(57)【要約】水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物であるときに、該水性−有機溶媒で植物材料又は動物材料を抽出することによって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、一般的に、該溶液を近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有するラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する近臨界流体相を生成する工程；近臨界流体相をラフィネート相から分離する工程；及び近臨界流体相からの低〜中極性構成成分と、ラフィネート相からの高極性構成成分とを回収する工程を含む方法。
2009525863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物であるときに、該水性−有機溶媒で植物材料又は動物材料を抽出することによって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、
（ａ）該溶液を近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有するラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）近臨界流体相をラフィネート相から分離する工程；及び
（ｃ）近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物であるときに、該水性−有機溶媒で植物材料又は動物材料を抽出することによって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、
（ａ）該溶液を近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１近臨界流体相を第２ラフィネート相と接触させて、中極性構成成分を含有する第３ラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する第２近臨界流体相を生成する工程；
（ｄ）第２近臨界流体相を第３ラフィネート相から分離する工程；及び
（ｅ）第２近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収する工程
を含む方法。
【請求項３】
該水性相から高極性構成成分を回収する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２及びジメチルエーテルから成る群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
近臨界流体が超臨界ＣＯ２又は液体ＣＯ２である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
近臨界流体がジメチルエーテルである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
水混和性有機溶媒がＣ１−Ｃ４アルコールである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該Ｃ１−Ｃ４アルコールがエタノールである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該近臨界流体が超臨界ＣＯ２であるときに、該水性−有機溶媒が５０〜９９容量％のエタノールを含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該水性−有機溶媒が７０〜９９容量％のエタノールを含有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該近臨界流体がジメチルエーテルであるときに、該水性−有機溶媒が０〜７０容量％のエタノールを含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
該水性−有機溶媒が０〜５０容量％のエタノールを含有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
該水混和性有機溶媒が、Ｃ３−Ｃ５ケトン、Ｃ１−Ｃ４カルボン酸、及びジメチルスルホキシドから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該近臨界流体相の圧力及び／又は温度を下げることによって、該近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
第２近臨界流体相の圧力及び／又は温度を下げることによって、第２近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収する、請求項３記載の方法。
【請求項１７】
２つ以上の画分中の低〜中極性構成成分を回収するために、圧力を２工程以上で下げる、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
圧力を下げずに、ラフィネート相と近臨界流体相を取り出す連続方法として、方法が行われる、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
圧力を下げずに、第３ラフィネート相と第２近臨界流体相を取り出す連続方法として、方法が行われる、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物であるときに、該水性−有機溶媒で植物材料又は動物材料を抽出することによって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、
（ａ）該溶液を第１近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１ラフィネート相を第２近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第２ラフィネート相と、中極性構成成分を含有する第２近臨界流体相を生成する工程；
（ｄ）第２近臨界流体相を第２ラフィネート相から分離する工程；及び
（ｅ）第２近臨界流体相から中極性構成成分を回収する工程
を含む方法。
【請求項２１】
第１近臨界流体と第２近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から独立的に選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
第１近臨界流体が、第２近臨界流体よりも高極性化合物に対して低い溶解力を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
第１近臨界流体が液体ＣＯ２又は超臨界ＣＯ２であり、第２近臨界流体が液体ジメチルエーテルである、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物であるときに、該水性−有機溶媒で植物材料又は動物材料を抽出することによって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、
（ａ）該溶液を第１近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１ラフィネート相を第２近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第２ラフィネート相と、中極性構成成分を含有する第２近臨界流体相を生成する工程；
（ｄ）第２近臨界流体相を第２ラフィネート相から分離する工程；
（ｅ）第２近臨界流体相を第３ラフィネート相と接触させて、中極性構成成分を含有する第４ラフィネート相と、他の中極性構成成分を含有する第３近臨界流体相を生成する工程；
（ｆ）第３近臨界流体相を第４ラフィネート相から分離する工程；及び
（ｇ）第３近臨界流体相から該他の中極性構成成分を回収する工程
を含む方法。
【請求項２５】
第１近臨界流体と第２近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から独立的に選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
第１近臨界流体が、第２近臨界流体よりも高極性化合物に対して低い溶解力を有する、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
