(57)【要約】  走査型プローブ顕微鏡法を用いて表面を調べる方法であって、この方法は、走査型プローブを表面へ接近させ、一定の距離を維持するように表面に対するプローブの位置を制御することを含み、プローブを通る液体の調整流によって表面に圧力を加え、続けてプローブの位置を監視することを特徴とし、プローブの動きが、結果として生じる表面の動きを示すようになっている。
2009545736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
走査型プローブ顕微鏡法を用いて表面を調べる方法であって、走査型プローブを前記表面へ接近させ、一定の距離を維持するように前記表面に対する前記プローブの位置を制御することを含み、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に圧力を加え、続けて前記プローブの位置を監視することを特徴とし、前記プローブの動きが、結果として生じる前記表面の動きを示すようになっている方法。
【請求項２】
前記表面に正圧を加えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面に負圧を加えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブは、マイクロピペットまたはナノピペットであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
調べられる前記表面は、細胞構造または細胞内構造であることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記表面は、液体の表面であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記液体は、乳濁液であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記表面は、非生物学的構造のものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記走査型プローブ顕微鏡法は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法であることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記表面の、または前記表面における電気的または機械的な変化を監視するための上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞の電気生理学的または化学的な変化を誘発する方法であって、走査型プローブを前記細胞の表面へ接近させ、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に既定圧力を加え、前記細胞の電気生理学的または化学的な信号の変化を監視することを含む方法。
【請求項１２】
前記電気生理学的または化学的な信号は、細胞に存在するイオンチャネルに関連したものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法を用いて前記プローブを前記細胞へ接近させることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
表面を調べる装置であって、走査型プローブ顕微鏡と、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に圧力を加える手段とを備える装置。
【請求項１５】
前記走査型プローブ顕微鏡は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡であることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型プローブ顕微鏡法と、構造体、特に細胞の可撓性または弾性の研究における走査型プローブ顕微鏡法の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物か植物かにかかわらず、細胞は生体の最も基本的な単位である。細胞の構造と構成や、細胞の様々な構成要素がどのように機能するかについて研究することにより、生物系全体で生じる複雑な過程についての貴重な見識が得られる。このためには、細胞試料を、実時間で、非侵襲的に、細胞の機能が保持されるように生理学的な条件を模倣した溶液中で調べることのできる技術が必要である。
【０００３】
生細胞の研究には、（可視光を用いた）光学顕微鏡法が広く利用されてきた。しかしながら、その解像度は、回折により約２００〜２５０ｎｍまでに限られる。さらに詳細にわたる研究のために一般に用いられる方法の一つには電子顕微鏡法があり、同法では、解像度１０ｎｍの画像を得ることができるが、撮像前に試料を固定する必要がある。従って、生細胞の研究には電子顕微鏡を用いることができない。
【０００４】
