(57)【要約】  展延性で凝集性の形状保持性パテを含む移植可能な医用材料であって、無機質粒子、不溶性コラーゲン繊維、および可溶性コラーゲンを含む移植可能な医用材料が開示されている。本発明の医用材料は、生物学的に活性な因子（例えば、患者における骨もしくは他の組織の欠陥を処置するための骨形成タンパク質）と組み合わせて使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
展延性で凝集性の形状保持性パテを含む移植可能な医用材料であって、前記パテが、６０〜７５重量％の水性液体媒体；パテ１ｃｃ当たり０．２５ｇ〜０．３５ｇのレベルでの、０．４ｍｍ〜５ｍｍの範囲の平均粒径を有する分散無機質粒子；パテ１ｃｃ当たり０．０４ｇ〜０．１ｇのレベルでの不溶性コラーゲン繊維；およびパテ１ｃｃ当たり０．０１ｇ〜０．０８ｇのレベルでの可溶性コラーゲン；を含み、但し不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとの重量比が４：１〜１：１の範囲である、前記移植可能な医用材料。
【請求項２】
前記パテが約６５％〜約７５％の水を含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項３】
パテ中の不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとの重量比が約７５：２５〜約６０：４０の範囲である、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項４】
前記不溶性コラーゲン繊維が、０．０５ｇ／ｃｃ〜０．０８ｇ／ｃｃのレベルにて前記パテ中に存在する、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項５】
前記可溶性コラーゲンが、０．０２ｇ／ｃｃ〜０．０５ｇ／ｃｃのレベルにて前記パテ中に存在する、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項６】
前記可溶性コラーゲンが、０．０２ｇ／ｃｃ〜０．０５ｇ／ｃｃのレベルにて前記パテ中に存在する、請求項４に記載の移植可能な医用材料。
【請求項７】
前記無機質粒子が二相リン酸カルシウムを含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項８】
前記無機質粒子が約０．４ｍｍ〜約２．０ｍｍの範囲の平均粒径を有する、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項９】
不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとの前記重量比が約７５：２５〜約６５：３５であり；前記無機質粒子が、約０．４ｍｍ〜約４．０ｍｍの範囲の平均粒径を有し；前記パテが、不溶性コラーゲン繊維を約０．０５ｇ／ｃｃ〜約０．０８ｇ／ｃｃのレベルにて含み；そして前記パテが、可溶性コラーゲンを約０．０２ｇ／ｃｃ〜約０．０５ｇ／ｃｃのレベルにて含む；請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項１０】
骨形成物質をさらに含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、医用移植材料であるパテに関し、特定の態様においては、医用移植材料であるコラーゲン含有パテに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損を治療するのに種々の材料が提唱されている。従来の骨移植片の他に、幾つかのパテ材料を含めた多くの合成骨移植片代替品が使用されている。
骨の端から端までの成長（ｂｏｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ−ｇｒｏｗｔｈ）を効果的に起こさせるために、移植材料は、実質的な骨格形成物質（例えば、生体適合性セラミックスや他の無機質骨格など）が存在することでメリットを導き出す。このような無機質物質は、一般には硬くて脆い物質である。パテ材料中に実質的な量の無機質粒子を組み込むこと（特に、グラニュールや他の比較的大きな粒子について）は困難であることがわかっている。なぜなら、硬質材料の大きなピースが存在するとパテ塊体が乱され、したがってパテ塊体が容易に崩壊するか又は徐々に侵食され、移植する前の取り扱いに対して必要な、そして移植後の持続性に対して必要な凝集性を失うからである。このことは、骨格形成粒状物の移行や分離を引き起こすので、所望する体積中に効果的な骨成長を達成する上で、そして所望する体積の端から端まで効果的な骨成長を達成する上で幾つかの問題が生じる。
【０００３】
この分野における背景を考慮して、比較的大きめの無機質粒子を高レベルにて組み込んでいるだけなく、展延性と凝集性の望ましい組み合わせを維持する改良されたパテ材料が求められている。特定の態様においては、本発明はこれらのニーズに関する。
【発明の開示】
【０００４】
したがって１つの態様においては、本発明は、無機質粒子とコラーゲンとの組み合わせ物を含んだ展延性で凝集性の形状保持性パテを含む移植可能な骨形成医用材料に関し、ここでコラーゲンが、不溶性コラーゲン繊維およびそれと同重量もしくは相対的により少ない重量の可溶性コラーゲンを含む。したがって１つの実施態様においては、本発明は、６０〜７５重量％の水性液体媒体を含み、そして約０．６ｍｇ／ｃｃ〜約２ｍｇ／ｃｃのレベルにて組み込まれた骨形態形成タンパク質を含む、展延性で凝集性の形状保持性パテを提供する。本発明のパテは、０．４ｍｍ〜５ｍｍの範囲の平均粒径を有する無機質粒子を、全体としてのパテ中に０．２５ｇ／ｃｃ〜０．３５／ｃｃのレベルにて分散状態で含む。本発明のパテはさらに、不溶性コラーゲン繊維を０．０４ｇ／ｃｃ〜０．１ｇ／ｃｃのレベルにて、および可溶性コラーゲンを０．０１ｇ／ｃｃ〜０．０８ｇ／ｃｃのレベルにて含み、但しパテ中の不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとの重量比は４：１〜１：１の範囲である。
【０００５】
他の実施態様においては、本発明は、水性液体媒体を６０〜７５重量％にて、そして０．４ｍｍ〜５ｍｍの範囲の平均粒径を有する分散無機質粒子を０．２５ｇ／ｃｃ〜０．３５ｇ／ｃｃにて含んだ展延性で凝集性の形状保持性パテを含む移植可能な医用材料を提供する。パテはさらに、不溶性コラーゲン繊維を０．０４ｇ／ｃｃ〜０．１ｇ／ｃｃのレベルにて、および可溶性コラーゲンを０．０１ｇ／ｃｃ〜０．０８ｇ／ｃｃのレベルにて含み、但し不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとの重量比は４：１〜１：１の範囲である。このようなパテは、骨伝導材料として（たとえば骨空隙充填剤の用途において）使用することもできるし、および／または、１種以上の骨形成タンパク質を組み込んで骨形成パテをもたらすように変性を施すこともできる。
【０００６】
他の実施態様においては、本発明は、移植可能な医用パテ材料を製造する方法を提供する。本発明の方法は、約０．４ｍｍ〜約５ｍｍの平均粒径を有する粒状無機質材料を崩壊可能なコラーゲンマトリックス中に埋め込んだ状態で含む乾燥多孔性材料を用意することを含む。この乾燥材料は、７０〜９０重量％の粒状セラミック材料と１０〜３０重量％のコラーゲンで構成される。コラーゲンマトリックスは、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンを４：１〜１：１の重量比にて含む。本発明の方法はさらに、乾燥した材料にある量の水性媒体を加える工程、および６０〜７５重量％の水を含む展延性で凝集性の形状保持性パテが得られるようにコラーゲンマトリックスを崩壊させる工程を含む。この実施態様の特定の態様においては、水性媒体は、移植可能な骨形成医用材料が得られるように、骨形態形成タンパク質を約０．６ｍｇ／ｃｃ〜約２ｍｇ／ｃｃのレベルにて水性媒体中に溶解した状態で含んでよい。
【０００７】
さらに他の実施態様においては、本発明は、約０．４ｍｍ〜約５ｍｍの平均粒径を有する粒状セラミック材料を崩壊可能なコラーゲンマトリックス中に埋め込んだ状態で含む乾燥多孔性物体を含む移植材料を提供し、このとき前記乾燥多孔性物体は、７０〜９０重量％の粒状無機質材料と１０〜３０重量％のコラーゲンを含む。コラーゲンマトリックスは、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンを含み、このとき不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンは４：１〜１：１の重量比にて存在する。この乾燥多孔性物体は、コラーゲン繊維と水性コラーゲンゲルと粒状無機質材料との混合物を含んだ、展延性で凝集性の形状保持性パテ材料を形成するよう、生体適合性の水性液体で湿潤可能である。
【０００８】
さらに他の実施態様においては、本発明は、本明細書に記載の医用材料を患者に移植することを含む、患者を処置する方法を提供する。
本発明のさらに他の実施態様ならびに特徴と利点は、下記の説明から当業者には明らかであろう。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の原理の理解を促進するために、特定の実施態様について言及し、これらの実施態様を説明するのに特定の用語を使用する。それでもなお理解しておかねばならないことは、これによって本発明の範囲を限定することは意図しておらず、図示した器具のさらなる変更や改良、および本発明の原理のさらなる応用は、本発明が関係する当業者にとっては普通に考えうるものであると見なされる、という点である。
【００１０】
上記したように、特定の態様においては、本発明は、移植可能な骨形成医用パテ、およびこのような骨形成医用パテを製造するのに有用な方法と材料に関する。本発明の好ましい医用パテ材料は、高い無機質含量、展延性、凝集性、および形状保持性を含めた有利な特性の組み合わせを有する。この点において、本明細書で使用している“展延性の（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）”とは、圧力を加えることによって、該材料を、第１の形状から第２の形状に永久的に変えることができる、ということを意味している。本明細書で使用している“凝集性の（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）”とは、延伸したときに、パテが破断せずにかなり長く伸びるという能力を示すことを含めて、延伸しても、パテが個々のつながった塊体のまま留まる傾向がある、ということを意味している。不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンを含有する本発明のパテという文脈においては、延伸すると、好ましいパテは伸張を示し、その伸張時に、互いにくっついている相当量の相互かみ合いコラーゲン繊維の存在が明らかになる。本明細書で使用している“形状保持性の（ｓｈａｐｅ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）”とは、パテ材料の粘性が高く、圧力を加えなければ、パテ材料は、そのままの形状を保持する傾向がある、ということを意味している。このことは、容易に流動し、したがって表面に施すと水たまりのようになる、より低粘性のペースト形態材料とは対照的である。本発明の特定の特徴においては、成分を新規に組み合わせることで、相当量の大きめの無機質粒子を含有するだけでなく、展延性、凝集性、および形状保持性に関して優れた特性を示す医用パテ材料が得られる。
