(57)【要約】PUFAの産生のためのPKS様の系（PUFA PKS系）を発現するように遺伝的に改変された植物が開示され、ここでその植物によって産生される油は、PUFA PKS系によって生成される少なくとも1つのPUFAを含み、かつ、標準的な脂肪酸経路におけるFAS系の生成物の修飾によって生成される脂肪酸生成物である、より短鎖かつより不飽和度の低い混合性PUFAを含まない。油糧種子、油、およびこの系によって生成されるそのような油を含む産物、ならびにそのような植物を作製する方法も開示される。2009529891.tif 000004
2009529891.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のすべてのPUFAを合計で5％未満含む、植物または植物の部分：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【請求項２】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のPUFAのそれぞれを1％未満含む、植物または植物の部分：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【請求項３】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）およびジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）を2％未満含む、植物または植物の部分。
【請求項４】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）およびジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）を1重量％未満含む、請求項4記載の植物または植物の部分。
【請求項５】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）を1％未満含む、植物または植物の部分。
【請求項６】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）を0.5重量％未満含む、請求項5記載の植物または植物の部分。
【請求項７】
植物が、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を生成する酵素を発現するように遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、該少なくとも1つのPUFAを少なくとも約0.5重量％含み、該少なくとも1つのPUFA以外の、該酵素によって生成される総脂肪酸が、該植物によって産生される総脂肪酸の約10％未満を構成する、植物または植物の部分。
【請求項８】
前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記酵素によって生成される総脂肪酸が、植物によって産生される総脂肪酸の5重量％未満を構成する、請求項7記載の植物または植物の部分。
【請求項９】
γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAからなる脂肪酸が、植物によって産生される総脂肪酸の5重量％未満を構成する、請求項7記載の植物または植物の部分。
【請求項１０】
γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）が、植物によって産生される総脂肪酸の1重量％未満を構成する、請求項7記載の植物または植物の部分。
【請求項１１】
植物が、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ酵素を発現するように遺伝的に改変されていない、請求項1〜10のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項１２】
植物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を産生する真核生物由来のPUFA PKS系によって遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量の該少なくとも1つのPUFAを含む、植物または植物の部分。
【請求項１３】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、前記少なくとも1つのPUFAを少なくとも0.5重量％含む、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項１４】
前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記PUFA PKS系によって生成される脂肪酸が、植物によって産生される総脂肪酸の約10重量％未満を構成する、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項１５】
前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記酵素によって生成される総脂肪酸が、植物によって産生される総脂肪酸の約5重量％未満を構成する、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項１６】
PUFA PKS系が以下を含む、請求項12記載の植物または植物の部分：
a）少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；
b）少なくとも4つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；
c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；
d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；
e）少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；
f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；および
g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；
h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。
【請求項１７】
PUFA PKS系が以下を含む、請求項12記載の植物または植物の部分：
a）2つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン；
b）8つまたは9つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；
c）2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；
d）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；
e）1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン；
f）2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；
g）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；および
h）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。
【請求項１８】
PUFA PKS系がヤブレツボカビ目（Thraustochytriales）の微生物由来である、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項１９】
PUFA PKS系がシゾキトリウム属（Schizochytrium）由来である、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項２０】
PUFA PKS系がヤブレツボカビ属（Thraustochytrium）由来である、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項２１】
PUFA PKS系が、以下からなる群より選択される微生物由来である、請求項12記載の植物または植物の部分：シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888、ヤブレツボカビ属23B ATCC番号20892および該微生物のいずれかの変異株。
【請求項２２】
PUFA PKS系をコードする核酸配列が、以下からなる群より選択される微生物由来のPUFA PKS系をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項12記載の植物または植物の部分：シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888、ヤブレツボカビ属23B ATCC番号20892および該微生物のいずれかの変異株。
【請求項２３】
PUFA PKS系をコードする核酸配列が、シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888またはその変異株由来のPUFA PKS系をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項２４】
PUFA PKS系が、ヤブレツボカビ目の微生物由来のPUFA PKS系からの少なくとも1つのドメインを含む、請求項12記載の植物または植物の部分。
【請求項２５】
植物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を生成するPUFA PKS系によって遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量の該少なくとも1つのPUFAを含み、PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを生成する細菌PUFA PKS系であり、細菌PUFA PKS系が以下を含む、植物または植物の部分：
a）少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン；
b）少なくとも6つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；
c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；
d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；
e）少なくとも1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン；
f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；
g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；
h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；および
i）少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）ドメイン。
【請求項２６】
PUFA PKS系が、以下からなる群より選択される微生物由来である、請求項25記載の植物または植物の部分：シュワネラ-オレヤナ（Shewanella olleyana）Australian Collection of Antarctic Microorganisms（ACAM）株番号644；シュワネラ-ジャポニカ（Shewanella japonica）ATCC株番号BAA-316および該微生物のいずれかの変異株。
【請求項２７】
PUFA PKS系をコードする核酸配列が、以下からなる群より選択される微生物由来のPUFA PKS系をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項25記載の植物または植物の部分：シュワネラ-オレヤナAustralian Collection of Antarctic Microorganisms（ACAM）株番号644；またはシュワネラ-ジャポニカATCC株番号BAA-316または該微生物のいずれかの変異株。
【請求項２８】
PUFA PKS系がホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をさらに含む、請求項12〜27のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項２９】
種子の総脂肪酸プロフィールが少なくとも20個の炭素原子および少なくとも4つの炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸を少なくとも1.0重量％含む成熟種子を産生し、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のすべてのPUFAを合計で5％未満含む、油糧種子植物または油糧種子植物の部分：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【請求項３０】
種子の総脂肪酸プロフィールが少なくとも20個の炭素原子および少なくとも4つの炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸を少なくとも1.0重量％含む成熟種子を産生し、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）を1％未満含む、油糧種子植物または油糧種子植物の部分。
【請求項３１】
少なくとも1つのPUFAが、少なくとも20個の炭素および5つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項３２】
少なくとも1つのPUFAが、以下からなる群より選択される、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分：DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、ARA（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（C20:4、n-6））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））およびEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3）。
【請求項３３】
少なくとも1つのPUFAが、以下からなる群より選択される、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分：DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））およびEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3）。
【請求項３４】
少なくとも1つのPUFAが、以下からなる群より選択される、請求項12〜28のいずれか一項記載の植物または植物の部分：DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、ARA（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（C20:4、n-6））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））、EPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3）、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；およびジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）。
【請求項３５】
少なくとも1つのPUFAがDHAである、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項３６】
植物によって産生されるEPA：DHA比が1：1未満である、請求項35記載の植物または植物の部分。
【請求項３７】
少なくとも1つのPUFAがEPAである、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項３８】
少なくとも1つのPUFAがDHAおよびDPAn-6である、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項３９】
少なくとも1つのPUFAがEPAおよびDHAである、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４０】
少なくとも1つのPUFAがARAおよびDHAである、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４１】
少なくとも1つのPUFAがARAおよびEPAである、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４２】
植物が油糧種子植物であり、植物の部分が成熟油糧種子である、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４３】
植物が作物植物である、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４４】
植物が双子葉植物である、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４５】
植物が単子葉植物である、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分。
【請求項４６】
植物が以下からなる群より選択される、請求項1〜30のいずれか一項記載の植物または植物の部分：キャノーラ、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコ。
【請求項４７】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））およびDPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6）を含み、DPAn-6のDHAに対する比が1：1であるかまたは1：1を上回る、植物または植物の部分。
【請求項４８】
植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のすべてのPUFAを合計で5重量％未満含む、請求項47記載の植物または植物の部分：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【請求項４９】
植物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を生成するPUFA PKS系によって遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量の該少なくとも1つのPUFAを含み、PUFA PKS系が以下を含む、植物または植物の部分：
a）2つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン；
b）8つまたは9つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；
c）2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；
d）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；
e）1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン；
f）2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；
g）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；
h）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；および
i）1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）。
【請求項５０】
請求項1〜49のいずれか一項記載の植物または植物の部分から得られた種子。
【請求項５１】
請求項50記載の種子を含む食品。
【請求項５２】
請求項1〜49のいずれか一項記載の植物の種子から得られた油。
【請求項５３】
図2または図3に示された脂肪酸プロフィールを含む油。
【請求項５４】
請求項52記載の油と別の油とを含む油混合物。
【請求項５５】
前記別の油が微生物油である、請求項54記載の油混合物。
【請求項５６】
前記別の油が魚油である、請求項54記載の油混合物。
【請求項５７】
以下の脂肪酸：DHA（C22:6n-3）、DPAn-6（C22:5n-6）、オレイン酸（C18:1）、リノレン酸（C18:3）、リノール酸（C18:2）、C16:0、C18.0、C20:0、C20:1n-9、C20:2n-6、C22:1n-9を含む油であって、以下の任意の脂肪酸を0.5％未満含む油：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【請求項５８】
少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、油の総脂肪酸プロフィールが、以下のすべてのPUFAを合計で5％未満含む、植物油：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【請求項５９】
検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））およびDPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6）を含み、DPAn-6のDHAに対する比が1：1であるかまたは1：1を上回る、植物油。
【請求項６０】
請求項52〜59のいずれか一項記載の油を含む食品。
【請求項６１】
請求項50記載の種子をさらに含む、請求項60記載の食品。
【請求項６２】
請求項52〜59のいずれか一項記載の油を含む医薬生成物。
【請求項６３】
請求項50記載の種子から油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法。
【請求項６４】
請求項1〜49のいずれか一項記載の植物または植物の部分から油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法。
【請求項６５】
少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用生成物を個体に対して提供するための方法であって、個体に対して、請求項1〜49のいずれか一項記載の植物もしくは植物の部分、請求項50記載の種子、請求項52〜59のいずれか一項記載の油、請求項51、60もしくは61のいずれか一項記載の食品、または請求項62記載の医薬生成物を提供する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、多価不飽和脂肪酸（PUFA）の産生のためのPKS様の系（PKS-like system）を発現するように遺伝的に改変された、油糧植物を含む植物におけるPUFAの産生（PUFA PKS系）、ならびに油糧種子、油、およびこの系によって生成されるそのような油を含む産物に関する。その植物によって産生される油は、PUFA PKS系によって生成される少なくとも1つのPUFAを含み、かつ、標準的な脂肪酸経路におけるFAS系の生成物の修飾によって生成される脂肪酸生成物である、より短鎖かつより不飽和度の低い混合性PUFAを含まない。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリケチドシンターゼ（PKS）系は、脂肪酸シンターゼ（FAS）系と関係のある酵素複合体として当技術分野で一般的に知られているが、これは往々にして、典型的には脂肪酸とほとんど類似性を示さない特化した産物を産生するように高度に改変されている。しかし、現在では、本明細書においてPUFA PKS系またはPUFAシンターゼ系とも呼ばれるPKS様の系は、アセチル-CoAおよびマロニル-CoAから多価不飽和脂肪酸（PUFA）を合成することのできる海洋細菌およびある種の真核生物に存在することが示されている。シュワネラ属（Shewanella）および別の海洋細菌であるビブリオ-マリナス（Vibrio marinus）におけるPUFA合成のためのPUFA PKS経路は、米国特許第6,140,486号（特許文献1）に詳細に記載されている。真核生物ヤブレツボカビ科（Thraustochytrid）のシゾキトリウム属（Schizochytrium）におけるPUFA合成のためのPUFA PKS経路は、米国特許第6,566,583号（特許文献2）に詳細に記載されている。シゾキトリウム属におけるPUFA PKS系のさらなる記載およびヤブレツボカビ属（Thraustochytrium）におけるPUFA PKS系の同定を含め、ヤブレツボカビ目（Thraustochytriales）のメンバーなどの真核生物におけるPUFA合成のためのPUFA PKS経路は、これらの系の使用法に関する詳細を含めて、2002年12月19日に公開された米国特許出願公開第20020194641号（特許文献3）、および2006年12月21日に公開されたPCT公開番号WO 2006/135866（特許文献4）に詳細に記載されている。2004年11月25日に公開された米国特許出願公開第20040235127号（特許文献5）は、ヤブレツボカビ属におけるPUFA PKS系の詳細な構造的記述、ならびにそのような系を用いたエイコサペンタエン酸（C20:5、ω-3）（EPA）および他のPUFAの生産に関するさらなる詳細を開示している。2005年5月12日に公開された米国特許出願公開第20050100995号（特許文献6）は、シュワネラ-オレヤナ（Shewanella olleyana）およびシュワネラ-ジャポニカ（Shewanella japonica）におけるPUFA PKS系の構造的および機能的な記述、ならびにそのような系の使用法を開示している。これらの出願はまた、微生物および植物を含む生物の遺伝的改変も、PUFA PKS経路を含む遺伝子ならびにそのような生物によるPUFAの産生とともに開示している。さらに、PCT特許公報番号WO 05/097982（特許文献7）はウルケニア属（Ulkenia）におけるPUFA PKS系を開示しており、米国特許出願公開第20050014231号（特許文献8）はスラウストキトリウム-アウレウム（Thraustochytrium aureum）由来のPUFA PKS遺伝子およびタンパク質を開示している。以上に特定した出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、栄養学的、薬学的、産業的および他の目的に有用であると考えられている。天然供給源から、および化学合成からのPUFAの現在の供給は、商業的需要に対して十分ではない。油糧種子作物に由来する植物油は比較的安価であり、魚油に付随する汚染の問題がない。しかし、商業的に開発された植物油中に見いだされるPUFAは、典型的には、リノール酸（Δ9位およびΔ12位に2個の二重結合を有する18個の炭素‐18:2 Δ9,12）およびリノレン酸（18:3 Δ9,12,15）に限定される。PUFA合成のための従来の経路（すなわち、「標準的」経路または「古典的」経路）では、中鎖長の飽和脂肪酸（脂肪酸シンターゼ（FAS）系の生成物）が、一連の伸長反応および不飽和化反応によって修飾される。伸長反応の基質は脂肪族アシル-CoA（伸長される脂肪酸鎖）およびマロニル-CoA（各伸長反応のたびに付加される2個の炭素の源）である。エロンガーゼ反応の生成物は、直鎖状鎖に2つの炭素が付加された脂肪族アシル-CoAである。デサチュラーゼは、酸素依存的反応における2つの水素の抽出により、既存の脂肪酸鎖の中にシス二重結合を作り出す。デサチュラーゼの基質は、PL（例えば、ホスフォチジルコリン）のグリセロール骨格に対してエステル化される、アシル-CoA（ある種の動物において）または脂肪酸である。
【０００４】
したがって、リノレン酸およびリノレン酸から、より飽和度が高くかつ長鎖のPUFAを生成させる脂肪酸合成のためには、多数の別個のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素が必要であるため、エイコサペンタエン酸（EPA）およびドコサヘキサ塩酸（DHA）などのPUFAの発現のために植物宿主細胞を操作するには、合成を達成するために、いくつかの別個の酵素の発現が必要になると思われる。さらに、このようなPUFAの利用可能な量での産生のためには、さらなる操作の取り組みも必要と思われる。このため、商業的な量のPUFAの生産を可能にするために、これらの脂肪酸を天然に産生する種から（例えば、PUFA PKS系から）PUFA生合成に関与する遺伝材料を入手すること、および、操作しうる異種の系において、単離された材料を単独で、または組み合わせて発現させることは興味深い。
【０００５】
内因的に産生される脂肪酸の改変によって油糧種子作物植物にPUFAを産生させるために多くの取り組みがなされてきた。脂肪酸エロンガーゼおよびデサチュラーゼに対するさまざまな個々の遺伝子を用いたこれらの植物の遺伝的改変により、EPAなどのPUFAを有意なレベルで含むものの、より短鎖かつ不飽和度の低い混合性PUFAをも有意なレベルで含む葉または種子が作製されている（Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)（非特許文献1）；PCT公開番号WO 04/071467（特許文献9）；Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)（非特許文献2））；Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64:387-393（非特許文献3）；Robert et al., Functional Plant Biology (2005) 32:473-479（非特許文献4）；または米国特許出願公開第2004/0172682号（特許文献10）。
【０００６】
したがって、油糧種子植物において所望のPUFAに富む多量の脂質（例えば、トリアシルグリセロール（TAG）およびリン脂質（PL））を効率的かつ効果的に産生させるための方法に対しては、当技術分野における需要が依然としてある。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第6,140,486号
【特許文献２】米国特許第6,566,583号
【特許文献３】米国特許出願公開第20020194641号
【特許文献４】WO 2006/135866
【特許文献５】米国特許出願公開第20040235127号
【特許文献６】米国特許出願公開第20050100995号
【特許文献７】WO 05/097982
【特許文献８】米国特許出願公開第20050014231号
【特許文献９】WO 04/071467
【特許文献１０】米国特許出願公開第2004/0172682号
【非特許文献１】Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)
【非特許文献２】Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)
【非特許文献３】Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64:387-393
【非特許文献４】Robert et al., Functional Plant Biology (2005) 32:473-479
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明の1つの態様は、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のPUFAをすべての合計で5％未満含む、植物または植物の部分に関する：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【０００９】
本発明のさらにもう1つの態様は、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のPUFAのそれぞれを1％未満含む、植物または植物の部分に関する：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【００１０】
本発明のもう1つの態様は、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）およびジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）を2％未満含む、植物または植物の部分に関する。この態様の1つの局面において、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールは、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）およびジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）を1重量％未満含む。
【００１１】
本発明のさらにもう1つの態様は、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）を1％未満含む、植物または植物の部分に関する。この態様の1つの局面において、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールは、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）を0.5重量％未満含む。
【００１２】
