(57)【要約】本発明は、タウの過剰リン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供し、従ってＡＤおよび関連状態を治療するのに適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＢＲＳＫを、ＡＴＰおよび試験化合物の存在下に、リン酸化可能なセリン残基を含むペプチド基質と共に、前記セリン残基のリン酸化と適合性の条件下でインキュベーションする段階；
（ｉｉ）ペプチド基質が前記セリン残基でリン酸化された程度を測定する段階；および
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得た結果を、試験化合物の不在下で実施した対応するブランクインキュベーションから得た結果と比較する段階
を含む、アルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態の治療または予防における使用に適した化合物を選択するためのスクリーニング方法。
【請求項２】
試験化合物を、ＭＡＲＫに対する活性に関してさらにスクリーニングする、請求項１のスクリーニング方法。
【請求項３】
試験化合物を、Ｃｄｋ−５、ＰＫＡ、ＧＳＫ３βおよびＣａＭＫＩＩから選択される１以上の付加的なキナーゼに対する活性に関してさらにスクリーニングする、請求項１または請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
アルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態の治療または予防のための薬剤の製造のためのＢＲＳＫ阻害剤の使用（「ＢＲＳＫ阻害剤」という用語は、請求項１に記載のスクリーニング方法において試験したとき、ブランクインキュベーションから得たものと比較してリン酸化の程度の低下を生じさせる化合物を指す。）。
【請求項５】
前記ＢＲＳＫ阻害剤がＭＡＲＫよりもＢＲＳＫに対して選択的である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＢＲＳＫ阻害剤がＭＡＲＫに対しても活性である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記ＢＲＳＫ阻害剤が、Ｃｄｋ−５、ＰＫＡ、ＧＳＫ３βおよびＣａＭＫＩＩから選択される１つ以上の付加的なキナーゼよりもＢＲＳＫに対して選択的である、請求項４から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記ＢＲＳＫ阻害剤が、式Ｉ：
【化１】
2009525039.tif 000005
［式中、Ｙはインドール環の４位または５位で結合しており、およびＸとＹは以下の表で指示されるとおりである。
【表１】
2009525039.tif 000006
2009525039.tif 000007
］の化合物または医薬的に許容されるこの塩である、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
アルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態を治療するまたは予防する方法であり、ＢＲＳＫ阻害剤（「ＢＲＳＫ阻害剤」という用語は、請求項１に記載のスクリーニング方法において試験したとき、ブランクインキュベーションから得たものと比較してリン酸化の程度の低下を生じさせる化合物を指す。）の治療有効用量をアルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態を治療するまたは予防する必要のある患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タウタンパク質の過剰リン酸化を阻害することができる物質を特定するための方法に関する。本発明はさらに、前記方法によって特定される化合物およびアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療または予防におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者における認知症の最も一般的な原因であり、緩やかに進行して、記憶喪失および見当識障害などの症状を生じさせる認知機能の低下によって特徴づけられる。死亡は、平均で、診断後９年で起こる。ＡＤの発生率は年齢と共に上昇し、７０歳以上の人々の約５％が罹患する一方、８０歳以上になるとこの数字は２０％に上昇する。
【０００３】
既存の治療はもっぱらＡＤの一次症状を標的とする。病変したニューロンは特定の神経伝達物質の不十分なまたは過剰の量を放出し得るため、現在の薬剤は、神経伝達物質レベルを上昇させることまたは神経伝達物質による神経細胞の刺激を低減することを目指す。これらの薬剤はＡＤの症状にある程度の改善を提供するが、この疾患の基礎となる原因に対処することはできない。
【０００４】
１９０７年に初めて記述された、ＡＤの古典的な臨床的および神経病理学的特徴は、老人斑または神経炎性斑ともつれた線維束（神経原線維変化）から成る［Ｖｅｒｄｉｌｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５０：３９７−４０９（２００４）］。加えて、海馬および大脳皮質におけるニューロンの重大な喪失がある。神経炎性斑は、主として、ジストロフィー性（腫脹、損傷および変性した）軸索および炎症過程によって活性化されるグリア細胞によって取り巻かれた、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の沈着から成る細胞外病変である。これに対し、神経原線維変化（ＮＦＴ）は、脳において広汎に認められる（例えば主としてＡＤにおける皮質と海馬で）、タウタンパク質の過剰リン酸化形態から構成される細胞内クラスターである。タウは、微小管の安定化において役割を果たす可溶性細胞質タンパク質である。このタンパク質の過度のリン酸化はこのタンパク質を不溶性にし、ペアードヘリカルフィラメントへのこの凝集を導き、次にＮＦＴを形成する。
【０００５】
アミロイドカスケード仮説は、Ａβペプチド、特にＡβ４２の異常蓄積が、ＡＤの古典的症状、および最終的には患者の死亡へと導く事象のカスケードを開始させると提案する。ＡＤのすべての神経病理学的および臨床的特徴を備える、早発性家族性ＡＤ（ＦＡＤ）は、主として、Ａβの産生において鍵となる成分であるβＡＰＰまたはプレセニリン内の突然変異によって引き起こされる［Ｍｕｄｈｅｒ，Ａ．，Ｌｏｖｅｓｔｏｎｅ，Ｓ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：２２−２６］。これに対し、タウ遺伝子内の突然変異がＦＡＤを引き起こすことはまだ認められておらず、βＡＰＰプロセシングの変化は病因の中の上流事象であることを示唆する。しかし、ＦＡＤ突然変異を担持するトランスジェニックマウスはＡβレベルおよび神経炎性斑の数の上昇を示すが、有意のニューロン喪失を示さず、最小限のタウリン酸化を示し、また神経細線維もつれの形成を示さず、２つの病理を結びつけるもう１つの因子が足りないことを示唆する。さらに、タウノックアウトマウスからの培養海馬ニューロンはＡβ投与後に神経変性を発現しないが、タウ遺伝子が再発現される場合、Ａβの神経毒性作用が回復される［Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６３６４−６３６９］。合わせて考慮すると、これらのデータは、タウ機能の調節不全が、最終的にニューロンの死へと導くアルツハイマー病の病理のカスケードにおける必要段階であることを強く示唆する。
【０００６】
さらに、タウ突然変異およびＮＦＴは、第１７染色体に関連する前頭側頭型認知症、ピック病およびパーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）などの、Ａβ病変が存在しない他の認知症で認められる［Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｔ．（１９９９）Ｒｉｎｓｈｏ  Ｓｈｉｋｅｉｇａｋｕ  ３９：１２６２−１２６３］。また、ＡＤでは、認知症の程度は老人斑の発生率よりもＮＦＴの発生率とより密接に相関する［Ａｒｒｉａｇａｄａ，Ｐ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４２：６３１−６３９］が、アミロイド斑の有意の数が非認知症高齢者の脳においてしばしば認められ、アミロイド病変だけでは認知症を引き起こすのに十分でないことを示唆する。
【０００７】
これらの理由から、タウ機能の正常化（特に過剰リン酸化の予防）は、ＡＤおよび他の認知症状態の治療のための望ましい治療目標と見られている。
【０００８】
タウは、主として軸索に局在し、中枢神経系（ＣＮＳ）において広く発現されるＭａｐｔ（微小管関連タンパク質タウ）遺伝子によってコードされる３５２−４４１アミノ酸タンパク質である［Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８５，１０１（４），１３７１−１３７８］。タウの主要機能は、軸索輸送と伸長ならびに細胞の極性と形状の生成などの多くの重要な細胞過程を調節する上で不可欠なチューブリン二量体を含む細胞内構造成分、微小管（ＭＴ）の安定性の調節である。チューブリンへのタウの結合は、ＭＴの重合／脱重合の速度（動的不安定性と称される）を決定する上で鍵となる因子であり、従って、タウは、多くの重要な細胞過程の調節にとっての鍵である［例えばＢｕｒｎｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５：７１７−７３０参照］。
【０００９】
タウは、数多くのセリンおよびトレオニン残基を有し、その多くがリン酸化を受けやすい、塩基性タンパク質である。正常なタウは２から３個のリン酸化されたアミノ酸残基を有するが、ＡＤおよび他のタウオパシーで認められる過剰リン酸化されたタウは、典型的には８または９個のリン酸化残基を有する。様々なキナーゼがこれらの部位のリン酸化を促進し、ＫＸＧＳモチーフとしても公知である、Ｌｙｓ−（Ｉｌｅ／Ｃｙｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列でタウをリン酸化する、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）およびサイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）などのプロリン特異的キナーゼ、およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）およびカルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）などの非プロリン特異的キナーゼが含まれる。１個のＫＸＧＳモチーフがＭＴ結合反復配列の各々で認められる。これらの部位でのリン酸化はタウ−ＭＴ結合の調節のために重要であり、リン酸化の程度は正常では低いが、ＡＤ患者からの脳組織では上昇していることが示された。ＫＸＧＳモチーフ内の１個の特定残基、Ｓｅｒ−２６２のリン酸化が、ＡＤにおけるＮＦＴから抽出されたタウタンパク質では上昇していることが示されており［Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６７：１７０４７−１７０５４］、この部位のリン酸化はまた、ＭＴ結合を劇的に低下させると思われる［Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ  １１：１５３−１６３］。
