(57)【要約】本発明は、第VII因子（ＦVII）および第VIIａ因子（ＦVIIａ）アルブミン結合ポリペプチドの分野に関する。より詳細には、本発明は、介在するペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによって結合させ得るヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡに遺伝子工学的に融合させたヒト第VII因子および第VIIａ因子および誘導体をコードするｃＤＮＡ配列、増加した安定性および延長された有効血漿半減期を示すそのようにコードされた誘導体、そのようなｃＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター、そのような組み換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞、未改変の野生型タンパク質の生物活性を有するが、安定性が向上し、半減期が延長した組み換えポリペプチドおよび誘導体、そのような組換え型タンパク質、ならびにそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、ヒト遺伝子治療で使用される、そのような改変ＤＮＡ配列を含むトランスファーベクターを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合させた、少なくとも１つの第VII因子もしくは第VIIａ因子ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含有し、少なくとも１つのそのような第VII因子もしくは第VIIａ因子ポリペプチドが該融合タンパク質のＮ末端側に位置し、そして、該融合タンパク質が第VII／VIIａ因子の生物活性を有する、アルブミン融合ポリペプチド。
【請求項２】
融合タンパク質が、融合していない野生型第VII因子もしくは第VIIａ因子のそれぞれ、またはその断片もしくは変異体と比較して、少なくとも２５％のモル特異的第VII／VIIａ因子生物活性を有する、請求項１に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項３】
融合タンパク質が、融合していない第VII因子または第VIIａ因子と比較して、増加したin vivoでの有効血漿半減期を有する、請求項１または２に記載の、第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドを含有するアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項４】
融合タンパク質が、融合していない第VII因子または第VIIａ因子と比較して、少なくとも１００％増加したin vivoでの有効半減期を有する、請求項３に記載の、第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドを含有するアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項５】
リンカーがアルブミン部分と第VII因子または第VIIａ因子部分を分離している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の、第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドを含有するアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項６】
ペプチドリンカーが、アルブミン部分から第VII因子または第VIIａ因子部分を分離し、そして、融合ポリペプチドが、リンカーを有しない第VII因子または第VIIａ因子の融合タンパク質と比較して、少なくとも２５％増加したモル特異的活性を有する、請求項５に記載の、第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドを含有するアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項７】
リンカーがプロテアーゼ切断部位を含む、請求項５または６に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項８】
切断部位が、第IIａ因子、第IXａ因子、第Ｘａ因子、第XIａ因子、第XIIａ因子、活性化プロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインからなる群から選択される凝固プロテアーゼによって切断されることが可能である、請求項７に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項９】
リンカーが、翻訳後修飾部位の挿入によって改変される、請求項５〜８のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１０】
翻訳後修飾が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ構造の１個またはそれ以上のＮ型糖鎖付加部位を含み、Ｘが、プロリン以外の任意のアミノ酸を表す、請求項９に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１１】
ペプチドリンカーが配列番号４７〜５５を含む、請求項５または６に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１２】
ペプチドリンカーが、少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１３】
ペプチドリンカーが、少なくとも３個のアミノ酸を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１４】
ペプチドリンカーが、少なくとも７個のアミノ酸を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１５】
ペプチドリンカーが、少なくとも２５個のアミノ酸を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１６】
アルブミン融合ポリペプチドが改変され、該改変が、異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を挿入により付加すること、または、該異なるビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアナログを挿入により付加することを含むように行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１７】
第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチド部分が凝固促進活性を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１８】
薬剤として使用される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
【請求項１９】
薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の、有効量のアルブミン融合ポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチド配列が、第VII／VIIａ因子融合部分のγ−カルボキシル化を仲介するプロペプチドをコードするヌクレオチド配列の３'末端に位置する、核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸分子を含む、プラスミドまたはベクター。
【請求項２２】
発現ベクターである、請求項２１に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項２３】
ヒト遺伝子治療で使用される遺伝子導入ベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチドを製造する方法であって、
ａ．生体内で発現させることができるアルブミン融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供すること、
ｂ．上記生体内で、上記核酸を発現させてアルブミン融合ポリペプチドを形成させること、および、
ｃ．上記アルブミン融合ポリペプチドを精製すること
を含む上記方法。
【請求項２６】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のプラスミドまたはベクターを含有する、医薬組成物。
【請求項２７】
血液凝固障害の治療用または予防用薬剤を製造するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアルブミン融合ポリペプチド、請求項２０に記載のポリヌクレオチド、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項２４に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２８】
以下の適応症：血友病Ａ、血友病Ｂ、外科手術に関係する出血エピソード、血液凝固障害をもたらす肝障害、「凝固因子（ＦVIIIまたはＦIX）のインヒビターによる、遺伝性または後天性血友病患者の出血エピソードおよび外科手術」、「抗血小板医薬品または抗凝固医薬品などの薬物療法の結果として発生した止血障害の回復」、「二次止血の改善」、「感染症またはビタミンＫ欠乏症もしくは重篤な肝臓病などの疾患に罹患中に生じた止血障害」、「肝臓切除術」、「蛇咬症の結果として生じる止血障害」、「胃腸出血」、「外傷」、「大量輸血の結果（希釈性凝固障害）」、「ＦVIIIおよびＦIX以外の凝固因子欠乏症」、「ＶＷＤ」、「Ｆｌ欠乏症」、「ＦＶ欠乏症」、「ＦVII欠乏症」、「ＦＸ欠乏症」、「ＦXIII欠乏症」、「ＨＵＳ」、「血小板減少症のような遺伝性または後天性の血小板疾患および障害、ＩＴＰ、ＴＴＰ、ＨＥＬＬＰ症候群、ベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、「ＨＩＴ」、「チェディアック・東症候群」、「ヘルマンスキー・パドラック症候群」、「ランデュ・オスラー症候群」、「ヘノッホ・シェーンライン紫斑病」、および「創傷治癒」；
のうち、１つまたはそれ以上を治療するための薬剤を製造するための、第VII因子もしくは第VIIａ因子ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、およびアルブミンまたはその断片もしくは変異体を含有するアルブミン融合ポリペプチドの使用。
【請求項２９】
