(57)【要約】本発明は抗ＦＧＦ１９抗体ならびにこれらの抗体を含む組成物およびそれらを使用する方法、抗ＦＧＦ１９抗体を使用する方法、ならびに、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の検出を含む方法を提供する。１つの態様において、本発明の抗体の完全長ＩｇＧ形態は約２０ｐＭより良好な結合親和性でヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する。一部の実施形態においては、抗体は約４０ｐＭより良好な結合親和性でヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する。
2009525764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ２；および、
（ｆ）配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される超可変領域（ＨＶＲ）配列少なくとも１、２、３、４，５および／または６つを含む抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項２】
ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）、ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）およびＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む軽鎖を含む、請求項１記載の抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項３】
ＴＹＧＶＨ（配列番号５）、ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）およびＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む重鎖を含む請求項１記載の抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項４】
以下：
（ａ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）、ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）およびＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む軽鎖；ならびに
（ｂ）ＴＹＧＶＨ（配列番号５）、ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）およびＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む重鎖
を含む請求項１記載の抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項５】
（ａ）配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；および（ｃ）ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖を含む請求項１記載の抗体。
【請求項６】
（ａ）配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖を含む請求項１記載の抗体。
【請求項７】
以下：
（ａ）（ｉ）配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；および（ｉｉｉ）ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ２；および（ｉｉｉ）配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖
を含む、請求項１記載の抗体。
【請求項８】
下記配列：
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）
を有する軽鎖可変ドメインを含む請求項１記載の抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項９】
下記配列：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）
を有する重鎖可変ドメインを含む請求項１記載の抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の抗体と同様のヒトＦＧＦ１９上のエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項１１】
請求項１〜９の何れか１項に記載の抗体と、ヒトＦＧＦ１９への結合に関して競合する単離された抗体。
【請求項１２】
抗体の完全長ＩｇＧ形態が６×１０５（Ｍ−１ｓ−１）またはこれより良好なｋｏｎでヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する単離された抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項１３】
前記ｋｏｎが５×１０−６（ｓ−１）またはこれより良好である請求項９記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が以下のアミノ酸配列：ＧＦＬＰＬＳＨＦＬＰＭＬＰＭＶＰＥＥＰＥＤＬＲ（配列番号９）を含むペプチドに結合する単離された抗ＦＧＦ１９抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である請求項１〜１４の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体および二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１〜１４の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体フラグメントである、請求項１〜１４の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
免疫複合体である請求項１〜１４の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１〜１４の何れか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１】
発現ベクターである、請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が原核生物のものである請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が真核生物のものである請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が哺乳類のものである請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２６】
抗ＦＧＦ１９抗体を作成するための方法であって、該方法が（ａ）適当な宿主細胞内で請求項２１のベクターを発現させる工程、および（ｂ）該抗体を回収する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が原核生物である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が真核生物である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体および製薬上許容しうる賦形剤を含む、組成物。
【請求項３０】
第２の医薬を更に含み、そして前記抗体が第１の医薬である、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記第２の医薬が別の抗体、化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、抗嘔吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤または増殖阻害因子である請求項２９記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体を含むキット。
【請求項３３】
腫瘍、癌または細胞増殖性疾患を治療するための方法であって、該方法がそのような治療の必要な個体に請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記癌が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および肝細胞癌からなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が結腸直腸癌または肝細胞癌である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
第２の医薬の有効量を対象に投与することを更に含み、そして前記抗ＦＧＦ１９抗体が第１の医薬である請求項３３〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の医薬が別の抗体、化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、抗嘔吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤または増殖阻害因子である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の医薬がタモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、イリノテカン、セツキシマブ、フルベストラント、ビノレルビン、エルロチニブ、ベバシツマブ、ビンクリスチン、イマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブまたはトラスツズマブである請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の医薬が前記抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前または後に投与される請求項３３〜３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の医薬が前記抗ＦＧＦ１９抗体と同時に投与される請求項３３〜３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４１】
更に、ＦＧＦ１９の発現またはＦＧＦＲ４の発現が前記抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間、またはその後に、前記個体の生物学的試料中で検出される請求項３３〜４０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
肝臓疾患を治療する方法であって、該方法が、そのような治療を要する個体に請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４３】
前記肝臓疾患が肝硬変である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
回帰性の腫瘍増殖または回帰性の腫瘍細胞の増殖を治療する方法であって、該方法がそのような治療を要する個体に請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
前記癌が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および肝細胞癌からなる群から選択される請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が結腸直腸癌または肝細胞癌である請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
第２の医薬の有効量を対象に投与することを更に含み、そして前記抗ＦＧＦ１９抗体が第１の医薬である請求項４４〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
ＦＧＦ１９の発現または活性またはＦＧＦＲ４の発現または活性に関連する疾患を調節するための方法であって、該方法がそのような治療を要する個体に請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４９】
前記疾患が胆汁鬱滞または胆汁酸代謝の調節不全である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および肝細胞癌からなる群から選択される請求項４８または４９記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が結腸直腸癌または肝細胞癌である請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を治療するための方法であって、該方法がそのような治療を要する個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含み、ここでＦＧＦ１９の発現およびＦＧＦＲ４の発現が該抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に該個体由来の生物学的試料中で検出される、方法。
【請求項５３】
前記抗体が請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体である請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
るいそうを治療するための方法であって、該方法がそのような治療を要する個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記個体が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を有する請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体である請求項５４または５５記載の方法。
【請求項５７】
ＦＧＦ１９の発現および／または活性に関連する疾患を検出するための方法であって、該方法が個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦ１９を検出することを含む、方法。
【請求項５８】
前記ＦＧＦ１９の発現が対照試料における発現と比較して増大した発現である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記疾患が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患である請求項５７または５８記載の方法。
【請求項６０】
前記疾患が結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である請求項５７〜５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記生物学的試料が腫瘍から得られる請求項５７〜６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ＦＧＦＲ４発現に関連する疾患を検出するための方法であって、該方法が個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦ１９を検出することを含む、方法。
【請求項６３】
前記ＦＧＦＲ４発現が対照試料中の発現と比較して増大した発現である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記疾患が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患である請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患が肺癌、乳癌および／または膵臓癌である請求項６２〜６４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記生物学的試料が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患から得られる請求項６２〜６５の何れか１項に記載の方法。
【請求項６７】
ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現に関連する疾患を検出するための方法であって、該方法が個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４を検出することを含む、方法。
【請求項６８】
前記ＦＧＦ１９の発現が対照試料中の発現と比較して増大した発現である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記ＦＧＦＲ４の発現が対照試料中の発現と比較して増大した発現である請求項６７または６８記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患である請求項６７〜６９の何れか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患が肺癌、乳癌および／または膵臓癌である請求項６７〜７０の何れか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾患が肺癌である請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記生物学的試料が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患から得られる請求項６７〜７２の何れかに記載の方法。
【請求項７４】
前記ＦＧＦ１９が前記個体に由来する第１の生物学的試料中で検出され、そして前記ＦＧＦＲ４が該個体に由来する第２の生物学的試料中で検出される請求項６７〜７３の何れかに記載の方法。
【請求項７５】
癌を治療するための方法であって、該方法がそのような治療を要する個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項７６】
ＦＧＦ１９の発現およびＦＧＦＲ４の発現が前記抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に前記個体に由来する生物学的試料中で検出される請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記癌が肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌である請求項７５または７６記載の方法。
【請求項７８】
前記癌が肝細胞癌である請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記癌が結腸直腸癌である請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
第２の医薬の有効量を投与することを更に含み、そして前記抗体が第１の医薬を含む、請求項７５〜７９の何れか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２の医薬が別の抗体、化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、抗嘔吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤または増殖阻害因子である請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
るいそうを治療するための方法であって、該方法がそのような治療を要する個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項８３】
前記個体が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を有する請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記抗ＦＧＦ１９抗体が請求項１〜１８の何れか１項に記載の抗ＦＧＦ１９抗体である請求項７５〜８３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８５】
個体に対する治療を選択するための方法であって、該方法が（ａ）該個体に由来する生物学的試料中にＦＧＦ１９発現があればそれを検出する工程；および（ｂ）工程（ａ）の後に該個体に対する治療を選択する工程であって、ここで該治療の選択は工程（ａ）において検出されたＦＧＦ１９発現に基づく、工程；を含む、方法。
【請求項８６】
個体に対する治療を選択するための方法であって、該方法が（ａ）該個体に由来する生物学的試料中にＦＧＦＲ４発現があればそれを検出する工程；および（ｂ）工程（ａ）の後に該個体に対する治療を選択する工程であって、ここで該治療の選択は工程（ａ）において検出されたＦＧＦＲ４発現に基づく、工程；を含む、方法。
【請求項８７】
個体に対する治療を選択するための方法であって、該方法が（ａ）該個体に由来する生物学的試料中にＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４発現があればそれを検出する工程；および（ｂ）工程（ａ）の後に該個体に対する治療を選択する工程であって、ここで該治療の選択は工程（ａ）において検出されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４発現に基づく、工程；を含む、方法。
【請求項８８】
ＦＧＦ１９発現が検出され、そして抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療が選択される、請求項８５、８６または８７記載の方法。
【請求項８９】
ＦＧＦＲ４発現が検出され、そして抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療が選択される、請求項８５〜８８の何れか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記個体が腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を有する、請求項８５〜８９の何れか１項に記載の方法。
【請求項９１】
以下のポリヌクレオチド配列：ＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ（配列番号４１）；ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４２）；ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ（配列番号４３）；およびＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＴＣＧＧＧ（配列番号４４）の１つ以上を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９２】
請求項１、５、６または７の抗ＦＧＦ１９抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、米国特許法§１１９の下、２００６年２月１０日に出願された米国仮出願第６０／７７２，３１０号、２００６年３月９日に出願された米国仮出願第６０／７８０，６０８号および２００７年１月１９日に出願された米国仮出願第６０／８８５，８６６号（これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般的に分子生物学の分野に関する。より詳細には本発明は抗ＦＧＦ１９抗体、その使用、ならびにＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーは４受容体チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ１−４）および１キナーゼ欠損受容体（ＦＧＦＲ５）に結合する２２の構造的に関連性のあるポリペプチドを含む（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ等（２００５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ１６，１３９−１４９；Ｏｒｎｉｔｚ等（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ２，ＲＥＶＩＥＷＳ３００５；Ｓｌｅｅｍａｎ等（２００１）Ｇｅｎｅ２７１，１７１−１８２）。ＦＧＦＲ１−４とのＦＧＦの相互作用は受容体のホモ２量体化および自己リン酸化、ＦＲＳ２などのシトゾル性アダプターのリクルートメント、ならびに、多数のシグナリング経路の開始をもたらす（Ｐｏｗｅｒｓ等（２０００）Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ７，１６５−１９７；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃ３０６，１５０６−１５０７）。
【０００４】
ＦＧＦおよびＦＧＦＲは細胞の増殖、遊走、化学遊走、分化、形態発生および血管形成を調節することにより発達および組織修復において重要な役割を果たしている（Ｏｒｎｉｔｚ等（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ２，ＲＥＶＩＥＷＳ３００５；Ａｕｇｕｓｔｅ等（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ３１４，１５７−１６６；Ｓｔｅｉｌｉｎｇ等（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１４，５３３−５３７）。数種のＦＧＦおよびＦＧＦＲは乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌および結腸癌の発症に関与している（Ｊｅｆｆｅｒｓ等（２００２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ６，４６９−４８２；Ｍａｔｔｉｌａ等（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０，２７９１−２８０４；Ｒｕｏｈｏｌａ等（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６１，４２２９−４２３７；Ｍａｒｓｈ等（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８，１０５３−１０６０；Ｓｈｉｍｏｋａｗａ等（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６３，６１１６−６１２０；Ｊａｎｇ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６１，３５４１−３５４３；Ｃａｐｐｅｌｌｅｎ（１９９９）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ２３，１８−２０；Ｇｏｗａｒｄｈａｎ（２００５）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ９２，３２０−３２７）。
【０００５】
ＦＧＦ１９はＦＧＦの７サブファミリーの最も遠縁のメンバーである。ＦＧＦ１９はＦＧＦＲ４の高親和性リガンドである（非特許文献１）。ＦＧＦ１９は胆嚢および腸の上皮から通常は分泌される。ＦＧＦ１９はコレステロールおよび胆汁酸の合成のための律速酵素であるコレステロール−７−α−ヒドロキシラーゼ１（Ｃｙｐ７α１）の肝発現を抑制することによりコレステロールのホメオスタシスにおける役割を果たしている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。トランスジェニックマウスモデルにおけるＦＧＦ１９の異所性発現は肝細胞を増大させ、肝細胞の形成不全を増進し、そして１０カ月齢までに腫瘍をもたらす（非特許文献５）。ＦＧＦ１９誘発肝細胞癌の機構にはＦＧＦＲ４相互作用が関与していると考えられている。ＦＧＦ１９による治療により代謝速度が増大し、食餌性およびレプチン欠損性の糖尿病が退行する。Ｆｕ等（２００４）１４５：２５９４−２６０３。ＦＧＦ１９はまた例えば、非特許文献１；およびＨａｒｍｅｒ等（２００４）４３：６２９−６４０にも記載されている。
【０００６】
ＦＧＦＲ４発現は広範に分布しており、そして発生中の骨格筋、肝臓、肺、膵臓、副腎、腎臓および脳において報告されている（Ｋａｎ等（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７４，１５９４７−１５９５２；非特許文献５；Ｏｚａｗａ等（１９９６）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ４１，２７９−２８８；Ｓｔａｒｋ等（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１３，６４１−６５１）。ＦＧＦＲ４の増幅は乳房および卵巣の腺癌において報告されている（Ｊａａｋｋｏｌａ等（１９９３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ５４，３７８−３８２）。ＦＧＦＲ４の突然変異および切断は悪性疾病、ならびに一部の場合においては前立腺および肺の腺癌、頭部頚部扁平上皮細胞癌、軟組織肉腫、星状細胞腫および下垂体腺腫の予後に相関付けられている（Ｊａａｋｋｏｌａ等（１９９３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ５４，３７８−３８２；Ｍｏｒｉｍｏｔｏ等（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  ９８，２２４５−２２５０；Ｑｉａｎ（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ８９，１９０４−１９１１；Ｓｐｉｎｏｌａ等（２００５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ２３，７３０７−７３１１；Ｓｔｒｅｉｔ等（２００４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１１１，２１３−２１７；Ｗａｎｇ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１４，１８１−１８８；Ｙａｍａｄａ（２００２）Ｎｅｕｔｏｌ  Ｒｅｓ２４，２４４−２４８）。
【非特許文献１】Ｘｉｅ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（１９９９）１１：７２９−７３５
【非特許文献２】Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ等、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ（２００６）２６，３０１−３０６
【非特許文献３】Ｙｕ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５，１５４８２−１５４８９
【非特許文献４】Ｈｏｌｔ，ＪＡ等、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ（２００３）１７（１３０）：１５８
【非特許文献５】Ｎｉｃｈｏｌｅｓ等、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（２００２）１６０，２２９５−２３０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
治療薬として開発するために最適である臨床的属性を有する薬剤の必要性がなお継続していることは明白である。本明細書に記載する本発明はこの必要性を満足させるものであり、そして他の利点も与える。
【０００８】
本明細書において引用するすべての参考文献、例えば特許出願および公開物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本発明は部分的には種々のＦＧＦ１９結合因子（例えば抗体およびそのフラグメント）の同定に基づいている。ＦＧＦ１９は重要で好都合な治療薬として提示され、そして本発明は結合ＦＧＦ１９に基づいた組成物および方法を提供する。本明細書に記載するＦＧＦ１９結合因子はＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４経路の発現および／または活性化に関連する病理学的状態を標的とする場合に使用するための重要な治療薬および診断薬を提供する。従って、本発明はＦＧＦ１９結合に関連する方法、組成物、キットおよび製造物品、ならびに、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４結合の検出を提供する。
【００１０】
本発明はＦＧＦ１９に結合（例えば特異的に結合）する抗体を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は単離された抗ＦＧＦ１９抗体を提供し、ここで抗体の完全長ＩｇＧ形態は約２０ｐＭより良好な結合親和性でヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する。一部の実施形態においては、抗体は約４０ｐＭより良好な結合親和性でヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する。当該分野で良く知られている通り、リガンドのその受容体に対する結合親和性は種々の試験の何れかを用いて測定でき、そして種々の定量値の項目において表示できる。従って、１つの実施形態において、結合親和性はＫｄ値で表示され、そして固有の結合親和性を反映している（例えば最小限の結合力効果を有するもの）。一般的に、そして好ましくは、結合親和性は無細胞または細胞系のセッティングにおいてインビトロで計測される。当該分野で知られた多くの試験の何れか、例えば本明細書に記載するもの、例えばＢｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡを使用することにより結合親和性の測定値を得ることができる。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、抗体の完全長ＩｇＧ形態が６×１０５（Ｍ−１ｓ−１）またはこれより良好なｋｏｎおよび／あるいは５×１０−６（ｓ−１）またはこれより良好なｋｏｆｆでヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する、単離された抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００１３】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ１９のＦＧＦＲ４結合領域に結合する単離された抗体を提供する。
【００１４】
１つの態様において、以下のアミノ酸配列：ＧＦＬＰＬＳＨＦＬＰＭＬＰＭＶＰＥＥＰＥＤＬＲ（配列番号９）またはＨＬＥＳＤＭＦＳＳＰＬＥＴＤＳＭＤＰＦＧＬＶＴＧＬＥＡＶＲ（配列番号１０）を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなるペプチドに結合する単離された抗体を提供する。
【００１５】
一部の実施形態においては、単離された抗体は成熟ヒトＦＧＦ１９アミノ酸配列のアミノ酸番号１６０〜２１７、１４０〜１５９、Ｇ１３３〜Ｒ１５５、Ｇ１５６〜Ｒ１８０および／またはＡ１８３〜Ｇ１９２を含むか、本質的にこれからなるか、あるいはこれからなる（即ちシグナルペプチドを欠く）ポリペプチドに結合する。一部の実施形態においては、単離された抗体は成熟ヒトＦＧＦ１９アミノ酸配列のアミノ酸番号Ｐ４１〜Ｙ４７、Ｐ４１〜Ｆ５８、Ｐ５１〜Ｆ５８、Ｅ８１〜Ｒ８８、Ｅ１２４〜Ｎ１３２および／またはＨ１６４〜Ｐ１７１を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる（即ちシグナルペプチドを欠く）ポリペプチドに結合する。
【００１６】
１つの態様において、本発明はＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）、ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）、ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）、ＴＹＧＶＨ（配列番号５）、ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）およびＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）からなる群から選択される超可変領域（ＨＶＲ）配列少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つおよび／または６つを含む抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００１７】
１つの態様において、本発明は（ａ）配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｃ）配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｄ）配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｆ）配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ３からなる群から選択される超可変領域（ＨＶＲ）配列少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つおよび／または６つを含む抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００１８】
１つの態様において、本発明は（ａ）配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｃ）配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖を含む抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００１９】
１つの態様において、本発明は（ａ）配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｃ）配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖を含む抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００２０】
１つの態様において、本発明は（ａ）（ｉ）配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖、および（ｂ）（ｉ）配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖を含む抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明の抗体は下記配列：ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）を有する軽鎖可変ドメインを含み、そして、下記配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）を有する重鎖可変ドメインを含む。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の抗体はＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）、ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）、およびＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）からなる群から選択されるＨＶＲ配列少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てを含む軽鎖を含む。
【００２３】
１つの実施形態において、抗体はアミノ酸配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）を有する軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１を含む。１つの実施形態において、抗体はアミノ酸配列ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）を有する軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２を含む。１つの実施形態において、抗体はアミノ酸配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）を有する軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明の抗体はＴＹＧＶＨ（配列番号５）、（ｅ）ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）、およびＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てを含む重鎖を含む。
【００２５】
１つの実施形態において、抗体はアミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号５）を有する重鎖ＨＶＲ−Ｈ１を含む。１つの実施形態において、抗体はアミノ酸配列ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）を有する重鎖ＨＶＲ−Ｈ２を含む。１つの実施形態において、抗体はアミノ酸配列ＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）を有する重鎖ＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明の抗体はＴＹＧＶＨ（配列番号５）、（ｅ）ＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号６）、およびＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹ（配列番号７）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てを含む重鎖およびＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳ（配列番号１）、ＹＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号２）；およびＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３）からなる群から選択されるＨＶＲ配列の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てを含む軽鎖を含む。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の抗体は下記配列：ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明の抗体は下記配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）を有する重鎖可変ドメインを含む。
【００２９】
別の態様において、本発明は下記配列：ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）を有する軽鎖可変ドメイン、および下記配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）を有する重鎖可変ドメインを含む抗体と競合する抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は下記配列：ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）を有する軽鎖可変ドメイン、および下記配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）を有する重鎖可変ドメインを含む抗体と同じ（または実質的に同様の）ＦＧＦ１９エピトープに結合する抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体を提供する。
【００３１】
当該分野で知られる通り、そして後に詳述する通り、抗体の超可変領域を明確化するアミノ酸位置／境界は当該分野で知られており、内容および種々の定義により変動する場合がある（後述）。可変ドメイン内の一部の位置は、それらの位置が１つのセットの基準の下に超可変領域内にあると推定されるが、別のセットの基準下では超可変領域外にあると推定される点においてハイブリッド超可変位置とみなしてよい。これらの位置の１つ以上はまた、伸長された超可変領域内に存在することもできる（後に詳述）。
【００３２】
一部の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体である。一部の実施形態においては、抗体はキメラ抗体、親和性成熟化抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選択される。一部の実施形態においては、抗体は抗体フラグメントである。一部の実施形態においては、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖである。
【００３３】
１つの実施形態において、抗体はキメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒトまたはヒト化配列（例えばフレームワークおよび／または定常ドメイン配列）にグラフトした非ヒトドナー由来の抗原結合配列を含む抗体である。１つの実施形態において、非ヒトドナーはマウスである。１つの実施形態において、抗原結合配列は合成によるもの、例えば、突然変異誘発（例えばファージディスプレイスクリーニング等）により得られたものである。１つの実施形態において、本発明のキメラ抗体はネズミＶ領域およびヒトＣ領域を有する。１つの実施形態において、ネズミ軽鎖Ｖ領域はヒトカッパ軽鎖に融合されている。１つの実施形態において、ネズミ重鎖Ｖ領域はヒトＩｇＧ１Ｃ領域に融合されている。
【００３４】
本発明のヒト化抗体はＦＲにおけるアミノ酸置換を有するもの、および、グラフトしたＣＤＲにおける変化を有する親和性成熟変異体を包含する。ＣＤＲまたはＦＲにおける置換されたアミノ酸はドナーまたはレシピエントの抗体内に存在するものに限定されない。他の実施形態において、本発明の抗体は更に増強されたＣＤＲおよび／またはＡＤＣＣ機能およびＢ細胞殺傷を包含する向上したエフェクター機能をもたらすＦｃ領域におけるアミノ酸残基の変化を含む。本発明の他の抗体は安定性を向上させる特定の変化を有するものを包含する。他の実施形態において、本発明の抗体は、低下したエフェクター機能、例えば低下したＣＤＲおよび／またはＡＤＣＣ機能および／または低下したＢ細胞殺傷をもたらすＦｃ領域におけるアミノ酸残基の変化を含む。一部の実施形態においては、本発明の抗体はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のヒト補体因子Ｃ１ｑおよび／またはヒトＦｃ受容体への結合を低減すること（結合の非存在等）により態様づけられる。一部の実施形態においては、本発明の抗体はヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減すること（結合の非存在等）により態様づけられる。一部の実施形態においては、本発明の抗体はＩｇＧクラスのもの（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４）であり、そして、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１および／またはＰ３２９（ナンバリングはＥＵ索引による）における突然変異少なくとも１つを含む。一部の実施形態においては、抗体は突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む。
【００３５】
１つの態様において、本発明は本明細書において提供される抗原結合配列の何れかを含む抗ＦＧＦ１９ポリペプチドを提供し、ここで、抗ＦＧＦ１９ポリペプチドはＦＧＦ１９に特異的に結合する。
【００３６】
１つの態様において本発明は、薬品などの物質にコンジュゲートされた本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体の何れかを含む免疫複合体（immunoconjugate）（互換的に「抗体薬品コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称する）を提供する。
【００３７】
本発明の抗体はＦＧＦ１９に結合し、そして一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９関連の作用の態様、例えば限定しないが、ＦＧＦＲ４の活性化、ＦＧＦＲ４下流分子シグナリング、ＦＧＦ１９へのＦＧＦＲ４の結合の破壊、ＦＧＦＲ４多量体化、ＣＹＰ７α１遺伝子の発現、ＦＧＦＲ４、ＭＡＰＫ、ＦＲＳ２および／またはＥＲＫ２のリン酸化、β−カテニンの活性化、ＦＧＦ１９誘発細胞遊走、ならびに／あるいは何れかの生物学的に関連するＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の生物学的経路の破壊、ならびに／あるいは、腫瘍、細胞増殖性疾患または癌の治療および／または防止、ならびに／あるいは、ＦＧＦ１９の発現および／または活性（例えば増大したＦＧＦ１９の発現および／または活性）に関連する疾患の治療または防止の１つ以上を調節してよい。一部の実施形態においては、本発明の抗体はＦＧＦ１９に特異的に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＦＧＦ１９のＦＧＦＲ４結合領域に特異的に結合する、一部の実施形態においては、抗体は約２０ｐＭ以上のＫｄで、ＦＧＦ１９に特異的に結合する。一部の実施形態においては、抗体は約４０ｎＭ以上のＫｄで、ＦＧＦ１９に特異的に結合する。一部の実施形態においては、本発明の抗体はインビボおよび／またはインビトロでＦＧＦ１９の活性を低減、抑制および／またはブロックする。一部の実施形態においては、抗体は約２０ｐＭ以上のＫｄで、ＦＧＦ１９に特異的に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＦＧＲＦ４との結合に関して競合する（ＦＧＦ１９へのＦＧＦＲ４の結合を低減および／またはブロックする）。
【００３８】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ１９に曝露された細胞においてＣＹＰ７α１遺伝子の発現のＦＧＦ１９誘導リプレッションを抑制、低減および／またはブロックする単離された抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００３９】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ１９に曝露された細胞においてＦＧＦＲ４、ＭＡＰＫ、ＦＲＳ２および／またはＥＲＫ２のＦＧＦ１９誘導リン酸化を抑制、低減および／またはブロックする単離された抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。
【００４０】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ１９誘発細胞遊走を抑制、低減および／またはブロックする単離された抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。一部の実施形態においては、細胞は腫瘍細胞である。一部の実施形態においては、細胞は腫瘍細胞である。一部の実施形態においては、細胞はＨＣＴ１１６細胞である。
【００４１】
１つの態様において、本発明は細胞におけるＷｎｔ経路活性化を抑制、低減および／またはブロックする単離された抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ経路活性化はβ−カテニンの免疫反応性、β−カテニンのチロシンリン酸化、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現、β−カテニン突然変異およびβ−カテニンへのＥ−カドヘリンの結合の１つ以上を含む。Ｗｎｔ経路の活性化の検出は当該分野で知られており、そして一部の例は本明細書に記載および例示する通りである。
【００４２】
１つの態様において、本発明は本発明の抗体１つ以上および担体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、担体は製薬上許容しうるものである。
【００４３】
１つの態様において、本発明は本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体１つ以上および担体を含む組成物を供給する。この組成物は更に第２の医薬を含んでよく、その場合、抗体が第１の医薬となる。例えば癌の治療のためのこの第２の医薬は、別の抗体、化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、抗嘔吐癌ワクチン、鎮痛剤、抗血管剤、または成長抑制剤であってよい。別の実施形態においては、第２の医薬を有効量において対象に投与し、この場合、抗体が第１の医薬となる。この第２の医薬は１つより多い医薬であり、そして好ましくは別の抗体、化学療法剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、抗嘔吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、抗血管剤、または成長抑制剤である。より特定される薬剤は、例えばイリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、ＥＦＧ受容体アンタゴニスト、例えばエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えばベバシツマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ｍＴｏｒ（セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ）の阻害剤、例えばラパマイシンおよびＣＣＩ−７７９、および抗ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢおよび／またはＥＧＦＲアンタゴニスト、例えばトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭ）またはラパチニブおよび他の細胞毒性剤、例えば化学療法剤を包含する。一部の実施形態においては、第２の医薬は抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン、フルベストラント、またはアロマターゼ阻害剤、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する、またはＥｒｂＢまたはＥｆｂ受容体またはＨｅｒ−１またはＨｅｒ−２に対するアンタゴニストである。一部の実施形態においては、第２の医薬はタモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、イリノテカン、セツキシマブ、フルベストラント、ビノレルビン、エルロチニブ、ベバシツマブ、ビンクリスチン、イマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブまたはトラスツズマブであり、そして好ましくは第２の医薬はエルロチニブ、ベバシツマブまたはトラスツズマブである。
【００４４】
１つの態様において、本発明は本発明の抗ＦＧＦ１９抗体に特異的に結合する抗イディオタイプの抗体を提供する。
【００４５】
１つの態様において、本発明は本発明の抗ＦＧＦ１９抗体をコードする核酸を提供する。
【００４６】
１つの態様において、本発明は本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００４７】
１つの態様において、本発明は本発明の核酸１個以上および担体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、担体は製薬上許容しうるものである
１つの態様において、本発明は本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは任意の型のもの、例えば、発現ベクターなどの組み換えベクターであることができる。宿主細胞の種々のものの何れかを使用できる。１つの実施形態において、宿主細胞は原核生物の細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉである。１つの実施形態において、宿主細胞は真核生物の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞である。
【００４８】
１つの態様において、本発明は本発明の抗体の製造方法を提供する。例えば、本発明は抗ＦＧＦ１９抗体（これは本明細書において定義する場合、完全長およびそのフラグメントを包含する）の製造方法を提供し、該方法は該抗体をコードする本発明の組み換えベクターを適当な宿主細胞内で発現させること、および該抗体を回収することを含む。
【００４９】
１つの態様において、本発明は容器、および容器内に含有された組成物を含む製造物品を提供し、組成物は本発明の抗ＦＧＦ１９抗体１つ以上を含む。１つの実施形態において組成物は本発明の核酸を含む。１つの実施形態において、抗体を含む組成物は更に、担体を含み、これは一部の実施形態においては製薬上許容される。１つの実施形態において、本発明の製造物品は個体に組成物（例えば抗体）を投与するための説明書（例えば本明細書に記載した方法の何れかに関する説明書）を更に含む。
【００５０】
１つの態様において、本発明は本発明の抗ＦＧＦ１９抗体１つ以上を含む組成物を含む第１の容器、および緩衝液を含む第２の容器を含むキットを提供する。１つの実施形態において緩衝液は製薬上許容される。１つの実施形態において、抗体を含む組成物は更に、担体を含み、これは一部の実施形態においては製薬上許容される。１つの実施形態においては、キットは更に個体に組成物（例えば抗体）を投与するための説明書を含む。
【００５１】
１つの態様において、本発明は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患などの疾患の施療的および／または予防的治療のための医薬の製造における本発明の抗ＦＧＦ１９抗体の使用を提供する。一部の実施形態においては、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、肺癌、乳癌および膵臓癌である。一部の実施形態においては、疾患は肝疾患、例えば肝硬変である。一部の実施形態においては、疾患はるいそう疾患である。
【００５２】
１つの態様において、本発明は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患などの疾患の施療的および／または予防的治療のための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。一部の実施形態においては、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、肺癌、乳癌および膵臓癌である。一部の実施形態においては、疾患は肝疾患、例えば肝硬変である。一部の実施形態においては、疾患はるいそう疾患である。
【００５３】
１つの態様において、本発明は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患などの疾患の施療的および／または予防的治療のための医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。一部の実施形態においては、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、肺癌、乳癌および膵臓癌である。一部の実施形態においては、疾患は肝疾患、例えば肝硬変である。一部の実施形態においては、疾患はるいそう疾患である。
【００５４】
１つの態様において、本発明は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患などの疾患の施療的および／または予防的治療のための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。一部の実施形態においては、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、肺癌、乳癌および膵臓癌である。一部の実施形態においては、疾患は肝疾患、例えば肝硬変である。一部の実施形態においては、疾患はるいそう疾患である。
【００５５】
１つの態様において、本発明は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患などの疾患の施療的および／または予防的治療のための医薬の製造における本発明の製造物品の使用を提供する。一部の実施形態においては、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、肺癌、乳癌および膵臓癌である。一部の実施形態においては、疾患は肝疾患、例えば肝硬変である。一部の実施形態においては、疾患はるいそう疾患である。
【００５６】
１つの態様において、本発明は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患などの疾患の施療的および／または予防的治療のための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。一部の実施形態においては、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、肺癌、乳癌および膵臓癌である。一部の実施形態においては、疾患は肝疾患、例えば肝硬変である。一部の実施形態においては、疾患はるいそう疾患である。
