(57)【要約】  本発明は、少なくとも成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）を含む融合ペプチドを提供する。成分（Ｉ）は、トランスポーターペプチドを含み、成分（ＩＩ）は、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、成分（ＩＩ）は、もっぱらＤ−エナンチオマーアミノ酸からなる。本発明はさらに、上記融合ペプチドを含む薬学的組成物、および該薬学的組成物を投与する方法、ならびに該融合ペプチドを使用するキットおよび使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）を含む融合ペプチドであって、
成分（Ｉ）は、トランスポーターペプチドを含み、
成分（ＩＩ）は、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、
成分（ＩＩ）は、もっぱらＤ−エナンチオマーアミノ酸からなる
融合ペプチド。
【請求項２】
成分（Ｉ）が以下の（ａ）〜（ｃ）に挙げられる細胞浸透ペプチドより選択されるか、あるいは配列ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２８）を含むＫＡＬＡペプチド、または配列ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号２９）を含むＢｕｌｆｏｒｉｎ  ２より選択され得るか、あるいはＤアミノ酸から構成される配列番号１〜２９のＲｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ型アイソマーである、請求項１に記載の融合ペプチド：
（ａ）以下より選択されるタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）およびＣＰＰ由来タンパク質：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１）またはＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−アミド（配列番号２）を含む、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ由来の配列であるｐＡｎｔｐ（４３−５８）；ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ＴＡＴ、ＴＡＴからの領域３７〜７２、領域３７〜６０、領域４８〜６０または領域４９〜５７に由来する配列である、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）、ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号５）またはＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣＣ（配列番号６）；配列ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ−ＮＨ２（配列番号７）を有するｈＣＴ（９−３２）、配列ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ−ＮＨ２（配列番号８）を含むｐＶＥＣ、配列ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ−ＮＨ２（配列番号９）を含むｐＩＳＬ、配列ＭＡＮＧＬＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ−ＮＨ２（配列番号１０）を含むマウスＰＲＰ（１−２８）およびヒトホモログを含むそのホモログ、配列ＲＱＧＡＡＲＶＴＳＷＬＧＬＱＬＲＩＡＧＫＲＬＥＧＲＳＫ−ＮＨ２（配列番号１１）を含むＥｍｓ（１９４−２２０）、配列ＫＬＩＫＧＲＴＰＩＫＦＧＫ−ＮＨ２（配列番号１２）を含むＲｅｓｔｒｉｃｏｃｉｎ  Ｌ３（６０−７３）、
（ｂ）配列ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ−ＮＨ２（配列番号１３）を含むＶＴ５；配列ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ−ＮＨ２（配列番号１４）を含むＭＡＰ；ＲＲＲＲＲＲＲ（（Ａｒｇ）７；配列番号１５）、ＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（（Ａｒｇ）７−ＮＨ２；配列番号１６）、ＲＲＲＲＲＲＲ−Ｃ（（Ａｒｇ）７−Ｃ；配列番号１７）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（（Ａｒｇ）８；配列番号１８）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（（Ａｒｇ）８−ＮＨ２；配列番号１９）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（（Ａｒｇ）９；配列番号２０）またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（（Ａｒｇ）９−ＮＨ２；配列番号２１）を含むアルギニンストレッチ、あるいは
（ｃ）以下を含む、設計されたＣＰＰ：配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ（配列番号２２）または配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−システアミド（ｃｙｓｔｅａｍｉｄｅ）（配列番号２３）を含むＭＰＧ；配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（配列番号２４）を含むトランスポゾン、配列ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（配列番号２５）を含むトランスポゾン１０；配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−システアミド（配列番号２７）を含むＰｅｐ−１。
【請求項３】
成分（Ｉ）が、配列番号１〜２９のいずれかの配列と、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上の配列同一性を示す細胞浸透ペプチドより選択され、かつなおその生物学的活性を維持して、該融合ペプチドが形質膜を超えることを指向する、請求項２に記載の融合ペプチド。
【請求項４】
成分（ＩＩ）が、ＮＭＤＡレセプターサブユニットＮＲ１およびＮＲ２、ＰＤＺ結合ドメインを含むペプチド、ｔＳＸｎＶモチーフを含むペプチド、あるいはシナプス後肥厚９５タンパク質、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ−９３、ＳＡＰ１０２より選択される、請求項３に記載の融合ペプチド。
【請求項５】
成分（ＩＩ）が、５〜４０個、より好ましくは、５〜３０個または５〜２０個、さらにより好ましくは５〜１５個または５〜１０個の長さのアミノ酸を含む、請求項４に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
成分（ＩＩ）が、配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ（配列番号３１）を含む配列より選択される、請求項４または５に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
成分（ＩＩ）が、配列番号３１に記載の配列と、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上の配列同一性を有する配列を含む配列より選択される、請求項４〜６のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項８】
成分（Ｉ）がもっぱらＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその両方からなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項９】
成分（Ｉ）および（ＩＩ）がリンカーによって連結されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項１０】
精製のためのタグである成分（ＩＩＩ）をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ペプチド、および必要に応じて薬学的キャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果に関する疾患を処置、改善または予防する薬学的組成物を調製するための、あるいは、興奮毒性および虚血性の傷害、興奮毒性損傷、神経栄養性の支持の欠落、分離（ｄｉｓｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、てんかんを含むニューロンに対する障害、慢性の神経変性状態、ならびに、ＰＳＤ−９５および／またはＮＭＤＡＲ相互作用に関連する痛みを含む神経障害性の痛みに対する神経保護作用を提供するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ペプチドの使用であって、
該疾患が、脳卒中または脊髄傷害、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害、および急性の中枢神経系（ＣＮＳ）傷害を含むＣＮＳニューロンに対する損傷、虚血性の脳卒中または脊髄傷害、ならびに無酸素症、虚血、機械的傷害より選択される、使用。
【請求項１３】
請求項１１に記載の薬学的組成物、ならびに該薬学的組成物の適用についての指示および／または情報を示す指示マニュアルまたはカタログを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）を含む融合ペプチドを提供する。成分（Ｉ）は、トランスポーターペプチドを含み、成分（ＩＩ）は、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、成分（ＩＩ）は、もっぱらＤ−エナンチオマー（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ）アミノ酸からなる。本発明はさらに、上記融合ペプチドを含む薬学的組成物、および該薬学的組成物を投与する方法、ならびに該融合ペプチドを使用するキットおよび使用方法を提供する。
【０００２】
脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害（例えば、虚血性脳卒中）は、頻繁に生じ、そして中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンおよびその作用（ｐｒｏｃｅｓｓ）にしばしば不可逆的な損傷を生成するので、主要な健康問題である。この損傷はしばしば重篤であるので、このような傷害の帰結に罹患している患者の処置のために、現在のところ、健康に関する当局によって、毎年多大な費用が費やされている。しかし、これら急性のＣＮＳ傷害についての効果的な薬学的処置は、現在まだ存在しない。
【０００３】
臨床的には、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害（例えば、虚血性脳卒中）は、小さな局所的な欠損から悲劇的で広範な機能不全までにわたる、ニューロンの能力の急激な低下として自身を明らかにするか、処置されるべき患者を死に至らしめ得る。この欠損の最終的な規模（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）は初期の物理的損傷の性質および程度によって決定され、そして、関連するニューロン細胞の死をさらに引き起こす二次的な現象が展開する一連のプロセスによって決定されると、現在考えられている。これらのプロセスの係り合いは即座におこるのではないので、まだ決定されていない持続時間の理論的な時間窓（ｔｉｍｅ−ｗｉｏｄｏｗ）が存在する。ここで、タイムリーな干渉が、遅延した神経毒性を生じるこれらの事象を妨害する。虚血性または外傷性のニューロン死の過程を引き起こしそして維持する細胞内機構（例えば、グルタミン酸トランスポーターの逆転）について多くが知られているが、実用的な予防戦略または処置プロトコルとして効果的なものは現在存在しない。したがって、上記疾患（脳卒中または脊髄傷害）に利用可能な、臨床的に有用な薬学的処置として効果的なものは現在存在しない。
