(57)【要約】  企図される組成物及び方法は、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせを包含し、茶ポリフェノール組成物又はラクトフェリンのいずれか単独による治療よりも有意に高い効率で口腔癌を予防及び／又は治療するのに効果的である。このような改善された効率はまた、種々の臨床的及び全身的パラメータに反映され、これらのパラメーターは、第１相／第２相酵素の調節された活性、サイトケラチン、ＮＦ−κＢ、Ｂｃｌ−２、ＰＣＮＡの発現、並びに細胞増殖の変化及びアポトーシスの誘発を含む。
2009509960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶ポリフェノール組成物またはラクトフェリンの経口投与を用いた口腔ガンの治療あるいは化学的予防を改善する方法であって、
当該茶ポリフェノール組成物または当該ラクトフェリンの経口投与が第一の効果で口腔ガンを軽減することを確認すること、および
当該茶ポリフェノール組成物および当該ラクトフェリンの組み合わされた経口投与が当該第一の効果を上回る第二の効果で口腔ガンを軽減する情報を提供すること、を含む口腔ガンの治療あるいは化学的予防を改善する方法。
【請求項２】
当該茶ポリフェノール組成物が複数のカテキン類、場合により重合したカテキン類を含む組成物よりなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該茶ポリフェノール組成物が緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含む、
請求項１記載の方法。
【請求項４】
当該ラクトフェリンがウシラクトフェリンであり、当該茶ポリフェノール組
成物が複数のカテキン類よりなる、または重合したカテキン類を含む組成物よりなり、ラクトフェリンとカテキンの当該組合せは液体物、カプセル、錠剤、粉体として場合により製剤化されている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
組み合わされた経口投与における、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの重量比が１：１〜１：３である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
当該重量比が相乗的である請求項５記載の方法。
【請求項７】
経口投与が１回分の投与単位形における同時投与である請求項１記載の方法。
【請求項８】
茶ポリフェノール組成物またはラクトフェリン単独の経口投与で達成される効果を超える効果でもって口腔ガンを軽減するために効果的な量の茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンの組合せからなる栄養補助食品または医薬品。
【請求項９】
当該茶ポリフェノール組成物が少なくとも紅茶または緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含み、液体物、カプセル、錠剤、粉体として場合により製剤化されている、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１０】
当該茶ポリフェノール組成物が少なくともひとつの合成カテキンを含む、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１１】
当該茶ポリフェノール組成物が単位用量あたり１００ｍｇ〜６００ｍｇで存在し、当該ラクトフェリンが単位用量あたり２００ｍｇ〜１２００ｍｇで存在する、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１２】
栄養補助食品または医薬品が、当該茶ポリフェノールと当該ラクトフェリンを含むように製剤化された非液体栄養補助食品である、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１３】
栄養補助食品または医薬品が栄養補助食品であり、当該茶ポリフェノールと当該ラクトフェリンのうち少なくとも１つが液体性担体に含まれる、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１４】
より大きな効果が相乗的効果である、請求項８記載の栄養補助食品または
医薬品。
【請求項１５】
口腔ガンの治療または化学的予防のための栄養補助食品または医薬品の製造における茶ポリフェノールおよびラクトフェリンの組合せの使用。
【請求項１６】
当該茶ポリフェノール組成物および当該ラクトフェリンがその重量比１：１〜１：３で存在する、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
当該重量比が相乗的重量比である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
当該茶ポリフェノール組成物が少なくとも紅茶または緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含む、請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
当該組合せが１回分の投与量単位に、液体製剤、カプセル、錠剤、または粉体として場合により製剤化されている、請求項１５記載の使用。
【請求項２０】
栄養補助食品または医薬品が、液体製剤、カプセル、錠剤、または粉体として場合により製剤化されている医薬品である、請求項１５記載の使用。
【請求項２１】
茶ポリフェノールとラクトフェリンの組合せを投与することを含む、口腔ガンの予防方法。
【請求項２２】
投与の工程が経口投与を含み、当該組合せが１回分の投与量単位で製剤化されている、請求項１２の方法。
【請求項２３】
当該茶ポリフェノールは少なくとも紅茶および緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含む、請求項１２の方法。
【請求項２４】
当該組合せは、液体性栄養補助食品、カプセル、錠剤、粉末の製剤からなる群より選ばれる品に製剤化されている、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年９月２２日に出願されたシリアル番号６０／７２０００７を有する我々の同時係属中の米国仮特許出願に対する優先権を請求する。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明の分野は、口腔癌の治療及び／又は化学予防、並びに特に茶抽出物とラクトフェリンとを組み合わせた投与による口腔癌の治療及び／又は化学予防である。
【背景技術】
【０００３】
口腔癌は、年間約５００，０００件のケースが新たに診断される世界的に５番目の最も普遍的な悪性腫瘍である。不運なことに、それらの約７５％は、発展途上国で生じ、このような国において幅広く利用可能であり並びに入手可能である効果的な治療は見つかっていない。
【０００４】
例えば、Ｔａｎａｋａらは、雄Ｆ３４４ラットにおける４−ニトロキノリン１−オキシド誘発性舌部発癌に及ぼす少なくともある程度のウシラクトフェリンの化学予防効果を報告し、舌部腫瘍形成に対する化学予防的作用が、細胞増殖活性の改変及び／又は解毒性酵素の活性を通じて介在されたかもしれないことを示唆した（Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  Ｊａｎ；９１（１）：２５−３３）。他の例において、種々の茶ポリフェノールが、ある程度の抗悪性腫瘍効果を有するとして種々の刊行物において報告された。Ｈｓｕらは、ｐ２１ＷＡＦ１が、いくつかの癌細胞の種類において緑茶ポリフェノールＥＧＣＧにより誘導できること、及びｐ２１ＷＡＦ１が、カスパーゼ３により介在されるアポトーシスを促進し得るＯＳＣ２細胞のＥＧＣＧ誘発性成長抑止に関与することを観察した。これらの観察に基づいて、Ｈｓｕは、機能的ｐ２１ＷＡＦ１の発現が、口腔癌細胞における植物化学物質介在性成長抑止及びアポトーシスを促進し得ると仮説を立てた（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２５（１Ａ）：６３−７）。さらなる実験において、Ｈｓｕは、緑茶及び緑茶の選択された構成物質が、口腔癌細胞においてのみ少なくともある程度までアポトーシスを選択的に誘導する一方、ＥＧＣＧが口腔癌細胞の成長及び侵襲を抑制できたことをさらに発見した（Ｇｅｎ  Ｄｅｎｔ．２００２  Ｍａｒ−Ａｐｒ；５０（２）：１４０−６）。
【０００５】
ＥＧＣＧは、Ｗｅｉｓｂｕｒｇらにより示されたように、酸化ストレスを促進することにおいて重要な役割を果たすことも報告された。ここで著者らは、ＥＧＣＧがプロオキシダントとして作用し、癌細胞が正常細胞よりも酸化ストレスに対する感度がより高いことを報告した（Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００４  Ｏｃｔ；９５（４）：１９１−２００）。
【０００６】
緑茶はまた、平均腫瘍負担量並びに異形成及び口腔癌の発生率をある程度まで低下させることが実証され（Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；３５（１）：７３−９）、Ｌｉらは、茶とクルクミンとの組み合わせが、口腔の可視腫瘍発症率、扁平上皮癌発症率、腫瘍体積並びに異形成病変及び乳頭腫の数を有意に低下させたことを示すデータを呈示した（Ｗｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｙａｎ  Ｊｉｕ．２００２  Ｏｃｔ；３１（５）：３５４−７）。
【０００７】
不運なことに、報告された組成物及び方法のほとんどが、少なくともある程度の化学予防的効果又は治療効果を発揮する一方で、多様な困難が、なおも残存する。とりわけ、効果を持続するのに必要なポリフェノールの濃度は比較的高い。さらに、ポリフェノールの代謝変換が比較的迅速であるため、血清濃度が動物及びヒトにおいて迅速に低下し、効能は望ましいものよりも低くなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、口腔癌の治療又は予防のための数多くの組成物及び方法が当分野で公知である一方、それらのすべて又はほぼすべてが１つ以上の不利点を抱えている。従って、腫瘍性疾患、及び特に口腔癌の化学予防及び／又は治療のための改善された組成物及び方法に対する必要性がなおもある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、茶ポリフェノール及びラクトフェリンが組み合わされて顕著な抗悪性腫瘍効果を発揮するような口腔癌の化学予防及び／又は治療のための組成物及び方法に向けられており、このような組み合わせにおける化合物は、単独又は共に投与され得る。
【００１０】
本発明の主題の１つの態様において、栄養学的又は薬学的製品は、茶ポリフェノール組成物単独又はラクトフェリン単独のいずれかでの製品の経口投与により達成される効率よりも大きな効率で口腔癌を低減する有効量における茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせを含む。最も好ましくは、ポリフェノール組成物は、紅茶及び／又は緑茶から得られる複数のカテキンの混合物を含み、１つ以上の合成カテキンも含み得る。さらなる好ましい態様において、ポリフェノール組成物は、投与単位あたり１００ｍｇと６００ｍｇとの間の量において存在し、ラクトフェリンは、投与単位あたり２００ｍｇと１２００ｍｇとの間の量において存在し、この組み合わせが相乗的であることが、特に好ましい。企図される栄養学的製品は、特に固体製剤（例えば、カプセル、錠剤、スナックバー等）を含むが、望まれる場合、ポリフェノール組成物及び／又はラクトフェリンはまた、液体担体中に存在し得る。
【００１１】
従って、茶ポリフェノール組成物の経口投与又はラクトフェリンの経口投与のいずれかを使用する口腔癌の治療又は化学予防を改善する方法は、一般に、茶ポリフェノール組成物の経口投与又はラクトフェリンの経口投与が第一効率で口腔癌を低減することを確実にする段階を含む。第二段階において、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせの経口投与が、第一効率よりも大きな第二効率で口腔癌を低減するという情報が提供される。
【００１２】
特に好ましい方法において、茶ポリフェノール組成物は、紅茶及び／又は緑茶から得られる複数のカテキンの混合物を含み、ラクトフェリンは、ウシラクトフェリンである。典型的に、組み合わせた経口投与における茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの間の重量比は、１：１と１：３との間であり、最も典型的に相乗的な比である。経口投与が単一投与単位形態において同時投与であることがなおもさらに好ましい。
【００１３】
まとめると、及びもう１つの見地から見て、本発明者らは、口腔癌の治療又は化学予防のための栄養学的又は薬学的製品の製造における、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせの使用を企図する。このような使用において、茶ポリフェノール組成物及びラクトフェリンは、１：１と１：３との間の重量比において存在し、及び最も典型的には相乗的な重量比において存在する。さらに、茶ポリフェノール組成物が紅茶及び緑茶のうちの少なくとも１つから得られる複数のカテキンの混合物（又は少なくとも１つの合成カテキン）を含むこと、及び茶ポリフェノール組成物及びラクトフェリンが単一投与単位中に（例、栄養学的又は薬学的製品中に）調合されることが一般に好ましい。
【００１４】
本発明の種々の目的、特徴、態様及び利点は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な記述からより明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本発明者らは、茶ポリフェノールの化学予防の及び／又は治療上の効果が、このような化合物及び組成物とラクトフェリンとの組み合わせにより有意に改善できることを予期せずして発見した。他の顕著な結果（後述）のうち、本発明者らは、改善された効果が多くの場合相乗的であり、癌細胞における（ミトコンドリア介在性）アポトーシスの選択的誘発、癌細胞の増殖における低減、第Ｉ期／第ＩＩ期酵素の調節、及び抗酸化効果の増強を含む、多数の内在する効果により推進されることを発見した。
【００１６】
従って、以下に呈示される結果及びさらなる考察に基づき、この度栄養学的又は薬学的製品が、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせを口腔癌を低減させる有効量において含むことが企図される。最も典型的に、このような組み合わせは、その組み合わせが茶ポリフェノール組成物又はラクトフェリンを単独で有する製品の経口投与よりもより大きな効率を有するよう提供される。このような増大された効率は、最も好ましくは相乗的である。異なる見地から見て、従って茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせが、口腔癌の治療又は化学予防のための栄養学的又は薬学的製品の製造において使用されることが企図される。
【００１７】
本発明の主題のさらなる特に好ましい態様において、本発明者らは、１つの段階において、茶ポリフェノール組成物の経口投与又はラクトフェリンの経口投与が第一効率で口腔癌を低減することを確かめる、口腔癌の治療又は化学予防を改善する方法（このような方法は、茶ポリフェノール組成物又はラクトフェリンのいずれかを単独で使用する。）を企図する。好ましい方法の１つのさらなる段階において、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせた経口投与が、第一効率よりも大きな効率で口腔癌を低減するという情報（例えば、印刷された、表示された、可聴性の）が提供される。
【００１８】
茶ポリフェノール組成物の経口投与又はラクトフェリンの経口投与が第一効率で口腔癌を低減する（例えば、発生率、多重度、重症度及び／又はより悪性の形態への進行の速度）ことを確実にする段階に関して、当分野において公知の、このような確実化に関して数多くの方法があることを理解されたい。しかしながら、最も典型的に、このような確実化の段階は、以下に記載のように又は類似の方法において実施される実験的決定を使用して達成される。例えば、動物を使用する対照試験又はヒトにおける口腔癌データの統計的分析が使用され得る。代替的に又は追加的に、確実化の段階にはまた、公表された結果（ヒト又は動物に関する；例えば、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００５  Ｍａｙ；９８（１）：４１−８、又はＮｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６  Ｓｅｐ；２２（９）：９４０−６；Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．２００５  Ｍａｒ；１９（２）：２３１−４２、又はＣｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５  Ｏｃｔ；３８（１０）：８７９−８６）に対する参照も含まれ得、その公表されたデータは、化学的組成物、用量、投与計画及び／又は投与経路に関して確実化されたデータと好ましくは同一であるが、必ずしも同一であるわけではない。
【００１９】
