, 352, 39, 106, 258, 309, 445, 195, 311, 179, 410, 265, 249, 354, 398, 408, 20, 44, 68, 31, 153, 187, 345, 69, 366, 348, 1, 324, 281, 88, 239, 36, 276, 29, 104, 70, 426, 302, 314, 369, 418, 58, 166, 384, 107, 18, 272, 41, 200, 180, 92, 386, 156, 455, 383, 361, 116, 277, 55, 252, 32, 93, 241, 120, 229, 121, 89, 382 及び 250 又はそれらの免疫原性一部分を含んでおり；さらに細胞質タンパクは、配列番号：6, 79, 346, 332, 11, 53, 81, 8, 21, 435, 234, 185, 450, 347, 424, 326, 155, 215, 399, 209, 216, 416, 147, 313, 157, 342, 343, 293, 271, 337, 72, 269, 103, 64, 425, 148, 341, 24, 285, 289, 429, 268, 177, 405, 260, 407, 100, 442, 321, 370, 47, 353, 80, 67, 436, 30, 220, 397, 212, 96, 149, 119, 273, 105, 85, 15, 3, 232, 40, 225, 420, 19, 286, 259, 196, 207, 176, 280, 431, 160, 367, 168, 128, 124, 394, 126, 5, 255, 242, 46, 152, 16, 65, 433, 167, 221, 414, 287, 412, 111, 303, 449, 114, 233, 406, 25, 210, 61, 203, 86, 141, 171, 447, 266, 437, 173, 78, 199, 319, 400, 392, 351, 184, 43, 217, 189, 174, 409, 204, 396, 83, 335, 98, 224, 113, 372, 301, 164, 246, 56, 175, 262, 226, 17, 362, 338, 267, 356, 251, 300, 62, 14, 350, 37, 202, 159, 115, 331, 317, 163, 38, 240, 318, 236, 304, 439, 191, 244, 97, 417, 133, 123, 22, 359, 165, 385, 218, 162, 102, 223, 283, 453, 290, 402, 71, 446, 380, 339, 122, 161, 117, 390, 82, 427, 371, 454, 49, 368, 28, 10, 42, 63, 57, 59, 54, 136, 84, 181, 60, 90, 52, 125, 230, 142, 440, 197, 363, 23, 325, 154, 227, 282, 213, 33, 391, 91, 312, 198, 101, 45, 422, 298, 448, 375, 274, 150, 206, 374, 248, 393, 222, 288, 235, 66, 182, 307, 334, 322, 169, 279, 13, 395, 434, 365, 137, 145, 170, 401, 441, 138, 94, 245, 411 及び 135 又はそれらの免疫原性一部分を含んでいた。さらに、上記のCELLO予測リストの各々で提供される順番は、当該グループのワクチン目的に関して最も適切でないものから最も適切なものまで順番に当該タンパクを提供する。従って、本発明の目的のために、ローソニアイントラセルラリスタンパクを用いるのが好ましい。より好ましくは、配列番号：456及び457によってコードされるタンパクと同様に、配列番号：1〜455及び466からなる群より選択される配列を用いるのが好ましい。さらにより好ましくは、細胞外タンパク又は外膜タンパク、さらにより好ましくは、配列番号：355, 11, 378, 50, 35, 231, 4, 328,  313, 27, 172, 275, 387, 134, 201, 256, 2, 12, 404, 388, 327, 306, 415, 343, 373, 214, 330, 316, 428, 190, 129, 320, 381, 9, 292, 158, 270, 336, 423, 211, 178, 430, 77, 186, 264, 140, 193, 192, 208, 183, 108, 109, 87, 253, 379,  243, 364, 51, 99, 419, 278, 295, 349, 219, 127, 389, 254, 263, 294, 315, 257, 443, 403, 76, 75, 73, 344, 74, 238, 6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284 及び 340 又は上述のローソニアタンパクのいずれの免疫原性一部分又は上述のローソニアタンパクのいずれのホモログ又は前記ホモログのいずれの免疫原性一部分からなる群より選択されるタンパクを用いるのが好ましい。さらに、これらのタンパクは、サブユニットワクチンでの使用に関して適合性の低い順にリストアップされる。さらにより好ましくは、細胞外タンパクが用いられ、さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284 及び 340 又は 上述のローソニアタンパクのいずれの免疫原性一部分、上述のローソニアタンパクのいずれのホモログ又は前記ホモログのいずれの免疫原性一部分からなる群より選択される。当該完全なCELLO結果は、その利益が本明細書で主張される出願である米国シリアル番号：60/675,806 の表１に盛り込まれる。
【０００９】
PSORTを用いて、細胞外タンパク（ECSVM-Localization）は、配列番号：237, 292 及び 327 を含んでおり；外膜タンパク（OMSVM-Localization）は、配列番号：51, 108, 140, 193, 194, 211, 217, 219, 237, 256, 257, 269, 278, 284, 292, 294, 315, 327, 329, 344, 349, 389 及び 403 を含んでおり；Motif-Localization によって同定される外膜タンパクは、配列番号：32, 70 及び 155 を含んでおり；PPSVM-Localization を用いて何らの周辺質タンパクも同定されず；Motif-Localization を用いて同定される周辺質タンパクは、配列番号：187, 250, 272 及び 303 を含んでおり；CMSVN-Localization によって同定される内膜タンパクは、配列番号：1, 16, 18, 20, 29, 31, 32, 41, 44, 55, 58, 68, 69, 70, 88, 89, 92, 93, 104, 107, 116, 120, 121, 153, 156, 166, 179, 180, 187, 195, 200, 229, 239, 241, 250, 252, 272, 276, 277, 300, 302, 314, 324, 345, 348, 361, 366, 369, 382, 383, 384, 386, 408, 410, 418, 426, 432 及び 455 を含んでおり；HMMTOP-Localization を用いて同定される内膜タンパクは、配列番号：16, 18, 20, 29, 31, 32, 36, 41, 44, 53, 55, 58, 67, 68, 69, 70, 74, 77, 88, 89, 92, 93, 104, 107, 114, 116, 120, 121, 140, 146, 153, 156, 166, 179, 180, 187, 195, 200, 201, 211, 229, 239, 241, 242, 250, 252, 265, 272, 276, 277, 278, 281, 292, 302, 310, 311, 314, 324, 341, 345, 348, 354, 355, 361, 366, 369, 382, 383, 384, 386, 404, 408, 410, 418, 424, 426, 427, 432, 443 及び 455 を含んでおり；さらに、CytoSVM-Localization を用いて同定される細胞質タンパクは、配列番号：5, 8, 10, 13, 17, 22, 23, 24, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 45, 49, 52, 54, 60, 62, 63, 64, 84, 85, 86, 90, 91, 94, 98, 101, 113, 125, 133, 135, 136, 137, 138, 142, 145, 150, 152, 154, 155, 165, 168, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 181, 182, 189, 197, 198, 202, 206, 213, 214, 218, 220, 221, 222, 223, 224, 226, 227, 230, 235, 236, 240, 242, 245, 247, 248, 254, 255, 268, 274, 279, 282, 288, 293, 295, 298, 303, 304, 307, 312, 313, 317, 325, 330, 334, 338, 350, 352, 353, 356, 362, 363, 365, 368, 371, 372, 374, 375, 380, 385, 390, 392, 394, 395, 400, 401, 402, 406, 407, 409, 411, 412, 417, 420, 422, 431, 433, 434, 437, 439, 440, 441, 443, 448, 453 及び 454 を含んでいた。当該完全なPSORT結果は、米国シリアル番号：60/675,806 の表２に提供した。
【００１０】
次に、当該配列の各々を、当該456個のローソニアタンパクと相同的な他のタンパクを発見するためにBLASTにより検索した。当該BLAST検索の結果を、図５として本明細書に含める。
最終的に、ローソニアDK15540ヘモリシンとデスルホビブリオ（Desulfovibria）のOmp-85様タンパク（Omp-85 like protein）との間のアミノ酸アライメントは、米国シリアル番号：60/675,806 の表３に提供した。
【００１１】