【０００４】
科学的な見地から、ＣＮＳ組織還流における局所的な縮小（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、インビボでの低酸素性および外傷性の両方のＣＮＳ傷害においてニューロン死を媒介する。このような局所的な低還流（ｈｙｐｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）は、通常、局所的な脈管構造の物理的な崩壊、血栓症、血管痙攣、または塞栓の塊による内腔閉塞によって生じる。病因にかかわらず、生じた虚血は、細胞の種々の恒常性機構に悪影響を及ぼすことによって、感受性のニューロンを傷害すると考えられている。正確な障害（ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）の性質はほとんどわかっていないが、ニューロン傷害の多くの実験モデルに共通する特徴は、遊離した細胞内カルシウムの濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）に起因する。ニューロンは、［Ｃａ２＋］ｉを生理学的機能に必要な低レベル（約１００ｎＭ）に制限する複数の機構を有している。［Ｃａ２＋］ｉの延長した上昇は、しっかりと制御されたＣａ２＋依存的プロセスを緩和し、これらのプロセスが過剰な反応産物を生成させ、正常には静止している酵素学的経路を活性化するか、または調節性の細胞保護機構を不活性化すると広く考えられている。このことは、実験的に観察可能な細胞破壊（例えば、脂肪分解、タンパク質分解、細胞骨格崩壊、ｐＨ変動、フリーラジカル形成、ミトコンドリア機能不全、細胞膨潤、血漿高潔（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の喪失、および細胞核凝縮）の生成を、次々と生じさせる。
【０００５】
虚血事象（ｅｐｉｓｏｄｅ）の間の有害なレベルのＣａ２＋流入の主要な要因は、ＥＡＡの過剰な放出を介する。よって、Ｃａ２＋の神経毒性を防ぐための古典的な手法は、電圧ゲートのＣａ２＋チャネル、および／または興奮性アミノ酸ＥＡＡゲートのチャネルを介するＣａ２＋流入の薬学的なブロックを介していた。この戦略のバリエーションは、しばしばＥＡＡ誘導性または低酸素性の細胞死をインビトロで減少させる。このことは、Ｃａ２＋神経毒性の仮説を信用させる。しかし、種々のＣａ２＋チャネルアンタゴニストおよびＥＡＡアンタゴニストは、ニューロン傷害、特に、実験的な脊髄傷害（ＳＣＩ）、頭部傷害、および広範な脊髄虚血に対してインビボで保護しない。このことが不十分な薬物濃度、不適切なＣａ２＋流入ブロック、またはＣａ２＋依存的ではない神経毒性プロセスの寄与に起因するのか否かは知られていない。しかし、Ｃａ２＋神経毒性は、種々のＣＮＳニューロンタイプにおいて種々の経路を介して引き起こされるようである。よって、首尾よくＣａ２＋ブロックすることは、典型的には多くの薬学的アプローチを必要とする。ＮＭＤＡＲの多くのアンタゴニストが開発されていることに注目すべきである。しかし、これらのアンタゴニストは、傷害の前に薬物を投与する時のみにインビボで動物モデルに効果的であり、よって典型的な臨床的筋書き（ここで、処置は典型的には例えば発作に引き続いて行われる。）に活用され得ない。また、ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、典型的には、インビボでヒトにおいてほとんど寛容性ではなく、治療的な濃度ウインドウが小さいかまたは時々存在しない。このことは、正常な生理学および病理学におけるＮＭＤＡＲの重要な役割を反映する。
【０００６】
Ｃａ２＋依存性の神経毒性プロセスに関して、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）活性が細胞内シグナル伝達経路の引き金となり、ニューロンの可塑性、発達、老化および疾患を支配することが、哺乳動物ニューロン系において観察される。ＮＭＤＡＲの足場となるタンパク質であるＰＳＤ−９５の発現を抑制することによる興奮毒性のＮＭＤＡＲシグナリングの研究は、選択的に減弱されたＮＭＤＡＲ興奮毒性を示したが、他のグルタミン酸チャネルまたはＣａ２＋チャネルによって興奮毒性は示されなかった（例えば、ＵＳ２００３００５０２４３参照）。これにより、ＮＭＤＡＲ機能は、レセプター発現として影響を受けなかったが、ＮＭＤＡＲを介するＮＭＤＡカレントおよび４５Ｃａローディングは変化しなかった。さらに、ＰＳＤ−９５の抑制は、ニューロン性一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）の発現または機能に影響を与えることなく、ＮＭＤＡＲによるＣａ２＋活性化一酸化窒素の産生を選択的にブロックしたが、他の経路による一酸化窒素の産生をブロックしなかった。従って、ＰＳＤ−９５は、ＮＭＤＡＲ活性の一酸化窒素毒性への効果的な結合に必要であり、神経毒性Ｃａ２＋シグナリングに対する特異性を付与すると認識されている。
【０００７】
さらに、ＮＭＤＡＲを介するカルシウム流入はシナプス伝達、ニューロン発達および可塑性を媒介するに重要な役割を担うということが知られている（例えば、Ghosh and Greenberg, Science 268, 239 (1995); Bliss and Collingridge, Nature 361, 31 (1993)参照）。過度には、Ｃａ２＋流入は興奮毒性（例えば、Olney, Kainic acid as a tool in neurobiology., McGeer, Olney and McGeer, Eds. (Raven Press, New York, 1978), p. 95.; Rothman and Olney, TINS 10, 299 (1987); Choi, Ann NY Acad Sci 747, 162 (1994)参照）、神経学的障害（発作、てんかん、および慢性の神経変性状態）においてニューロンを損傷するプロセス（例えば、Lipton and Rosenberg, New Eng J Med 330, 613 (1994)参照）を引き起こす。Ｃａ２＋流入がＮＭＤＡＲを介して生じる場合に、迅速なＣａ２＋依存的神経毒性が最も効果的に引き起こされ、非ＮＭＤＡＲまたは電位感受性Ｃａ２＋チャネル（ＶＳＣＣ）を介する等価量のＣａ２＋でニューロンをローディングすることにより再生され得ないということに注意すべきである（例えば、Sattler et al., J Neurochem 71, 2349 (1998).; Tymianski et al., J Neurosci 13, 2085 (1993)参照）。この観察は、
ＮＭＤＡＲチャネルを介するＣａ２＋流入が神経毒性シグナル伝達経路に機能的に結合し得ることを示す。よって、理論と関連付けられることなく、ＮＭＤＡＲによる致死的なＣａ２＋シグナリングは物理的に相互作用する分子（例えば、細胞内Ｃ末端ドメインを介してＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０に結合するＮＲ２  ＮＭＤＡＲサブユニット（Cho et al., Neuron 9, 929 (1992)参照）、ｃｈａｐｓｙｎ−１１０／ＰＳＤ−９３、および膜結合グアニル酸キナーゼ（ＭＡＧＵＫ）ファミリー（例えば、Kornau et al., Science 269, 1737 (1995).; Brenman et al., J Neurosci 16, 7407 (1996); Muller et al., Neuron 17, 255 (1996) 参照））によって決定され得るということが示唆される。ＮＭＤＡＲ結合ＭＡＧＵＫは、一般に非ＮＭＤＡＲと結合するものとは異なる（Dong et al., Nature 386, 279 (1997); Brakeman et al., Nature 386, 284 (1997)参照）。ＮＭＤＡＲによる神経毒性Ｃａ２＋シグナリングの選択的な活性化が、ＮＭＤＡＲ結合ＭＡＧＵＫまたは結合する細胞内タンパク質の識別力によって決定されることが見出された。ＰＳＤ−９５は膜直下の足場分子であり、ＮＭＤＡＲを選択的に結合しかつクラスタリングし、さらなるタンパク質−タンパク質相互作用を介して細胞内シグナル伝達分子に連結され得る（例えば、Craven and Bredt, Cell 93, 495 (1998); Niethammer et al., Neuron 20, 693 (1998); Kim et al., Neuron 20, 683 (1998); Tezuka et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 435(1999)参照）。よって、ＰＳＤ−９５を混乱させることによって、ＮＭＤＡＲを介する神経毒性Ｃａ２＋シグナリングに対して影響があることが示唆される。
【０００８】
一般に、タンパク質−タンパク質相互作用は、細胞増殖、分化、および、モジュラータンパク質ドメインとその同族の結合パートナーとの間のダイナミックな結合を介する細胞間コミュニケーションに関連するシグナリングを支配する（Pawson and J. D. Scott, Science 278, 2075-2080 (1997) 参照）。より詳細には、イオノトロピー（ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）グルタミン酸レセプターは、興奮性シナプスにて、シナプス後肥厚（ＰＳＤ）内での複数のタンパク質シグナリングの複合体へ組織化される（Sheng, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98, 7058-7061 (2001) 参照）。ＰＳＤ内で特に組織化されているタンパク質は、膜結合グアニル酸キナーゼ（ＭＡＧＵＫ）ファミリーのメンバーであるＰＳＤ−９５である。ＰＳＤ−９５は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸サブタイプのグルタミン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）ような膜貫通タンパク質を種々の細胞内シグナリング酵素に結合させる複数のドメインを含んでいる。ＰＳＤ−９５は、その第二のＰＤＺドメイン（ＰＤＺ２）を介して、ＮＭＤＡＲ  ２Ｂサブユニット（ＮＲ２Ｂ）およびニューロン性一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）の両方を結合する（Brenman et al., Cell 84, 757-767 (1996)参照）。この相互作用は、ＮＭＤＡＲ活性を一酸化窒素（ＮＯ）の産生に結合させ、このシグナリング分子はＮＭＤＡＲ依存的な興奮毒性を媒介する（Dawson et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 6368-6371 (1991)参照）。ＮＲ２は、ＰＳＤ−９５のＰＤＺ１またはＰＤＺ２のいずれかと相互作用し得る。しかし、ＰＳＤ−９５のＰＤＺ１ドメインはＮＭＤＡレセプターのＣＯＯＨ末端と相互作用する場合、ＰＤＺ２はｎＮＯＳのＮＨ２末端を結合しない（Cao et al., 2005, J.Cell Biol 168, 117-126; and Christopherson et al, 2005, J. Biol. Chem. 274:27467-27473.参照）。
【０００９】
ＮＭＤＡＲは、低酸素／虚血脳傷害において神経毒性での重要な役割を担う（Simon et al., Science 226, 850-852 (1984)参照）が、ＮＭＤＡＲ機能のブロックは、動物およびヒトにおいて有害であり得る（Fix et al., Exp Neurol 123, 204-215 (1993); Davis et al., Stroke 31, 347-354 (2000); Morris et al., J. Neurosurg. 91, 737-743 (1999)参照）。ＮＭＤＡＲアンタゴニストは発生段階の脳におけるアポトーシスを引き起こす。また、ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、外傷性の脳傷害の後の臨床期間または神経変性の緩やかな進行期間に投与された場合、成人の脳におけるニューロンの喪失を悪化させる（Ikonomidou et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12885-12890; Olney et al., 2002, Brain Pathology 12, 488-498）。さらに、ＮＭＤＡＲアンタゴニストを用いることによるＮＭＤＡＲ機能のブロックは、所望しない他の副作用（例えば、認識傷害および精神疾患）を導き得る。従って、ＰＳＤ−９５タンパク質を標的化することは、興奮毒性を含む疾患に対する代替的な治療アプローチを提示し、ＮＭＤＡＲ機能をブロックすることによるネガティブな帰結を回避し得る。しかし、ＰＳＤ−９５の変異または抑制は、脳傷害に対する治療として現実的ではないこと、および傷害が生じた後に適用され得ないことが証明されている。従って、ＰＳＤ−９５発現を変更する以外に、ＮＭＤＡＲ／ＰＳＤ−９５相互作用を干渉することが、インビトロでの興奮毒性およびインビボでの虚血性脳障害を抑制し得るか否かは疑問である。
