(57)【要約】  好熱性微生物は乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さず、好ましくは、活性なピルビン酸ギ酸リアーゼ経路を含有する。好熱性微生物は、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有する。ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化型である。ＤＮＡ構築物は、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の好熱性微生物における安定な発現を可能にする。ＤＮＡ構築物は、安定な発現、又は、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の中に挿入するための組換えを達成するための挿入配列の使用に基づいており、従って、遺伝子ノックアウト及び新しい機能性を一段階で達成する。微生物は、エタノールを製造するための糖の発酵において有用である。
2009529905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない、好熱性微生物。
【請求項２】
ピルビン酸ギ酸リアーゼを発現する、請求項１に記載の好熱性微生物。
【請求項３】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が好熱性微生物のゲノムに組み込まれる、請求項１または２に記載の好熱性微生物。
【請求項４】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子がそれ自体のプロモーターから発現されるか、又は、好熱性微生物のプロモーターから発現される、請求項１から３のいずれか一項に記載の好熱性微生物。
【請求項５】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が好熱性微生物の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の中に挿入され、これにより、前記好熱性微生物の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を不活性化する、請求項１から４のいずれか一項に記載の好熱性微生物。
【請求項６】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載の好熱性微生物。
【請求項７】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が、配列番号１又は配列番号２として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のいずれかに記載の好熱性微生物。
【請求項８】
配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含む熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に機能的に連結された調節配列を含むＤＮＡ構築物により形質転換されている、請求項１から７のいずれかに記載の好熱性微生物。
【請求項９】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、挿入配列とを含むＤＮＡ構築物により形質転換され、前記挿入配列が、前記ＤＮＡ構築物により形質転換された好熱性微生物のゲノムへの、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子の組み込みを容易にする、請求項１から７のいずれか一項に記載の好熱性微生物。
【請求項１０】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流領域に機能的に連結された、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ構築物により形質転換され、前記上流領域がプロモーターを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の好熱性微生物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ構築物が、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子の下流側に乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部をさらに含むものであり、これにより、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子の両側が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の十分な部分の間に挿入され、その結果ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が、好熱性微生物のゲノムにおいて乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との組み換えにより組み込まれることが容易となる、請求項１０に記載の好熱性微生物。
【請求項１２】
好熱性細菌である、請求項１から１１のいずれかに記載の好熱性微生物。
【請求項１３】
バチルス（Bacillus）属である、請求項１２に記載の好熱性微生物。
【請求項１４】
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）又はゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）である、請求項１３に記載の好熱性微生物。
【請求項１５】
前記バチルス・ステアロサーモフィルスがＬＬＤ−Ｒ又はＬＬＤ−１５の菌株に由来する、請求項１４に記載の好熱性微生物。
【請求項１６】
配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含む、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
【請求項１７】
配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含む、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に機能的に連結された調節配列を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項１８】
前記調節配列がプロモーターである、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
前記プロモーターが、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、挿入配列とを含むＤＮＡ構築物であって、前記挿入配列が、前記ＤＮＡ構築物により形質転換された好熱性微生物のゲノムへの、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子の組み込みを容易にする、ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
前記挿入配列がバチルス・ステアロサーモフィルスの菌株ＬＬＤ−Ｒ又は菌株ＬＬＤ−１５に由来する、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
前記挿入配列が、配列番号５として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
前記挿入配列が、配列番号６及び配列番号７として示されるヌクレオチド配列を含むプライマーと、テンプレートとしてのバチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−１５とを使用する増幅によって作製される、請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流領域に機能的に連結された、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ構築物であって、前記上流領域がプロモーターを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ構築物が、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子の下流側に乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部をさらに含むものであり、これにより、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子の両側が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の十分な部分の間に挿入され、その結果ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が、好熱性微生物のゲノムにおいて乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との組み換えにより組み込まれることが容易となる、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である、請求項１７から２５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする前記遺伝子が、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