高解像度技術の他の候補としては走査型プローブ顕微鏡法（scanning probe microscopy、ＳＰＭ）の利用に基づくものがあり、同法では、とがったプローブ先端を研究対象の試料に極めて接近させて走査させる。その結果として生じる相互作用、すなわち試料の化学的・物理的な特性を、試料に対する先端の位置の関数としてプロットして、この測定された相互作用のプロファイルを生成することができる。生物学的なイメージングに通常利用されるＳＰＭ系の仲間としては、原子間力顕微鏡法（atomic force microscopy、ＡＦＭ）、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（scanning ion-conductance microscopy、ＳＩＣＭ）、および走査型近接場光学顕微鏡法（scanning near-field optical microscopy、ＳＮＯＭ）がある。
【０００５】
ＳＩＣＭでは、電解質で満たされたガラス製マイクロピペットを、電解液に浸された試料の表面上で走査させる。これについてはサイエンス（Science）243:641-3のHansmaら（1989年）を参照されたい。ピペット開口を通って流れるイオン電流を監視することにより、ピペットと試料との離隔距離が一定値に維持される。この流れは２つの電極の間に存在する。電極の一方はピペット内側にあり、他方は外側の電解液中にある。電極間にかけられるバイアスについては、イオン電流信号は、マイクロピペットの抵抗（ＲＰ）とアクセス抵抗（ＲＡＣ）との組み合わせに依存する。ここで、アクセス抵抗（ＲＡＣ）とは、電解槽からマイクロピペット開口への収束経路に沿った抵抗である。ＲＰがマイクロピペットの先端径と円錐角とに依存する一方、ＲＡＣは、電解槽および試料の電気化学的特性、幾何学的配置、およびプローブからの離隔距離に対して、複雑な依存性を示す。ピペットと試料との離隔距離に対してイオン電流の感度を与え、それを利用して、接触が起こらないように距離を維持できるようにするのはＲＡＣである。
【０００６】
精密表面用の非接触プロファイル測定法としてＳＩＣＭを成立させることができる先端と試料との最適な離隔距離は、先端の直径のおよそ半分である。これについてはジャーナル・オブ・マイクロスコピー（J. Microsc.）188:17-23またバイオフィジカル・ジャーナル（Biophys. J.）73:653-8のKorchevら（1997年）を参照されたい。先端の位置を制御しているシステムの出力を用いて、試料表面の形状の特徴を表す画像が生成される。ＳＩＣＭを用いて達成できる空間分解能は、先端開口の大きさに依存し、典型的には５０ｎｍから１．５μｍの間である。これにより、相当する解像度が得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、例えば細胞などの表面構造を研究するための改良された方法および装置が、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、研究対象の表面に接近した位置にある走査型プローブを通る液体の調整流によって、局所的な、制御された圧力または力を表面に加えることができる、という認識に基づいている。この加圧を用いると、加えられた圧力とその結果として生じる表面の動きとの関係を監視することによって表面の可撓性または弾性を測定することができる。また、この加圧を用いると、例えば機械受容イオンチャネルといった細胞表面の構成要素を刺激し、続けて、その結果として生じる電気生理学的または化学的な信号の変化を監視することにより、この刺激を測定することもできる。
【０００９】
本発明の第１の態様によると、方法は、走査型プローブ顕微鏡法を用いて表面を調べる方法であって、走査型プローブを表面へ接近させ、一定の距離を維持するようにプローブの位置を制御することを含み、プローブを通る液体の調整流によって表面に圧力を加え、続けてプローブの位置を監視することを特徴とし、プローブの動きが、結果として生じる表面の動きを示すようになっている。
【００１０】
本発明の第２の態様によると、方法は、細胞の電気生理学的または化学的な変化を誘発する方法であって、走査型プローブを細胞の表面へ接近させ、プローブを通る液体の調整流によって表面に既定圧力を加え、細胞の電気生理学的または化学的な信号の変化を監視することを含む。
【００１１】
本発明の第３の態様によると、表面を調べる装置であって、走査型プローブ顕微鏡と、プローブを通る液体の調整流によって表面に圧力を加える手段とを備える装置がある。
【００１２】
表面からのプローブ先端の平均距離は典型的にはプローブの内半径に近いので、低い流速における流れパターンでは、プローブ内部の液体にかかる静水圧とほぼ同等の圧力が表面に生じ、表面の法線方向の正味の力は、その圧力と、プローブ先端における開口の断面積との積になる。先端下の表面が感じる局所的な圧力は、圧力を発生するのに用いられる手段にかかわらず、その手段により外部からピペット（プローブ）に加えられる圧力とほぼ正確に同じである。さらに、表面にかかる力は、結局はその圧力に先端の断面積を乗じたものに極めて近くなる。これら２つの特徴はいずれも、実験的に求められ、分析的に探求されたものである。これらによってデータの解釈が非常に明快になり、またこれらこそ、本発明の方法に特有の強みである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明を添付の図面を参照して説明する。
