(57)【要約】骨髄内において低酸素細胞を選択的に枯渇させる改良された方法が開示される。本方法は、宿主対象の骨髄における造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植を向上させるために使用することができる。又、宿主対象の骨髄内の癌を処置する方法も開示される。本発明は、低酸素細胞が選択的に枯渇されるように、具体的には低酸素細胞を殺傷するが、非低酸素細胞を殺傷しない殺細胞性薬剤と細胞を接触させることによって、ＨＳＣを含めた骨髄内の低酸素細胞を選択的に枯渇させる方法を提供する。一実施形態において、本薬剤は、対象が固形腫瘍を有さないことを条件に、細胞移植又は実質臓器移植（例えば、骨髄、ドナー動員抹消血、及び臍帯血）の前にｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄内の造血幹細胞を選択的に枯渇させる方法であって、該細胞が枯渇するように、低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤と該細胞とをｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含む、方法。
【請求項２】
宿主対象の骨髄にドナー造血幹細胞を植え付ける方法であって、
該対象の造血幹細胞が枯渇するように、低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤を該対象に投与すること；及び
ドナー対象由来の造血幹細胞を投与すること
を含む、方法。
【請求項３】
宿主対象の骨髄内の癌を処置する方法であって、
該対象の低酸素細胞が枯渇するように、該低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤を対象に投与すること；及び
該癌が処置されるように、ドナー対象由来の造血幹細胞を投与すること
を含む、方法。
【請求項４】
前記低酸素細胞が、骨髄に転移した癌細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記低酸素細胞が神経芽腫細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記低酸素細胞が乳癌細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が血液癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が、白血病及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、ドナー骨髄の投与前に対象に投与される、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、ドナーサイトカイン動員抹消血の投与前に対象に投与される、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、ドナー臍帯血の投与前に対象に投与される、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
成熟血液細胞は維持されるように、前記薬剤は、低酸素細胞と反応するが該成熟血液細胞とは反応しない、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が生体内還元剤である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が低酸素活性化プロドラッグである、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤がチラパザミン（ＴＰＺ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、ベンゾトリアジン、ニトロ芳香族化合物、アントラキノン、２−ニトロイミダゾールに対するクロロキノリンＤＮＡ標的単位、ジニトロベンズアミドマスタード、ニトロベンジルホスホルアミデートマスタード、ニトロ複素環式メチル４級塩、コバルト（ＩＩＩ）錯体、及びインドールキノンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、ミソニダゾール、ＲＢ  ６１４５、ＡＱ４Ｎ、ＮＬＣＱ−１、ＳＮ  ２３８６２、及びＳＮ  ２８３４３からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤がＨＩＦ−１α阻害剤である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＩＦ−１α阻害剤が、カンプトセシン類似体、トポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ）−Ｉ阻害剤、３−（５’−ヒドロキシメチル−２’フリル）−１−ベンジルインダゾール（ＹＣ−１）、及びＰＸ−４７８からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記低酸素細胞が原始造血幹細胞である、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記低酸素細胞が後期形成敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）である、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
枯渇が、敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）検定においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される、請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
枯渇が、対象に移植されるドナー骨髄の長期植付けによってｉｎ  ｖｉｖｏで測定される、先行請求項の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨髄が、前記細胞を前記薬剤と接触させる前、又は接触させた後に、放射線を照射されるか、又は化学療法剤と接触される、請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主対象が、前記薬剤を投与する前、又は投与した後に、化学療法剤を投与されるか、又は放射線を照射される、請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ドナー対象由来の前記造血幹細胞が、遺伝子組み換えされている、請求項２〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ドナー造血幹細胞の前記植付けが、短期免疫変調剤と組み合わせて実施される、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記短期免疫変調剤がＴ細胞枯渇抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ドナー特異的免疫寛容の状態を誘導するための、請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法の使用。
【請求項３０】
対象における移植片対宿主疾患を予防又は低減するための、請求項１〜２９の何れか１項に記載の方法の使用。
【請求項３１】
酵素欠損症を処置するための、請求項１〜３０の何れか１項に記載の方法の使用。
【請求項３２】
自己免疫疾患を処置するための、請求項１〜３１の何れか１項に記載の方法の使用。
【請求項３３】
血液癌を処置するための、請求項１〜３２の何れか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年１０月３日に出願された、米国仮特許出願第６０／７２３１８３号の優先権および利益を、これらの出願に共通する全ての主題に対して主張する。米国仮特許出願第６０／７２３１８３号の開示は、本明細書中に、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（政府の資金援助）
本発明は、国立保険研究所（ＮＩＨ）による補助金Ｒ０１  １０９４１−３１に基づく政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
造血系は、自己再生の重要な特徴、並びに血液免疫系の機能細胞を最終的に生じる多系列前駆細胞集団を生成する能力によって定義される原始造血幹細胞（ＨＳＣ）の希有集団によって維持される。通常の哺乳動物の造血系は、骨髄内の成体にわたって大部分が分布し、静止状態の幹細胞及び分化した前駆細胞で構成される。従って、ＨＳＣの増殖能は、ＨＳＣが自己再生によって自らを永続させる特異な能力を有することから、注目に値する。
【０００４】
機能的には、ＨＳＣは、照射を受けた受容体において造血作用を植え付け、維持する能力により、移植において定義されることが多い（非特許文献１）。従って、癌、免疫異常症、及び移植片拒絶反応等の、ＨＳＣに関連する疾患の処置において宿主ＨＳＣを有効に枯渇させるか、又は不活化することが重要となる。しかし、これは困難であることが実証されており、その理由としてはとりわけ、ＨＳＣの発症数が極めて少なく（競合的再増殖実験では１００，０００個の骨髄細胞につき僅か１〜２個と推定（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９８０））、これらの細胞を標的化して根絶することがより難しくなっている）。
【０００５】
現在の処置は一般的に、ＨＳＣだけでなく、造血系の全細胞を排除する高用量の殺細胞性薬剤を、通例は放射線と組み合わせて投与することを伴う。これらの療法は、明らかな欠点と深刻な毒性副作用を有する。従って、（例えば、造血細胞の完全又は混合キメラ現象を確立するためにドナーＨＳＣを移植する前に）ＨＳＣを枯渇させる改良された処置法が有益であると考えられる。
