(57)【要約】  本発明は、式（I）【化１】2009542614.tif 000011の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、認識機能の強化又は神経保護作用の獲得に適する薬剤の調製における使用に関する。式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を含有する薬剤は、神経細胞の死、精神的退化、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、記憶障害、記憶喪失、健忘症、卒中の治療又は予防又は記憶機能又は学習能力の改善に使用される。
2009542614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
【化１】
2009542614.tif 000010
の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、神経保護薬の調製における使用。
【請求項２】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、記憶又は学習能力の強化に適する薬剤の調製における使用。
【請求項３】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、神経細胞の死、精神的退化、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病記憶又は卒中の治療又は予防に適する薬剤の調製における使用。
【請求項４】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、記憶の改善、記憶喪失、記憶障害又は健忘症の治療又は予防に適する薬剤の調製における使用。
【請求項５】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩及び１以上の薬学上許容されるビヒクル及び／又は添加剤を含んでなる、神経保護薬。
【請求項６】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩及び１以上の薬学上許容されるビヒクル及び／又は添加剤を含んでなる、神経細胞の死、精神的退化、多発性硬化症、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病記憶又は卒中の治療又は予防に適する薬剤。
【請求項７】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩及び１以上の薬学上許容されるビヒクル及び／又は添加剤を含んでなる、記憶又は学習能力の強化に適する薬剤。
【請求項８】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩及び１以上の薬学上許容されるビヒクル及び／又は添加剤を含んでなる、記憶の改善、記憶喪失、記憶障害又は健忘症の治療又は予防に適する薬剤。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１記載の薬剤を製造する方法であって、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩を、好適な量の薬学上許容されるビヒクル及び任意に他の薬学上許容される添加剤と混合し、このようにして得られた混合物を製剤することを含んでなる、薬剤の製法。
【請求項１０】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、神経細胞の死、精神的退化、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病記憶又は卒中の予防又は治療における使用。
【請求項１１】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、学習能力の改善又は記憶力の強化における、又は記憶喪失、記憶障害又は健忘症の治療又は予防における使用。
【請求項１２】
神経細胞の死、精神的退化、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病記憶又は卒中を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を投与することを含んでなる、治療法。
【請求項１３】
記憶喪失、記憶障害又は健忘症を治療又は予防する方法であって、このような治療又は予防を必要とする患者に、治療上有効な量の式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を投与することを含んでなる、治療又は予防法。
【請求項１４】
学習能力を改善する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を投与することを含んでなる、学習能力の改善法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（I）
【化１】
2009542614.tif 000003
の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の、認識機能の強化に適する薬剤又は神経保護作用を有する薬剤の調製における使用及び対応する治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩は、初めて、国際特許出願公開WO 03/010166及びハンガリー国特許出願第P013063号に開示されている。
