(57)【要約】  選択されたプロシアニジンモノマーおよび／またはオリゴマーを抽出することを目的として、溶媒を特定の順番で使用することによる、カカオポリフェノールの混合水溶液からカカオプロシアニジンを選択的に抽出する方法について記載する。溶媒は、ｎ−酢酸ブチル、酢酸エチル、酢酸メチル、ジエチルエーテル、または酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である。カカオポリフェノールの混合水溶液は、最初にｎ−酢酸ブチルで抽出されることが好ましい。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液の割合は、２５：７５〜７５：２５（ｖ／ｖ）である。
2009510164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合水溶液をｎ−酢酸ブチルで抽出し、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、カテキンおよびエピカテキンを多く含むｎ−酢酸ブチル相を分離する工程を有してなる、カカオポリフェノールの混合水溶液からカカオプロシアニジンを選択的に抽出する方法。
【請求項２】
前記水相をジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン２量体を多く含む酢酸メチルまたは酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水相を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記水相を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相とプロシアニジン５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、水相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体および８量体を多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン５量体、６量体、７量体および８量体を多く含む水相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記水相を酢酸メチルおよびジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含む水相と、プロシアニジン５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、水相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記水相を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン２量体、３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記水相を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記水相を酢酸メチル相で抽出し、水相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン５量体、６量体、７量体、および８量体を多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含む水相と、プロシアニジン５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液をジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む水相と、プロシアニジン２量体を多く含むジエチルエーテル相または酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記水相を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン２量体、３量体、４量体、および５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、水相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記酢酸メチル‐ジエチルエーテル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液をジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン３量体、４量体、および５量体を多く含む水相と、プロシアニジン２量体を多く含むジエチルエーテル相または酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記水相を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン５量体を多く含む水相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記水相を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相と、プロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、および８量体を多く含む酢酸メチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液をジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、および８量体を多く含む水相と、プロシアニジン２量体を多く含むジエチルエーテル相または酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記水相を酢酸エチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記水相を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含む水相と、プロシアニジン５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含む水相と、プロシアニジン２量体、３量体、４量体、および５量体を多く含む酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
前記酢酸メチル‐ジエチルエーテル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、該水溶液をジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液で抽出し、プロシアニジン３量体、４量体、および５量体を多く含む水相と、プロシアニジン２量体を多く含むジエチルエーテル相または酢酸メチル‐ジエチルエーテル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記水相を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン５量体を多く含む水相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液がおよそ２５：７５（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項２，１７，２１，２４または２８記載の方法。
【請求項３１】
前記酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液がおよそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項４，９，１２，１６，１８，２６または２７記載の方法。
【請求項３２】
モノマーおよび／またはオリゴマーを含む混合水溶液からカテキンおよびエピカテキンモノマーおよび／またはそれらのプロシアニジンオリゴマーの特定の群を選択的に抽出する方法であって、
（ａ）前記混合水溶液を、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、および酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液からなる群より選択される有機溶媒で抽出し、
（ｂ）水相と溶媒相を分離し、
（ｃ）前記水相を上記溶媒の１つで抽出し、前記モノマーおよび／または前記オリゴマーの特定の群を多く含む水相および有機相を入手し、
（ｄ）必要に応じて、前記抽出・分離の工程を繰り返す、
各工程を有してなる方法。
【請求項３３】
ｎ−酢酸ブチルを工程（ａ）に用いて、カテキン、エピカテキン、および微量の２量体を選択的に抽出する、または、
酢酸エチルを工程（ａ）に用いて、カテキン、エピカテキン、および微量の２量体、３量体、および４量体を選択的に抽出する、または、
酢酸メチルを工程（ａ）に用いて、カテキン、エピカテキン、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、および微量の９量体を選択的に抽出する、または、
ジエチルエーテルを工程（ａ）に用いて、カテキン、エピカテキン、および２量体を選択的に抽出する、または、
酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）を工程（ａ）に用いて、カテキン、エピカテキン、２量体、および微量の３量体を選択的に抽出する、または、
酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）を工程（ａ）に用いて、カテキン、エピカテキン、２量体、３量体、４量体、５量体、および微量の６量体を選択的に抽出することを特徴とする請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本願は、２００５年１０月３日に出願され、現在係属中である米国特許出願第１１／２４２，４７３号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、溶媒を特定の順番で使用することによる、重合度に従ったカカオプロシアニジンの選択的抽出方法に関する。具体的には、本発明は、ｎ−酢酸ブチルを最初の抽出溶媒として用いる、カカオプロシアニジンの混合物から個々のオリゴマーまたはオリゴマーの小群を選択的に抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カテキン、エピカテキンおよびカカオプロシアニジンオリゴマーなどの個々のフラバン−３−オールは、それぞれ異なる性質を示し、ヒトまたは動物への用途も異なっていることが知られている。重合度に基づく特定のモノマーまたはオリゴマーを選択的に抽出することにより、薬理的用途および食品用途におけるそれらの利用を、より標的化し、効果的にすることができるであろう。
【０００４】
