(57)【要約】本発明は、線形動物由来のシスタチンの使用およびこのようなシスタチンを使用するスクリーニングの方法に関するものである。本発明は、線形動物由来のシスタチンを使用する、患者におけるアレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の治療および／または予防の方法にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるアレルギー疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための薬物の製造のための線形動物由来のシスタチンの使用。
【請求項２】
シスタチンが、寄生性線形動物由来であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
寄生性線形動物が、ヒトに対して寄生性であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
寄生性線形動物が、動物に対して寄生性であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
寄生性線形動物が、イヌ動物、好ましくはイヌに対して寄生性であり、または齧歯類動物、好ましくはマウスに対して寄生性であり、またはネコ動物、好ましくはネコに対して寄生性であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
線形動物が、回旋糸状虫、マレー糸状虫、バンクロフト糸状虫、ロア糸状虫およびアカントケイロネマヴィテアエ、イヌ糸状虫、ディロフィラリアレペンス、ブラジル鉤虫およびリトモソイデスシグモドンティスを含む群より選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
アレルギー疾患および／または自己免疫疾患が、喘息、枯草熱、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎等の呼吸器官の、食物アレルギー等の胃腸系の、アトピー性皮膚炎等の皮膚のアレルギー性疾患、アナフィラキシー反応等の全身性アレルギー疾患、関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症等の関節および／または皮膚および／または内部器官の自己免疫疾患、ならびに潰瘍性大腸炎およびクローン病等の炎症性腸疾患を含む群より選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
アレルギー疾患が、喘息または枯草熱であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
炎症性腸疾患が、大腸炎、好ましくは潰瘍性大腸炎であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
シスタチンが、配列番号1（アカントケイロネマヴィテアエシスタチンL43053）、配列番号2（回旋糸状虫シスタチンM37105）、配列番号3（マレー糸状虫シスタチン）ならびに上述のいずれかと70％同一であり、好ましくは80％同一であり、より好ましくは90％同一であり、および最も好ましくは99％同一である配列を含む群より選択される配列を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
シスタチンが、リコンビナントシスタチンであり、原核または真核発現系によって産生されたことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
疾病を有していない患者と比較した場合、該疾病が、好酸球血液細胞の増大した計数と、および／またはIgEの増大したレベルと関連しており、ならびに該患者への投与の際に、薬物が、好酸球血液細胞の該増大した計数の減少および／またはIgEの該増大したレベルの低下に、好ましくは健常個体の好酸球血液細胞の計数および／またはIgEのレベルに至ることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
好酸球血液細胞の増大した計数が、患者の白血球細胞全体の4％超であり、または360個超／μLの患者の末梢血中の好酸球血液細胞の総数であり、およびIgEの増大したレベルが、100kU超／Lの成人患者における血清レベルであることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
シスタチンが、患者へタンパク質として投与されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
シスタチンが、患者へ該シスタチンをコードする核酸として投与されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
シスタチンが、全身的に、好ましくは注入、吸入および／または摂取等の他の取り込みによって患者へ投与されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
シスタチンが、患者に対して鼻腔内に、肺内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、病巣内に、皮下的におよび／または筋肉内に投与されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
シスタチンが、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、および／または抗ヒスタミン等の抗炎症薬の群より選択される別の薬物との組み合わせで投与されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
患者が、哺乳動物、好ましくはヒトであることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
患者が、動物であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
動物が、イヌ動物、好ましくはイヌであり、またはネコ動物、好ましくはネコであり、または齧歯類、好ましくはマウスであることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
シスタチンが、CD36受容体へ結合するために使用されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
以下の工程：
−  CD36受容体を発現させる種類の細胞の第一の群を提供する工程、
−  該細胞を線形動物由来のシスタチンへ曝露し、該シスタチンおよび該線形動物が、請求項１〜２１のいずれか１項におけるように定義されている工程、
−  該シスタチンと該CD36受容体との間の結合の程度を、第一のシグナルとして検出および定量化する工程、
−  細胞の第一の群と同一の種類の細胞の第二の群を提供する工程、
−  細胞の該第二の群を候補化合物へ曝露する工程、
−  候補化合物と該CD36受容体との間の結合の程度を、第二のシグナルとして検出および定量化する工程、
−  該第一のシグナルを該第二のシグナルと比較する工程、および
−  該第二のシグナルによって定量化される結合の程度が、該第一のシグナルによって定量化される結合の程度に等しくまたは前記程度よりも大きな場合、アレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための候補薬物として、該候補化合物を同定する工程
を含むアレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療に有用な候補薬物に関してスクリーニングする方法。
【請求項２４】
患者におけるアレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための候補化合物に関するスクリーニングの方法におけるCD36受容体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線形動物由来のシスタチンの使用およびこのようなシスタチンを使用するスクリーニングの方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
望ましくない炎症および炎症性症状の存在を特徴とする疾病は、ヒトの大多数に対する平均余命および幸福の有意な損失の原因となる。さらに、前記疾病は、ヒトの寿命におけるいくつかの段階における実質的にすべてのヒトが、望ましくない炎症へ供されるという国家経済に対する損害における有意な因子を表す。過去の炎症性疾患の治療は、副腎皮質ステロイド等の広範囲の免疫抑制薬に基づいて多かれ少なかれ非特異的であった。有益ではあるが、これらの薬物は、前記薬物の使用を制限する有意な副作用を有する。
【０００３】
