(57)【要約】本発明は、ＣＲ２タンパク質もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、Ｈ因子タンパク質もしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子、ならびにＣＲ２−ＦＨ分子を含む医薬的組成物を提供する。ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２リガンドに結合する能力があり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は、補体活性化副経路の補体活性化を抑制する能力がある。また、補体活性化副経路が関与する疾患（例えば、加齢黄斑変性症、関節リウマチ、および虚血再灌流障害）の治療のために前記組成物を使用する方法を提供する。
2009540831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲ２−ＦＨ分子であって、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分を含み、前記ＣＲ２−ＦＨ分子がＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつ前記ＣＲ２−ＦＨ分子が補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である、ＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項２】
前記ＣＲ２部分がＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項３】
前記ＣＲ２部分がＣＲ２の少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項４】
前記ＦＨ部分がＦＨの少なくとも最初の４つのＳＣＲドメインを含む、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項５】
前記ＦＨ部分がＦＨの少なくとも最初の５つのＳＣＲドメインを含む、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項６】
前記ＣＲ２−ＦＨ分子が２つ以上のＦＨ部分を含む、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項７】
前記ＣＲ２部分がＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含み、かつ前記ＦＨ部分がＦＨの最初の５つのＳＣＲドメインを含む、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項８】
前記ＣＲ２部分が配列番号１の２３〜２７１のアミノ酸を含み、かつ前記ＦＨ部分が配列番号２のアミノ酸２１〜３２０を含む、請求項７に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項９】
前記ＣＲ２−ＦＨ分子が融合タンパク質である、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドをコードするベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１３】
医薬組成物であって、請求項１に記載のＣＲ２−ＦＨ分子および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が眼内投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、気管内投与、または吸入投与に適している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
個体において補体活性化副経路が関与する疾患を治療する方法であって、前記個体に請求項１３に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記補体活性化副経路が関与する前記疾患が黄斑変性症、関節リウマチ、虚血再灌流障害、臓器移植拒絶反応、ＭＰＧＮ  ＩＩ、ＨＵＳ、およびループス腎炎のいずれかである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
補体活性化副経路が関与する前記疾患が加齢黄斑変性症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
補体活性化副経路が関与する前記疾患が虚血再灌流障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
補体活性化副経路が関与する前記疾患が臓器移植拒絶反応である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本願は、２００６年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８１５，７４８号に対する優先権の利益を主張するものであって、米国仮特許出願第６０／８１５，７４８号の内容は、その全体が参照として援用される。
【０００２】
技術分野
本出願は、補体活性化副経路が関与する疾患を治療する組成物および方法に関する。具体的には、本出願は、ＣＲ２−ＦＨ分子に関し、かつ補体活性化副経路が関与する疾患を治療するためにその分子を使用する。
【０００３】
連邦により後援された研究または開発に関する申告
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成（契約）第ＡＩ４７４６９号、同第ＡＩ３１１０５号、同第ＥＹ１３５２０号のもと政府の支援によりなされた。
【背景技術】
【０００４】
背景
補体とは一連の血中タンパク質の総称であり、かつ免疫系の主要なエフェクター機構である。補体は、多数の自己免疫疾患、炎症性疾患、および虚血性疾患の病態において重要な役割を果たし、かつ生体不適合性に関連する数多くの病状の原因でもある。不適切な補体活性化および宿主細胞上でのその沈着は、炎症の強力なメディエターが生成されるために標的構造体の補体により媒介される細胞溶解、ならびに組織破壊がもたらされる可能性がある。
【０００５】
補体は、３つの経路（古典経路、レクチン経路、および補体活性化副経路）のうちの１つによって活性化され得る。古典経路は、補体系タンパク質Ｃ１ｑが抗原−抗体複合体、ペントラキシン、またはアポトーシス細胞に結合することを介して活性化される。ペントラキシンは、Ｃ反応タンパク質および血清アミロイドＰ成分を含む。レクチン経路は、マンノース結合クレチンを介して微生物サッカリドによって開始される。補体活性化副経路は中性電荷または正電荷の特性を有し、かつ補体抑制因子を発現しないもしくは含まない病原の表面で活性化される。これは、立体構造的に変化したＣ３とＢ因子との相互作用が関与して、自然に起こり、かつ病原体上または他の表面で活性Ｃ３ｂの固定化をもたらす「チックオーバー」と呼ばれるＣ３のプロセスに起因する。特定の抗体が内因性調節機構をブロックするとき、または補体調節タンパク質の発現が減少するとき、補体活性化副経路は、免疫複合体を含むＩｇＡによって開始されることも可能である。さらに、古典経路またはレクチン経路を介して標的上に沈着されるＣ３ｂが次いで因子Ｂに結合するとき、補体活性化副経路は、「増幅ループ」と呼ばれる機構によって活性化される（特許文献１）。例えば、炎症細胞が最初の補体活性化の後に動員されるとき、補体活性化副経路は局所損傷の部位で増幅されることをＨｏｌｅｒｓと共同研究者が示した（特許文献２）。補体活性化副経路を介しての著しい補体増幅は、次いで、補体を固定する損傷細胞の付加的な生成、もしくは補体活性化副経路成分の局所合成のいずれかに関与する機構を介して、または恐らく前もって作られるＣ３およびプロパージンを運ぶこれら浸潤性の炎症細胞が特異的にその部位で活性化を大きく増加させるために起こる。
【０００６】
循環因子Ｂが活性化したＣ３に結合するとき、補体活性化副経路の活性化は開始される。この複合体は、次いで、循環因子Ｄによって切断され、酵素的に活性の断片Ｃ３ｂＢｂをもたらす。Ｃ３ｂＢｂは、Ｃ３を切断してＣ３ｂを生成する。Ｃ３ｂは炎症を促進し、また活性化プロセスをさらに増幅させ、ポジティブフィードバックループを生成する。Ｈ因子（ＦＨ）は、補体活性化副経路の主要な調節因子（抑制因子）である。Ｈ因子は、Ｃ３ｂに結合するための因子Ｂと競合することによって機能する。Ｈ因子へのＣ３ｂの結合は、また、因子ＩによるＣ３ｂの不活性型Ｃ３ｂｉ（ｉＣ３ｂとも呼ばれる）への分解をもたらし、このようにして補体活性化についてさらなる抑制を発揮する。Ｈ因子の実際の血漿濃度は、約５００μｇ／ｍｌであり、液相で補体調節をもたらす。しかし、細胞へのその結合は、負に帯電した表面の存在、ならびに固定されたＣ３ｂ，Ｃ３ｂｉ、またはＣ３ｄによって増強される調節現象である（特許文献３）。
【０００７】
補体活性化の下方調節は、動物モデルおよびｅｘ  ｖｉｖｏ研究（例えば、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎（特許文献４）、関節リウマチ（特許文献５）、心肺バイパスおよび血液透析（特許文献６）、臓器移植における超急性拒絶反応（特許文献７）、心筋梗塞（特許文献８；特許文献９）、再灌流障害（特許文献１０）、ならびに成人呼吸促拍症症候群（特許文献１１））においていくつかの疾患の徴候の治療に有効であることが示されている。さらに、他の炎症性状態および自己免疫−免疫複合体の疾患（熱傷、重症の喘息、アナフィラキシーショック、腸炎症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、およびシェーグレン症候群を含む）も、補体活性化と密接に関連している（特許文献１２）。補体抑制因子およびその用途は、また特許文献１および特許文献２に開示される。
【０００８】
本明細書で参照するすべての刊行物、特許、特許出願、および公開された特許出願の開示を、それら全体を参考として本明細書に援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０４／０４５５２０号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，５２１，４５０号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，１９８８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：３２１
【非特許文献２】Ｇｉｒａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３，１１２：１６４４
【非特許文献３】Ｊｏｚｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ（２００４）１９：２５１−２５８
【非特許文献４】Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；１９９６；９３：８５６３−８５６８
【非特許文献５】Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，  １９９５；９２：８９５５−８９５９
【非特許文献６】Ｃ．Ｓ．Ｒｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９５；９６：１５６４−１５７２
【非特許文献７】Ｔ．Ｊ．Ｋｒｏｓｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９５；６０：１１９４−１２０２
【非特許文献８】Ｊ．Ｗ．Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３；１５０：１０５５−１０６４
【非特許文献９】Ｈ．Ｆ．Ｗｅｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２４９：１４６−１５１
【非特許文献１０】Ｅ．Ａ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９５；２６８：Ｈ４４８−Ｈ４５７
【非特許文献１１】Ｒ．Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２；１４９：１７４４−１７５０
【非特許文献１２】Ｂ．Ｐ．Ｍｏｒｇａｎ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９４：２４：２１９−２２８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１つの態様において本発明は、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を提供する。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子が提供され、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２リガンドに結合する能力があり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は、補体活性化副経路の補体活性化を抑制する能力がある。一部の実施形態では、単離されたＣＲ２−ＦＨ分子が提供される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、融合タンパク質の形で直接的に、または間接的に互いに融合する。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、化学架橋剤を介して結合される。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、非共有結合している。
【００１２】
一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子が提供され、ＣＲ２−ＦＨ分子はＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、互いに直接的に融合する（すなわち、結合する）。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、アミノ酸リンカー配列を介して結合する。一部の実施形態では、ＣＲ２部分のＣ末端は、ＦＨ部分のＮ末端に（直接的にまたは間接的に）結合する。一部の実施形態では、ＣＲ２部分のＮ−末端は、ＦＨ部分のＣ−末端に（直接的にまたは間接的に）結合する。
【００１３】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上のいずれか）のＣＲ２部分を含む。これらのＣＲ２部分は、例えば、アミノ酸配列、構造、および／または機能に関して、同一または異なることがある。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２またはその断片を含む２つ以上のＣＲ２部分と、２）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２またはその断片を含む２つ以上のＣＲ２部分と、２）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有し、ＣＲ２−ＦＨ分子はＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。
【００１４】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上のいずれか）のＦＨ部分を含む。これらのＦＨ部分は、例えば、アミノ酸配列、構造、および／または機能に関して、同一または異なることがある。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、２）ＦＨまたはその断片を含む２つ以上のＦＨ部分とを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、２）ＦＨまたはその断片を含む２つ以上（例えば、２つ）のＦＨ部分とを有し、ＣＲ２−ＦＨ分子はＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。
【００１５】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２またはその断片を含む２つ以上のＣＲ２部分と、２）ＦＨまたはその断片を含む２つ以上のＦＨ部分とを有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２またはその断片を含む２つ以上のＣＲ２部分と、２）ＦＨまたはその断片を含む２つ以上（例えば、２つ）のＦＨ部分とを有し、ＣＲ２−ＦＨ分子はＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。
【００１６】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）全長ＣＲ２と、２）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２の断片と、２）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端のＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１）ＣＲ２の少なくとも最初の４つのＮ末端のＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子はＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつ補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は２つ以上のＦＨ部分を含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は全長ＦＨを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分はＦＨ断片を含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの少なくとも最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ヘパリン結合部位が欠如している。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、加齢黄斑変性に対して防御的である多型性を有するＦＨまたはその断片を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、以下を有するＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）が提供される：ａ）以下のいずれかである（および一部の実施形態では、以下からなる群から選択される）リガンド結合部位を含むＣＲ２部分：（１）配列番号１に関してセグメントＧ９８−Ｇ９９−Ｙ１００−Ｋ１０１−Ｉ１０２−Ｒ１０３−Ｇ１０４−Ｓ１０５−Ｔ１０６−Ｐ１０７−Ｙ１０８を含むＣＲ２  ＳＣＲのＢ鎖およびＢ〜Ｃループ上の部位、（２）配列番号１に関してＫ１１９位置を含むＣＲ２  ＳＣＲ２のＢ鎖上の部位、（３）配列番号１に関してＶ１４９−Ｆ１５０−Ｐ１５１−Ｌ１５２を含むセグメント、および（４）配列番号１に関してＴ１２０−Ｎ１２１−Ｆ１２２を含むＣＲ２  ＳＣＲ２のセグメント；およびｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＤ部分。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつ補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、リガンド結合部位の三次元構造を維持するために必要とされる複数の配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、２つ以上のＦＨ部分を含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は全長ＦＨを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの断片を含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの少なくとも最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ヘパリン結合部位が欠如している。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、加齢黄斑変性に対して防御的である多型性を有するＦＨまたはその断片を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）が提供される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつ補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２の少なくとも最初の３、４、５、６、７、またはそれ以上のＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの少なくとも最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上のＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、ａ）ＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨの最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＦＨ部分とを有する（および一部の実施形態は、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、ａ）ＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨの最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む２つ以上（例えば、２つ）のＦＨ部分とを有する（および一部の実施形態は、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ａ）配列番号１のアミノ酸２３〜２７１を含むＣＲ２部分と、ｂ）配列番号２のアミノ酸２１〜３２０を含むＦＨ部分とを有する（および一部の実施形態は、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ａ）配列番号１のアミノ酸２３〜２７１を含むＣＲ２部分と、ｂ）配列番号２のアミノ酸２１〜３２０を含む２つ以上（例えば、２つ）のＦＨ部分とを有する（および一部の実施形態は、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）。
