(57)【要約】本発明は、炎症（ＬＩＧＨＴ経路）関連障害、および特に肝臓の炎症または肝炎を処置するための組成物に関する。本発明はまた、ＬＩＧＨＴ経路関連障害を処置する方法に関する。本発明はさらに、対象においてＬＩＧＨＴ経路関連障害を処置するためのキットに関する。本発明はさらに、対象においてＬＩＧＨＴ経路関連障害を処置するための新規の処置を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を調節する方法であって、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質モジュレーターを投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物における炎症を調節する方法であって、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質シグナル伝達を調節することを含み、ここでＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨害することにより細胞の炎症を調節する、前記方法。
【請求項３】
対象における異常なあるいは望ましくない炎症により特徴づけられる状態の処置および／または予防のための方法であって、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質シグナル伝達を調節することを含み、ここで、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨害することにより、細胞の炎症を調節する、前記方法。
【請求項４】
細胞が、肝臓細胞、軟骨細胞、消化管細胞、神経細胞、膵臓細胞、肺細胞、骨組織細胞、脾臓細胞、心臓細胞、腎臓細胞、精巣細胞または腸管細胞の１種または２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、１種または２種以上のＬＩＧＨＴ経路ファミリーのタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＬＩＧＨＴ経路ファミリーのタンパク質が、ＬＩＧＨＴまたはＬＴβＲを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨害することにより細胞の炎症を調節することにより、炎症を低減または緩和する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
状態が、肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌の１種または２種以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
調節が、細胞をＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を調節する化合物と接触させることを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
調節が、可溶性ＬＩＧＨＴの下方調節である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
調節が、ＬＩＧＨＴタンパク質経路シグナル伝達の下方調節である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
炎症をインビボで調節する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
炎症をインビトロで調節する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはこの症状を処置、防止、改善、低減または緩和するために有効なＬＩＧＨＴ経路モジュレーターの薬学的に有効な量および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターが、小分子、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体の抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチドをコードする核酸または有機分子の１種または２種以上から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害が、肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌の１種または２種以上を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状を処置、防止、改善、低減または緩和する方法であって：これを必要としている対象に、薬学的に有効な量のＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害が、肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌の１種または２種以上を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターが、小分子、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体の抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチドをコードする核酸または有機分子の１種または２種以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターが、抗ＬＴβＲ抗体またはそれらのフラグメントもしくはバリアントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターが、ＬＬＴＢ１、ＬＩＧＨＴまたはＢ７−Ｈ４抗体またはそのフラグメントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを、ＬＩＧＨＴ経路関連障害に罹患している危険性がある対象に予防的に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
組成物がさらに、治療的に有効な量の１種または２種以上の少なくとも１種の抗けいれん薬、非麻薬性鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗うつ薬、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ニコチン受容体ンタゴニストまたは局所麻酔薬を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
組成物を、経口、静脈内、くも膜下腔内または硬膜外、筋肉内、皮下、神経周囲、皮内、局所または経皮で、対象に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
対象が哺乳動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
対象がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状が、疼痛、黄疸、発熱、疲労、嘔吐、悪心、下痢、食欲喪失、肝腫大、肝硬変、肝細胞癌または肝炎の緩和により示される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
さらにＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを得ることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって：
コンカナバリンＡで刺激した細胞を試験化合物と接触させること、および
ＬＩＧＨＴ経路活性化または炎症を測定すること
を含む、前記方法。
【請求項３０】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって：
コンカナバリンＡで刺激した細胞を試験化合物と接触させること、および
ＬＩＧＨＴの可溶性形態を測定すること
を含む、前記方法。
【請求項３１】
ＬＩＧＨＴの可溶性形態の測定が、１種の可溶性ＬＩＧＨＴのタンパク質レベルの測定の１または２以上によるものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
試験化合物が、ペプチド、小分子、抗体またはそのフラグメント、核酸またはそのライブラリーの１種または２種以上である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターおよび薬学的に許容し得る担体、ならびにｂ）使用のための説明書を含む、キット。
【請求項３４】
Ｙ１７３Ｆ  ＬＩＧＨＴタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３５】
ＬＩＧＨＴΔＬタンパク質またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３６】
治療剤を試験するための請求項３４または３５に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項３７】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状を処置、防止、改善、軽減または緩和するための治療剤をスクリーニングするための方法であって：
試験剤を動物に投与すること、および
炎症、細菌のクリアランス、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤または肝細胞壊死の１または２以上の調節を測定すること
を含む、前記方法。
【請求項３８】
動物がマウスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
マウスが、正常なマウスまたはＹ１７３Ｆ  ＬＩＧＨＴもしくはＬＩＧＨＴΔＬタンパク質の１もしくは２以上を発現しているマウスの１または２以上である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
動物において肝炎を誘発することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
肝炎が、コンカナバリンＡでの処置、リステリア・モノサイトジェネス、肝炎ウイルス、自己免疫性肝炎、アセトアミノフェン誘発性肝細胞死またはアルコール誘発性肝炎により誘発されるものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
炎症または可溶性ＬＩＧＨＴの減少により、試験剤が、ＬＩＧＨＴ経路障害を処置するにあたり有用であり得ることが示される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳動物における炎症を処置する方法であって：（ａ）炎症を有するかまたはこれを発症する危険性がある哺乳動物を特定すること、ここで癌の細胞を可溶性ＬＩＧＨＴを発現するとして同定する；および（ｂ）該対象に、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨げる薬剤を含む化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
炎症を診断する方法であって、対象からの試料中の可溶性ＬＩＧＨＴの存在を検出することを含む、前記方法。
【請求項４５】
炎症が、強皮症または肝炎の１または２以上を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
試料が、血液試料、気管支肺胞洗浄試料または痰試料の１または２以上を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤についてリード化合物を特定するための方法であって：
細胞肝炎モデルを試験化合物と接触させること、および
ＬＩＧＨＴの可溶性形態を測定すること
を含む、前記方法。
【請求項４８】
ＬＩＧＨＴの可溶性形態の測定が、１種の可溶性ＬＩＧＨＴのタンパク質レベルの測定の１または２以上によるものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
試験化合物が、ペプチド、小分子、抗体またはそのフラグメント、核酸またはそのライブラリーの１種または２種以上である、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本研究は、国立衛生研究所により支援された。政府は、本発明において所定の権利を有し得る。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００５年１０月４日出願の米国仮出願第60/723,521号、題名「Novel  Mehod  to  Treat  Hepatitis（肝炎を処置する新規な方法）」に対して優先権を主張し、これを、この全体にわたり参照により本明細書中に導入する。
【背景技術】
【０００３】
背景
国際的な健康問題である肝炎は、肝臓の炎症である。数種の異なるウイルスが、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ型肝炎ウイルスにより引き起こされるウイルス性肝炎の原因となる。ウイルスの各々は、急性の、または短期のウイルス性肝炎を引き起こす。Ｂ、ＣおよびＤ型肝炎ウイルスはまた、慢性肝炎を引き起こし得、この感染は、遷延性であり、時には生涯のものである。肝炎はまた、肝臓が炎症性となることの原因となる自己免疫性反応によっても引き起こされ得る。当該疾患は、通常極めて重篤かつ慢性的であり、処置しなければ、時間と共に悪化し、肝臓の硬変（瘢痕および硬化）並びに最終的には肝不全をもたらす。
【０００４】
ＴＮＦスーパーファミリーに属する分子は、自然免疫および獲得免疫の調節において不可欠の役割を果たし、また非造血性の細胞に対する効果を介して炎症性応答に寄与する（１）。ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンと相同性であり、誘導性発現を示し、ＨＳＶ糖タンパク質ＤとＴリンパ球により発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターについて競合する）は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの最近同定されたＩＩ型膜貫通型糖タンパク質である（２）。ＬＩＧＨＴは、未成熟ＤＣおよび活性化されたＴ細胞において発現し（２、３）、３種の区別し得る受容体、即ちヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、リンホトキシン−β受容体（ＬＴβＲ）およびデコイ受容体３／ＴＲ６に結合する（２、４）。ＨＶＥＭに結合することにより、ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞を共刺激し、増殖およびサイトカイン産生を促進する（３、５）。ＬＩＧＨＴの遺伝子ターゲティングは、Ｔ細胞免疫の障害および同種移植片拒絶の不全をもたらす（６〜８）。したがって、獲得免疫系におけるＬＩＧＨＴの作用を示す十分な証拠がある。
【０００５】
肝臓の炎症は、肝臓指向性（liver-tropic）の病原体感染に続く肝細胞に対する免疫応答により、または病原性の自己反応性（autoreactivity）により、媒介される。肝臓の炎症の根底にある分子的および細胞的な機構の調査は、急性肝炎を処置するため、並びに慢性肝炎に続く肝硬変および肝細胞癌を予防することである。多くのレギュレーターが、ヒトのおよび実験的な肝炎の両方において関連付けられており、これには、ＴＮＦスーパーファミリー分子、例えばＴＮＦ−αおよびＦａｓＬが含まれる（１７）。したがって、当該分野において、炎症、特に肝臓の炎症および肝炎を処置する方法に対する必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、部分的に、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を遮断することにより、炎症応答の低下がもたらされるという発見に基づいている。本発明は、炎症、特に肝臓の炎症を処置するための新規の組成物、方法およびキットを提供する。本発明はさらに、対象における炎症を処置するための新規の処置を同定する方法を提供する。
【０００７】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を調節する方法であって、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質モジュレーターを投与することを含む、前記方法である。
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、哺乳動物における炎症を調節する方法であって、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質シグナル伝達を調節することを含み、ここで、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨害することにより、細胞の炎症を調節する、前記方法である。
【０００８】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、対象における異常なあるいは望ましくない炎症により特徴づけられる状態の処置および／または予防のための方法であって、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質シグナル伝達を調節することを含み、ここで、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨害することにより、細胞の炎症を調節する、前記方法である。
【０００９】
１つの態様において、細胞は、肝臓細胞、軟骨細胞、消化管細胞、神経細胞、膵臓細胞、肺細胞、骨組織細胞、脾臓細胞、心臓細胞、腎臓細胞、精巣細胞または腸管細胞の１種または２種以上である。
他の態様において、タンパク質は、１種または２種以上のＬＩＧＨＴ経路ファミリータンパク質を含む。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路ファミリータンパク質は、ＬＩＧＨＴまたはＬＴβＲを含む。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨害することにより細胞の炎症を調節することにより、炎症を低減または緩和する。
【００１０】
他の態様において、状態は、肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌の１種または２種以上である。
１つの態様において、調節は、細胞を、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を調節する化合物と接触させることを含む。
１つの態様において、調節は、可溶性ＬＩＧＨＴの下方調節である。
１つの態様において、調節は、ＬＩＧＨＴタンパク質経路シグナル伝達の下方調節である。
他の態様において、炎症をインビボで調節する。
１つの態様において、炎症をインビトロで調節する。
【００１１】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状を処置、防止、改善、軽減または緩和するのに有効なＬＩＧＨＴ経路モジュレーターの薬学的に有効な量および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物である。１つの態様において、症状には、疼痛、黄疸、発熱、疲労、嘔吐、悪心、下痢、食欲喪失、肝腫大、肝硬変、肝細胞癌または肝炎が含まれる。これらの１または２以上が緩和されることは、本明細書中に記載されるように処置の効能を示し得る。
【００１２】
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターは、小分子、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体の抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチドをコードする核酸または有機分子の１種または２種以上から選択される。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路関連障害は、肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌の１種または２種以上を含む。
【００１３】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状を処置、防止、改善、軽減または緩和する方法であって：これを必要としている対象に、薬学的に有効な量のＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを含む組成物を投与することを含む、前記方法である。
【００１４】
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路関連障害は、肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌腫の１種または２種以上を含む。
他の態様において、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターは、小分子、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体の抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチドをコードする核酸または有機分子の１種または２種以上である。
【００１５】
他の態様において、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターは、抗ＬＴβＲ抗体またはこれらのフラグメントもしくはバリアントである。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターは、ＬＬＴＢ１、ＬＩＧＨＴおよび／またはＢ７−Ｈ４抗体またはそのフラグメントである。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを、ＬＩＧＨＴ経路関連障害に罹患している危険性がある対象に、予防的に投与する。
【００１６】
他の態様において、組成物はさらに、治療有効量の１種または２種以上の少なくとも１種の抗けいれん薬、非麻薬性鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗うつ薬、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ニコチン受容体アンタゴニストまたは局所麻酔薬を含む。
他の態様において、組成物を、経口、静脈内、くも膜下腔内または硬膜外、筋肉内、皮下、神経周囲、皮内、局所または経皮で対象に投与する。
【００１７】
他の態様において、対象は哺乳動物である。
１つの態様において、対象はヒトである。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状は、疼痛の緩和および／または肝炎の緩和により示される。
１つの態様において、当該方法はさらに、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを得ることを含んでもよい。
【００１８】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって、コンカナバリンＡで刺激した細胞を試験化合物と接触させること、およびＬＩＧＨＴ経路活性化または炎症を測定することを含む、前記方法である。
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を同定するための方法であって、コンカナバリンＡで刺激した細胞を試験化合物と接触させること、およびＬＩＧＨＴの可溶性形態を測定することを含む、前記方法である。
【００１９】
１つの態様において、ＬＩＧＨＴの可溶性形態の測定は、１種の可溶性ＬＩＧＨＴのタンパク質レベルの１または２以上の測定によるものである。
他の態様において、試験化合物は、ペプチド、小分子、抗体またはこのフラグメント、核酸またはこのライブラリーの１種または２種以上である。
【００２０】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、例えばＬＩＧＨＴ経路モジュレーターおよび薬学的に許容し得る担体並びに使用のための説明書を含む、キットである。
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、Ｙ１７３Ｆ  ＬＩＧＨＴタンパク質またはこのフラグメントもしくはバリアントを含む、トランスジェニック非ヒト動物である。
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴΔＬタンパク質またはこのフラグメントもしくはバリアントを含む、トランスジェニック非ヒト動物である。
１つの局面において、本発明において提供されるのは、本明細書中に記載した方法による、トランスジェニック動物の、治療剤を試験するための使用である。
【００２１】
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはこの症状を処置、防止、改善、軽減または緩和するための治療剤をスクリーニングするための方法であって、試験剤を動物に投与すること、および炎症、細菌のクリアランス、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤および／または肝細胞壊死の１または２以上の調節を測定することを含む、前記方法である。
【００２２】
１つの態様において、動物はマウスである。
他の態様において、マウスは、正常なマウスまたはＹ１７３Ｆ  ＬＩＧＨＴもしくはＬＩＧＨＴΔＬタンパク質の１もしくは２以上を発現しているマウスの１または２以上である。
１つの態様において、当該方法はさらに、動物において肝炎を誘発することを含んでもよい。
１つの態様において、肝炎は、コンカナバリンＡおよび／またはリステリア・モノサイトゲネスでの処置、並びに肝炎または肝臓の炎症のいずれかを誘発することが当該分野において知られている他の方法により誘発される。
他の態様において、炎症または可溶性ＬＩＧＨＴの減少により、試験剤が、ＬＩＧＨＴ経路障害を処置するにあたり有用であり得ることが示される。
【００２３】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、哺乳動物における炎症を処置する方法であって：（ａ）炎症を有するかまたはこれを発症する危険性がある哺乳動物を同定すること、ここで癌の細胞を、可溶性ＬＩＧＨＴを発現するものとして同定する；および（ｂ）この対象に、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨げる薬剤を含む化合物を投与することを含む、前記方法である。
【００２４】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、炎症を診断する方法であって、対象からの試料中の可溶性ＬＩＧＨＴの存在を検出することを含む、前記方法である。
１つの態様において、炎症は、強皮症または肝炎の１または２以上を含む。
１つの態様において、試料は、血液試料、気管支肺胞洗浄試料および／または痰試料、並びにＬＩＧＨＴ経路タンパク質または可溶性ＬＩＧＨＴを検出することができる他の生体試料の１または２以上を含む。
【００２５】
１つの局面によれば、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤についてリード化合物を同定するための方法であって、細胞肝炎モデルを試験化合物と接触させること、およびＬＩＧＨＴの可溶性形態を測定することを含む、前記方法である。
他の態様において、ＬＩＧＨＴの可溶性形態の測定は、１種の可溶性ＬＩＧＨＴのタンパク質レベルの測定の１または２以上によるものである。
１つの態様において、試験化合物は、ペプチド、小分子、抗体またはこのフラグメント、核酸またはこのライブラリーの１種または２種以上である。
本発明の他の態様を、以下に開示する。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１は、肝炎における上方調節されたＬＩＧＨＴの病原性の役割を示す。（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを静脈内注射した。示した時点において、当該マウスを絶命させ、肝臓および脾臓から全ＲＮＡを抽出した。ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＬＴβＲおよびＧＡＰＤＨの発現を、ノーザンブロット分析により試験した。（ＢおよびＣ）野生型（白丸）およびＬＩＧＨＴ欠損（黒丸）マウスに、３０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを静脈内注射した。レシピエントマウスの生存（Ｂ）および血清ＡＬＴレベル（Ｃ）をモニタリングした。ＣｏｎＡ注射の１８時間後に血清を採取し、ＡＬＴレベルを、Methods．SF，Sigma-Frankelに記載されているように測定した。＊ｐ＝０．００３。
【００２７】
図２は、肝臓の炎症におけるＬＩＧＨＴの可溶性形態の役割を示す。（Ａ）Ｂ６マウスに、３０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを静脈内注射した。示した時点において、レシピエントマウスから血清を採取し、ＬＩＧＨＴ特異性ＥＬＩＳＡにより可溶性ＬＩＧＨＴ濃度について測定した。（ＢおよびＣ）Ｂ６マウスに、致死量以下の用量のＣｏｎＡ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を、単独で（黒丸、ｎ＝１３）、またはコントロールのｐｃＤＮＡ３．１（白丸、ｎ＝１３）、野生型ＬＩＧＨＴ（黒四角、ｎ＝１１）またはＬＩＧＨＴＬ（白四角、ｎ＝１０）をコードする２０μｇのプラスミドと共に、水力学的注射手法により注射した。マウスの生存（Ｂ）および注射の１８時間後にＨ＆Ｅで染色した肝臓切片（Ｃ）を、試験した。Ｎ、壊死領域。対数順位検定による群の間で、＊Ｐ＝０．３、＊＊Ｐ＝０．０３３。（Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０μｇの可溶性ＬＩＧＨＴ−ｆｌａｇ融合タンパク質またはコントロールのタンパク質を腹腔内注射した。１時間後、マウスに、２５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを静脈内注射し、血清ＡＬＴレベルを、６時間後に測定した。３つの独立した実験からの１つの代表的な結果を、平均±ＳＤとして示す。
【００２８】
