(57)【要約】【課題】本発明は、嚢胞性繊維症及び細胞内のタンパク質アドレッシング欠損に関連した疾患を治療する薬物を製造するためのグアナベンズ及びその誘導体の新規な使用を提供する。【解決手段】嚢胞性繊維症及び細胞中のタンパク質アドレッシング欠損症を治療する薬物を製造するためのグアナベンズ及び式（Ｉ）に表されるその誘導体又はその誘導体の薬理学的に許容しうる塩の使用。2009529488.tif 000010式（Ｉ）において、Ｒ＝Ｈ又はＣｌであり、フェニル基には少なくとも２つの置換基を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性繊維症及び細胞中のタンパク質アドレッシング欠損症を治療する薬物を製造するためのグアナベンズ及び式（Ｉ）に表されるその誘導体又はその誘導体の薬理学的に許容しうる塩の使用。
2009529488.tif 000006
式（Ｉ）において、Ｒ＝Ｈ又はＣｌであり、フェニル基には少なくとも２つの置換基を含む。
【請求項２】
式（ＩＩ）に表されるグアナベンズの請求項１に記載の使用。
2009529488.tif 000007
【請求項３】
グアナベンズ塩、特に式（ＩＩＩ）に表される酢酸塩の請求項１に記載の使用。
2009529488.tif 000008
【請求項４】
式（ＩＶ）に表される分子又は薬理学的に許容しうる塩の請求項１に記載の使用。
2009529488.tif 000009
【請求項５】
嚢胞性繊維症の治療のための薬物を製造するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ゼラチンカプセル、錠剤、糖衣状又はカプセル剤の形態で投与するために調製された薬物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
液体の形態で注射により投与するために調製された薬物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
エアロゾルの形態で投与するために調製された薬物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体タンパク質の形質膜へのアドレッシングを回復することができる薬物を製造するためのグアナベンズ及びグアナベンズ誘導体の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの病理学的状態においては、アドレッシング欠損でタンパク質の局在という不都合な変化の状態にあり、したがって、膜組成及び細胞機能の不都合な変化の状態にある。これらの疾患には、嚢胞性繊維症、幼児期における高インシュリン性低血糖症、神経変性病理学的状態であるパーキンソン病、遺伝性肺気腫、先天性ＱＴ延長症候群等が含まれる。
【０００３】
したがって、関係するタンパク質の再アドレッシングは、こうした病理学的状態を治療する手段となる。
【０００４】
真核細胞の機能構造は、独自のタンパク質及び脂質の組成を有する膜コンパートメントあるいはオルガネラ（核、小胞体、ゴルジ小体、エンドソーム）の精緻なシステムに基づいている。細胞中のタンパク質のアドレッシングは、タンパク質の合成において、正しい折り畳み、プロセッシング及び機能性タンパク質の局在性をもたらすことを可能とする１セットの分子機構を構成する。
【０００５】
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、ヨーロッパ及び北米の人々の間で、最も頻度が高い常染色体性劣性遺伝病である。ＣＦ遺伝子（７ｑ３１  ｌｏｃｕｓ）は、ＣＦＴＲ（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｎｄｉｃｔａｎｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）と命名された膜貫通タンパク質をコードする。このタンパク質は、健常者の呼吸器系及び消化器系細胞の頂端側形質膜に位置する塩素イオンチャネルである。
【０００６】
ＣＦＴＲタンパク質には、１０００以上の変異があるが、最も頻度が高い変異（患者の７０％）は、５０８位（ｄｅｌＦ５０８）のＮＢＦ１ドメインにあるフェニルアラニンの欠失である。
【０００７】