発現ベクターである、請求項１７から２７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
プラスミドである、請求項１７から２８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
請求項１７から２９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、微生物。
【請求項３１】
好熱性細菌である、請求項３０に記載の微生物。
【請求項３２】
バチルス（Bacillus）属である、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３３】
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）又はゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）である、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３４】
エタノールを製造するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の好熱性微生物、又は請求項３０から３３のいずれか一項に記載の微生物の使用。
【請求項３５】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の好熱性微生物、又は請求項３０から３３のいずれか一項に記載の微生物に糖を与えることを含む、エタノールを製造するための発酵プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法及びそれに使用される微生物に関し、具体的には、微生物によるエタノール製造の強化に関する。より詳細には、本発明は、バイオマスの加水分解に由来する混合糖からの好熱性細菌（例えば、バチルス（Bacillus）属など）による強化されたエタノール製造に関する。具体的には、本発明では、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を、ピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素複合体をコードする機能的な遺伝子を有するが乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない微生物にクローン化することによるエタノール製造のための新規な経路が想定される。
【背景技術】
【０００２】
バイオエタノールは現在、穀類デンプン、サトウキビ又はテンサイに由来するグルコース、マルトース又はスクロースから作製され、しかし、これらはすべてが食料としての価値を有する。セルロース及びヘミセルロースは農業副産物の大きな部分であり、特に、低コストで、再生可能なバイオエタノールの主要な供給源となり得る。しかしながら、発酵可能な糖をセルロースから得ることは困難であり、また、費用がかかる。それに反して、ヘミセルロースはセルロースとほぼ同じくらい豊富に存在し、また、容易に加水分解することができ、しかし、酵母が発酵することができないペントース糖を主とする混合物をもたらす。
【０００３】
この理由のために、Ｈａｒｔｌｅｙ（国際特許出願公開第ＷＯ８８／０９３７９号を参照のこと）は、バイオマスに由来する糖のすべてを７０℃までの温度で非常に迅速に発酵する好熱性バチルス属細菌の変異体によるエタノールの製造を提案した。しかしながら、高いエタノール収率は、ストレスを受けた瀕死の細胞によってのみ達成されるだけである。
【０００４】
多くの微生物が、ピルビン酸をアセチルＣｏＡ及びギ酸に変換するピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）経路を含有する（図１Ａ）。ヘテロ乳酸（heterolactate）発酵微生物が１つのそのような部類である。これらの微生物は最初に、流入した糖を（一般には解糖のＥＭＰ経路によって）ピルビン酸に変換し、その後、微生物は、増殖条件に依存して、乳酸、ギ酸、酢酸、エタノール及びＣＯ２を様々な割合で製造するために多くの経路を取ることができる。
【０００５】
完全に好気性の細胞において、そのようなピルビン酸は、通常の場合、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）経路、トリカルボン酸サイクル及び電子移動鎖によってＨ２Ｏ及びＣＯ２に代謝される。しかしながら、これらの生物の多くにおいて、特に、好熱性のバチルス属細菌では、糖の取り込み及び解糖が調節されないようであり、乳酸が、好気的条件下でさえ、高い糖濃度では優勢な産物である。このことは、ＰＤＨ流束がその後、飽和してしまうこと、及び、過剰なピルビン酸が、あふれる乳酸デヒドロゲナーゼ経路に向けられることを示唆する。これは増殖のために使用されないで、新鮮な草が堆肥の山に置かれるときに見られ得るように、周囲温度を上昇させ、好中温性の競合菌を殺す熱をもたらす。
【０００６】
ｌｄｈ遺伝子（これは乳酸デヒドロゲナーゼをコードする）が、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０２／２９０３０号に記載されるように不活性化されるならば、乳酸の製造が止まり、過剰なピルビン酸は大部分が、増殖に結び付けられるＰＦＬ経路に向けられる（図１Ａ）。しかしながら、非常に高い糖濃度及び／又は酸性ｐＨでは、ＰＦＬ経路の流束が低下し、過剰なピルビン酸が、その後、エタノール及びＣＯ２をもたらすだけである嫌気性のＰＤＨ経路にあふれる（図１Ｂ）。従って、高いエタノール収率を得るための好ましい条件は、ＰＦＬ経路を流れる流束を減少させ、ＰＤＨ経路を介する流束を増大させる条件である（Hartley, B. S. and Shama, G.、Proc. Roy. Soc. Lond.、321、555〜568 (1987)）。残念ながら、そのような条件の下では、細胞は代謝ストレスを受け、ＡＴＰ製造が低下し、また、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比及びＣｏＡ／アセチルＣｏＡ比のバランスが崩れる可能性がある（図１Ｃ）。
【０００７】
様々な発酵プロトコルが、この問題を回避するか、又は、最小限に抑えることを試みるために提案されている（例えば、上記で議論されるようなＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．のプロトコル（国際特許出願公開第ＷＯ８８／０９３７９号を参照のこと）など）。
【０００８】
２種類のギ酸デヒドロゲナーゼが存在する。１つ（これはｆｄｈＦ遺伝子によってコードされる）はギ酸をＣＯ２＋Ｈ２に変換し、腸内細菌（例えば、大腸菌など）に典型的である。もう一方（これはｆｄｈ１遺伝子によってコードされる）はギ酸＋ＮＡＤをＣＯ２＋ＮＡＤＨ２に変換し、多くの発酵性嫌気性菌に存在する。Ｂｅｒｒｉｏｓ−Ｒｉｖｅｒａら（Metabolic Engineering、4、217-219、2002）は大腸菌におけるｆｄｈＦ遺伝子を酵母のｆｄｈ１遺伝子により置き換え、還元された嫌気性産物（例えば、エタノール、乳酸及びコハク酸など）が、酸化された産物（例えば、酢酸など）と比較して増大したことを見出した。この観測結果を基にして、Ｓａｎ，Ｋ−Ｙ．、Ｂｅｒｒｉｏｓ−Ｒｉｖｅｒｓ，Ｓ．Ｊ．及びＢｅｎｎｅｔｔ，Ｇ．Ｎ．（国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０４０６９０号を参照のこと）は、広範囲の生物転換に関与する細胞において還元力を増大させるための一般的な方法として、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入を提案した。続いて、Ｓａｎ，Ｋ−Ｙ．、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇ．Ｎ．及びＳａｎｃｈｅｚ，Ａ．（米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２７３６Ａ１号）は、この概念の具体的な適用をコハク酸の製造のために提案した。これらの研究は大腸菌（糖の取り込みが調節される好中温菌の一例）において行われた。これらの実験の目的は、細胞内のＮＡＤＨレベルを増大させ、その結果、強化された還元力を様々な生物転換のために提供するようにすることであった。
【０００９】
