(57)【要約】  本発明は、Ｉｇ融合タンパク質の組成物、特に、Ｉｇ融合タンパク質、充填剤、二糖類、界面活性物質、および緩衝剤を含む組成物を提供する。１つの態様において、これらの組成物は長期にわたる保管または少なくとも１回の冷凍／解凍サイクルのもとで安定である。本発明はまた、Ｉｇ融合タンパク質組成物の調製方法も提供する。１つの態様において、本発明の組成物は凍結乾燥されている。さらなる態様において、前記組成物はアニーリング工程を含むプロセスにより凍結乾燥される。
2009516692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）６未満のｐＩを有するＩｇ融合タンパク質、
ｂ）グリシン、
ｃ）二糖類、
ｄ）界面活性剤、および
ｅ）緩衝剤
を含む医薬組成物であって、０．５ないし５％グリシン、０．５ないし５％二糖類および０．００１ないし０．５％界面活性剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
さらにＮａＣｌを１−２００ｍＭの濃度で含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物中のＩｇ融合タンパク質の濃度が０．０２５ないし６０ｍｇ／ｍｌである、請求項１または請求項２記載の組成物。
【請求項４】
Ｉｇ融合タンパク質が４未満のｐＩを有する、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
Ｉｇ融合タンパク質が受容体から由来の非Ｉｇ部分を含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｉｇ融合タンパク質が硫酸化、リン酸化またはグリコシル化されている非Ｉｇ部分を含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
グリコシル化された非Ｉｇ部分がシアル化またはフコシル化されている、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
Ｉｇ融合タンパク質がＩＬ−１３Ｒ−ＩｇまたはＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇである、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｉｇ融合タンパク質がＰＳＧＬ−ＩｇまたはＧＰ１ｂＩｇである、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
二糖類がシュークロースまたはトレハロースである、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
界面活性剤がポリソルベートである、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物中の緩衝剤の濃度が５ないし３０ｍＭである、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
緩衝剤がヒスチジン緩衝剤、トリス緩衝剤、またはリン酸塩緩衝剤である、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＮａＣｌを含有しない、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
凍結乾燥されている、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
−８０℃〜＋４０℃で少なくとも１週間安定している、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
復元されている、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
ａ）６未満のｐＩを有するＩｇ融合タンパク質、
ｂ）マンニトール、
ｃ）二糖類、
ｄ）界面活性剤、および
ｅ）緩衝剤
を含む医薬組成物であって、０．５ないし５％マンニトール、０．５ないし５％二糖類、０．００１ないし０．５％界面活性剤および３５ｍＭ未満のＮａＣｌを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
Ｉｇ融合タンパク質の濃度が０．０２５ないし６０ｍｇ／ｍｌである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
Ｉｇ融合タンパク質が４未満のｐＩを有する、請求項１８または請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
Ｉｇ融合タンパク質が受容体から由来の非Ｉｇ部分を含む、請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｉｇ融合タンパク質が硫酸化、リン酸化またはグリコシル化されている非Ｉｇ部分を含む、請求項１８ないし２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
グリコシル化された非Ｉｇ部分がシアル化またはフコシル化されている、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
Ｉｇ融合タンパク質がＩＬ−１３Ｒ−ＩｇまたはＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇである、請求項１８ないし２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
Ｉｇ融合タンパク質がＰＳＧＬ−ＩｇまたはＧＰ１ｂＩｇである、請求項１８ないし２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
二糖類がシュークロースまたはトレハロースである、請求項１８ないし２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
界面活性剤がポリソルベートである、請求項１８ないし２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
組成物中の緩衝剤の濃度が５ないし３０ｍＭである、請求項１８ないし２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
緩衝剤がヒスチジン緩衝剤、トリス緩衝剤、またはリン酸塩緩衝剤である、請求項１８ないし２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
ＮａＣｌを含有しない、請求項１８ないし２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
凍結乾燥されている、請求項１８ないし３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
−８０℃〜＋４０℃で少なくとも１週間安定している、請求項１８ないし３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
復元されている、請求項３１記載の組成物。
【請求項３４】
実質的に、０．０２５ないし６０ｍｇ／ｍｌの酸性のＩｇ融合タンパク質、１ないし４％のグリシン、０．５ないし２％の二糖類、０．００５ないし０．０２％の界面活性剤、１ないし４０ｍＭの緩衝剤、および任意の１−２００ｍＭのＮａＣｌからなる、医薬組成物。
【請求項３５】
実質的に、０．０２５ないし６０ｍｇ／ｍｌの酸性のＰＳＧＬ−ＩｇまたはＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ以外のＩｇ融合タンパク質、１ないし４％のマンニトール、０．５ないし２％の二糖類、０．００５ないし０．０２％の界面活性剤、１ないし４０ｍＭの緩衝剤、および任意の１−２００ｍＭのＮａＣｌからなる、医薬組成物。
【請求項３６】
実質的に、０．０２５ないし６０ｍｇ／ｍｌの酸性のＩｇ融合タンパク質、１ないし４％のマンニトール、０．５ないし２％の二糖類、０．００５ないし０．０２％の界面活性剤、および１ないし４０ｍＭの緩衝剤からなる、医薬組成物。
【請求項３７】
アニーリング工程を誘発する方法により凍結乾燥される、請求項１、１８および３４ないし３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