【００１９】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨは、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨは、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかの少なくとも約、４００、４５０、５００、５５０またはそれ以上の近接するアミノ酸を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列と少なくとも約、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％からのいずれかで同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質である。また、本明細書に包含されるのは、本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、また、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする配列の５’末端で作用可能に結合するシグナルペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＣＲ２部分とＦＨ部分とを結びつけるために使用される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列と少なくとも約、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％からのいずれかで同一であるアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする。また、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供され、および前記融合タンパク質を発現させる適切な条件下で前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞培養物から前記融合タンパク質を回収することとを含むＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質を生成する方法が提供される。
【００２０】
別の態様では、ＣＲ２−ＨＦ分子を含む医薬組成物および薬学的に許容される担体が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの投与に適したＣＲ２−ＦＨ分子と、薬学的に許容される担体とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼内注射に適したＣＲ２−ＦＨ分子と、薬学的に許容される担体とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼への局所投与に適したＣＲ２−ＦＨ分子と、薬学的に許容される担体とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射に適したＣＲ２−ＦＨ分子と、薬学的に許容される担体とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、動脈（例えば、腎動脈）、肝臓、もしくは腎臓への注射に適したＣＲ２−ＦＨ分子と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２融合タンパク質）ならびに薬学的に許容される担体から構成される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。一部の実施形態では、医薬組成物は、ａ）ＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）ならびに薬学的に許容される担体から構成される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ａ）ＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨの最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含むＦＨ部分とを有する（および一部の実施形態では、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）、ならびに薬学的に許容される担体から構成される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ａ）配列番号１の２３〜２７１のアミノ酸を含むＣＲ２部分と、ｂ）配列番号２の２１〜３２０のアミノ酸を含むＦＨ部分とを有する（および一部の実施形態では、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）ならびに薬学的に許容される担体から構成される。一部の実施形態では、医薬組成物は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一のアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼への送達（例えば、眼内注射による、または眼への局所送達による）に適する。一部の実施形態では、医薬組成物は静脈注射に適する。一部の実施形態では、医薬組成物は、動脈（例えば、腎動脈）、肝臓、もしくは腎臓への注射に適する。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼内投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、気管内投与、もしくは吸入に適する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、個体における補体活性化副経路に関与する疾患を治療する方法（本明細書に記載する組成物（例えば、医薬組成物）の有効量を前記個体に投与することを含む）を提供する。一部の実施形態では、方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分をと有するＣＲ２−ＦＨ分子と含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含み、ＣＲ２−ＦＨ分子はＣＲ２リガンドに結合することが可能であり、かつＣＲ２−ＦＨ分子は補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。一部の実施形態では、治療される疾患は、局所炎症に関与する疾患である。一部の実施形態では、治療される疾患は、ＦＨ欠損（例えば、ＦＨのレベルの低下、ＦＨ活性の低下、または野性型ＦＨもしくは防御ＦＨの欠如）と関連する疾患である。一部の実施形態では、治療される疾患は、ＦＨ欠損に関連する疾患ではない。一部の実施形態では、治療される疾患はドルーゼン関連疾患である。一部の実施形態では、治療される疾患は、古典的補体経路に関与しない。
【００２３】
一部の実施形態では、個体における黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ））の治療方法が提供され、前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を前記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、治療される疾患は、乾燥型ＡＭＤである。一部の実施形態では、治療される疾患は、湿潤型ＡＭＤである。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、静脈内投与によって投与される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、眼内注射によって投与される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、眼への局所投与によって（例えば、点眼剤の形態で）投与される。
【００２４】
一部の実施形態では、ＡＭＤの１つまたは複数の態様は、本発明の方法によって治療される。例えば、一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼におけるドルーゼンの形成を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼における炎症を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体の光受容細胞の損失を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼の視力または視野を改善する（例えば、損失を減少させる、進行を妨げる、またはブロックする）方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、血管新生（例えば、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ））を治療する方法が提供される。ＡＭＤの他の態様の治療も予測される。
【００２５】
本明細書に記載する方法は、ある腎疾患の治療にも有用である。例えば、一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型（ＭＰＧＮ  ＩＩ）を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、ループス腎炎を治療する方法が提供される。
【００２６】
一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、虚血再灌流障害（例えば、腎虚血再灌流障害および腸管虚血再灌流障害を含む）を治療する方法が提供される。
【００２７】
また、臓器移植拒絶反応を治療する方法が提供される。例えば、一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における急性血管拒絶反応（例えば、心臓移植の抗体介在性拒絶反応）の発症を遅らせる方法が提供される。
【００２８】
一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における臓器移植の生存を向上させる方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分、およびｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物を使用して個体に移植される臓器を灌流することを含む、個体における臓器移植の生存を向上させる方法が提供される。一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を臓器移植ドナーに投与することを含む、臓器移植ドナーの生存を向上させる方法が提供される。
【００２９】
一部の実施形態では、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む、関節リウマチを治療する方法が提供される。
【００３０】
本明細書に記載する方法にとって有用である単位剤形、キット、および製品も提供される。
【００３１】
当然のことながら、本明細書に記載する種々の実施形態の特徴の１つ、一部、もしくはすべてを、本発明の他の実施形態を形成するために組み合わせることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、典型的なＣＲ２−ＦＨ発現プラスミドおよびＣＲ２−ＦＨタンパク質の概略図を示す。ＣＲ２−ＦＨ発現プラスミドに関して、ｋはＫｏｚａｋ配列をいい、５はＣＤ５シグナルペプチドをいい、１はオプションのリンカーをいい、ｓは終止コドンおよびポリＡシグナルをいう。ＣＲ２−ＦＨタンパク質（シグナルペプチドを有するまたはなしの）に関しては、５はＣＤ５シグナルペプチドをいい、１はオプションのリンカーをいう。
【図２】図２は、ヒトＣＲ２のアミノ酸配列（配列番号１）およびヒトＦＨのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、典型的なヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）およびヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図４】図４は、本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子の典型的なアミノ酸配列（配列番号５〜６）を示す。「ｎｎｎ」はオプションのリンカーを表す。
【図５】図５は、本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子の典型的なアミノ酸配列（配列番号７〜８）を示す。「ｎｎｎ」はオプションのリンカーを表す。
【図６】図６は、本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子の典型的なアミノ酸配列（配列番号９〜１０）を示す。「ｎｎｎ」はオプションのリンカーを表す。
【図７】本明細書に記載するシグナルペプチドの典型的なアミノ酸配列（配列番号１１、１３、および２５）およびシグナルペプチドをコードする典型的なポリヌクレオチド配列（配列番号１２、１４、および２６）を示す。
【図８】図８は、マウスＣＲ２のアミノ酸配列（配列番号１５）およびマウスＦＨのアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図９】図９は、典型的なマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）、およびマウスＣＲ２−ＦＨに加えてシグナルペプチドをコードする典型的なポリヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図１０】図１０は、ＣＲ２ＮＬＦＨＦＨの典型的なＤＮＡ配列（すなわち、ＣＲ２部分および２つのＦＨ部分（リンカー配列なしで）を含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）（配列番号１９）を示す。
【図１１】図１１は、ＣＲ２ＬＦＨＦＨの典型的なＤＮＡ配列（すなわち、リンカー配列を介して２つのＦＨ部分に結合した１つのＣＲ２部分を含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）（配列番号２０）を示す。
【図１２】図１２Ａは、マウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２−ｆＨ）および単独のＨ因子（ｆＨ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのザイモサン補体アッセイで得たデータをグラフで示したものである。図１２Ｂは、ＦＨの最初の５つのＳＣＲドメイン（ＦＨ１５）およびＣＲ２の最初の４つのドメイン（ＣＲ２）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのザイモサン補体アッセイで得たデータをグラフで示したものである。
【図１３】図１３は、リンカーを有するマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２ＬＦＨ）、リンカーなしでのＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２ＮＬＦＨ）、リンカーを有するＣＲ２−ＦＨ−ＦＨ（ＣＲ２ＬＦＨＦＨ）、およびＣＲ２−Ｃｒｒｙを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのザイモサン補体アッセイで得たデータをグラフで示したものである。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、１つのＦＨ部分（ＣＲ２−ｆＨ）または２つのＦＨ部分（ＣＲ２−ｆＨＨ）を有するマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質を使用する腸管虚血再灌流障害の動物モデルで得たデータをグラフで示したものである。
【図１５】図１５Ａは、血清尿素窒素（ＳＵＮ）で測定した腎臓機能に対するＣＲ２−ｆＨの効果をグラフで示したものである。図１５Ｂは、腎臓形態に対するＣＲ２−ｆＨの効果をグラフで示したものである。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、マウスＣ３に対する抗体に結合したＦＴＩＣを使用してインキュベートした対照マウス（１５Ｃ）の腎臓切片およびＣＲ２−ｆＨ処置マウス（１５Ｄ）の腎臓切片の免疫蛍光染色の結果を示す。
【図１６】図１６は、ＣＲ２−ｆＨを使用してまたは使用せずに処置したマウスにおけるａ波およびｂ波の網膜反応の結果を示す。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、対照マウス（１７Ａ）および静脈注射によってＣＲ２−ｆＨで処置したマウス（１７Ｂ）に由来するマウス網膜病変部のイソレクチンＢ染色を示す。図１７Ｃは、図１７Ａおよび図１７Ｂのイソレクチン−ｂ染色に基づく病変部の大きさの定量化を示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、対照マウス（１８Ａ）および眼内注射によるＣＲ２−ｆＨで処置したマウス（１８Ｂ）に由来する病変マウス網膜のイソレクチン−ｂ染色を示す。図１８Ｃは、図１８Ａおよび図１８Ｂのイソレクチン−ｂ染色に基づく病変部の大きさの定量化を示す。
【図１９】図１９は、ＣＲ２−ｆＨの単回投与（ＣＲ２−ｆＨ）、ＣＲ２−ｆＨの複数回投与（ＣＲ２−ｆＨ（ｍ））、および対照緩衝液（ＰＢＳ）で処置した心臓移植レシピエントマウスの生存曲線を示す。
【図２０】図２０は、典型的なヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ヒトＣＲ２−ｆＨもしくはＣＲ２ｆＨと名付けられた）のアミノ酸配列（配列番号２１）およびヒトＣＲ２−ｆＨに加えてシグナルペプチドをコードする典型的なポリヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。シグナルペプチドをコードする配列を下線で示す。
【図２１】図２１は、２つのＦＨ部分を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ヒトＣＲ２−ＦＨ２またはヒトＣＲ２ｆＨ２と名付けられた）の典型的なアミノ酸配列（配列番号２３）およびヒトＣＲ２−ＦＨ２に加えてシグナルペプチドをコードする典型的なポリヌクレオチド（配列番号２４）を示す。シグナルペプチドをコードする配列は下線で示す。
【図２２】図２２Ａは、ザイモサン粒子上のＣ３ｂ沈着に特異的な補体活性化副経路上でのヒトＣＲ２ｆＨおよびＣＲ２ｆＨ２の抑制を示す。図２２Ｂは、ヒトＣＲ２ｆＨおよびヒトＣＲ２ｆＨ２による補体活性化副経路が関与する赤血球溶解の抑制を示す。
【図２３】図２３は、コラーゲン−坑コラーゲン抗体の免疫複合体により誘導されるＣ３活性化に対するマウスＣＲ２−ＦＨの効果を示す。Ｙ軸はＯＤ平均値を示す。
【図２４】図２４は、Ｃ４−／Ｃ４−ノックアウトマウス由来の血清を使用しての十分なカルシウムを含む緩衝液中のマウスＣＲ２−ＦＨの滴定を示す。Ｙ軸はＯＤ平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ＣＲ２−ＦＨ分子、ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供し、かつ補体活性化副経路が関与する疾患を前記組成物を投与することによって治療する方法を提供する。ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２部分とＦＨ部分とを含む。ＣＲ２部分はＣＲ２−ＦＨ分子を補体活性化の部位に標的送達することに関与し、ＦＨ部分は補体活性化副経路の補体活性化を特異的に抑制することに関与する。ＣＲ２−ＦＨ分子（具体的には、ＣＲ２タンパク質の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインと、Ｈ因子タンパク質の最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインとを含むＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのターゲティング活性および補体抑制活性の両方を有することを予備研究は示している。この分子は、ＣＲ２部分が欠如しているＨ因子分子よりも著しく有効であり、補体活性化部位へのＦＨを標的にすることが、補体活性化副経路が関与する黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症）等の疾患に有効な治療手段であることを示唆している。血漿中のＦＨの比較的高い濃度のため、および血漿と直接接触する細胞はすでに完全にＦＨで覆われていると長年信じられてきたのでこの観察は驚くべきことである。Ｊｏｚｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  （２００４）１９：２５１−２５８。
【００３４】
従って、１つの態様では、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子が提供される。一部の実施形態では、単離されたＣＲ２−ＦＨ分子が提供される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子および個体への全身的な投与（例えば、静脈注射）または局所投与（例えば、眼内注射または腎動脈を含む動脈への注入）に適した薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３５】
別の態様では、個体において補体活性化副経路が関する疾患を治療する方法が提供され、その方法は、ａ）ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。本発明の方法によって治療可能である適切な疾患としては、以下が含まれる：例えば、黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症）、関節リウマチ、虚血再灌流障害、臓器移植拒絶反応、および腎疾患（例えば、ＭＰＧＮ  ＩＩ、ＨＵＳ、およびループス腎炎）。
【００３６】
また、本明細書に記載する方法に有用である単位剤形、キット、および製品が提供される。
【００３７】
「（１つまたは複数の）組成物」の一般的な言及は、本発明の組成物を包含し、かつ本発明の組成物に適用できる。
【００３８】
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り複数形の言及を含む。例えば、単数形のＦＨ部分は、１つまたは複数のＦＨ部分を含む。
【００３９】
本明細書において、値またはパラメータに前置する「約」の言及は、その値またはパラメータそれ自体に向けられる実施形態を含む（および記述する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００４０】
当然のことながら、本明細書に記載する発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「のみからなる」および／または「実質的にのみからなる」を含む。
【００４１】
ＣＲ２−ＦＨ分子、およびＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物
本明細書で提供されるのは、ＣＲ２−ＦＨ分子およびＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）である。
【００４２】
本明細書で使用される「ＣＲ２−ＦＨ分子」は、ＣＲ２またはその断片（「ＣＲ２部分」）およびＦＨまたはその断片（「ＦＨ部分」）を含む非天然の分子をいう。ＣＲ２部分は、ＣＲ２の１つまたは複数の天然リガンと結合することが可能であり、従って補体活性化の部位へのＣＲ２−ＦＨ分子の標的送達に関与する。ＦＨ部分は、補体活性化副経路の補体活性化を特異的に抑制することに関与する。ＣＲ２−ＦＨ分子のＣＲ２部分とＦＨ部分は、これら２つの部分の所望の機能性が維持される限り、当該技術分野で公知の任意の方法によって結合することが可能である。
【００４３】
