(57)【要約】本発明は、インフルエンザ、とりわけ、鳥類流感、および差し迫る世界的な流行過程における鳥類流感より派生したウイルス株の、予防および処置のための薬剤の調製を目的とする、キステゥス（Cistus）属植物由来の抽出産物の使用に関連する。2009507874.tif 000003
2009507874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザの予防および／または処置のための薬剤の調製のための、キステゥス（Cistus）属植物由来の抽出産物の使用。
【請求項２】
抽出産物をキステゥス・インカヌス（Cistus incanus）より得る、請求項1記載の使用。
【請求項３】
抽出産物を植物の気生部分より単離する、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
抽出産物は液状、乾燥状、または半固体状である、請求項1から3の少なくとも一項記載の使用。
【請求項５】
抽出産物は水溶性の抽出産物またはアルコール性抽出産物である、請求項1から4の少なくとも一項記載の使用。
【請求項６】
鳥類流感の予防および／または処置のための、請求項1から5の少なくとも一項記載の使用。
【請求項７】
抽出産物は経口的または局所的に投与される、請求項1から6の少なくとも一項記載の使用。
【請求項８】
抽出産物は噴霧される、請求項1から6の少なくとも一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフルエンザの予防および／または処置のための薬剤の調製のための、抽出産物の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは流感としても公知であるが、感染性のウイルス疾患で季節的流行で世界的に拡大する。3つのウイルスタイプA、B、およびCが区別される。タイプBおよびCはヒトに限定され、一方、タイプAは哺乳動物および鳥類に蔓延する。
【０００３】
世界保健機構（The World Health Organizationn (WHO)）は、来る将来のインフルエンザ世界的流行について警告を発している。流行および世界的流行は多くの場合、タイプAのインフルエンザウイルスにより引き起こされる。インフルエンザウイルスの遺伝情報の主たる遺伝的変化により、20世紀において3回の世界的流行が引き起こされたが、いずれの感染因子もすべてタイプAであった。
【０００４】
今日、タイプAウイルスの一種である鳥類流感（avian flu）がとりわけ世界的流行の危機を示している。鳥類流感は近年、特に東南アジア地域において発生が増加している。疾患の抵抗性のキャリアーである野生の鳥類によりその拡大が助長される。専門家は鳥類流感を起こす感染因子がヒト流感の感染因子と交配することを危惧している。原理上、これはブタまたはヒトが鳥類流感およびヒト流感の感染因子に同時感染した場合、起こりうることである。これにより、感染性が高く、およびヒトにとって致死的なウイルスがもたらされ、世界的流行に至る可能性がある。これまでに、鳥類流感のヒトへの感染はごく局所的にのみ起こっている。しかし、鳥類流感のヒト間での感染は未だ観察されていない。
【０００５】
ワクチン接種はウイルス性疾患の予防法として最も重要な手法である。しかし、予防の観点から見ると、ワクチン接種はある種のウイルスに対するワクチンの調製に依存している。これには、そのウイルスが既に存在することが必須である。このこと、および、ワクチンの開発には長期間（約4ヶ月間）を要することから、世界的流行の際のワクチン利用には相当な制約が生じる。そのような場合、ワクチン使用は抗ウイルス剤の事前および同時の使用によってのみ確実なものとされる（WHO Guilelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Infuluenza Pandemics; World Health Organization 2004）。
【０００６】
インフルエンザ処置に効果的な抗ウイルス剤にはアマンタジン（amantadine）、リマンタジン（rimantadine）、ザナミビル（zanamivir）、および、オセルタミビル（oseltamivir）およびリバビリン（ribaavirin）が含まれる。ここに挙げられた全ての薬剤には副作用があり、時には深刻なものとなり得る。例えば、タミフル（Tamiflu(登録商標)）の名称で販売されているオセルタミビルは吐き気、嘔吐、腹痛などの副作用を頻繁に示す。年齢制限以下の若年者において、時には、耳感染、肺炎、副鼻腔感染、気管支炎、リンパ節の腫れ、および結膜炎（Red List, Catalogue of Medication for Germany, 2004）のような深刻な副作用が観察されているため、その使用は13歳以上に指定されている。
【０００７】
抗ウイルス薬剤はウイルス性疾患の予防ならびにその処置に効果的である。これまでに、ウイルス性疾患の直接的な医学的処置は成功例がない。
【０００８】
さらに、ある条件下ではニワトコ果実の抽出産物がインフルエンザの期間を縮める効果があることが公知であるが、評価できるほどの予防効果は実証されていない（Zakay-Rones, Z.; Varsano, N.; Zlotnik, M.; Manor, O.; Regev, L.; Schlesinger, M.; Mumcuoglu, M. J. Altern. Complement. Med. 1995, 1 (4), 361-9）.
