(57)【要約】  本発明は、変異型Fc領域を含む分子、特にポリペプチド、より詳細には免疫グロブリン(例えば、抗体)に関し、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、この変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べてより高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合する。本発明の分子は、疾患、障害または感染に伴う1種または複数の症状を予防、治療または回復するのに特に有用である。本発明の分子は、特に、FcγRによって媒介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)の効力が向上することが望ましい疾患または障害、例えば、癌、感染症を治療または予防するのに、またその効果がADCCによって媒介される治療用抗体の治療効力を向上させる上で有用である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型Fc領域を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、野生型Fc領域を含むポリペプチドと比べて改変された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変は、243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、305位でのイソロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および300位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および305位でのイソロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換および292位でのプロリンによる置換;243位でのロイシンによる置換;ならびに273位でのフェニルアラニンによる置換からなる群から選択される一組の置換を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
変異型Fc領域を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変は、243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、305位でのイソロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および300位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および305位でのイソロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換および292位でのプロリンによる置換;243位でのロイシンによる置換;ならびに273位でのフェニルアラニンによる置換からなる群から選択される一組の置換を含む、前記ポリペプチド。
【請求項３】
変異型Fc領域を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合し、前記ポリペプチドがさらに、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIBに結合するよりも低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変は、243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および300位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および305位でのイソロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換および292位でのプロリンによる置換;243位でのロイシンによる置換;ならびに273位でのフェニルアラニンによる置換からなる群から選択される一組の置換を含む、前記ポリペプチド。
【請求項４】
Fc領域がヒトIgG Fc領域である、請求項1、2または3に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ヒトIgG Fc領域がヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域である、請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
抗体である、請求項1、2または3に記載のポリペプチド。
【請求項７】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項6に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト化抗体である、請求項6に記載の抗体。
【請求項９】
CD16AまたはCD32Bに結合する可変ドメインを含む、請求項6に記載の抗体。
【請求項１０】
2B6である、請求項6に記載の抗体。
【請求項１１】
2B6のヒト化型である、請求項6に記載の抗体。
【請求項１２】
2B6抗体のCD32Bとの結合を競合的に阻害する、請求項6に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項1、2または3に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１４】
請求項13に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
発現ベクターである、請求項14に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項15に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項1、2または3に記載のポリペプチドを組換えによって産生するための方法であって、(i)培地中で、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、および(ii)前記ポリペプチドを前記培地から回収することを含む、前記方法。
【請求項１８】
癌抗原に特異的に結合する、変異型Fc領域を含む治療用抗体であって、前記治療用抗体が、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変は、243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、305位でのイソロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および300位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および305位でのイソロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換および292位でのプロリンによる置換;243位でのロイシンによる置換;ならびに273位でのフェニルアラニンによる置換からなる群から選択される一組の置換を含む、前記治療用抗体。
【請求項１９】
癌抗原に特異的に結合する、変異型Fc領域を含む治療用抗体であって、前記治療用抗体が、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合し、前記治療用抗体がさらに、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγRIIBに結合するよりも低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変は、243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および300位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および305位でのイソロイシンによる置換;243位でのロイシンによる置換および292位でのプロリンによる置換;243位でのロイシンによる置換;ならびに273位でのフェニルアラニンによる置換からなる群から選択される一組の置換を含む、前記治療用抗体。
【請求項２０】
野生型Fc領域を含む比較可能な治療用抗体と比べて増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を媒介する、請求項18または19に記載の治療用抗体。
【請求項２１】
Herceptin(登録商標)、Rituxan(登録商標)、IC14、PANOREX(商標)、IMC-225、VITAXIN(商標)、Campath 1H/LDP-03、LYMPHOCIDE(商標)、またはZEVLIN(商標)である、請求項18または19に記載の治療用抗体。
【請求項２２】
前記癌抗原が、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミン転移酵素、p15、β-カテニン、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、ヒトパピローマウイルス-E7、またはMUC-1である、請求項18または19に記載の治療用抗体。
【請求項２３】
癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療する方法であって、前記患者に、前記癌抗原に結合する治療上有効量の請求項18または19に記載の治療用抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記癌抗原が、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミン転移酵素、p15、β-カテニン、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、ヒトパピローマウイルス-E7、またはMUC-1である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌抗原が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、または膵癌の抗原である、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
1つまたは複数の追加の癌治療を施すことをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記追加の癌治療が、化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および外科手術からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者がヒトである、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
治療上有効量の請求項1、2または3に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療上有効量の請求項6に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
治療上有効量の請求項7に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
治療上有効量の請求項18または19に記載の治療用抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
1つまたは複数の追加の抗癌剤をさらに含む、請求項32に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記1つまたは複数の抗癌剤が、化学療法剤、放射線治療剤、ホルモン療法剤、または免疫療法剤である、請求項33に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
請求項6に記載の抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３６】
請求項35に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３７】
発現ベクターである、請求項36に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項37に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３９】
請求項6に記載の抗体を組換えによって産生するための方法であって、
(i)培地中で、
(a)前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、
(b)前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、
を含む宿主細胞を前記抗体の発現に適した条件下で培養すること、および、
(ii)前記抗体を前記培地から回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項４０】
癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療または管理する方法であって、前記患者に、前記癌抗原に結合する治療上有効量の請求項6に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療または管理する方法であって、前記患者に、治療上有効量の請求項18または19に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
野生型Fc領域を含む比較可能な抗体と比べて増強されたADCC活性を有する、請求項6に記載の抗体。
【請求項４３】
前記変異型Fc領域が、表5、6、7または8に挙げられたアミノ酸改変のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1、2または3に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  発明の分野
本発明は、変異型Fc領域を含む分子、特にポリペプチド、より詳細には免疫グロブリン(例えば、抗体)に関し、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、この変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べてより高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合する。本発明の分子は、疾患、障害または感染に伴う1種または複数の症状を予防、治療または回復するのに特に有用である。本発明の分子は、特に、FcγRによって媒介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)の効率が向上することが望ましい疾患または障害、例えば、癌、感染症を治療または予防するのに、またその効果がADCCによって媒介される治療用抗体の治療効率を向上させる上で有用である。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
2.1  Fc受容体および免疫系におけるその役割
抗体抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、幅広い一連の応答をもたらし、これは、抗体依存性細胞傷害、肥満細胞脱顆粒、食作用などのエフェクター機能から、例えば、リンパ球増殖および抗体分泌を調節する免疫調節シグナルにまで及ぶ。こうした相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のFcドメインが、造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体に結合することによって開始される。抗体および免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Fc受容体の構造不均一性から生じる。Fc受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると推定される構造的に関係したリガンド結合ドメインを共有する。
【０００３】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリータンパク質のメンバーであるFc受容体は、免疫グロブリン分子のFc部分に結合することができる表面糖タンパク質である。このファミリーの各メンバーは、Fc受容体のα鎖上の認識ドメインを介して1種または複数のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Fc受容体は、免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性によって定義される。IgGに対するFc受容体はFcγR、IgEに対するFc受容体はFεR、IgAに対するFc受容体はFcαRと称される。様々なアクセサリー細胞が、異なるアイソタイプの抗体に対するFc受容体を有し、所与の応答にどのアクセサリー細胞が関与するかを抗体のアイソタイプが決定する(Ravetch J.V. et al. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. et al. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al. 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681; Ravetch J.V. et al. 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4): 553-60に総説がある)。様々なFc受容体、それらを発現する細胞、およびそれらのアイソタイプ特異性を表1にまとめる(Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから引用)。
【０００４】
Fcγ受容体
このファミリーの各メンバーは、C2セットの免疫グロブリン関連ドメインに関係する細胞外ドメイン、1回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを有する内在性膜糖タンパク質である。3種のFcγRが知られており、それぞれFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)と称される。3種の受容体は異なる遺伝子によってコードされるが、3種のファミリーメンバー間の相同性が高いことは、これらが共通の祖先からおそらく遺伝子重複によって生じたことを示唆する。
【０００５】
FcγRII(CD32)
FcγRIIタンパク質は、40KDaの内在性膜糖タンパク質であり、単量体モノマーIgに対する親和性が低いので(106M-1)、複合体化したIgGにのみ結合する。この受容体は、最も広く発現されているFcγRであり、単球、マクロファージ、B細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めたすべての造血細胞上に存在する。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を2つしか有していないので、IgGに対する親和性がFcγRIよりもはるかに低い。3種のヒトFcγRII遺伝子(FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C)が存在し、これらはすべて集合体または免疫複合体のIgGに結合する。
【０００６】
FcγRII-AとFcγRII-Bの細胞質ドメイン内の明確な相違が、受容体連結に対して2種の機能的に異質な応答を生じる。基本的な相違は、Aアイソフォームが食作用、呼吸バーストなどの細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開始するのに対し、Bアイソフォームは例えば、Ｂ細胞活性化を抑制する抑制性シグナルを開始することである。
【０００７】
FcγRを介したシグナル伝達
活性化シグナルおよび抑制性シグナルはいずれも、連結後にFcγRを介して伝達される。こうした正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的相違から生じる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の2種の異なるドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)または免疫受容体チロシン抑制性モチーフ(ITIM)と呼ばれ、この異なる応答の原因となる。こうした構造に異なる細胞質内酵素が動員されることにより、FcγRによって媒介される細胞応答の結果が決まる。ITAM含有FcγR複合体はFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAを含むが、ITIM含有複合体はFcγRIIBしか含まない。
【０００８】
ヒト好中球は、FcγRIIA遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介したFcγRIIAのクラスター形成は、ITAMリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと一緒にITAMを凝集する働きをする。ITAMリン酸化は、Sykキナーゼのドッキング部位として働き、Sykキナーゼの活性化は下流の基質(例えば、PI3K)の活性化をもたらす。細胞の活性化により炎症誘発性メディエーターが放出される。
【０００９】
FcγRIIB遺伝子はBリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはFcγRIIAと96%同一であり、区別ができない形でIgG複合体に結合する。FcγRIIBの細胞質ドメインにITIMが存在することが、この抑制性サブクラスのFcγRを定義付ける。最近、この抑制の分子的機序が確立された。活性化FcγRと一緒に連結すると、FcγRIIBのITIMはリン酸化され、イノシトールポリリン酸5'-ホスファターゼのSH2ドメイン(SHIP)を引きつけ、これが、ITAM含有FcγRによって媒介されるチロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、その結果、細胞内Ca++の流入が阻止される。したがって、FcγRIIBの架橋は、FcγR連結に対する活性化応答を低下させ、細胞応答性を抑制する。こうして、B細胞活性化、B細胞増殖および抗体分泌が中断する。
【表１】
2009507470.tif 000003
【００１０】
2.2  関連疾患
2.2.1  癌
新生物または腫瘍は、制御されない異常な細胞増殖から生じる新生物塊であり、良性または悪性であり得る。良性腫瘍は通常、局在化したままである。悪性腫瘍はまとめて癌と称される。用語「悪性」は一般に、腫瘍が、隣接する体構造に侵入し、これを破壊し、離れた部位に広がって死を引き起こす恐れがあることを意味する(総説として、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122を参照されたい)。癌は、身体の多数の部位で生じ、その起源に応じて異なる挙動を示し得る。癌性細胞は、それが発生した身体の部分を破壊し、次いで身体の(複数の)他の部分に広がり、そこで新たな増殖を開始し、さらに破壊を引き起こす。
【００１１】
毎年120万人を超える米国人が癌を発症している。癌は米国において2番目に多い死亡症例であり、現在の傾向が続くと、2010年までに癌は死因の第1位になると予想される。肺癌および前立腺癌が米国における男性の癌の死因のトップである。肺癌および乳癌が米国における女性の癌の死因のトップである。米国の男性の2人に1人は生涯の間のある時期に癌と診断される。米国の女性の3人に1人は生涯の間のある時期に癌と診断される。
【００１２】
癌の治療法はいまだ見出されていない。外科手術、化学療法、放射線治療などの現在の治療選択肢は、効果がないかまたは重大な副作用を示すかのいずれかであることが多い。
【００１３】
癌治療
現在、癌治療は、患者の新生細胞を根絶するための外科手術、化学療法、ホルモン療法および/または放射線治療を含み得る(例えば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IVを参照されたい)。最近では、癌治療に生物学的療法または免疫療法も含まれると考えられる。こうした手法にはすべて、患者にとって重大な欠点が伴う。例えば、外科手術は、患者の健康状態によって禁忌であるか、または患者にとって容認できないものである可能性もある。さらに、外科手術では、新生物組織が完全に除去されない可能性もある。放射線療法は、放射線に対して新生物組織が正常組織よりも高い感受性を示す場合にのみ有効であり、放射線療法は、しばしば重大な副作用を誘発することがある。ホルモン療法は、単剤として投与されることはまれであり、有効であり得るが、他の治療で癌細胞の大部分を除去した後に癌の再発を予防または遅延するのに使用されることが多い。生物学的療法/免疫療法は数が限定されており、発疹もしくは腫脹、発熱、悪寒および疲労を含めたインフルエンザ様症状、消化管問題、またはアレルギー反応などの副作用を生じる恐れがある。
【００１４】
化学療法に関しては、癌の治療に利用可能な種々の化学療法剤が存在する。癌化学療法剤の大部分は、DNA合成を直接的に、またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成を阻害することにより間接的に阻害して、DNA複製および付随する細胞分裂を阻止することによって作用する(例えば、Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamom Press, New York, 1990)を参照されたい)。こうした薬剤には、ニトロソ尿素などのアルキル化剤、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素などの代謝拮抗剤、およびエトポシド、カンパテシン(campathecin)、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどの他の薬剤が含まれ、必ずしも細胞周期特異的でないが、DNA複製に対して影響を及ぼすのでS期の細胞を死滅させる。他の薬剤、具体的にはコルヒチン、ならびにビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイドは、微小管重合を妨害して有糸分裂を停止させる。化学療法のプロトコールは一般に、治療の効率を向上させるために化学療法剤を併用投与することを含む。
【００１５】
種々の化学療法剤が利用可能であるにもかかわらず、化学療法には多数の欠点がある(例えば、Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" in Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., ch. 12, sect. 10を参照されたい)。ほとんどすべての化学療法剤は毒性があり、化学療法は、重症の悪心、骨髄抑制、免疫抑制などを含めた、重大でしばしば危険な副作用を引き起こす。さらに、化学療法剤を併用投与しても、多数の腫瘍細胞は、化学療法剤に対して耐性を有するかまたは耐性を発達させる。実際、治療プロトコールで使用される特定の化学療法剤に対して耐性を有するこうした細胞は、他の薬物に対して、さらには特定の治療で使用される薬物の作用機序と異なる機序によって作用する薬剤に対してさえも耐性を有することが立証されることが多い。この現象は、多面的薬剤耐性または多剤耐性と称される。したがって、多数の癌は薬物耐性を有するので、標準的な化学療法治療プロトコールに不応であることが判明している。
【００１６】
代替の癌治療法、特に、外科手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法などの標準的な癌治療法に不応であることが判明している癌の治療法が大いに必要とされている。有望な代替法は免疫療法であり、この方法では癌細胞が癌抗原特異的抗体によって特異的に標的とされる。免疫応答の特異性を利用することに多大な努力が払われており、例えば、ハイブリドーマ技術は腫瘍選択的モノクローナル抗体の開発を可能にしており(Green M.C. et al., 2000 Cancer Treat Rev., 26: 269-286; Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(suppl. 14):43-51を参照されたい)、ここ数年で、米国食品医薬品局は癌治療用の最初のMAb:非ホジキンリンパ腫用のリツキシン(Rituxin)(抗CD20)および転移性乳癌用のハーセプチン(Herceptin)[抗(c-erb-2/HER-2)]を承認した(Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res., 3: 86-90)。しかし、例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害(「ADCC」)を媒介する抗体エフェクター機能の効力は、そのような治療に対する妨げとなる。したがって、このような免疫療法の効率を改善する方法が必要とされる。
【００１７】
2.2.2  炎症性疾患および自己免疫疾患
炎症は、身体の白血球および化学物質が細菌、ウイルスなどの生体異物による感染から我々の身体を防御する過程である。炎症は通常、患部の疼痛、腫脹、温感および発赤を特徴とする。サイトカインおよびプロスタグランジンとして知られる化学物質がこの過程を制御し、規則正しく自己限定的なカスケードで血液または患部組織中に放出される。この化学物質の放出は、傷害または感染の部位への血流を増加させ、発赤および温感をもたらすこともある。この化学物質の中には、組織中への体液の漏出を引き起こして腫脹をもたらすものもある。この防御過程は、神経を刺激し、疼痛を引き起こす恐れがある。こうした変化は、関連する部位で限定された期間に起こると身体の有益に働く。
【００１８】
自己免疫障害および/または炎症性障害では、免疫系は戦うべき生体異物が存在しないのに炎症応答を誘発し、身体の通常の防御免疫系が、誤って自己を攻撃することによりそれ自体の組織に損傷を与える。異なる自己免疫障害が多数存在し、身体を様々な方法で冒す。例えば、多発性硬化症の個体では脳が冒され、クローン病の個体では腸が冒され、また関節リウマチの個体では様々な関節の滑膜、骨および軟骨が冒される。自己免疫障害が進行すると、1つまたは複数の種類の体組織の破壊、器官の異常増殖、または器官機能の変化が生じることもある。自己免疫障害は、1種の器官型または組織型だけを冒すこともあり、または複数の器官および組織を冒すこともある。自己免疫障害によって通常冒される器官および組織には、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺(例えば、甲状腺または膵臓)、筋肉、関節、および皮膚が含まれる。自己免疫障害の例には、それだけには限定されないが、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、１型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、自己免疫内耳疾患、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、自己免疫性肝炎、家族性大腸腺腫症および潰瘍性大腸炎が含まれる。
【００１９】
関節リウマチ(RA)および若年性関節リウマチは、炎症性関節炎の種類である。関節炎は、関節における炎症を説明する一般用語である。すべてではないが、関節炎には誤って導かれた炎症の結果である種類もある。関節リウマチに加えて、炎症を伴う他の種類の関節炎には、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎 関節炎、および痛風性関節炎が含まれる。関節リウマチは、身体の両側の関節(両手、両手首または両膝など)で起こる慢性関節炎の一種である。この対称性が、関節リウマチを他の種の関節炎と区別するのに役立つ。関節リウマチは、関節を冒すことに加え、皮膚、眼、肺、心臓、血液または神経を冒すこともある。
【００２０】
関節リウマチは、世界の人口の約1%が罹り、身体障害になる可能性がある。米国における関節リウマチの発生数は約290万件である。女性は男性よりも2〜3倍多く発症する。関節リウマチを発症する典型的な年齢は25歳から50歳の間である。若年性関節リウマチは、71,000人の若い米国人(18歳以下)が発症しており、女子の発症数は男子より6倍多い。
【００２１】
関節リウマチは、身体の免疫系が、関節に滑液を分泌する滑膜を異物として不適切に識別する自己免疫障害である。炎症が起こり、関節内および関節周囲の軟骨および組織が損傷を受けるかまたは破壊される。重症例では、この炎症は、他の関節組織および周囲の軟骨に広がり、骨および軟骨を侵食または破壊し、関節変形をもたらすこともある。身体は損傷を受けた組織を瘢痕組織で置き換えるので、関節内の正常な空間が狭くなり、骨同士が融合する。関節リウマチは、硬直、腫脹、疲労、貧血、体重減少、発熱、さらにはしばしば肢体不自由にする疼痛を生じる。関節リウマチのいくつかの一般的症状には、目覚め時の1時間以上継続する関節硬直;特定の指関節または手関節の腫脹;関節周囲の軟部組織の腫脹;および関節の両側の腫脹が含まれる。腫脹は、疼痛を伴うかまたは伴わずに起こることがあり、進行的に悪化するか、または何年間も同じ状態が続いた後に進行することもある。
【００２２】
関節リウマチの診断は、疼痛を伴う関節の詳細な位置および対称性、朝の関節硬直の存在、皮下の瘤および小結節(リウマチ結節)の存在、関節リウマチを示唆するエックス線検査の結果、および/またはリウマチ因子と呼ばれる血液検査の陽性結果を含めた複数の要因の組合せに基づく。すべてではないが多くの関節リウマチ患者は、リウマチ様因子抗体をその血液中に有する。リウマチ因子は、関節リウマチを患っていない人にも存在することがある。他の疾患でも血液中にリウマチ因子が産生されることがある。こうした理由から、関節リウマチの診断は、血液中のリウマチ因子の存在だけでなくいくつかの因子の組合せに基づく。
【００２３】
この疾患の典型的な経過は、持続的であるが変動する関節症状の１つであり、約10年後に患者の90%は、骨および軟骨に構造的損傷を示すことになる。わずかな比率で、完全に治癒する短期の疾病に罹る人もいれば、また多数の関節変形、時には疾患の他の徴候を有する極めて重症の疾患に罹る人もいる。炎症の過程で、関節内の骨および軟骨の侵食または破壊を引き起こす。関節リウマチには、持続的抗原提示、T細胞刺激、サイトカイン分泌、滑膜細胞活性化、および関節破壊の自己免疫サイクルが存在する。この疾患は、個人および社会の両方に多大な影響を及ぼして、相当な疼痛、機能障害および身体障害をもたらし、ならびに医療費および賃金損失は数百万ドルにも達する(例えば、NIHウェブサイトおよびNIAIDウェブサイトを参照されたい)。
【００２４】
関節炎の現在利用可能な治療法は、抗炎症薬または免疫抑制薬を用いて関節の炎症を軽減することに重点が置かれている。任意の関節炎の第一選択の治療薬は通常、抗炎症薬、例えば、アスピリン、イブプロフェン、ならびにセレコキシブおよびロフェコキシブなどのCox-2阻害薬である。「第二選択薬」には、金、メトトレキサート、およびステロイドが含まれる。これらは十分に確立された関節炎の治療薬であるが、こうした選択の治療薬だけで寛解する患者はほとんどいない。最近、関節リウマチの病因の理解が進んだことから、メトトレキサートがサイトカインに対する抗体または組換え可溶性受容体と併用されるようになった。例えば、腫瘍壊死因子(TNF)-αの組換え可溶性受容体が、関節炎の治療においてメトトレキサートと併用されている。しかし、メトトレキサートとTNF-αの組換え可溶性受容体などの抗TNF-α剤との組合せで治療した患者の約50%しか臨床的に有意な改善を示さない。多数の患者は、治療にもかかわらず不応性のままである。関節リウマチ患者にとって困難な治療上の問題が依然として残っている。多数の現行の治療薬は、高い頻度で副作用を示すか、または疾患の進行を完全に阻止することができない。これまでのところ、理想的な治療はなく、治癒することはない。より効果的に関節リウマチおよび他の自己免疫障害を治療する新規治療薬が必要とされている。
【００２５】
2.2.3  感染症
疾患を引き起こす病原体は、5つの群:ウイルス、細菌、真菌、原生動物および蠕虫(寄生虫)に分類される。こうした病原体の注目すべき変種は、適応免疫の2種の決定的な特徴の自然選択をもたらした。第一に、広範囲の様々な病原体を認識することができる利点が、同等またはそれ以上の多様性を有するB細胞およびT細胞上の受容体を発達させた。第二に、病原体の異なる生息地および生活環が、ある範囲の異なるエフェクター機構によって妨害されなければならない。各病原体の特性は、その伝染様式、その複製機構、その病因またはそれが疾患を引き起こす手段、およびそれが誘発する応答である。
【００２６】
天然痘、コレラ、チフス、赤痢、マラリアなどによって引き起こされるヒトの苦痛および死の記録が感染症の存在を際立たせている。改善された公衆衛生、免疫化および抗菌剤療法によって与えられる制御に目覚ましい成功を収めたにもかかわらず、感染症は、現代医学の共通の重大な問題であり続ける。人間の最も一般的な疾患である感冒は感染症であり、恐れられている現代病のAIDSもそうである。以前は変性疾患であると考えられたいくつかの神経学的慢性疾患も感染性であると証明された。将来、感染症が主要な医学的問題として明らかにされ続けることに疑いの余地はない。
【００２７】
ヒトおよび動物の非常に多くの疾患は、上記の病原体のいずれかからの悪性感染および日和見感染によって生じる(Belshe (Ed.) 1984 Textbook of Human Virology, PSG Publishing, Littleton, MAを参照されたい)。
【００２８】
感染症の1つの範疇は、例えばウイルス感染である。呼吸器、CNS、皮膚、尿生殖路、眼、耳、免疫系、消化管および筋骨格系を含めた多様な組織のウイルス性疾患が、あらゆる年齢の莫大な数のヒトを冒している(Wyngaarden and Smith, 1988, Cecil Textbook of Medicine, 18th Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.1750-1753の表328-2を参照されたい)。効果的な抗ウイルス療法の設計にかなりの努力が注ぎ込まれてきたが、ウイルス感染は世界中の何百万の人々の生命を脅かし続けている。一般に、抗ウイルス薬を開発する試みは、ウイルスの生活環のいくつかの段階に重点が置かれていた(例えば、HIVについて論じているMitsuya et al., 1991, FASEB J. 5:2369-2381を参照されたい)。しかし、多数の現在の抗ウイルス薬を使用することに伴う一般的な欠点は、その有害な副作用、例えば、宿主に対する毒性またはあるウイルス系統による耐性である。
【発明の開示】
【００２９】
3. 発明の概要
本発明は、酵母ディスプレイ法を使った、FcγR受容体(例えば、活性化FcγR、抑圧性FcγR)に対する親和性が改変された突然変異型ヒトIgG1重鎖Fc領域の同定に一部基づいている。in vivo動物モデリングおよび臨床的実験により、Fc領域は、モノクローナル抗体療法の結果を判定する上で必須の役割を果たすことが示される。治療用モノクローナル抗体およびFc領域に融合した可溶性ポリペプチドにおけるFc領域機能(例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)活性)を最適化する現在の手法は、構造解析および/またはコンピュータ支援設計に基づく限定された数の単一アミノ酸変化に焦点を当てている。Fc領域を工学的に改変する際の代替の手法は、Fc領域機能を最適化するためのFc領域のグリコシル化に焦点を当てている。本発明は部分的に、Fc変異型の無作為のライブラリーから可能な突然変異体を、それだけには限定されないがADCC、CDCなどの、1種または複数のFc機能活性の改変について選択することに基づく。本発明は、Fc領域を工学的に改変し、構造的試験によって同定された期待される領域の外側で新規Fc変異体を同定およびスクリーニングするための方法を提供する。期待される領域は、本明細書では、構造的および/または生化学的試験に基づいて、Fcリガンドと接触する領域を指す。
【００３０】
本発明は、細胞ベースの機能的アッセイと最新技術で自動化されたコンビナトリアルライブラリー構築を組み合わせることによる、1種または複数のFcエフェクター機能が改善されたFc変異体を同定するためのディスカバリープラットフォームを提供する。本発明は、Fc内の対象の領域を、すべての可能なアミノ酸変化を包含する改変で飽和させることにより完全なコンビナトリアルライブラリーを組み立てる。改善された生物学的機能に基づいて突然変異体を選択するために、一組の結合および機能的アッセイを使用してコンビナトリアルライブラリーが試験される。
【００３１】
したがって、本発明は分子、好ましくはポリペプチド、およびさらに好ましくは、1つまたは複数の領域に、その改変がFcγRに対する変異型Fc領域の親和性を改変する、例えば、増大または低下させる1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換、しかし挿入または欠失も含む)を有する変異型Fc領域を含む免疫グロブリン(例えば、抗体)に関する。好ましくは、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させる。好ましい実施形態では、本発明の分子は、前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子(すなわち、Fc領域における1つまたは複数のアミノ酸改変を除き、本発明の分子と同一のアミノ酸配列を有する)がFcγRIIBに結合するよりも低い親和性で、さらに特異的にFcγRIIBに(前記Fc領域を介して)結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を有する分子を包含し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増強する。他の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を有する分子を包含し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を改変しない。好ましい実施形態は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAおよびFcγRIIAに対する親和性が増強されるが、FcγRIIBに対する親和性が低減された変異型Fc領域である。
【００３２】
本発明のFc変異体は、エフェクター機能を変化させる改変を含むがこれに限定されることはない他のFc改変と組み合わせてもよい。本発明は、本発明のFc変異体を他のFc改変と組み合わせて、抗体またはFc融合物において相加的な、相乗的な、または新規の特性を提供することを包含する。好ましくは、本発明のFc変異体は、それが組み合わされる改変の表現型を増強する。例えば、本発明のFc変異体が、野生型のFc領域を含む比較可能な分子よりも高い親和性でFcγRIIIAに結合することが知られている突然変異体と組み合わされた場合、本発明の突然変異体との組合せにより、FcγRIIIA親和性が何倍にも増強される。
【００３３】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564, Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662, Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59, Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543, Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984, Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117, Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119, Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104, Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969, Armour et aL, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624, Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184, Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933, Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26, Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575, Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604, Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65, Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490、米国特許第5,624,821号、米国特許第5,885,573号、米国特許第6,194,551号、PCT国際公開第00/42072号、PCT国際公開第99/58572号に開示されているFc変異体などの他の既知のFc変異体と組み合わせてもよい。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。ある実施形態では、本発明のFc変異体は、Fc変異体の1つまたは複数、すなわち、下記の表５、６、７および８で示される、野生型Fc領域と比べたアミノ酸改変と組み合わせてもよい。
【００３４】
本発明は、Fc領域のホモダイマーまたはヘテロダイマーである分子を包含する。Fc領域を含むヘテロダイマーは、2つのFc鎖が同じまたは異なる配列を有する分子を指す。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含むヘテロダイマー分子において、各鎖が他方の鎖と異なる1つまたは複数の改変を有する。他の実施形態では、変異型Fc領域を含むヘテロダイマー分子において、一方の鎖が野生型Fc領域を含み、他方の鎖が1つまたは複数の改変を有する。ヘテロダイマーのFc含有分子を工学的に改変する方法は当技術分野で知られており、本発明の範囲に包含される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、当業者に公知の標準的アッセイ(例えば、in vitroアッセイ)により決定した場合、その変異型Fc領域が、どんなFcγRにも結合しない、または前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて低下した親和性で結合する分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が1つのFcγRのみに結合し、前記FcγRがFcγRIIIAである分子を包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が1つのFcγRのみに結合し、前記FcγRがFcγRIIAである分子を包含する。さらに別の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が1つのFcγRのみに結合し、前記FcγRがFcγRIIBである分子を包含する。
【００３６】
本発明の分子のFcγRに対する親和性と結合特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわち、Fc領域のFcγRへの特異的結合を決定するための当技術分野で公知の、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを含むがこれに限定されることはないin vitroアッセイ(生化学的または免疫学的ベースのアッセイ)を使って最初に決定される(セクション5.2.1参照)。好ましくは、本発明の分子の結合特性は、1つまたは複数のFcγ媒介物エフェクター細胞機能を決定するためのin vitro機能アッセイにより特徴付けもされる(セクション5.2.6参照)。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、in vitroベースのアッセイにおける結合特性と類似の結合特性を、(本明細書に記載し開示するモデルなどの)in vivoモデルにおいて有する。しかし、本発明は、in vitroベースのアッセイにおいて所望の表現型を示さないがin vivoでは所望の表現型を確かに示す本発明の分子を排除するものではない。
【００３７】
詳細な実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記ポリペプチドが、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域は、329位、331位および332位のいずれにおいても置換を単に有しておらず、256位、290位、298位、312位、333位、334位、359位、360位、326位および430位のいずれのアラニン、330位でのリシン、339位でのスレオニン、320位でのメチオニン、326位でのセリン、326位でのアスパラギン、326位でのアスパラギン酸、326位でのグルタミン酸、334位でのグルタミン、334位でのグルタミン酸、334位でのメチオニン、334位でのヒスチジン、334位でのバリン、および334位でのロイシン、335位でのリシンのいずれの置換も含んでいないかまたは単に置換ではない分子を包含する。
【００３８】
別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記ポリペプチドが、野生型のFc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし1つまたは複数のアミノ酸改変は、256位、290位、326位、255位、258位、267位、272位、276位、280位、283位、285位、286位、331位、337位、268位、272位、もしくは430位のいずれかでアラニン、268位でアスパラギン、272位でグルタミン、286位でグルタミン、セリン、もしくはアスパラギン酸、290位でセリン、320位でメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはアルギニン、322位でグルタミン酸、326位でセリン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸、330位でリシン、335位でグルタミン、または301位でメチオニンによるいずれの置換も含んでいないかまたは単に置換ではない分子を包含する。
【００３９】
好ましい特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子がFcγRに対して改変された親和性を有するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域は、Sondermann et al., (2000 Nature, 406: 267-273、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする)により開示された相互作用などのFc-FcγR相互作用の結晶解析および構造解析に基づいて、FcγRと直接接触している位置に置換がない分子を包含する。前記Fc領域内の、FcγRと直接接触している位置の例は、アミノ酸234〜239 (ヒンジ領域)、アミノ酸265〜269(B/Cループ)、アミノ酸297〜299(C'/Eループ)、およびアミノ酸327〜332 (F/G)ループである。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、構造解析および結晶解析に基づいて、FcγRと直接接触していない、例えば、Fc-FcγR結合部位内にない少なくとも1つの残基の改変を含む。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む分子と比べて改変された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記少なくとも1つのアミノ酸改変は、255位、256位、258位、267位、268位、269位、270位、272位、276位、278位、280位、283位、285位、286位、289位、290位、292位、293位、294位、295位、296位、298位、300位、301位、303位、305位、307位、309位、312位、320位、322位、326位、329位、330位、332位、331位、333位、334位、335位、337位、338位、339位、340位、359位、360位、373位、376位、416位、419位、430位、434位、435位、437位、438位、439位のいずれにおいても置換を含まないかまたは単に置換ではない分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む分子と比べて改変された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域が255位、258位、267位、269位、270位、276位、278位、280位、283位、285位、289位、292位、293位、294位、295位、296位、300位、303位、305位、307位、309位、322位、329位、332位、331位、337位、338位、340位、373位、376位、416位、419位、434位、435位、437位、438位、439位のいずれにおいても置換を含まないかまたは単に置換ではなく、256位、290位、298位、312位、333位、334位、359位、360位、326位、もしくは430位のいずれでもアラニン、330位にリシン、339位にスレオニン、320位にメチオニン、326位にセリン、326位にアスパラギン、326位にアスパラギン酸、326位にグルタミン酸、334位にグルタミン、334位にグルタミン酸、334位にメチオニン、334位にヒスチジン、334位にバリン、または334位にロイシン、335位にリシン、268位にアスパラギン、272位にグルタミン、286位にグルタミン、セリン、もしくはアスパラギン酸、290位にセリン、320位にメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはアルギニン、322位にグルタミン酸、326位にセリン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸、330位にリシン、335位にグルタミン、または301位にメチオニンを有さない。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が268位、269位、270位、272位、276位、278位、283位、285位、286位、289位、292位、293位、301位、303位、305位、307位、309位、331位、333位、334位、335位、337位、338位、340位、360位、373位、376位、416位、419位、430位、434位、435位、437位、438位、もしくは439位のいずれにおいても置換を含まないかまたは単に置換ではなく、280位にヒスチジン、グルタミン、もしくはチロシン、290位にセリン、グリシン、スレオニン、もしくはチロシン、300位にロイシンもしくはイソロイシン、294位にアスパラギン、296位にプロリン、298位にプロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、もしくはバリン、295位にリシンを有さない分子を包含する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む分子と比べて低下した親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域が252位、254位、265位、268位、269位、270位、278位、289位、292位、293位、294位、295位、296位、298位、300位、301位、303位、322位、324位、327位、329位、333位、335位、338位、340位、373位、376位、382位、388位、389位、414位、416位、419位、434位、435位、437位、438位、もしくは439位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではない分子を包含する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が野生型Fc領域を含む分子と比べて増強された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域が280位、283位、285位、286位、290位、294位、295位、298位、300位、301位、305位、307位、309位、312位、315位、331位、333位、334位、337位、340位、360位、378位、398位、もしくは430位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではない分子を包含する。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、ただし、前記変異型Fc領域が330位、243位、247位、298位、241位、240位、244位、263位、262位、235位、269位、もしくは328位のいずれにおいても1置換を有していないか、または単に置換ではない、および243位にロイシン、298位にアスパラギン、241位にロイシン、240位にイソロイシンもしくはアラニン、244位にヒスチジン、330位にバリン、または328位にイソロイシンを有さない分子を包含する。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも2倍増大させる変異型Fc領域を含む。ある実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも2倍より多く、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍増大させる変異型Fc領域を含む。本発明の他の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、野生型Fc領域を含む分子と比べて、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに特異的に結合する。このような測定は、好ましくはin vitroアッセイである。
【００４４】
本発明は、活性化および/または抑制性Fcγ受容体に対する親和性が改変された分子を包含する。特に、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を有する分子を企図し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を低下させる。他の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を有する分子を包含し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を低下させ、さらにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域を低下させる。さらに他の実施形態では、本発明は、1つまたは複数アミノ酸改変を有する変異型Fc領域を有する分子を包含し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、さらにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させる。さらに他の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を有し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を低下させるが、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を改変しない分子を包含する。さらに他の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を有し、この改変は、野生型Fc領域を有する比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を低下させる分子を包含する。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変(すなわち、置換)を有し、その1つまたは複数の改変が、FcγRIIIAおよびFcγRIIBに野生型の親和性で結合する野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる変異型Fc領域を含む。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、256位、298位、333位、または334位のいずれでもアラニンによる置換ではない。
【００４６】
別の特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変(すなわち、置換)を有し、その1つまたは複数の改変が、FcγRIIAおよびFcγRIIBに野生型の親和性で結合する野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる変異型Fc領域を含む。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、320位でのアルギニンによる置換ではない。
【００４７】
最も好ましい実施形態では、変異型Fc領域を有し、活性化および/または阻害性受容体に対する親和性が改変された本発明の分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変が288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc10)(表5および6参照)、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換(MgFc13)、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換(MgFc27)、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc38)、または221位でのグルタミン酸による、270位でのグルタミン酸による、308位でのアラニンによる、311位でのヒスチジンによる、396位でのロイシンによる、および402位でのアスパラギン酸による置換(MgFc42)、または240位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc52)、または410位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc53)、または243位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、378位でのアスパラギン酸による、404位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc54)、または255位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc55)、または370位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換(MgFc59)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88A)、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換(MgFc155)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および396位での
ロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換である、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する。関連する実施形態では、変異型Fc領域は、下記の表5、6、7および8で開示される1つまたは複数アミノ酸改変をさらに含む。
【００４８】
改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子をスクリーニングおよび同定する好ましい方法は酵母表面ディスプレイ技術(総説については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているBoder and Wittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328: 430-444を参照されたい)である。具体的には、酵母表面ディスプレイは遺伝学的方法であり、それによって、Fc突然変異体を含むポリペプチドが、FcγRとの相互作用に利用可能な形で酵母細胞壁上に発現される。本発明の突然変異型Fc含有ポリペプチドの酵母表面ディスプレイは、当業者に知られている技術のいずれかまたは本明細書に記載の特定の方法に従って行うことができる。酵母ディスプレイは、所望の受容体に対する実際の結合を利用して、その受容体に対する結合が増強された変異型Fc領域を同定する利点を提供する。
【００４９】
本発明の一態様は、望ましい結合特性、例えば、突然変異型Fc融合タンパク質が、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに結合する能力を有する突然変異型Fc融合タンパク質を選択するための方法を提供する。突然変異型Fc融合タンパク質を提示する酵母細胞を、当技術分野の技術者に知られている、結合相互作用を評価するための任意の生化学または免疫学ベースのアッセイによってスクリーニングし、特徴付けることができる。詳細な実施形態では、突然変異型Fc融合タンパク質のスクリーニングは、1つまたは複数の生化学ベースのアッセイ、例えば、ELISAアッセイを使用して実施される。
【００５０】
好ましい実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の生化学に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。1つまたは複数の生化学アッセイは、それだけに限らないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析を含めて、Fc-FcγR相互作用、すなわちFc領域とFcγRの特異的結合の同定について当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。いくつかの実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の機能に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。機能に基づくアッセイは、本明細書の第5.2.6節に記載のものなどの1つまたは複数のFcγR媒介性エフェクター細胞機能の特徴付けについて当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。本発明の方法に従って使用することができるエフェクター細胞機能の非限定的な例には、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、C1q結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害がある。いくつかの実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の機能に基づくアッセイと組み合わせたまたはそれと並行した1つまたは複数の生化学に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。
【００５１】
本発明に従ってFcγRとFcの相互作用を測定するための好ましい方法は、本発明者らによって開発されたアッセイであり、受容体のそのリガンドに対する親和性が本質的に低い、例えば、FcγRIIBおよびFcγRIIIAに対してはマイクロモルの範囲であるにもかかわらず、相互作用の検出および定量を可能にする。この方法は、複合体化していないFcγRと比べて、Fc領域に対する結合活性が改善されたFcγR複合体(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIB)の形成を含む。詳細な実施形態では、本発明は、Fc領域に対する単量体FcγRの親和性と比べて、Fc領域に対する親和性が増強された四量体FcγR複合体を産生するための方法を包含し、前記方法は、(i)15アミノ酸AVITAG配列がFcγRの可溶性領域に作動的に連結するように融合タンパク質を産生すること、(ii)大腸菌BirA酵素を使用して、産生されるタンパク質をビオチン化すること、(iii)四量体FcγR複合体が形成されるように、産生されるビオチン化タンパク質をストレプトアビジン-フィコエリトリンと適切なモル比で混合することを含む。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、Fc領域を含むポリペプチドは、単量体の非複合体化FcγRに結合するより少なくとも8倍高い親和性で、本発明の方法に従って形成された四量体FcγR複合体に結合する。Fc領域を含むポリペプチドと四量体FcγR複合体の結合は、例えば蛍光活性化細胞スクリーニング(FACS)、ラジオイムノアッセイ、ELISAアッセイなど、当業者に知られている標準的な技術を使用して決定することができる。
【００５３】
本発明は、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイでFc領域を含む分子の機能を決定するための、上記に記載の方法に従って形成された免疫複合体の使用を包含する。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域を含む改変された免疫グロブリンを提供する。そのような免疫グロブリンには、天然にFcγR結合領域(例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域)を含有するIgG分子、またはFcγR結合領域(例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域)を含有するように工学的に改変された免疫グロブリン誘導体がある。本発明の改変された免疫グロブリンには、好ましくは、免疫特異的に、すなわち、特異的な抗原抗体結合を検定するための当技術分野で公知の免疫アッセイ法により決定される場合に非特異的結合と競合せずに、抗原に結合し、FcγR結合領域(例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域)を含有するあらゆる免疫グロブリン分子がある。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化型、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、ジスルフィド連結Fv、および、VLもしくはVHドメインのいずれか、または、抗原に特異的に結合し、ある種の場合には、FcγR結合領域を含有するよう工学的に改変されるもしくはFcγR結合領域に融合される相補性決定領域(CDR)までも含有する断片があるがこれらに限定されない。
【００５５】
ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリンが、増強されたエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を有するように、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを包含する。本発明の分子のエフェクター機能は、本明細書に記載の、または当技術分野の技術者に知られている任意のアッセイを使用してアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域を含む免疫グロブリンは、野生型と比べて少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍増強されたADCC活性を有する。
【００５６】
本発明は、その改変がFcγR活性化受容体および/またはFcγR抑制性受容体に対する治療用抗体の親和性を調節する、1つまたは複数のアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、Fc領域においてヒトまたはヒト化型治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)を工学的に改変することを包含する。一実施形態では、本発明は、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、1つまたは複数のアミノ酸残基の改変により、Fc領域においてヒトまたはヒト化型治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)を工学的に改変することを包含する。別の実施形態では、本発明は、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させ、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させる、1つまたは複数のアミノ酸残基の改変により、Fc領域においてヒトまたはヒト化型治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)を工学的に改変することに関する。工学的に改変された治療用抗体は、当業者に公知の標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能、例えば、増強されたADCC活性、貪食性活性などをさらに有していてもよい。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明は、その修飾がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、Her2/neu癌原遺伝子に特異的なヒト化型モノクローナル抗体(例えば、Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-9に開示されたAb4D5ヒト化型抗体)を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、ヒト化型Her2/neuモノクローナル抗体の改変は、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させてもよい。さらに別の特定の実施形態では、Her2/neuに特異的な工学的に改変されたヒト化型モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のおよび本明細書で開示し例示している標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能をさらに有していてもよい。
【００５８】
別の特定の実施形態では、本発明は、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、抗CD20抗体を工学的に改変することを包含する。関連する実施形態では、抗CD20抗体は、マウスヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗体の2H7である。本発明の方法で使用することができる抗CD20抗体のさらなる非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2005年11月10日出願の米国特許出願第11/271,140号で開示されている。別の特定の実施形態では、前記抗CD20モノクローナル抗体の2H7の改変は、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させてもよい。さらに別の特定の実施形態では、工学的に改変された抗CD20モノクローナル抗体の2H7は、当技術分野で公知のおよび本明細書で開示し例示している標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能をさらに有していてもよい。
【００５９】
別の詳細な実施形態では、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、抗FcγRIIB抗体、特にヒトFcγRIIBに特異的に結合する抗FcγRIIB抗体、より詳細には天然ヒトFcγRIIBを工学的に改変することを包含する。代表的な抗FcγRIIB抗体の非限定的な例は、すべて全体が参照により本明細書に組み込まれている、2002年8月12日出願の米国仮出願第60/403,266号;2003年8月14日出願の米国出願第10/643,857号;ならびに米国特許出願公開第2004-0185045号;第2005-0260213号;および第2006-0013810号で開示されている。本発明の方法に従って工学的に改変することができる抗FcγRIIB抗体の例は、それぞれATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960およびPTA-5959(ATCC、10801 University Boulevard, Manassas, VA02209-2011に寄託されており、すべて参照により本明細書に参考として組み込まれている)を有するクローン2B6、3H7、8B5.4.3、1D5、2E1、2H9、2D11および1F2によって産生されるモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化もしくは他の改変型である。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明は、2B6、3H7、または8B5.3.4の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗体を工学的に改変することを包含する。特定の実施形態では、本発明は、2B6、3H7、または8B5.3.4のCDRを含むヒト化型抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号1、配列番号2または配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、または配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗体を工学的に改変することを包含する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを包含する。
【００６１】
別の特定の実施形態では、抗FcγRIIB抗体の改変は、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させてもよい。さらに別の特定の実施形態では、工学的に改変された抗FcγRIIB抗体は、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載され例示されている標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能をさらに有していてもよい。特定の実施形態では、抗FcγRIIBモノクローナル抗体は、334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる改変(MgFc13)、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換(MgFc27)、または243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換(MgFc29)、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc38)、または221位でのグルタミン酸による、270位でのグルタミン酸による、308位でのアラニンによる、311位でのヒスチジンによる、396位でのロイシンによる、および402位でのアスパラギン酸による置換(MgFc42)、または410位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc53)、または243位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、378位でのアスパラギン酸による、404位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc54)、または255位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc55)、または370位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換(MgFc59)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88A)、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換(MgFc155)、または243位でのロイシンによる、292位での
プロリンによる、および300位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換を含む。関連する実施形態では、変異型Fc領域は、下記の表5、6、7および8で開示される1つまたは複数アミノ酸改変をさらに含む。
【００６２】
本発明はまた、本発明の方法によって同定されたポリペプチドおよび抗体を含めた本発明の分子をコードするポリヌクレオチドをも含む。当技術分野で知られている任意の方法によって、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本発明は、本発明の分子をコードする単離核酸に関する。本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の分子を産生するための方法を提供する。ポリペプチドおよび抗体を含めた本発明の分子は、当技術分野の技術者に知られている任意の方法によって、特に組換え発現によって産生することができる。詳細な実施形態では、本発明は、本発明の分子を組換えによって産生するための方法に関し、前記方法は、(i)培地中で前記分子をコードする核酸を含む宿主細胞を前記分子の発現に適した条件下で培養すること、および(ii)前記分子を前記培地から回収することを含む。
