(57)【要約】癌の悪性度のステージにより同定される分泌タンパク質の同定方法を記載する。タンパク質は最初に、どのような遺伝子にも挿入されうる蛍光タンパク質含有ベクターを用いてそれをトラップすることにより同定する。分泌タンパク質は最初にその蛍光により同定する。特定の悪性度の腫瘍を同定する分泌タンパク質を単離し、それらが癌の進行のマーカーとして機能し得るか評価する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の分泌タンパク質マーカーの同定方法であって、以下のステップ、
a) 種々の悪性度を有するが、悪性ではない状態へと復帰した複数のヒト癌細胞を、レポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターでトランスフェクトすること、
b) レポーター連結タンパク質をin vitroで分泌するレポーター発現細胞株を同定すること、
c) 各々の同定されたレポーター発現細胞株のクローンを動物に移植すること、
d) レポーター連結タンパク質を血清中に分泌する移植されたレポーター発現細胞株クローンを同定すること、および
e) 低〜高までの種々の悪性度ステージのヒト癌細胞に特異的な、ステップd)からの分泌レポーター連結タンパク質を同定すること、
を含み、
ここで同定されたタンパク質が癌の各ステージのマーカーである前記方法。
【請求項２】
f) 悪性ではないヒト癌細胞が悪性の種々のステージへと再度復帰するときの癌の進行に特異的な分泌レポーター連結タンパク質を同定すること、
をさらに含み、
ここで同定されるタンパク質が癌の進行および再発のマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
g) 悪性へと進行する悪性度の低いヒト癌細胞においてin vitroおよびin vivoで分泌されるレポーター連結タンパク質を比較することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
レポーターがGFPであり、かつステップb)がさらに以下のステップ、
b1) 正常状態へと復帰したトランスフェクト癌細胞をRFPで形質転換すること、
b2) GFP＋細胞を単離しクローニングすること、
b3) GFP＋クローンを培養すること、
b4) GFP＋蛍光発光クローンを同定すること、および
b5) 同定された蛍光発光クローンからGFPタンパク質を分泌する細胞を同定すること、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップd)の後にさらに、レポーター-タンパク質またはGFP-タンパク質をin vivoで分泌する細胞のライブラリーを調製することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子が、GFPまたはβ-ラクタマーゼである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
レポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターがHIV-1レンチウイルス-GFP-トラップベクターである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
HIV-1レンチウイルス-GFP-トラップベクターがpZR-1またはpZR-2である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
移植されるクローンが、前立腺癌、精巣癌、肺癌、肝臓癌、絨毛癌、乳癌、または結腸癌の細胞から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により同定されるタンパク質。
【請求項１１】
細胞がランダムにトラップされた遺伝子を有し、その各々がレポーター遺伝子を含む、種々の悪性度のヒト癌細胞を含むライブラリー。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１３】
細胞のサブセットが、分泌タンパク質をコードすることのできるレポータートラップ遺伝子を含む、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１４】
レポータートラップ遺伝子が、in vitroにて分泌されるタンパク質を発現することができる、請求項13に記載の細胞ライブラリーからのレポータートラップ遺伝子ライブラリー。