より近年、炎症における公知の標的を特異的に遮断する多くの方法を研究が同定した。これまでのところこれらのアプローチの最も成功したものは、身体において1つの細胞から他の細胞へ情報をシグナル伝達するホルモン様分子であるTNFαを遮断することであった。このような分子は、集約的にサイトカインとして公知である。TNFαのようなサイトカインは、正常な免疫においては不可欠な役割を担っているが、疾病状況においては、前記サイトカインのレベルは、上昇しまたは低下し、前記サイトカインは、細胞機能に、したがって、個体の健康に有害な効果を発揮する。大腸炎および関節リウマチ等の特定の疾病状況において、TNFαの遮断は、患者においていくらかの恩典と関連付けられてきた。これらの成功にもかかわらず、現に利用可能なTNFα治療は、患者の約半分で非効果的であり、ほとんどの場合、他の薬物とともに投与される。前記治療は、注入によって付与されなければならず、しばしば、有害な注入副作用および不便と関連付けられており、非常に効果であり、多くの患者に対する前記治療の有効性を潜在的に制限している可能性がある。
【０００４】
炎症性疾患の1つのサブセットは、アレルギー性疾患である。アレルギー性疾患は、埃、花粉、食物またはカビ等の通常無害な物質に対する有害な反応を特徴とする。アレルギー性疾患を有するヒトの免疫系は、これらの物質に過剰反応する。このような引き金になっている物質に対して感受性のあるヒトは、血液中にIgEの多量を有する。花粉粒等の引き金となっている物質の少量が、患者の身体中でIgEと出会う場合、身体は過剰反応する。免疫系は、したがって非自己として認識される物質と戦うよう試行する。このことは結果的に、膨潤、涙、鬱血、くしゃみおよび他の症状などのアレルギー性症状を生じる。アレルギー状態の例は、「枯草熱」とも呼ばれるアレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性副鼻腔炎、食物アレルギーである。アレルギーの治療は、環境規制、薬理学的療法およびアレルゲン免疫療法に焦点を絞ってきた。環境規制は、引き金となっている物質に対する曝露を回避することを包含するが、一定の程度までしかうまくいかない。薬理学的療法は、最も対症的な治療である。アレルゲン免疫療法とは、免疫系が、アレルギーの引き金に反応する方法を改善することによって、患者の免疫系を脱感作する方法である。これらのアプローチはいずれも、明白に成功しなかった。したがって、当技術分野において、アレルギー疾患のための現段階での治療法を改良する必要性が存在する。
【０００５】
自己免疫疾患とは、炎症性疾患の別のサブグループであり、炎症性症状が伴う。自己免疫疾患は、誤誘導された免疫系を特徴とし、その中で、患者の身体またはその部分は、免疫系によって攻撃され、それにより損傷を受ける。自己免疫疾患は、長期の炎症およびその後の組織破壊を生じる身体自体の組織に対して配向されている身体の免疫反応を特徴とする。自己免疫疾患は、細胞の免疫反応によって関節の裏打ちまたは特定の組織内での細胞の特定の種類を攻撃させ、それにより関節リウマチまたはインスリン依存性糖尿病などの疾病に至ることが可能である。自己免疫疾患には、セリアック病、クローン病、膵炎、エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０００６】
アレルギー疾患および自己免疫疾患は、両者の場合において、免疫系が誤誘導され、（因子が有害ではない）有害とされる因子としての外来因子を標的とし、または（因子が外来ではない）外来とされる因子として生物体自体の組織を標的とする共通の原因を特徴とする。両者の場合、このような誤誘導の効果は、損傷の部位へ誘引され、活性化され、毒性分子の産生ならびに身体自体の細胞の損傷及び破壊に至る好中球、好酸球またはマクロファージのような炎症細胞による生物体の身体への長期的な損傷である。結果的に、疾病の両群への治療的アプローチは、共通の要素を有し、炎症細胞の分化、誘引および活性化を標的とし得る。
【０００７】
アレルギー疾患および／または自己免疫疾患に関する現段階での治療法はいずれも、特にうまくいっていない。したがって、当技術分野において、アレルギー性疾患および自己免疫疾患のための治療の新たな方法を提供する必要性が存在する。特に、本発明の1つの目的は、喘息、枯草熱、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎等の呼吸器官のアレルギー性疾患の治療の新たな方法を提供することであった。さらに、食物アレルギー、セリアック病、乳糖不耐症等の胃腸系のアレルギー疾患のための治療の方法を提供することが、本発明の1つの目的であった。さらに、アトピー性皮膚炎等の皮膚のアレルギー疾患および／またはアナフィラキシー反応等の全身性アレルギー疾患を治療する方法を提供することが、本発明の1つの目的であった。さらに、関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症等の関節および／または皮膚および／または内部器官の自己免疫疾患ならびに大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病等の炎症性腸疾患を治療する新たな方法を提供することが、本発明の1つの目的であった。
【発明の概要】
【０００８】
これらの目的はすべて、患者におけるアレルギー疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための薬物の製造のための線形動物由来のシスタチンの使用によって解決される。
【０００９】
一実施態様において、該シスタチンは、寄生性線形動物由来である。
【００１０】
好ましくは、該寄生性線形動物は、ヒトに対して寄生性である。別の実施態様において、該寄生性線形動物は、動物に対して寄生性である。本明細書で使用される「動物」という用語は、非ヒト動物を指す。好ましくは、該寄生性線形動物は、イヌ動物、好ましくはイヌに対して寄生性であり、または齧歯類動物、好ましくはマウスに対して寄生性であり、またはネコ動物、好ましくはネコに対して寄生性である。
【００１１】
好ましくは、該線形動物は、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、マレー糸状虫（Brugia malayi）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、ロア糸状虫（Loa loa）およびアカントケイロネマ・ヴィテアエ（Acanthocheilonema viteae）、イヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）、ディロフィラリア・レペンス（Dirofilaria repens）、ブラジル鉤虫（Nippostrongylus brasiliensis）およびリトモソイデス・シグモドンティス（Litomosoides sigmodontis）を含む群より選択される。
【００１２】
一実施態様において、該アレルギー疾患および／または自己免疫疾患は、喘息、枯草熱、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎等の呼吸器官の、食物アレルギー等の胃腸系の、アトピー性皮膚炎等の皮膚のアレルギー性疾患、アナフィラキシー反応等の全身性アレルギー疾患、関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症等の関節および／または皮膚および／または内部器官の自己免疫疾患、ならびに潰瘍性大腸炎およびクローン病等の炎症性腸疾患を含む群より選択される。
【００１３】
好ましくは、該アレルギー疾患は、喘息または枯草熱である。一実施態様において、該炎症性腸疾患とは、大腸炎、好ましくは潰瘍性大腸炎である。本明細書で使用される「大腸炎」という用語は、急性および慢性の両方の大腸炎を含むものとして意味される。
【００１４】
一実施態様において、該シスタチンは、配列番号1（アカントケイロネマ・ヴィテアエシスタチンL43053）、配列番号2（回旋糸状虫シスタチンM37105）、配列番号3（マレー糸状虫シスタチンAF177193_1）ならびに、上述のいずれかと70％同一、好ましくは80％同一、より好ましくは90％同一、および最も好ましくは95、96、97、98および99％同一である配列を含む群より選択される配列を有する。
【００１５】
一実施態様において、該シスタチンは、リコンビナントシスタチンであり、原核または真核発現系によって産生された。
【００１６】
一実施態様において、疾病を有していない患者と比較した場合、該疾病が、好酸球血液細胞の増大した計数と、および／またはIgEの増大したレベルと関連しており、ならびに患者への投与の際に、薬物が、好酸球血液細胞の該増大した計数の減少および／またはIgEの該増大したレベルの低下に、好ましくは健常個体の好酸球血液細胞の計数および／またはIgEのレベルに至る。
【００１７】
好ましくは、好酸球血液細胞の該増大した計数が、患者の白血球細胞全体の4％超であり、または患者の末梢血中の好酸球血液細胞の総数が360個超／μlであり、およびIgEの該増大したレベルが、100kU超／lの成人患者における血清レベルである。
【００１８】