【０００９】
キステゥス（Cistus）属植物由来の抽出産物に殺菌効果があることも公知である。キステゥスの種インカヌス（incanus）およびその亜種タウリクス（tauricus）は双方とも中近東地域で優勢で、この地域の伝統的医薬として既に使用されている。キステゥス・インカヌスは畜産管理における自然処置薬として、ならびに、動物の健康状態を一般的に高める目的で使用される（Pieroni, A.; Howard, P.: Volpato, G: Santoro, R.F. Vet. Res. Commun. 2004, 28(1), 55-80）。ギリシャ北部では、キステゥス・インカヌス亜種タウリクスは伝統的に皮膚疾患の処置に使用された（Petereit F., Kolodziej H., Nahrstedt A. Phytochemistry 1991, 30(3), 981-985）。
【００１０】
キステゥス種は、とりわけ、フラボノイド（flavanoids）およびプロアントシアニジン（proanthocyanidines）を含み、（Petereit F., Kolodziej H., Nahrstedt A. Phytochemistry 1991, 30(3), 981-985）体内において抗酸化剤として作用しうる（Attaguile, G.; Russo, A.; Campisi, A.; Savoca, F.; Acquaviva, R.; Ragusa, N.; Vanella, A. Cell Biol Toxicol. 2000, 16(2), 83-90）。キステゥス・インカヌスの葉の抽出産物は抗細菌、抗真菌活性を有する（Bouamama, H. et al. Therapie 1999, 54(6), 731-3）。
【００１１】
鳥類流感の差し迫った世界流行の際の予防措置として、世界共同体の各国は抗ウイルス薬剤に期待を寄せている。例えば、数国では既述の薬剤であるオセルタミビル（タミフル（登録商標）；Hoffman La Roche）を世界流行の際の備蓄として、大量に注文した。しかしながら、緊急事態において薬剤は迅速に消費される可能性があると危惧される。加えて、多大な需要によりボトルネックの形成を引き起こしている。
【００１２】
さらに、（公知の）抗ウイルス剤の使用は動物管理において広いスペクトルの薬剤として使用されるという事実のため、徐々に危険にさらされてきている。国際的な禁止令にも関わらず、例えば中国においては、その実施により、鳥類流感のいくつかの株のこれらの薬剤に対する抵抗性を引き起こした。これに加え、時には深刻であり得るこれら薬剤の頻繁な副作用が存在する。さらに、これらの薬剤は、例えば13歳以上にのみ使用できるオセルタミビル（タミフル（登録商標））のように、ある年齢群にのみ処方される。
【発明の開示】
【００１３】
そこで本発明の目的は、経済的に調製でき、かつ、その投与においていかなる副作用も引き起こすことのない、インフルエンザの予防および／または処置のための抗ウイルス薬剤を提供することにある。
