(57)【要約】  新規なβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼヌクレオチド配列およびその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Nicotiana種または栽培品種の植物細胞内にキメラ遺伝子を導入してトランスジェニック植物細胞を作製することであって、該キメラ遺伝子は、以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメントを含む：
ｉ）植物発現可能プロモーター；
ｉｉ）下記：
（１）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第一のセンスＤＮＡ領域であって、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするヌクレオチド配列を含むか、またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択され、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む、ヌクレオチド配列；および
（２）該第一のＤＮＡ領域の相補体に少なくとも９５%の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第二のアンチセンスＤＮＡ領域
を含む転写可能ＤＮＡ領域であって、
該転写可能ＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ分子は、少なくとも、該第一のセンスＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ領域と、該第二のアンチセンスＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ領域との間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる転写可能ＤＮＡ領域である、転写可能ＤＮＡ領域；および
ｉｉｉ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域；
ｂ）場合により、トランスフォーメーションされていないNicotiana植物細胞よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有するトランスジェニックNicotiana植物細胞を同定すること；
ｃ）場合により、該トランスジェニックNicotiana植物細胞を再生してトランスジェニックNicotiana植物を得ること；
ｄ）場合により、トランスフォーメーションされていないNicotiana植物よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有するトランスジェニックNicotiana植物を同定すること
の工程を含む、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を生産する方法。
【請求項２】
Nicotiana種特異的ＸｙｌＴアミノ酸がNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴアミノ酸であり、該Nicotiana種が好ましくはNicotiana benthamianaである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドがNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴヌクレオチドであり、該Nicotiana種が好ましくはNicotiana benthamianaである、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸がNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸であり、該Nicotiana栽培品種が好ましくはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または６記載の方法。
【請求項８】
Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴ  ヌクレオチドがNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドであり、該Nicotiana栽培品種が好ましくはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1である、請求項１、６または７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項１または６から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
第一および第二のＤＮＡ領域が少なくとも５０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
第一および第二のＤＮＡ領域が少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を生産する方法であって、以下：
ａ）Nicotiana種または栽培品種の植物細胞または植物に一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を提供することであって、該二本鎖ＲＮＡ分子が二つのＲＮＡ鎖を含み、一つのＲＮＡ鎖が、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチド配列またはその相補体であって、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択され、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む；および
ｂ）該一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含まない、同じNicotiana植物細胞または植物に比べて低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有する、該一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含むNicotiana植物細胞または植物を同定すること
の工程を含む方法。
【請求項１３】
該二本鎖ＲＮＡが、Nicotiana種または栽培品種の植物細胞のゲノムにキメラ遺伝子を組み込むことによって該植物細胞または植物に提供され、トランスジェニック植物細胞を作製し、場合により、該植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る方法であって、該キメラ遺伝子が、以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをアンチセンス方向に含むＤＮＡ領域またはその相補体であって、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択され、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、アンチセンス方向に、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む、ＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
二本鎖ＲＮＡが、植物細胞のゲノムにキメラ遺伝子を組み込むことによって該植物細胞または植物に提供され、トランスジェニック植物細胞を作製し、場合により、該植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る方法であって、該キメラ遺伝子が、以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含むＤＮＡ領域であって、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、それが相補するNicotiana種特異的または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含み、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、センス方向に、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む、ＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
二本鎖ＲＮＡが、植物細胞のゲノムにキメラ遺伝子を組むことによって該植物細胞または植物に提供され、トランスジェニック植物細胞を作製し、場合により、該植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る方法であって、該キメラ遺伝子が、以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）下記：
ｉ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をアンチセンス方向に含む第一のＤＮＡ領域であって、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする第一のＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をアンチセンス方向に含み、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む、第一のＤＮＡ領域；
ｉｉ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をセンス方向に含む第二のＤＮＡ領域であって、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択され、該ヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む、第二のＤＮＡ領域
を含む転写可能ＤＮＡ領域であって、該転写可能ＤＮＡ領域の転写により生成するＲＮＡ分子が、少なくとも該第一のＤＮＡ領域に対応するＲＮＡ領域と、該第二のＲＮＡ領域に対応するＲＮＡ領域との間で塩基対形成することによって二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる転写可能ＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
Nicotiana種特異的ＸｙｌＴアミノ酸が、Nicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴアミノ酸であり、該Nicotiana種が、好ましくはNicotiana benthamianaである、請求項１２から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２から１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドがNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴヌクレオチドであり、該Nicotiana種が好ましくはNicotiana benthamianaである、請求項１２から１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項１２から１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸がNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸であり、該Nicotiana栽培品種が好ましくはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1である、請求項１２から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２から１５または２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドがNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドであり、該Nicotiana栽培品種が好ましくはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1である、請求項１２から１５、２０または２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項１２から１５、または２０から２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を生産する方法であって、以下：
ａ）以下：
ｉ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメント；
ｉｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、または配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメント；
ｉｉｉ）配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から１５１３個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；
ｉｖ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；
ｖ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；
ｖｉ）配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド配列；
ｖｉｉ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド配列；
ｖｉｉｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド配列；または
ｉｘ）配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０のいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド；
の群より選択される手段を用いて、第一のNicotiana種または栽培品種から得ることができるＤＮＡ配列をコードするＸｙｌＴタンパク質のフラグメントを同定すること
ｂ）該第一または第二のNicotiana種または栽培品種の植物細胞または植物に一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を提供することであって、該二本鎖ＲＮＡ分子が二つのＲＮＡ鎖を含み、一つのＲＮＡ鎖が、該ＸｙｌＴタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列より選択される２０から２１個の連続ヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチド配列またはその相補体から実質的になり、該２０から２１個の連続ヌクレオチドが、それぞれNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、または該２０から２１個の連続ヌクレオチドが、それぞれNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む；および
ｃ）該一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含まない同じNicotiana植物細胞または植物よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有する、該一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含むNicotiana種または栽培品種を同定すること
の工程を含む方法。
【請求項２５】
一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子の提供が、ＤＮＡフラグメントをコードするＸｙｌＴタンパク質のヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドの第一のヌクレオチド配列またはその相補体を含む一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を、植物細胞または植物に提供することによって達成され、該２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、または該２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つおよび該第一のヌクレオチド配列の相補体である第二のヌクレオチド配列を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
二本鎖ＲＮＡ分子が、植物細胞のゲノムにキメラＤＮＡを組み込むことによって該植物細胞または植物に提供され、トランスジェニック植物細胞を作製し、場合により該植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る方法であって、該キメラＤＮＡが、以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）以下：
