(57)【要約】【課題】本発明は、メチル移行領域のメチル化の有無を測定してがんの有無、がん転移の度合または予後を確認する方法及びメチル化確認用のプライマーに係り、がん診断に重要と考えられる新規なメチル移行領域を究明し、その領域のメチル化を測定可能なプライマーを提供することにより、メチル移行領域のメチル化の度合と染色体欠失の度合を同時に解析してがん予測の正確性を画期的に高めることができる。【解決手段】ＲＡＢＧＥＦ１、ＳＴＡＧ、ＣＨＧＢ、ＴＮＦＲＳＦ１４、及び、その他多種からなる群から選ばれる１以上の遺伝子のメチル移行領域を含むがん診断用の遺伝子マーカー。メチル移行領域のメチル化の有無を測定するステップを含むがんの有無、がん転移の度合または予後を確認する方法。【選択図】図１
2009542201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＢＧＥＦ１（ＲＡＢ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ  １）、ＳＴＡＧ(ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ)、ＣＨＧＢ（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１４(ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  １４)、ＳＥＲＰＩＮＢ５(ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｃｌａｄｅ  Ｂ，  ｍｅｍｂｅｒ  ５)、ＡＮＧＰＴＬ７(ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ７)、ＴＦＦ２(ｔｒｅｆｏｉｌ  ｆａｃｔｏｒ  ２)、ＢＧＬＡＰ（ｂｏｎｅ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  （ｇｌａ）  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＳＬＮ（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＤＤＸ５３(ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ５３)、ＭＡＧＥＡ２(ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆａｍｉｌｙ  Ａ)、ＶＤＲ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  （１，２５−  ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＳＴ１４（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  １４）、ＣＤＫＮ２Ａ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２Ａ）、ＭＹＢＰＣ２（ｍｙｏｓｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ，  ｆａｓｔ  ｔｙｐｅ）、ＲＵＮＸ３（ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ３）、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２）、ＭＬＨ１（ＭｕｔＬ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｔｅｎ）よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子のメチル移行領域を含むがん診断用の遺伝子マーカー。
【請求項２】
メチル移行領域のメチル化の有無を測定するステップを含むがんの有無、がん転移の度合または予後を確認する方法。
【請求項３】
メチル移行領域は、ＲＡＢＧＥＦ１、ＳＴＡＧ、ＣＨＧＢ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＡＮＧＰＴＬ７、ＴＦＦ２、ＢＧＬＡＰ、ＭＳＬＮ、ＤＤＸ５３、ＭＡＧＥＡ２、ＶＤＲ、ＳＴ１４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＢＰＣ２、ＲＵＮＸ３、ＲＵＮＸ２、ＭＬＨ１及びＰＴＥＮよりなる群から選ばれる１以上の遺伝子のメチル移行領域であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メチル移行領域のメチル化の有無を確認可能なプライマー。
【請求項５】
前記プライマーは、配列番号１〜１６０に記載の配列よりなる群から選ばれる正方向プライマーと逆方向プライマーであることを特徴とする請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
