(57)【要約】  本発明は、生細胞中のｐ３８−ＭＡＰＫ経路を通して、ストレスシグナルの伝達及び阻害を示唆するセンサーに関する。このセンサーは、レポーター遺伝子産物と、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のアイソフォームとを含んでいる。本発明は、生細胞をトランスフェクションするための、センサーをコードする核酸を含むプラスミド及びウイルスベクターも提供する。センサーを発現する安定細胞株は、生細胞又は固定化細胞で、この経路の活性化又は調節を測定するアッセイに使用できる。【選択図】  なし
2009513150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター遺伝子産物とｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のアイソフォームとを含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子産物とｐ３８ＭＡＰＫとを連結するリンカー基をさらに含む、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカー基が１０ペプチド未満のペプチドからなる、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記リンカー基がアミノ酸配列ＧＮＧＧＮＡＳからなる、請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ｐ３８ＭＡＰＫのアイソフォームが、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８β、ｐ３８δ（ＳＡＰＫ４）及びｐ３８γ（ＥＲＫ６、ＳＡＰＫ３）からなる群から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ｐ３８ＭＡＰＫのアイソフォームがｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子産物が、検出可能な発光性、蛍光性又は放射性基によって局在化できる、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子産物が蛍光タンパク質である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄからなる群から選択される、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）とを含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｅｍｅｒａｌｄとｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）とを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１１記載の融合タンパク質をコードする請求項１３記載のヌクレオチド配列であって、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列。
【請求項１５】
当該配列がプロモーターと機能的に連結し該プロモーターの調節下にある、請求項１３又は請求項１４記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
前記プロモーターが、哺乳類の構成的プロモーター、哺乳類の調節プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、酵母プロモーター、糸状菌プロモーター及び細菌プロモーターからなる群から選択される、請求項１５記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】
前記ウイルスプロモーターがＣＭＶ又はＳＶ４０プロモーターである、請求項１６記載のヌクレオチド。
【請求項１８】
前記プロモーターがヒトユビキチンＣプロモーターである、請求項１５又は請求項１６記載のヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載のヌクレオチド配列を含む複製可能なベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項１９記載の複製可能なベクター。
【請求項２１】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１９記載の複製可能なベクター。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターが、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サルウイルス４０、ウシパピローマウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２２記載の複製可能なベクター。
【請求項２３】
請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載のヌクレオチド配列で安定に形質転換された請求項２３記載の宿主細胞。
【請求項２５】
植物、昆虫、線虫、鳥類、魚類及び哺乳類細胞から選択される、請求項２３又は請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記ヒト細胞がヒト軟骨肉腫細胞株ＳＷ１３５３である、請求項２６記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質を発現することのできる、請求項２３乃至請求項２７のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２９】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を検出する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞内での融合タンパク質の局在化を経時的に測定するステップと
を含み、細胞内での融合タンパク質の局在化の変化が活性化の指標となる、方法。
【請求項３０】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合ペプチドを過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと、
ｉｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理して、細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと
を含み、上記作用因子で処理していない対照細胞と比較したときの細胞内での上記ペプチドの局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して上記作用因子の有する効果の指標となる、方法。
【請求項３１】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した第一及び第二の細胞を培養するステップと、
ｉｉ）第一の細胞を上記作用因子で処理して、第一の細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと、
ｉｉｉ）上記作用因子で処理していない第二の細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと
を含み、第一の細胞と第二の細胞内での上記タンパク質の局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して上記作用因子の有する効果の指標となる、方法。
【請求項３２】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理して、細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと、
ｉｉｉ）上記作用因子の存在下での上記タンパク質の局在化を、上記作用因子の非存在下でのタンパク質の局在化についての既知の値と比較するステップと
を含み、上記作用因子の存在下でのタンパク質の局在化と上記作用因子の非存在下での既知の値との差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して上記作用因子の有する効果の指標となる、方法。
【請求項３３】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合ペプチドを過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理するステップと、
ｉｉｉ）上記細胞をｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の既知の活性化因子で処理して、細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと
を含み、上記作用因子で処理せずに上記既知の活性化因子で処理した対照細胞と比較したときの細胞内での上記ペプチドの局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して上記作用因子の有する効果の指標となる、方法。
【請求項３４】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した第一及び第二の細胞を培養するステップと、
ｉｉ）  第一の細胞を上記作用因子で処理するステップと、
ｉｉｉ）第一の細胞と第二の細胞を、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の既知の活性化因子で処理して、第一の細胞と第二の細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと
を含み、第一の細胞と第二の細胞内での上記タンパク質の局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して上記作用因子の有する効果の指標となる、方法。
