(57)【要約】  本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者における量的表現型、例えばｇａｇ−表現型、インテグラーゼ表現型又は向性の予測方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶに感染した患者における量的表現型（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）、例えばｇａｇ表現型（ｇａｇ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）、インテグラーゼ表現型又は向性の予測方法であって、
ａ）患者からのウイルス遺伝物質を含んでなる試料を用い；
ｂ）該試料からウイルス遺伝物質を抽出し、続いて以下の段階：
１．特定のＨＩＶ領域のウイルス遺伝物質を増幅し、
２．アンプリコン一体性を分析し且つ試料をプールし、
３．プールされたアンプリコンを精製し、
４．アンプリコンのプールをベクター中に連結し、そして連結された生成物をコンピテント細胞中に形質転換し、
５．得られる個々の形質転換細胞を分析し、
６．得られる単クローン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ）を配列決定して単クローン遺伝子型配列を得る
段階を含んでなる単ゲノム配列決定を行い；
ｃ）該遺伝子型配列を用い、以下の段階：
１．該遺伝子型配列において、少なくとも１つの自然の可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンが量的表現型の結果、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性と関連する遺伝子パターン（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎ）を同定し、
２．段階ｃ１において遺伝子配列中で同定される自然の可変性、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンの少なくとも１つに類似の遺伝子パターンを有する少なくとも１つの遺伝子型エントリーに関して遺伝子型／表現型相関データベースを検索し、
３．相関遺伝子型／表現型データベースにおいて適合する表現型を有する類似の遺伝子パターンを有する該少なくとも１つの遺伝子型エントリーを得、そして
４．類似の遺伝子パターンを有する少なくとも１つの遺伝子型エントリーのデータベースからＨＩＶ表現型を予測する
段階を含んでなる予測アルゴリズムを用いて特定の表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性を予測し；
ｄ）ＨＩＶ感染患者の試料中に存在するすべての単配列クローンに関し、段階ｃ１〜ｃ４で得られる情報に基づいて量的表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性を予測する
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
段階（ｃ）の後で且つ段階（ｄ）の前に以下の段階
１．予測可能な表現型を含まないクローン配列を単クローン生物学的表現型決定アッセイにおいて分析し、
２．該分析の後に得られる情報を段階（ｃ）で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する（ｌｏａｄｅｄ）
段階をさらに含んでなる請求項１に従う方法。
【請求項３】
単クローン生物学的表現型決定アッセイが以下の段階
１．クローン部分的もしくは全−長ＨＩＶゲノムを形成し、
２．該ゲノムを用いて、組換えＨＩＶを得るのに適した主鎖と一緒に又は全長ＨＩＶ−１ゲノムとして直接、哺乳類細胞をトランスフェクションし、
３．細胞系を該組換えＨＩＶに感染させ、感染プロセスが起こっているそれらの生物学的表現型を決定し、
４．その後、得られる情報を段階（ｃ）で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する
段階を含んでなる請求項２に従う方法。
【請求項４】
段階２（トランスフェクション）及び段階３（感染）を一段階で行なう請求項３に従う方法。
【請求項５】
段階（ｂ１）における特定のＨＩＶ領域のウイルス遺伝物質の増幅をＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲにより行なう請求項１〜４に従う方法。
【請求項６】
段階（ｂ４）で用いられるコンピテント細胞がＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、酵母又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である請求項１〜５に従う方法。
【請求項７】
全−長ＨＩＶゲノム中に導入されるマーカー遺伝子により、又は指示細胞系（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）中に導入されるマーカー遺伝子により、あるいは細胞変性効果スコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）又はシンシチウム（ｓｙｎｃｉｔｉａ）形成により顕微鏡的に感染プロセスを監視する請求項３〜６のいずれかに従う方法。
【請求項８】
ＨＩＶに感染した患者の試料から得られ且つ配列決定されたＨＩＶ配列を量的表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性の予測のためのアルゴリズムに続いて相関遺伝子型−表現型データベース中に負荷し、その後、該表現型又は向性を報告する請求項１〜７のいずれかに従う方法。
【請求項９】
患者からの試料を血液試料、生検試料、血漿試料、唾液試料、組織試料及び体液又は粘液試料から選ばれる生物学的試料から得る請求項１〜８のいずれかに従う方法。
【請求項１０】
さらにＨＩＶに感染した患者の試料においてウイルス負荷量（ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）を決定する請求項１〜９のいずれかに従う方法。
【請求項１１】
量的向性の予測が、例えばＣＣＲ５からＣＸＣＲ４又はＣＸＣＲ４からＣＣＲ５へのＨＩＶ−１共−受容体使用における量的シフトである請求項１〜１０のいずれかに従う方法。
【請求項１２】
量的ｇａｇ−表現型の予測を、ｇａｇ読取り枠中及び／又はｇａｇ−切断部位における自然の可変性又は薬剤−誘導／選択可変性の結果としてのＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素活性と関連付ける請求項１〜１０のいずれかに従う方法。
【請求項１３】
量的インテグラーゼ−表現型の予測を、インテグラーゼ読取り枠及び／又はインテグラーゼ供与体／受容体部位における自然の可変性又は薬剤−誘導／選択可変性の結果としてのＨＩＶ−１インテグラーゼ酵素活性と関連付ける請求項１〜１０のいずれかに従う方法。
【請求項１４】
報告が請求項１〜１３の方法のいずれかを用いて予測される表現型又は向性を含む報告の作成法。
【請求項１５】
請求項１〜１３の方法のいずれかを用いて予測される表現型又は向性を含むコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１６】
配列番号：６を有するベクターｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ。
