(57)【要約】  本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムから単離されたガラクトース転移活性を有するβ−ガラクトシダーゼに関する。前記β−ガラクトシダーゼは、ラクトースをβ結合したオリゴ糖混合物に変換することが可能であり、またα結合した二糖であるガラクトビオースを産生する予期せざる効果を奏する。前記混合物は、腸内のビフィズス菌の増殖を促進して病原性微生物叢の増殖を抑制することにより腸内健康を改善するための、種々の食品または動物飼料に取り込ませることができる。
2009525037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列であって
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするか、または、
ｂ）ａ）に記載する配列に厳しいハイブリダイゼーション条件下でバイブリダイズするか、または、
ｃ）ａ）またはｂ）に記載する配列の縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）である、
該ＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記配列が、配列番号１に示される配列、またはその断片である、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
前記配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはその断片に、６０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは２５％未満の変化を生じさせる、ヌクレオチドの置換、付加または欠失を含む、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
前記配列が、保存的アミノ酸置換を生じさせるヌクレオチドの置換を含む、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列にコードされる酵素。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはその断片を含む酵素。
【請求項７】
配列番号２に定められる配列を有するβ−ガラクトシダーゼ。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項８または請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞または真菌細胞である、請求項１０または請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、エシェリキア属、バチルス属、及びアスペルギルス属から成る群より選択される、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、バチルス・スブチリス、バチルス・サーキュランス及びアスペルギルス・ニガーから成る群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
オリゴ糖混合物の製造のための、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素または請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項１６】
前記混合物が、二糖であるＧａｌ（β１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ及びＧａｌ（α１−６）Ｇａｌを含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記混合物が、三糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、四糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、及び五糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含む、請求項１５または請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
液乳、乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等の乳製品、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品、プレバイオティック食品、動物飼料、家禽飼料及び薬剤から成る群より選択される製品の一部となるオリゴ糖混合物の製造のための、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素または請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項１９】
前記混合物が、二糖であるＧａｌ（β１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ及びＧａｌ（α１−６）Ｇａｌ、三糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、四糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、並びに五糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
液乳、乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等の乳製品、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品、プレバイオティック食品、動物飼料、家禽飼料及び薬剤から成る群より選択される製品の製造のための、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２１】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞を、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素を発現させる条件下で、適切な培養培地中で培養すること、および、前記培養により生じた酵素を前記培養物から回収することを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素の製造方法。