【００１４】
この目的はインフルエンザの予防および／または処置のための薬剤の調製のための、キステゥス属の植物由来の抽出産物の使用により達成される。
【００１５】
抽出産物はキステゥス属の植物から単離される。キステゥス属の20種類は公知である。
C. アルビドゥス（albidus） L.
C. キナマデンシス（chinamadensis） Banares &P. Romero
C. クルシイ（clusii） Dunal
C. クリスプス（crispus） L.
C. ヘテロフィルス（heterophyllus） Desf.
C. インカヌス（incanus） (C. クレティクス（creticus）としても公知)
C. インフラテゥス（inflatus） Pourr. Ex Demoly（C. ヒルステゥス（hirsutus） Lam.またはC. プシロセパルス（psilosepalus） Sweetとしても公知）
C. ランダニフェル（ladanifer） L.
C. ラウリフォリウス（laurifolius） L.
C. リバノティス（libanotis） L.
C. モンスペリエンシス（monspeliensis） L.
C. ムンビイ（munbyi） Pomel
C. オクレアテゥス（ochreatus） Chr. Sm. ex Buch
C. オスベキイフォリウス（osbeckiifolius） Webb ex Christ.
C. パルビフロルス（parviflorus） Lam.
C. ポプリフォリウス（populifolius） L.
C. ポウゾルジイ（pouzolzii） Delile
C. サルビイフォリウス（salviifolius） L.
C. シンテニシイ（sintenisii） Litard.(C. アルバニクス（albanicus） E.F. Warburg ex Heywoodとしても公知)
C. シムフィティフォリウス（symphytifolius） Lam.
【００１６】
抽出産物は好ましくはキステゥス・インカヌス種より単離する。キステゥス・インカヌスは2つの亜種、キステゥス・インカヌス亜種タウリクス（C. incanus ssp. tauricus）ならびにキステゥス・インカヌス亜種ウンドゥラトゥス（C. incanus ssp. undulatus）を含む。これらのうち、キステゥス・インカヌス亜種タウリクスが特に抽出のために好ましく使用される。
【００１７】
抽出産物は植物の気生部分より単離する。好ましくは、同年中に再成長した植物の気生シュートを使用する。収穫後すぐに、つまり生の状態で植物部位を抽出に供する。または、抽出の前に植物部位を乾燥させる。続いて、植物の葉を例えば、擦り合わせる、または切り刻む等の適切な方法で砕粉する。
【００１８】
抽出は適切な溶媒中で行われる。適切な溶媒は、水、メタノール、エタノールまたはイソプロパノール等のアルコール、またはジクロロメタンのような塩素化された溶媒、ならびに、アセトン、アセチルアセトン、アンモニア、または氷酢酸である。指定の溶媒の混合物を使用してもよい。好ましくは、水とメタノールまたはエタノールとの混合物が使用される。
【００１９】
抽出は通常室温で行われる。しかし、抽出を、25度から、必要ならば、使用する溶媒の沸点までの高温で行うことも可能である。室温での抽出が好ましい。
【００２０】
ラードのような脂肪、ビーズワックスのようなワックス、またはオリーブオイルやアーモンドオイルなどの油脂も、抽出のためにさらに使用してもよい。アーモンドオイルの使用が好ましい。
【００２１】
可能な限り高い収率を達成するため、植物材料を複数回の抽出してもよい。ここでは、異なる抽出段階では異なる溶媒を使用してもよいし、または溶媒を用いた抽出の後、脂肪、ワックスまたは油脂により抽出してもよく、およびその逆の順序でもよい。
【００２２】
液体または半固体の粗製産物が抽出により得られ、この形態でインフルエンザの予防および／または処置のための薬剤の調製のために使用してもよい。
【００２３】
また粗製産物は薬剤として加工される以前に、濃縮、および／または乾燥、および／または更に精製されてもよい。例えば、精製は、抽出産物から懸濁された物質を除去するため、遠心分離、ろ過、またはデカンティングなど当業者に公知の精製段階を含んでもよい。
