(57)【要約】方法は、活性薬剤の微粒子への吸着を、その活性薬剤の構造的特長を改変することによって促進することを提供する。この方法は、上記微粒子に対する好ましい結合を容易にすることを目的とする。一般に、微粒子は、微粒子および溶解された活性薬剤を含む系を、活性薬剤が溶液中に残存するよりも大きい微粒子表面に対する親和性を有するように改変することによって、活性薬剤でコーティングされる。特に、本発明は、溶液中の多くの条件下おける活性薬剤の特性を改変／利用することによって微粒子表面への活性薬剤の吸着をさらに促進することを、模索する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁物中の予め形成された結晶性微粒子に対する活性薬剤の結合を促進する方法であって、
ｉ）該活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程であって、該改変する工程が、溶媒の除去とは関係なく、該活性薬剤と微粒子との間のエネルギー的に好ましい相互作用を可能にする、工程；および
ｉｉ）該活性薬剤を該微粒子の表面上に吸着させる工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記化学ポテンシャルを改変する工程は、前記活性薬剤の構造、可撓性、硬性、溶解性または安定性を改変する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、溶液の状態を変化させる工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液の状態を変化させる工程は、活性薬剤改変因子を該溶液に添加する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性薬剤改変因子は、塩、界面活性剤、イオン、オスモライト、アルコール、カオトロープ、コスモトロープ、酸、塩基、および有機溶媒からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩は、塩化ナトリウムである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記活性薬剤を前記微粒子の懸濁物の流体相に溶解し、そして該流体相のｐＨを変化させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨは、前記活性薬剤の添加の前に変えられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐＨは、前記活性薬剤の添加の後に変えられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性薬剤改変因子は、前記活性薬剤の構造的安定性または薬力学を改善する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性薬剤は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、小分子、または核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性薬剤は、インスリン、グレリン、成長ホルモン、および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性薬剤は、抗体または抗体フラグメントを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記小分子は、疎水性分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記小分子は、シクロスポリンＡ、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記小分子は、イオン化可能な分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、微粒子表面との１つ以上のエネルギー的に好ましい相互作用を調節する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性薬剤と微粒子との間の１つ以上のエネルギー的に好ましい相互作用は、静電相互作用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性薬剤と微粒子との間の１つ以上のエネルギー的に好ましい相互作用は、疎水的相互作用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記活性薬剤と微粒子との間の１つ以上のエネルギー的に好ましい相互作用は、水素結合相互作用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記微粒子は、ジケトピペラジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ジケトピペラジンは、フマリルジケトピペラジンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶媒を除去するための工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
活性薬剤と結晶性微粒子とを含む薬物送達組成物を調製するための方法であって、
活性薬剤分子を含む活性薬剤溶液を提供する工程；
該活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程；
微粒子を懸濁物または粉末で提供する工程；および
該活性薬剤溶液と該微粒子の懸濁物または粉末とを合わせる工程；
を包含する、プロセス。
【請求項２５】
前記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、該活性薬剤と微粒子との間の相互作用を可能にする、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、活性薬剤改変因子を前記溶液に添加する工程を包含する、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記活性薬剤改変因子は、塩、界面活性剤、イオン、オスモライト、アルコール、カオトロープ、コスモトロープ、酸、塩基、および有機溶媒からなる群より選択される、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記活性薬剤改変因子は、前記活性薬剤分子の溶解性を減少させる、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記活性薬剤改変因子は、前記活性薬剤と微粒子との間の会合を促進する、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記活性薬剤改変因子は、前記活性薬剤分子の構造的安定性を改善する、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記微粒子は、ジケトピペラジンを含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記ジケトピペラジンは、フマリルジケトピペラジンである、請求項３１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／７１７，５２４号（２００５年９月１４日出願）、および米国仮特許出願第６０／７４４，８８２号（２００６年４月１４日出願）（これらの内容全体は、その全体が本明細書によって参考として援用される）に基づく、米国特許法第１１９条（ｅ）の下における利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、薬物処方に関連し、そして本発明は、特に、方法に関連する。より具体的には、活性薬剤を結晶性微粒子の表面上に結合または吸着させることが、開示される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
治療剤の送達は、主要な懸案事項である。経口投与は、投与の容易さ、患者のコンプライアンス、およびコストの減少に起因して、送達の最も一般的でありかつ好ましい経路の１つである。しかし、この経路の不利益としては、治療薬の低いかまたは変動する効力、および治療薬の非効率的な吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）が挙げられる。これは、特に、送達される化合物が胃腸管において直面する条件下で不安定である場合に明白である。種々のコーティング法および封入法が、当該分野で開発されているが、この問題への取り組みにおいて有効であるものはわずかしかない。さらに、胃腸管の条件で活性がより低い傾向にあり、そして有効量で血流中に吸収されるためにより高い投薬量で投与されなければならない治療用化合物が、存在する。
【０００４】
広範な薬物処方系が、最適な薬物送達の懸案事項に取り組むために開発されており、そしてそれは、キャリアとして作用するマトリックス中への薬物の組み込みに基づく。薬物処方において考慮される因子としては、その薬物処方系が、非毒性でありかつ送達される薬物と非反応性であり、製造に関して経済的であり、容易に利用可能な成分から形成され、そして最終的な組成ならびに安定性および放出速度を含む物理的特性に関して合致する必要性が挙げられる。薬物送達系は正常な生理学的プロセスによって身体から容易に除去される材料から形成されることがまた、好ましい。
【０００５】
微粒子技術の進歩は、改善された薬物処方の開発に役立っている。しかし、これらの利点にかかわらず、特に肺性の手段によって医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）として投与される場合、長期の効果および最適な吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）を有する安定な薬物処方に対する必要性が、当該分野において依然として存在する。この不足に取り組む１つのアプローチは、微粒子表面への活性薬剤の吸着を促進し、そして溶液中に残存する活性薬剤の傾向を減少させる、活性薬剤の構造的特長／特性を標的とすることである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
