(57)【要約】本発明は、サンプル中の第１の検体を少なくとも１０，０００倍の濃度に高めるのに適合した１またはそれ以上のサイズ式選別モジュールに関し、前記第１の検体はサンプル中の初期濃度が１×１０−３検体／μＬ以下であり、そして、濃縮された媒体中の前記第１の献体を分析する分析器に関する。この選別モジュールを用いて患者の状態すなわち胎児の異常に関連する特性を同定する方法も提供される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の第１の検体を少なくとも１０，０００倍の濃度に高めるのに適合した１またはそれ以上のサイズ式選別モジュールを具え、前記第１の検体はサンプル中の初期濃度が１×１０−３検体／μＬ以下であり、
前記第１の検体を濃縮した媒体中の第１の検体を分析するコンピュータ実行可能なロジックを具える分析器を具えることを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１のシステムにおいて、前記分析器がさらに、顕微鏡、マイクロアレイ、またはセルカウンタを具えることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、胎児のヘモグロビン、グロビンγ、グロビンε、グロビンβ、ＧＰＡ、ｉ抗原、ＣＤ３６、セレクチン、ＣＤ７１、またはこれらの組合せの存在による変色を検出することを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項１のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、第１の検体を選択的に結合するプローブの強度を検出することを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項１のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、前記第１の検体の三次元分析を実行することを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項１のシステムにおいて、前記分析器はデュアルスキャン機能を有することを特徴とするシステム。
【請求項７】
請求項１のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、前記第１の検体を描写することを特徴とするシステム。
【請求項８】
請求項１のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、三染色体性、胎児の性別、関心ある細胞の遺伝子または染色体異常、またはこれらの組合せを検出することを特徴とするシステム。
【請求項９】
請求項１のシステムにおいて、前記サイズ式選別モジュールがそれぞれ、前記第１の検体を第１の方向へ決定論的に案内し、前記第１の検体より流体力学的サイズが小さな第２の検体を第２の方向へと案内する二次元障害物アレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
請求項９のシステムにおいて、前記第１の検体が有核赤血球であることを特徴とするシステム。
【請求項１１】
請求項９のシステムにおいて、前記前記第１の検体が胎児有核赤血球であることを特徴とするシステム。
【請求項１２】
請求項１のシステムにおいて、前記システムが、互いに並列に液体的に接続された２またはそれ以上のサイズ式選別モジュールを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１３】
請求項１のシステムにおいて、少なくとも前記液体サンプルの１０ｍＬ／時間の高スループット分析に適合していることを特徴とするシステム。
【請求項１４】
請求項１のシステムにおいて、さらに、前記サイズ式選別モジュールに液体接続された１またはそれ以上の捕獲モジュールを具え、前記捕獲モジュールは前記サンプルから選択的に前記第１の検体または第２の検体を捕獲することを特徴とするシステム。
【請求項１５】
請求項１４のシステムにおいて、前記捕獲モジュールがそれぞれ、二次元障害物アレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１６】
請求項１４のシステムにおいて、前記捕獲モジュールがそれぞれ、１またはそれ以上の抗体に結合される二次元障害物アレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１７】
請求項１６のシステムにおいて、前記抗体は選択的に、赤血球、白血球、胎児血液細胞、胎児有核血液細胞、癌細胞、上皮細胞、幹細胞、前駆細胞、泡沫細胞、または血小板、を結合することを特徴とするシステム。
【請求項１８】
請求項１６のシステムにおいて、前記抗体は、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ４５１、抗ＧＰＡ、抗セレクチン、抗炭水化物、抗抗原Ｉ、および抗ＥｐＣａｍからなる群から選択されることを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項１のシステムにおいて、前記液体サンプルは血液サンプルであり、前記第１の検体は、上皮細胞、内皮細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、または癌細胞からなる群から選択されることを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１のシステムにおいて、前記液体サンプルは血液サンプルであり、５ｍＬ以下であることを特徴とするシステム。
【請求項２１】
請求項１のシステムにおいて、前記液体サンプルは妊娠１２週以下の女性の血液サンプルであることを特徴とするシステム。
【請求項２２】
請求項１のシステムにおいて、前記選別領域の障害物の間の隙間は１０００ミクロン以下であることを特徴とするシステム。
【請求項２３】
請求項１のシステムにおいて、さらに、前記選別領域または捕獲領域に液体的に接続され磁気粒子を含んだリザーバを具えることを特徴とするシステム。
【請求項２４】
請求項１のシステムにおいて、前記システムがさらに、選択的に前記第１の検体または前記第２の検体を結合するよう構成された磁気ビードを具えることを特徴とするシステム。
【請求項２５】
請求項２４のシステムにおいて、前記磁気ビードが、特に前記第１の検体を結合する抗体に結合されることを特徴とするシステム。
【請求項２６】
請求項１のシステムにおいて、さらに、前記サイズ式選別モジュールに液体接続されたリザーバを具え、当該リザーバが基第１の検体を優先的に結合するよう構成された磁気粒子を具えることを特徴とするシステム。
【請求項２７】
請求項２のシステムにおいて、前記分析器が、前記第１の検体中の１またはそれ以上のＳＮＰを検出するよう構成されたマイクロアレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項２８】
請求項２のシステムにおいて、前記分析器が、前記第１の検体中のｍＲＮＡレベルを検出するよう構成されたマイクロアレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項２９】
請求項９のシステムにおいて、前記障害物は、サンプルの流れを不均一に次の隙間へと案内する隙間により隔てられていることを特徴とするシステム。
【請求項３０】
血液サンプルから除核細胞の９９．５％以上を取り除き、血液サンプルから有核細胞の９９％以上を保持するのに適合した選別モジュールを具えることを特徴とするシステム。
【請求項３１】
請求項３１のシステムにおいて、さらに、前記選別モジュールに液体接続され１またはそれ以上の有核細胞を分析するよう構成された分析器と、分析データを保存するデータベースとを具えることを特徴とするシステム。
【請求項３２】
１またはそれ以上の第１の濃縮領域であって、第１の検体用の第１の流体流路と第２の検体用の第２の流体流路とを規定する複数の二次元障害物を具え、前記第１の検体および第２の検体の流体力学的直径が異なる濃縮領域と、前記１またはそれ以上の濃縮領域に液体接続され前記第１の検体または第２の検体のデータを取得するための分析器と、前記データを格納するデータベースとを具えことを特徴とするシステム。
【請求項３３】
請求項３２のシステムにおいて、前記第１の検体が、赤血球（ＲＢＣ）、有核赤血球（ＮＲＢＣ）、胎児のＲＢＣ、胎児有核ＲＢＣ（ｆＮＲＢＣ）、栄養膜、胎児の繊維芽細胞、白血球（ＷＢＣ）、感染ＷＢＣ、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、癌細胞、ウィルス細胞、バクテリア細胞、および原生動物からなる群から選択されることを特徴とするシステム。
【請求項３４】
請求項３２のシステムにおいて、前記細胞種類が生体内で１×１０−３細胞／μＬ以下の濃度で見られることを特徴とするシステム。
【請求項３５】
請求項３２のシステムにおいて、前記第１の濃縮領域における障害物間の隙間は最大１０００ミクロンであることを特徴とするシステム。
【請求項３６】
請求項３２のシステムにおいて、さらに、１またはそれ以上の第２の濃縮領域を具え、前記第２の濃縮領域は前記第１の検体または第２の検体を捕獲し、前記第２の濃縮領域は前記第１の濃縮領域に液体接続していることを特徴とするシステム。
【請求項３７】
請求項３２のシステムにおいて、前記１またはそれ以上の第１の濃縮領域は、前記第１の検体の９９％以上を保持するよう構成されることを特徴とするシステム。
【請求項３８】
請求項３２のシステムにおいて、前記１またはそれ以上の第１の濃縮領域は、前記第１の検体の濃度を少なくとも１００，０００の係数で増大させるよう構成されることを特徴とするシステム。
【請求項３９】
患者の状態に関連する特性を同定する方法であって、
複数の対照試料を取得するステップと、
複数の症例試料を取得するステップと、
前記サンプルをそれぞれ、前記サンプルから第１の検体を前記血液サンプルから第２の検体とは別の方向へ偏向させる複数の障害物を具える装置にかけるステップであって、前記第１の検体と第２の検体の直径が異なるステップと、
前記サンプルから前記第１の検体を分析して前記第１の検体の特性を特定するステップと、
前記特性に基づいて関連する研究を行うステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体の存在または不存在であることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体の数であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体の形態（morphology）または前記第１の検体の表現型であることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体の遺伝子型であることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体の蛋白代謝であることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体のＲＮＡ構造であることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項３９の方法において、前記特性は前記第１の検体の遺伝子発現レベルであることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項３９の方法において、前記複数の対照試料は、少なくとも１００の対照試料を含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項３９の方法において、前記複数の症例試料は、少なくとも１００の症例試料を含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項３９の方法において、前記対照試料および症例試料は、血液サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４９の方法において、前記各血液サンプルの血液は１００ｍＬ以下であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項３９の方法において、前記検体は細胞型（cell type）であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１の方法において、前記検体は上皮細胞、癌細胞、または胎児細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項３２の方法において、前記障害物は、前記第１および第２の検体の液体の流れを決定論的に導くことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３の方法において、前記障害物アレイは、前記サンプルの流れを導く隙間を次の隙間へと不均一に規定することを特徴とする方法。
【請求項５５】
サンプル中のバイオハザード検体を検出する方法であって、前記バイオハザード検体はサンプルにおいて濃度１×１０−３検体／μＬ以下に見られ、前記サンプルを、前記検体の濃度を少なくとも１０，０００倍増大させるよう構成されたフロースルー濃縮装置にかけるステップと、前記濃縮されたバイオハザード検体を分析するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法において、前記濃縮装置は、前記バイオハザード検体の９９％以上を保持するよう構成されることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５５の方法において、前記濃縮装置は、前記バイオハザード検体を、少なくとも１００，０００の係数で濃縮するよう構成されることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５５の方法において、前記濃縮装置は、９８％以上の特異性と９８％以上の感度を有することを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５５の方法において、前記バイオハザード検体が、バクテリア、原生動物、およびウィルスを含む群から選択される病原体であることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５５の方法において、前記バイオハザード検体は、ペスト菌、炭疽菌、ボツリヌス菌、野兎病菌、コキシエラ菌、ブルセラ種、ブルクホルデリアつい骨、ブルクホルデリア仮性つい骨、連鎖球菌、エボラウィルス、ラッサウィルス、ＳＡＲＳ、大痘瘡、アルファウィルス、発疹チフスリケッチア、オウム病クラミジア、サルモネラ種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、コレラ菌、クリプトスポリジウムパルバム、ニパウィルス（Nipah virus）、ハンタウィルスからなる群から選択される病原体であることを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項５５の方法において、前記サンプルは水サンプル、空気サンプル、植物または動物サンプル、あるいは土壌サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項５５の方法において、前記サンプルは流体サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項５５の方法において、さらに、前記サンプルを融解させて流体サンプルとするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項５５の方法において、前記濃縮装置は、前記サンプルから第２の検体を９９％以上除去することを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項５５の方法において、前記バイオハザード検体は細胞型であることを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項５５の方法において、前記前記バイオハザード検体は毒素であることを特徴とする方法。
【請求項６７】
請求項５５の方法において、前記一連の分析はコンピュータ実行可能なロジックにより行われることを特徴とする方法。
【請求項６８】
請求項５５の方法において、前記濃縮装置は、前記バイオハザード検体を決定論的に第１の方向に案内し、サンプル中の第２の検体を第２の方向に案内する複数の障害物の二次元アレイを具えることを特徴とする方法。
【請求項６９】
胎児の異常を同定する方法であって、妊婦から母体の血液サンプルを、当該サンプル中の胎児細胞を決定論的に分離させるフロースルーモジュールに通し、ここで分離した胎児細胞を、前記血液サンプルから濃縮された１またはそれ以上の胎児細胞の画像を撮像するよう構成された分析器に供給するステップと、胎児の核酸を結合する１またはそれ以上の核酸プローブからの信号を分析するステップと、前記信号を分析するステップと、前記分析ステップに基づいて診断出力を生成するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項７０】
請求項６９の方法において、前記プローブは、染色体用であることを特徴とする方法。
【請求項７１】
請求項７０の方法において、前記染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体２１、染色体１３、および染色体１８からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７２】
請求項７０の方法において、前記分析は、前記プローブ信号の数を特定するステップ、前記プローブ信号のサイズを特定するステップ、前記プローブ信号の形を特定するステップ、前記プローブ信号のアスペクト比を特定するステップ、または前記プローブ信号の分布を特定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項７３】
胎児の状態を検出するコンピュータプログラム製品において、
サンプル中の胎児の有核赤血球（ｆｎＲＢＣ）を検出するコンピュータコードと、
関心ある核酸を結合する１またはそれ以上の核酸プローブからプローブ信号を受け取るコンピュータコードと、
前記プローブ信号を分析して１またはそれ以上の胎児細胞を検出するコンピュータコードと、
前記プローブ信号を分析して前記１またはそれ以上の胎児細胞の状態を検出するコンピュータコードと、
前記コンピュータコードを保存するコンピュータ読み取り可能な媒体とを具えることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項７４】
請求項７３に記載のコンピュータプログラム製品において、前記コンピュータ読み取り可能な媒体は、メモリ、ハードドライブ、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、フラッシュメモリ、またはテープであることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項７５】
請求項７３に記載のコンピュータプログラム製品において、前記プローブは、染色体専用であることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項７６】
請求項７５に記載のコンピュータプログラム製品において、前記染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体２１、染色体１３、および染色体１８からなる群から選択されることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項７７】
請求項７３に記載のコンピュータプログラム製品において、前記プローブは測色プローブであることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項７８】
請求項７３に記載のコンピュータプログラム製品において、前記プローブは蛍光プローブであることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項７９】
請求項６９に記載の方法において、前記妊婦の妊娠期間は１２週以下であることを特徴とする方法。
【請求項８０】
請求項６９に記載の方法において、前記フロースルーモジュールは１またはそれ以上の二次元障害物アレイを具え、前記障害物が、前記サンプルの流れを次の隙間へと不均一に導く隙間を規定していることを特徴とする方法。
【請求項８１】
出産前試験キットであって、
母体血液サンプルから１またはそれ以上の第１の種類の細胞を分離するよう構成されたサイズ式選別モジュールを具え、前記第１の種類の細胞は妊婦の生体内ですべての血液細胞中１％未満の濃度で見られ、前記１またはそれ以上の濃縮した細胞を分析して胎児の出産前診断を行うための一連の説明書を具えることを特徴とするキット。
【請求項８２】
出産前試験キットであって、
新生児の血液サンプルから１またはそれ以上の第１の種類の細胞を分離するよう構成されたサイズ式選別モジュールを具え、前記第１の種類の細胞は生体内ですべての血液細胞中１％未満の濃度で見られ、前記１またはそれ以上の濃縮した細胞を分析して胎児の出産前診断を行うために一連の説明書を具えることを特徴とするキット。
【請求項８３】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、さらに、ＰＣＲ試薬、リーシス試薬、核酸プローブ、およびラベリング試薬からなる群から選択される１またはそれ以上の試薬を具えることを特徴とするキット。
【請求項８４】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、ラベリング試薬は、ＦＩＳＨ試薬であることを特徴とするキット。
【請求項８５】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、前記ＦＩＳＨ試薬は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体１３、染色体１８、染色体２１からなる群から選択された染色体と特に結合することを特徴とするキット。
【請求項８６】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、さらに、マイクロアレイを具えることを特徴とするキット。
【請求項８７】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、前記サイズ式選別モジュールは、前記１またはそれ以上の第１の種類の細胞を第１の方向へと決定論的に案内し、１またはそれ以上の第２の種類の細胞を第２の方向へ案内する二次元障害物アレイを具えることを特徴とするキット。
【請求項８８】
請求項８７に記載のキットにおいて、前記第１の種類の細胞は、胎児の細胞であることを特徴とするキット。
【請求項８９】
請求項８７に記載のキットにおいて、前記第２の種類の細胞は除核赤血球であることを特徴とするキット。
【請求項９０】
請求項８９に記載のキットにおいて、前記サイズ式選別モジュールは  前記第１の種類の細胞の９９％以上を保持し、前記除核赤血球の９９％を除去することを特徴とするキット。
【請求項９１】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、さらに、障害物アレイを具え、前記障害物は、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ３６、抗セレクチン、抗ＧＰＡ、抗ＣＤ４５、および抗抗体ｉからなる群から選択される抗体に結合されていることを特徴とするキット。
【請求項９２】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、前記出産前診断は、胎児の性別を判定することを含むことを特徴とするキット。
【請求項９３】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、前記出産前診断は、染色体１３、染色体１８、染色体２１（ダウン症）、ターナー症候群（Ｘ染色体の損傷）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、または他の性染色体あるいは常染色体の数の異常の存在の判定を含むことを特徴とするキット。
【請求項９４】