Ｓｅｎら（２００４）によって提示された酵母のギ酸デヒドロゲナーゼは、バイオエタノール製造において潜在的に有用である好熱性細菌のための最低増殖温度である６０℃において不活性である。これまでに記載された最も熱安定性のギ酸デヒドロゲナーゼは、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）１０１の酵素である（A. Rojkova、A. Galkin、L. Kulakova、A. Serov、P. Savitsky、V. Fedorchuk、V. Tishkov、FEBS Letters、Volume 445、Issue 1、183-188、1999）。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、バイオマスからの高収率のエタノールをもたらすという問題を解決しようとするものである。具体的には、好熱性微生物（特に、細菌、例えば、バチルス属など）が最大のエタノール収率をもたらすことを可能にする新規な代謝経路が本明細書中に初めて記載される。
【００１１】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さず、従って、解糖により生じた過剰なＮＡＤＨの再酸化のための代替経路を必要とする微生物に依存する。これは、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例えば、ｆｄｈ１遺伝子など）を前記微生物に導入することによって提供される。好熱性微生物において、また、好中温菌（例えば、大腸菌など）とは対照的に、糖の取り込みが調節されず、このことは高レベルの糖の存在下におけるＮＡＤＨの蓄積を引き起こす。このことは、図１Ｃに概略的に示されるように、代謝崩壊、及び、いわゆる「レドックス死」を最終的には引き起こす。ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を微生物が取り込むことは、高い糖濃度における細胞死を防止することを、ＮＡＤＨレベルにおける低下及びＮＡＤレベルにおける増大を引き起こすことによって助ける。このことは部分的には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）経路を流れる流束を回復することによるものであり、しかし、最も重要なことは、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むことにより、新規なピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）−ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）経路がエタノール製造のために作られる。図１Ｄは、高い糖レベルの存在下での迅速な解糖により生じたピルビン酸のすべてを、特に中性ｐＨ条件の下で、エタノール及びＣＯ２に転換することによって、このＰＦＬ−ＦＤＨ経路がレドックスバランスを回復させる可能性を示す。重要なことは、この経路が、細胞増殖のための最適条件下で働き、これにより、迅速なエタノール製造及び高い収率をもたらす。これは、ＰＦＬ経路が、好熱性微生物における主要な、増殖に結び付けられる嫌気性経路であるからである。
【００１２】
従って、第１の態様において、本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）活性を有さない微生物（具体的には、好熱性微生物）であって、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ（ｆｄｈ）をコードする遺伝子を含有することを特徴とする微生物（好ましくは、好熱性微生物）を提供する。
【００１３】
１つの実施形態において、微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を取り除く適切な遺伝子欠失又は他の変異によって乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない。従って、好ましくは、ｌｄｈ遺伝子が欠失されるか、又は、他の場合には非機能的にされる。遺伝子ノックアウト及び遺伝子欠失の方法が当分野では周知であり、好ましい例が本明細書中に詳しく記載される。その上、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない細菌の公知菌株（例えば、アクセション番号ＮＣＩＭＢ４１０７５で寄託されたＴＮ−Ｔ９、及び、アクセション番号ＮＣＩＭＢ４１１１５で寄託されたＴＮ−ＴＫなど）が、本発明における使用のために好適であり得る。
【００１４】
本発明の微生物は、典型的には、活性なピルビン酸ギ酸リアーゼ経路を含有する。具体的には、微生物は、好ましくは、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（例えば、ｐｆ１遺伝子など）を含む。本発明の微生物はまた、典型的には、活性なピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）経路を含有する。
【００１５】
好ましい実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が好熱性微生物のゲノムに組み込まれる。しかしながら、安定な発現が、例えば、好適なプラスミドの導入によって組み込みを伴うことなく達成されることもまた可能である。組み込みの１つの好ましい方法が、組換えによるものである。ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現を行わせるための任意の好適な調節エレメントに機能的に連結することができる。「機能的に連結される」とは、機能的な連結が、調節エレメントと、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子との間に存在することを意味する。例えば、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、例えば、構成的プロモーター又は誘導可能なプロモーターであり得る好適なプロモーターに連結することができる。「プロモーター」は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合することに関与するＤＮＡの領域を含むことが本明細書中では定義される。
【００１６】
典型的には、プロモーターは原核生物のプロモーターであり、従って、適切な−１０配列及び−３５配列（それらのコンセンサス配列が当分野では十分に定義される）を含む。遺伝子はまた、他の適切な調節配列（例えば、ターミネーターなど）に機能的に連結することができる。「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるヌクレオチド配列として定義される。１つの実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はそれ自体のプロモーターから発現される。代わりの実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は（ゲノムにおける適切な場所での組み込みのために）好熱性微生物のプロモーターから発現される。ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が外来プロモーターによって駆動される構築物もまた想定され得る。これは、例えば、最大の発現レベル又は誘導可能な発現を達成するために行うことができる。一例として、ファージプロモーター（例えば、Ｔ７など）を、（別個のＤＮＡ構築物又は同じＤＮＡ構築物において提供され得る）好適なファージポリメラーゼとの併用で利用することができる。
【００１７】
特に好ましい実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の適切な調節領域（具体的には、上流の調節領域）に機能的に連結される。調節領域は、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーターを含む。プロモーターは、適切な−１０配列及び−３５配列を最小の機能的ユニットとして含むことが定義され得る。従って、本発明の１つの好ましい実施形態によれば、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は好熱性微生物の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の中に挿入され、従って、その好熱性微生物の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を不活性化する。本実施形態は、本発明の好熱性微生物を作製するために要求される両方の改変が一段階でもたらされるので、特に好ましい。このことを達成するための好適な構築物が本明細書中に詳しく記載される。
【００１８】