請求項４に記載のプライマーを含むがん診断用のキット。
【請求項７】
染色体欠失（ＬＯＨ）と染色体不安定性の度合を測定可能な単純反復塩基配列標識子群。
【請求項８】
前記標識子群は、配列番号１６１〜２４０に記載の配列よりなる群から選ばれる正方向及び逆方向の標識子であることを特徴とする請求項７に記載の標識子群。
【請求項９】
請求項７に記載の標識子群を含むことを特徴とするがん診断用のキット。
【請求項１０】
染色体欠失の度合を測定するステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の標識子群をさらに含む請求項６に記載のがん診断用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル移行領域のメチル化の有無を測定してがんの有無、がん転移の度合または予後を確認する方法及びメチル化確認用のプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、遺伝子の変化により発病する遺伝疾患であると認識されている。ＤＮＡは、塩基配列によってアミノ酸の配列及びタンパク質の機能を決定するが、タンパク質の発現有無はＤＮＡメチル化に影響される。すなわち、特定の遺伝子の機能と発現は塩基配列とＤＮＡメチル化によって左右されると言え、腫瘍組織においてはこれらの２種類、すなわち、遺伝子的な形態の変化及び後生的な形態の変化を両方とも観察することができる。このため、同じがん組織において遺伝子的な変化及び後生学的な変化を両方とも確認することができるならば、がんの発病原因をより細かく理解することができ、この理解に基づき、がんの予防と治療に活用することができるであろう。
【０００３】
これまで知られている腫瘍組織に見られるＤＮＡメチルの変化としては、下記の３種類が挙げられる。
１）腫瘍組織は、ＤＮＡメチル化と脱メチル化を両方とも示す。
２）ＤＮＡメチル化は遺伝子と隣り合うＣｐＧ島において起こるのに対し、脱メチル化は主として反復塩基配列において起こる。
３）腫瘍ＤＮＡのメチル化と脱メチル化は腫瘍の発生と進行において相互独立した役割を果たす。
【０００４】
このように、腫瘍ＤＮＡメチルの変化ががんの発病と進行に寄与する役割の詳細は未だ知られていないのが現状である。しかしながら、腫瘍ＤＮＡメチルの変化は、細胞の成長と分化、老化過程における様々なＤＮＡメチルの変化が知られるに伴い、遺伝子不安定性により発生する極めて異質的な悪性表現型を理解する上で新たな関心分野となっている。
【０００５】
ヒト遺伝体は、発生初期に後成遺伝子のリプログラミング過程により人間の各組織への分化が進行し、後成遺伝子は、発生の初期にほとんど確立されて一生を通じて維持される領域と、細胞分化と反復塩基配列ＲＮＡの核内密度に影響される可変的なメチル移行領域と、に分けられる。ヒト遺伝体の４０％以上を占めている逆転位体は、内因性レトロウイルス様遺伝因子に由来する反復塩基配列であって、自らはメチル化を誘導すると同時に、周りのＤＮＡにメチル化を伝搬して様々なＤＮＡメチル化を遺伝体の全般に亘って形成する核心的な役割を果たすということを把握することができる。
【０００６】
一方、単純反復塩基配列標識子により検出される染色体欠失は遺伝体の量的減少を随伴し、遺伝体の量的減少が及ぼす影響は各個体の遺伝体の量を厳しく維持しようとする遺伝体補償機序を作動することが予想される。このため、染色体欠失は量的減少を補償するために核酸脱メチル化変化を誘導するため、染色体欠失が核酸メチル化変化を通じて様々ながん進行を主導すると見られる。また、このような脱メチル化過程は妊娠初期に胎盤形成を誘導するために細胞の侵襲と転移のための後成遺伝子が活性化していて、分娩と共に退化・欠失される内因性プログラムに類似する遺伝子発現様相を示すことになる。
【０００７】
そこで、本発明においては、腫瘍組織における染色体欠失の度合に対する遺伝子型によるメチル化の変位の度合を確認し、遺伝子型によるメチル化変化の度合は既存のＣｐＧ島よりはＣｐＧ島と隣接逆転位体との間に形成される可変領域であるメチル移行領域においてさらに多く現れるということを究明し、がん診断に重要な役割を果たすことができるということを確認した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Balmain A, Gray J, Ponder B. Thegenetics and genomics of cancer. Nat Genet 2003; 33 S:238-24
【非特許文献２】Hong SJ, Choi SW, Lee KH, Lee S, Min KO,Rhyu MG. Preoperative genetic diagnosis of gastric carcinoma based onchromosomal loss and microsatellite instability. Int J Cancer. 2005 Jan10;113(2):249-58.
