(57)【要約】  リポペプチドを生産するバチルス種の細菌は、プロバイオティックとして投与された場合、消化器疾患の処置および予防に有効であることが見いだされている。とりわけ、Ｂ６として同定されたバチルス細菌菌株は、プロバイオティックとして投与された場合、抗生物質関連下痢症（ＡＡＤ）またはいっそう重篤な異常のクロストリジウムディフィシル関連下痢症（ＣＤＡＤ）の処置に有用である。その上、これらの細菌は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような免疫に関連した疾患の処置に効果があることが見いだされている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌をプロバイオティックとして投与するステップを含む、腸異常の予防の方法。
【請求項２】
腸異常が抗生物質関連下痢症、クロストリジウムディフィシル（Clostridium difficile）獲得性下痢症、炎症性腸疾患、および消化器疾患からなる群から選択される、請求項１に定義された方法。
【請求項３】
リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌をプロバイオティックとして投与するステップを含む、腸異常の治療の方法。
【請求項４】
腸異常が抗生物質関連下痢症、クロストリジウムディフィシル獲得性下痢症、炎症性腸疾患、および消化器疾患からなる群から選択される、請求項３に定義された方法。
【請求項５】
バチルス細菌と合わせたイヌリンの投与をさらに含む、請求項１に定義された方法。
【請求項６】
バチルス細菌と合わせたイヌリンの投与をさらに含む、請求項３に定義された方法。
【請求項７】
バチルス細菌と合わせたプロバイオティックの投与をさらに含む、請求項１に定義された方法。
【請求項８】
バチルス細菌と合わせたプロバイオティックの投与をさらに含む、請求項３に定義された方法。
【請求項９】
細菌がバチルスアミロリキファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）およびバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）からなる群から選択される、請求項１に定義された方法。
【請求項１０】
細菌がバチルスアミロリキファシエンスおよびバチルスサブチリスからなる群から選択される、請求項３に定義された方法。
【請求項１１】
バチルス細菌が投与時に相乗作用を持つ化合物を生産する、請求項１に定義された方法。
【請求項１２】
バチルス細菌が投与時に相乗作用を持つ化合物を生産する、請求項３に定義された方法。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、分離された細菌菌株。
【請求項１４】
菌株がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に少なくとも９０％相同性を有する、請求項１３に定義された、分離された細菌菌株。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の部分的ｇｙｒＡ配列を有する、分離された細菌菌株。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の部分的ｇｙｒＡ配列に少なくとも９０％相同性を有する、請求項１５に定義された、分離された細菌菌株。
【請求項１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の部分的ｇｙｒＡ配列を有する、分離された細菌菌株。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の部分的ｇｙｒＡ配列に少なくとも９０％相同性を有する、請求項１７に定義された、分離された細菌菌株。
【請求項１９】
バチルス細菌がＡＴＣＣ菌株ＰＴＡ−６７３７として同定された菌株の細菌からなる、請求項１に定義された方法。
【請求項２０】
バチルス細菌がＡＴＣＣ菌株ＰＴＡ−６７３７として同定された菌株の細菌からなる、請求項３に定義された方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この出願は、２００５年１１月２９日に出願されたアメリカ合衆国特許出願番号６０／７４０，５１８に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は一般に、消化器疾患を治療するための細菌の投与、およびいっそう明確には、抗生物質関連下痢症（ＡＡＤ）およびクロストリジウムディフィシル獲得性下痢症(ＣＤＡＤ)を治療するためのバチルスアミロリキファシエンス菌株の細菌の投与に関する。
【０００３】
抗生物質関連下痢症という用語は、抗菌剤の使用後の、良性で、定型的な下痢を表す。典型的には、病原体は全く確認されず、下痢は腸内細菌叢の組成および機能における変化に起因する。大部分の患者は支持的手段および抗生物質の中断に反応する。
【０００４】
複数の抗生物質、とりわけ腸吸収が少ないか、または胆汁への排出が多い広域抗菌スペクトルを有する薬剤の長期使用は、腸内細菌叢の組成および機能の変化を誘発し、それゆえＡＡＤの発生率がより高くなる１、２。変更の程度はコロニー化を阻止する正常細菌叢の能力および使用する抗生物質の型によって影響されることになる。結腸嫌気性細菌叢の減少は炭水化物および胆汁酸代謝を妨害する。浸透圧性または分泌性下痢が起こる可能性がある。微生物および代謝変化の結果、日和見病原体の過剰増殖が起こる。
【０００５】
嫌気性グラム陽性桿菌であるＣディフィシルは、すべてのＡＡＤ症例の１５％から２０％までを占める。とりわけ、この微生物は大腸炎の徴候を伴う多数のＡＡＤ症例において、および偽膜を持つすべてのＡＡＤ症例において分離されうる。それは環境に広く存在し、かなりの期間生存する可能性があり、そして糞便‐経口経路によって感受性の高い個体に移される。それは小児の正常細菌叢の一部であると見なされ、約５％の健康な成人において、そして無症候性の、または隔離された入院患者の１／３に至るまでにおいて分離されうる。
【０００６】
ＡＡＤの臨床徴候は軽度な下痢から劇症大腸炎まで変化する可能性がある３。Ｃディフィシル大腸炎の重症度は、年齢、同時罹病率、宿主の免疫反応、および逆蠕動剤の使用を含む、非常に多数の因子によって影響を受けるように見える。興味深いことに、細菌の遺伝子型および毒素生産が果たす役割は少ないように見える４。疾患の主な症状は下痢であり、それは一般に治療中に発生するが、抗生物質中断後遅くとも８週間の後には出現する可能性がある。ＡＡＤの多くの症例では、患者は軟便、大腸炎のわずかな徴候を呈し、本質的な症状はほとんど見られない。下痢は支持療法および抗菌剤の中断に即座に反応する。
【０００７】
クロストリジウムディフィシルは１９３５年に初めて記載された５が、１９７０年代後期まで抗生物質関連下痢症と関連付けられなかった。クロストリジウムディフィシルは芽胞形成グラム陰性嫌気性バチルスであり、少なくとも２種の外毒素：主としてエンテロトキシンであるトキシンＡと、細胞毒素であるトキシンＢを生産する。微生物は重症度が無症候性コロニー化から激しい下痢、偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）、中毒性巨大結腸、結腸穿孔、および死亡までに及ぶヒトの消化器感染症を引き起こす６、７、８。Ｃ．ディフィシルコロニー化の発生における最初のステップは、結腸の正常細菌叢の混乱であり、通常抗生物質により、あるいはまれな場合では、抗新生物または免疫抑制剤によって引き起こされる９、１０。コロニー化は糞便‐経口経路によって起こり；摂取されたＣ．ディフィシルの芽胞は胃酸バリアに耐え、結腸で発芽する１１、１２。ＣＤＡＤの症状は抗生物質療法開始初日、または抗生物質療法が中止された後数週間までに開始する可能性がある１３。以下の２つの因子が、病院でＣ．ディフィシルコロニー化を獲得する患者において症候性疾患が起こる見込みを増すことを示している：他の疾患の重症度、およびトキシンＡに対する血清ＩｇＧ抗体のレベル低下１４。これらの結果は、前もって存在する抗‐トキシンＡ抗体が疾患の重症度を改善する可能性があること、および免疫化が院内ＣＤＡＤを妨げ、制御することにおいて効果的である可能性があることを暗示する。
【０００８】
明確にするために、我々は、患者がＣ．ディフィシルに引き起こされた症候性の病変を提示する場合、Ｃ．ディフィシル‐関連疾患（ＣＤＡＤ）を有すると定義する。下痢を示す患者の糞便中のＣ．ディフィシル毒素存在の検出が、最も一般的に受け入れられている診断方法である。
【０００９】
クロストリジウムディフィシルは、抗生物質関連下痢症のすべての症例のおよそ２５％の原因である１５。Ｃ．ディフィシル‐関連疾患の大部分の症例は、病院または長期介護施設（１日につき１００，０００占有ベッドごとに２５〜６０症例の割合）で発生し、米国で１年に３００，０００より多い症例を引き起こし、そして多くのヨーロッパの国々にとって類似の割合が推定される。それは２週間に至るまでの入院期間および症例毎に＄６，０００〜＄１０，０００もの付加的な経費を追加しうる１６、１７、１８、１９、２０、２１。
【００１０】
原因となる抗生物質をいったん止めれば、ＣＤＡＤ患者において下痢は自然に治癒する可能性があり、軽度な疾患の患者の場合には特定の療法が必要でないかもしれない２２、２３。しかし、抗生物質バンコマイシンまたはメトロニダゾールによりほとんどすべての症候性患者を治療することが標準業務である。メトロニダゾールは現在ＣＤＡＤの処置に対してＦＤＡによって認可されていないが、バンコマイシンの費用が高いことおよびバンコマイシン耐性菌の出現に対する懸念から、最も重要な療法として広く使用されている。メトロニダゾールは事実上腸内細菌叢を混乱させるため、それはまた、患者にメトロニダゾール耐性エンテロコックスによるコロニー化をうけやすくする２４。１０〜１４日間の経口メトロニダゾール（２５０ｍｇを１日に４回、または５００ｍｇを１日に３回）が通常適切である。経口メトロニダゾールに耐えることができないもの、メトロニダゾール療法が効かないもの、妊娠している患者、そしてたぶんひどく具合の悪い患者に対しては、１０〜１４日間の経口バンコマイシン塩酸塩（１２５ｍｇを１日に４回）が指示される。クロストリジウムディフィシル大腸炎の１回目のぶり返しまたは再発は、経口メトロニダゾールまたはバンコマイシンの別の１０〜１４日コースで治療可能である。
【００１１】
バンコマイシンまたはメトロニダゾールによるＣＤＡＤの処置は、正常な、保護的腸内細菌叢を変化させることにより有害なサイクルを伝播させる。結果として、初期症状出現により治療された患者の２０％が、療法の中断後通常２週間以内にＣＤＡＤを再発する２５、２６、２７、２８。ＣＤＡＤの治療計画から抗生物質を除去することの別の利点は、細菌耐性に対する選択圧の軽減である。バンコマイシンおよびメトロニダゾールは、ＶＲＥのような、耐性グラム陽性球菌のために選択されることが明確に示されている。後ろ向き疫学的研究は、セファロスポリン、フルオロキノロンおよびメトロニダゾールのような、広域抗生物質の使用と腸内ＶＲＥコロニー化を結びつけている２９。腸内ＶＲＥコロニー化は、病院内でこの病原菌に対する病原巣を提供する。ＶＲＥの多くの菌株は多剤耐性であり、致命的な全身感染の治療に対する選択の余地がほとんどない。Ｃ．ディフィシル患者は、おそらく以前の抗生物質治療のために、ＶＲＥコロニー化および感染にとりわけ影響を受けやすいように見える３０、３１。ＶＲＥコロニー化の管理は、病院感染制御業務の重要な要素である。従って、一般的な患者集団およびＣ．ディフィシル患者の両方においてＶＲＥコロニー化のリスクを低下させる治療的方策が非常に望ましい。バンコマイシンおよびメトロニダゾール耐性Ｃ．ディフィシルの出現可能性は、この疾患を治療するための抗生物質の使用に対する付加的なリスクを提示する。現在、抗生物質耐性Ｃ．ディフィシルの発生は散発性であるが、臨床分離菌の１２％にまで至ることが報告されている３２。
【００１２】
発明の概要
本発明は、リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌を投与することによる、抗生物質関連下痢症、クロストリジウムディフィシル獲得性下痢症、炎症性腸疾患、および消化器疾患のような、腸異常の予防に関する。バチルス細菌はプロバイオティックとして投与されてもよく、イヌリンのような他のプロバイオティックスと一緒に組み合わせてもよい。
【００１３】
生化学的方法、特にＡＰＩ  ５０  ＣＢＨ／Ｌを使用して、好ましいバチルスがバチルスサブチリス候補として同定された。１６Ｓ  ｒＲＮＡを使用して、好ましいバチルスが同様にバチルスサブチリス候補として同定された。ｇｙｒＡを使用して、好ましいバチルスがバチルスアミロリキファシエンス候補として同定された。ｇｙｒＡアッセイの前に、好ましいバチルスがＡＴＣＣに寄託され、バチルスサブチリスとして同定された。