【００１０】
上記の観点から、当該分野において、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を減弱または阻害する化合物を用いる哺乳動物細胞の処置によって、障害効果を低減させるアプローチが開発されている（ＵＳ２００３００５０２４３）。ＵＳ２００３００５０２４３に記載の方法は、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質（例えば、ニューロンタンパク質）との相互作用を崩壊し得るペプチド化合物を使用する。このアプローチは、ＮＭＤＡＲ機能のブロックによって生じる不利益を回避する。ＵＳ２００３００５０２４３に記載の方法は、主に、シナプス後肥厚−９５タンパク質（ＰＳＤ−９５）のニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）に対する相互作用が、興奮毒性を媒介する経路につながり、よって、この特定の相互作用を崩壊させる選択的ペプチドを使用して、虚血性脳障害が治療され得るという知見に基づいている。より詳細には、この相互作用の崩壊は、ＵＳ２００３００５０２４３に従って、ＰＳＤ−９５／ＮＭＤＡＲ相互作用複合体のいずれかの部位上のモジュラードメインに結合するペプチドをニューロンに導入することによって達成される。この処置は、ＮＭＤＡＲ活性をブロックすることなくＮＭＤＡＲシグナリングの下流を減弱させ、大脳皮質培養ニューロンを興奮毒性の損傷から保護し、一過性の局所的な脳虚血に供したラットにおける脳梗塞の量を低減させた。ＵＳ２００３００５０２４３に従った処置法は、インビトロでの興奮毒性およびインビボでの脳虚血の前、または開始後１時間のいずれかで適用された場合に、効果的であった。従って、このアプローチは、ＮＭＤＡＲ活性をブロックすることに関連するネガティブな合併症（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を防ぐための、よい基礎を提供することを示している。
【００１１】
しかし、インビボで細胞内部位を標的化するために（例えば、特定の疾患を処置するために）およびインビトロでの細胞処置のために投与されるペプチド化合物は、典型的には、処置されるべき細胞内でバイオアベイラビリティをほとんど有していない。このバイオアベイラビリティがほとんどないことは、主に、これらのペプチド化合物のその標的細胞への指向が最適状態には及ばないことに起因している。これは、例えば、好適なトランスポーターシステムがないこと、またはふさわしくない（所望の標的細胞のインビボでの局在化に効果的に作用しない（例えば、細胞質または細胞内での特定の目的地を効果的に標的化しない）トランスポーターシステムを使用したことによって生じ得る。この効果は漸増量のペプチド化合物を投与することによって、またはその投与を反復することによって達成されるが、インビボでの漸増レベルのペプチド化合物は、投与の際に所望しない副作用を導き得る。さらに、ペプチド化合物の反復投与は、典型的には、医者が継続して存在することを必要とし、その帰結としてほとんどの場合において連続的に通院することを必要とする。このような効果は、ペプチド化合物の増加または反復した投与によって、またはより好適なトランスポーターシステム（例えば、ＵＳ２００３００５０２４３参照）を使用することによって、非現実的にされ得るとはいえ、これらはさらに、早期の分解を被り得、その帰結として、インビボでほとんどバイオアベイラビリティがないことを再度示し得る。この効果は、部分的に、細胞内プロセス（例えば、プロテアーゼまたはペプチドアーゼのような酵素の分解による分解プロセス）に起因しており、これらのペプチドのインビボでの不安定性、または血清、髄液（ｃｅｒｏｂｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）（ＣＳＦ）などにおけるタンパク質分解性の分解に起因し得る。しかし、ペプチドの不安定性は、そのペプチド化合物の投与の増加または反復のいずれによっても達成されない。
【００１２】
上述に起因して、本発明は、哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果を低減するための代替策を提供することを目的とし、より詳細には、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターとＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害する化合物を提供し、これにより、従来技術における制限の少なくともいくつか（例えば、ＵＳ２００３００５０２４３に従う化合物によって例示されるようなもの）を克服することを目的としている。
【００１３】
本発明の目的は、少なくとも成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）を含む融合ペプチドであって、成分（Ｉ）は、トランスポーターペプチドを含み、成分（ＩＩ）は、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害するペプチドより選択され、成分（ＩＩ）は、もっぱらＤ−エナンチオマーアミノ酸からなる、融合ペプチドによって解決される。本発明の目的のために、Ｄ−エナンチオマーアミノ酸は、本明細書中に示されるように、配列中にて小文字で示され、ここで、Ｌ−エナンチオマーアミノ酸は大文字で示される。
【００１４】
上述した本発明の融合ペプチドは、トランスポーターペプチドを成分（Ｉ）として含んでいる。このようなトランスポーターペプチドは、本発明に係る融合ペプチドを細胞質または特定の細胞内での目的地へ指向する任意のトランスポーターペプチドより選択され得る。成分（Ｉ）として使用されるトランスポーターペプチドは、例えば、本発明の融合ペプチドを所望の細胞内局在（例えば、核、リボソーム、小胞体、リソソーム、またはペルオキシソーム）に指向し得る。その結果として、好ましい実施形態において、本発明の融合ペプチドのトランスポーターペプチドは、結合した分子を規定された細胞内局在に施行する。いくつかの場合において、本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）として使用されるトランスポーターペプチドは、好ましくは、細胞膜を超えて（例えば、細胞外環境から形質膜を通って細胞質へ）本発明の融合ペプチドを指向し、これにより、本発明の融合ペプチドの細胞内への取り込みを、特に、細胞透過性を増強することによって、またはその細胞内での持続時間を延長することによって増強する。
【００１５】
より詳細には、上述した融合ペプチドの成分（Ｉ）は、以下のような細胞膜を透過するペプチド（細胞膜透過ペプチド）より選択され得るが、これらに限定されない：（ａ）以下より選択されるタンパク質伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメイン（ＰＴＤ）およびＣＰＰ由来タンパク質：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１）またはＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−アミド（配列番号２）を含む、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ由来の配列（例えば、ｐＡｎｔｐ（４３−５８））；ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）（例えば、ＴＡＴ、より好ましくは、ＴＡＴからの領域３７〜７２、領域３７〜６０、領域４８〜６０または領域４９〜５７）に由来する配列であり、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）、ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号５）またはＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣＣ（配列番号６）を含む配列；配列ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ−ＮＨ２（配列番号７）を含むｈＣＴ（９−３２）；配列ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ−ＮＨ２（配列番号８）を含むｐＶＥＣ；配列ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ−ＮＨ２（配列番号９）を含むｐＩＳＬ；配列ＭＡＮＧＬＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ−ＮＨ２（配列番号１０）を含むマウスＰＲＰ（１−２８）またはそのヒトホモログ；配列ＲＱＧＡＡＲＶＴＳＷＬＧＬＱＬＲＩＡＧＫＲＬＥＧＲＳＫ−ＮＨ２（配列番号１１）を含むＥｍｓ（１９４−２２０）；配列ＫＬＩＫＧＲＴＰＩＫＦＧＫ−ＮＨ２（配列番号１２）を含むＲｅｓｔｒｉｃｏｃｉｎ  Ｌ３（６０−７３）；など、（ｂ）モデルペプチド（例えば、配列ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ−ＮＨ２（配列番号１３）を含むＶＴ５；配列ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ−ＮＨ２（配列番号１４）を含むＭＡＰ）、アルギニンストレッチ（ＲＲＲＲＲＲＲ（（Ａｒｇ）７；配列番号１５）、ＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（（Ａｒｇ）７−ＮＨ２；配列番号１６）、ＲＲＲＲＲＲＲ−Ｃ（（Ａｒｇ）７−Ｃ；配列番号１７）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（（Ａｒｇ）８；配列番号１８）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（（Ａｒｇ）８−ＮＨ２；配列番号１９）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（（Ａｒｇ）９；配列番号２０）またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（（Ａｒｇ）９−ＮＨ２；配列番号２１）を含む）など、あるいは（ｃ）設計されたＣＰＰ（例えば、配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ（配列番号２２）または配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−システアミド（ｃｙｓｔｅａｍｉｄｅ）（配列番号２３）を含むＭＰＧ；配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（配列番号２４）を含むトランスポゾン、配列ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（配列番号２５）を含むトランスポゾン１０；配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）またはＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−システアミド（配列番号２７）を含むＰｅｐ−１など。あるいは、上述した融合ペプチドの成分（Ｉ）は、配列ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡ���ＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２８）を含むＫＡＬＡペプチド、または配列ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号２９）を含むＢｕｌｆｏｒｉｎ  ２などより選択され得る。本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）として使用されるペプチドは、さらに、上述した配列番号１〜２９のいずれかの配列と、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するペプチド配列より選択され得る。成分（Ｉ）は、なおその生物学的活性を維持しており、すなわち、該融合ペプチドが形質膜を超えることを指向する。本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）として、上記のような細胞膜透過ペプチドの選択は、典型的には、本発明の融合ペプチドが投与されるべき細胞システム、膜などの特定の要求に基づいて行われ得る。上記にて示したようなまたは当該分野において知られているトランスポーターペプチドの生物学的活性は、当業者によって、標準的なアッセイを使用することによって容易に決定され得る。例えば、トランスポーターペプチドは、ＧＦＰのようなタンパク質に融合されても、放射標識、酵素または蛍光団などを用いてラベルされてもよく、これらは細胞内で容易に検出され得る。次いで、融合されたトランスポーターペプチドは、細胞内にトランスフェクトされるか、または培養上清に添加され、細胞膜の浸透は、標準的な生物物理的方法を使用することによってモニタリングされ得る。