一実施態様において、該シスタチンは、タンパク質として該患者へ投与される。
【００１９】
別の実施態様において、該シスタチンは、該シスタチンをコードする核酸として該患者へ投与される。
【００２０】
一実施態様において、該シスタチンは、全身的に、好ましくは注入、吸入および／または摂取等の他の取り込みによって該患者へ投与される。
【００２１】
一実施態様において、該シスタチンは、該患者に対して鼻腔内に、肺内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、病巣内に、皮下的におよび／または筋肉内に投与される。
【００２２】
好ましい実施態様において、該シスタチンは、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、および／または抗ヒスタミン等の抗炎症薬の群より選択される別の薬物との組み合わせで投与される。
【００２３】
一実施態様において、該患者は、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施態様において、該患者は、動物である。好ましくは、該患者は、イヌ動物、好ましくはイヌであり、またはネコ動物、好ましくはネコであり、または齧歯類、好ましくはマウスである。
【００２４】
一実施態様において、該シスタチンは、CD36受容体へ結合するために使用される。
【００２５】
以下の工程：
−  CD36受容体を発現させる種類の細胞の第一の群を提供する工程、
−  該細胞を線形動物由来のシスタチンへ曝露し、該シスタチンおよび該線形動物が、請求項１〜２１のいずれか１項におけるように定義されている工程、
−  該シスタチンと該CD36受容体との間の結合の程度を、第一のシグナルとして検出および定量化する工程、
−  細胞の第一の群と同一の種類の細胞の第二の群を提供する工程、
−  細胞の該第二の群を候補化合物へ曝露する工程、
−  候補化合物と該CD36受容体との間の結合の程度を、第二のシグナルとして検出および定量化する工程、
−  該第一のシグナルを該第二のシグナルと比較する工程、および
−  該第二のシグナルによって定量化される結合の程度が、該第一のシグナルによって定量化される結合の程度に等しくまたは前記程度よりも大きな場合、アレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための候補薬物として、該候補化合物を同定する工程
を含むアレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療に有用な候補薬物に関してスクリーニングする方法によっても、本発明の目的は解決される。
【００２６】
患者におけるアレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための候補化合物に関するスクリーニングの方法におけるCD36受容体の使用によっても、本発明の目的は解決される。
【００２７】
線形動物由来のシスタチンを必要とする患者において前記シスタチンを投与することを含む、患者においてアレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の治療の方法または予防の方法によっても、本発明の目的は解決される。アレルギー性疾患および／または自己免疫疾患は、好ましくは上述に定義されるとおりである。患者およびシスタチンは、好ましくは上述に定義されるとおりである。投与は、上述に定義されるとおり実施される。
【００２８】
好ましくは、該シスタチンは、タンパク質として該患者へ投与される。
【００２９】
別の実施態様において、該シスタチンは、該シスタチンをコードする核酸として該患者へ投与される。
【００３０】
一実施態様において、該シスタチンは、該患者へ全身的に、好ましくは注入、吸入および／または摂取等の他の取り込みによって投与される。
【００３１】
一実施態様において、該シスタチンは、該患者に対して鼻腔内に、肺内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、病巣内に、皮下的におよび／または筋肉内に投与される。
【００３２】
好ましい実施態様において、該シスタチンは、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、および／または抗ヒスタミン等の抗炎症薬の群より選択される別の薬物との組み合わせで投与される。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「シスタチン」という用語は、システインプロテアーゼの阻害剤のスーパーファミリーのメンバーを指す。
【００３４】
「寄生性線形動物」とは、線形動物自体の必要条件に見合うための宿主生物体を活用する線形動物である。このことは、線形動物の一部のまたは全体の寿命の間の宿主の組織内での線形動物の寿命を包含し得る。好ましい実施態様において、このような寄生性線形動物の宿主は、ヒトである。
【００３５】
別の配列とx％の同一性を有する配列とは、配列の個々の位置上のx％の残基が、最適に整列化された場合に同一である配列である。
【００３６】
本明細書で使用される「線形動物由来のシスタチン」という用語は、線形動物において生じるシスタチンの配列を有するいずれのシスタチンも指すものとして意味される。前記用語は、具体的な産生方法に限定されるわけではなく、線形動物由来のシスタチンの単離またはリコンビナント技術もしくは化学合成等の他の方法によるシスタチンの生成を含み得る。「線形動物由来のシスタチン」という用語は、置換、挿入または欠失による1つまたはいくつもの位置において変異を受けたタンパク質のアミノ酸配列に関わらず、シスタチン機能を保持したタンパク質を含むものとしても意味される。「線形動物に由来される」として考慮されることがそれにもかかわらず可能なこのような変異を受けたシスタチンを生成するための技術は、例えば、"Proteins, Structures and Molecular Properties" by Thomas E. Creighton, second edition, W. H. Freeman and Co., New Yorkに記載されており、当業者に公知である。
【００３７】
「該シスタチンが別の薬物との組み合わせで投与される」という用語は、該シスタチンが、このような別の薬物の投与と同時に、前にまたは後に投与されるいずれの状況も含むものとして意味される。他の薬物およびシスタチンは、同一の薬用量単位にあり得または個別の薬用量単位で投与され得る。前記他の薬物およびシスタチンは、同一の経路または異別の経路によって投与され得る。
【００３８】
本発明者は、寄生性線形動物由来のシスタチンが、前記寄生性線形動物の宿主における炎症性免疫反応を抑制できることを驚くべきことに発見した。多くの実験において、本発明者は、線形動物のシスタチンが、免疫反応を抑制することが可能であり、したがって、例えば、アレルギー性気道反応性亢進の誘導またはアレルギー性胃腸反応性亢進の誘導を阻害できる。アレルギー性疾患と自己免疫疾患との間の共通の原因のため、本発明に従ったシスタチンが、自己免疫疾患の治療および／または予防においても有用であることも合理的に想定されることが可能である。本発明者はさらに、本発明に従ったシスタチンが、調節性T細胞をアップレギュレートしおよび誘導する上で、前記シスタチンが、調節性T細胞に影響を及ぼすことを示すことが可能であった。さらに、本発明に従ったシスタチンの投与によって、好酸球血液細胞の計数における実質的な低下およびアレルゲン特異的免疫グロブリンE（IgE）のレベルの低下が生じる。本発明に従ったシスタチンの投与によって、ほぼ「正常」レベル、すなわち健常個体のレベルに戻るこれら2つの変数の低下が生じる。
【００３９】
さらに、本発明者は、分子ベースで、本発明に従ったシスタチンが、将来の薬物研究のために、より具体的には、アレルギー性疾患および／または自己免疫疾患の治療および／または予防のための新たな治療を発見することを目的とした研究において、CD36受容体を刺激標的にするCD36受容体と相互作用することを示す。
【００４０】
以下において、図に対する参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、2つの異なる濃度（20μgおよび5μg）でのA. ヴィテアエシスタチン（リコンビナントアカントケイロネマヴィテアエシスタチン（rAv17））の適用スケジュールを示す。
【図２】図２は、マウスにおけるアレルギー性気道炎症のための動物モデルに及ぼすA. ヴィテアエシスタチンの影響を示し、その中で、図２aは、精製されたリコンビナントA. ヴィテアエシスタチンのSDSゲルを示し、図２bは、気管支肺胞液（BALF）中の好酸球の数を示し、図２cは、卵白アルブミン特異的IgEの血清レベルを示し、図２dは、気管支肺胞液中のIL-5の産生を示し、その中で、未処置とは、PBS（リン酸バッファー塩類溶液）のみで処置されたマウスを意味し、OVAとは、卵白アルブミンで処置されたマウスを意味し、rAv17(20)または(5)とは、rAv17の20μgまたは5μgでそれぞれrAv17/OVA処置されたマウスを意味する。
