(57)【要約】  バンコマイシンの徐放性製剤。本発明は、ヒスタミンの低下したレベルを有するバンコマイシン組成物及びバンコマイシン組成物中のヒスタミンのレベルを低下させる方法も含む。本発明は、レッドマン症候群、静脈炎及び低血圧の発生を低下させる、バンコマイシンを含有する医薬組成物も含む。さらに、本発明は、アミコラトプシス・オリエンタリスの増殖及びバンコマイシンの発酵を補助する無ヒスタミン増殖培地を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バンコマイシン及び４０ｎＭ未満のヒスタミンを含む医薬組成物。
【請求項２】
３０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
２０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
１０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
バンコマイシンの無ヒスタミン医薬組成物。
【請求項６】
ヒスタミンを除去するために処理されたバンコマイシンを含む医薬組成物。
【請求項７】
組成物が４０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
組成物が３０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物が２０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
組成物が１０ｎＭ未満のヒスタミンを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
バンコマイシンの１ｍｇ当り０．９０ｎｇ以下のヒスタミンを含む、請求項１から１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れかに記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む、バンコマイシンで治療可能な症状に罹患している患者を治療する方法。
【請求項１３】
症状が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）によって引き起こされる感染症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
治療を必要としている患者に、請求項１から１１の何れかに記載の医薬組成物を投与することを含む、バンコマイシンの投与に付随する副作用を低減するための方法。
【請求項１５】
副作用が、注入部位での静脈炎、血圧低下及びレッドマン症候群である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バンコマイシンからヒスタミンを分離するために、バンコマイシンが、陰イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーによって処理される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
バンコマイシン調製物からヒスタミンを分離するためのクロマトグラフィーを含む、ヒスタミンを含有するバンコマイシン調製物からヒスタミンを除去する方法。
【請求項１８】
クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
クロマトグラフィーが強陰イオン交換カラムを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィーがアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
アフィニテイークロマトグラフィーが抗ヒスタミン抗体を含むカラム上のヒスタミンを捕捉することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ヒスチジン脱炭酸酵素に対する機能的遺伝子を欠失するアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含む変異細菌性微生物
【請求項２３】
微生物がバンコマイシンを産生するが、ヒスタミン脱炭酸酵素を産生しない、請求項２２に記載の変異細菌性微生物。
【請求項２４】
アミコラトプシス・オリエンタリス由来のヒスチジン脱炭酸酵素の単離されたポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２５】
請求項２２に記載の微生物を準備すること、前記微生物を発酵させること、及び前記微生物から排出されたバンコマイシンを収集すること、を含む、バンコマイシンを製造する方法。
【請求項２６】
バンコマイシンの徐放性製剤を含む医薬組成物。
【請求項２７】
徐放性製剤が、ミセル、水中油エマルジョン、リポソーム又は静脈内投与のための脂肪をベースとした送達系を含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
バンコマイシンは、１０ｍｇ未満／分の速度で放出される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ヒスタミンが、０．９０ｎｇ未満／分の速度で放出される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