ｉ）ＸｙｌＴタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補体を含む第一のセンスＤＮＡ領域であって、該２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、それぞれNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、または該２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、それぞれNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む第一のセンスＤＮＡ領域である；
ｉｉ）該第一のＤＮＡ領域の相補体と少なくとも９５%の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第二のアンチセンスＤＮＡ領域
を含む転写可能ＤＮＡ領域であって、
該転写可能領域から転写されたＲＮＡ分子が、少なくとも該第一のセンスＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ領域と、該第二のアンチセンスＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ領域との間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる転写可能ＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物を、別のNicotiana植物と交配して、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana子孫植物を得る工程をさらに含む、請求項１から２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
Nicotiana  ＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを同定する方法であって、以下：
ａ）Nicotiana種または栽培品種から得ることができるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを提供すること；
ｂ）以下の群：
ｉ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメント；
ｉｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメント；
ｉｉｉ）配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から１５１３個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；
ｉｖ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；
ｖ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するための、ＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；
ｖｉ）配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド配列；
ｖｉｉ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド配列；
ｖｉｉｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド配列；または
ｉｘ）配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０のいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するための、オリゴヌクレオチド；
から手段を選択すること
ｃ）該ゲノムＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡ、および該プライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、または該ゲノムＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡ、および該プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって、該Nicotiana種または栽培品種からＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを同定すること
の工程を含む方法。
【請求項２９】
Nicotiana  ＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを単離する方法であって、以下：
ａ）請求項２８記載の方法により該Nicotiana  ＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを同定すること、および
ｂ）該Nicotiana  ＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを単離すること
の工程を含む方法。
【請求項３０】
タンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するNicotiana  ＸｙｌＴアレルを同定する方法であって、以下：
（ａ）異なる植物系統のNicotiana種または栽培品種の集団、場合により突然変異を誘発された集団を提供すること；
（ｂ）請求項２８記載の方法により、該集団の各植物系統においてNicotiana  ＸｙｌＴアレルを同定すること；
（ｃ）該集団の各植物系統のタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを分析し、他の植物系統よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有する植物系統を同定すること；
（ｄ）植物系統におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の該低レベルのβ−１，２−キシロース残基を、特異的Nicotiana  ＸｙｌＴアレルの存在と相関づけること
の工程を含む方法。
【請求項３１】
タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を得る方法であって、以下：
ａ）請求項３０記載の方法によりタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するNicotiana  ＸｙｌＴアレルを同定すること；および
ｂ）選択したNicotiana植物系統に該Nicotiana  ＸｙｌＴアレルを導入すること
の工程を含む方法。
【請求項３２】
配列番号１２もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離されたＤＮＡフラグメント、またはNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分。
【請求項３３】
配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項３２記載の単離されたＤＮＡフラグメント、またはNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分。
【請求項３４】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離されたＤＮＡフラグメント、またはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分。
【請求項３５】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項３４記載の単離されたＤＮＡフラグメント、またはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分。
【請求項３６】
Nicotiana種またはNicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする、請求項２８記載の方法により得ることができる単離されたＤＮＡフラグメント。
【請求項３７】
Nicotiana種またはNicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む、請求項３６記載の単離されたＤＮＡフラグメント。
【請求項３８】
以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）以下：
ｉ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をアンチセンス方向に含む第一のＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする第一のＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドを含む第一のＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む第一のＤＮＡ領域；および
ｉｉ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をセンス方向に含む第二のＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする第二のＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをセンス方向に含む第二のＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む第二のＤＮＡ領域
を含む転写可能ＤＮＡ領域であって、
該転写可能ＤＮＡ領域の転写により生成するＲＮＡ分子が、少なくとも該第一のＤＮＡ領域に対応するＲＮＡ領域と、該第二のＲＮＡ領域に対応するＲＮＡ領域との間で塩基対形成することによって二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる転写可能ＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含むキメラ遺伝子。
【請求項３９】
以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをセンス方向含むＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含むキメラ遺伝子。
【請求項４０】
以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメント：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドまたはその相補体をアンチセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをアンチセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、該２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域
を含むキメラ遺伝子。
【請求項４１】
Nicotiana種特異的ＸｙｌＴアミノ酸が、Nicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴアミノ酸である、請求項３８〜４０のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４２】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４１のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４３】
Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドがNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴヌクレオチドである、請求項３８〜４２のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４４】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４３のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４５】
Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸が、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸である、請求項３８〜４０のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４６】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４０、または４５のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４７】
Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドが、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドである、請求項３８〜４０、４５、または４６のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４８】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４０または４５〜４７のいずれか１項記載のキメラ遺伝子。
【請求項４９】
請求項３８〜４８のいずれか１項記載のキメラ遺伝子を含む、Nicotiana植物細胞。
【請求項５０】
請求項４９記載のNicotiana植物細胞から実質的になるNicotiana植物。
【請求項５１】
請求項３１記載の方法により得られるNicotiana植物細胞または植物。
【請求項５２】
請求項５０または請求項５１記載のNicotiana植物の種子。
【請求項５３】
Nicotiana植物におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを減少させるための、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドを含む、その任意の部分の使用。
【請求項５４】
Nicotiana植物におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを減少させるための、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドを含むその任意の部分の使用。
【請求項５５】
Nicotiana種または栽培品種におけるＸｙｌＴ遺伝子またはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡを同定するための、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分の使用。
【請求項５６】
Nicotiana種または栽培品種におけるＸｙｌＴ遺伝子またはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡを同定するための、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分の使用。
【請求項５７】
Nicotiana種または栽培品種におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するＸｙｌＴ遺伝子のアレルを同定するための、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分の使用。
【請求項５８】
Nicotiana種または栽培品種におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するＸｙｌＴ遺伝子のアレルを同定するための、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分の使用。
【請求項５９】
Nicotiana種または栽培品種におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基に相関するＸｙｌＴ遺伝子のアレルを導入するための、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分の使用。
【請求項６０】
Nicotiana種または栽培品種におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基に相関するＸｙｌＴ遺伝子のアレルを導入するための、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）をコードする、ニコチアナ（Nicotiana）種および栽培品種由来の、特にニコチアナ・ベンタミアーナ（Nicotiana benthamiana）およびニコチアナ・タバカム栽培品種Petite Havana SR1（Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1）由来の新規なヌクレオチド配列、ならびに対応する未改変Nicotiana植物に比べて低レベルまたは変更されたパターンの免疫原性タンパク質結合Ｎ−グリカンを、特にタンパク質結合Ｎ−グリカンに低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有する改変されたNicotiana植物、特にNicotiana benthamianaおよびNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1植物を生産するためのそれらの使用に関するものである。このようなNicotiana植物は、内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子の発現を低下させることによって、例えば内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子の活性を改変することによって、タンパク質結合Ｎ−グリカンに低レベルのβ−１，２−キシロース残基を提供する、ＸｙｌＴ遺伝子の別のアレルに内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子を交換することによって、またはその任意の組み合わせによって得ることができる。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
