(57)【要約】【解決手段】本発明は、後の移植のためにドナー臓器から分離される膵島の生着性及び回復性を高める方法に関する。望ましい実施例において、膵島は、ドナー膵臓から分離され、糖尿病患者の肝臓に移植される。保護剤は、分離溶液と混合し、保護分離溶液を生成し、ドナー膵臓が酵素で消化された後、保護分離溶液を利用して他の細胞から膵島細胞を分離する。保護剤は、分離プロセス中に膵島を通過する溶液の粘度を増加させ、膵島の緩衝効果をもたらし、それによって、膵島の生着性及び健康状態を高めて、膵島の膜がエドモントンプロトコールのような活発な単離処置に耐えることができるようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島を単離する方法であって、
保護剤を分離溶液に添加し、保護分離溶液を生成し、及び、
分離ステップ中に、保護分離溶液を用いてドナー臓器から膵島を分離し、保護分離溶液は膵島への損傷を低減する、
ことを含んでいる、膵島単離方法。
【請求項２】
ドナー臓器は、１又は複数のヒトの膵臓を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護剤は、デキストランである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
デキストランは、臨床グレードのデキストランである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
保護剤は、デキストラン、アルブミン、カルボキシルメチルセルロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
保護剤は、保護分離溶液の約１〜２０重量パーセントである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
保護剤は、ドナー臓器に導入される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
膵島は、エドモントンプロトコールによってドナー臓器から分離される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
保護剤は、使用に不適であると考えられかねないドナー臓器を救い出す請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
膵島を移植する方法であって、
保護剤を分離溶液に添加し、保護分離溶液を生成し、
保護分離溶液を用いてドナー臓器から膵島を分離し、
分離された膵島を目的臓器に移植する、
ことを含む、膵島を移植する方法。
【請求項１１】
ドナー臓器は、１又は複数のヒトの膵臓を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
目的臓器は、肝臓、腎臓、陰嚢、及び目の硝子体からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
保護剤は、デキストランである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
デキストランは、臨床グレードのデキストランである請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
保護剤は、デキストラン、アルブミン、カルボキシルメチルセルロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
保護剤は、保護分離溶液の約１〜２０重量パーセントである請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
保護剤は、ドナー臓器に導入される請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
膵島は、エドモントンプロトコールによってドナー臓器から分離される請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
保護剤は、使用に不適当であると考えられかねないドナー臓器を救い出す請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
保護剤は、溶液を用いてドナー臓器から膵島を分離する際、膵島へのストレス又は損傷を低減する請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜発明の分野＞
本発明は、膵島を単離及び移植する方法に関するものであり、より具体的には、膵島単離中、１又は複数の膵島分離ステップ中で保護剤を用いて、膵島への物理的なストレスを低減し、上手く移植することができる膵島の量を増加することで、膵島の生着率を高めることに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
＜背景情報＞