【００１１】
本発明の態様によるパテは、可溶性コラーゲンと不溶性コラーゲンとの組み合わせ物を含む。“可溶性コラーゲン”とは、酸性の水性環境において個々のトロポコラーゲン分子が溶解する、ということを表わしている。トロポコラーゲンは、コラーゲン繊維のモノマー単位であると見なすことができ、そのトリプルヘリックス構造は明確に理解されている。本明細書で使用している“不溶性コラーゲン”とは、化学的な改質を施さなければアルカリ水溶液や任意の無機塩溶液中に溶解させることができないコラーゲンを表わしており、例えば、皮膚、薄皮、および他の哺乳類もしくは爬虫類の外被などがある。例えば、“天然不溶性コラーゲン”は、動物の皮膚（例えば、ウシ属動物やブタなど）の中間層である真皮［グレイン側（ｇｒａｉｎ  ｓｉｄｅ）と肉のついた側（ｆｌｅｓｈ  ｓｉｄｅ）との間に位置する］から得ることができる。“再生コラーゲン”は、個々のトリプルヘリカル分子に解重合され、溶液にさらされ、そしてフィブリル様の形態に再構築されている、本質的にコラーゲン繊維セグメントである。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様のコラーゲンパテは、可溶性コラーゲンと不溶性コラーゲン繊維を含有する。可溶性コラーゲンと不溶性コラーゲン繊維は、最初に別々に作製し、それから混ぜ合わせることができる。可溶性コラーゲンと不溶性コラーゲン繊維は、ウシ属動物の皮膚から得ることができるが、他のコラーゲン供給源からも作製することができる（例えば、ウシ属動物の腱、ブタの組織、組み換えＤＮＡ技術、および発酵など）。
【００１３】
特定の実施態様においては、本発明は、不溶性コラーゲン繊維をパテ１ｃｃ当たり０．０４ｇ〜０．１ｇのレベルにて、そして可溶性コラーゲンをパテ１ｃｃ当たり０．０１ｇ〜０．０８ｇにて含むパテ形態組成物を提供する。他の実施態様においては、このような組成物は、不溶性コラーゲン繊維をパテ１ｃｃ当たり０．０５ｇ〜０．０８ｇのレベルにて、そして可溶性コラーゲンをパテ１ｃｃ当たり０．０２ｇ〜０．０５ｇにて含む。一般には、本発明のパテは、パテ材料の所望の取り扱いと移植特性に対して有利な形で寄与するために、不溶性コラーゲン繊維を、可溶性コラーゲンの量と同等以上の量（重量％）にて含む。好ましい実施態様においては、コラーゲンマトリックスは、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンを４：１〜１：１の重量比にて、さらに好ましくは約７５：２５〜約６０：４０の重量比にて含む。本発明のさらに望ましいパテは、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンを約７５：２５〜約６５：３５の重量比にて、そしてある特定の実施態様においては約７０：３０の重量比にて含む。
【００１４】
本発明の医用パテはさらに、ある量の粒状無機質材料を含む。本発明の特定の態様においては、粒状無機質材料は、本発明のパテ組成物中に、パテ１ｃｃ当たり少なくとも約０．２５ｇのレベルにて、一般には約０．２５ｇ／ｃｃ〜約０．３５ｇ／ｃｃの範囲にて組み込まれる。このような比較的高いレベルの無機質材料は、新たな骨の内なる成長のための骨格をもたらす上で有用となる。
【００１５】
本発明において使用される無機質は、骨の内なる成長のための骨格をもたらすのに有効な、天然もしくは合成の無機質を含んでよい。例えば、無機質マトリックスは、骨片、バイオグラス（Ｂｉｏｇｌａｓｓ）（登録商標）、リン酸三カルシウム、二相リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、コラリン（ｃｏｒｒａｌｉｎｅ）ヒドロキシアパタイト、および生体適合性セラミックからなる群からの１種以上の材料から選択することができる。二相リン酸カルシウムは、本発明において使用するための特に望ましい合成セラミックである。このような二相リン酸カルシウムは、約５０：５０〜約９５：５の、さらに好ましくは約７０：３０〜約９５：５の、さらに好ましくは約８０：２０〜約９０：１０の、そして最も好ましくは約８５：１５のリン酸三カルシウム：ヒドロキシアパタイト重量比を有してよい。無機質材料は、約０．４ｍｍ〜約５．０ｍｍの、より一般的には約０．４ｍｍ〜約３．０ｍｍの、そして望ましくは約０．４ｍｍ〜２．０ｍｍの平均粒径を有する粒子状物質であってよい。
【００１６】
本発明の他の態様においては、無機質材料は、粒状無機質材料に関して上記したうちの平均粒径をもたらすように粉砕された骨片（網状骨でもよいが、好ましいのは皮膚性骨である）を含んでよい。ヒトからの骨源も、ヒト以外からの骨源も、本発明において使用するのに適しており、骨は、移植を受け入れるよう、哺乳類に対して本質的に自己移植片であって、同種移植片であっても、あるいは異種移植片であってもよい。当業界に公知の適切な前処理を施して、骨片を無機質材料として、または無機質材料中に使用した場合に、疾病伝播および／または免疫原性反応のリスクを最小限に抑えることができる。
【００１７】
１つの実施態様においては、免疫原性を低下もしくは除去するよう前処理された異種骨が、移植組成物における多孔性無機質マトリックス中に、または多孔性無機質マトリックスとして使用される。例えば、骨を焼成するか、あるいは骨からタンパク質を除去して、移植材料に対する免疫原性反応のリスクを低下させることができる。
【００１８】
本発明のパテ形態組成物は、液体キャリヤー（一般には、水、塩水、または緩衝液などの水性液体である）をかなり高い割合で含んでよい。１つの態様においては、本発明の展延性で凝集性の形状保持性パテは、約６０〜７５重量％（好ましくは約６５〜７５重量％）の水性液体媒体（例えば水）を含む。
【００１９】
パテ形態組成物はさらに、骨形態形成タンパク質を、哺乳類（例えばヒト患者）に移植したときにパテを骨形成性にするのに効果的な量にて含んでよい。１つの実施態様においては、本発明のパテ組成物は、骨形態形成タンパク質を、パテ１ｃｃ当たり約０．６ｍｇ〜約２ｍｇのレベルにて（好ましくはパテ１ｃｃ当たり約０．８ｍｇ〜約１．８ｍｇのレベルにて）含む。
【００２０】
前述したように、本発明の組成物は一般に、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとを、例えば約４：１〜約１：１の重量比にて含む。本発明のパテ組成物は、不溶性コラーゲン繊維を可溶性コラーゲンより多く含む（例えば、重量比にて約７５：２５〜約６０：４０、さらに望ましくは約７５：２５〜約６５：３５、そして特定の実施態様においては約７０：３０）のが好ましい。これらの目的に適う適切なコラーゲン物質は、文献にて公知の方法を使用して作製することもできるし、あるいは工業用供給源［例えば、Ｓｅｍｅｄ  Ｓとして知られている可溶性コラーゲン、Ｓｅｍｅｄ  Ｆとして知られている繊維質コラーゲン、およびＰ１０７６として知られている複合コラーゲン；ペンシルベニア州エクストンのケンシーナッシュ社製造］から得ることもできる。
【００２１】
本発明の方法および／または組成物においては、例えば、得られた自己骨や他の適切な骨形成物質を含めた任意の適切な骨形成物質を使用することができる。特定の実施態様においては、骨形成物質は、骨の形成を引き起こす上で効果的な成長因子を含んでよい。成長因子は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）として一般的に知られている種類のタンパク質であるのが望ましく、特定の実施態様においては組み換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰであってよい。これらのＢＭＰタンパク質は、骨形成作用、軟骨形成作用、および他の成長・分化作用を有することが知られており、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ−４（ｒｈＢＭＰ−２Ｂとも呼ばれる）、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈＢＭＰ−６、ｒｈＢＭＰ−７（ｒｈＯＰ−１）、ｒｈＢＭＰ−８、ｒｈＢＭＰ−９、ｒｈＢＭＰ−１２、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−１３、ｒｈＢＭＰ−１５、ｒｈＢＭＰ−１６、ｒｈＢＭＰ−１７、ｒｈＢＭＰ−１８、ｒｈＧＤＦ−１、ｒｈＧＤＦ−３、ｒｈＧＤＦ−５、ｒｈＧＤＦ−６、ｒｈＧＤＦ−７、ｒｈＧＤＦ−８、ｒｈＧＤＦ−９、ｒｈＧＤＦ−１０、ｒｈＧＤＦ−１１、ｒｈＧＤＦ−１２、およびｒｈＧＤＦ−１４などがある。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７は、米国特許第５，１０８，９２２号、第５，０１３，６４９号、第５，１１６，７３８号、第５，１０６，７４８号、第５，１８７，０７６号、および第５，１４１，９０５号に開示されており；ＢＭＰ−８はＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示されており；ＢＭＰ−９はＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示されており；ＢＭＰ−１０は米国特許第５，６３７，４８０号に開示されており；ＢＭＰ−１１は米国特許第５，６３９，６３８号に開示されており；ＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３は米国特許第５，６５８，８８２号に開示されており；ＢＭＰ−１５は米国特許第５，６３５，３７２号に開示されており；ＢＭＰ−１６は米国特許第５，９６５，４０３号と第６，３３１，６１２号に開示されている。有用の可能性のある他の組成物としては、Ｖｇｒ−２、および成長・分化因子のいずれか１種（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５、ＷＯ９４／１５９４９、ＷＯ９５／０１８０１、ＷＯ９５／０１８０２、ＷＯ９４／２１６８１、ＷＯ９４／１５９６６、ＷＯ９５／１０５３９、ＷＯ９６／０１８４５、ＷＯ９６／０２５５９、および他のＰＣＴ出願に開示の組成物）がある。さらに、本発明において有用であると思われるのは、ＷＯ９４／０１５５７に開示のＢＩＰ；ＪＰ公開番号７−２５０６８８に開示のＨＰ００２６９；およびＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示のＭＰ５２；である。これら全ての特許および特許出願の開示内容を参照により本明細書に含める。さらに本発明において有用なのは、上記のヘテロダイマーおよび変性タンパク質もしくはそれらの部分欠失生成物である。これらのタンパク質は、単独で使用することもできるし、あるいは２種以上の混合物にて使用することもできる。好ましいのはｒｈＢＭＰ−２である。