第１近臨界流体が液体ＣＯ２又は超臨界ＣＯ２であり、第２近臨界流体が液体ジメチルエーテルである、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物であるときに、該水性−有機溶媒で植物材料又は動物材料を抽出することによって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、
（ａ）該溶液を第１近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１近臨界流体相から該低〜中極性構成成分と有機溶媒とを回収して、第２溶液を得る工程；
（ｄ）第２溶液を第２近臨界流体と接触させて、中極性構成成分を含有する第２ラフィネート相を生成する工程；
（ｅ）第２近臨界流体相を第２ラフィネート相から分離する工程；
（ｆ）第２ラフィネート相から中極性構成成分を回収する工程；及び
（ｇ）第２近臨界流体相から低極性構成成分を回収する工程
を含む方法。
【請求項２９】
第１近臨界流体と第２近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から独立的に選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
第１近臨界流体が、第２近臨界流体よりも高極性化合物に対して高い溶解力を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
第１近臨界流体が液体ジメチルエーテルであり、第２近臨界流体が液体ＣＯ２又は超臨界ＣＯ２である、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分離技術に関する。植物材料又は動物材料を水性−有機溶媒混合物で抽出することによって得られる溶液の構成成分を、該溶液を近臨界流体と接触させることによって、極性に基づいて画分に分離する方法を提供する。本発明はさらに、特に、該溶液を最初に近臨界二酸化炭素と接触させてラフィネート相を得て、次に、該ラフィネート相を近臨界ジメチルエーテルと接触させる、二工程方法に関する。
【０００２】
背景
植物の抽出物と植物のチンキ（有機溶媒、通常はエタノール中に溶解した植物抽出物）は、天然の健康治療薬(health remedies)として広範囲に用いられている。植物の抽出物は、例えば、摂取される量が新鮮な植物材料の使用に比べて減少する、そしてさらに貯蔵寿命が植物材料に比べて改良されるので、特に好ましい。既知の又は疑わしい生体活性を有する“マーカー化合物”に対して植物抽出物の強度を標準化することが望まれている。これらの植物材料を抽出するために最も広く用いられる溶媒は、水と水＋エタノール混合物であり、より軽度に用いられる溶媒は、他の親水性有機溶媒（例えば、アセトンと酢酸）と組み合わせた水である。これらの溶媒混合物は高い溶解強度を有するが、選択性は低く、望ましい生理的活性成分の全ての抽出と、同時に多量の不活性な成分又は好ましくない成分さえもの抽出を生じる。それ故、水性−有機溶媒混合物を用いて植物から得られる粗抽出物をさらに分割して、好ましい生体活性若しくはマーカー化合物の濃度を高めることができ、不活性及び／又は好ましくない成分を減ずる又は除去することができる分離方法の必要性が存在する。
【０００３】
生物学的活性抽出物を得るために植物材料を抽出するための最も一般的な溶媒は、水とエタノールとの混合物である。各溶媒成分の割合は０％から１００％まで変化することができる。これらの溶媒混合物は、植物材料からの抽出を行うために比較的簡単な技術を必要とし、食品等級プロセスに許容できるので、これらの溶媒混合物は広く用いられている。他のアルコール（例えば、イソプロパノールとプロパノール）をエタノールの代わりに用いることができるが、これらのアルコールの、最終生成物中の許容可能な濃度はエタノールに比べて低くなる。水性−有機溶媒混合物は、水とエタノール混合物に限定される訳ではない。例えばアセトン、酢酸、ジメチルスルホキシド及びメタノールのような、多くの他の親水性有機溶媒も用いることができる。
【０００４】
近臨界ＣＯ２又は超臨界ＣＯ２は、その臨界温度及び臨界圧力（３１℃、７４ｂａｒ）が比較的容易に得られ、さらにＣＯ２は不活性、安価で、かつ容易に入手可能であるので、生物学的活性化合物を抽出するための代替食品等級溶媒の可能性である。ＣＯ２がエタノールよりも実質的に弱い溶媒であることは、当該技術分野で周知である。超臨界ＣＯ２を用いて抽出可能な生理的活性化合物の範囲は、一般に、親油性（脂溶性）で、低〜中分子量分子（例えば、米国特許No. 4,632,837に記載されているフレーバーやフレイグランスのような）に限定される。溶解力を改良する試みは、例えば、米国特許No. 5,017,397（この特許では、３５０ｂａｒより大きい圧力が用いられている）と米国特許No. 5,252,729（この特許では、植物物質とＣＯ２不溶性分子が加水分解されて、該分子が抽出可能な断片に破壊されている）に記載されている。
【０００５】
純粋なＣＯ２の限界にトライして、克服するために、共溶媒として知られる、ＣＯ２と有機溶媒との単相混合物を用いて植物材料から天然産物を抽出することが、試みられている。共溶媒は通常、５〜２０質量％の割合で用いられる。植物から生理的活性化合物を抽出するためのＣＯ２と共溶媒との使用を述べている特許の例は、米国特許No. 5,252,729（上記）、米国特許No. 6,569,640及び米国特許No. 6,291,241を包含する。さらに、米国特許No. 6,326,504は、溶解した近臨界流体を含む有機溶媒を用いて植物材料を抽出する方法（この場合、近臨界流体は、総溶媒混合物の５０重量％未満、好ましくは７〜２５重量％である）を述べている。抽出は５０〜５００ｂａｒ、好ましくは１５０〜２８０ｂａｒの圧力で行われる。意図される利益は、溶媒混合物の粘性の減少と、拡散性の上昇である。純粋な溶媒に比べて該混合物の溶解力の低下は認められないが、この低下は、以下に記載するように当該技術分野では知られている。上記方法の全ては、植物材料の初期抽出に高圧の使用を必要とし、これによって、大きい抽出容器容量が必要となる。このことは、加工プラントの高い資本コストを生じる。
【０００６】
ＣＯ２に代わる近臨界流体は、ジメチルエーテルである。水を含む又は含まないジメチルエーテルも、米国特許No. 4,234,619、No. 4,157,404、No. 4,136,065、No.4,069,351、No. 4,048,343、No. 3,900,288、No.3,795,750 及び日本特許No. 20011006636に記載されているように、植物材料及び動物材料の抽出に用いられている。しかし、上記特許のいずれも、水性−有機溶媒溶液中に含有される植物又は動物産物を抽出し、抽出物を分画する方法を述べていない。超臨界ＣＯ２に比べてジメチルエーテルによると非常に低い圧力を、広範囲な化合物の抽出に用いることができ、植物材料の乾燥は必要でない可能性がある。しかし、多量のジメチルエーテルと共に、大型の加圧搾出器がまだ必要であり、このことは安全性に危害を及ぼすことになる。抽出されうる化合物の範囲も、水性−有機溶媒よりも実質的に小さい。
【０００７】
極性の及び／又は大きい分子に対してＣＯ２の低い溶媒特性を用いて、微細な粉末を生成することができる。ＣＯ２  ＧＡＳ(Gas Anti-Solvent)沈降プロセスは、米国特許No. 5,360,478に最初に記載された。固体物質を、
（ｉ）最終的には再結晶した物質である溶質；
（ｉｉ）該溶質のための適当な溶媒である液体；及び
（ｉｉｉ）溶媒に可溶性であり、該溶媒を過飽和状態に近付けるか又は過飽和状態に達しさせて、該溶質物質を沈降させることができるガス状成分（ＣＯ２）
から成る系から再結晶させることができる。
【０００８】
ＧＡＳプロセスの変形は、ＳＡＳ（Supercritical Anti-Solvent）又はＰＣＡ(Precipitation with a Compressed Anti-Solvent)である。この場合、再結晶すべき溶質を含有する有機溶媒溶液に、該溶媒が超臨界流体と完全に混和することができるが、該溶質が新たな溶媒混合物に不溶であるような条件下で、超臨界流体を混合する（WO 9003782）。該溶質は沈殿して、微細な粉末を形成する。
【０００９】
米国特許No. 5,349,084は、発酵プロセス中の粗酸の生成、熱水による発酵ブロスからの該粗酸の抽出、該粗酸／水混合物中の水含量の３〜３０％までの減少、その後の有機溶媒による該酸の再抽出の後に、ＧＡＳ分画を用いたジカルボン酸の精製方法を記載する。溶液から好ましくない化合物を沈殿させるためにアンチソルベント(anti-solvent)として、ＣＯ２が用いられる。アンチソルベントの圧力は、ＣＯ２の臨界点未満である。
