(57)【要約】  本発明は、ＡＤＣＣメカニズムを誘発するためのエフェクター細胞と有利に会合した新規な抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、特にマウス−ヒトキメラ抗ＣＤ７１モノクローナル抗体を提供するものである。抗ＣＤ７１抗体は、それらを含有する薬学的組成物と同様に、悪性腫瘍細胞、特に転移性の皮膚黒色腫細胞およびブドウ膜黒色腫細胞の増殖を阻害し、かつ／またはそれらを死滅させるのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の少なくとも一つの重鎖およびその配列が配列番号２と配列番号１１から選択される少なくとも一つの軽鎖を含む少なくとも一つの可変領域を含む、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片。
【請求項２】
配列番号３によりコードされる少なくとも一つの重鎖および配列番号４と配列番号１２から選択される配列によりコードされる少なくとも一つの軽鎖を含む少なくとも一つの可変領域を含む、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片。
【請求項３】
ＢＡ１２０と呼ばれ、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（パスツール研究所、パリ、フランス）に２００５年６月１４日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４９で寄託された、ハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項１または２に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の、少なくとも一つの抗ＣＤ７１モノクローナル抗体に特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体またはその機能的断片。
【請求項５】
配列番号１の少なくとも一つの重鎖およびその配列が配列番号２と配列番号１１から選択される少なくとも一つの軽鎖を含む一つの可変領域を含む、マウス−ヒトキメラ抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片。
【請求項６】
配列番号３によりコードされる少なくとも一つの重鎖および配列番号４と配列番号１２から選択される配列によりコードされる少なくとも一つの軽鎖を含む一つの可変領域を含む、マウス−ヒトキメラ抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片。
【請求項７】
−配列番号５と配列番号９から選択される配列の少なくとも一つの重鎖、および／または
−配列番号６の少なくとも一つの軽鎖
を含む定常領域をさらに含む、請求項５または６に記載のキメラ抗体またはその機能的断片。
【請求項８】
−配列番号７と配列番号１０から選択される配列によりコードされる少なくとも一つの重鎖、および／または
−配列番号８によりコードされる少なくとも一つの軽鎖
を含む定常領域をさらに含む、請求項５または６に記載のキメラ抗体またはその機能的断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一つに記載の、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体と、金属、毒素、薬剤、製剤（ｇａｌｅｎｉｃ）ベクター、所定の細胞型と結合し得る生体分子、酵素、核酸、ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンから選択される、生物活性分子との間の結合生成物。
【請求項１０】
前記金属が放射性同位体および非放射性金属から選択される、請求項９に記載の結合生成物。
【請求項１１】
前記毒素がジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスペプチド（ＰＡＰ）、トリカテクム（ｔｒｉｃａｔｈｅｃｕｍ）、およびその機能的断片から選択される、請求項９に記載の結合生成物。
【請求項１２】
前記薬剤が細胞傷害性および／または細胞溶解性の薬剤である、請求項９に記載の結合生成物。
【請求項１３】
前記生物活性分子が
−ベータ、アルファ、またはガンマ放射性同位体、
−リシン型またはアブリン型分子の毒性のＡ鎖およびジフテリア毒素のＡ鎖といった毒素またはその機能的断片、
−メトトレキサート、マイトマイシン、アドリアマイシンといった細胞溶解性薬剤、
−有利にはアンチセンスＲＮＡを含む、リポソームベクターおよび陽イオン性エマルションといった製剤（ｇａｌｅｎｉｃ）ベクター、
−二重特異性分子を得るための、抗体または組換えタンパク質といった、所定の細胞型と結合し得る生体分子、
−ＲＮアーゼ、
−アンチセンスＲＮＡ、
−ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン
から選択される、請求項９に記載の結合生成物。
【請求項１４】
前記生物活性分子がリポソームベクターまたは陽イオン性エマルションといった製剤（ｇａｌｅｎｉｃ）ベクターにより運ばれる、請求項９〜１３のいずれか一つに記載の結合生成物。
【請求項１５】
エステラーゼプロドラッグと接触した時に前記生物活性分子を放出するよう、Ｃ５〜Ｃ１５リンカーを含む、請求項９〜１４のいずれか一つに記載の結合生成物。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一つに記載の少なくとも一つの抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、または少なくとも一つのその機能的断片ならびに薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項９〜１５のいずれか一つに記載の少なくとも一つの結合生成物、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
抗体に対するＦｃ受容体を発現するかまたは発現する能力を有し、そして標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）反応を媒介し得る、ヒト白血球エフェクター細胞をさらに含む、請求項１６または１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記ヒト白血球エフェクター細胞がリンパ球、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、顆粒球、好酸球、および肥満細胞から選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
悪性腫瘍細胞の増殖を阻害し、かつ／または悪性腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、それを必要とする患者に、
−請求項１〜８のいずれか一つに記載の抗ＣＤ７１モノクローナル抗体もしくはその機能的断片、またはこのような断片を含む構築物、
−請求項９〜１５のいずれか一つに記載の結合生成物、および
−請求項１６〜１９のいずれか一つに記載の薬学的組成物
から選択される少なくとも一つの物質を、前記物質が悪性腫瘍細胞に結合するための条件下および十分な量で提供し、それにより悪性腫瘍細胞の増殖の阻害および／または死滅を引き起こすことを包含する方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の薬学的組成物が用いられる場合、前記ヒト白血球エフェクター細胞が、悪性腫瘍細胞の増殖の阻害および／または死滅を必要とする前記患者の自家細胞または同種細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記悪性腫瘍細胞が転移性皮膚黒色腫、転移性ブドウ膜黒色腫、神経膠芽腫、腎細胞癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、卵巣腺癌、膵臓腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳腺癌、結腸直腸腺癌、血液悪性腫瘍の細胞から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記提供の前に、前記悪性腫瘍細胞における細胞内トランスフェリンレベルおよび／または細胞内鉄レベルを激減させる工程をさらに包含する、請求項２０〜２２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの物質がさらに、調節性Ｔ細胞との結合により、前記患者における免疫応答を増強し得る、請求項２０〜２３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
