(57)【要約】  本発明は、医薬を製造するためのリボ核酸の使用であって、該リボ核酸は二本鎖構造を含み、該二本鎖構造は第１鎖及び第２鎖を含み、第１鎖は連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖は連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、第１ストレッチは、該医薬により処置されるべき生物の細胞の核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は、第２ストレッチは、該医薬により処置されるべき生物の細胞の核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なる、医薬を製造するためのリボ核酸の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
第１ストレッチが、医薬により処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は
第２ストレッチが、該医薬により処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なる、
核酸、好ましくは、リボ核酸の医薬を製造するための使用。
【請求項２】
標的核酸が、生物の細胞のいかなる核酸でもあり、好ましくは生物の細胞のいかなるｍＲＮＡでもある、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
標的核酸が、生物の細胞のトランスクリプトームのいかなるエレメントでもあり、好ましくは、生物の細胞のトランスクリプトームのすべてのエレメントである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４】
細胞が、好ましくは疾患に関与する病理学的細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
第１ストレッチが、処置されるべき生物の非病理学的細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性であり、及び／又は
第２ストレッチが、処置されるべき生物の非病理学的細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡと同一である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
非病理学的細胞の標的核酸が、１つ以上のヌクレオチド位置で病理学的細胞の標的核酸とは異なる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
医薬が疾患の処置及び／又は予防用であり、このような疾患が、好ましくは、腫瘍又はがんである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
病理学的細胞が腫瘍サプレッサー欠損であり、そして連続したヌクレオチドの第１ストレッチが機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸に対して相補性であり、及び／又は
連続したヌクレオチドの第２ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸と同一である、
請求項４〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
第１ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸に対して相補性であり、病理学的細胞が該機能的腫瘍サプレッサーに関して腫瘍サプレッサー欠損であり、そして
第２ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸と同一であり、病理学的細胞が該機能的腫瘍サプレッサーに関して腫瘍サプレッサー欠損である、
請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
病理学的細胞が、機能的腫瘍サプレッサーの遺伝子又はその転写物を欠いている、請求項４〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
病理学的細胞が、機能的に活性な腫瘍サプレッサーを与える遺伝子又はその転写物を欠いている、請求項４〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
遺伝子又はその転写物が、１つ又はいくつかの突然変異を含み、このような突然変異が、好ましくは、点突然変異及び欠失突然変異よりなる群から選ばれ、このような突然変異が、好ましくは、機能的に不活性な腫瘍サプレッサーをもたらす、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が、第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
該核酸又はその一部若しくは鎖が、ＲＮＡ干渉応答ネガティブである、
核酸、好ましくは、リボ核酸の医薬を製造するための使用。
【請求項１４】
核酸が、医薬で処置されるべき生物の病理学的細胞においてＲＮＡ干渉応答ネガティブである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
核酸が、医薬で処置されるべき生物の非病理学的細胞においてＲＮＡ干渉応答ポジティブである、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
核酸がストレス応答、好ましくは、病理学的細胞のアポトーシス及び／又は増殖の抑制を誘導する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
核酸、好ましくは、リボ核酸、及び好ましくは、薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物であって、
該核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
第１ストレッチが、該医薬で処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は、
第２ストレッチが、該医薬で処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なる、
医薬組成物。
【請求項１８】
標的核酸が、該医薬組成物を使用して処置されるべき生物の細胞のいかなる核酸でもあり、好ましくは、このような生物の細胞のいかなるｍＲＮＡでもある、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
標的核酸が、医薬組成物で処置されるべき生物の細胞のトランスクリプトームのいかなるエレメントでもあり、好ましくは、医薬組成物で処置されるべき生物の細胞のトランスクリプトームのすべてのエレメントである。請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
細胞が、好ましくは、該医薬組成物により処置及び／又は予防されるべき疾患に関与しいる病理学的細胞である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
核酸が請求項１〜１６のいずれか１項に定義されている、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの脂質、好ましくはカチオン性脂質を更に含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ヘルパー脂質を更に含む、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ヘルパー脂質が、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物及び／又は請求項１〜２５のいずれか１項に記載の核酸を投与する工程を含む、処置を必要とする患者の処置方法であって、好ましくは、がん及び／又は腫瘍を処置する方法。
【請求項２７】
患者が、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の細胞、好ましくは病理学的細胞を示す、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、お互いに対して本質的に相補性である第１鎖と第２鎖を含む二本鎖核酸及び医薬としてのその使用に関する。
【０００２】
一般に望まれない細胞増殖、特に腫瘍は、多くの場合に、機能の損失の結果である。この制御されていない細胞増殖は、腫瘍の処置のために選ばれる種々のアプローチのための標的である。このようなアプローチは、中でも、ある場合に腫瘍サプレッサー（tumor suppressors）の機能の損失の直接の結果である、過剰発現される因子の排除を可能とする化合物の使用を含む。その目的のための適当な手段は、中でも、低分子（small molecules）であって、該分子に対してスクリーニングされる低分子又は、中でも作用部位からの抗体によこの種の因子の除去である。しかしながら、これらの場合のいずれにおいても、処置は、継続した処置でなければならない。何故ならば、そうでないと、失調状態の因子（imbalanced factor）は、それぞれの手段がその疾患に罹っている生物にもはや与えられなくなると、再び過剰に発現され又は過剰に存在するからである。他のアプローチは、典型的には、腫瘍と関連して観察された生理学的現象、例えば、血管形成を利用する。成功したと思われるアプローチは、腫瘍への栄養の供給を抑制するようにＶＥＧＦに対する抗体を使用することである。しかしながら、血管形成はきわめて重大な生物学的現象であるので、副作用が極めて重大であり、そして注意深い配慮を必要とする。
【０００３】
腫瘍及び腫瘍関連疾患の処置で実行される更なるストラテジーは、腫瘍細胞崩壊ウイルス（oncolytic viruses）の使用である。このようなウイルス、中でも、アデノウイルスは、腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞は感染するとアポトーシスを受け、かくして腫瘍をそのまま溶解するのに使用される。しかしながら、ウイルス媒介腫瘍崩壊は、典型的には、細胞の腫瘍選択性溶解を与えるように処置されるためには、それぞれ細胞及び腫瘍のある種の遺伝子バックグラウンドを必要とする。
【０００４】
ｓｉＲＮＡとも呼ばれる低分子干渉ＲＮＡ(small interfering RNA）は、標的遺伝子の発現の配列特異的阻害のための手段として相当注目された。ｓｉＲＮＡは、サイレンシングされる遺伝子に対して配列が相同性の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される転写後の遺伝子サイレンシング機構であるＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象を媒介する(Fire(1999),Trend 15,358-63,Tuschl,et al.(1999),Genes Dev 13, 3191-7,Waterhouse,et al.(2001),Nature 411,834-42,Elbashir, et al.(2001),Nature 411 ,494-8, 概説については、Sharp(2001),Genes Dev 15,485-90,Barstead(2001),Curr Opin Chem Biol 5,63-6参照）。ＲＮＡｉは、植物（Baulocombe(1999),Curr Opin Plant Biol 2,109-13)、線虫(Montgomery, et al.(1998),Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,15502-7)、Drosophila（Kennerdell, et al.(1998),Cell 95,1017-26,Kennerdell,et al.(2000),Ｎat Biotechnol 18,896-8）を含む多数の生物における遺伝子機能を決定するために広く使用されてきた。線虫C.elegansでは、ゲノムの約１／３が、既にＲＮＡｉによる機能分析に付された（Kim(2001),Curr Biol 11,R85-7,Maeda et al,(2001),Curr Biol 11,171-6)。
【０００５】
最近まで、ＲＮＡｉは、早期のマウス発生を除いては、哺乳動物細胞には一般に適用可能ではなかった(Wianny,et al.(2001),Nat Cell Biol 2,70-5)。２１ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのリボオリゴヌクレオチドの二本鎖の哺乳動物細胞へのトランスフェクションは、遺伝子発現を妨害しそして、長いｄｓＲＮＡで通常得られる配列非依存性インターフェロン駆動抗ウイルス応答(sequence independent interferon-driven anti-virus response)を誘発しないという発見は、分化した哺乳動物細胞において新規な潜在的用途をもたらした(Elbashir et al.(2001),Nature 411,498-8）。興味深いことに、これらの低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）は、長いｄｓＲＮＡｓからのプロセッシング産物に似ており、これは、分化した哺乳動物細胞における潜在的バイパス機構（potential bypassing mechanism）を示唆する。最初のｄｓＲＮＡプロセッシングのために必要なＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーであるDicer複合体が同定された(Bernstein,et al.(2001),Nature 409,363-6,Billy,et al.(2001),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,14428-33)。修飾されていないリボオリゴヌクレオチドを使用する際に以前に遭遇した問題の１つは、細胞における又は血清含有培地における急速な分解であった(Wickstrom(1986),J.Biochem Biophys Methods 13,97-102,Cazenave,et al,(1987),Nucleic Acids Res 15,10507-21)。トランスフェクションされたｓｉＲＮＡにより誘発されたそれぞれのノックダウンが表現型の変化を達成するのに十分長く維持されるかどうかは、特定の遺伝子機能及び使用されるアッセイシステムに依存するであろう。
