(57)【要約】本発明は、調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストを同定するための方法、および調節性Ｔ細胞機能を抑制し得るＧＰＲ８３アンタゴニストを同定するための方法を提供する。この方法は、試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）とを接触させる工程、および上記試験化合物の、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性を刺激する能力を決定し、ここで上記ＧＰＲ８３ポリペプチドの能力の刺激は、上記試験化合物が調節性Ｔ細胞機能を刺激し得ることを示し、上記能力を決定することによって上記試験化合物を調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストとして同定する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストを同定するためのアッセイであって、
試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物とを接触させる工程；および
該試験化合物の、該ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性を刺激する能力を決定し、ここで該ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性の刺激は、該試験化合物が調節性Ｔ細胞機能を刺激することを示し、それによって該試験化合物を調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストとして同定する工程；
を包含する、アッセイ。
【請求項２】
調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストを同定するためのアッセイであって、
試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物とを接触させる工程；および
該試験化合物の、ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能を刺激する能力を決定し、それによって該試験化合物を、調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストとして同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
前記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む前記指標組成物は、試験化合物の該ライブラリーの各メンバーと接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む前記指標組成物は、試験化合物の該ライブラリーのメンバーのうちの少なくとも半分と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ調節性細胞機能に対する前記試験化合物の効果を、インビボアッセイを使用して決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記インビボアッセイは、アレルギー疾患または自己免疫疾患についての動物モデルの使用を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記指標組成物は、組換えＧＰＲ８３ポリペプチドを発現する細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞に、前記ＧＰＲ８３ポリペプチドをコードする発現ベクターを導入することによって、該細胞が該ＧＰＲ８３ポリペプチドを発現するように設計されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、前記試験化合物の存在下および非存在下で細胞内アデニリルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度を測定し、次いで該試験化合物の調節性Ｔ細胞機能を刺激する能力を試験する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記指標組成物は、指標細胞を含み、該指標細胞は、前記ＧＰＲ８３ポリペプチドおよび該ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性に感受性のレポーター遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記指標組成物は、Ｆｏｘｐ３含有Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターサイトカインの産生の抑制である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エフェクターサイトカインは、ＩＬ−２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞の機能の抑制である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記エフェクター細胞は、Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔヘルパー細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の増殖の抑制である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞によるサイトカイン産生の抑制である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
調節性Ｔ細胞機能を抑制し得るＧＰＲ８３アンタゴニストを同定するためのアッセイであって、
試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物とを接触させる工程；および
該試験化合物の、ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能を抑制する能力を決定し、それによって該試験化合物を調節性Ｔ細胞機能を抑制し得るＧＰＲ８３アンタゴニストとして同定する工程；
を包含する、アッセイ。
【請求項２０】
前記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む前記指標組成物は、試験化合物の該ライブラリーの各メンバーと接触される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む前記指標組成物は、試験化合物の該ライブラリーのメンバーのうちの少なくとも半分と接触される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ調節性細胞機能に対する前記試験化合物の効果を、インビボアッセイを使用して決定する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記インビボアッセイは、ＨＩＶについての動物モデルまたは腫瘍の動物モデルの使用を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記指標組成物は、組換えＧＰＲ８３ポリペプチドを発現する細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞に、前記ＧＰＲ８３ポリペプチドをコードする発現ベクターを導入することによって、該細胞が該ＧＰＲ８３ポリペプチドを発現するように設計されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は、前記試験化合物の存在下および非存在下で細胞内アデニリルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度を測定し、次いで該試験化合物の調節性Ｔ細胞機能を抑制する能力を試験する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記指標組成物は、指標細胞を含み、該指標細胞は、前記ＧＰＲ８３ポリペプチドおよび該ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性に感受性のレポーター遺伝子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記指標組成物は、Ｆｏｘｐ３含有Ｔ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターサイトカインの産生の抑制である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記エフェクターサイトカインは、ＩＬ−２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞の機能の抑制である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記エフェクター細胞は、Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔヘルパー細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の増殖の抑制である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞によるサイトカイン産生の抑制である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮特許出願第６０／７１８４８２号（２００５年９月１９日出願）および米国仮特許出願第６０／７８９４７７号（２００６年４月５日出願）（これらの各々の内容全体は、本明細書中に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫系は、ヒトの身体に、外来性でありかつ潜在的に有害であると認識される微生物、ウイルス、および物質を認識しそしてそれらに対してヒトの身体自体を防御するための手段を提供する。古典的免疫応答は、抗原提示細胞が抗原をＣＤ４＋  Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球に提示する場合に開始され、それは、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の増殖、およびエフェクターＴリンパ球の分化を生じる。感染または外来組織の移植によって生じるような抗原に対する曝露後、ナイーブＴ細胞は、異なる機能によって、Ｔｈｌ細胞およびＴｈ２細胞へと分化する。Ｔｈｌ細胞は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン２（ＩＬ−２）（両方とも細胞媒介性免疫応答に関連する）を産生する。Ｔｈｌ細胞は、一般に外来組織移植片の拒絶および多くの自己免疫疾患に関与する免疫応答において役割を果たす。Ｔｈ２細胞は、サイトカイン（例えば、インターロイキン−４（ＩＬ−４））を産生し、そして一般にアレルギーおよびアレルギー性炎症応答（例えば、アレルギー性鼻炎および喘息）に関与するような抗体媒介性免疫応答に関連する。Ｔｈ２細胞はまた、外来移植片の拒絶に寄与し得る。多くの状況では、この免疫応答は、例えば、細菌感染またはウイルス感染に対して身体を防御すること、癌性細胞の増殖を阻害することなどにおいて望ましい。しかし、他の状況では、このようなエフェクターＴ細胞は、例えば、移植レシピエントにおいて望ましくない。
【０００３】
免疫系が抗原によって活性化されるかまたは抗原に対して寛容化されるかは、Ｔエフェクター細胞の活性化とＴ調節性細胞活性化との間のバランスに依存する。Ｔ調節性細胞は、免疫学的寛容の誘導および維持を担う。これらの細胞は、低いレベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１２を産生するＴ細胞である。調節性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞よりも低いレベルではあるがＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を産生する。ＴＧＦβは、調節性Ｔ細胞によって産生される優勢なサイトカインであるが、そのサイトカインは、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞における産生よりも低いレベル（例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞における産生より一桁少ない）で産生される。調節性Ｔ細胞は、細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団において見出され得る（例えば、非特許文献１を参照のこと）。調節性Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、またはナイーブＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を活発に抑制し、それは、活性化シグナル（例えば、抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣの構成（ｃｏｎｔｅｘｔ）において抗原を模倣するシグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体））によって培養物中で刺激される。
【非特許文献１】ＷａｌｄｍａｎｎおよびＣｏｂｂｏｌｄ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００１年、第１４巻、ｐ．３９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在までに、望ましくない免疫応答は、免疫系全体（すなわち、望ましい免疫応答および望ましくない免疫応答の両方）を阻害する免疫抑制薬によって処置されてきた。一般的な免疫抑制剤は、長期間にわたって頻繁に投与されなければならず、そして多くの有害な副作用を有する。これらの薬物の中止は、一般に、疾患の再発をもたらす。したがって、免疫系全体をモジュレートすることなく免疫系のエフェクター機能（ａｒｍ）または調節機能を優勢にモジュレートする薬剤に対する必要性が、存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも部分的に、ＧＰＲ８３（Ｈａｒｒｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９１）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  ５：１３３１−１３３８によって初めて記載されたグルココルチコイド誘導性レセプター）が調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）中でｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において異なって発現されるという知見に基づく。本発明はまた、少なくとも部分的に、ＧＰＲ８３に対する潜在的なリガンドを含む脳由来の画分が、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を特異的に刺激し、そして（例えば、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を活性化することによって）それらの免疫調節活性を増大させて、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＩＮＦ−γ）を産生させ得るという知見に基づく。
【０００６】
したがって、１つの局面において、本発明は、調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストを同定するためのアッセイを提供する。この方法は、試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）とを接触させる工程、および上記試験化合物の、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性を刺激する能力を決定し、ここで上記ＧＰＲ８３ポリペプチドの能力の刺激は、上記試験化合物が調節性Ｔ細胞機能を刺激し得ることを示し、上記能力を決定することによって上記試験化合物を調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストとして同定する工程を包含する。
【０００７】
なお別の局面において、本発明は、試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物とを接触させ、そして上記試験化合物の、ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能を刺激する能力を決定し、それにより上記試験化合物を、調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストとして同定することによって、調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストを同定するためのアッセイを提供する。この方法は、調節性Ｔ細胞機能に対する上記試験化合物の効果を、インビボアッセイを使用して決定する工程をさらに包含し得る。１つの実施形態において、上記インビボアッセイは、アレルギー疾患または自己免疫疾患についての動物モデルの使用を含み得る。
【０００８】
１つの実施形態において、上記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む上記指標組成物は、試験化合物の上記ライブラリーの各メンバーと接触される。別の実施形態において、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む上記指標組成物は、試験化合物の上記ライブラリーのメンバーのうちの少なくとも半分と接触される。
【０００９】
１つの実施形態において、上記指標組成物は、組換えＧＰＲ８３ポリペプチドを発現する細胞である。例えば、上記細胞は、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドを発現するように設計され得、上記細胞は、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドをコードする発現ベクターを導入され得る。なお別の実施形態において、上記指標組成物は、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドおよび上記ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性に感受性のレポーター遺伝子を含む指標細胞（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を含む。１つの実施形態において、上記指標組成物は、Ｆｏｘｐ３含有Ｔ細胞である。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明のアッセイは、上記試験化合物の存在下および非存在下で細胞内アデニリルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度を測定し、次いで上記試験化合物の調節性Ｔ細胞機能を刺激する能力を試験する工程を包含する。
【００１１】
１つの実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターサイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の産生の抑制である。
【００１２】
１つの実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞（例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞））、および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）の機能の抑制である。別の実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の増殖の抑制である。なお別の実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞によるサイトカイン産生の抑制である。
【００１３】
別の局面において、本発明は、調節性Ｔ細胞機能を抑制し得るＧＰＲ８３アンタゴニストを同定するためのアッセイを提供する。この方法は、試験化合物と、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物とを接触させる工程、および上記試験化合物の、ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能を抑制する能力を決定し、それによって上記試験化合物を調節性Ｔ細胞機能を抑制し得るＧＰＲ８３アンタゴニストとして同定する工程を包含する。この方法は、Ｔ調節性細胞機能に対する前記試験化合物の効果を、インビボアッセイを使用して決定する工程をさらに包含し得る。１つの実施形態において、上記インビボアッセイは、ＨＩＶについての動物モデルまたは腫瘍の動物モデルの使用を含む。
【００１４】
１つの実施形態において、上記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む上記指標組成物は、試験化合物の上記ライブラリーの各メンバーと接触される。別の実施形態において、上記試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであり、そしてＧＰＲ８３ポリペプチドを含む上記指標組成物は、試験化合物の上記ライブラリーのメンバーのうちの少なくとも半分と接触される。
【００１５】
１つの実施形態において、上記指標組成物は、組換えＧＰＲ８３ポリペプチドを含む細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドを発現するように設計され、上記細胞は、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドをコードする発現ベクターを導入されている。なお別の実施形態において、上記指標組成物は、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドおよび上記ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性に感受性のレポーター遺伝子を含む指標細胞を含む。１つの実施形態において、上記指標組成物は、Ｆｏｘｐ３含有Ｔ細胞である。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明のアッセイは、上記試験化合物の存在下および非存在下で細胞内アデニリルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度を測定し、次いで上記試験化合物の調節性Ｔ細胞機能を抑制する能力を試験する工程を包含する。別の実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターサイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の産生の抑制である。
【００１７】
１つの実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞（例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ））の機能の抑制である。別の実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の増殖の抑制である。なお別の実施形態において、上記ＧＰＲ８３ポリペプチドによって媒介される調節性Ｔ細胞機能は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞によるサイトカイン産生の抑制である。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
古典的免疫応答において、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）応答は、抗原の除去を生じる調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の応答を支配する。寛容は、古典的活性化経路（すなわち、抗原の提示およびＴ細胞の活性化）と同一の工程によって始まるが、因子（抗原の豊富さ、抗原がＴ細胞に提示される手段、およびＣＤ４＋細胞の相対的有効性が挙げられるが、これらに限定されない）は、調節性Ｔ細胞と称されるリンパ球の異なるクラスの増殖をもたらすことを補助する。エフェクターＴ細胞が古典的免疫応答を媒介するのと同時に、調節性Ｔ細胞は、免疫寛容応答を媒介する。しかし、アレルギー、自己免疫疾患、器官の拒絶、治療用タンパク質の慢性投与などに関連するような、望ましくないかまたは誤って誘導された（ｍｉｓｄｉｒｅｃｔｅｄ）の免疫応答は、望ましくない身体における状態、およびいくつかの場合において致命的となり得る身体における状態をもたらし得る。エフェクターＴ細胞を上回る調節性Ｔ細胞のバランスの優勢またはそのバランスへの移行は、抗原保持および免疫学的寛容をもたらす。
【００２０】
本発明は、少なくとも部分的に、ＧＰＲ８３（Ｈａｒｒｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９１）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  ５：１３３１−１３３８によって初めて記載されたグルココルチコイド誘導性レセプター）が調節性Ｔ細胞中でｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において異なって発現されるという知見に基づく。本発明はまた、少なくとも部分的に、ＧＰＲ８３に対する潜在的なリガンドを含む脳由来の画分が、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を特異的に刺激し、そして（例えば、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を活性化することによって）それらの免疫調節活性を増大させて、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＩＮＦ−γ）を産生させ得るという知見に基づく。
【００２１】
本発明は、調節性Ｔ細胞機能を刺激し得るＧＰＲ８３アゴニストを同定するための方法および調節性Ｔ細胞機能を抑制し得るＧＰＲ８３アンタゴニストを同定するための方法を提供する。本明細書中に記載される方法を使用して同定されたＧＰＲ８３アゴニストは、調節性Ｔ細胞機能の刺激から利益を受ける状態（例えば、移植拒絶；アレルギー疾患および自己免疫疾患）を有する被験体を処置するのに有用である。本明細書中に記載される方法を使用して同定されたＧＰＲ８３アンタゴニストは、調節性Ｔ細胞機能の抑制から利益を受ける状態（例えば、免疫細胞のウイルス感染に関連する疾患（例えば、ＡＩＤＳ）または癌）を有する被験体を処置するのに有用である。
【００２２】
本発明のさらなる説明の前に、特定の用語は、便宜のために、下に記載される。
【００２３】
（Ｉ．定義）