【０００３】
当分野において、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンは、精神疾患、特に、統合失調症の治療において有用な貴重な神経遮断作用を有する医薬候補であることが知られている。表現「神経遮断作用」とは、当分野によれば、患者の精神疾患から生じた機能障害、妄想、幻覚症及び精神運動系興奮に対する抗精神病薬の軽減作用と理解される。
【０００４】
ここ数十年間では、加齢から生ずる神経細胞の死、慢性の神経細胞の衰退、知力の減衰又は痴呆に関連する各種の疾患が、医薬研究の対象となっている。
【０００５】
このような疾患としては、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、卒中及び急性の脳又は脊髄損傷による又は毒物の摂取から生ずる又は虚血の結果としての神経細胞の死が含まれる。これらの疾患の特徴的な症状は、学習能力の低減、記憶の喪失、及びいくつかのケースでは、知能の衰退である。
【０００６】
従来技術によれば、記憶は２つのタイプに区別される。いわゆる「短期記憶」は、情報が数分〜数時間の短期間保存されることを特徴とする。表現「長期記憶」は、情報が数時間〜数年間の期間保存されることを言う［Baddley及びWarington J. Verb, Learn. Verb Behav. 9, 176-179(1970); Wrightら, Science 229, 287-289(1985)］。
【０００７】
短期記憶から長期記憶へ情報を移すプロセスは、記憶の定着と称される。
【０００８】
短期記憶又は長期記憶からの固定された情報を再生するプロセスは、想起と称される。
【０００９】
全健忘は比較的稀であるが、記憶障害又は記憶の衰退を伴う疾患の発生は増大している。世界的には、1800万人がアルツハイマー病に罹っており、この疾患に罹った患者の数は、数年で、顕著に増大することが予測される［Fletcher, Mol. Med. Today, 3/10, p.429-434(1997)］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記事実に基づき、発明者らの研究の目的は、記憶の混乱及び記憶の衰退を伴う疾患及び病気（これらは、精神病に関するものではない）の治療に好適な薬を開発することにあった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的は、本発明によって解消される。
【００１２】
本発明は、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩が、動物モデル実験において、全脳虚血から生ずる神経細胞の死において、又は局所性脳虚血による神経細胞の損傷の防止において有効であるとの驚くべき知見に基づくものである。さらに、化学的に類似した式（II）
【化２】
2009542614.tif 000004
のリスペリドン（３-(２-(４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)-１-ピペリジニル)-エチル)-６,７,８,９-テトラヒドロ-２-メチル-４H-ピリド[１,２-a]ピリミジン-４-オン）又は他の抗精神病薬は、このような効力を発揮しないとの知見を得た。従って、上述の神経保護作用は、式（I）の化合物の公知の抗精神病作用とは関連しないものであると結論できる。
【００１３】
新たに認識された神経保護作用のため、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩は、多発性硬化症、運動神経疾患（すなわち、筋萎縮性側索硬化症（ALS））、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群及びパーキンソン病における神経細胞の死から生ずる行動パラメーターの改善に使用される。
【００１４】
さらに、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンを使用して行った薬理試験において、前記化合物は、学習能力及び記憶改善作用に関連する機能的効果の強化の検出のために開発されたインビボ動物モデル、例えば、受動的回避挙動モデル、８方向迷路モデル及びいわゆる物体認識モデルにおいて有効であるとの知見を得た。従来技術では、抗精神病薬、例えば、化学的に類似した式（II）のリスペリドンの学習能力の強化作用及び記憶改善作用については開示されていない。
【００１５】
上記マニフェストに記載された４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンの学習能力改善作用と共に、驚くべき神経保護作用及び記憶強化作用が、精神病に罹患していないヒトにおいても発揮される。従って、上記作用は、従来技術から公知の式（I）の化合物の抗精神病作用から独立したものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ラットの永続的局所性虚血モデルにおける式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン（Ｔ）及びリスペリドン（Ｒ）の作用を表すグラフである。
