(57)【要約】  肺閉塞性疾患、例えばＣＯＰＤを処置するために、例えば吸入により投与される式［Ｘ−（配列番号２）−Ｙ］で示されるＶＰＡＣ−２レセプターアゴニスト。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化７】
2009542593.tif 000014
［式中、
Ｘは、ヒスチジンのＮ末端アミノの水素であって、これは、場合により、加水分解可能なアミノ保護基、最も好ましくはアセチル基に置き換えられていてもよく、
Ｙは、スレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシであって、これは、場合により、加水分解可能なカルボキシ保護基、最も好ましくはＮＨ２に置き換えられていてもよく、
下線を付した残基は、そのセグメント内の最初（Ｌｙｓ２１）および最後（Ａｓｐ２５）のアミノ酸の側鎖−側鎖共有結合を示し、
Ｒ２は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
Ｒ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ又はＣαＭｅＶａｌであり、
Ｒ１６は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、又はＡｒｇであり、
Ｒ１８は、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
Ｒ２７は、Ｌｙｓ又はＬｅｕ（但し、Ｒ５がＣαＭｅＶａｌであり且つＲ１６がＡｒｇである時、Ｒ２７はＬｙｓでなければならない）であり、
Ｒ２８は、Ｌｙｓ又はＡｓｎである］
で示される環状血管作動性腸管ペプチド類似体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ５がＳｅｒ又はＣαＭｅＶａｌである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２７がＬｙｓである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
【化８】
2009542593.tif 000015
より成る群から選ばれる化合物。
【請求項５】
Ｘ−（配列番号８）−Ｙである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物および少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
肺閉塞性疾患を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物および少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物の有効量を吸入によって当該疾患に罹患しているヒトに投与することを含む方法。
【請求項８】
肺閉塞性疾患を処置するための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項１０】
本明細書前記の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）はブタの腸管から最初に発見され、単離され、そして精製された。［US3879371］。このペプチドは２８個のアミノ酸を有し、セクレチンおよびグルカゴンに対して広範囲の相同性を持っている。［Carlquist et al., Horm. Metab. Res., 14, 28-29(1982)］。ＶＩＰのアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０００２】
【化１】
2009542593.tif 000002
【０００３】
ＶＩＰは、消化管および循環系全体に幅広い生物活性を表すことが知られている。消化管ホルモンとの類似性に照らして、ＶＩＰは、膵液および胆汁分泌、肝臓のグリコーゲン分解、グルカゴンおよびインスリン分泌を刺激し、且つ膵臓の重炭酸塩放出を活性化することが判明している。
【０００４】
２種類のＶＩＰレセプターが知られ、ヒト、ラット、マウス、ニワトリ、魚およびカエルからクローニングされている。これらは現在ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２として同定されており、天然ＶＩＰに対して同等の親和性で応答する。ＶＰＡＣ２レセプターｍＲＮＡは、気管および気管支上皮を含むヒトの気道、腺および免疫細胞、肺胞壁およびマクロファージに見いだされる。［Groneberg et al., Lab. Invest. 81:749-755(2001) およびLaburthe et al., Receptors and Channels 8:137-153(2002)］。
【０００５】
ＶＩＰを含むニューロンは、イムノアッセイによって内分泌および外分泌系、腸および平滑筋の細胞に存在することが特定されている。ＶＩＰは、プロラクチン、サイロキシン、ならびにインスリンおよびグルカゴンを包含する幾つかのホルモンの放出を引き起こす神経効果器であることが判明している。さらにＶＩＰは、インビボおよびインビトロで腎臓からのレニン放出を刺激することも見いだされている。ＶＩＰは、様々な動物種およびヒトの気道において神経および神経終末に存在することが見いだされている。ＶＩＰが末梢、肺、および冠血管床に作用する強力な血管拡張物質および強力な平滑筋弛緩物質であることが判明しているため、ＶＩＰの心血管および気管支肺作用は興味深い。ＶＩＰは脳血管に対して血管拡張作用を有することが知られている。インビトロ研究では、脳動脈に体外から適用された血管作動性腸管ペプチドが血管拡張を誘導することが証明されており、このことは、ＶＩＰが脳血管拡張の潜在的な伝達物質であることを示唆している。目においてもＶＩＰが強力な血管拡張物質であることが示されている。
【０００６】
ＶＩＰは、免疫系に対して調節作用を有し得、例えばＶＩＰはリンパ球の増殖および移動を調節し得る。天然のＶＩＰは、ＩＦＮγ合成への作用と共に、ＬＰＳ刺激マクロファージにおけるＩＬ−１２の産生を阻害することが示されている。ＶＩＰはマウスマクロファージにおけるＴＧＦ−β１産生を阻害し、ＮＦкＢを介してヒト単球におけるＩＬ−８の産生を阻害する。［Sun et al., J. Neuroimmunol. 107:88-99(2000) およびDelgado and Ganea, Biochem. Biophys. Res. Commun. 302:275-283(2003)］。
【０００７】
上に述べたようにＶＩＰは平滑筋を弛緩させることが見いだされており、そしてそれは通常、気道組織に存在していることから、ＶＩＰが気管支平滑筋弛緩の内因性仲介物質であるかも知れないという仮説が立てられている。喘息患者由来の組織は正常な患者由来の組織と比較して免疫反応性ＶＩＰを含まないということが示されている。このことは、ＶＩＰ又はＶＩＰ作動性神経線維の喪失が喘息疾患に関連していることを示している可能性がある。インビトロおよびインビボ試験は、ＶＩＰが、気管平滑筋を弛緩させ、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＦ２αのような気管支収縮物質からの防御を行うことを示した。静脈内投与された場合、ＶＩＰはヒスタミン、プロスタグランジンＦ２α、ロイコトリエン、血小板活性化因子、および抗原誘導性気管支収縮物質のような気管支収縮物質からの防御を行うことが判明した。ＶＩＰはまた、ヒト気道組織の粘液分泌をインビトロで阻害することが見いだされている。
【０００８】
気道の疾患は様々な原因を有するが、種々の病態生理学的および臨床的特徴を共有する。これらの疾患の特徴は、気道閉塞に起因する気流の制限、気道壁の肥厚、間質組織の炎症又は弾性喪失である。併存疾患には、粘液の過剰分泌、気道の過反応性、および気体交換異常があり、それらによって、咳嗽、喀痰産生、喘鳴および呼吸困難が起こり得る。一般的な気道の疾患には、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、気腫、および肺高血圧症がある。［Mayer et al., Respiration Physiol. 128:3-11(2001)］。
【０００９】
ＣＯＰＤは、肺気道の閉塞により定義される慢性病態の一群である。ＣＯＰＤは、慢性（閉塞性）気管支炎および気腫という二つの主要な呼吸疾患を包含する。両疾患は呼吸困難および息切れと関係している。ＣＯＰＤは、肺高血圧症を伴うことがある。長期の喫煙はＣＯＰＤの顕著な危険因子である。ＣＯＰＤに関連する気道の制限は一般的に不可逆的であるとされる。
【００１０】
慢性気管支炎は進行性の炎症性疾患である。この疾患は気道粘液産生の増加および細菌感染の増加を伴う。この慢性炎症状態は、鬱血および呼吸困難の増加をもたらす気管支壁の肥厚を誘発する。
【００１１】
気腫は、気腔の拡大および肺胞表面積の喪失を伴う肺組織の損傷によるＣＯＰＤの基礎病理である。肺の損傷は、肺内部の肺胞嚢が脆弱化し破壊されることにより引き起こされる。肺組織の本来の弾性も失われ、過剰伸展および破裂につながる。小気管支が損傷を受けることがあり、それがそれらの崩壊と気流の妨害をもたらし、息切れにつながる。
【００１２】
ＣＯＰＤは、実質的な医学的意義において、常に気管支閉塞を伴う。したがって、ＣＯＰＤの最も一般的な症状は、息切れ、慢性咳嗽、胸部圧迫感、呼吸のためのより大きな努力、粘液産生増加および頻回の咳払いを包含する。患者は普通の日常活動を行うことができない。慢性気管支炎および気腫が独立して発症することはあり得るが、ＣＯＰＤをもつ殆どの人々は当該疾患を併発している。
【００１３】
肺実質中の結合組織、特にエラスチンの崩壊は、多くの気道疾患に見いだされる弾性の喪失を引き起こす。エラスチン分解の証拠が気腫およびＣＯＰＤで示されている。好中球エラスターゼが、エラスチン破壊の原因となる主たるプロテアーゼであると考えられる。［Barnes et al., Eur. Respir. J. 22:672-688(2003)］。好中球エラスターゼの産生がＣＯＰＤ患者の肺で亢進していることが示されている。［Higashimoto et al., Respiration 72:629-635(2005)］。
【００１４】
ＶＩＰの興味深い且つ潜在的な臨床上有用な生物活性の故に、このペプチドは、この分子の１以上の性質を増強する目的を持つ幾つかの報告されている合成プログラムの標的とされてきた。Takeyama等は、８位のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されているＶＩＰ類似体を報告している。この化合物は天然ＶＩＰより効果が弱いことが判明した。［Chem. Pharm. Bull. 28:2265-2269(1980)］。Wendlberger 等は、１７位のメチオニンがノルロイシンに置換されているＶＩＰ類似体の製造を開示している。［Peptide Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295(1980)］。このペプチドは、肝臓の膜調製物から放射性ヨウ素化ＶＩＰを駆逐する能力について天然ＶＩＰと同等の効力があることが見いだされた。WattsおよびWootonは、天然配列の６から１２残基までを含む一連の直線状および環状ＶＩＰフラグメントを報告している。［EP184309、EP325044；US4737487、US4866039］。Turner等は、フラグメントＶＩＰ（１０−２８）がＶＩＰのアンタゴニストであると報告している［Peptides 7:849-854(1986)］。置換類似体［４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ１７］−ＶＩＰもまたＶＩＰレセプターに結合しＶＩＰの活性に拮抗すると報告されている［Pandol et al., Gastrointest. Liver Physiol. 13:G553-G557(1986)］。Gozes et al. は、類似体［Ｌｙｓ１，Ｐｒｏ２，Ａｒｇ３，Ａｒｇ４，Ｐｒｏ５，Ｔｙｒ６］−ＶＩＰが、グリア細胞上にあるそのレセプターに結合するＶＩＰの競合的インヒビターであることを報告した。［Endocrinology 125:2945-2949(1989)］。Robberecht等は、天然ＶＩＰのＮ末端に置換されたＤ残基を有する幾つかのＶＩＰ類似体を報告している。［Peptides 9:339-345(1988)］。これらの類似体は全てＶＩＰレセプターとの結合がより緊密でなく、ｃ−ＡＭＰ活性化において天然ＶＩＰよりも低い活性を示した。TachibanaおよびItoは、前駆体分子の、幾つかのＶＩＰ類似体を報告している。［Peptide Chem. Shiba and Sakakibara(eds.), Prot. Res. Foundation, 1988, 481-486, JP1083012, US4822774］。これらの化合物は、ＶＩＰよりも１〜３倍強力な気管支拡張物質であることが示されており、そして１〜２倍高いレベルの降圧作用を有していた。Musso et al. はさらに、幾つかのＶＩＰ類似体が６−７、９−１３、１５−１７、および１９−２８位に置換を有することを報告した。［Biochem 27:8174-8181(1988)；US4835252］。これらの化合物は、ＶＩＰレセプターとの結合および生物学的応答において天然ＶＩＰと同等であるか、又はより効力が弱いことが判明した。Bartfai等は、一連の多置換［Ｌｅｕ１７］−ＶＩＰ類似体を報告している。［WO89/05857］。