アミコラトプシス・オリエンタリスの増殖及びバンコマイシンの発酵を補助する無ヒスタミン増殖培地。
【請求項３１】
ＲＭＳ、静脈炎及び低血圧の減少した発生を与える、バンコマイシンを含む医薬組成物。
【請求項３２】
ＲＭＳ、静脈炎及び低血圧の減少した発生を与える、バンコマイシンを含む大量瞬時注入用医薬組成物。
【請求項３３】
４０ｎＭ未満のヒスタミンを要求する規格下で製造される、バンコマイシンを含む医薬組成物。
【請求項３４】
バンコマイシン１ｇ当りヒスタミン０．９ｎｇ未満を要求する規格下で製造される、バンコマイシンを含む医薬組成物。
【請求項３５】
ヒスタミンの低下した量を有する培地中でアミコラトプシス・オリエンタリスを発酵させることを含む、バンコマイシン医薬製剤中のヒスタミンを低下させるための製造方法。
【請求項３６】
ヒスタミンを除去するためにバンコマイシンを精製することを含む、バンコマイシン医薬製剤中のヒスタミンを低下させるための製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性感染症を治療するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、ヒスタミンの低下した量を有するバンコマイシン医薬組成物に関し、及び体内のヒスタミンの放出速度を調節するバンコマイシン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バンコマイシンは、アミコラトプシス・オリエンタリス（旧称ノカルディア・オリエンタリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）及びストレプトミセス・オリエンタリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））から得られる三環系糖ペプチド抗生物質である。この糖タンパク質は、化学式Ｃ６６Ｈ７５Ｃｌ２Ｎ９Ｏ２４・ＨＣｌを有する。バンコマイシンは、グラム陽性細菌による感染症を治療するために使用される。バンコマイシンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）による感染症又はβラクタムアレルギー患者におけるメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）感染の一次治療である。バンコマイシンは、最後の拠り所となる抗生物質である。集団中のバンコマイシンに対する耐性の増加を防ぐために、バンコマイシンは、通例、これらの重度の感染症に対して保留される。複数の抗感染薬に対して耐性を有する細菌が出現しているために、バンコマイシンは、ますます重要となっている。
【０００３】
バンコマイシンの投薬は、典型的には、１日３回である。２つの主要な副作用である、注射部位の静脈炎及び「レッドマン症候群」（ＲＭＳ）を避けるために、投薬は、通常、ゆっくりとした注入によって行われる。静脈炎は、通例、治療を中断し、及び注射部位を変更し、及び／又は末梢からＰＩＣＣカテーテルへ変更することによって解決される。ＲＭＳは、通例、治療を中断し、抗ヒスタミンを投与し、より遅い注入速度で治療を再開することによって解決される。ＲＭＳ（「レッドマン」、「レッドマンズ」、「レッドネック」又は「レッドパーソン」症候群としても知られる。）は、一般に認められたバンコマイシン投与の有害な反応である。ＲＭＳは、掻痒症、じんましん、紅斑、血管浮腫、頻拍症、低血圧、時折生じる筋肉痛並びに、通常、顔、首及び上半身に出現する斑点状丘疹発疹などの症候の複合を特徴とする。心血管毒性が生じることがあり、心機能低下及び心停止をもたらす。患者は、一般に、発疹の発達を伴って又は伴わずに、頭部及び胸部にわたって痒みと温熱感を経験し始める。ＲＭＳの開始は、通常、注入の開始から３０分以内に起こるが、注入が終了した後に起こる場合もあり得る。反応は、典型的には、注入の終了から１時間ないし数時間に消滅する。低血圧症（ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ）又は低い血圧は、ＲＭＳに伴う他の症候の不存在下でも起こり得る。
【０００４】
ＲＭＳの正確な原因は不明である。不純物に起因するその色のために「ミシシッピーの泥」と一般に記載されるバンコマイシンの旧式製剤は差し替えられたにも関わらず、より新しく、より純粋なバンコマイシン製品も、なお、ＲＭＳなどの副作用を引き起こす。バンコマイシンの製造業者によって推奨される注入速度は、少なくとも１時間にわたって、１０ｍｇ／分以下である。ＲＭＳが生じる可能性のために、２時間の注入が典型的である。ＲＭＳ反応には、通常、注入の迅速な速度が関連しているが、ＲＭＳの可能性がある２症例では、バンコマイシンの経口投与後にＲＭＳが報告されている。注入のより遅い速度でさえ、バンコマイシンは、低血圧性の反応を引き起こした。
【０００５】
バンコマイシンが、バンコマイシン投与後の増加した血漿ヒスタミンレベルによって測定されるヒスタミン放出を直接引き起こすことが、幾つかの研究によって示唆されている。しかしながら、このことは、患者がバンコマイシンに対してアレルギーを示していることを示唆する。その後バンコマイシンに曝露された際に生じるより大きな強度の反応から明らかなように、患者の少数は真正のアレルギー反応を有する可能性がある。しかしながら、患者の多くに対して観察された病因は、ＲＭＳが真正のアレルギー反応ではないこと、すなわち、ＲＭＳは、ＩｇＥによって誘発される肥満細胞からのヒスタミン放出ではないことを示唆している。ＲＭＳに伴う反応は、治療の持続時間に依存していない。ＲＭＳに伴う反応は、注入中の何れの時間においても起こり得、以前にはバンコマイシンの大量投与に耐性を有した患者に対してさえ起こり得る。一旦症候が消滅したら、より遅い速度であるが、患者には、バンコマイシンを再投与することができる。従って、ヒスタミンの血漿濃度はバンコマイシンの投与後に増加するので、ＲＭＳの病因は、免疫とは無関係のヒスタミンの放出によるものであると考えられる。
