(57)【要約】  本発明は、有効な免疫抑制剤としての、単離された生理活性分子セルロマイシンＡ、その誘導体および類似体に関する。この化合物の免疫抑制性は、特にリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ細胞を標的とし、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γおよび抗体の産生を標的とする。この化合物は、活性化マーカーＣＤ２８の発現をダウンレギュレートし、免疫抑制マーカーＣＴＬＡ−４の発現をアップレギュレートするメカニズムを介して作用する。セルロマイシンＡは、すでにストレプトマイセス・カエルレウスから単離されており、有用な抗真菌活性を有することが判明している。しかしながら、この化合物が免疫調節活性を有することは、本発明以前には見出されていない。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１の化合物３，６−二置換−４−メトキシ−２，２’−ビピリジン、その誘導体、その薬学的に許容される塩の免疫抑制剤としての使用。
【化１】
2009507818.tif 000006
式中、
Ｘは、−ＣＨ＝ＮＯＲ１、−ＣＯＯＲ１、−ＣＨＯ、または−ＣＨ２ＯＲ２であり；
Ｙは、ＨまたはＯＲ３；
Ｒ１は、Ｈ、あるいはＣ１〜Ｃ１６直鎖または分枝鎖アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１６直鎖または分枝鎖アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ１６直鎖または分枝鎖アシルであり；
Ｒ３は、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはイソブチルである。
【請求項２】
前記化合物は、式２の（Ｅ）−４−メトキシ−２，２’−ビピリジン−６−カルバルデヒドオキシム（セルロマイシンＡ）である、請求項１に記載の使用。
【化２】
2009507818.tif 000007
【請求項３】
前記化合物は、式３の（Ｅ）−４−メトキシ−２，２’−ビピリジン−６−カルバルデヒドＯ−メチルオキシムである、請求項１に記載の使用。
【化３】
2009507818.tif 000008
【請求項４】
その投薬量が１.２５〜５.０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項５】
前記化合物は、免疫応答の抑制に関して、公知の免疫抑制剤であるシクロスポリンＡよりも１０倍有効である、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項６】
前記化合物の約０.１μｇ／ｍｌ希釈液は、４８時間以内に免疫細胞の約９０〜９７％を抑制する、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項７】
前記化合物は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、混合リンパ球反応、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原特異的エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の生体外での増殖を抑制する、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項８】
前記化合物は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）やインターロイキン−４（ＩＬ−４）などのサイトカインの生体外での分泌を抑制する、請求項１〜請求項７のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項９】
前記化合物は、Ｔ細胞において、活性化マーカーＣＤ２８の発現をダウンレギュレートし、抑制マーカーＣＴＬＡ−４の発現をアップレギュレートする、請求項１〜請求項８のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１０】
前記化合物は、マクロファージにおいて、Ｂ７−１の発現を増加し、Ｂ７−２およびＭＨＣ分子の発現を低減する、請求項１〜請求項９のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１１】
前記化合物は、α−βＴ細胞およびγ−δＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞；ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞および調節性Ｔ細胞の抑制を誘導する、請求項１〜請求項１０のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１２】
前記化合物は、Ｂ細胞、マスト細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、リンパ球様樹状細胞、間質樹状細胞）、単球、マクロファージ（脾マクロファージ、腹腔マクロファージ、肺胞マクロファージ、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、グリア細胞およびすべての種類のマクロファージ）、上皮細胞、骨芽細胞、好酸球、好塩基球、顆粒球、血小板および巨核球の抑制を誘導する、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１３】
前記化合物は、アジソン病、自己免疫溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、悪性貧血、特発性不妊症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自然流産などの自己免疫疾患の治療に有用である、請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１４】
前記化合物は、免疫抑制を誘導し、移植片拒絶、移植片対宿主反応を防ぎ、移植に有用である、請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１５】
前記化合物は、癲癇、脳卒中、脳虚血、脳性麻痺、アルパース病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レビー小体型認知症、レット症候群、神経障害性疼痛、脊髄外傷、または外傷性脳損傷などの神経疾患の治療に有用である、請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１６】
前記化合物は、インドのヒマラヤ山脈の寒冷地砂漠から分離された新種の放線菌アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］から単離される、請求項１〜請求項１５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１７】
アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］から、免疫抑制剤として有用な請求項１〜請求項１６のいずれかに記載の化合物を単離する方法であって、
［ａ］ｐＨ７.０〜８.５の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、２５〜３０℃で３０〜１００時間、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ ６１９４］の株を振盪培養するステップ；
［ｂ］ステップ［ａ］で得られた細胞を沈降させ、細胞を含有しない上清を得るステップと、
［ｃ］ステップ［ｂ］で得られた上清から、式２の化合物を公知の方法によって抽出し、続いてそれを精製するステップと、
［ｄ］任意に、ＮＭＲスペクトルデータ、赤外線スペクトルデータおよび質量スペクトルデータを用いて、精製画分を特徴付けするステップと、
を含む方法。
【請求項１８】
前記細胞は、好ましくは４０〜７０時間培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、好ましくは２８〜３０℃で培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、好ましくはｐＨ７〜８.５で培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
式２の化合物の回収量は、約１５０ｍｇ／Ｌ培養液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
得られた活性画分は、免疫抑制剤として有用である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
薬学的に許容される希釈剤、添加剤および／または担体と共に式１の化合物１.２５〜５.０ｍｇを含有する、免疫抑制に有用な免疫抑制医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビピリジン化合物セルロマイシンＡ（Caerulomycin A）、その誘導体および類似体の有効な免疫抑制剤としての使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、ナイーブリンパ球、ならびにマイトジェンで刺激したＴリンパ球およびＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞などの活性化リンパ球（エフェクター細胞）を抑制し、またＩＬ−４およびＩＦＮ−γの産生を抑制する、免疫抑制剤に関する。
【０００２】
本発明は、活性化Ｔ細胞により引き起こされる異常な免疫応答が原因の疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症性反応、自己免疫疾患もしくはそれに関連する疾患によって引き起こされ、組織損傷もしくは感染を伴う線維症もしくは機能不全、またはアレルギー性疾患を治療するのに有用であり、また臓器移植の拒絶反応および移植時の移植片対宿主疾患を抑制するのに有用である。
【０００３】
化合物セルロマイシンＡは、アクセッション番号ＭＴＣＣ６１９４Ｔ：ＤＳＭ４４８４８Ｔ：ＪＣＭ１２４７２Ｔを有する新種の放線菌アクチノアロテイチャス・スピティエンシス（Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.）のＲＭＶ−１３７８Ｔ株から単離した。
【背景技術】
【０００４】
生物の免疫システムは、細菌やウイルスなどの病原性外来微生物を認識・排除する監視・防御機構を有することにより発達してきた。したがって、生物は、外来微生物（非自己抗原）から自己の細胞または組織（自己抗原）を区別し、自己抗原には反応しないか、または免疫応答を失敗した自己抗原（them having the failure to mount immune response）に反応する。このように、生物は、非自己抗原を即座にかつ効率的に排除するための獲得免疫を発達させてきた。
【０００５】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）およびＢリンパ球（Ｂ細胞）は、免疫システムの適応免疫部門（adaptive arm）の主要な細胞である。いずれも獲得免疫に関与し、これらの細胞の複合的相互作用は、免疫応答における一連のエフェクター細胞および記憶細胞の発現に必要とされる。Ｔ細胞は外来抗原に特異的であり、その数は特異的な宿主防御に応答して極端に増加する。