【００１０】
従って、タウの過剰リン酸化を制御するため、従って（潜在的に）ＡＤおよび他のタウオパシーを治療するまたは予防するためのキナーゼ阻害剤の使用には多大の関心が寄せられている。特に興味深い標的は微小管親和性調節キナーゼ（ＭＡＲＫ）であり、それは、ＭＡＲＫが、Ｓｅｒ−２６２でタウをリン酸化し、それによって他のキナーゼによるさらなるリン酸化のためにタウをプライムする上での「マスターキナーゼ」として働くことの証拠が存在するからである［Ｄｒｅｗｅｓ，Ｇ．（２００４）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ  ２９：５４８−５５５］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＡＤおよび他のタウオパシーを治療するまたは予防することを目的として、脳セリン／トレオニンキナーゼの阻害を含む、タウの過剰リン酸化を制御する選択的手段に関する。脳セリン／トレオニンキナーゼ（ＢＲＳＫ、脳特異的キナーゼとしても公知である）は、２つのアイソフォーム（ＢＲＳＫ１とＢＲＳＫ２）でヒト脳において発現されるキナーゼであり、これまでＡＤまたは関連状態の制御における薬剤化可能な標的として示唆されたことはなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明によれば、
（ｉ）ＢＲＳＫを、ＡＴＰおよび試験化合物の存在下に、リン酸化可能なセリン残基を含むペプチド基質と共に、前記セリン残基のリン酸化と適合性の条件下でインキュベーションする段階；
（ｉｉ）ペプチド基質が前記セリン残基でリン酸化された程度を測定する段階；および
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得た結果を、試験化合物の不在下で実施した対応するブランクインキュベーションから得た結果と比較する段階
を含む、アルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態の治療または予防における使用に適した化合物を選択するためのスクリーニング方法が提供される。
【００１３】
本発明はさらに、アルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態の治療または予防のための薬剤の製造のためのＢＲＳＫ阻害剤の使用を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＢＲＳＫ阻害剤の治療有効用量をこの必要のある患者に投与することを含む、アルツハイマー病またはタウの異常リン酸化を含む他の状態を治療するまたは予防する方法を提供する。
【００１５】
ここで使用する、「ＢＲＳＫ阻害剤」という用語は、本発明のスクリーニング方法において試験したとき、ブランクインキュベーションから得たものと比較してリン酸化の程度の低下を生じさせる化合物を指す。
【００１６】
上記スクリーニング方法において使用されるＢＲＳＫは、典型的には宿主細胞からの組換え発現によって得られ、ＵｐｓｔａｔｅまたはＤｕｎｄｅｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより入手可能である。２つのアイソフォーム、ＢＲＳＫ１およびＢＲＳＫ２のいずれもが使用され得る。
【００１７】
本発明者らは、ＢＲＳＫ１およびＢＲＳＫ２のキナーゼドメインが、ＭＡＲＫアイソフォーム、ＭＡＲＫ１−４の対応するドメインと高度の相同性を有することを確認しており、ＢＲＳＫはＭＡＲＫと同様の方法でタウのリン酸化のためのマスターキナーゼとして働くという仮説が立てられる。この仮説の裏付けとして、本発明者らはさらに、ＢＲＳＫ１とＢＲＳＫ２が、Ｓｅｒ−２６２でタウをリン酸化することが示されたマウスキナーゼＳＡＤ−ＡおよびＳＡＤ−Ｂのヒト相同体であることを確認し［Ｋｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（２００５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：９２９−９３２］、ＢＲＳＫ１およびＢＲＳＫ２がＳｅｒ−２６２でタウをリン酸化することを明らかにした。
【００１８】
上記経路によって特定されたＢＲＳＫの阻害剤は、ＢＲＳＫに対して選択的に活性な化合物、または両方の酵素に対して活性な化合物を特定することを目的として、ＭＡＲＫに対する活性に関してさらにスクリーニングされ得る。化合物の両方のタイプが、以下で論じる理由から、有用と考えられる。
【００１９】
ＭＡＲＫはＣＮＳおよび他の組織内で広く発現されるが、ＢＲＳＫの発現は脳に限定される。従って、ＭＡＲＫよりもＢＲＳＫに選択的である阻害剤は、神経細胞特異的におよび望ましくない末梢作用への傾向を抑えつつ、タウのリン酸化を阻害し得る。他方で、ＢＲＳＫとＭＡＲＫの両方に対して活性な化合物は、ＢＲＳＫとＭＡＲＫが異なる段階によってタウをリン酸化することの証拠が存在するので、タウリン酸化のより強力な阻害剤を提供すると考えられる。ＭＡＲＫの場合、リン酸化は１４−３−３タンパク質の結合を含み、一方ＢＲＳＫによるリン酸化はこれを含まない。従って、ＢＲＳＫ／ＭＡＲＫ二元阻害剤は、２つの別々のリン酸化経路を遮断する可能性を提供する。
【００２０】
上記方法によって特定されるＢＲＳＫの阻害剤は、ＢＲＳＫに対して選択的な化合物を特定することを目的として、好ましくは、Ｃｄｋ−５、ＰＫＡ、ＧＳＫ３βおよびＣａＭＫＩＩなどの他のキナーゼに対してカウンタースクリーニングされる。ＢＲＳＫに対して選択的な化合物は、ＡＤまたは他のタウオパシーの治療のために使用されるとき、望ましくない副作用を生じさせる可能性がより低いからである。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法において、ペプチド基質は、原則として、Ｓｅｒ−２６２部位を含むタウ自体またはこのフラグメントを含めて、適切なセリン残基を含むいかなるペプチドでもよい。好ましい基質は、商業的に入手可能である適切に標識された形態の、Ｃｄｃ２５Ｃペプチドである。Ｃｄｃ２５Ｃペプチドは、Ｓｅｒ−２１６部位を含む完全長Ｃｄｃ２５Ｃタンパク質のフラグメントであり、本発明者らは、ＢＲＳＫが前記Ｓｅｒ−２１６部位でＣｄｃ２５Ｃをリン酸化することを確認した。
【００２２】
上述したスクリーニング方法において、リン酸化の程度の測定は、当業者に公知の標準的方法のいずれかを含み得る。非常に適切には、段階（ｉ）で使用されるペプチド基質は蛍光基で標識され、この蛍光特性の変化がリン酸化の程度の測定として使用される。そこで、１つの実施形態では、ペプチド基質は蛍光基で標識され、段階（ｉｉ）は、蛍光基の蛍光の分極を誘導する金属配位錯体へのリン酸化ペプチドの結合を含み、リン酸化の程度は蛍光分極の程度によって指示される。適切な蛍光標識基はフルオレセインである。適切に標識されたＣｄｃ２５Ｃペプチドは、ＩＭＡＰ（登録商標）の商標名で、適切な金属錯体および他の試薬と共に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．より市販されている。
【００２３】
選択的実施形態では、ペプチド基質は蛍光受容基で標識され、段階（ｉｉ）は、蛍光供与基で標識された抗体へのリン酸化ペプチドの結合を含み、リン酸化の程度は蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）分析によって（すなわち供与基の励起波長での照射に応答した受容基の蛍光を観測することによって）測定される。非常に適切には、供与基の励起波長での照射に応答した、受容基と供与基の両方の蛍光を測定し、この２つの比をリン酸化の程度の測定として使用する。好ましくは、受容基の蛍光は、ホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）分析として公知の手法において、エネルギー転移から生じる長期間蛍光を直接励起によって引き起こされる短期間蛍光から区別するために、時間分解ベースで測定される。適切な蛍光供与基および受容基標識試薬は、例えばＣｉｓｂｉｏから、市販されている。供与基は、典型的には基質上のリン酸化セリン部位についての抗体に結合したＥｕ３＋クリプテート錯体である。受容基は、適切には、ビオチニル化ペプチド基質に容易に結合する、例えばＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＸＬ６６５およびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＸＬｅｎｔ！の商標名でＣｉｓｂｉｏによって供給されるストレプトアビジン複合形態の、アロフィコシアニンである。従って、本発明のこの実施形態における使用のための好ましい基質は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている、ビオチニル化Ｃｄｃ２５Ｃである。ＨＴＲＦの総説については、Ｋｏｌｂ  Ａ，Ｂｕｒｋｅ  Ｊ，Ｍａｔｈｉｓ  Ｇ．，Ａ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ，Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ：Ｄｅｖｌｉｎ  ＪＰ，Ｅｄ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９９７．３４５−６０参照。
【００２４】
他のキナーゼ（例えばＭＡＲＫ、Ｃｄｋ−５およびＰＫＡ）に対するカウンタースクリーニングは、ＢＲＳＫを適切なキナーゼに置き換えて、類似の方法によって実施し得る。
【００２５】
本発明の１つの実施形態では、選択的ＢＲＳＫ阻害剤は、アルツハイマー病または他のタウオパシーの治療または予防において、もしくはアルツハイマー病または他のタウオパシーの治療または予防のための薬剤の製造において使用される。本発明のもう１つの実施形態では、ＢＲＳＫとＭＡＲＫの両方を阻害することができる化合物がこれらの目的のために使用される。
【００２６】
本発明の方法によって特定されるＢＲＳＫ阻害剤は、式Ｉ：
【００２７】
【化２】
2009525039.tif 000002
［式中、Ｙはインドール環の４位または５位で結合しており、およびＸとＹは以下の表で指示されるとおりである。
【００２８】
【表２】
2009525039.tif 000003
2009525039.tif 000004
］の化合物および医薬的に許容されるこの塩を含む。
Ａｃ＝アセチル
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明は、アルツハイマー病または他のタウオパシーの治療のための薬剤の製造のための、上記で定義される式Ｉの化合物または医薬的に許容されるこの塩または水和物の使用を提供する。
【００３０】
ＢＲＳＫ阻害剤は、有効成分（例えば式Ｉの化合物または医薬的に許容されるこの塩）および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で患者に適切に投与される。
【００３１】
