(57)【要約】【課題】本発明は、生体分子に関連する。【解決手段】具体的には、本発明は、対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び／又は重篤度を検出する方法を提供する。また、本発明は、対象における細胞増殖異常のための処置の効力をモニターする方法を提供する。【選択図】図１
2009542191.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び／又は、重篤度を検出及び／又は定量化する方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも１つのサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；
（ｃ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の存在、又は、素因、及び／又は、重篤度が示されるものである方法。
【請求項２】
対象における細胞増殖異常のための処置の効力をモニターする方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも２つのサンプルであって、それぞれのサンプルが異なる時点で得られるサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）少なくとも２つのサンプルにおけるＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を比較することを含む方法。
【請求項３】
対象における細胞増殖異常の結果を予後判定する方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも１つのサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；
（ｃ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の予後が示されるものである方法。
【請求項４】
前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも１つの対象である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異は、ヒトＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異であり、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントは、ヒトＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記検出は、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントを少なくとも１つのスルフェニルハライド試薬により標識し、その後、２次元ゲル電気泳動及び質量分析法によって行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記スルフェニルハライド試薬は２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の発現を変化させることを含む方法。
【請求項９】
前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子は、配列番号１に示される配列を有する、請求項１〜３及び８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な核酸を投与することによって得る、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得る、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を変化させることを含む方法。
【請求項１５】
前記方法は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＡ２Ｇ４タンパク質の発現を変化させることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントのアミノ酸配列の全体又は一部に結合するポリペプチドを投与することによって得る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合するポリペプチドは抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質のアミノ酸配列の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現を変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を低下させることを含む、請求項８及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのタンパク質及び／又はそのフラグメントの発現における変動を引き起こす少なくとも１つの薬物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも１つの薬物を少なくとも１つの対象に投与すること；
（ｂ）少なくとも１つのタンパク質を前記対象から得ること；
（ｃ）前記タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を少なくとも１つの試薬により標識すること；及び
（ｄ）前記タンパク質を質量分析法によって分析し、それにより、前記少なくとも１つのタンパク質及び／又はそのフラグメントを特定し、発現の変動が生じているかどうかを明らかにすることを含む方法。
【請求項２１】
前記分析する工程（ｄ）は、前記タンパク質を第１の特徴に基づいて分離し、場合により前記タンパク質を第２の特徴に基づいて分離し、前記タンパク質をイオン化し、前記分離されたタンパク質を検出及び特定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質及び／又はそのフラグメントはＰＡ２Ｇ４タンパク質及び／又はそのフラグメントである、請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質は配列番号２の配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬はスルフェニルハライドである、請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬は２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）である、請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸残基はトリプトファンである、請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記分離する工程は、質量、電荷、官能基及び等電点からなる群から選択される少なくとも１つの特徴に基づく、請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記分離する工程は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び／又はフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）のための工程である、請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）、ナノスプレーイオン化、大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）、化学的イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、電界脱離／電界イオン化（ＦＤ／ＦＩ）及びサーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）からなる群から選択される、請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記分析する工程（ｄ）はタンデム質量分析法によって行う、請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記タンデム質量分析法では、四重極飛行時間型配置が使用される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つの候補を、臨床試験、実験及び／又は診断検査のために選択する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの対象からの少なくとも１つのサンプルを提供すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子及び／又はその変異、あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象が候補として好適であることが示されるものである方法。
【請求項３３】
前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも１つの対象である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない１つの対象である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞増殖異常はがんである、請求項１〜３、８、１４、２０及び３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞増殖異常は乳がんである、請求項１〜３、８、１４、２０及び３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記対象は哺乳動物である、請求項１〜３、８、１４、２０及び３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記対象はヒトである、請求項１〜３、８、１４、２０及び３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
対象における細胞増殖異常の診断及び／又は予後評価のための診断及び／又は予後キットであって、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異にハイブリダイゼーション可能な少なくとも１つの分子、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合する少なくとも１つの分子を含むキット。
【請求項４０】
前記分子は、ＰＡ２Ｇ４遺伝子の転写物にハイブリダイゼーション可能なｓｉＲＮＡである、請求項３９に記載の診断及び／又は予後キット。
【請求項４１】
前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合するタンパク質である、請求項３９に記載の診断及び／又は予後キット。
【請求項４２】
前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合する抗体である、請求項３９のいずれかに記載の診断及び／又は予後キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的分子又は生体分子に関連し、具体的には、バイオマーカーに関連する。より具体的には、本発明は、疾患の診断又は予後評価のために、あるいは、疾患処置の効力をモニターするために使用される生体分子に関連する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんは、（肺がんに次いで）今日では女性におけるがん死亡者の２番目に多い原因であり、女性の間での最も一般的ながんの１つである。世界保健機関は、世界中で毎年１２０万人を越える人々が乳がんと診断されると推定する。
【０００３】
アメリカ癌学会は、２００５年には、合衆国におけるおよそ２１０，０００人の女性が浸潤性乳がん（第Ｉ期〜第ＩＶ期）と診断されると推定する。浸潤性乳がんを女性の生涯の期間中に発生する可能性はおよそ７人に１人（１３．４％）である。さらに６０，０００人の女性が上皮内限局乳がん（この疾患の非常に初期の形態）と診断される。男性もまた、より小さい確率ではあるが、乳がんに罹患し得る。推定では、１，７００の症例が２００５年には男性において診断される。
【０００４】
毎年、４０，０００人の女性及び４６０人の男性が合衆国では乳がんで死亡することが推定される。アメリカ癌学会によれば、乳がんが女性の死亡にかかわる可能性は約３３分の１（３％）である。乳がんの発生率（１００，０００人の女性あたりの新規乳がん患者の数）が１９８０年代の期間中におよそ４％増大したが、これは１９９０年代では１００，０００人の女性あたり１００．６人で横ばい状態になっている。乳がんによる死亡率はまた、１９９２年と、１９９６年との間では著しく低下し、最も大きい低下が若年女性の間であった。医療専門家は、乳がん死亡者におけるこの低下を、より早期の検出及びより効果的な処置の結果であると考えている。
【０００５】
乳がんは通常、乳房における触知可能なしこりとして、及び／又は、乳房の普通でない提示（例えば、皮膚の陥凹形成、ひだ形成、隆起、位置が変わっている乳頭、又は、陥没乳頭、赤み、ひりひりすること、発疹、腫れ、あるいは、乳房の非対称性など）によって最初に検出される。
【０００６】
理学的検査による検出の後で、ｘ線又は超音波によるマンモグラフィーが行われることがある。しかしながら、マンモグラフィーは、嚢腫、石灰沈着部及び良性のしこり（例えば、線維腺腫など）に起因する偽陽性の結果を伴う。結果として、通常の場合、生検物から得られる組織サンプルに対する細胞学に基づくさらなる診断が必要である。細胞学的サンプルの解釈では、高度に訓練された専門家が要求される。
そのため、乳がんを検出及び処置するための改善された方法が歓迎される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の目的
本発明は上記の問題を検討し、細胞増殖異常（例えば、がんなど）を検出及び／又は処置するための方法を提供する。一般に、当該異常はがんであり、具体的には乳がんである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
１つの局面において、本発明は、
［１］対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び／又は、重篤度を検出及び／又は定量化する方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも１つのサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の存在、又は、素因、及び／又は、重篤度が示されるものである方法を提供する。
【０００９】
［２］対象における細胞増殖異常のための処置の効力をモニターする方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも２つのサンプルであって、それぞれのサンプルが異なる時点で得られるサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）少なくとも２つのサンプルにおけるＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を比較することを含む方法もまた提供される。
【００１０】
［３］対象における細胞増殖異常の結果を予後判定する方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも１つのサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の予後が示されるものである方法もまた提供される。
【００１１】
［４］上記の方法［１］〜［３］のいずれかにおいて、前記コントロールは、例えば、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも１つの対象である場合がある。あるいは、前記コントロールは、ＰＡ２Ｇ４遺伝子及び／又はＰＡ２Ｇ４タンパク質の低いレベルの発現を有する少なくとも１つの対象である場合がある。前記コントロールはまた、選択された集団から得られる発現における平均値である場合がある。
【００１２】
［５］上記の方法［１］〜［３］のいずれかにおいて、前記遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異は、ヒトＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異である場合があり、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントは、ヒトＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントである場合がある。
【００１３】
［６］上記の方法［１］〜［５］のいずれかにおいて、前記検出は、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントを少なくとも１つのスルフェニルハライド試薬により標識し、その後、２次元ゲル電気泳動及び質量分析法によって行うことができる。
【００１４】
［７］上記の方法［６］において、前記スルフェニルハライド試薬は２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）であり得る。
【００１５】
［８］対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の発現を変化させることを含む方法もまた提供される。
【００１６】
［９］上記の方法［１］〜［８］のいずれかにおいて、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子は、配列番号１に示される配列を有し得る。
【００１７】
［１０］上記の方法［８］又は［９］において、前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な核酸を投与することによって得ることができる。
【００１８】
［１１］上記の方法［１０］において、前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
【００１９】
［１２］上記の方法［１１］において、具体的には、前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はｓｉＲＮＡであり得る。
【００２０】
［１３］上記の方法［８］又は［９］において、前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得ることができる。
【００２１】
［１４］対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を変化させることを含む方法もまた提供される。
【００２２】
［１５］上記の方法［１４］において、前記方法は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＡ２Ｇ４タンパク質の発現を変化させることを含むことができる。
【００２３】
［１６］上記の方法［１４］又は［１５］において、前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントのアミノ酸配列の全体又は一部に結合するポリペプチドを投与することによって得ることができる。
【００２４】
［１７］上記の方法［１６］において、前記結合するポリペプチドは抗体であり得る。
【００２５】
［１８］上記の方法［１４］において、前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質のアミノ酸配列の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得ることができる。
【００２６】
［１９］上記の方法［８］〜［１８］のいずれかにおいて、前記発現を変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を低下させることを含むことができる。
【００２７】