【００２４】
本発明はさらに乾燥抽出産物にも関連する。乾燥抽出産物を調製するため例えば、スプレー乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥などにより、溶媒を液体粗製抽出産物、濃縮された抽出産物、または精製された抽出産物から除去することが可能である。
【００２５】
既述の抽出産物はインフルエンザの予防および／または処置に利用される。
【００２６】
インフルエンザ感染因子はタイプA、BおよびCのウイルスである。時期的に起こるヒトインフルエンザはインフルエンザタイプAウイルスサブタイプH1、H2およびH3、ならびに、インフルエンザタイプBウイルスによって引き起こされる。鳥類流感は主にサブタイプH5、H7およびH9により引き起こされる。
【００２７】
既述の抽出産物は特に鳥類流感の予防および／または処置に適している。とりわけ、抽出産物はサブタイプH7により引き起こされる鳥類流感の予防および／または処置に使用可能である。
【００２８】
抽出産物は錠剤、フィルム錠剤、カプセル、粉末、顆粒、糖衣錠、軟膏、クリーム、ジェル、溶液またはスプレーなどの当業者に公知の任意の生薬の形態で使用することが可能である。また抽出産物は食事、特に動物の食事に混合するため粉末の形態でも使用可能である。
【００２９】
ここでは、抽出産物は錠剤固着剤、結合剤、保存料、錠剤崩壊剤、流量調節剤、軟化剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶媒、遅延剤、抗酸化剤、軟度付与剤、浸透および／または噴霧を改善するための薬剤などの一般的な生薬補助剤とともに加工することも可能である。
【００３０】
抽出産物はまた他の植物抽出産物、特に類似のまたは相乗効果のある他の植物の抽出産物とも混合可能である。
【００３１】
適用のタイプに依存して、使用形態において、抽出産物の濃度は様々である。通常、抽出産物の量は、固形の適用形態中、投薬単位あたり1から1000mgである。好ましくは、抽出産物の量は投薬単位あたり5から500mgである。液体の適用形態においては、抽出産物は1μg/mlから100mg/mlの濃度、好ましくは25μg/mlから50 mg/mlの濃度であってよい。半固体の適用形態では抽出産物の量は1から90重量パーセント、好ましくは5から75重量パーセントである。
【００３２】
抽出産物は乾燥抽出産物として存在するので、好ましくは錠剤の形態で投与される。
【００３３】
さらに、局所的な適用のためには抽出産物を軟膏またはクリームの形態で投与するのが好ましい。ここでは、活性物質が脂肪、ワックスまたは油脂によって植物から回収された抽出産物を使用する。さらに、乾燥抽出産物を脂肪、ワックスもしくは油脂と混合、またはこれらに溶解することが好ましい。
【００３４】
さらに、抽出産物が煙霧剤であることが好ましい。煙霧剤は、インフルエンザの原因物質が接触した、または接触した可能性がある対象物や家屋の除染、特に動物飼育施設、ならびに、ヒト、動物および、または食物が輸送される任意のタイプの輸送手段の殺菌に使用可能である。例えば、鳥類流感の蔓延を回避し、従ってヒトへの感染の危険を最小にするため、離陸前に本発明による煙霧剤を航空機に噴霧することも可能である。本発明による煙霧剤はヒトにいかなる有害な作用をももたらさないため、例えば、待合室のようなヒトの存在下でも噴霧可能である。
【００３５】
後述の実施例により、本発明を例証する。
【００３６】
抽出産物は細胞毒性、細胞生存率、ならびにインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性について試験された。この目的で、抽出産物は熱処理（100℃で1時間）により、（滅菌）リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解された（ストック溶液1mg/ml）。インビトロ実験での使用量は2、10、25および50μg/ml系であった。
【００３７】