請求項８１に記載のキットにおいて、前記出産前診断は、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫からなる群から選択される状態の判定を含むことを特徴とするキット。
【請求項９５】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、前記選別モジュールは、前記第１の検体を第１の方向へ、前記第２の検体を第２の方向へ決定論的に案内することを特徴とするキット。
【請求項９６】
請求項８１または８２に記載のキットにおいて、前記選別モジュールは、流れを続く隙間へと不均一に案内する複数の隙間を規定する１またはそれ以上の二次元障害物アレイを具えることを特徴とするキット。
【請求項９７】
請求項８１に記載のキットにおいて、前記出産前診断は、前記胎児の性別の判定を含むことを特徴とするキット。
【請求項９８】
請求項８１に記載のキットにおいて、前記出産前診断は、染色体１３の存在の判定を含むことを特徴とするキット。
【請求項９９】
請求項８２に記載のキットにおいて、前記出産後診断は、循環する有核赤血球の存在または数の判定を含むことを特徴とするキット。
【請求項１００】
出産前診断を試験するビジネス方法であって、
妊娠したあるいは或いはしている哺乳動物から血液サンプルを取得するステップと、
前記血液サンプルから１またはそれ以上の胎児細胞を濃縮するステップと、
前記胎児細胞を分析して胎児の状態を判断するステップと、
前記状態のレポートをサービス料金と引き換えに提供するステップとを含むことを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記ビジネスはＣＬＩＡ研究所に前記分析ステップの実行を委託することを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０２】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記濃縮ステップは、前記細胞をサイズによって異なる方向へ案内することにより前記胎児細胞を母体細胞から分離するよう構成された流体システムで行われることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０３】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記ビジネスは前記サービスを行うことを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０４】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記状態は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１（ダウン症）、ターナー症候群（Ｘ染色体損傷）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、および性染色体または常染色体の数の異常からなる群から選択されることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０５】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記状態は、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫（１３ｑ１４）からなる群から選択されることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０６】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記レポートは、医療提供者または医療保険会社用に作成されることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０７】
請求項１００に記載のビジネス方法において、前記ビジネスは、ＣＬＩＡ研究所に前記濃縮ステップの実行を委託することを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０８】
胎児の遺伝子欠陥についての出産前検査を実行するための診断製品の商業化を含むビジネスであって、前記診断製品は母体の血液サンプルから胎児細胞を濃縮することを特徴とするビジネス方法。
【請求項１０９】
請求項１０８に記載のビジネス方法において、前記ビジネスは、前記診断製品を製造することを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１０】
請求項１０８に記載のビジネス方法において、前記診断製品はポリマ材料から製造されることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１１】
請求項１０８に記載のビジネス方法において、前記診断製品は使い捨てであることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１２】
請求項１０８に記載のビジネス方法において、前記診断製品は、選択的に除核赤血球から胎児有核赤血球（ｆｎＲＢＣ）を分離させることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１３】
請求項１０８に記載のビジネス方法において、前記診断製品は、前記胎児細胞から遺伝子異常を検出することを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１４】
請求項１１３に記載のビジネス方法において、前記遺伝子異常は、核酸を結合するラベルを用いて検出されることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１５】
請求項１１４に記載のビジネス方法において、前記ラベルは蛍光ラベルであることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１６】
請求項１１５に記載のビジネス方法において、前記ラベルは比色ラベル（colorimetric label）であることを特徴とするビジネス方法。
【請求項１１７】
母体血液から胎児細胞を分離するビジネス方法であって、
胎児を妊娠したあるいはしている哺乳動物から血液サンプルを取得するステップと、
前記血液サンプルから１またはそれ以上の胎児細胞を費用と交換に濃縮するステップとを具えることを特徴とするビジネス方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特異性細胞の分析により、様々な疾病の洞察が可能となる。このような分析により、疾病の検出、診断、および予測についての被侵略性の試験が可能となり、侵略性の診断によるリスクが排除された。例えば、社会進化により胎児期の検査の数が増えた。しかしながら、今日利用可能な方法である羊水穿刺（amniocentesis）と絨毛膜（chorionic）ウィルスサンプリング（ＣＶＳ）は、潜在的に母体と胎児に有害である。羊水穿刺を受けた妊婦の流産率は０．５−１％程上昇し、この数字はＣＶＳで僅かに高くなる。羊水穿刺とＣＶＳにリスクが内在するため、これらの処置は第１に高齢、すなわち統計的に先天性障害のある子供を授かる可能性が高い３５才以上の女性に適用される。結果として、３５才の妊婦は、この年齢における０．３％以下の２１トリソミーの確率に対し、流産の原因となる羊水穿刺の平均０．５−１％のリスクを考量せねばならなかった。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの非侵略性の方法が、特定の先天性疾病の診断に開発されている。例えば、母体血漿アルファ−フェトプロテイン、非結合エストリオールのレベルやヒト絨毛性腺刺激ホルモンを、胎児のダウン症の可能性を特定するのに用いることができるが、これらの試験は１００％正確ではない。同様に、神経管疾患や手足異常などの先天性疾患を検査するのに超音波検査法が用いられているが、これは妊娠期間１５週以降でのみ有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
妊婦の血液中の胎児細胞の出現は、羊水穿刺に代わる胎児期の診断の機会を与え、今日では侵略性診断のリスクを除去することとなった。しかしながら、胎児細胞は背景となる多数の血液中の母体の細胞に対する少数の細胞で標本するため、時間がかかり間違いが多かった。
【０００４】
細胞の個体数を選別する工夫がいくつかなされている。このような細胞選別技術は、２つのカテゴリに分けられる：（１）例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）や磁気活性細胞選別（ＭＡＣＳ）などの様々な細胞特定マーカを用いて染色した細胞の選別に基づく方法と、（２）関心ある個体に特有の生物物理学的パラメータを用いて生体細胞を隔離する方法である。これらの方法は、例えばコスト高、低生産高、熟練が必要、特異性の欠如といった様々な制限がある。結果として、臨床診断に十分な、少ない細胞特に胎児細胞を周囲の血液サンプルから個体選別する改良方法であって臨床的に許容可能な改良方法はなかった。したがって、混合物から特定種類の細胞を選別する改良方法であって従来技術の制限を解消する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、サンプル中の第１の検体を少なくとも１０，０００倍の濃度に高めるのに適合した１またはそれ以上のサイズ式選別モジュールを具えるシステムに関し、前記第１の検体はサンプル中の初期濃度が１×１０−３検体／μＬ以下であり、分析器は選択的に前記第１の検体を濃縮した媒体中の第１の検体を分析するコンピュータ実行可能なロジックを具える。
【０００６】
いくつかの実施例では、分析器がさらに、顕微鏡、マイクロアレイ、またはセルカウンタを具える。
【０００７】
いくつかの実施例では、前記コンピュータ実行可能なロジックは、胎児のヘモグロビン、グロビンγ、グロビンε、ＧＰＡ、ｉ抗原、ＣＤ４６、セレクチン、ＣＤ４５、またはこれらの組合せの存在による変色を検出する。
【０００８】
いくつかの実施例では、前記コンピュータ実行可能なロジックは、第１の検体を選択的に結合するプローブの強度を検出する。いくつかの実施例では、前記コンピュータ実行可能なロジックは、前記第１の検体の三次元分析を実行する。
【０００９】
いくつかの実施例では、分析器はデュアルスキャン機能を有する。
【００１０】
いくつかの実施例では、前記コンピュータ実行可能なロジックは、前記第１の検体を描写する。
【００１１】
いくつかの実施例では、特に第１の検体が母体血液から得た胎児細胞である場合、前記コンピュータ実行可能なロジックは、前記胎児細胞について、胎児の性別、三染色体、または１以上の胎児細胞における染色体異常を検出する。
【００１２】
いくつかの実施例では、１またはそれ以上のサイズ式選別モジュールが、前記第１の検体を第１の方向へ決定論的に案内し、前記第１の検体より流体力学的にサイズの小さな第２の検体を第２の方向へと案内する二次元障害物アレイを具える。
【００１３】
いくつかの実施例では、２またはそれ以上のサイズ式選別モジュールが、互いに並列に液体的に接続されている。
【００１４】
いくつかの実施例では、前記システムは、少なくとも流体１０ｍＬ／時間の高スループット分析に適合している。
【００１５】
いくつかの実施例では、前記システムはさらに、流体サンプルから前記第１の検体または第２の検体を選択的に抽出する選別領域に接続された１またはそれ以上の抽出領域を具える。
【００１６】
いくつかの実施例では、前記システムは１またはそれ以上の捕獲モジュールを備え、当該抽出モジュールの１つが二次元障害物アレイを具える。
【００１７】
いくつかの実施例では、捕獲モジュールの障害物は、抗体に結合される。このような抗体は選択的に、サンプル中の第２の検体にわたって、赤血球、白血球、胎児血液細胞、胎児核血液細胞、癌細胞、上皮細胞、幹細胞、前駆細胞、泡沫細胞、血小板、を拘束する。いくつかの実施例では、前記抗体は、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ４６、抗炭水化物、抗セレクチン、抗ＣＤ４５１、抗ＧＰＡ、抗抗原Ｉ、抗ＥｐＣａｍからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施例では、前記液体サンプルは妊婦の血液サンプルであり、前記第１の検体は有核胎児赤血球である。
【００１９】
いくつかの実施例では、前記液体サンプルは血液サンプルであり、前記第１の検体は、上皮細胞、内皮細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、または癌細胞からなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施例では、前記サンプルは血液サンプルであり、５ｍＬ以下である。
【００２１】
いくつかの実施例では、前記液体サンプルは妊娠１２週以下の女性の血液サンプルである。
【００２２】
いくつかの実施例では、サイズ式選別モジュールまたは抽出モジュールの障害物間は１０００ミクロン以下である。
【００２３】
いくつかの実施例では、前記システムがさらに、磁気粒子を含んだリザーバを具える。このリザーバは、前記サイズ式選別モジュールまたは抽出モジュールに液体的に接続されている。
【００２４】
別の実施例では、本発明は、血液サンプルから除核細胞の９９．５％以上を取り除き、血液サンプルから有核細胞の９９％以上を保持するのに適した選別モジュールを具える。いくつかの実施例では、前記システムはさらに、前記選別モジュールに液体接続され１またはそれ以上の有核細胞を分析するよう構成された分析器と、分析によるデータを保存するデータベースとを具える。
【００２５】
本発明はさらに、例えばサンプル中で選択した種類の細胞検体を濃縮するのに有用なシステムと、症例および対照試料の検体に基づいて患者の状態を分析する方法を提供する。特に、本発明にかかるシステムは、１またはそれ以上の第１の濃縮領域であって、第１の検体用の第１の流体流路と第２の検体用の第２の流体流路とを規定する複数の障害物を具え、前記第１の検体および第２の検体の流体力学的直径が異なる濃縮領域と、前記１またはそれ以上の濃縮領域に液体接続され前記第１の検体または第２の検体のデータを取得するための分析器と、前記データを格納するデータベースとを具える。
【００２６】
本発明は、前記第１の検体が、赤血球（ＲＢＣ）、胎児のＲＢＣ、栄養膜、胎児の繊維芽細胞、白血球（ＷＢＣ）、感染ＷＢＣ、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、癌細胞、ウィルス細胞、バクテリア細胞、および原生動物からなる群から選択される実施例と、さらに、前記細胞種類が１×１０−３細胞／μＬ以下の濃度で生きている実施例とを含む。
【００２７】
特定の実施例では、前記システムの前記第１の濃縮領域における障害物間の隙間は約１０００ミクロンである。さらなる実施例では、前記システムは、１またはそれ以上の第２の濃縮領域を具え、前記第２の濃縮領域は前記第１の検体または第２の検体を捕獲し、前記第２の濃縮領域は前記第１の濃縮領域に液体接続している。
【００２８】
実施例において、前記１またはそれ以上の第１の濃縮領域は、前記第１の検体の９９％以上を保持するよう構成され、前記１またはそれ以上の第１の濃縮領域は、前記第１の検体の濃度を少なくとも１００，０００の係数で増大させるよう構成される。
【００２９】
本発明はまた、患者の状態に関連する特性を特定する方法に関し、複数の対照試料を取得するステップと、複数の症例試料を取得するステップと、前記サンプルをそれぞれ、前記サンプルから第１の検体を前記血液サンプルから第２の検体とは別の方向へ偏向させる複数の障害物を具える装置にかけるステップであって、前記第１の検体と第２の検体の直径が異なるステップと、前記サンプルから前記第１の検体を分析して前記第１の検体の特性を特定するステップと、前記特性に基づいて関連する研究を行うステップとを具える。
【００３０】
実施例において、前記特性は前記第１の検体の出現または消滅であり、別の実施例では、前記特性は前記第１の検体の数である。様々な企図する実施例において、前記特性は前記第１の検体の形態（morphology）、前記第１の検体の遺伝子型、前記第１の検体の蛋白代謝、前記第１の検体のＲＮＡ構造、および／または前記第１の検体の遺伝子発現である。
【００３１】
特定の実施例において、前記複数の対照試料は、少なくとも１００の対照試料を含む。特定の実施例において、前記複数の症例試料は、少なくとも１００の症例試料を含む。別の実施例では、前記対照試料および症例試料は、血液サンプルである。また、実施例の核血液サンプルの血液は１００ｍＬ以下である。
【００３２】
本発明の実施例において、前記検体は細胞種であり、特定の実施例では、前記検体は上皮細胞、癌細胞、または胎児細胞である。
【００３３】
別の実施例では、本発明は、限定しないが環境や他のサンプル中のバクテリア、原生動物、ウィルスウイルス病原体、毒素を含むバイオハザード検体を検出する方法に関する。
【００３４】
特に、本発明はサンプル中のバイオハザード検体を検出する方法に関し、前記バイオハザード検体はサンプルの１×１０−３検体／μＬの濃度以下に見られ、前記サンプルを濃縮装置／モジュールに適用するステップと、前記濃縮したバイオハザード検体を分析するステップとを具える。
【００３５】
前記濃縮装置は、いくつかの実施例において、前記バイオハザード検体を決定論的に第１の方向に、１またはそれ以上の非バイオハザード検体を第２の方向に案内する障害物の二次元アレイを具える。上記障害物のアレイに付加的あるいは代替的に、いくつかの実施例では、前記濃縮装置は前記バイオハザード検体を選択的に捕捉する障害物の二次元アレイを具える。上述した前記アレイにおける障害物間のギャップは好ましくは１０００ミクロン、５００ミクロン、１００ミクロン、５０ミクロン、あるいは１０ミクロンである。
【００３６】
いくつかの実施例において、前記濃縮装置は、前記バイオハザード検体の９９％以上を保持するよう構成される。
【００３７】
いくつかの実施例において、前記濃縮装置は、前記バイオハザード検体を、少なくとも１０，０００の係数で濃縮するよう構成されている。
【００３８】
本発明は、前記濃縮装置が当該濃縮装置で得られる特異性の約９８％と感度の９８％以上を有する実施例を実現する。
【００３９】
本発明は、前記バイオハザード検体が、バクテリア、原生動物、およびウィルスを含む群から選択される病原体である実施例を含む。より具体的には、本発明の実施例では、前記バイオハザード検体は、ペスト菌、炭疽菌、ボツリヌス菌、野兎病菌、コキシエラ菌、ブルセラ種、ブルクホルデリアつい骨、ブルクホルデリア仮性つい骨、連鎖球菌、エボラウィルス、ラッサウィルス、ＳＡＲＳ、大痘瘡、アルファウィルス、発疹チフスリケッチア、オウム病クラミジア、サルモネラ種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、コレラ菌、クリプトスポリジウムパルバム、ニパウィルス（Nipah virus）、ハンタウィルス、およびこれらのキメラを含む群から選択される病原体である。
【００４０】
いくつかの実施例では、バイオハザード検体は、細胞型または毒素である。
【００４１】
本発明の特定の実施例では、前記サンプルは水サンプル、空気サンプル、植物または動物サンプル、あるいは土壌サンプルである。特定の実施例では、前記サンプルは流体サンプルである。関連する実施例では、本発明はさらに、サンプルを融解して流体サンプルとするステップを含む。
【００４２】
本発明のさらなる実施例では、本発明は前記濃縮が前記サンプルから第２の検体を９９％以上除去する方法が実現される。
【００４３】
一態様では、本発明は、妊婦から母体の血液サンプルを、当該血液サンプルから濃縮された１またはそれ以上の胎児細胞の画像を撮像するよう構成された分析器に供給するステップと、胎児の核酸をつなぐ１またはそれ以上の核酸プローブからの信号を分析するステップと、前記信号を分析するステップと、前記分析ステップに基づいて診断出力を生成するステップにより、母体の血液サンプルから胎児の異常を特定する方法に関する。このようなプローブは、例えばＸ染色体、Ｙ染色体、染色体２１、染色体１３、および染色体１８などの染色体専用であってよい。
【００４４】
いくつかの実施例では、分析が、前記プローブ信号数を特定するステップ、前記プローブ信号のサイズを特定するステップ、前記プローブ信号の形を特定するステップ、前記プローブ信号のアスペクト比を特定するステップ、または前記プローブ信号の分布を特定するステップを含む。いくつかの実施例では、分析は、前記母体の血液サンプルから取得した胎児の赤血球の画像を撮像するステップと、関心のある胎児の核酸をつなぐ複数の核酸プローブ用のプローブ強度を入力するステップと、前記プローブ強度を分析するステップと、前記分析の結果に応じて診断出力を生成するステップを具える。一実施例では、前記プローブは染色体専用である。一実施例では、前記プローブは、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体２１、染色体１３、および染色体１８からなる群から選択される。一実施例では、分析ステップは、プローブ数を特定するステップを含む。
【００４５】
一態様において、本発明は、胎児の状態を検出するコンピュータプログラム製品に関し、サンプル中の胎児の有核赤血球（ｆｎＲＢＣ）を検出するコンピュータコードと、関心のある胎児の核酸をつなぐ１またはそれ以上の核酸プローブからプローブ強度を受け取るコンピュータコードと、前記受け取った強度を分析するコンピュータコードと、前記プローブ強度の分析結果に応じて信号（call）を生成するコンピュータコードと、前記コンピュータコードを保存するコンピュータ読み取り可能な媒体とを具える。一実施例では、前記コンピュータ読み取り可能な媒体は、メモリ、ハードドライブ、フロッピーディスク、ＣＤ＝ＲＯＭ、フラッシュメモリ、またはテープである。一実施例では、前記プローブは、染色体専用である。一実施例では、前記染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体２１、染色体１３、および染色体１８からなる群から選択される。一実施例では、前記プローブは測色プローブである。一実施例では、前記プローブは蛍光プローブである。
【００４６】
本発明は、出産前試験キットを提供し、母体の血液サンプルから１またはそれ以上の第１の種類の細胞を分離するよう構成されたサイズ式選別モジュールを具え、前記第１の種類の細胞は妊婦の生体内ですべての血球中１％未満の濃度で見られ、出産前診断を行うために前記１またはそれ以上の濃縮した細胞を分析する一連の命令を具える。
【００４７】
いくつかの実施例では、前記キットはまた、（瓶または容器に入った）１またはそれ以上の試薬を具える。このような試薬は、ＰＣＲ試薬、リーシス試薬、核酸プローブ、およびラベリング試薬からなる群から選択することができる。ラベリング試薬の一例は、ＦＩＳＨ試薬またはＦＩＳＨプローブである。好ましくは、前記ＦＩＳＨプローブは、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体１３、染色体１８、染色体２１からなる群から選択された染色体を選択的につなぐ。いくつかの実施例では、前記キットはマイクロアレイを具えてもよい。
【００４８】
一態様では、サイズ式選別モジュールは、前記１またはそれ以上の第１の種類の細胞を第１の方向へと決定論的に案内し、１またはそれ以上の第２の種類の細胞を第２の方向へ案内する二次元障害物アレイを具えてもよい。この第１の種類の細胞は、胎児の細胞としてもよい（癌の診断に用いるキットでは、この第１の周囲の細胞は上皮細胞または循環癌細胞となる）。いくつかの実施例では、前記第２の種類の細胞は除核赤血球または血小板である。
【００４９】
ここにおける実施例のいずれも、サイズ式選別モジュールは  前記第１の種類の細胞の９９％以上を保持し、前記除核赤血球の９９％を除去しうる。
【００５０】
本発明はさらに、サイズ式選別モジュールが障害物アレイに液体接続されてもよく、前記障害物が、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ３６、抗セレクチン、抗ＧＰＡ、抗ＣＤ４５、および抗抗体ｉからなる群から選択される抗体に接続されている。
【００５１】
