(57)【要約】  本発明は、試験試料中の標的化合物の存在及び／又は量を測定するための較正方法であり、表面に該標的化合物に特異的に結合しうる化合物Csおよび較正用化合物Csc が付着している固体支持体を用い、該化合物Csc と該化合物Csのモル比が既知であり、特に核酸または蛋白質バイオチップのための方法に関する。本発明はまた、特に表面プラズモン共鳴または蛍光による、測定値の自己較正のためのかかる支持体の使用、およびかかる支持体と標準的較正用試薬を含む装置またはキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の標的化合物Ccの存在及び／又は量を表面プラズモン共鳴イメージグ(SPRイメージング) により測定するための方法であり、上面に試験試料中に含まれるであろう該化合物Ccに特異的に結合しうるプローブ化合物Csが付着している、金属層で被覆された固体支持体を用い、以下の工程を含む方法：
−該化合物Ccを含むであろう試験試料を、特異的複合体Cc／Csの形成を可能にする条件下で該支持体に接触させることからなる工程a)、
−工程a)において形成されたであろう特異的複合体Cc／Csの形成のSPR イメージングを含む工程b)：
ここで、
−固体支持体はまた、較正用標的化合物Ccc に特異的に結合しうる較正用プローブ化合物Csc がこの上面に付着され、該化合物Csc と該化合物Csのモル比が既知であり、そして該方法が工程a)およびb)の前または後に以下の工程を含むことを特徴とする：
−c)該化合物Ccc の試料を、特異的複合体 Csc／Ccc の形成を可能にする条件下で該支持体と接触させる工程：および
−d)工程c)の複合体 Csc／Ccc の生成をSPR イメージングにより測定する工程、
ここで試験試料中の該標的化合物の存在及び／又は量の測定は工程b)および工程d)で得られた測定値に基づく。
【請求項２】
以下を特徴とする請求項１記載の方法：
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行う場合、固体支持体から複合体Csc ／Ccc の化合物Ccc を除去するために、工程d)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する；または
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の後に行う場合、固体支持体から複合体Cs／Ccの化合物Ccを除去するために、工程b)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する。
【請求項３】
工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行うことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
スペーサー化合物が前記支持体に付着し、化合物Csおよび化合物Ccが該スペーサー化合物によって支持体に付着していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
化合物Csc が共有結合により化合物Csに結合していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項記載の方法。
【請求項６】
化合物Csc が化合物Csc の支持体の遊離の非結合末端に結合していることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
化合物Csc が独立して化合物Csの固体支持体の表面に付着していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項記載の方法。
【請求項８】
化合物Csc および化合物Csが、同じ分子への固定化により固体支持体の表面に付着しており、後者は支持体に付着していることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
化合物Csc および化合物Csが付着している同じ分子がポリマーであることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
以下を特徴とする請求項１〜９のいずれかの項記載の方法：
−同じ化合物CsおよびCsc が支持体上の区画された表面 (プロットと称する) に付着している；
−化合物Ccc の試料および工程c)の化合物Ccを含有すると思われる試験試料を支持体上の該プロット全部と接触させる；
−該プロット上のポイントまたはピクセルのセットについて工程b)および工程d)での測定を行う；そして
−試験試料中の該標的化合物Ccの存在及び／又は量の測定を、該プロット上のポイントまたはピクセルのそれぞれについて工程b)および工程d)で得られた測定値のセットを考慮して行う。
【請求項１１】
同じプロットについては、複合体Cc／CsおよびCcc ／Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記支持体がｎ個のプロットを含み、ｎは２〜108 であることを特徴とする、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
使用する化合物Csc およびCcc がｎ個のプロットについて同じであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかの項記載の方法。
【請求項１４】
使用する化合物Csc およびCcc が少なくとも２個のプロットについて異なることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかの項記載の方法。
【請求項１５】
使用する化合物Csおよび調べるCc化合物が少なくとも２個のプロットについて異なることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれかの項記載の方法。
【請求項１６】
使用する化合物Csおよび調べるCc化合物が異なる２個のプロットについて、複合体Cc／CsまたはCcc ／Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物Csおよび前記化合物Ccが核酸、特に二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの該ＤＮＡの転写産物を有する一本鎖および二本鎖型核酸の混合物、および非天然ヌクレオチドを含むか含まない任意の核酸からなる核酸の群より選ばれることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかの項記載の方法。
【請求項１８】
化合物Csc およびCcc が、付着した化合物Csおよび調べられる化合物Ccまたはそれらの相補的配列とあまり相同性をもたない核酸であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
化合物Csc および必要であれば化合物Ccc が、６〜30ヌクレオチドの長さの核酸であることを特徴とする、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