【非特許文献３】Kim KM, Kwon MS, Hong SJ, Min KO, SeoEJ, Lee KY et al. Genetic classification of intestinal-type and diffuse-typegastric cancers based on chromosomal loss and microsatellite instability.Virchows Arch 2003; 443(4):491-50
【非特許文献４】Choi SW, Lee KJ, Bae YA, Min KO, KwonMS, Kim KM et al. Genetic classification of colorectal cancer based onchromosomal loss and microsatellite instability predicts survival. Clin CancerRes 2002; 8(7):2311-2322.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、内視鏡組織においてがん転移の度合はもとより、予後をも正確に予測可能な手術前遺伝学的な診断法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明は、メチル移行領域のメチル化の有無を測定してがんの有無、がん転移の度合または予後を確認する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記メチル移行領域のメチル化の有無を確認可能なプライマーを提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、染色体欠失（Ｌｏｓｓ  Ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ；ＬＯＨ）と染色体不安定性の度合を測定可能な単純反復塩基配列標識子群を提供する。
以下、本発明を詳述する。
【００１３】
本発明は、メチル移行領域のメチル化の有無を測定してがんの有無、がん転移の度合または予後を確認する方法を提供する。
【００１４】
ヒトの遺伝子上流の転写調節部に位置する隣接逆転位体とＣｐＧ島塩基配列との間に形成される可変領域である新規なメチル移行領域は、反復塩基配列の転写密度に応じて異なるレベルのメチル化部位が形成される領域である。この領域は、逆転位体反復塩基配列の転写密度に応じて異なるレベルのメチル化部位が形成される領域であって、がん診断に重要な役割を果たす。なお、個人別の可変化の度合が異なり、しかも、正常組織と腫瘍との間の違いが大きなため、がん診断になお一層有用である。
【００１５】
がん進行と関連する遺伝子を選別する基準としては、１）遺伝子と逆転位体との間の距離、２）遺伝子に近い逆転位体の種類、３）遺伝子周辺の逆転位体の密度、４）遺伝子と遺伝子との間の距離、５）ＣｐＧ島塩基配列と逆転位体との位置関係、及び６）核内の逆遺伝体の密度が挙げられる。これらを基準として、がん診断と関連して製作された４０個の後成遺伝子は、ＣｐＧ島塩基配列が豊富な領域において製作されたＲＡＢＧＥＦ１、ＳＴＡＧ、ＣＨＧＢなどの標識子と、ＣｐＧ島塩基配列の少ないＴＮＦＲＳＦ１４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＡＮＧＰＴＬ７、ＴＦＦ２、ＢＧＬＡＰ、ＭＳＬＮ、ＤＤＸ５３、ＭＡＧＥＡ２と、に分けられ、ＣｐＧ島塩基配列と隣接逆転位体との間の距離に応じて近位と遠位の２領域以上において考案されたＶＤＲ、ＳＴ１４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＢＰＣ２、ＲＵＮＸ３、ＲＵＮＸ２、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮなどに区分可能である。
【００１６】
遺伝子上流にＡｌｕよりもＬ１やＬＴＲの方が相対的に多く位置しており、遺伝子開始部にＣｐＧ島塩基配列が少ない場合には、メチル移行領域ががんの進行及び予測になお一層有用である。また、遺伝子開始部にＣｐＧ島塩基配列が多い場合、隣接逆転位体とＣｐＧ島塩基配列の途中領域において製作された標識子であるほど予測力が高いことを確認した。