本明細書で用いられるとおり、以下の定義が適用される：“配列同一性（Sequence Identity）”は、当業界で知られるとおり、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間、すなわち、参照配列及び当該参照配列と比較される所定の配列との間の関連性に言及する。配列同一性は、所定の配列及び参照配列を至適に整列させて最も高い程度の配列類似性（当該配列の列間のマッチ（match)によって判断される）を引き起こした後に、当該所定の配列を当該参照配列と比較することによって判断される。当該アライメントにおいて、配列同一性は位置毎の基盤で確認され、例えば、特定の位置でヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一である場合には、当該配列はその位置で同一である。当該位置同一性の総数を次に、当該参照配列中のヌクレオチド又は残基の総数で割って % 配列同一性が得られる。配列同一性は、それらの教示が参照によって本明細書に取り込まれる Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 及び Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) に記載されるものであってもよいがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。当該配列同一性を判断するための好ましい方法は、検証される当該配列間の最も大きなマッチを与えるように設計される。配列同一性を判断するための方法は、所定の配列間の配列同一性を判断する公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化される。当該プログラムの例としては、GCGプログラムパッケージ (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 及び FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)） が挙げられるが、これらに限定されない。BLASTプログラムは、NCBI及び他の出所から公的に入手可能である（その教示が参照によって本明細書に取り込まれる BLASTマニュアル, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）。これらのプログラムは、所定の配列と参照配列との間の最も高いレベルの配列同一性を引き起こすためにデフォルトギャップウエイト（default gap weights）を用いて配列を至適に整列させる。例として、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95 % の“配列同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、当該所定のポリヌクレオチド配列が当該参照ヌクレオチド配列の各々100個のヌクレオチド毎に５個までの点変異を含んでいてもよいことを除いて、当該所定のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は当該参照配列と同一であることが意図される。つまり、当該参照ヌクレオチド配列と少なくとも 95 % の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいては、当該参照配列中のヌクレオチドの５%までが欠失させられていてもよいし若しくは他のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は当該参照配列中の総ヌクレオチドの５%までの数のヌクレオチドが当該参照配列へ挿入さ��てもよい。当該参照配列のこれらの変異は、当該参照ヌクレオチド配列の5'末端若しくは3'末端の位置又はそれらの末端の位置間のどこに存在していてもよく、当該参照配列中のヌクレオチドの間に個別で散在させられるか又は当該参照配列内に１つ以上の連続するグループで散在させられてもよい。同じように、参照アミノ酸配列と少なくとも、例えば、95 % の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、当該所定のポリペプチド配列が当該参照アミノ酸配列の各々100個のアミノ酸毎に５個までのアミノ酸の変更を含んでいてもよいことを除いて、当該ポリペプチドの所定のアミノ酸配列は当該参照配列と同一であることが意図される。つまり、参照アミノ酸配列と少なくとも 95 % の配列同一性を有する所定のポリペプチド配列を獲得するために、当該参照配列中の５%までのアミノ酸残基が欠失させられていてもよいし若しくは他のアミノ酸で置換されていてもよく、又は当該参照配列中のアミノ酸残基の総数の５%までの数のアミノ酸が当該参照配列へ挿入されてもよい。当該参照配列のこれらの変異は、当該参照アミノ酸配列のアミノ末端若しくはカルボキシ末端の位置又はそれらの末端の位置間のどこに存在していてもよく、当該参照配列中の残基間に個別で散在させられるか又は当該参照配列内に１つ以上の連続するグループで散在させられてもよい。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存アミノ酸置換（conservative amino acid substitutions）により異なる。しかしながら、保存置換（conservative substitutions）は、配列同一性を判断する際に、マッチとして含まれない。
【００１２】
同様に、“配列相同性（sequence homology）”はまた、本明細書で用いられるとおり、２つの配列の関連性を判断する方法に言及する。配列相同性を判断するために、２つ以上の配列を上記に記載されるとおり至適に整列させて、必要であればギャップが導入される。しかしながら、“配列同一性”と対照的に、保存アミノ酸置換は、配列相同性を決定する際に、マッチとして数えられる。つまり、参照配列と 95 % の配列相同性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを獲得するために、当該参照配列の 95 % のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドがマッチしなければならない又は他のアミノ酸若しくはヌクレオチドでの保存置換を含む、又は保存置換を含めないで当該参照配列の総アミノ酸残基若しくはヌクレオチドの５%までの数のアミノ酸若しくはヌクレオチドが当該参照配列へ挿入されてもよい。
【００１３】
“保存置換”は、全体的な機能性が著しく変わらないような、サイズ、疎水性などを含む類似の特性又は性質を有する他のアミノ酸残基又はヌクレオチドでのアミノ酸残基又はヌクレオチドの置換に言及する。
【００１４】
“単離型”は、その自然状態から“ヒトの手によって”変えられていることを意味し、つまり、それが自然に存在している場合には、その本来の環境から変更させられる若しくは移動させられる又はその両方をされている。例えば、生命体中に自然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは“単離型”ではなく、その自然状態の共存する物質から分離される同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、当該用語が本明細書で採用されるとおり、“単離型”である。概して、タンパク配列及び当該タンパクをコードするＤＮＡを含む本明細書に記載される各々の配列はまた、当該開示される配列に関連してあるパーセンテージの配列相同性又は配列同一性を有するタンパク及びＤＮＡ配列をも包含する。高いパーセンテージの配列相同性又は配列同一性を有することが好ましい一方で、当該配列そのものよりも特許請求の範囲に記載されている配列の機能を維持することがより好ましい。つまり、当業者は本明細書に開示される当該配列への軽微な変更を行うことができ、さらに当該開示される配列の機能性を当該の“類縁体（derivative）”配列に維持することができる。保存置換は、まだ機能性を維持する一方で、当該配列への変更を行う１つの好ましい方法である。好ましくは、本発明は、本明細書に開示される当該配列を基盤とする類縁体配列を含む他の配列を包含する。当該他の配列は、好ましくは、本明細書に開示される配列と少なくとも約 85 % の配列同一性又は配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列同一性又は配列相同性を有する。好ましくは、当該相同性は、少なくとも25個のアミノ酸/ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも50個のアミノ酸/ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも75個のアミノ酸/ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも150個のアミノ酸/ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも200個のアミノ酸/ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも250個のアミノ酸/ヌクレオチド、さらに最も好ましくは、少なくとも300個のアミノ酸/ヌクレオチドの長さを超えて存在する。さらに、本明細書に記載されるタンパク配列が免疫原性組成物中で有用であること及びこれらの配列のいくつかのストレッチ（stretches）又は一部分が免疫応答を誘導するのに他のものよりもさらに重要な役割を果たすことが理解される。これは、選択される一部分が免疫応答を引き起こすのに十分な長さであるという条件で、十分な免疫応答がこれらのタンパクの当該選択される一部分だけを用いることによって誘導することができることを意味する。従って、本発明は、本明細書に記載される当該タンパクのいずれの免疫原性一部分をも包含する。さらに、本発明はまた、それらの免疫原性ストレッチ又は免疫原性一部分をコードするいずれのＤＮＡ分子をも包含する。概して、当該ストレッチ又は一部分は、当該配列の全長までの連続するアミノ酸/ヌクレオチドの配列を含む。さらに好ましくは、当該ストレッチ又は一部分は、優先度の低い順に、当該開示される配列又はいずれのその相同体の少なくとも300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個、９個又は最も好ましくは８個の連続するアミノ酸を有する。ＤＮＡ分子に関係付けられる際には、当該ストレッチ又は一部分は、優先度の低い順に、当該開示される配列の少なくとも300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個、９個又は最も好ましくは８個の連続するアミノ酸をコードする。好ましくは、前記の相同体配列は、好ましくは、本明細書に開示される配列と少なくとも約 85 % の配列同一性又は配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列同一性又は配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列同一性又は配列相同性を有する。当該配列それ自身と同様に、当該ストレッチもまた、機能を損なうことなく当業者によって操作可能である。従って、当該配列相同性及び配列同一性の定義はまた、当該開示されるタンパクのこれらのストレッチ又は一部分にも適用される。
【００１５】
本明細書で用いられるとおり、“L. イントラセルラリス”又は“ローソニアイントラセルラリス”又は“ローソニア”という用語は、その各々が参照によって本明細書に完全に取り込まれる C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1993) 及び S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995) によって詳細に記載される細胞内の湾曲したグラム陰性菌並びに WO96/39629 及び WO05/011731 に記載される分離株であってもよいがこれらに限定されない分離株を意味する。とりわけ、“L. イントラセルラリス”という用語はまた、ブタペスト条約の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 に寄託され、ATCC受入番号：PTA4926 又はATCC受入番号：55783 を割り当てられた分離株をも意味するが、これらに限定されない。両方の分離株はそれぞれ、WO96/39629 及び WO05/011731 に記載される。“L. イントラセルラリス”という用語はまた、いずれの他の L. イントラセルラリス菌株又は好ましくは WO96/39629 及び WO05/011731 に記載される L. イントラセルラリス菌株の少なくとも１つの免疫原性特性を有する分離株、とりわけ、ブタペスト条約の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 に寄託され、ATCC受入番号：PTA4926 又はATCC受入番号：55783 を割り当てられた分離株の少なくとも１つの免疫原性特性を有する分離株をも意味するが、これらに限定されない。