フラバン−３−オールのオリゴマーおよびポリマーであるプロアントシアニジン類は、リグニンに次いで、２番目に多い天然植物フェノールである。フラバン−３−オールのサブユニットは、主として、１つのサブユニットの４位から他のサブユニットの８位へと（Ｃ４→Ｃ８）炭素−炭素結合を通じて結合しており、割合は少ないがＣ４→Ｃ６の連結を通じても結合している。
【０００５】
プロシアニジンは、プロアントシアニジンの中では最も豊富な種類である。Ｇｕらは、プロアントシアニンを含有している４１種類の食物のうち、２７種類がプロシアニジンを含有していることを見出した（非特許文献１）。プロシアニジンは、典型的には（−）−エピカテキン、（＋）−エピカテキン、（−）−カテキンおよび／または（＋）−カテキンのサブユニットから構成される。
【０００６】
プロシアニジンには、Ｂ型とＡ型のプロアントシアニジンが含まれる。Ｂ型のプロアントシアニジンでは、モノマーサブユニット（カテキン、エピカテキン）は、Ｃ４→Ｃ６および／またはＣ４→Ｃ８のフラバン間の連結を通じて結合している。もっぱらＣ４→Ｃ８の連結からなるオリゴマーは直線状であるが、１つでもＣ４→Ｃ６結合が存在すると分岐鎖オリゴマーとなる。対照的に、Ａ型のプロアントシアニジンは、Ｃ２−Ｏ−Ｃ７、およびＣ４→Ｃ６またはＣ４→Ｃ８の連結を有する、２重に結合しているオリゴマーである。
【０００７】
プロアントシアニジンの分子量は、典型的には、重合度（ＤＰ）で表され、個々のオリゴマーは、一般に２量体、３量体などと称される。
【０００８】
個々のプロシアニジンオリゴマーは、ヒトまたは動物の用途に、特異的な性質および潜在的利益を与えることが知られている。例えば、Tempestaは、２〜１１の重合度（ＤＰ）のプロシアニジンオリゴマーが顕著な抗ウイルス活性を有し、呼吸器合胞体ウイルスなどのパラミクソ・ウイルス、インフルエンザＡ、ＢおよびＣなどのオルトミクソ・ウイルス、および単純疱疹ウイルスなどのヘルペス・ウイルスに感染した、ヒトを含めた温血動物の治療に有用であることを開示している（特許文献１）。Romanczyk Jr.らは、適切な担体と共に３〜１１のＤＰのプロシアニジンオリゴマーを含む、抗腫瘍性組成物について開示している（特許文献２）。Romanczyk Jr.らはまた、５〜１２のＤＰのプロシアニジンオリゴマーが抗酸化剤として有用であることも開示している（特許文献３）。Schmitzらは、抗血小板療法として、カカオプロシアニジンオリゴマー（ＤＰ２〜１８）をアセチルサリチル酸と共に利用することについて開示している（特許文献４）。
【０００９】
プロシアニジンオリゴマーの分離および分割における顕著な改善が実現されている（非特許文献２〜４参照）。５量体（ＤＰ＝５）までのプロシアニジンオリゴマーの分割が行われている。Hammerstoneらは、未発酵のカカオの種子の分析における単量体〜９量体の分割の改善につながる、この方法の改良法について開示している（非特許文献５）。Ｇｕらは、ポリマーピークの溶離（ＤＰ＞１０）、および全体的なピーク形状および分割の促進につながる、さらなる改良についても開示している（非特許文献６）。
【特許文献１】米国特許第５，２１１，９４４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５５４，６４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９１，９０５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５２４，６３０号明細書
【非特許文献１】Gu et al., J. Agric. and Food Chem. 51 (2003) 7513
【非特許文献２】Rigaud et al., Chromatogr. 654 (1993) 179
【非特許文献３】Cheynier et al., Methods in Enzymology 299 (1999)
【非特許文献４】Natsume et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (2000) 2581
【非特許文献５】Hammerstone et al., J. Agric. and Food Chem. 47 (1999) 490
【非特許文献６】Gu et al., J. Agric. and Food Chem. 50 (2002) 4852
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
所望の特定のモノマーおよび／またはオリゴマーを、さらなる研究または利用のために大量に溶離できるように、分取スケールのＨＰＬＣ系へのカカオプロシアニジンの装填量を最大化できることが望ましいであろう。理論的には、分取スケールのＨＰＬＣカラム（３００×５５ｍｍ、１００μｍ)の装填量は、材料およそ４ｇ分である。しかしながら、カカオプロシアニジン抽出物には溶解性の問題が存在するため、最大装填量はおよそ４００ｍｇに制限され、そのうちフラバノイドは、わずかに約４１％である。
【００１１】
試料の装填（フラバノール）含有量の顕著な増加は、ＨＰＬＣカラムへの注入前に、ポリフェノール混合物から個別のまたは小群のオリゴマーを選択的に抽出することにより達成することができると予想される。したがって、重合度に基づいて、カカオポリフェノールの抽出水溶液から他の所望のカカオプロシアニジンオリゴマーを選択的に抽出する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、混合水溶液をｎ−酢酸ブチルで抽出し、水相とｎ−酢酸ブチル相を分離することによる、カカオポリフェノールの混合水溶液からカカオプロシアニジンを選択的に抽出する方法を提供する。水相はプロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、ｎ−酢酸ブチル相はカテキンおよびエピカテキンを多く含む。
【００１３】
好ましい実施の形態では、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体を選択的に抽出するのに効果的な、ジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルとの混合溶液のいずれかの有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、有機相はプロシアニジン２量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ２５：７５（ｖ／ｖ）の割合であることが好ましい。さらにこの実施形態では、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸エチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含む。この実施形態ではさらになお、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を、カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体、３量体、４量体、および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、有機相はプロシアニジン５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）の割合であることが好ましい。この実施形態ではさらになお、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸メチル相はプロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含む。この実施形態ではさらになお、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。酢酸メチル相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００１４】
別の実施の形態では、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸メチル相はプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、および８量体を多く含む。この実施形態ではさらに、酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。２相を分離し、その際、水相はプロシアニジン５量体、６量体、７量体および８量体を多く含んでおり、酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含んでいる。この実施形態ではさらに、プロシアニジン５量体、６量体、７量体および８量体を多く含む水相を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルおよびジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含み、有機相はプロシアニジン５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この実施形態もまた、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。酢酸メチル相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００１５】
別の実施の形態では、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸エチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸エチル相はプロシアニジン２量体、３量体および４量体を多く含む。この実施形態では、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、有機相はプロシアニジン５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この実施形態ではさらに、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸メチル相はプロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含む。この実施形態ではさらになお、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。酢酸メチル相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。この実施形態もまた、酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体を選択的に抽出するのに効果的な、ジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液のいずれかである有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、有機相はプロシアニジン２量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ２５：７５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。あるいは、この実施形態では、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸メチル相はプロシアニジン５量体、６量体、７量体および８量体を多く含む。この別法でもまた、酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含み、有機相はプロシアニジン５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。
