(57)【要約】  マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を過剰発現する腫瘍および癌を治療するためのワクチンにおいて使用するための、ＭＭＰ−１１もしくはストロメライシン−３（ＳＴ−３）またはＭＭＰ−１１をコードする核酸を含む組成物を記載する。特定の実施形態においては、該組成物は、免疫増強要素にＣ末端において連結された触媒的に不活性化されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、ＭＭＰ−１１および該免疫増強要素をコードするコドンはヒト細胞における該融合ポリペプチドの発現の増強のために最適化されている。他の実施形態においては、該組成物は、免疫増強要素にＣ末端において連結された触媒的に不活性化されたＭＭＰ−１１を含む。該組成物は、単独で、または他の腫瘍関連抗原に対するワクチンならびに放射線療法および化学療法のような通常の療法と共に相乗的に使用されうる。
2009509553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
【請求項２】
該ヌクレオチド配列によりコードされるＭＭＰ−１１が更に、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
該変異がＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する、請求項２記載の核酸。
【請求項４】
ＭＭＰ−１１がヒトＭＭＰ−１１である、請求項１記載の核酸。
【請求項５】
ＭＭＰ−１１が霊長類由来のＭＭＰ−１１である、請求項１記載の核酸。
【請求項６】
該ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の核酸。
【請求項７】
免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含有する融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
該免疫増強要素が、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる、請求項７記載の核酸。
【請求項９】
該免疫増強要素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）である、請求項７記載の核酸。
【請求項１０】
該ＬＴＢがシグナル配列を含まない、請求項７記載の核酸。
【請求項１１】
該ＬＴＢが、配列番号８に示すヌクレオチド配列によりコードされている、請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
ＭＭＰ−１１が、それを触媒的に不活性にする変異を含む、請求項７記載の核酸。
【請求項１３】
ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている、請求項７記載の核酸。
【請求項１４】
ＭＭＰ−１１が、配列番号４に示すヌクレオチド配列によりコードされている、請求項７記載の核酸。
【請求項１５】
該融合ポリペプチドが、配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含む、請求項７記載の核酸。
【請求項１６】
プロモーターに機能的に連結された請求項１記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１８】
該融合ポリペプチドの製造のための条件下、細胞培養培地内で請求項１７記載の宿主細胞を培養することを含んでなる製造方法。
【請求項１９】
プロモーターに機能的に連結された請求項７記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２１】
該融合ポリペプチドの製造のための条件下、細胞培養培地内で請求項２０記載の宿主細胞を培養することを含んでなる製造方法。
【請求項２２】
免疫増強要素またはその実質的部分に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含んでなる融合ポリペプチド。
【請求項２３】
該免疫増強要素が、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる、請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
該免疫増強要素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）である、請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
該ＬＴＢがシグナル配列を含まない、請求項２４記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
該ＬＴＢが、配列番号９に示すアミノ酸を含む、請求項２５記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
ＭＭＰ−１１が、それを触媒的に不活性にする変異を含む、請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
該変異がＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する、請求項２７記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
ＭＭＰ−１１が、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
該ポリペプチドが、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む、請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３２】
該ヌクレオチド配列によりコードされるＭＭＰ−１１が更に、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含む、請求項３２記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３３】
該変異がＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する、請求項３３記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３４】
ＭＭＰ−１１がヒトＭＭＰ−１１である、請求項３２記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３５】
ＭＭＰ−１１が霊長類由来のＭＭＰ−１１である、請求項３２記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３６】
該ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項３３記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３７】
免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含有する融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３８】
該免疫増強要素が、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３９】
該免疫増強要素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）である、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４０】
該ＬＴＢがシグナル配列を含まない、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４１】
該ＬＴＢが、配列番号８に示すヌクレオチド配列によりコードされる、請求項４１記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４２】
ＭＭＰ−１１が、それを触媒的に不活性にする変異を含む、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４３】
ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４４】
ＭＭＰ−１１が、配列番号４に示すヌクレオチド配列によりコードされる、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４５】
該融合ポリペプチドが、配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含む、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４６】
遺伝的アジュバントを更に含む、請求項３８記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４７】
免疫増強要素またはその実質的部分に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含有する融合ポリペプチドを含んでなるポリペプチドワクチン。
【請求項４８】
該免疫増強要素が、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる、請求項５０記載のポリペプチドワクチン。
【請求項４９】
該免疫増強要素が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）である、請求項５０記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５０】
該ＬＴＢがシグナル配列を含まない、請求項５２記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５１】
該ＬＴＢが、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む、請求項５３記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５２】
ＭＭＰ−１１が、それを触媒的に不活性にする変異を含む、請求項５０記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５３】
該変異がＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する、請求項５５記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５４】
ＭＭＰ−１１が、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項５０記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５５】
該融合ポリペプチドが、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む、請求項５０記載のポリペプチドワクチン。
【請求項５６】
ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている、マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の使用。
【請求項５７】
個体における癌を治療するための医薬における、免疫増強要素に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含む融合ポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項５８】
個体における癌を治療するための医薬における、免疫増強要素に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含む融合ポリペプチドの使用。
【請求項５９】
（ａ）マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）をコードするヌクレオチド配列（ここで、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。）を含む核酸を含むワクチン、または免疫増強要素に連結されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むワクチンを準備すること、および
（ｂ）該ワクチンを個体に接種して癌を治療すること
を含んでなる、個体における癌の治療方法。
【請求項６０】
該個体が、化学療法、放射線療法および腫瘍関連抗原に対するワクチンよりなる群から選ばれる１以上の治療を受けている、請求項６２記載の方法。
【請求項６１】
該個体が、乳癌、結腸癌、頭部および頚部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌）、子宮癌（子宮頚癌および子宮内膜癌）よりなる群から選ばれる浸潤性癌を有する、請求項６２記載の方法。
【請求項６２】
該個体が、浸潤へと進展するリスクを有する非浸潤性癌を有する、請求項６２記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）免疫増強要素に連結されたマトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を含有する融合ポリペプチドを含むワクチンを準備すること、および
（ｂ）該ワクチンを個体に接種して癌を治療すること
を含んでなる、個体における癌の治療方法。
【請求項６４】
該個体が、乳癌、結腸癌、頭部および頚部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌）、子宮癌（子宮頚癌および子宮内膜癌）よりなる群から選ばれる浸潤性癌を有する、請求項６６記載の方法。
【請求項６５】
該個体が、浸潤へと進展するリスクを有する非浸潤性癌を有する、請求項６６記載の方法。
【請求項６６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を過剰発現する癌を抑制するアナライトを特定するための方法であって、
（ａ）マウスにおいて該癌を誘発させること、
（ｂ）該誘発癌を有するマウスに該アナライトを投与すること、および
（ｃ）該誘発腫瘍を有するマウスにおいて該アナライトが該癌を抑制するかどうかを判定して、ＭＭＰ−１１を過剰発現する癌を抑制するアナライトを特定すること
を含む、前記方法。
【請求項６７】
該アナライトを該マウスに投与する前に、該アナライトがＭＭＰ−１１に結合することを確認する、請求項６９記載の方法。
【請求項６８】
該マウスにおいて誘発される癌が結腸癌である、請求項６９記載の方法。
【請求項６９】
該マウスにおいて該癌を誘発するのに十分な量の１−２ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を該マウスに投与することにより、該マウスにおいて該癌を誘発させる、請求項６９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を過剰発現する腫瘍および癌を治療するためのワクチンにおいて使用するための、ＭＭＰ−１１もしくはストロメライシン−３（ＳＴ−３）またはＭＭＰ−１１をコードする核酸を含む組成物に関する。特定の実施形態においては、該組成物は、免疫増強要素にＣ末端において連結された触媒的に不活性化されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、ＭＭＰ−１１および該免疫増強要素をコードするコドンはヒト細胞における該融合ポリペプチドの発現の増強のために最適化されている。他の実施形態においては、該組成物は、免疫増強要素にＣ末端において連結された触媒的に不活性化されたＭＭＰ−１１を含む。該組成物は、単独で、または他の腫瘍関連抗原に対するワクチンならびに放射線療法および化学療法のような通常の療法と共に相乗的に使用されうる。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−１１（ＭＭＰ−１１）またはストロメライシン３（ＳＴ３）は、ほとんどではなくとも多数の浸潤性原発性癌および多数のそれらの転移癌において、そしてそれらより稀ではあるが肉腫および他の非上皮性悪性疾患において発現される（Ｂａｓｓｅｔら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２６：４３−５３，（１９９７）を参照されたい。）。ＭＭＰ−１１発現のレベルの測定は、癌再発の最大のリスクを有する患者を特定するために行われうる。腫瘍内に高レベルのＭＭＰ−１１  ＲＮＡまたはタンパク質を有する患者では、腫瘍内に低レベルのＭＭＰ−１１  ＲＮＡまたはタンパク質を有する患者の場合より再発性乳癌が頻繁に生じたことが示されている。同様に、ＭＭＰ−１１発現は、正常組織と比べて、膵腫瘍において上昇することが判明しており、ＭＭＰ−１１発現のレベルはリンパ節の関与および全体的な生存と強く関連していた（Ｊｏｎｅｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：２８３２−２８４５，（２００４））。ＭＭＰ−１１  ｍＲＮＡ発現は、非腫瘍組織におけるＭＭＰ−１１  ｍＲＮＡ発現と比べて結腸癌においても有意に上昇する（Ｔｈｅｗｅｓら，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５：２８４−２９０，（１９９６））。
【０００３】
癌の進行におけるＭＭＰ−１１の役割はいくつかの前臨床観察により実証されている。例えば、ＭＭＰ−１１発現はマウスにおける腫瘍獲得を促進することが示された（Ｎｏｅｌら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：１９２４−１９３０（１９９６））。ＭＭＰ−１１は悪性上皮細胞の回遊をパラ分泌の様態で促進することも示されており、該ホーミングは塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｍａｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６１８−６２６（１９９８））のような細胞外マトリックス関連因子を要するらしい（Ｍａｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４０：１５３５−１５４１（１９９８））。ＭＭＰ−１１プロテアーゼ活性は、細胞外マトリックスを再構築しそれが微環境因子を放出するのを誘導することにより、癌の進行を調節しうる（Ｎｏｅｌら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：１６０５−１６１２（２０００））。ＭＭＰ−１１は腫瘍状細胞に対して抗アポトーシスおよび抗壊死効果を及ぼし（Ｂｏｕｌａｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２１８９−２１９３（２００１））、これはその触媒活性により媒介されるらしい（Ｗｕら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２：５４９−５５５（２００１））。ＭＭＰ−１１欠損は腫瘍非含有生存（ｔｕｍｏｒ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を増進し、局所または遠位の浸潤を調節することが示されている（Ａｎｄａｒａｗｅｗａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：５８４４−５８４９（２００３））。胃癌細胞におけるＭＭＰ−１１  ｍＲＮＡのノックダウンはインビトロおよびインビボの両方における腫瘍成長を劇的に抑制するらしい（Ｄｅｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６：２７４−２８１（２００５））。ＭＭＰ−１１切断により生じるａ１−プロテイナーゼインヒビターの切断産物はナチュラルキラー細胞（ＮＫ）に対する腫瘍細胞の感受性を低下させる点で、ＭＭＰ−１１は腫瘍に対する免疫系の応答を妨げることも示されている（Ｋａｔａｏｋａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：４５７−４６８，（１９９９））。また、ＭＭＰ−１１ヌルマウスにおいては、野生型マウスの場合より多数の好中球およびマクロファージが腫瘍に浸潤し、このことは、ＭＭＰ−１１がこれらの細胞に対する誘引物質を抑制することを示している（Ｂｏｕｌａｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２１８９−２１９３（２００１））。したがって、ＭＭＰ−１１は腫瘍生成の初期段階において決定的に重要な役割を果たしているらしい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＭＭＰの合成を遮断する、または細胞表面へＭＭＰの活性を導く分子とＭＭＰとの相互作用を妨げる、またはそれらの酵素活性を抑制するいくつかの物質が開発されている（ＥｇｅｂｌａｄおよびＷｅｒｂ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２：１６３−１７４（２００２）に概説されている。）。それらの物質のほとんどはＭＭＰ−１１に特異的なものではなく、ＭＭＰファミリーの他のメンバーの機能を妨げるものであった。しかし、これらのＭＭＰインヒビターのいくつかを使用する臨床試験は、該インヒビターが、限られた抗腫瘍効果しか有していないことを示唆している。したがって、前記を考慮すれば、ＭＭＰ−１１活性を抑制または妨げる抗癌療法および治療方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の簡潔な要約