【００５７】
本発明はＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現および／または活性、例えば増大した発現および／または活性、あるいは、望ましくない発現および／または活性に関連する病状を調節するために有用な方法および組成物を提供し、該方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効用量を投与することを含む。
【００５８】
１つの態様において、本発明は細胞（例えば癌または腫瘍の細胞）を殺傷するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。
【００５９】
１つの態様において、本発明は腫瘍または癌の生育を低減、抑制、ブロックまたは防止するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。
【００６０】
本発明の方法は、任意の適当な病理学的状態に対して影響するために使用できる。例示される疾患は本明細書に記載する通りであり、そして食道癌、膀胱癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳線維腺腫、前立腺癌、頭部および頚部の扁平上皮細胞癌、軟組織肉腫、星状細胞腫、下垂体癌、乳癌、神経芽腫、黒色腫、乳房癌腫、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、上皮癌腫、脳癌、子宮内膜癌、精巣癌、胆管癌、胆嚢癌および肝細胞癌を包含する。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明の方法において標的にされる細胞は癌細胞である。例えば癌細胞は乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭状癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、食道癌細胞、骨原性肉腫細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭部頚部扁平上皮癌細胞、黒色腫細胞、白血病細胞、脳癌細胞、子宮内膜癌細胞、精巣癌細胞、胆管癌、胆嚢癌、肺癌細胞および／または前立腺癌細胞からなる群から選択される１つであることができる。１つの実施形態において、本発明の方法において標的にされる細胞は増殖亢進性および／または過形成の細胞である。１つの実施形態において、本発明の方法において標的にされる細胞は形成不全性の細胞である。更に別の実施形態においては、本発明の方法において標的にされる細胞は転移細胞である。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、標的にされる細胞は肝硬変性の肝細胞である。
【００６３】
本発明の方法は更に追加的な治療工程を含むことができる。例えば、１つの実施形態において、方法は更に、標的にされた細胞および／または組織（例えば癌細胞）を照射治療または化学療法剤に曝露する工程を含む。
【００６４】
任意の適当な抗ＦＧＦ１９抗体を疾患の治療および／または防止を行う方法のために使用してよく、例えばモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、および／または、抗体フラグメントが包含される。一部の実施形態においては、抗ＦＧＦ１９抗体は本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体の何れかである。
【００６５】
別の態様において、本発明は本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体の何れかとＦＧＦ１９の複合体を提供する。一部の実施形態においては、複合体はインビボまたはインビトロのものである。一部の実施形態においては、抗ＦＧＦ１９抗体は検出可能に標識される。
【００６６】
別の態様において、本発明はＦＧＦ１９の検出のための方法を提供し、方法は試料中のＦＧＦ１９−抗ＦＧＦ１９抗体複合体を検出することを含む。「検出」という用語は本明細書においては、対照との比較対象を伴うか伴わない定性的および／または定量的な検出（計測レベル）を包含する。
【００６７】
別の態様において、本発明はＦＧＦ１９の発現および／または活性に関連する疾患を検出するための方法を提供し、方法は個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦ１９を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、疾患は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍のものである。
【００６８】
別の態様において、本発明はＦＧＦＲ４の発現および／または活性に関連する疾患を診断するための方法を提供し、方法は個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦＲ４を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、疾患は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍のものである。
【００６９】
別の実施形態において、本発明はＦＧＦＲ４およびＦＧＦ１９の発現および／または活性に関連する疾患を診断するための方法を提供し、方法は個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦＲ４およびＦＧＦ１９を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、疾患は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍のものである。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を第１の生物学的試料中において検出し、そしてＦＧＦ１９の発現を第２の生物学的試料中において検出する。
【００７０】
別の態様において、本発明は個体に対する治療を選択するための方法を提供し、方法は（ａ）個体の生物学的試料中にＦＧＦ１９の発現がある場合はそれを検出すること、および（ｂ）工程（ａ）の後に、個体に対する治療を選択すること、ここで治療の選択は工程（ａ）で検出されたＦＧＦ１９発現に基づくこと、を含む。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現を検出し、そして、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療を選択する。一部の実施形態においては、個体は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌を有する。
【００７１】
別の態様において、本発明は個体に対する治療を選択するための方法を提供し、方法は（ａ）個体の生物学的試料中にＦＧＦＲ４の発現がある場合はそれを検出すること；および（ｂ）工程（ａ）の後に、個体に対する治療を選択すること、ここで治療の選択は工程（ａ）で検出されたＦＧＦＲ４発現に基づくこと、を含む。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦＲ４発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦＲ４発現を検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を検出し、そして、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療を選択する。一部の実施形態においては、個体は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌を有する。
【００７２】
別の態様において、本発明は個体に対する治療を選択するための方法を提供し、方法は（ａ）個体の生物学的試料中にＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現がある場合はそれを検出すること、および（ｂ）工程（ａ）の後に、個体に対する治療を選択すること、ここで治療の選択は工程（ａ）で検出されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現に基づくこと、を含む。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦＲ４発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦＲ４発現を検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現を検出し、そして、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療を選択する。一部の実施形態においては、第１の生物学的試料においてＦＧＦＲ４の発現を検出し、そして、第２の生物学的試料においてＦＧＦ１９の発現を検出する。一部の実施形態においては、個体は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌を有する。
【００７３】
別の態様において、本発明は抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することにより癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患または肝臓疾患（例えば肝硬変）を有するか、有することが疑われる個体を治療するための方法を提供し、更にここで、ＦＧＦ１９の発現および／またはＦＧＦＲ４の発現は、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後において個体の生物学的試料中で検出される。一部の実施形態においては、生物学的試料は癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患のものである。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清である。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の過剰発現を、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に検出する。発現は抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、最中、後、前および最中、前および後、最中および後、あるいは前、最中および後に検出してよい。
【００７４】
別の態様において、本発明は抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することにより癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患または肝臓疾患（例えば肝硬変）を有するか、有することが疑われる個体を治療するための方法を提供し、ここで癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患または肝臓疾患の生物学的試料はＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４を発現する。
【００７５】
検出を行う実施形態においては、ＦＧＦＲ４下流分子シグナリングの発現はＦＧＦＲ４の発現の検出に追加して、またはその代替として検出してよい。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４下流分子シグナリングの検出はＭＡＰＫ，ＦＲＳ２またはＥＲＫ２のリン酸化の検出１つ以上を含む。
【００７６】
検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現はＦＧＦＲ４遺伝子の欠失、遺伝子の増幅および／または遺伝子の突然変異の検出を含む。検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現はＦＧＦ１９遺伝子の欠失、遺伝子の増幅および／または遺伝子の突然変異の検出を含む。
【００７７】
検出を行う一部の実施形態は更に、Ｗｎｔ経路の活性化の検出を含む。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ経路の活性化の検出はβ−カテニンのチロシンリン酸化、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現、β−カテニン突然変異およびβ−カテニンへのＥ−カドヘリンの結合の１つ以上を含む。Ｗｎｔ経路の活性化の検出は当該分野で知られており、そして一部の例は本明細書に記載および例示する通りである。
【００７８】
一部の実施形態においては、治療は、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、下垂体癌、膵臓癌、乳線維腺腫、前立腺癌、頭部および頚部の扁平上皮細胞癌、軟組織肉腫、乳癌、神経芽腫、黒色腫、乳房癌腫、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、上皮癌腫、脳癌、子宮内膜癌、精巣癌、胆管癌、胆嚢癌および肝細胞癌からなる群から選択される癌に対するものである。
【００７９】
生物学的試料は例えば生物学的試料の定義において本明細書に記載する通りである。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍である。
【００８０】
ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の検出を行う実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリヌクレオチド発現ならびに／あるいはＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現を検出してよい。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を検出する。他の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現を抗ＦＧＦ１９剤および／または抗ＦＧＦＲ４剤を用いて検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現は抗体を用いて検出する。任意の適当な抗体を検出および／または診断のために使用してよく、例えばモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、および／または、抗体フラグメントが包含される。一部の実施形態においては、本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体を検出のために使用する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現は免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現はＩＨＣを用いた場合に２以上の評点となる。
【００８１】
ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の存在および／または非存在および／またはレベルを検出してよい。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現は増大してよい。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の非存在は有意でないものまたは最小限のレベルを包含する。一部の実施形態においては、被験生物学的試料中のＦＧＦ１９の発現は対照の生物学的試料について観察されるもの（または対照またはレファレンスの発現レベル）より高値である。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は対照生物学的試料中よりも被験生物学的試料中において少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍高値であるか、それよりも高値である。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９のポリペプチド発現は染色強度に関して少なくとも２以上の評点とされる免疫組織化学（ＩＨＣ）試験において測定される。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９ポリペプチド発現は染色強度に関して少なくとも１以上、または少なくとも３以上に評点されるＩＨＣ試験において測定される。一部の実施形態においては、被験生物学的試料中のＦＧＦ１９の発現は対照の生物学的試料について観察されるもの（または対照の発現レベル）より低値である。
【００８２】
１つの態様において、本発明は以下のポリヌクレオチド配列：ＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ（配列番号４１）；ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＧ（配列番号４２）；ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ（配列番号４３）；およびＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＴＣＧＧＧ（配列番号４４）の１つ以上を含むか、これからなるか、または本質的にこれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
（発明の詳細な説明）
本発明は本明細書において例えばＦＧＦ１９の発現および／または活性、例えば増大した発現および／または活性ならびに望ましくない発現および／または活性に関連する病状の治療または防止のために有用な抗ＦＧＦ１９抗体を提供する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を治療するために使用される。
【００８４】
別の態様において、本発明の抗ＦＧＦ１９抗体は種々の組織および細胞の型におけるＦＧＦ１９の検出などの、ＦＧＦ１９の検出および／または単離のための試薬として有用性を有する。
【００８５】
本発明は更に、抗ＦＧＦ１９抗体、抗ＦＧＦ１９抗体をコードするポリヌクレオチド、および、抗ＦＧＦ１９抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を作成する方法を提供する。
【００８６】
別の態様において、本発明はＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の検出を含む方法を提供する。
【００８７】
全般的手法
本明細書に記載または参照した手法および操作法は一般的に、当業者により、十分理解されており、そして従来の方法論、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編（２００３））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，およびＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））に記載の方法論を用いて共通して使用されている。
【００８８】
定義
「単離された」抗体とは、その天然の環境の成分から識別され、そして分離および／または回収されたものである。その天然の環境の夾雑物成分は抗体の診断または治療上の使用に干渉する可能性があり、そして、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を包含する。好ましい実施形態においては抗体の精製は（１）Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に抗体９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケンサーの使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質となるまで行う。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分も存在しなくなるため、組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。しかしながら通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により製造する。
【００８９】
「単離された」核酸分子は自身が通常抗体核酸の天然の原料中で会合している夾雑核酸分子少なくとも１つから識別され、分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は自身が天然に存在する形態または周囲状況にはないものである。従って、単離された核酸分子はそれが天然の細胞中に存在する状態の核酸分子からは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体位置にある抗体を通常発現する細胞内に含有される核酸分子を包含する。
【００９０】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置ナンバリング」という用語およびその変形例は、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに関して使用されているナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを用いれば、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短鎖化またはそれの内部への挿入に相当する過少な、または付加的なアミノ酸を含有してよい。例えば、重鎖可変ドメインはＨ２の残基５２の後に単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ等）を含んでよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所定の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより決定してよい。
【００９１】
「実質的に同様」または「実質的に同じ」という用語は、本明細書においては、２つの数値（一般的には、１つは本発明の抗体に関わるものであり、もう１つは参照物／比較物の抗体に関わるもの）の間の差が、その数値（例えばＫｄ値）が尺度となる生物学的態様の観点内で、殆どまたは全く生物学的および／または統計学的に有意でないと当業者が考えるほど十分高い程度の２つの数値間の同様性を指す。このような２つの数値の差は好ましくは、参照物／比較物抗体の数値の関数として、約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【００９２】
「結合親和性」とは一般的に分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば抗原）との間の非共有結合性の相互作用の合計の強度を指す。特段の記載が無い限り本明細書においては、「結合親和性」とは結合対（例えば抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映している内因性の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は本明細書に記載するものなどの当該分野で知られた一般的な方法により測定できる。低親和性抗体は一般的に緩徐に抗原に結合し、そして容易に解離する傾向にあるのに対し、高親和性抗体は一般的に急速に抗原に結合し、より長時間結合状態で残存する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該分野で知られており、その何れも本発明の目的のために使用できる。特定の例示される実施形態は後に記載する。
【００９３】
１つの実施形態において、本発明における「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」とは、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する後述の試験により説明される通り、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて、未標識の抗原の段階力価物の存在下（１２５Ｉ）標識抗原の最小濃度でＦａｂを平衡化させ、次に、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合抗原をキャプチャーすることにより測定する（Ｃｈｅｎ等（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。試験の条件を確立するために、マイクロプレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中キャプチャー用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５ｕｇ／ｍｌで一夜コーティングし、そしてその後、室温で２〜５時間（約２３℃）ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングした。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えばＰｒｅｓｔａ等、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の試験と合致）。次に目的のＦａｂを一夜インキュベートするが、インキュベートは確実に平衡が達成されるようにより長時間（例えば６５時間）継続してよい。その後、混合物を室温インキュベーション（例えば１時間）のためにキャプチャープレートに移す。次に溶液を取り出し、プレートをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０ｕｌ／ウェルを添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を競合的結合試験で使用するために選択する。別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すれば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。動態の測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃、流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は会合および解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離���数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．等（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照できる。上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌赤色キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大または低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【００９４】
本発明による「ｏｎ速度」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」はまた〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた上記表面プラズモン共鳴試験により測定する。慨すれば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は会合および解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のロングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．等（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照できる。しかしながら上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定した場合の抗原の漸増濃度の存在下ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大または低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。
【００９５】
「ベクター」という用語は本明細書においては、自身が連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは更に別のＤＮＡセグメントが連結されていてよい環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウィルスベクターであり、その場合更に別のＤＮＡセグメントがウィルスゲノム内に連結されていてよい。特定のベクターは自身が導入されている宿主細胞内において自己複製することができる（例えば複製の細菌起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞内への導入により宿主細胞のゲノム内に組み込まれることができ、これにより宿主細胞ゲノムとともに複製される。更にまた特定のベクターは自身が作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向することができる。このようなベクターは本明細書においては、「組み換え発現ベクター」（または単に「組み換えベクター」）と称する。一般的に、組み換えＤＮＡ手法において利用される発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であるため、互換的に使用してよい。
【００９６】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、本明細書においては、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ヌクレオチドはデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および／または、その類縁体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応により重合体に取り込まれることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびその類縁体を含んでよい。存在する場合は、ヌクレオチド構造に対する修飾は重合体の組み立ての前または後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは合成後に更に例えば標識とのコンジュゲーションにより修飾されてよい。他の型の修飾は、例えば天然に存在するヌクレオチド１つ以上の類縁体による「キャップ」置換、ヌクレオチド間修飾、例えば未荷電連結による（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カーバメート等）、および、荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるもの、懸垂部分を含有するもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）、インターカレーターを有するもの（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート形成剤を含有するもの（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの（例えばアルファ芳香族核酸等）、ならびに、未修飾形態のポリヌクレオチドを包含する。更にまた、糖に通常存在するヒドロキシル基の何れかは、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられているか、標準的な保護基により保護されているか、または、別のヌクレオチドへの追加的連結部を作成するために活性化されていてよく、あるいは、固体または半固体の支持体にコンジュゲートされていてよい。５’および３’末端のＯＨはリン酸化されるか、または、アミンまたは炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分により置換されていることができる。他のヒドロキシルはまた標準的保護基に誘導体化されていてよい。ポリヌクレオチドはまた当該分野で一般的に知られたリボースまたはデオキシリボース糖の類縁体形態、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類縁体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類縁体および非塩基性類縁体、例えばメチルリボシドを含有してよい。１つ以上のホスホジエステル連結部が別の連結基により置き換えられていてよい。これらの代替的連結基は、例えばホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（ホルムアセタール）で置き換えられている実施形態を包含し、ここで各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは場合によりエーテル（−Ｏ−）結合を含有する置換または未置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキルである。ポリヌクレオチド中の全連結部が同一である必要はない。前記はＲＮＡおよびＤＮＡを包含する本明細書に記載する全てのポリヌクレオチドに適用する。
【００９７】
「オリゴヌクレオチド」とは本明細書においては、必然ではないが一般的に約２００ヌクレオチド長未満の短鎖の一般的には１本鎖の一般的には合成されたポリヌクレオチドを一般的に指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関して上記したものは等しく、そして完全にオリゴヌクレオチドに適用できる。
【００９８】
「ＦＧＦ１９（互換的に「線維芽細胞成長因子１９」とも称する）」という用語は本明細書においては、特段または文脈上で別途記載が無い限り、何れかの未変性または変異体（未変性または合成）のＦＧＦ１９ポリペプチドを指すものとする。「未変性配列」という用語は特に、天然に存在する切断型、または分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異体の型（例えばオルタナティブスプライシング型）および天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。「野生型ＦＧＦ１９」という用語は一般的に天然に存在するＦＧＦ１９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦ１９配列」という用語は一般的に天然に存在するＦＧＦ１９中に存在するアミノ酸配列を指す。
【００９９】
「ＦＧＦＲ４」という用語（互換的に「線維芽細胞成長因子受容体４」とも称する）は、本明細書においては、特段または内容上の別様の記載が無い限り、未変性または変異体（未変性または合成に関わらず）のＦＧＦＲ４ポリペプチドを指す。「未変性配列」という用語は特に、天然に存在する切断された、または分泌された形態（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異体形態（例えばオルタナティブスプライシング形態）および天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。「野生型ＦＧＦＲ４」という用語は天然に存在するＦＧＦＲ４タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ４配列」という用語は一般的に天然に存在するＦＧＦＲ４中に存在するアミノ酸配列を指す。
【０１００】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は最も広範な意味において互換的に使用され、そしてモノクローナル抗体（例えば完全長または未損傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限りにおいて二重特異性抗体）を包含し、そして特定の抗体フラグメント（本明細書においてより詳述する）も包含してよい。抗体はヒト、ヒト化および／または親和性成熟のものであることができる。
【０１０１】
「可変」という用語は可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列において広範に異なっている事実を指し、そして各々の特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に渡って均一に分布しているわけではない。それは共に軽鎖および重鎖の可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される３セグメント内に濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と称される。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、βシート構造を連結し、そして一部の場合にはその部分を形成するループを形成する３ＣＤＲにより連結されたβシート配置を概ね採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により、そして他の鎖に由来するＣＤＲと共に、近接して保持されており、抗体の抗原結合の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合には直接関与していないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性における抗体の関わりを示す。
【０１０２】
抗体のパパイン消化は各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントおよび容易に結晶化する自身の能力を反映した名前を有する残余の「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は２つの抗原複合部位を有し、なお抗原に交差結合できるＦ（ａｂ’）２フラグメントをもたらす。
【０１０３】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。２本鎖Ｆｖ種においては、この領域は堅固な非共有結合の会合における１重鎖および２軽鎖可変ドメインの２量体からなる。１本鎖Ｆｖ種においては、軽鎖および重鎖が２本差Ｆｖ種のものと類似の「２量体」構造において会合できるように、フレキシブルなペプチドリンカーにより共有結合されることができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この配置においてである。併せて考えると、６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に付与している。しかしながら、たとえ単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な僅か３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）であっても、完全な結合部位よりは低い親和性においてであるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１０４】
Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域由来のシステイン１つ以上を包含する重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数残基の付加によりＦａｂフラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ’に関する本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは当初はそれらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として作成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【０１０５】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」はその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される２つの明確に異なる型の一方に割りつけられる。
【０１０６】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割りつけられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてこれらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割できる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γおよびμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元の配置はよく知られている。
【０１０７】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分のみを含み、その部分は好ましくは未損傷の抗体中に存在する場合にその部分に通常関わる機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分または全てを保持している。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体；１本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体を包含する。１つの実施形態において、抗体フラグメントは未損傷の抗体の抗原結合部位を含み、そしてこれにより、抗原に結合する能力を保持している。別の実施形態においては、抗体フラグメント、例えばＦｃ領域を含むものは、未損傷の抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常関わる生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期モジュレーション、ＡＤＣＣ機能および補体結合等の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、抗体フラグメントは未損傷の抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する１価の抗体である。例えばそのような抗体フラグメントはフラグメントにインビボ安定性を付与することができるＦｃ配列に連結した結合アームを抗原上に含んでよい。
【０１０８】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」という用語は、本明細書においては、配列内で超可変であり、および／または、構造的に定義されたループを形成する抗体可変止めの領域を指す。一般的に、抗体は６つの超可変領域；３つをＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内に、そして３つをＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内に含む。多くの超可変領域の定義が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づいており、そして、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭの超可変領域はＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の折衷を示し、そしてＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアにより使用されている。「接触」超可変領域は使用可能な複合体結晶構造の分析に基づいている。
【０１０９】
超可変領域は以下の通り、即ち：ＶＬ内の２４−３６（Ｌ１）、４６−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、およびＶＨ内の２６−３５（Ｈ１）、４９−６５または５０−６５（Ｈ２）および９３−１０２（Ｈ３）の「伸長超可変領域」を含んでよい。可変ドメイン残基はこれらの定義の各々につき上記Ｋａｂａｔ等の定義に従ってナンバリングされている。
【０１１０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１１１】
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（レシピエント抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである（レシピエント抗体）。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。更にまた、ヒト化抗体はレシピエント抗体内にもドナー抗体内にも存在しない残基を含んでよい。このような修飾は抗体の性能を更に精鋭化させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は場合により、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むことになる。詳細についてはＪｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照できる。更にまた以下の文献：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；ＩＩａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）およびそこに引用されている参考文献を参照できる。
【０１１２】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は特定の種から誘導した、または、特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖の一部分を有し、鎖の残余は、別の種から誘導した、または、別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体のフラグメントにおける相当する配列と、それらが所望の生物学的活性を示す限り、同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において使用するヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
【０１１３】
「１本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般的にｓｃＦｖポリペプチドは更にｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することができるようにするＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖに関する考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照できる。
【０１１４】
「抗原」とは抗体が選択的に結合する所定の抗原である。標的抗原はポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然に存在するまたは合成の化合物であってよい。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。
【０１１５】
「ダイアボディー」という用語は２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２ドメインの間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインはもう一方の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を生じさせる。ダイアボディーは例えばＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に説明されている。
【０１１６】
「ヒト抗体」はヒトにより生産される抗体に相当する、および／または、本明細書に開示するヒト抗体を製造するための手法の何れかを用いて作成されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１１７】
「親和性成熟」抗体は、１つ以上の改変をそのＣＤＲ１つ以上内に有するものであり、これによりそのような改変を保有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性が向上しているものである。好ましい親和性成熟抗体は標的抗原に対してナノモル、あるいは更にピコモルレベルの親和性を有することになる。親和性成熟抗体は当該分野で知られた操作法により製造される。Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）はＶＨおよびＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はＢａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）により記載されている。
【０１１８】
抗体の「エフェクター機能」とは抗体のＦｃ領域（未変性配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰属する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例はＣ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞の活性化を包含する。
【０１１９】
「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」即ち「ＡＤＣＣ」とは、特定の細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合している分泌Ｉｇにより、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、そしてその後、細胞毒素により標的細胞を殺傷することができるようになるという細胞毒性の形態を指す。抗体は細胞毒性細胞を「武装」させ、そしてそのような殺傷のために絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現はＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に総括されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を試験するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号に記載されているようなインビトロのＡＤＣＣ試験を実施してよい。このような試験のための有用なエフェクター細胞は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。あるいは、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は例えばＣｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいてインビボで試験してよい。
【０１２０】
「ヒトエフェクター細胞」とは１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を示す白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣ機能を示す。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞および好中球を包含し；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は未変性の原料から、例えば血液から単離してよい。
【０１２１】
「Ｆｃ受容体」即ち「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するものである。好ましいＦｃＲは未変性配列のヒトＦｃＲである。更にまた、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体を包含し、これらの受容体の対立遺伝子変異体およびオルタナティブスプライス型も包含される。ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）を包含し、これらはその細胞質ドメインにおいて主に異なっている同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有している（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）の考察Ｍ参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ等、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において考察されている。将来識別されるものを含む他のＦｃＲは本明細書においては用語「ＦｃＲ」に包含される。用語はまた胎児への母体ＩｇＧの移行の原因となり（Ｇｕｙｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、そして免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児受容体、ＦｃＲｎも包含する。
【０１２２】
ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は向上した、または低下したＦｃＲへの結合を有する抗体変異体を記載している。その特許公開の内容は参照により本明細書に組み込まれる。更にまた、Ｓｈｉｅｌｄｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照できる。
【０１２３】
ＦｃＲｎへの結合を計測する方法は知られている（例えばＧｈｅｔｉｅ  １９９７，Ｈｉｎｔｏｎ  ２００４参照）。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清中半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスまたはトランスフェクトされたヒト細胞系統において、またはＦｃ変異体ポリペプチドを投与された霊長類において試験できる。
【０１２４】
「補体依存性細胞毒性」即ち「ＣＤＣ」は補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化はその同属体抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を試験するためには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているものなどのＣＤＣ試験を実施してよい。
【０１２５】
改変されたＦｃ領域アミノ酸配列および増大または低減されたＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異体は米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号およびＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公開の内容は特に参照により本明細書に組み込まれる。更にまた、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照できる。
【０１２６】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体はそれが結合する抗原の生物学的活性を抑制または低減するものである。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を実質的または完全に抑制する。
【０１２７】
「生物学的試料」（互換的に「試料」または「組織または細胞の試料」とも称する）は個体から得られた種々の試料の型を包含し、そして、診断またはモニタリング試験において使用できる。定義は血液および生物学的起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本または組織培養物あるいはそれから誘導された細胞、および、その子孫を包含する。定義はまた、例えば試薬処理、可溶化あるいはタンパク質またはポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮、あるいは、切片作成目的のための半固体または固体のマトリックス中への包埋により前処理した後に、任意の方法において操作されている試料を包含する。「生物学的試料」という用語は臨床試料を包含し、そして、培養物中の細胞、細胞上澄み、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体および組織試料も包含する。生物学的試料の原料は新鮮、凍結および／または保存された臓器または組織試料または生検または吸引物に由来するものなどの固体組織；血液またはいずれかの血液成分；体液、例えば脳脊髄液、羊水、末梢体液または間質性体液；妊娠または対象発生の何れかの時期に由来する細胞であってよい。一部の実施形態においては、生物学的試料は原発または転移の腫瘍から得られる。生物学的試料は例えば保存料、抗凝固剤、緩衝液、固定剤、栄養物、抗生物質等、通常は天然には組織と相互に混合されていない化合物を含有してよい。
【０１２８】
本明細書の目的のためには、組織試料の「切片」とは組織試料の単一の部分または小片、例えば組織の薄片または組織試料から切り出した細胞を意味する。組織試料の多数の切片を採取し、そして本発明に従って分析に付してよいと理解される。一部の実施形態においては、組織試料の同じ切片を形態学的および分子レベルの両方において分析するか、あるいは、タンパク質および核酸の両方に関して分析する。
【０１２９】
「標識」という用語は本明細書においては、核酸プローブまたは抗体などの試薬に直接または間接的にコンジュゲートまたは融合され、そしてそれがコンジュゲートまたは融合した試薬の検出を容易にする化合物または組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であってよく（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変を触媒してよい。
【０１３０】
「医薬」とは問題となる疾患またはその症状または副作用を治療するための活性な薬品である。
【０１３１】
「疾患」または「疾病」とは本発明の物質／分子または方法による治療から利益を被る何れかの状態である。これには問題となる疾患に哺乳類を罹患し易くしている病理学的状態を包含する慢性および急性の疾患または疾病が包含される。本明細書において治療されるべき疾患の非限定的な例は、悪性または良性の腫瘍；癌腫、芽腫および肉腫を包含する。
【０１３２】
「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」という用語はある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を指す。１つの実施形態において、細胞増殖性疾患は癌である。
【０１３３】
「腫瘍」とは、本明細書においては、悪性または良性に関わらず全ての腫瘍性の細胞の成育および全ての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」および「腫瘍」は本明細書において言及する限り相互に排除されない。
【０１３４】
「癌」および「癌性」という用語は典型的には調節できない細胞の成育／増殖を態様とする哺乳類における生理学的状態を指すか描写するものである。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病を包含する。このような癌のより特定の例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、下垂体癌、食道癌、星状細胞癌、軟組織肉腫、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫瘍、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、脳の癌、子宮内膜癌、精巣癌、胆管癌、胆嚢癌及、胃癌、黒色腫および種々の型の頭部および頚部の癌を包含する。血管形成の調節不全は本発明の組成物および方法により治療できる多くの疾患をもたらす場合がある。これらの疾患は非腫瘍性および腫瘍性の状態の両方を包含する。腫瘍は例えば上記したものを包含する。非腫瘍性の疾患は例えば望ましくない、または、異常な肥大、関節炎、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性プラーク、糖尿病性および他の増殖性の網膜症、例えば未熟児網膜症、水晶体後腺維増殖症、血管新生緑内障、加齢関連黄斑変性、糖尿病性斑状浮腫、角膜血管新生、角膜グラフト血管新生、角膜グラフト拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、角の血管新生（皮膚紅潮）、眼の血管新生性疾病、血管再狭窄、動脈静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管腺維腫、甲状腺肥大（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺傷害／ＡＲＤＳ、敗血症、一次肺高血圧症、悪性肺滲出、脳水腫（例えば急性卒中／閉鎖性頭部傷害／外傷に関連）、滑膜炎症、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣症、子宮内膜炎、体液サードスペース形成疾病（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾病）、子宮線維症、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病および潰瘍性結腸炎）、腎臓同種移植片拒絶、炎症性腸疾病、ネフローゼ症候群、望ましくない、または、異常な組織嵩増大（非癌）、血友病性関節、肥大瘢痕、毛髪増殖抑制、オースラー‐ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖、硬皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心内膜液浸出（例えば心内膜炎に関連するもの）および胸水を包含する。