【００１６】
さらに、“L. イントラセルラリス”という用語はまた、いずれの L. イントラセルラリス抗原をも意味する。“L. イントラセルラリス抗原”という用語は、本明細書で用いられるとおり、動物、好ましくはブタへ投与される際に L. イントラセルラリスが引き起こす感染に対する免疫応答を誘導する、刺激する又は増強することができる少なくとも１つの抗原を含む物質のいずれの組成物をも意味するが、これらに限定されない。好ましくは、前記 L. イントラセルラリス抗原は、完全な L. イントラセルラリス細菌、とりわけ、不活性型（いわゆる、死菌）の完全な L. イントラセルラリス細菌、生存修飾した（modified live）若しくは弱毒化した L. イントラセルラリス細菌（いわゆる、ＭＬＢ）、L. イントラセルラリスの少なくとも１つの免疫原性アミノ酸配列を含むキメラベクター又は L. イントラセルラリスの少なくとも１つの免疫原性アミノ酸配列を含むいずれの他のポリペプチド若しくは構成成分である。“免疫原性タンパク”、免疫原性ポリペプチド”又は“免疫原性アミノ酸配列”という用語は、本明細書で用いられるとおり、前記の免疫原性タンパク、免疫原性ポリペプチド又は免疫原性アミノ酸配列を含む病原体に対する宿主における免疫応答を誘発するいずれのアミノ酸配列について言及する。とりわけ、L. イントラセルラリスの“免疫原性タンパク”、“免疫原性ポリペプチド”又は“免疫原性アミノ酸配列”は、前記の“免疫原性タンパク”、“免疫原性ポリペプチド”又は“免疫原性アミノ酸配列”が投与される宿主における L. イントラセルラリスに対する免疫学的応答を誘発する抗原をコードするいずれのアミノ酸配列をも意味する。例えば、配列番号：1〜455及び配列番号：466又はそれらのいずれの免疫原性一部分の配列を有する当該タンパクは、ローソニアイントラセルラリスの“免疫原性タンパク”、“免疫原性ポリペプチド”又は“免疫原性アミノ酸配列”であると考えられる。さらに、これらの用語は、いずれのタンパクの全長配列、それらのアナログ又はそれらの免疫原性フラグメント若しくは免疫原性一部分であってもよいが、これらに限定されない。“免疫原性フラグメント”又は“免疫原性一部分”という用語は、１つ以上のエピトープを含みそれによって関連する病原体に対する免疫学的応答を誘発するタンパクのフラグメントを意味する。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, New Jersey を参照（その教示及び内容は、参照によって本明細書に取り込まれる）。例えば、直線状のエピトープを、例えば、固体支持体（supports）上で当該タンパク分子の一部に相当するペプチドを多数同時に合成し、当該ペプチドがまだ当該支持体に付属される間に当該ペプチドを抗体と反応させることによって同定してもよい。当該技術は当業界で知られ、例えば、米国特許No. 4,708,871；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715 に記載される（その教示及び内容は、参照によって本明細書に取り込まれる）。同様に、立体構造エピトープは、アミノ酸の空間的な立体構造を例えば、Ｘ線結晶構造解析及び２次元ＮＭＲによって決定することによって容易に同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols, supra. を参照。��成抗原もまた、当該定義の範囲内に包含され、例えば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ（flanking epitopes）及び他の組み換え型若しくは合成的に生成される抗原が挙げられる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. 及び Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998 を参照（それらの教示及び内容は、参照によって本明細書に取り込まれる）。
【００１７】
菌株又は分離株は、WO96/39629 及び WO05/011731 に記載される L. イントラセルラリス株の少なくとも１つの“免疫原性特性”、とりわけ、ATCC受入番号：PTA4926 又はATCC受入番号：55783 として寄託された分離株の“免疫原性特性”を有し、WO06/01294 に記載される抗L. イントラセルラリス特異的抗体の少なくとも１つでやはり WO06/01294 に記載される検出アッセイにおいて検出可能である。好ましくは、それらの抗体は、参照番号 301:39、287:6、268:29、110:9、113:2 及び 268:18 を有する抗体から選択される。好ましくは、当該検出アッセイは、WO06/12949 の実施例２及び実施例３に記載されるとおりのサンドウィッチELISAであり、他方では、抗体 110:9 は捕捉抗体として用いられ、抗体 268:29 は抱合型抗体として用いられる。WO06/129449 に開示される全ての抗体は、ブタペスト条約に従う特許寄託物として Center for Applied Microbiology and Research（CAMR）及びEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）, Salisbury, Wilshire SP4 0JG, UK に寄託されるハイブリドーマ細胞によって産生される。寄託年月日は、2004年５月11日であった。ハイブリドーマ細胞株 110:9 は、ECACC Acc. No. 04092204 の下に首尾良く寄託される。ハイブリドーマ細胞株 113:2 は、ECACC Acc. No. 04092201 の下に首尾良く寄託される。ハイブリドーマ細胞株 268:18 は、ECACC Acc. No. 04092202 の下に首尾良く寄託される。ハイブリドーマ細胞株 268:29 は、ECACC Acc. No. 04092206 の下に首尾良く寄託される。ハイブリドーマ細胞株 287:6 は、ECACC Acc. No. 04092203 の下に首尾良く寄託される。ハイブリドーマ細胞株 301:39 は、ECACC Acc. No. 04092205 の下に首尾良く寄託される。
【００１８】
ローソニアイントラセルラリスのゲノムを含むいくつかの配列はヨーロッパ特許：1094070 と同様に、PCT出願：WO0069903、WO0069904、WO0069905 及び WO0069906 に記載されており、それらの全ての教示及び内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
【００１９】
組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”又は“免疫応答”は、当該組成物又はワクチンに対する細胞介在性免疫応答及び/又は抗体介在性免疫応答の宿主における発生である。通常、“免疫応答”は、以下の効果の１つ以上であってもよいが、これらに限定されない：当該組成物中又はワクチン中に含まれる抗原又は抗原群に特に向けられる抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び/又は細胞障害性Ｔ細胞及び/又はydＴ細胞（yd T cells）の産生又は活性化。好ましくは、当該宿主は、新たな感染に対する抵抗力が強化され及び/又は当該疾患の臨床的な重症度が軽減されるように治療的な免疫学的応答又は保護的な免疫学的応答のどちらかを示す。当該保護は、上記で記載されるとおり、宿主感染に関連する症状の軽減又は欠如のどちらかによって明らかにされる。
【００２０】
さらに、本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物は、１つ以上の獣医学的に許容されるキャリアを含んでいてもよい。本明細書で用いられるとおり、“獣医学的に許容されるキャリア”には、いずれの及び全ての、溶媒、分散媒（dispersion media）、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤（adsorption delaying agents）などが含まれる。
【００２１】
“希釈剤”には例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなどが含まれる。等張剤には例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが含まれる。安定化剤には例えば、アルブミンやエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。
【００２２】
“アジュバント”は、本明細書で用いられるとおり、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、例えば、Quil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、ウォーターインオイルエマルション（water-in-oil emulsion）、オイルインウォーターエマルション（oil-in-water emulsion）、ウォーターインオイルインウォーターエマルション（water-in-oil-in-water emulsion）などのサポニンであってもよい。当該エマルションはとりわけ、軽質流動パラフィンオイル（欧州薬局方型）；スクアラン若しくはスクアレンのようなイソプレノイドオイル；アルケン、とりわけイソブテン若しくはデセンのオリゴマー形成から結果として得られるオイル；直鎖アルキル基を含む酸のエステル若しくはアルコールのエステル、よりとりわけ、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-（カプリラート/カプラート）、グリセリルトリ-（カプリラート/カプラート）又はプロピレングリコールジオレアート；分鎖の脂肪酸若しくはアルコールのエステル、とりわけ、イソステアリン酸エステルを基盤とすることができる。当該オイルを乳化剤と組み合わせて用いてエマルションを形成する。当該乳化剤は好ましくは、非イオン性界面活性剤、とりわけ、ソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えば、無水マンニトールオレアート）、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（これらは、エトキシレート化されていてもよい）及びポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック共重合体、とりわけ、プルロニック製品、特に、L121 である。Hunter et al.m The theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.), John Wiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) 及び Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997) を参照。例えば、M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 によって編集された"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" の147頁に記載されるSPTエマルション及びこれと同じ本の183頁に記載されるエマルションMF59を用いることが可能である。