【請求項１５】
レポータートラップ遺伝子が、in vivoにて分泌されるタンパク質を発現することができる、請求項13に記載の細胞ライブラリーからのレポータートラップ遺伝子ライブラリー。
【請求項１６】
癌細胞がある特定の悪性度であるときに、レポータートラップ遺伝子がin vitroまたはin vivoで分泌されるタンパク質を発現することができる、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１７】
癌細胞は、該細胞が浸潤または転移する能力を有するような悪性度である、請求項16に記載のライブラリー。
【請求項１８】
レポータートラップ遺伝子が、in vitroおよびin vivoで分泌され、かつ該レポータートラップ遺伝子を発現する細胞を移植した齧歯類の血清から検出可能なタンパク質を発現することができる、請求項17に記載のライブラリー。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により同定される癌進行のタンパク質マーカーを発現することができる単離された遺伝子のライブラリーであって、ここで該遺伝子が腫瘍進行の特定の段階において、レポーター遺伝子または遺伝子トラップベクターを含むものではない、前記ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の分泌タンパク質マーカーの同定方法を提供する。詳細には、本発明は、遺伝子発現の変化を検出可能な遺伝子トラップ技術を使用する。
【背景技術】
【０００２】
癌による死亡の大部分は、遅い診断が原因であり、その時点では現在の治療法が有効ではない。質量分析および他の技術を用いるプロテオミックスは、血清、血漿および尿中のタンパク質の特徴付けを可能にするが、大部分の種類の癌に関して有用な早期マーカーは依然として不足している(非特許文献１、２)。
【０００３】
歴史的には、腫瘍マーカー候補は腫瘍細胞抽出物に対してモノクローナル抗体を用いて同定された(非特許文献３)。こうした候補のスクリーニングと評価が新規腫瘍マーカーを同定する伝統的な方法であった。しかしながらこの技術には制限がある。多数のマーカー候補を評価するのは大変な労力を要しそして時間がかかる。
【０００４】
また、ある特定の種類の癌を感知できそれに特異的であるマーカーを同定するのは非常に難しい。大部分の種類の癌については、診断、予後、ステージ決定(staging)、再発性および微小残存病変の検出のためのマーカーを同定するのは依然として困難である。
【０００５】
現在、血清分析に使用されているSELDI-TOF質量分析技術は、1μg/mL未満の濃度の血清成分を検出することができない(非特許文献４)。この濃度範囲は、循環血液中の既知の腫瘍マーカーの濃度よりも約1000倍高い(表1)(非特許文献４):
【表１】
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【０００６】
遺伝子トラップベクターは内在性遺伝子をマーキングし、遺伝子発現の変化の検出を可能にする。ある遺伝子をマーキングすることにより、ある特定のプロモーターおよびそれに対応する遺伝子の研究が可能になる。しかしながら、遺伝子トラップベクターは、その大部分がプラスミドまたはレトロウイルス主体のベクターであり、効率が低いこと、発現期間が短いことまたは分裂細胞に限定されることによる制限を受けてきた。最近開発されたHIV-1主体のレンチウイルスベクターはこうした障害を克服し、in vitroにおける遺伝子送達にますます使用されるようになっている。こうしたベクターは、中枢神経系(CNS)、造血細胞系、網膜、筋肉、肝臓、および膵臓ランゲルハンス島の細胞において、in vivoで長期遺伝子発現をもたらした(非特許文献４)。
【０００７】
HIV-1レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞のゲノムに組み込まれ、導入遺伝子を安定して発現する。２種のHIV-1主体のレンチウイルスベクター誘導体であるpZR-1およびpZR-2が、in vitroおよびin vivoでの哺乳動物細胞における遺伝子トラッピングのために開発された(非特許文献４)。こうしたレンチウイルス遺伝子トラップベクターは、β-ラクタマーゼまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)のいずれかのレポーター遺伝子を含み、それは長い3'末端反復のU3領域に挿入されている。トラップベクターのいずれもが、適当な感染手法を用いて宿主ゲノム中に容易に組み込まれ、GFPまたはβ-ラクタマーゼ発現をもたらす。この技術は、トラップ細胞の迅速な富化とクローニングを容易にする。レポーター遺伝子は、上流の、細胞特異的プロモーターにより駆動される(非特許文献４)。