好熱性細菌によるエタノール製造は、エタノール製造を高い温度で行うことができるので好都合である。好熱性微生物は酵母よりも低いエタノール耐性を有する一方で、エタノールを膜蒸発及び／又は穏和な真空蒸発によって高温発酵から連続的及び好都合に除去することができる。最適な嫌気性増殖条件において、バチルス菌株ＬＬＤ−Ｒは、ほとんどもっぱらＰＦＬ経路によって７０℃において非常に迅速に増殖する（Ｈａｒｔｌｅｙ及びＳｈａｍａ、１９８２）。新規なＰＦＬ−ＦＤＨ経路による増殖が同等に活発であることを想定することができ、しかし、最大増殖温度は、好熱性微生物に導入されたＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼの熱安定性によって制限されると考えられる。従って、１つの好ましい実施形態において、本発明の好熱性微生物は、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、及び／又は、ヌクレオチド配列が、好熱性微生物による発現を容易にするためにコドン最適化されている遺伝子を取り込む。そのような熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼの作製が本明細書中に詳しく記載される。具体的な実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列から本質的になるか、又は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列からなる。さらなる実施形態において、本発明の好熱性微生物は、バチルス属における発現のために最適化されたコドン、すなわち、配列番号２として示されるヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号２として示されるヌクレオチド配列から本質的になるか、又は、配列番号２として示されるヌクレオチド配列からなる、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を取り込む。この配列は、必要最小限の(basic)熱安定的なＮＡＤ結合型デヒドロゲナーゼ配列に加えて、プロモーター領域及びターミネーター領域、そしてまた、好適なＤＮＡ構築物への遺伝子のクローン化を容易にするためのＸｂａ１部位を含む。
【００１９】
さらなる実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｆｄｈ１遺伝子である。ｆｄｈ１遺伝子は任意の好適な供給源に由来することができ、好ましくは、関連した好熱性微生物における発現のためにコドン最適化される。
【００２０】
本発明の好熱性微生物は、本明細書中にさらに詳しく記載されるように、本発明のＤＮＡ構築物のいずれかによる形質転換によって作製することができる。従って、そこで提供される議論が本発明の本実施形態に準用される。
【００２１】
本発明の好熱性微生物は、エタノールをバイオマスから製造するための任意の好適な微生物であり得る。好ましくは、本発明の好熱性微生物はヘテロ乳酸発酵微生物である。より好ましくは、好熱性微生物は好熱性細菌であり、より好ましくは、バチルス属の細菌であり、一層より好ましくは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）である。１つの実施形態において、本発明の好熱性微生物は、（バチルス・ステアロサーモフィルスの）公知菌株のＬＬＤ−Ｒ又はＬＬＤ−１５に由来する。さらなる実施形態において、好熱性微生物はゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）である。
【００２２】
本発明によって容易にされる発酵プロセスでは、好ましくは、適切な好熱性微生物（例えば、バチルス菌株ＬＬＤ−Ｒなど）のコドン選択の使用に起因する熱安定的なアミノ酸配列を発現するように設計される合成されたＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼが利用される。そのような合成遺伝子は、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内への挿入を助けるための操作された制限部位を含有する。それにより、ＬＤＨ経路の欠失及びＰＦＬ−ＦＤＨ経路の作製が１回の操作で達成される。従って、第２の態様において、本発明は熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼを提供する。好ましくは、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼは６０℃の温度またはそれよりも高い温度で機能を保持したままである。好ましくは、熱安定性の酵素は、好熱性微生物における発現のためにコドン最適化されているヌクレオチド配列によってコードされる。ギ酸デヒドロゲナーゼは、１つの実施形態において、配列番号３として示されるアミノ酸配列を含むことができ、又は、配列番号３として示されるアミノ酸配列から本質的になることができ、又は、配列番号３として示されるアミノ酸配列からなることができる。
【００２３】
具体的な熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼが、下記の詳細な説明においてより詳しく議論されるように、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）１０１のギ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号３）に基づいて、また、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウスについての最適化されたコドンの使用によって設計されている。当業者は、この基本的配列の様々な誘導体が機能性を保持することを理解する。例えば、保存的置換及び半保存的置換は熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをもたらすことができ、また、これらの誘導体は、それらが、好熱性微生物を使用するエタノール製造において有用であるような効果的な触媒作用活性及び熱安定性を保持するならば、本発明の範囲内であることが意図される。同様に、アミノ酸の軽微な欠失及び／又は付加は、適切な機能性を保持する誘導体をもたらすことができる。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする合成遺伝子に関する。好ましくは、この遺伝子は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列から本質的になるか、又は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列からなる。この配列は、コドンが熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造のために最適化される新規のｆｄｈ遺伝子配列を表す。より具体的な実施形態において、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号２として示されるヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号２として示されるヌクレオチド配列から本質的になるか、又は、配列番号２として示されるヌクレオチド配列からなる。この配列は、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼのためのコード領域をバチルス属の好適なプロモーター及びｒｈｏ非依存性ターミネーターと一緒に取り込む。この配列はまた、クローン化を助けるための好適な制限部位（具体的には、Ｘｂａ１部位）を取り込む。当業者は、ヌクレオチド配列に対する軽微な改変体が、例えば、最適化されたコドンを適切な好熱性微生物の翻訳系において好まれる他のコドンにより置き換えることによって、得られた酵素の機能性又は熱安定性を変化させることなく、作製され得ることを容易に理解する。
【００２５】
本発明はまた、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ（具体的には、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ構築物に関し、この場合、遺伝子の両側には、好適なＤＮＡ構築物（例えば、発現ベクター又はプラスミドなど）への遺伝子のクローン化を容易にするための制限部位が存在する。
【００２６】
関連した態様において、本発明はまた、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に機能的に連結された調節配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。従って、このＤＮＡ構築物は、最大のエタノール収率を与える効率的な発酵を行うことができる好熱性微生物を作製するために、好熱性微生物（具体的には、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない好熱性微生物）の形質転換を容易にする。上記で述べられたように、本明細書中で使用される用語「機能的に連結された」は、調節配列が遺伝子発現に影響を及ぼすことができるような、調節配列と、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子との間における機能的な連結を示す。例えば、好ましい調節配列はプロモーターである。上記で述べられたように、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列から本質的になるか、又は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列からなる。好ましい調節配列はプロモーターであるが、ＤＮＡ構築物は、好適なターミネーター配列をさらに取り込むことができる。１つの具体的な実施形態において、プロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を含む。他のプロモーターを、上記で議論されたように、高レベルの発現及び／又は誘導可能な発現のために利用することができる。