【００２３】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体から選択される化合物である。好都合なアジュバント化合物は、架橋されるアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、とりわけ、糖のポリアルケニルエーテル又はポリアルコールで架橋されるアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られる（Pharmeuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、少なくとも３個の、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシ化された化合物であって、当該少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族のラジカルで置換される当該化合物で架橋される当該アクリルポリマーを記載する米国特許No. 2,909,462 を参照することもできる。好ましいラジカルは、２個〜４個の炭素原子を含むもの、例えば、ビニル基、アリル基及び他のエチレン的に不飽和な基である。当該不飽和ラジカルは、それら自身がメチルのような他の置換基を含んでいてもよい。Carbopol（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売される製品が、とりわけ適切である。それらは、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋される。それらの中でも、Carbopol 974P、934P及び971Pが言及されてもよい。最も好ましいのは、Carbopol 971P の使用である。無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体の中でも、無水マレイン酸とエチレンの共重合体である共重合体EMA（Monsanto）である。これらのポリマーの水中への溶解は結果として、免疫原性組成物、免疫学的組成物又はワクチン組成物それ自身が取り込まれるアジュバント溶液を与えるために中和することのできる、好ましくは、生理的ｐＨまで中和することのできる酸性溶液をもたらす。
【００２４】
さらなる適切なアジュバントとしては他の多くの中で、RIBIアジュバントシステム（Ribi Inc.）、ブロック共重合体（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emryville CA）、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン（Avridine）脂質-アミンアジュバント、E. Coli（組み換え型又は別のやり方）の熱不安定性エンテロトキシン、コレラトキシン、IMS1314又はムラミルジペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
好ましくは、当該アジュバントは、投与量あたり、約 100 μg 〜 約 10 mg の量で加えられる。さらにより好ましくは、当該アジュバントは、投与量あたり、約 100 μg 〜 約 10 mg の量で加えられる。さらにより好ましくは、当該アジュバントは、投与量あたり、約 500 μg 〜 約 5 mg の量で加えられる。さらにより好ましくは、当該アジュバントは、投与量あたり、約 750 μg 〜 約 2.5 mg の量で加えられる。最も好ましくは、当該アジュバントは、投与量あたり約１mgの量で加えられる。
【００２６】
遺伝暗号の縮重が原因で、核酸の種々のバリエーションが同一のタンパクをコードすることが知られる。アミノ酸及び遺伝暗号のコード化の両方が当業界においてよく知られているので、結果として同一のアミノ酸をもたらす塩基配列における当該バリエーションの全ては、本発明によってカバーされる。
【００２７】
本発明のある実施態様において、ローソニアイントラセルラリスに由来する免疫学的タンパクが提供される。“免疫原性”及び“免疫学的”という用語が本明細書において同義語として用いられることが本明細書と共に理解される。好ましくは、当該タンパクは、ローソニアタンパクからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパクは、配列番号：1〜455 及び466及びそれらの組み合わせからなる群より選択される配列と少なくとも 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するタンパクをコードするＤＮＡ配列によりコードされる。あるいは、当該タンパクは、配列番号：456 及び配列番号：457 からなる群より選択される配列と少なくとも約 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するＤＮＡ配列によってコードされる。より好ましくは、当該タンパクは、細胞外ローソニアタンパク及び外膜ローソニアタンパクからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：355, 11, 378, 50, 35, 231, 4, 328,  313, 27, 172, 275, 387, 134, 201, 256, 2, 12, 404, 388, 327, 306, 415, 343, 373, 214, 330, 316, 428, 190, 129, 320, 381, 9, 292, 158, 270, 336, 423, 211, 178, 430, 77, 186, 264, 140, 193, 192, 208, 183, 108, 109, 87, 253, 379, 243, 364, 51, 99, 419, 278, 295, 349, 219, 127, 389, 254, 263, 294, 315, 257, 443, 403, 76, 75, 73, 344, 74, 238, 6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284, 340, 466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：344、466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。本明細書で用いられるとおり、配列番号：1〜455の当該配列への言及は、各々個別の配列への言及を含む、つまり、例えば、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、... 、配列番号：450、配列番号：451、配列番号：452、配列番号：453、配列番号：454 及び配列番号：455 を意味することがさらに理解される。より好ましくは、当該免疫学的タンパク又はタンパクの組み合わせは、ウェスタンブロットにおいて回復期ブタ血清と反応する。本発明の他の実施態様において、当該免疫学的タンパクは、配列番号：456 若しくは配列番号：457 のどちらかにコードされるタンパク又は配列番号：1〜455 及び 466（例えば、“参照タンパク”）からなる群より選択されるタンパクと同様の機能を有する及び/又は同様の免疫応答を引き起こす。 “配列番号：456 若しくは配列番号：457 のどちらかにコードされる参照タンパク又は配列番号：1〜455 及び 466 からなる群より選択されるタンパクと同様の免疫応答を引き起こす”ことは、本明細書で用いられるとおり、当該免疫学的タンパクが標準化検出アッセイ、例えば ELISA において、当該対応する参照タンパクに関して検出される振幅（amplitude）と比較して、同一条件下の当該検出アッセイで用いられる際に少なくとも 20 %、好ましくは 50 %、さらにより好ましくは 75 %、最も好ましくは 100 % の振幅で反応することを意味する。タンパクの組み合わせが１つのタンパクよりも大きな免疫応答を誘発し、それによってより大きな防御免疫を提供することがさらに理解される。
【００２８】
本発明の他の実施態様は、上記に記載されるとおりのタンパク配列、そのホモログ若しくは免疫原性一部分又は前記の免疫原性一部分のホモログの少なくとも８個の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む免疫原性タンパク又はワクチン組成物を提供する。さらにより好ましくは、必須の連続するアミノ酸を含む当該アミノ酸配列は、長さで８個までのアミノ酸、より好ましくは、長さで14個までのアミノ酸、さらにより好ましくは、長さで23個までのアミノ酸、さらにより好ましくは、長さで40個までのアミノ酸、さらにより好ましくは、少なくとも長さで70個までのアミノ酸、さらにより好ましくは、長さで100個までのアミノ酸、さらにより好ましくは、長さで200個までのアミノ酸、さらにより好ましくは、長さで300個までのアミノ酸である。好ましい形態において、本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物は、上記で説明されるとおり、獣医学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００２９】
本発明の他の実施態様において、動物、好ましくはブタにローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクを接種することによる当該動物にワクチン接種する方法が提供される。好ましくは、当該タンパクは上記に記載されるとおりのものである。
【００３０】
本発明の他の実施態様において、当該ワクチンは、配列番号：1〜455 及び 466 のいずれか１つ、配列番号：456 にコードされるタンパク、配列番号：457 にコードされるタンパク、配列番号：1〜455 及び 466 のいずれか１つと同様の機能を有し同様の免疫応答を誘発するタンパク又はそれらのいずれの一部分、配列番号：456 にコードされるタンパクと同様の機能を有し同様の免疫応答を誘発するタンパク、配列番号：457 にコードされるタンパクと同様の機能を有し同様の免疫応答を誘発するタンパク、それらの免疫原性一部分、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパクを含む。
【００３１】
