(57)【要約】  本出願書類は、例えば、生体サンプルと接触させていない細胞における転写因子活性のプロファイルなどのコントロールプロファイルに対して、生体サンプルを接触させた細胞における転写因子活性のプロファイルを比較することを含む、生体サンプルの生物活性の測定方法を提供する。【選択図】  図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルの生物活性を測定する方法であって：
所定の時間、前記生体サンプルをバイオセンサーと接触させること；
前記バイオセンサー内の転写因子（TF）の活性プロファイルを評価すること；
前記転写因子（TF）の活性プロファイルを、前記生体サンプルと接触させなかったバイオセンサーにおけるTFの活性プロファイルと比較すること；及び、
前記調査サンプルの生物活性を表すTF活性の変化の示差的プロファイルを作成すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記TF活性プロファイルが、1より多いTFの活性を表す、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記TF活性プロファイルが、2、5、10、20、40、100、200、1,000、又は2,000種のTFの活性を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
生体サンプルの生物活性を測定する方法であって：
前記生体サンプルをバイオセンサーと接触させること；
前記接触後、異なる時間点で、前記バイオセンサー内のTFの時間的活性プロファイルを評価すること；
前記TFの時間的活性プロファイルを、前記生体サンプルを接触させなかったバイオセンサー内のTFの時間的活性プロファイルと比較すること；及び、
前記調査サンプルの生物活性を表すTF活性の変化の示差的な時間的プロファイルを作成すること；
を含む、前記方法。
【請求項５】
前記TF活性プロファイルが、1より多いTFの活性を表す、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記TF活性プロファイルが、2、5、10、20、40、100、200、1,000、又は2,000種のTFの活性を含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
前記プロファイルが、1より多い時間点で測定されたTF活性を含む、請求項4記載の方法。
【請求項８】
前記プロファイルが、2、5、10、20、40、100、又は200個の時間点で測定されたTF活性を含む、請求項4記載の方法。
【請求項９】
生体サンプルの生物活性を測定する方法であって：
前記生体サンプルを、バイオセンサーのパネルと接触させること；
前記接触に応答する、個々のバイオセンサー内でのTF活性の変化を評価すること；及び、
前記複数のバイオセンサー内のTF活性の変化のプロファイルを作成し、それによって前記調査サンプルの生物活性を特徴づけること；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記バイオセンサーのパネルが、1より多いバイオセンサーを表す、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオセンサーのパネルが、2、5、10、20、40、100、又は200個の個別的バイオセンサーを表す、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記個別的バイオセンサーが、異なる細胞型を含み、前記細胞型が、線維芽細胞、上皮細胞、免疫細胞、神経細胞、幹細胞などを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
前記個別的バイオセンサーが、異なる組織培養物、器官培養物、動物へと移植された細胞及び組織培養物、生きている動物の器官及び組織、並びに生きている動物全体を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
前記TF活性プロファイルが、前記TFのDNA結合活性である、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオセンサーが、前記TFの転写活性及びTFによって制御されるシス制御エレメント（cisRE）を評価することを可能にするレポーター遺伝子構築物で供給される、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項１６】
前記cisREが、遺伝子プロモーター、遺伝子エンハンサー、RNA安定性決定因子、転写活性が調査サンプルを接触させることで調節される天然又は合成DNA配列のDNA配列である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子構築物が、あるTFのトランス活性化ドメインと、別のタンパク質のDNA結合ドメインとの融合を表すキメラTFの転写活性を評価するために設計されている、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的バイオセンサーが、複数の細胞培養物、細胞の混合集団、組織培養物、器官培養物、移植された細胞及び組織培養物、生きている動物の器官又は組織である、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、生体液（唾液、血液、血清、脳脊髄液、滑液、尿、精液、母乳、胆液、涙、糞便、抽出物など）、並びにそれらの抽出物、濃縮物、構成要素、又は画分を含む、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、細胞及び組織抽出物、調整細胞培地などを含む、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、生細胞又は固定細胞を含む、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオセンサーを、前記サンプルと応答修飾作用物質との組み合わせと接触させる、請求項1、4又は9記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾作用物質が、サイトカイン、低分子量化合物、低分子干渉RNA、遺伝子発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、放射線、又はバイオセンサーの前記TF活性プロファイルを変化させることができる全ての他の処理である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