［２０］少なくとも１つのタンパク質及び／又はそのフラグメントの発現における変動を引き起こす少なくとも１つの薬物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも１つの薬物を少なくとも１つの対象に投与すること；
（ｂ）少なくとも１つのタンパク質を前記対象から得ること；
（ｃ）前記タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を少なくとも１つの試薬により標識すること；及び
（ｄ）前記タンパク質を質量分析法によって分析し、それにより、前記少なくとも１つのタンパク質及び／又はそのフラグメントを特定し、発現の変動が生じているかどうかを明らかにすることを含む方法もまた提供される。
【００２８】
［２１］上記の方法［２０］において、前記分析する工程は、前記タンパク質を第１の特徴に基づいて分離し、場合により前記タンパク質を第２の特徴に基づいて分離し、前記タンパク質をイオン化し、前記分離されたタンパク質を検出及び特定することを含むことができる。
【００２９】
［２２］上記の方法［２０］又は［２１］において、前記タンパク質及び／又はそのフラグメントはＰＡ２Ｇ４タンパク質及び／又はそのフラグメントであり得る。
【００３０】
［２３］上記の方法［２２］において、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質は配列番号２の配列を有する。
【００３１】
［２４］上記の方法［２０］〜［２３］のいずれかにおいて、前記試薬はスルフェニルハライドであり得る。
【００３２】
［２５］上記の方法［２０］〜［２４］のいずれかにおいて、具体的には、前記試薬は２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）であり得る。
【００３３】
［２６］上記の方法［２０］〜［２５］のいずれかにおいて、前記アミノ酸残基はトリプトファンであり得る。
【００３４】
［２７］上記の方法［２１］〜［２６］のいずれかにおいて、前記分離する工程は、質量、電荷、官能基及び等電点からなる群から選択される少なくとも１つの特徴に基づくことができる。
【００３５】
［２８］上記の方法［２１］〜［２７］のいずれかにおいて、前記分離する工程は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び／又はフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）のための工程であり得る。
【００３６】
［２９］上記の方法［２１］〜［２８］のいずれかにおいて、前記イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）、ナノスプレーイオン化、大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）、化学的イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、電界脱離／電界イオン化（ＦＤ／ＦＩ）及びサーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）からなる群から選択することができる。
【００３７】
［３０］上記の方法［２０］〜［２９］のいずれかにおいて、前記分析する工程はタンデム質量分析法によって行うことができる。
【００３８】
［３１］上記の方法［３０］において、前記タンデム質量分析法では、四重極飛行時間型配置が使用され得る。
【００３９】
［３２］少なくとも１つの候補を、臨床試験、実験及び／又は診断検査のために選択する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの対象からの少なくとも１つのサンプルを提供すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子及び／又はその変異、あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象が候補として好適であることが示されるものである方法もまた提供される。
【００４０】
［３３］上記の方法［３２］において、前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも１つの対象であり得る。
【００４１】
［３４］上記の方法［３２］又は［３３］において、具体的には、前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない１つの対象である場合がある。
前記コントロールはまた、ＰＡ２Ｇ４遺伝子及び／又はＰＡ２Ｇ４タンパク質の低いレベル又は低下したレベルの発現を有する少なくとも１つの対象である場合がある。前記コントロールはまた、選択された集団から得られる発現における平均値である場合がある。
【００４２】
［３５］上記の方法［１］〜［３４］のいずれかにおいて、前記細胞増殖異常はがんであり得る。
【００４３】
［３６］上記の方法［１］〜［３４］のいずれかにおいて、具体的には、前記細胞増殖異常は乳がんであり得る。
【００４４】
［３７］上記の方法［１］〜［３６］のいずれかにおいて、前記対象は哺乳動物である場合がある。
【００４５】
［３８］上記の方法［１］〜方法［３６］のいずれかにおいて、具体的には、前記対象はヒトである場合がある。
【００４６】
［３９］対象における細胞増殖異常の診断及び／又は予後評価のための診断キット及び／又は予後キットであって、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異にハイブリダイゼーション可能な少なくとも１つの分子、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合する少なくとも１つの分子を含む診断キット及び／又は予後キットもまた提供される。
前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異にハイブリダイゼーション可能な核酸配列であり得る。
【００４７】
［４０］上記の方法［３９］において、前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子の転写物にハイブリダイゼーション可能なｓｉＲＮＡであり得る。
【００４８】
［４１］上記の方法［３９］において、前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合するタンパク質であり得る。
【００４９】
［４２］上記の方法［３９］又は［４１］において、前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合する抗体であり得る。
前記キットはさらに、疾患状態又は処置条件の診断及び／又は予後評価などの目的ための化合物の使用に関連するパッケージング及び情報を含むことができる。
前記細胞増殖異常はがんである場合がある。具体的には、前記細胞増殖異常は乳がんである場合がある。前記対象は哺乳動物である場合があり、具体的にはヒトである場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】（Ａ）２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）によるトリプトファン残基の修飾。＊は１２Ｃ（軽）又は１３Ｃ（重）のいずれかを表す。（Ｂ）ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳによるタンパク質同定／定量法の概略図。本研究では、切り出しのためのスポットの選択が、従来の２ＤＥゲルを使用する先行技術での分析に基づいた（詳細については結果を参照のこと）。しかしながら、より包括的なプロテオーム研究が要求されるならば、ＮＢＳゲル上の認められ得るスポットのすべてをその後の分析のために切り出すこともまた明らかに実行可能である。
【図２】（Ａ）ニワトリのオバルブミンのトリプシン消化ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。２対のＮＢＳ標識ペプチド（ｍ／ｚ  １７３４．７／１７４０．７及びｍ／ｚ  ２０１２．０／１２１８．０）が強調表示される。（Ｂ）ＮＢＳ標識ペプチド対（ｍ／ｚ  １７３４．７／１７４０．７）のマススペクトル、これは、標識されたタンパク質の量と、得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルとの間における一貫性を示す。
【図３】（Ａ）タンパク質ケラチン−１８（Ｋ１Ｃ１８＿ＨＵＭＡＮ）由来のＮＢＳ標識ペプチド対（ｍ／ｚ  １１３５．５／１１４１．５）を、ＣＨＣＡ／ＤＨＢマトリックスを使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって取得した。（Ｂ）同じペプチド対を、ＨＮＢＡマトリックス及びＣＨＣＡ／ＤＨＢマトリックスの組合せを使用して分析した。比較を容易にするために、全範囲スペクトル（上段パネル）のスケールを１００ｍＶに設定し、一方、拡大スペクトル（下段パネル）のスケールを１０ｍＶに設定した。右側の図は、ＣＨＣＡ／ＤＨＢとの組合せでのＨＮＢＡがＮＢＳ標識ペプチドのイオン化を非常に高めたことを示す。
【図４】切り出され、ＭＳ分析によって特定されたＮＢＳ標識タンパク質スポットの２ＤＥマップ。４８個のタンパク質スポットが、２ＤＥ分析によって解析されるような示差的な蛍光染色強度を有する８８個のスポットからペプチドマスフィンガープリンティングによって確実に特定された。それらの中で、４４個のタンパク質スポットがＮＢＳ標識ペプチド対とともに検出され、これらを、１３Ｃ／１２Ｃのペプチド体積比を計算することによって定量した。
【図５】ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ法及び２ＤＥ法による相対的タンパク質定量化の相関（ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞と、ビヒクル処理されたＭＣＦ−７細胞との比率）。４４個の示差的に発現するタンパク質の中では、これら２つの方法により見積もられた比率の間での相関係数は０．５１であった。このことは、統計学的に有意な相関がこれら２つのタンパク質定量方法の間にあることを示す。スポット１４及びスポット２１がさらなる一致研究のために強調表示される（図６及び図７を参照のこと）。
【図６】スポット１４（ジスルフィドイソメラーゼＥＲ−６０）が、ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ定量と、２ＤＥ定量との間における良好な一致を有する。このスポットに対するＰＤＱｕｅｓｔの３Ｄ画像分析では、明確な１つだけの画像ピークが明らかにされる。対照的に、スポット２１（ＣＫ１９）は、ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ定量と、２ＤＥ定量化の間に良い一致はない。３Ｄ画像分析では、少なくとも２つの画像ピークがこのタンパク質スポットにおいて検出されることが示され、このことはタンパク質の同時移動を示している。
【図７】スポット２１（ＣＫ１９）のトリプシン消化ペプチドのマススペクトル。一致するペプチド（ｍ／ｚ  １２２２．７５）及び一致しないペプチド（ｍ／ｚ  １４１９．８５）のペプチド配列決定マススペクトルがそれらのｙ−イオンとともに示される。１２２２．７５の一致するペプチド（ＴＫＦＥＴＥＱＡＬＲ）（配列番号５６）はＣＫ１９由来であることが見出され、一方、ｍ／ｚ  １４１９．８５の一致しないペプチド（ＬＥＧＬＴＤＥＩＮＦＬＲ）（配列番号５７）はＣＫ８由来であった。
【図８】等電点が異なる熱ショック６０ｋＤａタンパク質（ＣＨ６０＿ＨＵＭＡＮ）の２つのイソ型（スポット７及びスポット８）。（Ａ）ＮＢＳ標識化による定量化に基づくと、このタンパク質はスポット８に関してはアップレギュレーションされ、しかし、スポット７に関してはダウンレギュレーションされた。（Ｂ）２ＤＥスポットの蛍光標識化の比率はＮＢＳ標識化比率と一致していた。
【図９】ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳプラットフォームの技術的再現性。２重に標識された、ＭＣＦ−７細胞の同じ生物学的バッチに由来する４０個のタンパク質スポットの量的倍数変化を比較した。これらのスポットの９５％を考慮したとき、線形回帰はｙ＝０．８８８４ｘ＋０．１４５２で、Ｒ２＝０．７１であった。これらのスポットの１００％を考慮したとき、線形回帰はｙ＝０．７７５１ｘ＋０．２０１で、Ｒ２＝０．６４であった。
【図１０】免疫ブロッティングによるＮＢＳ定量化のバリデーション。ＴＡＭ処理時に変化することが見出された２つの代表的なタンパク質（ＧＲＰ７８及びＣＫ１９）を、タンパク質特異的抗体による免疫ブロッティングによってそれらの有効性について確認した。（Ａ）ＧＲＰ７８は、ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞においてアップレギュレーションされる。（Ｂ）（上段）ＴＭＡ処理後の２４時間及び４８時間でのＰＡ２Ｇ４タンパク質のダウンレギュレーションを明らかにする免疫ブロット。β−アクチン抗体によるブロットは、総細胞ライセートが等しくロードされていることのために示される。（下段）オリゴｄＴをプライマーとしたｃＤＮＡからのＰＡ２Ｇ４転写物及びβ−アクチン転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅では、ＴＡＭ処理時のＰＡ２Ｇ４  ｍＲＮＡの相対的なダウンレギュレーションが示される。
【図１１】ＴＭＡ（Ａ）又はビヒクル（Ｂ）により４８時間処理されたＭＣＦ−７細胞の２ＤＥ画像、及び、ＮＢＳ標識され混合されたＴＡＭ処理細胞又はビヒクル処理細胞の２ＤＥ画像（Ｃ）。画像のすべてが、非常に類似するタンパク質パターンを示す。定性的及び定量的な画像分析の結果が図１２に示される。
【図１２】ＴＡＭ処理又はビヒクル処理（非処理）のＭＣＦ−７細胞の２ＤＥ画像を比較するＰＤＱｕｅｓｔ画像分析結果。三連のゲルをそれぞれの処理について泳動した。（Ａ）ゲルの２組についての一致率は約３４０個の視認されたゲルスポットにおいて約８５％〜９５％であった；（Ｂ）定性的レベル及び定量的レベルでの示差的に呈示されたタンパク質スポットの数。
【図１３】（Ａ）正常な組織に対するＰＡ２Ｇ４についてのＩＨＣ染色の観測結果（挿入図は正常な組織の拡大図である）、及び、（Ｂ）腫瘍組織に対するＰＡ２Ｇ４についてのＩＨＣ染色の観測結果（挿入図は腫瘍組織の拡大図である）。
【図１４】ＰＡ２Ｇ４の局在化を示すための、分画されたタンパク質抽出物（すなわち、細胞質のタンパク質抽出物（ｉ）、膜／オルガネラのタンパク質抽出物（ｉｉ）、及び、核のタンパク質抽出物（ｉｉｉ））に対するウエスタンブロッティング。
【図１５】ＰＡ２Ｇ４のバリデーション：（Ａ）抗アクチンを参照として使用する、がんサンプル及び正常なサンプルにおけるＰＡ２Ｇ４に対するウエスタンブロッティング、（Ｂ）（Ａ）において見出されたがんサンプル及び正常なサンプルでのＰＡ２Ｇ４のバンドの吸光度ユニットでのそれぞれの積分値。（Ａ）及び（Ｂ）の両方において、ＥＲ＋はがんサンプルを表し、ＴＮＴは正常なサンプルを表す。（Ｂ）において、縦軸はバンドの吸光度ユニットでの積分値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書において言及される参照文献は、便宜上、文献のリストの形態で列挙され、実施例の最後に加えられる。そのような参照文献の内容全体は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００５２】
定義
生物学的材料−生物学的ソースに由来する任意の材料。当該材料は、生体分子、細胞、組織及び／又は体液を含むことができる。当該材料は、細胞培養、動物対象、哺乳動物対象又はヒト対象から得ることができる。
【００５３】
生体分子−生物学的分子、例えば、タンパク質酸、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、脂質、炭水化物及びそれらの誘導体など。
【００５４】
バイオマーカー−バイオマーカーは、特定の疾患状態の存在及び重篤度、又は、異なる処置条件に関連する生化学的分子又は分子的分子（タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質など及びそれらの誘導体）である。本発明のもとでは、タンパク質又はタンパク質誘導体をバイオマーカーとして使用することができる。バイオマーカーは様々な方法によって検出可能であり、また、測定可能である。バイオマーカーを特定するためには、通常、生物学的分子の発現又は存在量における違い又は変化を検出し、その特定の分子を特定することが必要である。
【００５５】
バイオマーカーの発現又は存在量−バイオマーカーの発現を、その遺伝子、遺伝子転写物及び遺伝子産物の存在又は存在量から決定することができる。用語「遺伝子」及び用語「遺伝子転写物」には、遺伝子に対して相補的なＲＮＡ配列、及び、遺伝子転写物の逆転写によって得られるｃＤＮＡ配列が含まれる。これらの用語にはまた、遺伝子及び遺伝子転写物の野生型遺伝子、バリエーション及び変異体が含まれ、この場合、そのようなバリエーション又は変異体は遺伝子又は遺伝子転写物との実質的な同一性を共有する。同様に、「遺伝子産物」には、野生型の遺伝子産物、そのバリエーション、フラグメント又は誘導体が含まれる。「実質的な同一性」は、遺伝子又は遺伝子産物のバリエーションが、野生型の遺伝子又は遺伝子産物について使用される方法及びプローブによってそれらが検出可能であるための十分な同一性を保持し、かつ、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と同じ機能を保持することを意味する。決定は、例えば、バイオマーカーが発現しているかどうかなどのように定性的であり得るか、あるいは、決定は定量的であり得るか、あるいは、決定は、当分野で知られている任意の方法、例えば、マイクロアレイ技術又はポリメラーゼ連鎖反応などによって半定量的であり得る。非疾患状態での正常なレベルからの逸脱（増大又は低下）は、疾患状態、又は、疾患状態に対する素因を示すことができる。例えば、タンパク質の過剰発現又は増大した存在量により、疾患状態、疾患状態の重篤度、従って、バイオマーカーが測定された対象についての予後が示されることがあり、及び／又は、タンパク質の過剰発現又は増大した存在量は疾患状態に対する感受性の指標であるかもしれない。発現及び存在量における違いを、異なるバイオマーカーの間で、又は、異なる条件もしくは時点のもとでの同じバイオマーカーの間で決定することができる。バイオマーカーの発現は、その後、疾患状態の存在、重篤度との相関を決定するために、又は、処置の効力を決定するために、又は、対象についての疾患結果の予後を決定するために、参照値、又は、異なる時点もしくは異なるバイオマーカーの間で得られる他の値と比較することができ、また、そのような値と相関させることができる。参照値は、統計学的に有意な数の罹患又は非罹患の対象から求めることができる。バイオマーカーの発現はまた、より高レベルの信頼を得るために、他の好適な診断用又は予後用のマーカー、バイオマーカー又は指標と併せて使用することができる。バイオマーカーが、コントロールと比較されたときに「過剰発現する」と言われるときには、そのバイオマーカーの発現が、疾患段階又は疾患状態と診断されていない少なくとも１つの野生型又は非変異型のコントロール対象によって自然の状態で発現される存在量又はレベルよりも統計学的に著しく大きい存在量又はレベルにあることが意味される。同様に、バイオマーカーが、「過小発現する」と言われるときには、そのバイオマーカーの発現は、疾患段階又は疾患状態と診断されていない少なくとも１つの野生型又は非変異型のコントロール対象によって自然の状態で発現されるバイオマーカーの発現よりも統計学的に著しく少ない。この定義のもとでは、そのバイオマーカーが遺伝的に不足している対象は、そのバイオマーカーを過小発現していると言うことはできない。同様に、そのバイオマーカーを発現するようにそのバイオマーカーの遺伝子をトランスフェクトされたとき、そのような不足している対象は、そのバイオマーカーが元々不足していたので、そのバイオマーカーを過剰発現していると言うことはできない。
【００５６】
コントロール−試験で得られた値が比較され得る参照用の対象、実験又は値。コントロール値又はコントロール範囲は通常、「正常な」状態を表し、その結果、コントロール値又はコントロール範囲の統計学的な違い又は偏差により、異常な状態又は疾患段階が表される。参照として使用するためのコントロールの対象、実験又は値をどのように選択及び／又は取得するかは、当業者が知るところである。