【請求項３５】
生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理するステップと、
ｉｉｉ）上記細胞をｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の既知の活性化因子で処理して、細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと、
ｉｖ）上記作用因子及び活性化因子の存在下でのタンパク質の局在化を、活性化因子は存在するが上記作用因子の非存在下でのタンパク質の局在化についての既知の値と比較するステップと
を含み、上記作用因子の存在下でのタンパク質の局在化と上記作用因子の非存在下での既知の値との差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して上記作用因子の有する効果の指標となる、方法。
【請求項３６】
前記既知の値がデータベースに保存されている、請求項２３又は請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質の局在化をその発光、蛍光及び放射能特性によって測定する、請求項２９乃至請求項３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記作用因子が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化を誘導する、請求項３０乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
前記作用因子が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化を阻害する、請求項３０乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
前記作用因子が化学物質又は物理的実体である、請求項３０乃至請求項３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
前記化学物質が薬剤候補物質である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤候補物質が炎症誘発性又は抗炎症性化合物である、請求項４１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路によるストレスシグナルの伝達及び阻害を示すセンサーに関する。本センサーを発現する安定細胞株もを提供するが、かかる細胞株は、上記経路の活性化又は調節を測定するための生細胞又は固定化細胞アッセイに使用できる。
【背景技術】
【０００２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）はセリン／スレオニンキナーゼであり、細胞表面の受容体を細胞内の標的制御因子に接続し、細胞外からのシグナルを各種の細胞アウトプットに変換する。ｐ３８ＭＡＰＫカスケードはストレス又はサイトカインによって活性化され、プロテインキナーゼの逐次活性化の複雑な経路を経て遺伝子発現をもたらす。ｐ３８ＭＡＰＫ経路の主要な活性化キナーゼはＭＫＫ３及びＭＫＫ６であり、これらはカスケードのハブを通してシグナルを伝達する（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト；非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４参照）。
【０００３】
ストレス活性化プロテインキナーゼｐ３８のアイソフォームには、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４；非特許文献５）、ｐ３８β（非特許文献６）、ストレス活性化プロテインキナーゼ３／ｐ３８γ（ＥＲＫ６，ＳＡＰＫ３；非特許文献７）、ストレス活性化プロテインキナーゼ４／ｐ３８δ（ＳＡＰＫ４；非特許文献８）がある。各ｐ３８アイソフォームは生物学的機能及び生物学的基質が異なっているかも知れないが、いずれも、最小コンセンサス配列Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏを有する基質をリン酸化する（非特許文献９）。
【０００４】
ｐ３８ＭＡＰＫの他の３種類のアイソフォームとは異なり、αアイソフォーム（ＭＡＰＫ１４）は詳しく調べられており、全哺乳類に存在し、生体組織全体で普遍的発現を示す（非特許文献１０）。重要な点として、ｐ３８ＭＡＰＫは、ストレスシグナルの伝達のための一次ハブとして作用し、上流ストレス関連シグナルはｐ３８ＭＡＰＫを通して下流へと伝達され、下流シグナルの多様化を制御できる。ｐ３８ＭＡＰＫは、インビボで、ＭＡＰＫＡＰＫファミリー、ＳＴＡＴ１、ｐ５３、ＳＡＰ１、Ｃ／ＥＢＰファミリー、ＵＳＦ−１、ＮＦＡＴ、ＰＰＡＧ活性化補助因子、ＣＤＣ２５Ｂなどの広範な調節タンパク質をリン酸化する（例えば、Ｂｉｏｃａｒｔａウェブサイト参照）。このような多様なシグナル伝達タンパク質のリン酸化のため、ｐ３８は、細胞周期、増殖、分化、アポトーシス、遊走、細胞骨格のリモデリングなどに影響を及ぼす。
【０００５】
新規治療用化合物の発見と性質決定の要望並びに上述のような多様な細胞応答におけるｐ３８ＭＡＰＫの重要性から、医薬品及びバイオ産業では上記経路の阻害剤及び活性化因子の探索が進められている。細胞アッセイにおいて、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）の活性化は、リン酸化型特異的免疫蛍光アッセイ（例えば、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国サンフランシスコ）から市販のウサギ抗リン酸化型ｐ３８ＭＡＰＫポリクローナル抗体、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社（米国ピッツバーグ）から市販のｐ３８  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で直接検出することもできるし、或いはＭＡＰＫＡＰＫ２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国アマーシャム））のようなシグナル伝達プロセスの下流の標的分子に対する酵素の影響を測定することによって間接的に検出することもできる。
【０００６】
ｐ３８は、上流シグナルが通過して下流シグナルの多様化を制御する主要な制御タンパク質であると認められており、直接アッセイでは、ストレスシグナルの伝達に関する正確なデータが得られる。間接アッセイは、ｐ３８ＭＡＰＫを通して伝達されるストレスシグナルが伝達されなかったり、ストレスシグナルが特定の下流タンパク質で希釈されるおそれがあるので、精度に劣る。また、間接アッセイでは、シグナル伝達経路の複雑さ、多様性及び相互伝達に起因する非特異的効果のため擬陽性の結果を生じることがある。
【０００７】
しかし、直接的免疫蛍光アッセイは均質でなく、生細胞でリアルタイムに実施することができない。また、固定化プロセスには数多くの洗浄及び抗体処理ステップが必要とされ、アッセイにアーチファクト及び誤差が導入されて得られる画像データの解釈が困難となるおそれがある。多数の化合物のスクリーニングには、かなりの量の特異的抗体も必要とされ、資源及びコストがかかる。さらに、リン酸化型特異的免疫検出システムは、特異的リン酸化（例えば、Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２のリン酸化）のみによる活性化の検出手段を与え、ｐ３８に関してかなりの量の情報が入手できるにもかかわらず、他の活性化部位は未だ発見されていない。
【０００８】
特許文献１には、細胞増殖を制御する抗癌化合物としての可能性をもつ新規セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）修飾因子を特定する方法が記載されている。この特許文献に開示された方法の幾つかでは、ｐ３８キナーゼ活性を刺激する作用因子を特定する。かかる化合物がＳＨＭＴ酵素活性を阻害する可能性があるからである。この特許文献では、ｐ３８レポーター遺伝子細胞アッセイを被験作用因子のスクリーニングに使用することについてほのめかされているが、試験結果はすべてインビボ標識及び抗体実験に基づくものであり、かかるアッセイが実際に開発されていた証拠はない。
【０００９】
特許文献２には、所望の真核生物のＭＡＰＫ経路のメンバーの構成的活性化変異体をスクリーニングする方法、並びにかかる変異体をドラッグデザインにおけるＭＡＰＫ経路の阻害剤のスクリーニングに使用することが記載されている。かかる活性化変異体をレポーター遺伝子アッセイに使用することは示唆されているが、かかるアッセイがなされたことを裏付けるデータはない。
【００１０】
哺乳類細胞におけるｐ３８ＭＡＰＫの過剰発現は細胞傷害性であって、アポトーシス及び老化を生じることが示されており、生細胞での均一で安定なｐ３８ＭＡＰＫレポーター遺伝子アッセイは難しいことが判明している（非特許文献１１; 非特許文献１２; 非特許文献１０）。そのため、パブリックドメインには、かかるアッセイについて確証的な実験データで実証された報告はない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１１８６６３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０２１４１８６号明細書
【非特許文献１】Shi and Gaestel 2002, Biol. Chem. 282, 1519-36
【非特許文献２】Herlaar, E. and Brown, Z. (1999), Mol. Med. Today 5, 439-447
【非特許文献３】Ichijo, H. (1999) Oncogene 18, 6087-6093
【非特許文献４】Tibbles, L.A. and Woodgett, J.R. (1999) Cell. Mol. Life Sci. 55, 1230-1254