【００２２】
ＢＭＰは、遺伝子組み換え技術によって作製することもできるし、あるいはタンパク質組成物から精製することもできる。ＢＭＰは、ホモダイマーであってもよいし、あるいは他のＢＭＰとのヘテロダイマー（例えば、１つのＢＭＰ−２モノマーと１つのＢＭＰ−６モノマーとで構成されるヘテロダイマー）であってもよいし、あるいはアクティビン、インヒビン、およびＴＧＦ−β１等のＴＧＦ−β上科の他のメンバーとのヘテロダイマー（例えば、１つのＢＭＰモノマーと、ＴＧＦ−β上科の１つの関連メンバーとで構成されるヘテロダイマー）であってもよい。このようなヘテロダイマータンパク質の例が、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０９２２９（該特許出願を参照により本明細書に含める）に開示されている。本発明において有用な骨形成タンパク質の量は、前駆細胞に浸潤する骨形成作用の増大を刺激するのに有効な量であり、処置される欠陥の程度と特性、および使用されるキャリヤーとタンパク質の種類、を含めた幾つかのファクターに依存する。特定の実施態様においては、供給すべき骨形成タンパク質の量は約０．０５ｍｇ〜約１．５ｍｇの範囲である。
【００２３】
本発明のパテにおいては、他の治療用成長因子または治療用物質（特に、骨の形成を刺激するのに使用できるもの）も使用することができる。このようなタンパク質は公知であり、例えば、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、軟骨由来骨形態形成タンパク質、成長・分化因子［例えば成長・分化因子５（ＧＤＦ−５）］、および形質転換成長因子（ＴＧＦ−αとＴＧＦ−βを含む）などがある。同様に、生物学的に誘導される他のマトリックス物質［例えば脱塩骨マトリックス（ＤＢＭ）］も、本発明のパテ中に組み込むことができる。
【００２４】
本発明において使用される骨形成タンパク質または他の生物学的に活性な薬剤は、液状配合物（例えば緩衝化水性配合物）の形で供給することができる。特定の実施態様においては、本発明の骨形成パテ材料を作製するために、このような配合物を、乾燥移植材料と混合し、乾燥移植材料上に及び／又は乾燥移植材料中に受け入れ、あるいは乾燥移植材料と組み合わせる。
【００２５】
本発明の組成物をさらに向上させるものとして、当業者は、他の骨形成増進因子を組成物中に組み込むことができる、ということが容易にわかるであろう。このような追加因子としては、宿主適合性の骨形成前駆細胞、自己骨髄、同種骨髄、形質転換成長因子−β、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、ミクログロブリン−β、抗生物質、抗真菌剤、湿潤剤、グリセロール、ステロイド、および非ステロイド系の抗炎症性化合物などがあるが、これらに限定されない。
【００２６】
他の態様においては、本発明は、本発明のパテ材料を製造するために、適切な量の水性媒体と混合することができる乾燥移植材料を提供する。乾燥移植材料は、約０．４ｍｍ〜約５ｍｍの平均粒径を有する粒状無機質材料を崩壊可能なコラーゲンマトリックス中に埋め込んだ状態で含む多孔性物体である。乾燥多孔性移植材料は、７０〜９０重量％の粒状無機質材料と１０〜３０重量％のコラーゲンを含む。コラーゲンマトリックスは、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンを、上記の重量比（すなわち４：１〜１：１）にて、好ましくは約７５：２５〜約６０：４０にて、さらに好ましくは約７５：２５〜約６５：３５にて、そして特定の実施態様においては約７０：３０にて含む。さらに、前述したように、粒状無機質材料は、一般には０．４ｍｍ〜３．０ｍｍの平均粒径を、さらに好ましくは０．４ｍｍ〜２．０ｍｍの平均粒径を有する。
【００２７】
乾燥多孔性物体は、約０．１ｇ／ｃｃ〜約０．３ｇ／ｃｃの密度を有し、さらに望ましくは約０．１５ｇ／ｃｃ〜約０．２５ｇ／ｃｃの密度を有し、そして特定の態様においては約０．１８ｇ／ｃｃ〜約０．２５ｇ／ｃｃの密度を有する。このような乾燥多孔性移植物体はさらに、少なくとも約５０％の気孔率を示し、さらに望ましくは少なくとも約７０％から最大で約９０％の気孔率を示し、そして特定の実施態様においては約８０％〜約９０％の範囲の気孔率を示す。
【００２８】
本発明の乾燥多孔性移植物体は、円筒体、立方体、または他の形状を含めた任意の適切な形状にて提供することができる。特定の態様においては、乾燥多孔性移植物体は、種々の量の湿潤液体（例えば、乾燥移植材料からパテを製造する際に使用される）を受け入れるためのリザーバーを画定することができる。
【００２９】
乾燥多孔性物体は、例えば、乾燥成分を含有する液体媒体をキャストすること、次いで任意の適切な手段（例えば、空気乾燥や凍結乾燥）によって前記液体媒体を乾燥することを含む、任意の適切な方法を使用して製造することができる。
【００３０】
図１を参照すると、本発明の乾燥多孔性移植物体１１が示されている。物体１１は、リザーバー１３を画定する注型材料１２を有する。リザーバー１３は、底部表面１４と側壁１５を有していて、パテの形成時に物体１１を湿潤させるのに使用される液体を収容することができる（液体をリザーバー１３に簡便に仕込むことができ、時間の経過に従って液体を物体１１中に吸収させることができるようになっている）。物体１１は、リザーバー１３を取り囲んでいる上表面１６、側壁１７、および底部表面１８を有する。
【００３１】
図２を参照すると、本発明の１つの実施態様による他の乾燥多孔性移植物体２１が示されている。移植物体２１は、形状が円筒形であって、円形断面を有する。したがって移植物体２１は、ほぼ同等またはそれ以上の断面寸法を有する円筒形のシリンジバレル内にて簡便に形づくることができる。移植物体２１は、第１の端部２２、第２の端部２３、および滑らかで丸い外表面を含む。
【００３２】
使用する際には、乾燥多孔性物体（例えば１１，１２）と充分な量の液体物質（例えば水性媒体）とを混合して、本明細書に記載のパテ形態材料を製造することができる。物体（１１，１２）は崩壊可能な特性を示し、したがって物理的操作（例えば、手による圧潰や混練）によって崩壊させて、液体と混合したときにパテを形成させることができる。このように、乾燥材料中のコラーゲン物質間の化学的な共有架橋結合（起こりうる場合）は、一般には極めて少ない。物体（１１，２１）に完全性をもたらす他の方法［例えば、デヒドロサーマル架橋（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ）、あるいはイオン結合もしくは水素結合によって付与される架橋または密着力］も使用することができる。したがって理解しておかねばならないことは、乾燥多孔性物体（１１，２１）中には架橋結合が存在してよいが、本明細書に記載のパテを形成させるのは、該物体を崩壊可能のままにさせておくこのような特性である、という点である。
【００３３】
一般には、本発明の乾燥多孔性移植物体と液体キャリヤーとを混合し、得られた塊体に対して物理的な混練もしくは他のミキシングを施すと、乾燥多孔性物体の体積が減少する［例えば、パテの体積は、最初の移植物体の体積の約３０％〜約７０％（より一般的には約４０％〜約６０％）となる］。これは、比較的低い多孔性もしくは非多孔性のパテ移植組成物を形成するよう、乾燥移植物体の最初の多孔性が壊れたことによるものである。液体キャリヤーは一般に、例えば、滅菌水、生理的食塩水、血液、骨髄、骨髄フラクションや他の骨髄溶液（補助溶媒を含む場合と含まない場合）、エマルジョン、または懸濁液を含めた、本発明のパテが得られるように充分な湿潤特性をもたらす水性物質である。
【００３４】
使用する際には、本発明のパテ移植組成物は、例えば、疾患、欠損、もしくは外傷の所在を処置するために、および／または、人工関節の固定を促進するために、骨成長が必要とされる部位に移植される。本発明の組成物は、パテ形態であることから、新たな骨成長が必要とされる空隙、欠損、または他のエリア内での位置決め、造形、および／または成形が可能である。特に有利な実施態様においては、本発明のパテ材料の形状保持特性は、骨質の移植部位において、身体の隣接軟組織が突き当たったときに相当程度の圧縮に耐えるよう、充分な三次元完全性をもたらすのが望ましい。
【００３５】
本発明の医用パテ組成物を使用して処置することができる骨修復部位としては、例えば、負傷に起因する部位、外科手術の過程においてもたらされる欠損、感染症、悪性腫瘍、または発生奇形などがある。本発明のパテ組成物は、単純および複雑な骨折と癒着不能；外固定術と内固定術；関節固定等の関節再建術；一般的な関節形成術；臀部のカップ関節形成術；大腿骨頭置換術と上腕骨頭置換術；大腿骨頭表面置換術と全関節置換術；脊椎固定と内固定を含めた脊椎の修復；腫瘍の手術（例えば、欠損の充填）；円板除去術；椎弓切除術；脊椎腫瘍の切除；前頚部手術と胸部手術；脊椎損傷の修復；脊柱側弯症、脊柱前弯症、および脊柱後弯症の処置；骨折の顎間固定術；顎部形成手術；顎関節置換術；歯槽堤の増強と復元；インレー・オステオ移植（ｉｎｌａｙ  ｏｓｔｅｏｉｍｐｌａｎｔｓ）；移植の配置と修正；サイナス・リフト（ｓｉｎｕｓ  ｌｉｆｔｓ）；およびコスメティック・エンハンスメント（ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）；などを含めた（これらに限定されない）多種多様な整形外科的処置、歯周外科的処置、脳外科的処置、口腔外科的処置、および顎顔面外科的処置において使用することができる。アイソレート（ｉｓｏｌａｔｅ）もしくはアイソレートを含む移植片で修復または置換することができる特定の骨としては、例えば、篩骨、前頭骨、鼻骨、後頭骨、頭頂骨、側頭骨、下顎骨、上顎骨、頬骨、頚椎骨、胸椎骨、腰椎骨、仙骨、肋骨、胸骨、鎖骨、肩甲骨、上腕骨、撓骨、尺骨、手根骨、指の骨、腸骨、坐骨、恥骨、大腿骨、脛骨、腓骨、膝蓋骨、踵骨、足根骨、および中足骨などがあるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の骨形成パテ形態移植組成物は、いったん所定の位置に配置されると、霊長類患者［例えば、より小さな哺乳類（例えば、齧歯動物やウサギ）と比較して、骨形成の速度が比較的遅いヒト］でさえ、所望の部分への骨の内なる成長を効果的に誘発・維持することができる。