抗体、ワクチン、ヒト血液製剤、ホルモン、成長調節因子などの価値を付加した組換えタンパク質を生産するためのトランスジェニック植物の使用は、動物および昆虫細胞培養、酵母、糸状菌、および細菌などのさらに慣例的な系に比べて多数の実際的利点、経済的利点、および安全性の利点があると言われている（Stoger et al., 2002; Twyman et al, 2003; Fischer et al., 2004に総説されている）。
【０００３】
タンパク質合成経路は、植物および動物において大部分は同じであるものの、翻訳後修飾、特にグリカン鎖構造に関して幾分差がある。したがって、植物由来の組換えヒトタンパク質は、哺乳動物に存在しない糖質基β（１→２）−キシロースおよびα（１→３）−フコースを有するが、多数のネイティブなヒト糖タンパク質に見出される末端ガラクトースおよびシアル酸残基を欠如する傾向にある（Twyman et al., 2003）。
【０００４】
ＵＤＰ−キシロースからタンパク質結合Ｎ−グリカンのコアβ結合型マンノースへのキシロースの転移を触媒する酵素は、β−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）である。ＸｙｌＴは、植物および一部の無脊椎動物種、例えばシストソーマ（Schistosoma）種（Khoo et al., 1997）およびカタツムリ（例えばMulder et al., 1995）  に独特な酵素であり、ヒトや他の脊椎動物にも存在しない。
【０００５】
Tezukaら（1992）は、シカモア（アセル・シュードプラタヌスL.(Acer pseudoplatanus L.)）のＸｙｌＴをキャラクタリゼーションした。
【０００６】
Zengら（1997）は、ダイズミクロソームからのＸｙｌＴの精製について記載した。ダイズＸｙｌＴ  ｃＤＮＡの部分だけが単離された（ＷＯ９９／２９８３５Ａ１）。
【０００７】
Strasserら（2000）およびＷＯ０１／６４９０１は、アラビドプシス（Arabidopsis）ＸｙｌＴ遺伝子の単離、コードされるＸｙｌＴタンパク質の推定アミノ酸配列、ならびにそのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ酵素活性を記載している。
【０００８】
ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡおよびＸｙｌＴ遺伝子の実験的に実証された配列および推定配列、その部分、または相同配列を同定する、以下のデータベースエントリーを確認することができる：
【０００９】
【表１】
2009529898.tif 000002
【００１０】
Strasserら（2004a）は、植物におけるＮ−グリコシル化経路のモデュレーションに関する二つのアプローチについて報告している：第一の転写後遺伝子サイレンシングは、高等真核生物におけるハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンへのオリゴマンノシド残基のプロセシングに関与する酵素であるβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）の発現をノックダウンして、Nicotiana benthamianaにおける複合Ｎ−グリカンの形成に及ぼすＧｎＴＩ発現の影響を標定するために使用された。Ｎ−グリカンのプロファイリングからは、総Ｎ−グリカンのパターンの重大な変化が明らかとならず、これは、Nicotiana benthamianaにおいてＧｎＴＩの軽微な残留活性でも複合Ｎ−グリカンの生合成が可能なことを示している。彼らは、ＸｙｌＴのノックダウンのための類似のアプローチが、β−１，２−キシロシル化Ｎ−グリカンの重大な減少を招いたことをさらに報告している。第二に、Ｎ−グリカンからのβ−１，２−キシロースおよびα−１，３−フコース残基の完全な脱離を達成するために、挿入突然変異系を使用した三重ノックアウトArabidopsis植物が作製された。これらの植物は、活性β−１，２−キシロシルトランスフェラーゼおよびコアα−１，３−フコシルトランスフェラーゼの完全欠損を示し、免疫原性のタンパク質結合Ｎ−グリカンを欠如し、かつ末端β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するヒト化構造を主に合成する（Strasserら、2004b）。
【００１１】
タバコなどの葉作物は、組換えタンパク質を商業生産するための有力な候補と考えられる（例えばTwyman et al、2003を参照されたい）。
【００１２】
本発明の目的は、特定のNicotiana種または栽培品種におけるＸｙｌＴの発現を改変するためにさらに適する、Nicotiana種および栽培品種由来の、特にNicotiana benthamianaおよびNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来の代替ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列およびＴｙｌＴ遺伝子配列を提供することである。
【００１３】
発明の概要
本発明の一局面では、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を生産する方法が提供され、その方法は、Nicotiana種または栽培品種の植物細胞にキメラ遺伝子を導入してトランスジェニック植物細胞を作製する工程であって、このキメラ遺伝子が、作動可能に連結した植物発現可能プロモーター；Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、この２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするヌクレオチド配列か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、そのNicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、この２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むヌクレオチド配列を含む第一のセンスＤＮＡ領域；およびこの第一のＤＮＡ領域の相補体に少なくとも９５%の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第二のアンチセンスＤＮＡ領域を含む転写可能ＤＮＡ領域であって、この転写可能ＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ分子が、少なくとも第一のセンスＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ領域と、第二のアンチセンスＤＮＡ領域から転写されたＲＮＡ領域との間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる転写可能ＤＮＡ領域；ならびに植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域を含む工程と；トランスフォーメーションされていないNicotiana植物細胞よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有するトランスジェニックNicotiana植物細胞を同定する工程と；このトランスジェニックNicotiana植物細胞を再生してトランスジェニックNicotiana植物を得る工程と；場合により、トランスフォーメーションされていないNicotiana植物よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有するトランスジェニックNicotiana植物を同定する工程とを含む。このNicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸またはヌクレオチドは、Nicotiana benthamiana特異的またはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸またはヌクレオチドのことがあり、Nicotiana種または栽培品種は、好ましくはそれぞれNicotiana benthamianaまたはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1のことがある。Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２もしくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことがあり、Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列または配列番号３、配列番号��、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１７のヌクレオチド配列を含むことがある。
【００１４】
タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロースを有するNicotiana植物細胞または植物を生産する方法を提供することが本発明の別の目的であり、その方法は、Nicotiana種または栽培品種の植物細胞または植物に一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を提供する工程であって、この二本鎖ＲＮＡ分子が二つのＲＮＡ鎖を含み、一方のＲＮＡ鎖が、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、この２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＲＮＡヌクレオチド配列か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、このNicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、この２０から２１個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むＲＮＡヌクレオチド配列から実質的になる工程；およびこの一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含まない同じNicotiana植物細胞または植物に比べて低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有する、この一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含むNicotiana植物細胞または植物を同定する工程を含む。この二本鎖ＲＮＡは、Nicotiana種または栽培品種の植物細胞のゲノムにキメラ遺伝子を組み込んでトランスジェニック植物細胞を作製すること、および場合によりその植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得ることによって、植物細胞または植物に提供することができ、このキメラ遺伝子は、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをアンチセンスおよび／またはセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、このヌクレオチド配列が、該Nicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、この２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをアンチセンスおよび／またはセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、このヌクレオチド配列が、このNicotiana種または栽培品種から好ましくは得ることができ、この２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むＤＮＡ領域（このＤＮＡ領域は、植物発現可能プロモーターに作動可能に連結している）；ならびに植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域を含む。Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸またはヌクレオチドは、Nicotiana benthamiana特異的またはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸またはヌクレオチドのことがあり、このNicotiana種または栽培品種は、好ましくはそれぞれNicotiana benthamianaまたはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1のことがある。Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２もしくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことがあり、Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列または配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列を含むことがある。
【００１５】
本発明のなお別の目的は、Nicotiana  ＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを同定する方法を提供し、その方法は、Nicotiana種または栽培品種から得ることができるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを提供する工程；以下の群から手段を選択する工程：配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードする、プローブとして使用するためのヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメント；配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメント；配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から１５１３個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントもしくはオリゴヌクレオチド；配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド配列；配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド配列；または配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０のいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド；ならびにゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、およびプライマーを使用してＰＣＲを行うことによって、またはゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、およびプローブを使用してハイブリダイゼーションを行うことによって、Nicotiana種または栽培品種からＸｙｌＴ  ＤＮＡフラグメントを同定するためにその手段を利用する工程を含む。同定されたフラグメントは、続いて単離して、低レベルのβ−１，２−キシロ���ス残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有するNicotiana植物細胞または植物を得るために使用することができる。
【００１６】
本発明は、タンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するNicotiana  ＸｙｌＴアレルを同定する方法もまた提供し、その方法は、Nicotiana種または栽培品種の異なる植物系統の集団であって、場合により突然変異誘発された集団を提供する工程；上記の方法によりこの集団の各植物系統におけるNicotiana  ＸｙｌＴアレルを同定する工程；この集団の各植物系統のタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを分析し、他の植物系統よりも低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に有する植物系統を同定する工程；および植物系統におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基を特異的Nicotiana  ＸｙｌＴアレルの存在と相関づける工程を含む。このNicotiana  ＸｙｌＴアレルを、選択したNicotiana植物細胞または植物に導入して、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を得ることができる。
【００１７】