【非特許文献５】Han et al., 1993, J. Biol. Chem., 1993, 268, 25009-25014
【非特許文献６】Jiang et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, 17920-17926
【非特許文献７】Li et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm., 228, 334-340
【非特許文献８】Jiang et al., 1997, J. Biol. Chem., 272, 30122-30128
【非特許文献９】Kuma et al., 2005, J. Biol. Chem., 280, 19472-19479
【非特許文献１０】Zarubin, T and Han, J., 2005, Cell Res., 15, 11-18
【非特許文献１１】Chen et al., 2003, Cell Death and Differentiation, 10, 516-527
【非特許文献１２】Cong, F. and Goff, S., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13819-13824
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明の目的の一つは、上述の従来技術のアッセイに付随した問題がなく、簡単で均質で経済的なｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）のアッセイ法を提供することである。かかるアッセイは、医薬品及びバイオ産業における、抗癌化合物、炎症誘発性化合物及び抗炎症剤化合物のような治療用化合物のスクリーニングに特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様では、レポーター遺伝子産物とｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のアイソフォームとを含む融合タンパク質を提供する。
【００１３】
好ましくは、融合タンパク質は、レポーター遺伝子産物とｐ３８ＭＡＰＫとを連結するリンカー基をさらに含む。好ましくは、リンカー基は、２０ペプチド未満、好ましくは１５ペプチド未満、さらに好ましくは１０ペプチド未満のペプチドを含むペプチドからなる。さらに好ましくは、リンカー基は、アミノ酸配列ＧＮＧＧＮＡＳからなるヘプタペプチドである。
【００１４】
好適には、ｐ３８ＭＡＰＫのアイソフォームは、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８β、ｐ３８δ（ＳＡＰＫ４）及びｐ３８γ（ＥＲＫ６、ＳＡＰＫ３）からなる群から選択される。好ましくは、ｐ３８ＭＡＰＫのアイソフォームはｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）である。
【００１５】
好適には、レポーター遺伝子産物は、検出可能な発光性、蛍光性又は放射性部分によって局在化される。
【００１６】
好適には、レポーター遺伝子産物は、Ａｅｑｕｏｒｉａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ（オワンクラゲ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）その他の花虫綱に属するものに由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質である（Labas et al., Proc.Natl.Acad.Sci, (2002), 99, 4256-4261）。
【００１７】
米国特許第６１７２１８８号には、発色団の１個上流のアミノ酸を変異させて蛍光強度を増大させた変異ＧＦＰが記載されている。これらの変異体では、励起及び発光最大をシフトさせずにＧＦＰの蛍光強度が実質的に増大している。Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰは、発色団の成熟時間が短いため３７℃での蛍光が約６倍増大することが示されている。
【００１８】
好ましくは、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びＥｍｅｒａｌｄからなる群から選択される。
【００１９】
最も好ましくは、蛍光タンパク質は、高感度緑色蛍光タンパク質（Cormack, B.P. et al., Gene, (1996), 173, 33-38）又はＥｍｅｒａｌｄである。ＥＧＦＰは哺乳類優先コドンで構築され、哺乳類での発現に最適化されている。
【００２０】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、例えば配列番号３（Ｃ末端ＥＧＦＰ−ｐ３８α）又は配列番号４（Ｎ末端ｐ３８α−ＥＧＦＰ）のように、高感度緑色蛍光タンパク質とｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）とを含む。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、例えば配列番号５（Ｃ末端Ｅｍｅｒａｌｄ−ｐ３８α）又は配列番号６（Ｎ末端ｐ３８α−Ｅｍｅｒａｌｄ）のように、Ｅｍｅｒａｌｄとｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）とを含む。
【００２２】
好ましくは、融合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される。
【００２３】
なお、レポーター遺伝子産物は酵素であってもよい。適当な酵素としては、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）が挙げられる。
【００２４】
本発明の第２の態様では、上述の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。例えば、配列番号３は配列番号７でコードされ、配列番号４は配列番号８でコードされ、配列番号５は配列番号９でコードされ、配列番号６は配列番号１０でコードされている。
【００２５】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択される。
【００２６】
好適には、ヌクレオチド配列はプロモーターと機能的に連結しており、該プロモーターの調節下にある。
【００２７】
好ましくは、プロモーターは、哺乳類の構成的プロモーター、哺乳類の調節プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、酵母プロモーター、糸状菌プロモーター及び細菌プロモーターからなる群から選択される。プロモーターがウイルスプロモーターの場合、プロモーターは好ましくはＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０プロモーターである。最も好ましくは、プロモーターはヒトユビキチンＣプロモーターである。
【００２８】
本発明の第３の態様では、上述のヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。好ましくは、ベクターはプラスミドベクターである。
【００２９】
ベクターがウイルスベクターの場合、ベクターは、好ましくは、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サルウイルス４０、ウシパピローマウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスベクターからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の第４の態様では、上述のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は、上述のヌクレオチド配列で安定に形質転換されている。
【００３１】
好適には、宿主細胞は、植物、昆虫、線虫、鳥類、魚類及び哺乳類の細胞から選択される。宿主細胞は好ましくは哺乳類の細胞であり、最も好ましくはヒトの細胞である。一実施形態では、第四の態様の宿主細胞はヒト軟骨肉腫細胞株ＳＷ１３５３である。
【００３２】
好適には、宿主細胞は上述の融合タンパク質を発現することができる。
【００３３】
本発明の第５の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を検出する方法であって、
ｉ）上述の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞内での融合タンパク質の局在化を経時的に測定するステップと
を含み、細胞内での融合タンパク質の局在化の変化が活性化の指標となる方法を提供する。
【００３４】
本発明の第６の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合ペプチドを過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと、
ｉｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理して、細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと
を含み、上記作用因子で処理していない対照細胞と比較したときの細胞内での上記ペプチドの局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して上記作用因子の有する効果の指標となる方法を提供する。
【００３５】
本発明の第７の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した第一及び第二の細胞を培養するステップと、
ｉｉ）第一の細胞を上記作用因子で処理して、第一の細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと、