組成物を最終凍結温度よりも高い温度で所定の時間保持することでアニーリング工程が充填剤の結晶化を促進する、請求項３７記載の組成物の製法。
【請求項３９】
ａ）組成物を−４０℃よりも低い温度に凍結し；
ｂ）組成物中のグリシンまたはマンニトールの結晶化を促進するのに十分な時間、組成物の温度を−５℃から−４０℃までの範囲より選択される温度に上げ；
ｃ）組成物の温度を−３５℃より下げ；
ｄ）真空を確率し；そして
ｅ）該組成物を−２０℃から＋３０℃の範囲より選択される温度で乾燥させる
ことを含む、請求項３８記載の組成物の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２００５年１１月２２日に出願された米国特許出願６０／７３９２７１に対して優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、タンパク質製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオテクノロジーにおける進歩により、医薬用途のための多種多様なタンパク質を生産することが可能になっている。生産の後、タンパク質医薬品は使用の前に保管しなくてはならないことが多い。タンパク質が「従来の」医薬品よりも通常大きく複雑であるという事実に一部起因して、保管に適したタンパク質医薬品の製剤化および加工は特に困難なものになることがある。タンパク質医薬品の製剤化および加工の設計の総説については、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：９６９−９７５（１９９７）；Ｗａｎｇ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０３：１−６０（２０００）；ならびにＴａｎｇおよびＰｉｋａｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１９１−２００（２００４）を参照されたい。
【０００４】
タンパク質医薬品の生産のための製剤化および加工の設計において、いくつかの要素を考慮することができる。第一に考えることは、組成物の調製、冷凍、乾燥、保管、輸送、復元、冷凍／解凍サイクル、および最終消費者による復元後の保管を含み得る、製造工程、輸送工程および取扱工程のいずれかまたは全てを通してのタンパク質の安定性である。他の考えられる考慮事項には、製造、取扱および販売の容易性および経済性、患者への投与のための最終生産物の組成、ならびに、復元の際の凍結乾燥製剤の溶解度を含む最終消費者による使用の容易性が含まれる。
【０００５】
液体製剤はある特定の目的を満たし得る。液体製剤の考えられる有利性には、製造の容易性および経済性、ならびに最終消費者にとっての利便性が含まれる。
【０００６】
凍結乾燥製剤もまた、ある特定の有利性を提供し得る。凍結乾燥の、期待される利点には、輸送および保管の容易性および経済性に加えて、タンパク質の安定性の向上が含まれる。
【０００７】
組成物の基本形態（例えば、凍結乾燥、液体、冷凍など）の選択に加えて、タンパク質製剤の最適化は、典型的には、タンパク質の安定性を最大にするように製剤の構成成分とそれらのそれぞれの濃度を変更することを伴う。イオン強度、ｐＨ、温度、冷凍／解凍サイクル、せん断力、冷凍、乾燥、撹拌、および復元を含む様々な要素がタンパク質の安定性に影響し得る。タンパク質の不安定性は、物理的分解（例えば変性、凝集、もしくは沈殿）または化学的分解（例えば脱アミド、酸化、もしくは加水分解）に起因し得る。製剤の構成成分および濃度の最適化には、不安定性の原因を克服するための実験的研究および／または論理的アプローチが含まれ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、様々なタンパク質の安定的な保管を可能にする、タンパク質医薬品の様々なクラス、特に免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質に適した製剤を提供する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、長期にわたる保管の間および／または１回もしくは複数回の冷凍／解凍サイクルの後に十分に安定なＩｇ融合タンパク質を含むある特定の組成物の発見に少なくとも部分的に基づいている。本発明は、Ｉｇ融合タンパク質と、少なくとも以下の４つの非タンパク質性の構成成分：（１）充填剤、（２）二糖類、（３）界面活性物質、および（４）緩衝剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物はさらにＮａＣｌを含む。前記組成物はアルギニンまたはシステインを含まない。
【００１０】
Ｉｇ融合タンパク質は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５５１６９６４号、米国特許第５２２５５３８号、米国特許第５４２８１３０号、米国特許第５５１４５８２号、米国特許第５７１４１４７号、米国特許第５４５５１６５号、および米国特許第６１３６３１０号に記載されている。いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質は酸性であり、例えば、６．０より小さいｐＩを有するＩｇ融合タンパク質である。例示的な実施形態において、酸性のＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ、およびＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質は極めて酸性であり、例えば、４．０より小さいｐＩを有するＩｇ融合タンパク質である。例示的な実施形態において、極めて酸性のＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質の非Ｉｇ部分はサイトカイン受容体であり、例えばインターロイキン受容体である。例示的な実施形態において、サイトカイン受容体はＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−２１Ｒである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質の非Ｉｇ部分は硫酸化、リン酸化、および／またはグリコシル化されている。例示的な実施形態において、硫酸化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−ＩｇおよびＧＰ１ｂ−Ｉｇである。例示的な実施形態において、グリコシル化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ、およびＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇである。いくつかの実施形態において、グリコシル化されたＩｇ融合タンパク質はフコシル化および／またはシアル化されている。例示的な実施形態において、フコシル化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−ＩｇおよびＧＰ１ｂ−Ｉｇである。例示的な実施形態において、シアル化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ、およびＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇである。
【００１４】
充填剤の例示的な例には、グリシンおよびマンニトールが含まれる。例示的な二糖類には、ショ糖およびトレハロースが含まれる。界面活性物質の例示的な例には、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０が含まれる。緩衝剤の例示的な例には、アミン緩衝剤およびリン酸緩衝剤が含まれる。アミンベースの緩衝剤の例示的な例には、ヒスチジンおよびトロメタミン（Ｔｒｉｓ）が含まれる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物の構成成分は所定の濃度範囲で存在する。いくつかの実施形態において、タンパク質の濃度は０．０２５〜６０ｍｇ／ｍｌであり、充填剤の濃度は０．５〜５％であり、二糖類の濃度は０．５〜５％であり、界面活性物質の濃度は０．００１〜０．５％であり、これらは全て互いに独立している。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌの濃度は１〜２００ｍＭである。ある特定の実施形態において、ＮａＣｌの濃度は３５ｍＭ未満である。詳細な実施形態において、医薬組成物は１〜４％の充填剤、０．５〜２％の二糖類、および０．００５〜０．０２％の界面活性物質を含む。例示的な実施形態において、組成物は２％の充填剤、１％の二糖類、および０．０１％の界面活性物質を含む。