【００１４】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する分離された細菌菌株、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に９０％相同性、８０％相同性、７０％相同性、６０％相同性および５０％相同性を有する分離された細菌菌株に関する。
【００１５】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の部分的ｇｙｒＡ配列を有する分離された細菌菌株、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に９０％相同性、８０％相同性、７０％相同性、６０％相同性および５０％相同性を有する分離された細菌菌株に関する。
【００１６】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の部分的ｇｙｒＡ配列を有する分離された細菌菌株、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に９０％相同性、８０％相同性、７０％相同性、６０％相同性および５０％相同性を有する分離された細菌菌株に関する。
【００１７】
本発明はさらに、ＡＴＣＣ菌株ＰＴＡ‐６７３７として同定された菌株のバチルス細菌に関する。
好ましいバチルスＰＢ６は、その万能で特有の特徴のために、いくつかの満たされていない医学的必要性にとって重要であり得る。
【００１８】
好ましい態様の詳細な説明
ＰＢ６は天然から分離され、遺伝的に改変されていない特許登録された細菌菌株である。リボタイピング技術を使用して、この細菌はバチルスサブチリスの菌株であると同定された。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション研究は、バチルスＰＢ６菌株が、十中八九バチルスアミロリキファシエンスであってもよいことを示唆し、そのことは以下でさらに記載されることになる。
【００１９】
本明細書で使用する予防という用語は、医学的または公衆衛生手順を意味し、その目的は異常を治療することまたは治すことよりむしろ、防ぐことである。本明細書で使用する治療という用語は、医学的または公衆衛生手順を意味し、その目的は異常を治療するか、または治すことである。本明細書で使用する相乗作用を持つ化合物という用語は、疾患または健康状態異常の予防または治療のために投与されたバチルス細菌の予防作用または治療の有効性を高める化合物を意味する。本明細書で使用するリポペプチドは、脂質とタンパク質の両方を含む分子であり、いくつかのアミノ酸と１つ以上の脂肪酸を含む表面‐活性分子を含む。サーファクチン、イツリン、ミコサブチリン、バイロミシン、バシロペプチン、フェンギシン、およびプリパスタチンはリポペプチドの例である。
【００２０】
実施例１‐Ｃ．ディフィシル、ＡＡＤおよびＣＤＡＤに対するバチルスＰＢ６の有効性
バチルスＰＢ６の拮抗特性は、Ｃ．パーフリンジェンス（C. perfringens）ＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対して試験された。
【００２１】
バチルスＰＢ６は、Ｃ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対して拮抗作用を有した。両種のプレート上の画線（ｓｔｒｅａｋ−ｌｉｎｅ）の交差点に透明なゾーンが観察された。試験プレートの例は図１に表す。
【００２２】
バチルスＰＢ６はまた、Ｃ．ディフィシルＮＡＰ１／０２７に対して拮抗作用を有した。このＣ．ディフィシル菌株はいくつかの非常に危険な疾病の発生に関連し、抗生物質に対して耐性を示す。試験プレートの例は図２に表す。
【００２３】
バチルスＰＢ６の二次代謝産物の抗菌作用を確定するために、細菌を発酵させ、発酵産物はジエチルエーテルで抽出した。有機層を分け、真空下で濃縮し、スクリーニングのためにＤＭＳＯに再び溶かした。
【００２４】
抽出物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）はＣ．パーフリンジェンスに対して２．５〜５μｇ／ｍｌ、Ｃ．ディフィシルに対して５〜１０μｇ／ｍｌであった（表１）。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
バチルスＰＢ６はカンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni）の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻止することも証明された。試験プレートの例は図３に示す。Ｃ．ジェジュニに対するバチルスＰＢ６発酵産物エーテル抽出物のＭＩＣは２５〜１００μｇ／ｍｌであった。
【００２７】
カンピロバクタージェジュニとヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）は非常に近縁であり、それゆえ、バチルスＰＢ６はヘリコバクターピロリに対してもたぶん活性である。その上、バチルス細菌（たとえばバチルスサブチリス）がヘリコバクターピロリに対して活性を有すること３３を文献で見いだすことができる。
【００２８】
粗抽出物のそれ以上の調査は、クロストリジウムに対する活性に関与する分子は環状リポペプチドのサーファクチンであることを示した（図４）。
純粋なサーファクチン（我々の発酵産物から精製するか、またはＳｉｇｍａから購入）の活性がクロストリジウムに対して測定された場合、より高いＭＩＣが見いだされた。Ｃ．パーフリンジェンスに対するＭＩＣは１０〜２５μｇ／ｍｌであることが証明された。純粋な活性化合物が粗発酵抽出物より活性が低いことは注目に値する。このことは、抽出物中に存在するサーファクチンの活性を高める補因子に起因すると考えられる。このことは、サーファクチンのＭＩＣを不活性化合物と組み合わせたサーファクチンのＭＩＣと比較した実験によって示されている。この不活性化合物は、我々がサーファクチンを分離したものと同じ抽出物から分離された。この組み合わせのＭＩＣは１〜１０μｇ／ｍｌであった。
【００２９】
実験は、バチルスＰＢ６の濾液がペプシンとトリプシンで処理された場合、クロストリジウム種に対する活性が著しく減少したことを示している。ペプシンとトリプシンは胃および膵臓の粘膜内層で生産される酵素であるため、サーファクチンの経口投与が活性の著しい損失を導くことは明らかである。サーファクチンが０．１Ｎ  ＨＣｌと共に３０、６０および９０分間、３７℃でインキュベーションされた別の実験では、（胃の中のような）酸性条件が活性の損失を導くことを示した（表２）。それゆえ、（結局芽胞としての）バチルスＰＢ６の投与は、腸内でサーファクチンまたは他のリポペプチドの効果的な濃度を得るためにいっそう効果的である。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
抗菌二次代謝産物の生産の他に、バチルスＰＢ６芽胞は腸で発芽することが可能であり、それゆえ競合的排除により病原体を抑制することができる。
バチルス、より明確にはバチルスサブチリスは依然としてすべての健康状態‐促進および免疫‐刺激細菌の中の最も強力で有益な菌の１種である。医学的調査報告に引証されたいくつかの臨床研究に従って、摂取されたバチルスの細胞壁成分は少なくとも３種の特異的抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ）の活性化を含む、ヒト免疫防御のほとんどすべてのシステムを活性化することが可能であり、そのような抗体は通例ヒトシステムに侵入し、冒すことを企てる多くの有害なウイルス、真菌および細菌病原体に対して非常に効果的である。バチルスサブチリスはまた、ＢおよびＴリンパ球ならびにマクロファージを刺激することが示されている。また、バチルスサブチリス芽胞がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫調節作用を発揮する可能性があるという証拠が提供されている。そして、芽胞への暴露後のＴ依存的抗原に対するプラーク形成細胞の増大した反応、および異なる食作用機能の増進が記載されている３４、３５、３６、３７、３８，３９、４０、４１。
【００３２】
ある研究（表３）では、抗生物質および陰性対照に比較して、異なるレベルのＢ．アミロリキファシエンスＰＢ６で飼育したブロイラーで食作用の程度の上昇が観察された。
このことから、我々はバチルスアミロリキファシエンスも免疫‐刺激特性を有すると結論することができる。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
市販の免疫学的アッセイ（ＴＥＣＲＡおよびＯｘｏｉｄ）を使用して、溶血性、非溶血性エンテロトキシンおよびエンテロトキシンＫの存在に関してバチルスＰＢ６の濾液を評価した。同じ濾液はさらに、ＶｅｒｏおよびＨＥｐ−２細胞系に対する細胞毒性試験に供した。最後に、ＰＣＲを基礎にした方法を使用して、バチルスＰＢ６におけるエンテロトキシン産生能力を持つ可能性のある遺伝子の存在を確認した。２種の市販のイムノアッセイにおいて、Ｈｂ１またはＮｈｅエンテロトキシンと抗体には免疫交叉反応性が観察されなかった。ＶｅｒｏおよびＨＥｐ−２細胞アッセイでは、細胞毒性も観察されなかった。バチルスＰＢ６菌株は同じ条件下で溶血性、非溶血性エンテロトキシンおよびエンテロトキシンＫを生産せず、このことがＢ．セレウス（B. cereus）の公知の毒素生産菌株の検出を可能にした。
【００３５】
さらにバチルスＰＢ６のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性が試験されている。従って、１０１０ｃｆｕ／ｇのバチルスＰＢ６を含む噴霧乾燥産物は発酵産物から作製された。
【００３６】
Ｗｉｓｔａｒラットにおける噴霧乾燥Ｂ．アミロリキファシエンスの毒性研究
初めの研究はＷｉｓｔａｒラットにおける、噴霧乾燥バチルスＰＢ６産物（１０１０ｃｆｕ／ｇ）の急性経口毒性を測定するために計画され、行われた。全部で５匹の雄および５匹の雌動物は５０００ｍｇ／ｋｇ（２回蒸留水中の懸濁液、および１０ｍｌ／ｋｇの投与容量を使用）の経口投与量を投与された。対照群は５匹の雄および５匹の雌動物からなり、１０ｍｌ／ｋｇの投与量で２回蒸留水を与えられた。５０００ｍｇ／ｋｇ処置動物では、死亡は観察されなかった。バチルスＰＢ６産物を与えられた動物の５０％は、対照群と比較していっそう活発であった。バチルスＰＢ６で処置された動物はいずれも下痢を起こさなかった。剖検後、両群のいずれの器官でも病的変化は見られなかった。従って、Ｗｉｓｔａｒラットに経口投与されたバチルスＰＢ６産物の最大非致死量（ＬＤ０）およびＬＤ５０は５０００ｍｇ／ｋｇより多いことが見いだされた。
【００３７】
結論：Ｗｉｓｔａｒラットにおける経口経路によるＢ．ＰＢ６乾燥物（１０１０ｃｆｕ／ｇ）の最大非致死量（ＬＤ０）およびＬＤ５０は５０００ｍｇ／ｋｇより多いことが見いだされた。
【００３８】
ＷｉｓｔａｒラットにおけるＢ．ＰＢ６の２８日間反復投与経口毒性
この研究はＷｉｓｔａｒラットにおけるＢ．ＰＢ６（１０１０ｃｆｕ／ｇ）の反復投与（２８日間）経口毒性を測定するために計画され、行われた。それぞれの群において、６匹の雄および６匹の雌動物は２８日間、２５０、５００、または１０００ｍｇ／ｋｇの経口投与量を投与された。対照ベヒクル群も６匹の雄および６匹の雌動物からなり、それらは、１０ｍｌ／ｋｇの投与量で２８日間、２回蒸留水を与えられた。これらの群は２９日目に供試した。
【００３９】
研究はまた、対照ベヒクルおよび高投与量に関して２つの可逆的な群からなり、それらの群はそれぞれ６匹の雄および６匹の雌動物を有した。高投与量群は２８日目に至るまで薬物処置を受け、２９日から４２日までは処置を受けずに、４３日目に供試した。対照ベヒクル群は２８日目に至るまで１０ｍｌ／ｋｇの投与量で蒸留水を与えられ、２９日から４２日までは処置を受けずに、４３日目に供試した。
【００４０】
結論：ラットの２８日間毒性トライアルにおけるＢ．ＰＢ６（１０１０ｃｆｕ／ｇ）の最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は１０００ｍｇ／ｋｇより多いことが見いだされる。
【００４１】
Ｎｅｗ−Ｚｅａｌａｎｄ  ＷｈｉｔｅウサギにおけるＢ．ＰＢ６の局所刺激研究（皮膚および眼）
この研究では皮膚および眼刺激に、全部で３羽のＮｅｗ−Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギ（任意の性）‐同じウサギが使用された。２種の研究の間隔は最少で５日間維持された。１ｇのＢ．ＰＢ６（１０１０ｃｆｕ／ｇ）が皮膚刺激のために皮膚にペーストとして適用され、１００μｌの１０％Ｂ．ＰＢ６の懸濁液が眼刺激のために左眼に点滴された。