【００６４】
本発明の方法に従って同定された分子は、疾患、障害、または感染に関係する、1つまたは複数の症状を予防、治療、または回復するのに有用である。本発明の分子は、FcγRによって媒介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)の効力の増強が望ましい疾患または障害、例えば癌、感染症の治療または予防に、またその効果がADCCによって媒介される治療用抗体の治療効力を増強するのに特に有用である。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療する方法を包含し、前記方法は、本発明の方法に従って工学的に改変された、癌抗原に結合する治療上有効量の治療用抗体を投与することを含む。詳細な実施形態では、本発明は、癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療するための方法を包含し、前記方法は、前記癌抗原に特異的に結合する治療上有効量の治療用抗体を投与することを含み、前記治療用抗体は、変異型Fc領域を含み、前記治療用抗体が、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域は、329位、331位および332位での置換を有しておらず、256位、290位、298位、312位、333位、334位、359位、360位および430位のいずれにおいてもアラニン、330位でリジン、339位でスレオニン、320位でメチオニン、326位でセリン、326位でアスパラギン、326位でアスパラギン酸、326位でグルタミン酸、334位でグルタミン、334位でグルタミン酸、334位でメチオニン、334位でヒスチジン、334位でバリン、および334位でロイシンを有していない。別の詳細な実施形態では、本発明は、癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療するための方法を包含し、前記方法は、癌抗原に特異的に結合する治療上有効量の治療用抗体を投与することを含み、前記治療用抗体は、変異型Fc領域を含み、前記治療用抗体が、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合し、かつ前記治療用抗体がさらに、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγRIIBに結合するよりも低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するするように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域は、256位、298位、333位および334位のいずれにおいてもアラニンを有していない。本発明は、癌抗原によって特徴付けられる患者の癌を治療するための方法を包含し、前記方法は、前記癌抗原に特異的に結合する治療上有効量の治療用抗体を投与することを含み、前記治療用抗体は、抗体が増強されたADCC活性を有するように変異型Fc領域を含む。
【００６６】
本発明は、それを必要とする患者の自己免疫障害および/または炎症性障害を治療する方法を包含し、前記方法は、前記患者に、変異型Fc領域を含む治療上有効量の分子を投与することを含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子よりも高い親和性でFcγRIIBに特異的に結合し、かつ前記分子がさらに、野生型Fc領域を含む比較可能な分子よりも低い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合し、かつ前記分子が、免疫複合体(例えば、抗原/抗体複合体)に結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。本発明は、自己免疫障害および/または炎症性障害を治療する方法を包含し、このような疾患の治療および/または予防に使用される1つまたは複数追加の予防剤または治療剤、例えば、免疫調節剤、抗炎症剤を投与することをさらに含む。
【００６７】
本発明は、病原体またはその細胞受容体に結合する治療上または予防上有効量の1種または複数の本発明の分子を投与することを含む、対象における感染性疾患を治療または予防する方法を包含する。本発明の分子によって治療または予防することのできる感染性疾患は、それだけに限らないが、ウイルス、バクテリア、菌類、プロトザエ(protozae)、およびウイルスを含めた病原体に起因する。
【００６８】
本発明の一態様によれば、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、病原体、例えば、病原性タンパク質に対して増強された抗体エフェクター機能を有する。特定の実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患を生じさせる病原体の食作用および/またはオプソニン作用を増強することによって、感染性疾患の治療効力を増強する。別の特定の実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患を生じさせる感染細胞のADCCを増強することによって、感染性疾患の治療効力を増強する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患の治療および/または予防のために、治療上または予防上有効量の当業者に知られている1つまたはさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。本発明は、感染性疾患の治療およびまたは予防のために、当業者に知られている抗生物質と組み合わせた、本発明の分子の使用を企図する。
【００７０】
本発明は、本発明の分子、例えば、変異型Fc領域を含むポリペプチド、変異型Fc領域を含む免疫グロブリン、本発明に従って工学的に改変された治療用抗体、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、それだけには限定されないが、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤を含めた1つまたは複数の追加の治療剤をさらに含む医薬組成物を提供する。
【００７１】
3.1  定義
本明細書では、用語「Fc領域」は、IgG重鎖のC末端領域を定義するために使用される。境界はわずかに変化し得るが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、Cys226からカルボキシ末端に及ぶと定義される。IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3を含む。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメイン(「Cγ2」ドメインとも称される)は通常、アミノ酸231からアミノ酸338までにある。ヒトIgG Fc領域のCH3ドメインは通常、アミノ酸342から447までにある。CH2ドメインは、別のドメインと密接に対合していないという点で独特である。それどころか、完全な天然IgGの2つのCH2ドメイン間に、2つの分枝したN結合型糖鎖が介在している。
【００７２】
本明細書全体を通して、IgG重鎖中の残基の番号付けは、参照により本明細書に明確に組み込まれているKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)にあるようなEUインデックスの番号付けである。「KabatにあるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の番号付けを指す。
【００７３】
「ヒンジ領域」は一般に、ヒトIgG1のGlu216からPro230に及ぶと定義される。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間S-S結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、IgG1配列と整列させることができる。
【００７４】
本明細書では、用語「抗体」および「複数の抗体」は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化(camelized)抗体、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Fv(sdFv)、細胞内抗体、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体および抗抗Id抗体を含む)、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであり得る。
【００７５】
本明細書では、ポリペプチドまたはタンパク質の文脈での用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入によって改変されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書中では、「誘導体」はまた、修飾されている、すなわち、任意のタイプの分子がポリペプチドまたはタンパク質に共有結合することによって修飾されているポリペプチドまたはタンパク質を指す。例えば、それだけには限定されないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって修飾することもできる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、それだけには限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた、当技術分野の技術者に知られている技術を使用した化学修飾によって生成することができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが誘導されるポリペプチドまたはタンパク質と類似または同一の機能を保持する。
【００７６】
本明細書では、非タンパク質誘導体の文脈での用語「誘導体」は、第1の有機または無機分子の構造に基づいて形成された第2の有機または無機分子を指す。有機分子の誘導体は、それだけには限定されないが、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボキシル基またはアミン基の付加または欠失によって修飾された分子を含む。有機分子はまた、エステル化、アルキル化および/またはリン酸化されてもよい。
【００７７】
本明細書では、用語「障害」および「疾患」は、同義的に使用されて、対象の状態を指す。特に、用語「自己免疫疾患」は、用語「自己免疫障害」と同義的に使用されて、対象自体の細胞、組織および/または器官に対する対象の免疫反応によって生じた細胞、組織および/または器官の傷害によって特徴付けられる対象の状態を指す。用語「炎症性疾患」は、用語「炎症性障害」と同義的に使用されて、炎症、好ましくは慢性炎症によって特徴付けられる対象の状態を指す。自己免疫障害は、炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、炎症は、自己免疫障害によって引き起こされても引き起こされなくてもよい。したがって、ある障害は、自己免疫障害および炎症性障害の両方と特徴付けることもできる。
【００７８】
本明細書では、用語「癌」は、制御されない異常な細胞増殖から生じる新生物または腫瘍を指す。本明細書では、癌は明確に白血病およびリンパ腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は局在化したままである良性腫瘍を指す。他の実施形態では、癌は、隣接する体構造に侵入し、これを破壊し、離れた部位に広がった悪性腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、癌は特定の癌抗原を伴う。
【００７９】
本明細書では、用語「免疫調節剤」およびその変形は、宿主の免疫系を調節する薬剤を指す。ある実施形態では、免疫調節剤は免疫抑制剤である。ある他の実施形態では、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤には、それだけには限定されないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣体および有機分子が含まれる。
【００８０】
本明細書では、用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有するポリペプチドまたはタンパク質の断片を指す。免疫原活性を有するエピトープは、動物の抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野の技術者に周知の任意の方法、例えばイムノアッセイによって確認される、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【００８１】
本明細書では、用語「断片」は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5個の連続するアミノ酸残基、少なくとも10個の連続するアミノ酸残基、少なくとも15個の連続するアミノ酸残基、少なくとも20個の連続するアミノ酸残基、少なくとも25個の連続するアミノ酸残基、少なくとも40個の連続するアミノ酸残基、少なくとも50個の連続するアミノ酸残基、少なくとも60個の連続するアミノ酸残基、少なくとも70個の連続するアミノ酸残基、少なくとも80個の連続するアミノ酸残基、少なくとも90個の連続するアミノ酸残基、少なくとも100個の連続するアミノ酸残基、少なくとも125個の連続するアミノ酸残基、少なくとも150個の連続するアミノ酸残基、少なくとも175個の連続するアミノ酸残基、少なくとも200個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチドの断片は、そのポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。
【００８２】
本明細書では、用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子(例えば、mRNA)、DNAおよびRNA分子の組合せまたはハイブリッドDNA/RNA分子、およびDNAまたはRNA分子のアナログを含む。このようなアナログは、例えば、それだけには限定されないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含めたヌクレオチドアナログを使用して作製することができる。このようなアナログはまた、分子に、有益な属性、例えば、ヌクレアーゼ耐性、細胞膜を通過する向上した能力などを付与する、改変された骨格を有するDNAまたはRNA分子を含むこともできる。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖部分および二本鎖部分をどちらも含んでもよく、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
【００８３】
本明細書では、用語「治療上有効量」は、疾患または障害を治療または管理するのに十分な治療剤の量を指す。治療上有効量は、疾患の発症を遅延させるかまたは最小限にする、例えば、癌の拡大を遅延させるかまたは最小限にするのに十分な治療剤の量を指すこともある。治療上有効量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を提供する治療剤の量を指すこともある。さらに、本発明の治療剤に関しての治療上有効量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を提供する、単独でのまたは他の治療法と併用した治療剤の量を意味する。
【００８４】
本明細書では、用語「予防剤」および「複数の予防剤」は、障害の予防に、または障害の再発または拡大の予防に使用することができる任意の(複数の)薬剤を指す。予防上有効量は、過増殖性疾患、特に癌の再発または拡大、またはそれだけには限定されないが、過増殖性疾患の素因がある患者、例えば、遺伝的に癌の素因があるかまたは以前に発癌物質に曝された患者を含めた患者におけるそれらの発生を予防するのに十分な予防剤の量を指すことがある。予防上有効量は、疾患の予防において予防上の利益を提供する予防剤の量を指すこともある。さらに、本発明の予防剤に関しての予防上有効量は、疾患の予防において予防上の利益を提供する、単独でのまたは他の薬剤と併用した予防剤の量を意味する。
【００８５】
本明細書では、用語「予防する」、「予防すること」および「予防」は、予防剤または治療剤の投与の結果として、対象の障害の1種または複数の症状の再発または発症を予防することを意味する。
【００８６】
本明細書では、用語「併用して」は、複数の予防剤および/または治療剤の使用を指す。用語「併用して」の使用は、予防剤および/または治療剤を、障害を有する対象に投与する順序を制限するものではない。第1の予防剤または治療剤は、障害を有する対象に第2の予防剤または治療剤を投与する前に(例えば5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、または12週前に)、またはそれを投与すると同時に、またはそれを投与した後に(例えば5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、または12週後に)投与することができる。
【００８７】
本明細書では、「エフェクター機能」とは、抗体Fc領域とFc受容体またはリガンドとの相互作用によって生じた生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、それだけには限定されないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)、および補体依存性細胞傷害(CDC)が含まれる。エフェクター機能には、抗原との結合後に作動するものおよび抗原結合と独立して作動するものの両方が含まれる。
【００８８】
本明細書では、「エフェクター細胞」とは、1種または複数のFc受容体を発現し、1種または複数のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、それだけには限定されないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、B細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞が含まれ、それだけには限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含めた任意の生物に由来するものでもよい。
【００８９】
本明細書では、「Fcリガンド」とは、抗体のFc領域に結合してFcリガンド複合体を形成する、任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Fcリガンドには、それだけには限定されないが、FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、ブドウ球菌プロテインA、連鎖球菌Gタンパク質、およびウイルスFcγRが含まれる。Fcリガンドには、Fcに結合する未発見の分子が含まれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
5.  好ましい実施形態の説明
本発明は、変異型Fc領域を含み、その改変がFcγRに対する前記変異型Fc領域の親和性を改変する、例えば、増大させるまたは減少させる、1つまたは複数の領域に1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換であるが、挿入または欠失も含む)を有する分子、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくは免疫グロブリン(例えば、抗体)に関する。いくつかの実施形態では、2004年1月9日出願の米国特許出願第10/754,922号、2003年1月9日出願の米国特許仮出願第60/439,498号、2003年3月19日出願の米国特許仮出願第60/456,041号、2003年10月23日出願の米国特許仮出願第60/514,549号、2004年7月12日出願の米国特許仮出願第60/587,251号に開示された改変のいずれも含むがこれに限定されることはない前記Fc領域への改変を含む。上記出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、Fc-FcγR相互作用を決定するための当業者に公知の方法および本明細書に開示の方法、例えば、ELISAアッセイまたは表面プラズモン共鳴アッセイにより決定した場合、その変異型Fc領域が、変異型Fc領域はあるが前記1つまたは複数のアミノ酸改変を有していない前記分子と同じであり、前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて大きな親和性でFcγRIIIAに結合する分子を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Rc領域を含む比較可能な分子と比べて低下した親和性でFcγRIIIAに結合する分子を包含する。好ましい実施形態では、本発明の分子は、前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIBに結合するよりも低い親和性で、さらに特異的にFcγRIIBに(前記Fc領域を介して)結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて大きな親和性でFcγRIIIAおよびFcγRIIBに結合する分子を包含する。他の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて大きな親和性でFcγRIIBに結合する分子を包含する。別の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて低下した親和性でFcγRIIBに結合する分子を包含する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、いかなるFcγRへの検出可能な結合も示さない(例えば、例えばELISAアッセイにより決定した場合、FcγRIIA、FcγRIIB、またはFcγRIIIAに結合しない)分子を包含する。
【００９２】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が1つのFcγRのみに結合し、前記FcγRがFcγRIIIAである分子を包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が1つのFcγRのみに結合し、前記FcγRがFcγRIIAである分子を包含する。さらに別の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が1つのFcγRのみに結合し、前記FcγRがFcγRIIBである分子を包含する。本発明は、特に、例えば、治療用抗体のエフェクター機能を増強する、例えば、ADCCを増強することにより、治療用抗体の有効性を増強するためのヒトまたはヒト化型治療用抗体(例えば、腫瘍特異的抗血管形成または抗炎症性モノクローナル抗体)の改変に関する。
【００９３】
本発明の分子のFcγRに対する親和性と結合特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわち、Fc領域のFcγRへの特異的結合を決定するための当技術分野で公知の、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを含むがこれに限定されることはないin vitroアッセイ(生化学的または免疫学的ベースのアッセイ)を使って最初に決定される(セクション5.2.5.1参照)。好ましくは、本発明の分子の結合特性は、1つまたは複数のFcγ媒介物エフェクター細胞機能を決定するためのin vitro機能アッセイにより特徴付けもされる(セクション5.2.7参照)。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、in vitroベースのアッセイにおける結合特性と類似の結合特性を、(本明細書に記載し開示するモデルなどの)in vivoモデルにおいて有する。しかし、本発明は、in vitroベースのアッセイにおいて所望の表現型を示さないがin vivoでは所望の表現型を確かに示す本発明の分子を排除するものではない。
【００９４】
いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、アミノ酸342〜447から伸びていると定義される前記Fc領域のCH3ドメインに少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。他の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、アミノ酸231〜341から伸びていると定義される前記Fc領域のCH2ドメインに少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、1つの改変がCH3領域にあり1つの改変がCH2領域にある、少なくとも2個のアミノ酸改変を含む。本発明は、さらに、ヒンジ領域にアミノ酸改変を包含する。CH2および/またはCH3ドメインに1つまたは複数のアミノ酸改変のある本発明の分子は、本明細書に記載の、または当業者に公知の方法を使って決定される場合、FcγRに対する改変された親和性を有する。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明は、前記Fc領域のCH1ドメインにおけるアミノ酸改変を包含する。
【００９６】
特に好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異体が、当業者に公知であり、および本明細書に例示された方法を使って測定された場合、FcγRIIA(CD32A)への増大した結合および/または増大したADCC活性を有する分子を包含する。本発明の方法に従って使用されるADCCアッセイは、NK依存性でもマクロファージ依存性でもよい。
【００９７】
本発明のFc変異体は、エフェクター機能を変化させる改変、およびFcγR結合親和性を変化させる改変を含むがこれに限定されるものではない他の既知のFc改変と組み合わせてもよい。特定の実施形態では、CH3ドメイン、CH2ドメインまたはヒンジ領域に最初のアミノ酸改変を含む本発明のFc変異体は、第1のFc改変が第2のFc改変に相加的な、相乗的な、または新規の特性を与えるように、第2のFc改変が第1のFc改変と同一ドメインに存在しないよう、第2のFc改変と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のFc変異体は、CH2ドメインにはいかなるアミノ酸改変もない。
【００９８】
本発明のFc変異体は、下の表2に開示するFc改変などの当技術分野で公知のFc改変のいずれとも組み合わせてもよい。
【表２】
2009507470.tif 000004
【００９９】
2009507470.tif 000005
【０１００】
2009507470.tif 000006
【０１０１】
2009507470.tif 000007
【０１０２】
2009507470.tif 000008
【０１０３】
2009507470.tif 000009
【０１０４】
2009507470.tif 000010
【０１０５】
他の実施形態では、本発明のFc変異体は、下の表3AおよびBに開示するFc改変などの当技術分野で公知のFc改変のいずれとも組み合わせてもよい。
【表３Ａ】
2009507470.tif 000011
2009507470.tif 000012
【表３Ｂ】
2009507470.tif 000013
2009507470.tif 000014
2009507470.tif 000015
【０１０６】
好ましい特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子がFcγRに対して改変された親和性を有するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域は、Sondermann et al., 2000 (Nature, 406: 267-273、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする)により開示された相互作用などのFc-FcγR相互作用の結晶解析および構造解析に基づいて、FcγRと直接接触している位置に置換がない分子を包含する。前記Fc領域内の、FcγRと直接接触している位置の例は、アミノ酸234〜239 (ヒンジ領域)、アミノ酸265〜269(B/Cループ)、アミノ酸297〜299(C'/Eループ)、およびアミノ酸327〜332 (F/Gループ)である。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、構造解析および結晶解析に基づいて、FcγRと直接接触している少なくとも1つの残基の改変を含む。
【０１０７】
前記FcγR相互作用ドメインは下位のヒンジ領域およびIgG重鎖のCH2およびCH3ドメイン内の選択部位に位置する。実際の接触位置に隣接するアミノ酸残基およびCH3ドメインのアミノ酸残基は、それぞれ突然変異誘発試験および小ペプチド阻害剤を使った試験により示されるように、IgG/FcγR相互作用に関与している(Sondermann et al., 2000 Nature、406: 267-273; Diesenhofer et al., 1981、Biochemistry、20: 2361-2370; Shields et al., 2001、J. Biol. Chem. 276: 6591-6604。これらの文献はそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする)。本明細書で使用される直接接触とは、アミノ酸が互いの少なくとも1A、少なくとも2、もしくは、少なくとも3オングストローム以内に、または1Å、1.2Å、1.5Å、1.7Åもしくは2Åファンデルワールス半径内に存在することである。Fc相互作用タンパク質の結合をもたらすFc上の以前同定された部位の例となる一覧表は、下の表4に収載されている。いくつかの実施形態では、本発明は、下に収載した部位にはいかなる改変も有さないFc変異体を包含する。他の実施形態では、本発明は、改変が突然変異体の特性に相乗的または相加的効果を及ぼすように、本明細書に開示した他の改変と組み合わせて、下に収載した1つまたは複数の部位にアミノ酸改変を含むFc変異体を包含する。
【表４】
2009507470.tif 000016
【０１０８】
表4は、前記Fc領域内の、Fc-FcR相互作用にとって重要であると以前同定されている部位を収載する。FcR-Fcとラベルされた列は、前記FcRが接触しているFc鎖を特定している。文字はデータを引用した参考文献を特定している。CはShields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, DはJefferis et al., 1995、Immunol. Lett. 44: 111-7、EはHinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6, FはIdusogie et al., 2000, J. Immunol. 164: 4178-4184である。これらの文献は参照によりその全体を本明細書に組み込んでいるものとする。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む分子と比べて改変された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域は、255位、256位、258位、267位、268位、269位、270位、272位、276位、278位、280位、283位、285位、286位、289位、290位、292位、293位、294位、295位、296位、298位、300位、301位、303位、305位、307位、309位、312位、320位、322位、326位、329位、330位、332位、331位、333位、334位、335位、337位、338位、339位、340位、359位、360位、373位、376位、416位、419位、430位、434位、435位、437位、438位、439位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではない分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む分子と比べて改変された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域が255位、258位、267位、269位、270位、276位、278位、280位、283位、285位、289位、292位、293位、294位、295位、296位、300位、303位、305位、307位、309位、322位、329位、332位、331位、337位、338位、340位、373位、376位、416位、419位、434位、435位、437位、438位、439位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではなく、256位、290位、298位、312位、333位、334位、359位、360位、326位、もしくは430位のいずれでもアラニン、330位にリシン、339位にスレオニン、320位にメチオニン、326位にセリン、326位にアスパラギン、326位にアスパラギン酸、326位にグルタミン酸、334位にグルタミン、334位にグルタミン酸、334位にメチオニン、334位にヒスチジン、334位にバリン、または334位にロイシン、335位にリシン、268位にアスパラギン、272位にグルタミン、286位にグルタミン、セリン、もしくはアスパラギン酸、290位にセリン、320位にメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはアルギニン、322位にグルタミン酸、326位にセリン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸、330位にリシン、335位にグルタミン、または301位にメチオニンを有さない。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が268位、269位、270位、272位、276位、278位、283位、285位、286位、289位、292位、293位、301位、303位、305位、307位、309位、331位、333位、334位、335位、337位、338位、340位、360位、373位、376位、416位、419位、430位、434位、435位、437位、438位、もしくは439位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではなく、280位にヒスチジン、グルタミン、もしくはチロシン、290位にセリン、グリシン、スレオニン、もしくはチロシン、300位にロイシンもしくはイソロイシン、294位にアスパラギン、296位にプロリン、298位にプロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、もしくはバリン、295位にリシンを有さない分子を包含する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が、野生型Fc領域を含む分子と比べて低下した親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域が252位、254位、265位、268位、269位、270位、278位、289位、292位、293位、294位、295位、296位、298位、300位、301位、303位、322位、324位、327位、329位、333位、335位、338位、340位、373位、376位、382位、388位、389位、414位、416位、419位、434位、435位、437位、438位、もしくは439位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではない分子を包含する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記分子が野生型Fc領域を含む分子と比べて増強された親和性でFcγRに結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし、前記変異型Fc領域が280位、283位、285位、286位、290位、294位、295位、298位、300位、301位、305位、307位、309位、312位、315位、331位、333位、334位、337位、340位、360位、378位、398位、もしくは430位のいずれにおいても置換を有していないかまたは単に置換ではない分子を包含する。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、ただし、前記変異型Fc領域が330位、243位、247位、298位、241位、240位、244位、263位、262位、235位、269位、もしくは328位のいずれにおいても置換を有していないか、または単に置換ではない、および243位にロイシン、298位にアスパラギン、241位にロイシン、240位にイソロイシンもしくはアラニン、244位にヒスチジン、330位にバリン、または328位にイソロイシンを有さない分子を包含する。
【０１１２】
最も好ましい実施形態では、変異型Fc領域を有し、活性化および/または阻害性受容体に対する親和性が改変された本発明の分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変が288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc10)(表5および6参照)、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換(MgFc13)、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換(MgFc27)、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc38)、または221位でのグルタミン酸による、270位でのグルタミン酸による、308位でのアラニンによる、311位でのヒスチジンによる、396位でのロイシンによる、および402位でのアスパラギン酸による置換(MgFc42)、または240位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc52)、または410位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc53)、または243位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、378位でのアスパラギン酸による、404位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc54)、または255位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc55)、または370位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換(MgFc59)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88A)、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換(MgFc155)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および396位での
ロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換である、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する。
【０１１３】
１つの特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が396位でのロイシンによる、270位でのグルタミン酸による、および243位でのロイシンによる置換を含む分子を包含する。別の特定の実施形態では、前記分子は、本明細書に開示する改変などの1つまたは複数のアミノ酸改変をさらに含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の119位、125位、132位、133位、141位、142位、147位、149位、162位、166位、185位、192位、202位、205位、210位、214位、217位、219位、215位、216位、217位、218位、219位、221位、222位、223位、224位、225位、227位、288位、229位、231位、232位、233位、235位、240位、241位、242位、243位、244位、246位、247位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、258位、261位、262位、263位、268位、269位、270位、272位、273位、274位、275位、276位、279位、280位、281位、282位、284位、287位、288位、289位、290位、291位、292位、293位、295位、298位、300位、301位、303位、304位、305位、306位、307位、308位、309位、310位、311位、312位、313位、315位、316位、317位、318位、319位、320位、323位、326位、327位、328位、330位、333位、334位、335位、337位、339位、340位、343位、344位、345位、347位、348位、352位、353位、354位、355位、358位、359位、360位、361位、362位、365位、366位、367位、369位、370位、371位、372位、375位、377位、378位、379位、380位、381位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、388位、389位、390位、392位、393位、394位、395位、396位、397位、398位、399位、400位、401位、402位、404位、406位、407位、408位、409位、410位、411位、412位、414位、415位、416位、417位、419位、420位、421位、422位、423位、424位、427位、428位、431位、433位、435位、436位、438位、440位、441位、442位、443位、446位、447位のうちの1つまたは複数の位置にアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含する。好ましくは、そのような突然変異体は、本明細書に開示されおよび例示された、ならびに当業者に公知の方法を使って決定した場合、FcγRに対して改変された親和性を有しかつ/または改変されたエフェクター細胞媒介機能を有する分子をもたらす。
【０１１５】
本発明は、下の表(表5)に収載する突然変異体のいずれからでも成り、またはいずれでも含む変異型Fc領域を含む分子を包含する。
【表５】
2009507470.tif 000017
【０１１６】
2009507470.tif 000018
【０１１７】
さらに他の実施形態では、本発明は、2個を超えるアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含する。そのような変異体の限定されない例を下の表(表6)に収載している。本発明は、本明細書に開示する改変などの1つまたは複数のアミノ酸改変をさらに含む、表6に収載の突然変異体を包含する。
【表６】
2009507470.tif 000019
【０１１８】
2009507470.tif 000020
【０１１９】
2009507470.tif 000021
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明の分子、好ましくは免疫グロブリンは、1つまたは複数の炭水化物成分が前記分子に共有結合するように、1つまたは複数のグリコシル化部位をさらに含む。好ましくは、1つまたは複数のグリコシル化部位および/またはFc領域に1つまたは複数の改変を有する本発明の抗体は、増強された抗体媒介エフェクター機能、例えば、増強されたADCC活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体の炭水化物成分と直接的にまたは間接的に相互作用することが知られている、241位、243位、244位、245位、245位、249位、256位、258位、260位、262位、264位、265位、296位、299位、および301位のアミノ酸を含むがこれらに限定されることはないアミノ酸の1つまたは複数の改変を含む抗体をさらに含む。抗体の炭水化物成分と直接的にまたは間接的に相互作用をするアミノ酸は、当技術分野で公知であり、例えば、Jefferis et al., 1995 Immunology Letters、44: 111-7を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１２１】
本発明は、好ましくは、抗体の機能、例えばFcγRへの結合活性を改変せずに、抗体の1つまたは複数の部位に1つまたは複数のグリコシル化部位を導入することにより改変された抗体を包含する。グリコシル化部位は、本発明の抗体の可変および/または定常領域に導入してもよい。本明細書で使用する「グリコシル化部位」は、オリゴ糖(すなわち、互いに連結している2個以上の単糖類を含有する炭水化物)が特異的におよび共有結合的に結合する抗体の特定のアミノ酸配列のすべてを含む。オリゴ糖側鎖は、典型的にはN-またはO-結合のいずれかを介して抗体の骨格に連結している。N-結合グリコシル化とは、オリゴ糖成分がアスパラギン残基の側鎖に結合することである。O-結合グリコシル化とは、オリゴ糖成分がヒドロキシアミノ酸、例えばセリン、スレオニンに結合することである。本発明の抗体は、N-結合およびO-結合グリコシル化部位を含む1つまたは複数のグリコシル化部位を含んでいてよい。当技術分野で公知のN-結合またはO-結合グリコシル化のためのグリコシル化部位はいずれも、本発明に従って使用してよい。本発明の方法に従って有用である典型的なN-結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列、すなわち、Asn-X-Thr/Serであり、Xはいかなるアミノ酸でもよく、Thr/Serはスレオニンまたはセリンを示す。そのような部位または部位群は、本発明が属する技術分野で公知の方法を使って、本発明の抗体に導入してもよい。例えば、"In Vitro Mutagenesis," Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson、et al. W.H. Freeman and Company, New York、1983, chapter 8, pp. 106-116を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。グリコシル化部位を本発明の抗体に導入するための典型的な方法は、所望のAsn-X-Thr/Ser配列が得られるように、前記抗体のアミノ酸配列を改変するまたは変異導入することを含んでいてよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を付加するまたは欠失させることにより、本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。抗体の炭水化物含有量を改変するための方法は、当技術分野で公知であり、本発明内に包含される。例えば、米国特許第6,218,149号、欧州特許第0 359 096号、米国特許出願公開第2002/0028486号、国際公開第03/035835号、米国特許出願公開第2003/0115614号、米国特許第6,218,149号、米国特許第6,472,511号を参照されたい。これらの特許はすべてが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。他の実施形態では、本発明は、前記抗体の1つまたは複数の内在性の炭水化物成分を欠失させることにより、本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。特定の実施形態では、本発明は、297に隣接する位置を改変することにより、抗体のFc領域のグリコシル化部位を移動させることを包含する。特定の実施形態では、本発明は、296位がグリコシル化され、297位はグリコシル化されないように、296位を改変することを包含する。
【０１２３】
5.1  変異型Fc領域を有するポリペプチドおよび抗体
本発明は、酵母ディスプレイ法を使った、異なるFcγR受容体に対する親和性が改変された突然変異型ヒトIgG1重鎖Fc領域の同定に一部基づいている。したがって、本発明は分子、好ましくはポリペプチド、およびさらに好ましくは、1つまたは複数の領域に、その改変がFcγRに対する変異型Fc領域の親和性を改変する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換、しかし挿入または欠失も含む)を有する変異型Fc領域を含む免疫グロブリン(例えば、抗体)に関する。
【０１２４】
アミノ酸置換は別として、本発明は、1つまたは複数の改変された特性、例えば改変されたエフェクター機能を有するFc領域変異体を作製するために、Fc領域アミノ酸配列の他の改変を企図していることを当業者は理解するであろう。本発明は、FcγRへの結合を減少させるために前記Fc領域の1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を企図している。好ましくは、本発明のこの実施形態によれば、わずか5個の、わずか10個の、わずか20個の、わずか30個の、わずか50個のFc領域残基が欠失していることになる。1つまたは複数のアミノ酸欠失を含む本明細書のFc領域は、少なくとも約80%の、好ましくは少なくとも約90%の、最も好ましくは少なくとも約95%の野生型Fc領域をできれば保持していることになる。いくつかの実施形態では、例えば非免疫原性、FcγRIIIA結合、FcγRIIA結合、またはこれらの特性の組合せなどの、前記分子の1つまたは複数の特性が維持される。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明は、その変異体が改変されたエフェクター機能を含む、改変された特性を有するFc領域変異体を作製するためのアミノ酸の挿入を包含する。一特定の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのアミノ酸残基、例えば、本明細書で同定した1つまたは複数のFc領域の位置に隣接して、1個または2個のアミノ酸残基、および好ましくはわずか10個のアミノ酸残基を導入することを包含する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのアミノ酸残基、例えば、FcγR相互作用および/または結合に影響することが当技術分野で公知の1つまたは複数のFc領域の位置に隣接して、1個または2個のアミノ酸残基、および好ましくはわずか10個のアミノ酸残基を導入することを包含する。
【０１２６】
本発明は、本発明のFc変異体を作製するための非天然アミノ酸の組込みをさらに包含する。天然の生合成機構を使って非天然アミノ酸をタンパク質に組み込ませる方法など、そのような方法は当業者に公知であり、例えば、Wang et al., 2002 Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al., 2001, Science, 292: 498-500、van Hest et al., 2001. Chem. Comm. 19: 1897-1904を参照されたい。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。別の戦略は、アミノアシルtRNAの生合成を司る酵素に焦点を合わせており、例えば、Tang et al., 2001, J. Am. Chem. 123(44): 11089-11090, Kiick et al., 2001, FEBS Lett. 505(3): 465を参照されたい。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１２７】
本発明の分子のFcγRに対する親和性および結合性は、Fc-FcγR相互作用、すなわち、FcγRへのFc領域の特異的な結合を決定するための、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを含むがこれに限定されるものではない当技術分野では公知のin vitroアッセイ(生化学または免疫学ベースのアッセイ)を使って最初は決定される(セクション5.2.5.1参照)。好ましくは、本発明の分子の結合性は、1つまたは複数のFcγR媒介物エフェクター細胞機能を決定するためにも、in vitro機能アッセイにより特徴付けられる(セクション5.2.7参照)。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、in vitroベースのアッセイでの結合性に類似する結合性を、(本明細書に記載され開示されているモデルなどの)in vivoモデルで有する。しかし、本発明は、in vitroベースのアッセイでは所望の表現型を示さないが、in vivoでは所望の表現型を確かに示す本発明の分子を排除しない。本発明の分子のスクリーニングおよび特徴付けの代表的なフローチャートは図35で説明する。
【０１２８】
本発明は、比較的大きな親和性で1つまたは複数のFcγRに結合する変異型Fc領域を含む分子を包含している。そのような分子は、好ましくは、以下に議論するようにエフェクター機能を比較的効果的に媒介する。他の実施形態では、本発明は、比較的弱い親和性で1つまたは複数のFcγRに結合する変異型Fc領域を含む分子を包含する。エフェクター機能を低下させたりまたは除去するのは、ある種の場合、例えば、作用機序が標的抗原を担持する細胞に対し遮断または拮抗するが、死滅させることはない抗体の場合には好ましい。エフェクター機能を低下させたりまたは除去するのは、エフェクター細胞のFcγR活性化受容体を遮断すると考えられる自己免疫疾患の場合には好ましいであろう(この種の機能が宿主細胞に存在すると考えられる)。通常、増大したエフェクター機能は腫瘍および異質細胞に向けられると考えられる。
【０１２９】
本発明のFc変異体は、エフェクター機能を変化させる改変を含むがこれに限定されることはない他のFc改変と組み合わせてもよい。本発明は、本発明のFc変異体を他のFc改変と組み合わせて、抗体またはFc融合物において相加的な、相乗的な、または新規の特性を提供することを包含する。好ましくは、本発明のFc変異体は、それが組み合わされる改変の表現型を増強する。例えば、本発明のFc変異体が、野生型のFc領域を含む比較可能な分子よりも高い親和性でFcγRIIIAに結合することが知られている突然変異体と組み合わされた場合、本発明の突然変異体との組合せにより、FcγRIIIA親和性が何倍にも増強される。
【０１３０】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564, Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662, Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59, Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543, Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984, Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117, Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119, Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104, Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969, Armour et aL, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624, Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184, Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933, Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26, Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575, Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604, Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65, Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490、米国特許第5,624,821号、米国特許第5,885,573号、米国特許第6,194,551号、PCT国際公開第00/42072号、PCT国際公開第99/58572号に開示されているFc変異体などの他の既知のFc変異体と組み合わせてもよい。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明のFc変異体は、1つまたは複数の工学的に改変されたグリコフォーム、すなわち、Fc領域を含む分子と共有結合している炭水化物組成物を含み、前記炭水化物組成物がFc領域を含む親分子の炭水化物組成物とは化学的に異なる抗体またはFc融合物に組み込まれている。工学的に改変されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強するまたは低下させることを含むがこれに限定されるものではない種々の目的に有用である可能性がある。工学的に改変されたグリコフォームは、例えば、工学的に改変されたまたは変異発現株を使うことにより、1つもしくは複数の酵素、例えば、DI N-アセチルグルコサミン転移酵素III(GnTI11)との同時発現により、種々の生物もしくは種々の生物由来の細胞系においてFc領域を含む分子を発現することにより、または、Fc領域を含む分子が発現された後に炭水化物(群)を改変することにより、当業者に公知のいかなる方法によって作製してもよい。工学的に改変されたグリコフォームを作製するための方法は、当技術分野では公知であり、Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180, Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294, Shields et al、2002, J Biol Chem 277:26733-26740, Shinkawa et aL, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473、米国特許第6,602,684号、米国特許出願第10/277,370号、米国特許出願第10/113,929号、PCT国際公開第00/61739A1号、PCT国際公開第01/292246A1号、PCT国際公開第02/311140A1号、PCT国際公開第02/30954A1号、Potillegent(商標) technology (Biowa, Inc. Princeton, NJ)、GlycoMAb(商標)glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)に記載された方法があるが、その方法に限定されるものではない。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。例えば、国際公開第00061739号、欧州特許出願公開第01229125号、米国特許出願公開第20030115614号、Okazaki et al., 2004、JMB、336: 1239-49を参照されたい。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１３２】
本発明のFc変異体は、種々の特性を最適化されていてもよい。最適化されてもよい特性には、FcγRに対して増強されたまたは低下した親和性、すなわち増強されたまたは低下したエフェクター機能があるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、本発明のFc変異体は、ヒト活性化FcγR、好ましくはFcγR、FcγRIIA、FcγRIIc、FcγRIIIA、およびFcγRIIIB、最も好ましくはFcγRIIIAに対して増強された親和性を有するように最適化されている。別の好ましい実施形態では、前記Fc変異体は、ヒト阻害性受容体FcγRIIBに対して低下した親和性を有するように最適化されている。これらの好ましい実施形態は、抗体およびFcの融合物に、ヒトにおける増強された治療上の特性、例えば、本明細書に記載し例証している増強されたエフェクター機能および比較的大きな抗癌効力を与えると期待される。これらの好ましい実施形態は、抗体およびFc融合物に、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて増強された腫瘍除去を与えると期待される。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、およびFcγRIIIBを含むが、これに限定されるものではないヒトFcγRに対する低下した親和性を有するように最適化されている。これらの実施形態は、抗体およびFcの融合物に、ヒトにおける増強された治療上の特性、例えば、低下したエフェクター機能および低下した毒性を与えると期待される。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、マウス、ラット、ウサギ、サルを含むがこれに限定されることはない非ヒト生物由来のFcγRに対する増強されたまたは低下した親和性を有する。非ヒトFcγRへの結合のために最適化されるFc変異体は、実験での用途を見つけてもよい。例えば、所与の薬剤候補の有効性、毒性、および薬物動態などの特性を試験することができるマウスモデルは、種々の疾患に利用することができる。当技術分野では公知のように、癌細胞をマウスに移植しまたは注入してヒト癌を再現することができ、これは異種移植と呼ばれる方法である。1つまたは複数のマウスFcγRのために最適化されているFc変異体を含む抗体またはFc融合物を試験すれば、前記抗体またはFc融合物の有効性、その作用機序などに関する貴重な情報が提供されるであろう。
【０１３５】
FcγRへの結合を改変することは好ましいが、本発明はさらに、ネオナタル受容体(FcRn)への結合親和性が改変されたFc変異体を企図している。特定の作用機序によって結合されることを目的にしてはいないが、FcRnに対する親和性が改良されているFc領域変異体は血中半減期が長くなると期待され、そのような分子は、例えば、慢性の疾患または障害の治療のために投与されたポリペプチドの長い半減期が望まれる場合には、哺乳動物の治療法に有用な用途を有するであろう。特定の作用機序によって結合されることを目的にしてはいないが、FcRn結合親和性が減少したFc領域変異体は、それに比べて、半減期が短くなると予想され、そのような分子は、例えば、短縮された循環時間が、例えば、in vivo画像診断法にまたは、長期間血流中を循環するままになると中毒性副作用があるポリペプチドに有利となる場合には、哺乳動物に投与してもよい。FcRn結合親和性が減少したFc領域変異体は、胎盤を通過する可能性は少ないと期待され、したがって、妊婦の疾患または障害の治療に利用してもよい。
【０１３６】
他の実施形態では、これらの変異体は、国際公開第98/23289号、および国際公開第97/34631号、ならびに米国特許第6,277,375号に開示された改変などのFcRn親和性が変化した他の既知のFc改変と組み合わせてもよい。これらの特許文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１３７】
本発明は、例えば、IgG定常ドメインまたはそのFcRn結合断片(好ましくはFcまたはヒンジFcドメイン断片)に1つまたは複数のアミノ酸改変(すなわち、置換、挿入、もしくは欠失)を導入することにより、in vivoで半減期が増加した抗体を作製するための当技術分野で公知の他のあらゆる方法を包含する。例えば、国際公開第98/23289号、および国際公開第97/34631号ならびに米国特許第6,277,375号を参照されたい。これらの特許文献はそれぞれが、本発明のFc変異体と組み合わせて使用するために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。さらに、本発明の抗体は、前記抗体または抗体断片をin vivoにおいてさらに安定にする、またはin vivoで半減期を長くするためにアルブミンに結合させることができる。当技術分野で公知の技術は、例えば、国際公開第93/15199号、国際公開第93/15200号、および国際公開第01/77137号、ならびに欧州特許第413,622号を参照されたい。これらの特許文献はすべてが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１３８】
本明細書に記載の変異体(群)は、多くの場合、前記変異体の使用目的によってさらに改変を受けてもよい。そのような改変には、前記アミノ酸配列の追加の改変(アミノ酸残基の置換、挿入および/または欠失)、異種ポリペプチド(群)への融合および/または共有結合改変を含んでいてもよい。そのような追加の改変は、Fc受容体結合および/またはADCC活性の改変などの改変された特性をもたらす本明細書に開示しているアミノ酸改変の前に、同時に、または、後で行ってもよい。
【０１３９】
代案としてまたは追加として、本発明は本明細書に開示のアミノ酸改変と、in vitroおよび/またはin vivoにおいて決定される場合、前記Fc領域のC1q結合および/または補体依存性細胞障害機能を改変する1つまたは複数の追加のアミノ酸改変を組み合わせることを包含する。好ましくは、本明細書で特に関心のある開始分子は、通常、C1qに結合し補体依存性細胞障害(CDC)を示す分子である。本明細書に記載の追加のアミノ酸置換は、一般的に、前記開始分子がC1qに結合しかつ/またはその補体依存性細胞障害機能を改変する、例えば、これらのエフェクター機能を低下させ、好ましくは無効にする能力を改変するのに役立つであろう。他の実施形態では、前記記載された位置の1つまたは複数の位置に置換を含み、C1q結合および/または補体依存性細胞障害(CDC)機能が改善された分子を本明細書では企図している。例えば、前記開始分子は、C1qに結合しかつ/またはCDCを媒介することができなくてもよく、これらの追加のエフェクター機能を獲得するように本明細書の教唆に従って改変されてもよい。さらに、既存のC1q結合活性を有し、随意にさらにCDCを媒介する能力を有する分子は、これらの活性のうちの一方または両方が改変される、例えば、増強されるように改変されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明はCDC活性が改変され、C1q結合には全く改変がない変異型Fc領域を包含する。さらに別の実施形態では、本発明は、CDC活性が改変されC1q結合が改変された変異型Fc領域を包含する。
【０１４０】
C1q結合および/または補体依存性細胞障害(CDC)機能が改変されたFc領域を作製するために、改変されるアミノ酸の位置は、通常、270、322、326、327、329、331、333、および334の位置から選択され、IgG重鎖における前記残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (199)の場合のEUインデックスの番号付けである。これらのアミノ酸改変は、本明細書に開示されている1つまたは複数のFc改変と組み合わせて、C1q結合および/またはCDC活性への相乗的または相加的効果を提供してもよい。他の実施形態では、本発明は、C1q結合および/または補体依存性細胞障害(CDC)機能が改変され、396位でのロイシンによる、および255位でのロイシンによるアミノ酸置換、または396位でのロイシンによる、および419位でのヒスチジンによるアミノ酸置換、396位でのロイシンによる、および370位でのグルタミン酸によるアミノ酸置換、396位でのロイシンによる、および240位でのアラニンによるアミノ酸置換、396位でのロイシンによる、および392位でのスレオニンによるアミノ酸置換、247位でのロイシンによる、および421位でのリシンによるアミノ酸置換を含むFc変異体を包含する。本発明は、Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166(4) 2571-5, Idusogie et al., J. Immunol. 2000 164(8): 4178-4184に開示されている改変などの、C1q結合および/または補体依存性細胞障害(CDC)機能を改変する前記Fc領域のあらゆる既知の改変を包含する。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１４１】
上記のように、本発明は、エフェクター機能が改変された、例えば、C1q結合および/またはFcR結合が改変され、それによりCDC活性および/またはADCC活性が改変されたFc領域を包含する。特定の実施形態では、本発明は、C1q結合が改良されFcγRIII結合が改良された、例えば、ADCC活性も改良されCDC活性も改良された変異型Fc領域を包含する。別の実施形態では、本発明は、CDC活性が低下しおよび/またはADCC活性が低下した変異型Fc領域を包含する。他の実施形態では、例えば、ADCC活性は改良されているが、CDC活性は低下しているFc領域変異体、およびその逆のCDC活性は改良されているが、ADCC活性は低下しているFc領域変異体を作製するために、これらの活性のうちの一方のみを増大させ、随意にまたもう一方の活性を低下させてもよい。
【０１４２】
A.  FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する改変された親和性が増強された突然変異体
本発明は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、そのような改変が活性化FcγRに対する変異型Fc領域の親和性を改変する変異型Fc領域を含む分子を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも2倍増大させる変異型Fc領域を含む。別の特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて2倍よりも多く増大させる変異型Fc領域を含む。本発明の他の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する前記変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍増大させる。本発明のさらに別の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する前記変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍減少させる。そのような倍増は、好ましくはELISAまたは表面プラズモン共鳴アッセイにより決定される。特定の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、いずれのアミノ酸でも329位、331位もしくは322位のいずれか1つで置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、256位、290位、298位、312位、333位、334位、359位、360位、もしくは430位のアラニンのいずれか1つによる、330位でのリシンによる、339位でのスレオニンによる、320位でのメチオニンによる、326位でのセリン、アスパラギン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸による、334位でのグルタミン、グルタミン酸、メチオニン、ヒスチジン、バリン、もしくはロイシンによる置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。別の特定の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、280位、290位、300位、294位、もしくは295位のいずれかで置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。別のさらに特定の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、300位でのロイシンもしくはイソロイシンによる、295位でのリシンによる、294位でのアスパラギンによる、298位でのバリン、アスパラギン酸プロリン、アスパラギン、もしくはバリンによる、280位でのヒスチジン、グルタミン、もしくはチロシンによる、290位でのセリン、グリシン、セオニン、もしくはチロシンによる置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。
【０１４３】
別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記ポリペプチドが、野生型のFc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域は野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、ただし前記変異型Fc領域は256位、290位、326位、255位、258位、267位、272位、276位、280位、283位、285位、286位、331位、337位、268位、272位、もしくは430位のいずれかでアラニン、268位でアスパラギン、272位でグルタミン、286位でグルタミン、セリン、もしくはアスパラギン酸、290位でセリン、320位でメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはアルギニン、322位でグルタミン酸、326位でセリン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸、330位でリシン、335位でグルタミン、または301位でメチオニンを有していない分子を包含する。特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも2倍増大させる変異型Fc領域を含む。別の特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも2倍より多く増大させる変異型Fc領域を含む。本発明の他の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIAに対する前記変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍増大させる。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換であるが、挿入または欠失も含む)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも150%、および少なくとも200%増大させる変異型Fc領域を含む分子、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくは免疫グロブリン(例えば、抗体)を包含する。
【０１４５】
特定の実施形態では、1つまたは複数の活性化FcγRに対する前記変異型Fc領域の親和性を増大させる前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、347位でのヒスチジンによる、および339位でのバリンによる置換、または、425位でのイソロイシンによる、および215位でのフェニルアラニンによる置換、または408位でのイソロイシンによる、215位でのイソロイシンによる、および125位でのロイシンによる置換、または385位でのグルタミン酸による、および247位でのヒスチジンによる置換、または348位でのメチオニンによる、334位でのアスパラギンによる、275位でのイソロイシンによる、202位でのメチオニンによる、および147位でのスレオニンによる置換、または275位でのイソロイシンによる、334位でのアスパラギンによる、および348位でのメチオニンによる置換、または279位でのロイシンによる、および395位でのセリンによる置換、または246位でのスレオニンによる、および319位でのフェニルアラニンによる置換、または243位でのイソロイシンによる、および379位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、255位でのロイシンによる、および318位でのリシンによる置換、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換、または288位でのメチオニンによる、および334位でのグルタミン酸による置換、または334位でのグルタミン酸による、および380位でのアスパラギン酸による置換、または256位でのセリンによる、305位でのイソロイシンによる、334位でのグルタミン酸による、および390位でのセリンによる置換、または335位でのアスパラギンによる、370位でのグルタミン酸による、378位でのバリンによる、394位でのメチオニンによる、および424位でのロイシンによる置換、または233位でのアスパラギン酸による、および334位でのグルタミン酸による置換、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、366位でのセリンによる、および386位でのアルギニンによる置換、または246位でのスレオニンによる、および396位でのヒスチジンによる置換、または268位でのアスパラギン酸による、および318位でのアスパラギン酸による置換、または288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または244位でのヒスチジンによる、358位でのメチオニンによる、379位でのメチオニンによる、384位でのリシンによる、および397位でのメチオニンによる置換、または217位でのセリンによる、378位でのバリンによる、および408位でのアルギニンによる置換、または247位でのロイシンによる、253位でのアスパラギンによる、および334位でのアスパラギンによる置換、または246位でのイソロイシンによる、および334位でのアスパラギンによる置換、または320位でのグルタミン酸による、および326位でのグルタミン酸による置換、または375位でのシステインによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および305位でのイソロイシンによる置換、または234位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または234位でのロイシンによる置換を含む。In vitroにおいてFcγRIIIAに対する増強された親和性をもたらす他のアミノ酸置換の例は以下に開示し、表5に要約している。
【０１４６】
本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が243位でのイソロイシンによる、および379位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が243位でのロイシンによる、および255位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約3倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が288位でのメチオニンによる、および334位でのグルタミン酸による置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1.5倍高い親和性でFcγRI
IIAに結合するように、前記変異型Fc領域が316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が315位でのイソロイシンによる、379位でのメチオニンによる、および399位でのグルタミン酸による置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約2.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約3倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が247位でのロイシンによる、および421位でのリシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約4.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が293位でのバリンによる、295位でのグルタミン酸による、および327位でのスレオニンによる置換を含む、分子を包含する。
【０１４７】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約2倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が268位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約2倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が319位でのフェニルアラニンによる、352位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。