【００１０】
日本特許No. 6048952は、植物材料を有機溶媒（通常はエタノール）によって抽出して、脂溶性生理的活性成分を含有する溶液を得る多工程方法を記載する。該溶液を高圧ガス（ＣＯ２）と、該ガスが極性化合物を沈殿させる液体溶媒中及び／又は極性液体画分中に大幅に溶解するような条件下で混合する。次に、溶解したＣＯ２を含有する有機溶液を１００〜５００ｂａｒの圧力に加圧して、同圧力においてさらなる（超臨界）ＣＯ２と混合して、該有機溶媒中にさらなるＣＯ２を溶解して、該有機溶媒の溶解力をさらに減ずる。得られた溶液を次に、カラムに通すが、低極性成分は有機溶媒とＣＯ２との新たな溶液中に依然として溶解状態である。次に、この溶液を減圧バルブに通して、セパレータ中に入れると、そこでＣＯ２が該有機溶媒及び低極性成分から分離される。次に、該ＣＯ２はさらなるセパレータを、ＣＯ２がガスであるという条件下で、通過して、汚染物を除去する。
【００１１】
しかし、日本特許No.6048952の方法は、幾つかの不利な点を有する。第１の不利な点は、最初の分離工程がより高い圧力で汲み上げなければならないガス飽和有機溶液を生じることである。このことは、ガスの放出のために、ポンプ中にキャビテーションを生じる。第２の不利な点は、ＣＯ２ガスが、高圧においてさえも水性−有機溶液中に非常に低い溶解性を有することである（この資料は、水性−エタノール溶液がこの方法に使用可能であると述べている、但し、例は与えられていない）。それ故、この方法は、溶媒が水性−有機であるときに低い水分レベルに限定される。第３の不利な点は、最初の分離段階の低圧必要条件のために、再循環ＣＯ２がガス圧縮器を必要とすることである。ガス圧縮器の使用は、ポンプよりも大きいエネルギーを必要とする。
【００１２】
プロポリス・チンキの分画のための超臨界アンチソルベント方法は、O J Catchpole, J B Grey, K A Mitchell, J S Lan, J. Supercritical Fluids, 29, 97-106, 2004に記載されている。ミツバチは、幾つかの樹木種の葉からの樹脂状滲出物を集めて、次に、これをみつろうと混合して、プロポリスを得て、次に、これを用いて、ミツバチ巣に保護を与える。プロポリスは、ミツバチ巣からのワックス、フラボノイド及びデトリタス(detritus)を包含する成分の複雑な、樹脂状混合物である。プロポリスをミツバチ巣から剥ぎ取り、このプロポリスをエタノール又はエタノールと水との混合物中に溶解することによってチンキを作製する。次に、このチンキをさらに処理して、ワックスとデトリタスを取り出す。上記方法は、アグリコン・フラボノイド（炭水化物基の付着していないフラボノイド）が超臨界ＣＯ２を用いてチンキから抽出されることができ、そして他の未同定成分が沈殿することができる条件を同定する。この方法は、９５％エタノールを用いて作製されたチンキからのアグリコン・フラボノイドの回収において効果的であるが、エタノール−水混合物のエタノール含量が７０％に減少し、水含量が３０％に増加するときに、該効率は著しく低下する。水性−有機溶液によって直接抽出されたものである植物材料又は動物材料の分画方法については記載されていず、アグリコン・フラボノイド以外の化学化合物の単離方法についても記載されていない。葉材料の水性アルコール抽出物中にアグリコン・フラボノイドは通常見出されず、非常に多くの極性グリコシル化フラボノイドが見出されることができる。
【００１３】
WO 2005/075614は、オリーブ葉を抽出し、その後に該抽出物を分留する方法を記載する。この場合に、オリーブ葉をヘキサン若しくはエタノールのいずれかで抽出する、この場合に、粗抽出物は、真空分留によって取り出される溶媒の大部分を有する、これを濾過して又は清澄化して、沈殿を取り出す。ヘキサンは、低極性化合物のみを抽出し、エタノールは葉から低〜中極性化合物を抽出する。濃縮した抽出物を次に、向流充填カラムにおいて超臨界ＣＯ２と接触させる。第２の、より大きく極性の有機溶媒を、１０％の濃度まで、超臨界ＣＯ２に加えて、低〜中極性化合物の溶解性を改良する。ＣＯ２と有機共溶媒は、二段階減圧によって回収されうる抽出物中の全ての残留溶媒と低〜中極性化合物を抽出する。高極性化合物は、エタノールを用いた場合に、カラム内で沈殿する。これらの化合物の回収方法は記載されていない。第１抽出溶媒としてヘキサンを用いた場合には、沈殿画分が得られない。５％以上の水分を含有する水性−有機溶媒によって植物材料を抽出する方法も、水性−有機混合物を近臨界流体と直接接触させる（溶媒混合物は最初に部分的に蒸発する）方法も記載されていない。
【００１４】
WO 2005/075614に記載されている方法は、幾つかの不利な点を有する。最初に、粗抽出物を部分的に蒸発させ、濾過し／清澄化させなければならない。これは、溶媒を取り出し、回収するために高エネルギーを必要とし、より多くの処理工程とプロセス装置を必要とする。水性−有機溶媒は用いられていないので、最も高極性の化合物は溶媒抽出工程で抽出されない。抽出されている最高極性化合物は、カラム内で沈殿して、カラムからＣＯ２を除去し、次にカラムを有機溶媒で清浄化することによってのみ、不連続式に取り出されることができる。さらなる不利な点は、低〜中極性化合物に対するＣＯ２の溶解力を高めるための共溶媒として第２有機溶媒が必要であることである。
【００１５】
本発明者は、今回、溶液（植物材料又は動物材料を水性−有機溶媒によって抽出することによって得られる）を近臨界流体と接触させ、続いてさらなる処理を行うことによって該溶液の構成成分(constituents)を分画する方法が、既知方法の不利な点の１つ以上を克服する又は軽減するという驚くべき発見をした。
【００１６】
それ故、植物材料若しくは動物材料から抽出された成分の溶液の構成成分の分画方法を提供すること、又は少なくとも、有用な代替方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１７】
発明の説明
本発明の第１態様では、水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物である場合に、該水性−有機溶媒による植物材料若しくは動物材料の抽出によって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、下記工程：
（ａ）該溶液を近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有するラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）近臨界流体相をラフィネート相から分離する工程；及び
（ｃ）近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収する工程
を含む方法を提供する。
【００１８】
好ましくは、該方法は、該ラフィネート相から高極性構成成分を回収する工程をさらに含む。
【００１９】
本発明の第２関連態様では、水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物である場合に、該水性−有機溶媒による植物材料又は動物材料の抽出によって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、下記工程：
（ａ）該溶液を近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１近臨界流体相を第２ラフィネート相と接触させて、中極性構成成分を含有する第３ラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する第２近臨界流体相を生成する工程；
（ｄ）第２近臨界流体相を第３ラフィネート相から分離する工程；及び
（ｅ）第２近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収する工程
を含む方法を提供する。
【００２０】
近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から選択されることが好ましい。
【００２１】
近臨界流体は、典型的には、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２及びジメチルエーテルから成る群から選択され、大抵の場合には、超臨界ＣＯ２又は液体ＣＯ２のいずれかである。或いは、該近臨界流体が好ましくはジメチルエーテルでありうる。
【００２２】
好ましくは、該水混和性有機溶媒はＣ１−Ｃ４アルコール、例えばエタノールである。