【００４２】
試験品目のＰＢ６ペーストは、３羽のウサギにおいて毛を除去後に、背部側部領域の皮膚に適用した。１０％ＰＢ６の懸濁液は３羽のウサギの目に点滴した。試験品目は適用後４時間目に動物の皮膚から除去した。左眼に試験品目を点滴後、まぶたは２〜３秒間とじさせた。
【００４３】
試験品目ＰＢ６の除去後、１、２４、４８および７２時間目に、皮膚刺激に関してウサギを観察し、スコアを付けた。眼刺激に関しては、スコアリングはＰＢ６懸濁液の点滴後、同じ時点で実行した。
【００４４】
結論：皮膚：１ｇのＢ．ＰＢ６（１０１０ｃｆｕ／ｇ）がペーストとして適用された場合、刺激は全く観察されなかった。
眼：１００μｌの１０％Ｂ．ＰＢ６（１０１０ｃｆｕ／ｇ）懸濁液が点滴された場合、刺激は全く観察されなかった。
【００４５】
マウスにおけるＢ．アミロリキファシエンスＰＢ６の赤血球小核アッセイ
この研究は、試験物質によってＳｗｉｓｓアルビノマウスのクロモソームまたは有糸分裂装置に誘発された損傷を検出するために計画され、実行された。全部で５匹の雄と５匹の雌動物は２５００および５０００ｍｇ／ｋｇの経口投与量を投与され、対照ベヒクル群は５匹の雄と５匹の雌マウスからなり、２回蒸留水を１０ｍｌ／ｋｇの投与量で経口的に与えられた。陽性対照群（５匹の雄＋５匹の雌）は４０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口的にシクロホスファミドを与えられた。
【００４６】
動物はそれぞれの時点（対照群、２５００ｍｇ／ｋｇＰＢ６、シクロホスファミドは２４時間、５０００ｍｇ／ｋｇＰＢ６は２４時間および４８時間の両方）で過剰なＣＯ２により供試し、両大腿骨を除去し、骨髄スメアをスライドグラスに作製し、ギムザおよびメイ‐グリュンワルド染色を行い、２０００個の未熟赤血球を計数することにより小核の発生を顕微鏡下で観察した。
【００４７】
全（未熟＋成熟）赤血球の中の未熟赤血球の割合はまた、少なくとも２００個の赤血球を計数することによりそれぞれの動物に関して測定する。
結論：２５００＆５０００ｍｇ／ｋｇ投与量のＢ．ＰＢ６（１０１０ｃｆｕ／ｇ）はマウスにおいて小核多染性赤血球を有意に誘発しなかった。
【００４８】
ＣＤＡＤを患うゴールデンシリアンハムスターの処置における経口投与されたバチルスＰＢ６のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性の確認
研究計画
４２匹の雄ゴールデンシリアンハムスターはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＩＮ（Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａ）から得た。処置期間の開始時に、動物は１２〜１４週齢であった。試験施設への到着時に、動物は獣医師の管理下で完全な臨床検査を受け、それらが良好な状態であることを確かめた。動物は、少なくとも７日間、研究条件に順応させた。トライアル開始時に体重を記録し、その後研究群に動物を割り当てた。動物はポリカーボネートケージで個々に飼育した（２９０ｘ２２ｘ１４０ｍｍ、ＬｘＷｘＨ）。動物室および試験室の条件は以下の通りに設定した：温度：２２±４℃、相対湿度：５０±２０％、明／暗周期：１２時間／１２時間（明期：０７：００〜１９：００）および換気：フィルターを通し、再循環させない空気をおよそ７サイクル／時間。すべての動物はＨａｍｓｔｅｒ  Ｐｅｌｌｅｔ  Ｆｅｅｄ（ＮＩＮ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ）とＡｑｕａｇｕａｒｄ精製水を随意に自由に摂取した。
【００４９】
動物は７つの試験群の１つに割り当てた（Ａ〜Ｇ）。グループＡ〜Ｅでは、１００００ＣＦＵのクロストリジウムディフィシルＡＴＣＣ９６８９を０日目に経口投与し、その後クリンダマイシン１００ｍｇ／Ｋｇを１日目に、耳のすぐ後ろの胴体部分に皮下注射することによって、クロストリジウムディフィシル関連下痢症が誘発された。グループＡはそれ以上の処置は受けなかった。
【００５０】
グループＢは強制経口投与によりバンコマイシン５０ｍｇ／ｋｇを１日１回、２〜６日目まで処置された。グループＣ、ＤおよびＥは、４時間間隔で（１回目の投与は９．３０ａｍ）１日３回、それぞれ１．５ｘ１０８、１．５ｘ１０７および１．５ｘ１０６ＣＦＵ／Ｋｇの投与量のＰＢ６を強制経口投与により１〜６日目まで処置された。１日目は、クリンダマイシンの注射１時間後にＰＢ６の１回目の投与量が与えられた。グループＦおよびＧでは、動物は１．５ｘ１０９ＣＦＵ／Ｋｇの投与量でＰＢ６を強制経口投与により１〜６日目まで４時間間隔で（１回目の投与は９．３０ａｍ）１日３回与えられた。６日目が最後の処置日であった。臨床徴候および死亡に関して、１日２回、１５日目まで観察を行った。下痢の徴候は軽度、中等度または重度として採点した。動物の体重は０、７および１４日目に記録した。グループＡ〜Ｅの場合、Ｉｍｍｕｎｏｃａｒｄｓ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、クロストリジウムトキシンＡおよびＢの存在に関して糞便を１、２および７日目に試験した。１日目では、クリンダマイシン投与前に糞便試料が採取された。２および７日目では、２回目と３回目の処置投与の間に糞便試料を採取した。
【００５１】
試験調製物
クロストリジウムディフィシルＡＴＣＣ９６８９を含むＣｕｌｔｉ−ｌｏｏｐ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）は取り扱い説明に従って接種し、培養液は生理食塩水で希釈して１００００ＣＦＵ／ｍｌを得た。クリンダマイシン塩酸塩（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｕｕｒｓ−Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびバンコマイシン（Ｎｅｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｍｂａｙ，Ｉｎｄｉａ）は、それぞれ１０および５０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで２回蒸留水で懸濁した。投与量はクリンダマイシンおよびバンコマイシンそれぞれに対して１０および１ｍｌ／Ｋｇ体重であった。マルト−およびシクロデキストリンキャリア上で乾燥したバチルス‘ＰＢ６’発酵培養液である、ＰＢ６乾燥物（Ｋｅｍｉｎ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ  Ｃａｒｅ，Ｄｅｓ  Ｍｏｉｎｅｓ，ＵＳＡ）は、１．５Ｅ８、１．５Ｅ６および１．５Ｅ５  ＣＦＵ／ｍｌの濃度になるまで２回蒸留水で懸濁した。投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重であった。新鮮な調製物はそれぞれの投与前に作製した。クリンダマイシン、バンコマイシンおよびＰＢ６は最近測定した体重を基にして投与した。調製物はそれぞれの投与前に激しく攪拌した。
【００５２】
結果と考察
クリンダマイシンが投与された後約６時間目に、無処置群の３匹の動物、およびバンコマイシンで処置されることになる群の１匹の動物に軽度な下痢が観察された。Ｃ、Ｄ、Ｅ群では、クリンダマイシン投与後約１時間目に、動物はＰＢ６の１回目の投与量を与えられたが、その同じ日に、いずれかの下痢の徴候を示す動物はいなかった。下痢を患う動物の数および下痢の重症度は、その後の２日間で、処置群間で異なって出現した（表４）。クロストリジウムディフィシル関連下痢症が誘発されたすべての群は下痢の徴候を示した。バンコマイシンで処置された群および高投与量のＰＢ６で処置された群では下痢の強度が低かった。無処置群ならびに、低および中間投与量のＰＢ６群では、糞便は非常に水っぽく、全腹部領域は湿っていた。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
ＣＤＡＤが誘発された群のすべての動物は、３日目の終わりに依然として生きていたが、それらの一部はひどい下痢の徴候を示していた。クリンダマイシン投与後３日目に相当する４日目に、初めの動物が死亡した。処置期間の終わりに相当する６日目に、無処置群のすべてのハムスターが死亡した。バンコマイシンおよびＰＢ６高投与量処置群で生存率が最も高く、６匹のうち４匹が生き延びた（図５）。
【００５５】
７日目に、ＣＤＡＤが誘発されたすべての群で平均体重の減少が観察された。この体重減少に関して、ＰＢ６との明確な逆の用量反応関係があった（表５）。低い投与量のＰＢ６を与えられた動物は、高投与量を与えられた動物より平均して３倍多くの体重を失った。体重損失はバンコマイシン処置では最も少なかった。ＣＤＡＤが誘発されなかった２つの群では、同じ期間にわたり、平均体重がわずかに増加していた。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
ＣＤＡＤが誘発された動物の糞便試料中のクロストリジウムトキシンＡおよびＢの存在は１、２および７日目にチェックした。予想されるように、高い死亡率と高い平均体重の減少を示す群はまた、これらのトキシンに対して高い割合の動物が陽性の評価を受け、その上ＰＢ６と逆の用量反応関係にあった。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
結論
この研究は、十分に確立され、この感染の非常に感度の高いモデルであるクリンダマイシン‐誘発ＣＤＡＤのハムスターモデルにおいて、ＣＤＡＤを治療することにおけるＢ．ＰＢ６の有効性を評価するために計画され、実施された。ＣＤＡＤ誘発後処置されなかったハムスターはすべて重症の下痢を起こし、体重が減少し、５日以内に死亡した。ＰＢ６による治療は投与量に関連した反応を生じた。最も高い投与量のＰＢ６では、下痢、体重減少および死亡率は最低であった。治療停止時に、クリンダマイシン‐誘発ＣＤＡＤをハムスターが乗り切るのを助けることにおいて、最高投与量のＰＢ６はバンコマイシンと等しく有効であったことを示した。
【００６０】
経口投与されたバチルスＰＢ６の有効成分の評価
プロバイオティックス（たとえばイヌリン）の新規な食物概念は、栄養学者、医師、食物製造業者および消費者の間で人気を獲得し続けている。プロバイオティック食品の最も広く受け入れられている定義は以下の通りである：“プロバイオティックは消化器内細菌叢の組成および活性の両方において、特定の変化を可能にする選択的に発酵された成分であり、宿主の幸福および健康状態に利点を与える”。食物製品においてプロバイオティク成分として分類されるためには、その成分は以下の通りである必要がある。：１）胃および小腸の消化酵素による消化（加水分解）に耐える；２）化学的に無傷で結腸に入り、部分的な、または完全な発酵過程を経る；および３）健康状態に刺激された腸内細菌の活発な増殖および／または活性を刺激する。プロバイオティックに刺激された細菌増殖の健康状態への利点は広範に及び、たとえば結腸癌および病原体に対する好ましい効果、トリアシルグリセロールの減少、ＣａおよびＭｇの吸収増加、ならびに便通頻度および糞便重量の増加のような利点を含む。イヌリンは、２〜６０ユニットの範囲の鎖長を持つポリディスパースβ（２→１）フラクタンである。イヌリンのフルクトース分子とオリゴフルクトース間の特有の結合が、典型的な炭水化物とそれらを識別する。それらはヒトの消化酵素による消化および小腸における吸収に耐えるが、結腸内細菌叢により加水分解され、発酵し、それゆえプロバイオティックダイエタリーファイバーとして分類される４２、４３、４４、４５、４６。
【００６１】
プロバイオティックスが健康状態を刺激する腸内細菌の活発な増殖および／または活性を刺激するという事実が、それらをバチルスＰＢ６のようなプロバイオティックスと一緒に投与されることになる、非常に興味深い産物にしている。
【００６２】
その上、バチルスアミロリキファシエンスＰＢ６は、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属のような腸内細菌叢由来の“ヘルシーな”細菌の増殖を阻止しない。
【００６３】
材料と方法
分離されたＰＢ６細菌の同定
分離されたＰＢ６バチルス菌株はグラム陽性桿菌であり、カタラーゼを有する。マラカイトグリーン染色は、この微生物が内生芽胞を有し、芽胞形成体であることを確証した。この微生物は、長期のインキュベーション期間に全寒天表面に広がる傾向があることから、“有走細胞（ｓｗａｒｍｅｒ）”でもある。公知のバチルス属との関連性の点から、分離されたバチルス菌株は９２．０％ＩＤを有する。ＡＰＩ生化学的プロファイルに基づいて、ＰＢ６バチルス菌株はＢ．サブチリス候補として同定された。ＰＢ６バチルス菌株はそれゆえＡＴＣＣ‐ＰＴＡ６７３７として寄託され、そこでバチルスサブチリスと命名された。２００２年１１月２７日に出願された米国特許出願番号１０／３０６，３６５は本明細書に参照として援用される。