同様に、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせの経口投与が、第一効率よりも大きな効率で口腔癌を低減するという情報を提供する段階に関して、情報を提供する公知の方法の全てがここにおいて使用に適していると企図される。例えば、このような情報は印刷された形態、表示された形態、及び／又は可聴性の形態において提供され得る。例えば、企図される方法を規制当局の認可を得るために使用する場合（例、薬学的及び／又は栄養学的使用のため、又は効率の要求を具体化するため）、確実化の段階が動物及び／又はヒトでの治験を使用して実施され得るのに対して、情報を提供する段階は認可のための申請において印刷された（書面の及び図面の）形態において実施され得る。一方、企図される方法が、茶ポリフェノールとラクトフェリンとを含む組み合わせ製品を市販するために使用される場合、確実化の段階及び情報提供の段階は、第一効率に関して詳述する刊行物及び第一効率よりも大きな効率に関して詳述する刊行物を（一緒に又は別々に）参照する市販用材料を提供することにより実施され得る。
【００２０】
企図される化合物
企図されるポリフェノール組成物に関し、適したポリフェノール組成物が植物由来のカテキンの混合物であることが、一般に好ましい。例えば、ポリフェノールの単離に特に適した植物には、中国茶植物（カメリア・シネンシス（Camellia sinensis）、特にその葉）又はブドウ（ビティス・ビニフェラ（Vitis vinifera）、特にその種子）が含まれる。特に好ましいポリフェノール組成物には、Ｍｉｔｓｕｉ  Ｎｏｒｉｎ  Ｊａｐａｎからの、ポリフェノンＥ（緑茶ポリフェノール製剤）及びポリフェノンＢ（紅茶ポリフェノール製剤）の名称で市販されているものを含む。しかしながら、このような植物がポリフェノールのかなりの量を提供する限り、数多くの他の組成物が種々の植物から得られ得ることを理解されたい。
【００２１】
他の適した成分の間で、植物ポリフェノール組成物が、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、ガロカテキン−３−ガレート（ＧＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、テアフラビン、テアフラビンモノガレート−Ａ、テアフラビンモノガレート−Ｂ、テアフラビンジガレート、タンニン等（これらの各々は立体化学的／光学的に純粋であり得又は異性体の混合物として存在し得る。）のうちの１つ以上（一般的には２と７の間）の少なくとも２５重量％、より一般的に少なくとも５０重量％、さらにより一般的に少なくとも７５重量％、及び最も一般的に少なくとも８５重量％を含むことが一般に好ましい。植物ポリフェノール組成物が、一般的に５重量％未満の、より一般的に３重量％未満の、及び最も一般的に１重量％未満の濃度の低減されたカフェイン含有量を有することは、さらに一般に好ましい。植物に依り、特定のポリフェノールの互いに対する重量比がかなり変動し得ることは注意されたい。しかしながら、特に好ましい植物ポリフェノール組成物は、一般に緑茶抽出物、紅茶抽出物由来であるもの、及びＥＧＣＧが主要成分である（一般に少なくとも３０重量％、より一般に少なくとも４０重量％の濃度で）ものを含む。紅茶抽出物はまた、重合カテキンまで重合されたカテキンを含むことでも特徴付けられ得る。最も一般に、重合カテキンは、テアフラビン及びテアルガビン（ｔｈｅａｒｕｇａｂｉｎ）を種々の重量比及び平均分子量で含む。
【００２２】
さらなる企図される態様において、植物ポリフェノール組成物は、その組成物が２つの又は唯一でさえあるポリフェノールを含むように調製され得る。このような製剤において、単離された植物ポリフェノールを１つ以上の合成ポリフェノールと、及び特にＥＧＣＧと置換することは有利であり得る。望ましい場合、企図されるポリフェノール組成物はガロイル化されたカテキンが豊化されたものであり得る。ここで企図されるカテキン（ガロイル化されたもの及びガロイル化されていないもの）が光学異性体、キラル中心及び／又は立体異性体を含むこと、及びこのような形態（及びそれらの混合物）の全てが本明細書で企図されることを注意されたい。なおもさらに企図されるポリフェノールはまた、式１：
【００２３】
【化１】
2009509960.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’及びＲ５’は、独立してＨ、ＯＨ又はＭ（ここで、Ｍは、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｓ）Ｒ、ＯＣ（ＮＨ）Ｒ、ＯＲ、又はＲ（ここで、Ｒは場合により置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、又はアリールである。）である。）であり；及びＲ３”は任意の没食子酸エステル基又はＨである。］
で示される構造を有する（例えば、合成の、非天然型の）ポリフェノールも含み得る。
【００２４】
適したラクトフェリン組成物に関して、ラクトフェリンが牛乳から単離され得る又は組換え生成物であり得るウシラクトフェリンであることが一般に好ましい。従って、ラクトフェリンの鉄負荷量がかなり変動し得ること、及び全ての公知の鉄負荷量がここで考慮されることを注意されたい。例えば、ラクトフェリン負荷量は、０％から２０％の間の鉄飽和度、２０％から４０％の間の鉄飽和度、４％から６０％の間の鉄飽和度、又は６０％から１００％の間の鉄飽和度であり得る。あるいは、ラクトフェリンはまた、人乳もしくは初乳又は他の哺乳動物の乳源からも単離され得る。再言すると、このような代替の供給源由来のラクトフェリンが組換えのものであり得ることを銘記されたい。
【００２５】
なおさらなる企図される態様において、種々のその他の鉄及び特に３価鉄イオン錯化剤もまた適していることを理解されたい。特に適した化合物は、このようなキレート化能を有するタンパク質及び非タンパク質分子を含む。例えば、化合物が非タンパク質である場合、デスフェリオキサミンが採用され得、この化合物がタンパク質である場合、フェリチン又はヘモシデリンが使用され得る。さらに、タンパク質が比較的大きく、鉄結合ドメインが特徴付けられる場合、適した鉄キレート化剤は、鉄結合断片であり得る。
【００２６】
企図される栄養学的組成物
一般に、口腔癌の化学予防及び／又は治療のためのポリフェノールとラクトフェリンとの全ての組み合わせが可食性担体中に、及び特にポリフェノール及びラクトフェリンの両方が同一可食性品目（即ち、栄養補給食品又は食品）中に存在するような可食性担体中に含まれ得ることが企図される。
【００２７】
例えば、適した食品は、植物性材料（例えば、穀類、果物、野菜、ベリー等）及び／又は動物性材料（例えば、牛肉、豚肉、子羊肉、鶏肉、魚、甲殻類動物、乳、乳製品等）を含むか又はそれらから調製されるものを含み、このような材料は生であり得又は少なくとも部分的に加工されたものであり得る。従って、本発明の主題のさらなる企図される態様において、食品は固体又は液体であり、少なくとも１つの栄養素（例えば、炭水化物、タンパク質、脂質、ミネラル、ビタミン等）、繊維及び／又は水を経口投与可能な形態において提供する。ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの企図される組み合わせは、固体又は液体の形態における食品に添加され得、又はポリフェノール組成物が第一可食性担体中にあり、ラクトフェリンが第二可食性担体中にあるような方法において提供され得る。最も好ましくは、食品はヒトが消費するための食品であり、液体、液体栄養素として調合される又はカプセル、錠剤もしくは散剤中に調合される（最も好ましくは、カテキン及びラクトフェリンが組み合わせの単一投与単位として調合される。）。
【００２８】
例えば、食品が固体形態である場合、企図される形態は、特に、カプセル、錠剤又はその他の栄養学的に公知の固体形態として（例えば、散剤として）調合される栄養補助食品を含む。しかしながら、数多くの代替の固体処方も適していると考えられ、それらには、企図された化合物が添加された（又は、企図された化合物中に豊富に組み込まれた）スナックバー、チューインガム、トローチ剤等のそのまま消費できる製品、並びに発酵乳製品等が含まれる。同様に、食品が液体形態である場合、企図される食品製品は、特に茶又はブドウジュース、乳製品、炭酸飲料、果汁飲料（例えば、生果汁、濃縮物からのジュース又は果物ジュースを含む飲料）、スポーツドリンク、アルコール飲料、強化水（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｗａｔｅｒ）等を含む。
【００２９】
もう１つの例において、企図される食品の加工度がかなり変動し得ることが予想され、食品加工の全ての程度が本発明において使用に適していると考えられる。例えば、食品が加工されない場合（例えば、収穫された果実又は野菜）、本発明の主題による化合物は、被覆、混合物、溶液、注射剤として添加され得るか、でなければ食品と組み合わされ得ることが企図される。一方、食品が少なくともある程度まで加工される場合（例えば、物理的形態が変化する（例えば、押しオート麦）又は化学組成が変化する（例えば、果実抽出物又は食品との組み合わせ））、企図される化合物は、被覆として、混合した成分として添加され得るか、又は加工により増加され得る。
【００３０】
従って、食品及び／又は加工の特定の種類に依り、企図されるポリフェノール組成物及びラクトフェリンは、単離された個々の化合物として及び／又は個々の化合物の混合物として添加され得ることを理解されたい。従って、このような化合物は比較的純粋であり得又はこのような化合物の１つ以上において富む画分として存在し得る。代替的に又は追加的に、食品中の企図されるポリフェノール組成物及び／又はラクトフェリンの濃度はまた、加工段階（例えば、企図される化合物の濃度を増大させる加工）により増大され得る。企図される化合物の食品への混合が数多くの方法において実施され得ることはさらに理解されたく、全ての公知の方法がここに提示された教示との併用の使用に適していることが企図される。
【００３１】
企図される、食品中のポリフェノール組成物及びラクトフェリンの量に関して、そのような化合物の量は、組み合わせが茶ポリフェノール組成物との製品の又はラクトフェリン単独の経口投与よりも大きな効率を有するような量であることが一般に好ましい。従って、ポリフェノール組成物は一般に、１日用量あたり約２００ｍｇと１２００ｍｇとの間、及びより一般に４００ｍｇと８００ｍｇとの間の範囲（これらの量は、１単位から数単位において投与され得る。）において存在する。しかしながら、代替の態様において、ポリフェノール組成物のより少量もまた、適していると考えられる（例えば、１００ｍｇと２００ｍｇとの間、又はそれよりさらに少ない量、特にトローチ剤又はチューインガムの形態において）。同様に、より多量も考慮され、このような量は一般に、約１２００ｍｇと２０００ｍｇとの間（及びさらに多量）の範囲である。用語「約」は、本明細書で数とともに使用される場合、その数を含むその数＋／−１０％の範囲を指す。
【００３２】
同様に、ラクトフェリンの量はかなり変動し得、一般に、１日の用量あたり約４００ｍｇと３０００ｍｇとの間、及びより一般に８００ｍｇと２０００ｍｇとの間の範囲である（これらの量は、１単位から数単位において投与され得る。）。しかしながら、代替の態様において、ポリフェノール組成物のより少量も適していると考えられる（例えば、２００ｍｇと４００ｍｇとの間、又はそれよりさらに少ない量、特にトローチ剤又はチューインガムの形態において）。同様に、より多量も考慮され（例えば、飲料中）、このような量は一般に、約３０００ｍｇと５０００ｍｇとの間（及びさらに多量でさえもある）の範囲である。従って、ラクトフェリンに対するポリフェノールの特に好ましい比が約１：１から約１：３の範囲内であり、さらにより好ましくは約１：２であることを理解されたい。ラクトフェリンはポリフェノールとともに投与され得るが、ラクトフェリンを液体形態で及びポリフェノールを固体形態で投与することもまた本明細書で適していると考慮される。ほとんどの場合、ラクトフェリンに対するポリフェノールの重量比は相乗的な重量比であることが好ましい（以下の実験を参照されたい。）。従って、特に好ましい食品において、ポリフェノール組成物は投与単位あたり１００ｍｇと６００ｍｇとの間の量において存在し、ラクトフェリンは投与単位あたり２００ｍｇと１２００ｍｇとの間の量において存在する。本発明の主題のよりさらなる態様において、企図される食品が少なくとも認められたか又は実証された栄養価を有する追加の成分を含み得ることは理解されたい。例えば、特に好ましい追加の成分は、酸化ストレスを低減し、免疫状態を改善するなどが公知の又は明言される成分を含む。
【００３３】
企図される医薬組成物
ポリフェノールとラクトフェリンとの全ての組み合わせも医薬製剤として投与され得ることが一般に企図され、ここで、ポリフェノール及びラクトフェリンの投与は、単一投与単位において一緒に又は個別に行われ得る。特定の製剤に関わらず、ポリフェノール及び／又はラクトフェリンが薬学的に許容できる担体と混合されることが好ましい。特定の用途に依存して、製剤、経路及び／又は投与計画がかなり変動し得ることは理解されたく、本発明の主題が特定の製剤、経路及び／又は投与に限定しないように一般に企図される。
【００３４】
従って、適切な製剤は、経口投与、非経口投与及び／又は局所投与（点鼻、頬内投与、及び舌下投与を含む。）のための製剤を含み、企図される製剤が単位用量形態中にあることがさらに好ましい。担体と組み合わされて単位用量形態を形成する企図されるポリフェノール及び／又はラクトフェリンの量が、化学予防的及び／又は治療的効果を生じる量であることがなおもさらに好ましい。従って、有効成分の百分率（重量％）は一般に、総重量の約１０％から約９９％までの、好ましくは約２０％から約９５％までの、より好ましくは５０％から約９０％までの、及び最も好ましくは約７０％から約９０％までの範囲である。
【００３５】
しかしながら、医薬組成物の投与される用量がかなり変動し、特定の用量が少なくとも一部、（ａ）望ましい治療応答を達成するために効果的なポリフェノール及びラクトフェリンの量、（ｂ）企図される化合物の製剤、（ｃ）投与の経路、及び（ｄ）年齢、性別、体重、一般的な健康状態、治療される患者の既往歴を含む他の因子に依存することは理解されたい。当業者は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、調合できる。
【００３６】
企図される化合物の１日の用量が一般に、望ましい治療効果を生じるのに効果的な最低用量である化合物の量に対応することが一般に好ましい。このような効果的な用量は一般に、上述の因子に依存する。従って、本発明の主題による化合物の用量は、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇから約１００ｍｇまでの、より好ましくは１日あたり１ｋｇあたり約１．０ｍｇから５０ｍｇまでの、及びさらにより好ましくは１日あたり１ｋｇあたり約２．５ｍｇから約２５ｍｇまでの範囲である。したがって、ポリフェノールの単位用量は一般に、約１００ｍｇから約５０００ｍｇまで、より好ましくは約２００ｍｇから約１２００ｍｇまで、及び最も好ましくは約２００ｍｇから約８００ｍｇまでの範囲である。同様に、ラクトフェリンの単位用量は一般に、１日あたり約４００ｍｇと約３０００ｍｇとの間、及びより一般には８００ｍｇと２０００ｍｇとの間の範囲である。望まれる場合、有効化合物の効果的な１日用量は、その日を通じて適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回以上の分割用量として、場合により単位用量形態中で投与され得る。
【００３７】
典型的な経口用調合物
本発明の主題による医薬組み合わせが（個々に又は別々に）経口投与されることは一般に好ましく、固体形態及び液体形態を含む経口投与の全ての公知の形態が、本明細書での使用に適していると考えられる。例えば、固体経口形態は、カプセル剤、錠剤、トローチ剤、散剤を含むのに対し、好ましい液体経口形態は、溶液又は適している媒体（一般に水溶液）中の懸濁液を含む。
【００３８】
典型的な適している薬学的に許容できる担体は、充填剤又は増量剤（例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸）、結合剤（例えば、アルギン酸塩、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム又はジャガイモ若しくはタピオカデンプン）、溶液遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム塩）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリン、ベントナイト粘土）、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール）、着色料、緩衝剤等を含む。企図される経口固体用量は、有効成分の緩慢な又は制御された放出を提供するようにも処方され得る（例えば、望ましい放出特性を提供する種々の比率におけるヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又は微粒子を用いて）。企図される経口固体剤形の調製が当分野において公知であり、公知の方法全てが本明細書中に提示される教示とともに使用するのに適していると考えられることを理解されたい。
【００３９】
