(57)【要約】  潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に提供されるプロサイトトキシンを開示する。また標的細胞を選択的に破壊する組成物および方法を開示する。また患者の癌を治療する組成物および方法を開示する。またサイトトキシンに潜伏性を提供する組成物および方法を開示する。
2009510166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシン。
【請求項２】
前記細胞毒性ペプチドが細胞溶解ペプチドである請求項１に記載のプロサイトトキシン。
【請求項３】
前記細胞溶解ペプチドが、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｄｉｓｐａｒ）由来のアメーバポア（ａｍｏｅｂａｐｏｒｅ）、アメーバポアホモログ、ブレビニン（ｂｒｅｖｉｎｉｎ）−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン（ｅｑｕｉｎａｔｏｘｉｎ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）のエンテロトキシン、エスクレンチン（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎ）、グラヌリジン（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）、ビブリオ・パラハエモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）のインターメディリジン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）のロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィン（ｎｅｏｋｙｏｔｏｒｐｈｉｎ）、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ（ｐｅｒｆｒｉｎｇｏｌｙｓｉｎ  Ｏ）、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ならびにストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体からなる群より選択される請求項２に記載のプロサイトトキシン。
【請求項４】
前記細胞溶解ペプチドがアメーバポアである請求項３に記載のプロサイトトキシン。
【請求項５】
配列番号１０または配列番号１２を含む請求項４に記載のプロサイトトキシン。
【請求項６】
前記細胞溶解ペプチドがメリチンである請求項３に記載のプロサイトトキシン。
【請求項７】
配列番号２または配列番号４を含む請求項６に記載のプロサイトトキシン。
【請求項８】
前記潜伏関連ペプチドが、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前駆体ペプチドを含む請求項１に記載のプロサイトトキシン。
【請求項９】
前記タンパク質分解性切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である請求項１に記載のプロサイトトキシン。
【請求項１０】
前記タンパク質分解性切断部位が、ＭＭＰ２切断部位である請求項９に記載の前記タンパク質分解性切断部位。
【請求項１１】
請求項１に記載のプロサイトトキシンおよび薬剤学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
患者の癌を治療する方法であって、前記患者に、潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が前記潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシンの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記細胞毒性ペプチドが細胞溶解ペプチドである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞溶解ペプチドが、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー由来のアメーバポア、アメーバポアホモログ、ブレビニン−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエのエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン、アエロモナス・ハイドロフィラのエンテロトキシン、エスクレンチン、グラヌリジン、ビブリオ・パラハエモリティカスの溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウスのインターメディリジン、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィン、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ならびにストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体からなる群より選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞溶解ペプチドがアメーバポアである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロサイトトキシンが、配列番号１０または配列番号１２を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞溶解ペプチドがメリチンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロサイトトキシンが配列番号２または配列番号４を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記潜伏関連ペプチドが、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前記前駆体ペプチドを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質分解性切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質分解性切断部位が、ＭＭＰ２切断部位である請求項２０に記載方法。
【請求項２２】
癌が、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫／グリア芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、咽喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、頸癌、乳癌、ならびに上皮癌、腎臓癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血性癌、精巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌からなる群より選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
サイトトキシンに潜伏性を提供する方法であって、サイトトキシンと潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位とを共有結合することを含み、前記潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位が前記サイトトキシンに潜伏性を提供する方法。
【請求項２４】
前記細胞毒性ペプチドが細胞溶解ペプチドである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞溶解ペプチドが、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー由来のアメーバポア、アメーバポアホモログ、ブレビニン−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエのエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン、アエロモナス・ハイドロフィラのエンテロトキシン、エスクレンチン、グラヌリジン、ビブリオ・パラハエモリティカスの溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウスのインターメディリジン、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィン、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ならびにストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体からなる群より選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞溶解ペプチドが、アメーバポアである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロサイトトキシンが、配列番号１０または配列番号１２の配列を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞溶解ペプチドがメリチンである請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロサイトトキシンが、配列番号２または配列番号４からなる配列を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記潜伏関連ペプチドが、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前記前駆体ペプチドを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質分解性切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
癌細胞である標的細胞を選択的に破壊する方法であって、標的細胞を潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシンに接触させることを含み、前記潜伏関連ペプチドは、前記プロサイトトキシンが細胞溶解的な活性なコンフォメーションを形成することを阻止するように作用する方法。
【請求項３３】
前記細胞毒性ペプチドが、細胞溶解ペプチドである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞溶解ペプチドが、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー由来のアメーバポア、アメーバポアホモログ、ブレビニン−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエのエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン、アエロモナス・ハイドロフィラのエンテロトキシン、エスクレンチン、グラヌリジン、ビブリオ・パラハエモリティカスの溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウスのインターメディリジン、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィン、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ならびにストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体からなる群より選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞溶解ペプチドが、アメーバポアである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号１０または配列番号１２を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞溶解ペプチドが、メリチンである請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号２または配列番号４を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記潜伏関連ペプチドが、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前記前駆体ペプチドを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質分解性切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記タンパク質分解性切断部位が、ＭＭＰ２切断部位である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
癌細胞を囲む微小循環系に含まれる標的細胞を選択的に破壊する方法であって、標的細胞を潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が前記潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシンと接触させることを含み、前記潜伏関連ペプチドは、前記プロサイトトキシンが細胞溶解的な活性なコンフォメーションを形成することを阻止するように作用する方法。
【請求項４３】
前記細胞毒性ペプチドが、細胞溶解ペプチドである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞溶解ペプチドが、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー由来のアメーバポア、アメーバポアホモログ、ブレビニン−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエのエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン、アエロモナス・ハイドロフィラのエンテロトキシン、エスクレンチン、グラヌリジン、ビブリオ・パラハエモリティカスの溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウスのインターメディリジン、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィン、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ならびにストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体からなる群より選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞溶解ペプチドが、アメーバポアである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
配列番号１０または配列番号１２を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞溶解ペプチドが、メリチンである請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
配列番号２または配列番号４を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記潜伏関連ペプチドが、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前記前駆体ペプチドを含む請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質分解性切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記タンパク質分解性切断部位が、ＭＭＰ２切断部位である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＭＭＰ２を産生する癌細胞である標的細胞を選択的に破壊する方法であって、標的細胞を潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が前記潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシンと接触させることを含み、前記潜伏関連ペプチドは、前記プロサイトトキシンが細胞溶解的な活性なコンフォメーションを形成することを阻止するように作用する方法。
【請求項５３】
前記ＭＭＰ２を産生する癌細胞が、ＭＭＰ２を産生する腫瘍の微小血管内皮細胞である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞毒性ペプチドが、細胞溶解ペプチドである請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞溶解ペプチドが、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー由来のアメーバポア、アメーバポアホモログ、ブレビニン−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエのエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン、アエロモナス・ハイドロフィラのエンテロトキシン、エスクレンチン、グラヌリジン、ビブリオ・パラハエモリティカスの溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウスのインターメディリジン、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィン、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ならびにストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体からなる群より選択される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞溶解ペプチドが、アメーバポアである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
配列番号１０または配列番号１２を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞溶解ペプチドが、メリチンである請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
配列番号２または配列番号４を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記潜伏関連ペプチドが、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前記前駆体ペプチドを含む請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記タンパク質分解性切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記タンパク質分解性切断部位が、ＭＭＰ２切断部位である請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞を選択的に破壊する方法および組成物に関する。詳細には、本発明は標的細胞が活性化されたサイトトキシンにより破壊されるように、標的細胞に特異的にサイトトキシンに変換できるプロサイトトキシンを製造および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍治療、特に癌治療の現在の方法は依然として最適とは言えず、重篤な合併症を伴うことが多い。実際に、ほぼすべての既知の治療法は、重篤な副作用を有し、これは、腫瘍または癌細胞の破壊または除去において特異性および完全性を欠くことにより生じることが最も多い。
【０００３】
例えば、外科手術は、患者から癌細胞を取り除く一般的な手順であるが、除去が不完全であることが多く、患者の外観を損なうかまたは正常な身体機能を妨げる。同様に、化学療法および放射線治療はしばしば無差別に正常な細胞を破壊し、望ましくない副作用を生じるが、多くの癌細胞は影響を受けないままである。化学療法剤、特に代謝拮抗剤は、連続的に有糸分裂を行っているまたは有糸分裂の用意をしつつある癌細胞に対して様々な程度に有効ではあるが、静止期（Ｇ０）の癌細胞に対しては効果的でない。
【０００４】
癌治療は、癌細胞を患者の体からできる限り完全に取り除くことができれば効果的である。この目標を達成するために、連続的または継続的な用量が患者に投与される。ほとんどの利用可能な化学療法剤は正常細胞にも毒性であるため、細胞毒性作用物質の用量は悪性細胞の最大の破壊を達成する許容限度の範囲に調整され、腫瘍の再増殖速度が腫瘍の殺傷を超えないような用量の間でなければならない。したがって、副作用の減少を伴う高い効率を達成するために、化学療法剤は高い標的細胞特異性および高い標的細胞毒性または潜在的能力を有さなければならない。癌の治療に関する多くの研究にもかかわらず、現在利用可能な治療法は相当量の症例で効果がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、癌細胞の細胞周期に左右されない改善された癌治療および多くの方法が必要である。本発明はこれらの要求を満たし、さらに他の関連する長所を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、標的細胞を選択的に破壊する方法および組成物に関する。詳細には、本発明は標的細胞が活性化されたサイトトキシンにより破壊されるように、標的細胞に特異的にサイトトキシンに変換できるプロサイトトキシン（サイトトキシンが不活性型で維持される）を製造および使用する方法に関する。
【０００７】
したがって、従来の治療で特に癌を治療することに関する上述した欠点の一部またはすべてを克服することが、本発明の目的である。このために、プロサイトトキシンを製造する組成物および方法が記載される。典型的には、例えば潜伏関連ペプチド（latency associated peptide）（ＬＡＰ）にペプチド結合によって結合した細胞毒性作用物質で構成され、このペプチド結合が腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性であるプロサイトトキシンが提供される。したがって、このプロサイトトキシンは、Ｖ−Ｙ−Ｘと表すことができ、Ｖは細胞毒性作用物質であり、Ｙはタンパク質分解性切断部位であり、ＹはＬＡＰである。この細胞毒性作用物質は、例えば細胞毒性ペプチドであってもよい。ペプチド結合は、タンパク質分解性切断部位であってもよい。本発明のプロサイトトキシンは、細胞毒性ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合した標的分子を有してもよい。
【０００８】
その治療的有効性を増強するために、サイトトキシンをプロサイトトキシンとして知られている無毒性の形態になるように、このサイトトキシンは本発明にしたがって修飾される。プロサイトトキシンは、細胞毒性作用物質の周りに保護層を与えることにより無毒性にできる細胞毒性作用物質であり、以下「ケージング（ｃａｇｉｎｇ）」と呼ぶ。ＬＡＰは医薬的活性剤の周囲に保護「ケージ」を与えることができ、これにより活性剤を遮蔽し、細胞表面の他の分子またはその活性にとって重要な分子とのその相互作用を妨げたりまたは阻止する。このプロサイトトキシンは、電荷中性化および／またはペプチド毒性を与えるコンフォメーションの形成を立体的に阻害することにより無毒性にできる細胞毒性ペプチドであってもよい。詳細には、プロサイトトキシンはペプチド結合によってＬＡＰに結合した細胞毒性ペプチドを含んでもよく、前記ペプチド結合は腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性である。このＬＡＰは、細胞毒性ペプチドが活性なコンフォメーションを形成するのを妨げる。例えば、プロサイトトキシンが標的細胞に接触するとき、腫瘍特異的プロテアーゼ、例えば腫瘍細胞細胞膜または細胞外マトリックスに存在するプロテアーゼが、ＬＡＰとサイトトキシンの間のペプチド結合を切断し、それにより細胞毒性ペプチドがポアコンフォメーション（ｐｏｒｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を形成して細胞膜を破壊することを可能にする。したがって、ＬＡＰを含むように細胞毒性ペプチドを修飾することを含むプロサイトトキシンを製造する方法が記載される。
【０００９】
また、開示されたプロサイトトキシンおよび医薬として適切な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１０】
さらに、標的細胞を選択的に破壊する方法が提示される。開示された方法は、典型的には標的細胞を、ＬＡＰにペプチド結合により結合した細胞毒性作用物質を有するプロサイトトキシンに接触させることを伴い、このペプチド結合は標的特異的プロテアーゼによる切断に感受性である。標的細胞は、癌細胞を囲む微小循環系および癌細胞に含まれる細胞であってもよい。
【００１１】
さらに患者の癌を治療する方法が提供される。一般にこの方法は、患者にプロサイトトキシンの治療的有効量を投与することを含む。ある実施形態では、プロサイトトキシンは、アメーボポア（ａｍｏｅｂｏｐｏｒｅ）、メリチンまたはそれから由来する細胞溶解ペプチドに基づいてもよい。
【００１２】
さらなる方法は、サイトトキシンに潜伏性を与えることにより提供される。一般にこの方法は、潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位をサイトトキシンと共有結合することを含み、前記潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位は、前記サイトトキシンに潜伏性を提供する。
【００１３】
図の説明
図１は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞でｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンの検出を示す図である。ＬＡＰ  ＣＨＯ（ｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンでトランスフェクトした）溶解物およびＣＨＯ（トランスフェクトしていない）溶解物３０μｇ［全体を通じてμｇ／μｌを探索］を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。５０ｎｇのｈＬＡＰを、陽性対照として使用した。
図２は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞における、ＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン産生のメトトレキセートによる誘導を示す図である。正常なトランスフェクション培地の存在下で、ＣＨＯ細胞をＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を１０％ＦＢＳおよび５０ｎＭ  ＭＴＸを含む培地で培養した。ＦＢＳの量を培地で段階的に１％まで減した。次いで培地のＭＴＸの量を増加させて、細胞をタンパク質を産生するように誘導した。種々のＭＴＸ濃度の細胞から溶解物を得て、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。各ＭＴＸ濃度について、約３０μｇの溶解物を分析し、かつ５０ｎｇのｈＬＡＰ（ウェスタンブロット陽性対照）を分析した。
図３は、非変性条件下でｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの溶解物および上清の分析を示す図である。培地中に存在するｈＬＡＰ融合タンパク質（ｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン）を、アフィニティークロマトグラフィーによって分析前に濃縮した。３０μｇの融合タンパク質溶解物を分析し、５０ｎｇのｈＬＡＰを陽性対照として使用した。すべてのサンプルは、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。
図４は、部分的に精製したｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン融合タンパク質の分析を示す図である。精製したｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン融合タンパク質を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。この融合タンパク質は、ウォーターズＨＰＬＣシステムのサイズ排除クロマトグラフィーにより、部分的に精製した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の化合物、組成物、製品、装置および／または方法を開示および記載する前に、特に明記しない限り、これらは特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー法に限定されず、または特に明記しない限り特定の試薬に限定されず、もちろん変化し得ることを理解すべきである。また本明細書において使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のみで使用され、限定を意図しないこともまた理解すべきである。