【０００６】
Ｔ細胞の最適な活性化は、２つの別々の受容体−リガンド認識事象に依存する。主要な事象は、Ｂ細胞やマクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示されるペプチド−主要組織適合複合体（ｐＭＨＣ）と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用である。しかしながら、補助刺激シグナルの非存在下では、ＴＣＲ−ｐＭＨＣの相互作用のみではＴ細胞を十分に活性化することができず、応答性Ｔ細胞のアポトーシス死または長期不応答という結果となりうる（Agrewala et al. 1994, 1998）。
【０００７】
効率的なＴ細胞の活性化に必要とされる第２の補助刺激シグナルを与えるのは、関連する補助刺激受容体のファミリー（ＣＤ２８，ＣＤ４０Ｌ）と、それぞれのリガンドとの相互作用である。さらに、第２の補助刺激シグナルの相補的セット（ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｉ、ＢＴＬＡ）もまた、免疫応答を低減する負のシグナルを与え、かつそれ自体が末梢Ｔ細胞の寛容を維持するように機能し、自己免疫に対して保護する（Nishimura et al. 2001, Greenwald et al. 2001）。
【０００８】
Ｔ細胞表面に発現する主要な補助刺激分子は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞で恒常的に発現する。ＣＤ２８の結合（ligation）は、Ｔ細胞応答の大きさおよび期間を高め；抗アポトーシス遺伝子ＢＣＬ−ＸＬを誘導し；サイトカインの分泌、特にインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を増加し；細胞接着を高め；ＡＰＣに結合すると、Ｔ細胞の細胞膜の再構築を促進し；免疫不応答の誘発を防ぎ；胚中心の形成を補助する（Lanzavecchia et al. 1999）。ＣＤ２８補助刺激は、大部分のＴ細胞応答の開始に必要であり、ＣＤ２８シグナル伝達が遮断されると、タンパク質抗原、寄生虫および一部のウイルスに対して応答する能力、胚中心を形成する能力、およびＢ細胞へのヘルパー機能を仲介する能力が大幅に低下する。ＣＤ２８補助刺激の遮断は、極めて免疫抑制性であり、自己免疫疾患モデル動物における病原性Ｔ細胞応答の誘導を防ぎ、臓器移植モデル動物における同種移植片の長期受容を可能にすることから、ＣＤ２８補助刺激の遮断は治療学的意味を有する（Salomon et al. 2001）。
【０００９】
ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）は、このような抑制シグナルを伝達する。固定化されたモノクローナル抗体、または二次抗体で架橋された可溶性抗体によりＣＴＬＡ−４を架橋したところ、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体により誘導されるＴ細胞応答が抑制された（Krummel et al. 1996)。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８ファミリーメンバーの一般的な特徴を示すが、いくつかの重要な様式において固有である。第一に、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８と比較して共有リガンドＢ７−１およびＢ７−２に対して著しく高い親和性（Ｋｄ４.０μｍに対して０.２〜０.４μｍ）を有し、かつ４０〜１００倍高い結合力を有する（van der Merwe et al. 1997）。
【００１０】
第二に、ＣＴＬＡ−４は、固有の発現パターンを有する。ＣＤ２８と異なり、ＣＴＬＡ−４は、ナイーブＴ細胞の細胞表面に恒常的に発現するわけではない。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化した後（ＡＰＣ−ＴＣＲ結合から２〜３日後）のみ発現し、Ｂ７分子と結合した時に負のシグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＴＬＡ−４に対するＢ７−１およびＢ７−２の結合親和性はＣＤ２８に対する親和性よりも４０〜５０倍高いため、負のシグナル伝達は活性化Ｔ細胞において優勢となり、それによって免疫応答が終結する。生体内（in vivo）でのＣＴＬＡ−４遮断は、抗原特異的な抗寄生体応答、腫瘍拒絶、自己免疫疾患を亢進させ、移植片拒絶を悪化させる（Tivol et al.1996, Chambers et al. 2001）。生体外（in vitro）では、ＣＴＬＡ−４が結合した結果、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生および細胞周期の進行が抑制される（Chambers et al. 2001, Freeman et al. 2000）。
【００１１】
ＣＴＬＡ−４は、多くの様々なメカニズムによって、末梢性寛容を調節する。第一に、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達（つまり、ＴＣＲから始まる一連のリン酸化）（Lee et al. 1998）および生化学的シグナル（つまり、ＥＲＫ活性化）を直接調節することによって、Ｔ細胞の活性化を調節する。第二に、最近の研究から、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋免疫調節性Ｔ細胞が、恒常的にＣＴＬＡ−４を発現することが示されている（Salomon et al. 2000）。実際に、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達は、これらの細胞の機能に必須である（Takahashi et al. 2000）。したがって、ＣＴＬＡ−４は、細胞内のシグナル伝達を調節し、調節性Ｔ細胞への分化を誘導する；または、エフェクター細胞におけるＣＴＬＡ−４の結合は、シグナル伝達およびそれに続くサイトカイン産生を変化させる。ＣＴＬＡ−４を架橋させると免疫調節性ＴＧＦ−βサイトカインの分泌が誘発され（Chen et al. 1998）、このことはＣＤ４＋ＣＴＬＡ−４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の１つのあり得る作用機構を提供する。
【００１２】
免疫機能の変化に関するＣＴＬＡ−４の複数の機能効果が研究結果によって示唆されているが、これらの一見異なる活性はすべて関連しており、ＣＴＬＡ−４の主な作用はＴＣＲシグナル伝達における初期の事象を変化させることによってＴ細胞活性化の閾値を変えることであると、モデルのうちの１つによって述べられている。実際に、カルシウム動員を調節するカルシニューリン抑制剤のシクロスポリンＡでＴ細胞を処理すると、ＣＤ４＋ＣＴＬＡ−４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞と同様なＴＧＦβ産生Ｔ細胞が産生されることが実証されている（Prashar et al. 1995）。
【００１３】
このように、ＣＤ２８シグナル伝達の抑制、近位ＴＣＲシグナルまたはＴ細胞活性化の下流エフェクター経路の調節に向けられているかどうかにかかわらず、ＣＴＬＡ−４結合の作用によって、Ｔ細胞分化の変化および免疫応答のダウンレギュレーションが生じる。このため、セルロマイシンＡによりＴ細胞表面上のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８の発現を調節することによって疾患の悪化を抑える、治療学的可能性の見込みがある。
【００１４】
抗原提示細胞表面に発現する多くの補助刺激分子が、現在まで知られているが、Ｂ７−１およびＢ７−２は最も強力であり、Ｔ細胞の活性化を担っている。Ｔ細胞表面に発現したＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４受容体とのその相互作用は、極めて重要である。ＣＤ２８がそのリガンドＢ７−１およびＢ７−２に結合することによって、Ｔ細胞に補助刺激シグナルが送られ、その増殖およびサイトカイン分泌が高まり、Ｔ細胞アネルギーの誘導を防ぐ（Linsley et al. 1991）。一方、これらの同じリガンドがＣＴＬＡ−４に結合することによって、Ｔ細胞ホメオスタシスおよび自己寛容を維持するのに必須である、応答のダウンレギュレーションが起こる（Tivol et al. 1995）。約２５％の配列同一性を共有するＢ７−１およびＢ７−２は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質である（Stamper et al. 2001）。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４とＢ７リガンドとの相互作用は、免疫応答および免疫寛容それぞれの活性化および抑制に重要であることは確立された事象である（Greenwald et al. 2005）。
【００１５】
要するに、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答は、複数かつ複雑な相互依存事象に依存する。免疫においてＢ細胞およびＴ細胞の役割は重要であることから、その調節は、免疫の向上または低下が必要な、あるいは免疫の向上または低下により恩恵を受ける幅広い疾患、例えばＩ型糖尿病、多発性硬化症、喘息、関節炎、重症筋無力症、エリテマトーデス、乾癬、大腸炎、移植臓器の拒絶反応、または免疫不全疾患などの自己免疫疾患、および癌を治療および／または予防するための主要な標的である。したがって、非常に多くの免疫障害および免疫疾患を治療および予防する目的のために、Ｂ細胞およびＴ細胞の複合応答を調節することができる薬物が強く必要とされている。
【００１６】
臓器移植の成功には、臓器レシピエントの免疫システムの、有効な生理学的かつ薬理学的な介入が必要である。臓器移植レシピエント、特に同種移植片を移植されるレシピエントにおける免疫応答の介入への１つのアプローチは、免疫抑制薬の使用によるものである。例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺、骨髄および膵臓の移植を伴うケースにおいて、レシピエント体内の移植臓器の生着を延長するためにこれらの薬物が使用される。
【００１７】
移植時の臓器拒絶反応の低減に使用可能な免疫抑制薬には、種類がいくつかある。このような薬物は、増殖抑制剤、抗炎症化合物およびリンパ球活性化抑制剤の３つの主要なクラスに分けられる。
【００１８】
細胞毒性または増殖抑制剤のクラスの例は、アザチオプリン、シクロホスファミドおよびメトトレキセートである。増殖抑制クラスの薬物は、細胞の活性化および増殖を制限する、慢性炎症性疾患の患者および臓器移植レシピエントに対して有効な免疫抑制剤である。有糸分裂および細胞分裂を抑制するこれらの薬物は、骨髄細胞および消化管（ＧＩ）壁の細胞など、高い代謝回転速度を有する正常な細胞集団に対する重篤な細胞毒性副作用を有する。したがって、このような薬物は、重篤な副作用、特にリンパ球減少、好中球減少、骨髄抑制、出血性膀胱炎、肝障害、悪性疾患罹患率の上昇、脱毛、消化管壁障害、および不妊症を有する場合が多い。
【００１９】