本発明は、非常に局所的で制御された圧力または力を表面に加える手段を提供する。この手段は、細胞表面の弾性を測定したり、機械的刺激に反応して電気生理学的または化学的な信号を生成する様々な生物学的構造体を刺激したりするために用いられ得る。
【００１４】
本発明を実現する装置は、通常、プローブと、調べられる表面からのプローブの距離を測定および/または制御する手段と、制御された圧力をプローブ内部の液体に加える手段とを備える。加えられた圧力によって、プローブ先端を通る液体の流れが生じ、その結果、相関する圧力が調べられる表面に発生する。
【００１５】
「調べる」（interrogate）という用語は、構造体の表面における変化を監視して、例えば、単一の位置における、またはプローブが表面を走査するのに応じた表面上または表面における構造的変化を検出する能力のことを指すための用語である。
【００１６】
表面が十分にしなやかであれば、表面に加えられた圧力によって表面が動く。正圧、すなわちプローブを通って表面へ向かう流れは、表面をプローブから離れる方へ押す効果を有しており、表面とプローブとの離隔距離を長くする。負圧は、表面をプローブの方へ引き寄せ、離隔距離を短くする。ところが、本装置は表面からのプローブの距離を一定に制御するようにしてあるので、表面が何らかの動きをすると、それに対応するようにプローブが動く。この結果、液体の流れと圧力と動きとの間の相互関係を監視することができる。プローブの垂直位置の何らかの変化は、加えられた圧力に起因するであろう表面の垂直位置の変化の、直接的な指標となる。従って、加えられる圧力とその結果生じる表面の動きとの関係から、表面構造の弾性についての情報を得ることができる。
【００１７】
また、本発明は、機械的刺激に反応して電気生理学的または化学的な信号を発する細胞構造を刺激するためにも用いられ得る。例えば、イオンチャネルを刺激することができ、その結果として発せられる信号を、好適な検出器を用いて検出することができる。これは、機械的感覚の研究において有用である。機械的感覚は、浸透圧調節、成長、聴覚、重力屈性、平衡、固有受容、および触覚を含む様々な身体過程の動作に不可欠である（Ghaziら、Biochemie、1998年、80:357-62）。嗅覚、味覚、および視覚はすべてGタンパク質共役受容体の活性化によって働くが、これらとは違って、触覚、痛覚、および聴覚の基となる機械感覚の分子的基礎はいまだ不明である（SukharevおよびCorey、Sci STKE、2004年、219:re4、Kung、ジャーナル・オブ・アプライド・フィジオロジー（J. Appl. Physiol.）、2005年、98:2328-36）。機械受容（mechanosensitive、ＭＳ）イオンチャネルは、機械的な力を電気的または化学的な信号へ変換する膜貫通タンパク質から成る（SukharevおよびCorey、supra 2004）。ＭＳイオンチャネルは、バクテリア、酵母、植物、および多数の動物細胞を含む多様な有機体において、電気生理学的に検出されている（Ghaziら、supra 1998、Kung、supra 2005）。機械的に活性化されたチャネルは、様々なイオンチャネルファミリからの膜タンパク質の混成群のようである。様々なイオンチャネルファミリとしては、大腸菌のＭｓｃＬおよびＭｓｃＳ、（６回の膜貫通領域（transmembrane domain、ＴＭ）（ＳＡＫＣａ）および２回のＴＭ（ＫＡＴＰ）の）伸展活性化Ｋ＋チャネル、ＤＥＧ／ＥＮａＣ型チャネル、機械ゲート型２細孔（４ＴＭ）Ｋ＋漏洩チャネル、およびＴＲＰファミリのうちのいくつかの種類が含まれる（Ghaziら、supra 1998、SukharevおよびCorey、supra 2004）。
【００１８】
本発明は、細胞または細胞表面の構造を調べるのに有用なだけでなく、走査型顕微鏡により加えられる適切な水準の圧力を加えられることによって変形し得る表面や、あるいはそのような圧力に対して異なる水準の抵抗を示す表面の研究にも応用され得る。表面は、固体であっても液体であってもよい。例えば、表面は、乳濁液の表面であっても水性液体の表面であってもよく、表面の機械的特性が、その乳濁液または液体の特性を明らかにしてくれる。例えば、水性液体中の油滴は、加えられる圧力に対して、水と比較して異なる水準の抵抗を示すので、その水中油滴構成物の特性を特定するのに本発明を用いることができる。この特徴は、多くの食材、化粧品、および洗浄剤のバルク特性を決めるのに役立ち得る。研究対象の液体水は通常、プローブを満たすのに用いられる液体とは混合しない。
【００１９】
さらに、本発明は、例えばゴム系またはプラスチック系の材料などの非生物学的構造体を研究するのに用いることができ、加えられる圧力によってそのような材料の構造の違いを明らかにすることができる。
【００２０】
プローブを用いて表面を走査することもできる。つまり、走査型プローブ顕微鏡法によって行う。画像を生成することができ、関心の対象である表面の一部分を、特有の特性を有するものとして特定することができる。正または負の圧力を、非常に正確に、表面の選択された位置に加えることができ、それによって表面の機械的反応または動きを測定することができる。表面の同じ部分または異なる部分にこの処理を繰り返して、表面についての詳細な情報を得てもよい。