【０００６】
今日まで使用されたｓｉＲＮＡの主要な特徴は、二本鎖構造の一つの鎖が標的核酸配列に対して相補性であり、これに対して他方はｓｉＲＮＡの二本鎖構造の基礎をなす塩基対形成機構により、標的核酸と同じであるということである。ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を形成する２つの鎖のいずれかの各側に結合したいかなるヌクレオチド又は配列も、クローニング又は安定化の目的で加えられる。
【０００７】
今日まで、ｓｉＲＮＡｓは、それぞれ、腫瘍及び腫瘍疾患の処置に適当な手段であるとは思われない。失調状態の因子がｓｉＲＮＡｓによって分解されるとしても、このような分解は、非常に長い時間持続されなければならない。何故ならば、腫瘍を形成する細胞は、ｓｉＲＮＡｓにより排除されないからである。他方、制御因子の損失により特徴付けられないが異常なしかし他の生理学的因子により特徴付けられるこれらの形態の腫瘍は、異常な形態のみを扱う高度に特異的なｓｉＲＮＡを必要とする。しかしながら、このようなｓｉＲＮＡのデザインのためには、失調状態の因子のそれぞれの異常な形態の原因である核酸配列の種類を知ることが必要である。あるグループの腫瘍については、同じ異常が起こることが認められるべきであるけれども、ｓｉＲＮＡにより処置されるべき腫瘍の注意深い分子生物学的特徴付けが必要とされ、そのため、それは非常に時間とお金がかかる。更に、ｓｉＲＮＡの高い特異性が前提とされるならば、あるグループの患者の別の腫瘍の処置用にデザインされたｓｉＲＮＡ種が、異なるグループの患者の同じ腫瘍の処置に実際に適当であるかどうかは疑問があると思われる。
【０００８】
ゆえに、ｓｉＲＮＡの最近もくろまれた使用は、いくらかの問題に出会う。
【０００９】
ゆえに、腫瘍及び腫瘍関連疾患の処置のための手段を提供しそしてそのためのそれぞれの化合物を提供することは、本発明の基礎をなす問題である。
【００１０】
第１の観点では、本発明の基礎をなす問題は、
核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が第１鎖（first strand）及び第２鎖（second strand）を含み、
該第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
第１ストレッチが、医薬により処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は
第２ストレッチが、該医薬により処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なる、
核酸、好ましくは、リボ核酸の医薬を製造するための使用により解決される。
【００１１】
或る態様では、標的核酸は、生物の細胞のいかなる核酸でもあり、好ましくは生物の細胞のいかなるｍＲＮＡでもある。
【００１２】
或る態様では、標的核酸は、生物の細胞のトランスクリプトームのいかなるエレメントでもあり、好ましくは、生物の細胞のトランスクリプトームのすべてのエレメントである。
【００１３】
或る態様では、細胞は、好ましくは疾患にかかった病理学的細胞である。
【００１４】
ある態様では、第１ストレッチは処置されるべき生物の非病理学的細胞の核酸、好ましくはｍＲＮＡに対して相補性であり、及び／又は
第２ストレッチは、処置されるべき生物の非病理学的細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡと同一である。
【００１５】
好ましい態様では、非病理学的細胞の標的核酸は１つ以上のヌクレオチド位置で病理学的細胞の標的核酸とは異なる。
【００１６】
ある態様では、医薬は、疾患の処置及び／又は予防用であり、このような疾患は好ましくは、腫瘍又はがんである。
【００１７】
ある態様では、病理学的細胞は腫瘍サプレッサー欠損（tumor suppressor-defective）であり、そして連続したヌクレオチドの第１ストレッチは、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸に対して相補性であり、及び／又は
連続したヌクレオチドの第２ストレッチは、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸と同一である。
【００１８】
好ましい態様では、第１ストレッチは、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸に対して相補性であり、病理学的細胞が該機能的腫瘍サプレッサーに関して腫瘍サプレッサー欠損であり、そして
第２ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸と同一であり、病理学的細胞が該腫瘍サプレッサーに関して腫瘍サプレッサー欠損である。
【００１９】
ある態様では、病理学的細胞は、機能的腫瘍サプレッサーの遺伝子又はその転写物を欠いている。
【００２０】
ある態様では、病理学的細胞は、機能的に活性な腫瘍サプレッサーを与える遺伝子又はその転写物を欠いている。
【００２１】
好ましい態様では、該遺伝子又はその転写物は、１つ以上の突然変異を含み、このような突然変異は、好ましくは、点突然変異及び欠失突然変異よりなる群から選ばれ、このような突然変異（１つ又は複数）は好ましくは、機能的に不活性な腫瘍サプレッサーをもたらす。
【００２２】
第２の観点では、本発明の基礎をなす問題は、
核酸が二本鎖構造を含み、そして該二本鎖構造が、第１鎖及び第２鎖を含み、
該第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、そして第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
該核酸又はその一部若しくは鎖（strand）が、ＲＮＡ干渉応答ネガティブである、
核酸、好ましくは、リボ核酸の医薬を製造するための使用により解決される。
【００２３】
第２の観点のある態様では、核酸が、医薬で処置されるべき生物の病理学的細胞においてＲＮＡ干渉応答ネガティブである。
【００２４】
第２の観点のある態様では、核酸が、医薬で処置されるべき生物の非病理学的細胞においてＲＮＡ干渉応答ポジティブである。
【００２５】
第１及び第２の観点の態様において、核酸は、病理学的細胞のストレス応答、好ましくは、アポトーシス及び／又は増殖の抑制を誘導する。
【００２６】
第３の観点では、本発明の基礎をなす問題は、核酸、好ましくは、リボ核酸、及び好ましくは、薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物であって、
該核酸が二本鎖構造を含み、そして二本鎖構造が第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、そして第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
第１ストレッチが、該医薬で処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は、
第２ストレッチが、該医薬で処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なる、
医薬組成物により解決される。
【００２７】
第３の観点のある態様では、標的核酸は、該医薬組成物を使用して処置されるべき生物の細胞のいかなる核酸でもあり、好ましくは、このような生物の細胞のいかなるｍＲＮＡでもある。
【００２８】
第３の観点のある態様では、標的核酸は、いかなるエレメントでもあり、好ましくは、該医薬組成物で処置されるべき生物の細胞のトランスクリプトームのトランスクリプトームのすべてのエレメントである。
【００２９】
第３の観点のある態様では、細胞は、好ましくは、医薬組成物により処置及び／又は予防されるべき疾患にかかっている病理学的細胞である。
【００３０】
第３の観点のある態様では、核酸は、本発明の第１の観点に関して定義されたとおりである。
【００３１】
第３の観点のある態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの脂質、好ましくはカチオン性脂質を更に含む。
【００３２】
第３の観点の好ましい態様では、脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩である。
【００３３】
第３の観点のある態様では、医薬組成物はヘルパー脂質を更に含む。
【００３４】
第３の観点の好ましい態様では、ヘルパー脂質が、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンである。
【００３５】
第４の観点では、本発明の基礎をなす問題は、第３の観点に従う医薬組成物及び／又は本発明の第１の観点に関連して記載された核酸を投与する工程を含む、処置を必要とする患者の処置方法、好ましくは、がん及び／又は腫瘍を処置する方法により解決される。
【００３６】
第４の観点のある態様では、患者は、前記請求項のいずれか１項に記載の細胞、好ましくは、病理学的細胞を示す。
【００３７】
本発明者は、驚くべきことに、腫瘍又は腫瘍関連疾患を含む（しかしそれらに限定はされない）種々の疾患の処置のために二本鎖核酸を使用することが可能であることを見出した。好ましくは、本発明に従う二本鎖核酸の使用はストレス応答をもたらす。このようなストレス応答は、個々に又はいかなる組み合わせにおいても、本明細書でストレス応答とも呼ばれる下記の現象のいずれかをもたらし、即ち、細胞サイクル停止（cell cycle arrest)、増殖抑制、細胞死、アポトーシス、細胞の除去（elimination）、好ましくは、アポトーシスによる若しくはアポトーシスにより媒介される細胞の除去、又はこれらの現象のいずれかの誘発をもたらし、その際細胞は、原因的方法で又は非原因的方法で、即ち、直接又は間接に、該疾患に関与している。更に、ストレス応答は、二本鎖核酸で処置された細胞、組織、器官又は生物により又は二本鎖核酸で処置された細胞、組織、器官又は生物において、直接又は間接に、先天性免疫応答及び／又は抗ウイルス応答を伴うことができ、先天性免疫応答及び／又は抗ウイルス応答を引起すことができ、又は先天性免疫応答及び／又は抗ウイルス応答により引起されうるというのが、本発明者の最近の理解である。二本鎖核酸の作用様式を知ることなくそして該ストレス応答、更に詳しくは、その１つ以上の態様、例えば、それぞれ、アポトーシス及び細胞溶解をもたらす機構（１つ又は複数）を正確に知ることなく、本発明を実施することができることは理解されるべきである。
【００３８】
更に、本発明者は、驚くべきことに、ストレス応答は、ＲＮＡ干渉応答の存在下に誘発されうることも見出した。これは、もしも細胞が、ＲＮＡ干渉装置（RNA interference machinery）により処理できなくてこのような装置のオーバーフローをもたらす量の、標的核酸に対して特異的なＲＮＡｉ分子に直面するならば、達成することができる。ゆえに、ＲＮＡｉ分子のオーバーフローは、様々な経路に豊富な又は過剰のＲＮＡｉ分子を流すことにより本明細書に記載のストレス応答をもたらす。
【００３９】
本発明に従って使用されそして本明細書では本発明に従う二本鎖核酸とも呼ばれる二本鎖核酸は、第１鎖及び第２鎖を含む。第１鎖は、連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、そして第２鎖は、連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含む。両鎖は、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成により塩基対形成性である。更に好ましくは、塩基対形成は、完全である、即ち、第１ストレッチのヌクレオチドと第２ストレッチのヌクレオチドとの間にミスマッチはない。
【００４０】