方法は、結晶性微粒子表面上への活性薬剤の結合、コーティングまたは吸着を提供する。一般に、微粒子は、微粒子および溶解された活性薬剤を含む系を、活性薬剤が溶液中に残存するよりも大きい微粒子表面に対する親和性を有するように改変することによって、活性薬剤でコーティングされる。特に、本発明は、溶液中の多くの条件下おける活性薬剤の特性を改変／利用することによって微粒子表面への活性薬剤の吸着をさらに促進することを、模索する。
【０００７】
したがって、本発明において、懸濁物中の予め形成された結晶性微粒子に対する活性薬剤の結合を促進する方法が、提供され、その方法は：ｉ）上記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程であって、上記改変する工程が、溶媒の除去とは関係なく、上記活性薬剤と微粒子との間のエネルギー的に好ましい相互作用を可能にする、工程；およびｉｉ）上記活性薬剤を上記微粒子の表面上に吸着させる工程を包含する。
【０００８】
本発明の特定の実施形態において、上記化学ポテンシャルを改変する工程は、上記活性薬剤の構造、可撓性、硬性、溶解性または安定性を、個別かまたは組み合せで改変する工程を包含する。上記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、溶液の状態を変化させる工程を包含する。上記溶液の状態を変化させる工程は、活性薬剤改変因子を上記溶液に添加する工程を包含する。
【０００９】
特定の実施形態において、上記活性薬剤改変因子は、塩、界面活性剤、イオン、オスモライト、アルコール、カオトロープ、コスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）、酸、塩基、および有機溶媒からなる群より選択される。１つの実施形態において、上記塩は、塩化ナトリウムである。
【００１０】
本発明のさらになお別の実施形態において、上記方法は、上記活性薬剤を上記微粒子の懸濁物の流体相に溶解し、そして上記流体相のｐＨを変化させる工程をさらに包含する。１つの局面において、上記活性薬剤を流体相に溶解する工程とは、固体の溶解をいう。別の局面において、上記活性薬剤を溶解する工程とは、上記活性薬剤の濃縮溶液の添加をいう。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、上記活性薬剤改変因子は、上記活性薬剤の構造的安定性を改善する。
【００１２】
本発明のなお別の実施形態において、上記活性薬剤は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、小分子、または核酸分子である。本発明の別の実施形態において、上記活性薬剤は、インスリン、グレリン、成長ホルモン、および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）からなる群より選択される。上記活性薬剤は、抗体または抗体フラグメントを含み得る。本発明の種々の局面において、上記抗体は、疾患関連抗原を認識し得、その疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原または感染性病原体関連抗原を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明のさらになお別の実施形態において、上記小分子は、イオン化可能な分子または疎水性分子（例えば、シクロスポリンＡであるが、これらに限定されない）である。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、上記活性薬剤と上記微粒子表面との間の１つ以上のエネルギー的に好ましい相互作用（例えば、静電相互作用、疎水的相互作用、および／または水素結合相互作用であるが、これらに限定されない）を調節する工程を包含する。１つの実施形態において、上記微粒子は、ジケトピペラジン（例えば、フマリルジケトピペラジンであるが、これらに限定されない）を含む。
【００１５】
本発明のなお別の実施形態において、上記方法は、溶媒を除去または交換する工程をさらに含む。溶媒とは、本明細書中で使用される場合、上記活性薬剤および微粒子が「浸される（ｂａｔｈｅｄ）」流体媒体をいう。それは、全ての成分が溶けた状態であることを必要とすると解釈されるべきではない。実際に、多くの場合において、それは、上記微粒子が懸濁される液体媒体をいうために使用され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、活性薬剤と結晶性微粒子とを含む薬物送達組成物を調製するための方法が、提供され、その方法は：活性薬剤分子を含む活性薬剤溶液を提供する工程；上記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程；微粒子を懸濁物または粉末で提供する工程；および上記活性薬剤溶液と上記微粒子の懸濁物または粉末とを合わせる工程；を包含する。上記粉末は、例えば、濾過され得るが、乾燥されない。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、上記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変するプロセスは、上記活性薬剤と微粒子との間の相互作用を可能にする。１つの実施形態において、上記活性薬剤の化学ポテンシャルを改変する工程は、活性薬剤改変因子を上記溶液に添加する工程を包含する。このような活性薬剤改変因子は、塩、界面活性剤、イオン、オスモライト、アルコール、カオトロープ、コスモトロープ、酸、塩基、および有機溶媒からなる群より選択され得る。なお別の実施形態において、上記改変因子は、上記活性薬剤分子の溶解性を減少させ、上記活性薬剤と微粒子（例えば、ジケトピペラジン粒子）との間の会合を促進し、そして／または上記活性薬剤分子の構造的安定性を改善する。
【００１８】
添付の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本明細書中に開示される実施例の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中で提供される特定の実施形態の詳細な説明と組み合せてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、より十分に理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
薬学的活性薬剤を結晶性微粒子と組み合せて安定化するのに有用な方法が、本明細書中に記載される。得られる組成物は、結晶性微粒子表面上にコーティングされた安定な活性薬剤を提供する。
【００２０】
上記結晶性微粒子上にコーティングまたは吸着される物質は、本明細書中で活性薬剤と称される。活性薬剤のクラスの例としては、治療的、予防的、および／または診断的な有用性を有する薬学的組成物、合成化合物、および有機高分子が挙げられる。
【００２１】
一般に、ほとんどの活性薬剤は、結晶性微粒子の表面上にコーティングまたは吸着され得、その活性薬剤としては、有機高分子、核酸、合成有機化合物、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、多糖類および他の糖、ならびに脂質が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドは全て、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の鎖である。ペプチドは、一般に、３０個未満のアミノ酸残基であると見なされるが、３０個より多くのアミノ酸残基を含んでもよい。タンパク質は、３０個より多くのアミノ酸残基を含み得るポリマーである。当該分野において公知であり、そして本明細書中で使用されるような、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド、タンパク質、または複数のペプチド結合を有する任意の長さであるが、一般に、少なくとも１０アミノ酸を含む、アミノ酸の任意の他の鎖をいい得る。上記コーティング処方物において使用される活性薬剤は、種々の生物学的に活性なクラス（例えば、血管作動性薬剤、神経刺激性薬剤、ホルモン、抗凝固剤、免疫調節剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗原、および抗体）に納まり得る。
【００２２】
本発明において使用され得る活性薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：成長ホルモン、抗体およびそのフラグメント、アルキン類、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ＰＰＡＣＫ（Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン）、ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、クロピオグレル（ｃｌｏｐｉｏｇｒｅｌ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グレリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インスリンおよびインスリンアナログ（例えば、インスリンアスパルトおよびインスリン）ならびに抗体およびそのフラグメント（ヒト化抗体またはキメラ抗体；単独かまたは他のポリペプチドに融合されたＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、または単鎖抗体；癌抗原、サイトカイン、感染因子、炎症メディエーター、ホルモン、および細胞表面抗原に対する治療用モノクローナル抗体または診断用モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない）。腫瘍抗原に対する抗体の非限定的な例としては、抗ＳＳＸ−２４１−４９（滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２）、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１（食道腫瘍関連抗原）、抗ＰＲＡＭＥ（黒色腫の優先的に発現される抗原）、抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、抗Ｍｅｌａｎ−Ａ（黒色腫腫瘍関連抗原）、抗チロシナーゼ（黒色腫腫瘍関連抗原）、および抗ＭＯＰＣ−２１（骨髄腫プラスマ細胞タンパク質）が挙げられる。