【００２７】
本発明のさらなる態様において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、挿入配列とを含むＤＮＡ構築物が提供され、この場合、挿入配列は、このＤＮＡ構築物により形質転換された好熱性微生物のゲノムへの、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の組み込みを容易にする。「挿入配列」とは、適切な好熱性微生物のゲノムへの組み込みを可能にする転移可能なＤＮＡエレメントを意味する。挿入配列はまた、挿入配列エレメント（ＩＥ）として示される場合があり、天然に存在し得る。１つの具体的な実施形態において、挿入配列はバチルス・ステアロサーモフィルスの菌株ＬＬＤ−Ｒ又は菌株ＬＬＤ−１５に由来する。
【００２８】
より具体的な実施形態において、挿入配列は、配列番号５として示されるヌクレオチド配列（図３）を含むか、又は、配列番号５として示されるヌクレオチド配列（図３）から本質的になるか、又は、配列番号５として示されるヌクレオチド配列（図３）からなる。好ましい挿入配列を、配列番号６及び配列番号７として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、又は、配列番号６及び配列番号７として示されるヌクレオチド配列から本質的になるプライマー、又は、配列番号６及び配列番号７として示されるヌクレオチド配列からなるプライマーを使用する増幅によって作製することができる。この場合、公知のバチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−１５に由来するゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用することができる。１つの特に好ましいＤＮＡ構築物が、（下記の実験の節及び図５に記載されるような）プラスミドｐＵＢ−ＩＳＦ１である。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の適切な調節領域（具体的には、上流の調節領域）に機能的に連結された、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする（ｆｄｈ）遺伝子を含むＤＮＡ構築物に関する。調節領域は、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）のプロモーターを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの効果的な結合を可能にするために、適切な−１０配列及び−３５配列を最小の機能的ユニットとして含むことが定義され得る。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターは、好熱性微生物（例えば、バチルス属など）における高レベルの発現を行わせるために好適であり、これはまた、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の欠失及びＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ活性の導入の両方を同じ工程において達成するためのクローン化戦略の一部としても都合よく使用することができる。従って、ＤＮＡ構築物はまた、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）のプロモーターを含む核酸分子に機能的に連結された、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むものとして定義することができる。
【００３０】
ＤＮＡ構築物はまた、好ましくは、宿主の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列の一部を、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の下流側に含有する。このことは、ＤＮＡ構築物により形質転換された微生物における遺伝子の組み込みを容易にする。「少なくとも一部」とは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する微生物のゲノムへの組換え（好ましくは、２回の交差による組換え）による遺伝子組み込みを可能にするための十分な長さの遺伝子の一部分を意味する。コード配列の一部は、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の末端を取り込む。１つの実施形態において、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド又は７５０ヌクレオチドが、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の下流側に取り込まれる。従って、本発明の１つの実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含み、この場合、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子には、（対象の好熱性微生物に由来する）乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に由来するヌクレオチド配列が隣接する。そのような隣接する配列は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする宿主遺伝子への、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の組み込みを可能にし、それにより、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼ活性の導入及び乳酸デヒドロゲナーゼ活性のノックアウトを１回のクローン化工程においてもたらすための十分な長さである。好ましくは、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子には、組換えによる組み込みの後で、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がプロモーターに機能的に連結されるように、少なくとも、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター領域が上流側に隣接する。特に好ましい実施形態において、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の下流側部分は、菌株ＬＬＤ−Ｒをテンプレートとして使用するとき、配列番号８及び配列番号９として示されるヌクレオチド配列を含むプライマー、又は、配列番号８及び配列番号９として示されるヌクレオチド配列から本質的になるプライマー、又は、配列番号８及び配列番号９として示されるヌクレオチド配列からなるプライマーを使用するｌｄｈ遺伝子の増幅によって得ることができる部分である。上流側の隣接領域（これは、好ましくは、ｌｄｈプロモーターを取り込む）は、好ましくは、宿主ゲノムとの組換えによる組み込み効率を最大にするために、適切なｌｄｈ上流領域の少なくとも１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド又は７５０ヌクレオチドを含む。この上流領域は、当業者によって容易に決定されるように、対象の具体的な好熱性微生物におけるｌｄｈ遺伝子の配列状況に依存し得る。従って、ｌｄｈ遺伝子配列の知識を有する当業者は、組換えによる組み込みを可能にするための適切な隣接領域を容易に決定する。例えば、発表されたゲノム配列を調べることができ、又は、配列決定反応を行うことができ、又は、隣接領域を、ｌｄｈ遺伝子配列に由来するプライマーを使用するＰＣＲによって増幅することができる。従って、ｆｄｈ遺伝子は、ｆｄｈ遺伝子が、読み枠を一致させて、ｌｄｈ遺伝子の少なくとも一部に取り替えられるように、ｌｄｈ遺伝子に由来する２つのヌクレオチド配列の間に置かれる。
【００３１】