移植で使用される免疫抑制薬の第２のクラスは、抗炎症作用を有する化合物によって提供される。この薬物のクラスの代表は、副腎皮質ステロイドとして一般的に知られており、全身性細胞障害作用を及ぼさない利点を有する。これらの化合物は、通常、炎症反応、サイトカイン産生、走化性、好中球、マクロファージまたはリンパ球の活性化、あるいはそのエフェクター機能を抑制することによって作用する。副腎皮質ステロイドの一般的な例は、プレドニゾンおよびプレドニゾロンであり、炭水化物およびタンパク質の代謝ならびに免疫機能に影響を及ぼす。副腎皮質ステロイドは極めて毒性が低いため、このクラスの化合物は、増殖抑制クラスの化合物などの細胞毒性剤と組み合わせて使用されることがある。しかし、副腎皮質ステロイドは、作用特異性を欠いており、広範囲の代謝作用、抗炎症作用および免疫作用を発揮することができる。このクラスの一般的な副作用としては、臓器移植レシピエントの感染の増加；創傷治癒の妨害；血行バランス、炭水化物および骨の代謝ならびにミネラル調節の乱れ；が挙げられる。
【００２０】
臓器移植で使用される免疫抑制薬の第３のクラスは、免疫調節性の、白血球の活性化を抑制する化合物によって提供される。このような化合物は、通常、活性化Ｔ細胞のエフェクター機能または増殖をブロックすることによって；サイトカイン産生を抑制することによって；あるいは血小板、顆粒球、Ｂ細胞の活性化、分化もしくはエフェクター機能、またはマクロファージの活性を抑制することによって作用する。化合物のシクロスポリンファミリーは、このクラスの薬物の主な例である。このような化合物は、ポリペプチド真菌代謝産物であり、新たに遭遇した抗原に対する細胞性応答および体液性応答の両方を低減するように、ヘルパーＴ細胞を抑制するのに非常に有効であることが見出されている。シクロスポリンは、サイトカインの産生または分泌を低減することによって；特に、ＩＬ−２分泌および多くのＴ細胞産物の分泌を防ぐことにより、抗原特異的ＣＤ４細胞の活性化を妨げることによって；種々の細胞型上のこれらのリンホカインに対する受容体の発現を妨げることによって；マクロファージおよびリンパ球の活性を変化させる。特に、シクロスポリンＡは、臓器移植において免疫抑制剤として広く使用されている。他の微生物代謝産物としては、シクロスポリンＢおよびシクロスポリンＧなどのシクロスポリン、およびＦＫ−５０６として知られる他の微生物産物が挙げられる。シクロスポリンＡは、体液性免疫ならびに細胞媒介反応を抑える。シクロスポリンＡは、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、骨髄および心肺移植における臓器拒絶反応に使用される。シクロスポリンＡは、慢性関節リウマチ、クローン病、グレーブス病、重篤な乾癬、再生不良性貧血、多発性硬化症、円形脱毛症、天疱瘡および類天疱瘡、皮膚筋炎、多発性筋炎、ベーチェット病、ぶどう膜炎、肺サルコイドーシス、胆汁性肝硬変、重症筋無力症およびアトピー性皮膚炎を含む自己免疫および炎症性疾患の治療にも有用である。
【００２１】
シクロスポリンはいくつかの著しい不利点を有する。シクロスポリンは、臓器移植において優れた利点を提供しているが、シクロスポリンは非特異的な免疫抑制剤である。望ましい免疫反応が、外来抗原に対しても低減される。耐用量では、拒絶反応を完全に抑えられない。したがって、移植組織に対する免疫反応は完全に妨げられるわけではなく、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、および／または抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ５／ＣＤ７抗体などのモノクローナル抗体を含む他の免疫抑制剤で同時に治療する必要がある。シクロスポリンは、多くの臓器レシピエントに重篤な副作用を生じさせ、肝臓、腎臓、中枢神経系および胃腸管に対して宿主によって様々な作用を示す。有害な副作用の中でも、腎臓および肝臓への損傷、歯肉組織の肥厚、難治性高血圧症、および感染および悪性疾患罹患率の増加が著しい。
【００２２】
このように、自己免疫疾患の治療および臓器移植、特に完全に一致しているとは言えないドナー・レシピエント間の移植において、効果的かつ選択的な免疫抑制薬が依然として必要とされている。したがって、本発明者は、新種の放線菌から単離されたセルロマイシンを免疫応答を抑制するための免疫抑制薬として使用する、合理的アプローチを採る提案を示す。本発明のこの目的および他の目的、ならびにさらなる本発明の特徴は、本明細書に記載の詳細な説明から理解されよう。本発明の発明者は、生体内で必要とされるセルロマイシンＡの最適用量は、５.０ｍｇ／ｋｇ体重であることを立証した。増殖を抑制させるために生体外（in vitro）実験で使用されるセルロマイシンＡの用量は、公知の免疫抑制薬であるシクロスポリンＡよりも１０倍少ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
このように、本発明の主な目的は、化合物セルロマイシン、その誘導体セルロマイシンＡ、その薬学的に許容される塩を含む他のその誘導体が、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の免疫抑制を誘導することを実証することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、セルロマイシンＡが、混合リンパ球反応を抑制することを実証することである。
【００２５】
本発明の他の目的は、セルロマイシンＡが、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の増殖を抑制することを実証することである。
【００２６】
本発明の他の目的は、セルロマイシンＡが、Ｔ細胞によって産生されるサイトカインの分泌を抑制することを実証することである。
【００２７】
本発明の他の目的は、セルロマイシンＡが、Ｂ細胞による抗体の産生を抑制することを実証することである。
【００２８】
本発明の他の目的は、セルロマイシンＡが、Ｔ細胞のＣＤ２８やＣＴＬＡ−４などの補助刺激分子の発現を調節することを実証することである。
【００２９】
本発明のさらに他の目的は、セルロマイシンＡが、抗原提示細胞のＢ７−１やＢ７−２、ＭＨＣ分子などの補助刺激分子の発現を調節することを実証することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、化合物セルロマイシンＡを生成し、蓄積するための発酵方法であって、ほぼ中性の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、約２５〜３０℃で約２４〜１６８時間、アクセッション番号ＭＴＣＣ６１９４を有する新種の細菌アクチノアロテイチャス・スピティエンシス（Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.）を培養するステップを含む、発酵方法に関する。これにより、単離可能な量のセルロマイシンＡが培養液中に存在するようになる。
【００３１】
化合物セルロマイシンＡは、ａ）培養液から固形物を分離し；ｂ）ろ過した培養液を不混和性抽出溶媒で抽出し；ｃ）抽出溶媒を乾燥状態まで濃縮し；ｄ）残渣を飽和ＮａＣｌ水溶液および１０％メタノール（１：１）で希釈し、不混和性溶媒で分配し；ｅ）適切な溶媒で分配することにより、水性アルコール画分から活性物質を除去し；ｆ）未精製セルロマイシンＡを含有する回収溶媒相を合わせ、濃縮し；ｇ）クロマトグラフ技術により未精製濃縮物質からセルロマイシンＡを精製すること；により培養液から単離される。
【００３２】
本発明はさらに、有効な免疫抑制剤としてセルロマイシンＡを提供する。この薬物の免疫抑制性は、特にＴ細胞およびＢ細胞、ならびにこれらの細胞によるサイトカインの産生を標的とする。この薬物は、活性化マーカーＣＤ２８の発現をダウンレギュレートし、抑制マーカーＣＴＬＡ−４の発現をアップレギュレートすることによるメカニズムを介して作用する。
【００３３】
セルロマイシンＡは、最初にストレプトマイセス・カエルレウス（Streptomyces caeruleus）から単離され、強い抗真菌活性および穏やかな抗菌活性を有することが判明した（Funk and Divekar 1959）。セルロマイシンＡの抗アメーバ性および植物毒性もまた記述されている（Chatterjee et al. and Chandran et al.）。これらの特性の開示内容は、参照により本明細書に援用される。
【００３４】
本発明は、一般式１のビピリジン化合物、その誘導体、エステル、エーテル、その薬学的に許容される塩の免疫抑制剤としての使用を提供する。
【化１】
2009507818.tif 000002
式中、
Ｘは、−ＣＨ＝ＮＯＲ１、−ＣＯＯＲ１、−ＣＨＯ、または−ＣＨ２ＯＲ２であり；
Ｙは、Ｈ、またはＯＲ３であり；
Ｒ１は、Ｈ、あるいはＣ１〜Ｃ１６直鎖または分枝鎖アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１６直鎖または分枝鎖アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ１６直鎖または分枝鎖アシルであり；
Ｒ３は、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはイソブチルである。
【００３５】
本発明はさらに、式２のセルロマイシンＡ、（Ｅ）−４−メトキシ−２，２’−ビピリジン−６−カルバルデヒドオキシムの有効な免疫抑制剤としての使用を提供する。
【化２】
2009507818.tif 000003
【００３６】
本発明は、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］から式２の化合物を単離する方法であって、
［ａ］中性の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、２５〜３０℃で３０〜１００時間、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］の株を振盪培養するステップと、
［ｂ］ステップ［ａ］で得られた細胞を沈降させ、細胞を含有しない上清を得るステップと、
［ｃ］ステップ［ｂ］で得られた上清から式２の化合物を公知の方法によって抽出し、続いてそれを精製するステップと、
［ｄ］任意に、ＮＭＲスペクトルデータ、赤外線スペクトルデータおよび質量スペクトルデータを用いて、精製画分を特徴付けするステップと、
を含む方法も提供する。
【００３７】
本発明の実施形態において、前記化合物は、式２の（Ｅ）−４−メトキシ−２，２’−ビピリジン−６−カルバルデヒドオキシム（セルロマイシンＡ）である。
【化３】
2009507818.tif 000004
【００３８】
本発明のさらなる実施形態において、前記化合物は、式３の（Ｅ）−Ａ−メトキシ−２，２’−ビピリジン−６−カルバルデヒドＯ−メチルオキシムである。
【化４】
2009507818.tif 000005
【００３９】
本発明のさらに他の実施形態において、前記化合物は、１.２５〜５.０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で使用される。
【００４０】
本発明の実施形態において、前記化合物は、免疫応答の抑制に関して、公知の免疫抑制剤であるシクロスポリンＡよりも１０倍有効である。
【００４１】
本発明の実施形態において、前記化合物の約０.１μｇ／ｍｌ希釈液は、４８時間以内に免疫細胞の約９０％〜９７％を抑制する。
【００４２】
本発明の実施形態において、前記化合物は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、混合リンパ球反応、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原特異的エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の生体外（in vitro）での増殖を抑制する。
【００４３】