配列番号３、４および１２で示される一つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞または宿主生物。
【請求項２８】
請求項５または６に記載のキメラ抗体を産生する方法であって、
ａ）請求項２６に記載の少なくとも一つの発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ）前記宿主細胞を、発現を助ける条件下で培養する工程、そして
ｃ）培養培地から集合したキメラ抗体を精製する工程
を包含する方法。
【請求項２９】
請求項７または８に記載のキメラ抗体を産生する方法であって、
ａ）（ｉ）請求項２５に記載の核酸分子、ならびに
（ｉｉ）配列番号７、８および１０で示される一つまたは複数のヌクレオチド配列
を含む少なくとも一つの発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ）前記宿主細胞を、発現を助ける条件下で培養する工程、そして
ｃ）培養培地から集合したキメラ抗体を精製する工程
を包含する方法。
【請求項３０】
請求項１〜８のいずれか一つに記載の、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３１】
それを必要とする患者においてｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ７１陽性細胞を枯渇させる方法であって、
ａ）ＣＤ７１陽性細胞を含有すると思われる前記患者の生体サンプルを、
−請求項１〜８のいずれか一つに記載の抗ＣＤ７１モノクローナル抗体もしくはその機能的断片、またはこのような断片を含む構築物、
−請求項９〜１５のいずれか一つに記載の結合生成物、および
−請求項１６〜１９のいずれか一つに記載の薬学的組成物
から選択される少なくとも一つの物質と接触させること、
ｂ）前記物質と前記生体サンプル中に含有されるＣＤ７１陽性細胞との間で形成される複合体を除去すること、そして
ｃ）「パージされた」生体サンプルを回収すること
を包含する方法。
【請求項３２】
前記「パージされた」生体サンプルを前記患者に戻す工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体サンプルが、骨髄サンプル、ＣＤ３４＋細胞で濃縮された血液、臍帯血の多能性幹細胞、幹細胞から選択される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が移植を受けているか、または移植を必要としている、請求項３１〜３３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３５】
前記患者が癌を有する、請求項３１〜３３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が自己免疫疾患および神経免疫疾患から選択される疾患を有する、請求項３１〜３３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３７】
癌を有する患者における免疫応答を増強する方法であって、該患者に、
−請求項１〜８のいずれか一つに記載の抗ＣＤ７１モノクローナル抗体もしくはその機能的断片、またはこのような断片を含む構築物、
−請求項９〜１５のいずれか一つに記載の結合生成物、ならびに
−請求項１６〜１９のいずれか一つに記載の薬学的組成物
から選択される少なくとも一つの物質を、前記物質が調節性Ｔ細胞と結合するための条件下および十分な量で提供し、それにより該調節性Ｔ細胞による前記免疫応答の抑制を阻害する方法。
【請求項３８】
前記癌が黒色腫、特に皮膚黒色腫およびブドウ膜黒色腫、卵巣癌および肝臓癌から選択される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＣＣメカニズムを誘発するためのエフェクター細胞と有利に会合した新規な抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、特にマウス−ヒトキメラ抗ＣＤ７１モノクローナル抗体を提供するものである。抗ＣＤ７１抗体は、それらを含有する薬学的組成物と同様に、悪性腫瘍細胞、特に転移性の皮膚黒色腫細胞およびブドウ膜黒色腫細胞の増殖を阻害し、かつ／またはそれらを死滅させるのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、腫瘍標的細胞に直接的に作用するいくつかのメカニズムにより、および／または可溶性の因子または細胞により媒介されるエフェクターメカニズムの活性化により、腫瘍細胞の生存に影響をおよぼし得る。当初、抗体はマウス由来のものであり、そしてヒトに投与されると、外来のマウス免疫グロブリンに対して強力な免疫応答を誘導した。このことは、それらの使用を制限するものであった。遺伝子操作により、治療効果の増大したいわゆるヒト化抗体の開発が可能になった。
【０００３】
キメラ抗体は、６５〜９０％がヒトヌクレオチド配列であり、そしてヒト抗体の定常部またはエフェクター部に融合された、抗原認識をもたらすマウスの可変領域から成る。ヒト化抗体は約９５％がヒトであり、そして、抗体の特異性を決定する、マウス抗体の超可変領域または相補性決定領域のみをヒト抗体の骨格上にグラフトすることにより作製される。遺伝子操作したトランスジェニックマウスの開発および合成ヒト抗体ライブラリーの作成における進歩により、商業規模での完全ヒト抗体の産生が可能となった。
【０００４】
キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体は初期の抗体構築物よりも低い免疫原性を有し、そして、抗体投与の反復、細胞傷害性細胞および補体を動員する能力の改善、ならびに循環系における安定性の増大を可能にする。これらの改善は、モノクローナル抗体の治療効果の増大に寄与している。小さな抗体断片もまた、大きい無血管性腫瘍、特に固形腫瘍中への抗体の通過を改善するために操作されている。一本鎖の固定された可変（Ｆｖ）領域は一つの重鎖可変ドメインおよび一つの軽鎖可変ドメインのみから成り、これらは短いペプチドリンカーにより共有結合されている。これらの断片は、放射性同位体または薬剤を腫瘍部位に送達するために用いられ得る。二つの異なる抗原結合アームを有し、それゆえ二重結合特異性を有する抗体も設計されている。一例は、一方のアームが腫瘍細胞と結合し、他方がエフェクター細胞と結合する場合である。別の例は、アームが、腫瘍細胞上の二つの異なる抗原とだけでなく、自身のＦｃ断片によりエフェクター細胞とも結合する場合である。これらの構築物は、宿主の免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージ）の動員を通じて、抗体媒介性の腫瘍細胞の死滅を増大させる。
【０００５】
モノクローナル抗体により認識される多くの抗原は、悪性細胞だけでなく、健常な成人細胞の少なくとも一つのサブセットによっても発現される。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法のための最良の標的抗原は、全ての腫瘍細胞により安定的かつ均一的に発現されるものであり、正常組織により発現されないかまたはほとんど発現されず、（迅速な抗体のクリアランスを回避するため）可溶性型では存在せず、そしてモノクローナル抗体に容易にアクセス可能であるものである。
【０００６】
非標識抗体は、１）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）による、エフェクター細胞の動員および活性化、２）受容体−リガンド相互作用の遮断および増殖因子活性の阻止、３）アポトーシスの誘導、ならびに４）サイトカインの分泌という、異なるメカニズムの組合せを通じて、腫瘍細胞を死亡させるかまたはそれらの増殖を停止させる。
【０００７】
