(57)【要約】  個体が細胞内病原体抗原に応答して、（ａ）ＩＦＮ−γのみを分泌するＴ細胞、（ｂ）ＩＬ−２のみを分泌するＴ細胞または、（ｃ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌するＴ細胞を有するかどうかを決定し、場合によりこのサイトカインプロファイルにおけるいかなる変化も決定することを含む、個体での細胞内病原体感染を評価および／または細胞内病原体感染をモニタリングする方法。
2009529865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内病原体感染を評価および／またはモニタリングする方法であって：
（ｉ）個体からのＴ−細胞含有サンプルを細胞内病原体抗原と接触させること；
（ｉｉ）ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌する任意の細胞を検出すること；
（ｉｉｉ）サンプルが、
（ａ）ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞；
（ｂ）ＩＬ−２のみを分泌する細胞；および／または、
（ｃ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞
を含むかどうかを決定すること
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプロファイルが感染の状態を示す方法。
【請求項２】
前記個体が、前記感染を治療する薬物またはワクチンを服用していた請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体での前記感染の状態を前記感染の先に決定された状態と比較することをさらに含み、それにより前記個体での前記薬物またはワクチンの有効性をモニタリングする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記個体が、被験薬またはワクチンを服用していた請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記個体での前記感染の状態を前記感染の先に決定された状態と比較することをさらに含み、それにより前記被験薬またはワクチンの有効性を決定する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記感染が、抗酸菌感染であり、場合により結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
個体が、ヒトまたは哺乳動物である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記個体が、活動性結核疾患または潜在性結核感染症（ＬＴＢＩ）に罹患している請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記個体が、結核（ＴＢ）から回復しており、前記方法は再発の見込みを更に決定することを含み、再発の見込みが抗酸菌負荷と正に相関している請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体が、前記感染にかかる危険にさらされている請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
抗原が、ＥＳＡＴ−６もしくはＣＦＰ−１０または別の抗酸菌抗原である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗原が、タンパク質中の天然Ｔ−細胞エピトープ配列を認識するＴ−細胞により認識される天然に存在するタンパク質の断片または同族体である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２に対する固定化抗体を用いて検出する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、新たに単離されたＴ細胞または冷凍後のＴ細胞を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、インビトロで培養されたＴ細胞を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
個体での病原体負荷を決定することを含み、（ａ）の存在が、病原体負荷と正に相関しており、（ｂ）の存在が病原体負荷と負に相関している請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞および細胞内病原体抗原を検出する手段を含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキット。
【請求項１８】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２ならびに／またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌する細胞のプロファイルを感染の状態と相関させるための取扱説明書を更に含む請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞を検出するための前記手段が、固体支持体に固定化されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２抗体を含む請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
個体が細胞内病原体抗原に応答して、（ａ）ＩＦＮ−γのみを分泌するＴ−細胞、（ｂ）ＩＬ−２のみを分泌するＴ−細胞または（ｃ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌するＴ−細胞を有するかどうかを決定することを含む、個体での感染を評価および／またはモニタリングする方法。
