(57)【要約】本発明は、IL-1R1に結合し、かつ該受容体へのIL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）の結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体、及びかかるdAb単量体を含むリガンドに関する。本発明は、プロテアーゼ耐性dAb単量体、及びプロテアーゼ耐性dAb単量体を含むリガンドに関する。本発明はまた、dAb単量体及びリガンドをコードするベクターを含む核酸、該核酸を含む宿主細胞、並びにdAb単量体又はリガンドを作製する方法に関する。本発明はまた、dAb単量体又はリガンドを含む医薬組成物、及びリガンドのdAb単量体を投与することを含む治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン1受容体1型（IL-1R1）に対する結合特異性を有し、インターロイキン1（IL-1）の該受容体への結合を阻害するが、インターロイキン1受容体アンタゴニスト（IL-1ra）のIL-1R1への結合を阻害しない、ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項２】
IL-1はインターロイキン1α（IL-1α）及びインターロイキン1β（IL-1β）よりなる群から選択される、請求項1記載のdAb単量体。
【請求項３】
IL-1のIL-1R1への結合を約1μM以下のIC50で阻害する、請求項1記載のdAb単量体。
【請求項４】
in vitroアッセイで、MRC-5細胞（ATCC受託番号CCL-171）によるIL-1により誘導されるインターロイキン8放出を1μM以下のND50で阻害する、請求項1記載のdAb単量体。
【請求項５】
in vitroアッセイで、MRC-5細胞（ATCC受託番号CCL-171）によるIL-1により誘導されるインターロイキン8放出を、1nM以下のND50で阻害する、請求項4記載のdAb単量体。
【請求項６】
全血アッセイで、IL-1により誘導されるインターロイキン6放出を1μM以下のND50で阻害する、請求項1記載のdAb単量体。
【請求項７】
dAb単量体中の1つ又はそれ以上のフレームワーク領域（FR）は、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも8つの連続アミノ酸、又は(c)ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列を含み、ここで、該フレームワーク領域はKabatにより規定されるものである、請求項1〜6のいずれか1項記載のdAb単量体。
【請求項８】
dAb単量体中の1つ又はそれ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、又は1つ又はそれ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域と比較して最大で計5個のアミノ酸の相違を含む、請求項7記載のdAb単量体。
【請求項９】
dAb単量体中のFR1、FR2、FR3、及びFR4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、又はFR1、FR2、FR3、及びFR4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域と比較して最大で計10個のアミノ酸の相違を含む、請求項7記載のdAb単量体。
【請求項１０】
FR1、FR2、及びFR3領域を含み、該FR1、FR2、及びFR3のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである、請求項7記載のdAb単量体。
【請求項１１】
ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントはDPK9及びJK1である、請求項7〜10のいずれか1項記載のdAb単量体。
【請求項１２】
IL-1R1への結合について、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、DOM4-122-73(配列番号165)、DOM4-1(配列番号8)、DOM4-2(配列番号9)、DOM4-3(配列番号10)、DOM4-4(配列番号11)、DOM4-5(配列番号12)、DOM4-6(配列番号13)、DOM4-7(配列番号14)、DOM4-8(配列番号15)、DOM4-9(配列番号16)、DOM4-10(配列番号17)、DOM4-11(配列番号18)、DOM4-12(配列番号19)、DOM4-13(配列番号20)、DOM4-14(配列番号21)、DOM4-15(配列番号22)、DOM4-20(配列番号23)、DOM4-21(配列番号24)、DOM4-22(配列番号25)、DOM4-23(配列番号26)、DOM4-25(配列番号27)、DOM4-26(配列番号28)、DOM4-27(配列番号29)、DOM4-28(配列番号30)、DOM4-29(配列番号31)、DOM4-31(配列番号32)、DOM4-32(配列番号33)、DOM4-33(配列番号34)、DOM4-34(配列番号35)、DOM4-36(配列番号36)、DOM4-37(配列番号37)、DOM4-38(配列番号38)、DOM4-39(配列番