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１）を過剰発現する腫瘍および癌を治療するためのワクチンにおいて使用するための、ＭＭＰ−１１もしくはストロメライシン−３（ＳＴ−３）またはＭＭＰ−１１をコードする核酸を含む組成物を提供する。特定の実施形態においては、該組成物は、免疫増強要素にＣ末端において連結された触媒的に不活性化されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、ＭＭＰ−１１および該免疫増強要素をコードするコドンはヒト細胞における該融合ポリペプチドの発現の増強のために最適化されている。他の実施形態においては、該組成物は、免疫増強要素にＣ末端において連結された触媒的に不活性化されたＭＭＰ−１１を含む。該組成物は、単独で、または他の腫瘍関連抗原に対するワクチンならびに放射線療法および化学療法のような通常の療法と共に相乗的に使用されうる。
【０００６】
したがって、本発明は、ＭＭＰ−１１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、ここで、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている（すなわち、該ヌクレオチド配列はヒト由来細胞における核酸の高発現のために最適化されている。）。
【０００７】
該核酸の好ましい実施形態においては、該ヌクレオチド配列によりコードされるＭＭＰ−１１は更に、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含み、特定の実施形態においては、該変異はＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する。
【０００８】
該核酸の他の実施形態においては、該ポリヌクレオチドはＭＭＰ−１１をコードし、ここで、該ポリヌクレオチドはヒトＭＭＰ−１１または霊長類由来のＭＭＰ−１１をコードする。
【０００９】
該核酸の更に他の実施形態においては、該核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明は更に、免疫増強要素またはその実質的部分に連結されたＭＭＰ−１１を含有する融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。好ましい実施形態においては、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。特定の実施形態においては、該免疫増強要素は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素（ＬＴＢ）のサブユニットＢよりなる群から選ばれる。
【００１１】
該核酸の現在好ましい実施形態においては、該免疫増強要素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢである。他の実施形態においては、該ＬＴＢはシグナル配列を含まない。該核酸の更に他の実施形態においては、該ＬＴＢは、配列番号８に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１２】
前記核酸の好ましい実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含む。
【００１３】
該核酸の他の実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、配列番号４に示すヌクレオチド配列によりコードされる。更に他の実施形態においては、該融合ポリペプチドは、配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本発明は更に、プロモーターに機能的に連結された前記実施形態のいずれかの核酸を含む発現ベクターを提供する。本発明は更に、前記発現ベクターの実施形態のいずれかを含有する宿主細胞を提供する。本発明は更に、該融合ポリペプチドを産生する条件下、細胞培養培地内で前記宿主細胞を培養することを含む製造方法を提供する。
【００１５】
本発明は更に、免疫増強要素またはその実質的部分に連結されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドを提供する。
【００１６】
該融合ポリペプチドの特定の実施形態においては、該免疫増強要素は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる。
【００１７】
該融合ポリペプチドの現在好ましい実施形態においては、該免疫増強要素ポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢである。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢはシグナル配列を含まない。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢは、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む。
【００１８】
該融合ポリペプチドの好ましい実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、それを触媒的に不活性にする変異を含む。好ましくは、該変異はＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する。更に他の実施形態においては、該融合ポリペプチドを含むＭＭＰ−１１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、あるいは該ポリペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明は更に、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドワクチンを提供し、ここで、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。
【００２０】
該ポリヌクレオチドワクチンの好ましい実施形態においては、該ヌクレオチド配列によりコードされるＭＭＰ−１１は更に、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含む。現在好ましい実施形態においては、該変異はＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する。該ポリヌクレオチドワクチンの更に他の実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、ヒト由来または霊長類由来のＭＭＰ−１１である。該ポリヌクレオチドワクチンの更にもう１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明は更に、免疫増強要素またはその実質的部分に連結されたＭＭＰ−１１を含有する融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドワクチンを提供する。該ポリヌクレオチドワクチンの特定の実施形態においては、該免疫増強要素は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる。
【００２２】
該ポリヌクレオチドワクチンの好ましい実施形態においては、該ヌクレオチド配列によりコードされるＭＭＰ−１１は更に、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含む。現在好ましい実施形態においては、該変異はＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する。該ポリヌクレオチドワクチンの更に他の実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、ヒト由来または霊長類由来のＭＭＰ−１１である。該ポリヌクレオチドワクチンの更にもう１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
該ポリヌクレオチドワクチンの現在好ましい実施形態においては、該免疫増強要素ポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）である。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢはシグナル配列を含まず、更に他の実施形態においては、該ＬＴＢは、配列番号８に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
【００２４】
該ポリヌクレオチドワクチンのもう１つの好ましい実施形態においては、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。
【００２５】
もう１つの実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、配列番号４に示すヌクレオチド配列によりコードされる。更にもう１つの実施形態においては、該融合ポリペプチドは、配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
該ポリヌクレオチドワクチンの更に他の実施形態においては、該ワクチンは更に、１以上の遺伝的アジュバントを含む。そのような遺伝的アジュバントには、共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６；炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１α（ＩＬ−１α）；腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８；Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＩＬ−８；インターフェロンγ誘導タンパク質１０（γＩＰ−１０）；マクロファージ抑制タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）；ならびにＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
該ポリヌクレオチドワクチンの更に他の実施形態においては、該ワクチンは更に、１以上の通常のアジュバントを含む。通常のアジュバントには、無機塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、細菌由来アジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、ムラミルペプチド、脂質粒子、例えばカチオニックリポソームおよびマンナン被覆リポソーム、乳化剤アジュバント、例えばＱＳ−２１、および合成アジュバント、例えばウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明は更に、免疫増強要素またはその実質的部分に連結されたＭＭＰ−１１を含有する融合ポリペプチドを含むポリペプチドワクチンを提供する。好ましい実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、それを触媒的に不活性にする変異を有する。現在好ましい実施形態においては、該変異はＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する。
【００２９】
該ポリペプチドワクチンの特定の実施形態においては、該免疫増強要素は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる。
【００３０】
現在好ましい実施形態においては、該免疫増強要素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢである。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢはシグナル配列を含まない。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢは、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む。
【００３１】
該ポリペプチドワクチンの更に他の実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、あるいは配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む。
【００３２】
該ポリペプチドワクチンの更に他の実施形態においては、該ワクチンは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への免疫応答を調節しうる１以上の分子アジュバントを含む。そのような分子アジュバントには、共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６；炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１α（ＩＬ−１α）；腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８；Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＩＬ−８；インターフェロンγ誘導タンパク質１０（γＩＰ−１０）；マクロファージ抑制タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）；ならびにＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
該ポリペプチドワクチンの更に他の実施形態においては、該ワクチンは１以上の通常のアジュバントを含みうる。通常のアジュバントには、無機塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、細菌由来アジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、ムラミルペプチド、脂質粒子、例えばカチオニックリポソームおよびマンナン被覆リポソーム、乳化剤アジュバント、例えばＱＳ−２１、および合成アジュバント、例えばウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明は、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている、ＭＭＰ−１１をコードする核酸ヌクレオチド配列の使用；個体における癌を治療するための医薬における、免疫増強要素に連結されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードする核酸の使用；および個体における癌を治療するための医薬における、免疫増強要素に連結されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドの使用を提供する。
【００３５】
本発明は更に、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチド配列（ここで、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。）を含む核酸を含むポリヌクレオチドワクチン、または免疫増強要素に連結されたＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むポリヌクレオチドワクチンを準備し、該ワクチンを個体に投与して癌を治療することを含む、個体における癌の治療方法を提供する。該融合ポリペプチドをコードする核酸の現在好ましい実施形態においては、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において存在しない、該融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において存在するヌクレオチドコドンで置換されている。
【００３６】
前記方法の特定の実施形態においては、該個体は、化学療法、放射線療法、および腫瘍関連抗原に対するワクチンよりなる群から選ばれる１以上の治療を受けている。更に他の実施形態においては、該個体は、乳癌、結腸癌、頭部および頚部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌）、子宮癌（子宮頚癌および子宮内膜癌）よりなる群から選ばれる浸潤性癌を有し、あるいは該個体は、浸潤へと進展するリスクを有する非浸潤性癌を有する。
【００３７】
該方法の好ましい実施形態においては、該ヌクレオチド配列によりコードされるＭＭＰ−１１は更に、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を有する。現在好ましい実施形態においては、該変異はＭＭＰ−１１の亜鉛結合ドメイン内に存在する。該ポリヌクレオチドワクチンの更に他の実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、ヒト由来または霊長類由来のＭＭＰ−１１である。該ポリヌクレオチドワクチンの更にもう１つの実施形態においては、該ヌクレオチド配列は配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
該方法の特定の実施形態においては、該免疫増強要素は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる。
【００３９】
該方法の現在好ましい実施形態においては、該免疫増強要素ポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）である。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢはシグナル配列を含まず、更に他の実施形態においては、該ＬＴＢは、配列番号８に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
【００４０】
もう１つの実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、配列番号４に示すヌクレオチド配列によりコードされる。更にもう１つの実施形態においては、該融合ポリペプチドは、配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
該方法の更に他の実施形態においては、該ワクチンは更に、１以上の遺伝的アジュバントを含む。そのような遺伝的アジュバントには、共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６；炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１α（ＩＬ−１α）；腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８；Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＩＬ−８；インターフェロンγ誘導タンパク質１０（γＩＰ−１０）；マクロファージ抑制タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）；ならびにＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
該方法の更に他の実施形態においては、該ワクチンは更に、１以上の通常のアジュバントを含む。通常のアジュバントには、無機塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、細菌由来アジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、ムラミルペプチド、脂質粒子、例えばカチオニックリポソームおよびマンナン被覆リポソーム、乳化剤アジュバント、例えばＱＳ−２１、および合成アジュバント、例えばウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明は更に、免疫増強要素に連結されたＭＭＰ−１１を含有する融合ポリペプチドを含むワクチンを準備し、該ワクチンを個体に投与して癌を治療することを含む、個体における癌の治療方法を提供する。