【請求項２１】
前記感染が、抗酸菌感染であり、場合により結核であって、および／または前記方法を、個体が活動性結核にかかっているかどうかを決定するために実施する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原が、ＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ−１０である請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）疾病の進行および／または再発を予測するために；
（ｉｉ）抗病原体治療をモニタリングするために；
（ｉｉｉ）抗病原体薬物またはワクチンの有効性を評価するために；または
（ｉｖ）抗病原体治療が殺菌治癒をもたらすかどうかを決定して、
（ｖ）病原体が場合によりウイルスである病原体の除去が起きたかどうかを決定するために
実施する請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）結核の進行および／または再発を予測するために；
（ｉｉ）抗結核治療をモニタリングするために；
（ｉｉｉ）抗結核薬物またはワクチンの有効性を評価するために；または
（ｉｖ）抗結核治療が殺菌治癒をもたらすかどうかを決定するために
実施する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
個体が幼い子供であり、および／または免疫抑制状態である請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２０で定義されたモニタリング方法を、感染の状態の変化を決定するために多数の時間間隔で実施する請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
モニタリング方法を、少なくとも３〜２０回、好ましくは６〜１０回実施し、および／または少なくとも４０日毎におよび／または再発の恐れの期間中、実施し、および／または潜在性結核が活動性になっているかどうかを決定するために実施する請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染などの抗酸菌感染をモニタリングする方法およびそのような方法で使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
個体の感染状態のマーカーの必要性が存在する。そのようなマーカーの使用は、関連する病気の治療、予防および制御を可能とする。例えば、結核（ＴＢ）に感染した個体の状態をモニタリングすることは、この再発性病気の治療、予防および制御にとって不可欠である。抗酸菌負荷は、直接測定することができず、抗酸菌負荷を反映するバイオマーカーは、現在、存在しない。さらに、結核菌は、しばしば、活動性ＴＢ患者からの培養は困難であり、健康な潜在的に感染した人々からの培養は不可能である。したがって、結核菌感染症の状態を示している免疫系の診断試験は、この感染症の治療、予防および制御を指導する多くの臨床シナリオに非常に役立つであろう。例えば、活動性感染と潜伏感染との区別、活動性および潜在性ＴＢの抗結核療法の有効性のモニタリング、治療ワクチンおよび新薬の有効性のモニタリングならびに活動性疾患の進行の早期検出などである。
【０００３】
抗酸菌抗原は、当該分野で公知である。例えば、初期分泌型抗原標的−６（ＥＳＡＴ−６）および培養濾液タンパク質１０（ＣＦＰ１０）は、過去数年にわたって動物モデルおよびヒトで集中的に研究されてきた２つの結核菌抗原である。ＥＳＡＴ−６およびＣＰＦ１０は、動物モデル、結核患者および接触者における細胞性免疫応答の強い標的であり、したがって、特異的Ｔ細胞に基づく血液検査においての使用が可能である。
【非特許文献１】Lalvaniら(1997) J. Exp. Med.186、p859-865
【非特許文献２】Otaら(1990) Nature 346、p183-187
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、Ｔ−細胞由来のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌のプロファイルは、細胞内病原体感染の種々の臨床結果と相関することを証明してきた。したがって、本発明は、インビボでの細胞内病原体負荷および状態の間接的な免疫学的バイオマーカーを提供し、それは感染に対する治療またはワクチン介入の効果をモニタリングするのと同様に、臨床結果を予測、決定、モニタリングするのに使用することができる。
【０００５】
より詳しくは、本発明者らは、病原体抗原−特異的ＣＤ４  Ｔ−細胞のＩＦＮ−γ／ＩＬ−２サイトカインプロファイルが、抗原負荷に関して変わることを証明した。高い抗原負荷の状態の間、抗原−特異的ＣＤ４  Ｔ−細胞は、ＩＦＮ−γのみおよびＩＦＮ−γ／ＩＬ−２を分泌する。低い抗原負荷の状態の間、抗原−特異的ＣＤ４  Ｔ−細胞は、ＩＦＮ−γのみの分泌を止めて、主にＩＦＮ−γ／ＩＬ−２を分泌し、新たにＩＬ−２のみを分泌する。このサイトカインプロファイルの変化は、高い（活動性疾患）抗原負荷から低い（成功した治療の後）抗原負荷までシフトする間で観察されてきた。
【０００６】
したがって、本発明は、以下を提供する：
−  細胞内病原体感染症を評価する方法であって：
（ｉ）個体からのＴ−細胞含有サンプルを細胞内病原体抗原と接触させること；
（ｉｉ）ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌する任意の細胞を検出すること；
（ｉｉｉ）サンプルが、
（ａ）ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞；
（ｂ）ＩＬ−２のみを分泌する細胞；および／または、
