(57)【要約】本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激する、細菌のＩＩＩ型分泌系の、抗原欠損変異腫瘍を処置するための使用に関する。腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するおよび／または増大させるための方法が提供される。本発明はまた、ＩＩＩ型分泌系を有する細菌を用いる、末梢血単核球からの抗原提示細胞の調製に関する。
2009510169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍により発現される第１のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、
かかる処置を必要とする対象に、非病原性細菌であって、ＩＩＩ型分泌系と、前記非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合した前記腫瘍により発現される免疫原性の第２のタンパク質またはその免疫原性断片を含む融合タンパク質をコードする核酸とを含む前記非病原性細菌を投与すること
を含み、ここで、前記融合タンパク質は、前記第１のタンパク質および前記免疫原性の第２のタンパク質に対する免疫反応を刺激するものである、前記方法。
【請求項２】
免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
免疫原性の第２のタンパク質または免疫原性断片が、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
非病原性S. enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非病原性細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つより多い腫瘍抗原がコードされている、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
免疫応答の刺激が、既存の免疫応答の増大である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片が、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非病原性S. enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つより多い腫瘍抗原がコードされている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍により発現される第１のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、
かかる処置を必要とする対象に免疫原性の第２のタンパク質またはその免疫原性断片を発現する核酸を投与すること、および、
次いで前記対象に、非病原性細菌であって、ＩＩＩ型分泌系と、前記非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合した免疫原性の第２のタンパク質またはその免疫原性断片を含む融合タンパク質をコードする核酸とを含む前記非病原性細菌を投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片が、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
非病原性S. enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
非病原性細菌が経口投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
核酸が非経口投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
１つより多い腫瘍抗原がコードされている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
免疫応答の刺激が、既存の免疫応答の増大である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片が、第２の腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
非病原性細菌が、Salmonella spp., Yersinia spp., Bordetella spp., Escherichia coli, Shigella spp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
非病原性S. enterica 細菌がS. typhimuriumである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
非病原性細菌が経口投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
核酸が非経口投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
１つより多い腫瘍抗原がコードされている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍への免疫応答を誘発するための方法であって、
腫瘍を有する対象に、該対象が既存の免疫応答を有する抗原をＩＩＩ型分泌系により発現する、ＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を投与することを含み、それにより前記腫瘍の細胞の少なくともいくつかが前記抗原を発現する、前記方法。
【請求項４６】
第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片が、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
非病原性S. enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
非病原性S. typhimurium 細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
組み換え非病原性細菌が腫瘍内投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
組み換え非病原性細菌が注入により投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
組み換え非病原性細菌が腫瘍部位に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
組み換え非病原性細菌が腫瘍の全切除または部分切除後に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
抗原がウイルスの抗原である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
ウイルスがインフルエンザウイルス、Epstein-Barrウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
抗原が、対象が免疫された微生物の抗原である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
微生物が、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、水痘、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、細菌性髄膜炎（ｂ型インフルエンザ菌）、ポリオまたは肺炎連鎖球菌感染（侵襲性肺炎球菌疾患）を引き起こす、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
抗原が非腫瘍抗原である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
抗原が腫瘍抗原である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
腫瘍抗原がNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
腫瘍抗原がNY-ESO-1である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
腫瘍抗原がNY-CO-58である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
腫瘍抗原がMAGE-A3である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
腫瘍抗原がSSX2である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
細胞における抗原の発現が骨髄由来間質細胞への交差提示を誘発するのに十分である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６７】
１つより多い腫瘍抗原をコードする、請求項４６に記載の方法。
【請求項６８】
対象における抗原欠損変異腫瘍を処置するための方法であって、
１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍へ、該１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍における発現が欠損している抗原をＩＩＩ型分泌系により発現する、ＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を投与すること
を含み、これにより、前記組み換え非病原性細菌が前記１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍の細胞に感染し、前記細胞において前記抗原の発現を引き起こし、それにより前記１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍に対する免疫応答を誘導する、前記方法。
【請求項６９】
第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片が、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
非病原性S. enterica 細菌がS. typhimuriumである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
組み換え非病原性細菌が腫瘍内に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
組み換え非病原性細菌が注入により投与される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
組み換え非病原性細菌が腫瘍部位に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
組み換え非病原性細菌が腫瘍の全切除または部分切除後に投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
投与がＣＤ４＋免疫応答を誘発する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
投与がＣＤ８＋免疫応答を誘発する、請求項６８に記載の方法
【請求項８０】
細胞における抗原の発現が骨髄由来間質細胞への交差提示を誘導するのに十分である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８１】
抗原が腫瘍抗原である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
腫瘍抗原がNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
腫瘍抗原がNY-ESO-1である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
腫瘍抗原がNY-CO-58である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
腫瘍抗原がMAGE-A3である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
腫瘍抗原がSSX2である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
１つより多い腫瘍抗原がコードされている、請求項６９に記載の方法。
【請求項８８】
末梢血単核球から抗原提示細胞を調製するための方法であって、
対象からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得ること、
前記ＰＢＭＣを、ＩＩＩ型分泌系により抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌と接触させること、
前記接触させたＰＢＭＣを培養すること、および
抗原提示細胞を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項８９】
ＰＢＭＣがＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
非病原性S. enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
抗原が腫瘍抗原である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
腫瘍抗原が、NY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
腫瘍抗原がNY-ESO-1である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
腫瘍抗原がNY-CO-58である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
腫瘍抗原がMAGE-A3である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
腫瘍抗原がSSX2である、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
請求項８８〜９５のいずれかに記載の方法により調製した抗原提示細胞の単離された集団。
【請求項１０１】
細胞が抗原提示細胞である、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０２】
抗原特異的Ｔ細胞を調製するための方法であって、
対象からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得ること、
前記ＰＢＭＣを、請求項１００に記載の抗原提示細胞と接触させること、
前記接触させたＰＢＭＣを培養すること、および、
前記ＰＢＭＣから抗原特異的Ｔ細胞を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項１０３】
抗原特異的Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
抗原特異的Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項１０２に記載の方法により調製された抗原特異的Ｔ細胞の単離された集団。
【請求項１０６】
Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１０５に記載のＴ細胞の単離された集団。
【請求項１０７】
Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１０５に記載のＴ細胞の単離された集団。
【請求項１０８】
受動免疫付与のための方法であって、
かかる処置を必要とする対象に請求項１０５〜１０７のいずれかに記載のＴ細胞の集団を投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項１０９】
免疫付与のためのキットであって、
抗原をコードするＤＮＡワクチンベクターを含有する第１の容器、および、
ＩＩＩ型分泌系により前記抗原を発現する、ＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を含有する第２の容器、
を含む、前記キット。
【請求項１１０】
抗原が腫瘍抗原である、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
腫瘍抗原が、NY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
腫瘍抗原がNY-ESO-1である、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
腫瘍抗原がNY-CO-58である、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１４】
腫瘍抗原がMAGE-A3である、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１５】
腫瘍抗原がSSX2である、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１６】
免疫付与のためのキットであって、
抗原に対するワクチンを１回量または２回量以上含有する第１の容器、および、
ＩＩＩ型分泌系により前記抗原を発現する、ＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を含有する第２の容器、
を含む、前記キット。
【請求項１１７】
抗原が腫瘍抗原でない、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１１８】
抗原が、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、水痘、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、細菌性髄膜炎（ｂ型インフルエンザ菌）、ポリオまたは肺炎連鎖球菌感染（侵襲性肺炎球菌疾患）を引き起こす、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
抗原が腫瘍抗原である、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１２０】
腫瘍抗原が、NY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
腫瘍抗原がNY-ESO-1である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
腫瘍抗原がNY-CO-58である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２３】
腫瘍抗原がMAGE-A3である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２４】
腫瘍抗原がSSX2である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２５】
非病原性組み換え細菌であって、該非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合したNY-ESO-1またはその免疫原性断片からなる融合タンパク質をコードする核酸を含む、前記非病原性組み換え細菌。
【請求項１２６】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項１２５に記載の組み換え細菌。
【請求項１２７】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項１２６に記載の組み換え細菌。
【請求項１２８】
非病原性Salmonella enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項１２７に記載の組み換え細菌。
【請求項１２９】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項１２８に記載の組み換え細菌。
【請求項１３０】
非病原性組み換え細菌であって、該非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合したNY-CO-58またはその免疫原性断片からなる融合タンパク質をコードする核酸を含む、前記非病原性組み換え細菌。
【請求項１３１】
非病原性細菌が、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである、請求項１３０に記載の組み換え細菌。
【請求項１３２】
非病原性細菌がSalmonella entericaである、請求項１３１に記載の組み換え細菌。
【請求項１３３】
非病原性細菌Salmonella enterica細菌がS. typhimuriumである、請求項１３２に記載の組み換え細菌。
【請求項１３４】
非病原性S. typhimurium細菌がS. typhimurium pSB2470である、請求項１３３に記載の組み換え細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、２００５年１０月４日出願の米国仮特許出願第60/723,573号の35 U.S.C. § 119（e）に基づく利益を主張し、その内容の全体を本明細書中に参照により組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、１種または２種以上の腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激する、細菌のＩＩＩ型分泌系の使用に関し、これは抗原欠損変異腫瘍（antigen-loss variant tumor）を処置することを含む。本発明はまた、ＩＩＩ型分泌系を有する細菌を用いて、末梢血単核球から抗原提示細胞を調製することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