【００４４】
前記方法の特定の実施形態においては、該個体は、化学療法、放射線療法、および腫瘍関連抗原に対するワクチンよりなる群から選ばれる１以上の治療を受けている。更に他の実施形態においては、該個体は、乳癌、結腸癌、頭部および頚部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌）、子宮癌（子宮頚癌および子宮内膜癌）よりなる群から選ばれる浸潤性癌を有し、あるいは該個体は、浸潤へと進展するリスクを有する非浸潤性癌を有する。
【００４５】
該方法の特定の実施形態においては、該免疫増強要素は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および易熱性毒素のサブユニットＢ（ＬＴＢ）よりなる群から選ばれる。
【００４６】
該方法の現在好ましい実施形態においては、該免疫増強要素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢである。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢはシグナル配列を含まない。更に他の実施形態においては、該ＬＴＢは、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む。
【００４７】
該方法の更にもう１つの実施形態においては、ＭＭＰ−１１は、配列番号５に示すアミノ酸配列を含み、あるいは配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む。
【００４８】
該方法の更に他の実施形態においては、該ワクチンは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への免疫応答を調節しうる１以上の分子アジュバントを含む。そのような分子アジュバントには、共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６；炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１α（ＩＬ−１α）；腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８；Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＩＬ−８；インターフェロンγ誘導タンパク質１０（γＩＰ−１０）；マクロファージ抑制タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）；ならびにＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
該方法の更に他の実施形態においては、該ワクチンは１以上の通常のアジュバントを含みうる。通常のアジュバントには、無機塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、細菌由来アジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、ムラミルペプチド、脂質粒子、例えばカチオニックリポソームおよびマンナン被覆リポソーム、乳化剤アジュバント、例えばＱＳ−２１、および合成アジュバント、例えばウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明は更に、ＭＭＰ−１１を過剰発現する癌を抑制するアナライトを特定するための方法であって、マウスにおいて癌を誘発させ、該誘発癌を有するマウスに該アナライトを投与し、該誘発癌を有するマウスにおいて該アナライトが該癌を抑制するかどうかを判定して、ＭＭＰ−１１を過剰発現する癌を抑制するアナライトを特定する方法を提供する。
【００５１】
特定の実施形態においては、該アナライトを該マウスに投与する前に、該アナライトがＭＭＰ−１１に結合することを確認する。
【００５２】
更に他の実施形態においては、該マウスにおいて誘発される癌は結腸癌であり、更に他の実施形態においては、該マウスにおいて該癌を誘発するのに十分な量の１−２ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を該マウスに投与することにより、該マウスにおいて該癌を誘発させる。
【００５３】
定義
本明細書全体および添付の特許請求の範囲において用いる単数形表現は、文脈と明らかに矛盾しない限り、複数形に対する言及を含む。
【００５４】
本明細書全体および添付の特許請求の範囲においては、以下の定義および略語が適用される。
【００５５】
「プロモーター」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成して、プロモーターの下流に位置する核酸配列の転写活性を始動し駆動する。プロモーターは、「エンハンサー」と称される配列を活性化することにより又はプロモーター内の「サイレンサー」と称される配列を抑制することにより修飾されうる。該用語は更に、誘導可能であるプロモーターおよび構成的であるプロモーターの両方を含む。
【００５６】
「カセット」なる語は、ベクターから発現されるヌクレオチドまたは遺伝子配列、例えば、ｃＤｋｋ−４タンパク質をコードするヌクレオチドまたは遺伝子配列を意味する。一般に、カセットは、いくつかの実施形態においては該ヌクレオチドまたは遺伝子配列の発現のための調節配列を提供するベクター内に挿入された遺伝子配列を含む。他の実施形態においては、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は、その発現のための調節配列を提供する。他の実施形態においては、該ベクターはいくつかの調節配列を提供し、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は他の調節配列を提供する。例えば、該ベクターは該ヌクレオチドまたは遺伝子配列の転写のためのプロモーターを提供することが可能であり、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は転写終結配列を提供する。該ベクターにより提供されうる調節配列には、エンハンサー、転写終結配列、スプライス受容および供与配列、イントロン、リボソーム結合配列ならびにポリ（Ａ）付加配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
「ベクター」なる語は、宿主生物または宿主組織内へのＤＮＡ断片の導入をもたらしうる何らかの手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージおよびコスミドを含む種々のタイプのベクターが存在する。
【００５８】
「ＭＭＰ−１１」なる語は、ＭＭＰ−１１タンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００５９】
「免疫増強要素」なる語は、完全長野生型ＭＭＰ−１１と比べて関連ＭＭＰ−１１に対する免疫応答を刺激または増強しうる、本発明のＭＭＰ−１１融合ポリペプチドのポリペプチド部分を意味する。本発明の免疫増強要素には、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の細菌種の易熱性毒素Ｂサブユニットよりなる群から選ばれるポリペプチドの全部または実質的部分を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」なる語は、共有結合した少なくとも２つのポリペプチドを含有するタンパク質を意味し、ここで、一方のポリペプチドは１つのタンパク質配列またはドメインに由来し、もう一方のポリペプチドは第２のタンパク質配列またはドメインに由来する。本発明の融合タンパク質は、ＭＭＰ−１１と、免疫増強要素またはその実質的部分を含む第２のポリペプチド（いくつかの場合にはこれは細菌毒素である。）とを含む。ＭＭＰ−１１は、ヒトＭＭＰ−１１、または他の種に由来するＭＭＰ−１１でありうる。該融合タンパク質を含むポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端へ連結される。ＭＭＰ−１１および免疫増強要素は任意の順序で融合されうる。本発明のいくつかの実施形態においては、ＭＭＰ−１１のＣ末端が免疫増強要素のアミノ末端に融合され、あるいは免疫増強要素がＭＭＰ−１１のアミノ末端に融合される。
【００６１】
「ＭＭＰ−１１融合タンパク質」なる語は、免疫増強要素またはその実質的部分を含むポリペプチドに融合されたＭＭＰ−１１ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む、前記の融合タンパク質を意味する一般用語であると意図される。「ＭＭＰ−１１融合タンパク質」なる語は「ＭＭＰ−１１融合ポリペプチド」なる語と交換可能である。
【００６２】
「組換えＭＭＰ−１１」なる語は、遺伝子工学により修飾されたＭＭＰ−１１を意味する。例えば、該用語は、本明細書に開示されている触媒的に不活性なＭＭＰ−１１およびＭＭＰ−１１融合ポリペプチドを含む。
【００６３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」なる語は、ホスホジエステル結合により互いに結合したヌクレオチドの任意の重合体、例えば、任意長のリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を意味すると意図される。ポリヌクレオチドまたは核酸は、遺伝子およびその断片または一部、プローブ、オリゴヌクレオチドならびにプライマーを含みうる。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ、例えば、ＭＭＰ−１１またはその変異体をコードする遺伝子でありうる。「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる語は本明細書においては互換的に用いられる。
【００６４】
「組換えポリヌクレオチド」または「組換え核酸」なる語は、遺伝子工学により修飾されたポリヌクレオチドを意味する。例えば、該用語は、ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含む、ＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチドを含む。該用語は更に、ヌクレオチドコドンの１以上がヒトにおける発現の増強のために最適化された、ＭＭＰ−１１または触媒的に不活性なＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチドを含む。該用語はまた、本明細書に開示されているＭＭＰ−１１融合ポリペプチドを含む。
【００６５】
「その変異体」なる語は、組換えＭＭＰ−１１またはポリヌクレオチドを意味する。例えば、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１またはＭＭＰ−１１融合ポリペプチドは野生型ＭＭＰ−１１の変異体である。ヒトにおける発現の増強のためにコドンが最適化されたＭＭＰ−１１、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１またはＭＭＰ−１１融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、野生型ＭＭＰ−１１をコードする野生型ポリヌクレオチドの変異体である。
【００６６】
「実質的に類似」なる語は、ある与えられた核酸またはアミノ酸配列が基準配列に対して少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％の同一性を共有することを意味する。本発明においては、基準配列は、文脈により定められる野生型ＭＭＰ−１１ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列または免疫増強要素の野生型ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の対応部分でありうる。基準配列は、例えば、野生型ヒトまたは非ヒトＭＭＰ−１１配列でありうる。したがって、野生型ＭＭＰ−１１またはその断片に「実質的に類似」しているＭＭＰ−１１配列は、野生型ＭＭＰ−１１の対応断片に対して、該断片の長さに沿って、少なくとも７５％の同一性、好ましくは８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、より一層好ましくは９５％の同一性を共有する。与えられたＭＭＰ−１１または免疫増強要素のポリペプチドまたはヌクレオチド配列が基準配列に「実質的に類似」しているかどうかは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム・バージョン６．０のような配列解析ソフトウェアを使用して配列情報を比較することにより判定されうる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄａ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアライメント法を用いるものである。
【００６７】
「遺伝子」なる語は、多数の遺伝子の場合にはエキソンおよびイントロン配列の組合せを含む、遺伝子産物をコードするゲノム核酸、ならびにイントロン配列を含まない、遺伝子産物をコードするｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを意味する。
【００６８】
遺伝子もしくはポリペプチド、またはそれらの変異体、断片もしくはサブユニットの「実質的部分」なる語は、基準配列の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％の部分を意味する。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドを説明するための「コドン最適化」、「ヌクレオチドコドンがヒトにおける発現の増強のために最適化されている」、「ヌクレオチド配列が高発現のために最適化されている」などの表現は、ある生物における高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１および／または免疫増強要素のヌクレオチドコドンの１以上が、該生物における高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されていることを意味する。ある特定のアミノ酸に関する「低頻度」のヌクレオチドコドンは、該生物における高発現タンパク質をコードする核酸における最低使用頻度のヌクレオチドコドンである。ある特定のアミノ酸に関する「高頻度」のヌクレオチドコドンは、該生物における高発現タンパク質をコードする核酸における最高使用頻度のヌクレオチドコドン、または最低頻度のヌクレオチドコドンより高い使用頻度のヌクレオチドコドンである。
【００７０】
「治療」なる語は治療的治療および予防的手段を意味する。治療を要する個体には、障害を既に有する個体、および障害を有する傾向にある個体または障害が予防されるべきである個体が含まれる。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、異常細胞増殖により特徴づけられる、ＭＭＰ−１１の過剰発現に関連した障害または状態、例えば乳癌、結腸直腸癌および肺癌（これらの限定されるものではない）の治療剤として使用されることが意図される。
【００７２】
「有効量」なる語は、免疫応答が生じるよう適度なレベルの該ポリペプチドが産生されるのに十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。このレベルは様々となりうることが当業者に認識される。
【００７３】
「アナライト」なる語は、分子、化合物、組成物、薬物、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体およびその活性フラグメント、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどを含む。
【００７４】
発明の詳細な説明
本発明は、個体における、ＭＭＰ−１１を過剰発現する腫瘍および癌を抑制するための、特に、ＭＭＰ−１１を過剰発現する浸潤性癌、例えば特に乳癌、結腸癌、頭部および頚部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌）、子宮癌（子宮頚癌および子宮内膜癌）、または浸潤へと進展するリスクを有する非浸潤性癌を抑制するための、抗ＭＭＰ−１１ワクチンとして使用されうる組成物を提供する。該抗ＭＭＰ−１１ワクチンまたは抗腫瘍関連抗原（抗ＴＡＡ）ワクチンは、例えば、腫瘍細胞および基質区画を標的化する単独療法において、ならびに多重特異的細胞性免疫応答により腫瘍細胞および基質区画を標的化する別の抗ＴＡＡワクチンとの多重療法において、ならびに他の分子またはアジュバントとの多重療法において、ならびに基質構造の、細胞毒性物質に対する透過性を上昇させるという原理による、化学療法を含む療法において、ならびに放射線療法を含む療法において、ならびにＭＭＰ−１１が多エピトープポリペプチドまたはミニ遺伝子の一部として与えられる前記療法のいずれかにおいて使用されうる。本発明の抗ＭＭＰ−１１ワクチンはポリペプチドワクチン、または好ましくはポリヌクレオチドワクチンでありうる。
【００７５】
実施例に示すとおり、１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）で誘発された結腸腫瘍を有するマウスへの抗ＭＭＰ−１１ワクチンの投与は該マウスの結腸組織におけるＤＭＨ誘発性発癌の進行の有意な軽減をもたらすことが判明した。感受性マウス系統、例えばＡ／Ｊにおいて、そしてそれより低い度合ではあるがＢＡＬＢ／ｃにおいても、結腸組織におけるＤＭＨ誘発性発癌の進行は以下の異なる段階を経て進行する：（１）異常陰窩形成（ＡＣＦ）、（２）腺腫、（３）ポリープ、および（４）腺癌（Ｂｉｒｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．９３（１）：５５−７１（１９９５）を参照されたい）。本発明者らは、ＭＭＰ−１１がＤＭＨ誘発性腫瘍組織において過剰発現されることを見出した。このことは、マウスにおけるＤＭＨ誘発性発癌が抗ＭＭＰ−１１療法およびワクチン接種のモデルとして適していることを示唆するものであった。ついで本発明者らは、マウスＭＭＰ−１１（ｍＭＭＰ−１１）（該ｍＭＭＰ−１１は、触媒部位におけるＺｎ結合ドメイン内に点変異を導入することにより触媒的に不活性化されている。）をコードする核酸を含む遺伝的ワクチンがマウスにおいて免疫応答を誘導すること、ならびに触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１をコードする核酸が、シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のサブユニットＢ易熱性毒素（ＬＴＢ）をコードする核酸に連結されている場合、およびＭＭＰ−１１をコードするコドンが該マウスにおける発現の増強のために最適化されている場合、およびＬＴＢをコードするコドンがヒトにおける発現の増強のために最適化されている場合に、該免疫応答が更に増強されることを見出した。最後に、本発明者らは、該遺伝的ワクチンが、マウスにおけるＤＭＨ誘発性発癌の全段階における軽減をもたらすのに有効であることを見出した。したがって、該マウスモデルの結果を考慮して、本発明は、ＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチまたはＭＭＰ−１１ポリペプチドを含む抗ＭＭＰ−１１ワクチン、好ましくは、後記の実施形態のいずれかを有する抗ＭＭＰ−１１ワクチンを提供するものである。
【００７６】