【非特許文献１】Rai et al., Ann. NY Acad. Sci. (2004) 1022:286-294
【非特許文献２】Diamandis, J. Natl. Cancer Inst. (2004) 96:353-356
【非特許文献３】Fidler、Cancer Research (1978) 38:2651-2660
【非特許文献４】Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3651:3656
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法は遺伝子トラップ技術を利用して、種々の悪性度(例えばヒト早期癌)、癌の進行および癌の再発のマーカーとして機能する分泌タンパク質を同定する。ある代表的な実施形態では、最初に、悪性ヒト癌の正常状態へと復帰した変種（Jiangら, Proc. Am. Assoc. for Cancer Res. (2004) 45:937）を、上記のGFP-遺伝子トラップベクターでトランスフェクトする。GFP発現細胞株を同定して、それらがGFPトラップタンパク質を分泌するかを決定する。GFP連結タンパク質を分泌する細胞のクローンをマウスに移植して、血清中にGFP連結タンパク質が分泌されるか判別する。この悪性ではない変種に特異的なGFP連結分泌タンパク質を同定するために、かかるクローンをin vivoにて評価する。その後の実験で、動物を用いて、悪性ではないヒト変種が種々の悪性度ステージへと再度復帰する癌の進行に特異的な分泌GFP連結変種を同定する。悪性に向かって進行しているヒト細胞において、in vivoおよびin vitroでの分泌GFP連結タンパク質を比較するために、悪性度の低いヒト細胞変種について並行in vitro実験を行う(Jiang、上記)。
【０００９】
一の態様において、本発明は、癌の分泌タンパク質マーカーの同定方法であって、以下のステップ、a) 種々の悪性度であるが、悪性ではない状態へと復帰した複数のヒト癌細胞を、レポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターでトランスフェクトすること、b)レポーター連結タンパク質をin vitroにおいて分泌するレポーター発現細胞株を同定すること、c) 各々の同定されたレポーター発現細胞株のクローンを動物に移植すること、d) レポーター連結タンパク質を血清中に分泌する移植されたレポーター発現細胞株クローンを同定すること、およびe) 低〜高までの種々の悪性度ステージのヒト癌細胞に特異的な、ステップd)からの分泌レポーター連結タンパク質を同定すること、を含み、ここで同定されたタンパク質は癌の各段階のマーカーである前記方法を提供する。一の実施形態において、この方法はさらに、ステップf) 前記悪性ではないヒト癌細胞が悪性の種々のステージへと再度復帰するときの癌の進行に特異的な分泌レポーター連結タンパク質を同定することを含む。このとき、同定されたタンパク質は癌の進行および再発のマーカーである。この方法はまた、ステップg)悪性へと進行する悪性度の低いヒト癌細胞においてin vitroおよびin vivoで分泌されるレポーター連結タンパク質を比較することを含むことができる。
【００１０】
一部の実施形態では、レポーターはGFPであり、かつステップb)はさらに以下のステップ、b1) 正常状態へと復帰したトランスフェクト癌細胞をRFPで形質転換すること、b2) GFP＋細胞を単離しクローニングすること、b3) GFP＋クローンを培養すること、b4) GFP＋蛍光発光クローンを同定すること、およびb5) 同定された蛍光発光クローンからGFPタンパク質を分泌する細胞を同定すること、を含む。
【００１１】
この方法はさらに、ステップd)の後に、レポーター-タンパク質またはGFP-タンパク質をin vivoにおいて分泌する細胞のライブラリーを調製することを含むことができる。
【００１２】