前記支持体が透明な固体支持体、好ましくはスライドガラスであることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかの項記載の方法。
【請求項２１】
上部表面に付着した、試料中に含まれると思われる標的化合物Ccに特異的に結合しうる第１のプローブ化合物Cs、および別の標的化合物Ccc に特異的に結合しうる第２のプローブ化合物Csc を含む、金属層で被覆された固体支持体の使用であり、該化合物Csc と該化合物Csのモル比は既知であり、この固体支持体は、標的化合物Ccを含むと思われる試料を支持体の上部表面に接触させた後に、前記測定の較正または自己較正のために、特異的複合体Cs／Ccの形成を測定することにより標的化合物Ccの存在をＳＰＲイメージンクにより測定及び／又は定量するのに使用される、前記使用。
【請求項２２】
前記化合物Csc が、化合物Csの一方の末端へ共有結合により結合されていることを特徴とする、請求項２１記載の固体支持体の使用。
【請求項２３】
測定値の較正のためのキットもしくは必要な器具、またはＳＰＲイメージングによる、前記化合物Ccと、固体支持体の上部表面に付着したプローブ化合物Csとの間の特異的複合体の形成の測定により、試料中の標的化合物Ccの存在を測定及び／又は定量するためのキットもしくは必要な器具であり、該化合物Csは該標的化合物Ccに特異的に結合することができ、以下を含むことを特徴とする、前記キットもしくは必要な器具：
a)−上部表面に、プローブ化合物Cs、およびこのプローブ化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が付着し、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知である、金属層で被覆された固体支持体、または必要であれば、
−金属層で被覆された固体支持体、化合物Csを含む試薬Rs、および化合物Csc を含む試薬Rc、この２つの化合物CsおよびCsc は既知のモル比で該支持体の上部表面に固定するために使用される、および
b)較正用標的化合物Ccc を、好ましくは既知の濃度で含む試薬Rcc 、ここで化合物Ccc は前記化合物Csc に特異的に結合しうる。
【請求項２４】
化合物Csc が、化合物Csの末端の一方に、共有結合で結合していることを特徴とする、請求項２３記載のキットまたは必要な器具。
【請求項２５】
以下を含むことを特徴とする、上部表面に、標的化合物Ccに特異的に結合し得るプローブ化合物Csが付着した、金属層で被覆された固体支持体上での化合物Ccの特異的形成をＳＰＲイメージングにより測定するための装置：
−上部表面に、化合物Ccとは異なる較正用標的化合物Ccc に特異的に結合しうる、化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が付着し、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知であり、、該化合物Csc が化合物Csの末端の一方に共有結合により該支持体の上部表面に結合している、固体支持体、
−前記化合物Csc に特異的に結合しうる、較正用標的化合物Ccc を含む試薬；および
−支持体の上部表面で得られる特異的複合体Cs／CcおよびCsc ／Ccc の形成の測定を可能にする、該支持体のＳＰＲイメージング読み取りシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験試料中の標的化合物の存在及び／又は量を測定するための内部較正方法に関し、この方法は較正用プローブ化合物を表面に付着させた固体支持体を用いる、即ち、ＳＰＲイメージングまたは蛍光イメージング用である。本発明はまたかかる方法を実施するためのキットおよび装置を含む。
【０００２】
最近の数年にわたり、生物学的試料の分析ために、特に、多量の核酸または蛋白質の並行分析のための多く手法と装置が、殊にゲノムおよびプロテオミック工学の急速な発展に従って開発された。このようにＤＮＡまたは蛋白質チップ技術、即ち、バイオチップは、現在格別な拡がりをみせており、これは科学団体から非常に大きい興味をもたれるようになっている。これらの種々の状況における遺伝子発現のレベルを理解することは、機能の理解へと進み、また新規な分子の標的化および新規な医薬品や診断手段の同定へと進んでいくことになる。
【０００３】
これらの技術および装置は、多くの研究の課題を有する、バイオチップまたはＤＮＡもしくは蛋白質チップ（マイクロもしくはマクロアレイともいう）などの核酸またはペプチドの高速分析を可能となる支持体を含む。
【０００４】
特に、これらのバイオチップは、官能化され、所定の核酸またはペプチドが付着し（核酸プローブまたはペプチドプローブ）、そして核酸またはペプチドプローブが、対となることにより（即ち、特異ハイブリダイゼーション）、または生物学的試料中の検出、同定及び／又は定量すべき標的核酸もしくは蛋白質の結合部位を認識することにより、特異的に結合する固体支持体から製造しうる。
【０００５】
ＤＮＡバイオチップに単する技術を記載した文献の中で、特に以下が引用できる：
−ＤＮＡチップのための主な既知技術の最新の概要を示している、Wang J. による概説の論文 (Nucleic Acids Research, 28, 16, 3011-3016, 2000)、およびチップ設計者が直面する問題点を列挙しているSchubhart et al.の文献 (Nucleic Acids Rearch, 28, 10, e47, 2000)；
−スルフヒドリルまたはジスルフィド基により修飾された核酸のメルカプトシラン処理した表面でのグラフトを記載した米国特許第6,030,782 号、および複合分子、ＤＮＡ−チオールを自己組織化単層、即ちSAM 中に導入することによりＤＮＡを有する表面を得る方法を記載した、Bamdadの論文 (Biophysical Journal, 75, 1997-2003, 1998) ；
−グラフトの密度の増加を可能にする多官能性ポリマーによるオリゴヌクレオチドなどの固定化分子を示唆している国際特許出願 WO 00/43539。これらのポリマーはヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミドまたはビニルピロリドンなどのモノマーから得ることができる；
−ピロールまたは官能化ピロール共重合体の金属層型基体への重合、官能化ピロール上への網状化剤の固定、次いで生物学的プローブ (例、オリゴヌクレオチド) の固定を含むＤＮＡチップの製造方法を記載している国際特許出願 WO 00/36145。網状化剤は２官能性であって、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基およびマレイミド官能基を有していてもよい；
−チオール基を含む核酸をこのチオール基と反応する基を呈示している支持体に接触させることにより、おそらく網状化剤の中間体を介して、固体支持体へ核酸を高密度で固定化することを記載している国際特許出願 WO 98/20020。
【０００６】