【００１５】
定義
本明細書および特許請求の範囲に使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、他に明確に記載のない限り、複数の対象を含む。したがって、例えば「製薬担体」には、２またはそれ以上のこのような担体などの混合物が含まれる。
【００１６】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして、本明細書において示すことができる。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を用いて値が近似値として表される場合、特定の値は、別の実施形態を形成することは理解されよう。さらに、それぞれの範囲の終点は、他の終点に関して、および他の終点とは独立にどちらも有意であることは理解されよう。また、本明細書において開示された多数の値があり、それぞれの値も、値そのものに加えて、「約」その特定の値のように本明細書において開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合には、「約１０」も開示される。また、ある値が開示される場合、当業者により適切に理解されるように、その値「よりも小さいまたは等しい」、「その値より大きいまたはその値に等しい」および値間の可能な範囲も開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０よりも小さいまたは１０に等しい」ならびに「１０より大きいまたは１０に等しい」も開示される。また、本明細書全体を通してデータは、多数の異なる形式で提供され、このデータは終点および起点、ならびにこのデータポイントの任意の組合せの範囲を示すことも理解されよう。例えば、ある特定のデータポイント「１０」およびある特定のデータポイント１５が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５に等しいまたはこれより大きい、１０および１５よりも小さい、１０および１５に等しいかまたはこれよりも小さい、および１０および１５に等しいは、同様に１０および１５間も開示されたと考えられることが理解されよう。
【００１７】
本明細書およびその後の請求の範囲において、いくつかの用語が参照され、それらは以下の意味を有するものとして定義される。
【００１８】
「所望による」または「所望により」とは、記載する事象または状況が起こることも起こらないこともあること、およびその記載が上記事象または状況が起こる例も起こらない例も含むことを意味する。
【００１９】
「プライマー」は、あるタイプの酵素による操作を支援することが可能で、酵素による操作が起こりうるように１つの標的核酸とハイブリッド形成できるプローブの１つのサブセットである。プライマーは、酵素による操作を妨げない当該技術分野において入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体またはアナログを任意に組み合わせて製造することができる。
【００２０】
「プローブ」は、ある標的核酸と典型的には配列に特異的に、例えばハイブリッド形成によって相互作用することができる分子である。核酸のハイブリッド形成は、当該分野で十分に理解され、本明細書中に記載されている。典型的には、プローブは当該技術分野において入手可能であるヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体またはアナログの任意の組合せで製造することができる。
【００２１】
文脈により特記しない限り、用語「プロサイトトキシンと標的細胞とを接触させること」とは、標的細胞により発現したプロテアーゼまたは細胞外マトリックスに存在するプロテアーゼが、プロサイトトキシンのタンパク質分解性切断部位を切断でき、これによりサイトトキシンからＬＡＰを遊離し、それによりサイトトキシンが活性になることを可能にして、標的細胞でその機能を発揮するようにプロサイトトキシンおよび標的細胞を互いに十分に近傍に導くことを意味する。
【００２２】
本明細書において用いられる用語に関して、当業者であれば「標準」ペプチド結合とは、ペプチド鎖中で１つのアミノ酸のαカルボキシル群と次のアミノ酸のαアミノ群の間に形成され、ペプチド配列は、そのアミノ末端からそのカルボキシル末端へと読まれることは認識されるであろう。
【００２３】
文脈により特記しない限り、用語「ＲＧＤ」は、ペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを意味するだけでなく、これはインテグリンとの特異的相互作用を媒介する最小またはコアペプチド配列のクラスを一般的に意味する。したがって、「ＲＧＤ標的配列」は、インテグリン結合領域のすべての種類を包含する。
【００２４】
さらに文脈により特記しない限り、用語「ＮＧＲ」は、ペプチド配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを意味するだけでなく、血管系の細胞上に見出されるインテグリンシグナル配列との特異的相互作用を媒介する最小またはコアペプチド配列のクラスを一般的に意味する。例えば、あるＮＧＲ標的配列は、特定のインテグリンを結合するために用いることができ、血管内皮細胞および新生血管系（ｎｅｏ−ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）の他の細胞に対する有用な標的分子として用いることができる。したがって、「ＮＧＲ標的配列」は、インテグリン結合領域のすべての種類を包含する。
【００２５】
本出願を通じて、種々の文献が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野における技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願に参照として本明細書に組み込まれる。開示された参考文献はまた、この参考文献が依存する本文中で述べられる文献中に含まれる物質に関する本明細書の引用文献として、個別におよび具体的に組み込まれる。
【００２６】
組成物
開示された組成物ならびに本明細書において開示された方法の範囲内で使用される組成物それ自体の調製に用いられる成分が開示される。これらおよび他の物質が本明細書において開示され、これらの物質の組合せ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、各々の様々な個別的および総体的な組合せの特定の参考文献ならびにこれらの化合物の並べ換えは明確に開示されないかも知れないが、各々が本明細書に特に意図され記載されていることは理解されよう。例えば、ある特定のプロサイトトキシンが開示されて論じられ、プロサイトトキシンを含む多数の分子に製造され得る多数の修飾が論じられる場合、プロサイトトキシンのすべての組合せおよび並べ換えならびに異なる旨を特に示されない限り可能である修飾が特に意図される。したがって、あるクラスの分子Ａ、ＢおよびＣが開示される場合、同様にあるクラスの分子Ｄ、ＥおよびＦならびにある組合せ分子のＡ〜Ｄの例が開示される場合には、たとえ各々が個別に列挙されないとしても、各々は個別にまたは集合的に意図された意味の組合せ、Ａ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜Ｅ、およびＣ〜Ｆが開示されたとみなされる。同様に、これらのすべてのサブセットまたは組合せも開示される。したがって、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、およびＣ〜Ｅのサブグループが開示されたとみなされる。この概念は、本出願のすべての態様に適用され、限定されるものではないが、開示された組成物を製造し使用する方法の工程を含む。したがって、実施できる様々な追加工程がある場合、これらの追加工程のそれぞれは、任意の特定の実施形態または開示された方法の実施形態の組合せで実施され得ることが理解されよう。
【００２７】
ある標的細胞を選択的に破壊する方法および組成物が開示される。詳細には、本発明は腫瘍細胞が活性化されたサイトトキシンにより破壊されるように、腫瘍細胞の部位でサイトトキシンに変換できるプロサイトトキシンを製造および使用する方法に関する。
【００２８】
したがって、従来の治療で特に癌を治療することに関する上述した欠点の一部もしくはすべてを克服することが、本発明の目的である。このために、プロサイトトキシンを製造するための組成物および方法が記載される。
【００２９】
典型的には、潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）にペプチド結合によって結合した細胞毒性作用物質で構成され、このペプチド結合が腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性であるプロサイトトキシンが提供される。したがって、プロサイトトキシンは、Ｖ−Ｙ−Ｘと表すことができ、Ｖは細胞毒性のペプチドであり、Ｙはタンパク質分解性切断部位であり、ＹはＬＡＰである。この細胞毒性作用物質は、細胞毒性ペプチドであってもよい。このペプチド結合は、タンパク質分解性切断部位であってもよい。また本発明のプロサイトトキシンは、この細胞毒性ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合した標的分子を有してもよい。
【００３０】
細胞毒性ペプチドは、細胞溶解ペプチドであってもよい。サイトトキシンとしては、以下に限定されないが、タイプＩ細菌外毒素、タイプＩＩ細菌外毒素、タイプＩＩＩ細菌外毒素、Ａｅ  Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｄｉｓｐａｒ）由来のアメーバポア（ａｍｏｅｂａｐｏｒｅ）、アメーバポアホモログ、ブレビニン（ｂｒｅｖｉｎｉｎ）−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン（ｅｑｕｉｎａｔｏｘｉｎ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）のエンテロトキシン、エスクレンチン（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎ）、グラヌリジン（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）、ビブリオ・パラハエモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）のインターメディリジン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）のロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、Met-エンケファリン、ネオキョートルフィン（ｎｅｏｋｙｏｔｏｒｐｈｉｎ）、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫ−リジン、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、パーフォリン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ（ｐｅｒｆｒｉｎｇｏｌｙｓｉｎ  Ｏ）、シータトキシン、ファロリシン、ファロトキシン、ストレプトリシン、ポア形成細胞溶解ペプチドのアナログ、およびポア形成細胞溶解ペプチドの誘導体を挙げることができる。
【００３１】
例えば、タイプＩ細菌外毒素は、サイトトキシンとして用いることができる。さらに、タイプＩ細菌外毒素は、腫瘍細胞細胞膜または腫瘍微小環境の標的領域と融合することができる。
【００３２】
またタイプＩＩ細菌外毒素は、サイトトキシンとして用いることもできる。さらに、タイプＩＩＩ細菌外毒素は、それ自体の膜貫通領域を保持することができるか、またはこの毒素はＴＡＴのような異なる領域と融合することができる。
【００３３】
プロサイトトキシンの例は、以下の構造を有する。すなわち、（１）Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＩＩｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−［Ｙ］−（Ｘ）、および（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−［Ｙ］−（Ｘ）であり、（Ｘ）はＬＡＰであり、［Ｙ］はどちらの方向にも配向できるタンパク質分解性切断部位である。
【００３４】
このＬＡＰは、例えばＴＧＦβ−１、１．２、２、３、４または５の前駆体ペプチドであってもよい。またこのＬＡＰは、ヒトＴＧＦβ−１、２または３（配列番号２３〜２５）の前駆体ペプチドであってもよい。またこのＬＡＰは、ニワトリＴＧＦβ−４（配列番号２６）の前駆体ペプチドであってもよい。またこのＬＡＰは、カエルＴＧＦβ−５（配列番号２７）の前駆体ペプチドであってもよい。
【００３５】
タンパク質分解性切断部位は、ＭＭＰ切断部位、ＰＳＡ切断部位またはＧＧＨ切断部位であってもよい。例えば、ＭＭＰタンパク質分解性切断部位は、ＭＭＰ１、２、３、７、８、９、またはＭＴ−１−ＭＭＰ切断部位であってもよい。またＭＭＰタンパク質分解性切断部位は、配列番号：２８〜１００に列挙した任意のＭＭＰタンパク質分解性切断部位であってもよい。
【００３６】
さらに、タンパク質分解性切断部位は、Ｖｏｌｋｅｌらによって記載された配列を有するＰＳＡ切断部位であってもよい（前立腺特異抗原により活性化されたヒト凝固因子Ｘ変異体のエンジニアリング、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００５、第２９巻、１号、１９〜３０頁（１２））。
【００３７】
プロサイトトキシンは、さらに標的分子を含むことができる。例えば、この標的分子は標的細胞または組織と、または標的細胞または組織に、相互作用し、結合し、付着し、組み合わせ、接合し、連結することができる。より詳細には、この標的分子は抗フィブロネクチンＥＤ−Ｂ抗体の新生血管標的配列であり得る。この標的分子は、以下に記載のようにＲＧＤまたはＮＧＲ標的配列である得る。特定の組織を標的にできる任意の分子を本発明のプロサイトトキシンの標的分子として使用することができる。例えば、標的分子は、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ−１；Ｍｕｃ−１糖タンパク質の２０個のアミノ酸のコア反複が乳癌細胞および膵癌細胞上に存在する）、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子産物、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆ癌遺伝子産物、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、ｇｐ７５、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１＆２、ＨＰＶ−Ｆ４、６、７、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＰＶ−１６、ＭＵＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ５３、ｒａｓ癌遺伝子産物、ＨＰＶ  Ｅ７、ウィルムの腫瘍抗原−１（Ｗｉｌｍ’ｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）、テロメラーゼ、メラノーマガングリオシド、または単純な膜貫通配列と相互作用する抗体であってもよい。
【００３８】
またプロサイトトキシンは、サイトトキシン活性の立体的阻害剤を含むことに加えて電荷を中性化することもできる。例えば、［Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｒ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｒ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｒ）−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ］−（Ｘ）が提供され、本明細書に記載されるように、（Ｘ）はこのペプチド結合により括弧で示したペプチドに結合するＬＡＰであり、括弧で示したこのペプチドは、どちらの方向にも配向でき、ペプチド結合は腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性であり、かつＲは隣接したリジン残基の修飾されていないε−アミノ基、［ε−γ］−Ｇｌｕ、［ε−γ］−Ｇｌｕ−［α−γ］−（Ｇｌｕ）１−３、［ε−α］−（Ｐｈｅ）１−３、［ε−α］−（Ｔｙｒ）１−３、［ε−α］−（Ｔｒｐ）１−３、［ε−α］−（Ｌｙｓ）１−３および［ε−α］−（Ａｒｇ）１−３からなる群から独立して選択され、［ε−γ］は、リシンのイプシロンアミノ基と隣接したグルタミン酸のガンマカルボキシル基間のペプチド結合を示し、［α−γ］は、第一グルタミン酸のαアミノ基と第２のグルタミン酸のガンマカルボキシル基間のペプチド結合を示し、［ε−α］は、リシンのイプシロンアミノ酸と指示されたアミノ酸のαカルボキシル基間のペプチド結合を示し、かつ下付き数字は、指定されアミノ酸の付加的な数を通常のペプチド結合により第一に結合することができることを示す。
【００３９】
プロサイトトキシン
サイトトキシンの治療的有用性を増強するために、これをプロサイトトキシンとして知られている無毒性形態になるように、サイトトキシンは本発明にしたがって修飾される。本発明の１つの実施形態では、プロサイトトキシンは、電荷中性化および／またはペプチドを毒性にするコンフォメーションの形成を立体的に阻害することにより無毒性にできる細胞毒性ペプチドである。あるいは、このプロサイトトキシンは、細胞毒性ペプチドの周りに保護層またはシェルを提供する（「ケージング」）ことにより無毒性にできる細胞毒性ペプチドであってもよい。これにより細胞毒性ペプチドを遮蔽し、細胞表面の他の分子またはその活性にとって重要な分子とのその相互作用を妨げたりまたは阻止する。詳細には、このプロサイトトキシンは、ペプチド結合によりＬＡＰに結合した細胞毒性ペプチドを含み、前記ペプチド結合は、腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性である。ＬＡＰは、細胞毒性ペプチドが活性なコンフォメーションを形成することを妨げる。例えば、プロサイトトキシンが標的細胞に接触するとき、腫瘍特異的プロテアーゼは、ＬＡＰとサイトトキシンの間のペプチド結合を切断し、それにより細胞毒性ペプチドがポアコンフォメーションを形成して細胞膜を破壊することを可能にする。したがって、ＬＡＰを含むように細胞毒性ペプチドを修飾することを含むプロサイトトキシンを製造する方法も記載される。
【００４０】
多数の修飾方法が利用可能であり、その適応性は、サイトトキシンの構造的特性に依存するであろう。例えば、細胞毒性ペプチドがペプチドを毒性にするコンフォメーションを形成することを妨げるように、細胞毒性ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のいずれかにＬＡＰを付け加えることができ、したがって細胞毒性ペプチドを無毒性にする。また、ＬＡＰが細胞毒性ペプチドの周囲に保護シェルを形成し（「ケージング」）、これにより細胞毒性ペプチドを遮蔽し、細胞表面の他の分子またはその活性にとって重要な分子とのその相互作用を妨げたりまたは阻止するように、細胞毒性ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のいずれかにＬＡＰを付け加えることもできる。またＬＡＰはサイトトキシンのαヘリックス構造が形成されることを立体的に阻止できる。さらに細胞毒性ペプチドは負に荷電するアミノ酸を含むように修飾でき、これにより毒性のポアコンフォメーションが形成されるのを阻止できる。
【００４１】
本発明のプロサイトトキシンは、潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性作用物質を含み、タンパク質分解性切断部位が、潜伏関連ペプチドと細胞毒性作用物質の間に設けられている。ある実施形態では、この細胞毒性作用物質は、上記のような細胞毒性ペプチドまたは細胞溶解ペプチドであってもよい。他の実施形態では、この細胞毒性作用物質は、メリチン、メリチンアナログ、またはメリチン誘導体であってもよい。
【００４２】
例えば、本発明のプロサイトトキシンは、以下の構造、すなわちＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−［Ｙ］−（Ｘ）を含み、（Ｘ）は、ＬＡＰであり、［Ｙ］はどちらの方向にも配向できるタンパク質分解性切断部位である。このＬＡＰは、ＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前駆体ペプチドからなる群から選択し得る。またこのＬＡＰは、ヒトＴＧＦβ−１、２または３（配列番号２３〜２５）の前駆体ペプチドであり得る。またこのＬＡＰは、ニワトリＴＧＦβ−４（配列番号：２６）の前駆体ペプチドであり得る。またこのＬＡＰは、カエルＴＧＦβ−５（配列番号：２７）の前駆体ペプチドであり得る。
【００４３】
このタンパク質分解性切断部位は、ＭＭＰ切断部位、ＰＳＡ切断部位またはＧＧＨ切断部位であってもよい。例えば、ＭＭＰタンパク質分解性切断部位は、ＭＭＰ１、２、３、７、８、９または１０切断部位であり得る。１つの実施形態では、このＭＭＰ切断部位はＭＭＰ２切断部位である。［Ｙ］における標的特異的プロテアーゼによる切断で、Ｃ末端にポア形成を妨げない少数の追加のアミノ酸を有するメリチンペプチドを得ることができる。
【００４４】
また本発明において、別の選択性の基準を付け加える標的分子が意図される。この標的分子は、細胞内にまたはその近くにプロサイトトキシンを導くことができ、ならびにＬＡＰとして作用して不活性コンフォメーションで細胞溶解ペプチドを維持することができる。本発明の標的分子は、シグナル配列または抗体からなる群から選択することができる。ある実施形態では、この標的分子は、ＲＧＤ標的配列であってもよい。
【００４５】
したがってまた、立体的な決定因子に加えてまたはその代わりに、電荷決定因子も重要であることが理解されよう。ポア形成ペプチドの正電荷がその細胞溶解活性に含まれる場合、電荷を除去／中和することは、ペプチドを無毒性にする。この正電荷の部分的な中和でさえ効果的であると考えられる。したがって、ポア形成ペプチドの正電荷を除去／中和することに加えて、構造が形成されることを立体的に阻止することにより、サイトトキシンのαヘリックス構造を破壊することも本明細書において開示される。したがって、たとえ中和が達成されなくても下記の修飾のいくつかは、トキシンを不活性化してプロトキシンを作成する立体的な変化を生じるであろう。
【００４６】
本発明のプロ細胞毒性ペプチドは、保護、脱保護および開裂技術ならびにそれぞれの特異的アミノ酸またはペプチドに適切な試薬を用いる標準固相法により、化学的に合成され得る。マニュアルおよび自動化した（例えば、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ．４３０Ａ）固相法の組合せを、本発明の新規のペプチドの合成に用いることができる。固相法に関する背景につては、Ａｎｄｒｅｕら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：６４７５〜６４７９；Ａｎｄｒｅｕら、（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：１６８３〜１６８８；Ｆｉｎｋら、（Ｊｕｎｅ  １９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３３：４１２〜４２１；Ｆｉｎｋら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６２６０〜６２６７を参照のこと、これらのそれぞれは参照として本明細書中に組み込まれる。
【００４７】
本発明のプロサイトトキシンのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を、γ結合したグルタミン酸残基を有していないどちらかのＮ末端またはＣ末端にＤアミノ酸を付加することにより改善することができる。一部のｉｎ  ｖｉｖｏでの不安定性は、プロサイトトキシンがサイトトキシンに変換されたとき生じ得る起こりうる有害な副作用の危険を減少させる可能性があるので有利なことがあろう。この処置は、これらの製品が所望の生理学的機能を実行する前に、天然に存在する酵素により加水分解を受ける非経口的または経口的な条件下で使用される本発明の製品で特に有用である。
【００４８】
細胞毒性ペプチド
多くの天然および合成細胞毒性ペプチドが、当分野で公知である。一部ものは、病原細菌および微生物の他の種類に対する治療薬として有用であり、これらは昆虫、カエルおよび他の動物から分離され得る。特定の例には、アラメシシン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎｓ）、アタシン（ａｔｔａｃｉｎｓ）、バクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎｓ）、セクロピン（表１、セクロピンＡ、ＢおよびＣのアミノ酸配列を参照のこと）、バチルス  チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｇｉｅｎｓｉｓ）のＣｙｔＡおよびＣｙｔＢ、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）、エンテロシンＬ５０（ｅｎｔｅｒｏｃｉｎ  Ｌ５０）（ペディオシン  Ｌ５０（ｐｅｄｉｏｃｉｎ  Ｌ５０））、ランチビオティック（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、ＰＧＬａ、プロテグリンス（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎｓ）、サペシン（ｓａｐｅｃｉｎ）、およびザルコトキシンを含む。
【００４９】
細胞溶解ペプチド
ある実施形態では、細胞毒性ペプチドは、細胞溶解ペプチドである。ポア形成またはチャネル形成ペプチドとしても知られる細胞溶解ペプチドは、典型的には接触するとすぐに、細胞膜を破壊し、細胞溶解と細胞死を引き起こす。微生物、昆虫および高等動物由来の多くの天然に存在する細胞溶解ペプチドが、一般に知られている。それらは赤血球および他の真核細胞を溶解させるので溶血素と呼ばれることが多い。これらのトキシンは、タイプＩ細菌外毒素、タイプＩＩ細菌外毒素、タイプＩＩＩ細菌外毒素、Ａｅ  Ｉならびにイソギンチャクの他の細胞溶解素、エロリジン、アマトキシン、エントアメーバ・ディスパー由来のアメーバポア、アメーバポアホモログ、ブレビニン−１Ｅ、ブレビニン−２Ｅ、バルバトリジン、エンテロコッカス・フェカーリスの細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリアトキシン、ビブリオ・コレラエのエルトール細胞溶解素、イクイナトキシン、アエロモナス・ハイドロフィラのエンテロトキシン、エスクレンチン、グラヌリジン、ビブリオ・パラハエモリティカスの溶血素、ストレプトコッカス・インターメディウスのインターメディリジン、レンチウイルス細胞溶解ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのロイコトキシン、マゲイニン、メリチン、細胞膜関連リンホトキシン、メトエンケファリン、ネオキョートルフィンおよびネオキョートルフィンフラグメント（１−４）、ＮＫ−リジン、パラダキシン、パーフォリン（特にそのアミノ末端）、クロストリジウム・パーフリンジェンスのパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯまたはシ−タトキシン）、ファロリシン、ファロトキシン、ストレプトリシンを含む。またメリチンの様な一部の溶血素も、細菌を殺すことが知られている。他の細胞溶解ペプチドは、Ｄ、Ｌ−α−アミノ酸環状ペプチドを含んでいる。Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４１２：４５２〜４５５（２００１）。
【００５０】
例えば、タイプＩ細菌外毒素は、サイトトキシンとして用いることができる。さらにタイプＩ細菌外毒素は、腫瘍細胞細胞膜または腫瘍微小環境の標的領域と融合することができる。
【００５１】
またタイプＩＩ細菌外毒素は、サイトトキシンとして用いることもできる。さらに、タイプＩＩＩ細菌外毒素は、それ自体の膜貫通領域を保持することができるか、またはこの毒素はＴＡＴのような異なる領域と融合することができる。
【００５２】
ポア形成細胞溶解ペプチド
細胞溶解ペプチドは、ポア形成またはチャネル形成細胞溶解ペプチドであってもよい。多くの細胞溶解ペプチドは、非特異的に、または特異的なレセプターへのいずれかで細胞膜と結合し、個別的な大きさの膜貫通ポアを形成するサイトトキシンの群に属するポア形成トキシンである。ほとんどの毒性のポア形成ペプチドは、その細胞溶解活性に共通な特徴を利用する。例えば、非常に多くのこれらのトキシンは、標的細胞膜にトキシンのモノマーが結合して挿入し、次いで中心部を取り囲んで樽側板様に凝集し、水をポア注入する「樽−側板（ｂａｒｒｅｌ−ｓｔａｖｅ）」メカニズムを介して細胞を溶解させる。このポアが、標的細胞の急速で不可逆的な電解質平衡異常を生じて細胞の破壊に導く。
【００５３】