【０１３５】
「るいそう」疾患（例えばるいそう症候群、悪液質、肉質欠乏症）という用語は望ましくないおよび／または非健康的な、体重の損失または体細胞集塊の損失により誘発される疾患を指す。高齢者ならびにエイズおよび癌患者においては、るいそう疾病は脂肪および無脂肪コンパートメントの両方を包含する望ましくない体重損失をもたらす場合がある。るいそう疾病は不十分な摂食、および／または、病気および／または加齢過程に関連する代謝の変化の結果である場合がある。癌患者およびエイズ患者、ならびに広範な手術の後、または、慢性の感染症、免疫疾病、甲状腺機能亢進症、クローン病、心因性疾病、慢性の心不全または他の重度の外傷を有する患者はるいそう疾病に罹患する頻度が高く、これは場合により悪液質、即ち代謝性、そして場合によっては摂食の疾患と称される。悪液質は更に代謝亢進および異化亢進も態様とする。悪液質およびるいそう疾病はるいそう状態を指すために互換的に用いられる場合が多いが、無脂肪の身体塊、特に体細胞塊の損失として、るいそう症候群から悪液質を区別する研究も最低限存在している（Ｍａｙｅｒ，１９９９，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２９（１Ｓ  Ｓｕｐｐｌ．）２５６Ｓ−２５９Ｓ）。加齢個体に影響する場合があるもう１つのそのような疾患である肉質欠乏症は典型的には筋肉塊の損失を態様とする。上記した末期のるいそう疾病は悪液質または肉質欠乏症に罹患した個体において生じる場合がある。
【０１３６】
本明細書においては、「治療」とは治療すべき個体または細胞の本来の過程を改変させる試みにおける臨床介入を指し、予防のため、または臨床病理過程の間の何れかに実施できる。治療の望ましい作用は、疾病の発症または再発の防止、症状の緩解、任意の直接または間接的な疾病の病理学的結果の軽減、疾病進行速度の低減、疾病状況の緩和または沈静化、および、予後の軽快または改善を包含する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は疾病または疾患の発症を遅延するために使用される。
【０１３７】
「抗血管形成剤」または「血管形成抑制剤」とは、直接または間接的に、血管形成、脈管形成または望ましくない血管の透過性を抑制する、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組み換えタンパク質、抗体またはそのコンジュゲートまたは融合タンパク質を指す。例えば、抗血管形成剤は上記定義した血管形成剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ＶＥＧＦ受容体シグナリングをブロックする小分子（例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ）、ＡＭＧ７０６）である。抗血管形成剤はまた、未変性の血管形成抑制剤、例えばアンジオスタチン、エンドスタチン等を包含する。例えばＫｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）（例えば悪性黒色腫における抗血管形成療法を列挙している表３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば抗血管形成因子を列挙している表２）；および  Ｓａｔｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）（例えば臨床治験において使用されている抗血管形成剤を列挙している表１）を参照できる。
【０１３８】
「個体」とは脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は限定しないが、牧場動物（例えばウシ）、競技用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌおよびウマ）、霊長類、マウスおよびラットを包含する。
【０１３９】
「哺乳類」とは、治療目的の為には哺乳類として分類される何れかの動物を指し、ヒト、家畜および牧場動物、および、動物園、競技用または愛玩用の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を包含する。好ましくは哺乳類はヒトである。
【０１４０】
「有効量」とは所望の治療または予防上の結果を達成するために、必要な用量および時間において、有効である量を指す。
【０１４１】
本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療有効量」は個体の病状、年齢、性別および体重、および、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストが個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に従って変動する。治療有効量はまた、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの何れかの毒性または有害な作用よりも治療上有益な作用が勝っているものである。「予防有効量」は所望の予防結果を達成するために、必要な用量および時間において、有効である量を指す。必然ではないが典型的には、予防用量は疾病の前または早期の段階において対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも低値となる。
【０１４２】
「細胞毒性剤」という用語は本明細書においては、細胞の機能を抑制または防止、および／または細胞の破壊を誘発する物質を指す。用語は放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインタカレーション剤、酵素およびそのフラグメント、例えば核溶解酵素、抗生物質および毒素、例えば小分子毒素または細菌、カビ、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素ならびにそのフラグメントおよび／または変異体、および、以下に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤を包含する。他の細胞毒性剤は以下に記載する。殺腫瘍性の薬剤は腫瘍細胞の破壊を誘発する。
【０１４３】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例はアルキル化剤類、例えばチオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパおよびウレドパ；エチレンイミン類およびメチラメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミドおよびトリメチロールオメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトテシン（例えば合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチンおよび９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類縁体）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テミポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード類、例えばクロランブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸酸化メクロレタミン、メルファラン、ノべンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；クスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連の色素タンパク質エネジン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジ���スタチン、ゾルビシン；代謝アンタゴニスト、例えばメトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、デキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル類、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノェブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド類、例えばマイタンシンおよびアンサミトシン類；マイトグアゾン；マイトキサトロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピアルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、べラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｂｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＶＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イソフォスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノヴァントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチン酸；��ペシタラビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記物質の何れかの製薬上許容しうる塩、酸または誘導体；ならびに上記物質の二者以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ、即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニソロンの複合療法の略称、およびＦＯＬＦＯＸ、即ち５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いた治療用法の略称等、を包含する。
【０１４４】
この定義に同様に包含されるものは癌の生育を促進することが可能であるホルモンの作用を調節、低減、ブロックまたは抑制する作用を有し、そして、全身投与または身体全体投与の形態となる場合が多い抗ホルモン剤である。それらはそれら自体がホルモンであってよい。例示されるものは、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン類；エストロゲン受容体ダウンレギュレート剤（ＥＲＤ）；卵巣を抑制またはシャットダウンする機能を有する薬剤、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリン；他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；および副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲステロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドゾロール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アラストロゾールを包含する。更にまた、化学療法剤のこのような定義にはビスホスホネート類、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチロロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネートまたはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの異常な細胞増殖に関与するとされるシグナリング経路内の遺伝子の発現を抑制するもの；ワクチン類、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン類、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＰＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤、別名ＧＷ５７２０１６）；および上記物質の何れかの製薬上許容しうる塩、酸または誘導体も包含される。
【０１４５】
「増殖阻害因子」とは、本明細書において使用する場合は、インビトロまたはインビボの何れかにおいて細胞（例えばＦＧＦ１９を発現する細胞）の成育を抑制する化合物または組成物を指す。即ち、増殖阻害因子はＳ期における細胞（例えばＦＧＦ１９を発現する細胞）のパーセンテージを有意に低減するものであってよい。増殖阻害因子の例は細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置において）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤を包含する。伝統的なＭ期ブロッカーはビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン類およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンエトポシドおよびブレオマイシンを包含する。Ｇ１を停止させる薬剤はまたＳ期停止にまで作用を派生させるものがあり、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−Ｃが挙げられる。更に詳細な説明はＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ編．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １の表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇ」、Ｎｙｒａｊａｎｕ等（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ１９９５），ｐ．１３に記載されている。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は共にイチイの木から誘導される抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類縁体である。パクリタキセルおよびドセタキセルはチュブリン２量体からの微小管の組み立てを促進し、そして脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、これが細胞における有糸分裂を抑制する。
【０１４６】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１４７】
「Ｆｃ領域包含ポリペプチド」という用語はＦｃ領域を含む抗体またはイムノアドヘシン（後述する定義参照）などのポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングによれば残基４４７）は例えばポリペプチドの精製の間、または、ポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することにより、除去してよい。従って、本発明によるＦｃ領域を有するポリペプチドを含む組成物はＫ４４７を有する、全Ｋ４４７が除去されているポリペプチド、またはＫ４４７残基を有するおよび有さないポリペプチドの混合物を含むことができる。
【０１４８】
本発明の組成物およびその製造方法
本発明は抗ＦＧＦ１９抗体；および抗ＦＧＦ１９抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を包含する組成物を包含する。本明細書においては、組成物はＦＧＦ１９に結合する抗体１つ以上、および／または、ＦＧＦ１９に結合する抗体１つ以上をコードする配列を含むポリヌクレオチド１つ以上を含む。これらの組成物は更に、適当な担体、例えば製薬上許容しうる賦形剤、例えば緩衝剤を含んでよく、これらは当該分野で良く知られている。
【０１４９】
本発明はまた単離された抗体およびポリヌクレオチドの実施形態も包含する。本発明はまた実質的に純粋な抗体およびポリヌクレオチドの実施形態も包含する。
【０１５０】
本発明の抗ＦＧＦ１９抗体は好ましくはモノクローナルである。本発明の範囲に同様に包含されるものは、本明細書において提供される抗ＦＧＦ１９抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、  Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。これらの抗体フラグメントは伝統的な手段、例えば酵素消化により作成することができ、または、組み換え手法により形成してもよい。このような抗体フラグメントはキメラまたはヒト化されていてよい。これらのフラグメントは後述する診断および治療目的のために有用である。
【０１５１】
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体の集団から得られ、即ち、集団に属する個々の抗体は僅かの量のみ存在してよい可能な天然に存在する突然変異を除き同一である。即ち、「モノクローナル」という修飾語は個別の抗体の混合物ではないものとして抗体の態様を示している。
【０１５２】
本発明の抗ＦＧＦ１９抗体はＫｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作成することができ、または組み換えＤＮＡ法により作成してよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０１５３】
ハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を製造するか、製造することができるリンパ球を誘発するように免疫化する。ＦＧＦ１９に対する抗体は一般的にＦＧＦ１９およびアジュバントの多数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物において育成する。ＦＧＦ１９は当該分野で良く知られている方法を用いて製造してよく、その一部は更に本明細書に記載する通りである。例えば、ＦＧＦ１９の組み換え生産を以下に記載する。１つの実施形態において、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分に融合させたＦＧＦ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有するＦＧＦ１９の誘導体で動物を免疫化する。１つの実施形態においては、ＦＧＦ１９−ＩｇＧ１融合タンパク質で動物を免疫化する。動物を通常通り免疫原性コンジュゲートまたはＦＧＦ１９の誘導体に対し、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジクリノミクレート（ＴＤＭ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）で免疫化し、そして溶液を多数部位において比内注射する。２週間後、動物をブーストする。７〜１４日後、動物を出血させ、血清の抗ＦＧＦ１９価を試験する。抗体価が定常状態となるまで動物をブーストする。
【０１５４】
あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してよい。次にリンパ球をポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１５５】
このようにして製造したハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の生育または生存を抑制する物質１つ以上を好ましくは含有する適当な培地中に播種して生育させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を抑制する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有することになる（ＨＡＴ培地）。
【０１５６】
好ましい骨髄腫細胞は効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定した高レベルの生産を支援し、そしてＨＡＴ培地などの培地に対して感受性のものである。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞系統はネズミ骨髄腫系統、例えばＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡより入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたもの、および、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統もまた、ヒトモノクローナル抗体の製造のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１５７】
ハイブリドーマ細胞を生育させる培地をＦＧＦ１９に対して施行されたモノクローナル抗体の生産に関して試験する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、または、インビトロの結合試験、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により測定する。
【０１５８】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスカッチャード分析により測定できる。
【０１５９】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が発見された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、そして標準的方法により生育させてよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適当な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭおよびＲＰＭＩ−１６４０培地である。更に、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍としてインビボで生育させてよい。
【０１６０】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は従来の免疫グロブリン精製操作法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティーにティークロマトグラフィーにより培地、復水または血清から適宜分離する。
【０１６１】
本発明の抗ＦＧＦ１９抗体は所望の活性を有する合成抗体クローンを得るスクリーニングのためのコンビナトリアルなライブラリを用いることにより作成できる。原則として、合成抗体クローンは、ファージ皮膜タンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の種々のフラグメントをディスプレイするファージを含有するファージライブラリをスクリーニングすることにより選択される。そのようなファージライブラリは所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖフラグメントを発現するクローンは抗原に吸着され、これによりライブラリ中の非結合クローンから分離される。次に結合クローンを抗原から溶出させ、そして抗原吸着／溶出の追加的サイクルにより更に濃縮することができる。本発明の抗ＦＧＦ１９抗体の何れかは目的のファージクローンが選択されるように適当な抗原スクリーニング操作法を設計し、その後、目的のファージクローン由来のＦｖ配列およびＫａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載されている適当な定常領域（Ｆｃ）配列を用いて、完全長の抗ＦＧＦ１９抗体クローンを構築することにより得ることができる。
【０１６２】
抗体の抗原結合ドメインは両方が３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を呈する軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）に各々１つが由来する約１１０個のアミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成される。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載される通り、ＶＨおよびＶＬが短いフレキシブルなペプチドを介して共有結合的に連結している１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として、または、各々が定常ドメインに融合して非共有結合的に相互作用するＦａｂフラグメントとして、ファージ上に機能的にディスプレイすることができる。本明細書においては、ｓｃＦｖコードファージクローンおよびＦａｂコードファージクローンは総称して「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称する。
【０１６３】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングし、そして、ファージライブラリ内でランダムに組み換えすることができ、これを次にＷｉｎｔｅｒ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載される通り、抗原結合クローンを得るための検索に付すことができる。免疫化された原料に由来するライブラリはハイブリドーマの構築を必要とすることなく免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）の記載する通り、未処置のレパートリーをクローニングすることにより何れの免疫化も行うことなく非自己および自己抗原の広範な種類に対するヒト抗体の単一の原料を提供することができる。最終的に、未処置のレパートリーは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載の通り、幹細胞由来の未再配置のＶ遺伝子セグメントをクローニングすること、および、高度に可変であるＣＤＲ３領域をコードするため、および、インビトロにおける再配置を達成するためにランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより合成的に作成することもできる。
【０１６４】
マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体フラグメントをディスプレイするためにフィラメントファージを用いる。抗体フラグメントはＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の通りフレキシブルなポリペプチドスペーサーにより同じポリペプチド鎖上でＶＨとＶＬが連結されている１本鎖Ｆｖフラグメントとして、またはＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載の通り一方の鎖がｐＩＩＩに融合し、そしてもう一方が野生型のコートタンパク質の一部を排除することによりファージ表面上に標示されることになるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリである細菌宿主細胞のペリプラズム内に他方が分泌されるＦａｂフラグメントとしてディスプレイすることができる。
【０１６５】
一般的に抗体遺伝子フラグメントをコードする核酸はヒトまたは動物から採取された免疫細胞から得られる。抗ＦＧＦ１９クローンを優先するように偏ったライブラリが望ましい場合、対象をＦＧＦ１９で免疫化して抗体応答を発生させ、そして脾細胞および／または循環Ｂ細胞他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリ構築のために回収する。好ましい実施形態においては、抗ＦＧＦ１９クローンを優先するように偏ったヒト抗体遺伝子フラグメントライブラリは、ＦＧＦ１９免疫化がＦＧＦ１９に対するヒト抗体を生産するＢ細胞を生じさせるように機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを担持する（そして機能的内因性抗体生産系を欠いている）トランスジェニックマウスにおいて抗ＦＧＦ１９抗体応答を発生させることにより得られる。ヒト抗体生産トランスジェニックマウスの作成は後に記載する。
【０１６６】
抗ＦＧＦ１９反応性細胞集団の別の濃縮は、適当なスクリーニング操作法を用いてＦＧＦ１９特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離することにより、例えばＦＧＦ１９アフィニティークロマトグラフィーによる細胞分離、または蛍光色素標識ＦＧＦ１９への細胞の吸着とその後のフロー活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により、得ることができる。
【０１６７】
あるいは、脾細胞および／またはＢ細胞または免疫化ドナー由来の他のＰＢＬの使用により、可能な抗体レパートリーのより良好な提示ができ、そしてまた、ＦＧＦ１９が抗原性ではない何れかの動物（ヒトまたは非ヒト）種を用いた抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子構築を取り込んだライブラリについては、幹細胞を対象から採取して、未再配置の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。目的の免疫細胞は種々の動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマおよびトリの種等から得ることができる。
【０１６８】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨおよびＶＬセグメントを包含する）をコードする核酸を目的の細胞から回収して増幅させる。再配置したＶＨおよびＶＬ遺伝子のライブラリの場合は、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載の通り、リンパ球からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、その後、再配置したＶＨおよびＶＬ遺伝子の５’および３’末端にマッチするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができ、これにより、発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作成することができる。Ｏｒｌａｎｄｉ等（１９８９）およびＷａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載の通り、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端におけるリバースプライマーおよびＪセグメント内を基にするフォワードプライマーを用いて、Ｖ遺伝子をｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するためには、リバースプライマーはＪｏｎｅｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載の通りリーダーエクソンを基にすることもでき、そしてフォワードプライマーはＳａｓｔｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載の通り定常領域内を基にすることができる。相補性を最大にするためには、Ｏｒｌａｎｄｉ等、（１９８９）またはＳａｓｔｒｙ等、（１９８９）に記載の通りプライマー中に縮重を取り込むことができる。好ましくは、ライブラリの多様性は例えばＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の通り、またはＯｒｕｍ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）に記載の通り、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての使用可能なＶＨおよびＶＬの配置を増幅するために各Ｖ遺伝子ファミリーに標的にされたＰＣＲプライマーを使用することにより最大とする。発現ベクター内への増幅されたＤＮＡのクローニングの為には、稀少制限部位をＯｒｌａｎｄｉ等、（１９８９）に記載の通り一端におけるタグとしてＰＣＲプライマー内に導入することができ、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載の通りタグ付けされたプライマーを用いた更に別のＰＣＲ増幅によることもできる。
【０１６９】
合成的に再配置されたＶ遺伝子のレパートリーはＶ遺伝子セグメントからインビトロで誘導できる。大部分のヒトＶＨ遺伝子セグメントがクローニングされ、そして配列決定され（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）において報告）、そしてマッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４（１９９３））；これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１およびＨ２ループの主要なコンホーメーション全てを含む）はＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載の通り多様な配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作成するために使用することができる。ＶＨレパートリーはまたＢａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載の通り単一の長さの長いＨ３ループに着目した全ての配列多様性を有するように作成できる。ヒトＶκおよびＶλセグメントはクローニングおよび配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３）において報告）、そして合成の軽鎖レパートリーを作成するために使用できる。ある範囲のＶＨおよびＶＬの折り畳み、およびＬ３およびＨ３の長さに基づいた合成Ｖ遺伝子レパートリーはかなりの構造多様性の抗体をコードすることになる。Ｖ遺伝子コードＤＮＡの増幅の後、生殖細胞系統のＶ遺伝子のセグメントをＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従ってインビトロで再配置させることができる。
【０１７０】
抗体フラグメントのレパートリーは数種の方法においてＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーをともに組み合わせることにより構築できる。各レパートリーは異なるベクター内において作成でき、そして、ベクターをＨｏｇｒｅｆｅ等、Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載の通りインビトロで、またはＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載の通りコンビナトリアルな感染、例えばｌｏｘＰ系によりインビボで、組み換えることができる。インビボ組み換えの方策はＥ．ｃｏｌｉ形質転換効率により決定されるライブラリサイズに対する制限を克服するためのＦａｂフラグメントの２本鎖の性質を利用している。未処置なＶＨおよびＶＬレパートリーは、一方はファージミド内に、他方はファージベクター内に別個にクローニングする。次に２つのライブラリを、各々の細胞が異なる組み合わせを含有し、そしてライブラリのサイズが存在する細胞の数のみ（約１０１２クローン）により制限されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染により組み合わせる。両方のベクターは、ＶＨおよびＶＬ遺伝子が単一のレプリコン上に組み換えられ、そしてファージビリオン内に同時パッケージされるように、インビボ組み換えを含有する。これらの巨大なライブラリは良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）の多様な抗体を多数提供する。
【０１７１】
あるいはレパートリーはＢａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載の通り同じベクター内に逐次的にクローニングするか、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載の通りＰＣＲにより共に組立て、そして次にクローニングしてよい。ＰＣＲ組み立てはまた、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するためにフレキシブルペプチドスペーサーをコードするＤＮＡにＶＨおよびＶＬのＤＮＡを連結するために使用できる。さらに別の手法においては、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載の通り「細胞内ＰＣＲ組み立て」を用いて、ＶＨとＶＬの遺伝子をリンパ球内でＰＣＲにより組み合わせ、次に連結した遺伝子のレパートリーをクローニングする。
【０１７２】
未処置のライブラリにより製造された抗体（天然または合成の何れか）は中程度の親和性のもの（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）のものであることができるが、親和性成熟もまた上出のＷｉｎｔｅｒ等（１９９４）に記載の通り二次ライブラリから構築および再選択することにより模倣できる。例えば、突然変異は、Ｈａｗｋｉｎｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法において、またはＧｒａｍ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法において、エラープローンポリメラーゼを使用することによりインビトロでランダムに導入できる（Ｌｅｕｎｇ等、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）において報告）。更に、親和性成熟は、例えば選択された個々のＦｖクローンにおいて目的のＣＤＲに渡ってランダム配列を担持するプライマーによるＰＣＲを用いてＣＤＲ１つ以上をランダムに突然変異させること、および、より高い親和性のクローンを求めてスクリーニングすることにより、実施できる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために免疫グロブリンの軽鎖の相補性決定領域内で突然変異誘発を誘導するための方法を記載している。別の効果的な方策は、Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載の通り、未免疫化ドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーを有するファージディスプレイにより選択されたＶＨまたはＶＬドメインを組み換え、そして、鎖リシャフリングの数ラウンドにおいてより高い親和性を求めてスクリーニングすることである。この手法は１０−９Ｍ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの製造を可能にする。
【０１７３】
ＦＧＦ１９をコードする核酸配列はＦＧＦ１９の所望の領域のアミノ酸配列を用いて設計できる。あるいは、ｃＤＮＡ配列（またはそのフラグメント）を使用してよい。別のＦＧＦ１９配列はさらに例えばＮＭ＿０２２９６３およびＸｉｅ等、（１９９９）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１１：７２９−７３５に記載されている。ＦＧＦ１９をコードするＤＮＡは当該分野で知られた種々の方法により製造できる。これらの方法は限定しないが、Ｅｎｇｅｌｓ等、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４（１９８９）に記載されている方法の何れかによる化学合成、例えばトリエステル、ホスファイト、ホスホロアミダイトおよびＨ−ホスホネート法を包含する。１つの実施形態において発現宿主細胞により好まれるコドンをＦＧＦ１９コードＤＮＡの設計において使用する。あるいはＦＧＦ１９コードＤＮＡはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから単離できる。
【０１７４】
ＦＧＦ１９をコードするＤＮＡ分子の構築の後、ＤＮＡ分子をプラスミドなどの発現ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結し、この場合制御配列はベクターで形質転換された宿主細胞により認識される。一般的にプラスミドベクターは宿主細胞に適合する種から誘導された複製および制御の配列を含有する。ベクターは通常は複製部位ならびに形質転換された細胞における表現型選択をもたらすことができるタンパク質をコードする配列を担持している。原核生物および真核生物の宿主細胞における発現のための適当なベクターは当該分野で知られており、一部は本明細書において更に説明する。真核生物、例えば酵母または哺乳類などの多細胞生物から誘導された細胞を使用してよい。
【０１７５】
場合により、ＦＧＦ１９をコードするＤＮＡは、培地中への宿主細胞による発現産物の分泌をもたらす分泌リーダー配列に作動可能に連結させる。分泌リーダー配列の例はｓｔＩＩ、エコチン、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼおよびアルファ因子を包含する。更に、本発明において使用するのに適するものはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ等、ＥＭＢＯＪ．，４：３９０１（１９８５））。
【０１７６】
宿主細胞は本発明の上記発現またはクローニングベクターによりトランスフェクトおよび好ましくは形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜変性された従来の栄養培地中で培養する。
【０１７７】
トランスフェクションとは任意のコーディング配列が実際に発現されるか否かに関わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。トランスフェクションの多くの方法は当業者の知る通りであり、例えばＣａＰＯ４沈殿およびエレクトロポレーションを包含する。良好なトランスフェクションはこのベクターの作動を示す何らかのものが宿主細胞内に生じた場合に一般的に認識される。トランスフェクションのための方法は当該分野で良く知られており、一部は本明細書において更に説明する。
【０１７８】
形質転換とは染色体外エレメントとして、または染色体組み込み体により、ＤＮＡが複製されるように有機体内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適切である標準的な手法を用いて行う。形質転換のための方法は当該分野で良く知られており、一部は本明細書において更に説明する。
【０１７９】
ＦＧＦ１９を製造するために使用される原核生物宿主細胞は上出のＳａｍｂｒｏｏｋ等に一般的に記載されている通り培養できる。
【０１８０】
ＦＧＦ１９を製造するために使用される哺乳類宿主細胞は種々の培地中で培養でき、それらは当該分野で良く知られており、一部は本明細書において更に説明する。
【０１８１】
本開示において言及する宿主細胞はインビトロ培養物中の細胞ならびに宿主動物内にある細胞を包含する。
【０１８２】
ＦＧＦ１９の精製は当該分野で知られた方法により行ってよい。
【０１８３】
精製されたＦＧＦ１９はファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離において使用するために、適当なマトリックス、例えばアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリル系共重合体、ヒドロキシルメタクリレートゲル、ポリアクリル系およびポリメタクリル系の共重合体、ナイロン、中性およびイオン性の担体などに結合させることができる。ＦＧＦ１９タンパク質のマトリックスへの結合はＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４（１９７６）に記載の方法により行うことができる。多糖類マトリックス、例えばアガロース、デキストランまたはセルロースにタンパク質リガンドを結合させるために一般的に使用されている手法ハロゲン化シアンによる担体の活性化およびその後のペプチドリガンドの第１脂肪族または芳香族のアミンの活性化マトリックスへのカップリングを包含する。
【０１８４】
あるいは、ＦＧＦ１９は吸着プレートのウェルをコーティングするために使用され、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させ、または、ストレプトアビジンコーティングビーズによるキャプチャーのためにビオチンにコンジュゲートされるか、または、ファージディスプレイライブラリのパニングのための何れかの他の当該分野で知られた方法において使用することができる。
【０１８５】
ファージライブラリ試料は吸着材とのファージ粒子の少なくとも一部分の結合のために適する条件下に固定化されたＦＧＦ１９と接触させる。通常はｐＨ、イオン強度、温度などを包含する条件は生理学的状態を模倣するように選択する。固相に結合したファージは洗浄し、次に例えばＢａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載の通り酸により、またはＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の通りアルカリにより、または例えばＣｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合法と類似の操作法におけるＦＧＦ１９抗原競合により、溶離させる。ファージは選択の単一のラウンドにおいて２０〜１，０００倍濃縮することができる。更にまた、濃縮されたファージは細菌培養において生育させ、そして更に選択ラウンドに付すことができる。
【０１８６】
選択の効率は多くの要因、例えば洗浄中の解離の動態、および、単一のファージ上の多数の抗体フラグメントが同時に抗原と契合するかどうかにより異なる。高速の解離動態（および弱い結合親和性）を有する抗体は短時間の洗浄、多価のファージディスプレイおよび固相中の抗原の高いコーティング密度を用いることにより保持することができる。高い密度は多価の相互作用を介してファージを安定化させるのみならず、解離したファージの再結合にも好都合となる。緩徐な解離動態（および良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ等、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）およびＷＯ９２／０９６９０に記載の通り長時間の洗浄と１価のファージ、および、Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載の通り抗原の低コーティング密度を使用することにより増進することができる。
【０１８７】
僅かにしか親和性に差がない場合であっても、ＦＧＦ１９を異なる親和性のファージ抗体の間で選択することも可能である。しかしながら、選択された抗体のランダムな突然変異（例えば上記した親和性成熟の手法の一部において実施されるもの）は大部分が抗原に結合する多くの突然変異体を生じさせ、より高い親和性を有するものは僅かとなる可能性がある。ＦＧＦ１９を制限すれば、希少な高親和性のファージは駆逐される可能性がある。高親和性の突然変異体の全てを保持するためには、ファージを過剰のビオチン化ＦＧＦ１９と共に、ただし、ビオチン化ＦＧＦ１９はＦＧＦ１９に対する目標モル親和性定数よりも低モルの濃度としながら、インキュベートすることができる。次に高親和性の結合ファージを、ストレプトアビジンコーティング常磁性体ビーズでキャプチャーすることができる。そのような「平衡キャプチャー」により、低親和性を有するファージの大過剰量から、２倍高値親和性もの低値において突然変異体クローンの単離を可能にする選択性で、結合のそれらの親和性に従って抗体を選択できるようになる。固相に結合しているファージの洗浄において使用する条件もまた、解離の動態に基づいて判別するために操作できる。抗ＦＧＦ１９クローンは活性選択してよい。
【０１８８】
本発明のハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて（例えばハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から目的の重鎖および軽鎖コーディング領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）容易に単離され、そして配列決定される。単離後、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれを宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または別様には免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞内で所望のモノクローナル抗体の合成を達成できる。抗体コードＤＮＡの細菌中での組み換え発現に関する考察文献はＳｋｅｒｒａ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）を包含する。
【０１８９】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは重鎖および／または軽鎖の完全長または部分をコードするクローンを形成するために重鎖および／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば適切なＤＮＡ配列は上出のＫａｂａｔ等から得ることができる）と組み合わせることができる。当然ながら、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを包含する何れのアイソタイプの定常領域もこの目的のために使用することができ、そして、そのような定常領域は何れかのヒトまたは動物種から得ることができる。ある動物（例えばヒト）の可変ドメインＤＮＡから誘導され、そして次に別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させることにより「ハイブリッド」で完全長の重さおよび／または軽鎖に関するコーディング配列を形成したＦｖクローンは本明細書においては「キメラ」および「ハイブリッド」抗体の定義に包含される。好ましい実施形態においては、ヒト可変ＤＮＡから誘導されたＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合させることにより、全ヒトの、完全長または部分の重鎖および／または軽鎖に関するコーディング配列を形成する。
【０１９０】
本発明のハイブリドーマから誘導した抗ＦＧＦ１９抗体をコードするＤＮＡはまた、例えば、ハイブリドーマクローンから誘導された相同ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域に関するコーディング配列を置き換えることにより修飾することもできる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）の方法の場合）。ハイブリドーマまたはＦｖクローン誘導抗体またはフラグメントをコードするＤＮＡは更に、非免疫グロブリンポリペプチドに関するコーディング配列の全てまたは部分を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合的に連結することにより更に修飾できる。この態様において、本発明のＦｖクローンまたはハイブリドーマクローン誘導抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を製造する。
【０１９１】
抗体フラグメント
本発明は抗体フラグメントを包含する。特定の状況において、完全な抗体よりも抗体フラグメントを使用することが有利となる。より小型のフラグメントは急速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍への接触を向上させる場合がある。
【０１９２】
抗体フラグメントの製造の為には多くの手法が開発されている。伝統的にはこれらのフラグメントは未損傷の抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されている（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらのフラグメントは現在では組み換え宿主細胞により直接製造できる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントは全てＥ．ｃｏｌｉ内で発現され、それから分泌させることができるため、これらのフラグメントの大量生産が容易となる。抗体フラグメントは上記考察した抗体ファージライブラリから単離できる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、そして化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の方策によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期の増大したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントの製造のための他の手法は当該分野で良く知られている。他の実施形態においては、選択される抗体は１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照できる。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を有さない未損傷複合化部位を有する唯一の種であり；従って、それらはインビボの使用中の低減した非特異的結合のために適している。ｓＦ融合タンパク質はｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端の何れかにおいてエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築してよい。上記したＢｏｒｒｅｂａｃｋ編のＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを参照できる。抗体フラグメントはまた例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載される通り、「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体フラグメントは単一特異性または二重特異性であってよい。
【０１９３】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当該分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は非ヒトである原料からそこに導入されたアミノ酸残基１つ以上を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は頻繁には「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインに由来する。ヒト化は本質的にはヒト抗体の相当する配列の超可変領域配列を置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ等の方法に従って実施することができる（Ｊｏｎｅｓ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って実施することができる。従ってそのような「ヒト化」抗体は、未損傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種の相当する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際、ヒト化抗体は典型的には、一部の超可変領域残基およびおそらくは一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【０１９４】
ヒト化抗体の作成において使用すべき軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低減するためには極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従えば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次にげっ歯類のものに最も近かったヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして許容される（Ｓｉｍｓ等（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ等（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法は軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に対して使用してよい（Ｃａｒｔｅｒ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ等（１９９３）Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
【０１９５】
抗原に対する高い親和性および他の望ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化させることが更に重要である。この目標を達成するためには、１つの方法によれば、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、ヒト化抗体を製造する。三次元の免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者のよく知るものである。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元コンホーメーション構造を説明してディスプレイするコンピュータープログラムが使用できる。これらのディスプレイを精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、即ち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択し、レシピエントおよびインポート配列から、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように組み合わせることができる。一般的に超可変領域残基は、抗原結合への影響においては直接、そして最も大きく関与している。
【０１９６】
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＦＧＦ１９抗体は上記した通り既知のヒト定常ドメイン配列にヒト誘導ファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を組み合わせることにより構築できる。あるいは本発明のヒトモノクローナル抗ＦＧＦ１９抗体はハイブリドーマ法により作成できる。ヒトモノクローナル抗体の製造のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統は例えばＫｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）に記載されている。
【０１９７】
現在では、免疫化により、内因性免疫グロブリン生産の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを製造することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を製造できる。例えばキメラおよび生殖細胞系統突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）のホモ接合欠失が内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことがわかっている。そのような生殖細胞系統突然変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は抗原攻撃によりヒト抗体の生産をもたらすことになる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照できる。
【０１９８】
遺伝子シャフリングもまた、非ヒト、例えばげっ歯類の抗体からヒト抗体を誘導するために使用することができ、その場合、ヒト抗体は原料の非ヒト抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、上記したファージディスプレイ手法により得られる非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖可変領域の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えることにより、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦＶまたはＦａｂキメラの集団を作成できる。抗原を用いた選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦＶまたはＦａｂの単離がもたらされ、その場合、ヒト鎖は一次ファージディスプレイクローン内の相当する非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復し、即ち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。プロセスを反復することにより残存する非ヒト鎖を置き換える場合、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３  参照）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この手法は非ヒト起源のＦＲおよびＣＤＲを有さない完全にヒト型の抗体を提供する。
