(57)【要約】  １１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素（１１β―ＨＳＤ１）の発現を阻害することができる、ｓｉＮＡ化合物に関する発明、及び眼の疾患の治療方法。
2009513617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患の治療のための医薬の製造におけるｓｉＮＡの使用であって、前記ｓｉＮＡが１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素１（１１β―ＨＳＤ１）の発現を阻害することができる使用。
【請求項２】
前記眼疾患が、患者においての眼内圧（ＩＯＰ）の変化を特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記眼疾患が、緑内障、感染、炎症、ブドウ膜炎、及び全身性疾患の発現を含む群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記眼疾患が緑内障である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記眼疾患が糖尿病性網膜症である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
標的遺伝子の発現が、前記患者の眼において阻害される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ｓｉＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記ｓｉＮＡが１つまたはそれより多い修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ｓｉＮＡを患者の眼に局所的に投与する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ｓｉＮＡを患者の角膜に投与する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
複数の種類のｓｉＮＡを使用する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記複数の種類が同一種類のｍＲＮＡを標的とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ｓｉＮＡが、配列番号１から６１から選択される配列、または配列番号１から６１を含む配列を標的とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記標的遺伝子が１１β−ＨＳＤ１であり、前記ｓｉＮＡが、配列番号１から６１から選択される配列、または配列番号１から６１を含む配列を標的とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
本発明のｓｉＮＡ分子が配列番号６２から１２２の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ｓｉＮＡ分子が３’オーバーハングを含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ｓｉＮＡを投与することを含む眼疾患の治療方法であって、前記ｓｉＮＡが１１β−ＨＳＤ１の発現を阻害することができる方法。
【請求項２０】
配列番号１から６１から選択されるヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、１１β―ＨＳＤ１を標的とする単離されたｓｉＮＡ化合物。
【請求項２１】
配列番号６２から１２２の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、１１β―ＨＳＤ１を標的とする単離されたｓｉＮＡ化合物。
【請求項２２】
前記ｓｉＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項２０または２１に記載の単離されたｓｉＮＡ化合物。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡである、請求項２２に記載の単離されたｓｉＮＡ化合物。
【請求項２４】
前記ｓｉＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項２２に記載の単離されたｓｉＮＡ化合物。
【請求項２５】
修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の単離されたｓｉＮＡ化合物。
【請求項２６】
３’オーバーハングをさらに含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の単離されたｓｉＮＡ化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素（１１β―ＨＳＤ１）の高発現または高活性に関する、眼疾患の治療及び／または予防のための方法及び組成物に関する。特に、しかしそれだけには限られないが、緑内障の治療に関する。好ましい実施形態では、１１βＨＳＤ１の発現を下方制御するためのＲＮＡｉテクノロジーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は失明の主な原因の一つである。世界中の失明患者の約１５％は、緑内障の結果として生じる。最も一般的なタイプである、原発性開放隅角緑内障は、４０歳以上の年齢での一般的な集団において、２００人に１人の有病率を有する。緑内障は、眼組織の破壊の過程として単に定義されており、正常な生理学的な限界を超えた、持続的な眼内圧（ＩＯＰ）の上昇によって引き起こされる。いくつかの病因が緑内障における複合体に関与している可能性があるにも関わらず、治療選択における完全な決定因子は、虹彩角膜角内の圧力における、本来の及び／または誘導された変化の量である。
【０００３】
現在の治療には、この圧力を減少させることを目的とした、薬物治療または外科手術が含まれるが、どの上昇したＩＯＰによる病態生理学的なメカニズムが、緑内障での神経損傷へと到るのかはわかっていない。上昇したＩＯＰの医学的な抑制を、４タイプの薬を用いて、試みることが可能である：（１）房水産生抑制剤（例えば、炭酸脱水酵素阻害剤、βアドレナリン遮断薬、及びα２アドレナリン受容体作動薬）；（２）縮瞳薬（例えば、コリン作動薬及び抗コリンエステラーゼ阻害剤を含む、副交感神経興奮剤）；（３）ブドウ膜強膜流出能改善剤（ｕｖｅｏｓｃｌｅｒａｌ  ｏｕｔｆｌｏｗ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）；及び（４）高浸透圧剤（であって、毛様体上皮内の血液房水関門に対する浸透圧勾配を生み出す）。５番目のカテゴリーの薬としては、神経保護剤が、薬物療法に対する重要な追加選択として登場しており、例えばそれには、ＮＯＳ阻害剤、興奮性アミノ酸拮抗薬、グルタミン酸受容体拮抗薬、アポトーシス阻害剤、及びカルシウムチャンネル阻害剤が含まれる。
【０００４】
さまざまな眼疾患及びそれらの治療の概説は、非特許文献１から７に見出すことができる。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的な転写後の遺伝子抑制のプロセスを意味する。１９９０年代初頭に、植物でのこの現象の発見後、Ａｎｄｙ  ＦｉｒｅとＣｒａｉｇ  Ｍｅｌｌｏは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、非常に効率的な態様で、線虫での遺伝子発現を、特異的かつ選択的に阻害することを示した（非特許文献８）。第一鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）（センスＲＮＡ）の配列は、標的となるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の対応する領域の配列に合致した。第二鎖（ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンスＲＮＡ）はｍＲＮＡに相補的であった。結果として生じるｄｓＲＮＡは、対応する一本鎖ＲＮＡ分子（特に、アンチセンスＲＮＡ）よりも、数桁分（ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）以上、効率的であることが判明した。
【０００６】
ＲＮＡｉのプロセスは、酵素であるＤＩＣＥＲがｄｓＲＮＡと接触し、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる断片に切り刻む所から始まる。このタンパク質は、ＲＮａｓｅ３ヌクレアーゼファミリーに属する。タンパク質の複合体は、これらの残存するＲＮＡを集め、それらのコードを、ガイドとして用いて、マッチする配列、例えば標的ｍＲＮＡを有する、細胞内のいずれのＲＮＡも探し出して破壊する（非特許文献９及び１０）。
【０００７】
遺伝子ノックダウンのためにＲＮＡｉを利用する試みにおいて、哺乳類細胞は、この手法の使用を妨害することが可能なウイルス感染に対抗して、さまざまな防御機構を発達させていることがわかった。実際に、非常に低い濃度でのウイルスのｄｓＲＮＡの存在により、インターフェロン反応が引き起こされ、結果として、広範囲の非特異的な翻訳の抑制が生じ、それにより次々にアポトーシスが引き起こされる（非特許文献１１及び１２）。