【請求項１７】
請求項１〜１４に従う方法のいずれかにおける配列番号：６を有するベクターｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者における量的表現型（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）、例えばｇａｇ表現型（ｇａｇ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）、インテグラーゼ表現型又は向性の予測方法に関する。
【０００２】
通常ＨＩＶと呼ばれるヒト免疫不全ウイルスは、主にヒト免疫系の生体成分、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ及び樹状細胞に感染するレトロウイルスである。ＨＩＶは、直接又は間接的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊さえする。十分なＣＤ４＋細胞がＨＩＶにより破壊されてしまうと、免疫系はほとんど働かず、それはＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）に導く。さらに、ＨＩＶは腎臓、心臓及び脳のような器官を直接攻撃し、急性腎不全、心筋症、痴呆及び脳症に導く。ＨＩＶに感染した人々が直面する問題の多くは、免疫系が日和見感染及びガンから彼らを保護できないことから生ずる。
【０００３】
ＡＩＤＳは２０世紀の間にサブ−サハラアフリカ（ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａｎ  Ａｆｒｉｃａ）に発したと考えられ、それは現在世界的規模の流行病である。２００４年の終わりに、ＵＮＡＩＤＳは、４千万人に近い人々がＨＩＶと共に生きていると見積もった。世界保健機構は、３百万人より多い人々がＡＩＤＳ流行病にやられ、５百万人の人々が同じ年にＨＩＶに感染したと見積もった。現在、２千８百万人の人々が死亡し、アフリカ人のみで９千万人にそれが感染しつつあると見積もられ、アフリカ大陸のみにおいて最小で千８百万人の孤児の見積もりを生ずる。
【０００４】
細胞に感染するために、ウイルスは最初にその中に侵入することができなければならない。ＨＩＶは包膜ウイルスであり、ウイルス膜を細胞の原形質膜と融合させることにより、細胞侵入を行なう。このプロセスはウイルス包膜タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１により行なわれ、それらは切断前に１個の１６０ｋＤタンパク質として合成される。この切断の生成物は、細胞中へのウイルスの侵入のプロセスが始まるまで会合したままである。ｇｐ１２０はＣＤ４＋Ｔリンパ球上のＣＤ４及び単球／マクロファージ系列（ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞に結合する。この結合事象及びｇｐ１２０と細胞共−受容体の間のさらなる相互作用は、ｇｐ４１からのｇｐ１２０解離に導く。ｇｐ１２０の解離は、ｇｐ４１におけるコンフォーメーション的変化の一部として起こり、それはｇｐ４１を「融合−活性」形態で残す。このｇｐ４１の形態は、次いで細胞膜とウイルス膜の間の融合を媒介することができる。
【０００５】
ＨＩＶ侵入のための一次細胞受容体はＣＤ４である。しかしながら、標的細胞上におけるＣＤ４の発現は、ＨＩＶ侵入及び感染のために必要であるが十分ではない。いくつかのケモカイン受容体が補因子として働き、それは細胞表面上でＣＤ４と共−発現されるとＨＩＶ侵入を許す。
【０００６】
ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４は、ＨＩＶがヒト細胞中に侵入するために用いる主要なケモカイン共受容体である。この共−受容体使用に基づき、新しいＨＩＶ分類、すなわちＣＣＲ５−向性（Ｒ５）、ＣＸＣＲ４−向性（Ｘ４）又は二重向性（Ｒ５／Ｘ４）ＨＩＶ株が１９９８年に確立された。それより数年早く、ウイルス表現型（すなわち非−シンシチウム−誘導、ＮＳＩ又はシンシチウム−誘導、ＳＩ）とＨＩＶ株の病原性の間の関連性が同定されていた。
【０００７】
現在の知識は、試験管内でＲ５ウイルスが通常Ｔ−細胞系上のＮＳＩに相当し、単球−マクロファージ中で複製することができる（Ｍ−向性）ことを示し、すべての特徴は以前
に、より病原性でない株に結びつけられた。対照的に、Ｘ４株はＴ−細胞系上のＳＩであり、Ｔリンパ球上で好適に複製し（Ｔ−向性）、すべてより病原性のウイルス株の特徴である。この知識に基づき、ＨＩＶ共−受容体使用は疾患の進行と関連すると思われる。
【０００８】
同定されるべきこれらの補因子の第１は、Ｔ細胞上で発現されるＣＸＣＲ４又はフシン（ｆｕｓｉｎ）であった（非特許文献１）。細胞上におけるＣＸＣＲ４とＣＤ４の共−発現は、Ｔ−向性ＨＩＶ単離物が細胞と融合し且つ感染することを許す。ＣＸＣＲ４は多くのＴ細胞上で発現されるが、通常マクロファージ上で発現されず、従ってマクロファージ−向性（Ｍ−向性）ＨＩＶ単離物との融合を許さない（非特許文献１）。
【０００９】
ＣＸＣＲ４の同定から少し後に、別の共−受容体が同定された。マクロファージ及びＴ細胞のいくつかの集団上で発現されるＣＣＲ５もＣＤ４と共同して機能し、ＨＩＶ膜融合を許すことができる（非特許文献２）。ＣＣＲ５へのＨＩＶ  ｇｐ１２０結合はＣＤ４−依存性であり、それは、ＣＤ４の抗体阻害がＣＣＲ５への結合を８７％低下させることができるからである（非特許文献３）。Ｍ−向性ＨＩＶ単離物は、マクロファージ及びいくつかのＴ細胞の両方の感染のためのそれらの共−受容体としてＣＣＲ５を使用するようである。
【００１０】
上記のＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４として既知のこれらの２つの比較的大きなＨＩＶの受容体の存在は、種々のウイルス変異体が、２つの受容体の１つのみにより、または両方の受容体により細胞中に侵入するそれらの能力に従って３つのカテゴリー：Ｒ５、Ｘ４及びＲ５Ｘ４に分類されることを意味する。ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４は７−貫膜Ｇタンパク質−共役受容体群に属する。それらは４つの貫膜ドメイン、３つの細胞外ループ及び１つのＮ−末端ドメインから成るα−らせん構造を示す。ＣＤ４−ｇｐ１２０複合体は、ｇｐ１２０のＶ３可変ドメインを介して共−受容体に結合するが、Ｖ１／Ｖ２及びＣ４のような他のｇｐ１２０領域もこの相互作用に含まれる。しかしながら、Ｖ３のアミノ酸配列はＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４使用の主要な決定因子であると思われる。
【００１１】
ウイルス向性という用語は、ウイルスが感染し、その中で複製する細胞型を指す。現在、ウイルス向性の決定は診断試験として行なわれないが、それはＨＩＶ研究のある分野において非常に有用なパラメーターに相当する。さらに、ＨＩＶ侵入を標的とする、そしてさらに特定的に共−受容体ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４を標的とする特定の薬剤の導入は、ＨＩＶ−感染患者のウイルス向性の特性化が処置の開始の前に非常に重要になるであろうことを意味する。
【００１２】
共−受容体アンタゴニストは有望な新しい種類の抗−ＨＩＶ−１薬を構成し、いくつかの先駆的化合物が現在、全臨床的開発（ｆｕｌｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中である。