【００２１】
また、プローブを用いて表面を走査しながら、同時に表面に圧力を加えてもよい。このように、本発明を用いて、加えられた圧力に表面が反応するのに応じて表面の詳細な画像を構築し、表面および表面下の構造を明らかにすることができる。
【００２２】
表面が非常に柔軟で、加えられる圧力が正である領域では、表面が下にある下部構造上へつぶれ、例えば、細胞膜が下の細胞骨格の形状を呈する場合がある。表面が非常に柔軟で、加えられる圧力が負である領域では、表面までの隆起の程度の変動によって、例えば、細胞膜のどの部分が細胞骨格へ固定され、どの部分が自由に動けるのかが明らかになる場合がある。
【００２３】
本発明の効果は、プローブを表面に接触させることなく、表面を調べるということである。プローブを表面に接触させると、表面の損傷、先端の汚染、繰り返し実験による表面の二次汚染という結果を招きかねない。
【００２４】
本発明は、従来の装置を用いて実現することができる。例えば、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ＳＩＣＭ）を用いることができる。典型的なＳＩＣＭシステムは、すべての走査型プローブ顕微鏡の特徴となっている部品、すなわち走査型プローブ、ピエゾアクチュエータ走査素子、制御電子回路、およびコンピュータを備える。これらの部品が、例えばDiaphot 200（株式会社ニコン、日本国東京都）のような倒立顕微鏡の内部および周囲に組み立てられてよい。
【００２５】
任意の好適な中空プローブが用いられてよい。典型的には、プローブは、マイクロピペットまたはナノピペットである。そのようなプローブは、例えば外径および内径がそれぞれ１．００ｍｍおよび０．５８ｍｍのホウ珪酸ガラス毛細管を、レーザ系のマイクロピペット・プラー（例えば米国カリフォルニア州サンラファエルのサッター社（Sutter Instrument Co.）のP-2000型）を用いて引っ張ることによって製造できる。円錐テーパ長さおよび頂部の直径が２００ｎｍ、４００ｎｍ、および１．０μｍのプローブを得ることができる。装置は、典型的には、表面からのプローブ先端の平均距離がほぼプローブの内半径となるように設定される。
【００２６】
圧力は、プローブを通る液体の流れを制御する従来の手段によって加えることができる。典型的には、例えば米国コネチカット州ハムデンのワーナー社（Warner Instruments）のPM-4型のようなプログラム可能な圧力注入器システムが、可撓管によってＳＩＣＭピペット保持部の軸部に取り付けられ、必要な圧力−時間曲線を生成するように注入器がプログラムされる。必要な圧力の大きさは、当業者が決めることができる。典型的には、少なくとも１０ｋＰａ、例えば１０〜５０ｋＰａの正圧が加えられる。さらに典型的には、１３〜４０ｋＰａの圧力が加えられる。
【００２７】
本発明はまた、本発明を用いて、細胞または生物学的な表面により生成され、また刺激され得る電気生理学的または化学的な信号を測定する手段によっても実現することができる。そのような測定手段は、従来から走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法に存在し、本発明に適用可能である。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例により、本発明を説明する。
以下の実施例は、ヒトおよびラットのＤＲＧ知覚ニューロンの研究において、本発明の非接触式ＳＩＣＭ法を従来の接触式ＳＩＣＭ法と比較して調べたものである。
【００２９】
［走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）］
我々は、ＳＩＣＭプローブを用いて、機械的刺激を与えるのに用いられる大きなプローブでは通常アクセスできない、膜のサブミクロン領域を選び出し、機械的に刺激した。我々は、ＳＩＣＭ（イオンスコープ社（Ionscope Limited）、英国ロンドン）を用いて、形状の画像を得て細胞を機械的に刺激した。生細胞の形状の画像を撮るためのＳＩＣＭの基本的な設定については、これまでに説明されている（Korchevら、バイオフィジカル・ジャーナル（Biophys. J.）、1997a、73:653-8、Korchevら、ジャーナル・オブ・マイクロスコピー（J. Microsc.）、1997b、188(Pt1):17-23）。簡単に言うと、本ＳＩＣＭでは、試料に対して垂直に配置されたパッチクランプナノピペットを走査型プローブとして用いる。ピペットは、３軸ピエゾ平行移動ステージに取り付けられており、細胞表面に接近し、ピペットを通るイオン電流を一定に保つＳＩＣＭフィードバック制御を用いて先端と試料との離隔距離を一定に維持しながら、細胞表面を走査する（図１Ｂ）。ＳＩＣＭ制御部が細胞の表面画像を生成し（図１Ｃ）、細胞の、識別された特定の領域または構造に対してピペットが直接、正確に、膜から約１００ｎｍ以内にまで接近できるようにする。そして、ＳＩＣＭのピペットプローブを用いて、パッチクランプによる電気生理学的手法を同時に施しながら細胞を機械的に刺激し、膜電流を測定したり細胞内のＣａ２＋イメージングを行ったりすることができる（図１Ａ）。
【００３０】
