(57)【要約】  本発明は，修飾（ポリ）ペプチドを製造する方法に関し，前記方法は，クラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドを，有機溶媒中で，１またはそれ以上のカルボキシル基でエステル化またはチオエステル化により，および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基でアミド化またはアルキル化により修飾する工程を含む。さらに，本発明の方法により得られる（ポリ）ペプチドおよび抗体，ならびにその医薬としての使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾（ポリ）ペプチドを製造する方法であって，有機溶媒中で，クラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドを，１またはそれ以上のカルボキシル基でエステル化またはチオエステル化により，および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基でアミド化またはアルキル化により修飾する工程を含む方法。
【請求項２】
エステルまたはチオエステル結合による修飾が，
（ａ）  生体適合性ポリマー；
（ｂ）  脂質；
（ｃ）  ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基を含むリンカー分子；
（ｄ）  前記（ポリ）ペプチドの側鎖ヒドロキシル基；
（ｅ）  オリゴヌクレオチド；
（ｆ）  （プロ）ドラッグ；
（ｇ）  マーカー；
（ｈ）  標識；
（ｉ）  メタノールまたはベンジルアルコールの分子；
（ｊ）  同族輸送担体を有する小分子；
および（ａ）−（ｊ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択される１またはそれ以上とのエステルまたはチオエステル結合の形成である，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記カルボキシル基は，
（ａ）  Ｇｌｕの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；
（ｂ）  Ａｓｐの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；
（ｃ）  Ｃ末端アミノ酸の主鎖カルボキシル基；および
（ｄ）  （ａ）−（ｃ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択される，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は，前記リンカーを，
（ａ）  生体適合性ポリマー；
（ｂ）  脂質；
（ｃ）  リンカー；
（ｄ）  第２の（ポリ）ペプチド；
（ｅ）  オリゴヌクレオチド；
（ｆ）  （プロ）ドラッグ；
（ｇ）  マーカー；
（ｈ）  標識；
（ｉ）  同族輸送担体を有する小分子；および
（ａ）−（ｉ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択される１またはそれ以上の分子と反応させる更なる工程を含む，請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記反応は水性媒体中で行われる，請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記生体適合性ポリマーは，ポリエーテル，多糖類，ポリエステル（ポリオルトエステルを含む），ポリアルキルシアノアクリレート，ヒドロキシアルキルアクリルアミド，界面活性剤，およびこれらの混合物からなる群より選択される，請求項２−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生体適合性ポリマーは分枝しているか，および／または架橋されている，請求項２−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリエーテルはＰＥＧであるか，またはポリエステルはポリ（乳酸／グリコール酸）である，請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の（ポリ）ペプチドは，膜透過性（ポリ）ペプチドであるか，または胃腸（ＧＩ）輸送担体により認識されかつ輸送される（ポリ）ペプチドである，請求項２−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の（ポリ）ペプチドは，（プロ）ドラッグ分子に連結されている，請求項２−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記（プロ）ドラッグは抗癌（プロ）ドラッグである，請求項２−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドは，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ｓｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される，請求項２−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記（ポリ）ペプチドは，抗体または前記抗体の結合特異性を保持するそのフラグメントもしくは誘導体である，請求項２−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記クラウンエーテルは，１８−クラウン−６，１２−クラウン−４，１５−クラウン−５，ベンゾ−１８−クラウン−６，ジベンゾ−１８−クラウン−６，１２−クラウン−４，１５−クラウン−５，（１２−クラウン−４）−２−メタノール，１８−クラウン−６テトラカルボン酸ｓ，（１８−クラウン−６）−２−メタノール，ベンゾ−１５−クラウン−５，ジベンゾ−１５−クラウン−５，４’−アミノ−ベンゾ−１５−クラウン−５，４’−アミノ−ベンゾ−１８−クラウン−６，およびカリックス［４］アレーン，カリックス［６］アレーン，カリックス［８］アレーン，およびカリックス［６］アレーン−六酢酸ヘキサエチルエステル等のカリクサレンからなる群より選択される，請求項２−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記クラウンエーテルは１８−クラウン−６である，請求項２−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
クラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドの，修飾（ポリ）ペプチドの合成における中間体としての使用であって，前記（ポリ）ペプチドは，１またはそれ以上のカルボキシル基において，エステル化またはチオエステル化により，および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基においてアミド化またはアルキル化により修飾されていることを特徴とする使用。
【請求項１７】
前記修飾（ポリ）ペプチドは，請求項２−１５のいずれかに記載の方法により得ることができる，請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
請求項１−１５のいずれかに記載の方法により得ることができる修飾（ポリ）ペプチド。
【請求項１９】
生体適合性ポリマー，脂質，ヒドロキシル基を含むリンカー，第２の（ポリ）ペプチド，オリゴヌクレオチド，（プロ）ドラッグ，マーカー，標識，メタノールまたはベンジルアルコールの分子，同族輸送担体を有する小分子，またはこれらの任意の組み合わせの１またはそれ以上で修飾されている（ポリ）ペプチドであって，前記生体適合性ポリマー，脂質，リンカー，第２の（ポリ）ペプチド，オリゴヌクレオチド，（プロ）ドラッグ，マーカー，標識，メタノールまたはベンジルアルコールの分子または同族輸送担体を有する小分子は，エステルまたはチオエステル結合を介して（ポリ）ペプチドのカルボキシル基に結合しているか，および／または，（ポリ）ペプチドはＮ末端アミノ酸のアミノ基でアミド化またはアルキル化されていることを特徴とする（ポリ）ペプチド。
【請求項２０】
前記（ポリ）ペプチドのカルボキシル基は，
（ａ）  Ｇｌｕの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；
（ｂ）  Ａｓｐの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；
（ｃ）  Ｃ末端アミノ酸の主鎖カルボキシル基；または
（ｄ）  （ａ）−（ｃ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択される，請求項１９記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２１】
前記リンカーは，
（ａ）  生体適合性ポリマー；
（ｂ）  脂質；
（ｃ）  リンカー；
（ｄ）  第２の（ポリ）ペプチド；
（ｅ）  オリゴヌクレオチド；
（ｆ）  （プロ）ドラッグ；
（ｇ）  マーカー；
（ｈ）  標識；
（ｉ）  同族輸送担体を有する小分子；
または（ａ）−（ｉ）の任意の組み合わせの１またはそれ以上を有する，請求項１９または２０に記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２２】
前記生体適合性ポリマーは，ポリエーテル，多糖類，ポリエステル（ポリオルトエステルを含む），ポリアルキルシアノアクリレート，ヒドロキシアルキルアクリルアミド，界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される，請求項１９−２１のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２３】
前記生体適合性ポリマーは分枝しているか，および／または架橋されている，請求項１９−２２のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２４】
ポリエーテルはＰＥＧであるか，またはポリエステルはポリ（乳酸／グリコール酸）である，請求項２２または２３に記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２５】
前記第２の（ポリ）ペプチドは，膜透過性（ポリ）ペプチドであるか，または胃腸（ＧＩ）輸送担体により認識され輸送される（ポリ）ペプチドである，請求項１９−２４のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２６】
前記第２の（ポリ）ペプチドは（プロ）ドラッグ分子に連結されている，請求項１９−２５のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２７】
前記（プロ）ドラッグは抗癌（プロ）ドラッグである，請求項１９−２６のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドは，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ｓｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される，請求項１９−２７のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項２９】
前記（ポリ）ペプチドは，抗体または前記抗体の結合特異性を保持したそのフラグメントもしくは誘導体である，請求項１９−２８のいずれかに記載の（ポリ）ペプチド。
【請求項３０】
抗体または前記抗体の結合特異性を保持したそのフラグメントもしくは誘導体であって，エステルまたはチオエステル結合により前記抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の１またはそれ以上のカルボキシル基に結合している１またはそれ以上のリンカーを有し，前記リンカーは膜透過性（ポリ）ペプチドを有し，この膜透過性（ポリ）ペプチドは（プロ）ドラッグ分子を有することを特徴とする，抗体または前記抗体の結合特異性を保持したそのフラグメントもしくは誘導体。
【請求項３１】
請求項１８−２９のいずれかに記載の（ポリ）ペプチドおよび／または請求項３０記載の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
癌の治療用の医薬組成物の製造における請求項１８−２５のいずれかに記載（ポリ）ペプチドの使用であって，ここで，
（ａ）  （ポリ）ペプチドはインスリンであり，疾患は糖尿病であり；
（ｂ）  （ポリ）ペプチドはＥＰＯであり，疾患は貧血症または慢性腎不全であり；
（ｃ）  （ポリ）ペプチドはＧ−ＣＳＦであり，疾患は好中球減少症であり；
（ｄ）  （ポリ）ペプチドはアスパラギナーゼであり，疾患は癌であり；
（ｅ）  （ポリ）ペプチドは第ＶＩＩ因子であり，疾患は止まらない出血であり；
（ｆ）  （ポリ）ペプチドはインターフェロンαであり，疾患は慢性肝炎ＢまたはＣであり；
（ｇ）  （ポリ）ペプチドはインターフェロンαであり，疾患は線維症，結核，髄膜炎または癌であり；
（ｈ）  （ポリ）ペプチドはＢ２０３６であり，疾患は末端肥大症であり；