ｉｉｉ）上記作用因子で処理していない第二の細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと
を含み、第一の細胞と第二の細胞内での上記タンパク質の局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して上記作用因子の有する効果の指標となる方法を提供する。
【００３６】
本発明の第８の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理して、細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと、
ｉｉｉ）上記作用因子の存在下での上記タンパク質の局在化を、上記作用因子の非存在下でのタンパク質の局在化についての既知の値と比較するステップと
を含み、上記作用因子の存在下でのタンパク質の局在化と上記作用因子の非存在下での既知の値との差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に際して上記作用因子の有する効果の指標となる方法を提供する。
【００３７】
本発明の第９の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合ペプチドを過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理するステップと、
ｉｉｉ）上記細胞をｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の既知の活性化因子で処理して、細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと
を含み、上記作用因子で処理せずに上記既知の活性化因子で処理した対照細胞と比較したときの細胞内での上記ペプチドの局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して上記作用因子の有する効果の指標となる方法を提供する。
【００３８】
本発明の第１０の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した第一及び第二の細胞を培養するステップと、
ｉｉ）  第一の細胞を上記作用因子で処理するステップと、
ｉｉｉ）第一の細胞と第二の細胞を、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の既知の活性化因子で処理して、第一の細胞と第二の細胞内での上記タンパク質の局在化を測定するステップと
を含み、第一の細胞と第二の細胞内での上記タンパク質の局在化の差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して上記作用因子の有する効果の指標となる方法を提供する。
【００３９】
本発明の第１１の態様では、生細胞中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して作用因子の有する効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞を培養するステップと、
ｉｉ）上記細胞を上記作用因子で処理するステップと、
ｉｉｉ）上記細胞をｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の既知の活性化因子で処理して、細胞内での上記ペプチドの局在化を測定するステップと、
ｉｖ）上記作用因子及び活性化因子の存在下でのタンパク質の局在化を、活性化因子は存在するが上記作用因子の非存在下でのタンパク質の局在化についての既知の値と比較するステップと
を含み、上記作用因子の存在下でのタンパク質の局在化と上記作用因子の非存在下での既知の値との差が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化の調節に際して上記作用因子の有する効果の指標となる方法を提供する。
【００４０】
好適には、第８及び第１１の態様の方法における既知の値はデータベースに保存されている。
【００４１】
好適には、融合タンパク質の局在化は、その発光、蛍光及び放射能特性によって測定する。
【００４２】
好適には、作用因子は、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化を誘導する。或いは、作用因子は、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化を阻害するものであってもよい。
【００４３】
好適には、作用因子は化学物質又は物理的実体である。好ましくは、作用因子は薬剤候補物質であるような化学物質である。好ましくは、薬剤候補物質は炎症誘発性又は抗炎症性化合物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
定義
本明細書で用いる「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、鎖長にはかかわりなく、アミノ酸モノマー（残基）の天然又は合成ポリマーを表すものとして互換的に用いられ、ここでいうアミノ酸モノマーには、この場合、天然アミノ酸、天然アミノ酸の構造変異体、ペプチド結合に関与できる合成非天然類似体が包含される。
【００４５】
なお、「タンパク質」は、天然アミノ酸と呼ばれるアミノ酸以外のものを含んでいることも多く、所与のタンパク質において末端アミノ酸を始めとする多くのアミノ酸が、プロセシングその他の翻訳後修飾のような自然過程又は当業界で周知の化学修飾法で修飾されていることもある。糖鎖付加、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、水酸化及びＡＤＰリボシル化のような一般的修飾については、例えば‘Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993及びRattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 663: 48-62のような基本書に記載されている。
【００４６】
タンパク質で起こる修飾は、タンパク質がどのように作られるかによって左右される。例えば、宿主中でのクローン化遺伝子の発現で作られたタンパク質では、修飾の種類及び程度は、宿主細胞の翻訳後修飾能力及びタンパク質のアミノ酸配列に存在する修飾シグナルによって大きく左右される。例えば、周知の通り、大腸菌のような細菌宿主では糖鎖付加は起こらないことが多い。そのため、糖鎖付加が望まれる場合、糖鎖付加が起こる宿主（概して真核細胞）でポリペプチドを発現させるべきである。なお、所与のポリペプチドにおける幾つかの部位での同じ種類の修飾の程度が同一又は異なることもある。また、所与のタンパク質が多くの種類の修飾を含むこともある。「タンパク質」という用語は、このようなあらゆる修飾、特に宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現に起因する修飾を包含する。
【００４７】
本明細書で用いる「融合タンパク質」（「キメラタンパク質」ともいう。）という用語は、２種以上の異なるタンパク質配列からなる非天然タンパク質をいう。例えば、国際公開第０３／０８７３９４号には、基質とセリン／スレオニンキナーゼとを含む融合タンパク質が記載されている。これらの異なる配列の起源は同一の種又は属に由来するものでも、異なる種又は属に由来するものでもよく、合成された非天然配列に由来するものでもよい。融合タンパク質は、異なる配列に由来する別々の機能を備えていてもよいし、異なる配列が単一の機能に寄与するものでもよい。本発明の融合タンパク質は適当な方法で製造することができ、かかる手段は当業者に周知であって、以下で詳しく説明する。
【００４８】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子産物」という用語は、レポーター遺伝子でコードされる検出可能なポリペプチドをいう。かかるレポーター遺伝子は当業界で周知であり、プロモーターの強さ、遺伝子送達系の効率、遺伝子産物の細胞内運命、分子クローニング作業の成功などの様々な特性や事象の「レポート（報告）」に用いられている。レポーター遺伝子の例としては、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）及び蛍光タンパク質（ＦＰ）が挙げられる。
【００４９】
本明細書で用いる「アイソフォーム」という用語は、一次構造は異なるが同じ機能を保持している同一タンパク質の複数の形態をいう。
【００５０】
「機能的に連結」という用語は、２以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列など）の間の機能的関係をいう。通例、この用語は転写調節配列と転写配列との機能的関係をいう。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列が適当な宿主細胞中でのコード配列の転写を刺激又は調節する場合には、プロモーター又はエンハンサー配列はコード配列と機能的に連結している。
【００５１】
「ヌクレオチド配列」は、核酸であって、ヌクレオチド（例えばＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇなど、又は天然又は人工ヌクレオチド類似体）のポリマーである。所与の核酸又は相補的な核酸は、いずれかの特定されたポリヌクレオチド配列から決定することができる。
【００５２】
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーをいい、特記しない限り、核酸に対して天然ヌクレオチドと同様にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知の類似体も包含する。
【００５３】