図３は、ＬＴβＲが、ＬＩＧＨＴにより媒介された肝炎に必要であり、十分であることを示す。（Ａ）Ｂ６マウスに、空（empty）のベクター、または野生型ＬＩＧＨＴもしくはＹ１７３Ｆ変異体をコードするプラスミドＤＮＡのいずれかを、水力学的方法により、致死量以下の用量のＣｏｎＡ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて注射した。ＡＬＴレベルを、注射の１８時間後に測定した。２つの独立した実験からの１つの代表的な結果を、群あたり５匹のマウスの平均±ＳＤとして示す。（Ｂ）Ｂ６マウスに、３０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを、１００μｇのコントロールラットＩｇ（白丸、ｎ＝１２）、抗ＬＴβＲ（黒丸、ｎ＝１０）、または抗ＨＶＥＭ  ｍＡｂ（黒四角、ｎ＝９）と共に静脈内注射した。生存を、その後モニタリングした。（Ｃ）Ｂ６マウスに、空のベクター、またはＬＩＧＨＴをコードするプラスミドＤＮＡのいずれかを、水力学的方法により、致死量以下の用量のＣｏｎＡ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて注射した。マウスを、プラスミド注射の２時間前に、１００μｇの示したＡｂｓで腹腔内処置した。１８時間後、血清ＡＬＴレベルを測定した。２つの独立した実験からの１つの代表的な結果を、群あたり５匹のマウスの平均±ＳＤとして示す。ｈＩｇ、コントロールハムスターＩｇ；ｒＩｇ、コントロールラットＩｇ。
【００２９】
図４は、ＣｏｎＡにより誘発された肝炎における可溶性ＬＩＧＨＴの産生におけるＮＫＴ細胞の作用を示す。（ＡおよびＢ）Ｂ６マウスを、５００μｇのコントロールのマウスＩｇＧまたは抗ＮＫ１．１  ｍＡｂ（ＰＫ１３６）のいずれかで、０日および３日において腹腔内処置した（Ａ）。同様に、Ｂ６マウスを、３０μｇのコントロールのウサギＩｇＧまたは抗アシアロＧＭ１（ＡＳＧＭ１）で、０日および３日において腹腔内処置した（Ｂ）。４日目に、各々の群に、３０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを静脈内注射し、マウス血清を、１時間後に採取した。可溶性ＬＩＧＨＴの量を、ＥＬＩＳＡにより測定した。＊Ｐ＝０．０２。（Ｃ）ＣＤ１ｄ欠損マウスに、２０μｇのコントロールベクターまたはＬＩＧＨＴをコードするプラスミドを、水力学的注射により、致死量以下の用量のＣｏｎＡ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて注射した。マウス血清を、１８時間後に採取し、ＡＬＴレベルを測定した。＊＊Ｐ＝０．００２。
【００３０】
図５は、リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された肝炎についての処置としてのＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用の遮断を示す。（Ａ）Ｂ６マウス（白丸、ｎ＝２１）およびＬＩＧＨＴ欠損マウス（黒三角、ｎ＝２１）に、リステリア・モノサイトゲネス（マウスあたり２×ＬＤ５０）を腹腔内注射し、これらの生存をモニタリングした。群の間でＰ＝０．００７。（Ｂ）Ｂ６マウスに、１００μｇのコントロールＩｇＧ（白丸、ｎ＝１０）または抗ＬＴβＲ  ｍＡｂ（黒丸、ｎ＝１１）を静脈内注射した。同時に、マウスを、腹腔内注射によりリステリア・モノサイトゲネス（マウスあたり２×ＬＤ５０）に感染させた。マウスの生存を、その後モニタリングした。群の間でＰ＝０．０３。（Ｃ）Ｂにおけるように、Ｂ６マウスを、リステリア・モノサイトゲネスで感染させ、抗ＬＴβＲ  ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧのいずれかで処置した。感染の３日後に、肝臓切片を調製し、Ｈ＆Ｅで染色した。
【００３１】
詳細な説明
本発明は、部分的に、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を遮断することにより、免疫応答の低下がもたらされるという発見に基づいている。本発明は、炎症、特に肝臓の炎症を処置するための新規の組成物、方法およびキットを提供する。本発明はさらに、対象における炎症を処置するための新規な処置を同定する方法を提供する。
【００３２】
本明細書中で用いる「アゴニスト」は、受容体と連合して（例えば結合または相互作用して）薬理学的作用を開始することができる化合物または組成物を表す。
【００３３】
薬学的に許容し得る、とは、例えば、合理的な利益／危険性の比率と釣り合い、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適する化合物、物質、組成物および／または投薬形態を表す。
【００３４】
薬学的に許容し得る塩とは、例えば、その少なくとも１種の酸性または塩基性塩を作製することにより改変された、開示される化合物の誘導体を指し、無機および有機塩を含む。
モジュレーターの有効なアンタゴニスト量のとは、タンパク質の活性を有効に弱める（例えば遮断、阻害、防止またはこれと競合する）量を指す。
【００３５】
ＬＩＧＨＴ経路組成物の治療有効量とは、これを必要としている対象への投与により疼痛の少なくとも１種の症状の緩和または低減を誘発する量を指す。
【００３６】
以下の用語は、以下の名称によりGenbankにおいて同定されるポリペプチド、並びに以下に記載するこれらの名称によりGenbankにおいて同定されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一であるポリペプチドを包含する。代替の態様において、これらの用語は、これらの名称によりGenbankにおいて同定されるポリペプチドおよび少なくとも約８０、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を共有するポリペプチドを包含する。
【００３７】
「ＬＩＧＨＴ」（ＴＮＦＳＦ１４）は、即時型（immediate）ＴＮＦファミリーの構造的および機能的に不可欠のメンバーであり、これは、リンホトキシンαβ（ＬＴαβ）、ＬＴαおよびＦａｓリガンドとの受容体−リガンド対形成の密接な構造的相同性および共有パターンにより定義される（Mauri  DNら、LIGHT，a  new  member  of  the  TNF  superfamily，and  lymphotoxin  α  are  ligands  for  herpesvirus  entry  mediator．Immunity．1998;8:21-30；Yu  KYら、A  newly  identified  member  of  tumor  necrosis  factor  receptor  superfamily（TR6）suppresses  LIGHT-mediated  apoptosis．J  Biol  Chem．1999;274：13733-13736）。ＬＩＧＨＴは、ＩＩ型膜貫通型タンパク質であり、これは、活性化されたＴ細胞および未成熟の樹状細胞により産生され、２種の異なる細胞受容体を介してシグナル伝達する：Ｔ細胞上で顕著に発現されるヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、および間質細胞上で発現されるがリンパ球に存在しないＬＴβ受容体（ＬＴβＲ）。
【００３８】
ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞の活性化、生存または死滅を媒介し、また−ＬＴαβについてと同様に−リンパ組織を組織化するのを補助すると提案されている（Fu  Y-X，Chaplin  D．Development  and  maturation  of  secondary  lymphoid  tissues．Annu  Rev  Immunol．1999;17:399-433）。実際に、組織培養モデルにおける結果は、Ｔ細胞活性化におけるＬＩＧＨＴについての役割を支持すると見られる（Harrop  JAら、Herpesvirus  entry  mediator  ligand（HVEM-L），a  novel  ligand  for  HVEM/TR2，stimulates  proliferation  of  T  cells  and  inhibits  HT29  cell  growth．J  Biol  Chem．1998;273:27548-27556；Tamada  Kら、LIGHT，a  TNF-like  molecule，costimulates  T  cell  proliferation  and  is  required  for  dendritic  cell-mediated  allogeneic  T  cell  response．J  Immunol．2000;164:4105-4110）が、インビトロでのＬＩＧＨＴシグナル伝達に対するＴ細胞の応答は、むしろ微細である。異所性のＬＩＧＨＴを発現するマウスの表現型は、決して微細ではない。
【００３９】
本明細書中で用いる「ＬＩＧＨＴ経路タンパク質」とは、可溶性ＬＩＧＨＴのシグナル伝達または活性化または下流標的に関与するタンパク質を指す。
【００４０】
「ＬＩＧＨＴ経路モジュレーター」とは、ＬＩＧＨＴタンパク質ファミリーメンバーの阻害剤またはエンハンサーのいずれかである。「非選択的」ＬＩＧＨＴ経路タンパク質モジュレーターは、ＬＩＧＨＴ経路調節のために典型的に用いられる濃度において他のＬＩＧＨＴタンパク質ファミリーメンバーを調節する因子である。「選択的な」モジュレーターは、経路タンパク質ファミリーメンバーの正常な機能の１または２以上を、他の経路タンパク質が顕著に調節されない濃度において顕著に調節する。モジュレーターは、これがＬＩＧＨＴ経路タンパク質に結合する場合に、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバー「に対して直接作用する」。モジュレーターは、これがＬＩＧＨＴ経路タンパク質以外の分子に結合し、当該結合がタンパク質の調節をもたらす場合に、「ＬＩＧＨＴ経路タンパク質に対して間接的に作用する」。
【００４１】
本明細書中で用いる「ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を妨げる」は、例えば、以下のことを含む：（ａ）ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の物理的な相互作用を、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間に物理的な相互作用が実質的に存在しないように完全に遮断する；または（ｂ）ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの物理的相互作用を、当該物理的相互作用がシグナルを送達しないか、または炎症を実質的に生じないシグナルを送達するように、改変する。
【００４２】
本明細書中で用いるＬＩＧＨＴ経路タンパク質の「機能的フラグメント」は、全長タンパク質よりも短く、そのタンパク質の機能を保持する能力を有するタンパク質のフラグメントである。
【００４３】
「ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用のモジュレーター」は、その因子の不在（またはより少量の存在）において観察されるものと比較して、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間のシグナル伝達を低減するかまたは除去する因子である。ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用のモジュレーターは、以下のことに影響し得る：（１）タンパク質ファミリーメンバーの発現；ｍＲＮＡ安定性；もしくはタンパク質輸送、改変（例えばリン酸化）もしくは分解、または（２）タンパク質ファミリーメンバーの正常な機能の１もしくは２以上、例えば脱分極誘導性の内向き電流。ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用のモジュレーターは、非選択的または選択的であり得る。
【００４４】
「ＬＩＧＨＴ経路タンパク質のエンハンサー」は、その因子の不在（またはより少量での存在）において観察されるものと比較して、どの機構でも、増大させる因子である。タンパク質のエンハンサーは、以下のことに影響し得る：（１）タンパク質の発現；ｍＲＮＡ安定性；もしくはタンパク質輸送、改変（例えばリン酸化）もしくは分解、または（２）タンパク質の１もしくは２以上の正常な機能。タンパク質のエンハンサーは、非選択的または選択的であり得る。
【００４５】
１つの態様において、本発明は、ＬＩＧＨＴ経路の機能的レベルを下方調節して、細胞の集団に対する炎症を軽減または予防または緩和することに関する。しかし、それにもかかわらず、ＬＩＧＨＴ経路の機能的レベルを上方調節して細胞における炎症を誘発することが望ましい場合があることを理解するべきである。例えば、定義される細胞の集団との関連において、特定の目的を達成するのに十分な期間にわたりＬＩＧＨＴ経路の機能的レベルを上方調節することが求められ得る。しかし、当該目的を達成した後は、これがもはや過剰発現した対象の細胞ではないように、一時的ではない程度まで、ＬＩＧＨＴ経路の細胞内機能レベルを下方調節することが求められる可能性がある。
【００４６】
別の例において、ＬＩＧＨＴ経路の過剰発現または活性化により特徴づけられる特定の疾患状態、例えば肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌を同定することができる。ＬＩＧＨＴ経路のこのような過剰刺激またはＬＩＧＨＴ経路刺激の不適当な刺激もしくは活性化が存在する場合において、ＬＩＧＨＴ経路の機能的レベルを下方調節して、異常な炎症を終了させることが求められ得る。したがって、細胞ＬＩＧＨＴ経路シグナル伝達の下方調節は、治療的処置として望ましい。したがって、本発明は、独特な表現型の特性を細胞の集団に導入するためにＬＩＧＨＴ経路シグナル伝達を下方調節すること、および天然または非天然に誘導されたＬＩＧＨＴ経路過剰発現の状態を下方調節することに関するものと、理解するべきである。
【００４７】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状とは、炎症、例えば肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌、並びに関連する症状を指す。
【００４８】
上記で詳述したように、ＬＩＧＨＴ経路シグナル伝達を「調節する」という言及は、経路を介してシグナル伝達を上方調節または下方調節することに対する言及である。このような調節は、任意の好適な手段により達成され得、例えば：（ｉ）ＬＩＧＨＴ経路タンパク質の活性または不活性形態の絶対レベルを調節して（例えば細胞内ＬＩＧＨＴ経路タンパク質濃度を増大または低下させる）、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質の１種または２種以上の大体が、活性化のために有用であるようにし、かつ／またはこの下流の標的と相互作用させること、（ｉｉ）１種または２種以上のＬＩＧＨＴ経路タンパク質をアゴナイズ（agonizing）またはアンタゴナイズ（antagonizing）して、あらゆるの所与のＬＩＧＨＴ経路タンパク質分子の機能的有効性が、増大または減少するようにすることを含む。
【００４９】
例えば、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質の半減期を減少／増大させることにより、実際にＬＩＧＨＴ経路の絶対的な細胞内濃度における低下を必要とせずに、ＬＩＧＨＴ経路活性の全体のレベルにおける低下を達成することができる。同様に、例えばＬＩＧＨＴ経路のこの下流の標的への結合に関してある程度の立体障害を導入する分子にＬＩＧＨＴ経路をカップリングさせることによる、１種または２種以上のＬＩＧＨＴ経路タンパク質の部分的拮抗作用は、ＬＩＧＨＴ経路シグナル伝達の有効性を、必ずしも除去する訳ではないが、減少させる作用を有し得る。したがって、これにより、ＬＩＧＨＴ経路の絶対的な濃度を必ずしも下方調節せずに、ＬＩＧＨＴ経路機能を下方調節する手段が得られ得る。
【００５０】
ＬＩＧＨＴ経路機能の上方または下方調節を達成することに関して、この目的を達成するための方法および手法は、当業者に十分知られており、例えば以下のことを含む：  （ｉ）細胞中に、その細胞がＬＩＧＨＴ経路を発現する能力を上方調節するために、ＬＩＧＨＴ経路をコードする核酸分子または機能的に同等なもの、これらの誘導体または類似体を導入すること。（ｉｉ）細胞中に、遺伝子の転写および／または翻訳の制御を調節するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入すること、ここでこの遺伝子は、ＬＩＧＨＴ経路遺伝子もしくはその機能的部分、またはＬＩＧＨＴ経路遺伝子の発現を直接もしくは間接的に調節する他の遺伝子であり得る。
【００５１】
（ｉｉｉ）細胞中にＬＩＧＨＴ経路発現産物（活性もしくは不活性形態のいずれか）またはその機能的誘導体、相同体、類似体、同等なものもしくは模倣物を導入すること。（ｉｖ）ＬＩＧＨＴ経路発現産物に対してアンタゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入すること。（ｖ）ＬＩＧＨＴ経路発現産物のアゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入すること。（ｖｉ）ＬＩＧＨＴ経路タンパク質に対する抗体（例えば抗ＬＴβＲ抗体またはフラグメントまたは同様の分子、例えば単鎖またはこの一部）；ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アプタマーまたは小分子。
【００５２】
本明細書中で用いる用語「抗体」は、抗体分子全体のみならず、抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）フラグメントをも表す。ｓＦｖフラグメントは、ｓＦｖが誘導される抗体の重鎖および軽鎖可変部の両方を含む、単一のポリペプチド鎖である。このようなフラグメントは、例えば、全体が本明細書中に参考として援用される米国特許第4,642,334号に記載されているように製造することができる。またキメラ抗体も包含される。キメラ抗体は、１つより多い種から誘導された部分を含有する組換え抗体である；例えば、抗体分子の抗原結合領域（即ち、相補性決定領域（ＣＤＲ））は、マウス野性型抗体分子から由来し得、フレームワーク領域および定常領域は、ヒト抗体分子（１つ）またはヒト抗体分子（２つ以上）から由来し得る。
【００５３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」を、本明細書中で、アミノ酸のポリマーを表すために同義に用い、他に限定しない限りは、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる異型アミノ酸を含む。
【００５４】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、他に特定的に示さない限り、天然に存在するＬアミノ酸または残基を含む。アミノ酸について一般的に用いられる１文字および３文字の略語を、本明細書中で用いる（Lehninger，A．L．（1975）Biochemistry，第２版、７１〜９２頁、Worth Publishers，N.Y.）。用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、Ｄアミノ酸および化学的に改変されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似体、通常はタンパク質中に導入されない天然に存在するアミノ酸、およびアミノ酸の特徴的性質を有する化学的に合成された化合物（集合的に「非定型」アミノ酸）を含む。例えば、天然のＰｈｅまたはＰｒｏと同一のペプチド化合物の立体配座的制限を可能にするフェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣物は、「アミノ酸」の定義内に含まれる。
【００５５】
本明細書中で用いる「抗炎症化合物」には、炎症を遮断または低減することを目的とする化合物および疼痛を低減することを目的とする鎮痛薬、例えばアスピリンおよび他のサリチル酸塩化合物、フェニルプロピオン酸誘導体、例えばイブプロフェンおよびナプロキシン（Naproxin）、スリンダク、フェニルブタゾン、副腎皮質ステロイド類、抗マラリア薬、例えばクロロキンおよびヒドロキシクロロキン硫酸塩およびフェナメートが含まれる。リウマチ性疾患の処置において用いられる種々の薬剤の完全な概説については、J．Hosp．Pharm.，36:622（１９７９年５月）を参照する。
【００５６】
「試験剤」は、本発明のプレスクリーニングまたはスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得るあらゆる薬剤である。試験剤は、小分子、ペプチドまたはポリペプチドを含むあらゆる好適な組成物であり得る。
本明細書中で用いる用語「治療」は、存在する状態の処置および予防的処置（即ち予防）を包含する。したがって、「治療」効果および適用には、それぞれ予防的効果および適用が含まれる。
【００５７】
本明細書中で用いる用語「高い危険性」とは、（例えば年齢、性別などについて）適切に適合させたコントロール集団の危険性と比較して高い危険性を指す。
【００５８】
本明細書中で用いる「核酸」は、天然の供給源から単離された核酸；ＰＣＲ増幅もしくは化学的合成などの手法を用いてインビトロで調製された核酸；インビボで、例えば組換えＤＮＡ手法により調製された核酸；またはすべての適切な方法による核酸を表す。核酸は、あらゆる形状（直線状、円形など）または形態（一本鎖、二本鎖、高次コイルなど）であり得る。用語「核酸」はまた、限定せずに、核酸誘導体、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリペプチド−核酸複合体；少なくとも１種の化学的に改変された糖残基、骨格、ヌクレオチド間（internucleotide）架橋、塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチド類似体を有する核酸；並びに化学的に改変された５’または３‘末端を有する核酸；並びに２種または３種以上のこのような改変を有する核酸を含む。核酸中のすべての結合が、同一である必要はない。
【００５９】
一般的に、オリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または複合体（例えば、５‘および３’ＤＮＡ「クランプ」を有するＲＮＡ分子）または混成物（例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡ対形成分子）、または誘導体（この化学的に改変された形態）であり得る。しかし、一本鎖ＤＮＡが好ましい。その理由は、ＤＮＡはしばしばＲＮＡよりも不安定ではないからである。同様に、アプタマーの特異性または安定性を増強する化学的改変が、好ましい。
【００６０】
核酸中に導入され得る化学的改変には、限定も排他性も伴わずに、塩基改変、糖改変および骨格改変が含まれる。塩基改変：アプタマー中の塩基性残基は、天然に存在する塩基（例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、５ＭＣなど）以外であり得る。プリン類およびピリミジン類の誘導体は、当該分野において知られている；例示的な、しかし完全ではないリストには、アジリジニルシトシン、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン（５ＭＣ）、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（mannosylqueosine）、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、キューオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸および２，６−ジアミノプリンが含まれる。このような塩基誘導体の１種または２種以上を包含する核酸に加えて、プリンまたはピリミジン塩基が欠乏しているヌクレオチド残基を有する核酸はまた、アプタマー中に包含され得る。
【００６１】
糖改変：アプタマー中の糖残基は、通常のリボースおよびデオキシリボース残基以外であってもよい。非限定的例により、フラノース残基の２’位における置換により、ヌクレアーゼ安定性が増強される。改変された糖残基の例示的な、しかし完全ではないリストには、２’置換糖、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｓ−アルキル、２’−Ｓ−アリル、２’−フルオロ、２’−ハロまたは２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシド、エチルリボシドまたはプロピルリボシドが含まれる。
【００６２】
例示的な異型アミノ酸には、例えば、国際公開第WO 90/01940号に記載されているもの、並びにＧｌｕおよびＡｓｐで置換され得る２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）；ＧｌｕおよびＡｓｐで置換され得る２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸で置換され得る２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸で置換され得る２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙで置換され得る２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅで置換され得るシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ＡｒｇおよびＬｙｓで置換され得るホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓで置換され得る２，３−ジアミノプロピオン酸、（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａで置換され得るＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；ＡｓｎおよびＧｌｎで置換され得るＮ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓで置換され得るヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓで置換され得るアロヒドロキシリシン（Ａｈｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒで置換され得る３−（および４−）ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌで置換され得るアロイソロイシン（Ａｉｌｅ）；Ａｌａで置換され得るアミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａで置換され得るＮ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；Ｉｌｅで置換され得るＮ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸で置換され得るノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸で置換され得るノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓで置換され得るオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎで置換され得るシトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）フェニルアラニン、並びにＰｈｅで置換され得るトリフルオリルフェニルアラニンが含まれる。
【００６３】
２種または３種以上のアミノ酸またはヌクレオチド配列との関連での用語「同一」または「パーセントの同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または視覚的調査により測定して、比較し、最大の一致についてアラインメントした際に、同一であるかまたは特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２または３以上の配列またはサブシーケンスを意味する。
【００６４】
配列の比較のために、典型的に、１つの配列が基準配列として作用し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および基準配列を、コンピューターに入力し、サブシーケンス座標を所要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターに基づいて、試験配列（１または２以上）について、基準配列に対して相対的なパーセント配列同一性を計算し、これは、当業者に周知である。例えば、比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば以下により行うことができる： SmithおよびWaterman，Adv．Appl．Math．2:482（1981）の局所的相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch，J．Mol．Biol.48:443（1970）の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman（1988）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:2444の類似性についての探索（search for similality）法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin  Genetics  Software  Package，Genetics  Computer  Group，575  Science  Dr.，Madison，Wis.中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、または視覚的調査（一般的にAusubelら、上記を参照）。
【００６５】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適するアルゴリズムの他の例は、BLASTアルゴリズムであり、これは、Altschulら （1990）、J．Mol．Biol．215：403-410中に記載されている。パーセント配列同一性を計算することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、KarlinおよびAltschul（1993）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90：5873-5787を参照）。
【００６６】