【００５７】
対象又は候補を選択する−対象又は候補が、臨床試験、実験、診断検査及び／又は他の検査のための好適であることを、対象又は候補の少なくとも１つの特徴を測定することによって決定すること。そのような特徴を表す値は、その後、参照用又はコントロールの値又は値の範囲と比較され、結果が、対象又は候補が、臨床試験、実験、診断検査及び／又は他の検査のために好適であるかを決定するために使用される。対象又は候補を、特定の処置に対するその従順性、あるいは、特定の攻撃又は疾患に対するその感受性に基づいてどのように選択するかは、当業者が知るところである。
【００５８】
細胞増殖異常−細胞の異常な成長が存在する状態。
【００５９】
がん−身体の他の部分に拡大し得る、身体の一部分における細胞の悪性かつ制御されない成長。
【００６０】
核酸−「核酸」は、３’，５’ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチドの直鎖状ポリマーである。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）では、糖基がデオキシリボースであり、ヌクレオチドの塩基が、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンである。ＲＮＡ又はリボ核酸はリボースを糖として有し、チミンがウラシルに置き換わる。「単離された核酸」は、その構造が、天然に存在するいかなる核酸の構造、又は、天然に存在するゲノム核酸のいかなるフラグメントの構造とも異なる核酸である。従って、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、そのゲノムＤＮＡ分子が天然に存在する生物のゲノムにおける分子の一部に隣接するコード配列の両方に隣接しないＤＮＡ；（ｂ）得られる分子が、天然に存在するいかなるベクター又はゲノムＤＮＡとも異なるようにで、ベクター、あるいは、原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製されるフラグメント、又は、制限フラグメントなどのような独立した分子；及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。本発明はまた、例えば、対象におけるヒトＰＡ２Ｇ４遺伝子の検出のために、又は、細胞増殖関連異常を処置するための治療用化合物のスクリーニングのために使用することができる、配列番号１に対する少なくとも５０％（５０％〜１００％の間での任意の百分率、例えば、８５％、９５％又は１００％を含む）の同一性を有する単離された核酸を特徴とする。
【００６１】
遺伝子産物−本発明のもとでは、遺伝子産物はタンパク質以外の遺伝子産物を示す。遺伝子産物は、特定の遺伝子によってコードされる遺伝子転写物とは異なる、生物学的機能を有する所定の長さのＲＮＡである場合がある。
【００６２】
遺伝子転写物−遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ配列。
【００６３】
タンパク質−特定の遺伝子によってコードされる、特定の順序でのアミノ酸の１つ又は複数の鎖から構成される生物学的分子。そのようなものとして、遺伝子におけるいかなる変異は、発現する変異タンパク質に反映される場合がある。本発明のもとでは、非変異タンパク質の実質的に同じ生物学的な機能及び活性を有する変異タンパク質は、非変異タンパク質と同じであると見なされる。タンパク質は、イソ型などの誘導体を有する場合がある。タンパク質のイソ型は、いくつかの小さい違いを有するタンパク質の異形であり、通常の場合には、スプライスヴァリアント又は何らかの翻訳後修飾の産物である。本発明のもとでは、タンパク質はまた、タンパク質が、使用される方法によって検出、特定及び／又は定量されるほどに十分に大きいフラグメントを包含する。タンパク質複合体は異なるタンパク質の混合物である。
【００６４】
プロテオーム−特定の時期及び特定の条件のもとで細胞又は器官によって発現されるタンパク質の集合体。従って、プロテオーム分析は、ゲノムによってコードされる完全な一組のタンパク質の研究である。
【００６５】
百分率同一性−２つの核酸配列の「パーセント同一性」が、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）におけるように修正された、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムがＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）のＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴ核酸検索がＸＢＬＡＳＴプログラムにより行われる。ギャップが２つの配列の間で存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）に記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターが使用される。ワールドワイドウエブアドレス（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照のこと。他の配列（例えば、タンパク質配列など）の百分率同一性を同様に決定することができる。
【００６６】
抗体−特定の抗原分子に結合する、免疫系のＢリンパ球によって産生される免疫グロブリンタンパク質。この用語には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、並びに、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びＦｖフラグメントなど）が含まれる。
【００６７】
薬物−任意の疾患又は病理学的段階又は病理学的状態の処置（改善、軽減又は治療）のために使用される任意の化合物。
【００６８】
スクリーニングする−任意の疾患又は病理学的状態において効果を有する化合物を選び出すこと。スクリーニングでは、化合物によってその発現が影響される任意の生体分子（例えば、タンパク質など）を検出すること、特定すること、及び／又は定量することを伴う場合がある。
【００６９】
処置する−細胞増殖関連異常を有する対象に、その異常、その異常の症状、その異常の二次的な疾患状態、又は、その異常の素因を治療、緩和、軽減、修復、防止又は改善する目的で化合物又は薬物を投与すること。「効果的な量」は、処置された対象において医学的に望ましい結果（例えば、上記で記載されたような結果）をもたらすことができる組成物の量である。このような方法は単独で行うことができ、あるいは、他の薬物又は治療法との併用で行うことができる。処置するには、バイオマーカーを非疾患状態において見出されるレベルに低下させることが含まれる。
【００７０】
ハイブリダイゼーションする、ハイブリダイゼーション可能な−生体分子（例えば、核酸の配列など）は、十分なひと続きの相補的なヌクレオチドが両者の間に存在するならば、核酸の別の配列にハイブリダイゼーションすることができる。ペプチド又はタンパク質については、１つのタンパク質（例えば、抗体又はそのフラグメントなど）が、別のタンパク質に、十分な相補的な構造がこれら２つの生体分子の間に存在するならば、ハイブリダイゼーションすることができる。
【００７１】
診断する、診断−疾患を診断することは、疾患の性質又は正体を決定することである。診断には、疾患の重篤度に関する決定が付随する場合がある。
【００７２】
予後判定する、予後−予後判定することは、疾患の結果又は予後を予測することであり、例えば、臨床検査の観察及び結果に基づいて生存の可能性を伝えることなどである。
【００７３】
素因−特定の疾患と診断される可能性、又は、特定の疾患に対する感受性。
【００７４】
血液派生物−血液は細胞成分及び液体成分から構成される。血液派生物は、全血以外の血液成分の１つ又は複数のいずれかである。
【００７５】
本発明は上記の問題を検討し、細胞増殖異常（例えば、がんなど）を検出及び／又は処置する方法を提供する。一般に、当該異常はがんであり、具体的には乳がんである。
【００７６】
１つの局面において、本発明は、対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び／又は、重篤度を検出及び／又は定量化する方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも１つのサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の存在、又は、素因、及び／又は、重篤度が示されるものである方法を提供する。
【００７７】
対象における細胞増殖異常のための処置の効力をモニターする方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも２つのサンプルであって、それぞれのサンプルが異なる時点で得られるサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）少なくとも２つのサンプルにおけるＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を比較することを含む方法もまた提供される。
【００７８】
対象における細胞増殖異常の結果を予後判定する方法であって、
（ａ）対象からの少なくとも１つのサンプルを用意すること；
（ｂ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の予後が示されるものである方法もまた提供される。
【００７９】
前記コントロールは、例えば、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも１つの対象である。また、前記コントロールは、ＰＡ２Ｇ４遺伝子及び／又はＰＡ２Ｇ４タンパク質の低いレベルの発現を有する対象である場合がある。前記コントロールはまた、選択された集団から得られる発現における平均値である場合がある。
【００８０】
前記遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異は、ヒトＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異である場合があり、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントは、ヒトＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントである場合がある。
【００８１】
前記検出は、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントを少なくとも１つのスルフェニルハライド試薬により標識し、その後、２次元ゲル電気泳動及び質量分析法によって行うことができる。
【００８２】
対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の発現を変化させることを含む方法もまた提供される。
【００８３】
前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子は、配列番号１に示される配列を有し得る。変前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な核酸を投与することによって得ることができる。ハ前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。具体的には、前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はｓｉＲＮＡであり得る。前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得ることができる。
【００８４】
対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を変化させることを含む方法
もまた提供される。
【００８５】
この方法は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＡ２Ｇ４タンパク質の発現を変化させることを含むことができる。前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントのアミノ酸配列の全体又は一部に結合するポリペプチドを投与することによって得ることができる。前記結合するポリペプチドは抗体であり得る。前記変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質のアミノ酸配列の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得ることができる。
【００８６】
前記発現を変化させることは、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を低下させることを含むことができる。
【００８７】
少なくとも１つのタンパク質及び／又はそのフラグメントの発現における変動を引き起こす少なくとも１つの薬物についてスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの薬物を少なくとも１つの対象に投与すること；少なくとも１つのタンパク質を前記対象から得ること；前記タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を少なくとも１つの試薬により標識すること；及び前記タンパク質を質量分析法によって分析し、それにより、前記少なくとも１つのタンパク質及び／又はそのフラグメントを特定し、発現の変動が生じているかどうかを明らかにすることを含む方法もまた提供される。
【００８８】
前記分析する工程は、前記タンパク質を第１の特徴に基づいて分離し、場合により前記タンパク質を第２の特徴に基づいて分離し、前記タンパク質をイオン化し、前記分離されたタンパク質を検出及び特定することを含むことができる。前記タンパク質及び／又はそのフラグメントはＰＡ２Ｇ４タンパク質及び／又はそのフラグメントであり得る。前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質は配列番号２の配列を有する。前記試薬はスルフェニルハライドであり得る。具体的には、前記試薬は２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）であり得る。前記アミノ酸残基はトリプトファンであり得る。
【００８９】
前記分離する工程は、質量、電荷、官能基及び等電点からなる群から選択される少なくとも１つの特徴に基づくことができる。前記分離する工程は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び／又はフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）のための工程であり得る。前記イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）、ナノスプレーイオン化、大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）、化学的イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、電界脱離／電界イオン化（ＦＤ／ＦＩ）及びサーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）からなる群から選択することができる。前記分析する工程はタンデム質量分析法によって行うことができる。前記タンデム質量分析法では、四重極飛行時間型配置が使用され得る。
【００９０】
少なくとも１つの候補を、臨床試験、実験及び／又は診断検査のために選択する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの対象からの少なくとも１つのサンプルを提供すること；
（ｂ）前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子及び／又はその変異、あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を測定すること；及び
（ｃ）前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの発現を、少なくとも１つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象が候補として好適であることが示されるものである方法もまた提供される。
【００９１】
対象における細胞増殖異常の診断及び／又は予後評価のための診断キット及び／又は予後キットであって、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異にハイブリダイゼーション可能な少なくとも１つの分子、並びに／あるいは、ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合する少なくとも１つの分子を含む診断キット及び／又は予後キットもまた提供される。
【００９２】
前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子、そのＲＮＡ及び／又は変異にハイブリダイゼーション可能な核酸配列であり得る。前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４遺伝子の転写物にハイブリダイゼーション可能なｓｉＲＮＡであり得る。前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合するタンパク質であり得る。前記分子は、前記ＰＡ２Ｇ４タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントに結合する抗体であり得る。
【００９３】
前記細胞増殖異常はがんである場合がある。具体的には、前記細胞増殖異常は乳がんである場合がある。前記対象は哺乳動物である場合があり、具体的にはヒトである場合がある。
【００９４】
本出願は、遺伝子、その遺伝子転写物、ＲＮＡ遺伝子産物及び／又はその変異、並びに／あるいは、タンパク質、その誘導体、変異体及び／又はフラグメントの、乳がんを診断するための新規な使用、予後を決定するための新規な使用、及び、乳がんについての処置の効力をモニターするための新規な使用を記載する。質量分析法（ＭＳ）の使用によって、本出願人は、増殖関連遺伝子２Ｇ４（ＰＡ２Ｇ４）遺伝子がこれらの目的のためのバイオマーカーとして好適であるという驚くべき発見を行った。
【００９５】
質量分析法（ＭＳ）は、分子を分析するために使用することができる。ＭＳシステムでは、目的とする分子がイオン化され、そのｍ／ｚ比に基づいて分析計において分離され、その後、検出器によって検出される。結果をｍ／ｚのスペクトルの形態で表示することができる。ＭＳシステムは通常、データを分析するためのデータ分析サブシステムを含む。
【００９６】
分子のイオン化を多くの方法によって達成することができ、それらには、大気圧化学的イオン化（ＡＰＣＩ）、サーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）、化学的イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、電界脱離／電界イオン化（ＦＤ／ＦＩ）、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）及びマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれる。
【００９７】
分析計では、イオンを分析するための種々の原理又は配置を利用することができ、これらには、四重極、磁気セクター、並びに、フーリエ変換、四重極イオントラップ及び飛行時間（ＴＯＦ）型配置の両方が含まれる。２つ以上の分析計をタンデムに配置することができる。一般に使用されるタンデム型配置には、四重極−四重極型、磁気セクター−四重極型及び四重極−飛行時間型の配置が含まれる。
【００９８】
ＭＳにおいて、当業者は、目的とする生体分子（例えば、タンパク質など）を最もよく調べるために、種々のイオン化方法、分析方法及び検出方法を選択することができる。
【００９９】