【００６４】
１６ｒＲＮＡ遺伝子シークエンシング
バチルスＰＢ６のほとんど完全な１６ｒＲＮＡ配列が完成され、アラインメントされた（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、図６）。
【００６５】
ＧｙｒＡシークエンシング
２つの異なるグループによって得られたＰＢ６の部分的ｇｙｒＡ配列は図７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）および図８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）に示す。
【００６６】
ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはＥｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，４７によって記載された方法を改変し、ストリンジェントな条件下（４０℃で）行われた。ＤＮＡ相同性のパーセンテージは少なくとも４ハイブリダイゼーションの平均である。括弧で示された値は、逆数値間の差である。この技術による平均標準偏差は１４ユニットである４８。結果は表７に表す。
【００６７】
【表７】
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【００６８】
種の概要説明に対して一般に受け入れられる限界である７０％４９より高いＤＮＡ相同性が、バチルスＰＢ６、ＬＭＧ９８１４ＴおよびＬＭＧ２２４７８Ｔ間に見られる。
これらの結果から、Ｂ．ベレゼンシス（B. velezensis）とＢ．アミロリキファシエンスは同じ遺伝種に属し、それゆえ主観的な異名であり、それゆえ命名規則４２を適用する場合、最も古い規則に合った名称、すなわちＢ．アミロリキファシエンスが保持されるべきであり、バチルスＰＢ６（ＡＴＣＣ‐ＰＴＡ６７３７）はより適切にはＢ．アミロリキファシエンス種に分類されてもよいように見える。
【００６９】
画線アッセイによるバチルスアミロリキファシエンスの拮抗特性の試験
バチルスアミロリキファシエンスＰＢ６は、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙ血液プレート（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上に直線として接種し、嫌気性条件下、３７℃で２４時間インキュベーション後、異なる指標菌株がバチルスＰＢ６培養物に対して直角に接種された。クロストリジウム種を接種したプレートは、嫌気性条件下、Ａｎａｅｒｏｇｅｎ  Ｐａｋ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用してインキュベーションした。３７℃で一晩インキュベーション後、一方の微生物の他方に対する阻止作用を示唆する、画線の交差点周囲の透明帯の出現によって拮抗作用が評価された。
【００７０】
バチルスＰＢ６の二次代謝産物の抽出および抗菌スクリーニング
バチルスＰＢ６は５％ヒツジ血液（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加したＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙａ寒天プレート上、２４時間、３７℃で培養した。この培養物を使用して、０．６％酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加した１００ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ培養液を接種した。２４時間、振とうインキュベーター（１００ｒｐｍ）中、３７℃でインキュベーション後、培養液は等量のジエチルエーテル（Ａｃｒｏｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）と混合（３回）した。代謝産物の抽出後、両層を分離し、エーテル画分を集め、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００７１】
その後、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で溶媒を除去した。残渣を量り、ジメチルスルホキシド（Ａｃｒｏｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に溶かし、最終濃度１００００μｇ／ｍｌの粗抽出物を得た。さらに１／１１の比のＤＭＳＯ／水の混合物で希釈物（５００、２５０、１００、５０、２５および１０μｇ／ｍｌ）を作製した。最後に、それぞれの希釈物２５μｌをマイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ）のウェルにピペットで移した。
【００７２】
細菌菌株クロストリジウムパーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４（Ｃ１６００Ｌ，Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびクロストリジウムディフィシルＡＴＣＣ９６８９（Ｃ１６１０Ｌ，Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）は凍結乾燥したｃｕｌｔｉ−ｌｏｏｐｓとして購入し、取扱説明書に従って培養を行った。両方の培養物からＡｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｓａｌ培養液（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中でＭａｃｆａｒｌａｎｄ標準物（Ａ６２５ｍｍ＝０．１００)を調製した。この標準物２５０μｌを新鮮なＡｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｓａｌ培養液１０ｍｌに添加し、この培地２２５μｌをウェルにピペットで移した。それぞれのウェルの最終細胞密度５ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌを得た。マイクロタイタープレートは、気密プラスチック製バッグの中で、Ａｎａｅｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｃｔ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、１８時間（Ｃ．パーフリンジェンス）および４８時間（Ｃ．ディフィシル）、嫌気性条件下でインキュベーションした。インキュベーション期間の前および後に、それぞれのウェルの光学密度（ＯＤ）をＢｉｏｓｃｒｅｅｎＣアナライザー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して測定した。白色光（Ｗｉｄｅ  Ｂａｎｄ）を使用してＯＤを測定した。試験はデュプリケートで、さらに培地の対照、培地プラス接種物（陰性対照）および陽性対照において行い；３種の濃度（０．１、０．５および１．０μｇ／ｍｌ）のバンコマイシン（Ｆｌｕｋａ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）が試験バッチ中に含有された。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、増殖が全く起きないか、またはＯＤの増加が全く検出されない最も低い濃度として定義した。
【００７３】
サーファクチンの活性に対する補因子の増強作用の測定
Ｂ．アミロリキファシエンスＰＢ６発酵産物のエーテル抽出物は調整用ＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅ１６０、２０ｘ２ｃｍ、層の厚さ２ｍｍ）によって分離した。使用した溶離液はヘキサン／アセトン（３０／７０）であった。サーファクチンはＲｆ０〜０．３３のゾーンで分離された。このゾーンから分離されたサーファクチンのＣ．パーフリンジェンスに対するＭＩＣは１０〜２５μｇ／ｍｌであった。別のゾーン（Ｒｆ０．３３〜０．７６）ではＣ．パーフリンジェンスに対して活性でない（ＭＩＣ＞１００μｇ／ｍｌ）１種以上の産物が見いだされた。それぞれ１０μｇ／ｍｌの両抽出物の最終濃度で、両方のゾーンの産物の組み合わせが試験された場合、Ｃ．パーフリンジェンスの増殖は全く見られなかった。単独で活性を持たないこれらの産物と組み合わせた場合、サーファクチンのＭＩＣは１０μｇ／ｍｌ未満に減少した。
【００７４】
サーファクチンの抗菌活性に対する酸性処理の作用の測定
アセトニトリル／０．１Ｎ  ＨＣｌ（１／１；ｖ／ｖ）中のサーファクチン（Ｓｉｇｍａ）７５０μｇ／ｍｌの溶液が調製された。この溶液０．５ｍｌを３７℃で３０′、６０′または９０′インキュベーションし、その後０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３溶液０．２５ｍｌを添加し、混合物はボルテックスシェイカーを使用して混合した。すべての溶液はクロストリジウムパーフリンジェンスに対する活性に関してスクリーニングした。
【００７５】
バチルスＰＢ６によるエンテロトキシン生産の測定
細菌菌株および培養条件。  バチルスＰＢ６は０．６％酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）（ＴＳＢＹＥ）を添加した容量１００ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ培養液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で培養し、１００ｒｐｍにセットした振とうインキュベーター中、３７℃でインキュベーションした。１種のＢ．セレウスの毒素生産菌株ＡＴＣＣ１１７７８も振とうインキュベーター中、３７℃、ＴＳＢＹＥ中で培養した。同じようにＢ．セレウスＡＴＣＣ４９０６４および大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２の非毒素生産菌株も嫌気性条件下、３７℃、ＴＳＢＹＥ中で培養した。この研究に使用したすべての細菌菌株は毎週新鮮なＴＳＢＹＥに移し、常用培養物として４℃冷蔵庫に保存した。新しく増殖した菌株は４０％グリセロールに再懸濁し、長期保管のために−８０℃のフリーザーで保存した。
【００７６】
エンテロトキシン生産。  一晩培養した試験培養物の１ｍｌ容量は１％グルコースを添加した５０ｍｌのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）（ＢＨＩＧ）に接種し、振とうインキュベーター（１００ｒｐｍ）中、６時間、３２℃でインキュベーションした３１。細菌細胞は５０００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により沈殿させ、上清はＶｅｒｏ細胞の細胞毒性研究のために集めた３１。次に上清中のタンパク質は８０％までの飽和した硫酸アンモニウム溶液（１リットルに付き５６１ｇ）を使用して１０倍に濃縮した。１００００Ｘｇで２０分間遠心分離後、上清はデカンテーションし、タンパク質ペレットは２．５ｍｌのリン酸バッファー（２０ｍＭ；ｐＨ６．８）に再懸濁した。残った硫酸アンモニウム塩は４℃で６時間、同じバッファーに対する透析によって除去した。透析したタンパク質溶液の最終容量は、リン酸バッファー（２０ｍＭ；ｐＨ６．８）を使用して、元の容量の１／１０（５ｍｌ）に調整した３１。
【００７７】
催吐性トキシン生産。  一晩培養した試験培養物の１ｍｌ容量は１％グルコースを添加した５０ｍｌのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）（ＢＨＩＧ）に接種し、２５０ｒｐｍにセットした振とうインキュベーター中、６時間、３２℃でインキュベーションした３１。細菌細胞は２０００Ｘｇ、１０分間、４℃での遠心分離により沈殿させた３１。上清を集め、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけ、熱に不安定なエンテロトキシンを除去した２０。熱に安定な催吐性トキシン候補を含む、熱処理した濾液はＨＥｐ−２細胞に対する空胞形成アッセイのために集めた２０。
【００７８】