【０１４８】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が396位でのヒスチジンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が248位でのメチオニンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドに類似の親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が392位でのアルギニンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドに類似の親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が315位でのイソロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドに類似の親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が132位でのイソロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドに類似の親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が162位でのバリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が396位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が379位でのメチオニンによる置換を含む、���離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が219位でのチロシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が282位でのメチオニンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が401位でのバリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が222位でのアスパラギンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が334位でのグルタミン酸による置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が377位でのフェニルアラニンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が334位でのイソロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が247位でのロイシンに��る置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が326位でのグルタミン酸による置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が372位でのチロシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が224位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。
【０１４９】
本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が275位でのチロシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が398位でのバリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が334位でのアスパラギンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が400位でのプロリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が407位でのイソロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が372位でのチロシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドに類似の親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が366位でのアスパラギンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも低い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が414位でのアスパラギンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含す���。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも低い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が225位でのセリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも低い親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が377位でのアスパラギンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が243位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が292位でのプロリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が300位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が305位でのイソロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1個つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が396位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも大きな親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が273位でのフェニルアラニンによる置換を含む、単離されたポリペプチド��包含する。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約2倍大きい親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が379位でのメチオニンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約1.5倍大きい親和性でFcγRIIIAに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が248位でのメチオニンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、Fc-FcγR相互作用、すなわちFc領域のFcγRへの特異的結合を決定するための当技術分野において公知の、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ(セクション5.2.5.1参照)を含むが、これに限定されることはないin vitroアッセイ(生化学または免疫学ベースのアッセイ)を使って決定される場合、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する改変された親和性を有する。好ましくは、活性化FcγR受容体に対する親和性が改変されたこれらの分子の結合特性は、1つまたは複数のFcγR媒介物エフェクター細胞機能(セクション5.2.7参照)を決定するためのin vitro機能アッセイにより決定されるその活性とも相関があり、例えば、FcγRIIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域のある分子は、増強されたADCC活性を有する。最も好ましい実施形態では、活性化Fc受容体、例えば、FcγRIIIAに対する改変された結合特性をin vitroアッセイにおいて有する本発明の分子は、(本明細書に記載され開示されたモデルなどの)in vivoモデルにおいても改変された結合特性を有する。しかし、本発明は、in vitroベースのアッセイにおいて改変されたFcγR結合を示さないが、in vivoにおいて所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【０１５２】
B.  FcγRIIIAに対する親和性は増強されFcγRIIBに対する親和性は低下しているまたは全くない突然変異体
特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域に1つまたは複数のアミノ酸改変(すなわち、置換)を有し、その1つまたは複数の改変が、FcγRIIIAおよびFcγRIIBに野生型の親和性で結合する野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる変異型Fc領域を含む。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、256位、298位、333位、334位、280位、290位、294位、298位、もしくは296位のいずれかでアラニンによる置換、または298位でのアスパラギン、バリン、アスパラギン酸、もしくはプロリンによる置換、または290位でのセリンによる置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%減少させる。
【０１５３】
特定の実施形態では、ELISAアッセイおよび/またはch-4-4-20抗体を使ったADCCベースのアッセイ、もしくは変異型Fc領域を坦持するキメラ4D5抗体を使った表面プラズモン共鳴アッセイに基づいて決定される場合、FcγRIIIAに対する親和性は増強されFcγRIIBに対する親和性は低下しているまたは親和性は全くない変異型Fc領域を含む本発明の分子は、275位でのイソロイシンによる、334位でのアスパラギンによる、および348位でのメチオニンによる置換、または279位でのロイシンによる、および395位でのセリンによる置換、または246位でのスレオニンによる、および319位でのフェニルアラニンによる置換、または243位でのロイシンによる、255位でのロイシンによる、および318位でのリシンによる置換、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および 366位でのセリンによる置換、または334位でのグルタミン酸による、および380位でのアスパラギン酸による置換、または256位でのセリンによる、305位でのイソロイシンによる、334位でのグルタミン酸による、および390位でのセリンによる置換、または335位でのアスパラギンによる、370位でのグルタミン酸による、378位でのバリンによる、394位でのメチオニンによる、および424位でのロイシンによる置換、または233位でのアスパラギン酸による、および334位でのグルタミン酸による置換、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、366位でのセリンによる、および386位でのアルギニンによる置換、または312位でのグルタミン酸による、327位でのアスパラギンによる、および378位でのセリンによる置換、または288位でのアスパラギンによる、および326位でのアスパラギンによる置換、または247位でのロイシンによる、および421位でのリシンによる置換、または298位でのアスパラギンによる、および381位でのアルギニンによる置換、または280位でのグルタミン酸による、354位でのフェニルアラニンによる、431位でのアスパラギン酸による、および441位でのイソロイシンによる置換、または255位でのグルタミンによる、および326位でのグルタミン酸による置換、または218位でのアルギニンによる、281位でのアスパラギン酸による、および385位でのアルギニンによる置換、または247位でのロイシンによる、330位でのスレオニンによる、および440位でのグリシンによる置換、または284位でのアラニンによる、および372位でのロイシンによる置換、または335位でのアスパラギンによる、387位でのセリンによる、および435位でのグルタミンによる置換、または247位でのロイシンによる、431位でのバリンによる、および442位でのフェニルアラニンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および305位でのイソロイシンによる置換、または292位でのプロリンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる292位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイ���ンによる置換、または243位でのロイシンによる置換を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、ELISAアッセイおよび/または変異型Fc領域を坦持するch-4-4-20抗体を使ったADCCベースのアッセイに基づいて決定される場合、FcγRIIIAに対する親和性は増強されFcγRIIBに対する親和性は低下しているまたは親和性は全くない変異型Fc領域を含む本発明の分子は、379位でのメチオニンによる、219位でのチロシンによる、282位でのメチオニンによる、401位でのバリンによる、222位でのアスパラギンによる、334位でのイソロイシンによる、334位でのグルタミン酸による、275位でのチロシンによる、398位でのバリンによる置換を含む。さらに別の実施形態では、ELISAアッセイおよび/またはch-4-4-20抗体を使ったADCCベースのアッセイ、もしくは変異型Fc領域を坦持するキメラ4D5抗体を使った表面プラズモン共鳴アッセイに基づいて決定される場合、FcγRIIIAに対する親和性は増強されFcγRIIBに対する親和性は低下しているまたは親和性は全くない変異型Fc領域を含む本発明の分子は、243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる置換を含む。
【０１５５】
本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約3倍低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約10〜15倍低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約10倍低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が315位でのイソロイシンによる、379位でのメチオニンによる、および399位でのグルタミン酸による置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約7倍低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約3倍低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約5倍低い親和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が268位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドを包含する。本発明は、変異型Fc領域を含む単離されたポリペプチドであって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドよりも約2倍低い���和性でFcγRIIBに特異的に結合するように、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも1つのアミノ酸改変が319位でのフェニルアラニンによる、352位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、単離されたポリペプチドも包含する。
【０１５６】
C.  FcγRIIIAおよびFcγRIIBへの親和性が増強された突然変異体
本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有し、その改変がFcγRIIIAおよびFcγIIBに対する変異型Fc領域の親和性を、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%減少させる、変異型Fc領域を含む分子を包含する。特定の実施形態では、(ELISAアッセイおよび/またはch-4-4-20抗体を使ったADCCベースのアッセイ、もしくは、本明細書に記載の変異型Fc領域を坦持するキメラ4D5抗体を使った表面プラズモン共鳴アッセイに基づいて決定される場合)、FcγRIIIAに対する親和性は増強されFcγRIIBに対する親和性は増強された変異型Fc領域を含む本発明の分子は、415位でのイソロイシンによる、および251位でのフェニルアラニンによる置換、または399位でのグルタミン酸による、292位でのロイシンによる、および185位でのメチオニンによる置換、または408位でのイソロイシンによる、215位でのイソロイシンによる、および125位でのロイシンによる置換、または385位でのグルタミン酸による、および247位でのヒスチジンによる置換、または348位でのメチオニンによる、334位でのアスパラギンによる、275位でのイソロイシンによる、202位でのメチオニンによる、および147位でのスレオニンによる置換、または246位でのスレオニンによる、および396位でのヒスチジンによる置換、または268位でのアスパラギン酸による、および318位でのアスパラギン酸による置換、または288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または244位でのヒスチジンによる、358位でのメチオニンによる、379位でのメチオニンによる、384位でのリシンによる、および397位でのメチオニンによる置換、または217位でのセリンによる、378位で
のバリンによる、および408位でのアルギニンによる置換、または247位でのロイシンによる、253位でのアスパラギンによる、および334位でのアスパラギンによる置換、または246位でのイソロイシンによる、および334位でのアスパラギンによる置換、または320位でのグルタミン酸による、および326位でのグルタミン酸による置換、または375位でのシステインによる、および396位でのロイシンによる置換、または343位でのセリンによる、353位でのロイシンによる、375位でのイソロイシンによる、および383位でのアスパラギンによる置換、または394位でのメチオニンによる、および397位でのメチオニンによる置換、または216位でのアスパラギン酸による、345位でのリシンによる、および375位でのイソロイシンによる置換、または288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または247位でのロイシンによる、および389位でのグリシンによる置換、または222位でのアスパラギンによる、335位でのアスパラギンによる、370位でのグルタミン酸による、378位でのバリンによる、および394位でのメチオニンによる置換、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換、または315位でのイソロイシンによる、379位でのメチオニンによる、および394位でのメチオニンによる置換、または290位でのスレオニンによる、および371位でのアスパラギン酸による置換、または247位でのロイシンによる、および398位でのグルタミンによる置換、または326位でのグルタミンによる、334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換、または247位でのロイシンによる、および377位でのフェニルアラニンによる置換、または378位でのバリンによる、390位でのイソロイシンによる、および422位でのイソロイシンによる置換、または326位でのグルタミン酸による、および385位でのグルタミン酸による置換、または282位でのグルタミン酸による、369位でのイソロイシンによる、および406位でのフェニルアラニンによる置換、または397位でのメチオニンによる、411位でのアラニンによる、および415位でのアスパラギンによる置換、または223位でのイソロイシンによる、256位でのセリンによる、および406位でのフェニルアラニンによる置換、または298位でのアスパラギンによる、および407位でのアルギニンによる置換、または246位でのアルギニンによる、298位でのアスパラギンによる、および377位でのフェニルアラニンによる置換、または235位でのプロリンによる、382位でのメチオニンによる、304位でのグリシンによる、305位でのイソロイシンによる、および323位でのイソロイシンによる置換、または247位でのロイシンによる、313位でのアルギニンによる、および388位でのグリシンによる置換、または221位でのチロシンによる、252位でのイソロイシンによる、330位でのグリシンによる、339位でのスレオニンによる、359位でのアスパラギンによる、422位でのイソロイシンによる、および433位でのロイシンによる置換、または258位でのアスパラギン酸による、および384位でのリシンによる置換、または241位でのロイシンによる、および258位でのグリシンによる置換、または370位でのアスパラギンによる、および440位でのアスパラギンによる置換、または317位でのアスパラギンによる置換、および423位での欠失、または243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換、または227位でのセリンによる、および290位でのグルタミン酸による置換、または231位でのバリンによる、386位でのヒスチジンによる、および412位でのメチオニンによる置換、または215位でのプロリンによる、274位でのアスパラギンによる、287位でのグリシンによる、334位でのアスパラギンによる、365位でのバリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または293位でのバリンによる、295位でのグルタミン酸による、および327位でのスレオニンによる置換、または319位でのフェニルアラニンによる、352位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または268位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または290位でのスレオニンによる、390位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または326位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または268位でのアスパラギン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または210位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または358位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または288位でのアルギニンによる、307位でのアラニンによる、344位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または273位でのイソロイシンによる、326位でのグルタミン酸による、328位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または326位でのイソロイシンによる、408位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または334位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または379位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または227位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または217位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または261位でのアスパラギンによる、210位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または419位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または370位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または242位でのフェニルアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または255位でロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または240位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または250位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または247位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または410位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または419位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または427位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または258位でのアスパラギン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または384位でのリシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または323位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または244位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または305位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または400位でのフェニルアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または303位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、378位でのアスパラギン酸による、404位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または290位でのグルタミン酸による、369位でのアラニンによる、393位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または210位でのアスパラギンによる、222位でのイソロイシンによる、320位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または217位でのセリンによる、305位でのイソロイシンによる、309位でのロイシンによる、390位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または246位でのアスパラギンによる、419位でのアルギニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または217位でのアラニンによる、359位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または215位でのイソロイシンによる、290位でのバリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または275位でのロイシンによる、362位でのヒスチジンによる、384位でのリシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または334位でのアスパラギンによる置換、または400位でのプロリンによる置換、または407位でのイソロイシンによる置換、または372位でのチロシンによる置換、または366位でのアスパラギンによる置換、または414位でのアスパラギンによる置換、または352位でのロイシンによる置換、または225位でのセリンによる置換、または377位でのアスパラギンによる置換、または248位でのメチオニンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または292位でのプロリンによる、および305位でのイソロイシンによる置換を含む。
【０１５７】
D.  どのFcγRにも結合しない突然変異体
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、当技術分野で公知のおよび本明細書で開示している標準的アッセイにより決定する場合、その変異型Fc領域が野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べてどのFcγRにも結合しない、分子を包含する。特定の実施形態では、すべてのFcγRへの結合を無効にする前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、232位でのセリンによる、および304位でのグリシンによる置換、または269位でのリシンによる、290位でのアスパラギンによる、311位でのアルギニンによる、および433位でのチロシンによる置換、または252位でのロイシンによる置換、または216位でのアスパラギン酸による、334位でのアルギニンによる、および375位でのイソロイシンによる置換、または247位でのロイシンによる、および406位でのフェニルアラニンによる置換、または335位でのアスパラギンによる、387位でのセリンによる、および435位でのグルタミンによる置換、または334位でのグルタミン酸による、380位でのアスパラギン酸による、および446位でのバリンによる置換、または303位でのイソロイシンによる、369位でのフェニルアラニンによる、および428位でのロイシンによる置換、または251位でのフェニルアラニンによる、および372位でのロイシンによる置換、または246位でのグルタミン酸による、284位でのメチオニンによる、および308位でのアラニンによる置換、または399位でのグルタミン酸による、および402位でのアスパラギン酸による置換、または399位でのグルタミン酸による、および428位でのロイシンによる置換を含む。
【０１５８】
D.  FcγR媒介エフェクター機能が改変された突然変異体
本発明は、エフェクター機能が改変されたFc変異体を含む免疫グロブリンを包含する。いくつかの実施形態では、Fc変異体を含む免疫グロブリンは、当技術分野で公知のおよび本明細書で例証されているアッセイ法を使って決定した場合、エフェクター細胞の存在の下ではエフェクター機能をより効果的に媒介する。他の実施形態では、Fc変異体を含む免疫グロブリンは、当技術分野で公知のおよび本明細書で例証されているアッセイ法を使って決定した場合、エフェクター細胞の存在の下ではエフェクター機能をより非効果的に媒介する。特定の実施形態では、本発明のFc変異体は、組合せが相加的、相乗的効果を有するように、エフェクター機能を改変する他の既知のFc改変と組み合わせてもよい。本発明のFc変異体は、in vitroおよび/またはin vivoにおいてエフェクター機能を改変している。
【０１５９】
特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、本明細書で開示したADCC活性アッセイを使って決定した場合、増強されたFcγR媒介エフェクター機能を有する。本発明の分子により媒介することができるエフェクター機能の例には、C1q結合、補体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、貪食性などがあるが、これらの機能に限定されるものではない。本発明の分子のエフェクター機能は、当技術分野で公知の標準的方法を使って検定することができ、その例はセクション5.2.6に開示している。特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域を含む本発明の免疫グロブリンは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも2倍効果的に媒介する。他の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域を含む本発明の免疫グロブリンは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍効果的に媒介する。別の特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、C1q結合活性を改変した。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍高いC1q結合活性を有する。さらに別の特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、補体依存性細胞傷害を改変した。さらに別の特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも増強された補体依存性細胞傷害を
有する。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍高い補体依存性細胞傷害を有する。
【０１６０】
他の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、当業者には既知のまたは本明細書で開示された標準的アッセイ法により決定される場合、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンと比べて貪食性活性を増強した。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンと比べて、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍高い貪食性活性を有する。
【０１６１】
特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンが増強されたエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、または貪食性を有するように、1つまたは複数のアミノ酸改変を有し、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを包含する。特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、免疫グロブリンのADCC活性を高める1つまたは複数のアミノ酸改変は、379位でのメチオニンによる置換、または243位でのイソロイシンによる、および379位でのロイシンによる置換、または288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および255位でのロイシンによる置換、または334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換、または288位でのメチオニンによる、および334位でのグルタミン酸による置換、または334位でのグルタミン酸による、および292位でのロイシンによる置換、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換、または315位でのイソロイシンによる、379位でのメチオニンによる、および399位でのグルタミン酸による置換、または243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換、または247位でのロイシンによる、および421位でのリシンによる置換、または248位でのメチオニンによる置換、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または293位でのバリンによる、295位でのグルタミン酸による、および327位でのスレオニンによる置換、または268位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または319位でのフェニルアラニンによる、352位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換を含む。
【０１６２】
別の特定の実施形態では、免疫グロブリンのADCC活性を増大させる1つまたは複数のアミノ酸改変は、以下の表7に収載した変異体のいずれかである。
【表７】
2009507470.tif 000022
【０１６３】
2009507470.tif 000023
【０１６４】
代案としてまたは追加として、上のアミノ酸修飾をまたは本明細書で開示されたその他のすべてのアミノ酸改変を、Fc領域のC1q結合および/または補体依存性細胞傷害機能を改変する1つまたは複数の追加のアミノ酸改変と組み合わせるのは有用である可能性がある。本明細書において特に関心のある開始分子は、通常、C1qに結合し、補体依存性細胞傷害(CDC)を示す分子である。本明細書に記載した追加のアミノ酸置換は、一般に、C1qに結合しかつ/またはその補体依存性細胞傷害機能を改変する、例えば、これらのエフェクター機能を低下させる、および好ましくは無効にする開始分子の能力を改変するのに役立つであろう。しかし、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害(CDC)機能が改良された、前記記載の位置のうちの1つまたは複数における置換を含む分子は、本明細書で企図されている。例えば、前記開始分子は、C1qに結合するかつ/またはCDCを媒介することができない場合があり、開始分子がこれらの追加のエフェクター機能を獲得するように、本明細書の教唆に従って改変してもよい。さらに、既存のC1q結合活性を有し、随意にさらにCDCを媒介する能力を有する分子は、これらの活性のうちの一方または両方が増強されるように、改変されてもよい。
【０１６５】
上に開示するように、例えば、C1q結合および/またはFcR結合を改変し、それによってCDC活性および/またはADCC活性を変化させることにより、エフェクター機能が改変されたFc領域を設計することができる。例えば、C1q結合が改良され、FcγRIII結合が改良された、例えば、ADCC活性も改良されCDC活性も改良された変異型Fc領域を作製することができる。代案として、エフェクター機能が低下されるまたは切除されることを所望する場合、CDC活性が低下しおよび/またはADCC活性が低下した変異型Fc領域を工学的に改変してもよい。他の実施形態では、これらの活性のうちの一方のみを増大させ、随意にさらにもう一方の活性は低下させる、例えば、ADCC活性は改良されたが、CDC活性は低下した、およびその逆にCDC活性は改良されたが、ADCC活性は低下したFc領域変異体を作製してもよい。
【０１６６】
本発明は、ソーティングの2順目4順目の後、突然変異体の酵母ライブラリーから本発明の方法を使って同定し、表8に収載するFc領域の特定の変異体を包含する。表8は、本発明の方法を使って同定された種々の突然変異体をまとめている。前記突然変異体は、FcγRIIIAおよびFcγRIIBへの結合を判断するためにELISAアッセイを使って検定した。前記突然変異体は、本明細書に開示し例示している方法を使ってFc変異体をch-4-4-20抗体にクローン化することにより、ADCCアッセイでも試験した。太字の項目は、ADCCアッセイに先立って前記ch-4-4-20抗体を精製した実験を示している。使用した抗体濃度は0.5μg/mL〜1.0μg/mLの範囲であった。
【表８】
2009507470.tif 000024
【０１６７】
2009507470.tif 000025
【０１６８】
2009507470.tif 000026
【０１６９】
2009507470.tif 000027
【０１７０】
2009507470.tif 000028
【０１７１】
2009507470.tif 000029
【０１７２】
2009507470.tif 000030
【０１７３】
2009507470.tif 000031
【０１７４】
2009507470.tif 000032
【０１７５】
2009507470.tif 000033
【０１７６】
2009507470.tif 000034
【０１７７】
好ましい実施形態では、本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有し、その1つまたは複数のアミノ酸改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する分子の親和性を増大させる変異型Fc領域のある改変された免疫グロブリン分子(例えば、抗体)を提供する。そのような免疫グロブリンには、天然にFcγR結合領域(例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域)を含有するIgG分子、またはFcγR結合領域(例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域)を含有するように工学的に改変された免疫グロブリン誘導体がある。本発明の改変された免疫グロブリンには、好ましくは、免疫特異的に、すなわち、特異的な抗原抗体結合を検定するための当技術分野で公知の免疫アッセイ法により決定される場合に非特異的結合と競合せずに、抗原に結合し、FcγR結合領域(例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域)を含有するあらゆる免疫グロブリン分子がある。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化型、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、ジスルフィド連結Fv、および、VLもしくはVHドメインのいずれか、または、抗原に特異的に結合し、ある種の場合には、FcγR結合領域を含有するよう工学的に改変されるもしくはFcγR結合領域に融合される相補性決定領域(CDR)までも含有する断片があるがこれらに限定されない。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本発明の分子はFc領域の一部を含む。本明細書で使用する用語「Fc領域の一部」とは、Fc領域の断片、好ましくはエフェクター活性および/またはFcγR結合活性のある部分(または、そのような活性を欠く突然変異体の比較可能な領域)のことである。Fc領域の断片は、大きさが5個のアミノ酸からアミノ酸を1個欠く全Fc領域までの範囲がある。Fc領域の部分は、N末端またはC末端から最大10個、最大20個、最大30個のアミノ酸が欠失している場合もある。
【０１７９】
本発明のIgG分子は、好ましくはIgGのIgG1サブクラスであるが、所与の動物の他のIgGサブクラスのいずれであってもよい。例えば、ヒトでは、IgGクラスにはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4があり、ならびにマウスIgGにはIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2cおよびIgG3がある。
【０１８０】
免疫グロブリン(および本明細書に使用の他のポリペプチド)は、鳥類および哺乳動物を含むいかなる動物起源由来でもよい。好ましくは、抗体はヒト、げっ歯類(例えば、マウスおよびラット)、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書で使用する「ヒト」抗体には、下に記載のおよび、例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記載の、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体があり、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または1つまたは複数のヒト免疫グロブリンのトランスジェニック動物、および内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離した抗体がある。
【０１８１】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性でも、さらに大きな多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに特異的でもよいし、異種ポリペプチドまたは固体の支持物質などの異種エピトープに特異的でもよい。例えば、PCT国際公開国際公開第93/17715号、国際公開第92/08802号、国際公開第91/00360号、国際公開第92/05793号、Tutt, et al, J. Immunol., 147:60-69, 1991、米国特許第4,474,893号、米国特許第4,714,681号、米国特許第4,925,648号、米国特許第5,573,920号、米国特許第5,601,819号、Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553, 1992を参照されたい。
【０１８２】
多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。そのような分子は、通常は2つの抗原のみにしか結合しないが(すなわち、二重特異性抗体、BsAb)、三重特異性抗体などの追加の特異性のある抗体は本発明に包含される。BsAbの例には、無制限に、一方のアームは腫瘍細胞抗原に向けられもう一方のアームは細胞傷害分子に向けられた二重特異性抗体がある。
【０１８３】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野では公知である。全長二重特異性抗体の従来の作製は、2つの鎖が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の共発現に基づいている(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)、本文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無秩序な組合せのせいで、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は10の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうちの1つの抗体のみが正確な二重特異的構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー段階により行われる前記正確な分子の精製は、かなり厄介であり、生産収量は低い。類似の手法が国際公開第93/08829号、およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１８４】
別の方法に従えば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体抗原結合部位)は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合している。前記融合物は好ましくは、少なくともヒンジ、CH2、およびCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。軽鎖結合に不可欠な部位を含有し、前記融合物の少なくとも1つに存在する第1重鎖定常領域(CH1)を有することが好ましい。前記免疫グロブリン重鎖融合物、および必要であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトする。構築に使用される不均等な割合の3つのポリペプチド鎖が最適収量を提供する場合、これは、実施形態中の前記3つのポリペプチド断片の相互の割合を調整するのに大きな柔軟性を提供する。しかし、均等な割合の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、または前記割合が特に重要ではない場合には、2つまたは3つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することができる。
【０１８５】
この方法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第1の結合特異性を備えているハイブリッド免疫グロブリン重鎖、およびもう一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対(第2の結合特異性を与える)で構成されている。二重特異性分子の一方の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することが容易な分離法を提供するので、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離を促進することが発見された。この方法は、国際公開第94/04690号に開示されている。さらに詳細な二重特異性抗体の作製は、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology、121:210 (1986)を参照されたい。国際公開第96/27011号に記載の別の方法に従えば、1対の抗体分子を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするよう工学的に改変することができる。好ましい接触面は、少なくとも抗体定常ドメインのCH3ドメインの一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の接触面由来の1つまたは複数の小アミノ酸側鎖はさらに大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖(群)と同一のまたは類似の大きさの代償の「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をさらに小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはスレオニン)と置き換えることにより、第2の抗体分子の接触面に作られる。これは、ホモ二量体などの他の望まれない末端産物よりもヘテロ二量体の収量を増大させるための機序を提供する。
【０１８６】
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体がある。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンと結合し、もう一方はビオチンと結合することができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まれない細胞に標的するために(米国特許第4,676,980号)、およびHIV感染の治療のために(国際公開第91/00360号、国際公開第92/200373号、および欧州特許第03089号)提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、いかなる便利な架橋法を使って作製してもよい。適切な架橋剤は当技術分野では公知であり、米国特許第4,676,980号でいくつかの架橋技術とともに開示されている。
【０１８７】
二価を超える抗体が企図されている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)を参照されたい。この文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０１８８】
本発明の抗体には、他の方法で、すなわち、共有結合が、抗体が抗原に結合することおよび/または抗イディオタイプ応答を生じることを妨げないように、いかなる種類の分子でも抗体と共有結合させることにより改変される誘導体がある。例えば、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連鎖などにより改変された抗体があるが、これらの抗体に限定するつもりはない。数多くの化学修飾のうちいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されるものではない既知の技術により実施してもよい。そのうえ、前記誘導体は、1つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含有していてもよい。
【０１８９】
ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの使用のために、キメラ、ヒト化型、またはヒト抗体を使用するのが好ましいこともある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種由来である分子である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science, 229:1202, 1985, Oi et al., BioTechniques, 4:214 1986, Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125:191-202, 1989、米国特許第5,807,715号、米国特許第4,816,567号、および米国特許第4,816,397号を参照されたい。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。ヒト化型抗体は、非ヒト種由来の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)、ならびにヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域および定常ドメインを有し、所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、CDR供与体抗体由来の対応する残基で置換され、抗原結合を改変する、好ましくは改良するであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で公知の方法により、例えば、抗原結合にとり重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデル化、および特定の位置での珍しいフレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される。例えば、Queen et al.、米国特許第5,585,089号、およびRiechmann et al., Nature, 332:323, 1988を参照されたい。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。抗体は、例えば、CDRグラフティング(欧州特許第239,400号、PCT国際公開国際公開第91/09967号、米国特許第5,225,539号、米国特許第5,530,101号、および米国特許第5,585,089号)、べニアリングまたはリサーフェシング(欧州特許第592,106号、欧州特許第519,596号、Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498, 1991, Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814, 1994, Roguska et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973, 1994)、および、チェインシャフリング(米国特許第5,565,332号)を含む当技術分野で公知の種々の技術を使ってヒト化することができる。これらの文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。ヒト化型抗体は、米国特許第5,693,762号(Protein Design Labs)、米国特許第5,693,761号、(Protein Design Labs)、米国特許第5,585,089号(Protein Design Labs)、米国特許第6,180,370号(Protein Design Labs)、および米国特許公開第20040049014号、米国特許公開第200300229208号に開示された方法のいずれを使って製作してもよい。これらの特許文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１９０】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療上の処置に特に好ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使った上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の種々の方法により作製することができる。米国特許第4,444,887号、および米国特許第4,716,111号、ならびにPCT国際公開国際公開第98/46645号、国際公開第98/50433号、国際公開第98/24893号、国際公開第98/16654号、国際公開第96/34096号、国際公開第96/33735号、および国際公開第91/10741号を参照されたい。これらの特許文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０１９１】
ヒト抗体は、機能的内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使って作製することもできる。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概観は、Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol., 13:65-93、1995を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術の詳細な議論、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコールは、PCT国際公開国際公開第98/24893号、国際公開第92/01047号、国際公開第96/34096号、国際公開第96/33735号、欧州特許第0 598 877号、米国特許第5,413,923号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,885,793号、米国特許第5,916,771号、および米国特許第5,939,598号を参照されたい。これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont、CA)、Medarex (NJ) and Genpharm (San Jose、CA)などの会社は、上記の技術に類似の技術を使って、選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供することができる。
【０１９２】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を使って作製することができる。この方法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体、を使って、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する(Jespers et al., Bio/technology、12:899-903、1988参照)。
【０１９３】
本発明は、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、Fc領域においてヒトまたはヒト化型治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)を工学的に改変することを包含する。別の実施形態では、本発明は、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させ、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変により、Fc領域においてヒトまたはヒト化型治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)を工学的に改変することに関する。工学的に改変された治療用抗体は、当業者に公知の標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能、例えば、増強されたADCC活性、貪食性活性などをさらに有していてもよい。
【０１９４】
特定の実施形態では、本発明は、その修飾がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、Her2/neu癌原遺伝子に特異的なヒト化型モノクローナル抗体(例えば、Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-9に開示されたAb4D5ヒト化型抗体)を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、ヒト化型Her2/neuモノクローナル抗体の改変は、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させてもよい。さらに別の特定の実施形態では、Her2/neuに特異的な工学的に改変されたヒト化型モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のおよび本明細書で開示し例示している標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能をさらに有していてもよい。
【０１９５】
別の特定の実施形態では、本発明は、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により、マウスヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗体の2H7を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、前記抗CD20モノクローナル抗体の2H7の改変は、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させてもよい。さらに別の特定の実施形態では、工学的に改変された抗CD20モノクローナル抗体の2H7は、当技術分野で公知のおよび本明細書で開示し例示している標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能をさらに有していてもよい。
【０１９６】
ある実施形態では、本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.4.3、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により産生されたモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインを含む抗体(または、そのキメラ、ヒト化型、もしくは他のその工学的に改変された型の抗体)を工学的に改変することを包含する(ATCC、10801 University Boulevard、Manassas、VA 02209-2011に預託された。これらの文献はすべてが参照により本明細書に組み込まれているものとする)。特定の実施形態では、本発明は、2B6、3H7、または8B5.3.4の重鎖可変および/または軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、2B6、3H7、または8B5.3.4のCDRを含むヒト化型抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号1、配列番号2または配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、または配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むヒト化型抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを包含する。
【０１９７】
別の特定の実施形態では、本発明は、2002年8月12日出願の米国特許仮出願第60/403,266号、2003年8月14日出願の米国特許出願第10/643,857号、2004年4月16日出願の米国特許仮出願第60/562,804号、2004年6月21日出願の米国特許仮出願第60/582,044号、2004年6月21日出願の米国特許仮出願第60/582,045号、2004年12月15日出願の米国特許仮出願第60/636,663号、および2005年2月11日出願の米国特許出願第10/524,134号に開示された抗体のいずれかを含むが、これに限定されるものではない抗FcγRIIB抗体を、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、2004年5月10日出願の米国特許仮出願第60/569,882号、2004年6月21日出願の米国特許仮出願第60/582,043号、および2005年5月10日出願の米国特許出願第11/126,978号に開示された抗体のいずれかを含むが、これに限定されるものではないヒト化型抗FcγRIIB抗体を、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させる、少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)により工学的に改変することを包含する。上記出願書類はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。ヒト化されていてもいなくてもよく、本発明の方法に従って工学的に改変されてもよい抗FcγRIIB抗体の例には、ATCC受託番号PTA-4591を有する2B6モノクローナル抗体、およびATCC受託番号PTA-4592を有する3H7、ATCC受託番号PTA-5958を有する1D5モノクローナル抗体、ATCC受託番号PTA-5959を有する1F2モノクローナル抗体、ATCC受託番号PTA-5960を有する2D11モノクローナル抗体、ATCC受託番号PTA-5961を有する2E1モノクローナル抗体、ATCC受託番号PTA-7610を有する8B5.3.4、およびATCC受託番号PTA-5962を有する2H9モノクローナル抗体(すべてが10801 University Boulevard、Manassas、VA 02209-2011に預託されている)がある。これらの抗体は参照により本明細書に組み込まれているものとする。別の特定の実施形態では、抗FcγRIIB抗体の改変は、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させてもよい。さらに別の特定の実施形態では、工学的に改変された抗FcγRIIB抗体は、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載され例示されている標準的アッセイ法により決定される場合、増強されたエフェクター機能をさらに有していてもよい。
【０１９８】
特定の実施形態では、本発明は、それぞれATCC受託番号がPTA-4591、PTA-4592、およびPTA-7610のクローン2B6、3H7、または8B5.3.4により産生される抗体の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR) (例えば、重鎖CDR3)、好ましくは6つのCDRすべてを含む抗FcγRIIB抗体を本発明の方法に従って工学的に改変することを包含する。特定の実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変された抗FcγRIIB抗体は、それぞれATCC受託番号がPTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン1D5、2E1、2H9、2D11、および1F2により産生される抗体の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR) (例えば、重鎖CDR3)、好ましくは6つのCDRすべてを含む。別の実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変された抗FcγRIIB抗体は、それぞれATCC受託番号がPTA-4591、PTA-4592、およびPTA-7610のクローン2B6、3H7、または8B5.3.4から産生されるマウスモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合し、かつ/または、例えば、ELISAアッセイもしくは他の適切な競合的免疫アッセイで決定した場合、それぞれATCC受託番号がPTA-4591、PTA-4592、およびPTA-7610のクローン2B6、3H7、または8B5.3.4から産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、前記抗体またはその断片がFcγRIIAに結合するよりも大きな親和性でFcγRIIBにも結合する。別の実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変された抗FcγRIIB抗体は、それぞれATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン1D5、2E1、2H9、2D11、および1F2から産生されるマウスモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合し、かつ/または、例えば、ELISAアッセイもしくは他の適切な競合的免疫アッセイで決定した場合、それぞれATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン1D5、2E1、2H9、2D11、および1F2から産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、前記抗体またはその断片がFcγRIIAに結合するよりも大きな親和性でその可変領域を介してFcγRIIBにも結合する。
【０１９９】
本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%同一である重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することも包含する。本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の1つまたは複数のCDRのアミノ酸配列と少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%同一である1つまたは複数のCDRのアミノ酸配列を含む抗FcγRIIB抗体の工学的改変もさらに包含する。2つのアミノ酸配列の同一性％の決定は、BLASTタンパク質サーチを含む当業者に公知のいかなる方法によっても決定することができる。
【０２００】
本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により厳密な条件の下で産生されるマウスモノクローナル抗体の1つまたは複数の可変ドメインのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされた1つまたは複数の可変ドメインを含む1つまたは複数の抗FcγRIIB抗体の工学的改変もさらに包含する。好ましい実施形態では、本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により厳密な条件の下で産生されるマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖および/または可変重鎖ドメインのヌクレオチド配列に厳密な条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされた可変軽鎖および/または可変重鎖ドメインを含む1つまたは複数の抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを包含する。別の好ましい実施形態では、本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により産生されるマウスモノクローナル抗体の1つまたは複数のCDRのヌクレオチド配列に厳密な条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされた1つまたは複数のCDRを含む抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを提供する。厳密なハイブリダイゼーション条件には、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、それに続く約50〜65℃での0.2×SSC/0.1%SDSでの1回もしくは複数回の洗浄、約45℃での6×SSC中でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、それに続く約60℃での0.1×SSC/0.2%SDSでの1回または複数回の洗浄などの高度に厳密な条件、または当業者に公知のあらゆる他の厳密なハイブリダイゼーション条件があるが、これらの条件に限定されるものではない(例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology、vol. 1、Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc.、NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3を参照されたい。この文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする)。
【０２０１】
好ましい実施形態では、本発明の工学的に改変された抗体は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載のいかなる方法でもヒト化され、かつ/または、ヒト化型FcγRIIB特異的抗体のまたはヒト化型CD20特異的抗体のCDR領域であって、前記CDRがそれぞれFcγRIIBまたはCD20に特異的なマウス抗体由来であるCDR領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化型抗体は、受容体抗体、すなわち、供与体モノクローナル抗体の結合特異性を保持するのに不可欠なヒト重および/または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域のアミノ酸欠失、挿入、改変を含むがこれに限定されるものではない改変を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化型抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然のヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列からなるわけではなく、ヒト化抗体の特性を改変する、例えば、マウスFcγRIIBまたはCD20特異的抗体と同一の標的に特異的なヒト化型抗体可変領域の結合特性を改良する、アミノ酸欠失、挿入、改変を含むがこれに限定されるものではない種々の改変を含有する。最も好ましい実施形態では、非ヒトフレームワーク残基の大規模な導入を回避し、ヒトにおいて本発明のヒト化型抗体の最小限の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域には最少数の改変を加える。供与体モノクローナル抗体は、好ましくはクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、もしくは1F2(それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有する)により産生されFcγRIIBに結合するモノクローナル抗体であり、またはモノクローナル抗体は、リツキシマブもしくは2H7などのCD20抗体である。
【０２０２】
特定の実施形態では、本発明は、レシピエント抗体のフレームワーク残基、およびFcγRIIBに特異的に結合する供与体モノクローナル抗体、例えば、それぞれATCC受託番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-7610、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するクローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2により産生されるモノクローナル抗体由来の残基を含む重鎖可変領域ドメインを含むCDRグラフト抗体を工学的に改変することを包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、レシピエント抗体のフレームワーク残基、およびFcγRIIBに特異的に結合する供与体モノクローナル抗体、例えば、クローン2B6、3H7、8B5.3.4、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2から産生されるモノクローナル抗体由来の残基を含む軽鎖可変領域ドメインを含むCDRグラフト抗体を工学的に改変することを包含する。
【０２０３】
好ましくは、FcγRIIBヒト化型抗体は天然のヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに結合する。前記組合せのヒト化型抗FcγRIIB抗体は、CDR1(配列番号15もしくは配列番号16)および/またはCDR2(配列番号17もしくは配列番号18)および/またはCDR3(配列番号19もしくは配列番号20)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに/あるいはCDR1(配列番号21もしくは配列番号22)および/またはCDR2(配列番号23、配列番号24、配列番号25もしくは配列番号26)および/またはCDR3(配列番号27もしくは配列番号28)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有することができる。
【０２０４】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、または配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインのあるヒト化型抗FcγRIIB抗体の工学的改変を包含する。
【０２０５】
1つの特定の実施形態では、本発明は、FcγRIIB抗体のVH領域が、ヒト生殖系列VHセグメントVH1-18(Matsuda et al., 1998, J. Exp. Med. 188:2151062)およびJH6(Ravetch et al., 1981、Cell 27(3 Pt. 2): 583-91)由来のFRセグメント、ならびに配列番号1、配列番号17、または配列番号19のアミノ酸配列を有する2B6 VHの1つまたは複数のCDR領域からなる、ヒト化型抗FcγRIIB抗体を工学的に改変することを包含する。1つの実施形態では、前記2B6 VHは、配列番号1、配列番号3、または配列番号29のアミノ酸配列を有する。別の特定の実施形態では、ヒト化型抗FcγRIIB抗体は、ヒト生殖系列VLセグメントVK-A26 (Lautner-Rieske et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:1023-1029)およびJK4 (Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22)のFRセグメント、ならびに配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号25、および配列番号27のアミノ酸配列を有する2B6 VLの1つまたは複数のCDR領域からなるVL領域をさらに含む。1つの実施形態では、前記2B6 VLは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、または配列番号30のアミノ酸配列を有し、随意に上記の2B6 VHの1つと組み合わされる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、アミノ酸配列(H2B6VH-3):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS(配列番号3)
を含むVH鎖および/またはVHドメインを有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、アミノ酸配列(H2B6VL-5):
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKEVSESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK(配列番号8)
を含むVL鎖および/またはVLドメインを有する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、アミノ酸配列(H2B6VH-3):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS(配列番号3):
を含むVH鎖および/またはVHドメイン、ならびに、アミノ酸配列(H2B6VL-5):
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKEVSESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK(配列番号8):
を含むVL鎖および/またはVLドメインを有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、アミノ酸配列(8B5.3.4 VH、図2参照):
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYWGQGTTLTVSS(配列番号9)
を含むVHドメインおよび/またはVH鎖を有する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、アミノ酸配列(8B5.3.4 VL、図1参照):
DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELK(配列番号10)
を含むVLドメインおよび/またはVL鎖を有する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、アミノ酸配列(8B5.3.4 VH):
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYWGQGTTLTVSS(配列番号9、図2参照)
を含むVHドメインおよび/またはVH鎖、ならびにアミノ酸配列(8B5.3.4 VL、図1参照):
DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELK(配列番号10)
を含むVLドメインおよび/またはVL鎖を有する。
【０２１２】
別の特定の実施形態では、本発明の方法に従って工学的に改変される抗FcγRIIB抗体は、FcγRIIB VH領域がヒト生殖系列VHセグメント由来のFRセグメント、および、配列番号37のアミノ酸配列を有する3H7 VHのCDR領域からなる、ヒト化型3H7抗体である。別の特定の実施形態では、ヒト化型3H7抗体は、さらにヒト生殖系列VLセグメントのFRセグメント、および配列番号7のアミノ酸配列を有する3H7 VLのCDR領域からなるVL領域を含む。