治療が、ヒト遺伝子治療を含む、請求項２７または２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第VII因子（ＦVII）および第VIIａ因子（ＦVIIａ）アルブミン結合ポリペプチドの分野に関する。より詳細には、本発明は、介在するペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによって結合させ得るヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡに遺伝子工学的に融合させたヒト第VII因子および第VIIａ因子ならびに誘導体をコードするｃＤＮＡ配列、向上した安定性および延長された有効血漿半減期を示すそのようにコードされた誘導体、そのようなｃＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクター、そのような組み換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞、未改変の野生型タンパク質の生物活性を有するが、安定性が向上し、貯蔵寿命が延長された、組み換えポリペプチドおよび誘導体、そのような組換え型タンパク質、ならびにそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、ヒト遺伝子治療で使用される、そのような改変ＤＮＡ配列を含むトランスファーベクターを包含する。
【背景技術】
【０００２】
第VII因子および第VIIａ因子
血友病Ａは遺伝性の出血性疾患である。Ｘ染色体の血液凝固第VIII因子のＸ染色体連結欠損に起因し、殆ど男性に発症し、その発病率は１０,０００人に１人〜２人である。Ｘ染色体欠損は、自身は血友病患者でない女性保因者によって遺伝する。血友病Ａの臨床症状は出血傾向の増加である。第VIII因子濃縮物による治療が導入される前、重篤な血友病患者の平均寿命は２０歳に満たなかった。まず、血漿由来の第VIII因子の濃縮物を使用し、さらにその後第VIII因子の組換え型の濃縮物を使用することで、血友病患者の状況は相当に改善され、平均寿命も大幅に伸び、殆どの患者が、程度の差はあるものの、普通の生活を送ることが可能になった。血友病Ｂは、有病率は血友病Ａの５分の１であり、第IX因子の欠損または機能低下によって引き起こされ、血漿由来の第IX因子濃縮物または第IX因子の組換え型で治療する。血友病Ａと血友病Ｂのいずれにおいても、この疾患の治療における最も深刻な医学的問題は、補充された因子に対する同種抗体の発生である。血友病Ａ患者全体の３０％までに第VIII因子に対する抗体が生じる。第IX因子に対する抗体は、発生率はより低いが、免疫学的寛容導入療法に対する感受性が低下すればするほどより重篤な結果をもたらす。
【０００３】
現在の凝固のモデルによれば、生理的に凝固のきっかけとなるのは、通常血管系の外部に存在する組織因子（ＴＦ）発現細胞の表面で、ＴＦと第VIIａ因子（ＦVIIａ）との間に複合体が形成されることである。その結果、第IX因子と第Ｘ因子が活性化され、最終的に一定量のトロンビンが生成する。正のフィードバックループにおいて、トロンビンは第VIII因子および第IX因子を活性化し（血液凝固カスケードのいわゆる「内因性」経路）、それにより第Ｘａ因子の生成を増幅する。第Ｘａ因子は十分なトロンビンバーストを引き起こし完全な止血を達成するために必要なものである。通常の生理学的レベルを超える濃度の第VIIａ因子を投与することにより、止血が第VIIIａ因子および第IXａ因子の作用を経る必要なく達成されることが示された。第VII因子についてのｃＤＮＡのクローニング（米国特許第４,７８４,９５０号）により、活性型第VII因子を医薬品として開発することが可能になった。第VIIａ因子は、１９８８年に初めて成功裡に投与され、それ以来、第VIIａ因子の適応数は増加し、第VII因子が出血を止めるための普遍的な止血剤になりえる可能性を示している（Erhardtsen、2002）。しかし、第VIIａ因子の半減期は約２時間と短いため、その利用は限られている。
【０００４】
ＦVIIは、分子量５０ｋＤａを有する単鎖糖タンパク質で、アミノ酸４０６個からなる不活性なチモーゲンとして、肝細胞によって血流中に分泌されている。ＦVIIは、このタ
ンパク質のＮ末端Ｇｌａドメインに局在するγ−カルボキシ−グルタミン酸残基１０個（第６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９、および３５番目）を含む。Ｇｌａ残基を生合成するためには、ビタミンＫが必要である。Ｃ末端側からＧｌａドメインに向かって、２個の表皮増殖因子ドメイン、続いてトリプシンタイプのセリンプロテアーゼドメインが局在する。ＦVIIの翻訳後修飾にはさらに、ヒドロキシル化（Ａｓｐ６３）、ならびにＮ型糖鎖付加（Ａｓｎ１４５とＡｓｎ３２２）およびＯ型糖鎖付加（Ｓｅｒ５２とＳｅｒ６０）がある。
【０００５】
ＦVIIは、単一ペプチド結合Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３がタンパク質加水分解されることにより、その活性型第VIIａ因子に変換され、その結果、２個のポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（２４ｋＤａ）とＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）が形成され、これらは１個のジスルフィド架橋により結合している。他のビタミンＫ依存性凝固因子とは対照的に、ＦVIIについては、これらの他のビタミンＫ依存性凝固因子が活性化する間に切断される活性化ペプチドについて説明されていない。Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３切断部位および下流の数個のアミノ酸は、他のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化切断部位に対する相同性を示す。
【０００６】
第VIIａ因子の活性なコンフォメーションを達成するために不可欠なのは、活性化による切断後、Ｉｌｅ１５３とＡｓｐ３４３との間に塩架橋が形成されることである。第VII因子の活性化による切断は、in vitroで、第Ｘａ因子、第XIIａ因子、第IXａ因子、第VIIａ因子、血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼ、およびトロンビンにより達成される。Mollerupら（Biotechnol. Bioeng. (1995)48: 501-505）は、一定量の切断が重鎖のＡｒｇ２９０および／またはＡｒｇ３１５でも生じると報告している。
【０００７】
第VII因子は、濃度５００ｎｇ／ｍｌで血漿中に存在する。第VII因子の１％、例えば５ｎｇ／ｍｌが第VIIａ因子として存在する。第VII因子の血漿半減期は、約４時間で、第VIIａ因子の血漿半減期は約２時間であることが明らかにされた。２時間という第VIIａ因子の半減期は活性型凝固因子としては比較的長い（他の活性型凝固因子は、アンチトロンビンIIIのようなセルピンによる不可逆的阻害のため、分単位である場合が多い）にもかかわらず、止血を達成するためには複数回の静脈注射または持続的注入を行うことが必要になってくるため、第VIIａ因子の治療的用途の厳しい弱点になっている。そのため、患者にとっては高額な治療費の負担となり、不便を引き起こしている。これまで、血漿半減期が改善された第VIIａ因子の医薬製剤は市販されておらず、また、in vivoでの半減期が延長されたＦVII／ＦVIIａ変異体を示すデータも公表されていない。それでも、第VII／VIIａ因子は、普遍的な止血剤として使用される可能性をもつので、in vivoでより長い有効半減期を有する第VIIａ因子の形態を開発することが、医療上必要である。
【０００８】
Ballanceら（国際公開第０１／７９２７１号）多くの異なる治療用タンパク質またはその治療用タンパク質の変異体および／または断片の融合ポリペプチドについて記載している。この治療用タンパク質はヒト血清アルブミン、またはそのアルブミンの変異体および／または断片に融合させた場合、in vivoでの有効半減期の増加と増加した貯蔵期間を有することが期待されている。Ballanceらは、潜在能力のある融合パートナーの長いリストを提供し（これらのタンパク質のほとんどすべての実験データは示されていないが）、個々のアルブミン融合ポリペプチドが、実際に治療用タンパク質融合パートナーの生物活性を保持し、その特性も改良されているということを示している。さらに国際公開第０１／７９２７１号によれば、その治療用タンパク質のリストの各メンバーは、様々な配向にアルブミンと融合させることができる。例えば、ある治療用タンパク質の２個分子の片方を、アルブミンのＮ末端に、また一方をＣ末端に融合させる。または、ある治療用タンパク質の１個の分子を、アルブミンのＮ末端もしくはＣ末端に融合させる、あるいは、別のタンパク質の複数の領域を、他のタンパク質の複数の領域に融合させる、などである。潜在能力を有するアルブミン融合パートナーとして、国際公開第０１／７９２７１号にリストされている多くの治療用タンパク質の中に、第IX因子およびＦVII／ＦVIIａが含まれているが、これらのタンパク質のいずれについても、実験による原理の検証は行われていない。
【０００９】
Sheffieldは第IX因子（アミノ酸４１５個からなるプロトロンビン因子）アルブミン融合ポリペプチドを発現させ、ウサギの第IX因子アルブミン融合ポリペプチドのクリアランス挙動が、アルブミンよりも第IX因子にきわめて類似しており、終末相半減期が僅かに長くなる（２倍未満）のみであることを薬物動態学実験で示した(Sheffield WP et al. (2004 Br. J. Haematol. 126: 565-573)。
【００１０】
Sheffieldの結果を考慮し、かつ、第IX因子と第VII因子（両者ともにビタミンＫ依存性プロトロンビン因子である）との間の高い相同性とこれらがほぼ同様の大きさであることから、当業者でも、第VII因子も、in vivoでの有効半減期という観点からは、アルブミンに融合することで有益になるとは考えなかったであろう。
【００１１】
したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、生物活性を保持し、in vivoでの増加した有効半減期を示す、機能的なＦVIIａアルブミン融合タンパク質を開発することであった。
【００１２】
この点で、第VII／VIIａ因子ポリペプチドの生物活性とは、自身が活性化された後に、組織因子の存在下で、凝固第IX因子および第Ｘ因子を活性化する能力を意味する。
【００１３】
In vivoでの有効血漿半減期とは、第VII／VIIａ因子融合ポリペプチドが、ひとたび血漿に注入された後の、生物活性の半減期を意味する。好ましくは、血漿はヒト血漿である。
【特許文献１】米国特許第４,７８４,９５０号
【非特許文献１】Erhardtsen、2002
【非特許文献２】Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995)48: 501-505
【特許文献２】Balance et al.（国際公開第０１／７９２７１号）
【非特許文献３】Sheffield WP et al. (2004 Br. J. Haematol. 126: 565-573)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合させた、少なくとも１つの第VII因子もしくは第VIIａ因子ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含有し、少なくとも１つのそのような第VII因子もしくは第VIIａ因子部分がこの融合タンパク質のＮ末端に位置することを特徴とする、アルブミン結合ポリペプチドが、生物学的に活性な第VII因子／第VIIａ因子部分を有する融合ポリペプチドをもたらすことを発見した。
【００１５】
したがって、本発明の１つの態様は、第VII／VIIａ因子ポリペプチドをヒト血清アルブミンのＮ末端に融合させた、生物学上活性な融合タンパク質である。本融合タンパク質は、野生型第VII／VIIａ因子の分子特異的活性の少なくとも２５％、好ましくは４０％超、さらに好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超を示す。