前記胎児の診断は、胎児の性別、染色体１３・染色体１８・染色体２１（ダウン症）の存在、ターナー症候群（Ｘ染色体の損傷）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、または他の性染色体あるいは常染色体の数の異常の発現、あるいはＷｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫（１３ｑ１４）からなる群から選択される条件の出現とすることができる。
【００５２】
本発明は、動物の健康状態を診断する方法に関し、これは前記動物から流体サンプルを取得するステップと、前記サンプルから１×１０−３検体／μＬ以下の濃度の第１の検体を少なくとも１０，０００倍の係数で濃縮するステップと、１またはそれ以上の濃縮した第１の検体を分析して前記動物の健康状態を決定するステップとを具える。濃縮は、１またはそれ以上のサイズ式選別モジュールを用いて実行することが望ましい。サイズ式選別モジュールが、前記流体サンプルから第１の検体の決定論的流路と前記流体サンプルから第２の検体の決定論的流路とを生成する二次元障害物アレイを具え、前記第１の検体は前記第２の検体とは流体力学的サイズが異なる。いくつかの実施例では、前記第１の流路は第１の出口に延び、第２の流路は第２の出口に延びる。この方法は、１またはそれ以上の濃縮した第１の検体を分析して前記動物の健康状態を決定するステップを具える。いくつかの実施例では、前記第１の検体は癌細胞、胎児細胞、または病原体である。
【００５３】
いくつかの実施例では、前記動物は家畜である。いくつかの実施例では、前記家畜は、牛、鶏、豚、馬、魚、兔、犬、猫、および山羊からなる群から選択される。一実施例では、前記第１の検体は癌細胞である。いくつかの実施例では、前記第１の検体は胎児細胞である。いくつかの実施例では、前記第１の検体は病原菌である。一実施例では、前記病原菌は、バクテリア、ウィルス、または原生動物である。いくつかの実施例では、前記分析ステップが、ＤＮＡ分析を実行するステップを具える。いくつかの実施例では、前記分析ステップは、ＲＮＡ分析を実行するステップを具える。いくつかの実施例では、前記分析ステップは、蛋白質分析を実行するステップを具える。一実施例では、前記流体サンプルは血液サンプルである。
【００５４】
いくつかの実施例では、前記方法はさらに、サンプルに試薬を適用するステップを具え、前記試薬は第１の検体のサイズを少なくとも１０％増大させる。一実施例では、試薬適用ステップは、前記サンプルを障害物アレイに適用する前に発生する。いくつかの実施例では、試薬適用ステップは、前記試薬は、量子ドット、抗体、ファージ、アプタマー、フルオロフォア、酵素、またはビードを含む。
【００５５】
いくつかの実施例では、前記分析ステップは、濃縮した第１の検体の数を数えるステップを含む。いくつかの実施例では、この条件（condition）は動物の胎児の性別である。いくつかの実施例では、前記条件は動物の微生物感染を含む。いくつかの実施例では、前記条件は癌を含む。いくつかの実施例では、前記第１の出口は、選択的に前記第１の検体を捕獲する複数の障害物を含む１またはそれ以上の捕獲領域に液体接続している。いくつかの実施例では、選択的に捕獲する前記複数の障害物は、赤血球、胎児細胞、癌細胞、または上皮細胞を選択的に拘束する１またはそれ以上の結合部分（binding moieties）に結合されている。いくつかの実施例では、前記捕獲部分は抗体またはその断片を具える。
【００５６】
本発明はまた、胎児の状態を分析するスクリーニングサービスおよび診断が提供されるビジネス方法に関する。特に、本発明は、妊娠したあるいは或いはしている哺乳動物から血液サンプルを取得するステップと、前記血液サンプルをスクリーニングし、前記哺乳動物の胎児からの胎児細胞を特定するステップと、前記胎児細胞を分析して前記胎児の状態を判断するステップと、前記状態のレポートをサービス料金と引き換えに提供するステップとを含む胎児のスクリーニングサービスを提供するビジネスのビジネス方法に関する。関連する実施例では、前記ビジネスは前記サービスを実施する。
【００５７】
別の実施例では、前記ビジネスはＣＬＩＡ研究所に前記分析ステップを実行する許可する。本発明はまた、前記レポートが医療提供者または健康保険会社用に実行される実施例を含む。
【００５８】
本発明の特定の実施例では、前記スクリーニングは、前記細胞をサイズによって異なる方向へ案内することにより前記胎児細胞を母体細胞から分離するよう構成された流体システムで行われる。
【００５９】
別の実施例では、決定される胎児の状態は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１（ダウン症）、ターナー症候群（Ｘ染色体損傷）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、および性染色体または常染色体の数異常が生じた他の状態からなる群から選択される。特定の実施例では、前記状態は、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫（１３ｑ１４）からなる群から選択される。
【００６０】
本発明はまた、胎児の遺伝子欠陥についての出産前検査を実行する商業的診断を含む診断を提供するビジネスのビジネス方法に関し、前記診断は母体血液を分析する。関連する実施例では、前記ビジネスは、前記診断を製造する。別の関連する実施例では、前記診断はポリマ材料から製造される。特定の実施例では、前記診断は使い捨てである。
【００６１】
特定の実施例では、前記診断製品は、除核赤血球から胎児有核赤血球（ｆｎＲＢＣ）を分離させることにより母体血液を分析する。実施例では、前記診断は、前記ｆｎＲＢＣの遺伝子異常を検出する。関連する実施例では、核酸を結合するラベルを用いた前記遺伝子異常が検出されるビジネスモデルが含まれる。さらなる関連する実施例では、前記ラベルが蛍光ラベルまたは比色ラベル（colorimetric label）である。
【００６２】
本発明はまた、料金またはクロスライセンスの交換により行われる、母体血液から胎児細胞を分離するビジネス方法に関する。このようなビジネス方法は、妊娠したまたはしている哺乳動物（例えば人間）から血液サンプルを取得するステップと、前記血液サンプルから１またはそれ以上の胎児細胞を濃縮するステップとを具える。このサービスは、料金またはクロスライセンスの交換により行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明の好適な実施例がここに図示および開示されるが、当業者であればこのような実施例は単なる例示に過ぎないことを理解するであろう。当業者は本発明を逸脱するこおなく様々な変更例、変形例、および置換を想起しうる。ここに開示する発明の実施例の様々な代替例が、本発明を実践する際に生じうる。添付のクレームが本発明の範囲を規定することを意図し、これらのクレームの範囲内の方法や構造およびその均等物はここに包含される。
【００６４】
本発明は、サンプル、流体サンプル、またはより好ましくは全血液サンプルから稀有の検体（例えば、組織、細胞、および細胞成分）を分離、選別、および濃縮するシステム、装置、および方法を提供する。
【００６５】
表１  血液細胞の細胞種類、濃度、および細胞
2009509143.tif 000003
【００６６】
いくつかの実施例において、本装置は、混合流体から検体または細胞を選別または濃縮するのに用いられ、前記検体または細胞は、流体サンプルの１ｘ１０−３、１ｘ１０−４、１ｘ１０−５、１ｘ１０−６、または１ｘ１０−６細胞／μＬ以下の濃度である。いくつかの実施例では、本装置は、混合流体から検体または細胞を選別または濃縮するのに用いられ、前記検体または細胞は、サンプル中の総ての細胞の１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００、１：１００，０００，０００以下の濃度である。
【００６７】
好適な実施例では、本発明は、血液サンプルから１またはそれ以上の細胞を選別および濃縮するシステムおよび装置を提供する。例えば、母体血液サンプルから本システムおよび方法により胎児細胞が濃縮または分離される。また、上皮、内皮、原種、泡沫、幹、癌の細胞が、血液サンプルから濃縮され得る。流体サンプルからこれらの、および／または他の検体または稀有な細胞を選別および／または濃縮した後、本システムはこのような検体を検出してこの検体を分析するのに用いられる。検体の分析は、ここに開示する様々なアプリケーションに利用することができる。
【００６８】
Ｉ．サンプル収集／準備
本システムおよび方法は、分析すべきソースからの１またはそれ以上のサンプルを取得するステップを含む。サンプルは、水源、食品、土壌、空気、動物、その他から得ることができる。固体サンプル（例えば、組織サンプルまたは土壌サンプル）が得られた場合、このような固体サンプルは後続する濃縮および／または分析の前に融解または熔解させてもよい。気体サンプルが得られた場合、同様に溶融または熔解させてもよい。
【００６９】
いくつかの実施例では、動物からサンプルが供給される場合、それは動物から、より好ましくは人間から供給されたものであることが望ましい。動物から得られる液体サンプルの例は、限定しないが、全体血液、汗、涙、唾液、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣液、脳髄液、脳液（brain fluid）、腹水、母乳、呼吸分泌液、腸管および尿生殖器系、および羊膜液を含む。好適には、動物から得られる液体サンプルは血液サンプルである。動物からの液体サンプルを分析する場合、その動物は、例えば、牛、鶏、豚、馬、兔、犬、猫、山羊などの家畜である。好適な実施例では、前記動物は人間であり、前記血液サンプルは全体血液サンプルである。動物から得られる血液サンプルは、例えば、動物の状態の検査／診断や、妊娠した動物から出産前検査を行うのに用いることができる。好適な実施例では、本システムは、妊娠した人間から血液サンプルを取得して胎児の状態や異常性を検査する。
【００７０】
液体サンプルは、この分野の様々な公知技術を用いて取得することができる。例えば、血液を採取するには、シリンジまたは他の吸引器具を用いる。血液のような液体サンプルは、好適に吸引管または袋に採取される。
【００７１】
いくつかの実施例では、動物から得られる液体サンプルは、直接的に本装置に供給され、別の実施例では、本発明の装置に供給される前に予め処置または加工される。例えば、動物から採取した血液は、本発明の装置に供給する前に１またはそれ以上の試薬で処置されてもよいし、予めこのような試薬が入った容器に集められてもよい。ここで用いる試薬は、限定しないが、安定剤、保存薬、固定薬、溶融剤、希釈剤、抗アポトーシス剤、抗血栓剤、磁性調整剤、および／または交差結合剤を含む。
【００７２】
液体サンプルを処理し分析装置へ供給する方法の例が、２００４年３月３日出願の米国出願番号１１／０７１，２７０「Sytem For Delivering a Diluted Solution」と、２００５年９月１５日出願の米国出願番号未付与の「Methods and Systems for Fluid Delivery」に記載されており、これらは両方ともすべての目的において参照により組み込まれている。
【００７３】
動物から血液サンプルを取得する場合、動物のサイズ、妊娠期間、検査状態などにより血液量が変化する。いくつかの実施例では、５０ｍＬ、４０ｍＬ、３０ｍＬ、２０ｍＬ、１０ｍＬ、９ｍＬ、８ｍＬ、７ｍＬ、６ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、または１ｍＬ以下の液体サンプル（例えば血液）が動物から採取される。いくつかの実施例では、個体から１−５０ｍＬ、２−４０ｍＬ、３−３０ｍＬ、または４−２０ｍＬの血液が採取される。別の実施例では、５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，または１００ｍＬ以上の液体サンプルが動物から採取される。
【００７４】
収集されたサンプル全体が、胎児細胞や上皮細胞といった稀有な検体の濃縮および／または選別のために、本装置に適用される。いくつかの実施例では、サンプルは連続的な時間間隔で取得され、本装置に適用されてさらに分析される。
【００７５】
いくつかの実施例では、本システムおよび方法は、１０ｍＬ、５ｍＬ、または３ｍＬ以下の血液サンプルから稀有な細胞（例えば、胎児細胞、上皮細胞、または癌細胞）の濃縮、選別、および分析を実現する。いくつかの実施例では、本システムおよび方法は、２０ｍＬ、５０ｍＬ、または１００ｍＬより多い大量の血液サンプルから稀有な細胞を濃縮するのに利用できる。上記いずれかの能力は、例えば、１日未満、または１２，１０，１１，９，８，７，６，５，４，３，２時間以内、または６０，５０，４０，３０，２０，１０分以内で生じうる。
【００７６】
いくつかの実施例では、血液サンプルは、胎児細胞や血液細胞の成分といった血液サンプル中の１またはそれ以上の細胞または成分を選択的に溶解する熔解物と化合される。例えば、胎児細胞を含む母体の血液サンプルは、水または他の浸透圧重量モル濃度調整剤と化合され、本システムによる胎児細胞の細胞成分の選別や濃縮の前に、胎児細胞を選択的に熔解させてもよい。
【００７７】
好適には、血液サンプルは、血液が採取されてから１週間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、１日、１２時間、６時間、３時間、２時間、または１時間以内に本システムに供給される。いくつかの実施例では、血液サンプルは、動物から採取してすぐに本システムに供給される。好適には、サンプルは４−３７°Ｃの温度で本システムに供給される。
【００７８】
ＩＩ  濃縮
本発明は、サンプルからの稀有な検体の濃縮を組み入れている。いくつかの実施例では、稀有な検体は細胞または細胞成分である。稀有な細胞の例は、限定しないが、血小板、白血球、母体血液からの胎児有核赤血球、上皮細胞、内皮細胞、前駆細胞、癌細胞、腫瘍細胞、バクテリア、ウィルス、原生細胞、およびこれらのキメラを含む。細胞成分の例は、限定しないが、ミトコンドリア、リボザイム、小胞体、ゴルジ体、蛋白質、蛋白質複合体、および核酸を含む。これらの選別は、好適にはサイズにより達成される。本発明のサンプルは、固体、気体、または液体サンプルである。固体サンプルは、濃縮ステップの前に溶融または融解されるのが好ましい。
【００７９】
濃縮は、この分野で公知の１またはそれ以上の方法および装置で行うことができ、特に国際公開番号２００４／０２９２２１と２００４／１１３８７７、米国公開番号２００４／０１４４６５１、米国特許番号５，６４１，６２８、５，８３７，１１５、および６，６９２，９５２、米国出願番号６０／７０３，８３３、６０／７０４，０６７、６０／６６８，４１５、１０／７７８，８３１、１１／０７１，６７９、および１１／１４６，５８１で開示されており、これら総てが総ての目的のためここに参照により組み込まれる。好適な実施例では、検体の濃縮または選別は、１またはそれ以上のサイズ式選別モジュール（例えば、網目、マトリクス、電気泳動モジュール）や、選択的に１またはそれ以上の捕獲モジュール（例えば、親和式選別モジュール、抗体、および磁気ビード）を用いて実現する。
【００８０】
１．サイズ式選別
サイズ式選別モジュールは、サンプル中の検体の流体力学的サイズに基づいて、液体サンプルから検体を選別する。好適な実施例では、サイズ式選別モジュールは、隙間アレイを構成する１またはそれ以上の障害物の二次元アレイを具える。障害物アレイは好適には二次元であり、好適にはジグザグ配列のアレイを構成する。これらのアレイは、アレイの隙間を通る液体が連続する隙間に不均等に散らばるよう構成されている。偏向角は、例えば、少なくともピッチの１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０％である。好適には、選別モジュールは、基準サイズより大きい検体を障害物アレイから離してバイパスチャネルへと偏向させるよう構成されうる。いくつかの実施例では、サイズ式選別モジュールは、１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００以上の障害物を含む。障害物が２次元アレイに整列される場合、このアレイは、例えば２，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１４０，１６０，１８０，２００，４００，６００，８００，１０００以上の障害物の列を有する。
【００８１】
好適な実施例では、隙間、障害物、またはその両方が中規模（一方向において１ｍｍ以下）である。図１は、サイズ式選別モジュールの例を示す。障害物（様々な形であってよい）が、平坦な基板に取り付けられて隙間のアレイを構成している。透明カバーまたは蓋がアレイを覆うのに用いられる。障害物は二次元アレイを構成し、連続する各列が上下でジグザグ配列されている。平均流量は、このフィールドアレイにより設計される。いくつかの実施例では、障害物アレイは、少なくとも時間ごとに１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、または５００ｍＬの液体サンプルを通過させ処理するよう設計される。サイズ式選別モジュールのサンプル流は、アレイの見通し線（line of sight）に対し小さな角度（流れる角度）で配列されてもよい。選択的に、サイズ式選別モジュールを注入ポンプに結合して、サンプルを障害物に通してもよい。
【００８２】
このサイズ式選別モジュールは、流体力学的サイズが基準サイズより大きな検体（例えば細胞）がアレイの見通し線に沿って移動し、一方で流体力学的サイズが基準サイズより小さなものが流れを異なる方向へ流れるよう構成してもよい。検体の流体力学的サイズは、検体の物理的な寸法、液体媒質の浸透性、および検体の形状および変形能に依存する。
【００８３】
図２はこの実施例を示しており；第１の検体用の第１の流路Ａが第１の流体力学的サイズである。障害物内でより曲がりくねった第２の流路は、前記第１の検体より流体力学的サイズが小さな第２の検体用の決定論的流路（deterministic path）である。第２の検体は、アレイ中で第１の検体より平均流内でより多く流れるのが見られる。これは決定論的流路Ｂを流れる。また、第１および第２の検体より流体力学的サイズが小さい第３の検体が、もっぱらアレイの障害物および平均流路内の流路Ｃを流れる。
【００８４】
多重化
ここにおける実施例のいずれかで、１またはそれ以上の障害物アレイは直列または並列に液体接続している。いくつかの実施例では、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７０，８０，９０，１００以上の選別モジュールが並列に液体接続される。好適には約１０−２０のこのようなモジュールが並列に液体接続される。１より多い選別モジュールを並列に液体接続すると、検査されるサンプルの高スループット分析が達成される（例えば、毎時１，１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，または１００ｍＬの液体サンプル、またはより望ましくは毎時５ｍＬの流体サンプル）。
【００８５】
図３は、多重化の一実施例を示す。図３では、２つの障害物アレイが隣り合わせに、すなわちミラーイメージで配置されている。この構成では、２つのアレイの臨界サイズ（critical size）は同じであっても異なってもよい。さらに、これらのアレイは、主たる流れが２つのアレイの境界、各アレイの縁部、またはその組合せを流れるよう構成される。このような二重アレイはまた、２つのアレイの間に設けられ基準サイズより大きな粒子を回収したりサンプルを改質（例えば、緩衝剤交換、反応、またはラベリングによる）するための中央領域を具える。図３では、中央領域またはバイパスチャネルが、チーズ片形状の障害物内に設けられ逆流を不正でいる。
【００８６】
１のデバイスで並列に複数のアレイを設けると、サンプル処理のスループットが増大し、複数種のサンプルや、断片または操作が異なるサンプル部分の並行処理が可能となる。また、選別モジュールで処理される液体の流量が増大する。同じサンプルを並列処理する場合、出口は液体接続され、あるいはされなくてもよい。例えば、複数のアレイが同じ基準サイズである場合、出口を連結して高スループットサンプル処理を実現する。別の例では、アレイの基準サイズがすべて同じではなく、あるいはアレイ内の粒子がすべて同じ方法で処理されないと、その出口は液体接続されない。いくつかの実施例では、多重化は複数の二重アレイを単一のデバイスに搭載することにより実現する。二重または単一が複数あるアレイは、互いに様々な可能な三次元関係で配置しうる。いくつかの実施例では、多重デバイスは、直列に液体接続された２またはそれ以上の障害物アレイを具える。例えば、１のデバイスの主たる流れからの出口が、第２のデバイスの入口に接続されてもよい。あるいは、１のデバイスの小さな流れの出口が、第２のデバイスに接続されてもよい。
【００８７】
別の実施例では、複数のアレイを用いて広いサイズ範囲の検体を選別してもよい。例えば、あるデバイスは直列に液体接続された３つのアレイを具えるが、他の様々な数のアレイを用いてもよい。通常、第１のアレイ（最上流のアレイ）におけるカットオフサイズは、第２のアレイ（前記第１のアレイの下流側の次のアレイ）のカットオフより大きく、第１のアレイのカットオフサイズは第２のアレイの通過サイズより小さく構成される。後続のアレイでも同じである。第１のアレイは、第２のアレイで滞る検体を偏向させる（取り除く）。同様に、第２のアレイは第３のアレイで滞る検体を偏向させる（取り除く）。
【００８８】
上述したように、複数ステージのアレイ（多重アレイ）では、例えば下流の詰まりの原因となる細胞などの大きな粒子を最初に偏向するが、これらの偏向された粒子を下流ステージをバイパスさせて詰まるのを防止する必要がある。したがって、本発明のデバイスは、アレイからのアウトプットを取り除くバイパスチャネルを具える。ここでは基準サイズより大きい粒子を取り除く場合を説明するが、バイパスチャネルはまた、アレイの様々な部分からのアウトプットを取り除くのに用いることができる。
【００８９】
いずれの実施例においても、選別モジュールは好適に、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％以上の特異性で、液体サンプルから関心ある検体（特に胎児細胞や上皮細胞）を選別する。いずれの実施例でも、選別モジュールは好適に、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％以上の感度で、液体サンプルから関心ある検体（特に胎児細胞や上皮細胞）を選別する。
【００９０】
さらに、いずれの実施例でも、関心ある検体は、５，２，１，５ｘ１０−１，２ｘ１０−１，１ｘ１０−１，５ｘ１０−２，２ｘ１０−２，１ｘ１０−２，５ｘ１０−３，２ｘ１０−３，１ｘ１０−３，５ｘ１０−４，２ｘ１０−４，１ｘ１０−４，５ｘ１０−５，２ｘ１０−５，１ｘ１０−５，５ｘ１０−６，２ｘ１０−６，１ｘ１０−６，５ｘ１０−７，２ｘ１０−７，または１ｘ１０−７検体／μＬ液体サンプル以下の初期濃度から濃縮できる。また、いずれの実施例でも、選別モジュールは、サンプル中の全検体の１％未満の検体（例えば細胞）、またはサンプル（例えば人間などの動物から取得された血液サンプル）中の全検体（例えば細胞）の１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％、０．０００２％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００２％、０．００００１％、０．０００００５％、０．００００２％、０．０００００１％以下を選別しうる。この選別モジュールは、液体サンプルから濃縮サンプルへ変化させることにより（ときには緩衝液などの新たな液状媒体内で）このような関心のある検体の濃度を増大しうる。この濃縮サンプル中の検体の新たな濃縮は、少なくとも本のサンプルから１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、２００，０００，０００、５００，０００，０００、１，０００，０００，０００、２，０００，０００，０００、または５，０００，０００，０００倍以上濃縮されている。
【００９１】
入口／出口
さらに、入口および／または出口の数は、デバイスの使用目的により変化してもよい。好適な実施例では、単一の障害物アレイは、２またはそれ以上の出口を有する。このようなアレイの例が図４に示されており、サンプル処理の高スループット用に１４対のアレイが連結されている。各アレイは、サンプルを供給する第１の入口と、アレイに緩衝液などの試薬を供給する第２の入口を有する。各アレイはまた、廃棄物（不要な生産物）用の第１の出口と、生産物（関心ある検体）用の第２の出口を有する。
【００９２】