本発明者は、驚くべきことに、第１ストレッチ又は第１鎖の配列は、核酸、好ましくは標的核酸、更に好ましくは、転写システム、例えば、細胞、組織、器官又は生物中に含有されるこのような核酸に対して相補性ではないとの条件下に、この種の二本鎖核酸を使用することにより、上記したストレス応答を引起すことができることも見出した。この種の核酸は、一般に本明細書では標的核酸と呼ばれるであろう。このような相補性の欠如は、基本的に下記の２つのシナリオの下に創り出されうる。第１シナリオは、このような標的核酸が転写システム中に存在しないということであり、その際このような転写システムは好ましくは細胞であり、そしてこのような標的核酸は更に好ましくは細胞のトランスクリプトームには存在しないということである。このシナリオは、本明細書では、遺伝子の欠如とも呼ばれ、上記したストレス応答をもたらす。遺伝子の欠如シナリオの下では、好ましくはＲＮＡ干渉応答はないが、しかしこのようなＲＮＡ干渉応答が存在していてもよい態様がある。このようなストレス応答をいかにして測定することができるかに関するアッセイは、実施例で与えられる。第２シナリオの下では、標的核酸は基本的に存在するが、しかし、本発明に従う二本鎖核酸のそれぞれ第１ストレッチ及び第１鎖の配列は、細胞中に存在する標的核酸に対して又は比較して１つ以上のミスマッチを含み、更に好ましくは細胞のトランスクリプトームに対して１つ以上のミスマッチを含む。換言すれば、それらの第１ストレッチ及び第１鎖に１つ以上のミスマッチを与えて、転写システム、例えば細胞中に存在するいかなる標的核酸に対する相補性ももはや与えられないようにする、好ましくは細胞のトランスクリプトームに対する相補性がもはや与えられないようにすることによって、第１シナリオ下と同じ効果が実現される。このデザインのゆえに、相補性の点で、標的核酸と、本発明に従う二本鎖核酸のそれぞれ第１ストレッチ及び第１鎖との相互作用又は関係はなく、それにより、この種の相互作用又は関係の欠如は、上記したストレス応答を与えそして通常当該技術分野で知られているＲＮＡ干渉反応の誘発を生じないか、又は少なくとも、本発明に従う二本鎖核酸のそれぞれ第１ストレッチ及び第２ストレッチと標的核酸とのマッチの条件下に観察されたその結果を生じない。ゆえに、本明細書で概説され、更に詳しくはこの節で概説された第１シナリオ及び第２シナリオに固有な相補性及びミスマッチとなるとき、徐々の変化又は変移（transition）がある。このようなミスマッチ（１つ又は複数）が、該ストレス応答を誘発するのに必要とされる程度は、本明細書の実施例に記載されたアッセイを使用してルーチンな分析により各々のケース及びいかなる個々のケースについても決定することができる。いずれにせよ、ミスマッチを含むそれぞれ第１ストレッチ及び第１鎖は、転写システム、好ましくは細胞のいかなる他の標的核酸に対しても又は細胞のトランスクリプトームの他の標的核酸に対しても、上記した意味で相補性ではないということが好ましい。
【００４１】
それぞれ、第２鎖及び第２ストレッチのデザインについて、同じ考察が適用可能であり、その際、それぞれ、この第２ストレッチ及び第２鎖では、基準は相補性よりもむしろ同一性であり、その際、それぞれ、第１ストレッチと第２ストレッチ、並びに第１鎖と第２鎖は、完全に、即ち、それらの間にいかなるミスマッチ（１つ又は複数）もなしにマッチしている好ましい態様では、第１鎖及び第１ストレッチがそれぞれ上記したとおりにデザインされるならば、これは自動的に実現されるであろう。
【００４２】
いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、本明細書でＲＮＡ干渉応答とも呼ばれるＲＮＡ干渉に関与する、それぞれ、種々のタンパク質及び因子は、１つの鎖、好ましくは本発明に従う二本鎖核酸に関連して本発明で使用される好ましくは第１鎖であるアンチセンス鎖を標的核酸と比較すると思われる。本発明に従う二本鎖核酸により与えられるアンチセンス鎖が標的核酸、例えば、ｍＲＮＡ鎖とマッチするという意味でポジティブ応答がある場合に、直接又は間接に、ＲＮＡ干渉に関与するヌクレアーゼ（例えば、ＲＩＳＣ複合体）により認識される構造が産生され、そして標的核酸の分解が可能となる。この種の反応を与える二本鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡは、本明細書ではＲＮＡ干渉応答ポジティブであるとも言われる。しかしながら、それぞれの因子が、ｓｉＲＮＡｓの１つの鎖、好ましくはアンチセンス鎖にマッチするいかなる標的核酸も見出すことができないならば、このようなシグナル又は構造は与えられないか、又は最後に上記したストレス反応又はストレス応答をもたらす異なるシグナル又は追加のシグナルが与えられる。この種のストレス応答を引起す又は誘発する二本鎖核酸は、ＲＮＡ干渉応答ネガティブであるとも言われるが、少なくともいくらかの態様では、いくらかのＲＮＡ干渉応答が起こりうることは排除できない。ゆえに、本発明に従う二本鎖核酸の鎖の１つ、好ましくはアンチセンス鎖、更に好ましくは第１鎖と、好ましくは転写システムの核酸の各々及びいずれか、更に好ましくは、転写システム、例えば、細胞のトランスクリプトームのいかなる核酸でもある標的核酸との広い意味でのミスマッチを有する本発明に従う二本鎖核酸も、好ましくは、アポトーシス又は細胞死をもたらすシグナルを与える。しかしながら、本発明者は、ＲＮＡ干渉機構以外の更なる機構が、本発明に従う二本鎖核酸、即ち、ＲＮＡ干渉応答を誘発するという意味で標的核酸と相互作用しない核酸を投与するとき、ＲＮＡ干渉機構以外の更なる機構が、ストレス応答の観察された効果を媒介するのに関与していると推測する。このストレス応答に関与する更なる成分は、例えば、ＰＫＲ経路又はいかなる他のインターフェロン関連経路又はいかなるプロアポトーシス経路の一部でもありうる。
【００４３】
本発明者の最近の理解に従えば、好ましくはマッチしており、従って１つ以上のミスマッチにより中断されていない、又は本発明に従う二本鎖リボ核酸の相補性鎖又は同一鎖程ではない、総計１２、１３、１４個の連続したヌクレオチドが標的核酸とマッチしないか又は標的核酸と同一ではないならば、このような状況が好ましくは生じうる。好ましくは総計約１５以上のヌクレオチドが標的核酸に対して相補性であるか又は標的核酸と同一であるならば、これは、ＲＮＡ干渉応答をもたらし、かくしてアポトーシスをもたらさないであろう。後者は、第２シナリオが実現される場合、即ち、それぞれ第１ストレッチ及び第１鎖及び／又はそれぞれ、第２ストレッチ及び第２鎖に存在するミスマッチの故に、標的核酸が認識されない場合に、特に適用可能である。更に好ましくは、標的核酸が、それ自体、それぞれ、細胞中に及びそのトランスクリプトーム中に存在しないならば、このデザインが考慮されるべきではない。
【００４４】
本発明者は、更に詳しくは、本発明に従う二本鎖核酸が、腫瘍サプレッサーに対してデザインされ又は腫瘍サプレッサーを扱うならば、そしてこのような腫瘍サプレッサーが腫瘍細胞中に存在しないならば、これはＲＮＡ干渉応答ネガティブ反応をもたらし、したがって上記したストレス応答をもたらしそして最後にアポトーシス又は細胞死又は増殖抑制をもたらすということを見出した。
【００４５】
しかしながら、本発明に従う二本鎖核酸の適用可能性は、腫瘍、腫瘍疾患、がん及びがん疾患に限定されず、その際悪性及び良性の両方の腫瘍及びがんが含まれるが、他の疾患にも適用可能である。更に好ましくは、機能の損失又はこのような機能の損失をもたらす遺伝子の損失が、疾患又は病理学的条件の基礎を形成する場合には、常に本発明に従う二本鎖核酸を適用することができ、その際、好ましくは生物内のこの遺伝子の損失を有する又は示すそれぞれの細胞が排除されるべきである。ある態様では、転写システムのいかなる標的核酸に対してもミスマッチを与える本発明に従う二本鎖核酸、好ましくは、その１つの鎖がこの種の細胞においてＲＮＡ干渉応答を誘発しないような方法で標的核酸との塩基対形成しているとき、ミスマッチを与える本発明に従う二本鎖核酸は、好ましくは、それぞれ、細胞及び生物に投与される。
【００４６】
本発明に従う二本鎖核酸を使用することにより処置されうるなお更なる疾患は、疾患が核酸又はそれぞれのｍＲＮＡによりコードされているペプチド又はタンパク質と直接又は間接に関係するこれらの疾患であり、その際このような核酸又はｍＲＮＡは、野生型に比べて、１つ以上のヌクレオチド交換を示す。換言すれば、本発明に従って処置されうる更なる疾患は、１つ以上のヌクレオチド多型性（１つ又は複数）（ＳＮＰ（ｓ））を示すこれらの疾患である。疾患に罹った細胞、組織、器官及び生物中にあり、又はこのような疾患を発生させるべき素質を有するそれぞれいかなる細胞、組織、器官及び生物中にもあり、そして疾患に罹っていない又は健康な細胞、組織、器官及び生物の核酸又はｍＲＮＡとは異なるこのような核酸又はｍＲＮＡは、転写システムの標的核酸又は核酸の一部とみなされ、好ましくは、転写システム、例えば細胞のトランスクリプトームの核酸の１つとみなされる。本発明に従う二本鎖核酸をデザインするとき、この種の標的核酸も考慮されなければならない。ゆえに、二本鎖核酸、更に詳しくは、標的核酸に対してアンチセンス鎖であるその第１ストレッチ及び第１鎖は、本明細書で定義されたストレス応答の誘発又は発生を可能とするように、転写システムの核酸に相補性でなくてもよく、更に詳しくは、細胞、例えば、直接又は間接に疾患に関与する細胞のトランスクリプトームに対して相補性でなくてもよい。それに関連して、本発明に従うそれぞれの二本鎖核酸は、好ましくは、ＳＮＰ又は少なくともその１つを有する標的核酸のその部分を包含することが好ましく、何故ならば、そうでないと、ＳＮＰ（ｓ）を有していないこれらの細胞、組織、器官又は患者間の識別が可能ではないからであるということに留意されるべきである。換言すれば、ＳＮＰ（ｓ）は本発明に従う二本鎖核酸の第１ストレッチ及び第１鎖が本明細書で定義されたとおり相補性ではない標的核酸上のヌクレオチドストレッチを規定し、その際このような相補性の欠如は、本発明で定義されたストレス応答を誘発するようなものである。もちろん、好ましくは、本発明に従う二本鎖核酸は本明細書で教示されたとおり転写システムのいかなる核酸にも相補性ではないことも認められるべきである。
【００４７】
本明細書で使用された処置は、予防も含むことは本発明の範囲内にある。１つの態様では、特に、予防されるべき疾患がそれぞれがん及び腫瘍である場合に、本発明に従う医薬及び医薬組成物を、患者又は疾患を発生するのを防止されるべきひヒトに投与する。本発明に従う二本鎖核酸を使用して、本明細書に記載のシナリオのいずれか、例えば、腫瘍サプレッサーの遺伝子の損失又は機能の損失を示す傾向を有する又はこのような損失を既に受けたいかなる細胞も、扱うことができ、従って最後に抑制され又は溶解されうる。これにより、生物は、特にモノクローナルな腫瘍及びガンの場合に、腫瘍又はがん疾患の起源でありうるこのような細胞から解放される。それに関連して、細胞は通常二倍体細胞であることに留意されるべきである。ゆえにいかなる遺伝子情報も基本的に二倍で存在するけれども、遺伝子情報は、二組の遺伝子情報の間でそれぞれの遺伝子の転写を随意に変えることができる。しかしながら、意図される特定の疾患に関与する機能的に不活性なタンパク質、好ましくは、それぞれ、腫瘍及びがんの場合における腫瘍サプレッサー、の転写物の存在は、本発明に従って扱うことができ、かくして最後に直接又は間接にそれぞれの病理学的細胞の増殖抑制、アポトーシス又は溶解をもたらすストレス応答が誘発されうる。
【００４８】
本明細書で使用されそして本明細書でそうでないとの指示がなければ、本発明に従う二本鎖核酸は、下記の構造を有する：即ち、該核酸は、二本鎖構造を含み、そして該二本鎖構造は第１鎖と第２鎖を含み、第１鎖は連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖は連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含む。このデザインは基本的デザインとも呼ばれる。好ましくは、二本鎖核酸は二本鎖リボ核酸である。しかしながら、二本鎖核酸が二本鎖デオキシリボ核酸であることも、本発明の範囲内にある。更なる態様では、二本鎖核酸は第１鎖を含み、その際、それぞれ、第１ストレッチ及び第１鎖はリボ核酸であり、そしてそれぞれ第２鎖及び第２ストレッチはデオキシリボ核酸である。別の態様では、それぞれ、第１ストレッチ及び第１鎖は、デオキシリボ核酸であり、そしてそれぞれ第２ストレッチ及び第２鎖はリボ核酸である。
【００４９】
本発明に従えば、本発明に従う二本鎖核酸の基本的デザインは、特に本明細書に開示されている第２シナリオでは、即ち、標的核酸が転写システム中に存在するが、好ましくは本発明に従う二本鎖核酸のそれぞれ第１鎖及び第１ストレッチにより与えられるアンチセンス鎖が１つ以上のミスマッチにより標的核酸に対して完全に相補性ではないならば、相補性の欠如により本明細書で定義されたストレス応答が誘発される場合に、一般に下記のとおり修飾されうる。ミスマッチが、正しく塩基対形成していない反対鎖上のヌクレオチドの対により形成される。第１の修飾では、本発明に従う二本鎖核酸の連続したヌクレオチドの第１ストレッチは、このようなミスマッチを創り出す１つ以上のヌクレオチドを除いて標的核酸に対して相補性である。換言すれば、この種の第１ストレッチは、標的核酸に対して相補性ではなく、更に好ましくは、細胞のトランスクリプトームの如き転写システムの核酸のいずれに対しても相補性ではない。いずれにせよ、本発明に従うこのように修飾された二本鎖リボ核酸のデザインは、ＲＮＡ干渉応答ネガティブであることが好ましい。本発明に従う二本鎖核酸の連続したヌクレオチドの第２ストレッチは、１つの態様では、ミスマッチの位置に対応する位置における１つ以上のヌクレオチドを除いて標的核酸と同じである。ミスマッチ（１つ又は複数）は、連続したヌクレオチドの第１ストレッチが、標的核酸、更に好ましくは、転写システムのいずれかの核酸と塩基対形成するならば、出っ張り又はループ構造をもたらす。好ましい態様では、ミスマッチの数は、１〜１０、好ましくは２〜８、更に好ましくは２〜４、最も好ましくは４であり、その際、このようなミスマッチは好ましくは、それぞれ、第１ストレッチ及び第２ストレッチ上に配列される。本明細書で使用した、第１の数字〜第２の数字で特定された範囲は、その数字のいずれもその範囲により含まれることを意味する。例えば、範囲が１〜４であるならば、これは、実際に開示されているものは１〜４のいかなる整数でもあり、即ち、１，２、３及び４であることを意味する。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、基本的デザイン又はその修正を有する本発明に従う二本鎖核酸は、第１鎖上に長さが１４以下のヌクレオチドであるヌクレオチドの配列又はストレッチを含み、該配列又はストレッチは、本明細書で定義された標的核酸と完全にマッチしている。換言すれば、本発明に従う二本鎖核酸は、好ましくはアンチセンス鎖である第１鎖上に、長さが最大１４ヌクレオチドである配列を含み、このような配列は標的核酸に完全にマッチしている。本発明に従う二本鎖核酸の第１鎖又は第１ストレッチにより含まれる追加の又は他のヌクレオチドは、完全には塩基対形成せず、かくして、ミスマッチを生じさせ、このようなミスマッチは、全体の第１ストレッチが本明細書で定義された標的核酸に対して相補性ではないという本発明に従う二本鎖核酸の特徴を与える。この特徴は、本明細書で開示された両シナリオ下に、即ち、標的遺伝子は、細胞中に全然存在せず、更に正確に言えば、本発明に従う二本鎖核酸を使用して処置されるべき細胞のトランスクリプトーム中に全然存在しないというシナリオ、及び標的遺伝子は存在するが、本発明に従う二本鎖核酸はストレス応答を誘発し、このようなストレス応答及びその誘発は、標的核酸に相補性でない本発明に従う二本鎖核酸の第１ストレッチにより好ましくは引起されるというシナリオの下で実現されうる。