ＳＩＣＭナノピペットは、レーザ系の電極プラー（カリフォルニア州ノバトのサッター社（Sutter Instrument）のP-2000）を用いて、ホウ珪酸ガラス毛細管（英国ハートフォードシャー州のイントラセル社（Intracel Ltd.）のイントラフィル（Intrafil）、外径１．０ｍｍ×内径０．５８ｍｍ）から引いて作り、電解槽の溶液に浸したときの１５〜２０ＭΩのピペット抵抗を実現した。ピペット先端の内半径は、電解槽の溶液に浸したときのピペットの抵抗に基づくと、およそ２００ｎｍであった。
【００３１】
［機械的刺激］
我々は、ＳＩＣＭのナノピペットプローブを用いて、２つの異なる種類の機械的刺激を加えた。第１の手法である「接触法」では、ＳＩＣＭフィードバック制御をオフにし、ピエゾ制御によって、決められた距離および継続時間ずつピペットを細胞膜に対して垂直に下げた（図２Ａ）。この方法では、ピペットが膜の小さな領域（〜７００ｎｍ＝ピペット先端の外径）に物理的に接触して押し下げ、ピペットの物理的な閉塞によりピペットを通って流れる電流（Ｉ／Ｉｍａｘ）が減少した（図２Ｃ）。第２の手法は「非接触法」であり、ピペットの先端から細胞に対する圧力噴射の印加と同時に、ピエゾ制御によってピペットを細胞膜に向けて垂直に下げた（図２Ｂ）。下向き刺激ステップを行う数秒前にＳＩＣＭピペットの軸部を介して正圧（１３〜４０ｋＰａ）を加えてピペットの先端から液体を噴出させ、ステップ直後に停止した。溶液噴射が膜との接触を防ぎ、それによりピペットの閉塞を防いだが、このことは、ピペットを通る電流の流れに著しい減少が無かったことにより確認された（図２Ｄ）。この方法は、細胞膜に対する接触および物理的損傷を防ぐので、細胞に対する「非接触」の機械的刺激をもたらす。
【００３２】
我々は、記録チャンバーの底部ガラス表面に圧力噴射を加えて、ピペットの動きやピペット抵抗の変化を引き起こす可能性のある圧力噴射を加える際にピペットの偽の動きがないかを確かめるという実験で、機械的に誘発される人為現象の問題に取り組んだが、ＳＩＣＭピペットの著しい動きは見られなかった（＜１０ｎｍ）。
【００３３】
［細胞培養］
ニューロサイエンスレター（Neurosci. Lett.）2006年399:51-56のAnandらの記述のように、ヒトＤＲＧ知覚ニューロンを準備した。簡単に言うと、２週間前までの、交通事故における腕神経叢裂離、すなわち中枢軸索切断の５人の成人男性患者（ｎ＝５、年齢幅は２１〜２８歳）から、全頸部ＤＲＧを得た。神経修復に必須の部分として神経再建術の過程においてＤＲＧを切除し、患者の書面によるインフォームドコンセントと地域の倫理委員会の承認を得てこれを研究した。各患者からの２つないし３つの頸神経節を細かく切断し、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、０．５％ディスパーゼ（８Ｕ／ｍｇ、GIBCO）、および０．２％コラゲナーゼ（タイプＩＶ、ワージントン社（Worthington）、１６８Ｕ／ｍｇ）を含有するハムＦ１２培地（GIBCO）にて、３７℃で３時間、酵素消化し、続けてハムＦ１２＋１０％ウシ胎仔血清（fetal calf serum）にて機械的解離を行った。約３０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌを含有する２５０μｌの細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−リジン（２０μｇ／ｍｌ、シグマ社（Sigma））およびラミニン（２０μｇ／ｍｌ、シグマ社）でコーティングされた８ウェルのパーマノックス製Ｌａｂ−Ｔｅｋスライド（ナルジェヌンク社（Nalge Nunc Int.））上に蒔いた。２ｍｌのハムＦ１２＋１０％ＦＣＳをすべてのウェルに加え、ＮＧＦ−７Ｓ（１００ｎｇ／ｍｌ、シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich））、ｒｈＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびｒｈＮＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ）をウェルの半数に加えた。８％ＣＯ２／ａｉｒの湿潤環境下、３７℃で５日間、細胞を培養し、培地は３日間で交換した。
【００３４】
成体ウィスターラットを二酸化炭素により窒息死させ、すべての脊髄レベルからのＤＲＧを得てプールした。ＤＲＧをハムＦ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社（Invitrogen Life Technologies Ltd.）、英国ペーズリー）に捕集し、新しいハムＦ１２にて３回スピン洗浄した。次いでＤＲＧを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ移し、５％ＣＯ２下、３７℃で５０分間、１ｍｌの１０Ｕ／ｍｌパパイン溶液（シグマ社）に浸漬した。消化された組織をスピンし、過剰なパパインを除去してから、トリプシンインヒビター溶液（シグマ社）にて 浸軟させた。ラットおよびヒトのＤＲＧ知覚ニューロンを、ポリ−Ｌ−リジン（２０μｇ／ｍｌ）およびラミニン（１０μｇ／ｍｌ）（両方ともシグマ社）でプレコートされた丸いカバーガラス（直径１３ｍｍ）に蒔いた。