(57)【要約】  本発明は、リガンド分子の結合においておよびアナライト分子との相互作用において高性能を呈する、カルボン酸基またはその誘導体により置換された多糖を含む結合性層を提供する。結合性層の作製方法および種々のアナライト分子の測定方法も提供する。
2009513969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体により置換された多糖を含む結合性層であって、前記カルボン酸基またはその誘導体の各β原子が、水素原子または炭素原子であり、かつ複数の前記カルボン酸基またはその誘導体の少なくとも一部が、リガンド分子の結合に対して活性化される、結合性層。
【請求項２】
前記多糖が、アガロース、アルギン酸、アミロペクチン、アミロース、カラゲナン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、グリコーゲン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、アミロペクチン、アミラーゼ、およびデンプン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、請求項１に記載の結合性層。
【請求項３】
前記多糖が、アルギン酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ペクチン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、請求項１または２に記載の結合性層。
【請求項４】
前記リガンド分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗原、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、グリカン、小有機分子、細胞、ウイルス、細菌、および生物学的サンプルから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項５】
前記少なくとも１つのカルボン酸基が、１〜２０個の原子を含むリンカー分子に結合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項６】
前記リンカー分子が２個または３個の炭素原子を含む、請求項５に記載の結合性層。
【請求項７】
前記少なくとも１つの誘導体が、カルボン酸エステル、アミド、無水物、ハロゲン化アシル、およびアルデヒドから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項８】
前記誘導体がエステルである、請求項７に記載の結合性層。
【請求項９】
前記エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはその誘導体である、請求項８に記載の結合性層。
【請求項１０】
前記誘導体がＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルである、請求項９に記載の結合性層。
【請求項１１】
カルボン酸基とその誘導体との混合物を含む、請求項１に記載の結合性層。
【請求項１２】
前記誘導体が、カルボン酸エステル、アミド、無水物、ハロゲン化アシル、およびアルデヒドから選択される、請求項１１に記載の結合性層。
【請求項１３】
前記多糖が、表面を有する固体基材上に固定化される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項１４】
前記基材がバイオセンサーの検出素子である、請求項１３に記載の結合性層。
【請求項１５】
前記検出素子が、ガラス、プラスチック、および自由電子金属から選択される材料で構成される、請求項１４に記載の結合性層。
【請求項１６】
前記自由電子金属が金である、請求項１５に記載の結合性層。
【請求項１７】
実質的に完全に活性化される、請求項１に記載の結合性層。
【請求項１８】
少なくとも５０％活性化される、請求項１に記載の結合性層。
【請求項１９】
少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体を含む結合性層の作製方法であって、前記少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体のそれぞれが、β原子の位置に水素原子または炭素原子を有し、
表面を有する基材を提供する工程と、
前記基材の表面上に多糖を固定化する工程と、
前記多糖を化学修飾してそれから伸長するように少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体を形成する工程とであって、前記カルボン酸基またはその誘導体の各β原子は、水素原子または炭素原子である工程と、
リガンド分子の結合に対して前記カルボン酸基またはその誘導体の少なくとも一部を活性化させる工程と、
を含み、
前記化学修飾工程および前記活性化工程が、互いに独立して、前記固定化工程前、前記固定化工程中、または前記固定化工程後に行われる方法。
【請求項２０】
前記化学修飾工程が、β酸素原子を有する少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体の化学反応を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学反応がβ−アラニンまたはその任意の誘導体によるアミド化である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記多糖が、アルギン酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ペクチン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルボン酸基またはその誘導体の少なくとも５０％が活性化されてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを形成する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
複数の活性化された前記カルボン酸基またはその誘導体が、リガンド分子と反応することにより、前記層に共有結合したリガンド分子を提供する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
リガンド分子とアナライト分子との相互作用を測定する方法であって、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の結合性層を作製する工程と、少なくとも１種のアナライト分子と相互作用しうる少なくとも１種のリガンド分子を前記層に結合させる工程と、前記リガンド分子を前記アナライト分子と反応させてそれらの間に相互作用を引き起こす工程と、前記相互作用を測定する工程と、を含む方法。
【請求項２６】
前記リガンド分子および前記アナライト分子が、独立して、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、小有機分子、細胞、ウイルス、細菌、および生物学的試料から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記測定が、蛍光的、核的、磁気的、電気化学的、または光学的な方法に基づく、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記測定が光学的な方法に基づく、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記光学的な方法が表面プラズモン共鳴である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、バイオアッセイおよびバイオセンサーに使用するための結合性層および結合性マトリックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーは、オリゴヌクレオチドを含むさまざまな生体分子複合体、抗体−抗原相互作用、ホルモン−レセプター相互作用、および酵素−基質相互作用を検出するために開発されてきた。一般に、バイオセンサーは、２つの構成要素、すなわち、きわめて特異的な認識素子と、分子認識事象を定量可能なシグナルに変換する変換器とからなる。そのようなシグナル伝達は、蛍光法、干渉法、および重量法をはじめとする多くの方法により達成可能である。