生物系の機能状態の記載方法であって、前記生物系由来の1つ又は複数のサンプルの生物活性の分子的サインを、請求項1、4及び9に記載したように測定することによる、前記方法。
【請求項２５】
生物系の撹乱的機能状態のマーカーを同定する方法であって：
前記撹乱生物由来の1つ又は複数の生体サンプルの生物活性を、請求項1、4及び9に記載したように測定すること；
非撹乱生物由来の生物活性を、請求項1、4及び9に記載したように測定すること；及び、
前記生物活性を比較し、前記撹乱を特徴づける示唆的な分子的サインを作成すること；
による、前記方法。
【請求項２６】
調査サンプルにおける、前記撹乱に関連する生物活性強度を定量的に評価することによる、撹乱強度の評価方法。
【請求項２７】
前記撹乱が、疾患、前疾患状態、加齢、物理的処置、ストレス、食事制限、治療的処置、化合物投与、毒素、病原体などである、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記生物系が、細胞培養物、細胞の混合集団、組織培養物、器官培養物、移植された細胞及び組織培養物、生きている動物の器官又は組織、若しくは生きている動物全体である、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
前記生物系がヒトである、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
生物系の2つの撹乱機能状態を区別する示唆的マーカーを同定する方法であって：
生物のある撹乱状態由来の1つ又は複数の生体サンプルの生物活性を、請求項1、4及び9に記載したように測定すること；
生物の別の撹乱状態由来の1つ又は複数の生体サンプルの生物活性を、請求項1、4及び9に記載したように測定すること；及び、
前記生物活性を比較し、前記撹乱状態を区別する示唆的な分子的サインを作成すること；による、前記方法。
【請求項３１】
生物の疾患状態及び前疾患状態の診断方法であって：調査サンプル由来の1つ又は複数の生体サンプルの生物活性を、請求項1、4及び9に記載したように測定すること；及び、請求項25に記載したように、前記サンプルの生物活性を、撹乱機能状態マーカーデータベースで適合させること；による、前記方法。
【請求項３２】
前記疾患が、炎症性疾患、代謝疾患、ガン、神経変性疾患、心身症、感染、早老などである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
疾患又は前疾患状態の治療様式を同定する方法であって：
請求項25に記載したように、疾患又は前疾患状態のマーカーを同定すること；
前記疾患又は前記前疾患状態において、活性が示差的に制御されるTFを同定すること；
前記非撹乱状態におけるそれらの活性に対してそれらのTF活性を変化させること；
による、前記方法。
【請求項３４】
所望の治療特性を有する薬剤候補を選択する方法であって：
撹乱生物系を、調査薬剤候補で処理すること；
前記処理に応答する、前記撹乱系由来の生体サンプルにおける生物活性の変化を評価すること；及び、
非撹乱生物系に対する前記サンプルの生物活性を標準化させる薬剤候補を選択すること；
による、前記方法。
【請求項３５】
前記生物系が、細胞培養物、細胞の混合集団、組織培養物、器官培養物、移植された細胞及び組織培養物、生きている動物の器官又は組織、若しくは生きている動物全体である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
治療的処置への応答の個別的変動のマーカーを同定する方法であって：
前記治療的処置を、患者群に処理すること；
前記処置群を、前記処置の所望の結果を提供する1群と、前記処置の所望的でない結果を提供する別の群とに分割すること；
前記処置の所望の治療的結果を示す患者群から前記処置前及び処置後に生体サンプルを回収し、前記処置に応答した検体の生物活性に共通的な変化マーカーを測定すること；
前記処置の所望的でない治療的結果を示す患者群から前記処置前及び処置後に生体サンプルを回収し、前記処置に応答した検体の生物活性に共通的な変化マーカーを測定すること；及び、
前記処置の所望の結果に関連する示差的マーカーを同定すること；
による、前記方法。
【請求項３７】
治療的処置に対する個別的応答を予測する方法であって：
患者を、前記治療的処置に供すること；
前記処置前及び処置後の生体サンプルを回収し、前記処置に応答する前記サンプルの生物活性の変化を測定すること；及び、
前記サンプルの生物活性における処置誘導性変化を、前記処置の所望的治療結果及び非所望的治療結果を示す患者の生物活性データベースを用いて、請求項36に記載したように比較すること；
による、前記方法。
【請求項３８】
前記治療的処置が、天然及び合成薬剤、放射線、手術、遺伝子療法、催眠術、人的療法などを含むがこれらに限定されない、生物の生理的状態を変化させることに対して向けられる全ての処置を含む、請求項36又は37記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1.関連出願）