【００１３】
ＨＩＶ向性の決定のためにいくつかのアッセイが開発されている。現在、どれが最も簡単且つ信頼できる方法であるかは、不明瞭なままである。ＭＴ−２アッセイは、ＨＩＶ単離物の細胞変性効果を調べるために１９８０年代の後期の間に広く用いられ、ＨＩＶ株のＳＩ及びＮＳＩウイルスへの分類を確立するために役立った。ＭＴ−２細胞アッセイは、それらの細胞の表面上におけるＣＣＲ５ではなくてＣＸＣＲ４の独特の発現（ｕｎｉｑｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に基づく。しかし、主な欠点は、刺激された患者のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）からのウイルス株を必要とすることである。ＭＴ−２アッセイは、共−受容体アンタゴニストを用いて処置されている患者において使用するのに最も適してはいないかも知れない。
【００１４】
ウイルス向性決定のための別の手段は、Ｐｈｅｎｏｓｃｒｉｐｔ（ＶＩＲａｌｌｉａｎ
ｃｅ，Ｐａｒｉｓ）及びＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）のような組換えウイルス向性アッセイの使用である。両アッセイは、患者の血漿試料からのＨＩＶ−１包膜糖タンパク質遺伝子配列を増幅し、それぞれ複製−感応又は複製能−欠損組換えウイルスを作る。次いでこれらのウイルスを用いて、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４共−受容体と組み合わせてＣＤ４を発現する細胞系に感染させ、それはウイルス向性の決定を可能にする。これらのアッセイの重大な限界は、混合集団（Ｒ５＋Ｘ４）中のＸ４ウイルスの検出に関する閾値、すなわち混合ウイルス集団の存在下における少数派の準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）の検出に関する閾値である。
【００１５】
この限界は、ＣＣＲ５アンタゴニストを用いる処置を受けている患者において重要な意味を有するかも知れず、その患者においては、ベースラインにおける比較的小さい集団として存在するＸ４ウイルスの出現が有利であり得る。
【００１６】
ＣＣＲ５アンタゴニストを用いる治療の開始の前の共−受容体使用（又は向性）に関する試験は、ＣＸＣＲ４又は二重向性株に感染する患者におけるこれらの化合物の使用を避けるために重要であろう。
【００１７】
ＨＩＶ向性の分子的基礎はまだ研究下にあるが、いくつかの研究は、おそらくｇｐ１２０包膜タンパク質のＶ３ループが含まれ得ることを示した。Ｖ３ドメイン内のどの残基がウイルス共−受容体使用の決定に含まれ得るかを同定するための試みが成された。単独の変化が向性を担うとは思われないが、いくつかの遺伝子型のクラスターがウイルス向性を決定し得る。Ｖ３遺伝子配列に基づいてＨＩＶ共−受容体使用を予測するためにいくつかのアルゴリズムが作られた。
【００１８】
しかしながら、ウイルス株の共−受容体使用を正確に且つ高い感度を以って決定することができるウイルス包膜向性決定アッセイに対する緊急の必要性がある。さらに、成功した侵入阻害剤の開発の故に、侵入阻害剤及び融合阻害剤に対する耐性へのウイルス包膜変異の影響を評価することを目的とするアッセイは、ＨＩＶ治療を導くために確実に非常に重要になるであろう。
【００１９】
ＨＩＶに感染した患者は、それぞれそれら自身の共−受容体使用を有する多様なウイルス亜種を宿しているので、患者のウイルス集団全体における向性表現型の分布を分析することが重要である。さらに、向性表現型の予測方法は高度に可変な領域のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列に基づくので、クローンレベルで配列を決定することが必要である。
【００２０】
従って、簡単であり且ついずれの分析実験室にも得ることができる方法、これまで利用できなかったシステムにより、臨床的単離物内におけるＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４−向性準−種の可変性及び分布の我々の知識に実質的に寄与するために、患者でのＨＩＶ感染におけるウイルス向性の特性化を可能にする信頼できる適した方法を得るという満たされない高い要求が確かに存在する。
【非特許文献１】Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，ＨＩＶ−１  ｅｎｔｒｙ  ｃｏｆａｃｔｏｒ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｅｖｅｎ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６  Ｍａｙ  １０；２７２（５２６３）：８７２−８７７
【非特許文献２】Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６  Ｊｕｎ  ２０；３８１（６５８４）：６６１−６
【非特許文献３】Ｔｒｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．著，ＣＤ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＣＲ−５．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６  Ｎｏｖ  １４；３８４（６６０５）：１８４−７
【発明の開示】
【００２１】
本開示は、疾患の進行に関するマーカーとしてのＨＩＶ共−受容体使用を同定するための方法及び従って向性試験を記載する。
【００２２】
少なくとも２つの向性予測アルゴリズム、ＰＳＳＭ  ｈｔｔｐ：／／ｕｂｉｋ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ／ｐｓｓｍ／及び支持ベクターマシーン（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅ）法（ＳＶＭ）である手段のために示されたＧｅｎｏ２Ｐｈｅｎｏ（Ｇ２Ｐ）  ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍｐｉ−ｓｂ．ｍｐｑ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｐｌ／が公共的に利用可能であり、両方ともＨＩＶ−１  ｅｎｖのＶ３−ループの特定のアミノ酸特性の分析に基づく。しかしながらこれらのアルゴリズムの予測価値はまだ限られている。
【００２３】
クローンＶ３  ｅｎｖ配列を用い、ＰＳＳＭにより与えられる予測とＳＶＭモデルにより得られるものの間の比較が行なわれた。両プログラムモデルの間でＲ５−向性単離物に関して高い一致が見出されたが、Ｘ４予測は、一致が有意により低かった。
【００２４】
さらに特定的に、本開示は、ＨＩＶに感染した患者における量的表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性の予測方法を記載し、それは
ａ）患者からのウイルス遺伝物質を含んでなる試料を用い；
ｂ）該試料からウイルス遺伝物質を抽出し、続いて以下の段階：
１．特定のＨＩＶ領域のウイルス遺伝物質を増幅し、
２．アンプリコン一体性を分析し且つ試料をプールし、
３．プールされたアンプリコンを精製し、
４．アンプリコンのプールをベクター中に連結し、そして連結された生成物をコンピテント細胞中に形質転換し、
５．得られる個々の形質転換細胞を分析し、