【００１６】
上記の融合ペプチドの成分（Ｉ）は、天然に存在するアミノ酸（すなわち、Ｌ−アミノ酸）またはＤ−アミノ酸（すなわち、ネイティブ配列と比較してＲｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏな順番にあるＤ−アミノ酸を含むアミノ酸配列）のいずれかから構成され得る。用語「Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ」は、線状ペプチドのアイソマーをいい、ここで、この配列の方向は逆転しており、各アミノ酸残基のキラリティーは反転している。よって、Ｌ−型で示されている本明細書中の任意の配列が、Ｄ−エナンチオマー（Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ型）ペプチド配列としてもまた潜在的に開示される。本発明に係るＤ−エナンチオマー（Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ型）ペプチド配列は、例えば、対応するネイティブＬ−アミノ酸配列についての逆転したアミノ酸配列を合成することによって構築され得る。Ｄ−Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ型エナンチオマーペプチド（例えば、本発明の融合ペプチドの成分）において、各α炭素でのカルボニル基およびアミノ基の位置が交換されており、各α炭素の側鎖基の位置が保存されている。Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチドは、本発明の融合ペプチドの成分として使用される場合、種々の有用な特定を有している。例えば、これらのペプチドは、細胞へより効率的に侵入し、（特にインビボにて）より安定であり、対応するＬ−ペプチドよりも低い免疫原性を示す。対照的に、ほとんど全ての分解酵素（例えばプロテアーゼまたはペプチダーゼ）は、隣接するＬ−アミノ酸の間でペプチド結合を切断する。よって、本発明の融合ペプチドは、特に成分（ＩＩ）について、そして必要に応じて成分（Ｉ）について、Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏな順序でのＤ−エナンチオマーアミノ酸から構成され、タンパク質分解性の崩壊に対して大いに耐性である。
【００１７】
Ｄ−エナンチオマーアミノ酸を有する、上述した本発明の融合ペプチドの成分の調製は、対応する、天然に存在するＬ−型アミノ酸配列の逆のアミノ酸配列を化学的に合成するか、あるいは当業者に公知の任意の他の適切な方法によって達成され得る。この合成は、好ましくは、所望のＲｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ配列にＤアミノ酸を連結する固相合成によって行われる。使用されるＤアミノ酸およびＲｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏな順序でのアミノ酸の合成とは異なり、本発明のＤアミノ酸配列の固相合成は、Ｌアミノ酸に基づくペプチドの合成と化学的には同一である。任意の所望のＤＮＡ配列の構築のための一般的な方法は、例えば、Brown J. et al. (1979), Methods in Enzymology, 68: 109; Sambrook J, Maniatis T (1989) （前出）に提供される。
【００１８】
あるいは、本発明の融合ペプチドのＤ−Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ−エナンチオマー型またはその成分は、本発明の融合ペプチドのＬ型またはその成分を、Ｄ−Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ−エナンチオマー型の化学合成のマトリクスとして使用する、上述したような化学合成を使用して調整され得る。
【００１９】
上述したような本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）は、ニューロン性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）のＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質（例えば、結合タンパク質（例えば、ＰＳＤ−９５）、ニューロン性タンパク質など）との相互作用を阻害し得る任意のペプチドより選択される。このようなペプチドは、典型的には、ＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質をトラップし、その結果、ＮＭＤＡレセプターとこれらのタンパク質との相互作用を阻害する。あるいはその逆も同様である。さらに、これらのペプチドは、ＮＭＤＡレセプターをブロックせず、その結果、ＮＭＤＡレセプターのブロックに関連する不利益を回避する。より詳細には、上述したような本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）は、ＮＭＤＡＲの相互作用ドメイン（例えばＮＲ２のＣ末端ＰＤＺ相互作用ドメイン）を模倣することによって、あるいは、結合タンパク質の相互作用ドメイン（例えば、ＰＳＤ−９５のＰＤＺ１ドメイン）を模倣することによって、ＮＭＤＡＲとその結合タンパク質との間の相互作用（例えば、ＰＳＤ−９５−ＮＲ２相互作用）を破壊するように設計された任意のペプチドより選択される。本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）として適切なペプチドは、ＮＭＤＡレセプターサブユニットＮＲ１およびＮＲ２より選択され得るが、これらに限定されない。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターのＮＲ１サブユニットおよびＮＲ２サブユニットは異なる遺伝子によってコードされる。ラット脳において、ＮＲ１サブユニットのＣ末端バリアント４つ（ＮＲ１−１〜ＮＲ１−４）は、単一の遺伝子によってコードされ、Ｃ１およびＣ２のエクソンカセットの選択的スプライシングによって生成されるが、４つの異なる遺伝子が、ＮＲ２サブユニット（ＮＲ２Ａ〜Ｄ）をコードする。機能的ＮＭＤＡレセプターは、ＮＲ１バリアントと種々のＮＲ２サブユニットのヘテロ多量体アセンブリを生じる。ＮＲ２Ｂサブユニットは、シナプス後肥厚タンパク質９５（ＰＳＤ−９５）、ＳＡＰ９７など、および膜結合グアニル酸様キナーゼ（ＭＡＧＵＫ）ファミリータンパク質のメンバーと相互作用する。この相互作用は、ＮＲ２ＢサブユニットのＣ末端ｔＳＸｎＶ細胞内モチーフと、ＰＳＤ−９５タンパク質およびＳＡＰ９７タンパク質のＮ末端ＰＤＺ（ＰＳＤ−９５、ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ、ＺＯ−１）ドメインとの結合を介して生じる。ＮＲ１−３とＮＲ１−４の両方もまた、連続するＣ末端ｔＳＸｎＶモチーフを示す。よって、本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）として使用されるペプチドは、ｔＳＸｎＶモチーフを含むペプチドより選択され得、ここで、Ｓはセリンであり、Ｘｎは任意のアミノ酸（ｎは少なくとも１、２、３、４、５などである）であり、Ｖはバリンである。特に好ましくは、本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ９として使用されるペプチドは、ＮＭＤＡＲに由来しかつシナプス後肥厚−９５タンパク質、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ−９３、またはＳＡＰ１０２に結合し得るペプチド、より詳細には、ＰＤＺ結合ドメイン（例えばＰＤＺ２ドメイン含有ポリペプチド（好ましくはＰＳＤ−９５の残基６５〜２４８に対応し、ＰＳＤ−９５の第１および第２のＰＤＺドメイン（ＰＤＺ１〜２）をコードする。））を結合するペプチドより選択され得る。典型的には、本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）として使用されるこのようなペプチドは、５〜４０アミノ酸長を含み、好ましくは、５〜３０アミノ酸長もしくは５〜２０アミノ酸長、より好ましくは、５〜１５アミノ酸長または５〜１０アミノ酸長を含む。さらにより好ましくは、本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）として適切なペプチドは、Ｄ−エナンチオマーアミノ酸配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ（配列番号３１）、または配列番号３１に記載の配列と約６０、７０、８０、９０、９５、９９％の配列同一性を示す配列を含む配列より選択され得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」は、配列が以下のように比較されることが意図される。２つのアミノ酸配列の同一性％を決定するために、これらの配列が最適な組成目的のために整列され得る（例えば、ギャップが第１のアミノ酸配列中に導入され得る。）。対応するアミノ酸位でのアミノ酸は、次いで比較され得る。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置で同一のアミノ酸に占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間での同一性％は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の機能である。例えば、特定のペプチドが規定された長さの参照ポリペプチドに対して特定の同一性％を有しているといわれる場合、同一性％は参照ペプチドに関連する。よって、１００アミノ酸長である参照ポリペプチドに対して５０％同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸長部分に完全に同一である５０アミノ酸ポリペプチドであり得る。また、参照ポリペプチドの全長にわたって５０％同一な１００アミノ酸長のポリペプチドでもあり得る。よって、特定の同一性％を有しているといわれる特定のペプチドが、例えば、成分（Ｉ）について明確に示した（例えば配列番号１〜２９の何れかに記載の）ペプチド、成分（ＩＩ）について明確に示した（例えば配列番号３１に記載の）ペプチド、あるいはその全長融合ペプチドについて例えば配列番号３３および３５に示したペプチドより選択されるが、これらに限定されない。もちろん、他のポリペプチドも同一の基準を満たす。２つの配列の同一性％のこのような決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学アルゴリズムの、好ましい、非限定的な例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、これは、本発明のアミノ酸配列に対して所望の同一性を有する配列を同定するために使用され得る。Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402に記載されているようなギャップＢＬＡＳＴが、利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する際に、個々のプログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。配列はさらに、Version 9 of the Genetic Computing Group's GAP (global alignment program)を使用して、デフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（バリュー−４〜１１）を、（ギャップの第一のヌルに対する）−１２のギャップオープンペナルティ、および（ギャップにおけるさらなる連続的なヌルごとあたり）−４のギャップエクテンションペナルティにて使用して整列され得る。整列後、要求された配列におけるアミノ酸数のパーセントとしてマッチ数を示すことによって同一性％が算出される。２つのアミノ酸配列の同一性％の決定のために記載された方法は、核酸配列に対応して適用され得る。