号39)、DOM4-40(配列番号40)、DOM4-41(配列番号41)、DOM4-42(配列番号42)、DOM4-44(配列番号43)、DOM4-45(配列番号44)、DOM4-46(配列番号45)、DOM4-49(配列番号46)、DOM4-50(配列番号47)、DOM4-74(配列番号48)、DOM4-75(配列番号49)、DOM4-76(配列番号50)、DOM4-78(配列番号51)、DOM4-79(配列番号52)、DOM4-80(配列番号53)、DOM4-81(配列番号54)、DOM4-82(配列番号55)、DOM4-83(配列番号56)、DOM4-84(配列番号57)、DOM4-85(配列番号58)、DOM4-86(配列番号59)、DOM4-87(配列番号60)、DOM4-88(配列番号61)、DOM4-89(配列番号62)、DOM4-90(配列番号63)、DOM4-91(配列番号64)、DOM4-92(配列番号65)、DOM4-93(配列番号66)、DOM4-94(配列番号67)、DOM4-95(配列番号68)、DOM4-96(配列番号69)、DOM4-97(配列番号70)、DOM4-98(配列番号71)、DOM4-99(配列番号72)、DOM4-100(配列番号73)、DOM4-101(配列番号74)、DOM4-102(配列番号75)、DOM4-103(配列番号76)、DOM4-104(配列番号77)、DOM4-105(配列番号78)、DOM4-106(配列番号79)、DOM4-107(配列番号80)、DOM4-108(配列番号81)、DOM4-109(配列番号82)、DOM4-110(配列番号83)、DOM4-111(配列番号84)、DOM4-112(配列番号85)、DOM4-113(配列番号86)、DOM4-114(配列番号87)、DOM4-115(配列番号88)、DOM4-116(配列番号89)、DOM4-117(配列番号90)、DOM4-118(配列番号91)、DOM4-119(配列番号92)、DOM4-120(配列番号93)、DOM4-121(配列番号94)、DOM4-123(配列番号166)、DOM4-124(配列番号167)、DOM4-125(配列番号168)、DOM4-126(配列番号169)、DOM4-127(配列番号170)、DOM4-128(配列番号171)、DOM4-129(配列番号172)、DOM4-129-1(配列番号173)、DOM4-129-2(配列番号174)、DOM4-129-3(配列番号175)、DOM4-129-4(配列番号176)、DOM4-129-5(配列番号177)、DOM4-129-6(配列番号178)、DOM4-129-7(配列番号179)、DOM4-129-8(配列番号180)、DOM4-129-9(配列番号181)、DOM4-129-10(配列番号182)、DOM4-129-11(配列番号183)、DOM4-129-12(配列番号184)、DOM4-129-13(配列番号185)、DOM4-129-14(配列番号186)、DOM4-129-15(配列番号187)、DOM4-129-16(配列番号188)、DOM4-129-17(配列番号189)、DOM4-129-18(配列番号190)、DOM4-129-19(配列番号191)、DOM4-129-20(配列番号192)、DOM4-129-21(配列番号193)、DOM4-129-22(配列番号194)、DOM4-129-23(配列番号195)、DOM4-129-24(配列番号196)、DOM4-129-25(配列番号197)、DOM4-129-26(配列番号198)、DOM4-129-27(配列番号199)、DOM4-129-28(配列番号200)、DOM4-129-29(配列番号201)、DOM4-129-31(配列番号202)、DOM4-129-32(配列番号203)、DOM4-129-33(配列番号204)、DOM4-129-34(配列番号205)、DOM4-129-35(配列番号206)、DOM4-129-37(配列番号207)、DOM4-129-38(配列番号208)、DOM4-129-39(配列番号209)、DOM4-129-40(配列番号210)、DOM4-129-41(配列番号211)、DOM4-129-42(配列番号212)、DOM4-129-43(配列番号213)、DOM4-129-44(配列番号214)、DOM4-131(配列番号347)、DOM4-132(配列番号348)、及びDOM4-133(配列番号349)よりなる群から選択されるdAbと競合する、請求項1記載のdAb単量体。
【請求項１３】
前記dAb単量体が、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、DOM4-122-73(配列番号165)、DOM4-1(配列番号8)、DOM4-2(配列番号9)、DOM4-3(配列番号10)、DOM4-4(配列番号11)、DOM4-5(配列番号12)、DOM4-6(配列番号13)、DOM4-7(配列番号14)、DOM4-8(配列番号15)、DOM4-9(配列番号16)、DOM4-10(配列番号17)、DOM4-11(配列番号18)、DOM4-12(配列番号19)、DOM4-13(配列番号20)、DOM4-14(配列番号21)、DOM4-15(配列番号22)、DOM4-20(配列番号23)、DOM4-21(配列番号24)、DOM4-22(配列番号25