【００２３】
該近臨界流体が超臨界ＣＯ２であるときに、該水性−有機溶媒は好ましくは５０〜９９容量％のエタノール、より好ましくは７０〜９９容量％のエタノールを含有する。
【００２４】
該近臨界流体がジメチルエーテルであるときに、該水性−有機溶媒は好ましくは０〜７０容量％のエタノールを含有し、より好ましくは０〜５０容量％のエタノールを含有する。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施態様では、該水混和性有機溶媒が、Ｃ３−Ｃ５ケトン、Ｃ１−Ｃ４カルボン酸、及びジメチルスルホキシドから成る群から選択される。
【００２６】
該近臨界流体相の圧力及び／又は温度を下げることによって、該近臨界流体相又は第２近臨界流体相から低〜中極性構成成分を回収することが好ましい。
【００２７】
２つ以上の画分中の低〜中極性構成成分を回収するために、圧力を２工程以上で下げることが好ましい。
【００２８】
或いは、該方法を、圧力を下げずに、ラフィネート相と近臨界流体相又は第２近臨界流体相を取り出す連続方法として行うことも可能である。
【００２９】
本発明の第３態様では、水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物である場合に、該水性−有機溶媒による植物材料又は動物材料の抽出によって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、下記工程：
（ａ）該溶液を第１近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１ラフィネート相を第２近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第２ラフィネート相と、中極性構成成分を含有する第２近臨界流体相を生成する工程；
（ｄ）第２近臨界流体相を第２ラフィネート相から分離する工程；及び
（ｅ）第２近臨界流体相から中極性構成成分を回収する工程
を含む方法を提供する。
【００３０】
第１近臨界流体と第２近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から独立的に選択されることが好ましい。
【００３１】
第１近臨界流体が、第２近臨界流体よりも極性化合物に対して低い溶解力を有することが好ましい。
【００３２】
第１近臨界流体が液体ＣＯ２若しくは超臨界ＣＯ２であり、第２近臨界流体が液体ジメチルエーテルであることがより好ましい。
【００３３】
本発明の第４態様では、水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物である場合に、該水性−有機溶媒による植物材料又は動物材料の抽出によって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、下記工程：
（ａ）該溶液を第１近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１ラフィネート相を第２近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第２ラフィネート相と、中極性構成成分を含有する第２近臨界流体相を生成する工程；
（ｄ）第２近臨界流体相を第２ラフィネート相から分離する工程；
（ｅ）第２近臨界流体相を第３ラフィネート相と接触させて、中極性構成成分を含有する第４ラフィネート相と、他の中極性構成成分を含有する第３近臨界流体相を生成する工程；
（ｆ）第３近臨界流体相を第４ラフィネート相から分離する工程；及び
（ｇ）第３近臨界流体相から該他の中極性構成成分を回収する工程
を含む方法を提供する。
【００３４】
第１近臨界流体と第２近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から独立的に選択されることが好ましい。
【００３５】
第１近臨界流体が、第２近臨界流体よりも極性化合物に対して低い溶解力を有することが好ましい。
【００３６】
第１近臨界流体が液体ＣＯ２又は超臨界ＣＯ２であり、第２近臨界流体が液体ジメチルエーテルであることがより好ましい。
【００３７】
本発明の第５態様では、水性−有機溶媒が水と水混和性有機溶媒との混合物である場合に、該水性−有機溶媒による植物材料又は動物材料の抽出によって得られる溶液の構成成分の分画方法であって、下記工程：
（ａ）該溶液を第１近臨界流体と接触させて、高極性構成成分と水を含有する第１ラフィネート相と、低〜中極性構成成分を含有する第１近臨界流体相を生成する工程；
（ｂ）第１近臨界流体相を第１ラフィネート相から分離する工程；
（ｃ）第１近臨界流体相から該低〜中極性構成成分と有機溶媒とを回収して、第２溶液を得る工程；
（ｄ）第２溶液を第２近臨界流体と接触させて、中極性構成成分を含有する第２ラフィネート相を生成する工程；
（ｅ）第２近臨界流体相を第２ラフィネート相から分離する工程；
（ｆ）第２ラフィネート相から中極性構成成分を回収する工程；及び
（ｇ）第２近臨界流体相から低極性構成成分を回収する工程
を含む方法を提供する。
【００３８】
第１近臨界流体と第２近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、ジメチルエーテル、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の2つ以上の混合物から成る群から独立的に選択されることが好ましい。
【００３９】
第１近臨界流体が、第２近臨界流体よりも極性化合物に対して高い溶解力を有することが好ましい。
【００４０】
第１近臨界流体が液体ジメチルエーテルであり、第２近臨界流体が液体ＣＯ２又は超臨界ＣＯ２であることがより好ましい。
【００４１】
詳細な説明
本発明は、植物材料の水性−有機溶媒抽出から画分を生成するための近臨界アンチソルベント分画方法に関する。この方法では、近臨界流体は溶媒及びアンチソルベントとして同時に作用して、少なくとも２つの画分：低〜中極性化合物を含有する、少なくとも１つの抽出物画分と、高極性化合物と水を含有する、少なくとも１つの画分を生成する。これらの画分のいずれかに、第２近臨界流体を用いて、該方法を再適用することができる。
【００４２】
本発明は、大ざっぱには、水性−有機溶媒によって植物原材料又は動物原材料を抽出して、複数の化合物を有する抽出物を含有する溶液を得て、続いて、該溶液を近臨界流体と接触させることによって、該抽出物を画分に、それらの極性に基づいて分離することに関する。該近臨界流体は、溶媒とアンチソルベントの両方として作用する。
【００４３】
本明細書で用いる“高極性”なる用語は、一般的に、純粋なエタノール中よりもエタノール／水混合物中でより大きく溶解性である化合物に関係する。
【００４４】
本明細書で用いる“低極性”なる用語は、一般的に、脂肪若しくは油中に、典型的な脂肪溶媒(fat solvents)若しくは油溶媒(oil solvents)中に溶解性であり、エタノール中で中程度〜弱溶解性を有する（そして水中では不溶性である）化合物に関係する。
【００４５】
本明細書で用いる“中極性”なる用語は、一般的に、エタノール中で溶解性であるが、水中では弱溶解性又は不溶性である化合物に関係する。
【００４６】
本明細書で用いる“水性−有機溶媒”なる用語は、一般的に、水と低分子量の水混和性有機溶媒（例えば、Ｃ１−Ｃ３アルコール、アセトン、Ｃ１−Ｃ３カルボン酸、ジメチルスルホキシド、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミン、アリールアミン、Ｃ２−Ｃ４アルデヒド、及びピリジン）とを含有する溶媒混合物を意味する。該有機溶媒が水混和性有機溶媒であること、及び該有機溶媒が、当業者に知られた、適当な圧力及び温度において超臨界ＣＯ２又は近臨界ジメチルエーテルに対して非常に溶解性であるか又は混和性であることは、当業者によって理解されるであろう。
【００４７】
本明細書で用いる“接触(contact)”なる用語は、一般的に、当業者に周知であるような抽出器／沈降チャンバに連結する又は抽出器／沈降チャンバ内に含まれる、適当な装置中で該溶液を近臨界流体と混合することを意味する。適当な装置は、非限定的に、静的ミキサー、ノズル、混合弁、充填（構造化若しくはランダム）、Ｔ字型ジョイント、膜型コンタクター、及び同心パイプを包含する。好ましくは、該溶液と近臨界流体を、静的ミキサーを用いて接触させる。
【００４８】
本明細書で用いる“溶解力(solvent power)”なる用語は、一般的に、溶質を溶解する溶媒の能力を意味する。例えば、極性化合物に対して高い溶解力を有する流体は、該流体が、極性化合物に対して低い溶解力を有する流体よりも、極性化合物を溶解する大きい能力を有することを意味する。