【００２３】
（微粒子）
本質的に、用語「微粒子」とは、正確な外部構造または内部構造に関係なく、約０．５〜１０００μｍの直径を有する粒子をいう。微粒子の広範な分類内において、「マイクロスフェア」とは、均一な球形状を有する微粒子をいう。結晶性微粒子とは、本明細書中で使用される場合、結晶の内部構造を有するが、必ずしも結晶の外部形態を有さず、そして空間格子における原子の規則的な配列を有する微粒子をいう。イオン化可能な結晶表面とは、電荷を保有するためのさらなる能力を有する結晶性微粒子をいう。いくつかの実施形態において、上記微粒子は、単一の規則的に成形された結晶であり得る。種々の好ましい実施形態において、上記微粒子は、任意の組み合せで、不規則に成形されるか、有孔であるか、溶解された活性薬剤が到達可能（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）な内部表面を有するか、または複数の結晶を含む。このような特徴は、一般に、表面積を増大させ、それによって負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）能力を増大させる。このような特徴はまた、上記活性薬剤が上記微粒子を含む乾燥粉末の吸入によって送達される場合に重要である有利な空気力学特性に寄与し得る。
【００２４】
好ましくは、上記結晶性微粒子を含む化学物質は、可逆的に反応し、送達され、非毒性であり、そしてげっ歯類およびヒトによって代謝されない。上記にかかわらず、ある程度のレベルの毒性が、例えば、処置される状態の重篤度または患者が曝される物質の量に依存して許容され得る。同様に、その物質が完全に代謝的に不活性であることは、必要とされない。さらに、好ましい微粒子の結晶構造は、活性薬剤によるコーティングまたは結合のプロセスにおいて実質的に破壊される。上記結晶性微粒子の組成は、どのような型の化学的相互作用が活性薬剤の上記微粒子表面への吸着を駆動するために操作され得るかを、決定する。
【００２５】
多くの物質が、結晶性微粒子を形成するために使用され得る。表面を有するものとして微粒子は、その表面の特性が、本願と同じ年月日に出願された同時係属中の米国特許出願第＿／＿（代理人整理番号５１３００−０００２５）および米国仮特許出願第６０／７１７，５２４号（２００５年９月１４日出願）（これらの各々は、その全体が本明細書によって参考として援用される）に開示されるようなコーティングプロセスにおいて操作され得る。結晶性微粒子が形成され得る代表的な材料は、芳香族アミノ酸、または規定されたｐＨ範囲において限定された溶解性を有する化合物（例えば、ジケトピペラジンおよびモルホリンサルフェート）を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明において企図されるような微粒子の１つの特定の例は、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）微粒子である。本明細書中で考察される場合、ＤＫＰ微粒子は、上記活性薬剤の吸着を容易にするために使用される。米国特許第５，３５２，４６１号および同第５，５０３，８５２号（これらの各々は、その全体が本明細書によって参考として援用される）は、低いｐＨにおいて安定であり、そして血液または小腸のｐＨにおいて溶解するジケトピペラジン誘導体（例えば、３，６−ビス［Ｎ−フマリル−Ｎ−（ｎ−ブチル）アミノ］（フマリルジケトピペラジンまたはＦＤＫＰともいわれる；（Ｅ）−３，６−ビス［４−（Ｎ−カルボキシ−２−プロペニル）アミドブチル］−２，５−ジケトピペラジンとも称される））からのジケトピペラジン（ＤＫＰ）微粒子の形成に基づく薬物送達系を記載する。ジケトピペラジン構造エレメントまたはその置換誘導体（ジケトモルホリンおよびジケトジオキサンが挙げられるが、これらに限定されない）のうちの１つに基づく系は、所望のサイズ分布範囲およびｐＨ範囲および良好な負荷量許容性を有する微粒子を形成する。広範な安定であり再現可能な特徴は、置換基の適切な操作によってもたらされ得る。これらの特許は、上記活性薬剤を含む微粒子を形成するための、上記活性薬剤の存在下でのＤＫＰの析出を開示した。ジケトピペラジンおよびジケトピペラジン微粒子の合成、調製、および使用についてのさらなる詳細は、米国特許第６，０７１，４９７号；同第６，３３１，３１８号；同第６，４２８，７７１号ならびに米国特許公開第２００６００４０９５３号および同第２００６００４１１３３号（各々は、その全体が本明細書によって参考として援用される）に開示される。ジケトピペラジン粒子を含む組成物は、米国特許第６，９９１，７７９号および米国特許公開第２００４００３８８６５号（各々は、その全体が本明細書によって参考として援用される）に開示される。
【００２７】
本発明において企図される他のジケトピペラジンとしては、３，６−ジ（４−アミノブチル）−２，５−ジケトピペラジン；３，６−ジ（スクシニル−４−アミノブチル）−２，５−ジケトピペラジン（スクシニルジケトピペラジンまたはＳＤＫＰ）；３，６−ジ（マレイル−４−アミノブチル）−２，５−ジケトピペラジン；３，６−ジ（シトラコニル（ｃｉｔｒａｃｏｎｙｌ）−４−アミノブチル）−２−５−ジケトピペラジン；３，６−ジ（グルタリル−４−アミノブチル）−２，５−ジケトピペラジン；３，６−ジ（マロニル−４−アミノブチル）−２，５−ジケトピペラジン；３，６−ジ（オキサリル−４−アミノブチル）−２，５−ジケトピペラジンおよびそれらからの誘導体が挙げられる。ジケトピペラジン塩はまた、本発明において利用され得、そして、例えば、薬学的に受容可能な塩（例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、Ｍｇ、Ｃａ、アンモニウム、またはモノアルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウムまたはトリアルキルアンモニウム（トリエチルアミン、ブチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、またはピリジンなどから誘導されるようなもの））を含み得る。上記塩は、単一塩（ｍｏｎｏ−ｓａｌｔ）、二塩（ｄｉ−ｓａｌｔ）、または混合型の塩であり得る。より高次の塩もまた、Ｒ基が１つより多い酸基（ａｃｉｄ  ｇｒｏｕｐ）を含むジケトピペラジンに関して企図される。本発明の他の局面において、上記薬剤の塩基性形態は、薬物（その薬物は、ジケトピペラジンの対カチオンである）と上記ジケトピペラジンとの間に塩結合を形成するために上記ジケトピペラジンと混合され得る。薬物送達のためのＤＫＰ塩は、米国特許出願公開第２００６００４０９５３号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）においてさらに詳細に開示される。
【００２８】
米国特許第６，４４４，２２６号、および同第６，６５２，８８５号（各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）は、活性薬剤の溶液が添加される水性懸濁物中のＤＫＰの微粒子を調製および提供すること、ならびにその後の、活性薬剤のコーティングを有する微粒子を産生するためにその懸濁物を凍結乾燥する重要な工程を記載する。この処方についての基礎は、活性薬剤による微粒子のコーティングが凍結乾燥による液体媒体の除去によって駆動されることである（米国特許第６，４４０，４６３号（これは、その全体が本明細書によって参考として援用される）も参照のこと）。先行技術における教示とは対照的に、本発明は、溶媒除去の前に活性薬剤と上記微粒子との会合を調整するための手段を提供する。したがって、体積物理的（ｂｕｌｋ  ｐｈｙｓｉｃａｌ）方法（例えば、濾過または沈降）または蒸発による方法（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）による液体媒体の除去は、かなりの負荷をもたらし得る。
【００２９】
（活性薬剤の吸着の促進）
活性薬剤を結晶性微粒子の表面に吸着させることは、種々の溶液条件下で溶液または流体懸濁物中のその活性薬剤の特性を変化させ、それによってその微粒子表面への吸着を促進し、そして溶液中に残る活性薬剤の量を減少させることを包含し得る。上記活性薬剤に対する変更または改変は、改変因子（例えば、カオトロープおよびコスモトロープ、塩、有機物（例えば、アルコールであるが、これに限定されない）、オスモライト、および界面活性剤であるが、これらに限定されない）の使用によって生じ得る。これらの改変因子は、その因子自体の化学的な変化を伴わずに、上記活性薬剤に作用してその化学ポテンシャルを変化させ、それによってその活性薬剤の構造、可撓性、硬性または安定性を変化させ得る。用語「化学ポテンシャル」は、当業者にとって周知である。本発明の実施形態において、「化学ポテンシャル」とは、化学反応（例えば、活性薬剤と溶媒との間の相互作用または活性薬剤の微粒子上への吸着など）を駆動するのに必要な自由エネルギーをいう。用語「エネルギー的に好ましい」とは、本明細書中で使用される場合、コーティングされていない微粒子、または結合していない活性薬剤および／あるいは活性薬剤の不溶性形態（凝集または沈殿を含む）の自由エネルギーレベルに対する関係における、上記活性薬剤が上記微粒子上に吸着した状態の自由エネルギーレベルの低下をいう。用語「構造」とは、本明細書中で使用される場合、上記活性薬剤分子の二次構造をいい、そして上記活性薬剤分子（例えば、タンパク質）のα−ヘリックスの形成、βシート、またはランダムコイル（順序立てられていない）を含む。さらに、用語「構造」はまた、分子の三次構造および四次構造を含み得るが、これらに限定されず、そしてまた、分子の自己会合、凝集、多量体化、二量体化などをいい得る。用語「安定性」とは、本明細書中で使用される場合、上記改変因子の存在における上記活性薬剤の構造の安定化または不安定化をいう。