企図される化合物の経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容できる乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤として調製され得る。従って、及び特定の処方に依存して、液体剤形はまた、水又は他の水性及び非水性溶媒を含む不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール等）、懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール）、油（例えば、綿実、トウモロコシ、胚芽、オリーブ等）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びさらなる公知の薬学的に許容できる液体成分も含有し得る。
【００４０】
典型的な非経口用調合物
本発明の主題による組み合わせが非経口的使用のための処方において調製され得ることが一般に企図され、特に企図される非経口的調合物は、注射のための液体調合物である。従って、適切な調合物は一般に、薬学的に許容できる溶媒（例えば、滅菌済み等張性の水性又は非水性溶液）を含み及び／又は分散剤、懸濁剤又は乳剤として調製され得る。あるいは、非経口的調合物はまた、企図される化合物及び使用前に液体製品に再構成され得る他の成分を含むキットとしても提供され得る。
【００４１】
医薬組成物中に採用され得る適した水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適した混合物、植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料の使用により、分散剤の場合、必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持できる。
【００４２】
企図される使用
本発明の主題による組成物及び方法が口腔癌の化学予防及び／又は治療に採用されることは、一般に好ましい。従って、適した状態は、前腫瘍状態並びに転移性であり得るか又はあり得ない腫瘍状態を含むことを理解されたい。例えば、口腔前腫瘍状態は、（ウィルス及び非ウィルス由来の）疼痛及び前腫瘍病変を含む。典型的な口腔癌及び／又は咽頭癌は特に、口腔の底部、頬の内側、歯肉及び／又は口蓋に共通の扁平上皮癌を含む。
【００４３】
企図される化合物及び組成物の投与は、純粋に予防的であり得、又は前腫瘍病変若しくはさらに癌の第一診断において開始し得ることに注意されたい。従って、一般的な投与は好ましくは長期間に亘るものである。例えば、少なくとも３０日間、より一般的に少なくとも６０日間、及び最も一般的に少なくとも１８０日間にわたる毎日の投与が、特に好ましい。しかしながら、代替の態様において、投与は毎日である必要はないが、１週間に１回（又はさらに低頻度）と１週間に３回以上との間であり得る。
【００４４】
実験
（Ｉ）紅茶ポリフェノール単独の効果
我々は、７，１２ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）誘発性ハムスター頬嚢（ＨＢＰ）発癌の開始前段階中の紅茶ポリフェノール（ポリフェノンＢ）投与の化学予防効果を評価した。頬嚢中の増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の発現及び頬嚢、肝臓及び赤血球中の脂質過酸化物、タンパク質カルボニルの濃度、及び抗酸化状態を、化学予防の生物マーカーとして使用した。
【００４５】
薬品
ウシ血清アルブミン、２−チオバルビツール酸、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン、ＧＳＨ，５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ８）、ＤＭＢＡ及び３，３’−ジアミノベンジンをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＣＮＡマウス単クローン抗体及び抗マウスビオチン標識二次抗体を、Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｒｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡから購入した。Ｍｉｔｓｕｉ  Ｎｏｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎの御好意により提供されたポリフェノンＢは、エピカテキン（０．４％）、エピガロカテキン−３−ガレート（１．４％）、エピカテキン−３−ガレート（０．１％）、ガロカテキン−３−ガレート（０．２％）、遊離テアフラビン（０．３２％）、テアフラビンモノガレート−Ａ（０．１４％）、テアフラビンモノガレート−Ｂ（０．１５％）、テアフラビンジガレート（０．２１％）、タンニン（３５．６％）及びカフェイン（４．９％）の混合物である。使用した他の試薬は全て、分析等級であった。
【００４６】
動物及び食餌
実験は全て、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ  Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａから入手した、９０から１１０ｇの間の体重の６から１０週齢の雄シリアンハムスターを使用して実施した。動物を１つのポリプロピレンケージに５匹収容し、食餌及び水を自由に摂取させた。動物を、１２時間交代の明／暗サイクルで温度及び湿度の標準的な条件下で制御された環境において維持した。動物は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａの指針に従って維持され、Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの倫理委員会により承認された。実験用食餌は、ポリフェノンＢを計量済み標準固形食（Ｍｙｓｏｒｅ  Ｓｎａｃｋ  Ｆｅｅｄ，Ｍｙｓｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）に０．０５％の濃度で混合することにより毎日調製した。本研究において使用されるポリフェノンＢに関する用量は、茶４杯の毎日の摂取に対応する（ヒトの場合、体重１ｋｇあたり茶ポリフェノール３０ｍｇから４０ｍｇ）。食餌を毎日補充し、食餌消費量を記録した。
【００４７】
処置計画
ハムスターを実験群及び対照群に無作為に分け、各群１０匹の動物の４群に分割した。群２の動物は、６週齢のとき発癌物質投与４週間前にポリフェノンＢを含有する食餌を摂取させ、発癌物質への最終的な暴露まで続行した。１０週齢で、群１及び群２のハムスターにＤＭＢＡの０．５％液体パラフィン中の溶液を右頬嚢上に、４番ブラシを使用して１週間に３回で１４週間塗布した。各塗布により約０．４ｍｇのＤＭＢＡが残留する。群１におけるハムスターはさらなる処置を受けなかった。群３における動物には、群２同様、ポリフェノンＢを単独で投与した。群４の動物は基礎食を摂取し、対照の役割を果たした。
【００４８】
実験は１８週の末に終了し、動物は全て一晩の断食の後、頸椎脱離により屠殺した。動物を屠殺する前に、右嚢を肉眼で検査して前癌性病変又は腫瘍の発達を評価し、写真撮影した。腫瘍量を、平均腫瘍体積（４／３πｒ３）（ｒ＝１／２腫瘍直径（ｍｍ））に腫瘍の平均数を乗ずることにより算出した。頬嚢及び肝臓組織を細分し、各実験への分配のために多様に処理した。
【００４９】
病理組織学
嚢組織を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、ポリリジン被覆ガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。基底細胞過形成、異形成及び扁平上皮癌（ＳＣＣ９）を診断した。基底細胞の数の増加により示される頬嚢上皮の過形成を、内側の上皮の厚さに基づいて、軽度、中度及び重度として主観的に等級分けした。異形成を、不規則な上皮層別化、核分裂像の数の増加、細胞質に対する核の割合の増大及び基底細胞の極性の損失により特徴付けた。軽度、中度及び重度としての異形成の組織学的等級分けは、それぞれ上皮の１／３の関与、１／２の関与又は全部の関与に基づいた。ＳＣＣを、根底にある組織の侵襲、核の多形性及び有糸分裂の増大により診断した。その起源の組織に酷似した腫瘍を、高分化型ＳＣＣとして等級分けした。
【００５０】
免疫組織化学
組織切片を６０℃で１０分間加熱することにより脱パラフィン化した後、キシレン中で３回洗浄した。特級アルコールで徐々に水和した後、スライドを、抗原賦活のために電子レンジ中で５分の２サイクルでクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中に温置した。切片を２０分間放冷した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ１０）ですすいだ。切片を蒸留水中の３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処置して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片を正常ヤギ血清で２５分間温置することにより非特異的抗体結合を低減させた。次に、切片を、ＰＣＮＡマウス単クローン抗体で４℃で一晩温置した。スライドを、ＴＢＳで洗浄した後、抗マウスビオチン標識二次抗体に続きストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼを使用して、各々室温で３０分間温置した。免疫沈降を、３，３’−ジアミノベンジジンによる処理及びヘマトキシリンによる対比染色により可視化した。陰性の対照のために、一次抗体をＴＢＳで置換した。各抗体に関する陽性の対照も、同時に処理した。これらのタンパク質を発現する陽性腫瘍細胞の割合を、０＝５％未満、１＝５％から２５％、２＝２６％から５０％、３＝５１％から７５％及び４＝７５％超過として等級分けし、免疫反応性の強度を−＝なし、＋＝弱い染色、＋＋＝中等度の染色及び＋＋＋＝強い染色として等級分けした。腫瘍細胞の１０％超過が染色されたとき、腫瘍を陽性であるとみなした。
【００５１】
組織ホモジネート及び赤血球可溶化液の調製
新鮮な組織を用いて生化学的評価を行った。重量測定後の頬嚢組織及び肝臓組織をＴｅｆｌｏｎ乳棒を備えた総ガラス製ホモジナイザー中でホモジナイズし、使用まで氷中に保存した。血液サンプルをヘパリン処理したチューブ中に収集し、血漿を１０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離することにより、分離した。遠心分離後、バフィーコートを除去し、血中血球を、生理食塩水で３回洗浄した。赤血球サンプル（０．５ｍｌ）を０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）を含有する０．２Ｍリン酸塩緩衝液４．５ｍＬで可溶化した。溶血血液を、２５００ｇ、２℃、１５分間の遠心分離により分離した。生化学アッセイを、即時実施した。
【００５２】
生化学アッセイ
脂質過酸化を、チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ１１）、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ１２）及び共役ジエン（ＣＤ１３）の形成により証明されるように評価した。ＴＢＡＲＳを、嚢組織及び肝臓組織においてＯｈｋａｗａらの方法により、及び赤血球においてＢｕｅｇｅ  ａｎｄ  Ａｕｓｔによって記述された方法によりアッセイした。脂質ヒドロペルオキシドを、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の方法により、共役ジエンを、Ｒａｏ  ＆  Ｒｅｃｋｎａｇｅｌの方法により評価した。タンパク質の酸化を、カルボニル基が２，４−ジニトロフェニルヒドラジンと反応して２，４-ジニトロフェニルヒドラゾンを形成する反応に基づいたＬｅｖｉｎｅらの方法により測定した。総ＳＯＤ活性及びＭｎ−ＳＯＤ活性は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ１４）還元の５０％抑制に基づいてＯｂｅｒｌｅｙらにより記述されたようにアッセイした。Ｃｕ−Ｚｎ  ＳＯＤ活性を、総ＳＯＤ活性からＭｎ−ＳＯＤの活性を減じることにより算出した。ＣＡＴの活性を、酵素による過酸化水素の利用に基づいたＳｉｎｈａの方法によりアッセイした。ＧＳＨを、ＤＴＮＢをスルフヒドリル基含有化合物に添加するときに発色する黄色の測定によるＡｎｄｅｒｓｏｎの方法により測定した。酸化されたグルタチオン（ＧＳＳＧ１５）を、Ａｎｄｅｒｓｏｎの方法に従って３４０ｎｍでのグルタチオン還元酵素（ＧＲ１６、ＥＣ１．６．４．２）によるＮＡＤＨの酸化後に評価した。セレニウム依存性グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ１７、ＥＣ１．１１．１．９）活性を、Ｒｏｔｒｕｃｋらの方法に従って、過酸化水素の利用に従うことによりアッセイした。非依存性ＧＰｘ活性を、過酸化クメンを基質として使用するＬａｗｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋにより記述された方法に従ってアッセイした。γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ１８）の活性を、ガンマグルタミルｐ-ニトロアニリドを基質として使用するＦｉａｌａらの方法によりアッセイした。ＧＲ活性を、ＧＳＳＧを基質として及びＦＡＤを補助因子として使用するＣａｒｌｂｅｒｇ及びＭａｎｎｅｒｖｉｃｋの方法により評価した。タンパク質含有量を、ウシ血清アルブミンを標準物質として使用するＬｏｗｒｙらの方法により評価した。
【００５３】
統計分析
データを、平均±標準偏差として表す。体重を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により分析した。Ｙａｔｅの補正と組み合わせたχ２検定を使用して、腫瘍の発生率を分析した。腫瘍量、免疫組織化学的分析及び生化学アッセイのデータに関する統計分析を、分散分析（ＡＮＯＶＡ１９）を用いて行い、群平均を、最小有意差検定（ＬＳＤ２０）により比較した。結果は、ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意とみなした。
【００５４】
結果
総体的観察結果
図１の表１は、種々の群における平均体重、食餌消費量、腫瘍発生率、腫瘍多重度及び平均腫瘍量を示す。群１におけるハムスターは、実験中体重が低下する傾向を示し、平均最終体重は、対照（群４）と比較して有意に（ｐ＜０．０１）低下した。体重における有意差は、群２から群４において観察されなかった。群１から群４において消費された食餌量に有意差はなかった。実験期間の終了時に、群１における腫瘍発生率は、ハムスター１匹あたり１．８の多重度及び３４６ｍｍ３の腫瘍量を有するものが１００％であった。ポリフェノンＢの投与は、２０％まで腫瘍発生率を低下させ、多重度はハムスター１匹あたり０．３であった。さらに、腫瘍は、群１と比較して有意により小さかった（平均腫瘍量１７．２ｍｍ３）。腫瘍は、群３及び群４において観察されなかった。
【００５５】
組織病理学的観察結果
図１の表２は、実験群及び対照群におけるハムスターの頬嚢中の組織病理学的変化を要約する。群１のハムスターは全て、重度の角化症、過形成、異形成及び高分化型ＳＣＣを呈した。ＤＭＢＡを塗布したハムスター（群２）に対するポリフェノンＢの食餌性投与は、ＳＣＣの発生率、並びに過形成病変及び異形成病変を有意に低減した。１０匹の動物のうち、僅か２匹だけがＳＣＣを発症し、４匹の動物は軽度から中度の異形成を示し、残り４匹のハムスターは、中度の過形成だけを示した。軽度の過形成の変化が、群３のハムスターのうちの２匹において観察された。対照群の動物において、上皮は正常であり、無傷であり、連続していた。各群における組織病理学的変化の代表的な顕微鏡写真を図２に示す。図２は、対照群及び実験群の動物の頬嚢粘膜のＨ及びＥ染色した領域の顕微鏡写真を示す。Ａ．ＤＭＢＡ処置１４週間後の群１動物の結合組織への広範囲な浸潤を伴う高分化型ＳＣＣ（Ｈ及びＥ染色、１０倍）。Ｂ．中度の異形成を呈するＤＭＢＡ及びポリフェノンＢを投与した群２ハムスター由来の頬嚢上皮の顕微鏡写真（Ｈ及びＥ染色、４０倍）。Ｃ．軽度の過形成を呈するポリフェノンＢ単独を投与した群３ハムスター由来の頬嚢上皮の顕微鏡写真（Ｈ及びＥ染色、４０倍）。Ｄ．対照群動物の正常な頬嚢組織学を示す顕微鏡写真（群４、Ｈ及びＥ染色、４０倍）。
【００５６】
免疫組織化学的知見
図３は、ポリフェノンＢの、対照群動物及び実験群動物の頬嚢粘膜中のＰＣＮＡ発現に及ぼす効果を示す。ＤＭＢＡを塗布したハムスターにおいて、ＰＣＮＡの平均タンパク質発現（８１％）は、対照群動物（群４）と比較して有意に高かった。ポリフェノンＢの投与（群２）は、群１と比較してＰＣＮＡの発現（５２％）を有意に低減した。ＰＣＮＡの発現における有意の変化は、対照群と比較して群３動物において観察されなかった。免疫染色の代表的な顕微鏡写真を、図４に示す。ここでは、対照群及び実験群の動物におけるＰＣＮＡ発現の免疫組織化学的染色の顕微鏡写真（１０倍）は、Ａ．群１動物におけるＰＣＮＡタンパク質の過剰発現、Ｂ．群２動物におけるＰＣＮＡタンパク質の発現の低下、Ｃ．群３動物におけるＰＣＮＡタンパク質の発現、Ｄ．対照群動物におけるＰＣＮＡ発現を示す。
【００５７】
生化学的知見
図５の表３は、脂質過酸化及びタンパク質酸化に及ぼすポリフェノンＢによる前処置の効果を示す。脂質過酸化の程度及びタンパク質カルボニルの形成は、対照群と比較して、ＤＭＢＡを塗布したハムスター（群１）の頬嚢において有意により低く、肝臓においてより高かった。ポリフェノンＢの食餌性投与（群２）は、群１と比較して、肝臓における減少を伴う頬嚢における有意な増大により反映される、脂質及びタンパク質の酸化におけるＤＭＢＡ誘発変化を有意に和らげた。ポリフェノンＢ単独の投与は、対照群と比較して群３動物において、組織の脂質過酸化及びタンパク質酸化の程度を有意に低減した。