【０００３】
蛍光性化合物でアナライトを標識化する必要のない直接法は、測定が比較的単純であるうえに、小分子と容易に標識化されないタンパク質との相互作用を研究しうるので、興味深い。光学的直接法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、格子結合器（grating coupler）、偏光解析法、エバネッセント波デバイス、および反射率測定法を含む。これらの検出方法についての理論的に予測される検出限界が決定され、診断に関連する濃度範囲まで実現可能であることが実験的に確認されている。
【０００４】
一般的な、生体分子複合体または相互作用に関するリアルタイム研究では、たとえば化学結合性層を介して、センサーチップの表面に結合された固定化リガンド分子をアナライト分子に接触させる。その結果、以上に挙げた検出方法の１つ以上により測定されうる相互作用が起こる。そのような研究の有効性は主にリガンド分子に依存する可能性があるので、リガンド分子の効率的な固定化は、多くの場合、基本的かつ最も重要な要件である。リガンド分子の密度が高ければ、それと相互作用するアナライト分子の量が増大するので、より低い検出限界でより高感度の測定が可能になる。
【０００５】
固定化リガンドの量のほかに、他の重要な態様は、表面への結合時のリガンドの生物学的活性の維持である。高いリガンド活性が保持されれば、多数のアナライト分子がリガンドと相互作用することが保証されるので、より高感度の測定が達成される。リガンド活性は、固定化の方法および工程の種々のパラメーターだけでなく結合性層の生体適合性にも強く依存する。
【０００６】
測定感度の改良は、タンパク質のような巨大分子と小さい分子との相互作用に関する研究にとくに必要とされるが、タンパク質リガンドと小さなアナライト分子との間のサイズ差の結果として、得られるシグナルは比較的低い可能性がある。小さい標的分子の大きなタンパク質ベースの受容体への結合を測定することが必要とされることの多い薬剤探索の分野では、そのようなバイオアッセイはとくに重要である。
【０００７】
表面にリガンド分子を結合させるための最も対応している方法の１つは、酸性型でおよび／または対応するカルボン酸塩として存在するカルボン酸基（ＣＧ）を含有する結合性層の使用に基づく。ＣＧは、一般に、活性化されて反応性エステルを形成し、次に、リガンド分子の求核基、主に第一級アミン基と反応し、アミド共有結合を形成する。最もよく使用される活性化溶液は、反応性ＮＨＳエステルを形成すべく、水溶性カルボジイミド（ほとんどの場合、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ））とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との混合物からなる。欧州特許第１３４３０１０号明細書には、ＮＨＳの代わりにＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）が使用される、別のあまり一般的ではない選択肢の手順が教示されている。
【０００８】
種々の型のこのような結合性層のうち、市販のバイオセンサー中でよく使用される層は、たとえば、特許番号国際公開第０９／２２１９７６号パンフレットおよび米国特許第５４３６１６１号明細書に教示され、化学会化学通信誌（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９９０年、１５２６−１５２８頁および分析生化学（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９１年、第１９８巻、２６８−２７７頁のような科学論文に示されるように、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）をベースとするものである。標準的な活性化溶液を用いてこの層中のＣＧの最大３０〜４０％をＮＨＳエステルに活性化することが可能であると報告された。このほか、ＣＭＤ層は、通常、静電的に吸着されるタンパク質の量のごく一部分を結合するにすぎないことが示された。いくつかの場合では、結合は、相互作用測定を行うには実用上不十分であった。
【０００９】
他の態様から、活性化層は、非活性化ＣＧの存在に起因して正味の静電荷が負であることが実証された。活性化基をエタノールアミンと反応させて中性アミドを形成する一般的な不活性化工程の後も、この電荷が残留することは明らかである。当業者には周知であるが、荷電アナライト分子は層と非特異的に相互作用する可能性があり、測定結果の障害および歪みをもたらす可能性があるので、残留電荷は相互作用測定段階では望ましくない。
【００１０】
リガンド分子のより効率的な結合は、たとえば、バイオセンサーおよびバイオエレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃ．）、１９９５年、第１０巻、８１３−８２２頁に教示されるように、直接結合により、または他の選択肢として、ビオチンもしくはアビジン、抗体、チオール結合用ジスルフィドなどのような化学的捕捉性部分または生物学的捕捉性部分を用いることにより、取得可能である。より効率的に活性化されやすい層は、そのような部分を用いた場合にも、結合される捕捉性分子の量がより多くなるので、優れていると予想される。
【００１１】
さらに、不活性化工程時にそのように改良された層の残留電荷をより効率的に最少化することが可能であり、相互作用測定段階に一層有利な環境が得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、より活性化が容易な改良された層は、より効率的にリガンド分子を結合させる能力を有し、ひいては測定感度を増大させ、検出限界を低下させるので、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、現在使用されている公知のマトリックスと比較した場合にバイオアッセイおよびバイオセンサーに使用する上で有意な利点を有する、改良結合性層が提供される。
【００１４】
この革新的な層は一般に、水素原子または炭素基を保有するα原子を有する、少なくとも１つのカルボン酸（有機基−ＣＯＯＨ）またはその誘導体により置換された多糖を含む。すなわち、前記ＣＧに対するβ原子のそれぞれが、水素または炭素原子である。このようなＣＧを、本明細書中では、「易活性化カルボン酸基」と呼ぶ。これらのＣＧは、たとえば、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを含む標準的な活性化溶液への暴露時に効率的に活性化されやすい。
【００１５】
以下に示されるように、一般に使用される既存の層で一般的には最大３０〜４０％の活性化を生じる条件下で、易活性化ＣＧの少なくとも５０％は、アミンカップリング用に活性化された。
【００１６】
したがって、こうした層は、リガンド分子をより効率的に結合させることが可能である。たとえば、β位に酸素（α炭素に結合されたＲＯ−基）を有するＣＧ（先行技術の層中のＣＧ）を易活性化ＣＧに変換した場合、抗体の結合密度は２倍になった。
【００１７】
さらに意外なことに、改良された層は、より効率的なリガンド結合を呈するだけでなく、より高いリガンド活性をも呈するので、より高感度の測定が達成されることが判明した。
【００１８】