核酸または蛋白質の並行分析のために最近数年にわたり開発されてきた、生物学的試料の分析のための技術または装置の中で、表面プラズモン共鳴 (SPR)を挙げることもでき、これは、ここ数年、薄膜の特性決定に加え界面のプロセスを監視するための十分に認められた分析手段となってきた技術である。この技術は、支持体に付着したプローブと、検出、同定及び／又は定量化すべき標的化合物との間に形成される特定の複合体の標識を必要としないという利点がある。このSPR 技術では、方法の感度は、電磁場の刺激、金属誘導性の界面上に生じる表面プラズモン波に起因する。界面に極めて近接した光の場の位置は、低容量で光−物質の相互作用を制限し、そこでの最も少ない修飾が表面プラズモンの特性上重要な結果をもつ。かかるスーパーフェイシャルプラズモンは、偏光TMが全反射でプリズムによって金／誘導性界面を照らした場合、金表面で励起し、表面プラズモンモードでのある角度で、あるいは回折ネットワークを介して入射光とカップリングする。プラズモン形成は、フォトダイオードにより測定できる反射光の顕著な減少と関連する。表面状態の変化、特にバイオチップの通常の官能化に関連した変化は、表面プラズモン波の状態における、従ってある光学構造でのカップリング効果における修飾をもたらす。その結果、ハイブリダイズする標的を定量できる、即ち角度または共鳴波長における変化を測定することによって、あるいは、単に反射率における変化によってさえ定量できる。これらの変化は接触する媒体の屈折率 (n)における何らかの変化、および光学的厚さにおける何らかの変化に極めて感受性である。例えば、金および銀は可光領域でのSPR チップ中の金属薄膜の理想的な候補である。SPR 技術は標識なしでの検出、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応の研究およびリアルタイムでの分子および生体分子の事象の検出に広く使用されてきた。これは、検出の原理が、隣接する環境に比べた、界面に結合する分子により引き起こされる光学的対比における変化に基づいているという事実に起因する。SPR チップ上の金の表面への生物学的化合物の固定のために使用する化学は、主としてチオール化合物 (例えば、Peterlinz K.A. et al., Am. Chem. Soc., 1997, 119, 3401-3402 ； Smith E.A. et al., Langmuir, 2001, 17, 2502-2507 ； Smith E.A. et al., Am. Chem. Soc., 2003, 125, 6140-6148; Damos F.S. et al., Langmuir, 2005, 21, 602-609参照) 、または導電性ポリマー (例えば、Guedon P. et al., Anal. Chem., 2000, 72, 6003-6009; Jung L. S. et al., J. Phys. Chem. B., 2000, 104, 11168-11178; Szunerits S. et al., Langmuir, 2004, 20, 9236-9241参照) の使用に基づく。Biocore 社はSPR 現象に基づく生体分析システムを製造している (参照：http//www.biocore.com.) 。このシステムでは、官能化デキストラン層を金表面に結合し、各種の化学的および生物学的種を表面に結合させている。
【０００７】
ポストゲノム技術に関連して、研究実験室の環境外で利用できる日常的バイオチップシステムをもつ緊急の必要性がある。これを達成する前は、バイオチップシステムの質や性能を改善するために現在用いられている材料および化合物をより良く特性決定し理解する必要がある。
【０００８】
現在、研究実験室では３種類のバイオチップを用いた装置が主に見られる。得られる測定値の解釈には依然として、定量的解釈を困難にするこれらの測定値に関連する「ノイズ」及び／又は「変動」が高いレベルである場合、専門家の関与が必要である。特に遺伝子診断に関しては、大規模の遺伝子型判定 (自動) における信頼性も欠如しており、これが今まで低価格での日常的使用を妨げてきた。従って、現在この欠陥は補われていない。
【０００９】
現在、測定の正確さは、使用される表面の機能性に部分的に支配されることにより制限されている。バイオチッププロット (プロットまたはスポットは同じ物質が配置されたチップの個々の表面に対応する) を用いる場合、これは、異なるプロット間の均質性の欠如およびそれらの間の大きな不均一性により位置により見られる。これは、調査している差が、バイオチップ表面の固有の分散よりも小さいことを意味する。
【００１０】
このことが、得られた画像の各ピクセル (pixel)の自己較正を、これらの部位で生じる生化学的相互作用の反応性の測定を大きく改善するために利用できるようにすべき理由である。
【００１１】
かかる方法は、正確さ、従って同等の性能での情報密度におけるを顕著な向上を可能にしながら、バイオチップの調製のコストおよび使用のためのプロトコルにおける、非常にわずかな増加を含むかもしれない。
【００１２】
これがまさに本発明の主題である。
本発明者等は、特にＤＮＡバイオチップの場合には、標的化合物 (Cc) に特異的なプローブ化合物 (Cs) に加えて較正用標的化合物 (Ccc)に特異的な較正用プローブ化合物 (Csc)を、同じプロット中に、また必要であれば複数のプロットに導入することが可能であることを見出した。化合物Ccc を含有する溶液の１回の通過により、各ピクセルのための利用可能なCsプローブの有効密度を定量することが可能となり、次いでその値を個々の標準化パラメーターとして使用する。かかるプロセスについて、本発明者等は、同じプロットでのまたは複数の相補的プロット間の各ピクセルについてなされた測定値の分散を著しく減少させることが可能であり、従って、これらのバイオチップに関する測定の改善、およびより高い正確さをもたらすことを見出した。
【００１３】
かかるプロセスについて、本発明者等は、バイオチップの各ピクセルについて得られた測定値の自己較正を行うことができ、それによって用いた材料および化合物の均質性の欠如により生の測定値で生じる変動のほとんどを解消しうることを見出した。
【００１４】
本発明のバイオチップの自己較正方法は以下に基づく：
−予め官能化され組み立てられた表面上の、プローブ：標的複合体形成反応の動的読み取り方法による連続的読み取り；および
−少なくとも１つの較正用プローブと１つの特異的なプローブを含む多官能化プローブによる、この表面の適切な官能化。
【００１５】
従って、本発明は、試験試料中の標的化合物Ccの存在及び／又は量を測定するための固体支持体 (バイオチップ) 上で行われる測定の自己較正方法であり、上面に、試験試料中に含まれるであろう該化合物Ccに特異的に結合しうるプローブ化合物Csが付着している固体支持体を用いる、以下の工程を含む方法に関する：
−該化合物Ccを含むであろう試験試料を、特異的複合体Cc／Csの形成を可能にする条件下で該支持体に接触させることからなる工程a)、
−工程a)において形成されたであろう特異的複合体Cc／Csの形成を、好ましくは動的無標識測定方法により測定するための工程b)：
ここで、
−該固体支持体はまた、較正用標的Ccc に特異的に結合しうる較正用プローブ化合物Csc をこの上面に付着して含み、該化合物Csc と該化合物Csのモル比は既知であり、そして該方法は工程a)およびb)の前または後に以下の工程を含む：
−c)該化合物Ccc の試料を、特異的複合体 Csc／Ccc の形成を可能にする条件下で該支持体と接触させる工程：