【００１５】
Gourlet等は、ＶＩＰレセプターとの親和性を持つ［Ａｒｇ１６］−ＶＩＰ誘導体を報告している［BBA 1314:267-273(1996)］。Onoue等 は、ＶＩＰの一連のアルギニン誘導体および末端切除を報告している［Onoue et al., Life Sci. 74:1465-77(2004) およびOhmori et al., Regul. Pept. 123:201-207(2004)］。一連のポリアラニン誘導体もまた報告されている［Igarashi et al., J. Pharm. Exper. Ther. 303:445-460(2002)およびIgarashi et al., J. Pharm. Exper. Ther. 315:370-81(2005)］。
【００１６】
ＵＳ２００５０２０３００９では、選択的ＶＰＡＣ１アゴニスト活性を有するＶＩＰの類似体が記載されている。ＶＩＰの類似体およびＣ末端ｐｅｇ化誘導体が報告されており、それは糖尿病を包含する代謝性疾患の処置に有用である［例えばWO2006042152］。ＶＰＡＣ２アゴニスト活性を持つペプチドが同定されており、それらはＰＡＣＡＰおよびＶＩＰ類似体を包含している［Gourlet et al., Peptides 18:403-408；Xia et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:629-633(1997)］。強化された安定性および活性を有するＶＩＰの環状類似体が報告されている［Bolin et al., Biopolymers 37:57-66(1995), US5677419］。
【００１７】
ヒトにおいては、喘息患者に静脈内注入で投与された場合、ＶＩＰは最大呼気速度の増大を惹起し、ヒスタミン誘発気管支拡張に対する防御を行うことが示されている。［Morice and Sever, Peptides 7:279-280(1986)；Morice et al., The Lancet, II 1225-1227(1983)］。しかしながら、このＶＩＰ静脈内注入により観察される肺への影響は、心血管副作用、最も顕著なものとして血圧低下および頻脈、そしてさらに顔面紅潮を伴った。心血管作用を惹起しない静脈内用量を投与した場合、ＶＩＰは特異的気道コンダクタンスを変化させることができなかった。［Palmer et al., Thorax 41:663-666(1986)］。この活性の欠如は、低投与量のため、そしてことによると当該化合物の速やかな分解によるものであると説明された。エアロゾルによってヒトに投与した場合、天然ＶＩＰはヒスタミン誘発気管支収縮に対する防御において辛うじて有効であった。［Altieri et al., Pharmacologist 25:123(1983)］。ＶＩＰはベースライン気道パラメータには有意な作用がないが、ヒトに吸入投与する時、ヒスタミン誘発気管支収縮に対する防御的効果を有することが見いだされた。［Barnes and Dixon, Am. Rev. Respir. Dis., 130:162-166(1984)］。エアロゾルで投与された場合、ＶＩＰは、気管支拡張に併せて頻脈や血圧低下作用を示すことはないと報告された。［Said et al., in: Vasoactive Intestinal Peptide, Said］ed.), Raven Press, New York, 1928, 185-191］。
【００１８】
ＶＩＰの誘導体であるＲＯ２５−１５５３は、軽度喘息患者において前臨床的にも臨床的にも気管支拡張薬としての有効性があると報告されている［Kallstrom and Waldeck, Eur. J. Pharm. 430:335-40(2001) およびLinden et al., Thorax 58:217-21(2003)］。天然ＶＩＰは、ＣＯＰＤ、肺高血圧症およびその他の気道疾患の処置に有用性があると報告されている［WO03061680, WO0243746およびWO2005014030］。
【００１９】
しかしながら、既存のＶＰＡＣアゴニストと同等又はより良好な効力、薬物動態学的性質および薬理学的性質を持ちつつＶＰＡＣ２レセプターに対する選択性を有する血管作動性腸管ペプチドの新規な類似体に対する必要性が存在する。好ましくは、過去に入手可能であったものよりも活性持続時間が長い化合物に対する必要性が存在する。
【００２０】
本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
2009542593.tif 000003
［式中、
Ｘは、ヒスチジンのＮ末端アミノの水素であって、これは、場合により、加水分解可能なアミノ保護基、最も好ましくはアセチル基に置き換えられていてもよく、
Ｙは、スレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシであって、これは、場合により、加水分解可能なカルボキシ保護基、最も好ましくはＮＨ２に置き換えられていてもよく、
下線を付した残基は、そのセグメント内の最初（Ｌｙｓ２１）および最後（Ａｓｐ２５）のアミノ酸の側鎖−側鎖共有結合を示し、
Ｒ２は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
Ｒ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ又はＣαＭｅＶａｌであり、
Ｒ１６は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、又はＡｒｇであり、
Ｒ１８は、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
Ｒ２７は、Ｌｙｓ又はＬｅｕ（但し、Ｒ５がＣαＭｅＶａｌであり且つＲ１６がＡｒｇである時、Ｒ２７はＬｙｓでなければならない）であり、
Ｒ２８は、Ｌｙｓ又はＡｓｎである］
で示されるＶＰＡＣ−２レセプターアゴニスト又はその薬学的に許容される塩を含む。
【００２１】
本発明化合物は、ＶＰＡＣ２レセプターの活性なアゴニストであり、ヒト好中球エラスターゼに対して増強された安定性を有する。したがって、ヒト肺に存在するエラスターゼの作用に対して改善された抵抗性を有する天然ＶＩＰの安定な選択的類似体としての本化合物は、ＣＯＰＤを包含する気道疾患の処置に有用となるであろう。
【００２２】
本明細書で言及される全てのペプチド配列は、特に断りのない限り、Ｎ末端アミノ酸を左に、そしてＣ末端アミノ酸を右に表記する通常の慣習に従って記載される。２個のアミノ酸残基の間の短い線はペプチド結合を示す。下線付きのアミノ酸セグメントは、当該セグメント内部の最初と最後のアミノ酸の側鎖−側鎖共有結合を示す。典型的には、これはアミド結合である。アミノ酸が異性体型を有する場合、それは別途指摘のない限り、表現されているアミノ酸のＬ型である。本発明の説明に際する便宜のため、種々のアミノ酸に対する常套的および非常套的略語を使用する。これらの略語は当業者にとって周知であるが、明確にするため以下に列挙する：
【００２３】
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン；Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン；ＭｅＶａｌ＝ＭｅＶ＝ＣαＭｅＶａｌ；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；およびＶａｌ＝Ｖ＝バリン。
【００２４】
「加水分解可能なアミノ保護基」および「加水分解可能なカルボキシ保護基」という語に関して、本発明に従い、加水分解によって除去できる任意の常套的保護基が利用できる。そのような基の例を以下に示す。好ましいアミノ保護基は、式：
【化３】
2009542593.tif 000004
［式中、Ｘ３は、低級アルキル又はハロ低級アルキルである］
で示されるアシル基である。これらの保護基のうち、Ｘ３がＣ１−Ｃ３アルキル又はハロ−Ｃ１−Ｃ３アルキルである基が特に好ましい。好ましいカルボキシ保護基は低級アルキルエステル、ＮＨ２および低級アルキルアミドであり、Ｃ１−Ｃ３アルキルエステル、ＮＨ２およびＣ１−Ｃ３アルキルアミドが特に好ましい。
【００２５】
これもまた便宜のため、そして当業者には容易に理解できることであるが、本発明において使用する部分および試薬などを表記するために、以下の略語又は記号を使用する：Ｎｌｅ：ノルロイシン；ＣαＭｅＶａｌ：Ｃα−メチル−Ｌ−バリン；ＭｅＶａｌ：Ｃα−メチル−Ｌ−バリン；ＣＨ２Ｃｌ２：塩化メチレン；Ａｃ：アセチル；Ａｃ２Ｏ：無水酢酸；ＡｃＯＨ：酢酸；ＡＣＮ：アセトニトリル；ＤＭＡｃ：ジメチルアセトアミド；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＨＯＢＴ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスファート；ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスファート；ＮＭＰ：１−メチル−２−ピロリジノン；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型；ＦＡＢ−ＭＳ：高速原子衝突質量分析；ＥＳ−ＭＳ：エレクトロスプレー質量分析；ＲＴ：室温。
【００２６】
本明細書で使用する「アルキル」という語は、分岐又は非分岐の環式又は非環式飽和又は不飽和（例えばアルケニル又はアルキニル）ヒドロカルビル基を意味し、これは置換されていても非置換であってもよい。環式である場合、このアルキル基は好ましくはＣ３〜Ｃ１２、より好ましくはＣ５〜Ｃ１０、さらに好ましくはＣ５〜Ｃ７である。非環式である場合、このアルキル基は好ましくはＣ１〜Ｃ１０、より好ましくはＣ１〜Ｃ６、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピル又はイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ−ブチル）又はペンチル（ｎ−ペンチルおよびイソペンチルを包含する）、さらに好ましくはメチルである。
【００２７】
本明細書で使用する「低級アルキル」という語は、分岐又は非分岐の環式又は非環式飽和又は不飽和（例えばアルケニル又はアルキニル）ヒドロカルビル基を表し、ここで、この環式低級アルキル基はＣ５、Ｃ６又はＣ７であり、この非環式低級アルキル基はＣ１、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４であり、好ましくはメチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピル又はイソプロピル）又はブチル（ｎ−ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ−ブチル）から選ばれる。