【００５８】
対照群及び実験群の動物の頬嚢、肝臓及び赤血球中の抗酸化酵素ＳＯＤ（総ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤ、Ｃｕ−Ｚｎ  ＳＯＤ）及びＣＡＴの活性を図６に示す。ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において、ＳＯＤ及びＣＡＴの活性は、対照群と比較して有意により低かった。ポリフェノンＢの食餌性投与は、群１と比較して群２動物における抗酸化酵素の活性を有意に増大させた。ポリフェノンＢ単独の投与は、対照群（群４）と比較して群３動物においてＳＯＤ及びＣＡＴの活性を有意に増大させた。頬嚢、肝臓及び赤血球中のＧＳＨ濃度及びＧＳＨ依存性酵素の活性の変化を図７及び８に提示する。ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において、ＧＳＨ濃度、ＧＳＳＧ濃度及びＧＳＨ／ＧＳＳＧ比並びにＧＰｘ（Ｓｅ依存性及び非依存性）、ＧＲ及びＧＧＴの活性は、頬嚢において有意に増大したのに対し、肝臓及び赤血球においてはこれらの抗酸化剤は、対照と比較して有意に減少した。ポリフェノンＢの食餌性投与は、群２動物の頬嚢、肝臓及び赤血球中の全ての抗酸化剤及び解毒酵素を群１と比較して有意に増大させた。ポリフェノンＢ単独による処置は、群３動物においてＧＳＨ及びＧＳＨ依存性酵素を対照群と比較して有意に増強させた。
【００５９】
ＤＭＢＡ単独を１４週間塗布したハムスターは全て、ＰＣＮＡの発現の増大と関連した頬嚢癌を発症させ、脂質及びタンパク質の酸化を減少させ、抗酸化状態を増強した。担癌動物の肝臓及び赤血球において、脂質及びタンパク質の酸化の増強には、易感染性の抗酸化剤防御を伴った。ポリフェノンＢの食餌性投与は、腫瘍及びＰＣＮＡ発現の発生率の低下によって明らかにされたように、ＤＭＢＡ誘発性ＨＢＰ発癌を効果的に抑制した。また、ポリフェノンＢは、脂質及びタンパク質の酸化を和らげ、嚢、肝臓及び赤血球における抗酸化状態を増強した。我々は、ポリフェノンＢが、標的組織中の細胞増殖を抑制し、標的組織並びに宿主組織における酸化−抗酸化状態を調節することにより、その化学予防効果を発揮することを示唆する。
【００６０】
従って、紅茶カテキン、及び特にポリフェノンＢの投与は、標的器官及び宿主組織において酸化還元状態を調節し、頬嚢におけるＰＣＮＡ発現を有意に抑制したことを理解されるべきである。ＨＣＰＣ−ハムスター頬嚢癌細胞株ポリフェノンＢは、脂質及びタンパク質の酸化に対する感受性を逆転させる一方、同時に頬嚢における抗酸化状態を増大させ、他方で、肝臓及び赤血球において、脂質及びタンパク質の酸化の程度が抗酸化剤の増加とともに低減された。従って、ポリフェノンＢにより腫瘍組織及び宿主組織において誘発される差別的な酸化事象は、ＰＣＮＡ発現の下方制御及び腫瘍発生の抑制からも明白なように、細胞増殖に及ぼすその抑制的な役割に反映している。これらの結果は、ポリフェノンＢの食餌性投与が、ＰＣＮＡ発現を下方制御し、脂質及びタンパク質の酸化を調節し、抗酸化状態を増強することにより、ＨＢＰ発癌に対する著しい保護を発揮することを実証している。
【００６１】
我々はさらに、紅茶ポリフェノール（ポリフェノンＢ（Ｐ−Ｂ））の、７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン誘発性ハムスター頬嚢（ＨＢＰ）発癌の間のサイトケラチンの発現並びに増殖及びアポトーシス関連タンパク質の発現に及ぼす効果を評価した。発癌に対するマーカーとして、我々は、サイトケラチン、ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ、及びＢｃｌ−２の発現の増加並びにチトクロムＣ及びカスパーゼ３の発現の減少を伴う頬嚢癌腫の発生を使用した。
【００６２】
薬品
ＤＭＢＡ及び３’−ジアミノベンジジンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡより購入した。使用した他の試薬は全て、分析等級のものであった。
【００６３】
動物
実験を、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ，Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａから入手した９０ｇから１１０ｇの間の体重の６週齢から１０週齢の雄シリアンハムスターを使用して実施した。動物を１つのポリプロピレンケージに５匹収容し、食餌及び水を自由に提供し、１２時間交代の明／暗サイクルで温度及び湿度の標準的な条件下で制御された環境中に維持した。動物は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａの指針に従って維持され、Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの倫理委員会により承認された。実験用食餌は、Ｐ−Ｂを計量済み標準固形食（Ｍｙｓｏｒｅ  Ｓｎａｃｋ  Ｆｅｅｄ，Ｍｙｓｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）に０．０５％の濃度で混合することによって毎日調製した。本研究で使用されるＰ−Ｂに関する用量は、茶４杯の毎日の摂取に対応する（ヒトの場合、体重１ｋｇあたり茶ポリフェノール３０ｍｇから４０ｍｇ）。食餌を、毎日補充し、食餌消費量を記録した。
【００６４】
処置計画
ハムスターを実験群及び対照群に無作為に分け、各群１０匹の動物の４群に分割した。群２の動物は、６週齢のとき発癌物質投与４週間前にＰ−Ｂを含有する食餌を摂取し、発癌物質への最終的な暴露まで続行した。１０週齢で、群１及び群２のハムスターにＤＭＢＡの０．５％液体パラフィン溶液を右頬嚢上に、４番ブラシを使用して１週間に３回で１４週間塗布した。各塗布により約０．４ｍｇのＤＭＢＡが残留する。群１の２匹のハムスターはさらなる処置を受けなかった。群３の動物には、群２同様、Ｐ−Ｂを単独で投与した。群４の動物は基礎食を摂取し、対照の役割を果たした。実験を１８週の末に終了し、全ての動物を、一晩の断食の後、頸椎脱離により屠殺した。動物を屠殺する前に、右嚢を肉眼で検査して前癌性病変又は腫瘍の発達を評価し、写真撮影した。腫瘍量を、平均腫瘍体積（４／３πｒ３）（ｒ＝１／２腫瘍直径（ｍｍ））に腫瘍の平均数を乗ずることにより算出した。頬嚢組織を細分し、各実験への分配のために多様に処理した。組織を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、ポリリジン被覆ガラススライド上に載せた。各標本から１つの切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。残余切片を免疫組織化学的染色に使用した。
【００６５】
免疫組織化学
組織切片を６０℃で１０分間加熱することにより脱パラフィン化した後、キシレン中で３回洗浄した。特級アルコールで徐々に水和した後、スライドを、抗原賦活のために電子レンジ中で５分の２サイクルでクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中に温置した。切片を２０分間放冷した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ですすぎ、蒸留水中の３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処置して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片を、正常ヤギ血清で２５分間温置することにより、非特異的抗体結合を低減させた。次に、切片をサイトケラチン、ＰＣＮＡ及びＢｃｌ−２（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｒｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）マウス単クローン抗体及びＮＦ−κＢ及びカスパーゼ３ウサギ多クローン抗体及びチトクロムＣ単クローン抗体（全てＮｅｏ  Ｍａｒｋｅｒｓ，ＵＳＡ）に４℃で一晩温置した。該スライドをＴＢＳで洗浄した後、抗ウサギ及び抗マウスビオチン標識二次抗体（両方ともＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｒｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に続きストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼを使用して、各々室温で３０分間温置した。免疫沈降を３，３’−ジアミノベンジジンによる処理及びヘマトキシリンによる対比染色により可視化した。陰性の対照のために、一次抗体をＴＢＳで置換した。各抗体に関する陽性の対照も同時に処理した。ＰＣＮＡに関する標識指数を、３つの高倍率視野における１００個の計数された細胞あたりの陽性の染色を有する細胞の数として算出した。ＮＦ−κＢ、Ｂｃｌ−２、チトクロムＣ及びカスパーゼ３の発現を、１００個の計数された細胞あたりの正に染色された細胞の数に従って、Ｉ＝５％から２５％、ＩＩ＝２６％から５０％、ＩＩＩ＝５１％から７５％及びＩＶ＝７５％超過、として等級分けした。サイトケラチンの発現を、０＝ケラチンを検出できない、Ｉ＝基底領域又は基底上領域染色のいくらかの証拠に限定される染色、ＩＩ＝基底領域及び／又は基底上領域を通じての陽性の染色、として等級分けした。
【００６６】
カスパーゼ３活性の比色評価
ＤＥＶＤ特異的カスパーゼ３活性を、ＣＡＳＰ−３−Ｃ比色キット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ，ＵＳＡ）を使用して製造者の説明書に従ってアッセイした。細胞質抽出物を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭ  ＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で組織をホモジナイズすることにより調製した。上澄みを酵素源として回収した。カスパーゼ３比色アッセイは、ペプチド基質であるアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）のカスパーゼ３による加水分解の結果として、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）部分の放出が生じることに基づいている。基質から放出されるｐＮＡの濃度を、４０５ｎｍでの吸光度値から、又はｐＮＡ規定溶液で作成した検量線から算出する。
【００６７】
統計分析
腫瘍の発生率、及びＮＦ−κＢ、サイトケラチン、Ｂｃｌ−２、チトクロムＣ及びカスパーゼ３の等級分けを、Ｘ２検定を使用して統計的に比較した。腫瘍量に関するデータの統計分析を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して実施した。ＰＣＮＡ標識指数及びカスパーゼ３の比色アッセイデータを、ＡＮＯＶＡを使用した後ＬＳＤを使用して分析した。結果を、ｐ値が０．０５未満の場合統計的に有意と考慮した。
【００６８】
結果
図９の表４は、対照動物及び実験動物における腫瘍発生率、平均腫瘍量及び組織病理学的変化を示す。群１における腫瘍発生率は１００％であり、平均腫瘍量は３４６ｍｍ３であった。組織学的に、ＤＭＢＡにより誘発されるＨＢＰ腫瘍は、結合組織への扁平上皮の乳頭状突起を伴う侵襲性扁平上皮癌であった。ＤＭＢＡ及びＰ−Ｂで処置した１０匹のハムスターのうちの２匹はＳＣＣを発生し、他方、４匹のハムスターは軽度から中度の異形成を示し、残り４匹のハムスターは中度の過形成を示した。軽度の過形成性変化が、群３におけるハムスターのうちの２匹において観察された。対照動物において、上皮は正常であり、無傷であり、連続していた。
【００６９】
図１０の表５は、対照動物及び実験動物の頬嚢におけるＰＣＮＡ標識指数及びＮＦ−κＢ、サイトケラチン、Ｂｃｌ−２、チトクロムＣ及びカスパーゼ３の発現に及ぼすＰ−Ｂの効果を示す。ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において、ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ、サイトケラチン及びＢｃｌ−２の発現は、対照動物（群４）と比較して有意により高く、チトクロムＣ及びカスパーゼ３の発現は有意により低かった。Ｐ−Ｂの投与（群２）は、群１と比較して、ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ、サイトケラチン及びＢｃｌ−２の発現を有意に低下させ、チトクロムＣ及びカスパーゼ３の発現を有意に増大させた。群３の動物において、ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ、サイトケラチン、Ｂｃｌ−２、チトクロムＣ及びカスパーゼ３の発現の有意な変化は観察されなかった。ＰＣＮＡの免疫染色が核の局在化を示したのに対し、ＮＦ−κＢ、サイトケラチン、Ｂｃｌ−２、チトクロムＣ及びカスパーゼ３は、細胞質領域中に見られた。免疫染色の代表的な顕微鏡写真を、図１１及び１２に示す。
【００７０】
図１３は、対照ハムスター及び実験ハムスターにおける頬嚢中のＤＥＶＤ特異的カスパーゼ３の活性を示す。ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において、カスパーゼ３活性は、対照（群４）と比較して有意に低下した。Ｐ−Ｂによる処置は、群２動物における酵素活性を群１と比較して著しく増大させた。Ｐ−Ｂ単独投与した動物（群３）において、カスパーゼ３の活性は対照のそれと有意に違わなかった。
【００７１】
従って、紅茶ポリフェノール、及び特にＰ−Ｂの食餌性投与が、ＤＭＢＡ誘発性ＨＢＰ癌及び新生物発生前の病変の発生率を低減したことに留意されたい。Ｐ−Ｂは又、頬嚢中のＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ及びＢｃｌ−２の発現も有意に下方制御し、シトクロムＣ、カスパーゼ３及びサイトケラチンを上方制御した。これらデータは、Ｐ−Ｂは抑制剤として作用し、ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ及びＢｃｌ−２を下方制御すること及びチトクロムＣ、カスパーゼ３及びサイトケラチンを上方制御することにより、その抗悪性腫瘍特性を発揮することを強く示唆する。興味深いことに、Ｐ−Ｂは、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発したが、正常細胞において誘発できなかった。Ｈｓｕらは、ＥＧＣＧが正常な成長に影響を及ぼさずにアポトーシス経路を活性化することにより形質転換された細胞の成長阻害を誘発すること見出し正常細胞への保護的な効果が細胞分化と密接に関連する分子であるｐ５７によりもたらされるのであろうことを示唆した。これらの知見は、腫瘍細胞にはアポトーシスを経験させ、正常細胞には生存経路へ導く食餌性薬剤が、理想的な化学予防剤であるという仮説を支持する。
【００７２】
（ＩＩ）紅茶ポリフェノール−ラクトフェリンの組み合わせの効果
我々は、７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）誘発性ハムスター頬嚢（ＨＢＰ）発癌に及ぼすウシラクトフェリン（ｂＬＦ）と紅茶ポリフェノール（ポリフェノンＢ：Ｐ−Ｂ）との組み合わせの抗増殖性及びアポトーシス誘発効果を評価した。増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＮＦ−κＢ、ｐ５３変異体、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、Ｆａｓ及びカスパーゼ３を含むサイトケラチン及び他のマーカーの発現を、口腔癌の化学予防のためのマーカーとして使用した。
【００７３】
薬品
ＤＭＢＡをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入した。純度が９６．２％以上のｂＬＦ（ロット番号０２０１１９）をＭｏｒｉｎａｇａ  Ｍｉｌｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから入手した。紅茶ポリフェノール（ポリフェノン−Ｂ）は、Ｍｉｔｓｕｉ  Ｎｏｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎの好意により提供された。ポリフェノン−Ｂの組成は前述と同一であった。それは、エピカテキン（０．４％）、エピガロカテキン−３−ガレート（１．４％）、エピカテキン−３−ガレート（０．１％）、ガロカテキン−３−ガレート（０．２％）、遊離テアフラビン（０．３２％）、テアフラビンモノガレート−Ａ（０．１４％）、テアフラビンモノガレート−Ｂ（０．１５％）、テアフラビンジガレート（０．２１％）、タンニン（３５．６％）及びカフェイン（４．９％）の混合物である。使用した他の試薬は全て、分析等級であった。
【００７４】
動物及び食餌