−d)工程b)で用いた測定方法により工程c)の複合体 Csc／Ccc の生成を測定する工程、
ここで試験試料中の該標的化合物Ccの存在及び／又は量の測定は工程b)および工程d)で得られた測定値に基づく。
【００１６】
複合体Cc／Csまたは Ccc／Csc 、特に特異的核酸／核酸複合体、またはポリペプチド／ポリペプチド複合体の特異的形成を可能にする条件は当分野でよく知られており、本明細書には記載しないであろう。例えば、核酸複合体の場合は、この標的核酸のこの核酸プローブとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件は本明細書に記載するであろう。これらは好ましくは高ストリンジェントな条件、特に以下に記載するものである。
【００１７】
高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、温度およびイオン力の条件が、２つの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ断片間のハイブリダイゼーションを支持するように選ばれることを意味する。例としては、上記に記載のハイブリダイゼーションを規定するためのハイブリダイゼーション工程における高ストリンジェントな条件は、有利には以下の通りである。
【００１８】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２工程で行われる：
(1) ５×SSC(１×SSC は、0.15M NaCl＋0.015M  クエン酸ナトリウムの溶液に相当する) 、50％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、10×Denhardt、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸緩衝液 (20mM、pH7.5)中での３時間42℃での予備的ハイブリダイゼーション；
(2) プローブのサイズに応じた温度 (即ち、＞100 ヌクレオチドのサイズのプローブでは42℃) での20時間のハイブリダイゼーション、次いで２×SSC ＋２％SDS 中20℃での洗浄を２×20分、0.1 ×SSC ＋0.1 ％SDS 中20℃での洗浄１×20分。後者の洗浄は、＞100 ヌクレオチドのサイズのプローブでは0.1 ×SSC ＋0.1 ％SDS 中60℃で30分間行われる。所定の大きさのヌクレオチドについて上記した高ストリンジェントな条件は、当業者によりSambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の記載に従って、より大きいまたはより小さいオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
【００１９】
ポリペプチド／ポリペプチド型のCc／CsまたはCcc ／Csc 複合体については、これは最も一般的には２つのポリペプチド (リガンド／受容体、抗原／抗体など) 間の親和性により得られる特異的複合体である。かかる親和性複合体の形成を可能にする条件、特にインキュベーション温度 (20〜37℃) 、モル濃度、pH及び／又は使用する緩衝液の塩濃度 (pH7.4 のPBS 型緩衝液) に関してよく知られている。
【００２０】
好ましい態様によれば、本発明の方法は、以下を特徴とする：
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行う場合、固体支持体から複合体Csc ／Ccc の化合物Ccc を除去するために、工程d)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する；または
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の後に行う場合、固体支持体から複合体Cs／Ccの化合物Ccを除去するために、工程b)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する。
【００２１】
得られる複合体 (核酸／核酸、ポリペプチド／ポリペプチドまたは核酸／ポリペプチド) の性質に応じて、かかる複合体を変性させるために適用すべき条件および溶液の知識を当業者は有している。
【００２２】
例えば、約80℃での洗浄液が、複合体Csc ／Ccc またはCs／Ccに関して形成された核酸二本鎖を変性させるのに使用できるが、これに限定されることはない。通常使用される変性条件も、支持体に付着した二本鎖型のプローブ化合物から一本鎖型核酸Csのプローブ化合物を得るために使用できる (Peterson et al., Nucleic Acids Research, 29(24), 5163-5168, 2001, Materials and Methods 参照) 。
【００２３】
ポリペプチド／ポリペプチド型複合体については、生成した複合体のCcまたはCcc 化合物の除去は、pH及び／又はイオン力を複合体の変性を生じさせるように調整した洗浄液で行うことができる。かかる方法は、クロマトグラフィー支持体に付着させた別のポリペプチドの親和性により複合化する有用なポリペプチドを溶出させるためのアフィニティークロマトグラフィー法において一般に使用されている。
【００２４】
固体支持体から複合体Csc ／Ccc またはCs／Ccの化合物Ccc またはCcを除去するために工程d)またはb)の後に固体支持体を洗浄することが、任意のタイプの測定システムに有利に使用できるが、同じ標識を用いてCcまたはCcc 標的化合物を標識することを必要とする測定システムが必要な場合に洗浄を行うことは特に有利である。
【００２５】
好ましい態様によれば、本発明の方法は工程a)前に工程c)およびd)を行うことを特徴とする。
特に、プローブ化合物CsおよびCsc が核酸である場合、グラフトされたプローブに移動性を付与するために、プローブ化合物が結合される支持体とプローブ化合物との間にスペーサーアームを結合させることが有利でありうる。特に短い配列のオリゴヌクレオチドについては、支持体にグラフトされた核酸 (吸着または共有結合により) はハイブリダイゼーションの間に常に標的化合物に十分接近可能であるとは限らない。スペーサー化合物は一般的に、まず支持体への結合のためにプローブ化合物の末端に結合される。この化合物の性質は変化し得る。これは、標的配列CcもしくはCcc またはその相補的配列と相同性をもたない核酸配列であっても、あるいはポリエチレングリコール型の化合物 (WO 03/068712参照) であってもよい。
【００２６】
従って、本発明のある好ましい態様によれば、スペーサー化合物は支持体に付着し、化合物CsおよびCcがこのスペーサー化合物によって互いに独立に支持体に付着している。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、Csc が共有結合を介して化合物Csに結合していることを特徴とする。
【００２７】
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、化合物Csc が化合物Csc の支持体の遊離の非結合末端に結合していることを特徴とする。