好ましくは、これらの組成物は、経口、非経口、鼻内、舌下または直腸投与のため、もしくは吸入またはガス注入による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、無菌非経口溶液または懸濁液、定量噴霧式エアロゾルまたは液体スプレー、点滴剤、アンプル、経皮パッチ、自動注射装置または坐薬などの単位投与形態である。主要有効成分は、典型的には製薬担体、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムおよびリン酸二カルシウムなどの従来の錠剤化成分、またはゴム、分散剤、懸濁化剤またはモノオレイン酸ソルビタンおよびポリエチレングリコールなどの界面活性剤、および本発明の化合物または医薬的に許容されるこの塩を含有する均質な予備製剤（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）組成物を形成するための他の製薬希釈剤、例えば水と混合される。これらの予備製剤組成物を均質と称するとき、有効成分が組成物全体に均質に分散しているので、組成物が錠剤、丸剤およびカプセルなどの等しく有効な単位投与形態に容易に細分され得ることが意味される。次に、この予備製剤組成物は、本発明の有効成分０．１−約５００ｍｇを含有する上述したタイプの単位投与形態に細分される。典型的な単位投与形態は、有効成分１−１００ｍｇ、例えば１、２、５、１０、２５、５０または１００ｍｇを含有する。組成物の錠剤または丸剤は、持続性作用の利点を与える投与形態を提供するために被覆され得るかもしくは調合され得る。例えば錠剤または丸剤は、内部投与成分と外部投与成分を含むことができ、後者は前者を覆う外皮の形態である。２つの成分は、胃内での崩壊に抗するのに役立ち、内部成分が十二指腸へと無傷で通過するまたは放出を遅延させることを可能にする腸溶性の層によって分離され得る。様々な材料がこのような腸溶層または剤皮のために使用でき、このような材料は、多くの高分子酸およびシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料と高分子酸の混合物を含む。
【００３２】
本発明において有用な組成物が経口的または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態は、水溶液、液状又はゲル充填カプセル、適切に香り付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、および綿実油、ゴマ油、ヤシ油又は落花生油などの食用油による着香乳剤、ならびにエリキシルおよび同様の製薬ビヒクルを含む。水性懸濁液のための適切な分散剤または懸濁化剤は、トラガカント、アカシアなどの合成および天然ゴム、アルギネート、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルピロリドン）またはゼラチンを含む。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、ＢＲＳＫ阻害剤は、ＡＤ、ＦＴＤＰ−１７、ピック病または前頭側頭型認知症、好ましくはＡＤに罹患している患者に投与される。
【００３４】
本発明の選択的実施形態では、ＢＲＳＫ阻害剤は、軽度の認知障害または加齢性認知低下に罹患している患者に投与される。このような治療の好ましい結果は、ＡＤの発症の予防または遅延である。加齢性認知低下および軽度認知障害（ＭＣＩ）は、記憶障害が存在するが、認知症についての他の診断判定基準は存在しない状態である（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ａｎｄ  Ｓｗａｇｅｒｔｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，６３（２００１），７０３−１３）。（「Ｔｈｅ  ＩＣＤ−１０  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」，Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，１９９２，６４−５も参照のこと）。ここで使用する、「加齢性認知低下」は、記憶および学習；注意力および集中力；思考；言語；および視覚空間機能の少なくとも１つの少なくとも６ヶ月間の低下、およびＭＭＳＥなどの標準化された神経心理学検査に関する標準値より低い２以上の標準偏差のスコアを意味する。特に、記憶の進行性低下が存在し得る。より重症の状態では、記憶障害の程度であるＭＣＩは、患者の年齢について正常とみなされる範囲外であるが、ＡＤは存在しない。ＭＣＩと軽度ＡＤの鑑別診断は、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，５６（１９９９），３０３−８によって述べられている。ＭＣＩの鑑別診断に関するさらなる情報は、Ｋｎｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，７８（２００３），１２９０−１３０８によって提供される。高齢被験者の試験において、Ｔｕｏｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ（Ａｒｃｈ，Ｎｅｕｒｏｌ．，６０（２００３）５７７−８２）は、最初にＭＣＩを示す高齢被験者は５年以内に認知症を発現する危険度が３倍高いことを認めた。
【００３５】
Ｇｒｕｎｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９（２００２），２３−２８）は、ＭＣＩ患者におけるより低い基線海馬容積はその後のＡＤについての予後指標であることを報告している。同様に、Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ，１０７（２００３）４７−５１）は、全タウの高いＣＳＦレベル、ホスホ−タウの高いＣＳＦレベルおよびＡβ４２の低いＣＳＦレベルはすべてＭＣＩからＡＤへの進行の高い危険度に結びつくと報告している。
【００３６】
この実施形態の中で、ＢＲＳＫ阻害剤は、記憶機能障害を患っているが、認知症の症状を示さない患者に好都合に投与される。記憶機能のこのような障害は、典型的には、下垂体機能不全によって引き起こされる発作または代謝異常などの、全身または大脳疾患には起因しない。このような患者は、特に５５歳以上の人々、特に６０歳以上の人々、好ましくは６５歳以上の人々であり得る。このような患者は、患者の年齢に関して正常な成長ホルモン分泌のパターンとレベルを有し得る。しかし、このような患者は、アルツハイマー病を発症するための１以上の付加的な危険因子を有し得る。このような因子は、この疾患の家族歴；疾患への遺伝的素因；高い血清コレステロール；および成人発症糖尿病を含む。
【００３７】
本発明の特定実施形態では、ＢＲＳＫ阻害剤は、ＡＤの家族歴；ＡＤへの遺伝的素因；高い血清コレステロール；成人発症糖尿病；高い基線海馬容積；全タウの高いＣＳＦレベル；ホスホ−タウの高いＣＳＦレベル；およびＡβ（１−４２）の低いＣＳＦレベルから選択される、ＡＤを発症するための１以上の危険因子を付加的に有する加齢性認知低下またはＭＣＩに罹患している患者に投与される。
【００３８】
遺伝的素因（特に早期発症ＡＤに対する）は、ＡＰＰ、プレセニリン−１およびプレセニリン−２遺伝子を含む、多くの遺伝子の１以上における点突然変異から生じ得る。また、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子のε４アイソフォームについてホモ接合である被験者は、ＡＤを発症する危険度がより大きい。
【００３９】
患者の認知低下または障害の程度は、本発明に従った治療経過の前、治療経過の期間中および／または治療経過後に規則正しい間隔で好都合に評価されるので、この変化、例えば認知低下の緩慢化または停止が検出され得る。年齢および教育に合わせて調節される標準値を有するミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）などの、様々な神経心理学的検査がこの目的のために当分野で公知である（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｓｙｃｈ．Ｒｅｓ．，１２（１９７５），１９６−１９８，Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄ．，１２（１９８２），３９７−４０８；Ｃｏｃｋｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２４（１９８８），６８９−６９２；Ｃｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ’ｎ．１８（１９９３），２３８６−２３９１）。ＭＭＳＥは、成人における認知状態の簡単で定量的な測定である。認知低下または障害に関してスクリーニングするため、所与の時点での認知低下または障害の重症度を評価するため、個人における認知変化の経過を経時的に追跡するため、および治療に対する個人の応答を記録するために使用できる。もう１つの適切な検査は、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）、特にこの認知エレメント（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）である（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１４１（１９８４），１３５６−６４参照）。
【００４０】
活性な化合物における、アルツハイマー病の治療もしくは予防のために適切な用量レベルは、体重に対して、１日当たり約０．０１−２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり約０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１日当たり約０．０５−５０ｍｇ／ｋｇである。化合物は、１日に１−４回の投薬計画において投与されてよい。しかし場合によっては、この制限外の用量が使用されてもよい。
【００４１】
ＢＲＳＫ阻害剤は、場合により、ＡＤまたはこの症状の治療または予防において有用であることが公知の１以上の付加的化合物と組み合わせて投与され得る。このような付加的な化合物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えばドネペジルおよびガランタミン）、ＮＭＤＡアンタゴニスト（例えばメマンチン）またはＰＤＥ４阻害剤（例えばＡｒｉｆｌｏ（商標）およびＷＯ０３／０１８５７９、ＷＯ０１／４６１５１、ＷＯ０２／０７４７２６およびＷＯ０２／０９８８７８に開示されている化合物のクラス）などの認知増強薬を含む。このような付加的な化合物はまた、スタチン、例えばシンバスタチンなどのコレステロール低下薬を含む。このような付加的な化合物は、同様に、Ａβの分泌を調節する化合物（γ−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼ調節剤およびβ−セクレターゼ阻害剤を含む）、Ａβの凝集を阻害する化合物、およびＡβに選択的に結合する抗体などの、脳におけるＡβの産生またはプロセシングを調節することが公知の化合物（「アミロイド調節剤」）を含む。このような付加的な化合物はさらに、例えばＷＯ２００４／０８０４５９に述べられているような、成長ホルモン分泌促進物質を含む。
【００４２】