【０２１３】
特に、本発明は、抗体が天然のヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合し、前記FcγRIIB抗体が以下の組合せ、VH CDR1とVL CDR1; VH CDR1とVL CDR2; VH CDR1とVL CDR3; VH CDR2とVL CDR1; VH CDR2とVL CDR2; VH CDR2とVL CDR3; VH CDR3とVH CDR1; VH CDR3とVL CDR2; VH CDR3とVL CDR3; VH1 CDR1、VH CDR2とVL CDR1; VH CDR1、VH CDR2とVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2とVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3とVL CDR1; VH CDR2、VH CDR3とVL CDR2; VH CDR2、VH CDR2とVL CDR3; VH CDR1、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR1、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR2、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR2、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR3、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR3、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3とVL CDR1; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3 とVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3とVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2とVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1とVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1とVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2とVL CDR3; VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2とVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2とVL CDR3; または本明細書で開示しているVH CDRおよびVL CDRのそのあらゆる組合せのいずれかにおいて2B6、3H7、または8B5.3.4のCDR配列を含む(または、代案として、からなる)、抗FcγRIIB抗体の工学的改変を包含する。
【０２１４】
特定の実施形態では、抗FcγRIIBモノクローナル抗体は、334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる改変(MgFc13)、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換(MgFc27)、または243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換(MgFc29)、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc38)、または221位でのグルタミン酸による、270位でのグルタミン酸による、308位でのアラニンによる、311位でのヒスチジンによる、396位でのロイシンによる、および402位でのアスパラギン酸による置換(MgFc42)、または410位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc53)、または243位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、378位でのアスパラギン酸による、404位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc54)、または255位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc55)、または370位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換(MgFc59)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換(MgFc88A)、または234位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換(MgFc155)、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および300位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換を含む(表5および6参照)。
【０２１５】
5.1.1  ポリペプチドおよび抗体コンジュゲート
変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、ポリペプチド、抗体)は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチド(すなわち、無関係なポリペプチド、またはその部分、好ましくは前記ポリペプチドの少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸)に組換えで融合させても、または化学的にコンジュゲートさせ(共有結合的および非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む)てもよい。前記融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起きてもよい。
【０２１６】
さらに、変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、ポリペプチド、抗体)は、所与の生物学的応答を改変する治療薬または薬物成分にコンジュゲートしてもよい。治療薬または薬物成分は、古典的な化学的治療薬に制限されていると解釈すべきではない。例えば、前記薬物成分は、所望の生物活性を有するタンパク質でもポリペプチドでもよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素(すなわち、PE-40)、もしくはジフテリア毒素、リシン、ゲロニン、およびヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質などの毒素、腫瘍壊死因子、αインターフェロン(IFN-α)、βインターフェロン(IFN-β)を含むがこれに限定されることはないインターフェロン、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、アポトーシス剤(例えば、PCT国際公開国際公開第97/33899号で開示されたTNF-α、TNF-β、AIM I)、AIM II(PCT国際公開国際公開第97/34911号参照)、Fasリガンド(Takahashi et al., J. Immunol.、6:1567-1574, 1994)、およびVEGI (PCT国際公開国際公開第99/23105号)などのタンパク質、血栓症薬もしくは抗血管新生薬(例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン)、または、例えば、リンホカイン(例えば、インターロイキン1(「IL-1」)、インターロイキン2(「IL-2」)、インターロイキン6(「IL-6」))、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)、マクロファージコロニー刺激因子(「M-CSF」)、もしくは成長因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))、プロテアーゼ、もしくはリボヌクレアーゼなどの生物学的応答調節物質がある。
【０２１７】
本発明の分子(すなわち、ポリペプチド、抗体)は、精製を促進するためのペプチドなどのマーカー配列に融合させることができる。好ましい実施形態では、前記マーカーアミノ酸配列は、数ある中でもpQEベクター(QIAGEN, Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)に提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。例えば、Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製法を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素「HA」タグ(Wilson et al., Cell、37:767 1984)、および「flag」タグ(Knappik et al., Biotechniques、17(4):754-761、1994)があるが、これらのタグに限定されるものではない。
【０２１８】
追加の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および/またはコドンシャフリング(合わせて「DNAシャフリング」と呼ぶ)の技術によって作製してもよい。DNAシャフリングを用いて、本発明の分子の活性を改変してもよい(例えば、より高い親和性とより低い解離速度を有する抗体)。一般に米国特許第5,605,793号、米国特許第5,811,238号、米国特許第5,830,721号、米国特許第5,834,252号、および米国特許第5,837,458号、ならびにPatten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33, Harayama, 1998、Trends Biotechnol. 16:76, Hansson、et al., 1999、J. Mol. Biol. 287:265、およびLorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308を参照されたい(これらの特許文献および出版物はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする)。変異型Fc領域を含む本発明の分子、または本発明の分子をコードしている核酸は、変異性PCRによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または組換えに先立つ他の方法にかけることによりさらに改変してもよい。本発明の分子をコードしているポリヌクレオチドの1つまたは複数の部分は、1つまたは複数の異種分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み合わせてもよい。
【０２１９】
本発明は、血清中半減時間を延ばすことを望まれている診断もしくは治療薬またはその他のあらゆる分子にコンジュゲートされ、かつ/または細胞の特定のサブセットに標的される、変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、抗体、ポリペプチド)を包含する。本発明の分子を診断的に使って、例えば、臨床試験法の一部として、例えば、所与の治療計画の有効性を決定するために、疾患、障害、もしくは感染の発症または進行を監視することができる。本発明の分子と検出可能な物質を結合させることにより検出を促進することができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出物質、および非放射性常磁性金属イオンがある。前記検出可能な物質は、本発明の分子に直接結合させるもしくはコンジュゲートさせてもよいし、または当技術分野で公知の技術を使って媒介物(例えば、当技術分野で公知のリンカー)により間接的に結合させるもしくはコンジュゲートさせてもよい。例えば、本発明に従って診断薬として使用するため抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンは、米国特許第4,741,900号を参照されたい。そのような診断および検出は、種々の酵素、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含むがこれらの酵素に限定されるものではない酵素; ストレプトアビジン/ビオチン、およびアビジン/ビオチンなどの、しかしこれらの物質に限定されることはない補欠分子族複合体; ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシル塩化物、またはフィコエリトリンなどの、しかしこれらの物質に限定されるものではない蛍光物質; ルミノールなどのしかしこれに限定されるものではない発光物質; ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどのしかしこれらの物質に限定されるものではない生物発光物質; ビスマス(213Bi)、炭素(14C)、クロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリウム(153Gd、159Gd)、ガリウム(68Ga、67Ga)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタン(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレン(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(133Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、亜鉛(65Zn)などの、しかしこれらの物質に限定されるものではない放射性物質; 種々の陽電子放出断層撮影を使った陽電子放出物質、および非放射性常磁性金属イオンを含む検出可能な物質に、本発明の分子を結合させることにより実現することができる。
【０２２０】
変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、抗体、ポリペプチド)は、細胞毒などの治療成分(例えば、細胞分裂阻害剤もしくは細胞破壊剤)、治療薬、または放射性元素(例えば、α放射体、γ放射体など)にコンジュゲートしてもよい。細胞毒または細胞傷害薬物には、細胞に有害なあらゆる薬剤がある。例には、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびその類似体または相同体がある。治療薬には、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルダカルバジン)、アルキル化薬(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン))、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)、およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチン、およびビンブラスチン)があるが、これらの物質に限定されるものではない。
【０２２１】
さらに、本発明の分子は、放射性物質などの治療成分または放射性金属イオンのコンジュゲートに有用な大環状キレート剤にコンジュゲートすることができる(放射性物質の上記の例を参照されたい)。ある実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる1,4,7,10-テトラアザ環式ドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸(DOTA)である。そのようなリンカー分子は当技術分野では公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50に記載されている。これらの文献はそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
【０２２２】
そのような治療成分を抗体にコンジュゲートするための技術は公知である。Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.; Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.; Thorpe、"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; およびThorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58, 1982を参照されたい。
【０２２３】
本発明の分子が、変異型Fc領域を含む抗体である1つの実施形態では、前記分子は、治療上の処置として使用するために、治療成分をその分子にコンジュゲートして、または治療成分をコンジュゲートせずに投与する、単独で投与する、または細胞傷害因子(群)および/またはサイトカイン(群)と組み合わせて投与することができる。代案として、本発明の抗体は、米国特許第4,676,980号でSegalにより記載されているように、第2の抗体にコンジュゲートさせ、抗体異種コンジュゲートを形成することができる。この特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。本発明の抗体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用な固形支持体に結合させてもよい。そのような固形支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンがあるが、これらに限定されるものではない。
【０２２４】
5.2  増強されたFcγRIII結合についての変異型Fc領域を有する分子のスクリーニングおよびその特徴付け
好ましい実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の生化学に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。1つまたは複数の生化学アッセイは、それだけに限らないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析を含めて、Fc-FcγR相互作用、すなわちFc領域とFcγRの特異的結合の同定について当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。いくつかの実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の機能に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。機能に基づくアッセイは、本明細書の第5.2.7節に記載のものなどの1つまたは複数のFcγR媒介性エフェクター細胞機能の特徴付けについて当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。本発明の方法に従って使用することができるエフェクター細胞機能の非限定的な例には、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、C1q結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害がある。いくつかの実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の機能に基づくアッセイと組み合わせたまたはそれと並行した1つまたは複数の生化学に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。
【０２２５】
Fc領域とFcγRの「特異的結合」という用語は、例えばELISAまたは表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIAcore(商標))を使用して決定される、単量体FcγRIIIAの場合で少なくとも約150nM、二量体FcγRIIBの場合で少なくとも約60nMの親和定数を有するFc領域と特定のFcγRの相互作用を指す。単量体FcγRIIIAについてのFc領域の親和定数は、150nM、200nMまたは300nMでよい。二量体FcγRIIBについてのFc領域の親和定数は、60nM、80nM、90nM、または100nMでよい。本発明の方法で使用する二量体FcγRIIBは、当業者に知られている方法を使用して生成することができる。通常、FcγRIIBの細胞外領域は、二量体化が可能である異種ポリペプチドと共有結合し、その結果、得られる融合タンパク質が二量体となる(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2003年1月13日に出願された米国出願第60/439,709号(代理人整理番号11183-005-888)を参照されたい)。特異的相互作用は一般に、例えば、ヒトまたは他の脊椎動物あるいは無脊椎動物などの生存している個体中で起こる条件、ならびに哺乳動物細胞あるいは他の脊椎動物または無脊椎動物由来の細胞の維持および培養に使用する条件などの細胞培養中で起こる条件を含めた生理的条件下で安定である。
【０２２６】
特定の実施形態では、変異型Fc領域および改変されたFcγR親和性を含む分子のスクリーニングおよび同定は、酵母表面上に変異型Fc領域を含む分子を提示することと、Fc-FcγR相互作用を決定する生化学的アッセイ、好ましくはELISAに基づくアッセイを使用して変異型Fc領域を含む分子とFcγR(1つまたは複数)の結合を特徴付けることを含む。1つまたは複数のFcγRとの相互作用について変異型Fc領域を含む分子を特徴付け、少なくとも1つの生化学に基づくアッセイ、例えばELISAアッセイによってそれが1つまたは複数のFcγRについて変化した親和性を有することを決定した後、当技術分野で知られている標準的な組換えDNA技術の方法を使用してその分子を工学的に改変して完全なイムノグロブリンにし、さらなる生化学的特徴付けのために哺乳動物細胞中で変異型Fc領域を含むイムノグロブリンを発現させることができる。(例えばイムノグロブリンのFc領域を置換して)その中に本発明の変異型Fc領域を導入したイムノグロブリンは、それだけに限らないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体を含めた任意のイムノグロブリンでよい。好ましい実施形態では、変異型Fc領域を、細胞表面受容体、腫瘍抗原、または癌抗原に特異的なイムノグロブリン中に導入する。その中に本発明の変異型Fc領域を導入したイムノグロブリンは、例えば、それだけに限らないが、KS1/4汎癌腫抗原(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415)、卵巣癌抗原(CA125)(Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2): 468-475)、前立腺酸性リン酸塩(Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928)、前立腺特異抗原(Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2): 903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230)、黒色腫関連抗原p97(Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446)、黒色腫抗原gp75(Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380)、高分子量黒色腫抗原(HMW-MAA)(Natali et al., 1987, Cancer 59: 55-63; Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144)、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)(Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72(Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53: 751-758)などの結腸直腸腫瘍関連抗原; GICA 19-9(Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135)、CTA-1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原38.13、CD19(Ghetie et al., 1994, Blood 83: 1329-1336)、ヒトBリンパ腫抗原CD20(Reff et al., 1994, Blood 83:435-445)、CD33(Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430)、ガングリオシドGD2(Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシドGD3(Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380)、ガングリオシドGM2(Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044)、ガングリオシドGM3(Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 5244-5250)などの黒色腫特異抗原、DNA腫瘍ウイルスのT抗原およびRNA腫瘍ウイルスのエンベ
ロープ抗原を含めたウイルスによって誘導される腫瘍抗原などの細胞表面抗原の腫瘍特異的移植型(TSTA)、結腸のCEAなどの癌胎児性抗原α-フェトプロテイン、膀胱癌癌胎児性抗原(Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188)、ヒト肺癌抗原L6、L20などの分化抗原(Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46: 3917-3923)、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403)、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、EGFR(上皮成長因子受容体)などの乳癌抗原、HER2抗原(p185HER2)、多型上皮ムチン(PEM)(Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原APO-1(Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304)、胎児赤血球中に認められるI抗原、成体赤血球、着床前胚中に認められる初期内胚葉I抗原、胃腺癌中に認められるI(Ma)、乳房上皮中に認められるM18、M39、骨髄球中に認められるSSEA-1、結腸直腸癌中に認められるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌中に認められるC14、肺腺癌中に認められるF3、胃癌中に認められるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞中に認められるLey、TL5(血液型A)、A431細胞中に認められるEGF受容体、膵癌中に認められるE1シリーズ(血液型B)、胚性癌細胞中に認められるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中に認められるCO-514(血液型Lea)、腺癌中に認められるNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体中に認められるG49、結腸腺癌中に認められるMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌中に認められる19.9、胃癌ムチン、骨髄球中に認められるT5A7、黒色腫中に認められるR24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、ならびに4〜8細胞期胚中に認められるSSEA-3およびSSEA-4などの分化抗原(Feizi, 1985, Nature 314: 53-57)を含めた癌または腫瘍抗原に特異的に結合することができる。一実施形態では、抗原は、皮膚T細胞リンパ腫のT細胞受容体由来ペプチドである(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照されたい)。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型Fc領域を、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20 (参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Kranz et al., 1982 J. Biol. Chem. 257(12): 6987-6995)中に導入する。他の実施形態では、本発明の変異型Fc領域を、B細胞上のCD20細胞表面リン酸化タンパク質を認識するマウス-ヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗体2H7 (参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Liu et al., 1987, Journal of Immunology, 139: 3521-6)中に導入する。さらに他の実施形態では、本発明の変異型Fc領域を、Carter et al.により記載されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-9)ヒト上皮成長因子受容体2(p185 HER2)に対するヒト化抗体(Ab4D5)中に導入する。さらに他の実施形態では、本発明の変異型Fc領域を、ヒト化抗TAG72抗体(CC49)(Sha et al., 1994 Cancer Biother. 9(4): 341-9)中に導入する。他の実施形態では、本発明の変異型Fc領域を、リンパ腫の治療に使用するRituxan中に導入する。
【０２２８】
他の特定の実施形態では、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAについてFc領域の親和性を増大させる少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)による、それだけに限らないが、2002年8月12日に出願された米国仮出願第60/403,266号、2003年8月14日に出願された米国出願第10/643,857号、2004年4月16日に出願された米国仮出願第60/562,804号、2004年6月21日に出願された米国仮出願第60/582,044号、2004年6月21日に出願された米国仮出願第60/582,045号、2004年12月15日に出願された米国仮出願第60/636,663号、および2005年2月11日に出願された米国出願第10/524,134号で開示されている抗体のいずれかを含めた抗FcγRIIB抗体の工学的改変を包含する。他の特定の実施形態では、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAについてFc領域の親和性を増大させる少なくとも1つのアミノ酸残基の改変(例えば、置換、挿入、欠失)による、それだけに限らないが、2004年5月10日に出願された米国仮出願第60/569,882号、2004年6月21日に出願された米国仮出願第60/582, 043号および2005年5月10日に出願された米国出願第11/126,978号で開示されている抗体のいずれかを含めたヒト化抗FcγRIIB抗体の工学的改変を包含する。上記で述べた各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本発明の方法に従って工学的に改変することができる、ヒト化してもよく、あるいはヒト化しなくてもよい抗FcγRIIB抗体の例は、ATCCアクセッション番号PTA-4591を有する2B6モノクローナル抗体およびATCCアクセッション番号PTA-4592を有する3H7、ATCCアクセッション番号PTA-5958を有する1D5モノクローナル抗体、ATCCアクセッション番号PTA-5959を有する1F2モノクローナル抗体、ATCCアクセッション番号PTA-5960を有する2D11モノクローナル抗体、ATCCアクセッション番号PTA-5961を有する2E1モノクローナル抗体およびATCCアクセッション番号PTA-5962を有する2H9モノクローナル抗体(すべて10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011に寄託)であり、これらは参照により本明細書に組み込まれている。他の特定の実施形態では、抗FcγRIIB抗体の改変はまた、FcγRIIBについてFc領域の親和性をさらに低下させることもできる。さらに他の実施形態では、工学的に改変された抗FcγRIIB抗体はさらに、当技術分野で知られ、本明細書で開示され例示されている標準的なアッセイによって決定される、増強されたエフェクター機能を有してもよい。いくつかの実施形態では、それだけに限らないが、Erbitux(商標)(IMC-C225としても知られる)(ImClone Systems Inc.)、EGFRに対するキメラモノクローナル抗体; 転移性乳癌患者治療用のヒト化抗HER2モノクローナル抗体であるHERCEPTIN(登録商標)(トラスツズマブ)(Genentech, CA); 血餅形成防止用の、血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体であるREOPRO(登録商標)(アブシキシマブ)(Centocor); 急性腎異種移植片拒絶防止用の免疫抑制性ヒト化CD25モノクローナル抗体であるZENAPAX(登録商標)(ダクリズマブ)(Roche Pharmaceuticals, Switzerland)を含めた癌抗原または細胞表面受容体に特異的な治療用モノクローナル抗体中に本発明の変異型Fc領域を導入する。他の例は、ヒト化抗CD18 F(ab')2(Genentech); ヒト化抗CD18 F(ab')2であるCDP860(Celltech, UK); CD4と融合した抗HIV gp120抗体であるPRO542(Progenics/Genzyme Transgenics); 抗CD14抗体であるC14(ICOS Pharm); ヒト化抗VEGF IgG1抗体(Genentech); マウス抗CA 125抗体であるOVAREX(商標)(Altarex); マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX(商標)(Glaxo Wellcome/Centocor); キメラ抗EGFR IgG抗体であるIMC-C225(ImClone System); ヒト化αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN(商標)(Applied Molecular Evolution/MedImmune); ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03(Leukosite); ヒト化抗CD33 IgG抗体であるSmart M195(Protein Design Lab/Kanebo); キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN(商標)(IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE(商標)(Immunomedics); ヒト化抗HLA抗体であるSmart ID10(Protein Design Lab); 放射標識マウス抗HLA DR抗体であるONCOLYM(商標)(Lym-1)(Techniclone); ヒト化IgG1抗体である抗CD11a(Genentech/Xoma); ヒト化抗ICAM3抗体であるICM3(ICOS Pharm); 霊長類化抗CD80抗体であるIDEC-114(IDEC Pharm/Mitsubishi); 放射標識マウス抗CD20抗体であるZEVALIN(商標)(IDEC/Schering AG); ヒト化抗CD40L抗体であるIDEC-131(IDEC/Eisai); 霊長類化抗CD4抗体であるIDEC-151(IDEC); 霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152(IDEC/Seikagaku); ヒト化抗CD3 IgGであるSMART抗CD3(Protein Design Lab); ヒト化抗補体因子5(C5)抗体である5G1.1(Alexion Pharm); 霊長類化抗CD4 IgG1抗体であるIDEC-151(IDEC Pharm/SmithKline Beecham); ヒト抗CD4 IgG抗体であるMDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab); ヒト化抗TNF-α IgG4抗体であるCDP571(Celltech); ヒト化抗α4β7抗体であるLDP-02(LeukoSite/Genentech); ヒト化抗CD4 IgG抗体であるOrthoClone OKT4A(Ortho Biotech); ヒト化抗CD40L IgG抗体であるANTOVA(商標)(Biogen); ヒト化抗VLA-4 IgG抗体であるANTEGREN(商
標)(Elan); ヒト抗CD64(FcγR)抗体であるMDX-33(Medarex/Centeon);; ヒト化抗IgE IgG1抗体であるrhuMab-E25(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); 霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152(IDEC Pharm); マウス抗CD-147 IgM抗体であるABX-CBL(Abgenix); ラット抗CD2 IgG抗体であるBTI-322(Medimmune/Bio Transplant); マウス抗CD3 IgG2a抗体であるOrthoclone/OKT3(Ortho Biotech); キメラ抗CD25 IgG1抗体であるSIMULECT(商標)(Novartis Pharm); ヒト化抗β2-インテグリンIgG抗体であるLDP-01(LeukoSite); マウス抗CD18F(ab')2であるAnti-LFA-1(Pasteur-Merieux/Immunotech); ヒト抗TGF-β2抗体であるCAT-152(Cambridge Ab Tech); およびキメラ抗第VII因子抗体であるCorsevin M(Centocor)である。
【０２２９】
好ましくはイムノグロブリンとの関連で、本発明の変異型Fc領域は、好ましくは高処理能の形で1つまたは複数の生化学アッセイおよび/あるいは1つまたは複数の機能アッセイを使用してさらに特徴付けることができる。いくつかの代替の実施形態では、本発明の変異型Fc領域をイムノグロブリン中に導入せず、好ましくは高処理能の形で1つまたは複数の生化学に基づくアッセイおよび/あるいは1つまたは複数の機能アッセイを使用してそれをさらに特徴付ける。1つまたは複数の生化学アッセイは、それだけに限らないが、ELISAアッセイ、およびFc-FcγR相互作用の動態パラメーターを決定する表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ、例えば、BIAcoreアッセイを含めて、Fc-FcγR相互作用を同定するための、当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。1つまたは複数の機能アッセイは、当業者に知られまたは本明細書に記載した、1つまたは複数のFcγR媒介性エフェクター細胞機能を特徴付けるための、当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。特定の実施形態では、変異型Fc領域を含むイムノグロブリンを、ELISAアッセイで、1つまたは複数のFcγR、例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIAとの結合についてアッセイし、その後1つまたは複数のADCCアッセイを行う。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含むイムノグロブリンを、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ、例えば、BIAcoreを使用してさらにアッセイする。表面プラズモン共鳴に基づくアッセイは当技術分野で周知であり、第5.2.7節でさらに論じ、本明細書の実施例6.8で例示する。
【０２３０】
変異型Fc領域を含むイムノグロブリンを特徴付ける例示的な高処理能アッセイは、例えば標準的な組換えDNA技術の方法によって、4-4-20抗体中に本発明の変異型Fc領域を導入することと、変異型Fc領域を含む4-4-20抗体とFcγR(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIB)の特異的結合を特徴付けることと、(本明細書で開示されている方法を使用して)ADCCアッセイで変異型Fc領域を含む4-4-20抗体を特徴付けることとを含んでよく、変異型Fc領域を含む4-4-20抗体で標的細胞をオプソニン化し、次いで変異型Fc領域を、ADCCアッセイで特徴付けられた第2のイムノグロブリン、例えば4D5、2H7中にクローン化することができ、変異型Fc領域を含む第2のイムノグロブリンで標的細胞をオプソニン化する。次いで、ELISAに基づくアッセイを使用して変異型Fc領域を含む第2の抗体をさらに分析して、FcγRとの特異的結合を確認する。
【０２３１】
好ましくは、本発明の変異型Fc領域は、ELISAアッセイで決定される、野生型Fc領域より高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合する。最も好ましくは、本発明の変異型Fc領域は、ELISAアッセイで決定される、野生型Fc領域より高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合し、低い親和性でFcγRIIBに結合する。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域は、ELISAアッセイで決定される、野生型Fc領域がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合するより少なくとも2倍高い、少なくとも4倍高い、より好ましくは少なくとも6倍高い、最も好ましくは少なくとも8〜10倍高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合し、野生型Fc領域がFcγRIIBと結合する2分の1以下、4分の1以下、より好ましくは6分の1以下、最も好ましくは8〜10分の1以下の親和性でFcγRIIBと結合する。
【０２３２】
本明細書で開示され、当業者に知られている方法を使用して、Fc-FcγR相互作用の動態パラメーターを決定する表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ、例えば、BIAcoreを使用して任意の時点で変異型Fc領域を含むイムノグロブリンを分析することができる。好ましくは、BIAcore分析によって決定される、単量体FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAとの結合についての本発明の変異型Fc領域のKdは約100nM、好ましくは約70nM、最も好ましくは約40nMであり、二量体FcγRIIBの結合についての本発明の変異型Fc領域のKdは約80nM、約100nM、より好ましくは約200nMである。
【０２３３】
最も好ましい実施形態では、動物モデルで、FcγRとの相互作用について変異型Fc領域を含むイムノグロブリンをさらに特徴付ける。本発明の方法での使用に好ましい動物モデルは、例えば、ヒトFcγRを発現するトランスジェニックマウス、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第5,877,397号、および第6,676,927号に記載の任意のマウスモデルである。本発明の方法で使用するトランスジェニックマウスには、それだけに限らないが、ヒトFcγRIIIAを担持するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス; ヒトFcγRIIAを担持するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス; ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIIAを担持するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス; ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIAを担持するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス; ヒトFcγRIIIAおよびFcγRIIAを担持するヌードノックアウトFcγRIIIAおよびFcγRIIAマウス、ならびにヒトFcγRIIIA、FcγRIIAおよびFcγRIIBを担持するヌードノックアウトFcγRIIIA、FcγRIIAおよびFcγRIIBマウスがある。
【０２３４】
5.2.1  設計戦略
本発明は、それだけに限らないが、コンピュータによる設計戦略、ライブラリー生成方法、ならびに実験的作製およびスクリーニング方法を含めたFc変異体を生成する工学的改変方法を包含する。これらの戦略を個々にまたは様々な組合せで適用して、本発明のFc変異体を工学的に改変することができる。
【０２３５】
最も好ましい実施形態では、本発明の工学的改変方法は、Fc領域とFcリガンドの境界にあるアミノ酸を改変しない方法を含む。Fcリガンドには、それだけに限らないが、FcγR、C1q、FcRn、C3、マンノース受容体、プロテインA、プロテインG、マンノース受容体、およびFcに結合する未発見の分子がある。Fc領域とFcリガンドの境界にあるアミノ酸は、Fc領域とリガンドの間で直接的および/または間接的に接触するアミノ酸と定義され、境界の高次構造の決定で構造的役割を果たし、x線結晶分析や分子モデル化などの構造分析によって決定されるように互いに少なくとも約3オングストローム、好ましくは少なくとも2オングストローム以内である。Fc領域とFcリガンドの境界にあるアミノ酸には、Sondermann et al.(参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2000, Nature, 406: 267-273)によって開示されているものなどのFc-FcγR相互作用の結晶および構造分析に基づいてFcγRと直接的に接触するアミノ酸がある。FcγRと直接的に接触するFc領域内の位置の例は、アミノ酸234〜239(ヒンジ領域)、アミノ酸265〜269(B/Cループ)、アミノ酸297〜299(C'/Eループ)、およびアミノ酸327〜332(F/G)ループである。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、構造および結晶分析に基づいてFcγRと直接的に接触しない、例えばFc-FcγR結合部位内にない少なくとも1つの残基の改変を含む。
【０２３６】
好ましくは、本発明の工学的改変方法では、Shields et al.によって同定された、ヒンジ領域の近位にあるFc領域のCH2ドメイン中に、例えばLeu234〜Pro238、Ala327、Pro329に位置し、ヒトFcγRすべてとFc領域の結合に影響を及ぼすいずれのアミノ酸も改変しない。
【０２３７】
他の実施形態では、本発明は、Fc領域とFcリガンドの境界の位置でアミノ酸改変を有さないような、改変されたFcγR親和性および/または改変されたエフェクター機能を有するFc変異体を包含する。好ましくは、Fc領域とFcリガンドの境界にある1つまたは複数の他のアミノ酸の置換と組み合わせたそのようなFc変異体は、特定の改変された特性、例えば改変されたFcγR親和性に対してさらなる影響を有する。FcとFcリガンドの境界にあるアミノ酸の改変は、当技術分野で知られている方法を使用して、例えばFc-リガンド複合体の構造分析に基づいて行うことができる。例えばであって限定するものではないが、結合境界に影響を及ぼす、Fcの位置でのエネルギー的に好ましい置換を探索することによって、新たな境界の高次構造の標本抽出をする変異体を工学的に改変することができ、その変異体は、Fcリガンドとの結合を高める可能性もあり、Fcリガンドの結合を低下させる可能性もあり、他の好ましい特性を有する可能性もある。そのような新たな境界の高次構造は、例えば、境界を形成するFcリガンド残基との直接的な相互作用、または側鎖や骨格の高次構造の乱れなどアミノ酸改変によって引き起こされた間接的な影響の結果生じる可能性がある。
【０２３８】
本発明は、297位のFc炭水化物の高次構造を改変する他の改変と組み合わせた、本明細書で開示されているアミノ酸改変のいずれかを含むFc変異体の工学的改変を包含する。本発明は、所望の特性、例えばFcγRについての親和性の増大または低下が生じる、N297炭水化物における構造および組成変化を包含する。そのような改変によって、本発明のFc変異体の元のアミノ酸改変の表現型をさらに増強することができる。特定の作用機序に拘泥するものではないが、そのような戦略は、炭水化物の構造および高次構造がFc-FcγRおよびFc/C1 q結合に劇的に影響を及ぼすという観察結果によって支持される(Umaha et aL, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et aL, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et aL, 2001, J Biol Chem 276:45539 ; Radaev et aL, 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et aL 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et aL, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473)。
【０２３９】
Fc領域を再度工学的に改変してグリコシル化に対する構造的機能的依存性を消失させる、本発明に従ってFc変異体を生成する他の設計戦略が提供される。この設計戦略では、N297炭水化物不在下でFc構造、安定性、溶解性、および/またはFc機能(例えば1つまたは複数のFcリガンドについてのFcの親和性)を最適化する。一手法では、安定であり、Fc構造と構造上一致し、凝集する傾向を有さないように、グリコシル化の不在下で溶媒に曝す位置を工学的に改変する。非グリコシル化Fcを最適化する手法では、それだけに限らないが、Cg2-Cg2二量体の軸に対して内側に向く極性および/または荷電残基を組み込み、非グリコシル化Fc-FcγR境界または非グリコシル化Fcと一部の他のFcリガンドの境界を直接増強するアミノ酸改変を設計することによって、非グリコシル化Fcの安定性および/または溶解性を増強するアミノ酸改変を設計することができる。
【０２４０】
本発明のFc変異体は、それだけに限らないが、エフェクター機能を改変する改変を含めた他のFc改変と組み合わせることができる。本発明は、本発明のFc変異体を他のFc改変と組み合わせて、抗体またはFc融合物における相加的、相乗的、または新規の特性をもたらすことを包含する。そのような改変は、CH1、CH2、またはCH3ドメイン、あるいはその組合せの中で行ってよい。好ましくは、本発明のFc変異体は、それと組み合わせた改変の特性を増強する。例えば、本発明のFc変異体を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子より高い親和性でFcγRIIIAと結合することが知られている突然変異体と組み合わせる場合、本発明の突然変異体との組合せによって、FcγRIIIA親和性が高い倍率で増強される。
【０２４１】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. , 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:49634969; Armour et aL, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:41784184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); 米国特許第5,624,821号; 米国特許第5,885,573号; 米国特許第6,194,551号; PCT国際公開第00/42072号; PCT国際公開第99/58572号で開示されているものなどの、他の知られているFc変異体と組み合わせることができる。
【０２４２】
5.2.2  FcγR-Fc結合アッセイ
変異型Fc領域を含む本発明の分子とFcγRの結合を決定するためにFcγR-Fc結合アッセイを開発し、それによって、そのリガンドについての受容体の親和性が本質的に弱く、例えばFcγRIIBおよびFcγRIIIAについてはμM程度であるにもかかわらず、相互作用の検出および定量が可能となった。その方法では、非複合体化FcγRと比べてFc領域についての高い結合活性を有するFcγR複合体を形成する。本発明によれば、好ましい分子複合体は、(a)FcγRの可溶性領域(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAまたはFcγRIIBの可溶性領域); (b)FcγRの可溶性領域(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAまたはFcγRIIBの可溶性領域)のC末端に作動可能に連結したビオチン化15アミノ酸AVITAG配列(AVITAG); および(c)ストレプトアビジン-フィコエリスリン(SA-PE)を、四量体FcγR複合体を形成するモル比で(好ましくは5:1のモル比で)含む四量体免疫複合体である。本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、15アミノ酸AVITAG配列中のリシン残基を特異的にビオチン化する大腸菌Bir A酵素というビオチンリガーゼを使用して融合タンパク質を酵素によりビオチン化する。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質の85%をビオチン化し、それは、ストレプトアビジンシフトアッセイを含むがそれだけに限らない、当業者に知られている標準的な方法によって決定される。本発明の好ましい実施形態によれば、ビオチン化可溶性FcγRタンパク質をSA-PEと1× SA-PE:5×ビオチン化可溶性FcγRのモル比で混合して四量体FcγR複合体を形成する。
【０２４３】
本発明の好ましい実施形態では、Fc領域を含むポリペプチドは、単量体の非複合体化FcγRより少なくとも8倍高い親和性で、本発明の方法に従って形成された四量体FcγR複合体に結合する。Fc領域を含むポリペプチドと四量体FcγR複合体の結合は、例えば蛍光活性化細胞スクリーニング(FACS)、ラジオイムノアッセイ、ELISAアッセイなど、当業者に知られている標準的な技術を使用して決定することができる。
【０２４４】
本発明は、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイでFc領域を含む分子の機能を決定するための、上記に記載の方法に従って形成された免疫複合体の使用を包含する。
【０２４５】
便宜上、アッセイキット、すなわち、変異型Fc領域を含む分子がFcγR四量体複合体に結合できるかどうかアッセイを行うための包装された組合せの試薬として試薬を提供することができる。Fc-FcγR相互作用を決定する際に使用する他の形態の分子複合体、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている2003年1月13日に出願された米国仮出願第60/439,709号(代理人整理番号11183-005-888)に記載のように形成された融合タンパク質も、本発明の方法での使用に企図される。
【０２４６】
5.2.3  酵母ディスプレイライブラリーの突然変異生成および構築
IgG FcとFc受容体の分子相互作用は、構造的な技術と遺伝的な技術の両方によって以前から研究されている。これらの研究から、異なるFcγRとFcの機能的結合に決定的に重要なアミノ酸残基が同定された。これらの変化のうち、動物モデルにおいて治療用抗体のヒトFcγR媒介性効果を高めることが示されているものはない。これらの残基または他の潜在的に重要な残基での潜在的なアミノ酸変化すべての完全な分析は報告されていない。本明細書に記載の基盤(platform)は、すべての考えられるアミノ酸変化を有する突然変異ライブラリーを両方とも構築し、複数の機能アッセイを使用してライブラリーをスクリーニングし、関連するヒト化動物モデルで最後にライブラリーを分析する能力がある。
【０２４７】
本発明は、当技術分野で既知でありまたは開発中である遺伝学的データと構造的データの両方に基づく複数ライブラリーの構築を包含する。本明細書で記載され例示される方法は、Fc領域中の3〜6残基間での20個すべてのアミノ酸変化を試験する突然変異体を含む個々のライブラリーを構築することを組み込む。突然変異のすべての考えられる組合せにおいて突然変異の完全な組を構築する。生成した独立突然変異の数は、ライブラリー構築の間に飽和した部位の数に基づく(下記の表9)。ライブラリーのサイズは、一次スクリーニングの選択、したがって初期クローン化ステップ用ベクターの選択によって決まる。
【表９】
2009507470.tif 000035
【０２４８】
本発明は、限定された数の決定的に重要な残基(例えば、3〜6個)に焦点を合わせたコンビナトリアルライブラリーの構築を包含する。ランダムに突然変異を誘発させたIgG1 Fcのライブラリーおよび本明細書で記載され例示されるスクリーニングアッセイを使用してFc変異体を同定する。初回に、FcR結合プロファイルと機能活性の両方に基づく最良の5つの突然変異を選択する。すべての考えられるアミノ酸変化および5つの位置でのその組合せをカバーするには205個の独立突然変異体が必要となる。各突然変異体について少なくとも10倍のカバー範囲を有するライブラリーを生成する。さらに、利用可能な情報、例えば結晶構造データ、マウス/ヒトアイソタイプのFcγR結合の相違、遺伝学的データ、および突然変異生成によって同定された追加の部位に基づいて、領域を選択する。
【０２４９】
現在の部位特異的突然変異生成プロトコールの最大の不利な点は偏りのある集団が生じることであり、ある領域では変異が過剰に表され、他では突然変異が不十分に表されまたは完全に欠失する。本発明は、重複PCRや逆PCRなどのPCRに基づく手法によってライブラリー構築の際に導入された偏りを消失させる十分に開発された遺伝子構築技術を使用して偏りのない一連の所望されるFc突然変異体を生成することにより、この問題を克服するものである。本発明の手法で鍵となる特徴は以下のものである: 1)縮重プライマーの代わりとなる、全標的コドンに対する20個の個々のオリゴの等モル混合物の使用。このようにして各アミノ酸が単一の最も使用されるコドンによって表されるが、縮重プライマーは、少数のコドンによってコードされるものより多くのコドンによってコードされるアミノ酸を過剰に表す。2)鎖置換の手法による突然変異体の構築。これによって、最終産物中にすべての所望される変化が確実に偏りなく導入される。
【０２５０】
例示的なプロトコールは下記のステップからなる: 1)1つまたは複数の位置での所望される変化を表し、同じ鎖とすべて相補的であるリン酸化オリゴを、熱安定性5'>3'エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼおよびリガーゼとともに鋳型に添加する(図27a)。2)構築した混合物に、所望される量の産物の生成に十分な何回かの重合化/連結サイクルを施す。5'>3'エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼを使用すると、熱安定性リガーゼが個々のプライマー伸長断片を集合させて連続した一本鎖を構築するとき、プライマー配列およびそのリン酸残基が確実に組み込まれる。反応サイクルは、最終産物中に偏りが導入されることなくオリゴプールが完全に消耗するまで継続することができる(図27b)。3)逆方向遺伝子特異的プライマーを反応に添加することによって、一本鎖突然変異体の生成プールを二本鎖DNAに転換する(図27 1c)。4)末端を設計した制限部位で二本鎖産物を消化し、それを適当な発現ベクター中にクローン化する(図27 1d)。
【０２５１】
ライブラリーの品質を保証するために、PCR増幅断片を電気泳動により分析して、最終PCR産物の長さを決定する。反応は、PCR産物の>99%が予想された長さである場合に成功とみなされる。最終ライブラリーを発現ベクター中にクローン化する。突然変異体ライブラリーの分画の配列を決定して、突然変異型コドンの組込みの比率を決定する。配列決定した断片の数は突然変異した標的部位の数に基づき、ライブラリー検証は、標的部位での観察された突然変異率によって決定される(表10)。挿入物を有さないベクターの比率は2%未満であるべきである。非標的部位での突然変異率は8%未満であるべきである。>90%の正しい挿入物を有するクローンを含むライブラリーによって、スクリーニングの時系列を維持することが可能となる。
【表１０】
2009507470.tif 000036
【０２５２】
他の実施形態では、本発明は、ライブラリーを構築するための重複PCRまたは逆PCRを包含する。依然として偏りのないままにするために、縮重プライマーではなく各コドンについての個々のプライマーを使用する。上記で開示されている同様の検証スキームを使用する。
【０２５３】
最も好ましくは、高処理能ライブラリー作製に自動化プロトコールを使用する。自動化によって、処理量の向上、遠ざかっての操作、および退屈な反復操作を必要とする作業の実験誤差の全体的な低下が可能となる。オリゴ合成能力は、総産出能力が12時間当たり60merオリゴ575個である2 Mermade DNA合成機(Bioautomation, Inc.)に基づく。専売権付ソフトウェアは、最終的なオリゴヌクレオチドの設計、合成、および貯蔵のすべての面を取り扱う。ロボット液体ハンドラーを使用して完全長Fc突然変異体合成用オリゴを準備し、抗体重鎖発現ベクター中に突然変異型Fcを組み込む連結反応を準備する。連結後、ライブラリークローンを並べ、3つの部位で飽和したコンビナトリアルライブラリーと同等である約8000個のミニプレップを生成するには1 FTEで約10日かかると推定される。細菌の形質転換の後で、Qpix-2クローン採取ロボットを使用して、コロニーを採取して96穴深穴プレートに入れる。プレート12枚をインキュベートすることができる磁気浮上撹拌器を使用して培養増殖を行い、それによって37℃で12〜16時間高密度増殖を行う。Qiagenミニプレップロボットを使用して、2.5時間に96穴プレート4枚の速度でDNAプレップを行う。作業を重複させることによって、1 FTEで9ヶ月間に5つのそのようなライブラリーを構築することができる。
【０２５４】
親和性成熟は、選択プロトコールによって濃縮することができる、予め選択された突然変異体プールまたは遺伝子ファミリーの構成要素からの突然変異の新たな組の組合せの構築を必要とする。所望の表現型を有する突然変異体の単離が実現するまで、その工程を数回反復する。この工程を行う現在の酵素的手法であるDNAシャッフリングの不利な点は、ヌクレアーゼのホットスポットである遺伝子内の特定の部位、再構築された最終的なプール中での特定の突然変異体の優勢性、および最終的なプール中での元の突然変異体の一部の欠失により導入され得る偏りである。この欠点を克服するために、遺伝子構築(build-a-gene)(BAG)技術を使用して、(複数の)受容体結合に重要である可能性があるすべての潜在的な位置でランダムなアミノ酸変化を含むFc突然変異体の高度に複雑なライブラリーを生成する。IgGの特定の領域をカバーする縮重オリゴの組を使用する(図28を参照)。
【０２５５】
オリゴは約30ntとなり、1つ(4オリゴ)または2つのAA(8オリゴ)が変化するように合成された縮重オリゴを構築する。ギャップが入らずに重複するようにオリゴを設計する。すべての単一AAの変化に適応するのに約200個のオリゴが必要となり、オリゴヌクレオチド1つ当たり2つのAAを変化させるのに約2000個のオリゴが必要となる。2000+個のオリゴすべてを個々に、また組み合わせて使用して、上記で概略を述べたプロトコールを使用して一連のFc突然変異体を生成する(A.20)。家庭記入型(home-written)ランダム化プログラムおよびロボット液体ハンドラーを使用して、突然変異型および野生型オリゴの選択された組合せをプールする。大型ライブラリーを、酵母表面ディスプレイを使用したスクリーニングを可能にするベクター中にクローン化する。この手法は、磁性ビーズ選択を、その後にフローサイトメトリーを利用するものであり、それは、複雑性が>109であるライブラリーにうまく適用されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれているFeldhaus et al., 2003, Nat. Biotech. 21(2): 163-170)。これは任意の1つのプールで試験する部位の数を7に限定するものであり、その結果1プール当たりに考えられる突然変異が約1.3×109個となる。
【０２５６】
ライブラリーの品質を保証するために、PCR増幅断片を電気泳動により分析して、最終PCR産物の長さを決定する。反応は、PCR産物の>99%が予想された長さである場合に成功とみなされる。突然変異体ライブラリーの分画の配列を決定して、突然変異型コドンの組込みの比率を決定する。配列決定した断片の数は突然変異した標的部位の数に基づき、ライブラリー検証は、標的部位での観察された突然変異率によって決定される(表10)。挿入物を有さないベクターの比率は2%未満であるべきである。非標的部位での突然変異率は8%未満であるべきである。
【０２５７】
この手法によって所望のレベルの突然変異生成の効率を得ることができるかどうかを、クローンのサブセットの配列決定によって決定する。BAGの代替方法は、「DNAシャッフル」プロトコールを使用することとなる。これには、単一、二重、三重などの突然変異体をすべてプールすることが必要となる。DNA調製後、約700bpのFcの突然変異領域を選択的に増幅する隣接プライマーを使用したPCRによってFc領域を増幅する。増幅DNAのDNアーゼI処理および150〜200bpの断片の単離を介してFc中の突然変異を再度シャッフルすることによって新規の突然変異体を構築する(例えば、Stemmer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 10747-51を参照されたい)。断片を再度連結し、それを入れ子型プライマーでPCR増幅し、酵母表面ディスプレイベクターpYD1中にクローン化する。組換えたライブラリーを、本明細書で記載され例示されるように酵母Fcディスプレイスクリーニングで再度選択する。
【０２５８】
BAGライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーと同じ設備のほとんどを利用する。しかし、クローン化は、酵母表面ディスプレイに適したベクター中で行い、最初に酵母表面ディスプレイを大型ライブラリーの濃縮で使用するので個々のクローンを並べることを必要としない。適当なレベルの濃縮の後に個々のクローンを並べる。
【０２５９】
当技術分野で知られている任意のランダムベース突然変異生成技術を使用して変異型Fc領域を含む分子の初期ライブラリーを作製する。当業者に知られている任意の突然変異生成技術によってFc領域のアミノ酸配列変異体を得ることができることが当業者に理解されるであろう。これらの技術の一部を本明細書で簡潔に記載するが、代替の手順で同等の結果を得ることができることが認識されるであろう。好ましい実施形態では、下記の実施例6で例示されるエラープローンPCRによって変異型Fc領域を含む本発明の分子を調製する(Leung et al., 1989, Technique, 1:11を参照)。1Kb当たり2〜3bpの誤り率を有することが本発明の方法での使用に特に好ましい。一実施形態では、エラープローンPCRを使用して1Kb当たり突然変異2〜3個の突然変異頻度が得られる。
【０２６０】
それだけに限らないが、改変すべき抗体またはFc領域を含むポリペプチド(例えばCH2またはCH3ドメイン)のFc領域の配列内で1つまたは複数の改変を有するオリゴヌクレオチドの合成を含めた当技術分野で知られている任意の技術に従って、突然変異生成を行うことができる。部位特異的突然変異生成は、横断している欠失接合部の両側での安定した二重鎖の形成に十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列をもたらす、所望の突然変異のDNA配列、ならびに十分な数の隣接するヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド配列の使用によって突然変異体の産生を可能にする。通常、配列の接合部の両側にある約10〜約25個以上の残基が改変されている、長さが約30〜約45ヌクレオチド以上のプライマーが好ましい。1つまたは複数の位置で種々の異なる突然変異を導入するいくつかのそのようなプライマーを使用して、突然変異体のライブラリーを生成する。
【０２６１】
部位特異的突然変異生成の技術は当技術分野で周知であり、様々な刊行物によって例示されている(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Kunkel et al., Methods Enzymol., 154:367-82, 1987を参照されたい)。一般に、部位特異的突然変異生成は、その配列内に所望のペプチドをコードするDNA配列を含む一本鎖ベクターを最初に得、または二本鎖ベクターの2本の鎖を融解して離すことによって行う。所望の突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは一般に合成によって調製する。次いでこのプライマーを一本鎖ベクターとアニールさせて、突然変異を有する鎖の合成を終了するために、それをT7 DNAポリメラーゼなどのDNA重合化酵素に曝す。したがって、1本の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第2の鎖が所望の突然変異を有するヘテロ二重鎖が形成される。次いでこのヘテロ二重鎖ベクターを使用して、大腸菌細胞などの適当な細胞を形質転換またはトランスフェクトし、突然変異配列の配置を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。理解されるであろうが、その技術は、典型的には、一本鎖の形態でも二本鎖の形態でも存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異生成で有用である典型的なベクターには、M13ファージなどのベクターがある。これらのファージは、商業的に容易に入手可能であり、その使用は一般に当業者に周知である。二本鎖プラスミドも部位特異的突然変異生成で日常的に使用され、それによってプラスミドからファージへと対象とする遺伝子を移すステップが消失する。
【０２６２】
あるいは、Taq DNAポリメラーゼなどの市販されている熱安定性酵素を用いたPCR(商標)の使用を、突然変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを増幅DNA断片中に組み込むのに使用することができ、次いでその断片を適当なクローン化または発現ベクター中にクローン化することができる。例えば、PCR(商標)が媒介する突然変異生成の手順については、その全体が本明細書に組み込まれている、Tomic et al., Nucleic Acids Res., 18(6):1656, 1987、およびUpender et al., Biotechniques, 18(1):29-30, 32, 1995を参照されたい。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するPCR(商標)を使用して、リン酸化突然変異原性オリゴヌクレオチドを増幅DNA断片中に組み込むこともでき、次いでその断片を適当なクローン化または発現ベクター中にクローン化することができる(例えば、その全体が本明細書に組み込まれている、Michael,  Biotechniques, 16(3):410-2, 1994を参照されたい)。
【０２６３】
本発明で使用する変異体を調製する他の方法は、Wells et al.によって記載された技術(1985, Gene, 34: 315)に基づくカセット突然変異生成である。開始物質は、突然変異させるタンパク質をコードする所望のDNA(例えば、Fc領域を含むポリペプチドをコードするDNA)を含むプラスミドである。突然変異させるDNA配列中の(複数の)コドンを同定する; 同定された(複数の)突然変異部位の各側には独特の制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。そのような制限部位が存在しない場合、オリゴヌクレオチド特異的突然変異生成によってそれを生成することができる。制限部位をプラスミド中に導入した後、この部位でプラスミドを切断し直鎖化する。当業者に知られている標準的な手順を使用して、制限部位の間にあるDNAの配列をコードするが突然変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを合成する。その二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。直鎖化プラスミドの末端と適合する3'および5'末端を有するようにこのカセットを設計し、その結果、それをプラスミドに直接連結することができる。
【０２６４】
抗体またはFc領域を含むポリペプチドのFc領域の配列変異体の作製について当業者に知られている他の方法を使用することができる。例えば、抗体またはその断片の定常ドメインのアミノ酸配列をコードする組換えベクターをヒドロキシルアミンなどの突然変異原性作用物質で処理して、配列変異体を得ることができる。
【０２６５】
記載されている方法に従って突然変異体ライブラリーを作製した後、当業者に知られている標準的な酢酸リチウム形質転換プロトコール(ref)を使用して、突然変異誘発ライブラリーを酵母株、好ましくはEBY100 (Invitrogen)、MATa ura3-52 trpl leu2Δl his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1中に形質転換する。
【０２６６】
本発明の方法に従って、所望の結合特性を有する本発明の分子(例えば、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べてFcγRIIIAについての変異型Fc領域の親和性を増強する少なくとも1つのアミノ酸改変を有する変異型Fc領域を有する分子)を同定した(第5.1節および表2を参照されたい)後、この節で記載したように標準的な組換えDNA技術および任意の知られている突然変異生成技術を使用して他の分子(すなわち、治療用抗体)を工学的に改変して、同定された突然変異部位を担持する工学的改変分子を作製できることが当業者に理解されるであろう。
【０２６７】
5.2.4  酵母表面ディスプレイ
改変されたFcγR親和性(すなわち、増強されたFcγRIIIA親和性および/またはFcγRIIA)を有する変異型Fc領域を含む分子をスクリーニングおよび同定する好ましい方法は酵母表面ディスプレイ技術(総説については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているBoder and Wittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328: 430-444を参照されたい)であり、それは、細胞外翻訳後修飾タンパク質の結合相互作用についてスクリーニングする従来技術の欠陥に対処するものである。具体的には、酵母表面ディスプレイは遺伝学的方法であり、それによって、Fc突然変異体を含むポリペプチドが、FcγRとの相互作用に利用可能な形で酵母細胞壁上に発現される。本発明の突然変異型Fc含有ポリペプチドの酵母表面ディスプレイは、当業者に知られている技術のいずれかに従って行うことができる。すべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第6,423,538号; 第6,114,147号; および第6,300,065号を参照されたい。Boder et al., 1997 Nat. Biotechnol., 15:553-7;  Boder et al., 1998 Biotechnol. Prog., 14:55-62; Boder et al., 2000 Methods Enzymol., 328:430-44; Boder et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97:10701-5; Shusta et al., 1998 Nat. Biotechnol., 1998, 16:773-7; Shusta et al., 1999 J. Mol. Biol., 292:949-56; Shusta et al., 1999 Curr. Opin. Biotechnol., 10:117-22; Shusta et al., 2000 Nat. Biotechnol., 18:754-9; Wittrup et al., 1994 Ann. N.Y. Acad. Sci., 745:321-30; Wittrup et al., 1994 Cytometry, 16:206-13; Wittrup, 1995 Curr. Opin. Biotechnol., 6:203-8; Wittrup, 1999 Trends Biotechnol., 17:423-4; Wittrup, 2000 Nat. Biotechnol., 18:1039-40; Wittrup, 2001 Curr. Opin. Biotechnol., 12:395-9を参照されたい。
【０２６８】
酵母表面ディスプレイを使用して、>107個の独立クローンを含むライブラリーを濃縮する。この手法によって、1回のスクリーニングで大きなライブラリーを>20倍に濃縮することができる。>10,000個の独立突然変異体(4つ以上の部位)を有するFc突然変異体ライブラリーを酵母表面ディスプレイに適したベクター中にクローン化し、下記に記載の他の生化学アッセイおよび機能アッセイによって<8000個の突然変異体を試験することができるまでFACSスクリーニングによって濃縮する。
【０２６９】
本発明は、第5.2.2節に記載のように突然変異させたFc領域を含む分子を提示する酵母中でFc突然変異体ライブラリーを構築する方法を提供する。好ましくは、本発明の方法で使用するFc突然変異体ライブラリーは少なくとも107個の細胞、最大で109個の細胞を含む。本発明の方法で使用するFcライブラリーを構築する1つの例示的な方法は、以下のことを含む: Fc領域を含む分子をコードする核酸を酵母複製用ベクター、例えばpCT302に由来するベクターのマルチクローン化部位中にクローン化し、その結果、Fcをコードする核酸が、GAL1ガラクトース誘導性プロモーターの調節下で、Aga2pという接合アグルチニン細胞壁タンパク質をコードするヌクレオチド配列とインフレームで発現される。好ましい実施形態では、Fc領域を含む分子をコードする核酸をAga2pコード領域に対してC-末端にクローン化し、その結果、Fc領域Aga2p融合タンパク質がコードされる。Aga2pタンパク質およびFc領域を含むポリペプチドを含む融合タンパク質は、本発明の好ましい構築物を使用して、細胞外に分泌され、Aga1pタンパク質という内在性細胞壁タンパク質とのジスルフィド結合を介して細胞壁上に提示される。代替の実施形態では、構築物は、エピトープタグをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでよい。それだけに限らないが、血球凝集素(HA)、c-myc Xpress TAG、His-TAG、またはV5TAGをコードするヌクレオチド配列を含めた、当業者に知られている任意のエピトープタグヌクレオチドを本発明に従って使用することができる。酵母細胞表面上での融合タンパク質の存在は、FACS分析、共焦点蛍光顕微鏡法または標準的な免疫染色法を使用して検出することができ、それらはすべて当業者に知られている。一実施形態では、酵母細胞表面上での本発明のFc融合タンパク質の存在は、それだけに限らないが、IgG1 Fc-特異的モノクローナル抗体であるHP6017(Sigma)、JL512(Immunotech)、および参照によりその全体が本明細書に組み込まれているPartridge et al., 1986, Molecular Immunology, 23 (12): 1365-72で開示されている任意の抗体を含めたFc特異的モノクローナル抗体(CH
3特異的)を使用して検出される。他の実施形態では、本発明のFc融合タンパク質の存在は、当業者に知られている技術を使用するエピトープタグの免疫蛍光標識によって検出される。部分的にタンパク質分解された形で細胞壁上に融合タンパク質が提示されるどうかを検出する内部標準として、Fc融合タンパク質をコードする核酸に隣接するエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を使用することは、本発明の方法で特に有用である。
【０２７０】
5.2.5  酵母ディスプレイライブラリーのスクリーニング