（ｉ）  （ポリ）ペプチドはスーパーオキシドディスムターゼであり，疾患は脳傷害であり；
（ｊ）  （ポリ）ペプチドはインターロイキン−２であり，疾患は癌または免疫刺激を必要とする状態であり；または
（ｋ）  （ポリ）ペプチドはヒルジンであり，疾患はヘパリン誘発性血小板減少症またはアンギナであり，
および，（ポリ）ペプチドは，請求項１９−２５のいずれかで規定されるされるように修飾されていることを特徴とする使用。
【請求項３３】
癌の治療用の医薬組成物の製造における，請求項１８，２６または２７に記載の（ポリ）ペプチドの使用。
【請求項３４】
癌の治療用の医薬組成物の製造における，請求項１８または２９に記載の（ポリ）ペプチドまたは請求項３０記載の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の使用であって，前記（プロ）ドラッグは抗癌（プロ）ドラッグであり，前記（ポリ）ペプチドまたは抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は腫瘍関連抗原に特異的に結合することを特徴とする使用。
【請求項３５】
前記腫瘍関連抗原が，ＣＤ３０，ＣＤ７０，ＣａｎＡｇ，ＣＤ２２，ＰＳＭＡ，ＣＤ５６，Ｌｅｗｉｓγ，ＣＤ３３，ＣＤ２０，ＣＤ４４ｖ６，ＣＧ５６９７２，ＣＤ５２，ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ＨＥＲ２，ＥｒｂＢ２，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦＲ２，ＥＧＦＲ，ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＰＥＭからなる群より選択される，請求項３４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，修飾（ポリ）ペプチドを製造する方法に関し，この方法は，クラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドを，有機溶媒中で，１またはそれ以上のカルボキシル基でエステル化またはチオエステル化により，および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基でアミド化またはアルキル化により修飾する工程を含む。
【０００２】
本明細書においては，特許出願および製造元のマニュアルを含め，多数の文献が引用される。これらの文献の開示は，本発明の特許性に関連性があるとは考えられないが，その全体が参照として本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
生物薬剤（ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）の分野においては，改良された薬理学的特性を有する蛋白質が必要とされている。この目的のために，例えば免疫原性を低下させるために，酵素的分解に対する耐性を高めるために，またはその半減期を長くするために，治療用蛋白質を種々のポリマーとカップリングさせている。例えば，ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ），すなわちポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合することによる蛋白質の誘導化は，多くの治療関連蛋白質の生物薬剤特性および臨床特性を改良することが示されている。
【０００４】
欧州特許出願ＥＰ０８０９９９６は，インターフェロンαのＰＥＧ化誘導体を記載する。記載されるコンジュゲートは，分枝鎖のＰＥＧ構造を有する。これは，リジン残基のαおよびεアミノ基に結合した２つのＰＥＧ分子を有するカルボニル基を，インターフェロンαのＮＨまたはＯＨ基とコンジュゲートさせることにより得られる。蛋白質側の結合部位としてリジンならびにセリンが明示的に言及されている。Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００２）はペプチドおよび蛋白質のＰＥＧ化の総説を提供している。ＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体の蛋白質側の結合部位はＮＨ２であり，より少ない程度でスルフヒドリル基である。可逆的ＰＥＧ化に関する節では，ＰＥＧカルボン酸を含むエステルが中間体として言及されている。しかし，蛋白質へのカップリングにはすべてアミノ酸残基のαまたはεアミノ基が関与している。
【０００５】
当該技術分野において知られる，蛋白質をポリマーで誘導化するための化学は，しばしば永久的な結合を生成する。例えば，アミド化およびアルキル化は一般に永久的である。さらに，場合によっては，複数の誘導化の結果として活性の喪失が生ずる。アミド化の可逆性は，蛋白質に結合すべき分子をアミノ基の保護基を用いて運ぶ場合にのみ達成することができる（Ｔｓｕｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４））。
【０００６】
医薬品化学においては，エステル化は遅延型薬剤（例えば遅延型コルチゾン）を得るために用いられており，親油性アルコールによるエステル化（例えば，ピバンピシリンおよびタランピシリン等のペニシリンエステル）は吸収を高めるために用いられている。第１の場合には，鍵となる効果はエステル化した薬剤またはプロドラッグが不活性であるということである。次に，エステルの加水分解により，活性型がゆっくり放出される。第２の場合には，エステル化に関連する効果は，カルボン酸塩の電荷の除去およびエステルの親油性アルコール部分により引き起こされる親油性の増強である。しかし，コルチゾンおよびペニシリンの修飾に用いられた方法は，蛋白質の修飾には適用することができない。
【０００７】
ペプチドおよび蛋白質の脂質化は，粘膜透過性を改良し（吸収およびデリバリーの増強），バイオアベイラビリティーを改良し，場合によっては抗力を増加するために用いられている（Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１９，６０９−１４（２００２）；Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０１，１６４６０−１６４６５（２００４））。しかし，標準的な方法による蛋白質の脂質化は一般に永久的（不可逆的）であり，しばしば（アミドまたはウレタン結合が生ずる場合），蛋白質の沈殿が引き起こされる。さらに，脂質は一般に水にあまり溶解せず，脂質で蛋白質を再現性よくかつ調節可能なように官能化することは困難である。
【０００８】
Ｙａｍａｄａら（２０００）は，チトクロームｃをメタノール中に可溶化するためにラリアットエーテル類（またはクラウンエーテル類）の使用を記載する。著者らは，クラウンエーテル類の誘導化がチトクロームｃの可溶化効率に及ぼす影響を調べている。著者らの目的は有機溶媒中で作用する有効な生物触媒を提供することであり，可溶化の目的は有機溶媒に溶解させたチトクロームｃを得ることである。Ｏｓｈｉｍａら（２００２）は，バイオポリマーの認識ツールとしてカリクサレン誘導体を研究している。彼らは，リジンの豊富な蛋白質の抽出物において種々のカリクサレンの選択性を調べた。チトクロームｃの選択的抽出のために特定のカリクサレンを利用している。クロロホルム中に溶解したチトクロームｃはペルオキシダーゼの珍しい活性を示したことが記載されている。いずれの文献も，（ｉ）可溶化剤の化学的修飾が可溶化の効率に及ぼす影響を探索しており，（ｉｉ）溶解した蛋白質の珍しい触媒特性の観察を報告している。Ｊｕｌｉａｎら（２００１）はまた，チトクロームｃをクラウンエーテル類により有機溶媒中で可溶化することを記載する。ＥＳＩ−ＭＳを用いて，４つの１８−クラウン−６分子が蛋白質表面上の暴露されたリジン側鎖に強く結合したことを示すデータを提供している。これらの刊行物では，可溶化した後の蛋白質の誘導化については，想定も示唆もしていない。
【０００９】
Ｂｏｔｔｉら（１９９６）は，ペプチドをより小さいペプチドから段階的に合成することを記載しており，ここでは，クラウンエーテル類が保護基として用いられている。この方法の成功に必要な要件として，Ｂｏｔｔｉらは，２級窒素（Ｐｒｏ等）を有するかまたは窒素原子で二重に置換された（Ｆｍｏｃ保護アミノ酸またはペプチド等）Ｎ末端残基に言及する。さらに，ＡｓｐおよびＧｌｕのカルボキシル官能基を保護しなければならない。Ｂｏｔｔｉら（１９９６）の意図は，ペプチド合成において一般に用いられている共有結合性保護／脱保護戦略とは異なり，クラウンエーテル類を非共有結合保護基として用いる，ペプチドを合成する方法を提供することであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
制御された様式でポリマーの安全な，すなわち，蛋白質活性に有害な影響を与えない結合を可能とし，インビボで完全に可逆的な結合を与える方法論の必要性は満たされていない。したがって，従来技術に記載される方法の制限に鑑みて，本発明の基礎となる技術的課題は，蛋白質の薬理学的特性を改変するための改良されたまたは代替の手段および方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち，本発明は，修飾（ポリ）ペプチドを製造する方法に関し，前記方法は，クラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドを，有機溶媒中で，１またはそれ以上のカルボキシル基でエステル化またはチオエステル化により，および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基でアミド化またはアルキル化により修飾する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において用いる場合，"（ポリ）ペプチド"との用語は，３０までのアミノ酸からなるペプチド，および３０より多いアミノ酸からなるポリペプチドを記述する。これは，蛋白質，蛋白質のフラグメントおよび合成分子を含むことが理解される。さらにこれは抗体ならびに抗体のフラグメントおよび誘導体を含む。
【００１３】
本発明にしたがう"修飾（ポリ）ペプチド"との用語は，カルボキシル基の（チオ）エステル化および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基のアミド化またはアルキル化による誘導化に関連する。
【００１４】
"有機溶媒"との用語は，当該技術分野において知られており，有機合成において用いられる非水性溶媒に関連する。一般に，有機溶媒は，水より親油性ないしは疎水性である。その結果，これらのｌｏｇＰ値は一般にゼロより高い。ｌｏｇＰ値は，分配係数Ｐの１０進法対数であり，Ｐは，下記の比率として定義される：
Ｐ＝［Ａ］ｎ−オクタノール／［Ａ］水
ここで，Ａは，考慮中の化学種であり，この場合は有機溶媒である。本発明にしたがう有機溶媒としては，メタノール，エタノール，Ｃ３−Ｃ１０のアルコール，アセトニトリル，ブタノン，１，１，１−トルフルオロエタン（ＴＦＥ），ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ），酢酸エチル，四塩化炭素，ブタノール，ジブチルエーテル，ジエチルエーテル，シクロヘキサン，塩化メチレン（ジクロロメタン），ヘキサン，酢酸ブチル，ジイソプロピルエーテル，ベンゼン，ジペンチルエーテル，クロロホルム，ヘプタン，テトラクロロエチレン，トルエン，ヘキサデカン，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジオキサンが挙げられる。
【００１５】
"クラウンエーテル"との用語は，当該技術分野においてよく知られており，王冠の形の構造をもつ（大）環状ポリエーテルを表す。一般に用いられている命名法は，ｎ−クラウン−ｍ（ｎは環中の原子の総数を表し，ｍはポリエーテル環中の酸素原子の数を表す）である。この用語は，１またはそれ以上の芳香族環が（大）環状の環と縮合している誘導体，例えば，ジベンゾ−１８−クラウン−６を含む。
【００１６】
（ポリ）ペプチドは一般に有機溶媒に不溶性であるため，蛋白質を例えばＰＥＧ等の生体適合性ポリマーまたは脂質で誘導化することは，現在のところ，有機溶媒を必要としないタイプの反応に限られている。（ポリ）ペプチドをクラウンエーテル類を用いて複合体形成することにより，前記（ポリ）ペプチドの有機溶媒中の溶液を調製することが可能となり，これは次に，水性溶液中では，特に未保護（ポリ）ペプチドを用いては行うことができない化学的修飾を行う可能性を開く。これは，水溶性蛋白質の化学修飾および／または水溶性ではないか，または脂質などの十分に水溶性ではない分子による（ポリ）ペプチドの修飾に対して特に関連性がある。驚くべきことにかつ有利なことに，クラウンエーテル類による前記複合体形成は，（ポリ）ペプチドの表面上で荷電した１級アミノ基（ＬｙｓおよびＡｒｇ側鎖，およびＮ末端アミノ基）で生ずる。その結果，通常は，複合体形成の結果としても，有機溶媒への輸送の際にも蛋白質のミスフォールディングが生じず，生物学的活性は失われない。例えば，抗ＨＩＶ−１蛋白質であるＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓ［Ｎ−ホルミル−Ｔｒｐ５７］は，クラウンエーテル類との複合体形成（および続く有機溶媒中での溶解）（下記の実施例を参照）に際して，その抗ウイルス活性を完全に維持した。同時に，（ポリ）ペプチドとクラウンエーテル分子との間に形成される複合体は，有機溶媒中での溶解性を与えるのに十分に疎水性である（荷電アミノ基はクラウンエーテルによりマスクされている）。アミノ基のマスキングはまた，これらを副反応の進行から保護する役割も果たす。クラウンエーテル類との複合体形成は，穏和な条件下で行うことができ，したがって，完全に未保護の（ポリ）ペプチドを用いて行うことができる。クラウンエーテル類との複合体形成は，可逆的であり，例えばｐＨを変えることにより，または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）等の簡単な塩を加えることにより微調整することができる。