実験での使用に先立ち、完全ＢＳＦ２培地（ハムＦ１２、ウシ血清アルブミン、アポトランスフェリン、プロゲステロン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、プトレシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、および２％（ラット用）または１０％（ヒト用）の熱失活したウシ胎仔血清）に神経栄養性成長因子（１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ−７Ｓ、５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＮＴ３）を付加したものにて、９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で少なくとも４８時間、細胞を成長させた。
【００３５】
［電気生理学］
カバースリップで培養したＤＲＧ知覚ニューロンを潅流チャンバー（ワーナー社（Warner Instruments Inc.）のRC-25）へ移し、分離型のパッチクランプヘッドステージおよび電極を用いて、標準的な全細胞電圧クランプ記録を行った。パッチ電極は、ＳＩＣＭピペットと同じガラス毛細管から作ったものであり、１０〜１６ＭΩのピペット抵抗を実現した。パッチクランプピペット溶液は、ＣｓＣｌを１３０ｍＭ、ＮａＣｌを５ｍＭ、ＥＧＴＡ−Ｎａを５ｍＭ、および、ｐＨ７．３のＨＥＰＥＳを１０ｍＭ含有した。電解槽およびＳＩＣＭピペット溶液は、ＮａＣｌを１４０ｍＭ、ＫＣｌを５ｍＭ、ＭｇＣｌ２を２ｍＭ、ＣａＣｌ２を１．８ｍＭ、グルコースを１０ｍＭ、およびｐＨ７．４のＨＥＰＥＳを１０ｍＭ含有した。無機塩および試薬はすべてシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）（シグマ社、英国ジリンガム）のものとした。Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器およびClampex-pClamp 9（アクソン社（Axon Instruments）、カリフォルニア州バーリントン）を用いて、パッチクランプした細胞にパッチ電極を通じて−６０ｍＶの保持電位をかけ、記録を１０ｋＨｚで継続してサンプリングして２ｋＨｚでオンラインでフィルタ処理した。ソフトウェアを用いて容量性電流および／または線形のリーク電流を減じた。Clampfit-pClamp 9およびOrigin 5（マイクロキャル社（Microcal）、マサチューセッツ州ノーサンプトン）を用いてデータをさらに解析した。実験はすべて２３±２℃の室温にて行った。
【００３６】
［カルシウムイメージング］
ＤＲＧ知覚ニューロンにfluo-4アセトキシメチルエステル（オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブス社（Molecular Probes）のfluo-4 AM）を４μＭ、室温で１時間添加した。残ったfluo-4を洗浄し、続いて１５分間の脱エステル化の後、潅流チャンバーへ移した。fluo-4を４５０〜４８０ｎｍにて励起し、放射された５２０ｎｍを超える蛍光を、増感ＣＣＤ（英国サセックス州のフォトニックサイエンス社（Photonic Science）のCoolView IDIカメラシステム）をニコンのTE-2000倒立顕微鏡につなげてImage-Pro Plusソフトウェア（メディアサイバネティクス社（Media Cybernetics）、英国ウォーキンガム）で制御したものを用いて検出することによって、Ｃａ２＋の変動を撮像した。画像は、毎秒２フレーム、個々のフレーム露出時間１００ｍｓにて取得した。対応するタイムトレースが、関心領域における初期蛍光に対する蛍光の比（Ｆ／Ｆ０）として、正規化された蛍光強度を示す。
【００３７】
［結果］
我々は、Ｃａ２＋イメージング実験を用いて、機械的刺激に対するＤＲＧ知覚ニューロンの反応の特徴を明らかにした。まず、細胞体の小領域（＜１μｍ２）に接触接近を用いて、ＤＲＧニューロンを刺激した。図３に、ＳＩＣＭピペットがヒトＤＲＧニューロンの表面に１μｍを２ステップ分だけ接近した時の結果を示す。第１ステップでは、ニューロンは［Ｃａ２＋］ｉのわずかな増加を示す。fluo-4の蛍光強度は、基底水準（図３Ａ、フレーム１）からフレーム２の水準まで増加する。ピペットをさらに１μｍ進めると、Ｃａ２＋の反応のピークとなって、［Ｃａ２＋］ｉがさらに上昇する（図３Ａ、フレーム３）。約２分後には［Ｃａ２＋］ｉは基底レベルに戻り（図３Ａ、フレーム４）、そこで２μｍの第３の刺激によって再び［Ｃａ２＋］ｉが上昇する（図３Ａ、フレーム５）。我々は、両者、つまりヒト（ｎ＝１２）およびラット（ｎ＝２４）のＤＲＧニューロンについて、接触接近法による評価を行った。しかしながら、この接触法を用いるにあたっては大きな限界があった。所与の実験において、成功した順次刺激の数が限られたのである。ピペットが細胞の表面に接触するたびに、ピペットが膜にくっついて、細胞を物理的に損傷させる恐れがある。これは、蛍光色素分子が細胞から漏れ出て蛍光が急激に低下したこと（図３Ａ、フレーム６）から明らかである。この基準によれば、接触手順は研究対象のニューロン（ｎ＝３６）の６４±８％を「損傷させた」。