（ｃ）ＩＦ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞
を含むかどうかを決定すること
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプロファイルが感染の状態を示す方法；
−  個体が細胞内病原体抗原に応答して、（ａ）ＩＦＮ−γのみ、（ｂ）ＩＬ−２のみ、または、（ｃ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌するＴ−細胞を有するかどうかを決定すること、場合により、このサイトカインプロファイルにおけるいずれの変化も決定することを含む、個体での細胞内病原体感染をモニタリングする方法；ならびに
−  細胞内病原体抗原に応答してＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞を検出する手段を含む前述の請求項のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、個体での細胞内病原体感染を評価し、および／または細胞内病原体感染をモニタリングする方法であって、個体が細胞内病原体抗原に反応して、（ａ）ＩＦＮ−γのみを分泌するＴ−細胞、（ｂ）ＩＬ−２のみを分泌するＴ−細胞、または（ｃ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌するＴ細胞を有するかどうかを決定し、場合によりこのサイトカインプロファイルにおけるいずれの変化も決定することを含む方法を提供する。
【０００８】
細胞内病原体は、ウイルス、細菌または寄生虫であってよい。ウイルスは、典型的にＣＭＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＥＢＶまたはＨＳＶである。病原体は、リ−シュマニア症(Leishmaniasis)原虫、ハンセン病細菌またはリステリア属細菌であってよい。好ましい実施形態において、感染は結核菌などの抗酸菌感染である。
【０００９】
該方法は、病原体負荷を決定するために、病気の進行および／または再発を予測するために、抗病原体治療をモニタリングするために、抗病原体薬物またはワクチンの有効性を評価するために、または抗病原体治療が殺菌治癒をもたらすかどうかを決定するために使用することができる。例えば、該方法は、患者が活動性感染症、潜在性感染症、自発的に治癒したまたは治癒しつつある感染症または病気、医薬品の介在なしで治癒したまたは治癒しつつある感染症または病気、または治療を受けてきたまたは治療中である感染症または病気であるかどうかを決定および／またはモニタリングするために使用することができる。
【００１０】
本発明の方法は、典型的には、
（ｉ）個体からのＴ−細胞含有サンプルを細胞内病原体抗原と接触させること；
（ｉｉ）ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌する任意の細胞を検出すること；
（ｉｉｉ）サンプルが、
（ａ）ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞；
（ｂ）ＩＬ−２のみを分泌する細胞；および／または、
（ｃ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞を含むかどうかを決定すること
を含む。
【００１１】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプロファイルは、感染の状態を示す。
【００１２】
１実施形態において、本発明は、個体での病原体負荷を決定するための方法を提供し、（ａ）の存在および／または割合が、病原負荷と正に相関しており、（ｂ）の存在および／または割合が病原体負荷と負に相関している。
【００１３】
個体は、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトである。ヒトは、活動性もしくは潜在性の抗酸菌感染症を有していてよく、または最近では、そのような感染症に罹患した者であってよい。ヒトは、マントー(Mantoux)試験での陽性または陰性の試験であってよい。ヒトは、典型的には、社会的−経済的理由から、感染（例えば抗酸菌感染症）の危険にさらされている可能性があるか、または感染症に対する遺伝もしくは獲得素因を有する場合がある。
【００１４】
抗酸菌感染は、任意の抗酸菌に起因する場合がある。望ましくは、抗酸菌感染は、結核菌に起因する。
【００１５】
ヒトは、結核菌に曝されてきた、または曝されてきた可能性があることが知られているもしくは疑いのある接触者である可能性がある。典型的には、曝露は痰Ａ．Ｆ．Ｂ．（好酸性菌）塗抹陽性である「開放性」結核などの肺結核に対してである。接触者は、その曝露が家庭、仕事場所（例えば医療従事者など）または刑務所（例えば囚人など）での曝露である誰かである可能性がある。曝露は、ＴＢの高い罹患率を有する国に住んでいたこと、そしてＴＢの低い罹患率を有する国への移住の後の診断試験から生じる場合がある。このように、接触者は移住者である可能性がある。
【００１６】
ヒト（例えば、最近またはずっと以前の曝露が知られている、または疑われているヒト）は、健康かもしれないし、共同感染または慢性病態を有するかもしれないし、あるいは活動性ＴＢを進行させるそれらをより高いリスクにさらす治療薬に依存しているか、および／またはそれはＴＢ感染を診断するのをより困難にしているかもしれない。例としては、ＨＩＶ感染個体、免疫抑制薬（例えば、副腎皮質ステロイド、アザチオプリンおよびインフリキシマブなどの抗−ＴＮＦ−α剤、ならびにガン治療）服用個体、血液透析患者、臓器移植レシピエント、糖尿病患者および非常に幼い子供たち（５才未満、特に２才未満の）が挙げられる。
【００１７】