用語「ＧＰＲ８３」（「グルココルチコイド誘導性レセプター」（「ＧＩＲ」）としても公知である）、「ＧＰＲ７２」、「ｒｐ−２３」、および「ＨＣＥＰＴ０９」とは、グルココルチコイドおよびｃＡＭＰによって誘導される遺伝子としてＨａｒｒｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９１）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５（９）：１３３１−８によって初めて同定されたオーファンＧ共役型タンパク質レセプター（ＧＰＣＲまたはＧＰＲ）をいう。ヒトＧＰＲ８３の核酸配列およびアミノ酸配列は、当該分野において公知であり、そしてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ｇｉ：３３３５４２５７（ＮＰ０５７６２４）（その内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）において見出され得る。マウスＧＰＲ８３（ｍＧＰＲ８３）の核酸配列およびアミノ酸配列もまた、当該分野において公知であり、そしてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ｇｉ：１９３５１６（Ｍ８０４８１）（その内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）において見出され得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「調節性Ｔ細胞機能の刺激から利益を受ける状態」は、調節性Ｔ細胞機能の刺激および／またはエフェクターＴ細胞機能の抑制から利益を受ける疾患、障害、または状態を含む。例えば、この用語は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）（例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）の機能および／または細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）の機能の抑制から利益を受ける疾患、障害、または状態を含む。この用語はまた、エフェクターＴ細胞増殖の抑制および／またはエフェクターＴ細胞サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の産生の抑制から利益を受ける疾患、障害、または状態を含む。このような疾患、障害、または状態の非限定的な例としては、移植拒絶；アテローム硬化症；アレルギー疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、湿疹、鼻炎、アトピー性皮膚炎および蕁麻疹）；および自己免疫疾患（例えば、炎症性腸症候群、１型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、虫刺されに対する反応（ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  ｂｉｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に起因するアレルギー応答、クローン病、結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、特発性血小板減少症、慢性活動性肝炎、扁平苔癬、クローン病、若年性特発性関節炎、全身性脱毛症、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血（自己免疫性胃炎に起因する）および慢性自己免疫性肝炎）が挙げられる。
【００２５】
アテローム硬化症は、例えば、Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ，Ｈ．ら（２００６）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２：１７８−１８０に記載される。自己免疫性炎症性疾患は、例えば、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｓら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１５１−６４；Ｇａｍｂｉｎｅｒｉ  Ｅら（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１５（４）：４３０−５；およびＫｒｉｅｇｅｌ  ＭＡら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９（９）：１２８５−９１に記載される。移植関連疾患は、例えば、Ｍａｔｓｕｏｋａ  ＫＩら（２００５）Ｂｌｏｏｄ  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｐら（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９３：２６５−８５；Ｚｏｒｎ  Ｅら（２００５）Ｂｌｏｏｄ；Ｉｋｅｍｏｔｏ  Ｔら（２００４）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｉｎｖｅｓｔ．５１（３−４）：１７８−８５；Ｔａｙｌｏｒ  ＰＡら（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４（１２）：３８０４−１２；Ｅｄｉｎｇｅｒ  Ｍら（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９（９）：１１４４−５０；およびＧｕｏ  Ｌら（２００３）Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１）：４１−８に記載される。アレルギー、喘息は、例えば、Ｈａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ  ＣＭら（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（４）：２７１−８３；Ｌｏｓｅｒ  Ｋら（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２（１７）：１２９４−３０４；およびＳｈｉ  ＨＺら（２００５）Ａｌｌｅｒｇｙ  ６０（８）：９８６−９５に記載される。アレルギー、湿疹は、例えば、Ｓａｉｎｔ−Ｍｅｚａｒｄ  Ｐら（２００４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４（５）：２８４−９５；およびＧａｍｂｉｎｅｒｉ  Ｅら（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１５（４）：４３０−５に記載される。アレルギー性鼻炎は、Ｆｒａｎｃｉｓ  ＪＮら（２００３）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１（６）：１２５５−６１に記載される。アトピー、アトピー性皮膚炎は、例えば、Ｌｉｎｇ  ＥＭら（２００４）Ｌａｎｃｅｔ．３６３（９４０９）：６０８−１５に記載される。蕁麻疹は、例えば、Ｎｉｅｖｅｓ  ＤＳら（２００４）Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４０（４）：４６６−７２に記載される。炎症性腸疾患は、例えば、Ｕｈｌｉｇ  ＨＨら（２００５）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２７（２）：１６７−１８０；Ｋａｎａｉ  Ｔら（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．５（４）：４５１−６２；Ｃｏｏｍｂｅｓ  ＪＬら（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０４：１８４−９４；およびＭｏｔｔｅｔ  Ｃら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（８）：３９３９−４３に記載される。炎症性腸疾患、クローン病は、例えば、Ｍａｋｉｔａ  Ｓら（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（５）：３１１９−３０；およびＯｌｓｏｎ  ＴＳら（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（３）：３８９−９８に記載される。潰瘍性大腸炎は、例えば、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  ＪＶら（２００５）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２７（２）：２４９−７１に記載される。Ｉ型糖尿病は、例えば、Ｐｉｃｃ���ｒｉｌｌｏ  ＣＡら（２００５）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０５１：７２−８７；Ｏｔｔ  ＰＡら（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；およびＣｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌら（２００５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（３−４）：２４７−６７に記載される。関節リウマチは、例えば、Ｖｉｇｎａ−Ｐｅｒｅｚ  Ｍら（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１（２）：３７２−８０；Ｍｏｒｇａｎ  ＭＥら（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５２（７）：２２１２−２１；Ｒｕｐｒｅｃｈｔ  ＣＲら（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１（１１）：１７９３−８０３；Ｋｅｌｃｈｔｅｒｍａｎｓ  Ｈら（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．７（２）：Ｒ４０２−１５；およびＦｒｅｙ  Ｏら（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．７（２）：Ｒ２９１−３０１に記載される。若年性特発性関節炎は、例えば、ｄｅ  Ｋｌｅｅｒ  ＩＭら（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（１０）：６４３５−４３に記載される。乾癬は、例えば、Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｈら（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（１）：１６４−７３；およびＢｏｓ  ＪＤら（２００５）Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５２（６）：１０９８−１０７に記載される。多発性硬化症は、例えば、Ｂｅｙｅｒｓｄｏｒｆ  Ｎら（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０２（３）：４４５−５５；Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ＡＡ（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ．４（２）：２１７−２９；Ｈｏｎｇ  Ｊら（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２（１８）：６４４９−５４；Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ  Ｖら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９（７）：９７１−９；およびＭｃＧｅａｃｈｙ  ＭＪら（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（５）：３０２５−３２に記載される。重症筋無力症は、例えば、Ｌｕｔｈｅｒ  Ｃら（２００５）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（１−２）：１２４−８；Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ  Ｈら（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２（６）：２０２８−３３；およびＳｕｎ  Ｙら（２００４）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２（３）：２８４−９に記載される。全身性エリテマトーデスは、例えば、Ｃｈｅｎ  Ｙら（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（２）：１０８０−９；およびＷｏｌｆ  Ｄら（２００５）Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１６（５）：１３６０−７０に記載される。自己免疫甲状腺炎は、例えば、Ｇａｎｇｉ  Ｅら（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（１１）：７００６−１３；Ｍｏｒｒｉｓ  ＧＰら（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（５）：３１１１−６；およびＫｒｉｅｇｅｌ  ＭＡら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９（９）：１２８５−９１に記載される。円形脱毛症は、例えば、Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍら（２００２）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８（６）：９８３−９２に記載される。全身性脱毛症は、例えば、Ｎｉｅｖｅｓ  ＤＳら（２００４）Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４０（４）：４６６−７２に記載される。虫刺されに対するアレルギー応答は、例えば、Ｚｕｌｅｇｅｒ  ＣＬら（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３（２４）：３１８１−６に記載される。ブドウ膜網膜炎、自己免疫性ブドウ膜炎は、例えば、Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｍら（２００４）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４５（６）：１８７９−８６に記載される。自己免疫性溶血性貧血は、例えば、Ｍｑａｄｍｉ  Ａら（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５（９）：３７４６−８；およびＮｉｅｖｅｓ  ＤＳら（２００４）Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４０（４）：４６６−７２に記載される。特発性血小板減少症は、例えば、Ｎｉｅｖｅｓ  ＤＳら（２００４）Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４０（４）：４６６−７２に記載される。慢性活動性肝炎、ウイルス性は、例えば、Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙら（２００５）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１（２４）：３７７２−７；Ｒｕｓｈｂｒｏｏｋ  ＳＭら（２００５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９（１２）：７８５２−９；Ｓｔｏｏｐ  ＪＮら（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１（４）：７７１−８；およびＣａｂｒｅｒａ  Ｒら（２００４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４０（５）：１０６２−７１に記載される。慢性自己免疫性肝炎は、例えば、Ｌｏｎｇｈｉ  ＭＳら（２００５）Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２５（１）：６３−７１；およびＬｏｎｇｈｉ  ＭＳら（２００４）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．４１（１）：３１−７に記載される。セリアック病は、例えば、Ｐｏｐａｔ  Ｓら（２００２）Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．６６（Ｐｔ  ２）：１２５−３７に記載される。扁平苔癬は、例えば、Ｈａｓｓｅｕｓ  Ｂら（２００１）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４（５）：５１６−２４に記載される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語、ＧＰＲ８３ポリペプチドの「アゴニスト」または「ＧＰＲ８３アゴニスト」は、ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性を刺激または維持する化合物（例えば、低分子、ペプチド性化合物、非ペプチド性化合物（例えば、ポリペプチドアナログ、抗体、またはそのフラグメント））を含むことが意図される。例えば、ＧＰＲ８３アゴニストは、ＧＰＲ８３の天然に存在する形態と同じ生物学的活性またはその生物学的活性のサブセットを実質的に刺激または保持し得る。このようなＧＰＲ８３アゴニストは、ＧＰＲ８３の発現および／または活性（例えば、調節性Ｔ細胞機能を媒介するＧＰＲ８３の能力）を刺激する分子あるいはＧＰＲ８３標的分子を含む。例示的なＧＰＲ８３アゴニストとしては、低分子、ペプチド性分子または非ペプチド性分子（例えば、実施例８において単離されたペプチドに基づいて設計されたペプチド性分子または非ペプチド性分子）、および抗体またはそのフラグメント（例えば、実施例７において産生されるような抗体）が挙げられる。ＧＰＲ８３アゴニストは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語、ＧＰＲ８３ポリペプチドの「アンタゴニスト」または「ＧＰＲ８３アンタゴニスト」は、ＧＰＲ８３ポリペプチドの活性を拮抗する化合物（例えば、低分子、ペプチド性化合物、非ペプチド性化合物（例えば、ポリペプチドアナログ、抗体、またはそのフラグメント））を含むことが意図される。例えば、ＧＰＲ８３アンタゴニストは、例えば、ＧＰＲ８３の細胞活性を競合的に阻害することによって、ＧＰＲ８３の天然に存在する形態の活性の１つ以上を阻害し得る。このようなＧＰＲ８３アンタゴニストは、ＧＰＲ８３の発現および／または活性を抑制する（例えば、調節性Ｔ細胞機能を媒介するＧＰＲ８３の能力を抑制する）分子を含む。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫学的寛容の誘導および維持を担うＴ細胞を含む。調節性Ｔ細胞は、低いレベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１２を産生する。調節性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞よりも低いレベルではあるがＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を産生する。ＴＧＦβは、調節性Ｔ細胞によって産生される優勢なサイトカインであるが、そのサイトカインは、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞における産生よりも低いレベル（例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞における産生より一桁少ない）で産生される。調節性Ｔ細胞は、細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団において見出され得る（例えば、ＷａｌｄｍａｎｎおよびＣｏｂｂｏｌｄ．２００１．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１４：３９９を参照のこと）。調節性Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、またはナイーブＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を活発に抑制し、それは、活性化シグナル（例えば、抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣの構成において抗原を模倣するシグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体））によって培養物中で刺激される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「調節性Ｔ細胞機能」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで決定されるような、調節性Ｔ細胞によって発揮される活性を含む。１つの実施形態において、調節性Ｔ細胞機能は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞機能を含む。別の実施形態において、調節性Ｔ細胞機能は、ＩＬ−１０調節性Ｔ細胞機能を含む。なお別の実施形態において、調節性Ｔ細胞機能は、調節性Ｔ細胞と優勢に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、またはＩＦＮ−γなど）の産生を含む。用語「調節性Ｔ細胞機能」は、免疫学的寛容の開始および／または維持を含む。１つの実施形態において、調節性Ｔ細胞機能は、炎症の抑制を含む。調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）（例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ））の活性の抑制を含む。例えば、調節性Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の増殖の抑制、および／あるいはエフェクターＴ細胞サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の産生の抑制、および／あるいはエフェクターＴ細胞によって発揮される生物学的効果（例えば、炎症など）の抑制を含む。１つの実施形態において、エフェクターＴ細胞機能の抑制は、サイトカイン依存性である。別の実施形態において、エフェクターＴ細胞機能の抑制は、サイトカイン非依存性である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクターＴ細胞」は、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）およびヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）（例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）を含む。本明細書中で使用される場合、用語「エフェクターＴ細胞機能」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで決定されるような、エフェクターＴ細胞によって発揮される活性を含む。１つの実施形態において、エフェクターＴ細胞機能は、例えば、他の細胞の活性化をモジュレートする、エフェクターＴ細胞と優勢に関連するサイトカインの産生によるか、または細胞傷害活性による抗原の排除を含む。１つの実施形態において、Ｔエフェクター細胞機能は、細胞傷害性（または細胞溶解性）Ｔ細胞（ＴｃまたはＣＴＬ）機能（例えば、微生物に感染した細胞の細胞溶解など）である。別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞機能は、Ｔｈ１細胞機能（例えば、遅延型過敏症応答の媒介およびマクロファージ活性化）である。なお別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞機能は、Ｔｈ２細胞機能（例えば、Ｂ細胞に対する補助）である（ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、１９８９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７、１４５−１７３；ＰａｕｌおよびＳｅｄｅｒ、１９９４、Ｃｅｌｌ  ７６、２４１−２５１；ＡｒｔｈｕｒおよびＭａｓｏｎ、１９８６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３、７７４−７８６；Ｐａｌｉａｒｄら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１、８４９−８５５；Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１、２３３５−２３４１）。別の実施形態において、エフェクターＴ細胞機能は、炎症応答を含む。１つの実施形態において、エフェクターＴ細胞機能は、免疫学的寛容の抑制を含む。なお別の実施形態において、エフェクターＴ細胞機能は、調節性Ｔ細胞の活性の抑制を含む。例えば、エフェクターＴ細胞機能は、調節性Ｔ細胞増殖の抑制、および／または調節性Ｔ細胞サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０および／またはＩＦＮ−γ）の産生の抑制、および／または調節性Ｔ細胞によって発揮される生物学的効果（例えば、免疫学的寛容）の抑制を含む。１つの実施形態において、調節性Ｔ細胞機能の抑制は、サイトカイン依存性である。別の実施形態において、調節性Ｔ細胞機能の抑制は、サイトカイン非依存性である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫応答」は、免疫細胞活性化のモジュレーションに影響される免疫細胞媒介性（例えば、Ｔ細胞細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性）免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｂ細胞応答（例えば、抗体産生、例えば、ＩｇＡ産生）、Ｔ細胞応答（例えば、増殖、サイトカイン産生および細胞傷害活性）、およびサイトカイン応答細胞（例えば、マクロファージ）の活性化を含む。本発明の１つの実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性である。本発明の別の実施形態において、免疫応答は、Ｂ細胞媒介性である。本明細書中で使用される場合、免疫応答に関連する用語「ダウンレギュレーション」または「抑制」は、任意の１つ以上の免疫応答（好ましくは、Ｔ細胞応答）の減少を含み、一方で、免疫応答に関連する用語「アップレギュレーション」または「刺激」は、任意の１つ以上の免疫応答（好ましくは、Ｔ細胞応答）の増大を含む。１つの型の免疫応答のアップレギュレーションは別の型の免疫応答において対応するダウンレギュレーションをもたらし得ることが、理解される。例えば、特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の産生のアップレギュレーションは、細胞性免疫応答のダウンレギュレーションをもたらし得、そしてその逆も同じである。同様に、調節性Ｔ細胞機能のアップレギュレーションは、エフェクターＴ細胞機能のダウンレギュレーションをもたらし得、そしてその逆も同じである。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔヘルパー１型応答」（Ｔｈ１応答）とは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、およびリンホトキシン（ＬＴ）、ならびにＴｈ２細胞によるよりもむしろＴｈ１細胞によって優勢にまたは専ら産生される他のサイトカインから選択される１種以上のサイトカインの産生によって特徴付けられる応答をいう。