インフルエンザAウイルスA/Bratislava/79 (H7N7)(FPV)(トリ)、ならびに、インフルエンザAウイルスA/Puerto-Rico/8/34 (H1N1)(PR8)(ヒト)がウイルス分離株として用いられた。
【００３８】
イヌ腎上皮細胞株のマディンダービーイヌ腎（MDCK）細胞、およびヒト肺上皮細胞株のA549細胞が宿主細胞株として用いられた。
【００３９】
下記の試験法は抽出産物の特性決定のために用いられた。
【００４０】
顕微鏡解析：
顕微鏡解析においては、A549肺上皮細胞およびMDCKイヌ腎上皮細胞は異なる時間点(9時間、24時間、32時間、48時間)について、異なる濃度の抽出産物（2、10、25、50μg/ml）により処理され、引き続き光学顕微鏡で解析された。実験は対照を伴い2つ組で行われた。
【００４１】
生存率の試験：
生存率の試験においては、A549肺上皮細胞およびMDCKイヌ腎上皮細胞は異なる時間点(24時間、48時間、56時間、72時間)について、異なる濃度の抽出産物（2、10、25、50μg/ml）により処理され、引き続き死細胞と生存細胞の比率をフローサイトメトリーで決定するためヨウ化プロピジウムで染色された。実験は合計4回行われた。
【００４２】
アポトーシスのカスパーゼ活性化の解析：
アポトーシスのカスパーゼ活性化を解析するため、A549細胞は上述の実験に加え、25および50μg/mlの抽出産物により48時間処理された。これに次いで、細胞は溶解され、細胞のタンパク質はゲル電気泳動により分離され、カスパーゼによるタンパク質のアポトーシス切断について、抗PARP（カスパーゼの基質であるポリADPリボースポリメラーゼ（poly(ADP-ribos)polymerase））抗体を用いてウエスタンブロット法により解析された。アポトーシスの誘導物質スタウロスポリン（staurosporine）が正の対照刺激物質として用いられた。実験は2つの平行バッチで行われた。
【００４３】
抗ウイルス活性の解析：
抗ウイルス活性の解析の目的で、A549肺上皮細胞およびMDCKイヌ腎上皮細胞は異なる時間点について、異なる濃度の抽出産物（2、10、25、50μg/ml）により30分間事前培養され、続いて抽出産物存在下でインフルエンザウイルスA/FPV/Bratislava/79(H7N7)株およびA/PR8/34(H1N1)株に感染させられた。培養上清は感染後の異なる時間点（8時間または9時間、24時間、36時間または48時間）で単離され、新規に形成されたインフルエンザウイルスを溶菌斑定量法により解析した。
【００４４】
効果速度論的な解析：
効果速度論的な解析のため、MDCK細胞は50μg/mlの抽出産物により、異なる時間点（30分のプレインキュベーション、感染直後、または感染後2時間、4時間、および8時間）で処理された。培養上清は、24時間後、ウイルスの増殖について解析された。
【００４５】
抽出産物によるウイルスのプレインキュベーション後の抗ウイルス活性の解析：
ウイルスを抽出産物でプレインキュベーションした後の抗ウイルス活性を解析するため、ウイルスを含む感染溶液（FPV）は50μg/mlの抽出産物で2時間プレインキュベーションされた。その後、A549細胞を用いた感染実験がこの感染溶液と未処理のウイルス溶液との比較で行われ、24時間後に新規に形成されたウイルスがウイルス滴定法で検出された。この間、上清には抽出産物は存在しなかった。さらに、感染に用いられた事前処理済ウイルスが、MDCK細胞に対する感染能力について、未処理のウイルスとの比較で、溶菌斑定量法により直接解析された。
【００４６】
事前処理されたウイルスの免疫蛍光顕微鏡解析：
ウイルスを含む感染溶液（FPV）は50μg/mlの抽出産物とともに30分間または一晩プレインキュべーションされた。未処理のウイルス、ならびに、事前処理されていないウイルスにより事前処理された細胞の感染が比較として用いられた。未処理のウイルスによる比較感染実験は高感染量（MOI＝200）で行われ、1時間後、感染したウイルスまたは新規に形成されたウイルスタンパク質が、ウイルスタンパク質（ヌクレオプロテイン（NP））に対する特異的抗体を用いた免疫蛍光法により検出された。早期の検出時点および高感染量もまた、感染したウイルスまたはウイルス凝集体の検出を可能にする。