【００２１】
上述したような本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）は、全体がＤ−エナンチオマーアミノ酸、すなわち、上述したようなＲｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏな順序でＤ−アミノ酸を含んでいるアミノ酸配列から構成され、上述したように調製され得る。本発明の融合ペプチドの成分（ＩＩ）に使用されるようなＲｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏペプチドは、成分（ＩＩ）についてすでに上述しているような種々の有用な特性（例えば、この成分のタンパク質分解性崩壊を欠くことに起因した、本発明の融合ペプチドの部分を形成する成分の、より長いバイオアベイラビリティなど）を有している。
【００２２】
本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および（ＩＩ）の両方が直接的にかまたはリンカーを介して連結され得る。本明細書中において、「リンカー」は、好ましくはオリゴペプチドまたはポリペプチドであり、上記のように成分（Ｉ）および（ＩＩ）を連結するために使用され得る。好ましくは、リンカーは、１〜１０アミノ酸長を有しており、より好ましくは、１〜５アミノ酸長を有しており、最も好ましくは、１〜３アミノ酸長を有している。有利には、リンカーは、二次構造を形成させる任意の特性を有していない。すなわち、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成する傾向はない。例えば、リンカーは、少なくとも３５％のグリシン残基から構成される。リンカーは、典型的には、例えば、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧなどの全てグリシンからなる配列であり得る。細胞内の（内因性の）切断可能なオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列をリンカーとして使用することによって、標的細胞へ送達した後に成分（ＩＩ）を成分（Ｉ）から分離することができる。切断可能なオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列はまた、本明細書において、プロテアーゼで切断可能なオリゴペプチド配列またはポリペプチド配列が挙げられ、ここで、プロテアーゼ切断可能な部位は、典型的には、処置される細胞によって内因性に発現されているプロテアーゼに依存して選択される。上記のようなリンカーは、オリゴペプチド配列またはポリペプチド配列として存在する場合、Ｄ−アミノ酸または天然の存在するアミノ酸（すなわちＬ−アミノ酸）の何れかから構成され得る。上記の代替として、本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および（ＩＩ）の結合は、結合剤または複合体化剤（例えば、架橋試薬）を介して達成され得る。利用可能な分子間架橋試薬がいくつか存在する。例えば、Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39-43参照。これらの試薬としては、例えば、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（イオドアセタミド）または６〜１１個のメチレン基を有する他の試薬；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンが挙げられる。本目的に有用な他の架橋試薬としては、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン；ジメチルアジピミデート；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、あるいはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート；グルタルアルデヒドおよびジスジアゾベンジジンが挙げられる。架橋試薬は、ホモ二官能性であり得る。すなわち、同一の反応を行う２つの官能基を有していてもよい。好ましいホモ二官能性の課教師役は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）である。ＢＭＨは、マレイミド官能基を２つ含んでいる。これは、穏やかな条件（ｐＨ６．５〜７．７）においてスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。２つのマレイミド官能基は、炭化水素鎖によって連結されている。よって、ＢＭＨは、システイン残基を含むタンパク質（またはポリペプチド）の不可逆的な架橋に有用である。架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性の架橋試薬は、異なる２つの官能基（例えば、アミノ反応性基およびチオール反応性基）を有しており、それぞれ遊離アミンおよび遊離チオールを有する２つのタンパク質を架橋する。ヘテロ二官能性の架橋試薬の例としては、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）、およびスクシニミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）（ＭＢＳの伸張鎖アナログ）が挙げられる。一級アミンを有するこれらの架橋試薬のスクシニミジル基、およびチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。架橋試薬はしばしば水溶性が低いので、親水性部分（例えば、スルホネート基）が、架橋試薬に添加されてその水溶性を改善し得る。ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳおよびｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、水溶性について改変された架橋試薬の例である。多くの架橋試薬が、細胞内条件下で実質的には切断されない複合体を生成する。よって、いくつかの架橋試薬は、細胞内条件下で切断可能な共有結合（例えばジスルフィド）を含んでいる。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬、ジチオニス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）およびＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）が、切断可能な架橋リンカー（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）としてよく知られている。切断可能な架橋試薬は、標的細胞への送達の後に、この細胞が架橋リンカー試薬の特定の配列を切断し得る場合に、成分（Ｉ）からの成分（ＩＩ）の分離を可能にする。この目的のために、直接的なジスルフィド結合もまた、有用であり得る。化学的な架橋はまた、スペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、細胞内可撓性を提供するか、または複合体化した部分の間の細胞内での距離を調整し、これにより、生物学的活性の維持を補助し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸（例えば、プロリン）を含むタンパク質（またはポリペプチド）部分の形態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、架橋試薬の一部（例えば、「長鎖ＳＰＤＰ」（Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., cat. No. 21651 H）であり得る。多数の架橋試薬（上記下ものを含む。）は市販されている。それらの使用のための詳細な指示書が供給業者から容易に利用可能である。タンパク質架橋および複合体調製についての一般的な参考文献は、Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)である。
【００２３】
上記したような本発明の融合ペプチドは、必要に応じて、さらなる成分（ＩＩＩ）を含み得る。このような成分（ＩＩＩ）は、好ましくは、合成の後の、融合ペプチド精製のためのタグである。本明細書において、「精製のためのタグ」は、リコンビナントタンパク質の精製に好適な任意の種々のタグ（例えば、６ヒスチジンタグ（ｈｉｓタグ、ポリヒスチジンタグ）、ストレプトアビジンタグ（ｓｔｒｅｐタグ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジン結合タグ）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ、ダンシルタグなど）、あるいは抗体エピトープ（抗体結合タグ）（例えば、ｍｙｃタグ、Ｓｗａ１１エピトープ、ＦＬＡＧタグなど）であり得る。上述したタグは、好ましくは、成分（Ｉ）、（ＩＩ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ）から構成される、上述したような（完全な）融合ペプチドのＣ末端に位置される。例えば、上述したように、タグは、好ましくは、成分（Ｉ）が融合ペプチドのＣ末端に位置される場合、成分（Ｉ）のＣ末端に位置され、より好ましくは、成分（ＩＩ）が融合ペプチドのＣ末端に位置される場合、成分（ＩＩ）のＣ末端に位置される。さらに、上述したように、成分（ＩＩＩ）は、好ましくは、成分（Ｉ）または（ＩＩ）の生物学的機能性（例えば、本発明の融合ペプチドを細胞膜透過させる成分（Ｉ）の能力、およびＮＭＤＡＲとＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害する成分（ＩＩ）の能力）を干渉しないように選択される。よって、かさばらないタグ（例えば、６ヒスチジンタグ、ストレプトアビジンタグ（ｓｔｒｅｐタグ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジン結合タグ）、または抗体エピトープ（例えば、ｍｙｃタグ、Ｓｗａ１１エピトープ、ＦＬＡＧタグなど）が、成分（ＩＩＩ）として好ましく選択される。
【００２４】
さらに、上記のような成分（ＩＩＩ）は、オリゴペプチドまたはポリペプチドとして存在する場合、上記のようなＤアミノ酸または天然に存在するアミノ酸（すなわちＬアミノ酸）の何れかから構成され得る。よって、融合ペプチド全体は、成分（Ｉ）、（ＩＩ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ）、および上記したようなリンカーを含み、上記したようなＤアミノ酸から構成され得る。本発明の融合ペプチド全長が、成分（Ｉ）、（ＩＩ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ）、および上記したようなリンカーを含み、上記したようなＤアミノ酸から構成され得る場合、融合ペプチドは全体として、本発明の融合ペプチドのＤ−エナンチオマー成分のために、例えば、化学合成法または任意の他の適切な方法を使用して上記したように調製され得る。