【００４９】
本明細書で用いる“分離する(separate)”なる用語は、一般的に、近臨界流体相と溶解している低〜中極性化合物とを含む流れを装置から、該流れから沈降した極性化合物を除去しながら、取り出すことを意味する。
【００５０】
本明細書で用いる“近臨界流体(near-critical fluid)”なる用語は、一般的に、その臨界点に近い状態である流体を意味し、したがって、臨界未満流体と超臨界流体の両方を包含する。近臨界は、０．７０≦Ｔｒ≦１．２５（この場合、Ｔｒは該流体の臨界温度Ｔｃによって分割した温度である）の低い温度範囲と；Ｔ＜Ｔｃに対してＰ＞Ｐｖ（この場合に、Ｐｖは蒸気圧である）とＴ≧Ｔｃに対するＰ＞Ｐｃ（この場合に、Ｐｃは臨界圧力である）の圧力範囲を包含する。
【００５１】
用いる近臨界流体が、超臨界ＣＯ２、臨界未満ジメチルエーテル又はこれらの混合物であることが好ましい。超臨界ＣＯ２は該溶液と、好ましい圧力（≧７５ｂａｒ）及び好ましい温度Ｔ（＞３１．２℃）において混合することができる。或いは、液体ＣＯ２を用いることができる（Ｔ＜３１．２℃、ＴにおけるＣＯ２の蒸気圧よりも大きい圧力）；又は一定温度におけるその蒸気圧より大きい圧力において近臨界ジメチルエーテルを用いることができる、この場合、該温度は１０℃〜１００℃である。近臨界領域は、該溶媒の蒸気圧が室温（２９８Ｋ）において少なくとも５ｂａｒである領域を包含するように設定される。当該技術分野で知られた、他の近臨界流体（例えば、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、フッ化Ｃ２−Ｃ３炭化水素（特に、Ｒ１３４ａ−１，１，１，２−テトラフルオロエタン）、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、ジメチルエーテルの部分的及び完全フッ化類似体、及びこれらの任意の混合物）を用いることができる。しかし、ジメチルエーテルを除いた、これらの溶媒の全ては水との不良な相互溶解性を有するので、水性−有機溶媒が５０〜１００％水分（抽出物を含まない基準で）であるときに、ジメチルエーテルは好ましい溶媒である。
【００５２】
温度が２７３〜３４３Ｋの範囲内であり、圧力が低〜中極性化合物の完全な抽出と、高極性化合物の沈殿を保証するのに充分であることが好ましい。有機溶媒が近臨界流体中に実質的に溶解可能であるように温度及び圧力が選択されることを、当業者は理解するであろう。
【００５３】
適当な低〜中極性化合物は、近臨界流体中に溶解性であるか、又は近臨界流体と有機溶媒との混合物中に溶解性である化合物である。
【００５４】
本発明の方法によって抽出され易い低〜中極性化合物は、非限定的に、脂質（例えば、脂肪酸、脂肪酸Ｃ１−Ｃ４アルコールエステル、脂肪酸アミン、脂肪酸アミド、アルコキシグリセロール・エーテル、脂肪アルコール、脂溶性ビタミン、ステロール、ワックスエステル、カロテノイド、炭化水素）、オレオレジン、精油、アグリコン・フラボノイド、ハイパーフォリン、及びポリフェノール性アンチオキシダント（例えば、camosic acid、salvianolic acid及びルテオリン）を包含する。このリストは排他的ではなく、用いる近臨界流体に依存するものである。例えば、ＣＯ２を用いる場合には、リン脂質が沈殿するが、ジメチルエーテルを用いる場合には、リン脂質が抽出される。
【００５５】
近臨界流体中に溶解性でない如何なる中極性化合物もラフィネート中で水相と共沈することは理解されるであろう。
【００５６】
ラフィネート中で沈殿する高極性及び／又は高分子量化合物は通常、高度に水溶性であり、例えば、タンパク質、アミノ酸、酵素、単糖、炭水化物、タンニン及び尿素を包含する。
【００５７】
本発明を、大部分は、植物材料の抽出によって得られる溶液の分画に関連して記載するが、動物材料の抽出によって得られる溶液の分画も本発明の一部を同様に形成する。
【００５８】
水性アルコール混合物を用いる植物材料の抽出は、当該技術分野で周知である。抽出の収率と組成は、溶媒混合物中の親水性溶媒の水に対する比率、溶媒の固体物質に対する比率、抽出温度、植物材料を粉砕する程度、及び抽出前の植物材料の含水率に依存する。一般に、溶媒中の親水性溶媒の水に対する比率が高ければ高いほど、低〜中極性化合物の収率は大きくなる。溶媒混合物中の含水量の増加は高極性化合物の抽出の増加と低極性化合物の減少を生じる。広範囲な極性を有する植物材料からの抽出を達成するには、通常、親水性溶媒の水に対する最適比率が存在する。エタノール／水混合物の溶媒組成は、通常、９５％エタノール／５％水から７０％エタノール／３０％水までの範囲内である。溶媒の植物材料に対する比率は、溶媒から使用済み植物材料(spent plant material)を分離しうることを保証するために充分である。典型的な溶媒対固体比率は２：１〜２０：１である。
【００５９】
本発明の１実施態様では、超臨界ＣＯ２を、適当な植物材料の抽出から得られた水性−有機溶液と共に抽出器に導入する。
【００６０】
植物材料は、好ましくは、他の好ましくない化合物から分離されるべきである少なくとも１種類の好ましい化合物を含有すると分かっている植物材料から選択される、より好ましくは、水性−有機溶媒によって同時に抽出される、種々な分子量及び極性の複数種類の好ましい化合物を含有する。
【００６１】
植物材料は、植物全体及び／又はその部分（葉、幹、花、種子、根、樹皮、芯材、樹液又は樹脂）を包含することができる。植物は陸生又は海水／淡水由来（例えば、ミクロ及びマクロ藻類）であることができる。植物材料は、新鮮な、凍結した又は乾燥した形で、水性−有機溶媒を用いて抽出することができる。植物材料を抽出前に粉砕することが好ましい。
【００６２】
他の実施態様では、溶媒及びアンチソルベントと同時に超臨界ＣＯ２を用いる。ＣＯ２は、植物抽出物を含有する水性−有機溶液と接触すると、該溶液のｐＨを低下させて、低〜中極性抽出物構成成分とエタノールの殆どを抽出する。エタノールは、共溶媒として作用して、植物抽出物構成成分の溶解性を大きく高める。極性の植物抽出物構成成分と水は、超臨界ＣＯ２のアンチソルベント挙動によって抽出器中に沈降して、水中の極性植物構成成分の液体溶液として連続的に取り出されることができる。
【００６３】
低〜中極性の植物抽出物構成成分のＣＯ２溶液は適当な容器に移して、そこで、エタノールと植物抽出物構成成分が液体流として該容器中に沈降するような点まで圧力を低下させる。
【００６４】
図１を参照すると、種々な温度及び圧力における三成分系エタノール／水／ＣＯ２の相図(phase diagram)を示す。一定の温度及び圧力におけるラインの上方領域は単相混合物であり、下方領域は二相である。ＣＯ２軸から相ラインまでのダッシュ・ラインは、ＣＯ２がアンチソルベントとして作用し（そして沈降させ）うるほど充分なＣＯ２が液体相中に溶解し、そしてエタノールが溶媒として作用し、有機溶媒（エタノール）及び中極性化合物を溶解させうるほど充分なエタノールがＣＯ２中に溶解することを保証する、好ましい作用領域を示す。液体相は該ラインの右側に存在し、蒸気相は左側に存在する。該相図は、６８ｂａｒの低圧では、抽出を可能にする著しい量のエタノールを溶解する蒸気圧が形成されることができないことを示している。さらに、圧力がさらに低下すると、極性化合物を沈殿させるに十分なＣＯ２が液体相中に溶解することができない。低圧相ラインは、圧力低下中に中極性及び低極性溶質と有機溶媒を回収すると期待することができる相を示す。ジメチルエーテルに対しても同様な相図を描くことができるが、ジメチルエーテルは水との相互溶解性が大きいために、単相領域がＣＯ２に対する単相領域よりも大きい。
【００６５】
圧力低下を１工程又は複数工程で行って、植物抽出物構成成分の１つ以上の画分を得ることができる。次に、エタノールの蒸発によって、液体流（単数又は複数）から植物抽出物構成成分を回収することができる。
【００６６】
一般に、圧力が低下すると、近臨界流体中に最低溶解性であるような植物抽出物構成成分が最初に沈降するであろう。最高溶解性である植物抽出物構成成分は最後に沈降するであろう。それ故、植物抽出物構成成分の相互からの或る程度の分離又は分画が達成されうることは理解されるであろう。さらに、エタノールの大部分が最後に沈降し、したがって植物材料の再抽出のために再循環することができるように、分離条件を選択することができる。
【００６７】
高分子量で低極性の化合物は低極性を有する低分子量化合物よりも弱溶解性であり；同様な分子量の中極性化合物はそれらの対応する低極性化合物よりも弱溶解性であるので、分画は分子量並びに極性に関して行われる。