従って、ＤＮＡ構築物は一般に、対象の遺伝子（ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）が、組み込み時にノックアウトされる遺伝子（この場合には、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）のコード配列（ＯＲＦ）の内部に挿入される遺伝子組み込みカセットを含む。組換えにより組み込まれたとき、対象の遺伝子の発現は、事実上、ノックアウトされた遺伝子の制御下にある。そのような構築物は、１つの遺伝子が、異種遺伝子の発現に有利なようにノックアウトされることが必要である状況において一般的な適用性を有し得る。１つの好ましい実施形態において、ＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする。本明細書中に提供される熱安定的なＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼの議論が、本発明のこの態様に準用される。具体的には、１つの実施形態において、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１もしくは配列番号２として示されるヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号１もしくは配列番号２として示されるヌクレオチド配列から本質的になるか、又は、配列番号１もしくは配列番号２として示されるヌクレオチド配列からなる。特に好ましいＤＮＡ構築物が、（下記の実験の節及び図８に記載されるような）プラスミドｐＵＣＫ−ＬＦ１である。
【００３２】
本発明のすべてのＤＮＡ構築物について、好ましい形態が発現ベクターである。従って、本発明のＤＮＡ構築物は、構築物により形質転換された微生物における、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の確実な発現を可能にする。特に好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築はプラスミドである。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、宿主の好熱性微生物のゲノムとの組換えを介して宿主の好熱性微生物において複製することができるだけである。
【００３３】
本発明のＤＮＡ構築物はまた、好ましくは、好適なレポーター遺伝子を、成功した形質転換の指標物として取り込む。１つの実施形態において、レポーター遺伝子は抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子など）である。他のレポーター（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）など）を適するように利用することができる。ＤＮＡ構築物は多数のレポーター遺伝子を適するように取り込むことができる。レポーター機能の喪失は、その後の世代においてであるが、熱安定性のＮＡＤ結合型ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の、適切な隣接領域と一緒での組み込みを示す。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含む微生物に関する。好ましいレシピエント微生物はヘテロ乳酸発酵微生物である。具体的には、本発明は、好ましくは、好熱性細菌、例えば、バチルス属の細菌などに関し、特に、バチルス・ステアロサーモフィルスに関する。細菌は、例えば、ＬＬＤ−Ｒ又はＬＬＤ−１５の菌株に由来することができる。さらなる実施形態において、好熱性微生物はゲオバチルス・サーモグルコシダシウスである。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、発酵における本発明の微生物又は本発明の好熱性微生物の使用、具体的には、エタノールを製造するためのそれらの使用に関する。
【００３６】
同様に、本発明は、本発明の好熱性微生物又は本発明の微生物に糖を与えることを含む、エタノールを製造するための発酵プロセスに関する。本発明に従って構築された微生物は、最適な増殖条件の下での高いエタノール収率及び体積生産性のために特に好適である。従って、本発明の微生物はどれも、任意の発酵槽形態（例えば、回分式発酵プロセス、流加回分（fed-batch）式発酵プロセス又は連続発酵プロセスなど）において使用することができる。１つの好ましい実施形態において、発酵プロセスは流加回分式発酵プロセスである。
【００３７】
バイオエタノールを製造するために微生物（例えば、好熱性微生物など）を使用することの主要な利点の１つは、酵母とは異なり、そのような微生物は、農業廃棄産物（例えば、ヘミセルロースなど）に由来する広範囲の糖を発酵することができることである。従って、１つの実施形態において、本発明の発酵プロセスにおいて使用される糖はバイオマスに由来する。さらなる実施形態において、発酵は混合糖の発酵である。具体的な実施形態において、混合糖には、ペントース糖（好ましくは、ペントース糖の大部分）が含まれる。
【００３８】
さらなる実施形態において、発酵プロセスは、レドックスバランスが保たれた状態で維持される。このことは、好熱菌に関しては特に重要である。これは、好中温菌とは異なり、糖の取り込みがこれらの微生物では調節されないようであるからである。好ましくは、これはフィードバックセンサーの使用によって達成される。
【００３９】
好熱性細菌はエタノールに対する低い抵抗性を有するが、これは、エタノールの定期的な除去又は連続した除去によって本発明の発酵プロセスにおいて都合よく克服することができる。このことは、発酵におけるエタノール濃度が本発明の好熱性微生物又は微生物のエタノール許容度よりも低く保たれることを保証する。エタノールは、蒸発又は蒸留（例えば、膜蒸発及び／又は穏和な真空蒸発など）によって高温発酵から連続的かつ都合良く除去することができる。
【００４０】
次に、本発明は、下記の限定されない説明及び図を参照して記載される。
【実施例】
【００４１】
発明の説明
材料
培地及び緩衝液
ＬＢ培地：トリプトン  １０ｇ；酵母抽出物  ５ｇ；ＮａＣｌ  １０ｇ；脱イオン水（１Ｌにする）。
ｐＨを７に調節し、オートクレーブ処理して殺菌した。
平板培地については、２０ｇ／ｌの寒天を培地に加え、その後、オートクレーブ処理し、５５℃に冷却し、無菌のペトリ皿に注いだ（平板あたり約２０ｍｌ）。
ＬＢ−ａｍｐ平板については、ろ過滅菌したアンピシリン溶液を５０μｇ／ｍｌの最終濃度に加え、その後、ペトリ皿に注いだ。
【００４２】
ＳＯＣ培地：トリプトン  ２．０ｇ；酵母抽出物  ０．５ｇ；ＮａＣｌ  ０．０５ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２０４ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２４７ｇ；グルコース  ０．３６ｇ；脱イオン化Ｈ２Ｏ（１００ｍｌにする）。
溶解し、ｐＨを７に調節し、ろ過滅菌した。
【００４３】
ＴＧＰ培地：トリプトン  １７ｇ；ダイズペプトン  ３ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４  ２．５ｇ；ＮａＣｌ  ５ｇ；ピルビン酸Ｎａ  ４ｇ；グリセロール  ４ｍｌ；脱イオン水（１Ｌにする）。ｐＨを７に調節し、オートクレーブ処理して殺菌した。
平板培地については、２０ｇ／ｌの寒天を培地に加え、その後、オートクレーブ処理し、５５℃に冷却し、無菌のペトリ皿に注いだ（平板あたり約２５ｍｌ）。
ＴＧＰ−ｋａｎ平板については、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にするためのろ過滅菌されたカナマイシン溶液を、ペトリ皿に注ぐ前に加えた。
【００４４】
ＴＨ緩衝液：トレハロース  ２７２ｍＭ；ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨによりｐＨ７．５）  ８ｍＭ；２回蒸留Ｈ２Ｏ（１Ｌにする）。
【００４５】
微生物菌株
大腸菌ＤＨ５−αの化学的コンピテント細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（Ｃａｔ．１８２６５−０１７）。
バチルス・ズブチリス亜種ズブチリス（Bacillus subtilis subsp. Subtilis）、ドイツ培養物コレクションＤＳＭＺ（ＤＳＭ番号１０）。
バチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−Ｒ、これはＮＣＩＭＢ１２４０３として寄託された。
バチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−１５、これはＮＣＩＭＢ１２４２８として寄託された。
【００４６】
プラスミド
プラスミドのｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ及びｐＣＲ−ＴＯＰＯ２をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。
プラスミドｐＵＢ１１０、このプラスミドを保有する枯草菌（Bacillus subtilis）ＢＤ１７０をドイツ培養コレクションＤＳＭＺから得た（ＤＳＭ番号４５１４）。
プラスミドｐＵＣ１８をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００４７】