本発明のもう1つの態様は、植物が、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を生成する酵素を発現するように遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、前記少なくとも1つのPUFAを少なくとも約0.5重量％含み、前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記酵素によって生成される総脂肪酸が、前記植物によって産生される総脂肪酸の約10％未満を構成する、植物または植物の部分に関する。この態様の1つの局面において、前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記酵素によって生成される総脂肪酸は、前記植物によって産生される総脂肪酸の5重量％未満を構成する。この態様のもう1つの局面において、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAからなる脂肪酸は、前記植物によって産生される総脂肪酸の5重量％未満を構成する。この態様のもう1つの局面において、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）は、前記植物によって産生される総脂肪酸の1重量％未満を構成する。
【００１３】
本発明の上記の態様の任意のものの1つの局面において、植物はデサチュラーゼまたはエロンガーゼ酵素、特に、FASをベースにした、従来のまたは標準的なPUFA生成の経路に用いられるデサチュラーゼまたはエロンガーゼ酵素を発現するようには遺伝的に改変されていない。
【００１４】
本発明のもう1つの態様は、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を産生する真核生物由来のPUFA PKS系によって遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量の前記少なくとも1つのPUFAを含む、植物または植物の部分に関する。この態様の1つの局面において、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールは、前記少なくとも1つのPUFAを少なくとも0.5重量％含む、この態様のもう1つの局面において、前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記PUFA PKS系によって生成される脂肪酸は、前記植物によって産生される総脂肪酸の約10重量％未満を構成する。この態様のもう1つの局面において、前記少なくとも1つのPUFA以外の、前記酵素によって生成される総脂肪酸は、前記植物によって産生される総脂肪酸の約5重量％未満を構成する。
【００１５】
上記の態様の1つの局面において、PUFA PKS系は以下を含む：（a）少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）少なくとも4つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；（c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。
【００１６】
上記の態様のもう1つの局面において、PUFA PKS系は以下を含む：（a）2つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン；（b）8つまたは9つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；（c）2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；および（h）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。
【００１７】
上記のPUFA PKS系は、1つの局面において、ヤブレツボカビ目（Thraustochytriales）の微生物由来である。1つの局面において、PUFA PKS系はシゾキトリウム属（Schizochytrium）由来である。1つの局面において、PUFA PKS系はヤブレツボカビ属（Thraustochytrium）由来である。1つの局面において、PUFA PKS系は、以下からなる群より選択される微生物由来である：シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888、ヤブレツボカビ属23B ATCC番号20892および前記微生物のいずれかの変異株。1つの局面において、PUFA PKS系をコードする核酸配列は、以下からなる群より選択される微生物由来のPUFA PKS系をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする：シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888、ヤブレツボカビ属23B ATCC番号20892および前記微生物のいずれかの変異株。1つの局面において、PUFA PKS系をコードする核酸配列は、シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888またはその変異株由来のPUFA PKS系をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。1つの局面において、PUFA PKS系は、ヤブレツボカビ目の微生物由来のPUFA PKS系からの少なくとも1つのドメインを含む。もう1つの局面において、PUFA PKS系は、以下から選択される、任意の1つまたは複数の核酸配列またはアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO：1〜32または38〜68。
【００１８】
上記の態様の任意のものにおいて、1つの局面においては、PUFA PKS系はさらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）を含む。
【００１９】
本発明のさらにもう1つの態様は、植物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を生成するPUFA PKS系によって遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量の前記少なくとも1つのPUFAを含み、PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを生成する細菌PUFA PKS系であり、細菌PUFA PKS系が以下を含む、植物または植物の部分に関する：（a）少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン；（b）少なくとも6つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；（c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）少なくとも1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；および（i）少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）ドメイン。この態様の1つの局面において、PUFA PKS系は、以下からなる群より選択される微生物由来である：シュワネラ-オレヤナ（Shewanella olleyana）Australian Collection of Antarctic Microorganisms（ACAM）株番号644；シュワネラ-ジャポニカ（Shewanella japonica）ATCC株番号BAA-316および前記微生物のいずれかの変異株。1つの局面において、PUFA PKS系をコードする核酸配列は、以下からなる群より選択される微生物由来のPUFA PKS系をコードする遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする：シュワネラ-オレヤナAustralian Collection of Antarctic Microorganisms（ACAM）株番号644；シュワネラ-ジャポニカATCC株番号BAA-316および前記微生物のいずれかの変異株。もう1つの局面において、PUFA PKS系は、以下から選択される任意の1つまたは複数の核酸配列またはアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO：69〜80。
【００２０】
本発明のもう1つの態様は、種子の総脂肪酸プロフィールが少なくとも20個の炭素原子および少なくとも4つの炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸を少なくとも1.0重量％含む成熟種子を産生し、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、以下のPUFAをすべての合計で5％未満含む、油糧種子植物または油糧種子植物の部分に関する：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【００２１】
本発明のもう1つの態様は、種子の総脂肪酸プロフィールが少なくとも20個の炭素原子および少なくとも4つの炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸を少なくとも1.0重量％含む成熟種子を産生し、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）を1％未満含む、油糧種子植物または油糧種子植物の部分に関する。
【００２２】
本発明の上記の態様の任意のものにおいて、1つの局面において、少なくとも1つのPUFAは、少なくとも20個の炭素および5つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAは、以下から選択される：DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、ARA（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（C20:4、n-6））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））およびEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3）。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAは、以下から選択される：DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））およびEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3）。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAは、以下から選択される：DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、ARA（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（C20:4、n-6））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））、EPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3）、γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；およびジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAはDHAである。もう1つの局面において、標的PUFAがDHAである場合に、植物によって産生されるEPA：DHA比は1：1未満である。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAはEPAである。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAはDHAおよびDPAn-6である。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAはEPAおよびDHAである。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAはARAおよびDHAである。もう1つの局面において、少なくとも1つのPUFAはARAおよびEPAである。
【００２３】
本発明の上記の態様の任意のものの1つの局面において、植物は油糧種子植物であり、植物の部分は成熟油糧種子である。1つの局面において、植物は作物植物である。もう1つの局面において、植物は双子葉植物である。もう1つの局面において、植物は単子葉植物である。もう1つの局面において、植物は以下から選択される：キャノーラ、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコ。
【００２４】
本発明のさらにもう1つの態様は、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））およびDPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6）を含み、DPAn-6とDHAとの比が1：1であるか1：1を上回る、植物または植物の部分に関する。この態様の1つの局面において、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールは、以下のPUFAをすべての合計で5重量％未満含む：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【００２５】
本発明のもう1つの態様は、植物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を生成するPUFA PKS系によって遺伝的に改変されており、植物または植物の部分における総脂肪酸プロフィールが、検出可能な量の前記少なくとも1つのPUFAを含み、PUFA PKS系が以下を含む、植物または植物の部分に関する：（a）2つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン；（b）8つまたは9つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；（c）2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（h）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；および（i）1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）。
【００２６】
本発明のもう1つの態様は、以上に特定した植物または植物の部分から得られる種子に関する。本発明のさらにもう1つの態様は、そのような種子を含む食品に関する。
【００２７】
本発明のさらにもう1つの態様は、上記の植物のいずれかの種子から得られる油に関する。
【００２８】
本発明のもう1つの態様は、図2または図3に示された脂肪酸プロフィールを含む油を含む。
【００２９】
本発明のもう1つの態様は、本明細書に記載した植物によって産生される油と別の油とを含む油混合物を含む。1つの局面において、別の油は微生物油であり、もう1つの局面において、別の油は魚油である。
【００３０】
本発明のさらにもう1つの態様は、以下の脂肪酸：DHA（C22:6n-3）、DPAn-6（C22:5n-6）、オレイン酸（C18:1）、リノレン酸（C18:3）、リノール酸（C18:2）、C16:0、C18.0、C20:0、C20:1n-9、C20:2n-6、C22:1n-9を含む油であって；以下の脂肪酸のいずれかを0.5％未満含む油に関する：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【００３１】
本発明のもう1つの態様は、少なくとも20個の炭素および4つまたはそれ以上の炭素-炭素二重結合を有する少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を少なくとも約0.5重量％含み、油の総脂肪酸プロフィールが、以下のPUFAをすべての合計で5％未満含む植物油に関する：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA。
【００３２】
本発明のもう1つの態様は、検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））およびDPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6）を含み、DPAn-6とDHAとの比が1：1であるか1：1を上回る、植物油に関する。
【００３３】
本発明のさらにもう1つの態様は、上記の油のいずれかを含む食品に関する。1つの態様において、食品はさらに、上記の種子のいずれかを含む。
【００３４】
本発明のもう1つの態様は、上記の油のいずれかを含む医薬生成物に関する。
【００３５】
本発明のもう1つの態様は、上記の種子のいずれかから油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法に関する。
【００３６】
本発明のさらにもう1つの態様は、上記の植物または植物の部分のいずれかから油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法に関する。
【００３７】
本発明のもう1つの態様は、少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用生成物を個体に対して提供するための方法であって、個体に対して、上記の植物または植物の部分のいずれか、上記の種子のいずれか、上記の油のいずれか、上記の食品のいずれか、および／または上記の医薬生成物のいずれかを提供する段階を含む方法に関する。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は一般に、PUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変された油糧種子植物においてPUFAを産生させるための方法、ならびに油糧種子、油、およびこの系によって生成されるそのような油を含む産物に関する。その植物によって産生される油は、PUFA PKS系によって生成される少なくとも1つのPUFAを含み、かつ、標準的な脂肪酸経路におけるFAS系の生成物の修飾によって生成される脂肪酸生成物である、より短鎖かつより不飽和度の低い混合性PUFAを含まない。
【００３９】
PUFAシンターゼ（すなわち、PUFA PKS系）ファミリーの酵素の基本的なドメイン構造および配列上の特徴は記載されている（背景の項および以下を参照）。PUFAシンターゼ酵素がさまざまなPUFA（例えば、EPA、DHAおよびDPA n-6）のデノボ合成を行いうること、および、そのような生成物が宿主生物のリン脂質（PL）中に、場合によっては中性脂質（例えば、トリアシルグリセロール‐TAG）中に蓄積しうることは実証されている。さらに、植物を含む宿主生物を遺伝的に改変するためのこれらのPUFAシンターゼ系の使用も記載されている。本明細書に提示したデータは、シゾキトリウム属由来のPUFA PKS系、およびPUFA PKSのアクセサリー酵素である4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする遺伝子を発現するように遺伝的に改変された植物におけるPUFAの産生を示している。これらの植物によって産生される油は、PUFA PKS遺伝子の由来となったシゾキトリウム属によって産生される主たるPUFA（主PUFA）である、DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））およびDPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6）の両方を有意な量で含む。意義深いこととして、本発明者は、本明細書において、PUFA PKS経路を用いてPUFAを産生する植物からの油が、上記の「標準的」経路によって同じPUFAを産生するように遺伝的に操作された植物とは異なる脂肪酸プロフィールを有することを示す。詳細には、PUFA PKS経路によって特定のPUFAを産生するように遺伝的に操作された植物からの油は、標準的PUFA合成経路の使用の結果として産生される油の中に蓄積するさまざまな中間生成物および副生成物を実質的に含まない。この特徴については以下に詳細に考察する。
【００４０】
より詳細には、「標準的」経路によって植物において長鎖PUFAを産生させるための取り組みはすべて、この合成経路によって要求される同じ基本的なアプローチを採用している。これらの取り組みは、さまざまなエロンガーゼおよびデサチュラーゼをコードする遺伝子の導入による、植物の内因性の脂肪酸の改変に依拠している。植物は典型的には、そのプラスチド内のII型脂肪酸シンターゼ（FAS）を介して、18炭素型の脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸）を産生する。多くの場合は、その脂肪酸がACPと結合する時に単一の二重結合が形成され、続いて、アシル-ACPチオエステラーゼの作用によってオレイン酸（18:1）がACPから切断される。遊離脂肪酸はプラスチドから輸出されてアシル-CoAへと変換される。18:1はエステル化されてホスファチジルコリン（PC）となることができ、最大でさらに2つのシス二重結合が付加されうる。新たに導入されたエロンガーゼは、アシル-CoAプール中の基質を利用して、炭素2個ずつの増分で炭素を付加することができる。新たに導入されたデサチュラーゼは、エステル化されてPCとなった脂肪酸、またはアシル-CoAプール中のもののいずれかを、酵素の源に応じて利用する。しかし、長鎖PUFA生成に関するこの方式の1つの帰結は、経路において中間体または副生成物が蓄積し、標的長鎖PUFAではなくそれらが往々にして植物油における新規脂肪酸の大半に相当することである。
【００４１】
例えば、上記のような標準的または古典的な経路を用いて、標的PUFA生成物（すなわち、標準的な経路を用いることによって、生成のための標的とされる、生成させようと試みられる、または生成させようと企てられられるPUFA生成物）がDHAまたはEPA（例えば、FAS系の生成物からDHAまたはEPAを生成すると考えられる、エロンガーゼおよびデサチュラーゼを用いて生成される）である場合は、DHAまたはEPAに加えて種々の中間生成物および副生成物が生成させると考えられ、これらの中間体または副生成物は往々にして、経路によって生成される生成物の大半に相当し、産生生物における脂質中に少なくとも有意な量で存在すると考えられる。そのような中間体および副生成物には、標的または主PUFAよりも少数の炭素および／または二重結合を有する脂肪酸が非限定的に含まれ、標的または主PUFAと同じ数の炭素を有しうるものの特異な位置に二重結合を有する特異な脂肪酸副生成物も含まれうる。この成り行きは、標準的経路を用いたEPAの産生の1つの例で例証されている（例えば、米国特許出願公開2004／0172682号を参照）。具体的には、経路の標的PUFAはEPA（すなわち、EPAを生成するFAS系の生成物に対して特異的に作用するエロンガーゼおよびデサチュラーゼの使用に起因する）であるものの、系によって生成される油には、以下を含む種々の中間体および副生成物が含まれる：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）およびさまざまな他の中間体または副生成物、例えば、20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ11）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）；20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）など。系の中間体には、遺伝的改変の標的でない長鎖PUFAも含まれうる（例えば、DHAを生成するための標準的経路の酵素系は、実際には、例えば米国特許出願公開2004／0172682号に例証されているように、DHAよりも中間生成物としてのEPAをより多く生成する可能性があり、この点のさらなる考察については以下を参照）。
【００４２】
それに対して、本発明のPUFA PKSシンターゼは、FAS系の脂肪酸生成物を利用しない。その代わりに、それは最終的なPUFA生成物（主PUFA生成物）を、FASおよびエロンガーゼ（マロニル-CoA）によって利用されるのと同じ低分子量の前駆体分子から生成する。したがって、合成サイクルにおける中間体は有意な量では放出されず、PUFA生成物（本明細書では主PUFA生成物とも称される）は脂質のリン脂質（PL）およびトリアシルグリセロール（TAG）画分に効率的に移行する。実際に、PUFA PKS系は2つの標的または主PUFA生成物を生成するが（例えば、シゾキトリウム属由来のPUFA PKS系はDHAおよびDPA n-6の両方を主生成物として生成する）、DPAはDHAを生成するための経路における中間体ではない。そうではなくて、それぞれが同じPUFA PKS系における別個の生成物である。このため、PUFA PKS遺伝子は、植物などの異種宿主においてPUFA、特に長鎖PUFA（LCPUFA）を含む油を産生させる優れた手段であり、この場合に油は「標準的」なPUFA経路（以下に定義する）によって生成される油に混入する副生成物も中間体も実質的に含まない（同じく以下に定義する）。
【００４３】
したがって、本明細書に記載したような植物の遺伝子操作を介して、所望の鎖長および所望の数の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を、ひいては、そのような植物から得られる、これらのPUFAを含む油糧種子および油（すなわち、そのような植物の油糧種子から得られる）を生産することは、本発明の1つの目的である。本発明によって生産しうるPUFAの例には、DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、ARA（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（C20:4、n-6））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））およびEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3））が非限定的に含まれる。本発明は、PUFAを生成するポリケチドシンターゼ様の系の使用を通じての、本発明者らによる遺伝的に改変された植物の開発により、1つまたは複数の所望の（標的または主）PUFAに富む商業的に価値のある脂質の生産を可能にする。
【００４４】
本発明によれば、「主PUFA」、「標的PUFA」、「意図したPUFA」または「所望のPUFA」に対する言及は、PUFAを生産するために用いられる酵素経路の意図した、または標的とする生成物である特定の1つまたは複数のPUFAのことを指す。例えば、FAS系の生成物を改変するためにエロンガーゼおよびデサチュラーゼを用いる場合には、一緒に用いた場合に標的または所望のPUFA（例えば、DHAまたはEPA）を生成する、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの特定の組み合わせを選択することができる。以上に考察したように、標準的経路によって生成されるそのような標的または所望のPUFAは、その系によって生成される生成物の大半を実際には占める中間体および副生成物の形成のため、系によって生成される総脂肪酸に占めるパーセンテージとしてのPUFAの量という点では、実際には「主」PUFAではない。しかし、系において用いられるエロンガーゼまたはデサチュラーゼによって生成される標的または意図したPUFA生成物に言及する場合であっても、「主PUFA」という用語を用いてもよい。
【００４５】
本発明において好ましいようにPUFA PKS系を用いる場合、特定の生物に由来する所定のPUFA PKS系は、特定の生物由来のPUFA PKS系の選択が指定の標的または主PUFAの生成をもたらすと考えられるように、特定のPUFAを生成すると考えられる。例えば、シゾキトリウム属由来のPUFA PKS系の使用は、標的または主PUFAとしてのDHAおよびDPAn-6の生成をもたらすと考えられる。一方、さまざまなシュワネラ属の種由来のPUFA PKS系の使用は、標的または主PUFAとしてのEPAの生成をもたらすと考えられる。主または標的PUFAの比は、特定のPUFA PKS系の選択、およびそれが発現される具体的な条件に対してその系がどのように応答するかに応じて異なりうることを指摘しておく。例えば、ヤブレツボカビ属23B（ATCC番号20892）由来のPUFA PKS系も、標的または主PUFAとしてのDHAおよびDPAn-6の生成をもたらすと考えられる；しかし、ヤブレツボカビ属23Bの場合には、DHAとDPAn-6との比は約10：1であり（約8：1〜約40：1の範囲にわたりうる）、一方、シゾキトリウム属ではこの比は典型的には約2.5：1である。したがって、ヤブレツボカビ属のPUFA PKS系またはタンパク質もしくはドメインの使用は、標的PUFAがたとえ同じであっても、シゾキトリウム属と比較して、生物によって産生されるPUFAの比を変化させることができる。加えて、以下で考察するように、異なるPUFA PKS系またはPUFA PKSおよびPKS系からのタンパク質およびドメインを混合することによって所定のPUFA PKS系を改変することもでき、または標的PUFA生成物および／もしくは比を変化させるために所定のPUFA PKS系のドメインまたはタンパク質を改変することもできる。
【００４６】
本発明によれば、PUFAを生成する酵素系の「中間体生成物」または「副生成物」に対する言及は、系の標的または主PUFAの生成の結果として酵素系によって生成されるが、主または標的PUFAではない任意の生成物、特に脂肪酸生成物のことを指す。1つの態様において、中間体および副生成物には、野生型植物によって、または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物によって天然に産生されるが、野生型植物によって、または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物によって産生されるレベルと比較して、遺伝的改変の結果としてより上回るレベルで産生されることからここでは中間体または副生成物として分類される、標的でない脂肪酸が含まれうる。以上に考察したように、中間体および副生成物はPUFA合成のための標準的経路において特に意味が大きく、PUFA PKS経路においては実質的に意味が小さい。1つの酵素系の主または標的PUFAは、主または標的生成物が異なるPUFAである異なる酵素系の中間体でありうることを指摘しておくが、PUFA PKS系は中間体の生成を実質的に回避するため、これは特にPUFA生成の標準的経路の生成物について言えることである。例えば、EPAを生成するための標準的経路を用いる場合には、GLA、DGLAおよびSDAなどの脂肪酸が中間体生成物として有意な量で生成される（例えば、米国特許出願公開2004/0172682号はこの点を例証している）。同様に、米国特許出願公開2004/0172682号によっても例証されているように、DHAを生成するための標準的経路を用いる場合には、上述した脂肪鎖に加えて、ETAおよびEPA（上記の第1の例における標的PUFAであることに注目）が有意な量で生成され、実際に、総脂肪酸生成物に占める比率として標的PUFAそれ自体よりも有意に多い量で存在しうる。この後者の点は米国特許出願公開2004/0172682号でも示されており、そこでは、標準的経路によってDHAを産生するように操作された植物が、総脂肪酸に占めるパーセンテージとして、標的としたDHAよりも多くのEPAを産生した。
【００４７】
本明細書で用いる場合、PUFA PKS系（これはPUFAシンターゼ系またはPUFAシンターゼと称してもよい）は一般に、以下の識別的な特徴を有する：（1）それはPUFA、特に長鎖PUFAを、系の天然生成物として生成する；および（2）それは、選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復的処理と非反復的処理との両方を遂行する複合体として構築される複数の多機能性タンパク質を含む。加えて、PUFAシンターゼ酵素に存在するACPドメインは、補因子（4-ホスホパンテテイン）の結合による活性化も必要とする。この補因子の結合はホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）によって行われる。宿主生物の内因性PPTアーゼがPUFAシンターゼのACPドメインを活性化することができなければ、その機能を遂行しうるPPTアーゼを与えることが必要である。本発明者らは、ネンジュモ属のHetI酵素が、PUFAシンターゼのACPドメインを活性化するための例示的でかつ適切なPPTアーゼであるとして同定している。PUFA PKS系またはPUFAシンターゼに対する言及は、生物においてPUFAを産生するように複合体中で働く遺伝子およびそれらにコードされる産物のすべてをまとめて指す。したがって、PUFA PKS系は具体的には、天然生成物がPUFAであるPKS系のことを指す。
【００４８】
より具体的には、本明細書において言及されるPUFA PKS系は、多価不飽和脂肪酸（PUFA）、特に長鎖PUFA（LCPUFA）を生成物として生成する。例えば、PUFA PKS系を内因的に（天然に）含む生物は、この系を用いてPUFAを作り出す。本発明によれば、PUFAとは、炭素鎖の長さが少なくとも16個の炭素、より好ましくは少なくとも18個の炭素、より好ましくは少なくとも20個の炭素、より好ましくは22個またはそれ以上の炭素であって、少なくとも3つまたはそれ以上の二重結合、好ましくは4つまたはそれ以上、より好ましくは5つまたはそれ以上、さらにより好ましくは6つまたはそれ以上の二重結合を有し、すべての二重結合がシス配置にある脂肪酸のことである。本明細書における長鎖多価不飽和脂肪酸（LCPUFA）に対する言及は、より詳細には、炭素鎖の長さが18およびそれ以上、好ましくは炭素鎖の長さが20およびそれ以上であって、3つまたはそれ以上の二重結合を含む脂肪酸のことを指す。ω-6系列のLCPUFAには以下が含まれる：γ-リノレン酸（C18:3）、ジ-ホモ-γ-リノレン酸（C20:3n-6）、アラキドン酸（C20:4n-6）、アドレン酸（adrenic acid）（ドコサテトラエン酸またはDTAとも呼ばれる）（C22:4n-6）およびドコサペンタエン酸（C22:5n-6）が含まれる。ω-3系列のLCPUFAには以下が含まれる：α-リノレン酸（C18:3）、エイコサトリエン酸（C20:3n-3）、エイコサテトラエン酸（C20:4n-3）、エイコサペンタエン酸（C20:5n-3）、ドコサペンタエン酸（C22:5n-3）およびドコサヘキサエン酸（C22:6n-3）。LCPUFAにはまた、C28:8（n-3）を非限定的に含む、22個を上回る炭素および4つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸も含まれうる。