【００６８】
代替的に、又は段階的圧力低下による分画の他に、植物抽出物構成成分を充填カラムにおいてさらに分画することができる。
【００６９】
場合によっては、抽出工程後で、圧力低下工程前に、高圧水洗浄工程を導入して、近臨界ＣＯ２によって抽出されるエタノールを部分的に除去して、それによって近臨界流体相中の中極性化合物の溶解性を低下させる。これらの中極性化合物は次に沈降して、さらなる画分を生じる。
【００７０】
他の実施態様では、臨界未満のジメチルエーテルを溶媒及びアンチソルベントと同時に用いる。植物抽出物を含有する溶液と接触すると、ジメチルエーテルは低〜中極性の植物抽出物構成成分と、有機溶媒の全てと、水の一部を抽出する。同時抽出された有機溶媒と水は、共溶媒として作用して、植物抽出物構成成分の溶解性を非常に高める。極性の植物抽出物構成成分と残留する水は、近臨界ジメチルエーテルのアンチソルベント挙動によって抽出器中に沈降して、水中の極性植物構成成分の液体溶液として連続的に取り出されることができる。
【００７１】
低〜中極性の植物抽出物構成成分のジメチルエーテル溶液を適当な容器に移して、そこで、ジメチルエーテルが蒸気になり、有機溶媒の水及び植物抽出物構成成分が液体流として該容器中に沈降するような点まで圧力を低下させる。
【００７２】
或いは、一定圧力において温度を下げて、ジメチルエーテル中の水の溶解性を実質的に低下させることができる。この結果として、中極性化合物の沈殿が生じる。
【００７３】
別の代替手段として、温度を殆ど又は全く変化させないで、系ジメチルエーテル／水に関して３相領域が存在するような点まで圧力を部分的に低下させることができる。
【００７４】
次に図２を参照すると、該方法の好ましい実施態様に用いる装置の概略的で、非限定的な図を示す。最初の実施態様では、液体供給シリンダーＣＹＬ１とＣＹＬ２によって、近臨界溶媒を装置に供給する。次に、該近臨界溶媒は、冷水トラップＷＴ１とコンデンサー／サブクーラーＨＸ１を通過してから、容量型ポンプＭＰ１によって運転圧(operating pressure)に加圧される。加圧された近臨界溶媒は、次に、プレヒーターの熱交換器ＨＸ２を通過してから、第１接触容器ＥＸ１に垂直降下管（選択的に終端は静的ミキサーに入る）を介して達する。同時に、植物又は動物抽出物を含有する水性−有機溶液が供給タンクから引き出されて、ピストンポンプＬＰ１によって運転圧に加圧される。この高圧溶液は次に、ＥＸ１中に達する降下管の直前で、Ｔ字型ジョイント中で近臨界溶媒と混合される。不溶性の高極性抽出物と水は沈降して、ＥＸ１の底部から弁ＥＸＶ１を介して回収される。二次セパレーターを用いて、近臨界溶媒（フラッシュオフ(flash off)する）を回収することができる（図示せず）。残りの中〜低極性抽出物と、有機溶媒の大部分は近臨界流体中に溶解して、該容器の頂部に分離相を形成する。この相は、第１接触容器から弁ＥＸＶ４を介して連続的に取り出される。
【００７５】
一緒にした近臨界富化溶液(near-critical rich solution)は、次に、減圧弁ＣＶ１を通過し（ここで、圧力は少なくとも中極性抽出物を沈降させるに充分に低下する）、次に第１加熱分離容器ＳＶ１に入る（熱転移を改良するためにＣＶ１の後に熱交換器を含めることもできる）。中極性抽出物と有機溶媒量は該容器中に沈降する。この抽出物は弁ＥＶ４を通してのさらなる減圧によって二次抽出物回収容器ＳＶ４に連続的に回収され、次に弁ＶＶ４を通して回収されうる。有機溶媒からのガス分離から生じるガスは弁ＲＶ３を介して回収されうる。
【００７６】
近臨界流体の大部分と低極性抽出物は、ＳＶ１の頂部に分離相を形成する。この相は次に背圧調節弁ＢＰＲ１を通過して、そこで圧力がシリンダー圧に低下してから、第２分離容器ＳＶ２に熱交換器ＨＸ３を介して入る。抽出物の残部と有機溶媒は、この容器中に沈降する。この抽出物はさらなる減圧によって弁ＥＶ５を介して容器ＳＶ５中に連続的に回収することができ、次に弁ＶＶ５を介して回収されることができる。有機溶媒からのガス分離から生じるガスは、安全弁ＲＶ５を介して回収することができる。或いは、低〜中極性抽出物と有機溶媒の回収は、当該技術分野で周知であるように、単一分離工程で行われる。ガスの大部分はＳＶ２の頂部に存在し、次に、コリオリ効果質量流量計ＦＭ１とクーラー熱交換器ＨＸ４を通過してから、水トラップＷＴ１を介してＭＰ１に戻して再循環される。
【００７７】
該方法の第２実施態様では、第１接触容器ＥＸ１中に存在する近臨界相がこの容器を出るまで、工程は第１実施態様に関した述べたのと同じである。この場合に、該近臨界相は弁ＥＸＶ３を通過して、第２接触容器ＥＸ２に入り、そこで、該近臨界相は、静的ミキサーに終端が入る降下管中で、高圧ポンプＬＰ２によって供給される水と接触する。２つの流れが相互に接触した後で、一部の有機溶媒と中極性の植物抽出物又は動物抽出物を含有する水相は、上部の近臨界相から下部相として分離して、弁ＥＸＶ２を介して回収されうる。上部の近臨界相は弁ＥＸＶ７を介して回収され、次に、残留する低〜中極性抽出物と有機溶媒は、第１実施態様に関して述べたように回収される。
【００７８】
該方法のさらなる実施態様では、近臨界溶媒として超臨界ＣＯ２を用いての該方法の第１実施態様の適用から生じる複数の極性抽出物を含有する水相は、該方法の第１実施態様のさらなる適用のためのフィードストックになるが、この場合に該近臨界溶媒は今やジメチルエーテルである。
【００７９】
該方法の別の実施態様では、近臨界溶媒としてジメチルエーテルを用いての該方法の第１実施態様の適用から生じる複数の中極性又は低〜中極性抽出物を含有する水性有機相は、該方法の第１実施態様のさらなる適用のためのフィードストックになるが、この場合に該近臨界溶媒は今や超臨界ＣＯ２である。
【００８０】
該方法のなお、さらなる実施態様では、追加の有機溶媒がポンプＬＰ２と弁ＥＸＶ５を介して供給され、次に、水性有機溶媒混合物及び第１実施態様による近臨界流体と混合される。
【実施例】
【００８１】
実施例１  エキナセア・プルプレア水性−有機溶液（気中部分）
この実施例は、連続アンチソルベント／抽出方法を用いて、水／エタノール溶液から活性成分、フェノール系化合物(phenolics)及びアルカミドを分離する方法を実証する。エキナセア・プルプレアの乾燥した気中部分の溶媒抽出によって得られる、市販の水性アルコール（水／エタノール）溶液を用いた。水性アルコール溶媒のエタノール含量（抽出物を含まない基準）は９３％であった。エキナセア・プルプレア溶液を抽出容器中で２８０ｂａｒ及び６０℃において超臨界ＣＯ２と接触させた。ラフィネート画分を該抽出容器の底部から一定の時間間隔で回収した。抽出物は、３０ｂａｒ及び６０℃で操作される単一セパレーターから回収した。
【００８２】
フィード液体（エキナセア頂部の水性アルコール・チンキ）の、溶媒（超臨界ＣＯ２）に対する比率は、プロセス中に抽出されるアルカミド（親油性化合物）とプロセス中に沈降するチコリン酸（親水性化合物）との分離度に対する効果を調べるために、０．０１２〜０．２５の範囲にわたって変化させた。
【００８３】
ラフィネートと抽出物のサンプルを、チコリン酸を含めたフェノール系化合物に関して公開ＨＰＬＣ方法(N. B. Perry, E. J. Burgess, and V. L Glennie, J. Agri. Food Chem., 2001, 49, 1702-1706)によって分析した。溶媒を含有する液体サンプルに関しては、サブサンプル（１ｍｌ）を乾燥させ、エタノール／水（７０％）１０ｍｌ中に再溶解し、１５分間振とうし、濾過（０．４５μｍフィルター）してから、分析した。固体サンプルに関しては、サンプル１２５ｍｇをエタノール／水（７０％）２５ｍｌと共に１５分間振とうし、濾過（０．４５μｍフィルター）した。
【００８４】
ラフィネートと抽出物のサンプルを、アルカミドに関してＨＰＬＣによって公開方法(N. B. Perry, J. W. van Klink, E. J. Burgess, and G. A Parmenter, Planta Medica, 1997, 66, 58-62)を用いて分析した。溶媒を含有する液体サンプルに関しては、該サンプルのサブサンプル（１ｍｌ）を乾燥させ（回転蒸発、３５℃）、次に、水（０．２ｍｌ）中に再溶解した。この溶液を、内部標準としてＮ−フェニルペンタンアミド０．１ｍｇ／ｍｌを含有するアセトニトリル（１．８ｍｌ）によって希釈した。得られた懸濁液のサブサンプル（１ｍｌ）をＣ１８固相抽出カラム（Supelco、３ｍｌ、９：１アセトニトリル／水によって予め浸潤）に通して濾過し、さらなる９：１アセトニトリル／水（２ｍｌ）によってすすぎ洗いした。一緒にした溶出液をＨＰＬＣ分析の前に濾過した（０．４５μｍ）。固体サンプルの抽出はやや変化し、採取した質量（０．５ｇ）を水（１ｍｌ）中に溶解して、次に、内部標準としてＮ−フェニルペンタンアミド０．１ｍｇ／ｍｌを含有するＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（９ｍｌ）に加えた。