いくつかの抗体はそれ自体によっては細胞死を誘導せず、代わりに、放射性同位体、毒素、酵素または薬剤を腫瘍部位に送達するために用いられる。腫瘍細胞に対する細胞傷害性作用物質の特異的ターゲティングは、全身投与の用量制限をもたらす副作用を伴うことなく、腫瘍部位で高濃度に到達させる能力を有する。この場合、迅速に内在化される抗原を標的とする抗体は別の利点を提供する。
【０００８】
放射免疫複合体は、腫瘍部位に放射物を選択的に送達する。放射性核種に関しては、例えばＭＸ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−Ａ’’ＤＰＡ、Ｃ−ＤＯＴＡ、ＰＡ−ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−ＮＣＳ（２−ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）といった改良型キレート化技術を有利に用いて、例えばＩ１３１またはＹ９０、ならびに新規のβ（２１２Ｐｂ、混合βγ  １７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ・・・）またはα（２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ・・・）放射体を用い得る。細胞傷害性は、抗体の局在化および放射性核種の残留の薬物動態に依存している。強力な放射エネルギーのため、健常組織、特に骨髄も照射される。
【０００９】
植物毒素および細菌毒素（例えばリシン、ジフテリア毒素またはシュードモナス毒素）のアルファ鎖は、モノクローナル抗体に直接付着され得る。細胞への結合および細胞内への内在化の後、これらの毒素は低濃度でタンパク質合成を破壊する。これらの毒素はまた一般にヒトにおいて強い免疫応答を引き出し、それによりこれらの反復使用が制限される。
【００１０】
ドキソルビシンおよびカリケアマイシンといった薬剤は、モノクローナル抗体に直接付着され得る。カリケアマイシンの抗体媒介性送達により、逆にそれ自体では全身投与には非常に有毒であるこの非常に強力な作用物質の臨床使用が可能になる。
【００１１】
これらの様相を再検討するには、Ｍ．  Ｈａｒｒｉｓ（２００４）およびＣａｎｃｅｒ  Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ（２００４）を参照されたい。
【００１２】
ＣＤ７１は、Ｃｙｓ８９位においてジスルフィド結合により連結した１８０ｋＤａのホモ二量体として存在するＩＩ型糖タンパク質である。この糖タンパク質は、プロテインキナーゼＣによりシステイン６２でアシル化され、そしてセリン２４でリン酸化される。それは、テトラペプチドＹＴＲＦ（２０〜２３番アミノ酸）により構成される内在化シグナルを含有する（Ｃｏｌｌａｗｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３）。未知のプロテアーゼによりＡｒｇ１００とＬｅｕ１０１との間が切断されると、ＣＤ７１は可溶性になる。Ｔｈｒ１０４でのＯ−グリコシル化は、切断に対するＣＤ７１の感受性を低減する。哺乳類およびニワトリのトランスフェリン受容体はＲＧＤ配列を有し、このことは、接着分子との進化的な関連の可能性を示唆する。配列相同性に関しては、Ｃ５ａ連鎖球菌ペプチダーゼ配列との、そしてＰＳＡ配列（前立腺特異的ではないがＩＩ型酸性ジペプチダーゼ活性を示す、前立腺特異抗原）との相同性が存在する。ＣＤ７１のリガンドは、鉄の輸送に関与するタンパク質であるトランスフェリンである。近年、ＣＤ７１はＩｇＡの受容体でもあるということが示されている（Ｈａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３）。
【００１３】
トランスフェリン鉄は中性ｐＨ下でＣＤ７１と結合し、そしてｐＨが約５のエンドソーム区画中に内在化する。鉄は放出され、未知のメカニズムにより細胞質中に運び込まれる。アポトランスフェリンはｐＨ５ではＣＤ７１に結合したままであり、ｐＨが約７．４である細胞表面に戻る。中性ｐＨ条件下ではアポトランスフェリンはもはやＣＤ７１に対する親和性を有さず、したがって別のサイクルを開始させる。ＣＤ７１のこの特徴は、抗体に結合した薬剤、毒素または放射性元素を内在化させるためにこの表面分子を用いることを可能にする（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２）（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００２）（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。ＣＤ７１は、非共有結合によりＴＣＲのζ鎖とシスで結合するが、この場合、それはシグナル伝達に関与し得る。さらにＣＤ７１単量体は、ジスルフィド結合によりインテグリンＣＤ２９／ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ４）と複合体を形成すると推定される。
【００１４】
ＣＤ７１は、いくつかの代謝経路において不可欠である鉄の取り込みを制御することにより、細胞増殖において不可欠な役割を果たす。これは、トランスフェリンとの結合およびそのエンドサイトーシスにより起こるものである。ＣＤ７１の発現は、ＲＮＡの安定性を通じて転写後調節され、それは、鉄の細胞内レベルにも依存している。ＩＲＥ−ＢＰ（鉄応答性エレメント結合タンパク質）は、二つの異なる形態、即ちＩＲＰ−１およびＩＲＰ−２で存在する。ＩＲＰ−１はミトコンドリアのアコニターゼに類似しており、一方、ＩＲＰ−２に関しては未だアコニターゼ活性は報告されていないが、しかしながらこれは構造的にアコニターゼと相同である。鉄が欠乏している場合、ＩＲＰ−１およびＩＲＰ−２はＩＲＥ（ＲＮＡの非翻訳３’領域に位置する鉄応答性エレメント）と呼ばれる特定の配列と結合することによりＣＤ７１のＲＮＡを安定化する。鉄のレベルが高い場合、ＩＲＥに対するＩＲＥ−ＢＰの親和性は低く、そしてＲＮＡは分解に対してより感受性がある。さらに、酸化窒素は、ＩＲＥ−ＢＰの結合を活性化することにより、そしてＲＮＡを安定化することにより、ＣＤ７１の発現を変化させる。
【００１５】
ＣＤ７１は、白血球および静止細胞ではほぼ検出不可能である。この発現は、細胞の活性化および増殖により上向き調節される。これらの理由から、ＣＤ７１は多数の腫瘍を治療するための選択の対象であると思われる。それにもかかわらず、赤血球系では、赤血球前駆体および網状赤血球はＣＤ７１を発現する。これは、赤血球生成および神経発達の両方に影響をおよぼす重篤な表現型を有する、ＣＤ７１トランスフェリン受容体を欠くマウスからも推定される（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。これは、Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．およびＨｙｍａｎ  Ｅ．Ｓ（１９８４年）により、後天性鉄欠乏性貧血の場合のヒトにおいても示された。一方、このことは、幹細胞がＣＤ７１を発現しないことを示し、抗ＣＤ７１抗体が抗腫瘍療法に有用であり得ることを裏付けている（Ｚｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。その上、ＣＤ７１は脳内皮で発現し、そしてこれは、特に神経膠腫を治療するために、薬剤の脳血管関門の通過を可能にする（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。最後に、この最後の特性は、所定の状況下で有害である場合、クロロキンの同時投与により阻害され得る。
【００１６】