【００１６】
別の実施の形態では、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、有機相はプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この実施形態では、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸メチル相はプロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含む。この実施形態ではさらに、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。酢酸メチル相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。あるいは、この実施形態では、プロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を多く含む有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体を選択的に抽出するのに効果的な、ジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液のいずれかの有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含み、有機相はプロシアニジン２量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ２５：７５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この別法でもまた、プロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む水相を酢酸エチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン５量体を多く含み、酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含む。
【００１７】
さらなる実施の形態では、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を酢酸メチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、酢酸メチル相はプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、および８量体を多く含む。この実施形態では、酢酸メチル相から溶媒を除去し、それによって得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体を選択的に抽出するのに効果的な、ジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液のいずれかの有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体および８量体を多く含み、有機相はプロシアニジン２量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ２５：７５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この実施形態ではさらに、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相を酢酸エチルで抽出し、２相を分離する。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含み、酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含む。この実施形態ではさらになお、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体、７量体および８量体を多く含み、有機相はプロシアニジン５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。あるいは、この実施の形態では、プロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、および８量体を多く含む酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を選択的に抽出するのに効果的な、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液である有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン６量体、７量体、および８量体を多く含み、有機相はプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ７５：２５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この別法でもまた、プロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を多く含む有機層から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体を選択的に抽出するのに効果的な、ジエチルエーテルまたは酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液のいずれかの有機溶媒で抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含み、有機相はプロシアニジン２量体を多く含む。酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液は、およそ２５：７５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。この別法でもまた、プロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む水相を酢酸エチルで抽出し、２相を分離する。水相はプロシアニジン５量体を多く含み、酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含む。
【００１８】
これらおよび他の目的ならびに実施形態については、以下の詳細な説明において開示され、もしくは、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、カカオポリフェノールの混合水溶液からカカオプロシアニジンのモノマーおよび／またはオリゴマーを個別にまたは小群として選択的に抽出する方法について開示する。具体的には、本発明は、アセテート系および／またはジエチルエーテル系の溶媒を選択された順番で用いることによる、プロシアニジンのモノマーおよび／またはオリゴマーの選択的抽出に関し、ここで、第１抽出溶媒はｎ−酢酸ブチルである。
【００２０】
カカオポリフェノール抽出物を水に溶解し、その水溶液を酢酸エチルで抽出することにより、より小さい質量のプロシアニジンオリゴマー（カテキン、エピカテキン、プロシアニジン２量体、３量体および４量体）を選択的に抽出することが知られている。これらの結果を元に、水に不混和性ではあるが極性があり、「環境に優しい(green)」、食品用品質、かつ、手ごろな価格の、さらなる溶媒および溶媒の順番について研究されている。具体的には、カカオプロシアニジンのモノマーおよび／またはオリゴマーのｎ−酢酸ブチルおよび酢酸メチルを用いた選択的抽出について、ジエチルエーテル単独、またはジエチルエーテルも含めた順番の両方について、研究がなされている。３種類のアセテート系溶媒のすべてが食品用の品質で購入することができる。これは、抽出されたオリゴマー画分を食品または医薬品に使用する場合に、利点をもたらす。
【００２１】
図１は、個々のモノマーおよびオリゴマーを示す、標準カカオポリフェノールの高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるトレースを表している。
【００２２】
図２は、酢酸メチルでの選択的抽出の特徴を示している。カカオポリフェノール抽出水溶液の酢酸メチルを用いた最初の抽出で、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体および微量のプロシアニジン９量体が選択的に抽出されることが見出されている。より低次のオリゴマーを取り除いた後に酢酸メチルでさらに抽出すると、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーが選択的に抽出されることも判明している（図示せず）。
【００２３】
図３は、ｎ−酢酸ブチルによる選択的抽出の特徴を示しているが、これは、以前は知られていなかった。カカオポリフェノール抽出水溶液をｎ−酢酸ブチルで最初に抽出すると、カテキン、エピカテキンおよび微量のプロシアニジン２量体が選択的に抽出されることが見出されている。
【００２４】
図４は、酢酸エチルによる選択的抽出の特徴を示している。先に示したように、カカオポリフェノール抽出水溶液を酢酸エチルで最初に抽出すると、カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体、３量体および４量体が選択的に抽出される。
【００２５】
３種類のアセテート系溶媒に加えて、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液を用いて、カカオポリフェノール抽出水溶液からプロシアニジンオリゴマーの様々な画分を選択的に抽出してもよい。こういったジエチルエーテル系の溶媒では、酢酸メチル：ジエチルエーテルは、０〜１００：１００〜０（ｖ／ｖ）の割合であって差し支えない。
【００２６】