出願人らは、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）標識化技術（Ｋｕｙａｍａ他、２００３）を定量的プロテオーム分析のために２ＤＥ及びＭＳとの組合せで使用した（ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ）。ＮＢＳ標識化においては、軽いＮＢＳ成分及び重いＮＢＳ成分をトリプトファン残基に結合すること、これにより、６Ｄａの質量差を、軽いＮＢＳ標識されたトリプトファンペプチドと、重いＮＢＳ標識されたトリプトファンペプチドとの間で生じさせることが行なわれる。
【０１００】
タモキシフェン（ＴＡＭ）処理により誘導されるＭＣＦ−７乳がん細胞におけるプロテオーム変化を調べるためのＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ法。ＴＡＭは、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がんについての最初に選ばれるホルモン処置であるが、以前の報告では、ＴＡＭ処理に関連する乳がん患者及びセルラインにおけるｍＲＮＡ遺伝子発現パターンが記載されている（Ｓａｊｉ他、２００５；Ｚｈａｎｇ他、１９９９）。ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳを使用して、本発明者らは、ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞と、コントロールのＭＣＦ−７細胞との間で量的に変化した８８個のタンパク質スポットを選択し、そのうちの４４個をＮＢＳ標識化によって首尾良く特定及び定量化することができた。３つのタンパク質（ＣＫ１９、ＧＲＰ７８及びＰＡ２Ｇ４）はまた、ウエスタンブロッティングによってＭＣＦ−７細胞における正真正銘のＴＡＭ応答性タンパク質として有効であることが確認され、また、原発性乳がんでは、ＰＡ２Ｇ４の発現が、２つの独立した患者コホートにおいて新規な予後因子として挙動することがさらに示された。
【０１０１】
調べられたタンパク質の中で、増殖関連２Ｇ４（ＰＡ２Ｇ４）は、乳がんについてのバイオマーカーとしての使用のための非常に良好な潜在的可能性を有する。この遺伝子配列が配列番号１として示され、遺伝子産物（タンパク質）の配列が配列番号２に示される。
【０１０２】
ＰＡ２Ｇ４（Ｅｂｐ−１）は、増殖中の細胞の細胞周期活性を維持する細胞周期調節タンパク質又は複製タンパク質の大きなファミリーに属する。ＰＡ２Ｇ４（Ｅｂｐ−１）は、細胞複製の制御に関与する核のＤＮＡ結合タンパク質をおそらくはコードする増殖依存的な遺伝子であるようである。ＰＡ２Ｇ４／Ｅｂｐ−１は、ヒトのＥｒｂＢ受容体陽性の乳がん細胞及び前立腺がん細胞の分化に関係することが示されており、また、抗増殖作用を網膜芽細胞腫（Ｒｂ）の腫瘍抑制タンパク質とのその相互作用によって誘導することができる（Ｒａｏ他、２００２）。このタンパク質は哺乳動物及びヒトの両方で見出される。
【０１０３】
Ｅ２の分裂促進作用は、主として、重要な細胞周期調節遺伝子の発現を増大させるその能力に起因すると考えられている。古典的なＥ２応答性のヒトモデルを使用するＥ２の作用の包括的な遺伝子発現分析、及び、Ｅ２により標的化されたいくつかの遺伝子の特定が報告された。ＰＡ２Ｇ４が、Ｅ２処理の３時間後でさえ、ＭＣＦ−７において過剰発現することが見出された。この研究では、ＥＲ＋及びＥＲ−の様々な乳がんセルラインが使用された（Ｐｏｍｐｅｉａ他、２００４）。
【０１０４】
２つの他のタンパク質（ＣＫ１９及びＧＲＰ７８）が、ＭＣＦ−７細胞における正真正銘のＴＡＭ応答性タンパク質として有効であることが確認された。
【０１０５】
複雑なタンパク質混合物における薬物応答性バイオマーカーの特定は定量的プロテオミクスの重要な目標の１つである。一般には、我々は、試薬によるタンパク質の標識化及びその後のタンパク質の分離及び質量分析法による分析を組み合わせる、そのような薬物誘導されたタンパク質変化を特定するための新規の方法を開発した。具体的には、一例として、本発明者らは、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）によるトリプトファン標識化を二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）／質量分析法（ＭＳ）とともに使用した。薬物処理されたサンプル及びコントロールのサンプルに由来する溶解物が、軽いＮＢＳ残基及び重いＮＢＳ残基により標識され、その後、一般的な２ＤＥゲルで分離される。本発明の方法のもとでは、目的とするタンパク質が、ＭＳによる分析の前に、２ＤＥ工程によって分離及び単離される。タンパク質変化が、ＮＢＳペプチドピーク対の示差的強度より、ＭＳによって特定される。
【０１０６】
ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳを使用して、我々は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性のＭＣＦ−７乳がんセルラインにおけるタモキシフェン（ＴＡＭ）により誘導されるプロテオーム変化のプロファイリングを行った。ＴＡＭ処理時に著しく変化した８８個のタンパク質スポットのうち、２３個の別個のタンパク質種を表す４４個のスポットがＮＢＳ対形成ペプチドとともに首尾良く特定された。これら２３個のＴＡＭ変化タンパク質のうち、１６個（７０％）はこれまで、ＴＡＭ又はＥＲ活性に関連していなかった。我々は、ＮＢＳ標識化手法が技術的及び生化学的の両方で再現性を有することを見出した。ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳでの変化は、２ＤＥによる従来の示差的タンパク質定量化との良好な一致を示したが、別個のタンパク質が通常の２ＤＥゲルにおいて同時に移動することに主として起因する不一致があった。ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳの結果が妥当であることを確認するために、本発明者らは免疫ブロッティングを使用して、ＧＲＰ７８、ＣＫ１９及びＰＡ２Ｇ４を正真正銘のＴＡＭ調節のタンパク質として確認した。また、２つの独立した乳がん患者コホートにおいて、我々は、ＰＡ２Ｇ４の発現が無病生存についての新規な予後因子として役立ち得ることを明らかにする。
【０１０７】
ＰＡ２Ｇ４が乳がんについての信頼できるバイオマーカーとして特定されたので、その遺伝子、遺伝子転写物、ＲＮＡ遺伝子産物、遺伝子誘導体、遺伝子変異、タンパク質、タンパク質誘導体、タンパク質変異体及びタンパク質フラグメントをこの目的のためにそれに従って使用することができる。当分野で知られている任意の方法を、ＰＡ２Ｇ４の存在を定性的に検出するために、又は、ＰＡ２Ｇ４の存在を定量的に測定するために使用することができる。
【０１０８】
遺伝子発現
本発明の核酸は、当分野で知られている方法による好適な宿主細胞へのＤＮＡ移入によってインビトロで発現させることができる。例えば、核酸を組換え発現ベクターに挿入することができる。様々な宿主−発現ベクターシステムを、本発明の核酸を発現させるために利用することができる。これらには、微生物（例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、組換えプラスミドＤＮＡ又は組換えコスミドＤＮＡの発現ベクターにより形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母など）、及び、組換えウイルス発現ベクター又は組換えプラスミド発現ベクターを感染させたヒトセルラインが含まれるが、これらに限定されない。組換えポリペプチド又はそのフラグメントの単離及び精製は従来の手段によって行うことができ、そのような方法には、調製用クロマトグラフィー、及び、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を伴う免疫学的分離が含まれる。
【０１０９】
本発明はまた、細胞増殖関連異常についての予後判断、診断、処置を行なうための方法、及び、細胞増殖関連異常を処置するための治療用化合物を特定するための方法を特徴とする。
【０１１０】
本発明の予後判断方法は、患者由来のサンプルにおけるバイオマーカーの発現を、疾患結果がわかっている１名又は複数の患者から得られる参照値、あるいは、良性又は悪性がわかっている組織又は細胞から得られる参照値と比較することを伴う。その後、これらの患者の予後を判断することが可能である。
【０１１１】
本発明の診断方法は、対象（すなわち、動物又はヒト）から調製されたサンプルにおける、ＰＡ２Ｇ４、ＧＲＰ７８及びＣＫ１９のゲノムＤＮＡレベルの１つ又は複数を、正常な対象（すなわち、細胞増殖関連異常に罹患していないか、又は、細胞増殖関連異常を発症する危険性がない対象）から調製されたサンプルにおけるものと比較することを伴う。
【０１１２】
予後方法及び診断方法の両方について、ＰＡ２Ｇ４のより高いゲノムＤＮＡレベルにより、対象が細胞増殖関連異常に罹患しているか、又は、細胞増殖関連異常を発症する危険性があることが示される。これらの方法は単独で使用することができ、又は、適切な対象において細胞増殖関連異常を診断するための他の手法、及び、疾患の結果に関しての予後を提供するための他の手法との併用で使用することができる。
【０１１３】
遺伝子座の増幅は、当分野で知られている様々な方法によって検出することができる。例えば、遺伝子座のコピー数を、検査サンプル及びコントロールサンプルから調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって決定及び比較することができる。遺伝子座の増幅はまた、サザンブロット分析によって特定することができる。中期の染色体展開物に対するＤＮＡ配列の蛍光インシチュウーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）はさらに、染色体に存在するＤＮＡ配列の正確な染色体上の存在位置、及び、染色体に存在するＤＮＡ配列の量を提供するために使用することができる。
【０１１４】
本発明はまた、ＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡレベルを低下させるか、あるいは、ＰＡ２Ｇ４又はＰＡ２Ｇ４のｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現を調節するか、あるいは、ＰＡ２Ｇ４又はＰＡ２Ｇ４のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルを低下させるか、あるいは、ＰＡ２Ｇ４を認識する他の分子とのＰＡ２Ｇ４の相互作用のレベルを低下させる化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、ペプトイド、抗体又は小分子）を特定するための方法を提供する。得られる特定された化合物はその後、例えば、細胞増殖関連異常を防止及び処置するために使用することができる。
【０１１５】
本発明の候補化合物は、当分野で知られているコンビナトリアルライブラリー法における数多くの方法のいかなるものも使用して得ることができる。そのようなライブラリーには、ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、酵素分解に対して抵抗性である新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー）；空間的に接近可能な並列固相ライブラリー又は液相ライブラリー；デコンボリューション又はアフィニティークロマトグラフィー分離によって得られる合成ライブラリー；及び「１ビーズ１化合物」ライブラリーが含まれる。例えば、Ｌａｍ（１９９７）を参照のこと。
【０１１６】
分子ライブラリーを合成するための方法の様々な例が、当分野において、例えば、Ｇａｌｌｏｐ他（１９９４）において見出され得る。
【０１１７】
化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、１９９２）、あるいは、ビーズ（Ｌａｍ、１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９３）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ他、１９９２）又はファージ（米国特許第５，２２３，４０９号）において提示することができる。
【０１１８】
ある系において、ＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡレベルを低下させるか、又は、マーカーヌクレオチド配列の発現をＰＡ２Ｇ４に関連するプロモーターの制御下で調節するか、又は、ＰＡ２Ｇ４のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルを低下させるか、又は、ＰＡ２Ｇ４のレベルを低下させるか、又は、ＰＡ２Ｇ４のレベルを低下させる化合物を特定するために、当該系は候補化合物と接触させられ、ＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡレベル、マーカーヌクレオチド配列の発現、ＰＡ２Ｇ４のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベル、ＰＡ２Ｇ４相互作用のレベルが、当該候補化合物の非存在下における場合に対して評価される。細胞系において、細胞は、増幅されたＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡを含有することができ（例えば、がん細胞）、自然の状態でＰＡ２Ｇ４を発現することができ、例えば、異種のプロモーターに融合されたＰＡ２Ｇ４遺伝子を有する組換え核酸を発現するように改変することができる。ＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡのレベルが候補化合物によって変化するならば、すなわち、候補化合物の存在下ではその非存在下の場合よりも低いならば、又は、候補化合物の存在下でのマーカーヌクレオチド配列の発現が候補化合物の非存在下での発現と異なれば、その候補化合物は、細胞増殖関連異常を防止及び処置するために有用であるとして特定される。
【０１１９】
ＰＡ２Ｇ４、ＧＲＰ７８及びＣＫ１９のゲノムＤＮＡレベルを、上記で記載された方法によって、また、当分野では広く知られているいかなるの他の方法によっても決定することができる。
【０１２０】
遺伝子産物の発現
マーカーヌクレオチド配列（ＰＡ２Ｇ４、ＧＲＰ７８及びＣＫ１９）の発現をｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルのいずれかで明らかにすることができる。組織サンプル又は体液サンプルにおけるｍＲＮＡレベルを測定する様々な方法が当分野では知られている。ｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を溶解することができ、ライセートにおけるｍＲＮＡのレベル、あるいは、ライセートから精製又は半精製されたＲＮＡにおけるｍＲＮＡのレベルを、様々な方法のいかなるものによっても決定することができ、そのような方法には、限定されないが、検出可能に標識されたＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する定量的又は半定量的なＲＴ−ＰＣＲ方法論が含まれる。あるいは、定量的又は半定量的なインシチュウーハイブリダイゼーションアッセイを、例えば、組織切片又は非溶解の細胞懸濁物、及び、検出可能（例えば、蛍光又は酵素）標識されたＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブを使用して行うことができる。ｍＲＮＡを定量するためのさらなる方法には、ＲＮＡ保護アッセイ（ＲＰＡ）及び遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）が含まれる。
【０１２１】
ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳの方法が記載されているが、組織サンプル又は体液サンプルにおけるタンパク質レベルを測定する他の方法もまた当分野では知られている。多くのそのような方法では、標的タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）が用いられる。そのようなアッセイにおいて、抗体自身、又は、抗体に結合する二次抗体を検出可能に標識することができる。あるいは、抗体をビオチンとコンジュゲート化した後、検出可能に標識されたアビジン（ポリペプチド）と結合することを、その存在を検出するために使用することができる。当業者が熟知しているこれらの方法の組合せ（「多層サンドイッチ」アッセイを含む）を、方法論の感度を高めるために使用することができる。これらのタンパク質測定アッセイのいくつか（例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット）を細胞のライセートに適用することができ、他のタンパク質測定アッセイを組織学的切片又は非溶解の細胞懸濁物に適用することができる（例えば、免疫組織学的方法又は蛍光フローサイトメトリー）。
【０１２２】
標識の量を測定する方法は標識の性質に依存し、様々な方法が当分野では広く知られている。適切な標識には、限定されないが、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ又は３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光成分又は蛍光タンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ又はＢＦＰ）、あるいは、発光成分（例えば、Ｑｄｏｔ（商標）ナノ粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される））が含まれる。他の適用可能なアッセイには、定量的免疫沈殿アッセイ又は補体固定アッセイが含まれる。
【０１２３】
ＰＡ２Ｇ４のレベルは、当分野で知られている任意の方法によって、例えば、インビトロ結合アッセイによって、又は、酵母ハイブリッドシステムを使用することによって明らかにすることができる。ＰＡ２Ｇ４の結合ドメインを、例えば、変異誘発によって特定することができ、スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【０１２４】
［処置］
本発明はさらに、細胞増殖関連異常を防止及び処置するための方法を提供する。処置される対象は、例えば、対象から調製されたサンプルにおけるＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ転写物又はＤＮＡ産物のレベルを、上記で記載された方法によって明らかにすることによって特定することができる。ＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡレベルが、対象由来のサンプルにおいて、正常な対象に由来するサンプル（コントロール）におけるＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡレベルよりも高いならば、その対象は、ＰＡ２Ｇ４のゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ転写物又はＤＮＡ産物のレベルを低下させる化合物の効果的な量による処置についての候補である。
【０１２５】
インビボ方法において、治療用組成物（例えば、上記で記載されるように特定された化合物を含有する組成物）が対象に投与される。一般には、化合物は、医薬的に許容され得るキャリア（例えば、生理学的食塩水）に懸濁され、経口投与又は静脈内注入によって投与されるか、あるいは、皮下、筋肉内、クモ膜下、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内又は肺内に注入又は埋め込まれる。がんの防止及び処置のために、化合物をがん組織に直接に送達することができる。
【０１２６】