【００３７】
本発明の骨形成パテ組成物は、中〜低い程度でのみ血管新生される骨または骨部分に使用されるときに特に有利である。これらのエリアは、骨形成速度がかなり低く、したがってキャリヤーの吸収が速やかであるために困難が増大する。中程度もしくはほんのわずかな程度に血管新生される部位の例としては、例えば、脊椎の横突起もしくは他の後部エレメント、長骨の骨幹（特に、脛骨の中間骨幹）、および頭蓋欠損などがある。本発明のペースト組成物の特に好ましい用途は、ヒトもしくは他の哺乳類における脊椎固定術［例えば、体間後部および／または体間側方固定術を含めて］での脊椎間の関節固定を促進するための移植片としての用途である。例えば、下記の実施例３において説明されているように、組み換えヒトＢＭＰ−２を含有する骨形成パテ組成物は、後側方固定処置において適切に使用され、極めて有利であるとされている自家移植骨（長年にわたって、このような固定における“標準”と考えられている）と比較して、極めて有益な関節固定（Ｘ線写真法と生体力学的方法とによって検査）が達成された。
【００３８】
さらに、本発明の他の態様によれば、本発明のパテ組成物は、例えば少なくとも約１００００Ｎの圧縮強度を有する耐力脊椎移植器具［例えば、固定ケージ、ダボ（ｄｏｗｅｌ）、または骨形成組成物を収容するためのポケット、チャンバー、もしくは他のキャビティーを有する他の器具］中に、前記移植器具上に、あるいは前記移植器具を取り囲む形で組み込むことができ、体間固定等の脊椎固定術において使用することができる。このような用途の１つの例が後述の実施例２に説明されており、該実施例によれば、極めて順調な体間固定を達成するために、本発明の骨形成パテが、耐力体間脊椎スペーサーと組み合わせて使用された（このときも、自家移植骨の場合と比べて遜色がなかった）。
【００３９】
本発明の医用パテ組成物はさらに、例えば、胚組織源もしくは成体組織源から誘導される、および／または培養により採取される前駆細胞および／または幹細胞を含めた、種々の細胞と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明のパテは、処置しようとする患者からの血液、骨髄、もしくは他の組織源から誘導される細胞（自家細胞）を、あるいは同種のドナー源もしくは異種のドナー源から誘導される細胞を組み込むことができる。本発明の特定の実施態様においては、本発明のパテは、例えば２００５年６月１６日付け公開のＭｃＫａｙらによる米国特許公開第２００５／０１３０３０１号、または２００４年７月８日付け出願の米国特許出願第１０／８８７，２７５号（これら特許文献の全開示内容を参照により本明細書に含める）に記載のように作製された強化骨髄フラクションを組み込むことができる。したがってパテ材料は、結合組織増殖成分が強化された骨髄フラクション［すなわち、生物学的サンプルを遠心分離して、サンプルを、結合組織増殖成分を多く含んだフラクションを含めた幾つかのフラクションに分離することによって作製される］を組み込むことができる。結合組織増殖成分を多く含んだフラクションは、分離されたサンプルから単離することができ、例えば、フラクションを、前述した乾燥多孔性物体のための湿潤媒体中に、あるいは前記湿潤媒体として使用することによって、本発明のパテ材料中に組み込むことができる。
【００４０】
本発明はさらに、移植組成物を作製するのに使用することができる医療用キットを提供する。このようなキットは、本発明による乾燥多孔性物体を、パテが形成されるよう、多孔性物体と混合するための水性媒体、および／または、耐力移植片（例えば脊椎スペーサー）等の他の物品、および／または、ＢＭＰ等の骨形成物質と共に含んでよい。１つの特定の形態においては、このような医療用キットは、乾燥多孔性物体、凍結乾燥形態のＢＭＰ（例えばｒｈＢＭＰ−２）、および水性製剤を得るべくＢＭＰを再構成するための水性媒体を含み、この水性媒体と乾燥多孔性物体とを混合して本発明の骨形成パテを作製することができる。
【００４１】
以下に特定の実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。言うまでもないことであるが、これらの実施例は例証のためのものであって、これらの実施例によって本発明が限定されることはない。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
ｒｈＢＭＰ−２を含む本発明のパテの作製
体積が１８ｃｃで重量が約３．８ｇの乾燥多孔性円筒状物体に、ｒｈＢＭＰ−２の緩衝水溶液［１．５ｍｇ／ｍｌ溶液、テネシー州メンフィスのＭｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋからインフューズ（ＩＮＦＵＳＥ）（登録商標）ボーングラフトとして市販］９ｍｌを加えた。乾燥多孔性物体は、不溶性コラーゲン繊維、酸可溶性コラーゲン、およびセラミックグラニュールを含む水性懸濁液を注型し、次いで凍結乾燥することによって作製した。乾燥多孔性物体は約８５％の気孔率を示し、下記の成分で構成された。
【００４３】
【表１】
2009525158.tif 000002
【００４４】
吸収させた後、移植材料と加えたｒｈＢＭＰ−２溶液とを混練することによって充分に混合して、約１０ｃｃの移植可能なパテ材料（約７０重量％の水を含み、約０．３ｇ／ｃｃの二相リン酸カルシウムセラミックグラニュール、０．０５ｇ／ｃｃの不溶性コラーゲン繊維、０．０２ｇ／ｃｃの酸可溶性コラーゲン、および１．５ｍｇ／ｃｃのｒｈＢＭＰ−２を含有する）を作製した。得られた骨形成パテは、取り扱いおよび使用する上で優れた特性を示した。パテは、力を加えなければその形状を保持し、グラニュールを取り込んだ状態にて展延性で凝集性の繊維状塊体を形成し、延伸しても破断することなく伸張した。
【００４５】
（実施例２）
体間脊椎固定術における本発明のパテの使用
手術後６ヶ月での体間固定を果たすために、ヒツジの体間固定モデルを使用して、自家移植片を詰め込んだ５ｍｍ×１１ｍｍ×１１ｍｍのポリエーテルエーテルケトン脊椎スペーサー［ヴェルテ−スタック（ＶＥＲＴＥ−ＳＴＡＣＫ）（登録商標）コーナーストーン（ＣＯＲＮＥＲＳＴＯＮＥ）（登録商標）ＰＳＲ  ＰＥＥＫインプラント、テネシー州メンフィスのＭｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ］と、実施例１の本発明のパテを詰め込んだＰＥＥＫスペーサー（ＩＰ＋ｒｈＢＭＰ−２）とを比較した。ブラインデッドＸ線写真による（ｂｌｉｎｄｅｄ  ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ）方法、生体力学的方法、および組織学的方法を使用して、ヒツジの腰椎の固定モデルにおける体間固定を引き起こすためのこれら処置の有効性を評価した。固定の評価は、ファキシトロン（Ｆａｘｉｔｒｏｎ）高分解能ラジオグラフィー、非破壊生体力学的試験、および対応するマイクロラジオグラフィーによる非脱灰組織学（ｕｎｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）を使用して行った。分析は全て、ブラインデッド法（ａ  ｂｌｉｎｄｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）にて行った。さらに、非脱灰組織学を使用して、本発明のパテの骨適合性を評価した。評価した処置群のほかに、同じ方法を使用して正常な脊椎も評価した。全てのデータ取得が完了したとき、キーをブレイクし（ｋｅｙ  ｗａｓ  ｂｒｏｋｅｎ）、処置群によってラジオグラフィーデータ、生体力学的データ、および組織学的データを解析した。
【００４６】
動物モデル
ヒツジの腰椎とヒトの腰椎の間の生体力学的類似性から、ヒツジの腰椎モデルを使用した。Ｗｉｌｋｅらは、ヒツジの脊椎の生体力学的パラメーター［動きの範囲、ニュートラル・ゾーン（ｎｅｕｔｒａｌ  ｚｏｎｅ）、およびレベル・スティフネス（ｌｅｖｅｌ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）］を特性決定し、ＷｈｉｔｅとＰａｎｊａｂｉによってこれまでに報告されているヒト試験片からのデータ（「Ｗｉｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ：２２（２０）：２３６５−２３７４，１９９７」；および「Ｗｈｉｔｅ  ＡＡ  ａｎｄ  Ｐａｎｊａｂｉ  ＭＭ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ，第２版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ペンシルベニア州フィラデルフィア，１９９０」を参照）と比較した。Ｗｉｌｋｅらは、“異なった荷重方向に対するヒツジ脊椎の動きの範囲は、それらの頭尾動向という点において、文献に報告されているヒト試験片の動きの範囲と定性的には類似している”ということを見出した。彼らはさらに、“この研究において示されたヒツジ脊椎とヒト脊椎との生体力学的類似性に基づいて、ヒツジの脊椎は、脊椎移植片を評価する上での代替物としての機能を果たすことができると思われる”と結論付けた。
【００４７】
外科技術
施設に着いたらすぐに、１２匹のヒツジを、大形動物研究用納屋の適切な放牧地に収容した。ヒツジから虫を駆除し、識別のために耳標を付けた。健康診断を行い、呼吸器系疾患の兆候を有する動物については、それらの静脈血を完全血球算定（ＣＢＣ）に供した。
【００４８】
ヒツジに麻酔をかけた。背部腰椎エリアから羊毛を取り除き、ヒツジを手術台上に腹這いの姿勢で配置した。
腸骨稜自家移植片取り入れ：  自家移植片を対照標準として使用した。下記のプロトコルに従った。背部と背側部の腰椎エリアと腸骨稜エリアを、ポビドンヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回こすって、無菌手術ができるように準備した。上記エリアを布で覆い、左腸骨稜の上にて３ｃｍ切開した。臀筋のパーシャル・レフレクション（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を行った後に、骨切りのみを使用して、腸骨稜の頭蓋背部面に小さな窓を作った。キューレットを使用して約２ｃｃの自家網状骨を取り出し、次いで、腰椎固定に使用される移植片の１つ（例えばＰＥＥＫスペーサー）に詰め込んだ（これは対照標準の場合である）。ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ硫酸モルフィネを投与してから、腸骨稜の切断を終結した。皮下組織のための２／０ポリソーブ（ｐｏｌｙｓｏｒｂ）と、皮膚のためのステンレス鋼ステープルを使用して、通常の仕方で腸骨稜部位を閉じた。