「ベクター」は、細胞に所定の核酸を導入し、その複製及び／又は発現を促進する組成物である。ベクターとしては、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、細菌、ポリリジンなどが挙げられる。ベクターは、好ましくは、１以上の複製開始点と組換えＤＮＡを挿入できる１以上の部位とを有する。ベクターは、ベクターを含む細胞を含まないそうでないものから選別することのできる簡便な手段（例えば薬剤耐性遺伝子をコードする部分）を含むことが多い。一般的なベクターとしては、プラスミド、ウイルスゲノム及び（主に酵母及び細菌での）「人工染色体」などがある。「発現ベクター」は、ベクターにクローニングした核酸の転写機能を付与又は促進する要素を含むベクターである。かかる要素としては、例えば、核酸と機能的に連結したプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。
【００５４】
本明細書では、「プラスミド」は、当業者に周知の命名法に従って、小文字のｐの前及び／又は後に大文字及び／又は数字で表記する。本明細書で開示するプラスミドは、市販され、制限なく公衆に利用可能なものであるか、入手可能なプラスミドを周知の慣用法で構築することができる。本発明で使用できるプラスミドその他のクローニング用又は発現用ベクターの多くは周知であり、当業者が容易に入手できる。また、本発明での使用に適した他のプラスミドを構築することも当業者には容易であろう。さらに、本発明におけるかかるプラスミドその他のベクターの性質、構成及び使用法は、本明細書の開示内容から当業者には自明であろう。
【００５５】
本明細書で用いる「宿主細胞」という用語は、原核細胞又は真核細胞であって、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、形質転換、プラスミドトランスフェクション、ウイルス感染などの手段によって異種ＤＮＡを細胞に導入したものをいう。
【００５６】
「ヌクレオチド配列で安定に形質転換された宿主細胞」（「安定細胞株」という用語と互換的に用いられる。）は、細胞のゲノムＤＮＡにヌクレオチド配列が安定に組み込まれた宿主細胞をいい、ヌクレオチド配列でコードされたタンパク質を発現するという細胞の特性は、細胞分裂で受け継がれる。
【００５７】
「調節」という用語は、対象分子の細胞レベルその他の生物活性の変化をいう。調節は、上方制御（すなわち、活性化又は刺激）でも、下方制御（すなわち、阻害又は抑制）でもよい。発現レベルの調節については、かかる変化は、対象遺伝子（例えばレポーター遺伝子）の発現量の増減、対象タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増減、翻訳効率の増減、或いはタンパク質の翻訳後修飾又は安定性の変化などに起因する。その作用形態は直接的なもの、例えば対象タンパク質との結合又は対象タンパク質をコードする遺伝子との結合などであってもよい。かかる変化は間接的なもの、例えば対象タンパク質を調節する他の分子との結合及び／又は修飾（例えば酵素によるもの）であってもよい。
【００５８】
「処理」という用語は通常の意味で用いられ、第一の実体を第二の実体と（例えば、細胞を作用因子と）組み合わせたり接触させることをいう。
【００５９】
「作用因子（ａｇｅｎｔ）」という用語には、あらゆる物理的実体又は化学物質が包含される。物理的実体の例としては、電磁波（例えば紫外線や赤外線）が挙げられる。作用因子が化学物質である場合、作用因子は物質、分子、元素、化合物又はそれらの組合せとし得る。これらには、特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、低分子量有機分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどが挙げられる。作用因子は、天然物、合成化合物、化学品又は２種以上の物質の組合せでもよい。治療に潜在的有用性をもつ薬剤候補物質であってもよい。特記しない限り、「作用因子」、「物質」及び「化合物」という用語は互換的に用いられる。
【００６０】
図面の簡単な説明
図１Ａは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）のＤＮＡ配列を示す。
【００６１】
図１Ｂ  は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）のタンパク質配列を示す。
【００６２】
図２Ａは、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｎ１のベクターマップを示す。
【００６３】
図２Ｂは、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１のベクターマップを示す。
【００６４】
図３Ａは、アデノウイルスベクターｐＤＣ５１５−ＵＢＣ−Ｅｍｅｒａｌｄ−Ｎ１のベクターマップを示す。
【００６５】
図３Ｂは、アデノウイルスベクターｐＤＣ５１５−ＵＢＣ−Ｅｍｅｒａｌｄ−Ｃ１のベクターマップを示す。
【００６６】
図４は、Ｃ末端ＥＧＦＰ−ｐ３８αのタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【００６７】
図５は、Ｎ末端ｐ３８α−ＥＧＦＰのタンパク質配列（配列番号４）を示す。
【００６８】
図６は、Ｃ末端Ｅｍｅｒａｌｄ−ｐ３８αのタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【００６９】
図７は、Ｎ末端ｐ３８α−Ｅｍｅｒａｌｄのタンパク質配列（配列番号６）を示す。
【００７０】
図８は、Ｃ末端ＥＧＦＰ−ｐ３８αのＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【００７１】
図９は、Ｎ末端３８α−ＥＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。
【００７２】
図１０は、Ｃ末端Ｅｍｅｒａｌｄ−ｐ３８αのＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【００７３】
図１１は、Ｎ末端ｐ３８α−ＥｍｅｒａｌｄのＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す。
【００７４】
図１２は、活性化後のＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の核中への転位置の模式図である。
【００７５】
図１３Ａは、ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示す。
【００７６】
図１３Ｂは、ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示すとともに１５分間の０．４Ｍソルビトール処理に対する応答を示す。
【００７７】
図１３Ｃは、ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示すとともに１５分間の３００ｎＭアニソマイシン処理に対する応答を示す。
【００７８】
図１４は、ＳＷ１３５３生細胞におけるＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核から細胞質への経時的再配置（Ｎ：Ｃ比）を示すグラフである。経時的分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００装置で取得した画像データに基づいて行った。グラフでは、３５分間の３００ｎＭアニソマイシン処理に対する生細胞の応答（■及び実線）を未処理の対照細胞（▲及び点線）と対比して示す。
【００７９】
図１５Ａは、ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、０分間の１２ｐＭ  ＩＬ−１β処理に応答したＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示す。
【００８０】
図１５Ｂは、ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、２０分間の１２ｐＭ  ＩＬ−１β処理に応答したＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示す。
【００８１】
図１６は、ＳＷ１３５３生細胞におけるＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核から細胞質への経時的再配置（Ｎ：Ｃ比）を示すグラフである。経時的分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００装置で取得した画像データに基づいて行った。グラフでは、９０分間のＩＬ−１β（１２ｐＭ）処理に対する生細胞の応答（■及び実線）を未処理の対照細胞（▲及び点線）と対比して示す。この実験ではヘキスト３３３４２は使用せず、対照細胞におけるベースライン応答は視認できない（図１４と対比されたい。）。
【００８２】
図１７は、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間ＩＬ−１βで処理してから固定化したもので得られた活性化因子用量反応曲線である。分析はＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。安定細胞を８代及び１５代継代し、グラフは長期間の培養での応答の安定性（ＭＯＲ及びＥＣ５０）を示す。画像の取得及び分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置で実施した。
【００８３】
図１８は、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間ＩＬ−１βで処理してから固定化したもののＮ：Ｃ比とウェル当たりの細胞数のプロットである。分析は、「サイトカイン応答アッセイの再現性」（ｎ＝１４４）のデータで得られたＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。水平からのベストフィット直線のずれは処理群及び未処理群で顕著であった（それぞれＦ＝１９及び７０、両曲線ともＰ＜０．０００１）。画像の取得及び分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置で行った。×及び点線は対照細胞を、●及び実線はＩＬ−１β処理細胞を表す。