本発明の実施形態において、前記化合物は、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）やインターロイキン−４（ＩＬ−４）などのサイトカインの生体外（in vitro）での分泌を抑制する。
【００４４】
本発明の実施形態において、前記化合物は、Ｔ細胞において、活性化マーカーＣＤ２８の発現をダウンレギュレートし、抑制マーカーＣＴＬＡ−４の発現をアップレギュレートする。
【００４５】
本発明の実施形態において、前記化合物は、マクロファージにおいて、Ｂ７−１の発現を増加し、Ｂ７−２およびＭＨＣ分子の発現を低減する。
【００４６】
本発明の実施形態において、前記化合物は、α−βＴ細胞およびγ−δＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞および調節性Ｔ細胞の抑制を誘導する。
【００４７】
本発明の実施形態において、前記化合物は、Ｂ細胞、マスト細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、リンパ球様樹状細胞、間質樹状細胞）、単球、マクロファージ（脾マクロファージ、腹腔マクロファージ、肺胞マクロファージ、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、グリア細胞およびすべての種類のマクロファージ）、上皮細胞、骨芽細胞、好酸球、好塩基球、顆粒球、血小板および巨核球の抑制を誘導する。
【００４８】
本発明の実施形態において、前記化合物は、アジソン病や自己免疫溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、悪性貧血、特発性不妊症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自然流産などの自己免疫疾患の治療に有用である。
【００４９】
本発明の実施形態において、前記化合物は、免疫抑制を誘導し、移植片拒絶、移植片対宿主反応を防ぎ、移植に有用である。
【００５０】
本発明の実施形態において、前記化合物は、癲癇や脳卒中、脳虚血、脳性麻痺、アルパース病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レビー小体型認知症、レット症候群、神経障害性疼痛、脊髄外傷、外傷性脳損傷などの神経疾患の治療に有用である。
【００５１】
本発明の実施形態において、前記化合物は、インドのヒマラヤ山脈の寒冷地砂漠から分離された新種の放線菌アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］から単離される。
【００５２】
本発明の実施形態において、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］から式２の化合物を単離する方法であって、
［ａ］ｐＨ７.０〜８.５の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、２５〜３０℃で３０〜１００時間、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス［ＭＴＣＣ６１９４］を振盪培養するステップと、
［ｂ］ステップ［ａ］で得られた細胞を沈降させ、細胞を含有しない上清を得るステップと、
［ｃ］ステップ［ｂ］で得られた上清から式２の化合物を公知の方法によって抽出し、続いてそれを精製するステップと、
［ｄ］任意に、ＮＭＲスペクトルデータ、赤外線スペクトルデータおよび質量スペクトルデータを用いて、精製画分を特徴付けするステップと、
を含む方法が提供される。
【００５３】
本発明の実施形態において、前記細胞は、好ましくは４０〜７０時間培養される。
【００５４】
本発明の実施形態において、前記細胞は、好ましくは２８〜３０℃で培養される。
【００５５】
本発明の実施形態において、前記細胞は、好ましくはｐＨ７〜８.５で培養される。
【００５６】
本発明の実施形態において、式２の化合物の回収量は、約１５０ｍｇ／ｌ培養液である。
【００５７】
本発明の実施形態において、得られた活性画分は、免疫抑制剤として有用である。
【００５８】
本発明の実施形態において、一般式１の化合物１.２５〜５.０ｍｇ／ｋｇ体重を患者に投与するステップを含む、自己免疫疾患を治療する方法が提供される。
【００５９】
本発明の実施形態において、その化合物は、１日１回投与で３日間投与される。
【００６０】
本発明の実施形態において、薬学的に許容される希釈剤、添加剤および／または担体と共に一般式１の化合物１.２５〜５.０ｍｇを含有する、免疫抑制に有用な免疫抑制医薬組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明の詳細な説明
放線菌および真菌に由来する産物の体系的研究から、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６（タクロリムス）およびラパマイシン（シロリムス）などの免疫抑制剤が開発されている。これらの薬物は、強力な抗真菌作用を示すだけでなく、潜在的な免疫抑制薬としても使用される。この点を考慮して、本発明者は、ヒマチャルプラデシュ州のカザおよびスピティの寒冷なヒマラヤ山脈領域の土壌サンプルおよび水サンプルから様々な微生物を単離して、抗真菌活性を有する生理活性化合物をスクリーニングする研究を開始した。インドのヒマラヤ山脈の寒冷地砂漠から分離されたＲＭＶ−１３７８Ｔ株の多面的な特徴付けから、その株がアクチノアロテイチャス属に属することがはっきりと確認された。生理学的および生化学的試験によって、系統発生的に最も近い種とＲＭＶ−１３７８Ｔ株とを遺伝子型および表現型について区別可能となった。１６ＳｒＤＮＡの配列分析から、その分離株は、類似性９９％でアクチノアロテイチャス・シアノグリセウス（Actinoalloteichus cyanogriseus）と非常に近い関係にあることが明らかとなった。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの結果から、アクチノアロテイチャス・シアノグリセウスとのゲノム類縁性は低い（５１％）ことが示された。したがって、本発明者は、その分離株は、アクチノアロテイチャス属の新種として分類されることを提案し、その名前をアクチノアロテイチャス・スピティエンシス（Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.）と提案した。ＲＭＶ−１３７８Ｔ株は、インドのＭＴＣＣ（Microbial Type Culture Collection and Gene Bank）にアクセッション番号ＭＴＣＣ６１９４Ｔで寄託されており、ＲＭＶ−１３７８Ｔ基準株はまた、日本のＪＣＭ（Japan Collection of Micro-organisms；理化学研究所微生物系統保存施設）にアクセッション番号ＪＣＭ１２４７２Ｔで寄託されており、ドイツのＤＳＭＺ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）にアクセッション番号ＤＳＭ４４８４８Ｔで寄託されている。ＲＭＶ−１３７８株から単離された活性成分は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルデータ、赤外線（ＩＲ）スペクトルデータおよび質量スペクトルデータをベースとして特徴付けられた。同定された化合物は、（Ｅ）−４−メトキシ−２，２’−ビピリジン−６−カルバルデヒドオキシムであった。そのデータは、既に報告されているセルロマイシンＡのデータ（Divekar et al. 1967）とよく一致した。
【００６２】
単離されたアクチノアロテイチャス・スピティエンシス株の主な特徴は以下のとおりである。
ａ）アクチノバクテリアＲＭＶ−１３７８Ｔ株は、枝分れした非断片栄養菌糸（non-fragmenting vegetative hyphae）を形成し、拡散性色素を生成しない。気生菌糸も胞子形成も認められない。
ｂ）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は、７２.０モル％であった。
ｃ）その株は、アクチノアロテイチャス属に特有の化学分類学的特徴を有し、正式発表された学名を有する現在唯一のアクチノアロテイチャス属の種、アクチノアロテイチャス・シアノグリセウスに近い関係にある（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性９９.３％）。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験の結果から、アクチノアロテイチャス・シアノグリセウスの基準株との類縁性は５１.９％であることが示された。
ｄ）ＲＭＶ−１３７８Ｔ株（＝ＭＴＣＣ６１９４Ｔ＝ＪＣＭ１２４７２Ｔ＝ＤＳＭ４４８４８Ｔ）の上記のデータおよび生理学的および生化学的特殊性に基づいて、この株は、アクチノアロテイチャス属の新種の基準株として分類され、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス（Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.）という学名が与えられた。
【００６３】
微生物タイプカルチャーコレクション＆ジーンバンク（Microbial Type Culture Collection & Gene Bank；ＭＴＣＣ）は、１９８６に設立された国家施設であり、バイオテクノロジー局（ＤＢＴ）、インド政府および科学・産業研究協議会（ＣＳＩＲ）によって共同で資金援助されている。ＭＴＣＣは、チャンディガルの微生物工学研究所（Institute of Microbial Technology；ＩＭＴＥＣＨ）内にある、設備が整っている最新施設である。ＭＴＣＣは、世界微生物株保存連盟（World Federation of Culture Collection；ＷＦＣＣ）の支部メンバーであり、国際微生物データセンター（World Data Center for Microorganisms；ＷＤＣＭ）に登録されている（登録番号７７３）。この国家施設の主な目的は、寄託機関としての役割を果たすこと、信頼のおける微生物培養物を供給すること、研究機関、大学および産業界で働いている科学者に関連するサービスを提供することである。２００２年１０月４日に、ＭＴＣＣは、ブダペスト条約の下での微生物の寄託に関してインドにおける国際寄託機関（International Depositary Authority；ＩＤＡ）としてＷＩＰＯ（ジュネーブ）に承認された。
【００６４】
産生生物の発酵
セルロマイシンＡは、本発明において微生物の制御発酵によって産生される。この微生物を、好ましくは水性栄養培地中、好気および中温条件下にて、好ましくは２５〜３５℃、ｐＨ約６.０〜８.０で成長させる。発酵時間の長さは、一般的には２４〜１６８時間、好ましくは２４〜９６時間の範囲内である。３０℃、ｐＨ７.０〜８.５にて良好に産生する。使用される栄養培地は、好ましくはタンパク質加水分解産物やタンパク質および／または単離アミノ酸、アンモニウムおよび／または硝酸塩供給源などの適切な窒素供給源；炭素の供給源としての同化可能な炭水化物および／または脂肪で構成され、かつ塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどの塩も含有し得る。
【００６５】
グルコース５.４ｇ、酵母抽出物４.８ｇ、麦芽エキス８.５ｇ、ＣａＣＯ３３.０ｇ、蒸留水１０００ｍｌを含有する培地、ｐＨ７.２およびインキュベーション温度２８℃で、セルロマイシンＡは良好に産生される。
【００６６】