【０００８】
２０００年に、ｄｓＲＮＡが、マウスの卵母細胞及び初期胚において、３つの遺伝子を特異的に阻害することが報告された。翻訳阻止、及びＰＫＲ応答（ＰＫＲ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、胚が連続して発達する際には観察されなかった（非特許文献１３）。Ｒｉｂｏｐｈａｒｍａ  ＡＧ社（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、ドイツ）の研究により、哺乳類細胞でのＲＮＡｉの機能性は、短い（２０から２４塩基対の）ｄｓＲＮＡを用いることにより、急性期の反応を開始させることなく、ヒトの細胞において遺伝子のスイッチをオフにすることが示された。同様な実験が他の研究グループによっても行われ、これらの結果が確認された（非特許文献１４及び１５）。ヒト及びマウスの、さまざまな正常細胞株及びがん細胞株においてテストすることにより、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、それらのｓｉＲＮＡに相当するものと同じくらい効率よく遺伝子を抑制可能であることが判明した（非特許文献１６）。最近、小さいＲＮＡ（２１−２５塩基対）の別のグループでも、遺伝子発現の下方制御を媒介することが示された。これらのＲＮＡ、すなわち、小さな、一時的に制御されるＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）は、線虫の成長の間、遺伝子発現の時間的調節を制御する（参照として、非特許文献１７及び１８）。
【０００９】
科学者たちはさまざまな系においてＲＮＡｉを用いているが、それには線虫、ショウジョウバエ、トリパノソーマ、及び他の無脊椎動物が含まれる。最近、いくつかのグループは、ＲＮＡｉが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子抑制のために幅広く適用可能な方法であることを示し、さまざまな哺乳類細胞株（特にＨｅＬａ細胞）におけるタンパク質の生合成の特異的な抑制を、提示している。これらの結果に基づき、ＲＮＡｉは、遺伝子機能を確認する（同定し割り当てる）ための、急速に、非常に受け入れられたツールになっている。短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用するＲＮＡｉは、部分的にしか配列が決定していない遺伝子の機能理解をもたらすだろう。
【００１０】
既に述べたように、ＩＯＰは、（毛様体上皮の二重層（ｂｉ‐ｌａｙｅｒ）を介するナトリウム輸送に依存する）房水（ＡＨ）産生と（主に小柱網を介する）排水（ｄｒａｉｎａｇｅ）の間のバランスによって維持される。ＡＨは、虹彩と水晶体の間の、毛様体上皮から流れ出る、眼の後眼房中に分泌され、瞳孔の開口部を介して、前眼房に入り、終いには周辺部にすばやく流れるが、そこでは、小柱網のシュレム管を介して主に出て行くのであって、ブドウ膜強膜流出経路を介して出て行く分はより少ない（非特許文献１９及び２０）。
【００１１】
周辺の上皮組織では、ナトリウムと水の輸送は、コルチコステロイド及び１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素（１１β―ＨＳＤ）アイソザイム（コルチゾンからコルチソルを活性化する、１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素１（１１β―ＨＳＤ１）、並びにコルチソルを不活性化してコルチソンにする、１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素２（１１β―ＨＳＤ２））によって制御される。１１β―ＨＳＤ１は広く発現しており、とりわけ、多くのグルココルチコイド標的組織で発現しているが、それには、肝臓、脂肪組織、骨のほかに、肺、血管系、卵巣、中枢神経系が含まれる。
【００１２】
１１β―ＨＳＤの発現は、ヒトの眼においても記載されている。１１β―ＨＳＤ２は、角膜内皮で発現される一方で、１１β―ＨＳＤ１は小柱網、水晶体上皮及び角膜上皮においてより広範に発現している（非特許文献２１）。
【００１３】
１１β―ＨＳＤ２にはないが、１１β―ＨＳＤ１は、ヒトの無色素の感覚上皮細胞（ｎｏｎ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）またはＮＰＥにおいて局在している（非特許文献２２から２５）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、毛様体上皮における１１β―ＨＳＤ１の発現が明らかとなる一方で、毛様体の組織のＲＴ‐ＰＣＲにより、１１β―ＨＳＤ１の発現が確かめられ、グルココルチコイド受容体及びミネラルコルチコイド受容体の発現を伴った（非特許文献２６）。酵素１１β―ＨＳＤ１は、細胞内のグルココルチコイド濃度を決定するのに非常に重要な役割を果たしており、それは、可逆的な反応で、不活性のコルチゾン及び１１−デヒドロコルチコステロンから、活性のあるグルココルチコイド（ヒトにおけるコルチソル、ラット及びマウスにおけるコルチコステロン）を再生することによるものである。１４：１の、コルチソル／コルチゾンの高い比率は、房水において実証されており、この局所的なコルチソルの産生系と一致している（非特許文献２２）。
【００１４】
対象群を設定しないトライアルの試験における、志願者への１１β―ＨＳＤ１の阻害剤である、カルベノキソロン（ＣＢＸ）の経口投与により、ＩＯＰが１７．５％減少の結果となったことは、１１β―ＨＳＤ１の活性が、ＮＰＥ−色素性二重層（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｂｉ−ｌａｙｅｒ）を介するナトリウム輸送、及び結果的に房水の分泌を部分的に制御する可能性を示唆している（非特許文献２２）。さらに、健常者の志願者及び高眼圧症を有する患者（ＩＯＰは上昇しているが、視神経症ではない）における、無作為抽出した、プラセボ対照試験により、ＩＯＰに関するＣＢＸの効果を評価した（非特許文献２６）。前述は、ＲＮＡｉに関する関連技術の議論である。この議論は、この後に続く本発明の理解のためにのみ提供され、記載される本研究のいずれもが、主張される本発明に対する先行技術であることを承認するものではない。
【非特許文献１】Bunce et al., 2005, Associations between the deletion polymorphism of the angiotensin 1-converting enzyme gene and ocular signs of primary open-angle glaucoma. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.; 243(4); 294
【非特許文献２】Costagliola et al., 2000, Effect of oral losartan potassium administration on intraocular pressure in normotensive and glaucomatous human subjects. Exp Eye Res 71 (2): 167
【非特許文献３】Costagliola et al., 1995, . Effect of oral captopril (SQ 14225) on intraocular pressure in man. Eur J Ophthalmol., 5(1):19
【非特許文献４】Cullinane et al., 2002, Renin-angiotensin system expression and secretory function in cultured human ciliary body non-pigmented epithelium. Br J Ophthalmol., 86(6):676
【非特許文献５】Sakaguchi et al., 2002, Chymase and angiotensin converting enzyme activities in a hamster model of glaucoma filtering surgery. Curr Eye Res. 24(5):325
【非特許文献６】Shah et al., 2000, Oculohypotensive effect of angiotensin- converting enzyme inhibitors in acute and chronic models of glaucoma. J Cardiovasc Pharmacol., 36(2):169
【非特許文献７】Wang et al., 2005, Effect of CS-088, an angiotensin AT1 receptor antagonist, on intraocular pressure in glaucomatous monkey eyes. Exp Eye Res., 80(5):629.