さらに、提供された層の静電荷は、後続の活性化工程時および不活性化工程時に効率的に最少化することが可能である。一般に使用されるＣＧ、すなわち、α炭素の位置に置換された酸素基を有するＣＧを含む類似の層ではほとんど効果を示さない工程を用いて、易活性化ＣＧを含む層を中和することが実証される。
【００１９】
したがって、本発明の第１の態様において、少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体により置換された多糖を含む結合性層であって、前記カルボン酸基またはその誘導体に対する各β原子は水素原子または炭素原子であり、かつ複数の前記カルボン酸基またはその誘導体の少なくとも一部はリガンド分子の結合に対して活性化される、結合性層が提供される。
【００２０】
一実施形態では、結合性層は、少なくとも１つのカルボン酸基により置換された多糖を含む。他の実施形態では、結合性層は、本明細書中に定義される少なくとも１つのカルボン酸誘導体により置換された多糖を含む。さらに他の実施形態では、結合性層は、カルボン酸基とその誘導体との混合物により置換された多糖を含む。このような混合物は、任意比率、たとえば、比率１：１、１：１００、１：１０００、もしくはそれぞれの逆比率、または任意の中間の比率でありうる。
【００２１】
さらに他の実施形態では、カルボン酸基またはその誘導体は、互いに独立して、１〜２０個の原子を有しかつ本発明に係る結合性層の構造的または化学的または物理的な特性に影響を及ぼさないように選択されるリンカー分子を介して多糖に結合される。このようなリンカー分子の例としては、炭素直鎖、オリゴ（エチレングリコール）鎖、またはペプチド鎖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、リンカーは、２個または３個の炭素原子を有する。
【００２２】
本発明の他の態様において、少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体を含む結合性層の作製方法であって、前記少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体のそれぞれは、β原子の位置に水素原子または炭素原子を有する、結合性層の作製方法が提供される。前記方法は、
表面を有する基材を提供する工程と、
前記基材の表面上に多糖を固定化する工程と、
前記カルボン酸基に対する各β原子は、水素原子または炭素原子である、前記多糖を化学修飾してそれから伸長するように複数のカルボン酸基を形成する工程と、
リガンド分子の結合に対して前記カルボン酸基の少なくとも一部を活性化させる工程であって、前記化学修飾工程および前記活性化工程は、互いに独立して、前記固定化工程前、前記固定化工程中、または前記固定化工程後に行う方法、
を含む。一実施形態では、本方法は前記活性化カルボン酸基を不活性化させる工程をさらに提供する。
【００２３】
本発明のさらに他の態様において、本明細書中に詳述される結合性層を作製する工程と；少なくとも１種のアナライト分子と相互作用しうる少なくとも１種のリガンド分子を、前記層に結合させる工程と；前記リガンド分子を前記アナライト分子と反応させてそれらの間に相互作用を引き起こす工程と、前記相互作用を測定する工程と、を含む、リガンド分子とアナライト分子との相互作用の測定方法が提供される。
【００２４】
「結合性層」という用語は、本発明の内容の範囲内では、得られるコーティングが直接的化学置換を介してまたは間接的修飾を介して分子を結合させるのに好適であるように固体基材に固定化または結合される多糖を含む層を意味する。
【００２５】
「基材」という用語は、一般的には、固体基材を意味し、バイオアッセイまたはバイオセンサーにおいて検出部として使用するのに好適な表面を有する任意の基材でありうる。それは、種々の材料、たとえば、ガラス、プラスチック、または銅、銀、アルミニウム、および金のような自由電子金属表面で構成され、センサー表面は、本質的に親油性であってもよく、たとえば、ステアリルアミンのように１２〜２４個の炭素原子を有するアルキル鎖を含むものであってもよい。
【００２６】
「検出部」という用語は、単独でまたは他の手段との組合せで測定対象のアナライトの存在、量、または化学的もしくは物理的な状態に対して感受性を有する任意の基材を意味する。例としては、プリズム、電極、グレーティングなどが挙げられうる。
【００２７】
コーティングは、当業者に公知の任意の固定化方法により基材の表面に結合させることが可能である。本明細書中で使用する場合、「固定化」という用語またはその任意の変化形は、任意の化学的、物理的、または機械的な結合力または結合工程を介してコーティングの１つ以上の成分を基材の表面に固着させることを意味する。好ましくは、固定化方法により共有結合が生成される。
【００２８】
「多糖」という用語は、グリコシド結合により互いに連結された約１０個超の単糖残基からなる任意のポリマーを意味する。本発明の範囲内では、この用語はまた、互いに連結されない、固体基材の表面に結合された複数の単糖単位またはオリゴ糖単位も意味し、その場合、多糖集合体の連続層が形成される。多糖またはその集合体は、同一の単糖残基もしくは種々の単糖残基または単糖残基の誘導体で構成されうる。
【００２９】
本発明に有用でありうる代表的な多糖としては、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アガロース、カラゲナン、ペクチン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、および種々の硫酸化多糖、たとえば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、またはケラタン硫酸を含む。
【００３０】
「カルボン酸基」という用語またはその任意の変化形は、カルボン酸部分（−ＣＯＯＨ）または任意の金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなど）もしくは非金属（たとえば、アンモニウムカチオンなど）の対応するカルボン酸イオンを意味する。場合により、カルボン酸基は、１〜２０原子のリンカーに結合され、好ましくは、カルボン酸基は、２〜３炭素原子のリンカーに結合される。
【００３１】
「カルボン酸基の誘導体」という用語またはその任意の変化形は、カルボン酸基から直接誘導される任意の官能基、たとえば、エステル、アミド、無水物、アルデヒド、またはハロゲン化アシル（たとえば、塩化アシル、臭化アシル）を意味する。好ましくは、カルボン酸基の誘導体は、エステル基、より好ましくはＮＨＳエステルまたはスルホ−ＮＨＳエステル、さらにより好ましくはスルホ−ＮＨＳエステルである。
【００３２】
未改変型もしくは化学置換型のＣＧまたはその誘導体は、これらの官能基のさらなる修飾が可能になるように多糖から外向きに伸長する。「修飾」という用語またはその任意の変化形は、本発明の範囲内では、多糖またはそれに結合された任意の官能基の化学構造の変化をもたらす任意の種類の入換えを意味する。修飾は、当業者に公知の任意の方法により達成される。好ましくは、修飾の結果として、多糖から外向きに伸長する複数のカルボン酸基が直接生成される。しかしながら、このような結果はまた、最終的な所望の構造をもたらす２つ以上の工程を介しても達成される。
【００３３】
多糖またはその集合体の大きさが原因となって、固定化後に基材の表面上にいくつかの込み合ったまたは利用できないカルボン酸基が存在する可能性があることに留意されたい。したがって、「多糖から伸長するカルボン酸基」という表現またはその任意の変化形は、多糖に結合され（すなわち、多糖上に置換され）かつさらなる修飾に利用可能であるＣＧを意味するものとする。このような置換は、本質的に化学的であり、共有結合、イオン結合、または任意の他のタイプの結合を介しうる。好ましくは、化学置換は、共有結合性である。
【００３４】