【００１７】
エステル結合およびチオエステル結合は，インビボで可逆的であるという明確な利点を有する。切断は，（ｉ）触媒なしの加水分解，および／または（ｉｉ）エステラーゼによる酵素切断により生ずる（本発明にしたがう"間接的"方法（下記を参照）により得られた修飾（ポリ）ペプチドに生ずるこれらの切断プロセスについては図２を参照）。チオエステルはインビボで第３のメカニズム，すなわち内因性チオール（例えばグルタチオン）とのチオール交換によっても切断される。すべてのタイプの切断の速度は，基質の構造により異なる。（ポリ）ペプチドにエステルまたはチオエステル結合により結合させるべき成分を適切に選択することにより，放出速度を調節することができる。（ポリ）ペプチドのカルボキシル基のエステル化は，アミノ基が変化しない，すなわち，誘導化の結果としてその電荷が抑制されず，このことにより，（ポリ）ペプチドの沈殿後のミスフォールディングおよび／または溶解性の喪失を回避することができるという利点を有し，これは上述の従来技術とは対照的である。しかし，（ポリ）ペプチドのカルボキシル基のエステル化は，過剰のヒドロキシル基（アルコール）を含む有機溶媒中で実施しなければならない。本発明者らは，（ポリ）ペプチドのカルボキシル基のエステル化またはチオエステル化は，前記（ポリ）ペプチドを修飾する望ましい経路であることに着目し，驚くべきことに，クラウンエーテルに結合した形の（ポリ）ペプチドが前記エステル化を行うのに特に適した中間体であることを見いだした。（ポリ）ペプチドは，クラウンエーテルとの複合体形成および有機溶媒中への移動に際して，その天然の構造を維持するかまたは本質的に維持するため，エステル化は，表面に暴露されたカルボキシル基でのみ生じるようである。
【００１８】
本発明の方法を用いることにより，増強された薬理学的および／または薬物動態学的特性を有する（ポリ）ペプチドを得ることができる。前記増強された特性としては，例えば，増強された吸収またはデリバリー，分解からの保護，持続する活性および／または増加した抗力（詳細については下記を参照）が挙げられる。同時に，上述したように，修飾した形の（ポリ）ペプチドは，前記増強された特性を確実にするが，未修飾（ポリ）ペプチドが最終的に遊離し，その生物学的／治療効果を発揮することを確実にするものは，本発明の方法にしたがって行う修飾が可逆的であることである。あるいは，本発明の方法により得られる修飾された形の（ポリ）ペプチドは，目的とし，かつ未修飾（ポリ）ペプチドとは異なる治療効果を発揮することができるかもしれない。さらに，部分的加水分解，切断および／またはチオール交換により，治療上意義のある形において一部の修飾はなお存在し他の修飾は存在しないような，治療上意義のある形の（ポリ）ペプチドが形成される場合もある。
【００１９】
有機溶媒がヒドロキシル成分（アルコール）を有する場合，活性化剤を加えることにより，穏和なかつ制御可能なエステルまたはチオエステル形成が可能となる。穏和な条件には，室温での反応が含まれる。適当な活性化剤のリストは，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＩＩ  Ｅｄ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ３７３−３７７に見いだすことができ，例えば，シランまたはシリル化試薬，例えば，トリメチルクロロシラン（ＴＭＳｉＣｌ），カルボジイミド（例えばＤＩＣ，ＤＣＵ），１，１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ），２−エトキシ−１−（エトキシカルボニル）−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ），およびジメチルホルムアミドの亜リン酸トリアルキルおよびアセタールが挙げられる。"制御可能"との用語は，（エステルおよび／またはチオエステル形成による）官能化の程度が調節可能であることを表す。調節は，過剰の活性化剤を用いることにより行う。エステル化反応およびメカニズムの概説は，Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈｅｄ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９２，ｐｐ．３９２−４００に提供される。
【００２０】
塩基性アミノ酸の側鎖アミノ基を修飾しない場合の，Ｎ末端アミノ酸のアミノ基の選択的修飾は，穏和な酸性条件と等価のｐＨ，好ましくは約４から約６の範囲のｐＨを確立する適当な有機バッファ，例えば酢酸ピリジニウムを用いることにより行うことができる。そのような条件下では，側鎖アミノ基は実質的にプロトン化されたままであり，クラウンエーテルにより保護されるが，側鎖アミノ基より塩基性の低いＮ末端アミノ酸のアミノ基はプロトン化されないかまたは完全にプロトン化されず，このためクラウンエーテルにより保護されないかまたは完全に保護されず，したがって，反応に利用可能である。Ｎ末端アミノ酸のアミノ基に結合すべき好ましい基としては，脂質および生体適合性ポリマーが挙げられる。"脂質"および"生体適合性ポリマー"との用語は，下記に定義され，これらの基の好ましい態様である。結合させるべき前記基は，好ましくは，活性化エステル，例えば脂肪酸活性化エステルまたはアルデヒドとして提供される。活性化エステルと遊離Ｎ末端アミノ基との反応により，Ｎ末端がアミド化された（ポリ）ペプチドが得られ；アルデヒドを還元条件下で（例えばＮａＣＮＢＨ３またはＮａＢＨ４）反応させることにより，Ｎ末端アミノ酸のアミノ基がアルキル化された（ポリ）ペプチドが得られる。図１３はＮ末端修飾の例示的反応順序を示す。あるいは，Ｎ末端アミノ酸のアミノ基のアミド化は，１つのアミノ酸で行っても，２，３，４，５，または約１０個までのアミノ酸を含むオリゴペプチドで行ってもよく，ここで，前記アミノ酸または前記オリゴペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも１つは，天然に生じないアミノ酸，Ｄ−アミノ酸，アミノ酸誘導体またはこれらの組み合わせから選択される。"天然に生じないアミノ酸"との用語は，一般に蛋白質中で生じないことに関連する。この用語は，β−アラニン，α−アミノ酪酸，γ−アミノ酪酸，α−アミノイソ酪酸，ノルバリン，ノルロイシン，ε−リジン，オルニチン，ホモセリンおよびヒドロキシプロリンを含む。"Ｄ−アミノ酸"との用語は，天然に生ずるアミノ酸，ならびに天然に生じないアミノ酸の対応Ｄ体を含むことが理解される。"アミノ酸誘導体"との用語は，保護された側鎖を有するアミノ酸およびＮ−アルキル化アミノ酸を含む。適当な保護基は当該技術分野においてよく知られている。この態様においては，組換え的に製造することができる（ポリ）ペプチドをそのＮ−末端で本発明の方法により修飾して，改変されたまたは増強された薬理学的および／または薬物動態学的特性を有する（ポリ）ペプチドを得ることができる。付加されるアミノ酸または前記オリゴペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも１つは，（ポリ）ペプチドをコードする遺伝子またはｍＲＮＡによりコードされないアミノ酸であってもよい。
【００２１】
本発明の方法の好ましい態様においては，エステルまたはチオエステル結合による修飾は，（ａ）生体適合性ポリマー；（ｂ）脂質；（ｃ）ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基を含むリンカー分子；（ｄ）前記（ポリ）ペプチドの側鎖ヒドロキシル基；（ｅ）オリゴヌクレオチド；（ｆ）（プロ）ドラッグ；（ｇ）マーカー；（ｈ）標識；（ｉ）メタノールまたはベンジルアルコールの分子；（ｊ）同族輸送担体を有する小分子；および（ａ）−（ｊ）の任意の組み合わせからなる群より選択される１またはそれ以上を用いるエステルまたはチオエステル結合の形成である。
【００２２】
この態様は，記載される分子または基を前記（ポリ）ペプチドに結合させる方法に関連し，これは，（前記結合により修飾すべき）（ポリ）ペプチドに結合させるべき分子または基が少なくとも１つのヒドロキシル基（図解として図１ａを参照）を有することを必要とする。この態様はまた，前記リンカーを含む"間接的"方法による代替的または付加的結合に対して，"直接"（または"１工程"）修飾とも称される。前記間接法は，以下にさらに詳細に説明する。
【００２３】
"生体適合性ポリマー"との用語は，ヒトまたは動物の身体に有害な反応を生じさせないポリマーを表す。生体適合性ポリマーは，人工装具の目的に，縫合，持続および／または遅延放出医薬組成物等のために広く用いられている。"ポリマー"との用語は狭義のポリマー，すなわち，または１または２以上のタイプ（後者の場合，前記ポリマーはコポリマーとも称される）の複数の構築ブロックから形成される分子であって，ポリマーをその構築ブロックから形成したときに水などの別の分子が形成されないもの，ならびに縮重合体，すなわち，ポリマーをその構築ブロックから形成したときに，ポリマーの他に水などの別の分子が形成される，本発明にしたがうポリマーの両方を含むことが理解される。本発明の"直接"方法において前記生体適合性ポリマーを用いる態様については，生体適合性ポリマーは少なくとも１つの遊離ヒドロキシルまたは遊離スルフヒドリル基を示すことが理解される。
【００２４】
"脂質"との用語は，当該技術分野においてよく知られており，主として親油性／疎水性分子を表し，これは極性ヘッドグループを有して，このことにより脂質分子を両親媒性にしてもよい。（ポリ）ペプチド修飾の直接方法において脂質を用いるためには，ヒドロキシル基が存在することが必要条件である。本発明にしたがう脂質には，単純な脂質，例えば炭化水素（トリアコンタン，スクアレン，カロチノイド），アルコール（ワックスアルコール，レチノール，コレステロール，直鎖状のモノ−またはポリヒドロキシル化炭化水素，好ましくは２個から約３０個の炭素原子を有する），エーテル類，脂肪酸およびエステル，例えば，モノ−，ジ−およびトリアシルグリセロールが含まれる。さらに，複合脂質，例えばリポ蛋白質，リン脂質および糖脂質も含まれる。一方，リン脂質は，グリセロリン脂質，例えば，ホスファチジン酸，リソホスファチジン酸，ホスファチジルグリセロール，カルジオリピン，リソビスホスファチジン酸，ホスファチジルコリン，リソホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノールアミン，ホスファチジルセリン，ホスファチジルイノシトールおよびホスホノ脂質を含む。糖脂質には，グリコグリセロ脂質，例えばモノ−およびジガラクトシルジアシルグリセロールおよびスルホキノボシルジアシルグリセロールが含まれる。また，本発明にしたがう"脂質"との用語には，スフィンゴミエリン糖スフィンゴ脂質およびセラミドも含まれる。
【００２５】
"リンカー分子"との用語は，少なくとも２つの分子要素を一緒に連結することができる成分に関連することが理解される。連結を行う目的のためには，前記リンカー分子は，上述のヒドロキシル基またはスルフヒドリル基に加えて，別の官能基を保護された形または遊離の形で含み，ここで，前記官能基は，化学反応，好ましくは化学選択的反応に適合性である。前記化学選択的反応は，好ましくは前記官能基と第２の分子（修飾すべき前記修飾（ポリ）ペプチドまたは（ポリ）ペプチドを第１の分子とする）との間の反応のみを含み，第１の分子は前記化学選択的反応には参加しない。好ましいリンカーは，２から約１５個の炭素原子を有する炭化水素鎖，前記ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基および前記（第２の）官能基を含むかまたはこれらから構成される。前記官能基の好ましい構造は，下記および図５に提供される。
【００２６】
前記（ポリ）ペプチドの側鎖ヒドロキシル基を用いるエステル化とは，修飾すべき同一の（ポリ）ペプチド分子の中に内部エステル結合を形成することを表す。ヒドロキシル基はＳｅｒ，ＴｈｒまたはＴｙｒの側鎖から提供されることができる。得られるエステル（ラクトン）は環状または大環状である。
【００２７】
本発明にしたがう"オリゴヌクレオチド"との用語は，オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドに加えて，実質的に同じ結合特性を有するが異なる骨格，例えばリン酸−糖骨格の代わりにペプチド性骨格を有する分子を含む。したがって，"オリゴヌクレオチド"との用語は，ペプチド−核酸（ＰＮＡ）ならびにオリゴヌクレオチド−ＰＮＡキメラを含む。
【００２８】