【図２】受動的回避モデルにおける４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン（テスト）及びリスペリドン（risp）の作用を表すグラフである。
【図３】８方向迷路テストにおけるスコポラミン惹起型記憶欠失に対する４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン（テスト）の作用を表すグラフである。
【図４】物体認識モデルにおける４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン（テスト化合物）の作用を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上述の作用に基づき、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン及びその薬学上許容される塩は、学習能力の喪失、記憶障害又は精神的退化、例えば、急性の脳又は脊髄の損傷、卒中、脳の痙攣、脳又は脊髄の傷害後の神経細胞の死から生ずる状態に関連する疾患及び障害の治療に適している。さらに、加齢による精神的退化、毒物質の作用から生ずる認識機能の衰退も、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を投与することによって治療される。
【００１８】
この明細書では、表現「薬学上許容される塩」とは、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンを、薬学上好適な非毒性の無機又は有機酸と反応させることによって調製される塩を意味する。このような薬学上許容される塩は、式（I）の、例えば、塩酸、臭化水素、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等との塩である。
【００１９】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンの神経保護作用を、頸動脈の両側閉塞による全脳虚血モデルのアレチネズミ及び中大脳動脈の永久閉塞を介する局所性脳虚血のラットにおいてテストした。対照化合物として、式（II）のリスペリドン（３-(２-(４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)-１-ピペリジニル)-エチル)-６,７,８,９-テトラヒドロ-２-メチル-４H-ピリド[１,２-a]ピリミジン-４-オン）を使用した。
【００２０】
全脳虚血モデルにおけるテストは、体重５０〜８０ｇの雄アレチネズミにおいて実施した。外科処置の間、動物をエーテルにて麻酔し、頸動脈を、中央部における腹部切開によって、傍気管領域において露出させた。頸動脈を、迷走交感神経の神経幹から分離し、動脈鉗子を使用して３分間閉塞し、その後、解放した。外科処置の間、動物の体温をチェックし、赤外線ランプを使用して、正常範囲に維持した（37.5±０.５℃）。テスト物質の式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン及び対照物質の式（II）のリスペリドンを、外科処置後４５分の時点で、用量０.１mg/kgで腹腔内投与した。
【００２１】
外科処置後４日の時点で、ペントバルビタールNa（６０mg/kg, 腹腔内, １０ml/kg）を使用して、動物を麻酔し、左脳室を通して、脳を食塩水にて潅流した。固定液（200 ml/動物）を使用して、潅流をさらに３０分間続けた。固定液は、０.１Ｍリン酸塩緩衝液（pH７.４）中に、０.１％グルタルアルデヒド、４％パラホルムアルデヒド及び０.２％ピクリン酸を含有するものであった。潅流後、脳を頭蓋から取り出し、冷蔵庫において、上記固定液中、４℃で、少なくとも１週間保存した。
【００２２】
凍結ミクロトームを使用して、背側海馬を含む脳部分を、厚さ６０μmの冠状切片に解剖した。切片を、０.１Mリン酸塩緩衝液（pH７.４）中で３０分間振盪すること（振盪の間、切片は洗浄液中を浮遊している）によって、４回洗浄した。続いて、銀の含浸を使用して、脳切片を染色した。銀含浸法による染色は、（ａ）サンプルを準備溶液中に５分間で２回浸漬し（準備溶液は、水酸化ナトリウム２％及び水酸化アンモニウム0.875%の水溶液でなる）；（ｂ）サンプルを含浸溶液（水酸化アンモニウム0.875%及び硝酸銀０.５％を含有する水溶液）中に１０分間浸漬し；（ｃ）サンプルを、29.1％水性エタノール中に炭酸ナトリウム０.５％及び硝酸アンモニウム0.01％を含有する溶液中に、２分間で２回、最後に１分間洗浄し；（ｄ）切片を現像液（９.９％エタノール中に、ホルムアルデヒド１〜１.５％及び硝酸アンモニウム0.01％を含有する溶液）に浸漬することによって、１分間発色させ；（ｅ）０.５％酢酸溶液中で、各回３分ずつで３回固定することを含んでなる。染色した脳切片を、０.１Mリン酸塩緩衝液（pH７.４）及び続いてクロム含有ゼラチンに入れ、スライド上に載せ及び脱水（乾燥）し、キシレンで１０分間処理し、DPX組織学用接着剤（Fluka）を使用して、カバープレートを取付けた。
【００２３】