本明細書は、あらゆる目的のために引用により本明細書に組み込まれている、2005年9月28日に出願された米国仮出願第60/721,860号の利益を主張する。
（2.発明の分野）
本明細書は、細胞の転写因子及びシス-制御エレメントの転写活性を解析する方法、例えば、前記細胞に適用されたサンプルの生物活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（3.背景）
多細胞生物において、細胞は、神経介在因子、ホルモン、成長因子、サイトカインなどの無数のシグナルを放出することによって情報交換する。これらの介在因子は、特定の細胞型、器官及び組織が、それらの振る舞いをどのように変更すべきかに関する、特定の指示を伝達する。
宿主の状態（例えば、健康対疾患）は、異なる細胞型及び組織におけるそれらの作用に関して、その生体液内の生物活性のスペクトルを評価することによって解析することができる。
【０００３】
生体液及び他のサンプルの内容を解析するためのいくつかのアプローチ、例えば、抗体アレイを使用することによる生物検体内のタンパク質のタンパク質プロファイルを調査するプロテオミクス、及びメタボロミクスなどが開発されており、当該アプローチにおいて、生物学的介在因子のプロファイルは、例えばクロマトグラフィー、質量分析などを使用することによるそれらの重量及び分子構造によって調査される。しかしながら、個々の構成要素の物理化学的特性を解析することは、調査サンプルの生物活性に関して情報をほとんど提供しない。
【０００４】
生物活性は、様々な細胞に基づくアッセイを使用することによって直接的に評価することができ、当該アッセイにおいて、解析サンプルを培養物中で試験細胞に接触させ、試験細胞の表現型変化（例えば、アポトーシス、増殖、分化）が調査される。しかしながら、試験細胞において同じ表現型変化を誘発し得る多くの別の分子があるので、前記アッセイは、特定の活性（例えばアポトーシス促進活性、分裂促進因子活性など）を検出するために使用することができるが、前記サンプルにおける生物活性の複雑なスペクトルを解析するのにほとんど適さない。
【０００５】
最近、細胞に基づくアッセイは、調査される生体サンプルとの接触に応答して、試験細胞内で起こる遺伝子発現の変化に従う前記サンプルの特徴を提案した。このアプローチにおいて、試験細胞の応答は、例えば細胞性RNAを検出アレイにハイブリダイズさせることによって（米国特許公報第2005/0181354 Al号）、当該細胞における遺伝子発現のプロファイル(トランスクリプトーム)を評価することによって解析される。
しかしながらそのようなアプローチは、いくつかの欠点を有する。その一つは、当該転写反応を解析することが、数万種の遺伝子の解析を必要とすることである。別の難題は、マイクロアレイによって作り出される大量のデータの解釈方法である。何千もの遺伝子の発現の特徴的なパターンを見出すために、類似する様式で制御される遺伝子クラスターを同定することを可能にするアルゴリズムが開発されているが（例えば、Hughesらの文献, 2000, J. Mol. Biol. 296:1205-1214を参照されたい）、それでもこの問題は、高次の統計解析及びデータ管理のさらなる統合を必要とする。それゆえ、そのようなアッセイは、困難かつ高価であり、及びそれらの結果は、解析されたサンプルの生物活性に関して解釈することが難しい。
【発明の開示】
【０００６】
（4.発明の記載）
遺伝子発現のレベルで細胞を表現すること(すなわち、トランスクリプトミクス)に対する代替案は、シグナル伝達レベルで起こる分子変化を検討することである。細胞刺激に対する応答において、細胞は、遺伝子発現の変更をもたらすシグナル伝達経路を活性化させる。ほとんどのシグナル伝達経路の頂点には誘導性の転写因子（TF）があり、該タンパク質は、遺伝子のプロモーター領域内の特定のDNA配列に結合し、それによって転写を開始又は抑制させる。TFの活性は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化又はアセチル化）、分解、核移行、DNA結合など多くのレベルで制御され、及び／又は基本転写機構、活性化補助因子若しくはコリプレッサー、並びに他のTFを含む他のタンパク質との相互作用によって制御される。 制御のこれらの異なるレベルは、遺伝子発現をしっかりと統制することを可能にする。これらの制御機構の異なる組み合わせを介して、真核細胞生物は、無数の遺伝子発現パターンを誘発することができる。
【０００７】
数百の特徴的なTFファミリーを含む約2,000種の異なるTFが、ヒトゲノムに存在する。これらのTFファミリーは、 数万の遺伝子の発現を組織化する。細胞制御の複雑さは、TFレベルで劇的に減少するので、TFレベルで分子変化を解析することは、試験化合物の生物活性の解釈をより簡潔かつ包括的にすることができる。
本発明は、生物検体の生物活性のスペクトルを提供する方法であって、転写因子（TF）の活性、並びにこれらのTFによって制御されるシス制御応答エレメント（cisRE）の転写活性を解析する方法で提供されたシグナルにおける効果を評価することによる方法である。本発明の利点は、例えば、生物の機能状態を、当該生物由来の生体サンプルの生物活性を解析することによって特徴づけることを含む。これは、調査宿主へのレポーターシステムの導入の必要性を取り除き、それゆえ非侵襲的な評価の機会を提供する。さらに本発明は、例えば血清、組織などの保管材料の収集物の評価をする。本発明は、TF及びcisREの転写活性を解析する方法；様々な生物検体の生物活性に関する情報を送達する方法；並びに疾患、調査薬剤候補、治療的処置用標的の発掘、多くの他の生医学的用途の選択的マーカーを同定する方法；を提供する。
【０００８】