哺乳動物および細菌細胞の両方で作用する大部分のポア形成ペプチドは、その細胞溶解活性に両親媒性αヘリックス構造および正味の正電荷を必要とする。このペプチドの陽イオン部分と脂質頭部基の間の強い静電的相互作用が細胞膜を弱めて、疎水性のαヘリックスのペプチドの挿入を容易にする。したがって本発明に記載の細胞毒性ペプチドは、細胞溶解性で、直鎖α−ヘリックスのペプチドあり得る。一般にこれらの細胞毒性ペプチドは天然の形態では、その細胞溶解活性に関与する正味の正電荷を有している。
【００５４】
メリチン
本発明１つの実施形態によれば、この細胞溶解ペプチドは、メリチンまたはそれらのアナログもしくは誘導体であり得る。メリチンはハチ毒から分離され、アミノ酸２６個の両親媒性αヘリックスである（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：４６７１〜４６７８；Ｄｅｍｐｓｅｙら、５（１９９１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８１：２４０〜２４４）。メリチンのアミノ酸配列を表１および配列番号６に示す。残基１〜２０は大部分が疎水性であり、残基２１〜２６は親水性および塩基性である。メリチンは抗生物質活性を有するが、哺乳動物においては、これは白血球、赤血球および様々な他の細胞に対して溶解性である。また本発明の範囲内であるメリチンに類似した化合物には、マルハナバチ毒のボンボリチン（ｂｏｍｂｏｌｉｔｉｎ）（アミノ酸１７個の両親媒性αヘリックス）、ハチ毒のマストパラン（アミノ酸１４個の両親媒性αヘリックス）およびスズメバチ毒のクラボリン（ｃｒａｂｒｏｌｉｎ）（アミノ酸１３個の両親媒性αヘリックス）が含まれる（Ａｒｇｉｏｌａｓ  Ａ．とＰｉｓａｎｏ  Ｊ．Ｊ．、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、１４３７〜１４４４）。
【００５５】
【表１−１】
2009510166.tif 000003
【００５６】
【表１−２】
2009510166.tif 000004
【００５７】
アメーバポア
本発明による他のポア形成ペプチドは、エントアメーバ・ヒストリティカ由来の７７残基ポア形成ペプチドであるアメーバポアであってもよい（Ｙｏｕｎｇら、（１９８２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５６：１６７７；Ｌｙｎｃｈら、（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：８０１；ＹｏｕｎｇとＣｏｈｎ、（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２９：２９９；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔ  ３３：２３７；Ｊａｎｓｓｏｎら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１４４０）。これは、ほぼアミノ酸１〜２１、２５〜３６、４０〜６３および６７〜７７からの４つのαヘリックスを有し、それぞれ従来ヘリックス１、２、３および４と呼ばれている。
【００５８】
アメーバポアペプチドは、３つのジスルフィド結合により安定化され、４つの主に両親媒性αヘリックス構造を含む。第３の両親媒性ヘリックス構造（ヘリックス３）は、野生型ペプチドに類似した細胞溶解活性を保有する。この第３の両親媒性のαヘリックス配列に基づく合成ペプチドは、高濃度（１０〜１００μＭ）で有核細胞に対する細胞溶解活性を有することが最近示された（Ｌｅｉｐｐｅら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２６０２）。したがって、１つの実施形態では、サイトトキシンは、表１：ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨに列挙したアメーバポア誘導体である。
【００５９】
修飾および誘導体
上記細胞溶解ペプチドは、修飾されるかまたは誘導体化されて、細胞溶解活性を保有するかまたは増強された細胞溶解活性さえも示すアナログおよび誘導体を産生し得ることは容易に認められる。例えば、アンドラらは、短縮したアメーバポアアナログは、抗菌活性および細胞溶解活性を増強したことを開示している（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８５（１９９６）、９６〜１００頁、その開示全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
このようなアナログまたは誘導体を設計する際に、当業者は細胞溶解活性に結びつく両親媒性αヘリックス構造および正味の正電荷に関する前記の検討により情報が得られるであろう。したがって、当業者はサイトトキシンアナログ、すなわち天然タンパク質で観察された相同性ならびに既知の構造および特性に基づく事実上これまでに知られていない非天然型を設計して、本発明に従う細胞溶解ペプチドとして用いることができる。
【００６１】
本発明によれば、修飾および誘導体化には、限定されるものではないが、機能的に同等な分子を提供する置換、付加または欠失が含まれる（以下に示す実施例によって機能は評価し得る）。またアナログおよび誘導体を、細胞毒性ペプチドのアミノ酸残基の側鎖の修飾を介して作成することもできる。例えば、このアナログまたは誘導体は、天然のタンパク質またはポリペプチドと比べて機能的な活性を増強または増加することができる。
【００６２】
また二量体化、切り詰め、ジアステレオ異性体（Ｄアミノ酸組み込みアナログ）（Ｓｈａｉら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１−７３０５〜７３０８）、およびこれらの組合せが、サイトトキシンペプチドの代替治療薬形態、誘導体およびアナログの産生に使用されることもあり得る。例えば、Ｓｈａｉら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１−７３０５〜７３０８は、メリチンの細胞溶解活性に及ぼす配列および構造的変異の効果を開示しており、その開示全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００６３】
配列類似性
本発明のペプチドのホモログが提供される。本明細書で述べているように、相同性および同一性という用語の使用は、類似度として同じものを意味することが理解されよう。したがって、例えば相同性という語が２つの非自然配列の間で使用される場合、これが必ずしもこれらの２つの配列間の進化的関連性を示しているわけではなく、むしろその配列間の類似度または関連性を見ていることが理解されよう。２つの進化的に関連した分子間の相同性を測定する方法の多くが、それらが進化的に関連するかどうかにかかわらず配列類似度を測定するために任意の２もしくはそれ以上の核酸またはタンパク質に通常適用される。
【００６４】
一般に、任意の既知の変異体および誘導体または本明細書において開示された遺伝子およびタンパク質の生じる可能性があるものを定義する１つの方法は、特異的な既知の配列に対する相同性に関して変異体および誘導体を定義することによるものであることが理解されよう。本明細書において開示された特定の配列のこの同一性は、明細書中の他の箇所でも述べられている。一般に、本明細書で開示された遺伝子およびタンパク質変異体は、記載した配列または天然配列に対して典型的には、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性を有する。当業者であれば、２つのタンパク質または遺伝子など核酸の相同性を測定する方法は容易に理解できよう。例えば、この相同性は相同性がその最高レベルであるように２つの配列のアライニング後に算出できる。
【００６５】
相同性を算出する他の方法も、発表されたアルゴリズムにより実施できる。比較のための配列の最適アラインメントが、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）のサーチフォシミラリティーメソッド（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピュータ化した実施より、またはインスペクションにより実施し得る。
【００６６】
相同性の同じタイプが、例えば、Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６、１９８９において開示されたアルゴリズムによって核酸について得ることができ、少なくとも核酸アラインメントと関連する物質について参照として本明細書に組み込まれる。いずれの方法も、典型的には使用することができること、および場合によってはこれらの種々の方法の結果は異なる可能性があるが、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見出されるならばこの配列は記載した同一性を有すると言われ、本明細書において開示されることを当業者は理解することが理解されよう。
【００６７】
例えば、本明細書中で用いられる、他の配列に対して特定のパーセント相同性を有するとして列挙された配列は、任意の１つまたは複数の上記算出法により算出された列挙された相同性を有する配列を表す。例えばＺｕｋｅｒ算出法を用いて、第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合には、他の算出法のいずれかにより算出されるように、たとえ第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有しないとしても、第１配列は本明細書で定義されるように第２配列に対して８０パーセントの相同性を有する。別の例として、Ｓｍｉｔｈ  と  Ｗａｔｅｒｍａｎの算出法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの算出法、Ｊａｅｇｅｒ算出法、またはいずれかの他の算出法により算出されるように、たとえ第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有しないとしても、Ｚｕｋｅｒ算出法およびＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ算出法の両方を用いて、第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出さる場合には、第１配列は本明細書において定義されるように、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有する。さらに別の例として、それぞれの算出法を用いて（しかし実際には、算出法が異なれば異なる算出された相同性パーセンテージをもたらすことが多い）、第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合には、第１配列は本明細書で定義されるように第２配列に対して８０パーセントの相同性を有する。
【００６８】
核酸
核酸に基づく本明細書において開示された様々な分子が存在し、例えばメリチンおよびに本明細書において開示されたその他のタンパク質をコードする核酸、ならびに様々な機能的核酸が含まれる。開示された核酸は、例えばヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換基からなっている。これらの非限定例および他の分子が、本明細書において述べられている。例えばベクターが細胞で発現する場合、発現されたｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、ＧとＵからなっていることが理解されよう。同様に、例えば、外来性のデリバリーを介してアンチセンス分子が細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境中でアンチセンス分子の分解を減らすヌクレオチドアナログからなっていることは有利であることが理解されよう。
【００６９】
ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、そのリン酸部分および糖部分を介して互いに結合して、ヌクレオシド間結合をつくることができる。このヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびサイミン−１−イル（Ｔ）であってもよい。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例には、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）がある。
【００７０】
ヌクレオチドアナログは、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに対するいくつかのタイプの修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は、当分野では周知であり、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニンならびに糖またはリン酸部分の修飾を含む。
【００７１】
ヌクレオチド置換基は、ヌクレオチドに類似した機能的特性を有するが、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含んでいない分子である。ヌクレオチド置換基は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して互いに結合している分子である。ヌクレオチド置換基は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせんタイプの構造に適合できる。
【００７２】
例えば、細胞への取込みを増強するために、他のタイプの分子（抱合体）を、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに結合することも可能である。抱合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に結合することができる。このような抱合体には、限定されるものではないが、コレステロール部分などの脂質部分が含まれる。（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３〜６５５６）、
【００７３】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、少なくとも１つのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換基のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｆａｃｅ）での相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換基のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリンをベースとしたヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換基のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位およびピリミジンをベースとしたヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換基のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【００７４】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、２本鎖ＤＮＡの主溝（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）で露出するヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で生じる相互作用である。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応性基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【００７５】
配列
例えば、メリチンならびにＧｅｎｂａｎｋで開示される本明細書において開示されたその他のタンパク質と関連する種々の配列が存在し、これらの配列および他の配列は、本明細書においてその全体、ならびにその中に含まれるそれぞれのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）に関するその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００７６】
様々な配列が本明細書において提供され、これらおよびその他のものは、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ）において見出すことができる。当業者であれば、いかに配列の相違および差異を決定するか、ならびにいかに特定の配列を他の関連配列に関連させる組成物および方法を調整するかを理解するであろう。プライマーおよび／またはプローブが、本明細書において開示され、当該技術で周知の情報が提供される任意の配列について設計することができる。
【００７７】
ペプチドおよびタンパク質
開示され本明細書において意図される開示されたプロサイトトキシンタンパク質の多数の変異体、修飾体または誘導体が存在する。タンパク質の変異体および誘導体は、当業者にはよく理解されていており、アミノ酸配列修飾体を含むことができる。例えばアミノ酸配列修飾体は、典型的には１つまたは複数の３つのクラス、すなわち置換、挿入または欠失変異体に分類される。挿入には、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入より小規模な、例えば１から４残基のオーダーの挿入である。免疫原性融合タンパク質誘導体、例えば実施例で記載される誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの架橋結合による、またはこの融合をコードするＤＮＡで形質転換した組換え細胞の培養による標的配列に対して免疫原性を与えるのに十分に大きいポリペプチドを融合することによって作成される。欠失は、タンパク質配列から１つまたは複数のアミノ酸残基の削除を特徴とする。典型的には、約２から６を超えない残基が、タンパク質分子中の任意の部位で欠失する。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発と、これによる変異体をコードするＤＮＡの産生およびその後の組換え細胞培養でＤＮＡを発現することにより調製される。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換突然変異体を作成する技術、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発はよく知られている。アミノ酸置換は典型的には１つの残基であるが、同時に多数の異なる部位で生じ得て、挿入は通常約１から１０アミノ酸残基のオーダーであり、欠失は約１から３０残基の範囲に及ぶ。欠失または挿入は、隣接した対で、すなわち２つの残基の欠失または２つの残基の挿入で作成され得る。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組合せを、最終的な構築物に到達するために組み合わせ得る。突然変異はその配列を読み枠外に置いてはならないし、二次ｍＲＮＡ構造をもたらし得る相補領域を生み出さないことが好ましい。置換変異体は少なくとも１つの残基が削除され、異なる残基がその位置に挿入された変異体である。このような置換は、一般に以下の表２および３に従って作成され、保存的置換と呼ばれる。
【００７８】
【表２】
2009510166.tif 000005
【００７９】
【表３】
2009510166.tif 000006
【００８０】
機能的または免疫学的同一性の本質的な変化は、表３のよりも保存性の低い置換を選択することによって、すなわち（ａ）置換される領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシートもしくはらせんコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖の大きさを維持することに及ぼすその置換の効果がより有意に異なる残基を選択することによって生じる。一般にタンパク質の特性に最も大きな変化をもたらすと考えられる置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルもしくはスレオニルを（で）、疎水性の残基例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルを（で）置換するもの、（ｂ）システインもしくはプロリンを（で）、その他の残基を（で）置換するもの、（ｃ）正に帯電した側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニルもしくはヒスチジルを（で）、負に帯電した残基、例えばグルタミルもしくはアスパルチルを（で）置換するもの、または（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンで（を）、側鎖を有していない残基、例えばグリシンを（で）置換するものであり、この場合には、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化に対する部位の数を増加させることによる置換である。
【００８１】
例えば、生物学的におよび／または化学的に類似している他のアミノ酸残基による１つのアミノ酸残基の置換が、保存的置換として当業者に知られている。例えば保存的置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基に置換することまたは１つの極性残基を別の極性残基に置換することである。この置換は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを含む。それぞれ明確に開示された配列のこのような保存的に置換された変異が、本明細書において提供されるモザイクポリペプチド中に含まれる。
【００８２】
Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒもしくはＴｈｒ）に対する部位を挿入するために、置換または欠失突然変異誘発を使うことができる。またシステインまたは他の不安定な残基の欠失が好ましい場合もある。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１つを欠失させることまたはグルタミニルもしくはヒスチジル残基により１つの残基を置換することにより達成する。
【００８３】
特定の翻訳後の誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパリル残基に脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は緩酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ７９〜８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化ならびに場合によっては、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【００８４】
本明細書において開示されたタンパク質の変異体および誘導体を定義する１つの方法は、特異的な既知の配列に対する相同性／同一性について変異体および誘導体を定義することによることが理解されよう。例えば、配列番号６はメリチンの特定の配列を示し、配列番号１４はアメーバポアタンパク質の特定の配列を示す。具体的には、少なくとも明示された配列に対し７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を有する本明細書において開示されるこれらおよび他のタンパク質の変異体が開示される。１つの実施形態では、この変異体は、開示されたメリチン配列の１９位においてただ１つのトリプトファン残基を保有する。当業者であれば、２つのタンパク質の相同性を測定する方法は容易に理解できよう。例えば、この相同性は相同性がその最高レベルであるように２つの配列のアライニング後に算出できる。
【００８５】
相同性を算出する他の方法も、発表されたアルゴリズムにより実施できる。比較のための配列の最適アラインメントが、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）のサーチフォシミラリティーメソッドにより、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピュータ化した実施より、またはインスペクションにより実施し得る。
【００８６】
相同性の同じタイプが、例えば、Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６、１９８９において開示されたアルゴリズムによって核酸について得ることができ、少なくとも核酸アラインメントと関連する物質について参照として本明細書に組み込まれる。
【００８７】
保存的突然変異および相同性の記述には、特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有し、その変異体は保存的突然変異体である実施形態などの任意の組合せで互いに組み合わさることができることが理解されよう。
【００８８】
この明細書で種々のタンパク質およびタンパク質配列について論ずるように、これらのタンパク質配列をコードできる核酸も開示されることが理解されよう。これは特異的なタンパク質配列と関連するすべての縮重配列、すなわちこのタンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含む１つの特定のタンパク質配列ならびにすべての核酸をコードする配列を有するすべての核酸を含む。したがって、それぞれの特定の核酸配列は、本明細書において書かれていない場合もあるが、いずれの配列も事実上開示されたタンパク質配列を介して本明細書に開示されて記載されていることが理解されよう。例えば、配列番号：６に示されたタンパク質配列をコードできる多くの核酸配列の１つは、配列番号：５に示されている。配列番号：１４に示された同一のタンパク質配列をコードする他の核酸配列は、配列番号：１３に示されている。アミノ酸配列は、どの特定のＤＮＡの配列が生物の中でそのタンパク質をコードするかを指示しないが、開示されたあるタンパク質の特定の変異体が本明細書において開示される場合、そのタンパク質が生じる特定のプロサイトトキシンにおいてそのタンパク質をコードする既知の核酸配列も知られており、本明細書において開示されて記載されることもまた理解されよう。
【００８９】
この開示された組成物に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチドアナログが存在することが理解されよう。例えば、異なる官能性置換基を有する多数のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在し、そしてアミノ酸は表２と表３で示される。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体ならびにペプチドアナログの立体異性体が開示される。ｔＲＮＡ分子を選択したアミノ酸と結合し、例えばアンバーコドンを利用して、部位特異的な方式でアナログアミノ酸をペプチド鎖に挿入する遺伝的構築物を設計することにより、これらのアミノ酸をポリペプチド鎖に容易に取り込むことができる（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３〜７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：３４８〜３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７〜２１６（１９９５）；Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ、１４（１０）：４００〜４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ、１２：１５８〜１６３（１９９４）；ＩｂｂａとＨｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：６７８〜６８２（１９９４）；これらすべては、少なくともアミノ酸アナログと関連する物質について参照として本明細書に組み込まれる）。
【００９０】
ペプチドに類似する分子を作成することができるが、天然のペプチド結合を介して連結さていない。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログの結合は、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ならびに−ＣＨＨ２ＳＯ−を含むことができる（これらおよびその他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３）、１巻、３号、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３〜４６８；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７〜１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３〜１２４９（１９８６）（−ＣＨ  Ｈ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７〜３１４（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２〜１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ、ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１〜４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９〜１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）において見出すことができ、これらそれぞれは、参照として本明細書中に組み込まれる）。特に好ましい非ペプチド性結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチドアナログは、β−アラニン、γ−アミノ酪酸その他などの結合原子間に１つを超える原子を有することができることが理解されよう。