【図３】図３は、調節T細胞に及ぼす本発明に従ったシスタチンの影響を示し、その中で、図３aは、気管支周囲のリンパ節細胞（PBLN）における調節T細胞の％を示し、図３bは、1群あたり単一動物の染色された細胞のFACSプロット分析を示し、図３aの説明文に関しては、図２に対するコメントを参照されたい。
【図４】図４は、CD36を発現させるCHO細胞との本発明に従ったシスタチンの相互作用を示し、その中で、図４aは、使用されるアッセイの模式的な図であり、図４bは、CD36ネガティブ細胞との比較での、rAv17のCD36との相互作用の代表的な分析である。
【図５】図５は、A. ヴィテアエ、回線糸状虫由来のシスタチンおよび線虫（C. elegans）由来の2つのシスタチンの配列を示す。
【図６】図６は、OVAで処置され、OVA/シスタチンで同時処置されたマウスの肺組織の組織学的分析を示す。
【図７】図７は、OVA/シスタチンで処置されたマウスのBALF中での（図７a）およびOVAで再刺激されたマウスの脾臓細胞中での（図７b）IL-4の産生を示し、図７cは、脾臓細胞中でのIL-10の産生を示し、図７dは、BALFおよびOVAで再刺激された脾臓細胞中でのIL-5のレベルを示し、図７eは、OVAで処置された動物と比較したOVA/シスタチンで処置された動物における肺組織中でのTGF-βレベルを示す。
【図８】図８は、細胞総数（図８a）および好酸球（図８b）に関するOVA/シスタチンで処置されたマウスのマクロファージの枯渇の効果、脾臓中の総IgE（図８c）およびOVA特異的IgE（図８d）のレベルならびにOVA特異的IL-4（図８e）のレベルに及ぼすマクロファージの枯渇の効果を示し、図８fは、OVA/シスタチンで処置されたマウスに関するマクロファージ枯渇に応じたアレルギー性気道反応性亢進（AHR）を示す。
【図９】図９は、細胞総数（図９a）、好酸球数（図９b）、OVA特異的IgE産生（図９c）およびOVA特異的IL-4産生に及ぼす適切な抗体の適用によるIL-10受容体（IL-10R）の遮断の効果を示し、特に、図９は、フィラリア性シスタチンによるアレルギー反応の抑制が、IL-10に依存することを示す。マウスを卵白アルブミン（OVA）で感作させ、感作後およびOVAによる負荷の前に（負荷前モデル）、シスタチン（20μg/mL）および抗IL-10R抗体（1回の処置あたり1動物につき500μg）で3回処置した。脾臓細胞の細胞総数（A）、好酸球数（B）、OVA特異的血清IgEのレベル（C）、OVA特異的IL-4産生（D）。（E）Av17による刺激後の脾臓細胞のIL-10産生。未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；OVA/Aｖ17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）処置したマウス；OVA/Av17/aIL-10R：卵白アルブミンおよびAv17＋抗IL-10受容体抗体で処置したマウス；OVA/Av17/ラットIgG：卵白アルブミンおよびAv17＋アイソタイプの一致したコントロール抗体で処置したマウス；OVA/Av17リポソーム：マクロファージを枯渇させ、卵白アルブミンおよびAv17で処置したマウス；OVA/Av17/aCD25：Treg細胞を枯渇させた卵白アルブミンおよびAv17処置したマウス。
【図１０】図１０は、急性DSS大腸炎モデルにおけるフィラリア性シスタチンの効果を示す（炎症性スコア−図１０a）（組織学的分析−図１０b）；結腸組織像（b）：健常マウスにおける結腸の様相（1）、DSSおよびタンパク質適用バッファーを受容するマウス（2）、DSSおよびrAv17を受容するマウス（3）、ならびにDSSおよびリコンビナントコントロールタンパク質rDHFRで処置したコントロール動物（4）。ほとんど炎症性ではない細胞浸潤（3b）と関連した局所的かつ表層性のみの侵食と比較した場合に、結腸壁の陰窩の損失、侵食、高密度の炎症細胞浸潤、杯細胞枯渇および肥厚を伴って上皮が広範に損傷することに留意されたい。倍率40倍（aの上の行）および200倍（bの下の行）。
【図１１】図１１は、サイトカインの誘導に関与する特異的な寄生性モチーフを同定するためのペプチドライブラリのスクリーニングの結果を示す。
【図１２】図１２は、気道反応性亢進モデルのスキームを示す。気道反応性亢進の予防モデル（A）および負荷前モデル（B）のスキーム。フィラリア性シスタチンは、負荷前モデルにおける全細胞（C）および好酸球（D）の動員に干渉する。未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；OVA/Aｖ17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）で処置したマウス。
【図１３】図１３は、フィラリア性シスタチンが、肺における細胞の動員および粘液産生に干渉することを示す。予防モデルにおいて観察されるフィラリア性シスタチン（Av17）またはリコンビナントコントロールタンパク質ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）で処置したマウスのBALF中の細胞総数（A）および好酸球数（B）。未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；OVA/Av17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）で処置したマウス；OVA/DHFR：卵白アルブミンおよびDHFRで処置したマウス。
【図１４】図１４は、フィラリア性シスタチンが、血清IgEレベルおよび気道の反応性亢進を低下させることを示す。予防モデルにおいて観察されるフィラリア性シスタチン処置したマウスの血清中の総IgEレベル（A）および卵白アルブミン（OVA）特異的IgE濃度（B）；予防モデル（C）および負荷前モデル（D）におけるフィラリア性シスタチンで処置したマウスへの50mg/mLメタコリンの適用後の気道の反応性亢進。未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；OVA/Av17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）で処置したマウス；OVA/DHFR：卵白アルブミンおよびDHFRで処置したマウス。
【図１５】図１５は、細胞内脱顆粒を誘導するフィラリア性シスタチン処置したマウスの血清の低下した能力を示す。予防モデルにおけるシスタチン処置（A）、負荷前モデルにおけるシスタチン処置（B）。ラット好塩基球性白血病（RBL）細胞を、Hartmann et al. 2003に従って、異なって処置されたマウスの血清で感作した。細胞の脱顆粒をその後、卵白アルブミン（50μg/mL）の添加によって刺激した。未処置：PBS処置したマウスの血清；OVA：卵白アルブミン処置したマウスの血清；OVA/Av17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）で処置したマウスの血清。
【図１６】図１６は、CD25ポジティブ細胞の枯渇が、フィラリア性シスタチンによって発揮される免疫調節を部分的に逆転させたことを示す。マウスを卵白アルブミン（OVA）で感作し、感作の段階中にシスタチンで処置した（予防モデル）。負荷の5日前、抗CD25抗体の適用によって、Treg細胞を枯渇させた。PBLN中のTreg細胞（CD4+CD25+CD103+）の数（A）；総IgEのレベル（B）；OVA特異的血清IgEのレベル（C）。PBLN：気管支周囲のリンパ節細胞；未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；OVA/Aｖ17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）処置したマウス；OVA/Av17/aCD25：抗CD25抗体の適用によってTreg細胞が枯渇し、卵白アルブミンおよびAv17で処置したマウス。
【図１７】図１７は、DSSの適用による急性大腸炎の誘導のスキームを示す。Av17：フィラリア性シスタチン；DSS：デキストラン硫酸ナトリウム。
【図１８】図１８は、PBLNCにおける調節性T細胞（CD4+CD25+CD103+）内のFoxp3ポジティブ細胞の％を示す。マウスを卵白アルブミン（OVA）で感作し、感作の段階中にシスタチンまたはリコンビナントコントロールタンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）で処置した（予防モデル）。PBLNC：気管支周囲のリンパ節細胞；未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；OVA/Aｖ17：卵白アルブミンおよびフィラリア性シスタチン（Av17）処置したマウス；OVA/Av17/DHFR：卵白アルブミンおよびDHFRで処置したマウス。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明者は、気道の反応性亢進のいわゆる「予防」および「負荷前」モデルを使用する。予防モデルにおいて、シスタチンは、感作の間毎週の間隔で投与されるのに対し、負荷前モデルにおいて、シスタチンは、気道アレルゲン負荷前に感作後に投与される。
