(57)【要約】組織中の化学濃度を測定する方法には、２つの測定段階がある。第１に、第１の光を生成し、該第１の光を用いて組織の一部を照射するステップと、組織からの第１の反射光を捕捉するステップと、該第１の反射光を複数の光センサに向けるステップであって、各光センサが異なる波長の光を測定し、該波長が、組織中の化学物質に関する予測ラマン・シフト波長の波長に近接しているステップと、各光センサから測定値を得るステップとを含む。第２に、第２の光を生成し、該第２の光を用いて組織の一部を照射するステップと、組織からの第２の反射光を捕捉するステップと、該第２の反射光を複数の光センサに向けるステップであって、各光センサが異なる波長の光を測定し、該波長が、組織中の化学物質に関する予測ラマン・シフト波長の波長に近接しているステップと、各光センサから測定値を得るステップとを含む。
2009510473.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的サンプル中の選択された分子のレベルを測定する方法であって、
第１の波長Ｆ１の光を用いて前記標的を照射するステップと、
前記第１の波長Ｆ１に隣接する第２の波長Ｆ２の光を用いて前記標的を照射するステップと、
前記波長Ｆ１及びＦ２における前記照射の各々に起因する発光を前記標的から受容し、前記選択された分子及び前記照射波長の各々に関連する特徴的ラマン発光波長Ｆｃを含む波長範囲の前記発光の強度をサンプリングするステップと、
前記波長Ｆ１の照射に起因する発光に関する第１の組のサンプリングされた強度値を生み出すステップであって、前記サンプルが、前記選択された分子及び波長Ｆ１に関連する前記特徴的発光波長Ｆｃ、又はその付近の値を含み、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ１の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の下方に十分に変位されており、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ１の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の上方に十分に変位されている、ステップと、
前記波長Ｆ２の照射に起因する発光に関する第２の組のサンプリングされた強度値を生み出すステップであって、前記サンプルが、前記選択された分子及び波長Ｆ２に関連する前記特徴的発光波長Ｆｃ又はその付近の値を含み、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ２の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の下方に十分に変位されており、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ２の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の上方に十分に変位されている、ステップと、
非ラマン発光による前記強度値成分を除去する、Ｆ１及びＦ２の各々に関連する前記特徴的波長Ｆｃ間の発光に関する補完強度値を前記第１及び第２の組のサンプリングされた強度値から得るステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記波長Ｆ１の照射に起因する発光に関する第１の組のサンプリングされた強度値を生み出す前記ステップが、前記波長Ｆ１の照射から生じるサンプル値｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝を少なくとも４つの強度センサにおいて生み出すことを含み、前記波長Ｆ２の照射に起因する発光に関する第２の組のサンプリングされた強度値を生み出す前記ステップが、前記波長Ｆ２の照射から生じる少なくとも４つのサンプル値｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝を少なくとも４つの強度センサにおいて生み出すことを含み、｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝及び｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝の各々が順序付けられた組の値であり、ここで、ＳＦ１１が、前記選択された分子及びＦ１に関連する特徴的発光波長Ｆｃの測定値であり、ＳＦ２２が、前記選択された分子及びＦ２に関連する特徴的発光波長Ｆｃの測定値である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝及び｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝の各々を、前記少なくとも４つの強度センサの較正以降、そのようなセンサの出力における変動に関して調整することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝及び｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝の各々を、光学的ダーク・サンプルからの発光にラマン散乱を含まない前記光学的ダーク・サンプル標的から得られるダーク値に関して調整することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び第２の組のサンプリングされた強度値から補間強度値を導出する前記ステップが、比率｛ＳＦ１０／ＳＦ２０，ＳＦ１１／ＳＦ２１，ＳＦ１２／ＳＦ２２，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝を計算することを含み、得られた計算比率から、カーブ・フィッティングにより外挿して、点｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ３，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝を通過する曲線を見出し、前記曲線が点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝及び｛ｆ２，ＳＦ１２／ＳＦ２２｝から等距離にあり、ｆ０、ｆ１、ｆ２、及びｆ３の各々が、各第１、第２、第３、及び第４の前記４つのセンサの中心波長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カーブ・フィッティングが、前記曲線として放物線を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記得られる計算比率から、｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ３  ＳＦ１３／ＳＦ２３｝で固定される曲線を使用する放物線補間において、前記４つのセンサの前記波長範囲の中間点での値であり、点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝と｛ｆ２  ＳＦ１２／ＳＦ２２｝との間の中間にある値を、グラフで決定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記得られる計算比率から、｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ３，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝で固定される非線形曲線を用いたカーブ・フィッティングにより測定された場合に、点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝と｛ｆ２  ＳＦ１２／ＳＦ２２｝との間の中間にある値をグラフで決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的から前記波長Ｆ１及びＦ２の照射の各々に起因する発光を受容する前記ステップと、前記選択された分子及び前記照射波長の各々に関連する特徴的ラマン発光波長Ｆｃを含む波長範囲の前記発光の強度をサンプリングする前記ステップとは、前記発光を所定の分量で少なくとも４つの強度センサに向けることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光を所定の分量で少なくとも４つの強度センサに向けることは、前記発光を等分量で方向づけることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された分子がカロテノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的サンプルがヒト組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的サンプルがヒトの手の組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的を、前記第１の波長Ｆ１に隣接する第２の波長Ｆ２の光を用いて、且つ前記第１の波長Ｆ１の光の前記強度に対する所定の関係における強度で、照射する前記ステップが、前記第１の波長Ｆ１の光の強度に実質的に等しい強度を有する第２の波長Ｆ２の光を用いて前記標的を照射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆ１及びＦ２が３ナノメートル未満だけ分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｆ１及びＦ２が２ナノメートル未満だけ分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプリングされた発光強度値が１０ナノメートル未満の波長範囲にわたる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプリングされた発光強度値が７ナノメートル未満の波長範囲にわたる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記各光が照射している場合、前記第１の波長Ｆ１の光及び前記第２の波長Ｆ２の前記光の強度を調整して、前記標的での各光から等しい強度を提供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の波長Ｆ１及び第２の波長Ｆ２が実質的にラマン共鳴波長である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
標的サンプル中の選択された分子のレベルを測定する装置であって、
第１の波長Ｆ１の光を用いて前記標的を照射する第１の光源と、
前記第１の波長Ｆ１に隣接する第２の波長Ｆ２の光を用いて前記標的を照射する第２の光源と、
前記標的から、前記波長Ｆ１及びＦ２の照射の各々に起因する発光を受容し、前記選択された分子及び前記照射波長の各々に関連する特徴的ラマン発光波長Ｆｃを含む波長範囲の前記発光の強度サンプリングする手段と、
前記波長Ｆ１の照射に起因する発光に関する第１の組のサンプリングされた強度値を生み出す第１のサンプリング装置であって、前記サンプルが、前記選択された分子及びＦ１に関連する前記特徴的発光波長Ｆｃ又はその付近の値を含み、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ１の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の下方に十分に変位されており、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ１の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の上方に十分に変位されている、第１のサンプリング装置と、