上記の培地は、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス（Actinoalloteichus spitiensissp. nov.）の株によるセルロマイシンＡの産生に適した培地の単なる一例であることを理解しなければならない。成長および産生が良好な広範囲にわたる栄養培地を、本明細書に開示される培地の代わりに使用することができると考えられる。
【００６７】
すべての培養および発酵は、無菌培地および無菌条件下において行わなければならない。発酵を開始するためには、既に説明した発酵用の培地と同様の培地中で成長させた接種材料を培地に接種する必要がある。必要とされる接種材料の割合は一般的に１〜１０％の範囲であり；１０％が一般的に好ましい。
【００６８】
培養液からのセルロマイシンＡの単離および精製
発酵により産生されたセルロマイシンＡの単離および精製は、一般的に抽出とクロマトグラフ技術の組み合わせを使用して行われる。各ステップの好ましい順序は以下のとおりである。
【００６９】
ろ過した培養液を酢酸エチルなどの不混和性溶媒で抽出する。これらの抽出物を合わせ、真空内で乾燥状態まで濃縮する。抽出残渣を１０％ＮａＣｌ／メタノール（１：１）で希釈し、脂質を除去することができるヘキサンなどの不混和性溶媒でそれを分配する。酢酸エチルなどの適切な溶媒で分配することによって、水性アルコール画分から活性物質を除去する。回収した溶媒相は、未精製セルロマイシンＡを含む。
【００７０】
粗抽出物からのセルロマイシンＡのさらなる分離および精製は、例えば、カラムクロマトグラフィー（ＣＣ）、高性能フラッシュクロマトグラフィー、分取中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などのクロマトグラフ技術の適切な組み合わせを用いることによって行うことができる。分画は、免疫抑制活性によって導かれる。
【００７１】
その様々なスペクトル特性の詳細な分析に基づいて、その純粋化合物をセルロマイシンＡと同定した（図１，２，３および４それぞれで再現された１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲおよび質量スペクトルを参照）。
【００７２】
本発明の実施形態において、セルロマイシンＡは、マイトジェンで刺激されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性を抑制した。リンパ球をＴ細胞のマイトジェンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびＢ細胞のマイトジェンであるリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し、異なる用量のセルロマイシンＡ（０.０００３〜０.１μｇ／ｍｌ）で刺激した。マイトジェンのみと共に培養した細胞と比較して、セルロマイシンＡは、マイトジェン誘発増殖の著しい減少を誘導した。
【００７３】
本発明の他の実施形態において、セルロマイシンＡは、ＭＬＲ反応、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の生体外（in vitro）での抑制も示した。セルロマイシンＡの活性を既知の免疫抑制薬シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）と比較した。両方の薬物ともに、ＭＬＲにおける用量依存性抑制があることが確認された。興味深いことに、セルロマイシンＡは、ＣｓＡより１０倍少ない用量で、同等の増殖の抑制に効果を有した。
【００７４】
本発明の他の実施形態において、セルロマイシンＡは、抗原特異的Ｔ細胞の生体内（in vivo）での増殖も抑制した。抗原（オボアルブミン：１００μｇ／ｍｌ）をフロイント完全アジュバント中で乳化させ、各群（マウス５匹／群）について腹腔内に注射した。オボアルブミンで感作された（ovalbumin-primed）各動物群にそれぞれ異なる用量のセルロマイシンＡ（２５、５０、７５、１００μｇ／１００μｌ／マウス）を毎日注射した。７日後、マウスを屠殺し、各群からの脾細胞を別々にプールし、生体外（in vitro）での増殖をモニターした。
【００７５】
本発明のさらに他の実施形態において、セルロマイシンＡは、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの分泌を著しく抑制した。
【００７６】
本発明の他の実施形態において、セルロマイシンＡは、ＣＤ２８の発現をダウンレギュレートし、ＣＴＬＡ−４の発現をアップレギュレートすることによって免疫抑制を誘導する。ＣＴＬＡ−４は免疫抑制シグナルを送ることが証明されている。一方、ＣＤ２８はＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。セルロマイシンＡは、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ４の発現だけでなく、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合も著しく高め、かつＣＤ２８／ＣＤ４の発現およびＣＤ２８／ＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を低減することが確認された。同様な結果が、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞の場合にも認められた。
【００７７】
本発明の他の実施形態において、セルロマイシンＡは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ型の抗体の分泌を抑制した。
【００７８】
本発明のさらに他の実施形態において、セルロマイシンＡは、マクロファージのＢ７−１の発現をアップレギュレートしたが、Ｂ７−２の発現をダウンレギュレートした。多くの補助刺激分子が、ＡＰＣ表面に発現されるが、Ｂ７−１およびＢ７−２は最も強力である。Ｔ細胞表面に発現されるＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性を適切に調節するのに重要である。したがって、本発明者は、そのリガンドＢ７−１およびＢ７−２の発現をモニターした。Ｂ７−１は、Ｂ７−２よりも強くＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８のどちらにも結合する。しかしながら、相対的な相互作用を直接比較した場合には、Ｂ７−１は、ＣＤ２８と比較して、ＣＴＬＡ−４への結合作用が２０倍強いが、Ｂ７−２は、ＣＤ２８と比較して、ＣＴＬＡ−４への結合作用がわずか約８倍強いだけである。上記の知見を考慮すると、免疫抑制剤としてのセルロマイシンＡの強力な役割は、Ｔ細胞のＣＴＬＡ−４の発現およびＡＰＣのＢ７−１の発現を増大するメカニズムによるものと考察される。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【００８０】
実施例１：セルロマイシンＡは、リンパ球の免疫抑制を誘導する
［セルロマイシンＡは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の免疫抑制を誘導する］
４×１０５個のＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（反応細胞）および４×１０５個のγ線照射（３０００Ｒ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ脾細胞（刺激細胞）をＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％培地２００μｌ中に含有する各ウェルと、様々な濃度のセルロマイシンＡ（１〜０.０１２５μｇ／ｍｌ）、シクロスポリンＡ（０.０１２５〜１０μｇ／ｍｌ）とを使用して、９６ウェル組織培養プレートでＭＬＲを行った。培地単体にＢＡＬＢ／ｃ脾細胞のみ、γ線照射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ脾細胞のみ、およびＢＡＬＢ／ｃ脾細胞＋γ線照射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ脾細胞のみを含む対照培養物も用意した。４日後、培養物を［３Ｈ］−チミジン１μＣｉでパルスし、１６時間後にスカトロン（Skatron）セルハーベスターを用いて回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント／分（ｃｐｍ）として示した。
【００８１】
セルロマイシンＡは、ＭＬＲ反応を大幅に低減させた。セルロマイシンＡは、ＭＬＲ反応の抑制に関してシクロスポリンＡよりも１０倍強力であった。細胞のみを含有する対照培養物や、セルロマイシンＡの存在下で培養された細胞を含有する対照培養物（ＣｏｎＡ、ＬＰＳ、抗ＣＤ３抗体またはＡＰＣのいずれかを含まず）では、有意なレベルの［３Ｈ］−チミジン取り込みは観察されなかった。すべてのアッセイにおいて、セルロマイシンＡは用量依存的に作用した。
【００８２】
［セルロマイシンＡは、Ｔ細胞およびＢ細胞マイトジェンで刺激されたリンパ球の免疫抑制を誘導する］
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞をＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％培地２００μｌ中で培養し（５×１０４細胞／ウェル）、異なる濃度のＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ，２μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ，１０μｇ／ｍｌ）、およびセルロマイシンＡ（０.０００３〜０.１μｇ／ｍｌ）で刺激した。脾細胞からなる対照培養物を培地、ＣｏｎＡおよびＤＭＳＯのみと共にインキュベートした。４８時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン０.５μＣｉでパルスし、１４時間後に自動セルハーベスター（スカトロン社，ノルウェイ，トランビー）を用いて回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント／分（ｃｐｍ）として示した。
【００８３】
ＣｏｎＡのみと共に培養した細胞と比較して、セルロマイシンＡは、ＣｏｎＡ（１.０，２.０μｇ／ｍｌ）刺激細胞の増殖の有意に減少させた。本発明者は、ＬＰＳ（５，１０μｇ／ｍｌ）でもまた脾細胞を刺激した。興味深いことに、セルロマイシンＡは、ＬＰＳ（５，１０μｇ／ｍｌ）で刺激された細胞の増殖も抑制することができた。その用量（０.０５，０.１μｇ／ｍｌ）のセルロマイシンＡは増殖を強力に抑制することが観察された。
【００８４】
［セルロマイシンＡは、抗原感作動物から得たＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫抑制を誘導する］