ＶｅｒｏおよびＨＥｐ−２細胞の調製。  アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ）またはＨＥｐ−２（ヒト喉頭癌）は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１００ＵＩ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および３ｍｌウシ胎児血清（１０％）を含む、１９９培地アール液（Ｍｅｄｉｕｍ  １９９  ｗｉｔｈ  Ｅａｒｌｅ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓａｌｔｓ（ＭＥＭ））３０ｍｌ中で単層培養物として維持した。ロイシン‐フリー培地（ＭＥＭ）は最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）を基礎にして調製し、同様に１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、３．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．７）を含んだ。ＶｅｒｏまたはＨＥｐ−２細胞はＭＥＭ中、５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベーションした。ＶｅｒｏまたはＨＥｐ−２細胞のコンフルエント単層培養物は培地を捨て、ＰＢＳ（ｐＨ７．７）５ｍｌで洗浄することにより継代培養した。ＶｅｒｏまたはＨＥｐ−２細胞はその後、トリプシン溶液（０．２５％  トリプシン；０．０２５％  ＥＤＴＡ）２ｍｌの添加により培養フラスコから剥がした。ばらばらにされたＶｅｒｏまたはＨＥｐ−２細胞のレベルは顕微鏡で確認し、その後ＭＥＭ培地（８ｍｌ）を添加して、それ以上のトリプシンの作用を妨げた。次に、新たにトリプシン処理したＶｅｒｏまたはＨＥｐ−２細胞の５ｍｌアリコートを１５ｍｌのＭＥＭを含む新しい培養フラスコに移し、３７℃、５％  ＣＯ２下でインキュベーションした。
【００７９】
ＴＥＣＲＡ（登録商標）バチルス下痢毒素（ＢＤＥ）可視イムノアッセイ。  試験キット（ＴＥＣＲＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ，Ｃｈａｔｓｗｏｏｄ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のすべての成分は、ＢＤＥ試料の試験まで２０〜２５℃に保った。取り扱い説明書にあるように、ＢＤＥに特異的な高親和性抗体を含むマイクロタイターウェルは、洗浄液に予め浸し、キットに提供し、１０分間、２０〜２５℃に保った。ウェルを空にし、２００μｌ容量の試験試料および対照（陽性および陰性）を含むアリコートを個々のウェルに移した。ウェルは３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルは４回洗浄し、２００μｌのコンジュゲートのアリコートをそれぞれのウェルに添加し、２５℃で１時間インキュベーションした。それぞれのウェルは５回洗浄し、それぞれのウェルに２００μｌの基質を添加し、２５℃で３０分間インキュベーションした。３０分後、それぞれのウェルの比色展開を、試験キット中に提供されたＴＥＣＲＡカラーカードと比較した。
【００８０】
Ｏｘｏｉｄバチルスセレウスエンテロトキシン逆受動ラテックス凝集反応（ＢＣＥＴ−ＲＰＬＡ）。
試験は逆受動ラテックス凝集反応（ＲＰＬＡ）（Ｕｎｉｐａｔｈ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）によるバチルスセレウスの下痢毒素の検出のために開発された。ポリスチレンラテックス粒子はＢ．セレウスの下痢毒素により免疫したウサギ由来の精製した抗血清により感作する。キットはまた、陽性（エンテロトキシン）および陰性（特定のＢ．セレウスエンテロトキシンを含まないラテックス粒子）の両方を提供した。２５μｌの希釈剤、および試験および対照（陽性および陰性）試料を含むアリコートは、２つの異なるＶ−ウェルマイクロタイタープレートのセットに連続して分配した。次に２５μｌの感作されたラテックスおよびラテックス対照を含む溶液はＶ−ウェルマイクロタイタープレートの第１および第２セットにそれぞれ分配した。それぞれのウェルは２５℃、２０〜２４時間のインキュベーション後に、凝集を調べた。
【００８１】
細胞毒性の測定。  新たにトリプシン処理したＶｅｒｏ細胞は３０ｍｌのロイシン‐フリー培地（ＭＥＭ）に再懸濁した。Ｖｅｒｏ細胞懸濁液１ミリリットルは２４ウェルのそれぞれに移した（１ウェルにつき約５ｘ１０４細胞）。細胞は１ｍｌのロイシン‐フリーＭＥＭで１回洗浄し、２時間、３７℃、５％  ＣＯ２下でインキュベーションした。２時間後、増殖培地を除去し、それぞれのウェルを１ｍｌのロイシン‐フリーＭＥＭで１回洗浄した。予め加熱した（３７℃）１ｍｌ容量のロイシン‐フリーＭＥＭをそれぞれのウェルに添加し、その後すぐに、バチルスアミロリキファシエンスＰＢ６、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１１７７８、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ４９０６４および大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２の上清または濾液を５０μｌ添加した。接種されたウェルは２時間、３７℃、５％  ＣＯ２下でインキュベーションした。インキュベーション２時間後、上清または濾液で処理したＶｅｒｏ細胞は予め加熱した（３７℃）１ｍｌのロイシン‐フリーＭＥＭで１回洗浄した。放射性標識同位体（８ｍ１のロイシン‐フリーＭＥＭ中１６μｌの１４Ｃ−ロイシン）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｓｉａ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を含む容量３００μｌの溶液をそれぞれのウェルに添加した。１４Ｃ−ロイシンで標識されたＶｅｒｏ細胞は１時間、３７℃で、ＣＯ２を使用せずにインキュベーションし、その後増殖培地を捨てた。次に、５％トリクロロ酢酸を含む溶液のアリコート１ｍｌを１４Ｃ‐ロイシンで標識されたＶｅｒｏ細胞を含むそれぞれのウェルに添加し、２５℃で１０分間インキュベーションした。１０分間インキュベーション後に、それぞれのウェルの内容物は５％トリクロロ酢酸溶液１ｍｌで２回洗浄した。それぞれのウェルに０．１Ｍ  ＫＯＨの３００μｌ容量を添加し、２５℃でさらに１０分間インキュベーションした。１０分間インキュベーション後、それぞれのウェルにシンチレーション液を２ｍｌ容量添加した。最後に、それぞれのウェルのすべての内容物をシンチレーション管に移した。すべてのシンチレーション管は１分間激しく攪拌し、放射能計数を行った。Ｖｅｒｏ細胞による１４Ｃ−ロイシン取り込みの阻止割合は、以下の式を使用して計算する。
１４Ｃ−ロイシン取り込みの阻止割合＝［（毒素を添加しないＶｅｒｏ細胞のｃｐｍ−試験試料のｃｐｍ）］／［毒素を添加しないＶｅｒｏ細胞のｃｐｍ］ｘ１００％。１４Ｃ−ロイシン取り込みの阻止割合を計算するために使用されるｃｐｍは、バックグラウンドカウントの値（約３０〜６０ｃｐｍ）を差し引く必要がある。１４Ｃ−ロイシン取り込みの阻止が１０倍に濃縮後に２０％未満である場合、毒素は存在しない。それぞれのアッセイはデュプリケートで行った。結果は表８および９に示す。
【００８２】
【表８】
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【００８３】
【表９】
2009519238.tif 000011
【００８４】
ＨＥｐ−２細胞空胞形成アッセイ。  試験および対照培養物由来の濾液を含む２５μｌ容量は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で段階希釈（２倍）し、９６‐ウェル組織培養プレート（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｔｄ，Ｕｘｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のすべてのウェルに分配した。新たにトリプシン処理したＨＥｐ−２細胞１００μｌを含む容量をそれぞれのウェルに添加し、２４時間、３７℃でインキュベーションした。すべての空胞形成アッセイはデュプリケートで行った。ＨＥｐ−２細胞における空胞形成存在の顕微鏡による検査は、６時間目および２４時間目の間隔で実施した。
【００８５】
ＰＣＲを基礎にした方法。  ＰＣＲプライマーは非溶血性エンテロトキシン（ＮｈｅＢ‐ｎｈｅＣ）２５、２６、ヘモリシンＢＬ（ＨｂｌＤ−ｈｂＩＡ）１０，１１、およびエンテロトキシンＫ（ＥｎｔＫ）２７，２８に対して作製した。ＮｈｅＢ−ｎｈｅＣプライマーの配列は、５′ＣＧＧＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＡＣＡＧＣ３′および３′ＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣ−ＡＧＣ５′であった。ＨｂｌＤ−ｈｂｌＡのプライマー配列は５′ＣＧＣＴ−ＣＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧＧ３′および３′ＴＣＣＣＴＡＡＴＧＴ−ＣＴＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＣ５′であった。ＥｎｔＫのフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ５′ＧＡＡＴＴＡＣＧＴＴＧＧＣＧＡＡＴＣ３′および３′ＣＧＧＧ−ＣＧＧＡＴＧＧＧＡ５′であった。試料ＰＣＲならびにバチルスアミロリキファシエンスＰＢ６および毒素生産菌株Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１１７７８およびＢ．セレウスＡＴＣＣ４９０６４のＤＮＡを含む陽性対照の試験管の両方は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に置き、初期設定温度は９０℃に設定した。サーマルサイクリングの条件は、９４℃、２分間を１サイクル、続いて、９４℃１５秒、７０℃３分間の温度サイクリング手順を３８−サイクル行った。増幅後、７２℃、７分間で最後の伸長を行った。ＰＣＲ増幅ステップは完了に約３時間必要であった。それぞれの反応産物のアリコート（１５μｌ）および１５μｌ  ＤＮＡ標準物ラダー（５００、１０３１、２０００および３０００塩基対）はその後０．１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む２％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を通して、１８０ボルトで１時間電気泳動した。電気泳動後、すべてのゲルはＵＶ‐トランスイルミネーター（波長−３０２ｎｍ）（ＵＶＰ  Ｍｏｄｅｌ  Ｗｈｉｔｅ／２ＵＶ；ＵＶＰ  Ｉｎｃ．，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）を使用して観察し、その後Ｐｏｌａｒｏｉｄ  ＭＰ−４カメラ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して写真を撮った（図９、図１０および図１１を参照されたい）。
【００８６】
実施例２‐微量液体希釈法によるクロストリジウムパーフリンジェンスおよびクロストリジウムディフィシルに対する異なるプロバイオティックスおよびバチルスアミロリキファシエンスＰＢ６の代謝産物の抗菌特性の測定
この研究では、我々はバチルスＰＢ６ならびに４種の市販のプロバイオティックス：Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）、Ｐｅｒｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）（Ｂｉｏｄｉｐｈａｒ）、Ｂｉｏｐｌｕｓ  ２Ｂ（Ｍｉａｖｉｔ  ＧｍｂＨ）およびＢｉｏｓｐｏｒｉｎｕｍ（Ｄｎｉｐｒｏｆａｒｍ）由来の代謝産物の抗クロストリジウム特性を検討した。異なるプロバイオティックスから分離された種による小規模発酵が設定された。代謝産物を含む発酵培養液のエーテル抽出物は微量液体希釈法を使用してＣ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対してスクリーニングした。Ｂ．ＰＢ６の代謝産物は顕著な抗クロストリジウム特性を示した。最小阻止濃度はＣ．パーフリンジェンスに対して２．５〜５．０μｇ／ｍｌ、そしてＣ．ディフィシルに対して５．０〜１０．０μｇ／ｍｌの間にあった。Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（登録商標）、Ｐｅｒｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）、Ｂｉｏｐｌｕｓ  ２ＢおよびＢｉｏｓｐｏｒｉｎｕｍ由来発酵のエーテル抽出物は、両方のクロストリジウム種に対する顕著な抗菌活性を全く示さなかった。