前記波長Ｆ２の照射に起因する発光に関する第２の組のサンプリングされた強度値を生み出す第２のサンプリング装置であって、前記サンプルが、前記選択された分子及びＦ２に関連する前記特徴的発光波長Ｆｃ又はその付近の値を含み、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ２の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の下方に十分に変位されており、少なくとも１つのサンプルが、前記波長Ｆ２の照射に起因するラマン発光を除外するために、前記特徴的波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の上方に十分に変位されている、第２のサンプリング装置と、
非ラマン発光による前記強度値成分を除去するＦ１及びＦ２の各々に関連する前記特徴的波長Ｆｃ間の発光に関する補間強度値を前記第１及び第２の組のサンプリングされた強度値から得る論理と
を含む、装置。
【請求項２２】
前記波長Ｆ１の照射及び前記波長Ｆ２の照射それぞれに起因する発光に関する第１及び第２の組のサンプリングされた強度値を生み出す前記サンプリング装置が、前記波長Ｆ１の照射から生じる４つのサンプル値｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝を検出する論理、及び前記波長Ｆ２の照射から生じる４つのサンプル値｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝を検出する論理を有する少なくとも４つの強度センサを含み、｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝及び｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝の各々が、値の順序集合であり、ここで、ＳＦ１１が、前記選択された分子及びＦ１に関連する特徴的発光波長Ｆｃの測定値であり、ＳＦ２２が前記選択された分子及びＦ２に関連する特徴的発光波長Ｆｃの測定値である、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記少なくとも４つの強度センサの較正以降、そのようなセンサの出力における変動に関して｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝及び｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝の各々を調整する手段を更に含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記サンプルから発せられる前記光にラマン散乱を含まない光学的ダーク・サンプル標的から得られるダーク値に関して、｛ＳＦ１０，ＳＦ１１，ＳＦ１２，ＳＦ１３｝及び｛ＳＦ２０，ＳＦ２１，ＳＦ２２，ＳＦ２３｝の各々を調整する手段を更に含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
前記第１及び第２の組のサンプリングされた強度値から補間強度値を得る前記論理が、前記比率｛ＳＦ１０／ＳＦ２０，ＳＦ１１／ＳＦ２１，ＳＦ１２／ＳＦ２２，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝を計算する論理を含み、前記得られる計算比率から、カーブ・フィッティングにより外挿して、点｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ３，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝を通過する曲線を見出すことを含み、前記曲線が、点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝及び｛ｆ２  ＳＦ１２／ＳＦ２２｝から等距離にあり、ｆ０、ｆ１、ｆ２、ｆ３の各々が、前記４つのセンサの各第１、第２、第３、及び第４に関して中心波長である、請求項２１に記載の装置。
【請求項２６】
カーブ・フィッティングのための前記論理が、前記曲線として放物線を使用する、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記得られる計算比率を使用して、｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ３，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝で固定される曲線に基づき、放物線補間において、前記４つのセンサの前記波長範囲の中間点での値であり、点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝と｛ｆ２，ＳＦ１２／ＳＦ２２｝との間の中間にある値をグラフで決定する論理を含む、請求項２５に記載の装置。
【請求項２８】
前記得られる計算比率を使用して、｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ３，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝で固定される非線形曲線を用いたカーブ・フィッティングにより測定された場合に、点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝と｛ｆ２，ＳＦ１２／ＳＦ２２｝との間の中間にある値を、グラフで決定する論理を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２９】
前記標的から、前記波長Ｆ１の照射及び前記Ｆ２の照射の各々に起因する発光を受容し、前記選択された分子及び前記照射波長の各々に関連する特徴的ラマン発光波長Ｆｃを含む、波長範囲の前記発光の強度をサンプリングする前記手段が、前記発光を所定の分量で少なくとも４つの強度センサに向ける手段を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３０】
前記発光を所定の分量で少なくとも４つの強度センサに向ける前記手段は、前記発光を等分量で方向づける手段を含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
組織中の化学物質濃度を測定する方法であって、
第１の光を生成し、前記第１の光で前記組織の一部を照射するステップと、
前記組織からの第１の反射光を捕捉するステップと、
前記第１の反射光を複数の光センサに向けるステップであって、各光センサが、異なる波長の光を測定し、該波長が、前記組織中の前記化学物質に関する予測ラマン・シフト波長の波長に近接している、ステップと、
前記光センサの各々から、前記光センサを通る前記第１の反射光に固有である各測定値を得るステップと、
第２の光を生成し、前記第２の光で前記組織の一部を照射するステップと、
前記組織からの第２の反射光を捕捉するステップと、
前記第２の反射光を前記複数の光センサに向けるステップであって、各光源が、異なる波長の光を測定し、該波長が前記組織中の前記化学物質に関する予測ラマン・シフト波長の波長に近接している、ステップと、
前記光源の各々から、前記光源を通る前記第２の反射光に固有である各測定値を得るステップと、
前記第１の反射光の前記測定値及び前記第２の反射光の前記測定値を使用して、前記組織中の前記化学物質の濃度を計算するステップと
を含む、方法。
【請求項３２】
前記第１及び第２の光が、発光ダイオードにより生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１及び第２の光が、第１及び第２のフィルタそれぞれを通過する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のフィルタが、４７１．３ナノメートルの光のみを通過させ、前記第２のフィルタが、４７３ナノメートルの光のみを通過させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１及び第２の反射光がそれぞれ４つの等分量に分割され、前記ｓ等分量が４つの光センサに向けられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の光センサが５０５．８ナノメートルの光を測定し、前記第２の光センサが５０７．８ナノメートルの光を測定し、前記第３の光センサが５０９．８ナノメートルの光を測定し、前記第４の光センサが５１１．８ナノメートルの光を測定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１及び第２の反射光が４つの光センサに向けられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１及び第２の反射光の各々が、各光センサに向けられている等分量の各光に等分される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の反射光の前記測定値及び前記第２の反射光の前記測定値を使用して、前記組織中の前記化学物質の濃度を計算するステップが、
前記光センサを通る前記第１の反射光に固有の該光センサの各々からの前記測定値を、前記各光センサを通る前記第２の反射光に固有の該各光センサからの前記測定値で除して、ラマン比を得ることと、
前記ラマン比に前記組織からの蛍光の平均レベルを乗じることと
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記蛍光の平均レベルが、前記組織の部分が前記第２の光の照射されるときに測定される平均ＰＭＴ電圧により近似される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組織からの前記蛍光の平均強度レベルが、前記組織からのラマン・シフト発光の強度より少なくとも５０倍大きい、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
正規化データを収集するステップと、前記正規化データと共に前記第１の反射光の前記測定値及び前記第２の反射光の前記測定値を使用して、前記組織中の前記化学物質の濃度を計算するステップとを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記光センサが光電子増倍管である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２００５年１０月４日出願の名称「Ｒａｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｗｅａｋ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」（代理人整理番号１８７１２８／ＵＳ）の米国出願第１１／２４４，４３４号に対する利益を主張し、該出願の内容はその全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本発明は、生物組織に認められる化合物のレベルを測定する方法及び装置に関する。更に詳細には、本発明は、生物組織中のカロテノイド又は他の選択された分子のレベルの非侵襲的な検出及び測定のための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）は、人体において重大な効果を有する、食事から摂取可能な植物色素である。例えば、多くのカロテノイドは免疫機能にプラスの効果を有するらしいと考えられており、このことは、癌を阻止するのに重要である可能性がある。カロテノイドはまた、心臓疾患から身を守る可能性がある抗酸化作用を有する。更に、カロテノイドは、加齢に関連した黄斑変性などの変性疾患の危険性を低減することに役立つ可能性があることが、いくつかの研究により示されている。