必要される投薬量は、投与経路の選択；配合物の性質；対象の病気の性質；対象のサイズ、体重、表面積、年齢及び性別；投与されている他の薬物；並びに主治医の判断に依存する。好適な投薬量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる投薬量における広範囲の変化は、入手可能な化合物の多様性、及び、様々な投与経路の異なる効率を考慮して予想されるべきである。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも大きい投薬量を必要とすることが予想される。これらの投薬量レベルにおける様々な変化を、当分野では十分に理解されるような最適化のための標準的な経験的常法を使用して調節することができる。好適な送達ビヒクルでの化合物のカプセル化（例えば、ポリマーマイクロ粒子又は埋め込み可能なデバイス）は、特に経口送達については送達効率を増大させることができる。
【０１２７】
核酸の取り込みを達成するための別の方法は、標準的な方法によって調製されるリポソームを使用することである。この媒介物は単独でこれらの送達ビヒクルに配合することができ、又は、組織特異的な抗体と同時に配合することができる。あるいは、静電気又は共有結合の力によりポリ−Ｌ−リシンに結合させたプラスミド又は他のベクターから構成される分子コンジュゲートを調製することができる。ポリ−Ｌ−リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ他、１９９５）。あるいは、組織特異的な標的化を、当分野で知られている組織特異的な転写調節エレメント（ＴＲＥ）の使用によって達成することができる。筋肉内部位、皮内部位又は皮下部位への「ネイクドＤＮＡ」（すなわち、送達ビヒクルを伴わない）の送達は、インビボ発現を達成するための別の手段である。
【０１２８】
関連したポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、アンチセンスのＰＡ２Ｇ４  ＲＮＡをコードする核酸配列がプロモーター又はエンハンサー−プロモーター組合せに機能的に連結される。エンハンサーは、時間、場所及びレベルに関して発現の特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在するならば、転写開始部位からの様々な距離で存在するとき、機能することができる。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流側に存在させることができる。
【０１２９】
遺伝子発現の阻害を、小さい阻害ＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ）の使用によって達成することができる。ＰＡ２Ｇ４遺伝子の発現はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して阻害することができる。これは、標的遺伝子の活性が同族の二重鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）により特異的に無効化される転写後遺伝子サイレンシング（「ＰＴＧＳ」）のための技術である。多くの実施形態において、約１８ヌクレオチド〜２６ヌクレオチド（具体的には２０ヌクレオチド〜２４ヌクレオチド、より具体的には２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチド）のｄｓＲＮＡである。例えば、標的遺伝子に対して相同的な２１ヌクレオチドの配列が細胞に導入され、遺伝子活性の配列特異的な減少が観測される。ＲＮＡ干渉はＲＮＡレベルでの遺伝子サイレンシングの機構を提供する。ＲＮＡ干渉は、治療目的と同様に、遺伝子ノックアウトのための効率的かつ広範囲の適用可能な方法を提供する。
【０１３０】
遺伝子発現をＲＮＡ干渉によって阻害することができる配列は、任意の所望される長さであり得る。例えば、そのような配列は、少なくとも１５個、２０個、２５個又はそれ以上の連続するヌクレオチドを有することができる。そのような配列は、その配列が、標的ｍＲＮＡ転写物を分解するための機能的なサイレンシング複合体を形成することができるならば、ｄｓＲＮＡ又は任意の他のタイプのポリヌクレオチドであり得る。
【０１３１】
１つの実施形態において、そのような配列は短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなるか、又は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。ｓｉＲＮＡは、例えば、１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡを、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ関連ヌクレアーゼによる、より長いｄｓＲＮＡ分子の分解によって内因的に産生させることができる。ｓｉＲＮＡはまた、外因的に、又は、発現構築物の転写によって細胞に導入することができる。形成されると、ｓｉＲＮＡ成分及びタンパク質成分が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体に組み立てられる。ｓｉＲＮＡのＡＴＰ生成による巻き戻しにより、ＲＩＳＣが活性化され、その結果として、ＲＩＳＣはワトソン・クリック塩基対形成により相補的なｍＲＮＡ転写物を標的化し、それにより、そのｍＲＮＡを切断及び破壊する。ｍＲＮＡの切断が、ｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の中央部の近くで生じる。この配列特異的なｍＲＮＡ分解により、遺伝子サイレンシングがもたらされる。
【０１３２】
ポリヌクレオチドは、医薬的に許容され得るキャリアにおいて投与することができる。医薬的に許容され得るキャリアは、動物又はヒトへの投与のために好適である生物学的に適合し得るビヒクル（例えば、生理学的な生理的食塩水又はリポソーム）である。ポリヌクレオチドを投与するための好ましい投薬量はポリヌクレオチド分子のおよそ１０６コピー〜１０１２コピーである。この用量を、必要に応じて、繰り返し投与することができる。投与経路は、上記で示された投与経路のいずれかであり得る。
【０１３３】
ＰＡ２Ｇ４に対する抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を、ＰＡ２Ｇ４タンパク質のレベルを減少させるために、又は、対象におけるＰＡ２Ｇ４のレベルを低下させるために使用することができる。用語「抗体」には、インタクトな分子、並びに、ＰＡ２Ｇ４タンパク質に存在するエピトーク決定基に結合することができるそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなど）が含まれる。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びにそれらのフラグメントを作製する方法が当分野では知られている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０１３４】
ＰＡ２Ｇ４の発現を阻害するために使用することができる他の化合物には、ＰＡ２Ｇ４タンパク質のＣ末端におけるアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドが含まれる。
【０１３５】
加えて、本発明は、細胞増殖関連異常に罹患する複数の対象（例えば、増幅されたＰＡ２Ｇ４ゲノムＤＮＡの発現又はＰＡ２Ｇ４タンパク質の発現を有する対象）を提供すること；効果的な量のＰＡ２Ｇ４阻害剤、その後、効果的な量のヌクレオチド又はヌクレオシドアナログ（例えば、ゲムシタビン）をそれぞれ特有の時点でそれぞれの対象に投与すること；及び、細胞増殖関連異常が最大限に阻害される最適な時点を選択することによって、細胞増殖関連異常を処置するための手法を開発する方法を提供する。最適な時点が特定されると、この手法は、適切な対象における細胞増殖関連異常を処置するために使用することができる。
【実施例】
【０１３６】
下記の具体的な実施例は、単に例示であり、かつ、いかなる点でも決して本開示の残り部分の限定でないとして解釈されなければならない。さらなる詳しい説明がなくとも、当業者は、本明細書中の記載に基づいて、本発明を完全に利用し得ることが考えられる。本明細書中に引用されるすべての刊行物はその全体が本明細書により参考として組み込まれる。
【０１３７】
本発明はこれまで、一般的に記載されているが、本発明は、本発明の例示として提供され、本発明の限定であることが意図されない下記の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【０１３８】
［材料及び方法］
実施例１−化学試薬及び材料
ＭＣＦ−７乳がん細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）から得た。タモキシフェン（ＴＡＭ）、ニワトリオバルブミン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（ＨＮＢＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、プロテアーゼインヒビターカクテル、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、デオキシコール酸ナトリウム及びオルトバナジン酸ナトリウムをＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得た。スルフェニルハライド薬剤及び２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ、重形態及び軽形態）をＳｈｉｍａｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（京都、日本）から得た。Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）塩酸塩をＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）から得た。Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ蛍光色素、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体をＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）から得た。エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）及びポリビニリデンジフルオリドメンブレン（ＰＶＤＦ）をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）から得た。Ｃ１８  Ｚｉｐ  ＴｉｐをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）から得た。配列決定規格の修飾トリプシンをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）から得た。ダルベッコ改変イーグル培地５（ＤＭＥＭ）をＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得た。デキストラン活性炭処理のウシ胎児血清（ＦＢＳ）をＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ、米国）から得た。抗ビンキュリン抗体及び抗ＰＡ２Ｇ４抗体をＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＶＡ、米国）から得た。抗サイトケラチン１９抗体及び抗ＧＲＰ７８抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ、ＣＡ、米国）から得た。Ｔｒｉｚｏｌ及び逆転写酵素をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ、米国）から得た。ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されたオリゴヌクレオチドプライマーはＳｉｇｍａ  Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｓｉｇｍａ、シンガポール）から合成された。
【０１３９】
実施例２−ＭＣＦ−７細胞の細胞培養及びＴＡＭ処理
ＭＣＦ−７乳がん細胞を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭにおいて培養した。ＴＡＭ処理の前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、５％のデキストラン活性炭処理ＦＢＳを含むフェノールレッド非含有ＤＭＥＭにおいて２４時間維持した。その後、細胞を４０％〜５０％のコンフルエンスで１０μＭのＴＡＭにより処理し、２４時間及び４８時間で集めた。コントロールとして、姉妹培養物を等体積のビヒクル（０．１％エタノール）により処理した。
【０１４０】
［ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ］
実施例３−タンパク質の抽出及びＮＢＳ標識化
ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞及びコントロールのＭＣＦ−７細胞を２ＤＥ溶解緩衝液（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍＬのＤｎａｓｅＩ、５０μｇ／ｍＬのＲｎａｓｅＩ及びプロテアーゼインヒビターカクテル）において溶解し、抽出されたタンパク質を、２Ｄサンプルクリーンアップキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して８Ｍ尿素／５ｍＭ  ＥＤＴＡに緩衝液交換した。タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）によって定量し、１００μｇの各タンパク質ライセートを、振とうとともに、２５μＬの酢酸における２０倍モル過剰の１２Ｃ（軽）−又は１３Ｃ（重）−２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳ）により暗所で標識した。ＮＢＳ標識化では、１２Ｃ又は１３ＣのＮＢＳ成分がトリプトファン残基に選択的に導入され、これにより、６Ｄａの質量差が、軽いＮＢＳ標識トリプトファンペプチドと、重いＮＢＳ標識トリプトファンペプチドとの間でもたらされる。その後、質量分析法（ＭＳ）を使用して、ペプチドピーク対の強度比を求めることができ、これにより、それぞれの軽い集団及び重い集団の相対的な定量化がもたらされる（図１Ａ）（Ｋｕｙａｍａ他、２００３）。
【０１４１】
標識化した後で、これら２つのタンパク質混合物を一緒にし、非標識のＮＢＳ成分をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）によって除いた。注目すべきことに、我々は、過剰なＮＢＳ標識を除くためのＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムの使用はタンパク質回収を著しく妨害しないこと（Ｍａｔｓｕｏ他（２００６）における図２を参照のこと）、及び、サンプルが尿素又はＧｄｎＨｃｌのいずれかにより変性されるかどうかにかかわらず、タンパク質回収が変化しないことを以前に示している。サンプルを真空濃縮器により乾燥し、０．１％のＳＤＳを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）の５０μＬに再懸濁し、４ｍＭのＴＣＥＰにより３７℃で３０分間還元し、その後、１０ｍＭのヨードアセトアミドによるアルキル化を暗所において室温で４５分間行った。その後、ライセートを２ＤＥ溶解緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素及び４％のＣＨＡＰＳ）に緩衝液交換した。
【０１４２】
実施例４−二次元ゲル電気泳動
一次元目の分離の前に、それぞれのＩＰＧストリップ（１８ｃｍ、ｐＨ４〜７、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を３４０μＬの再水和緩衝液（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ、０．５％のＩＰＧ緩衝液（ｐＨ４〜７）及び２０ｍＭのＤＴＴ）により８時間再水和した。一次元目の分離をＩＰＧｐｈｏｒ  ＩＥＦシステム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）で行った。８０μＬの溶解緩衝液における１００μｇのタンパク質ライセート、２０ｍＭのＤＴＴ及び０．５％のＩＰＧ緩衝液（ｐＨ４〜７）を、カップローディングにより陽極側にアプライした。その後、ストリップを、２０℃において、２００Ｖで３時間、５００Ｖで１時間、５００Ｖから８０００Ｖまで７時間、その後、６７，０００Ｖｈに達するまで８０００Ｖでフォーカスさせた。フォーカス後、ＩＰＧストリップを２段階で平衡化した：（１）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、１％ＤＴＴ及び微量のブロモフェノールブルーにおいて１５分；（２）２．５％のヨードアセトアミドをＤＴＴの代わりに含有する類似する溶液において１５分。
【０１４３】
平衡化されると、ストリップを１０％の均一濃度のポリアクリルアミドゲル（１８ｃｍ×２０ｃｍ×０．７５ｍｍ）に移した。その後、ＩＰＧゲルを泳動用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシン及び０．１％ＳＤＳ）における０．５％（ｗ／ｖ）アガロースによりシールした。その後、二次元目の分離を、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ＸＬシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを８ｍＡ／ゲルにより１７℃で１時間行い、その後、２４ｍＡ／ゲルの定電流で、色素の先端がゲルの底部に達するまで行った。その後、ゲルを製造者のプロトコル（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に従ってＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ蛍光色素により標識した。ゲルを、ＦＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデジタル化し、画像分析を、ＰＤＱｕｅｓｔ７．３画像分析ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行った。
【０１４４】
実施例５−質量分析法によるタンパク質の特定
蛍光標識されたタンパク質のゲルスポットを切り出し、ゲル内トリプシン消化を、Ｘｃｉｓｅロボットシステム（Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、京都、日本）を使用して行った。自動操作では、消化前に、ゲル片を水により２回洗浄し、１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）により収縮させ、乾燥することが行なわれた。３０μＬのトリプシン（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）における３．３３ｎｇ／μＬ）をそれぞれのゲルプラグに加え、消化を振とうとともに３０℃で一晩行った。その後、サンプルを清浄化し、Ｃ１８  Ｚｉｐ  Ｔｉｐにより濃縮した。
【０１４５】