実施例１．合成されたギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の構築（図２）
シュードモナス種１０１のギ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩタンパク質データベースアクセション番号Ｐ３３１６０−配列番号３）を、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウスについての最適化されたコドンを有するＤＮＡ配列に逆翻訳した。バチルス属菌株に由来するプロモーター領域及びｒｈｏ非依存性ターミネーター領域を、翻訳された配列の上流側及び下流側にそれぞれ加えた（図２）。この新規な配列は公知のｆｄｈ遺伝子配列との４０％未満の類似性（公知のｆｄｈ１遺伝子との３７％の同一性）を示した。Ｘｂａ１部位が、好適なベクターへのそのクローン化を容易にするために構築物の両側に設計された。
【００４８】
所望の配列を、Ｇａｏらの方法（Xinxin Gao、Peggy Yo、Andrew Keith、Timothy J. Ragan及びThomas K. Harris (2003)、Nucleic Acids Research、31 (22)、e143を参照のこと）を使用して合成し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにその唯一のＸｂａ１位置においてクローン化した。得られたベクターｐＣＲ−Ｆ１（図４）を大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、陽性クローンをＰＣＲ分析及び制限分析によって確認した。
【００４９】
２つの代替戦略を、下記の実施例において示されるように、この合成ｆｄｈ遺伝子を標的バチルス属細菌のゲノムに挿入し、発現するために利用することができる。
【００５０】
実施例２．多重（ＩＳ）部位へのｆｄｈ遺伝子の挿入
この戦略は、多重挿入部位において組換えが頻繁に生じる挿入配列（ＩＳ）を含有する菌株（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−Ｒなど）に適用される。ｆｄｈ遺伝子及びこのＩＳ配列を有するベクターは、そのような場所の１又はそれ以上における安定な組み込みをもたらすことが予想される。
【００５１】
プラスミドｐＵＢ−ＩＳＦ１の構築（図５）
最初に、菌株ＬＬＤ−Ｒの公知の挿入配列（配列番号５及び図３）を、フォワードプライマー（ＡＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧ−配列番号６）及びリバースプライマー（ＡＧＴＡＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＡＧＣ−配列番号７）をテンプレートとしてのＢ．ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−１５とともに使用してＰＣＲ増幅する。Ｓｃａ１制限部位が配列の両側に導入される。ＰＣＲ生成物を最初にプラスミドｐＣＲ−ＴＯＰＯ２．１にクローン化し、その後、得られたプラスミドｐＣＲ−ＩＳを大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、ＩＳ領域をＳｃａ１制限消化によって単離するために使用する。その後、単離されたＩＳをｐＵＢ１１０にその唯一のＳｃａ１部位においてクローン化し、得られたプラスミドｐＵＢ−ＩＳを枯草菌に導入する。
【００５２】
その後、ｌｄｈプロモーターを含有する１．５ｋｂのフラグメントと、ｆｄｈ遺伝子とを、Ｘｂａ１制限酵素を使用してｐＣＲ−Ｆ１プラスミドから消化し、同じ酵素により既に線状化されたプラスミドｐＵＢ−ＩＳにクローン化する。その後、得られたプラスミドｐＵＢ−ＩＳＦ１（図５）をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに導入し、陽性クローンをＴＧＰ−ｋａｎ平板において選択し、ＰＣＲ分析及び制限分析によって確認する。
【００５３】
菌株ＬＬＤ−Ｒへのｆｄｈ遺伝子の組み込み
その後、プラスミドｐＵＢ−ＩＳＦ１をＨａｅＩＩＩメチラーゼ酵素によりインビトロでメチル化し、その後、バチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−Ｒ又はそのｌｄｈ欠失菌株（実施例３を参照のこと）の細胞をメチル化ｐＵＢ−ＩＳＦ１プラスミドにより形質転換する。陽性クローンを５０℃におけるＴＧＰ−Ｋａｎ平板において４８時間後に選択し、ｆｄｈ遺伝子のＰＣＲ増幅によって分析する。
【００５４】
その後、ｆｄｈ遺伝子を、形質転換クローンを６０℃〜６５℃で数世代にわたってＴＧＰ−Ｋａｎ培地で増殖させ、ＴＧＰ−Ｋａｎ平板において選択することによって染色体に組み込ませる。陽性クローンをｆｄｈ遺伝子の存在について分析し、その後、振とうフラスコ及び発酵装置においてエタノール製造ならびにＣ５（ペントース）糖及びＣ６（ヘキソース）糖の利用についてスクリーニングする。
【００５５】
実施例３．ｌｄｈ欠失菌株の構築
最初の工程は、バチルス属のカナマイシン耐性マーカー（ｋａｎ）と、Ｂ．ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−Ｒのｌｄｈ遺伝子を有するカセットとをプラスミドｐＵＣ１８（これはグラム陰性微生物においてのみ複製することができる）にクローン化することである。
【００５６】
バチルス属クローニングベクターの構築。プラスミドｐＵＣＫ（図６）
カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）を、プラスミドｐＵＣ１８に、プラスミドにおける任意のコード領域の外側及びレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）の外側に位置するその唯一のＺｒａ１部位においてクローン化した。ｋａｎ遺伝子をクローン化するために、カナマイシン耐性遺伝子を含有する１．１３ｋｂのフラグメントを、プラスミドｐＵＢ１１０をテンプレートとして使用して、下記のプライマー：
ｋａｎ−ＢｓＺ−Ｆ（ＡＣＡＣＡＧＡＣＧＴＣＧＧＣＧＡＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＣ−配列番号１０）および
ｋａｎ−ＢｓＺ−Ｒ（ＣＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＴＡＡＴＴＡＣＴＡＡＴＡＣＴＡＧＧ−配列番号１１）
によりＰＣＲ増幅した。Ｚｒａ１部位をプライマーを介してｋａｎ遺伝子の両端に導入した。その後、ＰＣＲ生成物をＺｒａ１制限エンドヌクレアーゼ酵素により消化し、事前にＺｒａ１消化され、脱リン酸化されたプラスミドｐＵＣ１８と連結した。その後、得られたプラスミドｐＵＣＫ（図６）を大腸菌ＤＨ５α細胞に導入した。陽性クローンをＬＢ−ａｍｐ平板において選択し、ＰＣＲ分析及び制限分析によって確認した。
【００５７】
欠失を有するｌｄｈ遺伝子を有するプラスミドｐＵＣＫ−ＬＣの構築（図７）
１．３６ｋｂのｌｄｈカセットを、そのＯＲＦの３６３ｂｐが欠失された菌株ＬＬＤ−Ｒのｌｄｈ遺伝子全体と、その隣接部とを含有するように設計した。このカセットを、菌株ＬＬＤ−Ｒをテンプレートとして使用するｌｄｈ遺伝子の上部領域及び下部領域のＰＣＲ増幅によって構築した。その後、これらの領域を連結し、プラスミドｐＵＣＫにクローン化した。ＢｇｌＩＩ部位を内側プライマーに導入した。上部領域を、下記のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
ＬＣ−Ｕ−Ｆ１（ＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＣ−配列番号１２）及び
ＬＣ−ＵＢ−Ｒ１（ＴＧＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＧＴＣ−配列番号１３）。
【００５８】
下部領域を、下記のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
ＬＣ−ＤＢ−Ｆ１（ＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＣ−配列番号１４）及び
ＬＣ−Ｄ−Ｒ１（ＴＡＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧ−配列番号１５）。
【００５９】
これらのＰＣＲ生成物をＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素により消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素を使用して連結した。連結物をテンプレートとして使用して、その後、ｌｄｈカセットを、プライマーとして、
ＬＣ−ＵＸ−Ｆ２（ＡＴＡＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＴＡＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＧＧＣ−配列番号１６）及び