【００９１】
アミノ酸アナログおよびアナログおよびペプチドアナログは、増強したまたは望ましい特性、例えば経済的製造、より大きな化学的安定性、向上した薬理学的特性（半減期、吸収、効能、有効性など）、特異性改変（例えば、生物活性の広域性）、抗原性の低下、その他を有していることが多い。
【００９２】
Ｄアミノ酸はペプチダーゼなどにより認識されないため、Ｄアミノ酸をより安定なペプチドを生成するために使用することができる。同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を用いるコンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の系統的置換を、さらに安定なペプチドを生成するために使用することができる。システイン残基を、２またはそれ以上のペプチドを互いに環化するかまたは付着するために使用することができる。これは、特定のコンフォメーションにペプチドを拘束するのに有益であり得る。（ＲｉｚｏとＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、参照として本明細書中に組み込まれる）。
【００９３】
潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）
機能／メカニズム
本発明による潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）が対象であり、細胞溶解ペプチドに付着したとき、これが電荷中性化および／またはペプチドを毒性にするコンフォメーションの形成を立体的に阻害することによりサイトトキシンを不活性化する。
【００９４】
ＬＡＰの大きさは多様である。ＬＡＰケージのアミノ酸が、電荷の中性化ならびに／または溶解ペプチドの膜内挿入およびポア中への構成の立体的な拘束を生み出す限りは、ペプチドは適切なＬＡＰである。
【００９５】
例えば、ＬＡＰはＴＧＦβの前駆体領域またはこれに対して実質的に同一である配列であり得る。またＬＡＰは、ファージまたはファージ粒子であり得る。
【００９６】
ＴＧＦβは、アミノ酸末端潜伏関連タンパク質（ＴＧＦβ−ＬＡＰ）およびそのＣＯＯＨ末端において活性なＴＧＦβサイトカインで構成される二量体の潜在的なサイトカインとして合成され得る（ＲｏｂｅｒｔｓとＳｐｏｒｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ  ＢとＲｏｂｅｒｔｓ，Ａ  Ｂ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４１９〜４７２（１９９６）；Ｒｏｔｈ−Ｅｉｃｃｈｏｒｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８  １５８８〜１５９６（１９９８））。前駆体ペプチドは、タンパク質分泌に必要なシグナルペプチド（残基１〜２９）を含むことができ、この分子を誘導してゴルジ体を通過しタンパク質分解性切断により加工してグリコシル化する。ＴＧＦβ−ＬＡＰ領域は、アルギニン（２７７〜２７８）でのタンパク質分解性切断により、ＴＧＦβから分離することができる。成熟したＴＧＦβがアラニン２７９で生じる。ＴＧＦβ−ＬＡＰは、潜在的な形状でＴＧＦβを維持することに加えて、他の分子との相互作用に必要な重要な残基を含んでいる。最近、ＴＧＦβ−ＬＡＰ領域の突然変異が常染色体優性カムラチ−エンゲルマン病と関連された（Ｊａｎｓｓｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２６、２７３：２７５（２０００）。システイン２２４および２２６は、２つのＴＧＦβ−ＬＡＰタンパク質間の分子間ジスルフィド結合において重要である。これらシステインのセリンへの突然変異は、分子を「活性化」する（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２５７２〜２５７６（１９９５）；Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６、１６９１〜１７００（１９９２）；Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６４、１３６６０〜１３６６４（１９８９））。ＲＧＤのモティーフ（２４５〜２４７）は、インテグリンとの相互作用を容易にする（Ｍｕｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、９、２６２７〜２６３８（１９９８；Ｄｅｒｙｎｃｋ  Ｒ、ＴＩＢＳ、１９、５４８〜５５３（１９９４））。ＴＧＦβをコードする核酸が、米国特許第５，８０１，２３１号に記載されており、ＴＧＦβ−ＬＡＰをコードする核酸配列の開示のために、参照として本明細書に組み込まれる。
【００９７】
間葉性、上皮性および内皮起源の細胞型を含む調べたほとんどの細胞型で、ＴＧＦβは、潜在的なＴＧＦβ−結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に共有結合したＴＧＦβサブユニットおよびＴＧＦβ−ＬＡＰプロペプチド二量体からなる潜在的な形状で分泌される。またＬＴＢＰは、ＴＧＦβの分泌およびフォールディングにも必要である（Ｍｉｙａｚａｎｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０、１０９１〜１１０１（１９９１）；Ｍｉｙａｚａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、５６６８〜５６７５（１９９２）；Ｅｋｌｏｖら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３、３１９３〜３１９７（１９９３））。システイン３３は、潜在的なＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）の第３の８つのシステインに富む繰り返しとのジスルフィド架橋ために重要である（Ｓａｈａｒｉｎｅｎら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１５、２４５〜２５３（１９９６）。酵素によるＬＴＢＰの修飾、例えばトロンボスポンジン（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９、２６７８３〜２６７８８（１９９４）；Ｃｒａｗｆｏｒｄら、Ｃｅｌｌ、９３、１１５９〜１１７０（１９９８））；トランスグルタミナーゼ（Ｎｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ．１３６、１１５１〜１１６３（１９９７）；Ｋｏｊｉｍａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２１、４３９〜４４８（１９９３））；ＭＭＰ９およびＭＭＰ２（ＹｕとＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ、１４、１６３〜１７６（２０００））は、潜在的な複合体からＴＧＦβの活性部分を遊離する可能性がある。
【００９８】
本発明のＬＡＰは、ＴＧＦβの前駆体領域、例えばＴＧＦβ−１、２もしくは３の前駆体ペプチド（ヒト由来）（Ｄｅｒｙｎｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３１６、７０１〜７０５（１９８５）；Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６  ３６７３〜３６７７（１９８７）；Ｈａｎｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、７９〜８２（１９８８）；Ｄｅｒｙｎｃｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７、３７３７〜３７４３（１９８８）；Ｔｅｎ  Ｄｙｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、４７１５〜４７１９（１９８８））、ＴＧＦβ−４（ニワトリ由来）（Ｊａｋｏｗｌｅｗら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２、１１８６〜１１９５（１９８８））、またはＴＧＦβ−５（アフリカツメガエル由来）（Ｋｏｎｄａｉａｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１０８９〜１０９３（１９９０））を含み得る。用語「前駆体領域」は、前駆体ペプチドをコードし、活性なＴＧＦβタンパク質をコードする配列を含まない配列として定義される。
【００９９】
ある実施形態では、ＬＡＰのアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ（ヒトゲノムマッピングプロジェクト）により提供されたＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０（１９９０）のデフォルトパラメータを使用して、アミノ酸レベルでＴＧＦβ１、２、３、４または５の前駆体領域に対して、少なくとも５０％の同一性を有することができる（ＲｏｂｅｒｔｓとＳｐｏｒｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｓｐｏｒｎ，Ｍ  ＢとＲｏｂｅｒｔｓ，Ａ  Ｂ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ８、４２２（１９９６））。他の実施形態では、このＬＡＰは、核酸またはアミノ酸レベルで、ＴＧＦβ１、２、３、４または５のＬＡＰに対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有することができる。別の実施形態においては、このＬＡＰは、ＴＧＦβ１、２、３、４または５のＬＡＰに対して核酸またはアミノ酸レベルで、９９％までのまたは９９％を超える同一性有することができる。
【０１００】
このＬＡＰは、配列番号：２３〜２７のＬＡＰから選択することができる。
【０１０１】
このＬＡＰは、ジスルフィド結合形成のために、少なくとも２つ、例えば少なくとも４つ、６つ、８つ、１０または２０のシステイン残基を含み得る。
【０１０２】
ＬＡＰは、医薬的な活性剤の周囲に保護「ケージ」を与えることができ、これにより活性剤を遮蔽し、細胞表面の他の分子またはその活性にとって重要な分子とのその相互作用を妨げたりまたは阻止する。
【０１０３】
このＬＡＰは、配列番号：１のヌクレオチド１〜８３１もしくは配列番号：３のヌクレオチド１０３〜９３３によりコードされるアミノ酸の配列、またはこのＬＡＰに対してＨＧＭＰにより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％。９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【０１０４】
このＬＡＰは、配列番号：９のヌクレオチド１〜８３１もしくは配列番号：１１のヌクレオチド９７〜９２８によりコードされるアミノ酸の配列、またはこのＬＡＰに対してＨＧＭＰにより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％。９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【０１０５】
部位
このＬＡＰは、細胞毒性ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端またはＮ末端およびＣ末端の両方に付け加えることができる。例えば、この細胞毒性ペプチドは細胞溶解ペプチドであることができ、このＬＡＰは細胞溶解ペプチドのＣ末端に付け加えることができる。さらにまた、本明細書において議論するように、このＬＡＰはさらに標的分子を含む場合もある。
【０１０６】
さらに、電荷中性化成分をプロサイトトキシンに付け加えることができ、この場合プロサイトトキシンは、立体的な決定因子に加えて、さらに電荷が中和される。
【０１０７】
例えば、［Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｒ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｒ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｒ）−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ］−（Ｘ）を含むペプチドが提供され、（Ｘ）は、本明細書に記載したペプチド結合を介して括弧で印をつけたペプチドに結合するＬＡＰであり、括弧で印をつけたペプチドはどちらの方向にも配向でき、ペプチド結合は腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性であり、かつＲは隣接したリジン残基の修飾されていないε−アミノ基、［ε−γ］−Ｇｌｕ、［ε−γ］−Ｇｌｕ−［α−γ］−（Ｇｌｕ）１−３、［ε−α］−（Ｐｈｅ）１−３、［ε−α］−（Ｔｙｒ）１−３、［ε−α］−（Ｔｒｐ）１−３、［ε−α］−（Ｌｙｓ）１−３および［ε−α］−（Ａｒｇ）１−３からなる群から独立して選択され、［ε−γ］は、リシンのイプシロンアミノ基と隣接したグルタミン酸のガンマカルボキシル基間ペプチド結合を示し、［α−γ］は、第１グルタミン酸のαアミノ基と第２のグルタミン酸のガンマカルボキシル基間のペプチド結合を示し、［ε−α］は、リシンのイプシロンアミノ酸と指示されたアミノ酸のαカルボキシル基間のペプチド結合を示し、かつ下付き数字は、指定されアミノ酸の付加的な数を通常のペプチド結合により第１に結合することができることを示す。
【０１０８】
標的特異的プロテアーゼ
機能／メカニズム／部位
本明細書中に記載する標的特異的なプロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を切断する標的細胞と結合した酵素である。本明細書中に記載する標的細胞は、その細胞溶解が望まれる任意の細胞であり得る。例えば標的細胞は、癌細胞、細菌細胞、神経細胞、骨髄細胞、前立腺細胞、または腫瘍新生血管系の血管内皮細胞であり得る。
【０１０９】
本発明の標的にする特異的プロテアーゼは、典型的には腫瘍で発現し得るが、独占的に腫瘍で発現される必要はない。したがって、標的にする特異的プロテアーゼは正常細胞と比較した場合、腫瘍細胞で優先的に発現され得る。さらに標的にする特異的なプロテアーゼは、細菌細胞などの非腫瘍形成性標的細胞により発現されるプロテアーゼであり得るが、それにもかかわらず非標的細胞と比較した場合、標的細胞で優先的に発現される。したがって、本明細書中に記載するプロサイトトキシンは、抗微生物剤または抗菌剤としてさらに有用である。また本明細書中に記載するプロサイトトキシンは、標的にする特異的プロテアーゼが標的細胞中に存在する限りは、所望の任意の標的細胞を溶解させるためにさらに有用である。
【０１１０】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）
ある実施形態では、標的にする特異的なプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）であり得る。例えば、標的にする特異的プロテアーゼは、ＭＭＰ２であり得る。ＭＭＰは、血管形成ならびに新生血管形成を伴う。したがって、腫瘍ならびに新たに形成された血管を供給する血管系を標的にすることは、腫瘍への血流の排除に役立ち、また腫瘍成形を阻止することがきる。
【０１１１】
例えば、ＭＭＰのような標的に特異的なプロテアーゼの存在下で、ＭＭＰで認識されるアミノ酸の配列によりＬＡＰに結合した細胞溶解ペプチドは、ＬＡＰから選択的に遊離することができる。この細胞毒性ペプチドは、次いで自由にその活性なコンフォメーションを形成して標的細胞を溶解させる。
【０１１２】
本発明に適切な別の標的にする特異的プロテアーゼは、Ｃｏｏｍｂｓら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、５（９）：４７５〜８８（１９８８）、ＰＳＭＡにＰＳＡに関して記載したプロテアーゼおよびガンマ−グルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）が含まれる。
【０１１３】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
本発明に適切な別の反応性ペプチド基質は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）について、Ｃｏｏｍｂｓら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、５（９）：４７５〜８８（１９８８）に記載の基質を含む。ＰＳＡはＫＬＫ３遺伝子の産物であり、前立腺および他の組織で発現する。これは健全な細胞で発現するが、血液中のＰＳＡの異常に高いレベルが前立腺癌を含む男性の前立腺障害および乳癌の女性で見出される。ＰＳＡは、前立腺癌および乳癌の両方の診断とモニタリングに用いる重要な腫瘍マーカーである。
【０１１４】
ＰＳＡは２３７個のアミノ酸残基の単鎖糖タンパク質、４個の炭水化物側鎖、および複数のジスルフィド結合からなる３３ｋｄのタンパク質である。ＰＳＡは、カリクレインファミリー（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ）のプロテアーゼの同族体である。ＰＳＡを８０％の相同性を有する他の前立腺癌マーカーであるヒト腺性カリクレイン−２（ｈＫ−２）から区別するために、ＰＳＡをヒト腺性カリクレイン−３（ｈＫ−３）と呼ぶことがある。ヒト腺性カリクレイン−１（ｈＫ−１）は、膵臓および腎臓組織で主として見出されるが、ＰＳＡと７３％および８４％の相同性を示すカリクレインである。ＰＳＡをコードする完全な遺伝子が配列決定され、第１９染色体に位置づけられた。ＰＳＡは、前立腺上皮細胞中および精液中に見出すことができる。
【０１１５】
またヒト腺性カリクレイン−３遺伝子発現およびＥＳＴ発現プロフィールの連続分析では、女性生殖器（卵巣のおよび子宮）ならびに胃腸（胃、結腸、食道および膵性）癌で、ヒト腺性カリクレイン−３遺伝子のアップレギュレーションを示した。有意なダウンレギュレーションが、その正常対応物に関して乳癌および脳腫瘍で認められた。（Ｄｉａｍａｎｄｉｓら、Ｔｈｅ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：Ｔｈｅ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ（１９９７））。現在、ＰＳＡはその組織特異性のため最も有用な腫瘍マーカーであると考えられ、前立腺癌のスクリーニング、診断および管理のために広く使用されている。
【０１１６】
ＰＳＡをコードする遺伝子の５’非翻訳領域には調節エレメントを含んでおり、これらの２つはアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ  ＩおよびＡＲＥ  ＩＩ）であり、もう１つは、強力なエンハンサーである（Ｓｃｈｕｕｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）、Ｃｌｅｕｔｊｅｎｓら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９７））。前立腺におけるＰＳＡ遺伝子転写は、ＡＲの作用を介してアンドロゲンにより調節されることが知られている（Ｒｉｅｇｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９１）；Ｓｃｈｕｕｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）；Ｃｌｅｕｔｊｅｎｓら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９７）；およびＹｏｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９１））。ＰＳＡが非常に大量（約１〜２ｇ／リットル）に存在する精漿で、ＰＳＡの役割は精子運動抑制因子セミノジェリン（ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ）のタンパク質分解性切断であり、射精後精液液化（ｓｅｍｅｎ  ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ  ｐｏｓｔ  ｅｊａｃｕｌａｔｉｏｎ）を生じるようである（Ｍａｌｍ  Ｊら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｓｕｐｐｌ（１９９５）およびＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏｇｙ（１９９５））。しかし、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）、プロテインＣ阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＰＴＨ関連ペプチド（Ｃｒａｍｅｒら、Ｊ  Ｕｒｏｌ（１９９６））、および推定の血管作用性ペプチドを遊離する未知の前駆体タンパク質（Ｆｉｃｈｔｎｅｒら、Ｊ  Ｕｒｏｌ（１９９６））を含むＰＳＡの他の基質が提案されている。男性血清で、ＰＳＡはα１−抗キモトリプシン（ＰＳＡ−ＡＣＴ）と、α２−マクログロブリン（ＰＳＡ−Ａ２Ｍ）の複合体として、および遊離のＰＳＡとして存在する（Ｓｔｅｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９１）およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９０））。
【０１１７】
前立腺特異的細胞膜抗原（ＰＳＭＡ）
他の標的にする特異的プロテアーゼは、前立腺特異的細胞膜抗原（ＰＳＭＡ）などのタイプＩＩ膜貫通タンパク質であり得る。前立腺癌細胞は、前立腺特異的細胞膜抗原であるタイプＩＩ膜貫通タンパク質を過剰発現することが以前に明らかにされている。ＰＳＭＡは、７Ｅ１１Ｃ５免疫グロブリンＧモノクロナール抗体に対して免疫反応性である細胞内エピトープを有する（Ｈｏｒｏｓｃｚｅｗｉｃｚら、（１９８３）、ＬＮＣＡＰ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：１８０９〜１８１８）。前立腺癌患者では、ＰＳＭＡは悪性前立腺上皮で高度に発現されるが、正常前立腺ではごくわずか、および良性前立腺肥大上皮（ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ）でより低い程度で発現される。（Ｐｉｎｔｏら、（１９９９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅｃｅｎｔ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｊ．１：１５〜２６；Ｗｒｉｇｈｔら、（１９９５）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１：１８〜２８；Ｌｏｐｅｓら、（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＣＹＴ−３５６  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｔｉｐｒｏｓｔａｔｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ７Ｅ１１−Ｃ５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６２３〜６４２８；Ｔｒｏｙｅｒら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６２：５５２〜５５８）。
【０１１８】
ＰＳＭＡのタンパク質分解性領域は、細胞表面の外側に位置する。標的細胞に到達後、本発明のプロサイトトキシンは標的細胞によって内部移行される必要なく、そのγ−グルタミン酸残基（複数可）が切断されて除去される。このようにプロサイトトキシンは、類似したメカニズムがＬＡＰを除去するために存在する限り、正確に所望の作用部位である標的細胞で活性化され得る。標的細胞に及ぼすこの直接的な効果は、前立腺癌の細胞致死効果を増強する。活性化された細胞溶解ペプチドを直ちに標的細胞に挿入して、隣接した標的外の細胞に作用する機会をほとんどなくする。実際にペプチドがＰＳＭＡにより活性化される前に、ペプチドの末端の１つが細胞膜にすでに挿入されていることはあり得る。さらにまた、上記のように標的細胞の細胞溶解後、細胞溶解ペプチドは標的細胞の細胞膜残屑に吸着されて残り、したがって活性化されたトキシンは細胞膜によって中和され、漏出して標的外の細胞に害を及ぼさない。
【０１１９】
ガンマグルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）
ガンマグルタミルヒドロラーゼ（ＧＧＨ）は、細胞内酵素である。癌の特定のタイプで、ＧＧＨを腫瘍の微小環境に分泌できる。
【０１２０】
ＧＧＨ（ＥＣ  ３．４．１９．９）は、ホリル（ｆｏｌｙｌ）およびアンチホリル（ａｎｔｉｆｏｌｙｌ）ポリ−ガンマ−グルタミン酸の代謝における中心的な酵素である（ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｊ．Ｊ．とＣｏｗａｒｄ，Ｊ．Ｋ．（１９８４）ｉｎ  Ｆｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｔｅｒｉｎｓ（Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｒ．Ｌ．とＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｌ．、編）、第１巻、１３５〜１９０頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ）。葉酸は、ＤＮＡ前駆体およびいくつかのアミノ酸のデノボ生合成で、いくつかの酵素のコファクターとして必要であり、正常細胞増殖と複製に必須である。メトトレキセート（ＭＴＸ）などの抗葉酸剤は、ほとんど４０年にわたり多く癌の従来の治療薬であった（Ｃｈａｂｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６、９０７〜９１２）。葉酸または抗葉酸剤が細胞へ移入されたとき、ホリルポリグルタミン酸合成酵素（ｆｏｌｙｌｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）（ＦＰＧＳ）（ＥＣ  ６．３．２．１７）によるグルタミン酸の逐次付加を介して、それらはホリルポリガンマグルタミン酸またはアンチホリルポリガンマグルタミン酸に変換される。これらのポリガンマグルタミン酸は細胞内に保持され、一般にほとんどの葉酸依存性酵素に対する対応するモノグルタミン酸よりも優れた基質または阻害剤である（Ｇａｌｉｖａｎ，Ｊ．（１９８０）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７、１０５〜１１０；Ｓｃｈｉｒｃｈ，Ｖ．とＳｔｒｏｎｇ，Ｗ．Ｂ．（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９、３７１〜３８０；Ｒｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．、Ｌｉｎｄａｕ−Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｂ．、Ｃｈａｖｅ，Ｋ．Ｊ．、Ｇａｌｉｖａｎ，Ｊ．とＲｙａｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３、１０４０〜１０４６）。
【０１２１】