６．得られる単クローン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ）を配列決定して単クローン遺伝子型配列を得る
段階を含んでなる単ゲノム配列決定を行い；
ｃ）該遺伝子型配列を用いて、以下の段階：
１．該遺伝子型配列において、少なくとも１つの自然の可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンが量的表現型の結果、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性と関連する遺伝子パターン（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎ）を同定し、
２．段階ｃ１において遺伝子配列中で同定される自然の可変性、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンの少なくとも１つに類似の遺伝子パターンを有する少なくとも１つの遺伝子型エントリーに関して遺伝子型／表現型相関データベースを検索し、
３．相関遺伝子型／表現型データベースにおいて適合する表現型を有する類似の遺伝子パターンを有する該少なくとも１つの遺伝子型エントリーを得、そして
４．類似の遺伝子パターンを有する少なくとも１つの遺伝子型エントリーのデータベースからＨＩＶ表現型を予測する
段階を含んでなる予測アルゴリズムを用いて特定の表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性を予測し；
ｄ）ＨＩＶ感染患者の試料中に存在するすべての単配列クローンに関し、段階ｃ１〜ｃ４で得られる情報に基づいて量的表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性を予測する
ことを含んでなる。
【００２５】
本発明に従う方法は、段階（ｃ）の後且つ段階（ｄ）の前に以下の段階
１．予測可能な表現型を含まないクローン配列を単クローン生物学的表現型決定アッセイにおいて分析し、
２．該分析の後に得られる情報を段階（ｃ）で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する（ｌｏａｄｅｄ）
追加の段階をさらに含んでなることができる。
【００２６】
上記の単クローン生物学的表現型決定アッセイは以下の段階
１．クローン部分的もしくは全−長ＨＩＶゲノムを形成し、
２．該ゲノムを用いて、組換えＨＩＶを得るのに適した主鎖と一緒に又は全長ＨＩＶ−１ゲノムとして直接、哺乳類細胞をトランスフェクションし、
３．細胞系を該組換えＨＩＶに感染させ、感染プロセスが起こっているそれらの生物学的表現型を決定し、
４．その後、得られる情報を段階（ｃ）で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する
段階を含んでなる。
【００２７】
上記の段階の２つ、すなわち段階２（トランスフェクション）及び段階３（感染）を一段階で行なうことができる。
【００２８】
段階（ｂ１）における特定のＨＩＶ領域のウイルス遺伝物質の増幅は、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲにより行なわれる。段階（ｂ４）で用いられるコンピテント細胞はＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又は酵母である。
【００２９】
上記の感染プロセスを、全−長ＨＩＶゲノム中に導入されるマーカー遺伝子により、又は指示細胞系（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）中に導入されるマーカー遺伝子により、あるいは細胞変性効果スコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）又はシンシチウム（ｓｙｎｃｉｔｉａ）形成により顕微鏡的に監視することができる。
【００３０】
本発明の他の態様において、ＨＩＶに感染した患者の試料から得られ、且つ配列決定されたＨＩＶ配列を量的表現型、例えばｇａｇ表現型、インテグラーゼ表現型又は向性の予測のためのアルゴリズムに続いて相関遺伝子型−表現型データベース中に負荷し、その後、該表現型又は向性を報告する。
【００３１】
ｇａｇ表現型を用いて、例えばプロテアーゼ又はｇａｇ阻害剤耐性を意味し、インテグラーゼ表現型を用いて、例えば侵入阻害剤耐性を意味する。
【００３２】
方法を実施するために用いられる患者からの試料は、血液試料、生検試料、血漿試料、唾液試料、組織試料及び体液又は粘液試料から選ばれる生物学的試料から得られる。
【００３３】
本方法に加えて且つ本発明に従って、ＨＩＶに感染した患者の試料においてウイルス負荷量を決定する。
【００３４】
例えばＣＣＲ５からＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４からＣＣＲ５あるいは二重向性ウイルスからＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４へのＨＩＶ−１共−受容体使用における量的シフトとしての量的向性の予測は、本発明の一部である。
【００３５】
本発明の他の態様において、量的ｇａｇ−表現型の予測を、ｇａｇ読取り枠中及び／又はｇａｇ−切断部位における自然の可変性又は薬剤−誘導／選択可変性の結果としてのＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素活性と関連付ける。
【００３６】
あるいはまた、量的インテグラーゼ−表現型の予測は本発明の一部であり、それをインテグラーゼ読取り枠及び／又はインテグラーゼ供与体／受容体部位における自然の可変性又は薬剤−誘導／選択可変性の結果としてのＨＩＶ−１インテグラーゼ酵素活性と関連付ける。
【００３７】
本発明に従う方法の最終的結果として報告を作成し、ここで該報告は処置する医師にＨＩＶ治療又は処置のための指針を与える予測された表現型又は向性を含んでなる。
【００３８】
本発明に従って行なわれる方法のいずれかを用いて予測される表現型又は向性を含んでなるコンピューター読取り可能な媒体も本発明の一部である。
【００３９】
配列番号：６を有するベクターｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ及び上記の方法のいずれかにおける該配列番号：６を有するベクターｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰの使用も本発明に属する。
【００４０】
図面への説明
図１において、フロー−チャートは、本発明において用いられる方法を概述して示す。
【００４１】
図２は、臨床的ｅｎｖ  ＮＨ２−Ｖ４アンプリコンのｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ主鎖への組換え、バクテリア中へのクローニング、２９３  Ｔ細胞における全長ＨＩＶゲノム組換えプラスミドのヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）及びＵ８７−ＣＤ４（−ＣＸＣＲ４又は−ＣＣＲ５）細胞中への組換えウイルスの感染の略表示を示す。
【００４２】
図３．クローン番号に従うＰＳＳＭスコア。クローンを、ＰＳＳＭ又はＳＶＭによるそれらの予測に従ってグループに細分した。表現型決定のために選ばれるクローンを、それらの対応する番号により記す。
【００４３】