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「Ｔヘルパー２型応答」（Ｔｈ２応答）とは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１種以上のサイトカインの産生によって特徴付けられ、かつＴｈ２細胞によって提供される効率的なＢ細胞の「補助」（例えば、ＩｇＧ１および／またはＩｇＥの産生の増強）に関連する、ＣＤ４＋  Ｔ細胞による応答をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｈ１関連サイトカイン」は、Ｔｈ２細胞によるよりもむしろＴｈ１細胞によって優勢にまたは専ら産生されるサイトカインをいうことが意図される。Ｔｈ１関連サイトカインの例としては、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、およびリンホトキシン（ＬＴ）が挙げられる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｈ２関連サイトカイン」は、Ｔｈ１細胞によるよりもむしろＴｈ２細胞によって優勢にまたは専ら産生されるサイトカインをいうことが意図される。Ｔｈ１関連サイトカインの例としては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０が挙げられる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患もしくは障害、疾患、障害、もしくは状態の少なくとも１つの症状を治癒（ｃｕｒｉｎｇ）するか、治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）するか、緩和するか、軽減するか、変化させるか、治療するか、寛解させるか、改善するか、あるいは疾患もしくは障害、疾患、障害、もしくは状態の少なくとも１つの症状に影響を及ぼす目的での、被験体へのＧＰＲ８３アゴニストもしくはＧＰＲ８３アンタゴニストの適用もしくは投与、または被験体から単離された組織もしくは細胞株へのＧＰＲ８３アゴニストもしくはＧＰＲ８３アンタゴニストの適用または投与を含み、その被験体は、疾患、障害、もしくは状態、疾患の症状、障害の症状、もしくは状態の症状、または疾患、障害、もしくは状態についての素因を有する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」または「治療的に活性な量」とは、所望の結果を達成するのに必要な投薬量および時間の間における、治療的に有効であるＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストの量をいう。例えば、ＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストの有効量は、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに薬剤の、被験体において所望の応答を誘発する能力などの因子によって変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するために調整され得る。例えば、いくつかに分割された用量が、毎日投与され得るか、またはその用量は、治療状況の危急によって示される通りに比例的に減少され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫細胞」は、造血起源の細胞であり、かつ免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞としては、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）；ナチュラルキラー細胞；および骨髄性細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球）が挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞」（すなわち、Ｔリンパ球）は、哺乳動物（例えば、ヒト）由来のＴ細胞系統内の全ての細胞（胸腺細胞、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞などを含む）を含むことが意図される。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかを発現するが、両方を共に発現することはなく、そしてＴ細胞レセプターを発現する成熟Ｔ細胞である。本明細書中に記載される種々のＴ細胞集団は、それらのサイトカインプロフィールおよびそれらの機能に基づいて定義され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「前駆Ｔ細胞」（「Ｔｈｐ」）は、ＣＤ４およびＣＤ８の両方を発現する多能性細胞である。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「ナイーブＴ細胞」は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の抗原に曝されておらず、したがって活性化された細胞でも記憶細胞でもないＴ細胞を含む。ナイーブＴ細胞は、循環しておらず、そしてヒトナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋である。ナイーブＴ細胞が、抗原を認識し、そして抗原の量、投与経路および投与のタイミング（これらに限られない）に依存してさらなるシグナルを受容する場合、ナイーブＴ細胞は、増殖し得、Ｔ細胞の種々のサブセット（例えば、エフェクターＴ細胞）へと分化し得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「末梢Ｔ細胞」とは、胸腺を離れ、そして末梢循環に進入する成熟シングルポジティブ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）Ｔ細胞をいう。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「分化した（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）」とは、刺激因子と接触したＴ細胞をいい、そしてエフェクターＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２）および記憶Ｔ細胞を含む。分化したＴ細胞は、ナイーブＴ細胞と比較して数種の表面タンパク質の発現において異なり、そして他の細胞を活性化するサイトカインを分泌する。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「記憶Ｔ細胞」は、抗原に対する曝露後に機能的に、静止状態になり、そして抗原の非存在下で長期間にわたって生存し得るリンパ球を含む。ヒト記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−である。
【００４５】
用語「低分子」は、当該分野において周知の用語であり、そして約１０００分子量未満、約８００未満、約７５０分子量未満、約７００分子量未満、約６５０分子量未満、約６００分子量未満、約５５０分子量未満、約５００分子量未満、約４５０分子量未満、約４００分子量未満、約３５０分子量未満、約３５０分子量未満、約２５０分子量未満、または約２００分子量未満である分子を含む。１つの実施形態において、低分子は、ペプチド結合だけを含むとは限らない。別の実施形態において、低分子は、オリゴマーではない。本発明の方法に従って活性についてスクリーニングされ得る例示的な低分子化合物としては、アミノ酸、ペプチド、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、炭水化物、脂質、有機低分子（例えば、ポリケチド）（Ｃａｎｅら  １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３）、天然産物抽出物ライブラリー、または他の有機（炭素含有）分子が挙げられるが、これらに限定されない。有機低分子は、代表的に、複数の炭素−炭素結合を有する。１つの実施形態において、上記化合物は、非ペプチド性の有機低分子化合物である。別の実施形態において、低分子は、生合成されない。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「指標組成物」とは、ＧＰＲ８３ポリペプチドを含み、そして本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて使用するのに適切である組成物をいう。例えば、指標組成物は、ＧＰＲ８３を天然に発現する細胞、ＧＰＲ８３をコードする発現ベクターを細胞に導入することによってＧＰＲ８３を発現するように設計されている細胞、ＧＰＲ８３を含む無細胞組成物、ＧＰＲ８３を含む動物（例えば、トランスジェニックマウス）、あるいはこのような動物に由来する細胞または組織であり得る。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語、試験化合物とＧＰＲ８３ポリペプチドを含む指標組成物とを「接触させる」は、上記試験化合物と上記指標組成物とを一緒に、インビトロ（例えば、上記試験化合物を培養物中の細胞に添加すること）、またはインビボ（例えば、上記試験化合物を疾患、障害、または状態の動物モデルを投与すること）でインキュベートすることを含むことが意図される。用語「接触させる」は、被験体において天然に存在し得るＧＰＲ８３アゴニストへの細胞の曝露（すなわち、天然の生理学的プロセスの結果として生じ得る曝露）を含まない。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」は、免疫応答が誘発され得る生きている生物体を含むことが意図される。好ましい被験体は、哺乳動物である。特に好ましい被験体は、ヒトである。被験体の他の例としては、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジならびに他の家畜およびコンパニオンアニマル（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ）が挙げられる。ヒトおよび獣医学的適用における調節性Ｔ細胞機能の刺激は、種々の疾患状態における異常な調節性Ｔ細胞機能から生じる障害を調節する手段を提供し、そしてその刺激は、本発明によって包含される。
【００４９】
（ＩＩ．スクリーニング方法）
本発明は、本明細書中に記載される通り、エフェクターＴ細胞機能を抑制するような調節性Ｔ細胞機能を刺激し得る（例えば、ＧＰＲ８３媒介性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞機能を刺激し得る）ＧＰＲ８３アゴニスト（例えば、ペプチド性化合物、低分子、非ペプチド性化合物、または抗体もしくはそのフラグメント）を同定するための方法をさらに提供する。
【００５０】
例えば、１つの実施形態において、例えば、ＧＰＲ８３の発現および／または活性を刺激すること、ならびに／あるいはＧＰＲ８３によって媒介される調節性Ｔ細胞機能を刺激すること、ならびに／あるいは標的分子に対するＧＰＲ８３の相互作用（例えば、結合）を刺激することによって調節性Ｔ細胞機能を刺激する化合物は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。
【００５１】
化合物の調節性Ｔ細胞機能を刺激する能力は、例えば、Ｔ細胞（例えば、調節Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞））の増殖を測定すること、および／またはエフェクターＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞））、またはこの細胞によって産生されるサイトカイン（例えば、Ｔｈ１特異的サイトカインおよび／またはＴｈ２特異的サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の産生）を測定することによって決定され得る。したがって、調節性Ｔ細胞機能をモジュレートする化合物の能力は、例えば、ＧＰＲ８３の発現および／または活性を測定することによって決定され得る。例えば、ＧＰＲ８３は、Ｇ共役型タンパク質レセプターであり、そして実施例において教示されるように、細胞内ｃＡＭＰまたは細胞内カルシウムの産生を刺激する能力を有する。したがって、細胞内アデニレートシクラーゼ活性、細胞内ｃＡＭＰ濃度、または細胞内カルシウム濃度は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイの部分として測定され得る。アデニレートシクラーゼ活性は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡから市販されているキットを使用した酵素免疫アッセイによって測定される。サイトカイン産生は、例えば、フローサイトメトリー（ＭｃＮｅｒｌａｎ，ＳＥら（２００２）Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ３７（２−３）：２２７−３４を参照のこと）および／または市販のＥＬＩＳＡアッセイによって測定され得る。化合物の、ＧＰＲ８３と結合パートナーとの間の複合体の形成を直接的にモジュレートする（例えば、増大させるかまたは安定化するか、あるいは減少させるかまたは不安定にする）能力もまた、測定され得る。
【００５２】
本明細書中で考察されるスクリーニングアッセイは、他の薬剤の存在下または非存在下で行なわれ得る。例えば、上記アッセイは、スクリーニングされる細胞の活性化状態をモジュレートする種々の薬剤の存在下で行なわれ得る。例えば、１つの実施形態において、Ｔ細胞レセプターを介してシグナルを伝達する薬剤が、含まれる。例示的な活性化薬剤は、当該分野において公知であり、そしてそれらとしては、例えば、マイトジェン（例えば、フィトヘマグルチニンまたはコンカナバリンＡ）、Ｔ細胞レセプターまたはＣＤ３と反応する抗体（いくつかの場合において、抗原提示細胞または抗体（ＣＤ２８と反応する）との組み合わせ）、あるいは抗原＋抗原提示細胞が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、サイトカインまたはサイトカインレセプターに対する抗体が、含まれる。
【００５３】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの２つ以上の組み合わせに関連する。例えば、ＧＰＲ８３アゴニストは、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを使用して同定され得、そして調節性Ｔ細胞機能を刺激するＧＰＲ８３アゴニストの能力は、例えば、動物（例えば、多発性硬化症（ＥＡＥ）、関節リウマチ、ＣＯＰＤ、またはアレルギーについての動物モデル）においてインビボで確認され得る。
【００５４】
さらに、本明細書中に記載されるようなＧＰＲ８３アゴニスト（例えば、低分子、ペプチド性化合物、ポリペプチドアナログ、または抗体、もしくはそのフラグメント）は、このような薬剤による処置の効力、毒性、または副作用を決定するための動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定されるＧＰＲ８３アゴニストは、このような薬剤の作用機序を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。例えば、薬剤は、当該分野で認識されたヒトの疾患の動物モデル（例えば、多発性硬化症のモデルのようなＥＡＥ、および糖尿病についてのモデルのようなＮＯＤマウス）またはヒト自己免疫疾患の他の良好に特徴付けられた動物モデルにおいて試験され得る。このような動物モデルとしては、エリテマトーデスについてのモデルとしてのｍｒｌ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス、関節リウマチについてのモデルとしてのマウスコラーゲン誘導性関節炎、およびマウス実験による重症筋無力症（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、ｐｐ．８４０−８５６を参照のこと）が挙げられる。本明細書中に記載されるように同定されるＧＰＲ８３アゴニストは、試験動物に投与され得、次いで、その試験動物における疾患の過程は、使用される特定のモデルについての標準的な方法を使用してモニタリングされ得る。ＧＰＲ８３アゴニストの有効性は、未処置の動物と比較した場合（またはコントロール薬剤によって処置された動物と比較した場合）の、ＧＰＲ８３アゴニストによって処置した動物における疾患の状態の改善によって証明される。
【００５５】
本発明のスクリーニングアッセイの実施形態において、一旦試験化合物がＧＰＲ８３アゴニストとして同定されると、その試験化合物の効果は、Ｔ調節性細胞機能を刺激する能力についてアッセイされ得、そして例えば、インビトロ（例えば、被験体に由来する細胞株または細胞を使用する）またはインビボ（例えば、動物モデルを使用する）での免疫細胞における効果の測定に基づいて、本発明の治療方法において使用するのに適切な化合物として確認され得る。したがって、本発明のスクリーニング方法は、少なくとも１つのＴ調節活性に対するＧＰＲ８３アゴニストの効果を決定し、それによって化合物が所望の効果を有すると確認する工程をさらに包含し得る。
【００５６】
１つの実施形態において、試験化合物の能力は、Ｔエフェクター細胞に関連する活性（例えば、増殖および／またはサイトカイン産生）をモジュレートする能力についてさらにアッセイされる。さらなる実施形態において、試験化合物の能力は、Ｔ調節性細胞に関連する活性（例えば、寛容）をモジュレートする能力についてアッセイされる。例えば、試験化合物の寛容をモジュレートする能力を決定することは、抗原提示細胞によるＴ細胞の刺激におけるその後の試行によって決定され得る。上記Ｔ細胞は、例えば、ＩＬ−２合成およびＴ細胞増殖によって決定される場合、次なる活性化の試みに応答性ではなく、寛容の状態が、誘導されており（例えば、調節性Ｔ細胞機能が、活性化されている）、そして代替的に、ＩＬ−２合成が刺激され、そしてＴ細胞が増殖する場合、エフェクターＴ細胞機能は、活性化されている。本発明に従うアッセイについての基礎として使用され得る例示的なアッセイ系については、例えば、Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、６５８６−６５９０；およびＳｃｈｗａｒｔｚ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１３４９−１３５６を参照のこと。寛容化されたＴ細胞の消失した活性を測定するための他の方法としては、細胞内のカルシウム動員を測定すること、ＭＡＰキナーゼカスケードのメンバーのタンパク質レベルを測定すること、および／またはＴ細胞におけるそのＴ細胞レセプターの結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）の際の転写因子のＡＰ−１複合体の活性を測定することが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞増殖は、例えば、［３Ｈ］チミジン取り込みをアッセイし、そして当業者によって一般的に使用される方法に従ってタンパク質レベルを測定することによって測定され得る。サイトカインレベルは、イムノアッセイのための多数の市販されているキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡが挙げられるが、これに限定されない）によってアッセイされ得る。
【００５７】
本明細書中に記載されるアッセイを使用して同定される化合物は、異常な調節性Ｔ細胞機能ならびに／あるいは異常なＧＰＲ８３発現および／またはＧＰＲ８３活性（例えば、第ＩＩ節において上で記載される疾患、障害、または状態）に関連する障害を処置するのに有用である。
【００５８】
本発明は、本明細書中に記載される通り、エフェクターＴ細胞機能を刺激するような調節性Ｔ細胞機能を抑制し得る（例えば、ＧＰＲ８３媒介性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞機能を抑制し得る）ＧＰＲ８３アンタゴニスト（例えば、ペプチド性化合物、低分子、非ペプチド性化合物、または抗体もしくはそのフラグメント）を同定するための方法をさらに提供する。これらの方法において、ＧＰＲ８３アゴニストの同定に関して本明細書中に記載される全てのアッセイが、反対の効果が試験される場合を除いて、使用され得る。例えば、調節性Ｔ細胞機能を抑制する化合物は、調節性Ｔ細胞の減少した増殖を検出すること、ならびに／またはエフェクターＴ細胞の増大した増殖を検出すること、ならびに／またはＴｈ１特異的サイトカインおよび／もしくはＴｈ２特異的サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の増大した産生を検出することによって同定され得る。
【００５９】
本発明のスクリーニングアッセイおよびそのアッセイにおいて使用される試験化合物は、下でより詳細に記載される。
【００６０】
（Ａ．細胞ベースのアッセイ）
本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用される指標組成物は、ＧＰＲ８３ポリペプチド（および／またはＧＰＲ８３ポリペプチドの標的もしくはＦｏｘｐ３遺伝子（Ｔｒｅｇにおいて種々の遺伝子の発現を調節する「主調節遺伝子（ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ）」であると考えられる）などの１種以上の他のポリペプチドもしくは遺伝子）を発現する細胞であり得る。例えば、内因性ＧＰＲ８３を天然に発現する細胞、またはより好ましくは、細胞に外因性ＧＰＲ８３ポリペプチドをコードする発現ベクターに導入することによって外因性ＧＰＲ８３ポリペプチドを発現するように設計された細胞が、使用され得る。
【００６１】
指標細胞は、ＧＰＲ８３発現ベクターによってトランスフェクトされ得、試験化合物の存在下および非存在下においてインキュベートされ得、そしてＧＰＲ８３によって調節される分子の発現またはＧＰＲ８３によって調節される生物学的応答に対するその化合物の効果が、決定され得る。ＧＰＲ８３の生物学的活性は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで決定されるような活性を含む。ＧＰＲ８３活性は、直接的な活性（例えば、ＧＰＲ８３とＧＰＲ８３標的分子との結合または調節性Ｔ細胞機能の刺激）であり得る。あるいは、ＧＰＲ８３活性は、下流の活性（例えば、ＧＰＲ８３ポリペプチドとＧＰＲ８３標的分子との相互作用の下流で生じる細胞シグナリング活性、またはその相互作用によって引き起こされるシグナリングカスケードの結果として生じる生物学的効果）である。例えば、本明細書中に記載されるように試験され得るＧＰＲ８３の生物学的活性は、以下を含む：調節性Ｔ細胞機能の刺激、免疫学的寛容の開始および／または維持、エフェクターＴ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）（例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）、および細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ））の機能の抑制（例えば、エフェクターＴ細胞増殖の抑制、エフェクターＴ細胞サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の産生の抑制）、ならびに／あるいはＦｏｘｐ３発現の刺激。
【００６２】
試験化合物がＧＰＲ８３発現をモジュレートするか否かを決定するために、インビトロ転写アッセイが、行われ得る。このようなアッセイを行うために、ＧＰＲ８３の完全長プロモーターおよび完全長エンハンサーが、レポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼ）に作動可能に連結され得、そして宿主細胞に導入され得る。
【００６３】
本明細書中で交換可能に使用される場合、用語「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」および「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド配列が、宿主細胞において（または細胞抽出物によって）そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することが意図される。調節配列は、当該分野で認識され、そして適切な宿主細胞における所望のポリペプチドの直接的な発現のために選択され得る。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現制御エレメントを含むことが意図される。このような調節配列は、当業者に公知であり、そしてＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載される。発現ベクターの設計はトランスフェクトされる宿主細胞の選択ならびに／あるいは発現が所望されるポリペプチドの型および／または量のような因子に依存し得ることが、理解されるべきである。
【００６４】
種々のレポーター遺伝子は、当該分野において公知であり、そして本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用するのに適切である。適切なレポーター遺伝子の例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子産物の活性を測定するための標準的な方法は、当該分野において公知であり、そして実施例の節において本明細書中に記載される。
【００６５】
１つの実施形態において、試験化合物の存在下での指標細胞におけるレポーター遺伝子の発現のレベルは、その試験化合物の非存在下での指標細胞におけるレポーター遺伝子の発現のレベルよりも高く、そしてその試験化合物は、ＧＰＲ８３の発現および／または活性、ならびに／あるいは調節性Ｔ細胞機能を刺激する化合物として同定される。別の実施形態において、試験化合物の存在下での指標細胞におけるレポーター遺伝子の発現のレベルは、その試験化合物の非存在下での指標細胞におけるレポーター遺伝子の発現のレベルよりも低く、そしてその試験化合物は、ＧＰＲ８３の発現および／または活性、ならびに／あるいは調節性Ｔ細胞機能を阻害する化合物として同定される。
【００６６】
種々の細胞型が、上記スクリーニングアッセイにおいて指標細胞として使用するのに適切である。好ましくは、エフェクターＴ細胞クローン（例えば、Ｔｈ２細胞クローン）またはＧＰＲ８３トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、Ｕ．Ｓ．２００２／０１８４６５７およびＷＯ０２／０３７９３（これらの各々の内容は、本明細書によって参考として本明細書中に明確に援用される）に記載される）などのＧＰＲ８３を通常は発現しない細胞株が、使用される。Ｕ．Ｓ．２００２／０１８４６５７およびＷＯ０２／０３７９３に記載される通り、ＧＰＲ８３を過剰発現する細胞は、脳、咽頭、精巣および前立腺において産生されており、そしてその細胞は、脳、咽頭、精巣および前立腺における発現を示す。したがって、これらの器官由来の細胞、またはその細胞からもたらされる細胞株は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。非リンパ系細胞株はまた、指標細胞として使用され得る（例えば、下の実施例に記載されるＨＥＫ２９３細胞株）。
【００６７】
被験体アッセイにおいて使用するための細胞は、真核生物細胞および原核生物細胞の両方を含む。例えば、１つの実施形態において、細胞は、細菌細胞。別の実施形態において、細胞は、真菌細胞（例えば、酵母細胞）である。別の実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞（例えば、鳥類細胞または哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、またはヒト細胞））。しかし、好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）である。
【００６８】