【０００４】
最近、研究者らは、カロテノイドのαカロテン（ニンジン）、リコピン（トマト及び赤ピーマンなどの赤い果物及び野菜）、βクリプトキサンチン（オレンジ）、並びにルテイン及びゼアキサンチン（ブロッコリ及び緑色葉野菜）などに焦点を当てている。これらの物質を欠損する人はある種の癌、特に肺癌を発症させる可能性が高いことが、ある研究により示されており、これらのカロテノイドを多く消費することが癌を防ぐ可能性があるという理論、及びこれらの物質の欠損を確認することで、ある個人に健康上の懸念の可能性に対する注意を喚起し得るという理論を支持している。１つの研究は、特にルテイン、即ちホウレンソウ、ブロッコリ、レタス、トマト、オレンジ、ニンジン、セロリ、及び葉野菜を含む多くの野菜並びに果物に認められるカロテノイドに注目した。この研究は結腸癌を患う約２０００人の患者を評価し、この研究群のルテイン摂取量が癌でない人のそれより大幅に低いことを確認した。
【０００５】
カロテノイドは、種々の組織における悪性腫瘍の形成に対してある程度の生物学的防御を提供することが例証されている。例えば、カロテノイドは、皮膚、唾液腺、乳腺、肝臓、及び結腸などの組織における癌腫形成を防ぐことが、動物モデルで示されてきた。更に、カロテノイド、及びレチノイドなどの関連物質のレベルが低いことは、悪性病変の高危険因子として判定されてきている。例えば、摂取するカロテノイドのリコピンのレベルが低いと、前立腺癌及び子宮頸癌に関連し、カロテノイドのルテイン、ゼアキサンチン、αカロテン、及びβカロテンは肺癌に関連し、並びにβカロテンは口腔癌に関連する。従って、これらのカロテノイド、レチノイド、及び他の関連物質の化学濃度を定量的に測定することは、癌の危険性又は存在の指標を提供する。
【０００６】
皮膚癌は、米国では最も一般的な癌である。皮膚関連の悪性腫瘍に関連する化学物質レベルの検出を実現する方法は、皮膚癌の早期診断及び早期治療において医師及び医療関係者の大きな力添えとなる。
【０００７】
皮膚中のカロテノイドは、皮膚の悪性腫瘍からの生物学的防御を提供するという理論が立てられている。皮膚癌に関連する化学物質の存在を検出するのに使用される先行方法は、主に、生検又は他の侵襲的手順により得られた組織の分析によるものであった。現在カロテノイドを測定するのに使用されている標準的な方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によるものである。そのような技術は、後の分析及び処理のために患者から大量の組織サンプルを採取することを必要とするため、通常、完了するのに少なくとも２４時間かかる。このように、この技術は侵襲的で時間がかかり、また費用もかかる。
【０００８】
目の黄斑組織中のカロテノイド・レベル測定のための非侵襲的方法は、特許文献１に記載されており、そこでは、カロテノイド及び関連物質のレベルは、ラマン分光法を用いて測定されている。ラマン分光法は、特定の化学物質の（正確な較正が実施された場合の）存在及び濃度を確認することができる。略単色の光が測定されるサンプルに入射し、入射光とは異なる波長の非弾性散乱光が検出され測定される。入射光と散乱光との間の波長シフトは、ラマン・シフトとして既知であり、該シフトは、選択された分子の振動エネルギー状態又は回転エネルギー状態の「指紋」であるエネルギーに対応する。通常、分子は、いくつかの特徴的ラマン活性の振動エネルギー状態又は回転エネルギー状態を示すので、その分子のラマン・スペクトルの測定は、その分子の指紋を提供する、即ち、分子特有の一連のスペクトル的に鋭い振動ピーク又は回転ピークを提供する。ラマン散乱光の強度は、関心分子（単数又は複数）の濃度に直接対応する。
【０００９】
ラマン分光法に関する１つの問題は、ラマン散乱光に固有の非常に低い信号強度である。散乱光強度が波長の４乗を用いて計測できることは周知である。微弱なラマン信号は、レーリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）散乱光とは区別しなければならない。レーリー散乱光は、入射光と同じ波長の弾性散乱光であり、総散乱光の大部分を構成している。ラマン信号は、フィルタ、回折格子、又は他の波長分離デバイスの使用により、レーリー散乱光から分離することができる。しかし、これには、光が波長分離デバイスを通過する時に起こり得る更なる減衰により、測定されたラマン信号を更に弱める作用を有する可能性がある。実際には、ラマン散乱光を検出することは極めて困難である。組織サンプルへの入射光の強度を高めてラマン信号を増強しようとする者もいるであろう。レーザは光強度を高める光源として使用されてきたが、これにより、サンプルの燃焼又は分解が生じる可能性がある。
【００１０】
これらの問題のいくつかを克服するために、本明細書上記で参照した特許文献１に記載されている通り、共鳴ラマン分光法として既知の技術が使用されてきた。そのような技術はまた、特許文献２にも記載されている。共鳴ラマン分光法では、利用されている入射照射は、関心分子の電子エネルギー遷移に対応する共鳴波長に相当する波長を有する。このことは、より強力な入力信号を使用することなく、ラマン出力信号を大いに強化する効果を有し、それにより、レーザ燃焼により生じるサンプルへの損傷を回避することができる。また、これらの共鳴ラマン信号は、ヒト組織を損傷しない出力レベルでは実質的に不可視である非共鳴ラマン信号よりもずっと高い強度を有する。従って、共鳴ラマン分光法では、関心種に属するこれらのラマン信号のみが得られる。
【００１１】
上記で参照した特許文献１では、共鳴ラマン技術を用いて、ヒトの眼の健康な黄斑組織に関連する２つの化学物質である、カロテノイドのルテイン及びゼアキサンチンの濃度を測定している。上記で参照した特許文献２は、共鳴ラマン分光法を使用して、血漿中の特定のカロテノイドを測定しており、種々の悪性疾患の存在を示す方法として、ラマン・スペクトル・ピークの強度比の使用を提唱している。
【００１２】
ラマン測定に関連する更に別の問題は、皮膚中の関心物質が入射光を散乱させるだけでなく、吸収することもあり、続いて実質的な強度で蛍光を発することである。この蛍光は、ラマン・スペクトル・ピークを「かき消す」か又は圧倒する傾向のある、非常に強いスペクトル的に広範な信号を含むことが多く、物質の同定及び定量化の困難を増大させる。
【００１３】
蛍光分光法はそれ自体が別の技術であり、生物組織中の化合物量を計測するのに使用することができる。例えば、特許文献３は、子宮頸部の組織異常を検出するための蛍光分光法及び／又はラマン分光法の使用を開示している。蛍光測定の欠点は、多数の異なる分子が広帯域の波長で蛍光を発するので、そのような測定は特定の物質の存在又は濃度を最終的に確認するのには使用できないことである。
【００１４】
特許文献４は、レーザを使用して手の皮膚面などの組織を励起し、得られた散乱光のスペクトルを観察することによりカロテノイド・レベルを測定するシステムを示している。弱いが狭帯域のラマン・ピークは、スペクトルにおいて広帯域の蛍光背景（通常、１００倍を超えて明るい）とは区別しなければならない。特許文献４におけるシステムは、予測ラマン・ピークの部分ではなくその両側に隣接するスペクトルの部分にカーブ・フィットを行なうことにより、ラマン・ピークの下にある蛍光（又は背景光）レベルを推定する技術を使用している。この分析に必要なスペクトル分解能は、該システムが依存する標準的な分光計を用いて組織から収集し得る光量を厳密に制限する。励起された組織領域は小さい、ミリメートル単位の小部分であることが求められる。レーザは、ラマン励起のための小点に焦点を集めることができる単色光の良好な光源であるが、必要な青−緑スペクトル領域の波長を有するレーザは高価であり、物理的条件が変動する環境下で安定に保つのは若干困難である。更に、ラマン・ピークの両側への光の測定に基づいて該ピークの下にある背景光のレベルを評価することは、特定のハードウェア変動によって変動する可能性のある誤りを生じやすい。
【００１５】
ラマン分光法は、比較的大きな組織励起領域に対応する十分なスペクトル測定感度を有しており、レーザ又はラマン・ピークの下にある蛍光のレベルのベースライン推定を使用する必要がなく、該分光法を使用して組織中の化学物質濃度を測定する装置及び方法を提供することは、飛躍的な進歩であると考えられる。そのような装置は、生物組織中に種々の程度で存在するカロテノイド又は他の類似の化学物質のレベルの、安全で、非侵襲的、迅速、正確、かつ詳細な測定を、より広く利用可能にすると考えられる。
【特許文献１】米国特許第５８７３８３１号明細書
【特許文献２】米国特許第４８３２４８３号明細書
【特許文献３】米国特許第５６９７３７３号明細書
【特許文献４】米国特許第６２０５３５４号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
組織中の化学濃度を測定する方法には、２つの測定段階がある。第１に、第１の光を生成し、該第１の光で組織の一部を照射するステップと、組織からの第１の反射光を捕捉するステップと、該第１の反射光を複数の光センサに向けるステップであって、各光センサが異なる波長の光を測定し、該波長が、組織中の化学物質に関する予測ラマン・シフト波長の波長に近接しているステップと、各光センサから測定値を得るステップであって、各測定値が該光センサを通る第１の反射光に固有であるステップの段階である。第２に、第２の光を生成し、該第２の光で組織の一部を照射するステップと、組織からの第２の反射光を捕捉するステップと、該第２の反射光を複数の光センサに向けるステップであって、各光センサが異なる波長の光を測定し、該波長が、組織中の化学物質に関する予測ラマン・シフト波長の波長に近接しているステップと、各光センサから測定値を得るステップであって、各測定値が該光センサを通る第２の反射光に固有であるステップの段階である。第１の反射光の測定値及び第２の反射光の測定値を使用して、組織中の化学物質を計算する。
【００１７】
多数の実施形態が開示されているが、以下の詳細な説明から、本発明の更に他の実施形態が当業者に明らかになるであろう。該説明は、本発明の例示的な実施形態を示し、記載している。理解されるであろうように、本発明は、いずれも本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の明白な態様における変更が可能である。従って、図面及び詳細な説明は、本質的に例示的であり、非限定的であるとみなされるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
生きている皮膚などの生物組織又は標的サンプル中のカロテノイド及び他の関連物質又は他の選択された分子のレベルの測定のための方法及び装置が提供されている。該装置は、励起部分、分析器部分、及び較正部分を含む。該装置により、組織中のカロテノイド（それらの異性体及び代謝産物を含む）及び類似物質のレベルの非侵襲的で、迅速、安全、且つ正確な判定が可能になる。この情報は、カロテノイド又は他の抗酸化化合物が有用な情報を提供する可能性がある場合、状態のマーカとなり得る。
【００１９】
本発明の技術を用いて非侵襲的に測定することができる生物組織の例には、ヒトの手の皮膚が含まれる。測定は子宮頸部、直腸、及び肺に関してもなされてよいことが予想される。適切なサンプル提示付属品を付加することで、測定可能な体液に唾液、全血、及び粘液が含まれることが予想される。
方法の概観