【請求項２２】
二糖であるＧａｌ（β１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ及びＧａｌ（α１−６）Ｇａｌ、三糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、四糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、並びに五糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含むオリゴ糖混合物の製造方法であって、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素または請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞を、ラクトース含有物質と接触させることを含む該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
製品及び方法
本発明は、ラクトースをβ結合したオリゴ糖の混合物へと変換することが可能なガラクトース転移活性を有し、α結合した二糖であるα１−６ガラクトビオースを作り出す予測されなかった効果を奏するβ−ガラクトシダーゼに関する。特に、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の最近発見された系統株から単離されたβ−ガラクトシダーゼに関する。
【０００２】
本発明は特に、単離されたβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列にコードされる酵素、及び前記ＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを含む宿主細胞に関する。また、本発明は、オリゴ糖を生産するための、ＤＮＡ配列にコードされた酵素、またはＤＮＡ配列もしくは組換えベクターを含む宿主細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ビフィズス菌は、天然状態では下部消化管にコロニーを形成し、そこは、宿主及び上部消化管に存在する微生物が単糖及び二糖を優先的に消費するため、単糖及び二糖が少ない環境である。下部消化管で生存するために、ビフィズス菌は、細胞表面結合型、及び／または細胞外型の種々のエキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼを生産し、これによって、多様な炭水化物を利用することができる。
【０００４】
加水分解酵素活性に加え、ビフィズス菌由来のいくつかの酵素は、トランスフェラーゼ活性も示す。グリコシダーゼのこの糖鎖転移活性は、種々のオリゴ糖の酵素合成に広範囲に使用されており、該オリゴ糖がビフィズス菌増殖促進因子として作用することが証明されている。
【０００５】
ビフィズス菌は、ラクトースの細菌代謝に関与するβ−ガラクトシダーゼ酵素を作り出すことが知られている。Ｍφｌｌｅｒ、  Ｐ．Ｌ．らは、Ａｐｐｌ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、  （２００１）、  ６２、  （５）、  ２２７６−２２８３において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの一系統株由来の３種類のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離と特性について記載している。彼らは、これら３種類のβ−ガラクトシダーゼ全てが、ガラクトース転移によって、β結合したガラクトオリゴ糖の形成を触媒できることを見出した。
【０００６】
Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒらは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  ２０１、  （１９９０）、  １１５−１２３において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＤＳＭ  ２０４５６のラクトース加水分解におけるガラクトース転移反応によるβ結合したオリゴ糖の形成について記載した。産生されたオリゴ糖混合物の構造についての分析により、β−（１→３）、  β−（１→６）及びβ−（１→４）−Ｄ−ガラクトシル結合であることが示された。Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムによって産生される化合物が、大腸における細菌の接着に関与していることを示唆した。
【０００７】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムの一系統株は、ラクトースをガラクトオリゴ糖の新規混合物へと変換するガラクトシダーゼ酵素活性を産生するものとして発見され、該混合物は、予期せぬことに、ガラビオース（Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ）を含む二糖類を最大３５％まで含む。該二糖は、志賀毒素のような毒素や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの病原体が腸壁へ接着することを防ぎ得る、接着防止剤として知られている（Ｐａｔｏｎ、  Ｊ  Ｃ  ａｎｄ  Ｐａｔｏｎ、  Ａ  Ｗ  （１９９８）、  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１１、４５０−４７９；  Ｃａｒｌｓｓｏｎ、  Ｋ  Ａ  （１９８９）、  Ａｎｎ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、３０９−３５０、を参照）。
【０００８】
前記Ｂ．ビフィダム株は、２００３年３月３１日に、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１１７１として、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（アバディーン、英国）に寄託されている。該株については、英国特許第２  ４１２  ３８０号にも記載されている。
【０００９】