【０１９９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト型またはヒト化された、抗体である。この例においては、結合特異性の１つはＦＧＦ１９に対するものであり、そしてもう１つは何れかの他の抗原に対するものである。例示される二重特異性抗体はＦＧＦ１９タンパク質の２つの異なるエピトープに結合してよい。二重特異性抗体はまたＦＧＦ１９を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させるために使用してよい。これらの抗体はＦＧＦ１９結合アームおよび細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン））に結合するアームを保有している。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として製造できる。
【０２００】
二重特異性抗体を作成するための方法は当該分野で知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組み換え製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、その場合、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、そのうち僅か１種のみが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は面倒であり、そして生成物収率は低値である。同様の操作法がＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、ＥＭＢＯＪ，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０２０１】
異なる、そしてより好ましい方策によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原複合化部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、融合は少なくとも一部のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行う。融合の少なくとも１つにおいて存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクターに挿入し安定な宿主有機体に同時トランスフェクトする。これにより、構築において使用した３種のポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたら場合の実施形態において、３種のポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する場合に大きな柔軟性がもたらされる。しかしながら、等しい比率における少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、または、比率が特に意味を有さない場合は、１つの発現ベクター内に２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖に関するコーディング配列を挿入することが可能である。
【０２０２】
この方法の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）を有する。この非対称の構造は、二重特異性分子の半片方にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することは分離の効率的方法となるため、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることがわかっている。この方法はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の形成の更に詳細な説明は例えばＳｕｒｅｓｈ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：２１０（１９８６）を参照できる。
【０２０３】
別の方法によれば、抗体分子対の間の界面を操作することにより組み換え細胞培養から回収されるヘテロ２量体の割合を最大限にすることができる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも部分を含む。この方法においては、第１の抗体分子の界面に由来する小型アミノ酸側鎖１つ以上をより大きい鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大型のアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面上には大型の側鎖と同一または同様のサイズの補償「空洞」が形成される。これはホモ２量体などの他の望ましくない最終生成物を超えてヘテロ２量体の収率を増大させるための機序を与える。
【０２０４】
二重特異性抗体は交差結合または「ヘテロコンジュゲート」抗体を包含する。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方をアビジンに、そして他方をビオチンにカップリングすることができる。このような抗体は例えば望ましくない細胞に免疫系細部を標的にすること（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３およびＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は何れかの好都合な交差結合法を用いて作成してよい。適当な交差結合因子は当該分野で良く知られており、そして多くの交差結合の手法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０２０５】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を形成するための手法もまた文献に記載されている。例えば二重特異性抗体はキメラ連結を用いて製造できる。Ｂｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９９：８１（１９８５）はＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成するために未損傷の抗体をタンパク質分解的に切断する操作法を記載している。これらのフラグメントをジチオール複合体形成剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元することにより、隣接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を防止する。次に形成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは次にメルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合することにより二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための試薬として使用できる。
【０２０６】
最近の進歩により、化学的にカップリングすることにより二重特異性抗体を形成できるＥ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接の回収が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを別個にＥ．ｃｏｌｉから分泌させ、インビトロの指向性化学カップリングに付すことにより、二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体はＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、同時にヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができる。
【０２０７】
組み換え細胞培養物より直接二重特異性抗体フラグメントを作成して単離する種々の手法も報告されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて製造されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に連結している。抗体のホモ２量体をヒンジ領域で還元することによりモノマーを形成し、次に、再酸化して抗体ヘテロ２量体を形成している。この方法はまた抗体ホモ２量体の製造の為にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載の「ダイアボディー」手法は二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替機序を与えている。フラグメントは同じ鎖の２ドメイン間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインが別のフラグメントの相補ＶＬおよびＶＨドメインに強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）２量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを作成するための別の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照できる。
【０２０８】
２価より多価の抗体も意図される。例えば３重特異性抗体を作成できる。Ｔｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０２０９】
多価抗体
多価抗体は抗体が結合する相手の抗原を発現する細胞により、２価抗体よりも急速に内在化（および／または異化）される場合がある。本発明の抗体は３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外である）（例えば４価抗体）であることができ、これは抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現により容易に製造できる。多価抗体は２量化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい２量化ドメインはＦｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれからなる）。この設定においては、抗体はＦｃ領域およびＦｃ領域に対してアミノ末端側に３つ以上の抗原結合部位を含むことになる。好ましい多価抗体は本発明においては、３〜約８個、好ましくは４個の抗原結合部位を含む（またはそれからなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここでポリペプチド鎖は２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでよく、式中ＶＤ１は第１の可変ドメイン、ＶＤ２は第２の可変ドメイン、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを示し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖はＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでよい。本発明の多価抗体は好ましくは更に少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。本発明の多価抗体は例えば約２〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでよい。本明細書において意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、そして場合により更にＣＬドメインを含む。
【０２１０】
抗体変異体
一部の実施形態においては、本明細書に記載した抗体のアミノ酸配列の修飾が意図される。例えば抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが望まれる場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は抗体核酸に適切なヌクレオチドの変化を導入することによるか、または、ペプチド合成により製造される。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を包含する。欠失、挿入および置換の何れかの組み合わせが最終コンストラクトに到達するまで行ってよいが、ただし最終コンストラクトは所望の特性を保有しなければならない。アミノ酸の改変は配列が作成される時点で対象となる抗体のアミノ酸配列に導入してよい。
【０２１１】
突然変異誘発のために好ましい位置である抗体の特定の残基または領域の発見のための有用な方法はＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載される通り「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称される。ここでは、残基または標的残基の群を発見（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）し、そして中性または逆に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えることにより抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与える。次に置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置を、置換の位置において、またはそのための、追加的または別の変異体を導入することにより精査する。即ち、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されるが、突然変異そのものの性質は予め決定されなくてよい。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するためには、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域において実施し、そして発現された免疫グロブリンで所望の活性を有するものをスクリーニングする。
【０２１２】
アミノ酸配列の挿入は、１残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端の融合、ならびに、単一または複数のアミノ酸残基の配列内の挿入を包含する。末端挿入の例はＮ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体を包含する。抗体分子の他の挿入による変異体は、血清中の抗体の半減期を増大させる酵素（例えばＡＤＥＰＴ）またはポリペプチドに対する抗体のＮまたはＣ末端への融合を包含する。
【０２１３】
抗体のアミノ酸変異体の別の型は抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。そのような改変は抗体中に存在する炭水化物１つ以上の欠失、および／または、抗体中に存在しないグリコシル化部位１つ以上の付加を包含する。
【０２１４】
ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ連結またはＯ連結となる。Ｎ連結とはアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン、ここでＸはプロリン以外の何れかのアミノ酸であるものは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合に関する認識配列である。即ちこれらのトリペプチド配列の何れかのポリペプチド中の存在が潜在的グリコシル化部位を生じさせる。Ｏ連結グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖類Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用してよい。
【０２１５】
グリコシル化部位の抗体への付加は、好都合には、アミノ酸配列を、それが上記したトリペプチド配列の１つ以上を含有するように改変することにより達成される（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）。改変はまた、元の抗体の配列に対する、セリンまたはスレオニン残基の１つ以上の付加または置換により行ってよい（Ｏ連結リコシル化部位の場合）。
【０２１６】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物は改変してよい。例えば抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠いている成熟炭水化物構造を有する抗体は米国特許出願第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）に記載されている。また、米国特許出願第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照できる。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物中に二分割Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）を有する抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８，Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ等および米国特許第６，６０２，６８４号，Ｕｍａｎａ等において参照されている。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖内にガラクトース少なくとも１つを有する抗体はＷＯ１９９７／３００８７，Ｐａｔｅｌ等に記載されている。更にまた自身のＦｃ領域に連結した改変された炭水化物を有する抗体に関するＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照できる。
【０２１７】
好ましいグリコシル化変異体は本明細書においては、Ｆｃ領域に結合した炭水化物構造がフコースを欠いているＦｃ領域を含む。そのような変異体は向上したＡＤＣＣ機能を有する。場合により、Ｆｃ領域は更にそこにＡＤＣＣを更に向上させるアミノ酸置換１つ以上、例えばＦｃ領域の２９８、３３３および／または３３４位の置換を含む（Ｅｕの残基ナンバリング）。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体に関する公開物の例は、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；Ｏｋａｚａｋｉ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）を包含する。脱フコシル化抗体を生産する細胞系統の例はタンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｏ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ等、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願第２００３／０１５７１０８  Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１，Ａｄａｍｓ等、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞系統、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））を包含する。
【０２１８】
変異体の別の型はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は異なる残基で置き換えられた抗体分子内のアミノ酸残基少なくとも１つを有する。置換突然変異誘発の最大の関心部位は超可変領域を包含するが、ＦＲ改変もまた意図される。保存的な置換は「好ましい置換」と題して表１に示すものである。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合は、表１において「例示される置換」と命名されたもの、またはアミノ酸のクラスに関して後述するような、より実質的な変化を導入して産物をスクリーニングしてよい。
【０２１９】
【表１】
2009525764.tif 000003
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は（ａ）例えばシートまたはらせん状のコンホーメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチドの骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または、（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するその作用において有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基を共通側鎖の特性に基づいて、下記の通りグループ分けしてよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０２２０】
非保存的置換はこれらのクラスの一方のメンバーを別のクラスと交換することを包含する。
【０２２１】
置換変異体の１つの型では、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の超可変領域残基の１つ以上が置換される。一般的に、得られた変異体でその後の開発のために選択されるものはそれらが形成される元となった親抗体と比較して向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換変異体を形成するための好都合な方法では、ファージディスプレイを用いたアフィニティー成熟化を行う。慨すれば、幾つかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を形成する。このようにして形成された抗体を、フィラメントファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイする。ファージディスプレイされた変異体を次に、本明細書に開示したその生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾に関する候補超可変領域部位を発見するためには、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施することにより抗原結合に大きく寄与している超可変領域残基を発見することができる。あるいは、または追加的に、抗体と抗原の間の接触点を発見するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合がある。このような接触残基および近隣の残基は本発明において考案した手法により置換のための候補である。このような変異体を形成した後、変異体のパネルを本明細書に記載する通りスクリーニングに付し、そして該当する試験１つ以上において優れた特性を有していた抗体を選択してその後の開発に付す。
【０２２２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られた種々の方法により製造される。これらの方法は、例えば天然原料（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、または、オリゴヌクレオチド媒介（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発および以前に作成された抗体変異体または非変異体型のカセット突然変異誘発による作成を包含する。
【０２２３】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内にアミノ酸修飾１つ以上を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を形成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体はヒンジシステインを包含するアミノ酸位置１つ以上においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでよい。本明細書の記載および当該分野の教示に従って、一部の実施形態においては、本発明の方法で使用する抗体は例えばＦｃ領域において野生型の対応する抗体と比較して改変１つ以上を含んでよいことを意図している。これらの抗体はしかしなお、その対応野生型と比較して治療利用性のために必要な実質的に同じ特性を保持している。例えば改変された（即ち向上した、または低減した）Ｃｌｑ結合および／または補体依存細胞毒性）（ＣＤＣ）をもたらすように、例えばＷＯ９９／５１６４２に記載する通り、特定の改変をＦｃ領域において行うことができる。同様にＦｃ領域変異体の別の例に関わるＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照できる。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）はＦｃＲへの向上した、または減衰した結合を有する抗体変異体を記載している。これらの特許公開の内容は特に参照により本明細書に組み込まれる。更にまた、Ｓｈｉｅｌｄｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照できる。増加した半減期および胎児への母性ＩｇＧの転移を担っている（Ｇｕｙｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体への向上した結合を有する抗体は米国特許出願第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎ等）に記載されている。これらの抗体はＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる置換１つ以上を自身内に有するＦｃ領域を含む。改変されたＦｃアミノ酸配列および増加または低下したＣ１結合能力を有するポリペプチド変異体は米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号，ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公開の内容は特に参照により本明細書に組み込まれる。更にまたＩｄｕｓｏｇｉｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照できる。
【０２２４】
抗体誘導体
本発明の抗体誘導体は、当該分野で知られ容易に入手できる別の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適する部分は水溶性重合体である。水溶性重合体の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体またはランダム共重合体の何れか）およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコールおよびこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。重合体は何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖または未分枝鎖であってよい。抗体に結合する重合体の数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じかまたは異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用する重合体の数および／または種類は、例えば向上させるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体を特定の条件下の治療に使用するのか等を考慮しながら決定することができる。
【０２２５】
所望の特性を有する抗体を得るためのスクリーニング
本発明の抗体はＦＧＦ１９に結合し、そして一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９関連作用の態様１つ以上、例えば限定しないが、ＦＧＦＲ４活性化、ＦＧＦＲ４下流分子シグナリング、ＦＧＦ１９へのＦＧＦＲ４の結合の破壊、ＦＧＦＲ４多量体化、ＣＹＰ７α１遺伝子の発現、ＦＧＦＲ４、ＭＡＰＫ、ＦＲＳ２および／またはＥＲＫ２のリン酸化、β−カテニンの活性化、ＦＧＦ１９誘発細胞遊走、および／または何れかの生物学的に関連するＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の生物学的経路の破壊、および／または、腫瘍、細胞増殖性疾患または癌の治療および／または防止、および／または、ＦＧＦ１９の発現および／または活性（例えば増大したＦＧＦ１９の発現および／または活性）に関連する疾患の治療または防止の１つ以上を調節してよい。
【０２２６】
精製された抗体は更に、一連の試験、例えば限定しないが、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズエクスクルージョン高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量スペクトル、イオン交換クロマトグラフィーおよびパパイン消化により特性化することができる。
【０２２７】
本発明の特定の実施形態においては、本明細書において製造される抗体をその生物活性に関して分析する。一部の実施形態においては、本発明の抗体はその抗原結合活性に関して試験する。当該分野で知られ、そして本発明において使用できる抗原結合試験は例えば限定しないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降試験、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイの手法を用いた任意の直接または競合的結合試験を包含する。代表的な抗原結合試験を実施例のセクションにおいて後に説明する。
【０２２８】
一部の実施形態においては、本発明はＦＧＦ１９への結合に関して下記配列：ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）を有する軽鎖可変ドメイン；および、下記配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）を有する重鎖可変ドメインを含む抗体と競合する、抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体を提供する。このような競合抗体は抗体により認識されるＦＧＦ１９エピトープと同じか重複するＦＧＦ１９エピトープを認識する抗体を包含する。このような競合抗体は下記配列：ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＰＣＫＡＳＱＤＩＮＳＦＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）を有する軽鎖可変ドメイン；および、下記配列：ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＰＧＧＧＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＬＡＮＤＴＡＩＹＦＣＶＲＫＥＹＡＮＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＡ（配列番号８）を有する重鎖可変ドメインを含む標識された抗体との競合において、固定化されたＦＧＦ１９への結合に関して抗ＦＧＦ１９ハイブリドーマ上澄みをスクリーニングすることにより得られる。競合抗体を含有するハイブリドーマ上澄みは非関連（または無）抗体を含有する対照結合混合物において検出される結合標識抗体の量と比較して、対象となる競合結合混合物において検出される結合標識抗体の量を低減することになる。本明細書に記載した競合結合試験の何れかが上記した操作法における使用に適している。
【０２２９】
本明細書に記載した特性を保有する抗ＦＧＦ１９抗体は、任意の好都合な方法により所望の特性に関して抗ＦＧＦ１９ハイブリドーマクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。例えば、ＦＧＦ１９へのＦＧＦＲ４の結合をブロックする、またはブロックしない抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体が望まれる場合は、候補抗体を結合競合試験において試験することができる。競合試験は当該分野で良く知られており、そしてそのような試験の１つは実施例において記載する通りである。
【０２３０】
抗ＦＧＦ１９抗体の抑制能力を測定するための他の機能的試験は当該分野で知られており、その一部はほめにおいて例示する通りである。
【０２３１】
一部の実施形態においては、本発明は、インビボの抗体の半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣ）は不必要または有害である多くの用途に対して、自身を望ましい候補とする、一部であるが全てではないエフェクター機能を保有する改変された抗体を意図する。特定の実施形態においては。生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を計測することにより、所望の特性のみが維持されていることを確実なものとする。インビボおよび／またはインビトロの細胞毒性試験を実施することによりＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合試験を実施することにより抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（従ってＡＤＣＣ活性を欠いている可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力は保持していることを確実なものとすることができる。ＡＤＣＣ媒介のための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に集約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロ試験の例は、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されている。このような試験のための有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。あるいは、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓ等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて試験してよい。Ｃ１ｑ結合試験はまた抗体がＣ１ｑに結合不能であり、それ故にＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために実施してよい。補体活性化を試験するためには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣ試験を実施してよい。ＦｃＲｎ結合およびインビボのクリアランス／半減期の測定もまた、当該分野で知られた方法を用いて実施できる。
【０２３２】
一部の実施形態においては、本発明は増大したエフェクター機能および／または増大した半減期を保有する改変された抗体を提供する。
【０２３３】
ベクター、宿主細胞および組み換え方法
本発明の抗体の組み換え製造のためには、それをコードする核酸を単離し、そして複製可能なベクターに挿入してその後のクローニング（ＤＮＡの増幅）に付すか、または、発現に付す。抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる等）を用いて容易に単離して配列決定される。多くのベクターが使用可能である。ベクターの選択は部分的には使用する宿主細胞による。一般的に、好ましい宿主細胞は原核生物または真核生物（一般的に哺乳類）起源の何れかのものである。当然ながら、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを包含する如何なるアイソタイプの定常領域も、この目的のために使用することができ、そしてそのような定常領域は何れかのヒトまたは動物の種から得ることができる。
【０２３４】
ａ．原核生物の宿主細胞を用いた抗体の作成
ｉ．ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は標準的な組み換え手法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ細胞などの抗体生産細胞から所望のポリヌクレオチド配列を単離して配列決定する。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成装置またはＰＣＲ手法を用いて合成することができる。得られた後、ポリペプチドをコードする配列を原核生物宿主内で複製し、異種ポリヌクレオチドを発現することができる組み換えベクター内に挿入する。当該分野で入手可能であり知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用できる。適切なベクターの選択はベクターに挿入すべき核酸の大きさ、および、ベクターで形質転換すべき特定の宿主細胞により主に決定されることになる。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現または両方）およびそれが入る特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、種々の成分を含有する。ベクター成分は一般的に、例えば複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサートおよび転写終止配列を包含する。
【０２３５】
一般的にレプリコンおよび宿主細胞と適合する種から誘導される制御配列を含有するベクターをその宿主と組み合わせて使用する。ベクターは通常は複製部位、ならびに、形質転換された細胞における表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を担持している。例えばＥ．ｃｏｌｉは典型的にはＥ．ｃｏｌｉ種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有しており、従って、形質転換された細胞を発見するための簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージはまた、内因性タンパク質の発現のために微生物により使用されることができるプロモーターを含有するか、含有するように修飾されていてよい。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はＣａｒｔｅｒ等の米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
【０２３６】
更に、レプリコンおよび宿主微生物と適合する制御配列を含有するファージベクターをそれらの宿主と組み合わせて形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１などのバクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用できる組み換えベクターを作成するときに利用してよい。
【０２３７】
本発明の発現ベクターはポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含んでよい。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する未翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは典型的には２つのクラス、即ち誘導および構成プロモーターに属する。誘導プロモーターは例えば栄養の有無または温度変化などの培養条件の変化に応答してその制御下にシストロンの転写の増大した水準を開始するプロモーターである。
【０２３８】
種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して原料ＤＮＡからプロモーターを取り出すこと、および、本発明のベクター内への単離されたプロモーター配列を挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。未変性のプロモーター配列および多くの異種のプロモーターの両方が標的遺伝子の直接の増幅および／または発現を指向するために使用してよい。一部の実施形態においては、異種のプロモーターは、未変性標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的により高値の転写および発現された標的遺伝子のより高値の収率を可能にすることから、これらが利用されている。
【０２３９】
原核生物宿主を用いる場合の使用に適するプロモーターはＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃまたはｔｒｃプロモーターを包含する。しかしながら、細菌内で機能する他のプロモーター（例えば他の既知の細菌またはファージのプロモーター）が同様に適している。そのヌクレオチド配列は公開されており、これにより当業者であればそれらを、何れかの必要な制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを用いて標的の軽鎖および重鎖をコードするシストロンに作動可能に連結することが可能である（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０２４０】
本発明の１つの態様において、組み換えベクター内の各シストロンは膜を通過する発現されたポリペプチドの転座を指向する分泌シグナル配列成分を含む。一般的にシグナル配列はベクターの成分であってよく、または、ベクター内に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの部分であってよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞により認識されプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに対して未変性であるシグナルペプチドを認識またはプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合は、シグナル配列は例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは熱安定性エンテロロキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡおよびＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。本発明の１つの実施形態において、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
【０２４１】
別の態様においては、本発明の免疫グロブリンの製造は宿主細胞の原形質内において起こることができ、従って各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点に監視、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は原形質内において発現され、折り畳まれ、そして組み立てられて機能的免疫グロブリンを形成する。特定の宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ系統）はジスルフィド結合の形成に好都合な原形質条件を提供し、これにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳みおよび組み立てを可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０２４２】
本発明の抗体を発現するために適する原核生物宿主細胞は例えばグラム陰性またはグラム陽性の生物などの原始細菌および真正細菌を包含する。有用な細菌の例はエシェリシア（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、バチルス（例えばＢ・サブチルス）、腸内細菌、シュードモナス種（例えばＰ・アエルギノーサ）、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルクレブシエラ、プロテウス、シゲラ、リゾビア、ビトレオシラまたはパラコッカスを包含する。１つの実施形態において、グラム陰性菌体を使用する。１つの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ菌体を本発明の宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の例は、菌株Ｗ３１１１（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）およびその誘導体、例えば遺伝子型Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ｌａｃＩｑｌａｃＬ８ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ｋａｎＲを有する菌株３３Ｄ３を包含する（米国特許第５，６３９，６３５号）。他の菌株およびその誘導体、例えばＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉλ１７７１（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）もまた適している。これらの例は例示的なものであり、限定するものではない。所定の遺伝子型を有する上記した細菌の何れかの誘導体を構築するための方法は当該分野で知られており、そして例えばＢａｓｓ等、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。細菌の菌体内のレプリコンの複製能力を考慮しながら適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチアまたはサルモネラ種はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＫＮ４１０などのよく知られたプラスミドを用いてレプリコンを供給する場合には、宿主として使用するのに適している。典型的には、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、そして細胞培養物には追加的なプロテアーゼ阻害剤を配合することが望ましい。
【０２４３】
ｉｉ．抗体の製造
宿主細胞は上記した発現ベクターで形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜調整された従来の栄養培地中で培養する。
【０２４４】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、または染色体組込物により複製可能であるように厳格細胞の宿主内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適する標準的な手法を用いて行う。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は一般的にはかなりの細胞壁バリアを含有する細菌細胞に対して使用されている。形質転換の別の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。更に別の手法はエレクトロポレーションである。
【０２４５】
本発明のポリペプチドを製造するために使用する原核生物の細胞は当該分野で知られ、そして選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成育させる。適当な培地の例はルリア培地（ＬＢ）＋必要な栄養補給物である。一部の実施形態においては、培地はまた発現ベクターを含有する原核生物の細胞の成育を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選ばれた選択物質を含有してよい。例えば、アンピシリンをアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成育のための培地に添加してよい。
【０２４６】
炭素、窒素および無機物リン酸塩の補給源に加えて、任意の必要な補給物も単独で導入するか、または他の補給物または培地との混合物として、例えば複合窒素源として、適切な濃度において含んでよい。場合により、培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトールおよびジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有してよい。
【０２４７】
原核生物宿主細胞は適当な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉの生育のためには、例えば好ましい温度は約２０℃〜約３９℃の範囲、より好ましくは約２５℃〜約３７℃、更に好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲である。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは好ましくは約６．８〜約７．４、更に好ましくは約７．０である。
【０２４８】
誘導プロモーターを本発明の発現ベクター中において使用する場合、タンパク質の発現はプロモーターの活性化に適する条件下に誘導する。本発明の１つの態様において、ＰｈｏＡプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。従って、形質転換された宿主細胞は導入のためのホスフェート制限培地中で培養する。好ましくは、ホスフェート制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えばＳｉｍｍｏｎｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７参照）。種々の他のインデューサーも当該分野で知られる通り、使用されるベクターコンストラクトに応じて使用してよい。
【０２４９】
１つの実施形態において、本発明の発現されたポリペプチドは宿主細胞のペリプラズム内に分泌させ、それより回収する。タンパク質の回収では、典型的には細胞の破壊を、一般的には浸透圧ショック、超音波または細部溶解などの手段により行う。細胞が破壊された後に細胞の破砕物または全細胞を遠心分離または濾過により分離してよい。タンパク質は例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより更に精製してよい。あるいは、タンパク質を培地中に移しそこで単離することもできる。生成したタンパク質を更に精製するために、細胞を培地から除去し、培養上澄みを濾過し、濃縮してよい。発現されたポリペプチドは更に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロットなどの一般的に知られた方法を用いて単離および同定することができる。
【０２５０】
本発明の１つの態様において、抗体の製造は醗酵法により大量に実施される。種々の大規模供給バッチ醗酵賞作法が組み換えタンパク質の製造のために使用できる。大規模醗酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの醗酵器は酸素と栄養物、特にグルコース（好ましい炭素原子／エネルギー源）を分散させるために攪拌羽根車を使用する。小規模醗酵とは一般的に約１００リットル以下の容量であり、約１リットル〜約１００リットルの範囲であることができる醗酵器内の醗酵を指す。
【０２５１】
醗酵過程においては、タンパク質発現の誘導は典型的には細胞が所望の密度、例えば細胞が早期定常期である約１８０〜２２０のＯＤ５５０となるまで適当な条件下に生育させた後に開始する。当該分野で知られる通り、そして、上記した通り、使用されるベクターコンストラクトに応じて種々のインデューサーを使用してよい。細胞は誘導の前に短時間生育させてよい。細胞は通常は約１２〜５０時間誘導するが、より長時間または短時間も使用してよい。
【０２５２】
本発明のポリペプチドの製造収率および品質を向上させるためには、種々の醗酵条件を変更できる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な組み立ておよび折り畳みを向上させるためには、追加的なベクター過剰発現シャペロンタンパク質、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤおよび／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペピチジルプロピルシストランス−イソメラーゼ）を使用して宿主原核生物細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は宿主細胞内で生産された異種タンパク質の適切な折り畳みおよび溶解性を促進することがわかっている。Ｃｈｅｎ等（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ等（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２５３】
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解的に感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限にするためには、タンパク質分解酵素に関して欠損である特定の宿主系統を本発明のために使用できる。例えば、宿主細胞系統はプロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩおよびその組み合わせなどの知られた細菌性プロテアーゼをコードする遺伝子内で遺伝子突然変異が起こるように修飾してよい。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損の系統が使用可能であり、例えばＪｏｌｙ等（１９９８）、上出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等の米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ等、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０２５４】
１つの実施形態において、タンパク質分解酵素について欠損であり、そしてシャペロンタンパク質１つ以上を過剰発現するプラスミドで形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ菌株が本発明の発現系における宿主細胞として使用される。
【０２５５】
ｉｉｉ．抗体の精製
当該分野で知られた標準的なタンパク質精製方法を使用することができる。以下の操作法、即ち、免疫アフィニティーまたはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＣＬ、シリカゲル上またはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法および例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過等が適当な精製操作法の例である。
【０２５６】
１つの態様において、固相上に固定化されたプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高親和性で結合するスタフィロコッカス・アウレウス由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ等（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡを固定化する固相は好ましくはガラスまたはシリカの表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔を有するガラスカラムまたはケイ酸カラムである。一部の適用例においては、カラムは、夾雑物の非特異的結合を防止するために、試薬、例えばグリセロールでコーティングされている。
【０２５７】
精製の第１工程として、上記した細胞培養物から誘導された調製物をプロテインＡ固定化固相上に適用し、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を行う。次に固相を洗浄して固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に溶出により固相から目的の抗体を回収する。
【０２５８】
ｂ．真核生物宿主細胞を用いた抗体の作成
ベクター成分は限定的ではないが一般的にはシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子１つ以上、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列の１つ以上を含む。
【０２５９】
（ｉ）シグナル配列成分
真核細胞宿主細胞において使用するためのベクターもまた目的の成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドを含有してよい。好ましく選択される異種のシグナル配列は宿主細胞により認識されプロセシングされる（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳類細胞発現においては、哺乳類シグナル配列、ならびに、ウィルス分泌リーダー、例えば単純疱疹ｇＤシグナルが使用できる。
【０２６０】
このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＮＤＡに読み枠内で連結される。
【０２６１】
（ｉｉ）複製起点
一般的に複製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要ではない。例えばＳＶ４０起点は典型的には、それが早期プロモーターを含有しているためにのみ使用してよい。
【０２６２】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子、即ち選択可能なマーカーとも称されるものを含有してよい。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか（ｂ）該当する場合は栄養要求性欠損を補充するか、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養を補給するタンパク質をコードする。
【０２６３】
選択スキームの他の例は宿主細胞の生育を停止させる薬剤を利用する。異種遺伝子で良好に形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を生産し、そしてこのため、選択環境において生存することができる。このような優性選択の例は薬剤ネオマイシン、マイコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
【０２６４】
哺乳類細胞に対する適当な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンカルボキシラーゼ等、抗体核酸を取り込む能力を有する細胞の発見を可能にするものである。
【０２６５】
例えばＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で全形質転換体を培養することによりまず発見される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統である（例えばＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）。
【０２６６】
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質および他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８などの選択可能なマーカーに関する選択剤を含有する培地中における細胞生育により選択できる。
【０２６７】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは通常は宿主生物により認識されるプロモーターを含有しそして抗体ポリペプチド核酸に作動可能に連結している。プロモーター配列は真核生物について知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子が転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に存在する別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは何れかのヌクレオチドである。大部分の真核生物遺伝子の３’末端は、コーディング配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに挿入するのに適する。
【０２６８】
哺乳類宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよびシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、または免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより、これらのプロモーターが宿主細胞系と適合する限りにおいて、制御される。
【０２６９】