本発明のこの実施形態では、アミロイド調節剤は、Ａβの分泌を阻害する化合物、例えばγ−セクレターゼの阻害剤（ＷＯ０１／９００８４、ＷＯ０２／３０９１２、ＷＯ０１／７０６７７、ＷＯ０３／０１３５０６、ＷＯ０２／３６５５５、ＷＯ０３／０９３２５２、ＷＯ０３／０９３２６４、ＷＯ０３／０９３２５１、ＷＯ０３／０９３２５３、ＷＯ２００４／０３９８００、ＷＯ２００４／０３９３７０、ＷＯ２００５／０３０７３１、ＷＯ２００５／０１４５５３、ＷＯ２００４／０８９９１１、ＷＯ０２／０８１４３５、ＷＯ０２／０８１４３３、ＷＯ０３／０１８５４３、ＷＯ２００４／０３１１３７、ＷＯ２００４／０３１１３９、ＷＯ２００４／０３１１３８、ＷＯ２００４／１０１５３８、ＷＯ２００４／１０１５３９およびＷＯ０２／４７６７１に開示されているものなど）、またはβ−セクレターゼ阻害剤（ＷＯ０３／０３７３２５、ＷＯ０３／０３０８８６、ＷＯ０３／００６０１３、ＷＯ０３／００６０２１、ＷＯ０３／００６４２３、ＷＯ０３／００６４５３、ＷＯ０２／００２１２２、ＷＯ０１／７０６７２、ＷＯ０２／０２５０５、ＷＯ０２／０２５０６、ＷＯ０２／０２５１２、ＷＯ０２／０２５２０、ＷＯ０２／０９８８４９およびＷＯ０２／１００８２０に開示されているものなど）、またはＷＯ９８／２８２６８、ＷＯ０２／４７６７１、ＷＯ９９／６７２２１、ＷＯ０１／３４６３９、ＷＯ０１／３４５７１、ＷＯ００／０７９９５、ＷＯ００／３８６１８、ＷＯ０１／９２２３５、ＷＯ０１／７７０８６、ＷＯ０１／７４７８４、ＷＯ０１／７４７９６、ＷＯ０１／７４７８３、ＷＯ０１／６０８２６、ＷＯ０１／１９７９７、ＷＯ０１／２７１０８、ＷＯ０１／２７０９１、ＷＯ００／５０３９１、ＷＯ０２／０５７２５２、ＵＳ２００２／００２５９５５およびＵＳ２００２／００２２６２１に開示されているものを含む、およびまたＰｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４２３（２００３）４３５−９に開示されているような、ＧＳＫ−３阻害剤、特にリチウムなどのＧＳＫ−３α阻害剤を含む、Ａβの形成または放出を阻害する何らかの他の化合物であり得る。
【００４３】
もしくは、アミロイド調節剤は、Ａβ（１−４２）の産生を選択的に減衰させるようにγ−セクレターゼの作用を調節する化合物であり得る。この作用を示すことが報告された化合物は、ある種の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびこれらの類似体（ＷＯ  ０１／７８７２１およびＵＳ２００２／０１２８３１９およびＷｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１４（２００１）２１２−１６；Ｍｏｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，８３（２００２），１００９−１２；およびＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（２００３），１８６４４−７０参照）、およびＰＰＡＲαおよび／またはＰＰＡＲδ（ＷＯ０２／１００８３６）の活性を調節する化合物を含む。γ−セクレターゼ調節剤のさらなる例は、ＷＯ２００５／０５４１９３、ＷＯ２００５／０１３９８５、ＷＯ２００５／１０８３６２、ＷＯ２００６／００８５５８およびＷＯ２００６／０４３０６４に開示されている。
【００４４】
もしくは、アミロイド調節剤は、Ａβの凝集を阻害するまたはさもなければ神経毒性を減衰させる化合物であり得る。適切な例は、クリオキノール（Ｇｏｕｒａｓ  ａｎｄ  Ｂｅａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，３０（２００１），６４１−２）などのキレート化剤およびＷＯ９９／１６７４１に開示されている化合物、特にＤＰ−１０９として公知のもの（Ｋａｌｅｎｄａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，２４（２００１），９６７−７５）を含む。本発明における使用に適するＡβ凝集の他の阻害剤は、Ａｐａｎ（商標）（Ｐｒａｅｃｉｓ）として公知の化合物を含む、ＷＯ９６／２８４７１、ＷＯ９８／０８８６８およびＷＯ００／０５２０４８に開示されている化合物；ＷＯ００／０６４４２０、ＷＯ０３／０１７９９４、ＷＯ９９／５９５７１（特にトラミプロセートまたはＡｌｚｈｅｍｅｄ（商標）としても公知である、３−アミノプロパン−１−スルホン酸）；ＷＯ００／１４９２８１およびＰＴＩ−７７７およびＰＴＩ−００７０３（ＰｒｏｔｅｏＴｅｃｈ）として公知の組成物；ＷＯ９６／３９８３４、ＷＯ０１／８３４２５、ＷＯ０１／５５０９３、ＷＯ００／７６９８８、ＷＯ００／７６９８７、ＷＯ００／７６９６９、ＷＯ００／７６４８９、ＷＯ９７／２６９１９、ＷＯ９７／１６１９４およびＷＯ９７／１６１９１に開示されている化合物を含む。さらなる例は、ＵＳ４，８４７，０８２に開示されているようなフィチン酸誘導体およびＵＳ２００４／０２０４３８７において教示されるようなイノシトール誘導体を含む。
【００４５】
もしくは、アミロイド調節剤は、Ａβに選択的に結合する抗体であり得る。前記抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、好ましくはモノクローナルであり、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。好ましくは、抗体は、ＷＯ０３／０１６４６６、ＷＯ０３／０１６４６７、ＷＯ０３／０１５６９１およびＷＯ  ０１／６２８０１に述べられているように、生体液から可溶性Ａβを分離することができる。適切な抗体は、ヒト化抗体２６６（ＷＯ０１／６２８０１に述べられている）およびＷＯ０３／０１６４６６に述べられているこの修飾型を含む。適切な抗体はまた、ＷＯ２００４／０３１４００に開示されているような、Ａβ由来の拡散性リガンド（ＡＤＤＬＳ）に特異的なものを含む。
【００４６】
ここで使用する、「と組み合わせて」という表現は、ＢＲＳＫ阻害剤と付加的な化合物の両方の治療有効量が被験者に投与されるが、これを達成する方法には何の制限も設けないことを必要とする。従って、２つの種は、被験者への同時投与のために単一投与形態中で組み合わされ得るか、または被験者への同時または連続投与のために別々の投与形態中で提供され得る。連続投与は時間的に近くてもまたは離れていてもよく、例えば１つの種は午前中に投与され、他方は夕方に投与され得る。別々の種は、同じ頻度または異なる頻度で投与されてもよく、例えば１つの種は１日１回、他方は１日２回以上投与され得る。別々の種は、同じ経路によってまたは異なる経路によって投与されてもよく、例えば１つの種は経口的に、他方は非経口的に投与され得るが、可能な場合には、両方の種の経口投与が好ましい。付加的な化合物が抗体であるとき、典型的には非経口的におよびＢＲＳＫ阻害剤とは別個に投与される。
【実施例】
【００４７】
ＢＲＳＫ阻害剤のためのＩＭＡＰスクリーニング方法
試験材料
ＡＴＰ                          Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ａ６４１９
ＦＡＭ−Ｃｄｃ２５Ｃペプチド    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｎｏ．Ｒ７２７５
ＩＭＡＰ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＫｉｔとＰｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ      Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｎｏ．Ｒ８１２７
３８４穴黒色プレート            Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｎｏ．３７１０
スタウロスポリン                Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｎｏ．１９−１２３
ＢＲＳＫ１（ヒト、組換え）      Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｎｏ．１４−６７５
ＢＲＳＫ２（ヒト、組換え）      Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｎｄｅｅ
ＤＴＴ                          Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｄ９７７９
試験方法
１．ＡＴＰ、ＤＴＴおよびＦＡＭ−Ｃｄｃ２５Ｃ基質を解凍する
２．氷上で酵素を解凍する
３．１ｍＭ  ＤＴＴと共に完全反応緩衝液を調製する
（ｉ）１×ＩＭＡＰ反応緩衝液９９ｍｌ
（ｉｉ）１００ｍＭ  ＤＴＴ１ｍｌ
４．阻害剤を調製する
（ｉ）化合物ストックをＤＭＳＯ中で１ｍＭに希釈する
（ｉｉ）４０×最終濃度範囲の濃度を与えるように化合物をＤＭＳＯ中で連続希釈する
（ｉｉｉ）４×化合物濃度範囲の濃度を与えるように完全反応緩衝液を使用して１：１０希釈する
（ｉｖ）最終濃度範囲の濃度を与えるようにアッセイプレートに１：４希釈する
５．酵素を調製する
（ｉ）酵素を完全反応緩衝液中で４×最終濃度（１２０ｎＭ）に希釈する
（ｉｉ）５μｌをアッセイプレートに移す
（ｉｉｉ）室温で２分間振とうし、放置して室温で５分間インキュベーションする
６．基質／ＡＴＰ混合物を調製する
（ｉ）ＡＴＰを完全反応緩衝液に添加して２００μＭ（２×最終濃度）にする
（ｉｉ）Ｃｄｃ２５Ｃ基質を添加して１００ｎＭ（２×最終濃度）にする
（ｉｉｉ）１０μｌをアッセイプレートに移す
（ｉｖ）室温で２分間振とうし、遮光する
７．室温で１時間インキュベーションし、遮光する
８．ＩＭＡＰビーズを調製する
（ｉ）１００ｍｌにつき、１×緩衝液Ａ７５ｍｌおよび１×緩衝液Ｂ２５ｍｌを添加する
（ｉｉ）ビーズ１６７μｌを添加する（１／６００希釈）
（ｉｉｉ）６０μｌをアッセイウエルに添加する
９．室温で１時間インキュベーションし、遮光する
１０．蛍光分極可能リーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｅｎａｂｌｅｄ  ｒｅａｄｅｒ）で読み取る
【００４８】
ＢＲＳＫ阻害剤のためのＨＴＲＦスクリーニング方法
試験材料
ＡＴＰ                                          Ｓｉｇｍａ
Ｃｄｃ２５Ｃビオチニル化ペプチド              Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｒ  １４−３−３結合モチーフマウス抗体      Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ユウロピウムクリプテート抗体複合体（ＥｕＫ）    ＣｉｓＢｉｏ
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＸＬｅｎｔ！６６５        Ｃｉｓｂｉｏ
３８４穴低容量黒色プレート                      Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ
スタウロスポリン                                Ｕｐｓｔａｔｅ
ＢＲＳＫ１（ヒト、組換え）                      Ｕｐｓｔａｔｅ
ＢＲＳＫ２（ヒト、組換え）            Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｎｄｅｅ
ＤＴＴ                                          Ｓｉｇｍａ
試験方法
１．ＡＴＰ、ＤＴＴおよびビオチン−ｃｄｃ２５Ｃ基質を解凍する
２．氷上で酵素を解凍する
３．キナーゼ反応緩衝液を調製する
（ｉ）２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
（ｉｉ）５ｍＭ  β−グリセロホスフェート
（ｉｉｉ）２ｍＭ  ＤＴＴ
（ｉｖ）０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４
（ｖ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
（ｖｉ）アッセイの日に０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加する
４．阻害剤を調製する
（ｖｉｉ）化合物ストックをＤＭＳＯ中で１ｍＭに希釈する
（ｖｉｉｉ）３０×最終濃度範囲を与えるように化合物をＤＭＳＯ中で連続希釈する
（ｉｘ）３×最終濃度範囲の濃度を与えるようにキナーゼ反応緩衝液中で１：１０希釈する
（ｘ）最終濃度範囲の濃度を与えるようにアッセイプレートに１：３希釈する
５．酵素を調製する
（ｘｉ）酵素をキナーゼ反応緩衝液中で３０ｎＭ（３×最終濃度）に希釈する
（ｘｉｉ）５μｌをアッセイプレートに移す
（ｘｉｉｉ）室温で２分間振とうし、放置して室温で５分間インキュベーションする
６．基質／ＡＴＰ混合物を調製する
（ｘｉｖ）３×ＡＴＰを反応緩衝液に添加する
（ｘｖ）３×最終濃度を与えるようにビオチン−Ｃｄｃ２５Ｃ基質を添加する
（ｘｖｉ）５μｌをアッセイプレートに移す
（ｘｖｉｉ）室温で２分間振とうする
７．３０℃で２時間インキュベーションする
８．停止緩衝液を調製する
（ｘｖｉｉｉ）５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８
（ｘｉｘ）０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
（ｘｘ）０．５Ｍ  ＫＦ
（ｘｘｉ）０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０
（ｘｘｉｉ）１５ｍＭ  ＥＤＴＡ
（ｘｘｉｉｉ）１：２１５  ＥｕＫ標識抗体
（ｘｘｉｖ）１：５００  １ｍｇ／ｍｌ  ＳＡ−ＸＬｅｎｔ６６５
９．停止緩衝液５μｌをアッセイプレートに移す
１０．４℃で一晩インキュベーションする
１１．ＨＴＲＦ可能リーダーでプレートを読み取る
【００４９】
（合成実施例）
（実施例１）
３−｛５−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
段階１：３−アミノ−４−メチルベンゾニトリル（１−２）
エタノール（１００ｍＬ）中の３−ニトロ−ｐ−トルニトリル（９．３０ｇ、５７．４  ｍｍｏｌ、１当量）および１０％Ｐｄ／Ｃ（４．００ｇ、３．７６ｍｍｏｌ、０．０６６当量）の混合物を水素バルーン下に２３℃で２０時間攪拌した。触媒をセライトパッドを通してろ過し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮して、３−アミノ−４−メチルベンゾニトリル（１−２）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９，１．５Ｈｚ），６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），３．７８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ）実測値１７４．２、要求値１７４．１。
【００５０】
段階２：１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
水（２０ｍＬ）中の硝酸ナトリウム（４．１４ｇ、５９．９ｍｍｏｌ、１．１０当量）の溶液を、水（５０ｍＬ）中の３−アミノ−４−メチルベンゾニトリル（１−２、７．２ｇ、５４．５ｍｍｏｌ、１当量）と濃塩酸水溶液（１２Ｍ、１３．６ｍＬ、１６３ｍｍｏｌ、３．００当量）のあらかじめ冷却しておいた（−１０℃）混合物に、０℃未満の反応混合物温度を保持する速度で緩やかに添加した。添加後、反応混合物を−５℃で３０分間攪拌し、その後ろ過した。水（１００ｍＬ）中のテトラフルオロホウ酸ナトリウム（１７．９ｇ、１６３ｍｍｏｌ、３．００当量）の溶液を低温ろ液に直ちに添加した。沈殿物をろ過し、氷冷水（３０ｍＬ）で洗浄した。残存する固体を空気乾燥して、５−シアノ−２−メチルベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラートを白色固体として得た。クロロホルム（１５０ｍＬ）中のこの生成物（１１．７ｇ、５０．７ｍｍｏｌ、１当量）、酢酸カリウム（１２．４ｇ、１２７ｍｍｏｌ、２．５０当量）および１８−クラウン−６（１．３４ｇ、５．０７ｍｍｏｌ、０．１００当量）の懸濁液を２３℃で２０時間攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮した。残留物を水とＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に分配した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−３）を明黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，０．９Ｈｚ），７．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３，１．５Ｈｚ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ）実測値１８５．１、要求値１８５．０。
【００５１】
段階３：３−ヨード−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−４）
ＤＭＦ（７５ｍＬ）中の１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−３、４．７ｇ、３２．８ｍｍｏｌ、１当量）、ヨウ素（１８．３ｇ、７２．２ｍｍｏｌ、２．２０当量）および水酸化カリウム（４．４２ｇ、７８．８ｍｍｏｌ、２．４０当量）の混合物を２３℃で５時間攪拌した。反応混合物を、飽和塩化ナトリウム水溶液および飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の１：１混合物と酢酸エチル（２×３００ｍＬ）に分配した。併合有機層を水、次いでブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、３−ヨード−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−４）を明黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，０．９Ｈｚ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ）実測値３１１．１、要求値３１１．０。
【００５２】
段階４：ｔｅｒｔ−ブチル５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−６）
ＴＨＦ中の水素化アルミニウムリチウムの溶液（１．０Ｍ、１８０ｍＬ、１８０ｍｍｏｌ、１．５０当量）を、０℃のＴＨＦ（４００ｍＬ）中のメチル１Ｈ−インドール−５−カルボキシラート（１−５、２１．０ｇ、１２０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に２０分間にわたって添加した。反応混合物を２３℃に温め、その後４０℃で２時間加熱した。反応混合物を氷水（１リットル）に注ぎ入れ、次に酢酸エチル（２×５００ｍＬ）で抽出した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、１Ｈ−インドール−５−イルメタノールを白色固体として得た。ジクロロメタン（３００ｍＬ）中の１Ｈ−インドール−５−イルメタノール（１８．０ｇ、１２２ｍｍｏｌ、１当量）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（２０．３ｇ、１３５ｍｍｏｌ、１．１０当量）、トリエチルアミン（４３．４ｍＬ、２４５ｍｍｏｌ、２．００当量）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．４９ｇ、１２．２ｍｍｏｌ、０．１００当量）の溶液を２３℃で２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残留物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチル（４００ｍＬ）に分配した。有機層を０．５Ｎ塩酸水溶液、次いでブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。ジクロロメタン（３００ｍＬ）中の残留油（５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（２９．４ｇ、１３５ｍｍｏｌ、１．１０当量）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．４９ｇ、１２．２ｍｍｏｌ、０．１００当量）の溶液を２３℃で３時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初ヘキサンで、ヘキサン中２０％酢酸エチルへの勾配）によって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−６）を無色の油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０７（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．５８（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．２５（ＣＨＣｌ３がｄｄを不明瞭にした，１Ｈ），６．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），４．８２（ｓ，２Ｈ），１．６７（ｓ，９Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．１１（ｓ，６Ｈ）。
【００５３】
段階５：１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イルボロン酸（１−７）
−７８℃のＴＨＦ中のＬＤＡの溶液（０．７７３Ｍ、２００ｍＬ、１５５ｍｍｏｌ、１．３０当量）を、カニューレを通して−７８℃のＴＨＦ（４００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−６、４３．０ｇ、１１９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加し、生じた混合物を４５分間攪拌した。トリメチルボラート（２７．０ｍＬ、２３８ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加し、生じた混合物を０℃に温めて、３０分間この温度に保持した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液と酢酸エチル（２×２００ｍＬ）に分配した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イルボロン酸（１−７）をオフホワイト色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，１．７Ｈｚ），６．６２（ｓ，１Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），１．６８（ｓ，９Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．１１（ｓ，６Ｈ）。