いくつかの実施例では、サイズ式選別モジュールは、大きな検体を除去するため普通の流れの方向から離して向けられる第１の出口と、障害物アレイを通る普通の流れの方向に流れる小さな検体を取り出す第２の出口とを有する。選別処理の様々なポイントで断片を回収するためにさらなる出口を設けてもよい。さらに、いくつかの実施例では、単一の二次元アレイに１以上の入口が設けられる。この入口は、例えば安定化剤、保存剤、固定剤、熔解剤、希釈剤、抗アポトーシス剤、ラベル剤、抗凝固剤、抗血栓剤、緩衝液、浸透圧重量モル調整剤、ｐＨ調整剤、安定剤、ＰＣＲ試薬、洗浄剤、および／またはクロスリンク剤などの追加のサンプルおよび／または試薬を供給しうる。
【００９３】
いくつかの実施例では、関心ある検体（例えば胎児細胞）は、選択的に溶融され、その後に関心ある細胞の細胞成分を含む液体サンプルが選別モジュールにかけられる。細胞中の関心ある細胞成分は、ここに開示した方法または公知の技術を用いて、サイズに基づいて血液サンプル中の他の細胞から分離される。選別器にサンプルと同時に熔解剤を供給したり、サンプルを最初に熔解剤に混合してから選別器に供給する場合、選別器は例えば核、ミトコンドリア、リボザイム、リソソーム、小胞体、またはゴルジ体などの１またはそれ以上の細胞小器官を偏向／分離するよう構成される。例えば、いくつかの実施例では、母体の血液サンプルは、選択的に胎児有核赤血球を熔解する熔解剤と混合される。このような熔解剤は、例えば、水や胎児細胞を選択的に熔解するこの分野で公知の薬剤である。血液サンプルはその後本訴打ちに供給され、血液サンプルから選択的に総ての検体またはほぼ総ての他の検体が偏向され、これにより胎児赤血球の細胞小器官（例えば核）の濃度が濃縮される。このような実施例では、核は「廃棄物」出口から排出される。別の実施例では、熔解剤は第２の入口から血液サンプルとともに供給される。この実施例では、熔解は選別と同時に行われる。
【００９４】
いくつかの実施例では、１またはそれ以上の検体が、検体を選択的に結合させそのサイズ（流体力学的サイズ）を増大させる結合材部分（例えば、磁気ビード）と接触されてもよい。結合が解かれた部分はサイズが小さくなるため（「廃棄物」出口から）取り除かれ、結合した検体はサイズにより変更され別の出口から取り出される。
【００９５】
装置の構成および／または形状は、様々な方法で設計されてもよい。例えば、環形の利井口と出口を用いてもよい（図４の環形入口を参照）。障害物がない入口領域が設計に組み込まれており、障害物が設けられた領域に到達した血液細胞が均一に分配されるようにしている。同様に、出口には存在する細胞を均一にダメージなく回収できるよう障害物がない出口領域が設けられている。
【００９６】
バイパスチャネル
液体サンプルの検体および／または細胞が障害物アレイを通って流れると、基準サイズより流体力学的サイズが大きいものがバイパスチャネルに偏向される。バイパスチャネルは、障害物間の平均的な隙間より広いチャネルを有する。さらに、バイパスチャネルの幅は、サンプルから分離される最も大きな要素（最も大きな細胞）と等しいかこれより大きい。例えば、いくつかの実施例では、選別モジュール内のバイパスチャネルの幅は、５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０ミクロン以上である。いくつかの実施例では、主チャネルの幅は１００，９０，８０，７０，６０，５０，４０，３０，２０ミクロン以下である。
【００９７】
バイパスチャネルは、障害物の周囲またはその外側縁部を形成するようにしてもよい。このような障害物は、好適にバイパスチャネルに到達した大きな細胞の逆流または乱流を防止する。いくつかの実施例では、バイパスチャネルの障害物は断面チーズ片形状であり、くさび形の尖った端部が下流側に向いている（図３参照）。
【００９８】
いくつかの実施例では、単一のバイパスチャネルを用いて、１またはそれ以上のステージ（アレイ）でこのバイパスチャネルを共有する。いくつかの実施例では、複数のバイパスチャネルが用いられる。例えば、複数ステージのそれぞれが自身のバイパスチャネルを有してもよい。一実施例では、大きな検体（例えば胎児細胞、上皮細胞、腫瘍細胞）は、主流へ、その後にバイパスチャネルへと偏向され詰まりが防止される。詰まりを生じない小さな細胞は第２ステージへと進み、ここでさらにサイズにより選別される。この設計は、所望するステージ数だけ繰り返される。各ステージで、バイパスチャネルは出口に液体接続され、したがってサンプルから複数の偏向を回収できる。バイパスチャネルはまた、デバイスを通る流れを一定に維持したり、一定量の流れを取り除いてアレイの流れが乱れないようにしたり、または特定の領域で流量を増やすよう設計されてもよい。土曜に、アレイの境界部分は唯一の流れパターンを形成するよう設計されてもよい（例えば流れを供給したり流れを抽出する等）。
【００９９】
いずれの実施例でも、各アレイは最大通過サイズがカットオフサイズの数倍大きい。この結果は、大きな隙間と小さな分岐比εを組み合わせて得ることができる。いくつかの実施例では、このεはほぼ１／２、１／３、１／１０、１／３０、１／１００、１／３００、１／１０００である。また、このような実施例では、障害物の形状は隙間を通る流れの形に影響するが、アレイを短くするために障害物は流れ方向に狭まってもよい。単一ステージのアレイはここに述べるバイパスチャネルを具えてもよい。
【０１００】
障害物の形状
サイズ式選別モジュールの障害物の寸法および形状は均一であってもよいし、均等または不均等なパターンを構成するよう変化してもよい。例えば、障害物は、筒状、月形、または正方形の断面をとりうる。好適な実施例では、障害物が丸い断面形状をとるように筒状である。好適には、障害物の直径（最も長い断面長さ）は４−４０ミクロン、５−３０ミクロン、６−２０ミクロン、または７−１０ミクロンである。いくつかの実施例では、選別用渉外部の直径は、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，３０，４０，５０ミクロン以上である。いくつかの実施例では、障害物の直径は１００，９０，８０，７０，６０，５０，４０，３０，２０，１０ミクロン以下である。この選別用障害物間の距離は変化してもよい。いくつかの実施例では、障害物間の距離は少なくとも１０，２５，５０，７５，１００，２５０，５００，７５０μｍである。いくつかの実施例では、障害物間の距離は最大で１０００，７５０，５００，２５０，１００，７５，５０，２５μｍである。さらに、障害物の直径、幅、長さは、少なくとも５，１０，２５，５０，７５，１００，２５０μｍであり、最大で５００，２５０，１００，７５，５０，２５，１０μｍである。障害物の高さも様々であってもよいが、好適には選別される最も大きな検体と同等かこれ以上である。いくつかの実施例では、選別用障害物の高さは１０−５００ミクロン、２０−２００ミクロン、３０−１００ミクロン、４０−５０ミクロンである。いくつかの実施例では、選別用障害物は１５００，１０００，５００，４００，３００，２００，１００，９０，８０，７０，６０，５０，４０，３０，２０，１０ミクロン以下である。
【０１０１】
検体サイズ
いくつかの実施例では、選別モジュールは、液体サンプルから検体（稀有な細胞）を分離するのに適合した第１の選別領域を具え、この検体の流体力学的サイズは２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０，９，８，７，６，５，４，３，２，１ミクロン以上である。より好適には選別モジュールは、液体サンプルから検体を選別するのに適合した第１の選別領域を具え、この検体の流体力学的サイズは１５，１４，１３，１２，１１，１０，９，８，７，６，５，４ミクロンより大きい。より好適には、液体サンプルから検体を選別するのに適合した第１の選別領域を具え、この検体の流体力学的サイズは１０，９，８，７，６，ミクロンより大きい。
【０１０２】
一実施例では、選別モジュールは、第１の選別領域と、第２の選別領域を具え、前記第１の選別領域は流体力学的サイズが少なくとも１５，２０，２５，３０，３５，４０ミクロン以上の検体を選別するよう構成され、前記第２の選別領域は流体力学的サイズが少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５ミクロン以上の検体を選別するよう構成され、前記第１の領域の基準サイズは、第２の領域の基準サイズより大きい。この第１および第２の選別領域は、互いに液体接続（液通）しており、第２の選別領域は第２の選別領域の下流に連続して設けられる。いくつかの実施例では、この選別領域はまた、流体力学的サイズが少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０ミクロン以上の成分を選別するよう構成された第３の選別領域を具えてもよく、ここで第２の領域の基準サイズは第１の領域の基準サイズより大きい。この第３の選別領域は、前記第２の選別領域の下流に液体接続されている。この選別モジュールは選択的に、それぞれサンプルからごく小さな成分を選別する上述したような追加の領域を具えてもよい。
【０１０３】
一実施例では、選別モジュールは、流体力学的サイズ（例えば直径）が１５ミクロン以上の検体を、これ以下の成分の流れる方向から離れて主チャネルに案内するよう構成され；第２の選別領域はサンプル中の流体力学的サイズ（例えばサイズ）が７．５ミクロン以上の成分を、これ以下の成分の流れる方向から離れて主チャネルに案内するよう構成され；第３の選別領域はサンプル中の流体力学的サイズ（例えばサイズ）が５ミクロン以上の成分を、これ以下の成分の流れる方向から離れて主チャネルに案内するよう構成される。上記実施例は特に、血液サンプルから赤血球を選別するのに有用である。
【０１０４】
もちろん、上記の選別モジュールは液体サンプルからより小さな、あるいはより大きな成分を選別するよう構成されてもよい。例えば、いくつかの実施例では、選別モジュールは直径４ミクロン以上のすべての成分を選別するよう構成される（例えば、胎児有核赤血球、有核赤血球、白血球）。いくつかの実施例では、選別モジュールは血液サンプル中の有核細胞を非核細胞から分離するよう構成される。
【０１０５】
いくつかの実施例では、選別デバイスは液体サンプル（例えば、血液サンプル、尿サンプル、他の身体サンプル）の細胞種類または関心ある成分を濃縮するのに用いられ、ここでは細胞種類または関心ある成分は生体内で全血液細胞の５０，４０，３０，２０，１０％以下の濃度で見られ、あるいはより好ましくは全血液細胞の０．９，０．８，０．７，０．６，０．５，０．４，０．３，０．２，０．１％以下であり、より好ましくは全血液細胞の０．０９，０．０８，０．０７，０．０６，０．０５，０．０４，０．０３，０．０２，０．０１以下、より好ましくは全血液細胞の０．００９，０．００８，０．００７，０．００６，０．００５，０．００４，０．００３，０．００２，０．００１以下、より好ましくは全血液細胞の０．０００９，０．０００８，０．０００７，０．０００６，０．０００５，０．０００４，０．０００３，０．０００２，０．０００１以下、より好ましくは全血液細胞の０．００００９，０．００００８，０．００００７，０．００００６，０．００００５，０．００００４，０．００００３，０．００００２，０．００００１以下である。
【０１０６】
特異性／感度
いずれの実施例においても、サイズ式選別装置は、向上させた有効性をもって混合された細胞集団（例えば全体血液）から１またはそれ以上の細胞種類を選別するのに用いることができる。例えば、サイズ式選別装置は、選別後に全体血液サンプルから総ての有核細胞の≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．９％を確保し、より好ましくは母体血液サンプルから総ての有核胎児赤血球の≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．９％を確保する。同様に、上記装置は選別後に全体血液サンプルから総ての上皮細胞の≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．９％を確保し、あるいは血液サンプルから総ての癌細胞の≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．９％を確保する。同時に、本選別モジュールはまた、液体サンプルから望まない検体（例えば赤血球や血小板）の選別後に全体血液サンプルから総ての有核細胞の≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．９％を取り除く。図８は、このサイズ式選別モジュールの一実施例で得られる特異性および感度のいくつかの例を示す。
【０１０７】
上述したステップのいずれかまたは総てが、生成物の最低限の希釈で生じうる。いくつかの実施例では、関心ある所望の検体は元のサンプルの５０，４０，３０，２０，１０，９．０，８．０，７．０，６．０，５．０，４．５，４．０，３．５，３．０，２．５，２．０，１．５，１．０，０．５倍以下の溶剤内で確保され分離される。いくつかの実施例では、上記ステップのいずれかまたは総てが、所望の生成物を濃縮しつつ生じうる。例えば、濃縮された関心ある検体は、最終的な濃縮溶液で元のサンプルより少なくとも１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，２０００，３０００，４０００，５０００，６０００，７０００，８０００，９０００，１０，０００，１００，０００，５００，０００倍濃縮されている。例えば、血液サンプルから第１の細胞種類を１０倍濃縮すると、本装置にかけた後にサンプル中の全細胞における第１の細胞種類の比率が１０倍大きくなる。このような濃縮は、関心ある稀有な成分を含む総量１０ｍＬまたは２０ｍＬ以上の液体サンプル（例えば血液サンプル）に用いられ、このような関心ある稀有な成分を総量５ｍＬ以下に濃縮することができる。
【０１０８】
一実施例では、選択的または非選択的にサンプル中の検体の流体力学的サイズを増大させる試薬がサンプルに加えられる。この調整されたサンプルは、本発明の障害物アレイに通される。検体が肥大され、流体力学的サイズが大きくなると、大きな障害物アレイで隙間サイズをより簡単に製造することが可能となる。好適な実施例では、肥大化ステップおよびサイズによる濃縮は、装置の統合した方法で達成される。適切な試薬は様々な低浸透圧溶剤を含み、例えば脱イオン水、２％糖液、または非水系溶剤がある。他の試薬は、例えば選択的（例えば抗体やアビジンビオチンを通して）または非選択的に結合する磁気またはポリマなどのビードを含む。
【０１０９】
別の実施例では、選択的または非選択的にサンプル中の検体の流体力学的サイズを減少させる試薬がサンプルに加えられる。サンプル中の粒体サイズを非均一に減少させると、検体間で粒体力学的サイズの差が大きくなる。例えば、有核細胞は、高浸透圧で細胞を収縮させることにより除核細胞から分離される。この除核細胞は非常に小さな粒体へと収縮するが、有核細胞は核サイズ以下には収縮しない。収縮剤の例は、高浸透圧溶剤がある。
【０１１０】
代替的な実施例では、親和性機能ビードを用いて、関心ある粒体の体積をサンプル中にある他の粒体に比べて増大させ、これによりより大きくより製造が簡単な隙間サイズの障害物の運用を可能とする。
【０１１１】
いずれの実施例でも、液体は装置に動的または静的に通されてもよい。液体は、電界、遠心力、圧力駆動流、電気浸透流、毛細管現象を用いて送り出してもよい。好適な実施例では、フィールドの平均の方向はアレイを含むチャネルの壁に平行である。
【０１１２】
捕獲による分離
本システムは、選択的に１またはそれ以上の捕獲モジュールを具えてもよい。捕獲モジュールは、その移動または動きを制限または禁ずることにより、あるいは捕獲部分と多重化することにより、液体サンプルから関心ある検体（例えば細胞）を濃縮する。いくつかの実施例では、前記捕獲モジュールは親和性に基づく選別を用いるが、親和性を用いる選別は単なる選択肢である。
【０１１３】
この捕獲モジュールは、高度に独特であり選択的である。いずれの実施例でも捕獲モジュールは好適に、液体サンプルから関心ある検体（例えば胎児細胞や上皮細胞）の分離において５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％以上の特異性を有する。いずれの実施例でも、捕獲モジュールは好適に、液体サンプルから関心ある検体（例えば胎児細胞や上皮細胞）の分離において５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％以上の感度を有する。
【０１１４】
さらに、いずれの実施例でも、関心ある検体は捕獲モジュールにより、５，２，１，５ｘ１０−１，２ｘ１０−１，１ｘ１０−１，５ｘ１０−２，２ｘ１０−２，１ｘ１０−２，５ｘ１０−３，２ｘ１０−３，１ｘ１０−３，５ｘ１０−４，２ｘ１０−４，１ｘ１０−４，５ｘ１０−５，２ｘ１０−５，１ｘ１０−５，５ｘ１０−６，２ｘ１０−６，１ｘ１０−６，５ｘ１０−７，２ｘ１０−７，または１ｘ１０−７検体／μＬ液体サンプル以下の初期濃度から濃縮（すなわち分離）できる。また、いずれの実施例でも、捕獲モジュールは、サンプル中の全検体の１％未満の検体（例えば細胞）、またはサンプル（例えば人間などの動物から取得された血液サンプル）中の全検体（例えば細胞）の１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％、０．０００２％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００２％、０．００００１％、０．０００００５％、０．００００２％、０．０００００１％以下を選別しうる。捕獲モジュールは、このような関心ある検体の濃度を、少なくとも元のサンプルから１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、２００，０００，０００、５００，０００，０００、１，０００，０００，０００、２，０００，０００，０００、または５，０００，０００，０００倍以上増大できる。
【０１１５】
いくつかの実施例では、捕獲モジュールは、障害物アレイを有するチャネルを具える。これらの渉外部は１またはそれ以上の形状であってもよい。アレイは好適には二次元であり、障害物は順番に均一でも非均一でもよい。好適な実施例では、あれいは二次元で均一のアレイであり、障害物がジグザグ配置されている。
【０１１６】
捕獲モジュールの例が、国際公開番号２００４／０２９２２１と、米国特許番号５，６４１，６２８、５，８３７，１１５、６，６９２，９５２に開示されており、これらは総ての目的においてここに参照により組み込まれている。
【０１１７】
形状およびサイズ
結合量を増大させるには、障害物の表面積を増大するか、サンプルと障害物の接触空き数を増やすのが望ましい。したがって、本発明の捕獲障害物は、様々な形状および形態としてその表面積および／またはサンプルとの接触回数を増やしてもよい。あｓらに、障害物の形状およびサイズは、捕獲される検体や、サンプル濃度によって変化してもよい。捕獲モジュールで捕獲される検体が大きくなれば、障害物の捕獲も多くなる。いくつかの実施例では、障害物の高さは、１５００，１４００，１３００，１２００，１１００，１０００，９００，８００，７００，６００，５００，４００，３００，２００，１００ミクロン以下である。いくつかの実施例では、障害物の高さは２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，３００，４００，５００ミクロン以上である。
【０１１８】
同様に、障害物間の隙間のサイズも、捕獲される障害物のサイズにより変化する。いくつかの実施例では、障害物間の隙間は５０，４０，３０，２０，１０ミクロン以下である。いくつかの実施例では、障害物間の隙間は、関心ある検体の粒体力学的サイズの１０，９，８，７，６，５，４，３，２倍以下である。いくつかの実施例では、障害物間の隙間は、関心ある検体の粒体力学的サイズ以下である。このような実施例では、関心ある検体は障害物間に捉えられる。本発明は、関心ある検体より隙間が幅広いアレイと、関心ある検体より狭いアレイの双方を企図している。いくつかの実施例では、制限された隙間（関心ある検体と幅が同じか少ないもの）が、障害物アレイにわたって均一または非均一に分散されている。好適には、制限された隙間は非均一に障害物アレイにわたって分散されている。
【０１１９】
いくつかの実施例では、各障害物の直径は１５００，１４００，１３００，１２００，１１００，１０００，９００，８００，７００，６００，５００，４００，３００，２００，１００，９０，８０，７０，６０，５０，４０，３０，２０ミクロン以下である。別の実施例では、各障害物の直径は５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００ミクロン以上である。
【０１２０】
いくつかの実施例では、捕獲アレイ内の障害物は、選択的（そして選択的に可逆的）に液体サンプルの１またはそれ以上の成分を可逆的あるいは非可逆的に結合する。１の障害物は、例えば、選択的に液体サンプル中の細胞または成分に親和力を有する１またはそれ以上の捕獲部分を具える。このような捕獲部分は、例えば胎児細胞、赤血球、白血球、血小板、上皮細胞、癌細胞、内皮細胞、または他の稀有な細胞などの関心ある細胞または成分を特に結合する。例えば、いくつかの実施例では、捕獲部分は、赤血球または上皮細胞を特に結合する抗体（またはその断片）を具える。このような抗体は、例えば、それぞれ抗ＣＤ７１およびＥｐＣＡＭ抗体を含む。好適な実施例では、このような抗体は単一細胞である。捕獲部分となりうる他の抗体は、限定しないが、抗ＣＤ２３５ａ、抗ＣＤ３６、抗セレクチン、抗炭水化物、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗抗原ｉを含む。図６は、本発明の一実施例を示し、胎児細胞が結合部分（抗ＣＤ７１）に結合された障害物に結合されている。図７Ａは、ポストアレイを通る第１の検体のパスを示し、ここで特にポストに結合していない検体はアレイを通って移動を続け、ポストを結合していないアレイはアレイに捕獲される。図７Ｂは、抗体で覆われたポストの写真である。図７Ｃは、本発明により実装される、基板（例えば障害物や側壁等）への抗体の結合を示す。
【０１２１】
選別モジュールとともに、捕獲モジュールは、それぞれが選択的に異なる関心ある細胞および／または成分を結合する複数の領域を有してよい。複数の捕獲領域を有するモジュールを具えるシステムは、互いに直列に液体接続された２またはそれ以上の捕獲領域を具える。さらに、１のシステムが並列に液体接続された複数の選別モジュールを具え、同時に分析されるサンプル量を増大させてもよい。
【０１２２】
混合された細胞の集合（例えば血液）から第１の種類の細胞を濃縮する場合、好適には捕獲モジュールの表面に結合しうる少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の細胞が、混合物から取り除かれる。捕獲モジュールの表面コーティングは好適に、細胞の非特異性の結合を最小限にするよう設計される。例えば、結合部分との結合が不可能な細胞または検体の９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％は、捕獲モジュールの表面に結合されない。捕獲モジュールの選択的な結合により、特定の検体（活性細胞の集合）を細胞の混合物から分離しうる。装置には、検体（例えば細胞）が相互作用するよう装置の表面積を増やすよう障害物が設けられ、障害物を含むチャンバ内では結合の可能性が上昇する。流れの状態は、検体細胞が装置内で非常に優しく扱われ、障害物間を通るために機械的に変形する必要がない。正の圧力または負の圧力の送り出しもしくは流体の列からの流れを用いて、本発明のマイクロ流体デバイス（例えば捕獲モジュール）内またはその外へ細胞を移動させる。
【０１２３】
好適には、この方法は、最初の混合物に比べて所望の検体（例えば細胞）の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％を確保し、所望の検体の集合をサンプル中の検体量と比較して１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００の係数で濃縮する可能性を有している。
【０１２４】
いくつかの実施例では、捕獲モジュールは、１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００以上の障害物を有する。このような障害物を二次元アレイに整列させる場合、このアレイは、例えば、２，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１４０，１６０，１８０，２００，４００，６００，８００，１０００列の障害物を有する。