【００１６】
さらに驚くべきことに、Sheffieldが発表した、第IX因子のヒト血清アルブミンＮ末端への融合とは対照的に、第VII／VIIａ因子のヒト血清アルブミンＮ末端へのアルブミン融合の結果、第VII／VIIａ因子融合タンパク質がもたらされ、それは第VII／VIIａ因子の生物活性を保持するばかりでなく、第VII／VIIａ因子のin vivoでの有効血漿半減期の有意な延長を示すことが明らかとなった。
【００１７】
発現させたアルブミン融合タンパク質が完全な分子として分泌されなかったため、アルブミンのＣ末端に所望のＦVII／ＦVIIａ部分を有するアルブミン融合構築物を発現させることは、成功しなかった。細胞膜を通過して移行する際、γ−カルボキシル化が損なわれたことによりモル特異的活性が減少した成熟ＦVII／ＦVIｌａ分子と、そのＣ末端にＦVIIプロペプチドが付着したアルブミン部分とに切断されるのが観察された。したがって、Ballanceらの開示内容とは対照的に、ＦVII／ＦVIIａ部分のヒト血清アルブミンＮ末端への融合のみが、所望の生物特性を有し、ＦVII／ＦVIIａのそれぞれの生物活性を保持し、そのうえ増加した血漿半減期を有する融合タンパク質をもたらすことが明らかとなった。
【００１８】
したがって、本発明の別の態様は、第VII／VIIａ因子ポリペプチドがアルブミンのＮ末端に融合した、融合していない第VII／VIIａ因子と比較して有効血漿半減期の有意な延長を示す、生物学的に活性な融合タンパク質である。好ましい実施形態では、ＦVII／ＦVIIａポリペプチドを含有する本発明のＦVII／ＦVIIａアルブミン融合ポリペプチドは、融合していないＦVII／ＦVIIａのin vivoでの半減期または治療活性と比較して、延長されたin vivoでの有効半減期、またはより長時間持続するかもしくは増加した治療活性を有する。
【００１９】
したがって、本発明の１つの態様は、融合していないＦVII／ＦVIIａと比較して、血漿半減期が、少なくとも１００％、好ましくは２００％超、さらに好ましくは５００％超、最も好ましくは１０００％超延長されている、アルブミンのＮ末端に融合したＦVII／ＦVIIａである。
【００２０】
本発明の別の意外な態様において、本発明者らは、リンカーを有しないＦVII／ＦVIIａアルブミン融合ポリペプチドは、生物活性の有意な減少を示すが、これに対し、ＦVII／ＦVIIａ部分がリンカーによってアルブミンから分離されているＦVII／ＦVIIａアルブミン融合ポリペプチドは、第VII／VIIａ因子の生物活性がリンカーの長さに依存して増加することを見出した。第VII因子または第VIIａ因子のペプチド部分を、ペプチドリンカーによってアルブミン部分と結合させると、融合分子は、コンフォメーションをとることができ、その結果、そのようなリンカー配列を有しない融合分子と比較して、モル特異的活性がより高くなるという効果がある。
【００２１】
したがって、本発明のまた別の態様は、第VII／VIIａ因子部分とアルブミンのＮ末端との間にリンカーペプチドを含む、増強された第VII／VIIａ因子生物活性を有する、第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドである。この生物活性は、例えば、そのようなリンカーを有しない第VII／VIIａ因子融合タンパク質と比較したモル特異的活性として測定される。第VII／VIIａ因子部分がペプチドリンカーによってアルブミンのＮ末端に融合した融合タンパク質のモル特異的活性の増加率は、そのようなリンカーを有しない対応する融合タンパク質と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも１００％である。また、このリンカーを有する第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドは、野生型ＦVIIａと比較して、増加したin vivoでの有効半減期を示す。しかし、ほぼ同等の距離が第VII／VIIａ因子部分とアルブミン部分とのに間に導入される限り、化学的リンカーまたはアビジン・ビオチン（これに限らず無限にあるが）のようなリンカーシステムも同様に機能すると思われる。以下、「リンカーペプチド」又は類似する用語は、このような他の機能的なリンカー手段を適宜含むものとする。
【００２２】
本発明は、アルブミンのＮ末端に結合した治療用の第VII／VIIａ因子ポリペプチド、組成物、医薬組成物、製剤、およびキットを包含する。本発明はまた、特定の医学的適応における、この治療用アルブミン結合ポリペプチドの使用を包含する。本発明は、さらに本発明のアルブミン結合ポリペプチドをコードする核酸分子のほか、このような核酸を含有
するベクター、このような核酸およびベクターで形質転換させた宿主細胞、ならびにこのような核酸、ベクター、および／または宿主細胞を使用する、本発明のアルブミン結合ポリペプチドの製造方法を包含する。
【００２３】
また本発明は、第VII因子もしくは第VIIａ因子ペプチドまたはその断片もしくは変異体、場合によりペプチドリンカー、およびアルブミンまたはその断片もしくは変異体を含む第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチド、ならびに薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物生物を提供する。本発明の別の目的は、出血性疾患患者の治療方法を提供することである。その方法は、有効量のＦVII／ＦVIIａ結合アルブミンポリペプチドを投与する工程を含む。
【００２４】
本発明の別の目的は、第VII因子もしくは第VIIａ因子ペプチドまたはその断片もしくは変異体、場合によりペプチドリンカー、およびアルブミンまたはその断片もしくは変異体、第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびに、そのような核酸分子を含有するベクターを提供することである。本融合タンパク質をコードする上述の核酸配列は、第VII／VIIａ因子融合部分のγ−カルボキシル化を仲介するプロペプチドをコードする核酸配列の３'末端に位置する。
【００２５】
本発明はさらに、第VII因子または第VIIａ因子ペプチドまたはその断片もしくは変異体、ペプチドリンカー、およびアルブミンまたはその断片もしくは変異体を含む、第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドの製造方法を提供する。この方法は、
（ａ）哺乳動物細胞内で発現させることができる第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供すること、
（ｂ）この生体内で前記核酸を発現させて第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドを生成させること、および
（ｃ）この第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドを精製することを特徴とする。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、アルブミン融合ポリペプチドおよび、疾患もしくは障害の治療法、予防法、または改善方法に関する。本明細書で使用する「第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチド」とは、第VII／VIIａ因子（またはその断片もしくは変異体）の少なくとも１つの分子を、アルブミン（またはその断片もしくは変異体）の少なくとも１つの分子のＮ末端に融合させることにより形成するポリペプチドを指す。ここで、これらの２つの部分は、場合によりペプチドリンカーで隔てられる。
【００２７】
本発明の第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドは、遺伝的融合（すなわち、アルブミン融合ポリペプチドは、第VII／VIIａ因子の全部または一部をコードするポリヌクレオチドが、場合によりリンカー配列をコードするポリヌクレオチドによって結合するアルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドの５'末端にインフレームで連結される核酸の翻訳により生成され、このリンカー配列が第VII／VIIａ因子部分とアルブミン部分との間にリンカーペプチドを導入する）などにより互いに関係している、第VII／VIIａ因子の少なくとも１つの断片または変異体、およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つの断片または変異体を含有する。
【００２８】
１つの実施形態では、本発明は、血清アルブミンポリペプチドのＮ末端に融合させた生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な第VII／VIIａ因子を含有する、またはこれからなる第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００２９】
他の実施形態では、本発明は、血清アルブミンタンパク質のＮ末端に融合した生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な第VII／VIIａ因子の断片と、血清アルブミンタン
パク質のＮ末端に融合させたペプチドリンカーとを含有する、またはこれらからなるアルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、血清アルブミンポリペプチドのＮ末端に融合させた生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な第VII／VIIａ因子の変異体と、場合によりペプチドリンカーとを含有する、またはこれらからなる第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３１】
さらなる実施形態では、本発明は、血清アルブミンの断片もしくは変異体のＮ末端に融合させた生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な第VII／VIIａ因子の断片もしくは変異体と、場合によりペプチドリンカーとを含む、またはこれらからなる第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、血清アルブミンの成熟部分のＮ末端に融合させた第VII／VIIａ因子の成熟部分と、場合によりペプチドリンカーとを含む、またはこれらからなるアルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３３】
国際公開第０１／７９２７１号によれば、ＦVII／ＦVIIａを含有するアルブミン融合ポリペプチドは、適応症「出血性疾患」、「血友病ＡおよびＢ」、「肝障害」、および「外科手術に関係する出血エピソード」に、治療薬として使用することができる。
【００３４】