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明において、眼疾患の治療のためにｓｉＲＮＡを使用することによって、１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素１（１１β―ＨＳＤ１）の発現及び／または活性を調節するための方法及び組成物を提供する。好ましい実施態様において、この眼疾患は、ヒトを含む動物において、ＩＯＰの変化を特徴とする。特には、この眼疾患は緑内障である。
【００１６】
本発明の別の態様は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ番号）１から６１から選択されるヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、あるいは配列番号６２から１２２の群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＮＡ化合物に関する。
【００１７】
本発明のさらなる別の態様は、１１β―ＨＳＤ１を標的とするｓｉＮＡ化合物を含む、医薬組成物に関する。
【００１８】
緑内障の治療に加えて、本方法は、眼の前眼房の他の疾患の治療にもまた適している。特に、この方法は、眼においての房水産生の変化及び流出によって特徴付けられる疾患の治療にも適用してもよい。本発明により治療される可能性のある疾患の例としては、感染または炎症のような局在的な疾患、並びに、ブドウ膜炎または全身性の疾患の発現のような全身疾患が含まれる。さらに、本発明の特定の実施態様は、糖尿病性網膜症のための治療を提供する。
【００１９】
下方制御は、二本鎖の核酸部分の使用によって効果を発する可能性があり、１１β―ＨＳＤ１のｍＲＮＡ発現と相互作用するように指示される、ｓｉＮＡ、すなわち短干渉核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＮＡ）と名付けられている。ｓｉＮＡは好ましくはｓｉＲＮＡであるが、修飾核酸（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）または同様に化学的に合成されるものも、本発明の範囲内に含まれる。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様は、ｓｉＮＡの局所適用に関する。本発明の実施態様は、眼疾患の治療における使用のための、医薬組成物をも提供する。本発明は、緑内障の病因に関連のある標的遺伝子のうち、局所的な眼の治療の範囲内で使用をしてもよく、さらに（ヒトを含む）動物を治療するために化学的に合成されるものを使用してもよい。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
第一の態様において、本発明は、眼疾患の治療のための医薬の製造におけるｓｉＮＡの使用であって、前記ｓｉＮＡは、１１β―ヒドロキシステロイド脱水素酵素１（１１β―ＨＳＤ１）の発現を阻害することができる。
【００２２】
本発明に照らして用いられる阻害するという用語は、１１β―ＨＳＤ１の下方制御を包含する。ある実施態様において、本発明にしたがっての眼疾患は、患者における眼内圧（ＩＯＰ）の変化を特徴とする。別の実施態様において、眼疾患は、緑内障、感染、炎症、ブドウ膜炎、及び全身性疾患の発現を含む群から選択される。眼疾患は、緑内障または糖尿病性網膜症から選択してもよい。本発明にしたがって、標的遺伝子の発現は、患者の眼の中で阻害されてもよい。
【００２３】
ある実施態様において、本発明にしたがうｓｉＮＡはｓｉＲＮＡである。好ましくは、ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡである。
【００２４】
ＲＮＡｉに関する機構は未だ知られていないにも関わらず、特異的なｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを産生するのに必要とされるステップは明らかである。長さにして２１−２６ヌクレオチドであるｄｓＲＮＡの二本鎖がＲＮＡ干渉を生み出すのに最も効果的に働くことが示されている。したがって、ある実施態様において、本発明のｓｉＮＡは長さにして２１−２６ヌクレオチドである。しかし、本発明にしたがうｓｉＮＡ化合物の長さには、制限はない。遺伝子内の、右側にある相同領域を選択することも、また重要である。開始コドンからの距離、Ｇ／Ｃ含量、及びアデノシン二量体の位置のような因子は、ＲＮＡｉに関してｄｓＲＮＡの産生を考慮したときに重要である。しかし、このことの結果の１つとして、最も効果的なＲＮＡｉのためにいくつもの異なる配列をテストする必要があるかもしれないし、このことにより費用がかかるかもしれない。
【００２５】
１９９９年に、ＴｕｓｃｈｌらはｓｉＲＮＡの抑制効果を解明し（Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev., 1999; 13(24):3191-7）、ｓｉＲＮＡの効率が、二本鎖の長さ、３’末端オーバーハングの長さ及びこれらのオーバーハングの配列の関数であることを示した。これら創始者の研究に基づいて、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃは、標的ｍＲＮＡ領域、及びｓｉＲＮＡの二本鎖の配列は、以下のガイドラインを用いて選択されるべきであると提言する。
【００２６】
ＲＮＡｉが複雑なタンパク質の相互作用の形成に依存しているので、ｍＲＮＡの標的が、関連性のない結合因子を持っているべきないことは明らかである。この文脈において、５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲｓ）並びに開始コドンに近い領域の両方は、それらが調節タンパク質の結合領域に豊富にある可能性があるので、避けるべきである。ｓｉＲＮＡの配列はしたがって、以下のように選択される：ｍＲＮＡ配列においては、AUG開始コドンの下流または終止コドンの上流の５０から１００ｎｔに位置する領域を選択する。
【００２７】
この領域では、以下の配列：ＡＡ（Ｎ１９）、ＣＡ（Ｎ１９）に対して探索する。同定される各配列に関するＧ／Ｃ割合を計算する。理想的には、Ｇ／Ｃ含量は５０％であるが、７０％未満でなければならず、３０％を超えなければならない。好ましくは、以下の反復を含む配列を避ける：ＡＡＡ、ＣＣＣ、ＧＧＧ、ＴＴＴ、ＡＡＡＡ、ＣＣＣＣ、ＧＧＧＧ、ＴＴＴＴ。ｍＲＮＡの二次構造に一致する近接性の予測をさらに行う。ヌクレオチド配列について、ＢＬＡＳＴも実行し（すなわちＮＣＢＩ  ＥＳＴｓデータベース）、このヌクレオチド配列が、１遺伝子のみが不活性化されることを確かにするための最も優れた前記の基準に適合するようにする。
【００２８】
この結果の解釈を最大限に生かすために、ｓｉＲＮＡを用いるときには以下のことに注意するべきである：
●センスとアンチセンスの一本鎖を常に別個の実験でテストする。
●スクランブルのｓｉＲＮＡ二本鎖を試す。これは、使用するｓｉＲＮＡと同じヌクレオチドの組成物を持つが、（使用するｓｉＲＮＡを含む）他のどの遺伝子とも、決定的な配列の相同性を欠いているべきである。
●可能であれば、２つの独立したｓｉＲＮＡ二本鎖を用いて同じ遺伝子をノックダウンし、抑制（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）プロセスの特異性を制御する。
【００２９】
実際には、選択される各遺伝子は、予測プログラムで、ヌクレオチド配列として導入され、最適のオリゴヌクレオチドの設計のために上記で記載されたあらゆる可変（性）が考慮に入れられる。このプログラムは、ｓｉＲＮＡによって標的にさらされる領域に関する、いずれのｍＲＮＡのヌクレオチド配列をもスキャンする。この解析により、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして可能であるもののスコアが算出される。最も高いスコアは、２本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられ（他の長さも可能ではあるが、通常は２１ｂｐ長）、通常は化学合成によって作製される。
【００３０】
本発明にしたがうヌクレオチドは、１つまたはそれより多い、修飾オリゴヌクレオチドを含んでもよい。１つまたはそれより多い修飾は、ｓｉＮＡの安定性または有効性を増加させることを目的とする。好適な修飾の例は、下記で参照される出版物に記載され、それぞれが、参照によって本発明に取り入れられる。本発明にしたがう、そのような修飾の例は、それだけには限られないが、ホスホロチオエート・インターヌクレオチド結合（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ）、２’‐Ｏ‐メチルリボヌクレオチド、２’‐デオキシ‐フルオロリボヌクレオチド、２’‐デオキシリボヌクレオチド、「共通残基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び反転された脱酸素脱塩基残基の取り込み（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｓｉＲＮＡの２つの相補鎖間の化学的架橋結合、及びｓｉＲＮＡの１本鎖の３’末端の化学修飾、内部修飾であって例として、糖修飾、核酸塩基修飾及び／または骨格修飾、２’−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び２’‐デオキシリボヌクレオチドが含まれる。
【００３１】