【０１２５】
磁気
いくつかの実施例では、捕獲モジュールが、１またはそれ以上の検体を分離および／または濃縮する目的で、磁気粒子、磁界、および／または磁気装置／装置部品を用いる。
【０１２６】
本発明の磁気粒子は、様々なサイズおよび／または形状であってもよい。いくつかの実施例では、磁気粒子の直径は５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５００ｎｍ以下である。いくつかの実施例では、磁気粒子の直径は１０−１０００ｎｍ、２０−８００ｎｍ、３０−６００ｎｍ、４０−４００ｎｍ、５０−２００ｎｍの間である。いくつかの実施例では、磁気粒子の直径は、１０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、５０００ｎｍ以上である。磁気粒子は乾燥しても液体に浸されてもよい。磁気粒子を含む液体サンプルと第２の液状媒体との混合物は、２００５年９月１５日出願の米国出願番号未付与の名称「Methods and Systems for Fluid Delivery」を含む様々な公知の手段で実現することができる。
【０１２７】
いくつかの実施例では、サンプル中の検体（関心ある、あるいはない検体）は、強磁性かそうでなくても磁性を有し、このような検体は磁界を利用して１またはそれ以上の他の検体（関心ある、あるいはない検体）から分離あるいは取り除くことができる。図８はこの捕獲メカニズムの実施例を示し、第１の検体が、この第１の検体を特に結合する抗体に結合され、この抗体もまたナノビードに結合されている。第１の検体−ナノビード複合体を含む検体の混合物と、第２の検体とが時価以内に供給された場合、前記第１の検体−ナノビード複合体が捕獲され、他の細胞は磁界内で移動を続ける。第１の検体は磁界を取り去ると解放される。
【０１２８】
磁界は、本装置の内部または外部にあってもよい。外部磁界は、ここにおけるデバイス（例えば容器、チャネル、障害物）外をソースとするものである。内部磁界は、ソースがここにおけるデバイス内にあるものである。
【０１２９】
いくつかの実施例では、選別される検体（例えば、関心あるまたは関心ない検体）が強磁性でない、あるいは磁性がない場合、磁気粒子はこのような検体を選択的に結合する結合部分と結合されてもよい。結合部分の例としては、限定しないが、ポリペプチド、抗体、核酸等がある。好適な実施例では、結合部分は関心ある検体（例えば赤血球、癌細胞、上皮細胞）と選択的に結合する抗体である。したがって、いくつかの実施例では、磁気粒子は、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ４５、抗ＥｐｉＣＡＭ、またはここに開示する様々な抗体でなる群から選択される抗体（好適には単クローン抗体）で覆われる。
【０１３０】
磁気粒子は、サンプルとの接触前に本明細書中の１またはそれ以上のデバイスと結合されてもよいし、サンプルをデバイスに供給する前にサンプルに混合されてもよい。
【０１３１】
いくつかの実施例では、このシステムは、捕獲されあるいは捕獲されない検体の磁性を変化させうる試薬（例えば磁気粒子）を収容するリザーバを具えてもよい。このリザーバは好適には１またはそれ以上の本デバイス／モジュールに液通している。例えば、いくつかの実施例では、磁気リザーバがサイズ式選別モジュールに接続され、別の実施例では、磁気リザーバが捕獲モジュールに接続されている。
【０１３２】
試薬の正確な性質は、検体の性質に依存する。試薬の例は、遷移金属の酸化剤または還元剤、ヘモグロビンを酸化または還元する試薬、検体に結合する磁気ビード、あるいは、鉄または他の磁気材料や粒子をキレート化させ、酸化させ、あるいは結合する試薬を含む。この試薬は、検体の磁性を変化させるよう作用し、磁界への吸着力を付与あるいは強化するか、磁界への反発力を付与あるいは強化するか、検体が磁界から影響を受ける磁性を除去する。
【０１３３】
磁界に反応する磁気粒子を、本発明の装置および方法に適用することができる。望ましい粒子は、表面の化学的性質が、例えば化学反応、物理的吸着、からみ合い、または静電相互作用により、化学的または物理的に変更可能なものである。
【０１３４】
捕獲部分は、この分野で公知の様々な手段で磁気粒子に結合されてもよい。例として、化学反応、物理的吸着、からみ合い、または静電相互作用がある。磁気粒子に結合される捕獲部分は、対象とする検体の性質に依存する。捕獲部分の例は、限定しないが、蛋白質（例えば抗体、アビジン、細胞表面レセプタ）、荷電または非荷電のポリマ（例えばポリペプチド、核酸、合成ポリマ）、疎水性または親水性のポリマ、小細胞（例えばビオチン、受容体リガンド、キレート剤）、炭水化物、イオンなどがある。このような捕獲部分は特に、細胞（例えば細菌性、病原性、胎児細胞、胎児血液細胞、癌細胞、血液細胞）細胞小器官（例えば核）、ウィルス、ペプチド、蛋白質、炭水化物、ポリマ、核酸、超分子複合体、その他の生物学的分子（例えば、有機あるいは無機分子）、小分子、イオン、またはこれらの組合せ（キメラ）か断片を含む。特に胎児細胞に用いる捕獲部分の例は、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ３６、抗セレクチン、抗ＧＰＡ、抗炭水化物、および完全トランスフェリン（holotransferrin）を含む。したがって、別の実施例では、捕獲部分は胎児細胞に特化している。
【０１３５】
検体の磁性が変化したら、サンプルの他の構成物と比較した検体の分離または濃縮に作用させるのに用いることができる。この分離または濃縮は、磁界を用いたポジティブ選択により所望の検体を磁界に引き寄せたり、ネガティブ選択で関心ない検体を引き寄せることを含む。いずれの場合でも、所望の検体を含む検体の集合は回収されて分析またはさらなる処理が行われる。
【０１３６】
この磁気選別を行う装置は、磁界を生成する様々な装置（例えば、ここに記載するいずれかの装置またはリザーバ）であってよい。一実施例では、ＭＡＣＳ列を用いて磁気改質検体の選別に作用させる。（例えば、ここに記載するいずれかの試薬を用いて）検体が試薬により磁気反応するようになった場合、前記ＭＡＣＳ列に結合され、これによりサンプルの他の成分と比較した所望のサンプルの濃縮が実現する。
【０１３７】
別の実施例では、選別は、好適には複数の磁気障害物を具えるマイクロ流体デバイスなどの装置を用いて達成される。（例えば、検体が本来有する磁性を強化するか、検体に磁気反応する粒子を結合することにより）サンプル中の検体が磁気反応するよう改変された場合、検体は障害物と結合し、これにより結合した検体の濃縮が達成される。代替的に、ネガティブ選択を用いてもよい。この例では、所望の検体が磁気反応しないようにして、あるいは所望しない検体に磁気反応粒子を結合する。この場合、所望しない検体が障害物に保持される一方で所望の検体は保持されず、これにより所望の検体が濃縮される。
【０１３８】
装置の磁気領域は、限定しないが、例えば希土類材料、ネオジミウム−鉄−ボロン、鉄−クロミウム−コバルト、ニッケル−鉄、コバルト−プラチナ、およびストロンチウムフェライトなどの硬磁性または軟磁性材料で作成することができる。装置の一部は、磁気材料から直接製造でき、あるいは磁気材料を別の材料に適用してもよい。硬磁性材料を用いると、他の作動を必要とせず磁界が生成されるため、装置の設計を単純化することができる。しかしながら軟磁性材料は、材料を消磁することにより結合した検体を簡単に解放して下流へ送ることができる。磁気材料によっては、適用プロセスは、陰極スパッタリング、焼結、電着、またはポリマ結合磁気粉体の合成物の薄膜フィルムコーティングを含む。好適な実施例は、ポリイミド−ストロンチウムフェライト（ポリイミドが結合剤として、ストロンチウムフェライトが磁気フィラーとして作用する）などのポリマ複合体を用いた回転成形によりマイクロ加工した障害物（例えばシリコンポスト）の薄膜コーティングである。コーティング後、ポリマ磁気コーティングが硬化して安定した機械的特性が得られる。硬化後、装置は短期間外部の誘導電磁界にさらされ、これが装置内の永久磁石の方向付けを好適に決定する。ポストからの磁界の磁束密度と固有の保磁力は、磁気フィラーの％量によって制御できる。
【０１３９】
別の実施例では、封入されたマイクロ流体装置の外側面に導電材料がマイクロパターン加工される。このパターンは、空間周期が約１００ミクロンである単一の電気回路からなる。この電気回路の設計と、回路を流れる電流の大きさとを制御することにより、風刺されたマイクロ流体装置内の高低磁気強度の周期的範囲を改善することができる。
【０１４０】
磁気粒子は、装置全体に均一に配分されてもよいし、空間的に分散した領域に配分されてもよい。さらに、磁気粒子は装置内で構造体を生成するのに用いることができる。例えば、チャネルの反対側に２つの磁気領域を用いて磁気粒子を引き付け、これら２つの領域を繋ぐ「ブリッジ」を形成してもよい。
【０１４１】
上述したように、本発明は、バクテリア、ウィルス、菌、細胞、細胞成分、ウィルス、核酸、蛋白質、蛋白質複合体、炭水化物、これらの断片または組合せ（キメラ）などの検体を濃縮する分析装置を構成する。さらに、磁気特性に代えて、本装置はサンプル中の検体に様々な操作を加えるのに用いることができる。このような操作は、粒子の肥大化または集中、サイズ式の細分化、あるいは、粒子自体または粒子を運ぶ液体の改質を含む。好適には、本装置は異成分からなる混合物から稀有な検体（稀有な細胞）を濃縮したり、例えば懸濁液内の液体を交換したり検体に試薬を接触させたりすることにより稀有な検体を改質したりするのに用いる。このような装置は、例えば細胞の機械的溶解や細胞内活動が少なく、細胞に与えるストレスを限定しつつ高度の濃縮が可能である。
【０１４２】
最初に細胞の例を説明したが、本発明の装置は、本発明の装置で選別可能なサイズの様々な検体に用いることができる。
【０１４３】
本発明の装置は、例えば検体が接触しており、互いに流体力学的に相互作用し、あるいは別の検体の周囲で流量配分に影響を与える、濃縮されたサンプルに用いることができる。例えば、この方法は、人間のドナーの全体血液の赤血球から白血球を選別することができる。人間の血液は通常、体積の４５％以下の細胞を含む。細胞は、アレイを通ると粒体力学的に互いに物理的に接触および／または結合される。
【０１４４】
本発明の方法は、サンプルから１またはそれ以上の検体を、当該１またはそれ以上の検体の磁気特性に基づいて選別するステップを含む。一実施例では、サンプルに、検体の磁気特性を改質する試薬が加えられる。この改変は、磁気粒子により達成される。一実施例では、粒子（例えば磁気粒子）が装置の表面に結合され、装置内でサンプル中の所望の検体（例えば胎児細胞、病原体の細胞、癌細胞、または細菌性の細胞などの稀有な細胞）が確保される。したがって、検体または関心ある検体は、その後装置の表面に結合する。別の実施例では、所望の検体は装置内でサイズ、形状、変形能に基づく機構を通して確保される。別の実施例では、ネガティブ選択が採用され、ここでは所望の検体は磁気粒子に結合されない。いずれの実施例でも、ＭＡＣＳ列を用いて検体（例えば、磁気粒子に結合した検体）を保持するようにしてもよい。ポジティブ選択の場合、少なくとも検体の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が装置内に確保されることが望ましい。装置の表面は、対象でない検体の非特異的な結合を最小限にするよう望ましく設計される。例えば、対象でない検体の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％が装置内に留まらない。この装置内の選択的な保持により、例えば血液、唾液、尿、土壌、空気、または水サンプルなどの混合物から特定の検体の集合の選別を達成することができる。
【０１４５】
検体の選択的な確保は、本発明の装置内に磁気粒子を導入することにより達成できる。捕獲部分を磁気粒子に結合させ、対象とする検体の特異的な結合に作用させてもよい。別の実施例では、選択されたサイズ、形状、または変形能の検体のみが装置を通過できるよう磁気粒子が配備される。これらの実施例の組合せも想起しうる。例えば、１の装置はサイズに基づいて特定の検体を保持するように構成し、他の装置は結合度（binding）に基づくようにしてもよい。さらに、１の装置が例えば直列的、並列的、あるいは装置内で領域が散在するように、１より多い関心ある検体を拘束するよう設計され、あるいは２またはそれ以上の捕獲部分が同じ磁気粒子または例えば同じ障害物または領域に結合された隣接する粒子に分配される。さらに、同じ検体（例えば抗ＣＤ７１および抗Ｃｄ３６）に特化した複数の捕獲部分を、同じか異なる磁気粒子に、例えば同じか異なる障害物または領域に適用してもよい。
【０１４６】
磁気粒子を装置内に存在する障害物に取り付け（あるいは、障害物を成形するよう操作し）、検体と相互作用する面を増やして結合が生じやすくしてもよい。流れの状態は通常、ダメージが生じないよう検体が装置内で非常に優しく扱われるようにされている。正の圧力または負圧の付与あるいは柱（column）からの流れを適用して、本発明のマイクロ流体装置へ、またはここから検体を送ってもよい。この装置は穏やかな処理が可能であり、かつ各検体が１またはそれ以上の磁気粒子と衝突する頻度を最大化する。対象とする検体は磁気粒子と衝突し、様々な捕獲部分と相互作用する。この捕獲部分は、装置内で磁気吸着するよう設計された障害物と共存しうる。この相互作用により、規定された場所の対象とする検体が捕獲され保持される。代替的に、検体は、例えばサイズ、形状、または変形能に基づく装置の通りにくさにより保持される。捕獲された検体は、磁気粒子を保持している磁気領域を消磁することにより解放される。選択的に検体を領域から解放するには、消磁は選択された障害物または領域に限定してもよい。例えば、磁界は電磁的に設計され、個々の領域または障害物で磁界のオンとオフが自在に可能であってもよい。別の実施例では、検体は、例えば化学的分離または非共有結合性の相互作用の解除により、検体と捕獲部分との結合を解除することにより解法されてもよい。例えば、いくつかの鉄粒子をＤＮＡ環を介して単一細胞の抗体に結合（link）させ、ＤＮＡｓｅを使用すると鉄粒子から検体を付着および脱着することができる。代替的に、抗体を破片にするプロテアーゼ（例えばパパイン）を用いて、技師が選択的に解放してもよい。特に強い磁気領域では、磁気粒子を磁気領域から解放するために磁気粒子の反発力を増大させてもよい。別の実施例では、捕獲された検体は解放されず、確保されたまま分析されさらなる処理が行われる。
【０１４７】
一実施例では、装置は複合混合物からトランスフェリンレセプタを表す（expressing）細胞を捉え分離させるよう構成されている。ＣＤ７１レセプタへの単一細胞の抗体は、例えば、限定しないが、ポリスチレンにドープした鉄と鉄粒子または鉄コロイド（例えば、Ｍｉｌｔｅｒｎｙｉ  ａｎｄ  Ｄｙｎａｌ社から）などの磁気材料と電子共有結合した既製品である。磁気粒子に結合したＣＤ７１のｍＡＢが、装置に流し込まれる。抗体でコートした粒子が障害物（例えば、ポスト）、床、壁に供給され、粒子と磁界の間の磁界作用の強度により保持される。障害物間の粒子と、障害物から離れて局所的な磁界の作用範囲にゆるく保持されたものが、すすぎにより除去される（この流量は、障害物から離れた検体にかかる流体力学的剪断ストレスが磁界強度より大きくなるよう調整される）。
【０１４８】
上記実施例に加え、本装置は、食品産業における病原体検査、化学的および生物学的な危険性に関する環境サンプリングにおける、血液由来の病原体、細菌性およびウィルス性の荷重（load）、水性媒体に可溶性の風媒の病原体の分離と検出に利用可能である。さらに、磁気粒子を捕獲部分や混成候補薬剤と共存させる。関心ある細胞の捕獲はさらに、捕獲した細胞を固定化混成薬剤と相互作用させるため分析される。したがって本装置は、高スループットで薬剤開発プロセスに用いるため、および二次的に細胞ベースの候補薬剤の検査のために、細胞の部分母集団を複合混合物から分離し、これらの混成候補薬剤との反応を検査することの双方に利用可能である。別の実施例では、例えば磁気粒子上や候補リガンド（または作用薬あるいは拮抗薬）の複合混合物内を流れるレセプタなどの捕獲部分を局所化することにより受容体リガンド作用の研究を本装置で実施可能である。関心あるリガンドは捕獲され、例えば二次的に蛍光プローブで染めることにより結合を検出可能である。本実施例は、組織や細胞の消化（digest）から抽出した複合混合物からの公知のリガンドの存在または不在を迅速に特定することができ、または候補薬剤化合物を特定できる。
【０１４９】
サイズ式選別と組み合わせた捕獲
ここにおける実施例では、サイズ式選別モジュールと、捕獲モジュールが好適に液体接続されている。例えば、選別モジュールの第１の出口が捕獲モジュールと液体接続される。捕獲モジュールを通るサンプルの平均流量は、選別モジュールと同じであっても異なってもよい。いくつかの実施例では、捕獲モジュールを通るサンプルの平均流量は、１，２，３，４，５，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００ｍＬ／時間より大きい。
【０１５０】
いくつかの実施例では、選別モジュールと捕獲モジュールが一体構成され、複数の障害物は、特定の検体をサイズによって偏向させて関し成る検体の方向と異なる流路へと導くのと、特定の検体をサイズ、親和性、磁気、または他の物理特性に基づき捕獲するのとの両方として作用する。
【０１５１】
ＩＩＩ検出／分析
いずれの実施例でも、濃縮した検体（例えば稀有な細胞）やその成分（他とｅｂあ、各や染色体）の検出および／または分析は、その全体または一部を人間または分析器で行うことができる。濃縮した検体が細胞の場合、検出／分析の前に浸透または溶解される。本発明の分析器は、高スループットの濃縮検体（例えば、血液や危険な検体からの稀有な細胞）の検出／分析用に自動化されている。分析器による検出および分析は、連続的なステップで行ってもよいし、１のステップに組み合わされてもよい。好適には、検出と分析は単一のステップで行われる。
【０１５２】
分析器は、公知の様々なサンプル分析装置を含んでもよく、例えば、顕微鏡、マイクロアレイ、細胞カウンタ等である。分析器はさらに、コンピュータ、データベース、メモリシステム、システム出力（例えばコンピュータ画面またはプリンタ）の１またはそれ以上を具えてもよい。好適な実施例では、分析器はコンピュータ読み出し可能な媒体、例えばフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープ、または濃縮検体に検出または分析を行う一連の命令を含むプログラムコードを具える他のデジタル保存媒体、を具えてもよい。いくつかの実施例では、コンピュータ実行可能なロジックまたは分析器のプログラムコードが記憶媒体に保存され、これがコンピュータにロードされおよび／または実行され、あるいは電気配線やケーブル、光ファイバ、電磁放射などの伝送媒体を介して伝送される。汎用のマイクロプロセッサに実装される場合、コンピュータ実行可能なロジックは、このマイクロプロセッサに特定の論理回路を生成するよう構成する。好適には、このコンピュータ実行可能なロジックは、サンプル提供、濃縮、検出および／または分析を含むここに記載されたタスクの一部または全部を実行する。
【０１５３】
いくつかの実施例では、分析器は、サイズし基線別モジュールまたは捕獲モジュールと液体接続される。いくつかの実施例では、濃縮検体（例えば関心ある細胞）が捕獲モジュール／サイズ式選別モジュールから取り出され、ガラススライドまたは細胞分類装置に供給されて分析される。好適な実施例では、この細胞分類装置は複数の検体（例えば細胞）をアドレス可能な場所に保持する。このような実施例の例が、米国特許番号６，６９２，９５２に開示されており、すべての目的においてここに参照により組み込まれる。このようなモジュールは、アドレス可能な場所からの細胞を選択的に解放するよう構成されたアクチュエータを具えてもよい。
【０１５４】
いくつかの実施例では、分析器は、関心ある１またはそれ以上の検体を視覚化するといった検出ステップを実行するよう構成される。関心ある検体の視覚化は、サイズ式選別モジュールおよび／または捕獲モジュールの障害物を覆う透明なカバーまたは蓋を通じて実現する。いくつかの実施例では、分析器は、例えば光学顕微鏡、明視野光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡などの顕微鏡を具える（好適には捕獲モジュールに液体接続される）。いくつかの実施例では、分析器はデュアルスキャン機能（例えば、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いる）を有する。好適には、分析器は濃縮検体（関心ある検体を含む）の三次元画像を提供する。例えば、コンピュータコードで、濃縮サンプル中の胎児有核赤血球を含む総ての有核赤血球を検出可能である。いくつかの実施例では、分析器は、カメラやビデオカメラといった画像装置を具える。このような画像装置は、（関心ある検体を含む）検体の画像を取得するのに用いられる。例えば、、画像装置は、母体の血液サンプルから取得される１またはそれ以上のｆｎＲＢＣの画像を取得可能である。上記のいずれも、濃縮検体を描写し保存するコンピュータ実行可能なロジックにより制御可能である。
【０１５５】
いくつかの実施例では、分析器は、例えば癌細胞、内皮細胞、上皮細胞などの関心ある検体を計数する分析ステップを実行するよう構成される。このような分析器は、例えば、細胞カウンタを具える。サンプル中で検出される関心ある検体の数は、（例えば癌の）診断または状態予測を行うのに用いることができる。いくつかの実施例では、分析器は既知のデータポイントから収集されるデータを比較する（および選択的に保存する）。いくつかの実施例では、分析器は、ケースサンプルおよび対照試料から収集したデータを比較し（および選択的に保存し）、付随する研究を実行する。
【０１５６】
いくつかの実施例では、分析器は、濃縮検体、関心ある検体、またはその成分を選択的に結合する１またはそれ以上のプローブからプローブ信号を検出する、コンピュータ実行可能なロジックを具える。いくつかの実施例では、このコンピュータ実行可能なロジックはまた、このような信号の強度、サイズ、形状、アスペクト比、および／または分布を分析する。このコンピュータ実行可能なロジックは、プローブ信号の分析結果に基づいてその後命令を生成しうる。
【０１５７】
検出器で検出／分析可能な信号のプローブの例は、限定しないが、蛍光プローブ（例えば、胎児細胞内のＸ、Ｙ、１３、１８、２１といった染色体を染色する）、発色プローブ、間接免疫剤（例えば、二次酵素と結合された未分類の一次抗体）、量子ドット、またはフォトンを放出する他のプローブである。いくつかの実施例では、本分析器は、蛍光プローブよりリード時間がかなり早い発色プローブを検出する。いくつかの実施例では、分析器は、核型、その場ハイブリダイゼーション（in situ hybridization:：ＩＳＨ）（例えば、蛍光その場ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、クロモゲンその場ハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、ナノゴールドその場ハイブリダイゼーション（ＮＩＳＨ））、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、フローサイトメトリー、電子顕微鏡法、量子ドット、および、単ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）またはＲＮＡレベルを検出する核酸アレイ、を実行するコンピュータ実行可能なロジックを具える。いくつかの実施例では、２またはそれ以上のプローブを使用する。例えば、複数のＦＩＳＨプローブまたは他のＤＮＡプローブを用いて単一の細胞おや関心ある成分を分析してもよい。稀有な細胞を検出するためにＦＩＳＨを用いる方法が、Zhen, D. K., et. al. (1999) Prenatal Diagnosis, 18(11), 1181-1185, Cheung, MC., (1996) Nature Genetics 14, 264-268に開示されており、すべての目的においてここに参照により組み込まれる。ＣＩＳＨを用いる方法は、Arnould, L. et al British Journal of Cancer (2003), 88, 1587-1591、および米国特許公開2002/0019001に開示され、すべての目的においてここに参照により組み込まれる。