配列番号１２もしくは配列番号１４のアミノ酸配列、またはNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分を含むタンパク質をコードする単離されたＤＮＡフラグメント；配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列、またはNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分を含む単離されたＤＮＡフラグメント；配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列、またはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするその任意の部分を含むタンパク質をコードする単離されたＤＮＡフラグメント；および配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列、またはNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むその任意の部分を含む単離されたＤＮＡフラグメントを提供することが、本発明のなお別の目的である。
【００１８】
本発明は、以下の作動可能に連結したＤＮＡフラグメントを含むキメラ遺伝子をさらに提供する：植物発現可能プロモーター；Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをアンチセンス方向に含む第一のＤＮＡ領域であって、この２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする第一のＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをアンチセンス方向に含む第一のＤＮＡ領域であって、この２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む第一のＤＮＡ領域と；およびNicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをセンス方向に含む第二のＤＮＡ領域であって、この２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする第二のＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをセンス方向に含む第二のＤＮＡ領域であって、この２０個のうち１９個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む第二のＤＮＡ領域とを含む転写可能ＤＮＡ領域であって、この転写可能ＤＮＡ領域の転写により生成したＲＮＡ分子が、少なくとも第一のＤＮＡ領域に対応するＲＮＡ領域と、第二のＤＮＡ領域に対応するＲＮＡ領域との間で塩基対形成することによって二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる転写可能ＤＮＡ領域；ならびに植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域。このキメラ遺伝子は、植物発現可能プロモーター；Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをセンスまたはアンチセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、この２０個からの１９個の連続ヌクレオチドは、Nicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＤＮＡ領域か、あるいはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、またはその相補体より選択される２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドをセンスまたはアンチセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、この２０個からの１９個の連続ヌクレオチドは、Nicotiana種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つの含むＤＮＡ領域；および植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域もまた含むことがある。
【００１９】
このようなキメラ遺伝子を含むNicotiana植物細胞およびこのようなNicotiana植物細胞から実質的になるNicotiana植物、ならびにその種子もまた本発明により提供される。
【００２０】
本発明は、Nicotiana植物におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを減少させるために、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドを含むその任意の部分を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用すること、あるいはNicotiana植物におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを減少させるために、Nicotiana種もしくは栽培品種におけるＸｙｌＴ遺伝子もしくはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡを同定するために、Nicotiana種もしくは栽培品種におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するＸｙｌＴ遺伝子のアレルを同定するために、またはNicotiana種もしくは栽培品種におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するＸｙｌＴ遺伝子のアレルを導入するために、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む２０個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドを含むその任意の部分を含むヌクレオチド配列を使用することにもまた関する。
【００２１】
本発明の性質は、本明細書下記に明らかになる本発明の前述および他の目的、利点、および特徴と共に、以下に示す本発明の種々の態様の詳細な説明、添付の特許請求の範囲、および図面を参照してさらに明確に理解することができる。
【００２２】
本発明の種々の態様の詳細な説明
本発明は、Nicotiana種および栽培品種、特にNicotiana benthamianaおよびNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来のＸｙｌＴ遺伝子およびＸｙｌＴ  ｃＤＮＡが、例えば内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子の活性を改変することによって、内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子を、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を提供する、そのNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子の別のアレルに交換することによって、またはその任意の組み合わせによって、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有する、それらのNicotiana種および栽培品種の植物、特にそれぞれNicotiana benthamiana植物およびNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1植物を得るための優れた起源ヌクレオチド配列であるという発見に基づく。
【００２３】
一態様では、本発明は、Nicotiana種または栽培品種の植物細胞または植物に一つまたは複数のサイレンシングＲＮＡ分子を提供することにより、Nicotiana植物細胞または植物における内在性ＸｙｌＴ遺伝子の発現を減少させることによって、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を得るための方法に関し、ここで、このサイレンシングＲＮＡ分子は、前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られるNicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分を含み、前記部分は、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするか、またはこのサイレンシングＲＮＡ分子は、前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分を含み、前記部分はNicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む。
【００２４】
本明細書に使用する「サイレンシングＲＮＡ」または「サイレンシングＲＮＡ分子」は、植物細胞に導入したときに標的遺伝子の発現を減少させる任意のＲＮＡ分子を表す。このようなサイレンシングＲＮＡは、ＲＮＡ分子が、ターゲット核酸の配列の、好ましくはターゲット遺伝子のコード配列の相補体に９５%の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの配列を含む、例えばいわゆる「アンチセンスＲＮＡ」のことがある。しかし、アンチセンスＲＮＡは、プロモーター配列および転写終結シグナルポリアデニル化シグナルを含む、ターゲット遺伝子の調節配列に対することもある。サイレンシングＲＮＡには、ターゲット核酸の配列に９５%の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの配列をＲＮＡ分子が含むいわゆる「センスＲＮＡ」がさらに含まれる。他のサイレンシングＲＮＡは、ＷＯ０１／１２８２４またはＵＳ６４２３８８５（両文書は、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されたような、ターゲット核酸の配列の相補体に９５%の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含む「非ポリアデニル化ＲＮＡ」のことがある。なお別の種類のサイレンシングＲＮＡは、ターゲット核酸の配列もしくはその相補体に９５%の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含み、かつＷＯ０３／０７６６１９に記載された大部分二本鎖の領域（ジャガイモやせいも病ウイロイド型ウイロイド由来核局在シグナルを含むか、またはＣＵＧトリヌクレオチド繰り返し部分を含む大部分二本鎖の領域を含む）をさらに含む、ＷＯ０３／０７６６１９（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されたＲＮＡ分子である。サイレンシングＲＮＡは、本明細書に規定されるセンスおよびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡのこともまたあり、ここで、このセンスおよびアンチセンス鎖は、相互に塩基対形成して、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる（好ましくはこのセンスおよびアンチセンスＲＮＡの前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドは相互に相補的である）。このセンスおよびアンチセンス領域は一つのＲＮＡ分子内にもまた存在することがあり、その結果としてこのセンスおよびアンチセンス領域が二本鎖ＲＮＡ領域を形成すると、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）が形成することができる。ｈｐＲＮＡは当技術分野で周知である（例えば参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９９／５３０５０を参照されたい）。ｈｐＲＮＡは、大部分相補的であり得るが、完全には相補的である必要はない長いセンスおよびアンチセンス領域を有する長鎖ｈｐＲＮＡ（典型的には約２００bpよりも大きく、２００〜１０００bpの間の範囲である）として分類されることがある。ｈｐＲＮＡは、かなり小さく、約３０から約４２bpの大きさの範囲で、９４ｂｐよりもあまり長くはないこともまたある（参照により本明細書に組み入れられるＷＯ０４／０７３３９０を参照されたい）。サイレンシングＲＮＡは、例えばＷＯ２００５／０５２１７０、ＷＯ２００５／０４７５０５、またはＵＳ２００５／０１４４６６７（全ての文書は参照により本明細書に組み入れられる）に記載された人工マイクロＲＮＡ分子のこともまたある。
【００２５】
別の態様では、サイレンシングＲＮＡ分子は、サイレンシングＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子を生成することができるキメラ遺伝子を含むNicotiana種または栽培品種のトランスジェニック植物細胞または植物を生産することによって、Nicotiana種または栽培品種の植物細胞または植物に提供され、ここで、このようなｄｓＲＮＡ分子の相補的ＲＮＡ鎖は、前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分を含む（ここで前記部分は、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＴｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする）か、またはこのようなｄｓＲＮＡ分子の相補的ＲＮＡ鎖は、前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分を含む（ここで、前記部分は、Nicotiana種または栽培品種特異的ＴｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む）。
【００２６】
本明細書に使用する「Nicotiana」には、非限定的に、ニコチアナ・アカウリス、Ｎ．アクミナータ、Ｎ．アフリカーナ、Ｎ．アラータ、Ｎ．アンプレキシカウリス、Ｎ．アレンシイ、Ｎ．アテヌアータ、Ｎ．ベナビデシイ、Ｎ．ビゲロビイ、Ｎ．ボナリエンシス、Ｎ．カビコラ、Ｎ．クレベランディイ、Ｎ．コルディフォリア、Ｎ．コリンボサ、Ｎ．デブネイ、Ｎ．エクセルシオール、Ｎ．フォルゲチアーナ、Ｎ．フラグランス、Ｎ．グラウカ、Ｎ．グルチノーサ、Ｎ．グッドスピーディイ、Ｎ．ゴッセイ、Ｎ．ヒブリッド、Ｎ．イングルバ、Ｎ．カワカミイ、Ｎ．ナイティアーナ、Ｎ．ラングスドルフィイ、Ｎ．リネアリス、Ｎ．ロンギフロラ、Ｎ．マリティマ、Ｎ．メガロシフォン、Ｎ．ミエルシイ、Ｎ．ノクティフロラ、Ｎ．ヌディカウリス、Ｎ．オブツシフォリア、Ｎ．オクシデンタリス、Ｎ．オトフォラ、Ｎ．パニクラータ、Ｎ．パウシフロラ、Ｎ．ペツニオイデス、Ｎ．プルンバギニフォリア、Ｎ．クアドリバルビス、Ｎ．ライモンディイ、Ｎ．レパンダ、Ｎ．ロスラータ、Ｎ．ロツンディフォリア、Ｎ．ルスティカ、Ｎ．セチェリイ、Ｎ．シムランス、Ｎ．ソラニフォリア、Ｎ．スペガジニイ、Ｎ．ストックトニイ、Ｎ．スアベオレンス、Ｎ．シルベストリス、Ｎ．チルシフロラ、Ｎ．トメントーサ、Ｎ．トメントシフォルミス、Ｎ．トリゴノフィラ、Ｎ．ウンブラティカ、Ｎ．ウンデュラータ、Ｎ．ベルティナ、Ｎ．ウィガンディオイデスおよびＮ．ｘ  サンデラなどの全ての公知のNicotiana種ならびに非限定的にcv. Burley21、cv. Delgold、cv. Petit Havana、cv. Petit Havana SR1、cv. Samsun、およびcv. XanthiなどのNicotiana tabacum栽培品種などの全ての公知のNicotiana栽培品種が含まれる。
【００２７】
普通のタバコであるNicotiana tabacumは、二倍体種であるNicotiana sylvestrisおよびNicotiana tomentosiformisを起源とする四倍体雑種である。
【００２８】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡは、Nicotiana種もしくは栽培品種に自然に存在するＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列を表すか、またはNicotiana種もしくは栽培品種に自然に存在するＸｙｌＴ遺伝子のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを表す。同様に、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質は、Nicotiana種または栽培品種に自然に存在するタンパク質を表す。
【００２９】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例には、配列番号１２または配列番号１４に示すアミノ酸配列をコードする、Nicotiana benthamianaから得られる配列および配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードする、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から得られる配列が含まれる。
【００３０】
Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列の例には、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号２１に示すヌクレオチド配列を含む、Nicotiana benthamianaから得られる配列および配列番号７または配列番号９に示すヌクレオチド配列を含むNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から得られる配列が含まれる。
【００３１】
Nicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の例には、配列番号３、配列番号５、または配列番号１７に示すヌクレオチド配列を含むNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から得られる配列が挙げられる。
【００３２】
しかし、例示されたヌクレオチド配列またはその部分を使用して、Nicotiana種または栽培品種におけるNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのさらなるヌクレオチド配列を同定することができること、およびこのようなヌクレオチド配列またはその部分が、例えばNicotiana植物におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルを減少させるためにもまた使用することができることは、当業者に一見して明らかであろう。例示されるヌクレオチド配列は、以下を選択するために使用することができよう：
ｉ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメント；
ｉｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメント；
ｉｉｉ）配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から１５１３個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチド；
ｉｖ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチド；
ｖ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から３５７４個の間の連続ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む、プローブとして使用するためのＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチド；
ｖｉ）配列番号４もしくは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド配列；
ｖｉｉ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド配列；
ｖｉｉｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１  １、配列番号１３、配列番号１７、もしくは配列番号２１のいずれか一つのヌクレオチド配列より選択される２０から２００個の間の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド配列；または
ｉｘ）配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０のいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド。
【００３３】
Nicotiana種もしくは栽培品種由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、および言及したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲを行うことによって、またはNicotiana種もしくは栽培品種由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡと、言及したプローブとの間で好ましくはストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うことによって、このような他のNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを同定および／または単離することができる。
【００３４】
本明細書に使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブとターゲット配列との間で少なくとも９５%、好ましくは少なくとも９７%の配列同一性があるならば、ハイブリダイゼーションが概して起こるものであることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０%硫酸デキストラン、およびサケ精子ＤＮＡなどの２０μg/ml変性断片化キャリアＤＮＡを含む溶液中での一晩のインキュベーションに続いて、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を例えば約１０分間（２回）洗浄することである。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY（1989）の特に第１１章に例示されている。
【００３５】
「Nicotiana種特異的ＸｙｌＴ  ヌクレオチド」または「Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチド」は、それぞれ配列番号２５に示すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ遺伝子の、もしくは配列番号２３に示すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡの対応するヌクレオチド配列と異なるか、またはそれに存在しない、Nicotiana種または栽培品種由来のＸｙｌＴ遺伝子またはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列のヌクレオチドを表す。
【００３６】
「Nicotiana種特異的ＸｙｌＴアミノ酸」または「Nicotiana栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸」は、それぞれ配列番号２６に示すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ遺伝子によりコードされるか、もしくは配列番号２４に示すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡによりコードされるＸｙｌＴタンパク質の対応するアミノ酸配列と異なるか、またはそれに存在しない、Nicotiana種または栽培品種由来のＸｙｌＴ遺伝子またはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡによりコードされるＸｙｌＴタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸を表す。
【００３７】
本発明の目的で、Nicotiana種もしくは栽培品種由来のＸｙｌＴ遺伝子もしくはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列における、またはNicotiana種もしくは栽培品種由来のＸｙｌＴ遺伝子もしくはＸｙｌＴ  ｃＤＮＡによりコードされるＸｙｌＴタンパク質のアミノ酸配列におけるNicotiana種または栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドまたはアミノ酸の存在を判定するために、Nicotiana種または栽培品種由来のＸｙｌＴヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、グローバルアライメント手順を使用してこれらの配列をアライメントすることによって、Nicotiana tabacum cv. Xanthi由来の対応するＸｙｌＴヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較される（ヌクレオチド配列について、使用する初期設定のスコア行列は、ミスマッチペナルティー＝２、開始ギャップペナルティー＝４、伸長ギャップペナルティー＝１の「標準線形」である。タンパク質配列について、初期設定のスコア行列は「ｂｌｏｓｕｍ  ６２」(Henikoff and Henikoff, 1992)である)。アライメントを行うために、Ａｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓプログラム（Scientific & Educational Software, USAが提供)を使用してもよい。
【００３８】
そのようなグローバルＤＮＡアライメントの一例は、図１の配列番号２３に表すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列と、配列番号３および５に表すNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列とのグローバルＤＮＡアライメントである。このグローバルＤＮＡアライメントに基づき判定されるNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドの例には、
- 配列番号３の位置１０４１、１３２３、１３３２、または１４２１のヌクレオチド、および
- 配列番号５の位置
【００３９】
【表２】
2009529898.tif 000003
【００４０】
のヌクレオチドが挙げられる。
【００４１】
このようなグローバルＤＮＡアライメントの別の例は、図３の配列番号２５に表すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ遺伝子配列と、配列番号７および９に表すNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ＸｙｌＴ遺伝子配列との、ならびに配列番号１１および１３に表すNicotiana benthamiana由来ＸｙｌＴ遺伝子配列とのグローバルＤＮＡアライメントである。このグローバルＤＮＡアライメントに基づき判定されるNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴヌクレオチドの例には：
- 配列番号７の位置
【００４２】
【表３】
2009529898.tif 000004
【００４３】
のヌクレオチド、および
- 配列番号９の位置
【００４４】
【表４】
2009529898.tif 000005
【００４５】
のヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
このグローバルＤＮＡアライメントに基づき判定されるNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴ  ヌクレオチドの例には：
- 配列番号１１の位置
【００４７】
【表５】
2009529898.tif 000006
【００４８】
のヌクレオチド、および
- 配列番号１３の位置
【００４９】
【表６】
2009529898.tif 000007
【００５０】
のヌクレオチドが挙げられる。
【００５１】
このようなグローバルタンパク質アライメントの一例は、図２の配列番号２４に表すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列によりコードされるＸｙｌＴタンパク質配列と、配列番号４および６に表すNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列によりコードされるＸｙｌＴタンパク質配列とのグローバルタンパク質アライメントである。このグローバルタンパク質アライメントに基づき判定されるNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸の例には：
- 配列番号４の位置４７２または５０２のアミノ酸、および
- 配列番号６の位置
【００５２】
【表７】
2009529898.tif 000008
【００５３】
のアミノ酸が挙げられる。
【００５４】
このようなグローバルタンパク質アライメントの別の例は、図４の配列番号２６に表すNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ＸｙｌＴ遺伝子配列によりコードされるＸｙｌＴタンパク質配列と、配列番号８および１０に表すNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ＸｙｌＴ遺伝子配列によりコードされるＸｙｌＴタンパク質配列との、ならびに配列番号１２および１４に表すNicotiana benthamiana由来ＸｙｌＴ遺伝子配列によりコードされるＸｙｌＴタンパク質配列とのグローバルタンパク質アライメントである。このグローバルタンパク質アライメントに基づき判定されたNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1特異的ＸｙｌＴアミノ酸の例には：
- 配列番号８の位置
【００５５】
【表８】
2009529898.tif 000009
のアミノ酸、および
- 配列番号１０の位置１８３、２１２、２９７、３１２、３３３、または３４９のアミノ酸
が挙げられる。
【００５６】
このグローバルタンパク質アライメントの基づき判定されるNicotiana benthamiana特異的ＸｙｌＴアミノ酸の例には：
- 配列番号１２の位置
【００５７】
【表９】
2009529898.tif 000010
【００５８】
のアミノ酸、および
- 配列番号１４の位置
【００５９】
【表１０】
2009529898.tif 000011
【００６０】
のアミノ酸が挙げられる。
【００６１】
サイレンシングＲＮＡ分子に、特に二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖に含まれる、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分およびNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の部分は、少なくとも１９個の連続ヌクレオチド長でなければならないが、約１９個の連続ヌクレオチド（nt）から、最長でNicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードする配列またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはｃＤＮＡ配列の（ヌクレオチド）長に等しい長さまで変動することがある。したがって、センスまたはアンチセンスヌクレオチド配列の合計長は、少なくとも２５nt、または少なくとも約５０nt、または少なくとも約１００nt、または少なくとも約１５０nt、または少なくとも約２００nt、または少なくとも約５００ntのことがある。センスまたはアンチセンスヌクレオチド配列の合計長に上限はないと予想される。しかし、実際的な理由（例えばキメラ遺伝子の安定性など）から、センスまたはアンチセンスヌクレオチド配列の長さは５０００ntを超えてはならず、詳細には２５００ntを超えてはならず、約１０００ntまでに限定されることがある。
【００６２】
Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ（センスまたはアンチセンス領域）のヌクレオチド配列の部分の合計長が長いほど、これらの領域と、それが相補するNicotiana種または栽培品種由来内在性ＸｙｌＴ遺伝子における対応する配列との間の配列同一性の要求が厳密ではなくなる。好ましくは、関心対象の核酸は、対応するターゲット配列と少なくとも約７５%、詳細には少なくとも約８０%、さらに詳細には少なくとも約８５%、全く詳細には約９０%、著しくは約９５%、さらに著しくは約１００%の配列同一性を有さねばならず、全く著しくはターゲット配列またはその相補体の対応する部分と同一である。しかし、関心対象の核酸が、ターゲットＸｙｌＴ核酸の対応する部分と１００%の配列同一性を有する約１９個の連続ヌクレオチド、詳細には約２５nt、さらに詳細には約５０nt、著しくは約１００nt、全く著しくは約１５０ntの配列を常に含むことが好ましく、ここで、前記約１９個の連続ヌクレオチド、詳細には約２５nt、さらに詳細には約５０nt、著しくは約１００nt、全く著しくは約１５０ntが少なくとも一つのNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸をコードするか、または少なくとも一つのNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを含む。
【００６３】
本発明の目的で、パーセントで表現した二つの関連するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「配列同一性」は、二つの最適にアラインメントされた配列中で、同一の残基を有する位置の数を、比較した位置の数で割ったもの（×１００）を表す。ギャップ、すなわちある残基が一方の配列に存在するが、もう一方の配列には存在しない場合のアライメントにおける位置は、非同一残基を有する位置とみなされる。好ましくは、配列同一性を計算するために、および対応するセンスまたはアンチセンス配列を設計するために、特に短いセンス配列のために、ギャップ数は最少にしなければならない。
【００６４】
ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を対応するＤＮＡ分子のヌクレオチドと参照することによって規定するときはいつも、ヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）と交換しなければならないことは明らかであろう。参照がＲＮＡまたはＤＮＡ分子に行われるかどうかは、適用の状況で明らかであろう。
【００６５】
特定のターゲット遺伝子をサイレンシングするために最低限必要なことは、ターゲット遺伝子配列に対応する約２０〜２１個の連続ヌクレオチド長のヌクレオチド配列がサイレンシングキメラ遺伝子ヌクレオチド配列に存在することであると実証されており、ここで、この２０〜２１個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドは、対応するターゲット遺伝子配列と同一である。本明細書に使用する「２０個のうち１９個の連続ヌクレオチド」は、ターゲット遺伝子から選択され、一つのミスマッチヌクレオチドを有する２０個の連続ヌクレオチド配列を表す。