本発明は、その最も基本的な実施形態において、ＭＭＰ−１１または後記に開示する遺伝暗号の縮重、遺伝子操作もしくはそれらの両方による変異体を適当な異種プロモーターの制御下に又は適当な異種プロモーターに連結された様態でコードする核酸またはポリヌクレオチド分子を含む核酸またはポリヌクレオチドを提供し、ここで、好ましくは、ＭＭＰ−１１をコードする核酸は、コードされるＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含むよう修飾されている。ＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異は遺伝子操作によりポリヌクレオチド内に導入されうる。触媒的に不活性なＭＭＰ−１１をコードする組換えポリヌクレオチドには、コードされるＭＭＰ−１１を触媒的に不活性にする変異を含むようポリヌクレオチドが修飾された、ヒトおよび非ヒト種に由来するポリヌクレオチドが含まれる。非ヒト種には、霊長類、例えばチンパンジー、アカゲザル、カニクイザルなど、および非霊長類種、例えばマウス、ラット、イヌなどが含まれる。現在好ましい実施形態においては、ＭＭＰ−１１をコードする組換えポリヌクレオチドはヒト由来であるか、あるいはヒトＭＭＰ−１１のアミノ酸配列と同じ又は実質的に類似しているアミノ酸配列を有するＭＭＰ−１１をコードする。ヒトＭＭＰ−１１（ｈＭＭＰ−１１）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ ００５９４０（配列番号１）に記載されており、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＭＭＰ−１１をコードする。ｈＭＭＰ−１１をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の抗ＭＭＰ−１１ワクチンにおいて使用されうる変異体をコードするよう後記に示すとおりに修飾される。本発明の現在好ましい実施形態は、ｈＭＭＰ−１１をコードする組換え核酸またはポリヌクレオチドを含むが、本発明は、ｈＭＭＰ−１１をコードする組換えポリヌクレオチドに限定されないと理解されるべきである。本発明は更に、該組換えポリヌクレオチドが非ヒト由来のＭＭＰ−１１をコードし、該組換え核酸またはポリヌクレオチドが、本発明の抗ＭＭＰ−１１ワクチンにおいて使用されうるＭＭＰ−１１変異体をコードするよう後記に示すとおりに修飾されている実施形態を含む。
【００７７】
該組換え核酸またはポリヌクレオチドの好ましい実施形態においては、該ポリヌクレオチドによりコードされるＭＭＰ−１１はＭＭＰ−１１の触媒的に不活性な変異体である。触媒的に不活性なＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチドは、ＭＭＰ−１１の亜鉛結合部位ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ（配列番号３）（ｈＭＭＰ−１１の場合には配列番号２のアミノ酸２１５−２２５）を含む保存アミノ酸をコードするヌクレオチドコドンの１以上を代替アミノ酸をコードするよう遺伝子操作により修飾して触媒的に不活性なＭＭＰ−１１をコードする組換えポリヌクレオチドを得ることにより製造される。例えば、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードする配列番号４におけるヌクレオチド配列により示されるとおり、ｈＭＭＰ−１１のアミノ酸２１６位の保存グルタミン酸をコードするヌクレオチドコドンＧＡＡを、アミノ酸バリンをコードするヌクレオチドコドンＧＴＧへと変化させて、アミノ酸２１６位がバリンである配列番号５に示すアミノ酸配列を有する触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を得た。Ｎｏｅｌら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：１６０５−１６１２（２０００）は、２１６位のヌクレオチドコドンを、アラニンをコードするヌクレオチドコドンに変化させると、ｈＭＭＰ−１１が触媒的に不活性になったこと、およびｍＭＭＰ−１１の対応領域のアミノ酸２２０位のグルタミン酸をコードするヌクレオチドコドンを、アラニンをコードするヌクレオチドコドンに変化させると、ｍＭＭＰ−１１が触媒的に不活性になったことを示している。触媒的に不活性なＭＭＰ−１１を得るために、配列番号３のアミノ酸２位のグルタミン酸をコードするヌクレオチドコドンは、バリンまたはアラニンをコードするヌクレオチドコドンに変化しているが、本発明から逸脱しない範囲で、該ヌクレオチドコドンを他のアミノ酸のものに変化させることも可能であり、あるいはＺｎ結合ドメインのその他の保存アミノ酸の１以上をコードするコドンを、他のアミノ酸をコードするよう変化させることが可能である。
【００７８】
特定のポリペプチドをコードする遺伝子または転写単位のコドン最適化は、コードされるポリペプチドの発現の増強、すなわち、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の増強をもたらすことが示されている。ポリヌクレオチドワクチンの場合、コードされるポリペプチドの発現の増強は、コードされるポリペプチドをより多量に産生し、これは該ワクチンのインビボでの免疫原性の増強につながり、今度はこれが該ワクチンの効力を増強しうる。コドン最適化の場合の「発現」なる語およびその派生語は、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を意味し、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を意味するものではない。本明細書中で用いる「遺伝子」なる語は、該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの両方、および該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを意味する。
【００７９】
コドン最適化は、ある遺伝子が、該遺伝子の天然環境とは異なるヌクレオチドコドン使用頻度を示す異種遺伝的環境に移される場合に、該遺伝子の異種発現を改善するための方法、あるいは高発現遺伝子をコードする、遺伝的環境に固有の遺伝子において通常は使用されない１以上のヌクレオチドコドンを該遺伝子が天然で含む場合に、該遺伝子の天然遺伝的環境における該遺伝子の異所性発現を改善するための方法である。換言すれば、コドン最適化は、特定の遺伝的環境または生物において比較的低い頻度で使用される或る遺伝子のヌクレオチドコドンを、該遺伝的環境または生物において、より高い頻度で発現遺伝子において使用されるヌクレオチドコドンで置換することを含む。そのようにして、遺伝子産物（ポリペプチド）の発現（翻訳）が増強される。その前提は、高発現遺伝子において高頻度で見出されるヌクレオチドコドンが、低頻度で見出されるヌクレオチドコドンより効率的に翻訳されるというものである。
【００８０】
一般に、特定の遺伝子のヌクレオチドコドンを最適化するための方法は、生物において高度に発現される遺伝子において使用されるアミノ酸のそれぞれのヌクレオチドコドンの頻度を特定し、ついで、高発現遺伝子において低頻度で使用される関心のある遺伝子におけるヌクレオチドコドンを、高発現遺伝子において使用されるものとして特定されたヌクレオチドコドンで置換することに基づくものである（例えば、Ｌａｔｈｅ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．：１８３：１−１２（１９８５）；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）；Ｆｕｇｌｓａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３１：２４７−２４９（２００３）を参照されたい）。遺伝子をコードする、生物の核酸のヌクレオチドコドンを自動的に解析し、生物において低頻度で見出されるヌクレオチドコドンを、生物において高度に発現される遺伝子において見出されるヌクレオチドコドンで置換するよう示唆する多数のコンピュータープログラムが存在する。簡便のために、Ｎａｋａｍｕｒａ（同誌）から導き出されたヒトに関するヌクレオチドコドン使用頻度の表を以下の表１に示し、ヒトにおいて高発現タンパク質をコードする核酸において、どのヌクレオチドコドンが低頻度で見出されるのか、およびヒトにおいて高発現タンパク質をコードする核酸において、どのヌクレオチドコドンが、より高い頻度で見出されるのを特定する。
【００８１】
【表１】
2009509553.tif 000003
【００８２】
したがって、他の実施形態においては、コードされるＭＭＰ−１１の発現が増強され、それにより抗ＭＭＰ−１１ワクチンの場合には抗ＭＭＰ−１１ワクチンの効力が増強されるよう、ＭＭＰ−１１を含むアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンの１以上が最適化された組換えポリヌクレオチドを提供する。すなわち、ある生物において高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１および／または免疫増強要素をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、該生物において高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。好ましくは、該ヌクレオチドコドンはヒトにおけるＭＭＰ−１１の発現の増強のために最適化される。しかし、別の生物、例えば霊長類における発現の増強のためにコドン最適化された組換えポリヌクレオチドは、ヒトにおける発現の増強のためにコドン最適化された組換えポリヌクレオチドの等価体である。現在のところ、ＭＭＰ−１１は触媒的に不活性であることが好ましく、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１はｈＭＭＰ−１１であることが現在好ましい。ＭＭＰ−１１の特定のアミノ酸に関する複数のヌクレオチドコドンが存在し、該ヌクレオチドコドンの２以上が高発現ヒト遺伝子における同じ相対使用頻度を有するか、または高発現ヒト遺伝子における最低使用頻度を伴うヌクレオチドコドンより大きな、高発現ヒト遺伝子における使用頻度を有する場合には、ＭＭＰ−１１におけるアミノ酸に関するヌクレオチドコドンのそれぞれは、独立して、最低使用頻度を有するヌクレオチドコドンより大きな使用頻度、または同じ使用頻度のヌクレオチドコドンのいずれかでありうる。ＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドにおける全てのヌクレオチドコドンが、高発現ヒト遺伝子において最高使用頻度を有するヌクレオチドコドンである必要はない。触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするコドンがヒトにおける発現のために最適化されている触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１のヌクレオチド配列の一例を配列番号６に示す。
【００８３】
ｍＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンがマウスにおける発現の増強のために最適化された、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１をコードする組換えポリヌクレオチド（ｍＭＭＰ−１１−ｏｐｔ）を含む抗ＭＭＰ−１１ワクチンの効力は、ｍＭＭＰ−１１−ｏｐｔのカルボキシ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドコドンが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の免疫増強性易熱性毒素Ｂ（ＬＴＢ）の実質的部分をコードするヌクレオチドコドンに連結または融合されてｍＭＭＰ−１１と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢとを含む融合ポリペプチドを産生するようにされた場合に更に増強されることが、マウスモデルから示された。したがって、好ましい実施形態においては、該組換えポリヌクレオチドは、免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分をコードする核酸に連結された触媒的に不活性なＭＭＰ−１１（ＭＭＰ−１１融合ポリペプチド）をコードする核酸を含む。現在好ましい実施形態においては、該組換えポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドがｈＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするよう、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬＴＢである免疫増強要素をコードする核酸に連結された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードする核酸を含む。他の実施形態においては、ＬＴＢをコードする核酸は、ＬＴＢシグナルペプチドをコードするコドンを含まない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢをコードする核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１１６７７において入手可能であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２５７２６に示されている。該シグナルペプチドは、ＢＡＡ２５７２６に示されているアミノ酸配列のアミノ酸残基１−２１を含む。該シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢのヌクレオチド配列を配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号９に示す。該ＬＴＢをコードするヌクレオチドコドンがヒトにおける発現の増強のために最適化された、該シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢをコードするポリヌクレオチド配列を表８に示す。特に好ましい実施形態においては、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１および該ＬＴＢをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチドコドンはヒトにおける発現に関して最適化されている。
【００８４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢが、本明細書に開示されている融合ポリペプチド実施形態において使用した免疫増強要素ポリペプチドの起源であったが、本発明は更に、他の免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に融合したＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む実施形態をも包含する。免疫増強要素ポリペプチドの具体例には、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および他の細菌種に由来するＬＴＢが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
したがって、前記を考慮して、本発明は更に、ＬＴＢもしくはその実質的部分または別の免疫増強要素ポリペプチドもしくはその実質的部分に連結された触媒的に不活性なＭＭＰ−１１含む単一融合ポリペプチドをコードする組換え核酸またはポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドの一例は、配列番号５（触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１）のアミノ酸と配列番号８（シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢ）のアミノ酸配列とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。該ポリヌクレオチドは、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードする配列番号４と、シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢをコードする配列番号７または配列番号８（ヒトにおける発現の増強のためにコドン最適化された、シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢをコードするポリヌクレオチド）とのヌクレオチド配列を含みうる。一例として、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドをコードしうる。そのようなポリペプチドは、配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００８６】
好ましい実施形態においては、本明細書に開示されている組換え核酸およびポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドコドンは、ヒトにおけるそれによりコードされる組換えポリペプチドの発現の増強のために最適化されている。すなわち、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、組換え核酸およびポリヌクレオチドのヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。本明細書に開示されている融合ポリペプチドのいずれかをコードする組換えポリヌクレオチドの場合には、該組換えポリペプチドを含む免疫増強要素ポリペプチドまたはＬＴＢをコードする組換えポリヌクレオチドのヌクレオチドコドンも、ヒトにおける該融合ポリペプチドの発現の増強のために最適化されていることが更に好ましい。そのような組換えポリヌクレオチドの一例は、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードする配列番号６のコドン最適化ヌクレオチド配列と、シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢをコードする配列番号８のコドン最適化ヌクレオチド配列とを含むであろう。一例として、コドン最適化された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号１２に示すヌクレオチド配列を有する。
【００８７】
本発明は更に、ＭＭＰ−１１の亜鉛結合部位ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ（配列番号３）を含む保存アミノ酸の１以上が代替アミノ酸に改変された、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１を含む組換えポリペプチドを提供する。例えば、ｈＭＭＰ−１１に関して配列番号５に示すとおり、ｈＭＭＰ−１１のアミノ酸２１６位の保存グルタミン酸をアミノ酸バリンへと変化させて、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を得た。好ましくは、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１ポリペプチドは、ＭＭＰ−１１がそのカルボキシ末端において免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に連結された融合ポリペプチド（ＭＭＰ−１１融合ポリペプチド）を含む。現在好ましい実施形態においては、免疫増強要素ポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢである。他の実施形態においては、該ＬＴＢはそのシグナルペプチドを含まない。ＭＭＰ−１１融合ポリペプチドの一例は、配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢポリペプチドのアミノ末端に、カルボキシ末端において連結された配列番号５に示すアミノ酸配列を有する触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を含む。該ＭＭＰ−１１融合ポリペプチドは、例えば、配列番号１１に示すポリヌクレオチド、または配列番号１２に示すコドン最適化ポリヌクレオチドによりコードされうる。
【００８８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢが、本明細書に例示されているＭＭＰ−１１融合ポリペプチド実施形態において使用した免疫増強要素ポリペプチドの起源であったが、本発明は更に、他の免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に融合したＭＭＰ−１１を含むＭＭＰ−１１融合ポリペプチドを含む実施形態をも包含する。免疫増強要素ポリペプチドの具体例には、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および他の細菌種に由来するＬＴＢが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