ＧＨはガンマ結合ポリグルタメート鎖の除去を触媒し、その基質をホリルまたはアンチホリル−モノ−ガンマグルタミン酸に変換するが、これはあまり保持がよくなく、したがって葉酸と抗葉酸剤の全体の有効性の減少に結びつく。葉酸または抗葉酸剤のポリグルタミル化の程度の調節におけるＦＰＧＳおよびＧＨ活性の役割はよく実証されている。ＧＨ活性の増加（Ｒｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．とＧａｌｉｖａｎ，Ｊ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５３、２２２７〜２２３０；Ｙａｏ，Ｒ．、Ｒｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．とＧａｌｉｖａｎ，Ｊ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４８、５０５〜５１１）またはＦＰＧＳ活性の減少（Ｐｉｚｚｏｒｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５５、５６６〜５７３；Ｒｕｍｂｅｒｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．２、３０５〜３１０；ＭｃＣｌｏｓｋｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６６、６１８１〜６１８７）は、ＭＴＸ、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸、および５、１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸などの抗葉酸剤に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抵抗性を伴っていた。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＨ活性の増加は、急性骨髄性白血病でＭＴＸに対する固有の抵抗性をもたらす可能性が報告された（Ｒｏｔｓら、Ｂｌｏｏｄ  ９３、１６７７〜１６８３）。最近ではＦＰＧＳ／ＧＨ活性の比率が、急性リンパ球性白血病におけるＭＴＸポリグルタミル化の指標として使用されている（Ｌｏｎｇｏら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９、２５９〜２６３）。
【０１２３】
タンパク質分解性切断部位
タンパク質分解性切断部位は、任意のプロテアーゼ特異的切断部位を含み得る。タンパク質分解性切断部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位、ＰＳＡ切断部位、ＰＳＭＡ切断部位、またはＧＧＨ切断部位を含み得るが、これらに限定されない。（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２８９、１２３９〜１２５１（１９９９）；（Ｖｏｔｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、９３、３１〜４１（１９９８）；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ、１１０、３４７〜３５５（１９９７）；Ｔｏｒｔら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、４３、１６１〜２６６（１９９９）；ＭｃＫｅｒｒｏｗ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、２９、８３３〜８３７（１９９９）；Ｙｏｕｎｇら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、２９、８６１〜８６７（１９９９）；ＣｏｏｍｂｓとＭｏｔｔｒａｍ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１１４、６１〜８０（１９９７））。
【０１２４】
ＭＭＰ切断部位は、ＭＭＰにより切断可能な任意のアミノ酸配列を含み得る。ＭＭＰ切断部位のアミノ酸配列は、配列番号１（メリチンに基づく）で示されるプロサイトトキシンのヌクレオチド８３２〜８５２により、または配列番号９（アメーボポアに基づく）で示されるプロサイトトキシンのヌクレオチド８３２〜８５２により、またはＭＭＰ切断部位の配列に対してＨＧＭＰにより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％。９０％、９５％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。例えば、ＭＭＰ切断部位をコードする核酸配列は、ＭＭＰによる認識および切断に必要とされる残基の最小数を含むことができる。
【０１２５】
ＭＭＰ切断部位は、ＭＭＰで認識可能ないくつかのアミノ酸残基を含み得る。さらにＭＭＰ部位のアミノ酸は、ＭＭＰによりタンパク分解的に切断可能な１つまたは複数のペプチド結合により結合され得る。このＭＭＰ部位を切断し得るＭＭＰには、限定されるものではないが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０またはＭＴ１−ＭＭＰが含まれる（ＹｕとＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１４、１６３〜１７６（２０００）；ＮａｇａｓｅとＦｉｅｌｄｓ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、４０、３９９〜４１６（１９９６）；Ｍａｓｓｏｖａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ．３、１７〜３０（１９９７）；ＶｕとＷｅｒｂ、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１４、２１２３〜２１３３（２０００）の概説）。ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１０のタンパク質切断部位の配列を配列番号２８〜１００に示す。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明のタンパク質分解性切断部位は、腫瘍の存在部位および腫瘍新生血管形成の部位で切断される。例えば、本発明のタンパク質分解性切断部位はＭＭＰ切断部位で、例えば配列番号：２８〜１００に示す任意のいずれか１つまたは複数のＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９またはＭＭＰ１０である。特定の実施形態では、この切断部位はＭＭＰ２切断部位である。
【０１２７】
例えば、ＭＭＰによって認識されるアミノ酸の配列によりＬＡＰに結合された本発明の細胞毒性ペプチドは、ＭＭＰなどの腫瘍特異的プロテアーゼの存在下で、ＬＡＰから選択的に遊離することができる。この細胞毒性ペプチドは、次いで遊離してペプチドの活性なコンフォメーションを形成して標的細胞を破壊する。
【０１２８】
標的分子
生体中の癌細胞への治療薬の選択的デリバリーは、癌特異的バイオマーカーの標的が集中的に研究されている研究の新たな領域である。（Ｅ．Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ、Ｇ．Ａ．ＫｏｎｉｎｇとＧ．Ｓｔｏｒｍ、「Ｉｍｍｏｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇｓ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９、４０：１０３〜２７；Ｊ．ＳｕｄｉｍａｃｋとＲ．Ｊ．Ｌｅｅ、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｉａ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０００、４１：１４７〜６２；Ｓ．Ｐ．ＶｙａｓとＶ．Ｓｉｈｏｒｋａｒ、「Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０００、４３：１０１〜６４）。葉酸レセプターに対する（Ｅ．Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ、Ｇ．Ａ．ＫｏｎｉｎｇとＧ．Ｓｔｏｒｍ、「Ｉｍｍｏｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇｓ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９、４０：１０３〜２７；Ｊ．ＳｕｄｉｍａｃｋとＲ．Ｊ．Ｌｅｅ、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｉａ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０００、４１：１４７〜６２）ＣＡ−１２５、（Ｅ．Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ、Ｇ．Ａ．ＫｏｎｉｎｇとＧ．Ｓｔｏｒｍ、「Ｉｍｍｏｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇｓ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９９、４０：１０３〜２７）、およびＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対する（Ｄ．Ｂ．Ｋｉｒｐｏｔｉｎ、Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ、Ｋ．Ｈｏｎｇ、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｗ．Ｌ．Ｌｉ、Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｃ．Ｃ．ＢｅｎｚとＤ．Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、「Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７、３６：６６〜７５）モノクロナール抗体を用いる免疫リポソーム媒介標的が記載されている。
【０１２９】
本発明の標的分子には、選択性を追加する手段を与える選択的特徴がある。この標的分子は標的細胞にプロサイトトキシンを導き、そこでプロサイトトキシンは毒性になり選択的にその標的を溶解する。さらにこの標的分子は細胞溶解ペプチドのＬＡＰとして作用し得る。この点に関して、この標的分子は電荷を中性化し得るかまたは細胞溶解ペプチドのポア形成を立体的に阻害し得る。この標的分子は、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはこの両方に付け加え得る。
【０１３０】
ある実施形態では、この標的分子は抗体である。例えば、抗体は抗フィブロネクチンＥＤ−Ｂ抗体であることができ、それによりプロサイトトキシンを新生血管形成に関連する細胞外マトリックスに向けさせる。
【０１３１】
また新生血管系を標的とする標的分子を、ＬＡＰに付け加えることもできる。新生血管系を標的にする分子は、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に同定することができる。任意のそのようなペプチドは、本発明の適切な標的分子であると考えられる。
【０１３２】
インテグリンと特異的に結合する標的分子は、血管系の細胞上に見出し得るシグナル配列の１つのクラスである。これらのペプチドは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）に基づくシグナル配列を有する。したがって、特定のインテグリンを結合する配列は、血管内皮細胞および新生血管系の他の細胞に対する有用な標的分子として機能することが可能である。例えば、この標的分子はＲＧＤ標的配列であり得る。
【０１３３】
非構造的スペーサーは、標的分子の特徴であり得る。このようなスペーサーは、典型的にはグリシンおよび／またはプロリン残基を含む。これらのスペーサーの長さは、約１個から約５個のアミノ酸の範囲に及ぶことができる。さらに通常、結合の増加を生じる環化により標的分子を物理的に拘束することが好ましいことが多い。これは通常、互いに約４個のアミノ酸（その間にＲＧＤのみを有する）から１０個のアミノ酸間隔を離してＲＧＤコアの側面に位置する一対のシステイン残基により達成される。例えば、ＲＧＤコアの側面に位置するこのシステイン残基対は、互いに７個のアミノ酸間隔離れていることができる。
【０１３４】
したがって、典型的な標的分子は下記の構造：
−ＸＲＧＤＹＸ−
を有し、式中、Ｘは０個から５個のアミノ酸であり、Ｙは１個または２個のアミノ酸であり、システイン、セリン、スレオニンおよびメチオニンから選択される。特に好適な実施形態では、Ｘはグリシン残基からなるが、所望により少なくとも１個、典型的には１個または２個の遊離のチオールまたはアミン含有アミノ酸および／または１個の疎水性アミノ酸を含んでいる。チオール含有残基はメチオニンおよびシステインを含み、アミン含有残基はリシンおよび（少なくともさらに１個の）アルギニンを含み、疎水性残基はロイシン、イソロイシン、アラニンおよびフェニルアラニンを含む。
【０１３５】
インテグリンと特異的に結合する標的分子は、血管系の細胞上に見出し得るシグナル配列の１つのクラスである。これらのペプチドは、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）に基づくシグナル配列を有する。したがって、特定のインテグリンを結合する配列は、血管内皮細胞および新生血管系の他の細胞に対する有用な標的分子として機能することが可能である。例えば、この標的分子はＮＧＲ標的配列であり得る。
【０１３６】
非構造的スペーサーは、標的分子の特徴であり得る。このようなスペーサーは、典型的にはグリシンおよび／またはプロリン残基を含む。これらのスペーサーの長さは、約１個から約５個のアミノ酸の範囲に及ぶことができる。さらに、通常、結合の増加を生じる環化により標的分子を物理的に拘束することが好ましいことが多い。これは通常、互いに約４個のアミノ酸（その間にＮＧＲのみを有する）から１０個のアミノ酸を離してＮＧＲコアの側面に位置する一対のシステイン残基により達成される。例えば、ＮＧＲコアの側面に位置するこのシステイン残基対は、互いに７個のアミノ酸間隔離れていることができる。
【０１３７】
したがって、典型的な標的分子は下記の構造：
−ＸＮＧＲＹＸ−
を有し、式中、Ｘは０個から５個のアミノ酸であり、Ｙは１個または２個のアミノ酸であり、システイン、セリン、スレオニンおよびメチオニンから選択される。特に好適な実施形態では、Ｘはグリシン残基からなるが、所望により少なくとも１個、典型的には１個または２個の遊離のチオールまたはアミン含有アミノ酸および／または１個の疎水性アミノ酸を含んでいる。チオール含有残基はメチオニンおよびシステインを含み、アミン含有残基はリシンおよび（少なくともさらに１個の）アルギニンを含み、疎水性残基はロイシン、イソロイシン、アラニンおよびフェニルアラニンを含む。
【０１３８】
また標的分子は、腫瘍抗原と相互作用する分子であってもよい。この腫瘍抗原は、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ−１；乳癌細胞および膵癌細胞上に存在するＭｕｃ−１糖タンパク質に対する２０個のアミノ酸コア反複）、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子産物、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆ癌遺伝子産物、ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、ｇｐ７５、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１＆２、ＨＰＶ−Ｆ４、６、７、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＰＶ−１６、ＭＵＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ５３、ｒａｓ癌遺伝子産物、ＨＰＶ  Ｅ７、ウィルム腫瘍抗原−１、テロメラーゼ、およびメラノーマガングリオシドからなるリストから選択可能である。
【０１３９】
この標的分子は、アプタマーまたは標的に特異的な抗体であってもよい。従来バイオマーカーの同定およびその特異的な標的に対する抗体の開発は、特定の用途に最高の結果をいつも提供するとは限らない困難で時間のかかるプロセスであった。例えば、多くの癌関連バイオマーカーが同定されたにもかかわらず、これらのほんの少数が癌のスクリーニングおよび予後について有望な結果を示し、これらのバイオマーカーの組合せのみが癌組織と正常組織の最もよい識別を提供可能にすることは真実であり得ることが認められている。
【０１４０】
多くの総説が、アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択における実施および製品について書かれている。（Ｃｏｎｒａｄ，Ｒ．Ｃ、Ｌ．Ｇｉｖｅｒら、（１９９６）。「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６７：３３６〜６７；Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｓ．Ｅ．、Ｉ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、（１９９７）。「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ：ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １（１）：５〜９；Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．とＧ．Ｍａｙｅｒ（１９９９）。「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４３：１２３〜３６；Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ，Ｊ．、Ｍ．Ｐ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、（２０００）。「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｉｔａｔｉｏｎ］」、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４（１）：１５〜２５）。本発明の方法は、所望の細胞に固有であるかまたは所望の細胞の中で、細胞の周囲で、もしくは細胞上で過剰に表現される（正常細胞または非標的細胞との比較として）標的に対する固有なまたは改善された結合特性を有するアプタマーを利用することができる。本明細書中で用いられる「アプタマー」は、本明細書に記載されている核酸アニーリング／ハイブリッド形成以外の相互作用またはコンフォメーションを介して標的分子に結合する核酸を意味する。アプタマーを作成して修飾する方法、および標的分子に対するアプタマーの結合をアッセイする方法は、当業者には周知のいずれかの機構によりアッセイまたはスクリーニングされ得る（例えば、米国特許第６，１１１，０９５号、第５，８６１，５０１号、第５，８４０，８６７号、第５，７９２，６１３号、第５，７８０，６１０号、第５，７８０，４４９号、第５，７５６，２９１号、第５，６３１，１４６号および第５，５８２，９８１号；ならびに国際公開第９２／１４８４３号、国際公開第９１／１９８１３号、および国際公開第９２／０５２８５号を参照のこと、これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４１】
アプタマーは、その形状によって所望の標的分子を認識して結合する１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡ分子である。例えば、国際公開第９２／１４８４３号、国際公開第９１／１９８１３号、および国際公開第９２／０５２８５号を参照。Ｇｏｌｄらに発行された米国特許第５，２７０，１６３号、Ｔｕｅｒｋら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５〜５１０、Ｓｚｏｓｔａｋら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８〜８２２およびＪｏｙｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：８３〜８７に記載されているＳＥＬＥＸ手法を標的特異的なＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーの選択に用い得る。ＳＥＬＥＸ手法ではオリゴヌクレオチドが構築され、ｎ−ｍｅｒ、好ましくはヌクレオチドのランダム配列領域は、それによりオリゴヌクレオチドの「ランドマー（ｒａｎｄｏｍｅｒ）プール」を形成して２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーにより挟まれている。次いで、標的分子にオリゴヌクレオチドが結合しやすい条件下で、この構築物を標的分子と接触させる。標的分子に結合するこれらのオリゴヌクレオチドは、（ａ）通常の方法、例えば濾過、遠心、クロマトグラフィーなどを用いて標的分子と結合しないこれらのオリゴヌクレオチドから分離されている；（ｂ）標的分子から切り離されている；（ｃ）通常のＰＣＲ技術を用いて増幅されオリゴヌクレオチドのリガンドに富んだプールを形成している。所望の結合親和性、特異性またはこの両方を有するアプタマーが得られるまで、さらなる回数の結合、分離、解離および増幅を行う。次いで同定された最終的なアプタマー配列が、化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写により調製され得る。
【０１４２】
ランダム配列領域の長さは、２０から１５０残基以上の範囲にすることができ、ライゲーションまたは他の方法により複数のランダムなオリゴヌクレオチドが１つのプールに併合される場合には、さらに長くなり得る。（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．とＪ．Ｗ．Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９３）。「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［コメントを参照］。」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１（５１２７）：１４１１〜８）。ランダム配列集団の個々の数は、典型的には少なくとも１０１３であり、１０１５を容易に越え得る。ほとんどのプールについて、これはすべての可能な２５−ｍｅｒｓ以上が存在すること、および２５を超えるモティーフの比例して少ない数を意味する。生物学的配列の冗長性のため、ほとんどのランダム配列プールの配列の多様性は、恐らく地球の生物圏の配列の多様性に匹敵する。
【０１４３】
アプタマーは、イオンから、小さな有機物、ペプチド、タンパク質、ウイルスおよび組織などの超分子構造の範囲に及ぶ標的の驚くべき範囲に対して選択された。（Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．とＧ．Ｍａｙｅｒ（１９９９）。「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４３：１２３〜３６；Ｘｕ，Ｗ．とＡ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（１９９６）。「Ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３（１５）：７４７５〜８０；Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．、Ｄ．Ｐｒｏｓｋｅら、（１９９７）。「ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｒＰ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１（１１）：８７９０〜７；Ｃｏｎｖｅｒｙ，Ｍ．Ａ．、Ｓ．Ｒｏｗｓｅｌｌら、（１９９８）。「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  ２．８  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５（２）：１３３〜９；Ｈｏｍａｎｎ，Ｍ．とＨ．Ｕ．Ｇｏｒｉｎｇｅｒ（１９９９）。「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｌｉｖｅ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７（９）：２００６〜１４）。特に、アプタマーは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどの多くの核酸結合タンパク質を含む様々なタンパク質（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．とＬ．Ｇｏｌｄ（１９９０）。「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（４９６８）：５０５〜１０。）およびＨＴＶ−１  Ｒｅｖ、（Ｇｉｖｅｒ，Ｌ．、Ｄ．Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）。「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｖ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−ｌ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１（２３）：５５０９〜１６）ならびに複数の非核酸結合タンパク質に対して選択された。一般に、抗タンパク質アプタマーは、タンパク質表面の塩基性部分を認識するように思われる。例えば、多くウイルスタンパク質のアルギニンに富むモティーフ（ＡＲＭ）は、アプタマー（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．、Ｆ．Ｌｅｃｌｅｒｃら、（１９９６）。「Ａｎ  ＲＮＡ  ｇｒｏｏｖｅ［ｎｅｗｓ］」、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３（１２）：９８１〜４に概説されている）、両方のキナーゼのリン酸結合ポケット（Ｃｏｎｒａｄ，Ｒ．、Ｌ．Ｍ．Ｋｅｒａｎｅｎら、（１９９４）。「Ｉｓｏｚｙｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｂｙ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９（５１）：３２０５１〜４．）およびホスファターゼ、（Ｂｅｌｌ，Ｓ．Ｄ．、Ｊ．Ｍ．Ｄｅｎｕら、（１９９８）。「ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ａ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（２３）：１４３０９〜１４）ならびに多くの表面タンパク質上のヘパリン結合部位および塩基性線維芽細胞成長因子などのサイトカイン（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，Ｄ．、Ｃ．Ｋ．Ｌｙｎｏｔｔら、（１９９３）。「Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０（２３）：１１２２７〜３１；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，Ｄ．、Ｌ．Ｓ．Ｇｒｅｅｎら、（１９９５）。「Ｐｏｔｅｎｔ  ２’−ａｍｉｎｏ−２’−ｄｅｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（３６）：１１３６３〜７２）ならびに血管内皮成長因子（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，Ｄ．、Ｌ．Ｓ．Ｇｒｅｅｎら、（１９９４）。「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（３４）：１０４５０〜６；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．、Ｄ．Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、（１９９５）。「Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２（１０）：６８３〜９５）により認識される。
【０１４４】
またアプタマーは、抗体の結合部などのタンパク質表面上のポケットもしくは尖頭（Ｔｓａｉ，Ｄ．Ｅ．、Ｄ．Ｊ．Ｋｅｎａｎら、（１９９２）。「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（１９）：８８６４〜８）または酵素の活性部位（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ、Ｓ．ＭａｃＤｏｕｇａｌら、（１９９２）。「ＲＮＡ  ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（１５）：６９８８〜９２）に対してアフィニティーを有するように思われる。ほとんどすべてのタンパク質は、表面ポケットまたは塩基性パッチのいずれかを有する（実際に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどの陰性のｐＩを有するタンパク質でさえ、典型的にはアプタマーを誘発できる部位を含んでいる）。ほとんどのアプタマー、すなわち標的複合体はナノモル範囲の解離定数を有する。さらにアプタマーは高い特異性でその標的を認識し、高度に相同であるかまたは２、３のアミノ酸だけ異なっているタンパク質標的の間を典型的には識別することができる。（Ｃｏｎｒａｄ，Ｒ．、Ｌ．Ｍ．Ｋｅｒａｎｅｎら（１９９４）。「Ｉｓｏｚｙｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｂｙ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９（５１）：３２０５１〜４；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．、Ｌ．Ｇｏｌｄら、（１９９５）。「Ｌｅｔ’ｓ  ｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ；ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ」、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２（１０）：６３３〜８；Ｈｉｒａｏ，Ｌ、Ｍ．Ｓｐｉｎｇｏｌａら、（１９９８）。「Ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｏ  ＭＳ２  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ」、Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ  ４（２）：７５〜８９）。