膵島は、膵臓内でインスリンを生成する多細胞体であって、各膵島は、直径が概ね約１００〜６００ミクロンであり、１０００以上の細胞を含んでいる。平均的なヒトは、約１００万の膵島を有しており、膵臓内の細胞の総質量のおよそ３パーセントを占めている。膵臓は、ランゲルハンス島を有し、インスリンやその他のホルモンを生成するβ細胞を収容している。β細胞は、血液中の血糖値をモニターし、精細に測定された量のインスリンを放出し、血糖ピークを平衡させる。１型糖尿病及び２型糖尿病は、これらのβ細胞の９０パーセント以上が損傷又は破壊された場合に発症する。
【０００３】
膵島は、細胞小器官のようなものであり、特徴的な形状と機能を有しており、膵島ユニット内に１種類以上の細胞（例えばβ細胞）を含んでいる。各膵島は、緩めに形成された膜により取り囲まれている。膵島を取り囲んでいる膜が破れると、全膵島は機能不全に陥り、膵島内部の細胞は壊滅する。膵島膜は、一般的に脆弱であり、過度のストレス下で破壊することがあるので、膵島膜破壊は、特定の状況下で容易に起こる可能性がある。そのような過度のストレスがもたらされる状況の１つは、膵島を通過する溶液が、膵島の膜に対して概ね垂直の経路で運搬される場合である。溶液が膵島を通り抜けるときの粘度は、細胞膜が損傷しやすい状態をもたらす。
【０００４】
エドモントンプロトコールと呼ばれる当該分野で周知の療法は、その他の発展的な療法と同様、健康なヒトの膵島を１型受容体に移植するものである。エドモントンプロトコールを用いた膵島移植は、[Shapiro, Ryan, and Lakey, Clinical Islet Transplantation - State of the Art, Transplantation Proceedings, 33, pp. 3502-3503 (2001); Ryan et al., Clinical Outcomes and Insulin Secretion After Islet Transplantation With the Edmonton Protocol, Diabetes, Vol. 50, April 2001, pp. 710-719; Ryan et al., Continued Insulin Reserve Provides Long-Term Glycemic Control, Diabetes, Vol. 51, July 2002, pp. 2148-2157; and, the New England Journal of Medicine (2000)]に記載されている。膵島が一旦肝臓に入ると、インスリンの生成と分泌を始める。エドモントンプロトコールは、使用される単離方法によって、７〜１０の画定されたステップを含んでいる。最初のステップには、膵管を介して酵素をドナー膵臓に送達することが含まれており、この酵素は、膵臓組織は消化(digests)されるが、膵島を消化しないものである。消化ステップの次に、膵島を膵臓内の他の細胞から分離する膵島分離と呼ばれるいくつかの連続的なステップがあり、膵島に概ね垂直に運ばれる分離溶液を使用することが含まれる。分離された膵島は、精製され、門脈として知られている肝臓の主血管に移植される。肝臓は、損傷を受けた場合、それ自体を再生でき、新たな血管を作って、組織をサポートする。それゆえに、膵島が肝臓に移植された場合、新たな血管が形成され、膵島をサポートすると考えられている。細胞が生成するインスリンは、これらの周囲の血管を通じて血流中に吸収され、全身に広がって、血液中の血糖値を制御する。
【０００５】
膵島は、脆弱な三次元構造を有しており、生着には、多量の酸素と、活発な単離プロセス中に脆弱な膜をサポートすることができる物質を必要としている。ここで、エドモントンプロトコールのステップは、活発なプロセスであるから、膵島の生着性を妥協することとなる。このプロセス中、膵島は、処置中、酸素送達条件が最適でなく、外側の細胞膜を損傷する物理的なせん断のストレスを受けると損傷又は破壊されることがあり、所定のドナー膵臓から取り出すことのできる健康な膵島の収率に影響を及ぼす。さらに、膵島移植は、ドナーの獲得可能性による厳しい制限を受け、加えて、一人の患者をインスリン非依存とするには、２つの膵臓が必要となってしまうことも多い。このため、膵島の損傷を緩和して、シングルドナーからインスリンの非依存を可能にすることのできる改良された単離及び移植方法が求められている。
【０００６】