【００１７】
メチル化の有無は、通常の方法を用いて測定することができ、大韓民国公開特許第２００４−００１５７０５号公報、大韓民国公開特許第２００６−００２６５９５号公報、大韓民国公開特許第２００３−００６９７５２号公報などに記載の方法を用いて測定することができる。
【００１８】
また、本発明は、前記メチル移行領域のメチル化の有無を確認可能なプライマーを提供する。
【００１９】
前記プライマーは、下記表１に示す配列よりなる群から選ばれる正方向プライマーと逆方向プライマーであって、メチル移行領域のメチル化の度合を極めて正確に測定することができ、電気泳動用とマイクロアレイチップ用など種々の診断法に適用可能である。
【００２０】
【表１】
2009542201.tif 000003
2009542201.tif 000004
2009542201.tif 000005
2009542201.tif 000006
【００２１】
また、本発明は、メチル移行領域のメチル化の有無を測定可能なプライマーを含むがん診断用のキットを提供する。
【００２２】
キットに含まれるプライマーとしては、ＲＡＢＧＥＦ１、ＳＴＡＧ、ＣＨＧＢ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＡＮＧＰＴＬ７、ＴＦＦ２、ＢＧＬＡＰ、ＭＳＬＮ、ＤＤＸ５３、ＭＡＧＥＡ２、ＶＤＲ、ＳＴ１４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＢＰＣ２、ＲＵＮＸ３、ＲＵＮＸ２、ＭＬＨ１またはＰＴＥＮ遺伝子のメチル移行領域配列に相補的に結合して増幅可能なあらゆる配列が採用可能であり、好ましくは、上記表１に示すプライマー配列よりなる群から選ばれる正方向及び逆方向のプライマーである。プライマーの製作は、当業界における通常の方法を用いて行うことができ、前記診断キットにおいてプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の確認は、当業界における通常のＰＣＲ解析装置を用いて行うことができる。
【００２３】
さらに、本発明は、染色体欠失と染色体不安定性の度合を測定可能な単純反復塩基配列標識子群を提供する。
【００２４】
本発明においては、頻繁な染色体欠失を示すがん関連染色体を選択する４０個の単純反復配列標識子を提供し、これを使用することにより、ヘテロ接合部の欠失の度合に応じて、初等度、ＬＯＨ−Ｌ（低等度）、ＬＯＨ−Ｈ（高等度）の染色体欠失型とＭＳＩ型の４種類に区分可能であることを確認した。これらの遺伝子変位を高危険遺伝子型（ＬＯＨ−Ｈ及びＬＯＨ−Ｂ）と低危険遺伝子型（ＬＯＨ−Ｌ及びＭＳＩ）に分類することができ、２期と３期の胃がん患者の生存率に対する極めて重要な予測因子であることが確認された（図４、図５及び図６）。
【００２５】
このため、胃がんの臨床病理学的な特性を最も表わす反復配列不安定性と染色体欠失の度合に基づいて、既存の形態学的な病期により予測できなかった転移と再発について説明可能な遺伝型に対する分類を設けた。
【００２６】
前記標識子群は、下記表２に示す配列よりなる群から選ばれる正方向及び逆方向の標識子である。
【００２７】
【表２】
2009542201.tif 000007
2009542201.tif 000008
【００２８】
さらに、本発明は、単純反復塩基配列標識子群を含むがん診断用のキットを提供する。
【００２９】
キットに含まれるプライマーは、上記表２に示す配列よりなる群から選ばれる正方向及び逆方向のプライマーである。プライマーの製作は、当業界における通常の方法を用いて行うことができ、プライマーにより増幅されたマーカー遺伝子のＰＣＲ産物の確認は、当業界における通常のＰＣＲ解析装置を用いて行うことができる。
【００３０】