転移性黒色腫は予後が非常に不良な腫瘍であり、その出現率は、現代の生活スタイルのため、そして日光への長期に渡る、繰り返しの、そして無防備な曝露のために、増大しつつある。フランスでは年に少なくとも約６０００の新規の症例が報告されており、出現率はパリおよびその地域における居住者１００，０００人当たり９人である。これらの症例の３分の１は、対象が４０歳未満である場合に生じる。予後は最初の腫瘍の深さに密接に関連し、そして転移性黒色腫の症例の約１００％で死亡に至る。２０余年前から、従来の、またはより革新的な種々の療法が試験されてきたが、それらによっては予後は変化せず、転移性黒色腫の致死という結果も変わらなかった。腫瘍抗原および自己反応性ＣＴＬの同定を含む、より良好な一般的知識にも関わらず、免疫療法は依然として上手くいっていない。免疫療法は、腫瘍細胞のワクチン接種に、四量体会合ペプチド、アジュバント、サイトカインまたは樹状細胞を種々の方法で伴わせてきたが、しかし依然として有効ではない。このことは少なくとも部分的には、宿主の免疫不全により説明され得る（Ｕｇｕｒｅｌ  Ｓ，２００４）。ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ｐ９７メラノトランスフェリン、高分子量のｐ２４０抗原に対する抗体といった、黒色腫に限定される抗原を標的とするモノクローナル抗体が用いられてきた（Ｎｏｒｏｎｈａ  ＥＪ，１９９８）。臨床試験により、これらの抗体が最小限の毒性で投与され得ることが示されている。それにもかかわらず、今日まで、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体も含め（Ｍｉｌｌｓ  Ｌ，２００２）、単独で、または毒素（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｈ，２０００）、化学療法、ＧＭ−ＣＦＳ等の増殖因子、ＩＬ２インターロイキン（Ｓｏｉｆｆｅｒ  ＲＪ，１９９７）、ＴＮＦ、もしくはインターフェロンと組合せて、実際に効果を示すことが立証された抗体はない。
【００１７】
さらに特定的には、脈絡膜黒色腫および皮膚黒色腫はともに、神経堤由来である。転移性脈絡膜黒色腫に罹患する人はほとんどいない。これらの黒色腫は、播種の様式、および転移により罹患する器官という二つの点で互いに異なる。したがって、転移性脈絡膜黒色腫の播種は、血行性のみによる。９０％を超える症例において、第一転移部位（しばしば唯一の）は肝臓である。他の腫瘍局在を発症する患者はほとんどおらず、その大多数が広範な肝臓転移の診断がされた６ヶ月後に腫瘍巣が原因で死亡する。皮膚黒色腫は、播種が血行性およびリンパ性の両方であるために、非常に可変的で予測不可能な進展の様式を示す。他の器官も影響を受け得るが、脳に対するより特異的な向性が存在する。これら二つの黒色腫の診断は大部分が限局段階で行われる。したがって、付随する治療は局所的なものであり、それは、脈絡膜黒色腫のための外科的行為または放射線療法、そして皮膚黒色腫のための外科的行為から成る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記のように、外科処置および放射線療法以外の、アジュバント治療の一部として適用される、または転移性疾患のために適用される従来の治療方法は、効果という点で非常に限定されるということに注目すべきである。さらに、長期入院を要するこれらの治療は、痛みを伴い、楽ではなく、そしてその多くは費用がかかる。したがって、従来の治療の他に、免疫療法といった革新的なアプローチを開発する必要があると思われる。局所的治療（外科処置、化学療法および放射線療法）の他の治療方法は、転移性脈絡膜黒色腫に関しては存在せず、そして転移性皮膚黒色腫に関しては非常に限定される。したがって、転移性黒色腫に罹患した患者の生存を増大させるためには、新規のアプローチが開発されなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
図１：抗ＣＤ７１  ｍＡｂ  ＢＡ１２０ｇにより誘導される、黒色腫細胞株Ａ３７５の増殖の阻害の動態
Ａ３７５黒色腫細胞株から得た１０３個の細胞を、９６平底組織培養プレートのウェルに、抗体および１０％ウシ胎仔血清を含有する０．１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０の存在下で０日目に分配した。ＣＤ１０１に対する５μｇの精製モノクローナル抗体「ＢＢ２７」、またはＣＤ２に対する「Ｏ２７５」、またはＣＤ７１に対する「ＢＡ１２０ｇ」を培養開始時に三組のウェルに添加し、２、３または４日後、培養の最後の１６時間に、１ｍＣｉの３Ｈ［Ｔｄｒ］で細胞をパルスした。液体シンチレーションカウンターを用いて３Ｈ［Ｔｄｒ］の取り込みを測定した。
【００２０】
図２：２５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ７１モノクローナル抗体Ｂａ１２０ｇの、腫瘍細胞株の増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害効果
用いた細胞株は、三つの黒色腫細胞株Ａ３７５、Ｍ７４およびＤａｕｖ１、赤白血病細胞株Ｋ５６２、Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ＨＴＬＶ１＋細胞株Ｃ８１６６、ならびに髄芽細胞腫細胞株Ｄｅｖであった。培養は三回実施した。細胞を、５μｇの精製ＢＡ１２０ｇまたはコントロールＣＤ２  ｍＡｂの存在下で４日間増殖させ、次に培養の最後の１６時間、１ｍＣｉの３Ｈ［ＴｄＲ］でパルスした。ＢＡ１２０ｇでの取り込みのレベルに対する、アイソタイプが一致する無関連な抗体での取り込みのコントロールレベルの間の割合を求めることにより、阻害％を算定した。コントロールｃｐｍは、Ａ３７５に関しては２８７，９８９、Ｍ７４に関しては４４，７４０、Ｄａｕｖ１に関しては１０８，３８９、Ｋ５６２に関しては７０，５１９、Ｊｕｒｋａｔに関しては１０，６５５、Ｃ８１６６に関しては７４，２９２、そしてＤｅｖに関しては１７９，２２０であった。
【００２１】
図３：Ａ３７５細胞の増殖に対する抗ＣＤ７１  ｍＡｂの影響
ＣＤ２に対する精製ｍＡｂ「Ｏ２７５」、またはＣＤ７１に対する「ＢＡ１２０ｇ」および「ＣＹ１Ｇ４」、ならびに抗体なし（Ａｂ）を、培養開始時に２５μｇ／ｍＬで０．２ｍｌ添加した。１０００個の細胞の培養を三回実施した。細胞を、５μｇの精製ＢＡ１２０ｇまたはコントロールＣＤ２  ｍＡｂの存在下で４日間増殖させ、次に培養の最後の１６時間、１ｍＣｉの３Ｈ［ＴｄＲ］でパルスした。
【００２２】
図４から図８：ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列
−図４：マウス抗ＣＤ７１抗体ＢＡ１２０ｇの重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号３）。
−図５：ヒトガンマ１免疫グロブリンの重鎖の定常領域のアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号７）。
−図６Ａおよび図６Ｂ：マウス抗ＣＤ７１抗体ＢＡ１２０ｇの択一的な軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号２、配列番号１１）およびヌクレオチド配列（配列番号４、配列番号１２）。
−図７：ヒトカッパ免疫グロブリンの軽鎖の定常領域のアミノ酸配列（配列番号６）およびヌクレオチド配列（配列番号８）。
−図８：ヒトガンマ４免疫グロブリンの重鎖の定常領域のアミノ酸配列（配列番号９）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）（ＧＥＮＢＡＮＫ、ｎ°ＢＣ０２５９８５）。
【００２３】
第一の様相において、本発明は、配列番号１の少なくとも一つの重鎖およびその配列が配列番号２と配列番号１１から選択される少なくとも一つの軽鎖を含む少なくとも一つの可変領域を含む、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片に関するものである。
【００２４】
「抗体」という用語は、その抗体、消化断片、特定部分、および変異体を含むものとし、その中には、抗体様物質が含まれるか、あるいは、抗体またはその特定断片もしくは特定部分の構造および／または機能を模倣する抗体の部分、例えば一本鎖抗体およびその断片が含まれる。
【００２５】
「機能的断片」としては、ＣＤ７１受容体と結合する抗原結合断片が挙げられる。例えば、ＣＤ７１と結合し得る抗体断片またはその部分、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ（例えばパパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えばペプシン消化および部分的還元による）およびＦ（ａｂ’）２（例えばペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えばプラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えばペプシンまたはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分的還元および再凝集による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば分子生物学的手法による）断片が本発明に包含される。