【００８４】
図１９は、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間３１６ｐＭ  ＩＬ−１β又は対照培地で処理したときの応答を示す固定化細胞アッセイで得られた画像である。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００で３色画像（ヘキスト、図示せず）を取得し、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の応答（最上段）、リン酸化型ｐ３８に対するＡｌｅｘａ  ６４７標識抗体による染色（中段）、シグナルの共局在（最下段）を示す。
【００８５】
図２０は、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質（緑色）の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間ＩＬ−１βで処理してから固定化したもので得られた活性化因子用量反応曲線である。固定後、細胞を抗リン酸化型（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）−ｐ３８（ＭＡＰＫ１４）抗体で処理して、Ａｌｅｘａ  ６４７標識二次抗体（赤色）で可視化した。分析はＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４シグナル（右側の縦軸、○印及び実線）の核／細胞質比に基づく。分析は、Ａｌｅｘａ  ６４７標識抗リン酸化型ｐ３８の核／細胞質シグナル強度に基づく。ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４アッセイ及び免疫蛍光アッセイでそれぞれ７．１６ｐＭ及び７．８２ｐＭ（ｎ＝８）のＥＣ５０値が得られた。
【００８６】
図２１は、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ、ｎ＝８）で３０分間インキュベートしてからアニソマイシン（１００ｎＭ）で３０分間活性化して固定化したもので得られた阻害剤応答である。棒は、ＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。画像の取得及び分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置で実施した。
【００８７】
図２２は、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を阻害剤Ａ（０．００５〜３００ｎＭ；ｎ＝８）で３０分間インキュベートしてから３０分間ＩＬ−１β（１２ｐＭ＝ＥＣ８０）で活性化して固定化したもので得られた阻害剤用量反応曲線である。曲線はＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。
【００８８】
ＭＡＰＫ１４レポーター遺伝子のベクターの生成
ｐ３８αＭＡＰＫ１４変異体２に対応する遺伝子は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（クローン５１８１０６４；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＢＣ０３１５７４、配列番号１、図１）から入手した。配列番号２は、配列番号１でコードされたタンパク質の配列を示す。ＰＣＲプライマーは、ＭＡＰＫ１４遺伝子全体が増幅され、その生成物をプラスミドベクターｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｎ１及びｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国アマーシャム）、図２ａ及び２ｂ）或いはアデノウイルスベクターｐＤＣ５１５−ＵＢＣ−Ｅｍｅｒａｌｄ−Ｎ１及びｐＤＣ５１５−ＵＢＣ−Ｅｍｅｒａｌｄ−Ｃ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ、図３ａ及び３ｂ）のＮ末端又はＣ末端融合タンパク質としてサブクローニングできるように設計した。ＭＡＰＫ１４断片の５′末端でのＮｈｅＩ制限酵素部位の導入及び３′末端でのＸｈｏＩ制限酵素部位の導入によって、ベクターのＮｈｅＩ及びＳａｌＩ制限部位のサブクローニングが可能となった。ｐＣＯＲＯＮ１００２ベクターは安定細胞株の生産ができるように細菌アンピシリン耐性遺伝子と哺乳類ネオマイシン耐性遺伝子を含んでおり、融合タンパク質はヒトユビキチンＣプロモーターによって発現される。ヒトユビキチンＣプロモーターを選択したのは、宿主細胞系の動揺を最小限に抑制して安定で頑強な細胞株及びアッセイを得るのに望まれる均質で一定レベルの融合タンパク質発現をもたらすためである。
【００８９】
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質を安定に発現する細胞株の生成
ヒト軟骨肉腫細胞株ＳＷ１３５３（ＡＴＣＣ）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション剤（Ｒｏｃｈｅ社（英国））を用いて、プラスミドベクターｐＣＯＲＯＮ１００２ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４及びｐＣＯＲＯＮ１００２ＥＧＦＰ−Ｎ１−ＭＡＰＫ１４でトランスフェクションした。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン、１％（ｖ／ｖ）グルタミン添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（英国））で維持した。組換え融合タンパク質を発現する安定クローンを、ジェネテシン（５００μｇ／ｍｌ）での選択によって、４週間かけて選別した。継代数の少ない段階での一次クローンの特性決定には、均質性及び発現レベルを測定するとともに親細胞株との形態的関連性及び生物学的反応の生理学的関連性を比較するためフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。これらの特性をさらに継代を重ねた細胞についても分析し、細胞株の経時的安定性を評価した。適宜二次クローンを単離して同様に分析した。ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈し、望ましい規準を満たす細胞株を、２００μｇ／ｍｌのジェネテシンを含有する増殖培地で維持した。選択したクローンでは、３０代目まで融合タンパク質が安定に発現されることが実証された。
【００９０】
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４を安定に発現する細胞株を用いた融合タンパク質の転位置測定によるＭＡＰＫ１４の活性化アッセイ
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質集団は主に休止細胞の細胞質に存在するか、或いは休止細胞全体に均一に分布している。しかし、浸透圧ショック、タンパク質翻訳阻害又はサイトカイン処理のような外部ストレスによって細胞が刺激されると、標識ＭＡＰＫ１４集団の一部は核に再局在化する（図１２）。
【００９１】
アッセイの準備及びアッセイ全体で、バックグラウンドストレス応答は最小限に維持し、マイクロプレート、細胞及び溶液は３７℃、５％ＣＯ２及び相対湿度９５％に維持した。阻害剤及び活性化因子はすべて完全培地中で細胞に添加した。
【００９２】
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質を安定に発現する細胞を、１００μｌの維持培地に懸濁し、Ｐａｃｋａｒｄ社製ブラック９６ウェルＶｉｅｗＰｌａｔｅにウェル当たり８×１０３の細胞数で播種した。完全培地中で予め調製しておいた試験活性化因子及び対照化合物５０μｌを加えて、３７℃、５％ＣＯ２及び相対湿度９５％でインキュベートした。固定化細胞アッセイでは、１５０μｌの１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン（４％ホルムアルデヒド）を室温で２０分間加えた。細胞はＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中のヘキスト溶液（１０μＭ）で核を染色してから、画像を取得した。プレートはＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国アマーシャム））又はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国アマーシャム））で画像化し、画像は製造業者の指示に従ってＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００のＮｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国アマーシャム））又はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００のＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国アマーシャム））で分析した。
【００９３】
浸透圧ショックに対する応答
ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４を安定に発現するＳＷ１３５３生細胞を、０．４Ｍソルビトール又は３００ｎＭアニソマイシンで１５分間処理し、その応答を、同じ構築物を発現する未処理の対照細胞と対比した。
【００９４】
ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４を安定に発現するＳＷ１３５３生細胞の画像を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００装置を用いて取得した（図１３）。左側の図（図１３Ａ）は、活性化因子も阻害剤を含まない培地中で１５分間処理した細胞（「対照細胞」）の画像であり、レポータータンパク質の緑色の蛍光が各細胞の全体に分布している。１５分間の０．４Ｍソルビトール処理（中央の図、図１３Ｂ）又は１５分間の３００ｎＭアニソマイシン処理（右側の図、図１３Ｃ）に対する応答としてのＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の核への転位置が図１３Ｂ及び図１３Ｃで認められる。
【００９５】
１５分間０．４Ｍソルビトール処理した細胞では、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核への蓄積が明らかに認められ、この刺激は刺激開始から９０分以上認められた。
【００９６】
タンパク質翻訳阻害に対する応答
ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００のデータから得た生細胞の経時的画像の分析（図１４）から、３５分間のアニソマイシン（３００ｎＭ）処理に応答して、ＳＷ１３５３細胞においてＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核から細胞質への顕著な再配置（Ｎ：Ｃ比）が認められる。この実験では、ヘキスト３３３４２を使用したが、これによって対照細胞でのベースラインストレス応答が起きた。
【００９７】
１５分間３００ｎＭアニソマイシン処理した細胞では、ＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核への蓄積が明らかに認められた（図１３Ｃ及び１４）。しかし、経時的分析では、この種のストレス応答で予測されるように、２０〜３５分の間にシグナルのゆっくりとした平衡化が起こった（図１４）。
【００９８】
サイトカインに対するＳＷ１３５３細胞の応答
１２ｐＭのＩＬ−１βで処理した生細胞では、細胞質から核へのＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４シグナルの明瞭な転位置が認められ（図１５Ａ及び１５Ｂ）、２０〜４０分で核におけるシグナルの蓄積が最大となった（図１６）。炎症反応で予想されるように、４０〜９０分の間にシグナルのゆっくりとした平衡化が起こった（図１６）。
【００９９】
サイトカイン用量反応
ＳＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４を安定に発現するＷ１３５３細胞に、ＩＬ−１βを０．０１７〜３３３ｐＭの最終濃度で加えた。単一クローン由来の安定細胞集団の８代目及び１５代目の細胞の用量反応曲線から、この細胞株の応答が、経時的に安定していることが分かる（図１７）。ＥＣ５０値はそれぞれ２．５及びｐＭであった（Ｎ＝８、Ｓ：Ｎはそれぞれ６．５及び４）。
【０１００】
サイトカイン応答アッセイの再現性
安定な発現を示すＳＷ１３５３細胞におけるＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の転位置に関するアッセイの再現性について検討した。アッセイあ３枚の別個の９６ウェルプレート上で実施した。各プレートのウェルに、対照培地で処理した細胞（ｎ＝４８）とＩＬ−１β（１２ｐＭ）で処理した細胞を交互に入れた。全体のシグナル／ノイズ比は３．６１：１（ｎ＝１４４）であった。
【０１０１】
細胞の播種密度及び成長速度によるサイトカイン応答アッセイのばらつき
処理細胞及び未処理細胞での核／細胞質比の平均の標準偏差に寄与するばらつきを分離できれば、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達を活性化／阻害する化合物のスクリーニングのための改良アッセイの作成に役立つはずである。
【０１０２】
ＩＬ−１β又は対照培地で処理した細胞のＮ：Ｃ比（上述の「サイトカイン応答アッセイの再現性」からのデータ）を細胞数に関して分析すると、「ベストフィット直線」が水平でないことから、細胞播種密度及び細胞数がアッセイのばらつきに有意な影響をもつことが明らかである（図１８）。スクリーニングの際にすべてのウェルに正確に同じ数の細胞を入れることやプレート全域で成長速度を制御するのは、周縁効果などのため、極めて困難である。そこで、薬剤スクリーニングアッセイにおいて、Ｎ：Ｃ比と細胞数とのプロットを用いると、細胞数のばらつき、化合物に起因する細胞傷害性及び細胞周期の停止などによる影響が明らかとなるので、正確な「ヒット」の識別に役立つ。
【０１０３】
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の生物学的活性化と、抗リン酸化型ｐ３８免疫蛍光アッセイとの相関
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４アッセイの経時的及び生物学的応答を、ｐ３８（ＭＡＰＫ１４）活性化の広く認められたアッセイであるリン酸化型（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）−ｐ３８（ＭＡＰＫ１４）に対する免疫蛍光アッセイとの同時分析によって評価した。ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質を安定に発現するＳＷ１３５３細胞を、ＩＬ−１βで処理し、固定化し、上述の通りヘキスト染色した。次いで、細胞を洗浄し（ＰＢＳ中１％ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ）、室温で１５分間透過処理し（洗浄緩衝液中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）、再度洗浄した。５０μｌのウサギ抗リン酸化型ｐ３８抗体（１：２００）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国サンフランシスコ））を添加して室温で１時間インキュベートしてから、２回洗浄し、５０μｌのヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ６４７抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を１：２００で加え、室温で１時間インキュベートした。２回洗浄した後、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置でＰＢＳ中の細胞の画像を取得して、ヘキスト、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４及びＡｌｅｘａ  ６４７を検出した。
【０１０４】
ＩＬ−１β処理細胞では、細胞質から核への緑色ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４シグナルの明瞭な転位置が認められた（図１９）。ＩＬ−１β処理細胞では、免疫蛍光アッセイ（赤色シグナル）で検出されるリン酸化型ｐ３８シグナルと、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４シグナルとが共局在を示し、これらの方法が相関していて、ＭＡＰＫ１４の活性化の検出にこれらの方法のいずれか又は両方を使用できることが実証された（図１９）。また、これらの方法を併用すると、転位置を起こさないがリン酸化を活性化／阻害する化合物を識別することができる。２つの方法を用いて得た用量反応曲線は、２つの方法の良好な相関を示している（図２０）。ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４アッセイ及び免疫蛍光アッセイでのＥＣ５０値はそれぞれ７．１６ｐＭ及び７．８２ｐＭであった。
【０１０５】
ＥＧＦＰの発現を示す安定細胞株を用いた融合タンパク質の転位置測定によるＭＡＰＫ１４の活性化の阻害剤のアッセイ
ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質を安定に発現する細胞を、（１００μｌ維持培地に懸濁して）Ｐａｃｋａｒｄ社製ブラック９６ウェルＶｉｅｗＰｌａｔｅｓにウェル当たり０．８×１０４の細胞数で播種した。次いで、培地中の阻害剤２μｌを加えて細胞を３０分間予めインキュベートしておいてから、培地中で予め調製しておいた試験活性化因子及び対照２５μｌを加えてさらに３０分間インキュベートした。細胞を上述の通り、固定化、画像化し、分析した。
【０１０６】
アニソマイシン（１００ｎＭ）によるＳＷ１３５３細胞でのＭＡＰＫ１４の活性化及び融合タンパク質の転位置は、ｐ３８α（ＭＡＰＫ１４）阻害剤ＳＢ２０３５８０（１０μＭ、図２１）で予めインキュベートしておくことによって、顕著に阻害された。
【０１０７】
ＩＬ−１βによるＭＡＰＫ１４活性化の阻害剤で予めインキュベートしておいた細胞は、活性化に応答せず、ＥＣ５０は３．６ｎＭであった（図２２）。
【０１０８】
本明細書で引用した特許文献その他の刊行物の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。本発明の好ましい例示的な実施形態について説明してきたが、単なる例示のために記載した実施形態以外の形態でも本発明を実施することができることは当業者には自明であり、本発明はこれらの実施形態に限定されない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）のＤＮＡ配列を示す。
【図１Ｂ】マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）のタンパク質配列を示す。
【図２Ａ】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｎ１のベクターマップを示す。
【図２Ｂ】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１のベクターマップを示す。
【図３Ａ】アデノウイルスベクターｐＤＣ５１５−ＵＢＣ−Ｅｍｅｒａｌｄ−Ｎ１のベクターマップを示す。