該Ｂ．ビフィダム株は、数種類のβ−ガラクトシダーゼを産生し、そのうち１種類が予期せぬことにα−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示すことが発見された。この酵素は、β結合した数多くの異なるオリゴ糖を作り出すのみならず、α結合した二糖であるガラビオースも作り出す。
【特許文献１】英国特許第２  ４１２  ３８０号
【非特許文献１】Ｍφｌｌｅｒ、  Ｐ．Ｌ．他、Ａｐｐｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、  （２００１）、  ６２、  （５）、  ２２７６−２２８３
【非特許文献２】Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  ２０１、  （１９９０）、  １１５−１２３
【非特許文献３】Ｐａｔｏｎ、  Ｊ  Ｃ  ａｎｄ  Ｐａｔｏｎ、  Ａ  Ｗ  （１９９８）、  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１１、４５０−４７９
【非特許文献４】Ｃａｒｌｓｓｏｎ、  Ｋ  Ａ  （１９８９）、  Ａｎｎ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、３０９−３５０
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、または該タンパク質をコードする該ＤＮＡ配列に厳しい条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を提供する。該ＤＮＡ配列は、配列番号１に示される配列であるか、その断片もしくは縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）を含み得る。
【００１１】
前記「縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）」という用語は、配列番号１に対して少なくとも５０％の相同性、好ましくは、５０〜９８％の相同性、最も好ましくは７５〜９５％の相同性を示すＤＮＡ配列を意味するものとして解釈される。
【００１２】
このようなＤＮＡ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に、６０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは２５％未満の変化を生じさせるような、ヌクレオチドの置換、付加または欠失を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明の第２の態様によれば、上記ＤＮＡ配列によりコードされる酵素が提供される。該酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の第３の態様によれば、上記ＤＮＡ配列を含む組換えベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。該ベクターは、細菌、酵母または真菌細胞等の宿主細胞内に取り込まれてもよい。もしくは、該ＤＮＡ配列が、このような宿主細胞内に取り込まれてもよい。適切な宿主細胞は、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）またはバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）等のバチルス属、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス属から選択され得る。
【００１５】
上記ＤＮＡ配列によりコードされる酵素は、ラクトースを基質として用いて、Ｇａｌ（β１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ及びＧａｌ（α１−６）Ｇａｌを含む二糖の混合物を産生する。また、該オリゴ糖混合物には、三糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、四糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、及び五糖であるＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃも存在する。
【００１６】
上記の酵素または宿主細胞は、腸内の健康を向上するための製品の一部を構成しうる、Ｇａｌ（α１−６）Ｇａｌ（ガラビオース）を含む二糖の混合物の産生に用いることができる。このような製品は、乳製品（例えば、液乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、脂肪補充粉乳（ｆａｔ  ｆｉｌｌｅｄ  ｍｉｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ）、ホエイパウダー等の乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等）、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、シンバイオティック食品（ｓｙｎｂｉｏｔｉｃ  ｃｏｍｅｓｔｉｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、プレバイオティック食品（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ  ｃｏｍｅｓｔｉｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、動物飼料、家禽飼料または他のあらゆる食料もしくは飲料から選択してもよい。
【００１７】
もしくは、産生されたオリゴ糖は、病原体または病原体によって産生された毒素の腸壁への接着を防ぐための錠剤またはカプセルの形態を有する薬剤の調製に用いることもできる。このような薬剤は、例えば、しばしば通常の健康な腸内細菌叢を変化もしくは破壊してしまう場合がある一連の抗生物質療法に続いて、患者に投与される。
【００１８】
本発明の更なる態様によれば、上記酵素を発現させる条件下で、上記宿主細胞を適切な培養培地中で培養すること、および、該培養で産生された酵素を該培養物から回収することを含む、該酵素の製造方法が提供される。
【００１９】
また、本発明は、上記酵素または上記宿主細胞を、二糖であるＧａｌ（α１−６）−Ｇａｌ（ガラビオース）を含むオリゴ糖混合物の製造方法であって、該オリゴ糖混合物を形成させる条件下でラクトース含有物質と接触させることを含む該方法にも関する。
【００２０】