解析サンプルの生物活性は、以下バイオセンサーという、試験細胞系においてシグナル伝達経路の活性の変化を誘導する、当該サンプルの活性を介して定義される。シグナル伝達経路の活性の変化は、これらのバイオセンサーにおいてTF及び／又はcis-REの活性のプロファイルを評価することによって調査される。
本発明は、一部、以下の前提に基づく：
（i）生物系の状態は、その構成要素（例えば、生体液、組織抽出物、又は他の検体）の生物活性を解析することによって特徴づけることができる；
（ii）解析サンプルの生物活性は、当該サンプルを試験細胞系（以下、バイオセンサーという）と接触させること、並びに当該バイオセンサー内のシグナル伝達の変化を測定することにより評価できる；
（iii）シグナル伝達の変化は、複数の転写因子（TF）の活性プロファイル、又はそれらのTFによって統制されるシス応答配列（cisRE）を含むレポーター構築物の活性プロファイルを評価することにより包括的に記述できる；
（iv）バイオセンサーの十分な分解能は、解析される生物系の異なる状態を区別することで達成することができる。
【０００９】
図1は、本発明の1つの効果を図示する。この例において、バイオセンサー1は、標準生育条件下にける培地中で維持されているある細胞型の均質な集団である。所定の時間、解析サンプルを増殖培地に添加することにより、バイオセンサーを解析サンプル3と接触させる。インキュベーションの最後に、バイオセンサー内のTFの活性プロファイルの測定を実施し、それゆえ調査TF活性プロファイル5を測定する。前記調査サンプルと接触させなかったバイオセンサー内のTF7の参照活性プロファイルの測定は、実施可能である。TF活性プロファイル（調査活性プロファイル対参照活性プロファイル）を比較することによって、解析サンプルに応答して起こる個々のTFの活性の変化を測定する。TF活性9の変化のプロファイルの結果は、調査サンプル3の生物活性の分子的サインを表す。
【００１０】
前記バイオセンサー内の活性は、異なるアプローチを使用することにより測定可能である。
一実施態様において、TF活性は、TF結合配列を含むDNAプローブに対する、TFの結合活性を測定することによって評価される。これは、任意の利用可能なDNA結合アッセイ、例えばゲルシフトアッセイ（エレクトロモビリティシフトアッセイ、又はEMSAとしても知られる）、ELISAに基づくDNA結合アッセイなどにおける細胞抽出物をアッセイすることにより実施可能である。
【００１１】
代替的実施態様において、TFの転写活性、しなわち標的遺伝子の発現を活性化させる能力を調査する。そのようにするために、バイオセンサー細胞は、複数のTF及びcisREの評価を可能にするレポーター構築物のライブラリに供給され、調査されるTFの活性は、対応するレポーター構築物の活性を解析することで評価される。多くのレポーター構築物は、この目的に関して、例えばルシフェラーゼ、CAT、GFPレポーターなどが利用可能である。レポーターRNA構築物のライブラリを使用することにより、複数のTF活性を同時に評価することができる（米国特許公報第2006/0160108号）。
【００１２】
調査サンプルのサインを、他のサンプルの分子的サインを含むデータベースと比較することによって、前記調査サンプルを他のサンプルへと関連付けることができる。この目的に対し、TF活性プロファイル、例えば相関関係解析を定量的に比較することができる数学的アルゴリズムが存在する。様々なパラメータ的及び非パラメータ的な評価指標、例えばユークリッド距離、ピアソン相関係数、順位相関などは、この目的に関して利用可能である。
【００１３】
分解能は、異なる生物活性間を区別する能力として定義することができる。例えば、多くの相異なる分子、例えば、転写因子NF-kBの活性を誘導し得るインターロイキン-1（IL-1）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）、細菌性リポポリサッカライド（LPS）が存在する。それゆえ、NF-kBそれ自体の活性を観測することは、それらの介在因子間を区別できない。しかしながら、多くの状況において、それらの分子を区別する能力を有することは重要である。例えば、循環系におけるTNFα及びIL-1βの存在は、慢性炎症性疾患又は内毒素血症を示し得るが、LPSの存在は内毒素血症の指標である。
【００１４】
いくつかの異なるアプローチがあり、それによりアッセイの分解能はさらに最適化できる。
一つのアプローチにおいて、異なる細胞型を表すバイオセンサーのパネルを使用することによって、サンプルを解析できる。すなわち、当該サンプルを、上皮細胞、免疫細胞、線維芽細胞、神経細胞などを表すバイオセンサーと接触させることによって分子的サインを評価し、それらの細胞におけるTF活性のプロファイルを評価する。分子的サインは、異なる細胞型において異なることは予想される。例えば、LPSは、LPS受容体（例えば、TLR-4）を発現する細胞においてNF-kBを活性化させるが、この受容体を欠く細胞では活性化させない。同様に、当該サンプルにおけるTNFαの存在は、TNFα受容体を発現している細胞においてNF-kBを活性化させるが、前記受容体を欠いている細胞内では活性化させない、などである。それゆえ、2つの異なる生物活性間を区別するために、所望の分解能が達成されるまで異なる細胞型を含むバイオセンサーのパネルを拡大すべきである（図2）。
【００１５】
別のアプローチにおいて、TF活性プロファイルの時間的パターンを解析することにより、示差的な生物活性を区別できる。例えば、TNFα及びIL-1βは、NF-kBの迅速な活性化を誘導し、これは、数分以内にピークに達した後、弱まる。2〜3時間後に、NF-kB活性化の第2波が起こる。対照的に、血小板由来成長因子（PDGF）は、刺激の数時間以内にピークに達する、NF-kBの遅い活性化を引き起こす（Romashkova及びMakarovの文献, 1999）。それゆえ、2つの異なる生物活性間を区別するために、サンプルとの接触後の様々な時間点で、TF活性プロファイルを比較することができる（図3）。