一実施形態では、化学修飾の工程は、β酸素原子を有する少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体のさらなる化学反応を含む。このような反応は、たとえば、β−アラニンまたはその任意の誘導体による、前記官能基または前記誘導体のアミド化である。
【００３５】
「複数のカルボン酸基」という用語は、多糖に結合された前記官能基の集団を意味し、前記集団のサイズは、リガンド分子とアナライト分子との相互作用の測定に利用される分析方法で測定可能なシグナルの生成を引き起こす大きさである。「複数の〜の少なくとも一部」という用語は、前記集団の一部が好ましくは少なくとも１０％〜１００％活性化されるか、または実質的に完全に活性化されることを意味する。より好ましくは、カルボン酸基の集団は、少なくとも２０％活性化、３０％活性化、４０％活性化、最も好ましくは少なくとも５０％活性化される。
【００３６】
「リガンド分子の結合に対して活性化される」という用語またはその任意の変化形は、それらとの直接的な化学反応または生物学反応を起こしてリガンド分子を結合させうる部分が生成されることを意味する。活性化された官能基は、たとえば、反応性エステル、無水物、またはハロゲン化アシルとのアミン結合の場合、脱離基を含む。活性化された官能基は、種々の機構により共有結合を形成する部分、たとえば、チオール基を結合させるためのジスルフィド部分もしくはマレイミド部分またはアルデヒド基を結合させるためのアミン部分をさらに含む。活性化された官能基は、リガンドに対して非共有結合性相互作用を生じる部分、たとえば、アビジンに対するビオチン部分またはその逆の部分をさらに含む。他の例は、組換えによりタグ付けされたタンパク質を捕獲するための金属キレート剤、たとえば、ヒスチジンタグ付きタンパク質を捕獲するためのニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）である。本明細書中で参照される部分とは、本発明の範囲内では、前記カルボン酸基の誘導体のことである。
【００３７】
「リガンド分子」という用語は、可逆的または不可逆的な相互作用を介して他の分子との相互作用が可能でありかつ相互作用の測定、すなわち、同定、分析、および定量が可能である、生物学的または非生物学的な分子を意味する。このようなリガンド分子は、たとえば、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗原、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント（たとえば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、グリカン、小有機分子、細胞、ウイルス、細菌、または生物学的サンプルである。リガンド分子は、一般的には、コーティングされた基材表面に付加された前記アナライトパートナーに特異的に結合するように選択される。たとえば、リガンド分子が抗体およびその結合性パートナーである場合、すなわち、アナライトが特定の抗原である場合、抗体は特定の抗原に特異的に結合する。
【００３８】
「アナライト」という用語またはその任意の変化形は、本発明の範囲内では、分析対象の化学物質を意味する。すなわち、これとリガンド分子との相互作用の存在、定量、または速度論的挙動もしくは熱力学的挙動が測定の対象となる。アナライトは、一般的には、本発明に係る結合性層に結合されたリガンドの結合性パートナーである。測定されるアナライトは、たとえば、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗原、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、グリカン、小有機分子などである。
【００３９】
好ましくは、測定されるこのようなリガンド−アナライト相互作用は、抗体−抗原相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（たとえば、酵素−阻害剤タンパク質相互作用）、およびタンパク質−小分子相互作用（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）である。
【００４０】
２つの結合性パートナー、すなわち、リガンドおよびアナライトの間の相互作用は、当業者に公知の任意の方法を用いて測定可能である。このような方法は、利用される蛍光的、核的、磁気的、電気化学的、または光学的な方法に基づく。好ましくは、利用される方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のような光学的方法である。
【００４１】
易活性化ＣＧは、未改変の多糖もしくは多糖構成要素（単糖、オリゴ糖）でありうるか、または当業者に公知の任意の化学修飾により置換されたものでありうる。種々の官能基をカルボン酸基に変換することについては、たとえば、広範な有機官能基変換（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、カトリツキー（Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ）編、１９９５年を参照されたい。
【００４２】
以上で述べたように、易活性化ＣＧの利点は、α炭素上の水素および／または炭素基の置換に起因する。言い換えれば、各β原子は、水素または炭素基である。当業者に公知のように、α炭素とは、官能基部分、この場合はカルボン酸基部分を保有する炭素のことである。β原子とは、α炭素に直接結合された原子のことである。したがって、この場合、ＣＧは、一般構造Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｃ−ＣＯＯＨで示される化合物であり、Ｒ１〜Ｒ３は、水素または炭素基である。α炭素は、不斉炭素であってもよく、すなわち、キラルであって、かつ一方の立体異性体もしくは他方の立体異性体としてまたは両方の異性体の混合物（ラセミ型（ｒｅｃｉｍｉｃ）または過剰型）として存在していてもよく、あるいは環状または大環状の主鎖構造から伸長したものであってもよい。
【００４３】
本発明の範囲内では、「α炭素」という用語は、単に、活性化およびリガンド分子への最終的結合に使用される末端カルボン酸基のα位の炭素原子を意味する。
【００４４】
α炭素がｓｐ３混成である場合、置換は、１つの水素および２つの炭素基により、２つの水素および１つの炭素基により、または３つの炭素基により行われる。α炭素がｓｐ２混成である場合、置換は、ジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）水素またはジェミナル炭素基およびβ炭素に対する二重結合によりシスまたはトランスのコンフォメーションで行われる。α炭素がｓｐ混成である場合、α炭素は、β炭素に三重置換される。α炭素を介して、または任意の他の原子を介してカルボン酸基を多糖構造に結合させることが可能である。
【００４５】
本明細書中で実証されるように、易活性化ＣＧを有する多糖をベースとする結合性層は、ＲＯ−のような電子求引性基をα炭素に結合させたＣＧを有する、一般に使用されるマトリックスよりも顕著な利点を有する。
【００４６】
次に、本発明を理解するために、またそれがどのように実施されうるかがわかるように、添付の図面を参照しながら限定ではなく単なる例として好ましい実施形態について説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本明細書に開示される本発明の独自性は、最適な方法で活性を保持しつつ高密度のリガンドを取得することにより測定感度の改良を可能にする結合性層を有する、ＳＰＲバイオセンサーの開発にある。
【００４８】