本明細書に提供する方法におけるレポーター遺伝子は、GFPまたはβ-ラクタマーゼであり得る。レポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターは、HIV-1レンチウイルス-GFP-トラップベクター、例えばpZR-1またはpZR-2であり得る。移植されるクローンは前立腺癌、精巣癌、肺癌、肝臓癌、絨毛癌、乳癌、または結腸癌の細胞から選択され得る。
【００１３】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載の方法により同定されたタンパク質を提供する。
【００１４】
さらに別の態様においては、本発明は、細胞がランダムにトラップされた遺伝子を有し、その各々がレポーター遺伝子を含む、種々の悪性度のヒト癌細胞を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。ヒト癌細胞のあるサブセットが分泌タンパク質をコードすることのできるレポータートラップ遺伝子を含むと考えられる。ある実施形態において、レポータートラップ遺伝子は、in vitroにおいて分泌されるタンパク質を発現することができる。一部の実施形態では、レポータートラップ遺伝子は、in vivo において分泌されるタンパク質を発現することができる。レポータートラップ遺伝子は、癌細胞がある特定の悪性度であるときにin vitroまたはin vivoにおいて分泌されるタンパク質を発現することができる。場合により、癌細胞は浸潤または転移する能力を有するような悪性度である。そのような細胞においては、レポータートラップ遺伝子は場合により、in vitroおよびin vivoにおいて分泌され、かつ該レポータートラップ遺伝子を発現する細胞を移植した齧歯類の血清から検出され得る、タンパク質を発現することができる。
【００１５】
一の態様においては、本発明は、本明細書に開示する方法のいずれかにより同定された癌の進行のタンパク質マーカーを発現することのできる単離された遺伝子のライブラリーを提供する。このとき、前記遺伝子は腫瘍進行の特定の段階においてレポーター遺伝子または遺伝子トラップベクターを含むものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法はレポーター遺伝子を含むHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターを利用し、これを種々の悪性度のヒト癌細胞にトランスフェクトする。一の態様において、正常状態に復帰しそれゆえ「悪性ではない」ヒト癌細胞とみなされるヒト癌細胞に特異的なタンパク質を同定する。細胞がこの悪性ではない状態から僅かに悪性に向かって進行することから、低い悪性度のヒト癌細胞をトランスフェクトすることができる。種々の悪性度のステージへと再度復帰する悪性ではないヒト癌細胞は、癌の進行と再発を同定するのに適している。したがって、「種々の悪性度」という用語は、悪性度の種々のステージにあるおよび／または悪性ではない癌細胞を言う。
【００１７】
本発明の遺伝子トラップベクターは好ましくはHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクターである。かかるベクターはレポーター遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)またはβ-ラクタマーゼを含む。他のレポーター遺伝子を使用することもできる。レポーター遺伝子は、別のフルオロホア、例えば青色蛍光タンパク質(BFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現することもできる。レポーターをコードするヌクレオチド配列をレンチウイルス遺伝子トラップベクターに機能的に連結するあらゆる方法が本発明の範囲内にある。GFPを発現するレポーター遺伝子が好ましい。
【００１８】
本発明の方法は、第１にin vitroステップを含む。レポーター連結タンパク質を分泌するレポーター発現細胞株は、in vitroで、したがって無血清培地中で同定する。レポーター-レンチウイルスベクターを発現する癌細胞（好ましくは正常状態に復帰した癌細胞）を培養し、レポーター発現について(好ましくはGFP蛍光について)分析する。レポーターにより同定された培養物を分離し増殖させる。レポーター連結タンパク質を分泌する培養物からの培地を濃縮し、次いで濃縮された培地の成分を(例えばネイティブポリアクリルアミドゲルを用いることにより)分離し、電気泳動および蛍光分析にかけて、レポーター連結分泌タンパク質の位置を決定することができる。その後、同定することのできるレポーター連結タンパク質を分泌するクローンをin vivoにてさらに評価する。