【００５４】
段階６：ｔｅｒｔ−ブチル２−（６−シアノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−８）
ジオキサン（３００ｍＬ）中の３−ヨード−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−４、５．００ｇ、１８．６ｍｏｌ、１当量）、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イルボロン酸（１−７、９．０４ｇ、２２．３ｍｍｏｌ、１．２０当量）、塩化リチウム（２．３６ｇ、５５．８ｍｍｏｌ、３．００当量）、炭酸ナトリウム水溶液（２Ｍ、４６．５ｍＬ、９２．９ｍｍｏｌ、５．００当量）、およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（１．０７ｇ、０．９２９ｍｏｌ、０．０５０当量）の脱酸素化混合物を窒素下に９０℃で２０時間加熱した。さらなる１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イルボロン酸（１−７、３．７７ｇ、９．３０ｍｍｏｌ、０．５００当量）を添加し、５時間加熱を続けた。反応混合物を半飽和塩化ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×３００ｍＬ）に分配した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。アセトニトリル（３００ｍＬ）中の残留物およびトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の溶液（１５．４ｍＬ、９２．９ｍｍｏｌ、５．００当量）を５０℃で３時間加熱した。反応混合物を濃縮し、残留物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×３００ｍＬ）に分配した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初ヘキサンで、ヘキサン中６０％ＥｔＯＡｃへの勾配）によって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル２−（６−シアノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−８）を橙色の泡として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１２．０３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．５９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．７Ｈｚ），７．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．０Ｈｚ），６．９１（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），１．２０（ｓ，９Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ−ｔ−Ｂｕ）実測値３３３．３、要求値３３３．１。
【００５５】
段階７：ｔｅｒｔ−ブチル２−（６−シアノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−ホルミル−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−９）
ジクロロメタン（３００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（６−シアノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−８、４．００ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、１当量）および酸化マンガン（ＩＶ）（４．４８ｇ、５１．５ｍｍｏｌ、５．００当量）の混合物を４０℃で２時間加熱した。さらなるＭｎＯ２（４．４８ｇ、５１．５ｍｍｏｌ、５．００当量）を添加して、２時間加熱を続けた。固体をろ過し、ジクロロメタン（合計４００ｍＬ）と酢酸エチル（合計４００ｍＬ）で繰り返し洗浄した。併合ろ液を濃縮し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初ヘキサンで、ヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃへの勾配）によって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル２−（６−シアノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−ホルミル−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−９）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．４９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．１２（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），７．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ），７．９４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．２Ｈｚ），６．９１（ｓ，１Ｈ），１．２１（ｓ，９Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ−ｔ−Ｂｕ）実測値３３１．２、要求値３３１．１。
【００５６】
段階８：３−｛５−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
１，２−ジクロロメタン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（６−シアノ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５−ホルミル−１Ｈ−インドール−１−カルボキシラート（１−９、９９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１当量）、１−アセチルピペラジン（４９ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．５当量）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（８１ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．５当量）の混合物を２３℃で４０分間攪拌した。さらなる１−アセチルピペラジン（４９ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．５０当量）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（８１ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、２時間攪拌を続けた。希薄重炭酸ナトリウム水溶液で反応を停止させ、水と酢酸エチル（３×５０ｍＬ）に分配した。併合有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残留油をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸の１：１混合物に溶解し、３時間放置した。溶液を濃縮し、残留物を逆相液体クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配  ｗ／０．１％ＴＦＡが存在）によって精製した。所望画分を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×５０ｍＬ）に分配した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、３−｛５−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリルを遊離塩基（明褐色固体）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．７５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．０８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．８９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．６０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．２Ｈｚ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．７Ｈｚ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），３．６５（ｓ，２Ｈ），３．４９（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，４Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３９９．４、要求値３９９．２。
【００５７】
（実施例２から９）
実施例１の方法の簡単な修正によって以下を調製した。
【００５８】
（実施例２）
３−［５−（ピペラジン−１−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３５７．４、要求値３５７．２。
【００５９】
（実施例３）
３−（５−｛［（２−アミノエチル）アミノ］メチル｝−１Ｈ−インドール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３３１．３、要求値３３１．２。
【００６０】
（実施例４）
３−（５−｛［（４−アミノシクロヘキシル）アミノ］メチル｝−１Ｈ−インドール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３８５．３、要求値３８５．２。
【００６１】
（実施例５）
３−（４−｛［４−（アミノメチル）ピペリジン−１−イル］メチル｝−１Ｈ−インドール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３８５．５、要求値３８５．２。