ＧＰＲ８３媒介性の調節性Ｔ細胞機能を刺激する試験化合物の能力はまた、標的分子へのＧＰＲ８３の結合をモジュレートする試験化合物の能力を決定することによって決定され得る。標的分子（例えば、細胞内結合パートナー）へのＧＰＲ８３の結合をモジュレートする試験化合物の能力を決定することは、例えば、ＧＰＲ８３へのＧＰＲ８３標的分子の結合が複合体中の標識されたＧＰＲ８３標的分子を検出することによって決定され得るように、ＧＰＲ８３標的分子と、放射性同位体、酵素標識または蛍光標識とをカップリングすることによって、達成され得る。あるいは、ＧＰＲ８３は、ＧＰＲ８３への上記化合物の結合が複合体中の標識されたＧＰＲ８３化合物を検出することによって決定され得るように、放射性同位体、酵素標識または蛍光標識とカップリングされ得る。例えば、ＧＰＲ８３標的は、直接的かまたは間接的かのいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈによって標識され得、そしてその放射性同位体は、放射線放出の直接的な計測またはシンチレーションカウンティングによって検出され得る。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識され得、そしてその酵素標識は、適切な基質の生成物への変換の測定によって検出され得る。
【００６９】
任意の相互作用因子の標識化を伴わずにＧＰＲ８３と相互作用する試験化合物の能力を決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）は、化合物とＧＰＲ８３との相互作用を、その化合物またはそのＧＰＲ８３のいずれかの標識化を伴わずに検出するために使用され得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、細胞がその環境を酸性化する速度を、光アドレス電位応答センサー（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）（ＬＡＰＳ）を使用して測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とＧＰＲ８３との間の相互作用の指標として使用され得る。
【００７０】
別の実施形態において、ＧＰＲ８３の上流または下流で作用するＧＰＲ８３を含む経路において作用する異なる（すなわち、非ＧＰＲ８３）分子は、スクリーニングアッセイにおいて使用するための指標組成物中に含まれ得る。このような分子を使用するスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物もまた、間接的ではあるが、ＧＰＲ８３活性をモジュレートするのに有用である。
【００７１】
本発明のなお別の局面において、ＧＰＲ８３ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＧＰＲ８３（「ＧＰＲ８３結合タンパク質」）と結合または相互作用し、そしてＧＰＲ８３活性に関与する他のポリペプチドを同定するために、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイトタンパク質（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」として使用され得る。このようなＧＰＲ８３結合タンパク質はまた、例えば、ＧＰＲ８３媒介性シグナリング経路の下流エレメントとして、ＧＰＲ８３ポリペプチドまたはＧＰＲ８３標的によるシグナルの伝播に関与するようである。あるいは、このようなＧＰＲ８３結合ポリペプチドは、ＧＰＲ８３活性のモジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であるようである。
【００７２】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュラー的な性質（ｍｏｄｕｌａｒ  ｎａｔｕｒｅ）に基づく。簡単にいうと、上記アッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物において、ＧＰＲ８３ポリペプチドをコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物において、未同定のタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインについてコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質が、インビボで相互作用してＧＰＲ８３依存性複合体を形成し得る場合、上記転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを、非常に近接させる。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されるレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。上記レポーター遺伝子の発現が、検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞クローンは、ＧＰＲ８３ポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローニングされた遺伝子を得るために、単離および使用され得る。
【００７３】
（Ｂ．無細胞アッセイ）
１つの実施形態において、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用される指標組成物は、ＧＰＲ８３ポリペプチドおよび／または１種以上の非ＧＰＲ８３ポリペプチドを含む無細胞組成物である。宿主細胞または培養培地中で組換え方法によって発現されたＧＰＲ８３ポリペプチドまたは非ＧＰＲ８３ポリペプチド（ＧＰＲ８３を含む経路においてＧＰＲ８３の上流または下流で作用する）は、無細胞組成物において使用され得るタンパク質を産生するために、ポリペプチドを精製するための標準的な方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＧＰＲ８３に特異的な抗体を用いた免疫アフィニティー精製）を使用して、その宿主細胞または細胞培養培地から単離され得る。あるいは、ＧＰＲ８３発現細胞または非ＧＰＲ８３発現細胞の抽出物は、無細胞組成物として使用するために調製され得る。
【００７４】
１つの実施形態において、ＧＰＲ８３活性を刺激することによって調節性Ｔ細胞機能を特異的に刺激する化合物は、ＧＰＲ８３と、ＧＰＲ８３が結合する標的分子との相互作用を刺激するそれらの化合物の能力に基づいて同定される。タンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にする適切なアッセイは、当該分野において公知である（例えば、免疫沈降アッセイ、蛍光偏光アッセイまたはエネルギー転移アッセイ、ツーハイブリッドアッセイなど）。試験化合物の存在下および非存在下でこのようなアッセイを行うことによって、これらのアッセイは、ＧＰＲ８３と標的分子との相互作用を刺激し、したがって調節性Ｔ細胞機能を刺激する化合物を同定するために、使用され得る。
【００７５】
１つの実施形態において、試験化合物の存在下における標的分子へのＧＰＲ８３の結合の量は、その試験化合物の非存在下における標的分子へのＧＰＲ８３の結合の量より多く、この場合において、その試験化合物は、ＧＰＲ８３の結合を増強または安定化し、そして／あるいは調節性Ｔ細胞機能を刺激する化合物として同定される。別の実施形態において、試験化合物の存在下における標的分子へのＧＰＲ８３の結合の量は、その試験化合物の非存在下における標的分子へのＧＰＲ８３の結合の量より少なく、この場合において、その試験化合物は、ＧＰＲ８３の結合を阻害または不安定化し、そして／あるいは調節性Ｔ細胞機能を阻害する化合物として同定される。
【００７６】
ＧＰＲ８３ポリペプチドへの試験化合物の結合は、上に記載される通り、直接的かまたは間接的かのいずれかで決定され得る。試験化合物に結合するＧＰＲ８３ポリペプチドの能力を決定することはまた、リアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を使用して達成され得る。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、任意の相互作用因子の標識化を伴わずにリアルタイムで生体特異的（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）相互作用を研究するための技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化は、生物学的分子の間のリアルタイムな反応の表示として使用され得る。
【００７７】
ＧＰＲ８３ポリペプチドと標的分子との間の相互作用をモジュレートする試験化合物を同定するための本発明の方法において、完全長ＧＰＲ８３ポリペプチドが、その方法において使用され得るか、あるいはＧＰＲ８３の部分のみが、使用され得る。ＧＰＲ８３ポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度は、例えば、検出可能な物質（例えば、放射性標識）によってそのポリペプチドの一方を標識し、非標識ポリペプチドを単離し、そして非標識ポリペプチドと結合している検出可能な物質の量を定量することによって、決定され得る。上記アッセイは、ＧＰＲ８３タンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激するかまたは阻害するかのいずれかである試験化合物を同定するために使用され得る。ＧＰＲ８３ポリペプチドと標的分子との間の相互作用を刺激する試験化合物は、ＧＰＲ８３ポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度をその試験化合物の非存在下での相互作用の程度と比較して増大させる、その試験化合物の能力に基づいて同定される。ＧＰＲ８３ポリペプチドと標的分子との間の相互作用を阻害する試験化合物は、ＧＰＲ８３ポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度をその試験化合物の非存在下での相互作用の程度と比較して減少させる、その試験化合物の能力に基づいて同定される。
【００７８】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多くの実施形態において、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３標的分子のいずれかを、上記ポリペプチドのうちの一方または両方の複合対形成していない形態からその複合体形成している形態を容易に分離するためか、あるいはアッセイの自動化に適応させるために、固定化することが、所望され得る。ＧＰＲ８３ポリペプチドへの試験化合物の結合、または試験化合物の存在下および非存在下でのＧＰＲ８３ポリペプチドとＧＰＲ８３標的分子との相互作用は、反応物を含むのに適した任意の容器中で達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心チューブが挙げられる。１つの実施形態において、上記ポリペプチドのうちの一方または両方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＧＰＲ８３融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、それは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物、および非吸着標的ポリペプチドまたは非吸着ＧＰＲ８３ポリペプチドのいずれかと合わせられ、そしてその混合物は、複合体形成を促す条件（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件）下でインキュベートされる。インキュベーション後、上記ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルは、あらゆる結合していない成分を除去するために洗浄され、そのマトリックスは、ビーズの場合において固定化され、そして複合体形成は、例えば、上で記載されるように、直接的かまたは間接的かのいずれかで決定される。あるいは、上記複合体は、上記マトリックスから解離し得、そしてＧＰＲ８３の結合または活性のレベルは、標準的な技術を使用して決定される。
【００７９】
ポリペプチドをマトリックス上に固定化するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＧＰＲ８３ポリペプチドまたはＧＰＲ８３標的分子のいずれかは、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して固定化され得る。ビオチン化ＧＰＲ８３ポリペプチドまたはビオチン化標的分子が、当該分野において公知である技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化され得る。あるいは、ＧＰＲ８３ポリペプチドまたは標的分子と反応性であるが、ＧＰＲ８３ポリペプチドのその標的分子への結合を妨げない抗体が、上記プレートのウェルに対して誘導体化され得、そして結合していない標的またはＧＰＲ８３ポリペプチドが、抗体との結合体化によってそのウェルに捕捉される。このような複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴ固定化複合体について上で記載されるものに加えて、ＧＰＲ８３ポリペプチドまたは標的分子と反応性の抗体を使用した複合体の免疫検出、およびＧＰＲ８３ポリペプチドまたは標的分子に関連する酵素活性による酵素結合アッセイが挙げられる。
【００８０】
（Ｃ．試験化合物）
種々の試験化合物は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイを使用して評価され得る。特定の実施形態において、試験される化合物は、ライブラリーに由来し得る（すなわち、その化合物は、化合物のライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用が、当該分野において良好に確立されている一方で、他の化合物（例えば、ベンゾジアゼピン（Ｂｕｎｉｎら（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９）、ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３−）、およびヒダントイン（ＤｅＷｉｔｔら、前出））の混合物を産生を可能にする新規技術が、開発されている。１０４〜１０５の多様性を有する有機低分子の分子ライブラリーの合成のためのアプローチが、記載されている（Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１）。
【００８１】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）、デコンボリューション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー方法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー方法を含む、当該分野において公知であるコンビナトリアルライブラリー方法における任意の多くのアプローチを使用して得られ得る。生物学的ライブラリーアプローチが、ペプチドライブラリーに限られる一方で、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。分子ライブラリーの合成のための他の例示的な方法は、例えば、Ｅｒｂら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｈｏｒｗｅｌｌら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：６８−；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において、当該分野で見出され得る。
【００８２】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）か、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）か、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）か、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）か、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ’４０９）か、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）かまたはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）に与えられ得る。なお別の実施形態において、上記コンビナトリアルポリペプチドは、ｃＤＮＡライブラリーから産生される。
【００８３】
活性についてスクリーニングされ得る例示的な化合物としては、ペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、炭水化物ライブラリー、低分子ライブラリー、および天然産物抽出物ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
候補／試験化合物としては、例えば、１）ペプチド（例えば、可溶性ペプチド（Ｉｇテイルド（Ｉｇ−ｔａｉｌｅｄ）融合ペプチドならびにランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照のこと）ならびにＤ−立体配置および／またはＬ−立体配置のアミノ酸からなるコンビナトリアル化学由来の分子ライブラリーのメンバーを含む））；２）リンペプチド（例えば、ランダムでありかつ部分的に変性した、定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）リンペプチドライブラリー（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照のこと）のメンバー）；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびエピトープ結合フラグメント）；４）有機低分子および無機低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーから得られた分子および天然産物ライブラリーから得られた分子）；５）酵素（例えば、エンドリボヌクレアーゼ、ヒドラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、シンセターゼ、イソメラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼおよびＡＴＰａｓｅ）、ならびに６）ＧＰＲ８３分子の変異形態（例えば、その分子のドミナントネガティブ変異形態）が挙げられる。
【００８５】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において、当該分野で見出され得る。
【００８６】
被験体スクリーニングアッセイにおいて同定された化合物は、調節性Ｔ細胞機能を刺激する方法において使用され得る。薬学的組成物（上に記載される）のような化合物を、それと細胞とを接触させる前に処方することが、所望され得ることは、理解される。
【００８７】
一旦、調節性Ｔ細胞機能を直接的かまたは間接的に刺激する試験化合物が、本明細書中で上記に記載される種々の方法のうちの１つによって同定されると、次いで、選択された試験化合物（または「目的の化合物」）は、例えば、目的の化合物と細胞とを、インビボ（例えば、目的の化合物を被験体に投与することによる）またはエキソビボ（例えば、被験体から細胞を単離し、そしてその単離した細胞と目的の化合物とを接触させることによるか、あるいは目的の化合物と細胞株とを接触させることによる）のいずれかで接触させ、そしてその細胞に対する目的の化合物の効果を、適切なコントロール（例えば、未処理の細胞、あるいは生物学的応答をモジュレートしないコントロール化合物またはキャリアによって処理された細胞）と比較して決定することによって、細胞に対するその効果についてさらに評価され得る。目的の化合物はまた、当該分野において公知である技術を使用した薬物設計に基づいた構造を使用して同定され得る。
【００８８】
（ＩＩＩ．刺激因子または阻害因子）
本発明の方法に従って、ＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストが、同定される。ＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストの例は、低分子、ペプチド性化合物、非ペプチド性化合物（例えば、ポリペプチドアナログ）、抗体、またはそのフラグメントを含み、そしてそれは、下でさらに詳細に記載される。
【００８９】
用語「ペプチド」または「ペプチド性化合物」は、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合によって連結された天然のアミノ酸残基（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）、またはその構造が標準的な配列決定の方法論（例えば、そのペプチドを構成するアミノ酸の直接配列決定またはそのペプチドをコードする核酸分子の配列決定）によって決定され得る他の残基のみから構成される分子を含むことが、意図される。用語「ペプチド」または「ペプチド性化合物」は、ペプチドに構造的に関連する分子（例えば、ペプチド誘導体、ペプチドアナログまたはペプチド模倣物）（その構造は、標準的な配列決定の方法論によって決定されされる可能性はないが、むしろより複雑な化学的ストラテジー（例えば、質量分析方法）によって決定されなければならない）を含むことを意図しない。
【００９０】
用語「非ペプチド化合物」は、本明細書中で使用される場合、天然のアミノ酸残基以外の少なくとも１つの分子を含む化合物を含むことが意図され、その化合物の構造は、標準的な配列決定の方法論によって決定される可能性はないが、むしろより複雑な化学的ストラテジー（例えば、質量分析方法）によって決定されなければならない。好ましい非ペプチド化合物は、完全には天然のアミノ酸残基から構成されないが、ペプチドに構造的に関連する化合物（例えば、ペプチド模倣物、ペプチド誘導体およびペプチドアナログ）である。本明細書中で使用される場合、化合物Ｘ（例えば、ペプチド）の「誘導体」とは、その化合物上の１つ以上の反応基が置換基によって誘導体化されたＸの形態をいう。ペプチド誘導体の例としては、アミノ酸側鎖、ペプチド骨格、またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端が誘導体化されたペプチドが挙げられる（例えば、メチル化されたアミド連結を有するペプチド性化合物）。本明細書中で使用される場合、化合物Ｘの「アナログ」とは、Ｘの機能活性に必要なＸの化学構造を保持し、またＸとは異なる特定の化学構造を含む化合物をいう。天然に存在するペプチドのアナログの例は、１個以上の天然に存在しないアミノ酸を含むペプチドである。本明細書中で使用される場合、化合物Ｘの「模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）」とは、Ｘの機能活性に必要なＸの化学構造がＸの立体配座を模倣する他の化学構造によって置換された化合物をいう。ペプチド模倣物の例としては、下でさらに記載される、ペプチド骨格が１つ以上のベンゾジアゼピン分子によって置換されているペプチド性化合物（例えば、Ｊａｍｅｓ，Ｇ．Ｌ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１９３７−１９４２を参照のこと）および「レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」ペプチド（Ｓｉｓｔｏによる米国特許第４，５２２，７５２号を参照のこと）が挙げられる。
【００９１】
用語「模倣物」、そして特に、「ペプチド模倣物」は、同配体を含むことが意図される。用語「同配体」は、本明細書中で使用される場合、第１の構造の立体配座が第２の構造に特異的な結合部位に適合するので第２の化学構造によって置換され得る化学構造を含むことが、意図される。この用語は、特に、当業者に周知であるペプチド骨格改変（すなわち、アミド結合模倣物）を含む。このような改変は、アミド窒素の改変、α−炭素の改変、アミドカルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸長、削除または骨格架橋を含む。数種のペプチド骨格改変が、公知であり、それらとしては、ψ［ＣＨ２Ｓ］、ψ［ＣＨ２ＮＨ］、ψ［ＣＳＮＨ２］、ψ［ＮＨＣＯ］、ψ［ＣＯＣＨ２］、およびψ［（Ｅ）または（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］が挙げられる。上で使用される命名法において、ψは、アミド結合の非存在を示す。アミド基を置換する構造が、括弧内に示される。同配体の他の例としては、１つ以上のベンゾジアゼピン分子によって置換されたペプチド（例えば、Ｊａｍｅｓ，Ｇ．Ｌ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１９３７−１９４２を参照のこと）、ペプトイド（Ｒ．Ｊ．Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）などが挙げられる。
【００９２】
ペプチドの他の可能な改変は、Ｎ−アルキル（またはアリール）置換（ψ［ＣＯＮＲ］）、ラクタムおよび他の環状構造を構築する骨格架橋、またはレトロ−インベルソアミノ酸組み込み（ψ［ＮＨＣＯ］）を含む。「インベルソ」によって、配列のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸によって置換することが、意味され、そして「レトロ−インベルソ」または「エナンチオ−レトロ」は、アミノ酸の配列を逆転させ（「レトロ」）、かつＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸によって置換することが、意味される。例えば、親ペプチドがＴｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒである場合、レトロ改変形態は、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒであり、インベルソ形態は、ｔｈｒ−ａｌａ−ｔｙｒであり、そしてレトロ−インベルソ形態は、ｔｙｒ−ａｌａ−ｔｈｒである（小文字は、Ｄ−アミノ酸を指す）。親ペプチドと比較して、レトロ−インベルソペプチドは、親ペプチドに酷似するトポロジーを有するレトロ−インベルソ異性体を生じる、側鎖の本来の空間的立体配座を実質的に保持しながら逆転した骨格を有する。Ｇｏｏｄｍａｎら「Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｐｐ．２８３−２９４（１９８１）を参照のこと。「レトロ−インベルソ」ペプチドのさらなる説明については、Ｓｉｓｔｏによる米国特許第４，５２２，７５２号も参照のこと。
【００９３】
ＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストはまた、ＧＰＲ８３の生物学的に活性な部分（すなわち、ＧＰＲ８３の生物活性フラグメント）、またはＧＰＲ８３リガンドの生物学的に活性な部分であり得る。
【００９４】