【００４９】
腹部（“腹側”）体間固定：  背部と背側部の腰椎エリアを、ポビドンヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回こすって、無菌手術ができるように準備した。上記エリアを布で覆い、平らな腹部に対する腹斜筋を通って横突起まで、Ｌ３／Ｌ４とＬ５／Ｌ６に向けて腹側両面の腹膜後アプローチを行った。
【００５０】
移植片の挿入：  腸骨稜からの骨移植片または研究されている骨移植片代替物（ｒｈＢＭＰ＋パテ）をＰＥＥＫスペーサー（約１．５ｃｃの材料）中に配置し、円板状スペース中に移植し、次いで端板を作成した。
【００５１】
創傷縫合：  外腹筋膜（０ポリソーブ（吸収性縫合糸））、皮下組織（２／０ポリソーブ）、および皮膚（２／０モノフィラメント非吸収性縫合糸）について普通の縫合を行った。各動物に対する手術時間は、通常約４０分であった。周術期の抗生物質（セファゾリンナトリウム）を投与した。ヒツジがまだ全身麻酔状態である間に、手術後のＸ線写真を撮った。
【００５２】
アフターケア：  外科手術の直後に、ヒツジを手術台から改良手押し車に移し、まだ全身麻酔状態の間にＸ線医学室に運び、そこで固定部位の背腹方向と横方向のＸ線写真を撮った。Ｘ線写真による評価の後、また改良手押し車中にある間に、嚥下反射が戻るまでヒツジを観察した。その時点において、ヒツジから抜管し、トレーラーに運び、そこで胸を下面につけた腹ばい状態の姿勢にした。その日の終わりに、その日に手術した全ての動物を研究用放牧地に移動させた。回復するようヒツジを屋外で収容し（３つの方向にシェルターがある）、自由に運動させておいた。術後鎮痛法を前述のように施した。術後３ヶ月にて、ヒツジに麻酔をかけ、Ｘ線撮影した。
【００５３】
安楽死：  術後６ヶ月にて１２匹のヒツジを、人道的方法で安楽死させた。安楽死は、「安楽死に関するＡＶＭＡパネル」（Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２０２：２２９−２４９，１９９３）によって説明されているガイドラインに従って行った。これらのヒツジについて腰椎固定部位のＸ線写真を撮って、Ｌ３−Ｌ４における固定の程度を評価した。
【００５４】
試験片の採集と取り扱い：  安楽死の後、１２匹の動物全てに対して徹底的な肉眼的検視を行った。全ての主要な臓器系に対する従来の肉眼的検査と、病理学的障害（存在する場合）の組織病理学的評価を行った。研究の過程で死んだか又は安楽死させた動物は、徹底的な検視を行って、疾患もしくは死亡の原因を調べた。検視により、固定された腰椎が得られた。
【００５５】
材料の分析：  ヒツジの腰椎エリアからの全てのサンプルを、固定部位についての機械的試験に付した。矢状面と前頭面の曲げモーメント（屈曲、伸張、右横曲げ、および左横曲げ）に対する剛性に関してサンプルを試験した。これらの機械的試験は非破壊的試験であるので、固定部位も組織学的に調べることができた。
【００５６】
移植片材料：  １２の処理した脊椎レベル（Ｌ４−Ｌ５）を評価した。実験グループを下記に示す。
【００５７】
【表２】
2009525158.tif 000003
【００５８】
サバイバルフェーズ（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｈａｓｅ）の実験が完了した後、評価すべく直ちに脊椎を凍結した。
分析方法
１．  処置した腰椎運動セグメントの生体外の生体力学的試験
フレキシビリティ試験
凍結試験片を解凍した後に、全ての脊椎に対して非破壊的な仕方で、制約なしの生体力学的試験を行った。試験は全て、試験片を解凍してから１２時間以内に行った。試験片は１回だけ凍結させた。脊椎と固定塊体構造物だけが（器具類ではなく）試験されるように、生体力学的試験の前に、椎体の前部に施された器具類を取り除いた。運動セグメントのフレキシビリティを、屈曲、伸張、右横曲げ、左横曲げ、右軸回転、および左軸回転に関して調べた。生体力学的試験の目的は、従来から説明されている体間固定処置により増大する、腰椎運動セグメントの剛性を定量化することにある。取り入れた腰椎から処置された（Ｌ４−Ｌ５）運動セグメントを解剖し、異質の軟組織を取り除き、これにより靭帯組織と骨組織を無損傷状態のままに残した。特別に設計された荷重枠と支持枠を、それぞれＬ４椎骨とＬ５椎骨に固定した。
【００５９】
それぞれの荷重方向において、０Ｎｍ、０．５Ｎｍ、２．５Ｎｍ、４．５Ｎｍ、６．５Ｎｍ、および８．５Ｎｍのモーメントが得られた。単なるモーメント（ｐｕｒｅ  ｍｏｍｅｎｔｓ）を加えるために静荷重を使用した。それぞれの椎骨に、赤外線を反射する３つのマーカーを付けた。赤外線反射マーカーの位置は、３つのＶＩＣＯＮカメラ（英国オックスフォードのＶｉｃｏｎＰｅａｋ）を使用して記録した。屈曲、伸張、左横曲げ、右横曲げ、左軸回転、および右軸回転において加えられる単なるモーメントを使用して、三次元荷重−変位データを取得した。３−Ｄ荷重−変位挙動を調べるための３−Ｄ運動解析システムについての基本的な原理は、文献にてよく知られている。
【００６０】
これまでに得られている、正常な（未処置の）無損傷グループのヒツジ腰椎運動セグメントからの生体力学データを、ヒツジのＬ４−Ｌ５に関する正常な腰椎運動に対する基本データとして使用した。損傷グループと正常グループとの間の剛性（フレキシビリティ）の差異を統計的に比較した。パラメーターによらないＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験とＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を使用して生体力学データを解析した。
【００６１】
２．  Ｘ線写真による評価：
手術の直後において（腹背と側面の写真）、一定の術後間隔にて（腹背と側面の写真）、そして犠牲の時点において（腹背と側面の写真）Ｘ線写真を撮った。高解像度ラジオグラフィー装置（ファキシトロン、オレゴン州マクミンビルのヒューレット・パッカード社）と高解像度フィルム（ＥＫＴＡＳＣＡＮ  Ｂ／ＲＡフィルム４１５３、ニューヨーク州ロチェスターのコダック社）を使用して、生体力学的試験の後の取り入れた腰椎の、高解像度の腹背Ｘ線写真と側面Ｘ線写真を得た。ウインドウズＸＰワークステーションに基づいて動作する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン５．０、メリーランド州シルバースプリングのメディア・サイバネティクス社）を使用して、Ｘ線写真をスキャンした。ビデオカメラ（モデルＤＦＣ２８０、英国ケンブリッジのライカ・マイクロシステムズ社）を使用して、Ｘ線写真のデジタル画像を得た。さらに、これらのＸ線写真を使用して、後述するような組織学的分析のためにサンプルをグロス（ｇｒｏｓｓ）した。
【００６２】
３人のｂｌｉｎｄｅｄ評価者が、体間固定に関して得られたファキシトロンＸ線写真を評価した。側面Ｘ線写真については、ディスクスペースの中心部だけでなく前縁と後縁を、下記の採点法に基づいて固定に関して評価した：４＝連続的な骨橋形成、３＝骨密度の増大、２＝半透明で幾らかの骨橋形成、および１＝固定されず。最後に、腹背Ｘ線写真と側面Ｘ線写真に基づいて、ｂｌｉｎｄｅｄ評価者は、下記の基準を使用して脊椎に対する全体的な固定スコアを等級付けした：
３＝体間スペースにＸ線透過性がない連続的な体間固定
２＝体間スペースがＸ線透過性を有する確度の高い固定
１＝ディスクスペースのＸ線透過性がかなり高く、上位から下位への骨橋形成の証拠がない
３．  非脱灰組織学とマイクロラジオグラフィー
プロセシングと染色非脱灰セクション
処置グループの全てに対し、非脱灰法を使用して二分脊椎レベルを分析した（マイクロＸ線写真と複数の染色）。分染法を定性的な光学顕微鏡法と共に使用して、ＰＥＥＫスペーサー内に詰め込んだ自家移植片もしくは骨移植片代替物に関連した骨橋形成と固定の程度を評価した。分染法を使用して、ＰＥＥＫスペーサーに隣接した固定またはＰＥＥＫスペーサー内の固定の程度、ＰＥＥＫスペーサーと骨移植片代替材料（存在する場合）に対する宿主の応答、ＰＥＥＫスペーサーの界面、骨移植片と代替物の組み込み、および固定塊体中での骨再形成を評価した。
【００６３】
ファキシトロンＸ線写真法の後、移植片を含有する全ての脊椎レベルを下記のやり方でグロスした（ｗｅｒｅ  ｇｒｏｓｓｅｄ）。帯鋸を使用して、柄の前面にて脊柱の全長に沿って、前部組織を無傷のままにしておいて前頭面の切れ目を作成した。ディスクスペースに対して後部の組織は廃棄した。次いで、脊椎レベルの前柱をｍｉｄ−ｓａｇｉｔｔａｌｌｙに二分して、右半分と左半分を得た。全体としてのディスクスペースは無損傷のままにした。処置したレベルに隣接したＬ４前柱の下位半分（ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｈａｌｆ）を保持した。処置したレベルに隣接したＬ５前柱の上位半分（ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｈａｌｆ）を保持した。レベルからの右矢状サンプルと左矢状サンプルにラベルを付け、ホルマリン中に固定し、そして処理した（アルコール中にて連続的に水分を取り除き、キシレン代替品中にて透明にし、そしてｇｒａｄｅｄ  ｃａｔａｌｙｚｅｄメチルメタクリレート中に埋め込んだ）。
【００６４】
重合が完了してサンプルが硬化した後に、セクショニングと染色を行った。脊椎レベルの処置面の右半分と左半分を含有するブロックを、低速のダイヤモンドソー（イリノイ州レークブラフのＢｕｅｈｌｅｒ  Ｉｓｏｍｅｔ）によって矢状面にて切開した。埋め込まれた全ての組織ブロックに対し、矢状セクショニングは、脊椎レベルの処置面の中央から始めて処置エリアの外側面まで行った。したがって、“右ブロック”からのセクション＃１は、固定塊体の中央部にてサンプル採取したが、“右ブロック”からのセクション＃６は、処置エリアの遠く離れた外側面にてサンプル採取した。３００μｍのオーダーのセクションを得るのにｗｅｉｇｈｔｓを使用した。約５〜１０のセクションを、体間スペースの各半分を通して、矢状面において作製した。必要に応じて、所望の厚さを得るために粉砕を行った。セクションの厚さは、メートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。三重染色を使用する分別染色を使用することで、組織学的な差別化が可能となった。
【００６５】