【図３Ｂ】アデノウイルスベクターｐＤＣ５１５−ＵＢＣ−Ｅｍｅｒａｌｄ−Ｃ１のベクターマップを示す。
【図４】Ｃ末端ＥＧＦＰ−ｐ３８αのタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【図５】Ｎ末端ｐ３８α−ＥＧＦＰのタンパク質配列（配列番号４）を示す。
【図６】Ｃ末端Ｅｍｅｒａｌｄ−ｐ３８αのタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図７】Ｎ末端ｐ３８α−Ｅｍｅｒａｌｄのタンパク質配列（配列番号６）を示す。
【図８】Ｃ末端ＥＧＦＰ−ｐ３８αのＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図９】Ｎ末端３８α−ＥＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。
【図１０】Ｃ末端Ｅｍｅｒａｌｄ−ｐ３８αのＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【図１１】Ｎ末端ｐ３８α−ＥｍｅｒａｌｄのＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す。
【図１２】活性化後のＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の核中への転位置の模式図である。
【図１３Ａ】ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示す。
【図１３Ｂ】ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示すとともに１５分間の０．４Ｍソルビトール処理に対する応答を示す。
【図１３Ｃ】ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示すとともに１５分間の３００ｎＭアニソマイシン処理に対する応答を示す。
【図１４】ＳＷ１３５３生細胞におけるＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核から細胞質への経時的再配置（Ｎ：Ｃ比）を示すグラフである。経時的分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００装置で取得した画像データに基づいて行った。グラフでは、３５分間の３００ｎＭアニソマイシン処理に対する生細胞の応答（■及び実線）を未処理の対照細胞（▲及び点線）と対比して示す。
【図１５Ａ】ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、０分間の１２ｐＭ  ＩＬ−１β処理に応答したＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示す。
【図１５Ｂ】ＳＷ１３５３生細胞のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００画像であり、２０分間の１２ｐＭ  ＩＬ−１β処理に応答したＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を示す。
【図１６】ＳＷ１３５３生細胞におけるＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の核から細胞質への経時的再配置（Ｎ：Ｃ比）を示すグラフである。経時的分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００装置で取得した画像データに基づいて行った。グラフでは、９０分間のＩＬ−１β（１２ｐＭ）処理に対する生細胞の応答（■及び実線）を未処理の対照細胞（▲及び点線）と対比して示す。この実験ではヘキスト３３３４２は使用せず、対照細胞におけるベースライン応答は視認できない（図１４と対比されたい。）。
【図１７】ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間ＩＬ−１βで処理してから固定化したもので得られた活性化因子用量反応曲線である。分析はＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。安定細胞を８代及び１５代継代し、グラフは長期間の培養での応答の安定性（ＭＯＲ及びＥＣ５０）を示す。画像の取得及び分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置で実施した。
【図１８】ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間ＩＬ−１βで処理してから固定化したもののＮ：Ｃ比とウェル当たりの細胞数のプロットである。分析は、上記の「サイトカイン応答アッセイの再現性」（ｎ＝１４４）のデータで得られたＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。水平からのベストフィット直線のずれは処理群及び未処理群で顕著であった（それぞれＦ＝１９及び７０、両曲線ともＰ＜０．０００１）。画像の取得及び分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置で行った。×及び点線は対照細胞を、●及び実線はＩＬ−１β処理細胞を表す。
【図１９】ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間３１６ｐＭ  ＩＬ−１β又は対照培地で処理したときの応答を示す固定化細胞アッセイで得られた画像である。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００で３色画像（ヘキスト、図示せず）を取得し、ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４の応答（最上段）、リン酸化型ｐ３８に対するＡｌｅｘａ  ６４７標識抗体による染色（中段）、シグナルの共局在（最下段）を示す。
【図２０】ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質（緑色）の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を３０分間ＩＬ−１βで処理してから固定化したもので得られた活性化因子用量反応曲線である。固定後、細胞を抗リン酸化型（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）−ｐ３８（ＭＡＰＫ１４）抗体で処理して、Ａｌｅｘａ  ６４７標識二次抗体（赤色）で可視化した。分析はＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４シグナル（右側の縦軸、○印及び実線）の核／細胞質比に基づく。分析は、Ａｌｅｘａ  ６４７標識抗リン酸化型ｐ３８の核／細胞質シグナル強度に基づく。ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４アッセイ及び免疫蛍光アッセイでそれぞれ７．１６ｐＭ及び７．８２ｐＭ（ｎ＝８）のＥＣ５０値が得られた。
【図２１】ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ、ｎ＝８）で３０分間インキュベートしてからアニソマイシン（１００ｎＭ）で３０分間活性化して固定化したもので得られた阻害剤応答である。棒は、ＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。画像の取得及び分析はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００装置で実施した。
【図２２】ＥＧＦＰ−ＭＡＰＫ１４融合タンパク質の安定な発現を呈するＳＷ１３５３細胞を阻害剤Ａ（０．００５〜３００ｎＭ；ｎ＝８）で３０分間インキュベートしてから３０分間ＩＬ−１β（１２ｐＭ＝ＥＣ８０）で活性化して固定化したもので得られた阻害剤用量反応曲線である。曲線は、ＥＧＦＰシグナルの核／細胞質比に基づく。
【図１Ａ】
2009513150.tif 000003
【図１Ｂ】
2009513150.tif 000004
【図２Ａ】
2009513150.tif 000005
【図２Ｂ】
2009513150.tif 000006
【図３Ａ】
2009513150.tif 000007
【図３Ｂ】
2009513150.tif 000008
【図４】
2009513150.tif 000009
【図５】
2009513150.tif 000010
【図６】
2009513150.tif 000011
【図７】
2009513150.tif 000012
【図８】
2009513150.tif 000013
【図９】
2009513150.tif 000014
【図１０】
2009513150.tif 000015
【図１１】
2009513150.tif 000016
【図１２】
2009513150.tif 000017
【図１３Ａ】
2009513150.tif 000018
【図１３Ｂ】
2009513150.tif 000019
【図１３Ｃ】
2009513150.tif 000020
【図１４】
2009513150.tif 000021
【図１５Ａ】
2009513150.tif 000022
【図１５Ｂ】
2009513150.tif 000023
【図１６】
2009513150.tif 000024
【図１７】
2009513150.tif 000025
【図１８】
2009513150.tif 000026
【図１９】
2009513150.tif 000027
【図２０】
2009513150.tif 000028
【図２１】
2009513150.tif 000029
【図２２】
2009513150.tif 000030
【配列表】
2009513150000001.app
【国際調査報告】
2009513150.tif 000031
2009513150.tif 000032
2009513150.tif 000033
2009513150.tif 000034
2009513150.tif 000035