【０００６】
注入によってバンコマイシンを投薬し、これに伴って副作用特性を活発にモニターする必要があることから、看護スタッフが絶えず注意を払う必要がある。従って、バンコマイシンの投与は、外来の状況においては困難である。静脈炎又はレッドマン症候群を伴わずにバンコマイシンの大量瞬時注入を可能とする組成物は、未だ満たされていない医学的ニーズである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書において使用される単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。
【０００８】
バンコマイシンは、アミコラトプシス・オリエンタリスの発酵産物である。ヒスタミン又はヒスタミン様化合物が発酵プロセス中に存在することは可能である。もしそうであれば、これらの化合物のレベルを低下させる工程及びこれらの化合物に対する適切な管理限界の使用は、バンコマイシンの副作用を低下又は除去し得る。ヒスタミンの低下した量を有するバンコマイシンの医薬製剤又は製剤からの血流中へのヒスタミンの放出を抑制若しくは調節するバンコマイシンの製剤は、より少ない副作用、看護の軽減、より低い罹患率及び死亡率、外来の状況におけるより容易な使用並びにより高い及び／又はより速い投薬の可能性という大量瞬時注射の利点をもたらす。
【０００９】
バンコマイシンは、栄養培地中で、細菌Ａ．オリエンタリスを培養することによって産生される。ヒスタミン又はヒスタミン様化合物は、発酵ブロス中に存在する成分に関連し得る。バンコマイシン経路の中間体又はバンコマイシンの分解産物がヒスタミン様である可能性もある。ヒスタミン、フェニルエチルアミン、チラミン、トリプタミン、ドーパミン及びセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）は、血管拡張物質又は血管作用性化合物である。これらの化合物の各々は、疎水性アミノ酸、１つ又は２つの環を有する環構造又は平面状の誘導体である。バンコマイシンが、疎水性アミノ酸から構築された糖ペプチドであることに鑑みれば、これらの血管作用性化合物は、合成経路の中間体又は副産物であり得る。金属によって誘導された触媒作用又は酵素的な触媒作用は、バンコマイシンからこれらの化合物を産生し、血管作用性分解産物を与える。バンコマイシンの構造は、この仮説を支持する。
【００１０】
詳しく特徴が明らかにされたバンコマイシンの製造法では、バンコマイシン発酵ブロスをろ過し、バンコマイシンを脱色及び脱塩する吸着性樹脂を含有するカラムに添加する。樹脂を洗浄し、低ｐＨの溶媒でバンコマイシンを溶出した後、炭素で脱色する。次いで、低ｐＨでの結晶化工程を用いて、バンコマイシン溶出物をさらに精製する。結晶化されたバンコマイシンを、塩酸（ＨＣｌ）などの強酸と混合した後、アセトンなどの有機溶媒中で沈殿させて、バンコマイシン・ＨＣｌを形成させる。バンコマイシン・ＨＣｌを製造及び精製するための本方法は、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋらに対するＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，０６７，０９９（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）に開示されている。
【００１１】
典型的には、所望のバンコマイシンＢは、吸収性カラムを通してバンコマイシンブロスを溶出することによって、バンコマイシン関連化合物及びその他の不純物から分離される。様々な樹脂が、バンコマイシンＢに対して選択的であることが知られている。バンコマイシン関連化合物及び不純物からバンコマイシンＢを分離するために、例えば、ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌから入手可能な陽イオン交換樹脂であるＤＯＷＥＸ５０ＷＸ２及びＲｏｈｍ＆Ｈａａｓから入手可能な非機能的樹脂であるＡＭＢＥＲＬＩＴＥＸＡＤ−１６及びその他が使用されてきた。
【００１２】
バンコマイシンの製造中、カラムからの溶出液は、画分中に集められる。バンコマイシンＢの濃度及び量を測定するために、各画分は分析される。このように、バンコマイシンＢの最大濃度を有する画分を合わせて、本方法からの収率を最適化することができる。バンコマイシンの純度は、画分ごとに変動し、カラムからバンコマイシンを溶出するために使用される溶媒及び発酵培地などの多数の要因に依存する。参照により、本明細書中にその全体が組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２５８，４９５に記載されているバンコマイシンの一製造方法において、選択されたバンコマイシン溶出物は、約２．０から約３．５のｐＨを有する溶液を得るために、塩化アンモニウム溶液と混合される。次いで、塩基性溶液中に再度溶解される前に、溶液は結晶化される。最終結晶化工程の前に、再度、酸はバンコマイシンに添加される。