ＯＶＡ−ＣＦＡ感作マウスから、マウス脾細胞の単細胞浮遊液を得た。溶血性ゲイ溶液で処理して赤血球を除去した。７％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２時間プラスチック製のペトリ皿にプレーティングして付着細胞を除去した。非付着細胞をナイロンウールカラムに充填し（１×１０６細胞／ｍｌ）、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション時間後、温かいＲＰＭＩ培地をカラムに通し、Ｔリンパ球を溶出した。Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄し、抗Ｍａｃ３抗体（ＴＩＢ−１６８）、抗ＩＡｄ抗体（ＭＫＤ６）、抗樹状細胞抗体（ＴＩＢ−２２７）、抗ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ８抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄し、仔ウサギ補体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、増殖アッセイに使用した。抗ＣＤ３抗体およびＣＤ４抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーによって細胞の純度を分析した。
【００８５】
ＯＶＡ−ＦＣＡ注射マウスからＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、抗原パルスおよびγ線照射脾細胞で刺激した。抗原刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、培養液中にセルロマイシンＡを添加することによって、増殖が有意に抑制された。
【００８６】
［セルロマイシンＡは、Ｔｈ２細胞の免疫抑制を誘導する］
抗原パルス脾細胞で刺激して７〜９日後に回収された細胞を使用して、Ｔｈ２クローンの増殖を測定した。死細胞をフィコール−ヒストパックによって除去した。Ｔｈ２クローン（５×１０４細胞／ウェル）を様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.００６２５〜０．１μｇ／ｍｌ）存在下で、抗ＣＤ３抗体（０.１μｇ／ｍｌ，０.５μｇ／ｍｌ）で刺激するか、またはＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％培地２００μｌ中においてγ線照射（３０００Ｒ）同系脾細胞（５×１０５細胞／ウェル）、コンアルブミン（１００μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。コンアルブミンのみと共にインキュベートされたＴｈ２細胞からなる対照培養物、およびγ線照射同系脾細胞（抗原なし）と共にインキュベートされたＴｈ２細胞からなる対照培養物も用意した。培養物を平底９６ウェルマイクロタイタープレートに入れ、７％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞をインキュベートした。４８時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン０.５μＣｉでパルスし、１６時間後に回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント／分（ｃｐｍ）として示した。
【００８７】
抗ＣＤ３抗体またはコンアルブミンのパルス刺激、γ線照射脾細胞のいずれかで刺激されたＴｈ２細胞の培養物中に、セルロマイシンＡを添加した。マイトジェン刺激リンパ球および抗原特異的Ｔ細胞で観察されたように、セルロマイシンＡは、どちらの刺激条件においてもＴｈ２クローンの増殖を実質的に制限した。
【００８８】
［セルロマイシンＡは、Ｔｈ１細胞の免疫抑制を誘導する］
Ｔｈ１細胞（１×１０４細胞／ウェル）を抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）および異なる用量のセルロマイシンＡで刺激した。２４時間後、［３Ｈ］−チミジンを添加し、その取り込みを８時間後に測定した。
【００８９】
セルロマイシンＡは、Ｔｈ１細胞（３ＤＯ.５４.８）の増殖も抑制した。この特徴は、Ｔｈ１細胞が抗ＣＤ３抗体で刺激されているかどうかにかかわらず認められた。
【００９０】
［セルロマイシンＡは、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの産生を抑制する］
ＯＶＡ（２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（０.０１Ｍ，ｐＨ７.２）に溶解し、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で乳化させた。次いで、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる群においてエマルジョン（１００μｌ）を腹腔内に注射した。対照群にはＰＢＳのみを注射した。７日後、マウスを屠殺し、脾細胞をプールし、増殖アッセイおよびサイトカインアッセイに使用した。脾細胞（５×１０５細胞／ウェル）をＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％培地２００μｌ中のＯＶＡ（２００μｇ／ｍｌ）、および様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.０００３〜０．１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。異なる濃度のセルロマイシンＡ（ＯＶＡなし）と共にインキュベートされた脾細胞からなる対照培養物、ＯＶＡおよび培地からなる対照培養物も用意した。その培養上清を４８時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによってサイトカインを測定した。
【００９１】
セルロマイシンＡ（０.０５〜０.１μｇ／ｍｌ）が、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を有意に抑制することが確認された。セルロマイシンＡは、ＩＬ−１０の産生の変化を誘導しなかった。セルロマイシンＡは、抗ＣＤ３抗体（０.１μｇ／ｍｌ，０.５μｇ／ｍｌ）またはコンアルブミンでパルス刺激されたＡＰＣのいずれかで刺激されたＤ１０Ｇ４.１Ｔｈ２クローンによるＩＬ−４の放出を抑制したことも興味深い。
【００９２】
［セルロマイシンＡは、抗原特異的Ｔ細胞の生体内（in vivo）での増殖を抑制する］
ＯＶＡ（２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（０.０１Ｍ，ｐＨ７.２）に溶解し、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で乳化させた。次いで、それぞれ５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる７つの群において、エマルジョン（１００μｌ）を腹腔内（ｉ.ｐ.）に注射した。４つの動物群において、セルロマイシンＡ（２５，５０，７５，１００μｇ／１００μｌ／マウス）を腹腔内に毎日注射した。ＰＢＳおよびエタノール−ＰＢＳをそれぞれ１００μｌ腹腔内注射して、対照群を免疫した。７日後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離し、生体外（in vitro）での増殖のためにプールした。
【００９３】
注射された抗原感作動物から細胞を単離した。セルロマイシンＡは、薬物が投与されていない動物と比較して、顕著な増殖の抑制を示した。
【００９４】
実施例２：Ｔｈ２クローンの増殖に対するセルロマイシンＡの効果の速度論
Ｔｈ２クローン（５×１０４細胞／ウェル）を抗ＣＤ３抗体（０.５μｇ／ｍｌ）で刺激した。培養の開始時（時間０）または様々な時点（４〜４８時間）でセルロマイシンＡ（０.０５μｇ／ｍｌ）を添加した。培養から４８時間後に、［３Ｈ］−チミジンを添加し、その取り込みを１２時間後に測定した。
【００９５】
セルロマイシンＡは、培養開始の１６時間前に添加した場合には、Ｔｈ２細胞に対して最大の抑制（７７〜９０％）作用を示した。セルロマイシンＡの抑制作用は、４２時間後に添加した場合でさえ培養液物中に観察された（５６％）。しかしながら、その応答は、１６時間前に薬物を添加した場合と比較して低かった。このことは、セルロマイシンＡは、活性化現象に対してだけでなく、細胞分裂の後期に対しても、その抑制作用を及ぼすことを示している。
【００９６】
実施例３：カルシウム依存性（ＰＭＡ＋イオノマイシン）経路に対するセルロマイシンＡの作用
平底９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで細胞を播種した。培養の開始時に様々な刺激およびセルロマイシンＡを加えた。４８時間後、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を添加し、その取り込みを１２時間後に測定した。セルロマイシンＡは、カルシウム依存性経路による増殖を有意に抑制することが確認された。
【００９７】
実施例４：セルロマイシンＡは、ＣＴＬＡ−４発現のアップレギュレーションおよびＣＤ２８発現のダウンレギュレーションを誘導する
休止ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣｏｎＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞表面のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４発現の発現をフローサイトメトリー分析によって検出した。簡潔には、脾細胞（３×１０６細胞／ウェル）をＯＶＡ（２００μｇ／ｍｌ）またはＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ，２μｇ／ｍｌ）で活性化し、異なる濃度のセルロマイシンＡ（０.０１２５〜０.４５μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。２４、４８、７２および９６時間後に培養物を回収し、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の発現を見るために細胞を染色した。さらに、培養液をセットし、培養を開始して２４および４８時間後にセルロマイシンＡを添加し、さらに２４時間インキュベートした後、細胞を染色した。細胞を回収し、ＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＣＤ４抗体、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識抗ＣＴＬＡ−４抗体、およびＣｙ（Ｃｙ−クロム）標識抗ＣＤ２８抗体を使用して、３色染色を行った。各浮遊液中からの細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社、カリフォルニア州マウンテンビュー）のＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェアで取得された。細胞浮遊液中のデブリスは、リンパ球と一致するサイズの光散乱現象（すなわち細胞）からのみデータを収集することができる適切なゲーティングによって分析から除外した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の分析をヒストグラムで行った。横座標および縦座標は、それぞれｌｏｇ蛍光強度および相対細胞数を示す。
【００９８】