腫瘍特異抗原の分子的同定に関し、合成ペプチドエピトープの形態のこれらの抗原を標的とする数々のがんワクチンの試用が試みられてきた。しかしながら、いくつかの臨床試験において特異的な免疫反応が観察されたものの、臨床反応を示したのは処置した患者のごく少数にすぎなかった。現在のがんワクチン試用の弱い臨床的有効性のために、多くの研究者が、より免疫原性の高い抗原、新たな有効なアジュバント、製剤、ベクターまたは予防接種法を見出そうと努力している（Jager, E., et al., Int. J. Cancer. 106:817-20, 2003、Belardelli, F., et al., Cancer Res. 64:6827-30, 2004、Rosenberg, S.A., et al., Nat. Med. 10:909-15, 2004）。がんワクチンの試用に関するもう１つの障壁は、患者の登録が、がん細胞における抗原発現に対する不可欠な要件により、しばしば制限されることである。これまでに発見された最も魅力のある腫瘍特異抗原は、がんにおいて限られた発現頻度を有するにすぎず、したがって多くの患者が適切な適格基準を満たすのを阻害する。
【０００４】
NY-ESO-1は、しばしばがん細胞により発現されるが、正常体細胞によっては発現されない胚細胞タンパク質である（Chen, Y.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94:1914-8, 1997）。それは、食道がん患者の血清を用いた組み換え発現クローニング（SEREX）による抗原の血清学的同定により発見された（Chen, Y.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94:1914-8, 1997、Sahin, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 92:11810-3, 1995）。NY-ESO-1発現腫瘍を有するがん患者においてこの抗原に対する体液性および細胞性免疫応答が頻繁にみられるため、それは最も免疫原性の高いヒト腫瘍抗原の１つとなっている（Jager, E. et al., J. Exp. Med. 187:265-70, 1998）。しかしながら、黒色腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、および膀胱がんにおけるNY-ESO-1の発現頻度は２０〜３０％にすぎず、そして一様でないことが多い（Chen, Y.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94: 1914-8, 1997、Jungbluth, A.A. et al., Int. J. Cancer. 92:856-60, 2001）。
【０００５】
がんの処置は進歩したが、がんを処置する改善された方法に対する必要性が依然存在する。特に、治療的および／または予防的に用いることができる改善されたがんワクチンに対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
近年の報告により、トール様受容体シグナルが、免疫応答を惹起するためだけではなく、制御性Ｔ細胞による抑制活性を阻止するために重要であることが見出され、組み換えウイルスベクターおよび組み換え細菌ベクターが、ワクチンベクターに必要な危険信号を提供する可能性があることで注目された（Belardelli, F., et al., Cancer Res. 64:6827-30, 2004、Rosenberg, S.A., et al., Nat. Med. 10:909-15, 2004、Pasare, C. & Medzhitov, R., Science. 299:1033-6, 2003、Yang, Y., et al., Nat. Immunol. 5:508-15, 2004）。細菌性ベクターのうち最も有望な候補の１つは、Salmonella enterica serovar Typhimurium（S. typhimurium）である（Russmann, H. et al., Science. 281:565-8, 1998; Shams, H., et al., Vaccine. 20:577-85, 2001; Evans, D.T. et al., J. Virol. 77:2400-9、2003）。その投与の簡易性、その遺伝子操作の容易性、およびいくつかの弱毒化変異の利用可能性のため、S. typhimuriumは非常に多用途な抗原送達プラットホームとなっている（Galan, J.E. et al., Gene 94:29-35, 1990; Russman et al., 1998）。Salmonella typhimuriumの宿主細胞との接触により、一連の細菌性サイトゾルタンパク質を宿主細胞サイトゾルに、標的細胞による細菌の取り込みを要することなく送達する、ＩＩＩ型と呼ばれる特化したタンパク質分泌系が活性化される（Russmann, H. et al., Science. 281: 565-8, 1998; Stebbins, C.E. & Galan, J.E., Nature. 414:77-81, 2001; U.S. 6,306,387）。
【０００７】
この独特のタンパク質分泌系を用いるために、我々は、非病原性構築物である、ＩＩＩ型分泌シグナルを生じる細菌性タンパク質SopEに融合した全長NY-ESO-1についてのΔphoP-phoQ Salmonella typhimurium組み換え体（Sal-NY-ESO-1）を樹立した。この構築物は宿主のプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）および非抗プロフェッショナル抗原提示細胞の抗原提示経路にNY-ESO-1タンパク質を送達する能力を有し、それにより免疫応答を惹起する。かかるアプローチは、リンパ球性脈絡髄膜炎ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープまたはサル免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質を発現するSalmonella typhimuriumを用いたモデルにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングするのに有用であることが証明されている（Russmann, H. et al., Science. 281:565-8, 1998; Shams, H., et al., Vaccine. 20:577-85, 2001; Evans, D.T. et al., J. Virol. 77: 2400-9, 2003）。
【０００８】
上述のとおり、改善されたがんワクチンに対するニーズが存在し、本発明はこのニーズに、抗原を細胞に送達するＩＩＩ型分泌系を有する非病原性細菌を用いたがんを処置するための方法を提供することにより対処する。
【０００９】
原理の証明として、我々は、細菌において産生されたNY-ESO-1タンパク質を宿主細胞に注入する、特殊なＩＩＩ型分泌系を用いる組み換えSalmonella typhimurium構築物を設計した。我々は、ヒトにおけるin vitro NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する能力、マウスにおけるNY-ESO-1発現腫瘍に対するそのin vivo処置の有効性、およびin vivoで抗原を腫瘍細胞に送達するその能力を検討した。
【００１０】
我々は、S. typhimurium-NY-ESO-1が、in vitroで、既存の免疫を有するがん患者由来のヒトＰＢＭＣにおいて、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を効率的に惹起することを見出した。さらに、S. typhimurium-NY-ESO-1のマウスへの経口投与により、既存のNY-ESO-1発現腫瘍の退縮（regression）が生じた。注目すべきことに、既存のNY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下、NY-ESO-1陰性腫瘍の局所部位におけるS. typhimurium-NY-ESO-1の投与によっても、腫瘍の退縮が誘導された。腫瘍の退縮を示した動物は、NY-ESO-1に対してだけではなく、ワクチンに含有されてない腫瘍抗原に対してもＣＤ８＋応答を起こした。これは、すなわち、エピトープスプレディング（epitope spreading）を介したものである。
【００１１】
本発明の側面において、腫瘍により発現される第１のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法が提供される。かかる方法は、かかる処置を必要とする対象に、非病原性細菌であって、ＩＩＩ型分泌系と、該非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合した腫瘍により発現される免疫原性の第２のタンパク質またはその免疫原性断片を含む融合タンパク質をコードする核酸とを含む前記非病原性細菌を投与することを含み、そこにおいて、前記融合タンパク質は第１のタンパク質および免疫原性の第２のタンパク質に対する免疫応答を刺激する。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。ある態様において、かかる免疫原性の第２のタンパク質または免疫原性断片は、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である。
【００１２】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。ある態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella entericaである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はS. Typhimurium pSB2470である。
【００１３】
いくつかの態様においては、１つより多い腫瘍抗原がコードされている。ある態様において、免疫応答の刺激は、既存の免疫応答の増大である。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。ある態様において、かかる免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。いくつかの態様において、かかる第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片は、腫瘍抗原タンパク質またはその腫瘍抗原断片である。
【００１４】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。ある態様において、かかる非病原性S. enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium細菌はS. typhimurium pSB2470である。いくつかの態様においては、１つより多い腫瘍抗原がコードされている。
【００１５】
本発明の側面において、腫瘍により発現される第１のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法を提供する。かかる方法は、かかる処置を必要とする対象に免疫原性の第２のタンパク質またはその免疫原性断片を発現する核酸を投与すること、およびその後に、かかる対象に非病原性細菌であって、ＩＩＩ型分泌系と、該非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合した免疫原性の第２のタンパク質またはその免疫原性断片を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む非病原性細菌を投与することを含む。ある態様において、かかる免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。ある態様において、かかる免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方である。ある態様において、かかる第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片は、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である。
【００１６】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたｈPseudomonas aeruginosaである。ある態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium細菌はS. typhimurium pSB2470である。
【００１７】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、経口的に投与される。ある態様において、かかる核酸は非経口的に投与される。いくつかの態様においては、１つより多い腫瘍抗原がコードされている。いくつかの態様において、かかる免疫応答の刺激は既存の免疫応答の増大である。いくつかの態様において、かかる免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。いくつかの態様において、かかる免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、かかる第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片は、第２の腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。別の態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。ある態様において、かかる非病原性S. enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium細菌は、S. typhimurium pSB2470である。
【００１９】
いくつかの態様においては、かかる非病原性細菌を経口投与する。いくつかの態様においては、かかる核酸を非経口投与する。ある態様においては、１つより多い腫瘍抗原がコードされている。
【００２０】
本発明の側面において、腫瘍に対する免疫応答を誘発するための方法を提供する。かかる方法は、腫瘍を有する対象に、対象が既存の免疫応答有する抗原をＩＩＩ型分泌系により発現する、ＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を投与することを含み、そこにおいて、かかる腫瘍の細胞の少なくともいくらかはかかる抗原を発現する。第２の態様において、かかる第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片は、腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である。
【００２１】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。別の態様において、かかる非病原性S. enterica細菌はS. typhimuriumである。ある態様において、かかる非病原性S. typhimurium細菌はS. typhimurium pSB2470である。
【００２２】
いくつかの態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を腫瘍内に投与する。いくつかの態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を注入（injection)投与する。ある態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を腫瘍の部位に投与する。いくつかの態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を腫瘍の全切除または部分切除後に投与する。
【００２３】
いくつかの態様において、かかる抗原はウイルスの抗原である。いくつかの態様において、かかるウイルスはインフルエンザウイルス、Epstein-Barrウイルス、または水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella zoster virus）である。ある態様において、かかる抗原は、対象が免疫付与された微生物の抗原である。いくつかの態様において、かかる微生物は流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、水痘、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、細菌性髄膜炎（ｂ型インフルエンザ菌）、ポリオまたは肺炎連鎖球菌感染（侵襲性肺炎球菌疾患）を引き起こす。いくつかの態様において、かかる抗原は非腫瘍抗原である。ある態様において、かかる抗原は腫瘍抗原である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である。ある態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1である。ある態様において、かかる腫瘍抗原はNY-CO-58である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はMAGE-A3である。ある態様において、かかる腫瘍抗原はSSX2である。いくつかの態様において、かかる細胞における抗原の発現は、骨髄由来間質細胞に対する交差提示を誘発するのに十分である。いくつかの態様において、１つより多い腫瘍抗原がコードされている。
【００２４】
本発明の側面において、対象における抗原欠損変異腫瘍を処置するための方法を提供する。かかる方法は、１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍に、ＩＩＩ型分泌系により抗原を発現する、ＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を投与することを含み、前記抗原の発現は１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍において欠損しており、そこにおいてかかる組み換え非病原性細菌はかかる１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍の細胞に感染し、そしてかかる細胞において前記抗原の発現を引き起こし、それにより１つまたは２つ以上の抗原欠損変異腫瘍に対する免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、かかる第２の免疫原性タンパク質または免疫原性断片は腫瘍抗原タンパク質またはその免疫原性断片である。
【００２５】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。ある態様において、かかる非病原性S. enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium 細菌はS. typhimurium pSB2470である。
【００２６】
いくつかの態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を腫瘍内に投与する。いくつかの態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を注入投与する。いくつかの態様においては、かかる組み換え非病原性細菌をかかる腫瘍の部位に投与する。ある態様においては、かかる組み換え非病原性細菌を腫瘍の前切除または部分切除後に投与する。
【００２７】
いくつかの態様において、かかる投与はＣＤ４＋免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、かかる投与はＣＤ８＋免疫応答を誘発する。いくつかの態様において、かかる細胞における抗原の発現は、骨髄由来間質細胞への交差提示を誘発するのに十分である。ある態様において、かかる抗原は腫瘍抗原である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-CO-58である。ある態様において、かかる腫瘍抗原はMAGE-A3である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はSSX2である。いくつかの態様において、１つより多い腫瘍抗原をコードする。
【００２８】
本発明の側面において、末梢血単核球から抗原提示細胞を調製するための方法を提供する。かかる方法は、対象からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得ること、かかるＰＢＭＣをＩＩＩ型分泌系により抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌と接触させること、かかる接触させたＰＭＭＣを培養すること、および抗原提示細胞を単離することを含む。いくつかの態様において、かかるＰＢＭＣはＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣである。
【００２９】
いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。ある態様において、かかる非病原性S. entericaはS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium 細菌はS. typhimurium pSB2470である。
【００３０】
いくつかの態様において、かかる抗原は腫瘍抗原である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である。ある態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-CO-58である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はMAGE-A3である。さらに別の態様において、かかる腫瘍抗原はSSX2である。
【００３１】
本発明の側面において、本発明の任意の方法により調製された抗原提示細胞の単離された集団を提供する。いくつかの態様において、かかる細胞は抗原提示細胞である。
【００３２】