本発明の別の態様では、ＦVII／ＦVIIａを含有するアルブミン融合ポリペプチドを、その他の適応症に治療上使用することができる。最も好ましい適応症は、「凝固因子（ＦVIIIまたはＦIX）のインヒビターによる、遺伝性または後天性血友病患者の出血エピソードおよび外科手術」、「抗血小板医薬品または抗凝固医薬品などの薬物療法の結果として発生した止血障害（hemostasis deficits）の回復」、「二次止血の改善」、「感染症またはビタミンＫ欠乏症や重篤な肝臓病などの疾患に罹患中に生じた止血障害（hemostasis deficits）」、「肝臓切除術」、「蛇咬症の結果として生じる止血障害（hemostasis deficits）」、「胃腸出血」、「外傷」、「大量輸血の結果（希釈性凝固障害）」、「ＦVIIIおよびＦIX以外の凝固因子欠乏症」、「ＶＷＤ」、「Ｆｌ欠乏症」、「ＦＶ欠乏症」、「ＦVII欠乏症」、「ＦＸ欠乏症」、「ＦXIII欠乏症」、「ＨＵＳ」、「血小板減少症のような遺伝性または後天性の血小板疾患および障害、ＩＴＰ、ＴＴＰ、ＨＥＬＬＰ症候群、ベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、ＨＩＴ」、「チェディアック・東症候群」、「ヘルマンスキー・パドラック症候群」、「ランデュ・オスラー症候群」、「ヘノッホ・シェーンライン紫斑病」、および「創傷治癒」である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の目的は、ヒト第VII因子およびヒト第VIIａ因子またはその断片もしくは変異体と比較して、in vivoでのより長い有効半減期を有する、ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体のＮ末端に融合させた、ヒト第VII因子およびヒト第VIIａ因子またはその断片もしくは変異体を提供することである。本発明のまた別の目的は、増加したモル特異的活性を有する、ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体のＮ末端に融合させたヒト第VII因子およびヒト第VIIａ因子またはその断片もしくは変異体を提供することである。この目標を達成するため、場合により、ＦVII／ＦVIIａとアルブミンとの間に介在するペプチドリンカーを有する、第VII因子または第VIIａ因子の血清アルブミンＮ末端への融合体を提供する。
【００３６】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書中で互換可能に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は、より広義であり、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片および変異体）ならびに他の種由来の
アルブミン（ならびにその断片および変異体）を包含する。アルブミンの代わりに、ヒトα−フェトプロテイン（国際公開第２００５／０２４０４４号に記載されている）のような（これに限らない）、他のアルブミン状タンパク質、およびそれらの機能的な断片または変異体を用いてもよい。
【００３７】
本明細書中で使用される「アルブミン」とは、アルブミンの１つまたはそれ以上の機能的活性（例えば生物活性）を有する、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体を集合的に意味する。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンもしくはその断片、詳細には、本明細書中の配列番号２２に示すヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子もしくは断片のアナログもしくは変異体を意味する。
【００３８】
本アルブミン結合ポリペプチドのアルブミン部分は、上述のＨＡ配列全長を含んでもよいし、または、治療活性を安定もしくは延長させることができるような、その配列の１つまたはそれ以上の断片を含んでもよい。そのような断片は、１０以上のアミノ酸長でもよいし、またはＨＡ配列からの約１５、２０、２５、３０、もしくは５０個以上の連続するアミノ酸を含んでもよい。あるいは、ＨＡのドメインの一部または全部を含んでもよい。
【００３９】
本発明のアルブミン結合ポリペプチドのアルブミン部分は、正常ＨＡの変異体であってよい。本発明のアルブミン結合ポリペプチドの第VII因子タンパク質部分もまた、本明細書中に記載する第VII因子ポリペプチドの変異体であってよい。「変異体」という用語は、保存性または非保存性の挿入、欠失、および置換を包含するが、この場合そのような変化が生じても、第VII因子ポリペプチドの治療活性を付与する活性部位（すなわち活性なドメイン）は実質的に変化しない。
【００４０】
特に、本発明のアルブミン結合ポリペプチドは、ヒトアルブミンの天然多型変異体およびヒトアルブミンの断片を含んでもよい。このアルブミンは任意の脊椎動物、特に、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタなどの任意の哺乳動物由来でよい。非哺乳動物のアルブミンの例としては、ニワトリおよびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本アルブミン結合ポリペプチドのアルブミン部分は、ＦVII／ＦVIIａ部分が由来している動物とはまた別の動物由来でもよい。
【００４１】
概して、アルブミン断片または変異体は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは７０超のアミノ酸長である。本アルブミン変異体は、優先的には、少なくともアルブミンの１つのドメイン全体、例えばドメイン１（配列番号２２のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号２２のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号２２のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号２２の１〜３８７）、２＋３（配列番号２２の１９５〜５８５）、または１＋３（配列番号２２のアミノ酸１〜１９４＋配列番号２２のアミノ酸３８８〜５８５）、またはこれらのドメインの断片からなってもよく、あるいは、これらを含んでいてもよい。各ドメイン自体は、２つの相同なサブドメイン、すなわち１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１、および５１２〜５８５から構成され、可撓性のサブドメイン間リンカー領域が、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５、およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含んでいる。
【００４２】
本発明のアルブミン融合ポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的改変体を含んでよい。
【００４３】
本発明は、第VII因子もしくは第VIIａ因子ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を、アルブミンポリペプチドまたはその断片もしくは変異体のＮ末端に結合させることを
含む、改変第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドに関する。ここで、場合により、この改変第VII因子または第VIIａ因子とアルブミンとの間に、介在するペプチドリンカーを導入し、改変型第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドが、アルブミンに結合していない第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドと比較して、増加したin vivoでの有効半減期を有するように、あるいは、介在するペプチドリンカーを有するアルブミン融合ＦVII／ＦVIIａのモル特異的活性が、介在するペプチドリンカーを有しないアルブミンに融合ＦVII／ＦVIIａのモル特異的活性より高くなるように、結合させる。
【００４４】
本願で用いる「第VII／VIIａ因子」とは、活性化されていない形態（第VII因子）もしくは活性化された形態（第VIIａ因子）のどちらか、またはそれらの混合物からなる、治療用ポリペプチドを意味する。上記の定義に含まれる「第VII／VIIａ因子」としては、天然のヒト第VII／VIIａ因子のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、これらのポリペプチドが実質的に第VIIａ因子の生物活性を保持している限り、末端アミノ酸の欠失または付加など、改変されたＮ末端またはＣ末端を有するポリペプチドも包含される。上記の定義に含まれる「VII因子」としては、個体ごとに存在し、発生する可能性がある天然の対立遺伝子変異も挙げられる。上記の定義に含まれる「VII因子」としてはさらに、ＦVII／ＦVIIａの変異体も挙げられる。このような変異体は、野生型配列とは１またはそれ以上のアミノ酸残基が異なっている。このような差異の例としては、１またはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）によるＮ末端および／またはＣ末端のトランケーション、または、Ｎ末端および／またはＣ末端での１またはそれ以上の余分な残基の付加のほか、保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸群、例えば（１）小さいアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、および（６）芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換が挙げられる。このような保存的置換の例を、以下の表に示す。
【００４５】
【表１】
2009525724.tif 000002
【００４６】
本融合タンパクは、融合していない野生型第VII／VIIａ因子またはその対応するＦVII／ＦVIIａ断片もしくは変異体のモル特異的活性の、少なくとも２５％超、好ましくは４０％超、さらに好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超を示す。
【００４７】
介在するペプチドリンカーによってアルブミンのＮ末端に結合した本発明のＦVII／VIIａポリペプチドは、介在するペプチドリンカーを有しない相同な第VII／VIIａ因子アルブミン融合体のモル特異的活性と比較して、増加したモル特異的活性を有する。本発明のアルブミン結合第VII／VIIａ因子ポリペプチドのモル特異的活性の増加は、介在するペプチドリンカーのない第VII／VIIａ因子アルブミン融合体のモル特異的活性と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも２００％である。第VII／VIIａ因子の活性とは、基質である第Ｘ因子を活性な第Ｘａ因子に変換する能力である。第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプ
チドのＦVIIａ活性は、好ましくはＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）を用いて測定してよい。本発明中で使用されるモル特異的活性とは、ＥＬＩＳＡによって測定されるような、第VII／VIIａ因子抗原の１００国際単位（ＩＵ）毎のＩＵで表される、ＦVII結合アルブミン融合タンパク質の活性化の後にＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）アッセイにおいて測定される活性を意味する。