【００１６】
さらに別のアプローチにおいて、当該アッセイにおいて評価されるTFの数を増やすことによって、分解能を増加させることができる。例えば、LPSは、NF-kB及びインターフェロン応答性エレメントの両方を活性化するが、TNFαはNF-kBのみを活性化させる。それゆえ、NF-kB及びIFNγ応答性エレメントの活性を評価することによって、解析サンプルにおけるLPSとTNFαとの間を区別することができる。それゆえ、2つの異なる生物活性を区別するために、所望の分解能が達成されるまで、調査TFの数を拡大すべきである。
【００１７】
さらに別のアプローチにおいて、バイオセンサーを、応答修飾作用物質の存在下で、解析サンプルと接触させる。例えば、炎症は、しばしば、IL-1受容体アンタゴニスト、コルチコステロイド、可溶性TNF受容体などの抗炎症性分子の循環系への放出をもたらす。これらの分子は、バイオセンサー内のシグナル伝達の変化を必ずもたらすとは限らないが、サイトカインによるTFの活性化を選択的に妨げ得る。例えば、調査サンプルが、サイトカインIL-1に対して応答するNF-kBの活性化を阻害するが、TNFαに対して応答するNF-kBの活性化を阻害しない場合、これはIL-1の選択的阻害剤の存在を示し得る。対照的に、調査サンプルによるTNFα誘導性NF-kB活性化の選択的抑制は、TNFαの選択的阻害剤の存在を示す。それゆえ、調査サンプルを応答修飾作用物質と組み合わせることによって、アッセイの分解能を増加させることができる。様々な作用物質は、サイトカイン及びサイトカイン混合物、成長因子、低分子量化合物、放射線などの応答修飾作用物質として使用可能である。また、バイオセンサー内のTF活性プロファイルは、様々な発現構築物を使用すること、例えば、様々な遺伝子並びにそれらの遺伝子のドミナントネガティブ変異体及び構成的活性変異体をコードするcDNAを発現させることによって、変更可能である。さらに、アンチセンス分子、低分子干渉RNAなどを含む、バイオセンサー内の遺伝子発現を変化させる多くの異なる手段が使用可能である。それゆえ、2つの異なる生物活性の間を区別することの一つは、所望の分解能が達成されるまで、様々な応答修飾作用物質の存在下でサンプルの生物活性を調査することである。
【００１８】
様々な生物系をバイオセンサーとして使用できる。例えば、バイオセンサーは、1つの細胞型を含む均質な細胞培養物であり得る。バイオセンサーはまた、異なる細胞型の混合集団も含み得る。バイオセンサーはまた、脳切片培養、肝臓切片培養、皮膚弁などの組織又は器官培養物も含み得る。また、細胞集団、器官又は組織を動物内に移植し、インサイチュウバイオセンサーとして扱うこともできる。例えば、移植組織、器官又は細胞集団はレポーター構築物ライブラリを供給することができ、かつレポーター構築物発現のモニタリングは、移植片を接触させる流体及び組織の生物活性に関する情報を提供する。生きている動物の全器官及び組織も、バイオセンサーとして使用できる。例えば、生きた動物の単離した肝臓を解析サンプルで灌流した後、前記肝臓内のTF活性プロファイルの評価をすることができ、又は動物の皮膚は解析サンプルを接触させた後、前記皮膚内のTF活性プロファイルの評価をすることができる。
【００１９】
例えば、唾液、血液、血清、脳脊髄液、滑液、尿、精液、母乳、胆液、涙、糞便抽出物などを含む生体液、並びにそれらの抽出物、濃縮物、構成要素、又は画分などの、様々な生体サンプルを本発明により解析することができる。細胞抽出物及び組織抽出物、調整細胞培地などの生物活性を解析することもできる。さらに、種々の細胞を生体サンプルとみなすこともできる。この点に関して、生物活性は、当該サンプルを用いるバイオセンサーの細胞−細胞接触、すなわち、生細胞又は固定細胞（例えば、グルタルアルデヒド固定、ホルマリン固定）細胞、又は細胞膜で起こるシグナル伝達の変化として定義できる。
【００２０】
本発明は、その構成要素の生物活性の評価を介する、生物系の機能状態を特徴づける手段を提供する。細胞培養物、細胞の混合集団、組織培養物及び器官培養物、移植細胞及び移植組織、生きている動物の器官及び組織、又は生きている動物全体を含む、生物系の多様性は、この手段で特徴づけることができる。生物系を特徴づけることは、この系（細胞上清、組織抽出物、生体液など）から生体サンプルを回収し、これらのサンプルをバイオセンサーと接触させ、及び前記バイオセンサーにおけるシグナル伝達の変化（すなわち、TF活性のプロファイルの変化）を測定することである。
【００２１】
本発明はさらに、様々な生物系の撹乱的機能状態、例えば疾患であり得る動物の撹乱的状態のマーカーの同定に有用である。疾患マーカーを測定することは、当該疾患罹患動物由来の1つ又はいくつかの生体サンプルの生物活性、及び非撹乱（健常）動物由来の対応サンプルの生物活性を評価することであり、かつこれらのサンプルを比較することにより、前記疾患マーカーを同定する。例えば、特定の疾患を有する動物の血清がバイオセンサーにおいて特定のTFの活性化を誘導するが、健常動物の血清は誘導しない場合、これらのTFの活性化は、前記疾患のマーカーを提供する。示差的に阻害したTFも、疾患マーカーを提供し得る。
【００２２】
さらに、撹乱強度（例えば、疾患の重篤度）を、前記撹乱マーカーの強度を定量的に評価することにより、評価することができる。
疾患、前疾患状態、加齢、生物系の機能状態を変化させる様々な処置、例えば、ストレス、食事制限、治療的処置、化合物投与、毒素、病原体などを含む、様々な種の撹乱を評価できる。
本発明は、生物系の異なる撹乱機能状態を区別するマーカーの同定方法を確立する。そのようにするために、生物のある撹乱状態及び別の撹乱状態の生物系由来の1つ又は複数の生体サンプルの生物活性を測定し、かつそれらの生物活性を比較することにより、それらの撹乱状態を区別するマーカーを同定する。