【００４９】
本発明によるPUFA PKS系はまた、選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復的処理と非反復的処理との両方を遂行する複合体として構築される複数の多機能性タンパク質（さらに単機能性タンパク質が、特に海洋細菌由来のPUFA PKS系に関して含まれうる）も含む。これらのタンパク質は、本明細書において、コアPUFA PKS酵素複合体またはコアPUFA PKS系と称することもできる。これらのタンパク質の内部に含まれるドメインおよびモチーフの一般的な機能は当技術分野で個々に公知であり、海洋細菌および真核生物由来のさまざまなPUFA PKS系に関して詳細に記載されている（例えば、米国特許第6,140,486号；米国特許第6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995号およびPCT公開第WO 2006/135866号を参照）。これらのドメインは、単一のタンパク質として（すなわち、ドメインおよびタンパク質は同義である）、または上述したように単一のタンパク質の中の2つもしくはそれ以上の（複数の）ドメインの1つとして見いだされる。
【００５０】
海洋細菌およびヤブレツボカビ属のメンバー由来のさまざまなPUFA PKS系ドメインの構成、ならびにそのようなPUFA PKS系を含む遺伝子およびタンパク質の構造的および機能的な特徴は、詳細に記載されている（例えば、米国特許第6,140,486号；米国特許6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995号およびPCT公開第WO 2006/135866を参照）。
【００５１】
本発明において有用な、PUFA PKS系およびそれらのタンパク質またはドメインには、細菌性および非細菌性PUFA PKS系の両方が含まれる。非細菌性PUFA PKS系とは、真核生物または古細菌といった細菌ではない生物由来の、またはそれから派生したPUFA PKS系のことである。真核生物は細胞の分化の程度に基づいて原核生物とは区別され、真核生物の方がより高度に分化している。一般に、原核生物は核膜を持たず、細胞分裂の間に有糸分裂を示さず、染色体を1つだけ有し、その細胞質中に70Sリボソームを含み、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、リソソームおよびゴルジ体を有さず、鞭毛は存在する場合は単一の細線維で構成される。これに対して、真核生物は、核膜を有し、細胞分裂の間に有糸分裂を示し、多くの染色体を有し、その細胞質中に80Sリボソームを含み、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体（藻類において）、リソソームおよびゴルジ体を含み、鞭毛は存在する場合は多くの細線維で構成される。一般に、細菌は原核生物であり、一方、藻類、真菌類、原生生物、原生動物および高等植物は真核生物である。本発明によれば、細菌PUFA PKSの機能性ドメインを有する非細菌性PUFA PKSの機能性ドメイン、さらには他のPKS系（I型反復またはモジュラー、II型またはIII型）またはFAS系由来のPKS機能性ドメインまたはタンパク質を組み入れた、遺伝的に改変された植物を作製することができる。
【００５２】
好ましくは、本発明のPUFA PKS系は、典型的には3つまたはそれ以上のタンパク質上に含まれる、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む：（a）少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）複数のアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン（例えば、少なくとも1つ〜4つの、好ましくは少なくとも5つのACPドメイン、いくつかの態様においては最大で6つ、7つ、8つ、9つ、10個または10個を上回るACPドメイン）；（c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。1つの態様において、本発明によるPUFA PKS系はまた、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域も含む。
【００５３】
1つの好ましい態様において、PUFA PKS系は、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む：（a）少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）少なくとも5つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；（c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；および（h）少なくとも1つのマロニルCoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。1つの態様において、本発明によるPUFA PKS系はまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域またはドメインも含む。これらのドメインのそれぞれの構造的および機能的な特徴は、米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995号；およびPCT公開第WO 2006/135866号に詳細に記載されている。
【００５４】
本発明によれば、3-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）生物活性（機能）を有するドメインまたはタンパク質は、FAS（およびPKSの）伸長反応サイクルの初期段階を行う酵素として特徴づけられる。「β-ケトアシル-ACPシンターゼ」という用語は、「3-ケトアシル-ACPシンターゼ」、「β-ケトアシル-ACPシンターゼ」および「ケト-アシルACPシンターゼ」という用語、ならびに類似の派生語と互換的に用いることができる。伸長が定められたアシル基は、その酵素の活性部位にあるシステイン残基とチオエステル結合によって連結される。多段階反応において、アシル-酵素はマロニル-ACPとの縮合を受けて、-ケトアシル-ACP、CO2および遊離酵素を生成する。KSは伸長サイクルにおいて鍵となる役割を果たし、多くの系において、反応サイクルの他の酵素よりも強い基質特異性を持つことが示されている。例えば、大腸菌は3つの別個のKS酵素を有する‐それぞれが、その生物の生理機能においてそれ自体に特有の役割を持つ（Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57, 522 (1993)）。本明細書に記載の海洋細菌およびヤブレツボカビ科で記載されているPUFA-PKS系の2つのKSドメインは、一続きのPUFA生合成反応において別個の役割を有する可能性がある。酵素の1つのクラスとして、KSは詳細に特徴づけられている。多くの実証済みのKS遺伝子の配列が公知であり、その活性部位モチーフが同定され、いくつかの結晶構造が決定されている。タンパク質（またはタンパク質のドメイン）は、公知のKS配列との相同性により、酵素のKSファミリーに属すると容易に同定することができる。
【００５５】
本発明によれば、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）生物活性（機能）を有するドメインまたはタンパク質は、マロニル部分をマロニル-CoAからACPに転移させるものとして特徴づけられる。「マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ」という用語は、「マロニルアシルトランスフェラーゼ」および類似の派生語と同義的に用いることができる。活性部位モチーフ（GxSxG）に加えて、これらの酵素は、それらをMAT酵素と同定させるカギとなる位置に、RおよびQアミノ酸による拡張モチーフを有する（例えば、以下に述べるATドメインとは対照的に）。いくつかのPKS系（しかし、PUFA PKSドメインではない）において、MATドメインは、メチル-マロネートまたはエチル-マロネートをACP基に（対応するCoAエステルから）選好的に取り付け、それにより、直鎖状炭素鎖に分枝を導入する。MATドメインは、公知のMAT配列とのそれらの相同性およびそれらの拡張モチーフ構造によって認識されうる。
【００５６】
アシルキャリアータンパク質（ACP）生物活性（機能）を有するドメインまたはタンパク質は、タンパク質の共有結合した補因子に対するチオエステル結合を介して脂肪アシル鎖を成長させるための担体として機能する、小型ポリペプチド（典型的には、80個〜100個のアミノ酸の長さ）として特徴づけられる。それらは単独の単位として、またはより大きなタンパク質の内部のドメインとして存在する。ACPは、ACPの高度に保存されたセリン残基へのCoAのホスホパンテテイニル部分の転移によって、不活性のアポ型から機能性のホロ型へと変換される。アシル基は、ホスホパンテテイニル部分の遊離末端でのチオエステル結合によってACPに結合される。ACPは、放射性パンテテインによる標識化および公知のACPとの配列相同性によって同定することができる。上述したモチーフ（LGIDS*）の変形物の存在もACPの特徴的サイン（signature）である。
【００５７】
本発明によれば、3-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）生物活性（機能）とも称されるケトレダクターゼ活性を有するドメインまたはタンパク質は、3-ケトアシル型のACPのピリジン-ヌクレオチド依存的還元を触媒するものとして特徴づけられる。それはデノボ脂肪酸生合成伸長サイクルにおける最初の還元段階であり、ポリケチド生合成においてしばしば行われる反応である。「β-ケトアシル-ACPレダクターゼ」という用語は、「ケトレダクターゼ」、「3-ケトアシル-ACPレダクターゼ」、「ケト-アシルACPレダクターゼ」という用語およびその用語の類似の派生語と同義的に用いることができる。顕著な配列類似性が、エノイルACPレダクターゼ（ER）の1つのファミリー、FASの他のレダクターゼ（しかし、PUFA PKS系に存在するERファミリーではない）および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーとの間に観察される。以上に示したPUFA PKS領域のPfam解析により、そのコア領域における短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーとの相同性が明らかになっている。同じ領域のBlast解析により、コア領域における公知のKR酵素とのマッチのほか、特徴づけられた他のPUFA PKS系由来のドメインとの相同性のある拡張領域が明らかになっている。
【００５８】
本発明によれば、ドメインまたはタンパク質は以下の根拠に基づいて鎖伸長因子（CLF）と称される。CLFは当初、II型（解離した酵素）PKS系の特徴として記載され、伸長サイクルの数を決定し、それ故に最終生成物の鎖の長さの決定に役割を果たすものと仮定された。CLFアミノ酸配列はKSドメインと相同性を示す（かつ、KSタンパク質とヘテロ二量体を形成すると考えられる）が、それらは活性部位システインを欠いている。PKS系におけるCLFの役割は議論の的となっている。新たな証拠（C. Bisang et al., Nature 401, 502 (1999)）により、PKS系のプライミング（伸長させるための最初のアシル基を供給すること）における役割が示唆されている。この役割において、CLFドメインはマロネート（マロニル-ACPのような）からカルボキシル基を除去し、それによりKS活性部位に転移されうる酢酸基を形成すると考えられる。したがって、この酢酸基は、最初の伸長（縮合）反応を受けることのできる「プライミング」分子として作用する。II型CLFの相同体は、いくつかのモジュール式PKS系において「ローディング（loading）」ドメインとして同定されている。CLFの配列特徴を有するドメインは、現在同定されているすべてのPUFA PKS系に見いだされており、それぞれの場合に多ドメインタンパク質の部分として見いだされる。
【００５９】
「アシルトランスフェラーゼ」または「AT」に対する言及は、多数の別個のアシル転移反応を行うことができる酵素の一般的なクラスのことを指す。「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、「アシル・トランスフェラーゼ」という用語と同義的に用いることができる。本明細書に記載したPUFA PKS系で同定されているATドメインは互いに対して、および現在調べられている他のPUFA PKS系のすべてに存在するドメインと良好な相同性を示し、特定の機能が同定されているいくつかのアシルトランスフェラーゼ（例えば、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ、MAT）と非常に弱い相同性を示す。MATと弱い相同性があるにもかかわらず、このATドメインは、それがそのような酵素に特徴的な拡張モチーフ構造を持たないことから、MATとして機能するとは考えられていない（上記のMATドメインの記載を参照）。本開示の目的において、PUFA PKS系におけるATドメインに関して考えられる機能には、以下が非限定的に含まれる：ORFA ACPドメインから水への脂肪族アシル基の転移（すなわち、チオエステラーゼ‐脂肪族アシル基を遊離脂肪酸として放出する）、CoAなどのアクセプターへの脂肪族アシル基の転移、さまざまなACPドメイン間でのアシル基の転移、または親油性アクセプター分子（例えば、リゾホスファチジン酸）への脂肪族アシル基の転移。
【００６０】
本発明によれば、このドメインはエノイルレダクターゼ（ER）生物活性を有する。ER酵素は、脂肪族アシル-ACPにおけるトランス二重結合（DH活性により導入された）を還元し、結果としてそれらの炭素を完全に飽和させる。PUFA-PKS系におけるそのERドメインは、ER酵素の新たに特徴づけられたファミリーと相同性を示す（Heath et al., Nature 406, 145 (2000)）。HeathおよびRockは、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）から関心対象の遺伝子をクローニングし、その遺伝子から発現されたタンパク質を精製して、それがER活性を有することをインビトロアッセイで示すことによって、ER酵素のこの新たなクラスを同定した。現在調べられているPUFA PKS系はすべて、肺炎連鎖球菌のERタンパク質と相同性を示すシゾキトリウム属ERドメインと非常に高い配列相同性を有する、少なくとも1つのドメインを含む。
【００６１】
本発明によれば、デヒドラーゼまたはデヒドラターゼ（DH）活性を有するタンパク質またはドメインは脱水反応を触媒する。本明細書で一般的に用いる場合、DH活性に対する言及は、典型的には、FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）生物活性のことを指す。FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）生物活性は、β-ケトアシル-ACPからHOHを除去し、炭素鎖にトランス二重結合を最初に生じさせる。「FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ」という用語は、「FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ」、「β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ」、「デヒドラーゼ」という用語および類似の派生語と同義的に用いることができる。PUFA PKS系のDHドメインは、そのFAS系と関連する細菌DH酵素に対して（他のPKS系のDHドメインに対してよりも）相同性を示す。細菌DHのサブセットであるFabA様DHは、シス-トランスイソメラーゼ活性を有する（Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996)）。これはFabA様DHタンパク質に対する相同性であり、本明細書に記載したDHドメインの1つまたはすべてがPUFA PKS生成物におけるシス二重結合の挿入の原因となることを示している。
【００６２】
また、本発明において有用なPUFA PKSタンパク質が、本明細書において非FabA様DH活性または非FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）生物活性と総称される、FabA様（例えば、上記のシス-トランス活性はFabA様活性と関連する）とは特徴づけられないデヒドラターゼ活性を有してもよい。より具体的には、保存的活性部位モチーフ（ほぼ13アミノ酸長：L*xxHxxxGxxxxP；例えば、SEQ ID NO：70のアミノ酸2504〜2516に示されている；*このモチーフでは、LをIとすることもできる）が、PKS系におけるデヒドラターゼドメインに見いだされる（Donadio S, Katz L. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51-60）。本明細書においてデヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフまたはDHモチーフとも称される、この保存的モチーフは、これまでに記載されているすべての公知のPUFA-PKS配列の類似の領域および本明細書に記載したPUFA PKS配列の中に見いだされるが、このモチーフはごく最近になって発見されたと考えられる。この保存的モチーフは、PUFA-PKS配列中のまだ特徴づけられていない高相同性領域の内部にある。提唱されているPUFA-PKSを介したPUFAの生合成は非FabA様の脱水を必要とし、このモチーフはその反応の原因である可能性がある。
【００６３】
例証を目的として、いくつかのPUFA PKS系の構造について以下に詳細に述べる。しかし、本発明はこれらのPUFA PKS系の使用には限定されないことが理解されるべきである。
【００６４】
シゾキトリウム属のPUFA PKS系
1つの態様において、シゾキトリウム属由来のPUFA PKS系は、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む：（a）2つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）5つ〜10個またはそれ以上のアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン、1つの局面においては9つのACPドメイン；（c）2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；および（h）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。1つの態様において、本発明によるシゾキトリウム属PUFA PKS系はまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域またはドメインも含む。これらのドメインの構造的および機能的な特徴は、当技術分野で個別的に一般に知られている（例えば、米国特許6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第20020194641号；およびPCT公開第WO 2006/135866を参照）。
【００６５】
以前に記載されている、シゾキトリウム属のコアPUFA PKS系を構成するオープンリーディングフレームは3つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
【００６６】
シゾキトリウム属のオープンリーディングフレームA（OrfA）：
OrfAに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：1として表されている。OrfAは、本明細書にSEQ ID NO：2として表されている2910アミノ酸の配列をコードする、8730ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。OrfAの内部には12個のドメインがある：（a）1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；（c）9つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；および（d）1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン。シゾキトリウム属ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfAをコードするゲノムDNAクローン（プラスミド）が単離され、シークエンシングが行われている。
【００６７】
シゾキトリウム属ATCC 20888株から単離された、本明細書においてJK1126と記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：1の1〜8730位に及ぶヌクレオチド配列を含み、対応するアミノ酸配列SEQ ID NO：2をコードする。ゲノムクローンpJK1126（シゾキトリウム属ATCC 20888株由来の「OrfA」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1126 OrfAゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7648が割り当てられている。pJK1126 OrfAゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００６８】
シゾキトリウム属N230D株から単離された、本明細書においてpJK306 OrfAゲノムクローンおよびpJK320 OrfAゲノムクローンと記載される2つのゲノムクローンはともに（部分的重複クローン）、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK306（シゾキトリウム属N230D株由来のOrfA遺伝子の5'部分を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK306 OrfAゲノムクローンと命名される（pJK320と2.2kBが重複））は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA7641が割り当てられている。pJK306 OrfAゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。ゲノムクローンpJK320（シゾキトリウム属N230D株由来のOrfA遺伝子の3'部分を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK320 OrfAゲノムクローンと命名される（pJK306と2.2kBが重複））は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7644が割り当てられている。pJK320 OrfAゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００６９】
OrfAにおける第1のドメインはKSドメインであり、これは本明細書においてORFA-KSとも称され、ORFA-KSドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：7として表されている（SEQ ID NO：1の1〜1500位）。ORFA-KSドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：8として表されている（SEQ ID NO：2の1〜500位）。ORFA-KSドメインは活性部位モチーフ：DXAC*（*アシル結合部位C215）を含むことを指摘しておく。また、シゾキトリウム属KS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGもSEQ ID NO：2におけるこのドメインに存在し、したがってSEQ ID NO：8に存在する。
【００７０】
OrfAにおける第2のドメインはMATドメインであり、これは本明細書においてORFA-MATとも称され、ORFA-MATドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：9として表されている（SEQ ID NO：1の1723〜3000位）。ORFA-MATドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：10として表されている（SEQ ID NO：2の575〜1000位）。MATドメインは93位にアスパラギン酸を含み、94位にヒスチジンを含む（それぞれSEQ ID NO：2の667位および668位に対応）。ORFA-MATドメインは、本明細書にSEQ ID NO：11として表されている活性部位モチーフ：GHS*XG（*アシル結合部位S706）を含むことを指摘しておく。
【００７１】
OrfAのドメイン3〜11は9つの縦列したACPドメインであり、これは本明細書においてORFA-ACPとも称される（配列における第1のドメインはORFA-ACP1であり、第2のドメインはORFA-ACP2であり、第3のドメインはORFA-ACP3であり、以下も同様）。第1のACPドメインであるORFA-ACP1は、SEQ ID NO：1（OrfA）の約3343位から約3600位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。ORFA-ACP1ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：12として表されている（SEQ ID NO：1の3343〜3600位）。第1のACPドメインを含むアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2の約1115位〜約1200位に及ぶ。ORFA-ACP1ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：13として表されている（SEQ ID NO：2の1115〜1200位）。ORFA-ACP1ドメインは、本明細書ではSEQ ID NO：14によって表されている活性部位モチーフ：LGIDS*（*パンテテイン結合モチーフS1157）を含むことを指摘しておく。
【００７２】
9つのACPドメインはすべて、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が高度に保存的であり、このため、各ドメインの配列を個別の配列識別子によって本明細書中に表してはいない。しかし、本明細書に開示した情報に基づいて、当業者は、他の8つのACPドメインのそれぞれを含む配列を容易に決定することができる。9つのACPドメインはいずれもSEQ ID NO：1の約3283位〜約6288位のOrfAの領域に及び、これはSEQ ID NO：2の約1095〜約2096位のアミノ酸位置に対応する。9つのすべてのドメインを含むACP領域全体に関するヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：16として表されている。SEQ ID NO：16によって表される領域は、個々のACPドメインの間のリンカーセグメントを含む。9つのドメインの反復の間隔は、SEQ ID NO：16のおよそ330ヌクレオチド毎である（隣接する活性部位のセリン間を計測したアミノ酸の実際の数は104〜116アミノ酸の範囲である）。9つのACPドメインのそれぞれは、パンテテイン結合モチーフLGIDS*（本明細書ではSEQ ID NO：14によって表されている）を含み、ここでS*はパンテテイン結合部位セリン（S）である。パンテテイン結合部位セリン（S）は、各ACPドメイン配列の中央近くに位置する。ACPドメイン領域の各末端および各ACPドメインの間にはプロリン（P）およびアラニン（A）に高度に富んだ領域があり、これはリンカー領域と考えられる。例えば、ACPドメイン1と2との間には配列：
2009529891.tif 000003
があり、これは本明細書にSEQ ID NO：15として表されている。SEQ ID NO：2のアミノ酸配列に関して、9つのACPドメインのそれぞれについての活性部位セリン残基（すなわち、パンテテイン結合部位）の位置は以下の通りである：ACP1＝S1157；ACP2＝S1266；ACP3＝S1377；ACP4＝S1488；ACP5＝S1604；ACP6＝S1715；ACP7＝S1819；ACP8＝S1930；およびACP9＝S2034。ACPドメインの平均サイズがリンカーを除いて約85アミノ酸、リンカーを含めて約110アミノ酸であり、活性部位セリンがほぼドメインの中央にあることを考慮して、当業者は、OrfAにおける9つのACPドメインのそれぞれの位置を容易に決定することができる。
【００７３】
OrfAにおけるドメイン12はKRドメインであり、これは本明細書においてORFA-KRとも称され、ORFA-KRドメインを含む配列を含むヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：17として表されている（SEQ ID NO：1の6598〜8730位）。ORFA-KRドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：18として表されている（SEQ ID NO：2の2200〜2910位）。KRドメインの内部には、短鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（KRはこのファミリーのメンバーである）と相同性を有するコア領域がある。このコア領域はSEQ ID NO：1の約7198位〜約7500位に及び、SEQ ID NO：2のアミノ酸位置2400〜2500位に対応する。
【００７４】
シゾキトリウム属のオープンリーディングフレームB（OrfB）：
OrfBに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：3として表されている。OrfBは、本明細書にSEQ ID NO：4として表されている2059アミノ酸の配列をコードする、6177ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。OrfBの内部には4つのドメインがある：（a）1つの-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（c）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；および（d）1つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン。
【００７５】
シゾキトリウム属ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfBをコードするゲノムDNAクローン（プラスミド）が単離され、シークエンシングが行われている。
【００７６】
シゾキトリウム属ATCC 20888株から単離された、本明細書においてpJK1129と記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：3のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：4のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK1129（シゾキトリウム属ATCC 20888株由来の「OrfB」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1129 OrfBゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA7649が割り当てられている。pJK1126 OrfBゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００７７】
シゾキトリウム属N230D株から単離された、本明細書においてpJK324 OrfBゲノムクローンと記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：3のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：4のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK324（シゾキトリウム属N230D株由来のOrfB遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK324 OrfBゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA7643が割り当てられている。pJK324 OrfBゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００７８】
OrfBにおける第1のドメインはKSドメインであり、これは本明細書においてORFB-KSとも称され、ORFB-KSドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：19として表されている（SEQ ID NO：3の1〜1350位）。ORFB-KSドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：20として表されている（SEQ ID NO：4の1〜450位）。このKSドメインはSEQ ID NO：20の371位に（同じくSEQ ID NO：20の371位にも）バリンを含む。ORFB-KSドメインは活性部位モチーフ：DXAC*（*アシル結合部位C196）を含むことを指摘しておく。また、このKS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGもSEQ ID NO：4におけるこのドメインに存在し、したがってSEQ ID NO：20に存在する。
【００７９】
OrfBにおける第2のドメインはCLFドメインであり、これは本明細書においてORFB-CLFとも称され、ORFB-CLFドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：21として表されている（SEQ ID NO：3の1378〜2700位）。ORFB-CLFドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：22として表されている（SEQ ID NO：4の460〜900位）。ORFB-CLFドメインは、アシル結合性システインを伴わないKS活性部位モチーフを含むことを指摘しておく。