海馬のCA1領域における両側の神経細胞の損傷を、６スコアースケールで次のように評価した：０−損傷が認められない；１−０〜１０％の神経細胞が損傷されている；２−１０〜３０％の神経細胞が損傷されている；３−３０〜５０％の神経細胞が損傷されている；４−５０〜７０％の神経細胞が損傷されている；５−７０〜９０％の神経細胞が損傷されている；６−９０〜100％の神経細胞が損傷されている。処置したグループにおいて測定された平均スコアーを、コントロール動物で観察された平均スコアーの百分率で表示した。ノンパラメトリックMann-Whitney U-テストによって、統計学的評価を行った。結果を表１に要約する。
【００２４】
【表１】
2009542614.tif 000005
【００２５】
上記の実験データは、驚くべきことには、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンが、用量０.１mg/kgの腹腔内投与において、海馬のCA1領域における神経細胞の損傷の割合を低減させるが、式（II）のリスペリドンは同じ用量では無効であることを証明している。
【００２６】
局所性脳虚血モデルにおける式（I）の化合物の作用を研究することを目的とする実験では、Brintらの方法を使用した（Brint, S, ラットにおける局所性脳虚血：遠位中心大脳動脈及び同側の総頸動脈のタンデム閉塞を使用する再現性新皮質インフラクション（neocortical infraction）のための方法, J. Cereb. Blood Flow Metab. 8: 474-485, 1988）。
【００２７】
体重200〜220ｇの雄SPRDラットをペントバルビタール６０mg/kg腹腔内投与にて麻酔し、電気焼灼器を使用して、中心大脳動脈の遠位アーム及び同じ側の頸動脈を閉塞した。テスト化合物及び対照化合物を、外科的処置後３０分の時点で腹腔内投与した。外科的処置から４８時間後、ペントバルビタール120mg/kg腹腔内投与を使用して、再度、ラットを麻酔し、左心室を介して、脳を４％塩化２,３,５-トリフェニルテトラゾリウム（TTC）溶液３mlにて潅流した。１時間後、脳を取り出し、瞬時に、氷冷却食塩水に１〜２分間入れた。
【００２８】
続いて、脳を、１つずつ、８％ホルマリン溶液に入れた。２４時間後、１mmの厚さの冠状切片を作成し、コンピューター化したイメージ記録及び分析システムによって、損傷を受けた脳組織の面積を測定した。統計学的分析を、ANOVA及びDuncanテストによって実施した。結果を表２及び図１に要約する。
【００２９】
【表２】
2009542614.tif 000006
【００３０】
ラットにおける局所性脳虚血モデルで得られた結果に基づき、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンが、用量0.03mg/kgで腹腔内投与される際には、統計学的に有意な様式で、脳損傷のサイズを減少させると判定できるが、式（II）のリスペリドンは同じ用量範囲（0.01〜０.３mg/kg腹腔内投与）では無効であることが証明された。
【００３１】
上述の動物実験では、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンは、全脳虚血から生ずる神経細胞の損傷及び局所性脳虚血による脳組織の損傷を防止した。式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンのこれらの作用は、４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンの公知の抗精神病活性と類似した作用を有する式（II）のリスペリドンが、神経保護作用を全く発揮しないため、予期し得ないものである。
４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンの学習及び記憶プロセスに対する影響を、受動的回避テスト、８方向放射状迷路テスト及び物体認識テストを使用して、ラットにおいて調査した。
【００３２】
体重200〜220ｇの雄Wistarラット（Charles River, ブダペスト）において、受動的回避テストを実施した。実験動物を、明−暗期間１２−１２時間の概日周期の室内に維持した。明期間は、午前６時にスイッチオンとする。室の相対湿度は６０±１０％である。
【００３３】
受動回避学習のテストに適する、いわゆるステップ−スルータイプの通路５個を持つ装置において実施した。
【００３４】
装置は、２０×２０×１６cmのプレキシガラス製のボックス２個を含んでなる。ボックスの内１個は透明であり、他は不透明であり、黒色に塗装されている。２個のボックスの間には、７.５×８cmの開口を有する分離壁が存在する。前記開口は、コンピューター制御のシャッタードアによって解放又は閉止される。１個のボックスから他のボックスへのラットの移動を、２つの平行光電セル列によって検知し、動物の移動後、ドアを自動的に閉じた。黒色塗装のボックスの床は、電気ショックを与えるのに適する電気回路を具備するステンレス鋼ロッドからなる。装置の明（透明）側には、ドアの上に、１０Wの電球がある。
【００３５】
テストを、２４時間の時間差で、連続２日間で実施した。
【００３６】
テストの第１部は、いわゆる習得期間であり、この期間に、動物は状況に特有の特別な情報（暗ボックスに入る際には、電気ショックが与えられる）を獲得することができる。テストの第２部は、いわゆる保存期間である。この段階では、第１部で集められた情報を思い出す動物の能力がテストされる（暗室に入る際には、電気ショックが与えられることになるから、明室に滞在する方が、よりショックが少ない）。
【００３７】