ＧＰＲ８３の生物活性フラグメントまたはＧＰＲ８３リガンドの生物活性フラグメントは、完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含む対象ポリペプチドのアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはそのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、かつ完全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示すポリペプチドを含む。代表的に、生物学的に活性な部分は、完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のポリペプチドの生物学的に活性な部分は、例えば、１０アミノ酸長、２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長、１００アミノ酸長、１５０アミノ酸長、２００アミノ酸長、２５０アミノ酸長、３００アミノ酸長、３５０アミノ酸長、４００アミノ酸長、４５０アミノ酸長、５００アミノ酸長以上であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が削除されている他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなタンパク質の機能活性の１つ以上について評価され得る。変異体はまた、アッセイ試薬として利用され得る（例えば、本明細書中に記載される活性アッセイのうちの１つによって同定される減少した生物学的特性、増強した生物学的特性、またはそうでなければ変化した生物学的特性を有する変異体）。
【００９５】
生物学的活性を保持するＧＰＲ８３ポリペプチド分子の改変体またはＧＰＲ８３に対するリガンドの改変体はまた、本発明の方法においてＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストとして使用され得る。１つの実施形態において、このような改変体ポリペプチドは、ＧＰＲ８３のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の同一性を有する。
【００９６】
本発明のＧＰＲ３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストはまた、抗体、またはそのフラグメントであり得る。用語「抗体」とは、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と特異的に免疫反応）する抗原結合部位を含む分子）をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、酵素（例えば、ペプシン）によって抗体を処理することによって産生され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに抗体分子からクローニングされ得、改変された抗原結合分子（例えば、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））を産生するために使用され得るＶＨドメインおよびＶＬドメインが挙げられる。
【００９７】
本発明の抗体は、本発明の種々の治療的組成物を処方するのに使用され得るか、または好ましくは、相補性決定領域をヒト化抗体またはキメラ抗体（下で詳細に記載される）の産生のために提供し得る。非ヒトモノクローナル抗体の産生（例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラット）は、例えば、目的の抗原（例えば、ＧＰＲ８３またはそのフラグメント（実施例７に記載されるようなもの））、または目的の抗原（例えば、ＧＰＲ８３）をコードする核酸分子によって動物を免疫化することによって、達成され得る。ＧＰＲ８３を含むより長いポリペプチドまたはＧＰＲ８３の免疫原性フラグメントまたはＧＰＲ８３の抗イディオタイプ抗体もまた、使用され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出（全ての目的のために参考として援用される）を参照のこと）。このような免疫原は、天然の供給源からか、ペプチド合成によってか、または組換え発現によって得られ得る。必要に応じて、上記免疫原は、下で詳細に記載されるように、キャリアタンパク質と一緒に投与されても、キャリアタンパク質と融合されても、キャリアタンパク質と複合体形成されてもよい。必要に応じて、上記免疫原は、アジュバントと一緒に投与され得る。
【００９８】
用語「アジュバント」とは、抗原と組み合せて投与される場合に抗原に対する免疫応答を増大するが、単独で投与される場合に抗原に対する免疫応答をもたらさない化合物をいう。アジュバントは、リンパ球のリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含む数種の機構によって免疫応答を増大し得る。いくつかの型のアジュバントは、下に記載されるように使用され得る。フロイント完全アジュバント後の不完全アジュバントは、実験動物の免疫化のために好ましい。
【００９９】
ウサギまたはモルモットは、代表的に、ポリクローナル抗体を作製するために使用され得る。ポリクローナル抗体（例えば、受動防御のため）の例示的な調製は、以下のように行われ得る。動物は、１００μｇ  ＧＰＲ８３＋アジュバントによって免疫化され、そして４〜５ヶ月目に安楽死される。血液が、回収され、そしてＩｇＧが、他の血液成分から分離される。免疫原に特異的な抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによって部分的に精製され得る。平均で約０．５〜１．０ｍｇの免疫原特異的抗体が、動物１体につき得られ、合計で６０〜１２０ｍｇを与える。
【０１００】
マウスは、代表的に、モノクローナル抗体を作製するために使用される。モノクローナルは、ＧＰＲ８３のフラグメントまたはより長い形態をマウスに注射し、ハイブリドーマを調製し、そしてＧＰＲ８３に特異的に結合する抗体についてハイブリドーマをスクリーニングすることによって、フラグメントに対して調製され得る。必要に応じて、抗体は、ＧＰＲ８３の他の重複していないフラグメントに結合を伴わないＧＰＲ８３の特定の領域または所望のフラグメントに対する結合についてスクリーニングされる。後者のスクリーニングは、ＧＰＲ８３ペプチドの欠失変異体のコレクションに対する抗体の結合を決定し、そして欠失変異体が抗体することを決定することによって、達成され得る。結合は、例えば、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって評価され得る。上記抗体への特異的な結合を示す最も小さいフラグメントは、その抗体のエピトープを規定する。あるいは、エピトープ特異性は、試験抗体と参照抗体とがＧＰＲ８３への結合について競合する競合アッセイによって決定され得る。上記試験抗体と参照抗体とが競合する場合、次いで、それらは、同じエピトープ（または十分に近縁のエピトープ）に結合し、その結果、一方の抗体の結合が他方の抗体の結合を妨げる。このような抗体についての好ましいアイソタイプは、マウスアイソタイプＩｇＧ２ａまたは他の種における等価のアイソタイプである。マウスアイソタイプＩｇＧ２ａは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の等価物である。
【０１０１】
リンパ球を融合するために使用される多くの周知のプロトコルのいずれかおよび免疫化された細胞株が、モノクローナル抗体を産生する目的のために適用され得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．（上で引用される）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（上で引用される）；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（上で引用される）を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションが存在し、それらが有用であることを、認識する。代表的に、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、上記リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物によって免疫化されたマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株とを融合することによって作製され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。任意の多くの骨髄腫細胞株（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１骨髄腫株、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫株またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）が、標準的な技術に従って融合パートナーとして使用され得る。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的に、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合される。上記融合から生じるハイブリドーマ細胞は、次いで、融合していない骨髄腫細胞または非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を使用して選択される（融合していない脾細胞は、それらが形質転換されていないので、数日後に死ぬ）。プロテインキナーゼＣθ経路のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗原に結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【０１０２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、モノクローナル抗体は、抗原を用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングし、それによってその抗原に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを同定することによって、同定および単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを産生およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。したがって、抗体ディスプレイライブラリー産生およびスクリーニングするのに使用するために特に適した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒ  ら．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４。
【０１０３】
本発明のＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストはまた、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３リガンドに特異的なキメラ抗体および／またはヒト化抗体（例えば、キメラ免疫グロブリンおよび／またはヒト化免疫グロブリン）であり得る（好ましくは、ＧＰＲ８３リガンドに特異的なキメラ抗体および／またはヒト化抗体である）。キメラ抗体および／またはヒト化抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体の構築のために出発材料を提供するマウス抗体または他の非ヒト抗体と、同一または類似の結合特異性および結合親和性を有する。
【０１０４】
キメラ抗体は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、代表的に、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工学によって構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）定常（Ｃ）セグメントに連結され得る。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が、好ましい。代表的なキメラ抗体は、したがって、マウス抗体由来のＶまたは抗原結合ドメインとヒト抗体由来のＣまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質である。
【０１０５】
用語「ヒト化結合分子」とは、ヒト結合分子鎖（アクセプター免疫グロブリンまたはアクセプター結合分子と称される）に由来する可変領域フレームワーク残基およびマウス結合分子（ドナー免疫グロブリンまたはドナー結合分子と称される）に由来する少なくとも１つの相補性決定領域を含む少なくとも１つの鎖を含む結合分子をいう。ヒト化結合分子は、下で考察される組換えＤＮＡ技術を使用して産生され得る。例えば、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．Ｋ．ら（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：３５；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９）、８６：１００２９−１００３３；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８６）、３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９８８）、３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８８）、２３９：１５３４−３６；Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９）、８６：３８３３−３７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第６，１８０，３７０号、Ｓｅｌｉｃｋら、ＷＯ  ９０／０７８６１、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号（それらの全体が全ての目的のために参考として援用される）。定常領域もまた、存在する場合、好ましくはヒト免疫グロブリンに由来する。
【０１０６】
ヒト可変ドメインフレームワーク中へのマウスＣＤＲの置換は、ヒト可変ドメインフレームワークがＣＤＲが由来するマウス可変フレームワークと同一または同様の立体配座を採る場合、ほぼそれらの正しい空間的配置の保持を生じるようである。これは、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するマウス可変フレームワークドメインとの高い程度の配列同一性を示すヒト抗体から、ヒト可変ドメイン得ることによって達成される。重鎖可変フレームワーク領域および軽鎖可変フレームワーク領域は、同一かまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であっても、数種のヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３（１９９１）；Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９７１（１９９３）およびＣａｒｔｅｒら、ＷＯ  ９２／２２６５３を参照のこと。
【０１０７】
マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域および適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域が同定されると、次の工程は、存在する場合、これらの成分由来の残基が、得られるヒト化抗体の特性を最適化するために置換されるべきであることを決定することである。一般に、ヒトアミノ酸残基のマウスによる置換は、最小限であるべきである。なぜならばマウス残基の組み込みは、ヒトにおいてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する抗体の危険性を増大させる。免疫応答を決定する当該分野で認識された方法は、特定の患者または臨床試験の間においてＨＡＭＡ応答をモニタリングするために行われ得る。ヒト化抗体を投与された患者は、その治療の適用の最初および全体にて免疫原性の評価を与えられ得る。ＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当業者に公知の方法を使用して、患者由来の血清サンプルにおいてヒト化治療用試薬に対する抗体を検出することによって測定される。
【０１０８】
ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、ＣＤＲ立体配座および／または抗原への結合に対する、可能性のあるそれらの影響に基づいて、置換について選択される。マウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域との不自然な近位は、特定のアミノ酸残基の置換によって補正されない限り結合親和性の損失をもたらす、不自然な立体配座の拘束を生じる。
【０１０９】
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、コンピューターモデリングによって決定され得る。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインについての解析された構造から出発してもたらされる。モデリングされる鎖は、解析された三次元構造の鎖またはドメインとのアミノ酸配列類似性について比較され、そして最も大きい配列類似性を示す鎖またはドメインが、分子モデルの構築の-ための出発点として選択される。少なくとも５０％の配列同一性を共有する鎖またはドメインが、モデリングのために選択され、そして好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％以上の配列同一性を共有する鎖またはドメインが、モデリングのために選択される。解析された出発構造は、モデリングされる免疫グロブリン鎖または免疫グロブリンドメイン中の実際のアミノ酸と、出発構造中のアミノ酸との間の違いを考慮するためにモデリングされる。次いで、モデリングされた構造は、複合性の免疫グロブリンへと組み立てられる。最終的に、そのモデルは、エネルギーの最小化により、そして全ての原子が互いから適切な距離内であること、ならびに結合の長さおよび角度が化学的に受容可能な限度内であることを確認することによって洗練される。
【０１１０】
置換のためのアミノ酸残基の選択はまた、部分的に、特定の位置におけるアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の経験的知見によって決定され得る。例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、通常、アミノ酸が：（１）直接的に抗原に非共有結合するか、（２）ＣＤＲ領域に隣接するか、（３）ＣＤＲ領域と他の方法で相互作用する（例えば、コンピューターモデリングによって決定される場合にＣＤＲ領域の約３〜６Å内である）か、または（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与することがかなり期待される場合にマウス抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸によって置換されるべきである。
【０１１１】
「直接的に抗原に非共有結合する」残基は、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによって確立された化学的な力に従って、抗原上のアミノ酸と直接相互作用する十分な確率を有するフレームワーク領域中の位置におけるアミノ酸を含む。
【０１１２】
「ＣＤＲ領域に隣接する」残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中のＣＤＲの１つ以上に直接隣接する位置（例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲ、またはＣｈｏｔｈｉａによって定義されるようなＣＤＲ（例えば、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  ＪＭＢ  １９６：９０１（１９８７）を参照のこと）に直接隣接する位置）にアミノ酸残基を含む。これらのアミノ酸は、特に、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用するようであり、そしてアクセプターから選択される場合、ドナーＣＤＲを歪め得、そして親和性を減少させ得る。さらに、その隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用し得（Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７（１９８６）（これは、本明細書中に参考として援用される））、そして上記ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、本来の抗体における親和性を提供する全ての抗原接触を保つことが望まれ得る。
【０１１３】
「ＣＤＲ領域と他の方法で相互作用する」残基は、二次構造分析によってＣＤＲ領域に影響を及ぼすのに十分な空間的配置にあると決定される残基を含む。１つの実施形態において、「ＣＤＲ領域と他の方法で相互作用する」残基は、ドナー免疫グロブリンの三次元モデル（例えば、コンピューターによってもたらされるモデル）を分析することによって同定される。代表的に、本来のドナー抗体の三次元モデルは、ＣＤＲの外側の特定のアミノ酸が、そのＣＤＲに近接し、そして水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによってそのＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する十分な確率を有することを示す。それらのアミノ酸位置において、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸よりもむしろドナー免疫グロブリンアミノ酸が、選択され得る。この基準に従うアミノ酸は、一般に、ＣＤＲ中のいくつかの原子の約３Å以内に側鎖原子を有し、そして確立された化学的な力（例えば、上に列挙されるもの）によってＣＤＲ原子と相互作用し得る原子を含まなければならない。
【０１１４】
水素結合を形成し得る原子の場合において、上記３Åは、それらの核の間で測定されるが、結合を形成しない原子については、上記３Åは、それらのファンデルワールス表面の間で測定される。したがって、後者の場合において、その核は、相互作用し得ると見なされる原子については約６Å以内（３Å＋合計のファンデルワールス半径）でなければならない。多くの場合において、上記核は、４Åまたは５Å〜６Å離れている。アミノ酸がＣＤＲと相互作用し得るか否かを決定することにおいて、重鎖ＣＤＲの最後の８アミノ酸をそのＣＤＲの部分として考慮しないことが、好ましい。なぜならば、構造の観点から、これらの８アミノ酸は、よりフレームワークの一部として機能するからである。
【０１１５】
ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用し得るアミノ酸は、なお別の様式で同定され得る。各フレームワークアミノ酸の表面領域にアクセス可能（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）な溶媒は、以下の２つの様式において算出される：（１）インタクトな抗体、および（２）抗体のＣＤＲが除去された抗体からなる仮定の分子。これらの数の間の約１０２オングストローム以上の有意差は、溶媒へのフレームワークアミノ酸のアクセスが、ＣＤＲによって少なくとも部分的にブロックされ、したがってアミノ酸がＣＤＲと接触させられることを示す。アミノ酸の表面領域にアクセス可能な溶媒は、当該分野において公知であるアルゴリズム（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６：５４８（１９８３）ならびにＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９（１９７１）（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される））を使用して、抗体の三次元モデルに基づいて算出され得る。フレームワークアミノ酸はまた、次にＣＤＲと接触する別のフレームワークアミノ酸の立体配座に影響することによって、ときにＣＤＲと間接的に相互作用し得る。
【０１１６】
フレームワークのいくつかの位置におけるアミノ酸は、多くの抗体中のＣＤＲと相互作用し得ることが公知である（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、前出、Ｃｈｏｔｈｉａら、前出ならびにＴｒａｍｏｎｔａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５（１９９０）（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される））。特に、上記軽鎖の２位、４８位、６４位および７１位ならびに上記重鎖の２６〜３０位、７１位および９４位（Ｋａｂａｔに従う番号付け）におけるアミノ酸は、多くの抗体中のＣＤＲと相互作用し得ることが公知である。上記軽鎖中の３５位および９３位ならびに上記重鎖中の１０３位におけるアミノ酸はまた、上記ＣＤＲと相互作用するようである。全てのこれらの番号付けされた位置において、上記ヒト化免疫グロブリンにあるアクセプターアミノ酸よりもむしろドナーアミノ酸の選択（それらが異なる場合）が、好ましい。一方で、上記ＣＤＲ領域と相互作用し得る特定の残基（例えば、上記軽鎖の最初の５アミノ酸）は、ときとして、上記ヒト化抗体における親和性の損失を伴わないアクセプター免疫グロブリンから選択され得る。
【０１１７】
「ＶＬ−ＶＨ界面に関与する」残基または「パッキング残基（ｐａｃｋｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ）」は、例えば、ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４５９２−６６（１９８５））またはＣｈｏｔｈｉａら、前出によって定義されるようなＶＬとＶＨとの間の界面における残基を含む。一般に、異常なパッキング残基は、それらがヒトフレームワーク中の残基と異なる場合、ヒト化抗体において保持されるべきである。
【０１１８】
一般に、上記の基準を満たすアミノ酸の１個以上が、置換される。いくつかの実施形態において、上記の基準を満たすアミノ酸の全てまたはほとんどが、置換される。ときに、特定のアミノ酸が上記の基準を満たすか否かについてのいくつかのあいまいさが、存在し、そして代替的な改変抗体が、産生され、その改変抗体のうちの１つは、特定の置換を有し、その改変抗体のうちの他のものは、特定の置換を有さない。あるいは、そのように産生された改変抗体は、本明細書中に記載される任意のアッセイにおいて所望の活性について試験され得、そして好ましい抗体が選択される。
【０１１９】
通常は、ヒト化抗体中のＣＤＲ領域は、実質的に同一であり、そしてより通常は、ドナー抗体の対応するＣＤＲ領域と同一である。通常では望ましくないが、得られるヒト化抗体の結合親和性にあまり影響しないＣＤＲ残基の１つ以上の保存的アミノ酸置換を行うことは、ときとして、可能である。保存的置換によって、組み合せ（例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ）が、意味される。
【０１２０】
置換についてのさらなる候補は、その位置においてヒト免疫グロブリンに関して異常か、または「稀な」アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価な位置またはより代表的なヒト免疫グロブリンの等価な位置由来のアミノ酸によって置換され得る。例えば、置換は、上記アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸が、その位置について稀であり、そして上記ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン配列中のその位置について一般的である場合；または上記アクセプター免疫グロブリン中のアミノ酸が、その位置について稀であり、そして上記ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸もまた、他のヒト配列と比較して稀である場合、所望され得る。これらの基準は、ヒトフレームワーク中の異型のアミノ酸が抗体の構造を破壊しないことを確保するのに役立つ。さらに、異常なヒトアクセプターアミノ酸をヒト抗体について代表的であるドナー抗体由来のアミノ酸によって置換することによって、そのヒト化抗体は、より小さい免疫原性をもたらし得る。