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子は、このように通常、ＣＲ２リガンドに結合する機能および補体活性化副経路の補体活性化を抑制する機能の２つを有する。「ＣＲ２リガンド」は、天然のＣＲ２タンパク質に結合するいかなる分子を言及し、以下が含まれるがこれらに限定されない：Ｃ３ｄ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ、およびＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合断片。ＣＲ２−ＦＨ分子は、例えば、ＣＲ２タンパク質の約、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかである結合親和性でＣＲ２リガンドに結合することが可能である。結合親和性は、当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、表面プラズモン共鳴法、滴定熱量測定法、ＥＬＩＳＡ法、およびフローサイトメトリーを含む）によって決定可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２の以下の特性から１つまたは複数を有する：（１）Ｃ３ｄへの結合、（２）ｉＣ３ｂへの結合、（３）Ｃ３ｄｇへの結合、（４）Ｃ３ｄへの結合、および（５）ＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合断片への結合。
【００４４】
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子は、通常、補体活性化副経路の補体活性化を抑制することが可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子は、天然のＦＨタンパク質よりもさらに強力な補体抑制剤であり得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＦＨタンパク質の補体抑制活性の約、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、またはそれ以上のいずれかである補体抑制活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、約、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のいずれかのＥＣ５０を有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、約５〜６０ｎＭ（例えば、８〜５０ｎＭ、８〜２０ｎＭ、１０〜４０ｎＭ、および２０〜３０ｎＭのいずれかを含む）のＥＣ５０を有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＦＨタンパク質の補体抑制活性の約、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかである補体抑制活性を有する。
【００４５】
補体抑制は、当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、ザイモサンｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、赤血球溶解アッセイ、免疫複合体活性化アッセイ、およびマンナン活性化アッセイ）に基づいて評価可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨは、ＦＨの以下の特性から１つまたは複数を有する：（１）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）への結合、（２）Ｃ３ｂへの結合、（３）ヘパリンへの結合、（４）シアル酸への結合、（５）内皮細胞表面への結合、（６）細胞インテグリン受容体への結合、（７）病原体への結合、（８）Ｃ３ｂ補助因子活性、（９）Ｃ３ｂ崩壊促進活性、および（１０）補体活性化副経路の抑制。
【００４６】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は融合タンパク質である。本明細書で使用する「融合タンパク質」は、互いに作用可能に結合した２つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を言及する。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は互いに直接的に融合する。一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、アミノ酸リンカー配列によって結合する。リンカー配列の例は当該技術分野で公知であり、例えば、以下が含まれる：（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（ＳｅｒＧｌｙ４）、（ＳｅｒＧｌｙ４）２、（ＳｅｒＧｌｙ４）３、および（ＳｅｒＧｌｙ４）４。リンカー配列は、補体因子の様々なドメイン間で見出される「天然の」リンカー配列も含むことが可能である。例えば、ヒトＣＲ２の最初の２つのＮ末端ショートコンセンサスリピートドメイン間のリンカー配列であるＶＳＶＦＰＬＥが使用可能である。一部の実施形態では、ヒトＣＲ２（ＥＥＩＦ）の第４と第５のＮ末端ショートコンセンサスリピートドメイン間のリンカー配列が使用される。融合タンパク質内のＣＲ２部分およびＦＨ部分の順序は、異なることがある。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２部分のＣ末端は、ＣＲ２−ＦＨ分子のＦＨ部分のＮ末端に（直接的または間接的に）融合される。一部の実施形態では、ＣＲ２部分のＮ末端は、ＣＲ２−ＦＨ分子のＦＨ部分のＣ末端に（直接的または間接的に）融合される。
【００４７】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかの少なくとも約４００、４５０、５００、５５０、またはそれ以上の近接するアミノ酸を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号５〜１０のいずれかのアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号５〜１０のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号５〜１０のいずれかの少なくとも約４００、約４５０、約５００、約５５０、またはそれ以上の近接するアミノ酸を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５０】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨは、化学架橋剤を介して結合するＣＲ２部分およびＦＨ部分を含む。これら２つの部分の結合は、これらの２つの部分の上に位置する反応基上で発生することが可能である。架橋剤を使用して標的とされることが可能な反応基としては、以下が含まれる：一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、糖質、およびカルボン酸、またはタンパク質に付加可能な活性基。化学リンカーの例は当該技術分野で公知であり、以下が含まれるがこれらに限定されない：ビスマレイミドヘキサン、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ＮＨＳ−エステル−マレイミド架橋剤（例えば、ＳＰＤＰ）、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ＭＢＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、イミドエステル架橋剤（例えば、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＴＢＰ、ＥＤＣ、およびＤＴＭＥ）。
【００５１】
一部の実施形態では、ＣＲ２部分およびＦＨ部分は、非共有結合している。例えば、これら２つの部分は、それぞれＣＲ２部分またはＦＨ部分に結合される２つの相互作用する架橋タンパク質（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）によって結合可能である。
【００５２】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、本明細書に記載する２つ以上の（同一もしくは異なる）ＣＲ２部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、本明細書に記載する２つ以上の（同一もしくは異なる）ＦＨ部分を含む。これらの２つ以上のＣＲ２（またはＦＨ）部分は、互いにタンデムに結合される（例えば、融合される）ことが可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１つのＣＲ２部分と、２つ以上（例えば、３、４、５、またはそれ以上）のＦＨ部分とを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、１つのＦＨ部分と、２つ以上（例えば、３、４、５、またはそれ以上）のＣＲ２部分とを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、２つ以上のＣＲ２部分と、２つ以上のＦＨ部分とを含む。
【００５３】
一部の実施形態では、単離されたＣＲ２−ＦＨ分子が提供される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ニ量体または多量体を形成する。
【００５４】
ＣＲ２−ＦＨ分子中のＣＲ２部分およびＦＨ部分は、同じ種（例えば、ヒトまたはマウス）、または異なる種に由来することが可能である。
【００５５】
ＣＲ２部分
本明細書に記載するＣＲ２部分は、ＣＲ２またはその断片を含む。ＣＲ２は、主に成熟したＢ細胞上および濾胞樹状細胞上で発現する膜貫通タンパク質である。ＣＲ２は、Ｃ３結合タンパク質ファミリーの一員である。ＣＲ２に対する天然リガンドとしては、例えば、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、およびＣ３ｄ、ならびにＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合分解断片が含まれる。Ｃ３の切断は、最初にＣ３ｂの生成をもたらし、次いで活性化細胞表面へのこのＣ３ｂの共有結合をもたらす。Ｃ３ｂ断片は、補体カスケードを増幅する酵素複合体の生成に関与する。細胞表面でＣ３ｂは、特に、補体活性化の調節因子を含む宿主表面（すなわち大部分の宿主組織）に沈着すると、急速に不活性ｉＣ３ｂに変わる。膜に結合した補体調節因子の非存在下でさえ、かなりのレベルのｉＣ３ｂが形成される。ｉＣ３ｂは続いて消化され、膜結合断片Ｃ３ｄｇが生じ、次いで血清プロテアーゼによってＣ３ｄが生じるが、このプロセスは比較的ゆっくりと行われる。このように、ＣＲ２に対するＣ３リガンドは、一旦産生されると比較的寿命が長く、補体活性化の部位で高濃度下でも存在する。従ってＣＲ２は、補体活性化の部位に分子を架橋するための強力な標的化ベヒクルとして役立つことが可能である。
【００５６】
ＣＲ２は、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲドメイン）として知られている１５あるいは１６の反復単位を有する細胞外部分を含む。ＳＣＲドメインは、４つのシステイン、２つのプロリン、１つのトリプロトファン、およびいくつかの他の部分的に保存されたグリシンと疎水性残基を含む高度保存残基からなる典型的なフレームワークを有する。配列番号１は、全長のヒトＣＲ２タンパク質配列を表す。１〜２０のアミノ酸はリーダーペプチドを含み、２３〜８２のアミノ酸はＳＣＲ１を含み、９１〜１４６のアミノ酸は、ＳＣＲ２を含み、１５４〜２１０のアミノ酸は、ＳＣＲ３を含み、２１５〜２７１のアミノ酸はＳＣＲ４を含む。活性部位（Ｃ３ｄ結合部位）は、ＳＣＲ１〜２（最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメイン）に位置する。これらのＳＣＲドメインは、スペーサーとして役立つ種々の長さの短い配列によって分離される。全長のマウスＣＲ２タンパク質配列は、本明細書では配列番号１５で表す。マウスＣＲ２タンパク質のＳＣＲ１とＳＣＲ２のドメインは、配列番号１５の１４〜７３の位置（ＳＣＲ１）で、並びに配列番号１５の８２〜１３８の位置（ＳＣＲ２）でマウスＣＲ２アミノ酸配列によって位置する。ヒトおよびマウスのＣＲ２は、配列番号１および配列番号１５で表した全長アミノ酸配列全体にわたり約６６％同一であり、配列番号１および配列番号１５のＳＣＲ１〜ＳＣＲ２領域にわたり約６１％同一である。マウスおよびヒトの両ＣＲ２は、Ｃ３（Ｃ３ｄ領域で）に結合する。当然のことながら、種および株のバリエーションは、開示したペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に対して存在し、本明細書に記載するＣＲ２またはその断片は、種および株のすべてのバリエーションを包含する。
【００５７】
本明細書で開示するＣＲ２部分は、ＣＲ２タンパク質のリガンド結合部位の一部またはすべてを含むポリペプチドをいい、以下が含まれるがこれらに限定されない：全長ＣＲ２タンパク質（例えば、配列番号１に示すヒトＣＲ２、または配列番号１５に示すマウスＣＲ２）、可溶性ＣＲ２タンパク質（例えば、ＣＲ２の細胞外ドメインを含むＣＲ２断片）、ＣＲ２の他の生物活性断片、ＳＣＲ１およびＳＣＲ２を含むＣＲ２断片、または以下に詳細に記述するように天然のＣＲ２の任意の相同体もしくはその断片。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、以下の特性の１つまたはＣＲ２を有する：（１）Ｃ３ｄへの結合、（２）ｉＣ３ｂへの結合、（３）Ｃ３ｄｇへの結合、（４）Ｃ３ｄへの結合、および（５）ＣＲ２の２つのＮ末端ＳＣＲドメインに結合するＣ３ｂの細胞結合断片（１つまたは複数）への結合。
【００５８】
一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の３つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２の最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメイン（例えば、ＣＲ２の少なくとも最初の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のＳＣＲドメインからのいずれかを含む）を含む（および一部の実施形態では、これらのみからなる、または実質的これらのみからなる）。
【００５９】
ＣＲ２タンパク質の相同体またはその断片は、少なくとも１つまたは数個のアミノ酸が除去され（例えば、ペプチドまたは断片等のタンパク質の切断型）、挿入され、転化され、置換され、および／または誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトール付加によって）されている点において、天然のＣＲ２（またはＣＲ２断片）とは異なるタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＲ２相同体は、天然のＣＲ２のアミノ酸配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）に少なくとも約７０％同一である（例えば、天然のＣＲ２のアミノ酸配列（例えば、配列番号１または配列番号１５）に少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一である）アミノ酸配列を有する。ＣＲ２相同体またはその断片は、好ましくは、ＣＲ２の天然リガンドに結合する能力（例えば、ＣＲ２結合能力を有するＣ３ｄまたは他のＣ３断片）を保持する。例えば、ＣＲ２相同体（またはその断片）は、Ｃ３ｄに対して結合親和性を有することが可能であり、それはＣＲ２（またはその断片）の結合親和性の少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【００６０】
一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ヒトＣＲ２（例えば、ヒトＣＲ２（配列番号１）の少なくとも２３〜１４６のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣＲ２部分）の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、例えば、ヒトＣＲ２（配列番号１）の２３〜１４６のアミノ酸と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一であるアミノ酸配列を有するヒトＣＲ２の少なくとも最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。
【００６１】
一部の実施形態では、ヒトＣＲ２（例えば、ヒトＣＲ２（配列番号１）の２３〜２７１アミノ酸を少なくとも含むアミノ酸配列を有するＣＲ２部分）の少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ヒトＣＲ２（配列番号１）の２３〜２７１のアミノ酸と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一であるアミノ酸配列を有するヒトＣＲ２の少なくとも最初の４つのＳＣＲドメインを含む。
【００６２】
参照配列（例えば、配列番号１）と例えば、少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列とは、前記アミノ酸配列が前記参照配列の各１００アミノ酸当たり最高５ポイントまでの変化を含み得ることを除いて前記参照配列と同一であることを意味する。これらの最高５ポイントまでの変化は、欠失、置換、付加であり得、参照配列のアミノ酸の中で個々に分散して、または参照配列内の１つもしくは複数の連続する基に分散して、配列のどこでも発生する可能性がある。
【００６３】
一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２タンパク質のリガンド結合部位の一部または全体を含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、リガンド結合部位の３次元構造を維持するのに必要な配列をさらに含む。ＣＲ２のリガンド結合部位は、ＣＲ２の結晶構造（例えば、米国特許出願公開第２００４／０００５５３８号に開示されるヒトおよびマウスのＣＲ２結晶構造）に基づいて容易に決定可能である。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、ＣＲ２のＳＣＲ２のＢ鎖およびＢ〜Ｃループを含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、配列番号１に関してセグメントＧ９８−Ｇ９９−Ｙ１００−Ｋ１０１−Ｉ１０２−Ｒ１０３−Ｇ１０４−Ｓ１０５−Ｔ１０６−Ｐ１０７−Ｙ１０８から構成されるＣＲ２のＳＣＲのＢ鎖上およびＢ〜Ｃループ上の部位を含む。一部の実施形態では、ＣＲ２部分は、配列番号１に関して位置Ｋ１１９を含むＣＲ２のＳＣＲ２のＢ鎖上の部位を含む。一部の実施形態では、配列番号１に関してＶ１４９−Ｆ１５０−Ｐ１５１−Ｌ１５２から構成されるセグメントを含む。一部の実施形態では、配列番号１に関してＴ１２０−Ｎｌ２１−Ｆ１２２から構成されるＣＲ２のＳＣＲ２のセグメントを含む。一部の実施例では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、これらの部位のうちの２つ以上を有する。例えば、一部の実施形態では、配列番号１に関してＧ９８−Ｇ９９−Ｙ１００−Ｋ１０１−Ｉ１０２−Ｒ１０３−Ｇ１０４−Ｓ１０５−Ｔ１０６−Ｐ１０７−Ｙ１０８およびＫ１１９から構成される部分を含む。これらの部位の他の組み合わせも十分考えられる。
【００６４】
Ｈ因子部分
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子のＦＨ部分は、ＦＨまたはその断片を含む。
【００６５】
補体Ｈ因子（ＦＨ）は、ポリペプチド単鎖血漿糖タンパク質である。このタンパク質は、約６０のアミノ酸からなる２０の反復ＳＣＲドメイで構成され、一連の２０のビーズ様に連続的に配置される。Ｈ因子は、Ｃ３ｂに結合し、補体活性化副経路Ｃ３転換酵素（Ｃ３Ｂｂ）の崩壊を容易にし、かつＣ３ｂのタンパク質分解性不活性化の補助因子として作用する。Ｈ因子の存在下で、Ｃ３ｂタンパク質分解はＣ３ｂの切断をもたらす。Ｈ因子は、Ｃ３ｂに対して少なくとも３つの異なる結合ドメインを有し、それらはＳＣＲ１〜４内、ＳＣＲ５〜８内、およびＳＣＲ１９〜２０内に位置する。Ｈ因子の各部位は、Ｃ３ｂタンパク質内の異なる領域に結合する。すなわちＮ末端部位は未変性のＣ３ｂに結合し、Ｈ因子の中間の領域に位置する第２の部位はＣ３ｃ断片に結合し、ＳＣＲ１９および２０内に位置する部位はＣ３ｄ領域に結合する。さらに、Ｈ因子は、Ｈ因子のＳＣＲ７内、ＳＣＲ５〜１２内、およびＳＣＲ２０内に位置しＣ３ｂ結合部位のそれと重なるヘパリン結合部位も含む。構造解析および機能解析によって、ＦＨの補体抑制活性のドメインが最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメイン内に位置することが示された。
【００６６】
配列番号２は、全長のヒトＦＨタンパク質配列を表す。アミノ酸１〜１８はリーダーペプチドに相当し、アミノ酸２１〜８０はＳＣＲ１に相当し、アミノ酸８５〜１４１はＳＣＲ２に相当し、アミノ酸１４６〜２０５はＳＣＲ３に相当し、アミノ酸２１０から２６２はＳＣＲ４に相当し、アミノ酸２６７〜３２０はＳＣＲ５に相当する。全長のマウスＦＨタンパク質配列は、本明細書では配列番号１６で表す。マウスＦＨタンパク質のＳＣＲ１とＳＣＲ２のドメインは、配列番号１６の２１〜２７の位置（ＳＣＲ１）で、および配列番号１６の８２〜１３８の位置（ＳＣＲ２）でマウスＦＨアミノ酸配列によって位置する。ヒトＦＨおよびマウスＦＨは、配列番号２および配列番号１６で表される全長アミノ酸配列全体にわたり約６１％同一である。当然のことながら、種および株のバリエーションは、開示するペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に対して存在し、かつＦＨまたはその断片は、種および株のすべてのバリエーションを包含する。
【００６７】
本明細書に記載するＦＨ部分は、ＦＨタンパク質の補体抑制活性の一部またはすべてを有するＦＨタンパク質の任意の部分をいい、以下が含まれるがこれらに限定されない：全長ＦＨタンパク質、ＦＨタンパク質の生物活性断片、ＳＣＲ１〜４を含むＦＨ断片、または以下に詳細に記述するように天然のＦＨの相同体またはその断片。一部の実施形態では、ＦＨ部分は以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：（１）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）への結合、（２）Ｃ３ｂへの結合、（３）ヘパリンへの結合、（４）シアル酸への結合、（５）内皮細胞表面への結合、（６）細胞インテグリン受容体への結合、（７）病原体への結合、（８）Ｃ３ｂ補助因子活性、（９）Ｃ３ｂ崩壊促進因子活性、および（１０）補体活性化副経路の抑制。
【００６８】
一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ＦＨの最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、コンストラクトはＦＨの最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、コンストラクトはＦＨの最初の６つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分はＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメイン（例えば、ＦＨの少なくとも最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上からのいずれかのＮ末端ＳＣＲドメインを含む）を含む（および一部の実施形態では、これらのみからなる、または実質的にこれらのみからなる）。
【００６９】