該方法で抗原を認識するＴ−細胞は、通常、病原体からの抗原に対してインビボで事前感作されたＴ−細胞である。これらの抗原−経験Ｔ細胞は、通常、１０6個中１個〜１０3個中１個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の頻度で病原体にさらされてきた宿主の末梢血に存在する。Ｔ−細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔ−細胞であってよい。
【００１８】
該方法では、Ｔ細胞はインビトロまたはインビボで、好ましくはインビトロで個体からのサンプル中の抗原と接触させることができる。
【００１９】
通常、該方法で接触されるＴ−細胞は、宿主から血液サンプルで採取されるが、Ｔ−細胞を含む他のタイプのサンプルを使用することも可能である。サンプルは、直接にアッセイ系へ添加してもよいし、最初に処理してもよい。典型的には、処理は、例えば水、緩衝液または媒体で希釈することを含むことができる。典型的には、サンプルは１．５〜１００倍、例えば、２〜５０倍または５〜１０倍まで希釈される。
【００２０】
処理は、サンプル成分の分離を含んでもよい。典型的には、単核細胞（ＭＣ）は、サンプルから分離される。ＭＣは、Ｔ−細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。したがって、該方法では、分離されたＭＣ中に存在するＡＰＣは、ペプチドをＴ細胞に提示することができる。別の実施形態において、ＣＤ４  Ｔ−細胞のみなどのＴ細胞のみは、サンプルから精製することができる。ＰＢＭＣ、ＭＣおよびＴ−細胞は、例えば、Lalvaniら(1997) J. Exp. Med.186、p859-865に記述された技術などの当該分野で公知の技術を使用してサンプルから分離することができる。
【００２１】
好ましくは、アッセイで使用されるＴ−細胞は、未処理または希釈されたサンプルの形態であり、エクスビボで直接使用される新たに単離したＴ−細胞（例えば、新たに単離したＭＣまたはＰＢＭＣの形態など）であり、すなわち、それらは該方法で使用される前には培養されないか、または解凍した細胞である。しかしながら、Ｔ−細胞は、使用前に例えば抗原および一般的には外因性増殖促進サイトカイニンの存在下でも培養することができる。培養の間、抗原は該方法で使われるＡＰＣなどのＡＰＣの表面に一般には存在する。Ｔ−細胞の前培養は、該方法の感度の増加をもたらす場合がある。このように、Ｔ−細胞は、短期細胞株（例えば、Otaら(1990) Nature 346、p183-187に記述されているように）などの細胞株に変換することができる。
【００２２】
該方法で典型的に存在するＡＰＣは、Ｔ−細胞と同じ宿主から、または異なる宿主から由来してよい。ＡＰＣは、天然に存在するＡＰＣまたは人工のＡＰＣであってもよい。ＡＰＣは、抗原をＴ細胞に提示することができる細胞である。それは、典型的にはＢ−細胞、樹状細胞またはマクロファージである。それは、典型的にはＴ−細胞と同じサンプルから分離され、典型にはＴ細胞と同時精製される。このように、ＡＰＣはＭＣまたはＰＢＭＣ中に存在することができる。ＡＰＣは、典型的にはエクスビボで新たに単離した細胞または培養細胞である。それは、短期細胞株または不死化細胞株などの細胞株の形態であってもよい。ＡＰＣは、その表面に空のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することができる。
【００２３】
１実施形態では、抗原はＴ−細胞およびＡＰＣを含むアッセイ系に添加される。例えば、抗原は容器（例えば血液が患者から採取されるチューブ）の内側面にコーティングされてよい；あるいは、抗原はＴ−細胞およびＡＰＣをすでに含む容器に加えられてよい。上記で議論したように、そのようなアッセイでのＴ−細胞およびＡＰＣは、ＭＣの形態であってもよいであろう。ＡＰＣによる提示を必要とすることなくＴ−細胞によって識認され得る抗原が使われる場合には、ＡＰＣは必要ではない。ＭＨＣ分子に結合した元の抗原によく似ている類似体は、そのような抗原の１例である。
【００２４】
１実施形態では、抗原はＴ−細胞の不在下でＡＰＣに提供される。次いでＡＰＣは、典型的にはその表面で抗原が提示された後にＴ細胞に提供される。抗原はＡＰＣの内部に取り込まれ、提示される場合があり、または単にＡＰＣ内部に入ることなく表面上に取り込まれる場合がある。
【００２５】
典型的には１０5〜１０7個、好ましくは、２．５×１０6個〜１０6個のＰＢＭＣが、各アッセイで添加される。ペプチドが直接、アッセイ系に添加される場合は、その濃度は１０-1〜１０3μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０μｇ／ｍｌまたは１〜１０μｇ／ｍｌである。
【００２６】
典型的には、Ｔ細胞が抗原とインキュベーションされるための時間の長さは、エフェクターＴ細胞に関しては４〜２４時間（好ましくは５〜１８時間）であり、または中央の記憶細胞に関しては２４時間を超える。エクスビボでＰＢＭＣを使用する場合は、５．０×１０6個のＰＢＭＣがペプチド１０μｇ／ｍｌ中、３７℃で５時間、インキュベーションできることが分かった。
【００２７】
任意の適切な抗原を本発明の方法で使用することができる。典型的には、抗原は抗酸菌または結核抗原である。抗原は、Ｔ−細胞によって認識される天然に存在するタンパク質の形態である。適切な結核抗原は、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０を含む。これらの抗原のアミノ酸配列は、配列番号１および２でそれぞれ示される。
【００２８】
抗原は、天然のＴ−細胞エピトープ配列を認識するＴ−細胞によって認識される天然に存在するタンパク質の断片（例えばペプチドなど）および／または同族体であってよい。抗原は、また、ＭＨＣ分子に結合した天然に存在するタンパク質のエピトープとよく似た類似体であってもよい。
【００２９】