【０１２１】
用語「稀な」は、本明細書中で使用される場合、約２０％未満でその位置に存在するが、通常、配列の代表的なサンプルにおいて配列の約１０％未満でその位置に存在するアミノ酸を示し、そして用語「一般的な（ｃｏｍｍｏｎ）」は、本明細書中で使用される場合、約２５％を超えてその位置に存在するが、通常、配列の代表的なサンプルにおいて配列の約５０％を超えてその位置に存在するアミノ酸を示す。例えば、全てのヒト軽鎖可変領域配列およびヒト重鎖可変領域配列は、それぞれ、特に互いに相同性である配列の「下位集団」へと分類され、そして特定の重要な位置（Ｋａｂａｔら、前出）に同じアミノ酸を有する。ヒトアクセプター配列中のアミノ酸がヒト配列の間で「稀」であるかまたは「一般的」であるかを決定する場合、そのアクセプター配列と同じ下位集団中のヒト配列のみを考慮することが、しばしば好ましい。
【０１２２】
置換のためのさらなる候補は、Ｃｈｏｔｈｉａら、前出によって提案された代替的な定義においてＣＤＲ領域の部分として同定されるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。置換のためのさらなる候補は、ＡｂＭおよび／または接触の定義においてＣＤＲ領域の部分として同定されるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。特に、上記可変重鎖中のＣＤＲ１は、残基２６〜３２を含むと定義される。
【０１２３】
置換のためのさらなる候補は、稀または異常なドナーフレームワーク残基に対応するアクセプターフレームワーク残基である。稀または異常なドナーフレームワーク残基は、その位置でマウス抗体について（本明細書中で定義されるように）稀または異常である残基である。マウス抗体について、上記下位集団は、Ｋａｂａｔおよびコンセンサスと異なる同定された残基の位置に従って決定され得る。これらのドナー特異的な差は、活性を増強するマウス配列における体細胞変異を示し得る。結合に影響すると予想される異常な残基が、保持されるのに対して、結合のために重要ではないと予想される残基は、置換され得る。
【０１２４】
置換のためのさらなる候補は、アクセプターフレームワーク領域に存在する非生殖系列残基である。例えば、アクセプター抗体鎖（すなわち、ドナー抗体鎖との顕著な配列同一性を共有するヒト抗体鎖）が生殖系列抗体鎖（同様に、ドナー鎖との顕著な配列同一性を共有する）と整列される場合、アクセプター鎖フレームワークとその生殖系列鎖フレームワークとの間で一致しない残基は、生殖系列配列由来の対応する残基によって置換され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、ＣＤＲ相同性ベースの方法が、ヒト化のために使用される（例えば、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．Ｋ．ら（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：３５（この内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。この方法は、一般に、類似した構造のマウスフレームワークおよびヒトフレームワークよりもむしろ類似した構造のマウスＣＤＲおよびヒトＣＤＲに基づいて、ヒト可変ドメインフレームワークへのマウスＣＤＲの置換を含む。マウスＣＤＲとヒトＣＤＲとの類似性は、一般に、上記マウス結合分子と同じ標準的なＣＤＲ構造の組み合せを有し、したがってＣＤＲペプチド骨格の三次元立体配座を保持する同じ鎖型（軽鎖または重鎖）のヒト遺伝子を同定することによって決定される。第２に、一致する標準的な構造を有する候補可変遺伝子の各々について、マウスＣＤＲと候補ヒトＣＤＲとの間における残基間の相同性が、評価される。最後に、ヒト化結合分子を産生するために、既にマウスＣＤＲと同一ではない選択されたヒト候補ＣＤＲのＣＤＲ残基は、マウス配列に変換される。１つの実施形態において、変異を有さないヒトフレームワークが、上記ヒト化結合分子に投入される。
【０１２６】
上で考察される特定のアミノ酸置換以外に、ヒト化抗体のフレームワーク領域は、通常、実質的に同一であり、そしてより通常は、それらが由来したヒト抗体のフレームワーク領域と同一である。当然に、上記フレームワーク領域中のアミノ酸の多くは、ほとんどかまたは全く、抗体の特異性または親和性に対して直接寄与しない。したがって、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、得られるヒト化抗体の特異性または親和性のかなりの変化を伴わずに許容され得る。したがって、１つの実施形態において、上記ヒト化抗体の可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列またはこのような配列のコンセンサスと少なくとも８５％の配列同一性を共有する。別の実施形態において、上記ヒト化抗体の可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列またはこのような配列のコンセンサスと少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。しかし、一般に、このような置換は、望ましくない。
【０１２７】
上記ヒト化抗体は、好ましくは、少なくともｌ０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１またはｌ０１０Ｍ−１の抗原に対する特異的結合親和性を示す。通常、抗原に対する上記ヒト化抗体の結合親和性の上限は、上記ドナー免疫グロブリンの結合親和性の３倍、４倍または５倍である。しばしば、結合親和性の下限もまた、ドナー免疫グロブリンの結合親和性の３倍、４倍または５倍である。あるいは、上記結合親和性は、置換を有さないヒト化抗体（例えば、抗体は、ドナーＣＤＲおよびアクセプターＦＲを有するが、ＦＲ置換を有さない）の結合親和性と比較され得る。このような場合において、（置換によって）最適化された抗体の結合は、好ましくは、未置換の抗体の結合よりも、少なくとも２倍〜３倍大きいか、または３倍〜４倍大きい。比較を行うために、種々の抗体の活性は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（すなわち、未標識の試薬を使用した表面プラスモン共鳴）または競合的結合アッセイによって決定され得る。
【０１２８】
ヒト化抗体のＣＤＲ成分およびフレームワーク成分は概念的に選択されており、種々の方法が、このような抗体を産生するために利用される。コード（ｃｏｄｅ）の縮重に起因して、種々の核酸配列が、各抗体アミノ酸配列をコードする。所望の核酸配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成によってか、または所望のポリヌクレオチドの早期に調製された改変体のＰＣＲ変異誘発によって産生され得る。
【０１２９】
オリゴヌクレオチド媒介性の変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの置換改変体、欠失改変体および挿入改変体を調製するための好ましい方法である（Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）を参照のこと））。簡単にいうと、上記標的ポリペプチドＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡテンプレートへの所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって変更される。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、かつ上記ポリペプチドＤＮＡにおける選択された変更をコードする上記テンプレートの、第２の相補鎖全体を合成するために使用される。
【０１３０】
上に記載されるように産生された抗体の可変セグメント（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域）は、代表的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的に、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部に連結される。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、周知の手順によって種々のヒト細胞（しかし、好ましくは、不死化Ｂ細胞）から単離され得る（Ｋａｂａｔら、前出、およびＬｉｕら、Ｗ０８７／０２６７１を参照のこと）（これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）。通常、抗体は、軽鎖定常領域および重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、およびＣＨ４領域を含む。本明細書中に記載される抗体は、全ての型（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ、ならびにＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを含む）の定常領域を有する抗体を含む。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性の補体媒介性および／または細胞媒介性の毒性が望ましいか否かに依存する。例えば、アイソトープＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体活性を有し、そしてアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、補体活性を有さない。抗体（例えば、ヒト化抗体）が細胞傷害活性を示すことが望ましい場合、定常ドメインは、通常、補体結合定常ドメインであり、そしてそのクラスは、代表的に、ＩｇＧ１である。このような細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインは、例えば、ＩｇＧ２クラスの定常ドメインであり得る。アイソタイプの選択はまた、抗体の脳への通過に影響し得る。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が、好ましい。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。上記ヒト化抗体は、１種より多いクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。抗体は、別個の重鎖、軽鎖としてか、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとしてか、または単鎖抗体として、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む４量体として発現され得、ここで重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、スペーサーを介して連結される。
【０１３１】
本発明の方法において使用され得る他のＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストは、化合物（例えば、低分子）である。このような化合物は、上で詳細に記載されるように、このような化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。
【０１３２】
（ＩＶ．薬学的組成物）
本発明の方法を使用して同定されるＧＰＲ８３アゴニストまたはＧＰＲ８３アンタゴニストは、被験体への投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記薬剤と薬学的に受容可能なキャリアとを含む。本明細書中で使用される場合、言語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において公知である。あらゆる従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、上記組成物におけるその使用が、企図される。追加の活性化合物もまた、上記組成物に組み込まれ得る。
【０１３３】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与）が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のための溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る：無菌の希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース））。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）によって調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能なシリンジまたは複数用量バイアルに封入され得る。
【０１３４】
注射用途に適した薬学的組成物としては、無菌の水溶液（水溶性）または分散物および無菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与に関して、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用、分散物の場合においては必要される粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の妨害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張化剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、および塩化ナトリウム）を組成物に含むことが、好ましい。注射可能な組成物の延長した吸収は、組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【０１３５】
無菌の注射可能な溶液は、上に挙げられる成分の１つまたは組み合わせと一緒に適切な溶媒中に上記活性化合物を必要量で組み込み、必要とされる場合に、次いで濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、上記活性化合物、基礎的な分散媒および上に挙げられるものからの必要とされる他の成分を含む無菌のビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、上記活性成分と、その予め濾過滅菌された溶液からの任意のさらなる所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１３６】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、上記活性化合物は、賦形剤と一緒に組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄剤として使用するために流体キャリアを使用して調製され得、ここでその流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、スウィッシュ（ｓｗｉｓｈ）され、そして吐き出されるか、または嚥下される。薬学的に適合可能な結合剤、および／または補助物質は、上記組成物の部分として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分、または同様の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味料（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香料（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー（ｏｒａｎｇｅ  ｆｌａｖｏｒｉｎｇ））。
【０１３７】
吸入による投与のために、上記化合物は、適切な噴霧体（例えば、二酸化炭素などの気体）を含む加圧式の容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エーロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１３８】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与のために、透過される障壁に適した浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野において公知であり、そしてそれとしては、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐薬の使用によって達成され得る。経皮投与のために、上記活性化合物は、一般に当該分野において公知であるように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方される。
【０１３９】
上記化合物はまた、坐薬の形態（例えば、従来の坐薬基剤（ココアバターおよび他のグリセリド）または直腸送達のための保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）によるもの）で調製され得る。
【０１４０】
１つの実施形態において、ＧＰＲ８３アゴニストまたはアンタゴニストは、身体からの迅速な排泄から化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方）、それとしては、移植物およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。生分解性であり生体適合性のポリマーが、使用され得る（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかであるはずである。上記物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得られ得る。リポソーム懸濁物もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知である方法に従って調製され得る。
【０１４１】
それは、特に、経口組成物または非経口組成物を、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で処方するために有利である。投薬単位形態とは、本明細書中で使用される場合、処置される被験体に対する単位投薬量として適した物理的に分離した単位をいう；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと合わせて所望の治療効果をもたらすために、算出された活性化合物の所定の量を含む。本発明の投薬単位形態についての明細は、上記活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を配合する分野における固有の制限によって決定され、そしてそれらに直接依存する。
【０１４２】
このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、標準的な薬学的手順によって細胞培養物または実験動物において決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてそれは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として示され得る。大きい治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性の副作用を示す化合物が、使用され得る一方で、治療は、感染していない細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それによって副作用を減少させるために、このような化合物を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するように行われるべきである。
【０１４３】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を処方することにおいて使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんどかまたは全く伴わずにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。その投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物に関して、治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１４４】
上記薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与のための説明書と一緒に含まれ得る。
【０１４５】
本発明は、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本願全体を通して引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図面は、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１：Ｆｏｘｐ３形質導入マウスＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞のトランスクリプトーム分析）
（実験の目的）
Ｆｏｘｐ３遺伝子は、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の発現および機能に必須である（Ｈｏｒｉ  ＳおよびＳａｋａｇｕｃｈｉ  Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１０５７−１０６１、２００３）。Ｆｏｘｐ３転写因子によって調節される遺伝子を同定するために、マウスＦｏｘｐ３を、レトロウイルスによってマウスＣＤ２５−ＣＤ４＋非調節性Ｔ細胞に形質導入し、そしてその細胞のトランスクリプトームを、正規化された表示ディファレンシャル分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）および遺伝子チップ分析によって分析した。
【０１４７】
（材料および方法）
（Ｆｏｘｐ３形質導入Ｔ細胞および空ベクター形質導入Ｔ細胞）
マウスＦｏｘｐ３遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿０５４０３９）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、マウスＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＲＮＡサンプル由来のｃＤＮＡおよび以下のプライマーセットを用いてＰＣＲによって増幅した：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧ−３’（順方向プライマー）および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＡＧＣ−３’（逆方向プライマー）。得られたＤＮＡフラグメントを、配列決定し、そしてｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｐＭＸ−Ｆｏｘｐ３−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）（Ｎｏｓａｋａ  Ｔら、ＥＭＢＯ−Ｊ  １８：４７５４−４７６５、１９９９）レトロウイルスベクターのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位との中にサブクローニングした。得られたｐＭＸ−ｍＦｏｘｐ３−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰクローンを、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）の使用によってＢＤ  ＥｃｏＰａｃｋ２−２９３細胞株（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にトランスフェクトし、そしてエコトロピックウイルス粒子を含む培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。上清を、雌ＢＡＬＢ／ｃ脾臓（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）から新鮮に単離したマウスＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞に、スピン感染法（ｓｐｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって適用した。Ｆｏｘｐ３形質導入Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞）に対するコントロールとして、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ空ベクターを含むウイルスをまた、空ベクター形質導入Ｔ細胞（偽（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞）を産生するために、マウスＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた。ＥＧＦＰポジティブＦｏｘｐ３−Ｔ細胞または偽Ｔ細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞分類システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって９９％を超える純度まで精製し、そして全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用することによって両方の細胞から単離した。
【０１４８】
（正規化された表示ディファレンシャル分析（Ｎ−ＲＤＡ））
Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞のＲＮＡサンプルまたは偽Ｔ細胞のＲＮＡサンプルを、ＷＯ  ０２／１０３００７  Ａ１（その内容全体は、本明細書中に参考として援用される）に記載される方法を使用してＮ−ＲＤＡに適用した。
【０１４９】
（遺伝子チップ分析）
非刺激Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞、抗体刺激Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞または偽Ｔ細胞を、遺伝子チップ分析のために調製した。遺伝子チップ分析の第１ラウンドにおいて、以下の４つの集団を、調製した；Ｍ−：非刺激偽Ｔ細胞、Ｍ＋：刺激偽Ｔ細胞、Ｆ−：非刺激Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞、Ｆ＋：刺激Ｆｏｘｐ３ｋ−Ｔ細胞。第２ラウンドにおいて、抗体刺激Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞または偽Ｔ細胞を、非刺激細胞と一緒に、異なる時点（６時間の刺激および２４時間の刺激）にて調製した。
【０１５０】