【００２６】
このような断片は、当該技術分野で既知であるような、および／または本明細書中に記載されるような、酵素切断、合成または組換え技術により産生され得る。抗体は、一つまたは複数の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を用いることで、種々の切断型形態でも産生され得る。例えばＦ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計され得る。抗体の種々の部分は、従来の技術により化学的に共に連結されるか、あるいは遺伝子操作技術を用いて連続したタンパク質として調製され得る。
【００２７】
別の実施態様によれば、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片は、配列番号３によりコードされる少なくとも一つの重鎖および配列番号４と配列番号１２から選択される配列によりコードされる少なくとも一つの軽鎖を含む、少なくとも一つの可変領域を含む。
【００２８】
抗体は、好ましくはＢＡ１２０と呼ばれるハイブリドーマ細胞株により産生され、ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４９の番号で、２００５年６月１４日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（パスツール研究所、パリ、フランス）に寄託されている。
【００２９】
第二の様相では、本発明は、本明細書中に記載されるような少なくとも一つの抗ＣＤ７１モノクローナル抗体と特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体またはその機能的断片に関するものである。
【００３０】
したがって、本明細書中に記載されるようなモノクローナルまたはキメラ抗ＣＤ７１抗体に加えて、本発明は、本発明のこのような抗体に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体に関するものでもある。抗Ｉｄ抗体は、一般的に別の抗体の抗原結合領域と関連する独自の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、Ｉｄ抗体の供給源として同一の種および遺伝子型の動物（例えばマウス系統）を抗体またはそのＣＤＲ含有領域で免疫付与することにより調製され得る。免疫付与された動物は、免疫付与した抗体のイディオタイプ決定基を認識してそれに反応し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物において免疫応答を誘導するための「免疫原」としても用いられ、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生し得る。
【００３１】
第三の様相では、本発明は、配列番号１の少なくとも一つの重鎖およびその配列が配列番号２と配列番号１１から選択される少なくとも一つの軽鎖を含む可変領域を含む、マウス−ヒトキメラ抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片に関するものである。
【００３２】
「マウス−ヒトキメラ抗体」とは、本明細書中では、可変領域がマウス由来であり、一方、定常領域がヒト由来である抗体を意味する。このようなキメラ抗体を産生する多数の方法が現在まで報告されており、したがって当業者の一般的知識の一部を構成している。
【００３３】
別の実施態様によれば、マウス−ヒトキメラ抗ＣＤ７１モノクローナル抗体またはその機能的断片は、配列番号３によりコードされる少なくとも一つの重鎖および配列番号４と配列番号１２から選択される配列によりコードされる少なくとも一つの軽鎖を含む可変領域を含む。
【００３４】
さらに別の実施態様では、キメラ抗体またはその機能的断片は、
−配列番号５と配列番号９から選択される配列の少なくとも一つの重鎖、および／または
−配列番号６の少なくとも一つの軽鎖
を含む定常領域をさらに含む。
【００３５】
さらに別の実施態様では、キメラ抗体またはその機能的断片は、
−配列番号７と配列番号１０から選択される配列によりコードされる少なくとも一つの重鎖、および／または
−配列番号８によりコードされる少なくとも一つの軽鎖
を含む定常領域をさらに含む。
【００３６】
第四の様相によれば、本発明は、本明細書中に記載される抗ＣＤ７１モノクローナル抗体と生物活性分子との間の結合生成物に関するものである。
【００３７】
このような生物活性分子は、以下から選択され得る。
Ａ）金属
金属は、放射性同位体および非放射性金属、例えばＮＭＲに有用なガドリニウムから選択される。好ましくは、金属は、
−ガンマ放射体（例えばＩ１３１）、
−ベータ放射体（例えばＹ９０、Ｌｕ１７７）、
−アルファ放射体（例えばＢｉ２１２、Ｂｉ２１３、Ａｃ２２５、Ａｔ２１１）
のような放射性同位体である。
治療または診断目的に用いられる主要な放射性同位体は、アクチニウム２２５、アクチニウム２２７、砒素７２（ＰＥＴ画像診断）、アスタチン２１１、ビスマス２１２および２１３、臭素７５（ＰＥＴ画像診断）、臭素７７、コバルト５５（ＰＥＴ画像診断）、銅６１（ＰＥＴ画像診断）、銅６４（ＰＥＴ画像診断および処理）、銅６７（ＰＥＴ画像診断）、ヨウ素１２３（ＰＥＴ画像診断）、ヨウ素１３１、ルテチウム１７７（ＰＥＴ画像診断および処理）、オスミウム１９４、ラドン２２３、レニウム１８６、ルテニウム１０５、テルビウム１４９、タリウム２２８および２２９、イットリウム９０および９１である。
これらの同位体は、抗体と直接的に、あるいは、大環状分子、ＤＴＡ、ＤＴＰＡといったキレート化剤を通じて間接的に連結され得る。
いずれの場合も、抗体と同位体との結合、あるいは抗体とキレート化剤／同位体との結合は、直接的であり得るか、またはリンカーを介した間接的なものであり得る。
【００３８】
Ｂ）毒素または細胞毒
ジフテリア毒素（Ａ鎖）、シュードモナス外毒素、リシン（Ａ鎖）、アブリン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスペプチド（ＰＡＰ）、トリカテクム（ｔｒｉｃａｔｈｅｃｕｍ）、およびその機能的断片といった、種々の毒性分子が用いられ得る。
ここでも、結合は直接的であるか、またはリンカーを介したものであり得る。
【００３９】
Ｃ）薬剤
適切な薬剤は、細胞傷害性および／または細胞溶解性である。例として、インターフェロン、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、タキソール、タキソテール、ナベルビン、アドリアマイシン等が挙げられる。
薬剤は、直接的にまたはリンカーを介して用いられ得る。
【００４０】
Ｄ）製剤（ｇａｌｅｎｉｃ）ベクター
これは、抗体輸送、半減期、細胞通過、治療効果等を改善するために興味深いものである。
種々のベクターが用いられ得る（リポソーム、ナノ粒子、ポリマー、陽イオン性エマルション、陰イオン性エマルション、中性エマルション、デンドライトーマ（ｄｅｎｄｒｉｔｏｍａｓ）等）。
有利には、製剤ベクターは、放射性同位体、薬剤、毒素、核酸、特にアンチセンスＲＮＡといった別の生物活性分子を運びうる。
さらにまた、結合はリンカーを介して直接的または間接的であり得る。
【００４１】
Ｅ）所定の細胞型と結合し得る生体分子
例としては、認識特異性を問わない抗体、二重特異性抗体、組換えタンパク質が挙げられる。
ここでの目的は、少なくとも二重特異性分子を得ることである。
【００４２】
Ｆ）酵素
例としては、ＲＮアーゼが挙げられる。
【００４３】
Ｇ）核酸
抗体は、アンチセンスＲＮＡといった核酸または合成オリゴヌクレオチドと、直接的にまたは非直接的に結合され得る。
【００４４】
Ｈ）ビオチン型、ストレプトアビジン型、またはアビジン型分子
このような分子は、抗体の結合特異性を改善するのに興味深いものである。
【００４５】
より詳細には、本発明の結合生成物は、
−ベータ−、アルファ−またはガンマ−放射性同位体、
−リシン型またはアブリン型分子の毒性のＡ鎖およびジフテリア毒素のＡ鎖といった毒素またはその機能的断片、
−メトトレキサート、マイトマイシン、アドリアマイシンといった細胞溶解性薬剤、