【００６６】
Nicotiana種または栽培品種由来の内在性ＸｙｌＴ遺伝子をサイレンシングするために、サイレンシングキメラ遺伝子ヌクレオチド配列は、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列由来の２０〜２１個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチド（ここで、前記２０〜２１個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドは、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードする）を含むか、またはNicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列由来の２０〜２１個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチド（ここで、前記２０〜２１個のうち少なくとも１９個の連続ヌクレオチドは、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む）ことが好ましい。
【００６７】
本明細書に使用する「タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物」は、ＸｙｌＴ活性が減少または消失している結果として、本発明の方法により処理されていない対照Nicotiana植物におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルに比べて低レベルのβ−１，２−キシロース残基をタンパク質結合Ｎ−グリカン上に生じるか、またはタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基が不在である植物（特に本発明の方法により得られるNicotiana植物）である。本発明の方法により得られるNicotiana植物由来タンパク質のグリカン上に存在するβ−１，２−キシロース残基のレベルを、本発明の方法により処理されていない対照Nicotiana植物由来タンパク質のグリカン上に存在するβ−１，２−キシロース残基のレベルと比較することによって、ＸｙｌＴ活性の指標を得ることができる。植物のタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルは、例えばFayeら（Analytical Biochemistry, 1993, 209: 104-108）により記載されたキシロース特異的抗体を用いた例えばウエスタンブロット分析によって、または例えばKolarichおよびAltmann（2000, Anal. Biochem. 285: 64-75）により記載されたマトリックス支援レーザ脱離／イオン化時間飛行型質量分析（MALDI-TOF-MS）を用いて、もしくは例えばHenrikssonら（2003, Biochem. J. 375: 61-73）によって記載された液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、植物糖タンパク質から単離したグリカンを質量分析することによって測定することができる。
【００６８】
Nicotiana  ＸｙｌＴの発現を減少させる、本発明によるキメラ遺伝子をコードするｄｓＲＮＡは、ＷＯ９９／５３０５０（参照により本明細書に組み入れられる）の開示によりセンスＲＮＡ領域とアンチセンスＲＮＡ領域との間のスペーサー配列に例えば位置する、異種イントロンなどのイントロンを含むことがある。
【００６９】
上記のような二本鎖ＲＮＡ分子が、植物細胞において約２０〜２１個のヌクレオチドの小さなＲＮＡフラグメントに切断され、そのフラグメントが対応するｍＲＮＡの分解（degeneration）におけるガイド配列として作用することが明らかとなった（Baulcombe, 2004により総説されている）。したがって別の態様では、本発明は、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を生産するための方法を対象とし、その方法は以下の工程を含む：
ａ）Nicotiana種または栽培品種の植物の細胞に一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を提供する工程であって、この二本鎖ＲＮＡ分子が、二つのＲＮＡ鎖を含み、一方のＲＮＡ鎖が、前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される２０から２１個の連続ヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチド配列であって、前記２０から２１個の連続ヌクレオチドが、種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＲＮＡヌクレオチド配列から実質的になるか、または一方のＲＮＡ鎖が、前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列由来の２０から２１個の連続ヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチド配列であって、前記２０から２１個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むＲＮＡヌクレオチド配列から実質的になる工程；および
ｂ）一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含まない同じNicotiana植物よりもタンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有する、これらの一つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含むNicotiana植物を同定する工程。
【００７０】
言及した２０〜２１nt長のｄｓＲＮＡ配列もまた、従来のアンチセンスＲＮＡ介在性サイレンシングまたはセンスＲＮＡ介在性サイレンシングの過程で作製される。したがって、本発明の別の態様では、タンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有するNicotiana植物細胞または植物を生産するための方法が提供され、その方法は、作動可能に連結した以下のＤＮＡフラグメントを含むキメラ遺伝子をNicotiana種または栽培品種の植物の細胞に提供する工程を含む：
ａ）植物発現可能プロモーター；
ｂ）前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列より選択される少なくとも２０個の連続ヌクレオチドをアンチセンスまたはセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくとも一つコードするＤＮＡ領域か、または前記Nicotiana種もしくは栽培品種から好ましくは得られる、Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子もしくはNicotiana  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列由来の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドをアンチセンスまたはセンス方向に含むＤＮＡ領域であって、前記少なくとも２０個の連続ヌクレオチドが、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含むＤＮＡ領域；および
ｃ）植物において機能する転写終結ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域。
【００７１】
したがって、言及したアンチセンスまたはセンスヌクレオチド領域は、２１nt、４０nt、５０nt、１００nt、２００nt、３００nt、５００nt、１０００nt、または実に約２０００nt長以上などの約２１ntから約５０００nt長のことがある。さらに、使用される阻害性ＸｙｌＴ遺伝子分子またはキメラ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列が、内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子（Nicotiana植物細胞における発現が減少するようにターゲティングされている）に完全に同一または相補的であることは本発明のために必要ない。配列が長いほど、全体的な配列同一性の要求は厳密ではなくなる。したがって、センスまたはアンチセンス領域は、内在性Nicotiana遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補体に約４０%または５０%または６０%または７０%または８０%または９０%または１００%の全体的な配列同一性を有することがある。しかし、言及したようにアンチセンスまたはセンス領域は、ＸｙｌＴ遺伝子のヌクレオチド配列に約１００%の配列同一性を有する１９〜２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を好ましくは含まねばならず、前記１９〜２０個の連続ヌクレオチドは、Nicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴアミノ酸を少なくともコードするか、またはNicotiana種もしくは栽培品種特異的ＸｙｌＴヌクレオチドを少なくとも一つ含む。約１００%の配列同一性のストレッチは、約５０、７５、または１００ntでありうる。
【００７２】
転写された場合にアンチセンスまたはセンスサイレンシングＲＮＡをもたらす、上に言及したキメラ遺伝子の効率は、異常非ポリアデニル化ＸｙｌＴ阻害性ＲＮＡ分子の発現を生じるＤＮＡエレメントの包含によってさらに高めることができる。その目的に適するこのようなＤＮＡエレメントの一つは、ＷＯ００／０１１３３に記載された自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。作製されたＲＮＡ分子に、ＷＯ０３／０７６６１９に記載された核局在シグナルまたは核内繋留シグナルを提供することによってもまたこの効率を高めることができる。
【００７３】
Nicotiana benthamianaおよびNicotiana tabacum由来の例示されたＸｙｌＴヌクレオチド配列は、タンパク質結合Ｎ−グリカン上の低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関する、Nicotiana種または栽培品種の植物集団におけるＸｙｌＴアレルを同定するためにもまた使用することができる。このようなNicotiana種または栽培品種の植物集団は、以前に突然変異誘発した集団であってもよい。次に、従来の育種技法を用いて、選択されたNicotiana種または栽培品種の植物系統に同定されたＸｙｌＴアレルを導入することができる。
【００７４】
Nicotiana植物をトランスフォーメーションする方法もまた、当技術分野において周知である。NicotianaのAgrobacterium介在性トランスフォーメーションは、例えばZambryskiら（1983, EMBO J. 2: 2143-2150）、De Blockら（1984, EMBO J. 3(8):1681-1689）、またはHorschら（Science (1985) 227: 1229-1231）に記載されている。
【００７５】
本発明によって得られるトランスフォーメーションされたNicotiana植物またはタンパク質結合Ｎ−グリカン上に低レベルのβ−１，２−キシロース残基を有する、得られるNicotiana植物（ここで、内在性Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子は、タンパク質結合Ｎ−グリカン上の、本来のＸｙｌＴアレルに比べて低レベルのβ−１，２−キシロース残基と相関するＸｙｌＴアレルに交換されている）を従来の育種スキームに使用して、同一の特性を有するより多くの植物を生産するか、あるいは同一もしくは関連する植物種の他の栽培品種または雑種植物に本発明によるキメラ遺伝子を導入することができる。トランスフォーメーションされた植物から得られる種子は、安定なゲノム挿入物として本発明のキメラ遺伝子を含有し、この種子もまた本発明に包含される。
【００７６】
さらに、アンチセンス、センス、もしくは二本鎖ＲＮＡ、またはコードするキメラ遺伝子の導入は、ターゲット遺伝子の発現のほとんど無抑制または非常に小さな抑制からターゲット遺伝子の非常に強い抑制または実に１００%もの抑制までの範囲の表現型の分布に至り得ることが公知である。しかし、当業者は、所望の程度のサイレンシングおよび所望の表現型に至るそれらの植物細胞、植物、事象、または植物系統を選択することができるものである。
【００７７】
本明細書に使用する「含む」は、一つまたは複数の特徴、整数、工程、もしくは構成要素、またはその群の存在または付加を除外するのではなく参照するものとして、定められた特徴、整数、工程、または構成要素の存在を詳記することと解釈することができる。したがって、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に引用されたものよりも多数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことがあり、すなわちより大きな核酸またはタンパク質に埋め込まれていることがある。機能的または構造的に規定されたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域などを含むことがある。
【００７８】
以下の非限定的な実施例は、Nicotiana種、特にNicotiana benthamianaおよびNicotiana栽培品種、特にNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1におけるタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基レベルを変更するためのキメラ遺伝子ならびにその使用を説明する。実施例に別に述べない限り、全てのリコンビナントＤＮＡ技法は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYおよびAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第１および２巻に記載された標準プロトコールにより実施される。植物の分子的な作業のための標準的な材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)およびBlackwell Scientific Publications, UKが共同出版したPlant Molecular Biology Labfax (1993)、R.D.D. Croy著に記載されている。
【００７９】
この説明および実施例にわたり、配列リストに表す以下の配列表が参照される：
配列番号１  Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはｃＤＮＡの部分を増幅するために適したオリゴヌクレオチドＸｙｌＦ４のヌクレオチド配列。
配列番号２  Nicotiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはｃＤＮＡの部分を増幅するために適したオリゴヌクレオチドＸｙｌＲ４のヌクレオチド配列。
配列番号３  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子変異体１の部分ｃＤＮＡ配列。
配列番号４  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴタンパク質変異体１の部分アミノ酸配列。
配列番号５  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子変異体２の部分ｃＤＮＡ配列。
配列番号６  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴタンパク質変異体２の部分アミノ酸配列。
配列番号７  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子変異体１の部分ヌクレオチド配列。
配列番号８  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴタンパク質変異体１の部分アミノ酸配列。
配列番号９：  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子変異体２の部分ヌクレオチド配列。
配列番号１０  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴタンパク質変異体２の部分アミノ酸配列。
配列番号１１  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子変異体１の部分ヌクレオチド配列。
配列番号１２  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴタンパク質変異体１の部分アミノ酸配列。
配列番号１３  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子変異体２の部分ヌクレオチド配列。
配列番号１４  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴタンパク質変異体２の部分アミノ酸配列。
配列番号１５  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子またはｃＤＮＡの部分を増幅するために適したオリゴヌクレオチドＸｙｌＦ８のヌクレオチド配列。