本発明の側面において、抗原特異的Ｔ細胞を調製するための方法を提供する。かかる方法は、対象からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得ること、かかるＰＢＭＣを本発明の抗原提示細胞と接触させること、かかる接触させたＰＢＭＣを培養すること、およびかかるＰＢＭＣから抗原特異的Ｔ細胞を単離することを含む。いくつかの態様において、かかる抗原特異的Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある態様において、かかる抗原特異的Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３３】
本発明の側面において、本発明の任意の方法によって調製された抗原特異的Ｔ細胞の単離された集団を提供する。いくつかの態様において、抗原特異的Ｔ細胞のかかる単離された集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある態様において、抗原特異的Ｔ細胞のかかる単離された集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３４】
本発明の側面において、受動免疫付与のための方法を提供する。かかる方法は、かかる処置が必要な対象に、本発明の任意の方法により調製されたＴ細胞の集団を投与することを含む。
【００３５】
本発明の側面において、免疫付与のためのキットを提供する。かかるキットは、抗原をコードするＤＮＡワクチンベクターを含有する第１の容器、およびＩＩＩ型分泌系により抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を含有する第２の容器を含む。いくつかの態様において、かかる抗原は腫瘍抗原である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-CO-58である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はMAGE-A3である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はSSX2である。
【００３６】
本発明の側面において、免疫付与のためのキットを提供する。かかるキットは、抗原に対するワクチンを１回量または２回量以上含有する第１の容器、およびＩＩＩ型分泌系により抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を含む組み換え非病原性細菌を含有する第２の容器を含む。いくつかの態様において、かかる抗原は腫瘍抗原ではない。いくつかの態様において、かかる抗原は、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、水痘、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、細菌性髄膜炎（ｂ型インフルエンザ菌）、ポリオまたは肺炎連鎖球菌感染（侵襲性肺炎球菌疾患）を引き起こす。ある態様において、かかる抗原は腫瘍抗原である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1、MAGE抗原、SSX抗原、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100またはgp75である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-ESO-1である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はNY-CO-58である。いくつかの態様において、かかる腫瘍抗原はMAGE-A3である。ある態様において、かかる腫瘍抗原はSSX2である。
【００３７】
本発明の側面において、かかる非病原性細菌のＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合したNY-ESO-1またはその免疫原性断片からなる融合タンパク質をコードする核酸を含む非病原性組み換え細菌が提供される。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌は、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。ある態様において、かかる非病原性Salmonella enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium細菌はS. typhimurium pSB2470である。
【００３８】
本発明の側面において、非病原性ＩＩＩ型分泌系により送達されるポリペプチドに融合したNY-CO-58またはその免疫原性断片からなる融合タンパク質をコードする核酸を含む非病原性組み換え細菌を提供する。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomalleiまたはPseudomonas aeruginosaである。いくつかの態様において、かかる非病原性細菌はSalmonella entericaである。いくつかの態様において、かかる非病原性Salmonella enterica細菌はS. typhimuriumである。いくつかの態様において、かかる非病原性S. typhimurium細菌はS. typhimurium pSB2470である。
【００３９】
薬剤の作製における前述の組成物の使用も提供する。好ましい態様において、かかる薬剤はがんの処置において有用である。
【００４０】
本発明のこれらのおよび他の目的を、本発明の詳細な説明と関連して詳細に記載する。
【００４１】
図面の簡単な説明
図１．S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系は標的細胞に組み換えNY-ESO-1を送達する
図１ａ：これらの研究において用いられる関連するプラスミドの略図である。
図１ｂ：SopEのＩＩＩ型分泌およびトランスロケーションシグナル（SopE-NY-ESO-1）に融合したNY-ESO-1を発現するプラスミドを、ΔphoP phoQ S. typhimurium（「野生型」と表示）および同系のＩＩＩ型分泌欠損invA変異型（「ＴＴＳＳ」と表示）に導入した。次いで、これらの株の全細胞溶解物および培養上清を、ウエスタンブロッティングによりキメラSopE-NY-ESO-1タンパク質の存在に関して検討した。
図１ｃ：マウスCMS5a腫瘍細胞をS. typhimuriumNY-ESO-1（「S. typh.-NY-ESO-1」で示した）またはトランスロケーション欠損株（「トランスロケーション欠損」で示した）に感染させ、種々の分画におけるSopE-NY-ESO-1の存在を検討した。トランスロケーションしたタンパク質を含有するブロットは、サンプルの等しいローディングを検証するため、宿主細胞タンパク質について再調査した。
図１ｄ：NY-ESO-1を発現しないヒト黒色腫細胞株であるSK-MEL-21を、S. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株に感染させ、抗NY-ESO-1 mAb ES121による免疫細胞化学により検討した。SK-MEL-37は、正常なNY-ESO-1発現を有するヒト黒色腫細胞株の陽性対照として用いた。
【００４２】
図２．S. typhimuriumＩＩＩ型分泌により送達された抗原はＣＤ８＋Ｔ細胞に効率的に提示される。
図２ａ：NY-ESO-1157-165に特異的なHLA-A*0201拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンであるクローン４９、またはインフルエンザマトリックス58-66に特異的なHLA-A*0201拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞株であるNW46-Fluを、S. typhimurium-NY-ESO-1、S. typhimurium-FluマトリックスまたはS. typhimurium対照株に感染させたSK-MEL-21細胞とともに培養し、特異的ＩＦＮ−γ分泌をELISPOTアッセイによりアッセイした。
図２ｂ：NY-ESO-1発現黒色腫患者ＮＷ２９およびＮＷ６３４のＰＢＭＣに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、NY-ESO-179-108ペプチドでパルスしたＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣで前感作した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を、ペプチドで感作したまたはS. typhimuriumに感染させた自己EBV-B細胞の認識に関するELISPOTアッセイにより解析した。これらの実験を３度独立して実施し、同様の結果を得た。データを平均±ＳＤで表した。
【００４３】
図３．S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系はＰＢＭＣから抗原特異的プライマリーＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する。
図３ａ：ＮＷ２９およびＮＷ６３４のＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、S. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株で前感作し、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を、ペプチドでパルスしたまたは組み換えFowlpoxウイルスに感染させた自己EBV-B細胞の認識に関するELISPOTアッセイにより解析した。データを平均±ＳＤで表した。
図３ｂ：ＮＷ２９由来のNY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、NY-ESO-192-100/HLA-Cw*0304四量体-PEおよび抗CD8-Tricolorで染色し、フローサイトメトリーで解析した。これらの実験を、少なくとも２回独立して実施し、同様の結果を得た。
【００４４】
図４：S. typhimurium-NY-ESO-1の経口投与により、マウスにおいてNY-ESO-1陽性腫瘍が退縮する
図４ａ：BALB/cを２×１０６個のCMS5a-NY-ESO-1または１×１０６個の親CMS5aで接種し、腫瘍増殖を週３回解析した。強制給餌ニードル（gavage needle）による１〜２×１０８個のS. typhimuriumの接種を７日後に実施した。マウスのいくつかの群にはまた、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８ｍＡｂ、あるいは対照Ａｂを、２５μｌの腹水の形態で５日ごとに静脈内注射した。矢印はS. typhimurium経口投与の時点を表わす。それぞれの線は個々のマウスの腫瘍増殖を表わす。腫瘍サイズは縦径×水平径の式で評価した。
図４ｂ：S. typhimurium-NY-ESO-1または対照株を投与したまたはしない、CMS5a-NY-ESO-1を有するマウスの脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の数をELISPOTアッセイで解析した。データを平均±ＳＤで表わす。これらの実験を独立して少なくとも２回実施し、同様の結果を得た。
【００４５】
図５．S. typhimuriumの腫瘍内投与の結果、腫瘍部位において抗原が送達される。
BALB/cマウスに１×１０６個の親ＣＭＳ５ａを接種した。１週間後、０．５〜１×１０６個のS. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株を、触知可能な腫瘤に直接接種した。外科的除去の後、腫瘍部位におけるNY-ESO-1の存在を方法において記載した免疫組織化学により検討した。矢印はNY-ESO-1陽性細胞を示す。スケールバー＝１ｍｍ。
【００４６】
図６．S. typhimuriumＩＩＩ型分泌による局所腫瘍抗原送達により、マウスにおいてエピトープスプレディングによる腫瘍の退縮が生じる。
図６ａ：BALB/cマウスを、NY-ESO-1をコードするプラスミドまたは対照ベクターで、遺伝子銃により、２週間間隔で２度免疫した。これらのマウスに２×１０６個のCMS5a-HE腫瘍細胞（NY-ESO-1陰性）を接種し、腫瘍増殖を週３回解析した。７日後、腫瘍部位における０．５〜１×１０６個のS. typhimurium-NY-ESO-1または対照株の注入を実行した。マウスのいくつかの群にはまた、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８mAb、あるいは対照Ａｂを、２５μｌの腹水の形態で、５日おきに静脈内注射した。矢印はS. typhimurium投与の時点を示す。それぞれの線は個々のマウスの腫瘍増殖を表わす。腫瘍サイズは縦径×水平径の数式で評価した。
図６ｂ：対照ベクターまたはNY-ESO-1で予備免疫した、S. typhimurium-NY-ESO-1または対照株で処置しないまたは処置した、CMS5a-HEを有するマウスの脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、ＩＦＮ−γ産生細胞の数をELISPOTアッセイにより解析した。データを平均±ＳＤで表現する。これらの実験を独立して少なくとも２回実施し、同様の結果を得た。
【００４７】
図７．S. typhimuriumＩＩＩ型分泌により送達される抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。
ＮＷ２９およびＮＷ６４３に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を、NY-ESO-179-108ペプチドでパルスした（図７ａ）、またはS. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株に感染させた（図７ｂ）ＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣで前感作した。特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、ペプチドでパルスした、または組み換えS. typhimuriumまたはFowlpoxウイルスに感染させた自己活性化Ｔ細胞ＡＰＣの認識に関し、ELISPOTアッセイで解析した。これらの実験を独立して少なくとも２回実施し、同様の結果を得た。データを平均±ＳＤで表わす。
【００４８】
図８．S. typhimuriumにおけるNY-CO-58 （kif2c）の発現。図８はSopEの分泌およびトランスロケーションシグナルに融合した腫瘍抗原NY-CO-58を発現するS. typhimuriumワクチン構築物の概略図を示す。また、全細胞溶解物および上清分画におけるこの構築物の発現を示すプロテインゲルも表示する。
【００４９】
配列の説明
配列番号１−NY-ESO-179-108の合成ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２−インフルエンザNP206-229の合成ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５０】
発明の詳細な説明
Salmonella類は強い免疫反応を刺激する能力を有するが、それは先天性免疫系を直接刺激するその能力の結果である。後天性免疫応答の生成における先天性免疫系の実証された重要性に鑑みれば、この特性がSalmonellaを有効な抗原送達系たらしめている。腫瘍自体の内部における先天性免疫応答および炎症反応を刺激することが、腫瘍抗原に対する特異的免疫応答の生成を利することは十分証明されている（Finn, O. J., et al., Nat Rev Immunol., 3:630-41, 2003; Gilboa, E., Nat Rev Cancer, 4:401-411, 2004）。
【００５１】
上記のように、ある細菌、例えばSalmonella typhimuriumのＩＩＩ型分泌系は、宿主細胞との細菌の接触に際し活性化される。ＩＩＩ型分泌系は、細菌性サイトゾルタンパク質のセットを宿主細胞サイトゾルに、細胞による細菌の取り込みを要することなく送達する。免疫応答、特に腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するためのこの独特のタンパク質分泌系の使用を実証するために、我々は、ＩＩＩ型分泌シグナルを有する細菌性タンパク質SopEに融合した抗原（例えば、全長腫瘍抗原NY-ESO-1に融合したSpoE）について組み換えた非病原性細菌構築物ΔphoP-phoQ Salmonella typhimuriumを樹立した。これらの構築物は宿主のプロフェッショナルおよびノンプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）の抗原提示経路に抗原を送達する能力を有し、それにより免疫反応を誘導または増大させる。
【００５２】
細菌性ＩＩＩ型分泌系は、細菌の取り込みを必要としない、細菌性エフェクタータンパク質の分泌および宿主細胞のサイトゾルへの送達を伴う。ＩＩＩ型分泌系は、１つまたは２つ以上の抗原の抗原提示経路への送達をもたらし、クラスＩおよびクラスＩＩ拘束性経路の両方に影響を与え得る。存在することが知られているが、まだ発見されていない任意のＩＩＩ型分泌系は、本発明による「ＩＩＩ型分泌系」の例である。例えば、現在知られている細菌性ＩＩＩ型分泌系の標的は、SalmonellaのSptP、SipA、SipB、SipC、SipD、InvJ、SpaO、AvrA、およびSopEタンパク質、YersiniaのYopおよびYpkタンパク質（例えば、YopE、YopH、YopMおよびYpkA）、ShigellaのIpaタンパク質、およびPseudomonas aeruginosaのExosタンパク質を含む。
【００５３】
本発明のある側面において、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するための方法を提供する。免疫応答は当業者に周知であり、免疫応答が細胞媒介性応答および／または抗体応答であることができると考えられる。本発明により刺激される免疫応答は、Th1応答、Th2応答、または混合したTh1/Th2応答を含む。したがって、刺激された免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答あるいはＣＤ８＋Ｔ細胞応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の両方であることができる。いくつかの態様において、免疫応答の刺激は、過去の抗原への暴露を介して存在する既存の免疫応答の刺激を含む。
【００５４】
明細書中で用いる「抗原」は、特異的免疫応答を刺激する物質である。本発明に関して、抗原は腫瘍抗原および非腫瘍抗原を含む。本発明の非病原性組み換え細菌によりコードされ送達される抗原は、ポリペプチドである。
【００５５】
非病原性抗原は、限定することなく、ウイルス抗原および微生物の抗原を含む。ウイルス抗原は、限定することなく、インフルエンザウイルス、Epstein-Barrウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの抗原を含む。ウイルス性抗原はまた、流行性耳下腺炎、麻疹、風疹、水痘、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびポリオを含む、ウイルス性疾患を引き起こすウイルスの抗原を含む。微生物の抗原は、限定することなく、ジフテリア、破傷風、百日咳、細菌性髄膜炎（インフルエンザ菌タイプＢ）を引き起こす抗原、および肺炎連鎖球菌抗原（侵襲性肺炎球菌疾患）を含む。
【００５６】
本明細書中で用いる腫瘍抗原は、腫瘍抗原ポリペプチドを指し、腫瘍抗原タンパク質またはその断片、および腫瘍抗原ペプチドを含む。好ましい腫瘍抗原は、限定せずに、NY-ESO-1、MAGE抗原、例えばMAGE-A3、SSX抗原、例えばSSX2、SCP1、CT7、NY-CO-58、BAGE抗原、GAGE抗原、Melan-A/MART-1、gp100およびgp75を含む。がん細胞および精巣細胞においてのみ、またはそこにおいて主に発現される、がん−精巣抗原は、好ましい腫瘍抗原である。いくつかのがん−精巣抗原のリストを表１に示す（Cancer Immunity, 4:1 （2004） Table 1）。
【００５７】
表１：ＣＴ遺伝子の最新の一覧表：４４ＣＴ遺伝子ファミリー、８９の個別遺伝子またはアイソフォーム
【表１】
2009510169.tif 000003
【００５８】
【表２】
2009510169.tif 000004
【００５９】
【表３】
2009510169.tif 000005
【００６０】
本発明の他の側面により、本明細書中に記載するポリペプチドを非病原性細菌を用いて発現するための方法を提供する。例示的態様において、かかる非病原性細菌はＩＩＩ型分泌系を含む。かかる細菌は当業者に既知である。簡潔に述べると、かかる細菌はタンパク質の細胞サイトゾルへの送達を、細菌がかかる標的細胞に入る必要なく提供する。さらなる詳細は、Russmann, H. et al., Science, 281:565-8, 1998; Stebbins, C.E. et al., Nature, 414:77-81, 2001に見出すことができる。ＩＩＩ型分泌系を有する細菌は、限定することなく、Salmonella spp.、Yersinia spp.、Bordetella spp.、Escherichia coli、Shigella spp.、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、およびPseudomonas aeruginosaを含む。好ましい態様において、非病原性細菌はSalmonella typhimuriumである。特に好ましい態様において、非病原性細菌はΔphoP-phoQ Salmonella typhimuriumである。特別な態様において、非病原性細菌は、Russmann et al. 1998. Science. 281:565-568において記載される、Salmonella typhimurium pSB2470である。
【００６１】
非病原性細菌は、当業者に既知の細菌増殖条件下、滅菌培地中で増殖させ、維持する。いくつかの例において、かかる非病原性細菌は、細菌性エンベロープのペプチドグリカン層の必須要素であるジアミノピメリン酸（DAP）の合成に関与するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子における欠失を含んでもよい。asd遺伝子を欠く細菌は、DAP含有培地中でしか増殖することができない。これらの例における非病原性細菌は、複製を補助するジアミノピリメリン酸（DAP）の存在下で増殖することができると考えられる。哺乳類はDAPを産生せず、それゆえasd遺伝子を欠く細菌は複製可能な世代数が限られており、細菌を非病原性にする。asd遺伝子の欠失により、抗生物質を用いる必要性がなくなる。抗生物質を用いる必要性がなくなることにより、ワクチンがFDAの規則に適合することが保証される。