−有利にはアンチセンスＲＮＡを含む、リポソームベクターおよび陽イオン性エマルションといった製剤ベクター、
−二重特異性分子を得るための、抗体または組換えタンパク質といった、所定の細胞型と結合し得る生体分子、
−ＲＮアーゼ、
−アンチセンスＲＮＡ、
−ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン
から選択される生物活性分子を組み込む。
【００４６】
いくつかの実施態様では、結合生成物は、リンカー、好ましくはＣ５〜Ｃ１５リンカーを含んでおり、結合生成物が例えばエステラーゼプロドラッグと接触すると生物活性分子が放出される。
【００４７】
第五の様相によれば、本発明は、
−本明細書中に記載される少なくとも一つの抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、またはその少なくとも一つの機能的断片、あるいは
−上記のような少なくとも一つの結合生成物、
ならびに薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物に関するものである。
【００４８】
好ましい一つの実施態様では、本発明の薬学的組成物はさらに、抗体に対するＦｃ受容体を発現するかまたは発現する能力を有し、そして標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）反応を媒介し得る、ヒト白血球エフェクター細胞を含む。
【００４９】
この点で、上記のヒト白血球エフェクター細胞は有利には、リンパ球、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、顆粒球、好酸球、および肥満細胞から選択され得る。
【００５０】
本発明の第六の様相は、悪性腫瘍細胞の増殖を阻害し、かつ／または悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、それを必要とする患者に、
−上記のような抗ＣＤ７１モノクローナル抗体もしくはその機能的断片、またはこのような断片を含む構築物、
−上記のような結合生成物、および
−上記のような薬学的組成物
から選択される少なくとも一つの物質を、前記物質が悪性腫瘍細胞に結合するための条件下および十分な量で提供し、それにより悪性腫瘍細胞の増殖の阻害および／または死滅を引き起こすことを包含する方法に関するものである。
【００５１】
「抗体断片を含む構築物」という用語は、前記断片をコードするポリヌクレオチド配列の生成物、ならびにアルブミン、オボアルブミンといった安定化機能または輸送機能を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。また該用語は、抗体または抗体断片を、アジュバント、および／または、リポソーム、陽イオン性小胞もしくはエマルジョンもしくはナノ粒子といった、前記抗体の輸送および／もしくは安定性を確実にする分子もしくは構造体と組合せた複合体も意味し得る。さらに該用語は、アジュバント、ならびに／または分子の輸送および／もしくは安定化を確実にする分子もしくは構造体と結合した、上記のような配列の生成物の組合せを意味する。
【００５２】
本発明に包含される治療方法は、原発性の腫瘍または癌に対するものを含むが、しかし有利には転移を治療するのに有用なものである。一例として、悪性腫瘍細胞を阻害するかまたは死滅させる方法は、患者の悪性腫瘍細胞にモノクローナル抗体または結合断片が結合するために十分な条件下で、患者に一つまたは複数の上記の物質を投与することを包含する。腫瘍細胞への抗体またはそれらの結合断片の結合は、患者の免疫細胞による細胞の阻害または死滅を誘導する。
【００５３】
このような抗体媒介性治療または療法は、腫瘍細胞または癌細胞を対象とする他の治療、例えば放射線療法、化学療法等を、ならびに上記の一つまたは複数の治療／療法手順によってオプソニン化した癌細胞または腫瘍細胞に対する免疫系の攻撃を増強するための補助的療法を伴い得る。
【００５４】
さらに特定的には、ヒト白血球エフェクター細胞をさらに含む上記のような薬学的組成物を用いる場合、前記ヒト白血球エフェクター細胞は、悪性腫瘍細胞の増殖の阻害および／または死滅を必要とする前記患者の自家細胞または同種細胞である。事実上、細胞は血球成分除去により、そしていくつかの場合には水簸により、患者またはドナーから得られる。それらは、物質による処理の後、あるいはサイトカイン（ＩＬ２など）または増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４）の存在下での短期間の培養の後、あるいは凍結（自己血輸血の場合など）の後に、新たに注入して戻される。
【００５５】
一つの実施態様においては、前記悪性腫瘍細胞は、固形腫瘍の細胞から選択される。これらの細胞は、例えば転移性皮膚黒色腫、転移性ブドウ膜黒色腫、神経膠芽腫、腎細胞癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、卵巣腺癌、膵臓腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳腺癌、結腸直腸腺癌、血液悪性腫瘍の細胞である。好ましくは、悪性腫瘍細胞は、転移性皮膚黒色腫または転移性ブドウ膜黒色腫の細胞である。
【００５６】
有利には、上記の方法はさらに、前記提供の前に、前記悪性腫瘍細胞における細胞内トランスフェリンレベルおよび／または細胞内鉄レベルを激減させる工程を包含する。例えば細胞内鉄レベルは、デフェロキサミンまたはフェリチンを用いて激減され得る。
【００５７】
さらに、本発明の方法では、上記のような物質はさらに、調節性Ｔ細胞との結合により、前記患者における免疫応答を増強し得る。実際、ＣＤ７１は調節性Ｔ細胞により発現されるため、調節性Ｔ細胞に抗ＣＤ７１モノクローナル抗体が結合することで、調節性Ｔ細胞による免疫応答の抑制を阻害することが可能である。
【００５８】
さらにまた、上記で言及されたような物質は、１）胎児の有核赤血球を同定することにより胎児病を診断し、胎児の赤血球を分類するため、２）トランスフェリン受容体／フェリチンの割合を調べることにより、貧血患者における貧血のタイプを確定するため、３）増殖中の細胞を伴う微小転移を同定し、それらを分類するために用いられ得る。
【００５９】
さらに、それらの物質は、自家移植のためのＧＭ−ＣＳＦの注射後に得られる末梢血ＣＤ３４＋幹細胞から増殖中の細胞をパージするためにｅｘ  ｖｉｖｏで用いられ得る。それはまた、臍帯血または骨髄の活性化細胞を枯渇させるためにも用いられ得る。さらにそれは、静止Ｔ  ｒｅｇ細胞がＣＤ７１を発現しない一方ＣＤ２５を発現するため、活性化した／増殖中の細胞を枯渇させるために抗ＣＤ２５  ｍＡｂの代わりに用いられ得る。
【００６０】
前記の物質は、１）ＡＴＬおよびＨＴＬＶ１＋Ｔ細胞白血病を治療するため、２）脳血管関門を越えて薬剤または別の抗体（二重特異性ｍＡｂ中にまたはアビジン融合タンパク質中に組み込まれる可能性がある）を送達するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでも用いられ得る。
【００６１】
第七の様相によれば、本発明は、配列番号３、４および１２で示される一つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子に関するものである。前記配列は、それぞれマウス抗ＣＤ７１抗体の可変領域の重鎖および軽鎖をコードする。
【００６２】
本発明の第八の様相は、上記のような核酸分子を含む発現ベクターに関するものである。
【００６３】
第九の様相は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞または宿主生物に関するものである。
【００６４】
第十の様相では、本発明は、上記のようなキメラ抗体を産生する方法であって、
ａ）本発明の少なくとも一つの発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ）前記宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養する工程、
ｃ）培養培地から集合したキメラ抗体を精製する工程
を包含する方法に関する。
【００６５】
別の実施態様によれば、本発明のキメラ抗体を産生する方法は、
ａ）（ｉ）上記の核酸分子、ならびに
（ｉｉ）ヒトガンマ免疫グロブリンの定常領域の重鎖または軽鎖をコードする、配列番号７、８および１０で示される一つまたは複数のヌクレオチド配列