ＳＶ４０ウィルスの早期および後期プロモーターは、好都合には複製のＳＶ４０ウィルス起点を同様に含有するＳＶ４０制限フラグメントとして得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは好都合にはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして得られる。ベクターとしてウシパピローマウィルスを使用する哺乳類宿主内でＤＮＡを発現するための系は米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端リピートをプロモーターとして使用できる。
【０２７０】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増大する場合が多い。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら典型的には真核細胞ウィルス由来のエンハンサーを使用することにある。例示されるものは複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、および、アデノウィルスエンハンサーを包含する。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関してはＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照できる。エンハンサーは抗体−ポリペプチドをコードする配列に対して５’または３’側の位置においてベクター内にスプライシングしてよいが、好ましくはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０２７１】
（ｖｉ）転写終止成分
真核生物宿主細胞内で使用される発現ベクターは典型的には転写の終止のため、および、ｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含有する。このような配列は真核生物またはウィルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの一般的には５’側、そして場合により３’側の未翻訳領域が得られる。これらの領域は抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示されている発現ベクターを参照できる。
【０２７２】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
ベクター内でＤＮＡをクローニングまたは発現するための適当な宿主細胞はここでは本明細書に記載した高等真核生物の細胞、例えば脊椎動物の宿主細胞を包含する。培養物（組織培養）中の脊椎動物の細胞の増殖は類型的な操作法になっている。有用な哺乳類宿主細胞系統の例はＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓系統（２９３または懸濁培養物中での生育のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｎｂ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ等、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０２７３】
宿主細胞は抗体製造のための上記した発現またはクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養する。
【０２７４】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を製造するために使用する宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞を培養するために適している。更にまたＨａｍ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許Ｒｅ．３０，９８５号に記載の培地の何れも宿主細胞のための培地として使用してよい。これらの培地の何れも必要に応じてホルモン類および／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリンまたは表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、干渉物質（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗体（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ剤）、微量元素（マイクロモル範囲の終濃度で通常存在する無機の化合物として定義される）およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補給してよい。何れかの他の必要な補給物もまた当業者の知るとおり適切な濃度で含有させてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用したものであり、そして当業者には容易に想到されるものである。
【０２７５】
（ｉｘ）抗体の精製
組み換え手法を用いる場合、抗体は細胞内に生産させるか、または、培地に直接分泌させることができる。抗体が細胞内に生産される場合は、第１工程年、宿主細胞または溶菌破断物である粒状の破砕物を例えば遠心分離または限外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合は、そのような発現系の上澄みを一般的にはまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを上記工程の何れかにおいて使用することによりタンパク質分解を抑制してよく、そして、抗生物質を添加して偶発的な夾雑菌の生育を防止してよい。
【０２７６】
細胞から調製された抗体組成物は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、ここではアフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの妥当性は抗体内に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプによるものである。プロテインＡはヒトγ１、γ２またはγ４の重鎖に基づく抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスのアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．５；１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドを結合させるマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用できる。機械的に安定なマトリックス、例えば制御された細孔を有するガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースで達成できるものよりも早い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製のために適している。タンパク質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＣＬ、シリカゲル上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上のクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈降法もまた回収すべき抗体に応じて使用される。
【０２７７】
任意の予備的精製工程の後、目的の抗体および夾雑物を含む混合物を、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）において実施される約２．５〜４．５のｐＨの溶出を用いた低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに付す。
【０２７８】
免疫複合体
本発明はまた細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬剤、成長抑制剤、毒素（例えば細菌、カビ、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント）または放射性同位体（例えば放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした本明細書に記載した抗ＯＸ４０Ｌ抗体を含む免疫複合体（互換的に「抗体薬剤コンジュゲート」即ち「ＡＤＣ」と称する）を提供する。
【０２７９】
細胞毒性または細胞生育抑制性の薬剤、即ち癌治療において腫瘍細胞を殺傷する薬剤（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）の局所送達のための抗体−薬剤コンジュゲートの使用は、理論的には、腫瘍への薬剤部分の標的にされた送達およびそこにおける細胞内蓄積を可能にし、その場合、これらのコンジュゲート薬剤の全身投与は正常細胞ならびに排除しようとする腫瘍細胞に許容できない水準の毒性をもたらす可能性がある（Ｂａｌｄｗｉｎ等、（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ等（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。このため最小限の毒性で最大の薬効とすることが求められている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はともにこれらの方策において有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ等、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法において使用されている薬剤はダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンデシンである（Ｒｏｗｌａｎｄ等、（１９８６）上出）。抗体−毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素は細菌性毒素、例えばジフテリア毒素、植物性毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ等（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ等（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ等（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ等、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３）およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ等（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）を包含する。毒素は、チュブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を包含する機序によりその細胞毒性および細胞増殖抑制作用を示す。一部の細胞毒性剤は大型の抗体またはタンパク質の受容体リガンドにコンジュゲートされると不活性化されるか、活性が低下する傾向を示す。
【０２８０】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）はチオ尿素リンカーキレーターにより結合された正常および悪性のＢリンパ球の表面上に存在するＣＤ２０抗原に対して指向されたネズミＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体と１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体からなる抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎ等（２０００）Ｅｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎ等（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇ等（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇ等（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＲＩＮはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与により重度および長期間の血球減少症が大部分の患者において起こる。カリケアマイシンに連結されたｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＹＬＯＴＡＲＧＴＭ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は注射による急性骨髄性白血病の治療のために２０００年に認可されている（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４９７０１９８号；第５０７９２３３号；第５５８５０８９号；第５６０６０４０号；第５６９３７６２号；第５７３９１１６号；第５７６７２８５号；第５７７３００１号）。マイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１にジスルフィドリンカーＳＰＰを介して連結されたｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメトラシン（Ｉｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は結腸癌、膵臓癌、胃癌など、ＣａｎＡｇを発現する癌の治療のための第ＩＩ相治験段階に入っている。マイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１に連結された抗前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は前立腺癌の潜在的治療のために開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびドラスタチンの合成類縁体はキメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のＬｅｗｉｓＹに特異的）およびｃＡＣ１０（血液悪性疾病上のＣＤ３０に特異的）（Ｄｏｒｏｍｉｎａ等．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１（７）：７７８−７８４）にコンジュゲートされており、そして治療薬開発中である。
【０２８１】
免疫複合体の形成に有用な化学療法剤は本明細書に記載する通りである（例えば上記）。使用できる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  Ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを包含する。例えば１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照できる。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用できる。例は２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを包含する。抗体および細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成される。例えば、リシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。
【０２８２】
抗体および１つ以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーロスタチン、トリコテセンおよびＣＣ１０６５および毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のコンジュゲートもまた本発明において意図している。
【０２８３】
ｉ．マイタンシンおよびマイタンシノイド
１つの実施形態において、免疫複合体はマイタンシノイド分子１つ以上にコンジュゲートされた本発明の抗体（完全長またはフラグメント）を含む。
【０２８４】
マイタンシノイドはチュブリン重合を抑制することにより機能する有糸分裂抑制剤である。マイタンシンは東アフリカの潅木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、特定の微生物もまたマイタンシノイド、例えばマイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルを生産することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成のマイタンシノールおよびその誘導体および類縁体は例えば米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０２８５】
マイタンシノイド薬剤部分は、それらが（ｉ）発酵または化学修飾、発酵生成物の誘導体化により比較的製造しやすく、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーを介したコンジュゲーションに適する官能基を用いた誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、そして（ｉｖ）種々の腫瘍細胞系統に対して有効であることから、抗体薬剤コンジュゲートにおける着目すべき薬剤部分である。
【０２８６】
マイタンシノイドを含有する免疫複合体、その製造方法およびその治療用途は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）はヒト結腸直腸癌に対して指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結したＤＭ１と指名されたマイタンシノイドを含む免疫複合体を記載している。コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対しては高度に細胞毒性であることがわかり、そしてインビボの腫瘍増殖試験において抗腫瘍活性を示している。Ｃｈａｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）はヒト結腸癌細胞系統上の抗原に結合するネズミ抗体Ａ７に、または、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のネズミモノクローナル抗体にジスルフィドリンカーを介してマイタンシノイドをコンジュゲートしている免疫複合体を記載している。ＴＡ．１−マイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性は細胞当たり３ｘ１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系統ＳＫ−ＢＲ−３に対してインビトロで試験されている。薬剤コンジュゲートは有利のマイタンシノイド薬剤と同様の細胞毒性の程度を達成しており、これは抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大させることができた。Ａ７−マイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいて低い全身細胞毒性を示した
抗体−マイタンシノイドコンジュゲートは抗体またはマイタンシノイド分子の何れかの生物学的活性を有意に低下させること無くマイタンシノイド分子に抗体を化学的に連結することにより製造する。米国特許第５，２０８，０２０号を参照できる（その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。抗体分子当たり平均３〜４個のマイタンシノイド分子をコンジュゲートすると抗体の機能または溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性を増強する場合に有効であることがわかっているが、１分子毒素／抗体であっても抗体単独の使用よりも細胞毒性を増強できることが期待される。マイタンシノイドは当該分野でよく知られており、そして知られた手法により合成するか、または、天然原料から単離することができる。適当なマイタンシノイドは例えば米国特許第５，２０８，０２０号に、そして、上記した他の特許または非特許の公開物に開示されている。好ましいマイタンシノイドはマイタンシノールおよび芳香環において、または、マインタンシノール分子の他の位置において修飾されているマインタンシノール類縁体、例えば種々のマインタンシノールエステルである。
【０２８７】
抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを作成するための当該分野で知られた連結基は多数存在し、例えば米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１およびＣｈａｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）および開示内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年１０月８日出願の米国特許出願第１０／９６０，６０２号に開示されているもの等が挙げられる。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−マイタンシノイドコンジュゲートは２００４年１０月８日出願の米国特許出願第１０／９６０，６０２号に開示されている通り製造してよい。連結基は上記特許に開示されている通りジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基を包含するが、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。別の連結器は本明細書に記載および例示する通りである。
【０２８８】
抗体とマイタンシノイドのコンジュゲートは種々の２官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してよい。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を与えるためのＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８））およびＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を包含する。
【０２８９】
リンカーは連結部の型に応じて種々の位置においてマイタンシノイド分子に結合してよい。例えば、エステル結合は従来のカップリング手法を用いてヒドロキシル基との反応により形成してよい。反応はヒドロキシル基を有するＣ３位、ヒロドキシメチルで修飾されたＣ１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ１５位およびヒドロキシル基を有するＣ２０位において起こってよい。好ましい実施形態においては、連結はマイタンシノールまたはマイタンシノール類縁体のＣ３位において形成される。
【０２９０】
ｉｉ．オーリスタチンおよびドラスタチン
一部の実施形態においては、免疫複合体はドラスタチンまたはドロスタチンペプチド類縁体および誘導体、オーリスタチン（米国特許第５６３５４８３号；第５７８０５８８号）にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。ドラスタチンおよびオーリスタチン微小管の力学的態様、ＧＴＰ加水分解および核および細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ等（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、そして、抗がん作用（米国特許第５６６３１４９号）および抗カビ活性（Ｐｅｔｔｉｔ等（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することがわかっている。ドラスタチンまたはオーリスタチン剤はペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシ）末端を介して抗体に結合させてよい（ＷＯ０２／０８８１７２）。
【０２９１】
例示されるオーリスタチンの実施形態は参照により開示内容全体が本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願の米国出願１０／９８３，３４０の「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」に開示されているＮ末端連結モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥおよびＤＦを包含する。
【０２９２】
典型的にはペプチド系薬剤部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することにより製造できる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で良く知られている液相合成法に従って製造できる（Ｅ．Ｓｃｈｒoｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌuｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照）。オーリスタチン／ドラスタチン剤部分は米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ等（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ等（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５；ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ等（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３に記載の方法に従って製造してよい。更にまた、参照により全体が本明細書に組み込まれるＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２１（７）：７７８−７８４；“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ”，ＵＳ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／９８３，３４０，ｆｉｌｅｄ  Ｎｏｖ．５，２００４（例えばリンカーおよびリンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物の製造方法を開示している）も参照できる。
【０２９３】
ｉｉｉ．カリケアマイシン
別の実施形態において、免疫複合体はカリケアマイシン分子１つ以上にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル未満の濃度において２本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの製造に関しては米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号を参照することができる（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。使用してよいカリケアマイシンの構造的類縁体は例えばγ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩｌ（Ｈｉｍｍａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）および上記したＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄへの米国特許）。抗体をコンジュゲートできる別の抗腫瘍剤は抗葉酸エステルであるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは両方とも細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介内在を介したこれらの薬剤の細胞内取り込みはその細胞毒性作用を大きく増大させる。
【０２９４】
ｉｖ．他の細胞毒性剤
本発明の抗体にコンジュゲートできる他の抗腫瘍剤はＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載の総称ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる薬剤ファミリー、ならびに、エスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を包含する。
【０２９５】
使用できる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  Ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを包含する。例えば１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照できる。
【０２９６】
本発明は更に抗体と核溶解活性を有する化合物との間に形成される免疫コンジュゲートを意図している（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）。
【０２９７】
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は高度に放射性の原子を含んでよい。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用される。例示されるものはＡＴ２１３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体を包含する。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（時期共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、更にヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含んでよい。
【０２９８】
放射標識または他の方式を知られた方法でコンジュゲートに取り込ませてよい。例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いて、ペプチドを性合成するか、またはアミノ酸化学合成法により合成してよい。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識をペプチド内のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ等（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いてヨウ素−１２３を取り込むことができる。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は他の方法を詳細に説明している。
【０２９９】
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の２官能性のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成してよい。例えば、リシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。リンカーは細胞内での細胞毒性剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してよい。
【０３００】
本発明の化合物は例えば、市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡより）交差結合因子：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣおよびスルホ−ＳＭＰＢおよびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて製造されたＡＤＣも意図している。例えば２００３−２００４Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ、ｐ４６７−４９８を参照できる。
【０３０１】
ｖ．抗体薬剤コンジュゲートの製造
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）においては、抗体（Ａｂ）を１つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体当たり約１〜約２０薬剤部分にリンカー（Ｌ）を介してコンジュゲートする。式Ｉ：
【０３０２】
【化１】
2009525764.tif 000004
のＡＤＣは、数種類の経路により、当業者の知る有機化学の反応、条件および試薬を用いて、例えば（１）共有結合を介したＡｂ−Ｌを形成するための２価リンカー試薬との抗体の親核基の反応、および、その後の薬剤部分Ｄとの反応；および（２）共有結合を介したＤ−Ｌを形成するための２価リンカー試薬との薬剤部分の親核基の反応、および、その後の抗体の親核基との反応、により製造してよい。ＡＤＣの製造のための別の方法は本明細書に記載する通りである。
【０３０３】
リンカーは１つ以上のリンカー成分を含んでよい。例示されるリンカー成分は６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）を包含する。追加的なリンカー成分は当該分野で知られており、一部は本明細書において更に説明する。更にまた内容が参照により本明細書に組み込まれる２００４年１１月５日出願の米国出願１０／９８３，３４０の「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」も参照できる。
【０３０４】
一部の実施形態においては、リンカーはアミノ酸残基を含んでよい。例示されるアミノ酸リンカー成分はジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドを包含する。例示されるジペプチドは、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）を包含する。例示されるトリペプチドは、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を包含する。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基は天然に存在するもの、ならびに少量存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸類縁体、例えばシトルリンを包含する。アミノ酸リンカー成分は特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計され、最適化されることができる。
【０３０５】
抗体上の親核基は例えば、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）糖ヒドロキシルまたはアミノ基であって抗体がグリコシル化されるところを包含する。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は親核性であり、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハライド；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基を包含するリンカー部分およびリンカー試薬上の親電子基と共有結合を形成するように反応することができる。特定の抗体は還元性の鎖間ジスルフィド、即ちシステイン架橋を有する。抗体はＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤による処理によりリンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性としてよい。即ち各システイン架橋は理論的には２つの反応性チオール親核物質を形成することになる。２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）とのリジンの反応を介して抗体に別の親核基を導入することができ、これによりアミンからチオールへの変換がもたらされる。反応性のチオール基は１、２、３、４つ以上のシステイン残基を導入することにより抗体（またはそのフラグメント）内に導入してよい（例えば非未変性のシステインアミノ酸残基１つ以上を含む突然変異体抗体を製造する）。
【０３０６】
本発明の抗体薬剤コンジュゲートはまたリンカー試薬または薬剤の上の親核性置換基と反応することができる親電子部分を導入するための抗体の修飾により製造してもよい。グリコシル化抗体の糖は例えば過ヨウ素酸塩の酸化剤で酸化することによりアルデヒドまたはケトン基とし、これをリンカー試薬または薬剤部分のアミン基と反応させてよい。形成されるイミンシッフ塩基の基は安定な連結部を形成するか、または、例えばボロハイドライド試薬で還元することにより、安定なアミン連結部を形成してよい。１つの実施形態において、ガラクトースオキシダーゼまたはｍ−過ヨウ素酸ナトリウムの何れかとのグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により薬剤上の適切な基と反応できるタンパク質中のカルボニル（アルデヒドまたはケトン）基を形成してよい（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態においては、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含有するタンパク質をｍ−過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの形成を行う（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ＆Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは薬剤部分またはリンカー親核物質と反応することができる。
【０３０７】
同様に、薬剤部分上の親核基は、例えば、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハライド；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基を包含するリンカー部分およびリンカー試薬上の親電子基と共有結合を形成するように反応することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアンヒドラジド基を包含する。
【０３０８】
あるいは、抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質、例えば組み換え手法またはペプチド合成により、作成してよい。ＤＮＡの長さは、相互に隣接するか、または、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分断されたコンジュゲートの２つの部分をコードする該当領域を含む。
【０３０９】
更に別の実施形態においては、抗体は腫瘍のプレターゲティングにおいて利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートしてよく、その場合、抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、その後、キレート剤を用いて循環系から未結合のコンジュゲートを除去し、そして次に細胞毒性剤（例えば放射性核種）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０３１０】
医薬品製剤
本発明の抗体を含む治療用製剤は、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥した製剤の形態において、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００））に所望の程度の純度を有する抗体を混合することにより保存用に製造される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は使用される用量および濃度においてレシピエントに非毒性であり、そして、緩衝物質、例えばリン酸塩、酢酸塩、ヒスチジンまたは他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；セタノール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖類、２糖類および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０３１１】
本発明の製剤はまた、治療すべき特定の適応症のために必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補足的な活性を有するものを含有してよい。このような分子は適宜、意図する目的のために有効である量において、組み合わせて存在する。
【０３１２】
活性成分はまた例えばコアセルベーション法によるか、または、界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕獲させてもよい。このような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００）に記載されている。
【０３１３】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを通過する濾過により容易に達成される。
【０３１４】
持続放出製剤を製造してよい。持続放出製剤の適当な例は本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、そのようなマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などの重合体は１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間にタンパク質を放出する。カプセル化免疫グロブリンが身体内に長時間残存する場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として、変性するか凝集し、生物学的活性を消失するか、または、免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方策は関与する機序に応じて安定化のために考案することができる。例えば、凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されれば、スルフィドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、および、特定の重合体マトリックス組成物の開発により安定化を達成してよい。
【０３１５】
用途
本発明の抗体は例えばインビトロ、エクスビボおよびインビボの治療方法において使用してよい。
【０３１６】
本発明はＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現および／または活性、例えば増大した発現および／または活性、または望ましくない発現および／または活性に関連する病状を調節するために有用な方法および組成物を提供し、該方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。一部の実施形態においては、病状はＦＧＦ１９の増大した発現に関連し、そして病状は胆汁鬱滞または胆汁酸代謝の調節不全を含む。
【０３１７】
１つの態様において、本発明は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を治療または防止するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。
【０３１８】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ１９の増大した発現および／または活性に関連する腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を治療または防止するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。
【０３１９】
１つの態様において、本発明はＦＧＦＲ４の増大した発現および／または活性に関連する腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を治療または防止するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。
【０３２０】
１つの態様において、本発明は肝臓疾患を治療および／または防止するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。一部の実施形態においては、肝臓疾患は肝硬変である。
【０３２１】
１つの態様において、本発明はるいそう疾患を治療および／または防止するための方法を提供し、方法はそのような治療の必要な個体に抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することを含む。一部の実施形態においては、個体は腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患を有する。
【０３２２】
任意の適当な抗ＦＧＦ１９抗体、例えばモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体および／または抗体フラグメントを治療方法において使用してよい。一部の実施形態においては、本明細書に記載した任意の抗ＦＧＦ１９抗体を治療のために使用する。
【０３２３】
更に、本発明の抗体の少なくとも一部は他の種由来の抗原に結合することができる。従って、本発明の抗体は例えば抗原を含有する細胞培養物において、ヒト対象において、または、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象（例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよびアカゲザル、ブタまたはマウス）において、特定の抗原活性に結合するために使用できる。１つの実施形態において、本発明の抗体は抗原活性が抑制されるように抗原に抗体を接触させることにより抗原活性を抑制すために使用できる。好ましくは、抗原はヒトタンパク質分子である。
【０３２４】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、対象内の抗原が結合するように本発明の抗体を対象に投与することを含む、増大した抗原発現および／または活性に関連する疾患に罹患した個体における抗原に結合するための方法において使用することができる。好ましくは、抗原はヒトタンパク質分子であり、そして対象はヒト対象である。あるいは、対象は本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳類であることができる。更にまた、対象は抗原が導入されている（例えば抗原の投与によるか、または、抗原トランスジーンの発現による）哺乳類であることができる。本発明の抗体は治療目的のためにヒト対象に投与することができる。更にまた、本発明の抗体は獣医科用途のため、または、ヒト疾病の動物モデルとしての、免疫グロブリンが交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳類（例えば霊長類、ブタまたはマウス）に投与できる。後者に関しては、そのような動物モデルは本発明の抗体の治療薬効を評価する（例えば用量および投与の時間的過程の試験）ために有用である。
【０３２５】
本発明の抗体は抗原分子１つ以上の発現および／または活性に関連する疾病、疾患または状態の治療、抑制、進行遅延、再発の防止／遅延、緩解または防止のために使用できる。
【０３２６】
特定の実施形態においては、コンジュゲートを患者に投与する。一部の実施形態においては、それが結合する免疫複合体および／または抗原は細胞により内在化され、これによりそれが結合している標的細胞の殺傷における免疫複合体の治療薬効の増大をもたらす。１つの実施形態において、細胞毒性剤は標的細胞内の核酸を標的とまたは妨害する。１つの実施形態において、細胞毒性剤は微小管重合を標的とまたは妨害する。そのような細胞毒性剤の例は本明細書に記載した化学療法剤の何れか（例えばマイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチンまたはカリケアマイシン）、放射性同位体、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼを包含する。
【０３２７】
本明細書における方法の何れかにおいて、本明細書の抗体と共に、第２の医薬（ここで抗体が第１の医薬となる）の有効量を対象または患者に投与してよく、それは治療を必要とする対象における状態を治療できる別の活性剤である。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤（化学療法剤とのカクテルを包含する）、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、および／または増殖阻害因子と共に共投与してよい。このような第２の医薬の型は種々の要因、例えば疾病型、例えば癌または自己免疫疾患、疾病の重症度、患者の状態および年齢、使用する第１の医薬の型および用量等に応じたものとなる。
【０３２８】
本発明の抗体月物生育を抑制する場合、例えば、それを腫瘍の生育をやはり抑制する他の治療薬１つ以上と組み合わせることが特に望ましい場合がある。例えば本発明の抗体は、投与スキームにおいて、例えば本明細書に記載した疾病の何れか、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌の治療において、抗血管形成剤、例えば抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））および／または抗ＥｐｈＢ抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）トラスツズマブ抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗ＨＥＲ２抗体、例えばＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭペルツズマブ抗ＨＥＲ２抗体）と組み合わせてよい。あるいは、または代替として、患者は複合放射線療法（例えば外部線照射または抗体などの放射標識剤を用いた療法）を受けてよい。このような上記した複合療法は複合投与（同じかまたは別個の製剤中に２つ以上の薬剤が包含される）および併用する療法の前および／または後に本発明の抗体の投与を行うことができる別個投与を包含する。更にまた、本発明の抗体を比較的非毒性の薬剤、例えば別の生体分子、例えば他の抗体と組み合わせることも、細胞に対して高毒性の他剤の化学療法剤と抗体を組み合わせる場合に対して細胞毒性を低減することが期待される。
【０３２９】
第２の医薬１つ以上と本明細書の抗体の組み合わせによる治療は、好ましくは、癌の兆候または症状の改善をもたらす。例えばそのような療法は第１の医薬のみ（例えば化学療法剤の実）で治療された患者と比較して生存（全体的生存および／または無進行生存）における改善をもたらすか、および／または、他覚的応答（部分的または完全な、好ましくは完全な）をもたらす場合がある。更にまた、本明細書の抗体と第２の医薬１つ以上の組み合わせによる治療は、好ましくは、患者に対して相加的、そしてより好ましくは相乗的な（または相加的より大きい）治療の利益をもたらす。好ましくは、この組み合わせの方法において、第２の医薬の少なくとも１投薬と本明細書の抗体の少なくとも１投薬の間のタイミングは約１か月以下、より好ましくは約２週間以下である。
【０３３０】
癌の治療の為には、第２の医薬は好ましくは別の抗体、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを包含する）、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、抗嘔吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、抗血管剤、および／または、増殖阻害因子である。細胞毒性剤はＤＮＡと相互作用する薬剤、代謝アンタゴニスト、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、または、紡錘抑制剤または安定化剤（例えば好ましくはビンカアルカロイド、より好ましくはビンブラスチン、デオキシビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビネピジン、ビンホシルチン、ビンゾリジンおよびビンフニンから選択されるもの）または化学療法に使用される何れかの薬剤、例えば５−ＦＵ、タキサン、ドキソルビシンまたはデキサメタゾンを包含する。
【０３３１】
別の実施形態においては、第２の医薬は癌を治療するために使用される別の抗体、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外ドメインに対して指向されたもの、例えばトラスツズマブ、または、その機能的フラグメントの１つ、ｐａｎ−ＨＥＲ抑制剤、Ｓｒｃ抑制剤、ＭＥＫ抑制剤またはＥＧＦＲ抑制剤（例えば抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するもの）、これは好ましくはマウスモノクローナル抗体２２５、そのマウス−ヒトキメラ誘導体Ｃ２２５、またはこの抗体２２５から誘導された、または、天然物から誘導されたヒト化抗体、ジアニリノフタルイミド、ピラゾロまたはピロロピリドピリミジン、キナジリン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＦＧ、カネルチニブ、ＥＫＢ−５６９およびＰＫＩ−１６６）または二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−２抑制剤、例えばラパタニブである。その他の第２の薬剤はアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ）、ＦａｖＩＤ（ＩＤＫＬＨ）、改変されたグリコシル化を伴ったＣＤ２０抗体、例えばＧＡ−１０１／ＧＬＹＣＡＲＴＴＭ、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥＴＭ）、サリドマイドおよびその類縁体、例えばレナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤＴＭ）、イマチニブ、ソラフェニブ、オファツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０ＴＭ）、抗ＣＤ４０抗体、例えばＳＧＮ−４０および抗ＣＤ８０抗体、例えばガリキシマブを包含する。
【０３３２】
抗嘔吐剤は好ましくは塩酸オンダンセトロン、塩酸グラニセトロン、メトロクロプラミド、ドムペリドン、ハロペリドール、サイクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、または、トロピセトロンである。ワクチンは好ましくはＧＭ−ＣＳＦＤＮＡおよび細胞系ワクチン、樹状細胞ワクチン、組み換えウィルスワクチン、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）ワクチン、同種異系または自系の腫瘍ワクチンである。鎮痛剤は好ましくはイブプロフェン、ナプロキセン、コリンマグネシウムトリサリシレート、または塩酸オキシコドンである。抗血管剤は好ましくはベバシズマブ、またはｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦである。別の第２の医薬は抗増殖剤、例えばファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、抗ＶＥＧＦ抑制剤、ｐ５３抑制剤またはＰＤＧＦＲ抑制剤を包含する。本明細書における第２の医薬はまた生物学的に標的とされた治療、例えば抗体を用いた治療、ならびに、例えば特定の受容体に対する小分子ターゲティング療法を包含する。
【０３３３】
本明細書に記載したもの、例えば定義の下に列挙したもの、および、例えばＣａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９−２５７（２０００）；Ｆｅｒｒａｒａ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３：３９１−４００（２００４）；およびＳａｔｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）により報告されたものも含めて、多くの抗血管形成剤が発見され、当該分野で知られている。更にまた米国特許出願ＵＳ２００３００５５００６も参照できる。１つの実施形態において、抗ＦＧＦ１９抗体は抗ＶＥＧＦ中和抗体（またはフラグメント）および／または別のＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば限定しないが、可溶性ＶＥＧＦ受容体（例えばＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニユーロピリン（例えばＮＲＰ１、ＮＲＰ２））フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲをブロックすることができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の低分子量阻害剤、ＶＥＧＦに対するアンチセンス法、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体；およびこれらの何れかの組み合わせと組み合わせて使用する。あるいは、または追加的に、２種以上の血管形成抑制剤を場合によりＶＥＧＦアンタゴニストおよび他の薬剤に加えて患者に共投与してよい。特定の実施形態においては、１つ以上の追加的治療薬、例えば抗癌剤を抗ＦＧＦ１９抗体、ＶＥＧＦアンタゴニストおよび抗血管形成剤と組み合わせて投与できる。
【０３３４】
本明細書において有用な化学療法剤は、例えば「化学療法剤」の定義において上記したものである。
【０３３５】
例示される第２の医薬は、アルキル化剤、ヨウ酸アンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、細胞毒性抗生物質、白金化合物または白金系の化合物、タキサン、ビンカアルカロイド、ｃ−Ｋｉｔ抑制剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管形成抑制剤、例えば抗ＶＥＧＦ抑制剤、ＨＥＲ−２抑制剤、ＥＧＦＲ抑制剤、または、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−２キナーゼ阻害剤、抗エストロゲン、例えばフルベストラントおよびホルモン療法剤、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ゲムシタビン、カペシタビン、エピルビシン、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤およびプレドニソンを包含する。最も好ましくは、癌は結腸直腸癌であり、そして第２の医薬はＥＧＦＲ抑制剤、例えばエロチニブ、抗ＶＥＧＦ抑制剤、例えばベバシツマブであるか、またはセツキシマブ、アリノテカン、イリノテカン、またはＦＯＬＦＯＸであるか、または癌は乳癌であり、そして第２の医薬は抗エステロゲンモジュレーター、例えばフルベストラント、タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤、例えばレトロゾール、エキセメスタンまたはアナストロゾールであるか、またはＶＥＧＦ抑制剤、例えばベバシツマブであるか、または化学療法剤、例えばドキソルビシンおよび／またはタキサン、例えばパクリタキセルであるか、または抗ＨＥＲ−２抑制剤、例えばトラスツズマブまたは二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−２キナーゼ阻害剤、例えばラパチニブまたはＨＥＲ−２ダウンレギュレーター、例えば１７ＡＡＧ（ヒートショックタンパク質［Ｈｓｐ］９０毒であるゲルダナマイシン誘導体）（例えばトラスツズマブで進行した乳癌に対する）である。他の実施形態においては、癌は肺癌、例えば小細胞肺癌であり、第２の医薬はＶＥＧＦ抑制剤、例えばベバシツマブまたはＥＧＦＲ抑制剤、例えばエルロチニブまたはｃ−Ｋｉｔ抑制剤、例えばイマチニブである。別の実施形態においては、癌は肝臓癌、例えば肝細胞癌であり、そして第２の医薬はＥＧＦＲ抑制剤、例えばエルロチニブ、化学療法剤、例えばドキソルビシンまたはイリノテカン、タキサン、例えばパクリタキセル、サリドマイドおよび／またはインターフェロンである。更にまた、癌のフロントライン療法のための好ましい化学療法剤は他の第２の医薬との組み合わせにおいて単独のタキソテレである。最も好ましくは、化学療法剤を投与する場合は、それをまず投与し、次に本明細書の抗体を投与する。
【０３３６】
そのような第２の医薬は本明細書に記載する抗体が投与された後４８時間以内、または該薬剤後２４時間以内、または１２時間以内、または３〜１２時間以内に投与してよく、または、所定期間に渡って投与してよく、それは好ましくは約１〜２日である。更にまた、そのような薬剤の用量は治療量未満であってもよい。
【０３３７】
本明細書の抗体は第２の医薬と同時、逐次的または交互に、または、他剤療法の非応答時に投与することができる。即ち第２の医薬との複合投与は、別個の製材または単一の医薬品製剤を用いる共投与（同時投与）、および何れかの順序における連続投与を包含し、その場合、両方（または全て）の医薬が同時にその生物学的活性を発揮する時間帯があることが望ましい。全てのこれらの第２の医薬は、本明細書において使用する「第２の医薬」という表記はそれらが第１の医薬以外の唯一の医薬であることをそれぞれ意味しているわけではないように、相互に組み合わせて、またはそれら自体、第１の医薬と共に使用してよい。即ち、第２の医薬は１つの医薬である必要はなく、そのような薬剤の１つより多くを構成乃至は含むことができる。