【００５１】
上記と同じ考察が本発明に従う二本鎖核酸の第２鎖に適用可能であり、その際基準は相補性よりはむしろ同一性である。
【００５２】
別の態様では、連続したヌクレオチの第１ストレッチは、標的核酸に対して完全には相補性ではなく、これに対して、第２ストレッチは、標的核酸と完全に同一である。しかしながら、本発明に従う二本鎖核酸のこのような構築物は、アンチセンス鎖と標的核酸との間に観察された構造と同様なミスマッチした又は出っ張りを有するした二本鎖構造をもたらす。しかしながら、第１ストレッチと第２ストレッチが、完全に、即ち、完ぺきに塩基対形成性であること、そしてこれは、第１ストレッチが標的核酸と完全には塩基対形成性ではない（何故ならば、１つ以上のヌクレオチドが標的核酸に対して相補性ではないからである）という前提の下で、第２ストレッチはしたがって標的核酸と完ぺきに同一ではないということを意味することも、本発明の範囲内にある。好ましい態様では、標的核酸に対する第１ストレッチのミスマッチの位置は、標的核酸と完全に同一ではない第２ストレッチの対応する位置に位置している。それらのミスマッチに関する上記した態様は、標的核酸が全然存在しない場合に使用することもでき、例えば、トランスクリプトームのそれぞれのｍＲＮＡメンバーが存在しない場合に、好ましくは、依然としてこの種の分子が上記したストレス応答を誘発するのに適当であるという条件下に、使用することができることも認められるべきである。
【００５３】
第１ストレッチと標的核酸とのミスマッチは、例えば、ヌクレオチドの第１ストレッチをトランケート（trancate）して相補性ストレッチの長さを減少させるように配列させることができ、又はミスマッチは、第１ストレッチ内に位置させることができ、これは好ましくは５’端部及び３’端部とは異なる位置を意味する。同じことが、一般に、標的核酸と同一であることが特徴付けられる、連続したヌクレオチドの第２ストレッチのレベルにおけるミスマッチの数及び局在化にも当てはまる。
【００５４】
ミスマッチの数及び局在化は変わることができ、その際このような変更は、上記した効果が観察されるかぎり、本発明の範囲内にあると思われること、即ち、ＲＮＡ干渉を媒介する因子、好ましくは発現システムがストレス応答をもたらすシグナルを与えるということは本発明の範囲内にある。
【００５５】
本発明に従う二本鎖核酸の長さに関して、それは１５オリゴヌクレオチド対という少ないもの及び数百オリゴヌクレオチド対という多いものである。ある態様では、本発明に従う二本鎖核酸の第１鎖及び第２鎖は同じ長さである。しかしながら、別の態様では、本発明に従う二本鎖核酸の第１鎖及び第２鎖は長さが異なる。ある態様では、第１ストレッチは第１鎖と同じ長さであり、第２ストレッチは第２鎖と同じ長さである。第１ストレッチ及び／又は第２ストレッチの最小の長さは、当該技術分野で知られているそして本明細書でも特定されたとおりＲＮＡｉの分野で実現されるこれらの長さと同様であることが認められる。別の態様では、第１ストレッチ及び／又は第２ストレッチの長さは、１９〜４０ヌクレオチド、好ましくは１９〜３０、更に好ましくは２１〜３０、最も好ましくは２１〜２７オリゴヌクレオチドであり、これは、それぞれ第１鎖及び第２鎖にも当てはまる。好ましくは第１ストレッチ及び／又は第２ストレッチの長さは、インターフェロン応答をもたらす遺伝子発現に対する非特異的効果の原因であるＰＫＲ反応を誘発するオリゴヌクレオチドの長さより少ないことが認められる。他方、それぞれ、第１ストレッチ及び／又は第２ストレッチ並びに第１鎖及び／又は第２鎖は、数百オリゴヌクレオチドという長いものであることができ、その際これらの状況下に好ましくはこれらのストレッチ及び鎖の一部のみが、本発明に従う二本鎖オリゴヌクレオチドに対して本明細書に記載した意味で作用する、即ち、ストレス応答を誘発する。第１ストレッチ及び／又は第２ストレッチが長ければ長いほど、それらは、その全体として又はその一部として、トランスクリプトームにおける標的配列を見出し、かくして、本発明に従う二本鎖核酸を適用するとき、好ましくは回避されるべき特異的ＲＮＡ干渉を誘発する可能性がより高い。それぞれ、第１ストレッチ及び第２ストレッチに関連して言われたことは、それぞれ、第１鎖及び第２鎖にも当てはまることは理解されるべきである。分かりやすくするという理由で、本発明のいくらかの態様では、この種のインターフェロン応答を許容することができるということが述べられるであろう。更なる観点では、本発明は、医薬の製造のための二本鎖核酸の使用にも関し、その際このような医薬は患者の免疫システムの刺激用であり、その際好ましくは、患者はそれを必要としている。本発明の他の観点に従ってデザインされるとき、更に詳しくは、疾患、例えば、腫瘍の処置のために使用されるとき、本発明に従う二本鎖核酸は、非特異的免疫応答を引き出すのに適当であると思われる。このような非特異的免疫応答は有利であり得、かくしてこのような非特異的免疫応答が主要な治療の効能を増加させるのに適当である場合の疾患のための支持治療として使用することができる。このような主治療は、好ましくは、いかなる腫瘍治療であることもでき、又は予防接種、例えば、感染性疾患の処置又はがん及び腫瘍疾患の処置のための予防接種を含むいかなる治療でもあることができる。
【００５６】
それにもかかわらず、本発明に従う二本鎖核酸の長さはインターフェロン応答を誘導しないことが好ましい。更に好ましくは、その長さ、更に詳しくは第１ストレッチ及び／又は第２ストレッチの長さは、本発明に従う二本鎖核酸について上記に概説したデザイン原理の場合に、１５〜３０、更に好ましくは、１７〜２５、なお更に好ましくは、１９〜２３、最も好ましくは、２１〜２３ヌクレオチドである。
【００５７】
好ましくは、本発明に従う二本鎖核酸は、第１鎖及び第２鎖の３’端部に１つ以上のデオキシリボヌクレオチド、好ましくは、２つのデオキシリボヌクレオチド、最も好ましくは２ＴＴを含む。あるいは、この種の修飾は、本発明に従う二本鎖核酸の第１鎖及び第２鎖の５’端部に存在することができる。更なる好ましい態様では、好ましくは、１つ以上、更に好ましくは２つのデオキシリボヌクレオチドからなるこの種の修飾は、好ましくは、アンチセンス鎖である第１鎖の３’端部に結合しており、そして１つ以上、更に好ましくは２つのデオキシリボヌクレオチド（１つ又は複数）は第２鎖、即ち、好ましくは、本発明に従う二本鎖核酸のセンス鎖である第２鎖の５’端部に結合している。本発明に従う二本鎖核酸の更なる別の態様では、第１鎖及び第２鎖の２つの端部は平滑末端である。二本鎖核酸の長さは、これまでに本明細書で記載された長さのいずれかであることができる。しかしながら、それぞれ第１ストレッチ及び第２ストレッチの長さは、好ましくは、１９〜３０ヌクレオチド、更に好ましくは２１〜２７ヌクレオチド、なお更に好ましくは２１〜２３ヌクレオチドである。更に好ましい態様では、もしあれば、ミスマッチの数は１〜４であり、２〜４及び３又は４が更に好ましい。
【００５８】
本発明に従う二本鎖核酸の更なるデザインは、下記のとおりであることができる。好ましくは、本発明に従う二本鎖核酸のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。あるいは、一般に、二本鎖核酸に含有されたヌクレオチドのいずれかは、好ましくは、逆向きの脱塩基部（inverted abasic）であるヌクレオチド及び２’−位置にＮＨ２修飾を有するヌクレオチドよりなる群から選ばれる修飾を含むことができる。本発明に従う二本鎖核酸に含有された個々のヌクレオチドのいかなる更なる修飾も、アミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシ及びアルキルよりなる群から選ばれうる。好ましくは、アルコキシはエトキシである。好ましくはアルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル及びイソブチルを意味は、その際このような修飾はヌクレオチドの糖部分の２’位置に位置している。修飾のタイプにかかわりなく、ヌクレオチドは、好ましくはリボヌクレオチドである。
【００５９】
上記した修飾に加えて又は上記した修飾に替わるものとして、ヌクレオチドの各々及びいずれかは、ヌクレオチドのホスフェート部分で修飾されうる。このような修飾は、ホスホチオエートの存在であることができる。本発明に従う二本鎖核酸のそれぞれストレッチ及び鎖の個々のヌクレオチドは、ホスホジエステル連結を介して又はホスホチオエート連結を介して又は両者の組み合わせを介して、それぞれ個々の鎖及びストレッチのヌクレオチド配列の長さに沿って連結されることは本発明の範囲内にある。
【００６０】
本発明に従う二本鎖核酸の鎖、即ち、各一つの鎖又は両方の鎖の更なる形態の修飾は、末端ヌクレオチド、即ち、最も３’又は最も５’のヌクレオチドのいかなる修飾でもある。このような種類の修飾は、逆向きの（デオキシ）脱塩基部（inverted (deoxy) abasics）、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール又はアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ又は置換されたシリル、中でも、欧州特許ＥＰ０５８６５２０Ｂ１又はＥＰ０６１８９２５Ｂ１に記載のもの、よりなる群から選ばれうる。本明細書で使用されそして更に詳しくは上記した修飾と関連して、アルキル又は「アルキル」を含むいかなる用語も、１〜１２個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜２Ｃ原子を含むいかなる炭素原子鎖も意味する。
【００６１】
更なる端部修飾はビオチン基である。このようなビオチン基は、好ましくは、第１鎖及び／又は第２鎖の最も５’のヌクレオチド又は最も３’のヌクレオチド又は両端部に結合させることができる。更に好ましい態様では、ビオチン基はポリペプチド又はタンパク質にカップリングされる。ポリペプチド又はタンパク質が他の上記した端部修飾のいずれかを介して結合されることも本発明の範囲内にある。ポリペプチド又はタンパク質は、本発明の核酸分子に更なる特徴を与えることができる。中でも、ポリペプチド又はタンパク質は、他の分子に対するリガンドとして作用することができる。該他の分子が受容体であるならば、受容体の機能及び活性は、結合するリガンドにより活性化されうる。受容体は、リガンド結合した本発明の核酸分子の有効なトランスフェクションを可能とする内部化活性を示すことができる。本発明の核酸分子にカップリングされるべきリガンドの例は、ＶＥＧＦであり、対応する受容体はＶＥＧＦ受容体である。
【００６２】
前記した修飾、好ましくは、ヌクレオチドの２’位置、更に好ましくはリボヌクレオチドの２’位置に関する修飾は、或るパターンで本発明に従う二本鎖核酸に適用することができる。１つのこのようなパターンは、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８６６６に記載の空間パターンである。更に詳しくは、このような空間パターンは、二本鎖リボ核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造は第１鎖と第２鎖を含み、該第１鎖は連続したヌクレオチの第１ストレッチを含み、該第１ストレッチは標的核酸に対しても少なくとも部分的に相補性であり、そして該第２鎖は連続したヌクレオチの第２ストレッチを含み、該第２ストレッチは標的核酸と少なくとも部分的に同一であり、そして該第１鎖及び／又は該第２鎖は、２’位置に修飾を有する修飾されたヌクレオチドの複数の基を含み、該鎖内の修飾されたヌクレオチドの各基はヌクレオチドのフランキング基（flanking group）により一側又は両側でフランキングされており（flanked）、ヌクレオチドのフランキング基を形成するフランキングヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチド、又は修飾されたヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドであることを特徴とするような空間パターンである。好ましい態様では、修飾されたヌクレオチドの基は、１つのヌクレオチドを含み、そして修飾されていないヌクレオチドの基は１つのヌクレオチドを含む。更に、修飾されていないヌクレオチドはリボヌクレオチドでありそして修飾されたヌクレオチドは本明細書で開示された修飾されたリボヌクレオチドであって、該修飾はヌクレオチドのリボース部分の位置２’におけるメトキシ基である、修飾されたリボヌクレオチドであることが好ましい。更なる好ましい態様では、第１鎖、即ちアンチセンス鎖の５’端部は、修飾されたヌクレオチドで始まり、これに対してセンス鎖の対応する位置において、３’端部のヌクレオチドは修飾されていないヌクレオチドである。