"ＰＮＡ"との用語は，"ペプチド核酸"を意味する。簡単には，ＰＮＡは，ＤＮＡまたはＲＮＡの糖リン酸骨格の代わりにアミド骨格を有する合成ＤＮＡ模倣体である（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７−１５００；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ，３６５，５６６−５６８）。ＰＮＡはいくつかの有利な特性を示す。これらは，酸性条件下で安定であり，ヌクレアーゼならびにプロテアーゼに対して耐性である（Ｄｅｍｉｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８，１３１０−１３１３）。これらは骨格が静電的に中性であるため，対応するＤＮＡ−ＤＮＡデュープレックスの安定性と比較して，相補的ＤＮＡに対する結合強度が増加している（Ｗｉｔｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，５６１−５６３；Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｅｎ（２０００），Ｆａｓｅｂ  Ｊ．，１４，１０４１−１０６０）。すなわち，ＰＮＡオリゴマーは，ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合，オリゴヌクレオチドより短くてもよい。一方，ミスマッチはより大きい不安定化効果を有するため，完全なマッチとミスマッチの間の判別が改良される。ＰＮＡは，電荷をもたない性質のため，低い塩濃度または塩なしの条件でのＤＮＡサンプルのハイブリダイゼーションを可能とする。これは，２つの負に荷電したＤＮＡ鎖間のような鎖間の反発力を弱める必要がないためである。その結果，標的ＤＮＡハイブリダイゼーション条件下でより少ない二次構造をとり，プローブ分子がよりアクセスしやすい。本発明にしたがうＰＮＡキメラは，１またはそれ以上のＰＮＡ部分を含む分子である。キメラ分子の残りの部分は１またはそれ以上のＤＮＡ部分を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい長さは，１２−２００塩基，より好ましくは２０−１００塩基である。本発明のオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである態様においては，２０−２５塩基の長さ，特に２１−２３塩基の長さの鎖を有するデュープレックスが好ましく，３’オーバーハングであることが好ましい。ＲＮＡｉの目的のために最も好ましいものは，２１塩基のセンス鎖と２１塩基のアンチセンス鎖からなり，１９−ヌクレオチドのデュープレックス領域およびそれぞれの３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有するよう塩基対形成したｓｉＲＮＡデュープレックスである。
【００３０】
"（プロ）ドラッグ"との用語は，薬剤（ドラッグ）とプロドラッグとの両方を含むことが理解される。"薬剤"との用語は，ヒトまたは動物への適用が認められている任意の活性薬剤を含む（リストについては，例えば，ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈｅｄ．Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ；およびＭａｒｔｉｎｄａｌｅ，"Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ"  Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｖｅｒｓｉｏｎ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｍｅｄｅｘ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｖｉｌｌａｇｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，３４ｔｈｅｄ．を参照）。"プロドラッグ"は，一般に生物学的におよび／または薬理学的に活性ではない化合物である。しかし，活性化される場合，典型的にはインビボで酵素的にまたは加水分解的に切断されてプロドラッグが生物学的および／または薬理学的化合物（薬剤）に変換される場合，プロドラッグの投与は，意図される医学的効果を有することになる。プロドラッグは，典型的には，生物学的および／または薬理学的化合物を化学修飾することにより形成される。適当なプロドラッグ誘導体を選択および製造するための慣用の方法は，例えば，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載されている。プロドラッグは，例えば，全身投与するには活性な薬剤の毒性が強すぎる場合，活性な薬剤が消化管でほとんど吸収されない場合，または活性な薬剤がその標的に到達する前に身体がこれを分解する場合に有用である。プロドラッグの活性化は，例えば細胞膜等の体内の関門を通過した後に，身体における代謝により生じうる。
【００３１】
"マーカー"との用語は，修飾（ポリ）ペプチドの検出を容易にするか可能とする分子，フラグメントまたはラジカルを表す。マーカーとしては，蛍光蛋白質等の蛋白質性分子，例えば，ブルー，シアン，グリーンおよびイエロー蛍光蛋白質（ＢＦＰ，ＣＦＰ，ＧＦＰおよびＹＦＰ）および発光蛋白質が挙げられる。また，当該技術分野においてよく知られるレポーターコンストラクトも含まれる。
【００３２】
"標識"との用語は，当該技術分野においてよく知られており，例えば，放射性，蛍光および／または発光性等の原子または官能基を有する分子，フラグメントまたはラジカルが含まれる。放射性核種としては，３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈ，９０Ｙおよび１３１Ｉが挙げられる。蛍光標識としては，フルオレン類，ピレン類，キサンテン類，例えば，フルオレセイン類，ローダミン類，クマリン類，ナフチルアミン類，アクリジン類，ベンゾオキサゾール類，ベンゾジオキサゾール類，スチルベン類，ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）類，ポリチオフェン類，ポリ（フェニレンエニチレン）類およびポリ（パラフェニレン）類が挙げられる。ナフチルアミン類は，アルファまたはベータ位にアミノ基を有していてもよく，例えば，１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸，１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸および２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホン酸が挙げられる。クマリン類としては，３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；アクリジン類としては９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；ベンゾオキサゾール類としてはＮ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミドが挙げられる。
【００３３】
"フルオレン類"等の複数形の使用は，フルオレンそれ自体のみならず，本出願の優先日において当該技術分野において知られるその誘導体も包含することを示すことが理解される。
【００３４】
発明にしたがう特定の蛍光標識としては，以下の市販の（例えばＳｙｎｔｈｅｇｅｎ社製）蛍光染料が挙げられる：Ｔａｍｒａ−ｄＴ，５−フルオレセイン（ＦＩＴＣ），５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），３’６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），６−カルボキシフルオレセイン−ＤＭＴ（ＦＡＭ−Ｘ），５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），６−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ），６−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ），ＪＯＥ，ライトサイクラーレッド６４０，ライトサイクラーレッド７０５，ＦＡＲ−フクシア（５’−アミダイト），ＦＡＲ−フクシア（ＳＥ），ＦＡＲ−ブルー（５’−アミダイト），ＦＡＲ−ブルー（ＳＥ），ＦＡＲ−グリーン１（ＳＥ），ＦＡＲ−グリーン２（ＳＥ），オレゴングリーン４８８，オレゴングリーン５００，オレゴングリーン５１４，ＢＯＤＩＰＹＦＬ−Ｘ，ＢＯＤＩＰＹＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ，ＢＯＤＩＰＹＲ６Ｇ，ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５，ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０，ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１，ＢＯＤＩＰＹＴＲ−Ｘ，ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０，ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３，カルボキシローダミン６Ｇ，ＭＡＸ，５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ），６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ），５（６）−カルボキシ−Ｘ，ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），ＡＭＣＡ−Ｘ（クマリン），テキサスレッド−Ｘ，ローダミンレッド−Ｘ，マリナブルー，パシフィックブルー，ローダミングリーン−Ｘ，７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸，７−メトキシクマリン−３−カルボン酸，Ｃｙ３，Ｃｙ３Ｂ，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５，ＤＹ−５０５，ＤＹ−５５０，ＤＹ−５５５，ＤＹ−６１０，ＤＹ−６３０，ＤＹ−６３３，ＤＹ−６３６，ＤＹ−６５０，ＤＹ−６７５，ＤＹ−６７６，ＤＹ−６８１，ＤＹ−７００，ＤＹ−７０１，ＤＹ−７３０，ＤＹ−７５０，ＤＹ−７５１，ＤＹ−７８２，Ｃｙ３．５およびＥＤＡＮＳ。
【００３５】
"同族輸送担体を有する小分子"との用語は，体内で特異的輸送担体により認識され輸送される分子を表す。そのような分子ならびにその同族輸送担体は当該技術分野においてよく知られている。好ましい分子としては，ビタミンＢ１２（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，２００１，４６，５９−７３を参照）およびビタミンＣが挙げられる。
【００３６】
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，前記カルボキシル基は，（ａ）Ｇｌｕの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；（ｂ）Ａｓｐの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；（ｃ）Ｃ末端アミノ酸の主鎖カルボキシル基；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００３７】
さらに別の好ましい態様においては，前記方法は，前記リンカーを，（ａ）生体適合性ポリマー；（ｂ）脂質；（ｃ）リンカー；（ｄ）第２の（ポリ）ペプチド；（ｅ）オリゴヌクレオチド；（ｆ）（プロ）ドラッグ；（ｇ）マーカー；（ｈ）標識；（ｉ）同族輸送担体を有する小分子；および（ａ）〜（ｉ）の任意の組み合わせからなる群より選択される１またはそれ以上の分子と反応させる工程をさらに含む。
【００３８】
この態様は，本発明にしたがう修飾（ポリ）ペプチドを製造するモジュール式方法に関連する（本明細書においては，"間接的"または"２工程"方法とも称される）。この態様においては，（ポリ）ペプチドを，第１工程でヒドロキシル基またはスルフヒドリル基を有するリンカーを用いてエステル化し，ここで，前記リンカーは，さらに，形成されたそれぞれのエステル結合に"フック"を導入する第２の官能基を有する。すなわち，第１工程の後に，規定された数のエステル結合が生成し，第２工程において，前記第２の官能基を介する円滑な化学選択的反応により目的とする基を結合させることができる（図解は図１ｂを参照）。このようにして蛋白質に連結すべき基の官能化のレベルを微調整することができる。この手法は，ポリマー等の大きな基または脂質等の疎水性基を挿入して，遅延型の治療関連（ポリ）ペプチドを得るのに理想的である。化学選択的反応（第２工程）は，それぞれの場合に所望の程度の置換を達成するように調節する。最後に，モジュール式の方法を用いることにより，目的とする（ポリ）ペプチドを２以上のタイプの基で官能化して，さらに生物薬理学的特性を増強することが可能である。
【００３９】