本発明は更に、本明細書に全体にわたって開示されている核酸分子（以下、「組換えポリヌクレオチド」と称する。）の少なくとも１つを含むベクターを提供し、ここで、好ましくは、該核酸分子は異種プロモーターに機能的に連結されている。これらのベクターはＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。ほとんどの目的においては、ＤＮＡプラスミドまたはウイルス発現ベクターが好ましい。典型的な発現ベクターには、プラスミド、修飾ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、および他の形態のエピソーム性の又は組み込まれたＤＮＡが含まれ、それらはいずれも、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを発現する。好ましくは、前記実施形態のいずれかをコードするヌクレオチドコドンはヒトにおける発現の増強のために最適化されている。
【００９０】
ＤＮＡが好ましくはヒトにおける発現の増強のためにコドン最適化されており異種プロモーターに機能的に連結されている、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、組換え宿主細胞内での本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかの発現のために使用されうる。そのような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養して、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを得ることが可能である。発現ベクターには、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたは特別に設計されたウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。実施例において記載する発現ベクターは、許容されうる発現ベクターである。
【００９１】
本発明の核酸は、好ましくは、ヒト細胞においてそれにコードされる本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかの効率的な発現をもたらす配列を含む発現カセットへと構築される。該カセットは、好ましくは、該核酸に機能的に連結された同種または異種の転写および翻訳制御配列を含有する。そのような制御配列は、少なくとも、転写プロモーター（構成的または誘導性）および転写終結配列を含み、更に他の調節要素、例えば転写エンハンサー、リボソーム結合配列、スプライス結合配列などを含みうる。ほとんどの実施形態においては、該プロモーターは異種プロモーターであるが、特定の実施形態においては、該プロモーターはＭＭＰ−１１の天然プロモーターでありうる。特に有用な実施形態においては、該プロモーターは、イントロンＡ配列を伴う又は伴わない構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターであるが、多数の他の公知プロモーター、例えば強力免疫グロブリンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、ＳＶ４０スモールまたはラージＴ抗原プロモーターなども使用可能であると当業者は認識するであろう。転写ターミネーターには、ウシ成長ホルモンターミネーターが含まれるが、他の公知転写ターミネーター、例えばＳＶ４０終結配列も使用可能である。プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢおよびｐＶ１ＪｎｓＡのそれぞれは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最／初期領域プロモーターおよびエンハンサー（イントロンＡを伴う）およびそれに続くクローニング部位およびＢＧＨポリアデニル化シグナルを含有し、有用な発現ベクターの具体例である。前記実施形態のいずれかにおけるＭＭＰ−１１を該クローニング部位内にクローニングして該発現カセットを完成させることが可能である。
【００９２】
本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかの発現に適した商業的に入手可能な哺乳類発現ベクターには、限定的なものではないが以下のものが含まれる：ｐＶ１ＪｎｓＡ、Ｖ１ＪｎｓＢ、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＡＣ）、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−ｌ（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）および１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）。
【００９３】
また、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを細菌細胞内で発現させるためには、種々の細菌発現ベクターが使用されうる。発現のために適当でありうる商業的に入手可能な細菌発現ベクターには、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
また、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドを真菌細胞内で発現させるためには、種々の真菌発現ベクターが使用されうる。発現に適している商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
また、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを昆虫細胞内で発現させるためには、種々の昆虫細胞発現ベクターが使用されうる。発現のために適当でありうる商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかの発現のために使用されうるウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルスなど）、レトロウイルスベクター、バクテリオファージベクターおよびバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明における組換えポリヌクレオチドのいずれかをコードする組換えウイルスを製造するためのウイルスベクターの多くは商標的に入手可能である。
【００９７】
現在好ましい実施形態においては、組換えウイルスを製造するために使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターであるが、プロモーターに連結された直鎖状ＤＮＡ、または他のベクター、例えばアデノ随伴ウイルスもしくは修飾されたワクシニアウイルス、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターも使用されうる。選択したベクターがアデノウイルスである場合には、該ベクターはいわゆる第１世代アデノウイルスベクターであることが現在好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能的Ｅ１遺伝子領域、好ましくは欠失アデノウイルスＥ１遺伝子領域を有することにより特徴づけられる。いくつかの実施形態においては、該発現カセットは、アデノウイルスＥ１遺伝子が通常存在する位置に挿入される。また、これらのベクターは、場合によっては、非機能的な又は欠失したＥ３領域を有する。使用されるアデノウイルスゲノムは、Ｅ１およびＥ３の両方の領域が欠失していること（ΔＥ１ΔＥ３）も好ましい。
【００９８】
該アデノウイルベクターは、ウイルスＥ１遺伝子を発現する公知細胞系、例えば２９３細胞またはＰＥＲＣ．６細胞において、あるいは余分のタンパク質を発現するよう一過性または安定に形質転換された２９３またはＰＥＲＣ．６細胞から誘導された細胞系において増殖されうる。例えば、制御された遺伝子発現を示す構築物、例えばテトラサイクリン調節可能プロモーター系を使用する場合には、該細胞系は、該調節系に関与する成分を発現しうる。そのような細胞系の一例としてＴＲｅｘ−２９３が挙げられ、他の細胞系は当技術分野で公知である。
【００９９】
アデノウイルスベクターの操作が簡便となるよう、アデノウイルスはシャトルプラスミド形態でありうる。本発明はまた、プラスミド部分とアデノウイルス部分（該アデノウイルス部分は、Ｅ１が欠失しており場合によってはＥ３も欠失しているアデノウイルスゲノムを含む）とを含む、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１ポリペプチドまたは触媒的に不活性なＭＭＰ−１１融合ポリペプチドをコードする核酸を含む挿入された発現カセットを有するシャトルプラスミドベクターに関する。好ましい実施形態においては、アデノウイルスベクターが容易に除去されうるよう、該プラスミドのアデノウイルス部分に隣接する制限部位が存在する。該シャトルプラスミドは原核生物細胞または真核生物細胞において複製されうる。
【０１００】
本発明の現在好ましい実施形態においては、本明細書に開示されている組換えＭＭＰ−１１のいずれかをコードする核酸を含む発現カセットはｐＭＲＫＡｄＳ−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（Ｅｍｉｎｉら，ＷＯ０２２２０８０を参照されたい）内に挿入される。このプラスミドは、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄｓアデノウイルスゲノムを含む。５’シス作用性パッケージング領域をＥ１遺伝子内に更に伸長させて、ウイルスパッケージングの最適化に重要であることが判明している要素を組み込んで、ウイルス増幅の増強をもたらすことにより、ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計は従来のアデノベクターに比べて改良された。好都合なことに、この増強されたアデノウイルスベクターは、高継代増殖後の遺伝的安定性を維持しうる。
【０１０１】
本発明は更に、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞、特に、プロモーターに機能的に連結された前記核酸分子のいずれかを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞には、細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞、例えば酵母、植物細胞、哺乳類細胞、例えばウシ、ブタ、サル、ヒトまたはげっ歯類由来の細胞系（これらに限定されるものではない）、および昆虫細胞、例えばジョウショウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ由来細胞系（これらに限定されるものではない）が含まれる。例えば、１つの昆虫発現系は、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と組合されたスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用するものである。また、商業的に入手可能な適当でありうる哺乳類種には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）、Ｓａｏｓ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、Ｃ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２６）、ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＳＴ２細胞（Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  ＲＣＢ０２２４）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＪＣＲＢ０６０２，ＪＣＲＢ９０８０，ＪＣＲＢ０００３またはＩＦＯ５０４１５）およびＣＰＡＥ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２０９）。
【０１０２】
前記のとおり、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現ベクターは、それにコードされる組換えＭＭＰ−１１を組換え宿主細胞内で発現させるために使用されうる。したがって、本発明は、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを組換え宿主細胞内で発現させるための方法であって、組換えＭＭＰ−１１をコードする核酸を含むベクターを適当な宿主細胞内に導入し、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかの発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。組換えＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチドは、構成的または誘導性でありうる異種プロモーターに機能的に連結されている。
【０１０３】
本明細書に開示されている組換え核酸またはポリヌクレオチドのいずれかを宿主細胞内で発現させた後、組換えＭＭＰ−１１ポリペプチドを、ポリペプチドに基づくワクチンにおいて使用するために回収することが可能である。ポリペプチドの精製方法は当技術分野でよく知られており、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は個々の適用による細胞ライセートおよび抽出物からの精製を含む。また、組換えＭＭＰ−１１は、ＭＭＰ−１１に特異的な、またはＭＭＰ−１１融合ポリペプチドの場合には免疫増強要素ポリペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体で調製された免疫アフィニティーカラムを使用して、他の細胞ポリペプチドから分離されうる。
【０１０４】
クローニング、発現ベクター、トランスフェクションおよび形質転換、ならびに発現されたタンパク質のタンパク質単離は当技術分野でよく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）またはＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）に記載されている。
【０１０５】
本発明の抗ＭＭＰ−１１ワクチンには、本明細書に開示されている組換えＭＭＰ−１１またはＭＭＰ−１１融合ポリペプチドの実施形態のいずれかをコードするポリヌクレオチドワクチン、および本明細書に開示されている組換えＭＭＰ−１１またはＭＭＰ−１１融合ポリペプチドの実施形態のいずれかを含むポリペプチドワクチンの両方が含まれる。ＭＭＰ−１１を過剰発現する浸潤性癌、例えば乳癌、結腸癌、頭部および頚部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌）、子宮癌（子宮頚癌および子宮内膜癌）または浸潤へと進展するリスクを有する非浸潤性癌に罹患した個体が、本発明のワクチンによる免疫による利益を受けうる。該抗ＭＭＰ−１１ワクチンは更に、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれかを含有する組換えアデノウイルスを含むアデノウイルス抗ＭＭＰ−１１ワクチンを含む。
【０１０６】
該核酸またはポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、その最も基本的な実施形態においては、本明細書に開示されている組換えポリヌクレオチドのいずれか、例えば、組換えＭＭＰ−１１ポリペプチドまたはＭＭＰ−１１融合ポリペプチドの前記実施形態のいずれかをコードする組換え核酸分子またはポリヌクレオチドを、適当な異種プロモーターの制御下に又は適当な異種プロモーターに機能的に連結された様態で含む。コードされる組換えＭＭＰ−１１ポリペプチドは、いずれかの種のＭＭＰ−１１ポリペプチド、例えばヒト；チンパンジー、アカゲザル、カニクイザルのような霊長類；マウス、ラット、イヌなどのような非霊長類に由来するＭＭＰ−１１（これらに限定されるものではない）のアミノ酸配列を有しうる。好ましくは、コードされる組換えＭＭＰ−１１はヒトＭＭＰ−１１のアミノ酸配列を有する。ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンとして使用するための、前記の遺伝子カセットおよび発現ベクター内に含有させるためのＭＭＰ−１１をコードする核酸の現在好ましい実施形態を以下に例示する。
【０１０７】
好ましい実施形態においては、該抗ＭＭＰ−１１ワクチンのポリヌクレオチドによりコードされるＭＭＰ−１１は触媒的に不活性である。例えば、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１は配列番号４のヌクレオチド配列により示され、ここで、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を得るために、ｈＭＭＰ−１１の２１６位の保存グルタミン酸をコードするヌクレオチドコドンＧＡＡが、アミノ酸バリンをコードするヌクレオチドコドンＧＴＧに改変されている。グルタミン酸残基をコードするヌクレオチドコドンが、バリンをコードするヌクレオチドコドンに改変されているが、本発明から逸脱しない範囲で、該ヌクレオチドコドンは他のアミノ酸に改変されることも可能であり、あるいはヒスチジン残基が他のアミノ酸に改変されうる。
【０１０８】
前記のとおり、特定のポリペプチドをコードする遺伝子または転写単位のコドン最適化は、コードされているポリペプチドの発現の増強、すなわち、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の増強をもたらすことが示されている。ポリヌクレオチドワクチンの場合には、コードされているポリペプチド産物の発現の増強は、コードされているポリペプチドをより多量に産生し、これは該ワクチンのインビボでの免疫原性の増強につながり、今度はこれが該ワクチンの効力を増強しうる。したがって、他の実施形態においては、ＭＭＰ−１１を含むアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンが、ＭＭＰ−１１の発現を増強するために、そしてそれにより抗ＭＭＰ−１１ワクチンの効力を増強するために最適化されている。すなわち、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸において低頻度で見出される、ＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンの１以上が、ヒトにおける高発現タンパク質をコードする核酸においてより高い頻度で見出されるヌクレオチドコドンで置換されている。触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするコドンがコドン最適化を受けており触媒的に不活性であるｈＭＭＰ−１１のヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【０１０９】
ｍＭＭＰ−１１−ｏｐｔをコードするコドンのカルボキシ末端コドンが、免疫増強要素ポリペプチド（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢ）をコードするコドンに連結された場合に、触媒的に不活性なコドン最適化マウスＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチドを含む抗ＭＭＰ−１１ワクチンの効力が増強されることが、実施例のマウスモデルから示されている。したがって、該抗ＭＭＰ−１１ワクチンの好ましい実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、免疫増強要素ポリペプチドまたは実質的部分をコードするポリヌクレオチドに連結された触媒的に不活性なＭＭＰ−１１（ＭＭＰ−１１融合ポリペプチド）をコードする核酸を含む。現在好ましい実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドがＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするよう、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢまたはその実質的部分をコードするポリヌクレオチドに連結された触媒的に不活性なＭＭＰ−１１をコードする核酸を含む。他の実施形態においては、ＬＴＢをコードするポリヌクレオチドは、ＬＴＢシグナルペプチドをコードするコドンを含まない。ＭＭＰ−１１はｈＭＭＰ−１１であることが現在好ましい。シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢのヌクレオチド配列を配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号９に示す。ヌクレオチドコドンがヒトにおける発現の増強のために最適化された、シグナルペプチドを伴わない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢをコードするポリヌクレオチド配列を、配列番号８に示す。特に好ましい実施形態においては、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１および該ＬＴＢをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチドコドンはヒトにおける発現の増強のために最適化されている。