配列番号１６  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子またはｃＤＮＡの部分を増幅するために適したオリゴヌクレオチドＸｙｌＲ８のヌクレオチド配列。
配列番号１７  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ遺伝子変異体１の部分ｃＤＮＡ配列。
配列番号１８  ベクターｐＴＫＷ２０のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列。
配列番号１９  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはｃＤＮＡの部分を増幅するために適したオリゴヌクレオチドＸｙｌＦ９のヌクレオチド配列。
配列番号２０：  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子またはｃＤＮＡの部分を増幅するために適したオリゴヌクレオチドＸｙｌＲ９のヌクレオチド配列。
配列番号２１  Nicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子変異体１の部分配列。
配列番号２２  ベクターｐＴＫＷ２９のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列。
配列番号２３  推定β−（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ（アクセッション番号ＡＪ６２７１８２）についてのNicotiana tabacum cv. Xanthi  ｍＲＮＡ。
配列番号２４  配列番号２３によってコードされる推定β−（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ。
配列番号２５  推定β−（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ（アクセッション番号ＡＪ６２７１８３）についてのNicotiana tabacum cv. Xanthi  ｘｙｌｔ遺伝子。
配列番号２６  配列番号２５によってコードされる推定β−（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ。
【００８０】
実施例
実施例１：Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1およびNicotiana benthamiana由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列およびＸｙｌＴ遺伝子配列の単離のための縮重プライマーの設計
Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1およびNicotiana benthamiana由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅に縮重プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列は、推定ＸｙｌＴタンパク質（アクセッション番号ＡＪ６２７１８３）をコードする、Nicotiana tabacum cv. Xanthi由来ゲノムＤＮＡ配列のエキソン配列に基づき設計した。フォワードプライマー（配列番号１）は、クローニング目的でその５’末端にＣＡＣＣを有するように設計した。このようにして、以下の縮重プライマーを作製した：
【００８１】
【表１１】
2009529898.tif 000012
【００８２】
実施例２：Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1からのＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列の単離
実施例１に記載した縮重プライマーを使用して、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1からＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列を単離した：
【００８３】
ＲＮＡは、製造業者のプロトコール通りにＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen）を用いてNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1の葉から抽出し、製造業者の説明書通りにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ用第一鎖合成システム（Invitrogen Life Technologies）を用いてｃＤＮＡ合成に使用した。
【００８４】
テンプレートとしてｃＤＮＡおよびプライマー対ＸｙｌＦ４／ＸｙｌＲ４を使用して、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った：９４℃で１５秒間（変性）および６８℃で３分間（アニーリングおよび伸長）を４０サイクル。
【００８５】
約１５００塩基対のＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen）にクローニングし、いくつかのクローンを配列決定した（配列番号３の配列ＸｙｌＴｃ２Ｎｔおよび配列番号５の配列ＸｙｌＴｃ７Ｎｔを含む）。
【００８６】
推定ＸｙｌＴタンパク質をコードするNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ｍＲＮＡ配列（アクセッション番号ＡＪ６２７１８２；配列番号２３）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離されたＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列（配列番号３および５）との間のアライメントを図１に示す。
【００８７】
Nicotiana tabacum cv. Xanthi由来ｍＲＮＡ配列によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質（アクセッション番号ＡＪ６２７１８２；配列番号２４）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離されたｃＤＮＡ配列によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質（配列番号４および６）との間のアライメントを図２に示す。
【００８８】
実施例３：Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1およびNicotiana benthamianaのＸｙｌＴ遺伝子配列の単離
実施例１に記載した縮重プライマーを使用して、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1およびNicotiana benthamianaからＸｙｌＴ遺伝子配列を単離した。
【００８９】
ＤＮＡは、BernatzkyおよびTanksley（1986）が記載したプロトコールに基づいてNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1およびNicotiana benthamianaの葉から抽出した。
【００９０】
テンプレートとしてゲノムＤＮＡおよびプライマー対ＸｙｌＦ４／ＸｙｌＲ４を使用して、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った：９４℃で１５秒間（変性）および６８℃で４分３０秒間（アニーリングおよび伸長）を４０サイクル。
【００９１】
ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとしてNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ゲノムＤＮＡを使用して、約３４００塩基対のＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen）にクローニングし、いくつかのクローンを配列決定した（配列番号７の配列ＸｙｌＴｇ１Ｎｔおよび配列番号９の配列ＸｙｌＴｇ３Ｎｔを含むもの）。
【００９２】
ＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列ＸｙｌＴｇ１ＮｔおよびＸｙｌＴｇ３Ｎｔは、二つの推定イントロン配列および三つの推定エキソン配列を含む。イントロン配列の配置は：
- ＸｙｌＴｇ１Ｎｔについて：配列番号７の位置６７９のヌクレオチドから位置１９７４のヌクレオチドまで、および位置２１２５のヌクレオチドから位置２７２２のヌクレオチドまで、ならびに
- ＸｙｌＴｇ３Ｎｔについて：配列番号９の位置６５８のヌクレオチドから位置１９５３のヌクレオチドまで、および位置２１０４のヌクレオチドから位置２７０１のヌクレオチドまでである。
【００９３】
ＰＣＲ増幅用のテンプレートとしてNicotiana benthamiana由来ゲノムＤＮＡを用いて、約３３００塩基対から約３６００塩基対との間のＤＮＡフラグメントを増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen）にクローニングし、いくつかのクローンを配列決定した（配列番号１１の配列ＸｙｌＴｇ１４Ｎｂおよび配列番号１３の配列ＸｙｌＴｇ１９Ｎｂを含む）。
【００９４】
ＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列であるＸｙｌＴｇ１４ＮｂおよびＸｙｌＴｇ１９Ｎｂは、二つの推定イントロン配列および三つの推定エキソン配列を含む。イントロン配列の配置は：
- 配列番号１１の位置６５８のヌクレオチドから位置１９１７のヌクレオチドまで、および位置２０６８のヌクレオチドから位置２６１２のヌクレオチドまでのＸｙｌＴｇ１４Ｎｂならびに
- 配列番号１３の位置６４９のヌクレオチドから位置２１９４のヌクレオチドまで、および位置２３４５のヌクレオチドから位置２８８８のヌクレオチドまでのＸｙｌＴｇｌ９Ｎｂである。
【００９５】
推定ＸｙｌＴタンパク質をコードするNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ゲノムＤＮＡ配列（アクセッション番号ＡＪ６２７１８３；配列番号２５）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離されたＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列（配列番号７および９）およびNicotiana benthamianaから単離されたＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列（配列番号１１および１３）との間のアライメントを図３に示す。
【００９６】
Nicotiana tabacum cv. Xanthi由来ゲノムＤＮＡ配列によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質（アクセッション番号ＡＪ６２７１８３；配列番号２６）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離されたゲノムＤＮＡ配列（配列番号８および１０）およびNicotiana benthamianaから単離されたゲノムＤＮＡ配列（配列番号１２および１４）によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質との間のアライメントを図４に示す。
【００９７】
実施例４：Nicotiana  ＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡベクターの構築
実施例２および３に記載したNicotiana  ＸｙｌＴ配列から増幅したＤＮＡフラグメントを使用して、キメラ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターを構築したが、このキメラ遺伝子は、転写の際に、増幅したＤＮＡフラグメントからセンスおよびアンチセンスＤＮＡ配列を含むＲＮＡ分子をもたらし、そのＲＮＡ分子は、塩基対を形成して二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができた。このようなキメラ遺伝子を使用して、Nicotianaにおける、特にNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1およびNicotiana benthamianaにおけるＸｙｌＴ遺伝子の発現を減少させることができる。
【００９８】
４．１  Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ＸｙｌＴ配列から増幅したＤＮＡフラグメントを有するＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターの構築
Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に非縮重プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列を、実施例２で単離したNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1由来ｃＤＮＡ配列に基づいて設計した。クローニング目的でその５’末端にＣＡＣＣを有するようにフォワードプライマー（配列番号１５）を設計した。このようにして、以下の非縮重プライマーを作製した：
【００９９】
【表１２】
2009529898.tif 000013
【０１００】
テンプレートとして実施例２に記載したNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1のＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列から増幅したＤＮＡフラグメントを含むベクター（配列番号３のＸｙｌＴｃ２Ｎｔ）およびプライマー対ＸｙｌＦ８／ＸｙｌＲ８を使用して、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った：９４℃で１５秒間（変性）、５６℃で３０秒間（アニーリング）および６８℃で４５秒間（伸長）を２５サイクル。
【０１０１】
約４７０ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＸｙｌＴｉ４Ｎｔ；配列番号１７）を増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Invitrogen）にクローニングし、プラスミドｐＫＷ１９をもたらした。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ（Invitrogen）を用いてプラスミドｐＫＷ１９をｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ１２（Helliwell and Waterhouse, Methods (2003) 30: 289-295）でリコンビネーションし、プラスミドｐＴＫＷ２０をもたらした。
【０１０２】
したがって、ｐＴＫＷ２０のＴ−ＤＮＡ配列（配列番号１８）は：
・以下を含むキメラＸｙｌＴサイレンシング遺伝子：
- カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写体のプロモーター領域を含むフラグメント（Odell et al., 1985)
（配列番号１８のヌクレオチド９６９からヌクレオチド２３１４）
- センス方向にクローニングされたNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列の部分を含むフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド２３６５からヌクレオチド２８３４）
- ヒマ由来カターゼ１（catase-1）遺伝子のイントロンを含有するフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド２８９３からヌクレオチド３０８８）
- RoscheおよびWesthoff（1995）により記載されたフラベリア・トリネルビア（Flaveria trinervia）由来ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ遺伝子の第二イントロンを逆方向に含有するフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド３１３０からヌクレオチド３８７１）
- アンチセンス方向にクローニングされたNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列の部分を含むフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド３９５７からヌクレオチド４４２６）
- De Greveら（1982）に記載されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオクトピンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含むフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド４４７９からヌクレオチド５２４４）および
・以下を含む選択マーカーをコードするキメラ遺伝子：
- Agrobacterium tumefaciens  Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域を含むフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド５５１２からヌクレオチド５７４４）