嚢胞性繊維症の患者では、小胞体（ＥＲ）内に保持されている上記タンパク質の欠陥があるアドレッシングのため、このタンパク質は形質膜に存在しておらず、ユビキチン／プロテアソームシステムによって分解される。この患者においては、ｄｅｌＦ５０８で変異しているＣＦＴＲタンパク質は、もはや機能性を有していない。生理的には、ＣＦＴＲは、水及び電解質の経上皮輸送を司っており、一般に、健常者における気道の水和、良好な消化器系分泌性機能、及び良好な外分泌腺機能を可能にする。上記疾患及びそのようなアドレッシングの問題に関係した病理学的状態一般を治療する１つの鍵は、ＣＦＴＲｄｅｌＦ５０８タンパク質を細胞の頂端側膜に再びアドレッシングすることにある。頂端側膜に位置すれば、生理的アゴニストによって輸送活性が刺激されうる。
【０００８】
驚くことに、本発明者は、高血圧の治療に長い間臨床的に使用されているグアナベンズが、野生型ＣＦＴＲと変異形態を活性化することができ、また、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質の膜再配置を引き起こし、それにより、その経膜輸送能が回復することを示した。
【０００９】
この特性は、グアナベンズ誘導体でも示した。一般に、この誘導体は細胞内のタンパク質アドレッシング欠損を回復することができる。
【００１０】
さらに、それらは高い安全性という利点を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それゆえ、本発明の課題は、嚢胞性繊維症及び細胞内のタンパク質アドレッシング欠損に関連した疾患、特に上述した疾患を治療する薬物を製造するための上記誘導体の新規な使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る誘導体は、式（Ｉ）で表される誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩である。
2009529488.tif 000002
式（Ｉ）において、Ｒ＝Ｈ又はＣｌであり、フェニル基には少なくとも２つの置換基を含む。
【００１３】
この誘導体は、細胞の形質膜へのＣＦＴＲタンパク質のアドレッシングを回復することができ、したがって、そのようなアドレッシング欠損の問題に関係した病理学的状態を治療する上で多大な利益となる化合物を構成する。関係する疾患には、嚢胞性繊維症に加えて、幼児期における高インシュリン性低血糖症、神経変性病理学的状態であるパーキンソン病、遺伝性肺気腫、先天性ＱＴ延長症候群等が挙げられる。
【００１４】
実施例で示したように、上記誘導体は、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質が小胞体に保持されている嚢胞性繊維症において、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質を再配置させる上で特に有効であり、そして、それにより、経膜輸送能が回復する。
【００１５】
本発明は、特にグアナベンズ及びその塩の使用に関する。  
【００１６】
本明細書及び請求項で使用される、用語“グアナベンズ”は、式（II）で表される化合物又はその塩の１つであり、特に式（III）の酢酸塩である。
2009529488.tif 000003
【００１７】
本発明の他の態様は、使用される化合物は、式（ＩＶ）又は薬理学的に許容しうる塩である。
2009529488.tif 000004
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
薬物を製造する際、治療における有効量を用いる活性成分は、選択した投与形態に向いている、薬学的に許容しうる媒体と混合する。この媒体は固体又は液体でありうる。
【００１９】
したがって、経口投与においては、薬物は、ゼラチンカプセル、錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、ドロップ、シロップ等の形態で調製する。このような薬物は、１単位あたり、１〜１００ｍｇの活性成分を含みうる。
【００２０】
注射（静脈、皮下、筋肉）によって投与する場合、薬物は滅菌された又は滅菌しうる溶液の形態で調製する。
【００２１】
上記薬物は、乳化剤又は懸濁剤の形態にすることもできる。
【００２２】
本発明の薬物は、特にはエアロゾルの形態で投与する。
【００２３】
投薬単位あたりの用量は、活性成分が１〜５０ｍｇの範囲である。１日の用量は、治療する患者の血中において、グアナベンズが最大で１００μＭとする最終濃度が得られるように選択する。
【００２４】
本発明の他の特徴及び利点は、本発明を実証するために下記に提示した結果に記載している。  
【００２５】
材料及び方法
Ｍ１．細胞培養
ＣＨＯ−ＷＴ細胞：ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞は、野生型ＣＦＴＲ（ＣＦＴＲ−ＷＴ）遺伝子を形質移入した繊維芽細胞である。したがって、この細胞は、ＣＦＴＲタンパク質を過剰に発現する。