【００４８】
本発明のＦVII／ＦVIIａアルブミン結合ポリペプチドは、介在するペプチドリンカーを有しない第VII／VIIａ因子アルブミン融合体と比較して、少なくとも２５％高いモル特異的活性を示し、かつ、第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドの非結合形態と比較して、増加したin vivoでの有効半減期を示す。in vivoでの有効半減期は、Lindleyら (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa, Clin. Pharmacol. Ther. 1994 55: 638-648)により示されているようにして測定することができる。
【００４９】
本発明のＦVII／ＦVIIａアルブミン結合ポリペプチドは、介在するペプチドリンカーを有しない第VII／VIIａ因子アルブミン融合タンパク質と比較して、少なくとも２５％高いモル特異的活性を示し、そのin vivoでの有効半減期は、第VII因子または第VIIａ因子ポリペプチドの非結合形態と比較して、通常少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、より好ましくは少なくとも５００％増加している。
【００５０】
したがって、本発明の１つの実施形態は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも７個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるペプチドリンカーを有する、ＦVII／ＦVIIａアルブミン結合ポリペプチドである。
【００５１】
ヒト第VII因子の野生型のin vivoでの有効半減期は、ヒトにおいて約４時間である。本発明の第VII因子アルブミン結合ポリペプチドの有効半減期は、通常、少なくとも約８時間、好ましくは少なくとも約１２時間、より好ましくは少なくとも約２４時間である。
【００５２】
ヒト第VIIａ因子の野生型のin vivoでの有効半減期は、ヒトにおいて約２時間である。本発明の第VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドの有効半減期は、通常、少なくとも約４時間、好ましくは少なくとも約６時間、より好ましくは少なくとも約１２時間である。
【００５３】
本発明によれば、第VII／VIIa因子部分は、ペプチドリンカーによってアルブミン部分に結合する。リンカーは好ましくは可撓性で、かつ非免疫原性である。リンカーを用いることにより、ヒトアルブミンとFVII／FVIIａとの間にある距離が生じるため、この２つの融合パートナーの潜在的干渉をできるだけ小さくすることができ、その結果、本融合タンパク質のＦVII／ＦVIIａ活性が増加する。典型的なリンカーとしては、(ＧＧＧＧＳ)Nまたは(ＧＧＧＳ)Nまたは(ＧＧＳ)Nが挙げられ、ここでＮは１以上の整数であり、Ｇはグリシンを、またＳはセリンを表わす。これらのアミノ酸は天然のアミノ酸に属し、そして全ての天然のアミノ酸の例として選ばれた。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、第VII／VIIａ因子部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーは、翻訳後修飾を付加するためのコンセンサス部位を含んでいる。好ましくは、そのような修飾は糖鎖付加部位から成る。さらに好ましくは、そのような修飾は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ構造の少なくとも１つのＮ型糖鎖付加部位からなる。ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸を示す。さらにより好ましくは、そのようなＮ型糖鎖付加部位はペプチドリンカーのアミノおよび／またはカルボキシ末端に接近して挿入される。そのように挿入することにより、Ｎ型糖鎖付加部位は、配列の中の、第VII／VIIａ因子部分がペプチドリンカー内へ移行している箇所とペプチドリンカーがアルブミン部分配列中へ移行している箇所で、それぞれに、生じる可能性のある潜在的ネオエピトープを保護することができる。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、第VII／VIIａ因子部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質中の天然のドメイン間リンカーとして働くペプチド配列からなる。天然環境では、そのようなペプチド配列は、被験者がこの配列に対する自己寛容を獲得することができるよう、タンパク質表面に接近して位置し免疫系を利用可能であることが好ましい。表２に例を示す
【００５６】
【表２】
2009525724.tif 000003
【００５７】
本発明のまた別の実施形態では、第VII／VIIａ因子部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーは、既知の血漿タンパク質のドメイン間リンカーであるペプチド配列からなる。表３に例を示す。
【００５８】
【表３】
2009525724.tif 000004
【００５９】
本発明のまた別の実施形態では、第VII／VIIａ因子部分を、凝固部位で第VII／VIIａ因子ポリペプチドを遊離するペプチドリンカーによってアルブミン部分に結合させる。ここで、このリンカーは血漿プロテアーゼ切断部位を含む。好ましくは、このような血漿プロテアーゼ切断部位はセリンプロテアーゼのものである。より好ましくは、この切断部位は凝固プロテアーゼ切断部位に由来するものである。最も好ましくは、この凝固プロテアーゼは、第IIａ因子、第IXａ因子、第Ｘａ因子、第XIａ因子、第XIIａ因子、活性化プロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインからなる群から選ばれる。これらのセリンプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列は、当業者には既知である（例えば、“Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice”, Fourth Edition, Colman et al. 2001 に記載の通り）。第IIａ因子：ｐ３４〜３５およびｐ１７６、第IXａ因子：ｐ４０〜４１、第Ｘａ因子：ｐ３４〜３５、第XIａ因子：ｐ１２８〜１２９、第XIIａ因子：ｐ１９４、ａＰＣ：ｐ３４〜３５およびｐ１５９、カリクレイン：ｐ１０３〜１０４またはエラスターゼ（O'Reilly et al., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science 285: 1926-1928）．
【００６０】
さらに本発明は、第VII／VIIa因子部分内に付加的な改変を含めた、本発明に係る改変第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドに関する。
【００６１】
特に、異なるビタミンＫ依存ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を付加することによって、または第VII／VIIａ因子ポリペプチドの推定上の活性化ペプチドの少なくとも一部を、異なるビタミンＫ依存ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することによって、第VII／VIIａをＡｒｇ１４４とＡｒｇ１５２ポリペプチド間で改変した第VII／VIIａ因子の改変体が本発明に包含される。これについては、欧州特許出願第０４０１９４８５.４（参照によって本明細書中に組み入れる）に記載されており、また次のパラグラフでも説明する。
【００６２】
ＦVIIは特に、ＦIX、ＦＸ、およびプロテインＣなどのその他のＧｌａドメインタンパク質と密接に関連している。これらは、Ｎ末端Ｇｌａドメイン、それ続いて２個の上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、それに続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインからなる。
【００６３】
特筆すべきは、これらの密接に関連した血漿タンパク質の血漿半減期の大きな差である。
ＦVII               ２〜４時間
プロテインＣ        ６〜８時間
ＦIX            １８〜３０時間
ＦＸ            ２０〜４２時間
【００６４】
これらの分子は高度に保存されており、最も著しい差異は、活性化ドメイン内にある。ＦVIIについては、活性化ペプチドは説明されていない。しかし、活性化の際に、ＦVIIはＡｒｇ１５２での切断に加えてＡｒｇ１４４でも切断される可能性もあり、その場合、保存されたＮ型糖鎖付加部位を含む８個のアミノ酸からなる推定上の活性化ペプチドが放出される。Ａｒｇ１４４とＡｒｇ１５２の間の配列は、欧州特許出願第第０４０１９４８５.４号において、「推定上の活性化ペプチド」と呼ばれている。
【００６５】
驚くべきことに、活性化ペプチドの長さおよび活性化ペプチドの翻訳後修飾は、半減期の増加と相関する。
【００６６】
【表４】
2009525724.tif 000005
【００６７】
したがって、本発明は、Ａｒｇ１４４とＡｒｇ１５２との間の領域で、第VII／VIIａ因
子ポリペプチドを改変することを含む、アルブミンに結合させた改変第VII／VIIａ因子ポリペプチドの製造方法に関する。このように改変させることにより、改変第VII／VIIａ因子ポリペプチドは、当該領域が改変されていない第VII／VIIａ因子ポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するようになる。
【００６８】
本発明はさらに、別のビタミンＫ依存ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を付加することによって、または第VII／VIIａ因子ポリペプチドの推定上の活性化ペプチドの少なくとも一部を、異なるビタミンＫ依存ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することによって、第VII／VIIａポリペプチドを上述の第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドのＡｒｇ１４４とＡｒｇ１５２との間の領域で改変させることを含む、このような改変第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドの製造方法に関する。
【００６９】
本発明はまた、触媒能力を促進したり、血漿半減期を延長させたり、または組織因子相互作用を改変する、第VII／VIIａ因子ポリペプチド配列内の付加的な突然変異を包含する。特に有用な第VII因子突然変異は  タンパク質の機能の増強について報告するShah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4229-4234 中に記載されている。他の有用な第VII／VIIａ因子突然変異は、欧州特許出願第０４０１９４８５.４号の先行技術の記載中で詳細に説明されている。
【００７０】