好ましい態様においては，前記リンカーを反応させる前記さらなる工程は，弱塩基−カルボニル化学により行う。そのような反応は，非常に穏和な，弱酸性条件下で行うことができる。したがって，（ポリ）ペプチドまたは抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の構造は妨害されない。好ましくは，前記反応は，アルデヒドまたはケトン等の求電子基を，ヒドラジンまたはヒドロキシルアミン誘導体（それぞれ一般式ＮＨ２ＮＨＲまたはＮＨ２ＯＲを有する）または１，２−官能基等の求核基と反応させて，反応生成物としてエーテル性環を生成することを含む。好ましい１，２−官能基は，１，２−アミノ−チオール，１，２−アミノ−ヒドロキシ，１，２−ヒドロキシ−チオール，１，２−ジチオールおよび１，２−ジヒドロキシである。求核基は前記リンカーの前記第２の官能基であってもよく，この場合にはリンカーに結合すべき基は求電子基を有し，あるいはこの逆でもよい（図５を参照）。
【００４０】
別の好ましい態様においては，銅により触媒されるアルキンとアジド基のカップリング（一般にクリック化学と称される，例えば，Ｖ．Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ  ｅｔ．ａｌ．２００２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，４１，２５９６を参照）を用いて，結合すべき分子にリンカーを化学選択的に連結させる。結合はエーテル性環形成により生ずる。
【００４１】
生体適合性ポリマーの結合により（ポリ）ペプチドを構造的に修飾すると，このようにして得られた修飾（ポリ）ペプチドは，以下の驚くべき，および／または有利な機能的特性の１またはそれ以上を示す：（ｉ）増強された吸収またはデリバリー，（ｉｉ）分解からの保護，（ｉｉｉ）持続する活性，および（ｉｖ）増加した効力。増強された吸収またはデリバリーは，生体適合性ポリマーが，例えば，前記生体適合性ポリマーの吸収または移動が（ポリ）ペプチドの吸収または移動に先行するかこれを容易にするように，優先的に吸収されるか，または例えば細胞膜または血液脳関門または粘膜表面等の体内の関門を超えて移動することにより生ずる。前記生体適合性ポリマーは，直鎖状（図７の図解を参照）であっても，分枝または架橋されていてもよい（図８および９を参照）。増強された吸収は，直鎖状のまたは分枝または架橋した生体適合性ポリマーとともにデリバリーされることにより達成することができる。酵素等による分解からの保護は，（ポリ）ペプチドに結合した生体適合性ポリマーの遮蔽効果により達成される。この場合には，分枝または架橋したポリマーが好ましい（図８および９を参照）。図８は部分的遮蔽を図解し，これは，好ましくは（ポリ）ペプチドを（ポリ）ペプチドより小さい生体適合性ポリマー分子で誘導化することにより行う。一方，図９は完全遮蔽を図解し，これは，好ましくは（ポリ）ペプチドより大きい，例えば分子量または全体のサイズで約２倍大きいポリマー分子を用いて行う。同様に，前記遮蔽効果は，長く持続する活性を引き起こすであろう。これは，生物学的活性を示すためには，生体適合性ポリマーが少なくとも部分的に分解されるか，または（ポリ）ペプチドが完全に放出されなければならないためである。そのような持続する活性を示す，本発明にしたがう修飾（ポリ）ペプチドは，例えば，前記（ポリ）ペプチドの徐放性剤として有用である。脂質化（ポリ）ペプチドについて，増加した効力が報告されている。特定の理論に拘束されるものではないが，この効果は，（ポリ）ペプチドの親油性が高まり，細胞膜に接着し，同族レセプターとの相互作用が増強されるかまたは持続するためであると想定される。
【００４２】
好ましい態様においては，前記リンカーと上述の分子の１またはそれ以上との反応は，水性媒体中で行う。つまり，本発明の２工程方法の第１工程が完了した後，１またはそれ以上のリンカーで修飾した（ポリ）ペプチドを，第２工程，すなわちリンカーの誘導化を行う水性媒体中に移す。"水性媒体"との用語は，水，バッファ，および水が溶媒として用いられる溶液を含む。あるいは，前記リンカーに結合させるべき基または分子が溶解性の理由で有機溶媒を必要とする場合には，誘導化した（ポリ）ペプチドをクラウンエーテルとの複合体とし，本発明にしたがう有機溶媒または水性媒体と有機溶媒との混合物を用いることができる。
【００４３】
本発明の方法の好ましい態様においては，前記生体適合性ポリマーは，ポリエーテル，多糖類，ポリエステル（ポリオルトエステル等），ポリアルキルシアノアクリレート，ヒドロキシアルキルアクリルアミド，界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される。
【００４４】
"界面活性剤"との用語は，当該技術分野においてよく知られている。これはミセルを形成しうる分子を含むことが理解される。"界面活性剤"との用語は，ポリマー性の性質を有する分子のみならず，脂質，例えばリン脂質および糖脂質も含み，これは上で詳細に説明されている。
【００４５】
物理化学的特性に関しては，本発明にしたがう生体適合性ポリマーはハイドロゲルであってもよい。その代わりにまたは付加的に，前記生体適合性ポリマーは，界面活性剤または張力活性剤であってもよい。さらにその代わりにまたは付加的に，前記ポリマーは，リポソーム，ポリマー性ミセル，微小球，マイクロカプセルおよび／またはナノ粒子を形成することができるものであってもよい。本発明の方法を用いることにより，クラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドは，リポソーム，ミセル，微小球，マイクロカプセルまたはナノ粒子の唯一の構成分子であるかまたは構成分子の１つであるポリマーに共有結合させることができる。このことにより，その内部に共有結合した（ポリ）ペプチドを含むリポソーム，ミセル，微小球，マイクロカプセルまたはナノ粒子が得られる。リポソーム，ミセル，微小球，マイクロカプセルまたはナノ粒子中に封入されたクラウンエーテル類は，例えば，塩化ナトリウムの水性溶液で洗浄することにより除去することができる。
【００４６】
好ましい多糖類としては，シクロデキストリン，スターチ，キチン，キトサン，キサンタン，デキストラン，セルロース，アルギン酸，プルラン，ペクチン，糖脂質およびグリコサミノグリカン（例えば，硫酸コンドロイチン，硫酸デルマタン，硫酸ケラタン，硫酸ヘパリン，ヘパリンおよびヒアルロン酸）が挙げられる。
【００４７】
より好ましい態様においては，前記ポリエステルは，ビルディングブロック（またはコポリマーの場合にはビルディングブロックの少なくとも１つ）がα−ヒドロキシ酸，例えば乳酸またはグリコール酸であるポリマーまたはコポリマーである。
【００４８】
さらに別の好ましい態様においては，前記生体適合性ポリマーは分枝しているか，および／または架橋されている。
【００４９】
分枝しているか，および／または架橋されているポリマーは，上述した遮蔽効果，すなわち（ポリ）ペプチドを包むのに特に適している。
【００５０】
好ましくは，ポリエーテルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるか，またはポリエステルはポリ（乳酸／グリコール酸）である。"ＰＥＧ"との用語は，当該技術分野においてよく知られるポリエーテルポリオールの一種である。ＰＥＧは，商業的供給元から広範な分子量のものが入手可能である。例示的分子量範囲は，約１００から約１０００００００であり，例えば，例えば約２００，３００，４００，５００，８００，１０００，２０００，５０００，１００００，１０００００，５０００００および１００００００の分子量のＰＥＧが挙げられる。本発明にしたがう"ポリ（乳酸／グリコール酸）"との用語は，ポリ乳酸，ポリグリコール酸および乳酸とグリコール酸とのコポリマーを含む。
【００５１】
好ましくは，前記第２の（ポリ）ペプチドは膜透過性（ポリ）ペプチドである。多くの場合，細胞デリバリーは，蛋白質導入ドメイン（または蛋白質形質導入ドメイン；ＰＴＤ）を標的蛋白質中に組み込むことにより行うことができる。これらは一般に小から中サイズのポリペプチド配列であり，この理由のため，しばしば細胞透過性（ポリ）ペプチド（ＣＰＰ）または膜透過性（ポリ）ペプチドと称される。これは顕著な親油性を示さないが，両親媒性であり，一般に生理学的ｐＨで多数の正電荷をもつ。これらは単独で，または蛋白質‘荷物’に連結して，効率的に細胞の細胞膜を横切ることができる。これらが膜を横切るメカニズムは完全には解明されていないが，ＰＴＤは，蛋白質を細胞にデリバリーするためのベクターとしてその使用が増加しており，ドラッグデリバリーにおけるその応用の可能性を示している。すなわち，特定の理論に拘束されるものではないが，エステル形成を介してポリマーにより蛋白質を誘導化することは，負電荷を排除し親油性ポリマーを付加することにより蛋白質それ自体の親油性を増加させるのみならず，蛋白質の化学的物理学的特性をカチオン性ＣＰＰと類似のものにし，このことにより細胞透過を可能としていると想定される。
【００５２】
好ましい態様においては，前記膜透過性（ポリ）ペプチドは，ペネトラチン（Ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ  ４３−５８），ＴａＴ，ＴＡＴ４６−６０，ＰＴＤ−４，ＳｙｎＢ１およびＳｙｎＢ３（Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ  Ｉ），トランスポータン，ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド），Ｐｅｐ−１，プロリンリッチペプチド（ＶＸＬＰＰＰ）ｎ，ｐＶＥＣ，ｐＩＳＬ，ポリアルギニン，ＳＮ５０，ＭＰＧからなる群より選択される（Ｚｏｒｋｏ，Ｍ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．（２００５）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ；５７：５２９−５４５を参照）。上述の膜透過性ペプチドは天然型（Ｌ−残基から形成される）であってもよく，またはＤ−残基から形成されていてもよい。
【００５３】
別の好ましい態様においては，第２の（ポリ）ペプチドは，胃腸（ＧＩ）輸送担体により認識され運搬される蛋白質または（ポリ）ペプチドである。そのような（ポリ）ペプチドおよび体内のその同族輸送担体は当該技術分野においてよく知られている。胃腸輸送担体により認識され輸送される好ましい（ポリ）ペプチドは，トランスフェリン（Ｘｉａ，Ｃ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２０００，２９５，５９４−６００）およびレクチン類（Ｌｅｈｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．，２０００，６５，１９−２９）である。
【００５４】
第２の（ポリ）ペプチドを修飾されるべき（ポリ）ペプチドと直接および／または間接的経路でコンジュゲートする，本発明の方法の好ましい態様においては，前記第２の（ポリ）ペプチドを（プロ）ドラッグ分子と連結する。
【００５５】
好ましくは，前記（プロ）ドラッグは抗癌（プロ）ドラッグである。
【００５６】
より好ましい態様においては，前記抗癌（プロ）ドラッグは，エトポシド，フェノールマスタード，メルファラン，葉酸拮抗薬（メトトレキセート等），ナイトロジェンマスタード，クロラムフェニコール，５−フルオロ−２’−デオキシウリジン，カンプトテシン，５−フルオロウラシル，５−フルオロウリジン，アントラサイクリン誘導体，アントラサイクリン（例えば，ダウノルビシン，ドキソルビシン）９−アミノカンプトテシン，ベラパミル，キニン，ジピリダモール，マイトマイシン，ビンカ誘導体，パクリタキセル，ドセタキセル，白金薬剤，ベンズアミドマスタード，エネジン，ネオカルジノスタチン，パリトキシン，ＣＣ−１０６５類似体，デュオカルマイシン類似体アミノ−ＣＢＩ誘導体，アウリスタチン，モノメチルアウリスタチン，ドラスタタチン１０，メイタンシン，メイタンシノイドＤＭ１，メイタンシノイドＤＭ４，ゲルダナマイシンカリケアマイシン，治療用放射性同位体（イットリウム−９０およびヨウ素−１３１），細菌由来毒素（ジフテリア毒素または緑膿菌エンドトキシン）および植物由来毒素（トウゴマ実由来リシンまたはゲロニン）からなる群より選択される。
【００５７】
本発明の方法は，（プロ）ドラッグが高い毒性および／または低い細胞内デリバリーおよび／または血液脳関門等の身体内関門を超える低いデリバリーを示す場合に用いることが特に好ましい。
【００５８】
好ましくは，前記オリゴヌクレオチドは，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ｓｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される。
【００５９】