一部の実施形態では、ＦＨは野性型のＦＨである。一部の実施形態では、ＦＨはＦＨの保護変異型である。
【００７０】
一部の実施形態では、ＦＨ部分はヘパリン結合部位が欠如している。これは、例えば、ＦＨ上のヘパリン結合部位の変異によって、またはヘパリン結合部位を含まないＦＨ断片を選択することによって達成できる。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、加齢黄斑変性症に対して防御的である多型性を有するＦＨまたはその断片を含む。Ｈａｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２（２０）：７２２７。このような配列を含むＣＲ２−ＦＨ分子の一例を、図４（配列番号６）に示す。
【００７１】
ＦＨタンパク質の相同体またはその断片は、少なくとも１つまたは数個（１つまたは数個に限定されないが）のアミノ酸が除去され（例えば、ペプチドまたは断片等のタンパク質の切断型）、挿入され、転化され、置換され、および／または誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトール付加によって）されている点において、天然のＦＨ（またはＦＨ断片）とは異なるタンパク質を含む。例えば、ＦＨ相同体は、天然のＦＨのアミノ酸配列（例えば、配列番号２または配列番号１６）に少なくとも約７０％同一である（例えば、天然のＦＨのアミノ酸配列（例えば、配列番号２または配列番号１６）に少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一である）アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＦＨの相同体（またはその断片）は、ＦＨ（またはその断片）の補体抑制活性のすべてを保持する。一部の実施形態では、ＦＨの相同体（またはその断片）は、ＦＨ（またはその断片）の補体抑制活性の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれか）を保持する。
【００７２】
一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ヒトＦＨ（例えば、ヒトＦＨ（配列番号２）の少なくとも２１〜２６２のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦＨ部分）の少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ヒトＦＨ（配列番号２）の２１〜２６２のアミノ酸と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかで同一であるアミノ酸配列を有するヒトＦＨの少なくとも最初の４つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。
【００７３】
一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ヒトＦＨ（例えば、ヒトＦＨ（配列番号２）の少なくとも２１〜３２０のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦＨ部分）の少なくとも最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＨ部分は、ヒトＦＨ（配列番号２）の２１〜３２０のアミノ酸と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかで同一であるアミノ酸配列を有するヒトＦＨの少なくとも最初の５つのＮ末端ＳＣＲドメインを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、Ｈ因子遺伝子の選択的にスプライシングされた転写物によってコードされたタンパク質であるＨ因子様１分子（ＦＨＬ−１）の全長または断片を含む。成熟ＦＨＬ−１は４３１のアミノ酸を含む。最初の４２７のアミノ酸は、７つのＳＣＲドメインを組織化し、かつＦＨのＮ末端ＳＣＲドメインと同一である。Ｃ末端の残存する４つのアミノ酸残基、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（ＳＦＴＬ）、はＦＨＬ−１に特異的である。ＦＨＬ−１は機能的に特徴づけられており、Ｈ因子補体調節活性を有することが示された。用語「ＦＨ部分」は、また、Ｈ因子関連分子の全長または断片を包含し、ＦＨＲ１、ＦＨＲ２、ＦＨＲ３、ＦＨＲ４、ＦＨＲ５の遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。これらのＨ因子関連タンパク質は、例えば、ｄｅ  Ｃｏｒｄｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００４，  ４１：３５５−３６７に開示されている。
【００７５】
ＣＲ２−ＦＨ分子の異型
ＣＲ２−ＦＨ分子の異型（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）も包含される。本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子の異型は以下のようである：（ｉ）ＣＲ２部分および／またはＦＨ部分の１つまたは複数のアミノ酸残基が保存アミノ酸または非保存アミノ酸の残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置換されたもので、かつこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子暗号によってコードされたものである可能性がある、または可能性がない、または（ｉｉ）ＣＲ２部分および／またはＦＨ部分の１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）が別の化合物（例えば、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ポリエチレングリコール）の半減期を増大させる化合物）と融合するもの、または（ｉｖ）付加的アミノ酸がＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）に融合するもの、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列またはＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）の精製に使用される配列、あるいは（ｖ）ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）が大きなポリペプチド（例えば、ヒトアルブミン、抗体、またはＦｃ）に長期の効果持続期間の間、融合するもの。このような異型は、本明細書の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【００７６】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子の異型は、１つまたは複数の予想される、好ましくは非必須アミノ酸残基でなされる保存アミノ酸置換（さらに以下に明示する）を含む。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなくタンパク質の野生型配列から変化することが可能な残基であり、一方「必須」アミノ酸残基は、生物活性に必要とされる残基である。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては以下が含まれる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。
【００７７】
ＣＲ２−ＦＨ分子のＣＲ２部分またはＦＨ部分におけるアミノ酸置換は、前記分子の官能性を改善するために導入可能である。例えば、ＣＲ２部分のそのリガンドへの結合親和性の増大のため、ＣＲ２部分のそのリガンドへの結合特異性の増大のため、所望の部位へのＣＲ２−ＦＨ分子の標的化の改善のため、ＣＲ２−ＦＨ分子の二量体化または多量体化の改善のため、およびＣＲ２−ＦＨ分子の薬物動態の改善のために、アミノ酸置換はＣＲ２−ＦＨ分子のＣＲ２部分に導入可能である。同様に、ＣＲ２−ＦＨ部分の官能性の増大のためおよびＣＲ２−ＦＨ分子の薬物動態の改善のために、アミノ酸置換はＣＲ２−ＦＨ分子のＦＨ部分に導入可能である。
【００７８】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増大させおよび／またはポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の潜在的免疫原性を減少させる化合物）と融合する。水溶性、大きさ、腎臓クリアランスの遅速性、および免疫原性低下をＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質に与えるために、ＰＥＧは使用可能である。米国特許第６，２１４，９６６号を参照されたい。ＰＥＧ化の場合、ＰＥＧへのＣＲ２−ＦＨ分子の融合（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）は、当業者に公知の任意の方法によって達成可能である。例えば、ＰＥＧ化は、最初にシステイン変異体をＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質に導入し、続いてＰＥＧ−マレイミドによる部位特異的誘導体化によって達成可能である。システインは、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のＣ末端に付加可能である。例えば（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７（１５）：８５４８−８５５３）を参照されたい。ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）に行うことが可能な別の修飾は、ビオチン化を含む。場合によっては、ストレプトアビジンとの反応を容易にするためにＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）をビオチン化させることは有用であり得る。タンパク質のビオチン化の方法は、当該技術分野では周知である。さらに、コンドロイチン硫酸はＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）と結合可能である。
【００７９】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２−ＦＨ分子の標的効率をさらに高める別の標的分子または標的部分に融合する。例えば、血管の内皮細胞に結合するか、さもなければ付着する能力を有するリガンド（例えば、アミノ酸配列）に、ＣＲ２−ＦＨ分子は融合することが可能である（「血管内皮標的アミノ酸リガンド」と呼ばれる）。典型的な血管内皮標的アミノ酸リガンドとしては、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、インテグリン、フィブロネクチン、Ｉ−ＣＡＭ、ＰＤＧＦ、または血管内皮細胞の表面で発現する分子に対する抗体。
【００８０】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、細胞接着分子のリガントに結合される（例えば、融合する）。例えば、ＣＲ２−ＦＨ分子は、細胞接着分子に結合する１つまたは複数の糖鎖に結合可能である。糖鎖は、損傷部位へのＣＲ２−ＦＨ分子の局在性を容易にする。糖鎖は、細胞外現象（例えば、化学的付着または酵素的付着）の方法によってＣＲ２−ＦＨ分子に付着可能であり、または適切な酵素の発現によって達成される細胞内プロセシング現象の結果であり得る。一部の実施形態では、糖鎖は、インテグリンまたはセレクチン（Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、またはＰ−セレクチンを含む）等の特定の種類の接着分子に結合する。一部の実施形態では、糖鎖はＮ結合糖質（例えば、フコシル化糖質およびシアル化糖質を含む複合型）を含む。一部の実施形態では、糖鎖はルイスＸ抗原（例えば、シアル化ルイスＸ抗原）に関連する。
【００８１】
ＡＭＤ等の眼疾患の治療のために、ＣＲ２−ＦＨは、ドルーゼンのネオエピトープを認識する抗体に結合される（例えば、融合する）ことが可能である。小さい標的ペプチド等の他の標的分子も使用することが可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子の他の修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化等が含まれる。
【００８２】
ＣＲ２−ＦＨ分子は、ポリペプチドの標的化または精製を容易にするために、免疫学的に活性のドメイン（例えば、抗体エピトープまたは他のタグ）の付加を含むことが可能である。タグとして６×ＨｉｓおよびグルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）の使用は、周知である。融合接合部でまたはその近辺での切断部位の包含は、精製後に外来ポリペプチドの除去を容易にする。ＣＲ２−ＦＨ分子に含まれ得る他のアミノ酸配列は、機能ドメイン（例えば、加水分解酵素等の酵素からの活性部位）、グリコシル化ドメイン、および細胞標的シグナルがある。
【００８３】
ＣＲ２−ＦＨ分子の異型は（例えば、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）、ＣＲ２−ＦＨ分子のアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。用語「十分に類似した」は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸配列に関して同一のまたは同等のアミノ酸残基を十分にまたは最小数で含む第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、好ましくは約７５％〜９８％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似すると本明細書では定義される。異型は、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはその補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質の異型を含む。このような異型は、通常、本発明の融合タンパク質の機能活性を保持する。ポリヌクレオチドの断片のライブラリーは、スクリーニングおよびそれに続く選択のための断片の変化に富んだ集団を生成するために使用可能である。例えば、大体１分子当たり１回だけニッキングが起こる条件下でヌクレアーゼを使用してポリヌクレオチドの二本鎖ＰＣＲ断片を処置し、前記二本鎖ＤＮＡを変性させ、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含むことが可能な二本鎖ＤＮＡを形成するために前記ＤＮＡを復元し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処置によって再編成した二本鎖から一本鎖部分を取り除き、結果として生じる断片ライブラリーを発現ベクターの中に結紮することによって断片のライブラリーは、生成可能である。この方法によって、本発明の融合タンパク質の種々の大きさのＮ末端および内部の断片をコードする発現ライブラリーを得ることが可能となる。
【００８４】
異型は、変異原性が原因するアミノ酸配列が異なる融合タンパクク質がある。さらに、ＣＲ２−ＦＨ分子（例えば、融合タンパク質）の生物学的に同等な類似体も、ＣＲ２部分および／またはＦＨ部分の残基または配列に対して種々の置換を行うことによって構築可能である。
【００８５】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子、特にＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質は、そのＮ末端でシグナルペプチドを融合する。このようなシグナルペプチドは、ＣＲ２−ＦＨ分子の分泌に有用である。適切なシグナルペプチドとしては、例えば、ＣＤ５タンパク質（例えば、ヒトＣＤ５タンパク質のシグナルペプチドＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡＳ、配列番号１１）のシグナルペプチドが含まれる。一部の実施形態では、ＣＲ２タンパク質のシグナルペプチドが使用される。例えば、一部の実施形態では、ヒトＣＲ２タンパク質のシグナルペプチド（ＭＧＡＡＧＬＬＧＶＦＬＡＬＶＡＰＧ、配列番号１３またはＭＧＡＡＧＬＬＧＶＦＬＡＬＶＡＰＧＶＬＧ、配列番号２５）が使用される。
【００８６】
ＣＲ２−ＦＨ分子の調製
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子（またはＣＲ２−ＦＨ分子の２つの部分）は、化学合成法によって、またはＣＲ２部分をコードするポリヌクレオチドとＦＨ部分（リンカー配列を有するもしくは前記配列がない）をコードするポリヌクレオチドとを結合し、結果として生じるポリヌクレオチド分子を、前記分子を発現することが可能な宿主細胞をトランスフェクトするためのベクターに導入することによって行われることが可能である。化学合成、特に固相合成は、短いペプチドのためにまたは非天然アミノ酸もしくは異常アミノ酸（例えば、Ｄ−Ｔｙｒ、オルニチン等）を含むペプチドのために好まれる。組換え方法は、長いポリペプチドのために好まれる。ＣＲ２−ＦＨ分子は、タンパク質精製法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子は、遺伝子治療系を目的の組織に導入し、次いでＣＲ２−ＦＨ融合を発現させることによって“ｉｎ  ｓｉｔｕ”で提供可能でもある。
【００８７】
ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質を生成するための組換えＤＮＡ法は、簡単に言えば、
ＣＲ２−ＦＨをコードするポリヌクレオチドを採取すること、それを適切なベクターに挿入すること、そのベクターを適切な宿主細胞に挿入すること、およびそれによって生成される融合タンパク質を回収するまたは単離することを含む。
【００８８】
本明細書で提供するのは、ＣＲ２−ＦＨ分子（すなわち、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、ＣＲ２−ＦＨの送達および発現のためにも使用されることがある。例えば、一部の実施形態では、ＣＲ２またはその断片を含むＣＲ２部分と、ＦＨまたはその断片を含むＦＨ部分とを有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、また、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする配列の５’末端で作用可能に結合されるシグナルペプチドをコードする配列を含む。シグナルペプチドの典型的なヌクレオチド配列は、図７（配列番号１２、１４、および２５）に示す。一部の実施形態では、ＣＲ２部分とＦＨ部分とを結合するためにリンカー配列が使用される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一であるアミノ酸を有するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの少なくとも約４００、４５０、５００、５５０、またはそれ以上のいずれかの近接するヌクレオチドを含むＣＲ２−ＦＨ分子をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの核酸配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかで同一である配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号２２、および配列番号２４のいずれかの少なくとも約１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、またはそれ以上のいずれかの近接するヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、前記融合タンパク質を培地に分泌するための分泌シグナル配列をコードする配列をさらに含む。分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、ＣＤ５のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドまたはＣＲ２のシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００８９】
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の発現のためのポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供される。発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の発現を導くために使用可能である。発現ベクターは、ベクターの従来の機能を確立するための任意の要素（例えば、プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、および複製開始点）を含むことも可能である。プロモーターは恒常的または調節的であり得、並びに例えば、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、エピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）等の遺伝子のプロモーターから選択される。
【００９０】
当業者にとって数多くの発現ベクターが公知である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｐＢＲ３２２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種に由来するプラスミド）を使用して形質転換され得る（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，５３：１５４（１９７０））。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン抵抗性およびテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含み、従って容易な選択方法を提供する。他のベクターは、様々なプロモーター等の様々な特徴を含み、それらは発現の際に重要であることが多い。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）、およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．，  ＵＳＡ）のすべては市販されている。本発明で使用することが可能な他のベクターとしては、以下が含まれるがこれらに限定されない：ｐＥＴ２１ａ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８５：６０−８９（１９９０））、ｐＲ１Ｔ５およびｐＲ１Ｔ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ならびにｐＢ０４７５（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；米国特許第５，５８０，７２３号）。哺乳類発現ベクターは、非転写要素（例えば、複製開始点、プロモーター、およびエンハンサー）、ならびに５’または３’の非翻訳配列（例えば、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、受容体部位とスプライス供与部位、および転写終結配列）を含むことが可能である。哺乳類発現ベクターで使用するプロモーターは、通常、例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＨＴＬＶ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ））である。ベクターは、上記ベクターの関連のある形質を組み合わせることによる標準的技法を使用して構築されることも可能である。