【００４７】
上述の解析結果は図1から9にグラフで示されている。
【００４８】
実施例
キステゥス・インカヌス亜種タウリクスからの抽出産物の調製  
【００４９】
再成長した気生のシュート（葉、花弁、および茎）が抽出に用いられた。植物材料は残留水分量が10パーセント以下になるまで屋外の日陰で常温乾燥される。続いて、植物部位は8ミリメートル以下の大きさに切断される。
【００５０】
切断された植物部位は10倍量の精製水（Ph. Eur.）とともに95℃で4時間から5時間かけてパーコレーションに供される。得られた溶液は75℃から80℃の蒸気温度で板状エバポレーターを用いて元の容量の18パーセントから19パーセントになるまで濃縮される。乾燥物質量は約45パーセントである。
【００５１】
抽出産物を低圧（0.6bar）条件下において撹拌エバポレーターを用いて110℃から114℃で4時間熱処理することにより、乾燥物質量は50パーセントから51パーセントにまで上昇する。続いて、抽出産物を100.3℃で1時間煮沸し、約53パーセントの乾燥物質量を得る。
【００５２】
最終的に、16mbarで段階的温度下降処理（140℃、120℃、90℃、20℃）を施し真空コンベヤー乾燥を行う。乾燥物質量は92パーセントから93パーセントである。続いて、抽出産物は粉砕される。上述のストック溶液はこの抽出産物から調製される。
【００５３】
顕微鏡解析
顕微鏡像では、細胞数や細胞形態の観点においては、未処理の対照サンプルと比較して、MDCK細胞およびA549細胞の解析シリーズに関し、使用された抽出産物濃度または解析された時間値のいずれについても、有意な変化は判定できなかった。
【００５４】
生存率試験
生存率試験の結果は図1と図2に示されている。ここでは、それぞれのサンプル各々の生存細胞数が、実施された4回の測定の平均値として、比較して要約されている。その結果、72時間の観察時間全体において、抽出産物は、MDCK細胞またはA549細胞の生存率に何ら否定的な影響を及ぼさなかった。
【００５５】
アポトーシスのカスパーゼ活性化の解析
アポトーシスのカスパーゼ活性化の解析結果は図3に示されており、これは、カスパーゼ活性の測定に関するウエスタンブロット解析の結果を示す。対照刺激物質であるスタウロスポリン（stauro）によりカスパーゼの基質（ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ、切断されたPARPバンド）の効率的な切断がもたらされたが、未処理（擬似処理（mock））細胞または抽出産物で処理（25μg/ml 、50μg/ml）された細胞のいずれにもそのような活性は検出されなかった。ERK2タンパク質に対する対照ブロットは均一なタンパク質ローディングについての対照として用いた。その結果、用いた濃度や観察期間においては、植物抽出産物による処理はカスパーゼ活性化およびアポトーシスの誘導は引き起こさないと結論することができる。
【００５６】
抗ウイルス活性の解析
抽出産物の抗ウイルス活性の解析において、複数の力価測定による独立した2回の実験それぞれの例示的な結果が図4から図7に示されている。ウイルス力価は未処理の感染サンプルの力価との比較で示されている。FPVの感染を受けたA549細胞においては、たとえより低い濃度であっても9時間後および24時間後にウイルス力価の有意な低下が見られ、このウイルス力価は、活性物質の最も高い濃度で2桁以上の規模の低下した。感染量が多いため、未処理のサンプルは48時間後には既にウイルス生育のプラトー期にあり、もはや阻害効果がそれほど顕著には示され得ない。しかし、ここでも、最も高濃度の活性物質についてはウイルス力価の低下が観察された。試料を25から50μg/mlの抽出産物で処理した場合、MDCK細胞における同一のウイルス分離株についても、ウイルス力価の著しい低下を見出すことができ、ここで、数桁の規模の阻害も達成された。驚くべきことに、より低濃度の活性物質で、いくつかのバッチにおいてウイルス力価のわずかな上昇が見られた。しかし、これはすべてのサンプルで一貫して起こったわけではなく、特に36時間の最長観察時間においては観察されなかったので、これは実験のアーティファクトであると推測され得る。