【００１３】
非経口投与用のバンコマイシンは、凍結乾燥された形態で提供され、これは、投与時に、無菌水で再構成される。凍結乾燥された製品は、バンコマイシン１ｇに対して、水２０ｍＬで再構成され、次いで、注入用の無菌生理的食塩水又はデキストロース溶液中に希釈される。非経口投与用バンコマイシンに対する投薬量は、一般に、２ｇ／日であり、６時間ごとに５００ｍｇ又は１２時間ごとに１ｇに分割される。ＲＭＳ、静脈炎及び低血圧などの副作用を回避するために、正常な腎機能を有する成人患者に対しては、１０ｍｇ以下／分の注入速度が推奨される。各投薬は、少なくとも６０分にわたって投与される。２時間の注入が、より典型的である。
【００１４】
世界市場の５０％超、米国市場の８０％超に相当する製造業者から得たバンコマイシンを、ヒスタミンの存在について分析した。ロット検査は、様々な原体薬物販売業者及び最終剤形から得られた結果を含んだ。表１に示されているように、これらの製品の各々が、再構成された処方中に４０ｎＭを上回るヒスタミンを含有していた。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
これらの分析のそれぞれにおいて、バンコマイシンの市販の試料は、ラベルに従って、５０ｍｇ／ｍＬに再構成した。原体薬物試料は、５０ｍｇ／ｍＬで、滅菌水中に再構成した。製造業者の指示に従って、ＳＰＩＢｉｏ（Ｍａｓｓｙ  Ｃｅｄｅｘ，  Ｆｒａｎｃｅ）のＨｉｓｔａｍｉｎｅＥＩＡＫｉｔを用いて試料を検査した。
【００１７】
各試料中に見出されるヒスタミン濃度は、感受性個体中において、経口経路により、生物学的に活性を有することが知られている（すなわち、５ｎＭ）。活性は、ヒスタミンが理論的に１００％生物利用可能である注射経路によってより大きくなり、おそらく、正常な個体中でヒスタミン応答を引き起こすのに十分な活性を有するものと予想される。これらの市販試料の製造業者は、これまで、ヒスタミンがバンコマイシン中に存在することを報告していない。これらの試料中にヒスタミンが存在することに気づいたことにより、製剤中に存在するヒスタミンに起因し得る副作用の多くを引き起こす製剤の調製が可能となる。
【００１８】
バンコマイシン精製工程中に使用される通常の分析操作は、幾つかの理由のために、ヒスタミンを検出しなかった。例えば、ヒスタミンは、強力な発色団を有しておらず、バンコマイシン精製工程をモニターするために通例使用されるＵＶ分光法によって観察されない。また、バンコマイシンは、多数の関連化合物のために、複雑なクロマトグラフィー特性を示す。この特性中の何れのヒスタミンピークも、異なる不純物で覆い隠され、又は異なる不純物を伴い得る。実際、化学検出の観点から、ヒスタミン濃度は極めて低い。従って、バンコマイシン製品中のヒスタミンの存在は、バンコマイシン中に存在するレベルでは、容易に見過ごされ得る。
【００１９】
一態様において、本発明は、実質的にヒスタミンが存在しない、バンコマイシンを含む医薬組成物に関する。実質的に存在しないとは、組成物中のヒスタミンの量が、静脈炎、ＲＭＳ及び低血圧を含むバンコマイシンの投与に付随する、望ましくないヒスタミン関連副作用を引き起こさないことを意味する。本発明の様々な態様において、医薬組成物は、バンコマイシンの１ｇ／溶液２０ｍＬの溶液を与えるために、凍結乾燥された粉末から再構成された場合に、バンコマイシンと、及びバンコマイシン中の４０ｎＭ未満のヒスタミン、又は３０ｎＭ、２０ｎＭ及び１０ｎＭ未満のヒスタミンとを含む。一態様において、本発明は、バンコマイシン１ｍｇ当りヒスタミン約０．９０ｎｇ未満を有するバンコマイシン製剤に関する。例えば、バンコマイシン１ｍｇ当りヒスタミン約０．８０、０．７０、０．６０、０．５０、０．４０、０．３０、０．２０又は０．１０ｎｇ以下。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ヒスタミンを除去するために処理されたバンコマイシンの医薬組成物に関する。ヒスタミンは、ゲルろ過、イオン交換（陽イオン又は陰イオン）交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー及び結晶化工程など、医薬精製の分野の当業者に公知の方法のあらゆる数によってバンコマイシンから除去することが可能である。現在、バンコマイシンの市販調製物の精製のために、これらの方法の１つ又はそれ以上、通常は、陽イオン交換クロマトグラフィー及び結晶化が使用されているが、本工程は、バンコマイシンを与えた患者内でヒスタミンが生理的に重要でないレベルまでヒスタミンを除去するように調節されていない。
【００２１】
ヒスタミンは、陰イオン交換カラム上にバンコマイシン製品を搭載し、バンコマイシンとは別個にヒスタミンを溶出することによって、バンコマイシンから除去することが可能である。特に、強陰イオン交換体であるカラムは、塩基性緩衝液と酸緩衝液の線形グラジエントを用いて使用される。例えば、０．２５Ｍ水酸化アンモニウム及び１Ｎ酢酸は、強陰イオン交換カラム上でバンコマイシンからヒスタミンを分離する。バンコマイシンは、塩基性条件下でカラムに結合するのに対して、ヒスタミンは溶出され得る。酸性条件は、バンコマイシンを溶出して、２つの化合物の明確な分離を与える。あるいは、ヒスタミンがカラムを結合し、まず、バンコマイシンが溶出されるように条件を調整することが可能である。より低強度の陰イオン交換及び陽イオン交換カラムも適切であり得るが、ヒスタミンの搭載及び分離能によっては、より低効率であり得る。