実験は、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ，Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａから入手した１００ｇから１１０ｇの体重の８週齢から１０週齢の雄シリアンハムスターを使用して実施した。動物を１つのポリプロピレンケージに５匹収容し、食餌及び水を自由に提供し、明／暗交互サイクルで温度及び湿度の制御された条件下で維持した。動物を、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａの指針に従って維持し、Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの倫理委員会により承認された。実験食は、化学予防剤を単独で又は組み合わせで計量済み標準固形食（Ｍｙｓｏｒｅ  Ｓｎａｃｋ  Ｆｅｅｄ，Ｍｙｓｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）に混合することにより毎日調製した。食餌を毎日補充し、食餌消費量を記録した。
【００７５】
処置計画
ハムスターを実験群及び対照群に無作為に分け、各群２０匹の動物の８群に分割した。群１において、ハムスターの右頬嚢に、０．５％ＤＭＢＡ液体パラフィン溶液を４番ブラシで毎週３回塗布した。各塗布により約０．４ｍｇのＤＭＢＡが残留する。群１のハムスターは、さらなる処置を受けなかった。群２から群４において、群１同様ＤＭＢＡを塗布した右頬嚢はさらに、０．２％ｂＬＦ、０．０５％ポリフェノン−Ｂを含有する基本食及び０．２％ｂＬＦと０．０５％ポリフェノン−Ｂとの組み合わせを含有する食餌をそれぞれ受容した。群５から群７の動物にｂＬＦ、ポリフェノン−Ｂ単独及びそれらの組み合わせをそれぞれ投与した。群８の動物は対照の役割をした。実験は１４週で終了し、全ての動物を、一晩の断食の後、頸椎脱離により屠殺した。動物を屠殺する前に、右嚢を肉眼で検視して前癌性病変又は腫瘍の発達を評価し、写真撮影した。腫瘍量を、平均腫瘍体積（４／３πｒ３）（ｒ＝１／２腫瘍直径（ｍｍ））に腫瘍の平均数を乗ずることにより算出した。頬嚢組織を細分し、各実験への分配のために多様に処理した。組織を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、ポリリジン被覆ガラススライド上に乗せた。各標本から１つの切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。残余切片を免疫組織化学的染色に使用した。
【００７６】
免疫組織化学
組織切片を６０℃で１０分間加熱することにより脱パラフィン化した後、キシレン中で３回洗浄した。特級アルコールで徐々に水和した後、スライドを、抗原賦活のために、電子レンジ中で５分×２サイクルでクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中に温置した。切片を２０分間放冷した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ですすいだ。切片を蒸留水中の３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処置して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片を正常ヤギ血清で２５分間温置することにより、非特異的抗体結合を低減させた。次に、切片をＰＣＮＡ、ｐ５３及びサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３マウスモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｒｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で４℃で一晩温置した。スライドをＴＢＳで洗浄した後、抗ウサギ及び抗マウスビオチン標識二次抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｒｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に続きストレプトアビジンビオチン−ペルオキシダーゼを使用して、各々室温で３０分間温置した。免疫沈降を３，３´−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）による処理及びヘマトキシリンによる対比染色により可視化した。陰性の対照のために、一次抗体をＴＢＳで置換した。各抗体に関する陽性の対照も、同時に処理した。ＰＣＮＡに関する標識指数を、１００個の計数された細胞あたりの陽性の染色を有する細胞の数として表した。サイトケラチンに関するデータを、Ｉ＝基底領域又は基底上領域染色のいくらかの証拠に限定される染色、ＩＩ＝基底領域及び／又は基底上領域を通じての陽性の染色、として等級分けした。ｐ５３発現を、１００個の計数された細胞あたりの正に染色された細胞の数に従って、Ｉ＝５％から２５％、ＩＩ＝２６％から５０％、ＩＩＩ＝５１％から７５％及びＩＶ＝７５％超過、として等級分けした。
【００７７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
各組織サンプル約５０ｍｇを、６２．５ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール及びブロモフェノールブルーを含有するサンプル緩衝液中における可溶化に供した。可溶化液のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉ法に従って各サンプルから等価のタンパク質抽出物（５５μｇ）を使用して実施した。分解したタンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）へ電気泳動的に転写した。膜を、５％無脂肪乾燥乳を含有するＴＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）中で温置して、非特異的結合部位を１時間遮断した。ブロットを抗Ｂｃｌ−２、抗Ｂａｘ、抗ｐ５３、抗ＮＦ−κＢ、抗Ｆａｓ、及び抗カスパーゼ３抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，ＵＳＡ）の１：１０００希釈とともに室温で一晩温置した。ブロットを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で徹底的に洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）の１：１０００希釈とともに室温で３０分間から４５分間温置した。ＴＢＳ−Ｔ中で徹底的に洗浄した後、タンパク質を３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）で処置することにより可視化した。濃度測定をＩＩＳＰ平板ベッドスキャナ上で実施し、Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ１．１１ソフトウェアで定量化した。
【００７８】
カスパーゼ３活性の比色評価
ＤＥＶＤ特異的カスパーゼ３活性を、ＣＡＳＰ−３−Ｃ比色キット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ，ＵＳＡ）を使用して製造者の説明書に従ってアッセイした。細胞質抽出物を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭ  ＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で組織をホモジナイズすることにより調製した。上澄みを酵素源として回収した。カスパーゼ３比色アッセイは、ペプチド基質であるアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）のカスパーゼ３による加水分解の結果として、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）部分の放出が生じることに基づいている。基質から放出されるｐＮＡの濃度を、４０５ｎｍでの吸光度値から、又はｐＮＡ規定溶液で作成した検量線から算出する。
【００７９】
統計分析
データを平均±ＳＤとして表す。Ｙａｔｅｓの補正と組み合わせたχ２検定を使用して、腫瘍の発生率を分析した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、腫瘍量、ＰＣＮＡ標識指数及び濃度測定分析に関するデータに対する統計分析を行って、群平均をＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定により比較した。ＣＫ及びｐ５３に関するデータに対する統計分析を、χ２検定を使用して行った。結果は、ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると考慮した。ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせの効果の間の相互作用の性質は、Ｙｏｋｏｙａｍａらによって記載されるとおり評価した。端的には、ｂＬＦ処置とポリフェノン−Ｂ処置との間の組み合わせの効果の期待値を、［（観察されたｂＬＦ処置値）／（対照値）］×［（観察されたポリフェノン−Ｂ処置値）／（対照値）］として算出し、組み合わせ指数を、期待値／観察値の比として算出した。１を超える比は相乗効果を示し、１未満の比は付加的な効果未満を示す。
【００８０】
結果
図１４の表６は、実験群及び対照群のハムスターの頬嚢における食餌消費量、腫瘍発生率、腫瘍量及びＳＣＣの発生率を要約する。１４週の終了時に、群１の腫瘍発生率は、１００％であった。これらの腫瘍は、外方増殖性であり、１７２．９７ｍｍ３の平均腫瘍量で明確に定義された。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂの単独の及び組み合わせの投与（群２から群４）は、腫瘍発生率、腫瘍量並びにＳＣＣの発生率を有意に低下させたが、前記組み合わせは、単一薬剤よりも効果的であった。さらに、腫瘍発生率に対するｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせに関する１．４６の組み合わせ指数比は、前記組み合わせがＨＢＰ発癌の抑制において相乗効果を有することを示す。腫瘍は、群５から群８においては観察されなかった。群１から群８において消費される食餌量は有意に異ならなかった。
【００８１】
図１５（Ａ）及び図１６の表７は、種々の群におけるサイトケラチンの免疫組織化学的分析を示す。ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において、サイトケラチンの発現は、対照動物よりも有意により高かった。さらに、我々は、浸潤している癌細胞が群１動物においてサイトケラチンの強力な発現を示すことを観察した。ｂＬＦとＰ−Ｂとの組み合わせは、いずれかの薬剤単独よりも有意にサイトケラチン発現を低下させた。化学予防剤単独の投与（群５から群７）は、対照群（群８）と比較して、サイトケラチンの発現に有意に影響を及ぼさなかった。
【００８２】
図１５（Ｂ）及び図１６の表７は、対照動物及び実験動物のハムスター頬嚢におけるＰＣＮＡ標識指数の免疫組織化学的分析を示す。ＤＭＢＡの局所適用（群１）は、対照群（群８）と比較して、平均ＰＣＮＡ標識指数を有意に増加させた。ｂＬＦとＰ−Ｂとの同時投与は、群１と比較していずれかの薬剤単独よりもＰＣＮＡ標識指数をより有意に低減させた。ｂＬＦ及びＰ−Ｂの単独の及び組み合わせの投与（群５から群７）は、処置されていない対照群（群８）と比較して、ＰＣＮＡ標識指数に有意に影響しなかった。
【００８３】
変異体ｐ５３タンパク質発現の免疫組織化学的分析の結果及びｐ５３免疫染色の代表的な顕微鏡写真を、図１５（Ｃ）の表７に示す。ＤＭＢＡを塗布した動物において、ｐ５３発現は、対照群（群８）と比較して有意に増大した。ｂＬＦとＰ−Ｂとを組み合わせた投与は、いずれかの薬剤単独よりも有意にｐ５３発現を低下させた。化学予防剤単独を投与された動物（群５から群７）において、ｐ５３の発現は、対照群と有意には異ならなかった。
【００８４】
図１７は、対照動物及び実験動物の頬嚢におけるＢｃｌ−２、Ｂａｘ、ＮＦ−κＢ、ｐ５３、Ｆａｓ及びカスパーゼ３の代表的なウェスタンブロット分析並びにカスパーゼ３の活性を示す。Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、ＮＦ−κＢ、ｐ５３、Ｆａｓ及びカスパーゼ３の発現は、それぞれ２５ｋＤａ、２１ｋＤａ、６５ｋＤａ、５３ｋＤａ、４８ｋＤａ及び３２ｋＤａの分子量帯として検出された。対照群の可溶化液からの平均タンパク質発現を、グラフ中の１００％として表した。各棒グラフは、処理あたりの１０回測定の平均タンパク質発現±ＳＤを表す。ＤＭＢＡの局所塗布は、対照群（群１）と比較して、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比並びにｐ５３及びＮＦ−κＢの発現を有意に増大し、Ｆａｓ及びカスパーゼ３の発現並びにカスパーゼ３活性を低下させた。ｂＬＦとＰ−Ｂとの同時投与は、いずれかの薬剤単独よりもより有意に、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比、ｐ５３及びＮＦ−κＢ発現を低下させ、Ｆａｓ及びカスパーゼ３の発現並びにカスパーゼ３の活性を増大させた。対照動物と比較して群５から群７において、これらのタンパク質の発現に有意な変化は観察されなかった。
【００８５】
従って、ｂＬＦと紅茶ポリフェノールＰ−Ｂとの組み合わせの投与が、腫瘍発生率の低下により明らかなように、ＤＭＢＡ誘発性ＨＢＰ癌発生の抑制において、いずれかの薬剤単独よりも効果的であったことが、理解されるべきである。このことは、ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ、ｐ５３及びＢｃｌ−２の下方制御及びＢａｘ、Ｆａｓ及びカスパーゼ３の発現の上方制御により実証されるように、細胞増殖の実質的な減少及びアポトーシスの有意な増強を伴っていた。ｂＬＦ及びＰ−Ｂの抗増殖誘導効果及びアポトーシス誘発効果は、ＤＭＢＡの発癌性効果を潜在的に緩和でき、それによりサイトケラチン発現により反映されるように、ＨＢＰ癌の浸潤能力を低下させた。
【００８６】
ｂＬＦとＰ−Ｂとの組み合わせの化学予防効果は、個々の薬剤の抗増殖誘導効果及びアポトーシス誘発効果を反映する。ｂＬＦは、４−ニトロキノリン１−オキシド誘発性舌部発癌におけるＰＣＮＡ発現を下方制御することが報告された。アゾキシメタン誘発性結腸発癌に及ぼすｂＬＦの抑制効果は、細胞死受容体Ｆａｓ並びにＢｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバーであるＢｉｄ及びＢａｘの誘発により媒介されることが発見された。茶ポリフェノールは、原位置でのＢｒｄｕ組み込み、ＰＣＮＡ下方制御及びＧ１期の抑止により検出される細胞増殖を抑制することが示された。
【００８７】
ここに呈示された結果は、ｂＬＦと多様な茶ポリフェノールとの、特に紅茶ポリフェノールとの組み合わせは、細胞増殖を抑制すること及びアポトーシスを誘発することにより、抑制剤として作用することを、明確に実証する。興味深い知見は、成長制御及びアポトーシスに対するＨＢＰ癌と正常細胞との識別感度である。いくつかのインビトロ研究も、腫瘍細胞が、正常細胞よりも茶ポリフェノールの抗増殖効果及びアポトーシス性効果に対して感受性がより高いことを実証した。これらの知見は、腫瘍細胞にはアポトーシスを経験させ、正常細胞には生存経路へ導く食餌性薬剤が、理想的な化学予防剤であるという事実を支持する。これらの観察に基づいて、我々のデータは、ｂＬＦとＰ−Ｂとの組み合わせがヒトの口腔癌の予防戦略における限りない能力を有し得ることを示唆する。
【００８８】
我々はさらに、７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン誘発性ハムスター頬嚢（ＨＢＰ）発癌における細胞の酸化還元状態及び発癌物質代謝酵素の調節に及ぼすラクトフェリンと種々の紅茶ポリフェノール（ポリフェノンＢ（Ｐ−Ｂ））との組み合わせの効果を評価した。 
【００８９】
薬品
ＤＭＢＡをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入した。純度が９６．２％のｂＬＦ（ロット番号０２０１１９）をＭｏｒｉｎａｇａ  Ｍｉｌｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから入手した。紅茶ポリフェノール（ポリフェノン−Ｂ）は、Ｍｉｔｓｕｉ  Ｎｏｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎの好意により提供された。ポリフェノンＢは、エピカテキン（０．４％）、エピガロカテキン−３−ガレート（１．４％）、エピカテキン−３−ガレート（０．１％）、ガロカテキン−３−ガレート（０．２％）、遊離テアフラビン（０．３２％）、テアフラビンモノガレート−Ａ（０．１４％）、テアフラビンモノガレート−Ｂ（０．１５％）、テアフラビンジガレート（０．２１％）、タンニン（３５．６％）及びカフェイン（４．９％）の混合物である。使用した他の試薬は全て、分析等級であった。
【００９０】
動物及び食餌