【００５７】
MDCK細胞における、濃度依存的なウイルス増殖の阻害はヒトのウイルス分離株PR8を用いた場合にも、すべての解析時間値において観測され得る。前記実験とも一致し、50μg/mlの最も高い活性物質濃度において、ウイルス力価の減少も観察された。
【００５８】
要約すると、特に25μg/mlおよび50μg/mlの抽出産物濃度では、異なるインフルエンザウイルスのウイルス増殖に対する強い阻害効果が2種の宿主細胞株において観察される。
【００５９】
効果速度論的な解析
ウイルス溶液を抽出産物でプレインキュベーションした後、抗ウイルス活性を測定した結果が図8にグラフで示されている。この比較されたウイルス力価の効果速度論的解析は、ウイルス増殖に対する強い阻害効果は、細胞を抽出産物とプレインキュベーションした場合にのみ観察可能であったことを示す。抽出産物は感染後2時間以上後に添加された場合は何らさらなる効果を示さなかった。
【００６０】
ウイルスと抽出産物とのプレインキュベーション後の抗ウイルス活性の解析
未処理ウイルスについての比較感染実験は、抽出産物と2時間プレインキュベーションした感染溶液について行われ、新規に形成されたウイルスが24時間後にウイルス滴定により測定された（図9B）。さらに、事前処理されたウイルスは、未処理のウイルスとの比較で、溶菌斑定量法を用いて感染能力について直接的に解析された（図9A）。溶菌斑定量法による感染能力の直接的な測定においては、プレインキュベーションが既に効果を有することが明らかになった。これは、抽出産物で処理されたウイルスと未処理のウイルスを丸24時間感染させた場合により明白になった。ここでは、ほぼ1桁の規模の力価減少が観察可能であった。
【００６１】
要約すると、ウイルスの抽出産物とのプレインキュベーションは、既にウイルス感染能力の顕著な減少に寄与するのに十分であったということができる。
【００６２】
事前処理したウイルスの免疫蛍光顕微鏡解析：
事前処理したウイルスの免疫蛍光顕微鏡解析において、既に1時間後には細胞核中の核タンパク質ヌクレオプロテイン(NP)濃度の上昇が観察可能であり、これは、NPを含むウイルスリボヌクレオプロテイン複合体の主要部分は細胞核に移行済みであるか、または新規のウイルスタンパク質の合成が既に開始されていることを示している。抽出産物とともに事前培養された感染細胞の場合、その分布はごく限定的にしか異ならなかったが、感染ウイルスを1晩プレインキュベーションした後には、特に有意な差が観察可能であった。ここでは、ウイルス粒子または凝集体はある時間点でのみ染色され、細胞核中の染色の濃縮はほとんど見出されなかった。このことから、事前処理されたウイルスは、細胞に感染すること、または細胞に取り込まれることが不十分にしかできないと結論することができる。
【００６３】
抽出産物により処理された細胞の形態、生存率、およびカスパーゼ活性化の解析により、50μg/mlまでの濃度の抽出産物はここで使用された宿主細胞であるA549およびMDCKに何ら有意な有毒効果をもたらさず、かつ、ネクローシスやアポトーシスによる細胞死も誘導しないことが示された。さらに、何ら有意な細胞数の減少も観察され得ず、よって抽出産物の効果により細胞増殖も減少しなかった。要約すると、実験における変動を加味しても、抽出産物の抗ウイルス活性の評価結果により、この抽出産物は25から50μg/mlの濃度において培養細胞中のインフルエンザウイルスの増殖に対し、有意かつ強い抗ウイルス効果を示すといえる。
【００６４】
試験された植物抽出産物は宿主細胞に対して有意な毒性がなく、細胞培養物中のインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を示した。分子レベルにおいては、抗ウイルス活性は抽出産物中の成分とウイルス粒子との直接的な物理的相互作用を経て主に媒介されていると想定されるが、細胞に対する抽出産物の更なる付加的効果は排除できない。
【００６５】