本方法及び装置は、共鳴ラマン分光法を使用する。該分光法は、皮膚などの生物組織中のカロテノイド及び類似物質又は他の選択された分子を同定し定量化するのに使用される。（例えば、発光ダイオードからの）単色又は略単色の励起光は、組織又は他の標的に向けられ、次に、散乱光は、スペクトル的にフィルタにかけられ検出される。このプロセスは、標的中の選択された分子構造が、標的に衝突する特徴的な波長の光により励起された場合、異なる特定の波長の光を発する、という前提に基づいている。その分子構造により発せられる非弾性散乱光子即ちラマン発光の強度は、単色光励起光源の波長からの波長分離機能即ちラマン・シフトである。例えば、４７３．０ナノメートルの光に暴露された場合、カロテノイドの炭素−炭素共役二重結合は、５０９．８ナノメートルの光を発する。
【００２０】
以下でより十分に記載する通り、約４７３．０ナノメートルの略単色の励起光は、標的に向けられてもよい。散乱光は標的から発せられ、レーリー散乱光及びラマン散乱光の両方、並びに標的からの蛍光も含む。レーリー光は、非弾性的に散乱された（又は入射励起光と同じ波長で散乱された）光である。
【００２１】
非弾性様式で散乱され、従って、入射励起光とは異なる波長である、光の小残余の一部は、ラマン信号を形成する。光源が４７３．０ナノメートルの光でカロテノイドを励起すると、カロテノイドは５０９．８ナノメートルに中心があるラマン信号を発し、その強度は組織中のカロテノイド量と相関する。レーリー散乱光とラマン散乱光とは波長で分類される。励起光の大半もまた標的で吸収され、標的からの蛍光発光につながる。ラマン測定における問題は、この不明瞭にする約５０９．８ナノメートルの非ラマン蛍光成分の除去である。該成分は、通常、ラマン信号より１００倍強度がある。ラマン信号の分析には、測定から背景光（蛍光発光及びレーリー発光）を除去することが含まれる。
【００２２】
励起光とラマン散乱光との間の波長差は、ラマン・シフトとして既知であり、通常、波数又は波長の差として測定され、相当する波長シフトに変換することができる。ラマン・シフトは、使用されている入射光の波長とは無関係である。従って、例えば、励起波長が４７３．０ナノメートルである場合、カロテノイド分子のラマン・ピークは５０９．８ナノメートルで生じる一方、励起波長が４７１．３ナノメートルである場合、ラマン・ピークは５０７．８ナノメートルで生じる。励起光の波長からのシフト量が、存在する分子の種類を示しており、ラマン・ピークの強度は、該シフトを引き起こした存在する分子の濃度に直接対応する。以前に示唆されている通り、特定の波数シフトは、これらの化学構造の特定の振動方式又は回転方式に対応する。このように、方法及び装置は、約４７１．３ナノメートル及び４７３．０ナノメートルの励起光を提供する光源に関して検討されているが、広範な励起波長が、対応する波長シフトと共に殆んど同様に良好に機能する。
【００２３】
上記で検討した通り、短い可視波長を使用する、組織におけるラマン分光法は、特に、より微弱なラマン信号をマスクする皮膚組織では、非常に高い固有の蛍光性が原因で複雑である。ラマン信号を（ラマン信号より少なくとも５０倍、通常１００倍明るい）背景蛍光と区別するために、背景蛍光の除去を可能にする２つの測定が行なわれる。第１の測定では、組織を４７３．０ナノメートルの励起波長に短時間暴露する。第２の測定では、組織を４７１．３ナノメートルの青色光に暴露する。正確な波長値が重要ではないのと同様に、これら２つの波長の正確な分離は重要ではない。従って、他の波長及び／又は他の波長間の分離が使用されてもよい。一般に、２つの励起波長を共に近づけるか又は隣接させることが好ましいが、フィルタ（例えば、両方とも以下で検討する、励起帯域通過フィルタ及びＰＭＴ帯域通過フィルタを含む）の帯域幅が原因で融合しないように、十分に離間させることが好ましい。本明細書で検討しているある特定の実施形態では、諸励起フィルタは、フィルタ幅０，８ナノメートルで、１．７ナノメートル離れている。これにより、励起フィルタの帯域幅によるある程度の広がりを有して、２ナノメートル離れた２つの励起波長に対応するラマン・ピークが置かれる。ラマン光を観察するようになされたＰＭＴの手前の帯域通過フィルタは、１ナノメートルの帯域幅を有し、これにより、ピークの更なる広がりを効果的に導入する。波長分離は、フィルタの帯域幅の制約内で、可能な限り狭いことが望ましい。更に、必要に応じて、フィルタ分離はより大きく、例えば３ナノメートルでもよい。
【００２４】
組織から発せられる光は、第１及び第２の測定の両方において類似の蛍光レベルを示す。なぜなら、組織に向けられた光の変動は比較的小さいからである。例えば５０５．８ナノメートル、５０７．８ナノメートル、５０９．８ナノメートル、及び５１１．８ナノメートルなど、ラマン信号ピークに近いか又はそれを含むいくつかの波長の発光は、４７３．０ナノメートル及び４７１．３ナノメートルの各励起波長に関して測定される。即ち、発光の４つのサンプルは、約５０５ナノメートルから約５１２ナノメートルの波長範囲で採取される。波長範囲及び特定のサンプリング波長は、選択された分子及び各励起波長に関連する特徴的発光波長Ｆｃの値か又はそれに近い値を含むように選択され、少なくとも１つのサンプルは、そのような励起波長の照射に起因するラマン発光を除外するために、特徴的発光波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の下方に十分に変位されており、少なくとも１つのサンプルは、そのような励起波長の照射に起因するラマン発光を除外するために、特徴的発光波長Ｆｃに隣接しているが、該波長の上方に十分に変位されている。これらの測定値は、次に、組織中のカロテノイド（このラマン・シフトに関連する化学物質）濃度を計算するのに使用されてもよい。更に詳細には、２つの励起波長に関して組織から発せられる個々の波長の測定値は、次に、それら自体で除される。測定値は２つの励起波長に関して略同一なので、ラマン信号ピーク波長付近で観察される各波長に関して比率は１に近い。この態様では、強い蛍光背景及び検出器応答における変動は、該除算により除外される。しかし、カロテノイドによるラマン・ピークは、２つの励起波長に関して異なる波長で生じるので、それを除すことはしない。このように、本方法及び装置を使用することで、カロテノイド・レベルは、たとえ強い固有蛍光の存在下であっても判定され得る。
装置の概観
装置は、カロテノイドの特徴を示す波長シフトを伴うラマン応答を生じる波長の光を生成する。装置は、通常約４７０ナノメートルと４７５ナノメートルとの間で選択される２つの励起波長に起因する発光の測定を実施可能にする構成要素を有し、該光を組織又は他の標的に向けるが、他の波長が使用されてもよい。非弾性散乱光が、組織中のカロテノイドに対応するラマン信号を生成する特徴的なエネルギー・シフト及び定量化可能な強度を有する状態で、弾性散乱光及び非弾性散乱光、並びに組織からの蛍光が収集される。ラマン信号を形成する非弾性散乱光の強度は、２つの測定の分析により定量化される。
光処理構成要素
図１は、装置１０の構成要素を概略的に示す。装置１０は、励起部分１２、分析器部分１４、及び較正部分１６を含む。励起部分１２は、組織又は他の標的が暴露される光を生成する。分析器部分１４は、標的から反射する光を受容し、特定の波長の光量を測定する。較正部分１６は、生データを分析しカロテノイド量の最終量を計算するのに使用されてもよいデータを収集する。コンピュータ（図１に図示せず）を使用して装置１０を制御し、分析を実施する。最終カロテノイド・レベル値の計算は、コンピュータがすべての生データを受信した後にコンピュータで実行されてもよいし、生データの収集を補助する、装置内に常駐のプロセッサで実行されてもよい。後者の場合、少量の分析されたデータ及び結果は、表示又は保存のためにコンピュータに伝達されてもよい。データ分析の位置は、この方法論にとって重要ではない。
【００２５】
励起部分１２は、２つの光源２０、２２を含む。光源２０、２２には、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）が含まれてもよい。一例では、ＬＥＤ２０、２２は類似しており、４７０〜４７５ナノメートルの波長範囲を包含する波長範囲の光を発する。２つの異なる特定の波長を得るために、各光源２０、２２からの光は、関連の非球面コリメート・レンズ２８，３０及び狭帯域光学フィルタ２４，２６を通過させられる。コリメート・レンズ及び光学フィルタは、単なる例示的な光学構成要素及び集束構造体であり、標的に到達している光が所望の質を有している限り、他のものが使用されてもよいし、何も使用されなくてもよい。このように、例えば、第１の光源２０からの光は、４７３．０ナノメートルの狭帯域光学フィルタ２４を通過させられる。第２の光源２２からの光は、４７１．３ナノメートルの狭帯域光学フィルタ２６を通過させられる。しかし、本発明は、これらの波長内で生成される光に限定されないことを理解すべきである。光源がＬＥＤである必要もなく、それらは、例えば、２つの異なる波長で発射するようになされたレーザとすることができるであろう。
【００２６】
第１の光源２０からのコリメート光がビームスプリッタ３２に衝突し、それを通って進む一方で、第２の光源２２からのコリメート光は、同ビームスプリッタ３２の反対側に衝突し、そこから反射する。図示の実施形態では、ビームスプリッタは５０：５０ビームスプリッタである。これは、２つの光源からの光を、該光の半分を犠牲にして共通の経路に置く。ビームスプリッタ３２は、光路を確立し、光源２０、２２からの光を標的に向けるためだけに動作し、光が、光ファイバ、又はコリメート光路に出入りする２つの狭帯域フィルタを備えた単一の光源などの他の手段により組織に向けられる実施形態では、設けられる必要はない。光は、次に、励起遮断物３６を通って進む。該遮断物は、生成されるラマン信号付近の波長を有する光源からの光をより完全に除去するのに使用される。励起遮断物は、関心波長以外の波長を遮断する。より詳細には、励起遮断物は、組織から収集される波長を遮断してもよい。従って、例えば、組織からの反射光がシアン光を含む場合、シアン光は励起遮断物により遮断される。フォトダイオード３８は、光源の強度を監視するのに使用され、５０：５０ビームスプリッタ３２により無駄にされた光を観察し、較正プロセスに組み込まれて、起こる可能性のある光源の強度変動を補正することができる。両光源２０、２２から生じる光は、次に、二色性ビームスプリッタ３４によって反射される。該ビームスプリッタは、励起波長の光に対して高反射性になされているが、生成される予測ラマン・ピーク付近の波長に対しては、高透過性になされている。
【００２７】
二色性ビームスプリッタ３４によって反射される励起光は、軸６０に沿って進み、非球面集光レンズ６１により、光誘導ロッド４０の端部に集められる。該ロッドは、光が組織に到達する前に、ビーム・ホモジナイザとしての機能を果たす。これにより、光源の変動、及び別途測定を混乱させる可能性のある光学フィルタからの影響を除去する。ロッド４０は、光を組織へ及びその内部へ向けさせ、組織の点を照射する。一実施形態では、ロッド４０は、ガラス・ロッドであり、これは、直径約２ミリメートルの点を照射する。図２及び１２を参照すると分かる通り、ロッド４０は、装置１０の開口部７１を若干通過して延出し、ロッド４０が組織又は標的１３に確実に接触するようにしてもよい。組織又は標的１３は、例えば、図１に示すように手でもよい。
【００２８】
光路にある構成要素（例えば、非球面集光装置２８、３０及びロッド４０）は、その表面での反射を低減するために抗反射コーティングを有しても良い。
【００２９】
組織から反射する発光は、ロッド４０を介して且つ非球面集光装置及び二色性ビームスプリッタ３４を介して分析器部分１４まで、中央光軸６３上を戻る。（反射光のための軸６３は、図１の中央軸６０とは分離して示されているが、これは単に説明のためであり、軸６０、６３は実際には一致する。）発光遮断物４１は、装置１０の分析器部分１４で使用される波長に亘る様に光のスペクトル成分を制限する。図示の実施形態では、光は発光遮断物４１を通過し、それにより、励起波長のレーリー散乱光が減少する。光は、次に、色ガラス・フィルタ４３を介して方向づけられる。色ガラス・フィルタはスペクトル遮断物であり、レーリー散乱光を吸収するために設けられてもよい。色ガラス・フィルタの通過帯域は、分析器部分のセンサにより測定されることになる波長を透過させるのに十分広い。分析器部分１４は、光を光検出システムに向ける。該システムは、例えば、皮膚中のカロテノイドに特徴的な波長などの、関心範囲のいくつかの波長の発光の強度を測定することを可能にする。図示の実施形態では、光検出システムは、光電子増倍管などの複数の分離した高感度光検出器を含む。十分な増幅率を有し低ノイズ・レベルであれば、アバランシェ・フォトダイオード、ＣＣＤ（電荷結合素子）検出器アレイ、又は増倍型ＣＣＤ検出器アレイなどの他の高感度デバイスを使用してもよい。