【００６２】
抗原欠損変異腫瘍を処置するための方法が提供される。本明細書中で用いられる「抗原欠損変異体」は、腫瘍抗原の発現を低下させたまたは排除した腫瘍または腫瘍細胞である。腫瘍抗原の発現を低下または排除することにより、抗原欠損変異腫瘍は、そうでなければかかる腫瘍細胞により発現されるこれらの抗原に対する免疫応答を生成するであろう免疫系による感知および殺傷を回避することができる。抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を有する組み換え非病原性細菌を、かかる抗原の発現が低下したまたは抗原を発現しない対象に（例えば、対象における抗原欠損変異腫瘍に）投与する。１つまたは２つ以上の抗原の投与により、存在しない抗原が対象において発現し、免疫応答を刺激する結果となり得る。また、対象において存在しない抗原の発現は、骨髄由来間質細胞への交差提示を誘発するのに十分であると考えられる。
【００６３】
交差提示は、これにより樹枝状細胞などの抗原提示細胞がMHC-IおよびMHC-IIの両方において抗原を提示できるプロセスである。抗原提示細胞は、典型的には、ウイルス感染細胞またはがん性細胞を貪食し、抗原を獲得する。かかる抗原がMHC-IおよびMHC-IIの両方において提示され、かかる樹枝状細胞はＣＤ８＋細胞（MHC-I提示を介して）およびＣＤ４＋細胞（MHC-II提示を介して）の両方からの応答を誘発することができる。かかる樹枝状細胞は、多くの非免疫細胞は発現しない共刺激因子を放出する。これらの共刺激因子は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性エフェクターＴ細胞への活性化およびクローン性増殖を促進する。
【００６４】
本明細書中で用いる「をコードする核酸分子」は、抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸分子を意味する。これらの核酸分子は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。（腫瘍）抗原をコードする核酸分子はまた、本明細書中に記載される核酸分子の変異体を包含する。これらの変異体は、ある抗原をコードする配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体であってよい。本発明の核酸分子の変異体は、以下でさらに説明するホモログおよび対立遺伝子を含むことを意図する。さらに、本明細書中で用いる、「腫瘍抗原分子」の用語は、腫瘍抗原（ポリペプチドおよびその断片）ならびに腫瘍抗原核酸を含む。全ての態様において、ヒト腫瘍抗原およびそれをコードする核酸分子が好ましい。
【００６５】
１つの側面において、本発明は、本明細書中に記載される方法および組成物に使用するための抗原をコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明の例示的な単離された核酸分子は、（ａ）配列番号１をコードするヌクレオチド配列またはその断片、（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸分子にハイブリダイズし、かつ腫瘍抗原をコードする単離された核酸分子、（ｃ）遺伝子コードの縮重のために（ａ）または（ｂ）と異なる核酸分子、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体である。ある好ましい態様において、かかる核酸分子は配列番号１に定めるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするもの、またはその免疫原性断片、あるいは配列番号１をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【００６６】
本明細書中で用いる「単離された核酸分子」なる用語は、（ｉ）in vitroで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅されたもの、（ｉｉ）クローニングにより組み換え的に産生されたもの、（ｉｉｉ）切断およびゲル分離により精製されたもの、または（ｉｖ）合成、例えば化学合成により得られたものを意味する。単離された核酸は、当該技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術により容易に操作可能であるものである。
【００６７】
１種または２種以上の抗原をコードする本発明の核酸分子はまた、慣用の技術ならびにin silico（すなわち、コンピューターソフトウェアを用いたコンピューターベースのホモログスクリーニング）により同定することができるホモログおよび対立遺伝子を包含するものとする。腫瘍抗原ポリペプチドのヒトホモログおよび他の生物のホモログ（例えば、オルソログ）の同定は、当業者に周知である。概して、核酸ハイブリダイゼーションは、既知の配列に対応する他の種の相同配列を同定するのに適合した方法である。標準的な核酸ハイブリダイゼーション手順は、選択された同一性パーセントの関連核酸配列を同定するために用いることができる。例えば、選択した組織からのｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡのライブラリーを構築し、選択した腫瘍抗原をコードする核酸、例えば本明細書中で同定されるものを用い、関連するヌクレオチド配列についてライブラリーをスクリーニングできる。好ましくは、かかるスクリーニングは、高ストリンジェンシー条件を用いて、配列同一性により緊密に関連する配列を同定する。そのようにして同定された核酸をポリペプチドに翻訳し、かかるポリペプチドを活性に関して試験できる。
【００６８】
本明細書中で用いる「高ストリンジェンシー」という用語は、当該技術分野で周知であるパラメーターを指す。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、かかる方法をまとめた参考資料、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなどに見出すことができる。より具体的には、本明細書中で用いる高ストリンジェンシー条件は、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー（3.5×SSC、0.02% Ficoll、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン、2.5mM NaH2PO4 （pH7）、0.5% SDS、2mM EDTA）中の６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。SSCは0.15M塩化ナトリウム／0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7、SDSはドデシル硫酸ナトリウム、そしてEDTAはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡをトランスファーした膜を、例えば室温にて2×SSCで、次いで６８℃以下の温度にて0.1〜0.5×SSC/0.1×SDSで洗浄する。洗浄温度を調節して、異なるレベルのストリンジェンシーを提供してもよい。例えば、洗浄は、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または６８℃の温度で実施できる。当業者は条件を調節し、必要とする最適条件を決定することができる。
【００６９】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、使用可能な他の条件、試薬などが存在する。当業者かかる条件を熟知し、そのため本明細書中においてはそれらを示さない。しかし当然のことながら、当業者はかかる条件を本発明の腫瘍抗原核酸のホモログおよび対立遺伝子をはっきりと同定できるように操作することできる（例えば、より低いストリンジェンシー条件を用いることにより）。当業者はまた、かかる分子の発現に関して細胞およびライブラリーをスクリーニングするための方法論に精通しており、これらは次いで定法により単離され、その後関連のある核酸分子が単離され、配列決定される。
【００７０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、代替的に、国立医学図書館のウェブサイトにおいて公的に利用可能な、BLASTなどのプログラムを用いて行ってもよい。UniGene（国立医学図書館ウェブサイト）、SAGE Anatomic ReviewerおよびそのVirtual Northernツール（がんゲノム分析プロジェクト（The Cancer Genome Anatomy Project CGAP）ウェブサイト）もまた、公的に利用可能である。当業者は、これらのプログラムを用いて配列をアラインメントし、ルーチンの実験だけで同一性パーセントを決定できる。
【００７１】
概して、ホモログおよび対立遺伝子は、典型的には、がん−精巣核酸およびポリペプチドの配列に対して、それぞれ少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、ある場合には少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９７％のアミノ酸同一性を共有し、他の場合には少なくとも９７％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９８％のアミノ酸同一性を共有し、他の場合には少なくとも９９％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有し、そしてある場合には少なくとも９９．５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を共有することができる。かかる同一性は、インターネットを介して得ることができる、NCBI（Bethesda, Maryland）によって開発された、さまざまな、公的に利用可能なソフトウェアを用いて計算できる。例示的なツールは、国立衛生研究所の全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイトより利用可能なBLASTシステムを含む。ペアワイズおよびClustalWアラインメント（BLOSUM30 matrix setting）ならびにKyte-Doolittleヒドロパシー解析（hydropathic analysis）を、MacVector配列解析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得ることができる。前述の核酸のWatson-Crick相補体もまた、本発明に包含される。
【００７２】
本発明の別の側面において、断片が意図される。断片は、限定することなく、核酸の断片またはポリペプチド分子の断片を含む。１つの態様において、断片は免疫原性断片である。ポリペプチドに関し、かかる断片は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００アミノ酸長であることができる。核酸分子に関し、かかる断片は、少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２塩基長であることができる。いくつかの態様において、核酸断片は、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、または５００ヌクレオチド長であることができる。
【００７３】
本発明の例示的な態様において、かかるポリペプチドは融合タンパク質である。１つの態様において、かかる融合タンパク質は、ＩＩＩ型分泌系により分泌されるポリペプチドに融合したNY-ESO-1またはその免疫原性断片からなる。そのようなペプチドの例は、SalmonellaのSptP、SipA、SipB、SipC、SipD、InvJ、SpaO、AvrA、およびSopEタンパク質、YersiniaのYopおよびYpkタンパク質（例えば、YopE、YopH、YopMおよびYpkA）、ShigellaのIpaタンパク質、ならびにPseudomonas aeruginosaのExoSタンパク質を含む。
【００７４】
免疫原性腫瘍抗原ポリペプチド（免疫原性ペプチドを含む）の断片はまた、ペプチド合成のよく確立した方法を用いて化学的に合成できる。そして、開示されたポリペプチドの断片は、免疫応答を誘導するために、および抗体、または他の類似の分子、例えばＴ細胞受容体などの存在をアッセイするために有用である。１つの態様において、少なくとも８アミノ酸長であり、免疫原性を呈する、配列番号１またはその断片を含むポリペプチドの断片が提供される。かかる断片は、８アミノ酸からポリペプチドの全長より１アミノ酸少ないアミノ酸長までの任意の長さであってよい。具体的な態様により、配列番号１に定めるポリペプチド配列または上記の断片を含むポリペプチドの断片が提供される。
【００７５】
好ましくは、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの明確な機能を保持する断片である。ポリペプチドの断片に保持することができる機能は、抗体またはＭＨＣ分子との相互作用（例えば、免疫原性断片）、他のポリペプチドまたはその断片との相互作用、核酸またはタンパク質の選択的結合、および酵素活性を含む。１つの重要な活性は、対象において免疫応答を引き起こす能力である。当業者によって理解され得るように、免疫応答を誘発するために用いることができる断片のサイズは、抗体により認識されるエピトープが線形エピトープであるかまたは立体構造エピトープであるか、あるいはかかる断片を結合し、提示する具体的なＭＨＣ分子（例えば、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ）などの要素に依存する。そして、腫瘍抗原ポリペプチドのいくつかの免疫原性断片は、より長いセグメントからなってもよいが、他のものはより短いセグメントからなってもよい（例えば、かかるポリペプチドの全長までのそれぞれの整数を含む、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはこれを超えるアミノ酸長）。当業者は、ポリペプチドの免疫原性断片を選択するための方法に十分精通している。
【００７６】
本発明は、上記の腫瘍抗原ポリペプチドの変異体を包含する。本明細書中で用いる、腫瘍抗原ポリペプチドの「変異体」は、腫瘍抗原ポリペプチドの１次アミノ酸配列への１つまたは２つ以上の変更を含有するポリペプチドである。腫瘍抗原変異体を作出する変更は、１）腫瘍抗原ポリペプチドの活性を低下させるまたは排除するため、２）腫瘍抗原ポリペプチドの特性、例えば発現系におけるタンパク質安定性またはタンパク質−タンパク質結合の安定性などを強化するため、３）腫瘍抗原ポリペプチドに新規の活性または特性、例えば抗原エピトープの付加または検出可能部分の付加などを提供するため、あるいは４）ＭＨＣ分子への同等のまたはよりよい結合を提供するために腫瘍抗原ポリペプチドに行うことができる。
【００７７】
腫瘍抗原ポリペプチドの改変は、典型的にはかかる腫瘍抗原ポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、欠失、点変異、切断、アミノ酸置換ならびにアミノ酸または非アミノ酸部分の付加を含むことができる。あるいは、改変を、例えば切断、リンカー分子の付加、検出可能部分、例えばビオチンの付加、脂肪酸の付加などにより、直接かかるポリペプチドに行うことができる。改変はまた、腫瘍抗原アミノ酸配列の全てまたは部分を含む融合タンパク質を包含する。当業者は、タンパク質配列における変化がタンパク質立体構造にもたらす効果を予見するための方法に精通しており、そして既知の方法により、腫瘍変異株抗原ポリペプチドを「設計」することができる。かかる方法の１例がDahiyatおよびMayoによりScience 278:82-87, 1997に記載されており、それによりタンパク質を新たに設計できる。かかる方法は、既知のタンパク質に適用し、ポリペプチド配列の一部分のみを変化させることができる。DahiyatおよびMayoの計算法を適用し、腫瘍抗原ポリペプチドの特異変異体を提案し、かかる変異体が所望の立体構造を保持するかどうかを決定するために試験することができる。
【００７８】
概して、変異体は、その所望の生理学的活性に関連しないポリペプチドの性質を変えるために、特異的に変更された腫瘍抗原ポリペプチドを含む。例えば、システイン残基を置換または欠失させ、必要としないジスルフィド結合を防ぐことができる。同様に、一部のアミノ酸を変化させ、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を排除することにより、腫瘍抗原ポリペプチドの発現を強化することができる（例えば、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基など）。
【００７９】
腫瘍抗原ポリペプチドをコードする核酸の変異は、好ましくはかかるコード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存し、そして好ましくは核酸において、かかる変異体ポリペプチドの発現に有害であり得る、ヘアピンやループなどの、２次構造を形成するようにハイブリダイズするような核酸における領域を作らない。
【００８０】
変異は、アミノ酸置換を選択することにより、またはかかるポリペプチドをコードする核酸における選択された部位のランダム変異導入により行うことができる。変異体ポリペプチドは次いで発現され、どの変異が所望の特性を持つ変異体ポリペプチドを提供するかを決定するため、１つまたは２つ以上の活性に関して試験される。さらなる変異を、かかるポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが、特別な宿主における翻訳に関して好ましいコドンを提供する変異体に（または非変異腫瘍抗原ポリペプチドに）行うことができる。例えば、E. Coliにおける核酸の翻訳に関する好ましいコドンは、当業者に周知である。さらに他の変異を、かかるポリペプチドの発現を強化させるために腫瘍抗原遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して行うことができる。腫瘍抗原ポリペプチドの変異体の活性を、かかる変異腫瘍抗原ポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌のまたは哺乳類の発現ベクターにクローニングすること、かかるベクターを適した宿主細胞に導入すること、かかる変異腫瘍抗原ポリペプチドを発現させること、および本明細書中に開示するかかる腫瘍抗原ポリペプチドの機能に関して試験することにより、試験することができる。例えば、かかる変異腫瘍抗原ポリペプチドを、自己または異種同系の血清との反応に関して試験することができる。当業者に既知であるように、他の変異ポリペプチドの作製は、他の活性を試験するのに有利となり得る。
【００８１】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換を免疫原性腫瘍抗原ポリペプチドに行い、機能的に同等な変異体、または前述のポリペプチドのホモログを提供できること、つまり、かかる変異体は免疫原性腫瘍抗原ポリペプチドの機能を保持することを理解することができる。本明細書中で用いる、「保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）」は、かかるアミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的なチャージまたはサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に既知のポリペプチド配列を変化するための方法、例えばかかる方法をまとめた、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook、et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなどの参考文献において見られる方法などに従って作製できる。かかる腫瘍抗原ポリペプチドの、例示的な、機能的に同等な変異体またはホモログは、本明細書中に開示されるタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換を含む。アミノ酸の保存的置換は、以下の群のアミノ酸においてなされる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。それゆえ、本明細書中に開示される腫瘍抗原のアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換を行い、かかる抗原の特異的な抗体結合特性を保持することができる。
【００８２】
同様に、腫瘍抗原ポリペプチドに由来するペプチドが、ＭＨＣ分子により提示され、抗体またはＴリンパ球（例えば、ヘルパーＴ細胞またはＣＴＬ）により認識されることを決定するに際し、保存的アミノ酸置換を、かかるペプチドのアミノ酸配列に、特にかかるＭＨＣ分子との直接の接触点ではないと考えられる残基において行うことができる。例えば、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体を同定するための方法が、StromingerおよびWucherpfennigの公開されたＰＣＴ出願（PCT/US96/03182）において提供される。１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を有するペプチドはまた、例えばD’AmaroおよびDrijfhoutにより記載されるコンピュータープログラム（D’Amaro et al., Human Immunol. 43:13-18, 1995; Drijfhout et al., Human Immunol. 43:1-12, 1995）などを用いて、合成する前に、既知のHLA/MHCモチーフとの一致に関して試験することができる。そして、置換されたペプチドは、ＭＨＣに結合するとき、かかるＭＨＣ分子への結合および抗体またはＴリンパ球による認識に関して試験することができる。これらの変異体は改善された安定性に関して試験することができ、とりわけ、ワクチン組成物において有用である。