先行技術の層および活性化方法の限界は、研究の過程で何回も観測された。一般的な多糖カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）をベースとする層をＥＤＣとＮＨＳとの標準的な溶液により活性化した場合、表面の近傍に吸着された生体分子のごく一部が実際に層に結合されることが多かった。おそらく、活性化のレベルは、より効率的な結合を行うには不十分であった。アルギン酸やカルボキシメチルセルロースのような他の多糖の場合にも類似の観測がなされた（実施例１および２参照）。
【００４９】
興味深いことに、ポリ（アクリル酸）やポリ（メタクリル酸）のような合成ポリマーは、かなり効率的な活性化および後続の固定化を呈した。しかしながら、リガンド分子は、低い活性を呈した。これは、おそらく、これらのポリマーの生体適合性が低いことが原因であると思われる（実施例１〜４参照）。
【００５０】
ＣＭＤ、アルギン酸、およびカルボキシメチルセルロースのような多糖ならびにＣＧ部分を含有する他の市販の多糖（たとえば、ヒアルロン酸およびペクチン）の活性化の減少は、共通した構造上の特徴、すなわち、酸素原子がＣＧに対してβ位に位置することに起因する可能性があることが確認された（図２）。これとは対照的に、より高い活性化を呈した合成ポリマーは、カルボン酸部分に対してβ位に炭素原子または水素原子を有する（図３）。
【００５１】
したがって、本発明は、β原子として、すなわちＣＧに対してβ位に、炭素または水素だけを有するＣＧを含む、修飾された多糖を含む結合性層を提供する。本明細書において以下で実証されるように、このような層（実施例１、図４）は、固定化効率の改善および高いリガンド活性の両方を呈し、全体としてアナライトシグナルの有意な増強をもたらした（実施例２〜６）。
【００５２】
理論により拘束されることを望むものではないが、観測された差は、β原子によりＣＧ上に誘起される極性効果により生じる可能性がある。一般的にエーテル基またはヒドロキシル基として多糖中に現れる酸素原子は、誘起的電子吸引に関与し、一方、炭素原子は、一般に電子を放出する傾向がある。したがって、β炭素ＣＧは、ほとんどの場合、β酸素ＣＧよりも電子が豊富である（すなわち、酸性が低い）。この電子の集積は、活性化工程の中間体、たとえば、ＣＧとカルボジイミドとの反応により形成されるＯ−アシルイソウレア中間体を安定化させうるので、活性化工程ひいてはリガンド固定化を促進しうる。さらに、たとえばカルボキシメチルキトサンをベースとする結合性層を用いることにより、アミン基のような他の電子求引性基をβ位に配置した場合、ＣＧの活性化レベルがβ酸素ＣＧのレベルに類似していたことに留意すべきである。
【００５３】
当業者に公知のように、α炭素とは、官能基部分、この場合はカルボン酸基を保有する炭素のことである。以上で述べたように、本発明に係る層は、β位に炭素基または水素を有するカルボン酸基（ｃａｒｂｏｘｌｉｃ  ｇｒｏｕｐ）で構成される。このような炭素基は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、アラルキル、ヘテロアラルキル、カルボキシ、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル（ａｒｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、アルキレン、アザアルキレン、チアアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキリデン、アリールアルキリデン、シクロアルキリデン、およびアミドからされる。それぞれの前記炭素基は、可能であれば、置換型または分岐型でありうる。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、アルキル炭素基、アルケニル炭素基、およびアルキニル炭素基は、１〜２０個の炭素または１個もしくは２〜１６個の炭素を含有し、直線状もしくは分枝状である。２〜２０個の炭素のアルケニル炭素基は、１〜８個の二重結合を含有し、２〜１６個の炭素のアルケニル炭素鎖は、１〜５個の二重結合を含有する。２〜２０個の炭素のアルキニル炭素鎖は１〜８個の三重結合を含有し、２〜１６個の炭素のアルキニル炭素鎖は、１〜５個の三重結合を含有する。ここで、代表的なアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソヘキシル、アリール（プロペニル）、およびプロパルギル（プロピニル）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、種々の官能基に対して使用される各化学用語は、その最も広義の用語として使用されるものとする。前記官能基のそれぞれに対する特定の定義は、たとえば、「化学用語（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ）」、Ｓ．Ｐ．パーカー（Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ）編、マグロウヒル・ブック・カンパニー（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ）、１９８５年中に見られる。
【００５６】
反応性エステルを形成するための活性化工程でＮＨＳおよびスルホ−ＮＨＳを利用した。この場合も理論により拘束されることを望むものではないが、スルホ−ＮＨＳ活性化層の独自性は、活性化時にその負電荷の大部分を保持する能力に起因する。したがって、活性化層に対する静電的な予備濃縮がより効率的であり、高レベルの固定化が達成される。易活性化ＣＧを有する層を使用した場合、活性化度が一般に使用される層の場合よりも高いので、この効果はかなり顕著になる（図５）。ＮＨＳ試薬またはスルホ−ＮＨＳ試薬は、システムオペレーター（使用者）によりオンラインで活性化を行って層に組み込むこと、または層の本質的部分（予備活性化層）として提供することが可能である。
【００５７】
高いリガンド密度およびリガンド活性、すなわち、増幅されたアナライトシグナルは、以上の手法を用いて多くの生物学的モデルで達成可能であることが判明した（実施例４〜６）。より特定的には、活性化工程でスルホ−ＮＨＳを使用することにより、とりわけ増幅されたアナライトシグナルを生じることが観測された。易活性化ＣＧを有する多糖をベースとする結合性層とスルホ−ＮＨＳ活性化との組合せは、リガンド密度およびリガンド活性に関して最適な結果をもたらすので、本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００５８】
本発明のさらに他の態様において、リガンド固定化後に前記層の静電荷を最少化する方法が提供される。活性化レベルを高くすれば、中性（たとえば、図５の場合）または陽性（たとえば、図６の場合）のアミン含有分子を用いた不活性化時に、効率的な電荷最少化を行うことが可能になる。スルホ−ＮＨＳ活性化の使用は、この用途では、不活性化前の固定化工程時に層の静電荷を保持するためにも好ましい。
【００５９】
以下の実施例では、プロテオン（ＰｒｏｔｅＯｎ）ＸＰＲ３６システム（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））の実験用プロトタイプを用いて、ＳＰＲセンサーチップ用の結合性層の作製およびバイオセンサー用途におけるその使用に関する本発明の実施形態について記載する。しかしながら、本発明は、当技術分野で公知の結合性層または結合性マトリックスの任意の用途を意図したものであることを明記しておかなければならない。本発明は、固体担体への分子の固定化を必要とする任意の形式のバイオアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡで実施可能である。本発明の原理はさらに、微小球への分子の固定化を含む精製方法、たとえばアフィニティークロマトグラフィーに使用した場合にも有益である。
【実施例】
【００６０】
実施例１−結合性層の作製
ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、２００１年、第１７巻、８３３６−８３４０頁から採用した技術を用いて、ＣＭＤ、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、またはポリ（アクリル酸）の薄層をプロテオン（ＰｒｏｔｅＯｎ）ＳＰＲセンサーチップの金表面に結合させた。
【００６１】
簡潔に述べると、ポリマーのＣＧの数パーセントがシスタミン（ｃｙｔａｍｉｎｅ）二量体で修飾される条件下で各ポリマーを水溶液中に溶解させ、ＥＤＣおよびＮＨＳの存在下でシスタミン二塩酸塩と反応させた。次に、シスタミンジスルフィド結合をテトラ（カルボキシエチルホスフィン）により還元し、溶液を透析により精製した。生成物は、この時点では金表面への結合を可能にするチオール末端基を含むポリマーの水溶液であった。
【００６２】
シスタミン修飾ポリマーを含む水溶液中にセンサーチップを２４時間浸漬させた。シスタミン修飾度、ポリマー濃度、溶液ｐＨ、およびイオン強度のような種々のパラメーターを変化させることにより、コーティングの構造を変化させた。その結果として、水ですすいだ後、異なるタンパク質吸着能を有する種々の層が形成された（表１）。
【００６３】
以下に詳述されるように、さらなる修飾を行うことなく種々の実験で各種類のポリマーのセンサーチップを使用した。そのほかに、多糖（ＣＭＤ、アルギン酸、およびカルボキシメチルセルロース）を含むセンサーチップをβ−アラニンで修飾して、易活性化ＣＧをむようにした（図４）。１Ｍのβ−アラニンエチルエステル塩酸塩、０．２ＭのＥＤＣ、および０．０５ＭのＮＨＳの水溶液中にこれらのセンサーチップを１６時間浸漬した。過剰の試薬を水で濯ぎ、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中に１時間浸漬して加水分解することによりエチルエステル保護基を除去した。以下に示されるように、作製された結合性層を特徴付け、種々の実験に使用した。
【００６４】
表１は、本明細書に提示された実施例で使用した結合性層について記載したものである。吸着能は、表面へのＩｇＧ型抗体タンパク質の静電濃縮により得られる典型的な飽和値に関連する。
【００６５】
本明細書中で使用されるＳＰＲシグナルの単位は、この分野で受け入れられている応答単位（ＲＵ）である。１０００ＲＵは、ＳＰＲ曲線で０．１度のシフトと等価であり、表面への約１ｎｇ／ｍｍ２のタンパク質の結合または吸着に相当することが知られている。
【００６６】
【表１】
2009513969.tif 000003
【００６７】
実施例２−代表的なタンパク質の結合効率
表２は、類似の条件下における５つの結合性層へのウサギＩｇＧ抗体の吸着または固定化後のリガンド密度の例を示している。活性化手順は、０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳとからなる溶液への暴露（７分間注入）を含んでいた。５０μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧの溶液の１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中への暴露（６分間注入）により、タンパク質の吸着／固定化を行った。最後に、１Ｍのエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）への暴露（５分間注入）により、活性化層を不活性化させた。
【００６８】
【表２】
2009513969.tif 000004
【００６９】
ポリ（アクリル酸）をベースとする層１は、比較的高い固定化レベルを示した。このレベルは、ＮＨＳ活性化の後のその吸着能に近く、かつスルホ−ＮＨＳ活性化の後のその吸着能に等しい。一方、非修飾多糖層（２〜４）は、低い固定化値およびスルホ−ＮＨＳ活性化とＮＨＳ活性化との間の差はほとんどなかった。最も重要なこととして、β−アラニンによるこれらの層の修飾（それぞれ層２Ｅ〜４Ｅ）は、吸着能に影響を及ぼすことなく結合の有意な増大をもたらした。スルホ−ＮＨＳ活性化の後、リガンド密度はとくに高く、吸着能の全潜在能力が発揮された。
【００７０】
これらの結果は、β酸素ＣＧの代わりにβ炭素ＣＧを含むように多糖を修飾することにより、活性化後にタンパク質を結合させる能力が改善されたことを示している。ＮＨＳとスルホ−ＮＨＳとの差がより顕著であることから、易活性化ＣＧを形成するβ−アラニンによる修飾後、活性化がより効率的であったことが示唆される。
【００７１】
実施例３−低ＰＩタンパク質の結合効率
低い等電点（ＰＩ）を有するタンパク質は固定化が困難であることが知られている。このようなタンパク質は、正電荷を提示させ、ひいては層への静電吸着を行うために、比較的低いｐＨを有する緩衝液中に溶解させなければならない。しかし、低ｐＨ値では、層自体に含まれるＣＧの負電荷が低減されるので、静電引力は弱くなる。
【００７２】
たとえば、３．０のＰＩを有するタンパク質ペプシンは、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳ活性化の後、ＣＭＤ層への無視しうる結合（７０ＲＵ）を呈するにすぎないことが報告された（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、第１９８巻、２６８−２７７頁）。β−アラニンで修飾されたアルギン酸をベースとする結合性層を用いた類似の実験の結果を表２の層５Ｅで示す。この結果は、かなり高度の結合、すなわち、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化の後で７５０ＲＵおよびＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ活性化時に２０５０ＲＵを示す。この利点は、層５Ｅの吸着能は、報告されたＣＭＤ層よりもかなり低かったからため（３０，０００ＲＵ超のＩｇＧと比較して１２，０００ＲＵのＩｇＧ）、易活性化ＣＧの使用に関連付けられる。
【００７３】
この実験は、一般に使用される層に十分に固定化することのできない低ＰＩリガンドを用いた測定を行うために、易活性化ＣＧを有する層を使用しうることを実証する。
【００７４】
実施例４−抗体−抗原相互作用研究におけるリガンド活性
表３は、種々の結合性層を用いて行われた速度論的測定の結果をまとめたものである。ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化の後、抗インターロイキン２モノクローナル抗体を固定化した。約２，０００ＲＵのこのタンパク質を結合させるべく最適化された条件下で行った。次に、２．５〜８０ｎＭのいくつかの濃度でインターロイキン２アナライトを表面上で流動させた。Ｒｍａｘは、速度論的分析から計算される最大のアナライトシグナルである。リガンド活性は、（Ｒｍａｘ／リガンド密度）＊（リガンドのＭＷ／アナライトのＭＷ）として定義される。
【００７５】
【表３】
2009513969.tif 000005
【００７６】
表３に示される結果は、多糖をベースとするすべての層が、易活性化ＣＧを含有するように修飾された場合、１００％に近い高いリガンド活性を保持したことを示している。これとは対照的に、合成ポリ（アクリル酸）をベースとする層は、リガンド活性の有意な減少をもたらした。これらの差は、多糖のより高い生体適合性に関連する。
【００７７】
実施例５−タンパク質−タンパク質相互作用研究における測定感度
表４は、β−ラクタマーゼタンパク質の突然変異体（ＴＥＭ１）とその阻害タンパク質（ＢＬＩＰ）間の速度論的測定の結果をまとめたものである。いずれの場合も、アルギン酸をベースとする結合性層を使用した。活性化手順は、０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳからなる溶液への暴露（７分間注入）を含んでいた。２μＭ  ＴＥＭ１溶液の１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中への暴露（５分間注入）により、リガンドの固定化を行った。最後に、１Ｍのエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）への暴露（５分間注入）により、活性化層を不活性化させた。９〜３００ｎＭの一連の濃度でＢＬＩＰアナライトを注入した。