本発明の他の実施態様において、当該動物は、ローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクをコードするＤＮＡをベクターへ挿入することによって調製されるワクチンを当該動物に接種すること及び当該ベクターをいずれの従来の方法で投与することによってワクチン接種される。１つの好ましい投与方法は経口である。好ましくは、当該ベクターは細菌である。より好ましくは、当該ベクターはサルモネラである。好ましくは、当該タンパクはローソニアタンパクからなる群より選択される。より好ましくは、ＤＮＡにコードされる当該タンパクは、配列番号：1〜455 及び 466、それらのホモログ、それらの免疫原性一部分、前記の免疫原性一部分のホモログ、配列番号：1〜455 及び 466 のいずれか１つと同様の機能を有し同様の免疫応答を誘発するタンパク、配列番号：457 にコードされるタンパクと同様の機能を有し同様の免疫応答を誘発するタンパク及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパクは、配列番号：1〜455 及び 466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される配列と少なくとも 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するタンパクをコードするＤＮＡ配列にコードされる。あるいは、当該タンパクは、配列番号：456 及び配列番号：457 からなる群より選択される配列と少なくとも約 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するＤＮＡ配列又は配列番号：456 及び配列番号：457 の配列にコードされる当該タンパクの免疫原性一部分をコードするその一部分にコードされる。より好ましくは、当該タンパクは、細胞外ローソニアタンパク及び外膜ローソニアタンパクからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：355, 11, 378, 50, 35, 231, 4, 328,  313, 27, 172, 275, 387, 134, 201, 256, 2, 12, 404, 388, 327, 306, 415, 343, 373, 214, 330, 316, 428, 190, 129, 320, 381, 9, 292, 158, 270, 336, 423, 211, 178, 430, 77, 186, 264, 140, 193, 192, 208, 183, 108, 109, 87, 253, 379,  243, 364, 51, 99, 419, 278, 295, 349, 219, 127, 389, 254, 263, 294, 315, 257, 443, 403, 76, 75, 73, 344, 74, 238, 6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284, 340, 466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：344、466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパク又はタンパクの組み合わせは、ウェスタンブロットにおいて回復期ブタ血清と反応する。本発明の他の実施態様において、当該免疫学的タンパクは、配列番号：456 若しくは配列番号：457 のどちらかにコードされるタンパク又は配列番号：1〜455 及び 466 からなる群より選択されるタンパク又はそれらの一部分、又は配列番号：456 及び配列番号：457 の配列にコードされるタンパクの免疫原性一部分をコードするヌクレオチド配列又はそれらの一部分と同様の機能を有し同様の免疫応答を引き起こす。
【００３２】
本発明の他の実施態様において、ローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクをコードする当該ＤＮＡは、ＤＮＡワクチンを用いて好ましい宿主へ送達される。好ましくは、当該タンパクは、ローソニアタンパクからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパクは、配列番号：1〜455 及び 466、それらのホモログ、それらの免疫原性一部分、前記の免疫原性一部分のホモログ、配列番号：1〜455 及び 466 のいずれか１つと同様の機能を有し同様の免疫応答を誘発するタンパク並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される配列と少なくとも 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するタンパクをコードするＤＮＡ配列にコードされる。あるいは、当該タンパクは、配列番号：456 及び配列番号：457 からなる群より選択される配列と少なくとも約 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するＤＮＡ配列、又は配列番号：456 及び配列番号：457 の配列にコードされる当該タンパクの免疫原性一部分をコードするその一部分にコードされる。より好ましくは、当該タンパクは、細胞外ローソニアタンパク及び外膜ローソニアタンパクからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：355, 11, 378, 50, 35, 231, 4, 328,  313, 27, 172, 275, 387, 134, 201, 256, 2, 12, 404, 388, 327, 306, 415, 343, 373, 214, 330, 316, 428, 190, 129, 320, 381, 9, 292, 158, 270, 336, 423, 211, 178, 430, 77, 186, 264, 140, 193, 192, 208, 183, 108, 109, 87, 253, 379, 243, 364, 51, 99, 419, 278, 295, 349, 219, 127, 389, 254, 263, 294, 315, 257, 443, 403, 76, 75, 73, 344, 74, 238, 6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284, 340, 466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：344、466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパクは又はタンパクの組み合わせは、ウェスタンブロットにおいて回復期ブタ血清と反応する。本発明の他の実施態様において、当該免疫学的タンパクは、配列番号：456 若しくは配列番号：457 のどちらかにコードされるタンパク又は配列番号：1〜455 及び 466 からなる群より選択されるタンパクと同様の機能を有する及び/又は同様の免疫応答を引き起こす。
【００３３】
本発明のさらに他の実施態様において、ローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクをコードする当該ＤＮＡは、原核生物系又は真核生物系で発現させて、次に精製して当該好ましい宿主へ送達することができる。好ましくは、当該タンパクは、ローソニアタンパクからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパクは、配列番号：1〜455 及び 466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される配列と少なくとも 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するタンパクをコードするＤＮＡ配列にコードされる。あるいは、当該タンパクは、配列番号：456 及び 配列番号：457 からなる群より選択される配列と少なくとも約 85 %、より好ましくは 90 %、さらにより好ましくは 93 %、さらにより好ましくは 95 %、さらにより好ましくは 97 %、さらにより好ましくは 98 %、さらにより好ましくは 99 %、さらに最も好ましくは 100 % の配列相同性を有するＤＮＡ配列にコードされる。より好ましくは、当該タンパクは、細胞外ローソニアタンパク及び外膜ローソニアタンパクからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：355, 11, 378, 50, 35, 231, 4, 328,  313, 27, 172, 275, 387, 134, 201, 256, 2, 12, 404, 388, 327, 306, 415, 343, 373, 214, 330, 316, 428, 190, 129, 320, 381, 9, 292, 158, 270, 336, 423, 211, 178, 430, 77, 186, 264, 140, 193, 192, 208, 183, 108, 109, 87, 253, 379, 243, 364, 51, 99, 419, 278, 295, 349, 219, 127, 389, 254, 263, 294, 315, 257, 443, 403, 76, 75, 73, 344, 74, 238, 6, 329, 296, 413, 194, 143, 146, 333, 438, 188, 261, 237, 336, 291, 151, 26, 139, 333, 444, 308, 131, 284, 340, 466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらにより好ましくは、当該タンパクは、配列番号：344、466 及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。より好ましくは、当該免疫学的タンパク又はタンパクの組み合わせは、ウェスタンブロットにおいて回復期ブタ血清と反応する。本発明の他の実施態様において、当該免疫学的タンパクは、配列番号：456 若しくは配列番号：457 のどちらかにコードされるタンパク又は配列番号：1〜455 及び 466 からなる群より選択されるタンパクと同様の機能を有する及び/又は同様の免疫応答を誘発する。
【００３４】
さらに、例えば、IM注射、生分解性マイクロスフェア又は吸入のような当業界で知られる他のワクチン接種方法を、本発明に従う免疫学的タンパクの送達のために用いてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
従って、本発明は、免疫学的タンパク又は免疫原性タンパク、好ましくは、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個、９個又は最も好ましくは８個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
の群より選択されるローソニアイントラセルラリスの免疫学的タンパク又は免疫原性タンパクに関する。
【００３６】
本明細書に記載される当該免疫原性タンパクは、単離及び/又は精製によってローソニアイントラセルラリスから獲得することができる又は当該免疫原若しくはその一部分若しくはそのエピトープをコードする核酸のインビトロ組み換え発現から獲得することができる。既知タンパクの単離及び/又は精製のための方法は、当業者によく知られる。さらに、既知配列のタンパクを組み換え的に発現するための種々の方法は、当業者に知られる。
【００３７】
本発明のさらなる側面は、上記に記載される当該免疫学的タンパクの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。好ましくは、当該ＤＮＡ分子は、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；及び/又は
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個、９個又は最も好ましくは８個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；
からなる群より選択される免疫学的タンパクを少なくとも１つコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
本発明のさらなる他の実施態様において、ローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクをコードするＤＮＡが、原核生物系、真核生物系で発現され、次に精製されて好ましい宿主へ送達される。好ましくは、当該タンパクは、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；及び/又は
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；
からなる群より選択される。
【００３９】