最後に、ペプチド混合物を、ＭＳ分析の前に、１μＬの５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡによりＭＡＬＤＩサンプルプレートの上に溶出し、１０ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）及び３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（ＨＮＢＡ）を５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡに含有する１μＬのマトリックスと混合した。これは、通常のＣＨＣＡ／ＤＨＢマトリックス（Ｌａｕｇｅｓｅｎ及びＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆ、２００３）に代わってＭａｔｓｕｏ他（２００６）に基づく新規なマトリックス配合物である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲｐｌｕｓ質量分析計（Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（京都、日本）及びＫｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国））を下記の設定のもとで使用して行った：窒素レーザー（３３７ｎｍ）；リフレクトロンモード；陽イオンの検出。加速電位を、グリッドレス型電極を使用して３５ｋＶに設定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを８００（ｍ／ｚ）から３０００（ｍ／ｚ）まで手動モードで取得し、２つのトリプシン自己消化ピーク（ｍ／ｚ、８４２．５１及び２２１１．１０）による内部基準により校正した。ペプチド質量マッピングスペクトルからのピークリストを自動的に取り出し、インハウスのＭａｓｃｏｔサーバー（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）に送り、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース及びＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。
【０１４６】
ＮＢＳ標識ペプチドについての検索を助けるために、１２Ｃ  ＮＢＳ（＋１５３Ｄａ）及び１３Ｃ  ＮＢＳ（＋１５９Ｄａ）の２つの修正値を変数修正としてＭａｓｃｏｔサーバーに加えた。ＮＢＳ標識されている対ピークをＴＯＦ  ＭＳスペクトルから手動で選択し、相対的定量化を、Ｋｏｍｐａｃｔソフトウエア（Ｓｈｉｍａｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ）を使用してそれぞれのＮＢＳ標識されているピーク対の体積比を計算することによって達成した。ＭＳ／ＭＳでのペプチド配列決定を、３３７ｎｍの窒素レーザーを備えるＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ  ＭＡＬＤＩ四重極イオントラップ飛行時間質量分析計（Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（京都、日本）及びＫｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国））を使用して行った。１マイクロリットルのトリプシン消化サンプルをＭＡＬＤＩプレートに置き、１μＬのＤＨＢ（５０％ＡＣＮ／０．５％ＴＦＡにおける１０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。ＴＯＦスペクトルを、ＭＡＬＤＩサンプルステージに事前に置かれたフラライトを使用して外部標準により校正した。すべてのスペクトルを中質量及び高質量での最適な透過のための標準的な装置設定により取得した。データ取得及びデータ処理を、Ｋｏｍｐａｃｔソフトウエア（Ｓｈｉｍａｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ）を使用して行った。
【０１４７】
実施例６−統計学的分析
ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳに関連する生物学的変動及び実験的変動を調べるために、また、タンパク質の量をＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ分析及び従来の２ＤＥ分析の間で比較するために、本発明者らは一連のＰｅａｒｓｏｎ相関検定を適用して、研究中のこれら２つのデータセットの類似性を評価した。何らかの認められた相関値の有意性を求めるために、ブートストラップ並び換え検定を、比較されているこれら２つのデータセットの指標を入れ換え、ランダム化されたデータセットについての相関係数を再計算することによって行った。相関検定については、何らかの認められた相関値の有意性を求めるために、ブートストラップ並び換え検定を、比較されているこれら２つのデータセットにおけるタンパク質の順序を入れ換え、ランダム化されたデータセットについての相関係数を再計算することによって行った。この手順を１０，０００回繰り返し、ランダム化された係数が、認められた値を超える頻度をコンピューター計算し、これを経験的ｐ値として反映させた。
【０１４８】
実施例７−ウエスタンブロッティング分析
全細胞ライセートを、ＴＡＭ処理された細胞及びコントロールの細胞を、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）において溶解することによって調製した。ライセートを、ＢＳＡを標準物として使用してＢｒａｄｆｏｒｄ試薬により定量した。等量の細胞ライセート（５０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに電気ブロットした。ブロットを、抗ビンキュリン抗体、抗サイトケラチン１９抗体及び抗ＧＲＰ７８抗体によりそれぞれプローブした。メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体とインキュベーションした後、反応性を、化学発光検出キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）で可視化した。
【０１４９】
実施例８−半定量的ＰＣＲ分析
ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲのために、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してＴＡＭ処理のＭＣＦ−７細胞から抽出した。ＲＮＡを定量し、等量のＲＮＡサンプルを２％アガロースゲルで電気泳動して、正常化を確認した。等量のビヒクル処理及びＴＡＭ処理のＲＮＡサンプルを、オリゴｄＴプライマーを製造者により提案される条件で使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素によって逆転写した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＰＡ２Ｇ４特異的プライマー及びβ−アクチン特異的プライマーを使用してｃＤＮＡから行った。この研究で使用されたオリゴの配列は、ＰＡ２Ｇ４−ＲＴＦ：ＣＡＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧ（配列番号５８）；ＰＡ２Ｇ４−ＲＴＲ：ＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＡ（配列番号５９）；β−アクチン−ＲＴＦ：ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴ（配列番号６０）；β−アクチン−ＲＴＲ：ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴ（配列番号６１）であった。
【０１５０】
実施例９−ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞の定量的ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ分析
その後、我々は、ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ法を、ＴＡＭ又はビヒクルのいずれかにより処理されたＭＣＦ−７乳がん細胞のプロファイリングを行うことによって、複雑な生物学的サンプルに適用した。最初に、比較の基礎を提供するために、ＭＣＦ−７サンプルを、従来の２ＤＥプラットフォームを使用して分析した。この従来の２ＤＥ分析では、ＴＡＭ処理のＭＣＦ−７細胞及びビヒクル処理のＭＣＦ−７細胞についての三連のゲルを作製し、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ蛍光標識化により可視化し、ＰＤＱｕｅｓｔを使用して、蛍光標識強度における違いを特定した。得られた２ＤＥゲルは、ＴＡＭ又はビヒクルのいずれかにより処理されたサンプルについて非常に類似したタンパク質パターンを示し、８５％〜９５％の一致率がそれぞれのゲルにおけるおよそ３４０個のタンパク質スポットにわたって存在した。定性的には、１つのタンパク質スポットがＴＡＭ処理の細胞において特徴的であり、一方、７個がビヒクル処理の細胞において特徴的であった。量的レベルでは、２７個のタンパク質スポット及び４７個のタンパク質スポットが、ＴＡＭ処理したとき、２倍を超える強度の増大及び低下をそれぞれ示した（図１１及び表３）。次に、ＴＡＭ処理の細胞及びコントロールの細胞に由来する同じタンパク質ライセートをＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ分析にもまた供した。
【０１５１】
下記の表１において、４４個の特定されたＮＢＳタンパク質スポットは２３の異なるタンパク質種を表す。１３Ｃ／１２Ｃの比率を、ＮＢＳ対ピークの強度に基づいて計算した。３つのタンパク質が２対以上のＮＢＳペプチドとともに特定された。それらについて、１３Ｃ／１２Ｃの比率は、同じタンパク質の対ペプチドの比率すべての平均であった。技術的再現性を調べるために、ＴＡＭ処理のＭＣＦ−７細胞及びビヒクル処理のＭＣＦ−７細胞の全く同じバッチに由来するタンパク質ライセートをＮＢＳにより再び標識し、２ＤＥゲルで分離し、１３Ｃ／１２Ｃの比率に基づいて再び定量した。従来の２ＤＥゲル画像分析によって導かれるとき、８８個のスポットがＮＢＳ標識の２ＤＥゲルから２６切り出され、そのうちの５８個のタンパク質スポットがペプチドマスフィンガープリンティングによって確信をもって特定された。スポット１〜スポット４４が、ＮＢＳ標識ペプチドピークにより検出されたタンパク質であった。中でも、４４個のタンパク質スポットが、ＮＢＳ標識ペプチド対とともに検出され、これらを、１３Ｃ／１２Ｃのペプチド体積比を計算することによって定量化した。
【０１５２】
【表１】
2009542191.tif 000003
【０１５３】
【表２】
2009542191.tif 000004
【０１５４】
【表３】
2009542191.tif 000005
【０１５５】
【表４】
2009542191.tif 000006
【０１５６】
表１において、いくつかのタンパク質スポットが２つ以上のＮＢＳペプチド対を有した。このことは、複数のトリプトファン含有ペプチドがこれらのタンパク質に存在することを示している。これらのタンパク質について、最終的なＮＢＳ比率を、同じタンパク質スポットに関連するすべてのＮＢＳ対ペプチドの比率を平均化することによって計算した。合計で、４４個の特定されたＮＢＳ標識タンパク質スポットは２３の異なるタンパク質種を表した（表１）。この場合、Ｋ１Ｃ１８＿ＨＵＭＡＮ（ＣＫ１８）を含めて、１０個の種が２ＤＥゲル上の複数のイソ型／スポットによって表された。ＮＢＳ比率分析を使用したとき、２０個のタンパク質スポットは、ＴＡＭ処理したとき、２倍を越える強度低下を示し、１個のスポットが２倍を超える増大を示し、残りの２３個のスポットは、ＴＡＭと、ビヒクルとの間で、２倍未満の変化であった。
【０１５７】
２３の異なるタンパク質種を表す４４個の特定されたＮＢＳタンパク質スポット。１３Ｃ／１２Ｃの比率を、ＮＢＳ対ピーク強度（１３Ｃ／１２Ｃ（１）の欄）に基づいて計算した。３つのタンパク質が２対以上のＮＢＳペプチドとともに特定された。これらのタンパク質について、１３Ｃ／１２Ｃの比率は、同じタンパク質の対ペプチドの比率すべての平均であった。技術的再現性を調べるために、ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞及びビヒクル処理されたＭＣＦ−７細胞の全く同じバッチに由来するタンパク質ライセートをＮＢＳにより再び標識し、２ＤＥゲルで分離し、１３Ｃ／１２Ｃの比率（１３Ｃ／１２Ｃ（２）の欄）に基づいて再び定量した。平均値及びＳＤ値は、１３Ｃ／１２Ｃ（１）の欄及び１３Ｃ／１２Ｃ（２）の欄からの統合値に基づく。
【０１５８】
表２（下記）：従来の２ＤＥゲル画像分析によって導かれるとき、８８個のスポットがＮＢＳ標識の２ＤＥゲルから切り出された。合計で５８個のタンパク質スポットがペプチドマスフィンガープリンティングによって確信をもって特定された（図４は、ＮＢＳ／２ＤＥの参照マップを、特定されたタンパク質スポットとともに示す）。そのうちの４４個がＮＢＳペプチド対を含有した（表２）。いくつかのタンパク質スポットが２つ以上のＮＢＳペプチド対を有した。このことは、複数のトリプトファン含有ペプチドがこれらのタンパク質に存在することを示している。これらのタンパク質について、最終的なＮＢＳ比率を、同じタンパク質スポットに関連するすべてのＮＢＳ対形成ペプチドの比率を平均化することによって計算した。ＮＢＳ比率分析を使用したとき、４４個中２１個のタンパク質スポットが、ＴＡＭ処理したとき、２倍を越える強度変化を示し、残りの４４個中２３個のスポットは、ＴＡＭと、ビヒクルとの間で、２倍未満の変化であった。比較において、従来の２ＤＥ分析については、これらのスポットの４４個中１７個が、２倍を越える差を伴い、一方、残りの４４個中２７個は２倍未満の差を伴った。４４個の特定されたＮＢＳ標識タンパク質スポットは２３の異なるタンパク質種を表した（表２）。この場合、Ｋ１Ｃ１８＿ＨＵＭＡＮ（ＣＫ１８）を含めて、１０個の種が２ＤＥゲル上の複数のイソ型／スポットによって表された。
【０１５９】
【表５】
2009542191.tif 000007
【０１６０】
【表６】
2009542191.tif 000008
【０１６１】
【表７】
2009542191.tif 000009
【０１６２】
【表８】
2009542191.tif 000010
【０１６３】
実施例１０−免疫ブロッティングによる示差的発現タンパク質のバリデーション
最後に、ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳから得られた量的情報の有効性を確認するために、我々は２つの代表的なタンパク質についての免疫ブロッティング実験を行った。ＴＡＭ又はビヒクルにより２４時間又は４８時間処理されたＭＣＦ−７細胞の独立したバッチに由来する総細胞ライセートを１Ｄゲルで分離し、タンパク質特異的抗体により免疫ブロッティングした（図１０）。７８ｋＤａのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）（多剤耐性タンパク質）は、ＮＢＳ／２ＤＥマップにおいて示される４つのイソ型を有した（図４におけるスポット１５〜スポット１８）。ＮＢＳ（１３Ｃ／１２Ｃ）比率及び２ＤＥ定量化の結果に基づいて、４つすべてのイソ型の発現が、４８時間のＴＡＭ処理を行ったとき、増大することが予想された（表１及び図５）。抗ＧＲＰ７８による免疫ブロッティングでは、ＴＡＭ処理後の２４時間でさえ、このタンパク質のアップレギュレーションが確認され、この増大した発現が４８時間まで安定していた（図１０）。同様に、５個のＣＫ１９イソ型が２ＤＥ分析によって特定された（図４におけるスポット１９〜スポット２３）。従来の２ＤＥ画像分析に基づいて、スポット１９を除くすべてが、４８時間のＴＡＭ処理を行ったとき、（２倍を超える）著しい増大を示した。しかしながら、ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳ定量化に基づいて、ＣＫ１９イソ型のすべてが、ＴＡＭ処理したとき、明確なダウンレギュレーションを示した（図５におけるスポット１９〜スポット２３）。抗ＣＫ−１９抗体による免疫ブロッティングでは、ＴＡＭ処理を４８時間行ったとき、このタンパク質のダウンレギュレーションが疑いなく確認された（図１０）。このデータは、ＮＢＳ／２ＤＥに基づくタンパク質定量化法が、２ＤＥのみの定量技術と比較して、個々のタンパク質に関するより正確な量的情報を提供する可能性が高いことを示している。
【０１６４】
［比較での２ＤＥ分析線並びに乳がんにおける診断指標及び予後指標としてのＰＡ２Ｇ４の使用］
実施例１１−乳がん細胞におけるＰＡ２Ｇ４のプロテオミクス。ａ）２つの乳がんセルライン（ＭＣＦ−７及びＨＣＣ−３８）及びＣＲＬセルラインの２ＤＥ分析では、ＰＡ２Ｇ４が、ＥＲ−のセルラインではなく、ＥＲ＋のセルラインにおいて過剰発現したことが示された。
【０１６５】
【表９】
2009542191.tif 000011
【０１６６】
ＣＲＬセルラインと比較したとき、ＰＡ２Ｇ４の発現はＨＣＣ−３８において著しい違いを示さず、しかし、ＭＣＦ−７において著しい違いを示した（表３）。これはＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ他（２０００）の知見と一致する。
【０１６７】
実施例１２−乳がんについての予後マーカーとしてのＰＡ２Ｇ４
ｂ）ＭＣＦ−７細胞におけるＰＡ２Ｇ４の過剰発現はタモキシフェン処置によって抑制することができる。ＮＢＳ分析を使用したとき、５倍の低下が見出され、２ＤＥ分析を使用したとき、３倍の低下が見出された。
【０１６８】
乳がんに対する我々の研究と、臨床的結果との関連性を明らかにするために、我々はＰＡ２Ｇ４（これはＥＲＢＢ３受容体相互作用タンパク質として最初に特定された）に照準を合わせた。我々は、ＴＡＭ処理されたＭＣＦ７細胞におけるＰＡ２Ｇ４タンパク質のダウンレギュレーションを確認するために２４の免疫ブロッティング実験を行った。図１０ｂに示されるように、ＭＣＦ７細胞をＴＡＭにさらすことにより、ＰＡ２Ｇ４タンパク質のあまり大きくなく、しかし、顕著なダウンレギュレーションが２４時間後に誘導され、これが４８時間まで持続した。独立した実験において、我々はまた、ＰＡ２Ｇ４タンパク質の発現が、ＭＣＦ−７（ＥＲ＋）では、ＨＣＣ−３８（ＥＲ−）乳細胞セルライン及びＣＣＤ−１０５９ｓｋ（ＥＲ−）乳細胞セルラインの場合よりも２倍を超えて大きいことを見出している。
【０１６９】
その後、我々は一連の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行い、ＰＡ２Ｇ４のｍＲＮＡが２４時間及び４８時間の両方の時点でＴＡＭ暴露によって明瞭にダウンレギュレーションされたことを見出した（図１０ｂ）。この転写調節を考えたとき、本発明者らは、その後、ＥＲ＋の原発性腫瘍の２つの独立したマイクロアレイデータセットに対するデータマイニングを行った。第１のセット（ＧＩＳ；Ｍｉｌｌｅｒ他、２００５）は２０１名のＥＲ＋乳がん患者からのデータからなり、この場合、６７名の患者が補助的なホルモン治療のみを手術後に受けていた。第２のセット（Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他、２００６）は６５名のＥＲ＋患者からのデータからなり、この場合、３３名の患者がＴＡＭのみを受け、残りの患者は処置を受けていなかった。一変量の統計学的分析を行うことによって、我々は、ＰＡ２Ｇ４転写物の発現により、両方のデータセットにおける無病生存との非常に著しい相関（ｐ値がそれぞれ、１．７５ｘ１０−５（ＧＩＳ）及び０．００１（Ｏｘｆｏｒｄ）である）が明らかにされ、高いＰＡ２Ｇ４を発現する腫瘍を有する患者がより不良な臨床的結果を示すこと（表４Ａ）を見出した。
【０１７０】
【表１０】
2009542191.tif 000012
【０１７１】
【表１１】
2009542191.tif 000013
【０１７２】
【表１２】
2009542191.tif 000014
【０１７３】
【表１３】
2009542191.tif 000015
【０１７４】
表４．ＥＲ＋乳がんにおける生存関連遺伝子としてのＰＡ２Ｇ４の一変量分析及び多変量分析。有意な関連（ｐ＜０．０５）が太字で強調される。
【０１７５】
一変量分析が、補助的なホルモン治療を受けているそのような患者のみに限定されたときには、ＰＡ２Ｇ４の発現と、生存との間での有意な関連もまた、両方のデータセットにおいて認められた（ｐ値がそれぞれ、０．００２（ＧＩＳ）及び０．００８（Ｏｘｆｏｒｄ）である；表４ａ）。その後、我々は、ＰＡ２Ｇ４の発現が、他の臨床的変数（例えば、腫瘍悪性度、患者年齢及び腫瘍サイズなど）との比較において、独立した予後因子として挙動し得るかを検定した。この多変量分析において、ＰＡ２Ｇ４の発現は依然として、その予後有意性を両方の患者コホートにおいて保持し（ｐ値がそれぞれ、０．００１（ＧＩＳ）及び０．０４（Ｏｘｆｏｒｄ）である）、同様にまた、補助的なホルモン治療を受けている患者のＧＩＳコホートにおいても保持した（ｐ＝０．００５）（表４ｂ）。従って、ＥＲ＋乳がんの２つの独立したマイクロアレイデータセットにおいて、原発性腫瘍における高いＰＡ２Ｇ４発現は、低いＰＡ２Ｇ４を発現する腫瘍を有する患者と比較した、低下した無病生存に関連する。これらの結果は、ＰＡ２Ｇ４が新規な生存関連の乳がん遺伝子であり、予後バイオマーカーとしての使用に好適であることを示す。