【００８３】
腫瘍抗原ポリペプチドの機能的に同等な変異体を生成する腫瘍抗原ポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、腫瘍抗原ポリペプチドをコードする核酸の変化によりなされる。そのような置換は、当業者に既知の様々な方法により行うことができる。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲによる変異（PCR-directed mutation）、Kunkelの方法による部位特異的変異導入（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985）、または腫瘍抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により行ってももよい。アミノ酸置換が腫瘍抗原ポリペプチドの小さなユニーク断片、例えば自己または同種異系の血清またはＴリンパ球により認識される抗原性エピトープなどになされる場合、かかる置換はかかるペプチドを直接的に合成することにより行ってもよい。腫瘍抗原ポリペプチドの機能的に同等な変異体の活性は、かかる変化した腫瘍抗原ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌のまたは哺乳類の発現ベクターにクローニングし、適した宿主細胞にかかる発現ベクターを導入し、かかる変化したポリペプチドを発現させ、そして本明細書中に開示される腫瘍抗原ポリペプチドの機能に関して試験することにより試験できる。化学合成されたペプチドは、直接、機能に関して、例えば関連する抗原を認識する抗血清への結合に関し試験できる。
【００８４】
末梢血単核球から抗原提示細胞を調製するための方法、および抗原特異的Ｔ細胞を調製するための方法が提供される。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、当業者に既知の方法を用いて対象から得る。ＰＢＭＣを、抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を有する組み換え非病原性細菌に感染させる。かかるＰＢＭＣを、例で記載される、および当業者に既知の、培地および方法を用いて培養する。Ｔ細胞をＡＰＣと接触させることにより、抗原特異的Ｔ細胞を調製する。簡潔に述べると、抗体で被覆された磁気ビーズを用いて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣを、ペプチドでパルスするか、または細菌に感染させ、照射する。かかる枯渇させた細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に添加する。細胞単離技術は当業者に既知であり、細胞ソーティング（例えば、FACS）、免疫沈降、遠心分離などを含む。好ましい態様において、かかるＰＢＭＣはＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣである。
【００８５】
本発明による、「処置する」および「処置」の用語は、予防および治療を含む。予防的に行われる場合、処置は、対象に、がんに先立って（例えば、がんのリスクのある対象に）、または対象におけるがんの初期の徴候が発症するに際して適用してもよい。予防的処置は、がんの発現またはがんに関連する徴候の出現を予防する、遅延させる、または速度を低下させるのに役立つ。治療的に行われる場合、処置は、実際のがんの徴候の出現の開始時（または開始後）に投与してもよい。治療により、がんを、またはがんに関連するある徴候を予防すること、遅延させること、停止させること、または逆転させることを含む。いくつかの態様において、処置は、がんまたはその徴候の重篤度および継続時間を低減することに役立ち得る。いくつかの態様において、対象を処置することは、がんの進行またはがんに関連する１つまたは２つ以上の徴候の進行を休止させることまたは遅延させることを含んでもよい。いくつかの態様において、対象を処置することは、がんに関連する長期の徴候の発現または進行の予防、遅延、または減速を含んでもよい。いくつかの態様において、対象を処置することは、完全なまたは部分的な寛解に関係する。
【００８６】
本明細書中で用いる、「対象」は、哺乳類、好ましくはヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類である。全ての態様において、ヒト対象が好ましい。本明細書中で用いる「必要性のある対象」および「処置の必要性のある対象」は、がんを有すると疑われる、またはがんを有すると診断された対象である。必要性のある対象はまた、限定することなく、喫煙、家族歴、遺伝的素因、および外部要因（例えば、環境要因）を含む、関連する危険因子により決定されるがんを有するリスクのある対象である。
【００８７】
ヒトのがんに関して、具体的な例は、胆道癌；膀胱癌；乳癌；脳腫瘍（膠芽細胞腫および髄芽細胞腫を含む）；子宮頸癌；絨毛腫；結腸癌（結腸直腸癌を含む）；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；頭部癌および頸部癌；血液学的新生物（急性リンパ球性および骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病を含む）；上皮内新生物（ボーエン病およびパジェット病を含む）；肝臓癌；肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む）；リンパ腫（ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含む）；神経芽細胞腫；口腔癌（扁平上皮細胞癌を含む）；骨肉腫；卵巣癌（上皮細胞、間質細胞、胚細胞および間葉細胞から生じるものを含む）；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、神経肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維組織細胞腫(malignant fibrous histocytoma)、神経膠腫、食道癌、肝癌および骨肉腫を含む）；皮膚癌（黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む）；精巣癌（セミノーマなどの胚腫瘍、非セミノーマ（奇形腫、絨毛腫）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍；精巣癌；甲状腺癌（甲状腺の腺癌および髄様癌）；移行癌ならびに腎癌（腺癌ならびにウィルムス腫瘍を含む）を含む。
【００８８】
本発明は、また、慣用のがんの処置方法および手順と組み合わせての、本発明の方法の使用を意図する。がんに対する慣用の処置は、外科的介入、化学療法、放射線療法、および補助的全身療法を、限定せずに含んでもよい。本発明の１つの側面において、処置は、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体などの結合ポリペプチドを投与することを含んでもよい。これらの結合ポリペプチドは、１つまたは２つ以上の検出可能なマーカー、抗腫瘍剤または免疫賦活剤に任意に連結することができる。
【００８９】
本発明は、本明細書中に開示されるさまざまな物質の、対象に「免疫付与する」ための、または「ワクチン」としての使用を含む。本明細書中で用いられる「免疫付与」または「ワクチン接種（vaccination）」は、抗原に対する免疫応答を増大または活性化させることを意味する。それは症状の除去または根絶を要しないが、むしろ抗原に対する免疫応答の臨床的に好ましい増強を意図する。一般的に認められている動物モデルは、がんに対する免疫付与を試験するために用いることができる。
【００９０】
免疫付与の方法（ワクチン組成物の処方および用量の選択を含む）、投与経路ならびに投与スケジュール（例えば、初期用量および１回または２回以上の追加用量）は、当該技術分野において周知である。試験はヒトにおいて実施でき、そこにおいて評価項目は、抗原を有する細胞に対する増強したレベルの循環ＣＴＬの存在に関して試験すること、抗原に対する循環抗体のレベルに関して試験すること、抗原を発現する細胞の存在を試験すること、などであり得る。さらに、免疫付与は抗原をコードするＤＮＡワクチンベクターおよびかかる抗原を発現するＩＩＩ型分泌系を有する組み換え非病原性細菌を含むキットを用いて実施してもよいと考えられる。この組み合わせは、患者が既に受けたワクチンについての追加免疫に、組み換え細菌が加わったものとみることができる。代わりに、腫瘍抗原に関し、それはプライミング−ブースト複合品（prime-boost combination product）として本質的に用いることができる。かかるキットは、抗原に対する１回量より多いワクチンを含有してもよい。
【００９１】
免疫付与組成物の部分として、ＩＩＩ型分泌系を介して１つまたは２つ以上の腫瘍抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組み換え細菌は、任意に１つまたは２つ以上のアジュバントとともに投与され、免疫反応を誘発させる、または免疫応答を増大させる。免疫付与はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団および／またはＴ細胞を対象に投与することにより、受動的に達成することができる。かかるＴ細胞は、１つまたは２つ以上の抗原を認識する。
【００９２】
アジュバントは、抗原に組み込まれ、または抗原とともに投与される、免疫応答を強化する物質である。アジュバントは、抗原の貯蔵所を提供し（細胞外に、またはマクロファージ内に）、マクロファージを活性化し、そしてリンパ球の特定の集団を刺激することにより、免疫応答を強化することができる。多くの種類のアジュバントが、当該技術分野で周知である。アジュバントの具体例は、Salmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同種物であるモノホスホリルリピドＡ（MPL, SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製された純粋なQA-21サポニンであるQS21（SmithKline Beecham）、PCT出願WO96/33739に記載のDQS21（SmithKline Beecham）、Quillaia saponaria molina樹木の樹皮由来のISCOM （CSL Ltd., Parkville, Victoria, Australia）、QS-7、QS-17、QS-18、およびQS-L1（So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997）を含むサポニン；不完全フロイントアジュバント；完全フロイントアジュバント；モンタナイド（montanide）；ミョウバン；CpGオリゴヌクレオチド（例えば、Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995を参照のこと）および他の免疫刺激性オリゴヌクレオチド；スクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生分解性油から作製されたさまざまな油中水エマルジョン；およびイミキモド（imiquimod）（3M, St. Paul, Minnesota）などの、皮膚の外側に見られる、一部の免疫細胞上のいわゆる「トール様受容体７」により取り込まれる因子を含む。好ましくは、抗原はDQS21/MPLの組み合わせと混合して投与される。MPLに対するDQS21の割合は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、より好ましくは約１：１であることができる。ヒトへの投与に関し、典型的にはDQS21およびMPLは、ワクチン製剤において、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲で存在することができる。他のアジュバントは当該技術分野において既知であり、本発明において用いることができる（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Ed., 1986を参照のこと）。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルジョンを作製するための方法はワクチン接種の当業者に周知である。
【００９３】
対象の免疫応答を刺激する他の薬剤を対象に投与することもできる。例えば、他のサイトカインもまた、そのリンパ球調整特性の結果、ワクチン接種プロトコールにおいて有用である。ワクチンの防御効果を強化することが示されたインターロイキン１２（IL-12）、GM-CSFおよびIL-18を含む、かかる目的に関して有用な多くの他のサイトカインが、当業者に既知である。したがって、サイトカインを抗原およびアジュバントとともに投与し、かかる抗原に対する免疫応答を増強することができる。ワクチン接種プロトコールにおいて用いることができる、免疫応答を強化するさまざまな追加の化合物がある。これらは、タンパク質または核酸の形態のいずれかで提供される共刺激分子を含む。それらの共刺激分子は、樹枝状細胞（DC）上に発現され、かつＴ細胞上に発現されるCD28分子と相互作用する、B7-1およびB7-2（それぞれCD80およびCD86）分子を含む。この相互作用により、抗原/MHC/TCRにより刺激された（シグナル１）Ｔ細胞への共刺激（シグナル２）が提供され、Ｔ細胞増殖、およびエフェクター機能が増強される。B7はまた、Ｔ細胞上のCTLA4（CD152）と相互作用し、CTLA4およびB7リガンドに関係する研究により、B7-CTLA4相互作用により、抗腫瘍免疫およびCTL増殖を強化することができるということが示されている（Zheng et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:6284-6289, 1998）。
【００９４】
B7は、典型的には、腫瘍細胞において発現されず、したがって、それらはＴ細胞に対する効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）ではない。B7発現の誘発により、腫瘍細胞がより効率的にＣＴＬ増殖およびエフェクター機能を刺激することを可能とするであろう。B7/IL-6/IL-12共刺激の組み合わせが、Ｔ細胞集団においてＩＦＮ−γおよびＴｈ１サイトカインプロファイルを誘発し、さらに強化されたＴ細胞活性を導くことが示されている（Gajewski et al., J. Immunol. 154:5637-5648, 1995）。B7による腫瘍細胞のトランスフェクションは、養子免疫療法のためのin vitro CTL拡張と関連して、Wang et al.により議論されている（J. Immunother. 19:1-8, 1996）。B7分子に関する他の送達機構は、核酸（裸のＤＮＡ）免疫付与（Kim et al., Nature Biotechnol. 15:7:641-646, 1997）およびアデノおよびポックスなどの組み換えウイルス（Wendtner et al., Gene Ther. 4:726-735, 1997）を含むことができる。これらの系はすべて、本明細書中で議論する抗原または抗原の断片（ポリトープを含む）あるいはサイトカインなどの選択された他の分子とＢ７との共発現のための発現カセットのに関する構築および使用に適している。これらの送達系は、in vitroでの適切な分子の誘発およびin vivoでのワクチン接種状況のための用いることができる。Ｔ細胞をin vitroおよびin vivoで直接刺激するための抗ＣＤ２８抗体の使用も考慮することができる。同様に、外来抗原にするＴ細胞応答を誘発する誘導性の共刺激性分子ＩＣＯＳを、例えば抗ＩＣＯＳ抗体を用いることにより調節できる（Hutloff et al., Nature 397:263-266, 1999）。
【００９５】
リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）は、ＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞で発現され、Ｔ細胞で発現されるＣＤ２と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞のＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を誘発し、したがって、B7/CD28共刺激相互作用を置換しないが、これを補完することができる（Parra et al., J. Immunol., 158:637-642, 1997; Fenton et al., J. Immunother., 21:95-108, 1998）。
【００９６】
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は、白血球上に発現され、ＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞上に発現されるICAM-1と相互作用する。この相互作用はＴ細胞のＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を誘発し、したがって、B7/CD28共刺激相互作用を置換しないが、これを補完することができる（Fenton et al., J Immunother., 21（2）:95-108, 1998）。そのため、ＬＦＡ−１は、B7に関して上で議論したさまざまな方法でのワクチン接種プロトコールにおいて提供できる共刺激分子のさらなる例である。
【００９７】
完全なCTLの活性化およびエフェクター機能は、Th細胞のCD40L（CD40リガンド）分子と、DCにより発現されるCD40分子との間の相互作用を介するTh細胞の援助を必要とする（Ridge et al., Nature 393:474, 1998; Bennett et al., Nature 393:478, 1998; Schoenberger et al., Nature  393:480, 1998）。この共刺激シグナルのこの機構は、B7の上方調節およびDC（APC）による関連するIL-6/IL-12産生を伴うようである。したがって、CD40-CD40L相互作用は、シグナル１（抗原/MHC-TCR）およびシグナル２（B7-CD28）相互作用を補完する。
【００９８】
DC細胞を直接刺激する抗CD40抗体の使用により、通常は炎症状況以外で遭遇する、またはノンプロフェッショナルAPC（腫瘍細胞）により提示される腫瘍関連抗原に対する応答の強化が期待される。樹枝状細胞の成熟を誘発するための他の方法、例えばCD40-CD40L相互作用を増加させること、またはDCをCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドまたは細胞外マトリックスからの刺激性糖部分と接触させることは当該技術分野で既知である。これらの状況において、Thによる援助およびB7共刺激シグナルは提供されない。これらの機構は、抗原パルスDCに基づく療法の状況またはThエピトープが既知の腫瘍関連抗原前駆体において定義されない状況において用いることができる。
【００９９】
投与される場合、本発明の治療組成物は、薬学的に許容し得る調製物として投与される。かかる調製物は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性の担体、アジュバントおよびサイトカインなどの追加の免疫増強剤、および任意に他の治療剤を、通常どおり含有してもよい。
【０１００】
本明細書中で用いる「薬学的に許容し得る」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性材料を意味する。「生理学的に許容し得る」という用語は、細胞、細胞培養物、組織、または生物などの生物系に適合性の非毒性材料を指す。担体の特性は、投与経路に依存し得る。生理学的および薬学的に許容し得る担体は、希釈剤、充てん剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野で周知の他の材料を含む。「担体」の用語は、適用を容易にするために有効成分と混合される、天然または合成の有機または無機成分を示す。かかる薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に損なうような相互作用がないように、本発明の分子と、および互いに混合することができる。
【０１０１】
本発明の治療剤は、注射または時間をかけた緩徐な注入を含む任意の慣用の経路により投与することができる。かかる投与は、例えば、経口（経鼻、経膣、経直腸、経粘膜表面）、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腔内、皮下、または経皮であってもよい。好ましい態様において、かかる組成物は、経口でまたは腫瘍内に投与される。
【０１０２】
本発明の調製物は、有効量で投与される。有効量とは、単独、またはさらなる用量とともに、所望の応答を刺激するような、薬学的調製物の量である。がんを処置する場合、所望の応答はがんの進行を阻害することである。これは疾患の進行を一時的に減速させることのみを伴ってもよいが、より好ましくは、疾患の進行の恒久的な停止を伴う。免疫応答を誘発する場合、所望の応答は、使用する腫瘍抗原に特異的な抗体またはＴリンパ球の増加である。これらの所望の応答は、ルーチンの方法によりモニターできる。
【０１０３】
本発明の治療組成物を用いて免疫応答を刺激することが望まれる場合、これは、血清中の抗体力価の上昇、細胞障害性リンパ球のクローン性増殖、またはいくつかの他の所望の免疫応答をもたらす体液性抗体応答の刺激を伴うことができる。投与形式に依存して、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる免疫原の用量が有効であり得る。好ましい範囲は５００ｎｇ〜５００μｇ／ｋｇの間であると考えられる。かかる絶対量は、投与のために選択した材料、投与が単回投与であるかまたは複数回投与であるか、および年齢、体調、サイズ、体重、および疾患のステージを含む個々の患者のパラメーターを含む、さまざまな要素に依存し得る。これらの要素は当業者に周知であり、ルーチンの実験を超えない範囲で解明することができる。
【０１０４】
本発明の治療組成物の投与は、他の要素と組み合わせて投与される場合、逐次的に（subsequently）、一斉に（concurrently）、または同時に（simultaneously）行うことができることがさらに意図される。当業者は、ルーチンの実験を超えない範囲で、必要な投与手順を決定できるであろう。
【０１０５】
例
例１