培養培地：ＭＥＭアルファ培地（ＧＩＢＣＯ）＋７％仔ウシ血清＋０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１００μＭメトトレキサート（アメトプテリン、Ｓｉｇｍａ）
ＣＦ１５細胞：ＣＦ１５細胞は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ遺伝子を発現する鼻由来のヒト上皮細胞である。
培養培地：ＤＭＥＭ培地＋ＨＡＭ  Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋０．６％ペニシリン／ストレプトマイシン＋成長因子（インシュリン５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン５μｇ／ｍｌ、エピネフリン５．５μＭ、アデニン０．１８ｍＭ、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ、Ｔ３  ２ｎＭ、ヒドロコルチゾン１．１μＭ）
Ｃａｌｕ−３細胞：Ｃａｌｕ−３細胞は、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を発現する呼吸器系由来のヒト上皮細胞である。
培養培地：グルタマックス含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋７％仔ウシ血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン
【００２６】
Ｍ２．免疫標識
免疫標識によれば、抗ＣＦＴＲプライマリー抗体（Ａｂ）、次いでフルオロフォアＣｙ３で標識した抗プライマリー抗体セカンダリー抗体を用いてＣＦＴＲタンパク質の細胞内位置をビジュアル化が可能になる。
【００２７】
前記細胞は、前もって、適当な培養培地中、ガラスカバースリップ上に播種する。３回、それぞれ５分間ＴＢＳ（Ｎａｃｌ：１５７ｍＭ、Ｔｒｉｓ塩基：２０μＭ、ｐＨ７．４）で洗浄する。次いで、該細胞にＴＢＳ−パラホルムアルデヒド（３％）を添加して２０分間、固定させる。ＴＢＳ（５分間）で３回洗浄した後、該細胞をＴＢＳ−トリトン０．１％（１０分間）とインキュベートし、これによって細胞膜に穴の形成が可能となる。次いで、該細胞をＴＢＳ−ＢＳＡ０．５％−サポニン０．０５％と１時間接触させる前に、再びＴＢＳで３回洗浄する。その後、該細胞を抗Ｃ末端ＣＦＴＲプライマリー抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートする。次いで、セカンダリー抗体ＧＡＭ−ｃｙ３（１／４００）と１時間インキュベートする前に、ＴＢＳ−ＢＳＡ−サポニンで３回、それぞれ５分間洗浄する。ＴＢＳで５分間、２回洗浄した後、Ｔｏｐｒｏ３（１／１０００）と５分間インキュベートして核を標識化する。最後に、ＴＢＳで５分間、最終の洗浄を３回行った後、ガラスカバースリップをスライド上に載置する。適当な波長のレーザー励起を用いて、共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で該スライドを調べる。ｃｙ３とＴｏｐｒｏ３の標識を区別するために、Ｔｏｐｒｏ３蛍光色を青（核の色）に変更した。
【００２８】
Ｍ３．放射性トレーサーの流出
細胞内での塩素イオン輸送の測定は、放射性ヨウ素流出技術（Ｂｅｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｄｏｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を利用して行った。トレーサー（125Ｉ）を細胞内培地に導入する。次いで、種々の薬理学的物質の添加後、細胞に残る放射性トレーサーの量をカウントする。ヨウ素を塩素イオン輸送トレーサーとして使用する。さらに125Ｉは35Ｃｌのような他のマーカーと比べて短い半減期を有するという利点がある（それぞれの半減期：３０日、３０００００年）。
【００２９】