を含む、少なくとも一つの発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ）前記宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養する工程、そして
ｃ）培養培地から集合したキメラ抗体を精製する工程
を包含する。
【００６６】
本発明の第十一の様相は、本明細書中に開示される抗ＣＤ７１モノクローナル抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関するものである。
【００６７】
本発明の第十二の様相によれば、本発明は、それを必要とする患者においてｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ７１陽性細胞を枯渇させる方法であって、
ａ）ＣＤ７１陽性細胞を含有すると思われる前記患者の生体サンプルを、
−本発明の抗ＣＤ７１モノクローナル抗体もしくはその機能的断片、またはこのような断片を含む構築物、
−本明細書中に開示される結合生成物、および
−上記のような薬学的組成物
から選択される少なくとも一つの物質と接触させること、
ｂ）前記物質と前記生体サンプル中に含有されるＣＤ７１陽性細胞との間で形成される複合体を除去すること、そして
ｃ）「パージされた」生体サンプルを回収すること
を包含する方法に関するものである。
【００６８】
好ましくは、本発明の方法はさらに、前記「パージされた」生体サンプルを前記患者に戻す工程を包含する。
【００６９】
一つの実施態様では、前記生体サンプルは、骨髄サンプル、ＣＤ３４＋細胞で濃縮された血液、臍帯血の多能性幹細胞、幹細胞から選択される。
【００７０】
別の実施態様では、前記患者は、例えば自家骨髄または同種骨髄などによる移植を受けているか、あるいは移植を必要としている。あるいは前記患者は癌を有し、例えば、該患者は、高線量の放射線療法または化学療法を受けた後に悪性増殖性細胞が枯渇した自家ＣＤ３４＋幹細胞の移植を必要とする。さらに別の場合には、前記患者は、自己免疫疾患および神経免疫疾患から選択される疾患を有し得る。
【００７１】
第十三の様相によれば、本発明は、癌を有する患者における免疫応答を増強する方法であって、
−上記のような抗ＣＤ７１モノクローナル抗体もしくはその機能的断片、またはこのような断片を含む構築物、
−上記のような結合生成物、ならびに
−本明細書中に開示されるような薬学的組成物
から選択される少なくとも一つの物質を、前記物質が調節性Ｔ細胞と結合するための条件下および十分な量で前記患者に提供し、それにより前記調節性Ｔ細胞による前記免疫応答の抑制を阻害することを包含する方法に関する。
【００７２】
特に、このような物質、特に抗ＣＤ７１モノクローナル抗体は、免疫療法／ワクチンアジュバントとして有用である。
【００７３】
一つの実施態様では、患者は、黒色腫、特に皮膚黒色腫もしくはブドウ膜黒色腫、または卵巣癌または肝臓癌を有する。
【００７４】
本発明の他の実施態様および利点は、以下の非限定的な実施例において示される。
【実施例】
【００７５】
Ｉ  材料および方法
【００７６】
Ｉ−１  ｍＡｂの産生および精製
ヒト胸腺Ｔ細胞クローン（ＢＡ１２０ｇ。ＢＡ１２０とも呼ばれ、ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４９、ＣＹ１Ｇ４、ＢＢ２７の番号で、２００５年６月１４日にＣＮＣＭに寄託された）、または以前に記載された胸腺細胞（Ｏ２７５）（Ｂｏｕｍｓｅｌｌ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，１９８０）でＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＢｉｏｚｚｉ高応答性マウスを免疫付与することにより、ｍＡｂを得た。記載されたように、ＮＳ１を用いて細胞融合を実行した（Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００７７】
スクリーニングを二段階で実施した。間接免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析の後、免疫付与細胞と反応しているすべてのハイブリドーマ上清を保存した。さらに、活性化した細胞と高強度で反応するが静止細胞とは反応しない上清を保存した。選択ｍＡｂを含有する培養物は、限界希釈によって二回クローニングされた。プリスタンまたは不完全フロイントアジュバントで初回免疫したＢａｌｂ／ｃマウスまたはヌードマウスから腹水を採取した。腹水をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、プロテインＧカラム上で精製し、そして限外濾過により滅菌し、そしてさらに指示濃度で利用した。ＥＬＩＳＡアイソタイピングキットで判定したところ、ＢＡ１２０ｇ、Ｏ２７５およびＢＢ２７はＩｇＧ１アイソタイプ、ＣＹ１Ｇ４は、ＩｇＧ２ａアイソタイプ、そしてＩＶＧ４２はＩｇＧ２ｂアイソタイプに属する。Ｏ２７５は、免疫沈降および組織分布によりＣＤ２を認識することが示されたが、一方、ＢＢ２７はＣＤ１０１を認識する。これらの抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプに属するためネガティブコントロールとして選択されたが、ＣＤ２分子およびＣＤ１０１分子はメラノサイト細胞株で欠けており、ＣＤ２はＮＫ細胞により発現され単球によっては発現されない一方で、ＣＤ１０１は単球のみにより発現される。
【００７８】
Ｉ−２  細胞および細胞株
ヒトＰＭＮＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｉｐａｑｕｅ（Ｆ／Ｈ）密度勾配遠心分離により調製した。単核球を、インフォームドコンセント後に健常なボランティアから得た。単球、ＮＫ細胞またはＴ細胞を、メーカー（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グルノーブル、フランス）の指示に従って、適切な幹細胞ロゼット分離枯渇系を用いて単離した。
【００７９】
ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５、Ｍ７４およびＤａｕｖ１ならびに他の細胞株の培養物を、３７℃、５％ＣＯ２下のインキュベーター内の１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０中で、対数増殖で維持した。Ａ３７５、Ｍ７４およびＤａｕｖ１を、それらがアポトーシスに対する感受性の種々のレベルを表すことが予め示されていたため選択した。要するに、Ｄａｕｖ  １およびＭ７４はＩＦＮγの存在下でＦａｓのみに対して感受性であり、ＴＮＦ、抗ＦａｓおよびＴｒａｉｌに対して耐性である。逆に、Ａ３７５は、ＩＦＮγのみを除いて、すべての上記シグナルに感受性である。
【００８０】
接着細胞株は標準的なトリプシン処理（０．０２ｍＭグルコース／ＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍｌトリプシン）により回収した。すべての細胞培養物をマイコプラズマ汚染について検査した。
【００８１】
用いた培養中の他の細胞株は、Ｄｅｖ（髄芽細胞腫）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病株）、Ｃ８１６６（ＨＴＬＶ１＋細胞株）およびＫ５６２（赤白血病）であった。
【００８２】
Ｉ−３  免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー
間接免疫蛍光を、Ｑｉｆｉｑｕｉｔ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、トラップ、フランス）で提供されたＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧを用いて、精製ｍＡｂにより実施した。以前に記載されたように、シングルレーザーＸＬアナライザーＥｐｉｃｓ（Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、フロリダ州）により、定量的なフローサイトメトリー分析を実施した。
【００８３】
Ｉ−４  増殖分析