ウインドウズＸＰワークステーションで動作する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン５．０、メリーランド州シルバースプリングのメディア・サイバネティクス社）を使用して、染色非脱灰セクションをスキャンした。ビデオカメラ（モデルＤＦＣ２８０、英国ケンブリッジのライカ・マイクロシステムズ社）を使用して、染色非脱灰セクションのデジタル画像を得た。
【００６６】
セクション固定基準：  非脱灰セクションを、ディスクスペースの中央もしくは器具のｔｈｒｕｇｒｏｗｔｈ区域、前縁、および後縁における固定に関して評価した。各セクションに対するこれらの解剖学的位置は、上位から下位への連続的な骨橋形成が認められた場合に限り固定されたものと見なされた。
【００６７】
レベル固定基準：  評価した全てのセクションに基づき、下記の基準を使用して、レベル中に組織学的固定が存在するかどうかを調べた。セクションの５０％以上［対応するマイクロＸ線写真も同時に分析したが、固定に関して“２回のカウント”はしなかった（ｎｏｔ  “ｃｏｕｎｔｅｄ  ｔｗｉｃｅ”）］が連続的な骨橋形成を示した場合には、脊椎レベルが固定されたと見なした。セクションの５０％未満（対応するマイクロＸ線写真）が連続的な骨橋形成を示した場合には、部分的な固定が存在したと見なした。セクションと対応するマイクロＸ線写真のいずれも連続的な骨橋形成を示さなかった場合には、固定は存在しなかったと見なした。
【００６８】
マイクロラジオグラフィー
処置した腰椎レベルからの非脱灰セクションに対し、マイクロラジオグラフィー装置（ファキシトロン、オレゴン州マクミンビルのヒューレット・パッカード社）と分光フィルム（Ｂ／ＲＡ４１５３フィルム４１５３、ニューヨーク州ロチェスターのコダック社）を使用してＸ線写真を撮った。曝露時間を決定するために、これらのセクションの厚さを、メートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。超微細マジックインキでセクションに標識を付け、セクションをＥｋｔａｓｃａｎ  Ｂ／ＲＡ４１５３フィルム上に配置し、それぞれ１００μｍのセクション厚さに対して、２０ｋＶおよび３ｍＡにて約４５秒にわたってＸ線源に曝露した。次いでフィルムを現像し、固定し、そして標準的な光学顕微鏡法を使用して、骨化作用に関して分析した。ウインドウズＸＰワークステーションで動作する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン５．０、メリーランド州シルバースプリングのメディア・サイバネティクス社）を使用して、マイクロＸ線写真をスキャンした。ビデオカメラ（モデルＤＦＣ２８０、英国ケンブリッジのライカ・マイクロシステムズ社）を使用して、マイクロＸ線写真のデジタル画像を得た。
【００６９】
セクションとマイクロＸ線写真を分析して下記のことを行った：
１）  ＰＥＥＫスペーサー、骨移植片、および代替組み込み物に隣接した固定の程度、ＰＥＥＫスペーサー、骨移植片、および代替組み込み物中の固定の程度、ならびに固定塊体中の骨再形成の程度を評価した；
２）  使用される生体材料に対する宿主の応答を調べた；および
３）  ＰＥＥＫスペーサーの界面を評価した。
【００７０】
結果
１．  Ｘ線写真による評価
処置した２つのグループにおいて、良好なＸ線写真固定スコアが得られ、本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループは、自家移植片グループより幾らか良好な性能を示した（平均で２．４に対して２．８、表１）。Ｘ線写真固定スコアと処置との間に関係があるかどうかを調べるために、分割表を作成し（表２）、カイ二乗解析を行った。表２からわかるように、３の固定スコア（連続した固定）を達成するための度数は、自家移植片＋ＰＥＥＫグループの場合が５６％であり、本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループの場合が８３％であった。２の固定スコア（確度の高い固定）を達成するための度数は、自家移植片＋ＰＥＥＫグループの場合が８３％であり、本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループの場合が１００％であった。カイ二乗解析により、本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループのほうが自家移植片＋ＰＥＥＫグループより高いＸ線写真固定スコアを達成する傾向がある、ということがわかった。
【００７１】
【表３】
2009525158.tif 000004
【００７２】
【表４】
2009525158.tif 000005
【００７３】
２．  生体力学による結果
２つの処置した体間固定グループおよび正常な無損傷グループに対する６つの荷重方向における平均剛性を図３〜５に示す。具体的には、図３は、正常な無損傷グループと２つの処置グループの、屈曲荷重と伸張荷重における平均フレキシビリティを示しているチャートである。処置グループと正常無損傷グループとの間の差異は、２つの荷重方向において統計的に有意であった。２つの処置グループ間の差異は、屈曲のみにおいて統計的に有意であった。図４は、正常無損傷グループと２つの処置グループの、右軸回転荷重と左軸回転荷重における平均フレキシビリティを示しているチャートである。処置グループと正常無損傷グループとの間の差異は、２つの荷重方向において統計的に有意であったが、２つの処置グループ間の差異は、統計的に有意ではなかった。図５は、正常無損傷グループと２つの処置グループの、右横曲げ荷重と左横曲げ荷重における平均フレキシビリティを示しているチャートである。処置グループと正常無損傷グループとの間の差異は、２つの荷重方向において統計的に有意であったが、２つの処置グループ間の差異は、統計的に有意ではなかった。
【００７４】
平均すると、２つの処置グループのレベル剛性（ｌｅｖｅｌ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）は、屈曲荷重において、正常無損傷グループより３．１倍（自家移植片＋ＰＥＥＫグループ）および５．４倍（本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループ）高い剛性を有し（ｐ＜０．０００１）、伸張荷重において、正常無損傷グループより４．６倍（自家移植片＋ＰＥＥＫグループ）および６．１倍（本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループ）高い剛性を有した（ｐ＜０．０００１）。２つの処置グループは、軸回転において、レベル剛性が正常無損傷グループより１．７〜３．０倍高く（ｐ＜０．０００４）、また横曲げ荷重において、正常無損傷グループより６．３〜９．３倍高かった（ｐ＜０．０００１）。２つの処置グループのフレキシビリティを比較すると、本発明のパテ＋ＢＭＰ２＋ＰＥＥＫグループのほうが、平均すると全ての荷重方向において剛性が高かった。統計的に有意な差異は、屈曲荷重においてのみ見られた（７４％高い剛性、ｐ＜０．００２）。
【００７５】
（実施例３）
後側方固定術における本発明のパテの使用
機器を備えたヒツジの後側方固定モデルを使用して、自家移植片と［実施例１の本発明のパテ＋ｒｈＢＭＰ−２］（ＩＰ＋ｒｈＢＭＰ−２）が、術後６ヶ月にて後側方固定を果たす能力を評価した。ブラインデッドＸ線写真による方法、生体力学的方法、および組織学的方法を使用して、ヒツジの腰椎固定モデルにおける後側方固定を引き起こす上でのこれら処置の有効性を評価した。固定の評価は、ファキシトロン高分解能ラジオグラフィー、非破壊生体力学的試験、およびマイクロラジオグラフィーによる非脱灰組織学を使用して行った。分析は全て、ブラインデッド法（ａ  ｂｌｉｎｄｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）にて行った。さらに、非脱灰組織学を使用して、骨移植片代替物の骨適合性を評価した。評価した処置群のほかに、同じ方法を使用して正常な脊椎の生体力学的特性も評価した。全てのデータ取得が完了したとき、キーをブレイクし（ｋｅｙ  ｗａｓ  ｂｒｏｋｅｎ）、処置群によってラジオグラフィーデータ、生体力学的データ、および組織学的データを解析した。
【００７６】
動物モデル
ヒツジの腰椎とヒトの腰椎の間の生体力学的類似性から、ヒツジの腰椎モデルを使用した。Ｗｉｌｋｅらは、ヒツジ脊椎の生体力学的パラメーター［動きの範囲、ニュートラル・ゾーン、およびレベル・スティフネス］を特性決定し、ＷｈｉｔｅとＰａｎｊａｂｉによってこれまでに報告されているヒト試験片からのデータ（「Ｗｉｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ：２２（２０）：２３６５−２３７４，１９９７」；および「Ｗｈｉｔｅ  ＡＡ  ａｎｄ  Ｐａｎｊａｂｉ  ＭＭ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ，第２版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ペンシルベニア州フィラデルフィア，１９９０」を参照）と比較した。Ｗｉｌｋｅらは、“異なった荷重方向に対するヒツジ脊椎の動きの範囲は、それらの頭尾動向という点において、文献に報告されているヒト試験片の動きの範囲と定性的には類似している”ということを見出した。彼らはさらに、“この研究において示されたヒツジ脊椎とヒト脊椎との生体力学的類似性に基づいて、ヒツジの脊椎は、脊椎移植片を評価する上での代替物としての機能を果たすことができると思われる”と結論付けた。
【００７７】
外科技術
施設に着いたらすぐに、１２匹のヒツジを、大形動物研究用納屋の適切な放牧地に収容した。ヒツジから虫を駆除し、識別のために耳標を付けた。健康診断を行い、呼吸器系疾患の兆候を有する動物については、それらの静脈血を完全血球算定（ＣＢＣ）に供した。
【００７８】
ヒツジに麻酔をかけた。背部腰椎エリアから羊毛を取り除き、ヒツジを手術台上に腹這いの姿勢で配置した。背部と背側部の腰椎エリアを、ポビドンヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回こすって、無菌手術ができるように準備した。上記エリアを布で覆い、背部腰椎筋肉組織を通してＬ３−Ｌ６への背部アプローチを行った。
【００７９】