【００３０】
さらに、溶液または流体懸濁物中の上記活性薬剤の特性を変化させることは、その活性薬剤および／または微粒子の疎水特性、水素結合特性、および静電特性に起因して、上記相互作用に影響を及ぼすようである。
【００３１】
疎水的相互作用は、非極性基の水における不溶解性に起因する、水溶液中での非極性基の互いとの会合である。疎水的相互作用は、多くの分子プロセス（構造安定化（単一分子、２分子または３分子からなる複合体、またはより大きい集合体の構造安定化）および動力学が挙げられるが、これらに限定されない）に影響を及ぼし得、そしてタンパク質−タンパク質結合プロセスおよびタンパク質−リガンド結合プロセスに対して重要に寄与し得る。これらの相互作用はまた、タンパク質の折り畳みの初期の事象において役割を果たし、そして複合体集合および自己集合現象（例えば、膜の形成）に関与することが公知である。
【００３２】
水素結合相互作用は、特に、分子間における強力な双極子−双極子の力；極性結合（例えば、Ｈ−Ｆ、Ｈ−ＯまたはＨ−Ｎ）中の水素原子は、電子の共有されていない対を有する（代表的に、別の分子上のＦ原子、Ｏ原子、またはＮ原子）、隣接する電気的陰性の分子またはイオンによる誘引力を受け得る。水素結合は、水の固有の特性を担い、そして生物学的分子の組織化（特に、タンパク質およびＤＮＡの構造に影響すること）において非常に重要である。
【００３３】
静電相互作用は、電荷が互いにより接近するにつれてより強力になる、反対の電荷間の引力、または同じような電荷間の反発力である。静電相互作用は、イオン性溶液中の荷電された物質（ｃｈａｒｇｅｄ  ｂｏｄｙ）の間の相互作用を理解することにおいて、重要な成分を構成する。例えば、溶媒中に分散したコロイド粒子の安定性は、反発性の静電相互作用と誘引性のファンデルワールス相互作用との間の競合を考慮することによって説明され得る。静電相互作用はまた、粒子間の相互作用および付着を考慮する場合に重要な相互作用である。
【００３４】
（塩）
本発明のいくつかの実施形態において、上記活性薬剤の特性は、塩（例えば、塩化ナトリウムであるが、これらに限定されない）を使用して変えられる。活性薬剤（例えば、ＰＴＨおよびＧＬＰ−１）は、塩の存在下において顕著な構造的変化を受ける。実施例５において示される（図４Ｄ）ように、塩の存在は、ＰＴＨの二次構造を、そのペプチドのよりヘリックスのコンホメーションを促すことによって増大させる。塩はまた、米国仮特許出願第６０／７４４，８８２号（２００６年４月１４日に出願され、そしてその全体が本明細書中に参考として援用される）において開示されるように、ＧＬＰ−１の構造に影響を及ぼすことが示されている。さらに、塩および他のイオン性化合物は、特に、溶液のｐＨと、タンパク質またはペプチドのｐＩとの間の差がより大きくなる場合、特異的に荷電された残基に結合することによってそのタンパク質およびペプチドを安定化し得るかまたは不安定化し得るかのいずれかである（Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｅｚ  Ｊら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：４１５−４３６、１９９４）。
【００３５】
（カオトロープ）
当該分野において周知であるようなカオトロープは、水との弱い相互作用を示し、したがって、分子（例えば、タンパク質またはペプチド）を不安定化するイオンである。これらの化合物は、水の水素結合されたネットワークを破壊し、そして水の表面張力を低下させ、したがってタンパク質およびペプチドのより大きい構造的自由度および変性を促す。カオトロープの例としては、ＮａＳＣＮ、（ＣＨ３）３Ｎ−ＨＣｌ、Ｎａ２ＮＯ３、およびＮａＣｌＯ４および塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
一方で、コスモトロープまたはリオトロープ（ｌｙｏｔｒｏｐｅ）は、水との強力な相互作用を示し、そして一般に、高分子（例えば、タンパク質およびペプチド）を安定化するイオンである。この安定化効果は、水の秩序を増大させ、そして水の表面張力を上昇させることによってもたらされる。コスモトロープの例としては、クエン酸ナトリウム（クエン酸Ｎａ）、および硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
（アルコール）
本発明において使用される活性薬剤の改変因子の別のクラスは、アルコールである。アルコールは、タンパク質およびペプチドのネイティブな構造を破壊し得、そしてまた、高分子中（最も注目すべきは、構造化されていないタンパク質およびポリペプチド内）においてα−ヘリックスコンホメーションを安定化および誘導し得る。このようなアルコールとしては、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、およびヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。それらのうちで、ＴＦＥおよびＨＦＩＰは、ペプチドおよびタンパク質におけるヘリックスへの転移を誘導するための最も強力なアルコールのうちの２つである（Ｈｉｒｏｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、６：４１６−４２１；１９９７（これがペプチドおよびタンパク質におけるヘリックスへの転移に関して含む全てのものについて、本明細書中に参考として援用される））。これらのアルコールは、溶媒の水素結合特性を破壊するそれらの能力によって、タンパク質およびペプチドの構造に影響を及ぼし得る（ＥｇｇｅｒｓおよびＶａｌｅｎｔｉｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１０：２５０−２６１；２００１（これがタンパク質の構造に対するアルコールの効果に関して含む全てのものについて、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００３８】
（オスモライト）
上記微粒子に対する活性薬剤の親和性に影響を及ぼす改変因子の別のクラスは、オスモライトである。当業者に周知であるようなオスモライトは、細胞の高分子を安定化するために、高ストレスの状況（例えば、極端な温度の変動、高濃度の塩環境など）においてほとんどの生物体の細胞によって生成される小分子化合物である。オスモライトは、高分子と直接相互作用しないが、細胞環境において溶媒の特性を変化させることによって作用し、すなわち、それらの存在は、タンパク質の安定性を間接的に改変する。これらの化合物としては、種々のポリオール、糖、多糖類、有機溶媒、および種々のアミノ酸ならびにそれらの誘導体が挙げられる。オスモライトの機構は、依然として明らかにされるべきであるが、これらの化合物は、ネイティブな状態と比較して変性した状態の化学ポテンシャルを上昇させ、それによりネイティブな集団と変性した集団との間において（正の）ギブスエネルギーの差（ΔＧ）を増大させることによって作用するようであることが、推測される（ＡｒａｋａｗａおよびＴｉｍａｓｈｅｆｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１９１４−１９２３；１９９０）。
【００３９】
本発明において企図されるようなオスモライトとしては、へキシレン−グリコール（Ｈｅｘ−Ｇｌｙ）、トレハロース、グリシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリメチルアミン  Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）、マンニトール、およびプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
（方法の一般的な説明）
本発明の方法において、以下の少なくとも３種類の成分が、液体媒体において合わせられる：上に記載されるような、少なくとも１種の活性薬剤、（予め形成された）微粒子、および少なくとも１種の活性薬剤改変因子。この系の成分は、任意の順序で合わせられ得る。いくつかの実施形態において、上記改変因子および活性薬剤は、混合物が微粒子の懸濁物と合わせられる前に、互いと合わせられる。他の実施形態において、上記薬剤および微粒子が、最初に合わせられ、次いで上記改変因子が、添加される。いくつかの実施形態において、上記活性薬剤または改変因子は、溶液として、提供されかつ別の成分と合わせられる。他の実施形態において、任意の上記成分は、固体形態で提供され得、そして別の成分を含む液体媒体に溶解され得るか、または微粒子の場合においては、懸濁され得る。さらなるバリエーションは、当業者にとって明らかである。
【００４１】
上記微粒子は、上記系の他の成分と合わせられる前に形成され、そしてその形成された微粒子自体は、懸濁物として存在する。それにもかかわらず、上記微粒子が懸濁される液体媒体は、ときとして、本明細書中で溶媒と称される。本方法において利用される液体媒体は、ほとんどの場合、水性である。しかし、いくつかの場合において、上記液体媒体は、それが水を含むよりも多くの有機化合物（例えば、改変因子として使用されるアルコール）を含み得る。
【００４２】