【００８７】
クロストリジウム種は天然の至る所に存在するが、それらの主な生息環境は土壌ならびに多くの動物およびヒトの消化管である。土壌試料における芽胞を含むＣ．パーフリンジェンスの広範な出現は、多くの食品を含む、塵埃汚染物質に曝された表面上のこの微生物のよく見られる存在の保証となる５０。Ｃ．パーフリンジェンスはまた、糞便を除く、ヒトの臨床標本からもっとも普通に分離される種である。創傷の単純な汚染から外傷性筋壊死、腹腔内敗血症、血管内溶血、誤嚥性肺炎、壊死性肺炎などに及ぶ多様な臨床環境中で該細菌に遭遇する５１。
【００８８】
Ｃ．ディフィシルは抗生物質関連性下痢症（ＡＡＤ）の主要な原因であり、そしてまた病院内獲得性下痢症の最も頻繁に同定される原因である。Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）では、主要な初期の事象は、抗生物質による処置中の保護的な腸内細菌叢の混乱を伴う。抗生物質のレベルは阻止濃度未満になるため、Ｃ．ディフィシルのような院内病原体は増殖することが可能である。糞便‐経口経路によりコロニー化が起こり、摂取された芽胞は胃酸バリアを生き延び、結腸中で発芽し始める５２、５３。毒素生産性および非毒素生産性分離菌は芽胞を形成することおよび院内環境で生存することが可能である。結果として、いずれの型も結腸を冒し、正常な細菌叢による競合がないため、入手可能な栄養素を利用することができる。微生物が結腸壁に付着するかどうかは不明であるが、おそらく微生物は結腸の内腔全体にわたって増殖する。毒素生産菌株は細胞が増殖し、溶解するに従って、トキシンＡおよび／またはＢを生産し、放出する。炎症反応と共にこの活性は組織病理学的事象を生じ、Ｃ．ディフィシル関連下痢症および結腸炎を引き起こす５４、５５、５６。
【００８９】
一般に受け入れられている定義による“プロバイオティック”は、“生きた微生物”フィード（ｆｅｅｄ）またはフードサプリメントであり、それは宿主の腸内微生物バランスを改善することにより、宿主に有益に影響する。しかし、プロバイオティックはどのように働くのであろうか？腸内生態系に対するプロバイオティックスの作用は消費者にとってなんらかの有益なやり方で強い影響を与える。プロバイオティックスを通した腸内環境の変化から生じた、以下のようないくつかの潜在的な利点が提示されている：感染性疾患、とりわけ腸のそのような疾患に対する耐性増大、下痢の期間の減少、血圧低下、血清コレステロール濃度の低下、アレルギーの低下など５７。
【００９０】
この論文に記載された比較研究は、クロストリジウム種に対する異なるプロバイオティク発酵抽出物の抗菌特性を比較するために計画された。
【００９１】
方法と材料
バチルスＰＢ６およびＢａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ−ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）から分離されたバチルスセレウス菌株は、５％ヒツジ血液（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加したＴｒｙｐｔｏｎ  Ｓｏｙａ寒天プレート上、２４時間、３７℃で培養した。フィードプロバイオティックＢｉｏｐｌｕｓ  ２Ｂは、２つの異なる種、バチルスリケニフォーミスＤＳＭ５７４９およびバチルスサブチリスＤＳＭ５７５０を含んでいた。両種も５％ヒツジ血液（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加したＴｒｙｐｔｏｎ  Ｓｏｙａ  寒天プレート上、２４時間、３７℃で培養した。これらの培養物の混合物を使用して、０．６％酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加した１００ｍｌＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ培養液に接種した。Ｂｉｏｓｐｏｒｉｎｕｍも２つの種、すなわちバチルスリケニフォーミスとバチルスサブチリスを含む。この製品はガラスバイアル中の凍結乾燥した培養物として市販されている。１バイアルの内容物は培養液に再懸濁し、この混合物を使用して０．６％酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加した１００ｍｌ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ培養液に接種した。すべてのプロバイオティックスを振とうインキュベーター（１００ｒｐｍ）中、３７℃で２４時間インキュベーション後、培養液を等しい量のジエチルエーテル（Ａｃｒｏｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）と（３回）混合した。代謝産物の抽出後、両方の層を分け、エーテル画分を集め、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００９２】
その後、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で溶媒を除去した。残渣を量り、ジメチルスルホキシド（Ａｃｒｏｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に溶かし、最終濃度１００００μｇ／ｍｌの粗抽出物を得た。１／１２の比のＤＭＳＯ／水の混合物で付加的な希釈物（５００、２５０、１００、５０、２５および１０μｇ／ｍｌ）を作製した。最後に、それぞれの希釈物２５μｌをマイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ）のウェルにピペットで移した。Ｐｅｒｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）（Ｂｉｏｄｉｐｈａｒ）で使用されるサッカロミセスボウラディー（Saccharomyces boulardii）はＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（Ｏｘｏｉｄ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）上で４８時間、３７℃で培養した。この培養物を使用して１００ｍｌのＳａｂｏｕｒａｕｄ液体培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に接種した。２日間、振とうインキュベーター（１００ｒｐｍ）中、３７℃でインキュベーション後、同じ手順を使用して代謝産物を抽出した。
【００９３】
細菌菌株クロストリジウムパーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４（Ｃ１６００Ｌ，Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびクロストリジウムディフィシルＡＴＣＣ９６８９（Ｃ１６１０Ｌ，Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）は、凍結乾燥したｃｕｌｔｉ−ｌｏｏｐｓとして購入し、取扱説明書に従って培養した。両培養物からＡｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｓａｌ培養液（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中でＭａｃｆａｒｌａｎｄ標準物（Ａ６２５ｍｍ＝０．１００)を調製した。この標準物２５０μｌを新鮮なＡｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｓａｌ培養液１０ｍｌに添加し、この培地２２５μｌをウェルにピペットで移した。それぞれのウェルにおいて最終細胞密度５ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌを得た。マイクロタイタープレートは、気密プラスチック製バッグ中、Ａｎａｅｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｃｔ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、１８時間（Ｃ．パーフリンジェンス）および４８時間（Ｃ．ディフィシル）、嫌気性条件下でインキュベーションした。インキュベーション期間前および後に、それぞれのウェルの光学密度（ＯＤ）をＢｉｏｓｃｒｅｅｎＣアナライザー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して測定した。白色光（Ｗｉｄｅ  Ｂａｎｄ）を使用してＯＤを測定した。試験はデュプリケートで、さらに、培地の対照、培地プラス接種物（陰性対照）および陽性対照中で行われ；３種の濃度（０．１、０．５および１．０μｇ／ｍｌ）のバンコマイシン（Ｆｌｕｋａ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）が試験バッチに含まれた。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は増殖が全く起きないか、またはＯＤの増加が全く検出されない最も低い濃度として定義した。
【００９４】
結果と考察
ＯＤの強い増加が両方の種の陰性対照ウェルで認められた。１．０および０．５μｇ／ｍｌバンコマイシンを含むウェルでは増殖は全く起きず、０．１μｇ／ｍｌバンコマイシンはＣ．パーフリンジェンスの増殖を阻止しなかった。１および２．５μｇ／ｍｌのＰＢ６抽出物を含むウェルでは、Ｃ．パーフリンジェンスの正常な増殖が起きた。５μｇ／ｍｌからＣ．パーフリンジェンスの増殖は全く認めることができなかった。ＰＢ６粗発酵抽出物のＣ．パーフリンジェンスに対するＭＩＣは、２．５〜５．０μｇ／ｍｌの間にあった。また、陰性対照群ウェルではＣ．ディフィシルに対して強いＯＤの増加が認められた。１．０および０．５μｇ／ｍｌバンコマイシンを含むウェルでは増殖が全く認められず、０．１μｇ／ｍｌバンコマイシンは増殖を阻止しなかった。１、２．５および５μｇ／ｍｌ粗ＰＢ６‐抽出物を含むウェルでは、Ｃ．ディフィシルの正常な増殖が見られた。１０μｇ／ｍｌから、増殖は全く検出されなかった。Ｃ．ディフィシルに対するＰＢ６代謝産物のエーテル抽出物のＭＩＣは５．０〜１０μｇ／ｍｌであった。Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（登録商標）（Ｂ．セレウス）、Ｐｅｒｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）（Ｓ．ボウラディー）、Ｂｉｏｐｌｕｓ  ２Ｂ（バチルスリケニフォーミスＤＳＭ５７４９およびバチルスサブチリスＤＳＭ５７５０）およびＢｉｏｓｐｏｒｉｎｕｍ（バチルスリケニフォーミス属種およびバチルスサブチリス属種）のエーテル抽出物は試験したすべての濃度に関して有意な抗菌活性を全く示さなかった。試験した両方のクロストリジウム種に対するＭＩＣは５０μｇ／ｍｌより大きかった。これらの結果は表１０に見いだすことができる。
【００９５】
【表１０】
2009519238.tif 000012
【００９６】
結論
我々はＢ．ＰＢ６、Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（登録商標）（Ｂ．セレウス）、Ｐｅｒｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）（Ｓ．ボウラディー）、Ｂｉｏｐｌｕｓ  ２Ｂ（Ｂ．リケニフォーミスＤＳＭ５７４９およびＢ．サブチリスＤＳＭ５７５０）およびＢｉｏｓｐｏｒｉｎｕｍ（バチルスリケニフォーミス属種およびバチルスサブチリス属種）由来のエーテル抽出物の抗クロストリジウム特性を検討した。これらの種によるラボスケール発酵が設定され、エーテル抽出物は、微量液体希釈法を使用してＣ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対してスクリーニングした。Ｂ．ＰＢ６の代謝産物は顕著な抗クロストリジウム特性を有し、ＭＩＣはＣ．パーフリンジェンスに対して２．５〜５．０μｇ／ｍｌ、そしてＣ．ディフィシルに対して５．０〜１０．０μｇ／ｍｌの間にある。Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（登録商標）、Ｐｅｒｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標）、Ｂｉｏｐｌｕｓ  ２ＢおよびＢｉｏｓｐｏｒｉｎｕｍ発酵物のエーテル抽出物は、Ｃ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対して有意な作用が全く見られなかった。