図４．６０個のクローン中に存在するＶ３ループの可変性を示す配列ロゴ。ロゴ中の各積重ねの全体的な高さは、その位置における配列保存を示すが、積重ね内の各文字の高さは、その位置におけるその相対的頻度に比例する。
【００４４】
図５．研究下にあるＨＩＶ−感染患者に関する系統樹。枝をＰＳＳＭ及びＳＶＭによる予測に基づく分類に従って着色した：暗緑：両プログラムによりＲ５と予測された；明緑：ＰＳＳＭによりＲ５と予測されＳＶＭにより予測されなかった；青：ＰＳＳＭによりＲ５予測及びＳＶＭによりＸ４予測；赤：両プログラムによりＸ４予測。Ｘ４配列のブートストラップ値（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  ｖａｌｕｅｓ）をその枝の基に示す。目盛りは、ヌクレオチド整列に基づく遺伝子距離を示す。
【００４５】
図６．１２個の選ばれたクローン及びＨＸＢ２ＤのＮＨ２−Ｖ４領域のヌクレオチド整列。保存的塩基対を青で示し、同じ塩基対を黄色で示す。ｅｎｖ  Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３及びＶ４ループを赤線で示す。
【００４６】
図７．１２個の選ばれたクローンならびに正（ＨＸＢ２Ｄ−ｅＧＦＰ及びＨＸＢ２Ｄ−ＪＲＣＳＦ−ｅＧＦＰ）及び負の標準（ＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ）に感染したＵ８７−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４及びＵ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５の蛍光顕微鏡画像。
【実施例】
【００４７】
実施例１
ＲＮＡ抽出
３つの臨床的血漿試料を無作為に選び、患者１、２及び３と呼んだ。合計で３００μｌの血漿から、ＥａｓｙＭａｇＴＭ  ＲＮＡ抽出プラットフォーム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｂｏｘｔｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。２５μｌの溶出緩衝液中における溶出の後、溶出液の５μｌを、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ（Ｒ）  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  ｖ１．１システム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｂｏｘｔｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いるウイルス負荷量測定に用いた。ＲＮＡ試料の残りをアンプリコン生成のために用いた。
【００４８】
アンプリコン生成
残る２０μｌのＲＮＡを、２ｘ反応緩衝液、０．２μＭ  プライマー  Ｅｎｖ ６２１０Ｆ（ＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ）（配列番号：１）、０．２μＭ  プライマー ＨＭＡ  Ｒ３（ＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＴ）（配列番号：２）及び２単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍからのＰｌａｔｉｎｕｍ（Ｒ）  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）と、１２０μｌの合計体積において混合した。この混合物をそれぞれ１５μｌの８回の反応を経て分割し、５３℃で３０分間、逆転写を行なった。初期変性は９４℃で２分間であり、熱サイクリングは９２℃における１５秒間の変性、５５℃における３０秒間のアニーリング及び６８℃における１分２０秒間の伸張の５０サイクルから成った。最終的伸張を６８℃で７分間行なった。得られるアンプリコンをプールし、ＬＣ９０プラットフォーム（Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて分析し、続いてＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。精製されたアンプリコンプールの最終的な体積は３０μｌであった。
【００４９】
ＴＯＰＯ−ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｒ）
配列決定のためのＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｒ）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からのｐＣＲ（Ｒ）４−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター（商業的に入手可能）中への連結のために、合計で２μｌの精製されたアンプリコンプールを用い、２μｌのクローニング反応混合物を用いて１アリコートのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（Ｒ）  ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、製造者の指示に従って形質転換した。
【００５０】
コロニーＰＣＲ
５０μｌのＰＣＲ反応混合物に接種するために、臨床的試料当たり合計で９５個のコロニー（プラス１個のブランク標準反応）を、無菌のチップ（ｔｉｐ）を用いて採取した（手動でか又はロボットを用いて）。ＰＣＲ反応混合物は１０ｘＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．３３μＭ  プライマー  Ｔ３（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ）（配列番号：３）、０．３３μＭ  プライマー  Ｔ７（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ  ＧＧＧ）（配列番号：４）及び０．０３単位のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から成った。９４℃における１０分間の変性、９４℃における１５秒間の変性、５０℃における３０秒間のアニーリング及び７２℃における２分間の伸張の１０サイクルで熱サイクリングを開始した。これに、９４℃における１５秒間の変性、５０℃における３０秒間のアニーリング及び７２℃における２分間の伸張の伸張の２０サイクルが続き、伸張の時間をサイクル当たり５秒間づつ増加させた。最後の伸張を７２℃において７分間行なった。Ｑｉａｇｅｎ  ９６００  ＰＣＲ精製プラットフォームを用い、５０μｌで溶出させて（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）コロニーＰＣＲ生成物を精製した。
【００５１】
サイクル配列決定
各精製されたコロニーＰＣＲ生成物から１μｌを、２．５ｘ  希釈緩衝液、１μｌ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｍｉｘ及び０．２μＭ  配列決定プライマーと、１１．５μｌの合計体積において混合した。プライマーＴ３及びＴ７を用い、別々の反応において各生成物を配列決定した。熱サイクリングは、９６℃における１０秒間の変性、５０℃における５秒間のアニーリング及び６０℃における４分間の伸張の２５サイクルから成った。エタノール／酢酸ナトリウム沈降を用いて過剰のＢｉｇ  Ｄｙｅを除去し、生成物を９５℃において２分間変性させ、ＡＢＩ３７３０キャピラリーシークエンサー上で分析した。