【００６２】
（実施例６）
３−［４−（｛［１−（ピリジン−４−イルメチル）ピペリジン−４−イル］アミノ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４６２．２、要求値４６２．２。
【００６３】
（実施例７）
３−［４−（｛［（ｌ−メチルピペリジン−４−イル）メチル］アミノ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３９９．２、要求値３９９．２。
【００６４】
（実施例８）
３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３５８．４、要求値３５８．２。
【００６５】
（実施例９）
３−［４−（｛［２−（ｔｅｒｔ−ブチルチオ）エチル］アミノ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４０４．２、要求値４０４．２。
【００６６】
（実施例１０）
メチル３−（４−｛［２−（６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−インドール−４−イル］メチル｝ピペラジン−１−イル）ブタノエート
ＷＯ２００３／０２４９６９に述べられているように調製した。
【００６７】
（実施例１１）
３−｛５−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１Ｈ−インダゾール
ジメチルアセトアミドとトルエンの１：５混合物中の３−｛５−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（実施例１、９０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）、およびアジドトリメチルチン（４７９ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ、１０．０当量）の混合物を１１０℃で１８時間加熱した。反応混合物を濃縮し、残留物を逆相ＬＣ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配  ｗ／０．１％  ＴＦＡが存在）によって精製し、３−｛５−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］−１Ｈ−インドール−２−イル｝−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１Ｈ−インダゾール（８−１）をＴＦＡ塩（明黄色固体）として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４４２．６、要求値４４２．２。
【００６８】
（実施例１２）
３−（５−｛［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル｝−１Ｈ−インドール−２−イル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１Ｈ−インダゾール
実施例１１と類似の方法で調製した。
ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４７８．４、要求値４７８．２。
【００６９】
（実施例１３）
メチル３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート
段階１：メチル１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート
水（２５ｍＬ）中の硝酸ナトリウム（４．１８ｇ、６０．５ｍｍｏｌ、２．００当量）の溶液を、水（５０ｍＬ）中のメチル３−アミノ−４−メチルベンゾアート（５．００ｇ、３０．３ｍｍｏｌ、１．００当量）と濃塩酸水溶液（１２Ｍ、７．６ｍＬ、９０．８ｍｍｏｌ、３．００当量）のあらかじめ冷却しておいた（−１０℃）混合物に、０℃未満の反応混合物温度を保持する速度で緩やかに添加した。添加後、反応混合物を−５℃で３０分間攪拌し、その後ろ過した。水（４０ｍＬ）中のテトラフルオロホウ酸ナトリウム（９．９７ｇ、９０．８ｍｍｏｌ、３．００当量）の溶液を低温ろ液に直ちに添加した。沈殿物をろ過し、氷冷水（５０ｍＬ）で洗浄した。残存する固体を空気乾燥して、５−（メトキシカルボニル）−２−メチルベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラートを白色固体として得た。クロロホルム（７５ｍＬ）中のこの生成物（５．００ｇ、２８．２ｍｍｏｌ、１当量）、酢酸カリウム（６．９２ｇ、７０．６ｍｍｏｌ、２．５０当量）および１８−クラウン−６（７４６ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ、０．１００当量）の懸濁液を２３℃で７２時間攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮した。残留物を水とＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に分配した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、メチル１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−２）を橙色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２０（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９Ｈｚ），７．８９（ｄ，１Ｈ，８．５Ｈｚ），７．６８，（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，１．５Ｈｚ），３．９０（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１７７．１、要求値１７７．１。
【００７０】
段階２：メチル３−ヨード−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−３）
ＤＭＦ（７０ｍＬ）中のメチル１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−２、３．９９ｇ、２２．６ｍｍｏｌ、１当量）、ヨウ素（１２．６ｇ、４９．８ｍｍｏｌ、２．２０当量）および水酸化カリウム（３．０５ｇ、５４．４ｍｍｏｌ、２．４０当量）の混合物を２３℃で１５時間攪拌した。反応混合物を、飽和塩化ナトリウム水溶液および飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の１：１混合物と酢酸エチル（２×３００ｍＬ）に分配した。併合有機層を水、次いでブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、メチル３−ヨード−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−３）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１１．６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），７．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，１．２Ｈｚ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．９８（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３０３．１、要求値３０３．０。
【００７１】
段階３：メチル３−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−４）
ジオキサン（２０ｍＬ）中のメチル３−ヨード−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−３、２．１１ｇ、６．９７ｍｏｌ、１当量）、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イルボロン酸（１−７、３．３９ｇ、８．３７ｍｍｏｌ、１．２０当量）、塩化リチウム（８８７ｍｇ、２０．９ｍｍｏｌ、３．００当量）、炭酸ナトリウム水溶液（２Ｍ、１７．４ｍＬ、３４．９ｍｍｏｌ、５．００当量）、およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（４０３ｍｇ、０．３４９ｍｍｏｌ、０．０５０当量）の脱酸素化混合物を窒素下に９０℃で２０時間加熱した。反応混合物を半飽和塩化ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×２００ｍＬ）に分配した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。アセトニトリル（５０ｍＬ）中の残留物およびトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の溶液（５．６８ｍＬ、３４．９ｍｍｏｌ、５．００当量）を５０℃で６時間加熱した。反応混合物を濃縮し、残留物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×２００ｍＬ）に分配した。併合有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初ヘキサンで、ヘキサン中６０％ＥｔＯＡｃへの勾配）によって精製して、メチル３−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−４）を暗色固体として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ−ｔ−Ｂｕ）実測値３６６．３、要求値３６６．２。
【００７２】
段階４：メチル３−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−ホルミル−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−５）
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のメチル３−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−４、１．６９ｇ、４．０１ｍｍｏｌ、１当量）および酸化マンガン（ＩＶ）（１．７４ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、５．００当量）の混合物を４０℃で２時間加熱した。さらなるＭｎＯ２（１．０５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ、３．００当量）を添加して、２時間加熱を続けた。固体をろ過し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）および酢酸エチル（３００ｍＬ）で繰り返し洗浄した。併合ろ液を半飽和塩化ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×２００ｍＬ）に分配した。併合有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、メチル３−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−ホルミル−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−５）を暗色固体として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ−ｔ−Ｂｕ）実測値３６４．３、要求値３６４．２。