【００８０】
OrfBにおける第3のドメインはATドメインであり、これは本明細書においてORFB-ATとも称され、ORFB-ATドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：23として表されている（SEQ ID NO：3の2701〜4200位）。ORFB-ATドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：24として表されている（SEQ ID NO：4の901〜1400位）。ORFB-ATドメインは、アシルトランスフェラーゼ（AT）タンパク質に特徴的な活性部位モチーフGxS*xG（*アシル結合部位S1140）を含むことを指摘しておく。
【００８１】
OrfBにおける第4のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてORFB-ERとも称され、ORFB-ERドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：25として表されている（SEQ ID NO：3の4648〜6177位）。ORFB-ERドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：26として表されている（SEQ ID NO：4の1550〜2059位）。
【００８２】
シゾキトリウム属のオープンリーディングフレームC（OrfC）：
OrfCに関する全ヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：5として表されている。OrfCは、本明細書にSEQ ID NO：6として表されている1502アミノ酸の配列をコードする、4506ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。OrfCの内部には3つのドメインがある：（a）2つのFabA様-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；および（b）1つのエノイルACPレダクターゼ（ER）ドメイン。
【００８３】
シゾキトリウム属ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfCをコードするゲノムDNAクローン（プラスミド）が単離され、シークエンシングが行われている。
【００８４】
シゾキトリウム属ATCC 20888株から単離された、本明細書においてpJK1131と記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：5のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：6のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpJK1131（シゾキトリウム属ATCC 20888株由来の「OrfC」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1131 OrfCゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA7650が割り当てられている。pJK1131 OrfCゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００８５】
シゾキトリウム属N230D株から単離された、本明細書においてpBR002 OrfCゲノムクローンと記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：5のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：6のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンpBR002（シゾキトリウム属N230D株由来のOrfC遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pBR002 OrfCゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託されており、ATCCアクセッション番号PTA7642が割り当てられている。pBR002 OrfCゲノムクローンのヌクレオチド配列およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００８６】
OrfCにおける第1のドメインはDHドメインであり、これは本明細書においてORFC-DH1とも称される。これはOrfCにおける2つのDHドメインの1つであり、このためDH1と命名されている。ORFC-DH1ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：27として表されている（SEQ ID NO：5の1〜1350位）。ORFC-DH1ドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：28として表されている（SEQ ID NO：6の1〜450位）。
【００８７】
OrfCにおける第2のドメインはDHドメインであり、これは本明細書においてORFC-DH2とも称される。これはOrfCにおける2つのDHドメインの第2のものであり、このためDH2と命名されている。ORFC-DH2ドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：29として表されている（SEQ ID NO：5の1351〜2847位）。ORFC-DH2ドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：30として表されている（SEQ ID NO：6の451〜949位）。このDHドメインは、SEQ ID NO：30の426〜440位にアミノ酸H-G-I-A-N-P-T-F-V-H-A-P-G-K-I（SEQ ID NO：6の876〜890位）を含む。
【００８８】
OrfCにおける第3のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてORFC-ERとも称され、ORFC-ERドメインをコードする配列を含むヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：31として表されている（SEQ ID NO：5の2995〜4506位）。ORFC-ERドメインを含むアミノ酸配列は本明細書にSEQ ID NO：32として表されている（SEQ ID NO：6の999〜1502位）。
【００８９】
ヤブレツボカビ属のPUFA PKS系
1つの態様において、ヤブレツボカビ属のPUFA PKS系は、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む：（a）2つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）5つ〜10個またはそれ以上のアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン、1つの局面においては8つのACPドメイン；（c）2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）2つのFabA様β-ヒドロキシアシルACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；（g）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；および（h）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。1つの態様において、本発明によるヤブレツボカビ属PUFA PKS系はまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域またはドメインも含む。これらのドメインの構造的および機能的な特徴は、当技術分野で個別的に一般に知られている（例えば、米国特許公報第2004035127号、前記を参照）。
【００９０】
以前に記載されている、コアヤブレツボカビ属23BのコアPUFA PKS系を構成するオープンリーディングフレームは3つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
【００９１】
ヤブレツボカビ属23BのオープンリーディングフレームA（OrfA）：
Th. 23B OrfAに関する全ヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：38として表されている。Th. 23B OrfAは、本明細書にSEQ ID NO：39として表されている2811アミノ酸の配列をコードする、8433ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。SEQ ID NO：38は、Th. 23B OrfAにおける以下のドメインをコードする：（a）1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；（c）8つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；および（d）1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン。
【００９２】
ヤブレツボカビ属23Bから単離された、本明細書においてTh23BOrfA_pBR812.1およびTh23BOrfA_pBR811（OrfAゲノムクローン）と記載される2つのゲノムクローンはともに（部分的重複クローン）、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：38のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：39のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンTh23BOrfA_pBR812.1（ヤブレツボカビ属23B由来のOrfA遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfA_pBR812.1ゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号＿＿＿が割り当てられている。OrfAゲノムクローンの1つであるTh23BOrfA_pBR812.1のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。ゲノムクローンTh23BOrfA_pBR811（ヤブレツボカビ属23B由来のOrfA遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfA_pBR811ゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号＿＿＿が割り当てられている。OrfAゲノムクローンの1つであるTh23BOrfA_pBR811のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【００９３】
Th. 23B OrfAにおける第1のドメインはKSドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfAKSとも称され、本明細書にSEQ ID NO：40として表されている、SEQ ID NO：38の約1位〜約1500位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：41として表されている、SEQ ID NO：39の約1位〜約500位に及ぶ領域である。SEQ ID NO：39のこの領域は、SEQ ID NO：39の1位〜約450位（同じくSEQ ID NO：41の1位〜約450位）に及ぶ、FabB（β-ケトアシル-ACPシンターゼ）に対するPfamマッチを有する。Th. 23B OrfA-KSドメインは活性部位モチーフ：DXAC*（*アシル結合部位C207）を含むことを指摘しておく。また、Th. 23B KS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGも、SEQ ID NO：39の453〜456位（同じくSEQ ID NO：41の453〜456位）に存在する。
【００９４】
Th. 23B OrfAにおける第2のドメインはMATドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfA-MATとも称され、本明細書にSEQ ID NO：42として表されている、SEQ ID NO：38の約1503位〜約3000位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B MATドメインを含む領域は、本明細書でSEQ ID NO：43によって表されている、約501位〜約1000位に及ぶSEQ ID NO：39の領域である。SEQ ID NO：39のこの領域は、SEQ ID NO：39の約580位〜約900位（SEQ ID NO：43の80〜400位）に及ぶ、FabD（マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ）に対するPfamマッチを有する。Th. 23B OrfA-MATドメインは、SEQ ID NO：39の695〜699位によって表されている活性部位モチーフ：GHS*XG（*アシル結合部位S697）を含むことを指摘しておく。
【００９５】
Th. 23B OrfAのドメイン3〜10は8つの縦列したACPドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfA-ACPとも称される（配列における第1のドメインはOrfA-ACP1であり、第2のドメインはOrfA-ACP2であり、第3のドメインOrfA-ACP3であり、以下も同様）。第1のTh. 23B ACPドメインであるTh. 23B OrfA-ACP1は、本明細書にSEQ ID NO：44として表されている、SEQ ID NO：38（OrfA）の約3205位〜約3555位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。第1のTh. 23B ACPドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書でSEQ ID NO：45によって表されている、SEQ ID NO：39の約1069位〜約1185位に及ぶSEQ ID NO：39の領域である。
【００９６】
Th. 23B OrfAにおける8つのACPドメインは互いに隣接しており、ホスホパンテテイン結合部位モチーフ、LGXDS*（SEQ ID NO：46によって表されている）の存在によって同定され、ここでS*はホスホパンテテイン結合部位である。SEQ ID NO：39に関して、8つのS*部位のそれぞれのアミノ酸位置は、1128（ACP1）、1244（ACP2）、1360（ACP3）、1476（ACP4）、1592（ACP5）、1708（ACP6）、1824（ACP7）および1940（ACP8）である。8つのTh. 23B ACPドメインはすべて、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が高度に保存的であり、このため、各ドメインの配列を個別の配列識別子によって本明細書中に表してはいない。しかし、本明細書に開示した情報に基づいて、当業者は、SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：39における他の7つのACPドメインのそれぞれを含む配列を容易に決定することができる。
【００９７】
8つのTh. 23B ACPドメインはいずれも、SEQ ID NO：38の約3205位から約5994位までのTh. 23B OrfAの領域に及び、これはSEQ ID NO：39の約1069〜約1998位のアミノ酸位置に対応する。8つのすべてのドメインを含むACP領域全体に関するヌクレオチド配列は、本明細書にSEQ ID NO：47として表されている。SEQ ID NO：47は、本明細書でSEQ ID NO：48によって表されているアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：48は、個々のACPドメインの間のリンカーセグメントを含む。8つのドメインに関する反復の間隔は、SEQ ID NO：48のおよそ116アミノ酸毎であり、各ドメインは活性部位モチーフ（上記）の中心に位置する約116個のアミノ酸からなると考えることができる。
【００９８】
Th. 23B OrfAにおける最後のドメインはKRドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfA-KRとも称され、本明細書でSEQ ID NO：49によって表されている、SEQ ID NO：38の約6001位〜約8433位に及ぶヌクレオチド配列の内部に位置する。Th. 23B KRドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書でSEQ ID NO：50によって表されている、SEQ ID NO：39の約2001位〜約2811位に及ぶSEQ ID NO：39の領域である。SEQ ID NO：39のこの領域は、SEQ ID NO：39の約2300位〜約2550位（SEQ ID NO：50の300〜550位）に及ぶ、FabG（β-ケトアシル-ACPレダクターゼ）に対するPfamマッチを有する。
【００９９】
ヤブレツボカビ属23BのオープンリーディングフレームB（OrfB）：
Th. 23B OrfBに関する全ヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：51として表されており、これは本明細書にSEQ ID NO：52として表されている1935アミノ酸の配列をコードする、5805ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。SEQ ID NO：51は、Th. 23B OrfBにおける以下のドメインをコードする：（a）1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（c）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；および（d）1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン。
【０１００】
ヤブレツボカビ属23Bから単離された、本明細書においてTh23BOrfB_pBR800（OrfBゲノムクローン）と記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：51のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：52のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンTh23BOrfB_pBR800（ヤブレツボカビ属23B由来のOrfB遺伝子配列を含む形態では、Th23BOrfB_pBR800ゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号＿＿＿が割り当てられている。OrfBゲノムクローンであるTh23BOrfB_pBR800のヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１０１】
Th. 23B OrfBにおける第1のドメインはKSドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfB-KSとも称され、本明細書にSEQ ID NO：53として表されている、SEQ ID NO：51（Th. 23B OrfB）の約1位〜約1500位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B KSドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：54として表されている、SEQ ID NO：52の約1位〜約500位に及ぶSEQ ID NO：52の領域である。SEQ ID NO：52のこの領域は、約1位〜約450位（SEQ ID NO：54の1〜450位）に及ぶ、FabB（β-ケトアシル-ACPシンターゼ）に対するPfamマッチを有する。Th. 23B OrfB-KSドメインは活性部位モチーフ：DXAC*を含み、ここでC*はアシル基結合の部位であり、C*はSEQ ID NO：52の201位にあることを指摘しておく。また、KS領域の末端にある特徴的モチーフであるGFGGも、SEQ ID NO：52のアミノ酸434〜437位に存在する。
【０１０２】
Th. 23B OrfBにおける第2のドメインはCLFドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfB-CLFとも称され、本明細書にSEQ ID NO：55として表されている、SEQ ID NO：51（OrfB）の約1501位〜約3000位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。CLFドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：56として表されている、SEQ ID NO：52の約501位〜約1000位に及ぶSEQ ID NO：52の領域である。SEQ ID NO：52のこの領域は、約550位〜約910位（SEQ ID NO：56の50〜410位）に及ぶ、FabB（β-ケトアシル-ACPシンターゼ）に対するPfamマッチを有する。CLFはKSタンパク質との相同性を有するが、これはKSタンパク質においてアシル基が結合する活性部位システインを欠いている。
【０１０３】
Th. 23B OrfBにおける第3のドメインはATドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfB-ATとも称され、本明細書にSEQ ID NO：58として表されている、SEQ ID NO：51（Th. 23B OrfB）の約3001位〜約4500位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B ATドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：58として表されている、SEQ ID NO：52の約1001位〜約1500位に及ぶSEQ ID NO：52の領域である。SEQ ID NO：52のこの領域は、約1100位〜約1375位（SEQ ID NO：58の100〜375位）に及ぶ、FabD（マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ）に対するPfamマッチを有する。PUFAシンターゼのこのATドメインはMATタンパク質との相同性を有するが、これはMATの拡張モチーフ（鍵となるアルギニンおよびグルタミン残基）を欠いており、マロニル-CoAの転移には関与しないと考えられる。アシルトランスフェラーゼのGXS*XGモチーフは存在し、ここでS*はアシル結合の部位であり、SEQ ID NO：52に関しては1123位に位置する。
【０１０４】
Th. 23B OrfBにおける第4のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfB-ERとも称され、本明細書にSEQ ID NO：59として表されている、SEQ ID NO：51（OrfB）の約4501位〜約5805位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B ERドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：60として表されている、SEQ ID NO：52の約1501位〜約1935位に及ぶSEQ ID NO：52の領域である。SEQ ID NO：52のこの領域は、約1501位〜約1810位（SEQ ID NO：60の1〜310位）に及ぶ、2-ニトロプロパンジオキシゲナーゼに関連したジオキシゲナーゼのファミリーに対するPfamマッチを有する。このドメインがERとして機能することを、肺炎連鎖球菌由来の新たに特徴づけられたER酵素に対する相同性からさらに予測することができる。
【０１０５】
ヤブレツボカビ属23BのオープンリーディングフレームC（OrfC）：
Th. 23B OrfCに関する全ヌクレオチド配列は本明細書にSEQ ID NO：61として表されており、これは本明細書にSEQ ID NO：62として表されている1470アミノ酸の配列をコードする、4410ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。SEQ ID NO：61は、Th. 23B OrfCにおける以下のドメインをコードする：（a）両方ともFabAタンパク質（トランス-2-デセノイル-ACPの合成およびこの生成物のシス-3-デセノイル-ACPへの可逆的異性化を触媒する酵素）との相同性を有する、2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（DH）ドメイン；および（b）シゾキトリウム属OrfBのERドメインに対する高度の相同性を有する、1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン。
【０１０６】
ヤブレツボカビ属23Bから単離された、本明細書においてTh23BOrfC_pBR709A（OrfCゲノムクローン）と記載されるゲノムクローンは、本発明者らの知る限りでは、SEQ ID NO：61のヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO：62のアミノ酸配列をコードする。ゲノムクローンTh23BOrfC_pBR709A（ヤブレツボカビ属23B由来のOrfC遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfC_pBR709Aゲノムクローンと命名される）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号＿＿＿が割り当てられている。OrfCゲノムクローンであるTh23BOrfC_pBR709Aのヌクレオチド配列、およびこのプラスミドによってコードされるアミノ酸配列は本発明に含まれる。
【０１０７】
Th. 23B OrfCにおける第1のドメインはDHドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfC-DH1とも称され、本明細書にSEQ ID NO：63として表されている、SEQ ID NO：61の約1位〜約1500位（OrfC）に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B DH1ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：64として表されている、SEQ ID NO：62の約1位〜約500位に及ぶSEQ ID NO：62の領域である。SEQ ID NO：62のこの領域は、上述したように、約275位〜約400位（SEQ ID NO：64の275〜400位）に及ぶ、FabAに対するPfamマッチを有する。
【０１０８】
Th. 23B OrfCにおける第2のドメインもDHドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfC-DH2とも称され、本明細書にSEQ ID NO：65として表されている、SEQ ID NO：61（OrfC）の約1501位〜約3000位に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B DH2ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：66として表されている、SEQ ID NO：62の約501位〜約1000位に及ぶSEQ ID NO：62の領域である。SEQ ID NO：62のこの領域は、上述したように、約800位〜約925位（SEQ ID NO：66の300〜425位）に及ぶ、FabAに対するPfamマッチを有する。
【０１０９】
Th. 23B OrfCにおける第3のドメインはERドメインであり、これは本明細書においてTh. 23B OrfC-ERとも称され、本明細書にSEQ ID NO：67として表されている、SEQ ID NO：61の約3001位〜約4410位（OrfC）に及ぶヌクレオチド配列の内部に含まれる。Th. 23B ERドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書にSEQ ID NO：68として表されている、SEQ ID NO：62の約1001位〜約1470位に及ぶSEQ ID NO：62の領域である。SEQ ID NO：62のこの領域は、上述したように、約1025位〜約1320位（SEQ ID NO：68の25〜320位）に及ぶ、2-ニトロプロパンジオキシゲナーゼに関連したジオキシゲナーゼに対するPfamマッチを有する。このドメインがERとして機能することも、肺炎連鎖球菌由来の新たに特徴づけられたER酵素に対する相同性からさらに予測することができる。
【０１１０】
シュワネラ-ジャポニカのPUFA PKS
以前に記載されている、シュワネラ-ジャポニカのコアPUFA PKS系およびそのPPTアーゼを構成するオープンリーディングフレームは5つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
【０１１１】
SEQ ID NO：69は、シュワネラ-ジャポニカのコスミド3F3に関するヌクレオチド配列であり、これは15個のORFを含むことが見いだされている。この微生物におけるPUFA PKS系に関連するORFは以下のように特徴づけられる。
【０１１２】
pfaA（SEQ ID NO：69のヌクレオチド10491〜18854）は、以下のドメインを内部に持つPUFA PKSタンパク質であるPFAS A（SEQ ID NO：70）をコードする：β-ケトアシル-シンターゼ（KS）（SEQ ID NO：69のヌクレオチド10575〜12029、SEQ ID NO：70のアミノ酸29〜513）；マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）（SEQ ID NO：69のヌクレオチド12366〜13319、SEQ ID NO：70のアミノ酸625〜943）；6つの縦列したアシル-キャリアータンパク質（ACP）ドメイン（SEQ ID NO：69のヌクレオチド14280〜16157、SEQ ID NO：70のアミノ酸1264〜1889）；β-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）（SEQ ID NO：69のヌクレオチド17280〜17684、SEQ ID NO：70のアミノ酸2264〜2398）；および、本明細書でDHモチーフ領域と称する、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP（SEQ ID NO：70のアミノ酸2504〜2516）を含む、SEQ ID NO：70のアミノ酸2399〜2787の間のPFASタンパク質の領域。
【０１１３】
PFAS Aにおいて、KS活性部位DXAC*はSEQ ID NO：70のアミノ酸226〜229に位置し、ここでC*はアシル結合の部位である。MAT活性部位であるGHS*XGはSEQ ID NO：70のアミノ酸721〜725に位置し、ここでS*はアシル結合部位である。LGXDS*のACP活性部位は以下の位置に位置する：SEQ ID NO：70におけるアミノ酸1296〜1300、アミノ酸1402〜1406、アミノ酸1513〜1517、アミノ酸1614〜1618、アミノ酸1728〜1732およびアミノ酸1843〜1847、ここでS*はホスホパンテテイン結合部位である。PFAS Aはまた、SEQ ID NO：70のアミノ酸2399〜2787の間に、以上に言及したデヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP（SEQ ID NO：70のアミノ酸2504〜2516）も含む。
【０１１４】
pfaB（SEQ ID NO：69のヌクレオチド18851〜21130）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS B（SEQ ID NO：71）をコードする：アシルトランスフェラーゼ（AT）（SEQ ID NO：69のヌクレオチド19982〜20902、SEQ ID NO：71のアミノ酸378〜684）。
【０１１５】
PFAS Bにおいて、活性部位GXS*XGモチーフはSEQ ID NO：71のアミノ酸463〜467に位置し、ここでS*はアシル結合の部位である。
【０１１６】
pfaC（SEQ ID NO：69のヌクレオチド21127〜27186）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS C（SEQ ID NO：72）をコードする：KS（SEQ ID NO：69のヌクレオチド21139〜22575、SEQ ID NO：72のアミノ酸5〜483）；鎖長因子（CLF）（SEQ ID NO：69のヌクレオチド22591〜23439、SEQ ID NO：72のアミノ酸489〜771）；ならびに、DH1（SEQ ID NO：69のヌクレオチド25408〜25836、SEQ ID NO：72のアミノ酸1428〜1570）およびDH2（SEQ ID NO：69のヌクレオチド26767〜27183、SEQ ID NO：72のアミノ酸1881〜2019）と称する2つのFabA 3-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ。
【０１１７】
PFAS Cにおいて、KS活性部位DXAC*はSEQ ID NO：72のアミノ酸211〜214に位置し、ここでC*はアシル結合の部位である。
【０１１８】
pfaD（SEQ ID NO：69のヌクレオチド27197〜28825）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS D（SEQ ID NO：73）をコードする：エノイルレダクターゼ（ER）（SEQ ID NO：69のヌクレオチド27446〜28687、SEQ ID NO：73のアミノ酸84〜497）。