【００９１】
ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質を発現させるための宿主細胞（例えば、単離細胞、一過性細胞系、および安定細胞系）も提供される。宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。典型的な原核生物宿主細胞としては、以下が含まれる：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ第３１４４６号）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ第３１５３７号）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、γ−、原栄養性／ＡＴＣＣ第２７３２５号）、桿菌（例えば、枯草菌）、および他の腸内細菌科（例えば、ネズミチフス菌または霊菌）、ならびに種々のシュードモナス種。１つの適した原核生物宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。これは、ＯｍｐＴプロテアーゼおよびＬｏｎプロテアーゼが欠損しており、インタクトな組換えタンパク質の単離を妨げる可能性があり、かつＴ７プロモーター駆動ベクター（例えば、ｐＥＴベクター）と共に有用である。別の適した原核生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ第２７３２５号）である。原核生物によって発現されるとき、ペプチドは、一般的にＮ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、かつグリコシル化されない。融合タンパク質の場合、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンは、前記融合タンパク質のアミノ末端上または前記融合タンパク質のシグナル配列上に存在する。これらの例は、もちろん、限定するよりはむしろ例示であることを目的とする。
【００９２】
原核生物に加えて、真核微生物（例えば、糸状菌または酵母）は、ベクターをコードする融合タンパク質の適切なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般に使用される下等真核宿主微生物である。その他としては、以下が含まれる：分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０：１４０（１９８１）、１９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９，３８３号）；クリベロミセス宿主（米国特許第４，９４３，５２９号、Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９：９６８−９７５（１９９１））、例えば、Ｋ．ラクティス（ＭＷ９８−８Ｃ，  ＣＢＳ６８３，  ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５４（２）：７３７−７４２（１９８３））、Ｋ．フラジリス（ＡＴＣＣ第１２，４２４号）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ第１６，０４５号）、Ｋ．ウィケラミ（ＡＴＣＣ第２４，１７８号）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ第５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ第３６，９０６号、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：１３５（１９９０））、Ｋ．テモトレランス、およびＫ．マルキシアナス；ヤロウィア（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキアパストリス（欧州特許第１８３，０７０号、Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２８：２６５−２７８（１９８８））；カンジダ；トリコデルマリーセイ（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７６：５２５９−５２６３（１９７９））；シュワニオミセス、例えば、シュワニオマイセスオクシデンタリス（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４，５３８号）；および糸状菌、例えば、アカパンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム（１９９１年１月１０日公開の国際公開第９１／００３５７号）およびアスペルギルス宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：１４７０−１４７４（１９８４））、およびクロコウジカビ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ４：４７５−４７９（１９８５））。メチロトローフ酵母は本発明で適しており、以下が含まれるがこれらに限定されない：ハンゼヌラ、カンジダ、クロエケラ、ピキア、サッカロミセス、トルロプシス、およびロドトルラからなる属から選択されるメタノール上で増殖可能な酵母。酵母の典型的なこの種類である特定の種の一覧表は、Ｃ．  Ａｎｔｈｏｎｙ，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，  ２６９（１９８２）に見出すことが可能である。宿主細胞としては、また、昆虫細胞（例えば、ショウジョ���バエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９）、ならびに植物細胞が含まれる。
【００９３】
有用な哺乳類宿主細胞系の例としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＨｅＬａチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ−７、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＣＨＬ−１、ＮＳＯ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８、ＢＨＫ、Ｃ１２７、またはＭＤＣＫの細胞系。別の典型的な哺乳類細胞系はＣＨＬ−１である。ＣＨＬ−１が使用されるとき、真核生物選択マーカーとしてハイグロマイシンが含まれる。ＣＨＬ−１細胞は、ＲＰＭＩ７０３２メラノーマ細胞、すなわち容易に入手可能なヒト細胞系に由来する。本発明での使用に適した細胞は、ＡＴＣＣから市販されている。
【００９４】
一部の実施形態では、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は２９３細胞である。
【００９５】
ＣＲ２−ＦＨ分子は、当該技術分野で公知の種々の方法によって単離可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子が増殖培地に分泌される融合タンパク質であるとき、前記ＣＲ２−ＦＨ分子はその培地から直接精製可能である。前記融合タンパク質が分泌されない場合、細胞溶解物から単離される。細胞破壊は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来の方法によって行うことが可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子は、種々の方法によって得られることが可能である。これらの方法としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：免疫親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびＨＰＬＣ。例えば、ＣＲ２−ＦＨ分子は、ＣＲ２部分を認識する抗体、もしくはＦＨ部分を認識する抗体、または両方を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製可能である。一部の実施形態では、ＣＲ２の最初の２つのＮ末端ＳＣＲドメインを認識する抗体がＣＲ２−ＦＨ分子を精製するために使用される。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子はイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。
【００９６】
融合タンパク質として発現されるとき、ペプチドは、適切に折り畳まれかどうか分らない。これらの因子は、前記融合タンパク質が変性され、かつ再び折り畳まれなくてはならないかどうかを決定する。もしその必要がある場合、これらの方法が切断の前後に使用されるかどうかを決定する。変性および再折り畳みが必要なとき、一般的に前記ペプチドは、カオトロープ（例えば、グアニジンＨＣＩ）で処置され、次いで、前記ペプチドがその天然構造に再度折り畳まれるように、例えば、還元および酸化ジチオスレイトールまたは還元および酸化グルタチオンを適切な割合、ｐＨ、および温度で含有するレドックス緩衝液で処理される。
【００９７】
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子は、また、精製のためのタグ（例えば、切断可能なタグ）を含むことも可能である。このタグは、ＣＲ２部分またはＦＨ部部分のＣ末端またはＮ末端に融合でき、かつタンパク質精製を容易にするために使用されることができる。
【００９８】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子は、当該技術分野で周知の化学方法を使用して全体的または部分的に新たに合成可能である。例えば、構成アミノ酸配列は、固相法によって合成され、樹脂から切断され、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され、続いて化学結合によって所望のポリペプチドが形成される。この合成ペプチド組成物は、アミノ酸分析または塩基配列決定法によって確認可能である。
【００９９】
ＣＲ２−ＦＨ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して、それらの所望の特性をアッセイされることができる。例えば、ＣＲ２リガンドへのＣＲ２−ＦＨの結合は、表面プラズモン共鳴法によって決定可能である。一例として、Ｃ３ｄｇ−ビオチンとのＣＲ２−ＦＨの相互作用に関する動態解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で行われる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を使用して実行可能である。ＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンセンサチップの１つのフローセル表面上にＣ３ｄｇ−ビオチンを注入することによって、ヒトＣ３ｄｇ−ビオチンは前記センサチップの表面に結合可能となる。結合は、ＣＲ２−ＦＨ濃度の範囲にわたって評価可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子のリガンドとの結合は、一定時間（例えば、１２０秒）の間モニタリング可能であり、その後前記複合体は緩衝液の存在下でさらに一定の時間（例えば、１２０秒）の間だけ解離させておく。ＣＲ２融合タンパク質断片のＣ３ｄｇ−固定化フローセルへの結合は、フローセルを制御するために結合を補正できる。結合データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．１（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用して１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させて、最良適合を評価できる。得られる動態学的な解離プロファイルを使用して、オン／オフ速度（ｋａおよびｋｄ）を算出し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバ−ジョン３．１を使用して親和性定数（ＫＤ）を算出可能である。リガンド結合のための他のアッセイ法は当該技術分野で公知であり、使用することも可能である。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏザイモサン補体アッセイを使用して、ＣＲ２−ＦＨ分子の補体抑制活性を決定可能である。Ｍｇ−ＥＧＴＡ中の血清によるウサギ赤血球の溶解は、利用できる別の活性尺度である。シアル酸を除去させたヒトＭｇ−ＥＧＴＡまたはヒツジ赤血球の溶解は、さらなる活性尺度を提供する。
【０１０１】
医薬組成物
また、本発明ではＣＲ２−ＦＨ分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、本明細書に記載する種々の投与モード（例えば、全身投与または局所投与を含む）に適していることがある。前記医薬組成物は、点眼剤、注射剤の形態、または吸入投与（経口的もしくは経鼻的のいずれかで）または経口投与に適した形態であり得る。本明細書に記載する医薬組成物は、単一単位投与形態または多投与形態でパッケージ可能である。
【０１０２】
一部の実施形態では、前記医薬組成物は、ヒトへの投与に適したＣＲ２−ＦＨおよび薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物は、眼内注射に適したＣＲ２−ＦＨおよび薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物は、眼への局所投与に適したＣＲ２−ＦＨおよび薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物は、静脈注射に適したＣＲ２−ＦＨ分子および薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物は、動脈（例えば、腎動脈）への注射に適したＣＲ２−ＦＨ分子および薬学的に許容される担体を含む。
【０１０３】
医薬組成物は、通常、無菌の組成物、実質的に等張の組成物として調剤されており、かつ米国食品医薬品局の医薬品の製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）のすべての規則に完全に従っている。一部の実施形態では、医薬組成物は、病原体が取り除かれている。注射の場合、医薬組成物は、溶液（例えば、ハンク溶液またはリンガー溶液等の生理的適合緩衝液）の形態であり得る。さらに、ＣＲ２−ＦＨ医薬組成物は、固体の形状であり得、かつ使用直前に再溶解させるか懸濁させることが可能である。凍結乾燥組成物も含まれる。
【０１０４】
経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容される賦形剤を使用する従来の方法によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとることが可能である。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤、もしくは懸濁液剤の形態をとることが可能であり、またはそれらの製剤は、使用前に水もしくは他の適切な溶媒を使用する構成の乾燥製品として提供可能である。このような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水溶性溶媒（例えば、アチオンド油（ａｔｉｏｎｄ  ｏｉｌ）、油性エステル、エチルアルコール、または分取した植物性油）、および防腐剤（例えば、メチル−もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）等の薬学的に許容される添加剤を使用する従来の方法によって調製可能である。前記製剤は、必要に応じて、緩衝塩、香料添加剤、着色剤、および甘味剤も含むことが可能である。
【０１０５】
一部実施例で本発明は、眼への投与に適するＣＲ２−ＦＨ分子および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。このような医薬担体は、石油起源、動物起源、植物起源、もしくは合成起源のもの（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油等）を含む水および油等の無菌液であり得る。生理食塩水と水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とグリセロール溶液は、液体担体（特に注射剤用）として使用可能である。適切な医薬賦形剤としては、以下が含まれる：デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、ナトリウム状態、グリセロールモノステアレート、グリセロール、プロピレン、水等。必要に応じて、前記医薬組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含むことが可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子および前記医薬組成物の他の成分は、前記分子の徐放性を提供するためにポリマーまたはフィブリン糊に内包可能である。これらの組成物は、液剤、懸濁液剤、乳剤、軟膏、ジェル剤、または他の固体もしくは半固体の組成物等の形態をとることも可能である。前記組成物は、一般に４．５〜８．０の範囲のｐＨを有する。前記組成物は、また、眼および眼組織の眼房水に適合する浸透値を有するように製剤化されなければならない。このような浸透値は、通常、水１ｋｇ当たり約２００〜約４００ミリオスモル（「ｍＯｓｍ／ｋｇ」）の範囲であるが、好ましくは約３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【０１０６】
一部の実施形態では、組成物は、静脈内、腹腔内、または硝子体内への注射に適応する医薬組成物として通常の方法に従って製剤化される。一般的に、注射用組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、前記組成物は、注射の部位での疼痛を軽減させるために可溶性薬剤および局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含むことも可能である。通常、その成分は、個別にもしくは混合して単位剤形で（例えば、活性薬剤の量を表示した密閉容器（例えば、アンプルまたは小袋）に入った凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として）のいずれかで供給される。前記組成物が点滴によって投与される場合、無菌の製薬等級純水または生理食塩水を含む点滴ボトルで投薬可能である。前記組成物が注射によって投与される場合、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合されるように提供可能である。
【０１０７】
前記組成物は、例えば、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、坑酸化剤と安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、粘度増強剤等の付加成分をさらに含むことも可能である。
【０１０８】
溶液での使用に適した防腐剤としては、以下が含まれる：ポリクオタニウム−１、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、塩化ベンゼトニウム等。通常（必ずしもではないが）、このような防腐剤は、０．００１重量％〜１．０重量％のレベルで使用される。
【０１０９】
適切な緩衝剤としては、ｐＨを約ｐＨ６〜ｐＨ８で、好ましくは約ｐＨ７〜ｐＨ７．５で維持するために以下の十分な量が含まれる：ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム並びに重リン酸ナトリウム等。
【０１１０】
適切な等張化剤は、点眼剤の塩化ナトリウム等価物が０．９±０．２％の範囲であるようなデキストラン４０、デキストラン７０、ブドウ糖、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウム等である。
【０１１１】
適切な坑酸化剤および安定剤としては、以下が含まれる：亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素等。適切な湿潤剤および清澄剤としては、以下が含まれる：ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロクサマー２８２、およびチロキサポール。適切な粘度増強剤としては、以下が含まれる：デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース等。
【０１１２】
単一の水性液の粘度よりも高い粘度を有する局所組成物を提供するために粘度増強剤の使用は、標的組織による活性化合物の眼内吸収を増加させるために、または眼内の保持時間を増加させるために望ましいこともある。このような粘度増強剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、または当業者にとって公知の他の薬剤が含まれる。このような薬剤は、通常、０．０１重量％〜２重量％のレベルで使用される。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子をコードするヌクレオチドの送達のための医薬組成物が提供される。遺伝子治療用の医薬組成物は、許容される希釈剤に含まれ得る、または遺伝子送達ベヒクルもしくは化合物が埋め込まれる徐放性基質を含むことも可能である。あるいは、完全な遺伝子送達系が組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）からインタクトに産生されことが可能な場合、医薬組成物は、前記遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含むことが可能である。
【０１１４】
臨床設定では、遺伝子治療用の遺伝子送達系は、いくつかの方法からのいずれかによって被験者に導入可能である。例えば、遺伝子送達系の医薬組成物は、例えば、静脈注射によって全身的に導入可能である。また、標的細胞におけるタンパク質の特異的形質導入は、遺伝子送達ベヒクルによって、受容体遺伝子の発現を制御する転写制御配列による細胞型発現もしくは組織型発現によって、またはそれらの組み合わせによってもたらされる形質移入の特異性から主に起こる。他の実施形態では、組換え遺伝子の最初の送達は、完全に局在化される動物への導入によってさらに限定される。例えば、遺伝子送達ベヒクルは、カテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位的注入によって（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７）導入可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子をコードするポリヌクレオチドは、技術（Ｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｖ．  ２０：１０５−１１５に記述される）を使用する電気穿孔法によって遺伝子治療のコンストラクトに送達可能である。
【０１１５】