用語「特異的結合」は、本明細書中で、特異的部位における、結合パートナーの別のもの（例えば２つのポリペプチド、ポリペプチドおよび核酸分子、または２つの核酸分子）への優先的な結合として定義される。用語「特異的に結合する」は、標的分子／配列についての結合優先度（例えば親和性）が、非特異的標的分子（例えば、特異的に認識される部位（１または２以上）が欠失しているランダムに生成された分子）と比較して少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍または２０倍であることを示す。
【００６７】
本明細書中で用いる用語、抗体とはまた、全抗体の改変により産生されたかまたは組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成された抗体フラグメントを含む。例えば、他の抗体フラグメントのより詳細な記載については、Fundamental  Immunology，W．E．Paul編、Raven  Press，N．Y．（1993）を参照。種々の抗体フラグメントが、完全抗体の消化に関して定義されている一方、当業者は、このようなＦａｂ’フラグメントを、化学的に、または組換えＤＮＡ手順を用いることにより、デノボ合成することができることを理解する。抗体はまた、一本鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）を含み、ここで、可変重鎖および可変軽鎖は、一緒に結合されて（直接、またはペプチドリンカーを介して）連続的なポリペプチドを形成する。
【００６８】
一本鎖Ｆｖ抗体は、共有結合により架橋されたＶＨ−ＶＬヘテロ二量体であり、これは、直接結合されているかまたはペプチドをコードするリンカーにより結合されたＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現され得る。Hustonら（1988）、Proc．Nat．Acad．Sci．USA，85：5879-5883。ＶＨおよびＶＬが単一のポリペプチド鎖として各々に結合している一方、ＶＨおよびＶＬドメインは、非共有結合的に会合している。ｓｃＦｖ抗体、並びに、抗体Ｖ領域由来の天然に凝集しているが化学的には分離しているＦ軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に類似した三次元構造中に折り畳まれる分子に変換する多くの他の構造が、当業者に知られている（例えば、米国特許第 5,091,513号、5,132,405号および4,956,778号を参照）。
【００６９】
用語「有効な量」および「十分な量」は、意図された生物活性をもたらす生物学的に活性な薬剤の量を表す。
【００７０】
用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表し、他に限定しない限りは、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、すべての形態のＤＮＡまたはＲＮＡを表し、これには例えば以下が含まれるゲノムＤＮＡ；相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、これは、ｍＲＮＡのＤＮＡ表現であり、通常はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写または増幅により得られる；合成で、または増幅により産生されるＤＮＡ分子；およびｍＲＮＡ。用語「ポリヌクレオチド」は、二本鎖核酸分子および一本鎖分子を包含する。二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチド鎖は、同一の広がりを有する必要はない（即ち、二本鎖ポリヌクレオチドは、両方の鎖の全長にわたって二本鎖である必要はない）。
【００７１】
本明細書中で用いる用語「相補的である」とは、２つのヌクレオチド間での正確な対形成についての能力を表す。即ち、核酸分子の所定の位置におけるヌクレオチドが、他の核酸分子のヌクレオチドと水素結合することができる場合には、２つの核酸分子は、当該位置において互いに相補的であると考慮される。用語「実質的に相補的である」とは、互いにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的である配列を表す。
【００７２】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野における当業者により一般的に理解されているのと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書中に記載されるものに類似するかまたは同等の方法および材料を、本発明を実施または試験するにあたり用いることができる。以下の参考文献は、本発明において用いる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singletonら、Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology（第２版、1994）；The  Cambridge  Dictionary  of  Science  and  Technology（Walker編、1988）；The  Glossary  of  Genetics，第５版、R．Riegerら（編）、Springer  Verlag（1991）；並びにHaleおよびMarham，The  Harper  Collins  Dictionary  of  Biology（1991）。本明細書中で用いる用語は、他に特定しない限り、これらに帰せられる意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許明細書および本明細書中で述べる他の参考文献を、これらの全体にわたり参照により導入する。本明細書中に開示した材料、方法および例は、例示的であるにすぎず、限定的であることを意図しない。
【００７３】
また、細胞中のＬＩＧＨＴ経路を活性化することにより、炎症の誘発がもたらされ得ることが、確認された。したがって、正常な細胞の特徴「に対して相対的に」細胞の炎症を「調節する」ことについての言及は、ＬＩＧＨＴ経路レベルの過剰発現の結果、機能的レベルでＬＩＧＨＴ経路を発現しない細胞との関連において一般的に観察されない炎症の誘発をもたらすことを含むと理解するべきである。
【００７４】
本明細書中で用いるＬＩＧＨＴ経路活性化の「レベル」または「機能的レベル」は、すべての所与の細胞中に存在するＬＩＧＨＴ経路活性のレベルに対する言及として理解するべきである。ＬＩＧＨＴ経路タンパク質の濃度の上昇は、一般的に細胞において観察されるＬＩＧＨＴ経路機能的活性のレベルの上昇と相関するが、当業者はまた、活性のレベルの上昇を、単に絶対的な細胞内ＬＩＧＨＴ経路濃度を上昇させる以外の手段により達成することができることを、理解する。例えば、延長した半減期を示すかまたは他の方法で増強された活性を示すＬＩＧＨＴ経路の形態を用いることができる。
【００７５】
したがって、対象のＬＩＧＨＴ経路レベルを「過剰発現させる」ことについての言及は、細胞内ＬＩＧＨＴ経路を、炎症の前に所与の細胞についての正常な生理学的状態の下で発現されるよりも高い有効な機能的レベルに上方調節すること、または、ＬＩＧＨＴ経路レベルを機能性の任意のレベルへ上方調節することへの言及として理解するべきであるが、ここで、上方調節の事象は、天然に存在する生理機能の影響に起因して炎症の前に対象の細胞において発生している増大ではなく、人工的に影響されているものである。したがって、上方調節のこの後者の形態は、正常な生理学的範囲内にあるが、刺激前（pre-stimulation）または炎症前（pre-inflammation）レベルよりも高いレベルにＬＩＧＨＴ経路を上方調節することと相関し得る。
【００７６】
上方調節を達成する機構は、生理学的経路を模倣することを追求する人工的な機構−例えばホルモンまたは他の刺激性分子、例えばレチノイン酸（ＲＡ）を導入することであってもよい。したがって、用語「発現」は、ＬＩＧＨＴ経路遺伝子の転写および翻訳の概念に限定されることを意図しない。むしろ、これは結果についての言及であり、特定の時点において細胞における正常な生理学的状態の下で見出されるよりも高く有効なＬＩＧＨＴ経路の機能的レベルの達成である（例えば、これは、当該増大が観察され得る正常な生理学的範囲内にあり得るとしても、天然には発生しないＬＩＧＨＴ経路レベルの増大を含む）。「有効な」レベルである対象の機能的レベルへの言及は、正常な細胞に対する細胞の炎症の調節を達成する過剰発現のレベルであると、理解するべきである。
【００７７】
細胞炎症との関連での「調節」への言及は、例えば、炎症、強皮症または肝炎を誘発するかまたは低減することを含む。ＬＩＧＨＴ経路の機能的レベルとの関連において、「調節」への言及は、例えば、ＬＩＧＨＴ経路活性の機能的レベルを上方調節または下方調節することを含む。ＬＩＧＨＴ経路活性を上方または下方調節して、すべての所与の細胞タイプについて所望の表現型の変化を達成するべきである、特定の機能的レベル（例えば「有効な」レベル）を決定することは、通常の手順の問題である。当業者は、このようなレベルを決定する方法に精通している。
【００７８】
本明細書中で用いる「細胞炎症を調節する」とは、炎症のすべての上方または下方調節を含む。これはまた、炎症の段階または炎症の緩和を開始または進行させることを含む。本明細書中で用いる調節はまた、細菌、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤、肝硬変、肝細胞癌および／または肝細胞壊死の排除をも言及し得る。これらは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の指標である。これらの１または２以上を調節することにより、試験化合物が、ＬＩＧＨＴ経路関連障害を処置するにあたり有用であり得ることが示され得る。
【００７９】
処置方法
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状を処置、防止、改善、軽減または緩和するための方法であって：これを必要としている対象に、薬学的に有効な量のＬＩＧＨＴ経路タンパク質モジュレーターを含む組成物、例えばＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの結合を直接的または間接的に遮断する組成物を投与することを含む、前記方法である。
【００８０】
「有効な量」は、例えば、所望の応答を実現するか、または開始を遅延させるか、または進行を阻害するか、または完全に停止させ、特定の状態の開始または進行を処置するのに少なくとも部分的に必要な量を含む。当該量は、処置されるべき個体の健康および物理的状態、処置されるべき個体の分類学的な群、所望の保護の程度、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連する要因に依存して変化する。当該量は、通常の試行により決定することができる比較的広い範囲内にあることが、予測される。
【００８１】
１つの態様において、組成物を、経口、静脈内、くも膜下腔内または硬膜外、筋肉内、皮下、神経周囲、皮内、局所または経皮で、に対象に投与する。
【００８２】
対象には、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、リス、霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギなどが含まれる。
本明細書中で用いる「ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターを得る」は、モジュレーターを製造するかまたは購入することを表す。
【００８３】
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはこの症状は、疼痛、黄疸（皮膚および目の黄変）；疲労；腹痛；食欲喪失；悪心；嘔吐；下痢；微熱の緩和、細菌、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤、肝細胞壊死、肝硬変（結合組織による肝臓細胞の置換）、肝細胞癌および／または頭痛の除去により示される。
【００８４】
本明細書中での「処置」および「予防」への言及は、この最も広い意味において考慮されるべきである。用語「処置」は、対象を完全な回復まで処置することの意味を必ずしも含まない。同様に、「予防」は、対象が疾患状態を最終的に縮小しないことを必ずしも意味しない。したがって、処置および予防は、特定の状態の症状の改善または特定の状態を発生させる危険を防止するか、もしくは他の方法で低減させることを含む。用語「予防」は、特定の状態の重篤度または開始を低減することを含むと考慮され得る。「処置」はまた、存在する状態の重篤度を低減し得る。
【００８５】
本発明はさらに、療法の組み合わせ、例えば調節剤を、所望の治療的または予防的結果を促進し得るタンパク質性の、または非タンパク質性の分子と共に投与することを意図する。
【００８６】
調節剤を、経口、静脈内（水溶性である場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内または坐剤の経路または移植（例えば徐放性分子を用いて）によるなどの従来の方法で投与してもよい。調節剤を、薬学的に許容し得る無毒性塩、例えば酸付加塩または例えば亜鉛、鉄などとの金属錯体（これは、本出願の目的のための塩として考慮される）の形態で投与してもよい。このような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分を錠剤形態で投与するべきである場合には、錠剤は、結合剤、例えばトラガカント、コーンスターチまたはゼラチン；崩壊剤、例えばアルギン酸；および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含んでいてもよい。
【００８７】
投与の経路には、例えば、呼吸器から（respiratorally）、気管内、鼻咽腔、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、くも膜下腔内、脳内、鼻腔内、注入、経口、直腸、ＩＶドリップパッチ（drip  patch）を介しておよび移植が含まれる。
【００８８】
これらの方法に従って、本明細書中で定義した剤を、１種または２種以上の他の化合物または分子と共投与してもよい。「共投与」により、同一の、もしくは異なる経路を介しての同一の配合物における、もしくは２種の異なる配合物における同時の、もしくは連続的な投与、または同一の、もしくは異なる経路による連続的投与を意味する。例えば、対象のＬＩＧＨＴ経路を、アゴニスト剤と一緒に投与して、この効果を増強することができる。あるいはまた、臓器組織移植の場合において、ＬＩＧＨＴ経路を、免疫抑制薬と一緒に投与してもよい。
【００８９】
「連続的な」投与により、２種のタイプの分子の投与の間の秒、分、時間または日における時間的差異を意味する。これらの分子を、任意の順序で投与することができる。他の態様において、組成物はさらに、少なくとも１種の抗けいれん薬、非麻薬性鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗うつ薬、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ニコチン受容体アンタゴニストまたは局所麻酔薬の１種または２種以上の治療的に有効な量を含む。
【００９０】
本発明の他の局面は、哺乳動物における細胞炎症を調節するための医薬の製造におけるＬＩＧＨＴ経路の機能的レベル（例えば可溶性ＬＩＧＨＴのレベル）を調節することができる剤の使用に関し、ここでＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を崩壊または調節することにより、細胞の炎症が調節される。
【００９１】
他の局面において、本発明は、ＬＩＧＨＴ経路またはＬＩＧＨＴ経路をコードする核酸の、哺乳動物における細胞炎症を調節するための医薬の製造における使用に関し、ここでＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を調節することにより、細胞の炎症が調節される。
【００９２】
「異常な、あるいは望ましくない細胞炎症」は、例えば、炎症が望まれているが発症しないかまたは逆である哺乳動物における状態を意味する。異常な炎症は、例えば、神経細胞、膵臓細胞、肺細胞、骨組織細胞、脾臓細胞、心臓細胞、腎臓細胞、精巣細胞または腸管細胞の１種または２種以上を発生させ得る。異常な炎症により、例えば、以下の状態の１または２以上が生じ得る：例えば肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌。当該炎症は、例えば、ＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を調節することにより対処することができる。
【００９３】
調節は、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質レベルまたはその断片の下方調節、および例えば妨害核酸分子をコードする核酸分子またはタンパク質分子、例えばＲＮＡｉタンパク質または機能的に同等なものの導入による下方調節であり得る。調節はまた、ＬＩＧＨＴ経路遺伝子の転写および／または翻訳制御を調節する化合物と細胞を接触させることによるものであり得る。調節はまた、細胞を、タンパク質発現生成物のアゴニストとして機能する化合物と接触させることによるものであり得る。
【００９４】
１つの態様において、調節は、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質レベルの下方調節であり、下方調節を、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質発現生成物に対するアンタゴニストとして機能する化合物と細胞を接触させることにより、行うことができる。
１つの態様において、調節は、ＬＩＧＨＴの切断を防止してＬＩＧＨＴの可溶性形態を形成することである。
【００９５】
上方または下方調節のいずれにおいても、炎症の調節は、インビボまたはインビトロであり得る。
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路またはこの相同体、誘導体もしくはフラグメントの、ＬＩＧＨＴ経路関連障害を処置するための医薬の製造のための使用である。
【００９６】
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはこの症状を処置、防止、改善、低減または緩和するのに有効なＬＩＧＨＴ経路モジュレーターの薬学的に有効な量および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００９７】
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路モジュレーターは、小分子、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体の抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチドをコードする核酸または有機分子の１種または２種以上から選択される。
【００９８】
本発明は、ＬＩＧＨＴ経路関連疾患または障害の危険性があるか、またはかかる疾患または障害に感受性である対象を処置する予防および治療方法を共に提供する。処置は、ＬＩＧＨＴ経路関連疾患もしくは障害、ＬＩＧＨＴ経路関連疾患もしくは障害の症状、またはＬＩＧＨＴ経路関連疾患もしくは障害に対する素因を有する患者への、治療剤の適用もしくは投与、または該患者からの単離された組織もしくは細胞系への治療剤の適用もしくは投与であって、当該疾患もしくは障害、当該疾患もしくは障害の症状、または当該疾患もしくは障害に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、救済、改善、好転もしくは影響を及ぼすことを目的とするものとして、定義される。
【００９９】
本発明の治療方法は、本明細書中に記載した本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子の投与を含む。
１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載した本発明のポリぺプチドまたは核酸分子を対象に投与することによる、対象におけるＬＩＧＨＴ経路関連疾患または障害を防止するための方法を提供する。
【０１００】
本発明は、ＬＩＧＨＴ経路関連疾患または障害を防止および処置するための治療方法および組成物を提供する。特に、本発明は、対象における疾患または障害を防止および処置するための方法および組成物を提供する。
【０１０１】
１つの態様において、本発明は：ａ）：ｉ）ＬＩＧＨＴ経路疾患または障害を有するか、またはこれを発生する危険性がある哺乳動物患者、特にヒトに、ｉｉ）本明細書中に記載した本発明の１種または２種以上の分子を提供する、即ち投与することを含む、処置方法を意図する。
【０１０２】
用語「発生する危険性がある」は、本明細書中では、汚染または他の健康的要因によるＬＩＧＨＴ経路関連疾患または障害に罹患する可能性が高い個体として定義される。例えば、肝炎ウイルス、例えばＡ〜Ｅ型肝炎との接触である。
【０１０３】
本発明はまた、分子の投与により達成される利点の程度により限定されない。例えば、本発明は、すべての症状が解消される状況に限定されない。１つの態様において、分子を投与することにより、ＬＩＧＨＴ経路関連疾患または障害の症状の数または重篤度が低下する。他の態様において、分子を投与することにより、ＬＩＧＨＴ経路関連疾患または障害の症状の開始が遅延され得る。
【０１０４】
本発明の尚他の局面は、疾患または疾患の症状（例えば肝臓の炎症、肝炎（自己免疫性の、および病原体により誘発された）、関節硬化症、関節炎、ＩｇＡ腎症、炎症性腸疾患、肝硬変および肝細胞癌を含むが、これらには限定されない）を有する対象（例えば哺乳動物、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、マウス）を処置する方法に関する。当該方法は、本明細書中に記載した化合物または本明細書中に記載した組成物のこのような効果を生じるのに有効な量を対象（このような処置を必要としていると特定された対象を含む）に投与することを含む。このような処置を必要としている患者を特定することは、対象または健康管理の専門家の判断においてとすることができ、主観的（例えば意見）または客観的（例えば試験もしくは診断方法により測定可能）であり得る。
【０１０５】
個体による処置のための典型的な対象には、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくはヒトが含まれる。本発明に従って処理した細胞はまた、好ましくは哺乳動物、特に霊長類、とりわけヒト細胞である。上記で討議したように、対象または細胞は、処置が必要であると好適に特定され、次に、特定された細胞または対象は、処置のために選択され、本発明の１種または２種以上の融合分子を投与される。
【０１０６】
本発明の処置方法および組成物はまた、獣医学的用途、例えばウマおよび家畜、例えばウシ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなど、並びにペット、例えばイヌおよびネコを処置することを含む、ヒト以外の哺乳動物の処置に有用である。
【０１０７】
他の態様において、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーの阻害を、すべての入手可能な手段、例えば：（１）タンパク質ファミリーメンバーの発現、ｍＲＮＡ安定性、タンパク質輸送、改変（例えばリン酸化）、もしくは分解、または（２）タンパク質ファミリーメンバーの正常な機能の１もしくは２以上の阻害により、達成することができる。
【０１０８】
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーの阻害を、当該タンパク質を発現する組織中のＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーのレベルを低下させることにより、達成する。したがって、本発明の方法は、タンパク質が以下に記載するように発現される組織中のタンパク質ファミリーメンバーを標的とし得る。これを、例えばアンチセンスまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）手法を用いて達成して、翻訳のために有用なＲＮＡのレベルを低下させることができる。
【０１０９】
スクリーニングの方法
ＬＩＧＨＴ経路関連障害の媒介におけるタンパク質ファミリーメンバーの作用により、ＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーが、これらの障害を調節して当該障害を有効に処置、防止、改善、軽減または緩和する薬剤についての魅力的な標的となる。したがって、本発明は、このような薬剤を同定することを目的とするプレスクリーニングおよびスクリーニング方法を提供する。本発明のプレスクリーニング／スクリーニング方法は、必ずしもではないが一般的に、インビトロで行う。したがって、スクリーニングアッセイは、一般的に、例えば、細胞可溶化物またはそれらのフラクション、培養細胞、または例えば組織もしくはそのフラクションもしくは動物などの生物学的試料における、精製されたかまたは部分的に精製された成分を用いて行う。
【０１１０】
したがって、１つの態様において、プレスクリーニング方法は、試験剤をＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーのメンバー（１種）またはメンバー（２種以上）（例えば可溶性ＬＩＧＨＴおよびＬＴβＲ）と接触させることを含む。このようなプレスクリーニングは、一般的に、単なるインビトロ結合アッセイまたは結合アッセイのインビトロ阻害用いて、最も好都合に達成される。試験剤のポリペプチドへの特異的な結合についてのアッセイの手段は、当業者に十分知られており、以下の例中に詳記されている。１つの結合アッセイにおいて、ポリペプチドを固定化し、試験剤（標識することができる）に曝露するか、あるいはまた試験剤（１または２以上）を固定化し、ポリペプチド（標識することができる）に曝露するか、またはタンパク質の１種を固定化し、試験剤（１または２以上）および他のタンパク質を、固定化されたタンパク質に曝露する。次に、固定化された種を洗浄して、すべての未結合の物質を除去し、結合した物質を検出する。多数の試験剤をプレスクリーニングするために、ハイスループットアッセイが、一般的に好ましい。種々のスクリーニング形式を、以下に一層詳細に討議する。
【０１１１】
例えば本発明のプレスクリーニングアッセイにおいて特定されたものを含む試験剤をまた、スクリーニングして、試験剤がタンパク質ファミリーメンバーまたはＲＮＡのレベルに影響するか否かを決定することができる。これらのレベルを低下させる剤は、潜在的に１または２以上のＬＩＧＨＴ経路関連障害を軽減し得る。
【０１１２】
したがって、本発明は、ＬＩＧＨＴ経路関連障害を調節する薬剤をスクリーニングする方法を提供し、ここで試験剤を、試験剤の不存在下でタンパク質ファミリーメンバーを発現する細胞と接触させる。好ましくは、当該方法を、インビトロアッセイまたはインビボを用いて行う。このようなアッセイにおいて、試験剤を、培養物中の細胞と、または組織に接触させることができる。あるいはまた、試験剤を、細胞可溶化物またはこのフラクション（例えば、タンパク質ファミリーメンバーもしくはそのポリペプチドを検出するための膜フラクション）と接触させることができる。（ｉ）タンパク質ファミリーメンバー；またはＲＮＡのレベルを、試験剤の存在および不在（または比較的少量の存在）下で決定して、レベルを変化させるすべての試験剤を同定する。アッセイしたレベルが変化する場合には、試験剤を、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の潜在的なモジュレーターとして選択する。好ましい態様において、アッセイしたレベルを低下または上昇させる薬剤を、１または２以上のＬＩＧＨＴ経路関連障害の潜在的なモジュレーターとして選択する。
【０１１３】
このスクリーニング方法において有用な細胞には、薬物関連効果または挙動を低下させる方法と関連して上記に記載したすべての種からのものが含まれる。タンパク質ファミリーメンバーを天然に発現する細胞は、このスクリーニング方法において有用である。例には、ＰＣ１２細胞、ＳＨ−ＳＹ５ｙ細胞、ＮＧ１０８−１５細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞およびＮＭＢ細胞が含まれる。あるいはまた、タンパク質ファミリーのメンバーを発現するように設計された細胞を、当該方法において用いることができる。
【０１１４】
スクリーニングにおいて有用なマウスには、正常なマウスおよびＹ１７３Ｆ  ＬＩＧＨＴまたはＬＩＧＨＴΔＬタンパク質の１種または２種以上を有するマウスが含まれる。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
他の局面において、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはこの症状を処置、防止、改善、低減または緩和するための治療剤をスクリーニングするための方法は、試験剤を動物に投与すること、および炎症、細菌の排除、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤、肝硬変および肝細胞癌および／または肝細胞壊死の１または２以上の調節を測定することを含み得る。研究において有用な動物には、マウス、霊長類、ウサギ並びに当業者に知られている他の有用な動物および細胞または器官モデルが含まれる。Ｙ１７３Ｆ  ＬＩＧＨＴまたはＬＩＧＨＴΔＬタンパク質の１または２以上を発現するマウスもまた、スクリーニング方法において有用である。
【０１１７】
動物、細胞または器官モデルにおいて肝炎を誘発することもまた、有用であり、これは、コンカナバリンＡ、リステリア・モノサイトゲネス、肝炎ウイルスでの処置による誘発、自己免疫性肝炎、アセトアミノフェンにより誘発された肝細胞死またはアルコールにより誘発された肝炎を含み得る。炎症または可溶性ＬＩＧＨＴレベルを低下させるとして見出された試験剤は、ＬＩＧＨＴ経路障害を処置するにあたり有用であり得る。また、炎症を低下させ、細菌の排除を低減し、肝臓の炎症を低減し、炎症細胞の浸潤、肝硬変、肝細胞癌を低減し、かつ／または肝細胞壊死を低減する薬剤はまた、ＬＩＧＨＴ経路障害、例えば肝炎を処置するにあたり有用であり得る。
【０１１８】
１つの態様において、試験剤を、薬物の存在下で細胞と接触させる。当該薬物は、一般的に、１種または２種以上の望ましくない影響または挙動を生じるもの、例えば鎮静催眠薬および鎮痛薬である。特定の態様において、当該薬剤は、エタノール、カンナビノイドまたはオピオイドである。
【０１１９】
上記のように、スクリーニングアッセイは、一般的に、インビトロで、例えば培養した細胞中、生体試料（例えば脳、後根神経節ニューロンおよび交感神経節ニューロン）中、またはこのフラクションにおいて、行う。記載の容易のために、細胞培養物、生体試料およびフラクションを、以下で「試料」と呼ぶ。当該試料は、一般的に、動物（例えば前述のすべての研究動物）、好ましくは哺乳動物、および一層好ましくはヒトに由来する。
【０１２０】
試料を、所要に応じて適切な緩衝溶液での希釈により前処理するか、または所望により濃縮してもよい。生理学的ｐＨでの１種または２種以上の種々の緩衝液、例えばリン酸緩衝液、トリスなどを用いた多種の標準的な水性緩衝溶液のすべてを用いることができる。