【００１９】
In vivo評価には、レポーター連結タンパク質を分泌することが特定された細胞を実験動物（例えばヌードマウス）に移植することが含まれる。実験動物は典型的には齧歯類、例えばマウス、ラット、またはウサギであるが、他の哺乳動物(例えばサル)であってもよい。検出できる量のレポーター連結タンパク質が分泌され、そのことにより細胞を同定することができるのが好ましい。細胞を動物中で増殖させ、血清を回収し、これを上に記載のようにin vitroにて分析するのと同様に分析する。
【００２０】
本発明はまた、レポーター連結分泌タンパク質を分泌する細胞の種々の悪性度および進行の分析を提供する。好ましくは細胞はレポーターで形質転換されたものであり、好ましくはこのレポーターはタンパク質に連結されたレポーターとは異なるものである。例えば、レンチウイルス遺伝子トラップベクターがGFPをレポートする遺伝子を含む場合、細胞を異なるレポーター遺伝子(例えばRFP)で形質転換することは有益であろう。レポーター連結分泌タンパク質を伴う癌細胞は、in vivoにおいてその悪性状態へと再度復帰することができ、そのような進行は遺伝子トラップベクターに含まれるのとは異なるレポーター遺伝子の発現を観察することにより追跡することができる。したがって血清サンプルを、腫瘍進行の種々のステージにおいて回収し、上に記載の方法を用いてレポーター連結分泌タンパク質の存在について分析することができる。このデータは、ヒト細胞が悪性へと再度復帰するにしたがい、in vivoでの悪性度の特定のステージにおいて、およびin vitroで継続的に、マーカー候補を同定するために使用することができる。
【実施例】
【００２１】
実施例１
ベクター構築およびウイルス製造
NL-neoプラスミドはNL 4-3分子クローンを主体としており、NsiI部位からBglII部位までの欠失を有する。pBKCMV (Stratagene)由来のSV40初期プロモーターおよびneo遺伝子配列を有する1,169-bp断片が、BamHI部位とXhoI部位の間に挿入されている。レンチウイルス主体の遺伝子トラップベクターを構築するために、緑色蛍光タンパク質 (GFP)を、XhoI部位とXbaI部位の間の長い3'末端反復(LTR)のU3領域に挿入し、ZR-2ベクター(図１)を得る(Lai、上記)。レポーター遺伝子の前にスプライス受容部位を配置し、上流の細胞特異的プロモーターからのその発現を可能にする。
【００２２】
融合転写産物を有効に翻訳させるために、遺伝子カセット中のポリアデニル化シグナルが融合遺伝子からの転写を停止させる(Lai、上記)。内部SV40初期プロモーターにより駆動される細菌性neo遺伝子は、レンチウイルス遺伝子トラップベクター中のBamHI部位とXhoI部位の間に配置され、これがG418選択を可能にする(Lai、上記)。さらに、pZR-2は、自己不活性化(SIN)レンチウイルス遺伝子トラップベクターとして作製され、ここでは3' LTRのU3領域が欠失されEGFP遺伝子により置き換えられている。SINプロウイルス中の長い末端反復の転写不活性化により複製-コンピテントウイルスによる可動化(mobilization)が妨げられると考えられる(Lai、上記)ことから、レンチウイルス遺伝子トラップベクターのこうした改変は、ベクター媒介遺伝子送達の安全性を高め、遺伝子の非分裂細胞への形質導入を促進するはずである(Lai、上記)。
【００２３】
HIV-1シュードタイプの調製のために、トランスフェクションキット(Stratagene)を用いて、ヘルパープラスミドDNA (5μg)、EnvプラスミドDNA(5μg)、およびベクタープラスミドDNA(5μg)をサブコンフルーエント状態の293 T細胞に共トランスフェクトする(Lai、上記)。トランスフェクションの24〜30時間前に、ウェル当たり約2×106個の細胞を6ウェルプレートに播種する。ウイルスストックは、トランスフェクションの60〜65時間後に回収し、0.45μm孔径フィルターで濾過し、分注し、−80℃にて冷凍する(Lai、上記)。
【００２４】
実施例２
種々の悪性度のヒト腫瘍細胞
種々のヒトクローンは記載されたように取得する(Jiang、上記)。
【００２５】
実施例３
レンチウイルスGFPベクターを用いたトランスフェクション