本発明者は、セルロマイシンＡが免疫抑制を仲介することを確認したことから、その作用メカニズムを調べることが必要となった。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞に免疫抑制シグナルを送り、ＣＤ２８は、増殖のための刺激シグナルを送ることはよく知られている。したがって、本発明者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の発現をモニターすることに興味が湧いた。セルロマイシンＡがＣＴＬＡ−４の発現だけでなく、ＣＴＬＡ−４陽性細胞の割合も有意に高めたことは興味深いことであった。それと対照的に、セルロマイシンＡは、ＣＤ２８の発現およびＣＤ２８陽性細胞の割合を低減した。同様な結果が、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞の場合にも認められた。このことは、セルロマイシンＡは、ＣＴＬＡ−４の発現を高め、かつＣＤ２８の発現を抑制することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞による増殖およびサイトカイン分泌を抑制することを示している。さらに、セルロマイシンＡは、ＬＦＡ−Ｉの発現またはＬＦＡ−Ｉ陽性細胞の割合の有意な変化を示さないことが確認された。
【００９９】
実施例５：マウス胸腺細胞におけるＣＤ６９の発現
セルロマイシンＡの存在下にて、胸腺細胞表面のＣＤ６９の発現を検出した。胸腺細胞は、３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから得た。セルロマイシンＡの存在下、非存在下で３７℃にて２４時間、胸腺細胞（４×１０６細胞／ウェル）をＣｏｎＡ １μｇ／ｍｌ，５μｇ／ｍｌで刺激した。ＰＥ標識抗マウスＣＤ６９抗体で細胞を染色した。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の場合に述べたように、染色細胞をＦＡＣＳｃａｎで取得した。
【０１００】
ＣＤ６９は、Ｔ細胞および胸腺細胞の活性化マーカーであることは公知である。興味深いことに、セルロマイシンＡを添加した後、胸腺細胞上のＣＤ６９の発現に変化はなかった。
【０１０１】
実施例６：セルロマイシンＡは、マクロファージの補助刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の発現を調節する
異なる濃度のセルロマイシンＡ（０.０５〜０.１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされた腹腔マクロファージ表面のＢ７−１およびＢ７−２の発現を検出した。４日前に２〜３ｍｌのチオグリコレートを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスから、腹腔マクロファージを採取した。細胞をＢＳＳで洗浄した。プラスチック製ペトリ皿上に３７℃で１時間付着させ、続いて冷たいＢＳＳで数回洗浄することによって、マクロファージを得た。セルロマイシンＡ（０.０５〜０.ｌμｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下にて、７％ＣＯ２雰囲気下３７℃で２４、４８および７２時間、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌでマクロファージ（１×１０６）を刺激した。次いで、細胞を回収し、各抗体で染色した。簡潔には、細胞を遠心分離し（１２００×ｇ，４℃，５分）、上清を吸引した。１％ＢＳＡ、０.１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄した。最初の段階において、ビオチン標識の抗マウスＢ７−１抗体、抗ＣＤ４０抗体および抗Ｉ−Ａｄ抗体（１μｇ／１００μｌ）と共に細胞（１×１０６）を４℃で４５分間インキュベートした。次の段階では、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（０.５μｇ／１００μｌ）またはＰＥ標識抗マウスＢ７−２抗体（０.５μｇ／１００μｌ）で細胞を染色し、４５分間インキュベートした。通常の洗浄段階を各段階で行った。最後に、細胞を５回洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４に関して述べたように、染色細胞をＦＡＣＳｃａｎで取得した。抗原提示細胞は、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８のリガンドであるＢ７−１およびＢ７−２を発現する。興味深いことに、セルロマイシンＡは、Ｂ７−１の発現を高め、Ｂ７−２分子の発現を低減した。それと対照的にＪ７７４においては、セルロマイシンＡは、Ｂ７−２の発現を増加させたが、Ｂ７−１発現については主な変化は認められなかった。本発明者は、他の補助刺激分子ＣＤ４０の発現に対するセルロマイシンＡの役割も評価した。ＣＤ４０の発現のわずかな増加が７２時間後に確認された。
【０１０２】
実施例７：セルロマイシンＡは、マクロファージのＩＡｄの発現をダウンレギュレートする
異なる濃度のセルロマイシンＡ（０.０５〜０.１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされた腹腔マクロファージ表面のＩＡｄの発現を検出した。４日前に２〜３ｍｌのチオグリコレートを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスから、腹腔マクロファージを採取した。細胞をＢＳＳで洗浄した。プラスチック製ペトリ皿上に３７℃で１時間付着させ、続いて冷たいＢＳＳで数回洗浄することによって、マクロファージを得た。セルロマイシンＡ（０.０５〜０.１μｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下にて、７％ＣＯ２雰囲気下３７℃で２４、４８、７２時間、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌでマクロファージ（１×１０６）を刺激した。次いで、細胞を回収し、各抗体で染色した。
【０１０３】
簡潔には、細胞を遠心分離し（１２００×ｇ，４℃，５分）、上清を吸引した。１％ＢＳＡ、０.１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄した。最初の段階において、ビオチン標識抗マウスＩ−Ａｄ抗体（１μｇ／１００μｌ）と共に細胞（１×１０６）を４℃で４５分間インキュベートした。次の段階では、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（０.５μｇ／１００μｌ）で細胞を染色し、４５分間インキュベートした。通常の洗浄段階を各段階で行った。最後に、細胞を５回洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４に関して述べたように、染色細胞をＦＡＣＳｃａｎで取得した。セルロマイシンＡがＩＡｄの発現をダウンレギュレートしたことは興味深いことである。このことは、セルロマイシンＡがＡＰＣによるプロセシングおよび抗原提示を抑制し得ることを示している。
【０１０４】
実施例８：生体内（in vivo）増殖のための免疫方法
オボアルブミン（３ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（ｐＨ７.２）に溶解し、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）中で乳化させた。次いで、それぞれ５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる各群の腹腔内（ｉ.ｐ.）にエマルジョン（１００μｌ）を注射した。４つの動物群にセルロマイシンＡ（２５、５０、７５、１００μｇ／１００μｌ／マウス）を腹腔内に毎日注射した。エタノール−ＰＢＳを腹腔内注射して対照群を免疫した。
【０１０５】
実施例９：ＯＶＡ誘導リンパ球増殖およびサイトカインの推定
７日後、マウスを屠殺し、脾細胞をプールし、増殖アッセイに使用した。ＯＶＡ（１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌのＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％培地中で、様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.１〜０.０００３μｇ／ｍｌ）と共に脾細胞（２×１０５細胞／ウェル）を培養した。様々な濃度のセルロマイシンＡ（ＯＶＡなし）と共にインキュベートされた脾細胞からなる対照培養物、ならびにＯＶＡおよび培地と共にインキュベートされた脾細胞からなる対照培養物も用意した。７２時間後、培養液を［３Ｈ］−チミジン１μＣｉでパルスし、１４時間後に回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント／分（ｃｐｍ）として示した。
【０１０６】
実施例１０：セルロマイシンＡは、抗原特異的Ｔ細胞の生体内（in vivo）での増殖を抑制する
様々な用量のセルロマイシンＡをマウスに７日間投与した（図１.１）。動物を屠殺し、抗原および様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.００６２５〜０.１０μｇ／ｍｌ）と共に生体外（in vitro）で脾細胞を培養した。興味深いことに、４通りすべての濃度のセルロマイシンＡ（２５〜１００μｇ／マウス／日）を注射した動物から単離された細胞は、薬物を投与していない動物と比較して、増殖を顕著に抑制した。増殖の減少は、用量依存的な様式で確認された。０.１０μｇ／ｍｌのセルロマイシンＡと共に細胞をインキュベートした場合に、ほぼ完全な抑制が認められた。他のセットの実験において、抗原で感作された後、ＰＢＳ−エタノールまたはセルロマイシンＡ（２５μｇ／マウス／日）のいずれかを７日間投与された動物から、細胞を単離した（図１.２）。セルロマイシンＡを注射したマウスから単離された細胞は、ＰＢＳ−エタノールで免疫化した動物から単離された細胞と比較して、有意なレベルの増殖の遅延を示した（図１.２）。
【０１０７】
図：セルロマイシンＡは、生体内（in vivo）でＯＶＡ特異的Ｔ細胞の増殖を抑制する
それぞれ動物５匹を含む別々の群をＯＶＡで免疫し、マウスを屠殺する前に７日間セルロマイシンＡを投与した。脾細胞（２×１０５細胞／ウェル）を単離し、生体外（in vitro）でＯＶＡ１００μｇ／ｍｌおよび様々な用量のセルロマイシンＡと共に培養した。７２時間後、［３Ｈ］−チミジンを添加し、その取り込みを１６時間後に測定した。培地のみで培養された細胞からなる対照培養物は、３７８９±３５９ｃｐｍを示し、細胞＋ＯＶＡは、１６３８７±４３１ｃｐｍを示し、ＰＢＳ−エタノールで免疫し、ＯＶＡと共に生体外で培養した動物から得られた細胞は、１３８０１±５８７ｃｐｍを示した（１.１）。他のセットの実験では、３つの別々の群をＯＶＡで免疫し、続いて、マウスを屠殺する前に、群の１つでセルロマイシンＡ（２５μｇ／マウス）を、もう１つの群でアルコール（賦形剤対照）を毎日７日間投与した。脾細胞（２×１０５細胞／ウェル）を単離し、単独で、またはＯＶＡ１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌと共に生体外で培養した（１.２）。各ポイントは、３つの代表実験のうちの１つから、３回繰り返した測定の平均±標準誤差に相当する。
【０１０８】
実施例１１：セルロマイシンＡの発酵による調製
Ａ．接種材料の調整
試験管内の培地５ｍｌに接種して種培養物を調製する。培地の組成は、１リットルの蒸留水に対して、グルコース５.４ｇ、酵母抽出物４.８ｇ、麦芽エキス８.５ｇ、ＣａＣＯ３３.０ｇである。ｐＨを７.２に調整した培養液を滅菌し、冷却した後、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス（Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.）の凍結培養物を添加する。２００ｒｐｍで回転攪拌しながら、２８℃で３０時間、細菌を培養する。容量１０００ｍｌの振盪フラスコ内の無菌培地１００ｍｌに上記の培養物７.５ｍｌを無菌接種する。無菌培地の組成は、１リットルの蒸留水に対して、グルコース５.４ｇ、酵母抽出物４.８ｇ、麦芽エキス８.５ｇ、ＣａＣＯ３３.０ｇである。アルカリ溶液でｐＨを７.０に調整する。２００ｒｐｍでオービタル攪拌しながら、２８℃で３０時間、細菌を培養する。