上記系の全ての成分の集合の際に、上記活性薬剤は、上記微粒子の表面に吸着する。本発明のますます好ましい実施形態において、上記系における活性薬剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または実質的に全てが、上記微粒子に、最大で１００％吸着する。本発明のいくつかの実施形態において、上記微粒子の到達可能な表面領域は、吸着された活性薬剤の全てがその微粒子表面と直接接触するのに十分である（すなわち、コーティングは、単一層である）。しかし、さらなる相互作用が存在し得ることは、理解されるべきである。いくつかの場合において、例えば、上記活性薬剤の自己会合もまた、エネルギー的に好ましくあり得、その結果、活性薬剤の多重層が、粒子をコーティングする。任意のこれらの層が完全であること、またはコーティングの厚さが均一であることは、必要とされない。以下の自己会合の２つの形態が、認識され得る：多量体化および凝集。多量体化は、特定の分子間相互作用および固定された化学量論によって特徴付けられる。凝集は、不特定の分子間相互作用および規定されていない化学量論によって特徴付けられる。多量体の活性薬剤は、多量体の状態で吸着され得るか、または単量体もしくはより低次の多量体へと解離され得、かつその状態で表面に吸着され得ることが、理解されるべきである。いずれかの場合において、凝集は、上記活性薬剤の上記微粒子上への層形成を媒介し得る。
【００４３】
負荷された微粒子は、種々の形態で利用され得る薬物送達組成物を構築する。その粒子は、固体投薬形態（例えば、錠剤）において粉末として使用されても、カプセル中に含まれても、液体キャリアに懸濁されてもよい。一般に、これは、上記負荷が行われた液体媒体の交換および／または除去を必要とする。これは、物理的手段（例えば、沈降または濾過であるが、これらに限定されない）、および蒸発による方法（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥であるが、これらに限定されない）を含む任意の種々の手段によって達成され得る。これらの技術は、当業者にとって公知である。本発明の１つの実施形態において、溶媒は、噴霧乾燥によって除去される。ジケトピペラジン微粒子を噴霧乾燥する方法は、例えば、米国仮特許出願第６０／７７６，６０５号（２００６年２月２２日出願）（これがジケトピペラジン微粒子の噴霧乾燥に関して含む全てのものについて、本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【００４４】
負荷が実質的に完全ではない場合、溶媒除去の物理的方法を使用する本発明の実施形態は、代表的に、吸着されていない活性薬剤を失うが、例えば、コーティングが単一層を超えて進行しないことを確保するのに有用であり得る。対照的に、溶媒除去のために蒸発による乾燥を使用する実施形態は、いくつかの場合において、上記粒子上にさらなる活性薬剤を析出させ得、それによって活性薬剤の損失を回避し得るが、含まれる吸着性の相互作用は、本方法のより初期の工程において結合された分子によって確立される相互作用と異なり得る。他の実施形態において、蒸発による溶媒除去は、活性薬剤の著しいさらなる析出をもたらさない（実質的に全ての活性薬剤が粒子上に既に吸着された場合を含む）。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するように本発明者によって見出された技術を再び示し、したがってその実施の好ましい様式を構成するために考慮され得ることは、当業者によって認識されるべきである。考察は、特定の機構に集中し得るが、いくつかの改変因子は上記薬剤に対してか、または実際には上記粒子表面に対しても複数の効果を有し得、これらの各々はその薬剤の粒子上への吸着を促進することに寄与し得ることが、理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、多くの変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において行われ得、そして依然として同様かまたは類似する結果を得ることを認識する。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
（実験手順：活性薬剤／ＦＤＫＰ微粒子の吸着研究）
上記活性薬剤であるインスリン、ＰＴＨ、グレリンおよびＧＬＰ−１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）またはＡｎａＳｐｅｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から販売されたか、あるいは自前（ＭａｎｎＫｉｎｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で調製されたかのいずれかであった。種々のｐＨかつ２０℃（特に記載しない限り）の水性サンプルを、分析した。サンプルを、一般に、新鮮に調製し、そしてＦＤＫＰ微粒子の添加前に特定の添加剤（例えば、塩、ｐＨ緩衝液など（存在する場合））と混合した。
【００４７】
懸濁物中の活性薬剤とジケトピペラジン（ＤＫＰ）粒子との会合を、吸着研究を行うことによって評価した。その吸着研究において調査したパラメータは、活性薬剤／フマリルジケトピペラジン（ＦＤＫＰ）微粒子の相互作用に対する、静電相互作用、水素結合、水の構造、タンパク質の可撓性、および特定の塩の対形成相互作用の効果を探索した。さらに、数種の一般的なタンパク質安定剤を、ＦＤＫＰ微粒子表面への活性薬剤の吸着の妨害について試験した。
【００４８】
活性薬剤の予め形成されたＦＤＫＰ粒子の表面上への吸着を促進する種々の条件を、研究した。１５ｍｇ／ｍＬのＦＤＫＰ微粒子懸濁物を、３×ｐＨ緩衝液および添加剤または賦形剤の３×溶液と合わせた。最終的な溶液は、５ｍｇ／ｍＬのＦＤＫＰ微粒子濃度と、０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＧＬＰ−１濃度、０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＰＴＨ濃度、０．７５ｍｇ／ｍＬ（１５％  ｗ／ｗ）のインスリン濃度、または０．１０ｍｇ／ｍＬ（２％  ｗ／ｗ）のグレリン濃度とを含んだ。上清中の結合されていない活性薬剤を、その懸濁物から濾過した。会合した活性薬剤を有するＦＤＫＰ粒子を、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムに溶解（再構成）し、そして濾過して、あらゆる凝集した活性薬剤分子を分離した。上清分画および再構成した分画の両方における活性薬剤の量を、ＨＰＬＣによって定量した。一連の実験を、行い、ここで、使用した条件は、添加剤（例えば、塩、オスモライト、カオトロープおよびコスモトロープ、ならびにアルコール）の使用を含んだ。これらから得られた結果を以下に記載する。
【００４９】
（実施例２）
（活性薬剤のＦＤＫＰ粒子上への吸着に対するカオトロープおよびコスモトロープの効果）
水およびタンパク質の構造に影響を及ぼすイオン性化学種（カオトロープおよびコスモトロープ）を、（低いｐＨにおける）疎水的機構による活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子表面上への吸着を調査するために研究した。上記活性薬剤のＦＤＫＰ粒子上への負荷を、５ｍｇ／ｍＬの微粒子、および０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＧＬＰ−１濃度、０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＰＴＨ濃度、または０．７５ｍｇ／ｍＬ（１５％  ｗ／ｗ）のインスリン濃度において行った。サンプル中のカオトロープまたはコスモトロープの濃度を、１００ｍＭにて一定に保ち、そしてｐＨを、２．０〜５．０で変化させた。カオトロープまたはコスモトロープを、以下から選択した：ＮａＳＣＮ、ＣｓＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、（ＣＨ３）３Ｎ−ＨＣｌ、Ｎａ２ＮＯ３、クエン酸Ｎａ、およびＮａＣｌＯ４。コントロールは、カオトロープまたはコスモトロープを添加しなかったことを示す。
【００５０】
図１Ａ〜１Ｃは、それぞれ、ＦＤＫＰ微粒子表面上へのインスリン、ＧＬＰ−１およびＰＴＨについての負荷曲線（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を、種々のカオトロープまたはコスモトロープの存在下でのｐＨの関数として示す。低いｐＨ（３．０）において、分析した全てのカオトロープおよびコスモトロープは、上記微粒子表面に対するインスリンの親和性を改善し、そしてコントロールと比較して顕著な負荷を示した。ｐＨ４において、この効果は、観察されなかった（図１Ａ）。より高いｐＨ（５．０）において、上記カオトロープおよびコスモトロープは、コントロールと比較して、そのインスリンタンパク質を析出させることによってインスリンの微粒子表面への吸着を妨害した。したがって、これらの因子は、より低いｐＨにおいてインスリンの上記ＦＤＫＰ粒子への結合を促進したが、より高いｐＨ条件においてほとんど効果を有さないか、または不利でさえある効果を有する。
【００５１】
ＧＬＰ−１は、カオトロープおよびコスモトロープの存在下で、ｐＨ２．０〜４．０において上記ＦＤＫＰ微粒子に対する改善された親和性を示し、より低いｐＨにてより大きい効果を示した（図１Ｂ）。同様の観察が、米国仮特許出願第６０／７４４，８８２号に開示された。そこで、約０．０２〜０．０４ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１ペプチド（０．００４〜０．００８の質量比に対応する）は、ＮａＳＣＮ、ＮａＣｌＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＮＯ３およびクエン酸Ｎａの存在下で、再構成した微粒子を含まないコントロールサンプルにおいて検出されたことが、指摘され、そのことは、その粒子への吸着よりもむしろ少ない割合のＧＬＰ−１が析出したことを示す。
【００５２】
上記ＦＤＫＰ微粒子表面に対するＰＴＨの親和性は、強力なカオトロープであるＮａＳＣＮおよびＮａＣｌＯ４の存在下で４．０〜約４．５のｐＨにてより大きかった（図１Ｃ）。