細胞を、９６ウェル平底組織培養プレート中で、種々の濃度の精製ｍＡｂの存在下または非存在下で４日間培養した。通常、培養開始時に０．２ｍｌウェル当たり、５μｇの精製ｍＡｂ（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。最後の１２〜１６時間の培養中、１ｍＣｉの３Ｈ［ＴｄＲ］で細胞をパルスした。液体シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、メリデン、コネチカット州）を用いて、３Ｈ［ＴｄＲ］の取り込みを測定した。
【００８４】
Ｉ−５  交差的遮断の実験およびビオチニル化ＯＫＴ９の結合分析
Ａ３７５細胞を３０分間、ＢＡ１２０ｇ、ＣＹ１Ｇ４、Ｔｆ−ＦｅまたはＮＳ１腹水とともに４℃または３７℃でインキュベートした後、ビオチン標識抗ＣＤ７１  ｍＡｂ  ＯＫＴ９を添加し、さらに２０分間インキュベートした。次に、一回洗浄した後、ストレプトアビジン−フルオレセインを添加し、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。下記の表２に示すように、平均蛍光強度を記録した。
Ｂａ１２０ＧおよびＣｙ１Ｇ４：１５μｇ（飽和状態）
コントロールの腹水  ＮＳ１：２μｌ
ＯＫＴ９−Ｂｉｏｔ：１μｌ
【００８５】
ＩＩ  結果
【００８６】
ＩＩ−１  Ａ３７５黒色腫細胞株の増殖の抗ＣＤ７１  ＢＡ１２０ｇ誘導性の阻害の動態
極少数の抗ＣＤ７１  ｍＡｂのみが細胞増殖を阻害し得ることが従来の報告により示されている。腫瘍細胞増殖の有意な阻害のためには、広範な受容体の架橋が必要であると仮定された（Ｔａｅｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｌｅｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。これは、ＩｇＧ抗ＣＤ７１  ｍＡｂが、トランスフェリン受容体の下向き調節と分解を誘導するにも関わらず細胞増殖の阻害に有効でなかった理由を説明し得た。
【００８７】
ウェル当たり１０３（または５×１０３）個のＡ３７５細胞を用いた場合、３Ｈ［Ｔｄｒ］の取り込みは４日目に最大であり（図１）、その後急激に低減した（図示されていない）。ともにＩｇＧ１アイソタイプである、５μｇ（２５μｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ２「Ｏ２７５」ｍＡｂまたは抗ＣＤ１０１「ＢＢ２７」ｍＡｂの存在下では、増殖の動態の変化は認められなかった。逆に、ＩｇＧ１アイソタイプの抗ＣＤ７１  ｍＡｂ  ＢＡ１２０ｇの存在下では、２日目から４日目まで横這いであった（図１）。
【００８８】
ＩＩ−２  抗ＣＤ７１  ＢＡ１２０ｇはすべての細胞株の増殖を阻害する
細胞増殖のＢＡ１２０ｇ誘導性の阻害が他の細胞株で観察されるか否かを判定することが目的であった。したがって、Ａ３７５のほかに、黒色腫細胞株Ｍ７４およびＤａｕｖ１、Ｔ細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＨＴＬＶ１＋細胞株Ｃ８１６６、赤白血病細胞株Ｋ５６２、ならびに髄芽細胞腫細胞株Ｄｅｖを試験した。すべての場合において、ＢＡ１２０ｇは図２に示すように４日目に高レベルの阻害を誘導し、すべての場合で７０％を上回る阻害に達した。
【００８９】
ＩＩ−３  抗ＣＤ７１  ｍＡｂ  ＢＡ１２０ｇのみがＡ３７５黒色腫細胞株の増殖を阻害する
Ａ３７５の増殖に対する二つの他の抗ＣＤ７１  ｍＡｂの阻害作用を調べた。ＣＹ１Ｇ４はＩｇＧ２ａアイソタイプに属するが、４Ｇ４２はＩｇＧ２ｂである。この三つのｍＡｂは抗ＣＤ７１  ｍＡｂであることが、組織分布および免疫沈降により以前に示されている。図３で分かるように、ＢＡ１２０ｇのみがＡ３７５細胞の増殖を阻害したが、ＣＹ１Ｇ４（図３に示されている）および４Ｇ４２（図示されていない）はＡ３７５の増殖を変化させなかった。
【００９０】
ＩＩ−４  黒色腫細胞株上の抗ＣＤ７１結合部位の定量
抗ＣＤ７１  ｍＡｂにおけるそれらの細胞増殖阻害の能力の差が、黒色腫細胞とのそれらのそれぞれの結合における差に関連するか否かを試験することが目的であった。三つの黒色腫細胞株Ａ３７５、Ｄａｕｖ１およびＭ７４、ならびに髄芽細胞腫細胞株ＤＥＶ上の、ＢＡ１２０ｇおよびＣＹ１Ｇ４によって同定される部位の数の比較分析を実施した。したがって、標準化したＦＩＴＣ結合抗マウス免疫グロブリン抗体および較正用ビーズ（Ｑｉｆｉｋｉｔ）を用いた。表１は、抗ＣＤ７１結合部位の数は２つのｍＡｂで同様であり、そしてＣＹ１Ｇ４でわずかに高かったことを示す。表１はさらに、結合部位の数は、Ｄｅｖよりも３つの黒色腫細胞株で高かったが、この髄芽細胞腫細胞株は、ＢＡ１２０ｇにより増殖が阻害された（図２に示されている）。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
ＩＩ−５  ＢＡ１２０ｇ結合部位の研究
トランスフェリン受容体上の、そのリガンドであるトランスフェリン鉄とは異なる部位に結合することが既知である、参照の抗ＣＤ７１抗体ＯＫＴ９と同じエピトープに、ＢＡ１２０ｇが結合していたか否かを調べた。そのために、交差的遮断の実験を実施したが、これにおいて、黒色腫細胞の最初のインキュベーションは、コントロールの腹水であるＮＳ１、または２つの抗ＣＤ７１  ｍＡｂであるＢＡ１２０ｇもしくはＣＹ１Ｇ４、またはトランスフェリン鉄とともに行った。次に、直接的にビオチニル化したＯＫＴ９の結合を上記のように分析した。以下の表２に示した結果は、ＣＹ１Ｇ４がＯＫＴ９の結合を阻害し得た一方、ＢＡ１２０ｇおよびトランスフェリン鉄の両方はＣＤ７１上の異なるエピトープに結合していたことを明瞭に示している。言い換えれば、ＢＡ１２０ｇは、ＣＹ１Ｇ４もしくはＯＫＴ９の両方とは異なる、またはそのリガンドであるトランスフェリン鉄とは異なるエピトープを同定する。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
ＩＩ−６  ＢＡ１２０ｇの結合はＣＤ７１のリガンドであるトランスフェリン鉄によってもヒトＡＢ血清によっても遮断されない
ヒト血清は、トランスフェリン鉄受容体および可溶性トランスフェリン受容体の両方を含有する。したがって、トランスフェリン鉄またはヒト血清のいずれかが細胞へのＢＡ１２０ｇの結合を遮断するか否かを判定することは重要であった。以下の表３に示すように、１０％ヒトＡＢ血清の存在下では、ＢＡ１２０ｇの結合は、１０％ウシ胎仔血清の存在下での結合と比較して増大した。さらに、トランスフェリン鉄の添加は、ヒトＡＢ血清に対してさえ、ＢＡ１２０ｇの結合をわずかに低減しただけであった。したがって、Ａ３７５黒色腫細胞株上のＢＡ１２０ｇ結合部位の数は、ヒトＡＢ血清またはトランスフェリン鉄の存在下では有意に変化しない。
【００９５】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】抗ＣＤ７１  ｍＡｂ  ＢＡ１２０ｇにより誘導される黒色腫細胞株Ａ３７５の増殖の阻害の動態を示したグラフ。
【図２】２５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ７１モノクローナル抗体Ｂａ１２０ｇの、腫瘍細胞株の増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害効果を示したグラフ。
【図３】Ａ３７５細胞の増殖に対する抗ＣＤ７１  ｍＡｂの影響を示したグラフ。
【図４】ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列。
【図５】ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列。
【図６Ａ】ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列。
【図６Ｂ】ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列。
【図７】ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列。
【図８】ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列。
【００９７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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