一部の実施形態では、眼への遺伝子送達のための医薬組成物が提供される。発現ベクターを貯蔵するおよび／または送達するために有用な点眼液は、例えば、国際公開第０３０７７７９６Ａ２号に開示されている。
【０１１６】
ＣＲ２−ＦＨ分子およびその組成物の用途
本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子は、補体活性化副経路のｉｎ  ｖｉｖｏ補体活性化およびそれに伴う炎症性症状（例えば、マクロファージ、好中球、血小板およびマスト細胞の動員および活性化、浮腫、組織損傷、ならびに局所細胞および内在細胞の直接的活性化）を特異的に抑制するよう機能可能である。ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物は、従って、補体系の過剰活性化または無制限活性化によって媒介される疾患または状態、特に補体第ニ経路の過剰活性化または無制限活性化によって媒介される疾患または状態の治療に使用可能である。一部の実施形態では、局所炎症のプロセスに関与する疾患の治療方法が提供される。一部の実施形態では、ＦＨ欠損（例えば、ＦＨレベルの減少、ＦＨ活性の減少、または野生型ＦＨもしくは保護ＦＨの欠如）と付随する疾患の治療方法が提供される。前記疾患としては、以下が含まれる：加齢黄斑変性症、膜性増殖性糸球体腎炎、タンパク尿疾患、溶血性尿毒症候群、再発性細菌感染症、虚血再灌流障害（例えば、腎虚血再灌流障害もしくは腸管虚血再灌流障害）、臓器移植拒絶反応、および慢性炎症（例えば、関節リウマチ）。
【０１１７】
一部の実施形態では、個体において補体活性化副経路に関与する疾患（例えば、ＡＭＤ等の黄斑変性症）を治療する方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する有効量の組成物を前記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、補体活性化副経路に関与する疾患（例えば、ＡＭＤ等の黄斑変性症）を有する個体において補体活性化を抑制する方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する有効量の組成物を前記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、補体活性化副経路に関与する疾患（例えば、ＡＭＤ等の黄斑変性症）を有する個体において炎症を抑制する方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する有効量の組成物を前記個体に投与することを含む。
【０１１８】
疾患を「治療すること」または「治療する」は、疾患または前記疾患の症状のいずれかを緩和させる、改善する、安定させる、回復に向かわせる、遅らせる、遅延させる、予防する、軽減させる、または排除するために、または前記疾患または前記疾患の症状の進行を遅らせるもしくは止めるために、他の治療薬と共にもしくは他の治療薬を含まずに１つまたは複数のＣＲ２−ＦＨ分子を投与することと定義する。上記に定義するように、「有効量」は疾患を治療するのに十分な量である。
【０１１９】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類とは、以下を含むがこれらに限定されない：家畜、運動競技用動物、ペット、霊長類、マウス、およびラット。一部の実施形態では、個体はヒトである。一部の実施形態では、個体はヒト以外の個体である。一部の実施形態では、個体は、補体活性化副経路が関与する疾患の研究のための動物モデルである。治療を受け入れられる個体は、現在、無症状であるが後に黄斑変性関連障害の症状を発症する危険性が高い個体を含む。例えば、ヒト個体は、このような疾患を経験した血縁者を有するヒト、およびそのヒトの危険性が遺伝子マーカーもしくは生化学マーカーの解析によって、生化学的方法によって、または他のアッセイ（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ）によって決定されるヒトを含む。一部の実施形態では、個体は、補体活性化副経路が関与する疾患（例えば、加齢黄斑変性症）を発症する感受性が高いことを示すそのＦＨ遺伝子に変異もしくは多形を有するヒトである。一部の実施形態では、個体は野生型ＦＨまたはハプロタイプの保護ＦＨを有する。ＦＨの様々な多形は、米国特許出願公開第２００７００２０６４７号に開示されており、その開示内容全体が本明細書で援用される。
【０１２０】
本明細書に記載する組成物は、特に黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ））の治療に有用である。ＡＭＤは、黄斑と呼ばれる網膜の領域で光受容細胞が損傷された結果として生じる進行性の中心視力低下によって臨床的に特徴づけられる。ＡＭＤは、２つの病態に大別される。すなわち湿潤型および乾燥型であり、乾燥型は全症例の８０〜９０％までを占める。乾燥型ＡＭＤは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルッフ膜との間に局在化した沈着物である黄斑ドルーゼンの存在によって、および光受容体萎縮に覆われることによるＲＰＥ細胞死によって特徴づけられる地図状萎縮によって臨床的に特徴づけられる。深刻な失明の約９０％の主な原因となる湿潤型ＡＭＤは、黄斑領域内の血管新生およびこれらの新生血管からの漏出を伴う。血液および体液の蓄積は、網膜剥離、それに続く光受容体の急速な変性、および失明の原因となる可能性がある。ＡＭＤの湿潤型は、乾燥型に先行しかつ乾燥型に起因することが一般的に認められている。
【０１２１】
ＡＭＤ患者のドルーゼン内容物の分析は、アミロイドタンパク質を含む多数の炎症タンパク質、凝固因子、補体経路の多数のタンパク質を示した。補体Ｈ因子の遺伝的変異は、実質的に加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の危険性を高め、無制限補体活性化がＡＭＤ発病の根底にあることを示唆する。Ｅｄｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，  ３０８：４２１；Ｈａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，  ３０８：４１９；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：３８５−３８９；Ｈａｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００５，  １０２：７２２７。
【０１２２】
本発明は、ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物の有効量を投与することによってＡＭＤ（例えば、湿潤型ＡＭＤまたは乾燥型ＡＭＤ）を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＡＭＤの１つまたは複数の態様または症状を治療するまたは予防する方法を提供する。それらの態様または症状としては以下が含まれるがこれらに限定されない：眼または眼組織における眼性ドルーゼン炎症の形成、光受容体細胞の損失、視力の喪失（例えば、視力および視野を含む）、血管新生（例えば、脈絡膜新生血管またはＣＮＶ）、および網膜剥離。他の関連した態様としては、以下も含まれる：光受容体変性、ＲＰＥ変性、網膜変性、脈絡網膜変性、錐体変性、網膜機能障害、光照射（例えば、持続する光照射）を受けての網膜損傷、ブルッフ膜の損傷、ＲＰＥ機能損失、正常な黄斑の細胞および／または細胞外基質の組織構造の完全性の損失、黄斑内細胞の機能損失、光受容体ジストロフィー、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、前部および後部ブドウ膜炎、および糖尿病性神経障害。
【０１２３】
一部の実施形態では、個体における黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症またはＡＭＤ）の治療方法が提供さる。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を前記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、治療される疾患は、乾燥型ＡＭＤである。一部の実施形態では、治療される疾患は、湿潤型ＡＭＤである。
【０１２４】
一部の実施形態では、個体の眼におけるドルーゼンの形成を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体の眼における炎症を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体の眼における光受容細胞の損失を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体の眼における光受容細胞の損失を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、ＡＭＤと関連する血管新生を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、ＡＭＤと関連する網膜剥離を治療する（例えば、減少させる、進行を妨げる、除去する、または予防する）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体の眼の視力または視野を改善する（例えば、損失を減少させる、進行を妨げる、またはブロックする）方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を個体に投与することを含む。
【０１２５】
黄斑変性症に加えて、本発明の方法によって治療可能な他の眼疾患としては、例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、および局所炎症のプロセスが関与する他の眼疾患が含まれる。一部の実施形態では、眼疾患は糖尿病性網膜症である。一部の実施形態では、眼疾患は網膜色素変性症である。
【０１２６】
本明細書に記載する方法は、ある腎疾患の治療にも有用であり得る。一部の実施形態では、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型（ＭＰＧＮ  ＩＩ）を治療する方法が提供される。ＭＰＧＮ  ＩＩは、持続性タンパク尿、血尿、および腎炎症候群を引き起こすまれな腎臓疾患である。ＭＰＧＮ  ＩＩにおけるＦＨ欠損および機能障害が、いくつかの症例で報告されている。例えば、ＦＨの変異がＭＰＧＮ  ＩＩヒト患者で発見された。Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ品種のブタは、劣性パターンで遺伝するＦＨ欠損を有する。これらの動物はＭＰＧＮＩＩを発症し、腎糸球体内に塊状の補体沈着物を示し、腎不全のために若年齢で死亡する。さらに、ＦＨを認識する自己抗体が低補体血症ＭＰＧＮ  ＩＩの患者において記述されている。従って、補体活性化部位へのＦＨを標的にすることは、ＭＰＧＮ  ＩＩを有する個体に治療効果がある。従って、一部の実施形態では、個体においてＭＰＧＮ  ＩＩを治療する方法が提供され、前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物を前記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、ＭＰＧＮ  ＩＩと関連するタンパク尿を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、ＭＰＧＮ  ＩＩと関連する血尿を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、ＭＰＧＮ  ＩＩと関連する腎炎症候群を治療する方法が提供される。
【０１２７】
一部の実施形態では、溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）を治療する方法が提供される。ＨＵＳは、末梢における連続的な血小板分解および腎臓の微小循環における血小板トロンビンに起因する微小血管症性溶血性貧血、血小板減少症、および急性腎不全からなる疾患である。Ｚｉｐｆｅｌ，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，  ２００１，  ２７（３）：１９１−１９９。ＨＵＳ（Ｄ−ＨＵＳ）の非下痢型は、ＦＨの交互変化および変異と関連するという考慮すべき証拠が現在、存在する。さらに、ＦＨに対する自己抗体がＨＵＳ患者で報告されている。従って、補体活性化部位へのＦＨを標的にすることは、ＨＵＳを有する個体に治療効果がある。従って、一部の実施形態では、個体におけるＨＵＳの治療方法が提供される。前記方法は、ａ）ＣＲ２もしくはその断片を含むＣＲ２部分と、ｂ）ＦＨもしくはその断片を含むＦＨ部分とを有するＣＲ２−ＦＨ分子を含有する組成物の有効量を前記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、ＨＵＳと関連する微小血管症性溶血性貧血を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、ＨＵＳと関連する血小板減少症を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、ＨＵＳと関連する急性腎不全を治療する方法が提供される。
【０１２８】
一部の実施形態では、治療される疾患は、全身性エリテマトーデス（例えば、ループス腎炎）である。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、結果として多臓器合併症を引き起こす原型の自己免疫疾患である。この坑自己応答は、種々の核および細胞質の細胞成分に対して向けられる自己抗体によって特徴づけられる。これらの自己抗体はそれぞれの抗原と結合し、循環して最終的に組織内に沈着する免疫複合体を形成する。この免疫複合体沈着物は、慢性炎症および組織損傷の原因となる。補体経路（補体活性化副経路を含む）は、ＳＬＥの病態に関与する。本明細書で提供される方法は、従ってＳＬＥ（例えば、ループス腎炎）の治療に対して有用である。
【０１２９】
一部の実施形態では、治療される疾患は、関節リウマチである。関節リウマチは、種々の全身症状を示すことがある慢性疾患である。この疾患は原因不明であり、かつ通常、対称分布で末梢関節に生じる持続性炎症性滑膜炎を示す。軟骨破壊、骨侵食、および最終的に関節変形を引き起こす、補体媒介炎症はこの疾患の最も重要な特徴である。本明細書で提供する方法は、従って、関節リウマチの治療に有用である。
【０１３０】
一部の実施形態では、治療される疾患は、虚血再灌流障害である。虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ）損傷は、低酸素組織の再灌流の後の内皮およびその下にある実質組織への炎症性損傷をいう。それは全身症候群であり、種々の組織（例えば、心筋、中枢神経系、後肢および腸を含む）への急性および慢性の両損傷に関与する。虚血再灌流障害は、結果的に壊死および不可逆的細胞損傷をもたらす。補体経路（補体活性化副経路を含む）は、Ｉ／Ｒ損傷の主要なエディエーターである。本発明で提供する方法は、従って、いかなる器官または組織で起こる虚血再灌流障害の治療に有用である。虚血再灌流障害としては以下が挙げられが、これらに限定されない：腸管虚血再灌流障害、腎虚血再灌流障害、心臓虚血再灌流障害、他の内臓器官（例えば、肺、肝臓）の虚血再灌流障害、中枢神経系虚血再灌流障害、四肢または指の虚血再灌流障害、外傷誘発性の血液量減少症、またはいかなる移植臓器もしくは組織の虚血再灌流障害。虚血再灌流障害は、また、種々の他の状態と併発する可能性がある。それらの状態としては以下が含まれるが、これらに限定されない：脳卒中、脊髄損傷、外傷誘発性の血液量減少性ショック、および関節リウマチ等の自己免疫疾患（例えば、滑膜の虚血傷害によって非常に悪化する可能性がある）、または種々の他の炎症性疾患（炎症によって媒介される疾患、または虚血現象および再灌流をもたらすもしくは虚血現象および再灌流を伴うことのある症状を有する炎症）。虚血再灌流障害が起こる他の状態および疾患は、当業者にとって公知である。
【０１３１】
一部の実施形態では、ドルーゼン関連疾患を治療する方法が提供される。用語「ドルーゼン関連疾患」は、ドルーゼンの形成またはドルーゼン様細胞外疾患プラークが起こるいかなる疾患をいい、ドルーゼンまたはドルーゼン様細胞外疾患プラークは、前記疾患の原因になる、もしくはそれに関与する、もしくはその徴候を表す。例えば、黄斑ドルーゼンの形成によって特徴づけられるＡＭＤは、ドルーゼン関連疾患とみなされる。非眼性ドルーゼン関連疾患としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：アミロイド症、弾力線維症、デンスデポジット病、および／またはアテローム性動脈硬化症。用語「ドルーゼン関連疾患」は、糸球体腎炎（例えば、ＭＰＧＮ  ＩＩ）も含む。
【０１３２】
本発明の方法によって治療することが可能な、補体活性化副経路が関与する他の疾患としては、例えば、以下が含まれる：（１）急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、圧坐損傷、多臓器不全、血液量減少性ショック腸管虚血、脊髄損傷、および外傷性脳損傷後の虚血再灌流障害による組織損傷、（２）炎症性障害（例えば、火傷）、内毒血症と敗血症性ショック、成人呼吸促拍症症候群、心肺バイパス、血液透析、アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、膜性腎炎、および膵炎、（３）移植拒絶反応（例えば、超急性異種移植片拒絶反応）、（４）妊娠関連疾患（例えば、再発性胎児消失および子癇前症）、および（５）薬物有害反応（例えば、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘発性血管漏出症候群、およびＸ線撮影造影剤アレルギー）。本発明の抑制剤を使用して治療可能な自己免疫障害としては、以下も含まれるがこれらに限定されない：重症筋無力症、アルツハイマー病、多発性硬化症、肺気腫、肥満症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、坑リン脂質抗体症候群、自己免疫肝炎、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、天疱瘡、シェーグレン症候群、および高安動脈炎。
【０１３３】
一部の実施形態では、治療される疾患は以下のいずれかである：心肺バイパス術後の合併症、心筋梗塞、虚血／再灌流障害、脳卒中、急性呼吸促迫症症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、火傷、心肺バイパスと血液透析に関連する炎症、プラスマフェレーシス、血小板フェレーシス、白血球フェレーシス、体外膜型肺（ＥＣＭＯ）、ヘパリン誘導体外ＬＤＬ沈澱（ＨＥＬＰ）、Ｘ線撮影造影剤誘発アレルギー反応、移植拒絶反応、および他の炎症状態ならびに自己免疫／免疫複合体病（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、膵炎、関節リウマチ、アルツハイマー病、喘息、熱傷、アナフィラキシーショック、腸炎症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡、および糸球体腎炎。
【０１３４】
本明細書に記載する組成物は、以下に限定されないがこれらの経路を介して個体に投与できる：静脈内（例えば、輸液ポンプによって）、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、くも膜下腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所的、吸入（例えば、噴霧ミストとして）、粘膜（例えば、鼻粘膜経由で）、皮下、経皮、胃腸管、関節内、嚢内、心室内、直腸（すなわち坐薬を介して）、膣内（すなわち膣坐薬を介して）、頭蓋内、尿道内、肝内、および腫瘍内。一部の実施形態では、組成物は、全身的に（例えば、静脈注射によって）投与される。一部の実施形態では、組成物は、局所的に（例えば、動脈内注射または眼内注射によって）投与される。
【０１３５】
一部の実施形態では、組成物は、眼または眼組織に直接投与される。一部の実施形態では、組成物は、局所的に（例えば、点眼剤中で）投与される。一部の実施形態では、組成物は、注射によって眼に（眼内注射）または眼に結合する組織に投与される。組成物は、例えば、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜内注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射、または後胸膜近傍送達によって投与可能である。これらの方法は当該技術分野で公知である。例えば、網膜薬物送達のための典型的な眼周囲経路の説明については、以下を参照：Ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ  ｒｏｕｔｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｒａｇｈａｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  １（１）：９９−１１４。組成物は、例えば、硝子体、眼房水、胸膜、結膜、胸膜と結膜との間の部分、網膜脈絡膜組織、黄斑、または個体の眼内もしくは眼に近接する他の部分に投与されることも可能である。組成物は、移植片として個体に投与されることも可能である。好ましい移植片は、ある期間にわたって化合物を徐々に放出する生体適合性および／または生分解性徐放性製剤である。薬物送達用の眼移植片は、当該技術分野では周知である。例えば、米国特許第５，５０１，８５６号、第５，４７６，５１１号、および第６，３３１，３１３号を参照されたい。組成物はイオン泳動を使用して個体に投与されることも可能であり、前記方法としては米国特許第４，４５４，１５１号、および米国特許出願公開第２００３／０１８１５３１号および第２００４／００５８３１３号に記述されるイオン泳動方法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３６】
一部の実施形態では、組成物は血管内に（例えば、静脈内に（ＩＶ）もしくは動脈内に）投与される。一部の実施形態（例えば、腎疾患の治療のため）では、組成物は動脈（例えば、腎動脈）に直接投与される。
【０１３７】
組成物の最適な有効量は、経験的に決定可能であり、かつ疾患の種類および重症度、投与経路、疾患の進行、および個体の健康、体格と身体部分に依存する。このような決定は、当業者の技術範囲内である。有効量は、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体活性化アッセイに基づいて決定され得る。本明細書に記載する方法で使用され得るＣＲ２−ＦＨ分子の投与量の例としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．１μｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの投与量範囲内の有効量。例えば、眼内に投与される場合、組成物は、低マイクログラム範囲（例えば、約０．１μｇ／ｋｇ以下、約０．０５μｇ／ｋｇ以下、または０．０１μｇ／ｋｇ以下を含む）で投与可能である。一部の実施形態では、個体に投与されるＣＲ２−ＦＨの量は、一投与当たり約１０μｇ〜約５００ｍｇであり、例えば、一投与当たり約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約２００μｇ、約２００μｇ〜約３００μｇ、約３００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約３００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約５００ｍｇのいずれかを含む。
【０１３８】