【００２２】
イムノアフィニティークロマトグラフィーも、バンコマイシンからヒスタミンを除去するのに適している。抗ヒスタミン抗体（ＩｇＧ）は、適切なカラムに結合された場合にヒスタミンを結合し、バンコマイシンを結合しない。バンコマイシンがカラムから洗浄された後、適切な溶媒を用いて、ヒスタミンを溶出させることができる。
【００２３】
さらに、適切な条件下において、ゲルろ過、アミノアフィニティーカラム及び結晶化は全て、バンコマイシンからヒスタミンを分離するために使用することができる技術である。ゲルろ過条件は、バンコマイシンの比較的小さなサイズを考慮に入れるべきである。
【００２４】
別の態様において、本発明は、バンコマイシンで治療可能な症状に罹患している患者を治療する方法に関する。本方法は、ヒスタミンの低下した量を有するバンコマイシンの医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む。バンコマイシンは、通例、バンコマイシン耐性細菌株の発生を抑えるために、最後の拠り所となる抗生物質として、使用が控えられるが、バンコマイシンは、文献に多数報告されているように、様々な感染症に対して有効な抗生物質である。最も一般的には、バンコマイシンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）によって引き起こされる感染症を治療するために使用される。複数の抗生物質耐性を有する細菌株の出現のために、バンコマイシンの使用は、ますます重要となっている。大量瞬時注入することができれば、看護職員への患者の負担は大幅に低下する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、バンコマイシンの投与に付随するヒスタミン関連の副作用を低下させる方法に関する。これらの副作用は、多数文献に報告されており、注入部位での静脈炎、血圧低下及びＲＭＳが含まれる。ヒスタミンの低下した量を有するバンコマイシンの投与は、これらの副作用を低下又は抑制することが可能である。
【００２６】
別の態様において、本発明はヒスチジン脱炭酸酵素に対する機能的遺伝子を欠失するアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含む変異細菌性微生物に関する。ヒスタミンは、ヒスチジン上のカルボキシル基の除去の産物であるので、ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子を欠失するこの生物は、ヒスタミンを産生せずにバンコマイシンを産生すると予想される。また、バンコマイシンを産生するが、ヒスタミンを産生しないアミコラトプシス・オリエンタリスの天然のバリアントが見出され得る。
【００２７】
従って、本発明は、ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子をコードする欠損したＤＮＡ、最も好ましくは欠失したＤＮＡを有するアミコラトプシス・オリエンタリスのいわゆる「ノックアウト」組み換え遺伝的細菌株を提供する。ノックアウト生物は、機能的ヒスチジン脱炭酸酵素ＤＮＡ配列を、欠損したコード配列又は欠失したコード配列、欠損したコード配列から５’及び３’の付加的相同性配列及び構築物を有する細胞のクローンを選択するための選択可能なマーカーを有する構築物で置換することによって作製することができる。このような選択可能なマーカーは、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性に対する遺伝子、Ｅ．コリのグアニンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ）及び本分野で公知のその他の選択可能な遺伝子など、あらゆる公知の選択可能な遺伝子であり得る。本発明のこれらの構築物は、組み換え細胞が、ヒスチジン脱水素酵素遺伝子を破壊する相同的組み換えによって、宿主細胞ゲノムＤＮＡ中に構築物ＤＮＡを取り込む可能性を最大化するために、提供される。
【００２８】
アミコラトプシス・オリエンタリスヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子の単離されたポリヌクレオチド配列及びその断片も想定される。
【００２９】
一態様において、本発明は、ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子を欠失するアミコラトプシス・オリエンタリスを発酵させ、微生物から分泌されるバンコマイシンを集めることによってバンコマイシンを製造する方法に関する。発酵は、公知の方法によって実施することができ、又は、生物のヒスタミン産生能の不存在下で増殖が確保されるように生物を補うために、培地を調整することができる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、バンコマイシンの徐放製剤を含む医薬組成物に関する。本態様において、１０ｍｇ以下／分という現在の目安より早く静脈内注射によって、バンコマイシンを投与することができるが、製剤からのバンコマイシン及びヒスタミンの血流への放出は、ずっと長い期間にわたって維持される。ヒスタミン放出の調節は、バンコマイシンの注入によって観察される濃度を超えない血漿濃度をもたらす。