【０１１９】
pfaE（逆相補鎖上のSEQ ID NO：69のヌクレオチド6150〜7061）は、同定されたドメイン（SEQ ID NO：69のヌクレオチド6504〜6944、SEQ ID NO：74のアミノ酸40〜186）を有する4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）である、PFAS E（SEQ ID NO：74）をコードする。
【０１２０】
シュワネラ-オレヤナのPUFA PKS
以前に記載されている、シュワネラ-オレヤナコアPUFA PKS系およびそのPPTアーゼを構成するオープンリーディングフレームは5つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
【０１２１】
SEQ ID NO：75は、シュワネラ-オレヤナのコスミド9A10に関するヌクレオチド配列であり、これは17個のORFを含むことが見いだされている。この微生物におけるPUFA PKS系に関連するORFは以下のように特徴づけられる。
【０１２２】
pfaA（SEQ ID NO：75のヌクレオチド17437〜25743）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS A（SEQ ID NO：76）をコードする：β-ケトアシル-シンターゼ（KS）（SEQ ID NO：75のヌクレオチド17521〜18975、SEQ ID NO：76のアミノ酸29〜513）；マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）（SEQ ID NO：75のヌクレオチド19309〜20265、SEQ ID NO：76のアミノ酸625〜943）；6つの縦列したアシル-キャリアータンパク質（ACP）ドメイン（SEQ ID NO：75のヌクレオチド21259〜23052、SEQ ID NO：76のアミノ酸1275〜1872）；β-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）（SEQ ID NO：75のヌクレオチド24154〜24558、SEQ ID NO：76のアミノ酸2240〜2374）；および、本明細書でDHモチーフ領域と称する、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP（SEQ ID NO：76のアミノ酸2480〜2492）を含む、SEQ ID NO：76のアミノ酸2241〜2768の間のPFASタンパク質の領域。
【０１２３】
PFAS Aにおいて、KS活性部位DXAC*はSEQ ID NO：76のAA 226〜229に位置し、ここでC*アシル結合の部位である。MAT活性部位であるGHS*XGはSEQ ID NO：76のアミノ酸721〜725に位置し、ここでS*はアシル結合部位である。LGXDS*のACP活性部位は以下に位置する：SEQ ID NO：76におけるアミノ酸1307〜1311、アミノ酸1408〜1412、アミノ酸1509〜1513、アミノ酸1617〜1621、アミノ酸1721〜1725およびアミノ酸1826〜1830、ここでS*はホスホパンテテイン結合部位である。PFAS Aはまた、SEQ ID NO：76のアミノ酸2241〜2768の間に、以上に言及したデヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP（SEQ ID NO：76のアミノ酸2480〜2492）も含む。
【０１２４】
pfaB（SEQ ID NO：75のヌクレオチド25740〜27971）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS B（SEQ ID NO：77）をコードする：アシルトランスフェラーゼ（AT）（SEQ ID NO：75のヌクレオチド26837〜27848、SEQ ID NO：77のアミノ酸366〜703）。
【０１２５】
PFAS Bにおいて、活性部位GXS*XGモチーフはSEQ ID NO：77のアミノ酸451〜455に位置し、ここでS*はアシル結合の部位である。
【０１２６】
pfaC（SEQ ID NO：75のヌクレオチド27968〜34030）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS C（SEQ ID NO：78）をコードする：KS（SEQ ID NO：75のヌクレオチド27995〜29431、SEQ ID NO：78のアミノ酸10〜488）；鎖長因子（CLF）（SEQ ID NO：75のヌクレオチド29471-30217、SEQ ID NO：78のアミノ酸502〜750）；ならびに、DH1（SEQ ID NO：75のヌクレオチド32258〜32686、SEQ ID NO：78のアミノ酸1431〜1573）およびDH2（SEQ ID NO：75のヌクレオチド33611〜34027、SEQ ID NO：78のアミノ酸1882〜2020）と称する2つのFabA 3-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ。
【０１２７】
PFAS Cにおいて、KS活性部位DXAC*はSEQ ID NO：78のアミノ酸216〜219に位置し、ここでC*はアシル結合の部位である。
【０１２８】
pfaD（SEQ ID NO：75のヌクレオチド34041〜35669）は、以下のドメインを内部に含むPUFA PKSタンパク質であるPFAS D（SEQ ID NO：79）をコードする：エノイルレダクターゼ（ER）（SEQ ID NO：75のヌクレオチド34290〜35531、SEQ ID NO：79のアミノ酸84〜497）。
【０１２９】
pfaE（逆相補鎖上のSEQ ID NO：75のヌクレオチド13027〜13899）は、同定されたドメイン（SEQ ID NO：75のヌクレオチド13369〜13815、SEQ ID NO：80のアミノ酸29〜177）を有する4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）である、PFAS E（SEQ ID NO：80）をコードする。
【０１３０】
他のPUFA PKS配列
sOrfA
sOrfAと命名されたSEQ ID NO：35は、酵母における最適化されたコドン用法のために再合成された、シゾキトリウム属由来のOrfAをコードする核酸配列（SEQ ID NO：1）を表す。SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：35はそれぞれSEQ ID NO：2をコードする。
【０１３１】
sOrfB
sOrfBと命名されたSEQ ID NO：36は、酵母における最適化されたコドン用法のために再合成された、シゾキトリウム属由来のOrfBをコードする核酸配列（SEQ ID NO：3）を表す。SEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：36はそれぞれSEQ ID NO：4をコードする。
【０１３２】
OrfB*
OrfB*と命名されたSEQ ID NO：37は、植物細胞における使用のためにSEQ ID NO：3の一部分の内部に再合成され、OrfB*とも称される、大腸菌における最適化されたコドン用法のために最初は開発された極めて類似した配列に由来するシゾキトリウム属由来のOrfBをコードする核酸配列（SEQ ID NO：3）を表す。OrfB*はいずれの型（大腸菌用および植物用）も、SacII断片（SEQ ID NO：3における一意的な部位）に対するBspHI再合成（SEQ ID NO：3のヌクレオチド4415）を除いて、SEQ ID NO：3と同一である。どちらのバージョン（大腸菌および植物）も、orfBの元のゲノム配列（SEQ ID NO：3）と比較して、遺伝子の開始部付近に他の2つのコドン改変を有する。第1に、第4のコドンであるアルギニン（R）が、ゲノム配列におけるCGGからorfB*ではCGCに変化している。第2に、第5のコドンであるアスパラギン（N）が、ゲノム配列におけるAATからorfB*ではAACに変化している。SEQ ID NO：37を作り出すための植物ベクター中へのこの遺伝子のクローニングを容易にするために、大腸菌orfB*配列中の、遺伝子の開始部から20塩基の箇所にPstI部位（CTGCAG）も人為的に作製した。この変化は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させなかった。SEQ ID NO：37およびSEQ ID NO：3（ならびに大腸菌用のOrfB*型）はいずれもSEQ ID NO：4をコードする。
【０１３３】
PUFA PKS系は、1つまたは複数のアクセサリータンパク質をさらに含むことができ、上記のコアPUFA PKS系の部分ではない（すなわち、PUFAシンターゼ酵素複合体それ自体の部分ではない）と考えられるタンパク質と定義されるが、本発明のコアPUFAシンターゼ酵素複合体を用いたPUFA産生のため、または少なくとも効率的なPUFA産生のためには必要と思われる、または必要である。例えば、PUFAを生成するためには、PUFA PKS系は、4'-ホスホパンテテイニル部分を補酵素Aからアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメインに転移させるアクセサリータンパク質とともに働かなくてはならない。このため、PUFA PKS系は少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）ドメインを含むと考えることができ、またはそのようなドメインはPUFA PKS系にとってのアクセサリードメインまたはタンパク質であると考えることができる。
【０１３４】
本発明によれば、4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）生物活性（機能）を有するドメインまたはタンパク質は、4'-ホスホパンテテイニル部分を補酵素Aからアシルキャリアータンパク質（ACP）に転移させる酵素として特徴づけられる。ACPの不変セリン残基へのこの転移は、不活性なアポ型をホロ型に活性化する。ポリケチドおよび脂肪酸のいずれの合成においても、ホスホパンテテイン基は、成長中のアシル鎖とチオエステルを形成する。PPTアーゼは、脂肪酸合成、ポリケチド合成および非リボソーム性ペプチド合成において十分に特徴づけられている酵素のファミリーである。多くのPPTアーゼの配列が公知であり、結晶構造が決定されている上に（例えば、Reuter K, Mofid MR, Marahiel MA, Ficner R. "Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase superfamily」 EMBO J. 1999 Dec 1;18(23):6823-31）、活性にとって重要なアミノ酸残基の突然変異分析も行われている（Mofid MR, Finking R, Essen LO, Marahiel MA. "Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: carrier protein recognition and reaction mechanism」 Biochemistry. 2004 Apr 13;43(14):4128-36）。PPTアーゼにおけるこれらの不変かつ高度に保存されたアミノ酸は、上記の両方のシュワネラ菌株由来のpfaE ORFの範囲内に含まれる。
【０１３５】
本明細書に記載したOrfA ACPドメインを基質として認識することが以前に実証されている1つの異種PPTアーゼは、ネンジュモ属PCC 7120（以前はアナベナ属（Anabaena）PCC 7120と呼ばれた）のHetIタンパク質である。HetIは、ネンジュモ属において、その生物の異質細胞に存在する糖-脂質層の構成要素である長鎖ヒドロキシ脂肪酸の合成に関与することが知られている遺伝子クラスター内に存在する（Black and Wolk, 1994, J. Bacteriol. 176, 2282-2292；Campbell et al., 1997, Arch. Microbiol. 167, 251-258）。HetIは、そのクラスター内に存在するタンパク質Hgl EのACPドメインを活性化する可能性が高い。Hgl Eの2つのACPドメインは、シゾキトリウム属OrfAに見られるACPドメインに対して高度の配列相同性を有する。SEQ ID NO：34はネンジュモ属HetIタンパク質のアミノ酸配列を表しており、これは、シゾキトリウム属およびヤブレツボカビ属由来のPUFA PKS系を含む、本明細書に記載したPUFA PKS系とともに用いうる機能性PPTアーゼである。SEQ ID NO：34はSEQ ID NO：33によってコードされる。HetIの内因性開始コドンは同定されていない（推定されるタンパク質にはメチオニンが全く存在しない）。オープンリーディングフレームの5'末端付近に、いくつかの有望な代替的開始コドン（例えば、TTGおよびATT）が存在する。メチオニンコドン（ATG）は配列中に存在しない。しかし、最も5'側の有望な代替的開始コドン（TTG）をメチオニンコドン（ATG、NdeI制限酵素認識部位の一部として）と置き換えるためのPCRを用い、コード配列の3'末端にXhoI部位を導入することでHetI発現構築物の構築を完了したところ、コードされるPPTアーゼ（SEQ ID NO：34）は機能的であったことが示されている。
【０１３６】
本明細書に記載したOrfA ACPドメインを基質として認識することが以前に示されているもう1つの異種PPTアーゼは、枯草菌（Bacillus subtilis）に由来するsfpである。Sfpは十分に特徴づけられており、広範囲にわたる基質を認識する能力のために広く用いられている。公開されている配列情報（Nakana, et al., 1992, Molecular and General Genetics 232: 313-321）に基づき、コード領域を、規定された上流および下流の隣接DNA配列とともに、pACYC-184クローニングベクター中にクローニングすることにより、sfpに関する発現ベクターが以前に作製されている。この構築物は、大腸菌においてシゾキトリウム属Orf A、B*およびCと共発現されて、適切な条件下で、それらの細胞におけるDHAの蓄積をもたらす能力によって実証されているように、機能性PPTアーゼをコードする（米国特許出願公開第20040235127号を参照）。
【０１３７】
本発明によるPUFA PKS系を発現させるために生物（例えば、微生物または植物）を遺伝的に改変する場合に、ある種の宿主生物は、PUFAを産生するためにPUFA PKSとともに働く必要のあるアクセサリータンパク質（例えば、PPTアーゼ）を内因的に発現する可能性がある。しかし、ある種の生物は、生物が同種アクセサリータンパク質をたとえ内因的に産生しても、生物によるPUFAの産生を可能にする、および／または強化するために、本明細書に記載した1つまたは複数のアクセサリータンパク質をコードする核酸分子によって形質転換することができる（すなわち、ある種の異種アクセサリータンパク質は、宿主細胞の内因性アクセサリータンパク質よりも、形質転換されたPUFAシンターゼタンパク質の方がより効果的または効率的に働く可能性がある）。本発明は、アクセサリーPPTアーゼを含む本発明のPUFA PKS系によって遺伝的に改変された酵母および植物の一例を提供する。PPTアーゼの構造的および機能的な特徴は、例えば、米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；および米国特許出願公開第20050100995号に詳細に記載されている。
【０１３８】
本発明によれば、PUFAの生成のための「標準的」または「古典的」な経路に対する言及は、中鎖長の飽和脂肪酸（脂肪酸シンターゼ（FAS）系の生成物）が一連の伸長反応および不飽和化反応によって修飾される脂肪酸合成経路のことを指す。伸長反応の基質は脂肪族アシル-CoA（伸長される脂肪酸鎖）およびマロニル-CoA（各伸長反応のたびに付加される2個の炭素の源）である。エロンガーゼ反応の生成物は、直鎖状鎖に2つの炭素が付加された脂肪族アシル-CoAである。デサチュラーゼは、酸素依存的反応における2つの水素の抽出により、既存の脂肪酸鎖の中にシス二重結合を作り出す。そのような経路およびそのような経路に関与する遺伝子は文献で周知である。
【０１３９】
本明細書で用いる場合、「脂質」という用語は、リン脂質（PL）；遊離脂肪酸；脂肪酸エステル；トリアシルグリセロール（TAG）；ジアシルグリセリド；モノアシルグリセリド；ホスファチド；ロウ（アルコールと脂肪酸のエステル）；ステロールおよびステロールエステル；カロテノイド；キサントフィル（例えば、オキシカロテノイド）；炭化水素；ならびに当業者に公知であるその他の脂質を含む。「多価不飽和脂肪酸」および「PUFA」という用語は、遊離脂肪酸型だけでなく、TAG型およびPL型などの、その他の型も同様に含む。
【０１４０】
有意に高収量の1つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸を産生させるために、植物を、植物にPUFA PKS系が導入されるように遺伝的に改変することができる。植物はPUFA PKS系を内因的に含まないことが知られており、このため、本発明のPUFA PKS系は、類いまれな脂肪酸産生能力を有する植物を作製するための機会となる。同じ植物において、EPA、DHA、DPA（n3またはn6）、ARA、GLA、SDAおよび他のものを含む、1つまたは複数のPUFAを産生するように植物を遺伝的に操作することは、本発明の1つの特に好ましい態様である。本発明は、さまざまな比および形態にある、種々の「人工的に設計された油（designer oil）」の任意のものを作り出す能力を提供する。さらに、本明細書に記載した特定の海洋生物由来のPUFA PKS遺伝子は、PUFA産生の範囲をより容易に拡張し、大半の作物植物を成育させるために用いられる温度範囲内でそのようなPUFAを首尾よく産生させるための機会も提供する。
【０１４１】
したがって、本発明の1つの態様は、植物がPUFAを産生するように少なくともコアPUFA PKS酵素複合体を含む、ならびに1つの態様において少なくとも1つのPUFA PKSアクセサリータンパク質（例えばPPTase）を含む、遺伝的に改変された植物または植物の部分（例えば、ここで植物は本明細書に記載のPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている）に関する。好ましくは、植物は油糧種子植物であり、ここで油糧種子および／または油糧種子中の油はPUFA PKS系によって生成される油を含む。そのような油は、PUFA PKS系の生成物である、検出可能な量の少なくとも1つの標的または主PUFAを含む。加えて、そのような油は、標的または主PUFA生成物でなく、野生型植物において内因性FAS系によっては天然に産生されない中間体または副生成物を実質的に含まない（すなわち、野生型植物は、FAS系を介して炭素18個のPUFAなどのいくつかのより短鎖または中鎖のPUFAを産生するが、PUFA PKS系による遺伝的改変の結果として、植物において新たな、または追加的な脂肪酸が産生されると考えられる）。換言すれば、野生型植物（遺伝的に改変されていない）または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物からの総脂肪酸のプロフィールと比較して、追加的な脂肪酸（遺伝的改変に起因する新たな脂肪酸または増加した脂肪酸）の大半は、PUFA PKS系によって遺伝的に改変された植物によって産生される総脂肪酸のプロフィールにおいて、PUFA PKS系の標的とした、または意図したPUFA生成物で構成される（すなわち、遺伝的に改変された植物によって産生された総脂肪酸における追加的または新たな脂肪酸の大半は標的PUFAである）。
【０１４２】
さらに、PUFAを合成するための系の中間体もしくは副生成物を「実質的に含まない」、または実質的な量で存在する中間体もしくは副生成物を有しないとは、PUFAを生成するための酵素系の導入または存在の結果として、遺伝的に改変された植物（および／または植物の部分および／または種子油画分）において産生された、任意の中間体または副生成物の脂肪酸（標的でないPUFA）（すなわち、野生型植物または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物によっては産生されない）が、植物によって産生される総脂肪酸の約10重量％未満、より好ましくは植物によって産生される総脂肪酸の約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満、より好ましくは植物によって産生される総脂肪酸の約0.5重量％未満で存在することを意味する。
【０１４３】
1つの好ましい態様において、PUFAを合成するための系の中間体もしくは副生成物を「実質的に含まない」、または実質的な量で存在する中間体もしくは副生成物を有しないとは、PUFAを生成するための酵素系の結果として、遺伝的に改変された植物（および／または植物の部分および／または種子油画分）において産生された、任意の中間体または副生成物の脂肪酸（すなわち、野生型植物または標的PUFAの産生のための指定された遺伝的改変のレシピエントとして用いられる親植物によっては産生されない）が、追加的な脂肪酸produced by植物によって産生される追加的な総脂肪酸（追加的な脂肪酸は、野生型植物または標的PUFAの産生のための指定された遺伝的改変のレシピエントとして用いられる親植物によって天然に産生される脂肪酸または脂肪酸のレベルと定義される）の約10重量％未満、より好ましくは、植物によって産生される追加的な総脂肪酸の約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満で存在することを意味する。したがって、標準的経路を介してPUFAを産生するように遺伝的に改変された植物の脂肪酸プロフィールとは対照的に、PUFA PKS系による遺伝的改変に起因する脂肪酸生成物の大半は、標的とした、または意図した脂肪酸生成物であると考えられる。
【０１４４】
PUFA PKS系の標的生成物が、DHA、DPA（n-6またはn-3）またはEPAなどの長鎖PUFAである場合、そのようなPUFA PKSによって遺伝的に改変された植物の総脂質中に実質的な量では存在しない中間生成物および副生成物には、非限定的に含まれうる：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）およびさまざまな他の中間体または副生成物、例えば20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ11）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）；20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）など。加えて、標的生成物がDHAなどの特定のPUFAである場合には、遺伝的に改変された植物の総脂質中に実質的な量では存在しない中間体生成物および副生成物には、この例におけるEPAのような、異なるPUFA PKS系の天然生成物である他のPUFAを含む、他のPUFAも含まれる。本発明のPUFA PKS系を、所望であれば、GLA、SDAまたはDGLAを含みうるPUFAである標的PUFAを産生させるために用いることもできることに留意すべきである。
【０１４５】
本明細書に記載したようなPUFA PKS系の遺伝的基盤およびドメイン構造に関する知識を用いて、本発明者らは、そのようなPUFA PKS系をコードする構築物を設計および作製しており、PUFA PKS系を発現するトランスジェニック植物を作製することに成功した。これらのトランスジェニック植物は、PUFAを含む油を産生し、その油は標準的PUFA経路において蓄積する中間体生成物を実質的に含まない。本発明者らはまた、トランスジェニック植物の作製の前に、概念実証実験として、別の真核生物である酵母においてPUFAを産生させるための構築物の使用についても実証している。それらの例は、標的PUFAとしてDHAおよびDPAn-6を生成するPUFA PKS系による酵母および植物の形質転換がいずれも、これらのPUFAの両方を植物および酵母の総脂肪酸における主要な追加的な脂肪酸として産生すること（すなわち、野生型植物で産生される脂肪酸は差し引かれる）、ならびに、野生型植物または親植物の脂肪酸中に存在しない他の脂肪酸はいずれも事実上検出不能であったことを実証している。本発明の遺伝的に改変された植物ならびにその部分および油の具体的な特徴について、以下に詳述する。
【０１４６】
以上に考察したように、本発明において有用な、遺伝的に改変された植物は、PUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。PUFA PKS系には、例えば、米国特許6,566,583号；米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995号；およびPCT公開第WO 2006/135866号に記載されたいずれかのPUFA PKS系のような、任意のPUFA PKS系が含まれうる。PUFA PKS系は、シゾキトリウム属American Type Culture Collection（ATCC）番号20888およびそれから派生した変異株（例えば、N230D株）；ヤブレツボカビ属23B ATCC番号20892およびそれから派生した変異株；シュワネラ-オレヤナAustralian Collection of Antarctic Microorganism（ACAM）株番号644およびそれから派生した変異株；またはシュワネラ-ジャポニカATCC株番号BAA-316およびそれから派生した変異株由来のPUFA PKS系などの、これらの特許および特許公報において同定されて特徴づけられている具体的なPUFA PKS系から選択しうるが、それらには限定されない。
【０１４７】
1つの態様において、PUFA PKS系は、以上のPUFA PKS系の任意のものから選択されたドメインであって、以上に考察したような最低限の要件を満たす完全なPUFA PKS系を形成するように組み合わせられた（混合してマッチングさせた）ドメインを含む。また、植物を、PUFA PKS系におけるドメインの代わりになりうる、I型PKS系（反復またはモジュラー）、II型PKS系および／またはIII型PKS系を非限定的に含む、別のPKS系の少なくとも1つのドメインまたはその生物活性断片によって、さらに改変することもできる。さらに、PUFA PKS系のドメインのいずれかを、PUFA PKS系におけるそのドメインの機能を改変または強化するために（例えば、系によって生成されるPUFAのタイプまたはその比を改変するために）、天然の構造から改変することもできる。キメラ性PUFA PKSタンパク質を作製するための、ドメインのそのような混合は、以上に参照した特許および特許公報に記載されている。
【０１４８】
なお、以上に考察したように、植物の遺伝的改変には、コアPUFA PKS酵素複合体とともに働いて植物によるPUFAの産生を実現、促進または強化すると考えられる1つまたは複数のアクセサリータンパク質の導入が含まれうる。例えば、本発明は、PUFA PKS酵素複合体、およびPUFA PKS複合体とともに働くと考えられるPPTアーゼの両方をコードする核酸分子による植物の形質転換を含む。植物内部のTAGおよびPL画分へのPUFAの移行および蓄積を促進する任意の分子といった他のアクセサリー分子を、植物を形質転換するために用いることもできる。以上に考察した態様は、米国特許6,566,583号；米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995号；および米国仮出願第60/689,167号に詳細に記載されている。
【０１４９】
本明細書で用いる場合、遺伝的に改変された植物には、高等植物、特に任意の消費可能な植物または本発明の所望のPUFAを産生させるのに有用な植物を含む、任意の遺伝的に改変された植物が含まれうる。「植物の部分」とは、本明細書で用いる場合、種子（未熟または成熟）、油、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植片などを非限定的に含む、植物の任意の部分を含む。遺伝的に改変された植物は、所望の結果（すなわち、PUFA PKS活性またはPUFAの産生）が達成されるように、その正常な（すなわち、野生型または天然の）形態から改変された（すなわち、変異または変化した）ゲノムを有する。植物の遺伝的改変は、微生物の遺伝的改変は、古典的な系統開発および／または分子遺伝学の手法を用いて達成されうる。所望のアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子がその植物のゲノムに組み入れられているトランスジェニック植物を作製するための方法は、当技術分野で公知である。本発明に従って遺伝的に改変するのに好ましい植物は、ヒトを含む動物による消費に適した植物であることが好ましい。
【０１５０】
本発明に従って遺伝的に改変するのに好ましい植物（すなわち、植物宿主細胞）には、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、特に作物植物、とりわけその油のために用いられる植物を含む、消費可能な植物が含まれる。そのような植物には、例えば、以下のものが非限定的に含まれる：キャノーラ、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコ。他の好ましい植物には、医薬生成物、香味剤、ニュートラシューティカル薬、機能的食品成分もしくは美容的活性物質として用いられる化合物を産生することが知られているような植物、またはこれらの化合物／作用物質を産生するように遺伝的に操作された植物が含まれる。
【０１５１】
本発明によれば、遺伝的に改変された植物には、古典的な突然変異誘発およびスクリーニング手法と組み合わせることのできる、組換え技術を用いてに改変された植物が含まれる。本明細書で用いる場合、遺伝子発現の低下、遺伝子の機能の低下、遺伝子産物（すなわち、遺伝子によりコードされるタンパク質）の機能の低下をもたらす遺伝的改変は、遺伝子の不活性化（完全または部分的）、欠失、中断、遮断またはダウンレギュレーションと呼ぶことができる。例えば、そのような遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の低下をもたらす遺伝子における遺伝的改変は、遺伝子の完全な欠失（すなわち、遺伝子が存在しない、そのためタンパク質が存在しない）、タンパク質の不完全な翻訳をもたらすもしくはタンパク質の翻訳をもたらさない（例えば、タンパク質が発現されない）遺伝子における突然変異、またはタンパク質の本来の機能を低下させるもしくは消失させる（例えば、低下した酵素活性もしくは作用を有する、または酵素活性もしくは作用を有しないタンパク質が発現される）遺伝子における突然変異の結果でありうる。遺伝子発現または機能の増加をもたらす遺伝的改変は、遺伝子の増幅、過剰産生、過剰発現、活性化、増強、付加またはアップレギュレーションと呼ぶことができる。
【０１５２】
本発明による植物の遺伝的改変は、植物による1つまたは複数のPUFAの産生をもたらす。植物によって産生されるPUFAプロフィールおよびPUFAの比は、PUFA PKS系の由来となった生物によって産生されるPUFAプロフィールおよびPUFAの比と必ずしも同じである必要はない。
【０１５３】
遺伝的に改変された植物の作製に関して、植物の遺伝子工学のための方法も当技術分野で周知である。例えば、生物的および物理的な形質転換プロトコールを含む、植物形質転換のためのさまざまな方法が開発されている。例えば、Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, BR. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88を参照されたい。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養方法も入手可能である。例えば、Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119を参照されたい。
【０１５４】
植物に発現ベクターを導入するために最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然の形質転換系に基づく。例えば、Horsch et al., Science 227:1229 (1985)を参照されたい。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびA.リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性の土壌細菌である。A.ツメファシエンスおよびA.リゾゲネスのそれぞれTiおよびRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を保有する。例えば、Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウムを介した遺伝子導入の方法に関する記載は、Gruber et al., 前記、Miki et al., 前記、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)、ならびに米国特許第4,940,838号および同第5,464,763号を含む、多くの参考文献によって提供されている。
【０１５５】
植物形質転換のもう1つの一般に適用可能な方法は、DNAが微小発射体（microprojectile）の表面で運搬される、微小発射体を介した形質転換である。発現ベクターは、植物細胞壁および膜を貫通させるのに十分なスピードにまで微小発射体を加速する遺伝子銃装置を用いて植物組織に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【０１５６】
植物に対するDNAの物理学的送達のためのもう1つの方法は、標的細胞の超音波処理である。Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)。または、リポソームまたはスフェロプラスト融合が、発現ベクターを植物に導入するために用いられている。Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)。CaCl2沈降、ポリビニルアルコールまたはポリ-L-オルニチンを用いたプロトプラストへのDNAの直接的な取込みも報告されている。Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)およびDraper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)。プロトプラストならびに全細胞および組織のエレクトロポレーションも記載されている。Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990)；D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992)およびSpencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)。