【０１２１】
タンパク質ファミリーメンバーを、当業者に周知の多種の方法のすべてにより、検出し、定量することができる。タンパク質ファミリーメンバーを検出するのに適する分析的生化学的方法の例には、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー（hyperdiffusion  chromatography）など、または種々の免疫学的方法、例えば流体またはゲル沈降素反応、免疫拡散法（単純または二重）、免疫組織化学法、アフィニティークロマトグラフィー、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、受容体結合（receptor-linked）免疫吸着法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティング、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ、酵母ツーハイブリッドアッセイ、全細胞または部分的細胞電流記録などが含まれる。ペプチドモジュレーターは、例えばファージディスプレイにより発見またはスクリーニングされ得る。5,096,815；5,198,346；5,223,409；5,260,203；5,403,484；5,534,621；および5,571,698を参照。
【０１２２】
ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を同定するための方法は、タンパク質を試験化合物と接触させ、炎症を測定することを含む。ＬＩＧＨＴ経路タンパク質をまた、改変、例えばキメラ的および／または欠失変異体としてもよい。タンパク質を単離されても、膜もしくは人工膜中であってもよい。接触は、直接または間接的であってもよい。
【０１２３】
本発明の方法はまた、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはこの症状を処置、防止、改善、軽減または緩和するための治療剤をスクリーニングする方法であって、試験剤を過剰発現したタンパク質を有するマウスに投与することを含む、前記方法を含む。
【０１２４】
上記のタンパク質性分子は、天然、組換えまたは合成の供給源などのすべての好適な供給源から由来し得、融合タンパク質または、例えば天然生成物スクリーニングもしくはハイスループットスクリーニングに従って同定された分子を含む。非タンパク質性分子への言及は、例えば、核酸分子への言及であっても、または、天然の供給源、例えば天然生成物スクリーニングに由来する分子であっても、または化学的に合成された分子であってもよい。本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができるＬＩＧＨＴ経路発現生成物または小分子の類似体を意図する。化学的アゴニストは、必ずしもＬＩＧＨＴ経路発現生成物に由来するわけではなく、ある立体配座的類似性を共有する場合がある。
【０１２５】
あるいはまた、化学的アゴニストを、ある生理化学的特性を満たすように特別に設計してもよい。アンタゴニストは、ＬＩＧＨＴ経路がこの正常な生物学的機能を遂行するのを遮断、阻害または他の方法で防止することができるすべての化合物、例えばこの活性化を防止するかあるいは活性化されたＬＩＧＨＴ経路の機能を下方調節するのを防止する分子であってもよい。アンタゴニストは、モノクローナル抗体、および哺乳動物細胞におけるＬＩＧＨＴ経路遺伝子の転写または翻訳を防止するアンチセンス核酸またはｍＲＮＡを含む。発現の調節をまた、共抑制（co-suppression）において用いるのに適する抗原、ＲＮＡ、リボソーム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡアプタマー、抗体または分子を用いて、達成することができる。上記の（ｉ）〜（ｖ）の点において言及されるタンパク質性および非タンパク質性分子は、本明細書中で、集合的に「調節剤」と呼ぶ。他の態様において、モジュレーターは、小分子、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体、抗ＬＩＧＨＴ経路抗体の抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプチドをコードする核酸、または有機分子の１種または２種以上である。
【０１２６】
調節剤についてのスクリーニングを、いくつかの好適な方法のいずれか１つにより達成することができ、これには、ＬＩＧＨＴ経路遺伝子またはこの機能的に同等なものもしくは誘導体の１または２以上を含む細胞を剤と接触させること、および可溶性ＬＩＧＨＴタンパク質の産生または機能的活性の調節、ＬＩＧＨＴ経路をコードする核酸分子の発現の調節、または下流のＬＩＧＨＴ経路細胞標的、例えば可溶性ＬＩＧＨＴの活性もしくは発現の調節についてのスクリーニングが含まれるが、決してこれらには限定されない。このような調節の検出を、ウエスタンブロット、電気泳動移動度シフト解析および／またはルシフェラーゼ、ＣＡＴなどのＬＩＧＨＴ経路活性のレポーターの読み取りまたは形態学的変化の観察などの手法を用いて、達成することができる。
【０１２７】
ＬＩＧＨＴ経路遺伝子またはこれらの機能的に同等なものもしくは誘導体は、試験の対象である細胞中に天然に存在し得るか、あるいはこれは、試験の目的のために宿主細胞中に形質移入されている場合がある。さらに、天然に存在するかまたは形質移入された遺伝子は、恒常的に発現され−これにより、特に核酸もしくは発現産物レベルのいずれかにおいてＬＩＧＨＴ経路活性を下方調節する薬剤についてのスクリーニングのために有用なモデルを得ることができるか、または遺伝子は活性化を必要とし得−これにより、特にＬＩＧＨＴ経路活性を上方調節する薬剤についてのスクリーニングのために有用なモデルを得ることができる。
【０１２８】
さらに、ＬＩＧＨＴ経路核酸分子が細胞中に形質移入される程度に、当該分子は、全体的なＬＩＧＨＴ経路遺伝子を含み得るか、またはこれは、単に遺伝子の一部、例えばＬＩＧＨＴ経路産物の発現を調節する部分を含むのみであり得る。例えば、ＬＩＧＨＴ経路プロモーター領域を、試験の対象である細胞中に形質移入してもよい。プロモーターを用いるに過ぎないこの点に関して、プロモーターの活性の調節の検出を、例えば、プロモーターをレポーター遺伝子に連結することにより、達成することができる。例えば、プロモーターを、ルシフェラーゼまたはＣＡＴレポーターに連結してもよく、当該遺伝子の発現の調節を、それぞれ蛍光強度またはＣＡＴレポーター活性の調節により、検出することができる。
【０１２９】
他の例において、検出の対象は、ＬＩＧＨＴ経路自体ではなくむしろ下流のＬＩＧＨＴ経路調節標的であり得る。なお別の例は、最小のレポーターに連結されたＬＩＧＨＴ経路結合部位を含む。例えば、ＬＩＧＨＴ経路活性の調節を、細胞中の機能的活性の調節についてスクリーニングすることにより、検出することができる。これは、ＬＩＧＨＴ経路発現の調節自体が検出の対象ではない間接的な系の例である。むしろ、ＬＩＧＨＴ経路が発現を調節する分子の調節を、モニタリングする。
【０１３０】
これらの方法により、推定の調節剤、例えば合成、コンビナトリアル、化学的および天然のライブラリーを含むタンパク質性または非タンパク質性薬剤のハイスループットスクリーニングを行うための機構が得られる。またこれらの方法により、ＬＩＧＨＴ経路核酸分子もしくは発現産物自体のいずれかに結合する薬剤の検出が容易になるか、またはこれにより、上流分子の発現が調節され、当該上流分子はその後、ＬＩＧＨＴ経路発現または発現産物活性を調節する。したがって、これらの方法により、ＬＩＧＨＴ経路発現および／または活性を直接的または間接的に調節する薬剤を検出するための機構が得られる。
【０１３１】
本発明の方法に従って用いる薬剤は、任意の好適な形態を採り得る。例えば、タンパク質性薬剤は、多様な程度にグリコシル化または非グリコシル化、リン酸化または脱リン酸化されていてもよく、かつ／または、用いられ、連結され、結合されているかあるいはタンパク質と結合する広範囲の他の分子、例えばアミノ酸、脂質、炭水化物もしくは他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を含み得る。同様に、対象の非タンパク質性分子はまた、任意の好適な形態を採り得る。本明細書中に記載したタンパク質性剤と非タンパク質性薬剤との両方を、すべての他のタンパク質性分子または非タンパク質性分子と連結、結合または他の方法で関連させてもよい。例えば、本発明の１つの態様において、当該薬剤を、局所化された領域へのこの標的を可能にする分子と結合させる。
【０１３２】
タンパク質性または非タンパク質性分子は、直接、または間接的に作用して、ＬＩＧＨＴ経路の発現またはＬＩＧＨＴ経路発現産物の活性を調節し得る。当該分子は、これが、それぞれＬＩＧＨＴ経路核酸分子または発現産物と関連して、発現または活性を調節する場合には、直接作用する。当該分子は、これが、それぞれ、他の分子がＬＩＧＨＴ経路核酸分子または発現産物の発現または活性を直接、または間接的に調節する、ＬＩＧＨＴ経路核酸分子または発現産物以外の分子と関連する場合には、間接的に作用する。したがって、本発明の方法は、ＬＩＧＨＴ経路核酸分子発現または発現産物活性を、調節段階のカスケードの誘発により調節することを包含する。
【０１３３】
用語「発現」は、例えば、核酸分子の転写および翻訳を表す。「発現産物」への言及は、核酸分子の転写および翻訳から産生された生成物への言及である。
【０１３４】
本明細書中に記載した分子の「誘導体」（例えばＬＩＧＨＴ経路または他のタンパク質性もしくは非タンパク質性剤）には、天然の、または天然でない供給源のいずれかからのフラグメント、部分（part）、部分（portion）またはバリアントが含まれる。天然でない供給源には、例えば、組換えの、または合成の供給源が含まれる。「組換えの供給源」により、対象の分子が収集される細胞供給源が、遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えば、産生の速度およびボリュームを当該特定の細胞供給源により増大させるか、または他の方法で増強するために、なされてもよい。部分またはフラグメントには、例えば、分子の活性領域が含まれる。
【０１３５】
誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から誘導され得る。アミノ酸挿入誘導体には、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合物、並びに単一または複数のアミノ酸の配列内（intrasequence）挿入物が含まれる。挿入アミノ酸配列バリアントとは、１または２以上のアミノ酸残基がタンパク質中の所定の部位中に導入されているものであるが、ランダムな挿入もまた、生じる生成物の好適なスクリーニングに伴って可能である。欠失バリアントは、１または２以上のアミノ酸の配列からの除去により特徴づけられる。置換アミノ酸バリアントは、配列中の少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその場所に挿入されているものである。アミノ酸配列への付加には、上記に詳記したように、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合物が含まれる。
【０１３６】
誘導体はまた、ペプチド、ポリペプチドまたは他のタンパク質性もしくは非タンパク質性分子に融合した全体のタンパク質の特定のエピトープまたは部分を有するフラグメントを含む。例えば、ＬＩＧＨＴ経路またはこの誘導体を、分子に融合させて、細胞中への侵入を容易にしてもよい。本明細書中で意図される分子の類似体には、例えば、側鎖への改変、天然でないアミノ酸および／またはこれらの誘導体のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の間の導入および架橋剤の使用並びに、タンパク質性分子またはこれらの類似体に対する立体配座的束縛を含む他の方法が含まれる。
【０１３７】
本明細書中に記載した方法に従って用いることができる核酸配列の誘導体は、同様に、他の核酸分子との融合を含む単一の、または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加から由来し得る。本明細書中に記載したように用いる核酸分子の誘導体には、例えば、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の同時抑制および融合において用いるのに適する分子が含まれる。核酸配列の誘導体はまた、縮重バリアントを含む。
【０１３８】
ＬＩＧＨＴ経路の「バリアント」は、例えば、これがバリアントであるＬＩＧＨＴ経路の形態の機能的活性の少なくともいくらかを示す分子を含むと解釈するべきである。変異は、いかなる形態をとってもよく、天然に存在するものであっても天然に存在しないものであってもよい。変異体分子は、例えば改変された機能的活性を示すものである。
【０１３９】
「相同体」には、例えば、分子が、本発明の方法に従って処置されるもの以外の種から誘導されることが含まれる。これは、例えば、処置されるもの以外の種がＬＩＧＨＴ経路の形態を生成し、これが、処置を受けている対象により天然に産生されるＬＩＧＨＴ経路のものに類似し好適な炎症を示すことが決定される場合に起こり得る。
【０１４０】
化学的および機能的に同等なものには、例えば、対象分子の機能的活性のいずれか１または２以上を示す分子が含まれ、当該機能的に同等なものは、あらゆる供給源から誘導され得、例えば、化学合成されるか、または天然生成物スクリーニングなどのスクリーニングプロセスにより特定される。例えば、化学的または機能的に同等なものを、周知の方法、例えば組換えライブラリーのコンビナトリアルケミストリーもしくはハイスループットスクリーニングを用いて、または天然生成物スクリーニングに従って、設計および／または同定することができる。
【０１４１】
例えば、小さい有機分子を含むライブラリーを、スクリーニングしてもよく、ここで多数の特定の親基置換を有する有機分子を、用いる。一般的な合成スキームは、公開された方法（例えばBunin  B  Aら（1994）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:4708-4712；De  Witt  S  Hら（1993）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:6909-6913）に従うことができる。簡単に述べると、各々の連続的な合成段階において、複数の異なる選択された置換基の１つを、アレイ中のチューブの選択されたサブセットの各々に加え、チューブサブセットの選択を、ライブラリーを作成するにあたり用いられる異なる置換基のすべての可能な順列を生じるようにする。１つの好適な順列の戦略は、米国特許第5,763,263号に概説されている。
【０１４２】
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害またはその症状を処置、防止、改善、軽減または緩和するための治療剤をスクリーニングする方法であって、試験剤を過剰発現したタンパク質を有するマウスに投与すること、および炎症の調節を測定することを含む、前記方法である。１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を特定するための方法であって、タンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させること、およびＬＩＧＨＴ経路の発現、調節または炎症もしくはＧＤＰＤ活性（例えばグリセロホスホジエステラーゼ活性）を測定することを含む、前記方法である。
【０１４３】
１つの局面において、本発明において提供されるのは、ＬＩＧＨＴ経路関連障害の処置において有用な薬剤のためのリード化合物を特定するための方法であって、タンパク質の機能的な量を発現しない細胞を試験化合物と接触させること、およびＬＩＧＨＴ経路発現または炎症の１または２以上を測定することを含む、前記方法である。
１つの態様において、ＬＩＧＨＴ経路発現または炎症を、タンパク質またはＲＮＡの発現を測定すること、物理的な炎症マーカーを観察すること、ＬＴβＲまたはＬＩＧＨＴの１または２以上のタンパク質またはＲＮＡレベルを測定することの１または２以上により、測定する。
【０１４４】
他の態様において、試験化合物は、ペプチド、小分子、抗体またはそのフラグメント、核酸またはそのライブラリーの１種または２種以上である。
また本明細書中に記載したスクリーニング手法において有用なのは、生物学的に活性な化合物を探索するためのランダムな有機分子のコンビナトリアルライブラリーである（例えば米国特許第5,763,263号を参照）。このタイプのライブラリーをスクリーニングすることにより発見されるリガンドは、天然のリガンドを模倣もしくは遮断するか、または生物学的標的の天然に存在するリガンドを妨害するにあたり、有用であり得る。この前後関係において、例えば、一層有効な薬理学的効果などの特性を示すＬＩＧＨＴ経路類似体を開発するための開始点として、これらを用いることができる。
【０１４５】
ハイスループットライブラリースクリーニング方法については、選択された生物学的剤、例えば生体分子、巨大分子複合体または細胞と特異的に相互作用することができるオリゴマーまたは小分子ライブラリー化合物を、周知の方法、例えば上記の方法の範囲内から当業者により容易に選択されるコンビナトリアルライブラリー装置を用いて、スクリーニングする。このような方法において、ライブラリーの各々の要素を、選択された剤と特異的に相互作用する能力について、スクリーニングする。この方法を行うにあたり、生物学的剤を、化合物を含むチューブに引き込み、各々の管中で個別のライブラリー化合物と相互作用させる。この相互作用を、所望の相互作用の存在をモニタリングするために用いることができる検出可能なシグナルを発生するように、設計する。好ましくは、この生物学的剤は、水溶液中に存在し、他の条件は、所望の相互作用に依存して適合されている。検出を、例えば物質の検出のためのあらゆる周知の機能に基づくまたは機能に基づかない方法により、行うことができる。
【０１４６】
ＬＩＧＨＴ経路の活性を模倣する分子についてのスクリーニングに加えて、ＬＩＧＨＴ経路に対してアゴニスト的に、またはアンタゴニスト的に機能する分子を特定し、用いて、ＬＩＧＨＴ経路の機能的活性を、細胞炎症の調節に関して上方または下方調節することが、望ましい場合がある。このような分子を用いることについて、以下に一層詳細に記載する。対象分子がタンパク質性である範囲で、これは、例えば、融合タンパク質を含む天然もしくは組換えの供給源に由来しても、例えば上記のスクリーニング方法に従って誘導されてもよい。
【０１４７】
非タンパク質性分子は、例えば、また上記で特同定される方法に従って同定または生生された化学的または合成分子であり得る。したがって、本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができるＬＩＧＨＴ経路の化学的な類似体を用いることを意図する。化学的アゴニストは、必ずしもＬＩＧＨＴ経路から由来しなくてもよいが、特定の立体配座的類似性を共有し得る。あるいはまた、化学的アゴニストは、ＬＩＧＨＴ経路のある種の生理化学的特性を模倣するように特別に設計されていてもよい。アンタゴニストは、ＬＩＧＨＴ経路がこの正常な生物学的機能を遂行するのを遮断、阻害または他の方法で防止することができるすべての化合物であり得る。アンタゴニストには、ＬＩＧＨＴ経路またはＬＩＧＨＴ経路の一部に特異的なモノクローナル抗体が含まれる。
【０１４８】
本発明において意図するＬＩＧＨＴ経路またはＬＩＧＨＴ経路アゴニストもしくはアンタゴニスト剤の類似体には、例えば、側鎖に対する改変、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の間の天然ではないアミノ酸および／または誘導体の導入並びに架橋剤および類似体に立体配座について拘束をもたらす他の方法を用いることが含まれる。このような改変を行うことができる特定の形態は、対象の分子がタンパク質性であるか、非タンパク質性であるかに依存する。特定の改変の性質および／または適合性は、当業者により通常の方法により決定され得る。
【０１４９】
例えば、本発明が意図する側鎖修飾の例には、例えばアルデヒドとの反応による還元的アルキル化によるアミノ基の改変とその後のＮａＢＨ４での還元；アセトイミド酸メチルでのアミジン化；無水酢酸でのアシル化；シアン酸塩でのアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でのアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸でのアミノ基のアシル化；並びにピリドキサール−５−リン酸でのリシンのピリドキシル化（pyridoxylation）とその後のＮａＢＨ４での還元が含まれる。
【０１５０】
アルギニン残基のグアニジン基を、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬での複素環式縮合生成物の生成により、修飾することができる。
【０１５１】
ハイスループットスクリーニングアッセイ
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、典型的には、多種の化合物を通じて所望の活性について探索するための自動分析を用いる。典型的には、ＨＴＳアッセイを用いて、特定の受容体または分子に対して作用する化学物質についてスクリーニングすることにより、新たな薬物を見出す。例えば、化学物質が受容体を不活性化させる場合には、これは、疾患を生じる細胞におけるプロセスを防止するにあたり有効であると明らかになり得る。ハイスループット方法により、研究者は、ロボット操作システムおよび結果の自動分析を用いて、数千種の異なる化学物質を各々の標的に対して、極めて迅速に試験することが可能になる。
【０１５２】
本明細書中で用いる「ハイスループットスクリーニング」または「ＨＴＳ」は、多種の化合物（ライブラリー）；一般的に、数万ないし数十万種の化合物の、ロボットスクリーニングアッセイを用いた迅速なインビトロでのスクリーニングを表す。超ハイスループット（）スクリーニング（ｕＨＴＳ）は、一般的に、１日あたり100,000より多い試験まで加速されたハイスループットスクリーニングを表す。例には、酵母ツーハイブリッドシステムおよびファージディスプレイが含まれる。ファージディスプレイの例については、米国特許第5,096,815号；5,198,346号；5,223,409号；5,260,203号；5,403,484号；5,534,621号；および5,571,698号を参照。
【０１５３】
ハイスループットスクリーニングを達成するために、試料をマルチコンテナキャリアまたはプラットフォームに収納するのが、最良である。マルチコンテナキャリアにより、複数の候補化合物の反応を同時に測定するのが容易になる。マルチウェルマイクロプレートを、キャリアとして用いてもよい。このようなマルチウェルマイクロプレートおよびこれらを多数のアッセイにおいて用いるための方法は共に、当該分野において公知であり、商業的に入手できる。
【０１５４】
スクリーニングアッセイは、アッセイの成分の適切な操作の較正および確認の目的のためのコントロールを含んでいてもよい。反応物のすべてを含むが、化学的ライブラリーの要素を含まないブランクウェルを、通常包含させる。他の例として、モジュレーターを求める受容体の既知のモジュレーター（またはアクチベーター）を、アッセイの１つの試料と共にインキュベートし、受容体活性の得られた減少（または増大）を、本明細書中の方法に従って決定することができる。モジュレーターをまた、受容体アクチベーターまたはモジュレーターと組み合わせて、他の方法で既知の受容体モジュレーターの存在により生じる受容体活性化または抑圧を阻害するモジュレーターを見出すことができることが、理解される。同様に、スフィンゴ脂質標的に対するリガンドを求める場合には、標的の既知のリガンドは、コントロール／較正アッセイウェル中に存在し得る。
【０１５５】
スクリーニングアッセイの間の結合反応の測定
マルチコンテナキャリヤー中での結合反応の進行を測定するための手法は、当該分野において知られており、これには、以下のものが含まれるが、これらには限定されない。
【０１５６】
分光光度アッセイおよび蛍光分光アッセイは、当該分野において周知である。このようなアッセイの例には、過酸化物を検出するための比色分析を用いることが含まれ、これは、例１（ｂ）並びにGordon，A．J.およびFord，R．A.，The  Chemist's  Companion：A  Handbook  Of  Practical  Data，Techniques，And  References，John  Wiley  and  Sons，N.Y.，1972，437頁に開示されているとおりである。
【０１５７】
蛍光分光分析法を用いて、反応生成物の発生をモニタリングすることができる。蛍光的手順は、一般的に、吸収的手順よりも感受性が高い。蛍光プローブを用いることは、当業者に周知である。概説については、Bashfordら、Spectrophotometry  and  Spectrofiuorometry：A  Practical  Approach，91〜114頁、IRL  Press  Ltd．（1987）；およびBell，Spectroscopy  In  Biochemistry，Vol．I、155〜194頁、CRC  Press（1981）を参照。
【０１５８】
蛍光分光的方法において、受容体は、標的受容体により処理されると内部蛍光が変化する基質に曝露される。典型的には、当該基質は、非蛍光性であり、１または２以上の反応によりフルオロフォアに変換される。非限定的例として、SMase活性を、Amplex.RTM．Red試薬（Molecular  Probes，Eugene，Oreg.）を用いて検出することができる。Amplex  Redを用いてスフィンゴミエリナーゼ活性を測定するために、以下の反応が起こる。先ず、SMaseは、スフィンゴミエリンを加水分解して、セラミドおよびホスホリルコリンを生じる。第２に、アルカリホスファターゼは、ホスホリルコリンを加水分解して、コリンを生じる。第３に、コリンは、コリンオキシダーゼにより酸化されて、ベタインとなる。最後に、Ｈ２Ｏ２は、セイヨウワサビペルオキシダーゼの存在下で、Amplex  Redと反応して、蛍光性生成物であるレゾルフィンを生成し、これからのシグナルは、蛍光分光法を用いて検出される。
【０１５９】
蛍光偏光（ＦＰ）は、より大きい分子、例えば受容体タンパク質に結合することにより生じるフルオロフォアの分子回転の速度の低下に基づいており、結合したリガンドによる偏向された蛍光発光を可能にする。ＦＰは、平面偏光での励起に続くフルオロフォア発光の垂直成分および水平成分を測定することにより、実験的に決定される。偏向された発光は、フルオロフォアの分子回転が低下する際に増大する。フルオロフォアは、より大きい分子（例えば受容体）に結合してフルオロフォアの分子回転を低下させる際に、より大きい偏光シグナルを発生する。偏向シグナルの規模は、蛍光リガンド結合の程度に定量的に関連する。したがって、「結合した」シグナルの偏向は、高アフィニティー結合の維持に依存する。
【０１６０】
ＦＰは、ホモジーニアスな技術であり、反応は極めて迅速であり、平衡に達するのに数秒ないし数分を要する。試薬は安定であり、大きいバッチを調製して、高い再現性を得ることができる。これらの特性のために、ＦＰは、高度に自動化可能であることが明らかとなっており、しばしば、単一の予め混合したトレーサー−受容体試薬との１回のインキュベーションにより行われる。概説については、Owickiら、Application  of  Fluorescence  Polarization  Assays  in  High-Throughput  Screening，Genetic  Engineering  News，17:27，1997を参照。
【０１６１】
ＦＰは、その読み取りが発光強度とは独立しており（Checovich，W．J.ら、Nature  375:254-256，1995；Dandliker，W．B.ら、Methods  in  Enzymology  74:3-28，1981）、したがって蛍光発光を消光する着色された化合物の存在に対して非感受性であるので、特に望ましく。蛍光偏光（ＦＰ）およびＦＲＥＴ（以下を参照）は、スフィンゴ脂質受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断する化合物を同定するのに、良好に適合している。例えば、Parkerら、Development  of  high  throughput  screening  assays  using  fluorescence  polarization：nuclear  receptor-ligand-binding  and  kinase/phosphatase  assays，J  Biomol  Screen  5:77-88，2000を参照。
【０１６２】
ＦＰアッセイにおいて用いることができる、スフィンゴ脂質から誘導されたフルオロフォアは、市販で入手できる。例えば、Molecular  Probes（Eugune，Oreg.）は現在、スフィンゴミエリンおよび１種のセラミドフルオロフォアを販売している。これらは、それぞれ、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシルホスホコリン（BODIPY.RTM.FL  Ｃ５−スフィンゴミエリン）；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン（BODIPY.RTM.FL  Ｃ１２−スフィンゴミエリン）；およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシン（BODIPY.RTM.FL  Ｃ５−セラミド）である。米国特許第4,150,949号（Immunoassay  for  gentamicin）には、フルオレセインチオカルバニルゲンタマイシンを含むフルオレセインで標識ゲンタマイシンが開示されている。さらなるフルオロフォアは、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。
【０１６３】
例示的な正常および偏光（normal-and-polarized）蛍光リーダーとして、POLARION蛍光偏光システム（Tecan  A  G，Hombrechtikon，Switzerland）が挙げられる。他のアッセイ用の一般的なマルチウェルプレートリーダー、例えばVERSAMAXリーダーおよびSPECTRAMAXマルチウェルプレート分光光度計（共にMolecular  Devicesから）が、入手可能である。