【００１６】
本発明はさらに、製剤の物理的状態にも関する。本発明は、限定はしないが、液体の、冷凍された、凍結乾燥された、および復元された製剤である。
【００１７】
本発明はさらに、アニーリング工程を含むプロセスにより組成物を凍結乾燥する方法を含む、本発明の組成物を作製する方法を提供する。
【００１８】
上述の概要および以下の詳細な記載は、本発明を例示および説明するものにすぎず、特許請求の範囲に記載されているように、制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物を提供する。本発明は、Ｉｇ融合タンパク質、緩衝剤、二糖類、充填剤、および界面活性物質を含む組成物が、長期にわたる保管および／または１回もしくは複数回の冷凍／解凍サイクルに対して十分に安定となるという発見に少なくとも部分的に基づいている。本発明はまた、Ｉｇ融合タンパク質を調製する方法も提供する。
【００２０】
融合タンパク質
本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【００２１】
Ｉｇ融合タンパク質は、（ａ）（ｂ）に連結している非Ｉｇ部分と、（ｂ）免疫グロブリンの定常領域に由来するＩｇ部分とを含むタンパク質である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質は酸性であり、例えば、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、または２．５より小さい等電点（ｐＩ）を有するＩｇ融合タンパク質である。例示的な実施形態において、例えば、酸性のＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ、およびＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇである。タンパク質の等電点とは、タンパク質の正味の電荷が０であるｐＨである。目的のタンパク質の等電点を決定するための方法は当技術分野で周知であり、限定はしないが、タンパク質のアミノ酸配列に基づいた理論的計算、および等電点電気泳動（ＩＥＦ）によるｐＩの直接の測定が含まれる。Ｓｋｏｏｇ，Ｂ．およびＷｉｃｈｍａｎ，Ａ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５：８２−８３（１９８６）；Ｐａｔｒｉｃｋｉｏｓ，Ｃ．Ｓ．およびＹａｍａｓａｋｉ，Ｅ．Ｎ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３１：８２−９１（１９９５）；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、１７１頁（１９９４）。
【００２３】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質は極めて酸性であり、例えば、４．０、３．５、３．０、または２．５より小さいｐＩを有するＩｇ融合タンパク質である。例示的な実施形態において、極めて酸性のＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質の非Ｉｇ部分は受容体に由来し、例えばサイトカイン受容体に由来する。例示的な実施形態において、サイトカイン受容体はインターロイキン受容体である。例示的な実施形態において、サイトカイン受容体はＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−２１Ｒである。他のサイトカイン受容体を用いてもよく、例えばＣｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第２巻：Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＯｐｐｅｎｈｅｉｍおよびＦｅｌｄｍａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１に記載されているサイトカイン受容体を用いてもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質は、硫酸化、リン酸化、および／またはグリコシル化されている非Ｉｇ部分を含む。例示的な実施形態において、硫酸化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−ＩｇおよびＧＰ１ｂ−Ｉｇである。例示的な実施形態において、グリコシル化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ、およびＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇである。いくつかの実施形態において、グリコシル化されたＩｇ融合タンパク質はフコシル化および／またはシアル化されている。例示的な実施形態において、フコシル化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−ＩｇおよびＧＰ１ｂ−Ｉｇである。例示的な実施形態において、シアル化されたＩｇ融合タンパク質はＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ、およびＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇである。タンパク質の硫酸化、リン酸化、およびグリコシル化の検出および解析の方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  Ｋａｎｎｉｃｈｔ編（２００２）に記載されている。
【００２６】
いくつかの実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質のＩｇ部分は、免疫グロブリン、例えば、ヒト、マウス、または他の種のＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、または別のＩｇＧアイソタイプ）のＦｃドメインに由来し、天然の状態で生じるＩｇ配列の機能的部分ならびにこのような配列の突然変異および修飾を含む。様々なＦｃドメインの配列が当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｋａｂａｔら編、１９９１で提供されている。Ｉｇ部分は、以下のＦｃドメインの部分：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域のいずれか１つまたは全てを含み得る。例えば、Ｆｃドメインは、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域を含むがＣＨ１を含まないものであり得る。
【００２７】
さらに、Ｉｇ融合タンパク質は、非Ｉｇ部分とＩｇ部分とを繋ぐリンカーを含み得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物におけるＩｇ融合タンパク質の濃度は、１００ｍｇ／ｍｌ未満、９０ｍｇ／ｍｌ未満、８０ｍｇ／ｍｌ未満、７０ｍｇ／ｍｌ未満、６０ｍｇ／ｍｌ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、４０ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、または５ｍｇ／ｍｌ未満である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物におけるＩｇ融合タンパク質の濃度は、約０．０２５〜約６０ｍｇ／ｍｌ、約０．０２５〜約４０ｍｌ／ｍｌ、約０．０２５〜約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．０２５〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲から選択される。例示的な実施形態において、Ｉｇ融合タンパク質の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２９】
緩衝剤