ＩＬ−２またはＩＦＮ−γは、それらをプレート、ビーズまたはサイトカイン分泌細胞自体などの支持体に固定化されていてもよい特異的捕捉剤と結合させ、次いで特異的結合試薬／ＩＬ−２複合体および／または特異的結合試薬／ＩＦＮ−γ複合体の存在を典型的には第２結合検出試薬で測定することにより典型的には検出することができる。洗浄工程は、捕捉剤に特異的に結合していない物質を除去するために組み込むことができる。
【００３０】
典型的には、第２試薬は、第１試薬を結合する部位とは異なる部位でＩＦＮ−γまたはＩＬ−２と結合する。第２試薬は、アルカリホスファターゼなどの酵素、または蛍光標識と直接にコンジュゲートされるか、またはストレプトアビジンを含む第３試薬で検知されるビオチン部分を含み、それは酵素または蛍光標識に直接コンジュゲートされることができる。コンジュゲートされた酵素は、次いで、試薬の色を変える。試薬は、好ましくは抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）である。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γに対する抗体は、市場で入手でき、または標準的な技術を使用して作成することができる。
【００３１】
ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を検出するために使用される好ましい方法は、色または蛍光ＥＬＩＳｐｏｔなどのサイトカイン分泌細胞の頻度を検出するサンドイッチイムノアッセイ、限界希釈アッセイ、細胞内サイトカイン染色、Miltenyi Biotecによって開発された、サイトカイン分泌細胞の濃縮をする、または濃縮しないサイトカイン分泌アッセイに基づくであろう。あるいはまた、分泌されるサイトカインの量は、例えば、プレート上に固定された捕捉抗体を用いて全血Quantiferon（登録商標）系などのＥＬＩＳＡ系、およびその修飾（例えば、Cellestisから入手可能であるように）またはビーズ上に固定された捕捉抗体を用いるBeadlyte（登録商標）キットを使用するLuminex（登録商標）サスペンジョンアレイ技術で測定することができる。サイトカインｍＲＮＡ発現は、またＲＴ−ＰＣＲなどのアッセイでも測定することができる。
【００３２】
１実施形態において、使用される検出系は、ＷＯ９８／２３９６０で記述されるエクスビボでのＥＬＩＳｐｏｔアッセイである。そのアッセイでは、Ｔ−細胞から分泌されるＩＦＮ−γは、固体支持体に固定された第１のＩＦＮ−γ特異的抗体により結合される。次いで、結合ＩＦＮ−γは、検出可能な標識で標識された第２のＩＦＮ−γ特異的抗体を用いて検出される。そのような標識された抗体は、MABTECH (Stockholm、Sweden)から入手することができる。使用することができる他の検出可能な標識は、以下で検討される。
【００３３】
本発明の方法は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γとＩＬ−２の両方を産生する病原抗原応答性Ｔ−細胞が個体中にそれぞれ存在するかどうかの決定を可能にするものである。抗原応答性Ｔ−細胞の各タイプの相対的な量は、また測定可能である。Ｔ−細胞の各タイプの有無は、個体における感染の状態および／または抗酸菌負荷を決定するのを可能にする。
【００３４】
ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌する細胞の存在は、高い抗原負荷の状態の間に起きる。低い抗原負荷の状態の間では、抗原特異的Ｔ−細胞は、ＩＦＮ−γのみの分泌を止めて、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を優先的に分泌し、そして新たにＩＬ−２のみを分泌する。このように、ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞は、抗原負荷と正に相関し、そしてＩＦＮ−γ／ＩＬ−２を分泌する細胞は、抗原負荷と負に相関する。抗原−応答性Ｔ−細胞の３つのタイプのプロファイルは、個体での病原負荷を決定するのに用いることが可能である。
【００３５】
個体が潜在的な抗酸菌感染を有し、病気の徴候を示していない場合、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−２／ＩＦＮ−γ分泌細胞のプロファイルを評価および／またはモニタリングすることは、再発の危険性を予測するであろう。ＩＦＮ−γのみまたはＩＦＮ−γ／ＩＬ−２を分泌する細胞の存在は、典型的には、個体が活動性結核に進行する危険性を伴う潜伏感染を有することを示す。ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞の数または割合は、進行または再発の危険性と正に相関する可能性があり、それはまた数種の宿主要因にも強く影響される（例えば、年齢、合併症、ＨＩＶ共同感染、医原性免疫抑制および感染はどれくらい最近かなどを含むが、これらに限定されない）。逆に、ＩＬ−２のみを分泌する細胞の数または割合は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌する細胞の存在の有無にかかわらず、進行または再発の危険性に逆に相関する可能性があり、そして、ＩＬ−２を分泌する細胞の比較的大きい数は、再発の非常に低い危険性を示す可能性がある。
【００３６】
該方法は、個体での活動性感染または潜伏感染における抗病原体（望ましくは抗酸菌）治療の進行をモニタリングするのに用いることが可能である。ＩＦＮ−γのみを分泌する細胞の数（または相対量）の減少および／またはＩＬ−２分泌細胞の数（または相対量）の増加は、治療が有効であることを示す。同様に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞の優勢の増加は治療が機能しているという徴候である。
【００３７】