)、DOM4-23(配列番号26)、DOM4-25(配列番号27)、DOM4-26(配列番号28)、DOM4-27(配列番号29)、DOM4-28(配列番号30)、DOM4-29(配列番号31)、DOM4-31(配列番号32)、DOM4-32(配列番号33)、DOM4-33(配列番号34)、DOM4-34(配列番号35)、DOM4-36(配列番号36)、DOM4-37(配列番号37)、DOM4-38(配列番号38)、DOM4-39(配列番号39)、DOM4-40(配列番号40)、DOM4-41(配列番号41)、DOM4-42(配列番号42)、DOM4-44(配列番号43)、DOM4-45(配列番号44)、DOM4-46(配列番号45)、DOM4-49(配列番号46)、DOM4-50(配列番号47)、DOM4-74(配列番号48)、DOM4-75(配列番号49)、DOM4-76(配列番号50)、DOM4-78(配列番号51)、DOM4-79(配列番号52)、DOM4-80(配列番号53)、DOM4-81(配列番号54)、DOM4-82(配列番号55)、DOM4-83(配列番号56)、DOM4-84(配列番号57)、DOM4-85(配列番号58)、DOM4-86(配列番号59)、DOM4-87(配列番号60)、DOM4-88(配列番号61)、DOM4-89(配列番号62)、DOM4-90(配列番号63)、DOM4-91(配列番号64)、DOM4-92(配列番号65)、DOM4-93(配列番号66)、DOM4-94(配列番号67)、DOM4-95(配列番号68)、DOM4-96(配列番号69)、DOM4-97(配列番号70)、DOM4-98(配列番号71)、DOM4-99(配列番号72)、DOM4-100(配列番号73)、DOM4-101(配列番号74)、DOM4-102(配列番号75)、DOM4-103(配列番号76)、DOM4-104(配列番号77)、DOM4-105(配列番号78)、DOM4-106(配列番号79)、DOM4-107(配列番号80)、DOM4-108(配列番号81)、DOM4-109(配列番号82)、DOM4-110(配列番号83)、DOM4-111(配列番号84)、DOM4-112(配列番号85)、DOM4-113(配列番号86)、DOM4-114(配列番号87)、DOM4-115(配列番号88)、DOM4-116(配列番号89)、DOM4-117(配列番号90)、DOM4-118(配列番号91)、DOM4-119(配列番号92)、DOM4-120(配列番号93)、DOM4-121(配列番号94)、DOM4-123(配列番号166)、DOM4-124(配列番号167)、DOM4-125(配列番号168)、DOM4-126(配列番号169)、DOM4-127(配列番号170)、DOM4-128(配列番号171)、DOM4-129(配列番号172)、DOM4-129-1(配列番号173)、DOM4-129-2(配列番号174)、DOM4-129-3(配列番号175)、DOM4-129-4(配列番号176)、DOM4-129-5(配列番号177)、DOM4-129-6(配列番号178)、DOM4-129-7(配列番号179)、DOM4-129-8(配列番号180)、DOM4-129-9(配列番号181)、DOM4-129-10(配列番号182)、DOM4-129-11(配列番号183)、DOM4-129-12(配列番号184)、DOM4-129-13(配列番号185)、DOM4-129-14(配列番号186)、DOM4-129-15(配列番号187)、DOM4-129-16(配列番号188)、DOM4-129-17(配列番号189)、DOM4-129-18(配列番号190)、DOM4-129-19(配列番号191)、DOM4-129-20(配列番号192)、DOM4-129-21(配列番号193)、DOM4-129-22(配列番号194)、DOM4-129-23(配列番号195)、DOM4-129-24(配列番号196)、DOM4-129-25(配列番号197)、DOM4-129-26(配列番号198)、DOM4-129-27(配列番号199)、DOM4-129-28(配列番号200)、DOM4-129-29(配列番号201)、DOM4-129-31(配列番号202)、DOM4-129-32(配列番号203)、DOM4-129-33(配列番号204)、DOM4-129-34(配列番号205)、DOM4-129-35(配列番号206)、DOM4-129-37(配列番号207)、DOM4-129-38(配列番号208)、DOM4-129-39(配列番号209)、DOM4-129-40(配列番号210)、DOM4-129-41(配列番号211)、DOM4-129-42(配列番号212)、DOM4-129-43(配列番号213)、DOM4-129-44(配列番号214)、DOM4-131(配列番号347)、DOM4-132(配列番号348)、及びDOM4-133(配列番号349)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項12記載のdAb単量体。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴により測定される約300nM〜約5pMの親和性（KD）でヒトIL-1R1と結合する、請求項1記載のdAb単量体。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか1項のdAb単量体と半減期延長部分とを含むリガンド。