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、化合物Csc が化合物Csとは独立に固体支持体表面に付着し、この付着した化合物Csc とこの付着した化合物Csとのモル比は既知であることを特徴とする。
【００２８】
独立にという用語は、ここでは、化合物Csc は化合物Csに直接付着していないことをいう。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、化合物Csc および化合物Csが、同じ分子への固定により固体支持体の表面に付着しており、後者は支持体に付着していることを特徴とする。
【００２９】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、化合物Csc および化合物Csが付着している同じ分子が、複数のアビジンに結合したピロールやポリエチレンイミンポリマーなどのポリマーであるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
例えば、SPR イメージングによる測定を用いたシステムについては、金属表面で被覆されたスライドガラス上にプローブ化合物 (CsまたはCsc)を有するピロール残基の電気重合 (electropolymerization)による固定化方法 (Maillart et al., Oncogene, p.1-8, 2004, およびGuedon et al., 2000)、またはビオチニル化プローブ化合物によってアビジンへ結合したポリエチレンイミンを用いる方法 (Bassil et al., Sensors and Actuators, B94, 313-323, 2003) に言及できる。
【００３１】
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は以下を特徴とする：
−同じCsおよびCsc 化合物が支持体上の同じ区画の表面 (プロットまたはスポットという) に付着している；
−化合物Ccc の試料、および工程c)の化合物Ccを含有すると思われる試験試料を支持体上の該プロットと接触させる；
−該プロット上のポイントまたはピクセルのセットについて、工程b)およびd)の測定を行う；そして
−試験試料中の該標的化合物Ccの存在及び／又は量の測定を、該プロット上の測定されたポイントまたはピクセルのそれぞれについて工程b)および工程d)で得た測定値のセットを考慮に入れて行う。
【００３２】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、同じプロットについては、複合体Cc／CsおよびCcc ／Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、該支持体がｎ個のプロットを含み、ｎは２〜108 、好ましくは２〜107 、２〜106 、２〜105 、２〜104 、２〜103 または２/103  プロットであることを特徴とする。
【００３３】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、使用するCsc およびCcc 化合物がｎ個のプロットについて同じであることを特徴とする。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、使用するCsc およびCcc 化合物が少なくとも２個のプロットについて異なることを特徴とする。
【００３４】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、使用するCsおよび調べるCc化合物が少なくとも２個のプロットについて異なることを特徴とする。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、使用するCsおよび調べるCc化合物が異なる２個のプロット、好ましくは固体支持体上の全プロットについて、複合体Cc／CsまたはCcc ／Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする。
【００３５】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、前記化合物Csが、核酸、ペプチド−核酸 (PNA)、ポリペプチド、オリゴ糖、脂質からなる化合物の群、好ましくは核酸、PNA およびポリペプチドからなる化合物の群より選ばれることを特徴とする。
【００３６】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、前記化合物Csおよび前記化合物Ccが、以下の対(Cs 、Cc) より選ばれることを特徴とする：
− (核酸、核酸) 
− (核酸、ポリペプチド) 
− (ポリペプチド、、核酸) 
− (ポリペプチド、ポリペプチド) 
好ましい (Cs、Cc) の対は (核酸、核酸) である。
【００３７】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、以下を特徴とする：
−前記化合物Csおよび前記化合物Ccが核酸である場合、化合物Csc およびCcc は核酸である、
−前記化合物Csおよび前記化合物Ccがポリペプチドである場合、化合物Csc およびCcc はポリペプチドである、
−前記化合物Csが核酸であり、前記化合物Ccがポリペプチドである場合、化合物Csc は核酸である。
【００３８】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、前記化合物Csおよび前記化合物Ccが核酸、特に二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡなどの該ＤＮＡの転写産物を有する一本鎖および二本鎖型核酸の混合物、および非天然ヌクレオチドを含むか含まない任意の核酸からなる核酸の群より選ばれることを特徴とする。
【００３９】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、固体支持体上のプロット上に付着した化合物Csc が、このプロット上の、付着した化合物Csおよび調べられる化合物Ccまたはそれらの相補的配列とあまり相同性をもたない核酸であることを特徴とする。
【００４０】
あまり相同性をもたないとは、ここでは、複合体Cc／Csの特異的形成を可能にする条件下で前記化合物Ccを含むと思われる試験試料を前記支持体と接触させる工程a)、および複合体Csc ／Ccc の特異的形成を可能にする条件下で前記化合物Ccc の試料を前記支持体と接触させる工程c)において使用される特異的ハイブリダイゼーション条件下で、これらの配列間のハイブリダイゼーションを可能とはしないような配列間の同一性の程度を意味する。
【００４１】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、化合物Csc および必要であれば化合物Ccc が、６〜30ヌクレオチド、好ましくは６〜24ヌクレオチド、６〜20ヌクレオチド、６〜15ヌクレオチドまたは６〜12ヌクレオチドの長さの核酸であることを特徴とする。
【００４２】