図５に示すように、溶媒が、０：１００（ｖ／ｖ）の割合の酢酸メチル：ジエチルエーテルである場合、すなわち、溶媒がジエチルエーテルのみである場合、溶媒は、カカオポリフェノール抽出水溶液からカテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体を選択的に抽出する。図６に示すように、溶媒が、２５：７５（ｖ／ｖ）の割合の酢酸メチル：ジエチルエーテルである場合、溶媒は、微量のプロシアニジン３量体と共に、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体選択的に抽出する。図７に示すように、混合溶媒が、５０：５０（ｖ／ｖ）の割合の酢酸メチル：ジエチルエーテルである場合、溶媒は、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体および４量体を選択的に抽出する。図８に示すように、混合溶媒が、７５：２５（ｖ／ｖ）の割合の酢酸メチル：ジエチルエーテルである場合、溶媒は、微量のプロシアニジン６量体と共に、カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体を選択的に抽出する。
【００２７】
本明細書で論じたアセテート系およびジエチルエーテル系の有機溶媒の選択的抽出の特徴について、下記の表にまとめる。
【表１】
2009510164.tif 000003
【００２８】
酢酸メチルのジエチルエーテルに対する他の割合を用いた、他のジエチルエーテル系の溶媒は、プロシアニジンオリゴマーの他の群を選択的に抽出するであろうことが予想される。
【００２９】
特定の選択的抽出順に用いられる溶媒を決定するには、主に２つの要因がある。第１の要因は、用いられる溶媒それぞれの抽出の特徴である。言及したとおり、アセテート系溶媒（ｎ−酢酸ブチル、酢酸エチルおよび酢酸メチル）では、カテキン、エピカテキンおよび微量のプロシアニジン２量体；カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体、３量体および４量体；カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体および微量のプロシアニジン９量体に、それぞれ選択的抽出が限定される。
【００３０】
対照的に、ジエチルエーテル系溶媒の群は、溶媒におけるジエチルエーテルの割合に応じて、プロシアニジンオリゴマーに対するより大きな選択性を有する。例えば、ジエチルエーテル単独では、カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体を選択的に抽出する。酢酸メチルおよびジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ ｖ／ｖ）は、カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体および微量のプロシアニジン３量体を選択的に抽出する。また、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ ｖ／ｖ）は、カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体および微量のプロシアニジン６量体を選択的に抽出する。
【００３１】
用いるべき溶媒を決定する第２の要因は、選択された溶媒における、目的のプロシアニジンオリゴマー画分の相対的な溶解性である。カカオプロシアニジンは、同じような抽出特性を生じる酢酸メチル：ジエチルエーテルの混合溶媒とは対照的に、アセテート系溶媒には溶けやすい傾向にある。例えば、酢酸エチルおよび酢酸メチルとジエチルエーテルの等量の混合溶液（５０：５０ ｖ／ｖ）の両方が、カカオポリフェノール抽出水溶液からカテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体、３量体および４量体を選択的に抽出する。しかしながら、酢酸エチルのほうが、目的のポリフェノールを回収するのに必要とされる抽出洗浄の回数が少ない。１回の抽出洗浄で、溶媒なしに目的のポリフェノールが余すところなく抽出されることが知られている。アセテート溶媒では、複数回の抽出洗浄（４回もの）が必要とされる。対照的に、ジエチルエーテルおよびジエチルエーテル系溶媒では、完全な抽出に近づけるためには、さらなる追加の抽出洗浄（１０回以上）が必要とされ、しかも、完全に抽出することはできないであろう。
【００３２】
したがって、ジエチルエーテル系溶媒を、それと類似した抽出特性を有するアセテート系溶媒に置き換えて利用することにより、抽出効率が改善される。
【００３３】
アセテート系およびジエチルエーテル系の溶媒の選択的抽出特性に基づいて、様々な選択的抽出順を用いて、目的のプロシアニジンモノマーおよび／またはオリゴマーを選択的に抽出して構わない。
【００３４】
カカオポリフェノール抽出水溶液は、いかなる従来法で調製されてもよい。第１溶媒がｎ−酢酸ブチルまたは酢酸メチルである場合の選択的抽出では、カカオポリフェノール抽出水溶液は以下のように調製される。
【００３５】
試料調製：脱脂されたカカオ固形物から抽出するカカオポリフェノール抽出物：カカオポリフェノール抽出物は、カカオプロシアニジンの損失を最小限にすることを目的とした多段階の工程を経て調製される。カカオの種子を収穫し、果肉成分(pulp)がなくなるまで洗浄し、乾燥する。周囲条件下、乾燥した豆を圧搾してカカオバターを除去する。次に、搾油後の粕(expeller cake)を挽いて粉末にし、エタノール：水（７０：３０ ｖ／ｖ）で抽出する。固形物を遠心分離により除去する。抽出液を減圧下で蒸発させてエタノールを除去し、最後に噴霧乾燥する。
【００３６】
試料調製：脱脂されたカカオ種子から抽出するカカオポリフェノール抽出物：新鮮な未発酵のカカオ種子（３０ｇ）を凍結乾燥した（１６．９ｇ）。凍結乾燥した種子（１０．２ｇ）をヘキサンで脱脂し、サブ試料である脱脂した豆（６．３ｇ）を挽いて粉にし、超音波分解（１０分、５０℃）しながら、４０ｍｌのアセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５ ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出した。減圧下でアセトンを回転蒸発(rotary evaporation)によって、併せた抽出液からアセトンを除去した。残る液体を凍結乾燥し、赤紫色の残渣（１．１３ｇ）を得た。
【００３７】
乾燥したカカオポリフェノール抽出物を水に溶解し（５０ｇの抽出物を２００ｍｌの水に溶解することが好ましい）、ｎ−酢酸ブチルまたは酢酸メチルから始まる選択的抽出用のカカオポリフェノール抽出水溶液を提供した。
【００３８】
オートサンプラー、４つのＨＰＬＣポンプ、カラムヒーター、ダイオードアレイ検出器および蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ装置を用いて、選択的に抽出された画分をＨＰＬＣによって分析した。用いたカラムは、フェノメネックス社(Phenomenex)（米国カリフォルニア州トランス）から購入したＤｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｄｉｏｌ（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，粒径５μｍ)であった。
【００３９】
２種類の移動相は、（Ａ）アセトニトリル：酢酸（９８：２，ｖ／ｖ）および（Ｂ）メタノール：水：酢酸（９５：３：２，ｖ／ｖ／ｖ）で構成した。以下のように、３５℃、流速１．０ｍｌ／分での直線勾配によって分離を行った。０〜３５分、Ｂ＝０％；３５〜４０分、Ｂ＝４０％均一濃度(isocratic)；４０〜４５分、Ｂ＝４０〜０％；その後、再平衡化５分間。溶出は、２８０ｎｍの紫外線および蛍光検出（ＦＬＤ）でモニタした（励起波長＝２７６ｎｍ、発光波長＝３１６ｎｍ）。抽出物および精製された画分は、参照することにより本明細書に援用する、HammerstoneらのJ. Agric. and Food Chem. 47 (1999) 490を出典としたＭＳ法および変数によって特徴付けた。イオン化剤は、質量分析計に供する直前に、ＨＰＬＣの溶離液の流れにＴ字管(tee)を通じて加え、ＨＰＬＣポンプを通じて供給した。陽イオンモードの分析条件として、イオン化を補助するための流速０．０５ｍｌ／分、３．５ｋＶのキャピラリ電圧、１００Ｖのフラグメンター電圧、ゲージ圧で０．１７２ＭＰａ(25psig)の噴霧圧、および３５０℃の乾燥ガス温度での０．０５ＭのＮａＣｌの導入が挙げられた。陰イオンモードの分析条件としては、流速０．０９ｍｌ／分で２９分間、次に０．０５ｍｌ／分で、緩衝剤として１．５Ｍ水酸化アンモニウムを導入することが挙げられ、キャピラリ電圧は３ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、噴霧圧はゲージ圧０．１７２ＭＰａ(25psig)、乾燥ガス温度は３５０℃であった。
【００４０】
水酸化アンモニウムの利用は、ＭＳ分析から除外した。試料をアセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５，ｖ／ｖ／ｖ）または移動相に溶解し、注入前に、０．４５μｍのＰＴＦＥシリンジフィルタでろ過した。抽出はすべて室温にて行なった。抽出溶媒に酸は用いなかった。
【００４１】
本発明に用いられる抽出溶媒の限定的性質を考慮して、以下の実施例で用いられるように、溶媒がｎ−酢酸ブチル、酢酸エチルまたは酢酸メチルである場合、「抽出された」は、その溶媒で最大４回まで抽出洗浄が行なわれたことを意味する。ジエチルエーテルまたはジエチルエーテルと酢酸メチルの混合溶液に関して用いられる場合は、「抽出された」は、その溶媒で、少なくとも１０回の抽出洗浄が行なわれたことを意味する。すべての抽出回から得られるすべての有機相は併せられ、必要に応じて利用またはさらなる抽出に用いられるということが、理解されよう。
【００４２】
また、本明細書で用いられるように、「〜に多く含まれる」は、当然、次のことを意味する。すなわち、溶媒がアセテート系またはジエチルエーテル系の有機溶媒である場合、「〜に多く含まれる」は、当然ながら、特定された相が、実質的に、微量の他の物質と共に指定された溶媒に溶解した、特定されたモノマーおよび／またはオリゴマーからなる、ということを意味する。溶媒が水の場合、すなわち、問題とされる相が抽出段階から得られる水相の場合は、「〜に多く含まれる」は、当然に、その相が、実質的に、微量の他の物質と共に水に溶解した、特定されたモノマーおよび／またはオリゴマーからなる、ということを意味する。
【００４３】
以下の実施例における各抽出から得られる有機相および水相は、従来の方法によって分離して差し支えなく、また分離された相は、希望に応じて、さらなる抽出にそのまま使用してもよいし、あるいは廃棄してもよいことは、当業者に理解されよう。望ましい場合には、従来法により有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解して混合水溶液を提供して構わない。さらには、有機溶媒相（ｎ−酢酸ブチル相、酢酸エチル相、酢酸メチル相、ジエチルエーテル相または他の有機相）が、例えば抽出の前に、抽出されている場合には、蒸発(evaporation)または他の従来法によって該有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、次に抽出されるであろう生成物の水溶液を提供して差し支えない、ということも理解されよう。