【００５３】
そのデータは、カオトロープ剤およびコスモトロープ剤が低いｐＨで最も顕著に上記活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子表面への吸着の促進において役割を果たすことを支持する。これらの改変因子は、上記微粒子表面がより小さいイオン性である場合、低いｐＨにてより大きい効果を有するので、吸着は疎水的機構によって生じるようである。より高いｐＨにて観察された吸着の減少は、上記粒子のより高度に荷電された表面と、上記活性薬剤の疎水性の増大に対して有するカオトロープ剤およびコスモトロープ剤の効果と組み合せによって生じ得る。さらに、イオン性化学種として、これらの因子は、上記微粒子への結合について上記活性薬剤と競合し得るか、または上記活性薬剤と上記微粒子との間の静電相互作用を破壊し得る。最終的に、Ｄｅｂｙｅ遮蔽が上記より高度に荷電された表面への吸着の減少に寄与し得ることもまた、示される。
【００５４】
（実施例３）
（活性薬剤のＦＤＫＰ粒子への吸着に対するオスモライトの効果）
吸着に対する活性薬剤の安定性の重要性を評価するために、活性薬剤のＦＤＫＰ粒子への結合に対するオスモライトの効果を、ＨＰＬＣ分析によって調べた。図２Ａ〜２Ｃは、ＦＤＫＰ粒子上へのインスリン（図２Ａ）、ＧＬＰ−１（図２Ｂ）およびグレリン（図２Ｃ）についての負荷曲線を、一般的な安定剤（オスモライト）の存在下でのｐＨの関数として示す。上記活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子上への負荷を、５ｍｇ／ｍＬの微粒子、および０．７５ｍｇ／ｍＬ（１５％  ｗ／ｗ）のインスリン濃度、または０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＧＬＰ−１濃度または０．１０ｍｇ／ｍＬ（２％  ｗ／ｗ）のグレリン濃度において行った。サンプル中のオスモライト（安定剤）の濃度を、１００ｍＭにて一定に保ち、そしてｐＨを、約２．０〜約５．０で変化させた。オスモライトを、へキシレン−グリコール（Ｈｅｘ−Ｇｌｙ）、トレハロース、グリシン、ＰＥＧ、ＴＭＡＯ、マンニトールおよびプロリンから選択した；コントロールは、オスモライトがないことを示す。
【００５５】
研究した活性薬剤のうち、インスリンは、オスモライト（ＰＥＧ、グリシン、トレハロース、マンニトールおよびＨｅｘ−Ｇｌｙ）の存在下で３．０〜５．０のｐＨ範囲にわたって、上記ＦＤＫＰ粒子表面に対する顕著に改善された親和性を示した（図２Ａ）。研究したオスモライトのうち、ＰＥＧおよびプロリンは、２．０〜４．０のｐＨ範囲にわたって、ＧＬＰ−１のＦＤＫＰ粒子表面上への吸着についての親和性を改善した。オスモライトであるＴＭＡＯは、低いｐＨ（２．０）にて、ＧＬＰ−１の上記ＦＤＫＰ微粒子表面への結合においてＰＥＧまたはプロリンよりも有効であったが、ｐＨ３．０以上において、やや不利であった（図２Ｂ）。しかし、グレリンは、約４．０〜５．０のｐＨ範囲にわたってコントロールと比較した場合、１００ｍＭマンニトール、ＰＥＧ、グリシン、Ｈｅｘ−Ｇｌｙ、およびトレハロースの存在下で、上記微粒子表面に対して、より大きい親和性を示した（図２Ｃ）。
【００５６】
これらの負荷曲線は、オスモライトが上記活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子表面への吸着を増強し得ること示唆した。この効果は、よりエネルギー的に好ましい吸着を可能にした上記活性薬剤を安定化する改変因子の能力によって生じたようである。
【００５７】
（実施例４）
（ＦＤＫＰ粒子に対する活性薬剤の親和性に対するアルコールの効果）
疎水的機構によって上記微粒子表面への吸着を可能にする、上記活性薬剤に対する改変因子の効果の評価において、アルコールの効果を、調べた。水素結合の強度を増大させることによって構造化されていないペプチドおよびタンパク質においてヘリックスコンホメーションを誘導することが公知であるアルコールを、活性薬剤のＦＤＫＰ粒子表面への吸着においてヘリックスコンホメーションが果たす役割を決定するために評価した。活性薬剤（例えば、ＧＬＰ−１およびグレリン）を、分析した。上記活性薬剤のＦＤＫＰ粒子上への負荷を、５ｍｇ／ｍＬの微粒子、および０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＧＬＰ−１濃度、または０．１０ｍｇ／ｍＬ（２％  ｗ／ｗ）のグレリン濃度において行った。各アルコールの効果を、２．０〜５．０のｐＨ範囲にわたって観察した。使用したアルコールは、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）およびヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）であった。各アルコールを、５％  ｖ／ｖ、１０％  ｖ／ｖ、１５％  ｖ／ｖ、または２０％  ｖ／ｖを含む種々の濃度にて評価した。
【００５８】
図３Ａ〜３Ｄは、ＦＤＫＰ微粒子上への活性薬剤についての負荷曲線を、各アルコールおよび各活性薬剤に関してｐＨの関数として示す。ｐＨ２．０〜４．０において、グレリンは、ＦＤＫＰ粒子に対するグレリンの質量比によって示されるように、ＨＦＩＰおよびＴＦＥの存在下で試験した全ての濃度（５％、１０％、１５％および２０％）において、上記微粒子表面に対する大きく改善された親和性を示した（図３Ａ〜３Ｂ）。
【００５９】
ｐＨ２．０〜５．０において、ＧＬＰ−１は、ＨＦＩＰおよびＴＦＥの存在下で示される濃度（５％および１０％）において、上記微粒子表面に対する改善された親和性を示した（図３Ｃ〜３Ｄ）。ＴＦＥの効果は、あまり顕著ではなく、そしてより低い試験したｐＨにおいて、不利であった。相当量のＧＬＰ−１ペプチド（０．０２６〜０．０３８の質量比に対応する０．１３〜０．１９ｍｇ／ｍＬ）が、１０％のＨＦＩＰおよび１０％のＴＦＥの存在下でｐＨ４．０にて、再構成した微粒子を含まないコントロールサンプルにおいて検出されたことが、示され、このことは、ある程度のＧＬＰ−１が析出したことを示す。しかし、より低いｐＨ（２．０〜３．０）において、再構成した微粒子を含まないコントロールにおいて１０％のＨＦＩＰおよび１０％のＴＦＥの存在下で検出されたＧＬＰ−１ペプチドの量は、著しく減少した。ｐＨ３．０において、０〜０．０２ｍｇ／ｍＬ（０〜０．００４の質量比に対応する）のＧＬＰ−１ペプチドが検出されたのに対して、ＧＬＰ−１は、ｐＨ２．０にてコントロールサンプルに関して検出されなかった。図３Ｃ〜Ｄにおける質量比は、吸着された活性薬剤および析出した活性薬剤の両方を反映するが、析出は、ｐＨが３．０に減少するにつれて、次第に少なくなる成分である。
【００６０】
そのデータは、アルコールが上記活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子上への吸着を改善し得ることを示した。吸着におけるこの増大は、アルコールの存在下における上記活性薬剤と上記微粒子の表面との間の増強された疎水的相互作用によって生じるようである。
【００６１】
（実施例５）
（活性薬剤のＦＤＫＰ粒子への吸着に対する塩の効果）
上記結合の疎水的機構にさらに取り組むために、活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子への吸着に対する塩の効果を、ＨＰＬＣ分析によって観察した。
【００６２】
上記活性薬剤のＦＤＫＰ微粒子上への負荷を、０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、および５００ｍＭのＮａＣｌの存在下で、５ｍｇ／ｍＬの微粒子、および０．７５ｍｇ／ｍＬ（１５％  ｗ／ｗ）のインスリン濃度、０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＧＬＰ−１濃度または０．２５ｍｇ／ｍＬ（５％  ｗ／ｗ）のＰＴＨ濃度において行った（図４Ａ〜４Ｃ）。ＰＴＨのＦＤＫＰ粒子上への負荷をまた、１０００ｍＭのＮａＣｌにおいて評価した。再構成した微粒子を含まないコントロールサンプルにおいてｐＨおよびＮａＣｌ濃度の関数として検出された活性薬剤の量を、評価した。そのｐＨを、２０ｍＭリン酸カリウム／２０ｍＭ酢酸カリウムの混合物によって制御した。
【００６３】
図４Ａにおいて観察される通り、インスリンのＦＤＫＰ粒子上への増大した結合（吸着）が、１００〜５００ｍＭの高い塩濃度で約２．５〜約３．５のｐＨにおいて明白であった。約４．０〜約５．０のｐＨにおいて、試験した全ての塩濃度に関して、インスリンの上記ＦＤＫＰ粒子への吸着の減少が、観察された。
【００６４】
約２．０〜約３．５のｐＨにおいて、ＧＬＰ−１のＦＤＫＰ粒子への増強された結合（吸着）は、試験した全ての塩濃度において明白であった（図４Ｂ）。ｐＨ４．０以上において、結合の減少がまた、示された。
【００６５】
ＰＴＨを上記活性薬剤として使用した同様の研究は、２５０〜１０００ｍＭの高い塩濃度で約２．０〜約３．５のｐＨにおける、ＰＴＨの上記ＦＤＫＰ粒子への増強された結合を示した（図４Ｃ）。約３．５〜約５．０のｐＨにおいて、ＰＴＨの上記微粒子への結合は、塩の存在下において減少した。
【００６６】
低いｐＨにおいて、吸着が良好ではない場合、塩の添加は、上記活性薬剤の化学ポテンシャルを、上記微粒子表面に対するその親和性を増大させるように改変し得た。結合のこのような増強は、疎水的機構によって生じたようである。さらに、そのデータは、ｐＨを上昇させた場合に、吸着が塩濃度の上昇によって減少したことを示した。上記微粒子表面は、ｐＨを上昇させることによって、より荷電されるので、仮定された疎水的機構は、上記活性薬剤の吸着の促進においてあまり有用ではないと予想され得る。この減少はまた、上記微粒子の表面上の結合部位について競合する塩によって生じている可能性があった。Ｄｅｂｙｅ遮蔽もまた観察された吸着の減少に寄与し得ることが、示される。
【００６７】