【００４３】
メタコリンを使用するアレルギー性気道反応性亢進（AHR）は、メタコリンの吸入後の気管支収縮として定義され、呼吸間の休止（pause）の亢進（「亢進した休止」）として測定される。
【００４４】
さらに、以下の配列に対する参照がなされ、その中で、配列番号1は、アカントケイロネマヴィテアエのシスタチン（シスタチンL43053）のタンパク質配列であり、配列番号2は、回旋糸状虫のシスタチン（シスタチンM37105）のタンパク質配列であり、配列番号3は、マレー糸状虫のタンパク質配列である。
【００４５】
【表１】
2009545624.tif 000002
【００４６】
以下において、本発明を説明するために付与され、本発明を制限するものではない実施例に対する参照がなされる。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］
線形動物からのシスタチンの産生
シグナルペプチドをコードする配列を有さないA. ヴィテアエ−シスタチン（Av17, Hartmann, S., Kyewsky, B., Sonnenburg, B. & Lucius, R. (1997) A filarial cysteine protease inhibitor downregulates T cell proliferation and enhances IL-IO production. Eur. J. Immunol. 27, 2253 - 2260.）のcDNA、および回旋糸状虫シスタチン（Ov 17, Lustigman S, Brotman B, Huima T, Prince AM, McKerrow JH. (1992) Molecular cloning and characterization of onchocystatin, a cysteine proteinase inhibitor of Onchocerca volvulus. J Biol Chem. 267:17339-46.；Schonemeyer, A., Lucius, R., Sonnenburg, B., Brattig, N., Sabat, R., Schilling, K., Bradley, J. & Hartmann, S. (2001) Modulation of human T cell responses and macrophage functions by onchocystatin, a secreted protein of the filarial nematode Onchocerca volvulus. J. Immunol. 167: 3207 - 3215）のcDNAを、全長の配列由来のプライマー（Ov17：順方向プライマー：5'- gttcagttgcaaggagcc-3'、逆方向プライマー： 5'tcatacttcttttgttccc3'；Av17：順方向プライマー：5'gttttggtgcgctgtgaa3'、逆方向プライマー：5'-tcacactgatgagagtac-3'）を使用するPCRによって増幅した。Tオーバーハングベクター（pGEM-T Easy Vector Systems; Promega, Madison, WI）中へPCR断片をクローニングし、6個のヒスチジンのリーダーを有するポリペプチドを生じる発現ベクター（pET-28 System; Novagen, Madison, USA）のEcoRI部位中へさらにサブクローニングした。コンピテントイー・コリBL21細胞中へプラスミドを形質転換した。イソプロピルガラクトシド（IPTG）による誘導後の細菌タンパク質の分析によって、発現のための形質転換体のスクリーニングを実施した。1.5mLの培養物の細胞ペレットをSDS-PAGE後のクーマシーブルーによる染色によって分析した。ニッケル-NTA-カラムを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、グリセロールPBSバッファー（10％グリセロール含有リン酸バッファー塩類溶液（PBS））を使用して、イー・コリ可溶化液からリコンビナントタンパク質を精製し、その後、pH変化（pH6〜pH5〜pH3）によって、カラムから溶出した。その後、溶出したタンパク質をPBS/0.05％トリトンに対して透析し、濾過滅菌した。
【００４８】
［実施例２］
配列比較
図５は、多様なシスタチン配列、およびアカントケイロネマヴィテアエ由来のシスタチンと回旋糸状虫との間の配列比較、および自由生活している線形動物である線虫（Caenorhabditis elegans）由来の2つのシスタチン（I＋II）との上述の2つのシスタチンのさらなる配列比較を示す。最初の2つのシスタチン間の同一性は、55.5％であり、アカントケイロネマヴィテアエ由来のシスタチンと線虫由来の2つのシスタチン（I＋II）との間の同一性はそれぞれ、22.9％および26.8％である。回旋糸状虫のシスタチンと線虫由来のシスタチンIおよびIIとの間の同一性はそれぞれ、31.0％および31.6％である。
【００４９】
［実施例３］
アレルギー性気道炎症および大腸炎に関する動物モデル
気道炎症モデル
重度の気道炎症を伴う喘息のためのモデルとして、以下の動物モデルを供した。ミョウバン（2mg）中の卵白アルブミン（OVA）（第VI等級：Sigma Deisenhofen, Germany）（20μg/200μL PBS）を使用して、BALB/cマウスを2回感作した。OVAを使用した2回目の感作の14日後、その後の2日間で、50μL PBS中の100μg OVAを鼻腔内に使用して、マウスを誘発した。気道の誘発の2日後、肺の機能をインビボで検査した。1日後、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄（BAL）を実施した（Stock et al, 2004, European Journal of Immunology; 34: 1817-1827）。その後、リンパ組織を単離した。シスタチンの投与に関し、リコンビナントに生成したタンパク質（20μgまたは5μg）を1週間の間隔で4回投与し、アレルゲン（OVA）の投与の2時間前に1回目の感作で開始した。線形動物シスタチンを腹腔内投与した。気道誘発時に、線形動物シスタチンを投与しなかった。より具体的には、200μLの総容積中のアジュバントとして水酸化アルミニウム（Imject（登録商標）Alum, Pierce, Rockford, USA）2mg中で乳化した20μgの卵白アルブミン（第VI等級、Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany）を使用して腹腔内に2回（第0日目および第14日目）で、雌BALB/cマウス（Harlan-Winkelmann, Bachem, Germany）を感作した。第28日目および第29日目に、50μL PBS中の50μgの卵白アルブミンをマウスに鼻腔内負荷した。Witzenrath et al., 2006, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 291, 466-472に記載されるように、メタコリン（Sigma）の増大する用量による負荷の後、無拘束のマウスにおいて第31日目に全身プレチスモグラフィーを介して、気道の反応性を測定した。PBS中のリコンビナントA. ヴィテアエシスタチン（20μg）またはコントロールタンパク質の同一量（両タンパク質はアジュバントなしで適用した）を、感作中に毎週の間隔で4回（卵白アルブミンの腹腔内注射の2時間前）に、または気道のアレルゲン負荷の前の感作後に3回、腹腔内注射した。感作手段のためのコントロールとしてのPBS中の水酸化アルミニウムで、未処置のコントロール動物を処置し、卵白アルブミンの代わりにPBSをこれらの動物に鼻腔内負荷した。
【００５０】
以下のパラメータを測定した。
【００５１】
肺機能の測定
気管支収縮剤（bronchostringent）メタコリンの上昇する薬用量の吸入によって誘発を使用してマウスの肺機能を測定し、その後、全身のプレチスモグラフにおいて測定した。動物を含有するプレチスモグラフと参照チャンバーとの間の圧力差を測定した。動物の呼吸周期中の圧力差は、数式を使用して増大した休止（「Penh」または「増大した休止」）として示されることが可能であり、実験動物間の呼吸収縮に関する指数として示されることが可能である（Hamelmann et al., 1997 Am. J. Respir. Crit. Care. Met.: 156:766-775）。
【００５２】