種々の悪性度のヒト腫瘍細胞にレンチウイルス遺伝子トラップベクターZR-2を形質導入する。細胞は、12ウェル培養皿中のポリ-L-リシン(Becton Dickinson)でコーティングされた12mmの丸いカバースリップ上で2.2mLの培地中で増殖させる。トラップされた細胞株を作製するために、上記のように、細胞をレンチウイルスZR遺伝子トラップベクターと共に37℃にて3〜5時間インキュベートする(Lai、上記)。G418選択の後に、薬剤耐性コロニーを24ウェルプレートに移し、コンフルーエント状態まで増殖させ、蛍光顕微鏡下でGFP発現について観察する。トラップを形質導入した細胞は、最大で100％がGFP陽性であり、このことは形質導入が非常に効率的であったことを示す(Lai、上記)。
【００２６】
実施例４
同所移植-前立腺
マウスをケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルで麻酔し、仰向けにする。弧状の皮膚弁を恥骨結合の直ぐ上に作り前立腺を露出させる。前立腺の周囲の筋膜を慎重に分離し、前立腺の２つの背面側部の葉を小さな外科用はさみを使用して小さな切開により露出させる。レンチウイルス性GFPを発現する前立腺癌細胞(106)を片方または両方の葉に注射する。6-0縫合糸を用いて腹部を閉じる。手術の全ての工程は7×解剖顕微鏡を用いて行う。
【００２７】
実施例５
同所移植-胸部
次に外科的同所移植を以下のように行う。マウスをケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルで麻酔し、仰向けにする。右の第２乳腺を同所移植に使用する。乳頭の内側に沿って小さく切開する。鈍的切開により乳房脂肪体を露出させる。次にレンチウイルスGFPを発現する細胞を注射する。皮膚を6-0絹縫合糸で閉じる。全ての工程は5×解剖顕微鏡の下で行った。
【００２８】
実施例６
同所移植-結腸
小さく正中切開し、腸の結腸盲腸部分を露出させる。結腸漿膜を除き、106個のGFP-レンチウイルス発現腫瘍細胞を注射する。腸を腹腔に戻し、6-0絹外科用縫合糸を用いて腹壁を閉じる。
【００２９】
実施例７
蛍光顕微鏡法
光学および蛍光顕微鏡分析は、キセノンランプパワーサプライを備えたNikon顕微鏡を用いて行う。水銀灯パワーサプライを備えたLeica ステレオ蛍光解剖顕微鏡モデルLZ12を使用することもできる。いずれの顕微鏡にもGFPフィルターセット(Chroma Technology、Brattleboro、VT)がある。顕微鏡写真は、Image Pro Plus Version 3.0ソフトウェア(Media Cybernetics、Silver Spring、MD)を用いて明るさとコントラストを加工する。
【００３０】
実施例８
蛍光イメージング
GFPおよびRFP蛍光の両方を同時に視覚化するために、励起をD425/60バンドパスフィルターおよび470 DCXR２色性ミラーにより生成する。発光された蛍光を長いパスフィルターGG475(Chroma Technology、Brattleboro、VT)により回収する。マクロイメージングはライトボックス(Lightools Research、Encinitas、CA)中で行う。GFPおよびRFP腫瘍の両方の蛍光励起は、ライトボックス中でスリット光ファイバーを用いて干渉フィルター(440+/-20 nm)を通して発生させる。蛍光は520nmロングパスフィルターを通して観察する。顕微鏡およびライトボックスからのイメージは、Hamamatsu C5810 3-チップ冷却カラーCCRカメラ(Hamamatsu Photonics Systems、Bridgewater、NJ)を用いてキャプチャーする。
【００３１】
実施例９
In vitroにおける分泌GFP連結タンパク質の同定
GFPレンチウイルスベクターを発現している、正常状態へと復帰したRFP-発現癌細胞のクローン(13)を24ウェルディッシュ中で培養する。各ウェルからのならし培地を回収し、最初に蛍光光度計中でGFP蛍光(励起490nm/発光510nm)について分析する。次にならし培地がGFP蛍光を発する培養物を6ウェルプレート中で増殖させる。こうしたGFP連結タンパク質分泌培養物からのならし培地を濃縮する。次いで濃縮培地をネイティブポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動にかける。蛍光下でゲルの写真を撮り、GFP連結分泌タンパク質の位置を決定する。次に同定することのできるGFP連結タンパク質を分泌するクローンをin vivoにおいてさらに評価する(下記参照)。