本発明は、それだけに限らないが、細胞に基づくアッセイ、溶液に基づくアッセイ、および固相に基づくアッセイを含めた免疫学に基づくアッセイを使用して、酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを包含する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、当業者に知られ、本明細書に包含される親和性成熟の方法を使用した、改変されたFcγR親和性を有するFc突然変異体の同定を包含する。簡潔に述べると、親和性成熟は、突然変異体ライブラリー中に存在する個々の突然変異をランダムに組換えることによって新規の対立遺伝子を生じさせる(例えば、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれているHawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896; Stemmer et al., 1994 Nature, 370: 389-91を参照されたい)。それを使用して、抗体、T細胞受容体および他のタンパク質の親和性を増大させることに成功している。本発明は、FcγR結合の増大を示す突然変異をベースラインとして使用して、増強された表現型を有する新たな突然変異体ライブラリーを構築することを包含する。本発明の方法を使用して、FcγR、例えばFcγRIIIAとの結合の増大について酵母表面ディスプレイによって濃縮されたIgG1 Fc突然変異体の集団を選択することができる。DNA調製後、当業者に知られ、本明細書で例示または開示されている方法を使用して約700bpであるFcの突然変異領域を選択的に増幅する隣接プライマーを使用したPCRによってFc領域を増幅することができる。したがって、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているStemmer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 10747-51によって開示されているものなどの方法を使用して増幅DNAのDNアーゼI処理および断片の単離を介してFc領域中の突然変異を再度シャッフルすることによって新規の突然変異体を構築することができる。次いで、当業者に知られている方法を使用して、断片を再度連結し、それを入れ子型プライマーでPCR増幅し、酵母ディスプレイベクター、例えばpYD1中にクローン化することができる。次いで、組換えたライブラリーを酵母Fcディスプレイスクリーニングで再度選択することができる。KDが10nM以下に低下すると、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているBoder et al., 1998, Biotechnol. Prog. 14: 55-62で開示されているものなどの当技術分野で知られている方法を使用して、Fc受容体からのFcγRIIIAリガンドの解離定数の低下に基づく親和性のさらなる増大を可能にする条件を確立することができる。本発明は、酵母ライブラリーの動態スクリーニングを包含する。動態スクリーニングは、標識リガンド、例えば蛍光リガンドで飽和までFc提示細胞を標識し、その後過剰な非標識リガンドとともにそれを所定の時間インキュベートすることによって確立することができる。過剰な緩衝液(例えば、1×PBS、0.5mg/ml BSA)の添加による反応の終結後、FACSにより細胞を分析し、スクリーニングゲートを設定して選択する。各回の濃縮の後、個々の突然変異体を親和性の増大倍数について試験し、多様性について配列決定することができる。in vitro組換え工程を反復することができる。いくつかの実施形態では、そのin vitroの工程を少なくとも3回反復する。
【０２７２】
本発明のFc変異体の選択は、それだけに限らないがFcγRの多型性変異体を含めた任意のFcγRを使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、Fc変異体の選択は、158位でフェニルアラニンを含むFcγRIIIAの多型性変異体を使用して行う。他の実施形態では、Fc変異体の選択は、158位でバリンを含むFcγRIIIAの多型性変異体を使用して行う。FcγRIIIA158Vは、158FよりIgG1について高い親和性、およびADCC活性の増大を示す(例えば、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれているKoene et al., 1997, Blood, 90:1109-14; Wu et al., 1997, J. Clin. Invest. 100: 1059-70を参照されたい); IgG1-FcγRIIIA同時結晶化の研究によって最近示されたように、この残基は実際にIgG1の低い方のヒンジ領域と直接相互作用する(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているSonderman et al., 2000, Nature, 100: 1059-70を参照されたい)。一部の場合には、FcγRIIIA-158Vホモ接合性患者で治療用抗体の効果が向上したことが研究から示されている。例えば、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体リツキシマブは治療上、FcγRIIIA158Fホモ接合性患者と比較してFcγRIIIA158Vホモ接合性患者でより有効であった(例えば、Cartron et al., 2002 Blood, 99(3): 754-8を参照されたい)。特定の作用機序に拘泥するものではないが、FcγRIIIA158Fアロタイプを用いた本発明のFc変異体の選択で、工学的に改変して治療用抗体にした後、臨床上FcγRIIIA158Fホモ接合性患者により有効となる変異体を提供することができる。
【０２７３】
本発明は、FcγRIIB除去およびFcγRIIIA選択に基づいて酵母ライブラリーをスクリーニングすることを包含し、その結果、FcγRIIIAについて増強された親和性を有するだけでなく、FcγRIIBについて低下した親和性をも有するFc突然変異体が選択される。連続した除去の方法によって、例えば、FcγRIIBで被覆した磁性ビーズとともに酵母ライブラリーをインキュベートすることによって、FcγRIIBについて低下した親和性を有するクローンについて酵母ライブラリーを濃縮することができる。好ましくはFcγRIIB除去を連続して行い、その結果、FcγRIIBについて低下した親和性を有するクローンとしてライブラリーが濃縮される。いくつかの実施形態では、FcγRIIB除去ステップによって、30%だけ、好ましくは10%だけ、より好ましくは5%だけ、最も好ましくは1%未満がFcγRIIBと結合するような細胞の集団となる。いくつかの実施形態では、少なくとも3サイクルで、少なくとも4サイクルで、少なくとも6サイクルでFcγRIIB除去を実施する。好ましくは、FcγRIIB除去ステップを例えばFACSスクリーニングを使用したFcγRIIIA選択ステップと組み合わせ、その結果FcγRIIIAについて増強された親和性を有するFc変異体が選択される。
【０２７４】
5.2.5.1  FACSアッセイ; 固相アッセイおよび免疫学に基づくアッセイ
本発明は、第5.2.3節に記載の方法による、酵母表面細胞壁上に提示された突然変異型Fc融合タンパク質の特徴付けを包含する。本発明の一態様は、所望される結合特性、具体的には、突然変異型Fc融合タンパク質の、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合する能力を有する突然変異型Fc融合タンパク質を選択する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、所望される結合特性、具体的には、突然変異型Fc融合タンパク質の、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合する能力、さらに、突然変異型Fc融合タンパク質の、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIBと結合するより低い親和性でFcγRIIBと結合する能力を有する突然変異型Fc融合タンパク質を選択する方法を提供する。任意の所望の結合特性を有する、分子のFc領域中での任意の突然変異の同定およびスクリーニングに本発明の方法を使用できることが当業者には理解されるであろう。
【０２７５】
結合相互作用を評価する、当業者に知られている任意の生化学または免疫学に基づくアッセイによって、突然変異型Fc融合タンパク質を提示する酵母細胞をスクリーニングし特徴付けることができる。
【０２７６】
好ましくは、当業者に知られている技術のいずれかを使用した蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して、FcγRIIIA、好ましくはFcγRIIIA四量体複合体、または、場合によってはFcγRIIBとの結合について、酵母細胞表面上に提示された突然変異型Fc融合タンパク質をスクリーニングする。フローソーターは、ライブラリー挿入物を含む多数の個々の細胞を迅速に調べることができる(例えば、1時間当たり1000万〜1億個)(Shapiro et al., Practical Flow Cytometry, 1995)。さらに、特定の結合特性、例えば野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドと比較して高いFcγRIIIAについての親和性を有するFc融合タンパク質を提示する細胞を選択するために、それだけに限らないが、リガンド濃度(すなわち、FcγRIIIA四量体複合体)、動態競合時間、またはFACSの厳密性を含めた最適化に使用する特定のパラメーターを変化させることができる。生物学的細胞をスクリーニングし調べるフローサイトメーターは当技術分野で周知である。知られているフローサイトメーターは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第4,347,935号; 第5,464,581号; 第5,483,469号; 第5,602,039号; 第5,643,796号; および第6,211,477号に記載されている。他の知られているフローサイトメーターは、Becton Dickinson and Companyによって製造されているFACS Vantage(商標)システム、およびUnion Biometricaによって製造されているCOPAS(商標)システムである。
【０２７７】
本発明の好ましい実施形態によれば、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって酵母細胞を分析する。最も好ましい実施形態では、酵母細胞のFACS分析は、反復する形で、少なくとも2回、少なくとも3回、または少なくとも5回行う。各回の選択の間に、細胞を再度増殖させ、Fc領域が最大数の酵母細胞表面上に提示されるように誘導する。特定の作用形態に拘泥するものではないが、この反復工程は、特定の表現型、例えばFcγRIIIAとの高い結合性を有する細胞の集団を濃縮する助けとなる。
【０２７８】
好ましい実施形態では、本発明のFc変異体のスクリーニングは、複数回のスクリーニング、例えば少なくとも2回のスクリーニングを有する選択工程を含む。一実施形態では、FcγRIIIAについて増強された親和性を有するFc変異体のスクリーニングは以下のステップを含んでよい: 初回のスクリーニングで、酵母細胞のライブラリー、例えば、細胞107個の未処置ライブラリーを、好ましくは反復する形で、FcγRIIIAについての増強された親和性を有するFc変異体を選択するのに例えば標識四量体FcγRIIIAを使用して、FACSによって濃縮する; 次いで、所望の表現型、例えばFcγRIIIAとの増強された結合で選択された変異型Fc領域を抗体、例えば4-4-20抗体中に導入し、二次スクリーニング、例えばFcγRとの結合についてのELISAを使用して、工学的改変抗体についてアッセイを行う。2回目のスクリーニングで、第1のスクリーニングに基づいて単一の突然変異ライブラリーを生成することができ、その結果Fc領域がFcγRIIIAについて増強された親和性を提示する変異体を内部に有する; 例えば非標識受容体の存在下と不在下の両方で標識単量体FcγRIIIAを使用したFACSによって濃縮する; 次いで変異型Fc領域を抗体、例えば4-4-20抗体中に導入し、二次スクリーニング、例えばFcγRとの結合についてのELISAを使用して、工学的改変抗体についてアッセイを行う。いくつかの実施形態では、二次スクリーニングは、本明細書で開示されている方法を使用したADCCまたはBIAcoreに基づくアッセイでFc変異体を含む抗体を特徴付けることをさらに含んでよい。
【０２７９】
本発明は、平衡または動態条件下での突然変異体酵母ライブラリーのFACSスクリーニングを包含する。平衡条件下でスクリーニングを行うとき、Fc突然変異体を担持する過剰な酵母ライブラリーを、FcγRIIIA、好ましくはKdの5分の1〜10分の1の濃度の標識FcγRIIIAとともに、少なくとも1時間インキュベートして、平衡条件下でFcγRIIIAとFc突然変異体の結合を可能にする。動態条件下でスクリーニングを行うとき、突然変異体酵母ライブラリーを標識FcγRIIIAとともにインキュベートする; 次いで細胞を等モル非標識FcγRIIIAとともに予め選択された時間インキュベートし、次いで、結合したFcγRIIIAをモニターする。
【０２８０】
FACSを用いて変異型Fc融合タンパク質を発現する酵母細胞を分析する1つの例示的な方法は、細胞をPEなどの蛍光標識で標識されているFcγRIIIA四量体複合体、および蛍光標識されているF(ab)2抗Fcなどの抗Fc抗体で同時染色することである。本発明の方法に従って作製された酵母ライブラリーの蛍光測定では、好ましくは、対照; 例えば、Fc領域を含む分子をコードする挿入物を欠く酵母細胞(陰性対照)と比較する。フローソーターは、迅速に細胞中の蛍光シグナルを測定するだけでなく、特定の蛍光特性を有する細胞を収集する能力も有する。この特徴を本発明の好ましい実施形態で使用して、特定の結合特性、例えば野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドと比較して高いFcγRIIIAについての親和性を有するFc融合タンパク質を発現する細胞について初期のライブラリー集団を濃縮することができる。本発明の好ましい実施形態では、FACSにより酵母細胞を分析し、スクリーニングゲートを設定して、酵母細胞表面上でのFc発現の量に関して最も高いFcγRIIIAについての親和性を示す細胞を選択する。好ましい実施形態によれば、4回の連続したスクリーニングを設定し、各連続的スクリーニングのゲートは5.5%、1%、0.2%、および0.1%である。本発明の方法に従って形成された酵母ディスプレイライブラリーは、まれなクローンを単離する確率を高めるために少なくとも10倍過剰標本抽出されていることが好ましい(例えば、クローン107個のライブラリーから細胞約108個を分析する)。あるいは、2〜5回のスクリーニングを設定して、所望の表現型の細胞を選択する。選択ゲートは、当業者によって経験的に設定することができる。
【０２８１】
他の好ましい実施形態では、固相に基づくアッセイ、例えば、好ましくはFcγR、例えばFcγRIIIAとの結合について高処理能の形で例えばDynalによって供給される磁性ビーズを使用したアッセイを使用して、酵母細胞表面上に提示された変異型Fc融合タンパク質をスクリーニングする。一実施形態では、磁性ビーズアッセイを使用して、FcγRIIIAについて増強された親和性、および/またはFcγRIIBについて低下した親和性を有する突然変異体を同定することができる。FcγRIIIAについて増強された親和性およびFcγRIIBについて低下した親和性を有する突然変異体を同定する例示的なアッセイは、FcγRIIBで被覆した磁性ビーズを使用する連続した固相除去、その後のFcγRIIIAで被覆した磁性ビーズを用いた選択によって突然変異体を選択することを含んでよい。例えば、1つのアッセイは、下記のステップを含んでよい: 本発明の方法に従って生成された酵母細胞のライブラリーを、FcγRIIBで被覆した磁性ビーズとともにインキュベートすること; 混合物を磁界中に置き、結合しなかった酵母細胞を取り出し、新鮮培地中にそれを入れることによって、ビーズに結合した酵母細胞を結合しなかった分画から分離すること; FcγRIIIAで被覆したビーズに酵母細胞を結合し、混合物を磁界中に置き、結合しなかった酵母細胞を除去することによってビーズに結合した酵母細胞を結合しなかった分画から分離すること; 徹底してボルテックスをかけることによって結合した細胞を取り出すこと; グルコース含有培地中で回収された細胞を増殖させること; ガラクトースを含む選択培地中で再度誘導すること。その選択工程は少なくとも1回反復する。次いで、当技術分野で知られている一般的な方法、例えばPCRを使用してFcドメインを含む挿入物を増幅し、すでに記載されている方法によってそれを抗体中に導入してさらに特徴付ける。
【０２８２】
代替の実施形態では、酵母に基づかない系を使用して、本発明の分子の結合特性を特徴付ける。本発明の分子を特徴付ける1つの例示的な系は、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20の重鎖を含む哺乳動物発現ベクターを含み、変異型Fc領域を有する本発明の分子をコードする核酸をその中にクローン化する。得られた組換えクローンを哺乳動物宿主細胞系統(すなわち、ヒト腎細胞系統293H)中で発現させ、得られた組換えイムノグロブリンを、それだけに限らないがELISAおよびFACSを含めた当業者に知られている任意の標準的なアッセイを使用して、FcγRとの結合について分析する。
【０２８３】
本発明の分子(例えば、抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子)は、様々な形で特徴付けることができる。具体的には、改変されたFc領域を含む本発明の分子を、リガンド、例えばFcγRIIIA四量体複合体と免疫特異的に結合できるかどうかアッセイを行うことができる。そのようなアッセイは、溶液中で(例えば、Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992)、ビーズ上で(Lam, Nature, 354:82-84, 1991)、チップ上で(Fodor, Nature, 364:555-556, 1993)、細菌上で(米国特許第5,223,409号)、胞子上で(米国特許第5,571,698号; 第5,403,484号; および第5,223,409号)、プラスミド上で(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869, 1992)またはファージ上で(Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1990; Devlin, Science, 249:404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382, 1990; およびFelici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991)で行うことができる(これらの参照文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている)。次いで、リガンド、例えばFcγRIIIAと免疫特異的に結合することが明らかとなった分子を、リガンドに対するその特異性および親和性についてアッセイを行うことができる。
【０２８４】
抗原(例えば、癌抗原)との免疫特異的結合および他の抗原(例えば、FcγR)との交差反応性について、当技術分野で知られている任意の方法により、改変されたFc領域を含むように工学的に改変された本発明の分子(例えば、治療用抗体)または所望の表現型(第5.1節を参照)を有することが酵母ディスプレイ系で明らかとなった本発明の分子のアッセイを行うことができる。免疫特異的結合および交差反応性の分析に使用することができるイムノアッセイには、それだけに限らないが、ほんの少数の例を挙げれば、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技術を使用する競合的および非競合的アッセイ系がある。そのようなアッセイは日常的であり、当技術分野で周知である(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい)。
【０２８５】
改変されたFc領域を含む本発明の分子とリガンド、例えばFcγR四量体複合体の結合親和性および相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例はラジオイムノアッセイであり、それは、四量体FcγRなどの多量の非標識リガンドの存在下で対象とする分子(例えば、改変されたFc領域を含む本発明の分子)とともに四量体FcγRなどの標識リガンド(例えば、3Hまたは125I)のインキュベーションを行うこと、および標識リガンドに結合した分子を検出することを含む。リガンドについての本発明の分子の親和性および結合解離速度は、スキャッチャード分析によって飽和データから決定することができる。
【０２８６】
好ましい実施形態では、BIAcore動態分析を使用して、FcγRなどのリガンドと本発明の分子の結合速度および解離速度を決定する。BIAcore動態分析は、表面上に分子(例えば、改変されたFc領域を含む分子)が固定化されたチップからのリガンドの結合および解離を検出することを含む。
【０２８７】
5.2.6  突然変異体の配列決定
当技術分野で知られている様々な配列決定反応のいずれかを使用して、変異型Fc領域を含む本発明の分子の配列を直接決定することができる。配列決定反応の例には、MaximおよびGilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560, 1977)またはSanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463, 1977)によって開発された技術に基づくものがある。質量分析による配列決定を含めて(例えば、PCT国際公開第94/16101号、Cohen et al., Adv. Chromatogr., 36:127-162, 1996、およびGriffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38:147-159, 1993を参照されたい)、様々な自動化配列決定手順のいずれかを利用することができる(Bio/Techniques, 19:448, 1995)ことも企図される。
【０２８８】
5.2.7  変異型Fc領域を有する分子の機能アッセイ
本発明は、分子のエフェクター細胞機能を同定する、当技術分野で知られているアッセイを使用した、本発明の分子(例えば、上記に記載の酵母ディスプレイ技術によって同定された変異型Fc領域を含む抗体; または本発明の方法に従って工学的に改変された治療用モノクローナル抗体)の特徴付けを包含する。具体的には、本発明は、FcγR媒介性エフェクター細胞機能についての本発明の分子の特徴付けを包含する。本発明に従ってアッセイを行うことができるエフェクター細胞機能の例には、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、C1q結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害がある。エフェクター細胞機能活性を決定する、当業者に知られている任意の細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを使用することができる(エフェクター細胞アッセイについては、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8:403-411を参照されたい)。
【０２８９】
一実施形態では、ヒト単球でのFcγR媒介性食作用について本発明の分子のアッセイを行うことができる。あるいは、本発明の分子のFcγR媒介性食作用は、他の食細胞、例えば、好中球(多形核白血球; PMN); ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージでアッセイを行うこともでき、それらは、当業者に知られている標準的な手順を使用して得ることができる(例えば、Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-164を参照されたい)。一実施形態では、以前に記載されている方法(Tridandapani et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 20480-7)によりフルオレセイン化IgG-オプソニン化ヒツジ赤血球(SRBC)を貪食するTHP-1細胞の能力を測定することによって本発明の分子の機能を特徴付ける。例えば、FcγRIIIAについて増強された親和性を有する変異型Fc領域を含む本発明の分子の食作用を測定する例示的なアッセイは、THP-1細胞を本発明の分子またはFcγRIIIAと結合しない対照抗体で処理すること、前記細胞の活性レベルを比較することからなり、細胞の活性(例えば、ロゼット形成活性(IgG被覆SRBCに結合しているTHP-1細胞の数)、接着活性(THP-1細胞に結合したSRBCの合計数)、および貪食速度)の相違から、本発明の分子の機能が示唆される。この例示的なアッセイを使用して、本発明の方法によって同定された分子のいずれかのアッセイを行うことができることを当業者なら理解することができる。
【０２９０】
本発明の分子の食作用を決定する他の例示的なアッセイは、抗体依存性オプソニン食作用アッセイ(ADCP)であり、それは以下のことを含み得る: 大腸菌(Escherichia coli)標識FITC(Molecular Probes)や黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)-FITCなどの標的生体粒子を(i)FcγR依存性ADCPの対照抗体である、フルオレセインに対する抗体の野生型4-4-20抗体(参照によりその全体が本明細書に組み込まれているBedzyk et al., 1989, J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569を参照されたい); または(ii)FcγR依存性ADCPのバックグラウンド対照である、FcγRIIIとの結合を不能にするD265A突然変異を内部に有する4-4-20抗体(iii)本発明の方法によって同定され、実施例6.6で例示されているように作製された変異型Fc領域を担持する4-4-20抗体で被覆すること; およびオプソニン化粒子を形成すること; (i〜iii)に記載のオプソニン化粒子のいずれかをTHP-1エフェクター細胞(ATCCから入手可能な単球細胞系統)に60:1の比で添加して、FcγR媒介性食作用を起こさせること; 好ましくは、細胞および大腸菌-FITC/抗体を37℃で1.5時間インキュベートすること; インキュベーション後トリパンブルーを細胞に添加して(好ましくは室温で2〜3分置いて)、内部移行せずに細胞表面の外側に接着した細菌の蛍光を失活させること; 細胞をFACS緩衝液(例えば、PBS中0.1%BSA、0.1%アジ化ナトリウム)中に移すこと; FACS(例えば、BD FACS Calibur)を使用してTHP1細胞の蛍光を分析すること。好ましくは、アッセイで使用したTHP-1細胞を、細胞表面上のFcγRの発現についてFACSにより分析する。THP-1細胞は、CD32AとCD64をどちらも発現する。CD64は高親和性FcγRであり、本発明の方法に従ってADCPアッセイを行う際に遮断される。好ましくは、THP-1細胞を100μg/mLの可溶性IgG1または10%ヒト血清で遮断する。ADCPの程度を分析するために、好ましくはTHP-1細胞上にゲートを設定し、中央蛍光強度を測定する。個々の突然変異体のADCP活性を計算し、得られた野生型chMab 4-4-20に対して標準化した値としてそれを報告する。オプソニン化粒子とTHP-1細胞の比が30:1または60:1となるように、オプソニン化粒子をTHP-1細胞に添加する。最も好ましい実施形態では、培地中の大腸菌-FITC、大腸菌-FITCおよびTHP-1細胞(FcγR非依存性ADCP活性として働く)、大腸菌-FITC、THP-1細胞および野生型4-4-20抗体(FcγR依存性ADCP活性として働く)、大腸菌-FITC、THP-1細胞、4-4-20 D265A(FcγR依存性ADCP活性のバックグラウンド対照として働く)などの対照とともにADCPアッセイを行う。
【０２９１】
他の実施形態では、当業者に知られている標準的な方法のいずれかを使用して(例えば、Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92を参照されたい)、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞でのFcγR媒介性ADCC活性について本発明の分子のアッセイを行うことができる。本発明の分子のADCC活性を決定する例示的なアッセイは、標的細胞を[51Cr]Na2CrO4(この細胞膜透過性分子は、それが細胞質タンパク質に結合し、緩徐な動態で細胞から自発的に放出されるが、標的細胞の壊死後に大量に放出されるので、標識に一般に使用される)で標識すること; 標的細胞を、変異型Fc領域を含む本発明の分子でオプソニン化すること; 標的細胞とエフェクター細胞の適当な比率で、マイクロタイタープレート中で、オプソニン化した放射標識標的細胞をエフェクター細胞と混合すること; 細胞の混合物を37℃で16〜18時間インキュベートすること; 上清を収集すること; および放射活性を分析することからなる51Cr放出アッセイに基づく。次いで、例えば下記の式: %溶解=(実験cpm-標的漏出cpm)/(界面活性剤溶解cpm-標的漏出cpm)×100%を使用して、本発明の分子の細胞傷害を決定することができる。あるいは、%溶解=(ADCC-AICC)/(最大放出-自発放出)。式: 特異的溶解=本発明の分子での%溶解-本発明の分子の不在下での%溶解を使用して、特異的溶解を計算することができる。標的:エフェクター細胞の比または抗体濃度を変化させることによって、グラフを作成することができる。
【０２９２】
さらに他の実施形態では、本発明の分子を、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)について特徴付けることができる(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ding et al., Immunity, 1998, 8:403-11を参照されたい)。
【０２９３】
好ましくは、本発明のADCCアッセイで使用するエフェクター細胞は末梢血単核細胞(PBMC)であり、好ましくは、それは当業者に知られている標準的な方法を使用して、例えばFicoll-Paque密度勾配遠心分離を使用して正常ヒト血液から精製される。本発明の方法での使用に好ましいエフェクター細胞は、様々なFcγR活性化受容体を発現する。本発明は、Fc抗体突然変異体が野生型IgG1抗体と比べてADCC活性および食作用の増大を示すかどうかを決定するための、FcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIBを発現するエフェクター細胞THP-1、ならびにFcγRIIAとFcγRIIBをどちらも発現する、ヒト全血に由来する単球由来初代マクロファージを包含する。
【０２９４】
ヒト単球細胞系統THP-1は、高親和性受容体FcγRIおよび低親和性受容体FcγRIIAの発現を介して食作用を活性化する(Fleit et al., 1991, J. Leuk. Biol. 49: 556)。THP-1細胞は、FcγRIIAまたはFcγRIIBを構成的に発現しない。サイトカインでのこれらの細胞の刺激はFcR発現パターンに影響する(Pricop et al., 2000 J. Immunol. 166: 531-7)。サイトカインIL4の存在下でTHP-1細胞を増殖させると、FcγRIIB発現が誘導され、FcγRIIAおよびFcγRI発現の低下が起こる。FcγRIIB発現はまた、細胞密度の増大によっても増強される(Tridandapani et al., 2002, J. Biol Chem. 277: 5082-9)。その一方で、IFNγがFcγRIIIAの発現を引き起こすことができることが報告されている(Pearse et al., 1993 PNAS USA 90: 4314-8)。細胞表面上での受容体の存在の有無を、当業者に知られている一般的な方法を使用してFACSにより決定することができる。サイトカインによって誘導されるFcγRの発現から、FcγRIIBの存在下で活性化と阻害をどちらも試験する系が提供される。THP-1細胞がFcγRIIBを発現することができない場合、本発明はまた、他のヒト単球細胞系統U937をも包含する。これらの細胞は、IFNγおよびTNFの存在下で最後にマクロファージに分化することが示されている(Koren et al., 1979, Nature 279: 328-331)。
【０２９５】
FcγR依存性腫瘍細胞死滅は、マウス腫瘍モデルにおいて、マクロファージおよびNK細胞によって媒介される(Clynes et al., 1998, PNAS USA 95: 652-656)。本発明は、食作用アッセイとADCCアッセイの両方でFc突然変異体が標的細胞の細胞性細胞傷害を誘発する効率を分析するエフェクター細胞としてのドナー由来水簸単球の使用を包含する。FcγRI、FcγRIIIA、およびFcγRIIBの発現パターンは、様々な増殖条件によって影響を受ける。凍結水簸単球、新鮮水簸単球、10%FBSで維持された単球、ならびにFBS+GM-CSFおよびまたはヒト血清で培養された単球からのFcγR発現は、当業者に知られている一般的な方法を使用して決定することができる。例えば、細胞をFcγR特異的抗体で染色し、それをFACSにより分析してFcRプロファイルを決定することができる。次いで、マクロファージのin vivoでのFcγR発現を最もよく模倣する条件を本発明の方法に使用する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、本発明は、特に正しいFcγRプロファイルを有するヒト細胞を得ることができないときのマウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスマクロファージ細胞系統RAW264.7(ATCC)を包含し、当技術分野で知られている方法を使用してそれにヒトFcγRIIIAをトランスフェクトし、安定したトランスフェクタントを単離することができる(例えば、Ralph et al., J. Immunol. 119: 950-4を参照されたい)。日常的な実験を使用したFACS分析により、FcγRIIIA発現についてトランスフェクタントを定量することができ、高発現体を本発明のADCCアッセイで使用することができる。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示されているものなどのノックアウトトランスジェニックマウスからの、ヒトFcγRを発現する脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。
【０２９７】
リンパ球は、ドナーの末梢血(PBM)から、Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を使用して回収することができる。細胞の単離された単核集団内で、大部分のADCC活性が、その表面上にFcγRIIIAを含むがFcγRIIBを含まないナチュラルキラー細胞(NK)を介して生じる。これらの細胞を用いた結果から、NK細胞のADCCの誘発に対する突然変異体の効果が示唆され、水簸単球を用いて試験するための試薬が確立される。
【０２９８】
本発明のADCCアッセイで使用する標的細胞には、それだけに限らないが、乳癌細胞系統、例えば、ATCCアクセッション番号HTB-30を有するSK-BR-3(例えば、Tremp et al., 1976, Cancer Res. 33-41を参照されたい); Bリンパ球; バーキットリンパ腫に由来する細胞、例えばATCCアクセッション番号CCL-86を有するRaji細胞(例えば、Epstein et al., 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240を参照されたい)、およびATCCアクセッション番号CCL-213を有するDaudi細胞(例えば、Klein et al., 1968, Cancer Res. 28: 1300-10を参照されたい)がある。標的細胞は、アッセイを行うべきイムノグロブリンの抗原結合部位によって認識されなければならない。
【０２９９】
ADCCアッセイは、アポトーシス経路を介して細胞死を媒介するNK細胞の能力に基づく。NK細胞は、部分的にはFcγRIIIAが細胞表面上で抗原と結合したIgGを認識することによって細胞死を媒介する。本発明の方法に従って使用するADCCアッセイは、放射性に基づくアッセイでもよく、あるいは蛍光に基づくアッセイでもよい。変異型Fc領域を含む本発明の分子の特徴付けに使用するADCCアッセイは、標的細胞、例えばSK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi細胞を標識すること、その抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体で標的細胞をオプソニン化すること; 日常的な実験によって決定することができる適当な比率で、標識されたオプソニン化標的細胞とエフェクター細胞を混合すること; 細胞を回収すること; 使用した標識に基づく適当な検出スキームを使用して、溶解した標的細胞の上清中の標識を検出することを含む。当技術分野で知られている標準的な方法を使用して、放射性標識または蛍光標識で標的細胞を標識することができる。例えば、標識には、それだけに限らないが、[51Cr]Na2CrO4; および蛍光増強リガンドのアセトキシメチルエステルの2,2':6',2"-テルピリジン-6-6"-ジカルボキシレート(TDA)がある。
【０３００】
具体的な好ましい実施形態では、蛍光増強リガンドのアセトキシメチルエステルの2,2':6',2"-テルピリジン-6-6"-ジカルボキシレート(TDA)で標識されている標的細胞に対するADCC活性の測定に、時間分解蛍光定量アッセイを使用する。そのような蛍光定量アッセイは当技術分野で知られ、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Blomberg et al., 1996, Journal of Immunological Methods, 193: 199-206を参照されたい。簡潔に述べると、標的細胞を膜透過性のTDAのアセトキシメチルジエステル(ビス(アセトキシメチル)2,2':6',2"-テルピリジン-6-6"-ジカルボキシレート、(BATDA))で標識し、それは生細胞の細胞膜全体に迅速に拡散する。細胞内エステラーゼはエステル基を分離し、再生した膜不透過性TDA分子が細胞内で捕捉される。エフェクター細胞および標的細胞を、例えば5%CO2下で37℃で少なくとも2時間、最大で3.5時間インキュベートした後、溶解された標的細胞から放出されたTDAをEu3+でキレート化し、形成したユーロピウム-TDAキレートを、時間分解蛍光測定器(例えば、Victor 1420、Perkin Elmer/Wallac)で定量する。
【０３０１】
他の例示的な実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子の特徴付けに使用するADCCアッセイは、下記のステップを含む: 好ましくは、4〜5×106個の標的細胞(例えば、SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji細胞)を、ビス(アセトキシメチル)2,2':6',2"-テルピリジン-t-6"ジカルボキシレート(DELFIA BATDA Reagent、Perkin Elmer/Wallac)で標識する。最適な標識効率にするには、ADCCアッセイで使用する標的細胞の数は、好ましくは5×106を超えるべきでない。BATDA試薬を細胞に添加し、その混合物を37℃で、好ましくは5%CO2下で、少なくとも30分間インキュベートする。次いで、細胞を生理的緩衝液、例えば0.125mMのスルフィンピラゾールを有するPBS、および0.125mMのスルフィンピラゾールを含む培地で洗浄する。次いで、変異型Fc領域を含む本発明の分子、すなわち、それだけに限らないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体を含めた本発明の変異型Fc領域を含むイムノグロブリンで、標識された標的細胞をオプソニン化(被覆)する。好ましい実施形態では、ADCCアッセイで使用する変異型Fc領域を含むイムノグロブリンは、細胞表面受容体、腫瘍抗原、または癌抗原に特異的である。本発明の変異型Fc領域が導入されたイムノグロブリンは、第5.4節で列挙するものなどの任意の癌または腫瘍抗原に特異的に結合する。さらに、本発明の変異型Fc領域が導入されたイムノグロブリンは、第5.4節で列挙するものなどの癌抗原に特異的な任意の治療用抗体でよい。いくつかの実施形態では、ADCCアッセイで使用する変異型Fc領域を含むイムノグロブリンは、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20(Kranz et al., 1982 J. Biol. Chem. 257(12): 6987-6995)、マウス-ヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗体2H7 (Liu et al., 1987, Journal of Immunology, 139: 3521-6); またはヒト上皮成長因子2(p185 HER2)に対するヒト化抗体(Ab4D5)(Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-9)である。ADCCアッセイにおける標的細胞は、イムノグロブリンが標的細胞の細胞表面受容体に特異的に結合するように本発明の変異型Fc領域が導入されているイムノグロブリンに従って選択される。好ましくは、本発明のADCCアッセイは、本発明のFc変異体を内部に有する複数の工学的改変抗体、例えば、抗Her2/neu、4-4-20、2B6、Rituxan、および2H7を使用して行う。最も好ましい実施形態では、本発明のFc変異体を少なくとも3つの抗体中に導入し、そのADCC活性を試験する。特定の作用機序に拘泥するものではないが、これらの機能アッセイで少なくとも3つの抗体を調べると、生存可能なFc突然変異を誤って除去する機会が少なくなる。
【０３０２】
オプソニン化標的細胞をエフェクター細胞、例えばPBMCに添加して、エフェクター:標的の比を約50:1、75:1、または100:1にする。特定の実施形態では、変異型Fc領域を含むイムノグロブリンが4-4-20の可変ドメインを有するとき、エフェクター:標的は75:1である。5%CO2下で、エフェクター細胞および標的細胞を37℃で少なくとも2時間、最大で3.5時間インキュベートする。細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液(例えば、DELFIA Europium Solution、Perkin Elmer/Wallac)に添加する。形成したユーロピウム-TDAキレートの蛍光を、時間分解蛍光測定器(例えば、Victor 1420、Perkin Elmer/Wallac)で定量する。最大放出(MR)および自発放出(SR)は、それぞれ1% TX-100および培地単独で標的細胞をインキュベートすることによって決定する。抗体非依存性細胞性細胞傷害(AICC)は、抗体の不在下で標的細胞およびエフェクター細胞をインキュベートすることによって測定する。好ましくは、各アッセイを三連で行う。特異的溶解の平均百分率は、実験放出(ADCC)-AICC)/(MR-SR)×100として計算する。
【０３０３】
本発明は、NK依存性とマクロファージ依存性のADCCアッセイの両方でのFc変異体の特徴付けを包含する。本発明のFc変異体は、NK依存性またはマクロファージ依存性のアッセイでアッセイが行われる改変されたエフェクター機能などの改変された表現型を有する。
【０３０４】
本発明は、C1qに結合し、補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介する、当技術分野で知られ本明細書で例示されるアッセイを包含する。C1q結合を決定するために、C1q結合ELISAを行うことができる。例示的なアッセイは、下記のことを含んでよい: 被覆緩衝液中で、ポリペプチド変異体または開始ポリペプチド(対照)でアッセイプレートを4℃で1晩被覆することができる。次いで、プレートを洗浄しブロッキング処理することができる。洗浄後、ヒトC1qのアリコートを各穴に添加し、室温で2時間インキュベートすることができる。さらなる洗浄の後、ヒツジ抗補体C1qペルオキシダーゼコンジュゲート抗体100uLを各穴に添加し、室温で1時間インキュベートすることができる。洗浄緩衝液でプレートを再度洗浄することができ、OPD(O-フェニレンジアミン二塩酸塩(Sigma))を含む基質緩衝液100uLを各穴に添加することができる。黄色の出現によって観察される酸化反応を30分間進行させ、4.5 NH2 SO4を100uL添加することによってそれを停止することができる。次いで吸光度を(492〜405)nmで読み取ることができる。
【０３０５】
本発明による好ましい変異体は、このアッセイまたは類似したアッセイで検出および測定されるC1q結合の有意な低下を示すものである。好ましくは、Fc変異体を含む分子は、突然変異していないIgG1 Fc領域を有する対照抗体と比較してC1q結合の約50倍の低下、約60倍、約80倍、または約90倍の低下を示す。最も好ましい実施形態では、Fc変異体を含む分子はC1qと結合せず、すなわち、その変異体は対照抗体と比較してC1q結合の約100倍以上の低下を示す。
【０３０６】
他の例示的な変異体は、野生型Fc領域を含む分子より良好なヒトC1qについての結合親和性を有するものである。そのような分子は、例えば、野生型Fc領域を含む親分子と比較してヒトC1q結合の約2倍以上、好ましくは約5倍以上の向上を示し得る。例えば、ヒトC1q結合は、野生型Fc領域を含む分子と比較して約2倍〜約500倍、好ましくは約2倍または約5倍〜約1000倍向上し得る。
【０３０７】
補体活性化を評価するため、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイを行うことができる。簡潔に述べると、様々な濃度の、変異型Fc領域を含む分子およびヒト補体を緩衝液で希釈することができる。変異型Fc領域を含む分子が結合する抗原を発現する細胞を希釈して、1ml当たり細胞約1×106個の密度にすることができる。変異型Fc領域を含む分子、希釈したヒト補体、および抗原を発現する細胞の混合物を平底組織培養96穴プレートに添加し、それを37℃および5% CO2で2時間インキュベートして補体媒介性細胞溶解を促進することができる。次いで、アラマーブルー(alamar blue)(Accumed International)50uLを各穴に添加し、37℃で1晩インキュベートすることができる。96穴用蛍光測定器を使用して、530nmで励起し590nmで放出させて吸光度を測定する。その結果は、相対的蛍光単位(RFU)で表すことができる。標準曲線から試料濃度を算出することができ、非変異型分子、すなわち野生型Fc領域を含む分子と比較したパーセント活性を、対象とする変異体について報告する。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本発明のFc変異体は補体を活性化しない。好ましくは、変異体は上記のCDCアッセイでCDC活性を有さないように見える。本発明はまた、親分子(野生型Fc領域を含む分子)と比較して増強されたCDCを有する、例えば、(例えば、比較される各分子のIC50値において)in vitroまたはin vivoでCDC活性の約2倍〜約100倍の向上を示す変異体にも関する。補体アッセイは、モルモット、ウサギまたはヒト血清を用いて行うことができる。標的細胞の補体溶解は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Korzeniewski et al., 1983 Immunol. Methods 64(3): 313-20; およびDecker et al., 1988 J. Immunol Methods 115(1): 61-9に記載のように、乳酸脱水素酵素(LDH)などの細胞内酵素の放出; または、本明細書に記載のように標的細胞を標識したユーロピウム、クロム51やインジウム111などの細胞内標識の放出をモニターすることによって検出することができる。
【０３０９】
5.2.8  他のアッセイ
当技術分野で知られている、表面プラズモン共鳴に基づく任意のアッセイを使用して変異型Fc領域を含む本発明の分子のアッセイを行って、Fc-FcγR相互作用の結合の動態パラメーターを特徴付けることもできる。それだけに限らないが、Biacore AB (Uppsala, Sweden)から入手可能なBIAcore機器; Affinity Sensors (Franklin, MA.)から入手可能なIAsys機器; Windsor Scientific Limited (Berks, UK)から入手可能なIBISシステム、Nippon Laser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan)から入手可能なSPR-CELLIAシステム、およびTexas Instruments (Dallas, TX)から入手可能なSPR Detector Spreetaを含めた市販されている任意のSPR機器を本発明で使用することができる。SPRに基づく技術の総説については、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照されたい。さらに、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第6,373,577号; 第6,289,286号; 第5,322,798号; 第5,341,215号; 第6,268,125号に記載のタンパク質とタンパク質の相互作用を測定するSPR機器およびSPRに基づく方法のいずれかが本発明の方法で企図される。
【０３１０】
簡潔に述べると、SPRに基づくアッセイでは、結合対の構成要素を表面上に固定化し、溶液中で結合対の他の構成要素とその相互作用をリアルタイムでモニターする。SPRは、複合体の形成または解離の後に起こる、表面の近くにある溶媒の屈折率の変化を測定することに基づく。固定化を行う表面はセンサーチップであり、それはSPR技術の心臓部である; それは、金の薄層で被覆されたガラス表面からなり、分子と表面の結合を最適化するように設計された一連の特殊化表面の基礎となる。様々なセンサーチップが、特に上記で列挙した会社から市販され、それらはすべて、本発明の方法で使用することができる。センサーチップの例には、BIAcore AB, Inc.から入手可能なもの、例えば、Sensor Chip CM5、SA、NTA、およびHPAがある。それだけに限らないが、アミン基を介する直接共有結合、スルフヒドリル基を介する直接共有結合、アビジン被覆表面とのビオチン結合、炭水化物基とのアルデヒド結合、およびNTAチップとのヒスチジンタグを介した結合を含めた当技術分野で知られている固定化の方法および化学反応のいずれかを使用して、本発明の分子をセンサーチップの表面上に固定化することができる。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子、例えば変異型Fc領域を含むイムノグロブリンとFcγRの結合の動態パラメーターは、BIAcore機器(例えば、BIAcore機器1000、BIAcore Inc., Piscataway, NJ)を使用して決定することができる。任意のFcγRを使用して、変異型Fc領域を含む本発明の分子との相互作用を評価することができる。特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIIA、好ましくは可溶性単量体FcγRIIIAである。例えば、一実施形態では、可溶性単量体FcγRIIIAは、リンカー-AVITAG配列と連結したFcγRIIIAの細胞外領域である(参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2003年1月9日に出願された米国仮出願第60/439,498号(代理人整理番号11183-004-888)および2003年3月19日に出願された米国仮出願第60/456,041号を参照されたい)。他の特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIB、好ましくは可溶性二量体FcγRIIBである。例えば、一実施形態では、可溶性二量体FcγRIIBタンパク質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2003年1月13日に出願された米国仮出願第60/439,709号に記載の方法に従って調製する。
【０３１２】
BIAcore機器を使用して、FcγRに対する、4-4-20抗体である変異型Fc領域を含む分子の動態パラメーターを決定する例示的なアッセイは、以下のことを含む: BSA-FITCを、センサーチップ表面の4つのフローセルの1つに、好ましくはアミン結合化学反応により固定化し、その結果、BSA-FITCの約5000反応単位(RU)が表面上に固定化される。適切な表面を調製した後、Fc突然変異を担持する4-4-20抗体を表面に、好ましくは流速5μL/mLで20μg/mLの溶液を1分間注入することによって通過させる。表面に結合した4-4-20抗体のレベルは400〜700RUである。次に、HBS-P緩衝液(20mM HEPES、150 mM NaCl、3mM EDTA、pH7.5)中の受容体(FcγRIIAおよびFcγRIIB-Fc融合タンパク質)の希釈系列を表面上に100μL/分で注入する。異なる受容体希釈物間の抗体再生は、好ましくは、100mM NaHCO3 pH9.4; 3M NaClの5秒間の単回注入によって実施する。当技術分野で知られている任意の再生技術が本発明の方法で企図される。
【０３１３】
データの組全体を収集した後、SPR機器製造業者、例えばBIAcore, Inc. (Piscataway, NJ)によって供給されるコンピュータアルゴリズムを使用して、得られた結合曲線を全体的に適合させる。このアルゴリズムはKonとKoffをどちらも計算するものであり、それから、みかけの平衡結合定数Kdが、2つの速度定数の比(すなわち、Koff/Kon)として推定される。個々の速度定数を導き出す方法のより詳細な処理は、BIAevaluaion Software Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)中に認めることができる。当技術分野で知られている任意の方法を使用して、得られたデータの分析を行うことができる。得られた動態データの解釈の様々な方法の総説については、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Myszka, 1997, Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al., 1994, Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy, 1994, Current Opinion in Biotechnology, 5:65-71; Chaiken et al., 1992, Analytical Biochemistry, 201: 197-210; Morton et al., 1995, Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83を参照されたい。
【０３１４】
好ましい実施形態では、SPR分析、例えばBIAcoreを使用して決定される動態パラメーターを、どのように本発明の分子が機能アッセイ、例えばADCCで機能するかの予測測定値として使用することができる。SPR分析から得られた動態パラメーターに基づいて本発明の物質の効果を予測する例示的な方法は、下記のことを含んでよい: 本発明の分子とFcγRIIIAおよびFcγRIIBの結合のKoff値を決定すること; ADCCデータに対して(1)FcγRIIIAのKoff(野生型)/Koff(突然変異型); (2)FcγRIIBのKoff(突然変異型)/Koff(野生型)をプロットすること。1より高い数は、野生型に比べて低いFcγRIIIAの解離速度および高いFcγRIIBの解離速度を示し、増強されたADCC機能を有する。
【０３１５】
5.3  本発明の分子の組換えによる産生方法
5.3.1  本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の方法によって同定された本発明のポリペプチドおよび抗体を含めた分子をコードするポリヌクレオチドをも含む。当技術分野で知られている任意の方法によって、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
【０３１６】
本発明の方法によって同定された分子(例えば、抗体)のヌクレオチド配列を決定した後、当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異生成、PCRなど(例えば、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照されたい)を使用してヌクレオチド配列を操作して、例えば、例えばアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を生じさせることによって異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
【０３１７】
特定の実施形態では、核酸が抗体をコードするとき、日常的な組換えDNA技術を使用して、1つまたは複数のCDRをフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域または共通フレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域でよい(例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧については、Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照されたい)。
【０３１８】
他の実施形態では、当技術分野で利用可能なヒトライブラリーまたは任意の他のライブラリーを当技術分野で知られている標準的な技術によりスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローン化することができる。
【０３１９】
5.3.2  本発明の分子の組換え発現
本発明の分子(すなわち、抗体)をコードする核酸配列を得た後、分子を産生するベクターを、当技術分野で周知の技術を使用して、組換えDNA技術によって作製することができる。当業者に周知である方法を使用して、本発明の分子のコード配列ならびに適当な転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、および in vivo遺伝子組換えがある(例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照されたい)。
【０３２０】
本発明の方法によって同定された分子(すなわち、抗体)のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、従来の技術(例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿)によって宿主細胞に移入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を従来の技術により培養して本発明の分子を産生する。特定の実施形態では、本発明の分子の発現は、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターによって制御される。
【０３２１】
本発明の方法によって同定された分子の発現に使用する宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞でもよく、あるいは、好ましくは、特に組換えイムノグロブリン分子全体を発現させるための真核細胞でもよい。具体的には、ヒトサイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せた、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)などの哺乳動物細胞は、イムノグロブリンに有効な発現系である(Foecking et al., 1998, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2)。
【０３２２】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明の方法によって同定された分子を発現させることができる。そのような宿主発現系は、本発明の分子のコード配列を作製しその後精製することができる媒体を表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換されまたはそれをトランスフェクトされたときにin situで本発明の分子を発現する細胞も表す。これらには、それだけに限らないが、本発明の方法によって同定された分子のコード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌および枯草菌(B. subtilis))などの微生物; 本発明の方法によって同定された分子をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロマイセスピチア(Saccharomyces Pichia)); 本発明の方法によって同定された分子をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系; 本発明の方法によって同定された分子をコードする配列を含む、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)およびタバコモザイクウイルス(TMV))に感染し、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系; あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター; ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を内部に有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、リンパ球系細胞(米国特許第5,807,715号を参照)、Per C.6細胞(Crucellによって開発されたヒト網膜細胞))がある。
【０３２３】
細菌の系では、有利には、発現させる分子に意図される使用に応じていくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を生成するために大量のそのようなタンパク質を産生するとき、精製が容易である融合タンパク質産物の高レベルの発現を誘導するベクターが望ましい可能性がある。そのようなベクターには、それだけに限らないが、融合タンパク質が産生されるようにlacZコード領域とインフレームで抗体コード配列をベクター中に個々に連結することができる大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791); pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)などがある。pGEXベクターを使用して、グルタチオンS-転移酵素(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズとの吸着および結合、その後の遊離グルタチオン存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローン化標的遺伝子産物を、GST部分から放出させることができる。
【０３２４】
昆虫の系では、オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(AcNPV)を、外来遺伝子を発現するベクターとして使用する。そのウイルスは、スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域(例えば、ポリへドリン遺伝子)中に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えば、ポリへドリンプロモーター)の調節下に置くことができる。
【０３２５】
哺乳動物宿主細胞では、ウイルスに基づくいくつかの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合では、対象とする抗体コード配列を、アデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列と連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)中に挿入すると、生存可能であり、感染した宿主中でイムノグロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが生じる(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照されたい)。特定の開始シグナルが、挿入された抗体コード配列の効率のよい翻訳に必要となる可能性もある。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入物全体が確実に翻訳されるために、所望のコード配列の読み枠を有する相になければならない。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でも様々な由来のものでよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子などを含めることによって高めることができる(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい)。
【０３２６】
さらに、挿入された配列の発現を調節し、または所望される特定の形で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能に重要である可能性がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾について特徴および特定の機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実に行われるように、適当な細胞系統または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化の細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、それだけに限らないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7030およびHs578Bstがある。
【０３２７】
組換えタンパク質の長期にわたる高収量の産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定して発現する細胞系統を工学的に改変することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)によって調節されたDNA、および選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、工学的改変細胞を濃縮培地中で1〜2日間増殖させることができ、次いで選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体中にプラスミドを組み込み、それを増殖させてフォーカスを形成することを可能にし、そのフォーカスをクローン化し細胞系統中で増殖させることができる。有利には、この方法を使用して、本発明の抗体を発現する細胞系統を工学的に改変することができる。そのような工学的改変細胞系統は、本発明の抗体と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価で特に有用である可能性がある。
【０３２８】
それだけに限らないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977, Cell 11: 223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル転移酵素(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202)、およびアデニンホスホリボシル転移酵素(Lowy et al., 1980, Cell 22: 817)遺伝子を含めたいくつかの選択系を使用することができ、これらの遺伝子はtk-、hgprt-またはaprt-細胞でそれぞれ使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎として使用することもできる: メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991,  3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215); およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147)。使用することができる、組換えDNA技術の分野で一般に知られている方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
【０３２９】
ベクター増幅によって、本発明の抗体の発現レベルを増大することができる(総説については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増大すると、マーカー遺伝子のコピー数が増大する。増幅した領域が抗体のヌクレオチド配列を伴うので、抗体の産生も増大する(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【０３３０】
宿主細胞に、第1のベクターが重鎖由来ポリペプチドをコードし、第2のベクターが軽鎖由来ポリペプチドをコードする本発明の2つの発現ベクターを同時にトランスフェクトすることができる。2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含んでよい。あるいは、重鎖と軽鎖のどちらのポリペプチドもコードする単一のベクターを使用することもできる。そのような状況では、軽鎖を重鎖の前に置いて、過剰な毒性遊離重鎖を回避すべきである(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197)。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAを含んでもよく、あるいはゲノムDNAを含んでもよい。
【０３３１】
本発明の分子(すなわち、抗体)を組換えによって発現させた後、ポリペプチドまたは抗体の精製について当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、具体的にはプロテインAの後の特定の抗原についての親和性によるクロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的溶解性(differential solubility)によって、あるいはポリペプチドまたは抗体の精製についての任意の他の標準的な技術によってそれを精製することができる。
【０３３２】
5.4  予防方法および治療方法
本発明は、疾患、障害、または感染に関係する、1つまたは複数の症状を予防、治療、または回復するために、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに、本発明の1種または複数の分子(例えば、抗体)を投与することを包含する。本発明の分子は、FcγRによって媒介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)の効力の増強が望ましい疾患または障害の治療または予防に特に有用である。本発明の方法および組成物は、原発性または転移性腫瘍性疾患(すなわち癌)および感染性疾患の治療または予防に特に有用である。本発明の分子は、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている、薬学的に許容される組成物中に提供することができる。以下に詳述するように、本発明の分子は、癌(特に受動免疫療法において)、自己免疫疾患、炎症性障害または感染性疾患を治療または予防する方法において用いることができる。
【０３３３】
本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性障害または感染性疾患の治療または予防のために、当技術分野で知られている他の治療剤と組み合わせて有利に利用することができる。特定の実施形態では、本発明の分子は、例えば、分子と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大させる役割を果たし、免疫応答を増大させる、モノクローナル抗体またはキメラ抗体、リンホカイン、または造血成長因子(例えば、IL-2、IL-3およびIL-7など)と組み合わせて用いることができる。本発明の分子はまた、例えば、以下の節5.4.1.2および5.4.2.1に詳述されている、例えば抗癌剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤などの、疾患、障害または感染を治療するために用いられる、1種または複数の薬物と組み合わせて有利に利用することができる。
【０３３４】
5.4.1  癌
本発明は、治療上有効量の、変異型Fc領域を含む1種または複数の分子を対象に投与することを含む、対象における癌または転移の治療または予防のための方法および組成物を包含する。
【０３３５】
変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、ポリペプチド、抗体)は、原発性腫瘍の成長または癌細胞の転移を予防、抑制、または低減することに用いることができる。一実施形態では、本発明の分子は、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドが、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合する変異型Fcを含み、かつ/または前記変異型Fc領域は、増強されたエフェクター機能、例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン作用などを有する。このような分子は、癌を治療または予防するために単独で用いることができる。別の実施形態では、本発明の分子は、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドが、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合し、さらに、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドが、FcγRIIBに結合するよりも低い親和性でFcγRIIBに結合する変異型Fc領域を含み、かつ/または前記変異型Fc領域は、増強されたエフェクター機能、例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン作用などを有する。このような分子も、癌を治療または予防するために単独で用いることができる。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、FγRIIIA-158VまたはFcγRIIIA-158F対立遺伝子にとってホモ接合性であるものなどのFcγR多型を有する対象における、癌の治療または予防のための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療用抗体、例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体を、工学的に改変された抗体が、FcγRIIIA(158F)の低親和性対立遺伝子にとってホモ接合性である患者において増強された効力を有するように、本発明の方法によって工学的に改変することを包含する。他の実施形態では、本発明は、治療用抗体、例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体を、工学的に改変された抗体が、FcγRIIIA(158V)の高親和性対立遺伝子にとってホモ接合性である患者において増強された効力を有するように、本発明の方法によって工学的に改変することを包含する。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、本発明の工学的に改変された抗体は、非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療および/または予防することにおいて特に有効である。本発明の工学的に改変された抗体は、それだけに限らないが、化学療法、および抗CD20 mAb、リツキシマブを用いる免疫療法を含めた、NHLに対する現行の治療法よりも治療上有効である。しかし、抗CD20モノクローナル抗体の効力は、対象のFcγR多型に依存する(ともに、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Carton et al., 2002 Blood, 99: 754-8; Weng et al., 2003 J Clin Oncol.21(21):3940-7)。これらの受容体は、エフェクター細胞の表面上で発現され、ADCCを媒介する。低親和性活性化受容体の、高親和性対立遺伝子は、エフェクター細胞の、ADCCを媒介する能力を改善する。本発明の方法は、Fc突然変異を有する抗CD20抗体を工学的に改変させることによって、その改変されたFcドメインを介してエフェクター細胞上のFcγRに対する親和性を増強する。本発明の工学的に改変された抗体により、患者のFcγR多型に関わらず、患者にとってより良好な免疫療法用試薬が提供される。
【０３３８】
対象における工学的に改変された抗CD20抗体の効力を判定する、例示的な方法には、以下のものを含むことができる。ADCCにおいて実質的に死滅の増加を示す、Fc突然変異を伴ったキメラ抗HER2/neuの重鎖遺伝子を有するプラスミドは、リツキシマブの重鎖遺伝子由来の可変ドメインに移行するためのバックボーンとして用いることができる。抗HER2/neu Fc変異体由来の可変領域は、リツキシマブ由来の可変領域で置換される。野生型FcドメインまたはFcR結合を抑止するためのD265A突然変異を含むプラスミド、あるいは抗CD20 Fc変異体は、293H細胞中にリツキシマブの軽鎖遺伝子を一過性にコトランスフェクトし、条件培地および抗体は、通常の方法を用いてタンパク質Gカラムで精製する。
【０３３９】
Fc変異体を有する抗CD20 mAbを、培養B細胞株を用いるADCCによって試験することによって、Fc突然変異の、ADCCを増強する能力を判定する。本明細書に開示した方法を用いて、標準的なADCCを行う。リンパ球を、Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を用いて末梢血から採取する。標的Daudi細胞、CD20を発現するB細胞株に、ユーロピウム(PerkinElmer)を添加し、エフェクターとともに37℃で4時間インキュベートする。放出されたユーロピウムを、蛍光プレートリーダー(Wallac)を用いて検出する。得られるADCCデータは、NK細胞媒介性細胞傷害を誘発する、Fc変異体の効力を示し、どの抗CD20 Fc変異体を、患者試料および水簸した単球の両方で試験することができるかを明らかにする。次いで、抗CD20抗体の効力を増強する最大の潜在性を示すFc変異体を、患者からのPBMCを用いるADCCアッセイで試験する。健康なドナーからのPBMCは、エフェクター細胞として用いる。抗CD20変異体およびリツキシマブを用いるIn vitro ADCCアッセイは、濾胞性リンパ腫を有する患者からの原発性リンパ腫細胞で行う。ドナーの特定のFcγR多型は、当技術分野で知られている方法を用いて決定し、登録する。ADCCアッセイは、異なるFcγRIIIAおよびFcγRIIA遺伝子型を有する患者からのエフェクター細胞によって行う。
【０３４０】
本発明の態様によれば、変異型Fc領域を含む本発明の分子(例えば、抗体)は、抗体エフェクター機能、例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン作用などの潜在性を、野生型Fc領域を含有する分子と比べて増大させることによって、癌免疫療法の効力を増強する。特定の実施形態では、抗体依存性細胞毒性および/または腫瘍細胞の食作用は、変異型Fc領域を有する本発明の分子を用いて増強される。本発明の分子は、少なくとも1つの抗体媒介性エフェクター機能を増強することによって、免疫療法の癌治療の効力を増強することができる。特定の一実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、補体依存性カスケードを増強することによって、免疫療法治療の効力を増強する。本発明の別の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、標的腫瘍細胞の食作用および/またはオプソニン作用を増強することによって、免疫療法治療の効力を増強する。本発明の別の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、標的腫瘍細胞の破壊における抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(「ADCC」)を増強することによって、治療の効力を増強する。
【０３４１】
本発明はさらに、例えば、治療用抗体のエフェクター機能(例えば、ADCC)を増強することによって、治療用抗体の治療効力を増強するために、治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)を工学的に改変することを企図する。治療用抗体は、細胞傷害抗体および/またはオプソニン化抗体であることが好ましい。所望の結合特性を有する本発明の分子(例えば、少なくとも1つのアミノ酸改変を含む変異型Fc領域を有する分子であって、その改変により、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性が増強される分子)が、本発明の方法によって同定されると(節5.2および表8参照)、治療用抗体は、節5.2.2に説明された、標準的な組換えDNA技術および任意の既知の突然変異誘発技術を用いて工学的に改変されることによって、所望の結合特性を伴う同定された突然変異点を有する、工学的に改変された治療剤を製造できることが当業者によって理解されよう。癌治療における治療有用性を実証された、表9に列挙する任意の治療用抗体は、本発明の方法によって、例えば、野生型Fc領域を有する治療用抗体と比較してFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する増強された親和性を有するようにFc領域を改変することによって、工学的に改変することができ、癌抗原を特徴とする癌の治療およびまたは予防に用いることができる。他の治療用抗体には、肺炎連鎖球菌血清型6Bに対するものなどの、病原性因子に対するものが含まれ、例えば、Sun et al., 1999, Infection and Immunity, 67(3): 1172-9を参照されたい。
【０３４２】
本発明のFc変異体は、本明細書に開示したもの、または他のFc融合物の臨床候補、すなわち臨床試験において承認されたFc領域を含む分子、または本発明のFc変異体、そのヒト化型、親和性成熟型、改変型もしくは工学改変型から恩恵を受けることのできる任意の他の分子などの治療用抗体中に組み込むことができる。