【０１０９】
Ｂ．発酵
５リットルの産生培地を含む発酵槽（容量７リットル）を１２２℃で３０分間滅菌する。産生培地の組成は、１リットルの蒸留水に対して、グルコース５.４ｇ、酵母抽出物４.８ｇ、麦芽エキス８.５ｇ、ＣａＣＯ３３.０ｇである。発酵槽に第二期接種材料５００ｍｌを接種する。２２０ｒｐｍで攪拌し、１ｖｖｍで通気しながら、発酵培養物を２８℃でインキュベートする。
【０１１０】
Ｃ．単離
培養が終了した後、遠心分離によって固形分を除去する。上清部分（４.８リットル）を酢酸エチル２.５リットルで２回抽出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下にて乾燥状態まで濃縮する。水：メタノール（１：１）８０ｍｌに粗残渣を溶解し、ヘキサン５０ｍｌで２回分配することによって脱脂した。酢酸エチル５０ｍｌで水／アルコール画分を２回抽出する。蒸発器で有機溶媒を蒸発させ、セルロマイシンＡを含有する粗残渣が得られる。
【０１１１】
実施例１２：粗抽出物からのセルロマイシンＡの分離
アセトン５ｍｌに粗残渣を溶解し、溶出溶媒としてトルエン／アセトン（７５：２５）の混合物を使用して、高性能フラッシュクロマトグラフィーシステム（Horizon HPFC system，米国バイオタージ社）によってシリカゲル（３２〜６３μＭ）上でクロマトグラフを行う。移動相としてクロロホルム／メタノール／２０％アンモニア水（９５：４：１）を使用したＴＬＣ分析に基づいて、同様な画分を合わせる。
【０１１２】
実施例１３：免疫抑制の誘導におけるセルロマイシンＡ［アクチノアロテイチャス属の新種から単離された］の役割は以下に基づく：
・ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞をＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ，２μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ，１０μｇ／ｍｌ）で刺激し、様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.０００３〜０.１μｇ／ｍｌ）と共に培養した。４８時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン０.５μＣｉでパルスし、１４時間後に自動セルハーベスターによって回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定した。
【０１１３】
・フロイント完全アジュバント中で乳化された抗原オボアルブミン（１００μｇ／ｍｌ）を５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる群に注射した。対照群には、ＰＢＳのみを注射した。７日後、マウスを屠殺し、脾細胞をプールし、増殖アッセイおよびサイトカインアッセイに使用した。オボアルブミン（２００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％培地２００μｌ中で、様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.０００３〜０.１μｇ／ｍｌ）と共に脾細胞を培養した。７２時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン１μＣｉでパルスし、１４時間後に回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーションによって測定した。培養上清を４８時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによってサイトカインを測定した。
【０１１４】
・様々な用量のセルロマイシンＡの免疫抑制効果をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ２クローンおよびＴｈ１ハイブリドーマでモニターした。γ線（３０００ラド）を照射し、かつ抗原でパルス刺激した脾細胞および様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.００６２５〜０.１μｇ／ｍｌ）と共に細胞をインキュベートした。７％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養物をインキュベートした。７２時間後、培養物を［３Ｈ］−チミジン０.５μＣｉでパルスし、１４時間後に回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーションによって測定した。
【０１１５】
・ＭＬＲ反応におけるセルロマイシンＡの免疫抑制作用。ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（反応細胞）およびγ線照射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ脾細胞（刺激細胞）を様々な濃度のセルロマイシンＡ（０.０１２５〜１μｇ／ｍｌ）、およびポジティブコントロールとしてのシクロスポリンＡ（０.０１２５〜１０μｇ／ｍｌ）と共に使用してＭＬＲを行った。４日後、培養物を［３Ｈ］−チミジン１μＣｉでパルスし、１６時間後に回収し、取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定した。
【０１１６】
・Ｔ細胞の増殖に対するセルロマイシンＡの生体内（in vivo）での免疫抑制効果。オボアルブミンをフロイント完全アジュバント中で乳化させ、異なる動物群（マウス５匹／群）に腹腔内注射した。抗原感作動物の異なる群にセルロマイシンＡ（２５、５０、７５、１００μｇ／１００μｌ／マウス）を毎日注射した。７日後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離し、生体外（in vitro）での増殖のためにプールした。
【０１１７】
・セルロマイシンＡは、Ｔ細胞においてＣＴＬＡ−４の発現をアップレギュレートし、かつＣＤ２８の発現を抑制することによって免疫抑制を誘導する。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の発現は、休止ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣｏｎＡ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でフローサイトメトリーによって検出された。脾細胞を抗原（ＯＶＡ）またはマイトジェン（ＣｏｎＡ）のいずれかで活性化し、セルロマイシンＡ（０.０１２５〜０.４５μｇ／ｍｌ）と共に種々の時間（２４、４８、７２および９６時間）インキュベートした。２４、４８、７２および９６時間後に培養物を回収し、ＰＥ（フィコエリトリン）標識抗ＣＤ４抗体、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオチアネート）標識抗ＣＴＬＡ−４抗体およびＣｙ（ｃｙ−クロム）標識抗ＣＤ２８抗体を使用して、３色染色によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の発現を評価した。
【０１１８】
・同様に、腹腔マクロファージにおけるＢ７−１、Ｂ７−２およびＩ−Ａｄの発現も、Ｎｏ.６に記載のようにフローサイトメトリーによってモニターした。
【０１１９】
一般式１の化合物セルロマイシン、その誘導体およびその薬学的に許容される塩は、免疫抑制剤として有効である。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明の主な利点は以下のとおりである：
（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫応答の開始および調節において重要な役割を果たすことから、その活性化の抑制によって、免疫抑制療法の強力なアプローチが得られる。これは、他の多くの免疫抑制薬および自己免疫の治療の場合における記録が非常に良く残されている（Galvin et al. 1993, Thomson 1991, Crespo-Leiro2003）。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞の役割は、多くの自己免疫疾患について非常に良く記録が残されている（Abbas et al. 2004, Wraith et al. 2004）。セルロマイシンＡは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞および抗原特異的エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞による増殖およびサイトカイン（ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ）分泌を抑制することから、自己免疫疾患に対するかなり有望な薬物であろう。さらに、セルロマイシンＡは、Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４の発現を有意に増加し、続いて、ＣＤ２８の発現をダウンレギュレートした。本発明者は、ＣＴＬＡ−４を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が増加し、かつＣＤ２８陽性細胞の数が減少することも見出した。同様な結果が、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞でも確認された。リンパ球応答が、ＣＴＬＡ−４仲介抑制シグナルによって抑制されるという概念の理解が高まっている（Krummel et al. 1996, Leibson 2004）。
【０１２１】
（ii）同種ＭＨＣ分子の認識は、臓器移植の生着の主な障害である。したがって、非自己認識の抑制によって、慢性拒絶反応の発生率および重症度が低下し、移植臓器の長期にわたる生着が得られる。本発明者は、セルロマイシンＡによるＭＬＲにおける用量依存的抑制を確認し、それは、確立された免疫抑制薬であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）よりも１０倍強力であった。本発明者は、セルロマイシンＡがＭＨＣ分子の発現も抑制することを確認した。高レベルの同種ＭＨＣは、臓器移植の生着の主な障害である。したがって、ＭＨＣ分子発現の減少によって、移植片に受容のより良い機会が与えられる。このように、セルロマイシンＡは、移植に有効に利用しうることが示されている。さらに、ＣｓＡの使用で報告されている癌の高発生率のために（Roviraetal. 2000）、セルロマイシンＡはシクロスポリンＡを超える利点を有する。
【０１２２】
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】実施例１０の結果を示すグラフ
【図１】
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【国際調査報告】
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