本発明者らは、染色体欠失の度合が高いほど脱メチル化の度合が増大し、染色体欠失の度合が低いほどメチル化の度合が増大するという相関関係を究明した。このため、同じ病変に対してメチル化の度合の解析と染色体欠失ＬＯＨを同時に測定するならば、既存の染色体欠失の非連続性による不正確性を大幅に低減することができる。本発明において提供する遺伝学的な方法ないし腫瘍のサイズとの組み合わせによる予測された琳派節転移の度合はＣＴによる病期よりも正確であり、このような手術前遺伝学的な診断は胃がんの臨床的な行路に関する情報を提供するであろう。このため、本発明において提供する手術前の遺伝学的な診断は手術と治療方針を立てる上で極めて有用であると見られる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の概略ブロック図であって、遺伝子転写開始部と隣接逆転位体との間に位置するメチル移行領域は、組織や細胞の反復塩基配列の転写密度に応じて異なるレベルのメチル化部位が形成される領域であって、組織特異的であり、且つ、個人別偏差があるということを示す図である。この可変領域における後成遺伝標識子を用いてがん細胞への進行過程を予測する。
【００３２】
【図２】胃がんにおいて染色体欠失が起こった染色体の数と病変のサイズをもって、腸型においてはＬＯＨ−Ｈ（高等度、４〜８個欠失）、ＬＯＨ−Ｌ（低等度、０〜３個欠失）の染色体欠失型に、且つ、びまん型においてはＬＯＨ−Ｈ（高等度、４〜８個欠失）、ＬＯＨ−Ｌ（低等度、３〜２個欠失）、ＬＯＨ−Ｂ（初等度、０〜１個欠失）に区分し、内視鏡組織の遺伝子型と手術組織の遺伝子型との比較及びがん病変のサイズに基づいて手術前診断にＬＯＨを活用する方法を示す図である。
【００３３】
【図３】染色体不安定性が発生した低危険群（ケース１０）と高危険群（ケース２５）のそれぞれに対して正常組織と腫瘍組織を比較して可変領域後成遺伝標識子により重合酵素連鎖反応と電気泳動を行った結果を示す図である。  ケース１０：低危険群（染色体不安定性が現れた場合）  ケース２５：高危険群（染色体不安定性はないが、高等度の染色体欠失がある。）  Ｕ：脱メチル化標識子により増幅した結果  Ｍ：メチル化標識子により増幅した結果  ％：メチル化の度合を百分率に換算した値
【００３４】
【図４】胃がんにおいて染色体腕４ｐ、５ｑ、９ｐ、１３ｑ、１７ｐ、１８ｑに位置する４０個の単純反復配列標識子により正常組織と腫瘍組織に対して重合酵素連鎖反応と電気泳動を行った結果を示す図である。＊によって示される部分は、正常組織と比較したときに染色体欠失が起こった領域であり、ケース２５はＬＯＨ−Ｈ（高等度）の染色体欠失を示している。
【００３５】
【図５】臨床２期と３期による手術後胃がん患者１３０名における生存曲線に関する図である。遺伝子型により患者を分類したとき、低等度危険群（低等度欠失型、染色体不安定性）においては高い生存率を示し、高等度危険群（高等度欠失型、初等度欠失型）においては低い生存率を示している。
【００３６】
【図６】がん診断に染色体欠失の度合と可変領域のメチル化の度合を併用する場合、高危険群（ＬＯＨ−Ｈ、ＬＯＨ−Ｂ）と低危険群（ＬＯＨ−Ｌ、ＭＳＩ）との区分が明確になる結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により詳述する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明がこれに限定されるものではない。
【００３８】
＜実施例１＞新規なメチル移行領域のメチル化の度合を測定するＰＣＲ標識子を用いたがん診断
＜１−１＞顕微切断及びＤＮＡ抽出
パラフィンブロックに固定されたがん組織見本を５μｍの厚さに細かく切り、キシレンによりワックス除去を行った後、エタノールに水和させた。ヘマトキシリン−エオシンにより染色してスライドガラスに固定した。顕微鏡観察をしながら、スライドガラスから針を用いてがん組織領域と正常組織領域をそれぞれ別々に掻き取った。以上のようにしてそれぞれの領域から掻き取った組織細胞を細胞破砕緩衝溶液に入れ、３７℃の温度条件下において３時間、且つ、５０℃の温度条件下において３時間放置した。そして、ＰＣＲ解析を始める前に、熱を加えてタンパク質分解酵素Ｋを不活性化させた。
【００３９】
＜１−２＞メチル化パターンの解析−試料確保のための重亜硫酸変形及びメチル化特異ＰＣＲ