【０１５７】
プラスチドまたは葉緑体に対する遺伝子産物のターゲティングは、さまざまなタンパク質のアミノ末端に見いだされ、輸入時に切断されて成熟タンパク質を生じるシグナル配列によって制御される（例えば、葉緑体ターゲティングについては、例えば、Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)を参照）。異種産物の葉緑体への輸入を生じさせるために、これらのシグナル配列を異種遺伝子産物と融合させることができる（van den Broeck et al. Nature 313: 358-363 (1985)）。RUBISCOタンパク質、CABタンパク質、EPSPシンターゼ酵素、GS2タンパク質、および葉緑体に局在することが知られている他の多くのタンパク質をコードするcDNAから、適切なシグナル配列をコードするDNAを単離することができる。
【０１５８】
前駆体を葉緑体輸入機構に向かわせる葉緑体ターゲティングペプチドをアミノ末端に含むより大きな前駆体タンパク質として合成された、葉緑体を標的とする天然のタンパク質が当技術分野で周知である。葉緑体ターゲティングペプチドは一般に、葉緑体オルガネラ内部に位置する特異的なエンドプロテアーゼによって切断され、それにより、標的とされた成熟型の、好ましくは活性のある酵素が前駆体から葉緑体環境内に放出される。植物細胞の葉緑体またはプラスチドに対して遺伝子または遺伝子産物のターゲティングを向けさせるのに適したペプチドをコードする配列の例には、ペチュニアEPSPS CTP、アラビドプシスEPSPS CTP2およびイントロン、ならびに当業者に公知である他のものが含まれる。そのようなターゲティング配列は、所望の発現されたタンパク質をそれが最も効果的に機能する細胞構造に移行させる、または所望の発現されたタンパク質を所望の表現型機能のために必要な細胞プロセスが集中している細胞領域に移行させる。葉緑体ターゲティングペプチドの具体的な例は当技術分野で周知であり、これにはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットats1A移行ペプチド、シロイヌナズナのEPSPS移行ペプチドおよびトウモロコシ（Zea maize）のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット移行ペプチドが含まれる。
【０１５９】
最適化された移行ペプチドは、例えば、Van den Broeck et al., "Targeting of a foreign protein to chloroplasts by fusion to the transit peptide from the small subunit of ribulose 1,5-biphosphate carboxylase", Nature, 313:358-363 (1985)によって記載されている。原核生物および真核生物シグナル配列は、例えば、Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425によって開示されている。本発明に用いうる移行ペプチドのそのほかの例には、Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126(1991)；Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987)；Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)に記載されたもののような葉緑体移行ペプチドが含まれる。Chen & Jagendorf（J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993)）は、異種導入遺伝子の輸入のための葉緑体移行ペプチドの使用を記載している。用いられたこのペプチドは、ニコチアナ-プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）由来のrbcS遺伝子からの移行ペプチドである（Poulsen et al. Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)）。本明細書において異種タンパク質を葉緑体に局在させるのに機能した1つのCTPは、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼに由来した（例えば、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼの配列について、Loader et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23: 769-778; Loader et al., 1995, Plant Physiol. 110:336-336を参照されたい ）。
【０１６０】
遺伝子を葉緑体またはプラスチドに局在させるための代替的な手段には、葉緑体またはプラスチドの形質転換が含まれる。本出願で想定している分子を組み入れるために葉緑体DNAのみが改変された組換え植物を作製することができる。葉緑体において機能するプロモーターは当技術分野で公知である （Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12:67-70, 1987）。異種DNAが挿入された葉緑体を含む細胞を入手するための方法および組成物は、例えば、Daniellら（米国特許第5,693,507号；1997）およびMaligaら（米国特許第5,451,513号；1995）によって記載されている。
【０１６１】
したがって、本発明に含まれるのは、ある種の海洋細菌および任意のヤブレツボカビ科または他の真核生物のPUFA PKS系からの遺伝子を利用することによって、植物細胞を遺伝的に改変するための方法であり、さらに、EPA、DHA、DPA（n-3またはn-6）、ARA、GLA、SDAおよび他のものを含むようにPUFA産物の範囲を拡張および／または変更するための遺伝子混合も利用することができる。これらの改変されたPUFA産生プロフィールを得るための方法には、種々の生物由来の遺伝子をヤブレツボカビ科PUFA PKS遺伝子の中に混合することだけでなく、本明細書に開示した内因性ヤブレツボカビ科PUFA PKS遺伝子を遺伝的に改変するさまざまな方法も含まれる。ヤブレツボカビ科PUFA PKS系および海洋細菌PUFA PKS系の遺伝的基盤およびドメイン構造に関する知識は、種々のPUFAプロフィールを生じる新規な遺伝的に改変された生物を設計するための基盤を提供する。ヤブレツボカビ科または大腸菌などの微生物において調製された新規PUFA PKS構築物を単離して、類似のPUFA産生特性を植物に対して付与する目的で植物を形質転換するために用いることができる。本発明に含まれるPUFA PKS系の特定の改変に関する詳細な考察は、例えば、米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；および米国特許出願公開第20050100995号に記載されている。
【０１６２】
遺伝的に改変された植物は、好ましくは、発酵培地中で培養するか、または土壌のような適した培地中で成育させる。適切または有効な発酵培地は、上記に詳細に論じられている。高等植物のために適した増殖培地には、土壌、砂、根の成長を補助するその他の任意の粒状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）または水耕栽培、ならびに適当な光、水および高等植物の成長を最適化する栄養補給剤を非限定的に含む、植物のための任意の増殖培地が含まれる。本発明の遺伝的に改変された植物は、PUFA PKS系の活性を通じてPUFAを産生するように操作されている。PUFAは、植物から化合物を抽出する精製工程を通じて回収することができる。1つの好ましい態様において、PUFAは植物を収集することによって回収される。1つの特に好ましい態様において、PUFAは植物から油を収集することによって回収される。植物はその自然の状態で消費されてもよく、または消費可能な産物へさらに加工処理されてもよい。
【０１６３】
好ましくは、本発明の遺伝的に改変された植物は、EPA（C20:5、n-3）、DHA（C22:6、n-3）、DPA（C22:5、n-6またはn-3）、ARA（C20:4、n-6）、GLA（C18:3、n-6）、ALA（C18:3、n-3）、および／またはSDA（C18:4、n-3））を非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸、より好ましくは、EPA（C20:5、n-3）、DHA（C22:6、n-3）、DPA（C22:5、n-6またはn-3）またはDTA（C22:4、n-6）を非限定的に含む、1つまたは複数の長鎖脂肪酸（LCPUFA）を産生する。1つの特に好ましい態様において、本発明の遺伝的に改変された植物は、EPA（C20:5、n-3）、DHA（C22:6、n-3）および／またはDPA（C22:5、n-6またはn-3）を非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する。
【０１６４】
したがって、本発明の1つの態様は、植物、好ましくは油糧種子植物であって、少なくとも1つのPUFA（標的PUFA）を産生し（例えば、油糧種子植物であればその成熟種子中に、または油糧種子植物の種子の油の中に）、かつ、植物またはPUFAが蓄積する植物の部分（例えば、植物が油糧種子植物であれば成熟種子、または油糧種子植物の種子の油）における総脂肪酸プロフィールが検出可能な量のこの1つまたは複数のPUFAを含む植物に関する。好ましくは、標的PUFAは少なくとも20炭素型のPUFAであって、少なくとも3つの二重結合を有し、好ましくは少なくとも4つの二重結合、さらにより好ましくは少なくとも5つの二重結合を有する。さらに、標的PUFAは好ましくは、植物（すなわち、遺伝的改変が存在しない野生型植物、または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物）によって天然には産生されないPUFAである。好ましくは、植物における、またはPUFAが蓄積する植物の部分（植物の種子油を含む）における総脂肪酸プロフィールは、標的PUFAを総脂肪酸の少なくとも0.1重量％含み、より好ましくは、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（標的PUFAまたはPUFA）を、植物によって産生される総脂肪酸の少なくとも約0.2重量％、より好ましくは少なくとも約0.3重量％、より好ましくは少なくとも約0.4重量％、より好ましくは少なくとも約0.5重量％、より好ましくは少なくとも約1重量％、より好ましくは少なくとも約1.5重量％、より好ましくは少なくとも約2重量％、より好ましくは少なくとも約2.5重量％、より好ましくは少なくとも約3重量％、より好ましくは少なくとも約3.5重量％、より好ましくは少なくとも約4重量％、より好ましくは少なくとも約4.5重量％、より好ましくは少なくとも約5重量％、より好ましくは少なくとも約5.5重量％、より好ましくは少なくとも約10重量％、より好ましくは少なくとも約15重量％、より好ましくは少なくとも約20重量％、より好ましくは少なくとも約25重量％、より好ましくは少なくとも約30重量％、より好ましくは少なくとも約35重量％、より好ましくは少なくとも約40重量％、より好ましくは少なくとも約45重量％、より好ましくは少なくとも約50重量％、より好ましくは少なくとも約55重量％、より好ましくは少なくとも約60重量％、より好ましくは少なくとも約65重量％、より好ましくは少なくとも約70重量％、より好ましくは少なくとも約75重量％、より好ましくは75重量％超、または標的PUFAの0.1重量％から75重量％または75重量％超（最大で100重量％または約100重量％）までの0.1重量％刻みでの任意のパーセンテージで含む。本明細書で一般的に用いる場合、PUFA産生のパーセンテージ量に対する言及は、別に指定する場合を除き、生物によって産生される総脂肪酸に対する重量比である（例えば、場合によっては、重量比でのパーセンテージは、PUFA PKS系などの酵素複合体によって生成される総脂肪酸に対するものである）。1つの態様において、植物によって産生される総脂肪酸は、脂肪酸メチルエステル（FAME）調製物のガスクロマトグラフィー（GC）分析によって決定される重量パーセントとして提示されるが、総脂肪酸の決定はこの方法には限定されない。
【０１６５】
上記のように、これらの植物によって産生される総脂肪酸が、標的PUFAを生成する酵素複合体によって生成される標的PUFA以外の、任意の脂肪酸を約10重量％未満含む（またはそれ以上で含まない）ことは、上記の植物（および／または植物の部分または種子油画分）によって産生される総脂肪酸のさらなる特徴である。好ましくは、標的PUFA以外の、標的PUFAを生成する酵素複合体によって（例えば、標的PUFAを生成する酵素または酵素複合体による植物の遺伝的改変の結果として）生成される任意の脂肪酸は、植物によって産生される総脂肪酸の約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満を構成する。
【０１６６】
もう1つの態様において、標的PUFA以外の、標的PUFAを生成する酵素複合体によって生成される任意の脂肪酸は、植物において標的PUFAを生成する酵素複合体によって生成される総脂肪酸の約10重量％未満を構成し（またはそれ以上で含まない）（すなわち、この測定は、標的PUFAを生成する酵素複合体によって生成されるような総脂肪酸に限定される）、より好ましくは、植物において標的PUFAを生成する酵素複合体によって生成される総脂肪酸の約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満、より好ましくは約0.5重量％未満を構成する。
【０１６７】
この態様のもう本発明の1つの局面において、植物（および／または植物の部分または種子油画分）によって産生される総脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物（遺伝的に改変されていない）に、もしくは指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物に存在するPUFA以外の、18個またはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される総脂肪酸の10重量％未満含む（またはそれ以上で含まない）。さらなる局面において、植物（および／または植物の部分または種子油画分）によって産生される総脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物（遺伝的に改変されていない）または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物に存在するPUFA以外の、18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される総脂肪酸の9重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを8重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを7重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを6重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを5重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを4重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを3重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを2重量％未満、または18個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを1重量％未満含む。
【０１６８】
この態様のもう本発明の1つの局面において、植物（および／または植物の部分または種子油画分）によって産生される総脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物（遺伝的に改変されていない）または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物に存在するPUFA以外の、20個またはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される総脂肪酸の10重量％未満含む（またはそれ以上で含まない）。さらなる局面において、植物（および／または植物の部分または種子油画分）によって産生される総脂肪酸は、標的PUFA、または野生型植物（遺伝的に改変されていない）または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物に存在するPUFA以外の、20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを、植物によって産生される総脂肪酸の9重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを8重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを7重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを6重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを5重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを4重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを3重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを2重量％未満、または20個もしくはそれ以上の炭素を有するPUFAを1重量％未満含む。
【０１６９】
1つの態様において、植物（および／または植物の部分または種子油画分）における総脂肪酸は、以下の任意の1つまたは複数から選択される脂肪酸を、植物によって産生される総脂肪酸の約10重量％未満、より好ましくは約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満含む：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）およびさまざまな他の脂肪酸、例えば20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ11）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）；20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）など。
【０１７０】
もう1つの態様において、植物において長鎖PUFAを生成する酵素系によって生成される脂肪酸は、以下から選択される脂肪酸：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）およびさまざまな他の脂肪酸、例えば20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ11）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）；20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）などを、植物によって産生される総脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量％未満含み、より好ましくは、以下から選択される脂肪酸を、約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満含む：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）およびさまざまな他の脂肪酸、例えば、20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ11）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）；20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）など。
【０１７１】
もう1つの態様において、植物において長鎖PUFAを生成する酵素系によって生成される脂肪酸は、以下のPUFA：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのすべてを、植物によって産生される総脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量％未満含み、より好ましくは、以下のPUFA：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのすべてを、約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満含む。
【０１７２】
もう1つの態様において、植物において長鎖PUFAを生成する酵素系によって生成される脂肪酸は、以下のPUFA：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのそれぞれを、植物によって産生される総脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量％未満含み、より好ましくは、以下のPUFA：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのそれぞれを、約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満含む。
【０１７３】
もう1つの態様において、植物において長鎖PUFAを生成する酵素系によって生成される脂肪酸は、以下のPUFA：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのうち任意の1つまたは複数を、植物によって産生される総脂肪酸に占めるパーセンテージとして約10重量％未満含み、より好ましくは、以下のPUFA：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）、18個の炭素および4つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、20個の炭素および3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFA、ならびに22個の炭素および2つまたは3つの炭素-炭素二重結合を有するPUFAのうち任意の1つまたは複数を、約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満含む。
【０１７４】
本発明のこの態様の1つの局面において、植物は少なくとも2つの標的PUFAを産生し、植物またはPUFAが蓄積する植物の部分（油糧種子からの油を含む）における総脂肪酸プロフィールは、検出可能な量のこれらのPUFAを含む。この態様において、PUFAは好ましくは、それぞれ少なくとも20炭素型のPUFAであって、しかも少なくとも3つの二重結合を含み、好ましくは少なくとも4つの二重結合、さらにより好ましくは少なくとも5つの二重結合を含む。そのようなPUFAは、最も好ましくは、DHA、DPAn-6およびEPAから選択される。1つの局面において、植物はDHAおよびDPAn-6を産生し、DHAとDPAn-6との比は約1：10〜約10：1であり、それらの間の任意の比を含む。1つの態様において、DHAとDPAとの比は約1：1〜約3：1であり、もう1つの態様においては約2.5：1である。1つの態様において、植物はDHAおよびEPAを産生する。
【０１７５】
もう本発明のこの態様の1つの局面において、植物は図3によって表された総脂肪酸プロフィールを生じる。
【０１７６】
本発明はさらに、本明細書に記載した植物によって産生される任意の種子、ならびに本明細書に記載した植物または種子によって産生される任意の油を含む。本発明はまた、本明細書に記載した植物、種子または油を用いて生産される任意の生成物も含む。
【０１７７】
好ましくは、以上に特定した特徴のいずれかを有する植物は、本明細書に詳述したようなPUFA PKS系（PUFAシンターゼ）を発現するように遺伝的に改変された植物である（すなわち、PUFA PKS系は、植物において標的PUFAを生成する酵素系である）。1つの態様において、植物は、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、ジャポノキトリウム属、アプラノキトリウム属、アルトルニア属（Althornia）またはエリナ属を非限定的に含むヤブレツボカビ科生物由来のPUFA PKSタンパク質／ドメインで構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。1つの態様において、植物は、ラビリンチュラ科生物由来のPUFA PKSタンパク質／ドメインから構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。もう1つの態様において、植物は、シュワネラ-ジャポニカまたはシュワネラ-オレヤナを非限定的に含む海洋細菌由来のPUFA PKSタンパク質／ドメインから構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。1つの態様において、植物は、上記のようなシゾキトリウム属のOrfsA、BおよびC（その相同体または合成バージョンを含む）ならびにPPTアーゼ（例えば、HetI）（例えば、SEQ ID NO：1〜32およびSEQ ID NO：33ならびに上記のシゾキトリウム属PUFA PKS系の考察を参照）から構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。もう1つの態様において、植物は、上記のようなヤブレツボカビ属のOrfsA、BおよびC（その相同体または合成バージョンを含む）ならびにPPTアーゼ（例えば、HetI）（例えば、SEQ ID NO：38〜68およびSEQ ID NO：33、ならびに上記のヤブレツボカビ属PUFA PKS系の考察を参照；同じく米国特許出願公開第20050014231号も参照されたい）から構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。もう1つの態様において、植物は、上記のような他のヤブレツボカビ科のOrfsA、BおよびC（その相同体または合成バージョンを含む）ならびにPPTアーゼ（例えば、HetI）（例えば、PCT特許公報第WO 05/097982号を参照）から構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。もう1つの態様において、植物は、上記のようなシュワネラ属などの海洋細菌由来のPUFA PKS Orfs（その相同体または合成バージョンを含む）ならびにPPTアーゼ（例えば、内因性シュワネラPPTアーゼ）（例えば、シュワネラ-ジャポニカについてはSEQ ID NO：1〜6、シュワネラ-オレヤナについてはSEQ ID NO：7〜12を参照）から構成されるPUFA PKS系を発現するように遺伝的に改変されている。もう1つの態様において、植物は、そのようなPUFA PKS系からのドメインおよびタンパク質の任意の組み合わせ（例えば、キメラ性PUFA PKS系）を発現するように遺伝的に改変されている。
【０１７８】
本発明はさらに、本明細書に記載した植物によって産生される任意の種子、ならびに本明細書に記載した植物または種子によって産生される任意の油を含む。本発明はまた、本明細書に記載した植物、種子または油を用いて生産される任意の生成物も含む。
【０１７９】
本発明の1つの態様は、少なくとも1つの脂肪酸を含む産物を改変するための方法であって、産物に対して、植物、植物の部分、種子、または本発明に従って本明細書に記載したように遺伝的に改変された植物によって産生された油を添加する段階を含む方法に関する（例えば、PUFA PKS系によって遺伝的に改変された植物は、本明細書に記載した脂肪酸プロフィールを有する）。本方法によって生産された、または任意の植物、植物の部分、種子、もしくは本明細書に記載した植物からの油を一般に含む産物も、本発明に含まれる。
【０１８０】
好ましくは、産物は、食品、栄養補助食品、医薬製剤、ヒト化動物乳および乳幼児用調合乳からなる群より選択される。適切な医薬製剤には、抗炎症製剤、化学療法薬、活性添加剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター-ピロリ（Helicobactor pylori）薬、神経変性疾患の治療薬、変性肝疾患の治療薬、抗生物質、およびコレステロール低下製剤が非限定的に含まれる。1つの態様において、産物は、以下からなる群より選択される病状を治療するために用いられる：慢性炎症、急性炎症、胃腸障害、癌、悪液質、心臓再狭窄、神経変性疾患、肝臓の変性疾患、血中脂質疾患、骨粗鬆症、骨関節炎、自己免疫疾患、子癇前症、早産、加齢性黄斑症、肺疾患およびペルオキシソーム病。
【０１８１】
適切な食品には、上質なベーカリー製品、パンおよびロールパン、朝食用シリアル、加工および非加工チーズ、香辛料（ケチャップ、マヨネーズなど）、乳製品（ミルク、ヨーグルト）、プリンおよびゼラチンデザート、炭酸飲料、茶、粉末飲料ミックス、加工魚製品、果物飲料、チューインガム、固形型菓子類、冷凍乳製品、加工肉製品、ナッツおよびナッツのスプレッド、パスタ、加工家禽肉製品、肉汁およびソース、ポテトチップスおよび他のチップスまたはクリスプ、チョコレートおよび他の菓子類、スープおよびスープミックス、大豆製品（ミルク、飲料、クリーム、漂白剤）、植物油をベースとするスプレッド、ならびに野菜飲料が非限定的に含まれる。
【０１８２】
一般的な定義
本発明によれば、「ヤブレツボカビ科生物（thraustochytrid）」という用語は、ヤブレツボカビ科（Thraustochytriaceae）を含む、ヤブレツボカビ目の任意のメンバーのことを指し、「ラビリンチュラ科生物（Labyrinthulid）」という用語は、ラビリンチュラ科（Labyrinthulaceae）を含む、ラビリンチュラ目の任意のメンバーのことを指す。ラビリンチュラ科のメンバーは一時、ヤブレツボカビ目のメンバーであると考えられていたが、そのような生物の分類法のさらに最近の改訂により、この科は現在ではラビリンチュラ目のメンバーであると考えられており、ラビリンチュラ目およびヤブレツボカビ目は両方ともラビリンチュラ菌門（Labyrinthulomycota）のメンバーと考えられている。進展の結果、ヤブレツボカビ科生物およびラビリンチュラ科生物の分類は頻繁に改訂されている。しかし、分類学の理論家は現在は一般に、これらの微生物の両方の群を、ストラメノパイル（stramenopile）の系譜に属する藻類または藻類様原生生物に位置づけている。ヤブレツボカビ科生物およびラビリンチュラ科生物の現在の分類法上の位置づけは以下のようにまとめることができる。
界：ストラメノパイル（クロミスタ）
門：ラビリンチュラ菌門
網：ラビリンチュラ網（Labyrinthulomycetes）
目：ラビリンチュラ目
科：ラビリンチュラ科
目：ヤブレツボカビ目
科：ヤブレツボカビ科
【０１８３】
しかしながら、分類法上の不確定性は残るため、本発明においてヤブレツボカビ科生物として記載した菌株には以下の生物が含まれると考えることが、本発明の目的には最善であると考えられる：目：ヤブレツボカビ目；科：ヤブレツボカビ科；属：ヤブレツボカビ属（種：アルヂメンタレ（arudimentale）、アウレウム、ベンチコラ（benthicola）、グロボサム（globosum）、キネイ（kinnei）、モチバム（motivum）、マルチルジメンテール（multirudimentale）、パキデルマム（pachydermum）、プロリフェルム（proliferum）、ローゼウム（roseum）、ストリアツム（striatum））、ウルケニア属（種：アメーボイデア（amoeboidea）、ケルゲレンシス（kerguelensis）、ミヌタ（minuta）、プロファンダ（profunda）、ラジアタ（radiata）、サイレンス（sailens）、サルカリアナ（sarkariana）、シゾキトロプス（schizochytrops）、ビスルゲンシス（visurgensis）、ヨーケンシス（yorkensis））、シゾキトリウム属（種：アグレガツム（aggregatum）、リムナセウム（limnaceum）、マングロベイ（mangrovei）、ミヌツム（minutum）、オクトスポルム（octosporum））、ジャポノキトリウム属（種：マリナム（marinum））、アプラノキトリウム属（種：ハリオチディス（haliotidis）、ケルグエレンシス（kerguelensis）、プロファンダ（profunda）、ストッキノイ（stocchinoi））、アルトルニア属（種：クロウキイ（crouchii））またはエリナ属（種：マリサルバ（marisalba）、シノリフィカ（sinorifica））。ウルケニア属に関する原記載は論文審査を要するジャーナル誌には掲載されていないため、この属およびそれに属すると位置づけられた種の正当性については若干疑問が残っていることに留意されたい。本発明の目的において、ウルケニア属に属するとして記載された種は、ヤブレツボカビ属のメンバーであるとみなすことが考えられる。
【０１８４】