２４穴プレートにて適当な培地中で細胞を培養する。無秩序に放射能を放出する死細胞を除去するため、流出培地（ＮａＣｌ：１３６．６ｍＭ、ＫＣｌ：５．４ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4：０．３ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4：０．３ｍＭ、ＮａＨＣＯ3：４．２ｍＭ、ＣａＣｌ2：１．３ｍＭ、ＭｇＣｌ2：０．５ｍＭ、ＭｇＳＯ4：０．４ｍＭ、ＨＥＰＥＳ：１０ｍＭ、Ｄ−グルコース：５．６ｍＭ）で２回洗浄する。次いで、細胞を５００μｌのロード（125Ｉの１μＣｉ／ｍｌ）とインキュベートする。ＣＨＯ−ＷＴ細胞３０分間又はＣＦ１５及びＣａｌｕ−３細胞に対しては１時間である。ヨウ素は細胞膜の両側で平衡となる。ロボット（ＭｕｌｔｉＰＲＯＢＥ、Ｐａｃｋａｒｄ）は以下の工程を行う：細胞外放射能を除去するため、流出培地でロード培地を洗浄する。毎分、上澄みを溶血チューブに集め、培地を同量（５００μｌ）入れ替える。最初の３分間に集められたサンプルには薬物は添加していない。該サンプルは、ヨウ素イオンの受動流出を特徴とする、安定したベースラインを得ることを可能にする。実験の終わりにおいて、５００μｌのＮａＯＨ（０．１Ｎ）／０．１％ＳＤＳ（３０分間）を添加して細胞を溶血させ、それにより細胞内に残留している放射能を決定する。溶血チューブに存在する放射能をガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  II、Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、１分当りのカウント（ｃｐｍ）を計測する。ｃｐｍの結果は、放射活性ヨウ素（Ｒ）の流出速度の形で表される。
Ｒ（ｍｉｎ-1）＝［Ｉｎ（125Ｉｔ1）−Ｉｎ（125Ｉｔ2）］／（ｔ1−ｔ2）
ここで、125Ｉｔ1；時間ｔ1におけるｃｐｍ；125Ｉｔ2：時間ｔ2におけるｃｐｍである。
このヨウ素の流れは、曲線の形で表現する。試験分子の投与によるヨウ素流出を定量化するために、以下の相対フローを計算する。これにより、ベースフローなしですますことができる。
相対速度＝Ｒｐｉｃ−Ｒｂａｓａｌ
最後に、種々の薬物の効果が互いに比較できるようにするため、得られた結果を標準化する。結果は、平均＋／−ＳＥＭの形で示される。Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓの検定を、薬物の効果を対照と比較するために用いる（Ｐ＜０．０１に該当する値は、統計的に有意と考えられる）。
【００３０】
Ｍ４．細胞毒性試験
ＭＴＴ毒性試験は、ミトコンドリアにある脱水素酵素によって、ＭＴＴ（黄色のテトラゾリウムの塩）をホルマザン（紫色）に変換させる比色法である。吸光度は、変換する発色物質の濃度に比例するが、スペクトル分光法によって測定することができる。細胞を９６穴のプレート上で試験すべき薬物の存在下で２時間インキュベートする。３つの対照を準備する。すなわち、１００％の生きている細胞：薬物なしの細胞；０％の生きている細胞：オープンエア内に置かれた細胞；ブランク：薬物なしの培地である。
細胞は、培地の色が吸光度測定の妨げにならないように、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地と洗浄する。次いで、細胞を４時間、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を補充した１００μｌのＲＰＭＩ溶液をインキュベートする。次いで、培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを添加することにより、変換した発色物質（ホルマザン）を可溶化する。スペクトル分光法によって、５７０ｎｍ（紫色）；６３０ｎｍ（バックグラウンドノイズ）で吸光度を測定する。以下の計算を行う。
ＯＤｒｅａｌ＝ＯＤ５７０ｎｍ−ＯＤ６３０ｎｍ
次いで、結果を対照（１００％及び０％の生きた細胞）と対比して標準化し、平均＋／−ＳＥＭの形で表す。
【００３１】
結果
Ｒ１．ＣＦ１５細胞のｄｅｌＦ５０８のアドレッシングへのグアナベンズの効果
ｄｅｌＦ５０８欠損に対してホモ接合であるヒト呼吸器系上皮ＣＦ１５細胞に対して、薬理学、細胞画像、生化学試験及び電気的病理学的アプローチを組み合わせることによって、ｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質のアドレッシングについての研究を行う。
各実験において、フォルスコリン（ｆｓｋ）１μＭの添加により、ＣＦＴＲが膜に付いている場合には、フォルスコリンの活性化が可能になる。このように、ｄｅｌＦ５０８のアドレッシングが回復したならば、ヨウ素流出を観察しうる。
ヒストグラムの形で表した結果は、参照処理（ＭＰＢ−９１  ２５０μＭで細胞を２時間処理）と比較して標準化した。結果から、１００％のＣＦＴＲ活性が存在すると考えられる。
【００３２】