【００２８】
本明細書で使用する「アシル」という語は、カルボニル基を介して結合している、場合により置換されていてもよいアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、アリール又はヘテロアリール基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、３−ピリジニルカルボニル、２−モルホリノカルボニル、４−ヒドロキシブタノイル、４−フルオロベンゾイル、２−ナフトイル、２−フェニルアセチル、２−メトキシアセチルなどを包含する。
【００２９】
本明細書で使用する「アリール」という語は、置換もしくは非置換炭素環式芳香族基、例えばフェニルもしくはナフチル、又は１個以上、好ましくは１個のヘテロ原子を含む置換もしくは非置換ヘテロ芳香族基を意味する。
【００３０】
アルキルおよびアリール基は置換されていても非置換であってもよい。置換されている場合、一般的に１〜３個の置換基、好ましくは１個の置換基が存在する。置換基は、炭素含有基、例えばアルキル、アリール、アリールアルキル（例えば置換および非置換フェニル、置換および非置換ベンジル）；ハロゲン原子およびハロゲン含有基、例えばハロアルキル（例えばトリフルオロメチル）；酸素含有基、例えばアルコール（例えばヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール（ヒドロキシ）アルキル）、エーテル（例えばアルコキシ、アリールオキシ、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル）、アルデヒド（例えばカルボキシアルデヒド）、ケトン（例えばアルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アリールカルボニル、アリールアルキルカルボニル、アリールカルボニルアルキル）、酸（例えばカルボキシ、カルボキシアルキル）、酸誘導体、例えばエステル（例えばアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルオキシアルキル）、アミド（例えばアミノカルボニル、モノ−又はジ−アルキルアミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、モノ−又はジ−アルキルアミノカルボニルアルキル、アリールアミノカルボニル）、カルバメート（例えばアルコキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、モノ−又はジ−アルキルアミノカルボニルオキシ、アリールアミノカルボニルオキシ）および尿素（例えばモノ−又はジ−アルキルアミノカルボニルアミノ又はアリールアミノカルボニルアミノ）；窒素含有基、例えばアミン（例えばアミノ、モノ−又はジ−アルキルアミノ、アミノアルキル、モノ−又はジ−アルキルアミノアルキル）、アジド、ニトリル（例えばシアノ、シアノアルキル）、ニトロ；硫黄含有基、例えばチオール、チオエーテル、スルホキシドおよびスルホン（例えばアルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、アリールチオ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオアルキル、アリールスルフィニルアルキル、アリールスルホニルアルキル）；および、１個以上、好ましくは１個のヘテロ原子を含むヘテロ環式基を包含できる。
【００３１】
本明細書で使用する「ハロゲン」という語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素基、好ましくはフッ素、塩素又は臭素基、より好ましくはフッ素又は塩素基を意味する。
【００３２】
「薬学的に許容される塩」とは、式Ｉの化合物の生物学的有効性および性質を保持し、適当な非毒性の有機もしくは無機酸又は有機もしくは無機塩基から形成される常套的な酸付加塩又は塩基付加塩を指す。例としての酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸から誘導される塩、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、蓚酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸から誘導される塩がある。例としての塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウムおよび第四アンモニウム水酸化物、例えば水酸化テトラメチルアンモニウムから誘導される塩がある。医薬化合物（即ち、薬物）から塩への化学的修飾は、化合物の物理的又は化学的安定性に関与する性質、例えば吸湿性、流動性又は溶解性の改善を試みる際に利用される周知の技術である。例えば、 Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(6th Ed. 1995) at pp. 196 and 1456-1457を参照されたい。
【００３３】
「薬学的に許容されるエステル」とは、常套的にエステル化された、カルボキシ基を有する式Ｉの化合物を指し、このエステルは、式Ｉの化合物の生物学的有効性および性質を保持し、インビボ（生体内）で、対応する活性なカルボン酸に開裂する。対応するカルボン酸にインビボで開裂する（この場合、加水分解される）エステル基の例は、開裂した水素が、場合により、例えばヘテロ環、シクロアルキルなどで置換されていてもよい低級アルキルに置き換わっているものである。置換低級アルキルエステルの例は、低級アルキルがピロリジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−メチルピペラジンなどで置換されているものである。インビボで開裂する基は、例えばエチル、モルホリノエチル、およびジエチルアミノエチルであってよい。本発明に関連して、−ＣＯＮＨ２もまたエステルと考えられるが、それは、−ＮＨ２はインビボで開裂してヒドロキシ基に置き換えられ、対応するカルボン酸を形成するためである。
【００３４】
医薬化合物のデリバリーのためのエステルの例およびその使用に関するさらなる情報は、Design of Prodrugs, Bundgaard(ed.)(Elsevier, 1985) で入手できる。さらに、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(6th Ed. 1995) at pp. 108-109；Krogsgaard-Larsen et. al., Textbook of Drug Design and Development(2d Ed. 1996) at pp. 152-191をも参照されたい。
【００３５】
或る態様では、本発明は、ＸがヒスチジンのＮ末端アミノの水素であるか、又はこの水素がアセチル基に置き換えられている、式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、ＸがヒスチジンのＮ末端アミノの水素である式Ｉの化合物を提供する。
【００３６】
或る態様では、本発明は、ＹがスレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシであるか、又はこの水素がＮＨ２に置き換えられている、式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、ＹがスレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシである式Ｉの化合物を提供する。
【００３７】
或る態様では、本発明は、Ｒ２がＳｅｒである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ２がＡｌａである式Ｉの化合物を提供する。
【００３８】
或る態様では、本発明は、Ｒ５がＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＣαＭｅＶａｌである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ５がＴｈｒである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ５がＳｅｒである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ５がＣαＭｅＶａｌである式Ｉの化合物を提供する。
【００３９】
或る態様では、本発明は、Ｒ１６がＧｌｎ又はＡｒｇである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ１６がＧｌｎである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ１６がＡｒｇである式Ｉの化合物を提供する。
【００４０】
或る態様では、本発明は、Ｒ１８がＡｌａである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ１８がＬｙｓである式Ｉの化合物を提供する。別の態様では、本発明は、Ｒ１８がＧｌｕである式Ｉの化合物を提供する。
【００４１】
或る態様では、本発明は、Ｒ２７がＬｙｓである式Ｉの化合物を提供する。
【００４２】
或る態様では、本発明は、Ｒ２８がＬｙｓである式Ｉの化合物を提供する。
【００４３】
或る態様では、本発明は、式Ｉ：
［式中、
Ｘは、ヒスチジンのＮ末端アミノの水素であるか、又はこの水素がアセチル基に置き換えられており、
Ｙは、スレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシであるか、又はこのヒドロキシがＮＨ２に置き換えられており、
Ｒ２は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
Ｒ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＣαＭｅＶａｌであり、
Ｒ１６は、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、
Ｒ１８は、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
Ｒ２７は、Ｌｙｓ又はＬｅｕ（但し、Ｒ５がＣαＭｅＶａｌであり且つＲ１６がＡｒｇである時、Ｒ２７はＬｙｓでなければならない）であり、そして
Ｒ２８は、Ｌｙｓである］
で示される化合物を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、式Ｉ：
［式中、
Ｘは、ヒスチジンのＮ末端アミノの水素であるか、又はこの水素がアセチル基に置き換えられており、
Ｙは、スレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシであるか、又はこのヒドロキシがＮＨ２に置き換えられており、
Ｒ２は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
Ｒ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＣαＭｅＶａｌであり、
Ｒ１６は、Ｇｌｎ又はＡｒｇであり、
Ｒ１８は、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、
Ｒ２７は、Ｌｙｓ又はＬｅｕ（但し、Ｒ５がＣαＭｅＶａｌであり且つＲ１６がＡｒｇである時、Ｒ２７はＬｙｓでなければならない）であり、そして
Ｒ２８は、Ｌｙｓである］
で示される化合物を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、式Ｉ：
［式中、
Ｘは、ヒスチジンのＮ末端アミノの水素であるか、又はこの水素がアセチル基に置き換えられており、
Ｙは、スレオニンのＣ末端カルボキシのヒドロキシであるか、又はこのヒドロキシがＮＨ２に置き換えられており、
Ｒ２は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
Ｒ５は、Ｓｅｒ又はＣαＭｅＶａｌであり、