ある好ましい態様では、本発明の方法は、前記支持体が、好ましくは以下の支持体から選ばれる固体支持体であることを特徴とする：ガラス、シリコン、シリコーン、KevlarTM、ポリマー (プラスチック、ポリアクリルアミド、ポリピロール、ポリオース) 、金属 (金、白金) 。使用する測定システムがSPR イメージングである場合、これらの支持体、好ましくはガラスの支持体は片方の表面を金属 (例、金または銀) の薄層で被覆されている。
【００４３】
プローブ化合物CsおよびCsc のためのこれらの支持体および固定化方法は当業者によく知られている。
これらの支持体の中で、検出のために標的の標識を必要とするものを挙げると、例えば：
−マクロアレイ型支持体、
支持体：ナイロン膜；スポットサイズ：0.5 〜１mm、密度：数百スポット／cm2 ；プローブ：例えばＰＣＲまたは合成産物；標的：例えば32P で放射性標識した  DNA ；
−スポットされたマイクロアレイ型支持体、
支持体：化学的被覆をもつスライドガラス、スポットサイズ：〜100 μm ；密度：1000〜10000 スポット／cm2 ；プローブ：例えばＰＣＲまたは合成オリゴヌクレオチド (20〜70マー) ；標的：例えば蛍光標識した (Ct3 およびCy5 による) cDNAまたはＰＣＲ産物；
−Affymetrix遺伝子チップ型支持体、
支持体：化学的被覆をもつスライドガラス、スポットサイズ：〜20μm ；密度：250000スポット／cm2 以下；プローブ：例えば、in situ 合成した20〜25マーのオリゴヌクレオチド；標的：ビオチン−ストレプトアビジンでの蛍光標識した  DNA またはＰＣＲ産物；
スポットされたチップの製造方法は現在、十分に確立されている (DeRisi et al., Science 278(5338): p.680-686, 1997)。標的化合物がＤＮＡ型核酸である場合、ＤＮＡ溶液はＰＣＲ増幅またはオリゴヌクレオチド合成のいずれかにより調製される。次いで、これらの溶液の微小液滴を規定された配置マトリックスに従い、ロボットにより、ＤＮＡプローブがマトリックス上の各スポット (またはプロット) に付着することを可能にする化学的層で処理したスライドガラス上に置く。
【００４４】
フォトリソグラフィーによりin situ 合成されるオリゴヌクレオチドチップの製造方法もよく知られている。これらには、Affymetrixにより開発された  eneChipsTM技術 (Lipshutz R.J. et al., Nat. Genet., 1999, 21(1 Suppl): p.20-24)、またはAgilent Technologies/Rosetta Inpharmaceuticsにより開発されたインクジェット印刷 (Hunges T.R. et al., Nat. Biotechnol, 2001, 19(4):p.342-347) がある。
【００４５】
本発明のバイオチップ自己較正法においては、工程b)およびd)における読み取りは、任意の動的読み取り方法、好ましくは任意の無標識読み取り方法により行うことができる。
本発明のバイオチップ自己較正法で使用できる無標識動的読み取り方法には以下の方法があるが、それらに限定されない：
・表面プラズモン共鳴 (SPR)；
・金属：誘導性界面でではなく、高い光学的インデックス案内帯域周囲での被きょう導波 (guided wave)の使用；
・表面音波の使用；
・集積電子工学化合物の使用；
・インピーダンスの使用；
・磁気抵抗の使用；または
・デフレクターマイクロミラーの使用。
【００４６】
これらの方法は当業者によく知られている。例えば、以下の文献を挙げることができる：
Dharuman et al.,≪電子化学的レドックスプローブを用いる交互嵌合超ミクロ電極上でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの無標識インピーダンス検出≫, Biosens. and Bioelect. 21, 645-654, 2005; 
Cheng et al., " 多層自己組織化金ナノ粒子によるＤＮＡの電気的検出のためのアレイによるCMOSバイオチップ", Sensors and Actuators, B 109, 249-255, 2005; 
Nikitin et al., " ピコスコープ、新規な無標識バイオセンサー", Sensors and Actuators, B 111-112, 500-504, 2005; 
または一般的概説の文献≪機能性蛋白質マイクロアレイ上の相互作用のリアルタイム無標識検出のための新たな手段≫, Ramachadran et al. (FEBS Jounal (Federation of European Biochemical Society) vol.272, p.5412-5425, 2005)、およびこれらの方法に適用される支持体で方法を行うための、この文献で参照として引用されている文献。
【００４７】
SPR 法に比べ、上記で引用したその他の無標識の動的読み取り方法は、多官能化プローブを配置する前の、特に選択された読み取り方法に使用する支持体での、表面の官能化においてわずかな変化を必要とするだけである。それらの使用のために行われるべきプロセスまたはプロトコルはSPR 法のものと同じである (読み取りは金属薄膜の使用が必要である) 。
【００４８】
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、工程b)およびd)における複合体の形成の測定が、固定支持体の下部表面 (プローブ化合物が付着している支持体表面の反対側) のシグナルを読むことにより行われる場合、特に、本発明方法が工程b)およびd)における複合体の形成の測定が表面プラズモン共鳴イメージング (SPR)により行われることを特徴とする場合、前記支持体は透明な固体支持体、特にスライドガラスであることを特徴とする。
【００４９】
本発明方法の別の態様には、化合物Ccおよび化合物Ccc が標識されている方法がある。
本発明方法が、標的化合物の予備標識を必要とする測定システム (即ち、蛍光または放射性シグナルの測定) を使用する場合、検出及び／又は定量すべき標的化合物CcおよびCcc は、直接または間接的に検出しうるシグナル、好ましくは蛍光で検出可能なシグナルを生じ得る標識で予備標識される。
【００５０】
好ましくは、化合物CcおよびCcc は、特に、複合体Cs／Ccの測定が複合体Csc ／Ccc の存在下で行われる、またはその逆の場合、異なる標識で予備標識される。
従って、ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、標識が蛍光標識であることを特徴とする。
【００５１】
好ましくは、前記標識が蛍光標識である場合、それらはシアニン誘導体、好ましくはシアニンスルホン酸誘導体、即ち化合物Cy5 またはCy3 、Alexa Fluor TMの製品 (Molecular Probes Inc. 米国) からの蛍光色素、またはローダミンもしくはその誘導体を有するものから選ばれる。
【００５２】
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、化合物CcおよびCcc を標識するのに用いる前記標識が同じであることを特徴とし、かつ以下を特徴とする：
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行う場合、固体支持体から複合体Csc ／Ccc の化合物Ccc を除去するために、工程d)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する；または