- ｎｐｔＩＩ抗生物質耐性遺伝子を含むフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド５７４５からヌクレオチド６６９０）
- A. tumefaciens  Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含むフラグメント
（配列番号１８のヌクレオチド６６９１からヌクレオチド７３９６）
を含む。
【０１０３】
ヘルパーＴｉ−プラスミドを含むAgrobacterium tumefaciensに、このＴ−ＤＮＡベクターを導入した。
【０１０４】
４．２  Nicotiana benthamiana由来ＸｙｌＴ配列から増幅したＤＮＡフラグメントを有するＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターの構築
Nicotiana benthamiana由来ＸｙｌＴ遺伝子配列のＰＣＲ増幅において非縮重プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列を、実施例３で単離したNicotiana benthamiana由来遺伝子配列に基づいて設計した。フォワードプライマー（配列番号１９）は、その５’末端にＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧを有するように設計し、リバースプライマー（配列番号２０）は、クローニング目的でその５’末端にＧＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣを有するように設計した。このようにして、以下の非縮重プライマーを作製した：
【０１０５】
【表１３】
2009529898.tif 000014
【０１０６】
テンプレートとして実施例３に記載したNicotiana benthamianaのＸｙｌＴ遺伝子配列から増幅したＤＮＡフラグメントを含むベクター（配列番号１１のＸｙｌＴｇ１４Ｎｂ）およびプライマー対ＸｙｌＦ９／ＸｙｌＲ９を使用して、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った：９４℃で１５秒間（変性）、５８℃で３０秒間（アニーリング）、および６８℃で３０秒間（伸長）を２５サイクル。
【０１０７】
約４３０ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＸｙｌＴｉＮｂ；配列番号２１）を増幅し、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩならびにＢａｍＨＩおよびＣｌａＩでそれぞれ消化した。ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ／ＣｌａＩで消化したフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ／ＣｌａＩで消化したｐＨＡＮＮＩＢＡＬにクローニングし（Helliwell and Waterhouse, 2003）、ｐＫＷ２８をもたらした。
【０１０８】
したがって、プラスミドｐＫＷ２８は、以下を含むキメラＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を制限部位ＭｓｃＩとＰｓｔＩとの間に含む：
・カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写体のプロモーター領域を含むフラグメント（Odell et al., 1985）
（配列番号２２のヌクレオチド３７７９からヌクレオチド２４３４）
・センス方向にクローニングされたNicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子配列の部分を含むフラグメント
（配列番号２２のヌクレオチド２４２７からヌクレオチド２０２３）
・RoscheおよびWesthoff（1995）に記載されたFlaveria trinervia由来ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ遺伝子の第二イントロンを含有するフラグメント
（配列番号２２のヌクレオチド１９９１からヌクレオチド１２５０）
・アンチセンス方向にクローニングされたNicotiana benthamiana  ＸｙｌＴ遺伝子配列の部分を含むフラグメント
（配列番号２２のヌクレオチド１２１１からヌクレオチド８０７）
・De Greveら（1982）により記載されたAgrobacterium tumefaciensのオクトピンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含むフラグメント
（配列番号２２のヌクレオチド７８６からヌクレオチド７６）。
【０１０９】
プラスミドｐＫＷ２８は、ＭｓｃＩおよびＰｓｔＩで消化させ、以下を含む選択マーカーをコードするキメラ遺伝子と一緒に、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩを用いて切断したＴ−ＤＮＡベクターのＴ−ＤＮＡ境界の間にキメラ遺伝子を導入し、ｐＴＫＷ２９をもたらした（ｐＴＫＷ２９のＴ−ＤＮＡの配列を配列番号２２に示す）：
・A. tumefaciens  Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域を含むフラグメント
（配列番号２２のヌクレオチド３８５４からヌクレオチド４１４０）
・ｂａｒホスフィノトリシン耐性遺伝子を含むフラグメント（De Block et al., 1987）
（配列番号２２のヌクレオチド４１６１からヌクレオチド４７１２）
・A. tumefaciens  Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含むフラグメント
（配列番号２２のヌクレオチド４７３１からヌクレオチド４９９１）。
【０１１０】
ベクターｐＴＫＷ２９は、ｐＧＳＣ１７００由来である（Cornelissen and Vandewiele, 1989）。このベクターのバックボーンは、以下の遺伝子エレメントを含有する：
・エシェリキア・コリ（Escherichia coli）における複製のためのプラスミドｐＢＲ３２２（Bolivar et al., 1977）由来複製起点（ＯＲＩ  ＣｏｌＥ１）およびAgrobacterium tumefaciensにおける複製のためのシュードモナス（Pseudomonas）プラスミドｐＶＳ１（Itoh et al., 1984）由来複製起点（ＯＲＩ  ｐＶＳ１）を含む制限フラグメントを含むプラスミドコア
・Escherichia coliおよびAgrobacterium tumefaciensにおけるプラスミドの増殖およびのために、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン耐性を付与する選択マーカー遺伝子（ａａｄＡ）
・トランスポゾンＴｎ９０３由来ｎｐｔＩ遺伝子のネオマイシンホスフォトランスフェラーゼコード配列のフラグメントからなるＤＮＡ領域（Oka et al., 1981）。
【０１１１】
このＴ−ＤＮＡベクターを、ヘルパーＴｉ−プラスミドを含むAgrobacterium tumefaciensに導入する。
【０１１２】
実施例５：  ＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を有するトランスジェニックNicotiana植物の分析
実施例４に記載したAgrobacterium tumefaciens株を用いて、Nicotiana植物をトランスフォーメーションした:
【０１１３】
５．１  ＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を有するトランスジェニックNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1植物の分析
Zambryskiら（1983）に記載されたプロトコール通りに、実施例４．１に記載したAgrobacterium tumefaciens株を用いてNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1植物をトランスフォーメーションした。実施例４．１に記載したキメラ遺伝子を含むトランスジェニックNicotiana tabacumを５２系統得た。
【０１１４】
サザンブロット分析を用いて分子レベルでトランスジェニック植物系統を分析した。同様に、ノーザンブロット分析を用いてＸｙｌＴ  ＲＮＡ発現についてその植物系統を分析する。
【０１１５】
ＸｙｌＴ活性の指標は、トランスジェニック系統由来タンパク質のグリカン上に存在するβ−１，２−キシロース残基のレベルを非トランスフォーメーション植物のレベルと比較することによって得ることができる。植物のタンパク質結合Ｎ−グリカン上のβ−１，２−キシロース残基のレベルは、例えばFayeら（1993）により記載されたキシロース特異的抗体を用いた例えばウエスタンブロットにより、または例えばKolarichおよびAltmann（2000）により記載されたマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いた、もしくは例えばHenrikssonら（2003）により記載された液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いた植物糖タンパク質から単離されたグリカンの質量分析により、測定することができる。
【０１１６】
５．２  ＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を有するトランスジェニックNicotiana benthamiana植物の分析
同様に、実施例４．２に記載したAgrobacterium tumefaciens株を用いてNicotiana benthamiana植物をトランスフォーメーションし、ＸｙｌＴの発現およびタンパク質のグリカン上に存在するβ-1,2-キシロース残基のレベルを上記のように分析した。
【０１１７】
ｐＴＫＷ２９を用いた葉ディスクトランスフォメーション後に、実施例４．２に記載したキメラ遺伝子を含むトランスジェニックNicotiana benthamianaの５４系統を得た。
【０１１８】
これらの植物系の内在性タンパク質のグリカン上に存在するβ−１，２−キシロース残基のレベルを判定するために、β−１，２−キシロース特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより、各個体の可溶性葉タンパク質を分析した。
【０１１９】
６個の試料が抗体と非常に弱い反応を示し、６個の試料が抗体と検出可能な反応を示さなかった。他の試料について、抗体との反応レベルは、弱から野生型レベルまでの範囲であった。
【０１２０】
ｐＴＫＷ２９由来キメラＸｙｌＴサイレンシング遺伝子の挿入数を判定するために、β−１，２−キシロース特異的抗体に対して非常に弱いまたは負の反応を示す植物系統由来ゲノムＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、３５Ｓプロモーター領域に及ぶプローブおよびホスフィノトリシン耐性ｂａｒ遺伝子のコード領域に及ぶプローブを用いたサザンブロットにより分析した。
【０１２１】
１２植物系統のうちただ一つの挿入を示したものはなかった。ウエスタンブロット分析を用いると、一つの植物系統が二つの挿入を含有し、キシロースについて陰性であった。
【０１２２】
これらの二つのキメラＸｙｌＴサイレンシング遺伝子が独立して挿入されたかどうかを試験するために、およびウエスタンブロットでキシロースについて陰性であり、単一のキメラＸｙｌＴサイレンシング遺伝子を含有する植物を得るために、二つの挿入を含有する植物系統の自家受精により生じた子孫を播種し、ウエスタンブロット分析により２５植物系統を分析した。
【０１２３】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】推定ＸｙｌＴタンパク質をコードするNicotiana tabacum cv. XanthiのｃＤＮＡ配列（アクセッション番号ＡＪ６２７１８２；配列番号２３）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離された二つの異なるＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列（配列番号３および５）との間のグローバルＤＮＡアライメント（以下のパラメーターを有する標準線形スコア行列に基づく：ミスマッチペナルティー＝２、開始ギャップペナルティー＝４、および伸長ギャップペナルティー＝１）を示す図である。点は、Nicotiana tabacum cv. Xanthi  ｃＤＮＡ配列における対応するヌクレオチドと同一のNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチドを表し；横棒は、Nicotiana tabacum cv. Xanthi  ｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチドに対応するNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1  ｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの不在を表す。
【図２】Nicotiana tabacum cv. Xanthi由来ｃＤＮＡ配列によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質（アクセッション番号ＡＪ６２７１８２；  配列番号２４）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離された二つの異なるＸｙｌＴ  ｃＤＮＡ配列によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質（配列番号４および６）との間のグローバルタンパク質アライメント（ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列に基づく）を示す図である。点は、Nicotiana tabacum cv. Xanthiタンパク質配列における対応するアミノ酸と同一のNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1タンパク質配列におけるアミノ酸を表し;横棒は、Nicotiana tabacum cv. Xanthiタンパク質配列におけるアミノ酸に対応するNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1タンパク質配列におけるアミノ酸の不在を表す。
【図３】推定ＸｙｌＴタンパク質をコードするNicotiana tabacum cv. Xanthi由来ゲノムＤＮＡ配列（アクセッション番号ＡＪ６２７１８３；配列番号２５）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離された二つの異なるＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列（配列番号７および９）およびNicotiana benthamianaから単離された二つの異なるＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列（配列番号１１および１３）との間のグローバルタンパク質アライメント（以下のパラメーターを有する標準線形スコア行列に基づく：ミスマッチペナルティー＝２、開始ギャップペナルティー＝４、および伸長ギャップペナルティー＝１）を示す図である。点は、Nicotiana tabacum cv. XanthiゲノムＤＮＡ配列における対応するヌクレオチドと同一のNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1ゲノムＤＮＡ配列におけるヌクレオチドを表し;横棒は、Nicotiana tabacum cv. XanthiゲノムＤＮＡ配列におけるヌクレオチドに対応するNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1ゲノムＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの不在を表す。
【図４】Nicotiana tabacum cv. Xanthi由来ゲノムＤＮＡ配列によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質（アクセッション番号ＡＪ６２７１８３；配列番号２６）と、Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1から単離された二つの異なるＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列（配列番号８および１０）により、およびNicotiana benthamianaから単離された二つの異なるＸｙｌＴゲノムＤＮＡ配列（配列番号１２および１４）によりコードされる推定ＸｙｌＴタンパク質との間のグローバルタンパク質アライメント（ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列に基づく）を示す図である。点は、Nicotiana tabacum cv. Xanthiタンパク質配列における対応するアミノ酸と同一のNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1タンパク質配列におけるアミノ酸を表し；横棒は、Nicotiana tabacum cv. Xanthiタンパク質配列におけるアミノ酸に対応するNicotiana tabacum cv. Petite Havana SR1タンパク質配列におけるアミノ酸の不在を表す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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