該方法は、既知の抗病原体薬あるいはワクチンの有効性を評価するために、あるいは潜在的な新しい抗病原体薬またはワクチンの有効性を試験するために使用されてもよい。病原体感染を有する個体では、ＩＦＮ−γのみ分泌する細胞の数（または相対量）の減少および／またはＩＬ−２を分泌する細胞の数（または相対量）の増加は、治療が効果的であることを示す。同様に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞の優位の増加は、有効性についての陽性の徴候でもある。
【００３８】
ワクチンを試験する際に、３つの抗原応答性細胞タイプのプロファイルは、ワクチンの有効性を決定するために感染後に調べることができる。典型的には、低い病原体負荷を伴うプロファイルは、ワクチンが有効であることを示し、高い病原体負荷を伴うプロファイルは、それほど有望ではないことを示す。
【００３９】
このように、本発明の方法で試験された個体は、抗病原体薬またはワクチンを服用していた可能性がある。この実施形態では、該方法は、前記個体での前記感染の状態を前記感染の以前に決定された状態と比較し、それにより前記個体での前記抗病原体薬またはワクチンの効果をモニタリングすることをさらに含むことが可能である。
【００４０】
あるいはまた、個体は被験用抗病原体薬またはワクチンを服用していた可能性がある。この実施形態では、該方法は前記感染の状態を前記個体での前記感染の以前に決定された状態と比較し、それにより前記被験薬またはワクチンの効果をモニタリングすることをさらに含んでよい。
【００４１】
本発明はまた、本発明方法を実施するためのキットを提供し、それは病原体（好ましくは抗酸菌）抗原に応答してＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞を検出するための手段を含む。キットは、場合により、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞のプロファイルを感染の状態に相関させるための取扱説明書を含んでもよい。例えば、取扱説明書は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γとＩＬ−２を分泌する細胞の検出を病原体負荷に相関させるためであってよい。
【００４２】
典型的には、認識を検出する手段は、上記で検討した技術に基づいて検出を可能にするまたは支援する。このように、該手段は、認識後Ｔ−細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の検出を可能にする場合がある。キットは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の各々に対する特異的結合剤試薬、例えば抗体をさらに含むことができる。該試薬は、典型的には個体支持体に固定化される。このことは、該試薬と結合した後で、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２が、それを分泌するＴ−細胞の近くに残ることを意味する。したがって、ＩＦＮ−γ／試薬およびＩＬ−２／試薬の複合体の「スポット」は支持体上に形成され、各スポットは、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌しているＴ−細胞を表す。スポットを定量化して、典型的には対照と比較することにより、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２ならびに／またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方を分泌する細胞の相対的な数の測定を可能にする。
【００４３】
キットは、また、ＩＦＮ−γ／試薬およびＩＬ−２／試薬の複合体を検出するための手段を含んでもよい。検出し得る変化、例えば色の変化は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を結合した後に、試薬そのものに生じることができる。あるいはまた、検出用に直接または間接的に標識された第２試薬は、スポットの測定を可能にするためにＩＦＮ−γ／試薬およびＩＬ−２／試薬の複合体に結合させることが可能である。上記で議論したように、第２試薬は、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２に特異的であるが、第１試薬とはＩＦＮ−γまたはＩＬ−２上の異なる部位に結合する。
【００４４】
固定された支持体は、マイクロタイタープレートなどのウエルを有するプレートであってよい。したがって、各アッセイは、プレートで別々のウエルで実施することができる。
【００４５】
キットは、検出工程で使用するＴ−細胞用媒体、検出試薬または洗浄用緩衝液をさらに含んでよい。キットは、サンプルからの分離、例えばサンプルからＰＢＭＣまたはＴ−細胞の分離に適した試薬をさらに含んでよい。キットは、サンプルの成分のいずれの分離も必要とすることなくサンプルで直接にＴ−細胞の検出が可能であるように設計することができる。
【００４６】
キットは、また、陽性対照または陰性対照などの対照を含むことができる。陽性対照は、検出系が試験できるようにする。したがって、陽性対照は、典型的には上記の方法のいずれにおいてもペプチドの認識がよく似ている。典型的には、インビトロで認識を測定するように設計されたキットでは、陽性対照は、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２である。
【００４７】
キットは、また、ヒトからＴ細胞を含むサンプル、例えば血液サンプルを採取する手段を含むことが可能である。キットは、個体からのサンプルから単核細胞またはＴ細胞を分離する手段を含んでよい。
【００４８】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例１】
【００４９】