ＣＲ２−ＦＨ組成物は、単回の一日投与量で投与されることも可能であり、または一日総投与量を２、３、もしくは４回に分割した用量で毎日投与されることも可能である。組成物は、また、毎日よりは低い頻度（例えば、週に６回、週に５回、週に４回、週に３回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、または６カ月に１回）で投与可能である。組成物は、また、一定期間にわたる使用のための組成物を徐々に放出する移植片等の中の徐放性製剤で投与されることも可能であり、これにより組成物をより低い頻度で（例えば、１カ月に１回、２〜６カ月に１回、毎年１回、もしくは単回投与でも）投与可能になる。徐放装置（例えば、ペレット、ナノ粒子、微小粒子、ナノスフェア、ミクロスフェア等）は、注射によって、または眼もしくは結合する組織内（眼内、硝子体内、網膜下、眼周囲、結膜内、もしくはテノン嚢下）の種々の部位に外科的に埋め込まれることによって投与されることも可能である。
【０１３９】
医薬組成物は、単独で、または網膜付着もしくは損傷した網膜組織に対して有益な効果を有することが知られている他の分子との組み合わせで投与可能である。このような分子には、組織の修復および再生が可能な分子、ならびに／または炎症を抑制することが可能な分子が含まれる。有用な補助因子の例としては、以下が含まれる：坑ＶＥＧＦ剤（例えば、ＶＥＧＦに対する抗体）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アクソカイン（ＣＮＴＦの突然変異タンパク質）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様増殖因子ＩＩ、プロスタグランジンＥ２、３０ｋＤの生存因子、タウリン、およびビタミンＡ。他の有用な補助因子としては、症状緩和因子があり、防腐剤、抗生物質、坑ウイルス剤と坑真菌剤、および鎮痛剤と麻酔剤が含まれる。
【０１４０】
遺伝子治療
ＣＲ２−ＦＨ分子は、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の発現によって送達可能であり、これは、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い。例えば、細胞は、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで操作可能であり、次いで、操作された細胞は、前記融合タンパク質を使用して治療される個体に提供される。このような方法は、当該技術分野で周知の方法である。例えば、細胞は、本発明のＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を使用しての当該技術分野で公知の方法によって操作可能である。
【０１４１】
遺伝子治療を使用する本発明のＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の局所送達によって、標的領域（例えば、眼または眼組織）に治療薬をもたらすことが可能となる。
【０１４２】
遺伝子送達の方法は、当該技術分野で公知の方法である。こらの方法としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：１）ＤＮＡ直接導入（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８を参照）、２）リポソーム介在によるＤＮＡ導入（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ３：３９−４６；Ｃｒｙｓｔａｌ  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １：１５−１７；Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １７９：２８０−２８５を参照）、３）レトロウイルス介在によるＤＮＡ導入（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１７−１１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３を参照）、４）ＤＮＡウイルス介在によるＤＮＡ導入。このようなＤＮＡウイルスとしては、以下が含まれる：アデノウイルス（好ましくは、Ａｄ２またはＡｄ５に基づくベクター）、ヘルペスウルス（好ましくは、単純ヘルペスウイルスに基づくベクター）、およびパルボウイルス（好ましくは、「欠損」または非自律パルボウイルスに基づくベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡＡＶ−２に基づくベクター）。例えば、ＡＩｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−３８４；米国特許第４，７９７，３６８号（これを参考として本明細書に援用する）、および米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。
【０１４３】
上述したレトロウイルスプラスミドベクターに由来するレトロウイルスは、以下に由来することが可能であるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルス）。一実施形態では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
【０１４４】
アデノウイルスは、広宿主域を有するという利点があり、静止細胞または最終分化細胞（例えば、ニューロンまたは肝細胞）を感染させることが可能であり、本質的に非発癌性であると思われる。例えば、ＡＩｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），ｓｕｐｒａ，ｐ．３６７を参照されたい。アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれるように見えない。アデノウイルスは、染色体外に存在するために、挿入突然変異の危険性が大きく軽減される。Ａｌ
ｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），ｓｕｐｒａ，ｐ．３７３。
【０１４５】
アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスに基づくベクターと同様の利点を示す。しかし、ＡＡＶは、ヒト染色体１９上に部位特異的組込みを示す（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），ｓｕｐｒａ，ｐ．３７３）。
【０１４６】
遺伝子治療ベクターは、１つまたは複数のプロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、多数の細胞型での発現を促進するプロモーターを有する。一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、特異的細胞型（例えば、網膜の細胞または腎臓の細胞）での発現を促進するプロモーターを有する。利用可能な適切なプロモーターとしては、以下が含まれるがこれらに限定されない：レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＶＭ）プロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７（９）：９８０−９９０に記述される）、他のいかなるプロモーター（例えば、ヒストン、Ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびβアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない真核細胞プロモーター等の細胞プロモーター）。利用可能な他のウイルスプロモーターとしては、以下が含まれるがこれらに限定されない：アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者にとって明らかである。
【０１４７】
ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質をコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。利用可能な適切なプロモーターとしては、以下が含まれるがこれらに限定されない：アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）、または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、誘導型プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター）、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡ１プロモーター、ヒトグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）、レトロウイルスＬＴＲ（本明細書に上述する修飾レトロウイルスＬＴＲを含む）、βアクチンプロモーター、およびヒト成長ホルモンプロモーター。
【０１４８】
レトロウイルスプラスミドベクターは、プロデューサー細胞系を形成するためのパッケージング細胞系を形質導入するために使用可能である。形質移入可能なパッケージング細胞の例は、Ｍｉｌｌｅｒ  （１９９０）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４に記述されている。ベクターは、当該技術分野で公知の方法を介してパッケージング細胞を形質導入することが可能である。このような方法は、以下を含むがこれらに限定されない：電気穿孔法、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱法。１つの方法では、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され、または脂質に結合し、次いで宿主に投与可能である。プロデューサー細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクター粒子は、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで真核細胞を形質導入するために使用可能である。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核細胞としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞、および気管支上皮細胞。
【０１４９】
一部の実施形態では、眼内でＣＲ２−ＦＨの発現を方向づける遺伝子送達ベクターが使用される。眼への遺伝子送達のためのベクターは当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９４３，１５３号、および米国特許出願公開第２００２０１９４６３０号、第２００３０１２９１６４号、第２００６００６２７１６５号に開示されている。
【０１５０】
一部の実施形態では、補体活性化は、ＣＲ２−ＦＨ分子が補体活性化を抑制するように機能できる条件下で、ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物との体液のｅｘ  ｖｉｖｏでの接触によって抑制される。適切な体液は、個体に戻されることが可能なもの（例えば、血液、血漿、またはリンパ液）である。アフィニティー吸着アフェレーシス療法は、大まかに以下に記述されている：Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｌｏｏｄ  ５８（１）：３８−４４；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３３：２３４−２４２；Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＡＳＡＩＯ  Ｊ．  ４３（１）：５３−５９；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：１０５−１１２；米国特許第５，７３３，２５４号；Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｍｅｔａｂｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  ４２：８８８−８９４；およびＷａｌｌｕｋａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｉｎｔ’ｌＪ．  Ｃａｒｄ．  ５４：１９１０１９５。
【０１５１】
従って、本発明は、本明細書に記載する個体における１つまたは複数の疾患を治療する方法を含み、前記方法は、ＣＲ２−ＦＨ分子が補体活性化を抑制するように機能できる条件下で、ＣＲ２−ＦＨ分子を含む組成物を使用して個体の血液を体外で（すなわち、体の外側でまたはｅｘ  ｖｉｖｏで）治療することと、前記血液を前記個体に戻すこととを含む。
【０１５２】
単位投与量、製品、およびキット
また、ＣＲ２−ＦＨ分子組成物の単位剤形が提供され、各投与量は、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ（例えば、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２０ｍｇ、または約１５ｍｇのいずれかでＣＲ２−ＦＨ分子を含む）を含有する。一部の実施形態では、ＣＲ２−ＦＨ分子組成物の単位剤形は、約０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇ、０．１ｍｇ〜０．２ｍｇ、０．２ｍｇ〜０．２５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜０．３ｍｇ、０．３ｍｇ〜０．３５ｍｇ、０．３５ｍｇ〜０．４ｍｇ、０．４ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜１．０ｍｇ、１０ｍｇ〜２０ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜８０ｍｇ、８０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜１５０ｍｇ、１５０ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜２５０ｍｇ、２５０ｍｇ〜３００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、または４００ｍｇ〜５００ｍｇのいずれかでＣＲ２−ＦＨ分子を含む。一部の実施形態では、単位剤形は、約０．２５ｍｇのＣＲ２−ＦＨ分子を含む。用語「単位剤形」は、個体のための単位投与量として適した物理的に別々の単位をいう。各単位は，適切な医薬担体、希釈剤、または賦形剤と関連して、所望の治療効果をもたらすよう算出された活性物質の所定量を含有する。これらの単位剤形は、単回または複数回の単位投与量で適切なパッケージングに貯蔵可能であり、またさらに無菌化され、密封できる。
【０１５３】
また、本明細書に記載する組成物を適切なパッケージングで含む製品が提供される。本明細書に記載する組成物（例えば、眼用組成物）のための適切なパッケージングは、当該技術分野で公知であり、例えば以下が含まれる：バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、柔軟なパッケージング（例えば、密封されたＭｙｌａｒ製またはプラスティック袋）等。これらの製品は、さらに無菌化および／または密封可能である。
【０１５４】
本発明は、また、本明細書に記載する組成物（または単位剤形および／または製品）を含むキットを提供する。前記キットは、組成物を使用する（例えば、本明細書に記載する用途）方法についての説明書をさらに含むことがある。本明細書に記載するキットは、商業上およびユーザーの点から見て望ましい他の材料をさらに含むことができ、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載する任意の方法の実行に関する説明付き添付文書が含まれ得る。
【実施例】
【０１５５】
（実施例１）  ＣＲ２−ＦＨ分子およびシグナルベプチドの典型的な配列
図４〜６は、本明細書に記載するＣＲ２−ＦＨ分子の典型的なアミノ酸配列（配列番号５〜１０）を示す。「ｎｎｎ」は、オプションのリンカーを表す。
【０１５６】
図７は、本明細書に記載するシグナルペプチドの典型的なアミノ酸配列（配列番号１１と１３）および前記シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１２と１４）を示す。
【０１５７】
図９は、マウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２−ｆＨまたはＣＲ２ＮＬＦＨと名付けられた）のアミノ酸配列（配列番号１７）、およびマウスＣＲ２−ＦＨとさらにシグナルペプチドをコードするポリヌクオチド（配列番号１８）を示す。
【０１５８】
図１０は、ＣＲ２ＮＬＦＨＦＨのＤＮＡ配列（すなわち、１つのＣＲ２部分と２つのＦＨ部分とをリンカー配列なしで含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）（配列番号１９）を示す。
【０１５９】
図１１は、ＣＲ２ＬＦＨＦＨのＤＮＡ配列（すなわち、リンカー配列を介して２つのＦＨ部分に結合されるＣＲ２部分を含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質）（配列番号２０）を示す。
【０１６０】
図２０は、ヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ヒトＣＲ２−ｆＨまたはＣＲ２ｆＨと名付けられた）のアミノ酸配列（配列番号２１）、およびヒトＣＲ２−ｆＨとさらにシグナルペプチドをコードするポリヌクオチド（配列番号２２）を示す。
【０１６１】
図２１は、２つのＦＨ部分を含むヒトＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ヒトＣＲ２−ＦＨ２またはＣＲ２ｆＨ２またはヒトＣＲ２ｆＨ２と名付けられた）のアミノ酸配列（配列番号２３）、およびヒトＣＲ２−ＦＨ２とさらにシグナルペプチドをコードするポリヌクオチド（配列番号２４）を示す。
【０１６２】
（実施例２）  ＣＲ２−ＦＨによる補体活性化副経路のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抑制
ＣＲ２の最初の４つのＳＣＲドメインおよびＦＨの最初の５つのＳＣＲドメインを含むマウス融合タンパク質（リンカーを介して（ＣＲ２ＬＦＨ）またはリンカーなしで（ＣＲ２ＮＬＦＨもしくはＣＲ２−ｆＨ））を組換えＤＮＡクローニングおよび遺伝子発現方法で作製した。ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の１例の配列を図９に示す。配列番号１７は、ＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質のポリヌクレオチド配列である。配列番号１８は、シグナルペプチドのＮ末端でＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質ならびにシグナルペプチドをコードするために使用されるヌクレオチドである。
【０１６３】
ＣＲ２の最初の４つのＳＣＲドメインおよびタンデムに結合された２つのＦＨ部分（それぞれＦＨの最初の５つのＳＣＲドメインを含む）を含むマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２ＬＦＨＦＨ、ＣＲ２−ｆＨ２、またはＣＲ２−ｆＨＨと名付けられた）も作製した。ＣＲ２部分および最初のＦＨ部分をリンカー配列によって結合した。ＣＲ２ＬＦＨＦＨのＤＮＡ配列（シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む）を図１１（配列番号２０）に示す。
【０１６４】
補体活性化副経路の活性化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、Ｑｕｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８，  １６０（９）：４５５３−６０に基本的に記述されるように行った。実験では、Ｈ因子（ｆＨ）またはＣＲ２−Ｃｒｒｙを対照として使用した。具体的には、１０ｍｌの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中の５０ｍｇのザイモサンビーズを、６０分間沸騰させてから、ＰＢＳで２回洗浄することによって活性化させた。各反応において以下の混合物を加える：１）１０ｍＭ  ＥＧＴＡおよび５ＭＭ  ＭｇＣｌ２（最終濃度）、２）１×１０７ビーズ、３）１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（負の対照１）またはＨＩＣ血清（負の対照２）または濃度を上げたＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質の１つまたは制御タンパク質、４）１０μｌの血清、および５）総容量を１００μｌにするためのＰＢＳ。これらの混合物を３７℃で２０分間インキュベートしてから、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を付加することで反応を停止させた。ビーズを冷たいＰＢＳＢ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄してから、ヤギ坑Ｃ３抗体に結合したＦＴＩＣを使用して、氷上で１時間インキュベートした。次いで、この試料をＰＢＳＢで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで再懸濁させて、フローサイトメトリー下で分析した。
【０１６５】
図１２Ａは、マウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２−ｆＨ）および単独のＨ因子（ｆＨ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのザイモサン補体アッセイで採取したデータのグラフを示す。図に示すように、ＣＲ２−ｆＨは、補体活性化の抑制においてＦＨよりも有意により効果的である。図１２Ｂは、マススＦＨの最初の５つのＳＣＲドメイン（ＦＨ１５）およびマウスＣＲ２の最初の４つのドメイン（ＣＲ２）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのザイモサン補体アッセイで採取したデータのグラフを示す。マウスＦＨの最初の５つのＳＣＲドメインは、２５０ｎＭでＥＣ５０を有した。これは、血清中のＦＨの量にほとんど等しい。ＣＲ２の最初の４つのドメインを有す分子は、全く抑制効果がない。ＣＲ２−ＦＨで見られる効果は、各部分の独立した機能よりはむしろ前記分子の２つの部分の複合効果のためであることをこれらのデータは示している。
【０１６６】
図１３は、リンカーを有するマウスＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２ＬＦＨ）、リンカーがないＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（ＣＲ２ＮＬＦＨ）、リンカーを有するＣＲ２−ＦＨ−ＦＨ（ＣＲ２ＬＦＨＦＨ）、およびＣＲ２−Ｃｒｒｙを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのザイモサン補体アッセイで採取したデータのグラフを示す。図に示すように、補体活性化副経路の補体活性化の抑制においてＣＲ２―ＦＨは、ＣＲ２−Ｃｒｒｙより効果的であった。ＣＲ２ＬＦＨとＣＲ２ＮＬＦＨは、補体活性化副経路の補体活性化の抑制において同様に効果的であった。ＣＲ２ＬＦＨＦＨは、ＣＲ２ＬＦＨおよびＣＲ２ＮＬＦＨよりはるかに効果的である。