Ｒ１６は、Ｇｌｎであり、
Ｒ１８は、Ａｌａであり、
Ｒ２７は、Ｌｙｓ又はＬｅｕであり、そして
Ｒ２８は、Ｌｙｓである］
で示される化合物を提供する。
【００４６】
この代表的化合物は、アミノ酸間のペプチド結合形成のための既知の常法によって容易に合成できる。そのような常法には、例えば、カルボキシ基およびその他の反応性基が保護された、アミノ酸又はその残基の遊離αアミノ基と、アミノ基又はその他の反応性基が保護された別のアミノ酸又はその残基の遊離第一カルボキシ基の間の縮合を可能にする任意の液相法がある。
【００４７】
本発明に係る新規化合物を合成するためのこのような常法には、例えば任意の固相ペプチド合成法がある。このような方法では、新規化合物の合成は、固相法の一般原則に従い、成長するペプチド鎖の中に、一度に１個ずつ所望のアミノ酸残基を連続的に組み込んでいくことによって実施できる。このような方法は、例えば、Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154(1963)；Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology,  Vol.2, Gross and Meienhofer,(Eds.) Academic Press 1-284(1980) に開示されており、これらを引用により本明細書の一部とする。ペプチド合成は手動で又は自動装置によって実施できる。マイクロ波支援合成もまた利用できる。
【００４８】
様々なアミノ酸部分の反応性側鎖基を適当な保護基で保護することは、ペプチドの化学合成にとって一般的であり、それは、保護基が最後に除去されるまでその部位で化学反応が起こることを防ぐ。カルボキシ基において反応する間、アミノ酸又はフラグメント上のαアミノ基を保護し、その後このαアミノ保護基を選択的に除去し、その部位でその後の反応が起こるようにさせることもまた、通常一般的である。固相合成法に関連した特異的保護基が開示されているが、各々のアミノ酸は、液相合成においてそれぞれのアミノ酸に常套的に使用される保護基によって保護することができるということに留意すべきである。
【００４９】
芳香族ウレタン型保護基、例えばアリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換ベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）；脂肪族ウレタン型保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルから選ばれる適当な保護基によってαアミノ基を保護できる。本発明においてＦｍｏｃがαアミノ保護に最も好ましい。
【００５０】
グアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、（Ｚ，）２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）；４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）から選ばれる適当な保護基によって保護できる。ＰｍｃおよびＭｔｒがアルギニン（Ａｒｇ）のために最も好ましい。
【００５１】
ε−アミノ基は、２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）−およびＢｏｃから選ばれる適当な保護基によって保護できる。Ｂｏｃが（Ｌｙｓ）のために最も好ましい。
【００５２】
ヒドロキシ基（ＯＨ）は、ベンジル（Ｂｚｌ）、２，６ジクロロベンジル（２，６−ジＣｌ−Ｂｚｌ）、およびｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）から選ばれる適当な保護基によって保護できる。ｔＢｕが（Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ）および（Ｔｈｒ）のために最も好ましい。
【００５３】
β−およびγ−アミド基は、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４，４−ジメトキシジチル／ビス−（４−メトキシフェニル）−メチル（Ｄｏｄ）およびトリチル（Ｔｒｔ）から選ばれる適当な保護基によって保護できる。Ｔｒｔが（Ａｓｎ）および（Ｇｌｎ）のために最も好ましい。
【００５４】
インドール基は、ホルミル（Ｆｏｒ）、メシチル−２−スルホニル（Ｍｔｓ）およびＢｏｃから選ばれる適当な保護基によって保護できる。Ｂｏｃが（Ｔｒｐ）のために最も好ましい。
【００５５】
β−およびγ−カルボキシ基は、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、および２−フェニルイソプロピルエステル（２Ｐｉｐ）から選ばれる適当な保護基によって保護できる。ｔＢｕが（Ｇｌｕ）のために最も好ましく、２Ｐｉｐが（Ａｓｐ）のために最も好ましい。
【００５６】
イミダゾール基は、ベンジル（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ、およびトリチル（Ｔｒｔ）から選ばれる適当な保護基によって保護できる。Ｔｒｔが（Ｈｉｓ）のために最も好ましい。
【００５７】
全ての溶媒、イソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ＤＭＦおよびＮＭＰは、Fisher、JT Baker又はBurdick & Jacksonから購入し、さらなる蒸留をせずに使用した。ＴＦＡはHalocarbon、Aldrich又はFlukaから購入し、さらなる精製をせずに使用した。
【００５８】
ＤＩＣおよびＤＩＰＥＡは、Fluka又はAldrichから購入し、さらなる精製をせずに使用した。ＨＯＢＴ、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）および１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）は、Aldrich、Sigma Chemical Co. 又はAnaspecから購入し、さらなる精製をせずに使用した。保護アミノ酸は一般にＬ配置であり、Bachem、Advanced ChemTech、CEM又はNeosystemから商業的に取得した。これらの試薬の純度は、薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲおよび融点により、使用前に確認した。ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）は、Bachem、Anaspec又はAdvanced Chemtechから取得したスチレン−１％ジビニルベンゼンのコポリマー（１００−２００又は２００−４００メッシュ）であった。これらの樹脂の総窒素含有量は一般に０．３〜１．２meq/gであった。
【００５９】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Constametric IおよびIIIポンプ、Gradient Master溶媒プログラマーおよびミキサー、ならびにSpectromonitor III可変波長ＵＶ検出器より成るＬＤＣ装置で実施した。分析用ＨＰＬＣは、Pursuit Ｃ１８カラム（４．５ｘ５０mm）を用いて逆相モードで実施した。分取ＨＰＬＣ分離はPursuitカラム（５０ｘ２５０mm）でランした。
【００６０】
好ましい態様では、ペプチドを、Merrifield（J. Amer. Chem. Soc. 85:2149(1963)）に一般的に記載された方法により、固相合成を用いて製造したが、前述のように、当分野において既知の他の同等の化学合成も使用できた。固相合成は、保護αアミノ酸を適当な樹脂にカップリングさせることにより、当該ペプチドのＣ末端から開始する。このような出発材料は、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（Wang）樹脂にαアミノ保護アミノ酸をエステル結合で結合させることにより製造でき、或いはＦｍｏｃリンカー、例えばｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメチルオキシベンジル）フェノキシ酢酸（Rinkリンカー）とベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂の間のアミド結合によって製造できる。ヒドロキシメチル樹脂の製造は当分野で周知である。Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、一般に、合成される所望ペプチドがＣ末端に非置換アミドを有する場合に使用される。
【００６１】
典型的には、アミノ酸又は類似物を、１−５当量のアミノ酸および適当なカップリング試薬を用いて、アミノ酸又は類似物のＦｍｏｃ保護型を使用してＦｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂上にカップリングさせる。カップリングの後、樹脂を洗浄し、減圧乾燥する。樹脂へのアミノ酸のロードは、Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂のアリコートのアミノ酸分析によって、又はＵＶ分析によるＦｍｏｃ基の測定によって測定できる。未反応アミノ基があればそれは、樹脂を、塩化メチレン又はＤＭＦ中の無水酢酸およびジイソプロピルエチルアミンで処理することによりキャッピングできる。
【００６２】
樹脂を、数回の連続サイクルに付して連続的にアミノ酸を付加する。αアミノＦｍｏｃ保護基を塩基性条件下に除去する。この目的にはＤＭＦ中のピペリジン、ピペラジン又はモルホリン（２０−４０%v/v）を使用できる。好ましくはＤＭＦ中４０%ピペリジンを典型的に使用する。
【００６３】
αアミノ保護基を除去した後、次の保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせて、中間体、保護ペプチド−樹脂を得る。ペプチドの固相合成においてアミノ酸のカップリングに使用される活性化試薬は当分野で周知である。例えば、このような合成のための適切な試薬は、ＢＯＰ、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒｏＰ）、ＨＢＴＵおよびＤＩＣである。ここで好ましいのはＨＢＴＵおよびＤＩＣである。BaranyおよびMerrifield（The Peptides, Vol.2, Meienhofer(ed.), Academic Press, 1979, pp1-284）により記載されているその他の活性化剤も利用できる。合成サイクルを最適化するため、ＨＯＢＴ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）および３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢＴ）などの種々の試薬をカップリング混合物に添加できる。ここで好ましいのはＨＯＢＴである。
【００６４】
典型的な合成サイクルのプロトコルは以下の通りである：
【００６５】
【表１】
2009542593.tif 000005
【００６６】
全ての洗浄およびカップリング用溶媒は１０−２０ml/g(樹脂)の体積であった。合成全体のカップリング反応は、完結の程度を測定するためカイザーニンヒドリン試験により監視した［Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595-598(1970)］。不完全なカップリング反応を、新たに調製した活性化アミノ酸を用いて再カップリングするか、又はペプチド樹脂を前記のように無水酢酸で処理することによりキャッピングした。完全に組み立てられたペプチド−樹脂を数時間減圧乾燥した。
【００６７】