腸骨稜自家移植片取り入れ：  自家移植片を対照標準として使用した。下記のプロトコルに従った。背部と背側部の腰椎エリアと腸骨稜エリアを、ポビドンヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回こすって、無菌手術ができるように準備した。上記エリアを布で覆い、左腸骨稜の上にて３ｃｍ切開した。臀筋のパーシャル・レフレクション（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を行った後に、骨切りのみを使用して、腸骨稜の頭蓋背部面に小さな窓を作った。キューレットを使用して約２ｃｃの自家網状骨を取り出し、次いで、腰椎固定に使用される移植片の１つ（例えばＰＥＥＫスペーサー）に詰め込んだ（これは対照標準の場合である）。ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ硫酸モルフィネを投与してから、腸骨稜の切断を終結した。皮下組織のための２／０ポリソーブ（ｐｏｌｙｓｏｒｂ）と、皮膚のためのステンレス鋼ステープルを使用して、通常の仕方で腸骨稜部位を閉じた。
【００８０】
背側（“後外側”）体間固定：  背部腰椎エリアを、ポビドンヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回こすって、無菌手術ができるように準備した。上記エリアを布で覆い、Ｌ３とＬ４および棘突起への背部アプローチができるよう、意図する切開の部位に沿って局所麻酔薬（ブピバカイン）をしみ込ませた。
【００８１】
横突起へのアプローチ：  皮膚を２０ｃｍ切開し、棘突起と薄層から傍脊椎筋を切り離した。面関節およびＬ３とＬ４との間の横突起を露出させた。
器具と脊椎固定技術：  Ｌ３とＬ４の横突起から左右相称に皮質を剥離除去した。腸骨稜からの骨移植片または骨移植片代替物（ｒｈＢＭＰ−２＋本発明のパテ）を、横突起の間に配置した（側部１つ当たり約１０ｃｃ）。ネジとロッドを使用して、ヒツジをトランス柄ねじ固定（ｔｒａｎｓｐｅｄｉｃｕｌａｒ  ｓｃｒｅｗ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）にかけた。処置のこの時点において、柄のねじとロッドを挿入した。
【００８２】
創傷縫合：  外腹筋膜（０ポリソーブ（吸収性縫合糸））、皮下組織（２／０ポリソーブ）、および皮膚（２／０モノフィラメント非吸収性縫合糸）について普通の縫合を行った。各動物に対する手術時間は、通常約５０分であった。周術期の抗生物質（セファゾリンナトリウム）を投与した。ヒツジがまだ全身麻酔状態である間に、手術後のＸ線写真を撮った。
【００８３】
アフターケア：  外科手術の直後に、ヒツジを手術台から改良手押し車に移し、まだ全身麻酔状態の間にＸ線医学室に運び、そこで固定部位の背腹方向と横方向のＸ線写真を撮った。Ｘ線写真による評価の後、また改良手押し車中にある間に、嚥下反射が戻るまでヒツジを観察した。その時点において、ヒツジから抜管し、トレーラーに運び、そこで胸を下面につけた腹ばい状態の姿勢にした。その日の終わりに、その日に手術した全ての動物を研究用放牧地に移動させた。回復するようヒツジを屋外で収容し（３つの方向にシェルターがある）、自由に運動させておいた。術後鎮痛法を前述のように施した。術後３ヶ月にて、ヒツジに麻酔をかけ、Ｘ線撮影した。
【００８４】
安楽死：  術後６ヶ月にて１２匹のヒツジを、人道的方法で安楽死させた。安楽死は、「安楽死に関するＡＶＭＡパネル」（Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２０２：２２９−２４９，１９９３）によって説明されているガイドラインに従って行った。これらのヒツジについて腰椎固定部位のＸ線写真を撮って、Ｌ３−Ｌ４における固定の程度を評価した。
【００８５】
試験片の採集と取り扱い：  安楽死の後、１２匹の動物全てに対して徹底的な肉眼的検視を行った。全ての主要な臓器系に対する従来の肉眼的検査と、病理学的障害（存在する場合）の組織病理学的評価を行った。研究の過程で死んだか又は安楽死させた動物は、徹底的な検視を行って、疾患もしくは死亡の原因を調べた。検視により、固定された腰椎が得られた。
【００８６】
材料の分析：  ヒツジの腰椎エリアからの全てのサンプルを、固定部位についての機械的試験に付した。矢状面と前頭面の曲げモーメント（屈曲、伸張、右横曲げ、および左横曲げ）に対する剛性に関してサンプルを試験した。これらの機械的試験は非破壊的試験であるので、固定部位も組織学的に調べることができた。
【００８７】
移植片材料：
実験グループを下記に示す。自家移植片グループからの動物は死亡し、全ての分析から除外した。したがって、下記の結果における自家移植片グループからの動物の総数は５に減少した。
【００８８】
【表５】
2009525158.tif 000006
【００８９】
サバイバルフェーズ（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｈａｓｅ）の動物実験が完了した後、評価すべく直ちに脊椎を凍結した。後外側固定と骨回復を果たす上での骨移植片や骨移植片代替物の有効性を、後述するＸ線写真分析、生体力学的分析、および組織学的分析によって行った。実験は、ブラインデッド法（ａ  ｂｌｉｎｄｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）にて行った。全ての分析が完了した後で、キーをブレイクし（ｋｅｙ  ｗａｓ  ｂｒｏｋｅｎ）、Ｘ線写真データ、生体力学的データ、および組織学的データを、処置グループにしたがって解析した。
【００９０】
分析方法：
１．  Ｘ線写真による評価：
手術の直後において、一定の術後間隔にて、そして犠牲の時点においてＸ線写真を撮った。ファキシトロン（オレゴン州マクミンビルのヒューレット・パッカード社）高解像度ラジオグラフィー装置と高解像度フィルム（ＥＫＴＡＳＣＡＮ  Ｂ／ＲＡフィルム４１５３、ニューヨーク州ロチェスターのコダック社）を使用して、生体力学的試験後に取り入れた腰椎の、高解像度ＰＡＸ線写真を得た。ウインドウズＸＰワークステーションに基づいて動作する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン５．０、メリーランド州シルバースプリングのメディア・サイバネティクス社）を使用して、Ｘ線写真をスキャンした。ビデオカメラ（モデルＤＦＣ２８０、英国ケンブリッジのライカ・マイクロシステムズ社）を使用して、Ｘ線写真のデジタル画像を得た。さらに、これらのＸ線写真を使用して、後述するような組織学的分析のためにサンプルをグロス（ｇｒｏｓｓ）した。
【００９１】
３人のｂｌｉｎｄｅｄ評価者が、横突間突起固定（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｕｓｉｏｎ）に関して得られたファキシトロンＸ線写真を評価した。ＰＡＸ線写真については、レベルの右側と左側に対し、横突間突起のスペースを、下記の採点法に基づいて固定に関して評価した：４＝連続的な骨橋形成、３＝骨密度の増大、２＝半透明で幾らかの骨橋形成、および１＝固定されず。右側のＰＡＸ線写真と左側のＰＡＸ線写真に基づいて、ｂｌｉｎｄｅｄ評価者は、下記の基準を使用して脊椎レベルに対する全体的な固定スコアを等級付けした：
３＝連続的な固定：右および左に関して連続的な横突間突起固定がなされ、Ｘ線透過性がない；
２＝あり得る固定：右または左に関して横突間突起固定があり得るが、どちらもＸ線透過性がない。右または左の横突間突起スペースがＸ線透過性；
１＝固定なし：右側と左側の両方に関して上位から下位への連続的な骨橋形成のない孤立した骨形成。Ｘ線透過性が高く、右または左に横突間突起固定の証拠がない。
【００９２】
処置コードをブレークした後、Ｘ線写真による固定データを統計的に解析した。
２．  処置した腰椎運動セグメントの生体外の生体力学的試験
フレキシビリティ試験
凍結試験片を解凍した後に、全ての脊椎に対して非破壊的な仕方で、制約なしの生体力学的試験を行った。脊椎と固定塊体構造物の剛性が試験できるように、生体力学的試験の前に、後側方固定を安定化させるのに使用された全ての金属製後部器具類を取り除いた。運動セグメントのフレキシビリティを、屈曲、伸張、右横曲げ、左横曲げ、右軸回転、および左軸回転に関して調べた。試験は全て、試験片を解凍してから１２時間以内に行った。試験片は１回だけ凍結させた。生体力学的試験の目的は、従来から説明されている固定処置により増大する、腰椎運動セグメントの剛性を定量化することにあった。取り入れた腰椎から処置された（Ｌ４−Ｌ５）運動セグメントを解剖し、異質の軟組織を取り除き、これにより靭帯組織と骨組織を無損傷状態のままに残した。特別に設計された荷重枠と支持枠を、それぞれＬ４椎骨とＬ５椎骨に固定した。
【００９３】
それぞれの荷重方向において、０Ｎｍ、０．５Ｎｍ、２．５Ｎｍ、４．５Ｎｍ、６．５Ｎｍ、および８．５Ｎｍのモーメントが得られた。単なるモーメント（ｐｕｒｅ  ｍｏｍｅｎｔｓ）を加えるために静荷重を使用した。６自由度のロードセルを、試験した試験片と直列に配置して、加えられたモーメントを確認した。それぞれの椎骨に、赤外線を反射する３つのマーカーを付けた。赤外線反射マーカーの位置は、３つのＶＩＣＯＮカメラ（英国オックスフォードのＶｉｃｏｎ  Ｐｅａｋ）を使用して記録した。屈曲、伸張、左横曲げ、右横曲げ、左軸回転、および右軸回転において加えられる単なるモーメントを使用して、三次元荷重−変位データを取得した。三次元座標データを解析して、下位椎骨に対する上位椎骨の回転角、および各運動セグメントの回転フレキシビリティを得た。
【００９４】
これまでに得られている、正常な（未処置の）無損傷グループのヒツジ腰椎運動セグメントからの生体力学データを、ヒツジのＬ４−Ｌ５に関する正常な腰椎運動に対する基本データとして使用した。損傷グループと正常グループとの間の剛性（フレキシビリティ）の差異を統計的に比較した。パラメーターによらないＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験とＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を使用して生体力学データを解析した。
【００９５】
３．  非脱灰組織学とマイクロラジオグラフィー
プロセシングと染色非脱灰セクション
処置グループのそれぞれに対し、非脱灰法を使用して二分脊椎の横突間突起スペースを分析した（マイクロＸ線写真と複数の染色）。分染法を定性的な光学顕微鏡法と共に使用して、自家移植片および骨移植片代替物に関連した骨橋形成と固定の程度を評価した。分染法を使用して、骨移植片代替材料に対する宿主の応答を評価した。
【００９６】