本発明はさらに、本願中に記載されている第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「ポリヌクレオチド」という用語は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチド、または、ポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、改変されていないＲＮＡまたはＤＮＡでも改変されたＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡでもよいし、一本鎖または二本鎖ＲＮＡでもよい。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、１またはそれ以上の修飾塩基および／または通常ではない塩基（例えばイノシン）を含むＤＮＡまたはＲＮＡも含む。当業者に既知の多くの有用な目的に役立つ様々な改変をＤＮＡおよびＲＮＡに施してもよいことは理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、このような化学的、酵素的、または代謝的に改変されたポリヌクレオチドの形態のほか、ウイルスおよび細胞（例えば単細胞および複雑型細胞など）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００７１】
遺伝コードの縮重により、所定のポリペプチドは、異なるポリヌクレオチドによってコードされている場合もあることは当業者なら理解するであろう。これらの「変異体」も本発明に包含される。
【００７２】
好ましくは、  本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。「単離された」ポリヌクレオチドという用語は、その他の核酸配列、例えば、その他の染色体のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ（これらに限らない）を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製してもよい。当業者既知の従来の核酸精製方法を用いて、単離されたポリヌクレオチドを得てもよい。「単離された」ポリヌクレオチドという用語は、組換えポリヌクレオチド、および化学合成されたポリヌクレオチドも含む。
【００７３】
本発明のさらにその他の態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するプラスミドまたはベクターである。好ましくは、本プラスミドまたはベクターは、発現ベクターである。具体的な実施形態において、このベクターは、ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである。
【００７４】
本発明のさらにその他の形態は、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞である。
【００７５】
本発明の宿主細胞は、第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドの製造方法において用いてもよく、それは本発明の一部である。
この方法は、
−第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドが発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養し、さらに
−場合により、その培地から第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドを回収することを含む。
【００７６】
提案した変異体の発現
適切な宿主細胞中で組換えタンパク質を大量生産するには、当業者に既知の方法に従い、上述の改変されたｃＤＮＡを、様々な発現系で増殖が可能な組換え発現ベクター中に、適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築する必要がある。効率的な転写調節因子は、動物細胞を天然の宿主とするウイルス、または動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくは、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導した、プロモーター−エンハンサーの組み合わせ、または、ベータ−アクチンもしくはＧＲＰ７８のような動物細胞中で強く構成的に転写された遺伝子を含む、プロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることができる。安定な高レベルのｃＤＮＡからのｍＲＮＡの転写を達成するためには、転写単位は、その３'近位部分に、転写終結のためのポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含む必要がある。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、または、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から誘導される。
【００７７】
次に、ｃＤＮＡは、第VII／VIIａ因子アルブミン融合ポリペプチドを発現させるための適切な宿主細胞系のゲノムに統合される。正しいフォールディング、Ｇｌａドメイン内のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合型の糖鎖付加、Ｏ−結合型の糖鎖付加、およびその他の翻訳後修飾、ならびに培地への分泌を確実にするため、上記細胞系は、脊椎動物由来の動物細胞系である必要がある。その他の翻訳後修飾の例としては、新成ポリペプチド鎖のチロシンのＯ−硫酸化、水酸化およびタンパク質分解処理ならびにプロペプチド領域の切断が挙げられる。使用可能な細胞系の例としては、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞が挙げられ、選択的にはハムスターＣＨＯ細胞である。
【００７８】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、数種の様々な方法で、動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスをベースとしたベクターから作製することができる。その例としては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および、好ましくはウシパピローマウイルスをベースとしたベクターが挙げられる。
【００７９】
また、ゲノムに組換えＤＮＡを統合した特定の細胞クローンの単離を容易にするために、対応するＤＮＡをコードする転写単位を、動物細胞に、その中で優勢な選択マーカーとして機能する可能性がある別の組換え遺伝子と共に導入することもできる。このタイプの優勢な選択マーカー遺伝子の例としては、Ｔｎ５アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ（ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与する）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシン耐性を付与する）、および、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシン耐性を付与する）が挙げられる。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクターに含有させてもよい。または、同時に導入されて宿主細胞のゲノムに統合される別個のベクターにコードされてもよく、そうすることにより、異なる転写単位間で堅い物理的な連結が形成されることが多い。
【００８０】
所望のタンパク質のｃＤＮＡと共に用いることができるその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位をベースとしたものである。このタイプの遺伝子を内因性ｄｈｆｒ活性が欠損した細胞、選択的にはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入した後、ヌクレオシドを含まない培地中でこれらを増殖させることが可能になると予想される。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないハムＦ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、凝固因子のｃＤＮＡ転写単位と共に、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに連結させて上記のタイプのＣＨＯ細胞に導入することができるため、組換えタンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性細胞系を作製することができる。
【００８１】
上記の細胞系を細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセートの存在下で増殖させる場合、メトトレキセート耐性の新しい細胞系が出現すると予想される。これらの細胞系は、連結されたｄｈｆｒと所望のタンパク質の転写単位の数が増幅されているために、組換えタンパク質を高速で生産する可能性がある。高濃度のメトトレキセート（１〜１００００ｎＭ）中でこれらの細胞系を増殖させると、極めて高速で望ましいタンパク質を生産する新しい細胞系を得ることができる。
【００８２】
上記の所望のタンパク質を生産する細胞系は、懸濁培養、または、様々な固体支持体のいずれかでラージスケールで増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストランまたはコラーゲンマトリックスをベースとしたマイクロキャリアー、または、中空糸の形態の固体支持体、または、様々なセラミック材料である。細胞懸濁培養またはマイクロキャリアーで増殖させる場合、上記の細胞系培養は、バッチ培養として、または、長期間にわたり調整培地の連続的な供給を伴う潅流培養のどちらかとして行うことができる。したがって、本発明によれば、上記の細胞系は、所望の組換えタンパク質の生産のための工業的プロセスの開発にきわめて適している。
【００８３】
上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換えタンパク質は、濃縮し、様々な生化学的な方法やクロマトグラフィー法によって精製することができ、例えば、細胞培地中での所望のタンパク質とその他の物質との、大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的な親和性などの差を利用する方法が挙げられる。
【００８４】
このような精製の例は、固体支持体に固定したモノクローナル抗体へ組換えタンパク質を吸着させることである。脱離させた後、タンパク質を、上記の特性に基づいて多種多様なクロマトグラフィー技術によってさらに精製することができる。
【００８５】
本発明の第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドは、純度８０％以上、より好ましくは純度９５％以上に精製することが好ましく、具体的には、汚染高分子、具体的にはその他のタンパク質や核酸に関して純度９９.９％超の製薬的に純粋な状態であり、さらに感染性の物質や発熱性の物質を含まないことが好ましい。単離された、または、精製された本発明の第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に含まないことが好ましい。