さらなる側面に従って、本発明はまた、本明細書に記載されるいずれのＤＮＡ分子を含むベクターに関する。好ましくは、当該ＤＮＡ分子は、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；及び/又は
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；
からなる群より選択される免疫学的タンパクを少なくとも１つコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
発現用のベクター（又は組み換え体）の製造方法及び/又は使用方法はとりわけ以下に開示される方法によって又は以下に開示される方法に類似したものによって行うことができる：米国特許：Nos.4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, PCT公開：WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti,"Applications of pox virus vectors to vaccination: An update,"PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996, Smith et al., U. S. Patent No. 4,745,051, (組み換えバキュロウイルス), Richardson, C.D. (編集者), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al.,"Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406; EPA0 370 573, 1986年10月16日に出願された米国出願 No. 920,197, 欧州特許公開 No. 265785, 米国特許 No. 4,769,331 (組み換えヘルペスウイルス), Roizman,"The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996, Robertson et al."Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996, Frolov et al.,"Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,"PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075,1991; 米国特許 Nos. 5,591,439, 5,552,143, WO 98/00166, 両方共に1996年７月３日に出願された許可された（allowed）米国出願シリアル Nos. 08/675,556, 及び 08/675,566 (組み換えアデノウイルス), Grunhaus et al., 1992,"Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65,Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70,42434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259: 1745-49,1993 and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996, 及び 米国特許 Nos. 5,591,639, 5,589,466, 及び 5,580,859 に加えて WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660, Tang et al., Nature and Furth et al. Analytical Biochemistry（特に、ＤＮＡ発現ベクターに関する）。さらにまた、WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739,1998 (レンチウイルス発現系); Sanford et al., 米国特許 No. 4,945,050; Fischbachet al. (イントラセル（Intracel）), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (ＤＮＡベクターシステム); Szoka et al., U. S. Patent No. (生細胞へＤＮＡを挿入する方法); McCormick et al., 米国特許 No. 5,677,178 (細胞壊死性ウイルスの使用); 及び米国特許 No. 5,928,913 (遺伝子運搬用ベクター), さらに本明細書で引用される他の文献も参照のこと。ＤＮＡベクター（ＤＮＡプラスミド）だけでなく、例えば、オーエスキー病ウイルスのようなブタヘルペスウイルス、ブタアデノウイルス、ポックスウイルス、とりわけワクチニアウイルス、トリポックスウイルス（avipox virus）、カナリアポックスウイルス及���ブタ痘ウイルスから選択されるウイルスベクターが、本発明の実施において有利に採用される。
【００４１】
さらなる側面に従って、本発明は、ローソニアイントラセルラリス感染に関連する臨床症状の重症度を軽減するために有効な免疫学的組成物、好ましくはワクチン組成物に関する。好ましくは、当該免疫学的組成物は、本明細書に開示されるとおりの免疫学的タンパク、免疫学的タンパクをコードするＤＮＡ分子及び/又は免疫学的タンパクをコードするＤＮＡを含むベクターを含む。好ましくは、前記免疫学的タンパクは：
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
である。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物は、希釈剤、等張剤、安定化剤及び/又はアジュバントを含むことができ、好ましくは、本明細書に開示されるものから選択される。
【００４３】
従って、さらなる側面に従って、本発明は、本明細書に記載される免疫学的タンパク、免疫学的タンパクをコードするＤＮＡ分子及び/又は免疫学的タンパクをコードするＤＮＡを含むベクター及び希釈剤、等張剤、安定化剤又はアジュバントを含む免疫学的組成物に関係する。好ましくは、前記免疫学的タンパクは：
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
である。
【００４４】
好ましくは、前記希釈剤、等張剤、安定化剤又はアジュバントは、上記に記載されるもののいずれの１つである。
【００４５】
本発明の他の実施態様において、動物にローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクを接種することによる、ローソニアイントラセルラリス感染に対する前記動物の予防方法又は治療方法が提供される。好ましくは、前記タンパク又は免疫学的組成物は、上記に記載されるもののいずれの１つである。好ましくは、前記免疫学的タンパクは：
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
である。
【００４６】
本発明の他の実施態様において、当該動物は、ローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクをコードするＤＮＡをベクターへ挿入することによって調製されるワクチンを当該動物に接種すること及び当該ベクターをいずれの従来の方法で投与することによってワクチン接種される。１つの好ましい投与方法は経口である。好ましくは、当該ベクターは細菌である。より好ましくは、当該ベクターはサルモネラである。好ましくは、当該ＤＮＡは、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるタンパクをコードする。
【００４７】
より好ましくは、当該免疫学的タンパク又は前記ＤＮＡ分子にコードされるタンパクの組み合わせは、ウェスタンブロットにおいて回復期ブタ血清と反応する。
【００４８】
本発明の他の実施態様において、ローソニアイントラセルラリス由来の免疫学的タンパクをコードするＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子ワクチンを用いて好ましい宿主へ送達される。好ましくは、当該ＤＮＡ分子は、宿主細胞へ入った際に、当該免疫学的タンパクを発現する。好ましくは、当該ＤＮＡ分子にコードされる免疫学的タンパクは、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；及び/又は
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；
からなる群より選択される。
【００４９】
より好ましくは、当該免疫学的タンパク又はタンパクの組み合わせは、ウェスタンブロットにおいて回復期ブタ血清と反応する。
本明細書に記載されるとおり、本発明のワクチン組成物は、例えば、インターロイキン、インターフェロン又は他のサイトカインのような１つ以上の他の免疫調節剤をさらに含むことができる。当該ワクチン組成物はまた、ゲンタマイシン及びメルチオラート（Merthiolate）を含むこともできる。本発明との関連で有用なアジュバント及び添加剤の量及び濃度を当業者が容易に決定することができる一方で、本発明は、当該ワクチン組成物の投与量１mLあたり約 50 μg 〜 約 2000 μg のアジュバント、好ましくは当該ワクチン組成物の投与量１mLあたり約 250 μg のアジュバントを含む組成物を熟慮する。他の好ましい実施態様において、本発明は、約１μg/mL 〜 約 60 μg/mL の抗生物質及び/又は免疫調節剤、より好ましくは、約 30 μg/mL 未満の抗生物質及び/又は免疫調節剤を含むワクチン組成物を熟慮する。
【００５０】
さらなる実施態様に従って、本発明に従うワクチン組成物は、第１に脱水することができる。当該組成物が第１に他の方法によって凍結乾燥される又は脱水される場合には、次に、ワクチン接種前に、前記組成物は水溶液（例えば、生理食塩水、PBS（リン酸緩衝食塩水））中又は非水溶液（例えば、オイルエマルション（ミネラルオイル、又は植物性の/代謝可能なオイルを基盤とする/シングル若しくはダブルのエマルションを基盤とする）、アルミニウムを基盤とするアジュバント、カルボマーを基盤とするアジュバント）中で再水和される。
【００５１】
本発明に従うワクチン組成物又は免疫原性組成物は、筋肉内に、鼻腔内に、経口的に、皮内に、気管内に又は膣内に投与されてもよい。好ましくは、当該組成物は、筋肉内に、経口的に又は鼻腔内に投与される。動物の体内において、上記で記載されるとおりの当該組成物を静脈内注射によって又は標的組織中への直接的な注射によって適用することが有利になり得る。全身適用に関しては、静脈内経路、血管内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、動脈内経路、腹腔内経路、経口経路又は髄腔内経路が好ましい。より局所的な適用は、皮下に、皮内に、皮膚内に、心臓内に、局所内に（intralobally）、随内に（intramedullarly）、肺内に（intrapulmonarily）又は処理される組織（結合性組織、骨組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織）の中又は近くで直接的にもたらされ得る。当該処理の好ましい持続時間及び有効性に応じて、本発明に従う当該組成物は、１回又は数回投与されてもよく、さらに断続的に投与されてもよく、例えば、数日、数週間又は数ヶ月の間に毎日基盤で投与されてもよく、さらに種々の投与量で投与されてもよい。
【００５２】