【０３３８】
第２の医薬は本明細書に記載する通り、一般的に、第１の医薬と同じ用量において、そして同じ投与経路を用いて、または、第１の医薬の用量の約１〜９９％で投与する。そのような第２の医薬を完全に使用する場合は、それらは、特に第１の医薬との初回投薬以降の後の投薬においては、第１の医薬が存在しない場合よりも低値の量において使用され、これによりこれらにより誘発される副作用を排除または低減する。
【０３３９】
本発明はまた、回帰性の腫瘍の生育または回帰性の癌細胞の生育を抑制または防止するための方法および組成物を提供する。回帰性の腫瘍増殖または回帰性の癌細胞の生育とは、現在使用可能な療法１つ以上（例えば癌療法、例えば化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、および／または、生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌に対する標準的な療法用法）を受けているかそれにより治療されている患者が患者を治療するために臨床的に不十分であるか、または、患者が追加的な有効療法を必要とするように治療から何れかの有利な作用を受けることがもはや無い状況を指す。本明細書においては、その表現はまた、例えば、治療に応答する患者がなお副作用に罹患している、抵抗性を発生させている、治療に応答しない、治療に十分応答しない等を説明する「非応答性／難治性」患者の状態を指す場合がある。種々の実施形態において、癌は回帰性の腫瘍増殖または回帰性の癌細胞の生育であり、その場合、癌細胞の数は有意に低減していないか、または増大しており、あるいは、腫瘍の大きさが有意に低減していないか、または増大しており、あるいは、癌細胞の大きさまたは数における如何なるそれ以上の低減も不可能である。癌細胞が回帰性の腫瘍増殖または回帰性の癌細胞の生育であるかどうかの判断は、そのような関連において、「回帰性」または「難治性」または「非応答性」の当該分野で許容されている意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性を試験するための、当該分野で知られた何れかの方法により、インビボまたはインビトロの何れかで行うことができる。抗ＶＥＧＦ治療に抵抗性の腫瘍は回帰性の腫瘍増殖の一例である。
【０３４０】
本発明は対象における回帰性の腫瘍増殖または回帰性の癌細胞の生育をブロックまたは低減するために抗ＦＧＦ１９抗体１つ以上を投与することによる対象における回帰性の腫瘍増殖または回帰性の癌細胞の生育をブロックまたは低減する方法を提供する。特定の実施形態においては、アンタゴニストは癌治療薬の後に投与できる。特定の実施形態においては、抗ＦＧＦ１９抗体は癌治療薬と同時に投与する。あるいは、または追加的に、抗ＦＧＦ１９抗体療法は他の癌療法と交互に行ってよく、それは何れかの順序において実施できる。本発明はまた、癌を有する素因がある患者における癌の発症または再発を防止するために抑制性抗体１つ以上を投与するための方法を包含する。一般的に、対象は癌療法を同時に進行させていたか、させている。１つの実施形態において、癌療法は抗血管形成剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストを用いた治療である。抗血管形成剤は当該分野で知られたものおよび本明細書における定義の下に記載したものを包含する。１つの実施形態において、抗血管形成剤は抗ＶＥＧＦ中和抗体またはフラグメント（例えば、ヒト化Ａ４．６．１，ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ），Ｙ０３１７，Ｍ４，Ｇ６，Ｂ２０，２Ｃ３等）である。例えば米国特許第６，５８２，９５９号、第６，８８４，８７９号、第６，７０３，０２０号；ＷＯ９８／４５３３２；ＷＯ９６／３００４６；ＷＯ９４／１０２０２；ＥＰ  ０６６６８６８Ｂ１；米国特許出願第２００３０２０６８９９号、第２００３０１９０３１７号、第２００３０２０３４０９号および第２００５０１１２１２６号；Ｐｏｐｋｏｖ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４（２００４）；およびＷＯ２００５０１２３５９．を参照できる。回帰性の腫瘍増殖または回帰性の癌細胞の生育をブロックまたは低減するためにＶＥＧＦアンタゴニストおよび抗ＦＧＦ１９抗体と組み合わせて別の薬剤を投与することができる。
【０３４１】
本発明の抗体（および副次的治療薬）は何れかの適当な手段、例えば非経腸、皮下、腹腔内、肺内および鼻内、および、所望により局所投与、患部内投与により投与される。非経腸注入は筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を包含する。更にまた、抗体は適宜、特に抗体の漸減用量によるパルス注入により投与される。投薬は何れかの適当な経路、例えば注射、例えば静脈内または皮下注射により行うことができ、これは部分的には投与が短期であるか長期であるかにより決まる。
【０３４２】
本発明の抗体組成物は良好な医療上の慣行に合致した態様において製剤され、容量決定され、そして投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の疾患、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程および医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は必然ではないが場合より問題となる疾患の防止または治療のために現在使用中の薬剤１つ以上とともに製剤される。そのような他剤の有効量は製剤中に存在する本発明の抗体の量、疾患または治療の種類および上記した他の要因に応じたものである。これらは一般的には以前に使用されていたものと同じ用量および投与経路において、または、以前に使用されていた用量の１〜９９％で使用される。
【０３４３】
疾病の予防または治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独使用、または他剤との組み合わせにおいて）は治療すべき疾病の種類、抗体の種類、疾病の重症度および経過、抗体を予防または治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴および抗体に対する応答性、および担当医の判断に応じて変動する。抗体は適宜、患者に対し、単回、または一連の治療に渡って投与する。疾病の種類および重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量である。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、投与は所望の疾病症状の抑制が起こるまで持続する。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。即ち、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（またはこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は間歇的に、例えば毎週または３週毎（例えば患者が約２〜約２０、例えば約６抗体投薬を受けるように）投与してよい。初期の高値の負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。例示される用量用法は約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量を投与した後、抗体約２ｍｇ／ｋｇの週当たり維持用量を含む。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法および試験により容易にモニタリングされる。
【０３４４】
本発明の抗ＦＧＦ１９抗体は、抗体が後述するように標識される、および／または、不溶性マトリックスに固定化される、特異的な細胞または組織におけるＦＧＦ１９発現を検出する試験（例えば診断または予後試験）において有用である。しかしながら、如何なる適当な抗ＦＧＦ１９抗体も検出および診断を行う実施形態において使用してよい。抗ＦＧＦ１９抗体を作成するための幾つかの方法は本明細書に記載する通りであり、抗ＦＧＦ１９抗体を作成するための方法は当該分野で良く知られている。
【０３４５】
別の態様において、本発明はＦＧＦ１９の検出のための方法を提供し、方法は試料中のＦＧＦ１９−抗ＦＧＦ１９抗体複合体を検出することを含む。「検出」という用語は本明細書においては、対照との比較対照を行うか行わない、定性的および／または定量的な検出（レベルの計測）を包含する。
【０３４６】
別の態様において、本発明はＦＧＦ１９の発現および／または活性に関連する疾患を診断するための方法を提供し、方法は疾患を有するか有することが疑われる患者に由来する生物学的試料中のＦＧＦ１９−抗ＦＧＦ１９抗体複合体を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は増大した発現または異常な（望ましくない）発現である。
【０３４７】
別の態様において、本発明は抗ＦＧＦ１９抗体が検出可能な標識を有する場合の本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体の何れかを提供する。
【０３４８】
別の態様において、本発明は何れかの本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体およびＦＧＦ１９の複合体を提供する。一部の実施形態においては、複合体はインビボまたはインビトロにある。一部の実施形態においては、複合体は癌細胞を含む。一部の実施形態においては、抗ＦＧＦ１９抗体は検出可能に標識される。
【０３４９】
抗ＦＧＦ１９抗体（例えば本明細書に記載したＦＧＦ１９抗体の何れか）は多くの良く知られた検出試験方法の何れか１つにおいてＦＧＦ１９の検出のために使用できる。
【０３５０】
１つの態様において、本発明はＦＧＦ１９の発現および／または活性に関連する疾患を検出するための方法を提供し、方法は個体由来の生物学的試料中のＦＧＦ１９を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、疾患は、腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍のものである。
【０３５１】
別の態様において、本発明は個体に対する治療を選択するための方法を提供し、方法は（ａ）個体の生物学的試料中のＦＧＦ１９発現を検出すること；および（ｂ）工程（ａ）の後に個体に対する治療を選択すること、ここで治療の選択は工程（ａ）で検出されたＦＧＦ１９発現に基づくこと、を含む。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現を検出し、そして、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療を選択する。抗ＦＧＦ１９抗体を用いた疾患の治療方法は本明細書に記載する通りであり、そして一部の方法は本明細書において例示する。
【０３５２】
別の態様において、本発明は抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することにより癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患または肝臓疾患（例えば肝硬変）を有するか、有することが疑われる個体を治療するための方法を提供し、更にここで、ＦＧＦ１９の発現および／またはＦＧＦＲ４の発現は、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後においてヒト患者由来の細胞および／または組織において検出される。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の過剰発現を、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に検出する。発現は抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前；最中；後；前および最中；前および後；最中および後、；または前、最中および後に検出してよい。抗ＦＧＦ１９抗体を用いた疾患の治療方法は本明細書に記載する通りであり、そして一部の方法は本明細書において例示する。
【０３５３】
例えば、生物学的試料は、所望の原料に由来する試料を得ること、試料に抗ＦＧＦ１９抗体を添加混合して混合物中にＦＧＦ１９が存在する場合は抗体がそれと抗体／ＦＧＦ１９複合体を形成できるようにすること、および、混合物中に抗体／ＦＧＦ１９複合体が存在すればそれを検出することにより、ＦＧＦ１９に関して試験してよい。生物学的試料は特定の試料に対して適当である当該分野で知られた方法により試験のために調製してよい。試料と抗体を添加混合する方法および抗体／ＦＧＦ１９複合体を検出する方法は使用する試験の型に応じて選択する。そのような試験は免疫組織化学的分析、競合的およびサンドイッチ試験および立体抑制試験を包含する。試料の調製の為には、哺乳類（典型的にはヒト患者）に由来する組織または細胞試料を使用してよい。試料の例は限定しないが、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、リンパ腫および白血病の癌細胞を包含する。試料は当該分野で知られた種々の操作法、例えば限定しないが、外科的摘出、吸引または生検により得ることができる。組織は新鮮または凍結物出会ってよい。１つの実施形態において、試料は固定してパラフィン等に包埋する。組織試料は従来の方法により固定（即ち保存）してよい（例えばＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｒｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９６０）Ｌｅｅ  Ｇ，Ｌｕｎａ，  ＨＴ（ＡＳＣＰ）Ｅｄｉｔｏｒ，Ｔｈｅ  Ｂｌａｃｋｓｔｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｕｌｒｅｋａ  Ｖ．Ｍｉｋｅｌ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｓｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．参照）。当業者の知る通り、固定材の選択は試料を組織学的に染色するか別様に分析する目的により決定される。やはり当業者の知る通り、固定の長さは組織試料の大きさおよび使用する固定材に応じたものとなる。例示すれば、中性緩衝ホルマリン、Ｂｏｕｉｎまたはパラホルムアルデヒドを試料を固定するために使用してよい。一般的に、試料をまず固定し、そして次にアルコールの漸増列を介して脱水し、パラフィンまたは他の切片化媒体に浸潤させて包埋し、これにより、組織試料を切片化してよい。あるいは、組織を切片化し、得られた切片を固定化してもよい。例示すれば、組織試料を従来の方法によりパラフィンに包埋して処理してよい（例えば上出のＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ参照）。使用してよいパラフィンの例は、限定しないが、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、ＢｒｏｌｏｉｄおよびＴｉｓｓｕｅｍａｙを包含する。組織を包埋した後、試料をミクロ���ーム等で切片化してよい（例えば上出のＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ参照）。この操作法に関して例示すれば、切片は約３ミクロン〜約５ミクロンの厚みの範囲としてよい。切片化の後、切片を数種の標準的な方法によりスライドに接着させる。スライド接着剤の例は限定しないが、シラン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジンなどを包含する。例示すればパラフィン包埋切片を正荷電のスライドおよび／またはポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたスライドに接着させてよい。パラフィンは包埋用材料として使用されている場合は、組織切片は一般的には脱パラフィン処理して水に再水和させる。組織切片は数種の従来の標準的方法により脱パラフィンしてよい。例えば、キシレンおよび漸減列のアルコールを使用してよい（例えば上出のＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ参照）。あるいは、市販の脱パラフィン用の非有機性の薬剤、例えばＨｅｍｏ−Ｄｅ７（ＣＭＳ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）を使用してよい。
【０３５４】
ＦＧＦ１９に関する分析方法は全て、以下の試薬、即ち、標識されたＦＧＦ１９類縁体、固定化されたＦＧＦ１９類縁体、標識された抗ＦＧＦ１９抗体、固定化された抗ＦＧＦ１９抗体および立体コンジュゲートの１つ以上を使用する。標識された試薬は「トレーサー」としても知られている。
【０３５５】
使用される標識はＦＧＦ１９および抗ＦＧＦ１９抗体の結合を妨害しない何れかの検出可能な官能性のものである。イムノアッセイにおける使用のための多くの標識が知られており、その例としては、直接検出してよい部分、例えば蛍光色素、ケミルミネセントおよび放射性の標識、ならびに、検出されるためには反応または誘導体化しなければならない部分、例えば酵素が包含される。
【０３５６】
使用される標識はＦＧＦ１９および抗ＦＧＦ１９抗体の結合を妨害しない何れかの検出可能な官能性のものである。イムノアッセイにおける使用のための多くの標識が知られており、その例としては、直接検出してよい部分、例えば蛍光色素、ケミルミネセントおよび放射性の標識、ならびに、検出されるためには反応または誘導体化しなければならない部分、例えば酵素が包含される。そのような標識の例は放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、蛍光団、例えば希土類のキレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ただしＨＲＰ、ラクトパーオキシダーゼまたはミクロパーオキシダーゼなどの染料前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素とカップリングさせたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル等を包含する。
【０３５７】
これらの標識をタンパク質オアポリペプチドに共有結合させるためには従来の方法が使用される。例えばカップリング剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビスイミデート、ビスジアゾ化ベンジジン等を用いることにより、上記した蛍光、ケミルミネセントおよび酵素標識で抗体をタグ付けしてよい。例えば米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光分析）および第３，６４５，０９０号（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４−１０２１（１９７４）；Ｐａｉｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４０：２１９−２３０（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７−４１２（１９８２）を参照できる。本明細書における好ましい標識はセイヨウワサビパーオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素である。そのような標識、例えば酵素の抗体へのコンジュゲーションはイムノアッセイ手法における当業者にとって標準的に操作できる操作法である。例えばＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ，Ｖｏｌ．７３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１），ｐｐ．１４７−１６６を参照できる。
【０３５８】
試薬の固定化が特定の試験方法には必要である。固定化は溶液中に遊離して残存しているＦＧＦ１９がある場合はそれから抗ＦＧＦ１９抗体を分離することを伴う。これは好都合には、試験の操作法の前に抗ＦＧＦ１９抗体またはＦＧＦ１９類縁体を、例えば水不溶性マトリックスまたは表面への吸着（Ｂｅｎｎｉｃｈ等、米国特許第３，７２０，７６０号）によるか、共有結合カップリング（例えばグルタルアルデヒド交差結合を用いる）により不溶性化するか、またはその後に抗ＦＧＦ１９抗体またはＦＧＦ１９類縁体を例えば免疫沈降により不溶性化することによるかの何れかにより、達成される。
【０３５９】
試料中のタンパク質の発現は免疫組織化学および染色のプロトコルを用いて調べてよい。組織切片の免疫組織学的染色は、試料中のタンパク質の存在を試験または検出する信頼性の高い方法であることがわかっている。免疫組織化学（ＩＨＣ）の手法は一般的に発色性または蛍光による方法により、インサイチュで細胞抗原をプローブして可視化するために抗体を利用している。試料調製の為には哺乳類（典型的にはヒト患者）由来の組織または細胞の試料を使用してよい。試料は当該分野で知られた種々の操作法、例えば限定しないが、外科的摘出、吸引または生検により得ることができる。組織は新鮮または凍結されていてよい。１つの実施形態において試料はパラフィン等に固定化および包埋する。組織試料は従来の方法により固定（即ち保存）してよい。当業者の知る通り、固定剤の選択は試料を組織学的に染色または別様に分析する目的により決定される。当該分野で知られる通り、固定の長さは組織試料の大きさおよび使用する固定剤による。
【０３６０】
ＩＨＣは別の手法、例えば形態学的染色および／または蛍光インサイチュハイブリダイゼーションと組み合わせて実施してよい。ＩＨＣの２つの一般的方法；直接および間接的な試験が使用できる。第１の試験によれば、標的抗原（例えばＦＧＦ１９）への抗体の結合を直接測定する。この直接測定は標識された試薬、例えば蛍光タグまたは酵素標識一次抗体を使用し、これはそれ以上の抗体相互作用を伴うことなく可視化することができる。典型的な間接的試験においては、未コンジュゲートの抗体を酵素標識にコンジュゲートし、色素原性または蛍光原性の基質を添加することにより抗原の可視化を行う。シグナル増幅が起こる理由は、数種の二次抗体が一次抗体の異なるエピトープと反応する場合があるためである。
【０３６１】
免疫組織化学のために使用される一次および／または二次抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。後述するカテゴリーに一般的にグループ分けすることができる多くの標識が使用できる。
【０３６２】
上記考察した試料調製の操作法のほかに、ＩＨＣの前、最中または後に組織切片を更に処理することが望ましい場合があり、例えば、クエン酸緩衝液中で組織試料を加熱する等のエピトープ回復方法を行ってよい（例えばＬｅｏｎｇ等、Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．４（３）：２０１（１９９６）参照）。
【０３６３】
任意のブロッキング工程の後、組織試料中の標的タンパク質抗原に一次抗体が結合するような十分な時間および適当な条件下において、組織切片を一次抗体に曝露する。これを達成するための適切な条件は定型的実験により決定できる。試料への抗体の結合の程度は上記考察した検出可能な標識の何れか１つを用いることにより測定される。好ましくは、標識は３，３‘−ジアミノベンジジン色素原などの色素原性の基質の化学的改変を触媒する酵素標識（例えばＨＲＰＯ）である。好ましくは、酵素標識は一次抗体に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされる（例えば一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、そして二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である）。
【０３６４】
このようにして調製された標本をマウントし、カバーガラスで覆ってよい。次にスライドガラスの評価を、例えば顕微鏡を用いて行い、そして、当該分野で定型的に使用されている染色強度基準を用いてよい。
【０３６５】
競合的またはサンドイッチ試験として知られている他の試験法は十分確立されており、そして商業的な診断薬産業において広範に使用されている。
【０３６６】
競合的試験は抗ＦＧＦ１９抗体抗原結合部位の限定された数に対して被験試料ＦＧＦ１９と競合するトレーサーＦＧＦ１９類縁体の能力に依存している。抗ＦＧＦ１９抗体は一般的に競合の前または後に不溶性化され、そして次にトレーサーおよび抗ＦＧＦ１９抗体に結合したＦＧＦ１９を未結合のトレーサーおよびＦＧＦ１９から分離する。この分離は傾瀉（結合相手が予め不溶性化されている場合）によるか、または、遠心分離（結合相手が競合的反応の後に沈殿している場合）により行う。被験試料のＦＧＦ１９の量はマーカー物質の量により測定した場合の結合トレーサーの両に反比例する。ＦＧＦ１９の既知量による用量応答曲線を作成し、そして被験試料の結果と比較することにより被験試料中に存在するＦＧＦ１９の量を定量的に測定する。これらの試験は酵素が検出可能なマーカーとして使用される場合にはＥＬＩＳＡ系と称する。
【０３６７】
競合定期試験の別の種類は「均質性」試験と称され、相分離を必要としない。ここでは、抗ＦＧＦ１９抗体がＦＧＦ１９に結合する場合に抗ＦＧＦ１９抗体の存在が酵素活性を変調させるように、ＦＧＦ１９との酵素のコンジュゲートを作成して使用する。この場合、ＦＧＦ１９またはその免疫学的に活性なフラグメントをパーオキシダーゼなどの酵素に二官能性の有機の架橋を用いてコンジュゲートする。コンジュゲートは、抗ＦＧＦ１９抗体の結合が標識の酵素活性を阻害または強化するように、抗ＦＧＦ１９抗体との使用のために選択する。この方法自体はＥＭＩＴの名称の下に広範に実施されている。
【０３６８】
立体コンジュゲートは均質性試験のための立体疾患法において使用される。これらのコンジュゲートは、ハプテンに対する抗体が抗ＦＧＦ１９抗体と同時にはコンジュゲートに結合することが実質的に不可能であるように小型ＦＧＦ１９フラグメントに低分子量ハプテンを共有結合することにより合成する。この試験の操作法の下においては、被験試料中に存在するＦＧＦ１９は抗ＦＧＦ１９抗体に結合することになり、これにより、抗ハプテンがコンジュゲートに結合できるようにし、コンジュゲートハプテンの態様に変化、例えばハプテンが蛍光団である場合は蛍光に変化が生じる。
【０３６９】
サンドイッチ試験は特にＦＧＦ１９または抗ＦＧＦ１９抗体の測定のために有用である。逐次的サンドイッチ試験の場合は、固定化された抗ＦＧＦ１９抗体を用いて被験試料ＦＧＦ１９を吸着し、被験試料を洗浄により除去し、結合ＦＧＦ１９を用いて第２の標識された抗ＦＧＦ１９抗体を吸着し、そして次に結合した物質を残留トレーサーから分離する。結合トレーサーの量は被験試料ＦＧＦ１９に直接的に比例する。「同時」サンドイッチ試験においては被験試料は標識された抗ＦＧＦ１９の添加の前には分離されない。１つの抗体として抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体を、もう１つの抗体としてポリクローナル抗ＦＧＦ１９抗体を用いる逐次的サンドイッチ試験がＦＧＦ１９の試料を試験する場合に有用である。
【０３７０】
上記はＦＧＦ１９に関する単なる例示される検出試験である。ＦＧＦ１９の測定のために抗ＦＧＦ１９抗体を使用する現在または将来開発される他の方法も、本明細書に記載したバイオアッセイを含めてその範囲に包含される。
【０３７１】
１つの態様において、本発明はヒト対象などの個体に由来する生物学的試料中のポリヌクレオチド（例えばＦＧＦ１９ポリヌクレオチド）を検出（例えば存在または非存在または量）するための方法を提供する。ポリヌクレオチドを検出するための種々の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ｔａｑｍａｎ、増幅方法、ポリヌクレオチドマイクロアレイ等を使用することができる。
【０３７２】
ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の検出のための方法はよく知られており、そして例えばＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション試験（例えば標識されたＦＧＦ１９リボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション）、ノーザンブロットおよび関連の手法、および種々の核酸増幅試験（例えばＦＧＦ１９に特異的な相補プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型検出方法、例えば分枝鎖ＤＮＡ、ＳＰＩＡ、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等）を包含する。
【０３７３】
哺乳類由来の生物学的試料は例えばＦＧＦ１９ｍＲＮＡに対して、ノーザン、ドットブロットまたはＰＣＲ分析を用いて、好都合に試験することができる。例えば定量的ＰＣＲ試験などのＲＴ−ＰＣＲは当該分野で良く知られている。本発明の説明のための実施形態においては、生物学的試料中のＦＧＦ１９ｍＲＮＡを検出するための方法は少なくとも１つのプライマーを用いて逆転写により試料からｃＤＮＡを生成すること；そのようにして生成されたｃＤＮＡをＦＧＦ１９ポリヌクレオチドをセンスおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅することによりその中でＦＧＦ１９ｃＤＮＡを増幅すること；および増幅されたＦＧＦ１９ｃＤＮＡの存在または非存在を検出することを含む。更にまた、そのような方法は生物学的試料中のＦＧＦ１９ｍＲＮＡの量（レベル）を測定可能（例えばアクチンファミリーメンバーなどのハウスキーピング遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることにより）とする工程１つ以上を包含できる。場合により増幅されたＦＧＦ１９ｃＤＮＡの配列を決定することができる。
【０３７４】
プローブおよび／またはプライマーは検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、蛍光化合物、バイオルミネセント化合物、ケミルミネセント化合物、金属キレート形成剤または酵素で標識してよい。そのようなプローブおよびプライマーは試料中のＦＧＦ１９ポリヌクレオチドの存在を検出するために、そして、ＦＧＦ１９タンパク質を発現している細胞を検出するための手段として使用できる。当該分野で知られる通り、多数種類の異なるプライマーおよびプローブを作成し（例えば本明細書に記載する配列に基づいて）、そして、ＦＧＦ１９ｍＲＮＡの増幅、クローニング、および／または、存在または非存在および／または量の測定のために効果的に使用してよい。
【０３７５】
本発明の任意の方法はマイクロアレイの技術を用いた組織または細胞の試料におけるＦＧＦ１９ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの検出を含む。例えば、核酸マイクロアレイを用いて、被験および対照の組織試料に由来する被験および対照ｍＲＮＡ試料を逆転写し、そして標識することによりｃＤＮＡプローブを作成する。次にプローブを固体支持体上に固定化された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイはアレイの各メンバーの配列および一がわかるように構成する。例えば、特定の病状において発現される潜在性を有する遺伝子の選択肢を固体支持体上にアレイ化してよい。特定のアレイメンバーとの標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブの誘導元である試料がその遺伝子を発現することを示している。疾病組織の示差的遺伝子発現分析により価値ある情報が得られる。マイクロアレイ技術は核酸ハイブリダイゼーション技術およびコンピューター技術を利用することにより単一の実験内で数千遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを評価している（例えば２００１年１０月１１日公開のＷＯ０１／７５１６６参照（アレイ作成の考察に関しては例えば米国特許第５，７００，６３７号、米国特許第５，４４５，９３４号および米国特許第５，８０７，５２２号、Ｌｏｃｋａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１（Ｓｕｐｐｌ）：１５−１９（１９９９）を参照できる））。ＤＮＡマイクロアレイはガラスまたは他の基盤上に直接合成されるか、またはスポットされる遺伝子フラグメントを含有する細密アレイである。単一のアレイに通常数千の遺伝子が提示されている。典型的なマイクロアレイ実験では以下の工程、即ち１．試料から単離されたＲＮＡに由来する蛍光標識された標的の調製、２．マイクロアレイへの標識標的のハイブリダイゼーション、３．アレイの洗浄、染色およびスキャン、４．スキャンされた画像の分析、および５．遺伝子発現プロファイルの作成を行う。現在では２つの主要な型のＤＮＡマイクロアレイ、即ちオリゴヌクレオチド（通常は２５〜７０量体）アレイおよびｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含有する遺伝子発現アレイが使用されている。アレイを形成する場合、オリゴヌクレオチドをあらかじめ作成し、そして表面上にスポットするか、または表面上で直接合成することができる（インサイチュ）。
【０３７６】
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）システムはガラス表面上のオリゴヌクレオチドの直接合成により作成されたアレイを含む市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチドは通常２５量体であり、半導体系写真石版法および固相化学合成技術の組み合わせによりガラスウエハ上に直接合成される。各アレイは４００，０００種までの異なるオリゴを含有し、各オリゴは数百万コピー存在する。オリゴヌクレオチドプローブはアレイ上の既知位置において合成されるため、ハイブリダイゼーションのパターンおよびシグナル強度はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅソフトウエアにより遺伝子の識別情報および相対的発現レベルの項目において解釈することができる。各遺伝子は異なるオリゴヌクレオチドプローブのシリーズによりアレイ上に提示される。各プローブ対は完全マッチのオリゴヌクレオチドおよびミスマッチのオリゴヌクレオチドからなる。完全マッチプローブは特定の遺伝子に厳密に相補である配列を有し、そしてこれにより、遺伝子の発現を計測する。ミスマッチプローブは標的遺伝子転写物の結合を混乱させる中央塩基位置における１塩基置換により、完全マッチプローブとは異なる。これは完全マッチオリゴに関して計測されるシグナルに寄与するバックグラウンドおよび非特異的ハイブリダイゼーションの測定を支援する。ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅソフトウエアは各プローブセットに関する絶対的または特異的な強度の値を測定するためにミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を完全マッチプローブのものから差し引く。プローブはＧｅｎＢａｎｋおよび他のヌクレオチドのレポジトリーから得た現在の情報に基づいて選択する。配列は遺伝子の３’末端のユニークな領域を認識すると考えられる。ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン（「ロティサリーオーブン」）を用いて１回で６４アレイまでのハイブリダイゼーションを実施する。流体工学ステーションがプローブアレイの洗浄および染色を実施する。完全に自動化されており、４つのモジュールを含有し、各モジュールが１プローブアレイを保持している。各モジュールは予備プログラムされた流体工学プロトコルを用いてＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅソフトウエアにより独立して制御されている。スキャナはプローブアレイに結合した標識ｃＲＮＡにより発射される蛍光の強度を計測する共焦点レーザー蛍光スキャナである。ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅソフトウエアを有するコンピューターワークステーションが流体工学ステーションおよびスキャナを制御する。ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅソフトウエアはプローブアレイに対して予備プログラムされたハイブリダイゼーション、洗浄および染色のプロトコルを用いて８つまでの流体工学ステーションをコントロールすることができる。ソフトウエアはまた、適切なアルゴリズムを用いて各遺伝子に対してハイブリダイゼーション強度データを獲得し、存在／非存在のコールに変換する。最後に、ソフトウエアは比較分析により実験間の遺伝子発現の変化を検出し、そしてアウトプットをテキストファイルにフォーマットし、これは別のデータ分析のための別のソフトウエアプログラムと共に使用できる。
【０３７７】
一部の実施形態においてはＦＧＦ１９遺伝子の欠失、遺伝子突然変異または遺伝子の増幅を検出する。遺伝子の欠失、遺伝子突然変異または増幅は当該分野で知られた広範な種々のプロトコルの何れか１つにより、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）または適切に標識されたプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、細胞遺伝子的方法または適切に標識されたプローブを用いた比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）により、計測してよい。更にまた、これらの方法はＦＧＦ１９リガンドの遺伝子欠失、リガンド突然変異または遺伝子増幅を検出するために使用してよい。本明細書においては、「ＦＧＦ１９発現を検出する」とは、ＦＧＦ１９の遺伝子欠失、遺伝子牟田または遺伝子増幅を検出することを包含する。
【０３７８】
更にまた、組織または細胞の試料中のＦＧＦ１９遺伝子のメチル化状態を調べることもできる。遺伝子の５’調節領域におけるＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化および／またはメチル化亢進は不朽化および形質転換された細胞において頻発し、そして種々の遺伝子の改変された発現をもたらす場合がある。遺伝子のメチル化状態を調べるための種々の試験が当該分野で良く知られている。例えば、サザンハイブリダイゼーションの方策においては、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を試験するためにメチル化ＣｐＧ部位を含有する配列を切断できないメチル化感受性制限酵素を利用できる。更にまた、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は所定の遺伝子のＣｐＧアイランドに存在するすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態を迅速にプロファイリングすることができる。この操作法では、重亜硫酸ナトリウム（全ての未メチル化シトシンをウラシルに変換する）によるＤＮＡの初期修飾、次いでメチル化ｖｓ未メチル化ＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いた増幅を行う。メチル化干渉を行うプロトコルもまた例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ１２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編、１９９５；ＤｅＭａｒｚｏ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９）；Ｂｒｏｏｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１−５３６；およびＬｅｔｈｅ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７６（６）：９０３−９０８（１９９８）に記載されている。本明細書においては、「ＦＧＦ１９発現を検出する」とはＦＧＦ１９遺伝子メチル化の検出を包含する。
【０３７９】
本出願の実施例はヒトの原発の肝臓、肺および結腸の腫瘍において、そして、結腸癌細胞系統においてＦＧＦＲ４が発現されること、および、更に、ＦＧＦ１９及ぶＦＧＦＲ４がヒトの原発の肝臓、肺および結腸の腫瘍において、そして、結腸癌細胞系統において同時発現されることを開示するものである。従って、一部の実施形態においては、生物学的試料におけるＦＧＦＲ４ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの発現を検出する（単独またはＦＧＦ１９発現との組み合わせ（同時および／または逐次的）において）。上記した通り、現時点ではＦＧＦ１９はＦＧＦＲ４の受容体に結合すると考えられている。本明細書に記載したものを包含する当該分野で知られた方法を用いて、ＦＧＦＲ４のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを検出できる。例示すれば、上記したＩＨＣ技術を用いることにより試料中のそのような分子１つ以上の存在を検出してよい。本明細書においては、「組み合わせにおいて」とは何れかの同時および／または逐次的な検出を包含する意味を有する。即ち、ＦＧＦ１９の存在に関してのみならず、ＦＧＦＲ４の存在に関しても生物学的試料を調べるべき実施形態においては、別個のスライドを同じ組織または試料から調製し、そして各スライドをそれぞれＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４に結合する試薬を用いて試験してよいことを意図している。あるいは、単一のスライドを組織または細胞の試料から調製し、そしてＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４に指向された抗体を多色染色プロトコルと関連させて使用することによりＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の可視化および検出が可能となる。
【０３８０】
別の態様において、本発明はＦＧＦＲ４の発現および／または活性に関連する疾患を診断するための方法を提供し、方法は個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦＲ４を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、疾患は、腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍のものである。
【０３８１】
別の態様において、本発明はＦＧＦＲ４およびＦＧＦ１９の発現および／または活性に関連する疾患を診断するための方法を提供し、方法は個体に由来する生物学的試料中のＦＧＦＲ４およびＦＧＦ１９を検出することを含む。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４発現は増大した発現または異常な発現である。一部の実施形態においては、疾患は、腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患、例えば結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌および／または膵臓癌である。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍のものである。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を第１の生物学的試料中で検出し、そしてＦＧＦ１９の発現を第２の生物学的試料中で検出する。
【０３８２】
別の態様において、本発明は個体に対する治療を選択するための方法を提供し、方法は（ａ）個体の生物学的試料中にＦＧＦＲ４の発現がある場合はそれを検出すること；および（ｂ）工程（ａ）の後に、個体に対する治療を選択すること、ここで治療の選択は工程（ａ）で検出されたＦＧＦＲ４発現に基づくこと、を含む。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦＲ４発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦＲ４発現を個体において検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を検出し、そして、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療を選択する。
【０３８３】
別の態様において、本発明は個体に対する治療を選択するための方法を提供し、方法は（ａ）個体の生物学的試料中にＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現がある場合はそれを検出すること；および（ｂ）工程（ａ）の後に、個体に対する治療を選択すること、ここで治療の選択は工程（ａ）で検出されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現に基づくこと、を含む。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦ１９発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦ１９発現を個体において検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の増大したＦＧＦＲ４発現を検出する。一部の実施形態においては、参照値または対照試料と相対比較した場合の個体の生物学的試料中の低減したＦＧＦＲ４発現を個体において検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現を検出し、そして、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた治療を選択する。一部の実施形態においては、第１の生物学的試料においてＦＧＦＲ４の発現を検出し、そして、第２の生物学的試料においてＦＧＦ１９の発現を検出する。
【０３８４】
別の態様において、本発明は抗ＦＧＦ１９抗体の有効量を投与することにより癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患または肝臓疾患（例えば肝硬変）を有するか、有することが疑われる個体を治療するための方法を提供し、更にここで、ＦＧＦ１９の発現および／またはＦＧＦＲ４の発現は、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後においてヒト患者由来の細胞および／または組織中で検出される。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の過剰発現を、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４の発現を、抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前、その間またはその後に検出する。発現は抗ＦＧＦ１９抗体の投与の前；最中；後；前および最中；前および後；最中および後、；または前、最中および後に検出してよい。
【０３８５】
検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４下流分子シグナリングの発現はＦＧＦＲ４の発現の検出に追加して、またはその代替として検出してよい。一部の実施形態においては、ＦＧＦＲ４下流分子シグナリングの検出はＭＡＰＫ，ＦＲＳ２またはＥＲＫ２のリン酸化の検出１つ以上を含む。
【０３８６】
検出を行う一部の実施形態は更に、Ｗｎｔ経路の活性化の検出を含む。一部の実施形態においては、Ｗｎｔ経路の活性化の検出はβ−カテニンのチロシンリン酸化、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現、β−カテニン突然変異およびβ−カテニンへのＥ−カドヘリンの結合の１つ以上を含む。Ｗｎｔ経路の活性化の検出は当該分野で知られており、そして一部の例は本明細書に記載および例示する通りである。
【０３８７】
一部の実施形態においては、治療は、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、下垂体癌、膵臓癌、乳線維腺腫、前立腺癌、頭部および頚部の扁平上皮細胞癌、軟組織肉腫、乳癌、神経芽腫、黒色腫、乳房癌腫、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、上皮癌腫、脳癌、子宮内膜癌、精巣癌、胆管癌、胆嚢癌および肝細胞癌からなる群から選択される癌に対するものである。
【０３８８】
生物学的試料は例えば生物学的試料の定義において本明細書に記載する通りである。一部の実施形態においては、生物学的試料は血清または腫瘍である。
【０３８９】
ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の検出を行う実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリヌクレオチド発現および／またはＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現を検出してよい。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を検出する。他の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現を抗ＦＧＦ１９剤および／または抗ＦＧＦＲ４剤を用いて検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現は抗体を用いて検出する。何れかの適当な抗体を検出および／または診断のために使用してよく、例えばモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、および／または、抗体フラグメントが包含される。一部の実施形態においては、本明細書に記載した抗ＦＧＦ１９抗体を検出のために使用する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４のポリペプチド発現は免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現はＩＨＣを用いた場合に２以上の評点となる。
【０３９０】
ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の検出を行う一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の存在および／または非存在および／またはレベルを検出してよい。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現は増大してよい。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の発現の非存在は有意でないものまたは最小限のレベルを包含する。一部の実施形態においては、被験生物学的試料中のＦＧＦ１９の発現は対照の生物学的試料について観察されるもの（または対照またはレファレンスの発現レベル）より高値である。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は対照生物学的試料中よりも被験生物学的試料中において少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍高値であるか、それよりも高値である。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９のポリペプチド発現は染色強度に関して少なくとも２以上の評点とされる免疫組織化学（ＩＨＣ）試験において測定される。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９ポリペプチド発現は染色強度に関して少なくとも１以上、または少なくとも３以上に評点されるＩＨＣ試験において測定される。一部の実施形態においては、被験生物学的試料中のＦＧＦ１９の発現は対照の生物学的試料について観察されるもの（または対照の発現レベル）より低値である。
【０３９１】
一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は血清中で検出し、そしてＦＧＦＲ４の発現は腫瘍試料中で検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９発現およびＦＧＦＲ４発現を腫瘍試料中で検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現は血清または腫瘍試料中で検出し、そしてＦＧＦＲ４下流分子シグナリングおよび／またはＦＧＦＲ４発現を腫瘍試料中で検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現を血清または腫瘍試料中で検出し、そして、Ｗｎｔ経路活性化を腫瘍試料中で検出する。一部の実施形態においては、ＦＧＦ１９の発現を血清または腫瘍試料中で検出し、そしてＦＧＦＲ４下流分子シグナリングおよび／またはＦＧＦＲ４発現および／またはＷｎｔ経路活性化を腫瘍試料中で検出する。
【０３９２】
製造物品
本発明の別の態様において、上記した疾病の治療、予防および／または診断のために有用な物質を含有する製造物品が提供される。製造物品は容器および容器上またはそれに伴ったラベルまたはパッケージインサートを含む。適当な容器は例えばビン、バイアル、シリンジ等を包含する。容器は種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成してよい。自身、または他の組成物と組み合わせた場合に状態の治療、予防および／または診断に有効となる組成物を容器が保持しており、そして滅菌された接触口を有してよい（例えば容器は静脈内投与用の溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な蓋つきのバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージインサートは組成物が例えば癌などの選択された状態の治療のために使用されることを示す。更にまた、製造物品は（ａ）その中に含有される組成物の入った第１の容器、ここで組成物は本発明の抗体を含むもの、および（ｂ）その中に含有される組成物の入った第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造物品は更に第１および第２の抗体組成物を例えば癌などの特定の状態の治療のために使用できることを示すパッケージインサートを含んでよい。あるいは、または追加的に、製造物品は更に製薬上許容しうる緩衝液、例えば注射用殺菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第２（または第３）の容器を含んでよい。それは更に商業上または使用者の観点から望ましい他の物質、例えば他の緩衝物質、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含んでよい。
【０３９３】
以下に記載するものは本発明の方法および組成物の実施例である。上記の一般的説明により、種々の他の実施形態も実施できると理解される。
【実施例】
【０３９４】
以下の材料および方法を実施例１〜１２において使用する。
【０３９５】
遺伝子発現
凍結組織試料由来の全ＲＮＡを製造元のプロトコルに従ってＲＮＡＳＴＡＴ−６０を用いて抽出した（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ”Ｂ”Ｉｎｃ．）。培養細胞由来の全ＲＮＡを製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキットで単離した（Ｑｉａｇｅｎ）。夾雑ＤＮＡをＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，ｃａｔ＃１９０６）を用いて除去し、試料をリアルタイミＰＣＲに使用した。ヒトＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ４およびＲＰＬ１９のｍＲＮＡに対する特定のプライマーおよび蛍光発生プローブ（表２）は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ１．１（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計し、遺伝子発現を定量するために使用した。遺伝子特異的シグナルはＲＰＬ１９ハウスキーピング遺伝子のシグナルに対して正規化した。データの３連のセットを各条件につき平均した。
【０３９６】
【表２】
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インサイチュハイブリダイゼーション
ヒトＦＧＦＲ４（ＮＭ＿０２２９６３のヌクレオチド４３５〜１１８３）またはＦＧＦ１９（ＮＭ＿００５１１７のヌクレオチド４９５〜１１３２）に相当する３３Ｐ−ＵＴＰ標識センスまたはアンチセンスプローブをポリメラーゼ連鎖反応により作成した（Ｍａｕａｄ等、（１９９４）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４５，１２３７−１２４５）。切片を脱パラフィン処理し、３７℃で３０分間プロテイナーゼＫ４ｍｇ／ｍＬ中で脱タンパク処理し、そして更にインサイチュハイブリダイゼーション用に処理した（Ｈｏｌｃｏｍｂ等、（２０００）ＥｍｂｏＪ１９，４０４６−４０５５）。プローブを一夜５５℃で切片にハイブリダイズし、そして未ハイブリダイズのプローブをＲＮＡｓｅＡ処理により除去した。スライドをＮＢＴ２エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）中に浸積し、４℃で４週間曝露し、現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。
【０３９７】
免疫沈降およびイムノブロッティング
組織試料（５０ｍｇ）を５００μｌの抽出緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８、１３７ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００，１０％グリセロール、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、完全ロゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））中でホモゲナイズした。培養細胞由来の全タンパク質は抽出緩衝液を用いて３０分間氷上で抽出した。溶解物を遠心分離（１０，０００ｘｇ、１５分間）し、そして次に、４℃で一夜、ＣｉｂａｃｒｏｎブルーアガロースおよびプロテインＧアガロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて清浄化した。溶解物（１００μｇタンパク質）を４℃で一夜、目的の抗体にカップリングしたアガロース２ｕｇと共に１ｍｌのＰＢＳ／０．１％トリトン中でインキュベートした。ゲルスラリーを同じ緩衝液で洗浄し、そしてエルーション緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１０μｌで溶出させた。試料は２ｕｇのビオチン化ＦＧＦ１９抗体（ＢＡＦ９６９，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＧＦＲ４抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）および二次試薬にコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ８００を用いてウエスタンブロットにより分析し、そしてＯｄｙｓｓｅｙスキャナ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて可視化した。
【０３９８】
免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片をトリロジー（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ）を用いて抗原回復のために処理し、そして次に１０ｕｇ／ｍｌのＦＧＦ１９抗体（１Ｄ１；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）と共にインキュベートした。免疫染色はビオチン化二次抗体、ＡＢＣ−ＨＲＰ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）および金属増強ＤＡＢ比色用パーオキシダーゼ器質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施した。
【０３９９】
細胞遊走試験
８μｍの細孔を有する２４穴フォーマットのＰＥＴメンブレンフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の表面を、０．０２Ｍ酢酸中の１型コラーゲン（５０μｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ）５０μｌで４℃で一夜コーティングした。０．１％ＢＳＡを含有する血清非含有最少必須培地中の細胞（５×１０４）を上方チャンバーに添加した。下方チャンバーには同じ培地を充填し、プレートを３７℃でインキュベートした。翌日、上方チャンバーを綿棒で拭き取り、インサーとの下側に遊走した細胞を染色し、顕微鏡下に計数した。データの３連のセットを各条件につき平均した。
【０４００】
固相受容体結合試験