前記実施例＜１−１＞において得たＤＮＡにＮａＯＨを入れ、１０分間３７℃の温度条件下において放置した後、ここにヒドロキノンと重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を新鮮に作成して混合した。次いで、上記の混合物の上に鉱油を載せて５０℃の温度条件下において１６時間かけて反応させた。次いで、Wizard ＤＮＡ purification resin（米国プロメガ社製）を用いて純粋精製して溶離した後、ＮａＯＨを０．３Ｍになるように入れて室温において５分間反応させることにより変形を完了した。エタノール沈殿のためにグリコーゲンと酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールを加えて混合した後、−２０℃の温度条件下において一晩中放置した。次いで、３０分間遠心分離して沈降させた後、７０％エタノールにより洗浄し、蒸留水に溶かして即座で使用したり−２０℃に保管した。
【００４０】
ＰＣＲ反応液は、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝溶液、ｄＮＴＰｓ、Ｐ３２−ｄＴＴＰ、プライマー、及び重亜硫酸による変形ＤＮＡまたは未変形ＤＮＡを含む。反応は、９５℃の温度条件下において５分間ホットスタートし、Ｔａｑ重合酵素を加えた後、増幅反応後に最後に７２℃の温度条件下において１０分間延長した。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲルに搬入して電気泳動を行った後、放射型光スキャナー（ＢＡＳ２５００、日本富士写真フィルム社製）により観察した。メチル化の度合（％）は標準検量線を用いて求め、図中のバンド下に％にて表記した。図３中、Ｕは脱メチル化標識子により増幅した結果、Ｍは、メチル化標識子により増幅した結果を示し、％はメチル化の度合を百分率に換算した値である。
【００４１】
図３は、染色体不安定性が生じた低危険群（ケース１０）と高危険群（ケース２５）のそれぞれに対して正常組織と腫瘍組織を比較し、可変領域の後成遺伝標識子及びＣｐＧ島塩基配列の付近において製作された標識子を用いて重合酵素連鎖反応と電気泳動を行った結果である。ＣｐＧ島塩基配列の付近において製作された標識子の場合、正常組織と腫瘍との違いが比較的に小さいが、ＣｐＧ島塩基配列から外れた本発明のメチル移行領域において製作された標識子の場合、低危険群（ケース１０）においてはメチル化、高危険群（ケース２５）の場合には脱メチル化の傾向を示している。ＣｐＧ島塩基配列の付近において製作された標識子の場合、正常組織と腫瘍との違いが比較的に小さいが、メチル移行領域標識子はより優れたがん診断領域であることを示している。例えば、高危険群（ケース２５）においてＰ１５やＲＡＳＳＦ１ＡなどのＣｐＧ島塩基配列領域において製作された標識子は正常組織と腫瘍との違いが小さいのに対し、本発明のメチル移行領域の方のＭＬＨ１、ＭＡＧＥＡ２などの標識子は正常組織と腫瘍との違いが大きいことが分かる。高危険群（ケース２５）におけるＭＬＨ１−０．６ｋｂの場合、ＣｐＧ島塩基配列領域において製作された染色体欠失の度合による違いや、正常組織と腫瘍との間のメチル化の度合に違いを示さず、がん診断予測力に劣る標識子であることを確認することができたが、本発明のメチル移行領域においては正常組織と腫瘍との間の違いを明らかに確認することができた。
【００４２】
＜実施例２＞単純反復配列標識子によるＬＯＨ（ヘテロ接合部の欠失）の度合測定
胃がんにおいて染色体腕４ｐ、５ｑ、９ｐ、１３ｑ、１７ｐ、１８ｑに位置する４０個の単純反復配列標識子により正常組織と腫瘍組織に対して重合酵素連鎖反応と電気泳動を行った。その結果、ケース１０の場合、１５個のホモ接合標識子のうち４０％以上において高等度の染色体不安定性を示し、ケース２５の場合にはＬＯＨ−Ｈ（高等度）の染色体欠失を示している。
【００４３】
＜実施例３＞内視鏡病変と手術病変における染色体欠失の度合の比較
内視鏡病変が全体の病変の遺伝子型を代表可能であるならば、手術前遺伝子の診断に内視鏡病変染色体欠失の解析を利用することができる。胃がん患者における９１組の内視鏡病変と手術病変を比較した結果、９６％が類似する遺伝子型を示す代表性があり、胃がん患者の手術前に内視鏡病変遺伝子が診断可能である。
【００４４】
＜実施例４＞ＬＯＨの度合及び病変のサイズとの組み合わせによる手術組織の正確度