グアナベンズで処理した後のＣＦ１５細胞のｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲの活性化についての結果を図１（抗プリオン化合物、すなわち、６ＡＰ（６−アミノフェナントリジン）も与えた結果）に示す。１００μｍの試験化合物又はこの化合物が不在下で２時間のインキュベーションの後、ヨウ素流出実験を行う。２７℃で２４時間処理したＣＦ１５細胞を陽性対照として使用し、処理していないＣＦ１５細胞を陰性対照として使用した（３７℃）。
【００３３】
グアナベンズで処理した２時間後の用量−応答の結果を図２Ａに示す。図２Ｂは、１００μＭのグアナベンズと２時間インキュベートしたＣＦ１５細胞のチャンネルのＣＦＴＲ薬理学的プロファイルである。
【００３４】
実施した研究は、ＣＦ１５細胞（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）とグアナベンズの処理によって、変異タンパク質Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲの再アドレッシングが可能になることを示している。
【００３５】
ヨウ素流出の実験は、ＥＣ５０の４０μＭで２時間処理した後、グアナベンズによってタンパク質Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲの再アドレッシングが可能になることを示している。さらに、この実験は、グアナベンズとＭＧ１３２、プロテアソーム阻害剤との間の競合、及びグアナベンズとスワインソニン、マンノシダーゼ阻害剤との間の競合を示している。これらの結果から、グアナベンズは、分解経路の阻害によりタンパク質Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲの再アドレッシングを可能にすること、及び／又は小胞体（ＥＲ）のシャペロンとの相互作用を阻害するタンパク質のグリコシル化状態を調節することが可能であることは明らかである。
【００３６】
以下の表は、グアナベンズと小胞体のシャペロン機構間のヨウ素流出技術によって行った競合実験を要約したものである。
【表１】
2009529488.tif 000005
【００３７】
小胞のＥＲＧＩＣ輸送の阻害剤であるブレフィルジン−Ａ（ＢＦＡ）によるグアナベンズの効果の阻害が観察されている。このことは、グアナベンズがＦ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲの再アドレッシングを誘導することを示している。
【００３８】
プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２の存在下では、グアナベンズの効果に変化は観察されない。このことは、グアナベンズとＭＧ１３２が競合することを示している。スワインソニンの存在下では、グアナベンズの効果の低い増強が観察されている。このことは、ＣＦＴＲのグリコシル化に対するグアナベンズの増強作用を示している。
【００３９】
調合例：
吸入用溶液が入っているバイアルネブライザーを、塩化ナトリウム、無水塩化カルシウム及び注入用の水から調製する。
グアナベンズ、又はグアナベンズ誘導体は、活性成分として添加する。該溶液は２．５ｍｌのバイアルに調合される。このようにして、５、１０又は２０ｍｇのグアナベンズ、又はグアナベンズ誘導体を含有するバイアルを調製する。
【００４０】
参照文献
ＢＥＣＱ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４，  ２７４１５−２７４２５，
ＤＯＲＭＥＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１４，  ４０７３−４０８１
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】１Ａ及び１Ｂ：グアナベンズで治療した後、ＣＦ１５細胞中のｄｅｌＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質の活性
【図２】２Ａ：グアナベンズで２時間治療して観察された用量−反応の関係、２Ｂ：グアナベンズで２時間インキュベートした後、ＣＦ１５細胞中の薬理的概略
【図１】
2009529488.tif 000011
【図２】
2009529488.tif 000012
【国際調査報告】
2009529488.tif 000013
2009529488.tif 000014
2009529488.tif 000015
2009529488.tif 000016