【００３２】
実施例１０
In Vivoにて分泌されたGFP連結タンパク質の同定
上記のような、in vitroにおいて特定のGFP連結タンパク質を分泌することが特定された、正常状態に復帰したRFP発現癌細胞のクローンを、上記のように、ヌードマウスに同所移植する。移植細胞を増殖させた動物からの血清を、上記のようにGFP連結タンパク質について分析する。血清からGFP連結分泌タンパク質が同定され得る癌細胞を、in vivoでその悪性状態へと再度復帰させ、これをRFP蛍光により追跡する。上記のように、腫瘍進行の種々のステージにおいて血清を回収し、GFP連結分泌タンパク質の存在について分析する。種々の悪性度および進行状態において細胞から分泌されるGFP連結分泌タンパク質全体を、ヒト細胞が悪性へと再度復帰する際の悪性の特定のステージのマーカー候補として、in vivoで、およびin vitroで継続的に分析する。
【００３３】
実施例１１
データ分析
ある特定の分泌GFP連結タンパク質の存在とある悪性ステージとの統計的有意性は、対応のあるt-検定により評価し、適当であれば分散分析(ANOVA)も使用する。悪性の初期ステージを次のように定義する。1) 5 mm未満の原発腫瘍、2) 1cm未満の原発腫瘍、3) 浸潤性局所領域型の癌の存在、4) 遠隔転移の存在。累積データを平均±SDおよび適当なp値で表現する。
【００３４】
実施例１２
研究に用いる動物
約500匹の無胸腺非近交系nu/nuヌードマウス(オス、5〜6週齢)を、種々の悪性度の移植細胞からのGFP-トラップ分泌タンパク質の分析のために使用する。
【００３５】
外科的同所移植(SOI)
安定してGFPを発現し、予めヌードマウス中で皮下増殖させた、細胞または組織(1 mm3)をヌードマウス中に外科的同所移植(SOI)により移植する。移植を施す臓器を適当に露出させた後に、8-0外科用縫合糸を用いて組織片を突き通し、それを適当な同所臓器に縫いつける。皮膚の切開を7-0外科用縫合糸を用いて１つの層として閉じる。手術中に、ケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルを麻酔のために使用する。上記手術の全工程は、7×拡大顕微鏡(Leica MZ6、Nussloch、Germany)を用いて行う。最後に、106〜107 個の細胞の50μL懸濁物を宿主臓器に注射する。
【００３６】
皮膚弁ウィンドウモデル
同所のGFP発現細胞を上腹壁の上の皮膚弁ウィンドウを介して可視化する。手術中に、ケタミン-キシラジン-マレイン酸アセプロマジン-カクテルを麻酔のために使用する。皮下の結合組織を分離して皮膚弁を解放する。皮膚弁を開くことにより、ほぼ透明のマウス体壁を介して内部の臓器を露出させることができる。この手法はイメージングを行う臓器の深さを減らすのみならず、緑色蛍光の散乱を大幅に低下させることができる。本発明者らは、注意深く滅菌手術手法を用いると病的状態や感染無しに週に３回ウィンドウを開いたり閉じたりすることができることを見出した。皮膚弁を局所的ネオスポリンで処置する。動物は、飲料水中のアンピシリンと共に、バリア施設内のラミナーフローラックで飼育する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図1は本発明のある実施形態を例示する実験フローチャートである。
【図２】図２は、Lai(上記)からのHIV-1レンチウイルス遺伝子トラップベクター系の構成要素を表す。(A)ベクター構築物。(i)遺伝子トラップベクターは、スプライス受容部位に続くレポーター遺伝子GFP(ZR-2)を含む。(ii) HIV-1レンチウイルス対照ベクター。BLAKはβ-ラクタマーゼをコードする遺伝子であり、SAはスプライス受容部位である。(B)ヘルパー(パッケージ化)構築物。(C)水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)をコードするエンベロープ構築物(Lai、上記)。
【図１】
2009510453.tif 000004
【図２】
2009510453.tif 000005
【国際調査報告】
2009510453.tif 000006
2009510453.tif 000007
2009510453.tif 000008
2009510453.tif 000009