活動性結核での、および抗結核治療中もしくは治療後のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイル
【００５０】
冷凍ＰＢＭＣを結核菌−特異的ＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ−１０ペプチドプール（１０個のアミノ酸でオーバーラップする１５−量体）を用いて３７℃で５時間刺激した。次いで、分泌されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を、３７℃、４５分間分泌細胞の表面で捕捉し、次いで、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２−陽性細胞の濃縮を、ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ）およびＩＬ−２（ＰＥ）細胞濃縮およびメーカー(Miltenyi Biotec Ltd)による検出キットを用いて行った。ＰＢＭＣを、抗−ＣＤ４抗体、抗−ＩＦＮ−γ抗体、抗−ＩＬ−２抗体、およびＰｅｒＣＰ−コンジュゲート抗−ＣＤ１４抗体、ＰｅｒＣＰ−コンジュゲート抗−ＣＤ１９抗体で染色して単球およびＢ細胞をそれぞれ除去し、Via-Probeで染色して死細胞を除去した。プロットを、ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ１９−ＶｉａＰｒｏｂｅ−細胞に関してゲートをかけた。
【００５１】
結果を図１に示す。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γ／ＩＬ−２−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は、活動性結核の個体で優勢であり、そこでは細菌負荷は高い（図１ＡおよびＢ）。対照的に、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２−分泌Ｔ−細胞は、インビボで生存可能な細菌を根絶した治療中および治療後で優位を占め、ＩＦＮ−γのみを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の損失およびＩＬ−２を分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞（図１ＣおよびＤ）の出現をもたらしている。このデータは、活動性結核の４症例、ならびに３ヵ月およびその後の治療での５人の患者からの９つの経過観察サンプルで再現的に観察された。
【００５２】
同じ結果を図２にも示し、治療開始前の活動性結核患者からのサンプルと治療開始後のサンプルとの間のＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２およびＩＬ−２−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の相対的割合および頻度を比較した。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＩＦＮ−γのみを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の相対的な割合および同様に絶対頻度は、治療中または治療後の経過観察と比較して未治療の活動性結核においてはより高かったが、一方、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＩＬ−２のみを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の相対的割合は、未治療の活動性結核に比較して経過観察期間中、より高かった。
【実施例２】
【００５３】
自己治療結核におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイル
【００５４】
ＰＢＭＣをＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０で刺激して、実施例１に記載したようにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２−分泌細胞に関して濃縮した。ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２およびＩＬ−２−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生細菌が持続している自己治療参加者中で観察された。自己治療参加者は、病気再発の危険性のある１群である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】図１は、活動性結核における、ならびに抗結核治療の間およびその後のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイルを表す。示される％は、非特異性サイトカイン産生のバックグラウンドレベルを差し引いた、濃縮画分中でＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を産生するＣＤ４＋細胞の相対的割合を示す。ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γ／ＩＬ−２−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は、活動性結核においてともに優勢であり、そこでは細菌負荷は高く（Ａ、Ｂ）、一方ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２−分泌Ｔ細胞は、インビボで生存可能な細菌を根絶した治療の間および後で優位を占め、ＩＦＮ−γのみを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の損失とＩＬ−２を分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ）の出現とをもたらしている。このデータは、活動性結核の４症例、ならびに３ヵ月およびその後の治療での５人の患者からの９つの経過観察サンプルで再現的に観察された。