【非特許文献１】Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇａｇｅ  Ｆ．（２００１）．Ｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｏｒｉｇｉｎｓ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ，ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔｓ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １７，３８７−４０３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、低酸素細胞が選択的に枯渇されるように、具体的には低酸素細胞を殺傷するが、非低酸素細胞を殺傷しない殺細胞性薬剤と細胞を接触させることによって、ＨＳＣを含めた骨髄内の低酸素細胞を選択的に枯渇させる方法を提供する。一実施形態において、本薬剤は、対象が固形腫瘍を有さないことを条件に、細胞移植又は実質臓器移植（例えば、骨髄、ドナー動員抹消血、及び臍帯血）の前にｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与される。このような実施形態において、骨髄は、低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤を投与する前、又は投与した後に、放射線を照射するか、又は化学療法剤と接触させることができる。特定の実施形態において、ＨＳＣは、後期形成敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）等の原始ＨＳＣである。骨髄内におけるＨＳＣの枯渇は、例えば、ＣＡＦＣ検定において、又は対象に移植された類遺伝子標識付きＣＤ４５．１骨髄の長期植付けによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。
【０００７】
別の態様において、本発明は、対象のＨＳＣが枯渇するように、低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤を対象に投与した後、ドナー対象由来のＨＳＣを投与することによって、宿主対象の骨髄にドナーＨＳＣを植え付ける方法を提供する。特定の実施形態において、宿主対象は、低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤を投与する前、又は投与した後に、化学療法剤を投与されるか、又は放射線を照射される。別の特定の実施形態において、宿主対象は、低酸素細胞を選択的に殺傷する薬剤の投与と組み合わせて（例えば、投与前に、投与と同時に、又は投与後に）、Ｔ細胞枯渇抗体等の短期免疫変調剤を投与される。
【０００８】
別の態様において、本発明は、対象の低酸素細胞が枯渇するように、低酸素癌細胞を選択的に殺傷する薬剤を対象に投与した後、ドナー対象由来のＨＳＣを投与することによって、宿主対象の骨髄内の癌を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、癌は、白血病又はリンパ腫等の血液癌である。別の特定の実施形態において、癌は、神経芽腫細胞又は乳癌細胞等の、骨髄に転移した癌である。
【０００９】
本発明で使用する好ましい薬剤は、ＨＳＣを選択的に殺傷するか、又は枯渇させるが、成熟血液細胞は維持されるように殺傷せず、枯渇することもない。一実施形態において、本薬剤は生体内還元剤である。別の実施形態において、本薬剤は低酸素症活性化プロドラッグである。本発明で使用することができる具体的な薬剤には、チラパザミン（ＴＰＺ；ＳＲ４２３３；１，２，４−ベンゾトリアジン−３−アミン１，４−ジオキシド）等のベンゾトリアジンが含まれる。
【００１０】
本発明は又、低酸素細胞における還元時に明らかな細胞毒を産生するその他のプロドラッグの使用も含む。これらのプロドラッグは、ニトロ芳香族化合物（例えば、ミソニダゾール；１−メチル−３−（２−ニトロ−１−イミダゾール）−２−プロパノール及びＲＢ  ６１４５；２−ニトロイミダゾール）（Ａｄａｍｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ２９，  ２３１−２３８，  １９９４）、アントラキノン（例えば、ＡＱ４Ｎ：１，４−ビス−［［２−（ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ］５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン）（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｈ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．  １２，  １１９−１３４，  １９９３；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｈ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｖ．  ３４，  ５８１−５９２，  ２００２；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８２，  １９８４−１９９０，  ２０００）、２−ニトロイミダゾールに対するクロロキノリンＤＮＡ標的単位（例えば、ＮＬＣＱ−１；４−［３−（２−ニトロ−１−イミダゾリル）−プロピルアミノ］−７−クロロキノリンヒドロクロリド）（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｍ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ５７１４−５７２０，  ２００３）、ジニトロベンズアミドマスタード（例えば、ＳＮ  ２３８６２；５−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ）−２，４−ジニトロベンズアミド及びＳＮ  ２８３４３）（Ｓｉｉｍ，  Ｂ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  ９，  ３５７−３６９，  １９９７；Ｈｅｌｓｂｙ，  Ｎ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １６，  ４６９−４７８，  ２００３）、ニトロベンジルホスホルアミデートマスタード（ニトロ複素環式ホスホルアミデート）（Ｂｏｒｃｈ，  Ｒ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４３，  ２２５８−２２６５，  ２０００）、ニトロ複素環式メチル４級塩（ニトロアリールメチル４級塩）（Ｔｅｒｃｅｌ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４４，  ３５１１−３５２２，  ２００１）、コバルト（ＩＩＩ）錯体（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｗ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ２９，  ３２３−３２７，  １９９４）、及びインドールキノン（Ｅｖｅｒｅｔｔ，  Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６３，  １６２９−１６３９，  ２００２）が含まれる。
【００１１】
低酸素誘導性因子１アルファ（ＨＩＦ−１α）は、低酸素張力に対する転写応答のマスター調節剤であることから、ＨＩＦ−１αを阻害することによりＨＳＣを不活化するか、又は枯渇させる能力を有する薬剤が、本発明に含まれる。ＨＩＦ−１α阻害剤の例には、カンプトテシン類似体（例えば、１Ｈ−ピラノ（３’，４’：６，７）インドリジノ（１，２−ｂ）キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン、４−エチル−４−ヒドロキシ−、（Ｓ）−）及びトポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ）−Ｉ阻害剤（Ｒａｐｉｓａｒｄａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２，  ４３１６−４３２４，  ２００２）、並びに３−（５’−ヒドロキシメチル−２’フリル）−１−ベンジルインダゾール（ＹＣ−１）（Ｙｅｏ，  Ｅ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９５，  ５１６−５２５，  ２００３）が含まれる。ＨＩＦ−１α阻害剤の別の例には、診療所に導入される段階にあるＰＸ−４７８と呼ばれる薬剤（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ，−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロリド）が含まれる（Ｇａｒｂｅｒ  Ｋ，  Ｊ  Ｎａｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９７，  １１１２−１１１４，  ２００５；Ｗｅｌｓｈ，  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ３，  ２３３−２４４，  ２００４）。
【００１２】
本発明の方法は、ＨＳＣに関与する広範な疾患を処置及び予防するために使用することができ、更には、悪性疾患及び非悪性疾患の処置において、細胞及び／又は実質臓器移植の免疫学的受容の誘導において（例えば、ドナー固有の免疫寛容の状態の誘導において）、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の予防又は軽減において、ドナー白血球輸注（ＤＬＩ）プラットフォームの提供において、酵素欠損疾患の処置において、自己免疫疾患の処置において、並びに遺伝子組換えＨＳＣの移植において、現行の療法よりも毒性を有意に少なくして、ドナー幹細胞移植片の移植を向上させるために（例えば、造血細胞の完全又は混合キメラ現象を確立するために）使用することができる。短期免疫変調剤（例えば、Ｔ細胞枯渇抗体）と好適に組み合わせることにより、同種及び異種ドナー由来の造血幹細胞を植え付ける方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は一般的に、ＨＳＣ及び転移した癌細胞を含めた、骨髄の正常又は悪性造血幹細胞（ＨＳＣ）を除去する改良された方法に関する。本発明は又、宿主対象の骨髄内の癌を処置する改良された方法にも関する。ドナーＨＳＣを移植する前に骨髄内のＨＳＣ及び低酸素癌細胞を枯渇させる既存の方法は、選択的ではなく、従って骨髄内のその他の細胞も著しく枯渇させることから、かなり毒性の副作用を有する。しかし、本発明の一部として、ＨＳＣ、並びに骨髄に転移した癌細胞等のその他の細胞は、それらが骨髄の低酸素ニッシェ内に存在するという事実から、選択的に枯渇させることができることが発見された。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、低酸素条件下においてのみ活性を有する薬剤を使用して、骨髄内の低酸素細胞を選択的に標的化して枯渇させ、それによって既存の療法に伴う望ましくない副作用を低減又は排除する。本発明は、血液悪性腫瘍及び骨髄に転移した癌等の種々の非固形悪性腫瘍の処置に特に有用である。特定の実施形態において、本発明の方法は、固形腫瘍を有さない対象の骨髄において低酸素細胞を選択的に除去するために（即ち、血液（非固形）悪性腫瘍のみを処置するために）使用される。