【０１７６】
実施例１３−ＰＡ２Ｇ４に対する抗体
ＰＡ２Ｇ４タンパク質に対する好適な抗体を商業的供給元から入手することができ、当分野で知られている任意の免疫学的結合／ハイブリダイゼーション反応においてＰＡ２Ｇ４を検出及び／又は定量するために使用することができる。例えば、ＰＡ２Ｇ４のポリクローナル抗体をＡｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（台湾）から入手することができる（製品番号Ｈ００００５０３６−Ａ０１）。これは、部分的組換えＰＡ２Ｇ４免疫原に対して惹起されたマウスポリクローナル抗体である。あるいは、別の一例が、Ｕｐｓｔａｔｅ（米国）から入手可能な、ウサギから惹起された抗Ｅｂｐ−１ポリクローナル抗体である（製品番号０７−３９７）。
【０１７７】
実施例１４−ＰＡ２Ｇ４のための好適な組換え発現ベクター
当業者は、好適なベクターを選択し、ＰＡ２Ｇ４遺伝子配列をその遺伝子のその後の発現のためにベクターに挿入することができる。ＰＡ２Ｇ４について、ＰＡ２Ｇ４が挿入されたベクターが市販されている。例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（米国）は、製品番号ＳＣ１０３０１７として、ＰＡ２Ｇ４配列をそのｐＣＭＶ６−ＸＬ６ベクターに有する。
【０１７８】
実施例１２−診断におけるＰＡ２Ｇ４の使用
本発明は、ＥＲ＋乳がん細胞及びＥＲ＋乳がん疾患患者におけるＰＡ２Ｇ４遺伝子及びＰＡ２Ｇ４タンパク質の示差的発現、並びに、その発現におけるタモキシフェン（ＴＡＭ）の抑制作用を開示する。この知見に基づいて、本発明は、対象におけるＥＲ＋乳がん疾患を診断又は予後判定するための方法、及び、対象が、乳がん疾患を発症する増大した危険性にあるかどうかを明らかにするための方法を提供する。さらに、本発明は、ＰＡ２Ｇ４遺伝子及びその対応する遺伝子産物を使用して乳がん疾患を処置又は防止するための治療的方法及び予防的方法を提供する。
【０１７９】
診断的適用のために、抗ヒトＰＡ２Ｇ４抗体を、このタンパク質をヒトサンプル（例えば、血清、乳頭吸引液、細胞外液及び原発性腫瘍組織など）において分析（検出及び測定）するために使用することができる。コントロール（例えば、乳がんと診断されていないか、又は、乳がんに罹患していない患者など）から得られた参照値に由来するレベルよりも高いＰＡ２Ｇ４の発現レベルにより、乳がんの可能性が示される。
【０１８０】
実施例１５−治療をモニターするためのＰＡ２Ｇ４の使用
ＰＡ２Ｇ４の遺伝子／タンパク質発現と、前記分子発現に対するＴＡＭの阻害的効果との関係性の我々の観察結果、並びに、２つの乳がん患者コホートにおける生存データ研究に基づいて、我々は、ＰＡ２Ｇ４遺伝子／タンパク質が、乳がんの治療をモニターするための潜在的用途を有すると考えている。さらなる研究のために、我々は、ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの後でのＥＲ＋細胞（例えば、ＭＣＦ−７）の生理学的変化を観測するための遺伝子サイレンシングのために使用する。その場合、我々は、ＥＲ＋細胞の生存におけるＰＡ２Ｇ４遺伝子の役割を評価することができ、また、我々が、ＰＡ２Ｇ４遺伝子を特異的に阻害することによってＥＲ＋のがん細胞を抑制することができるかどうかを明らかにすることができる。そのようなアッセイは用量依存的な経時的応答研究が可能であり、血清及び他の体液サンプルへの具体的な適用を有する。結果は、乳がん患者において治療をモニターするためにＰＡ２Ｇ４を使用するという実現可能性を示すことができる。
【０１８１】
実施例１６−ＰＡ２Ｇ４の治療的使用
細胞増殖異常（例えば、乳がんなど）を処置するための分子を、ＰＡ２Ｇ４遺伝子配列（配列番号１）又はＰＡ２Ｇ４タンパク質配列（配列番号２）を使用して調製することができる。当業者は、ＰＡ２Ｇ４の遺伝子又はｍＲＮＡに対して相補的な核酸（例えば、ｓｉＲＮＡなど）を、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、又は低下させるために、当分野で知られているいかなる方法によっても作製することができる。同様に、ＰＡ２Ｇ４タンパク質に基づく抗体（例えば、実施例１０において示される抗体など）を、ＰＡ２Ｇ４タンパク質に結合し、従って、ＰＡ２Ｇ４タンパク質の作用を不活性化する抗体を作製するために、当分野で知られているいかなる方法によっても惹起させることができる。そのような治療用分子は、好適な賦形剤、ビヒクル又はキャリアと混合し、所望される治療効果を得るために疾患組織又は疾患細胞に投与することができる。具体的には、所望される治療効果は、ＰＡ２Ｇ４の遺伝子及び／又はタンパク質の発現を低下又は減少させることである。
【０１８２】
キット
実施例１７−キット
本発明はまた、ＰＡ２Ｇ４遺伝子、その遺伝子転写物、遺伝子産物、バリエーション又はフラグメントに対して相補的又はハイブリダイゼーション可能である少なくとも１つのバイオマーカーを含むキットを提供する。そのような相補的又はハイブリダイゼーション可能なバイオマーカーには、ＰＡ２Ｇ４遺伝子あるいはその遺伝子産物又はフラグメント又はバリエーションを認識し、これに結合する核酸プローブ、並びに、ＰＡ２Ｇ４遺伝子産物又はそのフラグメントを認識し、これに結合する抗体が含まれる。十分な相同性が、相補的なバイオマーカーによる遺伝子又はタンパク質の認識を可能にするために存在する限り、遺伝子は野生型又はその変異型が可能であり、タンパク質は野生型又はその変異型が可能である。相補的又はハイブリダイゼーション可能な生体分子は標識することができ、従って、細胞増殖性疾患の予後評価（細胞増殖性疾患に対する感受性を予測すること）のために、又は、細胞増殖性疾患の診断のために、又は、疾患状態の重篤度を示すために、又は、一連の処置の効力をモニターするために使用することができる。
【０１８３】
実施例１８−乳がんについての他のバイオマーカー
本研究において、本発明者らは、敗血症患者におけるアポトーシス上皮の有用な血清マーカー（ｄｅ  Ｇｒａａｕｗ他、２００５）であることが示されている別のＴＡＭ調節タンパク質（ＣＫ１８ネオエピトープＭ３０）を見出した。アポトーシス時において、ＤＮＡの断片化、核の凝縮及びＣＫ１８の切断は既知の事象であり、また、Ｍ３０ネオ抗原と呼ばれるＣＫ１８におけるネオエピトープが、初期のカスパーゼ切断事象のとき、利用可能になる。ＣＫ１８のＴＡＭ媒介によるダウンレギュレーションが認められることにより、ＣＫ１８のダウンレギュレーションの測定が薬物応答性の尺度としてＴＡＭ処置患者において有用であることが示される。注目すべきことに、ＴＡＭが乳がんについての最初のホルモン治療であるとしても、ＴＡＭ治療の大きな有害な副作用は、望ましくない子宮内膜増殖である。そういうものとして、ＣＫ１８のダウンレギュレーションは、乳がんに対する素因を示し、ＣＫ１８は乳がんについてのバイオマーカーとして有用である。
【０１８４】
興味深いことに、２ＤＥを使用するＩｓｈｉｋａｗａ子宮内膜腺がんセルラインにおけるＴＡＭ媒介による変化に関する以前の報告では、ＣＫ１８の発現における著しい増大が示された（Ｓｈａｈ他、２００４）。これは、乳がん細胞における我々の観測結果とは逆である。ＭＣＦ−７セルラインにおけるＣＫ１８の選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）媒介によるダウンレギュレーションに関する現在の観測結果、及び、子宮内膜がんセルラインにおける全く逆の観測結果は、ＣＫ１８がＳＥＲＭの重要な組織特異的標的であることを表し得る。最後に、ＧＲＰ７８は、ＴＡＭ調節されるとしてＮＢＳ定量化により特定された別のタンパク質である。
【０１８５】
ＧＲＰ７８は、知られている薬物抵抗エフェクターであり、ストレス応答シャペロンでもある。ＧＲＰ７８の発現が陽性である肺がん患者及び神経芽細胞腫患者は、より良好な予後及び改善された生存を示す傾向を有した（Ｕｒａｍｏｔｏ他、２００５）。ＴＡＭ処理されたＭＣＦ−７細胞におけるＧＲＰ７８の観測されたアップレギュレーションは、薬物処理に対する即時的なストレス応答を表しており、また、このアップレギュレーションによりまた、細胞ストレスが細胞死プログラムに結びつけられ得る（Ｒａｏ他、２００２；Ｄｉｎｇ他、２００４）。このことは、ＴＡＭ処理時のｍＲＮＡレベルでの、別のＥＲストレス遺伝子（ＨＥＲＰ）の付随するアップレギュレーションによって裏付けられる。
【０１８６】
独立して有効性が確認された２つのタンパク質のＧＲＰ７８及びＣＫ１９はまた、ＴＡＭ処理の期間中における正真正銘のアップレギュレーションされたタンパク質及びダウンレギュレーションされたタンパク質であることが見出される。結果は、ＮＢＳ／２ＤＥ／ＭＳが、従来の２ＤＥ法よりも、細胞タンパク質定量化のための信頼できる方法であることを示す。
【０１８７】
乳がんの様々なバイオマーカーがプロテオーム及びゲノムの統合的研究から発見され、それらの有効性が、乳房組織マイクロアレイを使用して確認された。乳房組織マイクロアレーが提供され、偏りを最小限に抑えるために、１人だけの病理学者によって検討された（Ｍａｎｕｅｌ  Ｓａｌｔｏ−Ｔｅｌｌｅｚ博士：准教授、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；Ｓｅｎｉｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｓｅｎｉｏｒ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＮＵＨ、シンガポール）。
【０１８８】
実施例１９−組織のマイクロアレイ分析
方法
ＩＨＣ（免疫組織化学的）染色の最適化を、ＰＡ２Ｇ４抗体（Ａｂ）についてのＩＨＣ染色条件を最適化する目的で乳房組織マイクロアレイに対して行った。４つの異なる抗原回復法を、一次抗体の異なる濃度を用いて陽性コントロールの細胞ブロックに対して適用した。１：５０、１：１００、１：２００及び１：４００（体積に基づく比率）の希釈度を試験した。
【０１８９】
陽性コントロールとして、本発明者らはパラフィン包埋の細胞ブロックを使用し、抗原の細胞内存在場所を、分画化されたタンパク質抽出物に対するウエスタンブロッティングによって求めた。細胞ブロックを作製するために、ＭＣＦ７乳がん細胞を７５ｍＬフラスコで培養した。コンフルエンスになったとき、細胞をトリプシン処理し、５ｍｍ以下の厚さの細胞ペレットに遠心分離した。直ちに、細胞ペレットをホルマリンと２０分間インキュベーションし、続いて、パラフィン包埋を行った。
染色された陽性コントロール組織のスライドが最適化の後で病理学者によって検査された。最適な条件（具体的な抗原回復法及び具体的な一次抗体希釈を含む）を、病理学者の助言を聞いた後で決定し、乳房組織マイクロアレイに適用した。
【０１９０】
ＩＨＣ染色のためのプロトコル
Ｉ．溶液：
クエン酸（ｐＨ６．０）緩衝液
１０．５ｇのクエン酸
２ＭのＮａＯＨによりｐＨ６．０に調節する（約６５ｍＬ）
脱イオン水により５Ｌにする
（ｐＨが高ければ、クエン酸を加え、ｐＨが低ければ、ＮａＯＨを加える。）
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）緩衝液
１２ｇのＴｒｉｓ塩基
１ｇのＥＤＴＡ
脱イオン水により５００ｍＬにする
０．２ＭのＨＣｌによりｐＨ９に調節する
ＤＡＫＯ（ｐＨ６．０）緩衝液
６０ｍｌのＤａｋｏ（１０ｘ）（Ｃａｔ．Ｓ２３６９）標的回復、脱イオン水により６００ｍＬにする。
ＤＡＫＯ（ｐＨ９．０）緩衝液
６０ｍｌのＤａｋｏ（１０ｘ）（Ｃａｔ．Ｓ２３６７）標的回復、脱イオン水により６００ｍＬにする。
ＴＢＳ洗浄緩衝液（ｐＨ７．６）１０ｘ
０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ６０．６ｇ
９（ｗｔ／ｖ）％ＮａＣｌ  ９０ｇ
脱イオン水により１Ｌにし、ＨＣｌを加えて、ｐＨ７．６に調製する。
【０１９１】
ＩＩ．脱パラフィン化
脱パラフィン化の前に、アレイのスライドは室温で６０分間保たなければならないか、又は、オーブンにおいて、水平位置で２０分間、６０℃で加熱されなければならない。スライドを金属トレイにおいて整列させる。
１．スライドをキシレンに５分間浸漬し、新しいキシレンで１回、５分間繰り返す（キシレンは毒性である）。
２．スライドを１００％エタノールに５分間浸漬する。
３．スライドを９５（ｖ／ｖ）％エタノール／Ｈ２Ｏに５分間浸漬する。
４．スライドを７０（ｖ／ｖ）％エタノール／Ｈ２Ｏに５分間浸漬する。
５．スライドを洗浄のために流水に入れる。
【０１９２】
ＩＩＩ．抗原回復
方法Ａ．クエン酸塩緩衝液（高圧ポットにおいて加熱される）
１．２Ｌのクエン酸塩緩衝液をステンレス製圧力鍋において１０分間〜１５分間沸騰させる。
２．緩衝液が沸騰したら、スライドを垂直にポットに入れ、ふたをしっかり閉める。ふたの上の２つのボタンが持ち上がった後、時間を３分計り始める（スライドを鍋の底に直接に触れさせない）。
３．３分後、ポットを取り出し、流しにおいて流水下で冷却する。圧力は、ノブを回すことによって解放することができる。圧力を解放した後、ふたを開け、スライドを流水下に置いて冷却する。
【０１９３】
方法Ｂ．Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（電子レンジにおいて加熱される）
１．６００ｍｌの緩衝液をプラスチックジャーに注ぐ。
２．スライドをプラスチックトレーにおいて整列させ、緩衝液に移す。
３．ジャーをプラスチックフィルムで包み、数個の穴を上部に開ける。
４．ジャーを電子レンジに入れる。出力を５に設定し（１０段階の５の出力、中レベルで）、時間を２５分に設定する（緩衝液が、透明ではなく、乳白色になる）。
５．ジャーを取り出し、ジャーを流しにおいて流水下に置く。溶液が再び透明になり得る。
６．冷却後、スライドを、水の入った容器の中に取り出す。
方法Ｃ．ＤＡＫＯ（ｐＨ６．０）緩衝液（Ｂ．のような方法）
方法Ｄ．ＤＡＫＯ（ｐＨ９．０）緩衝液（Ｂ．のような方法）
【０１９４】
ＩＶ．免疫染色
１．スライドを軽く振って乾燥させ、ペン（ＤＡＫＯ、Ｓ２００２）を使用して、組織の領域の周りを描く。組織の周りにペンによって描かれた円により、液体（例えば、抗体溶液、洗浄緩衝液など）に対するバリアが提供される。
２．スライドを軽く振って乾燥させ、ブロッキング溶液（ＤＡＫＯ、Ｓ２０２３）を組織に滴下する。１０分間インキュベーションする。
インキュベーション期間中に溶液に泡がないことを確認する。
３．スライドから液を除き、脱イオン水によりすすぎ洗浄する。スライドをラックに入れ、流水下で５分間洗浄する。
４．スライドをプラスチックトレーに水平に置き、ＴＢＳを５分間注ぐ。
５．一次Ａｂを抗体希釈液（ＤＡＫＯ、Ｓ０８０９）で希釈する。
６．スライドから液を除き、スライドを軽くたたく。２００ｕＬの希釈されたＡｂを組織の上に加え、３０分間インキュベーションする（泡を立てさせない）。
７．スライドを引き上げ、ＴＢＳで満たす。液を除き、軽く振る。
８．ＴＢＳをスライドに注ぎ、５分間待つ。この期間中、さらにＴＢＳを時々加えて、スライドが乾燥することを避ける。
９．スライドから液を除き、スライドをハンドタオルで軽くたたく。エンビジョンキット（ＤＡＫＯ、Ｓ５００７）から白色ボトル（Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ（商標）ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＨＲＰウサギ／マウス）を取り出し、数滴を滴下し、組織を３０分間覆う。
１０．スライドから液を除き、スライドをＴＢＳにより洗浄する。ＴＢＳをスライドに注ぎ、５分間待つ。
１１．１ｍｌの基質緩衝液を２０μＬのＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン：毒性）と混合する。それらを使用前に混合する。基質緩衝液及びＤＡＢの両方がエンビジョンキット（ＤＡＫＯ、Ｓ５００７）に含まれる。
１２．スライドから液をＴＢＳとともに除き、軽くたたいて乾燥させ、ＤＡＢ混合物をスライドに滴下し、１０分間インキュベーションする。
１３．スライドを脱イオン水により洗浄する。
１４．スライドをＨ／Ｅラックに整列させ、流水下に５分間置く。
１５．組織が青く染色されるまで、スライドをヘマトキシリンの中に２分間入れ、スライドをＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）に１０秒間入れる。スライドを流水下で１０分間洗浄する。
１６．スライドを一連の溶液において脱水する：７０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノール（４回）、キシレン（２回）。それぞれ１分間。
１７．スライドを取り付け用装置に載せる。
【０１９５】
結果
腫瘍組織マイクロアレイでのＰＡ２Ｇ４のＩＨＣ染色は９６．５％（すなわち、８６個中８３個の腫瘍組織）の陽性染色（褐色に着色された）を示した。そのような陽性染色された腫瘍組織の中で、４０．７％（すなわち、８６個中３５個）の腫瘍組織が悪性度３の陽性染色であった；３６％（すなわち、８６個中３１個）の腫瘍組織が悪性度２の陽性染色であった；２０％（すなわち、８６個中１７個）の腫瘍組織が悪性度１の陽性染色であった。具体的には、正常な組織に対するＰＡ２Ｇ４についてのＩＨＣ染色の観測結果が図１３（Ａ）に示され、挿入図は正常な組織の拡大部を示す。
【０１９６】
他方で、正常組織マイクロアレイでの陽性染色を示すものはすべてが、悪性度１の陽性染色であった（非常に少量がかすかに褐色に着色された）。具体的には、腫瘍組織に対するＰＡ２Ｇ４についてのＩＨＣ染色の観測結果が図１３（Ｂ）に示され、挿入図は腫瘍組織の拡大部を示す。
このタンパク質は、良好なバイオマーカーであると見なすことができる。
【０１９７】
【表１４】
2009542191.tif 000016
【０１９８】
図１４は、ＰＡ２Ｇ４についての分画化されたタンパク質抽出物に対するウエスタンブロッティングの結果である。左側から右側のレーンで、タンパク質抽出物は、細胞質ゾルのタンパク質抽出物（ｉ）、膜／オルガネラのタンパク質抽出物（ｉｉ）、及び、核のタンパク質抽出物（ｉｉｉ）である。写真が示すように、ＰＡ２Ｇ４についてのタンパク質発現は細胞質及び核の両方においてであり、しかし、より高い発現が細胞質に存在する。
【０１９９】
実施例２０−ウエスタンブロッティング分析（組織サンプル）
方法
Ｉ．ウエスタンブロッティング
Ａ．タンパク質調製
１．目的とする組織をメスにより薄く切って、適切なサイズのフラグメントを得る。
２．組織の表面における血液及び他の混入物を除くために、薄く切った組織をＰＢＳで１回〜２回、３０秒間洗浄する（混入の程度に依存する、より多くの洗浄が、ひどく汚れた組織については必要となる）。
３．組織を、乳棒及び乳鉢を使用して液体窒素中でより小さいフラグメントに粉砕する。
４．組織フラグメントを、２５０ｍＭスクロースを含有するエッペンドルフチューブに集め、３０秒間、２回〜３回洗浄する（血液汚染の程度に依存する）。
５．それぞれの洗浄工程の後で８０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨てる。
６．スクロース洗浄の後、ペレットを取り出し、微粉末に完全に粉砕する。
７．粉末をエッペンドルフチューブに集め、タンパク質を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して抽出する。
８．多く存在する血漿タンパク質を、アルブミン・ＩｇＧ除去キット（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）、その後で、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することによってタンパク質ライセートから除く。
９．除去処理後のタンパク質ライセートの緩衝液をＳＤＳサンプル緩衝液（２（ｗｔ／ｖ）％ＳＤＳ、２０（ｗｔ／ｖ）％グリセロール、１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、及び、１６０ｍＭ  ＤＴＴ）に交換し、タンパク質濃度を測定する。
【０２００】
Ｂ．タンパク質濃度の測定
Ｂｒａｄｆｏｒｄのクーマシーブルー法に従う。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、２ｍｇ／ｍｌ）を標準物として使用する。