そのデータはまた、塩が活性薬剤の構造を変化させ得ることを示した。例えば、ＰＴＨを用いた円偏光二色性測定は、塩濃度が上昇するにつれてそのペプチドの二次構造がよりヘリックスのコンホメーションをとったことを示した（図４Ｄ）。これは、ＰＴＨの構造の変化が上記微粒子表面へのＰＴＨの結合を低いｐＨにおいて促進し得ることを示唆する。
【００６８】
水溶液において、塩の存在はまた、上記微粒子の表面上にテキサスレッドを分配することが示された。
【００６９】
（実施例６）
（ＦＤＫＰ粒子へのシクロスポリンＡの吸着に対する効果）
疎水性小分子のＦＤＫＰ粒子上への吸着に対する効果を、シクロスポリンＡを上記活性薬剤を使用してインビトロおよびインビボの両方で調査した。吸着を、上記活性薬剤の溶解性を変化させることによって促進した。
【００７０】
シクロスポリンＡ（親油性環状ポリペプチド）を、どのように疎水性分子が微粒子へ吸着させられ得るかを示すために研究した。さらに、一定の大きさのシクロスポリンＡ（１２０２．６１  ＭＷ）を、より小さい化合物についての微粒子の負荷能力を示すために利用した。
【００７１】
負荷を達成するために、溶媒／貧溶媒法を、使用した。この方法論の基本原理は、化合物を溶媒（メタノール）に溶解し、次いでその化合物を溶液から微粒子の表面上へと移動させるために貧溶媒（水）を使用する。この溶媒／貧溶媒アプローチを使用して、シクロスポリンＡを、微粒子の表面上に首尾よく負荷した。
【００７２】
溶解性プロフィールを決定するための予備実験において、シクロスポリンＡを、１０ｍｇ／ｍＬまでメタノールに溶解し、そして種々の濃度の貧溶媒（１０％の増分における１０〜９０％のＨ２Ｏ）を用いた１ｍｇ／ｍＬでのシクロスポリンＡの溶解性を、ＨＰＬＣによって分析した。シクロスポリンＡのピーク面積を、析出についての％損失を決定するためにメタノールのみを含むサンプルと比較した。溶解性は６０％未満のＨ２Ｏにおいて大部分保持されたことが、観察された。７０％のＨ２Ｏにおいて、その薬剤の大半は、不溶性であり、そして８０〜９０％のＨ２Ｏにおいて、５％未満の溶解性が、保たれた。
【００７３】
粒子の負荷を評価するために、ＦＤＫＰ微粒子を、シクロスポリンＡのメタノール溶液に懸濁した。次いで、水を、段階的に６０％、８０％、および９０％の最終濃度まで添加した。そのサンプルの半分を、ペレットにし、そして他の半分を、凍結乾燥した。次いで、それぞれの半部を、最終的な％が２０％のＦＤＫＰ微粒子／シクロスポリンＡ、２０％の０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム（ＡｍＢｉｃａｒｂ）、および６０％のメタノール（微粒子およびシクロスポリンＡの両方の溶解に必要な濃度）であるように再溶解した。各々のシクロスポリンＡ含量を、ＨＰＬＣによって分析し、そして上記粒子に吸着した割合を決定するために比較した。その結果を、図５Ａに提示する。６０％のＨ２Ｏにおいて、約２０％のシクロスポリンＡが上記粒子に結合したことが、観察された。８０％および９０％のＨ２Ｏにおいて、上記負荷は、それぞれ、約９０％および約９５％であり、このことは、シクロスポリンＡのＦＤＫＰ微粒子への強力な結合を示す。
【００７４】
シクロスポリンＡについての上記微粒子の負荷能力を、９０％の貧溶媒レベルにて、回収した固体の最終含量がシクロスポリンＡの全てが吸着したと仮定して２％〜２０％であるように、シクロスポリンＡの投入量を変えることによって分析した。上記投入量がこの範囲にわたって増大した場合、上記微粒子に結合された利用可能なシクロスポリンＡの％は投入量の５０％から９５％に増大したことが、観察された（図５Ｂ）。シクロスポリンＡの溶解性が９０％のＨ２Ｏにおいて０．０５ｍｇ／ｍＬであることを考慮して、これらの結果が、実質的に全ての不溶性シクロスポリンＡは析出するよりもむしろ粒子に吸着されるようになったこと示したことに、留意すべきである。
【００７５】
（実施例７）
（シクロスポリンＡ／ＤＫＰ粒子の肺ガス注入）
シクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子の薬物動態を調べるために、シクロスポリンＡの血漿濃度を、シクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子の種々の処方物を肺ガス注入または静脈内注射によって投与した雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて評価した。これらの研究を、９０％の貧溶媒にて作製したシクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子、および上記の実施例において記載したような０．０５、０．１０または０．２０の理論上の最大質量比を使用して構築した。これらを、５％負荷量、１０％負荷量および２０％負荷量と称する。
【００７６】
単回用量の２．５ｍｇのシクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子を、ラットの８個の群に肺ガス注入または静脈内注射によって送達した。血液サンプルを、投薬日に、投与前（時間０）ならびに投与の５分後、２０分後、４０分後、６０分後、２４０分後、４８０分後および２４時間後にて、各群について採取した。各時点において、約１００μＬの全血を、側部尾静脈からクリオバイアル中に回収し、反転して氷上に保存した。血液サンプルを、４０００ｒｐｍで遠心分離し、そして約４０μＬの血漿を、９６ウェルプレート中にピペットで移し、その９６ウェルプレートを、分析するまで−８０℃に保存した。
【００７７】
図６において示される通り、肺ガス注入による２．５ｍｇのＦＤＫＰ微粒子／シクロスポリンＡの投与は、雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて投与の２４時間後に最大の血清シクロスポリンレベルをもたらした。１０％の負荷は、その時点において３２．４ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを達成した。２．５ｍｇのＦＤＫＰ微粒子／シクロスポリンＡを０．１ｍＬで静脈内注射によって投与された動物は、シクロスポリンの最小レベルを投与の２４時間後までに示した。ＦＤＫＰ微粒子レベルは、投与の２０分後にてピークに達し、そして静脈内および肺ガス注入の両方の群について４時間でベースラインのレベルに戻ったことが、観察された。
【００７８】
概して、そのデータは、シクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子のバイオアベイラビリティーを示す。２４０分における単一ピークは異常であることが、示される。処置した全ての動物について、病理は、肉眼および顕微鏡での観察によって決定したところ、正常であった。
【００７９】
特に示されない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、特性（例えば、分子量）、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、添付の明細書および特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明によって得られることが追求される所望の特性に依存して変動し得る近似である。少なくとも、そして特許請求の範囲の範囲に対する均等論（ｄｏｃｔｒｉｎｅ  ｏｆ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に鑑みて、そして通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。広範にわたる本発明を示す数値範囲および数値パラメータが近似であるにもかかわらず、特定の例において示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、あらゆる数値は、本質的に、それらの各試験の測定値において見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。
【００８０】
用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに記載する本発明の文脈（特に、添付の特許請求の範囲の文脈）において使用される同様の指示対象は、本明細書中で特に示されないか、または文脈によって明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の記述は、単に、その範囲内に納まるそれぞれ別個の値を個別に参照する略記法として機能することが意図される。本明細書中で特に示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個別に引用されるかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で特に示されないか、そうでなければ文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中に提供される任意かつ全ての例、または例示的な言語（例えば、「などの（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に、本発明を十分に明らかにすることが意図され、そして別に特許請求された本発明の範囲を限定しない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須である任意の特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００８１】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、明確に示されない限り、代替物のみか、または代替物が相互排他的であることに言及する「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」に言及する定義を支持する。
【００８２】