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の後に行う場合、固体支持体から複合体Cs／Ccの化合物Ccを除去するために、工程b)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する。
【００５３】
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、化合物CcおよびCcc を標識するのに用いる前記標識が異なることを特徴とする。
例えば、標識が蛍光型のものであり、化合物CcおよびCcc が核酸である場合、化合物CcおよびCcc はそれぞれCy3 およびCy5 、あるいはその逆に標識することができる。
【００５４】
核酸化合物を蛍光標識で標識することは当業者によく知られており、ここでは説明しないであろう。例えば、所望の標的がゲノムＤＮＡである場合、使用される標識技術は、標識されたヌクレオチド (例、Cy3/Cy5 dCTP) の存在下で相補鎖の合成のためのＤＮＡポリメラーゼ (クレノー型酵素) であり、あるいは所望の標的がＲＮＡである場合、アミノアリルdUTPの存在下で逆転写酵素 (RT) と共に間接的標識技術が使用される。
【００５５】
本発明の別の面は、上部表面に付着した、試料中に含まれると思われる標的化合物Ccに特異的に結合しうる第１のプローブ化合物Cs、および別の標的化合物Ccc に特異的に結合しうる第２のプローブ化合物Csc を含む固体支持体の使用であり、この化合物Csc と化合物Csのモル比は既知であり、この固体支持体は、標的化合物Ccを含むと思われる試料を支持体の上部表面に接触させた後に、この支持体の上部または下部の表面で行われる前記測定の較正または自己較正のための動的読み取り方法、好ましくは無標識の方法により、特異的複合体Cs／Ccの形成の測定を可能にするシステムを用いて標的化合物Ccの存在を測定及び／又は定量するのに使用される。
【００５６】
好ましくは、本発明の固定支持体の使用は、前記化合物Csc および前記化合物Csが独立に、同じ方法によって前記支持体の上部表面に付着し、より好ましくは、前記化合物Csc が、化合物Csの末端への共有結合により前記支持体の上部表面に付着していることを特徴とする。
【００５７】
好ましい態様によれば、本発明の支持体の使用は、前記支持体および前記化合物Cs、Csc 、Ccc およびCcがさらに、本発明の上記方法において独立して規定された特性を有することを特徴とする。
【００５８】
好ましくは、本発明の固体支持体の使用は、この支持体が金属層で被覆されていること、および使用する無標識動的読み取り方法がSPR イメージングであることを特徴とする。
さらに別の面では、本発明は、測定値の較正もしくは自己較正のためのキットもしくは必要な器具、または固体支持体の上部表面に付着した前記化合物Ccとプローブ化合物Csとの間の特異的複合体の形成の測定のためのシステムにより試料中の標的化合物Ccの存在を測定及び／又は定量するためのキットもしくは必要な器具を包含し、該化合物Csは該標的化合物Ccに特異的に結合することができ、複合体の形成の測定が、動的読み取り方法、好ましくは無標識の方法により行われることを特徴とし、またキットもしくは必要な器具が以下を含むことを特徴とする：
a)−上部表面に、プローブ化合物Cs、およびこのプローブ化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が結合され、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知である、固体支持体、または必要であれば、
−固体支持体、化合物Csを含む試薬Rs、および化合物Csc を含む試薬Rc、この２つの化合物CsおよびCsc は既知のモル比で該支持体の上部表面に固定するめたに使用される、および
b)再構成のための乾燥形態もしくは溶液であるのが必要な場合、較正用標的化合物Ccc を、好ましくは既知の濃度で含む試薬Rcc 、ここで化合物Ccc は前記化合物Csc に特異的に結合しうる。
【００５９】
好ましくは、本発明のキットまたは必要な器具は、化合物Csc が、化合物Csの末端の一方、好ましくは化合物Csの支持体に結合していない遊離の末端に、共有結合で結合していることを特徴とする。
【００６０】
好ましくは、化合物CsおよびCsc は核酸である。
好ましい態様によれば、本発明のキットまたは必要な器具は、前記支持体および前記化合物Cs、Csc 、Ccc およびCcがさらに、本発明の上記方法において独立に規定された特性を有することを特徴とする。
【００６１】
好ましくは、本発明のキットまたは必要な器具は、前記支持体が金属層で被覆され、使用される無標識の動的読み取り方法がSPR イメージングであることを特徴とする。
最後の面によれば、本発明は、以下の特徴とする、上部表面に、前記標的化合物Ccに特異的に結合し得るプローブ化合物Csが付着した固体支持体上での化合物Ccの特異的形成を測定するための装置を含む：
−上部表面に、化合物Ccとは異なる較正用標的化合物Ccc に特異的に結合しうる、化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が付着し、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知であり、該化合物Csc および該化合物Csが同じ方法で該支持体の上部表面に独立に付着するか、または、該化合物Csc が化合物Csの末端の一方に共有結合により該支持体の上部表面に付着している、固体支持体、
−再構成のための乾燥形態もしくは溶液であるのが必要な場合、前記化合物Csc に特異的に結合しうる、較正用標的化合物Ccc を含む試薬；および
−支持体の上部表面で得られる特異的複合体Cs／CcおよびCsc ／Ccc の形成の測定を可能にする、該支持体の上部または下部表面の動的読み取り方法を用いる読み取りシステム。
【００６２】
好ましい態様によれば、本発明の装置は、前記支持体、化合物Cs、Csc およびCcc 、並びに読み取りシステムがさらに、本発明の上記方法において独立に記載された特性を有することを特徴とする。
【００６３】
好ましくは、本発明の装置は、前記支持体が金属層で被覆され、無標識の動的読み取り方法がSPR イメージングであることを特徴とする。
比較遺伝子発現プロフィールを得るために同定された変異の遺伝子型決定のための、健康分野における、また、例えばGMO (genetically modified organism、遺伝的改変生物) のトレーサビリティーおよび質の制御の点での健康監視のための、本発明のキットまたは装置の使用も本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明のその他の特徴および利点は、以下に説明する実施例および図面を通して明らかとなるであろう。
【実施例１】
【００６５】
較正用プローブCsc に結合された、標的化合物Csに特異的な核酸型のプローブがその表面に付着しているSPR イメージング用固体支持体の組み立て
材料および方法
・動的ＤＮＡ／ＤＮＡバイオチップの場合における適切な官能化の例