研究により、２つのヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡの２本鎖における３’末端のヌクレオチドのオーバーハング部分を、デオキシオリボヌクレオチドに置換することは、ＲＮＡｉ活性に関して悪影響を与えないことが示されている。ｓｉＲＮＡの各末端に関して４ヌクレオチドまでをデオキシリボヌクレオチドで置換することは、十分に許容されることが報告されている一方で、デオキシリボヌクレオチドですべてを置換してしまうと、結果的にＲＮＡｉ活性がなくなってしまう（Elbashir 2001）。加えて、Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、ｓｉＲＮＡを２’‐Ｏ‐メチルヌクレオチドで置換すると、ＲＮＡｉ活性が完全になくなることもまた報告している。
【００３２】
国際公開第２００５／０４４９７６号パンフレットにおいて記載されたように、親和性を修飾したヌクレオシドを用いてもよい。この出版物では、修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドについて記載されており、それにより、標的ｍＲＮＡにおいてそれらに相補的なヌクレオチド及び／または相補的なｓｉＮＡ鎖に対しての親和性を増加させまたは減少させることができる。
【００３３】
ＧＢ２４０６５６８には、化学的に修飾された、代替的な修飾オリゴヌクレオチドについて記載されており、分解への抵抗性の改善または取り込みの改善を提供する。そのような修飾の例としては、ホスホロチオエート・インターヌクレオチド結合（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ）、２’‐Ｏ‐メチルリボヌクレオチド、２’‐デオキシ‐フルオロリボヌクレオチド、２’‐デオキシリボヌクレオチド、「共通残基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド及び反転された脱酸素脱塩基残基の取り込み（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。
【００３４】
国際公開第２００４／０２９２１２号パンフレットには、修飾オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡの安定性を増強させ、または標的効率を上昇させることが記載されている。修飾には、ｓｉＲＮＡの２つの相補鎖間の化学的架橋結合、及びｓｉＲＮＡの１本鎖の３’末端の化学修飾が含まれる。好ましい修飾は、内部修飾であって、例として、糖修飾、核酸塩基修飾及び／または骨格修飾である。２’−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び２’‐デオキシリボヌクレオチドが記載されている。
【００３５】
国際公開第２００５／０４０５３７号パンフレットには、本発明で使用してもよい、修飾オリゴヌクレオチドがさらに列挙されている。
【００３６】
ｄｓＮＡ及び修飾したｄｓＮＡを用いるのみならず、本発明は短いヘアピンＮＡ（ｓｈＮＡ）を用いてもよい；ｓｉＮＡ分子の２本鎖を、リンカー領域で連結させてもよく、それには、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーでもよい。
【００３７】
ｍＲＮＡの標的領域での配列に相補的な、本発明にしたがうｓｉＮＡに加えて、縮重するｓｉＮＡ配列を用いて、本発明にしたがう相同領域を標的としてもよい。縮重するｓｉＮＡ配列は、当業者に周知の方法に従って設計することができる。例えば、国際公開第２００５／０４５０３７号パンフレットには、ｓｉＮＡ分子の設計によって、さらなる標的配列を提供できるように、相同配列を標的にすることが記載されており、例えばそれは、標準的でない塩基対の取り込みによって、例えばそれは、ミスマッチ及び／またはゆらぎ塩基対によってである。ミスマッチを同定している場合には、標準的でない塩基対（例として、ミスマッチ及び／またはゆらぎ塩基対）を用いて、１遺伝子以上の配列を標的にするｓｉＮＡ分子を作製することが可能となる。非制限的な例としては、例えばＵＵやＣＣ塩基対のような標準的でない塩基対を用いて、配列ホモロジーを共有する異なる標的に対する配列を標的とすることが可能であるｓｉＮＡ分子を作製できる。本発明のｓｉＮＡを用いる１つの利点は、それ自体、単一のｓｉＮＡが核酸配列を含むように設計され得ることであり、この核酸配列は、相同遺伝子間で保存されるヌクレオチド配列に相補的である。この手法により、単一のｓｉＮＡを用いて異なる遺伝子を標的とするために１つ以上のｓｉＮＡ分子を用いることなしに、１つ以上の遺伝子の発現を阻害することが可能となる。
【００３８】
本発明の好ましいｓｉＮＡ分子は２本鎖である。本発明のｓｉＮＡ分子は平滑断端、すなわち、いずれの突出しているヌクレオチドをも含んでいない断端を含んでもよい。ある実施態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つまたはそれより多い平滑断端を含み得る。好ましい実施態様において、ｓｉＮＡ分子は３’オーバーハングを有する。本発明のｓｉＮＡ分子は、２本鎖の核酸分子を含んでもよく、ｎ個のヌクレオチド（５≧ｎ≧１）の３’オーバーハングを有する。Ｅｌｂａｓｈｉｒ（２００１年）は２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの２本鎖が、３’末端にジヌクレオチドのオーバーハングを含んでいる時に最も活性であることを示している。
【００３９】
対象オリゴヌクレオチドは、種間の配列保存に関してさらにフィルターにかけられ（検索条件を追加され）、動物から人の臨床研究への移行の促進をできるようにする。本発明の好ましい実施態様において、保存されているオリゴヌクレオチドを用いる；これにより、単一のオリゴヌクレオチド配列で動物モデルと人の臨床試験の両方において使用することが可能となる。
【００４０】
本発明は、同時に１またはそれより多い種類のｓｉＮＡ分子の投与を含んでもよい。１またはそれより多いこれらの種類は、同一または異なる種類のｍＲＮＡを標的とするために選択してもよい。好ましくは、ｓｉＮＡは配列番号１から６１から選択される配列に対して、あるいは配列番号１から６１を含む配列に対して、標的とする。
【００４１】
１１β―ＨＳＤの２つの代替となる転写産物に相当する、ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号を図１にて提示する。本発明は、各転写産物を個々的に標的とすることを可能とする。したがって、ある実施態様において、図１にて提示したように、ｓｉＮＡは１１β―ＨＳＤのスプライシング型を標的にする。
【００４２】
ＲＮＡｉの標的として向けられているものに対する選択オリゴヌクレオチド配列を、図２ａ−ｃに示す。提示した配列は、ｓｉＮＡによって標的とされるＤＮＡ配列である。したがって、本発明は、表示されたＤＮＡ配列に相補的な配列を有するＮＡの２本鎖を用いる。
【００４３】
図２ａ−ｃにおいて示される配列には限られない。標的ＤＮＡは必ずしもＡＡもしくはＣＡによって先行される必要はない。さらに、標的ＤＮＡは、隣接するいずれかの配列によって側面に位置される図２ａ−ｃにおいて含まれる配列によって構成されることが可能である。
【００４４】
別の態様において、本発明は、ｓｉＮＡを投与することを含む、眼疾患の治療方法に関し、ここで前記ｓｉＮＡは１１β―ＨＳＤ１の発現を阻害することができる。このｓｉＮＡは本発明にしたがって定義される。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、また、１１β―ＨＳＤ１の発現を阻害することができるｓｉＮＡ化合物を投与することを含む、１１β―ＨＳＤ１の発現を阻害する方法に関する。このｓｉＮＡは本発明にしたがって定義される。
【００４６】
別の態様において、本発明は、１１β―ＨＳＤ１を標的とする単離されたｓｉＮＡ化合物に関し、ここで前記ｓｉＮＡ化合物は、配列番号１から６１から選択されるヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。ある実施態様においては、このｓｉＮＡ化合物は、配列番号６２から１２２の群から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。特に、本発明は、医薬として使用するための、配列番号１から６１または配列番号６２から１２２から選択されるヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、単離されたｓｉＮＡ分子に関する。
【００４７】
最後の態様において、本明細書で記載されているように、本発明は、単離されたｓｉＮＡ化合物を含む、医薬組成物に関する。ある実施態様において、この医薬組成物は、１１β―ＨＳＤ１を標的とする、単離されたｓｉＮＡ化合物を含み、ここで、このｓｉＮＡ化合物は、配列番号１から６１から選択されるヌクレオチド配列に相補的な配列を含み、あるいは配列番号６２から１２２の群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいる。
【００４８】