【００１４】
本発明をより容易に理解できるようにするため、以下の用語を以下の通りに定義する。
【００１５】
「枯渇」という用語は、ＨＳＣを不活化する、殺傷する、又はＨＳＣの数を減少させることを指す。
【００１６】
「選択的に」という用語は、非低酸素環境に存在する細胞（例えば、非ＨＳＣ前駆細胞、成熟血液細胞）を標的化せずに、低酸素細胞（例えば、ＨＳＣ及び／又は癌細胞）を標的化する薬剤の能力を指す。
【００１７】
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）という用語は、自己保全及び自己再生の広範な能力を有し、且つ種々の前駆細胞型に分化することができる多能性細胞を指す。この用語は、後期形成ＣＡＨＣ等の原始ＨＳＣを包含する。
【００１８】
「自己再生」という用語は、外見及び分化能が同一である後代をこれらの細胞が産生できることを指す。
【００１９】
「癌」という用語は、悪性の成長が固形腫瘍ではなく、且つ宿主対象が固形腫瘍を有していないことを条件に、異常及び未処置の細胞分割により生じる何れかの悪性成長を指す。この用語は、血液癌（例えば、白血病及びリンパ腫）、並びに骨髄に転移した癌（例えば、神経芽腫細胞及び乳癌細胞）を包含するが、これらに限定されない。
【００２０】
「ＣＡＦＣ」という用語は、未熟ＨＳＣである敷石状領域形成細胞を指す。これらの細胞は、「早期形成」及び「後期形成」ＣＡＦＣを包含する。「後期形成ＣＡＦＣ」は、通常、２５日目以降（例えば、２８〜３５日）に培養物に現れ、間質層に存在する未熟ＨＳＣである。これらの細胞は、「敷石状領域」として知られるコロニーを形成する。
【００２１】
「低酸素細胞」という用語は、例えばｐＯ２  １０ｍｍＨｇ未満の酸素張力等の低酸素化環境に存在する細胞を指す。「低酸素活性化プロドラッグ」という用語は、当初は不活性であるが、低酸素又は低酸素化環境において活性化される薬剤を指す。
【００２２】
「完全キメラ現象」又は「造血幹細胞の完全キメラ現象」という用語は、宿主対象において成功したドナーＨＳＣの植付けを指し、例えば血液におけるドナーＨＳＣ及び優勢な集団は、宿主において９９％を超える割合を占める。
【００２３】
「混合キメラ現象」又は「造血幹細胞の混合キメラ現象」という用語は、移植受容体において種々の割合で植え付けられたドナーＨＳＣ及び定住する宿主ＨＳＣの状態を指し、例えば血液におけるドナーＨＳＣ及び優勢な集団は、１％〜９９％のレベルを占める。
【００２４】
上述の通り、本発明の方法は、成熟血液細胞を殆ど枯渇させることなく、骨髄内の低酸素細胞（例えば、ＨＳＣ及び／又は癌細胞）を選択的に枯渇させる改良された方法であって、既存の骨髄切除術より毒性が少ない方法を提供する。選択的に枯渇されるＨＳＣは、後期形成敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）等の原始ＨＳＣを含めた、骨髄内の何れかのＨＳＣである場合がある。
【００２５】
本発明の一実施形態において、本方法は、宿主細胞において低酸素細胞（例えば、ＨＳＣ及び／又は癌細胞）を選択的に枯渇させた後、ドナーＨＳＣを対象に植え付けることを伴う。ドナーＨＳＣは、ドナー骨髄、ドナー抹消血細胞（例えば、サイトカイン動員抹消血細胞）、及びドナー臍帯血を含めた何れかの好適な供給源に由来する場合があり、当該技術分野で既知の何れかの好適な手段を使用して得られる場合がある。例えば、サイトカイン動員抹消血細胞からドナーＨＳＣを得るには、サイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ；顆粒球コロニー刺激因子）をドナーに投与してもよく、これにより、ＨＳＣは骨髄から抹消血へと移動し、そこでこれらの細胞を、宿主受容体に投与する前に回収することができる。更に、ドナー細胞は、同種又は異種ドナーを含めた何れかの好適なドナーから得る場合がある。ドナーＨＳＣは又、遺伝子組換えＨＳＣである場合もある。
【００２６】
本発明の方法は、毒性を有する薬剤を低酸素細胞（例えば、ｐＯ２  約１０ｍｍＨｇ未満の低酸素張力にて存在する細胞）に投与することによって、骨髄内の低酸素細胞（例えば、ＨＳＣ及び／又は癌細胞）を選択的に枯渇させるように設計される。このような薬剤は、種々のものが当該技術分野で周知である。例えば、本薬剤は、生体内還元剤、又は低酸素環境にて活性化される低酸素活性化プロドラッグである場合がある。このような薬剤には、ベンゾトリアジン及びベンゾトリアジン関連化合物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本薬剤は、チラパザミン（ＴＰＺ）（１，２，４−ベンゾトリアジン−３−アミン１，４−ジオキシド）、又はチラパジンの類似体若しくは誘導体である。チラパザミン及びその他のベンゾトリアジン化合物は、当該技術分野で周知であり、例えば、内容が参考として本明細書で援用される、米国特許第３，９５７，７７９号、米国特許第５，１７５，２８７号、米国特許第５，６７２，７０２号、米国特許第６，１２１，２６３号、米国特許第６，３１９，９２３号、米国特許第６，０６３，７８０号、米国特許第６，２７７，８３５号、及び国際特許第ＷＯ  ９７／２０８２８号に記載の通り、調製及び投与することができる。
【００２７】
低酸素細胞における還元時に明らかな細胞毒を産生するその他のプロドラッグには、ニトロ芳香族化合物（例えば、ミソニダゾール；１−メチル−３−（２−ニトロ−１−イミダゾリル）−２−プロパノール及びＲＢ  ６１４５；２−ニトロイミダゾール）（Ａｄａｍｓ，  Ｇ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ２９，  ２３１−２３８，  １９９４）、アントラキノン（例えば、ＡＱ４Ｎ；１，４−ビス−［［２−（ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ］５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン）（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｈ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．  １２，  １１９−１３４，  １９９３；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｈ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｖ．  ３４，  ５８１−５９２，  ２００２；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８２，  １９８４−１９９０，  ２０００）、２−ニトロイミダゾールに対するクロロキノリンＤＮＡ標的単位（例えば、ＮＬＣＱ−１；４−［３−（２−ニトロ−１−イミダゾリル）−プロピルアミノ］−７−クロロキノリンヒドロクロリド）（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｍ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ５７１４−５７２０，  ２００３）、ジニトロベンズアミドマスタード（例えば、ＳＮ  ２３８６２；５−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ）−２，４−ジニトロベンズアミド及びＳＮ  ２８３４３）（Ｓｉｉｍ，  Ｂ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  ９，  ３５７−３６９，  １９９７；Ｈｅｌｓｂｙ，  Ｎ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １６，  ４６９−４７８，  ２００３）、ニトロベンジルホスホルアミデートマスタード（ニトロ複素環式ホスホルアミデート）（Ｂｏｒｃｈ，  Ｒ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４３，  ２２５８−２２６５，  ２０００）、ニトロ複素環式メチル４級塩（ニトロアリールメチル４級塩）（Ｔｅｒｃｅｌ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４４，  ３５１１−３５２２，  ２００１）、コバルト（ＩＩＩ）錯体（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｗ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ２９，  ３２３−３２７，  １９９４）、及びインドールキノン（Ｅｖｅｒｅｔｔ，  Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６３，  １６２９−１６３９，  ２００２）が含まれる。
【００２８】