【００９７】
実施例３‐ＩＢＤに対するバチルスＰＢ６の有効性
サーファクチンは多くの炎症過程に中心的に関係する酵素である細胞質性ＰＬＡ２の活性を阻止することが公知である５８。炎症プロセスの阻止はサーファクチンを生産するプロバイオティックスを、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような炎症性疾患の治療に対して非常に興味あるものにしている。
【００９８】
炎症性腸疾患は腸の炎症を引き起こす２種の慢性疾患：潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を表す。該疾患は共通の特徴も持つが、重要な違いもある。
ＣＤは腸壁の慢性炎症であり、典型的には腸壁の完全な厚さに影響を与える。最も一般的には、それは小腸の最も低部（回腸）および大腸に発生するが、口から肛門までの消化管および肛門周囲の皮膚のいずれかの部分にも発生しうる。
【００９９】
ここ２、３０年で、ＣＤは西洋および発展途上国の両方でいっそう一般的になっている。それは両性においてほぼ等しく発生し、ユダヤ人の間でいっそうよく見られる。多くの症例が３０歳より前に発症し；大部分は１４〜２４歳の間に始まる。
【０１００】
それぞれの人において、該疾患は腸の特定の部分を冒し、ときどき正常な部分（スキップ部分）が冒された領域に挟まれる。ＣＤに冒された患者の約３５％は回腸だけが冒される。約２０％は大腸だけが冒される。患者の約４５％は回腸と大腸の両方が冒される。
【０１０１】
ＣＤの原因はわかっていない。調査は免疫システムの機能不全、感染、および食餌の３種の主な可能性に焦点を当ててきた。
ＣＤの最も一般的な初期の症状は慢性下痢、腹部痛、発熱、食欲不振、および体重減少である。症状はＣＤ患者間で異なるが、４種の共通のパターンがある：
・腹部の右下部における疼痛および圧痛を伴う炎症；
・腸壁の激しい痛みを伴う痙攣、腹部の腫れ、便秘、および嘔吐を引き起こす、繰り返し起こる急性腸閉塞；
・栄養不良および慢性衰弱を引き起こす炎症および慢性部分的腸閉塞；
・しばしば発熱、疼痛を伴う腹部腫瘤および激しい体重減少を引き起こす異常な瘻孔および膿瘍。
【０１０２】
ＵＣは、大腸が炎症を起こし、潰瘍を生じ、血性下痢、腹部痙攣、および発熱症状が出現する慢性疾患である。疾患はいずれの年齢でも発症するが、通常１５〜３０歳で始まる。
【０１０３】
ＣＤとは異なり、ＵＣは通常、腸の完全な厚さに影響を与えず、小腸を冒さない。疾患は通常直腸またはＳ字状結腸で始まり、結局部分的に、または完全に大腸中に広がる。患者によっては、大腸の大部分が初期から冒される。
【０１０４】
ＵＣに罹患しているように見える患者の約１０％は、ただ１回発病するだけである。しかし、そのような患者の一部は実際には、真のＵＣよりむしろ、発見されていない感染症を患っている可能性がある。多くの患者の場合、ＵＣは次第に悪化し、そして徐々に弱まる慢性疾患である。ＵＣの原因は依然としてわかっていない。腸における遺伝的形質および過剰な免疫反応が貢献している因子であると考えられている。
【０１０５】
ラットのＴＮＢＳ‐誘発大腸炎（ヒトにおける大腸炎のモデル）の治療における経口投与されたバチルスＰＢ６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の測定
この実験では、２，４，５−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与により誘発されるラットの大腸炎に対するＰＢ６の有効性を研究した。
【０１０６】
研究計画
２つの連続したトライアルが行われた。雄ＷｉｓｔａｒラットはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａ）（トライアル１）またはＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＴＡＮＵＶＡＳ（Ｃｈｅｎｎａｉ，Ｉｎｄｉａ）（トライアル２）から得た。処置期間の初めに動物は１０〜１２週齢であった。試験施設到着時に、動物が良好な状態であることを確実にするために、獣医師の監督の下で動物に完全な臨床検査が行われた。動物は少なくとも７日間、研究条件に順応させた。トライアル毎に、動物を無作為に選び、研究グループの１つに割り当てた。動物は研究グループごとにポリカーボネートケージ（４２１ｘ２９０ｘ１９０ｍｍ、ＬｘＷｘＨ）で飼育した。動物室および試験室の状態は以下のように設定した：温度２２±３℃、相対湿度５０±２０％、明／暗周期：１２時間／１２時間（明期０７．００−１９．００）および換気：濾過した、再循環しない空気を約７サイクル／時間。すべての動物はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＮＩＮ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａ）のラットペレットフィードとＡｑｕａｇｕａｒｄ精製水を随意に自由に摂取した（ＴＮＢＳ投与に先立つ一晩の絶食を除く）。両トライアルでは、大腸炎の誘発日は１日目に設定した。大腸炎は一晩絶食後に、肛門から８ｃｍのところへのＴＮＢＳ１００ｍｇ／ｋｇ体重の１回直腸内投与を使用して誘発した。大腸炎陰性対照群は、１日目に直腸内に生理食塩水（動物毎に０．５ｍｌを１回）を与えられた。大腸炎陰性および大腸菌陽性対照群は、蒸留水１０ｍｌ／ｋｇを１日３回、４時間間隔で、１日目に開始し、７日目まで与えられた。１回目のトライアルで、ＴＮＢＳ‐誘発大腸炎群は、ＰＢ６（それぞれ１．５  １０８ＣＦＵ／Ｋｇまたは１．５  １０９ＣＦＵ／Ｋｇ）、１日３回、４時間間隔、１日目に開始し、７日目まで；メサラジン（２５０ｍｇ／Ｋｇ／日）、１日目に開始し、７日目までの；またはインフリキシマブ（３ｍｇ／Ｋｇ）、１日目の単回投与として、で処置される。２回目のトライアルでは、ＰＢ６（１．５  １０８ＣＦＵ／Ｋｇ）、メサラジンおよびインフリキシマブ処置に関する１回目のトライアルを部分的に反復し、そしてＳ．ボウラディー（１．５  １０８ＣＦＵ／ｋｇ）、１日３回、４時間間隔、１日目に開始し、７日目まで、による付加的な処置を含んだ。１回目またはただ１回（インフリキシマブの場合）の処置の投与量は、ＴＮＢＳ投与後２（蒸留水、ＰＢ６、ボウラディーおよびメサラジン）または３（インフリキシマブ）時間以内に与えられた。静脈内に注射された５９インフリキシマブを除いて、すべての処置は強制経口によって投与された。臨床徴候および死亡に関して１日２回の観察が行われた。動物の体重は１、４および７日目に記録した。８日目に、動物を供試し、（肛門基部５〜１０ｃｍまでの）５ｃｍの長さの結腸セグメントを切除した。これらのセグメントは縦方向に切り開いた。内容物を生理食塩水で洗浄することにより除去し、以下のスケールを使用して肉眼的形態を採点した：０‐潰瘍または炎症なし、１‐潰瘍はなく、��所的な充血だけ、２‐充血のない潰瘍化、３‐１か所だけの潰瘍化および炎症、４‐２か所以上の潰瘍化および炎症、および５‐２ｃｍより長い潰瘍化。それぞれ５ｃｍの結腸セグメントの重量も記録し、炎症によって誘発された水腫を評価した。
【０１０７】
試験調製物
５％ＴＮＢＳ水溶液（ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）は５０％エタノールにより２．５％溶液に希釈した。投与量は４ｍｌ／Ｋｇ体重であった。マルト‐およびシクロデキストリンキャリア上で乾燥したバチルス‘ＰＢ６’発酵培養液である、ＰＢ６乾燥物（Ｋｅｍｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｄｅｓ  Ｍｏｉｎｅｓ，ＵＳＡ）は蒸留水で１．５  １０７および１．５  １０８ＣＦＵ／ｍｌの濃度に懸濁した。投与容量は１０ｍｌ／ｋｇ体重であった。サッカロミセスボウラディー（Ｅｎｔｅｒｏｌ（登録商標），Ｂｉｏｄｉｐｈａｒ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）は１．５  １０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度に蒸留水で懸濁した。投与量は１０ｍｌ／Ｋｇ体重であった。メサラジン（Ｍｅｓａｃｏｌ（登録商標），Ｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄ．Ｌｔｄ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）錠剤は乳棒と乳鉢を使用して粉末にし、１ｍｌに２５ｍｇの５−アミノサリチル酸を含む蒸留水中の溶液を調製した。投与容量は１０ｍｌ／Ｋｇ体重であった。Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｂ．Ｖ．，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は初めに注射用に１０ｍｌの水に溶かし、さらに生理食塩水を使用して２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。用いた投与容量は１．５ｍｌ／Ｋｇ体重であった。体重に依存した投与容量はすべて、最近測定した個々の体重を基礎に投与した。それぞれの投与前に新鮮な調製物が作製された。調製物はそれぞれの投与前に激しく攪拌した。
【０１０８】
結果と考察
１回目のトライアルで、インフリキシマブで処置したラットの中の１匹は２日目に死亡した。この動物は、１日目に１回目の注射で薬物溶液が漏れたため、２回目の注射を受けていた。ＴＮＢＳによる大腸炎の誘発後、いくつかの動物は軽度な下痢の徴候を示した。１日目から７日目までに、異なる処置群で記録された下痢の観察数（および冒された動物の数）は、１回目のトライアルでは、大腸炎‐陰性対照、大腸炎‐陽性対照、ＰＢ６  ３ｘ１．５  １０８ＣＦＵ／Ｋｇ／日、ＰＢ６  ３ｘ１．５  １０９ＣＦＵ／Ｋｇ／日、メサラジン２５０ｍｇ／Ｋｇ／日およびインフリキシマブ３ｍｇ／Ｋｇ単回投与量それぞれに対して０、２２（２）、４（１）、０、０および８（１）であり；そして２回目のトライアルでは、大腸炎‐陰性対照、大腸炎‐陽性対照、ＰＢ６  ３ｘ１．５  １０８ＣＦＵ／Ｋｇ／日、Ｓ．ボウラディー３ｘ１．５  １０８ＣＦＵ／Ｋｇ／日、メサラジン２５０ｍｇ／Ｋｇ／日およびインフリキシマブ３ｍｇ／Ｋｇ単回投与量それぞれに対して０、４２（４）、１０（１）、３４（３）、１２（１）および２４（２）であった。大腸炎‐陽性対照群は、大腸炎に伴って実質的な体重減少を示した。トライアル１では、この減少はトライアル２より大きく、このことは大腸炎の誘発時期での年齢および成長速度の違いに関連する可能性がある。トライアル１の大腸炎‐陰性対照群の、開始時の一般に低い体重と、トライアル期間にわたる百分率に換算した高い体重増加は、これらの動物がトライアル２の動物より平均で幾分若かったことを示唆する。トライアル１における共通の処置はすべて、体重増加に対する大腸炎の負の作用を有意に抑制したが、トライアル２ではこれはＰＢ６処置による場合だけであった（表１１）。
【０１０９】
【表１１】
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【０１１０】
トライアル１における、動物に対する大腸菌のより大きな影響はおそらく、いずれかの処置による改善の余地をより多く残した。ＰＢ６とメサラジンはいつも、大腸炎‐陽性対照とは明確に識別しうる、結腸セグメントの重量と肉眼的形態スコアをもたらした（表１２）。
【０１１１】
【表１２】
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【０１１２】
ＰＢ６およびＭｅｓａｃｏｌで処置された、ＴＮＢＳ誘発大腸炎を患うラット結腸壁の健康状態は、肉眼的には大腸炎フリーラットのそれと同じであった。不明の理由により、メサラジン処理はトライアル２では幾分効力が低く、潰瘍化が見られることもあった。縦方向に切り開いた結腸セグメントの目視検査は、陽性対照、Ｓ．ボウラディー、およびインフリキシマブ処置群に存在する潰瘍化および壊死組織領域、ならびにＰＢ６群およびトライアル１メサラジン群におけるそれらの欠如を明確に示す。トライアル１では、インフリキシマブで処置したラットの中の１匹は、肉眼的形態スコア１および結腸セグメント重量０．４０２ｇであった。これらのデータは、この特定の動物では、インフリキシマブ処置が成功したこと、または大腸炎の誘発がなかったことを暗示する。処置期間の終了時に、インフリキシマブで処置したラットの平均体重増加および結腸セグメント重量データは、両トライアルにおける大腸炎‐陰性および大腸炎‐陽性対照群のそれらの中間であった。このことは、おそらくインフリキシマブにはいくらかの作用があるが、これらのトライアルでは統計的に有意ではなかったことを示唆する。ラットにおける類似のトライアルでは、ＴＮＢＳによる大腸炎の誘発前に３ｍｇ／Ｋｇｉ．ｖ．２日間の同じ投与量でインフリキシマブが投与され、インフリキシマブは結腸の肉眼的形態に対して多少の作用を有するが、水腫レベルは大腸炎‐陽性対照群のそれ以下に、有意に低下させないことを示した１９。ＰＢ６で処置したラットの結腸セグメントでは、潰瘍化は見られなかった。これらのセグメントの大部分で、充血だけが観察された。ＰＢ６は、ＴＮＢＳの直腸内投与により誘発されるようなラット結腸壁における炎症を明確に弱める。以前のトライアルで観察された３ｘ１．５  １０９ＣＦＵ／Ｋｇ／日による７日間の誘発後処置の有効性はトライアル１で確かめられた２０。同じ以前のトライアルに基づいたＰＢ６  ３ｘ８  １０７ＣＦＵ／Ｋｇ／日による７日間の誘発後処置は有効でないと結論されたが、この処置のデータが大腸炎‐陽性対照群のデータともはや統計的に差異を識別できない程度にまで炎症を低下させるために、３ｘ１．５  １０８へのＣＦＵ／Ｋｇ／日の増加が十分であることが両トライアルで証明された。