【０１６４】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、相互作用を検出するための他の有用なアッセイであり、以前に記載されている。例えば、Heimら、Curr．Biol．6:178-182，1-996；Mitraら、Gene  173:13-17  1996；およびSelvinら、Meth．Enzymol．246:300-345，1995を参照。ＦＲＥＴは、既知の励起および発光波長を有する２種の極めて近接した蛍光物質の間のエネルギーの転移をして検出する。例として、タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質として発現することができる。２種の蛍光タンパク質が近接する場合、例えばタンパク質が標的分子と特異的に相互作用する場合には、共鳴エネルギーを、１つの励起された分子から他の分子に転移させることができる。この結果、試料の発光スペクトルはシフトし、これを、蛍光光度計、例えばｆＭＡＸマルチウェル蛍光光度計（Molecular  Devices，Sunnyvale  Calif.）により測定することができる。
【０１６５】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は、標的分子との相互作用を検出するために特に有用なアッセイである。ＳＰＡは、製薬において広く用いられており、既に記載されている（Hanselmanら、J．Lipid  Res．38:2365-2373（1997）；Kahlら、Anal．Biochem．243:282-283（1996）；Undenfriendら、Anal．Biochem．161:494-500（1987））。また米国特許第4,626,513号および4,568,649号、並びに欧州特許第0,154,734号をも参照。１種の市販で入手できるシステムは、FLASHPLATEシンチラント（scintillant）で被覆されたプレート（NEN  Life  Science  Products，Boston，Mass.）を用いる。
【０１６６】
標的分子を、シンチレータープレートに、種々の十分知られている手段により結合させることができる。融合タンパク質、例えばＧＳＴ、Ｈｉｓ６またはＦｌａｇ融合タンパク質に結合するように誘導体化されたシンチラントプレートが、入手可能である。標的分子がタンパク質複合体またはマルチマーである場合には、１種のタンパク質またはサブユニットを、先ずプレートに付着させ、次に複合体の他方の成分を、後に結合条件下で加え、結合した複合体を得ることができる。
【０１６７】
典型的なＳＰＡアッセイにおいて、発現プール中の遺伝子産物は、放射標識されてウェル中に加えられ、固相と相互作用させられる。固相は、ウェル中の固定化された標的分子およびシンチラント被膜である。
【０１６８】
アッセイを、直ちに測定するか、または平衡に到達させることができる。いずれの方法においても、放射標識がシンチラント被膜に十分近くなる場合には、これは、TOPCOUNT  NXTマイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard  BioScience  Co.，Meriden  Conn.）などの装置により検出可能なシグナルを生じる。放射標識した発現産物が標的分子に結合する場合には、放射標識は、検出可能なシグナルを発生するのに十分長くシンチラントに近接したままである。
【０１６９】
対照的に、標的分子に結合しないか、または短時間結合するに過ぎない標識タンパク質は、バックグラウンドより高いシグナルを発生するのに十分長くシンチラント付近に残留しない。また、ランダムなブラウン運動によりシンチラント付近に滞在したすべての時間も、顕著な量のシグナルをもたらさない。同様に、発現段階の間用いられた残りの組み込まれていない放射標識が存在し得るが、これは、標的分子と相互作用するよりはむしろ溶液中にあるため、顕著なシグナルを発生しない。したがって、これらの非結合性相互作用により、数学的に除去され得るあるレベルのバックグラウンドシグナルが生じる。過度に多くのシグナルが得られる場合には、塩または他の調節剤を、所望の特異性が得られるまでアッセイプレートに直接加えることができる（Nicholsら、Anal．Biochem．257:112-119，1998）。
【０１７０】
１つの態様において、タンパク質ファミリーメンバーを、リガンド結合アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイを用いて検出／定量する。簡単に述べると、タンパク質ファミリーメンバーを発現する組織からの試料を、インキュベーション期間にわたってリガンドの飽和濃度をもたらすように設計された条件の下で、好適なリガンドと共にインキュベートする。リガンド処理の後、試料を、放射性リガンド結合についてアッセイする。タンパク質ファミリーメンバーに結合するすべてのリガンドを、当該アッセイにおいて用いることができる。上記のタンパク質ファミリーメンバーモジュレーターのすべてを、例えばこのアッセイにおいて標識し、用いることができる。この目的のための例示的な好ましいリガンドは、１２５Ｉ−オメガ−コノトキシンＧＶＩＡである。このリガンドの細胞への結合を、例えばSolemら（1997）、J．Pharmacol．Exp．Ther．282:1487-95に記載されているようにアッセイすることができる。膜（例えば脳膜）への結合を、Wagnerら（1995）、J．Neurosci．8:3354-3359の方法に従ってアッセイすることができる（また、McMahonら（2000）、Mol．Pharm．57:53-58に記載されているこの方法の改変をも参照）。
【０１７１】
電気泳動手法を用いてポリペプチドを検出する手段は、当業者に周知である（一般的に、R．Scopes（1982）polypeptide  Purification，Springer-Verlag，N．Y.；Deutscher，（1990）Methods  in  Enzymology  Vol．182：Guide  to  polypeptide  Purification，Academic  Press，Inc.，N．Y.を参照）。
【０１７２】
この態様の変形は、ウエスタンブロット（免疫ブロット）分析を用いて、試料中のＬＩＧＨＴ経路ポリペプチド（１または２以上）の存在を検出および定量することである。この技術は、一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動により試料ポリペプチドを分離し、分離されたポリペプチドを好適な固体支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に移し、当該支持体を、標的ポリペプチド（１または２以上）に特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることを含む。標的ポリペプチド（１または２以上）に特異的に結合する抗体を、直接標識してもよく、あるいはまた一次抗体のドメインに特異的に結合する標識した抗体（例えば標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて、後に検出してもよい。
【０１７３】
ある態様において、ＬＩＧＨＴ経路ポリペプチド（１または２以上）を、多数の周知のイムノアッセイのいずれかを用いて、生体試料において検出および／または定量する（例えば、米国特許第4,366,241号；4,376,110号；4,517,288号；および4,837,168号を参照）。イムノアッセイの一般的概説については、Methods  in  Cell  Biology、第３７巻：Antibodies  in  Cell  Biology，Asai編、Academic  Press，Inc．New  York（1993）；Basic  and  Clinical  Immunology、第７版、StitesおよびTerr編（1991）をも参照。
【０１７４】
本発明において用いるのに適する検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能なすべての部分または組成物を含む。例には、標識されたストレプトアビジン複合体で染色するためのビオチン、電磁ビーズ（例えばDynabeads（登録商標））、蛍光染料（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、クマリン、オキサジン、緑色蛍光タンパク質など、例えばMolecular  Probes，Eugene，Oreg.，USAを参照）、放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、受容体（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられる他のもの）、並びに比色標識、例えば金コロイド（例えば４０〜８０ｎｍの直径の大きさの範囲の金粒子は、高い効率で緑色光を発散する）または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが含まれる。このような標識の使用を教示している特許明細書には、米国特許第3,817,837号；3,850,752号；3,939,350号；3,996,345号；4,277,437号；4,275,149号；および4,366,241号が含まれる。
【０１７５】
本発明のアッセイを、当業者に周知の標準的な方法に従って記録する（正の、または負の、または標的ポリペプチドの量として）。記録の特定の方法は、アッセイの構成および標識の選択に依存する。例えば、ウエスタンブロットアッセイを、酵素的標識により生成した着色生成物を視覚化することにより、記録することができる。正確な分子量における明瞭に視覚可能な着色されたバンドまたはスポットを、正の結果として記録し、一方明瞭に視覚可能なスポットまたはバンドが存在しないことを、負として記録する。バンドまたはスポットの強度により、標的のポリペプチド濃度の定量的な基準が得られ得る。
【０１７６】
好ましい態様において、本発明のイムノアッセイを、MicroElectroMechanical  System（ＭＥＭＳ）を用いて行う。ＭＥＭＳは、ケイ素上に組み込まれた顕微鏡的構造体であり、これは、機械的、光学的および流体的要素を電子機器と組み合わせて、目的の検体の好都合な検出が可能になっている。本発明において用いるのに適する例示的なＭＥＭＳ装置は、Protiverisのマルチカンチレバー（multicantilever）アレイである。このアレイは、特別に設計されたケイ素マイクロカンチレバーの化学機械的（chemo-mechanical）作動およびその後のマイクロカンチレバー偏差の光学的検出に基づいている。一方の側をタンパク質、抗体、抗原またはＤＮＡフラグメントで被覆した場合、マイクロカンチレバーは、相補的分子を含む溶液に曝露された際に湾曲する。この湾曲は、結合事象による表面エネルギーの変化により生じる。湾曲（偏向）の程度の光学的な検出により、マイクロカンチレバーに結合した相補的分子の量の測定が可能になる。
【０１７７】
タンパク質ファミリーメンバーのサブユニット発現レベルの変化を、ｍＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡから誘導されたポリヌクレオチド（例えば逆転写されたｃＤＮＡなど）のレベルの変化を測定することにより、検出することができる。
【０１７８】
ポリヌクレオチドを、当業者に周知の多数の方法のいずれかに従って、試料から調製することができる。ポリヌクレオチドの単離および精製のための一般的な方法は、Tijssen編（1993）、Laboratory  Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology：Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes，Part  I．Theory  and  Nucleic  Acid  Preparation，Elsevier，N.Y.の第三章、およびTijssen編により詳細に記載されている。
【０１７９】
１つの態様において、増幅に基づくアッセイを用いて、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出し、随意に定量することができる。このような増幅に基づくアッセイにおいて、試料中のｍＲＮＡは、検出可能な標識または標識システムの成分を含む核酸プライマーを用いて行う増幅反応において、鋳型（１または２以上）として作用する。好適な増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（WuおよびWallace（1989）、Genomics  4：560、Landegrenら（1988）、Science  241：1077、並びにBarringerら（1990）、Gene  89：117を参照）；転写増幅（Kwohら（1989）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  86：1173）、自立配列複製（Guatelliら（1990）、Proc．Nat．Acad．Sci．USA  87：1874）；ドットＰＣＲ、並びにリンカーアダプターＰＣＲなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１８０】
ＬＩＧＨＴ経路ｍＲＮＡのレベルを決定するために、多数の周知の「定量的な」増幅方法のいずれかを、用いることができる。定量的ＰＣＲは、一般的に、同一のプライマーを用いて既知の量のコントロール配列を同時に同時増幅する（co-amplify）ことを含む。これにより、ＰＣＲ反応を較正するために用いることができる内部標準が得られる。定量的ＰＣＲについての詳細な原理は、PCR  Protocols，A  Guide  to  Methods  and  Applications，Innisら、Academic  Press，Inc．N．Y.，（1990）に示されている。ハイブリダイゼーション手法は、一般的にHamesおよびHiggins（1985）、Nucleic  Acid  Hybridization，A  Practical  Approach，IRL  Press；GallおよびPardue（1969）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  63：378-383；並びにJohnら（1969）、Nature  223：582-587に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、例えば、Tijssen  （1993）、Laboratory  Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology，第２４巻：Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes，Elsevier，N．Y.に記載されている。
【０１８１】
ＬＩＧＨＴ経路ｍＲＮＡを検出するために本発明において用いる核酸プローブは、これらのポリヌクレオチドの全長または全長未満であり得る。比較的短いプローブは、一般的に特異性について実験的に試験される。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも約１５塩基、および一層好ましくは約２０塩基またはこれ以上の長さである。（核酸ハイブリダイゼーションにおいて用いるための核酸プローブ配列を選択する方法については、Sambrookらを参照。）ハイブリダイズしたプローブの視覚化により、目的のＬＩＧＨＴ経路ｍＲＮＡの存在または不在の定量的決定が可能になり、標準的な方法（例えば核酸プローブを放射活性物質で標識する濃度測定）を用いて、ＬＩＧＨＴ経路ポリヌクレオチドのレベルを定量することができる。種々のさらなる核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に知られている。標準的な形式には、サンドイッチアッセイおよび競合または置換アッセイが含まれる。サンドイッチアッセイは、ポリヌクレオチドを検出または単離するための商業的に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。
【０１８２】
１つの態様において、本発明の方法を、アレイに基づくハイブリダイゼーション形式において用いることができる。アレイ形式において、多数の種々のハイブリダイゼーション反応を、本質的に「平行して」行うことができる。これにより、多数のハイブリダイゼーションを単一の実験において迅速に、本質的に同時に評価することが得られる。アレイに基づく形式においてハイブリダイゼーション反応を行う方法は、当業者に周知の（例えばPastinen（1997）、Genome  Res．7：606-614；Jackson（1996）、Nature  Biotechnology  14:1685；Chee（1995）、Science  274：610；WO  96/17958，Pinkelら（1998）、Nature  Genetics  20：207-211を参照）。また、例えば米国特許第5,807,522号を参照。これには、表面に対してマイクロキャピラリーを開拓して小さい容積の生体試料を正確に配置する自動化されたシステムを用いることが、記載されている。このプロセスを繰り返して、高密度アレイを作製する。また、オリゴヌクレオチド合成技術を用いてアレイを作製することができる。したがって、例えば、米国特許第5,143,854号並びにＰＣＴ特許公開WO  90/15070および92/10092には、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイの光に向けられたコンビナトリアル合成を用いることが、教示されている。高密度アレイの合成はまた、米国特許第5,744,305号；5,800,992号；および5,445,934号に記載されている。
【０１８３】
核酸を種々の固体表面上に固定化するための多くの方法が、当該分野において知られている。広範囲の有機および無機ポリマー、並びに天然物質と合成物質との両方の他の物質を、固体表面のための材料として用いることができる。例示的な固体表面には、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロースおよび酢酸セルロースが含まれる。さらに、プラスチック、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどを用いることができる。用いることができる他の材料には、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料などが含まれる。さらに、ゲルを形成する物質を用いることができる。このような物質には、例えば、タンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミド類が含まれる。固体表面が多孔質である場合には、種々の孔の大きさを、システムの性質に依存して用いることができる。
【０１８４】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイをまた、MicroElectroMechanical  System  （ＭＥＭＳ）、例えばProtiverisのマルチカンチレバーアレイを用いて行うことができる。
【０１８５】
ＬＩＧＨＴ経路ＲＮＡを、上記のポリヌクレオチドに基づくアッセイにおいて、検出可能な標識により検出する。上記の標識はすべて、本発明のポリヌクレオチドに基づくアッセイにおいて用いることができる。当該標識を、ハイブリダイゼーションまたは増幅の前または後に、プローブまたはプライマーまたは試料ポリヌクレオチドに加えてもよい。いわゆる「直接的な標識」は、アッセイを行う前に標識したポリヌクレオチドに直接付着しているか、またはこの中に導入されている検出可能な標識である。対照的に、いわゆる「間接的な標識」は、ハイブリダイゼーションの後にハイブリッドの二本鎖に連結される。間接的な標識において、混成の二本鎖中のポリヌクレオチドの１つは、検出可能な標識が結合する成分を担持する。
【０１８６】
したがって、例えば、プローブまたはプライマーを、ハイブリダイゼーションの前にビオチン標識してもよい。ハイブリダイゼーションの後に、アビジン結合フルオロフォアは、ビオチンを有するハイブリッドの二本鎖に結合して、容易に検出される標識を提供することができる。ポリヌクレオチドの標識および検出の方法の詳細な概説については、Laboratory  Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology，第２４巻：Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes，P．Tijssen編、Elsevier，N．Y.，（1993）を参照。
【０１８７】
ハイブリダイゼーションアッセイの感受性を、検出される標的のポリヌクレオチドを増殖させるポリヌクレオチド増幅システムを用いることにより、増強することができる。このようなシステムの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）システムが含まれる。当該分野において最近記載されている他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBAO，Cangene，Mississauga，Ontario）およびＱβレプリカーゼシステムである。
【０１８８】
一般的に多数の試験剤のスクリーニングを伴う好ましい態様において、スクリーニング方法は、上記のプレスクリーニングまたは炎症を調節し得る剤のデータベースにおけるスクリーニング方法のいずれかにおいて選択されたすべての試験剤の記録を含む。用語「データベース」は、情報を記録し、検索するための手段を表す。好ましい態様において、データベースはまた、蓄積された情報を分類および／または探索するための手段を提供する。データベースは、すべての好都合な媒体を用いることができ、これには、紙システム、カードシステム、機械的システム、電子的システム、光学的システム、磁気的システムまたはこれらの組み合わせが含まれるが、これらには限定されない。好ましいデータベースには、電子的（例えばコンピューターを利用する）データベースが含まれる。データベースの貯蔵および操作において用いるためのコンピューターシステムは、当業者に十分知られており、これには、「パーソナルコンピューターシステム」、メインフレームシステム、インターネットおよびイントラネットにおける分散ノード、特定のハードウエア（例えばマイクロチップ）中に蓄積されたデータまたはデータベースなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１８９】
スクリーニングにより同定される試験剤
試験剤が、１または２以上のＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーまたはＲＮＡを調節することが見出された場合。本発明の好ましいスクリーニング方法はさらに、試験剤を、担体、好ましくは上記のような薬学的に許容し得る担体と混ぜ合わせることを含む。一般的に、試験剤の濃度は、タンパク質ファミリーメンバーもしくはＲＮＡまたは炎症のレベルを変化させるのに十分なものである。この濃度は、特定の試験剤および組成物が意図される特定の用途に依存して変化する。当業者が理解するように、担体を有する試験剤の配合に影響する考慮事項は、一般的に薬剤に関連する効果また挙動を低減する方法に関して、上記と同一である。
【０１９０】
好ましい態様において、試験剤を動物に投与して、選択された試験剤が対象における薬剤に関連する効果または挙動を調節する能力を測定し、これは以下に一層詳細に記載する通りである。
【０１９１】
本発明の治療方法において用いるための好ましい組成物は、例えば以下に記載する化合物の状態分析手法または調節分析結果に基づいて、細胞の炎症の阻害または開始の、約５％、より好ましくは約７．５％または１０％の、なおさらに好ましくは、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の炎症の開始または阻害で、タンパク質ファミリーメンバーの機能を阻害する。
【０１９２】
組成物
ＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーから誘導された可溶性ポリペプチド、またはＬＩＧＨＴとＬＴβＲとの間の相互作用を遮断する能力を有する他のタンパク質が、有用である。さらに、このような残基の改変により、当業者は、ポリペプチドの結合特異性および／または親和性を調整することが可能になり得る。
【０１９３】
ＬＩＧＨＴ経路タンパク質ファミリーメンバーは、これらが疾患の処置、防止、改善、軽減または緩和において関心を持たれているため、特に重要である。
【０１９４】
ポリペプチドを、例えば、受容体を含む細胞または細胞膜調製物のタンパク質分解による消化（Bartfeldら、Active  acetylcholine  receptor  fragment  obtained  by  tryptic  digestion  of  acetylcholine  receptor  from  Torpedo  californica，Biochem  Biophys  Res  Commun．89:512-9，1979；Borhaniら、Crystallization  and  X-ray  diffraction  studies  of  a  soluble  form  of  the  human  transferrin  receptor，J  Mol．Biol.218:685-9，1991）、組換えＤＮＡ手法（Marlovitsら、Recombinant  soluble  low-density  lipoprotein  receptor  fragment  inhibits  common  cold  infection，J  Mol  Recognit．11:49-51，1998；Huangら、Expression  of  a  human  thyrotrophin  receptor  fragment  in  Escherichia  coli  and  its  interaction  with  the  hormone  and  autoantibodies  from  subjects  with  Graves’disease，J  Mol  Endocrinol．8:137-44，1992）を含む分子生物学的手法を含む多様な方法で調製しても、またはオリゴペプチドのインビトロ合成により調製してもよい。
【０１９５】
ペプチド模倣薬
一般的に、ポリペプチド模倣薬（「ペプチド模倣薬」）は、ポリペプチドの生物活性を模倣するが、化学的性質においてペプチド性ではない分子である。一方、特定の態様において、ペプチド模倣薬は、ペプチド結合（即ち、アミノ酸間のアミド結合）を含まない分子であり、ペプチド模倣薬の用語は、特徴が完全にはペプチド性ではない分子、例えば擬ペプチド、半ペプチド（semi-peptide）およびペプトイドを含み得る。一層広い定義による（例えば、ポリペプチドの一部が、ペプチド結合を有しない構造により置換されている場合）数種のペプチド模倣薬の例を、以下に記載する。特徴が完全に非ペプチド性であるか、部分的に非ペプチド性であるかにかかわらず、本発明のペプチド模倣薬は、ポリペプチド中の活性基の三次元配置に近似の反応性化学的部分の空間的配置を提供し得る。この類似する活性部位の形状の結果、ペプチド模倣薬は、ポリペプチドの生物活性に類似する生物学的効果を示し得る。
【０１９６】
ポリペプチド自体ではなく所与のポリペプチドの模倣物を用いることについて、いくつかの利点があり得る。例えば、ポリペプチドは、２つの望ましくない特質、即ち乏しいバイオアベイラビリティおよび短い作用持続時間を示し得る。ペプチド模倣薬はしばしば、経口で活性でありかつ作用の長い継続時間を有するのに十分小さい。また、ポリペプチドについての安定性、貯蔵および免疫反応性に関する問題には、ペプチド模倣薬を用いて未然に防ぐことができるものもある。
【０１９７】
所望の生物活性を有する候補ポリペプチド、リードポリペプチド、および他のポリペプチドを、同様の生物活性を有するペプチド模倣薬の開発において用いることができる。ポリペプチドからペプチド模倣薬を開発する技術は、公知である。ペプチド結合を、ペプチド模倣薬が元のポリペプチドに類似する構造をとることを可能にし、したがって類似する生物活性をとることを可能にする非ペプチド結合により、置換することができる。また、アミノ酸の化学基を同様の構造、形状または反応性を有する他の化学基で置換することにより、さらなる改変を行うことができる。ペプチド模倣薬の開発を、ＮＭＲ分光法、結晶学的方法および／またはコンピューターにより補助された分子モデリングにより、遊離であるかまたはリガンドに結合した元のポリペプチドの三次構造を決定することにより、補助することができる。これらの手法は、元のポリペプチドよりも高い効能および／または高いバイオアベイラビリティおよび／または高い安定性を有する新規の組成物の開発を補助する（Dean（1994）、BioEssays，16：683-687；CohenおよびShatzmiller（1993）、J．Mol．Graph.，11：166-173；WileyおよびRich（1993）、Med．Res．Rev.，13：327-384；Moore（1994）、Trends  Pharmacol．Sci.，15：124-129；Hruby  （1993）、Biopolymers，33：1073-1082；Buggら（1993）、Sci．Am.，269：92-98、すべて本明細書において参考として援用する）。
【０１９８】
ペプチド模倣薬の具体例を、以下に述べる。これらの例は、例示的であり、他の、またはさらなる改変の観点において限定するものではない。
【０１９９】
還元型（reduced）アイソスター擬ペプチド結合を有するペプチド
プロテアーゼは、ペプチド結合に対して作用する。擬ペプチド結合によるペプチド結合の置換により、タンパク質分解に対する耐性が付与されるか、あるいは化合物が比較的不安定ではなくなる。多数の擬ペプチド結合が、一般的にポリペプチド構造および生物活性に影響しないことが記載されている。還元型アイソスター擬ペプチド結合は、生物活性を全くまたはほとんど損失せずに酵素切断に対する安定性を増強することが知られている好適な擬ペプチド結合である（Couderら（1993）、Int．J．polypeptide  Protein  Res．41:181-184、本明細書において参考として援用される）。したがって、これらの化合物のアミノ酸配列は、ペプチド結合の１または２以上がアイソスター擬ペプチド結合により置換されている以外は、これらの親のＬ−アミノ酸ポリペプチドの配列と同一であり得る。好ましくは、最Ｎ末端のペプチド結合が置換されている。その理由は、このような置換により、Ｎ末端に対して作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性が付与されるからである。
【０２００】
レトロインベルソ（retro-inverso）擬ペプチド結合を有するペプチド
タンパク質分解に対する耐性を付与するために、ペプチド結合をまた、レトロインベルソ擬ペプチド結合により置換してもよい（Dalpozzoら（1993）、Int．J．polypeptide  Protein  Res．41:561-566、本明細書において参考として援用する）。この改変により、化合物のアミノ酸配列は、ペプチド結合の１または２以上がレトロインベルソ擬ペプチド結合により置換されている以外は、これらのＬ−アミノ酸親ポリペプチドの配列と同一であり得る。好ましくは、最Ｎ末端のペプチド結合が置換されている。その理由は、このような置換により、Ｎ末端に対して作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性が付与されるからである。
【０２０１】
ペプトイド誘導体