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して細胞から抽出した、そしてＲＮｅａｓｙカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってさらに精製した。適切な量のｃＲＮＡを得るために、ビオチン化した相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を作製するための２サイクル増幅法（ｔｗｏ−ｃｙｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を、ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブのために行った。最初に、二本鎖ｃＤＮＡを、Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）プロモータープライマーを用いたＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、１００ｎｇの全ＲＮＡから調製した。エタノール沈殿によるｃＤＮＡの精製後、インビトロ転写（ＩＶＴ）を、ＭＥＧＡスクリプトＴ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して行い、次いでｃＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）（Ｆｉｒｓｔ  Ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ）によって清浄化した。ｃＲＮＡの増幅の第２サイクルとして、第２サイクルの第１のｃＤＮＡ鎖を、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、ランダムプライマーを用いて、４００ｎｇのｃＲＮＡから合成した、そして第２のｃＤＮＡ鎖を、Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）プロモータープライマーを用いて合成した。エタノール沈殿による精製後、第２サイクルのＩＶＴを、ビオチン化したＵＴＰおよびＣＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを用いて行い、次いで標識したｃＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラムによって精製した。この標識したｃＲＮＡを、断片化し、次いでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＭＯＥ４３０Ａアレイにハイブリダイズさせた。ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコルに従って、そのプローブアレイを、洗浄し、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルイディクスステーション上でストレプトアビジン−フィコエリトリンおよびビオチン化されたヤギ抗ストレプトアビジンによって染色した。蛍光強度を、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ共焦点レーザースキャナーを用いて捕捉した。全ての定量データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェア，ＭＡＳ５．０を使用して処理した。
【０１５１】
（結果）
Ｎ−ＲＤＡの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のサブトラクションの第４ラウンド後、９３クローンは、専らＦｏｘｐ３−Ｔ細胞において発現された分子として同定され、そしてとりわけ、ｍＧＰＲ８３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ｇｉ：６７５３９８７（ＮＭ＿０１０２８７））が、最も頻繁に検出された（９３クローン中１６クローン）。この高頻度は、ｍＧＰＲ８３が専らＦｏｘｐ３−Ｔ細胞において発現されるだけでなく、発現の量が比較的高いことも意味した。Ｎ−ＲＤＡにおいて用いられるものと同じＲＮＡサンプルを使用することによる定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞におけるｍＧＰＲ８３の独占的な発現を確認した。なぜならばｍＧＰＲ８３は、Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞においてのみ高レベルの発現が一貫して検出されたからである。Ｎ−ＲＤＡの検出と一致して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析はまた、ｍＧＰＲ８３が第１の分析および第２の分析の両方においてＦｏｘｐ３−Ｔ細胞に特異的な分子であることを示した。その発現レベルは、Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）媒介性刺激の後にダウンレギュレートされるが、ｍＧＰＲ８３はコントロール偽Ｔ細胞においてその細胞が刺激されたとしても検出されない傾向にあった。まとめると、前述のデータ（図１に記載した）は、がＦｏｘｐ３転写因子の存在下で実質的なレベルで特異的に誘導され、そして非Ｔｒｅｇ細胞集団において誘導されなかったことを示す。
【０１５２】
（実施例２：ｍＧＰＲ８３発現は、定量的リアルタイムＰＣＲによって確認されるように、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞に独占的である）
（実験の目的）
Ｎ−ＲＤＡおよびＧｅｎｅｃｈｉｐによるトランスクリプトーム分析は、ｍＧＰＲ８３をＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ特異的遺伝子として繰り返し検出した。ｍＧＰＲ８３がＴｒｅｇ細胞に対する分子標的であるか否かを検証および確認するために、定量的リアルタイムＰＣＲ実験を、マウスリンパ球パネルおよび新鮮に単離したＴ細胞または遺伝子形質導入Ｔ細胞を使用して行った。
【０１５３】
（材料および方法）
（細胞）
マウスリンパ球集団（例えば、Ｂ２２０＋  Ｂ細胞、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−マクロファージ、骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞Ｉ型（Ｔｈ１）およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞ＩＩ型（Ｔｈ２））のＲＮＡパネルは、マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ．Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から調製および産生した。ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコル（ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットおよびＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ．Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から磁気的に調製した。偽Ｔ細胞またはＦｏｘｐ３−Ｔ細胞を、実施例１に記載されるものと同じ方法によって調製した。いくつかの分析において、それらの細胞を、抗体（例えば、抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＣＴＬＡ−４、および組換えマウスインターロイキン−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ））の種々の組み合わせによってさらに刺激した。リアルタイムＰＣＲのために、その細胞を、回収し、そしてＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてホモジネートし、トランスファーＲＮＡを、製造業者のプロトコルによって単離した。
【０１５４】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
上記細胞中のｍＧＰＲ８３の発現レベルを、ｍＧＰＲ８３の量がハウスキーピング遺伝子（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ））のレベルと内部で比較される定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。最初に、ＲＮＡサンプルを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡ  ＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。以下のプライマーを、ＰＣＲにおいてｃＤＮＡサンプルに対して使用した：ＨＰＲＴについて、５’−ＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＧＡＴ−３’および５’−ＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴＣＴＴＡＧＧＣＴＴＴ−３’を、それぞれ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。ｍＧＰＲ８３について、５’−ＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＴ−３’および５’−ＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＡ−３’を、それぞれ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。全てのプライマーを、ＲＮＡの非特異的増幅を避けるために、ＷＷＷベースのソフトウェア、Ｐｒｉｍｅｒ  ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して設計した。
【０１５５】
ｃＤＮＡテンプレート、プライマー、ウラシルＤＮＡグリコシグリコシラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）および適切な量の蒸留水から構成される反応混合物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅが自動的に発現レベルを定量するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）に適用した。
【０１５６】
（結果）
図２に示した通り、リンパ球パネルの間で、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞を含むＣＤ４＋Ｔ細胞のみが、ｍＧＰＲ８３の高発現を示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５の発現に従って２つの集団へと分類され、そしてｍＧＰＲ８３を、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞と等しいＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞においてのみ検出した。抗体刺激のいくつかの組み合わせを使用した場合に、発現のレベルは変動しなかった。重要なことに、ｍＧＰＲ８３は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞を誘導しなかった。ｍＧＰＲ８３は、Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の抗体媒介性刺激後にダウンレギュレーションの傾向を示したので、ｍＧＰＲ８３を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８または抗ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）によって刺激したＦｏｘｐ３−Ｔ細胞において定量した。抗ＣＤ２８による刺激は、ｍＧＰＲ８３の発現を一過性に下方調節した。他方で、抗ＣＴＬＡ−４による刺激は、ｍＧＰＲ８３を徐々にダウンレギュレートするようである。しかし、ｍＧＰＲ８３が顕著な特異性を有する新鮮に単離したＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞およびＦｏｘｐ３形質導入Ｔ細胞において実際に発現されたことは、全ての実験から証明された（図２を参照のこと）。
【０１５７】
（実施例３：ｍＧＰＲ８３のリンパ系特異性を決定するためのｍＧＰＲ８３定量）
（実験の目的）
潜在的に薬物使用可能（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）な分子標的を選択するために、その分子の組織分布は、特異性に鑑みて、とても重要である。この実験において、ｍＧＰＲ８３の組織分布を、新鮮に単離したマウス組織を使用して評価した。
【０１５８】
（材料および方法）
種々の組織を、７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスから切除し、そしてＲＮＡの分解を避けるためにドライアイスを用いて迅速に冷凍した。全ＲＮＡを、組織をホモジネートした後にＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して組織から抽出した。リアルタイムＰＣＲテンプレートのためのｃＤＮＡを、実施例２において使用したものと同じプロトコルによって産生した。上記ＰＣＲ反応を、実施例２に記載した方法を使用して行った。ＨＰＲＴを、ｍＧＰＲ８３を定量するために内部コントロールとして使用した。ｍＧＰＲ８３についての参照として、Ｆｏｘｐ３をまた、評価した。ＨＰＲＴおよびｍＧＰＲ８３に対するプライマーセットを、実施例２において使用したものと同じであった。Ｆｏｘｐ３については、５’−ＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣ−３’および５’−ＧＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣ−３’を、それぞれ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。
【０１５９】
（結果）
図３に示した通り、Ｆｏｘｐ３メッセージが豊富なリンパ節を、ｍＧＰＲ８３の発現の主要な部位として検出した。脳は、ｍＧＰＲ８３の発現を特定のレベルにて与えたが、広範な分布は、見られなかった。
【０１６０】
（実施例４：ヒトＧＰＲ８３はまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ヒトＴｒｅｇ細胞において優勢に発現される）
（実験の目的）
マウス系を用いて上に記載した実験によって、ｍＧＰＲ８３が身体中でリンパ系において主に発現されたこと、および特に、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞がｍＧＰＲ８３を有する特有の細胞であったことが、証明された。ヒトＧＰＲ８３の発現パターンを確認するために、以下の分析を、行った。
【０１６１】
（材料および方法）
（ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞およびヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞の調製）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なボランティア由来の１５０ｍｌのヘパリン化した静脈血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）遠心分離によって単離した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞画分およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞画分を、製造業者の説明書に従ってヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋  調節性Ｔ細胞単離キット（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳ分離カラムによってＰＢＭＣから回収した。両方の単離した細胞画分を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、さらに精製し、そして９９％の純度のＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞画分および９１％の純度のＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞画分を、得た。
【０１６２】
（ｃＤＮＡの調製）
上記単離した細胞画分を、Ｉｓｏｇｅｎ溶液（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）において可溶化し、そして全ＲＮＡを、精製した。そのＲＮＡサンプルを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、そしてスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１のｃＤＮＡ鎖へと変換した。
【０１６３】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
遺伝子発現の定量的な確認のために、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。ｃＤＮＡサンプルを、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、アッセイに合わせた（Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ）プライマーおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって設計されたプローブ（Ｆｏｘｐ３：Ｈｓ００２０３９５８＿ｍ１、ＧＰＲ８３／ＧＰＲ７２：００１７３９０６＿ｍ１）を導入することによって増幅した。各発現レベルを、ヒトハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）のレベルによって標準化し、標準的なプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｍｓ）を使用して定量した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞中の両方の発現レベルを、ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞中のそれらのレベルと比較した変化倍率（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）として示した。
【０１６４】
（結果）
図４に示した通り、リアルタイムＰＣＲによって測定されたヒトＦｏｘｐ３遺伝子およびヒトＧＰＲ８３／ＧＰＲ７２遺伝子の両方の発現は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞画分における発現よりもＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞画分において有意に高かった。ＧＰＲ８３は、特に、（マウスＴｒｅｇ細胞についての場合のように）ヒトＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞において発現された。
【０１６５】
（実施例５：ヒトＧＰＲ８３はまた、ヒトＴｒｅｇ細胞において優勢に発現される）
（実験の目的）
マウス系を用いて上に記載した実験によって、ｍＧＰＲ８３が身体中でリンパ系において主に発現されたこと、および特に、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞がｍＧＰＲ８３を有する特有の細胞であったことが、証明された。ヒトＧＰＲ８３の発現パターンを確認するために、以下の分析を、行った。
【０１６６】
（材料および方法）
（細胞）
ヒト末梢血を、健康なボランティアから引き出し、そしてリンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて勾配遠心分離によって回収した。磁気的分離システム（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞単離キットヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞の濃縮後、細胞集団を、ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ２５ｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞を高純度にさらに分離した。
【０１６７】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
上記細胞中のＧＰＲ８３の発現レベルを、目的の遺伝子の量をコントロール遺伝子（β−アクチン）と比較した定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。
【０１６８】
最初に、ＲＮＡサンプルを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡ  ＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと変換した。ＦＯＸＰ３、ＧＰＲ８３およびβ−アクチンのレベルを測定するための特定のプライマーセットを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手し、そしてそれを、製造業者のプロトコルに従って定量的Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲを実行するために使用した。
【０１６９】
（結果）
図５に示した通り、ＦＯＸＰ３は、ＣＤ２５ｈｉｇｈ集団およびＣＤ２５ｌｏｗ集団の両方において検出されたが、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞においては検出されなかった。ヒトＧＰＲ８３は、ＦＯＸＰ３についての発現パターンと同じ発現パターンを示した。
【０１７０】
（実施例６：ｈＦＯＸＰ３およびｈＧＰＲ８３の組織分布）
（実験の目的）
下に記載した実験の目的は、種々の（ｖａｔｉｏｕｓｅ）ヒト組織サンプルにおいてヒトＧＰＲ８３の分布を評価することであった。
【０１７１】
（材料および方法）
（サンプル）
種々のヒト組織由来のＲＮＡサンプルを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１７２】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
実施例５に記載したものと同じ方法を、使用した。
【０１７３】
（結果）
図６に示した通り、ＦＯＸＰ３発現の部位（リンパ組織）とは対照的に、ヒトＧＰＲ８３発現の主要な部位は、脳であった。リンパ組織は、ＧＰＲ８３の高い発現を与えなかった。ＧＰＲ８３の発現レベルは、組織中のＧＰＲ８３発現細胞の頻度に直接依存するので、リンパ組織中のＧＰＲ８３の低い発現は、驚くべきことではなかった。
【０１７４】
（実施例７：マウスＧＰＲ８３に対する抗体の産生、およびＴｒｅｇ細胞におけるマウスＧＰＲ８３発現の特異性のタンパク質レベルでの確認）
（実験の目的）
この実験の目的は、ｍＧＰＲ８３の発現をタンパク質レベルで確認することであった。この目的のために、ｍＧＰＲ８３に対するモノクローナル抗体を、産生した。
【０１７５】
（材料および方法）
（抗原の調製）
ｍＧＰＲ８３に対するモノクローナル抗体を産生するために、Ｎ末端にグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合したｍＧＰＲ８３タンパク質（ＧＳＴ−１ｅｘｍＧＰＲ８３）を、最初に産生した。ｍＧＰＲ８３の第１の細胞外ドメインを、プライマー、５’−ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣａｔｇａａｇｇｔｔｃｃｔｃｃｔｇｔｃｃｔ−３’（順方向）および５’−ＧＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣｔｔｔｃａｃｃｇｔｇｇｇｇｔｔｃｔｇｇｇ−３’（逆方向）を使用してｐＧＥＸ４Ｔ３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）にサブクローニングした（ｐＧＥＸ４Ｔ３−１ｅｘｍＧＰＲ８３）。Ｅ．ｃｏｌｉ、ＪＭ１０９株（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を、ｐＧＥＸ４Ｔ３−１ｅｘｍＧＰＲ８３によって形質転換した。イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）によるタンパク質誘導の後、その細菌を、サルコシル（ｓａｌｋｏｓｙｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）によって可溶化し、その後、ＧＳＴ−１ｅｘｍＧＰＲ８３融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用することによって精製した。
【０１７６】
（動物の免疫化）
ＷＫＹラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ、Ｙｏｋｏｈａｍａ、Ｋａｎａｇａｗａ、Ｊａｐａｎ）を、２μｇの精製したＧＳＴ−１ｅｘｍＧＰＲ８３融合タンパク質と、アジュバントとしてのＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ）とを用いて免疫化した。連続的な免疫化の後、ラットのリンパ節細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｒｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＰ３ｘ６４Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を産生した。ＨＡＴ選択（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）の後、ハイブリドーマを、ｍＧＰＲ８３形質導入Ｂ３００細胞に対する感受性の評価の後に、限界希釈によってクローニングした。クローン２７．３１（ラットＩｇＧ２ｂ）は、選択したクローンのうちの１つであり、そしてそれを、さらなる実験のために使用した。ＦＡＣＳ分析のために、２７．３１を、製造業者のプロトコルに従って蛍光色素であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって標識した。
【０１７７】
（ＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析）
新鮮に単離したＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）およびデキサメタゾン（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の存在下で１８時間にわたって別々に培養した。最後の１時間の間に、それらの細胞を、ＦＩＴＣ結合体化抗ｍＣＤ４（ＲＭ４−５、５μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＰＥ結合体化ラット抗ｍＣＤ２５（ＰＣ６１．５、４μｇ／ｍｌ、ｅＢＩＯｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合体化２７．３１（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした。細胞を洗浄した後、それらの細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０１７８】
（結果）