１．ＢＳＡストック液を１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５００μｌの脱イオン水（ｄ−Ｈ２Ｏ）におけるＢＳＡ標準物の濃度系列（０μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ）を調製する。
２．１μｌのストック溶解緩衝液を標準物の系列溶液に加える。
３．サンプルを、１μｌの細胞ライセートを５００μｌのｄ−Ｈ２Ｏに加えることによって調製する。
４．５００μｌのクーマシーブルー試薬を加え、混合する。
溶液を過度に長く室温で混合したままにしない。沈殿が生じる。
５．吸光度を５９５ｎｍで読み取る。
細胞ライセートを−２０℃で保存する。総体積が大きいならば、細胞溶解物を０．５ｍｌのエッペンドルフチューブに小分けする。
【０２０１】
Ｃ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲル
１．１５分間絶えず撹拌しながら１５ｍｌの分離用ゲルをフラスコにおいて調製する。
１０％ＳＤＳ分離用ゲル：
３０（ｗｔ／ｖ）％アクリルアミド／Ｂｉｓ  ４．９５ｍｌ
１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ３．７５ｍｌ
１０（ｗｔ／ｖ）％ＳＤＳ                  ０．１５ｍｌ
ｄ−Ｈ２Ｏ                                      ６ｍｌ
注入前に、
ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン）  ７．５μｌ
１０（ｗｔ／ｖ）％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）              ７５μｌ
２．手袋を着用して、プレートを９５％エタノールにより清浄化する。Ｋｉｍｗｉｐｅｓにより乾燥する。プレートを組み立て、プレートをプレートホルダーに据える。短い方のプレートが外に向いている。
３．ＴＥＭＥＤ及び１０％ＡＰＳを分離用ゲル溶液に加え、しばらく撹拌する。ピペットを使用して、溶液を短い方のプレートの上端の約０．５ｃｍ上までプレート間のすき間に加える。直ちに少量のＨ２Ｏ飽和ブタノールを加えて、分離用ゲルの上端を覆う。
４．実験台で１時間放置する。プレートの底部からの漏れがないことを確認する。
５．ブタノールを除き、ゲルの表面のｄ−Ｈ２Ｏにより清浄化する。プレートをＫｉｍｗｉｐｅにより乾燥する。
６．  ５ｍｌの濃縮用ゲルを作製する：
４％ＳＤＳ濃縮用ゲル：
３０（ｗｔ／ｖ）％アクリルアミド／Ｂｉｓ  ０．６６ｍｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）      １．２８ｍｌ
１０（ｗｔ／ｖ）％ＳＤＳ                      ５０μｌ
ｄ−Ｈ２Ｏ                                      ３ｍｌ
注入前に、
ＴＥＭＥＤ                                      ５μｌ
１０（ｗｔ／ｖ）％ＡＰＳ                      ２５μｌ
７．濃縮用ゲルを短いプレートの上端まで分離用ゲルに載せる。１０ウエルのコームをプレートのすき間に直ちに挿入する。
８．重合させるために少なくとも５時間放置する。
９．コームを慎重に取り出し、ゲルの表面をｄ−Ｈ２Ｏにより洗浄する。ゲルを乾燥する。
１０．５００ｍｌの泳動用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍグリシン、０．３５（ｗｔ／ｖ）％ＳＤＳ）を調製する。
１１．ゲルを電気泳動ホルダーに固定し、タンク内に入れる。泳動用緩衝液を長い方のプレートの上端まで２つのプレートの間に注ぐ。上部チャンバーから下部チャンバーへの緩衝液の漏れがないことを確認する。緩衝液のレベルは低下し続けない。
１２．タンパク質ライセートを等体積の２ｘ負荷用緩衝液（６２．５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ６．８）、２５（ｗｔ／ｖ）％グリセロール、２（ｗｔ／ｖ）％ＳＤＳ、５（ｗｔ／ｖ）％メルカプトエタノール及び０．０１（ｗｔ／ｖ）％ブロモフェノールブルー）と混合する。
１３．溶解物（５μｇ／ウエル）を二連で負荷する。
１４．電気泳動を、色素がゲルの底に到達するまで１５０Ｖで１時間行う。
【０２０２】
Ｄ．セミドライ転写
転写緩衝液：６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４０ｍＭグリシン及び１５（ｖ／ｖ）％メタノール（ｐＨ９．２）
１．ゲルを２００ｍｌの転写緩衝液に３０分間浸漬する。
２．ＰＤＶＦメンブレンをメタノールで１５秒間湿らせ、脱イオン水ですすいだ後、転写緩衝液に少なくとも１５分間浸漬する。２枚のろ紙を転写緩衝液に１５分間浸漬する。
３．転写スタックをプレートの上に下記の順で組み立てる：
＋ろ紙、メンブレン、ゲル、ろ紙−
注意：ａ．メンブレン及びろ紙をゲルと同じサイズで切る。
ｂ．メンブレンと、ゲルとの間における気泡を避ける。
４．電源：１５〜２０Ｖ；時間：３０〜４５分（電力及び時間をゲルのサイズに従って調節する）。
【０２０３】
Ｅ．免疫ブロッティング
１．カセットを開ける。
２．転写メンブレンをブロッキング緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ−２０、５（ｖ／ｖ）％脱脂乳）に入れ、ブロットを４℃で一晩インキュベーションする。
３．ブロッキング緩衝液を除き、メンブレンを、洗浄緩衝液を１０分毎に交換しながら、洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ−２０）で撹拌しながら３０分間すすぎ洗浄する。
４．ブロッキング処理後、メンブレンを一次抗体とインキュベーションする。
５．すすぎ洗浄の後、一次抗体緩衝液をメンブレンからデカンテーションし、メンブレンを、洗浄緩衝液を１０分毎に交換しながら、洗浄緩衝液で撹拌しながら３０分間すすぎ洗浄する。
６．二次抗体を、通常の場合には１：５０，０００で、ブロック緩衝液で希釈する（西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体）。室温で１時間〜２時間インキュベーションする。
７．二次抗体緩衝液を除き、メンブレンを、洗浄緩衝液を１０分毎に交換しながら、洗浄緩衝液で撹拌しながら３０分間すすぎ洗浄する。
【０２０４】
Ｆ．バンドの検出
１．ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬（溶液Ａ及び溶液Ｂ（これらはＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ（英国）から得られる）の等体積混合物）を調製する。
２．試薬をメンブレンの上に加え、５分間反応する。
３．ブロットをＶｅｒｓａＤｏｃ５０００にさらし、バンドのパターンを、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを使用して分析する。
【０２０５】
ＩＩ．乳房組織サンプル及びタンパク質抽出
この分析のために使用された組織を、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから、独立した組織病理学者による２回の検査の後で得た。正常な乳房組織を美容外科患者から得た。
タンパク質抽出物の調製を、本質的には、Ｏｕ，Ｋ．、Ｋｅｓｕｍａ，Ｄ．、Ｇａｎｅｓａｎ，Ｋ．、Ｙｕ，Ｋ．他、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００６、５、２１９４〜２２０６に記載されるように行った。簡単に記載すると、薄く切った組織をＰＢＳで洗浄して、血液及び他の混入物を除いた。粉砕した組織を、７Ｍの尿素（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２Ｍのチオ尿素（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ）、４％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）、１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍＬのＤｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５０μｇ／ｍＬのＲｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、及び、プロテインインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、１ｍＬ／１０８細胞）からなるカクテルにより破砕した。得られた細胞ライセートをプローブ超音波処理器（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．、ＮＹ、米国）により超音波処理し、４０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞破片を除いた。その後、抽出されたタンパク質を、２Ｄサンプルクリーンアップキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、８Ｍ尿素及び５ｍＭ  ＥＤＴＡに緩衝液交換した。
ウエスタンブロティングのとき、我々は、ＥＲ＋（エストロゲン受容体）陽性である３名の乳がん患者に由来する抽出物の混合物、及び、正常者に由来する５つの抽出物をそれぞれ使用した。
【０２０６】
結果
ＰＡ２Ｇ４のバリデーションが図１５に示される。図１５（Ａ）は、抗アクチンを参照として使用する、がんサンプル及び正常なサンプルにおけるＰＡ２Ｇ４に対するウエスタンブロティングの結果を示す。図１５（Ａ）における各バンドが吸光度ユニットでの積分値として測定され、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウエアによって計算される。図１５（Ｂ）は、がんサンプル及び正常なサンプルにおけるそれぞれ、ＰＡ２Ｇ４のバンドの吸光度ユニットでの得られた積分値を示す。図１５（Ａ）及び図１５（Ｂ）の両方において、ＥＲ＋はがんサンプルを表し、ＴＮＴは正常なサンプルを表す。図１５（Ｂ）における垂直軸はバンドの吸光度ユニットでの積分値を表す。これらの図から、乳がんサンプルは、正常なサンプルとの比較において過剰発現を明確に示す。乳がん組織における類似するアップレギュレーションが個々のサンプル及びセルラインにおいてもまた観測される（データは示されず）。
【０２０７】
本発明はまた、動物のための獣医学において使用され得ることが当業者には明らかである。本発明を実施するための具体的な実施例が提供されているが、様々な改変及び改良が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが理解される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２０８】
【特許文献１】米国特許第５，２２３，４０９号
【非特許文献】
【０２０９】
【非特許文献１】Altschul et al., J Mol Biol 215, 403-410 (1990)
【非特許文献２】Altschul et al., Nucleic Acids Res 25, 3389-3402 (1997)
【非特許文献３】Bradford, M. M.  (1976) Anal. Biochem. 72, 248
【非特許文献４】Carell et al. Angew Chem Int Ed Engl 33, 2061(1994)
【非特許文献５】Carrell et al. Angew Chem Int Ed Engl 33, 2059  (1994)
【非特許文献６】Charpentier AH, Bednarek AK, Daniel RL, Hawkins KA, Laflin KJ, Gaddis S, MacLeod MC, Aldaz CM (2000) Effects of estrogen on global gene expression: identification of novel targets of estrogen action. Cancer Res 60: 5977-5983
【非特許文献７】Cristiano et al. J Mol Med 73, 479 (1995)
【非特許文献８】Cull et al. PNAS USA 89, 1865-1869 (1992)
【非特許文献９】Cwirla et al. PNAS USA 87, 6378-6382 (1990)
【非特許文献１０】de Graauw, M.; Tijdens, I.; Cramer, R.; Corless, S.; Timms, J. F.; van de, W. B. J.Biol.Chem., 280, 29885-29898 (2005)
【非特許文献１１】Ding, S. J.; Li, Y.; Tan, Y. X.; Jiang, M. R.; Tian, B.; Liu, Y. K.; Shao, X. X.; Ye, S. L.; Wu, J. R.; Zeng, R.; Wang, H. Y.; Tang, Z. Y.; Xia, Q. C. Mol Cell Proteomics, 3, 73-81 (2004)
【非特許文献１２】Felici J Mol Biol 222, 301-310 (1991)
【非特許文献１３】Fodor Nature 364, 555-556) (1993)
【非特許文献１４】Gallop et al. J Med Chem 37,1233 (1994)
【非特許文献１５】Houghten Biotechniques 13, 412-421 (1992)
【非特許文献１６】Hsu, W. M.; Hsieh, F. J.; Jeng, Y. M.; Kuo, M. L.; Tsao, P. N.; Lee, H.; Lin, M. T.; Lai, H. S.; Chen, C. N.; Lai, D. M.; Chen, W. J. Int.J.Cancer, 113, 920-927 (2005)
【非特許文献１７】Karlin and Altschul Proc Natl Acad Sci USA 87, 2264-2268) (1990)
【非特許文献１８】Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90, 5873-5877) (1993)
【非特許文献１９】Kuyama, H.; Watanabe, M.; Toda, C.; Ando, E.; Tanaka, K.; Nishimura, O. Rapid Commun.Mass Spectrom. 17, 1642-1650 (2003)
【非特許文献２０】Lam Nature 354, 82-84, (1991)
【非特許文献２１】Lam Anticancer Drug Des 12, 145, (1997)
【非特許文献２２】Laugesen, S.; Roepstorff, P. J.Am.Soc.Mass Spectrom. 14, 992-1002, (2003)
【非特許文献２３】Matsuo, E.; Toda, C.; Watanabe, M.; Ojima, N.; Izumi, S.; Tanaka, K.; Tsunasawa, S.; Nishimura, O. Proteomics, 6, 2042-2049 (2006)
【非特許文献２４】Miller, L. D.; Smeds, J.; George, J.; Vega, V. B.; Vergara, L.; Ploner, A.; Pawitan, Y.; Hall, P.; Klaar, S.; Liu, E. T.; Bergh, J. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2005, 102, 13550-13555
【非特許文献２５】Sotiriou, C.; Wirapati, P.; Loi, S.; Harris, A.; Fox, S.; Smeds, J.; Nordgren, H.; Farmer, P.; Praz, V.; Haibe-Kains, B.; Desmedt, C.; Larsimont, D.; Cardoso, F.; Peterse, H.; Nuyten, D.; Buyse, M.; Van de Vijver, M. J.; Bergh, J.; Piccart, M.; Delorenzi, M. J Natl.Cancer Inst. 2006, 98, 262-272
【非特許文献２６】Pompeia C, Hodge DR, Plass C, Wu YZ, Marquez VE, Kelley JA, Farrar WL. Cancer Res 64: 3465-3473 (2004)
【非特許文献２７】Rao, R. V.; Castro-Obregon, S.; Frankowski, H.; Schuler, M.; Stoka, V.; del Rio, G.; Bredesen, D. E.; Ellerby, H. M. J.Biol.Chem. 277, 21836-21842, (2002)
【非特許文献２８】Saji, S.; Kawakami, M.; Hayashi, S.; Yoshida, N.; Hirose, M.; Horiguchi, S.; Itoh, A.; Funata, N.; Schreiber, S. L.; Yoshida, M.; Toi, M. Oncogene, 24, 4531-4539 (2005)
【非特許文献２９】Scott and Smith Science 249, 386-390, (1990)
【非特許文献３０】Shah, Y. M.; Basrur, V.; Rowan, B. G. Mol Cell Endocrinol. 219, 127-139, (2004)
【非特許文献３１】Uramoto, H.; Sugio, K.; Oyama, T.; Nakata, S.; Ono, K.; Yoshimastu, T.; Morita, M.; Yasumoto, K. Lung Cancer 49, 55-62 (2005)
【非特許文献３２】Zhang, G. J.; Kimijima, I.; Onda, M.; Kanno, M.; Sato, H.; Watanabe, T.; Tsuchiya, A.; Abe, R.; Takenoshita, S. Clin Cancer Res 5, 2971-2977 (1999)
【非特許文献３３】Zuckernann et al. J Med Chem 37, 2678-85 (1994)
【非特許文献３４】Ou,K.,Kesuma,D.,Ganesan,K.,Yu,K. et al., J Proteome Res.2006,5,2194-2206.
【配列表フリーテキスト】
【０２１０】
配列番号５８は、ＰＡ２Ｇ４逆転写フォワードプライマーである。
配列番号５９は、逆転写リバースプライマーである。
配列番号６０は、ベータ−アクチン逆転写フォワードプライマーである。
配列番号６１は、ベータ−アクチン逆転写リバースプライマーである。
【図１】
2009542191.tif 000017
【図２】
2009542191.tif 000018
【図３】
2009542191.tif 000019
【図７】
2009542191.tif 000020
【図４】
2009542191.tif 000021
【図５】
2009542191.tif 000022
【図６】
2009542191.tif 000023
【図８】
2009542191.tif 000024
【図９】
2009542191.tif 000025
【図１０】
2009542191.tif 000026
【図１１】
2009542191.tif 000027
【図１２】
2009542191.tif 000028
【図１３】
2009542191.tif 000029
【図１４】
2009542191.tif 000030
【図１５】
2009542191.tif 000031
【配列表】
2009542191000001.app
【国際調査報告】
2009542191.tif 000032
2009542191.tif 000033
2009542191.tif 000034
2009542191.tif 000035