0.8mL PBS＋プロテアーゼ阻害剤（complete（商標） Mini, Boehringer Mannheim Germany）を各動物の肺中へ注入することによって、気管支肺胞洗浄を2回実施した。最初の洗浄液を4℃、2200rpm（320g）で10分間遠心分離し、上清を除去し、その後のサイトカイン分析用に-20℃で保存した。2回目の洗浄液を室温（2200rpm、10分間）で遠心分離し、両洗浄液の細胞ペレットをプールし、1mLのPBS中に再懸濁した。（サイトスピン遠心分離、10分間、800rpmを使用して）細胞懸濁液100μLをガラススライド上で遠心分離して単層を作製し、固定溶液、エオシンおよびチアゾ色素中で染色した。その後、製造元（Fisher Diagnostic Scientific, Schwerte, Germany）の説明書に従った組織学的な標準プロトコールを使用して、好酸球、マクロファージ、リンパ球および好中球の数を測定した。
【００５３】
気管支周囲のリンパ節における調節T細胞の定量化および前記調節T細胞のサイトカイン産生
特異的表面マーカー（CD4、CD25、CD103）および転写因子Foxp3の発現を用いて、FACSを使用して、調節T細胞を測定した（Lehmann et al, PNAS USA, 2002; 99:13031-13036）。OptEIA（商標）キットを使用するBDE Biosciencesの製造元の説明書に従って実施されるELISAを使用して、気管支肺胞洗浄および脾臓の細胞のサイトカイン（IL-4、IL-5、IL-10）の産生を測定した。より具体的には、表面マーカーCD4、CD25およびCD103（49）ならびに転写因子Foxp3の発現によって、気管支周囲のリンパ節中の調節T細胞を特徴付けた。冷PBS/0.2％BSA中で細胞を洗浄し、抗CD4-FITC（BD Biosciences、クローンRM4-5）、抗CD25-APC（BD Biosciences、クローンPC61）、抗CD103-Bio（Alexander Scheffold, DRFZ, Berlinから寄贈、クローンM290）およびストレプトアビジン-PECy7（BD Biosciences）を使用して、氷上で15分間染色した。eBioscience（San Diego, USA、クローンFJK- 16s）から購入したPE抗マウスFoxp3染色キットを使用して、製造元の説明書に従って、Foxp3染色を実施した。抗マウスFcγR（クローン2.4G2、Alexander Scheffold, DRFZ, Berlinから寄贈）の添加によって、抗体の非特異的な表面結合を防止した。全ラットIgG（Jackson Laboratories, Cambridgeshire, UK）によるブロッキングによって、Foxp3の染色中の非特異的な細胞内結合を阻害した。LSR II（BD Biosciences）上でFACS分析を実施した。
【００５４】
総IgEおよびアレルゲン特異的IgE産生
ELISAを使用して、血清中の総IgE濃度およびOVA特異的IgE濃度を測定した。総IgE力価を測定するために、捕捉抗体としての抗IgE抗体、（PBS/トゥイーン中で1：100に希釈した）実験動物の血清および検出抗体としてのビオチン化抗IgE抗体を使用して、サンドイッチELISAを実施した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（1：10,000）とのインキュベーションの後、基質TMBの反応を460nmで測光法で検出した。濃度を決定するために、市販のIgE標準物質を使用した。同一の方法を使用して、アレルゲン特異的IgEの測定を実施したが、血清を1：2および1：10に希釈し、検出分子としてビオチン化アレルゲン（3μg/mLの卵白アルブミン50μl）を使用してインキュベートした。ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（1：10,000）およびTMBを等価で使用した。
【００５５】
シスタチン処置したマウスのサイトカイン産生
密度勾配遠心分離（Lympholyte-M, Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada）によって、脾臓単核細胞（MNC）を単離し、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミンおよび10％FCS（Hyclone）を有するRPMI 1640中で、50μg/mL卵白アルブミンまたは10μg/mL Av17または10μg/mL DHFRの存在下で72時間培養した。サイトカインELISA（IL-4、IL-5、IL-10 BD OptEIA；TGFβ R&D）の実施まで、細胞培養上清を-20℃で保存した。BAL細胞によって産生されたサイトカインを同一の方法で分析した。7300Real-Time PCR System（Applied Biosystems, New Jersey, USA）およびTaqMan試薬（TGF-βプライマーおよびプローブ：Mm 00441729_gl, Applied Biosystems；ハウスキーピング遺伝子GAPDH (グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素): Mm 99999915_gl, Applied Biosystems）を使用して、肺組織中でのTGF-βの発現レベルを分析するためのリアルタイムPCRを実施した。
PCR条件：95℃で10分間の後、95℃で15秒および60℃で1分間の40サイクル。Livak et al., 2001, Methods, 25, 402-408に記載されるDDCｔ法を使用して、内在性GAPDHコントロールに相対的なTGF-βの発現を測定した。
【００５６】
マクロファージの枯渇
クロドロン酸リポソームを鼻腔内におよび腹腔内に適用する（100μL/回）ことによって、マクロファージを枯渇させた。他のどこかに記載されるように（Van Roijen N 1994, J. Immunol. Methods., 174, 83-93）、クロドロン酸リポソームを調製した。簡潔には、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを真空蒸発させ、窒素条件下で穏やかに振盪することによって生じる多層状小胞にクロンドロン酸を充填した。滅菌PBSによって2回洗浄し、同一のバッファー中で再懸濁するまで、小胞を窒素下に維持した。フローサイトメトリーまたは組織学的細胞分化のそれぞれによって、マクロファージ枯渇を分析した。負荷の5日前に、100μgの抗CD25抗体（クローンPC61、Alexander Scheffold, DRFZ, Berlinから寄贈）の腹腔内適用によって、Treg細胞を枯渇させた。フローサイトメトリーによって、Treg枯渇を確認した。抗IL-10受容体抗体（クローン1B1、Kirsten FaIk, MDC, Berlinから寄贈）を各回500μgでフィラリア性シスタチンとともに3回腹腔内適用した。ラット由来のアイソタイプの一致したコントロール抗体をコントロールとして供した（Sigma/Aldrich, St. Louis, USA）。
【００５７】
大腸炎モデル
体重18〜20gの7〜8週齢の雄C57BL/6マウスを実験に使用した。調節されたSPF条件下で、動物を22℃で飼育した。動物の保護に関する独国の法律に従って、すべての実験を実施した。2.5％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS、1モルの分子量40000、ICN, Eschwege, Germany）を含有する滅菌飲料水をマウスに7日間供給した。コントロール動物には、DSSを含まない水道水を供給した。200μLバッファー中の20μgのrAv17またはコントロールタンパク質rDHFRを使用して、7日間にわたるDSS供給を通じて、マウスに4回腹腔内処置した（第1、3、5および7日目）。さらなる群は、DSSを受容し、タンパク質適用バッファーで偽処置した。糞便の様相および体重減少を毎日モニターした。急性モデルにおいては、動物を第8日目に頸椎脱離によって屠殺したのに対し、慢性モデルの動物は、正常な飲料水での回復の5日間を挟む2回のさらなるDSS/タンパク質処置サイクルを通過した。切開当日、回盲接合部と近位直腸との間で、結腸を切除した。結腸を非吸着表面上に配置し、定規で測定した。結腸全体を3つのセグメント（近位、中間および遠位）に分割し、各セグメントの一部を10％中性緩衝ホルマリン中で固定した。固定後、標本をパラフィン中に包埋し、7μm切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、炎症の程度を評価した。上皮の損失および炎症性浸潤に関して0〜8のスコア（8が最も重度である）を割り当てた。マウスを個々にスコア化し、各値は、結腸の遠位の3番目の平均スコアおよび3つの部分を表した。
【００５８】
シスタチンペプチドによるIL-10の誘導
ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミンを有する氷冷RPMI1640で腹腔を3回洗浄することによって、雄のBALB/cマウスの腹膜滲出細胞を回収した。平底プレート中に細胞を播種し（2×105個/ウェル）、37℃で2時間接着させた。洗浄後、200μLの最終容積中でシスタチン由来のペプチド1μg/mLとともに細胞を24時間インキュベートした。ELISAによって、IL-10に関して細胞培養上清を分析した（BD OptEIA）。
【００５９】
Wilcoxon検定を使用して、統計分析を実施した。データを平均±標準偏差として表す。p＜0.05の値を有意として考慮した。
【００６０】
［実施例４］
実験の結果
アレルギー性気道反応性亢進のマウスモデルにおけるリコンビナントA. ヴィテアエシスタチンによる処置は、マウスにおけるアレルギー性気道炎症に及ぼすA.ヴィテアエシスタチンの影響を示す（図２）。1群あたり5匹のマウスを卵白アルブミン（OVA）で感作し、A. ヴィテアエシスタチン（Av17）で処置した。ミョウバン中の20μg卵白アルブミンでマウスを2回感作し（腹腔内）、2回目の感作後、PBS中の50μgの卵白アルブミンで14日間負荷した（鼻腔内）。20μgのシスタチンまたは5μgのシスタチンを感作期間中に1週間間隔で4回適用した。OVAによる感作および負荷によって、気管支肺胞液中の好酸球数によって反映される細胞総数が有意に増加した。20μg/mLのA. ヴィテアエシスタチンによる同時処置は、好酸球に及ぼすOVAの効果を完全に消滅させた（図２ｂ）。このような強い影響は、シスタチンのより低い用量（5μg/mL）によって観察されることは不可能であった。
【００６１】
感作中のシスタチン（各20μg）の4回用量による処置（予防モデルのスキーム、図１２A）は、気管支肺胞洗浄液（BALF）中の細胞総数を未処置のマウスのレベル（非感作、非負荷）まで有意に低下させた（p＜0.028）が、無関係なリコンビナントコントロールタンパク質であるマウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）による処置は低下させなかった（図１３A）。この効果は、好酸球に関して最も顕著であった（p＜0.05）（図１３B）。感作の後、シスタチンを3回適用した場合、同様の結果を得た（p＜0.02）（負荷前モデルのスキームおよびBALF中の細胞数、図１２B、C、D）。肺組織の組織学的分析は、これらのデータを実証し、肺組織内での細胞浸潤の背景レベルのみを示し、卵白アルブミン/シスタチンで同時に処置されたマウスにおいて免疫産生はほぼ欠失していることを示した（図６）。
【００６２】
アレルギー性気道炎症の第二の特徴は、アレルゲン特異的IgE濃度の有意なアップレギュレーションである。重ねて、図２cにおいて示されるように、本発明者は、OVAによる感作および負荷が、マウスの血清中のOVA特異的IgEの産生を有意に誘導することを明らかにした。しかしながら、シスタチンによる処置は、アレルゲン特異的IgEに及ぼす影響を完全に逆転させた。
【００６３】
シスタチンによる処置も、卵白アルブミン特異的IgEの血清レベル（p＜0.0002）および総IgEのレベル（p＜0.0003）を有意に低下させ、リコンビナントコントロールタンパク質であるDHFRの注入後には見られない効果であった（図１４A、B）。この効果は、卵白アルブミン特異的IgG1およびIgG2aの血清レベルが、感作され負荷されたコントロールと比較して有意に変化しなかったので、IgEに対して特異的であった（データ非表示）。卵白アルブミン特異的および総IgE産生の有意な阻害に伴って、シスタチン/卵白アルブミン処置したマウス由来の血清の、好塩基球の脱顆粒を誘導する能力が低下した（図１５A、B）。アレルゲン誘発性感作および気道炎症に及ぼすシスタチンの効果に伴って、予防モデルおよび負荷前モデルにおける処置されたマウスにおけるインビボでの気道反応性亢進（AHR）の発達が有意に低下した（p＜0.028）。これらのデータは、シスタチンが、炎症細胞の動員およびIgE産生に干渉し、したがって、感作中および感作後の両者でこのマウスモデルにおけるアレルゲン誘発性変化の主要な特徴を阻害することを示唆する。
【００６４】
気道反応性亢進の別の顕著な特徴は、サイトカインに及ぼすシスタチン処置の影響である。アレルギー反応の低下の原因となるメカニズムを決定するために、本発明者は、実験動物のサイトカインパターンを分析した。OVA/シスタチンで処置されたマウスのBALFは、OVAのみで処置された動物またはOVA/DHFRで処置された動物のBALFと比較して少量のIL-4を含有した。この効果は、OVAで再刺激したマウスの脾臓細胞も、有意に少量のIL-4を生じる（p＜0.015）ので、全身性であった（図７ａ、ｂ）。興味深いことに、本発明者は、BALFにおけるIL-10の上昇したレベルを決定することは不可能であったが、切開の時点での脾臓細胞中のIL-10のレベルは、負荷前の４日間シスタチンの最後の用量を受容した動物においては脾臓中で上昇した（p＜0.002）が、より早期に処置された動物においては正常であった（図７ｃ）。BALFおよびOVAにより再刺激された脾臓細胞の培養物中のIL-5のレベルは、シスタチンによる処置によって有意に変化しなかった（図７ｄ）。肺組織中でTGF-βレベルを測定し、リアルタイムPCRによって測定されたOVA群と比較して、OVA/シスタチン処置した群において低下することを発見した（図７ｅ）。これらのデータは、フィラリア性シスタチンによる好酸球、IgEおよびIL-4等のアレルギー反応のエフェクター分子の全体的なダウンレギュレーションに適合する。総じて、これらのデータは、20μgのシスタチンによる反復した処置が、アレルギー性気道炎症を健常個体のレベルにまで低下させることを示す。肺組織の組織学的分析は、これらのデータを実証し、肺組織内での細胞浸潤の背景レベル、および卵白アルブミン/シスタチンで同時に処置されたマウスの粘液産生の背景レベルを示した（図６参照）。
【００６５】
図２のパネルA〜Dは、以下を示す。Ａ：精製されたリコンビナントA. ヴィテアエシスタチンのSDSゲル；B：気管支肺胞液（BALF）中の好酸球数。C：OVA特異的IgEの血清レベル。未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；Av17：20または5μgのAv17によるAv17/OVA処置したマウス。
【００６６】
さらに、A. ヴィテアエシスタチンは、マウスのPBLNにおける調節性T細胞の誘導に及ぼす影響を示した（図３）。重ねて、1群あたり5匹のマウスを卵白アルブミン（OVA）で感作し、A. ヴィテアエシスタチン（Av17）で処置した。ミョウバン中の20μg卵白アルブミンでマウスを2回感作し（腹腔内）、2回目の感作後、PBS中の50μgの卵白アルブミンで14日間負荷した（鼻腔内）。20μgのシスタチンまたは5μgのシスタチンを感作期間中に1週間間隔で4回適用した。調節性T細胞の細胞表面マーカーCD25およびCD103の染色によって調節性T細胞（Treg）を特徴付け、二重ポジティブ細胞は、Tregに対する信頼できる別のマーカーを表す転写因子であるFoxp3が98％ポジティブであった。本分析は、OVAによるマウスの感作およびOVAによるその後の負荷で、未処置のマウスと比較して調節性T細胞の増大するに至らないことを示した。しかし、シスタチンで同時に処置した動物は、調節性T細胞の有意な増大を示した。図３ａは、1群あたりすべての動物のＴregの平均値を示す（n＝5）。図３ｂは、単一動物の代表的なFACSプロット分析を示す。各プロットの右上のパネルに示されているのは、両Tregマーカーに関して二重にポジティブの細胞の％である。これらのデータは、シスタチンの適用によって、これらの有力なサプレッサー細胞の数が増大したことを明確に示す。より具体的には、Treg細胞の割合が、卵白アルブミン-コントロールと比較して（3％対1.9％、p＜0.05）（図１６A）および卵白アルブミン/DHFRコントロールと比較して（3％対2.1％、（p＜0.05）図１６A）、卵白アルブミン/シスタチンで処置した動物において有意に上昇した。Treg細胞の約94〜98％は、Treg細胞に関する信頼できるマーカーであるFoxp3を発現させた（図１８）。シスタチン誘発性免疫調節におけるTreg細胞の役割を分析するために、本発明者は、最初の気道アレルゲン負荷の2日前に、感作した動物を抗CD25抗体で処置し、PBLNCにおけるCD25+Treg細胞の数を完全に減少させた（図６Ａ）。枯渇したTreg細胞を有するシスタチン処置したマウスにおいて、細胞全体ならびに好酸球、アレルゲン特異的IL-4産生およびAHRの発達のレベルは、有意に変化しなかった（データ非表示）。しかし、総IgE（p＜0.002）および卵白アルブミン特異的IgE（p＜0.002）の産生は、操作されていないTreg細胞を有するシスタチン処置した動物と比較して有意に回復した（図１６B、C）。これらのデータは、マクロファージよりも有意に低い程度にもかかわらず、Treg細胞が、気道の反応性亢進に及ぼすシスタチン誘発性効果に関与することを示す。
【００６７】