テストの第１日（習得期間）に、番号を付した動物を透明の室に入れ、その間、シャッターを閉じる。３０秒後、ドアを開放し、動物が自由に暗ボックスに入ることができるようにする。同時に、移動潜時の測定のための計時を開始する。移動潜時は、シャッタードアの開放と明室から暗室への動物の移動との間の期間である。動物が暗ボックスに入ったところで、潜時を測定する計時を停止する。暗室に入った後３秒の時点で、手足のショックの形で、動物に、１０秒間、０.４mAの電気ショックを与える。絶対コントロールグループに属する動物には、手足のショックを与えない。電気ショック後、直ちに、動物を装置から取り出す。動物が暗室に入るために、180秒間の期間が与えられる。絶対コントロールグループの役割は、動物が電気ショックを記憶できることを証明することにある。これが獲得の本質である。
【００３８】
２４時間後のテスト第２日（保持）では、動物を再度装置に入れる。操作の次の部は、第１日に行ったものと同一であり、ただし、１つのグループを除き、動物には電気ショックを与えない点でのみ相違する。第１日と同様に、動物が暗ボックスに入るために、180秒間が猶予される。
【００３９】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンの作用の測定を目的とするテストでは、第２日、動物を装置に入れる６０分前に、動物を、テスト物質（式（I）の化合物）及びビヒクル（０.４％メチルセルロース）にて処置した。この処置を、容量５mg/kgにおいて用量0.005mg/kgで経口投与にて実施した。
【００４０】
統計学的評価を、多元分散分析にて実施した。グループ間の差をDuncanテストによって分析した。
【００４１】
結果を表３及び図２に要約する。テスト結果に基づき、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンは、極めて低い用量0.005 mg/kgで、記憶を有意に改善するものであると判定できる。同じ用量では、リスペリドンは、全く作用を発揮しない。
【００４２】
【表３】
2009542614.tif 000007
【００４３】
８方向放射状迷路テストは、学習及び記憶プロセスの研究に適するものであり、このようなプロセスに影響を及ぼす薬剤候補のスクリーニングにも適するものである。
【００４４】
装置は、八角形の中央ステージ（直径３０cm, 高さ２５cm）及び中央ステージに結合され、その反対側端部が餌箱によって閉止されている長さ７０cm、高さ１１cmのアーム８個からなる。迷路の基底部はステンレス鋼であり、壁及び天井はプレキシガラス製である。餌箱はステンレス鋼製である。
【００４５】
研究に際し、体重240〜250ｇの雄SPRDラットを使用した。動物の明−暗サイクルは１２−１２時間であり、午前７時にスイッチオンとした。明サイクルにおいて（午前９時から午後３時の間）、テストを実施した。
【００４６】
いわゆるダイエット期間では、空腹欲望を学習に利用するため、動物を部分的に絶食させた。そのため、動物を、１日当り標準の餌ペレット２個からなる食事に１週間保持した。１週間後、動物の体重は、正常に食事を与えた動物の体重の約８０〜８５％となった。
【００４７】
順応化期間において、初めの２日間では、動物を１０分間迷路に入れる。各餌箱には、少量のビスケットを入れる。動物は、迷路に滞在した後にのみ餌が与えられる。
【００４８】
学習期間（１０〜１２日間）では、動物は、迷路内において全量のビスケットを発見すること及び既に滞在したアームに入ることを回避することを学習する。迷路内で５分間を過ごした後、動物は、日々の餌が与えられる各ケージに戻される。
【００４９】
学習フェーズ後に行われる選択フェーズの目的は、実験に参加するには、課題を学習した動物、すなわち、３回の試行で最大１回の誤りを犯す動物（TE≦１及びICR≧７、ｔ≦５分））のみが選択されることにある。ビデオカメラ（隣接する部屋にセットした）を使用して、動物の動きを監視した。
【００５０】
実際のテストでは、動物を３つのグループ：Ｃ（コントロール）、Ｓ（スコポラミン）及びＴ（テスト）に分けた。絶対コントロールとしてのグループＣの動物について、ビヒクル（０.４％メチルセルロース、前処理時間４０分）を腹腔内投与及び溶媒（食塩水、前処理時間３０分）を皮下投与した。グループＳについては、ビヒクルを腹腔内投与し、スコポラミン０.５mg/kgを皮下投与した。グループＳのパフォーマンスがグループＣのパフォーマンスよりも有意に悪い場合にのみ、テストの評価を行った。グループＴについては、４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン0.01 mg/kg又はリスペリドン0.01 mg/kgを腹腔内投与し、それぞれ、スコポラミン０.５mg/kgを皮下投与した。
【００５１】
テスト期間では、動物を、個々に、迷路に入れ、ビデオカメラを使用して、その動きを監視した。動物がその課題を完了した時、動物を迷路から取り出した。
【００５２】
結果の評価は、次の常数：初期の正しい応答数；総エラー数（TEエラー）；多数回入ったアームの数（WMエラー）；入らなかったアームの数（RMエラー）；１回目のエラーの前に入ったアームの数（ICR）の測定によるものである。ワーキングメモリー（WM）エラーは、動物は特別のアームへの進入を記憶しておくことができないため、動物のワーキングメモリーが損傷されたことを表す。RMエラーは、動物は、どのアームに進入しなければならないかを思い出すことができないため、参照記憶の損傷を表す（このテストでは、その全て）。