適切なラクトース含有物質は、市販のラクトース、全乳、セミスキムミルク、スキムミルク、ホエイミルク、脂肪補充乳（ｆａｔ  ｆｉｌｌｅｄ  ｍｉｌｋ）、ホエイ透過物から選択することができる。このような乳製品は、乳牛、水牛、ヒツジまたはヤギから得ることができる。脂肪補充乳は、全乳を脱脂して乳脂肪を取り除き、次いで、乳脂肪の代わりに植物脂肪または植物油を添加したものとして定義される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ゲノムＤＮＡは、Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｆｅｍｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６５、  （１−２）、４１−４５、に記載の方法を用いて前記ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ  ４１１７１）から単離した。ＤＮＡを制限酵素で処理し、最長で１５  ｋｂｐのサイズを有する断片を、同一の制限酵素で処理したｐＳＰ７２ベクターにライゲーションした。Ｐｓｔｌ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｋｐｎｌ、ＳｍａｌまたはＨｉｎｄＩＩＩで処理したＢ．ビフィダム由来の染色体ＤＮＡから成るインサートを含むベクターを用いて、大腸菌細胞を形質転換した。β−ガラクトシダーゼ活性を有するクローンは、ｐ−ニトロフェニル、Ｘ−β−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉアガープレート上でセレクションされた。Ｂａｍ  ＨＩ処理した染色体ＤＮＡを含むライゲーションミックスからは、７個のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローンが得られ、これらのうち１つをｐＢ１とした。
【００２２】
ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ．３．０  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法（Ｒｕｓｓｅｌ  Ｐ．、２００２  ｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１８７−１８９）により、挿入したＤＮＡ断片Ｂ１のＤＮＡ配列決定を行った。Ｂ１のＤＮＡ配列を図１に示す（配列番号１）。
【００２３】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＯＲＦ  ｆｉｎｄｅｒを用いて位置同定した。図１に示されるヌクレオチド配列を、６種類のオープンリーディングフレーム候補の全てについて翻訳し、β−ガラクトシダーゼと推定される配列をコードする１０５２残基のアミノ酸からなる１種類のオープンリーディングフレームが同定された。該翻訳配列を図２に示す（配列番号２）。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例を参照し、本発明を更に説明する。
【００２５】
実施例１
材料及び方法
本試験において使用した全ての試薬及び培地は、Ｓｉｇｍａ（ドーセット、英国）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ペイズリー、英国）、Ｏｘｏｉｄ（ベイジングストーク、英国）、Ｑｉａｇｅｎ（ウェストサセックス、英国）及びＰｒｏｍｅｇａ（サウザンプトン、英国）から入手した。
【００２６】
菌株
ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ  ４１１７１）は、Ｍｉｃｒｏｂａｎｋチューブ中の低温ビーズ上で−７０℃にて維持した。後の実験のため、該株を、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｃｈａｌｇｒｅｎ（ＷＣ）アガー（Ｏｘｏｉｄ、英国）及びＴＰＹ培地（トリプチケースファイトン酵母エキス培地）上で回復させ、嫌気的条件下（ＣＯ2およびＮ2がそれぞれ８０％および２０％）にて３７℃で４８時間増殖させた。グラム染色によりコロニーの形態およびコンタミネーションがないことを確認した。
【００２７】
Ｅ．  ｃｏｌｉ株
本試験で用いた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ株は、常法に従い、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）アガーまたはＬＢブロス中で３７℃の好気的条件下でインキュベートし（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｗ．  Ｄ．（２００１）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、必要な場合には、抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／または１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）及び４０μｌの２％  Ｘ−β−Ｇａｌ、７μｌの２０％  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を、事前に作製した９０ｍｍアガープレート上に塗付することにより補充した。
【００２８】
大腸菌ＤＨ５ａ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペイズリー、英国）（遺伝子型：Ｆ-  φ８０ｌａｃＺΔＭΔ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒk-、  ｍk-）ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１λ-）は、α−ガラクトシダーゼ陽性株であり、発現実験及びその他の遺伝子操作に用いた。
【００２９】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムからのゲノムＤＮＡ抽出
以下の方法により、ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ  ４１１７１）からゲノムＤＮＡを単離した。当該方法において、染色体ＤＮＡは、１００  ｍｌのＷＣ嫌気性菌培養液から回収した細胞ペレットより調製した。細胞を１０  ｍｌ  のＴＥＳバッファー（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁し、２００μｌのリゾチーム／ムタノリシン混合液（４：１、リゾチーム１０  ｍｇ／ｍｌ、ムタノリシン１  ｍｇ／ｍｌ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、該細胞を、２００μｌのプロテイナーゼＫ（２０  ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌのＲＮａｓｅ混合液（いずれも１０  ｍｇ／ｍｌ）で処理し、６５℃で１時間インキュベートした。最後に該細胞を、２  ｍｌの１０％  ＳＤＳで処理して、６５℃で１５分間インキュベートした。１２  ｍｌのフェノール／クロロホルムを添加し、水相が中間相から容易に分離できるようになるまで抽出を繰り返した。イソプロパノールを用いてゲノムＤＮＡを沈殿させ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に再懸濁した。次いで、該ゲノムＤＮＡを制限酵素で処理し、同一の酵素で処理し、アルカリホスファターゼ処理を施したｐＳＰ７２にライゲーションした。Ｂ．ビフィダムのゲノムＤＮＡの制限酵素処理は、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＫｐｎＩを用いて行った。ライゲーションミックスを用いて大腸菌  ＤＨ５ａを形質転換し、β−ガラクトシダーゼ陽性クローンを、Ｘ−Ｇａｌ含有プレート上の青色のコロニーとして同定した。
【００３０】
ベクターＤＮＡの調製
本試験において、クローニングと発現にはｐＳＰ７２ベクターを用いた（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）（Ｋｒｉｅｇ、Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ、  Ｄ．Ａ．（１９８７）．    Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１５５：３９７−４１５）。
【００３１】
ｐＳＰ７２には、β−ガラクトシダーゼのα断片がコードされておらず、これを補完する活性が欠けていることから、該ベクターが選択された。該ベクターは、β−ガラクトシダーゼの調節配列および最初の１４６残基のアミノ酸のコーディング情報を含む大腸菌ＤＮＡの短いセグメントを保持していない。該セグメントは、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端部分を発現する大腸菌株（即ち、ＤＨ５ａ）と組み合わせた場合に活性なβ−ガラクトシダーゼを生じさせる（α相補）。
【００３２】
該ベクターは、以下の制限酵素を用いて処理した：ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ；製造元の説明書に従い、ＤＮＡに対して１０倍過剰量の酵素を用いた（酵素のユニット数：ＤＮＡのμｇは、プラスミドＤＮＡ１μｇあたり酵素１０ユニット、または、プラスミドＤＮＡ０．５ｐｍｏｌあたり酵素１０ユニットである）。酵素を熱で不活性化（６５℃で２０分間）した後に、水平ゲル電気泳動解析により制限酵素処理パターンを解析した。ゲル中の単一断片の存在は、ベクターの完全消化、及びベクターの制限酵素消化が一箇所で起こったことを示す。
【００３３】
ベクターの制限酵素処理が十分であることは、ライゲーションを行っていない分子で大腸菌ＤＨ５ａのコンピテント細胞を形質転換することによってもテストした。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレート上に形成されたコロニー数は、未消化分子及び後の実験において予想されるバックグラウンドの指標である。
【００３４】
更に、仔牛腸管由来アルカリホスファターゼＣＩＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、サウザンプトン、英国）を製造元の説明書に従って用いてベクターを脱リン酸化した。脱リン酸化処理の効率は、セルフライゲーション（バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼを製造元の説明書に従って用いた）後に、ＤＨ５ａ細胞を形質転換することにより試験した。形成されたコロニーの数は、再び環状化された分子（インサートがクローニングされていないベクター）の数を示すので、ＣＩＡＰによるベクター処理無しで形成されたコロニーの数から上記の数を引くと脱リン酸化されていないベクターの数が示される。
【００３５】
ゲノムＤＮＡライブラリーの構築
原核生物のＤＮＡ内に高頻度に現れる６個のヌクレオチドから成る配列を認識する６種類の制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを部分的に消化した。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩは、それぞれ５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ’３、５’Ｇ／ＧＡＴＣＣ’３、５’ＣＴＧＣＡ／Ｇ’３  、５’ＧＧＴＡＣ／Ｃ３’、５’ＣＣＣ／ＧＧＧ３’及び５’Ａ／ＡＧＣＴＴ３’の配列を特異的に認識するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼであり、これらの配列内で２本鎖を切断し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩについては、それぞれ、４個のヌクレオチドＡＡＴＴ、ＧＡＴＣ、ＡＧＣＴから成る５’突出を生じさせ、ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩは、それぞれＡＣＧＴ、ＧＴＡＣから成る３’突出を生じさせ、ＳｍａＩは、平滑末端を生じさせる。
【００３６】
これらの酵素は、全て活性を有しており、２価のマグネシウムイオンの存在下でのみＤＮＡを切断することができる。これらのイオンは、唯一必要とされる補因子であった。
【００３７】
ＤＮＡの制限酵素処理