ファキシトロンＸ線写真法の後、移植片を含有する全ての脊椎レベルを下記のやり方でグロスした（ｗｅｒｅ  ｇｒｏｓｓｅｄ）。帯鋸を使用して、柄の前面にて脊柱の全長に沿って、前部組織を無傷のままにしておいて前頭面の切れ目を作成した。前部の組織は廃棄した。次いで、脊椎レベルの後部エレメントをｍｉｄ−ｓａｇｉｔｔａｌｌｙに二分して、右半分と左半分を得た。右側と左側に対してｔｉｓｓｕｅｓ  ｃｒａｎｉａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｒａｎｉａｌ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓを廃棄できるように、軸平面におけるアングルド・カット（ａｎｇｌｅｄ  ｃｕｔ）を作った。右側と左側に対してｔｉｓｓｕｅｓ  ｃａｕｄａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｕｄａｌ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓをトリミングして廃棄できるように、軸平面におけるアングルド・カットを作った。右横突間突起スペースと左横突間突起スペースの組織を矢状面にてさらに分割して、左固定塊体の中央サンプルと側方サンプル、ならびに右固定塊体の中央サンプルと側方サンプルを得た。右と左の中央サンプルと側方サンプルにラベルを付け、ホルマリン中に固定し、そして処理した（アルコール中にて連続的に水分を取り除き、キシレンもしくはキシレン代替品中にて透明にし、そしてｇｒａｄｅｄ  ｃａｔａｌｙｚｅｄメチルメタクリレート中に埋め込んだ）。
【００９７】
重合が完了してサンプルが硬化した後に、セクショニングと染色を行った。横突起、移植片もしくは移植片代替物、および横突起スペースの組織を含有するブロックを、低速のダイヤモンドソー（イリノイ州レークブラフのＢｕｅｈｌｅｒ  Ｉｓｏｍｅｔ）により矢状面にて切開した。上記の埋め込まれた中央組織ブロックと側方組織ブロックに対し、中央ブロックと側方ブロックの両方に対して固定塊体の中央からセクショニングを始めた。したがって、“右側方ブロック”からのセクション＃１は、固定塊体の中央部にてサンプル採取したが、“右側方ブロック”からのセクション＃６は、固定塊体の遠めの側方解剖面（横突起の先端）にてサンプル採取した。同様に、“右中央ブロック”からのセクション＃１は、固定塊体の中央部にてサンプル採取したが、“右中央ブロック”からのセクション＃６は、固定塊体の遠めの中央解剖面（薄層とファセットの接合部）にてサンプル採取した。３００μｍのオーダーのセクションを得るのにｗｅｉｇｈｔｓを使用した。約５〜１０のセクションを、横突間突起スペースの各半分を通して、矢状面において作製した。必要に応じて、所望の厚さを得るために粉砕を行った。セクションの厚さは、メートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。三重染色を使用する分別染色を使用することで、組織学的な差別化が可能となった。
【００９８】
ウインドウズＸＰワークステーションで動作する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン５．０、メリーランド州シルバースプリングのメディア・サイバネティクス社）を使用して、染色非脱灰セクションをスキャンした。ビデオカメラ（モデルＤＦＣ２８０、英国ケンブリッジのライカ・マイクロシステムズ社）を使用して、染色非脱灰セクションのデジタル画像を得た。この実験に対する非脱灰組織学セクションとマイクロＸ線写真を、背部が画像の頂部に位置するようにスキャンした。セクションの腹部側は通常フラットであり、２つの卵形横突起を示した。セクションは、横突起が画像の底部（腹側面）に位置するようにスキャンした。ミリメートルスケール（ａ  ｍｍ．  ｓｃａｌｅ）は、画像の底部（腹側面）にてスキャンした。マイクロソフト・フォトエディターを使用して画像を刈り込んだ。
【００９９】
セクション固定基準：  非脱灰セクションは、上位から下位への連続的な骨橋形成が認められた場合に固定されたものと見なされた。非骨組織の存在により連続的な骨橋形成が不要になった場合に、セクションを、さらに下記のように評価した。非固定セクション関しては、セクションを、Ａ）不完全なブリッジを含んでいて非固定であるが、セクションの長さの５０％超えに新たな骨が認められる；またはＢ）不完全なブリッジを含んでいて非固定であり、セクションの長さの５０％以下に新たな骨が認められる；に類別した。
【０１００】
右側と左側のレベル固定基準：  評価した全てのセクションに基づき、下記の基準を使用して、レベルの右側または左側に組織学的固定が存在するかどうかを調べた。セクションおよび対応するマイクロＸ線写真の５０％超えが連続的な骨橋形成を示した場合には、脊椎レベルの右側または左側が固定されたと見なした。脊椎レベルの右側または左側からのセクションおよび対応するマイクロＸ線写真の５０％以下が連続的な骨橋形成を示した場合には、部分的な固定が存在したと見なした。脊椎レベルの右側または左側からのセクションおよび対応するマイクロＸ線写真が骨橋形成を示さなかった場合には、固定は存在しなかったと見なした。
【０１０１】
マイクロラジオグラフィー
処置した腰椎レベルからの非脱灰セクションに対し、マイクロラジオグラフィー装置（ファキシトロン・ラジオグラフィー装置、オレゴン州マクミンビルのヒューレット・パッカード社）と分光フィルム（Ｂ／ＲＡ４１５３フィルム４１５３、ニューヨーク州ロチェスターのコダック社）を使用してＸ線写真を撮った。曝露時間を決定するために、これらのセクションの厚さを、メートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。超微細マジックインキでセクションに標識を付け、セクションをＥｋｔａｓｃａｎ  Ｂ／ＲＡ４１５３フィルム上に配置し、それぞれ１００μｍのセクション厚さに対して、２０ｋＶおよび３ｍＡにて約４５秒にわたってＸ線源に曝露した。次いでフィルムを現像し、固定し、そして標準的な光学顕微鏡法を使用して、骨化作用に関して分析した。ウインドウズＸＰワークステーションで動作する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン５．０、メリーランド州シルバースプリングのメディア・サイバネティクス社）を使用して、マイクロＸ線写真をスキャンした。ビデオカメラ（モデルＤＦＣ２８０、英国ケンブリッジのライカ・マイクロシステムズ社）を使用して、マイクロＸ線写真のデジタル画像を得た。
【０１０２】
セクションとマイクロＸ線写真を分析して下記のことを行った：１）組織学的固定を評価した；２）自家移植片および骨移植片代替物に対する宿主の応答を調べた；および３）横突間突起スペース内の固定塊体における骨の品質と量を評価した。
【０１０３】
結果
１．  Ｘ線写真による結果
処置したグループに対するＸ線写真平均固定スコアを表３に示す。本発明のパテ＋ｒｈＢＭＰ−２グループは、２．７の平均固定スコアを達成した。自家移植片グループに対する平均固定スコアは２．２であった。
【０１０４】
Ｘ線写真固定スコアに及ぼす処置の効果をさらに解析した。分割表を作成し（表４）、カイ二乗解析を行った。表４からわかるように、３の固定スコア（連続した固定）を達成するための度数は、本発明のパテ＋ＢＭＰ−２グループの場合が６７％であり、自家移植片グループの場合が４０％であった。２（確度の高い固定）以上の固定スコアを達成するための度数は、本発明のパテ＋ＢＭＰ−２グループの場合が１００％であり、自家移植片グループの場合が８０％であった。パテ＋ＢＭＰ−２グループと自家移植片グループとの間の差異は、統計的に有意ではなかった（ｐ＜０．０９）。
【０１０５】
【表６】
2009525158.tif 000007
【０１０６】
【表７】
2009525158.tif 000008
【０１０７】
２．  生体力学による結果
軸回転荷重、横曲げ荷重、屈曲荷重、および伸張荷重に関して、処置グループに対するグループ剛性を図６〜８に示す。具体的には、図６は、無損傷の動物グループと処置した動物グループの、屈曲荷重および伸張荷重下での平均剛性を示しているチャートであり、図７は、無損傷の動物グループと処置した動物グループの、軸回転荷重下での平均剛性を示しているチャートであり、そして図８は、無損傷の動物グループと処置した動物グループの、横曲げ荷重下での平均剛性を示しているチャートである。これら図面中の誤差バーは標準偏差を示している。
【０１０８】
正常な無損傷脊椎と比較すると、処置グループからの固定セグメントは、全ての荷重方向において統計的により剛性が高かった。２つの処置グループ間を統計的に比較すると、右横曲げの荷重方向においてわずかな統計的有意差が認められることがわかった（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験、ｐ＜０．００３）。さらに、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験によれば、本発明のパテ＋ＢＭＰ２処置グループの右横曲げにおけるフレキシビリティは、自家移植片処置グループよりかなり剛性が高かった（８７％高い剛性、ｐ＜０．００２）。
【０１０９】
図面と実施態様を挙げて本発明を詳細に説明してきたが、これらは例証のためのものであって、本発明がこれらによって限定されることはない。理解しておかねばならないことは、本明細書では好ましい実施態様だけが説明されており、本発明の要旨に基づいて考えうる全ての変形と改良形も保護されるべきである、という点である。さらに、本明細書に引用されている文献はいずれも当業者のレベルを表わしており、これら文献の全開示内容を参照により本明細書に含める。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】湿潤液体を受け入れるためのリザーバーを含んだ本発明の乾燥多孔性物体移植材料の斜視図である。
【図２】本発明の円筒状乾燥多孔性物体移植材料の斜視図である。
【図３】正常な無損傷グループと２つの処置グループの、屈曲荷重および伸張荷重における平均フレキシビリティを示しているチャートである（実施例２に記載）。
【図４】正常な無損傷グループと２つの処置グループの、右軸回転荷重および左軸回転荷重における平均フレキシビリティを示しているチャートである（実施例２に記載）。
【図５】正常な無損傷グループと２つの処置グループの、右横曲げ荷重および左横曲げ荷重における平均フレキシビリティを示しているチャートである（実施例２に記載）。
【図６】無損傷動物グループと処置動物グループの、屈曲荷重下および伸張荷重下での平均剛性を示しているチャートである（実施例３に記載）。
【図７】無損傷動物グループと処置動物グループの、軸回転荷重下での平均剛性を示しているチャートである（実施例３に記載）。
【図８】無損傷動物グループと処置動物グループの、横曲げ荷重下での平均剛性を示しているチャートである（実施例３に記載）。
【図１】
2009525158.tif 000009
【図２Ａ】
2009525158.tif 000010
【図２Ｂ】
2009525158.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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