マキシソーブ９６穴プレートを２μｇ／ｍｌ抗ヒト免疫グロブリンＦｃγフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）５０μｌで４℃において一夜コーティングし、そして１μｇ／ｍｌＦＧＦＲ−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をキャプチャーするために使用した。非特異的結合部位はＰＢＳ／３％ＢＳＡで飽和させ、そしてＦＧＦ１９をグリコサミノグリカン（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはオリゴ糖（Ｎｅｏｐａｒｉｎ  Ｉｎｃ．）の存在下にＰＢＳ／０．３％ＢＳＡ中で２時間インキュベートした。ＦＧＦ１９結合はビオチン化ＦＧＦ１９特異的ポリクローナル抗体（ＢＡＦ９６９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ比色分析用基質を用いて検出した。
【０４０１】
受容体プルダウン試験
ＦＨＦＲ−Ｆｃキメラタンパク質（４００ｎｇ）を１時間、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＢＳＡを含有する５０：５０ダルベッコ変性必須培地：ＨａｍＦ１２中、４００ｎｇのＦＧＦ１９または４００ｎｇのＦＧＦ１およびヘパリン（２００ｎｇ）と共にインキュベートした。プロテインＧ−アガロース（２０μｌ）を添加し、更に３０分間インキュベートした。マトリックスをＰＢＳ／０．１％トリトン−Ｘ１００で洗浄し、還元剤を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、そしてビオチン化ＦＧＦ１９抗体（ＢＡＦ９６９）またはビオチン化ＦＧＦ１抗体（ＢＡＦ２３２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたウエスタンブロットで分析した。
【０４０２】
ＨＳＰＧ固相結合試験
ヘパランスルフェートプロテオグリカン（Ｓｉｇｍａ）を４℃で一夜マキシソーブ９６穴プレートに吸着させた。非特異的結合部位をＰＢＳ／３％ＢＳＡで飽和させ、ウェルを１時間ＦＧＦ１９またはＦＧＦ１（１ｕｇ／ｍｌ〜０．０００１７ｕｇ／ｍｌまで１：３連続希釈）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートした。非特異的結合はヘパリン過剰量（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下において測定した。結合はビオチン化された特異的抗体およびＴＭＢ比色分析用基質を用いて検出した。特異的結合は総結合から非特異的結合を差し引くことにより計算した。
【０４０３】
ヘパリンアガロース結合試験
ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質（各々４００ｎｇ／ｍＬ）を１時間、１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４および０．１％ＢＳＡを含有する５０：５０ダルベッコ変性必須培地：ＨａｍＦ１２中、２０μｌのヘパリン−アガロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートした。ゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する２０ｍＭトリスｐＨ７．４の１ｍｌ、そして次に２０ｍＭＮａＣｌを含有する同じ緩衝液１ｍｌで洗浄した。結合タンパク質は還元剤を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。
【０４０４】
ＦＧＦ１９モノクローナル抗体の作成
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＦＧＦ１９−Ｈｉｓで逐次的に免疫化した。特に、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＭＰＬ−ＴＤＭ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）中に再懸濁したｈｕＦＧＦ１９−Ｈｉｓ２．０μｇで９回、後肢手掌各々において免疫化した。最終ブーストの３日後、脾臓を採取し、膝窩リンパ節細胞を３５％ポリエチレングリコールを用いてネズミ骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ．１（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９７）に融合させた。ハイブリドーマはＨＡＴ培地中で選択した。融合の１０日後、ハイブリドーマ培養上澄みをＥＬＩＳＡによりｈｕＦＧＦ−１９へのｍＡｂ結合に関してスクリーニングした。ヒトＦＧＦ−１９に対する抗体を生産している細胞系統を限界希釈法により２回クローニングした。選択されたＦＧＦ１９抗体産生ハイブリドーマを２回サブクローニングすることによりモノクローナル性を確保した。クローンを腹水生産用に接種し、抗体をプロテインＡ−アガロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０４０５】
全ＲＮＡを標準的な方法を用いて抗体を生産しているハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインを重鎖および軽鎖に対する縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。フォワードプライマーはＶＬおよびＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に対して特異的であるものとした。ＬＣおよびＨＣのリバースプライマーはそれぞれ、種に渡って高度に保存されている定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）における領域にアニーリングするように設計した。増幅されたＶＬおよびＶＨを哺乳類発現ベクターにクローニングした。インサートのポリヌクレオチド配列は定型的な配列決定方法を用いて決定した。
【０４０６】
抗体結合の親和性および動態の分析
結合動態に関しては、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）測定を使用した（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。慨すればカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ‘−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗ＦＧＦ１９またはＦＧＦＲ４抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で５ｕｇ／ｍｌとなるまで希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入することによりカップリングした抗体の約５００応答単位（ＲＵ）を達成した。次に１Ｍカテコールアミンを注入することにより未反応の基をブロックした。動態の測定の為には、ＦＧＦ１９−ＨｉｓまたはＦＧＦＲ４の分子のいずれかの２倍連続希釈物（０．７ｎＭ〜５００ｎＭ）を２５ｕｌ／分の流量で２５℃において０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳ中で注入した。会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）は単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）はＫｏｆｆ／Ｋｏｎの比として計算した。
【０４０７】
抗体エピトープ切り出し
ＦＧＦ１９タンパク質（１０μｇ）をアガロースカップリング抗体５０μｌを含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）中で２時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中３７℃で一夜トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｇで消化した。ゲルスラリーを洗浄し、結合ペプチドを１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。候補ペプチドを衝突誘導解離（ＱＳＴＡＲ）に付し、手作業により配列決定することによりペプチド質量マッピング識別情報を確認した（図Ｓ１）。
【０４０８】
固相抗体結合試験
ＨｉｓＧｒａｂニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）の非特異的結合部位はＰＢＳ／３％ＢＳＡで飽和させた。ウェルを１時間、ＰＢＳ／０．３％ＢＳＡ中の１μｇ／ｍｌのＦＧＦ１９−Ｈｉｓと共にインキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／０．３％ＢＳＡ中のＦＧＦ１９の存在下または非存在下にＦＧＦ１９抗体（１ｕｇ／ｍｌ〜０．００００１７ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度）と共に１時間インキュベートした。結合抗体はＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＴＭＢパーオキシダーゼ発色性基質（ＫＰＬ）を用いて検出した。
【０４０９】
ＣＹＰ７α１発現分析
ＨＥＰ３Ｂ細胞を血清非含有ダルベッコ変性必須培地：ＨａｍＦ１２（５０：５０）中で一夜飢餓状態とし、そして抗体１Ａ６、１Ａ１またはアイソタイプマッチの対照抗体（各々１０ｕｇ／ｍｌ〜０．０４ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度）の存在下または非存在下において６時間１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９で処理した。ＣＹＰ７α１発現は遺伝子特異的なプライマーおよびプローブ（Ｔａｑｍａｎ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、そしてＧＡＰＤＨ発現に関して正規化した。データの３連のセットを各条件につき平均した。
【０４１０】
ＦＧＦＲ４／ＭＡＰＫリン酸化
血清非含有培地中一夜飢餓状態としたＨＥＰ３Ｂ細胞を抗体の存在下または非存在下で１０分間４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９で処理した。細胞を一夜１０ｍＭＮａＦ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを添加したＲ２７Ａ緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ）中で溶解させた。溶解物を調製し、電気泳動に付し、ホスホ−ＦＲＳ２、ホスホ−ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫ特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＦＲＳ２特異的抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ）を用いたウエスタンブロットにより分析した。
【０４１１】
異種移植片実験
全ての動物のプロトコルはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されている。６〜８週齢の無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｉｎｃ．）に５×１０６細胞（２００μｌ／マウス）を皮下接種した。７日後、等しい体積（〜１００ｍｍ３）の腫瘍を担持したマウスを無作為に群分け（ｎ＝１０）し、そして週２回腹腔内で治療した。腫瘍は電子カリパス（Ｆｏｗｌｅｒ  Ｓｙｌｖａｃ  Ｕｌｔｒａ−Ｃａｌ  Ｍａｒｋ  ＩＩＩ）で計測し、そして平均腫瘍体積を以下の式：（Ｗ２ＸＬ）／２（Ｗ，小径；Ｌ，長径）を用いて計算した。統計学的差は正規分布に関するスチューデントｔ検定を用いて分析した。Ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。
【０４１２】
異種移植片腫瘍におけるＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびβ−カテニンのリン酸化
対照（ｇｐ１２０）および抗ＦＧＦ１９（１Ａ６）抗体投与動物から摘出した腫瘍を５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＮａＦ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、およびミニプロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液中でホモゲナイズした。溶解物のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質試験試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。当量のタンパク質（１００μｇタンパク質）を穏やかに回転させながら４℃で２時間プロテインＡ−セファロース上に固定化された抗ＦＧＦＲ４抗体（クローン１Ｇ７；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）または抗ＦＲＳ（ＵｐＳｔａｔｅ）抗体１μｇと共にインキュベートした。マトリックスを溶解緩衝液で洗浄し、そして免疫複合体を２ｘＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶出させ、煮沸し、そしてマイクロ遠心分離に付した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動に付し、ニトロセルロース膜に移し、そしてホスホチロシン抗体（１：１０００希釈度、４Ｇ１０、ＵｐＳｔａｔｅ）でプローブした。洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、免疫反応性のタンパク質をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で可視化した。ＥＲＫ２リン酸化レベルはホスホ−ＥＲＫ２抗体（１：１０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて予め免疫沈降することなく試験し、そしてβ−カテニンのリン酸化はＮ末端脱リン酸化β−カテニンに対して指向された抗体（１：１０００希釈、ＵｐＳｔａｔｅ）を用いて予め免疫沈降することなく試験した。膜を剥離させ（Ｐｉｅｒｃｅ）、そして適切な抗体で再プローブすることにより全タンパク質を求めた。
【０４１３】
ＦＧＦ１９ＴＧマウスにおける肝細胞癌のマイクロＣＴ画像化および分析
肝腫瘍は肝臓特異的造影剤であるＦｅｎｅｓｔｒａ−ＬＣを用いたマイクロｃｔ画像化により識別した。Ｆｅｎｅｓｔｒａ−ＬＣはカイロミクロンレムナントを模倣し、そして内因性の脂肪代謝経路を利用することにより肝細胞の造影剤蓄積をもたらすヨウ素化トリグリセリドである。これらの薬剤は肝臓の腫瘍を識別するための手段として以前は使用されていた（Ｌｅｅ等、１９９７；Ｗｅｉｃｈｅｒｔ等、１９９６）。６カ月例において、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにＦｅｎｅｓｔｒａＬＣ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｉｎｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を２０μｌ／ｇｉｖ注射し、そして意識下の３時間の肝取り込みを起こさせた後、マウスを安楽死させ、肝臓を摘出し、肉眼分析、計量、エクスビボのマイクロＣＴ分析（μＣＴ４０システム；Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｂａｓｓｅｒｓｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および組織学的染色に付した。全肝臓をガーゼ上で穏やかに水切りし、ダイズ油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に浸漬し、マイクロＣＴ画像化用に調製した。各肝臓につき、９０分スキャンを３０μｍ同位体ボクセルサイズでもとめ、３００ｍｓ積分時間、４５ｋｅＶエネルギーおよびチューブ電流１７７μＡにおいて５１２投影とした。容量分析的画像ファイルをＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ（Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）より入手した画像分析ソフトウエアを用いて分析した。−１６ハウンズフィールド単位（ＨＵ）の強度閾値を用いてバックグラウンドシグナル（ダイズ油）から組織塊を分割した。第２の閾値（２６ＨＵ）を用いることにより、造影剤を蓄積させることにより正常な肝組織を定義する高強度の領域をもたらす機能的関組織に関連する関組織の体積を推定した。脈管、胆嚢および胆管を包含するわずかな造影剤濃度により最小限の減衰であったＦＧＦ１９投与マウスの肝組織、おょび、肝細胞癌患部は、強度が低値であった。肝細胞癌を有していなかった野生型ＦＶＢマウス由来の総低強度肝臓体積の平均を、ＦＧＦ１９トランスジェニック対照および投与群の両方から差し引き、腫瘍のみに関連する体積を求めた。データは総肝臓体積の腫瘍体積パーセントとして表示する。
【０４１４】
統計学的分析
統計学的有意性は非対両側スチューデントｔ検定を用いて分析した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。データは平均±ＳＥＭで表示する。
【０４１５】
以下の材料および方法を実施例１３〜１７で使用した。
【０４１６】
細胞
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を１０％テトラサイクリン非含有ウシ胎児血清および４ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０中３７℃および５％ＣＯ２において定型的に維持した。血清飢餓状態の細胞をベヒクルまたはＦＧＦ１９（２５〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０分間）と共にインキュベートした。別個の実験において、細胞を３〜２４時間対照抗体（ｇｐ１２０）またはＦＧＦ１９抗体（ＩＡ６，１０μｇ／ｍｌ）の何れかで処理した。更にβ−カテニン活性化に対する作用を評価するため、細胞を４時間１μＭの濃度においてプロテオソーム抑制剤ＭＧ１３２（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）で予備処理し、その後、２４時間抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６処理を行うことにより、β−カテニン上のＳｅｒ３３／Ｓｅｒ３７、Ｓｅｒ４５およびＴｈｒ４１のリン酸化を評価した。インキュベートの後、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、溶解してタンパク質またはＲＮＡの文政の何れかに付した。
【０４１７】
免疫沈降およびウエスタンブロット分析
細胞を変性ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣｌ；１％ＩＧＥＰＡＬ；１ｍＭＥＤＴＡ；０．２５％デオキシコール酸ナトリウム；１ｍＭＮａＦ；１ｍＭＮａ３ＶＯ４；プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で溶解させ、遠心分離により清澄化した。溶解物のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質試験試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定した。当量のタンパク質を穏やかに回転させながら４℃で２時間プロテインＡ−セファロース上（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に固定化された特異的抗体と共にインキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で広範に洗浄し、免疫複合体を２ｘＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶出させ、煮沸し、そしてマイクロ遠心分離に付した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割し、ニトロセルロース膜に移し、そして特異的一次抗と共にインキュベートした。洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、免疫反応性のタンパク質をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｔ，ＩＬ）で可視化した。免疫沈降およびイムノブロッティングに使用した抗体は、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｒｕｃｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手した抗β−カテニンｍＡｂ、ＵｐＳｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）から入手したＮ末端脱リン酸化β−カテニンに対して指向された抗活性β−カテニン抗体、抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）および抗Ｅ−カドヘリン抗体、Ｃｅｌｌｓ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）より入手した抗ホスホ−β−カテニン（Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７およびＳｅｒ４５／Ｔｈｒ４１に特異的）抗体、および、抗ＦＧＦＲ４ｍＡｂ（１Ｇ７）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）とした。記載に応じて、膜を剥離し（Ｐｉｅｒｃｅ）別の抗体で再プローブした。特定のタンパク質のバンドの密度はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｃｓ２ｖｅｒｓｉｏｎ９（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて分析した。β−カテニンおよびＥ−カドヘリンのチロシンおよびＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化の定量的分析は３つの別個の実験に由来するデータを用いることにより全タンパク質およびリン酸化の間の比をも込めることにより行った。
【０４１８】
液体クロマトグラフィー−質量スペクトル分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
Ｎ末端β−カテニンリン酸化レベルの間接的定量は、線形イオントラップ質量分析を用いて実施した。β−カテニンは、ＭＧ１３２で予備処理され、次いで対照（ｇｐ１２０）または抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６処理された細胞から免疫沈降させ、そしてＴｒｉｓ−ＧｌｙＳＤＳＰＡＧＥを用いて分離した。ゲルをクーマシー染色し、そしてβ−カテニンバンドを切り出し、そして室温で３０分間１０ｍＭＤＴＴ中で還元し、そしてシステインを室温で１５分間５０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し、その後トリプシン消化した。ペプチドは５０ｍＭ重炭酸ナトリウムｐＨ８．０中トリプシン（１０ｎｇ／μｌ）で消化し、そしてペプチドミメティック（３ｍｌ）をＶｙｄａｃ２１４ＭＳ低ＴＦＡＣ４ビーズを充てんした０．２５ｘ３０ｍｍのトラッピングカートリッジ上にロードした。このカートリッジをＶｙｄａｃ２１８ＭＳＣ１８ビーズを充填した０．１ｘ１００ｍｍの分割カラムとインラインにおいた。分割カラムはマイクロ電子スプレーエミッターを形成する１５ｍｍ金属コーティング先端に引き付けられた「ピコフリット」（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）溶融シリカキャピラリーを用いて構築した。ペプチドは０．３ｍＬ／分の速度で０．１％蟻酸を含有するアセトニトリルの１時間勾配で溶出させた。データ依存性タンデム質量スペクトル分析は線形イオントラップ機器（ＬＴＱ；Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を用いて実施した。各ＣＩＤスペクトルに関する交差相関評点を作成し、ペプチドの相対的アバンダンスを求めた。Ｓｅｑｕｅｓｔデータベース検索プログラムを用いて各ＣＩＤスペクトルに関する交差相関評点を作成した。単一ペプチドのみマッチのタンパク質は衝突誘導解離スペクトルの手作業による解釈により確認した。リン酸化ペプチドは手作業により確認した。次にピーク面積を積分してペプチドの相対的アバンダンスを測定した。
【０４１９】
Ｗｎｔ標的遺伝子発現分析
全ＲＮＡは製造元のプロトコルに従って、ＱｉａｇｅｎＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用いて単離し、ＤＮａｓｅ処理（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）した。ＲＮＡ濃度はＮＤ−１０００分校高度計（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて測定した。リアルタイム定量的ＰＣＲを行うことによりＷｎｔ標的遺伝子（ｃｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ｃ−ｊｕｎ）ｍＲＮＡの相対的アバンダンスを測定した。プローブはＦＡＭ（５’末端）およびＴＡＭＲＡ（３’末端）で標識した。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りである。
ヒトサイクリンＤ１フォワード：ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣ（配列番号２６）；
リバース：ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＧＧ（配列番号２７）
プローブ：ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＧＡＣ（配列番号２８）；
ヒトＣＤ４４フォワード：ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＴ（配列番号２９）；
リバース：ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＧＣＡ（配列番号３０）；
プローブ：ＣＧＧ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  Ｃ（配列番号３１）；
ヒトＥ−カドヘリンフォワード：ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＡＧ（配列番号３２）；
リバース：ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＡ  ＣＧ（配列番号３３）；
プローブ：ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  Ｇ（配列番号３４）；
ヒトｃ−ｊｕｎフォワード：ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＡＣＴ（配列番号３５）；
リバース：ＣＣＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＡ（配列番号３６）；
プローブ：ＡＴＧ  ＣＴＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＡＣＡ（配列番号３７）；
ヒト特異的リボソームタンパク質Ｌ−１９（ＲＰＬ−１９）：
フォワード：ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  Ａ（配列番号３８）
リバース：ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＴＴ（配列番号３９）
プローブ：ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＡＧＧ（配列番号４０）。
【０４２０】
増幅反応（５０μｌ）には１００ｎｇのＲＮＡ鋳型、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、１ｘ緩衝液Ａ、１．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ類、２．５ＵのＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ、２０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤、１２．５ＵのＭｕＬＶ逆転写酵素、２μｍｏｌ／Ｌの各々のフォワードおよびリバースプライマー、および、５μｍｏｌ／Ｌのプローブ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。熱サイクル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出器）条件は４８℃３０分間、９５℃１０分間、そして９５℃１５秒とし、そして、６０℃１分間を４０サイクルとした。データの分析はシーケンスディテクター１．６．３（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、目的の遺伝子に関する結果はＲＰＬ１９遺伝子に対して正規化した、
ｓｈＲＮＡ試験
ｓｈＲＮＡ発現シャトルプラスミドおよびＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏカセットを含有するウィルスベクター骨格を含むｐＨＵＳＨ誘導ベクター系を使用した（Ｈｏｅｆｌｉｃｈ，ＫＰ等、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ６６：９９９〜１００６（２００６））。ＦＧＦＲ４ノックダウンベクターは、カスタムｓｉＲＮＡ配列を設計し、それらをｓｈＲＮＡに変換し、そして２９３Ｔ細胞における一過性の同時トランスフェクション実験においてそれらの効力を試験することにより構築した。以下のｓｈＲＮＡ配列をｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１ないにクローニングし、そして次にＨ１−ｓｈＲＮＡカセットをＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）組み換え反応によりｐＨＵＳＨ−ＧＷ内に転移させた。
ＦＧＦＲ４ｓｈＲＮＡ２フォワード：ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡ（配列番号４１）；
リバース：ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧ（配列番号４２）；
ＦＧＦＲ４ｓｈＲＮＡ５フォワード：ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡ（配列番号４３）；
リバース：ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＧＧＴ  ＴＣＧ  ＧＧ（配列番号４４）；
ｈＥＧＦＰ対照フォワード：ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡ（配列番号４５）；
リバース：ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＧＧ（配列番号４６）。
全てのコンストラクトは配列決定により確認した。
【０４２１】
誘導ｓｈＲＮＡ細胞クローンの作製
ＨＣＴ１１６細胞をリポフェクタミン２０００プラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。ベクター内にコードされたピューロマイシン耐性遺伝子は構成β−アクチンプロモーターの制御下にあるため、５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いてｓｈＲＮＡ発現トランスフェクト細胞を選択した。安定なクローンを単離し、７日間１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で処理することによりｓｉＲＮＡの発現を誘導した。機能的ＦＧＦＲ４タンパク質ノックダウンはウエスタンブロッティングで試験した。
【０４２２】
統計学的分析
スチューデントの両側ｔ検定を用いて２群間のデータを比較した。一元分散分析およびＤｕｎｎｅｔｔの検定を用いて３群以上の間のデータを比較した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【０４２３】
実施例１：ヒト組織におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現の分析
ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質の発現をヒト結腸腺癌、肺扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）において評価した。ＦＧＦ１９は結腸腺癌１０例中６例（図２Ａ）においいて、そして肺ＳＣＣ１０例中７例において、正常組織と相対比較した場合に、過剰発現されていた（図２Ｂ）。正常組織と比較して、ＦＧＦＲ４の発現は結腸腫瘍においては有意に改変されていなかったが、ＳＣＣにおいてダウンレギュレートされているように観察された（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０４２４】
腫瘍内のＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の発現を位置特定するためにインサイチュハイブリダイゼーションを実施した。両方の遺伝子に対するメッセンジャーＲＮＡは結腸腺癌および肺ＳＣＣにおける腫瘍性の上皮細胞において顕著であった（図２ＣおよびＤ）。３５例の結腸腺癌からなる組織マイクロアレイにおいて、２６例（７４％）がＦＧＦ１９ｍＲＮＡについて陽性シグナルを有しており、そして２２例（７７％）がＦＧＦＲ４ｍＲＮＡに対して陽性シグナルを有していた。抗ＦＧＦ１９抗体投与は非腫瘍誘導ＦＧＦ１９および腫瘍誘導のＦＧＦ１９の両方を標的としており、そしてこのため、抗ＦＧＦ１９の投与はＦＧＦ１９発現を欠いているＦＧＦＲ４陽性腫瘍において臨床上有益であると考えられる。表３は結腸腺癌組織のマイクロアレイ試料におけるＦＧＦＲ４および／またはＦＧＦ１９ｍＲＮＡの同時発現の存在または非存在を示している。
【０４２５】
【表３】
2009525764.tif 000006
結腸腺癌におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の存在の間の重複は腫瘍試料の大多数において観察された。１４例の肺ＳＣＣのうち、１４例（１００％）がＦＧＦ１９ｍＲＮＡに対して陽性シグナルを有し、そして、１３例（９３％）がＦＧＦＲ４ｍＲＮＡに対して陽性シグナルを有していた。更にまた、腫瘍性の上皮細胞は結腸腺癌（図２Ｃ）および肺ＳＣＣ（図２Ｄ）の両方において免疫組織化学分析によれば強力なＦＧＦ１９タンパク質染色を示していた。このような相対的に高値の発現の頻度は肺ＳＣＣにおけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４の存在の間の顕著な重複を示唆していた。
【０４２６】
トランスジェニックマウスにおける全身性のＦＧＦ１９の発現は肝細胞癌（ＨＣＣ）を増進することから、本発明者等はまた肝試料におけるＦＧＦ１９及ぶＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現も評価した。肝細胞癌５０例のうち、２３例（４６％）がＦＧＦ１９ｍＲＮＡに対して、そして３０例（６０％）がＦＧＦＲ４ｍＲＮＡに対して陽性シグナルを示している。両方の遺伝子は腫瘍性の肝細胞において発現されていた（代表例を図２Ｅに示す）。腫瘍性肝細胞はまた、免疫組織化学的分析においても強力なＦＧＦ１９タンパク質染色を示していた（図２Ｅ）。表４は結腸腺癌組織のマイクロアレイ試料におけるＦＧＦＲ４および／またはＦＧＦ１９ｍＲＮＡの同時発現の存在または非存在を示している。
【０４２７】
【表４】
2009525764.tif 000007
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ１９の発現の間の重複は試料の大きな割合において観察された。
【０４２８】
これらの結果はヒト癌の数型においてＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４が発現されることを示している。
【０４２９】
肝硬変は肝細胞癌に先行する場合が多いため、ＦＧＦ１９ｍＲＮＡ発現を肝硬変の肝臓において評価した。これらの試料は再生結節肝細胞において強力なＦＧＦ１９ｍＲＮＡおよびタンパク質のシグナルを示しており（図２Ｆ）、ＦＧＦ１９発現が肝腫瘍形成の進行の間、早期に起こることを示唆している。
【０４３０】
ＦＧＦ１９ｍＲＮＡの発現はまたインサイチュハイブリダイゼーションにより原発上皮腫瘍の数種の型において評価した。ＦＧＦ１９ｍＲＮＡ発現は１６／３８例（４２％）の乳腺癌、３９／７０例（５６％）の卵巣腺癌、および、８／７９例（１０％）の膵臓腺癌において検出された。これらの結果はＦＧＦ１９ｍＲＮＡが原発腫瘍の数種の型において発現されることを示している。更にまた、結腸腺癌のパネルを免疫組織化学分析を用いてＦＧＦＲ４タンパク質の発現に関してスクリーニングしたところ、１８／２０例の試料がＦＧＦＲ４発現に関して陽性であった。
【０４３１】
実施例２：ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４はヒト腫瘍細胞系統および異種移植片組織において発現される。
【０４３２】
ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を結腸、乳房および肝臓の腫瘍細胞系統において分析した。本発明者等はＣｏｌｏ２０１、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６を包含する結腸癌細胞系統のサブセットにおいてＦＧＦ１９ｍＲＮＡの発現を観察している（図３Ａ）。ＳＮＵ１８５、ＳＮＵ３９８、ＭＣＦ７および試験した全ての結腸癌細胞系統はＦＧＦＲ４ｍＲＮＡを発現した。ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４タンパク質発現はウエスタンブロット分析を用いて癌細胞系統のパネルにおいて測定した。ＦＧＦ１９タンパク質を発現しなかったＨＴ２９を除き、ＦＧＦ１９及ぶＦＧＦＲ４のタンパク質のレベルはこれらの細胞系統におけるそれらのｍＲＮＡの発現と合致していた（図３Ｂ）。細胞系統により分泌されたＦＧＦ１９の電気泳動の運動性は２４ｋＤａの予測分子質量と合致していた。しかしながら、追加的なより低分子質量のバンドもまた検出され、切断されたタンパク質の可能性を示していた。
【０４３３】
ＦＧＦ１９タンパク質の発現がインビボで維持されることを確認するため、結腸癌細胞系統誘導腫瘍異種移植片を免疫組織化学分析により評価した（図３Ｃおよび３Ｄ）。Ｃｏｌｏ２０５異種移植片腫瘍組織は腫瘍全体を通して全ての腫瘍性上皮細胞において強力なＦＧＦ１９の発現を示したが、関連するマウス支質や隣接正常組織では示さなかった。ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６異種移植片は分散した腫瘍性細胞において陽性の免疫反応性を示した。ＦＧＦ１９陰性ＨＴ２９細胞系統の異種移植片の免疫組織化学分析では如何なる染色も観察されなかった。これらの結果は結腸癌細胞系統が培養皿中のインビトロならびに皮下異種移植片セッティングにおけるインビボの生育時にＦＧＦ１９を発現することを示唆している。
【０４３４】
実施例３：ＦＧＦ１９はヘパリン結合因子ではない。
【０４３５】
グリコサミノグリカン結合試験を実施することによりＦＧＦ１９タンパク質およびヘパリンが相互作用するかどうかを直接調べた。固相結合試験において、ＦＧＦ１は表面吸着精製ヘパランスルフェートプロテオグリカンに対する用量依存性の結合を示した（図４Ａ）。これとは対照的に、ＦＧＦ１９はコーティング材料に結合しなかった。プルダウン試験において、ＦＧＦ１はヘパリンアガロースアフィニティーマトリックスに強力に結合した。以前に報告されている通り、ＦＧＦ１が１Ｍより高いＮａＣｌ濃度を有する緩衝液をもってのみ脱着された。これとは対照的に、ＦＧＦ１９は試験したＮａＣｌの最低濃度（２０ｍＭ）においてもヘパリンアガロースに有意に結合せず、そしてより高いＮａＣｌ濃度で洗浄した後もタンパク質は検出されなかった（図４Ｂ）。併せて考えると、これらの結果はＦＧＦ１９はグリコサミノグリカンには有意に結合せず、従って、ヘパリン結合因子とは考えられないことを示している。
【０４３６】
実施例４：ＦＧＦ１９はＦＧＦＲ４に特異的に結合する。
【０４３７】
以前の同時免疫沈降試験において、ＦＧＦ１９の受容体結合特異性がＦＧＦＲ４に限定されることが示唆されている（Ｘｉｅ等、１９９９）。ＦＧＦ１９の結合特異性をより完全に調べるために、本発明者等はその相互作用を、全ての既知ヒトＦＧＦＲに対して、それらの異なるオルタナティブスプライシング形態、例えば最近発見されたＦＧＦＲ５（ＦＧＦＲ１Ｌ）（Ｓｌｅｅｍａｎ等、２００１）において試験した。固相試験においては、ＦＧＦ１９の用量依存性結合はＦＧＦＲ４に限定されていた（図４Ｃ）。受容体プルダウン試験においては、ＦＧＦ１は全てのＦＧＦＲに結合したのに対し、ＦＧＦ１９の相互作用はＦＧＦＲ４に限定されていた（図４Ｄ）。これらの結果は以前の観察結果に合致しており（Ｏｒｎｉｔｚ等、１９９６；Ｘｉｅ等、１９９９）、そして更に、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１９のユニークな結合特異性を強調している。
【０４３８】
実施例５：ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合はグリコサミノグリカンにより調節される。
【０４３９】
ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合のためのグリコサミノグリカンの必要性の特異性を固相受容体結合試験を用いて分析した。図４Ｅに示す通りヘパリンはＦＧＦＲ４とのＦＧＦ１９の相互作用の最も強力なプロモーターを構成しており（ＥＣ５０＝０．０２５μｇ／ｍｌ）、次いでヘパランスルフェート（ＥＣ５０＝０．９μｇ／ｍｌ）、コンドロイチンスルフェートＢ（ＥＣ５０＝１μｇ／ｍｌ）およびコンドロイチンスルフェートＡ（ＥＣ５０＝４μｇ／ｍｌ）であった。コンドロイチンスルフェートＣはＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合を増進しなかった。
【０４４０】
種々の長さのヘパリン多糖類のＦＧＦＲ４結合増進に対する作用も分析した。ヘパリンの８糖類は最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）においてもＦＧＦＲ４結合に対しては最小限の作用のみを示した（図４Ｆ）。ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９結合の用量依存性の増進がヘパリン２糖類およびより長いフラグメントで観察され、そしてこの作用はヘパリンの分子量に比例していた。併せて考えると、これらの結果はＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合を支援している大部分の強力なグリコサミノグリカンをヘパリンが構成していること、および、ヘパリンの活性がその分子量に比例していることを示している。
【０４４１】
実施例６：ＦＧＦ１９は高い親和性でＦＧＦＲ４に結合する。
【０４４２】
ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合親和性は、漸増濃度の［１２５Ｉ］ＦＧＦ１９を固定化されたＦＧＦＲ４およびヘパリンと共に過剰量の未関連のリガンドの存在下または非存在下にインキュベートすることにより試験した。ＦＧＦ１９はＦＧＦＲ４への用量依存性および飽和可能な結合を示した（図４Ｇ、挿入図）。ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９結合について、０．２５ｎＭのＫｐがスカッチャード分析を用いて測定され、リガンドおよび受容体が高い親和性で相互作用することが確認された。
【０４４３】
実施例７：抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体の作成
抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体のパネルを上記した通り作成した。インサーとのポリヌクレオチド配列は定型的な配列決定方法を用いて決定した。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１６ＡＶＬおよびＶＨアミノ酸配列は図１に示す通りである。
【０４４４】
実施例８：表面プラズモン共鳴および酵素結合免疫吸着試験を用いた抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体の結合親和性の分析
マウス抗ＦＧＦ１９Ｍａｂの結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を実施し、その際上記した通り、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。この分析の結果を表５に示す。
【０４４５】
【表５】
2009525764.tif 000008
酵素結合免疫吸着試験においては、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ１および１Ａ６は４０ｐＭの同等のＥＣ５０においてＦＧＦ１９に結合したのに対し、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１は４００ｐＭのＥＣ５０で結合した（図５Ａ）。固相受容体結合試験においては、１Ａ６は３ｎＭのＩＣ５０でＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合をブロックした（図５Ｂ）。１Ａ１、１Ｄ１および非関連の対照抗体はこの相互作用を抑制しなかった。
【０４４６】
実施例９：細胞系試験において抗ＦＧＦ１９抗体はＦＧＦ１９シグナリングをブロックした。
【０４４７】
ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４の相互作用を抗ＦＧＦ１９抗体がブロックするかどうか調べるために数種の細胞系試験を実施した。
【０４４８】
ＦＧＦ１９はコレステロールおよび胆汁酸の合成のための律速酵素であるコレステロール−７−α−ヒドロキシラーゼ１（Ｃｙｐ７α１）の肝発現を抑制することによりコレステロールのホメオスタシスにおける役割を果たしている（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ等（２００６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ２６，３０１−３０６；Ｙｕ等（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７５，１５４８２−１５４８９）。抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ１および１Ａ６、またはアイソタイプマッチの陰性対照抗体（１０ｕｇ／ｍｌ〜０．０４ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度）がｃｙｐ７α１のＦＧＦ１９誘導ダウンレギュレーションをブロックする能力を上記した通り、肝細胞癌ＨＥＰ３Ｂ細胞を用いて試験した（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６：１５０６−１５０７（２００４））。抗ＦＧＦ１９抗体の非存在下においては、ＦＧＦ１９の投与は７５％までｃｙｐ７α１の発現を低減した。１．１μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６の投与はｃｙｐ７α１発現のＦＧＦ１９誘導抑制を根絶させた。これとは対照的に、マウス抗ＦＧＦ１９Ｍａｂクローン１Ａ１の投与は試験した最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）において５０％まで抑制を低減したのみであり、より低い抗体濃度では低減しなかった。対照抗体の存在はＦＧＦ１９活性に影響しなかった。ｃｙｐ７α１遺伝子発現のＦＧＦ１９誘導ダウンレギュレーションの抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６抑制のＩＣ５０は約０．４ｕｇ／ｍｌであった。ｃｙｐ７α１遺伝子発現のＦＧＦ１９誘導ダウンレギュレーションの抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ１抑制のＩＣ５０は約１０ｕｇ／ｍｌであった。
【０４４９】
抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６はまた、肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＦＧＦ１９誘導ＦＧＦ経路活性化をブロックする能力について試験した（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ等（２００５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ１６，１３９−１４９；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６：１５０６−１５０７）。血清飢餓状態の肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞に、陰性対照抗体の非存在下または存在下のＦＧＦ１９、または、種々の濃度の抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６または１Ｄ１（３０、１０および３．３ｎｇ／ｍＬ）を投与し、そして、ＦＲＳ２およびＭＡＰＫリン酸化を上記した通り測定した。抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６の投与は試験した全用量において、ＦＧＦ１９誘導のＦＲＳ２およびＭＡＰＫのリン酸化を有意にブロックした（図５Ｃ）。これとは対照的に、対照抗体および抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１の投与は有意な抑制活性を示さなかった。
【０４５０】
ＦＧＦＲ４は細胞遊走において役割を果たしていることから、本発明者等はＦＧＦ１９の化学走性活性を評価した（Ｗａｎｇ等（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１０：６１６９−６１７８）。Ｂｏｙｄｅｎチャンバー試験の変法において、ＦＧＦ１９は用量依存的な態様においてＨＣＴ１１６細胞の遊走を増進し、１６ｎｇ／ｍｌにおいて最高値に達した（図１０）。抗ＦＧＦ１９ｍａｂをＦＧＦ１９増進細胞ミグを抑制する能力について試験した。０．１μｇ／ｍｌにおいて、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与はＦＧＦ１９誘導細胞遊走を抑制した（図５Ｅ）。より高濃度の１Ａ６の投与は、基底値のＨＣＴ１１６細胞遊走レベルより低値にまで細胞遊走を低減し、おそらくは外因性に添加された、そして内因性に生産されたＦＧＦ１９の両方を抑制したことによると考えられる。
【０４５１】
これらの結果は抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６はインビトロにおいてＦＧＦ１９活性の強力な抑制剤であることを示している。
【０４５２】
実施例１０：抗１Ａ６結合決定基はＦＧＦＲ４とのＦＧＦ１９の結合界面に局在化している。
【０４５３】
質量スペクトル分析の方策を用いることにより抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６および１Ａ１のエピトープの位置決めを行い、および、ＦＧＦ１９のコンホーメーション成分がそれらの結合に寄与するかどうかを評価した。本発明者等はまず、アガロースカップリング１Ａ６アフィニティーマトリックスを用いて、ＦＧＦ１９トリプシン消化物からエピトープ含有ペプチドを単離した。この方策が奏功しなかった理由は、恐らくは、ＦＧＦ１９のフラグメント化が１Ａ６エピトープのコンホーメーション的一体性を損なったためと考えられる。この仮説を試験するために、本発明者等は方法を変更し、そしてＦＧＦ１９をアガロースカップリング抗体と共にインキュベートし、次に吸着されたタンパク質をトリプシンで消化した。総消化物の分析によれば、吸着されたＦＧＦ１９の完全なフラグメント化が明らかになり、如何なるトリプシン切断部位の１Ａ６マスキングも伴っていなかった（図６Ａ）。マトリックスを広範に洗浄し、そして結合したペプチドを溶出させ、質量スペクトルにより同定した。非特異的に吸着されたペプチドは平行した実験においてアガロースにカップリングさせた非関連の対照抗体を用いて同定した。
【０４５４】
この分析の結果を図６に示す。アガロースカップリング抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６はＦＧＦ１９ペプチドＧ１３３〜Ｒ１５５を特異的に認識した（図６Ｂおよび８Ａ）。アガロースカップリング抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ１はペプチドＧ１５６〜Ｒ１８０を特異的に認識した（図６Ｃおよび８Ｂ）。
【０４５５】
アガロースへの抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１のコンジュゲーションはそのＦＧＦ１９への結合を根絶させたため、ペプチド競合結合試験を用いてそのエピトープを同定した。ＦＧＦ１９アミノ酸Ａ１８３〜Ｇ１９２のみがｍａｂ１Ｄ１結合と競合した（図６Ｄ）。このペプチドはＦＧＦ１９へのｍａｂ１Ａ１の結合に競合しなかった。オーバーラップしたペプチドをこの競合試験において使用したため、本発明者等はｍａｂ１Ｄ１エピトープが少なくとも４つの遠位のＦＧＦ１９アミノ酸（ＳＦＥＫ）に位置していると推測した。
【０４５６】
ｍａｂ１Ａ１、１Ｄ１および１Ａ６のエピトープをＦＧＦＲ４とのＦＧＦ１９の相互作用の以前に記載されている構造モデル上にマッピングした（Ｈａｒｍｅｒ等（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３，６２９−６４０）。１Ａ１および１Ｄ１のエピトープはそれらが秩序のある構造を欠いているためにこのモデル上に提示されないＦＧＦ１９の遠位の部分に位置している。しかしながら、１Ａ６エピトープはＦＧＦＲ４とのＦＧＦ１９の結合界面に位置している（図６Ｅ）。これらの結果は抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６は直接、ＦＧＦ１９の受容体結合部位を閉塞させていることを示唆している。
【０４５７】
実施例１１：抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体の投与はインビボの腫瘍増殖を抑制した。
【０４５８】
ＦＧＦ１９の中和がインビボの腫瘍増殖を抑制するかどうか調べるために、抗ＦＧＦ１９抗体を上記した２つの腫瘍異種移植片モデルにおいて試験した。結腸癌細胞系統ＨＣＴ１１６およびｃｏｌｏ２０１は、それらがＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４の両方を発現し（図３Ａ）、そしてインビボにおいて腫瘍を形成することから選択した。更にまた、抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６はインビトロでＦＧＦ１９誘導ＨＣＴ１１６細胞遊走に対してブロッキング活性を示している。
【０４５９】
樹立されたＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍を有するマウスに抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６または対照抗体の何れかの５ｍｇ／ｋｇを週２回投与した。第３５日において、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与は対照抗体投与群と比較して５７％（ｐ＝０．０７、ｎ＝５）まで腫瘍増殖を有意に抑制した（図７Ａ）。この試験をより高用量の抗体１Ａ６（１５ｍｇ／ｋｇ；週２回）を用いて反復したところ、腫瘍増殖の統計学的に有意な抑制が観察された（６０％生育抑制；ｐ＝０．０１、ｎ＝５）。
【０４６０】
抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６がＦＧＦ１９活性をブロックすることにより腫瘍増殖を抑制することを確認するために、腫瘍をＦＧＦＲ４シグナリングのマーカーに関して試験終了時に調べた。ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニンの活性化は対照抗体を投与した動物と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与動物由来の腫瘍において有意に低減していた（図７Ｂ）。
【０４６１】
次に、本発明者等はＨＣＴ１１６よりも高値のＦＧＦ１９レベルを発現する結腸癌細胞系統であるＣｏｌｏ２０１の異種移植片を使用した（図１Ａ）。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６の投与（３０ｍｇ／ｋｇ；２ｘ／週）は対照抗体と比較して樹立されたｃｏｌｏ２０１腫瘍の生育を有意に抑制した（第２７日において、６４％生育抑制、ｐ＝０．０３、ｎ＝５）（図７Ｃ）。摘出腫瘍の分析によれば、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６の投与は対照抗体投与と比較して異種移植片腫瘍においてＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニンの活性化を有意に低減したことを示している（図７Ｄ）。これらの結果は、結腸癌における抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６の薬効を明らかにしており、そして、ＦＧＦ１９依存性のＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニンの活性化の抑制を伴うその活性を明らかにしている。
【０４６２】
実施例１２：抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体の投与はＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおいて肝細胞癌および体重減少を防止した。
【０４６３】
トランスジェニックマウスの骨格筋におけるＦＧＦ１９の過剰発現は、１０〜１２カ月齢までに肝細胞癌の発症をもたらしている（Ｎｉｃｈｏｌｅｓ等、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ１６０：２２９５−２３０７，２００２）。ＦＧＦ１９がこのモデルにおいて腫瘍プロモーターとして作用することを確認するために、本発明者等は腫瘍イニシエーターであるジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）をＦＧＦ１９トランスジェニックマウスに投与したとこと、これは５０％まで腫瘍形成を加速した。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６が肝細胞癌を防止するかどうか調べるために、ＤＥＮ加速ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスに１Ａ６または対照抗体（抗ｇｐ１２０）の何れかを６か月投与した。投与終了時、対照投与マウス全てが肉眼で明らかな多病巣の大型の肝細胞癌を肝葉全体に渡って有していたのに対し、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与動物は肝臓腫瘍を有さないか、または、１例（＃１８６２）における中葉の横隔膜側の表面に存在する単一の小型の腫瘍を有するのみであった（図９Ａ）。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与マウス由来の肝臓の重量（平均＝１．７１±０．０５グラム）は対照投与マウス由来の肝臓重量（平均＝３．１５±０．５８グラム；ｐ＝０．０１４）よりも有意に低値であったが、正常なＦＶＢ野生型マウス（平均＝１．５６±０．０８グラム；ｐ＝０．８２）のものとは有意差が無かった。更にまた、腫瘍体積をマイクロＣＴ画像分析により測定し、正常ＦＶＢ肝臓で腫瘍体積に関して補正し、そして総肝臓体積のパーセントとしてグラフ化した（図９Ｂ）。抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６投与マウスパーセント腫瘍体積（平均＝７．５±３．２％）は対照のｇｐ１２０投与マウス（平均＝２３．８±６．８％；ｐ＝０．０５）よりも有意に低値であった。更にまた、腫瘍重量はパーセント腫瘍体積と強力に相関していた（ｒ２＝０．９９３７０２）。これらのデータは抗ＦＧＦ１９Ｍａｂ１Ａ６が循環ＦＧＦ１９を効果的に中和することによりＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおける腫瘍形成を防止していることを明確に示している。
【０４６４】