【００４４】
以下の実施例は、図９〜１４を参照することにより、より容易に理解されよう。図において、「ＣＰ」は、カテキン、エピカテキンおよびプロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを含む、カカオポリフェノール抽出水溶液のことを指す。抽出される相（水相または有機相）と同様、「Ｏ」は抽出後の有機相を、「Ａ」は抽出後の水相のことを指す。溶媒では、「ｎＢＡ」はｎ−酢酸ブチルのことをいい、「０：１００」はジエチルエーテルのみを含む溶媒のことをいい、「２５：７５」はジエチルエーテルに対する酢酸エチルの割合が２５：７５（ｖ／ｖ）であるジエチルエーテル系溶媒のことをいい、「ＥｔＡｃ」は酢酸エチルのことをいい、「７５：２５」はジエチルエーテルに対する酢酸エチルの割合が７５：２５（ｖ／ｖ）であるジエチルエーテル系溶媒のことをいい、「ＭｅＡｃ」はジエチルエーテルを含まない酢酸メチルのことをいう。カッコ内の数字は抽出相に含まれるオリゴマーの重合度を表す。
【実施例】
【００４５】
実施例１〜１．５．２３では、最初の抽出溶媒はｎ−酢酸ブチルである。実施例は、図９のフロー図を参照することにより、より理解が深まるであろう。
【００４６】
実施例１：最初の抽出：ｎ−酢酸ブチル：カカオポリフェノール（カテキン、エピカテキン、およびプロシアニジン２量体ならびにさらに高次のオリゴマー）の混合水溶液をｎ−酢酸ブチルで抽出する。得られたｎ−酢酸ブチル相は、微量のプロシアニジン２量体と共にカテキンおよびエピカテキンを多く含み、得られた水相はプロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。図１と３を比較のこと。
【００４７】
実施例１．１：第２抽出：ジエチルエーテル：プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１）を、ジエチルエーテルで抽出し、プロシアニジン２量体を多く含む有機（ジエチルエーテル）相およびプロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００４８】
実施例１．１．１：第３抽出：酢酸エチル：プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１）を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、得られた水相はプロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００４９】
実施例１．１．２：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．１）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）である有機溶媒で抽出し、プロシアニジン５量体を多く含む有機相と、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００５０】
実施例１．１．３：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．２）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸メチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００５１】
実施例１．１．４：第６抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．３）を酢酸メチルで抽出してプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む有機相を提供する。得られた水相は実質的にプロシアニジンを含まない(depleted)。
【００５２】
実施例１．１．５：第４抽出：酢酸メチル：実施例１．１．２のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって実施例１．１．１の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸メチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００５３】
実施例１．１．６：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：蒸発または他の従来法によって実施例１．１．５の酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）である有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む有機相を提供する。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００５４】
実施例１．１．７：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．５）を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を提供する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００５５】
実施例１．１．８：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．１．１のバリエーションでは、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１）を、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、および５量体を多く含む。水相は、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００５６】
実施例１．１．９：第４抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．１．８の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相と、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む水相を提供する。
【００５７】
実施例１．１．１０：第４抽出：酢酸メチル：プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．８）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸メチルの有機相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００５８】
実施例１．１．１１：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．１０）を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を提供する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００５９】
実施例１．１．１２：第３抽出：酢酸メチル：実施例１．１．１の別のバリエーションでは、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸メチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００６０】
実施例１．１．１３：第４抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．１．１２の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相を提供する。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００６１】
実施例１．１．１４：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．１．１３）を、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）である有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む有機相を提供する。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００６２】
実施例１．１．１５：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．１．１３のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．１．１２の酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）である有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む有機相を提供する。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００６３】
実施例１．１．１６：第５抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．１．１５の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相と、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む水相を提供する。
【００６４】
実施例１．１．１７：第４抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．１．１２）を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相は、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００６５】
実施例１．２：第２抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．１のバリエーションでは、２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）である有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含む有機相と、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００６６】
実施例１．２．１：第３抽出：酢酸エチル：プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２）を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相はプロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００６７】