【００６３】
更なる形態の修飾は、個々のヌクレオチドがプリンであるか又はピリミジンであるかどうかを識別することに基づくことができる。１つの選択では、本発明に従う二本鎖核酸のいかなるプリンヌクレオチドも本明細書に記載のとおり修飾され、そして、他の選択では、本発明に従う二本鎖核酸の如何なるピリミジンヌクレオチドも本明細書に記載のとおり修飾される。このタイプの修飾パターンは、中でも国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／７０９１８に記載されている。更に詳しくは、それぞれ第１鎖及び第１ストレッチ、即ち、本発明に従う二本鎖核酸のアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、それぞれ第１鎖及び第１ストレッチ、即ち本発明に従う二本鎖核酸のアンチセンス鎖のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【００６４】
二本鎖核酸を形成する２つの鎖が互いに連結されていることも本発明の範囲内にある。このような連結は、単一の連結又は複数の連結からなることができる。好ましくは、連結は、本発明の二本鎖核酸を形成する２つの鎖の１つの５’端部と他方の鎖の３’端部の間で起こる。この種の連結は、好ましくはリンカーによりなされる。このようなリンカーは、好ましくは、多数のヌクレオチドからなる。あるいは、このようなリンカーは、非ヌクレオチドポリマー、例えばペプチド、ＬＮＡ、ＰＮＡ又はＰＥＧからなる。
【００６５】
本発明に従う二本鎖核酸を化学的に合成し、次いで処方する（formulated）ことは本発明の範囲内にある。このような処方は、当該技術分野で知られた処方のいずれかであることができる。好ましい処方は、少なくとも１種の脂質、好ましくは１種の脂質及びヘルパー脂質を含む。なお更に好ましくは、脂質はカチオン性脂質、例えば、実施例で使用された脂質であり、ヘルパー脂質は実施例で記載されたヘルパー脂質である。処方物は、好ましくは、実施例に記載された処方物としての特徴を示す。
【００６６】
本発明に従う二本鎖核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで合成することも本発明の範囲内にある。このような目的で、その転写が本発明に従う二本鎖核酸を形成する２つの鎖をもたらす遺伝子構築物が提供される。遺伝子構築物は、好ましくは、プロモーターを含む。そして、その制御下で鎖（１つ又は複数）をコードする配列は転写される。遺伝子構築物は、各々個々の鎖がそれ自身のプロモーターから転写され、その際該プロモーターは同一であるようにあることができる。別の態様では、プロモーターは同じである。更なる態様では、同じプロモーターが両方の鎖及びそれをコードする配列の転写を制御する。なお更なる態様では、遺伝子転写物は、本発明に従う二本鎖核酸の２つの鎖をコードする配列を含み、両配列は、遺伝子転写物又はその一部の転写後にループ又はヘアピンの形成を可能とする配列により互いに連結される。このような条件下に、転写物は、２つの相補性鎖、即ち、本発明に従う二本鎖核酸の第１鎖及び第２鎖が塩基対形成することができそしてループ配列により連結されるように折りたたまれることができる。この種の技術は、中でも、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９９／００１９５又は国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００６０６に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。それぞれのプロモーターは当該技術分野で知られており、そして中でも、Current protocols in Molecular Biology;Ausubel F.M.,Brent R, Kingston R.E.,Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl K.(1996);J.Wiley and Sons,New Yorkに記載されている。
【００６７】
更なる態様では、転写システムであって、本発明に従う二本鎖核酸が投与されるべき転写システム又は本発明に従う二本鎖核酸が本明細書で定義されたとおりその中で発現されるべき若しくは活性であるべき転写システムの中において標的核酸が存在しないことが示されるとの条件下に、本発明に従う二本鎖核酸は、先行技術に記載されそして知られているいかなるＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ分子のようにデザインすることもできる。本発明の技術的教示に従って使用することができる更なる形態のｓｉＲＮＡ分子は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５３４６に記載のｓｉＮＡである。
【００６８】
前記した可能な修飾に関連して、このような修飾は、本発明に従う二本鎖分子が、特にこのような分子がいかなるｓｉＲＮＡ分子若しくはいかなるＲＮＡｉ分子としてもデザインされる場合に、もしこのような修飾が細胞中に標的核酸を有しそして標的核酸を見出すＲＮＡｉ分子若しくはｓｉＲＮＡ分子上で実現されるならば、ＲＮＡ干渉応答が引起されるという意味で活性であることを可能とすることが好ましい。換言すれば、本発明に従う二本鎖核酸上で場合により実現される修飾は、好ましくは、もし先行技術に従うＲＮＡｉ分子及びｓｉＲＮＡ分子に適用されるならば、依然としてＲＮＡ干渉応答を引起すことができるいかなる修飾でもある。いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明者は、本明細書に記載されたストレス応答であって、本発明に従う二本鎖核酸により媒介される、例えば、それぞれアポトーシス及び細胞溶解のために使用されるストレス応答は、依然として少なくとも或る程度、ＲＮＡ干渉装置、例えば、ＲＩＳＣ複合体の成分（１つ又は複数）と相互作用することができ、そして修飾の許容性に対するこれらの成分の要件は、本発明に従う二本鎖核酸にも適用可能であると推測する。どの種類の修飾（１つ又は複数）が好ましくは本発明に従う二本鎖核酸にも許容されうるかを可能とする適当なアッセイについてはこれまでに説明された。
【００６９】
上記した本発明の第１シナリオにおいて、本発明に従う二本鎖核酸は、細胞の如き転写システム中にそのままで存在しない標的核酸に向けられる。好ましくは、該核酸は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又は他の転写産物として存在しない。更に詳しくは、本発明に従う二本鎖核酸は、該発現システムに含有されたそれぞれの核酸のいずれにも向けられず、その際、この核酸の全体は、一般に本明細書ではトランスクリプトーム又は標的核酸とも呼ばれる。これらの状況下に、標的核酸に向けられる本発明に従う二本鎖核酸は、第１鎖の第１ストレッチが本明細書で定義された程度に標的核酸に対して相補性であり、そして第２鎖の第２ストレッチが本明細書で定義された程度に同一であることを意味する。上記した機構により、干渉装置は、標的核酸を見出さず、かくしてストレス応答を誘発する。細胞が標的核酸を見出さないためには、本発明に従う二本鎖核酸は、トランスクリプトームの他の核酸が実際に標的として作用することができず、かくしてＲＮＡ干渉応答を誘発するようにデザインされることは必須である。これは、バイオインフォマティクスにより達成することができる。典型的には、可能な標的配列は、全体のトランスクリプトームに対して比較されそしてそれぞれのストレッチは、ヌクレオチド配列が他の核酸とマッチする配列を含まず、かくしてオフ標的効果（off-target effect）をもたらさず、かくしてこれはネガティブＲＮＡ干渉応答の結果を見ることを許容せず又は、治療用途において、場合により望まれない副作用を生じないようなヌクレオチド配列としてデザインされる。特に腫瘍疾患の場合に、標的核酸は、好ましくは、それぞれの細胞系のトランスクリプトームの一部ではない腫瘍サプレッサーである。したがって、この方法により処置されるべき、そして本発明に従う二本鎖核酸を使用することができる好ましい腫瘍は、腫瘍サプレッサーネガティブな（tumor suppressor-negative）腫瘍である。好ましい腫瘍サプレッサーは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ｐ２１及びＲｂであるが、本発明はそれらに限定はされない。本明細書に開示された目的、例えば医薬の製造の目的に、１つのタイプの二本鎖核酸のみならず２種以上のこのような二本鎖核酸も使用され、その際二本鎖核酸の少なくとも２つは、２つの異なる腫瘍サプレッサーを扱い、これが、ストレス応答自体の増加した効能又はストレス応答の誘発の増加した効能をもたらすことも本発明の範囲内にある。
【００７０】
病理学的細胞が腫瘍サプレッサー欠損（tumor suppressor-deffective）でもよいことは本発明の範囲内にある。これは、病理学的細胞が腫瘍サプレッサーを産生しないか又は持っていないことを意味する。腫瘍サプレッサーのこの欠如により、がん又は腫瘍が生じうる。機能状態の損失でもある腫瘍サプレッサー欠損状態は、種々の方法で発生させることができる。第１に、細胞は、該腫瘍サプレッサーについてのいかなる遺伝子情報も欠いていてもよい。このような欠損は、いかなる腫瘍サプレッサーもまったく持たない、したがってこのような遺伝子の転写物をもたない細胞をもたらす。第２に、細胞は、いかなる機能的腫瘍サプレッサーも欠いていてもよい。本明細書で好ましく理解されている機能的腫瘍サプレッサーは、腫瘍を抑制するのに活性ないかなる腫瘍サプレッサーでもある。いかなる機能的腫瘍サプレッサーの欠損も、機能的に不活性な腫瘍サプレッサーを生じる１つ以上の突然変異を有する、それぞれ遺伝子及びその転写物から生じることができる。このような突然変異は、例えば、点突然変異又は欠失突然変異であることができる。これらの突然変異（１つ又は複数）を有する転写物は、本明細書で定義された標的核酸とみなされ、かくして本発明に従う二本鎖核酸のそれぞれのデザインを可能とする。
【００７１】
１つの鎖が腫瘍サプレッサーに相補性であるこの種の二本鎖を、非病理学的細胞中で、即ち、本発明に従う二本鎖核酸の種類で処置されるべき生物の、疾患、例えば腫瘍に関与していない細胞において使用すると、これは腫瘍サプレッサーのノックダウンをもたらすことは認められるべきである。このようなノックダウンは、ＲＮＡ干渉応答により多分媒介されるようである。しかしながら、これはある種の副作用とみなされうるけれども、本発明に従う二本鎖核酸が一過性方式でのみ活性であり、これは、中でもアポトーシスをもたらす毒性副作用が一旦誘発されると、それぞれの病理学的細胞が除去され、これに対して非病理学的細胞はもはやこの種の作用物質にさらされず、かくして腫瘍サプレッサーのノックダウンは停止されるということを意味するという事実を認めれば、本発明に従う処置計画にとってそれは決定的に重要ではないと思われる。換言すれば、腫瘍サプレッサーは、細胞が病理学的状態を発生することを許容しない、それぞれの腫瘍細胞として腫瘍サプレッサーネガティブでないこれらの細胞において限定された期間の時間ノックダウンされるにすぎない。
【００７２】
同じことが、標的核酸に対する１つ以上のミスマッチを有する本発明に従う二本鎖核酸の使用に関する本明細書に開示された第２のシナリオであって、それぞれの標的核酸が細胞、更に詳しくは、病理学的細胞は又はいかなる病理学的状態若しくは疾患状態に関与している細胞にも存在する、第２シナリオの基礎をなすストラテジーにも当てはまる。また、本発明に従う二本鎖核酸は、好ましくは、ＲＮＡ干渉応答を創生しないように、しかし本明細書に記載されたストレス応答を誘発するようにデザインされ、これに対して、疾患状態に関与していない又はこのような状態を発生させる素地を有していないこれらの細胞は、一過性ノックダウンのみを経験する。もちろん、いかなる他のオフ標的効果も回避されるべきであり、これはそれぞれバイオインフォマティクスを使用して、適切な条件及び配列を選択することにより実現することができる。
【００７３】
更なる観点では、本発明は、本明細書に記載された疾患、更に詳しくは、腫瘍、腫瘍疾患、がん及びがん疾患並びに機能の損失又は遺伝子の損失により特徴付けられるいかなる疾患又は本明細書で定義された少なくとも１つのＳＮＰを伴う疾患のための医薬を製造及び／又はデザインするための方法に関する。この方法に従えば、処置されるべき疾患、更に詳しくは、該疾患に関与している細胞は、それらがこのような疾患の原因となる因子、好ましくは、それぞれペプチド及びタンパク質を発現するかどうかに関して特徴付けられる。該細胞がこのような因子を発現しない及び／又はこのような因子のための転写物若しくはこのような因子をコードする転写物を含まないならば、本発明の二本鎖核酸はいかなるオフ標的効果もを回避するようにデザインされ、それにより細胞のトランスクリプトームはそれぞれの因子のｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡを含まない。あるいは、それぞれの因子が正常な、即ち健康な細胞に見出される因子の突然変異された形態であるならば、二本鎖ＲＮＡは、突然変異された形態の因子のｍＲＮＡ若しくはｈｎＲＮＡ又は他の転写物に対して相補性であるようにデザインされ、それにより本明細書に記載のとおりのストレス応答の発生を可能とするように多くのミスマッチが導入されるが、これに対して、好ましくはポジティブＲＮＡ干渉応答は発生されず、そしてまたいかなるオフ標的効果も配列をそれ相応にデザインすることにより回避される。この種の配列デザインは、当業者に知られたバイオインフマティクスを使用することにより行うことができる。いかなるオフ標的効果も回避されることは認められるべきであるが、しかしながら、オフ標的効果が減少するか又は細胞にいかなる害もなさないと思われる細胞の他の成分又は因子に関して起こるならは、一般に十分である。しかしながら、それぞれの配列により引起されるオフ標的効果がないことがこのましい。