本発明のｓｉＮＡ分子及びそれらの製剤または組成物は、当該技術分野において一般的に知られているように、眼に対して直接に、または局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）（例えば、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ））、投与されてもよい。例えば、ｓｉＮＡ分子は、被験者への投与のために、リポソームを含む、送達のための賦形剤を含み得る。担体及び希釈剤及びそれらの塩は、医薬として許容できる製剤として存在することが可能である。核酸分子は、当業者に周知のさまざまな方法によって、細胞に投与することが可能であるが、それには、それだけには限られないが、リポソームカプセル化、イオン導入法によって、あるいは、例えば生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン‐ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡマイクロスフェア、生分解性ナノカプセル、及び生体接着マイクロスフェアのような他の賦形剤中に取り込むことによって、あるいはタンパク質ベクターによって、が含まれる。別の実施態様において、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン及びその誘導体とともに、錯体を形成し、または処方されることもまた可能であり、それには例えば、ポリエチレンイミン‐ポリエチレングリコール‐Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン‐ポリエチレングリコール‐ｔｒｉ‐Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体がある。
【００４９】
本発明のｓｉＮＡ分子は、膜破壊剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）及び／または陽イオン性脂質またはヘルパー脂質分子（ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と錯体を形成してもよい。
【００５０】
本発明とともに用いてもよい送達系には、例えば、水性及び非水性のゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及びパウダーを含み、並びに、例えば、可溶化剤、浸透促進剤（例として、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）及び親水性ポリマー（例として、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）などの、賦形剤を含むことができる。ある実施態様において、医薬として許容できる担体は、リポソームまたは経皮促進剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）である。
【００５１】
本発明の医薬製剤は、投与に好適な形であって、例えばそれは、全身性または局所的な投与を、細胞または被験者内に行い、例としてはヒトが含まれる。好適な形は、ある程度、使用または進入経路（例えば口、経皮、または注射によって）に依存する。他の因子も当該技術分野で周知であり、例えば組成物または製剤が効果を発揮するのを阻害する形態及び毒性のような考慮が含まれる。
【００５２】
本発明は、また、医薬として許容できる担体または希釈剤において、望ましい化合物が医薬的に有効量で含まれる投与または保管のための、組成物を調製することが含まれる。治療の用途のための、許容できる担体または希釈剤は、当該医薬技術分野においてよく知られている。例えば、防腐剤、安定剤、染料及び香味剤が提供され得る。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びパラオキシ安息香酸エステル類が含まれる。加えて、抗酸化剤及び懸濁化剤が使用され得る。
【００５３】
医薬的に有効量とは、疾患の状態を治療し（症状をある程度、好ましくは症状の全てを、緩和し）、あるいは発生を予防し、阻害するのに必要とされる用量である。医薬的に有効量とは、疾患のタイプ、用いられる組成物、投与経路、治療される哺乳類のタイプ、検討中の特定の哺乳類の身体的な特徴、同時使用する医薬及び当該医療技術分野における当業者が理解するだろう他の要素に依存する。
【００５４】
一般的には、体重／日の活性成分が０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間である量が投与される。
【００５５】
本発明の製剤は、従来的な非毒性の医薬として許容できる、担体、補助剤及び／または賦形剤を含む投与量単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）の製剤で投与され得る。製剤は、経口用に好適な形でも可能であり、例えばそれは、錠剤、トローチ、薬用キャンデー、水性または油性の懸濁剤、分散粉体または顆粒、エマルジョン、硬カプセル剤または軟カプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤、としてである。経口用を意図した組成物は、医薬組成物の製造に関して、当該技術分野で周知のいずれかの方法に従って調製することが可能であり、そのような組成物は、１またはそれより多い、例えば甘味剤、香味剤、着色剤または防腐剤を含むことが可能であるので、医薬として的確で受入れられる調製を提供することができる。錠剤は、錠剤の製造に好適な非毒性の医薬として許容できる賦形剤との混合物内に活性成分を含む。
【００５６】
これらの賦形剤は、例として不活性希釈剤（例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、造粒剤及び崩壊剤（例えば、コーンスターチ、アルギン酸）、結合剤（例えば、でんぷん、ゼラチン、またはアカシア）及び平滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石）であることが可能である。錠剤はコーティングされていなくても可能であり、あるいは周知技術でコーティングされていることも可能である。いくつかの場合においては、そのようなコーティングは、周知技術によって調製されることが可能であるので、胃腸管での分解や吸収を遅らせることができ、それによって、より長い期間にわたり、持続作用を提供することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルのような、時間遅延物質（ａ  ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を用いることが可能である。
【００５７】
経口用の製剤は、硬ゼラチンカプセルとして存在することもまた可能であり、ここで、その活性成分は、不活性の固体希釈剤とともに混合され、例えばそれは、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンであり、あるいは軟ゼラチンカプセルとして存在することもまた可能であり、ここで、その活性成分は、例えばピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油の媒体、または水とともに混合される。
【００５８】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に好適な賦形剤を有する混合物内に、活性物質を含む。そのような賦形剤には、懸濁化剤があり、それは例えば、カルボメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアゴムである；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するリン脂質でも可能であり、それは例えば、レシチンまたは酸化アルキレンの脂肪酸との縮合物（例として、ステアリン酸ポリオキシエチレン）または酸化エチレンの長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例として、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）または酸化エチレンの脂肪酸由来の部分エステルとの縮合物及びヘキシトール（例として、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート）または酸化エチレンの脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物（例として、ポリエチレンソルビタンモノオレアート）である。水性懸濁剤は、また、１またはそれより多い防腐剤（例として、エチル‐、もしくはｎ‐プロピル‐のパラオキシ安息香酸）、１またはそれより多い着色剤、１またはそれより多い香味剤及び１またはそれより多い甘味剤（例として、スクロースもしくはサッカリン）を含み得る。
【００５９】
油性懸濁剤は、植物油（例として、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油）内で、または流動パラフィンのような鉱油内で、活性成分を懸濁することによって調製され得る。油性懸濁剤は、増粘剤を含み得、それは例えば、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールである。甘味剤及び香味剤を加えて、口当たりがいい、経口剤を提供することが可能である。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を加えて保存することが可能である。
【００６０】