治療用がんワクチンのためのSalmonellaＩＩＩ型分泌系によるin vivo抗原送達
材料および方法
マウス
メスBALB/cマウスおよびC.B-17スキッドマウスを日本クレア （大阪、日本）より購入し、７〜１０週齢で用いた。マウスを三重大学医学部（三重、日本）の動物センターで飼育した。実験プロトコールは三重大学医学部の動物実験倫理委員会で承認された。
【０１０６】
患者およびエフェクターＴ細胞
患者NW29およびNW634は、NY-ESO-1発現黒色腫を有し、既述されている（35, 36）。全ての試料は、ヘッセン州医師会倫理委員会（フランクフルト）により承認された研究の一環としてのインフォームドコンセント後に採取した。NY-ESO-1157-165に特異的なHLA-A*0201拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンであるクローン４９は、黒色腫患者の腫瘍浸潤リンパ球から限界希釈により生成した（Dr. D. Valmori, Columbia University, New York, NYの寄贈）（Valmori, D. et al., Cancer Res. 60:4499-506, 2000）。インフルエンザマトリックス58-66に特異的なHLA-A*0201拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞NW46-Fluは、NW46黒色腫患者に由来した。
【０１０７】
細菌株
S. typhimurium ΔphoP-phoQ株は既述である（19）。この株は、全長NY-ESO-1（S. typhimurium-NY-ESO-1）に融合した、またはインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質（S. typhimurium-Flu マトリックス）のアミノ酸５８〜６６に融合した、分泌およびトランスロケーションシグナル（38）を含有するSopEの最初の１００アミノ酸からなるキメラタンパク質を発現するプラスミドを受け入れるために用いた。これらの研究において用いられるS. typhimurium対照株は、かかるプラスミドがSopEの最初の１００のアミノ酸のみを発現する以外は、上記の株と同一である。全ての構築物はSopE1-100にすぐ隣接して配置される２つのエピトープ：キメラタンパク質検出のためのアデノウイルスE4-6/7タンパク質からのM45エピトープタグ（39）、およびインフルエンザウイルス核タンパク質からの残基３６６〜３７４からなるマウスH-2bハプロタイプクラス−Ｉ拘束性エピトープを含有する。図１ｂで用いた対照ＩＩＩ型分泌欠損株および図１ｃで用いたトランスロケーション欠損株は既述である（40, 41）。全てのプラスミドは、標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて構築した。種々のワクチン構築物による培養上清タンパク質の解析およびＩＩＩ型分泌タンパク質の宿主細胞へのトランスロケーションは、構築物中に存在するM45エピトープタグに対するAbを用いて、既述のとおりに（19）行った。
【０１０８】
腫瘍
NY-ESO-1を発現するヒト黒色腫細胞株SK-MEL-37、およびNY-ESO-1を発現しないSK-MEL-21は、ともにHLA-A*0201+である。CMS5は、BALB/c起源の３−メチルクロラントレン誘発性肉腫細胞系である（DeLeo, A.B., J. Exp. Med. 146:720-34, 1977）。CMS5aは、mERK2発現腫瘍であるCMS5から得た、サブクローン化した細胞系である（42, 43）。CMS5a-NY-ESO-1およびCMS5a-HEは、それぞれNY-ESO-1またはc-erbB-2/HER2/neuで安定的にトランスフェクトしたCMS5a由来の細胞系である（Mukai, K. et al., Gene Ther. 9:879-88, 2002）。P1.HTRはDBA/2起源の肥満細胞腫P815のサブラインである（Van Pel, A., et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 11:467-75, 1985）。
【０１０９】
抗体および試薬
抗ＣＤ４ｍＡｂ（GK1.5, ラットIgG2b）および抗ＣＤ８ｍＡｂ（19/178, ラットIgG2b）についてのハイブリドーマを、C.B-17スキッドマウスに接種し、腹水を採取した。ともに２５μｌの腹水の形態で用い、枯渇（depletion）実験のために５日ごとに側尾静脈を介してマウスへ注射した。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４（GK1.5, ラットIgG2b）または抗ＣＤ８（19/178、ラットIgG2b）mAbの尾静脈投与により、既述（46, 47）のとおりにして枯渇させた。NY-ESO-179-108 （GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRS、配列番号１）およびインフルエンザNP206-229 （FWRGENGRKTRIAYERMCNILKGK、配列番号２）の合成ペプチド（Gnjatic, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:8862-7, 2003）を、Multiple Peptide Systems （San Diego, CA）より得た。組み換えFowlpoxベクターは、既述のとおりに（Gnjatic, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:10917-22, 2000）、Therion Biologics （Cambridge, MA）より得た。NY-ESO-1をコードするcDNAは、Dr. J. Miyazaki （大阪大学、大阪、日本）より寄贈されたpCAGGS-New （Niwa, H., et al., Gene. 108:193-9, 1991）にクローニングし、QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit （QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて精製した。
【０１１０】
Salmonella感染
細菌性ＩＩＩ型分泌タンパク質SopEが全長NY-ESO-1（Sal-NY-ESO-1）、インフルエンザマトリックスタンパク質エピトープ58-66 （Sal-Flu マトリックス）、または対照ベクター（Sal-ContVec）に融合した、ΔphoP-phoQ Salmonella typhimurium構築物を、既述（Russmann, H. et al., Science. 281:565-8, 1998; Shams, H., et al., Vaccine. 20: 577-85, 2001; Evans, D.T. et al., J. Virol. 77:2400-9, 2003; Galan, J.E., et al., Gene. 94:29-35, 1990）のとおりに作製した。Salmonella typhimurium感染を、既述のとおりに、いくつかの修正を加えて行った（Russmann, H. et al., Science. 281:565-8, 1998; Shams, H., et al., Vaccine. 20: 577-85, 2001; Evans, D.T. et al., J. Virol. 77:2400-9, 2003）。簡潔に述べると、Salmonella typhimuriumを300 mMのNaClを含有するLennoxブロス中で増殖させ、ＩＩＩ型分泌装置の成分の発現を誘発させた。細胞培養物またはマウスへの接種のためのSalmonella typhimuriumを調製するために、細菌を一晩３７℃で培養し、適した容量の培地で〜０．２の光学密度（OD600）が得られるように希釈した。培養物を３７℃で回転ホイール上でOD600が〜０．６となるようにさらに培養した。感染のための用量は、Salmonella typhimuriumの関連するOD値およびコロニー形成単位から構築された標準曲線から推測した。
【０１１１】
標的細胞を、感染多重度（MOI）４０のSalmonella typhimuriumのそれぞれと、３７℃で１時間共培養することにより感染させた。次いで、細胞外細菌を、標的細胞を１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Sigma）を含有するRPMI 1640培地に移し、３７℃で1時間培養することにより殺滅した。感染細胞をその後APCとして用いた。
【０１１２】
免疫細胞化学および免疫組織化学
〜５×１０３のサイトスピン試料を２０分間室温で空気乾燥し、１０％緩衝ホルマリンで２０分間固定した。その後、試料を３回ＰＢＳですすぎ、１μｇの抗NY-ESO-1マウスmAb、ES121とともに２時間室温で培養した。デキストランポリマー標識システム（EnVision Plus, DAKO, Glostrup, Denmark）を２次検出に用いた。３，３’−ジアミノ−ベンジジン（DAB, BioGenex, San Ramon, CA）をクロモゲンとして用いて、ヘマトキシリンで対比染色した。免疫組織化学的解析のために、外科的に切除した腫瘍試料を２ｍｍ厚にスライスし、そして１０％パラホルムアルデヒド中７時間、４℃で固定した。固定した試料を乾燥させ、パラフィン上にマウントした。２．５μｍのスライスした試料を用いた。免疫組織化学を、Histomouse-SP Plus Kit （Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA）を用いて実施した。抗原回復を、脱パラフィン化した試料を１０５℃で２０分間、DAKO high pH Target Retrieval Solution （Dako, Glostrup, Denmark）中で加熱することにより実行した。2.5 mg/mlの濃度の１次抗体ES121を１６時間４℃でインキュベートした。DABをクロモゲンとして用いた。ヘマトキシリン対比染色を実行した。
【０１１３】
In vitro前感作
In vitro前感作を、記述のとおりに実行した（Gnjatic, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:8862-7, 2003; Jager, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:4760-5, 2000; Atanackovic, D. et al., J. Immunol. Methods. 278:57-66, 2003）。簡潔に述べると、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をがん患者の末梢血単核球（PBMC）から抗体コート磁気ビーズ（Dynabeads; Dynal, Oslo, Norway）を用いて分離し、丸底９６ウェルプレート（Corning, NY）に、１０％ヒトAB血清（Gemini Bio-Products, Woodland, CA）、L-グルタミン（2 mM）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、および1%非必須アミノ酸を含むRPMI 1640培地中、５×１０５細胞／ウェルの濃度で播種した。前感作のためのＡＰＣとして、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣを１０μＭのペプチドで一晩パルスするか、または種々のS. typhimurium構築物で１時間感染させ、次いでゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）で１時間処置し、一晩培養した。S. typhimurium-NY-ESO-1感染後、NY-ESO-1の発現をＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣにおいて確認した。照射後、これらの細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するプレート上へ１×１０６細胞／ウェルの濃度で添加した。２０時間後、インターロイキン（ＩＬ）−２（10 U/ml; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）およびＩＬ−７（20 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN）を添加した。次いで、培地の半量をIL-2 （20 U/ml）およびIL-7 （40 ng/ml）を含有する培地で、週に２度交換した。
【０１１４】
標的細胞の生成および培養
最初の分離（上記を参照）からの残存ＣＤ４＋Ｔ細胞の画分を、２４ウェルプレート（Corning Glass, Corning, NY）に、、１０％ヒトＡＢ血清（Gemini Bio-Products）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン（2 mM）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、１％非必須アミノ酸および10μg/mlフィトヘマグルチニン（PHA HA15; Murex Diagnostics, Dartford, U.K.）を含むRPMI 1640培地中、２〜４×１０６細胞／ウェルの濃度で播種した。細胞に週に２度、IL-2 （10 U/ml）およびIL-7 （20 ng/ml）を含有する培地を供給し、増殖させた。２０〜３０日の培養後、活性化したＴ細胞APC（T-APC）を回収し、標的細胞として用いた。
【０１１５】
Epstein Barrウイルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を、10%ウシ胎仔血清（Sigma）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、および1%非必須アミノ酸を添加したRPMI 1640培地中で培養した。
【０１１６】
全てのアッセイにおいて、標的細胞を２度洗浄して血清を除去し、ペプチド（10μM）、組み換えFowlpoxウイルス（１細胞あたり100プラーク形成単位）またはSalmonella構築物（40 MOI）を添加し、それぞれ３７℃で一晩培養するか、または１時間培養し、次いでゲンタマイシン（100μg/ml）で１時間処置した。
【０１１７】
四量体染色
四量体染色を、既述のとおりに（Jager, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:4760-5, 2000）実行した。簡潔に述べると、２％ウシ胎仔血清を含有する５０μｌＰＢＳ中のＣＤ８＋Ｔ細胞を、フィコエリトリン（PE）標識NY-ESO-192-100/HLA-Cw*0304四量体（Ludwig Institute Core FacilityでDrs. P. GuillaumeおよびI. Luescher, Lausanne, Switzerlandにより作製）により１５分間、３７℃で染色し、次いでTricolor-CD8 mAb（Caltag Laboratories, South San Francisco, CA）により１５分間、３７℃で追加染色した。洗浄後、結果をフローサイトメトリー（FACSCalibur; BD Biosciences, San Diego, CA）で解析した。
【０１１８】
酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイ
インターフェロン（IFN）−γ分泌ペプチド特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、既述のとおりに（Mukai, K. et al., Gene Ther. 9:879-88, 2002; Gnjatic, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:8862-7, 2003; Jager, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:4760-5, 2000; Atanackovic, D. et al., J. Immunol. Methods. 278: 57-66, 2003; Nishikawa, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98: 14571-6, 2001）ELISPOTアッセイにより評価した。ヒトELISPOTアッセイにおいて、平底、９６ウェルのニトロセルロースコートマイクロタイタープレート（Millipore, Bedford, MA）をIFN-γmAb（1-D1K; MABTECH, Stockholm）でコートし、前感作したＴ細胞および標的細胞（ペプチドでパルスした、または組み換えFowlpoxウイルス（細胞あたり100 PFU）または種々のS. typhimurium構築物（40 MOI）で感染させたEBV-B細胞）をそれぞれのウェルに添加し、２４時間培養した。スポットをビオチン化抗IFN-γ（7-B6-1-biotin; MABTECH）、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（MABTECH, Sweden）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（Sigma）を用いて発色させ、C. T. L. Immunospotアナライザーおよびソフトウェア（Cellular Technologies, Cleveland, OH）でカウントした。
【０１１９】
マウスELISPOTアッセイにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、MACSカラム上のポジティブセレクションにより、脾臓細胞から調製した。標的細胞は、mMessage mMachine T7 Ultra Capped Transcription Kit （Ambion, Austin, TX）を用いて、NY-ESO-1、mERK2、c-erbB-2/HER2/neuまたはEGFPのプラスミドDNAから転写したmRNAでトランスフェクトしたP1.HTR（ECM830, BTX Harvard apparatus, Holliston, MA）であった。１×１０５のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ラット抗ＩＦＮ−γ（R4-6A2, BD PharMingen）でコートした９６ウェルニトロセルロースコートマイクロタイタープレート（Millipore）のウェル中で、それぞれのmRNAでトランスフェクトした１×１０５ＭＭＣ処置P1.HTRとともに、２４時間培養した。スポットをビオチン化抗ＩＦＮ−γ（XMG1.2, BD PharMingen）、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（MABTECH, Sweden）、およびアルカリフォスファターゼ基質キット（BioRad, Hercules, CA）を用いて発色させ、次いでカウントした。
【０１２０】
遺伝子銃による免疫付与
プラスミドＤＮＡでコートした金粒子（1μg/注入）を作製し、BALB/cマウスの腹壁の剃毛した皮膚にHelios Gene Gun System （BioRad）により、350-400 psiのヘリウム排気圧力で、既述のとおりに送達した（Nishikawa, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98:14571-6, 2001; Nishikawa, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:10902-6, 2003）。
【０１２１】
結果
S. typhimuriumによるNY-ESO-1腫瘍抗原の宿主細胞への異種分泌およびトランスロケーション
病原性島１（SPI-1）中にコードされるS. typhimuriumＩＩＩ型分泌系は、異種抗原の送達のために以前より利用されてきた（19）。我々は、プラスミドより、レポーターエピトープ（材料および方法を参照のこと）およびNY-ESO-1 腫瘍抗原（S. typhimurium-NY-ESO-1）の全アミノ酸配列に融合したＩＩＩ型分泌タンパク質SopEの最初の１０４アミノ酸から構成されるキメラタンパク質を発現する、S. typhimurium ΔphoP ΔphoQ 非病原性株を構築した。対照として、ＩＩＩ型分泌タンパク質SopEおよびレポーターエピトープのみを発現する同等なプラスミドを有する同じS. typhimurium ΔphoP ΔphoQ非病原性株を利用した（これらのプラスミド構築物の略図に関し、図１ａを参照のこと）。SopE-NY-ESO-1キメラタンパク質は、S. typhimuriumワクチン株の培養上清に効率的に分泌されたが、病原性島１（SPI-1）にコードされるＩＩＩ型分泌系を欠損する同系の変異株の上清には分泌されなかった（図１ｂ）。さらに、SopE-NY-ESO-1タンパク質は、SopE自体などの他のＩＩＩ型分泌タンパク質に関して観察されるものと同等な効率で、CMS5aマウス腫瘍細胞株のサイトゾル中に送達された（図１ｃ）（22）。次に我々は、S. typhimurium-NY-ESO-1がNY-ESO-1タンパク質を、感染したヒト黒色腫細胞株、SK-MEL-21のサイトゾルに送達できるかどうかを試験した。図１ｄに示すように、S. typhimurium-NY-ESO-1に感染したSK-MEL-21は、NY-ESO-1 mAbを用いた免疫組織化学で試験したところ、顕著な特異的染色を示したが、S. typhimurium対照株（対照プラスミドを担持する同じ菌株）に感染したものは示さなかった。同様のタンパク質移行は、上皮がん細胞株（SK-LC-14）を含む、他の細胞型のS. typhimurium-NY-ESO-1感染後に観察された（データは示さない）。これらの結果は、S. typhimurium-NY-ESO-1がS. typhimuriumＩＩＩ型分泌系を介してNY-ESO-1を効率的に送達できることを示すものである。
【０１２２】
S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系はNY-ESO-1をMHCクラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示経路に送達する