ゲノムＤＮＡサンプルの制限酵素処理物の全てを３７℃で２時間インキュベートし、最後に６５℃で２０分間インキュベートして熱により不活性化させた。次いで、反応物を室温にて冷まし、適当量のローディングバッファーを加え、密封ガラスキャピラリーを用いて穏やかに混和した。次いで、この溶液を０．８％アガロースゲルのウェルにローディングし（４−５ボルト／ｃｍの電力供給で１４−１６時間）、処理したＤＮＡのサイズを、１ｋｂｐのＤＮＡスタンダード（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）のサイズを用いて推計した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２））。
【００３８】
制限酵素処理後に生じた断片の精製
前記反応混合物及びアガロースゲルからの断片の精製は、Ｑｉａｇｅｎ製（ウェストサセックス、英国）のＱＩＡＥＸ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて行った。プロトコルは、製造元のマニュアルに詳細に記載されている。
【００３９】
ＤＮＡのライゲーション及び形質転換
ＱＩＡＥＸ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した後、これらの断片をＣＩＡＰ処理したｐＳＰ７２ベクターにライゲーションした。ライゲーションの際には、表１に示すように、適切量のＤＮＡを滅菌した０．５ｍｌマイクロチューブに移した。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１：ライゲーション混合物。チューブＡは、セルフライゲーションを起こしたベクターＤＮＡの数を表し、この数を、形質転換後の形質転換体の総数から引かなければならない。チューブＢは、ＤＮＡ断片とベクターとのライゲーションを表し、チューブＣは、形質転換効率を計算するための対照区を表す。
【００４２】
各ライゲーションの前に、断片精製過程で再アニーリングした粘着末端を融解するために、ＤＮＡ断片を４５℃で５分間温めた。全てのライゲーション反応において、ベクター：インサートＤＮＡモル比を１：１とし、反応液は、Ｐｒｏｍｅｇａの説明書に従って調製した。
【００４３】
チューブＡおよびＢに、１．０μｌの１０倍濃度ライゲーションバッファーと０．５  ＷｅｉｓｓユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）を添加し、分子生物学グレードの水でライゲーション体積を１０μｌに調節した。チューブＣには１．０μｌの１０倍濃度ライゲーションバッファーを添加し、分子生物学グレードの水でライゲーション体積を１０μｌに調整した。
【００４４】
水と共にＤＮＡ断片をチューブに加え、次いで、調整過程で再アニーリングした粘着末端を融解するために、ＤＮＡ断片を４５℃で５分間温めた。残りのライゲーション試薬を添加する前に、該ＤＮＡを０℃に冷却し、その後、反応混合液を１６℃で一晩インキュベートした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１）。
【００４５】
（形質転換効率を低下させる原因となるライゲーション混合液を取り除くため）ライゲーションした断片のエタノール沈殿および精製を行った後、Ｈａｎａｈａｎの説明書に従って形質転換を行った。５μｌ中に約５０ｎｇのライゲーションされたＤＮＡを含む溶液を１００μｌの大腸菌ＤＨ５ａコンピテント細胞に加えた。熱処理およびアンピシリン耐性遺伝子を発現させた後に、細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｘ−β−Ｇａｌ（４０μｌの２％  Ｘ−β−Ｇａｌ）及びＩＰＴＧ（７μｌの２０％  ＩＰＴＧ）を含むＬＢプレート表面に播種した。
【００４６】
各ライゲーション反応系による形質転換体の数を測定した。チューブＣから通常得られる形質転換体の数は、２×１０5〜１×１０6ｃｆｕ／μｇであり、一方でチューブＡから得られる形質転換体の数は、５００〜６００ｃｆｕ／μｇであった。チューブＡにおける形質転換体の数は、ベクターＤＮＡの効率的な処理を示すものであった。チューブＢでの形質転換体の数は、２〜４×１０4ｃｆｕ／μｇの範囲内にあった。
【００４７】
形質転換体の数
ＰｓｔＩ処理した染色体ＤＮＡのライゲーション混合液からは、スクリーニングを行った約２５００個の形質転換体の中から１３個のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローンが得られ、ＢａｍＨＩ処理の場合には（スクリーニングを行った約１５００個の形質転換体の中から）７個の陽性クローン、ＥｃｏＲＩの場合には（スクリーニングを行った約１３００個の形質転換体の中から）３個の陽性クローン、ＫｐｎＩの場合には（スクリーニングを行った約２０００個の形質転換体の中から）７個の陽性クローン、ＳｍａＩの場合には（スクリーニングを行った約１６００個の形質転換体の中から）３個の陽性クローン、そしてＨｉｎｄＩＩＩの場合には（スクリーニングを行った約１２００個の形質転換体の中から）２個の陽性クローンが得られた。
【００４８】
陽性クローンの制限酵素処理
異なる種類のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を同定するため、以下の表に従って、陽性クローンから単離したプラスミドを消化した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
消化後に生じた断片のゲル電気泳動解析により、ｐＢ１、ｐＰ１、ｐＰ２及びｐＰ１１の各プラスミドが、異なるβ−ガラクトシダーゼをコードするインサートを有していることが示された。ｐＢ１を含むクローンを更なる解析に用いた。
【００５１】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ．３．０  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法により行い、キャピラリー電気泳動が組み込まれた、蛍光に基づくＤＮＡ解析システムであるＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００を用いて解析を行った。
【００５２】
インサートされたＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端は、ベクターに特異的なプライマーを用いて配列決定された。インサートは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＰＳ−１）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、英国）を用いて更に配列決定された。ＧＰＳ−１は、ＴＮ７トランスポゾンに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムであり、ＴｎｓＡＢＣトランスポサーゼを用いて、ＤＮＡ標的内にランダムにトランスポゾンを挿入する。製造元の説明書に従い、ドナー：標的ＤＮＡを１：４の質量比で用いた。標的プラスミドにトランスプライマーを挿入した後に配列決定用に単離されたプラスミドの数は、２５個であった。この数は、製造元の説明書に従って計算したものであり、５倍のカバー率であると推測される。