当該技術分野において知られるように，アンチセンスＲＮＡ配列は，ｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり，前記ｍＲＮＡに選択的に結合することができ，前記配列は，ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の合成を阻害することができる。本発明にしたがうリボザイムは，ｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり，前記ｍＲＮＡに特異的に結合してこれを切断し，このことにより前記ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の合成を阻害することができる。好ましくは，本発明のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイムは，ｍＲＮＡのコーディング領域，例えば，コーディング領域の５’側の部分に相補的である。当業者は前記ｍＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡをコードする遺伝子の配列がわかれば，上述のアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを製造し利用することができる。ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉ技術において用いられる小干渉ＲＮＡである（例えば，Ｚａｍｏｒｅ  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２００１，８（９）：７４６−５０，またはＴｕｓｃｈｌ  Ｔ．ＣＨＥＭＢＩＯＣＨＥＭ．２００１，２：２３９−２４５を参照）。
【００６０】
好ましくは，前記（ポリ）ペプチドは，抗体または前記抗体の結合特異性を保持したそのフラグメントもしくは誘導体である。抗体に適用される本発明の方法の図解は図３（直接方法）および図４（間接方法）に示される。
【００６１】
本発明にしたがう"抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体"との用語は，モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体，一本鎖抗体，またはこれらのフラグメントを含み，さらに二重特異性抗体，合成抗体および抗体フラグメント，例えば，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ２）’，ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント等，またはこれらのいずれかの化学的に修飾した誘導体を含む。モノクローナル抗体は，例えば，ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），４９５，およびＧａｌｆｒｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１），３）により最初に記載された，マウスミエローマ細胞を免疫した哺乳動物に由来する脾臓細胞と融合することを含む手法により，当該技術分野において開発された改変を加えて，製造することができる。さらに，上述のペプチドに対する抗体またはそのフラグメントは，例えば，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ"Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載される方法を用いて得ることができる。ファージディスプレイ手法により前記抗体の誘導体を得る場合には，ＢＩＡｃｏｒｅシステムに用いられている表面プラスモン共鳴を用いて，本発明のペプチドまたはポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効力を増加させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。キメラ抗体の製造は，例えば，ＷＯ８９／０９６２２に記載されている。本発明にしたがって用いるべき抗体の別の起源は，いわゆる異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）抗体である。異種抗体，例えばマウスにおいてヒト抗体を製造する一般的原理は，例えば，ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５に記載されている。本発明にしたがって用いるべき抗体またはその対応するイムノグロブリン鎖は，当該技術分野において知られる慣用の手法を用いて，例えばアミノ酸の欠失，挿入，置換，付加，および／または組換え，および／または当該技術分野において知られる他の任意の修飾を単独でまたは組み合わせて用いることにより，さらに修飾することができる。イムノグロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にそのような修飾を導入する方法は，当業者にはよく知られている。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（上掲）を参照。
【００６２】
"モノクローナル"または"ポリクローナル抗体"（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，（１９８８）（上掲）を参照）との用語はまた，その結合特異性を保持するかまたは本質的に保持する前記抗体の誘導体に関連する。そのような抗体の他の好ましい誘導体は，例えば，マウスまたはラットの可変領域とヒトの定常領域を含むキメラ抗体である。
【００６３】
"ｓｃＦｖフラグメント"（一本鎖Ｆｖフラグメント）との用語は，当該技術分野においてよく理解されており，サイズが小さいこと，およびそのようなフラグメントを組換え的に製造しうるため，好ましい。本発明にしたがって用いられる抗体に関して，"結合特異性"との用語は，抗体等が標的抗原と類似する構造を有する抗原と交叉反応しないかまたは本質的に交叉反応しないことを意味する。調べる抗体等のパネルの交叉反応性は，例えば，慣用の条件下で前記抗体等のパネルの，目的とする抗原，ならびに程度の差はあるが密接に関連する（構造的におよび／または機能的に）多数の抗原に対する結合を評価することにより，試験することができる（例えば，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，（１９８８）（上掲）を参照）。目的とする抗原に結合するが，他の抗原，好ましくは目的とする抗原と同じ組織で発現される抗原のいずれにも結合しないかまたは本質的に結合しない抗体は，目的とする抗原に対して特異的であると考えられる。
【００６４】
本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記抗体または抗体結合部位は，ヒト抗体またはヒト化抗体であるか，またはこれに由来する。本発明にしたがえば，"ヒト化抗体"との用語は，非ヒト起源の抗体であって，可変領域中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ），例えばＣＤＲ３，好ましくは６個すべてのＣＤＲがヒト起源の抗体のＣＤＲにより置き換えられている，所望の特異性を有する抗体を意味する。任意に，抗体の非ヒト定常領域は，ヒト抗体の定常領域により置き換えられている。ヒト化抗体を製造する方法は，例えば，ＥＰ−Ａ１０２３９４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されている。
【００６５】
本発明の方法の好ましい態様においては，前記クラウンエーテルは，１８−クラウン−６，１２−クラウン−４，１５−クラウン−５，ベンゾ−１８−クラウン−６，ジベンゾ−１８−クラウン−６，１２−クラウン−４，１５−クラウン−５，（１２−クラウン−４）−２−メタノール，１８−クラウン−６テトラカルボン酸，（１８−クラウン−６）−２−メタノール，ベンゾ−１５−クラウン−５，ジベンゾ−１５−クラウン−５，４’−アミノ−ベンゾ−１５−クラウン−５，４’−アミノ−ベンゾ−１８−クラウン−６およびカリクサレン，例えばカリックス［４］アレーン，カリックス［６］アレーン，カリックス［８］アレーン，およびカリックス［６］アレーン−ヘキサ酢酸ヘキサエチルエステルからなる群より選択される。
【００６６】
より好ましくは，前記クラウンエーテルは１８−クラウン−６である。
【００６７】
本発明はまた，修飾（ポリ）ペプチドの合成における中間体としてのクラウンエーテル結合（ポリ）ペプチドの使用に関し，ここで，前記（ポリ）ペプチドは，１またはそれ以上のカルボキシル基において，エステル化またはチオエステル化により，および／またはＮ末端アミノ酸のアミノ基においてアミド化またはアルキル化により修飾されている。
【００６８】
本発明の使用の好ましい態様においては，前記修飾（ポリ）ペプチドは本発明の方法により得ることができる。
【００６９】
本発明はまた，本発明の方法により得られる修飾（ポリ）ペプチドに関する。
【００７０】
また本発明に包含されるものは，生体適合性ポリマー，脂質，ヒドロキシル基を含むリンカー，第２の（ポリ）ペプチド，オリゴヌクレオチド，（プロ）ドラッグ，マーカー，標識，メタノールまたはベンジルアルコールの分子，同族輸送担体を有する小分子またはこれらの任意の組み合わせの１またはそれ以上で修飾されている（ポリ）ペプチドであり，ここで，前記生体適合性ポリマー，脂質，リンカー，第２の（ポリ）ペプチド，オリゴヌクレオチド，（プロ）ドラッグ，マーカー，メタノール，ベンジルアルコールの標識または分子，または同族輸送担体を有する小分子は，エステルまたはチオエステル結合を介して（ポリ）ペプチドのカルボキシル基に結合しているか，および／または（ポリ）ペプチドはＮ末端アミノ酸のアミノ基でアミド化またはアルキル化されている。カルボキシル基がメタノールまたはベンジルアルコールでエステル化されている（ポリ）ペプチドの例は，以下に提供される。さらに，エステル化は４−（２−ヒドロキシエチル）−２−２−ジメチル−１，３−ジオキソランを用いて行ってもよく（実施例１（ｂ）を参照），またはチオエステル化はチオグリセロールを用いて行ってもよい（実施例２を参照）。
【００７１】
本発明の（ポリ）ペプチドの好ましい態様においては，前記（ポリ）ペプチドのカルボキシル基は，（ａ）Ｇｌｕの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；（ｂ）Ａｓｐの１またはそれ以上の側鎖カルボキシル基；（ｃ）Ｃ末端アミノ酸の主鎖カルボキシル基；または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００７２】
本発明の（ポリ）ペプチドのさらに別の好ましい態様においては，前記リンカーは，（ａ）生体適合性ポリマー；（ｂ）脂質；（ｃ）リンカー；（ｄ）第２の（ポリ）ペプチド；（ｅ）オリゴヌクレオチド；（ｆ）（プロ）ドラッグ；（ｇ）マーカー；（ｈ）標識；（ｉ）同族輸送担体を有する小分子；または（ａ）−（ｉ）の任意の組み合わせの１またはそれ以上を有する。
【００７３】
好ましくは，前記生体適合性ポリマーは，ポリエーテル，多糖類，ポリエステル（ポリオルトエステルを含む），ポリアルキルシアノアクリレート，ヒドロキシアルキルアクリルアミド，界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される。
【００７４】
好ましくは，前記生体適合性ポリマーは分枝しているか，および／または架橋されている。
【００７５】
好ましくは，ポリエーテルはＰＥＧであるか，またはポリエステルはポリ（乳酸／グリコール酸）である。
【００７６】
好ましくは，前記第２の（ポリ）ペプチドは膜透過性（ポリ）ペプチドである。
【００７７】
本発明の（ポリ）ペプチドの好ましい態様においては，前記第２の（ポリ）ペプチドは（プロ）ドラッグ分子に連結されている。
【００７８】
好ましくは，前記（プロ）ドラッグは抗癌（プロ）ドラッグである。
【００７９】
好ましくは，前記オリゴヌクレオチドは，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ｓｉＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される。
【００８０】
好ましい態様においては，前記（ポリ）ペプチドは，抗体または前記抗体の結合特異性を保持したそのフラグメントもしくは誘導体である。
【００８１】
本発明はまた，前記抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の１またはそれ以上のカルボキシル基にエステルまたはチオエステル結合を介して結合した１またはそれ以上のリンカーを有する，抗体または前記抗体の結合特異性を保持したそのフラグメントもしくは誘導体に関し，ここで，前記リンカーは，膜透過性（ポリ）ペプチドを有し，この膜透過性（ポリ）ペプチドは（プロ）ドラッグ分子を有する。この本発明にしたがうコンストラクトは，特定の細胞タイプに薬剤をデリバリーすることができる。デリバリーの特異性は，抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の結合特異性により達成され，これは，例えば，治療的介入の標的とすべき１またはそれ以上の細胞タイプに存在する細胞表面マーカーを認識する。チオエステル結合のエステルの切断により，膜透過性（ポリ）ペプチドと（プロ）ドラッグとのコンジュゲートが解放される。この膜透過性（ポリ）ペプチドは，細胞内への侵入を可能とし，活性化合物は細胞内で例えば細胞内酵素により膜透過性（ポリ）ペプチドから切断され，プロドラッグとして提供される場合には活性となる。本発明のこの態様は図６に図解される。
【００８２】