別の実施形態においては、ＨＩＦ−１αを阻害することによりＨＳＣを不活化するか、又は枯渇させる能力を有する薬剤が、本発明に含まれる。ＨＩＦ−１α阻害剤の例には、カンプトテシン類似体（例えば、１Ｈ−ピラノ（３’，４’：６，７）インドリジノ（１，２−ｂ）キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン、４−エチル−４−ヒドロキシ−、（Ｓ）−）及びトポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ）−Ｉ阻害剤（Ｒａｐｉｓａｒｄａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２，  ４３１６−４３２４，  ２００２）、並びに３−（５’−ヒドロキシメチル−２’フリル）−１−ベンジルインダゾール（ＹＣ−１）（Ｙｅｏ，  Ｅ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９５，  ５１６−５２５，  ２００３）が含まれる。ＨＩＦ−１α阻害剤の別の例には、診療所に導入される段階にあるＰＸ−４７８と呼ばれる薬剤（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ，−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロリド）が含まれる（Ｇａｒｂｅｒ  Ｋ，  Ｊ  Ｎａｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９７，  １１１２−１１１４，  ２００５；Ｗｅｌｓｈ，  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ３，  ２３３−２４４，  ２００４）。
【００２９】
本発明の低酸素活性化剤は、何れかの好適な投与経路を介して投与される場合がある。当業者により理解される通り、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に最適な経路は、患者又は所望の結果により異なる場合がある。本発明の薬剤に好適な投与経路には、例えば注入又は輸注による、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髄、又はその他の非経口投与経路が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注入による腸内及び局所投与を除いた投与様式を意味し、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、及び胸骨内の注入並びに輸注が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の低酸素活性化剤は、好ましくは、好適な薬理学的形態（例えば、薬学的組成物）で対象に投与される。例えば、本薬剤は、移植片、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤等、即時的な放出から薬剤を保護する担体及びその他の薬学的に許容される化合物と共に配合してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用してもよい。このような配合物は、当業者に周知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８を参照されたい。
【００３１】
非経口投与では、投与を容易にし、投与量を均一にするために投与量単位形態で薬剤を配合するが特に有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置する特定の個体の単位投与量として好適な物理的に区別された単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生成するように計算された所定の量の活性化合物を含む。
【００３２】
非経口投与する場合、本発明の薬剤は、通常、薬学的に許容されるビヒクルと共に、単位投与量注入形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で配合される。このようなビヒクルは、通常、無毒で非治療的である。このようなビヒクルの例には、水；生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液等の水性ビヒクル；並びに固定油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、及びゴマ油）、オレイン酸エチル、及びミリスチン酸イソプロピル等の非水性ビヒクルがある。ビヒクルは、溶解度、等浸透圧、及び化学安定性を向上させる物質（酸化防止剤、緩衝剤、及び保存剤等）等の付加剤を含む場合がある。
【００３３】
本発明の低酸素活性化剤は、骨髄の低酸素細胞（例えば、ＨＳＣ又は癌細胞）の選択的な枯渇を達成する量で、且つ達成するのに十分な期間にわたり、対象に投与される。本薬剤の適切な投与量は、疾患状態、緩和する病態の重篤度、並びに個体の年齢、性別及び体重等の要因により異なる。既知の化学療法の投与計画の調整は、当該技術分野の通常の技術範囲内に十分含まれる。更には、何れの特定の対象においても、個体の要求及び本組成物の投与を管理又は監督する担当者の専門的な判断に応じて、時間の経過と共に固有の投与計画を調整しなければならないことも理解されるであろう。本薬剤は、単回で投与される場合もあれば、種々の間隔で投与するためにより少量の複数の用量に分割される場合もある。
【００３４】
本発明の低酸素活性化剤は、単独で投与してもよければ、その他１つ以上の治療薬又は医薬品と組み合わせて（例えば、ドナー骨髄、ドナーサイトカイン動員抹消血、又はドナー靭帯血の投与前、又は投与後に）、投与してもよい。例えば、本発明の一実施形態において、本薬剤は、宿主の免疫細胞を枯渇させるか、又は不活化する機能を有する、Ｔ細胞枯渇抗体等の短期免疫変調剤と組み合わせる場合がある。
【００３５】
本発明の低酸素活性化剤は又、放射線治療又は化学治療等の１つ以上の骨髄切除術と組み合わせて投与してもよい。本薬剤は又、１つ以上の化学療法剤と組み合わせて投与される場合もある。このような補助療法は、本低酸素活性化剤の投与前、投与後、又は投与と同時に投与される場合がある。具体的な化学療法剤には、オールトランス型レチノイン酸、アミノグルテチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（マイエラン）、カルボプラチン、カルボプラチナム（パラプラチン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、カペシタビン、ＣＣＮＵ（ロムスチン）、クロラムブシル（ロイケラン）、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ；クラドリビン、ロイスタチン）、シス−プラチン（プラチノール）、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎｌ  ＣＴＸ）、クロロホスファミドヒドロキシ尿素、シタラビン（アラ−Ｃ；シトシンアラビノシド）、ダウノルビシン（セルビジン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキシアミド）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ジエチルスチベストロール、ドセタキセル（タキソテール）、ドキシフルリジン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エチニルエストラドイル、エトポシド（ＶＰ−１６、ベプシド）、フルオロウラシル（５−Ｆｕ；フロクスリジン、フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド、フルキシメステロン、ゲムシタビン（ジェムザール）、ヘルセプチン（トラスツズマブ；抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、イダルビシン、イフォスファミド（Ｉｆｅｘ）、インターフェロンα、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイオプロリド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロンア、酢酸メゲストロール、メルフェラン（アルケラン）、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、メトトレキレート（ＭＴＸ：アメトプテリン）、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサトロネ（ノバントロン）、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン）、プリカマイシン（ミトラマイシン）、プレドニゾン、プロカルバジン（マツラン；Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）、リツキサン（リツキシマブ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テルチポシド、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）、チオテパ、トミュデックス（ラルチトレキセド）、トポテカン（ハイカムチン；（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル」−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’、４’］、トレオスルファン（オバスタット）、バルルビシン、ビンブラスチン（ＶＬＢ；ベルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）、ビンデシン、及びビノレルビン（ナベルビン）が含まれる��、これらに限定されない。
【００３６】