【００５２】
未修正（ｒａｗ）配列決定分析
ＡＢＩ３７３０キャピラリーシークエンサーから電気泳動図を回収し、Ｓｅｑｓｃａｐｅ  ｖ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に移した。特性値（ｑｕａｌｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）及びＪＲ−ＣＳＦ参照配列の長さに基づいて配列末端をトリミングした（ｔｒｉｍｍｅｄ）；参照配列は増幅プライマー間の領域に及んだ。
【００５３】
生成した配列が：
●増幅プライマー配列の間の問題の全領域に及ばない
●ＳＴＯＰコドンを含有する
場合、あるクローンを分析から除去した。
【００５４】
向性予測
１．Ｖ３−ループアミノ酸配列抽出
ＰＳＳＭ予測アルゴリズムはアミノ酸配列を必要とするので、Ｅｎｖのアミノ末端部分からＶ４−ループまでの全領域に及ぶヌクレオチド配列からＶ３−領域の正しい翻訳を行なった。ＨＸＢ２  Ｖ３−ループアミノ酸配列を含有する小さいデータベースに対して翻訳されたヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴ検索を行なうことにより（６個の枠すべてにおいて）、Ｖ３と最も高い適合を有する領域を境界付けることができた。続いてこれらの領域を抽出し、翻訳した。
【００５５】
２．ＰＳＳＭ向性予測
Ｖ３−ループアミノ酸配列を：ｈｔｔｐ：／／ｕｂｉｋ．ｍｉｃｒｏｓｌｕ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ／ｐｓｓｍ／に、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｆ．Ｓ．Ｌｉ，Ａ．Ｂ．ｖａｎ’ｔ  Ｗｏｕｔ，Ｄ．Ｃ．Ｎｉｃｋｌｅ，Ｄ．Ｓｈｒｉｎｅｒ，Ｈ．Ｘ．Ｈｅ，Ｓ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｒ．Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａ，Ｊ．Ｂ．Ｍａｒｇｏｌｉｃｋ，ａｎｄ  Ｊ．Ｉ．Ｍｕｌｌｉｎｓ．２００３．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｓａｇｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｒ５−ｔｏ−Ｘ４  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｔｉｆ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｏｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｅｎｖ  Ｖ３  ｌｏｏｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１３３７６−８８に従って負荷する（ｕｐｌｏａｄｉｎｇ）ことにより、位置特異的スコアリングマトリックス（ＰＳＳＭ）予測を作成した。
【００５６】
３．ｇｅｎｏ２ｐｈｅｎｏ向性予測手段において利用可能な支持ベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム
ｇｅｎｏ２ｐｈｅｎｏ共受容体予測手段（ＳＶＭと示される）は、ヌクレオチド配列のバッチ寄託（ｂａｔｃｈ  ｓｕｂｍｉｔｔｉｎｇ）を許さないので、すべての配列の寄託（ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）を自動化するＰｅｒｌスクリプトを書き、次いでＨＴＭＬ出力（ＳＶＭ）を他のｐｅｒｌスクリプトと一緒に分析して（ｐａｒｓｅｄ）、患者ごとにｇｅｎｏ２ｐｈｅｎｏ向性予測を与えた。
【００５７】
４．ＳＶＭ及びＰＳＳＭ向性予測の比較
ＳＡＳスクリプトはすべての予測を１つのデータセットとし、各患者に関する分割表を作る。
【００５８】
結果．
３つの臨床的単離物を無作為に選択した。各単離物からウイルスＲＮＡを逆転写し、数回増幅し、得られるアンプリコンをプールし、精製し、バクテリア細胞中にクローニングした。５０個より多い無作為に選ばれたクローンを配列決定し、２つの予測プログラムに寄託した。この分析の結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
2009525035.tif 000002
【００６０】
Ｇ２Ｐ：ＳＶＭ法を用いてｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍｐｉ−ｓｂ．ｍｐｑ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｐｌ）において利用可能な予測手段；ＰＳＳＭ：ｈｔｔｐ：／／ｕｂｉｋ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ／ｐｓｓｍ／において利用可能な予測手段。
ＤＵＡＬ：ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４発現細胞の両方に感染すると予測されるＶ３配列。
ＮＯＮＥ：標準的な設定でのＳＶＭにおいて予測が得られない。
【００６１】
この研究で調べたすべての患者の場合に、ＳＶＭアルゴリズムにおいて予測を生じない有意な量のクローン配列があったが、ＰＳＳＭ法で予測が得られた。さらに、これらの予測を微調整するために、もっと大きな相関データベースに基づく予測手段の改良が必要である。単クローン表現型決定アッセイは、そのようなデータベースの構築のために役立つ。
【００６２】
実施例２
単クローン表現型決定アッセイ
完全なｇｐ１６０又はｇｐ１６０の一部を構成する患者−由来クローン配列を、それぞ
れ完全なｇｐ１６０又はその一部が欠失したｈＸＢ２Ｄ−ｅＧＦＰ主鎖（配列番号：５）中に、ＢＤ  Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎシステムを介して導入した。ＨＸＢ２Ｄ−ｅＧＦＰは、ｎｅｆの代わりにＧＦＰを含有するベクターである（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ著，（１９９７），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：５４９５−５５０４）。マーカーとしてのｅＧＦＰの代わりに、他の周知のマーカー、例えばルシフェラーゼ又は他の商業的に入手可能な蛍光タンパク質を本アッセイにおいて用いることができる。この方法で作られるすべての患者−由来全−長組換えＨＩＶ−ｅＧＦＰクローンに関し、ＤＮＡを調製し、制限分析により検査した。１μｇの正のクローンを、Ａｍａｘａヌクレオフェクション法を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４〜４８時間後に上澄みウイルス培養物を収穫し、Ｕ８７細胞（Ｕ８７を親とする、Ｕ８７−ＣＤ４、Ｕ８７−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４及びＵ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞）の感染に用いた。感染から２４〜９６時間後に、蛍光顕微鏡により共受容体使用を決定した。あるいはまた、上澄みウイルス培養物を用いて、ＣＸＣＲ４−ＣＣＲ５キメラ受容体を含有するＵ８７に感染させた（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著（２００３）  ＡＩＤＳ  １７：２５６１−２５６９）。この方法で、ＣＣＲ５−使用ウイルスがＣＸＣＲ４−向性ウイルスにシフトするポテンシー（ｐｏｔｅｎｃｙ）に関する予測が行なわれる。