シングルドナー移植の割合の改善について、膵臓保存の二層法（ＴＬＭ）を用いた報告がある。例として、[Salehi et al., Ameliorating ischemic injury during preservation and isolation of human islet cells using the two layer method with perfluorocarbon and University of Wisconsin solution, Transplantation 2005 (in press); Lakey et al., Human Pancreas Preservation Prior to Islet Isolation, Cell Preservation Technology, Vol. 1, No. 1, 2002, pp. 81-87; 及び、Tsujimura et al., Human Islet Transplantation From Pancreases with Prolonged Cold Ischema Using Additional Preservation by the Two-Layer (UW Solution/ Perfluorochemical) Cold-Storage Method, Transplantation, Vol. 74, No. 12, Dec. 27, 2002, pp. 1687-1691]を参照。ＴＬＭは、ウィスコンシン大学（ＵＷ）の溶液を、パーフルオロデカリンのようなパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）と共に用い、ヒトの膵臓を保存している。ＵＷは、長年に亘って臓器の保存に用いられている。それには、ラクトビオン酸のような細胞非透過性剤が含まれており、これは、抗酸化剤として機能するグルタチオンや、アデノシン・トリホスファターゼの合成に重要なアデノシンと同様に、保冷中に細胞の膨張を防ぐ。ＰＦＣは、水とは混ざらないが、酸素貯蔵能力が高く、酸素結合定数が低いため、膵臓の保存に有用であり、多量の酸素を貯蔵して、虚血臓器へ効果的に送達することができる。ＴＬＭ法によれば、臓器は、ＵＷとＰＦＣの入った容器に浸して、２つの液体の界面に位置するように配置して保存される。
【０００７】
しかしながら、膵臓のようなドナー臓器内の他の細胞から膵島を分離する活発なプロセス中、膵島の脆弱な膜に課されるストレスを低減し、肝臓のような目的臓器への移植に使用可能な生着能力のある膵島の数を増加することによって、膵島の生着率を改善する単離プロセスを向上する必要性が依然としてある。
【発明の開示】
【０００８】
＜発明の要旨＞
本発明は、後で移植するためにドナー臓器から分離される膵島の生着性と回復性を向上する方法を提供する。望ましい実施例では、膵島は、ドナー膵臓から分離され、糖尿病患者の肝臓に移植される。本発明は、望ましくはデキストランや、様々な分子量を有するグルコースの長鎖ポリマー（すなわち(Ｃ6Ｈ10Ｏ5)n）のような保護剤を、移植されるべき膵島を分離する分離溶液に添加することを含んでいる。より望ましくは、本発明は、およそ６０,０００ドルトンの分子量を有する臨床グレードのデキストランである保護剤の添加を含んでいる。
【０００９】
本発明は、保護剤を分離溶液に添加して、保護分離溶液を生成することを含む方法を提供する。保護分離溶液は、エドモントンプロトコールにおいて、膵臓組織が消化される消化ステージの後のエドモントンプロトコール中で使用される。保護剤は、膵臓内の他の細胞から膵島を分離する幾つかの連続分離ステップの何れかの間や、密度勾配遠心分離法が使用される最終精製ステップの前に、続いて添加することができる。保護剤は、分離溶液によって膵島に課されるせん断を低減することによって、脆弱な膵島膜によって生じたストレス量を低減する。そうすることで、本発明は、活発な分離処置中に損傷又は破壊されかねない膵島を救い出す。分離された膵島は、その後、肝臓の門脈に注入され、膵島は、血液を供給し、インスリンの生成と血糖値の調整を支援すると考えられる。
【００１０】
本発明の目的は、膵島を単離する方法を提供することであって、該方法には、ドナー臓器から膵島を分離する間に、保護剤をドナー臓器に導入することを含んでいる。
本発明の他の目的は、膵島を移植する方法を提供することであって、該方法は、ドナー臓器中で他の細胞から膵島を分離する間に、保護剤をドナー臓器に導入し、分離された膵島を目的臓器に移植することを含んでいる。
本発明の他の目的は、膵島を移植する方法を提供することであって、該方法は、ドナー臓器から膵島を分離する間に、デキストランをドナー臓器に導入し、分離された膵島を目的臓器に移植することを含んでいる。
本発明の他の目的は、分離プロセス中に膵島を通過する溶液の粘度を増加させ、それによって緩衝効果を持たせることを含んでいる。
本発明の他の目的は、分離プロセス中に膵島に課されるせん断損傷のレベルを低減することを含んでいる。
【００１１】
本発明の他の目的は、使用に不適当と考えられかねないドナー臓器を救い出すことである。
本発明の他の目的は、単離及び移植プロセス中に損傷又は破壊される膵島の数を低減し、生着能力のある健康な移植細胞の収率を増大することである。
本発明の他の目的は、インスリン非依存性を達成するために、複数のドナー臓器が必要となることを軽減することである。
本発明の他の目的は、ドナー臓器を、より長い輸送時間に持ちこたえるようにすることである。
本発明の他の目的は、様々な品質のドナー臓器に用いられる単離処置を標準化することである。