実験を、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ，Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａから入手した１００ｇから１１０ｇの体重の８週齢から１０週齢の雄シリアンハムスターを使用して実施した。動物を１つのポリプロピレンケージに５匹収容し、食餌及び水を自由に提供し、明／暗交互サイクルで温度及び湿度の調節された条件下で維持した。動物は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａの指針に従って維持し、Ａｎｎａｍａｌａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの倫理委員会により承認された。実験食を、化学予防剤を単独で又は組み合わせで計量済み標準固形食（Ｍｙｓｏｒｅ  Ｓｎａｃｋ  Ｆｅｅｄ  Ｌｔｄ，Ｍｙｓｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）に混合することによって毎日調製した。食餌を毎日補充し、食餌消費量を記録した。
【００９１】
処置計画
ハムスターを実験群及び対照群に無作為に分け、各群２０匹の動物の８群に分割した。群１において、ハムスターの右頬嚢に、０．５％ＤＭＢＡ液体パラフィン溶液を４番ブラシで毎週３回塗布した。各塗布により約０．４ｍｇのＤＭＢＡが残留する。群１のハムスターは、さらなる処置を受けなかった。群２から群４において、群１同様ＤＭＢＡを塗布した右頬嚢はさらに、０．２％ｂＬＦ、０．０５％ポリフェノン−Ｂを含有する基本食及び０．２％ｂＬＦと０．０５％ポリフェノン−Ｂとの組み合わせを含有する食餌をそれぞれ受容した。群５から群７の動物にｂＬＦ、ポリフェノン−Ｂ単独及びそれらの組み合わせをそれぞれ投与した。群８の動物は、対照の役割をした。実験は１４週で終了し、全ての動物を、一晩の断食の後、頸椎脱離により屠殺した。動物を屠殺する前に、右嚢を肉眼で検視して前腫瘍性病変又は腫瘍の発達を評価し、写真撮影した。腫瘍量を、平均腫瘍体積（４／３πｒ３）（ｒ＝１／２腫瘍直径（ｍｍ））に腫瘍の平均数を乗ずることにより算出した。頬嚢及び肝臓組織を細分し、各実験への分配のために多様に処理した。
【００９２】
微小核試験
実験群動物における染色体損傷を評価するために、骨髄微小核試験をＳｃｈｍｉｄに従って実施した。合計２５００個の多染性赤血球を動物１匹あたりにつき単一スライドからスコア化し、微小核を有する多染性赤血球の頻度を測定した。スライドを全て、同一観察者によりスコア化した。
【００９３】
生化学的アッセイ
ホモジナイズされたばかりの組織を用いて、生化学的評価を行った。チトクロムＰ４５０を、Ｏｍｕｒａ ａｎｄ Ｓａｔｏの方法により、９１ｃｍ２Ｍ−１ｍ−１の吸収度係数を使用する４００ｎｍから５００ｎｍの間の一酸化炭素差スペクトルを使用してアッセイした。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を、Ｈａｂｉｇらにより記載されたように１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを基質として使用して３４０ｎｍでの吸光度における増大から測定した。ＤＴ−ジアフォラーゼ（ＤＴＤ）の活性を、Ｅｒｎｓｔｅｒにより記載されたようにＮＡＤＰＨを電子供与体として、２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールを電子受容体として使用してアッセイした。脂質過酸化は、チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）、共役ジエン及び脂質ヒドロペルオキシドの形成により証明されるように評価した。ＴＢＡＲＳを、組織中でＯｈｋａｗａらにより記載された方法により、脂質ヒドロペルオキシドは、Ｊｉａｎｇらの方法により、共役ジエンは、Ｒａｏ  ａｎｄ  Ｒｅｃｋｎａｇｅｌの方法により、それぞれアッセイした。還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、スルフヒドリル基を含有する化合物に５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を添加するときの黄色の発色に基づくＡｎｄｅｒｓｏｎの方法により測定した。酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）は、グルタチオン還元酵素によるＮＡＤＰＨの酸化後、３４０ｎｍにてＡｎｄｅｒｓｏｎの方法に基づいて評価した。グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）活性を、Ｒｏｔｒｕｃｋらの方法に従い、過酸化水素を利用することによりアッセイした。タンパク質含有量を、Ｌｏｗｒｙらの方法により評価した。
【００９４】
統計分析
データを平均±ＳＤとして表す。体重をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により分析した。Ｙａｔｅｓの補正と組み合わせたχ２検定を使用して、腫瘍の発生率を分析した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、腫瘍量、腫瘍多重度、骨髄微小核の発生率及び生化学的アッセイに関するデータに対する統計分析を分析を行って、群平均をＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定により比較した。ｐ値が０．０５未満の場合、結果を統計的に有意であるとみなした。ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせの効果の間の相互作用の性質は、Ｙｏｋｏｙａｍａらによって記載されるとおり評価した。端的には、第１処置（ｂＬＦ）と第２処置（ポリフェノン−Ｂ）との間の組み合わせの効果の期待値を、［（観察された第１処置値）／（対照値）］×［（観察された第２処置値）／（対照値）］として算出し、組み合わせ指数を、（期待値）／（観察値）の比として算出する。１を超える比は相乗効果を示し、１未満の比は付加的な効果未満を示す。
【００９５】
肉眼での観察及び顕微鏡下での観察
図１８の表８は、種々の群の平均体重、食餌消費量、及び骨髄微小核の頻度を示す。１４週間のＤＭＢＡの局所塗布は、対照群（群８）と比較して、群１の動物の平均体重を有意に減少させた。体重における有意差は、群２から群８において観察されなかった。群１から群８において消費された食餌量に有意差はなかった。骨髄の微小核を有する多染性白血球（ＭｎＰＣＥ）の頻度は、対照群（群８）と比較して、ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において有意に高かった。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独の食餌性投与（それぞれ群２及び群３）は、群１と比較してＭｎＰＣＥの発生率を有意に低減し、ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせ（群４）は、他の群と比較して抑制がより大きい（４３．３３％）ことを示した。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独の投与及び組み合わせにおける投与（群５から群７）は、対照群（群８）と比較して、ＭｎＰＣＥの発生率に有意な変化を示さなかった。
【００９６】
図１９の表９は、実験群及び対照群のハムスターの頬嚢における腫瘍発生率、腫瘍多重度、平均腫瘍量及び組織病理学的変化を要約する。群１における腫瘍発生率は１００％であり、多重度はハムスター１匹あたり１．５５腫瘍であった。これらの腫瘍は外方増殖性であり、１７２．９７ｍｍ３の平均腫瘍量で明確に定義される。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂの単独の及び組み合わせの投与（群２から群４）は、腫瘍発生率、腫瘍多重度、及び腫瘍量並びに病理学的変化を有意に低下させた。群１から群４のうち、ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせ（群４）は、これらの変化をより大きく低下させた。さらに、腫瘍発生率に対するｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせに関する１．４６の組み合わせ指数比を、前記組み合わせがＨＢＰ発癌の抑制において相乗効果を有し得ることを示す。腫瘍は、群５から群８において観察されなかった。
【００９７】
生化学的知見
図２０は、ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独並びに組み合わせにおける処置が、頬嚢及び肝臓における第Ｉ相及び第ＩＩ相発癌物質代謝酵素の活性に及ぼす影響を示す。ＤＭＢＡの局所適用（群１）は、嚢における酵素活性を有意に増強し、一方肝臓においては、チトクロムＰ４５０における増大は、対照群（群８）と比較して、第ＩＩ相酵素活性における有意な低下を伴った（ｐ＜０．００１）。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独又は組み合わせでの、ＤＭＢＡを塗布した動物への食餌性投与は、群１と比較して嚢及び肝臓において、チトクロムＰ４５０の活性を有意に抑制し、第ＩＩ相酵素の活性を増強した（それぞれ群２から群４の動物に関してｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。食餌性薬剤単独及び組み合わせでの投与（群５から群７）は、チトクロムＰ４５０においていかなる有意な変化も誘発しなかったが、第ＩＩ相酵素の活性は、群８と比較して有意に増強された。
【００９８】
図２１は、ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独及び組み合わせでの処置が、ハムスターの頬嚢及び肝臓における脂質過酸化におけるＤＭＢＡ誘発性変化に及ぼす効果を示す。１４週間のＤＭＢＡの局所塗布は、頬嚢において脂質過酸化を低下させたのに対し、肝臓において、脂質過酸化の程度は、対照群と比較して増大した（ｐ＜０．００１）。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独の及び組み合わせの食餌性投与は、群１と比較して頬嚢及び肝臓における脂質過酸化においてＤＭＢＡ誘発性変化を有意に和らげた（それぞれ群２から群４の動物に関してｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。食餌性薬剤単独の及び組み合わせにおける投与は、群１と比較してそれぞれ群５から群７の動物の頬嚢及び肝臓における脂質過酸化の程度を有意に低減した。対照群及び実験群のハムスターの嚢及び肝臓におけるＧＳＨ、ＧＳＳＧ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比及びＧＰｘ活性を図２２に示す。ＤＭＢＡを塗布した動物（群１）において、ＧＳＨ及びＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の濃度及びＧＰｘ活性は頬嚢において増強されたのに対し、肝臓において、全ての抗酸化物質が、対照群と比較して有意に減少した（ｐ＜０．００１）。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独の及び組み合わせの処置は、群１と比較して嚢及び肝臓において全ての抗酸化物質を有意に増大させた（それぞれ群２から群４の動物に関してｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂ単独の投与及び組み合わせの投与（群５から群７）は、対照群（群８）と比較して、頬嚢及び肝臓における抗酸化物質の状態を有意に増強した。全体として、ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせは、発癌物質代謝酵素並びに脂質過酸化及び抗酸化物質を調節することにおいて、いずれかの薬剤を単独で使用するよりも効果的であることがわかった。
【００９９】
明らかであるように、１４週間のＤＭＢＡのＨＢＰへの局所塗布は結果的に、十分に発達したＳＣＣをもたらし、非常に高い平均腫瘍量を伴った。このことは、更に第Ｉ相及び第ＩＩ相異物代謝酵素、細胞内酸化還元状態、及び骨髄微小核の頻度の増大における不均衡を伴った。注目すべきことに、ｂＬＦと紅茶ポリフェノール（ポリフェノン−Ｂ）との同時投与は、嚢及び肝臓における第Ｉ相及び第ＩＩ相の酵素における調節された平衡及び酸化還元状態の調節を伴った、ＨＢＰ癌の発生率を有意に減少させた。このような平衡及び調節は、ＤＭＢＡの変異誘発性及び発癌性効果を緩和し、それにより骨髄微小核の頻度を最少化すると考えられる。
【０１００】
本発明者はさらに、ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂが、第Ｉ相酵素を抑制し、第ＩＩ相酵素の活性を増強することにより二重作用薬として機能することを見出した。二重作用薬は、解毒及び排泄を促進しながら、発がん物質の代謝活性化を同時に抑制するので、癌の化学予防剤としてより有望であると認識される。ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせの化学予防能は、その抗酸化特性にも起因し得る。頬嚢において、ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂは、脂質過酸化に対する感受性を逆転させた一方、同時にＧＳＨ／ＧＳＳＧ比及びＧＰｘ活性を増大させ、他方で、肝臓において、脂質過酸化の程度は、抗酸化防御システムの上昇に伴い低下させた。従って、ｂＬＦ及びポリフェノン−Ｂによる腫瘍及び宿主肝臓において誘発される差次的な酸化事象は、おそらくＨＢＰにおいて細胞増殖を低下させ得、腫瘍発生を遮断し得る。本研究のこれらの結果は、ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせの投与が、いずれかの薬剤が単独で使用される場合と比較して、ＨＢＰ発癌の抑制し、発癌物質代謝酵素及び酸化還元状態の調節においてより効果的であることを示唆している。これらの知見はさらに、ｂＬＦとポリフェノン−Ｂとの組み合わせが、ＨＢＰ発癌の抑制において相乗的に作用し得ることを示唆している。
【０１０１】
（ＩＩＩ）緑茶ポリフェノール−ラクトフェリンの組み合わせの効果
我々はさらに、種々の緑茶ポリフェノール（ポリフェノンＥ）及び紅茶ポリフェノール（ポリフェノンＥ）との組み合わせにおけるウシラクトフェリンが、ヒト舌部扁平上皮癌（ＣＡＬ−２７）及び正常ヒト歯肉線維芽（ＨＧＦ）細胞に及ぼす抗増殖性効果及びアポトーシス誘発効果を評価した。
【０１０２】
薬品
純度が９６．２％以上のｂＬＦ（ロット番号０２０１１９）を、Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｍｉｌｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから入手した。ｂＬＦの鉄含有量は、１８ｍｇ／１００ｇであった。緑茶ポリフェノール（ポリフェノン−Ｅ：Ｐ−Ｅ）及び紅茶ポリフェノール（ポリフェノン−Ｂ：Ｐ−Ｂ）は、Ｍｉｔｓｕｉ  Ｎｏｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎの好意により提供された。ポリフェノン−Ｅ及びポリフェノン−Ｂの組成は前述と同一である。ポリフェノン−Ｅ（Ｐ−Ｅ）は、エピガロカテキン−３−ガレート（６４．６％）、エピガロカテキン（４．３％）、エピカテキン（９．４％）、エピカテキン−３−ガレート（６．４％）、ガロカテキン−３−ガレート（３．５％）、カテキン−３−ガレート（０．２％）、ガラクトカテキン（０．２％）、カテキン（１．１％）及びカフェイン（０．７％）の混合物である。ポリフェノン−Ｂ（Ｐ−Ｂ）は、次の組成：エピカテキン（０．４％）、エピガロカテキン−３−ガレート（１．４％）、エピカテキン−３−ガレート（０．１％）、ガロカテキン−３−ガレート（０．２％）、遊離テアフラビン（０．３２％）、テアフラビンモノガレート−Ａ（０．１４％）、テアフラビンモノガレート−Ｂ（０．１５％）、テアフラビンジガレート（０．２１％）、タンニン（３５．６％）及びカフェイン（４．９％）を有する。使用した他の試薬は全て、分析等級であった。ｂＬＦ及びＰ−Ｅの原溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に調製した。Ｐ−Ｂを、０．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＰＢＳ中に溶解した。次に、原液を使用前に培地で希釈して望ましい濃度を得た。培地中のＤＭＳＯの最終濃度は、０．０１％未満であり、この濃度は細胞成長に及ぼす検出可能な効果がないことを証明するものであった。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、ＧＩＢＣＯから購入した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）、２’，７’−ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ−ＤＡ）、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）、ヨウ化プロピジウム、プロテアーゼＫ、フッ化−フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、ローダミン１２３、及びＲＮＡ分解酵素Ａを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入した。Ｄｒ．Ｄ．Ａ．Ｔｉｐｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ，ＵＳＡの好意により提供された正常ヒト歯肉線維芽（ＨＧＦ）の株細胞及び細胞培養液及びヒト舌部扁平上皮癌（ＣＡＬ−２７）株細胞を本研究において使用した。細胞を、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、及び５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。培養液を、３７℃で、空気中の５％ＣＯ２の加湿された雰囲気中で維持した。指数関数的に増殖する細胞を、全ての実験のために使用した。