ポリペプチドのペプトイド誘導体は、改変ポリペプチドの他の形態を表し、生物活性についての構造的決定要因を保持するが、ペプチド結合を解消し、これによりタンパク質分解に対する耐性を得る（Simonら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:9367-9371、参照により本明細書中に導入する）。ペプトイドは、Ｎ置換されているグリシンのオリゴマーである。多数のＮ−アルキル基が記載されており、各々は、天然のアミノ酸の側鎖に相当する。
【０２０２】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、類似体および他の改変されたバリアントを含めて、一般的に既知の手法に従って調製することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドの合成的製造は、固相合成方法によるものであり得る。例えば、固相合成は、十分理解されており、ポリペプチドの製造のための一般的な方法であり、当該手法の多様な改変もまた同様である[Merrifield（1964）、J．Am．Chem．Soc，85：2149；StewartおよびYoung（1984），Solid  Phase  polypeptide  Synthesis，Pierce  Chemical  Company，Rockford，Ill.；BodanskyおよびBodanszky（1984）、The  Practice  of  polypeptide  Synthesis，Springer-Verlag，New  York；AthertonおよびSheppard（1989）、Solid  Phase  polypeptide  Synthesis：A  Practical  Approach，IRL  Press，New  York]。
【０２０３】
あるいはまた、本発明のポリペプチドを、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いた組換え系において、調製することができる。例えば、融合タンパク質を、典型的には組換えＤＮＡ技術を用いて調製する。
【０２０４】
ポリペプチド誘導体
ポリペプチドの「誘導体」は、定義によりポリペプチドではない、即ち、少なくとも１つのペプチド結合ではない化学結合を含む化合物である。したがって、ポリペプチド誘導体は、限定されずに、グリコシル化などの翻訳後修飾を必然的に受けるタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、１つより多い以下の改変を同一のポリペプチド内に含み得ることが、理解される。好ましいポリペプチド誘導体は、望ましい特質を保持し、これは、生物活性であり得る；より好ましくは、ポリペプチド誘導体は、１または２以上の望ましい特質に関して増強されるか、または基本ポリペプチドにおいては見出されない１もしくは２以上の望ましい特質を有する。
【０２０５】
変異体ポリペプチド：天然の供給源から調製されたタンパク質中に見出されるものと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、「野性型の」ポリペプチドである。変異体オリゴペプチドを、限定されずにコンビナトリアル合成を含む化学的合成により、調製することができる。
【０２０６】
オリゴペプチドよりも大きい変異体ポリペプチドを、ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を改変することによる組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。ヌクレオチド配列中のいくつかの改変は、これによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を改変しないこともあるが（「沈黙」突然変異）、多くは、基本配列に対して改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生じる。このような改変アミノ酸配列は、このようなアミノ酸が天然に存在するアミノ酸であるという条件で、アミノ酸の置換、欠失および付加を含み得る。
【０２０７】
したがって、ポリペプチドをコードする核酸を変異誘発の対象とすることは、変異体ポリペプチド、特にアミノ酸の置換を有するが欠失または挿入を有しないものを作成するために用いることができる１つの手法である。インビトロまたはインビボで用いることができる種々の変異誘発手法が知られており、かかる手法として、化学的変異誘発およびＰＣＲにより媒介される変異誘発が挙げられるがこれらに限定されない。このような変異誘発は、ランダムに標的化される（即ち、突然変異が核酸内のどこで発生してもよい）か、または特に重要なアミノ酸の伸長物をコードする核酸の区域に指向されてもよい。このような手法を用いて、ランダム化されているか、コンビナトリアルであるか、または集中的な、化合物ライブラリー、プールおよび混合物を作成することが可能である。
【０２０８】
天然に存在するアミノ酸の欠失もしくは挿入を有するポリペプチドは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づくが親ポリペプチドの配列に対して挿入されたかまたは欠失した１または２以上のアミノ酸を有するアミノ酸配列の化学的合成から得られる合成のオリゴペプチドであり得る。比較的長いアミノ酸配列を有するポリペプチド中のアミノ酸残基の挿入および欠失は、方向付けられた変異誘発により生じさせることができる。
【０２０９】
化学的に修飾されたポリペプチド：本発明が意図するように、用語「ポリペプチド」は、他のポリペプチドに対して１または２以上の化学的修飾を有するもの、即ち化学的に修飾されたポリペプチドを含む。化学的に修飾されたポリペプチドが誘導されるポリペプチドは、野性型のタンパク質、変異体タンパク質もしくは変異体ポリペプチド、またはそれらのポリペプチドフラグメント、抗体または他のポリペプチドリガンドであり得、限定されずに、本発明による一本鎖抗体、細菌タンパク質およびこのポリペプチド誘導体、またはその開示に従って作製されたポリペプチドリガンドを含む。好ましくは、化学的修飾（１または２以上）は、ポリペプチドの望ましい特質を付与または改善するが、この生物活性を実質的に変化するかまたは損なわない。望ましい特質には、有効期間の延長；血清または他のインビボでの安定性の増大；プロテアーゼに対する耐性；などが含まれるが、これらには限定されない。このような修飾は、例としてＮ末端アセチル化、グリコシル化およびビオチニル化を含むがこれらに限定されない。
【０２１０】
Ｎ末端またはＣ末端化学基を有するポリペプチド：ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端残基において作用するペプチダーゼに対する耐性を付与するための有効な方法は、化学基をポリペプチド末端において付加して、修飾されたポリペプチドがもはやペプチダーゼのための基質ではないようにすることである。１つのこのような化学的修飾は、いずれかのまたは両方の末端におけるポリペプチドのグリコシル化である。特定の化学的修飾、特にＮ末端グリコシル化は、ヒト血清中でのポリペプチドの安定性を増大させることが示されている（Powellら（1993）、Pharma．Res．10：1268-1273）。血清中での安定性を増大させる他の化学的修飾には、アセチル基などの１〜２０個の炭素を有する低級アルキルからなるＮ末端アルキル基の付加、および／またはＣ末端アミドもしくは置換アミド基の付加が含まれるが、これらには限定されない。
【０２１１】
末端Ｄ−アミノ酸を有するポリペプチド：Ｎ末端Ｄ−アミノ酸の存在により、他の方法ではＬ−アミノ酸を含むポリペプチドの血清安定性が増大する。その理由は、Ｎ末端残基に対して作用するエキソペプチダーゼが、基質としてＤ−アミノ酸を利用することができないからである。同様に、Ｃ末端Ｄ−アミノ酸の存在はまた、ポリペプチドを安定化する。その理由は、Ｃ末端残基に対して作用する血清エキソペプチダーゼが、基質としてＤ−アミノ酸を利用することができないからである。これらの末端修飾を例外として、Ｎ末端および／またはＣ末端Ｄ−アミノ酸を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、通常は親のＬ−アミノ酸ポリペプチドの配列と同一である。
【０２１２】
非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換を有するポリペプチド：ポリペプチドのサブシーケンス中での非天然アミノ酸での天然アミノ酸の置換により、生物活性を含む所望の特質が付与または増強され得る。このような置換により、例えば、Ｎ末端で作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性が付与され得る。非天然アミノ酸を有するポリペプチドの合成は、通常のものであり、当該分野において知られている（例えば、上記に引用したCollerら（1993）を参照）。
【０２１３】
翻訳後化学的修飾：異なる宿主細胞は、異なる翻訳後修飾機構を含み、これは、かかる修飾を必要とするアミノ酸配列が融合タンパク質中に存在する場合には、融合タンパク質の翻訳後修飾の特定の型を提供し得る。多数（約１００個）の翻訳後修飾が記載されており、そのいくつかを、本明細書中で議論する。当業者は、適切な宿主細胞を選択し、特定の型の修飾に必要なアミノ酸配列を含むタンパク質要素をコードするキメラ遺伝子を設計することができる。
【０２１４】
グリコシル化は、多くの真核生物のシステム中に存在する翻訳後化学的修飾の１つの型であり、タンパク質の活性、安定性、薬理遺伝学、免疫原性および／または抗原性に影響し得る。しかし、適切なグリコシル化機構を補充するためには、特定のアミノ酸がかかる部位に存在しなければならず、、すべての宿主細胞が、適切な分子機構を有するわけではない。サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリスは、グリコシル化されたタンパク質の産生をもたらし、昆虫細胞を用いる発現系も同様であるが、グリコシル化のパターンは、いずれの宿主細胞を用いて融合タンパク質を産生するかに依存して変化し得る。
【０２１５】
他のタイプの翻訳後修飾は、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒ残基の１または２以上の側鎖の遊離の水酸基のリン酸化である。プロテインキナーゼは、このような反応を触媒する。リン酸化は、しばしばアミノ酸残基の脱リン酸化を触媒する受容体であるプロテインホスファターゼの作用のために、可逆的である。
【０２１６】
アミノ末端残基の化学構造の差異は、異なる宿主細胞に起因し、これらは各々が、開始コドンによりコードされるメチオニン残基の異なる化学的種類を有し得、その結果、異なる化学的修飾を有するアミノ末端が得られる。
【０２１７】
例えば、細菌タンパク質の多くまたはほとんどが、メチオニンの修飾された形態、即ちＮ−ホルミル−メチオニン（ｆＭｃｔ）であるアミノ末端アミノ酸を用いて合成される。すべての細菌タンパク質が、ｆＭｅｔイニシエータアミノ酸を用いて合成されるという記述がしばしば行われるが；これは、大腸菌については真実であり得るが、最近の研究により、これは、他の細菌、例えばシュードモナス・エルジノーサの場合においては真実ではないことが示されている（Newtonら、J．Biol．Chem．274:22143-22146，1999）。いずれにしても、大腸菌においては、ｆＭｅｔのホルミル基は、通常翻訳の後に酵素により除去されて、アミノ末端メチオニン残基が得られるが、全ｆＭｅｔ残基は、時々除去される（Hershey，Chapter  40，"Protein  Synthesis"：Escherichia  Coli  and  Salmonella  Typhimurium中：Cellular  and  Molecular  Biology，Neidhardt，Frederick  C.，Editor  in  Chief，American  Society  for  Microbiology，Washington，D.C.，1987，第１巻、613〜647頁および当該文献中で引用された参考文献を参照）。このような翻訳後修飾を触媒する受容体（例えばホルミラーゼ（formylase））が欠失している大腸菌変異体は、アミノ末端ｆＭｅｔ残基を有するタンパク質を生成する（Guillonら、J．Bacteriol．174:4294-4301，1992）。
【０２１８】
真核生物において、開始メチオニン残基、または開始メチオニンが除去された場合には最後から２番目の残基のアセチル化は、典型的には、翻訳と同時または翻訳後に起こる。アセチル化反応は、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴｓ、別名Ｎ−アルファ−アセチルトランスフェラーゼ）により触媒され、他方開始メチオニン残基の除去は、メチオニンアミノペプチダーゼにより触媒される（概説については、Bradshawら、Trends  Biochem．Sci.23:263-267，1998；およびDriessenら、CRC  Crit．Rev．Biochem．18:281-325，1985を参照）。アミノ末端でアセチル化されたタンパク質は、「Ｎ−アセチル化」、「Ｎアルファアセチル化」または単に「アセチル化」されていると言われる。
【０２１９】
真核生物において起こる他の翻訳後プロセスは、カルボキシ末端のアルファ−アミド化である。概説については、Eipperら、Annu．Rev．Physiol．50:333-344，1988およびBradburyら、Lung  Cancer  14:239-251，1996を参照。約５０％の既知の内分泌および神経内分泌ペプチドホルモンは、アルファ−アミド化される（Trestonら、Cell  Growth  Differ．4:911-920，1993）。ほとんどの場合において、カルボキシアルファ−アミド化は、これらのペプチドホルモンを活性化するのに必要である。
【０２２０】
置換は、種々の天然に存在するかまたは非在来型アミノ酸残基でアミノ酸が置換されるアミノ酸の変化を包含する。このような置換を、「保存的」と分類することができ、この場合において、ペプチド中に含まれるアミノ酸残基は、同様の特徴を有する他の天然に存在するアミノ酸で、例えばＧｌｙからＡｌａに、ＡｓｐからＧｌｕに、ＡｓｎからＧｌｎに、またはＴｒｐからＴｙｒに置換される。可能な代替のアミノ酸には、セリンまたはトレオニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸またはカルボキシグルタミン酸、プロリンまたはヒドロキシプロリン、アルギニンまたはリシン、アスパラギンまたはヒスチジン、ヒスチジンまたはアスパラギン、チロシンまたはフェニルアラニンまたはトリプトファン、アスパラギン酸またはグルタミン酸、イソロイシンまたはロイシンまたはバリンが含まれる。
【０２２１】
数種の非在来型アミノ酸もまた、天然に存在するアミノ酸についての好適な代替物であり得ることを、理解するべきである。本発明が包含する置換はまた、「非保存的」であり得、ここでポリペプチド中に存在するアミノ酸残基は、異なる特性を有するアミノ酸、例えば異なる群からの天然に存在するアミノ酸で置換される（例えば、荷電された、または親水性の、または疎水性のアミノ酸が、アラニンで置換される）か、あるいはまた、ここで天然に存在するアミノ酸は、非在来型アミノ酸で置換される。付加は、１または２以上の天然に存在するか、または非在来型アミノ酸残基を付加することを包含する。欠失は、１または２以上のアミノ酸残基の欠失を包含する。
【０２２２】
当業者は、他のペプチドを同定することができ、これらの分子の相同体および相同分子種は、本発明の組成物および方法において有用であることを理解する。さらに、ペプチドのバリアントは、本発明の方法および組成物において有用である。
【０２２３】
当業者は、１または２以上の機能的活性を上記で同定した分子と共有するがアミノ酸または核酸配列において差異を有する分子が、本発明の組成物および方法において有用であることを理解する。例えば、好ましい態様において、ポリペプチドまたはこの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号１〜２に記載するポリペプチドまたはこのフラグメントもしくはバリアントと、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。
【０２２４】
配列間の相同性または配列同一性（当該用語を、本明細書中では同義に用いる）の計算を、以下のようにして行う。
【０２２５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を、最適な比較の目的のためにアラインメントさせる（例えば、最適なアラインメントのために、第１のおよび第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方においてギャップを導入してもよく、相同でない配列を、比較目的のために無視してもよい）。好ましい態様において、比較目的のためにアラインメントさせた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、尚一層好ましくは少なくとも６０％、また尚一層好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合には、当該分子は、当該位置において同一である（本明細書中で用いるアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列の間の％同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入することが必要であるギャップの数および各々のギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数である。
【０２２６】
配列の比較および２つの配列間の％同一性の決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい態様において、２つのアミノ酸配列間の％同一性を、BLOSUM  62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重量（gap  weight）および１、２、３、４、５または６の長さ重量（length  weight）を用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comにおいて入手できる）におけるＧＡＰプログラム中に導入されたNeedlemanら（1970，J．Mol．Biol．48:444-453）のアルゴリズムを用いて、決定する。尚他の好ましい態様において、２つのヌクレオチド配列の間の％同一性を、NWSgapdna.CMPマトリックス、並びに４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comにおいて入手できる）におけるＧＡＰプログラムを用いて、決定する。パラメーターの特に好ましい組（および実施者が分子が本発明の配列同一性または相同性の制限の範囲内にあるか否かを決定するためにいずれのパラメーターを適用するべきであるかについて不確実である場合に用いるべきであるもの）は、１２のギャップペナルティー（gap  penalty）、４のギャップ拡張ペナルティー（gap  extend  penalty）および５のフレームシフトギャップペナルティーを有するBLOSUM  62記録マトリックスである。
【０２２７】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の％同一性を、PAM120重量残基表（weight  residue  table）、１２のギャップ長さペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いる、ALIGNプログラム（バージョン２．０）中に導入されたMeyersら（1989，CABIOS，4:11-17）のアルゴリズムを用いて、決定することができる。
【０２２８】
本明細書中に記載した核酸およびタンパク質配列を、「クエリー配列」として用いて、周知のデータベースに対する検索を行って、例えば当業者が本発明の分子を作製するために用いることができる他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定することができる。このような探索を、Altschulら（1990，J．Mol．Biol．215:403-410）のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）を用いて、行うことができる。BLASTヌクレオチド探索を、NBLASTプログラム、score=100、wordlength=12を用いて行って、本発明の13245個の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質探索を、XBLASTプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて行って、本発明の13245個のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップを含むアラインメントを得るために、ギャップを含むBLASTを、Altschulら（1997，Nucl．Acids  Res．25:3389-3402）に記載されているように利用することができる。BLASTおよびギャップを含むBLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを、用いることができる。
【０２２９】
ベクター
本発明の他の局面は、上記のような本発明の融合分子をコードする核酸分子またはこの成分を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で用いる用語「ベクター」は、これが結合している他の核酸分子を移送することができる核酸分子を表す。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる、環状の二本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの他のタイプは、ウイルスベクターであり、ここで追加のＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞において自律増殖が可能である。
【０２３０】
他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入により宿主細胞のゲノム中に統合され、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動的に連結する遺伝子の発現を制御することができる。このようなベクターを、本明細書中では、「発現ベクター」と呼ぶ。一般的に、発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」を、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられている形態であるように、同義に用いることができる。しかし、本発明は、同等の機能を発揮する発現ベクターのこのような他の形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むことを企図する。
【０２３１】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸分子を、宿主細胞において核酸分子の発現に適する形態で含み、これは、組換え発現ベクターが、発現のために用いるべき宿主細胞を基準として選択された１または２以上の制御配列を含み、これは発現されるべき核酸配列に作動的に連結している。組換え発現ベクター内で、「作動的に連結している」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターを宿主細胞中に導入する場合には宿主細胞中で）制御配列（１または２以上）に結合していることを意味することを意図する。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。
【０２３２】
このような制御配列は、例えば、Goeddel；Gene  Expression  Technology：Methods  in  Enzymology  185，Academic  Press，San  Diego，Calif．（1990）中に記載されている。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の恒常的な発現を制御するものおよび特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を制御するもの（例えば組織特異性制御配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることは、当業者により理解される。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入して、これにより、本明細書中に記載したように核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド（例えば、ケモカイン受容体リガンドおよび毒素部分を含む融合分子）を産生することができる。
【０２３３】
本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞または真核細胞中での本発明のポリペプチドの発現のために、設計することができる。例えば、ポリペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。好適な宿主細胞は、Goeddel，Gene  Expression  Technology：Methods  in  Enzymology  185，Academic  Press，San  Diego，Calif．（1990）中にさらに討議されている。あるいはまた、組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳することができる。
【０２３４】
原核生物におけるタンパク質の発現を、最も頻繁には、大腸菌において、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を制御する常在型または誘導型のプロモーターを含むベクターを用いて行う。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、これにおいてコードされたタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に加える。このような融合ベクターは、典型的には、３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させること；２）組換えタンパク質の可溶性を増大させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。
【０２３５】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合部分と組換えタンパク質との接合部においてタンパク質分解による切断部位を導入して、融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質の融合部分からの分離を可能にする。このような酵素およびこれらの同ファミリーの認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、pGEX（Pharmacia  Biotech  Inc；Smith，D．B.およびJohnson，K．S．（1988）、Gene  67:31-40）、pMAL（New  England  Biolabs，Beverly，Mass.）並びにpRIT5（Pharmacia，Piscataway，N.J.）が含まれ、これは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、標的の組換えタンパク質に融合する。
【０２３６】
好適な誘導型の非融合性大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（Amannら（1988）、Gene  69:301-315）およびpET  11d（Studierら、Gene  Expression  Technology：Methods  in  Enzymology  185，Academic  Press，San  Diego，Calif．（1990）60-89）が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。pET  11dベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現したウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（T7  gn1）により媒介されたT7  gn10−lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、T7  gn1遺伝子を有する常在性プロファージからの宿主菌株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により、lacUV  5プロモーターの転写制御の下で供給される。
【０２３７】
本発明の他の局面は、宿主細胞に関し、これに、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子、組換え発現ベクター中で、または、これが宿主細胞のゲノムの特定の部位中に相同的に結合することを可能にする配列を含む核酸分子中で導入する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中では同義に用いられる。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫または可能性のある子孫をも表すことが、理解される。特定の改変が突然変異または環境的影響のいずれかにより子孫において起こり得るので、このような子孫は実際には親細胞とは同一ではないが、本明細書中で用いる用語の範囲内に尚含まれる。
【０２３８】
宿主細胞は、あらゆる原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明の融合ポリペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞）において発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０２３９】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入手法により、原核細胞または真核細胞中に導入することができる。本明細書中で用いる用語「形質転換」および「形質移入」は、外来性の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための分野で認識されている種々の手法を表すことを意図し、リン酸または塩化物共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む。宿主細胞を形質転換または形質移入するための好適な方法は、Sambrookら（Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual．第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，N．Y.，1989）および他の研究室マニュアル中に見出すことができる。