本発明の組成物は、ｐＨを所望の範囲に維持する働きを一部で有する緩衝剤を含む。本発明における使用に適した緩衝剤には、限定はしないが、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤およびアミン緩衝剤が含まれる。リン酸緩衝剤は例えば、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムであり得る。アミン緩衝剤は例えば、ヒスチジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「ｔｒｉｓ」）、またはジエタノールアミンであり得る。
【００３０】
本発明の組成物における緩衝剤の濃度は、約１〜約１０００ｍＭ、約１〜約２００ｍＭ、約１〜約１００ｍＭ、約１〜約５０ｍＭ、約１〜約４０ｍＭ、約１〜約３０ｍＭ、約１〜約２０ｍＭ、または約１〜約１０ｍＭの範囲から選択し得る。例示的な実施形態において、組成物における緩衝剤の濃度は約１０ｍＭである。
【００３１】
本発明の組成物のｐＨは、４〜１０、５〜９、好ましくは６〜８の範囲から選択し得る。注射する組成物のｐＨを生理的レベルまたはそれに近いものに設定することにより、患者の不快を最小限にし得る。そのためには、医薬組成物のｐＨが約５．８〜約８．４であることが好ましく、またはより好ましくは、約６．２〜約７．４である。これらの範囲の内側または外側での通常のｐＨ調整が、組成物のポリペプチドまたは他の構成成分の溶解度または安定性を向上させるために必要であろう。
【００３２】
二糖類
本発明の組成物はさらに二糖類を含む。好ましくは、二糖類は非還元糖であり、例えばショ糖またはトレハロースである。ある特定の実施形態において、組成物における二糖類の濃度は、０．５〜５％、０．５〜４％、０．５〜３％、０．５〜２．５％、０．５〜２％、０．５〜１．５％、０．５〜１％、１〜１．５％、１．５〜２％、２〜２．５％、２．５〜３％、３〜４％、４〜５％、または５％超の範囲から選択される。詳細な実施形態において、組成物における二糖類の濃度は約０．５〜５％であり、例えば約０．５〜２．０％である。例示的な実施形態において、二糖類の濃度は０．９または１．０％である。
【００３３】
１つの態様において、二糖類は冷凍の間タンパク質を安定化させる働きを有する。冷凍の間の保護は二糖類の絶対濃度に依存するため（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：９６９−９７５（１９９７））、安定性を最大にするためには５％より高い濃度が必要であろう。
【００３４】
１つの態様において、二糖類は乾燥の間タンパク質を安定化させる。乾燥の間の保護は二糖類とタンパク質との間の最終質量の比率に依存し得る。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：９６９−９７５（１９９７）。したがって、いくつかの実施形態において、二糖類の濃度は、典型的には少なくとも１：１である、タンパク質に対する二糖類の所望の質量比を達成するように選択される。いくつかの実施形態において、二糖類：タンパク質の質量比が約５：１の時に安定性は最適となる。他の実施形態において、二糖類：タンパク質の質量比は１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１であるか、または１０００：１より高い。
【００３５】
二糖類は凍結乾燥保護剤および凍結保護剤として作用し得る。「凍結乾燥保護剤」には、凍結乾燥およびその後の保管の際のタンパク質の化学的または物理的不安定性を防ぐかまたは軽減させる物質が含まれる。１つの態様において、凍結乾燥保護剤は、乾燥プロセスの間に組成物から水分が除去される際の、タンパク質における化学的または物理的不安定性を防ぐかまたは軽減させる。さらなる態様において、凍結乾燥保護剤は、水素結合を介したタンパク質の適切な立体構造の維持を促すことによりタンパク質を安定化させる。
【００３６】
「凍結保護剤」には、生産、冷凍、保管、取扱、販売、復元、または使用の間、冷凍タンパク質に安定性を付与する物質が含まれる。詳細な態様において、「凍結保護剤」には冷凍プロセスにより生じるストレスからタンパク質を保護する物質が含まれる。凍結保護剤は凍結乾燥保護剤の効果を有し得る。
【００３７】
充填剤
本発明の組成物はさらに、グリシンおよびマンニトールである１つまたは複数の充填剤を含む。充填剤は、凍結乾燥された固形物の質量および物理的構造に寄与する働きを有する。１つの態様において、充填剤は美しい固形物の形成に寄与する。より具体的には、充填剤は、審美的に許容可能な、均一な、または機械的に強い固形物の形成を促進する。充填剤はまた、開孔構造の形成と、復元の容易性および速度とを促進する。充填剤はまた、固形物の崩壊、共晶融解、または残余水蒸気の保持を軽減させるかまたは防ぐ。別の態様において、充填剤は、ストレス（例えば物理的および化学的ストレス）に対するタンパク質の保護を促し、タンパク質活性の維持を促す。
【００３８】
ある特定の実施形態において、組成物における充填剤の濃度は、０．５〜１％、１〜１．５％、１．５〜２％、２〜２．５％、２．５〜３％、３〜３．５％、３．５〜４％、４〜４．５％、４．５〜５％、５％超、０．５〜５％、０．５〜４％、０．５〜３％、０．５〜２．５％、０．５〜２％、０．５〜１．５％、または０．５〜１％の範囲から選択される。ある特定の実施形態において、組成物における充填剤の濃度は０．５〜５％であり、例えば０．５〜３％であり、さらに詳細には１．８〜２％である。
【００３９】
界面活性物質
好ましくは、本発明の組成物はまた界面活性物質も含む。１つの態様において、界面活性物質は、界面（例えば、空気／溶液の界面、または溶液／表面の界面）で生じたストレスからタンパク質を保護する。１つの実施形態において、界面活性物質は凝集を防ぐかまたは軽減させる。界面活性物質には、ポリソルベート、例えばポリソルベート−２０またはポリソルベート−８０のような洗浄剤、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが含まれる。様々な界面活性物質が当技術分野で知られている（例えば、米国特許第６６８５９４０号、第１６欄、第１０〜３５行参照）。例示的な実施形態において、界面活性物質は植物由来のポリソルベート−８０である。
【００４０】
ある特定の実施形態において、組成物における界面活性物質の濃度は、０．００１〜０．５％、０．００１〜０．２％、０．００１〜０．１％、０．００１〜０．０５％、０．００１〜０．０１％、または０．００１〜０．００５％である。例示的な実施形態において、組成物における界面活性物質の濃度は０．００５〜０．０１％である。
【００４１】
他の構成成分
組成物はまた、医薬的に許容可能な付加的な構成成分を含み得る。適当な付加的な構成成分には、付加的な張度調整剤および当技術分野で知られている他の添加剤が含まれる。
【００４２】
張度調整剤は組成物の浸透圧に寄与する物質である。ヒト血清の浸透圧は約３００±５０ｍＯｓＭ／ｋｇである。タンパク質の安定性を維持し、患者の不快を最小限にするため、医薬組成物は等張であること、すなわちヒト血清とほぼ等しい浸透圧を有することが通常好ましい。したがって、組成物の浸透圧は好ましくは１８０〜４２０ｍＯｓＭ／ｋｇである。しかし、組成物の浸透圧が個別の条件の要求に従ってより高いかまたはより低くてもよいことは当業者に理解されよう。様々な張度調整剤が当技術分野で知られている（例えば、米国特許出願２００３０１８０２８７の第００４７段落参照）。限定はしないが緩衝剤、二糖類、充填剤、および界面活性物質が含まれる、組成物の他の構成成分もまた、組成物の浸透圧に寄与し得る。
【００４３】
添加剤には、限定はしないが、化学添加物、共溶質、および共溶媒が含まれる。好ましくは、添加剤はタンパク質の安定性に寄与するが、添加剤はその他に組成物の物理的、化学的、および生物学的特性に寄与し得ることも理解されたい。様々な添加剤が当技術分野で知られている（例えば、米国特許出願２００３０１８０２８７の第００４８〜００４９段落参照）。
【００４４】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに塩化ナトリウムを含む。詳細な実施形態において、組成物は１〜２００ｍＭ、または５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３５ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、もしくは５ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。ある特定の条件下において、ＮａＣｌは凍結乾燥の間の困難性の原因となるか、または復元した凍結乾燥物において乳白光の出現をもたらすことがある。したがって、詳細な実施形態において、組成物はＮａＣｌを含まない。