【０１４５】
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、任意のクラスの完全な免疫グロブリン（すなわち、完全な抗体）を含むが、これらに限定されるものではない。天然の抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる通常ヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、１つの共有結合であるジスルフィド結合により重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプのＨ鎖間で異なる。またそれぞれの重鎖および軽鎖は、規則的に間隔を空けた内部鎖ジスルフィド架橋を有する。それぞれの重鎖は、１つの末端で可変領域（Ｖ（Ｈ））に続くいくつかの定常領域を有する。それぞれの軽鎖は、１つの末端（Ｖ（Ｌ））に可変領域およびその他の末端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変領域間の界面を形成すると考えられている。すべての脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、その定常領域のアミノ酸配列に基づきカッパー（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分けることができる。当業者は、マウスに対して匹敵し得るクラスを認識するであろう。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
【０１４６】
用語「可変」とは、本明細書においては、抗体間で配列が相違している可変領域の特定の部分を説明するために用いられ、その特定の抗原に対するそれぞれ特定の抗体の結合および特異性に関して用いられる。しかし通常、可変性は抗体の可変領域を通して一様に分布していない。典型的には可変性は、軽鎖および重鎖可変領域の両方における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの部分に集中している。可変領域のさらに高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれは４つのＦＲ領域を含み、βシート構造の部分を連結するループを形成する、そして場合によってはβシート構造の部分を成形する３つのＣＤＲで連結された主としてβシート構造をとる。それぞれの鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により他の鎖のＣＤＲと極めて近傍に一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）を参照のこと）。定常領域は、抗体を抗原に結合することに直接に関与していないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【０１４７】
本明細書中で用いられる用語「抗体またはそれらのフラグメント」は、二重もしくは多重抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどのフラグメントを包含する。したがって、そのフラグメントに特異的な抗原を結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、インテグリン結合活性を保持する抗体のフラグメントが、「抗体またはそれらのフラグメント」という用語の意味に含まれる。具体的には、αＶベータ３結合活性を保持する抗体またはそれらのフラグメントが、「抗体またはそれらのフラグメント」という用語の意味に含まれる。このような抗体およびフラグメントは、当該技術分野で公知の技術により作成でき、実施例ならびに抗体を産生し特異性および活性に関して抗体をスクリーニングする一般的な方法に示した方法に従って、特異性および活性に関してスクリーニングすることができる（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）を参照のこと）。
【０１４８】
また、「抗体またはそれらのフラグメント」の意味には、例えば米国特許第４，７０４，６９２号に記載の抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質（単鎖抗体）の複合体が含まれ、この内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
所望により、抗体は他の生物種で作製され、ヒトへの投与のために「ヒト化」される。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化された形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体が、レシピエント抗体にもインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合もある。一般にヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のこれら領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変領域のすべてを実質的に含む。またヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２））。
【０１５０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当分野では周知である。一般にヒト化抗体は、ヒト以外の供給源からヒト化抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、これは典型的には「インポート」可変領域から取出される。ヒト化は、基本的にはＷｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従い、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、完全なヒト可変領域よりも実質的に小さい部分が、非ヒト生物種由来の対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはいくつかのＣＤＲ残基および恐らくはいくつかのＦＲの残基が、げっ歯類抗体の類似の部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【０１５１】
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖および重鎖両方のヒト可変領域の選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。「最良適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法に従い、げっ歯類抗体の可変領域の配列が既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いでげっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））。
【０１５２】
抗原に対する高いアフィニティーおよび他の好ましい生物学的特性を保持した状態で抗体がヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、開示された方法に従って、親のおよびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析の工程により、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の綿密な調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわちその抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、ＦＲ残基をコンセンサスおよびインポート配列から選択し組み合わせることができ、その結果、標的抗原（複数可）に対するアフィニティーの増加などの所望の抗体特性が達成される。一般にＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的にそして最も実質的に関与している（１９９４年３月３日公開のＷＯ９４／０４６７９を参照のこと）。
【０１５３】
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫後にヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いることができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内在性の抗体産生の完全な阻害を生じることが記述されている。このような生殖細胞系変異体マウスへヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列を移入することにより、抗原チャレンジ後にヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）を参照のこと）。またヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーで産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１））。またＣｏｔｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクロナール抗体の調製に利用できる（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（ｌ）：８６〜９５（１９９１））。
【０１５４】
本明細書中で用いられる用語「モノクロナール抗体」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体を意味する。すなわち集団を構成するそれぞれの抗体は、少量で存在し得る起こりうる天然に存在する突然変異を除いて同一である。本明細書においてモノクロナール抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の生物種由来の抗体の対応する配列に同一であるかもしくは相同であるかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する「キメラ」抗体を含み、一方、この鎖の残りの部分（複数可）は、別の生物種由来の抗体の対応する配列に同一であるもしくは相同であるかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラス、ならびに抗体フラグメントが所望する活性を示す限りは、このような抗体のフラグメントに属している（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）を参照のこと）。
【０１５５】
モノクロナール抗体は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）またはＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）に記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物を、典型的には免疫剤で免疫して、特異的に免疫剤に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいはリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫できる。例えば、免疫剤はヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ−１；乳癌細胞および膵癌細胞上に存在するＭｕｃ−１糖タンパク質に対する２０個のアミノ酸コア反複）、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子産物、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆ癌遺伝子産物、ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、ｇｐ７５、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１＆２、ＨＰＶ−Ｆ４、６、７、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＰＶ−１６、ＭＵＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ５３、ｒａｓ癌遺伝子産物、ＨＰＶ  Ｅ７、ウィルム腫瘍抗原−１、テロメラーゼ、ビトロネクチンレセプター（αｖβ３）、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０（Ｓｉｇｌｅｃ−２）、ＣＤ３０、ＴＮＦＲＳＦ１）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡ）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦＲβ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２７（ＰＥＭ、ＭＵＣ１、ムチン−１）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１）、ＥｐＣａｍ、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＥＲ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２）、ＰＳＭＡ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ、ＶＥＧＦおよびメラノーマガングリオシドからなるリストから選択可能である。従来はモノクロナール抗体の産生は、免疫原として用いる精製タンパク質またはペプチドの利用可能性に依存していた。より最近では、ＤＮＡに基づく免疫が強力な免疫応答を誘発してモノクロナール抗体を産生する方法として有望であることが示された。この方法では、ＤＮＡに基づく免疫を用いることができ、ヒトＩｇＧ１との融合タンパク質として発現するインテグリンの一部をコードするＤＮＡが、当該技術で周知の方法（例えば、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥら、Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｌｔ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９８  Ｄｅｃ；１７（６）：５６９〜７６；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥら、Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ５  ｍｉｃｒｏｇ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．２０００  Ａｕｇ；１９（４）；２９７〜３０２、これら全部が抗体産生の方法のために、参照として本明細書に組み込まれる）により、および実施例記載のように宿主動物に注射される。
【０１５６】
精製タンパク質またはＤＮＡのいずれかで免疫する別のアプローチは、バキュロウイルスで発現する抗原を用いることである。この系の利点には、産生の容易さ、高レベルでの発現、および哺乳動物系で見られるものと非常に類似している翻訳後修飾が含まれる。この系の使用には、融合タンパク質としてのインテグリン抗体の発現領域を含む。抗原は、インテグリン抗体ヌクレオチド配列のシグナル配列と成熟タンパク質領域間にインフレームで遺伝子フラグメントを挿入することにより産生される。これはウイルス粒子表面に外来タンパク質の表示をもたらす。この方法は完全なウイルスを用いる免疫を可能にし、標的抗原の精製の必要をなくする。
【０１５７】
一般にモノクロナール抗体を産生する方法で、ヒト起源の細胞が要求される場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が要求される場合には、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いでハイブリドーマ細胞をつくるために、このリンパ球をポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞系と融合する（Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）５９〜１０３頁）。不死化細胞系は、通常げっ歯類、ウシ、ウマ、およびヒト起源の骨髄腫細胞を含む形質転換した哺乳動物細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞系が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、非融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含むことができる適切な培地で培養できる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。不死化細胞系は効率よく融合し、選択した抗体産生細胞で抗体の安定な高レベルの発現を保持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性である細胞系である。他の不死化細胞系は、例えば、ｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ、およびｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．から入手可能なマウスのミエローマ系であってもよい。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もまた、ヒトモノクロナール抗体産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８７）５１〜６３頁）。次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培地を、インテグリンに対して作られるモノクロナール抗体の存在についてアッセイできる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合実験により測定できる。このような技術およびアッセイは、当分野で公知であり、以下実施例またはＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）にさらに記載されている。
【０１５８】
所望のハイブリドーマ細胞を同定後に、このクローンを限界希釈またはＦＡＣＳソーティング法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖できる。この目的のための適切な培地には、例えばダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物の腹水としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖できる。
【０１５９】
これらのサブクローンにより分泌されたモノクロナール抗体は、通常の免疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡ−セファロース、プロテインＧ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどにより、培地または腹水液から分離または精製できる。
【０１６０】
モノクロナール抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法によって作成することもできる。モノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、容易に分離して通常の方法（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）を用いて配列決定できる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立ち得る。一旦分離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、組換え宿主細胞でモノクロナール抗体合成を得るために、次いで発現ベクターは宿主細胞に、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、形質細胞腫細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しないものであれば骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。またこのＤＮＡは、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてもしくは部分を共有結合することにより修飾することができる。所望により、抗体の定常領域の代わりに、または抗体の１つの抗原結合部位の可変領域の代わりに、このような非免疫グロブリンポリペプチドを用いて、異なる抗原に対する特異性をもちインテグリンおよび他の抗原結合部に特異性を有する１つの抗原結合部を構成するキメラ二価抗体を作成する。
【０１６１】
またｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は、一価抗体を調製するのに適している。これらのフラグメントを産生する抗体の消化、特にＦａｂフラグメントの消化は、当分野で周知の通常の技法を用って達成することができる。例えば、消化はパパインを用いて実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８、米国特許第４，３４２，５６６号、およびＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）に記載されている。抗体のパパイン消化により、典型的にはＦａｂフラグメントと呼ばれ、それぞれ１つの抗原結合部位と残存するＦｃフラグメントを有する２つの同一の抗原結合フラグメントが産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原に架橋結合できるＦ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれる１つのフラグメントを生じる。
【０１６２】
また抗体消化で産生されるＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常領域および重鎖の第１の定常領域を含んでいる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖領域のカルボキシ末端側に数個の残基の付加が存在する点で、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ’フラグメントからなる二価のフラグメントである。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する本明細書における名称である。抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有する１対のＦａｂ’フラグメントとして当初は産生された。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【０１６３】
抗体の単離した免疫性の特異的パラトープまたはフラグメントも提供もする。抗体の特異的な免疫原性エピトープを、分子の化学的または機械的な破壊により完全な抗体から分離することができる。このようにして得られた精製フラグメントを、本明細書に開示される方法により、その免疫原性および特異性を決定するために試験した。抗体の免疫反応性パラトープは、所望により直接的に合成される。免疫反応性フラグメントは、抗体アミノ酸配列由来の少なくとも約２個から５個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列として定義される。
【０１６４】
抗体を構成するタンパク質を産生する１つの方法は、タンパク質化学技術により  ２またはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドを互いに結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、現在利用できる実験装置を使用し、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｏｙｌ））化学のいずれかを使用して化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。当業者には、抗体に相当するペプチドまたはポリペプチドを、例えば標準化学反応によって合成できることを容易に理解できよう。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することができ、その合成用樹脂から切り離されないのに対し、抗体の他フラグメントは合成することができ、次いで樹脂から切り離され、これにより他フラグメント上で機能的にブロックされている末端基を露出する。ペプチド縮合反応により、これらの２つのフラグメントは、それぞれのカルボキシル末端とアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合して、抗体または抗体フラグメントを形成することができる。（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭとＴｒｏｓｔ  Ｂ．編、（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．、ＮＹ）。あるいは上記のように、このペプチドまたはポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで独立して合成される。一旦分離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、類似したペプチド縮合反応を介して抗体または抗体フラグメントを形成するために結合され得る。
【０１６５】
例えば、クローン化されたペプチドセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチドフラグメントを結合して、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたはすべてのタンパク質領域を産生することができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然型の化学的ライゲーション（ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）を、より短いペプチドフラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用することができる。この方法は、２つの工程の化学反応から成っている（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９（１９９４））。第１工程は、最初の共有結合産物としてチオエステル結合中間体を提供する、保護されていない合成ペプチド−α−チオエステルとアミノ末端にＣｙｓ残基を有する別の保護されていないペプチドセグメントとの官能基選択的反応である。反応条件の変化なしで、この中間体は自発的で急速な分子内反応を経て、ライゲーション部位で天然型のペプチド結合を形成する。この天然型の化学的ライゲーション法のタンパク質分子の完全合成への適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製により例示される（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３〜３０（１９９４））。
【０１６６】
あるいは、化学的ライゲーションによりペプチドセグメント間に形成される結合が非天然型（非ペプチド性）結合である場合、保護されていないペプチドセグメントは化学的に結合される（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質領域のアナログならびに完全な生物活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質の合成に使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２５７〜２６７頁（１９９２））。