【０１１０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢが、本明細書に開示されている抗ＭＭＰ−１１ワクチンの融合ポリペプチド実施形態において使用した免疫増強要素ポリペプチドの起源であったが、本発明は更に、他の免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に融合したＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む実施形態をも包含する。免疫増強要素ポリペプチドの具体例には、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、破傷風トキソイドの断片Ｃ（ＦｒＣ）、ＦｒＣのＮ末端ドメイン（ＤＯＭ）、免疫グロブリンＧｌの定常鎖の重フラグメント（ＦｃＩｇＧ）、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のコレラ毒素（ＣＴ）および他の細菌種に由来するＬＴＢが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
したがって、前記を考慮して、本発明は、免疫増強要素またはその実質的部分、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに連結された触媒的に不活性なＭＭＰ−１１を含む単一融合ポリペプチドをコードする核酸またはポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンを提供する。そのようなワクチンの一例は、配列番号５（触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１）のアミノ酸および配列番号８（ＬＴＢ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号４（触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１）および配列番号７（シグナルペプチドを伴わないＬＴＢをコードする。）もしくは配列番号８（ここで、シグナルペプチドを伴わないＬＴＢをコードするヌクレオチドコドンがヒトにおける発現に関して最適化されている。）のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。一例として、該ワクチンは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。そのようなポリペプチドは、配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０１１２】
該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンの好ましい実施形態においては、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチドコドンは、前記のとおり、ヒトにおける発現の増強のために最適化されている。該免疫増強要素をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチドコドンも、ヒトにおける発現の増強のために最適化されていることが更に好ましい。そのようなポリヌクレオチドの一例は、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードする配列番号６のコドン最適化ヌクレオチド配列と、該ＬＴＢをコードする配列番号８のコドン最適化ヌクレオチド配列とを含むであろう。一例として、コドン最適化された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２に示すヌクレオチド配列を有する。
【０１１３】
該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、直接的な注射、エレクトロポレーション、粘膜運搬などのような種々の運搬メカニズムにより投与されうる。いくつかの好ましい実施形態においては、該ワクチンは、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内、遺伝子銃による射入、局所的または経口的に投与される。例えば、該ワクチンを三角筋の筋肉内に投与することが可能であり、０．５ｍＬシリンジを使用して投与し次いで該注射の２分以内に電気刺激を加えることが可能である。該電気刺激は、ＭＥＤＰＵＬＳＥＲ  ＤＮＡ運搬系（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて加えられうる。好ましくは、該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、水、食塩水（塩類液）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組合せのような医薬上許容される担体および賦形剤中に、前記ポリヌクレオチドのいずれかを含む。現在好ましい実施形態においては、該ワクチンは食塩水溶液として製剤化される。いくつかの場合には、該ポリヌクレオチドワクチンは、細菌、例えばシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）またはリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の弱毒化株内に、該発現ベクターを含みうると想定される。該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、バッファーなどのような補助物質をも含有しうる。
【０１１４】
該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、免疫応答がＴｈ１またはＴｈ２応答を調節しうる１以上の遺伝的アジュバント（１以上の分子アジュバントをコードする核酸）を含みうる。そのような遺伝的アジュバントには、共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６；炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１α（ＩＬ−１α）；腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８；Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＩＬ−８；インターフェロンγ誘導タンパク質１０（γＩＰ−１０）；マクロファージ抑制タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）；ならびにＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｓａｓａｋｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１：２４３−２５４（２００３）は、ＤＮＡワクチンのためのアジュバント配合および運搬系に関する優れた考察を記載している（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０：４８７−４９８（２０００）およびＫｉｍら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：３０５−３２１（２０００）も参照されたい）。該遺伝的アジュバントは、前記実施形態のいずれかにおけるｈＭＭＰ−１１をコードする発現ベクターとは別の発現ベクター上の、あるいは前記実施形態のいずれかにおけるｈＭＭＰ−１１をコードするのと同じ発現ベクター上の発現カセット内に提供されうる。
【０１１５】
該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは１以上の通常のアジュバントを含みうる。通常のアジュバントには、無機塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、細菌由来アジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、ムラミルペプチド、脂質粒子、例えばカチオニックリポソームおよびマンナン被覆リポソーム、乳化剤アジュバント、例えばＱＳ−２１、および合成アジュバント、例えばウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他のアジュバントおよび賦形剤はＶｏｇｅｌら，“Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９２に記載されている。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、好ましくは、約１０μｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲のＤＮＡ濃度で、医薬上許容される担体中の溶液または懸濁液として投与される。一般に、プラスミドワクチンベクター約５ｍｇ、好ましくは約０．０５の免疫学的または予防的に有効な量が筋肉組織内に直接投与される。適当な投与量は、ワクチン接種すべき個体に左右され、該ワクチン中に含有されるｈＭＭＰ−１１をコードする核酸を発現する個体の能力、および発現されたｈＭＭＰ−１１に反応する個体の免疫系に左右されうる。選択される厳密な投与量は、１つには、該ワクチンを投与する又はその投与を要求する医学的実施者の判断に左右されうる。
【０１１７】
該抗ＭＭＰ−１１ワクチンは更に、前記組換えポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えアデノウイルスを含む。現在好ましくは、アデノウイルスワクチンは、約１ｍＬ未満の最終容量でリン酸緩衝食塩水のような希釈剤中で希釈されて、三角筋の筋肉内に投与される。該組換えアデノウイルスの有効量は一般には約１０６〜１０１２ウイルス粒子、好ましくは約１０７〜１０１１ウイルス粒子である。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態においては、本明細書に開示されているアデノウイルスおよびポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、増強された免疫応答を誘導するために、種々の初回／追加投与の組合せで使用される。この場合、それらの２つのベクターは「初回および追加」方式で投与される。例えば、第１のタイプのベクターを１回以上投与し、ついで、予め決められた期間、例えば２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月または他の適当な間隔の後、第２のタイプのワクチンを１回以上投与する。好ましくは、該ベクターは、同じポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せをコードする発現カセットを含有する。プラスミドベクターをも使用する実施形態においては、該ベクターは、哺乳類または昆虫細胞により認識される１以上のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態においては、該プラスミドベクターは、強力なプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（これに限定されるものではない）を含有するであろう。
【０１１９】
前記のとおり、アデノウイルスベクター抗ＭＭＰ−１１ワクチンおよびポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、免疫応答を誘導するための単一の治療計画の一部として脊椎動物に投与されうる。１つの実施形態においては、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。もう１つの実施形態においては、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。前記の方法においては、第１のタイプのベクターは２回以上投与されることが可能であり、該ベクターの各投与は、予め決められた期間を隔てて行われる。第１のタイプのベクターのそのような一連の投与の後、予め決められた期間の経過後に、第２のタイプのベクターの投与が１回以上行われうる。第１のタイプのベクターでの治療と同様に、第２のタイプのベクターも、予め決められた期間の後で１回以上投与されうる。
【０１２０】
本発明のもう１つの実施形態は、適切に滅菌された容器（例えば、アンプル、ボトル、バイアルなど）内に複数用量または単位投与系として入れられた本発明のアデノウイルスベクターまたはポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンを含むキットである。該容器は、好ましくは、ワクチン製剤の充填後に密閉される。好ましくは、該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１ワクチンは、ラベルが添付された容器内に入れられる。該ラベルは該ワクチンを特定するものであり、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのような政府規制機関により規定された様式の、適当な法律に基づく該ワクチンの承認、投与情報などを示す注意書き有する。該ラベルは、好ましくは、該ワクチンを患者に投与する医療専門家にとって有用な該ワクチンに関する情報を含有する。該キットは、好ましくは、該ワクチンの投与、指示、適応症および必要な警告に関する印刷された情報資料をも含有する。
【０１２１】
本発明の抗ＭＭＰ−１１ポリペプチドワクチンは、その最も基本的な実施形態においては、ＭＭＰ−１１の亜鉛結合部位ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ（配列番号３）を含む保存アミノ酸の１以上が代替アミノ酸に改変された、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１を含む。例えば、配列番号５に示すとおり、ｈＭＭＰ−１１の２１６位の保存グルタミン酸をアミノ酸バリンへと変化させて、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を得た。好ましくは、触媒的に不活性なＭＭＰ−１１は、ＭＭＰ−１１がそのカルボキシ末端において免疫増強要素ポリペプチドまたはその実質的部分に融合または連結されたＭＭＰ−１１融合ポリペプチドである。現在好ましい実施形態においては、免疫増強要素ポリペプチドはＬＴＢポリペプチド、好ましくは、シグナルペプチドが除去されたＬＴＢであり、例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＬＴＢポリペプチドに、配列番号５に示す触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１が連結されている。
【０１２２】
該ポリペプチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、直接的な注射、エレクトロポレーション、粘膜運搬などのような種々の運搬メカニズムにより投与されうる。いくつかの好ましい実施形態においては、該ワクチンは、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内、局所的または経口的に投与される。好ましくは、該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、水、食塩水（塩類液）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組合せのような医薬上許容される担体および賦形剤中に製剤化される。該ポリヌクレオチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、バッファーなどのような補助物質をも含有しうる。該ポリペプチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは、免疫応答をＴｈ１またはＴｈ２応答へと調節しうる１以上の分子アジュバントを含みうる。そのような分子アジュバントには、共刺激分子、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６；炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１α（ＩＬ−１α）、腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８、Ｔｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−８、インターフェロンγ誘導タンパク質１０（γＩＰ−１０）、マクロファージ抑制タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ならびにＲＡＮＴＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。該ポリペプチド抗ＭＭＰ−１１ワクチンは１以上の通常のアジュバントを含みうる。通常のアジュバントには、無機塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、細菌由来アジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、ムラミルペプチド、脂質粒子、例えばカチオニックリポソームおよびマンナン被覆リポソーム、乳化剤アジュバント、例えばＱＳ−２１、および合成アジュバント、例えばウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他のアジュバントおよび賦形剤は前記のＶｏｇｅｌら，“Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）”に記載されている。
【０１２３】
本発明は更に、ＭＭＰ−１１を過剰発現する癌を抑制するアナライトを特定するための方法であって、マウスにおいて癌を誘発させ、該誘発癌を有するマウスに該アナライトを投与し、該誘発癌を有するマウスにおいて該アナライトが該癌を抑制するかどうかを判定して、ＭＭＰ−１１を過剰発現する癌を抑制するアナライトを特定する方法を提供する。特定の実施形態においては、該アナライトを該マウスに投与する前に、該アナライトがＭＭＰ−１１に結合することを確認する。更に他の実施形態においては、該マウスにおいて誘発される癌は結腸癌であり、更に他の実施形態においては、該マウスにおいて該癌を誘発するのに十分な量の１−２ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を該マウスに投与することにより、該マウスにおいて該癌を誘発させる。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の特徴および実施形態を更に例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２５】
マウスＭＭＰ−１１を発現するベクターを構築するために、基質区画の一部であったマウス繊維芽細胞からｃＤＮＡをクローニングした。全ＲＮＡをＮＩＨ−３Ｔ３細胞から抽出し、マウスＭＭＰ−１１に特異的なオリゴヌクレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを増幅した。使用したＰＣＲプライマーは、ヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧ  ＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧ  ＣＣＧＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１６）を有するフォワード５’−ＭＭＰ−１１、およびヌクレオチド配列５’−ＧＴＣＡＧＭＧＧＡＡ  ＡＧＴＲＴＴＧＧＣＡ  ＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣ  ＡＧ−３’（配列番号１７）（ここで、ＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである。）を有する縮重オリゴヌクレオチドリバース３’−ＭＭＰ−１１−１４７３であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応を以下のとおりに行った：４５℃で３０秒間；９４℃で２分間；ついで９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間および６８℃で２分間の４０サイクル。