【００４５】
組成物におけるある特定の構成成分を当技術分野で知られている代替物と置き換えてもよいことを理解されたい。しかし、限定はしないが化学的適合性、ｐＨ、張度、および安定性が含まれる理由により、ある特定の構成成分を含むことによって他の構成成分、濃度、または医薬組成物の調製方法の使用が除外されようこともまた、当業者には理解されよう。
【００４６】
本発明の組成物は、アルギニンもしくはその塩またはシステインもしくはその塩のいずれかを、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ以下含むか、検出不可能なレベルで含むか、または全く含まない。これらの化合物は組成物の調製において加えられないか、または、組成物において前記化合物の限度を超えて検出されることができない。これらの制限は、ポリペプチド内に存在するアルギニンおよび／またはシステインには適用されず、遊離アミノ酸およびそれらの塩にのみ適用される。
【００４７】
例示的な実施形態
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、Ｉｇ融合タンパク質、緩衝剤、二糖類、充填剤、および界面活性物質から本質的に構成される。いくつかの実施形態において、医薬組成物はＩｇ融合タンパク質、緩衝剤、二糖類、充填剤、および界面活性物質を含む。
【００４８】
１つの例示的な実施形態において、医薬組成物は、医薬的に効果的な量のＩｇ融合タンパク質、１ｍＭ〜１Ｍの緩衝剤、０．５〜５％の二糖類、０．５〜５％の充填剤、および０．００１〜０．５％の界面活性物質を含む。さらなる実施形態において、医薬組成物は、医薬的に効果的な量のＩｇ融合タンパク質、１ｍＭ〜１Ｍの緩衝剤、０．５〜５％の二糖類、０．５〜５％の充填剤、０．００１〜０．５％の界面活性物質、および１〜２００ｍＭのＮａＣｌを含む。さらなる実施形態において、医薬組成物は、医薬的に効果的な量のＩｇ融合タンパク質、１ｍＭ〜１Ｍの緩衝剤、０．５〜５％の二糖類、０．５〜５％の充填剤、０．００１〜０．５％の界面活性物質、および３５ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。さらなる実施形態において、医薬組成物は、医薬的に効果的な量のＩｇ融合タンパク質、１ｍＭ〜１Ｍの緩衝剤、０．５〜５％の二糖類、０．５〜５％の充填剤、および０．００１〜０．５％の界面活性物質を含み、ＮａＣｌを含まない。
【００４９】
１つの例示的な実施形態において、医薬組成物は、０．０２５〜２０ｍｇ／ｍｌのＩｇ融合タンパク質、５〜３０ｍＭの緩衝剤、０．５〜２％の二糖類、１．５〜２．５％の充填剤、および０．００１〜０．０２％の界面活性物質を含む。
【００５０】
さらなる実施形態において、医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌのＩｇ融合タンパク質、約１０ｍＭの緩衝剤、約１．８〜約２％の充填剤、約０．９〜約１％の二糖類、および約０．００５〜約０．０１％の界面活性物質を含む。
【００５１】
さらなる実施形態において、医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌのＩｇ融合タンパク質、約１０ｍＭの緩衝剤、約１．８〜約２％のグリシン、約０．９〜約１％の二糖類、および約０．００５〜約０．０１％の界面活性物質を含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌのＩｇ融合タンパク質、約１０ｍＭの緩衝剤、約１．８〜約２％のマンニトール、約０．９〜約１％の二糖類、約０．００５〜約０．０１％の界面活性物質、および３５ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。
【００５３】
１つの例示的な実施形態において、医薬組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのＰＳＧＬ−Ｉｇ、１０ｍＭのヒスチジン、２６０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのＮａＣｌ、１％のショ糖、および０．００５％のポリソルベート−８０を含む。
【００５４】
１つの例示的な実施形態において、医薬組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのＧＰ１ｂ−Ｉｇ、１０ｍＭのヒスチジン、１．８％のグリシン、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のショ糖、および０．０１％のポリソルベート−８０を含む。
【００５５】
１つの例示的な実施形態において、医薬組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、２％のマンニトール、４０ｍＭのＮａＣｌ、１％のショ糖、および０．０１％のポリソルベート−８０を含む。
【００５６】
組成物の物理的状態
限定はしないが、液体の、冷凍液体の、凍結乾燥された、および復元された製剤を含む様々な物理的状態が、本発明の医薬組成物に適している。復元製剤には、液体、典型的には注射用水（ＷＦＩ）内に再懸濁されている凍結乾燥組成物が含まれる。凍結乾燥組成物では、濃度および浸透圧は、凍結乾燥前の液体組成物の濃度および浸透圧を典型的には参照するが、これらの値は代わりに復元組成物を参照してもよい。冷凍液体組成物では、濃度および浸透圧は冷凍前の液体組成物を典型的には参照する。
【００５７】
医薬組成物の調製方法
当業者には、本発明の医薬組成物の調製に適した様々な方法が既知であろう。当業者にはまた、いくつかの構成成分の相互作用の結果、ある特定の調製方法または調製順序が不都合なものとなり得ることも理解されよう。
【００５８】
１つの実施形態において、組成物は、精製タンパク質を界面活性物質以外の組成物の全ての残りの構成成分を含む溶液にし、その後所望の濃度まで界面活性物質を加えることにより調製される。
【００５９】
１つの実施形態において、組成物を、アニーリング工程、すなわち、組成物を最終冷凍温度よりも高い温度に所定の時間保持して、潜在的に結晶性である構成成分の結晶化を促進する工程を含むプロセスにより凍結乾燥する。１つの態様において、アニーリングにより充填剤の完全なまたはより徹底的な結晶化が可能になり、それにより固形物の構造またはタンパク質の安定性が向上し得る。さらに、充填剤の結晶化により非晶質相のＴｇ’が上昇し得、それにより、高温で実施される最初の乾燥が可能になることでより効果的な乾燥が容易になり得、この場合もやはり固形物の質または安定性の向上がもたらされる。Ｗａｎｇ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０３：１−６０（２０００）参照。さらに、充填剤が完全に結晶化されないと、バイアルの破損をもたらし得る最初の乾燥の間の結晶化（ＴａｎｇおよびＰｉｋａｌ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１９１−２００（２００４））、または、タンパク質を不安定化させ得る保管の間の結晶化（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：９６９−９７５（１９９７））が生じ得る。
【００６０】
例示的な実施形態において、組成物を−４０℃未満で冷凍する工程、−５℃〜−４０℃の温度で、充填剤の結晶化を促進するのに十分な時間アニーリングする工程、温度を−３５℃未満に下げる工程、真空を確立する工程、および組成物を−２０℃〜＋３０℃の温度で乾燥させる工程を含むプロセスにより、医薬組成物を凍結乾燥する。
【００６１】
安定性