【００３８】
我々は、接触接近で観測したのと同様の反応を非接触接近を用いて生じさせたが（ヒトはｎ＝８、ラットはｎ＝３２）、今度は刺激による損傷は非常にわずかしかなかった。非接触接近で刺激されたニューロンは、２．５±２．５％しか損傷を受けなかった（ｎ＝４０）（図５Ｃ参照）。図４は、非接触手順を用いて順次の機械的刺激をラットＤＲＧニューロンに与えた様子を示しており、それぞれ細胞膜を３μｍ押し下げている。それぞれの押し込みで、［Ｃａ２＋］ｉが増加した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。最初の刺激は、その後の刺激と比べてよりおおきなＣａ２＋反応を生じさせた。加えた機械的刺激は、非常に局所的であり、近隣の細胞を乱すことはない（データは図示せず）。図４Ｄは、非接触手順を用いて、強度を増やしていく３回の順次の機械的刺激で刺激されたある細胞の反応の例を示す。段階的な［Ｃａ２＋］ｉの増加が検出されている。
【００３９】
図５は、接触接近と非接触接近とを比較する図である。我々は、ＭＳ（機械的刺激）に対して［Ｃａ２＋］ｉの増加で反応した細胞の割合を計算したが、接触接近は非接触接近よりも著しく多い個数の細胞で反応を誘発した（図５Ａ）。例えば、細胞膜に対するＳＩＣＭピペットの全変位３μｍの同様の刺激において、接触ＭＳには細胞の７５％が反応し（ｎ＝１６）、非接触には４４％しか反応しなかった（ｎ＝１４）。さらに、接触接近を用いた時は、［Ｃａ２＋］ｉの上昇が非接触接近よりも著しく高かった（図５Ｂ）。ただし、接触接近では一種の全か無かの反応が生じた一方、非接触接近では段階的な反応が生じた。接触接近における［Ｃａ２＋］ｉの上昇は、刺激強度との間に関連を示さないか、示したとしてもごくわずかだったが、非接触接近においては、Ｃａ２＋反応の強さは刺激強度に依存していた。１．５μｍおよび３μｍの押し下げを生じる機械的刺激によって［Ｃａ２＋］ｉの上昇が次第に大きくなり、４．５μｍでは最大となった（図５Ｂ）。
【００４０】
我々は、成体ラットから培養したＤＲＧ知覚ニューロンにおいて、機械的刺激により活性化される全細胞内向き電流を観測した。接触接近および非接触接近を用いた場合はいずれも、機械的刺激が、過渡的成分および持続的成分をもつ内向き陽イオン電流を惹起したが（図６Ａおよび図６Ｂ）、これは、ニューロサイエンスレター1999年273:179-82のMcCarterら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J. Neurosci.）2002年22:RC228のDrewら、およびジャーナル・オブ・フィジオロジー（J. Physiol.）2004年556:691-710のDrewらに報告されている通りである。接触接近の使用は限られた効果しか無かったが、これは細胞がすぐに損傷を受けてしまったためであり、あるいは、パッチクランプピペットが動いて、直接的な物理的接触、および／または機械的刺激による乱れにより、高抵抗のパッチを破ってしまったためである。ところが、非接触の機械的刺激であれば、場合によっては何度でも繰り返すことが可能であった。これはＳＩＣＭプローブと細胞との間に物理的接触がなく、損傷が回避されたからである。図６Ａは、電圧クランプされたラットＤＲＧニューロンに対する、非接触接近を用いた３回の順次の機械的刺激を示す。ＳＩＣＭピペットが細胞膜を１μｍ押し下げて、過渡的成分および持続的成分をもつ内向き電流を活性化した。同様に、相当する電流を接触手順によって活性化した（図６Ｂ）。これら１μｍの機械的刺激による結果は、所与の最大下の機械的刺激において、接触接近による活性化全細胞ピーク電流（３４２．７±３７．８ｐＡ、ｎ＝６）（図６Ｃ）が非接触の刺激（１２２．１±１２．４ｐＡ、ｎ＝４）よりも著しく大きいという点で、図５Ｂに示した［Ｃａ２＋］ｉの上昇と合致している。
【００４１】
非接触接近を用いた刺激の際にかけられた圧力噴射が、機械受容イオンチャネルを活性化するに足りる細胞膜の変位を生じさせたかどうかを明らかにするため、我々は、圧力噴射単独で生じる細胞膜変位を測定する、という対照実験を行った。我々は、非接触刺激の際に用いられた圧力の高さの３倍までの圧力を用いたが、膜は５００ｎｍまで動くものの全細胞電流には大した変化が検出されないことを観測した（図６Ｄ）。これが意味するのは、圧力を加えてプローブも１ｍｍ以上動かした時の付加的な変位こそが、細胞膜をより大きく変形させて機械受容チャネルを活性化するのであり、圧力単独によるものではない、ということである。
【００４２】
ヒトＤＲＧ知覚ニューロンの神経突起は非常に微細であり、直径が数百ナノメートルに至る。従来用いられてきた技術では、アクセスするのが非常に困難である。今回、我々は、非接触接近を用いて、直径約１〜２μｍの樹状突起への機械的刺激に対するヒトＤＲＧ知覚ニューロンの反応を研究した。ここで我々は、先の機械的刺激の例が、異なるニューロンどうしの収束から発した直径２μｍの２つの樹状突起間の交差部分に加えられたものであることを明示する（図７、矢印２）。ＳＩＣＭピペットは、膜に接近しながら、同時に１３ｋＰａの圧力噴射を加え、表面を７５０ｎｍ変位させた。蛍光強度が増加して刺激点から神経突起に沿って１２μｍ／ｓで伝播したが（図７、矢印１）、その一方で他の神経突起（図７、矢印３）では蛍光が増加しなかった。