【０３４３】
本発明はまた、それだけに限らないが、ENBRELを含めた、治療有用性を有するFc領域を含む任意の他のポリペプチドを、そのようなポリペプチドの治療効力を増強するために、本発明の方法によって、例えば、Fc領域を含むポリペプチドのエフェクター機能を増強することによって、工学的に改変することを包含する。
【表９】
2009507470.tif 000037
【０３４４】
2009507470.tif 000038
【０３４５】
2009507470.tif 000039
【０３４６】
2009507470.tif 000040
【０３４７】
したがって、本発明は、癌抗原に結合し、細胞傷害であり、親治療用抗体よりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合し、かつ/またはより有効にエフェクター機能(例えば、ADCC、食作用)を媒介するように、本発明によって、Fc領域の1つまたは複数の部位で改変された治療用抗体を用いて、癌抗原を特徴とする癌を予防または治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌抗原に結合し、細胞傷害であり、親治療用抗体よりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合し、低い親和性でFcγRIIBに結合し、かつ/またはより有効にエフェクター機能(例えば、ADCC、食作用)を媒介するように、本発明によって工学的に改変された治療用抗体を用いて、癌抗原を特徴とする癌を予防または治療する方法を提供する。本発明によって工学的に改変された治療用抗体は、増強された細胞傷害活性(例えば、腫瘍細胞死滅の増強および/もしくは増強された、例えばADCC活性またはCDC活性)を有するので、癌の予防または治療に有用である。
【０３４８】
癌抗原に関係する癌は、癌抗原に結合し、細胞傷害であり、例えば、増強されたエフェクター機能を有するように、本発明の方法によって工学的に改変された治療用抗体の投与によって治療または予防することができる。特定の一実施形態では、本発明の方法によって工学的に改変された治療用抗体は、特定の癌抗原に向けられた抗体の、抗体媒介性細胞傷害効果を増強する。例えば、限定の目的ではなく、以下の癌抗原に関係する癌は、本発明の方法および組成物によって、治療または予防することができる:KS1/4全癌腫抗原(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:32-37; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415)、卵巣癌抗原(CA125)(Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2):48-475)、前立腺酸性ホスフェート(Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(1):4928)、前立腺特異抗原(Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230)、黒色腫関連抗原p97(Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44)、黒色腫抗原gp75(Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380)、高分子量黒色腫抗原(HMW-MAA)(Natali et al., 1987, Cancer 59:55-3; Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144))、前立腺特異膜抗原、癌胎児抗原(CEA)(Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294)、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、直腸結腸腫瘍関連抗原、例えば:CEA、TAG-72 (Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52:3402-3408)、CO17-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53:751-758); GICA 19-9(Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2:135)、CTA-1およびLEAなど、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19(Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-1336)、ヒトB-リンパ腫抗原-CD20(Reff et al., 1994, Blood 83:435-445)、CD33(Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430)、黒色腫特異抗原、例えば、ガングリオシドGD2(Saleh et al., 1993, J.Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシドGD3(Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380)、ガングリオシドGM2(Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044)、ガングリオシドGM3(Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53:5244-5250)など、腫瘍特異移植型の細胞表面抗原(TSTA)、例えば、T-抗原DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含めたウイルス誘導腫瘍抗原など、癌胎児性抗原-α-フェトプロテイン、例えば、大腸のCEA、膀胱腫瘍癌の胎児性抗原(Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188)など、分化抗原、例えば、ヒト肺癌抗原L6、L20(Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923)など、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403)、ネオグリコプロテイン、スフィンゴ脂質、乳癌抗原、例えば、EGFR(上皮成長因子受容体)、HER2抗原(p185HER2)、多形性上皮ムチン(PEM)(Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359)など、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1(Bernhard et al., 1989, Science 245:301-304)、分化抗原(Feizi, 1985, Nature 314:53-57)、例えば、致死的エルトロサイト(erthrocyte)および初期内胚葉において発見されたI抗原、胃のアデンカルシノーマ(adencarcinoma)において発見されたI(Ma)、乳房上皮において発見されたM18およびM39、骨髄細胞中に発見されたSSEA-1、直腸結腸癌において発見されたVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、およびD156-22、結腸腺癌において発見されたTRA-1-85(血液型H)、C14、肺腺癌において発見されたF3、胃癌において発見されたAH6、胚性癌細胞中に発見されたYハプテン、Ley、A431細胞中に発見されたTL5(血液型A)、EGF受容体、膵癌において発見されたE1系(血液型B)、胚性癌細胞、胃腺癌に���いて発見されたFC10.2、腺癌において発見されたCO-514(血液型Lea)、腺癌において発見されたNS-10、結腸腺癌において発見されたCO-43(血液型Leb)、G49、EGF受容体、(血液型ALeb/Ley)、大腸癌、胃癌のムチンにおいて発見された19.9、骨髄細胞中に発見されたT5A7、黒色腫において発見されたR24、胚性癌細胞中に発見された4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、ならびに4〜8細胞期の胚において発見されたSSEA-3、SSEA-4など。別の実施形態では、抗原は、皮膚T細胞リンパ腫からのT細胞受容体誘導ペプチドである(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照)。
【０３４９】
本発明の方法および組成物によって治療または予防することのできる癌および関連した障害として、それだけに限らないが、以下のものが挙げられる:それだけに限らないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病および骨髄異形成症候群など、慢性白血病、例えば、それだけに限らないが、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ球性白血病など、ヘアリーセル白血病を含めた白血病;真性多血症;リンパ腫、例えばそれだけに限らないが、ホジキン疾患、非ホジキン疾患など;多発性骨髄腫、例えばそれだけに限らないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫など;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症;良性単クローン性高ガンマグロブリン血症;重鎖病;骨および結合組織の肉腫、例えばそれだけに限らないが、骨肉腫(bone sarcoma)、骨肉腫(osteosarcoma)、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫(angiosarcoma)(血管肉腫(hemangiosarcoma))、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫など;それだけに限らないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起細胞腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫を含めた脳腫瘍;それだけに限らないが、腺癌、小葉(小細胞)癌、乳管癌、乳房の髄様癌、乳房の粘液癌、管状乳癌、乳頭乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌を含めた乳癌;それだけに限らないが、フェオクロモシトム(pheochromocytom)および副腎皮質癌を含めた副腎癌;甲状腺癌、例えばそれだけに限らないが、乳頭様または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌など;それだけに限らないが、膵島細胞腺腫、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、VIP産生腫瘍、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイド腫瘍または膵島細胞腫瘍を含めた膵癌;それだけに限らないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症を含めた下垂体癌;それだけに限らないが、眼の黒色腫、例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫など、ならびに網膜芽細胞腫を含めた眼癌;それだけに限らないが、扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫を含めた膣癌;それだけに限らないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病を含めた外陰癌;それだけに限らないが、扁平上皮癌、および腺癌を含めた子宮頸癌;それだけに限らないが、子宮内膜癌および子宮肉腫を含めた子宮癌;それだけに限らないが、上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍を含めた卵巣癌;それだけに限らないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様シクティック(cyctic)癌, 粘表皮癌, 腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞(小細胞)癌を含めた食道癌;それだけに限らないが、腺癌、菌状(ポリープ状)、潰瘍性、表層拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫を含めた胃癌;大腸癌;直腸癌;��れだけに限らないが、肝細胞癌および肝芽腫を含めた肝癌;それだけに限らないが、腺癌を含めた胆嚢癌;それだけに限らないが、パピラリー(pappillary)、小結節性、およびびまん性を含めた胆管癌;それだけに限らないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌を含めた肺癌;それだけに限らないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的(典型的)、精母細胞、非セミノーム性、胎児性癌、奇形腫癌、絨毛癌(卵黄嚢腫瘍)を含めた精巣癌、それだけに限らないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫を含めた前立腺癌;ペナル(penal)癌;それだけに限らないが、扁平上皮癌を含めた口腔癌;基底癌;それだけに限らないが、腺癌、粘表皮癌、および腺様嚢胞癌を含めた唾液腺癌;それだけに限らないが、扁平上皮癌、および疣状を含めた咽頭癌;それだけに限らないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表層拡大型黒色腫、小結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、肢端黒子型黒色腫を含めた皮膚癌;それだけに限らないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌(腎盂および/またはウテレル(uterer))を含めた腎癌;ウィルムス腫瘍;それだけに限らないが、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫を含めた膀胱癌。さらに、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭様癌および乳頭様腺癌が含まれる(このような障害の総説に関して、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照されたい)。
【０３５０】
したがって、本発明の方法および組成物は、以下のものを含めた(それだけに限らないが)様々な癌または他の異常増殖性疾患の治療または予防にも有用である: 膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、頸部、甲状腺および皮膚の癌を含めた癌;扁平上皮癌を含めて;白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めたリンパ系統の造血系腫瘍;急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含めた骨髄系統の造血系腫瘍; 線維肉腫およびラブドミオスカルコマ(rhabdomyoscarcoma)を含めた間葉系由来の腫瘍;黒色腫、精上皮腫、テトラトカルシノーマ(tetratocarcinoma)、神経芽細胞腫および神経膠腫を含めた他の腫瘍; 星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、およびシュワン腫を含めた中枢および末梢神経系の腫瘍;線維肉腫、ラブドミオスカラマ(rhabdomyoscarama)、および骨肉腫を含めた間葉系由来の腫瘍;ならびに黒色腫、キセノデルマ  ペグメントスム(xenoderma pegmentosum)、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌および奇形癌を含めた他の腫瘍。アポトーシスにおける異常によって生じる癌も、本発明の方法および組成物によって治療されるだろうことも企図されている。そのような癌として、それだけに限らないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を伴う癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性大腸腺腫症、および骨髄異形成症候群などの前癌病変を挙げることができる。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、大腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮における、悪性腫瘍または異常増殖変化(異形成および形成異常など)、または過剰増殖障害は、本発明の方法および組成物によって治療または予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病は、本発明の方法および組成物によって治療または予防される。
【０３５１】
特定の実施形態では、本発明の分子(例えば、変異型Fc領域を含む抗体、または本発明の方法によって工学的に改変された治療モノクローナル抗体)は、原発性腫瘍の増殖または癌細胞の転移を、本発明の前記分子の不在下での原発性腫瘍の増殖または転移と比べて、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%抑制または低減する。
【０３５２】
5.4.1.1  併用療法
本発明はさらに、それだけに限らないが、現在標準的で実験的な化学療法、ホルモン療法、生物療法、免疫療法、放射線療法、または外科手術を含めた、癌の治療または予防について当業者に知られている他の療法と組み合わせて、本発明の分子を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療または予防的有効量の1種または複数の抗癌剤、治療用抗体(例えば、表9に列挙した抗体)、または癌の治療および/または予防について当業者に知られている他の薬剤(節5.4.1.2を参照)と組み合わせて投与することができる。
【０３５３】
ある実施形態では、本発明の1種または複数の分子は、癌の治療に有用な1種または複数の治療剤と同時的に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。「同時的に」という用語は、予防剤または治療剤を正確に同時に投与することに限定されるのではなく、むしろ本発明の分子および他の薬剤を、順にかつ本発明の分子が、他の薬剤とともに作用して、それらが別の方法で投与される場合よりも増大した利点を提供できるような時間間隔内で哺乳動物に投与されることを意味する。例えば、それぞれの予防剤または治療剤(例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物療法)は、同時に、または異なる時点で任意の順序で経時的に投与することができるが、同時に投与されない場合、それらは、所望の治療または予防効果をもたらすように十分に接近した時間に投与されるべきである。それぞれの治療剤は、別々に、任意の適切な形態で、および任意の適当な経路によって投与することができる。様々な実施形態では、予防剤または治療剤は、1時間未満ずらして、約1時間ずらして、約1時間から約2時間ずらして、約2時間から約3時間ずらして、約3時間から約4時間ずらして、約4時間から約5時間ずらして、約5時間から約6時間ずらして、約6時間から約7時間ずらして、約7時間から約8時間ずらして、約8時間から約9時間ずらして、約9時間から約10時間ずらして、約10時間から約11時間ずらして、約11時間から約12時間ずらして、24時間以内ずらして、または48時間以内ずらして投与される。好ましい実施形態では、同じ患者来診において2種以上の成分が投与される。
【０３５４】
他の実施形態では、予防剤または治療剤は、約2から4日ずらして、約4から6日ずらして、約1週間ずらして、約1から2週間ずらして、または2週間を超えてずらして投与される。好ましい実施形態では、予防剤または治療剤は、両方の薬剤が依然として活性である期間中に投与される。当業者は、投与された薬剤の半減期を決定することによって、そのような期間を決定することができるだろう。
【０３５５】
ある実施形態では、本発明の予防剤または治療剤は、対象に周期的に投与される。サイクリング療法は、一時期に第1の薬剤の投与、続いて一時期に第2の薬剤および/または第3の薬剤の投与、およびこの経時的投与を繰り返すことを伴う。サイクリング療法により、1つまたは複数の療法に対する耐性発現を低減し、療法の1つの副作用を回避または低減し、かつ/または治療の効力を改善することができる。
【０３５６】
ある実施形態では、予防剤または治療剤は、約3週間未満のサイクル、2週間毎に約1回、10日毎に約1回または毎週約1回投与される。1つのサイクルは、サイクル毎に約90分、サイクル毎に約1時間、サイクル毎に約45分にわたる注入による、治療剤または予防剤の投与を含むことができる。それぞれのサイクルは、少なくとも1週間の休止、少なくとも2週間の休止、少なくとも3週間の休止を含むことができる。投与されるサイクルの数は、約1から約12サイクル、さらに典型的には約2から約10サイクル、さらに典型的には約2から約8サイクルである。
【０３５７】
さらに他の実施形態では、本発明の治療剤および予防剤は、連続注入または長期の休止期間のない頻回投与のいずれかによって、規則正しい投与計画で投与される。このような規則正しい投与は、休止期間のない一定間隔での投与を含むことができる。典型的には、治療剤、特に細胞傷害剤は、低用量で用いられる。このような投与計画は、長期間の比較的低用量の長期連日投与を包含する。好ましい実施形態では、低用量の使用により、有毒副作用を最小限にし、休止期間を省くことができる。ある実施形態では、治療剤および予防剤は、約24時間から約2日まで、約1週間まで、約2週間まで、約3週間まで、約1ヵ月まで、約2ヵ月まで、約3ヵ月まで、約4ヵ月まで、約5ヵ月まで、約6ヵ月までの範囲の長期低用量または連続注入によって送達される。このような投与計画の計画作成は、熟練した腫瘍医によって最適化することができる。
【０３５８】
他の実施形態では、治療の複数のコースが同時的に哺乳動物に投与され、すなわち個々の用量の治療剤は、別々だが、本発明の分子が、他の薬剤または複数の薬剤とともに作用することができるような時間間隔内で投与される。例えば、1つの成分は、2週間毎に1回または3週間毎に1回投与することのできる他の成分と組み合わせて1週間当たり1回投与することができる。言い換えれば、治療剤の投与計画は、治療剤が同時に投与されなくても同時的に、または同じ患者来診の間に行われる。
【０３５９】
他の予防剤および/または治療剤と組み合わせて用いられる場合、本発明の分子および予防剤および/または治療剤は、相加的にまたはより好ましくは相乗的に作用することができる。一実施形態では、本発明の分子は、同じ医薬組成物中の1種または複数の治療剤と同時的に投与される。別の実施形態では、本発明の分子は、別々の医薬組成物における1種または複数の治療剤と同時的に投与される。さらに別の実施形態では、本発明の分子は、別の予防剤または治療剤の投与の前または後に投与される。本発明は、同じまたは異なる投与経路、例えば経口および非経口によって、他の予防剤または治療剤と組み合わせて本発明の分子を投与することを企図する。ある実施形態では、本発明の分子が、それだけに限らないが、毒性を含めた有害副作用を潜在的に生じる別の予防剤または治療剤と同時的に投与される場合、その予防剤または治療剤は、有害副作用が誘発される閾値より下に当たる用量で有利に投与することができる。
【０３６０】
本明細書で提供される投与量および投与頻度は、治療上有効および予防上有効という用語によって包含される。投与量および頻度はさらに、投与される特定の治療剤または予防剤、癌の重症度および種類、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答および過去の病歴に応じた、それぞれの患者にとって特定の要因によって一般に変動するだろう。適当な投与計画は、そのような要因を考慮することにより、および以下の例えば、文献に報告され、Physician's Desk Reference (56th ed., 2002)に勧告されている投与量により、当業者によって選択することができる。
【０３６１】
5.4.1.2  他の治療剤/予防剤
特定の実施形態では、本発明の方法は、癌の治療および/または予防に用いられる1種または複数の治療剤とともに、1種または複数の本発明の分子を投与することを包含する。一実施形態では、血管新生阻害剤を本発明の分子と組み合わせて投与することができる。本発明の方法および組成物に用いることのできる血管新生阻害剤として、それだけに限らないが、アンジオスタチン(プラスミノーゲン断片);抗血管新生アンチトロンビンIII;アンギオザイム(angiozyme);ABT-627; Bay 12-9566;ベネフィン;ベバシズマブ;BMS-275291;軟骨由来阻害剤(CDI);CAI;CD59補体断片;CEP-7055;Col 3;コンブレタスタチンA-4;エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片);フィブロネクチン断片;Gro-β;ハロフギノン;ヘパリナーゼ;ヘパリンヘキササッカリド断片;HMV833;ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG);IM-862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘導性タンパク質(IP-10);インターロイキン-12;クリングル5(プラスミノーゲン断片);マリマスタット;メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMPs);2-メトキシエストラジオール;MMI 270(CGS 27023A);MoAb IMC-1C11;ネオバスタット;NM-3;パンゼム;PI-88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;血小板因子-4(PF4);プリノマスタット;プロラクチン16kD断片;プロリフェリン関連タンパク質(PRP);PTK 787/ZK 222594;レチノイド;ソリマスタット(solimastat);スクアラミン;SS 3304;SU 5416;SU6668;SU11248;テトラヒドロコルチゾール-S;テトラチオモリブデート;サリドマイド;トロンボスポンジン-1(TSP-1);TNP-470;トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-b);バスクロスタチン(vasculostatin);バソスタチン(カルレティキュリン断片);ZD6126;ZD 6474;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI);およびビスホスホネートが挙げられる。
【０３６２】
本発明の医薬組成物および剤形およびキットを含めた、本発明の様々な実施形態において、本発明の分子と組み合わせて用いることのできる抗癌剤として、それだけに限らないが、アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン(ambomycin);酢酸アメタントロン;アミノグルテチミド;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン(asperlin);アザシチジン;アゼテパ(azetepa);アゾトマイシン(azotomycin);バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;ビスナフィドジメシラート;ビセレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキーナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン(carubicin hydrochloride);カルゼレシン;セデフィンゴール;クロランブシル;シロレマイシン(cirolemycin);シスプラチン;クラドリビン;クリスナトールメシレート;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;デザグアニンメシレート;ジアジクォン;ドセタキセル;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;ズアゾマイシン(duazomycin);エダトレキサート;塩酸エフロールニチン;エルサミトルシン(elsamitrucin);エンロプラチン;エンプロメート(enpromate);エピプロピジン;塩酸エピルビシン;エルブロゾール(erbulozole);塩酸エソルビシン(esorubicin hydrochloride);エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナトリウム;エタニダゾール; エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン(etoprine);塩酸ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン;ホスキドン;ホストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタビン;ヒドロキシ尿素;塩酸イダルビシン;イホスファミド;イルモホシ
ン;インターロイキンII(組換えインターロイキンII、すなわちrIL2を含めて)、インターフェロンα-2a;インターフェロンα-2b;インターフェロンα-n1;インターフェロンα-n3;インターフェロンβ-Ia;インターフェロンγ-Ib;イプロプラチン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩酸リアロゾール; ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;マイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;メトプリン(metoprine);メツレデパ;ミチンドミド;ミトカルシン(mitocarcin);ミトクロミン;マイトジリン(mitogillin);ミトマルシン(mitomalcin);マイトマイシン;ミトスペル(mitosper);ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン(peliomycin);ペンタムスチン(pentamustine);硫酸ペプロマイシン;ペルホスフアミド(perfosfamide);ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン(prednimustine);塩酸プロカルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン;リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルフォセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン;テコガランナトリウム(tecogalan sodium);テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン(trestolone acetate);リン酸トリシリビン;トリメトレキセート;グルクロン酸トリメトレキセート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン(vinepidine sulfate);硫酸ビングリシナート(vinglycinate sulfate); 硫酸ビンロイロシン(vinleurosine sulfate);酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンロシジン(vinrosidine sulfate);硫酸ビンゾリジン(vinzolidine sulfate);ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;塩酸ゾルビシンが挙げられる。
他の抗癌薬として、それだけに限らないが、20-epi-1,25 ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール(adecypenol);アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドクス(amidox);アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラホリド;血管新生阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリクス(antarelix);抗背方化形態形成タンパク質-1;抗アンドロゲン、前立腺癌;抗エストロゲン剤;アンチネオプラストン;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィディコリングリシナート;アポトーシス遺伝子モジュレーター;アポトーシスレギュレーター;アプリン酸;ara-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン(asulacrine);アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン(axinastatin)1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン(azatoxin);アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット;BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体;β-アレチン(alethine);ベタクラマイシン(betaclamycin)B;ベツリン酸;bFGF阻害剤;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテン(bistratene)A;ビセレシン;ブレフラート(breflate);ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシイミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体;カナリア痘IL-2;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRest M3;CARN 700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロルルンス(chlorlns);クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシン(collismycin)A;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クランベスシジン(crambescidin)816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;キュラシンA;シクロペンタントラキノン;シクロプラタム(cycloplatam);シペマイシン(cypemycin);シタラビンオクホスフェート(ocfosfate);細胞溶解因子;サイトスタチン(cytostatin);ダクリキシマブ(dacliximab);デシタビン;デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド(dexifosfamide);デキスラゾキサン;デキスベラパミル(dexverapamil);ジアジクォン;ジデムニンB;ジドックス(didox);ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール,9-;ジオキサマイシン(dioxamycin);ジフェニルスピロムスチン;ドセタキセル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン; エドレコロマブ;エフロールニチン;エレメン;エミテフール;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン(fluasterone);フルダラビン;塩酸フルオロダウノルニシン(fluorodaunorunicin hydrochloride);ホルフェニメクス;フォルメスタン;ホストリエシン;ホテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム(hepsulfam);ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イミダゾアクリドン(imidazoacridone);イミキモド;免疫賦活ペプチド;インスリン様成長因子-1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;イオベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール, 4-;イロプラクト(iroplact);イルソグラジン;イソベンガゾール(isobengazole);イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)B;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリド(kahalalide)F;ラメラリン-Nトリアセテート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトルスタチン(leptolstatin);レトロゾール;白血病抑制因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン;リュープロレリン;レバミソール;リアロゾール;直鎖ポリアミン類似体;親油性ジサッカライドペプチド;親油性白金化合物;リソクリンアミド(lissoclinamide)7;ロバプラチン;ロンブリシン(lombricine);ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロバスタチン;ロキソリビン;ルルトテカン(lurtotecan);ルテチウムテキサフィリン;リソフィリン(lysofylline);溶解ペプチド;マイタンシン;マンノスタチン(mannostatin)A;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;基質メタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン(meterelin);メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害剤;ミフェプリストーン;ミルテホシン;ミリモスチム;ミスマッチ二重鎖RNA;ミトグアゾン;ミトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド(mitonafide);ミトトキシン(mitotoxin)線維芽細胞成長因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン;モノホスホリル脂質A+ミオバクテリウム(myobacterium)細胞壁sk;モピダモール;多剤耐性遺伝子阻害剤;多発性腫瘍サプレッサー1をベースとする療法(multiple tumor suppressor 1-based therapy);マスタード抗癌剤;ミカペルオキシド(mycaperoxide)B;マイコバクテリア(mycobacterial)細胞壁抽出物;ミリアポロン(myriaporone); N-アセチルジナリン;N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチプ(nagrestip);ナロキソン+ペンタゾシン;ナパビン(napavin);ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン(nemorubicin);ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド;ニサマイシン(nisamycin);一酸化窒素モジュレーター;ニトロキシド抗酸化剤;ニトルリン(nitrullyn);O6-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン(okicenone);オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン(oracin);経口サイトカイン誘導因子;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン(oxaunomycin);パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン(palauamine);パルミトイルリゾキシン(palmitoylrhizoxin);パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン(parabactin);パゼリプチン;ペガスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサン多硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール(pentrozole);ペルフルブロン;ペルホスフアミド(perfosfamide);ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;フェニル酢酸塩;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチン(placetin)A;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金-トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;タンパク質Aをベースとする免疫モジュレーター;タンパク質キナーゼC阻害剤;タンパク質キナーゼC阻害剤類、微細藻類;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン(pyrazoloacridine);ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate);rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras-GAP阻害剤;脱メチルレテリプチン;エチドロン酸レニウム Re 186;リゾキシン;リボザイム;RII レチナミド(retinamide);ログレチミド;ロヒツキン(rohitukine);ロムルチド;ロキニメックス(roquinimex);ルビギノン(rubiginone)B1;ルボキシル(ruboxyl);サフィンゴール;サイントピン(saintopin);SarCNU;サルコフィトール(sarcophytol)A;サルグラモスチム;Sdi 1模倣剤;セムスチン;老化由来阻害剤(senescence derived inhibitor)1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達モジュレーター;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ナトリウムボロカプテート(sodium borocaptate);フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール(solverol);ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン(sonermin);スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン(splenopentin);スポンジスタチン(spongistatin)1;スクアラミン;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド(stipiamide);ストロメライシン阻害剤;スルフィノシン(sulfinosine);超活性型(superactive)血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ(suradista);スラミン;スウェインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム(tecogalan sodium);テガフール;テルラピリリウム(tellurapyrylium);テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン(tetrazomine);タリブラスチン(thaliblastine);チオコラリン(thiocoraline);トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣剤;チマルファシン;サイモポエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン(tin ethyl etiopurpurin);チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン(topsentin);トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チロホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリン(variolin)B;ベクター系、赤血球遺伝子療法;ベラレソール;ベラミン(veramine);ベルジン(verdin);ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン(vinxaltine);バイタクシン(vitaxin);ボロゾール;ザノテロン(zanoterone);ゼニプラチン;ジラスコルブ;およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましいさらなる抗癌薬は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０３６３】
本発明の方法に用いることのできる治療用抗体の例として、それだけに限らないが、免疫抑制剤、急性の腎臓同種移植拒絶反応を予防するためのヒト化抗CD25モノクローナル抗体である、ZENAPAX(登録商標)(ダクリズマブ)(Roche Pharmaceuticals、スイス);マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体である、PANOREX(商標)(Glaxo Wellcome/Centocor); マウス抗イディオタイプ(GD3エピトープ)IgG抗体である、BEC2(ImClone System);キメラ抗EGFR IgG 抗体である、IMC-C225(ImClone System);ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN(商標)(Applied Molecular Evolution/MedImmune);ヒト化抗CD33 IgG抗体である、Smart M195(Protein Design Lab/Kanebo);ヒト化抗CD22 IgG抗体である、LYMPHOCIDE(商標)(Immunomedics);ヒト化抗ICAM3抗体である、ICM3(ICOS Pharm);霊長類化抗CD80抗体である、IDEC-114(IDEC Pharm/Mitsubishi);ヒト化抗CD40L抗体である、IDEC-131(IDEC/Eisai);霊長類化抗CD4抗体である、IDEC-151(IDEC);霊長類化抗CD23抗体である、IDEC-152(IDEC/Seikagaku);ヒト化抗CD3 IgGである、SMART抗CD3(Protein Design Lab);ヒト化抗補体因子5(C5)抗体である、5G1.1(Alexion Pharm);ヒト化抗TNF-α抗体である、D2E7(CAT/BASF);ヒト化抗TNF-αFab断片である、CDP870(Celltech);霊長類化抗CD4 IgG1抗体である、IDEC-151(IDEC Pharm/SmithKline Beecham);ヒト抗CD4 IgG抗体であるMDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab);ヒト化抗TNF-α IgG4抗体である、CDP571(Celltech);ヒト化抗α4β7抗体である、LDP-02(LeukoSite/Genentech);ヒト化抗CD4 IgG抗体である、オルソクローンOKT4A(Ortho Biotech);ヒト化抗CD40L IgG抗体である、ANTOVA(商標) (Biogen); ヒト化抗VLA-4 IgG抗体である、ANTEGREN(商標)(Elan);およびヒト抗TGF-β2抗体である、CAT-152(Cambridge Ab Tech)が挙げられる。本発明によって用いることのできる治療用抗体の他の例は、表9に示されている。
【０３６４】
5.4.2  自己免疫疾患および炎症性疾患
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域中に1つまたは複数のアミノ酸改変を有し、この改変により、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性が増加するが、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性が減少する、変異型Fc領域を含む。このような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答を制御することにおいて、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する免疫応答を抑制することにおいて有用である。任意の作用機序によって制約されることを意図していないが、FcγRIIBに対する増強された親和性ならびにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する低減された親和性を有する本発明の分子は、FcγRへの活性化応答の減衰および細胞応答性の抑制をもたらすことができる。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、免疫グロブリンではなく、少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その改変により、野生型Fc領域を含む分子と比べてFcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性が増大する。他の実施形態では、前記分子は、1つまたは複数のアミノ酸改変をさらに含み、その改変により、活性化FcγRに対する分子の親和性が減少する。いくつかの実施形態では、分子は、可溶性(すなわち、膜結合ではない)Fc領域である。本発明は、本明細書に記載された、当業者に知られているものを含めた様々なFc受容体に対するその親和性を調節する、可溶性Fc領域内の他のアミノ酸改変を企図する。他の実施形態では、分子(例えば、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸改変を含むFc領域)は、当業者に知られており、本明細書に説明された技法を用いて改変されることによって、Fc領域のin vivo半減期を増大させる。このような分子は、自己免疫障害を治療および/または予防することにおいて治療有用性を有する。任意の作用機序によって制約されることを意図していないが、FcγRIIBに対する増強された親和性を有するこのような分子は、活性化受容体の減衰およびしたがって免疫応答の減衰をもたらし、自己免疫障害を治療および/または予防することに対して治療効力を有するだろう。
【０３６６】
ある実施形態では、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる、1つまたは複数のアミノ酸改変は、246位でのスレオニンおよび396位でのヒスチジンによる置換;または268位でのアスパラギン酸および318位でのアスパラギン酸による置換;または217位でのセリン、378位でのバリン、および408位でのアルギニンによる置換;または375位でのシステインおよび396位でのロイシンによる置換;または246位でのイソルクシン(isolcucine)および334位でのアスパラギンによる置換を含む。一実施形態では、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる、1つまたは複数のアミノ酸改変は、247位でのロイシンによる置換を含む。別の実施形態では、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる、1つまたは複数のアミノ酸改変は、372位でのチロシンによる置換を含む。さらに別の実施形態では、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる、1つまたは複数のアミノ酸改変は、326位でのグルタミン酸による置換を含む。一実施形態では、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を増大させるが、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる、1つまたは複数のアミノ酸改変は、224位でのロイシンによる置換を含む。
【０３６７】
野性型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する増強された親和性ならびにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する低減された親和性を有する変異型Fc領域は、自己免疫疾患または炎症性疾患を治療または予防するために用いることができる。本発明は、対象における自己免疫障害または炎症性障害に関係する1つまたは複数の症状を予防、治療または管理する方法であって、前記対象に、治療上または予防上有効量の、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する増強された親和性ならびにFcγRIIIAおよびまたはFcγRIIAに対する低減された親和性を有する変異型Fc領域を有する、1種または複数の本発明の分子を投与することを含む方法を提供する。
【０３６８】
本発明は、対象における炎症性障害に関係する1つまたは複数の症状を予防、治療または管理する方法であって、前記対象に、治療上または予防上有効量の1種または複数の抗炎症剤を投与することをさらに含む方法も提供する。本発明はまた、自己免疫疾患に関係する1つまたは複数の症状を予防、治療または管理する方法であって、前記対象に、治療上または予防上有効量の1種または複数の免疫調節剤を投与することをさらに含む方法を提供する。節5.4.2.1は、抗炎症剤および免疫調節剤の限定されない例を提供する。
【０３６９】
本発明の分子を投与することによって治療することのできる自己免疫障害の例として、それだけに限定されないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー-皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病(ITP)、IgAニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、ループスエルテマトースス(lupus erthematosus)、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、1型または免疫介在性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、ポリクロンドリチス(polychrondritis)、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、一過性アルテリスチス(arteristis)/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎(dermatitis herpetiformis vasculitis)などの脈管炎、白斑症、およびウェジナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性障害の例として、それだけに限らないが、喘息、エンセフィリチス(encephilitis)、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染または慢性バクテリア感染から生じる慢性炎症が挙げられる。本明細書の節2.2.2で述べたように、いくつかの自己免疫障害は、炎症状態に関係する。したがって、自己免疫障害と考えられているものと炎症性障害と考えられているものの間に共通部分が存在する。したがって、いくつかの自己免疫障害は、炎症性障害としても特徴付けることができる。本発明の方法によって、予防、治療または管理することのできる炎症性障害の例は、それだけに限らないが、喘息、エンセフィリチス、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染または慢性バクテリア感染から生じる慢性炎症が挙げられる。
【０３７０】
野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する増強された親和性およびFcγRIIIAに対する低減された親和性を有する変異型Fc領域を有する本発明の分子は、炎症性障害を有する動物、特に哺乳動物が受ける炎症を低減するために用いることもできる。特定の実施形態では、本発明の分子は、動物における炎症を、前記分子を投与されない動物における炎症と比べて、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%低減する。
【０３７１】
野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する増強された親和性およびFcγRIIIAに対する低減された親和性を有する変異型Fc領域を有する本発明の分子は、移植片の拒絶反応を予防するために用いることもできる。
【０３７２】
本発明はさらに、抗体が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIBに対する増強された親和性およびFcγRIIIAに対する低減された親和性を有すると、本発明の方法によって同定された、1つまたは複数のアミノ酸改変を含む変異型Fc領域を含むように、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療および/または予防のために、当技術分野で知られている任意の抗体を工学的に改変することを企図する。本発明によって工学的に改変することのできる、炎症性障害の治療または予防に用いられる抗体の、限定されない例を表10Aに示し、自己免疫障害の治療または予防に用いられる抗体の、限定されない例を表10Bに示す。
【表１０Ａ】
2009507470.tif 000041
2009507470.tif 000042
【０３７３】
【表１０Ｂ】
2009507470.tif 000043
2009507470.tif 000044
【０３７４】
5.4.2.1  免疫調節剤および抗炎症剤
本発明は、FcγRIIBに対する増強された親和性ならびにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する低減された親和性を有する変異型Fc領域を有する分子を他の治療剤とともに投与することを含む、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節剤の例として、それだけに限らないが、メトトレキセート、ENBREL、REMICADE(商標)、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド系抗生物質(例えば、FK506 (タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、コルチコステロイド、ステリオド(steriod)、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン (シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)、ブレキナル、マロノニトリロアミンド(malononitriloaminde)(例えば、レフルナミド(leflunamide))、T細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターが挙げられる。
【０３７５】
抗炎症剤は、炎症性障害および自己免疫障害の治療において成功を示してきており、現在ではこのような障害に対する一般的で標準的な治療である。当業者に周知の任意の抗炎症剤は、本発明の方法に用いることができる。抗炎症剤の限定されない例として、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、ステロイド性抗炎症薬、β-アゴニスト、抗コリン剤、およびメチルキサンチンが挙げられる。NSAIDの例として、それだけに限らないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ(CELEBREX(商標))、ジクロフェナク(VOLTAREN(商標))、エトドラク(LODINE(商標))、フェノプロフェン(NALFON(商標))、インドメタシン(INDOCIN(商標))、ケトロラック(TORADOL(商標))、オキサプロジン(DAYPRO(商標))、ナブメントン(nabumentone)(RELAFEN(商標))、スリンダク(CLINORIL(商標))、トルメチン(TOLECTIN(商標))、ロフェコキシブ(VIOXX(商標))、ナプロキセン(ALEVE(商標)、NAPROSYN(商標))、ケトプロフェン(ACTRON(商標))およびナブメトン(RELAFEN(商標))が挙げられる。このようなNSAIDは、シクロオキシゲナーゼ酵素(例えば、COX-1および/またはCOX-2)を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症薬の例として、それだけに限らないが、糖質コルチコイド、デキサメタゾン(DECADRON(商標))、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン(DELTASONE(商標))、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン(azulfidine)、およびプロスタグランジンなどのエイコサノイド、トロンボキサン、およびロイコトリエンが挙げられる。
【０３７６】
5.4.3  感染性疾患
本発明は、治療上または予防上有効量の1種または複数の本発明の分子を投与することを含む、対象における感染性疾患を治療または予防する方法を包含する。本発明の分子によって治療または予防することのできる感染性疾患は、それだけに限らないが、ウイルス、バクテリア、菌類、プロトザエ(protozae)、およびウイルスを含めた病原体に起因する。
【０３７７】
本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防することのできるウイルス性疾患として、それだけに限らないが、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスI型 (HSV-I)、単純ヘルペスII型(HSV-II)、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、フンタウイルス(huntavirus)、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタイン-バーウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスI型(HIV-I)、ヒト免疫不全症ウイルスII型(HIV-II)、およびウイルスミニンギチス(viral miningitis)、脳炎、デング熱または天然痘などのウイルス性疾患の因子に起因するものが挙げられる。
【０３７８】
バクテリアに起因する、本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防することのできるバクテリア性疾患として、それだけに限らないが、ミコバクテリアリケッチア(mycobacteria rickettsia)、マイコプラズマ、ナイセリア、S.肺炎、ライム病菌(Borrelia burgdorferi)(ライム病)、バシラスアントラシス(Bacillus antracis) (炭疽病)、破傷風、連鎖球菌、ブドウ球菌、ミコバクテリウム、破傷風、ペルチスス(pertissus)、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、黄色ブドウ球菌(S. aureus)およびレジオネラが挙げられる。
【０３７９】
原虫に起因する、本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防することのできる原虫疾患として、それだけに限らないが、リーシュマニア(leishmania)、コクジジオア(kokzidioa)、トリパノソーマ(trypanosoma)またはマラリアが挙げられる。
【０３８０】
寄生虫に起因する、本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防することのできる寄生虫疾患として、それだけに限らないが、クラミジアおよびリケッチアが挙げられる。
【０３８１】
本発明の一態様によれば、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、病原体、例えば、病原性タンパク質に対して増強された抗体エフェクター機能を有する。病原体の例として、それだけに限らないが、バクテリア(例えば、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、エンテロコッカスファエシアルス(Enterococcus faecials)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、プロテウス-ブルガリス(Proteus vulgaris)、スタフィロコッカス-ビリダンス(Staphylococcus viridans)、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa))、病原体(例えば、B-リンパ球向性パポーバウイルス(LPV);百日咳菌(Bordatella pertussis);ボルナ病ウイルス(BDV);ウシコロナウイルス;脈絡髄膜炎ウイルス;デング熱ウイルス(Dengue virus);ウイルス、大腸菌(E. coli);エボラ(Ebola);エコーウイルス1;エコーウイルス-11(EV);エンドトキシン(LPS);腸内細菌;エンテリックオーファンウイルス(Enteric Orphan virus);エンテロウイルス;ネコ白血病ウイルス;口蹄疫ウイルス;ギボンサル白血病ウイルス(GALV);グラム陰性菌;ピロリ菌(Heliobacter pylori);肝炎Bウイルス(HBV);単純ヘルペスウイルス;HIV-1;ヒトサイトメガロウイルス;ヒトコロノウイルス(coronovirus); インフルエンザA、B&C;レジオネラ;メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana);リステリア菌(Listeria monocytogenes);麻疹ウイルス(measles virus);髄膜炎菌(meningococcus);麻疹ウイルス(morbillivirus);マウス肝炎ウイルス;マウス白血病ウイルス;マウスガンマヘルペスウイルス;マウスレトロウイルス;マウスコロナウイルスマウス肝炎ウイルス;マイコバクテリウムアビウム-M(Mycobacterium avium-M);淋菌(Neisseria gonorrhoeae);ニューカッスル病ウイルス;パルボウイルスB19;熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum);ポックスウイルス;シュードモナス(Pseudomonas);ロタウイルス;サモネラチフィウリウム(Samonella typhiurium);赤痢菌(Shigella);連鎖球菌(Streptococci);T細胞リンパ球向性ウイルス 1;ワクチニアウイルス)が挙げられる。
【０３８２】
特定の実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患を生じさせる病原体の食作用および/またはオプソニン作用を増強することによって、感染性疾患の治療効力を増強する。別の特定の実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患を生じさせる感染細胞のADCCを増強することによって、感染性疾患の治療効力を増強する。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患の治療および/または予防のために、治療上または予防上有効量の当業者に知られている1つまたはさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。本発明は、感染性疾患の治療およびまたは予防のために、当業者に知られている抗生物質と組み合わせた、本発明の分子の使用を企図する。本発明の分子と組み合わせて用いることのできる抗生物質として、それだけに限らないが、マクロライド(例えば、トブラマイシン(Tobi(登録商標)))、セファロスポリン(例えば、セファレキシン(Keflex(登録商標))、セフラジン(Velosef(登録商標))、セフロキシム(Ceftin(登録商標))、セフプロジル(Cefzil(登録商標))、セファクロル(Ceclor(登録商標))、セフィキシム(Suprax(登録商標))またはセファドロキシル(Duricef(登録商標)))、クラリスロマイシン(例えば、クラリスロマイシン(Biaxin(登録商標)))、エリスロマイシン (例えば、エリスロマイシン(EMycin(登録商標)))、ペニシリン(例えば、ペニシリンV(V-Cillin K(登録商標)またはPen Vee K(登録商標)))またはキノロン(例えば、オフロキサシン(Floxin(登録商標))、シプロフロキサシン(Cipro(登録商標))またはノルフロキサシン(Noroxin(登録商標)))、アミノグリコシド系抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン(bambermycin)、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸塩、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン)、アンフェニコール(amphenicol)抗生物質(例えば、アジダムフェニコール(azidamfenicol)、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えば、リファミド(rifamide)およびリファンピン)、カルバセフェム(例えば、ロラカルベフ)、カルバペネム(例えば、ビアペネムおよびイミペネム)、セファロスポリン(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン(cefazedone)、セフォゾプラン、
セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム)、セファマイシン(例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム(tigemonam))、オキサセフェム(例えば、フロモキセフ、およびモキサラクタム)、ペニシリン(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン(fenbenicillin)、フロキサシリン、ペナムクシリン(penamccillin)、ペネタメートヨウ化水素酸塩(penethamate hydriodide)、ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリン0、ペニシリンV、ペニシリンV ベンザチン、ペニシリンV ヒドラバミン、ペニメピサイクリン(penimepicycline)、およびフェンシヒシリンカリウム(phencihicillin potassium))、リンコサミド(例えば、クリンダマイシン、およびリンコマイシン)、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン(enduracidin)、エンビオマイシン、テトラサイクリン(例えば、アピサイクリン(apicycline)、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン(clomocycline)、およびデメクロサイクリン)、2,4-ジアミノピリミジン(例えば、ブロジモプリム)、ニトロフラン(例えば、フラルタドン、および塩化フラゾリウム)、キノロンおよびその類似体(例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパグロキサシン(grepagloxacin))、スルホンアミド(例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド(noprylsulfamide)、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン、およびスルファシチン(sulfacytine))、スルホン(例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン)、サイクロセリン、ムピロシンおよびツベリンが挙げられる。
【０３８４】
ある実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効量の、1種または複数の抗真菌剤と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることのできる抗真菌剤として、それだけに限らないが、アムホテリシンB、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラテカル(intrathecal)、フルシトシン、ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ナイスタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロピロックス、エコナゾール、ハロプログリン(haloprogrin)、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレン酸塩、およびグリセオフルジン(griseofuldin)が挙げられる。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効量の1種または複数の抗ウイルス剤と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることのできる有用な抗ウイルス剤として、それだけに限らないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシド類似体が挙げられる。抗ウイルス剤の例として、それだけに限らないが、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル(gangcyclovir)、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン、ならびにフォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α-インターフェロン;アデフォビル、クレバジン(clevadine)、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
【０３８６】
5.5  ワクチン療法
本発明はさらに、それだけに限らないが、癌抗原および感染性疾患抗原(この例は以下に開示される)を含めた抗原剤または免疫原剤に対する免疫応答を誘発するために、本発明の組成物を用いることを包含する。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれる1種または複数の抗原剤または免疫原剤を含み、この1種または複数の抗原剤または免疫原剤は、FcγRIIIAに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体で被覆されている。特定の作用機序によって制約されることを意図していないが、抗原剤または免疫原剤を、FcγRIIIAに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体で被覆することにより、体液応答および細胞媒介応答を誘発することによって、所望の抗原剤または免疫原剤に対する免疫応答が増強される。本発明のワクチン組成物は、免疫応答、好ましくは抗原剤または免疫原剤に対する防御免疫応答を誘発することにおいて特に有効である。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物中の抗原剤または免疫原剤は、免疫応答が望まれるウイルスを含む。このウイルスは、組換え型またはキメラとすることができ、弱毒化されていることが好ましい。組換え、キメラ、および弱毒性ウイルスの生成は、当業者に知られている標準的な方法を用いて行うことができる。本発明は、本発明によって製剤される、組換えウイルス生ワクチンまたは組換えウイルス不活化ワクチンを包含する。宿主における増殖は、自然感染で起こるものと同じ種類および規模の持続した刺激をもたらし、したがって実質的な長期免疫を付与するので、生ワクチンが好ましい場合がある。このような組換えウイルス生ワクチン製剤の生成は、ニワトリ胚の細胞培養物または尿膜におけるウイルスの繁殖とそれに続く精製を伴う従来の方法を用いて達成することができる。
【０３８８】
特定の実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される対象に対して非病原性である。この関連で、ワクチン目的のために遺伝子的に工学的に改変されたウイルスの使用は、これらの系統における弱毒性の存在を必要とする場合がある。トランスフェクションに用いられるテンプレートへの適切な突然変異(例えば、欠失)の導入は、弱毒性を有する新規なウイルスを提供することができる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関係する特定のミスセンス突然変異は、欠失突然変異にすることができる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性の突然変異体に関係する点突然変異よりも安定であるはずであり、復帰突然変異の頻度は、極端に低いはずである。組換えウイルスを工学的に改変するための組換えDNA技術は、当技術分野で知られており、本発明に包含される。例えば、マイナス鎖RNAウイルスを改変する技法は、当技術分野で知られており、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,166,057号を参照されたい。
【０３８９】
あるいは、本発明の皮内ワクチン製剤において用いるために、「自殺」性を有するキメラウイルスを構築してもよい。このようなウイルスは、宿主内で1回または数回の複製を行うのみだろう。ワクチンとして用いられる場合、この組換えウイルスは、限定された複製サイクル(複数も)を行い、十分なレベルの免疫応答を誘発するが、ヒト宿主においてはさらに進まず、疾患を引き起こさないだろう。あるいは、不活化(死滅)ウイルスを、本発明によって製剤することができる。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」ための従来の技法を用いて調製することができる。不活化ワクチンは、その感染力が破壊されているという意味で「死んで」いる。理想的には、ウイルスの感染力は、その免疫原性に影響することなく破壊される。不活化ワクチンを調製するために、キメラウイルスをニワトリ胚の細胞培養物または尿膜において増殖させ、ゾーン超遠心分離によって精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンによって不活化し、プールすることができる。
【０３９０】
ある実施形態では、他のウイルス性または非ウイルス性病原体に由来する抗原を含めて、完全に外来性のエピトープは、本発明の皮内ワクチン製剤において用いるためのウイルスに工学的に改変することができる。例えば、HIV(gp160、gp120、gp41)寄生虫抗原(例えば、マラリア)、細菌抗原または真菌抗原、あるいは腫瘍抗原などの非関連ウイルスの抗原は、弱毒系統に工学的に改変することができる。
【０３９１】
実質的に、任意の異種遺伝子配列は、皮内ワクチン製剤において用いるための、本発明のキメラウイルスを構築することができる。好ましくは、異種遺伝子配列は、生物学的応答修飾因子として作用する部分およびペプチドである。好ましくは、任意の様々な病原体、または中和抗体に結合する抗原に対して防御免疫応答を誘発するエピトープは、キメラウイルスによって、またはキメラウイルスの一部として発現することができる。例えば、本発明のキメラウイルスに構築され得る異種遺伝子配列として、それだけに限らないが、インフルエンザならびにパラインフルエンザ赤血球凝集素ノイラミニダーゼならびにヒトPIV3のHN遺伝子およびF遺伝子などの融合糖タンパク質が挙げられる。さらに別の実施形態では、キメラウイルスに工学的に改変することのできる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例として、それだけに限らないが、サイトカイン、インターフェロンタイプ1、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12およびこれらの因子のアンタゴニストが挙げられる。
【０３９２】
さらに他の実施形態では、本発明は、その表面で変異抗体を発現する、病原体細胞またはウイルス、好ましくは弱毒性ウイルスを包含する。
【０３９３】
代替の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原剤または免疫原剤が、FcγRIIIAに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体に作動可能に連結している、融合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物において用いるための融合ポリペプチドの工学的改変は、通常の組換えDNA技術方法を用いて行われ、一般の技術レベル内である。