【０１５８】
例えば、母体血液からの濃縮された胎児細胞を分析する場合、分析器は、胎児細胞またはその成分を検出するよう構成される。いくつかの実施例では、胎児細胞またはその成分の分析が、胎児の性別特定、遺伝子異常（例えば、染色体／ＤＮＡ／ＲＮＡの異常）の存在／不存在、１またはそれ以上のＳＮＰを検出するのに用いられる。本分析装置で検出しうる染色体異常の例は、限定しないが、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、 Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、網膜芽腫（１３ｑ１４）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、トリソミー１３、トリソミー１６、トリソミー１８、トリソミー２１（ダウン症）、三倍体性、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）がある。本分析器で検出可能な性染色体異常の例としては、限定しないが、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、脆弱Ｘ染色体症候群、ターナー症候群（Ｘ染色体の損傷）、超雌または三染色体Ｘ、一染色体Ｘなどを含む。本分析器で検出／分析可能な他のあまり有名でない染色体異常は、限定しないが、欠失（小さな欠如部分）、微少欠失（単一の遺伝子のみを含む物質の微少量の欠如）、転座（染色体の一部が他の染色体と結合）、逆位（染色体の一部が切除され逆向きに挿入）を含む。
【０１５９】
いくつかの実施例では、検出器は、γおよびεグロビン、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、Ｉ抗体、ＣＤ３５からなる群から選択される抗体用に染色された検体（例えば細胞）を検出する。特に、本分析器は、抗εまたは抗γグロビン抗体あるいはその組合せで染めた細胞を検出できる。γとεグロビンの組合せは、妊娠１０−２４週のｆＮＲＢＣに９５−１００％見られる。A1 Mufti et al., (2001) Haematologica 85, 357-362; Choolani et al., (2003) Mol. Hum. Reprod., 9, 227-235。このε−γの組合せ、またはγグロビン単独が、ｆＮＲＢＣを染色するのに示されている。Bohmer, (1998); Choolani et al. (2003); Christensen et al., (2005) Fetal Diagn. Ther. 20, 106-112; Hennerbichler et al., (2002) Cytometry, 48, 87-92参照。両グロビンの抗体は当業者に知られており、様々なベンダから取得可能である。染色は、正または負の二値スコアで、または検体内の抗体量を示す様々な度合いで実現可能である。
【０１６０】
いくつかの実施例では、分析器は、ＧＰＡおよび／またはＣＤ７１用に染色された検体（例えば細胞）を検出する。ＧＰＡは赤血球系統を通して存在する。したがって、成熟度に拘わらず、各赤血球を特定するのに用いることができる。ＧＰＡは赤血球系統細胞でのみ見られると考えられ、通常は循環細胞で殆ど見つからず、妊娠期間に増大する。ＦＡＣＳ検査は、妊娠中はＣＤ７１とＧＰＡの組合せが少なくとも単核細胞の０．１５％現れることを示す。Price et al., (1991) Am. J. Obstet Gynecol., 165, 1713-1717; Sohda et al., (1997) Prenat. Diagn., 17, 743-752。いくつかの実施例では、分析器はＣＤ７１とＧＰＡに特化したプローブを検出するよう構成される。
【０１６１】
いくつかの実施例では、検出器はＩ抗体用に染色された検体（例えば細胞）を検出する。このＩ抗体は、患者の多クローン性の漿液を用いて１９５０年代に最初に開示された。連続的なデータは、抗原の２つの形態「Ｉ」または「ｉ」がそれぞれ大人と胎児の細胞を示すことを表している。より最近の構造上の証拠により、これらの抗原がＮアセチルアクトサミンの線形または分岐した繰り返しとして規定された。「ｉ」構造は、２つの酵素、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転位酵素と、β−１，４−ガラクトシル基転位酵素の作用で現れる。「ｉ」抗原の「Ｉ」への転位は、酵素（β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転位酵素）を介して生じる。これらの酵素用の遺伝子と染色体の座が近年特定された。Yu et al., (2001) Blood, 98, 3840-3845。より最近では、ｉ抗原用の抗体が、胎児細胞の分野で古くから用いられてきた。Kan et al., (1974) Blood 43, 411-415。これらは近年でも、分画密度遠心分離で取得された胎児細胞の検査に用いられている。Sitar et al. (2005) Exp. Cell. Res., 203, 153, 161。このように、特にｉ抗原と結合する抗体および抗体の断片は、本方法および合成物により胎児細胞を濃縮、分離、および検出するのに利用可能である。さらに、ｉ抗原は母体血液サンプル中の多くの胎児細胞を特定し（Sitar et al）、読み込み結果の速度を改善する。
【０１６２】
いくつかの実施例では、分析器は、濃縮サンプル中の稀有な細胞などの稀有な検体を特定／特性を表す一連の命令を提供するコンピュータ実行可能なロジックまたはコンピュータプログラムコードを具える。このコードはさらに、これらの稀有な検体を描写しこれらの画像を保存する命令を提供する。一実施例では、コンピュータ実行可能なロジックは、顕微鏡が稀有な細胞（例えば、胎児細胞や上皮細胞）を同定するように導く、コードはさらに、例えば、εグロビン、γグロビン、胎児ヘモグロビン、ＧＰＡ、ｉ抗原、ＣＤ７１、ＥｐＣＡＭ、またはこれらの組合せに特に結合する抗体などの、選択的に稀有な細胞またはその成分を結合するプローブを童貞する一連の命令を提供する。
【０１６３】
例えば、いくつかの実施例では、コンピュータ実行可能なロジックが、サンプル中の胎児有核赤血球を特定し、染色体などの稀有な細胞の成分特定および計数し、特に染色体１３，１８、２１，Ｘおよび／またはＹと結合するプローブを検出し、１またはそれ以上の単ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）を検出し、遺伝子配列の突然変異を検出し、ｍＲＮＡレベルを検出し、マイクロＲＮＡのレベルを検出するなどの命令を提供する。このコンピュータ実行可能なロジックはまた、例えば関心ある胎児核酸（例えば、染色体Ｘ、Ｙ、１３、１８、２１）と結合した１またはそれ以上の核酸プローブからのプローブの強度を検出および／または比較するコードと、プローブ強度の分析結果に関連するコールを生成するコードとを含む。
【０１６４】
図９Ａ−Ｄは、本発明の一実施例を示す図である。図９Ａは、スライドおまたは細胞アレイ装置に接続された顕微鏡に接続されたコンピュータを示す。図９Ｂは、明視野顕微鏡で視覚化した細胞を示す。図９Ｃは、ＸＸＹ細胞を示す。図９Ｄは、視野内の細胞の画像を示す。これはまた、様々なプローブ強度レベルを検出するコードの様々な特徴を示している。
【０１６５】
いずれの実施例でも、分析器は、ここに開示する様々なモジュールの１またはそれ以上を通るサンプルの流量を制御するコンピュータ実行可能なロジックを具える。
【０１６６】
ＩＶ  応用例
この装置／モジュールおよび方法は、限定しないが、既述した様々な応用例に用いることができる。
【０１６７】
出産前検診
いくつかの実施例では、このシステムおよび方法は、出産前検診を実施するのに利用することができる。例えば、妊娠した動物（好適には人間）からの末梢血液サンプルを取得して、ここに開示した前記方法および装置の１またはそれ以上を利用して濃縮する。好適には、母体血液サンプルは最初に１またはそれ以上のサイズ式モジュールを用いて濃縮し、血液サンプルから４ミクロンより大きい粒体力学的サイズの検体（すなわち胎児有核赤血球および母体白血球）を他の検体から分離する。次いで、胎児有核赤血球と母体白血球とを含む濃縮サンプルはさらに、１またはそれ以上の捕獲モジュールを用いて選別される。好適には、捕獲モジュールはポジティブに胎児血液細胞を白血球から選別する（選択的かつ開放可能に結合する）。この捕獲モジュールは、磁気粒子を用いないことが望ましい。いくつかの実施例では、捕獲モジュールは、抗ＣＤ７１単一細胞抗体で覆われた１またはそれ以上の障害物アレイを具える。このような装置に捕獲された細胞は、次に、ＦＩＳＨ検査、ＰＣＲ増幅、ＲＮＡ分析、ＤＮＡ分析等の１またはそれ以上を用いて遺伝子分析される。いくつかの実施例では、ＦＩＳＨ検査を用いて異数性の存在または不在を検出する。いくつかの実施例では、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析を用いて、濃縮した胎児細胞中のＳＮＰまたはｍＲＮＡレベルの１またはそれ以上を分析する。胎児細胞の寿命分析を検出するコンピュータ実行可能なロジックを具える分析器は、システムの自動化に用いることができる。この分析器はさらに、顕微鏡やマイクロアレイを具えてもよい。
【０１６８】
ｂ．癌診断
いくつかの実施例では、このシステムおよび方法は、癌診断を実施するのに利用することができる。例えば、癌の疑いのあるまたは癌の動物から周辺血液サンプルまたは他の液体を取得する。このサンプルは１またはそれ以上のサイズ式モジュールを通して流され、サンプルから８，１０，１２，１４，１６，１８，２０ミクロンより粒体力学的サイズが大きい検体が分離される。いくつかの実施例では、濃縮される細胞は、感染したＷＢＣ、幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、腫瘍細胞、癌細胞からなる群から選択される１またはそれ以上の細胞である。いくつかの実施例では、濃縮検体は選択的に、１またはそれ以上の上述した捕獲モジュールに通されてもよい。
【０１６９】
濃縮された細胞はその後分析され、例えばサンプル中の上皮細胞数、サンプル中の内皮細胞数、サンプル中の上皮／内皮の比、基準サイズより大きい全細胞のプロファイル、基準サイズより大きい全細胞の移動パターン、同時に異なる地点で同じ動物から採取した１以上の第２のサンプルに基づく特性の変化などが決定される。
【０１７０】
いくつかの実施例では、分析は、濃縮細胞を、特定のサイズ範囲の細胞を選択的に捕獲するか、関し成る細胞（例えば表面に１またはそれ以上のガンマーカーを示す癌細胞や上皮細胞）を選択的に捕獲する１またはそれ以上の捕獲モジュールに適用することを含む。いくつかの侍史ｓレ委では、濃縮された細胞はさらに分析され、細胞間のガンマーカーの存在または不在が決定される。いずれの実施例でも、さらに分析器を用いて細胞の検出、計数、分析を行ってもよい。
【０１７１】
本発明による診断または予測が実施される新生物の基準（neoplastic condition）は、乳癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、舌癌、脳癌、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、上皮小体癌、甲状腺癌、腎臓癌、神経細胞癌、頭部癌、頸部癌、大腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、腫瘍性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ細胞癌、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺癌、胆石腫瘍、島細胞腫瘍、原発生脳腫瘍、急性および慢性のリンパ腺および顆粒球性腫瘍、ヘアリーセル腫瘍、アデノーマ、過形成、髄様癌、クロム親和性細胞腫、粘膜神経腫、ｉｎｔｅｒｓｔｉｎａｌ神経節性過形成ｃｏｍｅａｌ神経細胞腫、マルファン症候群体型腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋肉腫、子宮頚部異形成およびそこの腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、軟部肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚障害、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、悪性カルシウム過剰血症、腎臓細胞腫、真性多血球血症、腺癌、多形神経膠芽腫、急性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、悪性黒色腫、および類表皮癌からなる群から選択されるものを含む。
【０１７２】
いくつかの実施例では、このシステムおよび方法は、獣医学的診断を実施するのに利用される。獣医学的診断は、好ましくは家畜化した動物から液体サンプル（例えば血液サンプル）を取得することを含む。家畜化した動物の例は、限定しないが、牛、鶏、豚、馬、兔、犬、猫、魚、山羊を含む。サンプルはその後１またはそれ以上のサイズ式モジュールを用いて濃縮され、例えば４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０ミクロンより大きな、または粒体力学的サイズ範囲（例えば６−１２ミクロンまたは８−１０ミクロンなど）の唯一の粒体力学的サイズの検体が分離される。濃縮された検体は、分析の前に、選択的に１またはそれ以上の追加の濃縮ステップにかけてもよい。例えば、いくつかの実施例では、濃縮検体は選択的に１またはそれ以上の上述した捕獲モジュールを通って流される。
【０１７３】
いくつかの実施例では、サンプルから濃縮される検体は胎児細胞である。このような細胞はその後、胎児の性別や胎児の状態を判定すべく検査される。
【０１７４】
いくつかの実施例では、サンプルから濃縮される検体は病原体である。動物から濃縮される病原体の例は、限定しないが、バクテリア、ウィルス、原生動物を含む（もちろん、このような応用例は家畜動物に限らず人間にも適用可能である）。濃縮したら、細胞はここに実現する検出／分析器を用いて分析される。このような分析器は、病原体感染種類、そのソース、治療処置等を特定するために、グラム陽性試験、ウィルス量試験、ＦＩＳＨ検査、ＰＣＲ検査等を実施可能である。
【０１７５】
いくつかの実施例では、サンプルから濃縮される検体は、内皮細胞または循環癌細胞である。このような細胞はさらに分析され、動物がかかった癌の出所、状態のひどさ、治療処置の有効性などが判定される。
【０１７６】
ｄ．バイオディフェンス
いくつかの実施例では、このシステムおよび方法は、バイオディフェンスまたは生物学的危険物質（例えば、バイオハザード検体）の存在を検出するのに利用することができる。バイオハザー検体は、限定しないが、人間、動物、植物に感染する有機体（例えば、パラサイト、ウィルス、バクテリア、菌類、プリオン、リケッチア）、細胞成分（例えば、組み換えＤＮＡ）、他の生物の病気の原因となるか環境または社会に有意な衝撃を与えうる生物学的活性剤（トキシン、アレルゲン、毒物）がある。バイオハザード検体となりうる病原体の例は、ペスト菌、炭疽菌、ボツリヌス菌、野兎病菌、コキシエラ菌、ブルセラ種、ブルクホルデリアつい骨、ブルクホルデリア仮性つい骨、連鎖球菌、エボラウィルス、ラッサウィルス、ＳＡＲＳ、大痘瘡、アルファウィルス、発疹チフスリケッチア、オウム病クラミジア、サルモネラ種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、コレラ菌、クリプトスポリジウムパルバム、ニパウィルス（Nipah virus）、ハンタウィルス、およびこれらのキメラを含む群から選択されるものを含む。バイオハザード物質は、本方法およびシステムを用いて検出可能であり、例えば例えば食品サンプル、水サンプル、空気サンプル、土壌サンプル、あるいは動植物からの生化学的サンプルである。
【０１７７】
いくつかの実施例では、本方法およびシステムで分析されたサンプルは、サンプル中の全検体の１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、０．０００００１％以下のバイオハザード検体を有しうる。さらに、いずれの実施例でも、バイオハザード検体は、初期濃度が５，２，１，５ｘ１０−１，２ｘ１０−１，１ｘ１０−１，５ｘ１０−２，２ｘ１０−２，１ｘ１０−２，５ｘ１０−３，２ｘ１０−３，１ｘ１０−３，５ｘ１０−４，２ｘ１０−４，１ｘ１０−４，５ｘ１０−５，２ｘ１０−５，１ｘ１０−５，５ｘ１０−６，２ｘ１０−６，１ｘ１０−６，５ｘ１０−７，２ｘ１０−７，または１ｘ１０−７バイオハザード検体／μＬ液体サンプル以下であってもよい。液体でないサンプルを分析する場合、様々な公知の手段でサンプルを熔解または液化することが望ましい。
【０１７８】
バイオハザード物質が分析されるサンプルは、１またはそれ以上のサイズ式選別モジュールに流される。好適には、このようなサイズ式選別モジュールは、バイオハザード検体の濃度を少なくとも１，０００または１０，０００倍増大させる。濃縮された検体は、これも選択的に１またはそれ以上の上述した捕獲モジュールに通してもよい。
【０１７９】
ｅ．研究
本システムおよび方法はさらに、研究を行うのに利用することができる。例えば、いくつかの実施例では、本システムおよび方法は、複数の対照試料と複数のケースサンプルから収集したデータに基づいて関連する研究を行うのに利用される。例えば、液体サンプル（例えば血液サンプル）は、１０，２０，５０，１００以上の個体（病気発現（phenotypic condition）がある個体）と、１０，２０，５０，１００以上の対照試料（病気発現がない個体）とから収集される。各個体からのサンプルはその後、第１または複数の検体について濃縮される。このような検体は次に計数され、および／または特徴付けられる。上記ステップによるデータは続いて、関連する研究を行うために利用される。データは好適には電子データベースに保存される。関連する研究は、ケースサンプルまたは対照試料に関連する１またはそれ以上の特徴を同定するコンピュータ実行可能なロジックを用いて行われる。
【０１８０】
好適な実施例では、関連する研究のため個体から採取された液体サンプルは、血液サンプルである。好適な実施例では、このようなサンプルから濃縮される検体は、流体力学的サイズが４ミクロンより大きく、あるいは６，８，１０，１２，１４，１６ミクロンより大きいものである。いくつかの実施例では、個体から採取されるサンプルは、ＲＢＣ、胎児ＲＢＣ、栄養膜、胎児栄養膜、赤血球（ＷＢＣ）、感染したＷＢＣ、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、前駆細胞、癌細胞、ウィルス性細胞、バクテリア細胞、および厳正動物からなる群から選択される１またはそれ以上の細胞が濃縮される。好適には、濃縮される細胞は、生体内での濃度が１ｘ１０−１、１ｘ１０−２、または１ｘ１０−３細胞／μＬ以下のものである。好適には、（濃縮された）関心ある細胞の９９％以上がサンプルから確保される。関連する研究を行うための濃縮により、関心ある第１の細胞腫類を少なくとも１０，０００倍濃縮できる。
【０１８１】
濃縮された検体は次に、１またはそれ以上の特性を判定するために分析される。このような特性としては、例えば、サンプル中の検体の存在または不存在、検体の量、２つの検体の比（例えば内皮細胞と上皮細胞）、１またはそれ以上の検体の形態、検体の遺伝子型、検体のプロテオーム、検体のＲＮＡ構造、検体内の遺伝子発現、マイクロＲＮＡレベル、あるいは濃縮検体の他の特性を含み、これが続いて関連する研究を行うために利用される。
【０１８２】
特性が対照試料に関連する場合、続いてこの特性は試験される患者の病気発現の不在を診断するのに用いられる。特性がケースサンプルに関連する場合、続いてこの特性は試験される患者の病気発現の存在を診断するのに用いられる。
【０１８３】
本発明が企図する病気発現の例は、限定しないが、癌、子宮内膜症、感染（例えばＨＩＶ、細菌性なと）、炎症、虚血、外傷、胎児異常などを含む。
【０１８４】
Ｖ．キット
本発明は、液体サンプルから検体を濃縮するキットを企図している。
【０１８５】
いくつかの実施例では、このようなキットは、選択的に母体血液サンプルから胎児細胞を濃縮するよう構成された捕獲モジュールに連結された１またはそれ以上の選別モジュールを具える。
【０１８６】
選別モジュールは高感度であり、９８％以上または９９％以上の感度で胎児細胞を濃縮することが望ましい。いくつかの実施例では、１またはそれ以上の捕獲モジュールが選別モジュールに液体接続されている。キットはさらに、濃縮された胎児細胞を分析して出産前検診を行う一連の説明を具えてもよい。このキットで行える出産前検診は、限定しないが、胎児の性別、染色体１３・染色体１８・染色体２１（ダウン症）の存在、ターナー症候群（Ｘ染色体の損傷）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、または他の性染色体あるいは常染色体の数の異常の発現、あるいはＷｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫がある。
【０１８７】
いくつかの実施例では、このキットは、選択的に血液サンプルから上皮細胞または癌細胞を濃縮する捕獲モジュールに連結された、１またはそれ以上の選別モジュールを具える。このようなモジュールは高感度であり、９８％以上または９９％以上の感度で胎児細胞を濃縮することが望ましい。好ましくは、選別モジュールと捕獲モジュールがともに同じ基板上にある。このキットはさらに、癌の出所、癌の転移、処置の有効性、予後などを検出する１またはそれ以上のラベリング試薬を具えてもよい。このような試薬は、細胞表面のガンマーカーを特に結合する抗体を具える。このキットはさらに、癌診断を行うために濃縮細胞を分析する一連の説明を具えてもよい。
【０１８８】
この方法を用いて診断できる癌の例は、限定しないが、乳癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、舌癌、脳癌、喉頭癌、胆嚢癌、膵臓癌、直腸癌、上皮小体癌、甲状腺癌、腎臓癌、神経細胞癌、頭部癌、頸部癌、大腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、腫瘍性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ細胞癌、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺癌、胆石腫瘍、島細胞腫瘍、原発生脳腫瘍、急性および慢性のリンパ腺および顆粒球性腫瘍、ヘアリーセル腫瘍、アデノーマ、過形成、髄様癌、クロム親和性細胞腫、粘膜神経腫、ｉｎｔｅｒｓｔｉｎａｌ神経節性過形成ｃｏｍｅａｌ神経細胞腫、マルファン症候群体型腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋肉腫、子宮頚部異形成およびそこの腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、軟部肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚障害、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、悪性カルシウム過剰血症、腎臓細胞腫、真性多血球血症、腺癌、多形神経膠芽腫、急性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、悪性黒色腫、および類表皮癌を含む。
【０１８９】
ＶＩ．ビジネス方法
このシステムおよび方法は、診断サービスおよび／または細胞診断用製品に用いることができる。診断用製品は、例えば、１またはそれ以上の選別モジュール、１またはそれ以上の捕獲モジュール、検出器、分析器、またはこれらの組合せを具えてもよい。
【０１９０】
出産前診断サービス
いくつかの実施例では、このビジネス方法は、出産前検査サービスを提供する。このようなビジネスは、胎児を診断しようとする哺乳動物からの血液サンプルを取得する。いくつかの実施例では、このビジネスは妊娠した患者（動物）から血液を採取するか、妊娠患者から直接血液を受けるかの双方が可能である。このビジネスは、血液サンプルの胎児細胞を濃縮し、胎児細胞に１またはそれ以上のスクリーニング試験を行って胎児の状態を判定する。判定される状態の例は、限定しないが、胎児の性別、染色体１３、１８、２１、Ｘ、Ｙなどの遺伝子異常、既知のＳＮＰに関連する状態、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫（１３ｑ１４）がある。本発明は他のすべての遺伝子疾患に対処させてもよい。