ペプチド合成は、Applied Biosystem 433A合成機（Foster City, CA）を用いて実施でき、FastMoc 0.25mmoleサイクルを、樹脂サンプリング又は非樹脂サンプリング、４１mL反応容器と共に使用した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂を、２．１g ＮＭＰ、ＤＭＦ中の２gの０．４５Ｍ ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ、および２Ｍ ＤＩＥＡを用いて溶解し、次いで反応容器に移した。基本的なFastMocカップリングサイクルはモジュール「ＢＡＤＥＩＦＤ」で表され、ここでは各々の文字がモジュールを表す。例えば、Ｂは、２０%ピペリジン／ＮＭＰを用いるＦｍｏｃ脱保護、および関連洗浄、および３０分間の読み取り（ＵＶ監視又は伝導度のいずれか）のモジュールを表し；Ａは、０．４５Ｍ ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔおよび２．０Ｍ ＤＩＥＡを伴うカートリッジ中でのアミノ酸の活性化、ならびにＮ２通気を伴う混合のモジュールを表し；Ｄは、反応容器中での樹脂のＮＭＰ洗浄のモジュールを表し；Ｅは、カップリング用反応容器への活性化アミノ酸の移動のモジュールを表し；Ｉは、反応容器を断続的に撹拌しながら１０分間の待機時間のモジュールを表し；そしてＦは、カートリッジを綺麗にし、およそ１０分間カップリングし、そして反応容器の水分を捨てるモジュールを表す。カップリングは典型的にはモジュール「Ｉ」を１回又は複数回追加することにより延長した。例えば、手順「ＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤ」を行うことにより二重カップリングを実施した。塩化メチレン洗浄のｃ、および無水酢酸によるキャッピングの「Ｃ」といったような他のモジュールも使用した。個々のモジュールは、例えば移動させる溶媒又は試薬の量を変えるため、移動時間のような様々な機能のタイミングを変化させることによっても修飾可能であった。上のサイクルを、典型的には１個のアミノ酸のカップリングに使用した。しかしながらテトラペプチドの合成には、このサイクルを反復し、ひと続きとした。例えば、第一のアミノ酸のカップリングにＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを使用し、続いて第二のアミノ酸のカップリングにＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを、次に第三のアミノ酸のカップリングにＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを、次に第四のアミノ酸のカップリングにＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを、そして最後の脱保護および洗浄にＢＩＤＤｃｃを使用した。
【００６８】
ペプチド合成は、マイクロ波ペプチド合成機、Liverty（CEM Corporation, Matthews, NC）を用いて実施できる。この合成機を、プレロードされた０．２５mmolサイクルを改変することにより二重カップリングおよびキャッピング用にプログラムした。Ｆｍｏｃ脱保護、アミノ酸カップリング、および無水酢酸によるキャッピングの間に使用するため、マイクロ波エディターを使用してマイクロ波出力方法をプログラムした。このタイプのマイクロ波制御は、反応が設定された温度で設定された時間行われるよう制御する方法を創成することを可能にする。Livertyは、反応へと送られる出力の量を自動調節して、設定点における温度を保持する。アミノ酸付加および最終的脱保護のためのデフォルトサイクルをサイクルエディターで選択し、ペプチドを創成する間に自動的にロードした。
【００６９】
合成を、Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を用いて０．２５mmolスケールで実施した。ＤＭＦ１０mLを入れた３０mL反応容器に樹脂を加えた。Ｆｍｏｃ脱保護はＤＭＦ溶液中２０%ピペリジンで行った。各々のアミノ酸カップリングのために、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸をＤＭＦに溶解して０．２Ｍ溶液を作製し、反応容器に添加した。全てのカップリング反応を０．５Ｍ ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵおよび２Ｍ ＤＩＥＡ／ＮＭＰで実施した。不完全なカップリング反応があれば、新たに調製した活性化アミノ酸で再カップリングするか、又はペプチド樹脂をＤＭＦ中の２５%無水酢酸で処理することによりキャッピングした。各々の脱保護、カップリングおよびキャッピング反応は、５０ワットの出力、７０℃で３００秒間のマイクロ波および窒素通気を用いて行った。
【００７０】
各々のアミノ酸カップリングには、以下の０．２５mmolカップリングサイクルを使用した：
【００７１】
【表２】
2009542593.tif 000006
【００７２】
本明細書に記載の化合物の合成のため、好ましい合成手順をスキーム１に示す。
【化４】
2009542593.tif 000007
【００７３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ樹脂１をピペリジン／ＤＭＦで処理し、次いでＤＩＣ、ＢＯＰ又はＨＢＴＵなどの試薬を用いてＦｍｏｃ−ＡＡ(Ｐ)３１とカップリングさせる［ここで、ＡＡ３１は３１番目のアミノ酸残基を表し、Ｐは適当な保護基を表す］と、Ｆｍｏｃ−ＡＡ(Ｐ)３１−Ｒｉｎｋ−樹脂２が生成する。各サイクルにおいて適当な保護アミノ酸を加えることにより工程１および２を３０サイクル反復すると、ペプチド樹脂３が生成する。ＡＡ２５およびＡＡ２１上の側鎖保護基を、それぞれＣＨ２Ｃｌ２中の２%ＴＦＡおよびＰｄＣｌ２／ｎＢｕ３ＳｎＨで処理することにより除去する。ＡＡ２１およびＡＡ２５の側鎖アミンおよびカルボキシをＤＭＦ中のＢＯＰおよびＮＭＭで処理することにより環化すると４が生成する。
【００７４】
各化合物について保護基を除去し、同じ工程でペプチドを樹脂から開裂させる。例えば、ペプチド−樹脂を、ＲＴで、樹脂１gあたりエタンジチオール１００μL、ジメチルスルフィド１００μL、アニソール３００μL、およびＴＦＡ ９．５mLで１８０分間処理できる。或いは、ペプチド−樹脂を、ＲＴで、樹脂１gあたりトリイソプロピルシラン１．０mLおよびＴＦＡ９．５mLで１８０分間処理することもできる。樹脂を濾去し、濾液を冷エチルエーテル中で沈殿させる。沈殿を遠心し、エーテル層をデカンテーションする。残留物を２又は３体積のＥｔ２Ｏで洗浄し、再度遠心する。粗生成物５を減圧乾燥する。
【００７５】
粗製ペプチドの精製を、逆相Pursuit C-18カラム（５０ｘ２５０mm、３００Å、１０μm）上の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりShimadzu LC-8A系で実施する。ペプチドを最少量の水およびアセトニトリルに溶解し、カラムに注入する。勾配溶離を一般に、２% Ｂ緩衝液、２%−７０% Ｂで７０分間（緩衝液Ａ：０．１%ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１%ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、流速５０ml/分で開始する。UV検出を２２０／２８０nmで行う。生成物を含有する画分を分離し、それらの純度を、逆相Pursuit C-18カラム（４．６ｘ５０mm）を使用し流速２．５ml/分、１０分間の勾配（２−７０%）のShimadzu LC-10AT分析系で判断する。［緩衝液Ａ：０．１%ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１%ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ］。充分な純度を持つと判断された画分をプールし凍結乾燥する。
【００７６】
最終生成物の純度を、上に述べたように逆相カラムの分析用ＨＰＬＣにより確認する。全ての最終生成物をさらに、高速原子衝突質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）又はエレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）にかける。実施例において、全ての生成物が、許容限界内の予想親Ｍ＋Ｈイオンを生成した。
【００７７】
本発明に記載したＶＩＰの類似体は、実施例２５で立証されるようにＶＰＡＣ２レセプターのアゴニストである。実施例２５のエラスターゼ安定性実験によれば、このような化合物はヒト好中球エラスターゼに対して増強された安定性を有する。故に、これらＶＰＡＣ２レセプターアゴニストの投与は、ＣＯＰＤのような気道疾患の治療に有用性を持つであろう。
【００７８】
本発明化合物は薬学的に許容される塩の形態で提供できる。好ましい塩の例は、薬学的に許容される有機酸、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はパモ酸、ならびにポリマー酸、例えばタンニン酸又はカルボキシメチルセルロースによって形成される塩、ならびに、無機酸、例えばハロゲン化水素酸（例えば塩酸）、硫酸、又はリン酸などによって形成される塩である。当業者にとって既知の、薬学的に許容される塩を取得するための任意の方法が使用できる。
【００７９】
本発明の方法の実施にあたり、本発明に係るペプチドのうち任意の一つ又は本発明に係る任意のペプチドの組み合わせ又はその薬学的に許容される塩の有効量を、単独でか又は組み合わせて、当分野で既知の通常の且つ許容される方法によって投与する。したがって当該化合物又は組成物は、経口（例えば口腔）、舌下、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、又は皮下）、直腸内（例えば、坐剤又は洗浄液によって）、経皮（例えば皮膚エレクトロポレーション）又は吸入によって（例えばエアロゾルにより）、そして、錠剤および懸濁剤を包含する固体、液体又は気体剤型で投与できる。投与は、連続的治療による単位投薬形態で、又は単回投与治療で随意に行うことができる。治療用組成物は、パモ酸のような親油性塩と併せて油性乳剤もしくは分散剤の形態とすることも、又は皮下もしくは筋肉内投与用の生分解性持続放出組成物の形態とすることもできる。
【００８０】
したがって本発明の方法は、症状の軽減が特に必要、又はことによるとそれが差し迫っている時に実施する。或いは、本発明の方法は、持続的又は予防的処置として有効に実施される。
【００８１】
本発明組成物の製造のために有用な薬学的担体は、固体、液体又は気体であってよく、したがって本組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、散剤、腸溶被覆もしくはその他の保護された調合物（例えば、イオン交換樹脂上に結合、又は脂質−蛋白ベシクル中にパッケージング）、持続放出調合物、液剤、懸濁剤、エリキシル、エアロゾルなどの形態をとることができる。担体は、石油、動物、植物もしくは合成起源の油を包含する種々の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などから選択できる。水、生理食塩水、水性デキストロース、およびグリコールが、特に（血液と等張である場合に）注射用液剤のために好ましい液体担体である。例えば、静脈内投与のための製剤は、活性成分（群）の無菌水溶液を含み、これは、固体活性成分（群）を水に溶解して水溶液を作製し、この溶液を無菌とすることによって製造する。好適な薬学的賦形剤には、澱粉、セルロース、タルク、グルコース、乳糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどがある。この組成物は、常套的な薬学的添加物、例えば保存剤、安定剤、湿潤又は乳化剤、浸透圧を調節するための塩類、緩衝剤などの影響を受ける。好適な薬学的担体およびそれらの製剤は、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。いずれにせよこのような組成物は、有効量の活性化合物を適当な担体と共に含有し、レシピエントへの適切な投与のための適正な投与型に調製される。
【００８２】