【０２４０】
本発明の分子を作製する方法
上記のように、本発明の分子を、上記の核酸分子、ベクター、宿主細胞および組換え生物を用いて、組換え的に作製することができる。
あるいはまた、ペプチドを、当業者に周知の方法および手法を用いて、合成により作製するか、または天然の供給源から単離し、炭水化物認識ドメインに結合させることができる。
【０２４１】
さらに、本発明の融合分子の安定性または半減期を増大させるために、ポリペプチドを、例えば合成により、または組換え的にして、１または２以上のペプチド類似体または模倣体を含ませることができる。例示的なペプチドを合成して、天然に存在するアミノ酸残基またはアミノ酸類似体のＤ−異性体を包含させて、対象に投与した際に分子の半減期を増大させることができる。
【０２４２】
医薬組成物
本発明の核酸およびポリペプチド融合分子（また本明細書中では「活性化合物」と呼ぶ）を、医薬組成物中に導入することができる。このような組成物は、典型的に、核酸分子またはタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む。本明細書中で用いる用語「薬学的に許容し得る担体」は、医薬投与に適合性の溶媒、分散媒体、被膜、抗菌剤および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤を含む。補助的な活性化合物もまた、当該組成物中に包含させることができる。
【０２４３】
本発明の医薬組成物はまた、１種または２種以上の他の活性化合物を含んでいてもよい。あるいはまた、本発明の医薬組成物を、１種または２種以上の他の活性化合物と共に投与してもよい。本発明の薬学的化合物と共に投与するかまたは本発明の医薬組成物中に配合することができる他の活性化合物には、例えば、抗炎症化合物が含まれる。
【０２４４】
医薬組成物を、この意図された投与の経路と適合性であるように処方する。投与の経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮的（局所的）、経粘膜的および直腸内投与が含まれる。経口、皮内または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：無菌の希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および浸透圧を調整するための剤、例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイアル中に封入することができる。
【０２４５】
本発明の好ましい医薬組成物は、活性成分の局所的送達、例えば腫瘍の位置に直接送達することを可能にするものである。ある態様においては全身への投与が有用であるが、ほとんどの態様においては局所的投与が好ましい。
【０２４６】
注射可能な使用に適する医薬組成物には、無菌の水性溶液（ここでは水溶性）または分散液および無菌の注射可能な溶液または分散液の即席の製剤のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理食塩水、静菌性水、Cremophor  EL（登録商標）（BASF，Parsippany，NJ.）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および貯蔵の状態の下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０２４７】
担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒体およびこれらの好適な混合物であり得る。適切な流動性を、例えばレシチンなどの被膜を用いることにより、分散体の場合には所要の粒度を維持することにより、または界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物の作用を防止することは、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを、組成物中に含むのが、好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより、もたらされ得る。
【０２４８】
無菌の注射可能な溶液を、適切な溶媒中の所要の量の活性化合物を、所要に応じて上記で列挙した成分の１種または組み合わせと共に組み込み、続いて濾過滅菌することにより、調製することができる。一般的には、分散液は、活性化合物を、上記に列挙したものからの基本的な分散媒および所要の他の成分を含む無菌ビヒクル中に組み込むことにより、調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合においては、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分とすべての追加の所望の成分との粉末が、その予め滅菌濾過した溶液から得られる。
【０２４９】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口的な治療的投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と共に組み込み、錠剤、トローチまたはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口組成物をまた、洗口液として用いるための流体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として組み込むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ剤などは、以下の成分または同様の性質を有する化合物のすべてを含むことができる：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelまたはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；または風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料。
【０２５０】
吸入による投与のために、化合物を、好適な高圧ガス、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で、送達する。
【０２５１】
全身への投与をまた、経粘膜的または経皮的手段によるものとすることができる。経粘膜的または経皮的投与のために、透過するべき障壁に適する浸透剤を、処方物において用いる。このような浸透剤は、一般的に当該分野において知られており、例えば経粘膜的投与については、洗浄剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜的投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤を用いることにより、達成することができる。経皮的投与について、活性化合物を、当該分野において一般的に知られているように、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲルまたはクリームに処方する。
【０２５２】
当該化合物をまた、坐剤（例えば慣用の坐剤ベース、例えばココアバターおよび他のグリセリド類と共に）、または直腸への送達のために停留浣腸の形態で、調製することができる。
【０２５３】
１つの態様において、活性化合物を、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護する担体、例えば移植片およびマイクロカプセル化された送達系を含む制御放出配合物を用いて、調製する。生分解性の、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ乳酸を、用いることができる。このような処方物の製造方法は、当業者に明らかである。当該物質をまた、Alza  CorporationおよびNova  Pharmaceuticals，Incから商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞に対して標的されたリポソームを含む）をまた、薬学的に許容し得る担体として用いることができる。これらを、例えば米国特許第4,522,811号に記載されているように、当業者に知られている方法により調製することができる。
【０２５４】
経口または非経口組成物を投薬単位形態で、投与の容易さおよび投薬の均一性のために処方するのが、有利である。本明細書中で用いる投薬単位形態は、処置するべき対象のための単一の投薬として適する物理的に別個の単位を表す；各々の単位は、所要の薬学的担体と関連して所望の治療的効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含む。
【０２５５】
このような化合物の毒性および治療的効能を、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）の決定についての、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により、決定することができる。毒性効果と治療的効果との間の用量比は治療係数であり、これをＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。高い治療係数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を用いることができる一方、このような化合物を、影響された組織の部位に対して標的として、感染していない細胞への損傷の可能性を最小化し、これにより副作用を低減する送達系を設計するように、注意しなければならない。
【０２５６】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトにおいて用いるためのある範囲の投薬を処方するにあたり用いることができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、毒性をほとんどまたは全く伴わない。用いられる投薬形態および用いられる投与の経路に依存して、投与量をこの範囲内で変化させることができる。本発明の方法において用いるすべての化合物について、治療的に有効な用量を、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養物において決定したように、ＩＣ５０（即ち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量を一層正確に決定することができる。血漿におけるレベルを、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２５７】
本明細書中で定義するように、タンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量（即ち、有効な投薬量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／体重１ｋｇ、一層好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、また尚一層好ましくは約１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ、２〜９ｍｇ／体重１ｋｇ、３〜８ｍｇ／体重１ｋｇ、４〜７ｍｇ／体重１ｋｇまたは５〜６ｍｇ／体重１ｋｇの範囲内である。タンパク質またはポリペプチドを、１週間あたり１回、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、一層好ましくは約３〜７週間、また尚一層好ましくは約４、５または６週間にわたり、投与することができる。当業者は、いくつかの要因は、対象を有効に処置するのに必要な投薬量およびタイミングに影響し得、当該要因には、疾患または障害の重篤度、予備的な処置、対象の一般的健康状態および／または年齢、並びに存在する他の疾患が含まれるが、これらには限定されないことを理解している。さらに、対象を治療的に有効な量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体で処置することは、単一の処置を含み得るか、または好ましくは一連の処置を含み得る。
【０２５８】
本発明の核酸分子を、ベクター中に挿入し、遺伝子療法ベクターとして用いることができる。遺伝子療法ベクターを、対象に、例えば静脈内注射、局所的投与（米国特許第5,328,470号を参照）または定位的注射（例えばChenら（1994）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  91:3054-3057）により送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬製剤は、遺伝子療法ベクターを許容し得る希釈剤中に含むことができるか、または遺伝子送達ビヒクルを組み込む持続放出マトリックスを含むことができる。あるいはまた、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから完全な状態で産生することができる場合には、医薬製剤は、遺伝子送達系を生じる１または２以上の細胞を含むことができる。
【０２５９】
医薬組成物を、容器、パック、キットまたはディスペンサー中に、指示書、例えば投与のための書面による指示書、特に活性剤を用いて、ＬＩＧＨＴ経路関連障害を含む本明細書中に開示した障害または疾患に対して処置するためのこのような指示書と共に、含めることができる。容器、パック、キットまたはディスペンサーはまた、例えばペプチドをコードする核酸配列または細胞を発現するペプチドを含んでいてもよい。
【０２６０】
研究的および治療的用途のために、タンパク質ファミリーメンバーのモジュレーターを、一般的には、タンパク質ファミリーメンバーを当該部位において阻害するのに十分な量でモジュレーターを標的部位に送達するように、処方する。
【０２６１】
本発明のモジュレーターの組成物またはペプチドは、随意に、例えば保存溶液、例えば好適な緩衝液、例えば生理的緩衝液を含む他の成分を含む。好ましい態様において、組成物は、医薬組成物であり、他の成分は、薬学的に許容し得る担体であり、これは、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（1980）、第１６版、Osol編、1980に記載されているとおりである。
【０２６２】
本発明において用いるのに適する薬学的に許容し得る担体は、用いる投与量において、細胞、組織または対象に対して無毒性であり、これには、緩衝液（例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液および他の有機酸から製造された緩衝液）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０個の残基より少ない）ペプチド、ポリペプチド（例えば血清アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよび／またはリシン）、単糖類、二糖類および／または他の炭水化物（グルコース、マンノースおよびデキストリンを含む）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、糖アルコール（例えばマンニトールおよびソルビトール）、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、および／またはアニオン系界面活性剤（例えばTween（登録商標）、Pluronics（登録商標）およびＰＥＧ）が含まれ得る。１つの態様において、薬学的に許容し得る担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。
【０２６３】
ある態様は、徐放性医薬組成物を含む。例示的な徐放性組成物は、モジュレーターが結合するかまたはモジュレーターが封入される固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを有する。好適なポリマーの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とＴ−エチル−Ｌ−グルタマーゼ（glutamase）とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。このようなマトリックスは、成形した物品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０２６４】
モジュレーターがポリペプチドである場合には、例示的な徐放性組成物は、典型的にはエプシロン−アミノ基を介してポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））に結合したポリペプチドを含む。ＰＥＧのタンパク質への結合は、免疫原性を低下させインビボでの半減期を延長する周知の手段である（例えばAbuchowski，J.ら（1977）、J．Biol．Chem．252:3582-86を参照）。「ペグ化された」バリアントが所望の機能（１または２以上）を維持する場合には、すべての慣用の「ペグ化」方法を用いることができる。
【０２６５】
他の態様において、徐放性組成物は、リポソームによって（liposomally）捕捉されたモジュレーターを含む。リポソームは、種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小胞である。これらの成分は、典型的には、生体膜の脂質配置と同様に、二重層構造中に配置される。タンパク質ファミリーメンバーのモジュレーターを含むリポソームは、既知の方法、例えばEpsteinら（1985）、PNAS  USA  82:3688-92およびHwangら（1980）、PNAS  USA，77:4030-34に記載されている方法により、調製される。通常は、このような製剤中のリポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、ここで、脂質含量は、約３０ｍｏｌ％のコレステロールより大きく、具体的なパーセンテージを、最適な療法を提供するように調整する。有用なリポソームを、例えばホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧから誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法により生成することができる。所望により、リポソームを、所定の孔の大きさを有するフィルターを通して押し出して、ある粒子の直径を有するリポソームを得る。
【０２６６】
医薬組成物はまた、膜上に吸着したモジュレーター、例えばシラスティック膜を含むことができ、これを、国際公開第WO  91/04014に記載されているように移植することができる。
【０２６７】
本発明の医薬組成物を、すべての標準的な形態で貯蔵することができ、これには、例えば水溶液または凍結乾燥したケークが含まれる。このような組成物は、典型的には、対象に投与した際に無菌である。水溶液の滅菌は、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。組成物を凍結乾燥した形態で貯蔵する場合には、当該組成物を、凍結乾燥および再構成の前または後に濾過することができる。
【０２６８】
特定の態様において、本発明の方法は、タンパク質ファミリーメンバーのポリペプチドモジュレーターをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物を用いる。このような組成物は、随意に、他の成分、例えば保存溶液、例えば好適な緩衝液、例えば生理的緩衝液を含む。好ましい態様において、当該組成物は、医薬組成物であり、他の成分は、上記のように薬学的に許容し得る担体である。
【０２６９】
好ましくは、本発明において有用なポリヌクレオチドを含む組成物はまた、ポリヌクレオチドの細胞中への侵入を容易にする成分を含む。ポリヌクレオチドの細胞内送達を容易にする成分は周知であり、例えば脂質、リポソーム、水−油エマルジョン、ポリエチレンイミン類およびデンドリマーを含み、このいずれをも、本発明の組成物において用いることができる。脂質は、このタイプの最も広範囲に用いられている成分であり、入手できる脂質または脂質処方物のいずれをも、本発明において有用なポリヌクレオチドと共に用いることができる。典型的には、カチオン性脂質が好ましい。好ましいカチオン性脂質には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および／またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が含まれる。ポリヌクレオチドをまた、上記のようにリポソーム中に捕捉することができる。
【０２７０】
他の態様において、ポリヌクレオチドをデンドリマーに複合させ、これを用いてポリヌクレオチドを細胞中に導入することができる。デンドリマーポリカチオンは、三次元の高度に秩序化されたオリゴマーおよび／またはポリマー化合物であり、典型的には、オリゴマーおよび／またはポリマーを付加し正に荷電した外側表面を提供する反復反応配列により、中心分子または表示された開始剤上に形成される。好適なデンドリマーには、「スターバースト」デンドリマーおよび種々のデンドリマーポリカチオンが含まれるが、これらには限定されない。ポリヌクレオチドを細胞中にインビボで導入するためのデンドリマーの製造および使用方法は、当業者に周知であり、例えばPCT/US  83/02052並びに米国特許第4,507,466号；4,558,120号；4,568,737号；4,587,329号；4,631,337号；4,694,064号；4,713,975号；4,737,550号；4,871,779号；4,857,599号；および5,661,025号に詳細に記載されている。
【０２７１】
治療的使用のために、本発明において有用なポリヌクレオチドは、特定の指標について適切な方式で処方される。Bennettらによる米国特許第6,001,651号には、オリゴヌクレオチド治療剤と共に用いるのに適する多数の医薬組成物および処方物並びにこのようなオリゴヌクレオチドを投与する方法が記載されている。
【０２７２】
トランスジェニック動物
トランスジェニック非ヒト動物は、霊長類、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ウサギまたは他の非ヒト動物であってもよい。細胞を、トランスジェニック非ヒト動物から単離し、培養することができる。細胞を、例えば初代培養または樹立培養において用いることができる。１つの局面において、本発明において提供されるのは、治療剤を試験するための本明細書中に記載したトランスジェニック動物の使用である。
【０２７３】
他の態様において、炎症の低減は、試験剤が、ＬＩＧＨＴ経路障害の処置またはＧＤＰＤ酵素活性における変化において有用であり得ることを示す。
本発明のトランスジェニック動物には、ＬＩＧＨＴのＴｙｒ１７３がＰｈｅである（Phe  for  Try173（Y173F）)突然変異を発現する動物が含まれる。本発明の他のトランスジェニック動物には、ＬＩＧＨＴのＬｅｕ６３〜Ａｓｐ８４のアミノ酸が除去されたＬＩＧＨＴＬ変異体を発現するものが含まれる。
【０２７４】
治療剤を試験するためのトランスジェニック動物の使用は、治療剤を動物に投与すること、並びに炎症、細菌の排除、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤、肝硬変および／または肝細胞癌および／または肝細胞壊死の１または２以上の調節を決定または測定することを含む。
【０２７５】
本発明の態様は、トランスジェニック接合体、胚、胚盤胞または非ヒト動物から由来するＥＳ細胞系を用いて、ヒトおよび非ヒト動物疾患を処置することを含む。
【０２７６】
当該方法は、ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニック動物およびキメラ動物を発生させるのに、有用である。このような種には、以下を含む非ヒト哺乳動物が挙げられるが、これらには限定されない：げっ歯動物、例えばマウスおよびラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ類（ovines）、、ブタなどのブタ類（porcines）、およびウシおよびバッファローなどのウシ類を含む。トランスジェニック動物を得る方法は、例えば、Puhler，A.編、Genetic  Engineering  of  Animals，VCH  Publ.，1993；MurphyおよびCarter編、Transgenesis  Techniques：Principles  and  Protocols（Methods  in  Molecular  Biology，第１８巻），1993；およびPinkert，CA編、Transgenic  Animal  Technology：A  Laboratory  Handbook，Academic  Press，1994に記載されている。ある態様において、トランスジェニックマウスを、Thomasら（1999）、Immunol.，163:978-84；Kanakarajら（1998）、J．Exp．Med.，187:2073-9；またはYehら（1997）、Immunity  7:715-725に記載されているように、発生させる。
【０２７７】
トランスジェニック動物を発生させる方法は、当該分野において周知である。例えば、Hooper，ML，Embryonal  Stem  Cells：Introducing  Planned  Changes  into  the  Animal  Germline（Modeem  Genetics，v．1），Int’．Pub．Distrib.，Inc.，1993；Bradleyら（1984）、Nature，309，255-258；Jaenisch（1988）Science，240:1468-1474；Wilmutら（1997）、Nature，385：810-813；DeBoerら、WO  91/08216；Wangら、Molecular  Reproduction  and  Development（2002）63:437-443）；Pageら、Transgenic  Res（1995）4（6）:353-360；Lebkowskiら、Mol  Cell  Biol（1988）8（10）:3988-3996；Sambrookらによる"Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual．Second  Edition"、Cold  Spring  Harbor  Laboratory：1989；"Transgenic  Animal  Technology：A  Laboratory  Handbook，"  C．A．Pinkert編、Academic  Press，2002，第２版、618頁；"Mouse  Genetics  and  Transgenics：A  Practical  Approach，"  I．J．JacksonおよびC．M．Abbott編、Oxford  University  Press，  2000，299頁；"Transgenesis  Techniques：Principles  and  Protocols，"  A．R．Clarke編、Humana  Press，2001，351頁；Velanderら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  89:12003-12007，1992；Hammerら、Nature  315:680-683，1985；Gordonら、Science  214:1244-1246，1981；並びにHoganら、Manipulating  the  Mouse  Embryo：A  Laboratory  Manual（Cold  Spring  Harbor  Laboratory，2002）を参照。これらを各々、これらの全体において参照により本明細書中に導入する。
【０２７８】
本明細書中に記載した、トランスジェニック非ヒト動物から得られた細胞を、動物の組織の試料を採取することにより、得ることができる。次に、当該細胞を、培養することができる。当該細胞は、好ましくは、配列番号１〜３を含むヌクレオチド配列またはこのフラグメントもしくはバリアントによりコードされた機能的タンパク質の産生を欠いている。
【０２７９】
１つの態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、雄の非ヒト動物である。他の好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、雌の非ヒト動物である。他の態様において、トランスジェニック非ヒト動物卵母細胞、胚盤胞、胚または子孫を、ヒト疾患のためのモデルとして、ヒト疾患を研究するかまたは分子、化合物および組成物をスクリーニングするためのモデルとして、用いてもよい。ある態様において、トランスジェニック卵母細胞、接合体、胚盤胞または胚を用いて、胚幹（ＥＳ）細胞系を確立する。幹細胞は、大規模な増殖可能性を有し、いくつかの細胞系列に分化し、移植により組織を再配置させる細胞として、定義される。（Thomson，J．ら、1995；Thomson，J．A.ら、1998；Shamblott，M．ら、1998；Williams，R．L.ら、1988；Orkin，S．1998；Reubinoff，B．E.，ら、2000）。
【０２８０】
診断方法
本明細書中に開示するのは、炎症を診断する方法であって、対象からの試料中の可溶性ＬＩＧＨＴの存在を検出することを含む、前記方法である。炎症は、強皮症または肝炎の１または２以上を含む。当該試料は、例えば血液試料、気管支肺胞洗浄試料、痰試料または可溶性ＬＩＧＨＴを当業者により決定されるように検出することができる他の組織の１または２以上であってもよい。炎症、細菌、肝臓の炎症、炎症細胞の浸潤、肝細胞壊死、肝硬変および／または肝細胞癌の排除の１または２以上をまた、可溶性ＬＩＧＨＴのレベルと共に診断指標として用いてもよい。
【０２８１】
キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するにあたり有用なキットを提供する。１つの態様において、本発明のキットは、例えば好適な容器中に含まれたタンパク質ファミリーメンバーのモジュレーターを含む。本発明において提供されるのは、１つの局面において、モジュレーターおよび薬学的に許容し得る担体並びにｂ）使用のための説明書を含む、キットである。この態様の変形において、タンパク質ファミリーメンバーのモジュレーターを、薬学的に許容し得る担体中に処方する。当該キットは、好ましくは、薬剤に関連する効果または挙動を低減または防止するために、Ｎ型モジュレーターを対象に投与するための説明書を含む。
【０２８２】