実施例１．２．２：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．１）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む有機相を提供する。水相は、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００６８】
実施例１．２．３：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．２）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸メチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００６９】
実施例１．２．４：第６抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．３）を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、一方、水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００７０】
実施例１．２．５：第４抽出：酢酸メチル：実施例１．２．２のバリエーションでは、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．１）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸メチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００７１】
実施例１．２．６：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：蒸発または他の従来法によって、実施例１．２．５の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００７２】
実施例１．２．７：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．５）を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を提供する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００７３】
実施例１．２．８：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．２．１のバリエーションでは、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２）を、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む。水相は、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００７４】
実施例１．２．９：第４抽出：酢酸エチル：６量体およびさらに高次のオリゴマー（実施例１．２．８）を多く含む水相を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相は、微量の９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含み、水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００７５】
実施例１．２．１０：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．９）を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含み、一方、水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００７６】
実施例１．２．１１：第４抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．２．８の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【００７７】
実施例１．２．１２：第３抽出：酢酸メチル：実施例１．２．１の別のバリエーションでは、プロシアニジン３量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２）を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含み、一方、水相はプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。
【００７８】
実施例１．１．１３：第４抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって実施例１．２．１２の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００７９】
実施例１．２．１４：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．２．１３）を、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００８０】
実施例１．２．１５：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．２．１３のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．２．１２の酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００８１】
実施例１．２．１６：第５抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．２．１５の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【００８２】
実施例１．２．１７：第４抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．２．１２）を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相は、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００８３】
実施例１．３：第２抽出：酢酸エチル：実施例１．１のさらなるバリエーションでは、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１）を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン２量体、３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相と、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００８４】
実施例１．３．１：第３抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．３の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出し、プロシアニジン２量体を多く含むジエチルエーテル相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む水相を提供する。
【００８５】
実施例１．３．２：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．３．１の代わりに、蒸発または他の従来法によって実施例１．３の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含む有機相と、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む水相を提供する。
【００８６】
実施例１．３．３：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマー（実施例１．３）を多く含む水相を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む有機相と、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００８７】
実施例１．３．４：第４抽出：酢酸メチル：プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．３．３）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸エチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００８８】
実施例１．３．５：第５抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．３．４）を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を提供する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００８９】
実施例１．３．６：第３抽出：酢酸メチル：実施例１．３．３のバリエーションでは、プロシアニジン５量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．３）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸エチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００９０】
実施例１．３．７：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：蒸発または他の従来法によって、実施例１．３．６の酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【００９１】
実施例１．３．８：第４抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．３．６）を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を提供する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【００９２】