【図１Ｂ】図１は、活動性結核における、ならびに抗結核治療の間およびその後のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイルを表す。
【図１Ｃ】図１は、活動性結核における、ならびに抗結核治療の間およびその後のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイルを表す。
【図１Ｄ】図１は、活動性結核における、ならびに抗結核治療の間およびその後のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイルを表す。
【図２Ａ−１】図２は、活動性結核におけるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ＩＦＮ−γ（白色バー／記号）、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２（灰色バー／記号）およびＩＬ−２（黒色バー／記号）応答の、経過観察時点（治療中および治療後）と比較した割合および頻度を表す。濃縮画分（Ａ）でのＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞分泌ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２の割合ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌細胞（Ｂ）の磁気濃縮後に測定されたこれらの細胞の頻度が示される。水平線は、中央値の陽性応答を示す。Ｐ値は活動性ＴＢと経過観察との統計的差異があるかどうかを示す。
【図２Ａ−２】図２は、活動性結核におけるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ＩＦＮ−γ（白色バー／記号）、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２（灰色バー／記号）およびＩＬ−２（黒色バー／記号）応答の、経過観察時点（治療中および治療後）と比較した割合および頻度を表す。
【図２Ａ−３】図２は、活動性結核におけるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ＩＦＮ−γ（白色バー／記号）、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２（灰色バー／記号）およびＩＬ−２（黒色バー／記号）応答の、経過観察時点（治療中および治療後）と比較した割合および頻度を表す。
【図２Ｂ−１】図２は、活動性結核におけるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ＩＦＮ−γ（白色バー／記号）、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２（灰色バー／記号）およびＩＬ−２（黒色バー／記号）応答の、経過観察時点（治療中および治療後）と比較した割合および頻度を表す。
【図２Ｂ−２】図２は、活動性結核におけるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ＩＦＮ−γ（白色バー／記号）、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２（灰色バー／記号）およびＩＬ−２（黒色バー／記号）応答の、経過観察時点（治療中および治療後）と比較した割合および頻度を表す。
【図２Ｂ−３】図２は、活動性結核におけるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ＩＦＮ−γ（白色バー／記号）、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２（灰色バー／記号）およびＩＬ−２（黒色バー／記号）応答の、経過観察時点（治療中および治療後）と比較した割合および頻度を表す。
【図３Ａ】図３は、自己治療結核におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイルを示す。ＰＢＭＣはＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０で刺激されて、図１に関してはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌細胞のために濃縮された。ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２およびＩＬ−２分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生細菌が持続する自己治療の参加者にて観察された。
【図３Ｂ】図３は、自己治療結核におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインプロファイルを示す。
【図４】結核感染症の異なる結果における観察されたサイトカインプロファイルを要約する。
【図５】本発明の可能性のある適用を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号：１は、結核菌抗原ＥＳＡＴ−６のアミノ酸配列である。
配列番号：２は、結核菌抗原ＣＰＦ１０のアミノ酸配列である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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