【請求項１６】
半減期延長部分は、ポリアルキレングリコール部分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、又はin vivoで半減期を高めるポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項15記載のリガンド。
【請求項１７】
半減期延長部分はポリエチレングリコール部分である、請求項16記載のリガンド。
【請求項１８】
半減期延長成分は、血清アルブミンもしくは新生児Fc受容体に対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項16記載のリガンド。
【請求項１９】
前記抗体または抗体フラグメントは抗体フラグメントであり、該抗体フラグメントは免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項18記載のリガンド。
【請求項２０】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト血清アルブミンに対する結合について、DOM7m-16(配列番号723)、DOM7m-12(配列番号724)、DOM7m-26(配列番号725)、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、DOM7r-8(配列番号731)、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、DOM7h-27(配列番号745)、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)よりなる群から選択されるdAbと競合する、請求項19記載のリガンド。
【請求項２１】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト血清アルブミンに結合し、かつDOM7m-16(配列番号723)、DOM7m-12(配列番号724)、DOM7m-26(配列番号725)、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、DOM7r-8(配列番号731)、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、DOM7h-27(配列番号745)、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項20記載のリガンド。
【請求項２２】
IL-1R1に対する結合特異性を有し、該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体を含むリガンドであって、該dAb単量体は、DOM4-122-23(配列番号1)及びDOM4-122-24(配列番号2)よりなる群から選択されるものである、上記リガンド。
【請求項２３】
dAb単量体である、請求項22記載のリガンド。
【請求項２４】
dAb単量体のホモ二量体、ホモ三量体、又はホモオリゴマーである、請求項22記載のリガンド。
【請求項２５】
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、又はヘテロオリゴマーであり、かつDOM4-122-23(配列番号1)及びDOM4-122-24(配列番号2)を含む、請求項22記載のリガンド。
【請求項２６】
血清アルブミンに結合するdAb単量体をさらに含む、請求項22記載のリガンド。
【請求項２７】
血清アルブミンに結合するdAb単量体はDOM7h-8(配列番号746)である、請求項26記載のリガンド。
【請求項２８】
DOM4-122-23(配列番号1)及びDOM7h-8(配列番号746)を含むか、又はDOM-122-24(配列番号2)及びDOM7h-8(配列番号746)を含む、請求項27記載のリガンド。
【請求項２９】
IL-1R1に対する結合特異性を有し、IL-1の該受容体への結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体と、TNFR1に対する結合特異性を有するdAb単量体とを含むリガンド。
【請求項３０】
IL-1R1に対する結合特異性を有し、かつIL-1R1へのIL-1及びIL-1raの結合を阻害する前記dAb単量体は、IL-1R1への結合について、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、DOM4-122-73(配列番号165)、DOM4-1(配列番号8)、DOM4-2(配列番号9)、DOM4-3(配列番号10)、DOM4-4(配列番号11)、DOM4-5(配列番号12)、DOM4-6(配列番号13)、DOM4-7(配列番号14)、DOM4-8(配列番号15)、DOM4-9(配列番号16)、DOM4-10(配列番号17)、DOM4-11(配列番号18)、DOM4-12(配列番号19)、DOM4-13(配列番号20)、DOM4-14(配列番号21)、DOM4-15(配列番号22)、DOM4-20(配列番号23)、DOM4-21(配列番号24)、DOM4-22(配