【０３９４】
本発明はさらに、本発明の組成物を投与することによって、対象における寛容性を誘発する方法を包含する。好ましくは、対象における寛容性を誘発するのに適した組成物は、本発明の変異抗体で被覆された抗原剤または免疫原剤を含み、この変異抗体は、FcγRIIBに対するより高い親和性を有する。特定の作用機序によって制約されることを意図していないが、このような組成物は、FcγRIIB媒介阻害経路を活性化することによって寛容性を誘発することにおいて有効である。
【０３９５】
5.6  組成物および投与方法
本発明は、変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、抗体、ポリペプチド)を含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、有効量の本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート分子、あるいは本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を対象へ投与することによって、疾患、障害または感染に関係する1つまたは複数の症状を治療、予防、および回復する方法を提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている(すなわち、その効果を制限するか、または望まれない副作用を生じる物質が、実質的に存在しない)。特定の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、非霊長類(例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)および霊長類(例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト)などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、対象と同じ種に由来する。
【０３９６】
様々な送達系、例えばリポソームでの被包物、微小粒子、マイクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現することのできる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照)、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸構築物などが知られており、変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、抗体、ポリペプチド)を含む組成物を投与するために用いることができる。本発明の分子を投与する方法として、それだけに限らないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外、および粘膜(例えば、鼻腔内および経口経路)が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の分子は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される。この組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入または大量注射によって、上皮または粘膜皮膚の内層(例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など)を通じた吸収によって投与することができ、他の生物活性剤とともに投与してもよい。投与は、全身的または局所的とすることができる。さらに、経肺投与も、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤(aerosolizing agent)を含む製剤によって用いることができる。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第6,019,968号;第5,985,320号;第5,985,309号;第5,934,272号;第5,874,064号;第5,855,913号;第5,290,540号;および第4,880,078号;ならびにPCT国際公開第92/19244号;第97/32572号;第97/44013号;第98/31346号;および第99/66903号を参照されたい。
【０３９７】
本発明は、変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、抗体、ポリペプチド)が、抗体の量を表示しているアンプルまたは小袋(sachette)などの密封容器中に梱包されていることも提供する。一実施形態では、本発明の分子は、密封容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、例えば水または生理食塩水を用いて、対象への投与に適切な濃度に戻すことができる。好ましくは、本発明の分子は、少なくとも5mg、より好ましくは、少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、または少なくとも75mgの単位用量で、密封容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。本発明の凍結乾燥された分子は、その当初の容器中で2と8℃の間で貯蔵されるべきであり、この分子は、元に戻された後、12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与されるべきである。代替の実施形態では、本発明の分子は、分子、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の量および濃度を表示している密封容器中の液体形態で供給される。好ましくは、液体形態の本発明の分子は、少なくとも1mg/ml、より好ましくは、少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも150mg/ml、少なくとも200mg/mlの分子の、密封容器で供給される。
【０３９８】
障害に関係する1つまたは複数の症状の治療、予防または回復に有効となる、本発明の組成物の量は、標準的な臨床技法によって決定することができる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、および状態の重症度にも依存することになり、開業医の判断およびそれぞれの患者の状況によって決定されるべきである。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から導かれた用量-応答曲線から推定してもよい。
【０３９９】
本発明によって包含される抗体について、患者に投与される用量は、典型的には、患者の体重1kg当たり0.0001mgから100mgである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重1kg当たり、0.0001mgと20mg、0.0001mgと10mg、0.0001mgと5mg、0.0001と2mg、0.0001と1mg、0.0001mgと0.75mg、0.0001mgと0.5mg、0.0001mgから0.25mg、0.0001から0.15mg、0.0001から0.10mg、0.001から0.5mg、0.01から0.25mgまたは0.01から0.10mgの間である。一般に、ヒト抗体は、外来性ポリペプチドに対する免疫応答のために、他の種由来の抗体よりもヒトの体内において長い半減期を有する。したがって、より少ない容量のヒト抗体およびより少ない頻度の投与が、多くの場合可能である。さらに、本発明の抗体またはその断片の投与の用量および頻度は、例えば、脂質化などの修飾により、抗体の取込みおよび組織透過性を増強することによって低減することができる。
【０４００】
一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の用量は、単剤療法として用いられる場合、0.01mgから1000mg/日である。別の実施形態では、本発明の分子は、他の治療組成物と組み合わせて用いられ、患者に投与される用量は、前記分子が単剤療法として用いられる場合よりも低い。
【０４０１】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療の必要のある範囲に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、例えば、限定の目的ではなく、局所注入によって、注射によって、またはインプラントの手段によって達成することができ、前記インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜などの膜、または繊維を含めた、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料である。好ましくは、本発明の分子を投与する場合、分子が吸収しない材料を用いることに注意しなければならない。
【０４０２】
別の実施形態では、組成物は、小胞で、特にリポソームで送達することができる(Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照されたい;一般に同書を参照されたい)。
【０４０３】
さらに別の実施形態では、組成物は、制御放出系または徐放系で送達することができる。1種または複数の本発明の分子を含む徐放製剤を生産するために、当業者に知られている任意の技法を用いることができる。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,526,938号;PCT国際公開第91/05548;PCT国際公開第96/20698; Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189、Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;およびLam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。一実施形態では、制御放出系においてポンプを用いることができる(Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; and Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:5
74を参照)。別の実施形態では、抗体の制御放出を達成するために、ポリマー材料を用いることができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61;を参照。また、Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号; PCT国際公開第99/15154号;およびPCT国際公開第99/20253号を参照)。徐放製剤において用いられるポリマーの例として、それだけに限らないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(polyglycolide)(PLG)、ポリアンヒドリド(polyanhydride)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的(例えば、肺)の近くに配置することができ、したがって全身的用量の何分の1かが必要であるにすぎない(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照)。別の実施形態では、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunnら(米国5,945,155を参照)に従って用いられる。この特別な方法は、ポリマー系からの生理活性物質のin situ制御放出の治療効果に基づいている。植込みは、一般に、治療処置の必要な患者の身体のどこにでも行うことができる。別の実施形態では、非ポリマー持続性送達系が用いられ、それによって、対象の身体における非ポリマーインプラントが、薬物送達系として用いられる。身体に植え込むと、インプラントの有機溶媒が、組成物から周囲の組織液に散逸、分散、または浸出し、非ポリマー材料は、徐々に凝固または凝結して固体の微孔質の基質を形成するだろう(米国5,888,533参照)。
【０４０４】
制御放出系は、Langer (1990, Science 249:1527-1533)による総説において考察されている。1種または複数の本発明の治療剤を含む徐放製剤を生産するために、当業者に知られている任意の技法を用いることができる。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,526,938号;国際公開第91/05548号および第96/20698号; Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al., 1997,  Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。
【０４０５】
本発明の組成物が抗体をコードする核酸である、特定の実施形態では、核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用(米国特許第4,980,286号を参照)により、あるいは直接注射により、あるいは微粒子照射(例えば、遺伝子銃;Biolistic, Dupont)の使用、または脂質、もしくは細胞表面受容体、もしくはトランスフェクト剤での被覆により、あるいは核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて核酸を投与すること(例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照)などにより、その核酸が細胞内になるように投与することによって、そのコードされる抗体の発現を促進するためにin vivoで投与することができる。あるいは、核酸は、相同組換えによって細胞内に導入し、発現のために宿主細胞DNA内に取り込ませることができる。
【０４０６】
抗体について、対象に投与される治療上または予防上有効用量は、典型的には、対象の体重1kg当たり0.1mgから200mgである。好ましくは、対象に投与される用量は、対象の体重1kg当たり0.1mgと20mgの間であり、より好ましくは、対象に投与される用量は、対象の体重1kg当たり1mgから10mgの間である。本発明の抗体の投与量および投与の頻度は、例えば、脂質化などの修飾により、抗体または融合タンパク質の取込みおよび組織透過性(例えば、肺中への)を増強することによって低減することができる。
【０４０７】
治療上または予防上有効量の本発明の分子での対象の治療は、単一治療を含むことができ、または好ましくは、一連の治療を含むことができる。好ましい例では、対象は、約1から10週間、好ましくは2から8週間、より好ましくは約3から7週間、およびさらにより好ましくは約4、5、または6週間、1週間当たり1回、体重1kg当たり約0.1から30mgの間の範囲の本発明の分子で治療される。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、1日1回、1日2回、または1日3回投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、1週間に1回、1週間に2回、2週間毎に1回、1ヵ月1回、6週間毎に1回、2ヵ月毎に1回、1年に2回または1年当たり1回投与される。治療に用いられる分子の有効用量は、特定の治療の間に増減できることも理解されよう。
【０４０８】
5.6.1  医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原体薬剤組成物(例えば、不純または非滅菌組成物)および単位剤形の調製に用いることのできる医薬組成物(すなわち、対象または患者への投与に適した組成物)を含む。このような組成物は、予防または治療上有効量の本明細書に開示した予防剤および/または治療剤あるいはこれらの薬剤の組合せ、ならびに薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防または治療上有効量の1種または複数の本発明の分子および薬学的に許容される担体を含む。
【０４０９】
特定の一実施形態では、医薬組成物は、治療上有効量の、変異型Fc領域を含む1種または複数の本発明の分子であって、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合するよりも、高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合し、かつ/または前記変異型Fc領域は野生型Fc領域を含む比較可能な分子よりも、少なくとも2倍有効にエフェクター機能を媒介する分子、および薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、治療上有効量の、変異型Fc領域を含む1種または複数の本発明の分子であって、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも、高い親和性でFcγRIIIAに結合し、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIBに結合するよりも、低い親和性でFcγRIIBに結合し、かつ/または前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子よりも、少なくとも2倍有効にエフェクター機能を媒介する分子、および薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態では、前記医薬組成物は、1種または複数の抗癌剤をさらに含む。
【０４１０】
本発明は、本発明によって決定された、Fc領域における1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、特定の癌抗原に特異的な治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体)、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を包含する。
【０４１１】
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物における、より具体的にはヒトにおける使用のために、連邦政府または州政府の管理機関によって認可された、または米国薬局方もしくは他の一般に認知された薬局方に列挙されたことを意味する。「担体」という用語は、それとともに治療剤が投与される、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全および不完全)、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水、およびラッカセイ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、野菜または合成由来の油を含めた油などの滅菌液体とすることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、特に注射用溶液に対して液体担体として用いることができる。適当な医薬賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じて、組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態をとることができる。
【０４１２】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば、活性剤の量を表示しているアンプルまたは小袋などの密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位剤形で別々に、または一緒に混合して供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬品グレード水または生理食塩水を含有する注入ビンで分配することができる。組成物が、注射によって投与される場合、成分を投与前に混合できるように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０４１３】
本発明の組成物は、中性形態または塩形態で製剤することができる。薬学的に許容される塩には、それだけに限らないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンで形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンで形成された塩が含まれる。
【０４１４】
5.6.2  遺伝子治療
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療によって、疾患、障害または感染に関係する1つまたは複数の症状を治療、予防または回復するために投与される。遺伝子治療は、対象への発現した核酸または発現できる核酸の投与によって行われる療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療または予防効果を媒介する、そのコードされた抗体または融合タンパク質を産生する。
【０４１５】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法を、本発明によって用いることができる。例示的な方法を以下に述べる。
【０４１６】
遺伝子治療方法の一般的な総説については、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993);およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。用いることのできる、組換えDNA技術の分野で一般に知られている方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０４１７】
好ましい態様では、本発明の組成物は、抗体をコードする核酸を含み、前記核酸は、適当な宿主において抗体を発現する、発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性または構成性、および必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態では、抗体のコード配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接している核酸分子が用いられ、したがって抗体コード核酸の染色体内発現を提供する(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
【０４１８】
別の好ましい態様では、本発明の組成物は、融合タンパク質をコードする核酸を含み、前記核酸は、適当な宿主において融合タンパク質を発現する、発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域に作動可能に連結したプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性または構成性、および必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接している核酸分子が用いられ、したがって融合タンパク質の染色体内発現を提供する。
【０４１９】
対象への核酸の送達は、直接的(この場合、対象は、核酸または核酸保有ベクターに直接曝される)か、または間接的(この場合、細胞は最初にin vitroで核酸で形質転換され、次いで対象に移植される)のいずれであってもよい。これらの2つの手法は、それぞれin vivoまたはex vivo遺伝子治療として知られている。
【０４２０】
特定の実施形態では、核酸配列は、in vivoで直接投与され、それが発現されることによってコードされた産物を産生する。これは、当技術分野で知られた任意の多数の方法によって、例えば、核酸配列を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、欠陥もしくは弱毒レトロウイルスベクターもしくは他のウイルスベクターを用いる感染(米国特許第4,980,286号)により、あるいは裸DNAの直接注射により、あるいは微粒子照射(例えば、遺伝子銃;Biolistic, Dupont)の使用、または脂質、もしくは細胞表面受容体、もしくはトランスフェクト剤での被覆、リポソーム、微小粒子、もしくはマイクロカプセルでの被包により、あるいは核に入ることが知られているペプチドに連結させて核酸配列を投与することにより、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結させて核酸配列を投与すること(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照)(これは、特異的に受容体を発現する標的細胞型に用いることができる)などにより、その核酸配列が細胞内になるように投与することによって達成することができる。別の実施形態では、リガンドが、エンドソームを破壊するための膜融合ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解するのを回避させている、核酸-リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態では、核酸は、特異的受容体を標的とすることにより、細胞特異的取込みおよび発現のためにin vivoで標的となることができる(例えば、PCT国際公開第92/06180号;92/22635号;92/20316号;93/14188号;93/20221号を参照)。あるいは、核酸は、相同組換えによって細胞内に導入し、発現のために宿主細胞DNA内に取り込ませることができる(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
【０４２１】
特定の実施形態では、本発明の分子(例えば、抗体または融合タンパク質)をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる(Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みのために必要な構成要素を含む。遺伝子治療に用いられる抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列は、1つまたは複数のベクター中にクローン化され、これはヌクレオチド配列の対象へ送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのさらに詳細は、Boesenら、(1994, Biotherapy 6:291-302)に見出すことができ、これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、mdr 1遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明している他の文献は、Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141;およびGrossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114である。
【０４２２】
アデノウイルスは、遺伝子治療に用いることのできる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸上皮に送達するのに特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、呼吸上皮に自然に感染し、そこで軽い疾患を生じさせる。アデノウイルスベース送達系についての他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有する。KozarskyおよびWilson(Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, 1993は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の総説を示している。Boutら、(Human Gene Therapy, 5:3-10, 1994)は、遺伝子をアカゲザルの呼吸上皮に移行するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; PCT国際公開W094/12649;およびWang et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスが用いられる。
【０４２３】
アデノ関連ウイルス(AAV)も、遺伝子治療における使用に関して提唱されてきた(例えば、Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第 5,436,146号を参照)。
【０４２４】
遺伝子治療への別の手法は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法によって、遺伝子を組織培養中の細胞に移行させることを伴う。通常、移行方法は、選択可能マーカーの細胞への移行を含む。次いでこの細胞は、移行された遺伝子を取込み、発現している細胞を単離するための選択下に置かれる。次いでこれらの細胞は、対象に送達される。
【０４２５】
この実施形態では、得られる組換え細胞のin vivo投与の前に、核酸が細胞中に導入される。このような導入は、それだけに限らないが、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小核体媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含めた、当技術分野で知られている任意の方法によって行うことができる。外来遺伝子の細胞中への導入について、多くの技法が当技術分野で知られており(例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618, Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644;およびClin. Pharma. Ther. 29:69-92, 1985を参照)、レシピエント細胞の必要な発生的および生理的機能が破壊されていないという条件で、本発明によって用いることができる。この技法は、核酸が細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝的であってその細胞の子孫によって発現可能であるように、核酸の細胞への安定な移行を提供すべきである。
【０４２６】
得られる組換え細胞は、当技術分野で知られている様々な方法によって対象に送達することができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞または前駆細胞)は、静脈内に投与されることが好ましい。使用のために想定される細胞量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定することができる。
【０４２７】
遺伝子治療の目的で核酸を導入することのできる細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、それだけに限らないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞; Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞;様々な幹細胞または前駆細胞、特に骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる造血幹細胞または造血前駆細胞を含む。
【０４２８】
好ましい実施形態では、遺伝子治療に用いられる細胞は、対象に対して自己由来である。
【０４２９】
遺伝子治療において組換え細胞が用いられる実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列は、それらが細胞またはその子孫によって発現可能であるように細胞中に導入され、次いでこの組換え細胞は、治療効果を得るためにin vivo投与される。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が用いられる。単離し、in vitroで維持できる任意の幹細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの実施形態によって潜在的に用いることができる(例えば、PCT国際公開第94/08598号; Stemple and Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229;およびPittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照)。
【０４３０】
特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、核酸の発現が、転写の適切な誘導因子の存在または不在を制御することによって制御可能であるように、コード領域に作動可能に連結した誘導性プロモーターを含む。
【０４３１】
5.6.3  キット
本発明は、本発明の分子(すなわち、変異型Fc領域を含む抗体、ポリペプチド)で満たされた1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な1種または複数の他の予防剤または治療剤も、この医薬パックまたはキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の1種または複数の成分で満たされた1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。必要に応じてこのような容器(複数も)に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関によって定められた形式での注意書を加えることができ、この注意書は、機関によるヒト投与のための製造、使用または販売の認可を反映する。
【０４３２】
本発明は、上記方法に用いることのできるキットを提供する。一実施形態では、キットは、本発明の1種または複数の分子を含む。別の実施形態では、キットは、1つまたは複数の容器中に、癌の治療に有用な1種または複数の他の予防剤または治療剤をさらに含む。別の実施形態では、キットは、癌に関係する1種または複数の癌抗原に結合する1種または複数の細胞傷害抗体をさらに含む。ある実施形態では、他の予防剤または治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤または治療剤は、生物学的治療剤またはホルモン治療剤である。
【０４３３】
5.7  治療有用性の特徴付けおよび実証
本発明の医薬組成物、予防剤または治療剤のいくつかの態様は、好ましくは、ヒトでの使用の前に所望の治療活性について、細胞培養系において、および齧歯動物モデル系などの動物モデル生体において、in vitroで試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを判定するのに用いることのできるアッセイには、患者の組織試料を培養で成長させ、本発明の医薬組成物に曝すか、または別の方法で接触させ、組織試料に対するそのような組成物の効果を観察する、細胞培養アッセイが含まれる。組織試料は、患者から生検によって得ることができる。この試験は、それぞれ個々の患者に対する、治療上最も有効な予防用または治療用分子(複数も)の同定を可能にする。様々な特定の実施形態では、in vitroアッセイは、自己免疫障害または炎症性障害に関与する細胞型の代表的な細胞(例えば、T細胞)を用いて行うことができ、本発明の医薬組成物が、そのような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかを判定する。
【０４３４】
予防剤および/または治療剤の組合せは、ヒトでの使用の前に、適当な動物モデル系において試験することができる。このような動物モデル系として、それだけに限らないが、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知の任意の動物系を用いることができる。本発明の特定の実施形態では、予防剤および/または治療剤の組合せは、マウスモデル系において試験される。このようなモデル系は、広く用いられており、当業者に周知である。予防剤および/または治療剤は、繰り返して投与することができる。この手順のいくつかの態様は、変わり得る。前記態様には、予防剤および/または治療剤を投与する時間体制、ならびにこのような薬剤が別々にまたは混合物として投与されるかどうかが含まれる。
【０４３５】
本発明の方法に用いるのに好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上でヒトFcγRsを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国5,877,396(その全体が参照により本明細書に組み込まれている)に記載されている任意のマウスモデルを、本発明において用いることができる。本発明の方法において用いるためのトランスジェニックマウスとして、それだけに限らないが、ヒトFcγRIIIA保有マウス;ヒトFcγRIIA保有マウス; ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIIA保有マウス;ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIA保有マウスが挙げられる。
【０４３６】
好ましくは、上述した機能アッセイにおいて最高レベルの活性を示す突然変異は、ヒトでの使用の前に、動物モデル研究において使用のための試験が行われる。ch4D5およびch520C9、2種類の抗Erb-B2抗体、およびchCC49、抗TAG72抗体を含めた、本発明の方法を用いて同定され、ADCCアッセイで試験されたFc突然変異体を有する抗体は、それらが、異種移植マウスモデルにおいて以前に用いられてきた(Hudsiak et al., 1989, Mol. Cell Biol. 9: 1165-72; Lewis et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-63; Bergman et al., 2001 Clin. Cancer Res. 7: 2050-6; Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 1387-93)ので、動物モデルにおいて用いるのに好ましい。上述した方法を用いて、例えば、本明細書に開示し、例証した哺乳動物発現系およびIgG精製法を用いて、動物モデルにおいて用いるために、十分な量の抗体を調製することができる。典型的な実験では、少なくとも約5.4mgの突然変異体抗体が必要である。この計算は、4μg/gの負荷用量および10週間の2μg/gの週単位の維持用量を採り入れている、8〜10匹の30gのマウスを保護するのに必要な野生型抗体の平均量に基づく。本発明は、乳腺癌を有する患者に由来するSK-BR-3、BT474およびHT29細胞などの、異種移植腫瘍の源としての腫瘍細胞株を包含する。これらの細胞は、その表面上にErb-B2およびプロラクチン受容体の両方を有する。SK-BR-3細胞は、ADCCおよび異種移植腫瘍モデルの両方において、首尾よく用いられてきた。他のアッセイでは、ヒト卵巣腺癌に由来するOVCAR3細胞を用いることができる。これらの細胞は、細胞表面上で抗原TAG72を発現し、chCC49抗体とともに用いることができる。異なる抗体および多発性腫瘍モデルの使用により、抗体特異的Fc突然変異体の不和合性による任意の特異的突然変異の喪失が回避されるだろう。
【０４３７】
マウス異種移植モデルは、抗体分子のCDR領域の親和性および特異性ならびに抗体のFc領域の、免疫応答を誘発する能力に基づいて、腫瘍特異的標的に対して生じるマウス抗体の効力を検査するために用いることができる(Wu et al., 2001, Trends Cell Biol. 11: S2-9)。マウスエフェクター細胞上にヒトFcγRsを発現するトランスジェニックマウスは、独特であり、ヒトFc-FcγR相互作用の効力を試験するための目的にかなった動物モデルである。以下の表11に列挙したものなどの、Jeffrey Ravetch博士の研究室で生成されたFcγRIIIA、FcγRIIIBおよびFcγRIIAトランスジェニックマウス株の組(Rockefeller大学およびSloan Kettering Cancerセンターとのライセンス契約を通じて)を用いることができる。
【表１１】
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【０４３８】
好ましくは、FcγRIIIAに対する増強された結合およびFcγRIIBに対する低減された結合の両方を示すFc突然変異体は、ADCCアッセイおよび食作用アッセイにおける活性の増大が、動物モデル実験で試験される。この動物モデル実験では、自然抗体を投与された対照と比較した、FcγRIIIAトランスジェニック、ヌードmCD16AノックアウトマウスにおけるFc突然変異体を有する抗体の効力の増大が検査される。好ましくは、8〜10匹のマウスの群が、標準的なプロトコールを用いて検査される。代表的な動物モデル実験は、以下のステップを含むことができる:乳癌モデルでは、第1日に、約2×106個のSK-BR-3細胞を、Matrigel(Becton Dickinson)と混合した0.1mLのPBSとともに皮下に注射する。最初に、野生型キメラ抗体およびアイソタイプの対照を投与することによって、所定の治療用量、第1日に4μg/gの初期用量での4D5の静脈内注射とそれに続く2μg/gの週単位の注射に対する曲線を確立する。腫瘍体積を6〜8週間モニターすることによって疾患の進行を測定する。アイソタイプの対照を注射された動物においては、腫瘍体積は時間とともに直線的に増大するはずである。対照的に、4D5を注射された群では、ほんの少しの腫瘍増殖しか起こらないはずである。標準的な用量研究からの結果は、Fc突然変異体を試験する実験についての上限を設定するために用いられる。これらの研究は、Fc突然変異体を含む抗体の治療量以下の用量を用いて行われる。FcγRIIBノックアウトマウス(Clynes et al., 2000, Nat. Med. 6: 443-6参照)において行われた実験では、10分の1の用量が異種移植モデルに対して用いられ、結果として腫瘍細胞増殖を遮断した。本発明の突然変異体は、FcγRIIIA活性化の増大およびFcγRIIB結合の低減を示すことが好ましいので、突然変異体は、10分の1の治療用量で検査される。異なる間隔での腫瘍寸法の検査により、より低い用量での抗体の効力が示される。t試験を用いるデータの統計分析は、データが有意であるかを判定する方法を提供する。効力の増大を示すFc突然変異体を、漸進的により低い用量で試験することによって、その効力の基準として最も少量の可能な用量を決定する。
【０４３９】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、当技術分野で知られており、Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている、炎症性関節炎の様々な実験的動物モデルを用いることによって判定することができる。炎症性関節炎および自己免疫性リウマチ性疾患の実験的および自発的動物モデルは、本発明の併用療法の抗炎症活性を評価することにも用いることができる。以下のものは、例としてかつ限定によってではなく提供されるいくつかのアッセイである。
【０４４０】
当技術分野で知られており、広く用いられている、関節炎または炎症性疾患についての主要動物モデルとして、アジュバント誘導性関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導性関節炎ラットおよびマウスモデルならびに抗原誘導性関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデルが挙げられ、すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている。
【０４４１】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、カラゲナン誘導性関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラゲナン誘導性関節炎は、慢性関節炎または炎症の研究において、ウサギ、イヌおよびブタにも用いられてきた。定量的組織形態計測的評価が、治療効力を判定するために用いられる。このようなカラゲナン誘導性関節炎モデルを用いるための方法は、Hansra P. et al., "Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat," Inflammation, 24(2): 141-155, (2000)に記載されている。当技術分野で知られており、記載されているザイモサン誘導性炎症動物モデルも一般に用いられる。
【０４４２】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、Winter C. A. et al., "Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962)に記載されている方法の改変を用いて、ラットにおけるカラゲナン誘導性足浮腫の抑制を測定することによっても評価することができる。このアッセイは、ほとんどのNSAIDの抗炎症活性のin vivoでの一次スクリーニングとして用いられてきており、ヒトの効力の予測とみなされている。試験予防剤または試験治療剤の抗炎症活性は、ビヒクルを投与された対照群と比べた、試験群の後足重量の増大の抑制率として表される。
【０４４３】
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルも、本発明の併用療法の効力を評価するために用いることができる(Kim et al., 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober, 1985, Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S)。潰瘍性コリチス(cholitis)およびクローン病は、動物において誘発することのできるヒト炎症性腸疾患である。それだけに限らないが、アミロペクチン、カラギーン(carrageen)、硫酸アミロペクチン、および硫酸デキストランを含めた硫酸化多糖体、またはそれだけに限らないが、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)および酢酸を含めた化学性刺激剤は、炎症性腸疾患を誘発するために経口的に動物に投与することができる。
【０４４４】
自己免疫障害の動物モデルも、本発明の併用療法の効力を評価するために用いることができる。1型糖尿病、甲状腺自己免疫、シテミックループスエルテマトースス(sytemic lupus eruthematosus)、および糸球体腎炎などの自己免疫障害のための動物モデルが、開発されてきた(Flanders et al., 1999, Autoimmunity 29:235-246; Krogh et al., 1999, Biochimie 81:511-515; Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19:12-24)。
【０４４５】
さらに、当業者に知られている任意のアッセイは、自己免疫疾患および/または炎症性疾患について、本明細書に開示した組合せ療法の予防および/または治療有用性を評価するために用いることができる。
【０４４６】
本発明の予防および/または治療プロトコールの毒性および効力は、例えば、LD50(母集団の50%に致命的な用量)およびED50(母集団の50%に治療上有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学手順によって求めることができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、これは、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す予防剤および/または治療剤が好ましい。有毒副作用を示す予防剤および/または治療剤を用いることができるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減するために、そのような薬剤を患部組織部位に対する標的にする送達系を設計することに注意を払うべきである。
【０４４７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに用いるための予防剤および/または治療剤の投与量の範囲を処方することに用いることができる。このような薬剤の投与量は、ほとんどまたは全く毒性を含まないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法に用いられる任意の薬剤について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養で決定されたIC50(すなわち、症状抑制の最大の半分を達成する試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定するために用いることができる。血漿の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０４４８】
本発明によって用いられる療法の抗癌活性も、当技術分野で知られており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd);およびAnticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)に記載されている、SCIDマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片を有するヌードマウス、ハムスター、ウサギなどの動物モデルなどの、癌の研究用の様々な実験動物モデルを用いることによって求めることができる。
【０４４９】
本発明の分子の治療効力を求めるための好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデルである。異種移植腫瘍の源として用いることのできる腫瘍細胞株として、それだけに限らないが、乳腺癌を有する患者に由来し得る、SKBR3細胞およびMCF7細胞が挙げられる。これらの細胞は、erbB2およびプロラクチン受容体の両方を有する。SKBR3細胞は、ADCCおよび異種移植モデルとして、当技術分野で日常的に用いられてきた。あるいは、ヒト卵巣腺癌に由来するOVCAR3細胞を、異種移植腫瘍の源として用いることができる。
【０４５０】
本発明のプロトコールおよび組成物は、ヒトでの使用の前に、所望の治療または予防活性について、in vitroで、次いでin vivoで試験されることが好ましい。治療剤および方法は、腫瘍または悪性細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野で標準的な多くのアッセイを、そのような生存および/または増殖を評価するために用いることができ、例えば、細胞増殖は、3H-チミジン取込みを測定することによって、直接細胞計数によって、プロトオンコジーン(例えば、fos、myc)または細胞周期マーカーなどの既知の遺伝子の転写活性の変化を検出することによってアッセイすることができ、細胞生存率は、トリパンブルー染色によって評価することができ、分化は、形態の変化、軟寒天中の増殖および/またはコロニー形成の減少、三次元基底膜での管状ネットワーク形成または細胞外基質生成などに基づいて視覚的に評価することができる。
【０４５１】
治療に用いるための化合物は、ヒトにおいて試験する前に、それだけに限らないが、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含めた適当な動物モデル系、例えば上述した動物モデルにおいて試験することができる。次いでこの化合物は、適切な臨床試験に用いることができる。
【０４５２】
さらに、当業者に知られている任意のアッセイを、癌、炎症性障害または自己免疫疾患の治療または予防のために、本明細書に開示した組合せ療法の予防および/または治療有用性を評価するために用いることができる。
【実施例】
【０４５３】
6.  実施例
酵母ディスプレイ系を使用して、異なるFc受容体に対する改変された親和性について突然変異ヒトIgG1重鎖Fc領域をスクリーニングした。特に、エラープローンPCR(Genemorph、Stratagene)により突然変異型Fcライブラリーを作製し、次に突然変異型Fcタンパク質をAga2p細胞壁タンパク質と融合させた。これにより、融合タンパク質は細胞外に分泌され、酵母細胞壁上に提示された。
【０４５４】
可溶型のヒト受容体(FcγRIIIAおよびFcγRIIB)をクローニングした。しかし、FcγRのそのリガンドに対する低親和性が原因で、酵母細胞表面のIgG1 Fcドメインの検出は妨害される。この制約を回避するために、AVITAG配列を使用して可溶性FcγR四量体型複合体を形成させた。その四量体型複合体は、酵素的にビオチン化し、続いてフィコエリトリンにコンジュゲートしたストレプトアビジン(SA-PE; Molecular Probes)と反応させ、可溶性四量体性FcγR複合体を形成させることができた。ELISAアッセイにより、可溶性FcγR四量体型複合体の方が単量体型FcγRよりもヒトIgG1に対して高いアビディティーを有することを確認した。FACS分析により評価したように、酵母細胞表面のFc融合タンパク質もまた可溶性FcγR四量体型複合体に結合した。
【０４５５】
酵母細胞表面に発現したFc融合タンパク質の可溶性四量体型FcγR複合体への結合の差を、FACS分析によりモニターした。このように、1つまたは複数の可溶性四量体型FcγR複合体に対して改変された親和性を有するFc融合タンパク質を同定し、次に、完全な免疫グロブリンに組込み、哺乳動物細胞に発現させた。この哺乳動物に発現された産物をELISAアッセイに使用し、酵母表面ディスプレイ系で得られた結果を確認した。最後に、突然変異型Fc領域を配列決定し、改変された残基を確認した。
【０４５６】
6.1  FcγRIIIAのクローニング、発現、および精製
材料と方法
可溶性FcγRIIBおよびFcγRIIIAを以下のようにクローニングした。ヒトFcγR遺伝子(FcγRIIBおよびFcγRIIIA)についてのcDNAクローンを得た(Ravetch研究所からの贈与)。FcγRIIIA遺伝子の可溶性領域(アミノ酸7〜203)をPCRにより増幅させ(表12)、BamHI/HindIIIで消化し、pET25ベクター(Novagen)に連結した。このベクターをSal1/Not1で消化し、370by断片をゲルで単離した。ベクターhu3A(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/Sal1で消化し、FcγRIIIAのN末端を有する270by断片を単離した。BamH/NotIで切断したpcDNA3.1に両方の断片を同時連結し、pcDNA3-FcγRIIIA(アミノ酸1〜203)を作った。FcγRIIBの可溶性領域(アミノ酸33〜180)をPCRにより増幅し(表12)、BglII/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)に連結した。このベクターをBamHI/NotIで消化し、140bp断片をゲルで単離した。ベクターhuRIIb1(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/EcoRIで消化し、440bpのN-末端FcγRIIB断片を単離した。これらの断片の両方をpcDNA3.1に共連結し、BamHI/NotIで切断し、pcDNA3-FcγRIIB(アミノ酸1〜180)を作った。組換えクローンを293H細胞にトランスフェクトし、細胞培養液から上清を収集し、可溶性組換えFcγR(rFcγR)タンパク質をIgGセファロースカラムで精製した。
【０４５７】
結果
組換え可溶性FcγRIIIA(rFcγRIIIA)および組換え可溶性FcγRIIB(rFcγRIIB)を均一になるまで精製した
組換え可溶性FcγRタンパク質の発現およびIgGセファロースカラムでの精製の後に、精製された組換え可溶性受容体タンパク質の純度およびみかけの分子量をSDS-PAGEで決定した。図3に示すように、可溶性rFcγRIIIA(図3、レーン1)は約35KDaの予想されるみかけの分子量を有し、可溶性rFcγRIIB(図3、レーン4)は約20KDaの予想されるみかけの分子量を有した。図3に示すように、可溶性rFcγRIIIAは広がった「不明瞭な(fuzzy)」バンドとなって泳動しているが、これはFcγRIIIAに通常みられる高度のグリコシル化が原因とされた(Jefferis, et al., 1995 Immunol Lett.44、111-117)。
【０４５８】
6.1.1  精製組換え可溶性FcγRIIIAの特徴付け
材料と方法
ELISAアッセイを使用して、ヒト単量体型IgGまたは凝集型IgGに対する直接結合について、上記のように得られた精製可溶性rFcγRIIIAを分析した。1×PBS中の可溶性rFcγRIIIA、10ngで、プレートを一晩被覆する。被覆に続いて、1×PBS/0.1% Tween20でプレートを3回洗浄する。ビオチン化単量体型IgGまたはビオチン化凝集型IgGのいずれかであるヒトIgGを0.03mg/mLから2mg/mLの範囲の濃度でウェルに加え、可溶性rFcγRIIIAに結合させる。反応を37℃で1時間行う。再度1×PBS/0.1% Tween20でプレートを3回洗浄する。ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて650nmでの吸光度をモニターすることにより、可溶性rFcγRIIIAへのヒトIgGの結合を検出する。650nmでの吸光度は、結合した凝集型IgGに比例する。
【０４５９】
ブロッキングELISA実験では、FcγRIIIAモノクローナル抗体である3G8マウス抗FcγRIIIA抗体(Pharmingen)が凝集型IgGへのこの受容体の結合を遮断する能力をモニターする。IgG添加前に5倍モル濃度過剰の3G8を添加し、37℃で30分間インキュベートさせた以外は、洗浄条件およびインキュベーション条件は上記と同じであった。
【０４６０】
結果
精製組換え可溶性FcγRIIIAは特異的に凝集型IgGに結合する。
【０４６１】
ELISAアッセイを使用して、凝集型IgGおよび単量体型IgGへの精製組換え可溶性FcγRIIIAの直接結合を試験した(図4)。IgG濃度2μg/mlで、凝集型IgGの強い結合が観察された。しかし、同様の濃度で単量体型IgGへの結合は検出されなかった。凝集型IgGへの結合は、リガンド結合部位を遮断する3G8マウス抗FcγRIIIAモノクローナル抗体により遮断された。これは、凝集型IgGの結合が通常のFcγRIIIAリガンド結合部位の結合を介することを示している(図4)。可溶性rFcγRIIBもまた特徴付け、それが可溶性rFcγRIIIAと類似の特性でIgGに結合することを示した(データは示さず)。
【０４６２】
6.2  可溶性FcγR四量体型複合体の形成
材料と方法
AVITAGペプチドに融合した可溶性FcRγIIIAおよびFcRγIIBの発現のためのプラスミドの構築
可溶性FcγR四量体型複合体を発生させるために、ヒトFcRgIIIA遺伝子の可溶性領域(アミノ酸7〜203)をPCRにより増幅し(表12)、BamHI/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)に連結した。このベクターをSalI/Not1で消化し、370bpの断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。ベクターhu3A(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/SalIで消化し、FcRγIIIAのN末端を有する270bpの断片を単離した。BamH/NotIで消化したpcDNA3.1(Invitrogen)に両断片を同時連結し、pcDNA3-FcRgIIIA(アミノ酸1〜203)を作った。
【０４６３】
FcRγIIB(アミノ酸33〜180)の可溶性領域をPCRにより増幅し(表I)、BglII/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)に連結した。このベクターをBamHI/NotIで消化し、140bpの断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。ベクターhuRIIb1(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/EcoRIで消化し、440byのFcRγIIB N-末端断片を単離した。BamHI/Notlで消化したpcDNA3.1にこれらの断片の両方を同時連結し、pcDNA3-FcRγIIBを作った(アミノ酸1〜180)。続いて、リンカー-AVITAG配列を、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの両C末端に融合させた。FcγRIIIA-リンカー-avitagおよびFcγRIIB-リンカー-avitag構築物を作製するために、pcDNA3.1 FcγRIIIAおよびpcDNA3.1 FcγRIIB構築物をNotIおよびXbaI(ともにベクター配列の中を切断)で消化し、5'末端のNotI部位および3'末端のXbaIからなる86塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドをベクターに連結した。NotIおよびXbaIについての制限部位をすでに予め消化しておいた2つの5'リン酸化逆相補的オリゴヌクレオチド(5'リンカー.avitagプライマーおよび3'リンカー.avitagプライマーとして表12に示す)をアニーリングすることによりこの86bpの断片を発生させた。100ng/ulの各プライマーを等体積で混合し、このDNAを90℃で15分間加熱し、室温で1時間冷却し、アニーリングさせた。これにより、制限酵素で消化されたpcDNA3.1-FcγRIIIAおよびpcDNA3.1-FcγRIIB構築物にすぐに連結することができる二本鎖DNA断片が生じた。この結果、pcDNA3.1-FcRγIIIA-リンカー-AVITAGおよびpcDNA3.1-FcRγIIB-リンカー-AVITAGが構築された。
【表１２】
2009507470.tif 000046
【０４６４】
BirAによるビオチン化
Lipofectamine2000試薬(Invitrogen、カリフォルニア州)を使用して293H細胞を一過性トランスフェクトすることによって、可溶性Fc受容体(FcγR)のC末端でアミノ酸15個のAVITAG配列(Avidity、コロラド州)に融合したこのタンパク質(Schatz P.J., 1993, Biotechology, 11:1138-1143)をpcDNA3.1にクローニングしたものを作製した。培養液から上清を収集し、上清にIgGセファロースカラムを通過させることによって可溶性FcRタンパク質を精製した。可溶性FcR-AVITAG融合タンパク質の濃度は280nmでの吸光度から定量した。可溶性FcRタンパク質上に存在するAVITAGを、ビオチンリガーゼである大腸菌BirA酵素を用いて製造業者のプロトコール(Avidity、コロラド州)通りにビオチン化した。プロテアーゼ阻害剤(Sigmaカタログ番号P8849)および終濃度1mg/mlのロイペプチン(Sigma L-8511)の終希釈1:100の混液をこの混合物に添加し、これらのタンパク質の分解を阻害した。BirA反応物を室温で一晩インキュベートし、続いてBiomax 10K-限外濾過装置(Millipore)を使用して4℃で3500rpmで遠心分離することによりこの溶液を濃縮した。このタンパク質をTris-HCl(20mM、pH8.0)、50mM NaCl中でFPLC Superdex 200HR10/30カラム(Pharmacia Biotech)に負荷し、標識可溶性FcγRを遊離ビオチンと分離した。
【０４６５】
ストレプトアビジンシフトアッセイによるビオチン化度の決定
BirA酵素(Avidity、コロラド州)により約80〜85%のタンパク質をビオチン化した。ストレプトアビジン-シフトアッセイを使用して、タンパク質のビオチン化度を決定した。ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン(MW60000ダルトン)とともに種々の比でインキュベートした。ビオチン化度を決定するための対照として未ビオチン化タンパク質単独およびストレプトアビジン単独を含める。氷上で2時間または4℃で一晩インキュベーションを行う。還元剤の存在下で試料を沸騰させずに4〜12% SDS-PAGE Bis-Tris(Invitrogen、カリフォルニア州)で試料を分析する。ストレプトアビジンと結合したビオチン化タンパク質は、高分子量のバンドとして泳動する。ビオチン化の程度は、試料に残る単量体タンパク質の量により推定する。単量体低分子量種の不在およびストレプトアビジン単独よりも大きい分子量を有する複合体の存在は、高度のビオチン化を示す。
【０４６６】
FcγR四量体型複合体の形成
FcγR四量体型複合体の形成は、MHCクラスI四量体について以前に確立された方法通りに行った(Busch, D. H. et al., 1998 Immunity 8:353-362; Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94-96参照)。ビオチン化単量体型FcγRの濃度は280nmの吸光度に基づき計算した。1分子のストレプトアビジン-フィコエリトリン(SA-PE) (Molecular Probes、オレゴン州)は、4分子のビオチンと結合する能力を有する。過剰のビオチン化タンパク質を確実にするために、モル比5:1の単量体性ビオチン化FcγRおよびSA-PE(5×単量体性ビオチン化FcγR:1×SA-PE)を使用した。SA-PEの計算上の分子量が300000ダルトンであることから、ストレプトアビジン-PEの1mg/mL溶液303mLは1nmolのSA-PEを有し、これを5nmolのタンパク質に添加した。四量体型タンパク質の効率的な形成には、SA-PEを段階的に漸増して添加する必要がある。半量のSA-PEを前もって添加し、残りのSA-PEは、暗条件で4℃で20〜30分毎に少量ずつ添加した。残りのSA-PEの添加間隔は自由に変えられる。SA-PEの添加が完了後に、溶液を濃縮し、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水中で上記FPLCサイズ排除カラムに負荷した。SA-PE単独よりも大きな分子量で間隙容量に溶出した画分を収集した。プロテアーゼ阻害剤を補充してタンパク質の分解を阻害した。この溶液を濃縮し、最終的な複合体に追加的なプロテアーゼ阻害剤を添加して保存に供した。可溶性FcγR四量体型複合体の終濃度は、ビオチン化単量体型タンパク質の出発濃度に基づき計算した。例えば、四量体型複合体を製造するためにビオチン化タンパク質500μgを使用し、最終的な濃縮四量体が体積500μLであったならば、濃度は約1mg/mLと推定される(四量体の各形成段階にどれだけ多くの損失があったかを正確に決定することが困難であることから、濃縮の間に被った損失は考慮しない。PEからの妨害が原因で、280nmでの吸光度を採用して濃度を測定することもまた不可能である)。プロテアーゼ阻害剤とともに長期保存するために、可溶性FcγR四量体型複合体を-80℃で少量ずつ分配した。四量体を酵母ディスプレイライブラリーのスクリーニングに使用することから、これらの調製物にアジ化ナトリウムは添加しなかった。一定分量を解凍した場合、この四量体は4℃で最長1週間保存した。
【０４６７】
四量体型FcγR複合体を特徴付けるためのELISAアッセイ
ELISAを使用して四量体型FcγR複合体の特徴付けを行った。PBS緩衝液中のヒトIgG、25ngでMaxisorb F96ウェルプレート(Nunc)を被覆し、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS/0.5% BSA/0.1% Tween20(洗浄および希釈緩衝液)で洗浄してから、FcγRIIIA四量体および被験抗体の組合せを添加し、下記のように3G8マウス抗ヒトFcγRIIIA抗体を用いたブロッキングを決定した。以下のようにブロッキング段階を行った。緩衝液PBS/0.5% BSA/0.1% Tween20中で一定の終濃度0.5mg/mlの可溶性FcγRIIIA四量体を抗体とともに室温で1時間予備インキュベートした。抗体の終濃度は60mg/mLから0.25mg/mLの範囲であった。3G8はマウス抗ヒトFcγRIIIA抗体であり、この実験のためにキメラ型、すなわち抗体の可変領域がマウス抗ヒトFcγRIIIAであり、重鎖および軽鎖の定常領域がIgG1ヒト領域由来である抗体を使用した。アスパラギン酸がヒトIgG1におけるアラニンと置換されていることにより、FcγRへの結合低下を招く突然変異をFc領域が位置265に有する抗フルオレセイン抗体であるキメラ4.4.20.D265Aもまたこの実験に使用した。この抗体は、以前に特徴付けられている(Clynes et al., 2000, Nat. Med. 6: 443-446; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 6591-6604参照)。この抗体を陰性アイソタイプ対照として使用した。
【０４６８】
室温で1時間予備インキュベートすることにより、抗体をFcγRIIIA四量体に結合させた。次に、洗浄したプレート上のIgGにその混合物を添加し、室温でさらに1時間インキュベートした。このプレートを緩衝液で洗浄し、1:5000希釈のDJ130c(DAKO(デンマーク)から入手できるマウス抗ヒトFcγRIIIA抗体であり、そのエピトープは3G8抗体のエピトープとは異なる)を添加し、結合したFcγRIIIA四量体を検出するために室温で1時間インキュベートさせた。未結合の抗体を緩衝液で洗い落とし、結合したDJ130cをヤギ抗マウスペルオキシダーゼ(Jackson laboratories)で検出した。この試薬は、ヒトFcを検出しないものである。未結合のペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を洗い落とした後に、基質であるTMB試薬(BioFx)を添加して、アイソタイプ対照に対する3G8を用いたブロッキングの程度を検出し、発色を650nmで読み取った。
【０４６９】
ELISAによるIgGへの可溶性四量体FcγRIIIAの直接結合のために、maxisorbプレートを上記のIgG、25ngで被覆した。可溶性四量体FcγRIIIAを20mg/mLから0.1mg/mL添加し、ビオチン化単量体型可溶性四量体FcγRIIIAを20mg/mLから0.16mg/mLの範囲の濃度で添加した。検出は、DJ130cに続いてヤギ抗マウスペルオキシダーゼ抗体を用いて上記と同様に行った。TMB試薬で発色させ、プレートを650nmで読み取った。
【０４７０】
結果
可溶性FcγRIIIA四量体型複合体はその通常のリガンド結合部位を介して単量体型ヒトIgGと結合する
ELISAアッセイを使用して材料と方法の節に記載したように可溶性FcγRIIIA-AVITAG融合タンパク質を発生させ、単離し、分析した。この融合タンパク質は非AVITAG可溶性FcγRIIIAタンパク質と類似の性質を有することが示された(データは示さず)。この融合タンパク質をビオチン化し、上記のように四量体型複合体を発生させた。
【０４７１】
次に、ELISAアッセイを使用して、この可溶性FcγR四量体型複合体のリガンドである単量体型ヒトIgGへの結合について、この複合体を評価した。ELISAによる分析は、可溶性四量体型FcγR複合体が単量体型ヒトIgGと特異的に結合することを示した。図5Aに示すように、650nmでの吸光度によりモニターした単量体型ヒトIgGへの可溶性四量体FcγRIIIAの結合は、3G8マウス抗ヒトFcγIIIAモノクローナル抗体により遮断される。他方で、D265A突然変異を有する4-4-20モノクローナル抗体は、単量体型ヒトIgGへの可溶性四量体FcγRIIIAの結合を遮断することができなかった(図5A)。したがって、この実験は、可溶性四量体FcγRIIIA複合体の結合が天然リガンド結合部位を介して起こることを確認している。
【０４７２】
可溶性FcγRIIIA四量体型複合体は、単量体性可溶性FcγRIIIAよりも大きいアビディティーで単量体型ヒトIgGに結合する
ELISAアッセイを使用して凝集型ヒトIgGへの可溶性四量体FcγRIIIAの直接結合を評価し、単量体型ヒトIgGへの可溶性単量体FcγRIIIAの直接結合と比較した。図5Bに示すように、可溶性四量体FcγRIIIAは、450nmでの吸光度によりモニターされたように可溶性単量体性受容体よりも高いアビディティー(8〜10倍)でヒトIgGに結合する。
【０４７３】
IgG1から精製したFc断片で被覆した磁気ビーズを使用して、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体の結合もまたアッセイした(図5)。単量体の結合が検出されない条件で、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体はIgG1 Fc被覆ビーズに結合する。Fcの結合を遮断する抗FcγRIIIAモノクローナル抗体LNK16とともに受容体複合体を予備インキュベートすることにより、結合の特異性を示した。このアッセイは、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体がその通常のリガンド結合部位を介して単量体型IgGに結合すること、そしてこの複合体の中の複数の結合部位により、この受容体のアビディティーが増大していることをさらに確認している。
【０４７４】
6.3  突然変異IgG1 Fcドメインのディスプレイのための酵母株の構築
材料と方法
pYD1ベクター(Invitrogen)は、T細胞受容体およびいくつかのscFVを提示するためにうまく使用された酵母複製ベクターpCT302(Shusta, et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18: 754-759)から直接得られる。このプラスミドは動原体性であり、trpl酵母株で細胞1個当たり1〜2個のプラスミドという比較的一定のコピー数を可能にするTRP1遺伝子を有する。ポリリンカーへの定方向クローニングは、GAL1プロモーターの制御下でAGA2のフレーム内に関心対象の遺伝子を置く。酵母Aga2pとのIgG Fcドメインの融合は、Aga2-Fc融合タンパク質の細胞外分泌と、それに続いて内在性細胞壁タンパク質である酵母Aga lpタンパク質へのジスルフィド結合を介した、細胞壁上のFcタンパク質の提示とを招く。
【０４７５】
ディスプレイレベルを最適化するために、IgG1重鎖からの種々の断片をPCRにより増幅し、pYD1にクローニングした。具体的には、IgG1重鎖のFc領域(アロタイプIG1m(a);アミノ酸206〜447)をIMAGEクローン182740からPCRにより増幅し(表1)、EcoRI/SalIで消化し、pYD1ベクター(Invitrogen)に連結した。IMAGEからの最初のクローンは位置319に単一ヌクレオチドの欠失を有し、それをin vitro部位特異的突然変異誘発により補正してpYD-GIF206(Quickchange、Stratagene)を構築した。
【０４７６】
5'オリゴ(mcr025;chl(f))および3'オリゴ(H021)を使用してpCINEOベクター中のMAb B6.2の重鎖クローンからCH1-CH3断片(アミノ酸118〜447)を増幅した(表8参照)。この断片をBamHI/NotIで消化し、pYD1ベクターに連結してpYD-CH1を構築した。
【０４７７】
図7はこの構築物の概略図を示す。CH1-CH3構築物は、重鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインに加えてCH1ドメインを有し、GIF206はヒンジの上流に6個のアミノ酸残基を有し、GIF227はヒンジ領域内の内因性タンパク質分解開裂部位から始まる(Jendeberg et al., 1997 J. Immunol. Meth. 201: 25-34)。
【０４７８】
6.4  酵母細胞壁上のFcドメインの免疫局在性および特徴付け
材料と方法
標準的な酢酸リチウム酵母形質転換プロトコールを使用して、Aga2p-Fc融合タンパク質を有する構築物および挿入部を全く欠如した対照ベクターpYDIを酵母株EBY100(Invitrogen)(MATa ura3-52 trpl leu2Δl his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1)に形質転換した(Gietz et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 1425)。続いて、所定の培地でトリプトファン原栄養株を選択した。グルコース中で生育させ、続いて主炭素源としてガラクトースを含有する培地中で20℃で24〜48時間生育させることによって、独立した細胞集団の増幅、ならびにAga1p-FcおよびAga2p-Fc融合タンパク質の誘導を果たした。ガラクトース中での生育は、GAL1プロモーターを介したAga2-Fc融合タンパク質の発現を誘導し、それは続いて酵母細胞表面でのFc融合タンパク質のディスプレイを引き起こす。
【０４７９】
結果
Fc融合タンパク質のFACS分析
PEコンジュゲートポリクローナルF(ab)2ヤギ抗ヒトFcγRおよびHP6017(Sigma)抗体(Jackson  Immununoresearch Laboratories, Inc.)を使用した免疫染色により、酵母細胞壁上でのFc融合タンパク質の発現を分析した。蛍光顕微鏡観察により、3つのFc融合タンパク質についての末梢染色が示される。ベクター単独を有する対照株は、ほとんどまたは全く染色を示さない(データは示さず)。この染色を定量するためにFACS分析を使用した(図8)。CH1-CH3融合を有する酵母株は、両抗体で染色された細胞を最高率で示した(図8BおよびF)。GIF227構築物は最大の平均蛍光強度を示した(図8、CおよびG欄)。
【０４８０】
酵母細胞表面で発現したFc融合タンパク質の結合の特徴付け
自然の状況のFcタンパク質およびFcγRタンパク質は、この受容体を細胞表面に、そしてFcを可溶性リガンドとして置いている。しかし、Fcの酵母表面の提示は自然の相互作用の幾何的関係から逆転している。酵母細胞壁表面でのIgG1 Fcタンパク質の検出は、FcγRのリガンドに対するFcγRの低親和性と、ディスプレイ系固有の逆の幾何的関係との両方により複雑になっている。後者のポイントを変えることはできないが、リガンドのアビディティーは、可溶性FcγR四量体型複合体を形成させることにより上に説明したように改善した。それにより、酵母細胞壁表面に発現したFc融合タンパク質へのFcγRの結合を検出できるようになる。
【０４８１】
表面に提示されたFc融合タンパク質との可溶性四量体型FcγR複合体の結合を特徴付けるために、種々のFc構築物を発現している酵母細胞を可溶性rFcγRIIIA四量体複合体とともにインキュベートし、FACSにより分析した。野生型CH1-CH3構築物を提示しているpYD-CH1を有する酵母細胞は、FACS分析に示されるように可溶性rFcγRIIIA四量体型複合体により結合された。しかし、GIF206およびGIF227株は、FACS分析に示されるように可溶性rFcγRIIIA四量体型複合体にほとんどまたは全く結合を示さなかった(データは示さず)。
【０４８２】
FcγRへの結合を遮断する、Fc領域の突然変異が同定されている(Shields et al., 2001; J Biol.Chem. 276: 6591-6604)。これらの突然変異の1つであるD265AをpYD-CH1に組込み、この突然変異体を酵母細胞表面に発現させた。高濃度のリガンド(0.15mMのFc;7.5mMのD265A)を使用して、これらの細胞を可溶性FcγRIIIA四量体型複合体とともにインキュベートした。FACS分析は、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体が野生型Fcと結合した(図9A)が、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体はD265A-Fc突然変異体と結合しなかったことを示した。これは、FcγRが下流のヒンジ-CH2領域で通常のFcR結合部位と相互作用していることを示している(図9B)。
【０４８３】
FACSにより分析したように、FcγRIIIAリガンド結合部位に対する抗体は、酵母細胞表面の壁に提示された野生型Fcタンパク質への可溶性FcγRIIIA四量体型複合体の結合を遮断した(図10)。可溶性FcγRIIIA四量体型複合体の結合は、3G8抗体および別の抗FcγRIIIAモノクローナル抗体であるLNK16抗体(Advanced Immunological)により遮断され(Tam et al., 1996 J. Immunol. 157:, 1576-1581)、無関係のアイソタイプ対照には遮断されなかった。したがって、酵母細胞表面に提示されたFcタンパク質への可溶性FcγRIIIA四量体型複合体の結合は、通常のリガンド結合部位を介して起こる。FcγRIIIA四量体型複合体の限られた結合は、細胞の亜集団が、FcγRに接近可能な正しく折り畳まれたFcを有することを示す。なぜ細胞の亜集団だけがリガンドに結合できるかの理由は無数にあり、例えばそれらの細胞は細胞周期の異なる段階であるおそれもあるし、また融合タンパク質が搬出されていないおそれもある。
【０４８４】
酵母細胞表面でFc融合タンパク質に結合するFcγRIIIA-四量体の解離定数を決定するために、一連のFcγRIIIA四量体型複合体の結合をFACSを使用して分析した。FcγRIIIA四量体型複合体を1.4μMから0.0006μMの濃度でタイトレーションした。結合親和性の尺度としての平均蛍光強度および非線形回帰分析を使用して、KDを0.006μM(+/-0.001)と決定した(データは示さず)。
【０４８５】
6.5  Fc突然変異体ライブラリーの構築
Fc-CH1構築物のFc断片に隣接するプライマーおよび誤りがちなPCR(Genemorph、Stratagene)を使用して、突然変異型Fcライブラリーを構築した。ベクターpYD-CHIでのCH1-CH3挿入部を突然変異誘発PCR(Genemorph、Stratagene)を使用して増幅した。pYD-上流プライマーおよびpYD-下流プライマー(Invitrogen)を使用して5つの反応を行った。結果として生じた増幅断片をXHOI/BamHIで消化し、pYD1に連結した。次に、連結反応物をXL10ウルトラコンピテント細胞(Stratagene)に形質転換し、それにより約1×106個の形質転換体が生じ、その形質転換体の80%が挿入部を有した。
【０４８６】
ライブラリーからの28個のランダムプラスミドの配列分析は、保存されたヌクレオチドの変化が40%およびアミノ酸変化を生じる突然変異が60%という破壊を伴う、約2〜3突然変異/kbの突然変異頻度を示した。
【０４８７】