本発明においてラビリンチュラ科生物として記載した菌株には、以下の生物が含まれる：目：ラビリンチュラ目、科：ラビリンチュラ科、属：ラビリンチュラ属（種：アルジェリエンシス（algeriensis）、コエノシスチス（coenocystis）、シャトニイ（chattonii）、マクロシスチス（macrocystis）、マクロシスチス-アトランティカ（macrocystis atlantica）、マクロシスチス-マクロシスチス（macrocystis macrocystis）、マリナ（marina）、ミヌタ（minuta）、ロスコフェンシス（roscoffensis）、バルカノビイ（valkanovii）、ビテリナ（vitellina）、ビテリナ-パシフィカ（vitellina pacifica）、ビテリナ-ビテリナ（vitellina vitellina）、ゾプフィイ（zopfii））、ラビリンチュロイデス属（種：ハロチディス（haliotidis）、ヨルケンシス（yorkensis））、ラビリントミキサ属（種：マリナ（marina））、ディプロフリス属（Diplophrys）（種：アーケリ（archeri））、ピロソラス属（Pyrrhosorus）（種：マリヌス（marinus））、ソロジプロフリス属（Sorodiplophrys）（種：ステルコレア（stercorea））またはクラミドミクサ属（Chlamydomyxa）（種：ラビリンチュロイデス（labyrinthuloides）、モンタナ（montana））（しかし、ピロソラス属、ソロジプロフリス属またはクラミドミクサ属の正確な分類法上の位置づけについては現時点で合意は得られていない）。
【０１８５】
本発明によれば、PUFA PKS系からのタンパク質またはペプチドなどの、単離されたタンパク質またはペプチドとは、その天然の環境から取り出された（すなわち、人為的な操作を受けた）タンパク質またはその断片（ポリペプチドまたはペプチドを含む）のことであり、これには例えば、精製されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、組換的に産生されたタンパク質、および合成的に生成されたタンパク質が含まれうる。このため、「単離された」タンパク質は、タンパク質が精製される程度を反映しない。好ましくは、本発明の単離されたタンパク質は、組換え的に産生される。単離されたペプチドは、合成的に（例えば、ペプチド合成などによって化学的に）または組換え的に生産することができる。
【０１８６】
本発明によれば、「改変」および「突然変異」という用語は、特に、本明細書に記載したタンパク質またはペプチドの一次アミノ酸配列（または核酸配列）に対する改変／突然変異に関して互換的に用いることができる。「改変」という用語はまた、メチル化、ファルネシル化、カルボキシメチル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、および／またはアミド化を非限定的に含む、タンパク質またはペプチドに対する翻訳後修飾を記載するために用いることができる。改変にはまた、例えば、別の化合物とのタンパク質またはペプチドの複合体化が含まれうる。そのような改変は、例えば、その改変が天然の、野生型タンパク質またはペプチドで起こる翻訳後修飾とは異なる場合には、突然変異であると考えることができる。
【０１８７】
本明細書で用いる場合、「相同体」という用語は、天然のタンパク質またはペプチドに対する1つまたは複数の軽微な改変または突然変異によって天然のタンパク質またはペプチド（すなわち、「原型」または「野生型」タンパク質）とは異なるが、天然型の全体的な基本タンパク質および側鎖の構造を維持する（すなわち、相同体が野生型タンパク質と関連していると同定可能であるように）タンパク質またはペプチドを指して用いられる。そのような変化には、1個もしくは数個のアミノ酸側鎖の変化；欠失（例えば、タンパク質もしくはペプチドの短縮型）、挿入および／もしくは置換を含む、1個もしくは数個のアミノ酸の変化；1個もしくは数個の原子の空間的配置の変化；ならびに／または以下を非限定的に含む軽微な誘導体化：メチル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシル化、カルボキシメチル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、および／もしくはアミド化。相同体は、天然のタンパク質またはペプチドと比較して強化した、低下した、または実質的に類似した特性を有することができる。PUFA PKSタンパク質またはドメインの好ましい相同体は、以下に詳細に記載される。相同体は、合成によって生産された相同体、所定のタンパク質もしくはドメインの天然の対立遺伝子変異体、またはその参照配列が由来する生物以外の生物からの相同的配列を含みうることを指摘しておく。
【０１８８】
保存的置換は典型的には、次の群の内部での置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。また、置換が、保存された疎水性または親水性に基づいて（Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105 (1982)）、または類似のポリペプチド二次構造をとる能力に基づいて（Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45 (1978)）、施されてもよい。
【０１８９】
相同体は、天然の対立遺伝子変異または天然の突然変異の結果であってよい。タンパク質をコードする核酸の天然の対立遺伝子変異体は、そのようなタンパク質をコードするが、例えば、突然変異または組換えにより引き起こされる天然の変異によって、類似するが同一ではない配列を有する遺伝子とゲノム中で本質的に同じ遺伝子座（または座位）に生じる遺伝子である。対立遺伝子変異体は典型的には、それらが比較されている遺伝子によってコードされるタンパク質のものと類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子変異体の1つのクラスは、同じタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重性のために異なる核酸配列を有することができる。対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の5'または3'非翻訳領域に（例えば、調節制御領域に）変化を含むこともできる。対立遺伝子変異体は当業者に周知である。
【０１９０】
相同体は、単離された天然のタンパク質に対する直接的な改変、直接的なタンパク質合成、または、例えば、ランダムもしくは標的指向的な突然変異誘発をもたらす古典的なもしくは組換えDNA手法を用いてのタンパク質をコードする核酸配列に対する改変を非限定的に含む、タンパク質の作製のための当技術分野で公知の技術を用いて作製することができる。
【０１９１】
野生型タンパク質と比べて、タンパク質相同体における改変または突然変異は、天然の（野生型）タンパク質と比べて相同体の基礎生物活性を増大させる、減少させる、または実質的に変化させないかのいずれかである。一般に、タンパク質の生物活性または生物作用とは、インビボ（すなわち、そのタンパク質の自然な生理的環境において）またはインビトロ（すなわち、実験室条件下）で測定または観察される、そのタンパク質の天然の型に帰するそのタンパク質によって呈示または遂行される任意の機能を指す。PUFA PKS系およびPUFA PKS系を構成している個々のタンパク質／ドメインの生物活性は、本明細書の他の箇所ならびに参照した特許および出願に詳細に記載されている。相同体などにおけるタンパク質の改変は、結果として、その天然のタンパク質と同じ生物活性を有するタンパク質、またはその天然のタンパク質と比較して減少もしくは増加した生物活性を有するタンパク質を生じうる。タンパク質の発現における減少または活性における減少を生じる改変は、タンパク質の不活性化（完全または部分的な）、ダウンレギュレーション、または低下した作用（または活性）と称しうる。同様に、タンパク質の発現の増加または活性の上昇をもたらす改変は、タンパク質の増幅、過剰産生、活性化、増強、アップレギュレーションまたは増大した作用（または活性）と称することができる。野生型タンパク質の生物活性を有する相同体に対する一般的な言及は、相同体が生物活性のレベルに関してとりわけ、野生型タンパク質と必ずしも同一の生物活性を有することを意味するわけではないことを指摘しておく。むしろ、相同体は野生型タンパク質と同じ生物活性を、しかし野生型タンパク質と比べて低下したまたは増加したレベルの活性で遂行することができる。PUFA PKS系の機能ドメインは、生物機能を遂行する能力がある（すなわち、生物活性を有する）ドメイン（すなわち、ドメインはタンパク質の部分でありうる）である。
【０１９２】
PUFA PKSタンパク質またはドメインの活性を検出および測定する方法には、PUFA PKS遺伝子の転写の測定、PUFA PKSタンパク質またはドメインの翻訳の測定、PUFA PKSタンパク質またはドメインの翻訳後修飾の測定、PUFA PKSタンパク質またはドメインの酵素活性の測定、および／またはPUFA PKS系の1つもしくは複数の産物の産生（例えば、PUFAの産生）の測定が非限定的に含まれる。本発明の単離タンパク質（相同体を含む）は必ずしも野生型タンパク質の生物活性を有する必要がないことを指摘しておく。例えば、PUFA PKSタンパク質またはドメインは、例えば、短縮タンパク質、突然変異タンパク質または不活性なタンパク質であってもよい。そのようなタンパク質は、例えばスクリーニングアッセイ法において、または抗体産生などの他の目的に有用である。1つの好ましい態様において、本発明の単離されたタンパク質は、野生型タンパク質のものに類似する（以上で考察したように、必ずしも等価である必要はないが）生物活性を有する。
【０１９３】
タンパク質発現レベルを測定する方法には一般に、ウェスタンブロット法、イムノブロット法、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）法、ラジオイムノアッセイ（RIA）法、免疫沈降法、表面プラスモン共鳴法、化学発光法、蛍光偏光法、リン光、免疫組織化学分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析法、マイクロサイトメトリー法、マイクロアレイ法、顕微鏡検査、蛍光活性化細胞分取（FACS）法、およびフローサイトメトリー、ならびに酵素活性またはその他のタンパク質パートナーとの相互作用を非限定的に含むタンパク質の特性に基づくアッセイが非限定的に含まれる。結合アッセイ法も当技術分野で周知である。例えば、BIAcore機器を用いて、2つのタンパク質間の複合体の結合定数を測定することができる。複合体の解離定数は、緩衝液がチップを通過する際の時間に対する屈折率の変化をモニターすることによって測定することができる（O'Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457  (1993)；Schuster et al., Nature 365:343  (1993)）。あるタンパク質の別のタンパク質との結合を測定するのに適したその他のアッセイ法には、例えば、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）などのイムノアッセイ法、または蛍光、UV吸収、円偏光二色性、もしくは核磁気共鳴（NMR）を通じたタンパク質の分光学的もしくは光学的特性の変化のモニタリングによる結合の測定が含まれる。
【０１９４】
本発明によれば、本明細書に記載した核酸またはアミノ酸配列に関する「隣接した」または「連続した」という用語は、間断のない配列として連結されていることを意味する。例えば、第1の配列が第2の配列の30個の隣接した（または連続した）アミノ酸を含むとは、その第1の配列が、第2の配列における30個のアミノ酸残基の間断のない配列と100％同一である30個のアミノ酸残基の間断のない配列を含むことを意味する。同様に、第1の配列が第2の配列と「100％の同一性」を有するとは、その第1の配列がヌクレオチドまたはアミノ酸間にギャップを含まずにその第2の配列と正確にマッチすることを意味する。
【０１９５】
典型的には、参照タンパク質の相同体は、参照タンパク質のアミノ酸配列に対して（例えば、PUFA PKS系の一部であるタンパク質、またはそのようなタンパク質内に含まれるドメインに対して）、少なくとも約50％同一な、より好ましくは少なくとも約55％同一な、より好ましくは少なくとも約60％同一な、より好ましくは少なくとも約65％同一な、より好ましくは少なくとも約70％同一な、より好ましくは少なくとも約75％同一な、より好ましくは少なくとも約80％同一な、より好ましくは少なくとも約85％同一な、より好ましくは少なくとも約90％同一な、より好ましくは少なくとも約95％同一な、より好ましくは少なくとも約96％同一な、より好ましくは少なくとも約97％同一な、より好ましくは少なくとも約98％同一な、より好ましくは少なくとも約99％同一な（または1パーセント刻みでの、60％〜99％の間の任意のパーセンテージ）、アミノ酸配列を有する。相同体は、好ましくは、その由来であるか関連性のあるタンパク質またはドメインの生物活性を有する（すなわち、参照アミノ酸配列を有するタンパク質またはドメイン）。ACoAS相同体に関しては、相同体は、好ましくはACoAS酵素活性を有し、より具体的には、長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）のアシル-CoAへの変換を触媒する能力を有する。本発明は、本明細書に記載された任意のPUFA PKSタンパク質のそのような相同体を明確に含む。
【０１９６】
本明細書で用いる場合、別に指定する場合を除き、一致度（％）に対する言及は、以下のものを用いて行われる相同性の評価のことを指す：（1）アミノ酸検索についてはblastp、核酸検索についてはblastn、ならびにすべての6個のオープンリーディングフレームにおける核酸検索および翻訳されるアミノ酸の検索についてはblastXをすべて標準デフォルトパラメーターで用いる、BLAST 2.0 Basic BLAST相同性検索、ここでクエリー配列はデフォルトにより低複雑度領域に関してフィルタリングされる（Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Thang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）；（2）BLAST 2アラインメント（下記のパラメーターを用いる）；および／または（3）標準デフォルトパラメーターを用いるPSI-BLAST（位置特異的反復BLAST）。BLAST 2.0 Basic BLASTとBLAST 2の間での標準パラメーターにおけるいくらかの相違のせいで、2つの特定の配列がBLAST 2プログラムを用いて有意な相同性をもつとして認識されえたとしても、クエリー配列としてその配列のうちの1つを用いるBLAST 2.0 Basic BLASTにおいて行われた検索では第2の配列を上位マッチにて同定しない場合があることを指摘しておく。さらに、PSI-BLASTは「プロファイル」検索の自動化した使いやすいバージョンを提供しており、配列相同体を探索するための高感度な方法である。このプログラムは、まず、ギャップド（gapped）BLASTデータベース検索を行う。PSI-BLASTプログラムは、位置特異的スコア行列を構成するために戻されたいずれの有意なアラインメントからの情報も使用し、データベース検索の次のラウンドのためにそのクエリー配列を取り替える。このように、これらのプログラムのいずれか1つを使用することによって一致度が決定されうることは理解されるべきである。
【０１９７】
2つの特定の配列は、Tatusova and Madden, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247 (1999)に記載されているように、BLAST 2を用いて互いに整列化することができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。BLAST 2配列アラインメントは、その結果生じるアラインメントにギャップの導入（欠失および挿入）を許してその2つの配列間でギャップドBLAST検索（BLAST 2.0）を行うBLAST 2.0アルゴリズムを用いるblastpまたはblastnにおいて行われる。本明細書での明確さを目的として、BLAST 2配列アラインメントは、以下の標準デフォルトパラメーターを用いて行われる。
0 BLOSUM62行列を用いる、blastnに関して：
マッチについての報酬＝1
ミスマッチについてのペナルティ＝-2
オープンギャップ（5）および伸長ギャップ（2）ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ（50）期待（10）ワードサイズ（11）フィルター（オン）
0 BLOSUM62行列を用いる、blastpに関して：
オープンギャップ（11）および伸長ギャップ（1）ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ（50）期待（10）ワードサイズ（3）フィルター（オン）。
【０１９８】
本発明によれば、PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、本明細書で詳細に記載したPUFA PKS系の少なくとも1つのドメイン（例えば、KSドメイン、ATドメイン、CLFドメイン、その他）の生物活性を有するアミノ酸配列である。したがって、本発明において有用な単離されたタンパク質には、以下が含まれうる：任意のPUFA PKSオープンリーディングフレームの翻訳産物、任意のPUFA PKSドメイン、そのような翻訳産物もしくはドメインの任意の生物活性断片、または、生物活性を有する、天然のPUFA PKSオープンリーディングフレーム産物もしくはドメインの任意の相同体。
【０１９９】
本発明の1つの局面において、本明細書に記載した特定のPUFA PKSタンパク質またはドメイの相同体を含む、本発明に含まれるPUFA PKSタンパク質またはドメインは、参照PUFA PKSタンパク質からのアミノ酸配列の少なくとも約100個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を含み、ここで相同体のアミノ酸配列は、本明細書に記載したような少なくとも1つのドメインまたはタンパク質の生物活性を有する。1つのさらなる局面において、タンパク質のアミノ酸配列は、参照タンパク質の任意のアミノ酸配列の、少なくとも約200個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約300個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約400個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約500個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約600個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約700個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約800個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約900個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約1000個の連続したアミノ酸を含む。
【０２００】
本発明の好ましい態様において、本発明の単離されたタンパク質またはドメインは、米国特許6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995；および2005年6月10日に提出されたPCT公報番号WO2006/135866のいずれかに記載されたアミノ酸配列のいずれか、またはそれらの任意の生物活性相同体、断片もしくはドメインを含む、またはそれらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０２０１】
本発明のもう1つの態様において、本発明のPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列には、本明細書に具体的に記載した天然のPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドと十分に類似するアミノ酸配列であって、天然のPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に対して（すなわち、それと）（すなわち、天然のPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸鎖の相補物に対して）、中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるアミノ酸配列をコードする核酸配列が含まれる。好ましくは、本発明のPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、PUFA PKSタンパク質またはドメインの上記アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列の相補物に対して、中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。相補配列を推定するための方法は当業者に公知である。アミノ酸のシークエンシングおよび核酸配列のシークエンシングの技術は全くエラーがないわけではないため、本明細書に提示した配列は、最善であっても、本発明のPUFA PKSドメインおよびタンパク質の見かけ上の配列を表していることに留意すべきである。
【０２０２】
本明細書で用いる場合、ハイブリダイゼーション条件とは、類似した核酸分子を同定するために核酸分子が用いられる標準的なハイブリダイゼーション条件のことを指す。そのような標準的な条件は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)に開示されている。Sambrookら、同上は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる（特にページ9.31-9.62を参照されたい）。さらに、ヌクレオチドのミスマッチの程度を変えることを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を計算する式が、例えば、Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138, 267 (1984)に開示されている；Meinkothら、同上は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２０３】
より詳細には、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、本明細書で言及する場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索のために用いられる核酸分子と少なくとも約70％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、ヌクレオチドの約30％またはそれ未満のミスマッチを許容する条件）のことを指す。高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、本明細書で言及する場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索のために用いられる核酸分子と少なくとも約80％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、ヌクレオチドの約20％またはそれ未満のミスマッチを許容する条件）のことを指す。非常に高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件とは、本明細書で言及する場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索のために用いられる核酸分子と少なくとも約90％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、ヌクレオチドの約10％またはそれ未満のミスマッチを許容する条件）のことを指す。以上に考察したように、当業者は、これらのヌクレオチドミスマッチの特定のレベルを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を計算するために、Meinkothら、同上における式を使用することができる。そのような条件は、DNA：RNAまたはDNA：DNAのハイブリッドのいずれが形成されるかに応じて異なると考えられる。DNA：DNAハイブリッドに関して計算される融解温度は、DNA：RNAハイブリッドに関してよりも10℃低い。個々の態様において、DNA：DNAハイブリッドに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6X SSC（0.9 M Na+）のイオン強度で、約20℃〜約35℃の間の温度（低度のストリンジェンシー）、より好ましくは約28℃〜約40℃の間の温度（よりストリンジェント）、さらにより好ましくは約35℃〜約45℃の間の温度（さらによりストリンジェント）でのハイブリダイゼーションを、適切な洗浄条件とともに含む。個々の態様において、DNA：RNAハイブリッドに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6X SSC（0.9 M Na+）のイオン強度で、約30℃〜約45℃の間の温度、より好ましくは約38℃〜約50℃の間の温度、さらにより好ましくは約45℃〜約55℃の間の温度でのハイブリダイゼーションを、同様にストリンジェントな洗浄条件とともに含む。これらの値は、約100ヌクレオチドよりも大きい分子、0％ホルムアミドおよび約40％のG＋C含有量についての融解温度の計算に基づいている。または、Tmを、Sambrookら、前記、ページ9.31〜9.62に示されているように経験的に計算することもできる。一般に、洗浄条件は可能な限りストリンジェントであるべきであり、選択されたハイブリダイゼーション条件に対して適切であるべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリッドの算出Tmよりも約20℃〜約25℃低い、塩および温度条件の組み合わせを含むことができ、洗浄条件は典型的には、その特定のハイブリッドの算出Tmよりも約12℃〜約20℃低い、塩および温度条件の組み合わせを含む。DNA：DNAハイブリッドでの使用に適するハイブリダイゼーション条件の1つの例は、約42℃で6X SSC（50���ホルムアミド）中での2時間〜24時間のハイブリダイゼーション、続いて室温で約2X SSC中での1回またはそれ以上の洗浄を含む洗浄段階、続いてより高い温度およびより低いイオン強度での追加の洗浄（例えば、約37℃で約0.1X〜0.5X SSC中での少なくとも1回の洗浄、続いて約68℃で約0.1X〜0.5X SSC中での少なくとも1回の洗浄）を含む。
【０２０４】
本発明のもう1つの態様は、1つまたは複数の融合セグメントと結合された任意のPUFA PKSタンパク質もしくはドメインまたはその任意の相同体もしくは断片を含む、融合タンパク質を含む。本発明で用いるのに適した融合セグメントには、以下を行いうるセグメントが非限定的に含まれうる：タンパク質の安定性を高める；他の望ましい生物活性を提供する；および／または、タンパク質の精製を補助する（例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより）。適した融合セグメントは、所望の機能を有する（例えば、安定性、溶解性、生物活性の増大を付与する；および／または、タンパク質の精製を平易にする）任意のサイズのドメインでありうる。融合セグメントはタンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端に連結させることができ、所望のタンパク質の直接的な回収を可能とするために切断を受けやすくすることができる。融合タンパク質は、以上に考察したように本発明のタンパク質のカルボキシルおよび／またはアミノ末端のいずれかと結合された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸分子がトランスフェクトされた、組換え細胞の培養によって産生されることが好ましい。
【０２０５】
本発明の1つの態様において、任意の上記PUFA PKSアミノ酸配列、ならびにそのような配列の相同体のいずれかを、その所定のアミノ酸配列のC末端および／またはN末端のそれぞれに隣接する、少なくとも1個から最大で約20個までの追加的な異種アミノ酸を伴って作製することができる。その結果生じたタンパク質またはポリペプチドは、所定のアミノ酸配列「から本質的になる」と称することができる。本発明によれば、異種アミノ酸とは、所定のアミノ酸配列に隣接することが自然下では見いだされない（すなわち、インビボで天然には見いだされない）、または、所定のアミノ酸配列をコードする天然の核酸配列に隣接するヌクレオチドが遺伝子に存在する場合に、仮に天然の配列中のそのようなヌクレオチドが所定のアミノ酸配列の由来である生物に関する標準的なコドン用法を用いて翻訳されたとして、それによってはコードされないと考えられる、アミノ酸の配列のことである。同様に、「から本質的になる」という語句は、本明細書で核酸配列に言及して用いられる場合、所定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の5'末端および／または3'末端のそれぞれに少なくとも1個から最大で約60個までの追加的な異種ヌクレオチドが隣接しうる、所定のアミノ酸配列をコードする核酸配列のことを指す。異種ヌクレオチドは、それが天然の遺伝子に存在する場合に、所定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接することが自然下では見いだされない（すなわち、インビボで天然には見いだされない）。
【０２０６】
本発明のタンパク質またはドメイン、および／またはその相同体もしくは断片の最小サイズは、1つの局面において、必要な生物活性を有するのに十分な、または抗体の産生のための抗原として、もしくはインビトロアッセイにおける標的として機能を果たすのに十分なサイズである。1つの態様において、本発明のタンパク質は、長さが少なくとも約8アミノ酸（例えば、抗体エピトープ用に、またはアッセイにおいて検出可能なペプチドとして適する）、または長さが少なくとも約25アミノ酸、または長さが少なくとも約50アミノ酸、または長さが少なくとも約100アミノ酸、または長さが少なくとも約150アミノ酸、または長さが少なくとも約200アミノ酸、または長さが少なくとも約250アミノ酸、または長さが少なくとも約300アミノ酸、または長さが少なくとも約350アミノ酸、または長さが少なくとも約400アミノ酸、または長さが少なくとも約450アミノ酸、または長さが少なくとも約500アミノ酸などであり、完全な整数（例えば、8、9、10、...25、26、...500、501、...）である、8アミノ酸から最大で本発明のタンパク質またはドメインの全長までの間の任意の長さまたはそれ以上の長さである。そのようなタンパク質の最大サイズに関しては、タンパク質がPUFA PKSタンパク質の一部分、ドメイン、またはその生物活性断片もしくは有用な断片、または完全長のPUFA PKSタンパク質またはドメイン、その上、必要に応じて、さらなる配列（例えば、融合タンパク質配列）を含みうるという点で、実用的な限界以外には制限はない。
【０２０７】
本発明の1つの態様は、本明細書に記載したPUFA PKSタンパク質またはドメインのいずれかの相同体または断片を含め、そのようなタンパク質またはドメインのいずれかをコードする核酸配列、ならびにそれらに対して完全に相補的である核酸配列を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる、単離された核酸分子に関する。本発明によれば、単離された核酸分子とは、その天然の環境から取り出された（すなわち、人為的な操作を受けた）核酸分子のことであり、その天然の環境はその核酸分子が自然下で見いだされるゲノムまたは染色体である。このため、「単離された」とは、核酸分子が精製される程度を必ずしも反映するとは限らず、その核酸分子が自然下で見いだされるゲノム全体または染色体全体をその分子が含まないことを示している。単離された核酸分子は遺伝子を含みうる。遺伝子を含む単離された核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、その遺伝子に関連するコード領域および制御領域を含むが、本明細書に記載したPUFA PKS系の他のタンパク質をコードする他の遺伝子を除き、同じ染色体上に天然に見いだされる追加的な遺伝子を含まない。単離された核酸分子はまた、自然下ではその特定の核酸配列に通常は隣接していない追加的な核酸（すなわち、異種配列）に隣接されている（すなわち、その配列の5'末端および／または3'末端で）特定の核酸配列も含みうる。単離された核酸分子には、DNA、RNA（例えば、mRNA）、またはDNAもしくはRNAのいずれかの誘導体（例えば、cDNA）が含まれうる。「核酸分子」という語句は主として物質的な核酸分子のことを指し、「核酸配列」という語句は主として核酸分子上のヌクレオチドの配列のことを指すが、この2つの語句は、タンパク質またはタンパク質のドメインをコードする能力がある核酸分子または核酸配列については特に、互換的に用いることができる。
【０２０８】
好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、組換えDNA技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、クローニング）または化学的合成を用いて生産される。単離された核酸分子には、天然の核酸分子、ならびに天然の対立遺伝子変異体、および改変が所望の効果を本明細書に記載のPUFA PKS系の生物活性を与えるような様式でヌクレオチドが挿入、欠失、置換および／または反転されている改変された核酸分子を非限定的に含む、その相同体が含まれる。タンパク質の相同体（例えば、核酸相同体によってコードされるタンパク質）は、以上で詳細に考察されている。
【０２０９】
核酸分子相同体は、当業者に公知のいくつかの方法を用いて作製することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, (1989)を参照）。例えば、核酸分子は、部位指定突然変異誘発、突然変異を誘導するための核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片の連結、核酸配列の選択された領域のPCR増幅および／または突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、および核酸分子の混合物を「構築する」ための混合群の連結、ならびにそれらの組み合せといった、古典的な突然変異誘発法および組換えDNA手法を非限定的に含む、さまざまな技術を用いて改変することができる。核酸分子相同体は、核酸によってコードされるタンパク質の機能のスクリーニングによって、および／または野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、改変された核酸の混合物から選択することができる。