【００３０】
図示の実施形態では、光検知システムは、４本の光電子増倍管（ＰＭＴ）４２、４４、４６、４８を含む。光は分割され、各ＰＭＴに略同量が向けられる。ＰＭＴは光検出器であり、蛍光分光法などの低強度用途に有用である。高い内部増幅率により、ＰＭＴは、高感度を用いて低レベルの光を測定する能力を有する。光電子増倍管は、一般に、真空のガラス筺体内にフォトダイオード及び一連のダイノードを含む。光電子放出陰極に衝突する光子は、光電効果により電子を放出する。電子はダイノード鎖により加速され、カスケード効果により、第１のカスケードに衝突する各光子につき１０５〜１０７の電子が生成される。
【００３１】
ビームスプリッタは、中央軸６３に沿って方向づけられた光がＰＭＴ４２、４４、４６、４８で等分されるように、各ＰＭＴ（図１のＰＭＴ０〜ＰＭＴ３）に関連して設けられている。このように、図示の実施形態では、４つのビームスプリッタ５０ａ〜５０ｄが設けられている。分析器フィルタ５４及び集束レンズ５２が、各ＰＭＴ４２、４４、４６、４８に対する各ビームスプリッタ５０ａ〜５０ｄからの光路に設けられている。集束レンズ５２は、光をそのＰＭＴの活性領域上に集めるフレネル・レンズであってもよい。各フィルタ５４は、特定の波長の光のみを通過させる帯域通過フィルタである。第１のビームスプリッタ５０ａは、光の４分の１をＰＭＴ０  ４２へ方向転換させる。第２のビームスプリッタ５０ｂは、残りの光の３分の１を方向転換させ、発光全体の４分の１をＰＭＴ１  ４４に供給する。第３のビームスプリッタ５０ｃは、残りの光の２分の１を方向転換させ、発光全体の４分の１をＰＭＴ２  ４６に供給する。第４のビームスプリッタ５０ｄ即ちミラーは、残りの光すべてを方向転換させ、発光全体の４分の１をＰＭＴ３  ４８に供給する。このようにして、ＰＭＴ４２、４４、４６、４８はそれぞれ、発光の等しい分量の強度を測定することができ、それぞれ、関連する帯域通過フィルタの使用により、関心波長範囲の特定の部分を測定することができる。この手法では、利用可能な光の大部分が、比較的少数の検出器に対して利用可能になり、測定される特定の波長における感度の増強を実現する。更に、４つの検出器の相対感度は、本方法及び装置にとって重要ではないので、光に対して極度に感度の良いＰＭＴを使用することが可能になる。
【００３２】
各ＰＭＴ４２、４４、４６、４８は、光源２０、２２により発せられた光に基く、カロテノイドのラマン信号の波長に近い、光の異なる特定の波長に暴露され、それを測定する。従って、ＬＥＤ２０、２２が４７１．３〜４７３．０ナノメートルの波長の光を発する場合、分析器フィルタ５４は、５０５．８、５０７．８、５０９．８及び５１１．８ナノメートルを中心とする可能性がある。特定の実施形態では、各フィルタ５４は、１ナノメートルの通過帯域幅を有する。但し、種々の通過帯域幅及び種々の中心波長を使用することができると考えられる。従って、第１のＰＭＴ４２は、５０５．８ナノメートルの光を測定してもよく、第２のＰＭＴ４４は、５０７．８ナノメートルの光を測定してもよく、第３のＰＭＴ４６は、５０９．８ナノメートルの光を測定してもよく、且つ第４のＰＭＴ４８は、５１１．８ナノメートルの光を測定してもよい。
【００３３】
各ＰＭＴからの出力は、組織中に存在するカロテノイド・レベルを判定するために、装置の分析構成要素に伝達される。ある特定の実施形態では、各ＰＭＴの出力は、１秒間につき３０００回サンプリングされ、アナログ・デジタル・コンバータを通過する。ＰＭＴ出力は、０〜１０ボルトの範囲の値を有する電圧として分析構成要素に伝達される。この電圧は、ＰＭＴが暴露される光量と相関する。
【００３４】
測定は次のように行なわれる。４７１．３ナノメートルに濾過された光源がオンにされ、該光源が組織サンプルを照射し、多量の不要な蛍光背景光と同様に、５０７．８ナノメートルでラマン信号が生成される。４本のＰＭＴは、サンプルから生成され発光される予測ラマン・シフト波長に近接する波長を測定する。例えば、４本のＰＭＴＳは、それぞれ５０５．８ナノメートルの光、５０７．８ナノメートルの光、５０９．８ナノメートルの光、及び５１１．８ナノメートルの光を測定する。この光の大部分は蛍光である。しかし、５０７．８ナノメートルの光を観察するＰＭＴは、ラマン信号による少量の付加光を認める。各ＰＭＴの平均示度は、測定の休止期間中に得られ、記録される。４７１．３ナノメートルに濾過された光源は、次にオフにされ、４７３．０ナノメートルに濾過された光源がオンにされる。測定は繰り返される。各ＰＭＴで観察される蛍光レベルは類似しているが、今度は少量のラマン信号が、５０９．８ナノメートルを測定するＰＭＴで付加光として出現する。この測定順序は反復され平均されて、ＰＭＴの平均示度におけるノイズを低減させる（８つの示度の総計、各ＰＭＴは、各光源でのサンプルの照射中に読み取られている）。次に、サンプルの４７１．３ナノメートルでの照射で得られた４つのＰＭＴ示度はそれぞれ、サンプルの４７３．０ナノメートルでの照射で得られた４つのＰＭＴ示度で除される。これにより、値が１に近い４つの数字が生成される。なぜなら、４つのＰＭＴ示度の２つのグループは蛍光が優勢であり、非常に類似しているからである。しかし、５０７．８ナノメートルを観察するＰＭＴに関して生成された数字は、第１の測定における余分なラマン信号が原因で１より若干大きく、例えば、１．００５であり、５０９．８ナノメートルを観察するＰＭＴに関して生成された数字は、第２の測定における余分なラマン信号が原因で１より若干小さく、例えば０．９９５であろう。この１との差は、サンプルの蛍光に対するラマン・ピークの比を示す。次の、蛍光の平均レベルによる乗算で、サンプル中のカロテノイド分子量に比例する数字が生じる。
【００３５】
上記の測定の説明は、４７１．３ナノメートルに濾過された第１の光源及び４７３．０ナノメートルに濾過された第２の光源に特定のものであるが、光源は任意の適切な波長に濾過されてもよいことを理解されたい。
【００３６】
較正部分１６は光源２３を含む。該光源はＰＭＴ応答の較正のためだけに使用される光を発して、温度変化又は印加される電圧の変動によって起こるドリフトの影響を除去する。光源２３により発せられる光の波長は、一般に、分析器部分１４によって処理するために組織から受容されることになる光の波長に対応する。従って、光源２３により発せられる光は、約５０５ナノメートル〜約５１２ナノメートルの範囲のＬＥＤ光でもよい。光はフィルタ５６を通過する。フィルタ５６には、例えば、減光フィルタが含まれてもよい。減光フィルタ５６は、光の出力を、ラマン測定において組織から反射する光に匹敵するレベルまで低減させる。フォトダイオード５８は、較正部分１６内に設けられている。フォトダイオードは、較正光が通過する空洞共振器内の光を測定する。
【００３７】
光源２３からの光は、光線送達システムを介して中央光軸へ且つ分析器部分１４の方向へ向けられる。光線送達システムは、光を測定されるＰＴＭへ向ける光学構成要素の任意の組合せを含んでもよい。図示の通り、光線送達システムは二色性ミラー３４を含み、該ミラーは、５０５〜５１２ナノメートルの範囲の光を透過するようになされているとしても、少量の光を反射する。従って、光源２３からの光は、フィルタ５６を通過し、二色性ミラー３４により、中央光路６０上に且つ分析器部分１４へと向けられる。
【００３８】
図２〜８は、図１に概略的に示す構成要素を具現化する商品の例示的な物理的配置を示す。この配置は、検討されている種々の構成要素のための内部ハウジング（全般的に７０）を含み、該ハウジングは、次に、該商品の可搬式種類に適した外部ハウジング９００内に封入されてもよい。そのような種類は、手又は他の組織をガラス・ロッド４０の端部に直接置くことを比較的容易にする。温度センサ（図示せず）が、ＰＭＴ温度を感知するために、ＰＭＴ４２，４４，４６、４８に、又はそれらの付近に設けられていてもよい。図９〜１４は、外部ハウジング並びに種々の内部ハウジング及び構造を示す。図９〜１４は構成要素の全体的な位置を示すが、簡略化のために、図１にはある光路を示そうとはしていない。
支援用電気構成要素
前述した光処理構成要素は、装置で使用される励起光を生成させ、方向付け、発光を受容させ、方向付け、測定して、生の発光値を提示する。これらの構成要素は、ソフトウェアを含む、関連する支援構成要素及び制御構成要素を有し、該構成要素は、以下で検討する動作方法を実行するのに必要である。支援構成要素及び制御構成要素は、一部分は、光処理構成要素のためのハウジング９００（図９参照）の内部に、一部分は別個のコンピュータ２００（図２参照）又はデータ・プロセッサ上に配置されてもよい。該データ・プロセッサは、装置１０の光処理構成要素のためのハウジング内部に含まれている支援構成要素及び制御構成要素と通信する。ファン２０３（図５及び６参照）が、構成要素を冷却するために含まれていてもよい。
【００３９】
コンピュータ２００は、装置１０への動力供給をオンオフし、ＰＭＴへの電圧を調節し、光源への電流を調節し、個々の光源をオン又はオフに切り換え、ＰＭＴ、フォトダイオード、及び温度センサにより出力された値を読み取る機能を制御する。コンピュータ２００はまた、データ分析の種々のステップのためにデジタル化され作成された生データを受信してもよい。或いは、データ処理構成要素（マイクロプロセッサ、ＤＳＰ、又は他の論理構成要素）は、ハウジング９００内部の回路基板１２１０、１２１２、及び１２１４（図１２参照）上に配置することができる。これらのデータ処理構成要素は、処理のすべて又は大部分を実行することができ、コンピュータ２００に結果データの小セットを渡す。該セットは、更なる計算を殆んど又はまったく必要としないが、ユーザの再検討、保存、更なる通信のために表示されてもよい。
【００４０】
支援構成要素及び制御構成要素の機能には、以下のものが含まれる。励起光源２０、２２及び較正光源１６に電力を供給し、供給されている電力を感知し、制御し、且つ調節する。光電子増倍管に電力を供給し、供給されている電圧を感知し、制御し、且つ調節する。出力電圧、又はＰＭＴ４２、４４，４６，４８、フォトダイオード３８及び５８、並びに温度センサ（図示せず）の出力である他の値を読み取り、感知した電圧及び他の値をデジタル化し、デジタル処理構成要素への伝達、任意の可能な機械構成要素の起動のためにそれらをフォーマットし、データを保存し伝達し、装置及び任意の利用可能な構成要素の動作順序並びにシステム試験を制御する、ユーザ・インターフェースからの且つソフトウェアからの制御信号を受信し実行する。これらのことは、以下で検討する方法を実行する制御ソフトウェアを用いて且つ上記で検討した光処理構成要素を用いて、動作するように構成されている、従来の構成要素により実行され得る。
【００４１】
ハウジング９００内部のすべての支援構成要素及び制御構成要素のための電力は、例えば、電源２０１（図２参照）から、コネクタ１４１２において供給され、一方、コンピュータ２００との往復の通信は、コネクタ１４１０においてハウジング９００に接続されている通信チャネルにより行なわれる。電力はまた、電池などの内部電源により供給することができ、通信チャネルは、物理接続又は無線接続であってもよい。
方法の検討