【０１０３】
細胞毒性アッセイ
細胞毒性を、生細胞のミトコンドリア脱水素酵素によるＭＴＴの紫色ホルマゾン生成物への還元に基づいたＭＴＴアッセイにより評価した。簡潔に述べると、細胞を増殖培地中で希釈し、２４ウェルプレート（５×１０４細胞数／ウェル）に播種した。一晩増殖させた後、増殖培地を、ｂＬＦ、Ｐ−Ｅ、Ｐ−Ｂ単独及びｂＬＦとＰ−Ｅとの又はＰ−Ｂとの組み合わせの表示された用量を含有する曝露培地（ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ）と置換した。２４時間後、各ウェル中の細胞をＰＢＳ２００μＬで洗浄し、３７℃で、ＰＢＳ中の５００μｇ／ｍＬのＭＴＴ１００μＬとともに３時間、温置した。ＤＭＳＯ２００μｌ中に溶解したＭＴＴ−ホルマゾン生成物を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて５７０ｎｍでの吸光度を測定することにより評価した。細胞生存を、対照サンプルに対する処理されたサンプルの生細胞の百分率として表した。食餌性薬剤を全て３回試験し、実験を、少なくとも３回反復した。
【０１０４】
核の形態学
ＣＡＬ−２７細胞を１ウェルあたり５×１０４個の細胞の密度で６ウェルチャンバースライドに平板接種した。８０％コンフルエンスの後、ＣＡＬ−２７細胞を食餌性薬剤単独で及び組み合わせで２４時間処理した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノール：酢酸（３：１（ｖ／ｖ））中で１０分間固定し、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで２０分間染色した。濃縮した／断片化した核を有するアポトーシス性細胞の核の形態を、蛍光顕微鏡下で検査し、アポトーシス性細胞死を評価するため、少なくとも１×１０３細胞数を計数した。
【０１０５】
細胞周期分析
アポトーシス性細胞の百分率の細胞周期分布及び測定をフローサイトメトリーにより実施した。処理後、培地中に浮遊している細胞を、トリプシン処理により回収した付着細胞と組み合わせた。次に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、−２０℃でＰＢＳ中の８０％エタノール中において固定した。１２時間後、固定した細胞をペレット化し、３７℃で３０分間ＲＮＡ分解酵素Ａ（２０μｇ/ｍｌ）の存在下でヨウ化プロピジウム（５０μｇ/ｍｌ）で染色し、約１０４個の事象をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。細胞周期ヒストグラムをＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。アポトーシス性細胞を、それらのサブＧ０／Ｇ１相下の領域中に現れるより低いヨウ化プロピジウム染色強度により測定されるような、これら細胞のＤＮＡ含有量の低下により、非アポトーシス性無傷細胞から識別した。
【０１０６】
ＲＯＳ発生の測定
細胞内ＲＯＳの発生を評価するために、酸化感受性蛍光プローブＤＣＦＨ−ＤＡを使用した。簡潔に述べると、処理後、ＣＡＬ−２７細胞を回収し、１０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡを含有する０．５ｍＬのＰＢＳ中に３７℃で暗所、１５分間懸濁した。ＤＣＦＨ−ＤＡを細胞により取り込ませ、細胞エステラーゼにより脱アセチル化して非蛍光生成物ＤＣＦＨを形成し、これを、処理されたＣＡＬ−２７細胞により生成する細胞内ＲＯＳにより緑色蛍光生成物ＤＣＦへと変換した。ＤＣＦ蛍光の強度を、励起設定及び発光設定をそれぞれ４８８ｎｍ及び５３０ｎｍとするフローサイトメトリーにより測定した。合計１０４の事象を計数し、ヒストグラムを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析し、対照群の未処置細胞のヒストグラムと比較した。
【０１０７】
ミトコンドリア膜電位差の測定
ミトコンドリア膜電位差における変化（ΔΨｍ）を、ミトコンドリア特異的脂質親和性カチオン染料ローダミン１２３の取り込みによって測定した。処理後、室温で１０分間遠心分離することによりＣＡＬ−２７細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。ペレット化した細胞を１０μｇ／ｍＬのローダミン１２３を含有する暴露培地１ｍＬとともに室温で暗所、３０分間温置し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。次に、サンプル（１０４事象）を即座に、励起波長４８８ｎｍ及び発光波長５４５ｎｍでのフローサイトメトリー分析に供した。ヒストグラムを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析し、対照群の未処置細胞のヒストグラムと比較した。
【０１０８】
免疫蛍光
６ウェルチャンバースライド中で約８０％コンフルエンスまで培養したＣＡＬ−２７細胞を、食餌性薬剤単独及び組み合わせに２４時間暴露した。処理に続き、細胞をあらかじめ４℃に冷却しておいたアセトン中で５分間固定した。固定した細胞を、ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００で透過可能にし、抗Ｂｃｌ−２及び抗Ｂａｘ抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の１：１０００希釈とともに４℃で一晩温置した。次に、タンパク質を、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識二次抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに温置することによって検出し、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。 
【０１０９】
ウェスタンブロット法
食餌性薬剤による処置後、ＣＡＬ−２７細胞を、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ノニデットＰ−４０、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ及び０．５ｍＭ  ＤＴＴ）中、４℃で３０分間溶解し、上澄みを１２，５００×ｇで２０分間遠心分離することによって回収した。Ｂｒａｄｆｏｒｄのタンパク質評価キットによって測定されるような上澄み由来の総タンパク質の約５０μｇを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した後、セミドライ転移システム（ＢＩＯＲＡＤ）を使用して、ニトロセルロース膜へ転写した。前記膜を、５％無脂肪乾燥乳を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（１５０ｍＭ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍＭ／Ｌトリス、ｐＨ７．４）中で１時間温置して非特異的結合部位を遮断した。次に、この遮断したものを抗Ｂｃｌ−２及び抗Ｂａｘ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，ＵＳＡ）の１：１０００希釈で一晩温置した。この遮断したものを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで徹底的に洗浄し、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（１：２０００）とともに室温で６０分間から９０分間温置することにより、タンパク質を検出した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ中での徹底的な洗浄の後、転移したタンパク質をＤＡＢを使用して可視化した。濃度測定をＩＩＳＰ平板ベッドスキャナ上で実施し、Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ１．１１ソフトウェアで定量化した。
【０１１０】
カスパーゼ−３活性の比色評価
カスパーゼ−３活性を、ＣＡＳＰ−３−Ｃ比色キット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用してアッセイした。処理後、ＣＡＬ−２７細胞を２５０ｍＭ／ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭ／Ｌ  ＣＨＡＰＳ及び２５ｍＭ／Ｌ  ＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で可溶化した。上澄みを酵素源として使用した。カスパーゼ−３比色アッセイは、ペプチド基質であるアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）のカスパーゼ−３による加水分解の結果として、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）部分の放出が生じることに基づいている。基質から放出されるｐＮＡの濃度を、４０５ｎｍでの吸光度値から、又はｐＮＡ規定溶液で作成された検量線から算出した。
【０１１１】
統計分析
細胞毒性データを、対照群の平均百分率±Ｓ．Ｄとして提示し、直線回帰分析を使用して、ＩＣ５０値を算出した。茶ポリフェノール単独及びｂＬＦとの組み合わせでのＣＡＬ−２７及びＨＧＦ細胞に及ぼす細胞毒性に関するデータに対する統計分析を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実施した。茶ポリフェノールとｂＬＦとの組み合わせの効果の間の相互作用の性質を、Ｙｏｋｏｙａｍａらにより記載されたように評価した。相乗効果をｂＬＦと茶ポリフェノールとの組み合わせ処理の期待値（Ｅ）／観察値（Ｏ）の比から算出し、１を超える比は相乗効果を示し、ｂＬＦ及び茶ポリフェノールのＥ値＝［（ｂＬＦのＯ値）／（対照群の細胞のＯ値）］×［（茶ポリフェノールのＯ値）／（対照群の細胞のＯ値）］×（対照群の細胞のＯ値）とした。核の形態、細胞周期分析、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比及びカスパーゼ３活性に関するデータを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により分析した。ｐ値が０．０５未満の場合、結果は統計的に有意であると考慮した。
【０１１２】
結果
細胞毒性アッセイ
我々はまず、ＣＡＬ−２７細胞及びＨＧＦ細胞の増殖に及ぼすＰ−Ｅ、Ｐ−Ｂ及びｂＬＦの種々の濃度の抑制効果を検討した（図２３）。Ｐ−Ｅ及びＰ−Ｂは両方とも、それぞれ２０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を有するＣＡＬ−２７細胞の増殖の用量依存的抑制を示した。しかしながら、ＨＧＦ細胞は、それぞれ７０μｇ／ｍＬ及び１２０μｇ／ｍＬのＩＣ５０値であり、Ｐ−Ｅ及びＰ−Ｂの増殖抑制効果に対してより耐性であった。ｂＬＦによる処置は、ＣＡＬ−２７細胞又はＨＧＦ細胞のいずれにも細胞毒性効果を何ら誘発しなかった。我々は次に、ＣＡＬ−２７細胞及びＨＧＦ細胞に及ぼすｂＬＦとの組み合わせでの茶ポリフェノールの増殖抑制効果を検討した。我々は、ＣＡＬ−２７細胞に関してＰ−Ｅ及びＰ−ＢのＩＣ５０値を選択し、ｂＬＦの濃度の上昇との組み合わせにおいてこれを試験した。図２４Ａは、ｂＬＦの濃度の上昇を有するＰ−Ｅの組み合わせによるＣＡＬ−２７細胞のＵ字型増殖抑制を示す。１：２の比でのＰ−Ｅ（２０μｇ／ｍｌ）＋ｂＬＦ（４０μｇ／ｍｌ）の組み合わせにより、有意な相乗効果が観察された。ＨＧＦ細胞は、Ｐ−ＥとｂＬＦとの組み合わせによってＣＡＬ−２７細胞の優先的な増殖抑制を示すＣＡＬ−２７細胞よりも増殖抑制に対してほとんど影響されないようであった。図２４Ｂは、ＣＡＬ−２７細胞及びＨＧＦ細胞の増殖に及ぼすＰ−Ｂ及びｂＬＦの組み合わせによる処置の効果を示す。Ｐ−Ｂ及びｂＬＦによる同時処置は、Ｐ−Ｂ単独と比較して、増殖抑制に対するＣＡＬ−２７細胞の感受性を有意に低下させた。これらの結果は、ｂＬＦが、Ｐ−Ｂの抗癌性効果を抑制することを示唆する。全体として、ＭＴＴアッセイの結果は、食餌性薬剤が正常ＨＧＦ細胞と比較してＣＡＬ−２７細胞の増殖を優先的に抑制することを示唆し、食餌性薬剤の細胞毒性効果の程度は、Ｐ−ＥとｂＬＦとの組み合わせ（１：２の割合）＞Ｐ−Ｅ＞Ｐ−Ｂであることを示唆する。食餌性薬剤が、ＣＡＬ−２７細胞の増殖を優先的に阻害し、ｂＬＦの添加がＰ−Ｂの抗癌性効果を抑制したため、細胞死の様式を探査するため、Ｐ−Ｅ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｐ−Ｂ（４０μｇ／ｍｌ）及びｂＬＦ（４０μｇ／ｍｌ）単独で、及びＰ−Ｅ（２０μｇ／ｍｌ）とｂＬＦ（４０μｇ／ｍｌ）との組み合わせで温置することにより、ＣＡＬ−２７細胞のみにおいてさらなる研究を実施した。
【０１１３】
食餌性薬剤によるＣＡＬ−２７細胞におけるアポトーシスの誘発
食餌性薬剤による細胞増殖の抑制がアポトーシスに起因するかどうかを決定するため、蛍光ＤＮＡ結合剤であるヨウ化プロピジウムを使用して、核の形態を観察した。２４時間の食餌性薬剤によるＣＡＬ−２７細胞の温置は、核の断片化及び凝集によって明白なように、対照群と比較して、アポトーシス性細胞の数を有意に増大させた（図２５）。ＣＡＬ−２７細胞のＰ−Ｅ（２０μｇ／ｍｌ）及びＰ−Ｂ（４０μｇ／ｍｌ）単独による処置は、対照群と比較して、アポトーシス性細胞数を有意に増大させた（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）。ｂＬＦ単独ではアポトーシスを誘発しなかったが、Ｐ−Ｅ（２０μｇ／ｍｌ）及びｂＬＦ（４０μｇ／ｍｌ）による同時処置は、アポトーシス性核の数を６０．２４％まで有意に増大させた（対照群及びＰ−Ｅ単独処置細胞とそれぞれ比較して、ｐ＜０．００５及びｐ＜０．０５）。特に、４０μｇ／ｍｌのｂＬＦは、２０μｇ／ｍＬのＰ−Ｅのアポトーシス誘発能を〜１．９倍まで増大させた。食餌性薬剤のアポトーシス誘発能の程度は、Ｐ−Ｅ及びｂＬＦ（１：２）＞Ｐ−Ｅ＞Ｐ−Ｂであった。
【０１１４】
ＣＡＬ−２７細胞の細胞周期調節に及ぼす食餌性薬剤の効果
食餌性薬剤が、細胞周期制御に及ぼす役割を有するかどうかを研究するため、我々は、蛍光励起細胞分取装置を使用することにより、細胞周期特性における変化を分析した。図２６に示されるように、ＣＡＬ−２７と食餌性薬剤との２４時間の温置によって、Ｇ１期の細胞が損失するアポトーシスを示すＤＮＡ含有量の減少した細胞（サブＧ０／Ｇ１又はＡ０ピーク）の割合を有意に増加させた。アポトーシスの特徴であるＤＮＡの損失は、エンドヌクレアーゼの開裂後の細胞の外でのＤＮＡの分解の拡散の結果として生じ、ヨウ化プロピジウムによる染色後、これらの細胞はほとんど染色されず、サブＧ０／Ｇ１又はＡ０ピークに、すなわち、Ｇ０／Ｇ１ピークの左に現れる。ＣＡＬ−２７細胞のＰ−Ｅ及びＰ−Ｂ単独との温置によって、ＤＮＡ含有量が８．３６％（対照群）から３５．９９％（Ｐ−Ｅ）及び２４．０１％（Ｐ−Ｂ）まで低下した細胞の割合が有意に増大した。ｂＬＦ単独は、サブＧ０／Ｇ１細胞の割合を有意に変化させることはなかったが、２０μｇ／ｍｌのＰ−Ｅ及び４０μｇ／ｍｌのｂＬＦの同時処置によって、サブＧ０／Ｇ１細胞の割合が７２．８６％まで有意に増大した（対照群及びＰ−Ｅ単独で処置された細胞と比較してそれぞれｐ＜０．００５及びｐ＜０．０１）。具体的に、４０μｇ／ｍｌのｂＬＦによって、２０μｇ／ｍｌのＰ−Ｅのアポトーシス誘発能は〜２倍まで増大した。食餌性薬剤のアポトーシス誘発能の程度は、核形態分析に関するものと同一であった。
【０１１５】
細胞内ＲＯＳ発生に及ぼす食餌性薬剤の効果
ＲＯＳが食餌性薬剤によって誘発されるアポトーシスを仲介するのに関与するかどうかを研究するため、我々は、蛍光プローブＤＣＦＨ−ＤＡを使用して、ＲＯＳの細胞内発生を測定した。食餌性薬剤による処理によって、未処理の対照群と比較してＣＡＬ−２７処置した細胞においてＲＯＳ発生が有意に増大し、ＲＯＳ発生の順序は、Ｐ−Ｅ＋ｂＬＦ＞Ｐ−Ｅ＞Ｐ−Ｂ（図２７Ａ）であった。ＤＣＦ蛍光の平均は、Ｍａ＝３８１（対照群）からＭｂ＝９３８（Ｐ−Ｅ処置群）、Ｍｃ＝１２２９（Ｐ−Ｅ及びｂＬＦ、１：２の比）及びＭｄ＝６４９（Ｐ−Ｂ処置群）まで増大した。ＣＡＬ−２７細胞のｂＬＦ単独への暴露は、ＲＯＳ発生を誘導しなかった（データ非表示）。
【０１１６】
ミトコンドリア膜電位差（ΔΨｍ）に及ぼす食餌性薬剤の効果
ΔΨｍの変化がアポトーシスと連結するという証拠の増大に伴い、我々は、ＣＡＬ−２７細胞のΔΨｍに及ぼす食餌性薬剤単独及び組み合わせにおける影響を、蛍光プローブローダミン１２３を使用するフローサイトメトリーにより検討した。陽イオン性染色剤であるローダミン１２３は、ΔΨｍと直接比例する程度までミトコンドリアにより選択的に取り込まれる。図２７Ｂに示されるように、茶ポリフェノールへ２４時間暴露されたＣＡＬ−２７細胞は、対照群と比較して、ローダミン１２３の蛍光強度を低下させることによって明らかなように、ΔΨｍの損失を示した。ローダミン１２３の平均蛍光は、Ｍａ＝４６３６（対照群）からＭｂ＝２４５６．１２（Ｐ−Ｅ処置群）及びＭｄ＝２６５９．８８（Ｐ−Ｂ処置群）まで低下した。ｂＬＦ単独は、ΔΨｍにおいて何ら有意な変化を示さなかった（データ非表示）が、Ｐ−ＥとｂＬＦとの組み合わせによる処置は、対照群細胞及びＰ−Ｅ単独処置細胞と比較して、ローダミン１２３蛍光強度が２０９８．７５までさらに鋭敏に低下することを示した。