【０１９１】
このビジネス方法は、その後サービス料金と引き換えに状態のレポートを提供する。このレポートは、試験された患者に直接提供されてもよいし、医療提供施設、患者の保険会社、または政府に提供されてもよい。
【０１９２】
いくつかの実施例では、このビジネスは、ＣＬＩＡ研究所に濃縮および分析を委託してもよい。別の実施例では、このビジネスは濃縮ステップを行い、分析ステップを第三者（例えばＣＬＩＡ研究所）に委託してもよい。
【０１９３】
図１０Ａは、ここに開示するビジネス方法の一例を示す図である。このビジネスまたはＣＬＩＡ研究所、患者の医療提供者により、血液サンプル（例えば血液１６−２０ｍＬ）が妊娠女性から採取される。このビジネスまたはＣＬＩＡ研究所は、以下の１またはそれ以上のステップを実行する：（ａ）サンプルから赤血球と血小板を除去するよう構成されたサイズ式選別モジュールにサンプルを流すステップ；（ｂ）抗ＣＤ７１抗体に結合され選択的に白血球を超えて赤血球を結合する捕獲モジュールに通すステップ；（ｃ）磁気ビードを用いてサンプルを濃縮するステップ（例えば、ＣＤ７１でコーティングして前に行った濃縮ステップを繰り返す）；（ｄ）濃縮した細胞を配列する（例えば、サイトスピン２Ｄスライドに）；（ｅ）濃縮細胞に、Ｘおよび／またはＹ染色体を特に結合する１または２のＦＩＳＨプローブを加える；（ｆ）分析／検出モジュールを用いてＦＩＳＨプローブを検出する；（ｇ）濃縮された細胞から有核赤血球またはより好ましくは胎児有核赤血球を同定し、選択的にこれらを特徴付ける；（ｈ）胎児異常の検出の有無に関するレポートを、例えば試験した患者、医療施設、保険会社に提供する。
【０１９４】
図１０は、ここに開示するビジネス方法の別の実施例を示す図である。３２−４０ｍＬの血液を妊娠した女性から採取する。このサンプルは自動化されたサイズ式選別モジュールを通して流され、サンプルから赤血球と血小板が除去される。この自動選別モジュールは、供給装置に接続されている。このサンプルは次に、抗ＧＰＡ抗体に接続された捕獲モジュールを通して流される。このサンプルは次に、磁気ビードを用いて濃縮される（例えば、ＣＤ７１でコートして前に行った濃縮ステップを繰り返す）。残った濃縮細胞は、染色体Ｘ、Ｙ、１３、１８、２１用のＦＩＳＨプローブを有するサイトスピン２Ｄスライドに配列される。続いて上述した分析／検出モジュールか、好適には多スペクトル感応性画像システムを用いてＦＩＳＨプローブが読み取られ、有核ＲＢＣが特定され類別される。最後に、胎児異常の存在または不存在により胎児を診断する、試験された患者、医療提供者、または保険会社用のレポートが作成される。
【０１９５】
診断サービス−腫瘍学
いくつかの実施例では、このビジネス方法は、腫瘍学検査サービスを提供する。この方法により、診断される患者から液体サンプル（例えば血液）が採取される。このビジネスは次に１またはそれ以上の濃縮ステップを実施し、サンプルから癌細胞、腫瘍細胞、上皮細胞、内皮細胞、または癌の存在を示す多の細胞のいずれか１以上を濃縮する。上記の細胞は、ここに開示するいずれかのシステムおよび方法を用いて液体サンプルから濃縮される。濃縮後、細胞はさらに分析され（例えば、計数、特定の生体マーカ検査等）、この患者が癌を有するか否か、癌の出所、この患者に有効な治療法、癌の転移などが判定される。このビジネスにより作成されたレポートが、患者に直接、あるいは患者の医療提供者または保険会社に提供される。
【０１９６】
診断サービス−感染
いくつかの実施例では、このビジネス方法は、感染検査サービスを提供する。このサービスでは、感染が診断される哺乳動物から液体サンプル（例えば尿や血液）が採取される。いくつかの実施例では、、このビジネスは患者（動物）から直接血液を採取しサンプルを取得してもよい。いくつかの実施例では、サンプルがこのビジネスに配送される。このビジネスは次に、サンプルのスクリーニング試験を行い、１またはそれ以上の感染した細胞（例えば感染した白血球）または細菌性細胞、ウィルス、原生動物などの感染性組織を濃縮する。感染性組織はこのビジネスにより、ここに開示されたシステムおよび方法で濃縮可能である。この方法により選別／濃縮しうる循環性の病原体の例としては、ウィルス（例えばＨＩＶ、インフルエンザ、ＳＡＲＳ）、バクテリア（大腸菌、Ｈインフルエンザ、Ｓ肺炎、Ｍ髄膜炎など）、原生動物（マラリア原虫、トリパノソーマ、ｂｒｕｓｅｉ等）がある。いくつかの実施例では、この方法は血液サンプル中のＨＩＢ感染細胞の分離および検出に用いられる。このビジネスにより作成されたレポートが、患者に直接、あるいは患者の医療提供者または保険会社に提供される。
【０１９７】
診断用製品
いくつかの実施例では、本発明のビジネス方法は、血液サンプルから１またはそれ以上の検体を濃縮するのに適合した診断用製品を商業化する。例えば、１のビジネス方法は、ここにおける胎児細胞を選別し選択的に分析する１またはそれ以上の装置／モジュールを個々に、あるいは選択的に１またはそれ以上の試薬（例えばラベル試薬）とともにキットとして、販売することを企図している。このようなキットは、出産前検診用の説明を含んでもよい。別のビジネス方法は、循環する癌細胞を選別し選択的に分析する１またはそれ以上の装置／モジュールを個々に、あるいは選択的に１またはそれ以上の試薬（例えばラベル試薬）とともにキットとして、販売することを企図している。このようなキットは、癌検診を行うための説明書を有してもよい。別のビジネス方法は、循環する上皮細胞を選別し選択的に分析する１またはそれ以上の装置／モジュールを個々に、あるいは選択的に１またはそれ以上の試薬（例えばラベル試薬）とともにキットとして、販売することを企図している。このようなキットは、癌検診を行うための説明書を有してもよい。
【０１９８】
好適な実施例では、診断用製品は、１またはそれ以上の選別モジュールと、選択的に１またはそれ以上の捕獲モジュールを具える。この診断用製品は選択的に、状態検出のための検出／分析ツール（例えばコンピュータコードまたはソフトウェア）を具えてもよい。
【０１９９】
いくつかの実施例では、このビジネス方法は、診断ツールを製造する。いくつかの実施例では、このビジネス方法は、診断ツールの製造を第三者に委託する。いずれの実施例でも、診断ツールは好適に重合材料で製造され、選択的に使い捨て可能である。
【０２００】
検体の隔離
いくつかの実施例では、ビジネス方法は、費用と交換あるいはクロスライセンスで、ここにおけるシステムと方法を用いて１またはそれ以上の検体を隔離する。サンプルは例えば、血液サンプルまたは他の身体サンプルである。いくつかの実施例では、ＣＬＩＡ研究所または他の第三者機関が血液サンプルをこのビジネスに提供し、例えば胎児細胞、上皮細胞、癌細胞などの稀有な細胞を血液サンプルからこのシステムおよび方法を用いて隔離する。いくつかの実施例では、このビジネスは１またはそれ異常の個体から血液サンプルを取得し、このような血液サンプルから１またはそれ以上の治療的な血液成分、例えば血小板、白血球、循環幹細胞などを分離する。このような血液成分は次に、このビジネスにより料金をとって販売される。このような血液製品は、研究および／または治療目的を有する。
【０２０１】
ＶＩＩ．製造
本例では、標準的な写真石版術を用いて、絶縁体上シリコン（ＳＯＩ）ウェハに障害物のフォトレジストパターンを形成する。ＳＯＩウェハは、５００μｍ厚のＳｉ（１００）ウェハの上の１μｍ厚のＳｉＯ２層の頂上の１００μｍ厚のＳｉ（１００）ウェハから構成されている。フォトレジスト接着を最適化すべく、このＳＯＩウェハををフォトレジスト皮膜の前にヘキサメチルジシラザンの蒸気にさらしてもよい。ＵＶ反応性フォトレジストはウェハ上にスピンコートされ、９０°Ｃで３０分間焼かれ、クロム接触マスクを通してＵＶ光に３００秒当てられ、現像液で５分間現像され、９０°Ｃで３０分間後焼成される。このプロセスパラメータは、フォトレジストの性質および厚さにより変化してもよい。クロム接触マスクのパターンはフォトレジストに転写され、障害物の輪郭を決定する。
【０２０２】
障害物と同じフォトレジストパターンを形成したら、エッチングを開始する。ＳｉＯ２はエッチングプロセスのストッパとして作用する。このエッチングはまた、ストッパ層を用いることなく与えられた深さで止まるよう制御されてもよい。フォトレジストパターンは、プラズマエッチングにおいて１００μｍ厚Ｓｉ層に転写される。複合的なディープエッチングを用いて、均一な障害物を得るようにしてもよい。例えば、基板をＳＦ６が流れるフッ素高純度プラズマ（fluorin-rich plasma）に１５秒間あて、次にシステムはＣ４Ｆ８のみが流れる過フッ化炭化水素高純度プラズマに１０秒間切り替わり、ここで全面的に保護フィルムで覆われる。続くエッチングサイクルで、イオン衝撃にあてると水平面から優先的にポリマが除去され、例えばＳｉＯ２層に達するまでこのサイクルが複数回行われる。
【０２０３】
障害物表面に結合部分を結合させるには、結合部分が吸着するシリコン二酸化層を生成すべく表面変化させる前に、基板を酸素プラズマにあてる。基板はその後、蒸留した脱イオン化した水で２度すすいで空気乾燥される。サンプルを直前に準備した３−［（２−アミノエチル）アミノ］プロピルトリメトキシシランの２％ｖ／ｖ水溶液に３０秒間浸すことにより露出したガラスの上にシラン固定がなされ、その後さらに蒸留した脱イオン化水で洗浄される。基板はその後、窒素ガス内で乾燥され焼かれる。次に、リン酸燐酸塩でバッファしたサリン中の２．５％グルタルアルデヒド溶液に基板を常温で１時間浸す。基板はその後再びすすがれ、例えば抗ＣＤ７１などの結合部分を蒸留した脱イオン水の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に１５分間常温で浸し、結合剤が障害物に結合するのを待つ。その後基板は再び蒸留した脱イオン水ですすがれ、７０％エタノールに一晩浸して滅菌する。
【０２０４】
固定部分を障害物上および装置の表面に固定するには、上述した方法以外の複数の技術がある。表面上に単に物理吸着させることが、単純化とコスト面での選択となる。他のアプローチは、様々な結合部分で官機能を持たせた自己集合型単分子層（例えば金の上のチオール）を用いることである。結合される結合部分や装置を構成するのに用いられる材料によってはさらなる方法を用いてもよい。表面改質方法はこの分野で周知である。さらに、特定の細胞が材料の改質された表面に優先的に結合する。例えば、いくつかの細胞は、陽電荷を持たせた、負電荷を持たせた、あるいは疎水性の面、または特定のポリマに現れる化学薬品群に優先的に結合する。
【０２０５】
次のステップは、障害物を含む微細製造されたシリコンに最上層を接着することによりフロー装置を製造することを含む。最上部の基板はガラスであり、捕獲中およびその後に細胞を視認できるようになっている。熱接着またはＵＶ硬化性エポキシを用いて、フローチャンバを形成する。頂部と底部は例えばシリコンガスケットを用いて圧迫結合（compression fit）される。このような圧迫結合は解除可能である。他の接着方法（例えばウェハ接合）がこの分野で公知となっている。どの方法を用いるかは、使用する材料の性質による。
【０２０６】
細胞の消耗装置（the cell depletion device）は、異なる材料で製造することができる。材料の選択に応じて、異なる製造技術を用いてもよい。この装置は、例えばポリスチレンなどのプラスチックで熱エンボス技術を用いて作成することができる。障害物や必要な他の構造体は、プラスチックに型押しされ、底面が形成される。その後最上層が底部層と接着される。射出形成は、このような装置を作成しうる別のアプローチである。ポリ（脱メチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）からなるチャンバ全体をソフトな石版印刷を用いてもよいし、障害物のみをＰＤＭＳで成形してからガラス構造体と接着して閉じたチャンバを作成してもよい。さらなる他のアプローチはエポキシキャスト技術を用いた障害物形成であり、所望の構造体の反対のレプリカをもつマスターにＵＶまたは温度硬化型エポキシを用いる。レーザまたは他の種類のマイクロ加工アプローチを用いてフローチャンバを形成してもよい。装置を製造するのに利用可能な他の適切なポリマは、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ（メチルメタクリレート）である。さらに、鉄やニッケルなどの金属を用いて、例えば従来の金属加工により、本発明の装置を製造してもよい。三次元製造技術（例えば、ステレオリソグラフィー）を用いて装置を１ピースで製造してもよい。他の製造方法も知られている。
【実施例１】
【０２０７】
実施例１．シリコンデバイス多重１４トリプルステージ複式アレイ
図１１Ａ−１１Ｆは、本発明のサイズ式選別モジュールの例であり、以下のように特徴付けられる：
大きさ：９０ｍｍｘ３４ｍｍｘ１ｍｍ
アレイデザイン：３ステージ、隙間サイズ＝第１、第２、第３ステージでそれぞれ１８，１２，８μｍ。分岐比＝１／１０。複式（duplex）：単一バイパスチャネル
装置デザイン：多重１４アレイ複式；流れの安定のためのフローレジスタあり
装置の製造：アレイとチャネルは、標準的な写真石版術とシリコン反応平凹版技術を用いてシリコンで製造される。エッチング深度は１５０μｍである。液体アクセス用の貫通口がＫＯＨ湿式エッチングを用いて設けられる。シリコン基板はエッチング面がシールされ、血液と反応しない感圧接着剤（９７９５，３Ｍ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）を用いて封止された流体チャネルが形成される。
装置パッケージ：本装置は、血液と緩衝液を装置に供給し生成された画分を取り出すための外部流体リザーバを有するプラスチックマニホルドと機械的に連結されている。
装置の動作：外部圧力源を用いて緩衝液と血液のリザーバに２．４ＰＳＩの圧力をかけ、液体供給を調節しパッケージ装置から取り出す。
試験状況：承諾した人間の大人の血液を、Ｋ２ＥＤＴＡヴァキュテーナー（３６６６４３、ベクトンディッキンソン、フランクリンレイクス、ＮＪ）で採取する。生の血液は、上述した実施例の装置を用いて常温で９時間以内で処理される。血液からの有核細胞は、除核細胞（赤血球と血小板）から分離され、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａ８４１４−１００ＭＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含みカルシウムとマグネシウムを除去したＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（１４１９０−１４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）の緩衝液の流れにプラズマが供給される。
計測技術：Ｃｏｕｌｔｅｒインピーダンス血液分析器（ＣＯＵＬＴＥＲ（Ｒ）Ａｃ・Ｔ  ｄｉｆｆ（ＴＭ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて完全な血液計数が確定される。
パフォーマンス：図１２Ａ−１２Ｆは、血液分析器が血液サンプルと廃棄物（緩衝液、プラズマ、赤血球、血小板）と装置が生成する製品（緩衝液と有核細胞）画分とから作成した典型的なヒストグラムを示す。
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【実施例２】
【０２０８】
実施例２．シリコンデバイス多重１４シングルステージ複式アレイ
図１３Ａ−１３Ｄは、本発明の装置の例であり、以下のように特徴付けられる：
大きさ：９０ｍｍｘ３４ｍｍｘ１ｍｍ
アレイデザイン：１ステージ、隙間サイズ＝２４μｍ。分岐比＝１／６０。複式（duplex）：二重バイパスチャネル
装置デザイン：多重１４アレイ複式；流れの安定のためのフローレジスタあり
装置の製造：アレイとチャネルは、標準的な写真石版術とシリコン反応平凹版技術を用いてシリコンで製造される。エッチング深度は１５０μｍである。液体アクセス用の貫通口がＫＯＨ湿式エッチングを用いて設けられる。シリコン基板はエッチング面がシールされ、血液と反応しない感圧接着剤（９７９５，３Ｍ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）を用いて封止された流体チャネルが形成される。
装置パッケージ：本装置は、血液と緩衝液を装置に供給し生成された画分を取り出すための外部流体リザーバを有するプラスチックマニホルドと機械的に連結されている。
装置の動作：外部圧力源を用いて緩衝液と血液のリザーバに２．４ＰＳＩの圧力をかけ、液体供給を調節しパッケージ装置から取り出す。
試験状況：承諾した大人のドナーの人体血液を、Ｋ２ＥＤＴＡヴァキュテーナー（３６６６４３、ベクトンディッキンソン、フランクリンレイクス、ＮＪ）で採取する。生の血液は、上述した実施例の装置を用いて常温で９時間以内で処理される。血液からの有核細胞は、除核細胞（赤血球と血小板）から分離され、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａ８４１４−１００ＭＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含みカルシウムとマグネシウムを除去したＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（１４１９０−１４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）の緩衝液の流れにプラズマが供給される。
計測技術：Ｃｏｕｌｔｅｒインピーダンス血液分析器（ＣＯＵＬＴＥＲ（Ｒ）Ａｃ・Ｔ  ｄｉｆｆ（ＴＭ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて完全な血液計数が確定される。
パフォーマンス：この装置は、１７ｍＬ／時間で動作し、９９％以上の赤血球の取り出しが達成され、９５％以上の有核細胞が確保され、９８％以上の血小板が取り出される。
【実施例３】
【０２０９】
実施例３．胎児臍帯血の分離
図１４Ａ−１４Ｄは、胎児臍帯血から有核細胞を分離するのに用いる装置の概略図である。
大きさ：１００ｍｍｘ２８ｍｍｘ１ｍｍ
アレイデザイン：３ステージ。隙間サイズ＝第１、第２、第３ステージでそれぞれ１８，１２，８μｍ。分岐比＝１／１０。複式（duplex）：単一バイパスチャネル
装置デザイン：多重１０アレイ複式；流れの安定のためのフローレジスタあり
装置の製造：アレイとチャネルは、標準的な写真石版術とシリコン反応平凹版技術を用いてシリコンで製造される。エッチング深度は１４０μｍである。液体アクセス用の貫通口がＫＯＨ湿式エッチングを用いて設けられる。シリコン基板はエッチング面がシールされ、血液と反応しない感圧接着剤（９７９５，３Ｍ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）を用いて封止された流体チャネルが形成される。
装置パッケージ：本装置は、血液と緩衝液を装置に供給し生成された画分を取り出すための外部流体リザーバを有するプラスチックマニホルドと機械的に連結されている。
装置の動作：外部圧力源を用いて緩衝液と血液のリザーバに２．０ＰＳＩの圧力をかけ、液体供給を調節しパッケージ装置から取り出す。
試験状況：人体の臍帯血を、クエン酸ブドウ糖抗凝結剤を含むリン酸緩衝食塩水中に供給する。１ｍＬの血液を、上述の装置を用いて常温で３ｍＬ／時間で４８時間以内に処理する。血液からの有核細胞は、除核細胞（赤血球と血小板）から分離され、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａ８４１４−１００ＭＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と２ｍＭ  ＥＤＴＡ（１５５７５−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）とを含みカルシウムとマグネシウムを除去したＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（１４１９０−１４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）の緩衝液の流れにプラズマが供給される。
計測技術：細胞の塗沫標本と、廃棄画分（図１５Ａ−１５Ｂ）が準備され、改良ライト・ギムザ染色が行われる（ＷＧ１６、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）。
パフォーマンス：胎児有核赤血球が製品画分で観測され（図１５Ａ）、廃棄画分では不在である（図１５Ｂ）。
【実施例４】
【０２１０】
実施例４．母体血液からの胎児細胞の分離
実施例１で詳細に説明した装置およびプロセスを、免疫磁気親和性濃縮技術とともに用いて、母体血液から胎児細胞を分離する可能性が示された。
【０２１１】
試験状況：男の胎児をもつ承諾した妊婦ドナーからの血液を、人工中絶の直後に、Ｋ２ＥＤＴＡヴァキュテーナー（３６６６４３、ベクトンディッキンソン、フランクリンレイクス、ＮＪ）で採取する。生の血液は、上述した実施例１の装置を用いて常温で９時間以内で処理される。血液からの有核細胞は、除核細胞（赤血球と血小板）から分離され、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａ８４１４−１００ＭＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含みカルシウムとマグネシウムを除去したＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（１４１９０−１４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）の緩衝液の流れにプラズマが供給される。次いで、有核細胞の画分が抗ＣＤ７１マイクロビード（１３０−０４６−２０１、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）でラベルされ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ（ＴＭ）列（１３０−０４６−２０１、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて製造者の指示書に従い濃縮される。最後に、ＣＤ７１陽性画分をガラススライドに置かれる。
計測技術：スポットされたスライドは、蛍光その場ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術を用いて、製造者の指示書に従いＶｙｓｉｓプローブ（Ａｂｂｏｔｔ研究所、Ｄｏｗｎｅｒ’ｓＧｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて染色される。サンプルは、ＸおよびＹ染色体の発現により染色される。あるケースでは、既知のトリソミー２１妊婦から得たサンプルも、染色体２１で染められる。
パフォーマンス：有核細胞の画分（図１６）から用意されたＣＤ７１陽性集団内の男性細胞の確実な出現により、胎児細胞の分離が確認された。単一の異常症例試験では、トリソミー２１病状もまた同定された（図１７）。
【０２１２】
以下の例は、本発明の装置の特定の実施例を示す。各装置の説明は、連続したステージの数、各ステージの隙間のサイズ、ε（フロー角度）、装置毎のチャネル数（アレイ／チップ）を提供する。各装置は、ＤＲＩＥＲを用いたシリコンで製造され、各装置は熱酸化層を具える。
【実施例５】
【０２１３】
この装置は、単一のアレイに５つのステージを具える。
2009509143.tif 000005
【実施例６】
【０２１４】
この装置は複数ステージを具え、各ステージがバイパスチャネルを有し二重化されている。装置の高さは１２５μｍである。
2009509143.tif 000006
【０２１５】
図１８Ａは、サイズ式選別装置の製造に用いるマスクを示す。図１８Ｂ−１８Ｄはこのマスクの拡大図であり、入口、アレイ、出口が規定されている。図１９Ａ−１９Ｇは、サイズ式選別モジュールのＳＥＭが示されている。
【実施例７】
【０２１６】