【００８５】
結果は、表１にラフィネート・サンプル及び抽出物サンプルに関して、特定の溶媒流速対ＣＯ２流速比率において示す。総フェノール系化合物がラフィネート・サンプルの質量に直接関連付けられるように、ラフィネート・サンプルを蒸発乾燥させた。抽出物サンプルは該チンキからのエタノールを含有するが、エタノールを蒸発させずに分析した。この実施例は、超臨界アンチソルベント分画が、抽出物中に濃縮されている活性アルカミド成分と、ラフィネート中に濃縮されている活性フェノール系成分とを分離することができることを示す。該実施例はさらに、溶媒のフィードに対する比率が該２種類の化合物の分離効率に殆ど影響を及ぼさないことを示す。
【００８６】
【表１】
2009525863.tif 000003
【００８７】
実施例２  エキナセア・アウグスチフォリア水性−有機溶液（根）
この実施例は、連続アンチソルベント／抽出方法を用いて、水／エタノール溶液から活性成分、フェノール系化合物及びアルカミドを分離する方法を実証する。エキナセア・アウグスチフォリアの乾燥した根の溶媒抽出によって得られる、市販の水性アルコール（水／エタノール）溶液を用いた。水性アルコール溶媒のエタノール含量（抽出物を含まない基準）は９３％であった。用いた実験方法と分析方法は、実施例１で用いたものと同じであった。
【００８８】
結果は、表２にラフィネート・サンプル及び抽出物サンプルに関して、各々特定の溶媒溶液対ＣＯ２比率において示す。この実施例は、超臨界アンチソルベント分画が、抽出物中に濃縮されている活性アルカミド成分と、ラフィネート中に濃縮されている活性フェノール系成分とを分離することができることを示す。該実施例はさらに、溶媒のフィードに対する比率が該２種類の化合物の分離効率に殆ど影響を及ぼさないことを示す。
【００８９】
【表２】
2009525863.tif 000004
【００９０】
実施例３  セージ水性−有機溶液
この実施例は、水／エタノール溶液から親水性ポリフェノール系化合物(polyphenolics)、親油性アンチオキシダント、及びフレーバー／アロマ化合物を３つの分離画分に分離するための超臨界アンチソルベント分画方法を実証する。該エタノール／水溶液は、乾燥したダルマチアン・セージ葉の溶媒抽出によって得た。乾燥したセージ葉の抽出は、撹拌式タンク内で行った。植物材料をナイフ・ミルで約０．５〜１ｍｍの粒度に粉砕した。植物材料約２ｋｇを該撹拌式タンクに加えて、次に、該植物材料が水中に沈むまで、溶媒（７０：３０エタノール：水の質量比）を加えた。溶媒対固体の総合比率は３：１（溶媒体積／固体質量）であった。該タンクを４０℃において３時間撹拌した。植物材料から真空濾過によってチンキを分離して、フィード溶液を得た。セージ・フィード材料、水性アルコール抽出物の分析、及びアンチソルベント分画からの抽出物とラフィネートを、ＧＣによる精油マーカー成分、比色分析による総フェノール、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）のラジカル・スカベンジング、ＨＰＬＣによるポリフェノール系含量(polyphenolic content)、及びＨＰＬＣによる親油性アンチオキシダントに関して分析した。分析方法に関する詳細は、以下に簡単に述べる。
【００９１】
セージ精油のＧＣ分析  乾燥したラフィネート又は抽出物をヘキサンによって抽出し、加熱水浴中で振とうした。ヘキサン溶解性抽出物を不溶性セージ材料から濾過によって分離して、次に蒸発乾燥させた。ＧＣ分析は、８０〜３００℃（７．５℃／分）での石英ガラスＤＢ−５カラムと、ＦＩＤデテクター（３００℃）を用いて、行った。外部標準及び内部標準として、樟脳とｎ−オクタデカンを用いた。
【００９２】
総フェノール含量  セージ画分の総フェノール含量は、Folin-Ciocalteau試薬を用いて比色法によって測定した。測定は、酸性化水性メタノール中に溶解した種々な濃度の没食子酸を用いて没食子酸当量として行った。
【００９３】
ラジカル・スカベンジング能力  セージ画分の１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカル・スカベンジング能力を、新たに調製したＤＰＰＨの０．１ｍＭメタノール溶液を用いて測定した。ラフィネート及び抽出物の溶液をメタノール中に１．０ｍｇ／１０ｍｌの濃度になるように調製して、これらの０．１ｍｌアリコートを該ＤＰＰＨ溶液の２．０ｍｌに加えた。対照のために、メタノール０．１ｍｌをメタノール２．０ｍｌに加えた。各添加後に該混合物を振とうして、１時間放置した。サンプルの吸光度を５１７ｎｍにおいて測定し、対照に比較した吸光度の低下は、各サンプルの相対的フリースカベンジング活性値(value of the relative free scavenging activity)を与えた。
【００９４】
ＨＰＬＣによるポリフェノール系化合物  セージ抽出物サンプルとラフィネート・サンプルを７０％水性アセトンによって３回抽出した。３回のアセトン抽出物を一緒にして、濃縮して、凍結乾燥した。一緒にしたアセトン抽出物をＨＰ２０カラム上で水画分とメタノール画分に分画して、水画分から、水又は水性メタノ−ル（３０％までメタノール）を用いて、Sephadex及び／又はＭＣｌ  ＨＰ２０上でのカラムクロマトグラフィーによって、グリコシドを単離した。画分を自動画分コレクターを用いて回収して、ＨＰＬＣによってモニターした。ＨＰＬＣ分析は、ＤＡＤデテクター（２８０と３５０ｎｍに設定）と３０℃に保持されたLiChrospher 100 RP-18カラムを装備したHewlett Packard series 1100上で、下記溶媒プログラム：溶媒Ａ、Ｈ２Ｏ中２％ＨＯＡｃ；溶媒Ｂ、ＣＨ３ＣＮ中２％ＨＯＡｃ；４％Ｂから出発して、２０分間で１２％Ｂまで、３０分間で２０％Ｂに、及び４５分間で５０％Ｂにする、で行った。流速は１ｍｌ／分間に設定した。
【００９５】
超臨界アンチソルベント分画は、ＣＯ２対溶媒混合物の一定比率における３種類の圧力と、一定の抽出圧力（３００ｂａｒ）及び抽出温度（３１３Ｋ）における３種類のＣＯ２対溶媒混合物比率において行った。パラメーター及びこの分画試行からの結果は、表３と表４に、それぞれ、種々な圧力と種々な流速比率に関して示す。
【００９６】
【表３】
2009525863.tif 000005
【００９７】
【表４】
2009525863.tif 000006
【００９８】
この実施例は、ロズマリン酸とその他の高分子量ポリフェノール系化合物はラフィネート画分中に濃縮され、親油性アンチオキシダント、カルノソール、カルノシン酸及びメチル・カルノセートは第１分離画分中に濃縮され、揮発性の油／オレオレジンは第２セパレーター中で濃縮される。各画分中に回収される総フィード固体の割合は、圧力と流速比率の関数である。
【００９９】
実施例４  クロフサスグリ水性有機溶液
この実施例では、アントシアニンとフラボノイドを含有するクロフサスグリ搾りかすのエタノール−水抽出物の分画は、超臨界ＣＯ２又は液体ジメチルエーテルを用いて行った。クロフサスグリ搾りかすを凍結乾燥させ、次に、粉砕せずに、充填床において７０％エタノール：３０％水混合物を用いて抽出した。該溶媒は、固体床を通して６時間連続的に循環させた。該溶媒を次に該固体から排出させ、部分的に蒸発させた。次に、該固体を、７０％エタノール：３０％水混合物によって６時間にわたって２度目の再抽出した。溶媒を再び固体から排出させ、部分的に蒸発させた。２つの濃縮物を一緒にして、次に、２８質量％の固形分に部分的に蒸発させて、貯蔵中の分解を最小にした。
【０１００】
該水性−有機抽出溶液を、ＣＯ２を用いる超臨界アンチソルベント分画によって画分に分離した。クロフサスグリ抽出物の濃縮溶液を９５％エタノールによって１４％固形分に希釈した。クロフサスグリ搾りかすと溶媒混合物のアンチソルベント分画は、超臨界ＣＯ２によって３００ｂａｒの圧力、３３３Ｋの温度及び０．０３５の流速比率（溶媒混合物対ＣＯ２）において行った。クロフサスグリ搾りかす抽出物とＣＯ２を含有する溶媒を静的ミキサー中で混合してから、抽出容器中で沈降させた。弁を通っての減圧によって抽出容器から赤／紫色に着色したラフィネート溶液が連続的に得られた。超臨界ＣＯ２と、溶解した溶媒及び溶解性抽出物は次に、それぞれ、９０ｂａｒと３２８Ｋ及び５２ｂａｒと３１３Ｋの圧力と温度における２つの減圧段階を通過した。第１分離段階は赤色溶液を生じ、これは第１段階分離容器から連続的に回収された。第２分離段階は淡黄色／緑色溶液を生じ、これは主として溶媒であった。アンチソルベント画分プロセスからのフィード溶液、ラフィネート及び抽出物画分中のアントシアニン及びフラボノイド濃度を表５に示す、表５では、ジメチルエーテルに対して比較する。