【００２５】
一般に、上記したような本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）、（ＩＩ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ）は、適切に配列され得る。すなわち、本発明の融合ペプチドにおいて整列される場合、任意の順番において、成分（Ｉ）が、形質膜を超えるように本発明の融合ペプチドを指向することを可能にする。さらに、成分（ＩＩ）は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプターとＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害し得る。好ましい実施形態において、成分（Ｉ）は、本発明の融合ペプチドのＮ末端に位置され、成分（ＩＩ）は、本発明の融合ペプチドのＣ末端に位置される。さらに、上記のような成分（ＩＩＩ）が本発明の融合ペプチドに含まれる場合、成分（ＩＩＩ）は、本発明の融合ペプチド全体のまさにＣ末端に位置され得る。よって、本発明の融合ペプチドの好ましい配列は、Ｎ末端からＣ末端へ、成分（Ｉ）、成分（ＩＩ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ）を示し得る。しかし、他の整列（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ、成分（ＩＩ）、成分（Ｉ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ））もまた選択され得る。好適には、上述したように、リンカーが、成分（Ｉ）と成分（ＩＩ）との間に挿入され得る。
【００２６】
本発明の融合ペプチドはまた、上記のような成分（Ｉ）および／または成分（ＩＩ）の「誘導体」を含み得る。本発明における成分（Ｉ）および／または（ＩＩ）の誘導体は、アミノ酸配列の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸が置換されることによって、天然に存在する配列の任意の部位で１つ以上のアミノ酸が欠失されることによって、および／または天然に存在するペプチド配列の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸が挿入されることによって、上記のような成分（Ｉ）または成分（ＩＩ）の天然に存在する（Ｌアミノ酸）配列に由来した、成分（Ｉ）または（ＩＩ）の配列を意味することが意図される。「誘導体」は、本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）または（ＩＩ）として使用される場合、それらの生物学的活性を維持している。例えば、成分（Ｉ）の誘導体は、上述したように、本発明の融合ペプチドを細胞質内へ、さらには特定の細胞内での位置へ指向し得、成分（ＩＩ）の誘導体は、ニューロンのＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡＲ）とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害し得る。本明細書において、誘導体はまた、上述したように、Ｌ−アミノ酸配列またはＤ−アミノ酸配列、あるいはその両方の形態で生じ得る。
【００２７】
アミノ酸の置換が、本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および／または成分（ＩＩ）の誘導体の調製のために行われ、保存的（アミノ酸）置換が好ましい。保存的（アミノ酸）置換としては、典型的には、以下の群に含まれる置換が挙げられる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。よって、好ましい保存的置換の群は、アスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシンおよびリジン−アルギニンである。このような変異によって、例えば、本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および（ＩＩ）の安定性および／または効果が増強され得る。本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および（ＩＩ）に変異が導入される場合、これらの成分（Ｉ）および（ＩＩ）は、例えば、配列において、機能において、および抗原性特性または他の機能において、対応する親配列を有するタンパク質と（機能的な）相同性を維持する。本発明の融合ペプチドのこのように変異された成分（Ｉ）および（ＩＩ）は、改変された特性を有し得、特定の適用（例えば、増加したｐＨ最適性、増加した温度安定性など）に対して、改変されていない成分（Ｉ）ｏｙｏｂｉ（ＩＩ）の配列よりも有利であり得る。
【００２８】
本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）の誘導体または成分（ＩＩ）の誘導体は、それぞれ上記のような本発明の融合ペプチドの、成分（Ｉ）または成分（ＩＩ）の修飾されていない配列（例えば、成分（Ｉ）として使用される場合のＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質転座配列）と実質的同一性を有している。特に好ましくは、天然に存在するアナログに対して、
少なくとも３０％の配列同一性を有しているアミノ酸配列であり、好ましくは、少なくとも５０％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の配列同一性、よりさらに好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性、なおさらに好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも９５％または９９％以上の配列同一性を有しているアミノ酸配列である。本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および（ＩＩ）の機能的な誘導体の合成または単離、ならびに２つのアミノ酸配列の同一性％の決定のために適切な方法は、上述したとおりである。さらに、上記のように、本発明の融合ペプチドの成分（Ｉ）および（ＩＩ）の誘導体の生産法は周知であり、そして当業者に周知の標準法（Sambrook J, Maniatis T (1989)、前出）が実施され得る。
【００２９】
さらなる実施形態として、本発明は、上記のような本発明の融合ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。このような薬学的組成物は、上記のような成分（Ｉ）、（ＩＩ）、必要に応じて成分（ＩＩＩ）、および任意のリンカーを有する本発明の融合ペプチドを含む。さらに、このような薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含み得る。本発明における「薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクル」は、処方された際に、本発明の融合ペプチドの薬学的活性を破壊しない、非毒性のキャリア、アジュバント、またはビヒクルをいう。本発明の薬学的組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レクチン、血清タンパク質（例えば、ヒト結成アルブミン）、緩衝化物質（例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム）、植物性の飽和脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロ多民、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム）、亜鉛塩、シリカコロイド、マグネシウム三シリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、経口的に、非経口的に（吸入スプレーによって、局所的に、経直腸にて、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または移植容器を介して）投与され得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「非経口」としては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、基質内、髄膜内、肝臓内、病変内および頭蓋内への注射技術または注入技術が挙げられる。好ましくは、薬学的組成物は、経口的に、腹腔内へまたは静脈内へ投与される。本発明の薬学的組成物の滅菌された注入可能な形態は水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて当該分野で公知の技術に従って処方され得る。滅菌された注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口受容可能な希釈剤または溶剤（例えば、１，３−ブタンジオール）中の、滅菌された注入可能な溶液または懸濁液であり得る。利用可能である受容可能なビヒクルおよび溶剤は水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌された不揮発性油が、溶剤または懸濁媒体として慣用的に利用されている。
【００３２】
本目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が使用され得る。天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ油またはカストロール油）と同様に、脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体（特にこれらのポリオキシエチル化型））は、注入可能な調製物に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈物または分散物（例えば、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤）を含み得る。これは薬学的に受容可能な投薬形態（エマルジョンおよび懸濁物を含む。）の処方物に一般に使用されている。一般的に使用される他の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎｓおよび他の乳化剤）、または薬学的に受容可能な固体、液体または他の投薬形態の製造に一般に使用されるバイオアベイラビリティ増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）もまた、処方物の目的に使用され得る。
【００３３】
本明細書中において、薬学的に受容可能な組成物は、任意の経口受容可能な投薬形態（カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない。）で経口的に投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとしては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）もまた、典型的に添加される。カプセル形態での経口投与のために有用な希釈材としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口使用に求められる場合、活性成分が、潤滑剤および懸濁剤と組み合わされる。所望されるならば、特定の甘味料、香料または着色剤もまた添加され得る。
【００３４】
あるいは、上記のような本発明の薬学的組成物は、直腸投与のための座剤の形態で投与され得る。このような座剤は、薬剤を、室温では固体であるが直腸温で液体になり、これにより、直腸で薬物を放出するために溶解する適切な無刺激の賦形剤と混合されることによって調製され得る。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３５】
本明細書中で規定される、本発明の薬学的組成物はまた、特に、処置の標的が局所適用に容易に受容可能な領域および器官（目、皮膚、または下部腸管）を含む場合、局所的に投与され得る。適切な局所的処方物は、これらの領域または器官の各々のために容易に調製される。
【００３６】
下部腸管のための局所適用は、直腸への座剤形態（上記参照）または適切な浣腸形態でもたらされ得る。局所的経皮パッチもまた使用され得る。