【０１１７】
Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比に及ぼす食餌性薬剤の効果
我々は、免疫蛍光（データ非表示）及びウェスタンブロット法を使用してΔΨｍを調節することによりアポトーシスを制御することにおいて重要な役割を担うＢｃｌ−２及びＢａｘの発現に及ぼす食餌性薬剤の効果を検討した。ＣＡＬ−２７細胞のＰ−Ｅ、Ｐ−Ｂ及びＰ−ＥとｂＬＦとの組み合わせ（１：２の比）との温置によって、未処置の対照群と比較して、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘタンパク質発現が有意に低下し、食餌性薬剤の効能を低下させるＢｃｌ−２／Ｂａｘの順序は、Ｐ−Ｅ＋ｂＬＦ＞Ｐ−Ｅ＞Ｐ−Ｂであった（図２８Ａ）。
【０１１８】
カスパーゼ３活性に及ぼす食餌性薬剤の効果：食餌性薬剤によって処置されたＣＡＬ−２７細胞におけるカスパーゼ３のアッセイは、アポトーシス誘発が、カスパーゼ３活性の活性化を通じて介在されることを明白にした（図２８Ｂ）。ＣＡＬ−２７細胞の、Ｐ−Ｅ、Ｐ−Ｂ及びＰ−ＥとｂＬＦとの組み合わせ（１：２の比）との温置によって、対照群と比較してカスパーゼ３活性が有意に増大した。ｂＬＦはカスパーゼ３活性に何ら効果を呈しなかったが、ｂＬＦとＰ−Ｅとの同時処置によって、酵素活性は〜１．４６倍まで増強された。
【０１１９】
これらの結果は、茶ポリフェノールが、ヒト舌部扁平癌（ＣＡＬ−２７）細胞の増殖を用量依存的様式において優先的に抑制することを示唆する。本データは、Ｐ−ＥがＣＡＬ−２７細胞の増殖を抑制する上でＰ−Ｂよりも効果的であることをさらに示す。さらに、Ｐ−ＥとｂＬＦとの組み合わせ（１：２の比）が、Ｕ字型増殖曲線によって反映されるように、腫瘍の増殖を抑制する上で有意な相乗効果を発揮するのに対し、ｂＬＦとの同時処置は、Ｐ−Ｂの抗発癌性効果を阻害した。全体として、ＣＡＬ−２７細胞の増殖の優先的抑制及び抗増殖性効果の順序は、Ｐ−Ｅ＋ｂＬＦ（１：２）＞Ｐ−Ｅ＞Ｐ−Ｂであった。ＣＡＬ−２７細胞の増殖を抑制することにおけるＰ−Ｅのより大きな効能は、ＥＧＣＧのより高い濃度を明らかに反映する。本結果は、核の形態及びＡ０ピークの特徴的変化により明白なように、アポトーシスを誘発することによって、緑茶及び紅茶ポリフェノールがＣＡＬ−２７細胞の増殖を抑制することも示す。化学予防剤又は化学治療剤によって誘発されるアポトーシスが、細胞周期の特定の期の変動と関連しているという証拠が増大している。図４に示されるように、ＣＡＬ−２７細胞の茶ポリフェノールとの２４時間の温置によって、アポトーシス性細胞の出現の同時に起こる増加とともにＧ０／Ｇ１期の細胞損失をもたらし、茶ポリフェノールによりＧ０／Ｇ１期において抑止されたＣＡＬ−２７細胞は、選択的にアポトーシスを経験していることを示唆した。ｂＬＦ単独ではＣＡＬ−２７細胞のアポトーシスを誘発しなかったが、Ｐ−ＥとｂＬＦとの同時処置によって、Ｐ−Ｅのアポトーシス誘発能が〜２倍まで増大した。食餌性薬剤のアポトーシス誘発能の順序は、増殖抑制効果のそれと同一であり、すなわち、Ｐ−Ｅ＋ｂＬＦ（１：２）＞Ｐ−Ｅ＞Ｐ−Ｂであった。
【０１２０】
アポトーシスにおいて中枢的役割を担うミトコンドリアは、ＲＯＳ発生の主要部位である。ＲＯＳの過剰発生によって、ミトコンドリアの透過性移行孔が開口するとともに、ΔΨｍが低下し、その結果、カスパーゼカスケードの活性化及びアポトーシス性細胞死に到らせる、膜間空間から細胞質へのチトクロムｃ放出が生じ得る。本研究の結果は、ＣＡＬ−２７細胞とＰ−Ｅ、Ｐ−Ｂ及びＰ−Ｅ＋ｂＬＦ（１：２の比）との温置が、ＲＯＳ発生を増大させ、それが順に、ΔΨｍにおける低下によって明白なように、ミトコンドリアの機能を破壊することによってアポトーシスを惹起し、カスパーゼ−３を活性化させたことを示す。ＥＧＣＧは、ＲＯＳの発生によって、ジャーカット細胞においてアポトーシスを誘発することが報告されている。幾つもの研究が、ＥＧＣＧ及び茶ポリフェノールによって誘発されるアポトーシス中のＲＯＳの関与、ΔΨｍの消失及びカスパーゼ活性に関する証拠を提供してきた。ともにこれらの結果は、茶ポリフェノールが、ＲＯＳ誘発性ミトコンドリア破壊を介するアポトーシスを誘発することを示唆する。
【０１２１】
要約して、本結果は、茶ポリフェノールが、アポトーシスを通じて介在されるＣＡＬ−２７細胞に対する増殖抑制効果を発揮することを示す。本データは、ΔΨｍを消失させ、カスパーゼ−３を活性化させることによる、ミトコンドリア媒介性アポトーシスにおけるＲＯＳ及びＢｃｌ−２／Ｂａｘに関する重要な役割を示す。本研究は、Ｐ−Ｅの単独及びｂＬＦとの組み合わせの両方のより大きな効能も強調する。緑茶ポリフェノールがすでに、肝臓癌及び前立腺癌に関する高い危険にある患者で臨床治験に取り入れられているため、Ｐ−Ｅの化学予防効能を評価するために、口腔の前悪性病変を有する患者において同様の治験を計画することは、価値のあることであろう。
【０１２２】
かくして、茶ポリフェノールの特異的な態様及び適用が開示された。しかしながら、すでに記載のもののほかにより多くの改変が、本明細書の本発明の概念から逸脱せずに可能であることは、当業者にとって明白である。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神を除いて限定されるべきではない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する上で、全ての用語は、文脈と一致する限り最も広範な可能な様式において解釈されるべきである。特に、用語「を含む」及び「含んでいる」は、非排他的な様式において要素、構成要素又は段階を指すものとして解釈されるべきであり、このことは参照された要素、構成要素又は段階は、表現上参照されてはいない他の要素、構成要素又は段階とともに存在し得、利用され得、又は組み合わされ得ることを示す。さらに、本明細書に参照により組み込まれた参照文献における用語の定義又は使用が、本明細書で提供された前記用語の定義と不一致であるか又は反対である場合、本明細書に提供された前記用語の定義が適用され、参照文献における前記用語の定義は適用されない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の種々の腫瘍及び病理組織学的パラメータを列挙する２つの表を含む。
【図２】図２は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の組織（Ｈ及びＥ染色した）の種々の顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物におけるＰＣＮＡ発現の定量分析を示すグラフである。
【図４】図４は、図３の動物の組織の種々の顕微鏡写真（ＰＣＮＡ染色した）を示す。
【図５】図５は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の種々の生化学的パラメータを列挙する表である。
【図６】図６は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の選択された器官における酵素活性を示す種々のグラフを示す。
【図７】図７は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の選択された器官におけるさらなる酵素活性を示す種々のグラフを示す。
【図８】図８は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の選択された器官におけるなおもさらなる酵素活性を示す種々のグラフを示す。
【図９】図９は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の種々の腫瘍パラメータを列挙する表である。
【図１０】図１０は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の種々の腫瘍関連タンパク質の発現を列挙する表を示す。
【図１１】図１１は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の組織（ＰＣＮＡ、ＮＦ−κＢ、サイトケラチンに関して染色した。）の種々の顕微鏡写真を示す。
【図１２】図１２は、紅茶ポリフェノール組成物で処置された動物の組織（Ｂｃｌ−２、Ｃｙｃ−ｃ、カスパーゼ３に関して染色した。）の種々の顕微鏡写真を示す。
【図１３】図１３は、図１２の動物におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物の種々の腫瘍パラメータを列挙する表を示す表である。
【図１５】図１５は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物の選択された組織（サイトケラチン、ＰＣＮＡ、及びｐ５３に関して染色された。）の顕微鏡写真を示す。
【図１６】図１６は、図１５の動物に関する定量分析の結果を示す表ある。
【図１７】図１７は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物の選択されたタンパク質に関するウェスタンブロット及びそれらの濃度測定分析を示す。
【図１８】図１８は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物における微小核の多染性赤血球の測定に対する結果を列挙する表である。
【図１９】図１９は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物のさらなる腫瘍パラメータを列挙する表を示す表である。
【図２０】図２０は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物の選択された器官における酵素活性（Ｃｙｔ−Ｃ、ＧＳＴ、ジアフォラーゼ）を示す種々のグラフを示す。
【図２１】図２１は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物の選択された器官における種々の生化学的パラメータ（ＴＢＡＲＳ、ＬＯＯＨ、ＣＤ）を示す種々のグラフを示す。
【図２２】図２２は、紅茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせで処置された動物の選択された器官におけるさらなる生化学的パラメータ（ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比、ＧＰｘ）を示す種々のグラフを示す。
【図２３】図２３は、ラクトフェリン、緑茶ポリフェノール及び紅茶ポリフェノールへの暴露の関数としての、ヒトの（癌及び正常）細胞の生存率を示すグラフを示す。
【図２４】図２４は、ラクトフェリンと、緑茶ポリフェノール又は紅茶ポリフェノールとの組み合わせへの暴露の関数としての、ヒトの細胞（癌細胞及び正常細胞）の生存率を示すグラフを示す。
【図２５】図２５はラクトフェリンと緑茶ポリフェノール又は紅茶ポリフェノールとの組み合わせによる治療の関数としてのアポトーシス性微小核に関して染色した細胞の顕微鏡写真及びその定量分析を示す。
【図２６】図２６は、ラクトフェリンと緑茶ポリフェノールとの組み合わせで治療されたヒト口腔癌細胞の細胞周期分布を示す種々のグラフを示す。
【図２７】図２７は、ヒト口腔癌細胞におけるＲＯＳ及びミトコンドリア膜電位に及ぼすラクトフェリンと緑茶ポリフェノールとの組み合わせの効果を示す種々のグラフを示す。
【図２８】図２８は、緑茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの組み合わせによる治療の関数としてのヒト口腔癌細胞におけるＢｃｌ−２／Ｂａｘ及びカスパーゼ３のウェスタンブロット及びそれらの濃度測定分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月11日(2008.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶ポリフェノール組成物またはラクトフェリンの経口投与を用いた口腔ガンの治療あるいは化学的予防を改善する方法であって、
当該茶ポリフェノール組成物または当該ラクトフェリンの経口投与が第一の効果で口腔ガンを軽減することを確認すること、および
当該茶ポリフェノール組成物および当該ラクトフェリンの組み合わされた経口投与が当該第一の効果を上回る第二の効果で口腔ガンを軽減する情報を提供すること、を含む口腔ガンの治療あるいは化学的予防を改善する方法。
【請求項２】
当該茶ポリフェノール組成物が複数のカテキン類、場合により重合したカテキン類を含む組成物よりなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該茶ポリフェノール組成物が緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含む、
請求項１記載の方法。
【請求項４】
当該ラクトフェリンがウシラクトフェリンであり、当該茶ポリフェノール組
成物が複数のカテキン類よりなる、または重合したカテキン類を含む組成物よりなり、ラクトフェリンとカテキンの当該組合せは液体物、カプセル、錠剤、粉体として場合により製剤化されている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
組み合わされた経口投与における、茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンとの重量比が１：１〜１：３である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
当該重量比が相乗的である請求項５記載の方法。
【請求項７】
経口投与が１回分の投与単位形における同時投与である請求項１記載の方法。
【請求項８】
茶ポリフェノール組成物またはラクトフェリン単独の経口投与で達成される効果を超える効果でもって口腔ガンを軽減するために効果的な量の茶ポリフェノール組成物とラクトフェリンの組合せからなる栄養補助食品または医薬品。
【請求項９】
当該茶ポリフェノール組成物が少なくとも紅茶または緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含み、液体物、カプセル、錠剤、粉体として場合により製剤化されている、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１０】
当該茶ポリフェノール組成物が少なくともひとつの合成カテキンを含む、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１１】
当該茶ポリフェノール組成物が単位用量あたり１００ｍｇ〜６００ｍｇで存在し、当該ラクトフェリンが単位用量あたり２００ｍｇ〜１２００ｍｇで存在する、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１２】
栄養補助食品または医薬品が、当該茶ポリフェノールと当該ラクトフェリンを含むように製剤化された非液体栄養補助食品である、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１３】
栄養補助食品または医薬品が栄養補助食品であり、当該茶ポリフェノールと当該ラクトフェリンのうち少なくとも１つが液体性担体に含まれる、請求項８記載の栄養補助食品または医薬品。
【請求項１４】
より大きな効果が相乗的効果である、請求項８記載の栄養補助食品または
医薬品。
【請求項１５】
口腔ガンの治療または化学的予防のための栄養補助食品または医薬品の製造における茶ポリフェノールおよびラクトフェリンの組合せの使用。
【請求項１６】
当該茶ポリフェノール組成物および当該ラクトフェリンがその重量比１：１〜１：３で存在する、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
当該重量比が相乗的重量比である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
当該茶ポリフェノール組成物が少なくとも紅茶または緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含む、請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
当該組合せが１回分の投与量単位に、液体製剤、カプセル、錠剤、または粉体として場合により製剤化されている、請求項１５記載の使用。
【請求項２０】
栄養補助食品または医薬品が、液体製剤、カプセル、錠剤、または粉体として場合により製剤化されている医薬品である、請求項１５記載の使用。
【請求項２１】
茶ポリフェノールとラクトフェリンの組合せを投与することを含む、口腔ガンの予防方法。
【請求項２２】
投与の工程が経口投与を含み、当該組合せが１回分の投与量単位で製剤化されている、請求項２１の方法。
【請求項２３】
当該茶ポリフェノールは少なくとも紅茶および緑茶由来の複数のカテキン類の混合物を含む、請求項２１の方法。
【請求項２４】
当該組合せは、液体性栄養補助食品、カプセル、錠剤、粉末の製剤からなる群より選ばれる品に製剤化されている、請求項２１の方法。
【国際調査報告】
2009509960.tif 000032