【０１６７】
また、生物活性を有する抗体フラグメントが開示される。このポリペプチドフラグメントは、アデノウィルスまたはバキュロウイルス発現系などの、これらのポリペプチドフラグメントを産生することができる発現系に、ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質であってもよい。例えば、インテグリンと抗体の相互作用に関連する生物学的効果を生じ得る特定のハイブリドーマ由来の抗体の活性領域を決定することができる。例えば、抗体の活性または結合特異性もしくはアフィニティーのいずれにも関与しないことが認められているアミノ酸を、それぞれの活性を失うことなく削除することができる。例えば種々の実施形態において、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のアミノ酸が、天然もしくは修飾された非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子から逐次的に削除され、そのそれぞれの活性が多くの利用可能なアッセイの１つでアッセイされた。他の例では、抗体のフラグメントは修飾された抗体を含み、特異的位置で天然に存在するアミノ酸の代わりに少なくとも１つのアミノ酸が置換しており、アミノ末端のアミノ酸もしくはカルボキシ末端のアミノ酸の一部または抗体の内部領域でさえも、ポリペプチドフラグメントまたは別の部分で、例えば修飾された抗体の精製を容易にできるビオチンで置換されている。例えば、ペプチド化学によってまたはコード領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じるように、２つのポリペプチドフラグメントをコードするそれぞれの核酸を発現ベクターにクローニングによって、修飾された抗体をマルトース結合タンパク質と融合することができる。ハイブリッドポリペプチドは、これをアミロースアフィニティカラムを通過させてアフィニティー精製でき、次いで特異的プロテアーゼファクターＸａ（ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）を用いてハイブリッドポリペプチドを切断することにより、修飾された抗体レセプターをマルトース結合領域から分離することができる。（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ、１９９６、ｐｇ．１６４を参照のこと）。類似した精製方法が、同様に真核細胞からのハイブリッドタンパク質の分離に利用できる。
【０１６８】
フラグメントは、他の配列に付着しているかいなかにかかわらず、フラグメントの活性が、非修飾抗体または抗体フラグメントと比べて有意に変更されないかまたは損なわれないならば、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含む。これらの修飾は、いくつかの付加的な特性、例えば、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を削除または追加して、そのバイオ長命（ｂｉｏ−ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）を増加させる特性、その分泌特性を変更する特性その他を提供することができる。いずれにせよ、このフラグメントは生物活性特性、例えば結合活性、結合領域での結合の調節その他を有していなければならない。抗体の機能的または活性領域は、タンパク質の特定領域の突然変異誘発に引き続く、発現と発現したポリペプチドを試験することより同定され得る。このような方法は、当業者には容易に理解され、抗原をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含み得る。（Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７〜５００（１９８２）。
【０１６９】
様々なイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質、変異体、またはフラグメントに選択的に結合する抗体の選択に用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、あるタンパク質、タンパク質変異体、またはこれらのフラグメントと選択的に免疫反応性である抗体の選択に通常用いられている。選択的結合の測定に用い得るイムノアッセイ形式および条件の解説に関しては、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）を参照のこと。モノクロナール抗体の結合アフィニティーは、例えばＭｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により決定することができる。
【０１７０】
組成物の作成方法
本明細書において開示された組成物および開示された方法の実施に必要な組成物は、他に特別の記載のない限り、その特定の試薬または化合物について当業者には周知の任意の方法を用いて作成することができる。
【０１７１】
核酸合成
例えば、核酸は標準的化学合成法を用いて作成することができ、または酵素法もしくは任意のその他の既知の方法を用いて産生することができる。このような方法は、標準的酵素消化に引き続くヌクレオチドフラグメント分離から（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）第５、６章を参照のこと）、例えばＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成装置またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を用いるシアノエチルホスホラミダイト法による純粋な合成法の範囲であることができる。またオリゴヌクレオチドの作成に有用な合成法は、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３〜３５６（１９８４），（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ−ｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、（リン酸トリエステルおよび亜リン酸トリエステル法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５：６１０〜６２０（１９８０）、（ホスフォトリエステル法に）により記載されている。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３〜７（１９９４）に記載されているような既知の方法を用いて作成することができる。
【０１７２】
ペプチド合成
本発明の有用なペプチドの特別の利点は、これらは固相法により容易に合成され、詳細に要求された結果を達成するため多様な組合せが可能である。固相法の用いる利点は、この産物を、本発明のプロサイトトキシンの形成に有利であるアミド化された、またはブロックされたＣ末端を用いて直接的に合成できることである。
【０１７３】
開示されたタンパク質、例えば（メリチン）配列番号：６を産生する１つの方法は、タンパク質化学技術により２またはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドを互いに結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、現在利用できる実験装置を使用し、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｏｙｌ））化学のいずれかを使用して化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。当業者には、この開示されたタンパク質に相当するペプチドまたはポリペプチドを、例えば標準化学反応によって合成できることを容易に理解できよう。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することができ、その合成用樹脂から切り離されないのに対し、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントは合成することができ、次いで樹脂から切り離され、これにより他のフラグメント上で機能的にブロックされている末端基を露出する。ペプチド縮合反応により、これらの２つのフラグメントは、それぞれのカルボキシル末端とアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合して、抗体または抗体フラグメントを形成することができる。（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭとＴｒｏｓｔ  Ｂ．編、（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．、ＮＹ（これらは、少なくともペプチド合成と関連する物質について参照として本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載されているように、このペプチドまたはポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで独立して合成される。一旦分離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、類似したペプチド縮合反応を介してペプチドまたはペプチドのフラグメントを形成するために結合され得る。
【０１７４】
例えば、クローン化されたペプチドセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチドフラグメントを結合して、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたはすべてのタンパク質領域を産生することができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然型の化学的ライゲーションを、より短いペプチドフラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用することができる。この方法は、２つの工程の化学反応から成っている（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９（１９９４））。第１工程は、最初の共有結合産物としてチオエステル結合中間体を提供する、保護されていない合成ペプチド−チオエステルとアミノ末端にＣｙｓ残基を有する別の保護されていないペプチドセグメントとの官能基選択的反応である。反応条件の変化なしで、この中間体は自発的で急速な分子内反応を経て、ライゲーション部位で天然型のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３〜３０（１９９４））。
【０１７５】
あるいは、化学的ライゲーションによりペプチドセグメント間に形成される結合が非天然型（非ペプチド性）結合である場合、保護されていないペプチドセグメントは化学的に結合される（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質領域のアナログならびに完全な生物活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質の合成に使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２５７〜２６７頁（１９９２））。
【０１７６】
開示されたタンパク質、例えば（メリチン）配列番号６を産生する別の方法は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法を用いることである。タンパク質をコードするＤＮＡは、通常の方法を用いて容易に分離できて配列決定できる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立ち得る。一旦分離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、組換え宿主細胞でタンパク質合成を得るために、次いで発現ベクターは宿主細胞に、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、形質細胞腫細胞、またはタンパク質を産生しないものであれば骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。
【０１７７】
医薬組成物
また、本発明のこの目的を達成するための、一般に開示されたプロサイトトキシンおよび薬学的に適切な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【０１７８】
本発明の他の態様は、本発明の１つまたは複数のプロサイトトキシンおよび薬学的に適切な担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
【０１７９】
本発明の組成物は、患者に単独で投与できるが、薬剤学的に許容し得る担体中でｉｎ  ｖｉｖｏで組成物を投与することもできる。「薬剤学的に許容し得る」とは、生物学的でないかまたは有害ではない物質を意味し、すなわち、いかなる望ましくない生物学的効果も生じることなく、もしくはそれが含まれている医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互に作用することなく、核酸またはベクターとともにこの物質を対象に投与され得ることを意味する。この担体は当業者にとって周知であるように、当然活性成分のいかなる分解も最小限にするように、かつ対象でいかなる有害な副作用も最小限にするように選択される。
【０１８０】
使用する場合、この組成物の非経口的投与は一般に注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液のいずれか、注射前の液体中の懸濁液の溶液に適した固体形態、または乳液として通常の形態で調製できる。ごく最近改定された非経口的投与のためのアプローチは、一定の用量を維持するように緩慢放出または遅延放出システムを使用することを含んでいる。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。これは参照として本明細書中に組み込まれる。
【０１８１】
この物質は溶液、懸濁液（例えば、これらが取り込まれた微小粒子、リポソーム、または細胞）であってもよい。これらは、上記ならびに下記のように特定の標的を標的にし得る。
【０１８２】
この物質は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれた）であってもよい。これらは抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して特定の細胞型を標的にし得る。以下の参考文献は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２：４４７〜４５１、（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５〜２８１、（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８：７００〜７０３、（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、４：３〜９、（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１〜４２５、（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚとＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７〜８０、（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４２：２０６２〜２０６５、（１９９１））。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」および他の抗体結合リポソーム（結腸癌を標的にする脂質媒介薬剤を含む）などのビヒクル、細胞特異的リガンドを介するレセプター媒介のＤＮＡの標的化、リンパ球誘導の腫瘍の標的化、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療的レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、腫瘍組織に特異的なタンパク質標的にするこの技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４〜６２２０、（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒとＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１０４：１７９〜１８７、（１９９２））。一般にレセプターは、構成的なまたはリガンドで誘導されたエンドサイトーシスの経路に関与している。クラトリンで被覆されたピット中のこれらのレセプターのクラスターは、クラトリンで被覆された小胞を経由して細胞に入り、レセプターが選別される酸性化されたエンドソームを通過し、次いで細胞表面へ再循環するか、細胞内に貯蔵されるかまたはライソソーム中で分解される。内在化経路は様々な機能、例えば養分吸収、活性化されたタンパク質の除去、巨大分子、ウイルスおよびトキシンの日和見性侵入の排除、リガンドの解離および分解、ならびにレセプター濃度の調節に機能する。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドのタイプ、リガンド結合価、およびリガンド濃度に依存して１つ以上の細胞内経路をたどる。レセプター依存性エンドサイトーシスの分子的および細胞のメカニズムが概説されている（ＢｒｏｗｎとＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９〜４０９（１９９１））。
【０１８３】
この組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静注により）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外で、局所的な鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む局所的などにより投与され得る。
【０１８４】
薬剤学的に許容し得る担体
本明細書において記載される組成物は、薬剤学的に許容し得る担体と組み合わせて治療的に使用できる。
【０１８５】
適切な担体およびその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容し得る塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。この薬学的に許容し得る担体の例には、限定されるものではないが、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が含まれる。この溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８であり、より好ましくは約７から約７．５である。さらに別の担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの遅延放出調製物を含み、このマトリックスは、例えばフィルム、リポソームまたは微小粒子の成形品の形態である。例えば投与の経路および投与される組成物の濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは当業者には明らかである。
【０１８６】
製剤学上の担体は、当業者には周知である。これらは最も典型的には、無菌水、生理食塩水、および生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含むヒトに対する薬剤投与のための標準的担体である。この組成物は、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者により行われている標準的な方法に従って投与される。
【０１８７】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤などを含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えば抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などを含み得る。
【０１８８】
この医薬組成物は、局所治療が望まれるかまたは全身治療が望まれるかによって、および治療する部位によって多数の方式で投与され得る。投与は、局所的な（眼科的、経膣的、経直腸的、経鼻的を含む）、経口的な、吸入によるもの、または非経口的な、例えば点滴静注、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射によるものであってもよい。開示された抗体は、静注で、腹膜内に、筋肉内に、皮下に、腔内へ、または経皮的に投与することができる。
【０１８９】
非経口的投与のための調製物には、無菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。水溶性の担体には、水、アルコール性／水溶性溶液、乳液または生理食塩水および緩衝化培地を含む懸濁液が挙げられる。非経口的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースをベースもの）などが挙げられる。また保存剤および他の添加物、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。
【０１９０】
局所的投与用の製剤には、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤および散剤が含まれ得る。通常の医薬担体、水、粉末または油性基剤、増粘剤なども必要であり得るしまた望ましい場合がある。
【０１９１】
経口投与用の組成物には、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性基剤中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、サシェ剤、丸剤、散剤、顆粒剤または錠剤が含まれる。また増粘剤、調味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤も使用され得る。
【０１９２】
いくつかの組成物が、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸、ならびに有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸との反応により、もしくは無機塩基例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、ならびに有機塩基例えばモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換されたエタノールアミンとの反応により形成される薬剤学的に許容し得る酸付加塩または塩基付加塩として投与され得る場合もある。
【０１９３】
本発明のプロサイトトキシンは両性型であるので、これらは遊離塩基として、酸付加塩としてまたは金属塩として利用し得る。塩類は、もちろん薬学的に許容可能でなければならなくて、これらは金属塩、特にアルカリおよびアルカリ土類金属塩である適切なカリウムまたはナトリウム塩を含むであろう。様々な薬剤学的に許容し得る酸付加塩が利用できる。これらは、有機酸および無機酸の両方から調製される酸付加塩を含み、例えば、薬剤学的に許容し得る酸性付加塩は、鉱酸であってもよい。例として挙げられ得る典型的な酸には、クエン酸、コハク酸、乳酸、塩酸および臭化水素酸が含まれる。このような製品は、当業者によく知られた方法により容易に調製される。
【０１９４】
さらにまた、また本発明の組成物は、より長いクリアランス率を有するように修飾することができ、したがって対象によりもたらされる免疫応答および他の排除メカニズムから組成物を保護することにより、生体有用性を増加させることもできる。実際にＷＯ９／２８０２は、ＰＥＧ化化合物が免疫原性および抗原性を減少することを示し、結合していないタンパク質に比べかなり長く血流中を循環することを開示している。例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）ポリマー鎖は、当該技術で周知の方法、例えばＷａｎｇら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ；５４（２００２）５４７〜５７０に記載されているＰＥＧ化法により、プロラクチン変異体／プロラクチンレセプターアンタゴニストに結合することができ、これは参照として本明細書中に組み込まれる。
【０１９５】
しかし、本発明の治療薬組成物の排出半減期を延長できる他の薬剤も当業者に公知であり、本明細書で企図されている。
【０１９６】
さらに、本明細書に記載される組成物は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）で修飾することもできる。ＨＥＳは、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、体内のα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳ−タンパク質結合体を作成する方法は、当分野で公知である。例えば、ＥＰ１３９８３２２、ＤＥ２６１６０８６およびＤＥ２６４６８５４を参照のこと、これらは参照として本明細書中に組み込まれる。
【０１９７】
すべてのこのような組成物で、細胞溶解ペプチドは、通常は主要な生理学的に活性な構成分子である。しかし、本発明のペプチドは、組合せ治療のために別の薬理学的薬剤と共に製剤化され得る。癌治療に用いられる場合、例えばこれらは適合した通常の化学療法剤と共に製剤化され得る。
【０１９８】
治療的使用
組成物の効果的用量および投与スケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。この組成物の投与の投与量範囲は、疾患の症状が影響を受ける所望の効果をもたらすのに十分に大きな投与量範囲である。この用量は、有害な副作用、例えば望まない交差反応、アナフィラキシー反応などが生じるほどに多くないようにすべきである。一般に、用量は患者の年齢、症状、性別および疾患の程度、投与経路、または他の薬剤が療法に含まれるかどうかによって変化し、当業者により決定することができる。何らかの使用禁忌の場合には、個々の医師により用量は調整することができる。用量は変えることができ、１日または数日間、毎日１つまたは複数の用量投与で投与することができる。ガイダンスは、医薬品の所定のクラスについて適切な用量に関する文献に見出すことができる。例えば、抗体の適切な用量を選択するガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｆｅｒｒｏｎｅら、編、Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＮＪ．、（１９８５）第２２章および３０３〜３５７頁；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら、編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）３６５〜３８９頁に見出すことができる。単独で使用される抗体の典型的な１日の用量は、約１μｇ／体重ｋｇから１００ｍｇ／体重ｋｇまでかまたは前述した要素に依存して１日当りさらに多くであってもよい。
【０１９９】
開示された組成物の投与に続く、腫瘍形成または腫瘍増殖の治療、阻害、または阻止に関するこの治療的組成物の有効性は、熟練した実務家に公知の種々の方法により評価することができる。例えば、当業者は本明細書において開示された組成物は、この組成物が腫瘍形成もしくは腫瘍増殖を減少するかまたは腫瘍形成もしくは腫瘍増殖のさらなる増加を阻止することを観察することによって、対象における腫瘍形成もしくは腫瘍増殖の治療または阻害に有効であることを理解するであろう。また開示された組成物の投与の有効性は、血液中に存在する腫瘍特異抗原の濃度を測定することにより決定され得る。腫瘍特異抗原の濃度を測定する方法は、当分野では周知である。
【０２００】
本明細書において開示された腫瘍形成または腫瘍増殖を阻害する組成物は、腫瘍形成または腫瘍増殖の危険がある患者または対象に予防的に投与され得る。
【０２０１】
腫瘍と相互に作用して腫瘍形成または腫瘍増殖を阻害する他の分子、特異的な薬学的機能を有していないが、例えば細胞の染色体内の変化を追跡するためにもしくは診断ツールのデリバリーのために使用され得る他の分子は、医薬品について記載した方法と類似した方法でデリバリーすることができる。
【０２０２】
またこの開示された組成物および方法は、例えば様々な癌の新規候補薬剤を分離し、テストするツールとして使用することもできる。
【０２０３】
またこの開示された組成物および方法は、細胞死を研究するために用いることもできる。またこの開示された組成物および方法は、細胞中でＭＭＰの細胞発現を研究するために用いることもできる。
【０２０４】
またこの開示された組成物および方法は、異なるサイトトキシンが異なる細胞型に及ぼす効果を研究するために用いることができ、異なるタンパク質分解性切断部位を切断する異なる酵素の能力を研究するためにも用いることもできる。