好ましくは、ヒスタミン放出特性は、現在利用可能なバンコマイシンの典型的な注入速度によって観察される濃度を下回る血漿濃度をもたらす。従って、製剤からのバンコマイシン及びヒスタミンの持続的放出は、現在処方されているバンコマイシンの遅い静脈内投与と類似しているので、バンコマイシンの投与に付随するヒスタミン関連の副作用が低下し、軽減し、又は抑制され得る。例えば、バンコマイシンの徐放製剤を用いれば、１０ｍｇ／分を上回る速度でのバンコマイシンの注入によって、バンコマイシンの全用量を患者に投与することができるが、血流中への製剤からのバンコマイシンの放出は、１０ｍｇ／分未満、例えば、９、８、７、６、５、４，３、２及び１ｍｇ／分になるように調節することができる。より重要なことには、製剤は、９ｎｇ未満／分、例えば、８、７、６、５、４、３、２又は１ｎｇ以下／分でヒスタミンを放出する。好ましくは、製剤は、血流中にヒスタミンを全く放出しない。一態様において、バンコマイシンは、１０ｍｇ／分より速く放出されるが、ヒスタミンは、９ｎｇ／分未満で放出される。
【００３１】
バンコマイシンの徐放製剤は、油及び水エマルジョン、ミセル及びリポソーム製剤を含む。例えば、バンコマイシンは、バンコマイシンを界面活性剤ミセル中に取り込ませる非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＥＮ（登録商標）など）を用いて乳化させることができる。油と水エマルジョンの例には、注射用水中の、非発熱性植物油（１０から５０％）、乳化剤として添加される卵ホスファチド（最大５％）及びグリセリン（最大５％）が含まれる。好ましくは約６．０から９．０の間に、ｐＨを調整するために、水酸化ナトリウムを添加し得る。
【００３２】
別の態様において、本発明は、バンコマイシン製剤中に存在し得るヒスタミンの徐放を可能にするバンコマイシンのリポソーム製剤に関する。非経口投与のために、エマルジョン、リポソーム又は脂質をベースとする他の送達系を調合することができる。これらの製剤は、静脈内環境との適合性を保ちながら、薬物の徐放を与えることができるので有利である。
【００３３】
本発明の組成物中に使用される脂質は、リン脂質、トコフェロール、ステロイド、脂肪酸、アルブミンなどの糖タンパク質、負に帯電した脂質及び陽イオン性脂質など、合成、半合成又は天然に存在する脂質であり得る。リン脂質には、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、卵ホスファチジルイノシトール（ＥＰＩ）、卵ホスファチジルセリン（ＥＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）及び卵ホスファチジン酸（ＥＰＡ）；大豆の対応物、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）；ＳＰＧ、ＳＰＳ、ＳＰＩ、ＳＰＥ及びＳＰＡ；水素添加された卵及び大豆の対応物（例えば、ＨＥＰＣ、ＨＳＰＣ）、１２から２６個の炭素原子の鎖を含有する、グリセリロール位置の２及び３中の脂肪酸のエステル結合と、及びコリン、グリセロール、イノシトール、セリン、エタノールアミンを含む、グリセロールの１位中の異なる頭部基から構成される他のリン脂質並びに対応するホスファチジン酸が含まれる。これらの脂肪酸鎖上の鎖は、飽和又は不飽和であり得、リン脂質は、異なる鎖長の脂肪酸及び不飽和の異なる程度から構成され得る。特に、製剤の組成物は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、天然に存在する肺界面活性剤の主要成分及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含み得る。他の例には、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチミルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）並びにパルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）及びパルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、セラミド、スフィンゴシン、スフィンゴミエリンのような混合リン脂質並びにモノ−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＯＰＥ）のような一アシル化されたリン脂質が含まれる。
【００３４】
使用される脂質は、脂肪酸、リン脂質、及びグリセリド、ステロイド、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びホスファチジルセリン（ＰＳ）のアンモニウム塩を含むことが可能である。脂肪酸は、飽和又は不飽和の何れかである１２から２６個の炭素原子の炭素鎖長の脂肪酸を含む。幾つかの具体例には、ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ラウリルアミン及びステアリルアミン、ジラウロイルエチルホスホコリン（ＤＬＥＰ）、ジミリストイルエチルホスホコリン（ＤＭＥＰ）、ジパルミトイルエチルホスホコリン（ＤＰＥＰ）及びジステアロイルエチルホスホコリン（ＤＳＰＥ）、Ｎ−（２，３−ジ−（９（Ｚ）−オクタデセニルオキシ）−プロプ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及び１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチル−アンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。ステロイドの例には、コレステロール及びエルゴステロールが含まれる。ＰＧ、ＰＡ、ＰＩ、ＰＣ及びＰＳの例には、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＩ、ＤＰＰＩ、ＤＳＰＩ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ及びＤＳＰＳ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、卵ＰＣが含まれる。