水の付加による、水性懸濁剤の調製に好適な分散粉体及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤並びに１つ又はそれを超える防腐剤との混合物内に、活性成分を提供する。好適な分散剤または湿潤剤または懸濁化剤は、上記において既に言及したように例示してある。さらなる賦形剤（例として、甘味剤、香味剤、及び着色剤）もまた存在し得る。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、また、水中油型乳剤（エマルジョン）であることも可能である。油相は植物油または鉱油またはそれらの混合物であることが可能である。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム（例として、アカシアゴム、またはトラガカントゴム）、天然に存在するリン脂質（例として、大豆、レシチン）、並びに脂肪酸及びヘキシトール、無水物、由来のエステルまたは部分エステル（例としてソルビタンモノオレアート）、並びに前記部分エステルの酸化エチレンとの縮合物（例としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）であることが可能である。エマルジョンは甘味剤及び香味剤をも含むことが可能である。
【００６２】
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤で調製することが可能であり、例えばそれは、グリセロール、プロピレン・グリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースである。そのような製剤は、また、鎮痛剤、防腐剤及び香味剤及び着色剤を含むことが可能である。医薬組成物は、無菌の注射用の、水性もしくは油性の、懸濁剤の形でも可能である。
【００６３】
この懸濁剤は、上記において既に言及しているこれらの好適な分散剤、または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、周知の当該技術にしたがって調製することが可能である。
【００６４】
無菌の注射用製剤は、非毒性の、非経口的に許容できる希釈剤もしくは溶媒での（例えば、１，３−ブタンジオール溶液としての）無菌の、注射剤または懸濁剤であることも可能である。利用可能な、許容できる賦形剤及び溶媒のうちでは、水、リンガー溶液、及び等張食塩水溶液がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁化剤として、従来から利用されている。この目的のために、いずれの無菌性の固定油も利用することができ、それには、合成のグリセリドまたはジグリセリド（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｏｎｏ−ｏｒ  ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）が含まれる。さらに、例えばオレイン酸のような脂肪酸は、注射用製剤としての使用が見出されている。
【００６５】
本発明の核酸分子は、坐薬の形でも投与することが可能であり、例えばそれは薬剤の直腸投与である。これらの組成物は、常温で固形であるが、直腸の温度では液体であり、したがって直腸内で溶解して薬剤を放出するであろう、好適な無刺激性の賦形剤を、薬剤と混合させることによって調製可能である。このような物質は、ココアバター及びポリエチレングリコールを含む。
【００６６】
本発明の核酸分子は、無菌培地において非経口的に投与され得る。賦形剤と使用濃度に依存する薬剤は、懸濁され得るか、賦形剤内に溶解され得るかどちらかである。補助剤、例えば局所性麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤のようなものは、有利に賦形剤内に溶解され得る。
【００６７】
どの特定の被験者に対する特定の用量レベルであっても、さまざまな因子に依存すると理解されており、それには、用いられる特定化合物の活性、年齢、体重、相対的な健康、性、食生活、投与時間、投与経路、及び排泄率、薬剤の組合せ及び治療を受けている特定疾患の重篤性が含まれる。
【００６８】
非ヒト動物に対する投与のために、組成物は、動物の食事または飲料水に加えることが可能である。動物の食事及び飲料水の組成物に処方することは都合がよく、それにより、動物が食事によって、治療に適する組成物の量を摂取することができる。食事または飲料水に事前に加えて混合しておくのも、組成物として提示するのにまた都合がよい。
【００６９】
本発明の核酸分子は、他の治療化合物と組合せて、被験者に投与することがまた可能であり、それにより、全体的な治療効果を上げることができる。適応症を治療するための多数の化合物の使用は、有益な効果を上げることが可能な一方で、副作用の存在を減少させ得る。
【００７０】
また、本発明の特定のｓｉＮＡ分子は、真核生物のプロモーターから、細胞内で発現され得る。ｓｉＮＡ分子を発現することが可能な組換えベクターは、標的細胞内に送達され得、及び持続され得る。また、ベクターは、核酸分子の一過性発現を提供するために用いることが可能である。このようなベクターは、必要時に反復投与することが可能である。いったん発現すると、ｓｉＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ反応を生じさせる。ｓｉＮＡ分子を発現しているベクターの送達は、全身性であることが可能であり、例えばそれは静脈内または筋肉内投与であり、被験者から移植された標的細胞に投与し続いてその被験者内に再導入する（戻す）ことによってあるいは望ましい標的細胞内に導入することを可能にするいずれかの手段による。
【実施例】
【００７１】
ｓｉＲＮＡの２本鎖を得ること
好ましくは、ＲＮＡは化学的に合成され、それには、適切に保護されたリボヌクレオチドフォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）及び従来どおりのＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いる。ｓｉＲＮＡ２本鎖の、２’‐デオキシ、または２’‐Ｏ‐メチル、のオリゴリボヌクレオチドによる、片方または両方の鎖の置換は、ハエの抽出物（ｆｌｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）（Elbashir et al. 2001）においては、抑制（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を無効にする。しかし、哺乳類細胞では、センスｓｉＲＮＡを、２’‐Ｏ‐メチルオリゴリボヌクレオチドによって置換することは可能であると思われる（Ge et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc Natl Acad Sci U S A., 2003; 100(5):2718-23）。
【００７２】
もっとも好都合なのは、ｓｉＲＮＡを、商業的なＲＮＡオリゴ合成業者から手に入れることであり、彼らは、さまざまな品質と費用のＲＮＡ合成製品を販売する。通常は、２１‐ｎｔのＲＮＡは、合成するのがそれほど難しくはなく、ＲＮＡｉに好適な品質で容易に提供される。
【００７３】
ＲＮＡ合成試薬の供給業者には、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ）、Ａｍｂｉｏｎ（ＵＳＡ）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓｃｏｔｌａｎｄ）が含まれる。前述のカスタムＲＮＡ合成会社は、ｓｉＲＮＡを提供する資格を有し、標的の妥当性確認（ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）に関するライセンスを有している。特には、我々のｓｉＲＮＡ供給業者は、Ａｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎであり、これらの会社は、ｓｉＲＮＡに関しての従来的なカスタム化学合成サービスを提供し、ＨＰＬＣ精製のｓｉＲＮＡを供給し、ＲＮａｓｅフリーの水とともに乾燥状態で配送する。ＲＮＡｉ及びｓｉＲＮＡの方法論に関する、ホームページに基づく重要な資料は、さらなるｓｉＲＮＡ関連製品及びサービスへのリンクとともに、前記記載の供給業者のウェブサイトで見つけることができる。
【００７４】
１本鎖のＲＮＡ分子と作用する場合、アニーリングステップが必要である。全ての操作ステップを、滅菌かつＲｎａｓｅフリーの条件化で行うことが非常に重要である。ＲＮＡをアニーリングするために、オリゴは、初めに、２６０ナノメートル（ｎｍ）での紫外線（ＵＶ）吸収によって定量化されなければならない。次に、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１年）に基づく以下のプロトコルを、アニーリングのために用いる。
●別々に等分して、５０μＭの濃度に各ＲＮＡオリゴを希釈する。
●各ＲＮＡオリゴ溶液３０μｌと５Ｘアニーリングバッファー１５μｌを混合する。バッファーの最終濃度は：１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  酢酸マグネシウム。最終量は７５μｌである。
●９０℃で１分間、溶液をインキュベーションし、１５秒間チューブを遠心し、３７℃で１時間置いてから、室温で使用する。溶液は‐２０℃で凍らせて保存が可能であり、５回までは凍結融解が可能である。ｓｉＲＮＡの２本鎖の最終濃度は、通常２０μＭである。また、既にアニーリングされているｄｓＲＮＡを供給業者から購入してもよい。
【００７５】
化学的に修飾された核酸を使用してもよい。例えば、使用してもよい修飾のタイプの概説としては、国際公開第０３／０７００４４号パンフレットに与えられており、その内容は、参照によって本明細書に取り込まれる。特別な留意により、この出版物の１１から２１項を引用する。他の可能な修飾は前記で記載したとおりである。当業者であれば、ＲＮＡ分子内に取り込んでもよい化学修飾の別のタイプに気が付くであろう。