酵母系EBY100(MATα ura3-52 trp l leu2Δ1 his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can l GAL GAL-AGA 1::URA3)に、30回の独立した形質転換反応で約3.3×105形質転換体/ugという高効率でこのライブラリーを形質転換し、合計約107個の酵母形質転換体を作った(Gietz, et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425)。このライブラリーをプールし、グルコース中での生育により増幅させた。
【０４８８】
6.6  Fc突然変異体の選択および分析
材料と方法
Fc突然変異体をスクリーニングするためのELISAアッセイ
50ml/ウェルの炭酸塩緩衝液中の0.5mg/ml BSA-FITCでELISAプレート(Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate)を4℃で被覆し、一晩インキュベートさせた。プレートを1×PBS/0.1% Tween20(PBST)で3回洗浄した。200ml/ウェルのPBST/0.5% BSAを添加し、プレートを室温で30分間インキュベートした。プレートをPBSTでさらに3回洗浄した。野生型か、Fc突然変異体を有するかのいずれかの4-4-20抗体を、馴化培地からPBST/0.5% BSAに1:4希釈(約3mg/mLであり、終濃度は0.7〜0.8mg/ウェルとなる)して50ml/ウェル添加し、室温で2時間インキュベートさせた。プレートをPBSTで3回洗浄した。(PBST/0.5% BSA中の)3mg/mlの精製ビオチン化単量体型FcγRIIIAをプレートに添加し(50μl/ウェル)、室温で1.5時間インキュベートさせた。プレートをPBSTで3回洗浄した。PBST/0.5% BSAに1:5000希釈したストレプトアビジン-HRP(Pharmacia、RPN 123v)を50ml/ウェル添加し、プレートを室温で30分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。次に、80ml/ウェルのTMB試薬(BioFX)をプレートに添加し、暗い場所で室温で10〜15分間インキュベートさせた。停止溶液(0.18M硫酸)を40ml/ウェル添加することにより反応を最終的に停止させた。次に、450nmでの吸光度についてプレートをモニターした。最初のスクリーニング後に、免疫複合体に基づく結合ELISAでの4-4-20-Fc突然変異体の段階タイトレーションにより、関心対象の候補をさらに確認した。このELISAで少数の改変を行った。プレートの被覆には2mg/ml BSA-FITCを使用した。IgGの定量結果に基づいて、PBST-/0.5% BSAに終濃度1、0.5、0.25、0.125、0.063、および0mg/mlとなるように馴化培地から希釈した4-4-20Fc(野生型または突然変異体)を添加した。
【０４８９】
細胞表面に提示されたFcタンパク質のためのFACSスクリーニング
少なくとも10mlのHSM-Trp-Ura(pH5.5)中でグルコースとともに16〜24時間、またはOD600が2.0を超えるまで細胞を生育させた。約2000rpmで5分間細胞を遠心沈殿させた。ガラクトースを有する等体積のHSM-Trp-Ura(pH7.0)に細胞を再懸濁した。125ml容フラスコ中で、ガラクトース培地36mlを添加し、培養液9mlを接種し、それを振盪しながら20℃で24〜48時間インキュベートした。8〜16時間間隔でOD600を測定することにより生育をモニターした。2000rpm、5分間で細胞を採集し、等体積の1×PBS(pH7.4)に再懸濁した。
【０４９０】
平衡スクリーニング:
過剰のリガンドを維持しながら、適切な量の細胞をインキュベートした。例えば、ライブラリーの10倍のカバー度を確実にするために必要な細胞数で開始することが好ましい。107個の形質転換体を有するライブラリーを用いた最初の分取のために、108個の細胞を使用すべきである。実際は、染色プロトコールの間の損失を代償するために109個の細胞で始めることが最良である。
【０４９１】
インキュベーションは、典型的には1.5mL容試験管の中で20〜100mlの体積で回転装置の上で暗条件で4℃で1時間行った(インキュベーション緩衝液:1×PBS pH7.4;1mg/ml BSA)。細胞をインキュベーション緩衝液500mlの中で1回洗浄し、4000rpmで2.5分間遠心沈殿させた。細胞をインキュベーション緩衝液100ml中に再懸濁し、第2染色試薬とともにインキュベートした。Fc-CH1について、F(ab)2ヤギ抗hFc F(ab)2-FITC抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)を使用して、CH1の発現について染色することができる。染色は1mLを用いて30分間行った。細胞を追加的にインキュベーション緩衝液500mLの中で洗浄し、4000rpmで2.5分間遠心沈殿させ、1×PBS 1mg/mL BSA、1mL中に再懸濁し、FACSにより分析した。
【０４９２】
典型的な平衡スクリーニングの分取ゲートおよび収集された細胞数を表13に示す。
【表１３】
2009507470.tif 000047
【０４９３】
3回目および4回目の分取の後で、細胞を-trp-uraプレート上で直接培養し、個別の突然変異体を同定した。これにより、典型的にはプレート1枚当たり約200〜400コロニーを回収した。収集後に細胞を50mL容のコニカル試験管中のグルコース培地10mLに入れ、30℃で生育させた。この手順全体を繰り返した。
【０４９４】
結果
Fc突然変異体のFACS分析
ガラクトース培地での誘導後に、細胞を採集し、PE標識した可溶性FcγRIIIA四量体型複合体およびFITC標識したマウス抗ヒトFcのF(ab2)(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)とともに同時染色した。細胞をFACSにより分析し、分取ゲートを使用して、細胞表面のFc発現量に対して、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体に対する最高の親和性を示す細胞を選択した(図11)。例えば、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体によく結合する突然変異型Fcを有する細胞の方が、酵母細胞表面で少ないFc融合タンパク質を発現することがあるが、この細胞は分取ゲートの左下側の隅に入るであろう。
【０４９５】
連続する分取を4回行って、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体に最高の親和性を示す突然変異体を濃縮した。各連続する分取についてのゲートは、5.5%、1%、0.2%、および0.1%であった。最後の分取の後に、細胞を選択培地上で培養し、個別のコロニーを単離した。個別のコロニーは、それぞれAga2-Fc融合タンパク質中に単一のFc突然変異体を有する細胞のクローン集団に相当した。最初に32個の独立したコロニーを釣り上げ、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体への結合についてFACSで試験した(図12)。18個の突然変異体は、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体により結合した細胞の率および結合した細胞の平均蛍光強度により測定された結合強度に増大を示した。
【０４９６】
FcγRIIIAへの結合の増大を示す突然変異を、可溶性FcγRIIB四量体型複合体への結合についてもまた試験した(図12)。可溶性FcγRIIIA四量体型複合体への結合の増大に至る大部分の突然変異は、FcγRIIB四量体型複合体の染色の検出もまた招いた(図12)。以前の物理および遺伝データの両方に基づき、FcγRIIIAへの結合を増大させる一部の突然変異は、FcγRIIBへの結合もまた増大させると予想される(Shields et al., 2001, J Biol.Chem. 276: 6591-6604; Sondermann et al., 2000, Nature  406: 267-273)。
【０４９７】
ヒト細胞系で産生された4-4-20MAbにおける突然変異の分析
酵母系での突然変異の単離および分析は、新規な突然変異対立遺伝子の迅速同定を可能にする。突然変異を単離するために異種系を使用する結果として、誤った折り畳みを招く改変または酵母に特異的なグリコシル化の改変により結合が高まる突然変異を同定することがができるであろう。ヒト細胞で産生される免疫グロブリン分子のFc突然変異を分析するために、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20の重鎖を有する突然変異体を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした(Kranz et al., 1982  J.Biol.Chem, 257(12): 6987-6995)。ヒト腎臓細胞系(293H)で突然変異4-4-20重鎖を軽鎖クローンとともに一過性同時発現させた。上清を収集し、ELISAにより分析した(図13)。
【０４９８】
ELISAアッセイによると、2回目のFACS分析で可溶性単量体型FcγRIIIA複合体に対して高い親和性を有すると同定された大部分の突然変異体は、ヒト細胞系で産生された4-4-20モノクローナル抗体のFc領域に存在するときに、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体への結合の増大もまた示した(図13A)。しかし、2つの突然変異体16番および19番は、可溶性FcγRIIIA単量体型複合体への結合の減少を示した。
【０４９９】
表14は、同定された突然変異、ならびに酵母ディスプレイに基づくアッセイおよびELISAの両方により決定されたFcγRIIIAおよびFcγRIIBに対応するそれらの結合特性の概要である。表14では、記号は以下を表す。黒丸は、野生型Fc領域を含む類似する分子に比べたときの親和性の1倍の増大に対応し;+は、親和性の50%増大に対応し;-は、親和性の1倍減少に対応し;→は、親和性に変化なしに対応する。
【表１４】
2009507470.tif 000048
【０５００】
2009507470.tif 000049
【０５０１】
2009507470.tif 000050
【０５０２】
可溶性FcγRIIB四量体型複合体の結合の分析は、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体への結合の増大を示した8つの突然変異体のうち7つが可溶性FcγRIIB四量体型複合体にもまた増大した結合を有したことを示している(図13B)。1つの突然変異体である第8番は、可溶性FcγRIIB四量体型複合体への結合の減少を示した。突然変異体のうち3つは可溶性FcγRIIIA四量体型複合体および可溶性FcγRIIB四量体型複合体のどちらにも結合の差を示さない。これは、酵母特異的な改変を招く突然変異が原因の可能性がある。
【０５０３】
6.7  Fc突然変異体のADCCアッセイ
エフェクター細胞の調製物:
末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll-Paque(Pharmacia、17-1440-02)のFicoll-Paque密度勾配遠心分離により、正常ヒト末梢血(Biowhittaker/Poietics、1W-406)から精製した。同じ日に血液を外界温度で輸送し、PBSおよびグルコース(1g/1L)に1:1希釈し、15mL容コニカル試験管中のFicoll(3mL Ficoll;4mL PBS/血液)または50mL容コニカル試験管中のFicoll(15mL:Ficoll;20mL PBS/血液)に重層した。遠心分離を室温で1500rpm(400rcf)で40分間行った。PBMC層を取り出し(50mLコニカル試験管から約4〜6mL)、50mL容コニカル試験管中でPBS(Ca2+およびMg2+を含有しない)で1:10希釈し、室温で1200rpm(250rcf)でさらに10分間回転させた。上清を除去し、ペレットをPBS(Ca2+およびMg2+を含有しない)10〜12mLに再懸濁し、15mL容コニカル試験管に移し、室温で1200rpmでもう10分間回転させた。上清を除去し、ペレットを最小体積(1〜2mL)の培地(Isocove培地(IMDM)+10%ウシ胎児血清(FBS)、4mM Gln、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S))に再懸濁した。再懸濁したPBMCを適切な体積に希釈し、ADCCアッセイに供した。ELISA用96ウェルプレート(Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate)の中で2倍希釈を行った。PBMCの収量は、全血40〜50mL当たり約3〜5×107細胞であった。
【０５０４】
標的細胞の調製:
アッセイに使用した標的細胞は、SK-BR-3細胞(ATCC受託番号HTB-30; Trempe et al., 1976, Cancer Res. 33-41)、Raji細胞(ATCC受託番号CCL-86; Epstein et al., 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-40)、またはDaudi細胞(ATCC受託番号CCL-213; Klein et al., 1968, Cancer Res. 28: 1300-10)(IMDM培地0.5mLに再懸濁)であり、これらの細胞はユーロピウムキレートであるビス(アセトキシメチル) 2,2":6',2"テルピリジン6,6'ジカルボキシレート(BATDA試薬; Perkin Elmer DELFIA試薬; C136-100)で標識した。K562細胞(ATCC受託番号CCL-243)はNK活性についての対照細胞として使用した。Daudi細胞およびRaji細胞を遠心沈殿させ、SK-BR-3細胞は37℃、5% CO2で2〜5分間トリプシン処理し、培地を中和してから200〜350Gで遠心沈殿させた。標識効率が2×106細胞という少数で最高であったことから、アッセイに使用した標的細胞数は約4〜5×106細胞であり、5×106細胞を超えなかった。細胞を遠心沈殿させると培地を15mL容Falcon試験管に0.5mLまで吸引した。BATDA試薬2.5μlを添加し、この混合物を37℃、5% CO2で30分間インキュベートした。細胞をPBSおよび0.125mMスルフィンピラゾール(sulfinpyrazole)(「SP」;SIGMA S-9509)10mL中で2回、およびアッセイ培地(細胞培地+0.125mMスルフィンピラゾール)10mL中で2回洗浄した。細胞をアッセイ培地1mLに再懸濁し、計数し、希釈した。
【０５０５】
最初にPBS/SPで洗浄した後でSK-BR-3細胞を標的細胞として使用したときに、PBS/SPを吸引し、SP、Gln、およびP/Sを含有するIMDM培地に溶かした500μg/mLのFITC(PIERCE 461110)を添加し、37℃、5% CO2で30分間インキュベートした。細胞をアッセイ培地で2回洗浄し、アッセイ培地1mL中に再懸濁し、計数し、希釈した。
【０５０６】
抗体のオプソニン化:
標的細胞を上記のように調製すると、それらの細胞を適切な抗体でオプソニン化した。Fc変異体の場合、Fc変異体を有する2×濃度の抗体に50μLの1×105細胞/mLを添加した。終濃度は以下の通りであった。Ch-4-4-20の終濃度は0.5〜1μg/mLであり、Ch4D5の終濃度は30ng/mL〜1ng/mLであった。
【０５０７】
オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞に添加し、Fc変異体を有する4-4-20抗体の場合、75:1のエフェクター:標的比とした。Fc変異体を有するCh4D5抗体の場合、50:1または75:1のエフェクター:標的比を実現した。アッセイに有効なPBMC勾配は100:1から1:1の範囲である。細胞にアッセイ培地100μLを添加することにより自然放出(SR)を測定し、4% TX-100を添加することにより最大放出(MR)を測定した。Beckman遠心分離器で200rpm、57Gで室温で1分間細胞を遠心沈殿させた。細胞を37℃、5% CO2で3〜3.5時間インキュベートした。インキュベーション後にBeckman遠心分離器で1000rpm(約220×g)、10℃で5分間細胞を回転させた。上清20μlを収集し、Eu溶液200μLを添加し、その混合物を120rpmの回転振盪装置で室温で15分間振盪した。時間分解蛍光計(Victor 1420、Perkin Elmer)で蛍光を定量した。
【０５０８】
結果
上記のように、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20の重鎖を有する哺乳動物発現ベクターに変異型Fc領域をサブクローニングした(Kranz et al., 1982  J.Biol.Chem, 257(12): 6987-6995)。ヒト腎臓細胞系(293H)に、変異型4-4-20重鎖を軽鎖クローンとともに一過性に同時発現させた。上清を収集し、ADCCアッセイを使用して分析した。図14は突然変異体のADCC活性が濃度依存的であることを示している。表8にまとめるように、変異型Fc領域を有する5つの免疫グロブリンは、野生型ch4-4-20に比べて高いADCC活性を有した。5つの突然変異体は以下の通りであった: MGFc-27(G316D、A378V、D399E);MGFc-31(P247L、N421K);MGFc-10(K288N、A330S、P396L);MGFc-28(N315I、V379M、T394M);MGFc-29(F243I、V379L、G420V)。
【０５０９】
野生型Fc領域を有する4-4-20免疫グロブリンに比べたADCC活性について、変異型Fc領域を有する追加の4-4-20免疫グロブリンをアッセイした。これらの結果を表15に概要する。
【０５１０】
4-4-20抗体について以前に記載したものと同じプロトコールを使用して、ADCCアッセイもまた行ったが、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2/neu)に特異的なヒト化抗体(Ab4D5)に変異型Fc領域をクローニングした。この場合、標的細胞として変異型Fc領域を担持するHER2/neu抗体を用いてオプソニン化したSK-BR-3細胞を使用した。HER2/neuはSK-BR-3細胞により内因性発現され、したがって、これらの細胞の表面に存在する。図15は変異型Fc領域を担持するHER2/neu抗体のADCC活性を示す。表16にHER2/neu抗体に関連した突然変異体のADCC活性の結果を概要する。突然変異体の濃度を、比細胞溶解率の値に必要な野生型抗体と比較することによって、基準化を実施した。
【０５１１】
図15Aに示すように、ヒト化抗HER2/neu抗体にクローニングしたMGFc-5(V379M)、MGFc-9(P243I、V379L)、MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-13(K334E、T359N、T366S)、およびMGFc-27(G316D、A378V、D399E)突然変異体は、野生型抗体よりも高いSK-BR-3細胞の比溶解率(%)を示した。
【表１５】
2009507470.tif 000051
【０５１２】
【表１６】
2009507470.tif 000052
【０５１３】
6.8  Fc突然変異体の動力学的パラメーターの分析
FcγRIIIAおよびFcγRIIBへの、Fc突然変異体を有するch4-4-20抗体の結合の動力学パラメーターは、BIAcoreアッセイ(BIAcore装置1000、BIAcore Inc.、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)を使用して分析した。このアッセイで使用したFcγRIIIAは、FcγRIIIA細胞外領域が上記6.2節に記載したリンカー-AVITAG配列に連結している可溶性単量体タンパク質であった。このアッセイに使用したFcγRIIBは、参照により本明細書に組み込まれている、2003年1月13日に出願された米国仮出願第60/439,709号に記載された方法通りに調製された可溶性二量体タンパク質であった。簡潔には、使用したFcγRIIBは、ヒトIgG2のヒンジ-CH2-CH3ドメインに融合したFcγRIIB細胞外ドメインであった。
【０５１４】
(NHS/EDCの混合物を用いたカルボキシメチル基の修飾による)アミンカップリング化学反応によりセンサーチップ表面の4つのフローセルの1つ(フローセル2)にBSA-FITC(10mM酢酸緩衝液(pH5.0)中に36μg/mL)を固定化することにより、この表面にBSA-FITCの約5000の応答単位(RU)を固定化した。この後に、1M Et-NH2をインジェクトして未反応活性エステルの「キャップを除去(capped off)」した。適切な表面を調製すると、20μg/mL溶液を5μL/mLの流速で1分間インジェクトすることにより、Fc突然変異を担持するch4-4-20抗体に表面を通過させた。表面に結合したch-4-4-20抗体のレベルは400から700RUの範囲であった。次に、HBS-P緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005% Surfactant P20、3mM EDTA, pH7.4)中の受容体(FcγRIIIA-FcおよびFcγRIIB-Fc融合タンパク質)の希釈系列を100μL/minで表面にインジェクトした。異なる受容体希釈物の間の抗体の再生は、100mM NaHCO3(pH9.4);3M NaClの5秒間1回のインジェクトにより行った。
【０５１５】
基準インジェクションとして、アッセイの最初および終わりに、ch-4-4-20抗体を全く有さないBSA-FITC表面にもまた同希釈のこの受容体をインジェクトした。
【０５１６】
データの組全体を収集すると、結果として生じた結合曲線を、製造業者であるBIAcore, Inc.(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)が供給したコンピューターアルゴリズムを使用して全体的にあてはめた。このアルゴリズムはKonおよびKoffの両方を計算し、そこからみかけの平衡結合定数KDを2つの速度定数の比(すなわちKoff/Kon)として推定した。個別の速度定数がどのように得られるかのさらに詳細な処理は、BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore, Inc.、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に見出すことができる。
【０５１７】
2つの異なる濃度(FcγRIIIA融合タンパク質について200nMおよび800nM、ならびにFcγRIIB融合タンパク質について200nMおよび400nM)についての結合曲線を配列させ、捕捉された抗体が同レベルになるように反応を調整し、実験曲線から基準曲線を引いた。会合期および解離期を別々にあてはめた。解離速度定数は、32〜34秒間の解離期について得て、会合期のあてはめは、1:1のLangmuirモデルにより得て、基本のあてはめはRmaxおよびχ2基準に基づき選択した。
【０５１８】
結果
図16に、BSA-FTIC固定化センサーチップ上への突然変異型Fc領域を有するch4-4-20抗体の捕捉を示す。約20μg/mLの濃度の抗体6μLを5μL/minでBSA-FITC表面にインジェクトした。図17は、変異型Fc領域を担持するch-4-4-20抗体へのFcγRIIIAのリアルタイム結合のセンサーグラムである。FcγRIIIAの結合を200nM濃度で分析し、野生型ch-4-4-20抗体について得られた反応レベルに共鳴シグナル反応を基準化した。ch-4-4-20抗体へのFcγRIIIAの結合についての動力学的パラメーターは、2つの異なるFcγRIIIA濃度である200および800nMで得られたデータをあてはめることによって得た(図18)。実線は、32〜34秒間の解離曲線について計算したKoff値に基づいて得られた会合のあてはめを表す。KDおよびKoffは、使用した2つの異なるFcγRIIIA濃度から計算した平均に相当する。図19は、変異型Fc領域を担持するch-4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質のリアルタイム結合のセンサーグラムである。FcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合を200nM濃度で分析し、野生型ch-4-4-20抗体について得られた反応レベルに共鳴シグナル応答を基準化した。ch-4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合についての動力学的パラメーターは、2つの異なるFcγRIIB-Fc融合タンパク質濃度である200および800nMで得られたデータをあてはめることによって得た(図20)。実線は、32〜34秒間の解離曲線について計算したKoffに基づいて得られた会合のあてはめを表す。KDおよびKoffは、使用した2つの異なるFcγRIIB-Fc融合タンパク質濃度からの平均に相当する。
【０５１９】
BIAcore分析から決定した動力学的パラメーター(KonおよびKoff)は、ELISAアッセイから決定された突然変異体の結合特性およびADCCアッセイで決定された突然変異体の機能的活性と相関した。具体的には、表17に示すように、野生型タンパク質に比べて高いADCC活性を有し、ELISAアッセイにより決定されたようにFcγRIIIAの高い結合を有した突然変異体は、FcγRIIIAに対して向上したKoff(すなわち低いKoff)を有した。したがって、野生型タンパク質よりも突然変異型Fcタンパク質についてFcγRIIIAに対するKoff値が低いことは、高いADCC機能を有する見込みがありうる。他方で、表18に示すように、野生型タンパク質に比べて高いADCC活性を有し、ELISAアッセイにより決定されたように、FcγRIIB-Fc融合タンパク質に対して低下した結合を有した突然変異体は、FcγRIIB-Fc融合タンパク質に対して高いKoffを有した。
【０５２０】
このように、FcγRIIIAおよびFcγRIIBについてのKoff値は、突然変異体がADCCアッセイなどの機能的アッセイでどのように挙動するかの予測尺度として使用することができる。実際に、FcγRIIIA-FcおよびFcγRIIB-Fc融合タンパク質についての突然変異体のKoff値に対する野生型タンパク質のKoff値の比を、ADCCのデータに対してプロットした(図21)。具体的には、FcγRIIIAについてのKoff値の場合、Koff(野生型)/Koff(突然変異体)の比をADCCのデータに対してプロットし、FcγRIIBについてのKoff値の場合、Koff(突然変異体)/Koff(野生型)の比をADCCのデータに対してプロットした。1よりも大きい数は、野生型に比べてFcγRIIIAについての解離速度の減少、およびFcγRIIB-Fcについての解離速度の増大を示す。指し示した欄に入る突然変異体は、FcγRIIIAの結合について低いオフ速度、およびFcγRIIB-Fcの結合について高いオフ速度を有し、高いADCC機能を有する。
【表１７】
2009507470.tif 000053
【０５２１】
【表１８】
2009507470.tif 000054
【０５２２】
6.9  固相アッセイを使用した多回濃縮を用いたFc突然変異体についてのスクリーニング
以下の突然変異体のスクリーニングは、FcγRIIIAへの結合向上およびFcγRIIBへの結合減少を示す追加の組の突然変異体を同定することを目的にした。選択されたFc変異体の2次スクリーニングは、ELISAに続いて4-4-20系でADCCについて試験することにより行った。次に、標的としてフルオレセイン被覆SK-BR3細胞およびエフェクター細胞集団としてヒトドナーから単離したPBMCを使用して、突然変異体が4-4-20を介したADCCを媒介する能力に主に基づいて、その突然変異体を選択した。次に、ADCCの相対的増大、例えば係数2の増強を示したFc突然変異体を抗HER2/neuまたは抗CD20 chAbにクローニングし、標的として適切な腫瘍細胞を使用したADCCアッセイで試験した。この突然変異体もまたBIAcoreにより分析し、それらの相対Koffを決定した。
【０５２３】
スクリーニング1: 連続固相枯渇およびFcγRIIB被覆磁気ビーズを使用した選択に続くFcγRIIIA被覆磁気ビーズを用いた選択
このスクリーニングの目的は、FcγRIIBにもはや結合しないか、FcγRIIBへの結合減少を示すかのいずれかのFc突然変異体の同定であった。10倍過剰の未処理ライブラリー(約107細胞)を、FcγRIIBで被覆した磁気ビーズ(「My One」、Dynal)とともにインキュベートした。ビーズに結合した酵母は、磁場中にこの混合物を含む試験管を置くことにより未結合画分から分離した。ビーズに結合しなかった酵母細胞を取り出し、新鮮培地に入れた。次に、これらの細胞をFcγRIIIA被覆ビーズに結合させた。ビーズに結合した酵母は、磁場中にこの混合物を含む試験管を置くことにより未結合画分から分離した。未結合の酵母を除去し、結合した細胞をボルテックスで激しく撹拌することにより取り出した。回収した細胞はグルコース含有培地の中で再生育させ、ガラクトースを含有する選択培地中で再誘導した。この選択工程を繰り返した。次に、最終的な培養物をDNAの採集に使用した。Fcドメインを有する挿入部をPCRにより増幅し、4-4-20にクローニングした。約90個のFc突然変異体を4-4-20 ELISAアッセイおよびADCCアッセイによりスクリーニングし、結果として得られた陽性突然変異体を表19に示す。
【表１９】
2009507470.tif 000055
【０５２４】
スクリーニング2および3: FACS、平衡スクリーニング、および動力学的スクリーニングにより選択された突然変異体
最初のライブラリースクリーニングから、位置396でアミノ酸がプロリンからロイシンに変化した(P396L)突然変異を同定した。このFc変異体は、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方に増大した結合を示した。2番目のライブラリーは、ベースラインとしてP396Lを使用して構築した。PCR突然変異誘発を使用して、それぞれP396L突然変異を有し、追加のヌクレオチド変化を有する約107個の突然変異体を発生させた。2組の条件を使用してP396Lライブラリーをスクリーニングした。
【０５２５】
すでに記載した方法を使用して、単量体としてビオチン化FcγRIIIA-リンカー-avitagを使用して平衡スクリーニングを行った。約7nMのFcγRIIIA、0.5mL中で1時間約10倍過剰のライブラリー(108細胞)をインキュベートした。この混合物をFACSにより分取し、結合細胞の上位1.2%を選択した。選択した酵母細胞を、グルコース含有選択培地中で生育させ、ガラクトース含有選択培地中で再誘導した。繰り返して2回目の平衡スクリーニングを行い、結合細胞の上位0.2%を収集するように分取ゲートを設定した。次に、選択した酵母細胞をグルコース中で選択条件で生育させた。次に、この培養物を使用してDNAを採集した。Fcドメインを有する挿入部をPCRにより増幅し、すでに記載した方法を使用して、4-4-20可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列にクローニングした。約90個のFc突然変異体を4-4-20 ELISAおよびADCCによりスクリーニングし、結果として得られた陽性突然変異体を表20に示す。
【表２０】
2009507470.tif 000056
【０５２６】
動力学的スクリーニングもまた、FcγRIIIAへの結合に向上したKoffを有する突然変異体を同定するために実行した。P396L Fc変異体が酵母表面に提示された株を使用して、P396Lライブラリーをスクリーニングするための条件を樹立した。簡潔には、誘導条件で生育した細胞を0.1μMビオチン化FcγRIIIA-リンカー-avitag単量体とともに1時間インキュベートした。細胞を洗浄して標識されたリガンドを除去した。次に、標識された細胞を0.1μM未標識FcγRIIIA-リンカー-avitag単量体とともに異なる時間インキュベートし、洗浄し、次にSA:PEで染色してFACS分析に供した(図22)。細胞をヤギ抗ヒトFcでもまた染色し、Fcの提示が実験の間に維持されたことを示した。
【０５２７】
競合実験に基づき、1分間のインキュベーションが細胞染色の約50%の喪失を招いたと判定した。P396Lライブラリーを使用した動力学的スクリーニングのためにこの時点を選択した。約10倍過剰のライブラリー(108細胞)を0.1μMビオチン化FcγRIIIA-リンカー-avitag単量体とともに体積0.5mLでインキュベートした。細胞を洗浄し、次に未標識リガンドとともに1分間インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、SA:PEで標識した。この混合物をFACSにより分取し、結合細胞の上位0.3%を選択した。選択された酵母細胞はグルコースを含有する選択培地中で生育させ、ガラクトースを含有する選択培地中で再誘導した。繰り返して2回目の動力学的スクリーニングを行い、結合細胞の上位0.2%を採集するように分取ゲートを設定した。FACSによる結合の向上について、選択されなかったP396Lライブラリーを、選択された酵母細胞と比較した(図23)。ヒストグラムは、FcγRIIIA/PEおよびヤギ抗ヒトFc/FITCの両方で同時染色される細胞の率を示す(上右欄)。
【０５２８】
次に、2回目の分取から選択された酵母細胞を、グルコース中で選択条件で生育させた。次に、この培養物を使用してDNAを採集した。Fcドメインを有する挿入部をPCRにより増幅し、上記の方法を使用して4-4-20可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列にクローニングした。約90個のFc突然変異体を4-4-20 ELISAおよびADCCによりスクリーニングし、結果として得られた陽性突然変異体を表21に示す。
【表２１】
2009507470.tif 000057
【０５２９】
スクリーニング4および5: 固相FcγRIIB枯渇段階と、FcγRIIIA 158V対立遺伝子を使用したFACs分取によるFcγRIIIA選択との組合せ
スクリーニング1からのFc変異体の分析は、2回目のスクリーニングから選択された突然変異が、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方に結合向上を有したことを示した。したがって、確立した条件で磁気ビーズ(固相)を使用した連続枯渇および選択がFcγRIIIAおよびFcγRIIBの結合の差について効率的に選択しなかったことを示唆した。したがって、FcγRIIIAに結合するが、FcγRIIBもは結合減少を有するか、または結合しない突然変異体についてさらに効果的にスクリーニングするために、固相FcγRIIB枯渇段階をFACs分取によるFcγRIIIA選択と組合せた。この組合せによって、野生型Fcよりも大きいまたは等しい親和性でFcγRIIIAに結合するFc変異体を同定した。
【０５３０】
10倍過剰の未処置ライブラリー(約107個)を、FcγRIIB被覆磁気ビーズとともにインキュベートした。この混合物を含む試験管を磁場中に置くことにより、ビーズに結合した酵母を未結合画分と分離した。ビーズに結合していないこれらの酵母細胞を取り出し、新鮮培地に入れ、続いてガラクトース含有培地中で再誘導した。磁気ビーズによるFcγRIIB枯渇を5回反復した。結果として生じた酵母集団を分析し、ヤギ抗ヒトFcで50%を超える細胞染色を示すことを見出した。ごくわずかな率の細胞がFcγRIIIAで染色された。次に、0.1μM ビオチン化FcγRIIIA リンカー-avitagを使用したFACS分取により、これらの細胞を2回選択した(データは示さず)。FcγRIIIAは158Vアロタイプであった。各分取の後に酵母細胞をFcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方の結合について分析し、野生型Fcドメインによる結合と比較した(図24A〜B)。
【０５３１】
次に、2回目の分取から選択された酵母細胞をグルコース中の選択条件で生育させた。次に、この培養物を使用してDNAを採集した。Fcドメインを有する挿入部をPCRにより増幅し、4-4-20可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列にクローニングした。約90個のFc突然変異体を4-4-20 ELISAおよびADCCによりスクリーニングし、結果として得られた陽性突然変異体を表22に示す(突然変異体61〜66)。
【表２２】
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【０５３２】
FcγRIIIAの158F対立遺伝子を使用したFc突然変異体のスクリーニング:
IgG1 Fcドメインに異なる結合親和性を有する、FcγRIIIA受容体の2つの異なる対立遺伝子が存在する(Koene et al., 1997, Blood 90: 1109-1114; Wu et al., 1997, J. Clin. Invest. 100: 1059-70)。158F対立遺伝子は158V対立遺伝子の5〜10分の1の結合定数でFcドメインに結合する。以前に、リガンドとして高結合性158V対立遺伝子を使用して、酵母ディスプレイを用いたFcスクリーニングの全てが行われた。この実験では、リガンドとしてビオチン化FcγRIIIA 158F-リンカー-avitag単量体を使用して、FcγRIIB枯渇酵母集団からFc突然変異体を選択した。FcγRIIIA 158F結合細胞の上位0.25%を選択するように分取ゲートを設定した。結果として得られた濃縮集団をFACSにより分析した(図24B)。次に、個別のクローンを単離し、異なるFcγRへの個のクローンの結合をFACSにより分析した(図24B)。この集団からの個別のクローンの分析は、5つの突然変異を有する単一の突然変異体MgFc67(V284M、S298N、K334E、R355W、R416S)の同定を招いた。この突然変異体は、FcγRIIIAへの結合増強およびFcγRIIBへの結合減少を有した。
【０５３３】
スクリーニング1、2、および3についてのADCCアッセイによる突然変異体の二次スクリーニング:
次に、標準的なADCCアッセイを使用して、上記スクリーニングで選択した突然変異体を分析し、Fc突然変異体を有するch4-4-20により媒介された溶解の相対速度を決定した。すでに上に記載した方法を使用して、Fc変異体を担持するch4-4-20抗体を構築した。上記(6.7節)のように、SK-BR3細胞を標的として使用し、エフェクター細胞は、Ficoll勾配を使用してドナーから単離したPBMCであった。突然変異体についてのADCC活性の結果を表23にまとめる。
【０５３４】
表23に示すように、FcγRIIB枯渇およびFcγRIIIA選択に基づく上記一次スクリーニングおよび二次スクリーニングを使用して単離された突然変異体は、野生型に比べて高いADCC活性を示した。
【表２３】
2009507470.tif 000059
【０５３５】
0.5μg/mL ch4-4-20を使用して突然変異体37、38、39、41、43を分析した。他の抗体全てを1μg/mLで試験した。全ての速度を野生型ch4-4-20(IgG1)に対して基準化した。
【０５３６】
追加的に、抗腫瘍モノクローナル抗体4D5(抗HER2/neu)および抗CD20モノクローナル抗体2H7のFcドメインを交換することにより、これらのモノクローナル抗体の重鎖に突然変異体をクローニングした。これらのキメラモノクローナル抗体を発現させ、精製し、293H細胞への一過性トランスフェクションおよびプロテインGカラムを通した精製による標準的な方法を使用したADCCアッセイで試験した。キメラ4D5抗体は、標的としてSK-BR3細胞を使用したADCCアッセイで試験した(図25)が、キメラ2H7抗体は、標的としてDaudi細胞を使用したADCCアッセイで試験した(図26)。
【０５３７】
BIAcoreによる突然変異体の二次スクリーニング:
次に、上記スクリーニングで選択された突然変異体をBIAcoreにより分析し、FcγRIIIA(158V)およびFcγRIIBへの結合についての動力学的パラメーターを決定した。使用した方法は、上記6.8節に開示した方法に類似していた。
【０５３８】
示したデータは、ch4-4-20モノクローナル抗体におけるFc突然変異体を使用した実験から決定した野生型オフ速度に対するKoff値である。1よりも大きい相対数は、Koff速度の減少を示す。1未満の数は、オフ速度の増大を示す。
【０５３９】
FcγRIIIAに対するオフ速度の減少を示した突然変異体は、MgFc38(K392、P396L)、MgFc43(Y319F、P352L、P396L)、MgFc42(D221E、D270E、V308A、Q311H、P396L、G402D)、MgFc43b(K288R、T307A、K344E、P396L)、MgFc44(K334N、P396L)、MgFc46(P217S、P396L)、MgFc49(K261N、K210M、P396L)であった。FcγRIIBに対するオフ速度の減少を示した突然変異体は、MgFc38(K392、P396L)、MgFc39(E293V、Q295E、A327T)、MgFc43(K288R、T307A、K344E、P396L)、MgFc44(K334N、P396L)であった。Biacoreのデータを表24にまとめる。
【表２４】
2009507470.tif 000060
【０５４０】
6.10  PBMC媒介性ADCCアッセイ
材料と方法
FcγRIIIAへの結合向上を示すFc変異体を、60:1のエフェクター:標的比を用いたPBMCに基づくADCCにより試験した。2つの異なる腫瘍モデル系SK-BR3(抗HER2/neu)およびDaudi(抗CD20)を標的として使用した。各突然変異体について比溶解率を定量した。最大溶解率を100%に設定して、一次回帰分析を用いてデータをプロットした。
【０５４１】
ADCCは、低親和性FcγRと免疫複合体との間の相互作用によりトリガーされるシグナル伝達経路により免疫系エフェクター細胞で活性化する。エフェクター細胞集団は、初代血液または活性化単球由来マクロファージ(MDM)のいずれかから得た。標的細胞にユーロピウムを負荷し、キメラMAbとともにインキュベートし、続いてエフェクター細胞集団とともにインキュベートした。ユーロピウムは51Crと同様に作用するが、放射性ではなく、放出されたユーロピウムは蛍光プレートリーダーで検出される。Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を使用してドナーの末梢血から採集されたリンパ球(PBM)は、主にナチュラルキラー細胞(NK)を含有する。ADCC活性の大部分は、FcγRIIBではなくFcγRIIIAを表面に有するNKにより起こるものである。
【０５４２】
HER2/neuおよびCD20をそれぞれ発現している2つの異なる標的細胞集団SK-BR-3およびDaudiを使用して実験を行った。Ch4-4-20/FITC被覆SK-BR-3、Ch4D5/SKBR3、およびRituxan/Daudiを使用してADCCアッセイを計画した(データは示さず)。同定したFc突然変異体を使用してキメラMAbを改変した。Fc突然変異体をCh4D5にクローニングした。精製Abを使用してSK-BR-3細胞またはDaudi細胞をオプソニン化した。Fc突然変異体をCh4D5にクローニングした。
【０５４３】
結果
Fc突然変異体はSK BR3細胞において向上したPBMC媒介性ADCC活性を示した(図29)。このプロットは、標準ADCCアッセイの一次回帰分析を示す。エフェクター:標的比を75:1で使用して、対数が3の範囲で抗体をタイトレーションした。溶解率(%)=(実験での放出-SR)/(MR-SR)×100。
【０５４４】
Fc突然変異体は、Daudi細胞においてPBMC媒介性ADCC活性の向上を示した(図30)。
【０５４５】
6.11  単球由来マクロファージ(MDM)に基づくADCCアッセイ
マウス腫瘍モデルにおいて、FcγR依存的腫瘍細胞殺滅はマクロファージおよびNK細胞によって媒介される(Clynes et al., 1998, PNAS USA, 95: 652-6)。ドナーから精製した単球をエフェクター細胞として使用して、Fc突然変異体がADCCアッセイにおいて標的細胞の細胞傷害をトリガーする効率を分析した。FcγRI、FcγR3A、およびFcγR2Bの発現パターンは、異なる生育条件により影響される。凍結した単球を、異なる組合せのサイトカインおよびヒト血清を含有する培地中で培養したものからのFcγRの発現を、FcR特異的MAbを使用したFACSにより調べた(図31)。培養細胞をFcγR特異的抗体で染色し、FACSにより分析してMDM FcγRプロファイルを決定した。マクロファージのin vivoのFcγR発現を最もよく模倣する条件、すなわちCD16およびCD32Bを発現している細胞が最大画分を示した条件を、単球由来マクロファージ(MDM)に基づくADCCアッセイに使用した。図31での実験について、水ひした単球を凍らせたものを、M-CSF(条件1)またはGM-CSF(条件2)のいずれかを含有するDMEMおよび20% FBS中で8日間生育させた。図32の実験について、水ひした単球を凍らせたものを、GM-CSF、IL-2、およびIFNγを含有するDMEMおよび20% FBS中で2日間培養してからADCCアッセイを行った。高レベルのCD16およびCD32Bを発現させる無血清条件もまた開発した(データは示さず)。簡潔には、精製単球を、GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-10、およびIL-1βを含有するMacrophage-SFM(Invitrogen)中で6〜8日間生育させた。これらの培養液中のCD32B+/CD16+細胞の存在度は、サイトカインの混合物を使用したときに最高であるが、2つ以上のサイトカインの組合せは、FcγRの発現もまた高めるものである(M-CSF/IL-6、M-CSF/IL-10;またはM-CSF/IL-1β)。ADCCアッセイのために最終の24〜48時間にIFNγを添加する。
【０５４６】
MDMに基づくADCCは、標的細胞の殺滅を観察するために>16時間のインキュベーション時間を必要とした。標的細胞にインジウム-111を負荷した。長いインキュベーションの間にインジウムは標的細胞内に保持される。ガンマカウンターを使用してインジウムの放出を定量した。その他の全ての試薬であるAbおよび標的細胞は、PBMCに基づくADCCアッセイに類似していた。FcγRIが原因のADCC活性は、抗FcRIブロッキング抗体(M21、Ancell)を使用して効率的に遮断することができる。アッセイ条件は、PBMCに基づくアッセイとはやや異なる。標的対エフェクターが20:1、37℃で18〜14時間のインキュベーションである。
【０５４７】
PBMCのADCCの向上、FcγRIIIAへの結合増大、またはFcγRIIBへの結合減少を示すFc突然変異体を試験した(図32)。
【０５４８】
6.12  補体活性に及ぼすFc突然変異体の効果
Fc突然変異体は、FcγRIIIAへのその結合増大に基づき最初に同定した。続いて、全ての低親和性受容体についての親和性向上および多くの場合でPBMCにより媒介されるADCCにおける活性向上について、これらの突然変異体を確認した。in vivo抗体媒介性細胞傷害は、複数のメカニズムにより起こることがある。ADCCに加えて、その他の可能性のあるメカニズムには、補体依存性細胞傷害(CDC)およびアポトーシスがある。免疫グロブリンのFc領域へのC1qの結合は、CDCにより細胞溶解を生じるカスケードとして開始する。C1qとFcとの相互作用は、一連のFc突然変異体で研究されている。これらの実験結果は、C1qおよび低親和性FcRがFcの重複する領域に結合するが、Fc内の正確な接触残基は変動することを示す。
【０５４９】
PBMCに基づくアッセイにおいてADCCの向上を示した突然変異体のCDCでの効果について、それらの突然変異体を調べた。抗CD20 Ch-mAb、2H7で抗体を分析した。試験した各突然変異型ch-mAbについて向上したCDCを検出した。興味深いことに、向上したADCCについてこれらの突然変異体が選択されたが、これらの突然変異体はCDCの向上もまた示す。
【０５５０】
材料と方法
Fc突然変異体を試験するために抗CD20および標的としてDaudi細胞を用いたCDCアッセイを使用した。モルモット血清(US Biological)を補体原として使用した。CDCアッセイはPBMCに基づくADCCに類似していた。標的細胞にユーロピウムを負荷し、ChMAbでオプソニン化した。しかし、補体であるモルモット血清をエフェクター細胞の代わりに添加した。図33はアッセイのフローチャートを示す。3オーダーの強度にわたり抗CD20 ChMabをタイトレーションした。溶解率(%)を計算した。Daudi細胞(3×106個)をBADTA試薬で標識した。1×104細胞を96ウェルプレートのウェルに分取した。3倍希釈を用いて抗体をウェルにタイトレーションした。オプソニン化反応は、5% CO2中で37℃で30〜40分間進行させた。モルモット血清を終濃度20%まで添加した。反応は5% CO2中で37℃で3.5時間進行させた。続いて、細胞培養液100ulを反応物に添加し、細胞を遠心沈殿させた。検出のために、上清20ulをユーロピウム溶液200ulに添加し、プレートをVictor2(Wallac)で読み取った。
【０５５１】
結果:
活性化FcRまたはC1qのいずれかに対する結合向上を示す全ての突然変異体を、CDCアッセイに配置した(図34)。FcγRIIIAへの結合増強を示したFc突然変異体は、補体活性の向上もまた示した。各突然変異体は、野生型に比べて高い補体活性を示す。試験した突然変異体は二重突然変異体である。それぞれの場合で、存在する突然変異の1つはP396Lである。
【０５５２】
CDCでの増大がIgG1 FcへのC1qの結合増大と相関したかどうかを判定するために、表面プラズモン共鳴を使用して2つのタンパク質の間の結合をリアルタイムで測定した。C1qとIgG1 Fcとの間の結合を調べるために、Fc変異体を抗CD32B ch-mAbである2B6にクローニングした。これにより本発明者らは、可溶性CD32Bタンパク質を介して野生型抗体および突然変異型抗体をガラススライドに捕捉することができた(図36A)。CDCを試験した4つの突然突然変異体のうち3つもまたBiacoreで調べた。3つ全てが、野生型Fcに比べてずっと高いKoffを示した(図36B)。2B6突然変異体へのC1qの結合のためのBiacore形式は、P396L突然変異を有する突然変異体の結合増強を実証した(図37)。突然変異D270Eは異なる程度でC1qの結合を減少することができる。FcγRおよびC1qの結合の動力学的分析の概要を下の表25に示す。
【表２５】
2009507470.tif 000061
【０５５３】
6.13  FcγRIIBへの結合が減少したFc変異体の設計
FcγRIIBへの結合を減少させ、FcγRIIA 131Hへの結合を増大させるFc突然変異体についての選択に基づいて、D270Eを含むいくつかの突然変異を同定した。低親和性Fc受容体およびその対立遺伝子変異体への結合について各突然変異を個別に試験した。
【０５５４】
D270EがFcγRIIBの結合を特異的に減少させるであろうと示唆した結合特性をD270Eは有した。全てのFcRへの結合向上に基づいて以前に同定された突然変異と組合せてD270Eを試験した。
【０５５５】
結果
表26および27、ならびに図38および39に示すように、D270E突然変異の付加は、FcγRIIIAおよびFcγRIIA H131の結合を高め、FcγRIIBへの結合を減少させる。図40は、選択された突然変異体についてのCD32A H131Hの結合について決定された、Koffに対するMDM ADCCデータのプロットを示す。
【表２６】
2009507470.tif 000062
【０５５６】
【表２７】
2009507470.tif 000063
【０５５７】
6.14  Fc突然変異体の動力学的パラメーターの分析
2つのアロタイプのFcγRIIIA、FcγRIIA 131H、およびFcγRIIBにFc突然変異体を有するキメラ4D5抗体の結合の動力学的パラメーターは、上記6.8節に開示した方法に類似した方法を用いてBIAcoreにより分析した。2つのアロタイプのFcγRIIIA、すなわちFcγRIIIA 158V、およびFcγRIIIA 158Fを上記6.9節にさらに詳細に述べる。
【０５５８】
材料と方法
このアッセイに使用した両アロタイプのFcγRIIIAは、可溶性単量体タンパク質であり、FcγRIIIAの細胞外領域は、6.2節に記載するようにリンカー-AVITAG配列に連結している。このアッセイに使用したFcγRIIBおよびFcγRIIAは、可溶性二量体タンパク質であり、すなわちFcγRIIBまたはFcγRIIAの細胞外ドメインは、上記6.8節に記載されたヒトIgG2のヒンジ-CH2-CH3ドメインに融合していた。
【０５５９】
BIAcoreの方法および分析の詳細は、6.8節に見出される。このアッセイでは、変異型Fc領域を、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2/neu)に特異的なキメラ4D5抗体にクローニングした。抗原HER2/neuをセンサーチップのフローセルの1つに固定化した。次に、流速5μl/minで300mM溶液を3分間インジェクションすることにより、Fc突然変異体を担持するキメラ4D5抗体に表面を通過させた。次に、HBS-P緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCL、0.005% Surfactant P20、3mM EDTA、pH7.4)中でこの受容体を段階希釈したものを100μl/minで表面にインジェクトした。
【０５６０】
2つの異なる濃度の受容体についての結合曲線(FcγRIIIA V158およびFcγRIIIA 158Fの両方について400nMおよび800nM;FcγRIIAおよびFcγRIIBの両方について100nMおよび200nM)を整列させ、同レベルの捕捉された抗体に反応を調整し、実験曲線から基準曲線を引いた。会合期および解離期を別々にあてはめた。
【０５６１】
結果
FcγRIIIAのアロタイプ158Vおよび158F、FcγRIIB、ならびにFcγRIIA 131Hの結合を分析し、野生型キメラ4D5抗体について得られた反応レベルに共鳴反応を基準化した。キメラ4D5抗体へのFcγRの結合についての動力学的パラメーターは、2つの異なるFcγR濃度、すなわちFcγRIIIA V158およびFcγRIIIA 158Fの両方について400nMおよび800nM;FcγRIIAおよびFcγRIIBの両方について100nMおよび200nMでデータをあてはめることにより得た。
【０５６２】
表28は、表示した変異型Fc領域と関連して分析した4つの受容体のそれぞれについてのオフ速度を表す。
【表２８】
2009507470.tif 000064
【０５６３】
表29は、野生型オフ速度に対するキメラ4D5抗体のKoff値を計算したときの2回繰り返しの実験結果を表す。1を超える相対数は、Koff値の減少を示す。1未満の数はKoff速度の増大を示す。
【表２９】
2009507470.tif 000065
【０５６４】
6.15  Fc突然変異体のADCCアッセイ
実施例6.14で、FcγIIIAおよび/またはFcγIIAに対して増大した親和性を含むと同定されたFc突然変異の相対ADCC活性についてそれらの突然変異体を分析した。
【０５６５】
材料と方法
ADCCアッセイに関する詳細は、6.7節に見出される。このアッセイでは、インジウム-111を負荷したHT29結腸癌細胞(ATCC受託番号HTB-38)を標的として使用し、エフェクター細胞は、Ficoll勾配を用いてドナーから単離されたPBMCであった。標的細胞は、変異型Fc領域を含む終濃度2〜5000ng/mlのキメラ4D5抗体でオプソニン化した。次に、オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞に添加して、エフェクター:標的比を50:1とし、37℃、5% CO2で18時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を約220×gで10℃で5分間遠心分離した。上清中のインジウム-111のレベルをガンマカウンターで記録した。
【０５６６】
結果
変異型Fc領域であるMGFc88(F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L)、MGFc88A(F243L、R292P、Y300L、P396L)、およびMGFc155(F243L、R292P、Y300L)を含むキメラ4D5抗体を、FcγRIIIAおよび/またはFcγIIAに対する結合増強に基づいて選択し、それらのADCC活性について試験した。図41AおよびBは、試験したFc変異体が、20ng/mlを超えるオプソニン化濃度で濃度依存的に野生型抗体に比べて高いADCC活性を示すことを示している。このデータは、FcγRIIIAに対して増大した親和性を含むと同定されたFc突然変異体が、高いADCC活性もまた示すと考えられることを示している。
【０５６７】
6.16  in vivo腫瘍モデルにおいてFc突然変異体が媒介する腫瘍成長の制御
in vivo腫瘍モデル系を用いて、FcγIIIAおよび/またはFcγIIAに対して高い親和性を含むと同定されたFc突然変異体を、腫瘍制御の相対有効性についてさらに分析した。
【０５６８】
材料と方法
マウス異種移植系での抗腫瘍活性についてFc突然変異体を有する抗体を試験した。Balbc/ヌードマウスにDaudi細胞5×106個を皮下注射し、続いて病気の全身徴候、例えば体重増加/減少およびグルーミング活動についてモニターした。無処置では、このモデル系は腫瘍細胞接種から約2週間の平均生存期間で100%の死亡率を生じる。処置は、1週間間隔で適用した野生型抗体または変異型Fc領域を含む抗体の投与からなる。同間隔で緩衝液単独を投与した動物を対照とする。式(幅2×長さ)/2により推定した皮下の腫瘍の体積に基づいて腫瘍重量を計算する。
【０５６９】
結果
Daudi細胞を接種したマウスに、1週間間隔で野生型ヒト化2B6(「h2B6」)、突然変異型FcMG0088(F243L、R292P、Y300L、V305I P396L)を含むヒト化2B6(「h2B6 0088」)、または緩衝液単独を投与した。野生型およびFc突然変異型h2B6抗体は、試験した最高用量スケジュールである1週間用量25μgで類似のレベルの腫瘍抑制を示した(図42AおよびB)。しかし、抗体の有効性の有意差は、用量を減らしたときに観察された。野生型h2B6の投薬量を100分の1および10分の1に減らすと、緩衝液単独の投与よりも大きい腫瘍制御はもたらされなかった(図42A)。対照的に、h2B6 0088は、2.5μgの1週間用量で有意な防御を、および0.25μgの1週間用量で少なくとも限定された防御をもたらした(図42B)。
【０５７０】
最低用量のFc突然変異型抗体によってさえも付与される防御を、生存の比較により確認した。11週目に0.25μg用量のh2B6 0088で処置した群では、同用量の野生型h2B6で処置した群での7匹中わずか1匹に比べて、マウス7匹中4匹が生存した(図43AおよびB)。
【０５７１】
本明細書に開示された特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様の例示として意図されるため、本明細書において記載および請求された本発明は、これらの実施形態により範囲が限定されるべきではない。任意の均等な実施形態が、本発明の範囲内に入ると意図される。実際に、本明細書に表示および記載された改変に加えた、本発明の様々な改変は、上述の記載から当業者に明らかとなるであろう。当該改変もまた添付の特許請求の範囲の範囲内に入ると意図される。
【０５７２】
本出願の至るところで様々な刊行物が引用されている。それらの内容は、これによって全ての目的でその全体が本出願に参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０５７３】
【図１】8B5.3.4可変軽鎖ドメインの配列を示す概略図である。8B5.3.4 VLのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列(それぞれ配列番号11および10)の図。
【図２】8B5.3.4可変重鎖ドメインの配列を示す概略図である。8B5.3.4 VHのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列(それぞれ配列番号12および9)の図。
【図３】組換え可溶性FcγRのSDS-PAGE分析を示す図である。組換え可溶性FcγRタンパク質の純度を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。このゲルをクマシーブルーで染色した。レーン1:精製組換え可溶性FcγRIIIA;レーン2:分子量マーカー;レーン3:分子量マーカー;レーン4:精製組換え可溶性FcγRIIB。棒線はマーカーの分子量を表し、上から下にそれぞれ分子量98、50、36、および22KDaに対応する。
【図４】組換え可溶性FcγRのELISAアッセイを示す図である。凝集型IgGおよび単量体型IgGへの精製組換え可溶性FcγRIIIAの直接結合をELISAアッセイを使用して決定した。(▲)3G8存在下の凝集型IgG;(◆)ビオチン化IgG;(■)凝集型IgG;(×)マウスIgG1存在下の凝集型IgGの結合。
【図５】ELISAアッセイを用いたFcγRIIIA四量体型複合体の特徴付けを示す図である。A.可溶性四量体FcγRIIIA複合体は、特異的に可溶性単量体型ヒトIgGに結合する。ヒトIgGへの可溶性四量体FcγRIIIAの結合は、3G8(◆)マウス抗FcγIIIAモノクローナル抗体により遮断される。D265A突然変異を有する4-4-20モノクローナル抗体は、凝集型ヒトIgGへの可溶性四量体性FcγRIIIAの結合を遮断することができなかった(Δ)。B.可溶性単量体型ヒトIgGへの可溶性四量体型FcγRIIIA複合体の結合(■)を、可溶性単量体型ヒトIgGへの単量体型可溶性FcγRIIIAの結合(◆)と比較する。
【図６−１】磁気ビーズアッセイを用いたFcγRIIIA四量体型複合体の特徴付けを示す図である。A.FcγRIIIA複合体:2つのFcγRIIIA(黒)はモノクローナル抗体DJ130c(1次Ab)により連結している;抗マウスF(ab)2はPE(丸)にコンジュゲートしている。B.Fc被覆ビーズに結合したFcγRIIIAのFACS分析:(a)ビーズ単独;(b)FcγRIIIAを有さない複合体;(c)FcγRIIIAを有する複合体;(d)FcγRIIIAおよびLNK16を有する複合体。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図７】Fc含有構築物を示す概略図である。pYD1にクローニングされたIgG1 Fcドメインの概略図を示す。白四角は、ヒンジ-CH2-CH3ドメインを表し;平行の垂直線はCH1ドメインを表す。GIF206および227構築体の場合はN-末端アミノ酸を示す。下線部残基はヒンジ領域に対応し;*はXpressエピトープタグを表し;斜線の四角はGly4-Serリンカーを表し、点彩の四角はAga2p遺伝子を表す。
【図８−１】酵母細胞壁上のFc融合タンパク質のFACS分析を示す図である。PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体(図8A〜D)またはHP6017(Sigma)マウス抗ヒトIgG1 Fc(CH3)特異的モノクローナル抗体(図8E〜H)いずれかとともに細胞をインキュベートした。AおよびEはベクター単独を表し;BおよびF欄はCH1-CH3構築物を表し;CおよびG欄はGIF227を表し;DおよびH欄はGIF 206構築物を表す。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図８−３】図８−２の続きである。
【図８−４】図８−３の続きである。
【図９−１】表面に提示されたFc融合タンパク質への可溶性四量体性FcγRIIIAの結合を示す図である。pYD1-CH1(A);pYD-CH1-D265A(B);およびpYDベクター(C)を有する細胞を、細胞表面にAga2p融合タンパク質を発現させる条件で生育させた。それぞれ0.15mM、7.5mM、および7.5mMのFcγRIIIAとともに細胞をインキュベートし、FACSにより分析した。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０】表面に提示されたFc融合タンパク質への可溶性四量体性FcγRIIIAの結合の特徴付けを示す図である。酵母細胞表面上のFc融合タンパク質へのFcγRIIIA四量体型複合体の結合を分析した。PE-コンジュゲートFcγRIIIA四量体型複合体を種々の濃度の3G8(◆)、LNK(▲)、または無関係のアイソタイプ対照(■)とともに予備インキュベートし、続いて酵母細胞とともにインキュベートした。PE蛍光について細胞をFACSにより分析した。FcγRIIIA四量体型複合体に結合した細胞の率をy軸にプロットした。
【図１１】FcγRIIIAへの結合が増加したFc突然変異体を選択するための分取ゲートの例を示す図である。細胞をPE-コンジュゲートFcγRIIIA四量体型複合体(y軸)および抗Fc-FITCコンジュゲート抗体(x軸)で染色した。枠内の領域は、細胞集団の約1.0%を選択するように設定した分取ゲートを表す。
【図１２−１】FcγRIIIA四量体型複合体に対して増大した親和性を有すると同定された一部のFc突然変異体のFACS分析を示す図である。グルコースを含有する選択培地中で、独立したFc突然変異を有するpYD-CH1プラスミドを有する個別のクローンを増幅し、ガラクトースを含有する選択培地中でFc発現について誘導し、続いてFACsにより分析した。図12AおよびBは野生型Fcを有する細胞を表し;図12CおよびDは突然変異体第5番を表し;図12EおよびFは突然変異体第20番を表し;図12GおよびHは突然変異体第21番を表し;図12IおよびJは突然変異体第24番を表し;図12KおよびLは突然変異体第25を表し;図12MおよびNは突然変異体第27番を表す。細胞をFcγRIIIA四量体型複合体(図12A、C、E、G、I、K、およびM)またはFcγRIIB四量体型複合体(図12B、D、F、H、J、L、およびN)で染色した。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−２の続きである。
【図１２−４】図１２−３の続きである。
【図１２−５】図１２−４の続きである。
【図１２−６】図１２−５の続きである。
【図１２−７】図１２−６の続きである。
【図１３】ELISAによる4-4-20モノクローナル抗体におけるFc突然変異体の特徴付けを示す図である。pYD-CH1プラスミド由来のFcドメインをキメラ4-4-20モノクローナル抗体の重鎖にクローニングした。4-4-20モノクローナル抗体を293細胞に発現させ、上清を収集した。ELISAプレートをフルオレセインコンジュゲートBSAで被覆し、キメラ4-4-20突然変異型抗体を捕捉した。次に、Fcドメインへの変異型受容体の相対親和性を決定するために、4-4-20モノクローナル抗体を吸収させたELISAプレートにFcγRIIIA(A)およびFcγRIIB(B)受容体を被覆した。突然変異体第15番および第29番は、対照として含めた非結合性単離体であった。
【図１４】4-4-20モノクローナル抗体における突然変異体のADCC活性を示す図である。突然変異型Fc領域を有する4-4-20抗体のADCC化活性についてこの抗体を評価し、野生型4-4-20抗体のADCC活性と比較した。分析した突然変異体は以下の通りである: MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-26(D265A)、MGFc-27(G316D、A378V、D399E)、MGFc28(N315I、A379M、D399E)、MGFc29(F243I、V379L、G420V)、MGFc30(F275V)、MGFc-31(P247L、N421K)、MGFc-32(D280E、S354F、A431D、L441I)、MGFc-33(K317N、F423欠失)、MGFc-34(F241L、E258G)、MGFc-35(R255Q、K326E)、MGFc-36(K218R、G281D、G385R)。
【図１５−１】HER2/neuヒト化モノクローナル抗体における突然変異体のADCC活性を示す図である。A.突然変異型Fc領域を有するヒト化HER2/neuモノクローナル抗体のADCC活性についてこの抗体を評価し、野生型Her2/neu抗体のADCC活性と比較した。分析した突然変異体は以下の通りである:MGFc-5(V379M)、MGFc-9(F243I、V379L)、MGFc-10(K288N、A330S、P396L)、MGFc-13(K334E、T359N、T366S)、MGFc-27(G316D、A378V、D399E)。B.ヒト化Her2/neuモノクローナル抗体に関連した追加の突然変異体MGFc-37(K248M)、MGFc-39(E293V Q295E、A327T)、MGFc-38(K392T、P396L)、MGFc-41(H268N、P396L)、MGFc-23(K334E、R292L)、MGFc-44、MGFc-45のADCC活性。各突然変異体について2つの独立したクローンを試験した。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１６】BSA-FITC表面でのch4-4-20抗体の捕捉を示す図である。濃度約20μg/mLの抗体6μLを5μL/分でBSA-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)表面にインジェクトした。突然変異型Fc領域を有するch4-4-20抗体の、BSA-FITC固定化センサーチップ表面上の結合のBIAcoreセンサーグラムを示す。マーカーは、捕捉された野生型抗体の反応に設定した。
【図１７】変異型Fc領域を担持するch4-4-20抗体へのFcγRIIIAのリアルタイム結合を示すセンサーグラムである。変異型Fc領域を担持するch-4-4-20抗体へのFcγRIIIAの結合を200nM濃度で分析した。野生型について得られたch-4-4-20抗体のレベルに反応を基準化した。使用した突然変異体は以下の通りであった: Mut6(S219V)、Mut10(P396L、A330S、K288N); Mut18(K326E); Mut14(K334E、K288N); Mut11(R255L、F243L); Mut16(F372Y); Mut19(K334N、K246I)。
【図１８−１】変異型Fc領域を担持する抗体に結合するFcγRIIIAの動力学的パラメーターの分析を示す図である。変異型Fc領域を担持する抗体へのFcγRIIIAの結合の動力学的パラメーターは、200nMおよび800nMについて別々の最良あてはめの曲線を作製することによって得た。実線は、32〜34秒間隔で解離曲線について計算したkoff値に基づいて得られた会合あてはめを示す。Kdおよびkoff値は2つの濃度の平均を表す。
【図１８−２】図１８−１の続きである。
【図１８−３】図１８−２の続きである。
【図１８−４】図１８−３の続きである。
【図１８−５】図１８−４の続きである。
【図１８−６】図１８−５の続きである。
【図１８−７】図１８−６の続きである。
【図１８−８】図１８−７の続きである。
【図１９】変異型Fc領域を担持する抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質のリアルタイム結合を示すセンサーグラムである。変異型Fc領域を担持するch-4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合は200nM濃度で分析した。野生型について得られたch-4-4-20抗体のレベルに反応を基準化した。
【図２０−１】変異型Fc領域を担持する抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質の動力学的パラメーターの分析を示す図である。変異型Fc領域を担持する抗体へのFcγRIIB-Fcの結合についての動力学的パラメーターは、200nMおよび800nMについて別々の最良あてはめの曲線を作製することによって得た。実線は、32〜34秒間隔で解離曲線について計算したkoff値に基づいて得られた会合あてはめを示す。KdおよびKoff値は、2つの濃度の平均を表す。使用した突然変異体は以下の通りである: Mut6(S219V)、Mut10(P396L、A330S、K288N); Mut18(K326E); Mut14(K334E、K288N); Mut11(R255L、F243L); Mut16(F372Y); Mut19(K334N、K246I)。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２０−３】図２０−２の続きである。
【図２１】ADCCのデータに対してプロットした、FcγRIIIA-FcについてのKoff(野生型)/Koff(突然変異体)の比を示す図である。1よりも大きい数は、野生型に比べてFcγRIIIAの結合についての解離速度の減少およびFcγRIIB-Fcの結合についての解離速度の増大を示す。枠内の突然変異体は、FcγRIIIAの結合について低いオフ速度およびFcγRIIB-Fcの結合について高いオフ速度を有する。
【図２２】未標識FcγRIIIAとの競合を示す図である。FcγRIIIAへの結合について改善されたKoff速度を有するFc領域突然変異体を同定するために動力学的スクリーニングを実行した。P396L突然変異を有するFc領域変異体のライブラリーを、0.1μMビオチン化FcγRIIIA-リンカー-Avitagとともに1時間インキュベートし、次に洗浄した。続いて0.8uMの未標識FcγRIIIAを標識酵母とともに種々の時間インキュベートした。酵母を遠心沈殿させ、未標識FcγRIIIAを除去した。FACS分析のために、受容体に結合した酵母をSA(ストレプトアビジン):PE(フィコエリトリン)で染色した。
【図２３】動力学的スクリーニングに基づくFACS分析を示す図である。図22に示したデータから計算したKoffに基づき、1分時点での選択を選んだ。10倍過剰のライブラリーを0.1μMビオチン化FcγRIIIA-リンカー-Avitag単量体とともにインキュベートし、細胞を洗浄し、未標識リガンドとともに1分間インキュベートし、次に洗浄し、SA:PEで標識した。次に、細胞をFACSにより分取し、結合細胞の上位0.3%を選択した。選択されなかったP396Lライブラリーは、結合向上についてFACSにより選択された酵母細胞と比較した。このヒストグラムは、FcγRIIIA/PEおよびヤギ抗ヒトFc/FITCの両方で同時染色される細胞の率を示す。
【図２４−１】FcγRIIBへのFc結合細胞の固相枯渇に基づく選択を示す図である。A.磁気ビーズを用いたFcγRIIB枯渇およびFcγRIIIA選択に基づきP396Lライブラリーをスクリーニングした。磁気ビーズによるFcγRIIB枯渇を5回繰り返した。結果として得られた酵母集団を分析し、ヤギ抗ヒトFcで50%を超える細胞の染色を示すことを見出し、非常にわずかな率の細胞がFcγRIIIAで染色した。続いて、0.1μMビオチン化FcγRIIIA リンカー-avitagを用いたFACSにより細胞を2回選択した。各分取の後にFcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方の結合について酵母細胞を分析し、野生型の結合と比較した。B.ビオチン化FcγRIIIA 158Fリンカーavitag単量体をリガンドとして用いて、FcγRIIB枯渇酵母集団からFc突然変異体を選択した。分取ゲートは、FcγRIIIA 158F結合細胞の上位0.25%を選択するように設定した。異なるFcγRIIIA(158Fおよび158V)、FcγRIIIB、およびFcγRIIA(131R)への結合について、結果として得られた濃縮集団をFACSにより分析した。
【図２４−２】図２４−１の続きである。
【図２４−３】図２４−２の続きである。
【図２４−４】図２４−３の続きである。
【図２４−５】図２４−４の続きである。
【図２５】Fc突然変異体を担持するキメラ4D5により媒介されるSKBR3標的細胞の溶解の相対速度を示す図である。試験した各Fc突然変異体について溶解の相対速度を計算した。Fc突然変異体を有する4D5抗体の溶解速度を、野生型4D5抗体により媒介される溶解速度で割った。少なくとも2回の独立したアッセイからのデータを平均し、ヒストグラムにプロットした。2つの異なる抗体濃度からの各Fc突然変異体のデータについて示す。抗体濃度は、溶解が約50%の曲線上の点に並ぶように選択した。
【図２６】Fc突然変異体を有するキメラ2H7により媒介されるDaudi細胞溶解の相対速度を示す図である。試験した各Fc突然変異体について溶解の相対速度を計算した。Fc突然変異体を有する2H7抗体についての溶解速度を、野生型2H7抗体により媒介される溶解の速度で割った。少なくとも1〜2回の独立したアッセイからのデータを平均し、ヒストグラムにプロットした。各Fc突然変異体について、2つの異なる抗体濃度からのデータを示す。溶解が約50%の曲線上の点に基づいて、抗体濃度を選択した。
【図２７】ライブラリーの産生を示す概略図である。DNA鎖を表す。順方向の矢印は突然変異コドンを有するプライマーを表す。逆方向の矢印は逆遺伝子特異的オリゴを表す。
【図２８】遺伝子構築プロトコールによるライブラリーの産生のための戦略を示す図である。長方形の枠は、それぞれヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを表す。短い黒の線は5'オーバーハングを有する二本鎖オリゴを表す。
【図２９】新規なFc突然変異体がSKBR3細胞におけるPBMC媒介性ADCCを向上させることを示す図である。このプロットは標準ADCCアッセイの一次回帰分析を示す。75:1のエフェクター対標的比を使用して、対数が3の範囲で抗体をタイトレーションした。溶解率(%)=(実験的放出-SR)/(MR-SR)×100。
【図３０】新規なFc突然変異体がDaudi細胞におけるPBMC媒介性ADCCを向上させることを示す図である。このプロットは、標準ADCCアッセイの一次回帰分析を示す。75:1のエフェクター対標的比を使用して、対数が3の範囲で抗体をタイトレーションした。溶解率(%)=(実験的放出-SR)/(MR-SR)×100。
【図３１】単球のサイトカイン処理のときのFACSによるFc受容体プロファイルを示す図である。単球のサイトカイン処理は低親和性Fc受容体の発現を増加させる。洗浄した単球を無血清培地中で特異的サイトカインを用いて培養した。Fc受容体のプロファイルをFACSを用いてアッセイした。
【図３２】マクロファージ由来単球に基づくADCCにおいてFc突然変異体を使用した腫瘍細胞殺滅の向上を示す図である。対数が2の範囲のCh4D5 MAbの濃度を、35:1のエフェクター:標的比を使用して試験した。溶解率は図30と同様に計算した。
【図３３】補体依存性細胞傷害アッセイのフローチャートを示す図である。このフローチャートは、使用したCDCアッセイを概要している。
【図３４】補体依存性細胞傷害活性を示す図である。FcγRIIIAに高い結合を示すFc突然変異体は、向上した補体活性もまた示した。3オーダーの強度にわたる抗CD20 ChMAbをタイトレーションした。溶解率を図30と同様に計算した。
【図３５】Fc突然変異体の選択のための意志決定樹図である。Fc突然変異体を選択するための例示的なプロトコール。
【図３６】2B6抗体へのC1qの結合を示す図である。A. 補体カスケードの第一成分への2B6の結合の分析のためのBIAcore形式を示す略図である。B. 変異型Fc領域を担持する2B6抗体のC1qへのリアルタイム結合のセンサーグラム。
【図３７】2B6突然変異型抗体へのC1qの結合を示す図である。C1q(3.25nM)への2B6突然変異体のリアルタイム結合のセンサーグラム。欄AのMgFc51(Q419H、P396L)およびMgFc51/60; MgFc55およびMgFc55/60(欄B); MgFc59およびMgFc59/60(欄C); ならびにMgFc31/60(欄D)に突然変異体を示す。
【図３８】FcγRIIBへの結合が減少したFc変異体を示す図である。R255L、P396L二重突然変異体(MgFc55)に及ぼすD270E(60)の効果を比較するための、ch4D5抗体へのFcRの結合。異なる濃度のFcR、すなわち400nM CD16A 158V;800nM CD16A 158F;200nM CD32B;200nM CD32A 131HでKDを分析した。Biacore3000ソフトウェアを用いて別々のKDを使用して分析を行った。
【図３９】FcγRIIB枯渇/FcγRIIA H131選択から選択された4D5突然変異体の動力学的特性を示す図である。CD32B枯渇およびCD32A H131スクリーニング戦略により選択された異なるFc突然変異を担持するch4D5抗体へのFcRの結合。種々の濃度のFcR、すなわち400nM CD16A 158V;800nM CD16A 158F;200nM CD32B;200nM CD32A 131HでKDを分析した。Biacore3000ソフトウェアを用いて別々のKDを使用して分析を行った。
【図４０】BIAcoreにより決定されたCD32A 131Hの結合について決定されたKOFFに対するMDM ADCCのデータのプロットを示す図である。突然変異体は以下の通りである: MgFc25(E333A、K334A、S298A); MgFc68(D270E); MgFc38(K392T、P396L); MgFc55(R255L、P396L); MgFc31(P247L、N421K); MgFc59(K370E、P396L)。
【図４１】HER2/neuキメラモノクローナル抗体における突然変異体のADCC活性を示す図である。突然変異型Fc領域を有するキメラHER2/neuモノクローナル抗体のADCC活性について2回の繰り返しでこの抗体を評価し、野生型、キメラHer2/neu抗体のADCC活性と比較した。分析した突然変異体は以下の通りである: MGFc88(F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L)、MGFc88A(F243L、R292P、Y300L、P396L)、MGFc155(F243L、R292P、Y300L)。
【図４２】野生型またはFc突然変異型h2B6で処置したマウスにおける推定腫瘍重量を示す図である。Balb/cヌードマウスにDaudi細胞を皮下接種し、このマウスに野生型h2B6(A)またはFc突然変異体MGFc0088(F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L)を有するh2B6(B)のいずれかの1週間用量25μg、2.5μg、または0.25μgを投与した。緩衝液単独を投与したマウスを対照として使用した。式(幅2×長さ)/2による皮下腫瘍の推定体積に基づき腫瘍重量を計算した。
【図４３】野生型またはFc突然変異型h2B6を用いて処置された腫瘍担持マウスにおける生存を示す図である。ヌードマウスにDaudi細胞を接種し、このマウスに野生型h2B6(A)またはFc突然変異体MGFc0088(F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L)を有するh2B6(B)のいずれかの1週間用量25μg、2.5μg、または0.25μgを投与した。緩衝液単独を投与したマウスを対照として使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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