我々は、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系により送達されるNY-ESO-1がMHCクラスＩ経路に入るかどうか、およびＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されるかどうかを試験した。SK-MEL-21細胞を、S. typhimurium-NY-ESO-1、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質に由来するペプチドを送達する能力を付与されたS. typhimurium（S. typhimurium-Flu マトリックス）、またはS. typhimurium対照株（対照プラスミドベクターを有する同一菌株）に感染させた。次いで、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞へ抗原を提示する感染細胞の能力を、酵素結合イムノスポット（ELISPOT）アッセイにより評価した。HLA-A*0201拘束性NY-ESO-1157-165特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンであるクローン４９を、S. typhimurium-NY-ESO-1感染SK-MEL-21細胞で刺激した（図２ａ）。対照的に、このＴ細胞クローンは、S. typhimurium-Fluマトリックスを感染させたSK-MEL-21細胞によっては刺激されなかったが、この感染細胞はインフルエンザマトリックス58-66に対して特異的なHLA-A*0201拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞NW46-Fluを刺激することができた（図２ａ）。
【０１２３】
我々はまた、がん患者からのプライマリーＴ細胞を用いたS. typhimuriumＩＩＩ型分泌系の抗原送達能力を試験した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、NY-ESO-1に対する既存の免疫を有する、NY-ESO-1発現黒色腫患者（NW29およびNW634）のＰＢＭＣから精製した。細胞を「方法」で記載したとおりに、NY-ESO-179-108ペプチドでパルスした自己ＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣで前感作し、刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的IFN-γ分泌をELISPOTアッセイで分析した。前感作したプライマリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、S. typhimurium-NY-ESO-1感染自己EBV形質転換Ｂ細胞（EBV-V細胞）に、同種のペプチドでパルスした細胞と同様の様式で反応した（Fig. 2b）。対照的に、S. typhimurium対照株を感染させた、または非同種のペプチドでパルスした自己EBV-B細胞は、いかなる測定可能な応答も示さなかった。
【０１２４】
次に我々は、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系が、がん患者のＰＢＭＣから抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導できるかどうかを検討した。患者NW29およびNW634から得たPBMCに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、S. typhimurium-NY-ESO-1または対照株に感染させたＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣで前感作し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的IFN-γ分泌をELISPOTアッセイまたは四量体染色で分析した。S. typhimurium-NY-ESO-1を感染させたＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣでの前感作により、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導されたが、対照株では誘導されなかった（図３ａおよび３ｂ）。
【０１２５】
我々は、また、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系により送達された抗原が、がん患者の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示され得るかどうかを試験した。NY-ESO-179-108ペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同種のペプチドでパルスした、またはS. typhimurium-NY-ESO-1を感染させた自己活性化Ｔ細胞ＡＰＣに対し同等に反応した（図７ａ）。NW29およびNW634からのＣＤ４＋Ｔ細胞が、S. typhimurium-NY-ESO-1を感染させたまたはNY-ESO-1ペプチドでパルスした、ＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣにより前感作された場合、同等な数のNY-ESO-179-108ペプチド特異的ＣＤ４＋細胞が得られた。総合すると、これらの結果は、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系により送達された抗原がＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞に効率的に提示されることができることを示している。
【０１２６】
S. typhimurium-NY-ESO-1の経口投与により、マウスにおいて、NY-ESO-1発現腫瘍の退縮が引き起こされる
我々は、S. typhimurium-NY-ESO-1の治療的がんワクチンとしての可能性を、マウスモデルにおいてNY-ESO-1発現腫瘍の退縮を引き起こす能力を試験することにより調査した。BALB/cマウスを２×１０６個のCMS5a-NY-ESO-1細胞または１×１０６個のCMS5a親細胞で接種した。腫瘍接種の７日後、動物は１〜２×１０８個のＳ. typhimurium-NY-ESO-1または対照株の経口投与を受けた。腫瘍増殖の進行をモニターするために、腫瘍のサイズを週３回測定した。S. typhimurium-NY-ESO-1または対照株の投与は、非処置対照群と比較した場合、CMS5a腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかった（図４ａ）。S. typhimurium対照株を受けたマウスはいかなる測定可能な腫瘍退縮も示さなかったことから、かかる効果はNY-ESO-1抗原の送達に依存性であった（図４ａ）。
【０１２７】
S. typhimurium-NY-ESO-1が腫瘍退縮を誘発する機構への洞察を得るために、我々は、この株を接種した動物からのＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇の腫瘍増殖への影響を調査した。抗CD8 mAbの注入により、S. typhimurium-NY-ESO-1の治療効果は効果的に阻止された（図４ａ）。対照的に、抗CD4 mAbまたは無関連の対照Abの注入は、S. typhimurium-NY-ESO-1の腫瘍退縮を誘発する能力に影響を及ぼさなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞のS. typhimurium-NY-ESO-1の治療効果における関与と一致して、この株を接種されたマウスは顕著なNY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した。対照的に、S. typhimurium対照株を受けたマウスは、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のいかなる検出可能なレベルも有しなかった（図４ｂ）。
【０１２８】
一部の免疫付与方法により、エピトープスプレディングとして知られる現象である、ワクチンには含有されないが、腫瘍細胞には含有される腫瘍抗原に対する免疫応答が展開されることが以前より示されている（23, 24）。それゆえ、我々はS. typhimurium-NY-ESO-1の投与の結果、ワクチンには含有されないが腫瘍細胞に含有される抗原に対する免疫応答の生成が起きるかどうかを調査した。S. typhimurium-NY-ESO-1を受けたCMS5a-NY-ESO-1腫瘍を有するマウスは、CMS5a腫瘍細胞に存在する抗原である変異ERK2（mERK2）に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成した（図４ｂ）。対照的に、S. typhimurium対照株を接種したCMS5a-NY-ESO-1を有するマウスあるいはS. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株を接種したCMS5a親腫瘍を持つマウスは、mERK2に対するいかなる応答も展開しなかった（図４ｂ）。これらの結果により、S. typhimurium-NY-ESO-1の投与により、標的腫瘍細胞によって発現されるが、ワクチンには存在しない抗原に対する免疫応答を誘発できること、およびこれらの免疫応答の結果腫瘍が退縮することが示された。
【０１２９】
S. typhimuriumは、腫瘍内に投与されると、標的細胞へ抗原を送達する
S. typhimurium-NY-ESO-1による効率的なin vitro抗原送達は、このワクチンのin vivoでの抗原を腫瘍細胞に送達する能力を試験するよう、我々を駆り立てた。S. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株を、（NY-ESO-1を発現しない）触診可能なCMS5a 腫瘍に直接接種した。そして接種した腫瘍を外科的に除去し、免疫組織化学によりNY-ESO-1の存在に関して解析した。NY-ESO-1は、S. typhimurium-NY-ESO-1を接種した腫瘍細胞において検出されたが、S. typhimurium対照株を接種した腫瘍細胞においては検出されなかった。NY-ESO-1は壊死巣を取り囲む領域で、広く検出された（図５）。しかしながら、非特異的な染色がまた、接種から生じた壊死巣において観察された（図５）。NY-ESO-1は腫瘍細胞において主に検出されたが、線維芽細胞を含有する周囲の間質もまた、NY-ESO-1に関して陽性であった（図５）。これらの結果により、局所投与される場合、S. typhimuriumはそのＩＩＩ型分泌系を介して抗原を腫瘍部位に送達できることが示された。
【０１３０】
S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系による局所腫瘍抗原送達は、エピトープスプレディングおよび腫瘍退縮をもたらす
in vivoでのS. typhimurium-NY-ESO-1による腫瘍細胞への効果的な抗原送達に鑑み、我々は、かかるS. typhimuriumＩＩＩ型分泌系がNY-ESO-1を抗原を発現しない腫瘍細胞に移送し、既存のNY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に感受性とすることができるか否かを検討した。したがって、我々は、BALB/cマウスを遺伝子銃により、NY-ESO-1をコードするプラスミドで、または対照ベクタープラスミドで、２週間の間隔で２度免疫した。この免疫付与方法の結果、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導がNY-ESO-1で免疫されたマウスにおいて起こったが、対照プラスミドで免疫されたマウスにおいては起こらなかった（図６ｂ）。次に、免疫したマウスに、腫瘍特異抗原mERK2およびc-erbB-2/HER2/neuを発現するが、NY-ESO-1は発現しない、２×１０６細胞のCMS5a-HE腫瘍細胞株を接種した。腫瘍接種後７日目に、０．５〜１×１０６個のS. typhimurium-NY-ESO-1またはS. typhimurium対照株を腫瘍部位へ直接注入し、腫瘍増殖を１週間に３回調べた。S. typhimurium-NY-ESO-1の投与は、NY-ESO-1免疫動物において腫瘍増殖を防いだだけでなく、初期腫瘍の退縮をも引き起こした（図６ａ）。対照的に、NY-ESO-1予備免疫マウスにおけるS. typhimurium対照株の投与、または対照プラスミドで予備免疫した動物におけるS. typhimurium-NY-ESO-1投与は、初期のわずかな腫瘍増殖速度の低下を引き起こしたが、腫瘍は最終的には発達し続け、非処置の対照動物とほぼ同じサイズに達した（図６ａ）。S. typhimurium-NY-ESO-1のNY-ESO-1予備免疫マウスへの腫瘍内投与の結果、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルの顕著な増加が起こった（図６ｂ）。より重要なことに、これらの動物はまた、腫瘍細胞により発現されているが、免疫付与構築物においては存在しなかったmERK2およびc-erbB-2/HER2/neu抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を展開した（図６ｂ）。これらの効果はS. typhimurium対照株を受けた動物、または対照プラスミドで予備免疫された動物においては観察されなかった（図６ｂ）。再び、エピトープスプレディングは、腫瘍退縮に随伴した。総合すると、これらの結果は、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系による腫瘍細胞への異種抗原の送達が、これらの細胞を、異種抗原に対する既存のＣＤ８＋Ｔ細胞の標的とし、その結果エピトープスプレディングおよび腫瘍の根絶がもたらされることを示している。
【０１３１】
考察
我々は、ＩＩＩ型タンパク質分泌系を用いて、細菌において産生されるNY-ESO-1タンパク質を宿主細胞に注入する、組み換えS. typhimurium株を作出した。我々は、ヒトにおけるin vitroでNY-ESO-1特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を生成する能力、マウスにおけるNY-ESO-1発現腫瘍を根絶する能力、およびin vivoでかかる抗原を腫瘍細胞へ送達する能力を検討した。我々は、S. typhimurium-NY-ESO-1がNY-ESO-1をin vitroでＩＩＩ型分泌系を介して効果的にヒト黒色腫細胞に送達すること、およびこれらの細胞がこの抗原をＴ細胞クローンおよびＴ細胞系にＭＨＣクラスＩ経路を介して提示できることを示した（図１および２ａ）。S. typhimurium-NY-ESO-1感染細胞による抗原提示は、NY-ESO-1発現細胞の数が、S. typhimurium-NY-ESO-1感染腫瘍細胞において、NY-ESO-1を天然に発現する腫瘍細胞に比べて少なかったものの、NY-ESO-1を天然に発現する腫瘍細胞による提示よりも効率的であった（図２ａ）。これは、ＩＩＩ型分泌系により送達される場合、抗原が非常に有効にプロセッシングされることを示唆している。S. typhimurium感染標的細胞のＴ細胞認識は、ペプチドパルス細胞のものと同等であった（図２ｂ）。NY-ESO-1発現腫瘍および既存のNY-ESO-1免疫を有する患者からのS. typhimurium-NY-ESO-1感染ＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣは、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を効率的に誘導した。NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するS. typhimurium-NY-ESO-1の能力は、組み換えFowlpoxウイルスまたはアデノウイルスベクターのものと同等であった（図３、追加図１およびデータを示さない）。ペプチドパルスＡＰＣは、S. typhimurium-NY-ESO-1感染APCと比較してより多数の四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する一方、IFN-γ分泌細胞の数に差はなかった（図２ｂおよび３）。このことは、S. typhimuriumはペプチドよりも効率的に共刺激シグナルを欠くエフェクター細胞を活性化することができ、その結果、IFN-γ非分泌ＣＤ８＋を以前報告されたように（25）活性化し得ることを示唆するものである。我々は、我々の実験条件においてSalmonellaによるＴ細胞増殖のいかなる阻害をも観察しなかったが、直接的な接触依存的な阻害が長期培養でおこることが近年報告された（26）。総合すると、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系はヒトにおいて有効なNY-ESO-1抗原送達プラットホームである。
【０１３２】
我々のデータはまた、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系が、in vivoにおいても有効な抗原送達系であることを示している。NY-ESO-1発現腫瘍を有するマウスへのS. typhimurium-NY-ESO-1の経口投与の結果、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成および腫瘍の完全な退縮が起こった。これらの研究において用いたワクチン株は、深部組織に達するのに非常に非効率であり（27）、かかる免疫応答が主として粘膜部位においてプライミングされたであろうことが示唆される。実際、サルにおいて行われた同等な株での以前の実験により、この可能性が強く示された（21）。しかしながら、少量の細菌が深部組織へ到達できるため、全身的なプライミングは除外できない。１）腫瘍の退縮が、S. typhimurium対照株でなくS. typhimurium-NY-ESO-1を受けたNY-ESO-1発現腫瘍を有する動物においてのみ観察されたこと、および、２）免疫した動物からのＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇が腫瘍の退縮を無効にしたこと（図４）から、腫瘍の退縮は、NY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導に依存していた。したがって、S. typhimurium-NY-ESO-1の抗腫瘍活性は、マウスに投与された場合に腫瘍の退縮を引き起こすS. typhimuriumのいくつかの非病原性株の以前報告された抗腫瘍活性とは異なる。既述の抗腫瘍活性は、腫瘍細胞におけるS. typhimuriumの直接の毒性作用によるものであり、細菌の腫瘍組織内への局在化を必要とする（28, 29）。我々の実験条件下において、我々の実験で用いた経口投与されたS. typhimurium ΔphoP ΔphoQ株は、顕著な数で腫瘍の局所分画に達しなかった。より重要なことに、抗腫瘍効果は、SopE-NY-ESO-1キメラタンパク質をコードする遺伝子を有しない対照プラスミドベクターを有する同一の対照株の投与後には観察されなかった（図４）。
【０１３３】
ＩＩＩ型分泌を介して腫瘍抗原を送達する能力を付与されたS. typhimuriumの急速で有効な抗腫瘍活性は、顕著なものである。免疫寛容を解消するのに先天性免疫系の刺激が不可欠であることが既に示されている（14）。我々の研究において利用されるS. typhimurium株などの細菌に存在する細菌関連分子パターンを認識するTLRシグナルは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Tregの抑制活性を阻止することができるだけでなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Tregの存在下でさえもＣＤ８寛容を解消する（11-13, 15）。我々のin vivoマウスモデルにおいて、増殖する腫瘍細胞単独によるNY-ESO-1の発現は、測定可能な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導しなかった。しかしながら、S. typhimurium-NY-ESO-1を経口投与すると、動物は抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成し、腫瘍は退縮した。S. typhimuriumの先天性免疫を強く刺激する実証された能力は、NY-ESO-1に対して強いＣＤ８＋応答を誘発する能力に貢献し得る（16, 17）。
【０１３４】