【００７６】
「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」の系
ｓｉＲＮＡ干渉の特異性を確かめるために、標的遺伝子を発現するさまざまな細胞培養がなされ、例えばそれは、無色素の毛様体上皮細胞（ｎｏｎ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｃｅｌｌ）であるＮＰＥ、毛様体上皮細胞であるＯＭＤＣ、または胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３を用いる。また、細胞膀胱癌の細胞株であるＴ−２４、肺癌の細胞株であるＡ５４９、またはヒトの胎児性ケラチノサイト（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨＥＫを使用する。
【００７７】
細胞を、対応するｓｉＲＮＡ２本鎖とともにインキュベーションし、標的遺伝子の発現の下方制御（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の解析を行う。ｓｉＲＮＡのノックダウンを培養細胞における特定の表現型と結び付けるためには、標的タンパク質の減少の立証を行い、または少なくとも標的ｍＲＮＡの減少の立証を行う必要がある。
【００７８】
標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量化される。さらに、タンパク質レベルは、当該技術分野で周知の、さまざまな方法で決定され得、例えばそれは、標的タンパク質の減少を直接観察することが可能な、さまざまな標的に対する特定の抗体を用いるウェスタンブロット解析である。
【００７９】
ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクション
当該技術分野で周知の技術のいくつかの例は以下の通りである：我々は、陽イオン性脂質を用いるｓｉＲＮＡ２本鎖の単一のトランスフェクション（ｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、陽イオン性脂質には例えば、ＲＮＡｉＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）があり、トランスフェクション後２４、４８及び７２時間での抑制（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）について評価する。
【００８０】
標準的なトランスフェクションのプロトコルは以下のように行うことが可能である：６ウェルプレートのうちの１ウェルに関して、ｓｉＲＮＡの最終濃度が１００ｎＭになるようにトランスフェクトする。ＲＮＡｉＦｅｃｔプロトコルに従い、トランスフェクションの前日に、各ウェルあたり３ｍｌの適当な成長培地に、２‐４Ｘ１０５の細胞数で播種し、その培地には、ＤＭＥＭ、１０％血清、抗生物質、グルタミンが含まれており、通常の成長条件下で細胞をインキュベートする（３７℃及び５％  ＣＯ２）。トランスフェクション当日には、細胞は３０‐５０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になっていなければならない。２０μＭのｓｉＲＮＡ２本鎖１５μｌ（これは、最終濃度で１００ｎＭに相当する）を、８５μｌのバッファーＥＣ‐Ｒで希釈し、最終量が１００μｌになるようにしてから、ボルテックスによって混合する。複合体形成のために、ＲＮＡｉＦｅｃｔトランスフェクション試薬１９μｌを、希釈されたｓｉＲＮＡに加え、ピペッティングまたはボルテックスによって混合する。１０‐１５分間、室温でサンプルをインキュベーションしてトランスフェクション複合体の形成を可能にした後、抗生物質が少ない、新しい２．９ｍｌの成長培地の細胞上に、この複合体を滴下の方法（ｄｒｏｐ‐ｗｉｓｅ）で加える。プレートをゆすってトランスフェクション複合体の均一な分配を確かにした後、通常の成長条件化で細胞のインキュベーションを行う。その日の後、複合体を取り除き、新しい完全な成長培地を加える。遺伝子抑制を観察するために、細胞をトランスフェクション後２４、４８及び７２時間で回収する。リポフェクトアミン２０００試薬のプロトコルはかなり似ている。トランスフェクションの前日に、各ウェルあたり３ｍｌの適当な成長培地に、２‐４Ｘ１０５の細胞数で播種し、その培地には、ＤＭＥＭ、１０％血清、抗生物質、グルタミンが含まれており、通常の成長条件下で細胞をインキュベートする（３７℃及び５％  ＣＯ２）。トランスフェクション当日には、細胞は３０‐５０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になっていなければならない。２０μＭのｓｉＲＮＡ２本鎖１２．５μｌ（これは、最終濃度で１００ｎＭに相当する）を、２５０μｌのＤＭＥＭで希釈し、最終量が２６２．５μｌになるようにして混合する。また、６μｌのリポフェクトアミン２０００を、２５０μｌのＤＭＥＭで希釈し混合する。室温で５分インキュベーションした後、希釈したオリゴマー及び希釈したリポフェクトアミンを混合し、室温で２０分間インキュベーションを行って、複合体の形成を可能にする。その後、抗生物質が少ない、新しい２ｍｌの成長培地の細胞上に、この複合体を滴下の方法（ｄｒｏｐ‐ｗｉｓｅ）で加え、プレートを前後に揺らすことによって穏やかに混合し、トランスフェクション複合体の均一な分配を確かにする。細胞を通常の成長条件化でインキュベーションし、その日の後に複合体を取り除き、新しい完全な成長培地を加える。遺伝子抑制を観察するために、細胞を、トランスフェクション後２４、４８及び７２時間で回収する。
【００８１】
トランスフェクションの効率は、細胞のタイプに依存するが、また、継代数や細胞のコンフルエンシーにも依存する可能性がある。ｓｉＲＮＡ‐リポソーム複合体の形成の時間と態様（例えば、転倒対（ｖｅｒｓｕｓ）ボルテックス）もまた、非常に重要である。トランスフェクションの低効率は、抑制（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）が成功しない、最も頻発する原因である。良いトランスフェクションは、重大な議題であり、使用するそれぞれの新しい細胞株に対して注意深く調査される必要がある。トランスフェクション効率は、レポーター遺伝子をトランスフェクションして調査してもよく、例えばそれは、ＣＭＶ駆動（ｄｒｉｖｅｎ）のＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より）、またはＢ−ｇａｌ発現プラスミドであり、その後に位相差顕微鏡法及び／または蛍光顕微鏡でその次の日に評価した。
【００８２】
ｓｉＲＮＡ２本鎖の調査
標的タンパク質の、豊富さ及びライフタイム（ｌｉｆｅ  ｔｉｍｅ）（つまり代謝回転）に依存して、ノックダウンの表現型は、１から３日後、またはそれ以降に明らかになる可能性がある。表現型がまったく観察されない場合には、タンパク質の枯渇が、免疫蛍光法及びウェスタンブロットによって観察される可能性がある。
【００８３】
トランスフェクション後、細胞から抽出した全てのＲＮＡフラクションを、ＤＮａｓｅＩで前処理し、ランダムプライマーを用いて逆転写のために使用した。ＰＣＲは、少なくとも１つのエキソン‐エキソンのジャンクションをカバーする特異的なプライマー対で増幅され、その結果、ｐｒｅ‐ｍＲＮＡの増幅を制御する。標的ではないｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲもコントロールとして必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇にも関わらず、標的タンパク質の減少が検出できないのは、細胞内に安定なタンパク質の巨大な貯留分（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）が存在する可能性を示唆しているかもしれない。また、リアルタイムＰＣＲの増幅は、ｍＲＮＡが減少しまたは消滅するのにより正確な方法で検出するために、使用することができる。リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲは、テンプレートの初期量をもっとも、特異的に、感知しやすく、及び再現性よく、定量化する。リアルタイムＰＣＲは、各ＰＣＲサイクル間のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の産生の指標として、反応の間に放出される蛍光を観測する。このシグナルは、反応におけるＰＣＲ産物の量に直接比例して増加する。各サイクルにおける蛍光の放出量を記録することにより、対数期間のＰＣＲ反応を観測することが可能となり、対数期には、ＰＣＲ産物の量の、最初の重要な増加が、標的テンプレートの初期量に相関している。
【００８４】
細胞培養において同定される、違った形で発現している遺伝子の干渉パターンを検証するために、ｑＲＴ‐ＰＣＲを製造業者のプロトコルに従って行う。定量的ＲＴ‐ＰＣＲ（ｑＲＴ‐ＰＣＲ）に関して、全ＲＮＡで約２５０ｎｇを逆転写に用い、その後、Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含む反応混合物において、各遺伝子に対して特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う。基本的なＰＣＲ条件は、９１℃で３０分の初期段階の後、９５℃で５秒、６２℃で１０秒及び７２℃で１５秒の４０サイクルを含む。各標的遺伝子に対応する、特異的なプライマー配列が用いられる。βアクチンのｍＲＮＡの定量化が、データのノーマライズのためにコントロールとして用いられる。相対的な遺伝子発現の比較は、選択される、内因性／内部コントロールの遺伝子発現が、全ＲＮＡの割合に対して、サンプル間において、より豊富であり、かつ定常である場合に、最良に機能する。活性の参照として、量が不変の内因性コントロールを用いることにより、ｍＲＮＡの標的の定量化が、各反応での全ＲＮＡの量の違いのノーマライズによって可能になる。