実施例１．４：第２抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．１のさらに別のバリエーションでは、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出し、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を多く含む有機相と、プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【００９３】
実施例１．４．１：第３抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．４の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出する。得られたジエチルエーテル相は、プロシアニジン２量体を多く含み、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む。
【００９４】
実施例１．４．２：第４抽出：酢酸エチル：微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む水相（実施例１．４．１）を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相と、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む水相を生成する。
【００９５】
実施例１．４．３：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．４．１のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．４の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含む。水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体を多く含む。
【００９６】
実施例１．４．４：第４抽出：酢酸エチル：微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体を多く含む水相（実施例１．４．３）を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相と、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む水相を生成する。
【００９７】
実施例１．４．５：第３抽出：酢酸エチル：実施例１．４．１の別のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．４の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン２量体、３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【００９８】
実施例１．４．６：第４抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．４．５の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出する。得られたジエチルエーテル相は、プロシアニジン２量体を多く含み、一方、水相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む。
【００９９】
実施例１．４．７：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．４．６のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．４．５の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含む。水相は、３量体および４量体を多く含む。
【０１００】
実施例１．４．８：第３抽出：酢酸メチル：プロシアニジン６量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．４）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む酢酸エチル相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を生成する。
【０１０１】
実施例１．４．９：第４抽出：酢酸メチル：プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．４．８）を酢酸メチルで抽出し、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を生成する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【０１０２】
実施例１．５：第２抽出：酢酸メチル：実施例１．１のさらに別のバリエーションでは、プロシアニジン２量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１）を酢酸メチルで抽出し、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む有機相と、プロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相を提供する。
【０１０３】
実施例１．５．１：第３抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．５の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解する。溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出し、プロシアニジン２量体を多く含むジエチルエーテル相と、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相を提供する。
【０１０４】
実施例１．５．２：第４抽出：酢酸エチル：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．１）を酢酸エチルで抽出し、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む酢酸エチル相と、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体含む水相を提供する。
【０１０５】
実施例１．５．３：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．２）を、酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１０６】
実施例１．５．４：第３抽出：酢酸エチル：実施例１．５．１のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．５の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン２量体、３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１０７】
実施例１．５．５：第４抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．４の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出する。得られたジエチルエーテル相は、プロシアニジン２量体を多く含み、一方、水相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む。
【０１０８】
実施例１．５．６：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．４）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１０９】
実施例１．５．７：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．１）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１１０】
実施例１．５．８：第５抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．７の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【０１１１】
実施例１．５．９：第５抽出：酢酸メチル：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．７）を酢酸メチルで抽出する。得られた酢酸メチル相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【０１１２】
実施例１．５．１０：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．５．１の別のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．５の酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、プロシアニジン２量体、３量体、４量体および５量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１１３】
実施例１．５．１１：第４抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．１０の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出する。得られたジエチルエーテル相は、プロシアニジン２量体を多く含み、一方、水相は、微量の６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体を多く含む。
【０１１４】
実施例１．５．１２：第５抽出：酢酸エチル：微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体を多く含む水相（実施例１．５．１１）を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【０１１５】
実施例１．５．１３：第４抽出：酢酸エチル：実施例１．５．１１のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．１０の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン２量体、３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【０１１６】
実施例１．５．１４：第５抽出：ジエチルエーテル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．１３の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物をジエチルエーテルで抽出する。得られたジエチルエーテル相は、プロシアニジン２量体を多く含み、一方、水相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含む。