【００５３】
統計学的評価を、分散分析によって実施した。グループ間の差を、Duncanテストによって測定した。
【００５４】
表４において要約したテスト結果に基づき、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンは、用量0.01 mg/kgを腹腔内投与して行った３つのパラメーターの全てで、スコポラミン処理から生ずる記憶の悪化を、有意に防止したと判定できる。同じ用量では、神経安定薬のリスペリドンは、有意の作用を示さなかった。
【００５５】
【表４】
2009542614.tif 000008
【００５６】
ラットにおける物体認識テストは、動物が未知の環境に遭遇した際、探索し、利用できるエリアを発見するとの観察に基づくものである。未知の物体が彼らのエリア内に配置された場合には、動物は同様に行動する。
【００５７】
現在の実験法では、実際のテスト日の前日に、動物をボックス内に入れ、ここで、２分間、その環境に親しむ。実験の初日には、同一の物体２個（現在の実験法では、プラスチック樹脂製ボトル及びガラス製ボトル）をボックスに入れ、動物が２つの物体を探索しながら過ごす期間の長さを測定する。テスト期間の長さは４〜５分である。各物体を探索して過ごす期間の長さの差が、いわゆる識別指数である。
【００５８】
実験の第２日（第１のテスト期間から２４時間後）では、２つの異なる物体（これらの内の１つは、動物にとって既知のものであり、他方は未知のものである）をボックスに入れる。
【００５９】
コントロールグループでは、識別指数は有意に異なり、これは、動物が、初日に、精通するようになった物体を記憶しておくことができないことを意味する。初日に、記憶増強剤が投与される（例えば、テスト前６０分の時点で経口投与）場合には、動物は既知の物体をより良好に思い出すことができ、識別指数は、未知の物体の場合に増大する。
【００６０】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンは、極めて低い用量0.01 mg/kgであっても、記憶機能を有意に強化したとの知見を得た（表５）。
【００６１】
【表５】
2009542614.tif 000009
【００６２】
要約すれば、本発明は、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン及びその薬学上許容される塩は、アレチネズミにおける頚動脈の閉塞による全脳虚血から生ずる海馬のCA1領域における神経細胞の死の防止に好適なものであるため、顕著な神経保護作用を有する、及び前記化合物は、ラットにおける局所性虚血から生ずる脳の損傷を顕著に低減するとの驚くべき評価に基づくものである。
【００６３】
さらに、意外にも、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン及びその薬学上許容される酸付加塩は、学習プロセス及び記憶プロセスの強化において、有利な作用を発揮するとの知見を得た。従って、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンは、虚血又は外傷を原因とする急性の脳又は脊髄の神経細胞の損傷（各種の卒中、脳の痙攣、脳の血管収縮、事故による頭部又は脊髄の傷害、慢性の神経変性疾患（運動神経疾患（ALS）、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン症候群、パーキンソン病を含む）を含むが、これらに限定されない）において及び神経又はその一部が損傷又は破壊された各種の疾患、障害又は状態おいて、神経細胞の死の速度を低減し、このようにして各種疾患の進行速度を低減するために、治療上有利に使用されることが結論付けられる。
【００６４】
さらに、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン及びその薬学上許容される塩は、学習又は記憶機能が損傷された又はこのような損傷の恐れがある疾患、障害又は状態の治療及び／又は予防に好適である。
【００６５】
このような疾患としては、加齢による精神的退化、脳血管性痴呆又は毒物質の摂取により生ずる認識機能の喪失と共に、アルツハイマー病、コルサコフ病、ハンチントン症候群及びパーキンソン病がある。
【００６６】
上述の効果は、対照化合物である式（II）のリスペリドンも抗精神病活性を有するものではあるが、上述の神経保護作用及び認識強化作用に欠けるものであるため、従来技術から公知の式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノンから想起されない。
【００６７】
本発明の第１の態様によれば、神経保護作用を得るため又は認識機能を強化するために、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を使用する方法が提供される。式（I）の化合物の使用は、一般に、このような治療を必要とする患者に、４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を、治療上有効な量で含有する薬剤を投与することによって、薬剤を介して達成される。
【００６８】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩の実際の用量の決定は医者の役割である。
【００６９】