本発明の他の側面は、本発明に従うタンパクを利用する診断/検出アッセイを提供する。好ましくは、当該診断/検出アッセイは、サンプル中の抗体の検出に関して特異的であり、ローソニアイントラセルラリスの抗原と特異的に反応する。好ましくは、当該診断/検出アッセイは、サンプル中の抗体の検出に関して特異的であり、それらの抗体は、ローソニアイントラセルラリス感染の原因で生成される。好ましくは、当該タンパクは、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
からなる群より選択される。
【００５３】
当該タンパクは、ELISAを基盤とする試験で用いることができる。当該タンパクはまた、動物（例えば、ウサギ）へ注射して抗体又は抗原を検出するために有用な抗血清を作成することができる。当該アッセイは、ローソニア感染を確認する又は除外するのに有用である。
【００５４】
好ましくは、当該検出アッセイ、好ましくは、ELISAを基盤とする試験は、
１）ローソニアイントラセルラリス細菌に対する抗体を含むサンプルを本明細書に記載されるとおりのローソニアの免疫原性タンパクと接触させること；
２）ローソニアの当該免疫原性タンパクが当該サンプルのローソニア特異的抗体へ結合することを可能にしかつローソニア特異的抗体及び当該免疫原性タンパクの複合体を生成することを可能にする条件下で前記１）の混合物をインキュベートすること；及び、
３）前記２）の複合体の存在を検出すること：
を含む。
【００５５】
本発明の他の側面は、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるタンパクを含む部分キット（kit in parts）に関係する。
【００５６】
好ましくは、当該部分キットは、サンプル中の抗体の検出のための検出キットであり、ローソニアイントラセルラリスの抗原と特異的に反応する。好ましくは、当該検出キットは、サンプル中の抗体の検出に関して特異的であり、それらの抗体はローソニアイントラセルラリス感染の原因で生成される。
【００５７】
本発明の他の側面は、本発明の目的のために有用なタンパクを発現するための発現系を提供する。当業者は、当該発現系に精通している。この関連で好ましい発現系は、E. Coli又は組み換え型バキュロウイルスを利用して組み換え型タンパクを発現する又は生成する。好ましくは、当該E. Coli又はバキュロウイルスは、上記に記載されるとおりのタンパクをコードしE. Coli又はバキュロウイルスの中に挿入される塩基配列を有する。発現系の当該例が模範的な様式で上記に記載されることが理解される。
【００５８】
本発明の他の側面において、融合タンパク及びキメラが提供される。好ましくは、存在する又は発現される当該融合タンパク又はキメラは、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
のいずれの１つを含む。
【００５９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
以下の実施例は、本発明に従う好ましい材料及び方法を説明する。しかしながら、これらの実施例が例証のみを目的として提供され、その中のいずれも本発明の全体の範囲を限定するものとみなされるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
本実施例は、原核生物融合タンパクとして発現されるローソニアイントラセルラリスDK15540ヘモリシンＡ（HlyA）タンパク及びOmp85タンパクの免疫学的検出を実証する。
材料及び方法
（E. Coli菌株のトランスフォーメーション）
初めに、ローソニアイントラセルラリス（“ローソニア”）細胞ペレットからMcCoy細胞ＤＮＡを取り除いた。これは、初めにMcCoy細胞懸濁培養中でローソニアのDK15540菌株を増殖させることによって行った。ローソニアが感染したMcCoy細胞を次に、JA-17ローター（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて４℃、10,000 rpm で30分間遠心分離することによってペレット化した。当該上清を除去し、当該ペレット化された細胞を次に、２つのシリンジを用いる22Gのダブルハブ（double-hub）の乳化針を繰り返し通過させることによってバラバラにした。当該バラバラにした細胞混合物を次に、35 mL のPercoll/ＮａＣｌ溶液と混合した。結果として得られた溶液を次に、４℃、14,000 rpm で45分間遠心分離した。遠心分離後、デブリ（debris）の上層をピペットで除去し、細菌バンドを回収した。当該細菌バンドを次に、14,000 rpm で15分間遠心分離した。結果として得られたローソニアペレットを次に、35 mL のPBS中に当該ペレットを再懸濁することによって３回洗浄した。結果として得られた懸濁液を次に、14,000 rpm で15分間遠心分離した。上清を廃棄し、当該ペレットを３mLのPBS中に再懸濁した。次に、30 μL の１Ｍ ＭｇＳＯ4 及び 30 μL のDNase Aを当該懸濁液に加えた。結果として得られた混合物を次に、37℃で２時間インキュベートした。当該混合物を次に、Percoll/ＮａＣｌで 35 mL まで希釈し、上記のとおり（４℃、14,000 rpm で15分間）遠心分離した。結果として得られたペレットをPBS中で３回洗浄し、次に４℃で一晩保管した。
【００６１】
ローソニア細胞ペレットからゲノムＤＮＡを抽出するために、一晩の保管の後に、当該ペレットをQiagenゲノムＤＮＡキット（Qiagen, Valencia, CA）の 3.5 mL のバッファーＢ１中に再懸濁した。次に、10 μL の RNase A（５μg/μL）、80 μL のリゾチーム溶液（100 mg/mL）及び 100 μL のプロテイナーゼＫ（20 mg/mL）。結果として得られた混合物を37℃で１時間インキュベートし、QiagenゲノムＤＮＡキットの 1.2 mL のバッファーＢ２をそれに加えた。結果として得られた溶液を次に、転置によって穏やかに混合した。混合に続いて、当該溶液を次に、50℃で30分間インキュベートした。当該溶液をインキュベートしている間、ゲノムチップ（genomic-tip）500G（QiagenゲノムＤＮＡキットから）を 10 mL のQBTバッファーで平衡化した。インキュベーション後、結果として得られた溶液を最高速度（14,000 rpm）で10秒間ボルテックスして、平衡化しておいたチップへ注いだ。全ての溶液を当該チップに入れた後、30 mL のバッファーＱＣで２回洗浄し、ＤＮＡを 15 mL のバッファーＱＦで溶出した。溶出されたＤＮＡへ 10.5 mL のイソプロパノールを加え、当該チューブを次に、穏やかな転置によって混合した。結果として得られた混合物を次に、別々の 1.5 mL のマイクロチューブへ分注し、14,000 rpm で15分間遠心分離した。結果として得られた上清を次にデカントして、当該ペレットを 0.5 mL の 70 % エタノールですすいだ。当該チューブ遠心分離して、上清を再びデカントし、当該ペレットを短時間乾燥した。12.5 μL のＴＥバッファーを次に、各々のチューブへ加えた。当該チューブを次に、37℃で穏やかに振盪しながら一晩インキュベートした。当該溶液を次に１つのチューブへプールし、55℃で２時間インキュベートし、次に、ＵＶ分光法によって定量化した。
【００６２】
次に、ＰＣＲをローソニア遺伝子で行い、次にBLAST検索データを含むゲノム配列解析を用いて興味の対象となる２つの遺伝子：Omp85（配列番号：456）及びHlyA（配列番号：457）を同定した。結果として得られたＤＮＡ配列データを用いて各々の遺伝子に関する潜在的なオープンリーディングフレーム（“ＯＲＦｓ”）を特定し、各々個別のプライマーの5'末端へ付加された付加的なライゲーション非依存性クローニング（“ＬＩＣ”）オーバーハングを有する好ましい遺伝子の5'末端及び3'末端に対応するＰＣＲプライマーを設計した（各々、pET-32Xa/LIC へのLIMOP85プライマー用に 配列番号：458  GGTATTGAGGGTCGCATGACAAAACGCCTGAATATATT 及び配列番号：459  AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTAGAAGAATTGCCCCA 並びに pET-32Xa.LIC ベクターのヘモリシンプライマー用に 配列番号：460  GGTATTGAGGGTCGCATGGCCAAACATAAAGTACGTGC 及び配列番号：461  AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTAACGTTTTTTCAAGTAAA）。これらのプライマーの各々に関して、下線部分は、ＬＩＣプロセスに必要とされるプライマー特異的配列を表す。これらの配列をまた本明細書において、それぞれ、配列番号：462、463、464及び465としても提供する。ＰＣＲを次に、ローソニアDK15540ゲノムＤＮＡをテンプレートとして行った。
【００６３】
HlyAのＰＣＲサイクルに関して、当該ＰＣＲ反応物を、95℃まで５分間加熱した。当該反応を次に、95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で１分間の35サイクルまで続けた。72℃で10分間の最終サイクルに続いて、ＰＣＲサイクルを完結させた。
Omp85のＰＣＲサイクルに関して、当該ＰＣＲ反応物を、95℃まで５分間加熱した。当該反応を次に、95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で1.83分間の35サイクルまで続けた。72℃で10分間の最終サイクルに続いて、ＰＣＲサイクルを完結させた。
両方のＰＣＲサイクルに関して、当該反応混合物は、１μL のＤＮＡ、５μL のExTaqバッファー、４μL の 2.5 mＭ ｄＮＴＰ、１μL の 10pm プライマーＬ、１μL の 10pm プライマーＲ、0.5 μL のEqTaq 及び 38.5 μL の蒸留水を含んでいた。ExTaqバッファー、ｄＮＴＰ及びExTaqは、Takara Bio, Inc.（日本）から提供された。
【００６４】
発現解析のためのローソニアDK15540ヘモリシン及びOmp85 ORFをクローン化するために、結果として得られたＰＣＲ産物を次に、Qiagen MiniElute Gel Purificationキットを用いてゲル精製し、pET-32Xa LIC プラスミドと混合して、製造業者の説明書（Novagen, Madison, WI）に従いライゲーションした。当該ライゲーション混合物を用いてNovaBlue（登録商標）E. coli（Novagen）のコンピテント細胞をトランスフォームし、アンピシリン耐性プレートに蒔いた。トランスフォームしたコロニーを用いて３mLのＬＢブロス及びアンピシリンに接種し、37℃で一晩培養した。次に、当該一晩培養物の 1.5 mL の一定分量を、14,000 ×ｇで２分間の遠心分離によって回収した。当該プラスミドＤＮＡを次に、Qiagen Mini-Prepプラスミドキットによって抽出した。精製したプラスミドＤＮＡを次に、デオキシヌクレオチドシークエンシングによって確認した。それぞれのプラスミドを次に、原核生物の融合タンパク発現研究用にE. ColiのBL21（DE3）菌株にトランスフォームした。
【００６５】
（発現解析）
トランスフォームしたE. Coliの発現解析を行うために、E. Coliのトランスフォームした各々の菌株（１つの菌株はヘモリシンＡを生成し、１つの菌株はOmp85を生成する）の 10 mL を、コニカルチューブ中の ２% グルコースw/v及びアンピシリン（50 μg/mL）を含むＬＢ培地中で、37℃において225rpmで振盪しながら一晩インキュベートした。翌朝、これらの２つの培養物を用いて、コニカルチューブ中の ２% グルコース及びアンピシリン（50 μg/mL）を含むＬＢ培地の２つの別個の 10 mL の温めておいた培養液に、37℃において225rpmで振盪しながら接種した。当該培養物を次に、37℃で約0.8〜約1.0のOD600nmまで増殖させた。これには約３時間〜４時間かかった。各々の菌株の１つのチューブに次に、１mＭのイソプロピル-beta-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）で37℃において３時間誘導させた。各々の菌株の２つ目のチューブは、非誘導のままにしておいた。