【００２３】
本発明はさらに、生物の疾患及び前疾患状態の診断方法を明示する。そのようにするために、調査生物由来の1つ又は複数の生体サンプルにおける生物活性を測定し、疾患及び前疾患状態のマーカーデータベースを用いてこれらの生物活性を比較する。慢性炎症性疾患（例えば、関節炎、狼瘡など）、代謝疾患（糖尿病など）、様々なガン、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など）、心身症、様々な感染（例えば、細菌性感染症及びウイルス性感染症）、遺伝性疾患（例えば、早老）、前梗塞状態、前糖尿病状態などを含む、様々な疾患をこの方法で診断することができる。
【００２４】
本発明はさらに、様々な疾患及び前疾患状態に対する推定上の治療標的及び薬剤候補の同定方法を明示する。そのようにするために、前記疾患及び前疾患状態のマーカーを同定する。先に論じたように（[0028]）、それらのマーカーは、罹患生物由来のサンプルと接触させることによって、バイオセンサーにおいて上方制御又は下方制御されるTFを表す。それゆえ、これらのマーカーは、推定上の治療標的を表す。例えば、当該疾患マーカーが、上方制御されたNF-kB活性である場合、その後のNF-kB阻害剤又はNF-kBFを統制する上流シグナル伝達カスケードの阻害剤は、前記疾患の推定上の治療を表す。逆もまた同様に、特定のTFが阻害される場合、このTFの活性化因子は推定上の治療を表す。
同様に、本発明は、薬剤候補及び疾患に対する他の治療の効果の評価方法を明示する。
【実施例】
【００２５】
（5. 実施例）
以下の実施例は、異なる型のレポーター細胞を使用して、糖尿病動物の血清中に存在する生物活性の非重複セットを測定するための健常動物及び糖尿病動物由来の血清の生物活性の成功的評価、並びに疾患を同定するためにどのように情報を組み合わせ得るかを実証する。
（5.1. 実施例1）
以下の実施例に使用される材料及び一般的手順を以下に記載する。
動物。実験用ラットを用いた操作は、動物施設内において保証され、かつ認可された動物プロトコルに従って実施した。
【００２６】
細胞。ヒト肝細胞ガン, HepG2、肺性腎臓上皮, HEK293、及びラットインスリノーマ, U7、の細胞株を、10% FBS (HyClone社, Logan, UT, USA)を添加し、及びさらに抗生物質を添加したDME培地（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で維持した。ストレプトゾトシンは、Sigma (Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO, USA)から購入した。
プラスミドDNA操作。プラスミドDNAを用いた操作は、例えば、Sambrook及びRussellの文献, 『分子クローニング：研究室マニュアル第3版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed）』(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)、並びに分子生物学の最新プロトコル（Ausubelら編, John Wiley & Sons, 1994-1998, 最新プロトコル, 1987-1994、2005年7月に追補された（付録71））に記載されているように、当業者に既知の標準的な分子生物学的手法を使用して実施した。
【００２７】
形質移入。形質移入に関して、細胞を、12ウエルプレートのウエル中にサブコンフルエント密度（5×105/ウエル）でまく。18時間後、細胞に、製造業者のプロトコルに従い、各々の制御因子用の1.5μl/0.5μgの割合の総プラスミドDNAを形質移入した。形質移入の翌日、培地を1mlの新鮮な増殖培地で置換した。
細胞性RNAの単離。総細胞性RNAは、製造業者のプロトコルに従いTRIZOL試薬（Invitrogen社, Carlsbad, CA, USA）を使用して単離し、水に再溶解した。日常的に、0.5mlのTRIZOL試薬を使用して、12ウエルプレートのウエル内の細胞のコンフルエント単層からRNAを抽出した。
【００２８】
RT-PCR。製造業者の説明書に従い、総RNAのサンプルを、DNaseI（Ambion社, Austin, TX USA）で処理した。残留DNaseを、70℃、15分間の熱で不活化させた。DNase処理RNAを、製造業者の説明書に従い、オリゴdTポリヌクレオチド及びMo-MLV逆転写酵素（Invitrogen社, Carlsbad, CA, USA）を使用することによって逆転写した。逆転写したRNAの1/10を、Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen社, Carlsbad, CA, USA）、並びに下記のレポーター配列特異的プライマー：（フォワードプライマー1： 5'-AAATACGAGATCCACCGAGACTCC-3' (配列番号：1)、及びリバースプライマー2：5'-GCAGGAACAGCGCCGATACAAT-3' (配列番号：2)）を使用することにより、PCR反応において増幅させた。使用したPCR条件は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許公報第2006/0160108号に記載されているものと類似又は同一の条件であった。PCR反応は、ABI 9700 GENEAMPサーモサイクラーで実施した。
【００２９】
PCR産物の標識化。各PCR完了物の1/10を、6-カルボキシフルオレセイン (6-FAM) 5'-標識レポーターポリヌクレオチド特異的プライマー(プライマー2: 5'-GCAGGAACAGCGCCGATACAAT-3')を含む新鮮PCR反応混合物で希釈した後、95℃で2分間、68℃で20秒間、及び72℃で10分間インキュベートした。