【００３７】
局所適用のために、上記のような本発明の薬学的組成物は、１つ以上のキャリアに懸濁または溶解された、上記のような本発明の融合ペプチドを含む適切な軟膏に処方され得る。本発明の融合ペプチドの局所投与のためのキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水。あるいは、上記のような本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアに懸濁または溶解された、本発明の融合ペプチドを含む適切なローションまたはクリームに処方され得る。適切なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鉱油、ソルビタン一ステアリン酸、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【００３８】
眼用途のために、本発明の薬学的組成物は、等張性の、ｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の微粉懸濁液、または好ましくは、防腐剤（例えばベンジルアルコニウムクロリド）を含むかまたは含まない、等張性の、ｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の溶液として処方され得る。あるいは、眼用途のために、薬学的に受容可能な組成物は、軟膏（例えば、ペトロラタム）中に処方され得る。
【００３９】
上記のような本発明の薬学的組成物はまた、鼻内エアロゾルまたは吸入器によって投与され得る。このような組成物は、薬学的処方物の技術分野において周知の技術に従って調製され得、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収プロモータ、フルオロカーボン、および／または他の慣用的な可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００４０】
最も好ましくは、本発明において、薬学的に受容可能な組成物は、経口投与または非経口投与（例えば注射によって）のために処方される。
【００４１】
処置目的のために、非毒性の、損傷を低減する、有効量の本発明の融合ペプチドが、上記のような本発明の薬学的組成物の調製のために使用され得る。よって、本発明の融合ペプチドの量は、上記のような組成物を生産するために、キャリア材料と結合され得る。本発明の薬学的組成物は、典型的には、単一（または複数の）投与形態にて調製され得る。これは、処置されるホストおよび投与の特定の様式に依存して変更される。通常、本発明の薬学的組成物は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の、投薬あたりの投与量範囲が、本発明の薬学的組成物を受ける患者に投与され得るように処方される。好ましい投薬あたりの投与量範囲は、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日を変動し、さらに好ましい投薬あたりの投与量範囲は、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／日を変動する。しかし、上述したような投与量範囲および処置レジメンは、種々の因子（使用される本発明の融合ペプチドの比活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、処置する臨床医の判断、および処置されるべき特定疾患の重篤度）に依存して、任意の特定の患者に好適に適合され得る。本明細書において、投与は、初期投薬量範囲で行われ得、これは、例えば、上記の範囲内の初期投薬量範囲を増加または減少することによって、処置時間にわたって変化し得る。例えば、投薬量範囲が処置の種々のセクションの間で適合（増加または減少）されるが単一のセクション内では一定に保たれる場合、両方の投与形態が、さらに組み合わされ、その結果、種々のセクションでの投薬量範囲は互いに異なる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、本明細書中に開示されたような哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果に関する疾患の処置、改善または予防のために使用され得る。上記疾患としては、特に、脳卒中または脊髄傷害、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害、および中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンに対する損傷が挙げられ、急性のＣＮＳ傷害、虚血性の脳卒中または脊髄傷害、ならびに無酸素症、虚血、機械的傷害、神経障害性の痛み（特にＰＳＤ−９５および／またはＮＭＤＡＲ相互作用に関連する痛み）などを含む。さらに、本発明の薬学的組成物は、興奮毒性および虚血性の傷害、興奮毒性損傷、神経栄養性の支持の欠落などに対する神経保護作用またはこれらの処置を提供するために使用され得る。本明細書において、興奮毒性は、脳卒中、外傷性傷害、および中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患（例えば、本明細書において処置され得る多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、線維筋肉痛、パーキンソン病およびハンチントン病）に特に関与し得る。ニューロン周辺に過剰なグルタミン酸濃度を引き起こす他の一般的な状態であり本明細書において処置されるものは、低血糖症および癇癪重積症／網膜神経節細胞の変質などである。
【００４３】
上記のような哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果に関する疾患ならびに本明細書中にて言及したようなさらなる疾患または障害の処置、改善または予防は、典型的には、上述した投薬量範囲でおおよそ規定された本発明の薬学的組成物を投与することによって行われる。本発明の薬学的組成物の投与は、興奮毒性および／または（虚血性）脳損傷（すなわち、哺乳動物細胞に対する傷害の損傷効果）の開始前、あるいはこれらと同時または引き続いて行われ得る。例えば、本発明の薬学的組成物の投与は、脳卒中または脊髄傷害、脳または脊髄に対する虚血性または外傷性の傷害、および一般に中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンに対する損傷の、１時間まで（０〜１時間）、２時間まで、３〜５時間まで、あるいは２４時間以上経過した後に行われ得る。
【００４４】
本発明はさらに、少なくとも１つ以上の上記処方物中の、上記の本発明の薬学的組成物（１つ以上のキャリア中の）、および本発明の薬学的組成物の適用に関する指示および／または情報に関する指示マニュアルまたは情報カタログを備えているキットを提供する。
【００４５】
本明細書の開示は、本発明の特定の好ましい実施形態を記載しかつ例証しているが、本発明が特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書中に記載および例証された特定の実施形態および特徴の機能的または機械的な等価物である実施形態の全てを含む。
【００４６】
（図面の記載）
添付の図面は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例証することが意図される。
【００４７】
図１は、２０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３２および３３（特定には、ＴＡＴ−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドのＬ型（Ｌ−ＴＡＴ−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号３２）；ＵＳ２００３００５０２４３と同一）対そのＤ型（Ｄ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ（配列番号３３））に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。本実験において（および以下の実験において）、ＮＭＤＡレセプターと相互作用することによって細胞死を阻害し得るペプチドの添加と平行して細胞死の割合を測定した。図１に示されるように、任意の単一の実験において、配列番号３３に記載のＤ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃは、配列番号３２に記載のＬ−ＴＡＴ−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（比較化合物）に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合（％）を示した。図１において、＊はＰ＜０．０５を示し、＠はＰ＜０．０７を示す（対ｔ検定；ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較）。特に、Ｄ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃは、ペプチドインキュベーションとＮＭＤＡ添加との間のギャップが≧８時間である場合に、その陽性効果を示した。このことは、Ｄ型の延長された薬学的活性を示す。最も効果的な治療ウインドウを、４時間〜４８時間（特に８〜２４時間）の間で観察した。
【００４８】
図２は、４０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３２および３３（特定には、ＴＡＴ−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドのＬ型（Ｌ−ＴＡＴ−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号３２）；ＵＳ２００３００５０２４３と同一）対そのＤ型（Ｄ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙｉｎ（配列番号３３））に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。図２に示されるように、任意の単一の実験において、配列番号３３に記載のＤ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃは、配列番号３２に記載のＬ−ＴＡＴ−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（比較化合物）に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合（％）を示した。図２において、＊はＰ＜０．０５を示し、＠はＰ＜０．０７を示す（対ｔ検定；ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較）。時間ウインドウが２４時間未満の場合に、本発明の融合ペプチドの顕著に陽性な効果が明らかになった。
【００４９】
図３は、２０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３４および３５（特定には、（Ａｒｇ）８−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドのＬ型（Ｌ−（Ａｒｇ）８−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号３４））対そのＤ型（Ｄ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ（配列番号３５））に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。図３に示されるように、任意の単一の実験において、配列番号３５に記載のＤ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃは、配列番号３４に記載のＬ−（Ａｒｇ）８−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（比較化合物）に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合（％）を示した。図３において、＊はＰ＜０．０５を示し、＠はＰ＜０．０７を示す（対ｔ検定；ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較）。