さらなる研究において、病原性の高いインフルエンザウイルスのサブタイプであるH5N1（アジア熱）およびH7N7に対するキステゥスのウイルス阻害特性が解析されている。ウイルス分離株A/Thailand/1(KAN-1)/2005 (H5N1)(ヒト)、ならびにインフルエンザAウイルスA/Bratislava/79（H7N7）(FPV)(トリ)が下記実験においてウイルス分離株として使用された。
【００６６】
高病原性ウイルスH5N1およびH7N7ウイルスの凝集能力の阻害：
キステゥス抽出産物はストック溶液濃度の1/2、1/4、1/8、1/16、および1/32の濃度に希釈された。H5N1およびH7N7ウイルス分離株は元の濃度の1/64の最終濃度に希釈された。各々のキステゥス溶液は96穴プレートで1穴あたり、それぞれ、50μlのH5N1溶液（PFU：4.5 X 108）およびH7N7溶液（PFU：5.7 X 108）と混合された。プレートは二酸化炭素培養器中、37℃で1時間インキュベーションされ、その後、1穴あたり1/20希釈された50μlのニワトリ血液が添加され、プレートは30から45分間冷蔵庫で再度インキュべーションされた。対照として、赤血球細胞がH5N1およびH7N7により処理されず、または処理され、これによりキステゥス抽出産物が省かれた。
【００６７】
その結果、抽出産物はH5N1およびH7N7ウイルス分離株の赤血球細胞の架橋を効果的に阻害し得ることが見出された。従って、キステゥス抽出産物はH5N1およびH7N7において、細胞受容体に対する血球凝集素の結合能力を有意に低下させることができる。
【００６８】
高病原性ウイルスH5N1の増殖能力の阻害：
A549細胞が播種され、24時間培養された。続いて、細胞はキステゥス抽出産物と30分間プレインキュベーションされた。抽出産物の濃度は50μg/ml、75μg/mlおよび100μg/mlが用いられた。同様に、H5N1ウイルスは室温で抽出産物（50μg/ml、75μg/mlおよび100μg/ml）と30分間プレインキュベーションされた。プレインキュベーションの後、細胞は二酸化炭素培養器中、37℃で時折旋回されながら、インフルエンザAウイルスサブタイプH5N1(MOI：0.001）に30分間感染を受けた。引き続き、非結合ウイルスを除去するため細胞はPBSで洗浄され、二酸化炭素培養器中、37℃でキステゥス抽出産物（50μg/ml、75μg/mlおよび100μg/ml）と20時間インキュベーションされた。20時間の培養後、上清は除去され、ウイルス力価が溶菌斑定量法により測定された。未処理の感染サンプルは対照として用いられた。
【００６９】
結果は図10に示されており、ここで、未処理の対照サンプルが100%を表すよう設定されている。抽出産物の2回の異なる添加（AとB）が解析された。
【００７０】
図10に見られるように、抽出産物は増殖ウイルスの数を有意に低下させる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】生存率の検証結果を示す図である。
【図２】生存率の検証結果を示す図である。
【図３】カスパーゼ活性の測定に関するウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】抽出産物の抗ウイルス活性の解析を示す図である。
【図５】抽出産物の抗ウイルス活性の解析を示す図である。
【図６】抽出産物の抗ウイルス活性の解析を示す図である。
【図７】抽出産物の抗ウイルス活性の解析を示す図である。
【図８】ウイルス溶液を抽出産物でプレインキュベーションした後、抗ウイルス活性を測定した結果を示す図である。
【図９】ウイルスと抽出産物とのプレインキュベーション後の抗ウイルス活性の解析を示す図である。
【図１０】高病原性ウイルスH5N1の増殖能力の阻害を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月1日(2008.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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