１３０名の胃がん患者に対する多病所研究において、琳派節転移はサイズとは無関係に高危険遺伝子型において頻繁であり、低危険遺伝子型は５ｃｍ以上の病変において８３％であった。腸膜侵襲は、遺伝子型とは無関係に、病変が小さな（＜５ｃｍ）場合よりも、病変が大きな（＞５ｃｍ）場合に頻繁であった。内視鏡病変の遺伝子型と病変のサイズを組み合わせて予測する場合、手術組織に対する予測正確度は、琳派節転移及び腸膜侵襲のそれぞれに対してＲＯＣ領域（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｒｅａ）が０．８１５及び０．６８５と優れていた。
【００４５】
＜実施例５＞染色体欠失（ＬＯＨ）の度合と病変のサイズとの組み合わせによる手術組織予測の正確度とコンピュータ断層撮影の正確度との比較
【００４６】
下記表３は、ＬＯＨの度合と病変サイズとの組み合わせ検査の正確度とコンピュータ断層撮影の正確度を比較した実施例である。同図を参照すると、腸膜侵襲（ＲＯＣ領域＝０．６９１  ｖｓ  ０．５４８）や琳派節転移（ＲＯＣ領域＝０．６９１  ｖｓ  ０．６４２）の結果より、コンピュータ断層撮影よりも、遺伝子検査と病変サイズを組み合わせた予測の方が予測度が高いことが分かる。
【００４７】
【表３】
2009542201.tif 000009
【００４８】
＜実施例６＞染色体欠失（ＬＯＨ）の度合と染色体不安定性による遺伝子型の分類と生存率との関係
図５は、臨床２期と３期による手術後胃がん患者１３０名における生存曲線を示すものである。遺伝子型により患者を分類したとき、低危険群（低等度欠失型、染色体不安定性）においては高い生存率を示し、高危険群（高等度欠失型、初等度欠失型）においては低い生存率を示している。
【００４９】
＜実施例７＞染色体欠失の度合と可変領域のメチル化の度合を並行測定して遺伝子診断の予測正確性を高める
図６は、染色体欠失の度合を高等度、低等度、初等度、染色体不安定性に区分する場合、メチル化の度合を並行して調べることにより染色体欠失の度合の区分がなお一層明確になることを示すものである。図６のＡ、Ｂは、染色体欠失によってメチル化の度合が減少することを示すグラフであり、図６のＣ、Ｄは、染色体欠失の度合が増大するに伴いメチル化の度合は減少する傾向を示している。染色体欠失の度合によって、高等度、初等度の欠失においてはメチル化が減少し、低等度、染色体不安定性においてはメチル化が増大する傾向を示している。このような染色体欠失とメチル化の度合が有意差を示す点を用いてがん診断時における予測力をなお一層高めることができる。すなわち、可変領域のメチル化の度合とＬＯＨの度合との相関関係が高いため、メチル化の度合はＬＯＨの不連続性による不正確性を大幅に低減して２種類の測定方法を同じ病変の解析に適用すれば、既存の遺伝子診断の正確性を大幅に高めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、１）メチル移行領域のメチル化を測定してがん診断に活用可能な標識子群を提供し、２）染色体欠失と関連する単純反復塩基配列標識子群を提供する他、３）メチル移行領域のメチル化の度合と染色体欠失の度合を同時に解析してがん予測の正確性を画期的に改善する方法を考案した。従って、本発明は、病変の小さな一部である内視鏡組織においてがん転移の度合はもとより、予後をも正確に予測可能な手術前遺伝学的な診断法を提供する結果、手術と治療方針を立てる上で極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
配列番号１〜１６０はがん診断と関連するメチル移行領域後成遺伝標識子４０個に対する正方向プライマー及び逆方向プライマーであって、配列番号１〜４はＲＡＢＧＥＦ１、−０．２
ｋｂ、配列番号５〜８はＳＴＡＧ１、−０．４ ｋｂ、配列番号９〜１２はＣＨＧＢ、−０．３ ｋｂ、配列番号１３〜１６はＶＤＲ、−０．７
ｋｂ、配列番号１７〜２０はＶＤＲ、＋１．０ ｋｂ、配列番号２１〜２４はＳＴ１４、−０．３ ｋｂ、配列番号２５〜２８はＳＴ１４、−０．８
ｋｂ、配列番号２９〜３２はＣＤＫＮ２Ａ、−０．１ ｋｂ、配列番号３３〜３６はＣＤＫＮ２Ａ、−１．５ ｋｂ、配列番号３７〜４０はＣＤＫＮ２Ａ、＋０．８