エンドヌクレアーゼ制限。Hpa I制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs社, Ipswich, MA, USA）を、5U/反応物の濃度で、前記標識PCR産物に直接添加した。当該サンプルを2時間消化し、Qiaquick PCR精製カラム（Qiagen社, Hilden, Germany）を使用し、製造業者のプロトコルに従って精製した。
キャピラリー電気泳動。各Hpa I消化サンプルの連続希釈物を、ABI PRIZM 3100ジェネティックアナライザー（Applied Biosystems社, Foster City, CA, USA）を使用するキャピラリー電気泳動で解析した。X-ローダミン標識MAPMARKER1000分子量標準（Murfreesboro, TN USA）のセットを、分子量対照として、解析サンプルと同時に泳動した。
【００３０】
（5.2. 実施例2）
以下の実施例は、健常動物及び糖尿病動物由来の血清の生物活性の成功的評価を示す。
ラットにD-グルコサミンのN-ニトロソ誘導体であるストレプトゾトシン（STZ）を使用することにより、実験的糖尿病I型を誘導した。ストレプトゾトシンは、ランゲルハンス島の膵臓B細胞の急速なネクローシスを引き起こす（Okamotoの文献, 1985, Bioessays 2:15-21）。STZは、様々な実験動物にインスリン依存性糖尿病状態を誘発させるために広く使用されており、かつSTZ処理動物は、糖尿病のモデルとして当業者に認識されている（Like及びRossiniの文献, 1976, Science 193:415-417）。
糖尿病ラット及び健常ラット由来の血清を比較するアプローチの設計を図4に図示する。10〜12週齢のスプラーグ-ダウリーラットのオスを、2つの群にランダムに振り分けた。1つの群のラットは、新規に調製した50mMクエン酸緩衝液（pH 4.0）に溶解させた70mg/kgのSTZ（Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO, USA）の1回の腹腔内注射を受けた。コントロール群の動物は、同容量のクエン酸緩衝液を受けた。注射の7日後、血液サンプルは、コントロール動物及びSTZ処理動物の尾静脈由来であった。STZ処理動物の糖尿病状態の進行は、血液グルコース濃度測定で確認した。全てのSTZ処理ラットにおいて高血糖（少なくとも300mg/dlのグルコースレベル）が観測されたが、コントロール群由来の全ての動物のグルコースレベルは正常（100mg/dl以下）であった。
【００３１】
製造業者のプロトコルに従い、凝固活性化因子（Becton Dickinson社, NJ,USA）を含む血清分離チューブを使用して、コントロール群から選択した5匹の動物、及びSTZ処理群から選択した5匹の動物（STZ注入後7日）から正常ラット血清（NRS）及び糖尿病ラット血清（DRS）にサンプルを採取した。
個々の転写レポーター構築物のライブラリ（ここで、各レポーターは、特定のTFに応答するシス制御エレメントを含み、かつ各レポーターRNA構築物は、識別可能なレポーター配列を有した）を構築した。該ライブラリ内において位置が異なるプロセシングタグを提供する同一のレポーター配列を提供する各々の個別的レポーター構築物により、前記アプローチを使用した。当該アプローチは、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許公報第2006/0160108号に詳細に記載されている。
【００３２】
このアプローチに従って、個々のレポーターの転写産物は、プロセシングタグ（唯一のHpa I消化部位）の位置で対応するRT-PCR産物のプロセシング（すなわち、消化）、それに続く蛍光標識し加工した（Hpa I制限エンドヌクレアーゼで消化することによる）レポーター配列特異的プライマー対の分離、及びキャピラリー電気泳動による分離により、区別することができる。個々の転写レポーター構築物の相対活性は、エレクトログラム上で対応する個々のピークの値として計算し、かつ全てのレポーターのピークの平均値で標準化した。5匹それぞれの糖尿病ラット血清で得られた各々の個別的レポーター構築物の平均値を、5つのそれぞれの健常ラット血清で得られた個別的レポーター構築物の平均値と比較した。
【００３３】
図7A及び7Bは、それぞれ、健常ラット血清を用いて処理した参照細胞中のレポーターの活性に対して標準化した糖尿病ラット血清を用いて処理したHEK293バイオセンサー細胞及びU7バイオセンサー細胞におけるそれぞれのレポーターの活性の誘導/下方制御のプロファイルを示す。3種の異なる細胞株において、6時間目に、糖尿病血清によって誘導された転写反応のプロファイルは多様であった（図7A、図8A及び図8Bを比較）。NF-kBは、唯一の転写レポーター構築物であった：すなわち、その活性は、全てのバイオセンサー細胞株において、糖尿病血清によって構成的に誘導された。NF-kB誘導の度合いも、全ての型のバイオセンサー細胞を通じて同等であった：HepG2細胞では2.3倍の誘導であり、HEK293細胞では2.4倍の誘導であり、U7細胞では2.0倍の誘導であった。TGFβレポーター活性の増加は、HepG2バイオセンサー細胞 (2.8倍)及び HEK293バイオセンサー(1.5倍)に限定されていた。SV40転写産物は、HEK293細胞 (1.6倍)及びU7 (1.8倍)において糖尿病血清により誘導されたが、HepG2細胞においては誘導されなかった。CRE転写産物の顕著な下方制御は、U7細胞（1.7倍減少）でのみ観測された。それゆえ、糖尿病動物の血清によって誘導される転写レポータープロファイルの変化は、細胞型特異的である。
【００３４】
（5.4 実施例4）
本実施例は、データから、例えば、ラットにおける実験的糖尿病を診断するための比較標準のような有用なマトリクス形態への組み立てを実証する。