ＬＣ−ＤＸ−Ｒ２（ＴＣＡＣＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＣＡＴＡＡＡＣ−配列番号１７）
を使用してＰＣＲ増幅した。
【００６０】
ＸｂａＩ部位をプライマーを介してカセットの両端に導入した。その後、ＰＣＲ生成物をＸｂａＩ酵素により消化し、同じ酵素により事前に消化され、脱リン酸化されたプラスミドｐＵＣＫにクローン化した。その後、得られたプラスミドｐＵＣＫ−ＬＣを大腸菌ＤＨ５αに導入した。陽性クローンをＬＢ−ａｍｐ平板において選択し、ＰＣＲ分析及び制限分析によって確認した。
【００６１】
ｌｄｈ欠失菌株の構築
プラスミドｐＵＣＫ−ＬＣをＨａｅＩＩＩメチラーゼ酵素によりインビトロでメチル化し、野生型の好熱性細胞（例えば、菌株ＬＬＤ−Ｒ）をエレクトロポレーション（１０００Ｖ、２０１オーム、２５マイクロファラデー及び５ミリ秒）によってメチル化プラスミドにより形質転換する。陽性クローンを６５℃でＴＧＰ−Ｋａｎ平板において選択し、ｋａｎ遺伝子のＰＣＲ増幅によって１回の交差事象体（single cross-over event）として確認する。
【００６２】
２回の交差による遺伝子欠失を達成するために、陽性クローンを数世代にわたってＴＧＰ培地で増殖させ（約５回の継代培養）、ＴＧＰ平板において増殖することができるがＴＧＰ−ｋａｎ平板においては増殖することができないクローンを選択する。その後、陽性クローンを、ｌｄｈ遺伝子欠失体として、ＰＣＲ分析によってカナマイシン遺伝子の不在について確認する。その後、クローンを振とうフラスコ及び発酵装置においてエタノール製造ならびにＣ５糖及びＣ６糖の利用について特徴づける。
【００６３】
実施例４．同時でのｆｄｈ遺伝子の導入及びｌｄｈ遺伝子の欠失
この代替戦略は、広範囲の種類のヘテロ乳酸発酵微生物に対して、好熱性バチルス属と同様に広く適用可能であるが、後者が例示として使用される。
【００６４】
プラスミドｐＵＣＫ−ＬＦの構築（図９）
ｆｄｈ遺伝子を含有し、それに加えて、ｌｄｈ遺伝子全体、ならびに、約３００ｂｐの上流側及び下流側の隣接領域を含有する遺伝子組み込みカセットをプラスミドｐＵＣＫにクローン化する。この構築物では、ｌｄｈオープンリーディングフレームの最初の４５０ｂｐが、遺伝子発現がｌｄｈ遺伝子のプロモーターの制御下になるような方法でｆｄｈ遺伝子により置き換えられる。
【００６５】
これを達成するために、ｌｄｈ遺伝子の下流側領域を含有する約７５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、
ＬＤＨＢ−Ｘ−Ｆ１（ＧＡＡＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＣ−配列番号８）及び
ＬＤＨＢ−Ｅ−Ｒ１（ＧＴＴＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＧＣＡＧ−配列番号９）
をプライマーとして、バチルス・ステアロサーモフィルス菌株ＬＬＤ−Ｒをテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅する。従って、Ｘｂａ１部位及びＥｃｏＲ１部位がＰＣＲフラグメントの端部に導入される。その後、ＰＣＲフラグメントを消化し、Ｘｂａ１部位と、ＥｃｏＲ１部位との間においてプラスミドｐＵＣＫに一定方向でクローン化する。得られたプラスミドｐＵＣＫ−ｌｄｈＢ（図８）を大腸菌ＤＨ５αに導入し、陽性クローンをＬＢ−ａｍｐ平板において選択し、ＰＣＲ分析及び制限分析によって確認する。
【００６６】
その後、ｌｄｈプロモーター及びｆｄｈ遺伝子を含有する１．５ｋｂのフラグメントを、Ｘｂａ１制限酵素を使用してｐＣＲ−Ｆ１プラスミドから消化し、同じ酵素により既に線状化されたプラスミドｐＵＣＫ−ｌｄｈＢにクローン化する（図８）。得られたプラスミドｐＵＣＫ−ＬＦ１（図９）を大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、クローンをＬＢ−ａｍｐ平板において選択する。陽性クローン及び構築物の正しい配向をＰＣＲ分析及び制限分析によって確認する。
【００６７】
エタノールを新規なＰＦＬ−ＦＤＨ経路によって作製する菌株の構築
プラスミドｐＵＣＫ−ＬＦ１をＨａｅＩＩＩメチラーゼ酵素によりインビトロでメチル化し、標的の野生型細胞（例えば、菌株ＬＬＤ−Ｒ細胞）をメチル化プラスミドにより形質転換し、ＴＧＰ−Ｋａｎ平板において６０℃で選択する。陽性クローンは１回の交差事象体を表し、陽性クローンをｆｄｈ遺伝子のＰＣＲ増幅によって分析する。
【００６８】
２回の交差による遺伝子組み込みを達成するために、ＴＧＰ平板において増殖するがＴＧＰ−Ｋａｎ平板においては増殖しないクローンを選択する。その後、陽性クローンをｆｄｈ遺伝子の存在及びカナマイシン遺伝子の不在について確認する。最後に、クローンを振とうフラスコ及び発酵装置においてエタノール製造ならびにＣ５糖及びＣ６糖の利用についてスクリーニングする。
【００６９】
すべての参考文献はその全体が本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】乳酸デヒドロゲナーゼ経路が不活性化されている好熱性微生物における代謝経路に対する様々な条件の影響を示す。矢の濃淡及び太さは個々の代謝経路の相対的な優勢を示す。中性ｐＨ及び低い糖の存在下で活性である代謝経路。この場合、ピルビン酸ギ酸リアーゼ経路が優勢である。
【図１Ｂ】乳酸デヒドロゲナーゼ経路が不活性化されている好熱性微生物における代謝経路に対する様々な条件の影響を示す。矢の濃淡及び太さは個々の代謝経路の相対的な優勢を示す。低いｐＨ及び低い糖の存在下で活性である代謝経路。この場合、嫌気性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路が優勢である。
【図１Ｃ】乳酸デヒドロゲナーゼ経路が不活性化されている好熱性微生物における代謝経路に対する様々な条件の影響を示す。矢の濃淡及び太さは個々の代謝経路の相対的な優勢を示す。低いｐＨ及び高い糖の存在下で活性である代謝経路。この場合、細胞は代謝ストレスを受け、レドックスバランスが崩れ、これにより、いわゆる「レドックス死」を引き起こす。
【図１Ｄ】乳酸デヒドロゲナーゼ経路が不活性化されている好熱性微生物における代謝経路に対する様々な条件の影響を示す。矢の濃淡及び太さは個々の代謝経路の相対的な優勢を示す。中性ｐＨ及び高い糖の存在下で本発明の好熱性微生物において活性である代謝経路。この場合、新規なＰＦＬ−ＦＤＨ経路が優勢となり、エタノール及びＣＯ２が唯一の嫌気性産物である。
【図２】熱安定性を最大にするためのコドン最適化によって作製された合成ｆｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ｆｄｈオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列には、プロモーター及びターミネーター（斜体字）の領域が隣接する。プロモーターの−３５ボックス及び−１０ボックスには下線が付される。構築物を好適なベクターにクローン化するために、Ｘｂａ１部位が配列の両側に導入された。
【図３】Ｂ．ステアロサーモフィルスのＬＬＤ−１５菌株の挿入配列（ＩＳ）のヌクレオチド配列を示す。９ｂｐの逆方向反復の末端が太字フォントで示される。
【図４】ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ誘導体プラスミドのｐＣＲ−Ｆ１の概略図である。このプラスミドは、唯一のＸｂａ１部位においてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローン化された、ｌｄｈプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたｆｄｈ１遺伝子を含む。
【図５】ｐＵＢ１１０誘導体プラスミドのｐＵＢ−ＩＳＦ１の概略図である。このプラスミドは、ｐＣＲ−Ｆ１プラスミドに由来する、ｌｄｈプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたｆｄｈ１遺伝子を含み、公知のバチルス属菌株ＬＬＤ−１５に由来する挿入配列（ＩＳ）もまた含む。
【図６】ｐＵＣＫと呼ばれるｐＵＣ１８誘導体プラスミドの概略図である。このプラスミドは、プラスミドｐＵＢ１００からｐＵＣ１８における唯一のＺｒａ１制限部位にクローン化されたカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【図７】ｐＵＣＫ誘導体のｐＵＣＫ−ＬＣの概略図である。このプラスミドは、ＯＲＦの中央における３６３ｂｐの欠失を伴うｌｄｈ遺伝子を有する。
【図８】ｐＵＣＫ誘導体のｐＵＣＫ−ｌｄｈＢの概略図である。このプラスミドは、遺伝子の下流側領域を含む、ｌｄｈ遺伝子の７５０ｂｐを含有する。
【図９】ｐＵＣＫ−ＬＦ１プラスミドの概略図である。このプラスミドは、ｆｄｈ遺伝子をｌｄｈプロモーターの制御下に含有する遺伝子組み込みカセットを取り込むｐＵＣＫ誘導体である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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