【０１１７】
実施例１．５．１５：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．５．１４のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．１３の酢酸エチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含み、水相は、３量体および４量体を多く含む。
【０１１８】
実施例１．５．１６：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．５．１１の別のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．１０の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含む。水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体および５量体を多く含む。
【０１１９】
実施例１．５．１７：第５抽出：酢酸エチル：微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体を多く含む水相（実施例１．５．１６）を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は微量のプロシアニジン６量体とともにプロシアニジン５量体を多く含む。
【０１２０】
実施例１．５．１８：第３抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（２５：７５ｖ／ｖ）：実施例１．５．１のさらに別のバリエーションでは、蒸発または他の従来法によって、実施例１．５の酢酸メチル相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン３量体と共にプロシアニジン２量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１２１】
実施例１．５．１９：第４抽出：酢酸エチル：微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．１８）を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相はプロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は微量のプロシアニジン９量体とともにプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１２２】
実施例１．５．２０：第５抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：微量のプロシアニジン９量体とともにプロシアニジン５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．１９）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１２３】
実施例１．５．２１：第４抽出：酢酸メチル：ジエチルエーテル（７５：２５ｖ／ｖ）：実施例１．５．１９のバリエーションでは、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体を多く含む水相（実施例１．５．１８）を酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）からなる有機溶媒で抽出する。得られた有機相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン３量体、４量体、５量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン９量体と共にプロシアニジン６量体、７量体、８量体を多く含む。
【０１２４】
実施例１．５．２２：第５抽出：酢酸エチル：蒸発または他の従来法によって、実施例１．５．２１の有機相から溶媒を除去し、得られた生成物を水に溶解し、溶解した生成物を酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル相は、プロシアニジン３量体および４量体を多く含み、一方、水相は、微量のプロシアニジン６量体と共にプロシアニジン５量体を多く含む。
【０１２５】
実施例１．５．２３：第３抽出：酢酸メチル：微量のプロシアニジン９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む水相（実施例１．５）を酢酸メチルで抽出し、９量体およびさらに高次のオリゴマーを多く含む酢酸メチル相を提供する。水相は、実質的にプロシアニジンを含まない。
【０１２６】
最初に別の溶媒を用いた他の抽出順の例を図１０〜１４に記載する。図１０は実施例２〜２．５．２を表しており、ここで最初の抽出溶媒（実施例２）は酢酸エチルである。図１１は実施例３〜３．６を表し、ここで最初の抽出溶媒（実施例３）は酢酸メチルである。図１２は実施例４〜４．４．５を表し、ここで最初の抽出溶媒はジエチルエーテルである。図１３は実施例５〜５．４．５を表し、ここで最初の抽出溶媒は酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）である。図１４は実施例６〜６．５．１を表し、ここで最初の抽出溶媒は酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）である。
【０１２７】
上記実施例がカカオポリフェノール抽出水溶液の選択的抽出に関する場合には、プロトン性の極性オリゴマーを含むいずれの材料も、提供された実施例に従って選択的に抽出して差し支えないことは、当業者に理解されよう。適切なプロトン性の極性オリゴマーとしては、プロアントシアニジン、加水分解性タンニン、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アクリルアミド、ポリソルベート、ポリケチド、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルコールおよびポリビニルアルコールが挙げられる。極性プロトン性オリゴマーがプロアントシアニジンである場合、それらは、プロアピゲニニジン(Proapigeninidins)、プロルテオリニジン(Proluteolinidins)、プロトリセチニジン(protricetinidins)、プロペラルゴニジン(properalgonidins)、プロデルフィニジン(prodelphinidins)、プロギボルチニジン(Proguibourtinidins)、プロフィセチニジン(profisetinidins)、プロロビネチニジン(Prorobinetinidins)、プロテラカシニジン(proteracacinidins)および／またはプロメラカシニジン(promelacacinidins)であって差し支えない。
【０１２８】
本発明はいくつかの特定の実施例に関して記載しているが、当然ながら、本発明から離れることなく、当業者によって多くの修正および変更が行なわれるであろう。したがって、本発明の真の精神および範囲内に含まれるであろう、こういった修正および変更のすべてが、添付物によって、対象とされることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】標準カカオポリフェノールのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出された酢酸メチル有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム。
【図３】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出されたｎ−酢酸ブチル有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム。
【図４】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出された酢酸エチル有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム。
【図５】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出されたジエチルエーテル有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム。
【図６】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出された有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム：溶媒は酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ｖ／ｖ）。
【図７】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出された有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム：溶媒は酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（５０：５０ｖ／ｖ）。
【図８】カカオポリフェノール抽出水溶液から抽出された有機抽出画分のＨＰＬＣ／ＦＬＤクロマトグラム：溶媒は酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ｖ／ｖ）。
【図９】第１溶媒がｎ−酢酸ブチルである、カカオポリフェノール抽出水溶液から選択的に抽出するための選択的抽出経路のフロー図。
【図１０】第１溶媒が酢酸エチルである、カカオポリフェノール抽出水溶液から選択的に抽出するための選択的抽出経路のフロー図。
【図１１】第１溶媒が酢酸メチルである、カカオポリフェノール抽出水溶液から選択的に抽出するための選択的抽出経路のフロー図。
【図１２】第１溶媒がジエチルエーテルである、カカオポリフェノール抽出水溶液から選択的に抽出するための選択的抽出経路のフロー図。
【図１３】第１溶媒が酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（２５：７５ ｖ／ｖ）である、カカオポリフェノール抽出水溶液から選択的に抽出するための選択的抽出経路のフロー図。
【図１４】第１溶媒が酢酸メチルとジエチルエーテルの混合溶液（７５：２５ ｖ／ｖ）である、カカオポリフェノール抽出水溶液から選択的に抽出するための選択的抽出経路のフロー図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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