【００３５】
リポソームは、封入された水の容積を含有する完全に閉じた脂質二層膜である。リポソームは、単層小胞（単一の膜二重層を有する。）又は多層小胞（それぞれ、水層によって隣から隔てられている、複数の膜二重層を特徴とするタマネギ様構造）であり得る。二重層は、疎水性「尾部」領域及び親水性「頭部」領域を有する２つの脂質単層から構成される。膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）「尾部」が二重層の中心方向を向くのに対して、親水性「頭部」が水相の方向を向くようになっている。脂質複合体は、脂質と取り込まれている抗感染剤との間の会合である。この会合は、共有、イオン性、静電的、非共有又は立体性であり得る。これらの複合体は非リポソーム性であり、さらなる水溶性溶質を封入することができない。特定の例において、静脈内製剤は、スクロース９００ｍｇ、ＮＦ及び緩衝液としてのクエン酸二ナトリウム六水和物２７ｍｇと一緒に、概ね、水素付加された大豆ホスファチジルコリン２１３ｍｇ、５２ｍｇコレステロール、ＮＦ；ジステアロイルホスファチジルグリセロール８４ｍｇ；αトコフェロール、ＵＳＰ０．６４ｍｇからなるリポソーム膜に介在されたバンコマイシン５０ｍｇの量で供給される静脈内注入用の無菌非発熱性凍結乾燥産物を含有し得る。無菌注射用水ＵＳＰで再構成した後、懸濁液の得られるｐＨは、５から６の間である。
【００３６】
別の態様において、本発明は、慣用の溶媒に比べてヒスタミンの低下した量を有し、アミコラトプシス・オリエンタリスの増殖及びバンコマイシンの発酵を補助する増殖培地に関する。培地に関わらず、バンコマイシン製剤の製造が確実に行われるように、製造規格を提供し、製剤が４０ｎＭ未満のヒスタミンを確実に有するように製造規格を検査することができる。
【００３７】
以下の記述は、例示の目的のために提供されているに過ぎず、上記の広範な用語で記載されている本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本開示中に引用されている全ての参考文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００３８】
実施例
【実施例１】
【００３９】
バンコマイシンからのヒスタミンのクロマトグラフィーによる分離
ラベルの指示に従って、バンコマイシン（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．）を、５０ｍｇ／ｍＬで再構成し、次いで、１Ｍ原液を用いて、０．２５Ｍ水酸化アンモニウムになるように調整した。強陰イオン交換体である５ｍＬＨｉｇｈＱカラム（ＢｉｏＲａｄ）を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステム上に取り付け、０．２５Ｍ水酸化アンモニウム移動相で平衡化した。１ｍＬの注入ループを介して、バンコマイシンをカラム上に搭載し、２．５ｍＬ／分の流速での３０ｍＬの均一濃度工程を用いてカラムを洗浄した。次いで、０．２５Ｍ水酸化アンモニウムの１Ｎ酢酸への３５ｍＬ線形グラジエントを用いて、バンコマイシンを溶出した。クロマトグラフィーの間、ＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）、ｐＨ及び伝導率をモニターした。ヒスタミンについてはＥＬＩＳＡ（ＳＰＩ−Ｂｉｏ）によって、バンコマイシンについてはＵＶによって、カラム画分（２．５ｍＬ）をアッセイした。図１は、バンコマイシンの試料中にヒスタミンが存在することを確認し、バンコマイシン（画分２１から２２）及びヒスタミン（画分４から５）のクロマトグラフィーによる分離が可能であることを示した。酢酸は、画分２１から始まるヒスタミンＥＬＩＳＡを妨害した。ｐＨ７より大きくなるようにｐＨを調整した場合に、画分２１及び２２は、１０ｎＭ未満のヒスタミンを示した。
【実施例２】
【００４０】
抗ヒスタミンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
キットの指示書に従って、抗ヒスタミンウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）をＡｆｆｉ−ＧｅｌＨｚ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）に結合した。２ｍＬカラムは、抗ヒスタミン抗体約０．４７ｍｇを含有した。１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液の５容量で、カラムを平衡化した。
【００４１】