【００５０】
図４は、４０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３４および３５（特定には、（Ａｒｇ）８−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドのＬ型（Ｌ−（Ａｒｇ）８−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号３４））対そのＤ型（Ｄ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ（配列番号３５））に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す。図４に示されるように、８時間までの任意の単一の実験において、配列番号３５に記載のＤ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃは、配列番号３４に記載のＬ−（Ａｒｇ）８−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（比較化合物）に対して、少なくとも等価な、しかし優勢に顕著に増加された効果、すなわち、ニューロン細胞の顕著に低減された細胞死の割合（％）を示した。図４において、＊はＰ＜０．０５を示し、＠はＰ＜０．０７を示す（対ｔ検定；ペプチド処理したニューロンのコントロールニューロンとの比較）。
【００５１】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の範囲をこれらの実施例に限定することなく本発明をさらに例証することが意図される。
【００５２】
（実施例１：融合ペプチドの合成）
ＴＡＴ−ＮＲ２Ｂ９Ｃペプチドを、標準的な手順に従って、ＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem, Merck）上にＮα−ＢｏｃケミストリーＳＰＰＳによって手動で合成した。全てのカップリングを、ＴＮＢＳＡカラー試験によってモニタリングした。ペプチドを切断し、同時に、適切なスカベンジャーとともに９０％ＨＦを用いて０℃で１時間処理することによって、樹脂から脱保護した。粗ペプチドを、２０％水性酢酸溶液に取り出し、二重の蒸留水で５％酢酸溶液に希釈し、残存するスカベンジャーを、ジエチルエステル洗浄によって抽出した。次いで、ペプチドを含む溶液を凍結して酢酸を除去した。ペプチドＬ／Ｄ−ＮＲ２８９Ｃを、Atlantis (Waters) dC18 カラム（流速１５ｍＬ／分で４５分間にわたる１５〜４５％の緩衝液Ｂ）での予備ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって特徴付けた。
【００５３】
（Ａｒｇ）８−ＮＲ２Ｂ９Ｃペプチドを手動で合成した。Novabiochem からのFmoc-Val-NovaSyn TGA 樹脂にてＦｍｏｃストラテジーを用いる固相支持体上で合成を行った（ローディング０．２２ｍｍｏｌ／ｇ）。ＡＣＴロボットにて、１４５μｍｏｌに対応するウェルにて、４等量のアミノ酸、４等量のカップリング試薬ＨＯＢｔおよび４等量のＤＩＰＣＤＩを用いて、合成を行った。合成の要求に起因して、二重カップリングを３アミノ酸ごとに行った。
・４等量のアミノ酸、４等量のＨＯＢｔおよび４等量のＤＩＰＣＤＩとの第１のカップリング
・４等量のアミノ酸、４等量のＨＡＴＵおよび４等量のＤＩＥＡとの第２のカップリング。
【００５４】
各カップリングの後、ＤＭＦ中１０％酢酸無水物を用いてキャッピング工程を行った（１５分間）。脱保護工程を、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて行った（２０分間）。部位「ｎ」でのＦｍｏｃを、合成の終了まで維持した。切断を、スカベンジャーの存在下で８６％ＴＦＡ溶液中にて行った。ペプチドをエーテル中に沈降させた。次いで、６０分間で０〜６０％の勾配のアセトニトリルを用いて、ペプチドをＣ−１８逆相カラムにて精製した。ペプチド結合について２２０ｎｍ、Ｆｍｏｃ保護について３００ｎｍのＵＶ照射を用いた。続いて、ペプチドを、Ｆｍｏｃ保護基とともに凍結した。Ｆｍｏｃ保護基はＤＥＡの２０棟梁溶液での処理によって後に除去された。次いで、ペプチドを、凍結前に（上記と同じ条件を用いて）再度精製し、分析し、そして引き続く実験に用いた。
【００５５】
（実施例２：興奮毒性損傷に接したＴＡＴ−ＮＲ２Ｂ９ｃによって生成される神経保護の持続の試験）
（プロトコル）
ラット大脳皮質ニューロンをＥ２１ラットより取り出し、Neurobasal-A mediumおよびB-27 supplement（いずれもInvitrogen）、１ｍＭグルタミン、および５０ユニット／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン中で，７〜９日間インビトロで培養した。
１．化合物の曝露前の種々の時点で、ニューロンをNeurobasal-Aベースの培養培地から取り出し、「トランスフェクション培地」（（TM; Bading et al. (1993), Science 260, 181-186）：１０％（Earles salt を含むがＬ−グルタミンを含まないMinimum Essential Medium, Invitrogen (21090022)）、９０％塩−グルコース−グリシン（ＳＧＧ）培地ＳＧＧ、１１４ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２１９％  ＮａＨＣＯ３，５．２９２ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ  グリシン，３０ｍＭ  グルコース，０．５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，０．１％  フェノールレッド、インスリントランスフェリンセレナイト補充物（Sigma，７．５μｇ  インスリン／ｍｌ；７．５μｇ  トランスフェリン／ｍｌおよび７．５ｎｇ  セレナイトナトリウム／ｍｌ））；ｓａｉｓｈｕｕ  ｓｉｎｎｔｏｕａｔｕ  ３２５ｍｏｓｍ／ｌ）中に置いた。引き続く全ての工程をＴＭ中にて行った。
２．次いで、ニューロンを、本発明のペプチドに曝露した（１０μＭで１時間）。用いたペプチドは、ＴＡＴ−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドのＬ型（Ｌ−ＴＡＴ−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号３２）；ＵＳ２００３００５０２４３と同一）およびそのＤ型（Ｄ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙｉｎ（配列番号３３）である。
３．１時間後、ニューロンをＴＭで一度洗浄し、ペプチドを除去した。
４．種々の時間の後、ニューロンを、２０μＭまたは４０μＭのいずれかで１時間ＮＭＤＡに曝露し、その後にニューロンをＴＭ中に２４時間置いた。
５．ニューロンを、３％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色した。染色された（ｐｙｋｎｏｔｉｃ）核の数を、全体の％として計数した。実験を三連で行った。
【００５６】
（結果）
Ｄ型およびＬ型のＴＡＴ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（Ｌ−ＴＡＴ−Ｌ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号３２）；ＵＳ２００３００５０２４３と同一、およびそのＤ型（Ｄ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙｉｎ（配列番号３３））の両方が、ＮＭＤＡ（２０μＭおよび４０μＭ）に接した際に、ペプチドの洗浄４時間後までに保護を提示した。しかし、Ｄ型による保護はより低い濃度のＮＭＤＡについて洗浄４８時間時間まで延長した（図１）。このことは、Ｄ型が治療薬物としてより有望な候補であることを示している。また、４０μＭ  ＮＭＤＡに接した際の２４時間までの顕著な保護が提供されたが、Ｌ型で得られた神経保護は、１時間で顕著であったのみであった（図２）。
【００５７】
（実施例３：興奮毒性損傷に接した（Ａｒｇ）８−ＮＲ２Ｂ９ｃによって生成される神経保護の持続の試験）
（プロトコル）
ラット大脳皮質ニューロンをＥ２１ラットより取り出し、Neurobasal-A mediumおよびB-27 supplement（いずれもInvitrogen）、１ｍＭグルタミン、および５０ユニット／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン中で，７〜９日間インビトロで培養した。
１．化合物の曝露前の種々の時点で、ニューロンをNeurobasal-Aベースの培養培地から取り出し、インスリン−トランスフェリン−セレナイト補充物（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＭ（上述）に置いた。引き続く全ての工程をＴＭ中にて行った。
２．次いで、ニューロンを、本発明のペプチドに曝露した（１０μＭで１時間）。用いたペプチドは、（Ａｒｇ）８−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドのＤ型（Ｄ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ（配列番号３５））およびそのＬ型（配列番号３４）である。
３．１時間後、ニューロンをＴＭで一度洗浄し、ペプチドを除去した。
４．種々の時間の後、ニューロンを、１時間ＮＭＤＡに曝露し、その後にニューロンをＴＭ中に２４時間置いた。
５．ニューロンを、３％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色した。染色された（ｐｙｋｎｏｔｉｃ）核の数を、全体の％として計数した。実験を三連で行った。
【００５８】
（結果）
Ｄ型の（Ａｒｇ）８−ＮＲ２Ｂ９ｃ（Ｄ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列（配列番号３５））は、ＮＭＤＡ（２０μＭ）に接した際に、Ｌ型と比較して、ペプチドの洗浄８時間後までに保護を提示した。しかし、Ｄ型による保護はより低い濃度のＮＭＤＡについて洗浄４８時間時間まで延長した（図３）。より高いＮＭＤＡ濃度（４０μＭ）では、Ｄ型はまたよりよい保護効果を示した（図４）。これらの結果は、Ｄ型が治療薬物としてより有望な候補であることを示唆している。全体的には、Ｄ−（Ａｒｇ）８−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ配列（配列番号３５）は、神経保護活性の持続がより短いにもかかわらず、Ｄ−ＴＡＴ−Ｄ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（配列番号３３）と同様に機能した。このことは、Ｄ−ＴＡＴよりもＤ−（Ａｒｇ）８の方がより著しい細胞透過能を有していることを示唆し得る。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、２０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３２および３３に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す図である。
【図２】図２は、４０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３２および３３に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す図である。
【図３】図３は、２０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３４および３５に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す図である。
【図４】図４は、４０μＭ  ＮＭＤＡの存在下での、配列番号３４および３５に記載の融合ペプチドの効果の持続を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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