【０２０５】
標的細胞を選択的に破壊する方法
また、標的細胞を選択的に破壊する方法が開示される。この開示された方法は、典型的には標的細胞を本明細書において開示されたプロサイトトキシンと接触させることを伴う。例えば、このプロサイトトキシンは、ペプチド結合を介してＬＡＰに結合された細胞毒性ペプチドを有することができ、このペプチド結合は標的特異的プロテアーゼによる切断に感受性である。標的細胞は、癌細胞を囲む微小循環系および癌細胞に含まれる細胞であってもよい。
【０２０６】
本発明のプロサイトトキシンは、標的細胞に関連した活性により標的細胞に特異的に細胞毒性ペプチドに典型的には変換され、これにより活性化される。換言すれば、標的細胞は、プロサイトトキシンをサイトトキシンに変換する特異的メカニズムを備えている。活性化された細胞毒性ペプチドは、標的細胞に作用して選択的に標的細胞を破壊する。例えば、細胞と関連する活性はプロテアーゼであり得る。
【０２０７】
したがって、標的細胞を、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシンと接触させることを含む、標的細胞を選択的に破壊する方法が記載される。例えば、標的細胞は癌細胞であり得るが、細胞特異的プロテアーゼを含むすべての細胞が標的になる可能性がある。
【０２０８】
標的細胞は、ＬＡＰが結合したタンパク質分解性切断部位を選択的に切断するプロテアーゼを有し得る。したがって、プロサイトトキシンがＭＭＰ切断部位を含む場合、ＭＭＰを有する標的細胞はタンパク質分解性切断部位を切断することができ、細胞溶解ペプチドを「活性化」する。さらに、プロサイトトキシンは標的分子を含むことができる。標的配列はそれ自体ＬＡＰとして作用することもでき、またプロサイトトキシンを標的細胞を囲む新生血管系および細胞骨格要素に導くこともできる。例えば、プロサイトトキシンは、ＲＧＤ標的配列および抗フィブロネクチンＥＤ−Ｂ抗体からなる群から選択される標的分子を含むことができる。
【０２０９】
１つの実施形態では、プロサイトトキシンは潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられ、細胞毒性ペプチドは細胞溶解ペプチドであり、タンパク質分解性切断部位はＭＭＰ切断部位であり、ＬＡＰはＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前駆体ペプチドを含む。例えば、プロサイトトキシンは潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含むことができ、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられている細胞毒性ペプチドはメリチンであり、タンパク質分解性切断部位はＭＭＰ２切断部位であり、ＬＡＰはＴＧＦβ−１の前駆体ペプチドである。
【０２１０】
別の例では、プロサイトトキシンは潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含むことができ、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられ、細胞毒性ペプチドはアメーボポアであり、タンパク質分解性切断部位はＭＭＰ２切断部位であり、ＬＡＰはＴＧＦβ−１の前駆体ペプチドである。どちらの例でも、ＭＭＰを含んでいない標的外の細胞はプロトキシンを活性化することができず、したがってプロトキシンにより影響を受けない。
【０２１１】
本発明の細胞溶解ペプチドをベースとしたプロサイトトキシンを用いる癌の治療的処置は、細胞溶解ペプチドが標的細胞の細胞膜に吸収されることが知られているので特に有利である。したがって、標的細胞が溶解した後でさえも、細胞溶解ペプチドが隣接した標的外の細胞に作用することおよび望ましくない破壊を生じることが阻止される。例えば、Ｌｅｉｐｐｅら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７６５９〜７６６３を参照のこと。さらに、少なくとも特別な安定化工程（上記）が実施されない場合は、本発明の薬剤は、一般にかなり短い半減期を有する小さなペプチドであることに留意されたい。したがって、たとえ小量の活性化された細胞溶解ペプチドが癌細胞の表面を漏れ出るとしても、それはかなり短命なはずであり、たとえあるとしても標的外の細胞の破壊をほとんど生じない。
【０２１２】
患者における癌治療法
さらに、患者で癌を治療する方法が開示される。一般にこの方法は、治療有効量のプロサイトトキシンを患者に投与することを含む。ある実施形態では、プロサイトトキシンは、アメーボポア、メリチンまたはそれから由来する細胞溶解ペプチドに基づくことができる。
【０２１３】
また、本明細書に記載された治療有効量の医薬組成物を投与することを含む癌患者を治療する方法も開示される。例えば、プロサイトトキシンの用量は、１日当り約１μｇ／体重ｋｇから１００ｍｇ／体重ｋｇまたはそれ以上であってもよい。例えば、この用量は５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり得る。１つ以上のプロサイトトキシンが投与され得て、プロサイトトキシンの組合せも投与され得る。当業者は、所定の哺乳動物宿主のための最適なデリバリー経路、用量および療法を容易に確定することができる。使用される実際の用量は、製剤化された特定の組成物、使用される特定の化合物、投与法ならびに治療される特定の部位、宿主および疾患によって変わることはもちろん理解されるであろう。年齢、体重、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、患者の症状、配合薬剤、反応感受性および疾患の重篤度を含む薬剤の作用を修飾する多くの要素が考慮される。
【０２１４】
開示された組成物は、任意の固形腫瘍を治療するために用いることができる。開示された組成物を治療に用いることが可能である代表的かつ非限定的な癌のリストは次の通りである。すなわち、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫／グリア芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、咽喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、頸癌、乳癌、ならびに上皮癌、腎臓癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血性癌、精巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌である。
【０２１５】
また本明細書において開示された化合物は、前癌症状、例えば子宮頸および肛門異形成、その他の異形成、高度異形成、過形成、非定型的過形成、ならびに新形成の治療に使用され得る。例えば、この開示されたプロサイトトキシンを用いて、ＭＭＰ２を発現する血管形成中の任意の組織を標的とすることができる。
【０２１６】
癌患者を治療する方法は、患者への潜伏関連ペプチドおよび細胞毒性ペプチドを含み、タンパク質分解性切断部位が潜伏関連ペプチドと細胞毒性ペプチドの間に設けられているプロサイトトキシンの治療有効量の投与を含むことができる。例えば上記のように、細胞毒性ペプチドは、ポア形成細胞溶解ペプチドであることができる。ある実施形態では、細胞溶解ペプチドは、メリチン、メリチンアナログ、またはメリチン誘導体であることができる。
【０２１７】
サイトトキシンに潜伏性を提供する方法
また、サイトトキシンと潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位とを共有結合することを含むサイトトキシンに潜伏性を提供する方法が開示され、前記潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位が前記サイトトキシンに潜伏性を提供する。
【０２１８】
一般に、このプロサイトトキシンは、電荷中性化および／またはペプチドを毒性にするコンフォメーションの形成を立体的に阻害することにより無毒性にされる細胞毒性ペプチドである。詳細には、このプロサイトトキシンはペプチド結合を介してＬＡＰに結合された細胞毒性ペプチドを含み、前記ペプチド結合は腫瘍特異的プロテアーゼによる切断に感受性である。本発明のＬＡＰは、細胞毒性ペプチドが活性コンフォメーションを形成することを妨げる。例えば、プロサイトトキシンが標的細胞に接触するとき、腫瘍特異的プロテアーゼはＬＡＰとサイトトキシン間のペプチド結合を切断し、それにより細胞毒性ペプチドがポアコンフォメーションを形成して細胞膜を破壊することを可能にする。
【０２１９】
サイトトキシンに潜伏性を提供する方法は、サイトトキシンと潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位とを共有結合することを含むことができ、前記潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位が、前記サイトトキシンに潜伏性を提供する。上記のように、サイトトキシンは、ポア形成細胞溶解ペプチドであることができる。ある実施形態では、細胞溶解ペプチドはメリチン、メリチンアナログ、またはメリチン誘導体であることができる。タンパク質分解性切断部位は、ＭＭＰ切断部位であることができ、ＬＡＰはＴＧＦβ−１、２、３、４または５の前駆体ペプチドを含むことができる。
【０２２０】
またサイトトキシンに潜伏性を提供する方法は、サイトトキシンと潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位とを共有結合することを含むことができ、前記サイトトキシンは、ペプチドを毒性にするコンフォメーションの形成を妨げ、したがって細胞毒性ペプチドを無毒性にする。
【０２２１】
またサイトトキシンに潜伏性を提供する方法は、サイトトキシンと潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位とを共有結合することを含むことができ、前記潜伏関連ペプチドは、細胞毒性ペプチドの周囲に保護シェルを形成し（「ケージング」）、これにより細胞毒性ペプチドを遮蔽し、細胞表面の他の分子またはその活性にとって重要な分子とのその相互作用を妨げたりまたは阻止する。細胞毒性ペプチドの周囲でＬＡＰに二量体を形成させ、これによって、細胞毒性ペプチドの周囲に保護シェルまたはケージを形成することにより、これを達成することができる。
【０２２２】
またサイトトキシンに潜伏性を提供する方法は、サイトトキシンと潜伏関連ペプチドおよびタンパク質分解性切断部位とを共有結合することを含むことができ、前記潜伏関連ペプチドは、サイトトキシンのαヘリックス構造が成形されることを立体的に阻止する。さらに、細胞毒性ペプチドは負に荷電するアミノ酸を含むように修飾でき、これにより毒性のポアコンフォメーションが形成されるのを阻止できる。
【０２２３】
キット
本明細書において、ここに開示された方法の実施に使用できる試薬が提供されるキットを開示する。このキットは、本明細書中に記載されている任意の試薬もしくは試薬の組合せ、または開示された方法の実施に必要とされるかもしくは有益であることが理解されるであろう任意の試薬もしくは試薬の組合せを含むことができる。例えば、このキットは、本方法の特定の実施形態に記載されたプロサイトトキシンならびに医薬賦形剤およびプロサイトトキシンの意図した使用に必要とされる他の試薬を含み得る。
〔実施例〕
【０２２４】
以下の実施例は、当業者に本明細書における請求の範囲に記載の化合物、組成物、製品、装置および／または方法が作成されて評価される方法の完全な開示および説明を提供するために示されており、そして本発明を単に例示することを意図し、開示を限定することを意図しない。数値（例えば、量、温度など）については、正確性を確実にするための努力がなされているが、いくつかの誤差および偏差が考慮に入れられるべきである。他に指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。
【実施例１】
【０２２５】
メリチンをベースとしたプロサイトトキシンのクローニング
２本鎖ＭＭＰ２／メリチンテンプレートの作成
２つの相補的オリゴであるＥｃｏＲＩ／ＭＭＰ２／メリチンセンス鎖（配列番号：１７）およびＥｃｏＲＩ／ＭＭＰ２／メリチンアンチセンス鎖（配列番号：１８）を標準的方法を用いて合成した。この２つのオリゴを等しいモル比で混合し、次いで沸騰水入りの１リットルビーカー中で５分間加熱した。この混合物を実験台上で室温に冷却し、２本鎖ＭＭＰ２／メリチンテンプレートを得た。
【０２２６】
２本鎖ＭＭＰ２／メリチンテンプレートの増幅とサブクローニング
２本鎖ＭＭＰ２／メリチンテンプレートを、リン酸化された５’末端を有するプライマーＰ１（配列番号：１９）およびプライマーＰ２（配列番号：２０）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、以下の条件下で実施した。すなわち、９４℃で５分間、次いで９４℃で３０秒間、６２．５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を２８サイクル、次いで７２℃で１０分間を実施した。次いでこのＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮキット（カタログ番号：２８１０４）を用いて精製した。
【０２２７】
ＰＣＲ産物の精製後、この精製産物をＥｃｏＲＩで消化した。さらにＰｃＲ２．１ベクターをＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶを用いて消化した。次いで消化したＰｃＲ２．１ベクターに消化したＰＣＲ産物を挿入できるように、ＥｃｏＲＩで消化したＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶで消化したＰｃＲ２．１ベクターと共にインキュベートした。この得られたプラスミドをｐＣＲＭＭＰ２／メリチンと名づけた。
【０２２８】
ＬＡＰフラグメントの増幅
ＬＡＰ  ｃＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐｈＴＧＦＢ−２（ＡＴＣＣ＃  ５９９５４）を用いたＰＣＲを用いて増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位（配列番号：２１）を含むＬＡＰセンスプライマーおよびＥｃｏＲＩ部位（配列番号：２２）を含むＬＡＰアンチセンスプライマーをＰＣＲ反応に用いた。
【０２２９】
ＰＣＲは、以下の条件下で実施した。すなわち、９４℃で５分間、次いで９４℃で３０秒間、７５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を２５サイクル、次いで７２℃で１０分間を実施した。次いでＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮキット（カタログ番号：２８１０４）を用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した。並行して、ｐＣＲＭＭＰ２／メリチンプラスミドもＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した。
【０２３０】
次いで消化したｐＣＲＭＭＰ２／メリチンプラスミドに、この消化したＰＣＲ産物を挿入できるように、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化したＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＣＲＭＭＰ２／メリチンプラスミドと共にインキュベートした。この得られたプラスミドを、ｐＣＲＬＡＰ／ｍｍｐ２／メリチンと名づけた。
【０２３１】
哺乳動物発現ベクターの作製
マウスＤＨＦＲ  ｃＤＮＡフラグメントを、ＢｓｔＸ１およびＮｏｔＩを用いてプラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ＃  ３７１４６）から切り出した。ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミドも、ＢｓｔＸ１およびＮｏｔＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で消化した。
【０２３２】
次いでＢｓｔＸ１／ＮｏｔＩ消化ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡフラグメントおよびＢｓｔＸ１／ＮｏｔＩ消化ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミドを精製した。次いでＢｓｔＸ１／ＮｏｔＩ消化ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡフラグメントおよびＢｓｔＸ１／ＮｏｔＩ消化ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミドを、消化したＤＨＦＲ  ｃＤＮＡフラグメントの挿入を可能にする適切な条件下で、それ自体を消化したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミドに挿入するために一緒にインキュベートした。このプラスミドはｐＩＲＥＳ／ＤＨＦＲと名づけた。
【０２３３】
ＬＡＰ／ｍｍｐ２／メリチンフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＣＲＬＡＰ／ｍｍｐ２／メリチンから切り出し、ＳｍａＩを用いて切断したｐＩＲＥＳ／ＤＨＦＲプラスミドに挿入した。得られた哺乳動物の発現ベクターを、ｐＬＡＰ／ｍｍｐ２／メリチン／ＩＲＥＳ／ＤＨＦＲと名づけた。
【０２３４】
ＣＨＯ細胞発現
ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−（ＡＴＣＣ＃  ９０９６）細胞を、ｐＬＡＰ／ｍｍｐ２／メリチン／ＩＲＥＳ／ＤＨＦＲプラスミドでトランスフェクトし、ＤＭＥＭ＋１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．０１６ｍＭチミジン、０．００２ｍＭメトトレキセート、１０％ＦＢＳ、１×ＰＳＮ、および１０００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地でＧ４１８により選択した。
【０２３５】
単一のコロニーを選択対象から釣菌し、発現させるために増殖した。
【０２３６】
発現を誘導するために、上記の選択した細胞を５００ｎＭのメトトレキセートを補充した無血清培地に入れ換え、一夜インキュベートした。さらに精製するために培地を採取した。
【実施例２】
【０２３７】
メリチンをベースとしたプロサイトトキシンのクローニング
ＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン融合タンパク質の産生
ＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン構築物を、ｐＩＲＥＳ−ＤＨＦＲベクターにクローニングした。次いで実施例１に記載したように、このプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、ＤＭＥＭ＋１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．０１６ｍＭチミジン、０．００２ｍＭメトトレキセート、１０％ＦＢＳ、１×ＰＳＮ、および１０００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で、細胞をＧ４１８により選択した。１０％のＦＢＳを含むＧ４１８培地で細胞を連続培養した。Ｇ４１８選択が完了した後に、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１％のＦＢＳのみを含む培地に順応させる。
【０２３８】
培地のＭＴＸ濃度を５０ｎＭ  ＭＴＸから５００ｎＭ  ＭＴＸまで増加させて、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン融合タンパク質を産生するように誘導した。それぞれのＭＴＸ濃度で、細胞溶解物を得て、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くＬＡＰ抗血清を用いるウェスタン分析により分析した（図１）。ウェスタン分析により、ＬＡＰ融合タンパク質の予測された分子量分を有するタンパク質が明らかとなった。このタンパク質は、２５０ｎｍおよび５００ｎｍのＭＴＸ濃度で最も増強されていた。また非常に濃いバンドが、５０ｎＭ  ＭＴＸ濃度で見られたが、他のバンドの混合物も存在した。
【０２３９】
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞で観察されるこのタンパク質は、単に人工産物でなことを示すために、５００ｎＭ  ＭＴＸに暴露したトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞から溶解物を得た。図２は、ＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチン融合タンパク質でトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞には、このタンパク質が存在しないことを示している。したがって、ＬＡＰ融合タンパク質は、融合タンパク質でトランスフェクトした細胞から得た溶解物中に存在すると結論することができる。
【０２４０】
次の工程は、ＬＡＰ融合タンパク質が培地に分泌されるかどうかを確かめることである。これは、５００ｎＭ  ＭＴＸの存在下でトランスフェクトした細胞から培地を採取することにより調べた。培地の採取前に、細胞をそれぞれの以下のＭＴＸ濃度、すなわち、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、および５００ｎＭのに４８時間暴露した。次いで培地を、５００ｎＭ  ＭＴＸに暴露した細胞から採取し、細胞の破片をペレット化し、上清を摂氏−２０度で保存した。培地中の融合タンパク質の量を濃縮するために、培地を凍結乾燥した。次いで凍結乾燥した培地を、最初の容量よりも約１０倍少ない容量に水で再懸濁した。バッチ法を用いるｈＬＡＰアフィニティークロマトグラフィーにより、ＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチン融合タンパク質を濃縮した培地から部分的に精製した。このサンプルを、ｎａｔｉｖｅＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した（図３）。このサンプルを、トランスフェクトした細胞溶解物から得たタンパク質と比較した。同じバンドが、ウェスタン上のこれらのサンプルの両方について観察された。
【０２４１】
またＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチンを、別の方法で培地から精製した。サンプルは、先に述べたように凍結乾燥して、ウォーターズＨＰＬＣのサイズ排除カラムを精製に用いた。図４は、部分的に精製されたタンパク質を示す。
【実施例３】
【０２４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける標的細胞の殺傷
またＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチン融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｏでの機能も評価され得る。例えば、ＭＭＰ２を分泌するＤＵ−１４５前立腺癌細胞を、０日目に４８穴プレートに播種され得る。１日目にこれらの細胞を、３時間この融合タンパク質で処理し得て、次いでＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）アッセイにより細胞溶解を測定する。この反応は、ＬＤＨアッセイにより可視化され得る。
【０２４３】
これに加えて、またはこれに代えて、精製ＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチン融合タンパク質を、活性なＭＭＰ２の存在下または非存在下で、摂氏３７度で一夜でインキュベートされ得る。次の日、処理したおよび未処理のサンプルを、ＣＨＯ細胞と共にインキュベートされ得る。細胞は１時間で処理され得て、次いで細胞が溶解したかどうかを測定するためにＬＤＨアッセイを実施し得る。一夜の活性なＭＭＰ２による融合タンパク質の処理により、ＭＭＰ２切断部位でこのタンパク質を切断することができ、遊離のメリチンを放出できる。ＭＭＰ２処理融合タンパク質をＣＨＯ細胞と共にインキュベートする場合、細胞は、未処理の融合タンパク質と共にインキュベートした細胞と比べて細胞溶解の増加を示す。
【実施例４】
【０２４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的細胞の殺傷
またＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチン融合タンパク質の機能を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて示すこともできる。例えば、Ｃ５７雌マウスに約８０万のＢ１６細胞を皮下に接種し得る。腫瘍接種後の７日目に、マウスに５０μｇのＬＡＰ  ＭＭＰ２メリチンプラスミドＤＮＡを筋肉内に注射し得る。次いでマウスは週当りさらに２回注射され得る。腫瘍の大きさは減少し、マウスの寿命は増加する。
【０２４５】
本出願を通じて様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野における技術水準をより完全に記載するために、その全体が本出願に参照として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】トランスフェクトしたＣＨＯ細胞でｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンの検出を示す図である。ＬＡＰ  ＣＨＯ（ｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンでトランスフェクトした）溶解物およびＣＨＯ（トランスフェクトしていない）溶解物３０μｇ［全体を通じてμｇ／μｌを探索］を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。５０ｎｇのｈＬＡＰを、陽性対照として使用した。
【図２】トランスフェクトしたＣＨＯ細胞における、ＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン産生のメトトレキセートによる誘導を示す図である。正常なトランスフェクション培地の存在下で、ＣＨＯ細胞をＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を１０％ＦＢＳおよび５０ｎＭ  ＭＴＸを含む培地で培養した。ＦＢＳの量を培地で段階的に１％まで減した。次いで培地のＭＴＸの量を増加させて、細胞をタンパク質を産生するように誘導した。種々のＭＴＸ濃度の細胞から溶解物を得て、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。各ＭＴＸ濃度について、約３０μｇの溶解物を分析し、かつ５０ｎｇのｈＬＡＰ（ウェスタンブロット陽性対照）を分析した。
【図３】非変性条件下でｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチンでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの溶解物および上清の分析を示す図である。培地中に存在するｈＬＡＰ融合タンパク質（ｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン）を、アフィニティークロマトグラフィーによって分析前に濃縮した。３０μｇの融合タンパク質溶解物を分析し、５０ｎｇのｈＬＡＰを陽性対照として使用した。すべてのサンプルは、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。
【図４】部分的に精製したｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン融合タンパク質の分析を示す図である。精製したｈＬＡＰ−ＭＭＰ２−メリチン融合タンパク質を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに引き続くｈＬＡＰ抗血清を用いるウェスタンブロット法により分析した。この融合タンパク質は、ウォーターズＨＰＬＣシステムのサイズ排除クロマトグラフィーにより、部分的に精製した。
【図１】
2009510166.tif 000007
【図２】
2009510166.tif 000008
【図３】
2009510166.tif 000009
【図４】
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【配列表】
2009510166000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月4日(2008.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009510166000001.app
【国際調査報告】
2009510166.tif 000043
2009510166.tif 000044
2009510166.tif 000045
2009510166.tif 000046
2009510166.tif 000047
2009510166.tif 000048