図３のパネルA〜Bは、A：気管支周囲リンパ節細胞における調節性T細胞（CD4+/CD25+/CD103+）の％；B：1群あたりの単一動物の染色された細胞のFACS-プロット分析。未処置：PBS処置したマウス；OVA：卵白アルブミン処置したマウス；Av17：20または5μgのAv17によるAv17/OVA処置したマウスを示す。
【００６８】
フィラリア性シスタチンはマクロファージを標的にする
シスタチンの免疫調節効果が、マクロファージに依存していることを、インビトロでの先行研究（Schonemeyer et al. 2001, J. Immunol. 2001, Sept. 15; 167 (6) : 3207-3215）が示したので、本発明者は、マクロファージの細胞を枯渇させることによってマクロファージの関連性を研究した。感作中にシスタチン処置を受けたOVAにより感作された動物は、OVAによる負荷の前2日間、クロドロン酸リポソームの適用によって、マクロファージを選択的に枯渇した。この処置によって、CD19およびCD3に対してネガティブなF4/80ポジティブ細胞のFACS染色によって分析されるように、BALFおよび腹膜においてマクロファージの95％が損失した（データ非表示）。OVA/シスタチンで処置したマウスのマクロファージの枯渇は、全BAL細胞（p＜0.008）および好酸球（p＜0.002）の数を、OVA群のレベルまで回復させた（図８a、b）。本処置は、マウス血清中の総IgEレベル（p＜0.05）およびOVA特異的IgEレベル（p＜0.007）（図８c、d）ならびに脾臓中のOVA特異的IL-4レベル（図８e）も部分的に回復させた。同様に、マクロファージの枯渇したOVA/シスタチン処置したマウスのAHRは、OVAのみで処置した動物のレベルにほぼ回復した（p＜0.04）（図８f）。メタコリンの吸入後の呼吸間の休止として、AHRを測定する。総じて、これらの結果は、マクロファージが、炎症細胞の動員の阻害を通じてのシスタチンによるアレルギー反応のダウンレギュレーション、IgEレベルの低下およびIL-4産生の部分的な回復における鍵となる細胞であることを示す。
【００６９】
シスタチンによるアレルギー反応の阻害はIL-10に依存する
本発明者は、IL-10が、シスタチン誘発性免疫調節の鍵となる仲介因子であり得ると仮定し、OVA誘発性気道反応性の負荷前モデルにおける抗IL-10受容体抗体（抗IL-10R）の適用によるその影響を分析した（図１２Bも参照）。OVAによる感作と負荷との間でのシスタチン処置とともに、抗IL-10Rを3回注入した。OVA/シスタチン処置した動物におけるIL-10Rのブロッキングは、全細胞の減少した数を完全に回復させた（p＜0.02）（図９a）。IL-10の中和効果は、BALFにおける好酸球数に関して最も顕著であった（p＜0.02）（図９b）。同様に、AHR値は、OVAのみで処置したマウスと比較して、抗IL10R抗体の適用によって上昇し、OVA/シスタチン群におけるOVA特異的IgE産生は、抗IL10R抗体の適用によって回復した（p＜0.031）（図９c）。しかしながら、OVA/Aｖ17動物における抑制したアレルゲン特異的IL-4産生（p＜0.0003）は、抗IL-10R抗体の適用によって可逆的ではなかった（図９d）。すべての場合において、アイソタイプの一致したコントロール抗体の適用は、有意な効果を有さなかった。これらのデータは、IL-10が、シスタチン誘発性免疫調節の鍵となる仲介因子であるが、また、アレルゲン特異的IL-4の抑制のようなIL-10非依存的メカニズムが、ある役割を担っているように見えることを示す。マクロファージおよびTreg細胞が両者とも、IL-10の強力な源であるので、本発明者は、これらの細胞のいずれがフィラリア性シスタチンによる処置後のIL-10誘導の主たる原因であるかを尋ねた。シスタチンで処置した動物は、卵白アルブミンで処置した動物と比較して、脾臓中のIL-10の有意に上昇したレベルを示した（p＜0.01）（図７Cおよび９E）。しかしながら、マクロファージの枯渇の後、IL-10産生は、卵白アルブミン/シスタチン処置した動物において有意に減少した（p＜0.04）（図９E）のに対し、このような効果は、Treg細胞の枯渇した動物においては観察されなかった。Tregの枯渇したマウスは、上昇したIL-10値の傾向を実際に示した（図９E）。これらのデータは、アレルギー性気道炎症および反応性亢進のシスタチン誘発性調節におけるマクロファージの中心的役割を強調する。
【００７０】
フィラリア性シスタチンは急性および慢性大腸炎を阻害する
シスタチンが、Th1炎症を阻害するかどうかを検討するために、本発明者は、飲料水中の2.5％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の7日間の適用によって誘発される大腸炎のマウスモデルにおける線形動物の免疫調節物質も検査した（図１７）。DSS適用の期間にわたるフィラリア性シスタチンの20μgの4回用量の腹腔内投与によって、DSS/DHFRによる処置と比較した結腸の炎症スコア（54％）の有意な低下（p＜0.03）が明らかとなった（図１０a、b）。慢性大腸炎モデルにおいて、各1週間の間隔を有する1週間の期間の4回のＤＳＳサイクルで動物を処置し、各DSSサイクルの間にシスタチンを４回適用した。急性大腸炎モデルにおけるのと同様に、シスタチンは、63％のDSS/DHFRコントロール群と比較して炎症スコアの有意な低下を結果的に生じた。それゆえ、シスタチンは、慢性および急性の両大腸炎の処置に有用である。
【００７１】
特異的タンパク質ドメインによるマクロファージにおけるIL-10の誘導
本発明者は、シスタチン由来のペプチドが、マクロファージのIL-10産生を誘導する能力を有するであろうかどうかを尋ね、3個のアミノ酸がオーバーラップするシスタチンタンパク質を表す20マーペプチドのライブラリをスクリーニングした。ペプチドライブラリを、BALB/cマウスの腹腔から回収したマウスマクロファージとともにインキュベートすると、シスタチンのIL-10誘導領域が同定され（図１１）、アミノ酸66からアミノ酸115まで到達した。最も強力なIL-10産生は、シスタチンスーパーファミリーにおいてジスルフィド結合を形成すると記載される（Bode et al. 1988, Janowski et al. 2001）2つの保存されたシステイン残基を含有するペプチドであるアミノ酸81〜99によって誘導された。これらのシステイン間の領域は、ヒトシスタチン（25％同一性）のような脊椎動物シスタチンの公知の配列との相同性を示さないが、他の寄生性線形動物のシスタチン内では、回旋糸状虫シスタチンに対する60％、マレー糸状虫シスタチンに対する75％およびリトモソイデスシグモドンティスに対する65％の相同性が決定されることが可能であり、寄生虫特異的モチーフが、IL-10の誘導に関与することを示唆する。
【００７２】
さらに、本発明者は、A. ヴィテアエシスタチンのスカベンジャー受容体CD36との相互作用に関する証拠を有する（図４）。CD36で安定してトランスフェクトされるCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣）を、2つの濃度（2.5μg/mL、5μg/mL）でリコンビナントA. ヴィテアエシスタチン（rAv17）とともにインキュベートした。シスタチンに対するモノクローナル抗体との反応によって、CD36に対する結合を検出した。その後、FITC標識した二次抗体によって、受容体/抗原/抗体を検出した。ポジティブコントロールとして、FITC標識した抗CD36抗体を使用した。本分析は、シスタチンがCD36に結合することを示し、それぞれ20％から71％または89％まで蛍光のポジティブな細胞における有意な増大によって検出されることが可能であった（図４）。マクロファージ等の免疫細胞におけるシスタチンとスカベンジャー受容体CD36との相互作用は、CD36の標的化が、結果的にIL-10の産生および他の抗炎症過程を生じるので、前記相互作用の治療上の可能性を説明することが可能であった。
【００７３】
図４A〜Bは、
（A）アッセイの模式的な線図；B）CD36ネガティブ細胞およびポジティブコントロールと比較したAv17とCD36との相互作用に関する1つの代表的な分析（FITC標識した抗体によるCD36発現細胞におけるCD36の検出）を示す。
【００７４】
図５は、多様なシスタチンの配列比較を示す。A. ヴィテアエおよび回旋糸状虫のシスタチンの、自由生活している線形動物である線虫のシスタチンとのアミノ酸比較は、自由生活している線形動物のシスタチンに対する約30％と比較して、寄生性シスタチン間の56％の同一性を示す。自由生活している線形動物と比較した寄生性線形動物のシスタチンのアミノ酸配列における差異は、特定のタンパク質ドメインによる機能の差異を意味する。
【００７５】
明細書、特許請求の範囲および／または付随する図において開示される本発明の特徴は、個別におよびそのいずれかの組み合わせにおいての両方で、本発明の多様な形態において本発明を理解するための材料であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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