本発明のキット中に含まれる説明書を、包装材料に添付しても、または包装挿入物として含めてもよい。当該説明書は、典型的には書かれた、または印刷された資料であるが、このようには限定されない。このような説明書を保存し、これらを最終的な使用者に伝達することができるすべての媒体は、本発明により意図される。このような媒体には、電子的記憶媒体（例えば磁気的ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えばＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれるが、これらには限定されない。本明細書中で用いる用語「説明書」は、当該説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【０２８３】
例
以下の例を、例示により、限定によるものではなく提供する。具体例を提供するが、上記の記載は、例示的であり、限定的ではない。上記の態様の特徴のすべての１つまたは２つ以上は、本発明中のすべての他の態様の１つまたは２つ以上の特徴と、任意の方式で組み合わせることができる。さらに、本発明の多くの改変が、本明細書の概説により当業者に明らかとなる。したがって、本発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではなく、添付した特許請求の範囲をこれらの等価物の全範囲と共に参照して、決定されるべきである。
【０２８４】
例１
マウス、細胞株および試薬。
C57BL/6J（Ｂ６）およびBALB/cマウスを、それぞれ国立癌研究所（Frederick，Maryland，USA）およびJackson  Laboratoryから購入した。ＣＤ１ｄまたはＬＩＧＨＴ（Ｂ６バックグラウンド）が欠損しているマウスは、前に記載されている（７、３２）。すべての実験について、年齢を合わせた５〜８週齢のマウスを用いた。本原稿に記載したすべての動物実験は、Johns  Hopkins  Animal  Care  and  Use  Committee  of  the  Johns  Hopkins  University  School  of  Medicineにより承認された。Ａ２０および２９３Ｔ細胞を、ＡＴＣＣから購入した。ＬＩＧＨＴ−ｆｌａｇ、ＬＴβＲ−ＩｇおよびＨＶＥＭ−Ｉｇ融合タンパク質を、前に記載されているように（３、５）調製した。抗マウスＨＶＥＭ  ｍＡｂ（クローン、ＬＨ１）および抗マウスＬＴβＲ  ｍＡｂ（クローン、ＬＬＴＢ１）を、前に記載されているように（５４）本発明者らの実験室において作製した。ＰＫ１３６ハイブリドーマを、ＡＴＣＣから購入し、ｍＡｂを、前に記載されているように（５４）精製した。抗アシアロＧＭ１を、Cedarlane  Laboratories  Ltdから購入した。マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧおよびヒトＩｇＧを、Sigma-Aldrichから購入した。ハムスターＩｇＧを、Rockland  Immunochemicalsから購入した。すべてのｃＤＮＡプラスミドを、EndoFree  Maxi調製キット（QIAGEN）により精製した。
【０２８５】
ＣｏｎＡにより誘発された肝炎。
マウスに、致死用量（２５〜３０ｍｇ／ｋｇ）または致死量以下の用量（１２．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかのＰＢＳ中のＣｏｎＡ（Sigma-Aldrich）を、プラスミドＤＮＡの水力学的注射を伴って、または伴わずに静脈内注射した。マウスの生存および血清ＡＬＴレベルを、周期的にモニタリングした。血清ＡＬＴレベルを、トランスアミナーゼキット（Sigma-Aldrich）により、製造者の指示に従って測定した。いくつかの実験において、肝臓を、処置したマウスから収穫し、ホルマリン溶液中に固定し、パラフィンで包埋した。切片を、組織学的研究のためにＨ＆Ｅで染色した。
【０２８６】
リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された肝炎。
マウスに、病原性のあるリステリア・モノサイトゲネス（菌株DP-L4056）を腹腔内で感染させ、これは、Cerus  CorpからThomas  W．Dubensky  Jr.の好意により提供された。その後、マウスの生存をモニタリングした。いくつかの実験において、肝臓および脾臓を、組織学的分析およびホモジナイズした器官をCHROMagar  Listeriaプレート（BD  Diagnostics）上にプレーとすることによる細菌力価の測定のために、感染の３日後に収集した。
【０２８７】
ノーザンブロット分析。
全ＲＮＡを、肝臓および脾臓から、RNeasy  Mini  Kit（Qiagen）を用いて抽出した。精製したＲＮＡ（１０μｇ／試料）を、１．５％変性アガロースゲル上での電気泳動により、分離した。次に、分画したＲＮＡを、Hybond-N+膜（Amersham  Pharmacia  Biotech）上に移し、３２Ｐで標識した全長マウスＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＬＴβＲまたはＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡプローブで、Rediprimeキット（Amersham  Pharmacia  Biotech）を用いてブロットした。
【０２８８】
マウスＬＩＧＨＴに特異的なＥＬＩＳＡ。
２つの別個のＬＩＧＨＴ特異性ＡｂであるＭＬ１６３およびＭＬ２０９を、前に記載されているように（５）樹立した。ＬＩＧＨＴ特異性ＥＬＩＳＡについては、ＭＬ１６３  （２μｇ／ｍｌ）を、プレート上に塗布し、ビオチン結合ＭＬ２０９（５μｇ／ｍｌ）を、検出Ａｂとして用いた。ＥＬＩＳＡを、前に記載されている（５）手順に従って行った。ＬＩＧＨＴ−ｆｌａｇ融合タンパク質を正のコントロールとして用いて、直線状の標準曲線を得た。
【０２８９】
インビトロ遺伝子発現および水力学的注射。
リポフェクタミン2000（Invitrogen  Corp.）を、製造者の指示に従って２９３Ｔ細胞中への遺伝子形質移入のために用いた。インビボ遺伝子発現のために、２ｍｌのＰＢＳ  中の２０μｇのプラスミドＤＮＡを尾静脈中に迅速に注射するプラスミドの水力学的注射を、前に記載されているように（２７）行った。致死量以下の用量のＣｏｎＡ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を、いくつかの実験において希釈剤中に混合した。
【０２９０】
ＬＩＧＨＴ変異体の作製。
Ｔｙｒ１７３がＰｈｅに置換される単一のアミノ酸置換（Ｙ１７３Ｆ）をコードするプラスミドを、２段階ＰＣＲにより発生させ、ここで野性型マウスＬＩＧＨＴ  ｃＤＮＡを、鋳型として用いた。先ず、所望の突然変異をコードするオーバーラップするオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、２つの隣接（flank）する５’および３’プライマーを、それぞれＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて設計した。ｃＤＮＡの適切な領域を、対応する重複する、および隣接するプライマーを用いて、最初に増幅した。次に、隣接する５’および３’プライマーを用いて、配列がオーバーラップするフラグメントを融合させて、増幅した。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化したpcDNA3.1ベクター（Invitrogen  Corp.）中にライゲーションした。ＬＩＧＨＴＬ変異体をコードするプラスミドを設計して、ＬＩＧＨＴのＬｅｕ６３からＡｓｐ８４までのアミノ酸を除去した。ＬＩＧＨＴＬを、所望の欠失に隣接した配列をコードするオーバーラップするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた２段階ＰＣＲにより、同様に構成した。突然変異の精度を評価するために、両方の変異体を、ABI  PRISM  310  Genetic  Analyzer  （Applied  Biosystems）を用いて配列決定した。
【０２９１】
統計。
血清中のＡＬＴレベルおよびＬＩＧＨＴレベルを、群の間で、両側スチューデントｔ−検定を用いて比較した。生存実験は、カプラン・マイヤー生存曲線として示されており、対数順位検定を用いて分析した。０．０５より小さいＰ値を、両方の試験において統計的に有意であると考慮した。
【０２９２】
用いる標準外の略語：ＡＬＴ、アラニンアミノ基転移酵素；Ｂ６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＢＴＬＡ、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ；ＣｏｎＡ、コンカナバリンＡ；ＨＶＥＭ、ヘルペスウイルス侵入メディエーター；ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンに対して相同性であり、誘導性発現を示し、Ｔリンパ球により発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターについてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合する；ＬＴβＲ、リンホトキシン−β受容体。
【０２９３】
例２
実験的肝炎におけるＬＩＧＨＴの発現の増大および病原性作用。
肝臓の炎症におけるＬＩＧＨＴの可能性がある役割を研究するために、本発明者らは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）注射（２６）により誘発されたマウス肝炎モデルを利用した。先ず、本発明者らは、このモデルにおけるＬＩＧＨＴおよびこの受容体の発現を調査した。ノーザンブロット分析により、ＣｏｎＡ処置の１．５〜３時間後に、ＬＩＧＨＴおよびＨＶＥＭ  ｍＲＮＡ発現が主に脾臓において上方調節され、一方ＬＴβＲは、ＣｏｎＡ処置とは無関係に肝臓において恒常的に発現したことが、示された（図１Ａ）。この発見により、実験的な急性肝炎の初期相において、ＬＩＧＨＴの増強された発現が示され、これにより本発明者らは、肝臓におけるＬＩＧＨＴの病原性作用をさらに調査するに至った。
【０２９４】
次に、ＬＩＧＨＴ欠損マウスを用いて（７）、本発明者らは、ＬＩＧＨＴ発現の増大がＣｏｎＡにより誘発された肝炎の発症に関与するか否かを試験した。致死量のＣｏｎＡを注射した４日後に、コントロールのＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスの８０％が、急性肝炎で死滅し（図１Ｂ）、これは、肝臓における炎症細胞の大量の浸潤（データは示していない）および血清アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の増加により特徴づけられた（図１Ｃ）。対照的に、９０％を超えるＬＩＧＨＴ欠損マウスは、顕著に低いＡＬＴのレベルを伴って無制限に生存した。これらの結果は、ＬＩＧＨＴ発現がＣｏｎＡにより誘発された肝炎の開始および／または進行についての事象であることを、明確に示す。
【０２９５】
可溶性ＬＩＧＨＴのサイトカインとしての炎症誘発性機能。
ＬＩＧＨＴにより媒介された肝臓の炎症の根底にある機構を探索するために、本発明者らは、扱うべき３つの疑問を提起した。第１のものは、ＬＩＧＨＴの可溶性形態が肝臓病原性に寄与するか否かである。その理由は、ＬＩＧＨＴが、炎症刺激と共にＭＭＰにより細胞膜から切断されるからである（１５、１６）。第２の疑問は、ＨＶＥＭまたはＬＴβＲが、この効果に機能的受容体として関与するか否かである。第３のものは、いかにして、およびいずれの細胞が、肝臓の炎症を媒介するＬＩＧＨＴを生じるかである。
【０２９６】
第１の疑問を扱うために、本発明者らは、ＬＩＧＨＴの可溶性形態が、ＣｏｎＡ処置の際にインビボで検出可能であるか否かを試験した。マウスＬＩＧＨＴに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡにより、可溶性ＬＩＧＨＴを、ＣｏｎＡ処置の１時間後に直ちにマウス血清において検出し、続いて４時間後に急速に低下し（図２Ａ）、これは、肝臓の炎症の発症における可溶性ＬＩＧＨＴの作用の可能性を示唆している。これをさらに確認するために、本発明者らは、酵素的切断に対して耐性のあるＬＩＧＨＴ変異体を設計した。ＬＩＧＨＴＬ、即ちＬｅｕ６３からＡｓｐ８４までのアミノ酸を欠いている欠失変異体は、インビトロでの２９３Ｔ細胞への形質移入の際と、インビボでの水力学的注射による遺伝子発現との両方で、可溶性ＬＩＧＨＴを産生する能力を失う（２７）；むしろ、これは、細胞膜上に優先的に存在する（補足図１；この項についてオンラインで入手できる補足的材料；doi:10.1172/JCI27083DS1）。この変異体は、機能的に損なわれていない。その理由は、これは、ＨＴ−２９細胞における細胞死を、全長ＬＩＧＨＴに必要なものと同様のレベルでのＩＦＮ−γの存在下で生じ得るからである（補足図２）。
【０２９７】
致死量以下のＣｏｎＡ処置と共に、水力学的注射による野性型のＬＩＧＨＴのインビボでの発現の結果、レシピエントマウスの高い死亡率がもたらされた（図２Ｂ）。対照的に、ＬＩＧＨＴＬを発現するマウスは、コントロールのベクタープラスミドを施与されたマウスと同様に生存した。これらの発見と一致して、病理学的分析により、肝細胞は、ＬＩＧＨＴＬ発現の後では壊死による細胞死を殆ど含まなかったが、一方、野性型のＬＩＧＨＴ発現の後では大量の肝細胞の壊死病巣が存在したことが示された（図２Ｃ）。さらに、組換え可溶性ＬＩＧＨＴタンパク質の直接の投与により、６時間において血清ＡＬＴレベルが顕著に増大し（図２Ｄ）、２４時間までにすべてのマウスの死がもたらされた（データは示していない）。集合的に、これらの発見は、膜結合形態の切断による可溶性ＬＩＧＨＴ産生が肝炎の進行のための機構であることを示唆している。
【０２９８】
ＬＩＧＨＴの炎症誘発効果におけるＨＶＥＭではなくＬＴβＲの作用。
本発明者らは次に、ＨＶＥＭまたはＬＴβＲが、可溶性ＬＩＧＨＴの機能的受容体としての肝臓の炎症における原因となる役割を果たすか否かに取り組んだ。このために、本発明者らは、マウスＬＩＧＨＴの別の変異体であるＹ１７３Ｆを、ＰｈｅによるＴｙｒ１７３での単一アミノ酸置換により作製した。ＬＩＧＨＴ  Ｙ１７３Ｆは、ＨＶＥＭへの結合を選択的に失うが、ＬＴβＲへの結合は失わず（補足図３）、これは、ヒトＬＩＧＨＴの類似する変異体と整合する（９）。マウスへの致死量以下の用量のＣｏｎＡの水力学的注射により、ＬＩＧＨＴ  Ｙ１７３Ｆは、肝炎を、野性型ＬＩＧＨＴに匹敵するレベルで媒介し（図３Ａ）、これは、ＬＩＧＨＴにより媒介された肝炎におけるＨＶＥＭの不必要な役割を示唆する。
【０２９９】
この考えをさらに確認するために、本発明者らは、ＬＴβＲまたはＨＶＥＭに対するアンタゴニストｍＡｂを作製した。本発明者らの抗ＬＴβＲ  Ａｂは、ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用を選択的に遮断するが、ＬＴβ−ＬＴβＲ相互作用を遮断せず、一方抗ＨＶＥＭ  ｍＡｂは、ＬＩＧＨＴ−ＨＶＥＭ相互作用を妨げるが、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）とＨＶＥＭとの間の相互作用を妨げない（補足図４）。抗ＬＴβＲ  ｍＡｂの注射により、致死的用量のＣｏｎＡにより誘発された肝炎を有するマウスの死亡率が顕著に低下するが、一方、抗ＨＶＥＭ  Ａｂは、生存に対してわずかな効果を示した（図３Ｂ）。
【０３００】
同様に、ＬＩＧＨＴおよび致死量以下のＣｏｎＡ処置での水力学的注射により誘発された肝炎モデルにおいて、ＬＩＧＨＴ−ＨＶＥＭではなくＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲの遮断の結果、血清ＡＬＴレベルの顕著な低下がもたらされた（図３Ｃ）。総合して、これらの発見により、ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用が、ＬＩＧＨＴにより媒介された肝臓の炎症に必要かつ十分であることが示される。
【０３０１】
ＣｏｎＡにより誘発された肝炎における可溶性ＬＩＧＨＴの産生におけるＮＫ１．１＋Ｔ細胞の役割。
ＣｏｎＡにより誘発された肝炎の発症におけるＮＫ１．１＋Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）の役割が記載されているため（２８、２９）、本発明らは次に、可溶性ＬＩＧＨＴの産生におけるＮＫＴ細胞の役割の可能性を試験した。インビボでＮＫおよびＮＫＴ細胞が欠損している、抗ＮＫ１．１  ｍＡｂで処置したマウス（３０、３１）は、ＣｏｎＡ注射に応答して、コントロールのＡｂで処置したマウスよりも顕著に少量の可溶性ＬＩＧＨＴを発現した（図４Ａ）。対照的に、ＮＫ細胞が欠損しているがＮＫＴ細胞は欠損していない、アシアロＧＭ１で処置したマウス（２９）は、コントロールのＡｂで処置したマウスと同程度の量の可溶性ＬＩＧＨＴを産生し（図４Ｂ）、これは、可溶性ＬＩＧＨＴの産生におけるＮＫＴ細胞の作用を示唆している。
【０３０２】
他方、ＬＩＧＨＴを水力学的注射により外因的に発現させた際には、ＮＫＴ細胞を欠失しているＣＤ１ｄ欠損マウス（３２）は、血清ＡＬＴの顕著な増大を示し（図４Ｃ）、これは、ＬＩＧＨＴにより媒介される肝炎のエフェクター相においてＮＫＴ細胞の不必要な役割を示している。さらに、全長ＬＩＧＨＴがこの実験において発現される場合、ＮＫＴ細胞は、膜結合ＬＩＧＨＴの切断に必要ではない場合がある。実際に、可溶性ＬＩＧＨＴは、抗ＮＫ１．１  ｍＡｂで処置したマウスにおいて、全長ＬＩＧＨＴの水力学的発現の後に、正常なレベルで検出された（補足図５）。
【０３０３】
さらに、ＬＩＧＨＴの外因性の発現により、ＣｏｎＡの不在下においてまたはＲａｇ遺伝子を欠損しているマウスにおいてすら、特定のレベルの肝炎が媒介され（補足図６）、これは、可溶性ＬＩＧＨＴの切断およびエフェクター機能には、他の炎症性刺激も順応性の免疫細胞も必要ではないことを、示唆している。総合して、本発明者らの発見により、ＮＫＴ細胞が、ＬＩＧＨＴの下流の切断またはエフェクター細胞のレギュレーターであるよりむしろ、肝炎についてのＬＩＧＨＴの細胞供給源として機能することが、示される。
【０３０４】
リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された肝炎におけるＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ経路の治療的有効性。
最後に、本発明者らは、リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された急性肝炎モデルにおけるＬＩＧＨＴの病原性作用および治療的有効性を評価した。高用量のリステリア・モノサイトゲネス（マウスあたり２×ＬＤ５０）での腹腔内感染により、免疫細胞浸潤および肝細胞壊死と関連する急性肝炎が発生し、最終的には約５日で死滅に至る（３３）。本発明者らが野性型またはＬＩＧＨＴ欠損Ｂ６マウスをこの用量のリステリア・モノサイトゲネスで攻撃した際に、本発明者らは、ＬＩＧＨＴ欠損マウスの生存が、コントロールマウスの生存よりも顕著に長いことを、見出した（図５Ａ）。同様に、本発明者らの抗ＬＴβＲ  ｍＡｂによるＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用の選択的遮断により、高用量リステリア・モノサイトゲネス感染マウスの生存が、コントロールのＡｂで処置したものと比較して、顕著に延長された（図５Ｂ）。
【０３０５】
この効果は、細菌の増強されたクリアランスによるものではなかった。その理由は、肝臓および脾臓におけるリステリア・モノサイトゲネスの力価が、抗ＬＴβＲ  ｍＡｂおよびコントロールのＡｂで処置したマウスの間で同程度であったからである（データは示していない）。さらに、本発明者らは、少量であるが顕著な量の可溶性ＬＩＧＨＴを、血清中で、感染の２４時間後に検出した（１００±７０ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５）。病理学的分析により、抗ＬＴβＲ  ｍＡｂ処置により、炎症細胞の浸潤および肝細胞の壊死が低減され、したがって肝臓の微細構造の全体的な完全性が維持されることが、明らかになった（図５Ｃ）。これらの発見により、ＬＩＧＨＴが、リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された肝炎において病理学的な役割を果たし、ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ経路の遮断が、肝臓指向性の病原体感染により媒介された肝臓の炎症において治療的有効性を有することが示される。
【０３０６】
肝細胞損傷についての炎症誘発性サイトカインとしてのＬＩＧＨＴの新規の機能を発見した。実験的肝炎の経過の間に、免疫細胞、主にＮＫＴ細胞の活性化により、ＬＩＧＨＴ産生およびサイトカインとしてのその後の切断がもたらされる。可溶性ＬＩＧＨＴは、全身を循環し、ＬＴβＲとの相互作用により肝細胞死を媒介する。ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用の選択的な遮断により、ＣｏｎＡまたはリステリア・モノサイトゲネスにより誘導された実験的な肝炎が改善され、これは、肝臓の炎症促進における機構の非重複的役割として示される。
【０３０７】
種々の炎症疾患におけるＬＩＧＨＴのＨＶＥＭおよびＬＴβＲとの相互作用の役割の病原性効果および根底にある機構は、完全には探索されていない。しかし、本明細書において、ＬＩＧＨＴ欠損マウスを用いて、ＬＩＧＨＴは、炎症カスケードの単なる副産物であはなく、炎症応答を開始および／または促進するにあたって役割を果たすことが、観察された。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＬＩＧＨＴ欠損マウスは、損傷されたＴ細胞免疫性の表現型を示すため（６〜８）、ＬＩＧＨＴ共刺激効果によるリンパ球活性化が炎症応答に寄与するか否かを考慮するのは、価値がある。この点に関して、本発明者らは、本明細書において、抗ＨＶＥＭ  ｍＡｂおよびＬＩＧＨＴ  Ｙ１７３Ｆ変異体を用いることにより、ＨＶＥＭによる共刺激の役割は、ＬＩＧＨＴ媒介性の肝臓の炎症に必要でないことが示唆されることを示す。この考えはまた、ＬＩＧＨＴ欠損マウスが、主にＣＤ８＋Ｔ細胞において免疫機能障害を示す（６〜８）一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞は、ＣｏｎＡ誘発性肝炎における中心的なプレーヤーである（２６、２８）という証拠により、支持され得る。
【０３０８】
リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された肝炎のモデルにおいて、本発明者らは、病原性に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む獲得免疫性が未だ優勢ではない場合には、ＬＩＧＨＴ欠損マウスの生存の差異は、感染の３〜５日後に明らかになる（３３）ことを、見出した。さらに、抗ＬＴβＲ  ｍＡｂによるＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲの選択的遮断により、ＬＩＧＨＴ欠損症と同様に有効に肝炎が改善され、これは、ＨＶＥＭ共刺激経路の役割が無視できることを示唆している。興味深いことに、最近の研究により、ＨＶＥＭ欠損マウスが、ＣｏｎＡに対する増強された応答を有し、肝臓ではなく脾臓の重篤な損傷および血清サイトカインのレベルの増大を伴うことが、報告された（３４）。これらの表現型は、ＢＴＬＡ、即ちＨＶＥＭの他の結合パートナーによる阻害シグナルの欠乏によるものである可能性がある（３５）。これらの発見の観点から、ＬＩＧＨＴは、ＨＶＥＭではなくＬＴβＲにより非リンパ球性集団に対して炎症応答を媒介し、一方ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用は、リンパ球活性化を弱めることにより、炎症を負に調節すると、仮定することができる。
【０３０９】
ＬＴβＲの細胞内領域は、死シグナルの送達に関与するＴＲＡＦ−２、−３および−５に結合するための特異的なドメインを有すると示された（３９）。ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用は、ＩＦＮ−γの存在下において特定の腫瘍細胞株の細胞死を媒介し、ここでｐ３８−ＭＡＰＫおよびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）経路は、Ｂａｋなどのアポトーシス促進性分子の上方調節およびＢｃｌ−２などの抗アポトーシス性分子の下方調節を誘導する（４０）。さらに、ＳｍａｃおよびＩＡＰ−１ならびにＴＲＡＦ−２およびＴＲＡＦ−３などのアポトーシス促進性分子、の、内因性ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ複合体との関連性が、報告されている（４１）。より具体的には、肝細胞腫細胞株であるＨｅｐ３Ｂにおいて、ＬＩＧＨＴが、ＬＴβＲからのＴＲＡＦ−３およびＴＲＡＦ−５シグナルの下流のＲＯＳおよびＡｓｋ−１の活性化により細胞死を媒介すると、仮定されている（４２）。
【０３１０】
ＭＭＰにより切断された可溶性ＬＩＧＨＴの存在についての証拠があるが（１５、１６）、本発明者らの知識の限りにおいて、研究によっては、可溶性ＬＩＧＨＴの生物学的機能は特徴づけられていない。本明細書において、ＬＩＧＨＴ変異体は、可溶性ＬＩＧＨＴが肝臓の炎症の発症において役割を果たすことを示すことが、示される。プラスミドの水力学的注射により肝細胞において優勢な遺伝子発現がもたらされる（４３）場合には、ＬＩＧＨＴＬが肝炎を媒介することができないことにより、可溶性ＬＩＧＨＴの細胞から細胞への接触ではなく広範囲にわたる分布は、肝細胞などの密に密集した細胞に対して炎症を誘発するのに有用であり得ることが、示唆される。さらに、本発明者らは、ＣｏｎＡ注射の後の血清中の可溶性ＬＩＧＨＴを検出し（図２Ａ）、可溶性ＬＩＧＨＴが肝炎を媒介することができることを見出し（図２Ｄ）、これらは可溶性ＬＩＧＨＴの機能を支持する。
【０３１１】
実際に、この考えは、特定のＭＭＰ阻害剤が、内毒素（４４）または肝臓毒（４５）により誘発された致死的な肝炎からマウスを保護するという、以前の報告と整合する。臨床的な状況において、最近の研究により、活性な炎症を有する強皮症患者の気管支肺胞洗浄中に可溶性ＬＩＧＨＴが存在するが、活性な炎症を有しない患者には存在しないことが示された（４６）。本発明者らはまた、Ｂ型肝炎ウイルスに慢性的に感染した患者の約３０％において、可溶性ＬＩＧＨＴの低いが検出可能なレベルを見出した（K．Tamadaら、公開されていないデータ）。総合して、これらの発見により、可溶性ＬＩＧＨＴが、組織炎症の促進剤として、および炎症活性化についての有効な臨床的マーカーとして機能することが、示唆される。
【０３１２】
ＮＫＴ細胞が、ＣｏｎＡにより誘発された肝炎の発症において役割を果たすという証拠がある（２８、２９）。また、リステリア・モノサイトゲネスの感染が、ＮＫＴ細胞の活性化と関連することも、示唆された（４７、４８）。ＮＫＴ細胞により媒介された肝臓の損傷の機構は、完全には探索されていないが、ＦａｓＬおよびＩＦＮ−γのこれらの発現により、クッパー細胞の活性化により直接的または間接的に肝細胞死が引き起こされ、ＴＮＦ−αが生成し得る（４９）。ＮＫＴ細胞およびＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（TRAIL）に由来するオステオポンチンはまた、肝臓の炎症に対する顕著な寄与体であると示された（５０、５１）。本明細書における本発明者らの研究により、ＮＫＴ細胞は、ＣｏｎＡ注射により誘発された可溶性ＬＩＧＨＴの産生のために必要であるが、切断またはエフェクター機能のためには必要でないことが、示された。
【０３１３】
興味深いことに、ＣｏｎＡ注射に応答しての、オステオポンチンではなくＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの血清レベルは、ＬＩＧＨＴ欠損マウスにおいて顕著に低下する（補足図７）。本発明者らは、ＬＩＧＨＴ媒介性肝炎におけるこれらの効果の関与の可能性を探索していないが、ＬＩＧＨＴの下流の炎症メディエーターが、ＬＩＧＨＴとの相乗効果により直接的または間接的に発症に寄与すると考えられる（２４）。
【０３１４】
肝臓の炎症および肝臓の再生は、同一の硬貨の２つの側面であると考えられる。肝臓の死および炎症を媒介するＴＮＦリガンドスーパーファミリー分子はまた、ＴＮＦ−αおよびＦａｓＬにより示されているように、肝臓再生をも促進する（５２、５３）。Andersらによる最近の研究により、ＬＩＧＨＴおよびＬＴβのＬＴβＲとの相互作用はまた、肝臓の再生の刺激において役割を果たすと示されている（２５）。肝細胞に対するＬＩＧＨＴのこの二重の機能は、これが肝細胞を死から保護する（３６）か、またはアポトーシス自体を引き起こし得る（２４）という、一見して相反する知見を説明し得る。したがって、ＬＩＧＨＴならびにＴＮＦ−αおよびＦａｓＬは、肝臓の恒常性の調節において、不可欠の機能を有する。これらの要因は、他のものにより補償することができない、不可欠の役割を果たすと、考えられる。その理由は、これらの要因のいずれの操作も、肝臓の恒常性を顕著に変化するからである。したがって、本発明者らの研究は、肝臓の炎症の発症における可溶性ＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用の役割を、同定する。ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ、ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡの間の相互作用の中でのこの部門の選択的調節により、これらの分子経路に関連する他の機能に影響せずに炎症性疾患に介入し得るる能力が増強される。
【０３１５】
【表２】
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【０３１６】
【表３】
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【０３１７】
【表４】
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【０３１８】
【表５】
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【０３１９】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】肝炎における上方調節されたＬＩＧＨＴの病原性作用を示す図である。
【図２】肝臓の炎症におけるＬＩＧＨＴの可溶性形態の作用を例証する図である。
【図３】ＬＴβＲが、ＬＩＧＨＴにより媒介された肝炎に必要であり、十分であることを示す図である。
【図４】ＣｏｎＡにより誘発された肝炎における可溶性ＬＩＧＨＴの産生におけるＮＫＴ細胞の作用を示す図である。
【図５】リステリア・モノサイトゲネスにより誘発された肝炎についての処置としてのＬＩＧＨＴ−ＬＴβＲ相互作用の遮断を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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