ＨＥＰＥＳ緩衝液中に、５０ｍｇ／ｍＬで、バンコマイシンを再構成し、２ｍＬの分取試料をカラム上に搭載した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液の１容量で、続いて、ＨＥＰＥＳ緩衝液の２容量でカラムを洗浄した。次いで、０．１Ｎ酢酸の２容量で、結合したヒスタミンを溶出した。画分（０．５ｍＬ）を集め、次いで、ＵＶ及びＥＬＩＳＡによってアッセイした。図２は、抗体によって結合されたヒスタミンの存在を示している。バンコマイシンピーク中に残存するヒスタミンは、カラムの過剰搭載から生じたものであると思われる。バンコマイシンピーク画分を合わせて、再度、抗ヒスタミンアフィニティーカラム上にかけた。図３に示されているように、これらの結果は、バンコマイシンピークがヒスタミンを欠失していること、及び出発材料中に存在していた付加的なヒスタミンがバンコマイシンから分離されたことを示した。
【実施例３】
【００４２】
質量分析によるヒスタミンの測定
実施例１のとおり、ＨｉｇｈＱカラムの複数実施から得られたヒスタミンピークに相当する画分を集め、凍結乾燥し、水の少容量中に再構成した。グラジエント高性能液体クロマトグラフィーを用いて、クロマトグラフィー分離を行った。液体クロマトグラフ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）は、以下のグラジエント特性を用いて、１．０ｍＬ／分で実行した。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
移動相Ａは、ＨＰＬＣ等級の水（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ）５０ｍＬを、アセトニトリル（ＥＭＤ）９５０ｍＬと混合することによって調製した。移動相Ｂは、１２．５ｍＭ酢酸アンモニウム（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）６７０ｍＬ、氷酢酸（ＥＭＤ）０．７２ｍＬ及びアセトニトリル３３０ｍＬを混合することによって調製した。両移動相は、直列真空脱気装置を用いて脱気した。クロマトグラフィーカラムは、３ミクロンの粒径を有するＨｙｐｅｒｓｉｌＡＰＳ−２、１５０×３ｍｍであった。カラム温度は、６０℃に維持した。注入容量は１００μＬであった。ヒスタミンの標準試料は、ＨＰＬＣ等級の水中にヒスタミン二塩酸塩（Ｆｌｕｋａ）を溶解し、希釈することによって調製された。
【００４５】
陽イオンエレクトロスプレーイオン化によるｍ／ｚ１１２からｍ／ｚ９５への遷移（プロトン化されたヒスタミンからの中性アンモニアの喪失）をモニターするために、単一反応モニタリングモード（ＳＲＭ）中で、三重四極子質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ）を使用した。図４に示されているように、約７．７９分後に、９５．２の質量を有するピークが観察された。このピークは、同じ条件下で実行されたヒスタミン二塩酸塩標準で観察された保持時間及び質量と一致していた（データは示さず。）。従って、データは、バンコマイシン中にヒスタミンが存在することを示すＥＬＩＳＡの結果を確認した。ＥＬＩＳＡによる検出のために必要な濃度と比べて、化学的検出のために、ヒスタミンは５から１０倍濃縮された。
【００４６】
本明細書において、本発明の様々な具体的実施形態を記載してきたが、本発明は、正確な実施形態に限定されないこと、並びに、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な変化及び改変が当業者によって本発明に実施され得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた、バンコマイシンからのヒスタミンの分離を示すグラフである。バンコマイシンは、２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。画分を集め、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒスタミンに対してアッセイを行った。
【図２】図２は、抗ヒスタミンアフィニティーカラムを用いた、バンコマイシンからのヒスタミンの分離を示すグラフである。バンコマイシンは、２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。画分を集め、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒスタミンに対してアッセイを行った。
【図３】図３は、抗ヒスタミンアフィニティーカラムを用いた、バンコマイシンからのヒスタミンの分離を示すグラフである。バンコマイシンは、２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。画分を集め、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒスタミンをアッセイした。
【図４】図４は、ＨＰＬＣ分離後に、質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いて、バンコマイシン試料中のヒスタミンを測定した結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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