【００８６】
本発明に記載される第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドは、治療用途に応じた医薬配合物に製剤化することができる。精製したタンパク質は、従来の生理学的に適合する水性のバッファー溶液に溶解してもよく、そこに場合により、医薬調合物を提供するための製薬用賦形剤を添加してもよい。
【００８７】
そのような薬学的担体および賦形剤、ならびに好適な医薬製剤は、当技術分野で既知である(例えば、“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000)または“Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)を参照されたい）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含有する医薬組成物は、凍結乾燥形態または安定な可溶化形態で製剤化してもよい。本ポリペプチド変異体は、当技術分野で既知の様々な手法によって凍結乾燥してよい。凍結乾燥製剤は、使用に先立ち、注射用減菌水または減菌生理食塩液などの１つまたはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤を添加することにより再構成される。
【００８８】
本組成物の製剤は、任意の薬学的に適切な投与手段により個体に送達される。様々な送達系が既知であり、任意の都合よい経路により組成物を投与するために使用することができる。選択的には、本発明の組成物は全身投与する。全身での使用のため、本発明のアルブミン結合第VII／VIIａ因子変異体は、定法に従って、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、もしくは経皮）、または腸内（例えば、経口、膣内、もしくは直腸内）送達のために製剤化する。最も優先的な投与経路は静脈内投与である。当該製剤は、注入または急速静注によって連続投与することができる。製剤によっては、徐放系も包含する。
【００８９】
本発明の、改変型の生物学的に活性なアルブミン結合第VII／VIIａ因子ポリペプチドは、治療上有効量で患者に投与する。治療上有効量とは、耐えられないほどの副作用を生じる投与量に達することなく、治療中の状態または適応症の重症化または広がりを予防または軽減し、所望の効果を生むのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、例えば、適応、製剤、および投与方法などの多くの要因に左右され、個々の適応症の前臨床および臨床試験において決定する必要がある。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、単独投与してもよいし、他の治療薬と併用投与してもよい。これらの薬剤を同じ医薬品の一部として組み込んでもよい。
【００９１】
本発明の様々な製品は、医薬品として有用である。したがって、本発明は、本明細書中に記載されている第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のプラスミドもしくはベクターを含有する医薬組成物生物に関する。
【００９２】
また、本発明の改変ＤＮＡは、ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターに統合してもよい。
【００９３】
本発明のまた別の形態は、出血性疾患の治療用または予防用の医薬品を製造するための、本明細書中に記載している第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミドもしくはベクター、または本発明の宿主細胞の使用である。出血性疾患としては、血友病Ａが挙げられるがこれに限定されない。本発明の別の実施形態では、該治療には、ヒト遺伝子治療が含まれる。
【００９４】
本発明は、さらに、以下の適応症のうち、１つまたはそれ以上において、個体を治療する方法に関する：「凝固因子（ＦVIIIまたはＦIX）のインヒビターによる、遺伝性または後天性血友病患者の出血エピソードおよび外科手術」、「抗血小板医薬品または抗凝固医薬品などの薬物療法の結果として発生した止血障害（hemostasis deficits）の回復」、「二次止血の改善」、「感染症またはビタミンＫ欠乏症や重篤な肝臓病などの疾患に罹患中に生じた止血障害（hemostasis deficits）」、「肝臓切除術」、「蛇咬症の結果として生じる止血障害（hemostasis deficits）」、「胃腸出血」。また好ましい適応症は「
外傷」、「大量輸血の結果（希釈性凝固障害）」、「ＦVIIIおよびＦIX以外の凝固因子欠乏症」、「ＶＷＤ」、「Ｆｌ欠乏症」、「ＦＶ欠乏症」、「ＦVII欠乏症」、「ＦＸ欠乏症」、「ＦXIII欠乏症」、「ＨＵＳ」、「血小板減少症のような遺伝性または後天性の血小板疾患および障害、ＩＴＰ、ＴＴＰ、ＨＥＬＬＰ症候群、ベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、ＨＩＴ」、「チェディアック・東症候群」、「ヘルマンスキー・パドラック症候群」、「ランデュ・オスラー症候群」、「ヘノッホ・シェーンライン紫斑病」、および「創傷治癒」である。本方法は、有効量の本明細書中に記載されている第VII／VIIａ因子結合アルブミンポリペプチドを、前記個体に投与することを含む。別の実施形態では、本方法はこの個体に、有効量の本発明のポリヌクレオチド、または本発明のプラスミドもしくはベクターを投与することを含む。あるいは、本方法は、この個体に有効量の本明細書中に記載されている本発明の宿主細胞を投与することを含んでもよい。
【実施例】
【００９５】
［実施例１］ＦVIIアルブミン融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの作製
プライマーＷｅ１３０３およびＷｅ１３０４（配列番号１および２）を用いて、第VII因子コード配列を、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＰｒｏＱｕｅｓｔ、インビトロジェン）からＰＣＲにより増幅した。プライマーＷｅ１２８６およびＷｅ１２８７（配列番号３および４）を用いた２回目のＰＣＲの後、得られた断片をｐＣＲ４ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングした。そこから、ＦVII  ｃＤＮＡを、すでに内部のＸｈｏＩ部位を削除したｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤバイオサイエンシーズ）のＥｃｏＲＩ部位に、ＥｃｏＲＩ断片としてトランスファーした。得られたプラスミドをｐＦVII−６５９と命名した。
続いて、オリゴヌクレオチドＷｅ１６４３およびＷｅ１６４４（配列番号５および６）を用いて、標準プロトコール（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット、ストラタジーン）による部位特異的突然変異誘発法により、ＸｈｏＩ制限部位を、ｐＦVII−６５９の天然ＦVII停止コドン（図１）の部位に導入した。得られたプラスミドをｐＦVII−７００と命名した。
【００９６】
オリゴヌクレオチドＷｅ１７３１およびＷｅ１７３２（配列番号７および８）を、標準ＰＣＲ条件下で、９４℃で２分間初期変性の後、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、７２℃で１５秒間伸長のサイクルを７回繰返し、最後に７２℃で５分間伸長工程というＰＣＲプロトコールを用いて、等モル濃度（１０ｐｍｏｌ）でアニールし、平滑化し、増幅した。得られた断片は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＦVII−７００にライゲートした。得られたプラスミドをｐＦVII−７３３と命名した。これは、ＦVIIおよびトロンビン切断可能グリシン／セリン・リンカーのＣ末端の伸展のためのコード配列を含んでいた。
【００９７】
ｐＦVII−７３３を元に、トロンビン切断部位および付加的なＮ型糖鎖付加部位のない他のリンカーを挿入した。そのために、プライマー対Ｗｅ２１４８およびＷｅ２１４９（配列番号９および１０）、Ｗｅ２１４８およびＷｅ２１５０（配列番号９および１１）、Ｗｅ２１４８およびＷｅ２１５１（配列番号９および１２）、Ｗｅ２１５２およびＷｅ２１５３（配列番号１３および１４）、Ｗｅ２１５２およびＷｅ２１５４（配列番号１３および１５）、Ｗｅ２１５２および２１５５（配列番号１３および１６）、ならびにＷｅ２１５６およびＷｅ２１５７（配列番号１７および１８）をそれぞれ、上述の通り、アニールし増幅した。それぞれのＰＣＲ断片は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨ１で消化し、同酵素により消化したｐＦVII−７３３に挿入した。成熟ヒトアルブミンのｃＤＮＡを含むＢａｍＨ１断片を、得られたプラスミドおよびｐＦVII−７３３のＢａｍＨ１部位に挿入した。この断片は、標準条件下で、プライマーＷｅ１８６２およびＷｅ１９０２（配列番号１９および２０）を用いて、アルブミンｃＤＮＡ配列に対してＰＣＲを行い、作製しておいたものである。最終プラスミドを、それぞれｐＦVII−９３５、ｐＦVII−９３６、ｐＦVII−９３７、ｐＦVII−９３８、ｐＦVII−９３９、ｐＦVII−９４０、ｐＦVII−９４１、およびｐＦVII−８３４と命名した。それらのリンカー配列ならびにＣ末端ＦVIIおよびＮ末端アルブミン配列の概要を図２に示す。
【００９８】
ｐＦVII−９３８を元に、より短いリンカー配列を欠失突然変異誘発により作製した。そのために、突然変異誘発プライマーＷｅ２２４７およびＷｅ２２４８（配列番号２３および２４）、Ｗｅ２２４９およびＷｅ２２５０（配列番号２５および２６）、Ｗｅ２２５１およびＷｅ２２５２（配列番号２７および２８）、ならびにＷｅ２２５３およびＷｅ２２５４（配列番号２９および３０）を用いて、標準突然変異誘発プロトコール（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット、ストラタジーン）で用いて、プラスミドｐＦVII−１０１４、ｐＦVII−１０１５、およびｐＦVII−１０１６、およびｐＦVII−１３７０をそれぞれ作製した。
【００９９】
リンカーを有しないＦVIIアルブミン融合タンパク質を生成するため、プライマーＷｅ２１８１およびＷｅ２１８２（配列番号３１および３２）を用いて、上記の通り、プラスミドｐＦVII−９３５に対し欠失突然変異誘発を行った。得られたプラスミドをｐＦVII−９７４と命名した。
【０１００】
プラスミドｐＦVII−９７４を元に挿入突然変異誘発を行い、１〜３個のアミノ酸からなるリンカーを作製した。そのため、突然変異誘発プライマーＷｅ２４３２およびＷｅ２４３３（配列番号３３および３４）、Ｗｅ２４３４およびＷｅ２４３５（配列番号３５および３６）、ならびに  Ｗｅ２４３６およびＷｅ２４３７（配列番号３７および３８）を用いて、標準突然変異誘発プロトコール（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット、ストラタジーン）により、プラスミドｐＦVII−１１５８、ｐＦVII−１１５９、およびｐＦVII−１１６０をそれぞれ作製した。
【０１０１】