【０１２６】
約１６３０ｂｐの増幅産物を得、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングしてプラスミドｐＣＲ２．１−ＭＭＰ−１１を得た。クローニングされた増幅産物のＤＮＡ配列分析は、クローニングされた増幅産物のＤＮＡ配列がマウスＭＭＰ−１１  ｃＤＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ ００８６０６）のヌクレオチド配列と完全に一致することを示した。マウスＭＭＰ−１１をコードするｃＤＮＡをＥｃｏＲＩでの消化によりｐＣＲ２．１−ＭＭＰ−１１から取り出し、プラスミドベクターｐＶ１ＪｎｓのＥｃｏＲＩ部位内にクローニングして、発現ベクターｐＶ１ＪｎｓＢ−ＭＭＰ−１１（図１）を得た。図１に示すとおり、ＭＭＰ−１１をコードするｃＤＮＡはヒトＣＭＶプロモーターの下流に存在する。ＰＶ１ｊベクターはＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３（１９９３）に記載されている。
【０１２７】
ＭＭＰ−１１の発現を確認するために、ＨｅＬａ細胞をｐＶ１ＪｎｓＢ−ＭＭＰ−１１でトランスフェクトした。マウスＭＭＰ−１１と交差反応するヒトＭＭＰ−１１に対する抗体を使用するウエスタンブロットにより、細胞抽出物を分析した。図２に示すとおり、約５０ｋＤａのバンドが検出され、このことは、ＭＭＰ−１１が該ベクターにより発現されたことを示している。
【実施例２】
【０１２８】
種々のタイプの抗原をコードする遺伝子のコドン最適化はインビボにおける発現の増強および免疫原性の増強をもたらしうることが示されている。したがって、ｍＭＭＰ−１１の発現を増強し、免疫原性を増強するためには、ｍＭＭＰ−１１コード配列をコドン最適化した。
【０１２９】
ｍＭＭＰ−１１  ｃＤＮＡ配列を、同じアミノ酸配列をコードするがマウス細胞における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有するポリヌクレオチド配列に変換した（コドン使用頻度に関する全般的考察は、Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．：１８３：１−１２（１９８５）を参照されたい）。該方法論は一般に、マウスにおける高発現遺伝子に一般に用いられていない、野生型ｍＭＭＰ−１１ポリヌクレオチド配列におけるコドンを特定し、マウスにおける高発現遺伝子に一般に用いられるコドンでそれらを置換して、マウス由来の細胞における該ポリヌクレオチドの高発現のために高発現遺伝子において一般に用いられるコドンのみを含有するポリヌクレオチドを得ることよりなる。ついで新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換により生じた望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の非意図的生成、望ましくない制限酵素部位、高いＧＣ含量など）に関して検査した。望ましくない配列を含むコドンを他のコドン（好ましくは、実用的な場合には、同じアミノ酸をコードする、高発現遺伝子において用いられる別のコドン）で置換することにより、望ましくない配列を排除した。ついで、発現の改善に関して、合成遺伝子セグメントを試験する。マウスにおける発現のための該コドン最適化遺伝子は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムアルゴリズム（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して設計した。転写のレベルを上昇させるために、最適化されたコザック配列をＡＴＧ開始コドンの５’側に挿入した。さらに、翻訳の終結を増強するために、２つの連続的な終止コドンを該コード配列の下流に挿入した。
【０１３０】
ｍＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙにおいて行われたオリゴヌクレオチド構築により合成し、ついでｐＶ１ＪｎｓＡベクターのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位内にクローニングして、ｐＶ１ＪｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１ｏｐｔを得た。ＭＭＰ−１１の免疫原性を改変することなくＭＭＰ−１１の酵素活性を阻害するために、２２０位のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）へと変化させる点変異を触媒部位に導入した（Ｎｏｅｌら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９：１６０５−１２（２０００））。これはベクターｐＶ１ＪｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔを与えた。ｍＭＭＰ−１１の触媒的に不活性な該コドン最適化変異体（ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔ）のヌクレオチド配列を図３（配列番号３）に示し、ベクターｐＶ１ＪｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔの地図を図６Ａに示す。
【０１３１】
ＷＯ２００５０７７９７７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素Ｂ（ＬＴＢ）への免疫増強要素への癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の遺伝的融合がＣＥＡに対するワクチン接種の効力を更に増強することを示した。したがって、ＭＭＰ−１１の効力を増強するために、シグナル配列が除去された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに融合された触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを合成し、ｐＶ１ＪｎｓＡベクターのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位内にクローニングしてｐＶ１ＪｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ（図６Ｂ）を得た。触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１ＬＴＢ融合体は、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙにおいて行われたオリゴヌクレオチド構築により合成した。ＬＴＢをコードするコドンを、ヒト由来の細胞における発現のために最適化した。図４は、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示し、図５は、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
ｐＶ１ＪｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔの発現を試験するために、ＨｅＬａ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｐＶ１ｊｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔでトランスフェクトした。全細胞抽出物を、細胞溶解バッファー（２％ＳＤＳ，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）を使用して調製し、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合タンパク質の発現に関してウエスタンブロットにより分析した。標準的なウエスタンブロットプロトコールに従い抗ＭＭＰ−１１および抗ＬＴＢ抗体を使用して、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合タンパク質を検出した。抗ＭＭＰ−１１および−ＬＴＢ抗体はＢＩＯＭＯＬ（Ｅｘｔｅｒ，ＵＫ  ａｎｄ  Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，抗ＭＭＰ−１１  ｃａｔ．＃ＳＡ−３７１）およびＡｂｅａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ  ａｎｄ  ＭＡ，抗Ｅ．Ｃｏｌｉ易熱性毒素，ｃａｔ＃ａｂ９１９９）から入手した。図７に示すとおり、両方の抗体は、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合タンパク質の分子量に対応する約６０ＫＤａのバンドに結合した。
【実施例３】
【０１３３】
野生型ｍＭＭＰ−１１と比較してｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔおよびｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔの免疫原性能を試験するために、Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら（Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎ  ＨＣＶ  Ｅ２  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｍｕｓｃｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１５９８−１１６０７，（２０００））に従い、各ＢＡＬＢ／ｃマウスを、食塩水中の５０μｇのプラスミドＤＮＡの４回のＤＮＡ注射により筋肉内に免疫し、ついで１週間を隔ててエレクトロポレーションを行った。最後の注射の２週間後、マウスを犠死させ、ｍＭＭＰ−１１ペプチドに対する免疫応答をインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）に関する細胞内染色により測定した。図８に示すとおり、野生型および触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１ｏｐｔは共に、マウスにおける免疫寛容を効率的に破壊するものであった（％ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋＞０．１％）。ｍＭＭＰ−１１と触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１ｏｐｔとの間には有意差は何ら存在しないようであった。しかし、同様に図８に示されているとおり、ＬＴＢへの触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１ｏｐｔの融合は免疫応答を有意に増強した（ｐ＜０．０５）。
【０１３４】
体液性応答をウエスタンブロットにおいて測定した。体液性免疫応答を測定するために、ｐＶ１ＪｎｓＢ−ＭＭＰ−１１でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの全細胞抽出物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースメンブレン上にトランスファーした。前記の免疫マウスからの血清を該メンブレンと共にインキュベートした。ついでｍＭＭＰ−１１に対するマウス抗体の検出を、アルカリホスファターゼに結合した抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用することにより行った。ｍＭＭＰ−１１の分子量に対応するバンドの検出は、ｍＭＭＰ−１１に対する抗体の存在を示す。図９に示すとおり、ｍＭＭＰ−１１で免疫されたマウスと触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔで免疫されたマウスとの間で体液性応答における見掛け上の有意差は観察されなかった。
【０１３５】
図８に示す結果に基づき、ワクチン接種研究の使用するための最良の免疫原としてｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔを選択した。
【実施例４】
【０１３６】
ＭＭＰ−１１を過剰発現する腫瘍モデルを以下のとおりに作製した。１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）またはその代謝産物アゾキシメタンは、しばしば、腫瘍誘発研究における発癌物質として使用される。ＤＭＨは、いくつかの場合には１回の経口暴露後でさえも、多数の動物種において結腸腫瘍を誘発することが判明しているが（ＣｈｏｕｄｈａｒｙおよびＨ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ  ３７：８０１−８４３（１９９８））、典型的には６〜１０回の週１回の処理が用いられる。ＤＭＨはアルキル化剤であり、この化学物質での処理はＤＮＡ塩基に対するメチル付加体、点変異、小核小体および姉妹染色分体交換を誘発することが示されている。ＤＭＨでの処理は結腸内のアポトーシス（Ｂｌａｋｅｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：２４２−２４９（１９８５））、およびヒト結腸癌に特徴的な結腸上皮細胞の細胞増殖の促進を誘発する（Ｍａら，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．８：８４７−８５２（２００２））。
【０１３７】
感受性マウス系統、例えばＡ／Ｊにおいて、そしてそれより低い度合ではあるがＢＡＬＢ／ｃにおいても、結腸組織におけるＤＭＨ誘発性発癌の進行は以下の異なる段階を経て進行する：（１）異常陰窩形成（ＡＣＦ）、（２）腺腫、（３）ポリープ、および（４）腺癌。腫瘍形成のこの過程におけるｍＭＭＰ−１１の発現を確認するために、Ａ／Ｊマウスに６回の週１回のＤＭＨの注射を行い、最後のＤＭＨ注射の５週間後に該マウスを犠死させた。この段階で、異常陰窩およびいくつかの腺腫の両方がマウス結腸組織内に存在した。腸組織を凍結し、ｍＭＭＰ−１１に対する抗体を使用するウエスタンブロットおよび免疫組織化学法（ＩＨＣ）により分析した。未処理マウス（ビヒクル）においては、ＩＨＣ分析は、正常陰窩の基底部にｍＭＭＰ−１１の発現を示し、ｍＭＭＰ−１１の発現は結腸幹細胞に限定されているらしかった。異常陰窩および腺腫形成においては強力かつ広汎な発現が検出された。この観察は、ＤＭＨで処理されたマウスまたは未処理のままのマウスからの結腸組織抽出物のウエスタンブロット分析により証明された。ＤＭＨ処理結腸には活性化形態のｍＭＭＰ−１１が存在しており（図１０）、このことは該腫瘍状組織による該プロテイナーゼの過剰発現を示している。これらのデータは、ＤＭＨ誘発性発癌が抗ＭＭＰ−１１療法およびワクチン接種に関するモデルとして適していることを示している。
【実施例５】
【０１３８】
この実施例は抗ＭＭＰ−１１ワクチンの治療効力を示す。前実施例において示したとおり、Ａ／Ｊマウスで１−２ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）の投与により誘発された異常陰窩形成（ＡＣＦ）および腺腫において、ＭＭＰ−１１は過剰発現される。他の研究は、ＤＭＨが免疫系および遺伝的ワクチン接種の効力を妨げないことを示している。ＤＭＨが免疫系の機能および遺伝的ワクチン接種の効力を妨げるかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
【０１３９】
１０匹のＢＡＬＢ／ｃまたはＡ／Ｊマウスの群を第５週齢からＤＭＨの６回の腹腔内（ＩＰ）注射で処理するか、あるいは未処理（模擬）のままとした。第８週および第１１週に、該マウスのすべてに５０μｇのプラスミドｐＶ１Ｊ−ＣＥＡｏｐｔの注射を行った（ｐＶ１Ｊ−ＣＥＡｏｐｔに関してはＷＯ２００５０７７９７７を参照されたい）。２週間後、マウスから採血し、ｐＶ１Ｊ−ＣＥＡｏｐｔによりコードされるＣＥＡに対するその免疫応答を、ＣＥＡタンパク質を包含する１５マーペプチドでの刺激直後の細胞内染色により分析した。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＣＤ８＋免疫応答が測定された。図１９Ａは、ＤＭＨ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスと模擬処理ＢＡＬＢ／ｃマウスとの間にＣＤ８＋応答における有意差が無かったことを示している。Ａ／Ｊマウスでは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋免疫応答が測定された。図１９Ｂおよび１９Ｃは、ＤＭＨ処理Ａ／Ｊマウスと模擬処理Ａ／Ｊマウスとの間にＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答における有意差が無かったことを示している。これらの結果は、ＤＭＨが免疫系の活性に影響を及ぼさないらしいことを示した。総合すると、これらのデータは、ＭＭＰ−１１が腫瘍関連抗原であること、およびＭＭＰ−１１に対するワクチンが、ＭＭＰ−１１を過剰発現する癌を治療するための実施可能な手段となることを示唆した。
【０１４０】
抗ＭＭＰ−１１ワクチンの効力を試験するために、６０匹のＡ／Ｊマウスの群を６回の週１回の注射でＤＭＨで処理した。１群は未処理のままである（ナイーブ）。もう１つの群をｐＶ１ＪｎｓＡ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔで免疫し、ついでエレクトロポレーションを行う（図１１Ａに示すスキームに示されているとおり）。最後の免疫の２週間後、ｍＭＭＰ−１１に対する細胞性免疫（ＣＭＩ）を、全タンパク質を包含する１５マーペプチドのプールで分析したが、該分析群においては、乏しい免疫応答が検出されたに過ぎなかった（データ非表示）。ＤＭＨの最後の注射の７〜８週間後、１群当たり２０匹のマウスを犠死させ、ＡＣＦ、腺腫、ポリープおよび腺癌の存在に関して結腸を分析した。ワクチン接種されたマウスは、ＤＭＨにより誘発されたＡＣＦ、腺腫、ポリープおよび腺癌の存在の有意な軽減を示している（図１１Ｂ〜１１Ｅ）。
【実施例６】
【０１４１】
もう１つのマウス系統におけるＤＭＨ発癌モデルでの腫瘍防御の効力を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、前記と同じ処理および免疫方式に従った。最後の免疫の２週間後、ｍＭＭＰ−１１に対するＣＭＩを、全タンパク質を包含する１５マーペプチドのプールで分析した。
【０１４２】
免疫マウスからの脾細胞の調製のために、脾臓を犠死マウスから無菌的に摘出し、格子（ｇｒｉｄ）を通して擦り取ることにより破砕した。ＡＣＫ細胞溶解バッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の存在下での１０分間のインキュベーションにより、赤血球ライセートを得た。１２００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、白血球をＲ１０培地に再懸濁させた。１〜２×１０６個の脾細胞またはＰＢＭＣ（抹消血単核細胞）を１ｍＬのＲ１０培地に再懸濁させた。抗原ペプチドを１μｇ／ｍＬの最終濃度までブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａと共に加えた。ｍＭＭＰ−１１抗原ペプチドは１５マーペプチドのプールを含み、それらは一緒になって全ＭＭＰ−１１ペプチドを包含するものであった。ペプチドの総数は１２１であり、４つのプール（Ａ，１〜３０；Ｂ，３１〜６０；Ｃ，６１〜９０；Ｄ，９１〜１２１）に分割された。
【０１４３】
３７℃で１２時間のインキュベーションの後、該細胞を３ｍＬのＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳで補足され０．０５％  ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で洗浄し、室温で１０分間遠心分離した。該細胞を、１００μＬのＦＡＣＳバッファー中、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２と共に４℃で１５分間インキュベートした。ついで、該細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１５マーｍＭＭＰ−１１抗原ペプチドの存在下のインキュベーションの際のＩＦＮγの分泌に関して該細胞を分析した。
【０１４４】