１つの態様において、本発明は安定的な医薬組成物に関する。「安定的な」組成物とは、組成物内のタンパク質が、保管または使用の際にある特定の物理的および化学的特性を基本的に保持する組成物である。１つの態様において、「保管または使用」には、冷凍／解凍の１回または複数回のサイクルが含まれる。タンパク質の安定性および／または不安定性の様々な分析が実施例に記載され、他の適した方法が当技術分野で周知であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７−３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）で見ることができる。このような分析には、限定はしないが、高分子量物質（例えば凝集物）の定量、低分子量物質（例えば分解生成物）の定量、タンパク質濃度の定量、タンパク質活性の定量、および翻訳後のアミノ酸修飾の定量が含まれる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、保管または使用の際に１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満の凝集物質（高分子量）または分解生成（低分子量）物質を含む。同様に、本発明の医薬組成物は、好ましくは、保管または使用の際に８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％のタンパク質活性を保持する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、組成物はある特定の温度（例えば−８０℃〜４０℃、−４０℃〜４０℃、約２０℃）で特定の期間（例えば、１、４、７、１２もしくは２４週間、または１、２、３、４、６、７．５、９もしくは１２ヶ月間、またはそれ以上）にわたり安定である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、組成物は特定の回数の冷凍／解凍サイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）の後、安定である。
【００６４】
１つの態様において、医薬組成物は、組成物の調製、冷凍、乾燥、保管、輸送、復元、冷凍／解凍サイクル、および最終消費者による復元後の保管を含み得る、製造工程、輸送工程および取扱工程のいずれかまたは全てを通して安定なタンパク質である。
【００６５】
イオン強度、ｐＨ、温度、冷凍／解凍サイクル、せん断力、冷凍、乾燥、撹拌、および復元を含む様々な要素がタンパク質の安定性に影響し得る。タンパク質の不安定性は、物理的分解（例えば変性、凝集、もしくは沈殿）または化学的分解（例えば脱アミド、酸化、もしくは加水分解）により生じ得る。
【実施例１】
【００６６】
ＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤
Ａ．ＰＳＧＬ−Ｉｇの背景
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は、ヒト白血球上のＰ−セレクチンに対する主要な高親和性受容体である。ＰＳＧＬ−Ｉｇは、米国特許第５８２７８１７号に記載されているように、突然変異したヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに連結した可溶性ＰＳＧＬを含む融合タンパク質である。ＰＳＧＬ−Ｉｇの等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、およそ３のｐＩに集合した、２．８から３．３のｐＨ範囲内の顕著なバンドを示す。ＰＳＧＬ−Ｉｇの翻訳後修飾には硫酸化およびグリコシル化が含まれる。ＰＳＧＬ−Ｉｇのグリコシル化にはＯ結合型グリカンおよびＮ結合型グリカンが含まれる。ＰＳＧＬ−ＩｇにおけるＯ結合型グリカンには、シアル化および／またはフコシル化された構造が含まれる。ＰＳＧＬの翻訳後修飾およびその生物学的重要性の概観のために、Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：７０７８−７０８７（１９９８）を参照されたい。
【００６７】
Ｂ．ＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤の最適化
ＰＳＧＬ−ＩｇをＱＡＥカラムで精製し、ＰＢＳ−ＣＭＦまたは「Ｈｉｓ／Ｓｕｃ／Ｇｌｙ」（１０ｍＭのヒスチジン、２６０ｍＭのグリシン、１％のショ糖）内において約２５μｇ／ｍｌで製剤化した。サンプルを、ポリソルベート−８０の不存在下、冷凍／解凍サイクルの前に０．００５％まで加えたポリソルベート−８０の存在下、または冷凍／解凍サイクルの後、しかしＨＭＷ測定の前に０．００５％まで加えたポリソルベート−８０の存在下（ＰＢＳ−ＣＭＦの場合のみ）のいずれかで処理した。サンプルは２０サイクルの冷凍／解凍に付した。高分子量種（ＨＭＷ）のパーセンテージを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣにより、冷凍／解凍サイクルの前後に決定した。表１に示されているように、ポリソルベート−８０はＰＢＳ−ＣＭＦおよびＨｉｓ／Ｓｕｃ／Ｇｌｙの両方においてＨＭＷの蓄積を著しく減少させたが、これは冷凍／解凍サイクルの前に加えた場合のみである。
【００６８】
【表１】
2009516692.tif 000003
【００６９】
ＰＳＧＬ−Ｉｇの安定性に対する緩衝剤およびｐＨの寄与を決定するために、ＰＳＧＬ−Ｉｇを、１５ｍＭの緩衝剤のみ（追加の添加剤なし）において約５０μｇ／ｍｌで製剤化した。５つの緩衝剤（コハク酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、およびＴｒｉｓ）を全７ｐＨで試験した（表２参照）。サンプルは５サイクルの冷凍／解凍に付した。ＨＭＷのパーセンテージを冷凍／解凍サイクルの前後にＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。表２に示されているように、クエン酸およびヒスチジンでは冷凍／解凍後のＨＭＷのパーセンテージにおける変化が最も小さくなり、一方、ｔｒｉｓ、リン酸、およびコハク酸ではＨＭＷのパーセンテージがより大きく上昇した。
【００７０】
【表２】
2009516692.tif 000004
【００７１】
Ｃ．ＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤の長期にわたる安定性
精製ＰＳＧＬ−Ｉｇを、１％のショ糖、２６０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．５〜６．６）内において５ｍｇ／ｍＬとした。ポリソルベート−８０を０．００５％の最終濃度まで加えた。１ｍｌのアリコートをタイプＩガラスの２ｍｌの管状バイアル内に満たし、ストッパーを付した。サンプルは、凍結乾燥して５℃、２５℃、または４０℃で保管したか、あるいは冷凍液体として−８０℃で保管した。タンパク質の安定性を、ＨＭＷの形成、硫酸化の低下の程度、相対結合ユニット（ＲＢＵ）において測定される生物活性、およびＮ末端のグルタミンのピログルタミン酸への環化の程度により評価した。時間０のサンプルは凍結乾燥前後の製剤で構成されたものである。サンプルはまた、上記に挙げた温度での保管の３または７．５ヶ月後にも解析した。表３に示されているように、凍結乾燥製剤および冷凍液体製剤は試験した条件下で安定である。
【００７２】
【表３】
2009516692.tif 000005
【実施例２】
【００７３】
ＧＰ１ｂ−Ｉｇ製剤
Ａ．ＧＰ１ｂ−Ｉｇの背景
ＧＰ１ｂ−αは血小板により発現される受容体である。ＧＰ１ｂ−αに対する主要なリガンドはフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）である。ＧＰ１ｂ−Ｉｇは、ＰＣＴ公報ＷＯ０２／０６３００３に記載されているような、不活性化されたヒトＩｇＧ１のＦｃの２２５個のアミノ酸に連結したＧＰ１ｂ−αのＮ末端の２９０個のアミノ酸からなる可溶性のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質である。ＧＰ１ｂ−ＩｇのＶＷＦ結合ドメインは、そのＶＷＦ結合親和性を高める２つの機能獲得型突然変異、Ｍ２３９ＶおよびＧ２３３Ｖを含む。ＧＰ１ｂ−Ｉｇの等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、およそ５のｐＩに集合した、４．１から５．６のｐＨ範囲内の顕著なバンドを示す。ＧＰ１ｂ−Ｉｇの翻訳後修飾にはＮ結合型グリコシル化が含まれる。ＧＰ１ｂ−ＩｇにおけるＮ結合型グリカンには、シアル化および／またはフコシル化された構造が含まれる。
【００７４】
Ｂ．ＧＰ１ｂ−Ｉｇ製剤の最適化