【００６６】
次に、各々の培養物の２つの１mLのサンプルを採取し、次に20,000×ｇで１分間の遠心分離によってペレット化した。これにより、各々の菌株に関して２つの非誘導サンプルと２つの誘導性サンプルを作成した。各々のサンプルの１つ（つまり、各々の菌株の１つの非誘導サンプルと１つの誘導サンプル）を次に、10 mＭの2-MEを含む 400μL の１×SDS-Pageバッファー中に懸濁した。当該懸濁液を次に、85℃まで５分間加熱した。次に、残りのサンプル（つまり、各々の菌株の１つの誘導サンプルと１つの非誘導サンプル）を、50 mＭ リン酸ナトリウム、0.5 Ｍ ＮａＣｌ、５mＭ 2-ME 及び１% テルギトールの 200 μL 中に懸濁した。当該サンプルの全てを次に、75% の振幅で0.5秒間の負荷サイクルを用いて４分間超音波処理した。テルギトールを含むバッファー中に懸濁した当該サンプルを20,000×ｇで５分間遠心分離して、次に、ペレットを廃棄する一方で、上清を採取した。
【００６７】
一度このように調製したら、次に、当該サンプルの各々のウェスタンブロット解析を行った。結果として得られたゲルは、図１として見ることができる。
当該ゲル中に見ることができるとおり、HlyAタンパク発現は、総細胞タンパクの約 20 % 〜 約 30 % に達する。しかしながら、Omp85様タンパクは同様には発現しなかった。さらに、両方のタンパクは共に総タンパクの誘導されたサンプルレーンでのみ観察され、その結果、これらのタンパクは１% テルギトールバッファーに可溶性でないことが示唆された。
【００６８】
（実施例２）
本実施例は、E. Coli細胞において発現されるヘモリシンＡローソニアタンパク及びOmp85ローソニアタンパクの精製を実証する。
材料及び方法
E. Coliの各々のトランスフォームした菌株の 10 mL を、ＬＢ、２% のグルコース及び 50 μg/mL のアンピシリンの培地中で一晩増殖させた。翌朝、当該一晩培養物を用いて１L の温めておいたＬＢ、グルコース及びアンピシリンのブロスに接種した。これらの培養物を、それらが約0.8〜約1.0のOD600nmに達するまで37℃で約３時間〜４時間増殖させた。次に、当該培養物に 0.5 mＭ のIPTGで各々誘導した。誘導後、当該細胞を採取し、20,000×ｇで20分間の遠心分離によってペレット化した。当該ペレットを次に、50 mＭ のリン酸ナトリウム、0.5 Ｍ の塩化ナトリウム、８Ｍ の尿素、５mＭ の2-ME 及び 10 mＭ のイミダゾールを含む 33 mL のバッファー中に懸濁させた。結果として得られた懸濁液を次に一晩抽出して細胞を破壊し、タンパクを変性させ、それによって４℃における溶解性を増加させた。抽出したサンプルを次に、20,000×ｇで20分間遠心分離した。次に、結果として得られた上清を採取し、0.2 μm のシリンジフィルターを用いて濾過した。次に、各々のサンプルの 16 mL をサンプルループ上にロードし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーIMACを用いて部分精製を行った。精製の後、当該フラクションを採取し、標準的なSDS-PAGEを行った（MOPSバッファー中の４% 〜 12 % のBis-Trisゲル）。当該ゲルのランニングの後、クーマシーブルー染色を行った。
【００６９】
結果及び考察
結果として得られたゲルは、図２として見ることができる。見ることができるとおり、１L 培養物での発現はあまり良くなかった。しかしながら、乏しい発現産生量にもかかわらず、遅いグラジエントの溶離液ピークのレーン７〜12においていくらかの約48kDaのタンパクが存在するようである。さらに、レーン９〜12において高分子量タンパクのはっきりしたバンドパターンが存在するように見える。
【００７０】
（実施例３）
本実施例は、Omp85様総タンパク及びヘモリシンＡ総タンパクの免疫学的検出を実証する。
材料及び方法
Omp85様タンパク、HlyAタンパク及びIMACフラクションA12タンパクを、３つのウェスタンブロットで使用した。第１のブロットは、前もってIFAT及びELISAによってローソニア感染に関してネガティブであることを検査しておいた９週齢のブタから回収した回復期ブタ血清から獲得したローソニアELISA抗体（“完全なコントロール”）で達成した。当該抗体は、TTBS＋２% 粉ミルクで 1：50 に希釈した。第２のブロットは、TTBS＋２% 粉ミルクで 1：50 に希釈したブタ抗ローソニア回復期血清で達成した。第３のブロットは、TTBS＋２% 粉ミルクで 1：1000 に希釈したヤギ抗ブタHRP（goat anti-swine HRP）（KPL, Inc., Gaithersburg, Maryland）を用いて達成した抱合体のみのブロットであった。
【００７１】
初めに、当該タンパクを、SDS-PAGEゲル（MOPSバッファー中の 10 % Bis/Tris）を通してランさせた。次に、当該タンパクを、Novexブロットモジュール（Invitrogen）を用いて30Vの一定電圧で１時間ゲルからPVDF膜へ転写した。次に、当該タンパクを、50 mL TTBS＋２% 粉ミルク（w/v）で少なくとも１時間ブロッキングした。次に、当該膜を、上記に記載される抗体と共にインキュベートした。次に、当該膜をTTBS（１×TBS＋ 0.05 % Tween20）で３回洗浄し、各々の洗浄は約２分間続けた。次に、当該膜を、TTBS＋２% 粉ミルクで 1：1000 に希釈した二次抗体（ヤギ抗ブタHRP（goat anti-swine HRP）、KPL）と共に各々１時間インキュベートした。インキュベーション後、当該膜をTTBSで２回洗浄し、各々の洗浄は約２分間続けた。次に、当該膜を、PBSで約２分間１回洗浄した。洗浄後、10 mL のOpti-4CN（Bio-Rad, Hercules, CA）を基質として加えた。次に、当該膜を最大で30分間まで現像し、次に水ですすいで停止させた。
【００７２】
結果及び考察
図３は、先の実施例のIMACフラクションA12から部分精製したHlyAタンパクに加えて総HlyAタンパクサンプル及び総Omp85様タンパクのクーマシー染色したゲル写真を示す。当該抱合体のみのブロットからの結果を図４Ａに提供する；ブタ抗ローソニアブロットの結果は、図４Ｂとして見ることができる；さらにネガティブコントロールブロットの結果は、図４Ｃとして見ることができる。ほんの少しのバンドが当該抱合体のみのブロットで観察された。ブタ血清中の抗体のE. Coliタンパクへのバックグラウンドの反応性がいくらか存在した。HlyAタンパク及びOmp85様タンパクの反応性は、完全なコントロールとは対照的に、ブタ回復期血清においてよりもはるかにより強いものであった。当該回復期血清はまた、HlyAサンプル中のユニークな高分子量バンドと反応した。HlyAバンド及びOmp85様バンドは完全なコントロールウェスタンブロットにおいて観察することができるが、それらは強くはない。このデータに基づいて、ローソニアでのブタの感染/チャレンジが結果としてHlyAタンパク及びOmp85様タンパクに対する抗体の産生をもたらすように見え、これらがワクチン用の有用なタンパクであり得ることを示唆する。
【００７３】
（実施例４）
本実施例は、ワクチンの配合物を記載する。概して、
１）配列番号：1〜455、配列番号：466 又は配列番号：456、配列番号：457 若しくは配列番号：466 にコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
２）前記１）のポリペプチドと少なくとも 85 %の配列相同性、より好ましくは、少なくとも約 90 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 95 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 97 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 98 % の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約 99 % の配列相同性を有するいずれのポリペプチド；
３）前記１）及び/又は２）のポリペプチドのいずれの免疫原性一部分；
４）配列番号：1〜455、配列番号：456 又は配列番号：457 若しくは配列番号：466 によってコードされるアミノ酸配列の配列群に包含される少なくとも 300個、290個、280個、270個、260個、250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、90個、80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、18個、15個、13個、10個又は最も好ましくは９個の連続するアミノ酸を含む前記３）の免疫原性一部分；及び/又は
５）配列番号：1〜455 又は配列番号：466 の配列を含むペプチドをコードするＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
からなる群より選択されるタンパクのいずれの１つ又は組み合わせが、ワクチンの免疫原性一部分としての使用のために提供される。
【００７４】
アジュバント、希釈剤などのような獣医学的に許容されるキャリアを当該ワクチンに加えることができ、当該ワクチンをいずれの従来の様式で投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、Omp85様タンパクの発現を示すクーマシー染色ゲルの写真である。
【図２】図２は、E. Coli（pET HlyA）のIMACフラクションの写真である。
【図３】図３は、HlyA及びOmp85様タンパクのゲル写真である。
【図４】図４のＡ−Ｃは、本発明のHlyAタンパク及びOmp85様タンパクに対する反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【図５】図５は、456個のローソニアタンパクに関する相同性データを示すBLAST検索の結果を提供する。
【図６】図６は、456個のローソニアタンパクの一覧表であり、初めの６個のタンパクは当該タンパクの名称が前に付き、それぞれ配列番号：1〜6であり、残りの450個のタンパクはそれらの対応する配列番号が前に付く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図５−２１】
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【図５−２２】
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【図５−２３】
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【図５−２４】
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【図５−２５】
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【図５−２６】
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【図５−２７】
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【図５−２８】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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