【０１６７】
（実施例３）  ＣＲ２−ＦＨによる腸管虚血および再灌流障害の治療
この実験は、マウスモデルにおける腸管虚血および再灌流障害の治療を示す。
【０１６８】
腸管虚血再灌流障害：８週齢で体重２０〜２５ｇの成熟雄性マウス３匹に、腹腔内注射によって１０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび６ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔をかけた。実験中、動物は自発呼吸をしており、ヒートマットを使用してその体温を維持させた。中央開腹術を施して、上腸間膜動脈に近づけるように腸を慎重に移動させた。超微細手術用クランプ（Ｆｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  ＵＳＡ）を使用して上腸間膜動脈を固定した。虚血を小腸の蒼白によって確認した。シャム処置マウスに、上腸間膜動脈をクランプ固定しない開腹手術を施した。３０分後、虚血動脈のクランプ固定を取り外して、腸間膜血管の血流再開を可能にした。６．０エチコン縫合糸使用して動物を縫合して、２時間、再灌流させておいた。０．１ｍｇもしくはは０．０５ｍｇのＣＲ２−ｆＨ、または対照（ＰＢＳ）を、血流再開から３０分後に静脈内投与した。合計２時間の血流再開から９０分後に動物を屠殺した。
【０１６９】
組織診断：組織染色のための組織試料を腸から採取した。前記試料を４℃で１０％ホルマリン中に一晩固定してからパラフィンで処理するために処置するか、あるいは免疫蛍光分析のために液体窒素で凍結させた。それぞれの動物からの腸切片をヘマトキシリンおよびエオシン染料で染色し、前述（４６）のように、粘膜損傷と絨毛高をスコアを付けた。手短に言えば、正常な絨毛をスコア０とし、先端に歪みを有する絨毛をスコア１とした。杯細胞が欠如し、Ｇｕｇｅｎｈｅｉｍｓ空隙を含む絨毛をスコア２とした。上皮細胞のパッチ状崩壊を有する絨毛をスコア３とした。露出しているがインタクトな固有層および上皮細胞脱落を有する絨毛をスコア４とした。固有層が滲出している絨毛をスコア５とし、最後に、出血を示す絨毛または裸出した絨毛をスコア６とした。すべての組織学的評価を盲検様式で行った。
【０１７０】
実験の結果を図１４Ａに示す。図に示すように、対照動物は、投与されたＣＲ２−ｆＨの量を上回る正常なレベルの循環内在性Ｈ因子（約０．５ｍｇ／ｍｌ）を有したが、対照動物と比較して０．１ｍｇおよび０．０５ｍｇの両用量のＣＲ２−ｆＨは、動物モデルにおいて保護効果を示した。
【０１７１】
（実施例３．１）  マウスＣＲ２−ＦＨによる腸管虚血および再灌流障害の治療
実験を、基本的に実施例３に開示するように行った。
【０１７２】
手短に言うと、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、もしくは０．２ｍｇのマウスＣＲ２−ｆＨまたはマウスＣＲ２−ｆＨ２（ＣＲ２−ｆＨＨ）を血流再開から３０分後に静脈内に投与し、９０分後に組織学分析のために動物を屠殺した。実験の結果を図１４Ｂに示す。図１４Ｂに示すように、マウスＣＲ２−ｆＨおよびマウスＣＲ２−ｆＨＨは、補体が関与する虚血再灌流障害から腸を保護した。
【０１７３】
（実施例３．２）  マウスＣＲ２−ＦＨによる腸管虚血および再灌流障害の治療
この実験は、補体活性化副経路および腸管虚血再灌流障害に対するマウスＣＲ２−ｆＨおよびＣＲ２−ｆＨ２の効果を示す。基本的に上述のように実験を行う。
【０１７４】
補体活性化副経路の抑制においてマウスＣＲ２−ｆＨは、ＣＲ２−Ｃｒｒｙより有意に効果的であり、マウスＣＲ２−ｆＨ２は、マウスＣＲ２−ｆＨよりも約２倍効果的であることをｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは示した。坑ＣＲ２抗体ブロック実験が示すように、マウスＣＲ２−ｆＨの補体抑制活性は、ＣＲ２媒介標的に依存した。さらに、精製マウスＨ因子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてわずかな補体抑制活性のみを有した。
【０１７５】
マウスＣＲ２−ｆＨおよびマウスＣＲ２−ｆＨ２は、腸管虚血および再灌流障害の後、局所的および遠隔的（肺）な補体活性化の部位を標的にし、両タンパク質は、低用量かつ用量依存的方法で腸管粘膜および肺実質を損傷から保護した。マウスＣＲ２−ｆＨ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウスＣＲ２−ｆＨより強力な補体活性化副経路抑制剤であったが、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてこれら２つのタンパク質の保護効果には相違がなかった。ＣＲ２−Ｃｒｒｙと比較して、局所的損傷から同等の保護をもたらすには、約２倍高い用量のマウスＣＲ２−ｆＨが必要であった。
【０１７６】
（実施例４）  マウスＣＲ２−ＦＨによる腎虚血再灌流障害の治療
本実施例は、腎虚血再灌流障害に対するＣＲ２−ＦＨの効果を示す。
【０１７７】
虚血性ＡＲＦを誘導するためのプロトコル：体重２０〜２５グラムのマウスに、３００μｌの２，２，２−トリブロモエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内に注射することで麻酔をかけた。麻酔をかけてから、マウスをヒートパッドに置き、術中にそれらの体温を維持させた。次いで、開腹手術を施して、腎茎を見つけ、ブラント切開によって分離した。腎茎を外科手術用クリップで（Ｍｉｌｔｅｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ）固定して、腎臓を目視検査することにより血流の閉塞を確認した。クリップを２４分間そのままにして置いてから、解放した。最低の血管内血栓を有する虚血性ＡＲＦの可逆モデルを得るため、および動物の死亡を回避するために虚血の時間を選択した。腎臓を約１分間観察して血液の再流を確認した。血流再開から１５分後、マウスに０．２５ｍｇのマウスＣＲ２−ｆＨ（ＣＲ２ＮＬＦＨ）を腹腔内投与した。筋膜および皮膚を４−０シルク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ）で縫合した。マウスを０．５ｍｌの生理食塩水でボリューム蘇生させ、体温を維持させるために２９℃のインキュベーターで保存した。
【０１７８】
血流再開から２４時間後、マウスに麻酔をかけて、心臓穿刺によって採血した。開腹手術を施し、腎臓を収集した。本研究プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０１７９】
血清尿素窒素測定：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して、血清尿素窒素をマウスごとに決定した。結果を図１５Ａに示す。図に示すように、マウスＣＲ２−ｆＨで処置した動物において血清尿素窒素は減少し、腎臓機能の保存を示した。
【０１８０】
腎臓形態：腎臓をマウスから摘出した後、矢状切片を４％のパラホルムアルデヒド．で固定した。切片をパラフィンに包埋した後、４μｍ切片に切り、過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆで染色した。腎病理医はこれらの切片を盲検様式で評価した。髄質外部の皮質および外部横紋を、上皮壊死、刷子縁の損失、尿細管膨張、および円柱形成について評価した。少なくとも１０フィールド（４００×）を各スライドで精査し、これらの所見を示す尿細管のパーセンテージを決定した。腎臓切片を、冒された尿細管のパーセンテージに基づいて以下のようにスコア化した：０（無し）、１（＜１０％）、２（１１〜２５％）、３（２６〜４５％）、４（４６〜７５％）、５（＞７５％）。実験の結果を図１５Ｂに示す。図に示すように、ＣＲ２−ｆＨは、対照動物と比較して動物モデルにおいて保護効果を示した。
【０１８１】
免疫蛍光法：免疫蛍光のために、腎臓の矢状切片をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）でスナップ凍結させた。４μｍ切片をクリオスタットで切り、−７０℃で貯蔵した。その後これらのスライドをアセトンで固定して、マウスＣ３に対するＦＩＴＣ結合抗体（Ｃａｐｐｅｌ）と共にインキュベートした。室温で１時間、この抗体とハイブリダイズさせた後、スライドをヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を使用して対比染色した。実験の結果を図１５Ｃおよび１５Ｄに示す。図に示すように、マウスＣＲ２−ｆＨで処置したマウス（１５Ｄ）に比べて、シャム処理したマウス（１５Ｃ）の腎臓により多くのＣ３が沈着した。
【０１８２】
（実施例５）  ＣＲ２−ＦＨによる加齢黄斑変性症の治療
光照射に連続的に曝された白ネズミを、加齢黄斑変性症（乾燥型ＡＭＤ）の動物モデルとして使用する。５〜８匹の動物に、一日おきにＣＲ２−ＦＨ融合タンパク質（４．３ｍｇ／ｍｌ原液から１μｌ）を麻酔下で眼内に注射した。１回目の注射は、連続的光曝露（−１日目、１日目、３日目、５日目、７日目）の開始前日に始めた。一方の眼は実験用としての役割を果たし、他方の眼はＰＢＳを注射する対照眼としての役割を果たす。８日目にＥＲＧを使用して動物を検査し、次いで組織診断およびＰＣＲ分析のために安楽死させる。ＣＲ２−ＦＨを注射した眼において光受容体の列数をＰＢＳ対照眼のそれと比較する。
【０１８３】
ＣＲ２−ＦＨの効果を以下の３つのパラメータを使用して測定する：機能的活性（ＥＲＧおよびＤＣポテンシャル、すなわち光受容体およびＲＰＥの反応）、炎症の組織診断、および炎症の測定（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現および免疫組織化学によるタンパク質発現）。
【０１８４】
第２の動物モデル（湿潤型ＡＭＤ）では、補体活性化因子を除去することによって、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が減少するかどうかを調べる。Ｋｒｙｐｔｏｎレーザー（２００ｍＷ、５０μｍ、０．０５秒）を使用して５〜８匹のマウスにＣＮＶを生成させ、フルオレセインを注射した後に脈絡膜フラットマウントを作成する。
【０１８５】
ＣＲ２−ＦＨの効果を以下の４つのパラメータを使用して測定する：機能的活性（ＥＲＧおよびＤＣポテンシャル、すなわち光受容体およびＲＰＥの反応）、組織診断、血管の完全性（フルオレスセイン注射の後の脈絡膜フラットマウント）、および炎症の測定（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現および免疫組織化学によるタンパク質発現）。
【０１８６】
（実施例６）  マウスＣＲ２−ＦＨによるＣＮＶのボリュームの減少
ＣＮＶ生成のために、３月齢の動物にキシラジンおよびケタミン（それぞれ、２０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔し、フェニレフリンＨＣｌ（２．５％）および硫酸アトロピン（１％）を１滴滴下して瞳孔を散大させた。アルゴンレーザー光凝固術（５３２ｎｍ、スポットサイズ５０μｍ、照射時間０．０５秒、２５０ｍＷ）を使用して視神経に囲まれた各眼に４ヶ所のレーザースポットを生成した。コンタクトレンズとして小形のカバースリップを使用した。レーザースポットで形成された泡は、ブルッフ膜の破裂を示した。Ｎｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ２００６，  １０３（７）：２３２８−３３。
【０１８７】
ＣＮＶ病変の評価のために、ＣＮＶの大きさを、イソレクチンＢ（内皮細胞の表面で末端のβ−Ｄ−ガラクトース残基に結合し、マウス血管を選択的に標識する）を使用して染色したＲＰＥ／脈絡膜のフラットマウント標本で決定した。共焦点顕微鏡を使用して２μｍ切片で採取した蛍光測定値をＣＮＶの大きさの決定で使用した。手短に言えば、すべての実験で同じレーザー強度設定を使用して、ＣＮＶ病変を介してＺスタックの画像を取得した。各スライスに対して全体の蛍光を決定し、深度に対してプロットした。
【０１８８】
網膜電図検査のために、動物にキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ／体重）およびケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ／体重）を使用して麻酔した。フェニレフリンＨＣｌ（２．５％）およびトロピカミド（１％）を一滴滴下して瞳孔を散大させた。３７℃に維持させたＤＣ電源ヒートパッドを介して体温を安定させた。使用したＥＲＧ設定は、Ｒｏｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌによって以前記述された（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９９，  １９（２０）：８９１９−３０）ものであり、ＬｙｕｂａｒｓｋｙおよびＰｕｇｈ  Ｌｙｕｂａｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９６，  １６（２）：５６３−５７１）に従って構築した。刺激光強度は、減光フィルターを使用して制御した。刺激パラダイム：動物を一昼夜暗順応させて、ＥＲＧを記録する。次第に光強度を増加させてのシングルフラッシュ刺激に反応する桿体を分析した。シングルフラッシュ反応は、１５秒から２分（それぞれ、最低強度から最高強度）の刺激間隔（ＩＳＩ）で平均少なくとも３フラッシュであった。種々のＩＳＩにより、所定の強度でのＥＲＧ振幅が最初のフラッシュおよび最後のフラッシュの間で同じであることを確定した。データ分析：すべてのＥＲＧ記録に対して、ａ波振幅をベースラインからトラフまで測定した。ｂ波振幅を、ａ波トラフまたはベースラインからｂ波のピークまで測定した。潜時を、刺激の開始からａ波トラフまたはｂ波ピークまで測定した。
【０１８９】
一実施形態では、マウスをレーザー火傷から３０分後、レーザー火傷から４８時間後、およびレーザー火傷から６時間後にマウスＣＲ２−ｆＨ（２５０μｇ）を使用して静脈内処置した。レーザー火傷から６日後、網膜機能を評価し、次いでマウスを組織診断のために屠殺した。
【０１９０】
図１６は、ＣＲ２−ｆＨを使用してまたは使用せずに処置したマウスにおけるａ波およびｂ波網膜反応を示す。図１６に示すように、網膜反応のａ波およびｂ波は、ＰＢＳ治療と比較してＣＲ２−ｆＨ治療によって保護されていた。図１７Ａおよび１７Ｂは、レーザー火傷から６日後の病変のイソレクチンｂ染色を示す。図１７Ｃは、イソレクチンｂ染色に基づく病変の大きさの定量化を示す。図１７Ａ〜Ｃに示すように、ＣＲ２−ｆＨを使用して処置されたマウスは、ＰＢＳを使用して処置された動物と比較して、病変の大きさにおいて有意な減少を示す。
【０１９１】
別の実験では、１μｇのマウスＣＲ２−ｆＨを、レーザー火傷の直後、レーザー火傷から４８時間後、およびレーザー火傷から９６時間後に眼内に投与した。組織診断のために６日目に眼を収集した。イソレクチンｂ染色によって病変を可視化した。結果を図１８に示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、レーザー火傷から６日後の病変のイソレクチンｂ染色を示す。図１８Ｃは、イソレクチンＢ染色に基づく病変の大きさの定量化を示す。図１８Ａ〜Ｃに示すように、眼に直接送達されたＣＲ２−ｆＨは、病変の広がりを減少させる。
【０１９２】
（実施例７）  異所性心臓移植のマウスモデルにおける抗体仲介性拒絶反応の開始を、マウスＣＲ２−ＦＨによって遅延させる
この実験では、心臓をＣ３ＨドナーマウスからＢａｌｂ／ｃレシピエントマウスに異所性移植した。この系統の組み合わせは、急性血管拒絶反応を促進するＴＨ２免疫表現型を促進させ、坑移植片抗体の産生および補体活性化断片の移植片沈着によって特徴づけられる。
【０１９３】
レシピエントマウスを、以下のように処置した。１）ＰＢＳ（静脈内注射で）、２）０．２５ｍｇのマウスＣＲ２−ｆＨを単回投与（血流再開から３０分後、静脈内注射で）、３）０．２５ｍｇのマウスＣＲ２−ｆＨを複数回投与（血流再開から３０分後、静脈内注射で）。その後、２日おきに処置した。
【０１９４】
分析のために、血流再開から２４時間後心臓を収集した。組織診断によって評価された（Ｃ３の非存在下で、好中球浸潤の減少、および炎症サイトカインの減少）ようにＣＲ２−ｆＨで処置したマウスは、虚血および再灌流障害から保護された。
【０１９５】
急性血管拒絶反応に対するマウスＣＲ２−ｆＨの効果を、図２１に示す。図に示すように、１１．１±１．６日生存（単回投与群）および１０．７±１．３日生存（複数回投与群）と比較して、対照の心臓移植レシピエントは７．１±１日生存した。対照と比較すると、マウスＣＲ２−ｆＨを使用して処置したマウスの生存は有意な改善が見られる（ｐ＝０．０２）。
【０１９６】
収集時に、病理学的拒絶反応プロファイルにおいて、またはいずれかの群の間に坑ドナー抗体のレベルにおいて明らかな相違は見られなかった。興味深いことに、単回投与群と比較したとき、マウスＣＲ２−ｆＨの複数投与量の投与と付随する生存において有意な改善はないように見える（ｐ＜０．０５）。
【０１９７】
（実施例８）  ヒトＣＲ２−ＦＨによる補体活性化副経路の抑制
シグナルペプチドを含まないヒトＣＲ２−ＦＨのタンパク質配列（配列番号２１、ＣＲ２ｆＨとしても命名される）およびヒトＣＲ２−ＦＨ２のタンパク質配列（配列番号２３、ＣＲ２ｆＨ２としても命名される）は、それぞれ図２０および図２１に示す。シグナルペプチドのヌクレオチド配列を含むヒトＣＲ２−ＦＨ（配列番号２２）およびヒトＣＲ２−ＦＨ２（配列番号２４）の核酸配列は、それぞれ図２０および図２１に示す。
【０１９８】
ヒトＣＲ２−ＦＨおよびヒトＣＲ２−ＦＨ２を、ＨＢ５−セファロースを使用して、形質移入された２９３細胞上清から親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＨＢ５−セファロースは、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合した坑ヒトＣＲ２モノクローナー抗体ＨＢ５（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＢ−１３５）を含む。粗製ＣＲ２−ＦＨまたはＣＲ２−ＦＨ２の上清を基質の上を通してから、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出した画分を、直ちに１Ｍトリス−Ｃｌ（ｐＨ９．０）を付加して中和し、続いてセントリコンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳと交換した。３００ｎｇの非還元化、精製ＣＲ２−ＦＨおよびＣＲ２−ＦＨ２を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ染色によって可視化した。脱グリコシル化後に単一のバンドに分離した６４．０ｋＤａおよび６５．３ｋＤＡについてマススペクトロメトリー（Ａｌｐｈａｌｙｓｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）によって決定したように、ＣＲ２−ＦＨは２つの明白なタンパク質として存在し、一方ＣＲ２−ＦＨ２は、９９．２ｋＤａの単一種であった。これらの分子の固有の二次構造は、非還元条件下でそれらの実際の分子量よりも小さく移動させる。
【０１９９】
ザイモサン粒子上に沈着するＣ３ｂに特異的な補体活性化副経路に対するヒトＣＲ２−ＦＨおよびヒトＣＲ２−ＦＨ２の効果を、図２２Ａに示す。手短に言うと、５ｍＭのＭｇ２＋、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１０％ヒト血清を含むＰＢＳ中でザイモサン粒子をインキュベートして、ＦＩＴＣ結合ヤギ坑ヒトＣ３抗体を使用してＣＲ２−ＦＨおよびＣＲ２−ＦＨ２の濃度を室温で３０分間徐々に上げた。ザイモサンをペレット状にして、洗浄し、続いてＦＡＣＳ分析を行った。図２４Ａに示すように、ＣＲ２−ＦＨおよびＣＲ２−ＦＨ２は、補体活性化副経路の活性化を抑制した。マウス血清でのインキュベーション、続いてＦＩＴＣ結合ヤギ坑マウスＣ３抗体による検出によって同様の結果が得られた。有意に、アッセイ系には２００〜４００ｎＭのＦＨが存在した。ＣＲ２−ＦＨは、８〜２２ｎＭのＥＣ５０を有した。これは、アッセイに存在するＦＨの量よりも２０倍低いものであり、内在性ＦＨ上の標的ＦＨの明らかな利点を示した。
【０２００】
補体活性化副経路が関与する赤血球溶解に対するヒトＣＲ２−ＦＨおよびヒトＣＲ２−ＦＨ２の効果を、図２２Ｂに示す。手短に言うと、１×ＧＶＢ＋＋（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）および１７％ヒト血清中で種々の濃度のＣＲ２−ＦＨまたはＣＲ２−ＦＨ２と共に、ウサギ赤血球（１×１０８）を３７℃で３０分間インキュベートした。低温のＰＢＳの十分の一の容量を付加することによって反応を停止させ、続いて遠心分離によって非溶解赤血球をペレット化した。溶血は、ＯＤ４１５ｎｍ測定することによって定量化した。図２４Ｂに示すように、ＣＲ２−ＦＨおよびＣＲ２−ＦＨ２は、補体活性化副経路．の活性化を有意に抑制した。有意に、アッセイには３４０〜６８０ｎＭのＦＨが存在した。ＣＲ２−ＦＨは、２０〜３０ｎＭでＥＣ５０を有した。これは、アッセイに存在するＦＨの量よりも１５〜２０倍低いものであり、内在性ＦＨ上の標的ＦＨの明らかな利点を示した。
【０２０１】
（実施例９）  マウスＣＲ２−ＦＨによる補体活性化副経路の抑制
本実施例は、古典経路を欠損したマウスの血清を使用するマウスＣＲ２−ＦＨによって補体活性化副経路の抑制を示す。
【０２０２】
プレート上でコラーゲン−坑コラーゲン抗体の免疫複合体によるＥＬＩＳＡアッセイを使用した。野生型またはＣ４−／Ｃ４−マウス由来の結成の存在下で坑Ｃ３ｂ抗体を使用することによりＣ３沈着／活性化を測定した。種々の量の全長マウスＦＨ（２μｇ／１０μｌ）、マウスＣＲ２の最初の４つのＳＣＲドメイン（２μｇ／１０μｌ）、およびマウスＣＲ２−ＦＨ（２μｇ／１０μｌ）を前記血清に加えた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の結果を図２３に示す。図に示すように、マウスＣＲ２−ＦＨは、野生型マウス由来の血清を使用するＣ３ｂ沈着に対してほとんど影響を与えなかった。それに反して、マウスＣＲ２−ＦＨは、古典経路が欠損したマウス由来の血清において、ほぼ完全にＣ３ｂの沈着を阻止した。一方、マウスＦＨまたはマウスＣＲ２は、両アッセイ系においてほとんど影響を与えなかった。この実験は、特に古典補体経路が関与しないとき、補体活性化副経路を抑制するためにＣＲ２−ＦＨを使用する明確な利点を示す。
【０２０３】
ＣＲ２−ＦＨによって観察されるＣ３ｂ沈着の抑制は、補体活性化副経路の抑制のためであることをさらに示すために、古典経路の非存在下（Ｃ４−／Ｃ４−マウス）でＣ３ｂ沈着に対するＣＲ２−ＦＨの効果を調べた。カルシウムはレクチン補体経路を抑制する。図２４は、Ｃ４−／Ｃ４−ノックアウトマウス由来の血清を使用する、十分なカルシムを含む緩衝液中のマウスＣＲ２−ＦＨの滴定曲線を示す。図に示すように、ＣＲ２−ＦＨは、０．５μｇ／μｌの濃度でＣ３ｂ沈着を有意に抑制する。
【０２０４】
前述の発明は、明瞭に理解することを目的とした例証および実施例として多少詳細に記述したのだが、いくつかの些細な変更および修飾が行われることは当業者にとって明白である。従って、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月18日(2009.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009540831000001.app
【国際調査報告】
2009540831.tif 000029
2009540831.tif 000030
2009540831.tif 000031
2009540831.tif 000032
2009540831.tif 000033