２７．３１  ｍＡｂが、ｍＧＰＲ８３によって形質導入したＢ３００細胞において特異的にｍＧＰＲ８３を検出したとしても、ｍＧＰＲ８３のポジティブな染色は、新鮮に単離したＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞において、モノクローナル抗体を使用してほとんど観察されなかった。したがって、実験技術を、ｍＧＰＲ８３を誘導するために、（Ｈａｒｒｉｇａｎ  Ｍら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９：３４３８−３４４６、１９８９およびＣｈｅｎ  Ｘら、Ｅ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：８５９−８６９、２００４に記載される技術に基づいて）設計した。その技術は、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞と、ＩＬ−２と、グルココルチコイドとのインキュベーションを使用する。
【０１７９】
Ｔｒｅｇ細胞のみが、ＩＬ−２およびグルココルチコイド（デキサメタゾン）に応答し、その細胞の大きさの増大（分芽性の変化）ならびにＣＤ２５およびＣＤ４のさらなる誘導（左のチャート中のＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４ｈｉｇｈ集団）を伴った一方で、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞において表現型の変化は、観察されなかった。興味深いことに、分芽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞のみが、２７．３１によるポジティブな染色を与えた一方で、２７．３１ポジティブな染色は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞において見られなかった。したがって、上述の実験（図７においてグラフで示す）は、ｍＧＰＲ８３が専らＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞において発現されることを、ｍＲＮＡレベルだけでなくタンパク質レベルにおいても示す。
【０１８０】
（実施例８：ＧＰＲ８３リガンド活性を、マウスの脳およびブタの脳由来のペプチド性画分において検出した）
（ＧＰＲ８３遺伝子によって操作したＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーター細胞）
ヒト分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）遺伝子に機能的に連結されたヒト血管作動性腸管ペプチド遺伝子プロモーターのフラグメントの上流にクローニングされたサイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）のタンデムテトラマーを含むＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーター遺伝子を、Ｃｈｅｎ，Ｗ．ら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６、３４９−３５４．、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８４、３１６−３２６．、およびＧｏｔｏ，Ｍ．ら（１９９６）４９（５）、８６０−８７３に記載されるように、レトロウイルスベクターにおいて構築した。安定なＣＲＥ−ＰＬＡＰ発現ＨＥＫ２９３細胞株を得るために、細胞を、ＣＲＥ−ＰＬＡＰ発現ユニットを含むレトロウイルスベクターによって形質導入した。形質導入した細胞株を、ＰＬＡＰアッセイを使用して分析し、そして最良のクローンを、ＧＰＲ８３遺伝子によるトランスフェクションのために宿主細胞株として使用した。ヒト脳ｃＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲによって得られたＧＰＲ８３遺伝子をまた、同じ手順によって導入した。
【０１８１】
（ＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーター細胞によるリガンドスクリーニングアッセイ）
ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＰＬＡＰ／ＧＰＲ８３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補充した１００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地／Ｈａｍ栄養混合物Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地を用いて、９６ウェルプレート中に１ウェルあたり１×１０４個の細胞にて接種し、そしてＣＯ２インキュベーター（５％  ＣＯ２）中で３７℃にて２４時間にわたってインキュベートした。次いで細胞を、１ウェルあたり１０μｌの再構成したサンプルおよび１０μｌの１０μＭフォルスコリン／ＤＭＥＭの添加によって刺激した。３７℃／５％  ＣＯ２にて２４時間にわたるインキュベーション後、１ウェルあたり５μｌの培養培地を、２０μｌのアッセイ緩衝液（２８０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ１０）および２５μｌのＬｕｍｉｐｈｏｓ  ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ）と一緒に、白色の３８４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に移し、そして室温にて２時間にわたってインキュベートした。発現したＰＬＡＰのレベルを、Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において定量した。
【０１８２】
（ＧＰＲ８３の粗天然リガンドの部分的な精製）
マウス脳由来画分について、小脳を含まない約６０ｇの脳を、１０×容量の７０％（ｖ／ｖ）アセトン、１Ｍ酢酸および２０ｍＭ  ＨＣｌにおいてブレンダーによってホモジネートし、次いで１５０００×ｇで３０分間にわたって４℃にて遠心分離した。得られた上清を、回収し、そしてジエチルエーテルによって２回抽出した。水相を、再び遠心分離し、そしてその上清を、０．１％  ＴＦＡによって予め平衡化した２つの１０ｇカートリッジＣ１８カラム、ＨＦ  ＭＥＧＡ  ＢＥ−Ｃ１８（ＶＡＲＩＡＮ）にロードした。カートリッジを、４０ｍｌの０．１％  ＴＦＡによって洗浄し、次いで５０％  ＣＨ３ＣＮ／０．１％  ＴＦＡによって溶出させた。溶出物を、凍結乾燥し、１Ｍ酢酸に再溶解し、そしてＨＰＬＣに適用した。工程１：上記溶出物の１／４を、０．１％  ＴＦＡによって予め平衡化したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム、ＹＭＣ  ＰｒｏＣ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）にロードした。ロードしたサンプルを、１ｍｌ／分の流速にて、０．１％  ＴＦＡ中で２４％〜４８％  ＣＨ３ＣＮの５０分間の直線勾配によって溶出させた。画分を、１分間隔で回収した。約１％の各画分を、その画分がＧＰＲ８３によって形質導入したＣＲＥ−ＰＬＡＰレポーター細胞に対する効果を有したか否かを決定するために、ＣＲＥ−ＰＬＡＰアッセイに供した。工程２：活性画分を、プールし、０．１％  ＴＦＡによって４倍に希釈し、そして０．１％  ＴＦＡによって予め平衡化したジフェニル逆相カラム、Ｖｙｄａｃ  ２１９ＴＰ５４（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）にロードした。０．１％  ＴＦＡ中でＣＨ３ＣＮの２９．４％〜５１％の勾配を、１ｍｌ／分の流速にて５０分間にわたって適用した。画分を、１分間隔にて回収し、そして各画分の５％を、アッセイした。ホモジナイゼーションおよび抽出の手順（工程１および工程２）を、６回繰り返し、その結果、合計３６０ｇのマウス脳を、処理した。工程３：全ての活性画分を、プールし、０．１％  ＴＦＡによって４倍に希釈し、そして０．１％  ＴＦＡによって予め平衡化したＣ１８逆相カラム、Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）にロードした。０．１％  ＴＦＡ中でＣＨ３ＣＮの３０％〜５４％勾配を、１ｍｌ／分の流速にて、５０分間にわたって適用した。画分を、１分間隔にて回収し、そして１０％の各画分を、アッセイした。その活性画分を、ＧＰＲ８３の粗リガンドとして使用した。
【０１８３】
ブタ由来画分について、最初の脳の容量が９０ｇであり、サンプルの１／６をＨＰＬＣに供し、次いで約３％の各画分をＣＲＥ−ＰＬＡＰアッセイに供したことを除いて、ほぼ同じ手順を、行った。
【０１８４】
上記分析の結果を、図８に示す。図８に示した通り、実質的なリガンド活性が、マウス脳由来活性画分において検出される。
【０１８５】
（ＧＰＲ８３の粗ＧＰＲ８３リガンドの特徴付け）
サンプルを、上に記載したように調製した。
【０１８６】
ペプチドリガンドと比較するために、ガラニンレセプター２（ＧＡＬ２Ｒ）を、コントロールとして使用した（なぜならば脳抽出物は、多くのガラニンを含むからである）。各画分を、以下の通りに処理した。
【０１８７】
１）コントロール。５０μｌの０．１％  ＴＦＡによって再構成し、乾燥し、そして２４μｌの０．１％  ＴＦＡによって溶解した。次いで、（ＧＰＲ８３発現細胞およびガラニンレセプター２（Ｇａｌ２Ｒ）発現細胞に対して）１０μｌ／ｅａを、ＰＬＡＰアッセイに添加した。次いで、Ｇａｌ２ＲおよびＧＰＲ８３の特異的活性を、決定した。
【０１８８】
２）酸処理。５０μｌの５Ｍ  ＨＣｌによって再構成し、そして５５℃にて１２時間にわたってインキュベートした。次いで、乾燥し、そして２４μｌの０．１％  ＴＦＡによって再び溶解した。次いで、１０μｌ／ｅａを、ＰＬＡＰアッセイにおいて添加した。酸処理は、ガラニン活性およびＧＰＲ８３特異的活性の両方を消失させた。
【０１８９】
３）プロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）処理。５０μｌのＰｒｏＫ溶液（１００ｕｇ／ｍｌ  ＰｒｏＫ／ＰＢＳ）によって再構成し、そして５５℃にて１時間にわたってインキュベートした。ＰｒｏＫを不活性化する（なぜならばＰｒｏＫは、ＰＬＡＰアッセイを阻害するからである）ために、サンプルを、９０℃にて１５分間にわたってインキュベートした。次いで、乾燥し、そして２４μｌの０．１％  ＴＦＡによって溶解した。次いで、１０μｌ／ｅａを、ＰＬＡＰアッセイにおいて添加した。ＰｒｏＫ処理は、ガラニン活性およびＧＰＲ８３特異的活性の両方を消失させた。
【０１９０】
４）熱処理。５０μｌのＨ２Ｏによって再構成し、そして上の実験によって標準化するために、５５℃にて１時間にわたってインキュベートした。次いで、サンプルを、９０℃にて１５分間にわたってインキュベートし、次いで乾燥し、そして２４μｌの０．１％  ＴＦＡによって溶解した。次いで、１０μｌ／ｅａを、ＰＬＡＰアッセイにおいて添加した。熱処理は、ＧＰＲ８３特異的活性を半分に減衰させたが、ガラニン活性を変化させなかった。
【０１９１】
（実施例９：Ｔｒｅｇ細胞機能のインビトロ分析）
このアッセイは、Ｉｔｏｈ  Ｍ．ら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：５３１７−５３２６（この内容は、本明細書によって参考として援用される）に記載されるように行われ得る。簡単にいうと、マウスＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコル（ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットおよびＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ．Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から磁気的に調製した。得られたＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞（レスポンダー、１×１０５個の細胞）を、可溶性の抗ＣＤ３  ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１、１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）の存在下で、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）処理した非ＣＤ４脾細胞（１×１０５個の細胞）と一緒に共培養した。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞（灰色）またはＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞（黒色）を、それぞれ、レギュレーター細胞またはレギュレーターのコントロールとして、異なるレスポンダー／レギュレーター比（１：０〜１：１）でその培養物に添加した。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞は、任意のＴＣＲ媒介性刺激に対してアネルギー性である（すなわち、それらは、ＴＣＲ媒介性刺激に対して非増殖性である）ので、その培養物の増殖の値は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞にのみ由来する。この状況において、Ｔｒｅｇ細胞をその培養物に添加する場合、増殖のＴｒｅｇ数依存性の阻害が、観察されるが、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞の添加において、阻害を見ることはできないが、増大した増殖が、見られ得る（図９を参照のこと）。
【０１９２】
（実施例１０：ＧＰＲ８３に対するマウス脳由来リガンドは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強する）
（実験の目的）
ＧＰＲ８３のリガンドのＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞に対する生物学的効果を決定するために、インビトロＴｒｅｇアッセイを、マウス脳由来活性画分（実施例８に記載した通りに産生した）の存在下で行った。
【０１９３】
（材料および方法）
マウスＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコル（ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットおよびＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ．Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から磁気的に調製した。得られたＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ、１ｘ１０５個の細胞）を、可溶性の抗ＣＤ３  ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１、１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）の存在下で、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）処理した非ＣＤ４脾細胞（１×１０５個の細胞）と一緒に共培養した。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞（図１０、左のパネル）またはＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１０、右のパネル）を、それぞれ、レギュレーター細胞またはレギュレーターのコントロールとして、１：０．３の比のレスポンダー／レギュレーター比にてその培養物に添加した。ＧＰＲ８３に対するリガンドの生物学的効果を評価するために、マウス脳由来画分を、上記培養物に添加した（３μｌまたは６μｌ、図１０、黒塗りの円）。リガンド画分に対するコントロールとして、そのリガンド画分の溶媒である０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水を、上記培養物に添加した（３μｌまたは６μｌ、図１０、白抜きの円）。９６時間培養の最後の４時間の間に、ＷＳＴ−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ、Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）試薬を、製造業者のプロトコルに従ってＴ細胞の増殖の程度を測定するために、添加した。全ての培養を、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、Ｄｏｊｉｎｂｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）と、硫酸カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、２−メルカプトエタノール（５５μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）と１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｕｔｈａ、ＵＳＡ）とを補充したＳ−クローンＳＦ−Ｏ３完全無血清培地（Ｓａｎｋｏ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）の存在下で行った。
【０１９４】
（結果）
図１０に示した通り、レスポンダーＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖は、マウス脳由来活性画分の添加によって、用量依存的様式で有意に阻害されたが、阻害は、コントロールにおいて観察されなかった。さらに、上記マウス脳由来活性画分は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞培養物に対する効果を有さなかった。上述のデータ（図１０にグラフで示した）は、上記マウス脳由来活性画分（ＧＰＲ８３に対する可能なリガンドを含む）が、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を特異的に刺激し、そしてＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞の免疫調節活性を増大させることを示す。
【０１９５】
（実施例１１：ＧＰＲ８３に対するマウス脳由来リガンドは、サイトカインを産生するようにＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞を活性化する）
（実験の目的）
上に記載したインビトロＴｒｅｇアッセイ（Ｔ細胞増殖アッセイ）に加えて、マウス脳由来ＧＰＲ８３リガンドの効果を、Ｔｒｅｇ細胞由来のサイトカイン産生を測定することによって評価した。ＩＬ−１０（Ｈａｒａ  Ｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３７８９−３７９６、２００１、Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ＣＩら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１０８０−１０８６、２００２）およびＩＦＮ−γ（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ  Ｆら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２０６−１２１２、２００３）は、Ｔｒｅｇ細胞免疫調節活性のために重要なサイトカインであることが公知であるので、これらのサイトカインを、マウス脳由来活性画分（ＧＰＲ８３リガンドを含む）の存在下または非存在下で測定した。
【０１９６】
（材料および方法）
磁気的に精製したＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞を、上記活性画分またはコントロール０．１％  ＢＳＡを用いてか、あるいはそれらを用いずに、プレートに結合した抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、可溶性の抗ＣＤ２８（３７．５１、２μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）および組換えマウスＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）によって刺激した。２４時間後または４８時間後に、その培養上清を、回収し、製造業者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡキット（ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用してＩＬ−１０の量（図１０、上部）およびＩＦＮ−γの量（図１０、下部）を測定した。
【０１９７】
（結果）
図１１に示した通り、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ（Ｔｒｅｇ由来サイトカインは、免疫調節における主要因子（ｋｅｙ  ｐｌａｙｅｒ）であることが公知である）は、上記マウス脳由来活性画分（ＧＰＲ８３に対するリガンドを含む）を含む培養物において、用量依存的様式で顕著に増加した。図１０および図１１のデータは、上記マウス脳由来画分に含まれたＧＰＲ８３リガンドが、Ｔｒｅｇ細胞を特異的に刺激し、そして細胞の免疫調節活性／免疫阻害活性を増大させることを、明確に示す。
【０１９８】
レスポンダーＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、免疫不全ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスにおいて致命的な自己免疫疾患を誘導し得る自己反応性の病原性Ｔ細胞を含むので、マウス脳由来画分内に含まれたＧＰＲ８３アゴニストは、自己免疫疾患を制御、処置または予防するために使用され得る。さらに、外因的に移入されたＴｒｅｇ細胞は、数種の前臨床マウスモデルにおいてアレルギー反応の発症および移植片の拒絶を予防し得る。したがって、上記マウス脳由来画分内に含まれたＧＰＲ８３アゴニストはまた、アレルギー疾患または移植片拒絶を制御、処置または予防するために使用され得る。
【０１９９】
（実施例１２：ＧＰＲ８３に対するマウス脳由来リガンドは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の免疫調節機能を活性化する）
（実験の目的）
図１０および図１１に示した結果を確認するために、インビトロＴｒｅｇアッセイを、抗原特異的Ｔ細胞によって認識される公知の抗原によって開始されるより生理学的な刺激を使用して行った。このアッセイにおいて、オボアルブミン（ｏｖａｌｕｂｕｎｉｍｅ）（ＯＶＡ）ペプチドを、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を有するＴ細胞およびＴｒｅｇ細胞の両方を刺激するために、抗原として使用した。Ｔ細胞を、ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＤＯ１１．１０マウス）から調製した。
【０２００】
（材料および方法）
ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞（１ウェルあたり５×１０４個の細胞）を、ＤＯ１１．１０マウスから精製し、次いで、単独か、またはＤＯ１１．１０から単離した示された数のＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞（１ウェルあたり２．５×１０４個または５×１０４個）と一緒に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（１ウェルあたり１×１０５個）およびＯＶＡペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間にわたって培養した。各ウェルを、５００ｎＣｉの［３Ｈ］チミジンによって最後の６時間にわたってパルス（ｐｕｌｓｅ）した。次いで、その細胞を、ガラス繊維フィルターにおいて回収し、そしてチミジンの取り込みを、βプレートカウンター（ｂｅｔａ−ｐｌａｔｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ）によって測定した。
【０２０１】
（結果）
図１２に示した通り、ＣＤ２５−ＣＤ４＋  Ｔ細胞に対するＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の抗増殖活性は、上記マウス脳由来活性画分（ＧＰＲ８３リガンドを含む）の存在下において明らかに増強された。
【０２０２】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、またはそれらを慣用的に過ぎない実験を用いて確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、Ｆｏｘｐ３形質導入マウスＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞のトランスクリプトーム分析を図示する。
【図２】図２は、ｍＧＰＲ８３発現がＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞に限られることを示す定量的リアルタイムＰＣＲ実験の結果を図示する。
【図３】図３は、ｍＧＰＲ８３のリンパ系特異性を決定するためのｍＧＰＲ８３定量の結果を図示する。
【図４】図４は、ヒトＧＰＲ８３がまたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ヒトＴｒｅｇ細胞において優勢に発現されることを示す実験の結果を図示する。
【図５】図５は、ヒトＧＰＲ８３がまたヒトＴｒｅｇ細胞において優勢に発現されることを示す実験の結果を図示する。
【図６】図６は、ｈＦＯＸＰ３およびｈＧＰＲ８３の組織分布を図示する。
【図７】図７は、Ｔｒｅｇ細胞に対するｍＧＰＲ８３発現の特異性をタンパク質レベルで確認する実験の結果を図示する。
【図８】図８は、実質的なリガンド活性が上記マウス脳由来活性画分において検出されることを示す実験の結果を図示する。ＧＰＲ８３の粗リガンドのＣ１８逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）溶出プロフィールの第３の工程が、示される。黒色のバーは、ＧＰＲ８３に対する特異的活性を示し、そして白色のバーは、ＰＬＡＰアッセイ（実施例８に示される）によって得られたＧＰＲ３７に対する特異的活性を示す。
【図９】図９は、Ｔｒｅｇ機能をインビトロで分析するために設計された実験の結果を図示する。
【図１０】図１０は、マウス脳由来ＧＰＲ８３リガンドが、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を特異的に刺激し、そしてそれらの免疫調節活性を増大することを示す実験の結果を図示する。
【図１１】図１１は、ＧＰＲ８３に対するマウス脳由来リガンドが、サイトカインを産生するようにＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞を活性化することを示す実験の結果を図示する。
【図１２】図１２は、ＧＰＲ８３に対する上記マウス脳由来リガンドが、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の免疫調節機能を活性化すること示す実験の結果を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月14日(2008.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009509142.tif 000015
2009509142.tif 000016
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