【００７８】
【表４】
2009513969.tif 000006
【００７９】
非修飾層は、十分量のリガンドを結合させることができなかったので、アナライトシグナルは、速度論的分析を行うには低すぎた。β−アラニンによる修飾後、リガンド結合は有意に改良され、優れた速度論的測定結果が記録された。ＮＨＳの代わりにスルホ−ＮＨＳを用いた活性化では、リガンドの量だけでなくその活性も増大され、より高いシグナル対ノイズ比を有する、より明瞭なセンサーグラムが得られた（図６）。
【００８０】
したがって、易活性化ＣＧで修飾することにより、他の方法では実施不可能である測定を行うことが可能になった。スルホ−ＮＨＳ活性化との組合せは、最も有利であった。
【００８１】
実施例６−タンパク質−小分子相互作用研究における測定感度
表５は、タンパク質カルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）とその阻害剤４−カルボキシベンゼンスルホンアミド（ＣＢＳ、分子量２０１ｇ／ｍｏｌ）間の速度論的測定の結果をまとめたものである。いずれの場合も、アルギン酸をベースとする結合性層を使用した。活性化手順は、０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳとからなる溶液への暴露（７分間注入）を含んでいた。０．１２５ｍｇ／ｍｌ  ＣＡＩＩ溶液の１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中への暴露（９分間注入）により、リガンドの固定化を行った。最後に、１Ｍのエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）への暴露（５分間注入）により、活性化層を不活性化させた。０．０８２〜２０μｍｏｌ／Ｌの一連の濃度でＣＢＳアナライトを注入した。
【００８２】
【表５】
2009513969.tif 000007
【００８３】
実施例５と同じように、β−アラニンで修飾することにより生じる改善は明らかであった。リガンド密度が有意に増大されただけでなく、リガンド活性もより高くなった。この場合、ＮＨＳを活性化に使用したときでさえも、リガンド活性の改良が観測されるが、スルホ−ＮＨＳ活性化を行うとさらに改善される。
【００８４】
したがって、この場合もまた、易活性化ＣＧで修飾することにより、測定感度が有意に改良された。タンパク質−小分子相互作用をより高い感度で測定することは、バイオセンサーの分野における「至高の目標（ｈｏｌｌｙ ｇｒａｉｌｓ）」の１つであるので、この実施例はとくに意味がある。このような改良の実用的重要性は、たとえば、薬剤探索のための測定で明らかである。
【００８５】
実施例７−電荷の最少化
β−アラニン修飾を行った場合または行わない場合について、アルギン酸をベースとする２つの結合性層を類似の実験で比較した。手順を図７に模式的に記載し、結果を以下の表６にまとめる。
【００８６】
０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳからなる溶液への暴露（７分間注入）によりセンサーチップを活性化し、その直後、１Ｍのジメチルエチレンジアミン（ｐＨ８．５）への暴露（７分間注入）により不活性化させた。この肯定により、層の負電荷の減少、さらには排除が行われると予想される。なぜなら、ＣＧの一部が陽性第三級アミンに変換されるからである。より効率的な活性化を行えば、より効率的な電荷最少化が達成されるであろう。
【００８７】
層への陽性タンパク質アビジン（ＰＩ＝１０．５）の吸着を測定することにより、負電荷のレベルを比較推定した。のアビジン（５０μｇ／ｍｌ）を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に７分間注入した。電荷最少化の前後で、この試験を行った。
【００８８】
【表６】
2009513969.tif 000008
【００８９】
表６に示される結果は、β−アラニン修飾効果の明確な指標を提供する。電荷最少化の工程は非修飾層にごくわずかな影響を及ぼしたにすぎないが、修飾層の負電荷は完全に排除された。したがって、修飾層がより効果的に活性化されたので、より多くのＣＡがジアミン分子と反応したと結論付けることが可能である。
【００９０】
さらに、ｐＨ７．４ではＣＧは本質的に陰性でありかつ第三級アミンは本質的に陽性であるので、易活性化ＣＧの少なくとも５０％はＥＤＣ／ＮＨＳ溶液またはＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ溶液により活性化されたことになる。これと対比して、類似の条件下で、ＣＭＤ層中のＣＧのわずか３０〜４０％が活性化されるにすぎないことが報告された（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、第１９８巻、２６８−２７７頁）。
【００９１】
本発明に係る層のこの特徴は、実用的な重要性を有する。以上で実証された電荷最少化の工程は、活性化後および不活性化前にリガンドが結合される、リガンド固定化の一部でありうる。他の選択肢として、通常のリガンド固定化工程の前または後のいずれかで、この工程も行うことが可能である。いずれにせよ、その効果は、リガンド結合の後の負電荷を有していない層である。以上で述べたように、アナライト相互作用の段階で静電荷を有していない層は、とくに高荷電アナライトを使用する場合、非特異的結合および他の電荷妨害を防止するうえで有益である。
【００９２】
したがって、この実施例は、提示された層の特徴の指標になるだけでなく、リガンドの結合前、結合中、または結合後に層の有効電荷最少化を達成する方法も記載する。ジアミン不活性化剤は、単に例として提示されているにすぎず、類似の分子、たとえば、エチレンジアミンまたはヒドラジンも同様に使用可能である。
【００９３】
この場合、結果は、ＮＨＳとスルホ−ＮＨＳとの差を示さない。しかしながら、以上に示された他の結果に基づいて、リガンドを活性化と不活性化の工程間で結合させる場合、より効率的な結合を達成するために、スルホ−ＮＨＳが好ましいことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｘ＝Ｈ）またはスルホ−ＮＨＳ（Ｘ＝ＳＯ３−）による活性化を用いてリガンド分子をカルボン酸含有結合性層に固定化するための先行技術の手順を示す概略図である。ジグザグ線は、結合性層の主鎖を表しており、いかなるリンキング分子をも用いずにカルボン酸基が層に直接結合されることを意味するものではない。
【図２Ａ−２Ｅ】種々のカルボン酸含有多糖の構造を示している。図２Ａ−カルボキシメチルデキストラン、図２Ｂ−アルギン酸、図２Ｃ−カルボキシメチルセルロース、図２Ｄ−ペクチン、図２Ｅ−ヒアルロン酸。
【図３Ａ−３Ｂ】２つの代表的な合成カルボン酸含有ポリマーの一般構造を示している。ただし、ｎは、反復単位の数を表す整数である。
【図４】β酸素カルボン酸を本発明に係る易活性化β炭素カルボン酸に変換するために使用される代表的な方法を示している。この例に使用されるβ−アラニンエチルエステルは、本方法の一実施形態とみなされる。
【図５】ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ活性化を用いた易活性化基を有する結合性層上への、本発明に係る効率的な固定化工程を示す概略図である。先行技術の結合性層上への固定化工程との図式的比較のために、詳細な説明および図１を参照されたい。