【００７４】
本発明を図及び実施例によりここで更に説明する。これから本発明の更なる特徴、態様及び利点が分かりうる。
【００７５】
実施例１：種々のノックダウン技術によるＨｅＬａ細胞中のＰＴＥＮタンパク質の減少
種々のノックダウン技術によるＨｅＬａ細胞中のＰＴＥＮタンパク質の減少を評価するために、ｓｉＲＮＡ構築物及び遺伝子ブロック、即ち、アンチセンス構築物を調製した。それぞれの配列及びデザイン原理は図１Ａから確かめることができる。ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡｓ構築物を、それぞれＰＴＥＮ１、ＰＴＥＮ２及びＰＴＥＮ３と名付けることに留意されるべきである。ＰＴＥＮ１  ＭＭ、ＰＴＥＮ２  ＭＭ及びＰＴＥＮ３  ＭＭと呼ばれる各場合に４つのミスマッチを有するｓｉＲＮＡ構築物を創生した。これらのｓｉＲＮＡ構築物におけるミスマッチの配列は、いかなる他のｓｉＲＮＡにも使用することができること、即ち、この配列はＰＴＥＮのための使用に限定されないで、他の標的核酸配列にも使用することができることは認められるべきである。ＰＴＥＮｍＲＮＡ配列、即ち、標的配列と比較したミスマッチを矢印によりマークした。更に、５’端部及び３’端部に逆向き脱塩基部（inverted abasic）を有しそしていずれかの端部に６個のオリゴヌクレオチドによりフランキングされた９デスオキシリボヌクレオチドのストレッチをコアに含むアンチセンス構築物を創生した。それぞれのアンチセンス構築物は、ＰＴＥＮ１  ＧＢと呼ばれる。この種のアンチセンス分子についても、標的ＰＴＥＮｍＲＮＡと比較して総計４つのミスマッチを含むミスマッチしているアンチセンスバージョンをデザインした。
【００７６】
ＨｅＬａ細胞を最小必須培地Ｅａｇｌｅ（Ｌ−グルタミン２mM、Ｅａｒｌ’ｓ  ＢＳＳピルビン酸ナトリウム１mM、非必須アミノ酸０．１mM、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％を有するＥＭＥＭ）中に維持した。合成ｓｉＲＮＡ及びアンチセンストランスフェクション、即ち、ＧｅｎｅＢｌｏｃｓトランスフェクションをＬ８脂質（Atugen,Berlin）を使用することにより１０cmプレートで行った（密集度３０〜５０％で）。血清を含まない培地中のｓｉＲＮＡｓ及び脂質の予め形成された５ｘ濃度の複合体を完全培地中の細胞に加えることにより、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。総トランスフェクション容積は、１０cmプレートにおける細胞について１０mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に依存して０．８〜１．２μg／mlであった。イムノブロットのために、細胞を溶解させそして等量のタンパク質を含有する細胞抽出物のアリコートをニトロセルロース膜上にブロットしそしてマウスモノクローナル抗ＰＴＥＮ抗体（Santa Cruz Biotechnology）及びマウスモノクローナル抗ｐ１１０α抗体を使用する標準方法により分析して、同等ローディング(equal loading)を評価した（Klippel,1994）。
【００７７】
種々の構築物の効果をＨｅＬａ細胞で試験しそして結果をイムノブロットとして示した。
【００７８】
一般に、ＰＴＥＮがノックダウンされる場合にはいつも、Ａｋｔのリン酸化形態（phosphorlyated form）のレベルは増加するであろう。しかしながら、リン酸化Ａｋｔ（phospho-Akt）はストレス条件下に増加した発現を示すことも知られている。種々のｓｉＲＮＡ構築物を比較すると、下流の読み取り（downstream read-out）、即ち、リン酸化Ａｋｔは基本的な生物学的シグナリングカスケードともはや一致しないけれども、ノックダウンが一般に発生されることは図１Ｂから理解することができる。この効果は、もっぱらｓｉＲＮＡ構築物により示されるが、これに対してアンチセンス構築物はＨｅＬａ細胞の発現レベルでこの種の不対反応（unpaired reaction）を示さない。換言すれば、ｓｉＲＮＡ媒介ＰＴＥＮノックダウンは、必ずしもＡｋｔリン酸化の刺激をもたらさない。この結果は、細胞中のｓｉＲＮＡ分子の存在が、正常なシグナル伝達を阻止することがあることを示唆する。これは、ＰＴＥＮ３  ＭＭに関して例示されたとおり、本発明に従ってデザインされた二本鎖リボ核酸は、細胞毒性応答及びアポトーシス及び損なわれた細胞シグナリングを含むストレス反応をもたらすことができるという結論に導く。
【００７９】
更に、なお更に下流の可能な読み取りとしてｐＦＫＨＲを使用した。ｐＦＫＨＲは更なる転写因子である。この実験で、特に興味深いことが分かったＰＴＥＮ３構築物を、図２Ｂに示された結果を確認する滴定実験に付した。この滴定実験は、損なわれた細胞シグナリングは、それが制限された量のｓｉＲＮＡの送達により減少させることができないという事実により証明されるとおり、過剰の細胞内ｓｉＲＮＡにより引起されないということを証明する。
【００８０】
実施例２：Affymetrix実験における種々のノックダウン技術の影響の試験
Affymetrix実験は、実施例１に関連して記載されたヌクレオチドを使用してデザインされたが、その際ＧＢ１はＰＴＥＮ１  ＧＢに対応し、ＧＢ１  ＭＭはＰＴＥＮ１  ＧＢ  ＭＭに対応し、ｓｉＲＮＡ１はＰＴＥＮに対応しそしてｓｉＲＮＡ１ＭＭはＰＴＥＮ１  ＭＭに対応する。
【００８１】
コールドプローブセット（called probe sets）についての選択基準は、処理された細胞及び未処理細胞の両方における存在及び少なくとも２．５倍のシグナルの強度の変化があるということであった。
【００８２】
ミクロアレー実験では、対応するＧＢ／ｓｉＲＮＡで処理された細胞からのＲＮＡを調製し、そしてビオチニル化ｃＲＮＡプローブを発生させそして製造者のプロトコール（Affymetrix,Santa Clara,CA-USA）に従ってAffymetrix Human genomeU95セット（Ｃｈｉｐ  ＨＧＵ１３３Ａ及びＢ）にハイブリダイゼーションさせた。Affymetrixソフトウエア（Microarray suite,Version5.0）を使用することにより、各チップの絶対分析及びサンプルの比較分析を行った。
【００８３】
これらの実験の結果を図３Ａに示す。Affymetrix実験から、前記したノックダウン構築物によりそれぞれのＨｅＬａ細胞を処理して、約６０００のプローブセツトを分析した。いずれにせよ、特定の配列にかかわりなく、１２時間後にコールドプローブセットにおいて有意な減少があることが結果から確かめることができる。ｓｉＲＮＡは、１２時間後にコールドプローブセットの有意な減少を有することに留意されるべきである。いずれにせよ、アンチセンス媒介された効果（antisense mediated effects）については、ｓｉＲＮＡ構築物の効果ほどは言い切れない。
【００８４】
２４時間のインキュベーションの後、それぞれのＨｅＬａ細胞は、アンチセンス構築物の場合に、ミスマッチがあるかないかにかかわりなく、コールドプローブセットの有意な増加を示し、したがって、これは１２時間後に観察された状況の逆転である。これは、依然としてコールドプローブセットの有意な減少を示すｓｉＲＮＡ構築物での状況とは対照的である。それに関連して、本発明に従う二本鎖リボ核酸構築物に対応するミスマッチｓｉＲＮＡは、コールドプローブセットの有意な減少を示す。
【００８５】
実施例３：腫瘍細胞のトランスクリプトームに対して対形成しないｄｓＲＮＡによる腫瘍細胞増殖の抑制
この実施例では、腫瘍細胞増殖の抑制が腫瘍細胞のトランスクリプトームに対して対形成しないｄｓＲＮＡにより引き起される実験を説明する。
【００８６】
この実験の基本的方法は、下記のとおり要約することができる。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）を発現するヒト前立腺がん細胞（ＰＣ３）又はＨｅＬａ細胞を発生させた。総計５×１０６個の細胞を８ｎｕ／ｎｕマウスに注射した（皮下ＨｅＬａ、前立腺内ＰＣ３）。マウスをＰＣ３では注射後５６日目、ＨｅＬａでは注射後１０日目に殺した。最終点は移植腫瘍の増殖であった。
【００８７】
その結果を図４に示す。
【００８８】
図４Ａは、示されたｓｈＲＮＡ発現構築物で安定にトランスフェクションされたＰＴＥＮ（−／−）前立腺がん細胞（ＰＣ）の腫瘍容積を示す。ＧＦＰ発現プラスミドで安定にトランスフェクションされたＰＣ３細胞は、同所腫瘍モデル（orthotopic tumor model)のコントロールとして含まれた。それぞれの配列は、
【表１】
2009513487.tif 000002
である。
【００８９】
この特定の実験では、ＰＩ３Ｋの２つのサブユニット、即ち、ｐ１１０ｂ及びｐ１１０ａに対するｓｉＲＮＡがデザインされた。ｐ１１０βとも呼ばれるｐ１１０ｂの重要性を前提とすれば、この標的に対するｓｉＲＮＡ構築物は、この実験により確かめられたとおり腫瘍容積を減少させるという点で特に有効であろう。しかしながら、ｐ１１０ａ  ＭＭであるｓｉＲＮＡも腫瘍特異的ｐ１１０ｂｓｉＲＮＡｓとほぼ同じく有効であるということを見るのは驚くべきであり、これに対して、ｐ１１０ａはｐ１１０ｂに対するネガティブコントロールである。更に、ｐ１１０ｂのミスマッチされた形態であるｓｉＲＮＡ構築物は、ＰＣ３腫瘍細胞容積の有意な抑制を依然として示す。この効果は、本発明に従う二本鎖リボ核酸がＰＣ３腫瘍細胞のトランスクリプトームのｍＲＮＡ又は他のエレメントと相互作用しないようにデザインされるとしても、これは腫瘍容積の減少から確かめられうるとおり、それぞれ細胞毒性応答及びアポトーシスをもたらすという理解を確証する。
【００９０】
それぞれの細胞系に存在せずそして他の核酸とのＲＮＡ干渉応答を誘発しないトランスクリプトームのメンバーに対してｓｉＲＮＡ構築物が向けられる場合に、細胞毒性応答及びアポトーシスを誘発するのにｓｉＲＮＡ構築物も一般に有効であるという本発明の基礎をなす驚くべき発見は、高度に特異的なｐ１１０ｓｉＲＮＡ構築物とほぼ同じく有効であるＰＴＥＮ構築物の効果により確かめられる。
【００９１】
この実験からの更なる結果は図４Ｂに示され、図４Ｂは、皮下腫瘍モデルで使用されたｓｈＲＮＡ発現プラスミドで安定にトランスフェクションされたＰＴＥＮ（＋／＋）ＨｅＬａ細胞の腫瘍容積を示す。ここで、ＰＴＥＮｓｉＲＮＡ構築物は標的を見出す。何故ならば、ＨｅＬａ細胞は、両対立遺伝子に関してＰＴＥＮポジティブであり、かくしてその細胞毒性応答を誘発しないからである。それにもかかわらず、ｐ１１０ｂ  ＭＭ構築物、即ち、ｐ１１０に対して特異的であり、しかしながら、正しい、即ちポジティブＲＮＡ干渉応答を許容しない本明細書で開示されたデザイン原理に従っていくつかのミスマッチを有するｓｉＲＮＡ構築物も、ＨｅＬａ腫瘍容積の有意な減少をもたらす。
【００９２】
実施例４：ｄｓＲＮＡ分子のトランスフェクションにより誘導される減少したＰＣ３細胞増殖
ｄｓＲＮＡ分子の修飾パターンの影響及び導入されたｄｓＲＮＡ分子の標的核酸のそれぞれ存在及び不存在の影響を評価するために、この実施例を行った。
【００９３】
下記のｄｓＲＮＡ分子を誘導させた：
【表２】
2009513487.tif 000003
太字及び下線を施されたもの＝２’−Ｏ−メチル修飾
大文字＝デスオキシヌクレオチド（desoxy nt)
【００９４】
種々のｄｓＲＮＡ分子の効能を、ＰＣ３細胞を使用して１０cmプレート上の増殖アッセイで評価した。
【００９５】
プラスチックディッシュ上での増殖アッセイ
３０〜５０％の密集度のＰＣ３細胞をそれぞれのｄｓＲＮＡ分子（実施例１参照）でトランスフェクションした。インキュベーション後に、７２時間目に写真を撮り、これは図５Ａ（７２時間インキュベーション）でありそして１６０時間目のものは図５Ｂ（１６０時間インキュベーション）である。トランスフェクション条件は、ａｔｕＦＥＣＴ０１（１μg／ml）と複合した１００nMｓｉＲＮＡ分子であった。
【００９６】
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩
【００９７】
【化１】
2009513487.tif 000004
【００９８】
ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン
【００９９】
【化２】
2009513487.tif 000005
【０１００】
ｄｓＲＮＡ分子の処方
カチオン性脂質β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩及びヘルパー脂質ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンのクロロギ酸溶液を、両脂質が１：１のモル比で存在するようにブレンドした。次いで、クロロホルムを真空下に除去し、得られる脂質フイルムを１μg脂質／mlの濃度で水中で再水和させた。かくして形成されたカチオン性脂質を超音波浴中で室温で６分間分散液の超音波処理に付した。脂質をｄｓＲＮＡ分子と複合させるために、ｄｓＲＮＡ（２mg/lＤＰＢＳ）を１：１の容積比で脂質（０．７３５mg／ml超純水）と混合し、ボルテツクスしそして３７℃で約２０分間インキュベーションした。この処方は本明細書ではａｔｕＦＥＣＴ０１とも呼ばれる。
【０１０１】