実施例2及び3において、糖尿病動物及び正常動物由来の血清は、示差的変化に基づいて区別でき、それらが転写レポーター構築物の活性プロファイルに影響することを実証した。
【００３５】
様々なレポーター細胞型において、糖尿病動物由来の血清抽出物によって示差的に誘導される転写反応は、マトリクス形態で組織化することができ、当該マトリクス中、各々の列は、個々のレポーター細胞型における転写レポーター構築物のライブラリの誘導プロファイルをそれぞれ表し、かつ各ロー（raw）は、異なるレポーター細胞型を通じて個々の転写レポーター構築物の誘導プロファイルを表す。このマトリクスにおいて、（レポーター細胞：レポーター構築物）の各々の対は、正常ラット血清で処理された所与のレポーター細胞型における所与のレポーター構築物の平均活性に対して標準化された糖尿病ラット血清に対する、所与のレポーター細胞型における所与のレポーター構築物の平均活性の誘導倍率に等しい値を与える。糖尿病血清を用いて処理した所与のレポーター細胞型における所与のレポーター構築物の平均活性は、正常ラット血清を用いて処理した所与のレポーター細胞型における所与のレポーター構築物の活性とは明らかに異なる場合、前記値には1を与えた。糖尿病血清によって誘導された所与のレポーター構築物の活性の変化の有意性は、任意の標準的な統計的アルゴリズムを使用することによって評価してよい。当業者は、結果が、使用した個々の糖尿病血清及び正常血清の数、並びに異なる血清に影響された反応の可変性にも依存することを理解する。本実施例の目的に関して、糖尿病血清によって誘導された転写レポーター活性の変化の有意性の下記基準を設定した：1）糖尿病血清の存在下での活性の平均値は、正常血清の存在下とは少なくとも1.5倍異なる；2）糖尿病血清及び正常血清の存在下で測定した活性の平均値（標準偏差）付近の個々の変動の拡がりは重複しない。図8は、HepG2、HEK293及びU7レポーター細胞株において、糖尿病血清によって誘導され、図6及び図7（6時間の時間点）において示されたデータに基づきまとめた、顕著な転写反応の原型的マトリクスの例を図示する。
【００３６】
図8において示し原型的マトリクスは、1）個々の転写レポーター単位のライブラリを拡張すること、及び2）レポーター細胞型のリストを拡げることによって、容易に拡張することができる。当業者は、実験のサイズ（すなわち、解析する個々の血清の数）が大きくなる場合、当該マトリクスに含まれる顕著な変化の組成及び閾値が変化し得ることを理解するであろう。
図7において示したものと同様の転写反応のマトリクスは、STZ誘導性糖尿病状態の唯一の分子的サインを提供する。これは、当該疾患の同定目的に使用することができる。
【００３７】
本明細書で引用した全ての出版物及び特許出願書類は、引用により組み込まれるべきその各々の出版物及び特許出願書類があたかも具体的かつ個別的に示されているかのように、引用により本明細書に組み込まれている。先行発明は、理解を明確にする目的で図解及び例示の手段としていくつか詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱しない特定の変化及び修飾を作成し得ることは、本発明の教示を考慮すると、当業者にとって明らかに容易であろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】
2009509545.tif 000003
【図２】
2009509545.tif 000004
【図３】
2009509545.tif 000005
【図４】
2009509545.tif 000006
【図５】
2009509545.tif 000007
【図６Ａ】
2009509545.tif 000008
【図６Ｂ】
2009509545.tif 000009
【図７Ａ】
2009509545.tif 000010
【図７Ｂ】
2009509545.tif 000011
【図８】
2009509545.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月30日(2008.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
PCR産物の標識化。各PCR完了物の1/10を、6-カルボキシフルオレセイン (6-FAM) 5'-標識レポーターポリヌクレオチド特異的プライマー(プライマー2: 5'-GCAGGAACAGCGCCGATACAAT-3'（配列番号：2）)を含む新鮮PCR反応混合物で希釈した後、95℃で2分間、68℃で20秒間、及び72℃で10分間インキュベートした。
エンドヌクレアーゼ制限。Hpa I制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs社, Ipswich, MA, USA）を、5U/反応物の濃度で、前記標識PCR産物に直接添加した。当該サンプルを2時間消化し、Qiaquick PCR精製カラム（Qiagen社, Hilden, Germany）を使用し、製造業者のプロトコルに従って精製した。
キャピラリー電気泳動。各Hpa I消化サンプルの連続希釈物を、ABI PRIZM 3100ジェネティックアナライザー（Applied Biosystems社, Foster City, CA, USA）を使用するキャピラリー電気泳動で解析した。X-ローダミン標識MAPMARKER1000分子量標準（Murfreesboro, TN USA）のセットを、分子量対照として、解析サンプルと同時に泳動した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009509545000001.app
【国際調査報告】
2009509545.tif 000013
2009509545.tif 000014
2009509545.tif 000015