本発明はさらに，本発明の（ポリ）ペプチドおよび／または抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む医薬組成物を包含する。
【００８３】
医薬組成物は，個々の患者の病状，医薬組成物のデリバリー部位，投与方法，投与スケジュール，および医師に知られる他の因子を考慮して，適正な医療行為と一致するように製剤し投与する。したがって，本発明の目的のための"有効量の"医薬組成物は，そのような考慮により決定される。
【００８４】
当業者には，個人に投与される有効量の医薬組成物は，とりわけ，化合物の性質によって異なることがわかる。例えば，前記化合物が（ポリ）ペプチドまたは蛋白質である場合，非経口的に投与される医薬組成物の１回投与あたりの薬学的に有効な総量は，患者の体重あたり，約１μｇ蛋白質／ｋｇ／日から１０ｍｇ蛋白質／ｋｇ／日の範囲内であるが，上述したように，これは治療上の裁量による。より好ましくは，この投与量は，少なくとも０．０１ｍｇ蛋白質／ｋｇ／日，ヒトについて最も好ましくは約０．０１から１ｍｇ蛋白質／ｋｇ／日である。連続的に投与する場合には，医薬組成物は典型的には約１μｇ／ｋｇ／時間から約５０μｇ／ｋｇ／時間の投与速度で，１日１−４回の投与により，または例えばミニポンプを用いる連続皮下注入により投与される。静脈内バッグ溶液を用いてもよい。変化が観察されるのに必要な治療の長さおよび応答が生ずる治療後の機関は，所望の効果により様々である。
【００８５】
本発明の医薬組成物は，経口，直腸，非経口，嚢内，膣内，腹腔内，局所（粉体，軟膏，点眼剤または経皮パッチとして），口腔内，または経口もしくは経鼻スプレーとして投与することができる。"薬学的に許容しうる担体"とは，無毒性の固体，半固体または液体の充填剤，希釈剤，カプセル化剤または任意の種類の製剤補助剤を意味する。本明細書において用いる場合，"非経口"との用語は，静脈内，筋肉内，腹腔内，胸骨内，皮下および関節内注射および注入を含む投与モードを表す。
【００８６】
医薬組成物はまた，持続放出系により適宜投与される。持続放出組成物の適当な例としては，成形した製品，例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスとしては，ポリ乳酸（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，７７３，９１９，ＥＰ５８，４８１），Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３）），ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１），およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）），エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄ．）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。持続放出医薬組成物には，リポソームに封入された化合物も含まれる。医薬組成物を含むリポソームは，それ自体知られる方法により製造する：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許出願８３−１１８００８；米国特許４，４８５，０４５および４，５４４，５４５；およびＥＰ１０２，３２４。通常，リポソームは，小さい（約２００−８００オングストローム）単層タイプのものであり，脂質含有量が約３０モル％のコレステロールより多く，選択される比率は最適な治療用に調節される。
【００８７】
非経口投与用には，一般に，医薬組成物は，所望の程度の純度で，薬学的に許容しうる担体（すなわち，用いられる投与量および濃度で受容者に無毒性であり，製剤の他の成分と適合しうるもの）とともに，単位投与量の注射可能な形（溶液，懸濁液または乳濁液）に混合することにより製剤する。
【００８８】
一般に，製剤は，医薬組成物の成分を液体担体または微粉化した固体担体，またはこれらの両方と均一かつ密接に接触させることにより製造する。次に，必要であれば，生成物を所望の処方物の形状にする。好ましくは担体は非経口担体であり，より好ましくは受容者の血液と等張の溶液である。そのような担体ベヒクルの例としては，水，食塩水，リンゲル溶液，およびデキストロース溶液が挙げられる。非水性ベヒクル，例えば固定油およびオレイン酸エチル，ならびにリポソームもまた本発明において有用である。担体は，少量の添加剤，例えば，等張性および化学的安定性を増加させる物質を適切に含む。そのような物質は，用いる用量および濃度で受容者に対して無毒性であり，例えば，バッファ，例えばリン酸，クエン酸，コハク酸，酢酸，および他の有機酸またはその塩；抗酸化剤，例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）の（ポリ）ペプチド，例えば，ポリアルギニンまたはトリペプチド；蛋白質，例えば，血清アルブミン，ゼラチン，またはイムノグロブリン；親水性ポリマー，例えば，ポリビニルピロリドン；アミノ酸，例えば，グリシン，グルタミン酸，アスパラギン酸，またはアルギニン；単糖類，二糖類，および多の炭水化物，例えばセルロースまたはその誘導体，グルコース，マンノース，またはデキストリン；キレート剤，例えばＥＤＴＡ；糖アルコール，例えばマンニトールまたはソルビトール；カウンターイオン，例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤，例えば，ポリソルベート，ポロキサマー，またはＰＥＧが挙げられる。
【００８９】
治療用投与に用いるべき医薬組成物の成分は滅菌したものでなければならない。滅菌は，滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンの膜）を通して濾過することにより容易に行うことができる。医薬組成物の治療用成分は一般に，滅菌したアクセスポートを有する容器，例えば，皮下注射針で刺し通すことができる栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れる。医薬組成物の成分は，通常，１回用量のまたは多数回用量の容器，例えば，密封したアンプルまたはバイアル中で，水性溶液として，または再構成用の凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥した製剤の一例として，１０ｍｌバイアルに５ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）水性溶液を引用例，得られた混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した化合物を静菌性の注射用水を用いて再構成することにより注入溶液を調製する。
【００９０】
本発明はまた，疾患の治療用の医薬組成物の製造における本発明の（ポリ）ペプチドの使用に関し，ここで，（ａ）（ポリ）ペプチドはインスリンであり，疾患は糖尿病である；（ｂ）（ポリ）ペプチドはＥＰＯであり，疾患は貧血症または慢性腎不全である；（ｃ）（ポリ）ペプチドはＧ−ＣＳＦであり，疾患は好中球減少症である；（ｄ）（ポリ）ペプチドはアスパラギナーゼであり，疾患は癌である；（ｅ）（ポリ）ペプチドは第ＶＩＩ因子であり，疾患は止まらない出血である；（ｆ）（ポリ）ペプチドはインターフェロンαであり，疾患は慢性ＢまたはＣ型肝炎である；（ｇ）（ポリ）ペプチドはインターフェロンγであり，疾患は線維症，結核，髄膜炎または癌である；（ｈ）（ポリ）ペプチドはＢ２０３６であり，疾患は末端肥大症である；（ｉ）（ポリ）ペプチドはスーパーオキシドディスムターゼであり，疾患は脳傷害である；（ｊ）（ポリ）ペプチドはインターロイキン−２であり，疾患は癌または免疫刺激を必要とする状態である；（ｋ）（ポリ）ペプチドはヒルジンであり，疾患はヘパリン誘発性血小板減少症またはアンギナである，そして，（ポリ）ペプチドは上述するように修飾されている。この態様は，その薬理学的特性を改変，増強または改良するために，本発明にしたがって修飾された，既知の生物学的活性を有し，確立された治療上の関連性を有する（ポリ）ペプチドの使用に関連する。本発明はまた，本発明にしたがって修飾された，さらに治療上の関連性のある（ポリ）ペプチドの使用に関するものであることが理解される。この場合，想定される適応症は，検討中の（ポリ）ペプチドを用いて予防，軽減または治癒することができる適応症である。
【００９１】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）アンタゴニストＢ２０３６は当該技術分野においてよく知られている。Ｂ２０３６は，ｈＧＨから，アンタゴニスト特性およびレセプター親和性の増加を付与する９個のアミノ酸置換の導入により得られる（米国特許５，８４９，５３５を参照）。末端肥大症の治療の目的のためには，他の任意の成長ホルモン（ＧＨ）−レセプターアンタゴニスト（ＧＨ−レセプターアンタゴニストＢ２０３６の代わりにまたはこれに加えて）が想定される。アスパラギナーゼによる治療に適合する好ましい癌の型は，リンパ芽球性白血病および大細胞リンパ腫である。
【００９２】
本発明はまた，癌の治療用の医薬組成物の製造における，本発明の（ポリ）ペプチドの使用に関連し，ここで，前記（ポリ）ペプチドは抗癌（プロ）ドラッグに連結されている。
【００９３】
本発明はまた，癌の治療用の医薬組成物の製造における，抗体，そのフラグメントもしくは誘導体である本発明の（ポリ）ペプチド，または本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の使用に関し，ここで，前記（プロ）ドラッグは抗癌（プロ）ドラッグであり，前記（ポリ）ペプチドまたは抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は腫瘍関連抗原に特異的に結合する。"腫瘍関連抗原"との用語は，当該技術分野においてよく知られており，腫瘍細胞により優先的にまたは実質的に独占的に発現されている抗原を表す。前記腫瘍関連抗原は腫瘍細胞の表面で発現されていることが好ましい。
【００９４】
前記使用の好ましい態様においては，前記腫瘍関連抗原は，ＣＤ３０，ＣＤ７０，ＣａｎＡｇ，ＣＤ２２，ＰＳＭＡ，ＣＤ５６，Ｌｅｗｉｓγ，ＣＤ３３，ＣＤ２０，ＣＤ４４ｖ６，ＣＧ５６９７２，ＣＤ５２，ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ＨＥＲ２，ＥｒｂＢ２，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦＲ２，ＥＧＦＲ，ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＰＥＭからなる群より選択される。
【００９５】
本発明の使用のより好ましい態様においては，前記特異的腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記（ポリ）ペプチドまたは抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は，特定の型の癌について用いるべきものである。前記（ポリ）ペプチドまたは抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体がＣＤ３０に特異的に結合する場合，ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫がこの好ましい態様にしたがって治療すべきものである。同様に，ＣＤ７０は腎臓細胞癌腫に関与する細胞により提示される抗原であり；ＣａｎＡｇは胃腸および非小細胞肺癌に関与する細胞により提示される抗原であり；以下同様である：Ｂ−細胞白血病におけるＣＤ２２；前立腺癌におけるＰＳＭＡ；小細胞肺癌および神経内分泌多発性骨髄腫におけるＣＤ５６；非小細胞肺癌，結腸癌および胃癌におけるＬｅｗｉｓγ；急性骨髄性白血病におけるＣＤ３３，卵巣癌におけるＰＥＭ，頭頚部癌および乳癌におけるＣＤ４４ｖ６，癌におけるＨＥＲ２，黒色腫におけるＧＣ５６９７２，転移性結腸癌におけるＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ，慢性リンパ性白血病におけるＣＤ５２，および再発／難治性非ホジキンリンパ腫におけるＣＤ２０。
【００９６】
図面
図１：（ポリ）ペプチドのカルボキシル基の直接（ａ）および間接的ないし２工程（ｂ）エステル化。
図２：エステル結合の形成のインビボでの可逆性。
図３：抗体のカルボキシル基の直接エステル化。
図４：抗体の２工程修飾。"ＰＴＤ"は蛋白質導入ドメインを表す。
図５：本発明にしたがう（ポリ）ペプチドの２工程修飾の第２工程で関与する例示的官能基。
図６：例示的抗体−吸収促進剤（脂質または蛋白質導入ドメイン）−薬剤コンジュゲートおよびそれがヒトまたは動物の体内に取り込まれる経路。
図７：増強された吸収／デリバリー特性を示す修飾（ポリ）ペプチド。
図８：分子の表面における遮蔽効果を達成するためにｎ個（コピー数）のポリマーが可逆的エステル結合により結合している修飾（ポリ）ペプチド。十分な数のコピー数のポリマーによるポリマーラッピングにより分子の遮蔽が得られた。
図９：（ポリ）ペプチドに結合した架橋された生体適合性ポリマー分子が与える遮蔽効果により酵素消化から保護された修飾（ポリ）ペプチド。（ポリ）ペプチドは増強された吸収も示した。