低酸素癌細胞及びＨＳＣの選択的な枯渇は、当該技術分野で既知の何れかの手段によって試験することができる。一実施形態において、ＨＳＣの枯渇は、当該技術分野で周知の検定である敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）検定を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される（例えば、Ｎｅｂｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；及びＰｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９を参照されたい）。或いは、ＨＳＣの枯渇は、対象に移植された類遺伝子標識付きＣＤ４５．１骨髄の長期植付けによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定してもよい。長期植付けは、ドナー固有マーカーを担持する抹消白血球の割合に応じて、骨髄移植後１６週間以降における安定したドナー型キメラ現象により定義される。何れの場合にも、選択的な枯渇は、所望の臨床効果を達成しなければならない。骨髄をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合には、ドナーＨＳＣの部分的又は完全な植付けを促進するために、３０％〜１００％の宿主ＨＳＣを枯渇させるのが望ましい。例えば、３０％以上の宿主ＨＳＣ、より好ましくは５０％以上の宿主ＨＳＣ、最も好ましくは７５％以上の宿主ＨＳＣを枯渇させるのが望ましい。免疫疾患又は遺伝子疾患を処置するためにｉｎ  ｖｉｖｏ投与する場合は、疾患の症状の予防又は軽減によって枯渇を測定してもよい。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明の方法及び組成物は、悪性疾患及び非悪性疾患の処置において、細胞及び／又は実質臓器移植の免疫学的受容の誘導において（例えば、ドナー固有の免疫寛容の状態の誘導において）、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の予防又は軽減において、ドナー白血球輸注（ＤＬＩ）プラットフォームの提供において、現行の療法よりも毒性を有意に少なくして、ドナー幹細胞移植片の移植を向上させるために（例えば、造血細胞の完全又は混合キメラ現象を確立するために）使用することができる。
【００３８】
ドナー幹細胞移植片の移植を促進することに加えて、本発明の方法及び組成物は、広範な悪性及び非悪性疾患を処置及び予防するために使用してもよい。このような疾患には、自己免疫疾患、酵素欠損症、及び非固形癌が含まれる。具体的に、癌には、骨髄に転移した癌（例えば、神経芽腫細胞及び乳癌細胞）、並びに血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、及び骨髄異常形成症候群）が含まれる場合があるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の方法は又、遺伝子組換えドナーＨＳＣをＨＳＣ枯渇宿主骨髄に投与することにより広範な疾患を処置又は予防するために使用される場合もある。具体的には、本発明の方法は、ドナー幹細胞移植片の移植を促進するか、又は容易にする（例えば、造血細胞の完全又は混合キメラ現象を確立する）ために、及び移植片の拒絶反応（例えば、細胞、組織、又は臓器の移植片）を処置又は予防するために使用してもよい。
【００４０】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に例示するが、これらの実施例は、更に限定するものと解釈してはならない。本出願全体を通して引用される全ての図面並びに全ての参考文献、特許、及び特許出願公開の内容は、参考として本明細書で明示的に援用される。当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定実施形態の多くの等価物を認識するか、又は極日常的な実験を使用して確認することができるであろう。このような等価物は、以下の実施例及び特許請求の範囲に包含されるものとして意図される。
【実施例】
【００４１】
以下の実施例は、ＨＳＣ（例えば、後期敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）として知られる原始ＨＳＣ）が骨髄内の画定された低酸素ニッシェに存在し、且つ種々の疾患を処置するために低酸素活性化細胞毒を使用して選択的に標的化することができることを実証する。ヘキスト灌流勾配（実施例１）にわたって、原始ＣＡＦＣ３５日目サブセットの頻度における約１００倍の差が観察されたが、これは、骨髄幹細胞ニッシェの位置を画定することを目的としたその他の手法で認められた２〜４倍の差よりも有意に大きなものである（Ｌｏｒｄ，  １９９０；Ｎｉｌｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。種々の分類断片間のＣＡＦＣ３５日目頻度の相対変化は、ＣＡＦＣ検定がマウスの骨髄のＨＳＣを定量化する信頼性の高い手段であることを更に確認するために、これらの同じ集団が長期照射移植片受容体を再増殖させる能力に反映させた。ＨＳＣの低酸素の性質を裏付ける証拠（実施例２）は、染料の静脈内送達後におけるヘキスト蛍光の分布が酸素勾配と類似するという見解と一貫する。
【００４２】
材料及び方法
マウス：提案された実験の大部分では、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｌｙ５．２マーカー使用）を使用した。マウスは特定病原菌が不在のマイクロアイソレーター環境にて維持した。幾つかのｉｎ  ｖｉｖｏ再増殖検定では、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＢ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪ類遺伝子マウス（Ｌｙ５．１マーカー使用）をドナーとして使用した。
【００４３】
骨髄、胸腺、回収：２％ＦＢＳ及び１０Ｍｍ  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤を含むＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ＋）中で後肢の脛骨及び大腿骨を破砕することによって、骨髄細胞をマウスから回収した。単一の細胞懸濁液を得るために、骨髄細胞、胸腺細胞、及び脾細胞に２１ゲージ針を通した。血球計で全生存細胞（トリパン青色を使用）及び全ＷＢＣ（３％酢酸における結晶バイオレットを使用）を計数することによって、骨髄及び胸腺の細胞充実度を測定した。
【００４４】
マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのヘキスト灌流の測定：文献に既述されている方法に従って、マウスにおけるヘキスト染料の灌流を実施した（Ｄｕｒａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；Ｏｌｉｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｏｌｉｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。簡潔に言えば、活性染料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで排除するには不十分とされる期間である、骨髄回収の１０分前及び５分前に、２種類の投与量（０．８ｍｇ／マウス）のヘキスト染料（Ｓｉｇｍａ）を、イソフルラン麻酔下で眼窩後方洞からＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈注射した。脛骨及び大腿骨を氷のすぐ上に置き、予め冷却した乳鉢及び乳棒にて破砕し、濾過して、冷ＨＢＳＳ＋に懸濁させた。胸腺を回収し、細胞に２１ゲージ針を通して胸腺細胞懸濁液を作製した。骨髄及び胸腺におけるヘキスト蛍光の２重発光波長を、フローサイトメトリーを使用し、ヨウ化プロピジウム陽性細胞を排除して対数スケールで評価した。
【００４５】
ピモニダゾール結合：骨髄及び胸腺における低酸素細胞の検出を、Ｏｌｉｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．に記載の方法を使用したピモニダゾール結合によって実施した（Ｏｌｉｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｏｌｉｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。簡潔に言えば、ピモニダゾール塩酸塩（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を１２０ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに腹腔内注射し、注射から３時間後に骨髄並びに胸腺を回収した。これらの細胞集団を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎのキットを使用して固定及び透過処理し、マウスモノクローナル抗ピモニダゾール抗体（ＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅＴＭ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８  ２次抗体で染色した。幾つかの実験では、細胞へのピモニダゾール結合を検出するために、マウスモノクローナルＦＩＴＣ標識抗ピモニダゾール抗体を使用した。染色の蛍光強度は、フローサイトメトリーを使用して測定した。
【００４６】
ＳＰ細胞の単離：骨髄細胞を、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．に記載の通り、ヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ）で染色した（Ｇｏｏｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。簡潔に言えば、細胞を遠心分離し、ペレット化して、ＤＭＥＭ＋中で１０６／ｍＬの細胞で再懸濁した後、５μｇ／ｍＬの最終濃度でヘキスト３３３４２を添加した。陰性対照として、５０μＭのベラパミルを少量のアリコートに添加した。次いで、全ての細胞を３７℃にて９０分間培養した後、遠心分離によってペレット化し、冷ＨＢＳＳ＋中に再懸濁した。その後、これらの細胞を抗体の染色（更なる選択が必要な場合）又は細胞の分類に使用した。フローサイトメトリー及び分類分析を実施する前に、試料を２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、生育不能細胞を識別した。そして、既述の通り（Ｇｏｏｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）、デュアルレーザーＭｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．［米国コロラド州フォートコリンズ］）でフローサイトメトリー分析を行い、ヘキスト流出ＳＰ細胞を検出した。
【００４７】