ＧＰ１ｂ−Ｉｇの安定性に対するポリソルベート−８０の影響を２ｍｌのポリプロピレンバイアルにおいて評価した。ＧＰ１ｂ−Ｉｇを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭのＮａＣｌ、および様々な濃度のポリソルベート−８０（０％、０．００５％、０．０１％、または０．０２％）内において２ｍｇ／ｍｌで製剤化した。バイアルを液体窒素内に１分間沈めることにより冷凍し、２０℃のウォーターバスにおけるインキュベーションにより全ての氷がなくなるまで解凍した。サンプルを１４回の冷凍／解凍サイクルに付し、アリコートを１サイクルおき後に解析のために取り出した。ＨＭＷのパーセンテージをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。タンパク質の回収を、２８０ｎｍでの吸光シグナル上のタンパク質ピークの領域を積分することにより評価した。図１に示されているように、ポリソルベート−８０の添加によりＨＭＷの蓄積は著しく減少した。
【００７５】
ＧＰ１ｂ−Ｉｇの安定性に対するグリシンの影響を同様の様式で評価した。ＧＰ１ｂ−Ｉｇを、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．５）、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のショ糖、０．０１％のポリソルベート−８０、および様々な濃度のグリシン（０％、１．０％、１．８％、２．０％、または４．０％ｗ／ｖ）内において５ｍｇ／ｍｌで製剤化した。バイアルを液体窒素内に１分間沈めることにより冷凍し、２０℃のウォーターバスにおけるインキュベーションにより全ての氷がなくなるまで解凍した。サンプルを１０回の冷凍／解凍サイクルに付し、アリコートを１サイクルおき後に解析のために取り出した。ＨＭＷのパーセンテージをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。表４に示されているように、１．８％のグリシンの添加により、６回、８回、または１０回の冷凍／解凍サイクルの後のＨＭＷの蓄積が最少となった。
【００７６】
【表４】
2009516692.tif 000006
【００７７】
ＧＰ１ｂ−Ｉｇの安定性に対するｐＨの影響を同様の様式で評価した。ＧＰ１ｂ−Ｉｇを、様々なｐＨレベル（５．０、６．０、７．０、または８．０）の２０ｍＭのリン酸ナトリウム内において１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。バイアルを液体窒素内に１分間沈めることにより冷凍し、２０℃のウォーターバスにおけるインキュベーションにより全ての氷がなくなるまで解凍した。サンプルを１０回の冷凍／解凍サイクルに付し、アリコートを１サイクルおき後に解析のために取り出した。ＨＭＷのパーセンテージをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定し、タンパク質の回収を、２８０ｎｍおよび２１４ｎｍでのＨＰＬＣ検出器のシグナルによりモニターした。１０サイクルの後、ｐＨ５．０および６．０のサンプルは濁り、この濁りは可溶性タンパク質の回収の低下を示している。表５に示されているように、ｐＨ５．０または６．０での製剤化ではＨＭＷの蓄積が増加し、タンパク質の回収が減少する。
【００７８】
【表５】
2009516692.tif 000007
【００７９】
１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．５）、１．８％のグリシン、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のショ糖、および０．０１％のポリソルベート−８０内において０．２５、１０、または１９ｍｇ／ｍｌのＧＰ１ｂ−Ｉｇで半分を満たした２０ｍｌのボトルにおいて、ＧＰ１ｂ−Ｉｇの安定性に対するタンパク質濃度の影響を評価した。ボトルを液体窒素内に１０分間沈めることにより冷凍し、２５℃のウォーターバスにおける１５〜２０分間のインキュベーションにより解凍した。サンプルを１０サイクルの冷凍／解凍に付し、アリコートを０、１、２、４、６、８、および１０サイクルの後に解析のために取り除いた。解析に先立って、全サンプルにおけるタンパク質濃度を、それ以外の点においては等しい製剤において０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈することで標準化した。ＨＭＷのパーセンテージをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。表６に示されているように、ＧＰ１ｂ−Ｉｇはこの製剤において広範な濃度にわたって安定であった。
【００８０】
【表６】
2009516692.tif 000008
【００８１】
Ｃ．ＧＰ１ｂ−Ｉｇ製剤の長期にわたる安定性
精製ＧＰ１ｂ−Ｉｇを使用のために解凍するまで−８０℃で保管した。タンパク質濃度をＡ２８０により１９ｍｇ／ｍｌと推定した。ＧＰ１ｂ−Ｉｇを、適当なストック溶液における希釈によって、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．５）、１．８％のグリシン、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のショ糖、および０．０１％のポリソルベート−８０内において１０ｍｇ／ｍｌに製剤化した。得られた製剤を０．２μｍのフィルターユニットを通してろ過し、ガラスバイアルに分配した。バイアルをスチールトレイ上に置き、凍結乾燥した。凍結乾燥は、表７にまとめたサイクルのパラメーターに従って行った。
【００８２】
【表７】
2009516692.tif 000009
【００８３】
サイクルの完了の際に凍結乾燥チャンバを乾燥窒素で再充填し、その後ストッパーを弱め、残りの真空を解除した。バイアルに速やかにクリンプを付し、ラベルを付し、２〜８℃、２５℃、または４０℃で保管した。
【００８４】
各時点（０、１、２、３、４、６、９、および１２ヶ月）において、１つまたは複数の凍結乾燥バイアルを開封した。生産物の固形物を外観について評価し、残余水蒸気をカールフィッシャー滴定により決定した。固形物を次に、外観および復元時間についてモニターしながら１ｍｌの注射用水（ＷＦＩ）で復元した。復元の後、４００μｌの製剤を含む２ｍｌのクライオバイアル内に電極を浸すことによりｐＨを測定した。残りの溶液を３×２００μｌのアリコートに分割し、そのうちの２つは−８０℃で冷凍し、１つは解析用として２〜８℃で保存した。
【００８５】
復元したＧＰ１ｂ−Ｉｇ製剤を同一の溶液に１０回希釈し、１ｍｇ／ｍｌの溶液を理論上得た。実際のタンパク質濃度は、ＵＶ透過性の９６ウェルプレートを用いてＵＶ分光法により測定した。タンパク質濃度は以下の式により計算した：濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝希釈係数×（Ａ２８０−Ａ３２０）／（１．１）。
【００８６】
生物活性を、ヒトの血漿由来ＶＷＦに対するＧＰ１ｂ−Ｉｇの結合の程度として評価した。測定したタンパク質濃度を、ユニット／μｇで表される特異的活性を計算するために用いた。
【００８７】
ＨＭＷの蓄積をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定し、全種に対するパーセンテージとして表した。
【００８８】
低分子量種（ＬＭＷ）の蓄積を逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣによりモニターし、全種に対するパーセンテージとして表した。
【００８９】
硫酸化されたアイソフォームの分布を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）により決定した。
【００９０】
表８から表１０に示されているように、これらの分析は、試験した条件下において少なくとも９ヶ月の間このＧＰ１ｂ−Ｉｇ製剤が安定であるということを実証している。表８は２〜８℃での保管の後に得られた結果を示す。表９は２５℃での保管の後に得られた結果を示す。表１０は４０℃での保管の後に得られた結果を示す。
【００９１】
【表８】
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【００９２】
【表９】
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【００９３】
【表１０】