【０２１０】
本発明の核酸分子の最小サイズは、本発明の核酸分子の相補配列と（例えば、中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー条件下で）安定的なハイブリッドを形成しうるプローブもしくはオリゴヌクレオチドプライマーを形成するのに十分なサイズである、または本発明によるPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードするのに十分なサイズのものである。このため、そのようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成および核酸分子と相補配列との間の相同度または一致度（percent homology or identity）、ならびにハイブリダイゼーション条件それ自体（例えば、温度、塩濃度およびホルムアミド濃度）に依存しうる。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして用いられる核酸分子の最小サイズは、典型的には、核酸分子がGCリッチである場合には少なくとも約12〜約15ヌクレオチドの長さであり、それらがATリッチである場合には少なくとも約15〜約18塩基の長さである。本発明の核酸分子の最大サイズに関しては、核酸分子が、PUFA PKS系のドメイン、PUFA PKS系の全体のドメイン、PUFA PKS系のオープンリーディングフレーム（Orf）内のいくつかのドメイン、PUFA PKS系のシングルドメインタンパク質またはマルチドメインタンパク質の全体、またはPUFA PKS系の複数のタンパク質の生物活性断片をコードするのに十分な配列を含みうるという点で、実用的な限界以外には制限はない。
【０２１１】
本発明のもう1つの態様は、組換えベクター、および本明細書に記載されるPUFA PKSタンパク質の少なくとも1つのドメイン（またはその相同体または断片）生物活性を有するタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え核酸分子を含む。そのような核酸配列は以上に詳細に記載されている。本発明によれば、組換えベクターは、選択した核酸配列を操作するため、およびそのような核酸配列を宿主細胞に導入するためのツールとして用いられる、操作された（すなわち、人工的に作製された）核酸分子である。組換えベクターはこのため、組換え細胞を形成させるために選択した核酸配列を発現させること、および／または宿主細胞に送達することなどによって、選択した核酸配列のクローニング、シーおよび／または別の方法による操作に用いるのに適している。そのようなベクターは、典型的には、クローニングまたは送達しようとする核酸配列に隣接することが天然には見いだされない核酸配列である異種核酸配列を含むが、ベクターはまた、本発明の核酸分子に隣接して天然に見いだされる、または本発明のその核酸分子の発現のために有用である調節性核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）も含みうる（以下で詳細に考察する）。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれ、原核生物性または真核生物性のいずれであってもよく、典型的にはプラスミドである。ベクターは、染色体外要素（例えば、プラスミド）として維持されうる、またはそれは組換え生物（例えば、微生物または植物）の染色体に組み込まれうる。ベクター全体が宿主細胞内のしかるべき所に留まることもでき、または、ある特定の条件下では、プラスミドDNAが除去されて本発明の核酸分子が残るようにすることもできる。組み込まれた核酸分子は、染色体のプロモーター制御下、天然のもしくはプラスミド性のプロモーター制御下、または複数のプロモーターの組み合わせの制御下におかれうる。核酸分子の単一または複数のコピーを染色体に組み込むことができる。本発明の組換えベクターは少なくとも1つの選択マーカーを含みうる。
【０２１２】
1つの態様において、本発明の組換え核酸分子において用いられる組換えベクターは、発現ベクターである。本明細書で用いる場合、「発現ベクター」という語句は、コードされる産物（例えば、関心対象のタンパク質）の産生のために適したベクターを指して用いられる。この態様において、産生させようとする産物（例えば、PUFA PKSドメインまたはタンパク質）をコードする核酸配列は、組換え核酸分子を産生するための組換えベクターに挿入される。産生させようとするタンパク質をコードする核酸配列は、その核酸配列を、組換え宿主細胞内での核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクター中の制御配列と機能的に連結させる様式で、ベクターに挿入される。
【０２１３】
もう1つの態様において、本発明の組換え核酸分子において用いられる組換えベクターは、ターゲティングベクターである。本明細書で用いる場合、「ターゲティングベクター」という語句は、特定の核酸分子を組換え宿主細胞に送達するために用いられるベクターを指して用いられ、ここで核酸分子は、宿主細胞または微生物内で内因性遺伝子または遺伝子の一部分を欠失させる、不活性化させる、または置換するために用いられる（すなわち、標的化された遺伝子破壊またはノックアウト技術のために用いられる）。そのようなベクターは、「ノックアウト」ベクターとしても当技術分野で公知であると思われる。この態様の1つの局面において、ベクターの一部分、しかしより典型的にはベクターに挿入された核酸分子（すなわち、インサート）は、宿主細胞における標的遺伝子（すなわち、欠失または不活性化させるためにターゲティングを受ける遺伝子）の核酸配列と相同性を示す核酸配列を有する。ベクターインサートの核酸配列は、標的遺伝子と会合して標的遺伝子およびインサートが相同組換えを行い、それによって、内因性標的遺伝子が欠失、不活性化、減弱化（すなわち、内因性標的遺伝子の少なくとも一部分が突然変異または欠失することにより）または置換されるように設計されている。内因性シゾキトリウム属遺伝子を、例えば組換え遺伝子と置換させるためのこの種の組換えベクターの使用は記載されており（例えば米国特許出願第20050100995号を参照されたい）、ヤブレツボカビ科生物の遺伝的形質転換のための一般的な技術は、2003年9月4日に公開された米国特許出願公開第20030166207号に記載されている。植物に対する遺伝的形質転換技術は当技術分野で周知である。本明細書に記載した海洋細菌遺伝子を、単独で、またはヤブレツボカビ科由来のPUFA PKSと組み合わせて、そのような植物のPUFA PKS産生能力を強化および／または変更（改変する、変化させる）する目的で植物を形質転換するために用いうることは、本発明の1つの態様である。
【０２１４】
典型的には、組換え核酸分子は、1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結された本発明の少なくとも1つの核酸分子を含む。本明細書で用いる場合、「組換え分子」または「組換え核酸分子」という語句は主として、発現制御配列に機能的に連結された核酸分子または核酸配列を指すが、そのような核酸分子が本明細書で考察した組換え分子である場合には、「核酸分子」という語句と互換的に用いることができる。本発明によれば、「機能的に連結された」という語句は、分子が宿主細胞にトランスフェクトされた（すなわち、形質転換された、形質導入された、トランスフェクトされた、結合された、または導かれた）場合に発現されうるような様式で、核酸分子を発現制御配列（例えば、転写制御配列および／または翻訳制御配列）に連結することを指す。転写制御配列は、転写の開始、伸長または終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列のように転写開始を制御するものである。適した転写制御配列は、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物において機能しうる任意の転写制御配列を含む。
【０２１５】
本発明の組換え核酸分子はまた、翻訳調節配列、複製起点といったさらなる制御配列、および組換え細胞と適合性のある他の制御配列も含みうる。1つの態様において、本発明の組換え分子は、宿主細胞染色体に組み込まれるものも含めて、発現されるタンパク質がそのタンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にする分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）も含む。適したシグナルセグメントは、発現されるタンパク質に天然に付随するシグナルセグメント、または本発明によるタンパク質の分泌を指令しうる任意の異種シグナルセグメントを含む。もう1つの態様において、本発明の組換え分子は、発現されるタンパク質が宿主細胞の膜に送達されて挿入されることを可能にするリーダー配列を含む。適したリーダー配列は、タンパク質に天然に付随するリーダー配列、または細胞膜へのタンパク質の送達および挿入を指令しうる任意の異種リーダー配列を含む。
【０２１６】
本発明の1つまたは複数の組換え分子を用いて、本発明のコードされる産物（例えば、PUFA PKSドメイン、タンパク質、または系）を産生させることができる。1つの態様において、コードされる産物は、タンパク質を産生させるのに効果的な条件下で、本明細書に記載したような核酸分子を発現させることによって産生される。コードされるタンパク質を産生させるのに好ましい方法は、宿主細胞に1つまたは複数の組換え分子をトランスフェクトして、組換え細胞を形成させることによる。トランスフェクトするのに適した宿主細胞には、トランスフェクトされうる任意の細菌、真菌（例えば、酵母）、昆虫、植物または動物の細胞が非限定的に含まれる。本発明の1つの態様において、好ましい宿主細胞は植物宿主細胞である。宿主細胞は、非トランスフェクト細胞または少なくとも1つの他の組換え核酸分子によってすでにトランスフェクトされた細胞のいずれかでありうる。
【０２１７】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）を細胞に挿入しうる任意の方法を指して用いられる。「形質転換」という用語は、そのような用語が藻類、細菌および酵母などの微生物細胞への、または植物細胞への核酸分子の導入を指して用いられる場合、「トランスフェクション」という用語と互換的に用いることができる。微生物系および植物系では、「形質転換」という用語は、微生物または植物による外因性核酸の獲得に起因する遺伝性変化を記載するために用いられ、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。しかし、動物細胞では、形質転換はもう1つの意味を獲得しており、それは例えば、癌化した後の培養下の細胞の増殖特性の変化を指すことができる。このため、混乱を避けるために、「トランスフェクション」という用語は、動物細胞への外因性核酸の導入に関して用いられることが好ましく、「トランスフェクション」という用語は、この用語が細胞への外因性核酸の導入に関係する限りにおいて、動物細胞のトランスフェクション、および微生物細胞または植物細胞の形質転換を全般的に含むように本明細書において用いられるものとする。したがって、トランスフェクションの手法には、形質転換、粒子射入、拡散、能動輸送、槽内超音波処理（bath sonication）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が非限定的に含まれる。
【０２１８】
当業者は、組換えDNA技術の使用が、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、そのような核酸分子が転写される効率、その結果として生じる転写物が翻訳される効率、および翻訳後の改変の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善しうることを理解すると考えられる。さらに、天然のプロモーターに比べて発現レベルを向上させるために、プロモーター配列を遺伝的に操作することも考えられる。核酸分子の発現を制御するために有用な組換え手法には、1つまたは複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン-ダルガノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン用法に対応させるための核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の除去が非限定的に含まれる。
【０２１９】
本発明によれば、例えばPUFA産生プロフィールに影響を及ぼすことのように、PUFA PKS系の活性に影響を及ぼすことには、遺伝的改変の非存在下と比較して、生物によって発現されるPUFA PKS系の生物活性に何らかの検出可能なまたは測定可能な変化または改変を引き起こす、PUFA PKS系と相互作用するPUFA PKS系または遺伝子の任意の遺伝的改変が含まれる。本発明によれば、「PUFAプロフィール」、「PUFA発現プロフィール」および「PUFA産生プロフィール」は互換的に用いることができ、生物によって発現／産生されるPUFAの全体的なプロフィールを記載している。PUFA発現プロフィールには、生物によって発現されるPUFAのタイプ、ならびに産生されるPUFAの絶対的および／または相対的な量が含まれうる。このため、PUFAプロフィールは、生物によって産生されるPUFAの互いの比に関して、生物によって産生されるPUFAのタイプに関して、ならびに／または生物によって産生されるPUFAのタイプおよび絶対的および／もしくは相対的な量に関して記載することができる。
【０２２０】
以下の例は、例証のために提供されており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
【０２２１】
実施例
実施例に関する一般的な背景
シゾキトリウム属PUFAシンターゼによるPUFA合成の生化学の意味
以前の出願において、シゾキトリウム属およびシゾキトリウム属様のPUFAシンターゼを介したPUFA合成のための生化学的経路は記載されている。鍵になるいくつかの点は以下である：炭素はマロニル-CoAに由来し（アセチル-CoAはプライミング反応に用いられうる）、NAPDHは還元剤として用いられ、PUFAはシンターゼ酵素それ自体と不可分の活性によって遊離脂肪酸として放出される。ここで、本発明者は、シゾキトリウム属由来のPUFAシンターゼを、ネンジュモ属由来のPPTアーゼ（HetI）とともに酵母およびアラビドプシスにおいて発現させる例を示す。シゾキトリウム属PUFAシンターゼの生化学的特徴と酵母および高等植物の生化学に関する一般的な知識とを総合することで、酵母または植物細胞の細胞質における、ならびに植物のプラスミドにおけるこの系の発現はPUFA蓄積をもたらすはずであると示唆され、実際にそれが観察された。
【０２２２】
適切なPPTアーゼの共発現
シゾキトリウム属ならびに他のPUFAシンターゼを大腸菌において発現させた以前の研究により、内因性PPTアーゼはPUFAシンターゼのACPドメインを活性化しないことが判明している。また、ネンジュモ属由来のPPTアーゼであるHetIが、そのようなドメインを活性化するための適切な異種PPTアーゼとして役立ちうること、ならびにDHAおよびDPAn-6（シゾキトリウム属PUFAシンターゼの主生成物）が、HetIおよびシンターゼの両方を発現する大腸菌細胞に蓄積しうることも実証されている。ここに示す研究は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼを酵母において、または植物細胞の細胞質もしくはプラスチドにおいて発現させた場合、そのような宿主におけるDHAおよびDPAn-6の検出は、HetI（または任意の適切なPPTアーゼ）の共発現に依存することを示している。
【０２２３】
酵母における発現のためのシゾキトリウム属のPUFAシンターゼOrf AおよびBの改変
米国特許出願公開第20040235127号に示されているように、大腸菌における天然型のシゾキトリウム属Orf B遺伝子の発現は、短縮型タンパク質の産生をもたらした。完全長タンパク質産物は、15個の隣接する同一なセリンコドン（TCT）を含むおよそ190bpの領域が、大腸菌におけるコドン用法をより良く模倣するように改変された改変Orfの発現後に検出された。この改変Orf B配列はOrf B*と命名された。予備的実験により、酵母におけるOrf AおよびOrf B*（SEQ ID NO：36）の発現は、予想されるタンパク質の発現をもたらさなかった。このため、酵母におけるより良い発現のためにOrfを再合成した。再合成されたOrfは、sOrfA（SEQ ID NO：35）およびsOrfB（SEQ ID NO：36）と命名された。sOrfAおよびsOrf Bによってコードされるタンパク質は、それぞれ天然のOrf A（SEQ ID NO：2）およびOrf B（SEQ ID NO：4）によってコードされるものと同じアミノ酸配列を有する。同様の戦略を、他の異種生物における構築物の発現のためにコドン用法を最適化するために用いることができる。
【０２２４】
実施例1
下記の実施例は、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）における、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ（sOrf A、sOrfBおよび天然のOrf C）コードする遺伝子の、Het Iを伴っての発現を示している。
【０２２５】
シゾキトリウム属PUFAシンターゼ遺伝子およびHetIを、Invitrogenから入手した材料を用いて酵母において発現させた。サッカロミセス-セレビシエのINVsc1株を、以下の形質転換ベクターとともに用いた：pYESLeu（sOrfA、SEQ ID NO：35）、pYES3/CT（sOrfB、SEQ ID NO：36）、pYES2/CT（OrfC、SEQ ID NO：5）およびpYESHis（HetI、SEQ ID NO：33）。ベクターのいくつかは、特定のクローニング要求条件に適合するように改変した。個々の実験に応じて適切な選択培地を用いた。それぞれの場合に、GAL1プロモーターの後ろに遺伝子をクローニングし、洗浄した細胞を、Invitrogenによって与えられた指針に従ってガラクトースを含む培地中に再懸濁させることによって発現を誘導した。細胞を30℃で増殖させ、誘導培地に移してから指定時間後に収集した（遠心により）。細胞ペレットを凍結乾燥させ、酸性メタノールを用いてFAMEを調製し、ヘキサン中に抽出して、GCによって分析した。
【０２２６】
図1は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ系（sOrfA、sOrfB、OrfCおよびHetI）を発現する酵母細胞からの脂肪酸プロフィールと、対照細胞（sOrfA遺伝子を欠く）から得られたものとの被殻を示している。細胞は誘導のほぼ20時間後に収集した。完全なPUFAシンターゼ系を発現する株のプロフィールに2つの新規FAMEピークが出現したことが見てとれる。これらの2つのピークは、基準となる標準物質との溶出時間の比較およびその後のMS分析により、DPA n-6およびDHAと同定された。本発明者らによるシゾキトリウム属PUFAシンターゼの特徴づけによって予測された通り、DHAおよびDPA n-6以外に、他の新規ピークはプロフィール中に認められなかった。図2は、PUFA FAMEを含む、図1のGCクロマトグラムの領域を示している。対照細胞およびPUFAシンターゼを発現する細胞の両方が、DHA FAME付近で溶出するピークを含む。これはC26:0 FAMEと同定され、（参考文献によれば）スフィンゴ脂質に由来する。これはDHAピークの近くで溶出するものの、分離は十分であり、このためDHAの定量には干渉しない。DPAn-6ピークは、FAMEプロフィールにおいて他の内因性酵母脂質とは隔たっている。この特定の例において、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ系を発現する細胞は、2.4％のDHAおよび2.0％のDPAn-6（総FAMEに占めるパーセンテージとして）を蓄積した。DHAとDPA n-6の合計＝細胞において測定された脂肪酸の4.4％。細胞において観察されたDHAとDPA n-6との比はほぼ1.2：1であった。
【０２２７】
酵母におけるシゾキトリウム属PUFAシンターゼの発現を示している、以上に提示した結果は、以前の出願において提唱された経路、ならびに期待しうる脂肪酸プロフィールの変更に関する予測に対する裏づけを提供する。
【０２２８】
実施例2
下記の実施例は、アラビドプシスにおける、シゾキトリウム属PUFAシンターゼをコードする遺伝子（OrfA、OrfB*およびOrfC）のHetIを伴っての発現、ならびに検出可能な中間体または副生成物が実質的に存在しない標的PUFA、DHAおよびDPAn-6の産生を説明している。
【０２２９】
シゾキトリウム属OrfA（SEQ ID NO：1によって表されるヌクレオチド配列）、OrfB*（SEQ ID NO：37によって表されるヌクレオチド配列）およびOrfC（SEQ ID NO：5によって表されるヌクレオチド配列）を、HetI（SEQ ID NO：33によって表されるヌクレオチド配列）とともに、植物への遺伝子の導入のための適切なバイナリーベクター中にクローニングした（別個に、または1つの超構築物（superconstruct）上に4つの遺伝子すべてを含むさまざまな組み合わせで）。そのような構築物およびベクターの例は、以下（3つの発現構築物）および実施例13（1つの4127に関する「超構築物」）に記載されている。
【０２３０】
5720の構築：Orf B*（プラスチド性発現）
Orf B*（SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：4をコードする）を、flax lininプロモーター／ターミネーター（米国特許第6,777,591号）の制御下にある発現カセット中に制限クローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf B*のすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するOrf B*のターゲティングのための、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ由来のプラスチドターゲティング配列（PT-シグナルペプチド）があった。この植物バイナリーベクターはまた、陽性選択用の左および右の境界配列（Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296）の間のパセリ（Petroselinum crispum）由来のユビキチンプロモーター／ターミネーター（Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684）によって作動される既存の大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48）も含んでいた。
【０２３１】
4107の構築：HetIおよびOrf C（プラスチド性発現）
シゾキトリウム属Orf C（SEQ ID NO：5によって表されるヌクレオチド配列、SEQ ID NO：6をコードする）を、HetI（SEQ ID NO：33によって表されるヌクレオチド配列、SEQ ID NO：34をコードする）とともに、flax lininプロモーター／ターミネーター（米国特許第6,777,591号）の制御下にある発現カセット中にクローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf CおよびHetIのすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するPUFAシンターゼおよびPPTアーゼのターゲティングのための、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ由来のプラスチドターゲティング配列（PT-シグナルペプチド）があった。続いて、両方のプラスミドを、左および右の境界配列の間のパセリ由来のユビキチンプロモーター／ターミネーター（Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684）によって作動される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性を付与するpat遺伝子（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37）を含む、1つの植物バイナリーベクター中に集成させた。
【０２３２】
4757の構築：Orf A（プラスチド性発現）
シゾキトリウム属Orf A（SEQ ID NO：1によって表されるヌクレオチド配列、SEQ ID NO：2をコードする）を、flax lininプロモーター／ターミネーター（米国特許第6,777,591号）の制御下にある発現カセット中にクローニングした。lininプロモーターは種子発生中に導入遺伝子の特異的な時間的および組織特異的な発現を制御する。シゾキトリウム属Orf Aすぐ上流かつインフレームには、プラスチドに対するPUFAシンターゼおよびPPTアーゼのターゲティングのための、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼ由来のプラスチドターゲティング配列（PT-シグナルペプチド）があった。この発現カセットは、左および右の境界配列の間のMASプロモーター／ターミネーターによって作動される、宿主植物にカナマイシン耐性を付与するnptII遺伝子を含む植物バイナリーベクターの内部に含まれた。
【０２３３】
1つの例では、導入遺伝子を3つの別々の発現カセット中にクローニングした：上記の通りの、5720と命名された構築物（OrfB*を含み、SEQ ID NO：4をコードする）、4107と命名された構築物（OrfCを含み、SEQ ID NO：6をコードする、かつHetIを含み、SEQ ID NO：34をコードする）および4757と命名された構築物（OrfAを含み、SEQ ID NO：2を含む）。各構築物において遺伝子をクローニングした。タンパク質をプラスチドに向かわせるためには、アブラナのアシル-ACPチオエステラーゼに由来するプラスチドターゲティング配列をコードする追加的な5'配列を、Orf A、B*、CおよびHetIのすぐ上流に配置した。このペプチドをコードするヌクレオチド配列を、各PUFAシンターゼOrfの開始メチオニンコドン、ならびにHetIの人工的に作製した開始コドン（ATG）に対してインフレームで配置した。PUFAシンターゼの局在を植物細胞の細胞質に対してターゲティングさせる他の構築物では、Orfの5'末端に追加的なタンパク質コード配列を付け加えなかった。
【０２３４】
アラビドプシスへの遺伝子の導入のためには標準的な方法を用いた（Clough et al., 1998, Plant J. 16:735-743に実質的に記載されたような、適切なベクターを含むアグロバクテリウム株の懸濁液中への花の浸漬）。手短に述べると、すべての植物バイナリーベクターの完全性が、診断用制限消化および配列解析によって確かめられた。続いて、単離されたプラスミドを用いて、エレクトロポレーション（25μF、2.5kV、200Ω）によるコンビテントアグロバクテリウム株EH101（Hood et al., 1986, J. Bacteriol. 144:732-743）の形質転換を行った。組換えアグロバクテリウムをAB-スペクチノマイシン／カナマイシン（20x AB塩、2Mグルコース、0.25mg／ml FeSo4 7H2O、1M MgSo4、1M CaCl2）上にプレーティングし、単一のコロニーを5mLのAB-スペクチノマイシン／カナマイシンブロスへの接種に用いた。これらの培養物を28℃で一晩増殖させた。続いて、プラスミドを含む組換えアグロバクテリウムを用いて、花浸漬法（Clough et al., 1998, Plant J. 16: 735-743）による野生型C24シロイヌナズナ植物の形質転換を行った。
【０２３５】
これらの植物から得られた種子を選択培地上にプレーティングした。陽性と同定された実生を土壌に移して成熟に至らせ、その後に種子をPUFA含量に関して分析した。PUFA含量に基づき、それらの種子の一部は次世代へと進ませた。それらの植物から得られたプールした種子を脂肪酸含量に関して分析した。これらのトランスジェニック植物から期待される標的PUFAは、植物を形質転換するために用いた遺伝子の由来であるシゾキトリウム属PUFA PKS系によって生成される主PUFAであるドコサヘキサエン酸（DHA）およびドコサペンタエン酸（DPAn-6）であった。
【０２３６】
例示的なトランスジェニック植物系統の1つにおける1つの例示的な脂肪酸分析の結果は図3に示されている。図3の上のパネルは、プールした種子試料から調製したFAMEのGC分離およびFID検出によって表された、野生型アラビドプシス種子の典型的な脂肪酸プロフィールを示している。主たる脂肪酸は以下である：16:0、18:0、16:1、18:1、20:1、20:2および22:1。野生型種子からの試料中にはDHAもDPA n-6も存在しない。
【０２３７】
図3の下のパネルは、上記の通りに、いずれもプラスチドを標的とする3つの別々の発現カセット（5720、4107および4757）から導入した、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ遺伝子およびHetI遺伝子を発現する例示的なトランスジェニックアラビドプシス系統（263系統）の1つからプールした種子試料の脂肪酸プロフィールを示している。263系統の脂肪酸プロフィールを参照すると、トランスジェニック植物種子からのプロフィール中には、野生型種子からのプロフィール中には存在しない2つのFAMEピークが容易に観察される。これらの2つのピークの溶出パターンは、基準となるDHAおよびDPAn-6（標準物質としてシゾキトリウム属の油から調製したFAME、ならびにNuCheck Prepから購入したDHA標準物質を使用）の溶出と正確に一致した。この特定の例において、DHAピークは算出された総FAMEの0.8％に相当し、一方、DPA n-6ピークは1.7％に相当した。新規PUFAの合計は総FAMEの2.5％であった。
【０２３８】
他のトランスジェニック植物系統を用いた実験でも同様の結果が得られた。例えば、263系統と同じ構築物および同じ様式を用いて形質転換された、269と命名された別のトランスジェニック系統は、算出された総FAMEのおよそ0.75％のDHA、および算出された総FAMEの1.41％のDPAn-6を産生した（非提示データ）。
【０２３９】
さらに、上記と同じ核酸分子を用いて作製された複数の他のトランスジェニックアラビドプシス植物も、それらがPUFA PKS遺伝子およびHetI PPTアーゼを提供する構築物を、別々の構築物、組み合わせた構築物または単一の超構築物のいずれを用いて作製されたかにかかわらず、標的PUFAを産生した。
【０２４０】
加えて、PUFA PKS遺伝子をサイトゾルにターゲティングさせたトランスジェニック植物はすべて、標的PUFAを発現した（詳細データは非提示）。例えば、上記の3つの別々の発現カセット（プラスチドターゲティング配列を伴わない）上にて導入されたシゾキトリウム属PUFA PKS＋HetIをサイトゾル中で発現する植物系統は、総FAMEに占めるパーセンテージとしておよそ0.45％のDHAおよびおよそ0.8％のDPAを産生した。もう1つの例において、単一の超構築物上にて導入されたシゾキトリウム属PUFA PKS＋HetIをサイトゾル中で発現する植物系統は、総FAMEに占めるパーセンテージとしておよそ0.2〜0.3％のDHAおよびおよそ0.5％のDPAを産生した。
【０２４１】
図3に示された種子脂肪酸プロフィールにおける（および、他の類似のトランスジェニック植物種子における）DHAおよびDPAn-6の出現は、導入されたシゾキトリウム属PUFAシンターゼ系が植物細胞内で発現された場合に機能すること、およびタンパク質をプラスチドに対してターゲティングさせうることを実証している。以前の生化学的データおよび異種発現データ（例えば、大腸菌および酵母における）から予想されたように、トランスジェニック植物からの種子のプロフィール中に検出された新規脂肪酸はDHAおよびDPAn-6のみであり、このことは植物におけるPUFAの産生のための標準的な経路の酵素を上回るPUFA PKS系の利点をさらに例証している。
【０２４２】
本出願は、以下の特許、出願公報および刊行物を、その全体にわたって参照により組み入れる：米国特許第6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第20020194641号；米国特許出願公開第20040235127号；米国特許出願公開第20050100995号およびPCT公開第WO 2006/135866号。
【０２４３】
2006年3月15日に提出された米国仮出願第60/784,616および米国仮出願第60/783,205号のそれぞれの全開示内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４４】
本明細書で引用または考察したそれぞれの刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４５】
本発明のさまざまな態様を詳細に記載してきたが、それらの態様の変更および適合化が当業者に想起されるであろうことは明らかである。しかしながら、そのような変更および適合化は本発明の範囲内にあることが明示的に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】対照酵母、ならびにシゾキトリウム属Orf sA、sB、CおよびHet Iを発現する酵母におけるFAMEプロフィールである。
【図２】標的PUFAの産生を例証するために拡大した、図1からの酵母に関するFAMEプロフィールである。
【図３】野生型アラビドプシス（Arabidopsis）、ならびにシゾキトリウム属のOrf A、B*、CおよびHet Iを発現するシロイヌナズナ263系統（プラスチドにターゲティングされた）のFAMEプロフィールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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