フローサイトメトリー：フローサイトメトリー分析及び分類は、デュアルレーザーＭｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）で実施した。ヘキスト染料を紫外線励起により励起し、その蛍光発光を、４５０／６５  ＢＰ（４５０／６５ｎｍバンドパスフィルター）及び６３０／３０  ＢＰ（６３０／３０ｎｍロングパスバンドパスフィルター）の光学フィルター（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）を使用し、２つの波長にて測定した。発光波長の分離には、５１０  ＤＣＬＰ（５１０ｎｍロングパスバンドパスフィルター）を使用した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）蛍光も、６３０  ＢＰ（紫外線励起により励起）により測定した。ヘキスト「青色」は、ヘキスト３３３４２  ＤＮＡ含有量分析の標準的な分析波長である４５０  ＢＰフィルターを使用する。ＰＩ陽性の死亡及び瀕死細胞は、ヘキスト「赤色」（６３０  ＢＰ）軸の右端に見られ、排除する。ヘキスト染料からの蛍光を、ＳＰ細胞の場合は線形スケールで、ヘキスト灌流勾配の場合は指数スケールで得た。前方散乱及び側方散乱のゲーティングは、厳密ではなく、赤血球及び破片のみを排除した。
【００４８】
敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）検定：マウス間質細胞株ＦＢＭＤ−１細胞（Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ［オランダ  ロッテルダム］のＤｒ．  ＲｏｂＰｌｏｅｍａｃｈｅｒより入手）を、ＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号３１９８０−０３０）、１０−６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、カタログ番号Ｈ−０１３５）、１０−４Ｍ  β−メルカプトエタノール（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１９４７０５）、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号１０４３７−８２８）、１００単位／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、カタログ番号１７−５０２Ｅ）中で、０．３％ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．［米国ミズーリ州セントルイス］、カタログ番号Ｇ−２５００）コーティング９６平坦ウェルプレート上に平板培養し、５％ＣＯ２中で３７℃にて培養した。間質細胞がコンフルエンシーに達したら、回収したＢＭＣを実験群毎に保存し、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号３１９８０−０３０）、１０−６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、カタログ番号Ｈ−２２７０）、１０−４Ｍ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ−７５２２）、２０％ウマ血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、カタログ番号１４−４０３Ｆ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、カタログ番号１７−５０２Ｅ）中で平板培養し、５％ＣＯ２中で３３℃にて培養した。実験群につき６〜９種類の希釈液（希釈液につき２０個のウェル）を使用した。少なくとも１種の敷石状細胞を含む陽性ウェルを、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ倒立顕微鏡でオーバーレイしてから７〜３５日目に計数した。大腿骨当たりのＣＡＦＣの数及び９５％信頼間隔を、Ｆａｚｅｋａｓ  ｄｅ  Ｓｔ．  Ｇｒｏｔｈ  （１９８２）に記載の方法により、ＬＣＡＬＣコンピュータプログラム（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＬＤＡコンピュータプログラムを使用して計算した。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける長期再増殖：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける長期再増殖検定（ＬＴＲＡ）は、当該技術分野で周知の標準的な原始細胞検定である。ＬＴＲＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験幹細胞集団の長期再増殖能力を測定する検定である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９８０）。この検定は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＳＣの選択的な枯渇を測定又は確認するために使用することができる。再増殖検定は、記載の通りに（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｌｌａｙ，  １９９０）類遺伝子Ｌｙ５．１／Ｌｙ５．２系を使用することによって実施した。ＬＴＲＡの判定のため、Ｂ６（Ｌｙ５．１）マウス由来の種々の数の骨髄試験細胞（１×１０３〜１×１０６）を、受容体Ｂ６−Ｌｙ５．２マウスから回収した２×１０５の非ＳＰ支持骨髄細胞と混合した。これらの混合物を、５〜１０個の致死照射Ｂ６Ｌｙ５．２受容体（１０００  ｃＧｙ投与量ＴＢＩ）からなる群に注入した。１つの群Ｌｙ５．２に対照細胞のみを注入することによって、内因性骨髄再増殖の不在を判定した。選択した時点（３〜６ヶ月）において受容体を採血し、白血球をＬｙ５．１抗体で染色することによって、ドナー細胞の再増殖能力細胞を判定した。更に、ドナー由来のＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞を、抗ＣＤ３、抗Ｂ２２０、抗Ｇｒ−１、及び抗Ｍａｃ−１抗体で共染色することによって判定した。
【００５０】
統計：ＣＡＦＣ検定の統計分析では、ポアソンのＬＤＡ計算をＣＡＦＣの頻度に使用し、各サブセットの９５％信頼限界（ＣＬ）を計算した。使用可能なデータが単一の実験のみのデータである場合は、重複しない９５％のＣＬを有意な結果と解釈した（ｐ＜０．０５）。
【００５１】
（実施例１）  異なる造血サブセットが、血管からの距離及び酸素化のレベルを反映することが可能であるヘキスト染料灌流勾配に沿って分布する証拠
幾つかの以前の動物研究は、低酸素症に関連する固体腫瘍の灌流について蛍光顕微鏡下で組織セクションを視覚化するために、拡散可能染料ヘキスト３３３４２の静脈注射を使用した。腫瘍血液灌流が変動して「急性」又は「一過性」の低酸素症となる状況とは別に（Ｂｒｏｗｎ，  １９７９）、殆どの報告は、Ｔｈｏｍｌｉｎｓｏｎ及びＧｒａｙの古典的モデル（Ｔｈｏｍｌｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ，  １９５５）に従って、慢性低酸素症又は拡散限定低酸素症を示すために、血管から比較的一定における低酸素細胞の位置を報告している（Ｂｅｒｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｃｈａｐｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；Ｄｕｒａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；ｖａｎ  Ｌａａｒｈｏｖｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。Ｐｅｇｇｙ  Ｏｌｉｖｅと同僚は、腫瘍組織が細胞懸濁液に解離することと、ヘキスト染色の強度が酸素化の程度をどのように模倣するかについて提供された証拠とに従って、フローサイトメトリーを使用してヘキスト染料拡散勾配をより定量的に特徴付けることができる見事な一連の実験を記載している（Ｏｌｉｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【００５２】
現在の研究では、骨髄細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのヘキストの摂取量を評価するために、同様の手法を使用した。低酸素マーカー及び酸素電極測定により極めて低酸素であることを最近示した組織である胸腺の灌流と、これらの結果を比較した（Ｈａｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【００５３】
活性染料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで排除するには不十分であると判定された期間である骨髄を摂取する１０分及び５分前に、２投与量（０．８ｍｇ／マウス）のヘキスト染料をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈注射した。脛骨及び大腿骨を氷のすぐ上に配置し、事前に冷却した乳鉢及び乳棒において破砕し、濾過して、冷ＨＢＳＳ＋に懸濁させ、骨髄及び胸腺におけるヘキスト蛍光の２重発光波長を、ヨウ化プロピジウム陽性細胞を排除して対数スケールで評価した。同じマウスから摂取した胸腺細胞についても分析を実施した。
【００５４】
図１Ａは、３つの対数の蛍光強度を覆う骨髄についてヘキスト染色の広い分布を示す。次いで、Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒと同僚（Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）により、ヘキスト蛍光の減少に共ない（Ｒ２〜Ｒ７）６つの異なるゲート領域に基づいてＦＡＣＳ機械上で細胞を単離し、一連の限定希釈液で９６ウェルプレートにおいて骨髄間質細胞株の融合培養物の上に分類した細胞を平板培養することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖能を評価した。造血サブセットのスペクトルを反映するように幾つかの過去の研究から十分に確立された週間隔において、敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）の頻度を決定した。具体的には、７日目及び１４日目のＣＡＦＣは、早期前駆細胞及びＣＦＵ脾臓１２日目の細胞に対応し、一方、後期形成２８日目及び３５日目のＣＡＦＣは、移植受容体において長期再増殖することができるＨＳＣと関連する（Ｄｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；Ｄｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；Ｄｏｗｎ  ａｎｄ  Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  １９９３；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【００５５】