代替的な要素または本明細書中に開示される本発明の実施形態の分類は、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個別かまたは本明細書中に見出される群の他のメンバーもしくは他の要素との任意の組み合わせにおいて、言及および特許請求され得る。群の１つ以上のメンバーは、利便性および／もしくは特許性のために群に含まれ得るか、または群から削除され得ることが、予期される。任意のこのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、ここで、改変され、そうして添付の特許請求の範囲において使用される全てのＭａｒｋｕｓｈ群の文書による説明を満たすような群を含むと見なされる。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中に記載され、それは、本発明を実施するために本発明者らとって公知である最良の形態を含む。当然に、それらの好ましい実施形態に対するバリエーションは、上述の説明を読む際に当業者にとって明らかとなる。本発明者は、当業者に、適切な場合にこのようなバリエーションを使用することを期待し、そして本発明者は、本発明について、本明細書中に具体的に記載されるものとは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適切な原理によって許容されるような、ここに添付された特許請求の範囲において列挙される対象事項の全ての改変および等価物を含む。さらに、上記の要素のあらゆる組み合わせが、本明細書中で特に示されないか、またはそうでなければ文脈によって明確に否定されない限り、その全ての可能なバリエーションにおいて本発明によって包含される。
【００８４】
さらに、多くの参照は、本明細書全体を通して特許および出版刊行物に対してなされている。上記の引用された参考文献および出版刊行物の各々は、その全体が本明細書中に参考として個別に援用される。
【００８５】
さらに、本明細書中で開示される本発明の実施形態は本発明の原理の例示であることが、理解されるべきである。使用され得る他の改変は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではないが例として、本発明の代替的な構成は、本明細書中の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は、明確に示されかつ記載されるものに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、本発明の教示に従って、フマリルジケトピペラジン（ＦＤＫＰ）微粒子上の活性薬剤に対するカオトロープおよびコスモトロープの効果を負荷曲線により、ｐＨと１００ｍＭのカオトロープ／コスモトロープ剤との関数として示す。図１Ａは、カオトロープおよびコスモトロープの存在下でｐＨ３．０〜５．０における、０．７５ｍｇ／ｍＬインスリンの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、本発明の教示に従って、フマリルジケトピペラジン（ＦＤＫＰ）微粒子上の活性薬剤に対するカオトロープおよびコスモトロープの効果を負荷曲線により、ｐＨと１００ｍＭのカオトロープ／コスモトロープ剤との関数として示す。図１Ｂは、カオトロープおよびコスモトロープの存在下でｐＨ２．０〜４．０における、０．２５ｍｇ／ｍＬグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、本発明の教示に従って、フマリルジケトピペラジン（ＦＤＫＰ）微粒子上の活性薬剤に対するカオトロープおよびコスモトロープの効果を負荷曲線により、ｐＨと１００ｍＭのカオトロープ／コスモトロープ剤との関数として示す。図１Ｃは、強力なカオトロープ（ＮａＳＣＮおよびＮａＣｌＯ４）の存在下でｐＨ４．０〜５．０の間における、０．２５ｍｇ／ｍＬ副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対するオスモライトの効果を負荷曲線により、ｐＨとオスモライト（１００ｍＭ）との関数として示す。図２Ａは、オスモライトの存在下でｐＨ３．０〜５．０における、０．７５ｍｇ／ｍＬインスリンの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対するオスモライトの効果を負荷曲線により、ｐＨとオスモライト（１００ｍＭ）との関数として示す。図２Ｂは、オスモライトの存在下でｐＨ２．０〜４．０における、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＧＬＰ−１の５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対するオスモライトの効果を負荷曲線により、ｐＨとオスモライト（１００ｍＭ）との関数として示す。図２Ｃは、オスモライトの存在下でｐＨ４．０〜５．０の間における、０．１０ｍｇ／ｍＬグレリンペプチドの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対するアルコールの効果を負荷曲線により、ｐＨとアルコールとの関数として示す。図３Ａは、５％  ｖ／ｖ、１０％  ｖ／ｖ、１５％  ｖ／ｖ、および２０％  ｖ／ｖのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の存在下でｐＨ２．０〜４．０の間における、０．１０ｍｇ／ｍＬグレリンペプチドの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。図３Ｂは、５％  ｖ／ｖ、１０％  ｖ／ｖ、１５％  ｖ／ｖ、および２０％  ｖ／ｖのトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の存在下でｐＨ２．０〜４．０の間における、０．１０ｍｇ／ｍＬグレリンペプチドの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。図３Ｃおよび３Ｄは、それぞれ、ＨＦＩＰおよびＴＦＥの存在下でｐＨ２．０〜５．０における、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＧＬＰ−１の５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対する塩の効果を負荷曲線により、ｐＨおよびＮａＣｌの関数として示す。図４Ａは、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でｐＨ２．０〜５．０における、０．７５ｍｇ／ｍＬインスリンの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対する塩の効果を負荷曲線により、ｐＨおよびＮａＣｌの関数として示す。図４Ｂは、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でｐＨ２．０〜５．０における、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＧＬＰ−１の５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対する塩の効果を負荷曲線により、ｐＨおよびＮａＣｌの関数として示す。図４Ｃは、０〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でｐＨ２．０〜５．０の間における、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＰＴＨペプチドの５ｍｇ／ｍＬ  ＦＤＫＰ微粒子上への負荷を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、本発明の教示に従って、ＦＤＫＰ微粒子上の活性薬剤に対する塩の効果を負荷曲線により、ｐＨおよびＮａＣｌの関数として示す。図４Ｄは、種々の塩濃度（２０℃）におけるＰＴＨの二次構造分析を示す。ｐＨ５．８における４．３ｍｇ／ｍＬ  ＰＴＨのｆａｒ−ＵＶ  ＣＤは、ＮａＣｌの濃度が増大するにつれて、ペプチドの二次構造がよりヘリックスのコンホメーションをとることを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、本発明の教示に従って、疎水性分子の微粒子上への吸着を示す。図５Ａは、６０％、８０％および９０％の濃度の漸増する貧溶媒（水）に関して、シクロスポリンＡのＦＤＫＰ微粒子への結合を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、本発明の教示に従って、疎水性分子の微粒子上への吸着を示す。図５Ｂは、９０％貧溶媒の存在下でシクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子の種々の質量比において、シクロスポリンＡについて達成される理論上の最大負荷の％を示す。
【図６】図６は、本発明の教示に従って、９０％貧溶媒にてシクロスポリンＡ／ＦＤＫＰ微粒子の種々の質量比を使用したマウスにおける単回の静脈内注射（ＩＶ）および肺ガス注入（ＩＳ）の薬物動態を示す。
【図１Ａ】
2009507929.tif 000002
【図１Ｂ】
2009507929.tif 000003
【図１Ｃ】
2009507929.tif 000004
【図２Ａ】
2009507929.tif 000005
【図２Ｂ】
2009507929.tif 000006
【図２Ｃ】
2009507929.tif 000007
【図３】
2009507929.tif 000008
【図４Ａ】
2009507929.tif 000009
【図４Ｂ】
2009507929.tif 000010
【図４Ｃ】
2009507929.tif 000011
【図４Ｄ】
2009507929.tif 000012
【図５Ａ】
2009507929.tif 000013
【図５Ｂ】
2009507929.tif 000014
【図６】
2009507929.tif 000015
【国際調査報告】
2009507929.tif 000016
2009507929.tif 000017
2009507929.tif 000018