図１５のハイレベル・フロー・チャートに示す通り、本装置の動作において使用されている３つの全体的な方法は、ブロック５００に示す、装置の較正、ブロック５０２に示す、２つの励起波長からの、組織又は別の標的から散乱される光の測定、及びブロック５０４に示す、カロテノイド・レベルの最終値を得るための、これら２つの測定からのデータの分析である。これらの方法の各々を、以下で検討する。
【００４２】
１．較正
較正プロセスは、構成要素をそれらの適切な動作パラメータに調整し、生データを分析し正規化するために使用されるデータを収集し、例えばカロテノイド（又は他の選択された分子）などの化学物質量の最終量を計算する。この最終量は、「カロテノイド・スコア」と称されてもよい。カロテノイド・スコアは、任意の適切な範囲にあってもよく、組織中のカロテノイド・レベルを反映している。適切な範囲は０〜１００，０００であってもよい。図１６に示す通り、較正プロセスは次のことを含んでもよい。（１）ブロック５０６及び５０８に示す通り、ＰＭＴへ供給される電圧、及び光源に供給される電流の最適値を見出すこと、（２）ブロック５１０に示す通り、「ダーク差引き（Ｄａｒｋ  Ｓｕｂｔｒａｃｔ）」プロセスに使用するための光学的ダーク物質を測定すること、（３）ブロック５１２に示す通り、（従って、約４７３ナノメートルの光源、約５０９ナノメートルのラマン信号の）カロテノイドの波長に相当するシフトした発光波長のラマン信号を生成する参照標準物質を測定すること、（４）ブロック５１４に示す通り、データ分析で使用するための一次方程式の係数を計算し、示度をカロテノイド・スコアに変換すること、及び（５）ブロック５１６に示す通り、データ分析における正規化のためのデータを収集すること。これらのステップのすべてが一度に実施される訳ではなく、それらは、図示とは異なる順序で実施されてもよい。参照標準物質は、較正プロセスでの使用のために考案された、用意されたサンプルである。これらの物質は、例えば、参照により本明細書に援用されている、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏ−ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｃａｎｎｅｒｓ」という名称の、２００４年１１月３日出願の米国特許出願第１０／９８１１３９号明細書で検討されている組成物の方法により且つ該組成物を使用して、又は当技術分野で既知の他の方法により用意されてもよい。
【００４３】
較正は所望の回数行なわれてもよいが、一般に、組織測定の前に行なわれ、組織測定より少ない回数行なわれる。較正からのデータ及び動作パラメータは、本明細書で後述される通り、データを分析するのに使用される。
【００４４】
「自動調整」５２０として既知の較正プロセスの部分を、図１７に図示する。自動調整は、ＰＭＴ入力電圧及び光源電流の最適な設定を決定するのに使用される。一般に、第１及び第２の光源２０、２２は、同一条件下で作動された場合、異なる光出力レベルを示す。特定の実施形態では、第１及び第２の光源２０、２２の電流、及び各ＰＭＴの入力電圧は、典型的な設定に初期設定される。
【００４５】
最適電圧を決定するために、ボックス５２２で開始し、参照標準物質は光源２０、２２の１つを使用して照射される。ボックス５２６で判定される通り、最低ＰＭＴの出力値が１．２ボルトの５％以内になるまで、ボックス５２４に示す通り、ＰＭＴ入力電圧が変更される。この入力電圧において、ＰＭＴは、参照標準及び大部分の組織の良質な示度を得る（以下で検討するように、異常に高い蛍光性を有する組織での測定を実施するために、ＰＭＴ電圧の微調整が必要な場合がある）。このように、ボックス５２８に示す通り、これが最適電圧である。
【００４６】
較正光源の最適電流レベルを決定するために、ボックス５２０で開始し、ボックス５３４で判定される通り、最高示度のＰＭＴの出力電圧が７．５ボルトの５％以内になるまで、ブロック５３２に示す通り、較正部分１６の較正光源２３の電流レベルを調整する。ボックス５３５に示す通り、これが最適電流である。
【００４７】
第１及び第２の励起光源２０、２２の最適電流レベルを決定するために、ボックス５３６で開始し、ボックス５４０で判定される通り、１つの光源がオンの場合に参照標準物質を照射している間に測定される平均ＰＭＴ出力電圧が、その他の光源がオンの場合に平均の１％以内になるまで、ボックス５３８に示す通り、第１及び第２の励起光源２０、２２に使用される光源電流を調整する。ボックス５４１に示す通り、これが最適電流である。
【００４８】
一般に、自動調整プロセスで得られる値は、日々若干変動する。該プロセスは、工場での較正の必要を排除し、装置が老朽化するにつれて又は異なる環境で運転されるのに従って適応する。
【００４９】
光学的ダーク物質を読み取ること（「ダーク・スキャン」）は、外部蛍光源の不在下で、光信号及び電気信号のベースライン測定を提供する。これは「ダーク・データ」と称される場合がある。黒色アルマイト・レンズ・キャップ１２１１（図１２参照）が、光学的ダーク物質として使用するために、装置に設けられてもよい。標的としてのダーク物質を有するＰＭＴの出力値は、後にデータ分析（後述）で使用するために保存される。ダーク・データは、光源をオンオフすることにより、第１及び第２の光源２０、２２の各々に関して捕捉される。「ダーク・データ」値は、ＰＭＴのすべての後続の読取りからの生データから減じられる。これらの値は、他の較正物質又は組織が読み取られた場合に捕捉された値と比較した場合、通常小さい。
【００５０】
参照標準物質を測定することを用いて、「Ｃ」と称されてもよい非較正スコアを計算することができる。非常に高い示度の組織と比肩する５０９ナノメートルのラマン応答を有する参照物質は、該装置を使用して測定される。この「高」参照物質の測定からのデータは、非較正スコアを算出するために分析される。高参照物質のＣ値は、データ分析に使用するための一次方程式の係数計算へと更に進められる。較正プロセスはまた、データ分析に高次方程式を使用してもよい。
【００５１】
特定の実施形態では、組織測定のＣ値からカロテノイド・スコアを計算するのに使用される一次方程式の係数及び補正値を、較正プロセスが計算する。該式は、データ分析に関連して以下でより十分に検討する。以前に高参照物質と称された高較正標準標的サンプルは、公称７７，０００のカロテノイド・スコアを割り当てられている。この数字は任意であり、変更されてもよい。しかし、この数字は、広範な組織サンプリングを、組織中の相対的カロテノイド含有量を反映する尺度を使用して、０と１００，０００との間に記録することを可能にする。特定の実施形態では、直線の傾き−切片型の式である簡単な一次方程式により、Ｃ値がこの尺度に位置づけられる。
【００５２】
カロテノイド・スコア＝Ｃ値×係数＋補正値
係数は、高参照物質の割り当てられた（公称）値を、読取り時に得られたＣ値で除することにより計算される。通常、直線の係数及び補正値を計算するのに使用する２点を提供するために、第２の参照基準が読み取られてもよい。しかし、装置は、ラマン作用物質を含有しない参照サンプルを読み取る際、０に十分に近いＣ値を得るので、第２の点は０の割当て値及び０のＣ値を有すると考えられる。従って、係数を計算する式は１つの示度しか必要とせず、補正値は０である。較正は、より複雑で時間のかかる二点較正ではなく、単一点較正である。異なる割当てスコアを有する標準参照物質を使用して、追加の測定を行ない、高次較正式を生成することができる。
【００５３】
いくつかの他の値が、データ分析中に生データを正規化するのに使用するために、較正中に捕捉されてもよい。これらには次のものが含まれるが、それらに限定されない。（ａ）較正部分１６のシアン色／緑色フォトダイード５８の示度（「緑色ダイオード較正示度」）、（ｂ）較正光源２３が自動調整されている間の各ＰＭＴの出力電圧の示度（「緑色較正データ」という）、及び（ｃ）高参照物質の読取り中に第１及び第２の光源２０、２２に関して捕捉される、励起部分１２のフォトダイード３８の示度（第１及び第２の光源それぞれに関する「第１の青色ダイオード較正示度」及び「第２の青色ダイオード較正示度」）。
【００５４】
装置が「ゼロ化している」かどうかを判定するために、較正プロセスの最後にチェックが実施されてもよい。これにより、機械の高品質の示度を示す能力を測定する。適切にゼロ化する機械は、蛍光を有するが、カロテノイド（例えば、５０９ナノメートル）と同じ波長のラマン信号を有さない参照物質を読み取った場合、０に近いＣ値を得る。このチェックを行なうためのデータは、自動調整プロセス中に捕捉される。ダーク・データが捕捉されるまでＣ値は計算されないので、「ゼロ化」チェックは較正プロセスの最後に実施される。
【００５５】
２．スキャン及び測定
図１８は、スキャン及び測定のプロセスを広範に示す。組織の各スキャンを実施する前に、（後述する）データ分析中に使用するために、ブロック６００に示す通り、データが収集される。ブロック６０２に示す通り、較正部分１６の緑色／シアン色光源２３を照射し、分析部分１４により該光を方向づけ、ＰＭＴを用いて該光を処理することにより、「緑色示度」が収集される。各ＰＭＴの出力は収集され、スキャンの「緑色示度」を含む。励起部分１２の第１の光源２０に関する「第１の青色ダイオード示度」（ブロック６０４）、励起部分１２の第２の光源２２に関する「第２の青色ダイオード示度」（ブロック６０６）、較正部分１６の光源２３に関する「緑色ダイオード示度」（ブロック６０８）は、各光源を別個に照射することにより、且つ関連するフォトダイオード３８又は５８において値を測定することにより収集される。
【００５６】
装置１０の動作中、第１の光源２０が起動され第１の励起光が生成される。光は、励起フィルタ（例えば、狭帯域フィルタ２４）を介して、且つ光送達システムを介して、組織又は他の標的に向けられる。第１の光源２０への電流は、その輝度を制御するために調節されてもよい。短時間の遅延がもたらされ、第１の光源２０からの出力を安定させることが可能にされてもよい。組織からの後方散乱光は、光収集システムを通過させられ、分析器部分１４に向かう。光は等分され、ＰＭＴに向けられる。各ＰＭＴの出力は、例えば、１００ミリ秒の休止期間に亘って１秒間に３０００サンプルの速度でサンプリングされる。各サンプルにおけるＰＭＴ出力は、アナログからデジタルに変換され、電圧として記録される。値は各ＰＭＴに関して収集される。このプロセスは、次に、第２の光源２２を用いて繰り返される。
【００５７】
第１及び第２の光源２０、２２の各々に加えられる電流は異なっていてもよい。一般に、組織に向けられる光の強度は、各光源２０、２２から同じであることが望ましい。そうするために、２つの光源の輝度に差があり、２つの励起フィルタの透過効率に差があるため、光源は異なる電流で駆動されてもよい。各光源の最適電流は、較正プロセスの自動調整部分で決定されていてもよい。以前に検討した通り、そのような最適電流は、必ずしも各個別スキャンに関して決定される訳ではない。
【００５８】
ＰＭＴに印加される電圧もまた、自動調整プロセス中に決定されてもよい。一般に、ＰＭＴの電圧は、高い蛍光性を有する組織を読み取る場合にアナログ・デジタル・コンバータが飽和状態になる程高すぎず、（前述した）参照標準物質の良好な示度を示すのに十分に高い、ＰＭＴから出力を生じる値に設定される。
【００５９】
示度は、２つの測定値、即ち１つは第１の光源２０からで１つは第２の光源２２から、を使用して生み出される。従って、一実施形態では、ある示度を生み出すために、第１の測定値が、４７１．３ナノメートルの励起フィルタを介して第１の光源を用いて測定される。従って、第１の測定値は、第１の波長Ｆ１の光を用いた標的の照射に対応する。この第１の測定値からの、各ＰＭＴから１つの４つのＰＭＴ値は保存される。第２の測定値は、４７３．０ナノメートルの励起フィルタを介して第２の光源を用いて測定される。従って、第２の測定値は、第２の波長Ｆ２の光を用いた標的の照射に対応する。この第２の測定からの、各ＰＭＴから１つの４つのＰＭＴ値は保存される。このように、示度は８つの値、即ち４７１．３のフィルタを用いて測定された４つのＰＭＴ値及び４７３．０のフィルタを用いた４つのＰＭＴ値、を使用する。（当業者に明らかになるであろう通り、種々の数のＰＭＴが、示度に使用されている種々の数の値と共に使用されてもよい。特徴的ラマン発光波長Ｆｃは、組織中で測定される選択された分子に関連する。各ＰＭＴは、予測発光波長の又はそれに隣接する波長の光強度をサンプリングし、このように、ラマン散乱信号のみを測定することが所望される波長の近傍の標的蛍光に関するデータを提供する。）