約２nmのクロムの層および約50nmの金の層を被覆したスライド型顕微鏡のガラス基体からチップを製造した。Bassil et al., 2003 の文献に記載のようにして、この被覆にMUA (11-メルカプトウンデカン酸) ／PEI(ポリエチレンイミン) ／エキストラアビジン型、または11- メルカプトウンデカノール／デキストラン／アビジン型(Biorad)の分子自己組織化システムを加えた。最後の層はアビジン基に富むので、ビオチンと官能化する新規な基の被覆に特に適している (アビジン／ビオチン複合体は特に安定である) 。ビオチン化プローブ配列をスポットすることによりバイオチップを官能化した (プローブ配列はPBS １×および1.5 M ベタイン溶液中で７μM 濃度に希釈した) 。使用した製品はすべて市販のものである。
【００６６】
この例におけるCsc 較正用配列は、プローブプロットのセット用のプローブCs配列の3'末端に共有結合により導入する。
例えば、膵臓繊維症に関連するCFTR遺伝子のエキソンn10 の「MV470 」変異の遺伝子型を特定決定するために、以下の配列を有する構造を使用した。
【００６７】
変異：固定 (5'ビオチン) ＋スペーサー ((T16) ＋標的配列＋較正 (gac cgg tat gcg)、即ち較正用化合物Ccc に結合したプローブ化合物Cs用、それぞれ非変異遺伝子 (野生型)M470V-WT 、変異遺伝子 (変異型)M470V-MT および陰性対照用：
M470V-WT：  5'ビオチン(T)16 TTC TAA TGA TGA TTA gac cgg tat gcg 3'
M470V-MT：  5'ビオチン(T)16 TTC TAA TGG TGA TTA gac cgg tat gcg 3'
陰性対照：  5'ビオチン(T)18 CAC TTC GTG CCT T gac cgg tat gcg 3'
較正用配列は、その長さが、形成される相補的二本鎖が十分に安定であり、好ましくはバイオチップで使用されるその他の配列と交差反応を示さないようになれば採用できる。かかる較正用プローブ配列を選択する方法を簡単にするために、それらは、「zip 」として紹介され (Gerry et al., J. Mol. Biol., vol.292, pp.251-262, 1999参照) 、原則としてヒトゲノムに存在する配列とは相互作用しないことが見出されているものから選択できる。Csc 化合物としてのこの種の配列は、所望の標的化合物が何であろうと、修飾の必要なく利用できるという特別な利点を有する。
【００６８】
PBS １×緩衝液 (0.137 M NaClを含む25mMリン酸緩衝液、pH7.4)中で行った実験の過程で、較正用標的化合物Ccc の試料まず、標的化合物Ccの試料の前にバイオチップと接触させるか、または逆に、Csc とCcc 間 (または逆にCsおよびCc間) で形成される二本鎖を、２シリーズの測定の間で変性する。別の態様では、Csc とCcc 間 (または逆にCsおよびCc間) で形成される第１の二本鎖の変性を行わないことが可能である。この後者の態様については、表面とプローブ化合物間に較正用プローブ化合物Csc を置くことが好ましい。
・使用する測定システム
読み取りはSPR イメージングモード (SPR)で行う。測定の規模はTE偏光 (transverse electric)に関して、TM偏光 (transverse megnetic)における反射率 (R)のレベルである。この物理的現象は、我々の測定値に関連して６次元を与える：２つの空間的次元（ｘおよびｙと称する）１つの時間的次元（t)、１つのスペクトルの次元 (λ) 、１つの角の次元( θ) および１つの偏光の次元 (TMi)。共鳴の状態は、表面に近い光学的インデックスｎにおける変化、特に生化学分子のハイブリダイゼーションにより生じ、平均厚さの薄膜を形成する変化により影響される。サブ−ナノメトリック (sub-nanometric) の解像度は多くの用途、特にＤＮＡ配列ハイブリダイゼーションの測定を必要とする用途にとって十分である。
【００６９】
かかる測定はリアルタイムで行われ、経時的に所定の表面での変化を追うことが可能となる。
複数の測定を連続的および一時的に行うことができる動的バイオチップの一般的な場合では、較正段階と、興味ある生体分子の相互作用を監視する段階を組み合わせることができる。これにより、生の実験測定値を補正し、これらの測定がなされた条件における局所的変動を考慮することが可能となる。
【００７０】
これは実際の測定の間に同じ特異性をもつかもしれない較正用物質を結合することを含む。これにより、Δｎ／Δｅを測定することにより、すべてのピクセル（ｘ、ｙ、＊）の実際の官能度が定量できる。次いで、測定相での挙動に見られる分散を判断し量的に補正するために、バイオチップ表面の均質性の実際の欠如、特に利用しうるプローブの密度を考慮に入れることが可能である。結果として、この補正は、経時的に安定である空間的変動のすべての原因の測定値を解消する。表面に相対的に支配される現在のレベルおいて、これは測定の精度において１桁大きい規模を達成することを可能にする。一般的に、これは使用する化合物のスケジュール設計の制限を最小とする。
【実施例２】
【００７１】
結果
Ａ）１プロットの100 ピクセル (または多分同じである100 のプロット) で得られた測定値の記録の例
図２Ａおよび２Ｂ参照。
【００７２】
１プロットの100 ピクセル (または同じであろう100 ピクセル) での測定値の記録 (記号×)。
同じピクセル (プロット) については、対応する較正用測定値は記号＋で与えられる。
【００７３】
較正相で測定された変動により補正された測定値のデータは記号◆で表される。
本件においては、較正用測定の値は100 を中心とするガウス分布の結果であり、10のマグニチュードであり、測定の値はマグニチュード１のガウス分布を有する較正用測定値と関連している。これは、我々が補正データ中に当然に単独で見出す桁である。
Ｂ) 較正用測定により補正された生の測定値のヒストグラム
図３Ａおよび３Ｂ参照。
【００７４】
１プロット上の100 ピクセル (または同じであろう100 プロット) についてのかかる１シリーズの測定値に対応するヒストグラムを図３Ａおよび３Ｂに図示する。
較正用測定値で補正された生のデータは有意に分散が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、機能単位で示した本発明の多官能性プローブの構造の例を示す図である。ここで較正用の基 (Csc)の利用可能な有効濃度の局所測定値は、特異的官能基 (Cs) の利用可能な有効濃度に直接比例する。
【図２】図２は、おそらく同一だが、特に利用しうるプローブ濃度において位置的な変動の結果としてその値が分散している、100 の測定値の例を示す。図２Ｂは図２Ａに示したヒストグラムで得られた実際の値を示す。
【図３】図３は、上記図２Ａおよび２Ｂと関連するヒストグラムを示す。較正用測定値により補正された生の測定値は著しく分散が少ない。図３Ｂは、図３Ａに示されるヒストグラムで得られた実際の値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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