【００７３】
段階５：メチル３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート
１，２−ジクロロエタン（６０ｍＬ）中のメチル３−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−ホルミル−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラート（２−５、９５０ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）、モルホリン（０．７９０ｍＬ、９．０６ｍｍｏｌ、４．００当量）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．９２ｇ、９．０６ｍｍｏｌ、４．００当量）の混合物を窒素下に２３℃で１４時間攪拌した。反応物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチル（３×１００ｍＬ）に分配した。併合有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残留物をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸の１：１混合物に溶解し、３時間放置した。溶液を濃縮し、残留物を逆相液体クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配  ｗ／０．１％ＴＦＡが存在）によって精製して、メチル３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキシラートをＴＦＡ塩（明褐色固体）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．６１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．２３（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，１．２Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１，１．２Ｈｚ），７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），７．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１，１．２Ｈｚ），４．４３（ｍ，２Ｈ），３．９７（ｍ，２Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｓはＨ２Ｏピークにより不明瞭であった，２Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３９１．５、要求値３９１．２。
【００７４】
（実施例１４）
Ｎ−メチル−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド
段階１：１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸
エタノールと１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）の１：１混合物中の１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−３、１．５０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、１．００当量）および水酸化ナトリウム（１．２６ｇ、３１．４ｍｍｏｌ、３当量）の混合物を８０℃に４時間加熱した。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチル（４×５０ｍＬ）に分配した。有機層を廃棄し、水層をｐＨ５に酸性化して、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄した。併合有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸（４−１）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１６３．１、要求値１６３．０。
【００７５】
段階２：Ｎ−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１Ｈ−インダゾール−６−カルボン酸（４−１、１．１１ｇ、６．８５ｍｍｏｌ、１当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．６５ｇ、２０．５ｍｍｏｌ、３．００当量）、（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）（トリピロリジン−１−イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｐｙｂｏｐ、５．３４ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、１．５０当量）およびメチルアミン（１０．３ｍＬ（ＴＨＦ中２Ｍ）、２０．５ｍｍｏｌ、３．００当量）の混合物を２３℃で１４時間攪拌した。反応混合物を塩化ナトリウム水溶液および重炭酸ナトリウム水溶液の１：１混合物と酢酸エチル（２×５０ｍＬ）に分配した。次に水層をｐＨ５に酸性化して、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄した。併合有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初ヘキサンで、１００％ＥｔＯＡｃ、次いでＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨへの勾配）によって精製して、Ｎ−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド（４−２）を明褐色固体として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１７６．２、要求値１７６．１。
【００７６】
段階３：３−ヨード−Ｎ−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＮ−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド（４−２、３．３０ｇ、１８．８ｍｍｏｌ、１当量）、ヨウ素（１０．５ｇ、４１．４ｍｍｏｌ、２．２０当量）および水酸化カリウム（２．５４ｇ、４５．２ｍｍｏｌ、２．４０当量）の混合物を２３℃で１５時間攪拌した。反応混合物を、飽和塩化ナトリウム水溶液および飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液の１：１混合物と酢酸エチル（２×３００ｍＬ）に分配した。併合有機層を水、次いでブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。残留物をアセトニトリルで粉砕し、３−ヨード−Ｎ−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド（４−３）を明褐色固体として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３０２．２、要求値３０２．０。
【００７７】
段階４：Ｎ−メチル−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール−６−カルボキサミド
段階３の生成物を１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−１Ｈ−インドール−２−イルボロン酸とカップリングし、アルデヒドに酸化して、実施例１の段階６−８で述べた手順によってモルホリンおよびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムと反応させた。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３９０．４、要求値３９０．２。
【００７８】
（実施例１５）
６−（４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾール−２−イル）−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−１Ｈ−インダゾール
１Ｈ−インダゾール−６−カルボニトリル（１−３、１００ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ、１当量）、エタノールアミン（０．２１ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ、５．００当量）および酢酸カドミウム脱水物（５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．０３当量）の混合物をそのまま１４０℃で２時間加熱した。反応混合物を、強く攪拌し、加熱することによって水と酢酸エチルに分配した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮し、６−（４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（９−１）を褐色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．１１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．７０（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），４．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ３ＣＮ）実測値１８８．２、要求値１８８．１。
【００７９】
この中間体を、実施例１の段階３−８で述べた手順により、段階８でモルホリンを使用して表題化合物に変換した。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４０２．５、要求値４０２．２。
【００８０】
上記実施例はすべて、ＨＴＲＦアッセイにおいてＢＲＳＫに対し＜１μＭのＩＣ５０を与えた。実施例１から９は、ＢＲＳＫおよびＭＡＲＫ３の両方に対して＜５００ｎＭのＩＣ５０を示し、従って二元ＢＲＳＫ／ＭＡＲＫ阻害剤とみなし得るが、実施例１０から１５はＢＲＳＫに対して選択性を示した（ＩＣ５０ＭＡＲＫ＞１μＭおよび／または少なくともＩＣ５０ＢＲＳＫより４倍大きい）。
【国際調査報告】
2009525039.tif 000008
2009525039.tif 000009
2009525039.tif 000010
2009525039.tif 000011