図１Ｂ及び図１Ｃに示す通り、培養物において２８日〜３５日に現れる原始ＣＡＦＣサブセットは、ヘキスト蛍光の減少と共に漸進的に豊富になり、一方、７日目のＣＡＦＣサブセットの頻度は、比較的一定のままであった。最高にヘキスト染色された細胞では（Ｒ２領域）、ＣＡＦＣが全体的に欠乏しており、その理由はおそらくは、この断片の殆どが、循環血液からなるためである。この勾配の最遠端部から分類された細胞も、競合的ｉｎ  ｖｉｖｏ再生検定において分析した。この場合、Ｌｙ５．１類遺伝子マウスから単離した細胞を、照射の急性毒性作用を軽減するために１０５の短期再増殖非ＳＰ受容体タイプ支持細胞と共に、異なる細胞濃度において致死照射した（１０Ｇｙ）Ｌｙ５．２受容体に静脈注射した。ＢＭＴの１８週後のドナータイプ血液細胞キメラ現象の評価は、原始ＡＦＣ周波数結果による結果を示した。最低ヘキスト蛍光（勾配のＲ７領域）を有する細胞は、断片化されていない骨髄細胞全体より１０倍高い再増殖能力を示した。対照的に、高い蛍光（を有する細胞勾配のＲ３領域）は、低レベルの植付け（図２）を示した。
【００５６】
（実施例２）  側方集団（ＳＰ）骨髄細胞は、低酸素細胞マーカーについて陽性である。
【００５７】
本発明の研究では、還元性２−ニトロイミダゾール化合物ピモニダゾールを使用し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与される時、抗ピモニダゾール抗体によって識別することができる（図３）低酸素領域（１０ｍｍＨｇのｐＯ２未満）において付加物を形成する。
【００５８】
骨髄及び胸腺において低酸素細胞を検出するために、１２０ｍｇ／ｋｇのピモニダゾールをマウスに腹腔内注射し、注入の３時間後に骨髄及び細胞を回収した。骨髄細胞をヘキスト３３３４２でｉｎ  ｖｉｔｒｏで染色し、染料から流出するＳＰ細胞（非ＳＰ細胞と共に）をＦＡＣＳによって単離した。次いで、染色及びフローサイトメトリーによる検出のために、胸腺細胞及び分類した骨髄集団を固定し、透過処理し、１次マウス抗ピモニダゾール抗体（ＨｙｐｏｘｙＰｒｏｂｅ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びヤギ抗マウス２次と共に培養した。
【００５９】
胸腺は、ヘキスト注入後に非常に不十分に灌流していることが判明し、予期されたように、胸腺細胞の大部分は、低酸素マーカー（ピモニダゾール付加物）について陽性であり、胸腺はｉｎ  ｖｉｖｏで低酸素である（図４）というＨａｌｅらによる以前の報告（２００２）を確認した。
【００６０】
骨髄断片では、非ＳＰ細胞は、ＳＰ細胞に関する染色と比較して、ピモニダゾール染色のごく小さい変位を有していた。ＳＰ細胞内では、低染料流出断片が抗ピモニダゾール染色の増大を示し、高染料流出ＳＰ細胞が、最高のピモニダゾール染色を有していた（図５）。以前に考察した通り、高染料流出ＳＰ細胞（「チップ」ＳＰ細胞）は、マウスの骨髄において最も原始的な幹細胞である。
【００６１】
まとめると、これらのデータは、マウスの骨髄における最も原始的な造血細胞は、比較的低酸素であり、酸素勾配の最低端部の位置と一貫するという第１の直接的な証拠を示す。従って、ヘキスト染色は、酸素の拡散を励起するようであり、血液供給から最も遠く、且つ図６に示す通り骨内膜領域にあるとしてＨＳＣを空間的に画定する。
【００６２】
（実施例３）  ｉｎ  ｖｉｖｏのチラパザミン処置による骨髄における後期形成敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）サブセットの選択的枯渇
幾つかの低酸素活性化プロドラッグが現在開発されており、その中で、ＳＲ４２３３としても知られるベンゾトリアジン、チラパザミン（ＴＰＺ）は、最も広範に研究されており、放射線治療及び化学治療と組み合わせて段階ＩＩ及びＩＩＩの臨床試験に現在入る程度の治療効率を有する（Ｒｉｓｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；ｖｏｎ  Ｐａｗｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。低酸素条件下において、ＴＰＺは、ベンゾトリアジニル遊離基及びその他の反応中間物に還元され、最終的には、ＤＮＡ２重らせんの分裂及び細胞死に至る（図７）。しかし、酸素が存在する時、ＴＰＺ遊離基は、非毒性の親化合物に再び酸化される（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  ２００４；Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，  ２００２）。
【００６３】
従って、本研究は、多くのＨＳＣは低酸素であるため、ＨＳＣはＴＰＺ処置に対して過敏になることが可能であるという考えから生じた。そのため、３〜４の雄Ｂ６受容体マウスの年齢整合（放射線／ＴＰＺ治療について１５〜１６週齢、及びＢｕｓｕｌｆｅｘ処置について９週齢）群は、１）生理食塩水のみ、２）１．５ｍｇ／ｍＬにおいて生理食塩水に溶解し、４日にわたって毎日３０ｍｇ／ｋｇの投与量で２００μＬ／１０ｇ体重において腹腔内注射されたＴＰＺ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ［米国ミズーリ州セントルイス］、ロット番号０８２Ｈ４０２９）、又は３）殺菌生理食塩水で希釈されたＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド３３％ｗｔ／ｗｔ及びポリエチレングリコール４００、６７％ｗｔ／ｗｔ（Ｏｒｐｈａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．［米国ミネソタ州ミネトンカ］、ロット番号６２１６１−００５−３１）に溶解し、２日にわたり毎日投与量当たり１００μＬ／１０ｇ体重容積又は１０ｍｇ／ｋｇ（全投与量＝２０ｍｇ／ｋｇ）において腹腔内注射された６ｍｇ／ｍＬブスルファンからなるＢｕｓｕｌｆｅｘを受け取った。１３７Ｃｓ源（Ｇａｍｍａ  Ｃｅｌｌ４０、Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ［カナダ  オタワ］）を使用して、９４ｃＧｙ／ｍｉｎの投与率及び４００ｃＧｙの全投与量おいて、全身照射（ＴＢＩ）をマウスに与えた。
【００６４】
最終処置の２４時間後、マウスを犠牲にし、大腿骨及び脛骨を除去し、乳鉢及び乳棒で破砕し、濾過して、ＨＢＳＳ＋（２％ＦＢＳ及び１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含むハンクス液、Ｇｉｂｃｏ）における骨髄細胞の単一細胞懸濁液。大腿骨当たりの有核細胞収率を決定した。
【００６５】
図８に示す通り、チラパザミン（ＴＰＺ）でｉｎ  ｖｉｖｏで処置されたマウスから保存した骨髄におけるＣＡＦＣ含有量の評価は、この薬剤による後期対早期形成ＣＡＦＣサブセットがより多く枯渇することを示した。この実験は、ＴＰＺが、ＨＳＣサブセットに対応する原始ＣＡＦＣをどのように選択的に枯渇させるかを示す。受容体における後期形成ＣＡＦＣサブセットの枯渇の程度として（培養物において２８〜３５日に展開する）、他のタイプの薬剤での以下の処置が、骨髄移植後の長期ドナータイプ造血キメラ現象の程度と強い相関を示し（Ｄｏｗｎ  ａｎｄ  Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  １９９３，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２１：９１３−９２１；Ｄｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １９９４，  ７０：６１１−６１６；Ｄｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｂｌｏｏｄ  ８６：１２２−１２７；Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ  ＧＲ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：５４７０−５４７８；ＰｌｏｅｍａｃｈｅｒＲＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０：２３６−２４５）、従って、ＴＰＺ処置は、移植されたＨＳＣの植付けを容易にすることが予期される。
【００６６】
（実施例４）  チラパザミン処置による低酸素造血細胞及び白血病幹細胞を枯渇させる例証、並びにドナー造血幹細胞移植及び悪性疾患の根絶の結果
図９は、酸素勾配との逆相関として、どのようにチラパザミン（ＴＰＺ）が骨髄内の造血細胞を枯渇させ、それにより、ＨＳＣが、低酸素微環境ニッシェに存在することによってより過敏になるかに関して概略的表示を示している。この方式は、ＴＰＺが、移植に続いてドナーＨＳＣの移植及び再増殖をどのように容易にするかを示す。ある悪性幹細胞（例えば、白血病の）が同じ低酸素ニッシェに存在する可能性があるため、これらの幹細胞は、ＴＰＺ処置後に同様に枯渇され、疾患の根絶を可能にする（図１０）。
【００６７】
（実施例５）  ５−フルオロウラシル処置は、骨髄におけるヘキスト拡散勾配を摂動させ、ＳＰ表現型を失うことになる。
【００６８】