ｋｂ、配列番号４１〜４４はＰＰＡＲＧ、−０．２ ｋｂ、配列番号４５〜４８はＭＹＢＰＣ２、−１．２ ｋｂ、配列番号４９〜５２はＭＹＢＰＣ２、−０．７
ｋｂ、配列番号５３〜５６はＲＢ１、−０．４ ｋｂ、配列番号５７〜６０はＲＵＮＸ３、−０．５ ｋｂ、配列番号６１〜６４はＲＵＮＸ３、−１．７
ｋｂ、配列番号６５〜６８はＲＵＮＸ３、＋１．０ ｋｂ、配列番号６９〜７２はＰＡＸ５、−１．０ ｋｂ、配列番号７３〜７６はＭＬＨ１、−０．６
ｋｂ、配列番号７７〜８０はＭＬＨ１、−１．０ ｋｂ、配列番号８１〜８４はＣＤＨ１、０ ｋｂ、配列番号８５〜８８はＰＴＥＮ、−１．４
ｋｂ、配列番号８９〜９２は−０．９ ｋｂ、配列番号９３〜９６はＫＩＡＡ１７５２、＋０．４ ｋｂ、配列番号９７〜１００はＦＬＪ４３８５５、−１．１
ｋｂ、配列番号１０１〜１０４はＲＵＮＸ２、−０．７ ｋｂ、配列番号１０５〜１０８はＲＵＮＸ２、−３．０ ｋｂ、配列番号１０９〜１１２はＲＵＮＸ２、−３．８
ｋｂ、配列番号１１３〜１１６はＲＵＮＸ２、＋１．６ ｋｂ、配列番号１１７〜１２０はＭＵＣ８、＋２．０ ｋｂ、配列番号１２１〜１２４はＥＳＲ２、−０．９
ｋｂ、配列番号１２５〜１２８はＥ２Ｆ４、０ ｋｂ、配列番号１２９〜１３２はＴＮＦＲＳＦ１４、−０．６ ｋｂ、配列番号１３３〜１３６はＳＥＲＰＩＮＢ５、−０．３
ｋｂ、配列番号１３７〜１４０はＡＮＧＰＴＬ７、＋０．５ ｋｂ、配列番号１４１〜１４４はＴＦＦ２、−０．２ ｋｂ、配列番号１４５〜１４８はＢＧＬＡＰ、−０．５
ｋｂ、配列番号１４９〜１５２はＭＳＬＮ、−０．８ ｋｂ、配列番号１５３〜１５６はＤＤＸ５３、０ ｋｂ、配列番号１５７〜１６０はＭＡＧＥＡ２、−０．１ｋｂに対する正方向及び逆方向のプライマーである。
配列番号１６１〜２４０は染色体欠失と染色体不安定性の度合を測定可能な単純反復塩基配列標識子群であって、配列番号１６１と１６２はＤ３Ｓ１５９７、配列番号１６３と１６４はＤ３Ｓ１５５２、配列番号１６５と１６６はＤ３Ｓ１３１２、配列番号１６７と１６８はＤ３Ｓ１４７８、配列番号１６９と１７０はＤ３Ｓ１６１９、配列番号１７１と１７２はＤ４Ｓ１６０９、配列番号１７３と１７４はＤ４Ｓ２９４６、配列番号１７５と１７６はＤ４Ｓ１７４、配列番号１７７と１７８はＤ４Ｓ３９１、配列番号１７９と１８０はＤ４Ｓ２３０、配列番号１８１と１８２はＤ５Ｓ５１９、配列番号１８３と１８４はＤ５Ｓ３４６、配列番号１８５と１８６はＤ５Ｓ４０９、配列番号１８７と１８８はＤ５Ｓ３４９、配列番号１８９と１９０はＤ５Ｓ４２２、配列番号１９１と１９２はＤ８Ｓ２６１、配列番号１９３と１９４はＤ８Ｓ２６２、配列番号１９５と１９６はＤ８Ｓ５０３、配列番号１９７と１９８はＤ８Ｓ５５２、配列番号１９９と２００はＤ８Ｓ２７７、配列番号２０１と２０２はＤ９Ｓ１５７、配列番号２０３と２０４はＤ９Ｓ２００、配列番号２０５と２０６はＤ９Ｓ２７０、配列番号２０７と２０８はＤ９Ｓ１９９、配列番号２０９と２１０はＤ９Ｓ２８８、配列番号２１１と２１２はＤ１３Ｓ２６７、配列番号２１３と２１４はＤ１３Ｓ２６３、配列番号２１５と２１６はＤ１３Ｓ１３５、配列番号２１７と２１８はＤ１３Ｓ２８６、配列番号２１９と２２０はＤ１３Ｓ１１８、配列番号２２１と２２２はＴＰ５３、配列番号２２３と２２４はＤ１７Ｓ１２２、配列番号２２５と２２６はＤ１７Ｓ７９６、配列番号２２７と２２８はＤ１７Ｓ１３５８、配列番号２２９と２３０はＤ１７Ｓ１５６６、配列番号２３１と２３２はＤ１８Ｓ６７、配列番号２３３と２３４はＤ１８Ｓ５７、配列番号２３５と２３６はＤ１８Ｓ４７４、配列番号２３７と２３８はＤ１８Ｓ７０、配列番号２３９と２４０はＤ１８Ｓ５８に対する正方向及び逆方向のプライマーである。
【図１】
2009542201.tif 000010
【図２】
2009542201.tif 000011
【図３】
2009542201.tif 000012
【図４】
2009542201.tif 000013
【図５】
2009542201.tif 000014
【図６】
2009542201.tif 000015
【配列表】
2009542201000001.xml
【国際調査報告】
2009542201.tif 000083
2009542201.tif 000084
2009542201.tif 000085
2009542201.tif 000086