【００６３】
実施例３
前以て処置を受けていない（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｎａｉｖｅ）ＨＩＶ−１感染患者試料についての遺伝子型的Ｖ３−ループ向性予測のクローン表現型的確証
ＲＮＡ抽出及びＶｉｒｃｏ  ＴｙｐｅＴＭ
無作為に選択されたＨＩＶ−１−感染患者から得た合計で３００μｌの血漿から、ＥａｓｙＭａｇＴＭ  ＲＮＡ抽出プラットフォーム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｂｏｘｔｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ（Ｒ）  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  ｖ１．１システム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ；ＩＵ／ｍｌにおいて出力）によりウイルス負荷量を決定した。Ｖｉｒｃｏ  ＴｙｐｅＴＭを作成した。
【００６４】
増幅
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（Ｒ）  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用い、ＲＮＡを逆転写して７−倍において増幅した。前進プライマーをＥｎｖの開始コドンの前に置き、逆プライマーをＥｎｖ  Ｃ４領域中に置いた。ＰＣＲフラグメントをＮＨ２−Ｖ４アンプリコンと呼んだ。
【００６５】
クローン配列決定
プールした後、アンプリコンをｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。感応ＴＯＰ１０  Ｅ．コリ細胞中への形質転換の後、個々のクローンを採取し、前進及び逆プラスミドプライマーを用いるコロニーＰＣＲにより挿入断片を増幅した。精製の後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いてコロニーＰＣＲ生成物を配列決定し、ＡＢＩ  ３７３０  ＸＬ自動シークエンサー上に流した（ｒｕｎ  ｏｎ）。ＳｅｑＳｃａｐｅ  ｖ２．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列修正及びコンティグ集合（ｃｏｎｔｉｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行なった。
【００６６】
データ分析
ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて整列を構築し、配列ロゴの作成のための入力として用いた（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉ）。ＰＳＳＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｕｂｉｋ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ／ｐｓｓｍ）及びＳＶＭ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍｐｉ−ｓｂ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．ｐｌ）により、ウェブサイト上に与えられる標準的な設定を用いて、Ｖ３ループ配列に基づいてウイルス向性を予測した。系統発生的分析は、全ＮＨ２−Ｖ４配列（〜１２６０ｂｐ）のヌクレオチド整列に基づいた。距離を計算し（ＤＮＡＤＩＳＴ）、ツリーを構築し（ＮＥＩＧＨＢＯＲ）、そして最後にコンセンサスツリー（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｔｒｅｅ）を組み立てた（ＣＯＮＳＥＮＳＥ）。Ｖ３−ループのＮ−結合グリコシル化を、ＥＭＢＯＳＳプログラムｐａｔｍａｔｄｂ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ＥＭＢＯＳＳ／ｐａｔｍａｔｄｂ．ｈｔｍｌ）により評価した。すべてのクローン配列を、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ：ｉｎｄｅｘ）からダウンロードされた６６個のＨＩＶ−１クレード（ｃｌａｄｅ）参照株の同じ領域と整列させることにより、ＮＨ２−Ｖ４配列に基づくクレーディング（ｃｌａｄｉｎｇ）を行なった。類似性の表を回収し、すべてのクローンとの同一性の最高のパーセンテージを示す参照株を記録した。
【００６７】
クローン表現型決定
クローンＮＨ２−Ｖ４アンプリコンを、ｈＸＢ２Ｄに基づくｅＧＦＰ−含有ＮＨ２−Ｖ４−欠失主鎖（配列番号：６）であるｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ中に、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＴＭ  ＣＦ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により組み換えた。マーカーとしてのｅＧＦＰの代わりに他の周知のマーカー、例えばルシフェラーゼ又は他の商業的に入手可能な蛍光タンパク質を本アッセイにおいて用いることができる。ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｔｂｌ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中への形質転換の後、ＱｉａＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを調製した。Ａｍａｘａヌクレオフェクション法を用いて組換えプラスミドを２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションした後、調製されたウイルスを、Ｕ８７−ＣＤ４、Ｕ８７−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４及びＵ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞の感染に用いた（図２）。３７℃における１２０時間のインキュベーションの後、蛍光顕微鏡により感染を視覚化した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて組換えプラスミド及びウイルス株を配列決定し、ＡＢＩ  ３７３０  ＸＬ−自動シークエンサー上に流した。ＳｅｑＳｃａｐｅ  ｖ２．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列修正及びコンティグ集合を行なった。
【００６８】
結果
クローン遺伝子型的Ｖ３−ループ向性予測
一人のＨＩＶ−１−感染患者を、クローン遺伝子型的及び表現型的向性分析のために無作為に選んだ。Ｖｉｒｃｏ  ＴｙｐｅＴＭ分析は、選ばれたＨＩＶ−１株がすべてのＦＤＡに承認されたプロテアーゼ及びＲＴ阻害剤に感受性であることを示した。さらに、血漿試料は５．４８  ｌｏｇ  ＩＵ／ｍｌのウイルス負荷量を含有し、患者が前以て処置を受けていないことを示した。ＧＰＲＴ（Ｖｉｒｃｏ  Ｔｙｐｅ  ＴＭ）及びＥｎｖ  ＮＨ２−Ｖ４−配列の両方に基づくクレーディングは、選ばれた株がクレードＢであることを示した。