【００５３】
プラスミドｐＢ１の場合、使用したベクターのマルチプルクローニングサイトから９７３ｂｐ下流の位置に約１６９９ｂｐのトランスポゾンインサートが挿入していることにより、β−ガラクトシダーゼ活性が完全に失われることから、開始コドンがベクターのＭＣＳ（マルチプルクローニングサイト）とトランスポゾン挿入部位の間に位置していたことが示され、一方で、ＭＣＳの８４１ｂｐ下流へのインサートの挿入では、活性なβ−ガラクトシダーゼが形成されたので、開始コドンが、ＭＣＳの８４１ｂｐ〜９７３ｂｐ下流部位に存在することが示された。ＭＣＳの３５６５ｂｐ下流の位置へのインサートの挿入により、酵素活性が完全に失われたことは、終止コドンがこの位置より下流にあることを示す。更に、１２３９ｂｐ、１５４９ｂｐ、１６８３ｂｐ、１８３２ｂｐ、２１０８ｂｐ、２１８９ｂｐ、２２７０ｂｐ、２３４０ｂｐ、２４１４ｂｐ、２５７４ｂｐ、２６４８ｂｐ、２７３４ｂｐ、２８０７ｂｐ及び３４１０ｂｐの位置への挿入によっても、完全に酵素活性が失われた。
【００５４】
配列決定反応混合液は、約４００〜６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、３．２ｐｍｏｌのプライマー溶液及び４μｌのＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液を含む。
【００５５】
オープンリーディングフレームの同定
Ｂ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＣＢＩのＯＲＦ  ｆｉｎｄｅｒを用いて位置特定した。細菌の遺伝暗号を用い、フレームの長さを１００ｂｐと定めた。ヌクレオチド配列は、６種類の全てのフレーム候補を翻訳し、β−ガラクトシダーゼと推定される配列をコードする１０５２個のアミノ酸から成るオープンリーディングフレームを同定した（翻訳産物を図２に示す）。
【００５６】
実施例２
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ  ４１１７１から単離してクローニングしたβ−ガラクトシダーゼ酵素を用いた、大腸菌宿主（ＤＨ５ａ株）内における合成
他に記載のない限り、以下に記載する合成は、細胞透過性を増加させ、その細胞膜を破壊することにより細胞を増殖不能にするために、大腸菌試料（１０、０００ｇの遠心により回収）を２０００ｐｐｍの濃度のトルエンで処理した大腸菌ＤＨ５ａ宿主細胞を用いて行った。該大腸菌試料は、実施例１「大腸菌株」に記載の通りに調製した。
【００５７】
クローニングした酵素を用いた合成
β−ガラクトシダーゼを用いた合成は、初期のラクトース濃度を４０％  （ｗ／ｗ）とした基質で行った。合成溶液は、ｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸バッファー（またはｐＨ  ６．２の０．１Ｍクエン酸バッファーまたはｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸カリウムバッファー）中に調整した。合成は、１５０  ｒｐｍの振とう水浴中で４０℃にて行った。特定の酵素試料の異なるｐＨ値での活性測定（基質としてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用）に基づいて、特定の酵素の最適ｐＨを選択した。
【００５８】
ガラクトオリゴ糖の合成には、５  ｍｌの大腸菌ＤＨ５ａ細胞懸濁液（２．２  Ｕ／ｍｌの活性を有する）を遠心（１０、０００  ｇ）して、大腸菌試料を回収し、上清を捨てた。合成を行うため、該大腸菌試料を１０ｇの４０％（ｗ／ｗ）基質溶液に再懸濁した。
【００５９】
合成において、混合液中に存在した種々の糖の濃度を図３に示す。Ｂ．ビフィダムＮＣＩＭＢ  ４１１７１からクローニングしたβ−ガラクトシダーゼにより合成されたガラクトオリゴ糖混合物のパルスアンペロメトリック検出器と連結した高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）のクロマトグラムを図４に示す。最適な合成時点におけるガラクトオリゴ糖混合物の糖濃度を表１に示す。
【００６０】
表１．  ４０  ％  （ｗ／ｗ）の  初期ラクトース濃度でのガラクトオリゴ糖合成における、最高のオリゴ糖濃度が観察された時点における炭水化物組成。
【表３】
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【００６１】
Ｌａｃ：ラクトース、Ｇｌｃ：グルコース、Ｇａｌ：ガラクトース、ＤＰ：  重合度
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダム由来β−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、配列番号１のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、β−ガラクトシダーゼおよび基質として０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ６．０）中の４０％（ｗ／ｗ）のラクトースを用いたガラクトオリゴ糖合成における経時的反応を示すグラフである。
【図４】図４は、基質として０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）中の４０％  （ｗ／ｗ）のラクトースを用いて、Ｂ．ビフィダムＮＣＩＭＢ  ４１１７１由来のβ−ガラクトシダーゼによって合成したガラクトオリゴ糖混合物の高速陰イオン交換クロマトグラフである。（Ｇｌｃ＝グルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース、Ｌａｃ＝ラクトース、α（１−６）  ガラクトビオース、ＤＰ＝重合度）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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