代謝拮抗物質５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、造血系に対する効果に関して最も広範に調査された薬剤の１つである確立された化学療法剤である。興味が持たれるのは、循環する前駆細胞集団を枯渇させるｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の処置の差別的な効果である。Ｄａｖｉｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎと同僚（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，  １９９１）は、照射された受容体に長期移植することができる骨髄ＨＳＣが５−ＦＵに対して耐性であり、従って通常の定常状態条件下において干満な状態又は循環しない状態におそらくはあるということを確立するためにこの薬剤を使用することを率先した先駆者に含まれる。しかし、この耐性は、５−ＦＵの第２投与が第１投与の２日〜４日後に送達される時、劇的に失われ、後続期間は恒常的プロセスを包含し、それにより、休止しているＨＳＣは、その優勢な後代の損失に応答して、活動増殖に入るように促進される。
【００６９】
５−ＦＵは、ｃキット配位子で励起することに続いて、ＨＳＣを同様に枯渇させることができることが以前に示されている（ｖａｎ  Ｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。免疫委任前駆細胞に対する単一投与量５−ＦＵの選択的毒性も、早期形成ＣＡＦＣサブセットの標識付き枯渇によって明瞭に示され、一方、原始後期形成ＣＡＦＣの骨髄含有量は、図１１に例示されたように正常なままである。
【００７０】
マウスＨＳＣの励起に対する５−ＦＵの十分に説明された効果は、本研究が、これがヘキスト染料の骨髄灌流にどのように関係するか、並びにＳＰ表現型を示す細胞の数を決定するのを促進した。図１２は、ヘキスト勾配が、この薬剤の投与後６日の期間にわたり、どのように大きく短縮されるかを示す。この図は、図１３に示されたように、ＳＰ細胞の割合及び全骨髄含有量の劇的な減少と一致するようである。
【００７１】
機能ＨＳＣの数は５−ＦＵによって依然として影響を受けていないため、これらの細胞は、ヘキストを流出させる能力をもはや有さず、従って通常のＳＰ特性を失っていると結論付けることができる。この染料を静脈注射する際の蛍光の増大及びヘキスト勾配の短縮は、図１４に図で示されるようにＨＳＣの酸素化が向上したことを示唆する。これは、従来の５−ＦＵ処置が、酸素消費及び代謝活性前駆細胞を破壊し、固体腫瘍の放射線処置中に生じる状況とそれほど異ならない状況であるＨＳＣニッシェの再酸素化を可能にすることを示す（Ｂｅｇｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９；Ｆｉｅｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８；Ｈｏｗｅｓ，  １９６９；Ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｋａｌｌｍａｎ，  １９６８）。
【００７２】
【数１】
2009510165.tif 000002
【００７３】
【数２】
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【００７４】
【数３】
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【００７５】
【数４】
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【００７６】
【数５】
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【００７７】
【数６】
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【００７８】
【数７】
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【００７９】
【数８】
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【００８０】
【数９】
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【００８１】
【数１０】
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【００８２】
【数１１】
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【００８３】
【数１２】
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【００８４】
【数１３】
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【００８５】
【数１４】
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【００８６】
【数１５】
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【００８７】
【数１６】
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【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１−１】図１は、ヘキスト拡散勾配による種々の骨髄断片の分離を示す。（Ａ）細胞を単離する分類ゲートでヘキスト染料（５分及び１０分にて０．８ｍｇ）を静脈注射した後の青色対赤色の蛍光強度。（Ｂ）種々の断片についての培養物における時間の経過に伴うＣＡＦＣの頻度。（Ｃ）赤色ヘキスト蛍光を関数とした早期及び後期形成ＣＡＦＣの頻度。
【図１−２】図１は、ヘキスト拡散勾配による種々の骨髄断片の分離を示す。（Ａ）細胞を単離する分類ゲートでヘキスト染料（５分及び１０分にて０．８ｍｇ）を静脈注射した後の青色対赤色の蛍光強度。（Ｂ）種々の断片についての培養物における時間の経過に伴うＣＡＦＣの頻度。（Ｃ）赤色ヘキスト蛍光を関数とした早期及び後期形成ＣＡＦＣの頻度。
【図２】図２は、高（Ｒ３）及び低（Ｒ７）ヘキスト灌流骨髄から分離されたドナー細胞（Ｌｙ５．１／ＣＤ４５．１）の長期再増殖を示す。骨髄細胞の用量応答は、１０Ｇｙ照射受容体（Ｌｙ５．１／ＣＤ４５．２）におけるＢＭＴの１８週後における骨髄（ＧＲ−１／ＣＤ１１ｂ）植付けについてのものである。Ｔ細胞（ＣＤ３）及びＢ細胞（Ｂ２２０）のキメラ現象においても、同様の結果を得た。各細胞用量群のマウス数が示されている。
【図３】図３は、低酸素張力におけるピモニダゾール代謝を示す。この２−ニトロイミダゾールは無毒であるが、抗体により認識することができる付加物を低酸素条件にて形成する。この低酸素マーカーは、臨床用及び実験用の両腫瘍試験片において低酸素細胞を測定するために通常使用されている。
【図４】図４Ａは、低ヘキスト灌流を示す。図４Ｂは、胸腺における低酸素細胞マーカーを使用した陽性の染色を示す。
【図５】図５は、骨髄における低酸素サイドポピュレーション（ＳＰ）細胞の証拠を示す。３時間前に１２０ｍｇ／ｋｇピモニダゾール（ｎ＝５）を注入されている、又は注入されていないマウスに由来する、ヘキスト染料流出に基づく３つの異なる領域（非ＳＰ（Ｒ１）、高ＳＰ（Ｒ２）及び低ＳＰ（Ｒ３））を分類した後、マウス抗ピモニダゾール１次抗体及びヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ２次抗体で細胞内を染色した。又、Ｂ細胞に対するヤギ抗体の交叉反応性を排除するために、分類した細胞をラット抗ＣＤ４５Ｒ  ＰＥ接合抗体でも染色した。
【図６】図６は、比較的低酸素な張力（低酸素）の微環境における幹細胞ニッシェを特定した、血液供給に関連する酸素拡散のモデルを示す。
【図７】図７は、チラパザミンが低酸素細胞を選択的に殺傷する機序を示す。チラパザミン（ＴＰＺ）は、一電子（１ｅ−）レダクターゼの基質である。結果として得られる遊離基（ＴＰＺ・）は、酸化水酸遊離基（ＯＨ・）又は酸化ベンゾトリアジニル遊離基（ＢＴＺ・）に即座に崩壊する。酸素が存在する場合、ＴＰＺ遊離基は、親化合物に再び酸化して、超酸化物遊離基（Ｏ２−・）を生成する（この図は、Ｂｒｏｎｗ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ，  ２００４から転載したものである）。
【図８】図８は、４×３０ｍｇ／ｋｇのチラパザミン（ＴＰＺ）投与、２×１０ｍｇ／ｋｇのＢｕｓｕｌｆｅｘ（ＢＸ）投与、又は４Ｇｙガンマ照射を受けた後における未処置（生理食塩水注入）対照の割合として表した後肢当たりのＣＡＦＣ含有量を示すグラフである。データは、９５％信頼限界で３〜４匹の個々のマウスから保存した骨髄細胞試料の平均を表す。
【図９】図９は、ＴＰＺにより低酸素正常ＨＳＣを優先的に枯渇させた後、移植したドナーＨＳＣを植え付けて再増殖させる概念図である。
【図１０】図１０は、低酸素であるためにＴＰＺの処置を受けやすい悪性ＨＳＣを優先的に枯渇させた後、疾患を根絶させる概念図である。
【図１１】図１１は、５−ＦＵが早期形成ＣＡＦＣを選択的に枯渇させることを示す。５−ＦＵは、１５０ｍｇ／ｋｇの単回用量でＢ６受容体に腹腔内注射した。２日目に大腿骨及び脛骨の骨髄をマウスから回収して保存し、後肢当たりのＣＡＦＣ含有量を推定するために平板培養した。誤差のバーは、９５％信頼間隔を表す。
【図１２】図１２は、５−ＦＵ処置後の骨髄におけるヘキスト灌流の増大を示す。５−ＦＵ注射後の種々の時間に、ヘキスト染料を静脈注射し（５分及び１０分にて０．８ｍｇ）、ヘキスト摂取量の強度について骨髄を分析した。作成したグラフには、下方１％レベルの細胞の赤色蛍光強度が示され、５−ＦＵ注射後１日目〜６日目にヘキスト勾配が短縮される様子が示されており、処置後に残存する細胞の酸素化が向上する証拠が示されている。
【図１３】図１３は、５−ＦＵ処置後に骨髄のＳＢ細胞の数が減少することを示す。５−ＦＵ注射後の種々の時間に、骨髄を回収し、有核細胞を計数して、ヘキスト染料中で培養した後、ＳＰ尾部の高率（下方ゲート）及び低率（上方ゲート）染料流出細胞について分析した。ＳＰ細胞の割合は１日目〜４日目に増大したように見えるが、細胞の収率は減少を続けたことから、後肢当たりの実際のＳＰ細胞の数は、少ないままであった。
【図１４】図１４は、５−ＦＵ処置後にＨＳＣが再酸素化する概念図を示す。このモデルは、ＨＳＣの酸素化の増大に伴うヘキスト拡散勾配の減少、並びにＨＩＦ−１αによって調節されるＡＢＣＧ２の発現によってＳＰ表現型を測定した場合におけるＳＰ表現型の喪失の両方についての説明を提供している（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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