この装置は複数ステージを具え、各ステージがバイパスチャネルを有し二重化されている。バイパスチャネルの側面に「フィン」が設けられバイパスチャネルからの液体がアレイに再び入らないようにしている。このチップはまた、オンチップチップフローレジスタ、すなわちアレイより流体抵抗が大きい入口と出口を具える。装置の高さは１１７μｍである。
2009509143.tif 000007
【０２１７】
図２０Ａは、サイズ式選別装置の製造に用いるマスクを示す。図２０Ｂ−２０Ｄはこのマスクの部分の構成を示し、入口、アレイ、出口が規定されている。図２１Ａ−２１Ｆは、この例で用いられているサイズ式選別モジュールのＳＥＭが示されている。
【実施例８】
【０２１８】
この装置は複数ステージを具え、各ステージがバイパスチャネルを有し二重化されている。バイパスチャネルの側面に「フィン」が設けられバイパスチャネルからの液体がアレイに再び入らないようにしている。このチップはまた、オンチップチップフローレジスタ、すなわちアレイより流体抵抗が大きい入口と出口を具える。装置の高さは１１７μｍである。
2009509143.tif 000008
【０２１９】
図１４Ａは、装置の製造に用いるマスクを示す。図１４Ｂ−１４Ｄはこのマスクの部分の構成を示し、入口、アレイ、出口が規定されている。図２２Ａ−２２Ｆは、上記装置のＳＥＭが示されている。
【実施例９】
【０２２０】
この装置は複数ステージを具え、各ステージがバイパスチャネルを有し二重化されている。Ｆｅｍｌａｂを用いて「フィン」が最適化され、バイパスチャネルからの液体がアレイに再び入らないようにしている。フィンのアレイに最も近い縁部は、アレイの形状に倣っている。このチップはまた、オンチップチップフローレジスタ、すなわちアレイより流体抵抗が大きい入口と出口を具える。装置の高さは１３９−１４２μｍである。
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【０２２１】
図２３Ａは、装置の製造に用いるマスクを示す。図２３Ｂ−２３Ｄはこのマスクの部分拡大図であり、入口、アレイ、出口が規定されている。図２４Ａ−２４Ｓは、上記装置のＳＥＭが示されている。
【実施例１０】
【０２２２】
この装置は、単一ステージの、両アレイの端部からのアウトプットを受けるよう設けられたバイパスチャネルを有する複式装置を具える。この装置の障害物は楕円形である。アレイの境界はＦｅｍｌａｂモデルである。このチップはまた、オンチップチップフローレジスタ、すなわちアレイより流体抵抗が大きい入口と出口を具える。装置の高さは１５２μｍである。
2009509143.tif 000010
【０２２３】
図１３Ａは、装置の製造に用いるマスクを示す。図１３Ｂ−１３Ｄはこのマスクの部分拡大図であり、入口、アレイ、出口が規定されている。図２５Ａ−２５Ｃは、実際の装置のＳＥＭが示されている。
【０２２４】
上記明細書に記載したすべての公開、特許、および特許出願は、参照によりここに組み込まれる。当業者であれば、本発明の開示された方法およびシステムの様々なさまざまな変更や変形例を、本発明の意図および範囲を逸脱することなく理解することができる。本発明を特定の実施例に関連して説明したが、クレームにある本発明は、このような特定の実施例に限定されるべきではない。とりわけ、本発明を実施するのに開示したモードの様々な変形例は、当業者であれば本発明の範囲に収まることを理解するであろう。
【０２２５】
他の実施例はクレームにある。  
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】図１は、サイズ式選別モジュールの一実施例を示す図である。
【図２】図２は、それぞれ流体力学的サイズが異なる個別の検体が通るサイズ式選別モジュールの一実施例を示す図である。
【図３】図３は、チーズ片形状のバイパス障害物を具えるサイズ式選別モジュールの一実施例を示す図である。
【図４】図４は、互いに平行な複数のサイズ式選別モジュールの一実施例を示す図である。
【図５】図５は、サイズ式選別モジュールの一実施例の選別能力を示すテーブルである。
【図６】図６は、捕獲モジュールで捕獲された細胞を示す写真である。
【図７】図７Ａ−７Ｃは、捕獲モジュールの様々な実施例を示す図である。
【図８】図８は、捕獲モジュールの一実施例を示す図である。
【図９】図９Ａ−９Ｄは、検出モジュールの様々な態様を示す図である。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、ここに開示されるビジネス方法の実施例を示す図である。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｆは、本発明のサイズ式選別モジュール一例を示す図である。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｆは、装置で生成される血液サンプルからの血液学的検体により生成される典型的なヒストグラムである。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄは、サイズ式選別モジュールの様々な実施例を示す図である。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｄは、サイズ式選別モジュールの様々な実施例を示す図である。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂは、製品の細胞の塗沫標本（cell smear）と無駄な部分（waste fraction）を示す図である。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｆは、製品の細胞の塗沫標本（cell smear）と無駄な部分（waste fraction）を示す図である。
【図１７】図１７は、分離された胎児有核赤血球のトリソミー２１病状を示す図である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは、サイズ式選別モジュールを製造するのに用いるマスクの例を示す図である。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｇは、サイズ式選別モジュールのＳＥＭの例を示す図である。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｄは、サイズ式選別モジュールを製造するのに用いるマスクの一実施例を示す図である。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｆは、サイズ式選別モジュールのＳＥＭの例を示す図である。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｆは、サイズ式選別モジュールのＳＥＭの例を示す図である。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｄは、サイズ式選別モジュールのマスクと部分を示す図である。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｓは、サイズ式選別モジュールのＳＥＭの例を示す図である。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｃは、サイズ式選別モジュールの例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009509143.tif 000020
【図１１Ａ】
2009509143.tif 000021
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2009509143.tif 000028
【図１７】
2009509143.tif 000029
【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０】
2009509143.tif 000035
【図２１Ａ】
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【図２１Ｃ】
2009509143.tif 000037
【図２１Ｅ】
2009509143.tif 000038
【図２２Ａ】
2009509143.tif 000039
【図２２Ｂ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｆ】
2009509143.tif 000042
【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｊ】
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【図２４Ｌ】
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【図２４Ｍ】
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【図２４Ｏ】
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【図２４Ｑ】
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【図２４Ｓ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｃ】
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2009509143.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月12日(2008.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の濃縮モジュールであって、
ｉ）第１の検体を第１の方向に、第２の検体を第２の方向に偏向させる障害物を具える１またはそれ以上の第１の流体力学的濃縮領域か、
ｉｉ）主たる流れの中の第１の検体がアレイの縁部へ、第２の検体が小さい流れへと流れるよう構成された障害物アレイを具える１またはそれ以上の第１の流体力学的濃縮領域か、または、
ｉｉｉ）第１の検体用の第１の流路と第２の検体用の第２の流路とを規定する複数の二次元障害物アレイであって前記第１の検体と第２の検体は流体力学的直径が異なるアレイ、を具える第１の濃縮モジュールと、
ｂ）前記第１の濃縮モジュールと液体接続された第２の濃縮モジュールであって、
ｉ）前記第１の検体を濃縮する１またはそれ以上の磁気領域を具え、
ａ）前記磁気領域がビード（beads）を具えるか、
ｂ）前記磁気領域が障害物を具え、
ｉｉ）酸化ヘモグロビンを還元する試薬を含む液体リザーバを具える、第２の濃縮モジュールと、
ｃ）選択的に、前記第２および第１の濃縮モジュールに連結されたセルカウンタを具えることを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１のシステムにおいて、さらに、前記第１の検体を分析するためのコンピュータ実行可能なロジックを具える分析器を具えることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１のシステムにおいて、前記システムがさらに、データを保存するデータベースを具えることを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項２のシステムにおいて、前記分析器がさらに、顕微鏡、マイクロアレイ、またはセルカウンタを具えることを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項２のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、胎児のヘモグロビン、グロビンγ、グロビンε、グロビンβ、ＧＰＡ、ｉ抗原、ＣＤ３６、セレクチン、ＣＤ７１、またはこれらの組合せの存在による変色を検出することを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項２のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、第１の検体を選択的に結合するプローブの強度を検出することを特徴とするシステム。
【請求項７】
請求項２のシステムにおいて、前記コンピュータ実行可能なロジックは、トリソミー、胎児の性別、関心ある細胞の遺伝子または染色体異常、あるいはこれらの組合せを検出することことを特徴とするシステム。
【請求項８】
請求項１のシステムにおいて、前記サイズ式選別モジュールは、前記第１の検体を第１の方向へ決定論的に案内し、前記第１の検体より流体力学的サイズが小さな第２の検体を第２の方向へと案内する二次元障害物アレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項９】
請求項１のシステムにおいて、互いに並列に液体接続された２またはそれ以上のサイズ式選別モジュールを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
請求項１のシステムにおいて、前記選別領域の障害物の間の隙間は１０００ミクロン以下であることを特徴とするシステム。
【請求項１１】
請求項１のシステムにおいて、さらに、前記サイズ式選別モジュールに液体接続され磁気粒子を含んだリザーバを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１２】
請求項２のシステムにおいて、前記分析器が、前記第１の検体中の１またはそれ以上のＳＮＰを検出するよう構成されたマイクロアレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１３】
請求項２のシステムにおいて、前記分析器が、前記第１の検体中のｍＲＮＡレベルを検出するよう構成されたマイクロアレイを具えることを特徴とするシステム。
【請求項１４】
請求項１のシステムにおいて、前記障害物は、サンプルの流れを不均一に次の隙間へと案内する隙間により隔てられていることを特徴とするシステム。
【請求項１５】
請求項１のシステムにおいて、前記第１または第２のモジュールがさらに、１またはそれ以上の抗体に結合された障害物を具えることを特徴とするシステム。
【請求項１６】
請求項１５のシステムにおいて、前記抗体は選択的に、赤血球、白血球、胎児血液細胞、胎児有核血液細胞、癌細胞、上皮細胞、または幹細胞、前駆細胞、泡沫細胞、または血小板、を結合することを特徴とするシステム。
【請求項１７】
請求項１５のシステムにおいて、前記抗体は、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ４５、抗ＧＰＡ、抗セレクチン、抗炭水化物、抗抗原Ｉ、および抗ＥｐＣａｍからなる群から選択されることを特徴とするシステム。
【請求項１８】
請求項１５のシステムにおいて、前記第１の検体が、赤血球（ＲＢＣ）、有核赤血球（ＮＲＢＣ）、胎児のＲＢＣ、胎児有核ＲＢＣ（ｆＮＲＢＣ）、栄養膜、胎児の繊維芽細胞、白血球（ＷＢＣ）、感染ＷＢＣ、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、癌細胞、ウィルス細胞、バクテリア細胞、および原生動物からなる群から選択されることを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項１のシステムにおいて、前記第２の濃縮モジュールは前記第１の検体または前記第２の検体を捕獲し、前記第２の濃縮領域は前記第１の濃縮領域と液体接続されていることを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項２のシステムにおいて、前記分析器はＰＣＲ増幅またはフローサイトメトリーに用いられることを特徴とするシステム。
【請求項２１】
請求項１のシステムにおいて、前記複数の二次元障害物はジグザグ配列（staggered）であることを特徴とするシステム。
【請求項２２】
患者の状態に関連する特性を同定するシステムの製造における障害物の使用であって、
請求項１のシステムにサンプルを適用するステップと、
前記第１の検体を磁気的に濃縮するステップと、
前記第１の検体の特性を判定するために前記サンプルからの前記第１の検体を分析するステップとを具えることを特徴とする使用。
【請求項２３】
請求項２２の使用において、前記第１の検体を磁気的に濃縮するステップは、ヘモグロビンを酸化または還元する試薬を加えることにより、１またはそれ以上の細胞を磁気的にレンダリングするステップを具えることを特徴とする使用。
【請求項２４】
請求項２２の使用において、前記特性に基づいて関連する研究を実施するステップを具えることを特徴とする使用。
【請求項２５】
請求項２２の使用において、前記特性は、前記第１の検体の数であることを特徴とする使用。
【請求項２６】
請求項２２の使用において、前記特性は前記第１の検体の形態（morphology）であることを特徴とする使用。
【請求項２７】
請求項２２の使用において、前記特性は前記第１の検体の表現型であることを特徴とする使用。
【請求項２８】
請求項２２の使用において、前記サンプルは血液サンプルであることを特徴とする使用。
【請求項２９】
請求項２２の使用において、前記サンプルは妊娠１２週以下の女性の血液サンプルであることを特徴とする使用。
【請求項３０】
請求項２２の使用において、前記第１の検体は細胞型であることを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項２２の使用において、前記第１の検体が、赤血球（ＲＢＣ）、有核赤血球（ＮＲＢＣ）、胎児のＲＢＣ、胎児有核ＲＢＣ（ｆＮＲＢＣ）、栄養膜、胎児の繊維芽細胞、白血球（ＷＢＣ）、感染ＷＢＣ、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、癌細胞、ウィルス細胞、バクテリア細胞、および原生動物であることを特徴とする使用。
【請求項３２】
請求項２２の使用において、前記分析器は、染色体と結合した１またはそれ以上の核酸プローブからの信号を分析することを特徴とする使用。
【請求項３３】
請求項３２の使用において、前記染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体２１、染色体１３、および染色体１８からなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項３４】
請求項２２の使用において、前記分析するステップは、顕微鏡、マイクロアレイ、またはセルカウンタで有核赤血球を分析するステップを具えることを特徴とする使用。
【請求項３５】
請求項２２の使用において、前記分析ステップは、胎児の性別を分析するステップを具えることを特徴とする使用。
【請求項３６】
請求項２２の使用において、前記特性は、染色体１３、染色体１８、染色体２１（ダウン症）、ターナー症候群（Ｘ染色体の損傷）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、または他の性染色体あるいは常染色体の数の異常からなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項３７】
請求項２２の使用において、前記特性は、Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ症候群（４ｐ−）、猫鳴き症候群（５ｐ−）、ウィリアムス症候群（７ｑ１１．２３）、プラダー・ウィリ症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、アンジェルマン症候群（１５ｑ１１．２−ｑ１３）、Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（１７ｑ１３．３）、Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群（１７ｐ１１．２）、ディジョージ症候群および膜−心臓−顔面症候群（２２ｑ１１．２）、カルマン症候群（Ｘｐ２２．３）、ステロイドサルファターゼ不全（ＳＴＳ）（Ｘｐ２２．３）、Ｘ連鎖魚鱗癬（Ｘｐ２２．３）、および網膜芽腫（１３ｑ１４）からなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項３８】
サンプル中のバイオハザード検体を検出するフロースルー濃縮装置の製造における複数の障害物の使用であって、前記バイオハザード検体はサンプルにおいて濃度１×１０−３検体／μＬ以下に見られ、
前記サンプルを、前記検体の濃度を少なくとも１０，０００倍増大させるよう構成されたフロースルー濃縮装置にかけるステップと、
前記濃縮されたバイオハザード検体を分析するステップとを具えることを特徴とする使用。
【請求項３９】
請求項３８の使用において、前記バイオハザード検体が、バクテリア、原生動物、ウィルス、およびこれらのキメラを含む群から選択される病原体であることを特徴とする使用。
【請求項４０】
請求項３８の使用において、前記バイオハザード検体は、ペスト菌、炭疽菌、ボツリヌス菌、野兎病菌、コキシエラ菌、ブルセラ種、ブルクホルデリアつい骨、ブルクホルデリア仮性つい骨、連鎖球菌、エボラウィルス、ラッサウィルス、ＳＡＲＳ、大痘瘡、アルファウィルス、発疹チフスリケッチア、オウム病クラミジア、サルモネラ種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、コレラ菌、クリプトスポリジウムパルバム、ニパウィルス（Nipah virus）、ハンタウィルスからなる群から選択される病原体であることを特徴とする使用。
【請求項４１】
母体血液サンプルから第１の細胞型の１またはそれ以上の細胞を分離するよう構成されたサイズ式選別モジュールを具え、前記第１の細胞型は妊婦の生体内ですべての血液細胞中１％未満の濃度で見られ、
磁気的な濃縮により第１の細胞型の１またはそれ以上の細胞を分離するよう構成された第２の濃縮モジュールと、
ヘモグロビンを酸化または還元する試薬と、
前記１またはそれ以上の濃縮した細胞を分析して胎児の出産前診断を行うための一連の説明書を具えることを特徴とするキット。
【請求項４２】
請求項４１に記載のキットにおいて、さらに、ＰＣＲ試薬、リーシス試薬、核酸プローブ、およびラベリング試薬からなる群から選択される１またはそれ以上の試薬を具えることを特徴とするキット。
【請求項４３】
請求項４１に記載のキットにおいて、前記ＦＩＳＨ試薬は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、染色体１３、染色体１８、染色体２１からなる群から選択された染色体と特に結合することを特徴とするキット。
【請求項４４】
請求項４１に記載のキットにおいて、さらに、顕微鏡、マイクロアレイ、フローサイトメーターまたはセルカウンタを具えることを特徴とするキット。
【請求項４５】
請求項４１に記載のキットにおいて、前記サイズ式選別モジュールは、前記第１の細胞型の１またはそれ以上の細胞を第１の方向へと決定論的に案内し、第２の細胞型の１またはそれ以上の細胞を第２の方向へ案内する二次元障害物アレイを具えることを特徴とするキット。
【請求項４６】
請求項４１に記載のキットにおいて、前記第１の細胞型が、赤血球（ＲＢＣ）、有核赤血球（ＮＲＢＣ）、胎児のＲＢＣ、胎児有核ＲＢＣ（ｆＮＲＢＣ）、栄養膜、胎児の繊維芽細胞、白血球（ＷＢＣ）、感染ＷＢＣ、幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、癌細胞、ウィルス細胞、バクテリア細胞、および原生動物からなる群から選択されることを特徴とするキット。
【請求項４７】
請求項４１に記載のキットにおいて、前記第２の細胞型は除核赤血球であることを特徴とするキット。
【請求項４８】
請求項４１に記載のキットにおいて、前記選別モジュールは、流れを続く隙間へと不均一に案内する複数の隙間を規定する１またはそれ以上の二次元障害物アレイを具えることを特徴とするキット。
【請求項４９】
請求項４１に記載のキットにおいて、さらに、前記胎児の性別を判定するよう構成されたプローブを含むことを特徴とするキット。
【請求項５０】
請求項４１に記載のキットにおいて、さらに、染色体１３の存在を判定するよう構成されたプローブを含むことを特徴とするキット。
【請求項５１】
請求項４１に記載のキットにおいて、さらに、循環する有核赤血球の存在または数を判定するよう構成されたプローブを含むことを特徴とするキット。
【国際調査報告】
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