本発明のこれら及びその他の様相は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から、より容易に明らかになるであろう。
【００１２】
＜詳細な説明＞
本発明は、後の移植のためにヒトのドナー臓器から分離される膵島の生着率と回復力を向上する方法を提供するものである。望ましい実施例において、膵島は、ドナー膵臓から分離され、糖尿病患者の肝臓に移植される。本明細書に含まれる説明は、主として、肝臓への細胞移植を意味するが、本発明は、その他の移植目的、例えば精巣に用いることもできると理解されるべきである。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、「患者」、「ドナー」及び「ドニー」なる用語は、ヒトを含む動物界の構成員を意味する。
本明細書で用いられる場合、「保護剤」なる用語は、分離溶液に添加されると、単離処置の分離ステップ中に膵島へのストレス及び／又は損傷を低減する物質を意味する。
本明細書で用いられる場合、膵島「単離」なる用語は、膵島分離と、任意数の他のステップを含んでいる。
【００１４】
本発明は、膵島分離プロセス中、望ましくは「エドモントンプロトコール」の適用中に、保護剤をドナー膵臓に導入することを含んでいる。具体的には、保護剤の導入は、ドナー膵臓を酵素で消化させた後、密度勾配遠心分離法で膵島を精製する前に起こる。
【００１５】
保護剤の導入は、膵島がドナー臓器内の他の細胞から分離される１又は複数の分離ステップ中に起こすことができる。保護剤の導入は、膵島精製前に１又は複数回起こすことができる。この導入は、保護剤を分離溶液に添加することによって成すことができ、分離溶液を膵島に導入する前に保護分離溶液を生成する。保護分離溶液は、その後、１又は複数の分離ステップ中で利用される。あるいは、保護剤は、分離溶液とともに、同時に膵島に導入することができ、その中で保護分離溶液を生成する。分離溶液は、エドモントンプロトコールで見られるような膵島細胞を分離する分野で周知の溶液である。
【００１６】
保護剤は、分離溶液の粘度を増加させ、溶液によって生じたストレスに対して、膜に緩衝効果をもたらす。膵島の膜へのストレスを低減することによって、保護剤は、膵島の健康状態及び生着率を高めて、膵島がエドモントンプロトコールのような活発な分離／単離処置に耐えうるようにすることができる。その結果として、本発明は、単離及び移植処置によって損傷又は破壊されかねない膵島を救い出す。
【００１７】
望ましい実施例において、保護剤は、デキストラン、様々な分子量で発生する可能性がある長鎖ポリマー(Ｃ6Ｈ10Ｏ5)nである。より望ましい実施例において、保護剤は、臨床グレードのデキストランであって、該デキストランは、およそ６０,０００ドルトンの分子量を有している。
【００１８】
分離溶液に添加される保護剤の量は、本発明の範囲内で変更することができる。採用される保護剤の量と、使用される分離溶液の総量は、ドナー臓器の品質、健康状態及びサイズと、ドナーから取り出された時間と、臓器を輸送する方法によって、上記の値とかなり異なる及び／又は離れることもある。望ましくは、添加される保護剤の量は、分離溶液の約１〜２０重量％である。添加される保護剤の重量％は、２０重量％より多くすることもできるが、これにより、分離溶液の分離能力に影響が及び、分離能力が低減する可能性がある。
【００１９】
代替実施例として、他の保護剤を使用することもできる。一実施例において、タンパク質であるアルブミンを、保護剤として利用できる。アルブミンは、臨床グレードのデキストランのように、およそ６０,０００ドルトンの分子量を有している。代替実施例において、６０,０００ドルトン以外の範囲の分子量を有する保護剤を使用できる。これらの保護剤として、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）と６０,０００ドルトン以外の分子量を有するデキストランが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
保護剤は、望ましくは分解溶液に混ぜ合わされ、消化されたドナー臓器に導入されて、消化されたドナー臓器内の他の細胞及び細胞小器官から膵島を分離する。混合物は、エドモントンプロトコールにて開示されているような器具、例えば細い針、カニューレ、プラスチックチューブ又は同様のデバイスを使用して、消化されたドナー臓器に導入される。
【００２１】
望ましい実施例において、エドモントンプロトコールは、消化されたドナー臓器、望ましくは１つのドナー膵臓又は複数の膵臓内の他の細胞から膵島を分離するために用いられる。エドモントンプロトコールは、複数のステップを含む。例として、管還流(ductal perfusion)を通じた膵臓の膨張と、それに続く酵素及び機械的消化と、密度勾配遠心分離法を用いた膵島の精製が挙げられる。分離ステップは、一般的に多くの膵島を損傷や破壊を伴う活発なプロセスであって、生着可能で移植可能な単離後の細胞の収率低下をもたらす。しかしながら、保護剤を添加することで、より多くの膵島が、膜に生ずる可能性のある破壊を切り抜け、これにより、これら細胞の多数が、プロセスを切り抜ける。