式（I）の化合物の一般的な日用量は0.01〜300 mg/kgであり、例えば、治療すべき疾患のタイプ、性質及び重篤度、患者の年齢、性別、生理学的状態、他の治療及び投与方法に左右される。
【００７０】
本発明の他の態様は、認識機能の強化又は神経保護作用の提供に有用な薬剤の製造における、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン及びその薬学上許容される塩の使用にある。
【００７１】
本発明の他の態様によれば、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩及び薬学上許容されるビヒクルを、従来技術に従って公知の任意の１以上の医薬添加剤との混合物として含有する薬剤が提供される。
【００７２】
本発明による薬剤における有効成分の含量は、一般に、０.１〜９５質量％、好ましくは１〜５０質量％、最も有利には５〜３０質量％である。
【００７３】
本発明による薬剤は経口投与される。経口投与用の薬剤は、粉末、錠剤、コーチング錠、チュワブル錠、カプセル、マイクロカプセル、顆粒、糖衣錠、トローチ、溶液、懸濁液又はエマルジョンの剤形である。本発明による薬剤の他のタイプは、非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射又は浸剤に適する剤形である。本発明による異なるタイプの薬剤が、直腸内（例えば、座剤）、経皮（例えば、パッチ剤）、インプラントの形で投与され、又は局所（例えば、クリーム、軟膏又はパッチ剤）投与される。従来技術に従って公知の製薬技術の方法に従って、本発明による固状、半固状又は液状医薬調製物が調製される。
【００７４】
本発明に従って経口投与に好適な薬剤は、ビヒクル又は賦形剤（例えば、乳糖、グルコース、デンプン、リン酸カルシウム、マイクロ結晶性セルロース）、結合剤（例えば、ゼラチン、ソルビトール、ポリビニルピロリドン）、錠剤分解剤（例えば、クロスカルメロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、Crospovidone）、打錠補助剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、ケイ酸、シリカ、二酸化ケイ素）及び界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）と共に、有効成分として、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩を含有する。
【００７５】
経口投与に適する式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を含有する液状の薬剤は、溶液、シロップ、懸濁液又はエマルジョンの形で調製され、懸濁剤（例えば、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース）、溶媒（例えば、水、オイル、グリセロール、プロピレングリコール、エタノール）、緩衝剤（例えば、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩緩衝剤）又は安定剤（例えば、メチル-４-ヒドロキシ-安息香酸）を含有できる。
【００７６】
有効成分として式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を含有する非経口投与用の薬剤は、殺菌等張溶液（溶媒以外に、保存料及び緩衝剤を含有できる）である。
【００７７】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を含有する半固状薬剤は、調製用基剤（例えば、ポリエチレングリコール又はカカオ脂）中に均質に分散された有効成分を含有する。
【００７８】
本発明による式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を含有する薬剤は、従来技術から公知の製薬技術の方法を使用して調製される。有効成分を、固状又は液状のビヒクル及び添加剤と均質に混合し、所望の剤形とする。好適な方法と共に、好適なビヒクル又は添加剤は、文献（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18版, Mack Publishing Co., Easton, 米国, 1990）に開示されている。
【００７９】
式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される塩を含有する薬剤は、単位剤形として、有効成分を含有する。
【００８０】
本発明の他の目的は、認識機能を強化する又は神経保護作用を提供する方法であって、このような治療を必要とする患者に、式（I）の４-クロロ-５-{２-[４-(６-フルオロ-１,２-ベンズ[d]イソキサゾール-３-イル)ピペリジン-１-イル]エチル-アミノ}-２-メチル-３-(2H)ピリダジノン又はその薬学上許容される酸付加塩を、治療上有効な量で投与することを特徴とする方法にある。
【図１−１】
2009542614.tif 000012
【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【国際調査報告】
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