【図６】６つの異なる濃度におけるβ−ラクタマーゼタンパク質の突然変異体ＴＥＭ１とその阻害タンパク質ＢＬＩＰとの相互作用の２つのセンサーグラムを示している。図６Ａは、ＮＨＳ活性化を用いた反応のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を示し、一方、図６Ｂは、スルホ−ＮＨＳ活性化を用いた反応のセンサーグラムを示している。
【図７】活性化プロセス時およびそれに続くジアミン分子による不活性化プロセス時の電荷最少化を示す概略図である。不活性化後に非陰性層を得るためにＣＡの少なくとも５０％をＮＨＳ（Ｘ＝Ｈ）またはスルホ−ＮＨＳ（Ｘ＝ＳＯ３−）により活性化しなければならないことに留意されたい。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体により置換された多糖を含む結合性層であって、前記少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体に対する少なくとも１つのβ原子が炭素原子であり、かつ複数の前記カルボン酸基またはその誘導体の少なくとも一部が、リガンド分子の結合に対して活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルから選択される、結合性層。
【請求項２】
前記多糖が、アガロース、アルギン酸、アミロペクチン、アミロース、カラゲナン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、グリコーゲン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、アミロペクチン、アミラーゼ、およびデンプン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、請求項１に記載の結合性層。
【請求項３】
前記多糖が、アルギン酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ペクチン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、請求項１または２に記載の結合性層。
【請求項４】
前記リガンド分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗原、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、グリカン、小有機分子、細胞、ウイルス、細菌、および生物学的サンプルから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項５】
前記少なくとも１つのカルボン酸基が、１〜２０個の原子を含むリンカー分子に結合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項６】
前記リンカー分子が２個または３個の炭素原子を含む、請求項５に記載の結合性層。
【請求項７】
カルボン酸基と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルから選択されるエステルとの混合物を含む、請求項１に記載の結合性層。
【請求項８】
前記多糖が、表面を有する固体基材上に固定化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合性層。
【請求項９】
前記基材がバイオセンサーの検出素子である、請求項８に記載の結合性層。
【請求項１０】
前記検出素子が、ガラス、プラスチック、および自由電子金属から選択される材料で構成される、請求項９に記載の結合性層。
【請求項１１】
前記自由電子金属が金である、請求項１０に記載の結合性層。
【請求項１２】
実質的に完全に活性化される、請求項１に記載の結合性層。
【請求項１３】
少なくとも５０％活性化される、請求項１に記載の結合性層。
【請求項１４】
少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体を含む結合性層の作製方法であって、前記少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体のそれぞれが、少なくとも１つのβ炭素原子を有し、
表面を有する基材を提供する工程と、
前記基材の表面上に多糖を固定化する工程と、
前記多糖を化学修飾してそれから伸長するように少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体を形成する工程であって、前記カルボン酸基またはその誘導体の各β原子は、炭素原子である工程と、
リガンド分子の結合に対して前記カルボン酸基またはその誘導体の少なくとも一部を活性化させる工程と、
を含み、
前記カルボン酸誘導体が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルから選択されるエステルであり、かつ前記化学修飾工程および前記活性化工程が、互いに独立して、前記固定化工程前、前記固定化工程中、または前記固定化工程後に行われる方法。
【請求項１５】
前記化学修飾工程が、β酸素原子を有する少なくとも１つのカルボン酸基またはその誘導体の化学反応を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学反応がβ−アラニンまたはその任意の誘導体によるアミド化である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多糖が、アルギン酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ペクチン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合性層がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび／またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルにより少なくとも５０％活性化される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
複数の活性化された前記カルボン酸基またはそのエステルが、リガンド分子と反応することにより、前記層に共有結合されたリガンド分子を与える、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
リガンド分子とアナライト分子との相互作用を測定する方法であって、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の結合性層を作製する工程と、少なくとも１種のアナライト分子と相互作用しうる少なくとも１種のリガンド分子を前記層に結合させる工程と、前記リガンド分子を前記アナライト分子と反応させてそれらの間に相互作用を引き起こす工程と、前記相互作用を測定する工程と、を含む方法。
【請求項２１】
前記リガンド分子および前記アナライト分子が、独立して、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、小有機分子、細胞、ウイルス、細菌、および生物学的試料から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定が、蛍光的、核的、磁気的、電気化学的、または光学的な方法に基づく、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記測定が光学的な方法に基づく、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記光学的な方法が表面プラズモン共鳴である、請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
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