図５Ａ及び５Ｂから確かめることができるとおり、種々のＲＮＡ分子は、ＰＣ３細胞の増殖に関する能力に対して異なる影響を有する。増殖アッセイは、細胞が増殖する潜在力を指示するのに適当なアッセイであり、かくしてそれらのマイトジェン活性及びアポトーシス活性のインディケーターでもある。
【０１０２】
図５Ａ及び５Ｂに示された結果を比較すると、７２時間増殖の後、種々のＲＮＡ分子を使用する細胞の処理効果は、細胞が１０cmのプレート上で１６０時間の増殖の後に再び観察された場合の状況と対照的に、顕著な効果ではないということに留意することは重要である。
【０１０３】
ｓｉＲＮＡ分子であるＰＫ７１ＡＢ、即ち、２１塩基対を含む二本鎖ＲＮＡ分子は、ＰＫＮβ（ＮＭ ０１１３３５５）に対して向けられ、かくしてＲＮＡ干渉機構に従ってＰＫＮβｍＲＮＡをダウンレギュレートするのに適当である。しかしながら、ＰＫＮβはＰＣ３の増殖に対していかなる影響も与えない。
【０１０４】
ＰＴＥＮＡＢは、上記したＰＴＥＮＡ及びＰＴＥＮＢ配列を含む二本鎖構造である。１６０時間後、ＰＣ３細胞を抑制し、そして増殖及び生存を有意に減少させる。ＰＣ３はＰＴＥＮ−／−細胞であるので、即ち、それらはＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ又は他の転写されたＲＮＡを含むトランスクリプトームを持たないので、これは、細胞増殖の抑制及びアポトーシスが、二本鎖核酸、更に好ましくは、トランスクリプトームにマッチしない二本鎖リボ核酸としてのリボ核酸の使用により誘導されうるという本願に開示された発見を確証する。
【０１０５】
ＰＴＥＮＡＢＭＭの使用は、ＰＴＥＮＡＢについて上記したと同様な効果を示す。ＰＴＥＮＡＢＭＭは上記した配列ＰＴＥＮＡＭＭ及びＰＴＥＮＢＭＭを含む二本鎖リボ核酸である。ＰＴＥＮ遺伝子の転写物を示さないＰＣ３細胞のほかに、ミスマッチは、抑制された細胞増殖の点でより強くすらある応答をもたらし、かくしてそれぞれ７２時間及び１６０時間後に密度を比較すると、細胞密度の点からみてより強いアポトーシス効果をもたらす。
【０１０６】
しかしながら、一本鎖構築物として、それぞれＰＴＥＮＡ及びＰＴＥＮＢを使用すると、一本鎖リボ核酸がＰＣ３細胞増殖の抑制をもたらさず、かくして本明細書に開示された効果を達成するために二本鎖核酸構造の必要を裏付けることが、図５Ａ及び図５Ｂを比較することから確かめることができる。
【０１０７】
二本鎖リボ核酸分子ＰＴＥＮＡＢＶ１５は、上記した２つの鎖ＰＴＥＮＡＶ１５及びＰＴＥＮＢＶ１５からなる。この分子は、第１、第３等の如き修飾パターンを示す、即ち、いかなる１つ置いて次のヌクレオチドも、修飾、特定の場合には２’Ｏ−メチル化リボース部分を含み、修飾された最初のヌクレオチドはアンチセンス鎖の５’端部から出発する最初のヌクレオチドである。ＰＴＥＮＡＶ鎖に相補性であるＰＴＥＮＢＶ１５鎖は同じパターンを有するが、しかし、１ヌクレオチドのフレームシフトがあり、その結果、第２、第４、第６等の、即ち、やはりどの１つ置いて次のヌクレオチドもアンチセンス鎖と同じ方法で、即ち、２’Ｏ−メチル化リボースにより修飾される。
【０１０８】
この結果は、本明細書では空間的修飾パターンの１つの態様とも呼ばれる修飾パターンは本明細書に記載の効果を生じることを確証する。
【０１０９】
二本鎖ＲＮＡ分子ＰＴＥＮＡＢＶ１０にも同じことが言え、これはＰＴＥＮｍＲＮＡ又はＰＴＥＮ転写物にも関係しているが、しかし、ＰＴＥＮｍＲＮＡ又はＰＴＥＮ転写物は、ＰＣ３細胞の特定の遺伝子バックグラウンドが与えられるならば、存在しない。この配列も増殖アッセイにおいてＰＣ３細胞の増殖の抑制をもたらし、かくして本明細書に開示された機構に基づく細胞溶解及びアポトーシスを示している。
【０１１０】
最後に、上記した個々の配列ＰＴＥＮＡＶ１及びＰＴＥＮＢＶ1からなる分子ＰＴＥＮＡＢＶ１がアッセイされたが、しかし、このアッセイにおいて活性ではない、即ち、この種の分子は細胞増殖を抑制するのに適当ではない。配列それ自体はＰＴＥＮに対して向けられそしてそのかぎりにおいて働くはずであるけれども、しかし、この分子はリボースの２’位置で両鎖が完全にメチル化されているような特徴を有し、それによりこのような全体の修飾はＲＮＡ干渉を誘発しないことが知られる。これから、本発明者は、修飾は本明細書に記載の効果を誘発するように許容できるけれども、しかしながら、アンチセンス鎖が２’リボースで完全にメチル化されそして好ましくはセンス鎖もそうである、完全に修飾されたｄｓＲＮＡ分子の発生は、ＲＮＡｉ応答を引き出すのに有効ではないことが知られ、本発明に関して作用可能ではないと結論した。
【０１１１】
この実施例で使用されたｄｓＲＮＡ分子の長さは、２１ヌクレオチド対であることに留意されるべきである。
【０１１２】
実施例５：ミスマッチで誘導されるアポトーシス
本発明の基礎をなす発見、即ち、ＲＮＡ干渉反応を引き出す最適ｓｉＲＮＡ分子に比べて、完全に塩基対形成しないで、少なくとも１つ、好ましくはいくつかのミスマッチを示す二本鎖核酸、好ましくは二本鎖リボ核酸により、細胞増殖を抑制することができ、更に詳しくはアポトーシスを誘導することができるということを裏付けるために、下記の実験を行った。
【０１１３】
実施例４に関して上記した如くして調製されたａｔｕＦＥＣＴ０１（１μg／ml）を使用してｓｉＲＮＡ１００nmでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。下記の配列を使用した：
【０１１４】
【表３】
2009513487.tif 000006
下線を施したｎｔ＝導入されたミスマッチに対応する
大文字＝デスオキシｎｔ
【０１１５】
このようにして処理された細胞をそれぞれ４８時間及び７２時間後に溶解させそして指示された抗体を使用してイムノブロットにより分析した。
【０１１６】
上記配列において、ｄｓＲＮＡ分子のミスマッチは下線を施すことにより示されることに留意されたい。ゆえに、ＰＴＥＮＭＭの場合に、ミスマッチはヌクレオチドｎｏ．１が５’端部にあるアンチセンス鎖上の位置４、９、１３及び１８に基づいたが、このようなミスマッチは、ＨｅＬａに存在しているＰＴＥＮｍＲＮＡと呼ばれた（ＨｅＬａのトランスクリプトームは依然としてＰＴＥＮｍＲＮＡｓを含むので）。
【０１１７】
実施例３に記載のＰＩ３Ｋのサブユニットであるｐ１１０αの場合に、ミスマッチは、第１ヌクレオチドが５’端部のヌクレオチドであるセンス鎖上の位置３、８、１２及び２０にありそしてセンス鎖上の対応する位置にある。いずれにせよ、二本鎖ＲＮＡ分子は２１ヌクレオチドの第１ストレッチ及び２１ヌクレオチドの第２ストレッチからなっていた。各場合に、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々の３’端部にジデオキシヌクレオチド、即ちＴＴがあった。
【０１１８】
結果を図６に示す。図６から確かめられるとおり、ｐ１１０αに対して向けられたｄｓＲＮＡ分子は、ｐ１１０αタンパク質の減少をもたらす。二本鎖ＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡ、即ち、ｐ１１０αｍＲＮＡに完全にマッチしていた場合。ＰＴＥＮについて同じことが言える。
【０１１９】
更なる読み取り（read-out）は、ＲＢ及びＧＳＫ３αであったが、これらはその脱リン酸化された形態で増殖の抑制を示し、両場合に脱リン酸化は活性化を意味する。更なる読み取りは、開裂されたＰＡＲＰシグナルであり、これはアポトーシスを示す。活性化されたカスパーゼ３がデス基質（death substrate）ＰＡＲＰを開裂することは十分に確立されている（Lazebnik et al., 1994, Nature 371, 346-347）。
【０１２０】
再び図６を参照すると、少なくとも７２時間後に、ＰＴＥＮＭＭ及びｐ１１０αＭＭは、ＲＢ及びＧＳＫ３αがリン酸化される程度を明らかに減少させる。更に、まさに同じｄｓＲＮＡ分子について、開裂された部分が有意なレベルで存在し、これは、これらのｄｓＲＮＡで処理された細胞がアポトーシスを受けることを示す、ということが確立されうる。これは、標的配列が存在するとしても、完全にマッチしない二本鎖ＲＮＡ分子の使用は、アポトーシスを含む（しかしそれに限定はされない）ストレス反応を生じさせ、そして最後に増殖抑制及び／又は細胞停止及び／又は細胞溶解を生じさせることを裏付ける。
【０１２１】
実施例６：ヒトＰＣ３マウスモデルにおけるｄｓＲＮＡに基づく治療
実験デザイン
食品医薬品協会の非臨床実験室的研究のための良好な実験室実施（Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies(GLP Regulations) of the Food and Drug Administration）(U.S Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration,Rockville,MD)に相当する実験を、法律的基礎としてドイツ動物保護法、連邦官報，I, 25May1998, p.1094（Bundesgesetzblatt,I,25 May 1998,p.1094）に従って行った。地方政府機関の許可を与えられた（Landesamt feur Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin）。ヒト前立腺がん細胞ＰＣ３（American Type Culture Collection(ATCC)2002),Manassas,VA20108)を、グルタミン（Gibco BRL)２mM、Ｈｅｐｅｓ（Biochrom）２０mM及びウシ胎仔血清（Gibco BRL)１０％を含有するＦ−１２Ｋカインの改変培地（F-12K Kaighn's modification medium）(Gibco BRL) 中で増殖させた。培養した細胞をトリプシン処理しそして培地によるトリプシン効果を停止した後回収した。洗浄手順（ＰＢＳ；遠心５分／１．０００rpm）を加え、最後にペレットを、接種されるべき細胞数及び容積を考慮して再懸濁させた。
【０１２２】
動物及び細胞チャレンジ
ＳＰＦ条件（空気層流装置、Scasntainer,Scanbur）下に維持されたオスのＳｈｏｅ：ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウス（DIMED Schoenwalde GmbH）をＰＣ細胞の受容体として使用した。８週齢、体重２８〜３２gのこの動物に、５×１０６個／０．１mlの腫瘍細胞を鼠頚部領域（inguinal region）に皮下に接種した。細胞チャレンジの１７日後に、動物を各グループ当たり６匹の動物からなる4つの処理グループに従って無作為化した。腫瘍サイズは処理グループ当たり１５０〜１６０mm３の範囲であつた。動物を所見のプロトコール化を含めて順次に検査した。Ｓｓｎｉｆｆ  ＮＭ−Ｚ、１０mm、オートクレーブ処理可能（ssniff Spezialdiaeten GmbH）を、強化食餌として投与し、飲用水道水を酸性化し、両方とも適宜に行った。
【０１２３】
処方
実施例４に関連して前記したとおりに処方物を調製した。
【０１２４】
更に、この処方物３００μlを、３０gのマウスに静脈内注射し、それによりそれぞれ体重１kg当たりｓｉＲＮＡ１０mg及び脂質３．７mgの用量が投与される。裸のｓｉＲＮＡ（２mg／mlＤＰＢＳ）を同じ容積比でＤＰＢＳで満たしそして適当に処理した。複合体を各処理について新たに調製した。
【０１２５】
ｓｉＲＮＡ処理
コントロールとしてＰＢＳを含むｓｉＲＮＡ調製物を、尾部静脈を経由して静脈内に投与した。処理スケジュールは、９回の連続した毎日の注射からなっていた。投与レベルは、それぞれ、体重１kg当たりｓｉＲＮＡ１０mg、脂質３．７mgに達し、０．３ml／３０gマウスの注射容積を達成した。下記の処理グループが含まれていた：
ＰＢＳ：
ＰＴＥＮ／ＡＢ／裸（Ｎａｋｅｄ）
ＰＴＥＮ／ＡＢ
【０１２６】
評価
実験期間中定期的に体重を記録して、動物の物理的状態を評価した。腫瘍を、処理期間中は毎日そして処理後は１週間に３回、一対のカリパー（calliper）によって二次元的に測定した。容積は、Ｖ（mm３）＝ａｂ２／２（ここでｂ＜ａである）に従って計算した（In vivo cancer models.1976-1982.Washington,D.C.:National Cancer Institute 1984(NIH Publication No.84-2635,February 1984)）。一般に、このアプローチで達成された細胞数は１００％腫瘍生着（tumor take）を引起した。
【０１２７】
血液パラメーターを、眼窩洞（orbital sinus）からの血液穿刺（blood punctures）によって評価した：
酵素：ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＰ；
細胞構成分：ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＬＴ、Ｈｂ、Ｈｋｔ；
白血球分化。
【０１２８】
組織学的分析のために、腫瘍及び肝臓組織のサンプルを５％ホルムアルデヒド中に固定しそしてパラフィンに埋めた。ルーチンに、切片をＨＥ染色した。
【０１２９】
腫瘍サイズに関する結果を、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙのｕ検定（u-test）により統計的に証明した。
／ａｔｕＦｅｃｔ０１；
ＭＴＰ１８／ａｔｕＦｅｃｔ０１．
ＰＴＥＮＶ１／ａｔｕＦｅｃｔ０１
ＰＴＥＮＧＢ／ａｔｕＦｅｃｔｏ１
【０１３０】
下記の二本鎖リボ核酸及びアンチセンス分子を使用した：
【表４】
2009513487.tif 000007
【０１３１】