複数のＰＭＴは同時に読み取られる。ＰＭＴからの値は、第１の光源２０を使用する測定に対して捕捉される。ＰＭＴからの値は、次に、第２の光源２２を使用する測定に対して捕捉される。この測定対は、一緒に単一の示度を示す。各光源２０、２２に関して複数の読取りが実施され、１つの完全なスキャンに関して生データの８つの値を集めるために結果が平均される。値が収集され平均されて、測定毎に生じる可能性のある小さい変動をならす。
【００６０】
このように、サンプリングされた強度値の第１の組は、第１の波長Ｆ１の光を用いた標的の照射に起因する光に関して生み出され、サンプリングされた強度値の第２の組は、第２の波長Ｆ２の光を用いた標的の照射に起因する光に関して生み出される。各組は、選択された分子及び各波長Ｆ１又はＦ２に関連する特徴的発光波長Ｆｃ又はその付近の値を含む。各組は、更に、各波長Ｆ１又はＦ２に起因するラマン発光を除外するために、特徴的波長Ｆｃに隣接するが該波長から十分に変位された少なくとも２つの値を含む。これらの値の少なくとも１つは、予測特徴的波長Ｆｃより低く、該値の少なくとも１つは、予測特徴的波長Ｆｃより高い。強度値の各組は、各強度センサ（例えば、ＰＭＴ）からの値を含む。従って、サンプリングされた強度値の第１の組は、第１の波長Ｆ１の照射に起因する、複数のセンサからの値を含む。例えば、第１の組は、４つの値ＳＦ１０、ＳＦ１１、ＳＦ１２、ＳＦ１３を含み、１つは４つのセンサの各々に起因する。値の組は、順序集合であり、値の１つ、例えば、Ｆ１１は、選択された分子及び第１の波長Ｆ１に関連する特徴的波長Ｆｃの測定値である。同様に、サンプリングされた強度値の第２の組は、第２の波長Ｆ２の照射に起因する、複数のセンサからの値を含む。例えば、第２の組は、４つの値ＳＦ２０、ＳＦ２１、ＳＦ２２、ＳＦ２３を含み、１つは４つのセンサの各々に起因する。値の組は、順序集合であり、値の１つ、例えば、Ｆ２１は、選択された分子及び第２の波長Ｆ２に関連する特徴的波長Ｆｃの測定値である。
【００６１】
従って、完全なスキャン及び測定は、以下を含む。（１）ブロック６１０に示す通り、実施される読取りの数を決定すること（一般に、よい結果を得るためには、参照基準を読み取る場合より皮膚を読み取る場合に、より多くの読取り及びより長いスキャンを行なう。実施されるスキャンの数は、当業者による、通常の実験により容易に決定されてもよい）、（２）ＰＭＴへの電圧を自動調整プロセス中に決定された値に調整すること、（３）ブロック６１２、６１４に示す通り、決定された数の読取りを実施し、それぞれから返された８つの値を保存すること、及び（４）ブロック６１６に示す通り、各測定から返された８つの値の結果を平均すること。スキャンからの生の未処理データは、このように、全部で８つの、各光源での各ＰＭＴの平均値を含む。（較正プロセスが繰り返されたので、これらが変更されていない限り、ＰＭＴ電圧を調整するステップは実施される必要がないことに留意されたい。）
以下で検討する通り、生の未処理データは、カロテノイド・スコアに変換するためのデータ分析を受ける。一般に、第１及び第２の波長Ｆ１及びＦ２の各々に関連する特徴的波長Ｆｃ間の発光に関する補間強度値は、サンプリングされた強度値の第１及び第２の組から得られる。補間強度値は、非ラマン発光による強度値成分を除去する。
【００６２】
異常に高い蛍光性を示す組織が、アナログ・デジタル・コンバータが値を正確に変換できないようなＰＭＴからの高出力を生成する可能性があることに留意すべきである。このことが起こった場合、ＰＭＴ電圧が約２０ボルト下げられてもよく、スキャンは繰返される。電圧は、スキャンが成功するまで、約２０ボルトずつ繰り返し下げられてもよい。緑色ダイオード信号を再度読み取り、前回の緑色ダイオード示度と比較して、下げられたＰＭＴ電圧での組織の示度を適切に較正することができる。
【００６３】
３．データ分析
データ分析プロセスは、読取りにおいて得られた生データをカロテノイド・スコアに変換する。カロテノイド・スコアは任意の範囲で表されてもよく、組織中のカロテノイド・レベルを示す。一実施形態では、範囲は０〜１００，０００である。前述したように、カロテノイド・スコアの計算は次の通りである。
【００６４】
カロテノイド・スコア＝Ｃ値×係数＋補正値
分析プロセスは、現在のスキャンからの生データを処理するために、較正中に収集されたデータを使用する。
【００６５】
上記で検討した通り、現在のスキャンは、複数の値、即ち第１の光源を使用する各ＰＭＴに関する値及び第２の光源を使用する各ＰＭＴに関する値、をもたらす。検討されている実施形態では、従って、スキャンは８つの値、即ち４７１．３ナノメートルのフィルタを有する光源を使用する４つのＰＭＴの各々に関する値及び４７３．０ナノメートルのフィルタを有する光源を使用する４つのＰＭＴの各々に関する値、をもたらす。該値はそれぞれ、各ＰＭＴの示度を平均すること、ＰＭＴ及びそれらの帯域通過フィルタが対象としている波長範囲における異なる波長のサンプルを示すことを含む。
【００６６】
温度変化は、スキャンが行なわれている環境の変化が原因で、又は通常動作中の機械及びＰＭＴの単なる温度上昇が原因で、起こる可能性がある。ＰＭＴの光感受性の任意の変動及びＰＭＴの応答における結果の変動を補正するために、生データ上で「緑色正規化」が実施される。緑色正規化は、生データを緑色較正データ（図１６の５１６に示す通り、較正で測定された較正部分の光源のＰＭＴ示度）の比率で調整し（と乗算し）、緑色示度（図１８の６０２に示す通り、照射される較正部分の光源を用いるスキャンの最初に測定されたＰＭＴ示度）で除することを含む。この手順は、生のＰＭＴ示度を、較正時にスキャンが行なわれた場合に示したであろう示度に調整する。
【００６７】
緑色正規化がＰＭＴ応答の変動を補正する一方、両光源２０又は２２の輝度の変動を補正するために、輝度較正が行なわれる。一実施形態では、励起部分１２の第１又は第２の光源２０、２２を用いて測定されたＰＭＴ示度は、ＰＭＴ信号に、組織読取り中に測定された青色ＬＥＤ信号に対する較正プロセス中に測定された対応する青色ＬＥＤ信号の比率を乗じることにより補正される。
【００６８】
このように、生データは、機械較正時とスキャン実行時との間に起こった可能性のある、（例えば、温度変化が原因の）ＰＭＴ応答の変動及び光源の輝度の変動に関して補正される。ＰＭＴ電圧は、較正部分１６の光源２３の示度における変動を使用して補正される。光源の輝度は、青色フォトダイオード３８の示度における変動を使用して補正される。
【００６９】
フォトダイオードの示度もまた、補正されてもよい。光源２０、２２、２３のスイッチが切られた場合、システム中に光が存在するはずはなく、フォトダイオードは０を読み取るはずである。これは、必ずしもそうとは限らない。従って、スキャンの初めに、光源２０、２２、２３のスイッチが切られている場合があり、フォトダイオード３８、５８において、短時間の示度が非ゼロ電圧で測定される。測定された非ゼロ電圧は、次に、同一スキャン内で行なわれるすべての後続のフォトダイオードの読取りから減ぜられてもよい。
【００７０】
データ分析中、すべてのＰＭＴ示度は「ダーク差引きされる」。ダーク・スキャンからのダーク・データは、ダーク差引き中に使用される。ダーク・スキャンから保存された各生データ値は、正規化データ・アレイにおいてそれに対応する値から減じられる（即ち、第１の光源２０及びフィルタ２４を用いたＰＭＴ４２におけるダーク値は、第１の光源２０及びフィルタ２４を有するＰＭＴ４２における正規化データから減じられる）。一実施形態では、ダーク・データは、捕捉時又はその応用時に、正規化又は補正されない。
【００７１】
各ＰＭＴに関して、（例えば、４７１．３ナノメートルの励起フィルタを有する）第１の光源が照射された時に捕捉された、ダーク差引き済みの、緑色正規化済みの生データの比率は、（例えば、４７３ナノメートルのフィルタを有する）第２の光源が照射された時の同等のデータで除される。図示の実施形態では、このプロセスにより、各ＰＭＴにつき１つの４つの正規化された信号比率が生成される。従って、これらの比率は、ＳＦ１０／ＳＦ２０、ＳＦ１１／ＳＦ２１、ＳＦ１２／ＳＦ２２、及びＳＦ１３／ＳＦ２３を含んでもよい。値「Ｄ」は、これら４つの比率を使用して計算される。
【００７２】
Ｄは、カロテノイド信号の存在下又は不在下でＰＭＴの比率間の差の大きさである。機械により測定される標的蛍光に対してカロテノイドが付加する信号における差である。「Ｄ」は、図２０に示す、４つの比率を通って描かれた放物線に関して計算される。放物線は２つの特徴を有する。第１に、放物線は第１及び最後のＰＭＴの比率を通過する。第２に、第２のＰＭＴに関する比率と放物線との間の距離の大きさは、第３のＰＭＴでの距離の大きさに等しい。図２０は、ＰＭＴ比率及びそれらに由来する放物線を示す。Ｄは、ＰＭＴ１の曲線まで下がるか又はＰＭＴ２の曲線まで上がる、ＰＭＴ比率からの距離である。図示のアルゴリズムの実施形態では、これらの距離は等しい。この補間アルゴリズムで使用されている放物線の式は、以下でより詳細に検討する。
【００７３】
一般に、放物曲線は、２つの既知の端点（ＰＭＴ０及びＰＭＴ３）間を補完して、ＰＭＴ１とＰＭＴ２との間の中間に標的蛍光レベルを見出すために使用される。このレベルは、Ｄの値を決定するのに使用されてもよい。ＰＭＴ０及びＰＭＴ３において測定された比率をこのように放物線補完アルゴリズムに使用して、ＰＭＴ０とＰＭＴ３との間で測定されたスペクトル（波長サンプリング範囲）の中間点における標的蛍光を決定してもよい。この手順は、ＰＭＴ１で測定された比率と背景蛍光信号レベルとの差の大きさ、及び／又はＰＭＴ２で測定された比率と背景蛍光信号レベルとの差の大きさである値Ｄを返す。
【００７４】
別の方法で述べると、曲線は計算された比率をフィッティングするために外挿され、曲線は点｛ｆ０，ＳＦ１０／ＳＦ２０｝及び｛ｆ０，ＳＦ１３／ＳＦ２３｝を通過し、そこでは、ｆ０、ｆ１、ｆ２及びｆ３の各々は、４つのセンサの各第１、第２、第３、及び第４の中心波長であり、曲線は、点｛ｆ１，ＳＦ１１／ＳＦ２１｝及び｛ｆ２，ＳＦ１２／ＳＦ２２｝から等距離にある。
【００７５】
従って、値Ｄは、ラマン信号が存在する場合及び存在しない場合の、ＰＭＴの示度の比率間の差の大きさを表す。この差は、装置により測定される標的蛍光に対してカロテノイドが付加する信号における差である。この値は、標的中の相対カロテノイド濃度レベルを示す。Ｄは非常に小さい数字であり、背景蛍光と比べてラマン信号が非常に小さいという事実を反映している。通常、ラマン活性成分を有さない参照標準を読み取る場合、Ｄは０に近い。相当なラマン信号を生成する物質を含む参照標準を読み取る場合、Ｄは０．０２を超過し得る。皮膚組織のＤは、通常、０．００５０〜０．０１００の範囲にある。特定の値は、センサ又は検出器のスペクトル分解能の影響を受ける。本実施形態におけるセンサ又は検出器は、一式のＰＭＴである。
【００７６】
以下でより十分に検討する通り、通常、Ｄを計算するために、放物線はＰＭＴ比率を通って描かれる。放物線は２つの特徴を有する。第１に、放物線は第１及び最後のＰＭＴの比率を通過する。第２に、第２のＰＭＴに関する比率と放物線との間の距離は、第３のＰＭＴにおける比率と放物線との間の距離に等しい。Ｄは、第２のＰＭＴの曲線まで下がるか又は第３のＰＭＴの曲線まで上がる、ＰＭＴ比率からの距離である（これらの距離は等しい）。
【００７７】