【０１１３】
結論
この研究は、以前のトライアルで観察された、ラットにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）‐誘発大腸炎に対するバチルス‘ＰＢ６’の有効性を確かめ、証拠を提供するため、ならびにその有効性をＳ．ボウラディー（プロバイオティック）、メサラジンおよびインフリキシマブ（標準薬）の有効性と比較するために計画され、実施された。このラットモデルは十分に確立され、信頼性があり、ＩＢＤを処置することを目的とした薬物の効率を試験するために広く使用されている。大腸炎の誘発後にいずれかの処置をしないと、数匹のラットは軽度な下痢の徴候を示し、その後のトライアル期間中、平均して体重を減らし続けた。それらの結腸の腸壁の肉眼的形態は炎症、潰瘍化により、そして壊死にさえ特徴付けられた。１．５  １０８ＣＦＵ／Ｋｇ／日を３回、または１．５  １０９ＣＦＵ／Ｋｇ／日を３回、７日間の処置により、結腸壁を、陰性対照群の健康状態および抗炎症薬である、標準薬メサラジンで処置した群の健康状態と統計的に同一である健康な状態にした。
【０１１４】
実施例４‐ＰＢ６代謝産物の抗菌特性
方法と材料
バチルスＰＢ６およびＢａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ（Ｓａｎｏｆｉ−ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）から分離されたバチルスセレウスの拮抗特性は、たとえばＣ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４、Ｃ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９、およびカンピロバクタージェジュニＡＴＣＣ３２９１のような異なる指標菌株に対して試験した。
【０１１５】
バチルスセレウスおよびバチルスＰＢ６はそれぞれ滅菌生理食塩水５ｍｌに懸濁した。スワブを使用して、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙ寒天プレート（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上に、プロバイオティック懸濁液の画線を１本作製し、プレートは好気性条件下、３７℃で２４時間インキュベーションした。
【０１１６】
その後、異なる指標菌株の懸濁液をスワブにより両方のバチルス培養物に直角に接種し、好気性条件下で２４時間インキュベーションした。嫌気性条件下、Ａｎａｅｒｏｇｅｎ  Ｐａｋ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、クロストリジウムパーフリンジェンスを接種したプレートは２４時間インキュベーションし、Ｃ．ディフィシルを接種したプレートは４８時間インキュベーションした。４８時間Ｃ．ジェジュニＡＴＣＣ３３２９１培養物の懸濁液を使用して、プロバイオティック培養物に対して直角に４本の画線を作製した。カンピロバクター種を接種したプレートは微小好気性条件（ＣａｍｐｙＧｅｎ，Ｏｘｏｉｄ）下、３７℃で４８時間インキュベーションした。画線はお互いに触れてはならない。３７℃でのインキュベーション後、拮抗作用は、ストリークラインの交差点周囲の透明帯の出現によって評価し、１種の微生物の他の微生物に対する阻止作用を示唆した。
【０１１７】
結果と考察
ＰＢ６はＣ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対する拮抗作用を有した。両種に対し、プレート上の画線の交差点で透明帯を観察することができた。Ｃ．パーフリンジェンスに対する拮抗作用は、この種の溶血特性のために明確に肉眼で見える。例は図１に表す。この写真ほど明確ではないが、著しい透明帯がＰＢ６とＣ．ディフィシル培養物の交点でも認められた。
【０１１８】
バチルスセレウス（Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ）はＣ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９に対して拮抗作用を示さなかった。プレート上の画線の交差点では透明帯は観察できなかった。試験プレートの例は図１２に表す。
【０１１９】
バチルスＰＢ６はＣ．ジェジュニＡＴＣＣ３３２９１に対して拮抗作用を有した。透明帯はプレート上のストリークラインの交点で観察可能である。試験プレートの例は図１３に表す。
【０１２０】
バチルスセレウス（Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ）は図１４で観察することができるように、Ｃ．ジェジュニに対して拮抗作用がなかった。
【０１２１】
結論
天然から分離したバチルスＰＢ６は明確に、Ｃ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４、Ｃ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９およびＣ．ジェジュニＡＴＣＣ３３２９１に対して強い拮抗特性を有する。対照的に、試験した他のヒト病原性細菌に対しては作用が観察できなかった。
【０１２２】
バチルスセレウス（Ｂａｃｔｉｓｕｂｔｉｌ）はＣ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４、Ｃ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９および他の試験した微生物に対して拮抗作用を全く示さなかった。
【０１２３】
ＰＢ６菌株の生細胞は２００５年５月２７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６７３７を割り当てられている。寄託は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８０１−１．８０９に従って行われた。
【０１２４】
先の記載および図面は本発明の実例となる態様を含む。先の態様および本明細書に記載された方法は、当業者の能力、経験、および好みに基づいて変化してもよい。単にある順序で方法のステップを列挙することは、方法のステップの順序に対していかなる制約も与えない。先の記載および図面は単に本発明を説明し、実例を挙げるものであり、特許請求の範囲がそのように限定しない限り、本発明はそれらによって限定されない。それ以前に開示を有する当業者は、本発明の範囲から逸脱せずに、その中の改変および変更をすることが可能である。
【０１２５】
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【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】Ｃ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４（２）およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９（３）に対するバチルスＰＢ６（１）の拮抗作用の写真である。
【図２】クロストリジウムディフィシルＮＡＰ１／０２７に対するバチルスＰＢ６の拮抗作用の写真である。
【図３】カンピロバクタージェジュニＡＴＣＣ５５９１８に対するバチルスＰＢ６の拮抗作用の写真である。
【図４】サーファクチンの化学構造である。
【図５】異なる処置によるＣＤＡＤを患うハムスターの％生存率のチャートである。
【図６】バチルスＰＢ６の１４６６‐ｂｐ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（ヌクレオチド位置２７〜１４９２）である。
【図７】バチルスＰＢ６の１０２３‐ｂｐ部分的ｇｙｒＡ配列（ヌクレオチド位置４３〜１０６５）である。
【図８】バチルスＰＢ６の部分的ｇｙｒＡシークエンシングから得られた８０１‐ｂｐコンセンサス配列である。
【図９】ヘモリシンＢＬをコードするＰＣＲ産物（１６５０‐ｂｐ）検出のゲルである；レーン１、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（登録商標）マスラダー（ｍａｓｓ  ｌａｄｄｅｒ）（３０００、２０００、１５００、１２００‐ｂｐ）；レーン２、バチルスＰＢ６；レーン３、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２；レーン４、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ４９０６４；レーン５、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１１７７８。１６５０‐ｂｐのＰＣＲ産物に相当する増幅されたバンドは、レーン４および５を除いていずれのレーンでも検出されなかった。
【図１０】非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）をコードするＰＣＲ産物（１４３７‐ｂｐ）の検出のゲルである。レーン１、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（登録商標）マスラダー（３０００、２０００、１５００、１２００‐ｂｐ）；レーン２、バチルスＰＢ６；レーン３、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２；レーン４、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ４９０６４；レーン５、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１１７７８。１４３７‐ｂｐのＰＣＲ産物に相当する増幅されたバンドはいずれのレーンでも検出されなかった。
【図１１】エンテロトキシンＫ（ＥｎｔＫ）をコードするＰＣＲ産物（１４００‐ｂｐ）の検出のゲルである。レーン１、バチルスＰＢ６；レーン３、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２；レーン４、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ４９０６４；レーン５、Ｂ．セレウスＡＴＣＣ１１７７８；レーン６、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（登録商標）マスラダー（３０００、２０００、１５００、１２００‐ｂｐ）。１４００‐ｂｐのＰＣＲ産物に相当する増幅されたバンドはいずれのレーンでも検出されなかった。
【図１２】Ｃ．パーフリンジェンスＡＴＣＣ１３１２４（２）およびＣ．ディフィシルＡＴＣＣ９６８９（３）に対するバチルスセレウス（１）の拮抗作用の欠如を示す写真である。
【図１３】カンピロバクタージェジュニＡＴＣＣ３３２９１に対するバチルスＰＢ６の拮抗作用の写真である。
【図１４】カンピロバクタージェジュニＡＴＣＣ３３２９１に対するバチルスセレウスの拮抗作用の欠如を示す写真である。
【図１】
2009519238.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009519238.tif 000021
【図８】
2009519238.tif 000022
【図９】
2009519238.tif 000023
【図１０】
2009519238.tif 000024
【図１１】
2009519238.tif 000025
【図１２】
2009519238.tif 000026
【図１３】
2009519238.tif 000027
【図１４】
2009519238.tif 000028
【配列表】
2009519238000001.xml
【国際調査報告】
2009519238.tif 000032