表面抗原染色のために、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗マウスＣＤ３フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗マウスＣＤ４およびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）結合抗マウスＣＤ８α（すべて、ＦＡＣＳバッファー中で１：５０希釈されたもの）を該細胞に加えて１００μＬの最終容量とし、該細胞を暗所にて室温で３０分間インキュベートした。ＰＥＲＭＷＡＳＨ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）での洗浄の後、細胞を１００μＬのＣＹＴＯＦＩＸ−ＣＹＴＯＰＥＲＭ溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に再懸濁させ、ボルテックスし、暗所にて４℃で２０分間インキュベートした。
【０１４５】
細胞内染色のために、該細胞を、ＰｅｒＷａｓｈ中で１：５０希釈されたフルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合抗マウスインターフェロンγ（１００μＬの最終容量）と共に暗所にて室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、該細胞をＰＢＳ中の１％  ホルムアルデヒド（２５０〜３００μＬ）に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  ＣＡＬＩＢＥＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。
【０１４６】
免疫群において、主として該タンパク質のＣ末端に対する有意な免疫応答が検出され、それはＣＤ８＋特異的であった（図１２Ａ）。惹起されたＣＤ８＋エフェクターは機能的であった。なぜなら、それは、ｍＭＭＰ−１１抗原ペプチドで負荷された腫瘍状標的細胞を細胞溶解することが可能だったからである（図１２Ｂ）。最も重要なことは、ワクチン接種マウスにおいて、ＡＣＦから腺腫の全段階において非常に有意な防御が観察されたことである（図１３Ａ〜１３Ｄ）。これらのデータは、ＭＭＰ−１１が能動的特異的免疫療法のための最適な標的であり、遺伝的ワクチン接種が腫瘍防御において極めて効率的であることを示している。
【実施例７】
【０１４７】
触媒的に不活性なヒトＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチド配列のクローニングおよび最適化
マウスＭＭＰ−１１と同様にして、ヒトＭＭＰ−１１をヒト細胞における最高コドン使用頻度に従いコドン最適化し、２２０位の触媒部位内のグルタミン酸（Ｅ）のコドンをアラニン（Ａ）のものに変化させることにより触媒的に不活性にした。コドン最適化された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を含むポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチド構築により合成し（ＧＥＮＥＡＲＴ，ＧｍｂＨ）、ベクターｐＶ１ＪｎｓＡのＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位内にクローニングしてｐＶ１ＪｎｓＡ−ｈＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔを得た（図１８）。触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を図１４に示す。触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１のアミノ酸配列を図１５に示す。ベクターｐＶ１ＪｎｓＡ−ｈＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔはヒトにおける使用のために設計した。これは、免疫原性エピトープを特定するためにヒトＭＨＣクラスＩ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）に関するマウストランスジェニックのような前臨床モデルにおいて使用されうる。
【０１４８】
ｈＭＭＰ−１１を含む抗ＭＭＰ−１１ワクチンの効力を改善するために、シグナル配列が除去された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに融合された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを合成し、ｐＶ１ＪｎｓＡベクターのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位内にクローニングしてｐＶ１Ｊｎｓ−ＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ（図２０）を得る。ｐＶ１Ｊｎｓ−ＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔのヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。該ヌクレオチド配列は、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするヌクレオチドコドンを、ＬＴＢをコードするヌクレオチドコドンから分離するＸｂａＩポリリンカーの第２ヌクレオチドから始まる。配列番号１８のヌクレオチド配列においては、ＣＭＶプロモーターはヌクレオチド３６４７−４２６１を含み、イントロンＡはヌクレオチド４３９６−５２２１を含み、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１はヌクレオチド５２５３−６７１５を含み、ＸｂａＩポリリンカーはヌクレオチド６７１５−５を含み、ＬＴＢはヌクレオチド６−３１５を含み、ＢＧＨポリＡはヌクレオチド３８２−５９９を含む。触媒的に不活性なヒトＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合体のポリヌクレオチドは、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙにおいて行われうるオリゴヌクレオチド構築により合成されうる。
【０１４９】
本発明は、例示されている実施形態に関して記載されているが、本発明はそれらに限定されるものではないと理解されるべきである。本明細書中の教示を利用する当業者は、本発明の範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１はベクターｐＶ１ＪｎｓＢ−ｍＭＭＰ−１１の地図を示す。ヒトＣＭＶプロモーターおよびマウスＭＭＰ−１１  ｃＤＮＡが示されている。
【図２】図２はマウスＭＭＰ−１１の発現を示す。ＨｅＬａ細胞をｐＶ１ＪｎｓＢ−ＭＭＰ−１１でトランスフェクトし、抽出物をウエスタンブロットで分析した。ＭＭＰ−１１の分子量に対応するバンドが検出された。
【図３】図３は、触媒的に不活性なマウスＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化核酸（ｍＭＭＰ−１１ｏｐｔ）のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。コドン最適化された触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１に対応するヌクレオチドが黒で示されており、ＸｂａＩ部位を含むポリリンカーの追加的ヌクレオチドが下線で示されている。クローニング部位、コザック配列および終止コドンのヌクレオチドが斜体で示されている。ｍＭＭＰ−１１の開始コドンが太字で示されている。
【図４】図４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに連結された触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化核酸（ｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢｏｐｔ）のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。コドン最適化された触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１に対応するヌクレオチドが黒で示されており、ＸｂａＩ部位を含むポリリンカーの追加的ヌクレオチドが下線で示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢ配列をコードするヌクレオチドが小文字で示されている。クローニング部位、コザック配列および終止コドンのヌクレオチドが斜体で示されている。
【図５】図５は、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１−ＬＴＢｏｐｔ融合ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１に対応するポリペプチドを含むアミノ酸が黒で示されており、ＬＴＢ配列が斜体で示されている。ポリリンカーによりコードされるアミノ酸が下線で示されている。
【図６Ａ】図６Ａは、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを含むベクターｐＶ１Ｊ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔの地図を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに連結された触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを含むベクターｐＶ１Ｊ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ＬＴＢｏｐｔの地図を示す。
【図７】図７は、ｐＶ１ＪｎｓＡ−ＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるｐＶ１ＪｎｓＡ−ＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔの発現を示す、抗ＭＭＰ−１１または抗ＬＴＢ抗体を使用したウエスタンブロットを示す。
【図８】図８は、ｍＭＭＰ−１１、ｍＭＭＰ−１１ｏｐｔおよびｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔにより惹起された細胞性免疫応答を示す。ＤＮＡエレクトロポレーション（ＤＮＡ−ＥＰ）の４回の週１回の注射により６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。ｍＭＭＰ−１１タンパク質のＣ末端を含むペプチドを使用するＩＦＮγに関する細胞内染色により、免疫応答を測定した。丸印は、それぞれの単一のマウスに関するＣＤ８＋ＩＦＮγ＋の割合（％）を表す。水平の棒線は該群の幾何平均を表す。
【図９】図９は、触媒的に不活性なｍＭＭＰ−１１およびｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔにより惹起された体液性応答を示す。ＤＮＡエレクトロポレーション（ＤＮＡ−ＥＰ）の４回の週１回の注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。抗体の存在をウエスタンブロットにより測定した。ｍＭＭＰ−１１に対応する５０ＫＤａのバンドの検出はｍＭＭＰ−１１に対する体液性応答を示している。
【図１０】図１０は、ｍＭＭＰ−１１が、ＤＭＨにより誘発されたマウス結腸腺腫において過剰発現されることを示す。Ａ／ＪマウスをＤＭＨの６回のＩＰ注射で処理した。５週間後、結腸組織をＩＨＣおよびウエスタンブロット法により分析する。Ｖｅｈはビヒクル（ＰＢＳ）を意味する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、結腸癌を予防するためのｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示すために行った実験の概要図を示す。Ａ／ＪマウスをＤＭＨの６回のＩＰ注射で処理した。マウスの一群を未処理のままにし（ナイーブ）、もう１つの群を５０μｇのプラスミドｐＶ１Ｊ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔでワクチン接種した。最後のＤＭＨ注射の７〜８週間後、マウスを犠死させ、結腸を異常陰窩形成（ＡＣＦ）（図１１Ｂおよび１１Ｃ）、ポリープ（図１１Ｄ）および腺腫（図１１Ｄ）に関して顕微鏡で分析した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＡＣＦの抑制におけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＡＣＦの抑制におけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ポリープの抑制におけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、腺腫の抑制におけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１２Ａ】図１２Ａは、抗ｍＭＭＰ−１１遺伝的ワクチンにより惹起された免疫応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＭＨの６回のＩＰ注射で処理した。マウスの一群を未処理のままにし（ナイーブ）、もう１つの群を５０μｇのプラスミドｐＶ１Ｊ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔでワクチン接種した。ＩＦＮγに関する細胞内染色により免疫応答を測定した。黒い丸印は、それぞれの単一のマウスに関するＣＤ８＋ＩＦＮγ−の割合（％）を表す。水平の棒線は該群の幾何平均を表す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、抗ｍＭＭＰ−１１遺伝的ワクチンにより惹起された免疫応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＭＨの６回のＩＰ注射で処理した。マウスの一群を未処理のままにし（ナイーブ）、もう１つの群を５０μｇのプラスミドｐＶ１Ｊ−ｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔでワクチン接種した。エフェクター細胞を７日間にわたりｍＭＭＰ−１１ペプチドで刺激するＣＴＬアッセイを用いて、免疫応答を測定した。ｍＭＭＰ−１１ペプチドで負荷（ｌｏａｄ）されていない又は負荷されたｐ８１５肥満細胞腫細胞を標的として使用した。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＡＣＦの抑制におけるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。最後のＤＭＨ注射の７〜８週間後、マウスを犠死させ、結腸をＡＣＦに関して顕微鏡で分析した。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＡＣＦの抑制におけるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。最後のＤＭＨ注射の７〜８週間後、マウスを犠死させ、結腸をＡＣＦに関して顕微鏡で分析した。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ポリープの抑制におけるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。最後のＤＭＨ注射の７〜８週間後、マウスを犠死させ、結腸をポリープに関して顕微鏡で分析した。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、腺腫の抑制におけるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ遺伝的ワクチンの治療効力を示す。最後のＤＭＨ注射の７〜８週間後、マウスを犠死させ、結腸をポリープに関して顕微鏡で分析した。白い丸印はマウス１匹当たりの形成数を示し、黒い丸印は該群の幾何平均を示す。統計分析（Ｔスチューデント検定）が示されている。
【図１４】図１４は、ヒトにおける発現のためにコドンが最適化されている、触媒的に不活性なヒトＭＭＰ−１１（ｈＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔ）をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図１５】図１５は、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図１６】図１６は、ＭＭＰ−１１およびＬＴＢの両方をコードするコドンがヒトにおける発現のために最適化されている、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに連結された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１を含む融合ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１２）（ｈＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ）を示す。ＬＴＢのアミノ酸１−２１をコードするコドンは該融合ポリペプチド内に含まれない。コドン最適化された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１に対応するヌクレオチドが黒で示されており、ＸｂａＩ部位を含むポリリンカーの追加的ヌクレオチドが下線で示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢ配列をコードするヌクレオチドが小文字で示されている。
【図１７】図１７は、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１−ＬＴＢ融合ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。触媒的に不活性なＭＭＰ−１１を含むアミノ酸が大文字で示されており、ＬＴＢを含むアミノ酸が斜体で示されており、ポリリンカーによりコードされるアミノ酸が下線で示されている。開始コドンが太字で示されている。
【図１８】図１８は、触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを含むベクターｐＶ１Ｊ−ｈＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）ｏｐｔの地図を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＤＭＨがＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋免疫応答を妨げないことを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＤＭＨがＡ／ＪマウスのＣＤ８＋免疫応答を妨げないことを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＤＭＨがＡ／ＪマウスのＣＤ４＋免疫応答を妨げないことを示す。
【図２０】図２０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴＢに連結された触媒的に不活性なｈＭＭＰ−１１をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを含むベクターｐＶ１Ｊ−ｈＭＭＰ−１１（ｃａｔ−）−ＬＴＢｏｐｔ（配列番号１８を参照されたい）の地図を示す。
【図１】
2009509553.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2009509553.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009509553.tif 000014
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2009509553.tif 000021
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
2009509553.tif 000027
【図１６】
2009509553.tif 000028
【図１７】
2009509553.tif 000029
【図１８】
2009509553.tif 000030
【図１９Ａ】
2009509553.tif 000031
【図１９Ｂ】
2009509553.tif 000032
【図１９Ｃ】
2009509553.tif 000033
【図２０】
2009509553.tif 000034
【配列表】
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【国際調査報告】
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