図１０：メタノール中の［Ｎ−ホルミル−Ｔｒｐ５７］ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓのエステル化のＭＳ。
図１１：４−（２−ヒドロキシエチル）−２−２−ジメチル−１，３−ジオキソランによるＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓのエステル化のＨＰＬＣ（上）およびＭＳ（下）。
図１２：Ｍ８チオグリセロールエステル化のＨＰＬＣおよびＭＳ：ピーク１（１つのエステルが形成），ピーク２（２つのエステルが形成）。
図１３：（ポリ）ペプチドのＮ末端修飾の例示的反応順序。
図１４：クラウンエーテルとの複合体化が生物学的活性に及ぼす影響。（ａ）［Ｎ−ホルミルＴｒｐ５７ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓ］がＨＩＶ−１の融合を阻害する活性の生物学的アッセイ（二重）；（ｂ）１８−クラウン−６と複合体化し，メタノール中で６時間可溶化した後の［Ｎ−ホルミルＴｒｐ５７ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓ］の生物学的アッセイ（二重）。メタノール蒸発およびカラムＨＰＬＣでの濾過による脱塩工程の後，蛋白質を生理学的バッファに溶解し，ＨＩＶ−１の融合阻害活性について試験した。
図１５：（ａ）Ａｃ−ＥＥＥＤペプチドを半透過性カルボキシエステル化法により細胞内にデリバリーするよう設計されたコンストラクト。（ｂ）α−ＳＭＡ−ＥＧＦＰコンストラクト（Ｃｌｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１８，１３９５−１４０４（２００５））でトランスフェクションしたＲａｔ胚性線維芽細胞（ＲＥＦ−５２細胞）をトリプシン処理し，カバーガラス上でＤＭＥＭ／２％ＦＣＳ中に１日置き，ＦＣＳなしのＤＭＥＭ中でＳＭＡ−ペプチド［Ａｃ−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ｄ（ＯＢｚｌ）−Ｋ（Ａｃ）−ＣＯＮＨ２］（５μｇ／ｍｌ）で４５分間処理した（３７℃，インキュベータ）。細胞をＤＭＥＭですすぎ，１％ＰＦＡで固定し，マウントして共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で観察した。α−ＳＭＡ−ＥＧＦＰでトランスフェクションした細胞は，未処理（対照；左），またはＳＭＡ−ペプチド［Ａｃ−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ｄ（ＯＢｚｌ）−Ｋ（Ａｃ）−ＣＯＮＨ２］で４５分間処理した（右）。ＳＭＡ−ＦＰ処理はα−ＳＭＡ陽性の張線維（ｓｔｒｅｓｓｆｉｂｅｒ）の消失を引き起こす。
図１６：有機溶媒中でのクラウンエーテルとの複合体化が生物学的活性に及ぼす影響。（ａ）ケモカインＰＳＣ−ＲａｎｔｅｓがＨＩＶ−１の融合を阻害する活性の生物学的アッセイ；（ｂ）１８−クラウン−６と複合体化し，メタノール中で６時間可溶化した後のＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓの生物学的アッセイ。メタノール蒸発および脱塩工程の後，蛋白質を生理学的バッファに溶解し，ＨＩＶ−１の融合阻害活性について試験した。
図１７：以下の配列：
ＦＡＰＭＳＱＱＳＴＳＣＣＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥＭＳ
を有し，短いＰＥＧ（ＨＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＨ）を有する，Ｌ２Ｐ７と称されるケモカインのエステル化の結果。ＨＰＬＣ出力（上）およびＭＳスペクトル（下）。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は，本発明を例証するが，限定するものと解釈してはならない。
実施例１
フォールディングしたＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓを用いるエステル化実験
（ａ）メチル−エステルの形成
［Ｎ−ホルミル−Ｔｒｐ５７］ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓ０．５ｍｇ，（ＭＷ＝７９２１）を，ＤＣＭ／メタノールの混合物中で２．５ｍｇの１８−クラウン−６と複合体形成させた。次に，溶媒を蒸発させ，残基を０．２ｍｌのメタノール中に取り出した。次に１１μｌのクロロトリメチルシランを加えて，室温で１時間反応させた。主要なピークの質量分析４エステルと一致する主生成物（ＭＷ＝７９７７），痕跡量の５エステル（ＭＷ＝７９９１）および６エステル（ＭＷ＝８００６）が形成されたことを示す（図１０を参照）。
【００９８】
対照として，ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓのホルミル−Ｔｒｐ誘導体のサンプルを，上述のようにして１８−クラウン−６と複合体化させた。次に，上述のようにしてサンプルをメタノールに溶解し，室温で１時間放置した。メタノールを蒸発させ，蛋白質をＨＰＬＣにより脱塩して１８−クラウン−６を除去した。蛋白質は，Ｒ５指向性エンベロープ依存性細胞融合アッセイ（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，１６４６０−１６４６５（２００４））において，ＨＩＶ−１の融合阻害活性について試験し，参照サンプルと同程度の効力があることがわかった。すなわち，蛋白質をクラウンエーテル類と複合体化して可溶化することにより生物学的活性は低下しないことが確認された（図１４および１６を参照）。
【００９９】
（ｂ）４−（２−ヒドロキシエチル）−２−２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（ＭＷ１４６．１８）エステルの形成
ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓ（０．５ｍｇ，ＭＷ＝７８９４）をＤＣＭ／メタノールの混合物中で，２．５ｍｇの１８−クラウン６と複合体化させた。次に，溶媒を蒸発させ，残渣を０．２ｍｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−２−２−ジメチル−１，３−ジオキソラン中に取り出した。次に，１１μｌのクロロトリメチルシランを加えた後，室温で４５分間反応させた。１時間後，ＨＰＬＣのメジャーピーク（図１１，上部）は，約５０％の１エステルの形成を示した。注目すべきことに，ジオキソラン環が開裂し，生成物のＭＳは，アセトンの１分子の喪失と一致した。このような効果は，おそらくは，クロロトリメチルシラン（酸性条件）から生成したＨＣｌによる環構造の加水分解（痕跡量の水で）によるものであろう。対応するＭＳスペクトルを図１１の下部に示す。
【０１００】
実施例２
ケモカインＭ８のエステル化
チオグリセロール（Ｍｗ１０８．１）エステルの形成は，Ｍ８と称される，ファージディスプレイにより得られた新たなケモカイン（Ｄｒ．Ｏｌｉｖｅｒ  Ｈａｒｔｌｅｙより供与）を用いて行った。上述のようにして，ケモカインＭ８（０．２５ｍｇ，ＭＷ＝７９９５．３）を１８−クラウン−６と複合体化した。溶媒を蒸発させ，残渣を０．１ｍｌの無水チオグリセロール中に取り出した。次に５μｌのクロロトリメチルシランを加えた後，室温で３０および６０分間反応させた。対応するＨＰＬＣデータおよびＭＳスペクトルを図１２に示す。
【０１０１】
実施例３
モデルケモカインＬ２Ｐ７のエステル化
Ｍｓ７９７６．５のフォールディングした，１８−クラウン−６と複合体化した０．２ｍｇのケモカインＬ２Ｐ７を０．１Ｍの市販のＰＥＧ（ＨＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＨ）に溶解した。次に，８μｌのクロロトリメチルシランを加えた後，室温で３０および９０分間反応させた。ｔ＝９０分の対応するＨＰＬＣデータおよびＭＳスペクトルを図１７に示す。ＭＡＬＤＩＭＳは，２つのＰＥＧ分子の付加に対応するＭｓ８２４２．９４および３つのＰＥＧ分子の付加に対応するＭｓ８３７４．８９のピークを示す。
【０１０２】
実施例４
エステル化ペプチドの細胞浸透特性
Ａｃ−ＥＥＥＤは，マイクロインジェクション（Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＪＣＢ，１９９５）およびＰＴＤへの融合（Ｈｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．ＪＣＢ，２００２）を用いる両方の研究において，α−平滑筋−アクチン（α−ＳＭＡ）の重合を妨害し，したがって，多数の生理学的プロセス，特に創傷治癒の間の筋線維芽細胞収縮活性に関与するストレス線維の形成を制御しうることが示されている短いペプチドである。この実施例は，Ｃ末端リジン残基を組み込んだ，すなわち，そのカルボキシ末端がアミド化されており，そのイプシロンアミノ基がアセチル化されているかまたはトレーサー（蛍光色素，ビオチン等，図１５（ａ））の結合のためのハンドルとして用いられる合成ペプチドの，半永久的カルボキシエステル化法を用いるペプチドのデリバリーに関する。保護エステル成分の親油性が異なる４つのコンストラクトを試験した。ベンジル基でエステル化したカルボキシレートを有するテンプレートは，予測される生物学的活性の検出によりモニターして，細胞内への浸透を示した（図１５（ｂ））。
【０１０３】
浸透の程度（標準物質の生物学的活性との比較により測定）は不完全であったとしても，これは用いたテンプレートが水に対して低い溶解度を有するため，あるいはそれぞれの分子中の各エステル成分の非定量的切断のためであると容易に説明することができる。すなわち，リジンの側鎖のアセチル基を置き換えて，またはＣαに例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を導入することは，分子の水性への分配とエステル基の可溶化とに同時に好ましく，両方の課題を一度に解決するものである。
【０１０４】
追加の参考文献
Botti, P. et al., J. Pept. Sci. 2, 371-380 (1996). 
Julian et al., Int. J. Mass Spectrom. 210, 613 (2001). 
Oshima, T. et al., Biomacromolecules 3, 438-444 (2002).
Roberts, M. J. et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 459-476  (2002).
Tsuberyet al., J. Biol. Chem. 279, 38118-38124 (2004).
Yamada, T. et al., Inorg. Chem. 39, 3049-3056 (2000)
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】（ポリ）ペプチドのカルボキシル基の直接（ａ）および間接的ないし２工程（ｂ）エステル化。
【図２】エステル結合の形成のインビボでの可逆性。
【図３】抗体のカルボキシル基の直接エステル化。
【図４】抗体の２工程修飾。"ＰＴＤ"は蛋白質導入ドメインを表す。
【図５−１】本発明にしたがう（ポリ）ペプチドの２工程修飾の第２工程で関与する例示的官能基。
【図５−２】本発明にしたがう（ポリ）ペプチドの２工程修飾の第２工程で関与する例示的官能基。
【図６】例示的抗体−吸収促進剤（脂質または蛋白質導入ドメイン）−薬剤コンジュゲートおよびそれがヒトまたは動物の体内に取り込まれる経路。
【図７】増強された吸収／デリバリー特性を示す修飾（ポリ）ペプチド。
【図８】分子の表面における遮蔽効果を達成するためにｎ個（コピー数）のポリマーが可逆的エステル結合により結合している修飾（ポリ）ペプチド。
【図９】（ポリ）ペプチドに結合した架橋された生体適合性ポリマー分子が与える遮蔽効果により酵素消化から保護された修飾（ポリ）ペプチド。
【図１０】メタノール中の［Ｎ−ホルミル−Ｔｒｐ５７］ＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓのエステル化のＭＳ。
【図１１】４−（２−ヒドロキシエチル）−２−２−ジメチル−１，３−ジオキソランによるＰＳＣ−Ｒａｎｔｅｓのエステル化のＨＰＬＣ（上）およびＭＳ（下）。
【図１２】Ｍ８チオグリセロールエステル化のＨＰＬＣおよびＭＳ：ピーク１（１つのエステルが形成），ピーク２（２つのエステルが形成）。
【図１３】（ポリ）ペプチドのＮ末端修飾の例示的反応順序。
【図１４】クラウンエーテルとの複合体化が生物学的活性に及ぼす影響。
【図１５】Ａｃ−ＥＥＥＤペプチドを半透過性カルボキシエステル化法により細胞内にデリバリーするよう設計されたコンストラクト。
【図１６】有機溶媒中でのクラウンエーテルとの複合体化が生物学的活性に及ぼす影響。
【図１７】Ｌ２Ｐ７と称されるケモカインのエステル化の結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009510000.tif 000021
2009510000.tif 000022
2009510000.tif 000023
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