【００６９】
ＲＮＡ抽出の後、一巡（ｓｉｎｇｌｅ  ｒｏｕｎｄ）ＲＴ−ＰＣＲ反応でＮＨ２−Ｖ４領域を７−倍において増幅した。プールし、ＮＨ２−Ｖ４アンプリコンをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングした後、合計で９５個のコロニーを配列決定のために採取した。２個のクローンはＮＨ２−Ｖ４挿入断片を含有せず、４個のクローンは早すぎる停止コドンを含有した。
【００７０】
８９個の残りのクローンの中から、６０個をアルゴリズムＰＳＳＭ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ）及びＳＶＭ（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）による向性予測のために選択した。４種のカテゴリー：Ｒ＝Ｒ５−向性、Ｘ＝Ｘ４−向性、Ｕ＝予測不可能であるＲＲ、ＸＸ、ＲＸ及びＲＵを特性化し、ここでそれぞれの二重項（ｄｕｐｌｅｔ）中の第１の文字はＰＳＳＭによる予測を示し、第２の文字はＳＶＭによる予測を示す。２つのアルゴリズムの間で、１１．７％の一致したＲ５予測及び１６．７％の一致したＸ４予測が観察された。クローンのほとんど１２％は一致しない予測（ＰＳＳＭによりＲ５及びＳＶＭによりＸ４）を示し、クローンの６０％はＳＶＭにより予測を与えなかった。ＰＳＳＭプロット（図３）及び配列ロゴ（図４）は、選ばれたＨＩＶ−１株における大きな可変性を示した。さらに、ＰＳＳＭスコアは、１）両プログラムによりＲ５と予測されたクローン（ＲＲ群）から２）ＳＶＭによる予測なしに対してＰＳＳＭによるＲ５を有するクローン（ＲＵ群）に、３）一致しない結果を有するクローン（ＰＳＳＭによりＲ５及びＳＶＭによりＸ４，ＲＸ群）に、４）一致したＸ４クローン（ＸＸ群）に徐々に増加することが観察された。最後に、Ｒ５予測に関するカット−オフ（−７．３）とＸ４予測に関するカット−オフ（−３．２）の間の中間区域内に１個のみのクローン（ＲＸ群から）が位置することを観察することができた。
【００７１】
配列間の関連性を示すために、系統発生的分析を完全ＮＨ２−Ｖ４ヌクレオチド領域に関して行なった（図５）。大きな可変性の他に、Ｘ４クローンが密集し、Ｘ４クラスターとＲ５クラスターの間の遺伝子距離が比較的短いことが明らかであった。ブートストラッピングにより評価すると、Ｘ４密集は有意であった。
【００７２】
すべてのクローンを、Ｒ５  ｇｐ１２０とＣＣＲ５の相互作用に含まれ得るＮ−結合グリコシル化モチーフ、Ｎ｛Ｐ｝Ｓ／Ｔ｛Ｐ｝の存在に関してスクリーニングしたが、それはＣＸＣＲ４使用を排除し得る。合計で１１個のクローン：ＸＸ群からの１０個のクローン及びＰＳＳＭスコアリングの中間区域中に位置するＲＸ群からの１個のクローン（クローン３０）にグリコシル化モチーフがなかった。
【００７３】
クローン表現型的向性決定
１２個のクローン：クローン１及び７４（ＲＲ群）、クローン１４及び８３（ＲＵ群）、クローン２７及び３０（ＲＸ群）ならびにクローン２３、５４、５９、７２、８０及び８７（ＸＸ群）を、表現型的向性決定のために選択した。選ばれたクローンのいくつかの特性を含むＮＨ２−Ｖ４ヌクレオチド整列を行い、図６に示した。
【００７４】
それぞれのクローンＮＨ２−Ｖ４領域をｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ（配列番号：６）主鎖ベクター中に組換え、ｎｅｆにｅＧＦＰを保有するＨＩＶ完全ゲノムプラスミドを得た。２９３Ｔ細胞中へのトランスフェクションの後、複製−感応組換えウイルス株を得た。組み換えプラスミド及び組換えウイルス株の両方の組換え部位を含むＮＨ２−Ｖ４領域の配列決定は、クローン遺伝子型決定実験で得た最初のクローン配列と比較すると、誤対合がないことを明らかにした。
【００７５】
Ｕ８７−ＣＤ４、Ｕ８７−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４及びＵ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞の感染により、組換えウイルス株を表現型的に調べた（図７）。ＲＲ群及びＲＵ群から選ばれたクローンはＲ５−向性のみであったが、ＸＸ群から選ばれたクローンはＣＸＣＲ４使用のみを示した。ＲＸ群から選ばれた１個のクローンはＣＣＲ５使用を示したが（クローン２７）、この群からの他のクローンは二重−向性であると表現型決定された（クローン３０）。興味深いことに、後者のクローンは−７．１１の中間ＰＳＳＭスコアを示した。
【００７６】
前以て処置を受けていないＨＩＶ−１−感染患者についてのクローン遺伝子型的及び表現型的向性分析は、Ｒ５−、二重−及びＸ４−向性ウイルス株のいずれもの存在を明らか
にした。向性アルゴリズムは、単離物の共−受容体に関して明白な親和性を有する単離物（ＲＲ及びＸＸ群、おそらくＲＵ群も）に関しては正確であり、一致しない予測を示す単離物（ＲＸ及びおそらくＲＵ群）のためには改善を要する。
【００７７】
上記は、このプラットフォームが最初の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）患者の試料中に存在するウイルス準−種の、正確な再現性を持った量的（ＮＨ２−Ｖ４クローン配列決定及びＮＨ２−Ｖ４クローン表現型決定）向性試験を可能にすることを示す。さらに、４０種のＨＩＶ−１試料についてＮＨ２−Ｖ４集団表現型決定を行い、Ｖ３集団配列決定と該ＮＨ２−Ｖ４集団表現型決定の間に優れた相関性が観察された。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明において用いられる方法を概述するフロー−チャート。
【図２】臨床的ｅｎｖ  ＮＨ２−Ｖ４アンプリコンのｐＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ主鎖への組換え、バクテリア中へのクローニング、２９３  Ｔ細胞における全長ＨＩＶゲノム組換えプラスミドのヌクレオフェクション及びＵ８７−ＣＤ４（−ＣＸＣＲ４又は−ＣＣＲ５）細胞中への組換えウイルスの感染の略表示。
【図３】クローン番号に従うＰＳＳＭスコア。
【図４】６０個のクローン中に存在するＶ３ループの可変性を示す配列ロゴ。
【図５】研究下にあるＨＩＶ−感染患者に関する系統樹。
【図６】１２個の選ばれたクローン及びＨＸＢ２ＤのＮＨ２−Ｖ４領域のヌクレオチド整列。
【図７】１２個の選ばれたクローンならびに正（ＨＸＢ２Ｄ−ｅＧＦＰ及びＨＸＢ２Ｄ−ＪＲＣＳＦ−ｅＧＦＰ）及び負の標準（ＨＸＢ２Ｄ−ΔＮＨ２−Ｖ４−ｅＧＦＰ）に感染したＵ８７−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４及びＵ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５の蛍光顕微鏡画像。
【図１】
2009525035.tif 000003
【図２】
2009525035.tif 000004
【図３】
2009525035.tif 000005
【図４】
2009525035.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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