いかなる２’Ｏ−メチル修飾されたリボヌクレオチドも太字で示されそして下線を施されており、大文字はデスオキシリボヌクレオチドを示しそして大文字及びイタリック体のいかなる文字もホスホチオエートを含むデスオキシリボヌクレオチドを示していることに留意されたい。
【０１３２】
結果を図７に示す。
【０１３３】
２０日後ではＰＴＥＮＡＢ／ａｔｕＦＥＣＴ０１の投与により誘発された応答に比べてＰＢＳに対する応答は、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙに従って統計的に有意であり（Ｐ＝０．０５）そして絶対腫瘍容積は、いかなる他の処理計画に比べてさほど増加しなかった。種々の処方の投与は１７〜１８日に毎日行った。
【０１３４】
更なる態様では、動物をＰＢＳでチャレンジしそして別法としてＰＴＥＮＡＢ／ａｔｕＦＥＣＴ０１  １０mg／kg及びＰＴＥＮＡＢ／ａｔｕＦＥＣＴ０１  １mg／kgでチャレンジした。それぞれの処方物を投与し、１９〜２６日に毎日投与した。結果を図８に示す。
【０１３５】
図８から確かめることができるとおり、より大量の処方物を投与するならば、相対的腫瘍容積の増加はより少なく、かくしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究でも観察された投与量依存性反応を確証する。
【０１３６】
更なる実験では、ＰＢＳ、ＰＴＥＮＶ１／ａｔｕＦＥＣＴ０１  １０mg／kg及びＧｅｎｅ  Ｂｌｏｃ  ５３／ａｔｕＦＥＣＴ０１  １０mg／kgの影響をまったく同じ動物モデルで評価し、その結果を図９に示す。
【０１３７】
上記したＰＴＥＮＡＶ１及びＰＴＥＮＢＶ１鎖からなるＰＴＥＮ−Ｖ１構築物を使用して、特定の脂質と共に上記したとおりに処方し、その際このような分子は、いかなる２’ＯＨ位置も２’Ｏ−メチルとなるように修飾されるように、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方において完全に修飾されることは、この図形から確かめることができる。この分子は、マウスモデルで実際に有効ではなく、そして腫瘍容積の増加は、ＰＢＳによる処理による腫瘍容積増加と同様であった。この理由は、完全な修飾、好ましくはアンチセンス鎖の完全な修飾は、該鎖を不活性にし、その結果この種の二本鎖ＲＮＡ分子が細胞システムで使用されるときに観察される効果は、標的核酸、即ち、ｍＲＮＡ、更に正確にはＰＴＥＮｍＲＮＡが存在しない場合には、上記したとおりのストレス応答をもたらすということである。
【０１３８】
ＰＴＥＮに対して向けられるＧｅｎｅ  Ｂｌｏｃ  ５３／ａｔｕＦＥＣＴ０１も、腫瘍容積を減少させるのには有効ではないが、これは、特定のＰＣ３細胞が標的を与えずそして実施例４に記載の実験に従って、一本鎖オリゴヌクレオチドは本明細書で観察されそして開示された効果を誘導するのには適当ではないという事実を前提とすれば、驚くには当たらない。
【０１３９】
本明細書、特許請求の範囲及び／又は図面で開示された本発明の特徴は、個々に及びそのいかなる組み合わせにおいても、本発明をその種々の形態において認識するための資料である。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】低分子ＲＮＡ二本鎖の主反応を示し、図１Ａは本発明の基礎をなす原理機構を説明し、これに対して図１ＢはｓｉＲＮＡの作用の様式を示す。
【図２Ａ】本発明に適用可能な種々のｓｉＲＮＡ構築物を示す。
【図２Ｂ】ＰＴＥＮに対してデザインされたｓｉＲＮＡ又はアンチセンス分子を使用する細胞溶解のイムノブロットの結果を示す。
【図２Ｃ】ＰＴＥＮに対してデザインされたｓｉＲＮＡ又はアンチセンス分子を使用する細胞溶解のイムノブロットの結果を示し、ｐ１１０α、ＰＴＥＮ及びｐＡｋｔのほかに、ｐＦＫＨＲが読み取り（read-out）として使用される。
【図３Ａ】それぞれ、１２時間及び２４時間後に種々のアンチセンス構築物及びｓｉＲＮＡ構築物を使用するアフィマトリックス実験のプローブセットの数の増減を示す図形を示す。
【図３Ｂ】ＰＴＥＮｍＲＮＡノックダウンのための種々のアンチセンス構築物及びＲＮＡ構築物を使用するアフィマトリックス実験の結果を示す。
【図４Ａ】種々のｓｉＲＮＡ発現構築物で処理したときのＰＣ３腫瘍の容積を示す図形を示す。
【図４Ｂ】種々のｓｉＲＮＡ発現構築物により処理したときのＨｅＬａ腫瘍の容積を示す図形を示す。
【図５Ａ】細胞が種々のＲＮＡ分子を使用してトランスフェクションに付されている細胞増殖アッセイにおける、７２時間後のＰＣ−３細胞を示す。
【図５Ｂ】細胞が種々のＲＮＡ分子を使用するトランスフェクションに付された細胞増殖アッセイにおける、１６０時間後のＰＣ−３細胞を示す。
【図６】種々の二本鎖ＲＮＡ分子を使用するＨｅＬａ細胞の処理後の細胞溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【図７】種々の処方物を使用して細胞チャレンジ後の日数として表された時間の関数としての絶対腫瘍容積を示す図形を示す。
【図８】ＰＢＳ及び二本鎖リボ核酸を含有する種々の濃度の脂質処方物の投与による細胞チャレンジ後の日数の関数としての腫瘍容積を示す図形を示す。
【図９】ＰＢＳ、及び二本鎖リボ核酸を含有する種々の濃度の脂質処方物の投与による細胞チャレンジ後の日数の関数としての腫瘍容積を示す図形を示す。
【図１】
2009513487.tif 000008
【図２】
2009513487.tif 000009
【図３Ａ】
2009513487.tif 000010
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009513487.tif 000018
【図９】
2009513487.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月22日(2005.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
第１ストレッチが、医薬により処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は
第２ストレッチが、該医薬により処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なり、
第１ストレッチが、処置されるべき生物の非病理学的細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性であり、及び／又は
第２ストレッチが、処置されるべき生物の非病理学的細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡと同一である、
核酸、好ましくは、リボ核酸の医薬を製造するための使用。
【請求項２】
標的核酸が、生物の細胞のいかなる核酸でもあり、好ましくは生物の細胞のいかなるｍＲＮＡでもある、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
標的核酸が、生物の細胞のトランスクリプトームのいかなるエレメントでもあり、好ましくは、生物の細胞のトランスクリプトームのすべてのエレメントである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４】
細胞が、好ましくは疾患に関与している病理学的細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
非病理学的細胞の標的核酸が、１つ以上のヌクレオチド位置で病理学的細胞の標的核酸とは異なる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
該医薬が疾患の処置及び／又は予防用であり、このような疾患が好ましくは、腫瘍又はがんである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
病理学的細胞が腫瘍サプレッサー欠損であり、そして連続したヌクレオチドの第１ストレッチが機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸に対して相補性であり、及び／又は
連続したヌクレオチドの第２ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸と同一である、
請求項４〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
第１ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸に対して相補性であり、病理学的細胞が該機能的腫瘍サプレッサーに関して腫瘍サプレッサー欠損であり、そして
第２ストレッチが、機能的腫瘍サプレッサーをコードする核酸と同一であり、病理学的細胞が該機能的腫瘍サプレッサーに関して腫瘍サプレッサー欠損である、
請求項７に記載の使用。
【請求項９】
病理学的細胞が、機能的腫瘍サプレッサーの遺伝子又はその転写物を欠いている、請求項４〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
病理学的細胞が、機能的に活性な腫瘍サプレッサーを与える遺伝子又はその転写物を欠いている、請求項４〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
遺伝子又はその転写物が、１つ又はいくつかの突然変異を含み、このような突然変異が、好ましくは、点突然変異及び欠失突然変異よりなる群から選ばれ、このような突然変異が、好ましくは、機能的に不活性な腫瘍サプレッサーをもたらす、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が、第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
該核酸又はその一部若しくは鎖が、ＲＮＡ干渉応答ネガティブである、
核酸、好ましくは、リボ核酸の医薬を製造するための使用。
【請求項１３】
核酸が、医薬で処置されるべき生物の病理学的細胞においてＲＮＡ干渉応答ネガティブである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
核酸が、医薬で処置されるべき生物の非病理学的細胞においてＲＮＡ干渉応答ポジティブである、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
核酸が、ストレス応答、好ましくは、病理学的細胞のアポトーシス及び／又は増殖の抑制を誘導する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
核酸、好ましくは、リボ核酸、及び好ましくは、薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物であって、
該核酸が二本鎖構造を含み、該二本鎖構造が第１鎖及び第２鎖を含み、
第１鎖が連続したヌクレオチドの第１ストレッチを含み、第２鎖が連続したヌクレオチドの第２ストレッチを含み、
第１ストレッチが、該医薬で処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに対して相補性ではなく、及び／又は、
第２ストレッチが、該医薬で処置されるべき生物の細胞の標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡとは異なり、
該核酸が、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸である、
医薬組成物。
【請求項１７】
標的核酸が、該医薬組成物を使用して処置されるべき生物の細胞のいかなる核酸でもあり、好ましくは、このような生物の細胞のいかなるｍＲＮＡでもある、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
標的核酸が、医薬組成物で処置されるべき生物の細胞のトランスクリプトームのいかなるエレメントでもあり、好ましくは、医薬組成物で処置されるべき生物の細胞のトランスクリプトームのすべてのエレメントである。請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
細胞が、好ましくは、該医薬組成物により処置及び／又は予防されるべき疾患に関与している病理学的細胞である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの脂質、好ましくはカチオン性脂質を更に含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
脂質が、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸塩である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ヘルパー脂質を更に含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ヘルパー脂質が、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物及び／又は請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸を投与する工程を含む、処置を必要とする患者の処置方法であって、好ましくは、がん及び／又は腫瘍を処置する方法。
【請求項２５】
患者が、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の細胞、好ましくは病理学的細胞を示す、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2009513487.tif 000020
2009513487.tif 000021
2009513487.tif 000022