【０１０１】
水性−有機抽出物溶液も、ジメチルエーテルを用いて、近臨界アンチソルベント分画によって画分に分離した。クロフサスグリ抽出物の濃縮溶液を水によって１４％に希釈した。クロフサスグリ搾りかすと溶媒混合物のアンチソルベント分画を、近臨界ジメチルエーテルによって４０ｂａｒの圧力、３３３Ｋの温度及び０．０９６の流速比率（溶媒混合物対ジメチルエーテル）において行った。クロフサスグリ搾りかす抽出物とジメチルエーテルを含有する溶媒を静的ミキサー中で混合してから、抽出容器中で沈降させた。弁を通っての減圧によって抽出容器から暗紫色に着色したラフィネート溶液が連続的に得られた。ジメチルエーテルと、溶解した溶媒及び溶解性抽出物は次に、それぞれ、１０ｂａｒと３３３Ｋ及び５〜６ｂａｒと３１３Ｋの圧力と温度における２つの減圧段階を通過した。第１分離段階は赤色溶液を生じ、これは第１段階分離容器から連続的に回収された。第２分離段階も赤色溶液を生じ、これは主として溶媒であった。フィードとアンチソルベント画分のアントシアニン及びフラボノイド濃度を表５に示す、表５では、ＣＯ２に対して比較する。
【０１０２】
濃縮水性−有機抽出物溶液も、ジメチルエーテルを用いて、希釈せずに、近臨界アンチソルベント分画によって画分に分離した。クロフサスグリ搾りかすと溶媒混合物のアンチソルベント分画を、近臨界ジメチルエーテルによって４０ｂａｒの圧力、３３３Ｋの温度及び０．１０の流速比率（溶媒混合物対ジメチルエーテル）において行った。クロフサスグリ搾りかす抽出物とジメチルエーテルを含有する溶媒を静的ミキサー中で混合してから、抽出容器中で沈降させた。弁を通っての減圧によって抽出容器から暗紫色に着色したラフィネート溶液が連続的に得られた。ジメチルエーテルと、溶解した溶媒及び溶解性抽出物は次に、それぞれ、１０ｂａｒと３３３Ｋ及び５〜６ｂａｒと３１３Ｋの圧力と温度における２つの減圧段階を通過した。第１分離段階は赤色溶液を生じ、これは第１段階分離容器から連続的に回収された。第２分離段階も赤色溶液を生じ、これは主として溶媒であった。フィードとアンチソルベント画分のアントシアニン及びフラボノイド濃度も表５に示す。
【０１０３】
【表５】
2009525863.tif 000007
【０１０４】
この実施例は、超臨界ＣＯ２がアントシアニンの濃縮と（グリコシル化）フラボノイドからのアントシアニンの分離のために効果がないことを示す、この理由は、両方の種類の化合物が超臨界ＣＯ２と有機溶媒に殆ど不溶であるからである。この実施例は、液体ジメチルエーテルを用いて、アントシアニン濃度がフィードから実質的に変化している画分を得ることができ、この場合に、フラボノイドからの或る程度の分画も可能であることを示す。ラフィネート中のアントシアニン濃度は、フィードに比べて、実質的に上昇し、フラボノイド濃度は実質的に低下する。この実施例はさらに、高い含水量がフラボノイドのほぼ完全な抽出（第２抽出物中の総固体の７９．４％）に有利に作用し、高いエタノール含量がより大きく選択的な分画を可能にするので、水性−有機溶液の溶媒組成が重要であることを示す。
【０１０５】
実施例５  オリーブ葉水性−有機溶液
この実施例は、如何にしたらアンチソルベント分画を超臨界ＣＯ２によって最初に行って、植物抽出物の所望の画分に富化したラフィネートを得ることができ、次に、該ラフィネートを近臨界ジメチルエーテルによって処理して、所望の画分の成分をさらに富化させることができるかを実証する。オリーブ葉を風乾させ、粉砕して微細粉末にした。次に、オリーブ葉粉末６ｋｇを撹拌式タンクにおいて４対１の溶媒対固体比率で９５％エタノールによって３１３Ｋの温度で１時間抽出した。この溶液を次に、濾過して、濾液を脇に置いておいた。次に、残留固体を４対１の溶媒対固体比率で３０％エタノールによって３１３Ｋの温度で１時間再抽出した。該溶液を次に濾過して、最初の抽出からの濾液と混合した。次に、混合した溶液を冷蔵して、ワックスを沈殿させてから、超臨界ＣＯ２によってアンチソルベント処理した。
【０１０６】
オリーブ葉抽出物と溶媒混合物のアンチソルベント分画を、超臨界ＣＯ２によって３０ｂａｒの圧力、３３３Ｋの温度及び０．０４〜０．１９の流速比率（溶媒混合物対ＣＯ２）において行った。オリーブ葉抽出物とＣＯ２を含有する溶媒を静的ミキサー中で混合してから、抽出容器中で沈降させた。弁を通っての減圧によって抽出容器から褐色に着色したラフィネート溶液が連続的に得られた。超臨界ＣＯ２と、溶解した溶媒及び溶解性抽出物は次に、それぞれ、１００ｂａｒ、６０℃及び５７ｂａｒ、４３℃の圧力と温度における２つの減圧段階を通過した。第１分離段階は強度に緑色に着色した溶液を生じ、これは第１段階分離容器から連続的に回収された。第２分離段階は淡黄色に着色した溶液を生じ、これは主としてエタノールであった。ラフィネートと抽出物画分をＨＰＬＣによってオレウロペインと関連化合物（フラボノイドとビタミンＥ）に関して分析した。蒸発乾燥させた後の各画分の組成を表６に示す。
【０１０７】
【表６】
2009525863.tif 000008
【０１０８】
該ラフィネートは、オレウロペインとオレウロペイン誘導体とフラボノイドとの高められた濃度を有し、ビタミンＥを有さない。最初の抽出物は、クロロフィルとビタミンＥに強化されているが、第２抽出物はほぼ１００％溶媒であり、これは新たな植物材料の再抽出のために再循環することができる。
【０１０９】
ＣＯ２アンチソルベント分画実験からの回収ラフィネートを次に、ジメチルエーテルを用いたアンチソルベント分画によってさらに分画した。オリーブ葉抽出物と溶媒のアンチソルベント分画を、近臨界ジメチルエーテルによって４０ｂａｒの圧力、３３３Ｋの温度及び０．２１の流速比率（溶媒混合物対ジメチルエーテル）において行った。オリーブ葉抽出物とジメチルエーテルを含有する溶媒を静的ミキサー中で混合してから、抽出容器中で沈降させた。弁を通っての減圧によって抽出容器から褐色に着色したラフィネート溶液が連続的に得られた。近臨界ジメチルエーテルと、溶解した溶媒及び溶解性抽出物は次に、一定圧力における温度低下段階（最終温度２０℃）を通過して、第１抽出物画分を生じて、次に４２℃の一定温度における減圧段階（最終圧力６．６ｂａｒ）を通過して、第２抽出物画分を生じた。第１分離段階は少量の暗褐色の抽出物を生じ、これは第１段階分離容器から連続的に回収された。第２分離段階は淡黄色／緑色に着色した溶液を生じ、これは主としてエタノールと所望のオレウロペイン濃縮物であった。ラフィネートと抽出物画分をＨＰＬＣによってオレウロペインと関連化合物（フラボノイドとビタミンＥ）に関して分析した。溶媒を除去した後の各画分の組成を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
二工程アンチソルベント分画方法は、オレウロペイン濃度を溶媒抽出物中の溶解固体の１２．７％から、最終生成物中の２４．０％まで高めている。この実施例はさらに、２種類の溶媒の溶解力の差異も示す。オレウロペインは超臨界ＣＯ２＋エタノール中に事実上不溶性であるが、オレウロペインは、ジメチルエーテルとエタノールと水との三成分混合物中に非常に溶解性である。
【０１１２】
本発明を例を挙げて説明したが、本発明の範囲から逸脱せずに、変化又は修正を行いうることを理解すべきである。さらに、特定の特徴に対して既知の同等物が存在する場合には、このような同等物は、本明細書中に、あたかも具体的に言及されているかのように組み込まれる。
【産業的利用性】
【０１１３】
本発明の方法は、植物材料又は動物材料から得られる粗抽出物を含有する水性−有機溶媒混合物の分画と、他の分画方法によっては容易に得られない、このような抽出物の種々な成分の回収のために有用である。このような抽出物の成分は、例えば、食品成分若しくは医薬品として非常に望ましいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、エタノール−水−ＣＯ２系に関する３０８Ｋにおける３圧力と、３１３Ｋにおける３００ｂａｒでの三元状態図を示す。
【図２】図２は、本発明の方法の１実施態様の概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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