従って、Ｄは、ラマン信号の存在によるＰＭＴ比率の増加を測定する。ＤはＰＭＴ信号の比率を使用して計算されたため、存在するラマン活性物質量の有意味な測定を行なうには、Ｄに平均ＰＭＴ電圧を乗ずることが必要である。平均ＰＭＴ電圧は、第２の光源が第２のフィルタを照射した時に測定された電圧である。この値はＣと称され、組織中のラマン活性物質量の、最終的な非較正量である。
【００７８】
最終ステップにおいて、カロテノイド・スコアは、スキャンから得られるＣの値、並びに較正プロセスにより生成される係数及び補正値から計算される。これにより、較正カロテノイド・スコアが提示される。較正プロセスは、日々機械内で又は機械毎に起こる可能性のある変動を緩和する。構成要素は老朽化し機械毎に同一ではない。較正プロセスは、これらのことがスコアに影響するのを防ぐ。
【００７９】
活性物質の漸増濃度とＣ値との間の参照標準を読み取ると、一般に直線の関係が認められる。従って、一次方程式を使用して、スキャンの最終結果を計算する。
【００８０】
カロテノイド・スコア＝（Ｃ×係数）＋補正値
別の実施形態では、活性物質の漸増濃度を有する較正物質の示度を表すのに、高次多項式が使用されることもある。
【００８１】
４本のＰＭＴ測定に関して、カーブ・フィットは直線又は放物線でしかあり得ないことに留意されたい。しかし、ＰＭＴの数が増えた場合、多項式はＰＭＴの数−２まで作られてもよい。従って、例えば、５本のＰＭＴが設けられた場合、三次多項式が適している可能性がある。
【００８２】
更に、２つの励起波長が使用される一方、任意の数の励起波長が使用されてもよい。
【００８３】
利益及び用途
本方法及び装置を使用して、ヒトの皮膚などの組織中のカロテノイド含有量を検出及び測定してもよい。類似の機器及び較正を用いる２００万回のスキャンからのデータを使用すると、ヒトの皮膚のカロテノイド・スコアは２６，０００である。果物及び野菜が多い食事とカロテノイド・スコアとの間には、高い相関がある。健康に良い食事を取り、栄養補助食品を使用する人は、７０，０００を超えるスコアを出すこともある。好ましくない食習慣又は喫煙などの他の習慣を持つ人は、１０，０００未満のスコアを出すこともある。
【００８４】
皮膚中のカロテノイド、レチノイド、及び類似の化学物質のレベルと特定の健康状態との間に相関があることは、ある研究において以前に例証されている。低レベルのカロテノイドが測定された場合、栄養補助食品を含む食事の是正などの予防措置を取ることができる。
【００８５】
健康と関連のあることが認められているいくつかのカロテノイドには、オールトランス型β−カロテン（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−．ｂｅｔａ．−ｃａｒｏｔｅｎｅ）、リコピン、α−カロテン、γ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、セプタプレノ型β−カロテン（ｓｅｐｔａｐｒｅｎｏ−．ｂｅｔａ．−ｃａｒｏｔｅｎｅ）、７，７’ジヒドロ−β−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、β−アポ−8'−カロテナール（ｂｅｔａ−ａｐｏ−８’−ｃａｒｏｔｅｎａｌ）、ビオラキサンチン、及びロドキサンチン（ｒｈｏｄｏｘａｎｔｈｉｎ）が含まれる。これらは、種々の長さ及び連結を有する鎖様分子であり、すべて、炭素二重結合及び炭素単結合がそれぞれ交互になった状態の炭素骨格を有する。すべてのカロテノイドに共通の、これらの結合の振動は、ラマン分光法を用いて検出することができる。これらのカロテノイドの波数シフトが一般に８００〜２０００ｃｍ−１（波数）の範囲内にあることは、別個の測定から既知である。例えば、カロテノイドのルテイン及びゼアキサンチンが、それぞれ約１１６０ｃｍ−１及び１５２０ｃｍ−１の波数シフトを有することは既知である。
【００８６】
カロテノイドは、皮膚の抗酸化防御系の重要な成分であり、そこでは、カロテノイドは、フリーラジカル及び一重項酸素スカベンジャーとしての役割を果たすと考えられている。更に、カロテノイドは、多数の活性酸素種（ＲＯＳ）から皮膚を防御する。ＲＯＳは、例えば、太陽光などからの紫外（ＵＶ）線への皮膚の過剰な暴露により形成される。一旦形成されると、ＲＯＳはＤＮＡ、タンパク質、及び不飽和脂肪酸に効率的に反応し、ＤＮＡ鎖の破壊及び酸化損傷、並びにタンパク質−タンパク質及びタンパク質−ＤＮＡの交差結合を引き起こす。脂質の酸化は過酸化脂質の形成をもたらし、これは細胞中で比較的長期間持続し、従って、ラジカル連鎖反応を開始して酸化損傷を増強する可能性がある。
【００８７】
本方法及び装置は、種々のヒト組織及び体液におけるカロテノイド・レベルの迅速で非侵襲的な査定を実現し、更に有益な用途を有する。これらには、ヒト組織における全体的な抗酸化状態を査定すること、組織のカロテノイド含有量又は他の抗酸化物質含有量の食事操作の監視を提供すること、及びカロテノイドの分布及び化粧品化合物からの摂取を査定するための道具を提供することが含まれる。
【００８８】
更に、本方法及び装置は、皮膚及び皮膚病巣中のカロテノイド・レベルを測定するのに使用されてもよい。カロテノイド分子から非弾性散乱され、ラマン信号を形成する光の強度は、正常な生物組織からのラマン散乱の強度と比較して、状態を査定することができる。ラマン信号の強度もまた定量化して、組織の酸化状態を査定することができる。
【００８９】
「Ｄ」を導出する
以下の検討は、放物線と（ｘ，ｙ）点の対に関する式の一般形式で開始する。（ｘ，ｙ）点の対の値は、ＰＭＴの数、及び読取りに４７１．３のフィルタが使用された場合のその出力値を４７３．０のフィルタを使用した場合の値で除した比率である。この検討は、Ｄ及びベースライン放物線の係数を計算するのに使用されてもよい式の導出を示す。図２０を参照されたい。
【００９０】
Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３は、ＰＭＴ０〜３それぞれの比率の値である。放物線上の４点は既知である。
【００９１】
【化１】
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これらの値及び放物線の式の一般形式（ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ）を使用して、Ｄの値を求めることができる。
【００９２】
【化２−１】
2009510473.tif 000004
【００９３】
【化２−２】
2009510473.tif 000005
第１の式では、Ｐ０＝ｃである。ｃをＰ０で置き換え、Ｐ０を左辺に移項し、定数を乗ずることにより、上記の式は単純化できる。４つの式は以下のようになる。
【００９４】
【化３】
2009510473.tif 000006
このように、ｃの値が求められる。ａ及びｂの値を求めると、Ｄは消去される。最初に、式２及び３を解いてＤの値を求める。
【００９５】
【化４】
2009510473.tif 000007
Ｄ＝Ｄなので、２つの式は等しく置き直し得る。
【００９６】
【化５】
2009510473.tif 000008
式５を解いてａの値を求める。
【００９７】
【化６】
2009510473.tif 000009
式２及び３を解いてａの値を求める。ａを式４に代入してｂを求める。
【００９８】
【化７】
2009510473.tif 000010
ｂを求めたら、式２の簡略版を使用してＤを求めてもよい。
【００９９】
【化８】
2009510473.tif 000011
式６から、ａの値を代入する。
【０１００】
【化９】
2009510473.tif 000012
最後に、式７からｂの値を当てはめてＤを求める。
【０１０１】
【化１０】
2009510473.tif 000013
結果のＤは、式３を使用するプロセスを繰返すことにより、チェックされてもよい。
【０１０２】
【化１１】
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最初にａ＝（−２Ｐ０＋Ｐ１＋Ｐ２−３ｂ）／５を代入し、次にｂ＝（−１３Ｐ０＋９Ｐ１＋９Ｐ２−５Ｐ３）／１２を代入すると、Ｄに関して同じ結果が生じる。
【０１０３】
【化１２】
2009510473.tif 000015
式３から導かれるＤを求める最後の式は、式２から導かれる式と同一であることに留意されたい。
Ｄを計算するために「ａ」は必要なく、その解を求めないことに留意されたい。基線放物線を計算する場合は、「ａ」の解を求めてもよい。最初の式のいずれが使用されてもよい。例えば、式４である。
【０１０４】
【化１３】
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このように、ａ、ｂ、ｃの値が計算され、次の式を用いて、ＰＭＴ比率の値であるＤが得られる。
【０１０５】
【化１４】
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最終チェックが、４つの最初の式の各々を実証することにより実施されてもよい。
【０１０６】
【化１５】
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【０１０７】
【化１６】
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好適な実施形態を参照して本発明を記載してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形式及び詳細において変更がなされてもよいことを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、装置の基本的な光処理構成要素の概略図である。
【図２】図２は、正面からの絵画図、並びに装置、その制御コンピュータ及びその電源の概略図である。
【図３】図３は、分光計の主要構成要素のための内部ハウジングの背面からの絵画図である。
【図４】図４は、装置の主要構成要素のための内部ハウジングの上面図である。
【図５】図５は、装置の主要構成要素のための内部ハウジングの正面からの絵画図であり、また、支援構成要素及び冷却ファンのための上部回路基板の位置も示している。
【図６】図６は、装置の主要構成要素のための内部ハウジングの背面からの絵画図であり、また、支援構成要素及び冷却ファンのための下部回路基板の位置も示している。
【図７】図７は、装置の主要構成要素のための内部ハウジングの左側面図である。
【図８】図８は、装置の主要構成要素のための内部ハウジングの右側面図である。
【図９】図９は、装置の外面の正面からの絵画図である。
【図１０】図１０は、装置の外面の背面からの絵画図である。
【図１１】図１１は、装置の外面の背面図である。
【図１２】図１２は、装置の内部の左側面からの絵画図及び横断面図である。
【図１３】図１３は、装置の内部の上面からの絵画図及び内部図である。
【図１４】図１４は、装置の内部の後方斜めからの絵画図及び内部図である。
【図１５】図１５は、装置と共に使用されている方法のハイレベル・フロー・チャートである。
【図１６】図１６は、装置と共に使用されているフィールド較正プロセスのフロー・チャートである。
【図１７】図１７は、装置と共に使用されているフィールド較正プロセスの自動調整部分のフロー・チャートである。
【図１８】図１８は、組織測定における示度を収集するために使用されているデータ収集及び初期計算のフロー・チャートである。
【図１９】図１９は、最終ラマン散乱値を提示するために分析される測定値を提供するのに必要な２つのスキャンを実行するステップのフロー・チャートである。
【図２０】図２０は、２つの異なる励起波長での測定に関するＰＭＴ比率と該比率値を使用して構成されている放物曲線とをグラフで表して示す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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