【００２２】
膵島は、一旦単離されると、目的臓器に導入される。一実施例において、目的臓器は、糖尿病患者の肝臓である。しかしながら、他の実施例において、その方法の恩恵を受け得る何れの患者臓器を使用することもできる。例えば、他の目的臓器として、患者の陰嚢、患者の腎臓又は患者の目の硝子体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
別の実施例において、エドモントンプロトコールも、ドナー臓器内の他の細胞から膵島を分離するものであれば、本発明、即ち、膵島の膜へのストレスを低減するために保護剤を添加することを組み入れることができる。
【実施例】
【００２４】
＜実施例１＞
ヒトのドナー膵臓を入手し、表１及び表２に示すように、臨床グレードのデキストランが細胞の生着率に与える影響をテストした。表１に示すように、ドナー臓器１、２、３、４及び５と称する５つの実験用ドナー膵臓には、臨床グレードのデキストランを含有する分離溶液を利用し、添加された臨床グレードのデキストランの重量％は、それぞれ３％、３％、５％、５％及び５％とした。表２に示すように、対照のために、ドナー臓器６、７、８、９及び１０と称する５つのドナー膵臓には、臨床グレードのデキストランを含有する分離溶液を与えなかった。この差異を別にして、ドナー臓器からのすべての膵島は、標準的なエドモントンプロトコールを用いて単離した。
【００２５】
【表１】
2009513721.tif 000002
【００２６】
【表２】
2009513721.tif 000003
【００２７】
上記の表は、ドナー膵臓の膵島当量（ＩＥ）を、エドモントンプロトコールによる膵島の単離前（プレＩＥ）と、単離後（最終ＩＥ）で比較している。ＩＥは、膵島の物理的な量を測定する標準化された単位である。プレＩＥは、プロセス開始時における膵島当量の数を意味している。ポストＩＥは、プロセスの最後における膵島当量の数を意味している。％プレＩＥは、プレＩＥで割ったポストＩＥを意味している。Ｔｘは、細胞が移植されたか否かを意味している。
【００２８】
表に見られるように、大部分の膵島は、臨床グレードのデキストランで処理されたドナー臓器中で生き延びた。ドナー臓器１、２、３、４及び５についての％プレＩＥは、それぞれ、６０.７％、１２９％、６８.１％、８４.０％及び４１.５％であり、総平均は５７.６％であった。対照的に、ドナー臓器６、７、８、９及び１０についての％プレＩＥは、それぞれ、５０.６％、５６.９％、１０３％、５１.７％及び１６.８％であり、総平均は４８.０％であった。最終ＩＥの平均％の差異は、デキストランを用いたドナー臓器のプレＩＥと対照とを対比した割合で、デキストランを用いたドナー臓器が２０％増であった。
【００２９】
さらに、膵島細胞の生着率を測定した。生着率は、生着能力のある膵島を着色し、生着能力のない膵島を着色しない染色液で測定した。この目的のために、当該分野で知られているあらゆる種類の染色液が適している。膵島は、当該分野で周知のように、グリッド上でカウントした。表１に示すように、ドナー臓器１、２、３、４及び５の生着率は、それぞれ８３％、９３％、９２％、８９％及び９３％であり、総平均は生着率９０％であった。望ましくは、３００,０００の生着能力のある膵島細胞が移植には必要であるが、それら細胞の等級が良ければ、少ない量でも移植できる。生着能力のある膵島の割合と、最終ＩＥ膵島カウントの結果、臨床グレードのデキストランを用いたドナー臓器の１００％が、患者に移植するために生着可能な膵島を作り出した。
【００３０】
対照ドナー臓器６、７、８、９及び１０の生着率は、それぞれ５２％、９５％、７８％、８３％及び８５％であり、総平均は生着率７９.０％であった。さらに、生着能力のある膵島が少数であるため、対照ドナー臓器１、３及び５は、患者への移植に不適であった。したがって、臨床グレードのデキストランで処理したドナー臓器の移植率が１００％であるのに対して、対照ドナー臓器のわずか４０％が移植のために生着可能であった。
【００３１】
＜実施例２＞
ヒトのドナー膵臓を入手し、表３に示すように、臨床グレードのデキストランが細胞の生着率に与える影響をテストした。ドナー膵臓は、エドモントンプロトコールの分離ステップ中、臨床グレードのデキストランが１０重量％の溶液で処理した。
【００３２】
【表３】
2009513721.tif 000004
【００３３】
表３に示すように、最終ＩＥは、プレＩＥの５４％であった。しかしながら、膵島の８９.６％に生着能力があることが分かり、該膵島は移植に十分であることが分かった。
【００３４】
本発明の特定の実施例を例示目的で上述したが、当該分野の専門家であれば、本発明の詳細に関する様々な変更は、添付の請求項に規定される発明から逸脱することなく、行われることが明らかであろう。
【国際調査報告】
2009513721.tif 000005