本発明化合物の用量は、幾つかの因子、例えば投与方法、対象の年齢および体重、および治療される対象の状態に依存し、最終的には担当している医師又は獣医師によって決定される。担当している医師又は獣医師により決定されるこのような活性化合物の量を、本明細書および請求項では「有効量」と称する。例えば、吸入投与の用量は、典型的には約０．５〜約１００μg/kg(体重)の範囲である。好ましくは、本発明化合物は、約１μg/kg〜約５０μg/kg/日の用量率で投与する。
【００８３】
代表的なデリバリーレジメンには、経口、非経口（皮下、筋肉内および静脈内を包含する）、直腸内、バッカル（舌下を包含する）、経皮、肺内および鼻内がある。好ましい投与経路は経口吸入による肺内投与である。肺内投与の方法は、本発明に係る環状ペプチドの水溶液のエアロゾル化、又は、微粉化した乾燥粉末製剤の吸息を包含する。エアロゾル化組成物は、逆ミセル又はリポソーム中に内包された該化合物を包含し得る。有効な肺胞デリバリーを提供するために適切に粒子径を制御した微粉化粉末の製造は周知である。このような製剤の特定用量を直接肺内にデリバリーするための吸入器（定量吸入器又は「ＭＤＩ」）は当分野で周知である。
【００８４】
したがって、本発明はさらに、このようなアゴニストを含有する医薬組成物、およびＣＯＰＤを包含する肺疾患の治療のための、係るアゴニストの使用を包含する。
【００８５】
或る態様では、本発明は、式Ｉの化合物および少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を溶液又は微粉化乾燥粉末形態中に含む、吸入投与用医薬組成物を提供し、ここでこの化合物は、前記組成物の肺内デリバリーのための薬理学的に有効な濃度で存在する。別の態様では、本発明は、式Ｉの化合物および少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を溶液又は微粉化乾燥粉末形態中に含む、吸入投与用医薬組成物を提供し、ここでこの化合物の濃度は、１回の吸入用量において該化合物を約１μg/kg〜約５０μg/kgデリバリーするに充分である。
【００８６】
或る態様では、本発明は、式Ｉの化合物および少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を溶液又は微粉化乾燥粉末形態中に含む、吸入投与用医薬組成物の有効量、例えば約１μg/kg/日〜約５０μg/kg/日を、吸入によって投与することを含む、肺閉塞性疾患、例えばＣＯＰＤを治療する方法を提供し、ここでこの化合物は、例えばそのような疾患に罹患している人間に、該組成物を肺内デリバリーするための薬理学的に有効な濃度で存在する。
【００８７】
ここで本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、それらは例示のみを意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８８】
実施例
実施例１：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号３）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＴｈｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【００８９】
【化５】
2009542593.tif 000008
【００９０】
上のペプチドを、Applied Biosystem 433A又はマイクロ波ペプチド合成機でＦｍｏｃ化学を使用して合成した。この合成機を、上記プロトコル１又は２に記載のモジュールを使用して二重カップリング用にプログラムした。この合成は、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を使用し０．２５mmolスケールで実施した。合成終了時に、樹脂を振盪機上の反応容器に移した。ＤＭＦ中のペプチド樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。この樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中の２%ＴＦＡで３分間ずつ５回処理した。直ちに樹脂を５%ＤＩＰＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２で２回処理し、ＣＨ２Ｃｌ２およびＤＭＦで洗浄した。ペプチド樹脂を、ゴムの隔壁をしっかりと取り付けた振盪容器に入れたＤＭＦに懸濁した。ここにＰｄＣｌ２（Ｐｈ３Ｐ）２６０mg、モルホリン１５０μlおよびＡｃＯＨ３００μlを加えた。この容器をＡｒでよくパージした。次にｎＢｕ３ＳｎＨをシリンジで添加した。この黒色溶液を３０−４５分間振盪し、ＤＭＦで洗浄し、反復した。２度目のＰｄ処理の後、樹脂を、ＤＭＦ、２ｘｉＰｒＯＨ、ＤＭＦ、５%ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦおよびＤＭＦで洗浄した。ＤＭＦ中でＢＯＰおよびＮＭＭで一夜処理することによりペプチド樹脂を環化した。樹脂をＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、次いで減圧乾燥した。
【００９１】
９７%ＴＦＡ／３%Ｈ２Ｏ １３．５mLおよびトリイソプロピルシラン１．５mLをＲＴで１８０分間使用してペプチドを樹脂から開裂させた。脱保護溶液を冷Ｅｔ２Ｏ １００mLに加え、ＴＦＡ１mLおよび冷Ｅｔ２Ｏ ３０mLで洗浄してペプチドを沈殿させた。このペプチドを、２本の５０mLポリプロピレン管に入れて遠心した。個々の管からの沈殿を１本の管に合し、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、ハウスバキューム下にデシケーター中で乾燥した。
【００９２】
粗生成物をPursuit C18カラム（２５０ｘ５０mm、１０μm粒子径）上の調製用ＨＰＬＣにより精製し、２−７０%Ｂの直線勾配（緩衝液Ａ：０．１%ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．１%ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）で９０分間、流速６０mL/分で溶出し、２２０／２８０nmで検出した。画分を集め、分析用ＨＰＬＣで確認した。純粋な生成物を含有する画分を合し、白色のアモルファス粉末１０６mg（９．７%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５９Ｈ２５６Ｎ４６Ｏ４７としての理論値（ｃａｌｃｄ）３５６５．０５、実測値３５６３．７。
【００９３】
実施例２：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号４）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【００９４】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末２８mg（２．５%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５８Ｈ２５４Ｎ４６Ｏ４７としての理論値３５５１．０２、実測値３５４８．７。
【００９５】
実施例３：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号５）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＡｓｐであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【００９６】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末９．２mg（１%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５９Ｈ２５４Ｎ４６Ｏ４８としての理論値３５７９．０３、実測値３５７７．８。
【００９７】
実施例４：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号６）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＧｌｎであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【００９８】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末９．８mg（１%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６０Ｈ２５７Ｎ４７Ｏ４７としての理論値３５９２．０７、実測値３５８９．５。
【００９９】
実施例５：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号７）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＰｒｏであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１００】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末１５．２mg（１．４%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６０Ｈ２５６Ｎ４６Ｏ４６としての理論値３５６１．０６、実測値３５６０．０。
【０１０１】
実施例６：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＭｅＶａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号８）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＭｅＶａｌであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１０２】
【化６】
2009542593.tif 000009
【０１０３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末４０mg（３．６%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２６０Ｎ４６Ｏ４６としての理論値３５７７．１０、実測値３５７６．８。
【０１０４】
実施例７：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号９）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＧｌｕであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１０５】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末１２６mg（１１．４%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６０Ｈ２５６Ｎ４６Ｏ４９としての理論値３６０９．０６、実測値３６０９．２。
【０１０６】
実施例８：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１０）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｅｕであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１０７】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末７７mg（７．３%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５８Ｈ２５３Ｎ４５Ｏ４７としての理論値３５３６．００、実測値３５３４．９５。
【０１０８】