ＦＧＦ１９はマウス中のトランスジーンとして過剰発現されると体重減少を誘発する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２００２年５月；１４３（５）：１７４１−７）ことから、本発明者等は２投与群においてマウスの体重を評価した。マウスは毎週計量し、体重を投与群間で比較した。３カ月齢において、対照投与マウス（平均体重２７．９８ｇ±０．８３５１；Ｎ＝５）は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与（平均体重２１．３２±０．５０３６；Ｎ＝６）よりも有意に低値の体重であった（ｐ＜０．０００１）。１Ａ６投与ＦＧＦ１９ＴＧマウスの体重は異なる実験で評価した正常ＦＶＢ野生型マウスの体重と同様であった（平均体重３３．２２±１．８３８、Ｎ＝６）。これらのデータは抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６投与がＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおいてＦＧＦ１９誘導体重減少を効果的に停止させたことを示している。
【０４６５】
実施例１３：ＨＣＴ１１６細胞においてＦＧＦ１９投与はβ−カテニンのチロシンリン酸化を誘導し、そしてβ−カテニンへのＥ−カドヘリンの結合の損失をもたらした。
【０４６６】
ＦＧＦ１９発現トランスジェニックマウスにおいて観察される肝細胞癌はベータ−カドヘリン（β−カテニンまたはβ−ｃａｔ）抗体に対して免疫反応性を示す腫瘍細胞を有する（Ｎｉｃｏｌｅｓ等、上出）。更にまた、Ｗｎｔシグナリングは、ヒト結腸直腸癌を包含する種々の細胞過程の間、が種々の細胞型および臓器においてＦＧＦシグナリングを開始または増進できること、および、腫瘍におけるＷｎｔとＦＧＦシグナリング経路の同時活性化はより悪性の表現型をもたらすことが示唆されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ＆Ｔｈｅｒａｐｙ５：９，１０５９−６４，２００６の参考文献７〜１２参照）。即ち、Ｗｎｔシグナリング経路に対するＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９シグナリングの抑制の作用をＦＧＦ１９投与、抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６投与またはＦＧＦＲ４指向ｓｈＲＮＡノックダウンを用いてヒト結腸癌（ＨＣＴ１１６）細胞において試験した。β−カテニンチロシンリン酸化、β−カテニン−Ｅ−カドヘリン結合および活性β−カテニンレベルを免疫沈降およびイムノブロット分析を用いて投与細胞において試験した。
【０４６７】
ＦＧＦ１９（２５〜１００ｎｇ／ｍＬ）の結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）への投与はベヒクル投与対照と比較して１０分もの早期に（図１１）β−カテニンのチロシンリン酸化の有意な増大をもたらした。安定な細胞−細胞接着を形成するカドヘリンへのβ−カテニンの結合はβ−カテニンのチロシンリン酸化により調節されることがわかっている。従って、本発明者等は抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いてチロシンリン酸化ブロットを剥離して再プローブすることにより、ＦＧＦ１９投与細胞におけるＥ−カドヘリンのレベルを評価した。結果はＦＧＦ１９投与細胞におけるβ−カテニンへのＥ−カドヘリンの結合の実質的消失を示していた。同様の結果は、Ｅ−カドヘリンを免疫沈降させ、そして抗β−カテニン抗体射を用いてイムノブロット分析を実施した場合にも観察されている。Ｅ−カドヘリンの結合の低減はＦＧＦ１９投与細胞において観察されたチロシンリン酸化レベルの上昇と反比例していた。
【０４６８】
実施例１４：抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６を用いたＦＧＦ１９の抑制はＨＣＴ１１６細胞において活性β−カテニンのレベルを低下させた。
【０４６９】
以前の試験によれば、Ｗｎｔ調節β−カテニン分解は癌形成にとって必須であること（Ｐｏｌａｋｉｓ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ１４：１８３７−５１，２０００）およびＷｎｔシグナルはＮ末端脱リン酸化されたβ−カテニンを介して伝達されること（Ｓｔａａｌ  ＦＪＴ等、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ３：６３−６８，２００２）が明らかにされている。残基Ｓｅｒ３７およびＴｈｒ４１におけるβ−カテニンの脱リン酸化に特異的な特定の抗体を用いて、本発明者等はＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９の抑制がＨＣＴ１１６細胞においてＷｎｔシグナリングに影響するかどうか調べた。ＦＧＦ１９のＨＣＴ１１６への投与は活性β−カテニンレベルに対して如何なる用量または時点においても影響せず、内因性ＦＧＦ１９がオートクリン態様において飽和レベルにβ−カテニンを活性化したことを示している。しかしながら、抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６のＨＣＴ１１６細胞への投与は、対照抗体（ｇｐ１２０）投与細胞と比較して、投与後３時間もの早期の時点において、活性β−カテニンレベルを低減し、そして、低下した活性β−カテニンのレベルを２４時間まで持続させた（ｇｐ１２０に対して７１．８±１．５％低下、ｐ＜０．００１）（図１２）。
【０４７０】
実施例１５：抗ＦＧＦ１９抗体投与はＳｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｓｅｒ４５およびＴｈｒ４１リン酸化を誘導した。
【０４７１】
ＦＧＦ１９抑制はＨＣＴ１１６細胞において活性β−カテニンレベルを低下させたことから、本発明者等は次に、抗ＦＧＦ１９抗体の投与がβ−カテニンのＮ末端Ｓｅｒ−Ｔｈｒリン酸化の増大をもたらし、そしてこのため、ユビキチン化およびプロテオソーム分解のためにβ−カテニンを標的とするかどうかについて評価した。４時間プロテオソーム抑制剤（ＭＧ１３２、１μＭ）を予備投与し、その後抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６を投与したＨＣＴ１１６細胞は、プロテオソーム抑制剤＋対照抗体（ｇｐ１２０）投与細胞と比較してＳｅｒ３３／Ｓｅｒ３７およびＳｅｒ４５／Ｔｈｒ４１リン酸化の有意な増大を示した（図１３）。Ｓｅｒ３３／３７のリン酸化の定量（総β−カテニンタンパク質およびリン酸化タンパク質レベルの間の比を計算することにより求める）は、対照抗ｇｐ１２０抗体投与細胞に対して抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６投与細胞において１２３．４±７％の増大（ｐ＜０．０５）を示していた。同様に、Ｓｅｒ４５／Ｔ４１リン酸化は対照抗ｇｐ１２０抗体投与細胞に対して抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６投与細胞において１６６．８±１１％の増大（ｐ＜０．０５）を示していた。
【０４７２】
β−カテニンのＮ末端におけるＳｅｒ−Ｔｈｒリン酸化は更に、線形イオントラップ質量スペクトルを用いて分析した。非リン酸化β−カテニンペプチドのシグナル強度はプロテオソーム抑制剤を予備投与し、その後抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６または対照抗ｇｐ２０抗体の何れかを投与した細胞において線形イオントラップ質量スペクトルを用いて測定した。データは投与および未投与の試料由来のシグナル強度において差を示さなかったノン関連ペプチド（４つ全てのリン酸化部位を含有）に対して正規化した。抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６投与細胞から単離されたβ−カテニンペプチドは対照抗ｇｐ２０抗体投与細胞から単離したβ−カテニンペプチドと比較して低値のシグナル強度を呈し（図１４）、抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６投与細胞におけるβ−カテニンのＮ末端における増大したリン酸化を明確に示している。
【０４７３】
実施例１６：ｓｈＲＮＡを用いたＦＧＦＲ４発現の低減は低減した活性β−カテニンレベルをもたらした。
【０４７４】
ＦＧＦＲ４受容体の抑制が抗ＦＧＦ１９抗体の投与に起因するＦＧＦ１９抑制の作用を模倣するかどうかを調べるために、ＦＧＦＲ４指向ｓｈＲＮＡおよびＥＧＦＰ指向ｓｈＲＮＡを発現する安定な細胞系統を上記した通り作成した。ＦＧＦＲ４指向ｓｈＲＮＡを発現する安定な細胞系統はＦＧＦＲ４タンパク質発現の効果的なノックダウンを示した。ＦＧＦＲ４指向ｓｈＲＮＡを発現する安定な細胞系統に由来する細胞溶解物のイムノブロット分析によれば、ＥＧＦＰに指向されたｓｈＲＮＡを発現する対照の安定な細胞系統と比較した場合の活性β−カテニンのレベルのほぼ完全な低減を示していた（図１５）。
【０４７５】
実施例１７：抗ＦＧＦ１９抗体投与は結腸癌細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子転写レベルを低減した。
【０４７６】
Ｗｎｔ標的遺伝子（サイクリンＤ１、ＣＤ４４，Ｅ−ｃａｄ、ｃ−ｊｕｎ）の発現レベルを抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６投与ＨＣＴ１１６細胞においてリアルタイムＰＣＴを用いて測定した。図１６に示す通り、抗ＦＧＦ１９抗体１Ａ６投与により、サイクリンＤ１、ＣＤ４４、Ｅ−ｃａｄおよびｃ−ｊｕｎのｍＲＮＡの発現レベルは、対照抗体（抗ｇｐ１２０）投与細胞におけるこれらの遺伝子の発現と比較して６時間の時点において低減された。
【０４７７】
部分的な参考文献のリスト
【０４７８】
【化２】
2009525764.tif 000009
【０４７９】
【化３】
2009525764.tif 000010
【０４８０】
【化４】
2009525764.tif 000011
上記した本発明は理解の明確化の目的のために解説および例示により一部詳細に説明したが、説明および実施例は本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０４８１】
【図１Ａ】図１ＡおよびＢはマウス抗ヒトＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６可変領域のアミノ酸配列を示す。（Ａ）軽鎖可変領域（配列番号４）。（Ｂ）重鎖可変領域（配列番号８）。アミノ酸はＫａｂａｔに従ってナンバリングしている。ＨＶＲの位置を図中に示す。
【図１Ｂ】図１ＡおよびＢはマウス抗ヒトＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６可変領域のアミノ酸配列を示す。（Ａ）軽鎖可変領域（配列番号４）。（Ｂ）重鎖可変領域（配列番号８）。アミノ酸はＫａｂａｔに従ってナンバリングしている。ＨＶＲの位置を図中に示す。
【図２Ａ】結腸（Ａ）および肺（Ｂ）に由来する正常および腫瘍の試料におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各組織に関する最低発現試料と比較した。結腸腺癌（Ｃ）、肺扁平上皮細胞癌（Ｄ）および肝細胞癌（Ｅ）におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（左パネル）および暗視野（右パネル）の照明およびＦＧＦ１９免疫組織学的分析（ＩＨＣ）（下パネル）の代表的な画像。肝硬変の肝臓の結節（Ｆ）におけるＦＧＦ１９リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（上左パネル）および暗視野（上右パネル）の照明およびＦＧＦ１９ＩＨＣ（下パネル）の代表的画像。
【図２Ｂ】結腸（Ａ）および肺（Ｂ）に由来する正常および腫瘍の試料におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各組織に関する最低発現試料と比較した。結腸腺癌（Ｃ）、肺扁平上皮細胞癌（Ｄ）および肝細胞癌（Ｅ）におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（左パネル）および暗視野（右パネル）の照明およびＦＧＦ１９免疫組織学的分析（ＩＨＣ）（下パネル）の代表的な画像。肝硬変の肝臓の結節（Ｆ）におけるＦＧＦ１９リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（上左パネル）および暗視野（上右パネル）の照明およびＦＧＦ１９ＩＨＣ（下パネル）の代表的画像。
【図２Ｃ】結腸（Ａ）および肺（Ｂ）に由来する正常および腫瘍の試料におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各組織に関する最低発現試料と比較した。結腸腺癌（Ｃ）、肺扁平上皮細胞癌（Ｄ）および肝細胞癌（Ｅ）におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（左パネル）および暗視野（右パネル）の照明およびＦＧＦ１９免疫組織学的分析（ＩＨＣ）（下パネル）の代表的な画像。肝硬変の肝臓の結節（Ｆ）におけるＦＧＦ１９リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（上左パネル）および暗視野（上右パネル）の照明およびＦＧＦ１９ＩＨＣ（下パネル）の代表的画像。
【図２Ｄ】結腸（Ａ）および肺（Ｂ）に由来する正常および腫瘍の試料におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各組織に関する最低発現試料と比較した。結腸腺癌（Ｃ）、肺扁平上皮細胞癌（Ｄ）および肝細胞癌（Ｅ）におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（左パネル）および暗視野（右パネル）の照明およびＦＧＦ１９免疫組織学的分析（ＩＨＣ）（下パネル）の代表的な画像。肝硬変の肝臓の結節（Ｆ）におけるＦＧＦ１９リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（上左パネル）および暗視野（上右パネル）の照明およびＦＧＦ１９ＩＨＣ（下パネル）の代表的画像。
【図２Ｅ】結腸（Ａ）および肺（Ｂ）に由来する正常および腫瘍の試料におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各組織に関する最低発現試料と比較した。結腸腺癌（Ｃ）、肺扁平上皮細胞癌（Ｄ）および肝細胞癌（Ｅ）におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（左パネル）および暗視野（右パネル）の照明およびＦＧＦ１９免疫組織学的分析（ＩＨＣ）（下パネル）の代表的な画像。肝硬変の肝臓の結節（Ｆ）におけるＦＧＦ１９リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（上左パネル）および暗視野（上右パネル）の照明およびＦＧＦ１９ＩＨＣ（下パネル）の代表的画像。
【図２Ｆ】結腸（Ａ）および肺（Ｂ）に由来する正常および腫瘍の試料におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各組織に関する最低発現試料と比較した。結腸腺癌（Ｃ）、肺扁平上皮細胞癌（Ｄ）および肝細胞癌（Ｅ）におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（左パネル）および暗視野（右パネル）の照明およびＦＧＦ１９免疫組織学的分析（ＩＨＣ）（下パネル）の代表的な画像。肝硬変の肝臓の結節（Ｆ）におけるＦＧＦ１９リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションの明視野（上左パネル）および暗視野（上右パネル）の照明およびＦＧＦ１９ＩＨＣ（下パネル）の代表的画像。
【図３Ａ】腫瘍細胞系統および異種移植片組織におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡは結腸腫瘍細胞系統、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６において高い相対的発現を示した。ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現は半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各遺伝子に関する最低発現細胞系統と比較した。（Ｂ）結腸癌細胞系統のパネルにおいて発現されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質のウエスタンブロット。ＦＧＦ１９タンパク質の発現は免疫沈降およびウエスタンブロット分析により結腸癌細胞系統において確認した。（Ｃ）、（Ｄ）結腸癌細胞系統のサブセットをヌードマウスに皮下接種した。３週間後、腫瘍を摘出し、ＦＧＦ１９の免疫染色用に処理した。４００倍（Ｃ）および６００倍の差し込み図を伴った４００倍（バー＝２５μｍ）（Ｄ）における代表的な視野の写真を示す。
【図３Ｂ】腫瘍細胞系統および異種移植片組織におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡは結腸腫瘍細胞系統、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６において高い相対的発現を示した。ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現は半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各遺伝子に関する最低発現細胞系統と比較した。（Ｂ）結腸癌細胞系統のパネルにおいて発現されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質のウエスタンブロット。ＦＧＦ１９タンパク質の発現は免疫沈降およびウエスタンブロット分析により結腸癌細胞系統において確認した。（Ｃ）、（Ｄ）結腸癌細胞系統のサブセットをヌードマウスに皮下接種した。３週間後、腫瘍を摘出し、ＦＧＦ１９の免疫染色用に処理した。４００倍（Ｃ）および６００倍の差し込み図を伴った４００倍（バー＝２５μｍ）（Ｄ）における代表的な視野の写真を示す。
【図３Ｃ】腫瘍細胞系統および異種移植片組織におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡは結腸腫瘍細胞系統、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６において高い相対的発現を示した。ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現は半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各遺伝子に関する最低発現細胞系統と比較した。（Ｂ）結腸癌細胞系統のパネルにおいて発現されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質のウエスタンブロット。ＦＧＦ１９タンパク質の発現は免疫沈降およびウエスタンブロット分析により結腸癌細胞系統において確認した。（Ｃ）、（Ｄ）結腸癌細胞系統のサブセットをヌードマウスに皮下接種した。３週間後、腫瘍を摘出し、ＦＧＦ１９の免疫染色用に処理した。４００倍（Ｃ）および６００倍の差し込み図を伴った４００倍（バー＝２５μｍ）（Ｄ）における代表的な視野の写真を示す。
【図３Ｄ】腫瘍細胞系統および異種移植片組織におけるＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡは結腸腫瘍細胞系統、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６において高い相対的発現を示した。ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡの発現は半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。値はＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化し、そして各遺伝子に関する最低発現細胞系統と比較した。（Ｂ）結腸癌細胞系統のパネルにおいて発現されたＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質のウエスタンブロット。ＦＧＦ１９タンパク質の発現は免疫沈降およびウエスタンブロット分析により結腸癌細胞系統において確認した。（Ｃ）、（Ｄ）結腸癌細胞系統のサブセットをヌードマウスに皮下接種した。３週間後、腫瘍を摘出し、ＦＧＦ１９の免疫染色用に処理した。４００倍（Ｃ）および６００倍の差し込み図を伴った４００倍（バー＝２５μｍ）（Ｄ）における代表的な視野の写真を示す。
【図４Ａ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図４Ｂ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図４Ｃ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図４Ｄ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図４Ｅ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図４Ｆ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図４Ｇ】ＦＧＦＲ４複合体の成分に結合したＦＧＦ１９。（Ａ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ４のタンパク質をマイクロウェルに吸着させたヘパリンスルフェートプロテオグリカンと共にインキュベートした。結合はビオチン化特異的抗体、次いでセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンおよび比色分析用基質を用いて検出した。（Ｂ）ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１のタンパク質をヘパリン−アガロースと共にインキュベートし、そしてゲルスラリーを種々のＮａＣｌ濃度を有する結合緩衝液１ｍｌで洗浄した。残存するヘパリン−アガロース結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ウエスタンブロットで分析した。対照レーン（Ｃｏｎｔ）はゲル上に直接ロードされたタンパク質の元の量を示す。ＦＧＦ１９タンパク質は固相（Ｃ）に対してまたは溶液（Ｄ）中において、キャプチャーされたＦＧＦＲ４に対して独特の結合特異性を有していた。（Ｅ）種々のグルコサミノグリカンの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合（ＨｅｐＳｌｆ：ヘパリンスルフェート；ＣＳＢ：コンドロイチンスルフェートＢ；ＣＳＡ：コンドロイチンスルフェートＡ；ＣＳｂ：コンドロイチンスルフェートＣ）。（Ｆ）種々の長さのヘパリンのフラグメントの存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４ＩｇＧタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質結合。（Ｇ）固相キャプチャーＦＧＦＲ４タンパク質への１２５Ｉ−ＦＧＦ１９タンパク質結合のスカッチャード分析。
【図５Ａ】抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６はインビトロでＦＧＦ１９の活性を抑制している。（Ａ）固相キャプチャーＦＧＦ１９タンパク質へのモノクローナル抗体の結合。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体（ｍａｂ）の存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合。（Ｃ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦシグナリング経路のＦＧＦ１９活性化を抑制している。（Ｄ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘導ＣＹＰ７α１リプレッションを抑制している。血清非含有の培地中で一夜インキュベートしたＨＥＰＧ２細胞に抗体の存在下または非存在下においてＦＧＦ１９タンパク質により治療した。ＣＹＰ７α１の発現は遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、そしてＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。（Ｅ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘発ＨＣＴ１１６細胞遊走を抑制している。８μｍ多孔性２４穴変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの表面をＩ型コラーゲンでコーティングした。血清非含有培地中の細胞を上方のチャンバーに添加した。ＦＧＦ１９および種々の濃度の抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６を含有する同じ培地を添加した後に下方チャンバーに遊走した細胞を染色し、計数した。データの３連のセットを各条件について平均した。
【図５Ｂ】抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６はインビトロでＦＧＦ１９の活性を抑制している。（Ａ）固相キャプチャーＦＧＦ１９タンパク質へのモノクローナル抗体の結合。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体（ｍａｂ）の存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合。（Ｃ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦシグナリング経路のＦＧＦ１９活性化を抑制している。（Ｄ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘導ＣＹＰ７α１リプレッションを抑制している。血清非含有の培地中で一夜インキュベートしたＨＥＰＧ２細胞に抗体の存在下または非存在下においてＦＧＦ１９タンパク質により治療した。ＣＹＰ７α１の発現は遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、そしてＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。（Ｅ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘発ＨＣＴ１１６細胞遊走を抑制している。８μｍ多孔性２４穴変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの表面をＩ型コラーゲンでコーティングした。血清非含有培地中の細胞を上方のチャンバーに添加した。ＦＧＦ１９および種々の濃度の抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６を含有する同じ培地を添加した後に下方チャンバーに遊走した細胞を染色し、計数した。データの３連のセットを各条件について平均した。
【図５Ｃ】抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６はインビトロでＦＧＦ１９の活性を抑制している。（Ａ）固相キャプチャーＦＧＦ１９タンパク質へのモノクローナル抗体の結合。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体（ｍａｂ）の存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合。（Ｃ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦシグナリング経路のＦＧＦ１９活性化を抑制している。（Ｄ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘導ＣＹＰ７α１リプレッションを抑制している。血清非含有の培地中で一夜インキュベートしたＨＥＰＧ２細胞に抗体の存在下または非存在下においてＦＧＦ１９タンパク質により治療した。ＣＹＰ７α１の発現は遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、そしてＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。（Ｅ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘発ＨＣＴ１１６細胞遊走を抑制している。８μｍ多孔性２４穴変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの表面をＩ型コラーゲンでコーティングした。血清非含有培地中の細胞を上方のチャンバーに添加した。ＦＧＦ１９および種々の濃度の抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６を含有する同じ培地を添加した後に下方チャンバーに遊走した細胞を染色し、計数した。データの３連のセットを各条件について平均した。
【図５Ｄ】抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６はインビトロでＦＧＦ１９の活性を抑制している。（Ａ）固相キャプチャーＦＧＦ１９タンパク質へのモノクローナル抗体の結合。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体（ｍａｂ）の存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合。（Ｃ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦシグナリング経路のＦＧＦ１９活性化を抑制している。（Ｄ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘導ＣＹＰ７α１リプレッションを抑制している。血清非含有の培地中で一夜インキュベートしたＨＥＰＧ２細胞に抗体の存在下または非存在下においてＦＧＦ１９タンパク質により治療した。ＣＹＰ７α１の発現は遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、そしてＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。（Ｅ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘発ＨＣＴ１１６細胞遊走を抑制している。８μｍ多孔性２４穴変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの表面をＩ型コラーゲンでコーティングした。血清非含有培地中の細胞を上方のチャンバーに添加した。ＦＧＦ１９および種々の濃度の抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６を含有する同じ培地を添加した後に下方チャンバーに遊走した細胞を染色し、計数した。データの３連のセットを各条件について平均した。
【図５Ｅ】抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体１Ａ６はインビトロでＦＧＦ１９の活性を抑制している。（Ａ）固相キャプチャーＦＧＦ１９タンパク質へのモノクローナル抗体の結合。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体（ｍａｂ）の存在下の固相キャプチャーＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質へのＦＧＦ１９タンパク質の結合。（Ｃ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦシグナリング経路のＦＧＦ１９活性化を抑制している。（Ｄ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘導ＣＹＰ７α１リプレッションを抑制している。血清非含有の培地中で一夜インキュベートしたＨＥＰＧ２細胞に抗体の存在下または非存在下においてＦＧＦ１９タンパク質により治療した。ＣＹＰ７α１の発現は遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、そしてＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。（Ｅ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療はＦＧＦ１９誘発ＨＣＴ１１６細胞遊走を抑制している。８μｍ多孔性２４穴変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの表面をＩ型コラーゲンでコーティングした。血清非含有培地中の細胞を上方のチャンバーに添加した。ＦＧＦ１９および種々の濃度の抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６を含有する同じ培地を添加した後に下方チャンバーに遊走した細胞を染色し、計数した。データの３連のセットを各条件について平均した。
【図６Ａ】抗ＦＧＦ１９抗体により認識されるエピトープの識別。ＦＧＦ１９タンパク質をアガロースカップリング抗体と共に２時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、３７℃で一夜トリプシン消化した。ゲルスラリーを洗浄し、結合ペプチドを溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。（Ａ）アガロースカップリングｍａｂ１Ａ６に結合したトリプシン消化ＦＧＦ１９の可溶性画分の質量スペクトル分析。（Ｂ）アガロースカップリング１Ａ６抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｃ）アガロースカップリング１Ａ１抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｄ）固相キャプチャーＦＧＦ１９への抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１結合のペプチド競合。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１をＦＧＦ１９タンパク質の種々の部分を示すペプチドの存在下においてニッケルコーティングプレートにキャプチャーされたＦＧＦ１９−Ｈｉｓと共にインキュベートした。抗体の結合はＨＲＰ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧおよび発色性の基質を用いて検出した。（Ｅ）ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４相互作用モデルへの１Ａ６エピトープ（矢印）のマッピング。ＦＧＦＲ４表面は球状の形態で表し、ＦＧＦ１９はリボン型として表している。
【図６Ｂ】抗ＦＧＦ１９抗体により認識されるエピトープの識別。ＦＧＦ１９タンパク質をアガロースカップリング抗体と共に２時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、３７℃で一夜トリプシン消化した。ゲルスラリーを洗浄し、結合ペプチドを溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。（Ａ）アガロースカップリングｍａｂ１Ａ６に結合したトリプシン消化ＦＧＦ１９の可溶性画分の質量スペクトル分析。（Ｂ）アガロースカップリング１Ａ６抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｃ）アガロースカップリング１Ａ１抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｄ）固相キャプチャーＦＧＦ１９への抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１結合のペプチド競合。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１をＦＧＦ１９タンパク質の種々の部分を示すペプチドの存在下においてニッケルコーティングプレートにキャプチャーされたＦＧＦ１９−Ｈｉｓと共にインキュベートした。抗体の結合はＨＲＰ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧおよび発色性の基質を用いて検出した。（Ｅ）ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４相互作用モデルへの１Ａ６エピトープ（矢印）のマッピング。ＦＧＦＲ４表面は球状の形態で表し、ＦＧＦ１９はリボン型として表している。
【図６Ｃ】抗ＦＧＦ１９抗体により認識されるエピトープの識別。ＦＧＦ１９タンパク質をアガロースカップリング抗体と共に２時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、３７℃で一夜トリプシン消化した。ゲルスラリーを洗浄し、結合ペプチドを溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。（Ａ）アガロースカップリングｍａｂ１Ａ６に結合したトリプシン消化ＦＧＦ１９の可溶性画分の質量スペクトル分析。（Ｂ）アガロースカップリング１Ａ６抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｃ）アガロースカップリング１Ａ１抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｄ）固相キャプチャーＦＧＦ１９への抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１結合のペプチド競合。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１をＦＧＦ１９タンパク質の種々の部分を示すペプチドの存在下においてニッケルコーティングプレートにキャプチャーされたＦＧＦ１９−Ｈｉｓと共にインキュベートした。抗体の結合はＨＲＰ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧおよび発色性の基質を用いて検出した。（Ｅ）ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４相互作用モデルへの１Ａ６エピトープ（矢印）のマッピング。ＦＧＦＲ４表面は球状の形態で表し、ＦＧＦ１９はリボン型として表している。
【図６Ｄ】抗ＦＧＦ１９抗体により認識されるエピトープの識別。ＦＧＦ１９タンパク質をアガロースカップリング抗体と共に２時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、３７℃で一夜トリプシン消化した。ゲルスラリーを洗浄し、結合ペプチドを溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。（Ａ）アガロースカップリングｍａｂ１Ａ６に結合したトリプシン消化ＦＧＦ１９の可溶性画分の質量スペクトル分析。（Ｂ）アガロースカップリング１Ａ６抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｃ）アガロースカップリング１Ａ１抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｄ）固相キャプチャーＦＧＦ１９への抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１結合のペプチド競合。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１をＦＧＦ１９タンパク質の種々の部分を示すペプチドの存在下においてニッケルコーティングプレートにキャプチャーされたＦＧＦ１９−Ｈｉｓと共にインキュベートした。抗体の結合はＨＲＰ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧおよび発色性の基質を用いて検出した。（Ｅ）ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４相互作用モデルへの１Ａ６エピトープ（矢印）のマッピング。ＦＧＦＲ４表面は球状の形態で表し、ＦＧＦ１９はリボン型として表している。
【図６Ｅ】抗ＦＧＦ１９抗体により認識されるエピトープの識別。ＦＧＦ１９タンパク質をアガロースカップリング抗体と共に２時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、３７℃で一夜トリプシン消化した。ゲルスラリーを洗浄し、結合ペプチドを溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。（Ａ）アガロースカップリングｍａｂ１Ａ６に結合したトリプシン消化ＦＧＦ１９の可溶性画分の質量スペクトル分析。（Ｂ）アガロースカップリング１Ａ６抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｃ）アガロースカップリング１Ａ１抗体から溶出したＦＧＦ１９トリプシンペプチドの質量スペクトル分析。（Ｄ）固相キャプチャーＦＧＦ１９への抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１結合のペプチド競合。抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ｄ１をＦＧＦ１９タンパク質の種々の部分を示すペプチドの存在下においてニッケルコーティングプレートにキャプチャーされたＦＧＦ１９−Ｈｉｓと共にインキュベートした。抗体の結合はＨＲＰ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧおよび発色性の基質を用いて検出した。（Ｅ）ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４相互作用モデルへの１Ａ６エピトープ（矢印）のマッピング。ＦＧＦＲ４表面は球状の形態で表し、ＦＧＦ１９はリボン型として表している。
【図７Ａ】抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体１Ａ６による治療はインビボにおける結腸腫瘍の生育を抑制している。無胸腺マウスに５×１０６ＨＣＴ１１２６またはＣｏｌｏ２０１細胞を皮下接種した。等しい容量（〜１００ｍｍ３）の樹立された腫瘍を担持しているマウスを無作為に群分けし、そして、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６または対照抗体を週２回腹腔内で治療した。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥＭで表示する。試験終了時、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療または対照抗体治療のマウスに由来するＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍およびＣｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍を摘出し、ホモゲナイズし、そしてＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニン活性に関してウエスタンブロットで分析した。（Ａ）ＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｂ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化およびβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療ＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ｃ）Ｃｏｌｏ２０１結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｄ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化ならびにβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療Ｃｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ａ）および（Ｃ）において、矢印は治療の投与を示す。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥで示す。
【図７Ｂ】抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体１Ａ６による治療はインビボにおける結腸腫瘍の生育を抑制している。無胸腺マウスに５×１０６ＨＣＴ１１２６またはＣｏｌｏ２０１細胞を皮下接種した。等しい容量（〜１００ｍｍ３）の樹立された腫瘍を担持しているマウスを無作為に群分けし、そして、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６または対照抗体を週２回腹腔内で治療した。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥＭで表示する。試験終了時、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療または対照抗体治療のマウスに由来するＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍およびＣｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍を摘出し、ホモゲナイズし、そしてＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニン活性に関してウエスタンブロットで分析した。（Ａ）ＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｂ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化およびβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療ＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ｃ）Ｃｏｌｏ２０１結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｄ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化ならびにβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療Ｃｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ａ）および（Ｃ）において、矢印は治療の投与を示す。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥで示す。
【図７Ｃ】抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体１Ａ６による治療はインビボにおける結腸腫瘍の生育を抑制している。無胸腺マウスに５×１０６ＨＣＴ１１２６またはＣｏｌｏ２０１細胞を皮下接種した。等しい容量（〜１００ｍｍ３）の樹立された腫瘍を担持しているマウスを無作為に群分けし、そして、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６または対照抗体を週２回腹腔内で治療した。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥＭで表示する。試験終了時、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療または対照抗体治療のマウスに由来するＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍およびＣｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍を摘出し、ホモゲナイズし、そしてＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニン活性に関してウエスタンブロットで分析した。（Ａ）ＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｂ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化およびβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療ＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ｃ）Ｃｏｌｏ２０１結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｄ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化ならびにβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療Ｃｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ａ）および（Ｃ）において、矢印は治療の投与を示す。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥで示す。
【図７Ｄ】抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体１Ａ６による治療はインビボにおける結腸腫瘍の生育を抑制している。無胸腺マウスに５×１０６ＨＣＴ１１２６またはＣｏｌｏ２０１細胞を皮下接種した。等しい容量（〜１００ｍｍ３）の樹立された腫瘍を担持しているマウスを無作為に群分けし、そして、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６または対照抗体を週２回腹腔内で治療した。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥＭで表示する。試験終了時、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療または対照抗体治療のマウスに由来するＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍およびＣｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍を摘出し、ホモゲナイズし、そしてＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、ＥＲＫおよびβ−カテニン活性に関してウエスタンブロットで分析した。（Ａ）ＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｂ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化およびβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療ＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ｃ）Ｃｏｌｏ２０１結腸腫瘍異種移植片の生育は対照抗体治療と比較して抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６による治療により抑制されている。（Ｄ）ＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２およびＥＲＫのリン酸化ならびにβ−カテニンの活性化は抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療Ｃｏｌｏ２０１異種移植片腫瘍において抑制されている。（Ａ）および（Ｃ）において、矢印は治療の投与を示す。結果は平均の腫瘍容量±ＳＥで示す。
【図８−１】抗体エピトープの配列決定。エピトープ切り出し操作を用いて単離されたペプチドの衝突誘導解離および手作業による配列決定。（Ａ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号９）。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ１のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号１０）。
【図８−２】抗体エピトープの配列決定。エピトープ切り出し操作を用いて単離されたペプチドの衝突誘導解離および手作業による配列決定。（Ａ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号９）。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ１のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号１０）。
【図８−３】抗体エピトープの配列決定。エピトープ切り出し操作を用いて単離されたペプチドの衝突誘導解離および手作業による配列決定。（Ａ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号９）。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ１のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号１０）。
【図８−４】抗体エピトープの配列決定。エピトープ切り出し操作を用いて単離されたペプチドの衝突誘導解離および手作業による配列決定。（Ａ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号９）。（Ｂ）抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ１のエピトープを含むペプチドの配列（配列番号１０）。
【図９Ａ】抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体１Ａ６による治療によりＦＧＦ１９トランスジェニック肝細胞癌動物モデルにおいてインビボで肝細胞癌が抑制された。ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスに対照抗体または抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６で治療し、肝臓を収集して目視による評価に付した（Ａ）。正常幹細胞の増強の為にヨウ素化トリグリセリドを用いたマイクロＣＴ分析によれば、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療肝臓に対して対照治療において未増強腫瘍容量の増大が明らかになった（Ｂ）。
【図９Ｂ】抗ＦＧＦ１９マウスモノクローナル抗体１Ａ６による治療によりＦＧＦ１９トランスジェニック肝細胞癌動物モデルにおいてインビボで肝細胞癌が抑制された。ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスに対照抗体または抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６で治療し、肝臓を収集して目視による評価に付した（Ａ）。正常幹細胞の増強の為にヨウ素化トリグリセリドを用いたマイクロＣＴ分析によれば、抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６治療肝臓に対して対照治療において未増強腫瘍容量の増大が明らかになった（Ｂ）。
【図１０】ＦＧＦ１９タンパク質による治療はＨＣＴ１１６細胞の遊走を増進している。８μｍ多孔性２４穴変性Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの表面をＩ型コラーゲンでコーティングした。血清非含有培地中のＨＣＴ１１６細胞を上方のチャンバーに添加した。下方チャンバーに種々の濃度の抗ＦＧＦ１９を含有する同じ培地を充填し、プレートを３７℃でインキュベートした。翌日、インサートの下側に遊走した細胞を染色し、顕微鏡下に計数した。データの３連のセットを各条件について平均した。
【図１１】ＦＧＦ１９による治療は結腸癌細胞系統ＨＣＴ１１６においてβ−カテニンのチロシンリン酸化を誘導し、そしてβ−カテニンへのＥ−カドヘリンの結合の損失をもたらした。血清飢餓結腸癌細胞にベヒクル（ｖｅｈ）（対照）またはＦＧＦ１９の何れかを２５および１００ｎｇ／ｍｌにおいて１０分間治療した。β−カテニンのチロシンリン酸化は免疫沈降（ＩＰ）およびイムノブロッティング（ＷＢ）により測定した。同じブロットを剥離し、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いて再プローブし、そしてその後、抗β−カテニン抗体を用いて全β−カテニンに関して再プローブした。３つの別個の実験で得られた代表的なブロットを示す。β−カテニンリン酸化およびＥ−カドヘリンに結合したβ−カテニンの定量分析は、３つの別個の実験から得られたリン酸化Ｅ−カドヘリンと総β−カテニンレベルの間の比を計算することにより行った（平均値±ＳＥ）。
【図１２】抗ＦＧＦ１９抗体による治療はＨＣＴ１１６細胞における活性β−カテニンのレベルを低減している。細胞を血清存在下に生育させ、そして種々の時間間隔において対照（ｇｐ１２０）または抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６（共に２０μｇ／ｍｌ）の何れかで治療した。（Ａ）活性β−カテニン（ａｃｔ−β−ｃａｔ）レベル（Ｎ末端脱リン酸化β−カテニン）はイムノブロッティングにより測定した。同じブロットを剥離し、総β−カテニン（β−ｃａｔ）レベルに関して再プローブした。３つの別個の実験で得られた代表的なブロットを示す。（Ｂ）３つの別個の実験から得られた活性β−カテニンと総β−カテニンレベルの間の比を計算することにより求めた治療後２４時間における活性β−カテニンレベルの定量分析（平均値±ＳＥ）。β−アクチンのレベルを対照として測定した。
【図１３】抗ＦＧＦ１９抗体による治療はＨＣＴ１１６細胞においてβ−カテニンのアミノ酸残基Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｓｅｒ４５およびＴｈｒ４１に対するリン酸化を誘導している。細胞を血清存在下に生育させ、４時間ＭＧ１３２（１μＭ）を投与し、次いで２４時間対照（ｇｐ１２０）または抗ＦＧＦ１９（１Ａ６）抗体（共に２０μｇ／ｍｌ）の何れかで治療した。Ｓｅｒ３３／Ｓ３７／Ｓ４５およびＴｈｒ４１に対するβ−カテニンリン酸化をイムノブロッティングにより分析した。同じブロットを剥離し、総β−カテニンに関して再プローブした。３つの別個の実験で得られた代表的なブロットを示す。β−アクチンのレベルを対照として測定した。
【図１４】ＦＧＦＲ４指向性ｓｈＲＮＡによる治療はＨＣＴ１１６細胞においてＦＧＦＲ４タンパク質および活性β−カテニンの発現を抑制している。ＦＧＦＲ４ノックダウンベクターはｓｈＲＮＡ配列を設計してレトロウィルス誘導発現ベクター系内にクローニングすることにより構築した。ｃＤＮＡをトランスフェクトし、ピューロマイシン選択を用いてＨＣＴ１１６細胞においてｓｉＲＮＡを発現している安定な細胞系統を作成した。対照のｓｈＲＮＡおよびＦＧＦＲ４指向性ｓｈＲＮＡを含む安定な細胞系統をドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を使用して、または使用せず治療し、ＦＧＦＲ４タンパク質および活性β−カテニンのレベルを免疫沈降およびイムノブロッティングにより測定した。３つの別個の実験で得られた代表的なブロットを示す。
【図１５】線形イオントラップ質量スペクトルを用いたＮ末端β−カテニンリン酸化の間接的定量。ＭＧ１３２、続いて対照（ｇｐ１２０）または抗ＦＧＦ１９ｍａｂ１Ａ６を用いて治療した細胞に由来する免疫沈降β−カテニンに由来するＮ末端ペプチドに対するデータ依存性タンデム質量スペクトル分析を実施例に記載する通り線形イオントラップ機器を用いて実施した。各ＣＩＤスペクトルに関する交差相関評点を作成し、ペプチドの相対的アバンダンスを求めた。データは治療および未治療の試料のシグナル強度の差を示さなかった他の非関連ペプチドのシグナル強度に対して正規化した。
【図１６】抗ＦＧＦ１９抗体による治療は結腸癌細胞においてＷｎｔ標的遺伝子転写のレベルを低減している。ＨＣＴ１１６細胞を血清存在下に生育させ、６時間対照（ｇｐ１２０）または１Ａ６抗体（２０μｇ／ｍｌ）の何れかを用いて治療した。β−カテニン標的遺伝子（サイクリンＤ１、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリンおよびｃ−ｊｕｎ）発現レベルをＴａｑｍａｎ分析により分析した。データの分析はシーケンスディテクター１．６．３（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、結果はＲＰＬ１９遺伝子発現レベルに対して正規化した。
【図１Ａ】
2009525764.tif 000012
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
2009525764.tif 000031
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2009525764.tif 000037
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2009525764.tif 000051
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月25日(2008.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009525764000001.app
【国際調査報告】
2009525764.tif 000058
2009525764.tif 000059
2009525764.tif 000060
2009525764.tif 000061