NY-ESO-1 DNAでプライミングした動物の腫瘍部位でのS. typhimurium-NY-ESO-1の投与により、NY-ESO-1抗原を当初は発現していなかった腫瘍の急速な根絶がもたらされた。１）腫瘍根絶はS. typhimuriumＩＩＩ型分泌系によるNY-ESO-1の送達に厳密に依存し、S. typhimurium対照株を受けた動物においては観察されなかったこと、２）腫瘍退縮はＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に依存したこと、および３）腫瘍退縮はプライミングしなかった動物において観察されなかったこと（図６）から、これらの結果は驚くべきことである。腫瘍部位におけるS. typhimuriumの投与はいくらかの壊死を引き起こしたが、それ自体は腫瘍を根絶するのに十分ではなかった（図５および６ａ）。このケースにおいて、腫瘍の退縮は、少なくとも初期は、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系を介してNY-ESO-1抗原を受けた腫瘍細胞の、既存の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による認識に起因すると考える。NY-ESO-1を受けなかったマウスが、CMS5腫瘍の急速な増殖を阻止できなかったことから、この仮説は、腫瘍の退縮が既存の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に厳密に依存するという観察と一致する。NY-ESO-1はマウスにとって免疫原性抗原であにもかかわらず、S. typhimurium-NY-ESO-1による腫瘍内処置は、NY-ESO-1に対する既存の免疫が存在しない状況では、防御を提供するのに十分速く、特異的なＴ細胞を誘導することができない（図６ａ）。全ての腫瘍細胞をS. typhimurium-NY-ESO-1により標的化できたわけでないことは疑いないため、効率的な腫瘍根絶に、ワクチンには存在しない他の腫瘍抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成が関与していた可能性が最も高い。この仮説と一致して、S. typhimurium-NY-ESO-1を受けたNY-ESO-1予備免疫動物は、恐らくは既に観察されている現象である「エピトープスプレディング」により、かかるワクチンに存在しない少なくとも２つの他の腫瘍抗原に対するＣＤ８＋応答を展開した（23, 24）（図６ｂ）。実際、「エピトープスプレディング」がまた、NY-ESO-1発現腫瘍を有する動物へのS. typhimurium-NY-ESO-1の経口投与後に観察される急速な腫瘍退縮にとって必要不可欠であると我々は考えるが、これは、このケースにおいて、我々が、ワクチンに存在しない抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の生成をも観察したからである（図６ｂ）。これらのデータは、腫瘍ワクチン誘導性ＣＴＬが、同種の抗原を生じる腫瘍細胞を殺傷するエフェクターとして作用するだけでなく、他の腫瘍抗原特異的ＣＴＬを刺激することを可能にする条件を作り出すという近年の報告と一致する（30, 31）。S. typhimuriumは、上皮細胞などの非貪食性の細胞を侵す能力を有する（32）。図５に示すように、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系はNY-ESO-1を腫瘍細胞だけでなく周囲の組織へも同様に注入した。腫瘍間質細胞がまた標的とされ、腫瘍根絶を促進したと考えられる（33, 34）。考慮すべき１つの懸念は、潜在的に自己免疫反応をプライミングし得る、S. typhimuriumベクターによる正常組織への望まない抗原送達である。S. typhimuriumの腫瘍内注入で処置したマウスは、治癒後、局所の炎症を除いて如何なる副作用も示さなかったが、さらなる観察がこの可能性を完全に除外するために必要であるかもしれない。
【０１３５】
我々の研究は、腫瘍抗原の組成に対する予備知識を必要としない抗原送達プラットホームとしてS. typhimuriumＩＩＩ型分泌系を用いるがん免疫療法に関する新規の方策を示唆する。この方策は、患者が既存のＣＤ８＋Ｔ細胞を有するであろう抗原を、そのＩＩＩ型分泌系を介して腫瘍細胞に送達するよう操作されたS. typhimurium株の投与を必要とするであろう。その抗原は、腫瘍抗原において発現される必要がない。実際、ワクチン接種および／または病後免疫によりヒト集団においてよく見られるインフルエンザまたはＥＢウイルスなどのウイルス抗原に対する既存のＣＤ８＋Ｔ細胞を、この目的のために用いることができると考えられる。
【０１３６】
例２
Salmonella typhimuriumＩＩＩ型分泌系の新規の抗がんワクチンの開発のための使用
S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系（TTSS）
ここ数年、新規のタンパク質分泌経路が、Yersinia pestis、Burkholderia malleiおよびpseudomallei、ならびにS. entericaなど、多くのバイオテロの潜在的な病原体を含む、多種の病原性グラム陰性菌において同定されてきた（Galan, J. E., and A. Collmer, Science, 284:1322-1328, 1999）。ＩＩＩ型または接触依存性と名づけられたこの経路は、細菌性エフェクタータンパク質の宿主細胞サイトゾルへの分泌および送達に関与する。これらのタンパク質は病原性にとって不可欠であり、細胞の機能を病原菌に有利となるよう調節する能力を有する。Salmonella spp.は、感染のプロセスの異なるステージに関与するこれらの系の２つをコードする（Galan, J. E., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 17:53-86, 2001）。広範囲な研究により、Salmonellaの腸上皮との初期の相互作用に関与する、細菌染色体の病原性島１（SPI-1）内にコードされたS. typhimurium TTSSを特性化するするに至った（Galan, J. E., Curr. Op. Microbiol., 2:46-50, 1999）。病原性島２（SPI-2）内にコードされる他の系は、全身感染を確立するのに不可欠である（Hensel, M., Mol Microbiol., 36:1015-23, 2000）。
【０１３７】
S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系の抗原送達のための使用
TTSS経路を介して移動するようになっているタンパク質は、分泌または宿主細胞へのトランスロケーションを導く、分離した独立の領域を有する。概して、これらのタンパク質のＮ末端側の最初の１０〜２０アミノ酸残基はその分泌に必要とされる一方、６０〜８０残基の隣接する領域は、特異的な同種のシャペロンへの結合および宿主細胞へのトランスロケーションに関与する（Galan, J. E., and A. Collmer, Science, 284:1322-1328, 1999で概説される）。いくつかの分泌された基質タンパク質の分泌およびトランスロケーションドメインは、分子レベル、そしてある場合は原子レベルにおいても決定され、これはSptP、SopEおよびInvJを含む（Russmann, H., et al., Mol. Microbiol., 46:769-7916, 2002; Stebbins, C. E., and J. E. Galan, Nature, 414:77-81, 2001）。これにより、これらのドメインが異種タンパク質の分泌およびトランスロケーションを導くことができるという観察に基づき、抗原送達系の開発が可能となった（米国特許6,306,387）。より重要なことに、この系を介して送達されたタンパク質は、インフルエンザウイルスおよびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）からの明確に定義された抗原と、マウスの感染モデルとを用いた関連する感染モデルによるチャレンジに対する防御を導く、強力な抗体応答、ならびにCD4およびCD8Ｔ細胞応答を誘導できることが示された（Russmann, H., et al., Science, 281:565-8, 1998; Shams, H., F., et al., Vaccine, 20:577-85, 2001）。TTSSを介して宿主細胞に注入され得る細菌性タンパク質に融合したインフルエンザウイルスまたはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスの免疫優勢CTLエピトープを発現するSalmonella組み換え体による感染は、細胞をin vitro CTL認識に対して感作した。CTL認識は、MHC クラスＩ拘束性およびTAP依存的であった。さらに、LCMVの単一の免疫優勢CTLエピトープを送達するように操作されたSalmonellaの弱毒化株でのマウスの免疫付与は、致死的なLCMVチャレンジを防御する強力なウイルス特異的ＣＴＬ応答を刺激した。最近になって、SalmonellaＩＩＩ型分泌系がサルにおいて抗原特異的粘膜性ＣＤ８応答をプライミングすることが示された。ＩＩＩ型分泌SopEタンパク質に融合したSIV Gagタンパク質の断片を発現するS. typhimuriumおよびS. typhiのΔphoP-phoQ-弱毒化株は、in vitro CTL認識に対してアカゲザル細胞を感作した（Evans, D. T., et al., J. Virol., 77:2400-2409, 2003）。さらに、組み換えSalmonellaで経口接種したMamu-A*01+マカクはGag特異的CTL応答を展開し、これはSIV Gagを発現する修飾ワクシニアAnkara （MVA Gag）での免疫付与で顕著にブーストされた。より重要なことに、免疫された動物におけるGag特異的Ｔ細胞集団の大部分は、腸ホーミング受容体α4β7も発現した。さらに、Gag特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が大腸から単離されたリンパ球中で検出され、これらの細胞が胃腸粘膜にホーミングすることが示された。これらの知見により、免疫されたマカクの胃腸粘膜に細胞性免疫応答を導くSalmonella TTSSによる粘膜性プライミングの可能性が示された。
【０１３８】
腫瘍抗原の送達のためのS. typhimuriumワクチン株の構築
我々は、ＩＩＩ型分泌系により宿主細胞に送達されるSalmonellaタンパク質であるSopEの分泌およびトランスロケーションシグナルに融合した腫瘍抗原NY-ESO-1およびNY-CO-58を発現するS. typhimuriumワクチン株を構築した（Fig. 1aおよびFig. 8）。かかるキメラタンパク質は培養上清に効率的に分泌され、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞クローンによる認識に対してさまざまな細胞を感作することができた。これらの構築物をヒトボランティアにおいて試験した。
【０１３９】
例３
TTSS送達のための融合タンパク質の構築
SPI-1 TTSSを介して抗原を送達するために、SopE （SopE1-104）の分泌およびトランスロケーションシグナルを利用した。これは、このドメインが、抗原提示コンパートメントに異種抗原を送達する優れた「分子配達人」として行動するからである（Evans, D. T., et al., J. Virol., 77:2400-2409, 2003）。腫瘍抗原NY-ESO-1をコードするcDNAは、SopEまたはSptPなどのTTSS分泌タンパク質の分泌およびトランスロケーションシグナルに、別々におよび単一の構築物中にタンデムで融合した。関連するプラスミドの構築は、標準的な組み換えDNA技術により行った。用いたベクターは既述のものである（Evans, D. T., et al., J. Virol., 77:2400-2409, 2003）。得られたプラスミドを、S. typhimurium ΔphoP phoQ ΔaroA Δasdワクチン株（Galan, J. E., et al., Micro. Path., 6:433-443, 1989; Galan, J. E., et al., Gene, 94:29-35, 1990; Hoiseth, S. K., and B. A. Stocker, Nature, 291:238-239, 1981）、および、TTSS依存性分泌に関する対照として、SPI-1 TTSSが欠損したinvA変異株に導入した（Galan, J. E., et al., J. Bacteriol., 17:4338-4349, 1992）。２つの弱毒化変異の存在により構築物の安全性が確保される一方、SPI-1 TTSSの発現がこの特定の株において上方調節されていることから、抗原送達能力は維持される。かかる発現ベクターのバックボーンは低コピープラスミドベクターpWSK29からのものであり、遺伝子はその天然のプロモータから発現される（Evans, D. T., et al., J. Virol., 77:2400-2409, 2003; Russmann, H., et al., Science, 281:565-8, 1998）。さらに、かかるベクターはその維持を確保する抗生物質の必要性を回避するSalmonella asd遺伝子を有する（Galan, J. E., et al., Gene, 94:29-35, 1990）。このベクターバックボーン／プロモーターの組み合わせが、in vitroおよびin vivoでの効率的で安定した抗原の送達を提供することを見出した。FDA規定に適合するよう、Salmonellaベクター株あるいはプラスミドのいずれにも抗生物質遺伝子は存在しない。さらに、かかるプラスミドの維持は、asdバランス／致死系によって確保される（Galan, J. E., et al., Gene, 94:29-35, 1990）。腫瘍抗原MAGE-A3、SSX2、SCP1およびCT7を用いた同様の構築物を作製し、本明細書中に記載のとおりに試験した。
【０１４０】
in vitroにおける腫瘍抗原を発現および送達する能力に関する異なる構築物の評価
融合タンパク質を、S. typhimuriumＩＩＩ型分泌系により、培養宿主細胞に分泌およびトランスロケーションされる能力に関して、既述のとおりに試験した（Russmann, H., et al., Science, 281:565-8, 1998）。さらに我々は、キメラタンパク質における代用「指標エピトープ」を設計することによる、クラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示コンパートメントへの送達を試験した。クラスＩ拘束性免疫応答をモニターするために、我々はインフルエンザウイルス核タンパク質からの３６６〜３７４残基からなるH-2bクラスＩ拘束性エピトープを設計した（IVNP366-374）。クラスＩＩ拘束性応答をモニターするために、我々は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質の残基８５〜１０４からなるI-Ed エピトープを利用した。抗原提示細胞への抗原送達を、Salmonellaにより発現されるキメラタンパク質に由来する関連ペプチドの提示の際してIL-2を産生するＴ細胞ハイブリドーマ12.164および3DV315.14（それぞれPeter DochertyおよびCarol Reissにより提供）を用いてモニターした。これらのアッセイは、既述のとおりに実行した（Evans, D. T., et al., J. Virol., 77:2400-2409, 2003; Russmann, H., et al., Science, 281:565-8, 1998）。さらに、かかる構築物を、種々の腫瘍抗原に特異的な、関連するＴ細胞による認識に対して抗原提示細胞を感作する能力に関して試験した。
【０１４１】
第一相臨床試験用調製物における構築物の免疫原性を維持することができる、増殖、輸送および貯蔵パラメーターの確立
FDA規定に適合するよう、種々のワクチン構築物の増殖は、認可された施設で行う。種々のSalmonellaワクチン構築物を遠隔サイトで増殖させ、次いで第一相臨床試験が行われる場所に移送する。種々のワクチン株の増殖および輸送は、抗原送達系のためのバックボーンとしての役割を果たすSalmonellaＩＩＩ型分泌系の発現および機能に影響を及ぼすさまざまな環境要因のために、それらの免疫原性に非常に顕著な影響を及ぼす（Galan, J. E., et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 17:53-86, 2001）。広範囲な研究を実行し、種々の構築物の免疫原性を干渉しない増殖および貯蔵条件を同定する。種々の条件下で増殖させ、および異なるプロトコール（例えば、冷凍、凍結乾燥、など）に従って貯蔵した細菌株を、種々のin vitro抗原提示アッセイで試験し、抗原送達能力を評価する。
【０１４２】
抗腫瘍免疫応答を増強するために先天性免疫の生成および腫瘍内の限局性炎症を刺激するSalmonellaに基づく系の開発
Salmonella spp. は、先天性免疫系を直接刺激する能力の結果である、強力な炎症反応を刺激する能力を有する。後天性免疫応答の生成における先天性免疫系の実証された重要性に鑑みれば、Salmonellaを有効な抗原送達系にしているのはおそらくこの特性である。腫瘍抗原に対する特異的免疫応答の生成のための腫瘍自体の内部の先天性免疫応答および炎症反応の刺激の利益は、十分に実証されている（Finn, O. J., et al., Nat Rev Immunol., 3:630-41, 2003; Gilboa, E., Nat Rev Cancer, 4:401-411, 2004）。
【０１４３】
それゆえ、腫瘍自体の内部での限局された、自己限定的炎症反応を安全に生成する系が開発される。この系は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子における欠失を有する、S. typhimuriumの条件致死変異体の使用に基づく（Galan, J. E., et al., Gene, 94:29-35, 1990）。この遺伝子は、細菌エンベロープのペプチドグリカン層の不可欠な成分である、ジアミノピメリン酸（DAP）の合成に関与する。S. typhimurium Δasdは、DAPが培地中に提供される場合のみ生育できる。哺乳類はDAPを産生しないため、この株は宿主組織内で複製できず、それゆえ完全に非病原性である。DAPが存在しないと、Salmonella Δasd変異体は、細菌内の既存のDAPが使い尽くされるまで、ごく限られた世代数複製できるにすぎない。
【０１４４】
腫瘍内の限定された複製が限局された炎症反応を誘導するのに十分であるが、副作用を生じるのに十分ではないかどうかを試験する。asd遺伝子に欠失を有するS. typhimurium株を構築し、２つの十分に特性化されたマウスモデル、１つはヒトパピローマウイルス１６型、他方はメチルコラントレン誘発肉腫cms5の使用に基づくものを用いて試験する。前者において、このウイルスのE6およびE7タンパク質を発現する細胞を注入したマウスは、接種後３週間以内に腫瘍を発症する。S. typhimurium Δasd株によるE6またはE7タンパク質の腫瘍への直接送達により、かかる腫瘍に対する免疫応答が増大するかどうかを調査する。後者において、腫瘍はS. typhimurium Δasdにクローニングされている変異型ERKを発現し、この構築物を天然に存在するマウス抗原を特異標的として評価する目的で試験する。これらの試験は、腫瘍内の先天性免疫および抗原提示の刺激が特異的な抗腫瘍応答を増大させ、結果として腫瘍の排除が起こるかどうかを決定する。S. typhimurium Δasd株が複製する世代数は、マウスへのDAPの投与により増加する。我々は、マウスの感染モデルにおけるΔasd S. typhimurium変異株の複製を成功裏に増加させるこの方策を既に用いたことがある。
【０１４５】
参考文献
【表４】
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【０１４６】
【表５】
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【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
【表７】
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【０１４９】
【表８】
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【０１５０】
【表９】
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【０１５１】
本明細書は、当業者が本発明を実施できるようにするのに十分であると考えられる。本実施例は本発明の１つの側面の単一の例示として意図され、他の機能的に同等な態様が本発明の範囲に含まれるため、本発明の範囲は提供した実施例により限定されるものではない。本明細書中に示され、記載されたものに加えて、本発明のさまざまな改変は、前述の記載から当業者には明らかとなるものであり、添付する特許請求の範囲の範囲内にある。
【０１５２】
本発明の利点および目的は、本発明のそれぞれの態様に必ずしも包含されるわけではない。当業者は、ルーチンの実験のみを用いて、本明細書中に記載される発明の特定の態様の多くの均等物を認識、または解明できるであろう。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されることを意図する。
本明細書中に記載された全ての参考文献を、その全体を参照により組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１Ａ】関連するプラスミドの略図である。
【図１Ｂ】キメラSopE-NY-ESO-1タンパク質の存在を試験したウエスタンブロッティングの結果を示した図である。
【図１Ｃ】種々の画分におけるSopE-NY-ESO-1タンパク質の存在を試験したウエスタンブロッティングの結果を示した図である。
【図１Ｄ】抗NY-ESO-1 mAb ES121による免疫細胞化学の結果を示した図である。
【図２Ａ】特異的ＩＦＮ−γ分泌をELISPOTアッセイで評価した結果を示したグラフである。
【図２Ｂ】ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を解析したELISPOTアッセイの結果を示したグラフである。
【図３Ａ】特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を解析したELISPOTアッセイの結果を示したグラフである。
【図３Ｂ】ＮＷ２９由来のNY-ESO-1特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリー法で解析した結果を示したグラフである。
【図４Ａ】種々の条件におけるマウスの腫瘍増殖を示したグラフである。
【図４Ｂ】特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の数を解析したELISPOTアッセイの結果を示したグラフである。
【図５】NY-ESO-1の存在を試験した免疫組織化学の結果を示した図である。
【図６Ａ】種々の条件におけるマウスの腫瘍増殖を示したグラフである。
【図６Ｂ】ＩＦＮ−γ産生細胞の数をELISPOTアッセイで解析した結果を示すグラフである。
【図７Ａ】自己活性化Ｔ細胞ＡＰＣを認識する特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をELISPOTアッセイで解析した結果を示したグラフである。
【図７Ｂ】自己活性化Ｔ細胞ＡＰＣを認識する特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数をELISPOTアッセイで解析した結果を示したグラフである。
【図８】S. typhimuriumにおけるNY-CO-58 （kif2c）の発現を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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