実施例９：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１１）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＬｙｓであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１０９】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末７９mg（７．５%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２６１Ｎ４７Ｏ４７としての理論値３６０８．１１、実測値３６０７．６。
【０１１０】
実施例１０：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１２）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｌａであり、Ｒ１８がＧｌｕであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１１１】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末６５mg（６%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５８Ｈ２５３Ｎ４５Ｏ４８としての理論値３５５２．００、実測値３５５１．２。
【０１１２】
実施例１１：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１３）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｅｕであり、そしてＲ２８がＡｓｎである、式Ｉの化合物の製造。
【０１１３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末１０９mg（１０．６%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５６Ｈ２４７Ｎ４５Ｏ４８としての理論値３５２１．９３、実測値３５２０．５。
【０１１４】
実施例１２：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１４）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＡｌａであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１１５】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末２０mg（１．８%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５８Ｈ２５４Ｎ４６Ｏ４６としての理論値３５３５．０２、実測値３５３３．４。
【０１１６】
実施例１３：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１５）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１１７】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末６０mg（５．３%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５９Ｈ２５８Ｎ４８Ｏ４６としての理論値３５７９．０８、実測値３５７７．８。
【０１１８】
実施例１４：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１６）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｅｕであり、そしてＲ２８がＡｓｎである、式Ｉの化合物の製造。
【０１１９】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末４０mg（３．７%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１５７Ｈ２５１Ｎ４７Ｏ４７としての理論値３５４９．９９、実測値３５４９．２。
【０１２０】
実施例１５：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１７）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＧｌｕであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１２１】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末３６mg（３．６%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２６０Ｎ４８Ｏ４８としての理論値３６３７．１１、実測値３６３６．４。
【０１２２】
実施例１６：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１８）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＬｙｓであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１２３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末５１mg（４．４%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６２Ｈ２６５Ｎ４９Ｏ４６としての理論値３６３６．１７、実測値３６３４．８。
【０１２４】
実施例１７：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号１９）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＡｌａであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＧｌｕであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１２５】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末２７mg（２．７%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２６０Ｎ４８Ｏ４７としての理論値３６２１．１１、実測値３６２０．４。
【０１２６】
実施例１８：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号２０）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＡｌａであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＬｙｓであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１２７】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末５３．５mg（４．６%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６２Ｈ２６５Ｎ４９Ｏ４５としての理論値３６２０．１７、実測値３６１８．８。
【０１２８】
実施例１９：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号２１）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＳｅｒであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＧｌｕであり、Ｒ２７がＬｅｕであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１２９】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末３３mg（３．３%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２５９Ｎ４７Ｏ４８としての理論値３６２２．１０、実測値３６２０．８。
【０１３０】
実施例２０：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＭｅＶａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号２２）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＭｅＶａｌであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｅｕであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１３１】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末５５mg（５．２%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２５９Ｎ４５Ｏ４６としての理論値３５６２．０９、実測値３５６１．０９。
【０１３２】
実施例２１：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＭｅＶａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号２３）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＡｌａであり、Ｒ５がＭｅＶａｌであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１３３】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末４９mg（４．５%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２６０Ｎ４６Ｏ４５としての理論値３５６１．１０、実測値３５６０．０。
【０１３４】
実施例２２：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＭｅＶａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号２４）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＳｅｒであり、Ｒ５がＭｅＶａｌであり、Ｒ１６がＡｒｇであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｙｓであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１３５】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末１３．８mg（１．２%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６２Ｈ２６４Ｎ４８Ｏ４５としての理論値３６０５．１６、実測値３６０４．０。
【０１３６】
実施例２３：Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＭｅＶａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２［Ａｃ−（配列番号２５）−ＮＨ２］、即ち、ＸがＡｃであり、ＹがＮＨ２であり、Ｒ２がＡｌａであり、Ｒ５がＭｅＶａｌであり、Ｒ１６がＧｌｎであり、Ｒ１８がＡｌａであり、Ｒ２７がＬｅｕであり、そしてＲ２８がＬｙｓである、式Ｉの化合物の製造。
【０１３７】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を実施例１の手順に従って固相合成および精製に付し、白色アモルファス粉末３０．２mg（２．８%）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ、Ｃ１６１Ｈ２５９Ｎ４７Ｏ４５としての理論値３５４６．０９、実測値３５４４．８。