さらに別の構築物を同様の手法で生成した。標準突然変異誘発プロトコールにより、プラスミドｐＦVII−１３７０を元に突然変異誘発プライマーＷｅ２７１３およびＷｅ２７１４（配列番号３９および４０）を、プラスミドｐＦVII−１３７０を元にＷｅ２７１５およびＷｅ２７１６（配列番号４１および４２）を、プラスミドｐＦVII−１０１６を元にＷｅ２７１７およびＷｅ２７１８（配列番号４３および４４）を、ならびにプラスミドｐＦVII−９３５を元にＷｅ２７５６およびＷｅ２７５７（配列番号４５および４６）を用いて、プラスミドｐＦVII−１３６１、ｐＦVII−１３６２、ｐＦVII−１３６３、およびｐＦVII−１３８２をそれぞれ作製した。
リンカー配列、ならびに上述の各プラスミドのＣ末端ＦVIIおよびＮ末端アルブミン配列の概要を図２に示す。
【０１０２】
［実施例２］第VII因子アルブミン融合ポリペプチドのトランスフェクションおよび発現
プラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン）中で増殖させ、標準的なプロトコール（キアゲン）で精製した。ＨＥＫ２９３細胞をリポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクトし、無血清培地（インビトロジェン２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓ）中で、５０ｎｇ／ｍｌビタミンＫ、および４μｇ／ｍｌビューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクトした細胞集団をＴ−フラスコを介してローラーボトルに拡散させ、そこから精製のために上清を回収した。
【０１０３】
［実施例３］ＦVIIおよびＦVIIアルブミン融合ポリペプチドの精製
ＦVIIまたはＦVIIアルブミン融合ポリペプチドを含む細胞培養回収物を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）バッファーで平衡化した２.０６ｍＬのＱ−セファロースＦＦカラムに適用した。続いて、カラムを１０倍量の指定されたＨｅｐｅｓバッファーで洗浄した。結合したＦVII分子を、２０カラム容積以内の２０のｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー中で
、塩化ナトリウム濃度０〜１.０Ｍまで直線濃度勾配により溶出させた。溶出液には、適用したＦVII抗原の約８５〜９０％が、タンパク濃度０.５〜１ｇ／Ｌで含まれていた。
別の方法として、ＦVIIを、欧州特許出願公開第０７７０６２５Ｂ１号に記載されているように、固定した組織因子を用い、クロマトグラフィーにより精製した。
実施例４に記載の通りに、ＦVII抗原および活性を測定した。
【０１０４】
［実施例４］ＦVII活性および抗原の測定
ＦVII活性を、 Seligsohn et al. Blood (1978) 52: 978-988に記載されている方法に基づき、標準ヒト血清（デイド・ベーリング）を標準として、市販の比色試験キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｃｏａｓｅｔ  ＦVII）を用い測定した。
ＦVIIａ活性は、Morissey et al. (1993) Blood 81: 734-744に記載された方法に基づいて、市販の試験キット（ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標））VIIａ−ｒＴＦ（ダイアグノティカ・スターゴ）を用い測定した。
ＦVII抗原を、当業者に性能が既知のＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔に述べると、マイクロプレートを、ウェルあたり１２０μＬの捕捉抗体（ヒツジ抗ヒトＦVII  ＩｇＧ、セダレーンＣＬ２００３０ＡＰ、バッファーＡ（シグマＣ３０４１）で１０００倍に希釈）と共に、周囲温度で一晩インキュベートした。プレートをバッファーＢ（シグマＰ３５６３）で３回洗浄した後、各ウェルを、バッファーＣ（シグマＰ３６８８）２００μＬと共に、周囲温度で１時間インキュベートした。バッファーＢでさらに３回洗浄工程を行った後、試験サンプルのバッファーＢでの連続希釈液、および、標準ヒト血漿（デイド・ベーリング；５０〜０.５ｍＵ／ｍＬ）のバッファーＢ（ウェルあたりの共に：１００μＬ）での連続希釈液を、周囲温度で２時間インキュベートした。バッファーＢでの３回の洗浄工程の後、検出抗体（ヒツジ抗ヒトＦVII  ＩｇＧ，セダレーンＣＬ２００３０Ｋ，ペルオキシダーゼ標識）のバッファーＢでの５０００倍希釈液１００μＬを各ウェルに添加し、周囲温度でさらに２時間インキュベートした。バッファーＢでの３回の洗浄工程の後、基質溶液（ＴＭＢ，デイド・ベーリング，ＯＵＶＦ）をウェルあたり１００μＬで添加し、暗所で周囲温度で３０分間インキュベートした。希釈していない停止溶液（デイド・ベーリング，ＯＳＦＡ）１００μＬを添加して、適切なマイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍで読み取るためのサンプルを製造した。次に、参照として標準ヒト血漿を用いた標準曲線を用いて、試験サンプルの濃度を計算した。
【０１０５】
［実施例５］因子ＸａによるＦVIIおよびＦVIIアルブミン融合ポリペプチドの活性化
実施例３に記載の通りに精製したＦVIIポリペプチドを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌ  カプリル酸ナトリウム  ｐＨ８.５から成るバッファーに対して透析した。このバッファー環境内でＦVIIをＦＸａ（市販の調合物、１００ＩＵ／ｍＬ、ＥＲＬ）、リン脂質（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｉｐｏｎ  ２５Ｐ、１ｇ／ｌ、ローヌ・プーランク−ナターマン、ケルン）、およびＣａ++（塩化カルシウムをＡｑｕａ  ｄｅｓｔに溶解させたもの、１Ｍ）と共に、３７℃で様々な時間間隔でインキュベートすることにより、ＦVIIａに活性化した。比色アッセイによって測定した最終濃度は、約３０〜６５ＩＵ／ｍＬ  ＦVIIであった。よって、ＦVIIに対して０.５％ＦＸａ、すなわち１ＩＵ  ＦＸａ、２００ＩＵ  ＦVII、０.０２ｇ／ｌリン脂質、５ｍＭ  ＣａＣｌ2であった。
活性化は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌカプリル酸ナトリウム  ｐＨ５.０からなる１０％（ｖ／ｖ）のバッファーを添加することにより終了させた。
【０１０６】
並行して、分子の切断をモニターするため、活性化混合物のサンプルおよび対応する活性化されていないサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー染色し、スキャンしてバンドの密度を調べた。
簡潔に述べると、サンプルを還元してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１６％グラジエント、ポ
リアクリルアミド、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス・グリシン・ゲル、インビトロジェン；メーカーの使用説明書に従う）に供し、クマシーブルーＧ−２５０で染色した。得られたバンドをスキャンし（Ｖｅｒｓａ  ＤＯＣ（登録商標）、バイオラッド）、相対的タンパク質濃度を、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔソフトウェア（Ｖ４.２０（アマシャム））を用いて計算した。
【０１０７】
［実施例６］ＦVIIアルブミン融合タンパク質の活性はリンカーの長さに依存する。
上述のように、リンカーの長さが０〜３１アミノ酸のＦVIIアルブミン融合タンパク質を活性化し、ＦVIIａ活性をＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）アッセイにより測定した。融合ポリペプチドは、リンカーの長さにかかわらず、同程度のＦＸａ切断を示したが、活性アッセイにより測定したアルブミン融合タンパク質のＦVIIａ活性は、驚くべき結果を示した。すなわち、ＦVIIとアルブミン部分間のリンカーが長くなるほど、測定されたモル特異的ＦVIIａ活性は高くなり（図３および表５）、リンカーを有しない構築物（９７４）は、１９以上のアミノ酸長からなるアミノ酸構築物と比較して、ＦVIIａ活性が半分未満になることが示された。１アミノ酸増加しただけのリンカー（ｐＦVII−１１５８）でさえ、リンカーを有しない融合タンパク質（ｐＦVII−９７４）と比較して、融合タンパク質のモル特異的活性が３１％増加した。このことは、ＦVIIとアルブミン配列とを直接融合させると、アルブミン部分が、そのＦVIIａ部分の立体配座またはその基質とのその相互作用のいずれかに干渉する立体配座の立場に導く可能性があることを強く示唆している。この干渉は、第VII／VIIａ因子とアルブミンとの間に介在するペプチドリンカーを導入した構築物では、有意に減少すると考えられる。
【０１０８】
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較した場合、リンカーを有しないアルブミン融合タンパク質（９７４）は、約２５％の特異的分子活性を示した（表６）。
【０１０９】
【表５】
2009525724.tif 000006
【０１１０】
【表６】
2009525724.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＴＡＧをＴＣＧで置換することにより、天然のＦVII停止コドン部位に導入したＸｈｏＩ制限部位を、アンダーラインで示す。別の構築物に使用したＮｏｔＩ部位を、二重アンダーラインで示す。第VII因子Ｃ末端のアミノ酸配列を、３文字コードで示す（四角で囲む）。
【図２】様々なｐＦVII構築物において、第VII因子のＣ末端とアルブミンのＮ末端との間に挿入したリンカー配列の概要である。ｐＦVII−８３４中のトロンビン切断部位を、アンダーラインで示す。Ｎ型糖鎖付加部位のアスパラギンを、二重アンダーラインで示す。
【図３】ＦVIIアルブミン融合タンパク質をＦＸａで活性化させ、ＦVIIａ活性をＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）アッセイで測定した。プロットは、リンカーを有さないタンパク質（プラスミドｐＦVII−９７４由来）に関する、リンカーの長さの増加に伴う上記タンパク質の活性を示す。
【図４】ＥＬＩＳＡにより測定した、野生型第VII因子（ｐＦVII−６５９）、ＦVIIアルブミン融合タンパク質、ならびに血漿由来ＦVII（ｐｄＦVII）およびｒＦVIIａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））のＰＫ実験の結果を示す。
【図１】
2009525724.tif 000008
【図２】
2009525724.tif 000009
【図３】
2009525724.tif 000010
【図４】
2009525724.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月3日(2008.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009525724000001.app
【国際調査報告】
2009525724.tif 000012
2009525724.tif 000013
2009525724.tif 000014