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【実施例３】
【００９４】
ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ製剤
Ａ．ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇの背景
ＩＬ−１３Ｒはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）の主要な受容体である。ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇは、米国特許第６２６８４８０号に記載されているような、スペーサー配列およびヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２ＣＨ３領域に連結しているＩＬ−１３Ｒα２の可溶性の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇの等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、およそ４．３のｐＩに集合した、３．８から４．７のｐＨ範囲内の顕著なバンドを示す。ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇの翻訳後修飾にはＮ結合型グリコシル化が含まれる。ＩＬ−１３Ｒ−ＩｇにおけるＮ結合型グリカンにはシアル化された構造が含まれる。
【００９５】
Ｂ．ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ製剤の最適化
ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇを、４つの異なる製剤：１０ｍＭのＮａＰＯ４、０．０１％のポリソルベート−８０、１％のショ糖、および２％のマンニトール（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＮａＰＯ４、０．０１％のポリソルベート−８０、０．９％のショ糖、および１．８％のグリシン（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０１％のポリソルベート−８０、１％のショ糖、および２％のマンニトール（ｐＨ７．４）；または１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０１％のポリソルベート−８０、０．９％のショ糖、および１．８％のグリシン（ｐＨ７．４）内において１０ｍｇ／ｍｌで製剤化した。凍結乾燥バイアルを最大１２週間、４℃、２５℃、および４０℃で保管した。各時点において、各製剤と温度との組合せの１つまたは複数のバイアルを復元し、タンパク質の回収（Ａ２８０またはＳＥＣによる）、ＨＭＷの蓄積（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる）、または生物活性（ＩＬ−１３依存性細胞系の増殖の阻害についての分析におけるＩＣ５０による）について分析した。表１１は、保管して１２週間後の各製剤および温度についての、Ａ２８０により評価したタンパク質回収のパーセンテージを示す。表１２は、保管して１２週間後の各製剤および温度についての、ＳＥＣにより評価したタンパク質回収のパーセンテージを示す。表１３は、製剤（上記に挙げた４つ）と、温度（４℃、２５℃、または４０℃）と、保管期間（０、１ヶ月間、７週間、または１２週間）との各組合せ、ならびに凍結乾燥後の出発物質についての、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより評価したＨＭＷ蓄積のパーセンテージを示す。表１４は、４週間（２〜８℃または２５℃で）、７週間（２〜８℃または２５℃で）、または１２週間（２〜８℃、２５℃、または４０℃で）の各製剤、および凍結乾燥後の出発物質についての、ＩＣ５０のデータを示す。
【００９６】
【表１１】
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【００９７】
【表１２】
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【００９８】
【表１３】
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【００９９】
【表１４】
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【０１００】
Ｃ．ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ製剤の長期にわたる安定性
精製ＩＬ−１３Ｒを、１％のショ糖、２％のマンニトール、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のポリソルベート−８０、および１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）内において１０ｍｇ／ｍｌに製剤化した。５ｍｌの管状バイアルを１ｍｌの各製剤で満たし、Ｌｙｏ−Ｓｔａｒ（商標）開発乾燥器内で凍結乾燥した。凍結乾燥バイアルを２〜８℃、２５℃、または４０℃で最長２４週間保管し、サンプルを０、４、７、１２、および２４週間で解析した。サンプルを、外観（復元の前後）、ｐＨ、タンパク質濃度（Ａ２８０による）、ＨＭＷ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる）、および生物活性（ＩＣ５０）について分析した。表１５〜１７に示されているように、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ製剤は試験した条件下で少なくとも２４週間にわたって安定である。表１５は２〜８℃での保管の後に得られた結果を示す。表１６は２５℃での保管の後に得られた結果を示す。表１７は４０℃での保管の後に得られた結果を示す。
【０１０１】
【表１５】
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【０１０２】
【表１６】
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【０１０３】
【表１７】
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【０１０４】
本明細書における実施形態は本発明の実施形態の実例を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者には、多くの他の実施形態が本発明により包含されることが容易に認識されよう。本明細書の開示において引用された全ての刊行物および特許は、参照により全体が組み込まれる。参照により組み込まれる物質が本明細書と相反するか矛盾する場合に限り、本明細書はあらゆるこれらの物質に優先する。本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明に対する先行技術であることを承認するものではない。特に明記しない限り、全てのパーセンテージは重量／重量の値をいう。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】最大１４回までの冷凍／解凍サイクル後の、ＧＰ１ｂ−Ｉｇ製剤におけるタンパク質の凝集およびタンパク質の回収に対するポリソルベート−８０の影響を示す図である。ＧＰ１ｂ−Ｉｇは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭのＮａＣｌ、および０％、０．００５％、０．０１％、または０．０２％のポリソルベート−８０内において２ｍｇ／ｍＬで製剤化した。各製剤のバイアルを最大１４サイクルまでの冷凍／解凍に付し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって高分子量種（ＨＭＷ）の％について分析した。タンパク質の回収を２８０および２１４ｎｍでのＨＰＬＣ検出器のシグナルによってモニターした。Ｘ軸は冷凍／解凍サイクルの回数を示す。Ｙ軸はＨＭＷのパーセンテージを示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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