【００４３】
上述したすべての公表の内容は、引用することによりここに組み込まれているものとする。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１（Ａ）および図１（Ｂ）は、細胞表面を調べるために用いられるＳＩＣＭシステムの構成を示す図であり、図１（Ｃ）は、結果として得られる細胞表面の走査画像を示す図である。
【図２】図２は、接触接近および非接触接近の両方によるＳＩＣＭを説明する図である。
【図３】図３は、ＳＩＣＭピペットがヒトＤＲＧニューロンに接近する時の［Ｃａ２＋］を説明する図である。
【図４】図４は、非接触接近を用いたＤＲＧニューロンへの順次の機械的刺激の結果を説明する図である。
【図５】図５は、［Ｃａ２＋］に基づく、接触接近および非接触接近による機械的刺激の結果を示す図である。
【図６】図６は、ＤＲＧ知覚ニューロンへの機械的刺激によって活性化された電流を示す図である。
【図７】図７は、本発明のＳＩＣＭを用いて生成された、ＤＲＧ知覚ニューロンの蛍光刺激を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月25日(2009.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上の、または表面における構造的、電気的、または機械的な変化を、走査型プローブ顕微鏡法を用いて前記表面の可撓性または弾性を測定することにより検出する方法であって、走査型プローブを前記表面へ接近させ、一定の距離を維持するように前記表面に対する前記プローブの位置を制御することを含み、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に圧力を加え、続けて前記プローブの位置を監視することを特徴とし、前記プローブの動きが、結果として生じる前記表面の動きを示すことによって前記変化を明らかにするようになっている方法。
【請求項２】
前記表面に正圧を加えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面に負圧を加えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブは、マイクロピペットまたはナノピペットであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記表面は、細胞構造または細胞内構造であることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記表面は、液体の表面であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記液体は、乳濁液であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記表面は、非生物学的構造のものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記走査型プローブ顕微鏡法は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法であることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記表面の、または前記表面における電気的または機械的な変化を監視するための上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞の電気生理学的または化学的な変化を誘発する方法であって、走査型プローブを前記細胞の表面へ接近させ、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に既定圧力を加え、前記細胞の電気生理学的または化学的な信号の変化を監視することを含む方法。
【請求項１２】
前記電気生理学的または化学的な信号は、細胞に存在するイオンチャネルに関連したものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法を用いて前記プローブを前記細胞へ接近させることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
表面上の、または表面における構造的、電気的、または機械的な変化を検出する装置であって、走査型プローブ顕微鏡と、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に圧力を加える手段とを備える装置。
【請求項１５】
前記走査型プローブ顕微鏡は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡であることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【国際調査報告】
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