【００８５】
動物での研究
ニュージーランドウサギは、ＩＯＰを研究するためにデザインされた、実験プラットフォームにおける最高の判断水準である。扱い易く、大きな眼を有しており、人間の器官とサイズが似ている。加えて、ＩＯＰを測定するための現在の装置は、眼の小さな動物（例えばマウスやラット）においての使用には適していない。最後に、ウサギは（約２３ｍｍ  Ｈｇの）ＩＯＰを有し、局所性の商業的な降圧薬を使用して、その値を４０％まで引き下げることが可能となる。したがって、ウサギの緑内障モデルを作り出すことが可能であるにも関わらず（例えば、外科的に強膜上静脈（ｅｐｉｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｖｅｉｎ）を阻害しまたは人工的に小柱網を閉塞させる）、我々は、自分たちの管理下における、正常血圧のウサギを用いており、その理由は、ＩＯＰの薬理学的な減少が簡単に可能であり、再現性良く測定が可能だからである。
【００８６】
実験プロトコル
正常血圧のニュージーランド白ウサギ（雄、２‐３ｋｇ）を用いた。これらの動物を食事と水に、自由にありつける、別々のケージの中で飼育した。人工的に１２時間の昼／夜サイクルで管理し、ＩＯＰの制御不能な日周振動を避け、並びに、動物の扱いと処置は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ(86/609/EEC)、ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎの声明及びＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ及びＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにしたがって行った。
【００８７】
薬剤は、概して角膜の表面上に、少量（概して４０μｌ）を注入することによって投与した。反対側の眼は、賦形剤単体で処置し、他の眼との共鳴現象がないように、各実験におけるコントロールとして用いた。同じ動物での複合的な実験は無効にされるべきである。
【００８８】
ＩＯＰ測定は、接触眼圧計（ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ）(ＴＯＮＯＰＥＮ  ＸＬ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｎｏｒｗｅｌｌ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ)を用いて行った。ＴｏｎｏＰｅｎ眼圧計は、その信頼性と小型のサイズのために、非常に便利である。この機器による測定は、角膜表面に、眼圧計のセンサーを慎重に作用させることによって行った。この装置は、ウサギにおいて３から３０ｍｍＨｇの範囲内にある眼内圧を測定するための選択肢を有する眼圧計であることが示されている（Abrams et al. Comparison of three tonometers for measuring intraocuiar pressure in rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996 Apr; 37(5):940-4.）。全ての測定結果は、この値域の中に収まった：すなわち、眼内圧のベースラインの平均値は１７．０±０．３９ｍｍＨｇ（ｎ＝１００）であった。夜から昼にかけてＩＯＰは変化するので、全ての実験は同時に行ったが、その結果、より安定なＩＯＰが可能となり、賦形剤の処置群との客観的な比較ができるようになった。動物への苦痛を避けるために、ウサギは局所的に麻酔された（０．４％／１％のオキシブプロカイン／テトラカイン（ｏｘｉｂｕｐｒｏｃａｉｎｅ／ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）入り食塩水（１／４ｖ：ｖ））。この溶液は、眼内圧の各測定を行う前に、角膜に点眼された（１０μｌ）。ｓｉＲＮＡまたは食塩水を、４０μｌの体積で角膜に局所的に作用（点眼）（ａｐｐｌｙ）させた。
【００８９】
ウサギにおけるｓｉＲＮＡ適用の標準プロトコルは、下記の通りである。最終量４０μｌである食塩水（０．９％  ｗ／ｖ）中のｓｉＲＮＡの量を、連続して４日間、毎日片方の眼に点眼した。反対側の眼はコントロールとして用い、無菌の食塩水（０．９％  ｗ／ｖ）４０μｌを、同じ時点（ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）で目に注入した。ＩＯＰは、１０日間、それぞれを点眼する前、点眼後２時間、４時間、及び６時間で測定した。最大の応答は２日と３日の間で観察された。他の低血圧性化合物とのｓｉＲＮＡの効果を比較するために、キサラタン（Ｘａｌａｔａｎ）（ラタノプロスト（Ｌａｔａｎｏｐｒｏｓｔ）０．００５％）及びトルソプト（Ｔｒｕｓｔｏｐ）（ドルソラミド（Ｄｏｒｚｏｌａｍｉｄｅ）２％）を評価し、同じ条件でＩＯＰを測定した。
【００９０】
ウサギは、前記に記載した標準プロトコルに基づいて処置された。これらの実験により、正常血圧のニュージーランドウサギにおけるＩＯＰの減少に関しての、２つのｓｉＲＮＡの最大効果が立証された。図４における値は、コントロール（賦形剤のみでの反対側の眼）に対するＩＯＰの減少の割合の平均値及びそれらの標準誤差（ＳＤ）を示す。用いたｓｉＲＮＡは、１１ＨＳＤ／０１：ＣＣＡＣＡＵＣＡＣＣＡＡＣＧＣＵＵＣＵｄＴｄＴ（配列番号１３３；ヒト配列番号Ｎ○１００に相同する、ウサギのホモログ配列）及び１１ＨＳＤ／０２：ＣＧＵＣＡＡＵＧＵＡＵＣＡＡＵＣＡＣＵｄＴｄＴ（配列番号１３４；最高のスコアを有し、開示されたヒト配列に相当するものを有さない、ウサギのホモログ配列）。
【００９１】
この結果は、また、時間に対する、正常血圧のニュージーランドウサギでのＩＯＰの減少に関して、ｓｉＲＮＡ  １１ＨＳＤ／０２のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す（図５）。４回連続して２６５μｇのｓｉＲＮＡを点眼することにより、コントロールに対して、ＩＯＰが２０．３４減少した。対照的に、スクランブルのｓｉＲＮＡは、ＩＯＰレベルに関してなんらの効果も持たなかった。それぞれの値は、異なる４匹の動物におけるコントロール（賦形剤のみでの反対側の眼）に対するＩＯＰ減少の割合の平均値を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】１１βＨＳＤの２つの代替となる転写産物に相当する、ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号を示す図である。
【図２ａ】本発明のｓｉＮＡの標的配列として選択される、標的遺伝子配列の短い断片を示す図である。
【図２ｂ】本発明のｓｉＮＡの標的配列として選択される、標的遺伝子配列の短い断片を示す図である。
【図２ｃ】本発明のｓｉＮＡの標的配列として選択される、標的遺伝子配列の短い断片を示す図である。
【図３ａ】本発明のｓｉＮＡ分子を示す図である。
【図３ｂ】本発明のｓｉＮＡ分子を示す図である。
【図３ｃ】本発明のｓｉＮＡ分子を示す図である。
【図３ｄ】本発明のｓｉＮＡ分子を示す図である。
【図４】正常血圧のニュージーランドウサギにおけるＩＯＰの減少に関する、２つのｓｉＲＮＡの最大効果を示す図である。値はコントロール（賦形剤のみでの反対側の眼）に対するＩＯＰの減少の割合の平均値及びそれらの標準誤差（ＳＤ）を示す図である。用いたｓｉＲＮＡは、１１ＨＳＤ／０１：ＣＣＡＣＡＵＣＡＣＣＡＡＣＧＣＵＵＣＵｄＴｄＴ（配列番号１３３；ヒト配列番号Ｎ○１００に相同する、ウサギのホモログ配列）及び１１ＨＳＤ／０２：ＣＧＵＣＡＡＵＧＵＡＵＣＡＡＵＣＡＣＵｄＴｄＴ（配列番号１３４；最高のスコアを有し、開示されたヒト配列に相当するものを有さない、ウサギのホモログ配列）。
【図５】時間に対する正常血圧のニュージーランドウサギでのＩＯＰの減少に関して、ｓｉＲＮＡ  １１ＨＳＤ／０２のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。４回連続して２６５μｇのｓｉＲＮＡを点眼することにより、コントロールに対してＩＯＰが２０．３４減少した。対照的に、スクランブルのｓｉＲＮＡはＩＯＰレベルに関してなんらの効果も持たなかった。それぞれの値は、異なる４匹の動物におけるコントロール（賦形剤のみでの反対側の眼）に対するＩＯＰ減少の割合の平均値を示す。
【図１】
2009513617.tif 000003
【図２ａ】
2009513617.tif 000004
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
2009513617.tif 000009
【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009513617.tif 000013
2009513617.tif 000014
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