【０１３８】
実施例２４：Ｓｕｐ−Ｔ１ ｃＡＭＰアゴニストアッセイ
ＶＰＡＣ２レセプターを発現するヒトＴリンパ球系セルラインＳｕｐ−Ｔ１をAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１９４２）から入手し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中の増殖培地に０．２〜２ｘ１０６細胞／mLの間の密度で維持した。増殖培地は、２５mM ＨＥＰＥＳ緩衝液および１０%牛胎児血清（Gemini Bioproducts）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen）であった。
【０１３９】
ＶＰＡＣ２アゴニスト化合物の活性を評価するため、対数増殖期の細胞をＲＴにおいて増殖培地で１回洗浄し、増殖培地１５０μL中に、ウェルあたり４ｘ１０４細胞の密度で９６ウェルプレートに撒いた。次に、増殖培地中に適当な濃度に調製した被験化合物５０μLを、指定されたウェルに添加した。ＲＴで５分後、各ウェルに溶解試薬１Ａ（cAMP Biotrak EIA system, Amersham Biosciences, RPN225）２５μLを加えることにより、細胞を溶解した。この９６ウェルプレートを振盪しつつＲＴで１０分間保持し、次いでｃＡＭＰを分析するまで４℃で保存した（２時間以内）。サイクリックＡＭＰレベルを、各溶解液１００μL中で、cAMP Biotrak Enzymeイムノアッセイ（ＥＩＡ）キットを使用し、製造者（Amersham Biosciences, RPN225）の指示に従って測定した。GraphPad Prismプログラム（GraphPad Software, Inc.）により提供されたシグモイド用量反応式に７濃度の用量反応データを当てはめることにより、各々のＶＰＡＣ２アゴニスト化合物の活性（ＥＣ５０値）を評価した。
【０１４０】
【表３】
2009542593.tif 000010
【０１４１】
実施例２５：好中球エラスターゼに対するペプチドの安定性
ペプチド類似体の蛋白分解安定性を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ ＭＳ）で評価した。ペプチド類似体をヒト好中球エラスターゼと共にインキュベートし、未消化類似体の量を適当な時点でＥＳＩ ＭＳにより測定した。ＨＰＬＣ保持時間および／又は分子量で区別できる限り、複数のペプチド類似体を一つの実験に含めることができた。Ａｃ−Ｈｉｓ Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＮＨ２を全実験において対照およびリファレンス標準として使用した。リファレンス標準と共に複数のペプチド類似体を同時使用することで、複数の実験にわたる酵素の蛋白分解忠実度における変動が補償可能となる。個々の未消化ペプチドについて得られた統合イオン電流を定量に使用した。半減期の算出のため、一次速度論的挙動であると仮定し、全ての計算をリファレンス標準の半減期に対して正規化した。
【０１４２】
ペプチド保存溶液を、水で２．５mg/mLの濃度に作製した。使用していない時は全ての保存溶液を−２０℃に維持した。作製した保存溶液中の相対的ペプチド含有量を測定するため、アリコートで逆相ＨＰＬＣを行い、観測されたＵＶ吸収をリファレンス標準由来の同等のアリコートと比較した。それに従ってペプチド類似体の濃度を調節した。蛋白分解的消化を行うため、ペプチドを０．１mg/mL濃度となるようにリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。６つの異なるペプチド類似体を一つの５０μL反応体積中に混合した。リファレンス標準を全ての実験にリファレンスおよび内部標準として加えた。エラスターゼ保存溶液からエラスターゼ（Human Neutrophil, Calbiochem, Cat#324681）を１〜２μg/mL濃度となるように加えた。ペプチド類似体の蛋白分解安定性の相違を補償するため、異なる量の酵素を選択した。前もって濃度１mg/mLのエラスターゼ保存溶液を水で作製した。融解および凍結サイクルの回数を制限することにより酵素活性をより良好に維持するため、酵素保存溶液の小アリコートを−２０℃に維持した。ＨＰＬＣ系（Agilent 1100 Series）のオートサンプラー内のオートサンプラー管中で、消化を周囲温度で実施した。経時変化を知るため、５μLアリコートを逆相ＨＰＬＣカラム（Phenomenex, Luna C18、３μ、１００Å、１５０ｘ２．００mm）に７０分間隔で注入した。開始時点のためには、蛋白分解酵素の添加直前にアリコートを注入した。一つの実験で、開始点を含めて合計８個の時点で記録ができた。５%〜３０%有機相の５０分間勾配を用いた逆相カラムでペプチドを分離した。水相は、水中０．０５%（v/v）トリフルオロ酢酸であり、有機相はアセトニトリル中０．０４５%（v/v）トリフルオロ酢酸であった。それぞれ２１４および２８０nmで吸光度を記録した。全てのカラム流出液をエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ABI 4000 QTrap LC/MS/MS System）のターボＶソース中に導入した。非分解ペプチド類似体の三重荷電イオンを全て含んだ質量範囲で、質量スペクトルをＱ３ＭＳモードで取得した。クロマトグラフィーの保持時間又は分子量の相違のいずれかによってペプチド類似体が明瞭に区別できることを保証するよう留意した。各々の未消化ペプチド類似体の相対量を、統合された総イオン電流から算出した。２．５Ｄａのウィンドウを選択し、製造者のソフトウェアを使用して個々のイオン電流を統合した。一次速度論的挙動をとると仮定することにより、個々のペプチド類似体の全ての半減期を算出し、リファレンス標準の半減期に関して正規化した。
【０１４３】
【表４】
2009542593.tif 000011
【０１４４】
実施例２６：雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＬＰＳ誘発性肺炎症に及ぼす化合物の効果。
エアロゾルＬＰＳ：リポ多糖（ＬＰＳ、滅菌生理食塩水中５００μg/mL）のエアロゾルに１５〜３０分間暴露する前にＣ５７ｂｌ／６マウスを媒質又は薬物で前処置する。このエアロゾルは、Pari Ultraジェット噴霧器によって発生させ、その出口を動物を入れた小さな透明プラスチック箱［ＨｘＷｘＤ、１０．７ｘ２５．７ｘ１１cm（４ｘ１０ｘ４．５インチ）］に接続する。２４時間後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行って細胞の炎症強度を測定する。ＢＡＬ手順は下記のように実施する。
【０１４５】
ＬＰＳの鼻腔内投与：リポ多糖の鼻腔内投与（滅菌生理食塩水中０．０５〜０．３mg/kg；総体積５０μL、２５μL/鼻孔）の前に、マウスを媒質又は薬物で前処置する。鼻腔内投与は、２５〜５０μLエッペンドルフピペットを用いて投与溶液の小滴を鼻孔に投与することにより行う。ＢＡＬを前記のようにＬＰＳチャレンジの３〜２４時間後に実施して、細胞の炎症強度を測定する。
【０１４６】
気管支肺胞洗浄：ＬＰＳ暴露の２４時間後、ペントバルビタール（８０〜１００mg/kg、ｉ．ｐ．）、ケタミン／キシザリン（８０〜１２０mg/kg/２〜４mg/kg、ｉ．ｐ．）又はウレタン（１．５〜２．４g/kg、ｉ．ｐ．）で動物を麻酔し、小さな頸部正中切開（１５〜２０mm）によって気管を露出させ、２０ゲージのチューブアダプターを用いてカニューレを挿入する。Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない滅菌ハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）２ｘ１mLで肺を洗浄する。３０秒後、穏やかな吸引により洗浄液を回収し、各動物についてプールする。次に試料を５℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心する。上清を吸引し、得られたペレット由来の赤血球細胞を蒸留水０．５mLで３０秒間溶解し、その後、残存細胞に対する浸透圧をＨＢＳＳ ５mLの添加によって保持する。試料を５℃、２０００ｒｐｍで１０分間再遠心し、上清を吸引する。得られたペレットをＨＢＳＳ １mLに再懸濁する。血球計又はコールターカウンターを使用し、細胞懸濁液のアリコートから、トリパンブルー（Sigma Chemical, St. Louis, MO）エクスクルージョンによって総細胞数を測定する。分画細胞のカウントのため、細胞懸濁液のアリコートをCytospinで遠心し（５分間、１３００ｒｐｍ；Shandon Southern Instruments, Sewickley, PA）、スライドを改良ライト染色（Hema 3 染色キット、Fisher Scientific）で固定および染色する。標準的形態学基準を用いて、光学顕微鏡の下で少なくとも３００の細胞を分類する。表３のデータは、好中球および総細胞についてＢＡＬ細胞ｘ１０４／動物、又はＬＰＳで誘発されたＢＡＬ液好中球増加反応の阻害パーセントとして表されている。
【０１４７】
【表５】
2009542593.tif 000012
【０１４８】
実施例２７：マウスにおけるメタコリン誘発性気管支攣縮に及ぼす化合物の効果
BUXCO Electronics, Inc(Troy, NY)社製全身プレチスモグラフ（ＷＢＰ）を使用して、自由に動ける覚醒マウスで呼吸機能を測定する。ＷＢＰ室では、呼吸機能を測定する間、動物は室内を自由に動くことができる。８室を同時に使用し、８匹のマウスを同時に測定できる。各々のＷＢＰ室をバイアスフローレギュレータに接続し、試験の間、円滑で一定の新鮮な空気の流れを供給する。各室に取り付けたトランスデューサーが、動物が呼吸する際に起こる圧力変化を検出する。圧力の信号をＭＡＸ IIひずみゲージプリアンプで増幅し、当該システム（BUXCO Electronics, Inc.）と共に供給されるBiosystem XAソフトウェアで分析する。各室内部の圧力変化は、試験前に注入口から正確に１mLの空気を注入し、コンピューターシグナルを適宜調節することにより、較正する。マウスをＷＢＰ室に入れ、試験前に１０分間順応させる。試験は、動物を１５分間自由に運動および呼吸させつつ以下のパラメータを測定することによって遂行する：１回換気量（mL）、呼吸速度（１分あたりの呼吸）、分時拍出量（呼吸速度を乗じた１回拍出量、mL/分）、吸気時間（秒）、呼気時間（秒）、ピーク吸気流（mL/秒）、およびピーク呼気流（mL/秒）。上に列挙した各パラメータのための生データをソフトウェアのデータベースに捕捉し、１分間に１回平均して、パラメータ毎に合計１５のデータ点を求める。この１５のデータ点の平均を報告する。累積体積（mL）は累積した体積（平均していない）であり、１５分間の試験セッションについての１回換気量を全て合計したものを表す。
【０１４９】
スパスモーゲンチャレンジの前、最中、および後の測定値を含めてこのプロトコルをカスタマイズし、Ｐｅｎｈを決定する。ネブライザーでエアロゾルをおよそ５〜１０分の間隔で投与（３０〜６０秒間の暴露）することにより、特定のスパスモーゲン（即ち、メタコリン（ＭＣｈ）、アセチルコリンなど）の用量反応効果を得る。
【０１５０】
マウス（ｂａｌｂ／ｃ）は、スパスモーゲンチャレンジの前に、上記のように、媒質（Ｈ２Ｏ中２%ＤＭＳＯ）又は媒質４mLに溶解した薬物を用いてエアロゾルにより２０分間処置する。チャレンジの５、３０および６０分後にＰｅｎｈを測定する。データは媒質と比較したＰｅｎｈの阻害パーセントとして報告する。
【０１５１】
【表６】
2009542593.tif 000013
【配列表】
2009542593000001.app
【国際調査報告】
2009542593.tif 000016
2009542593.tif 000017
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