列番号25)、DOM4-23(配列番号26)、DOM4-25(配列番号27)、DOM4-26(配列番号28)、DOM4-27(配列番号29)、DOM4-28(配列番号30)、DOM4-29(配列番号31)、DOM4-31(配列番号32)、DOM4-32(配列番号33)、DOM4-33(配列番号34)、DOM4-34(配列番号35)、DOM4-36(配列番号36)、DOM4-37(配列番号37)、DOM4-38(配列番号38)、DOM4-39(配列番号39)、DOM4-40(配列番号40)、DOM4-41(配列番号41)、DOM4-42(配列番号42)、DOM4-44(配列番号43)、DOM4-45(配列番号44)、DOM4-46(配列番号45)、DOM4-49(配列番号46)、DOM4-50(配列番号47)、DOM4-74(配列番号48)、DOM4-75(配列番号49)、DOM4-76(配列番号50)、DOM4-78(配列番号51)、DOM4-79(配列番号52)、DOM4-80(配列番号53)、DOM4-81(配列番号54)、DOM4-82(配列番号55)、DOM4-83(配列番号56)、DOM4-84(配列番号57)、DOM4-85(配列番号58)、DOM4-86(配列番号59)、DOM4-87(配列番号60)、DOM4-88(配列番号61)、DOM4-89(配列番号62)、DOM4-90(配列番号63)、DOM4-91(配列番号64)、DOM4-92(配列番号65)、DOM4-93(配列番号66)、DOM4-94(配列番号67)、DOM4-95(配列番号68)、DOM4-96(配列番号69)、DOM4-97(配列番号70)、DOM4-98(配列番号71)、DOM4-99(配列番号72)、DOM4-100(配��番号73)、DOM4-101(配列番号74)、DOM4-102(配列番号75)、DOM4-103(配列番号76)、DOM4-104(配列番号77)、DOM4-105(配列番号78)、DOM4-106(配列番号79)、DOM4-107(配列番号80)、DOM4-108(配列番号81)、DOM4-109(配列番号82)、DOM4-110(配列番号83)、DOM4-111(配列番号84)、DOM4-112(配列番号85)、DOM4-113(配列番号86)、DOM4-114(配列番号87)、DOM4-115(配列番号88)、DOM4-116(配列番号89)、DOM4-117(配列番号90)、DOM4-118(配列番号91)、DOM4-119(配列番号92)、DOM4-120(配列番号93)、DOM4-121(配列番号94)、DOM4-123(配列番号166)、DOM4-124(配列番号167)、DOM4-125(配列番号168)、DOM4-126(配列番号169)、DOM4-127(配列番号170)、DOM4-128(配列番号171)、DOM4-129(配列番号172)、DOM4-129-1(配列番号173)、DOM4-129-2(配列番号174)、DOM4-129-3(配列番号175)、DOM4-129-4(配列番号176)、DOM4-129-5(配列番号177)、DOM4-129-6(配列番号178)、DOM4-129-7(配列番号179)、DOM4-129-8(配列番号180)、DOM4-129-9(配列番号181)、DOM4-129-10(配列番号182)、DOM4-129-11(配列番号183)、DOM4-129-12(配列番号184)、DOM4-129-13(配列番号185)、DOM4-129-14(配列番号186)、DOM4-129-15(配列番号187)、DOM4-129-16(配列番号188)、DOM4-129-17(配列番号189)、DOM4-129-18(配列番号190)、DOM4-129-19(配列番号191)、DOM4-129-20(配列番号192)、DOM4-129-21(配列番号193)、DOM4-129-22(配列番号194)、DOM4-129-23(配列番号195)、DOM4-129-24(配列番号196)、DOM4-129-25(配列番号197)、DOM4-129-26(配列番号198)、DOM4-129-27(配列番号199)、DOM4-129-28(配列番号200)、DOM4-129-29(配列番号201)、DOM4-129-31(配列番号202)、DOM4-129-32(配列番号203)、DOM4-129-33(配列番号204)、DOM4-129-34(配列番号205)、DOM4-129-35(配列番号206)、DOM4-129-37(配列番号207)、DOM4-129-38(配列番号208)、DOM4-129-39(配列番号209)、DOM4-129-40(配列番号210)、DOM4-129-41(配列番号211)、DOM4-129-42(配列番号212)、DOM4-129-43(配列番号213)、DOM4-129-44(配列番号214)、DOM4-131(配列番号347)、DOM4-132(配列番号348)、及びDOM4-133(配列番号349)よりなる群から選択されるdAbと競合する、請求項29記載のリガンド。
【請求項３１】
IL-1R1に対する結合特異性を有し、かつIL-1R1へのIL-1及びIL-1raの結合を阻害する前記dAb単量体は、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、DOM4-122-73(配列番号165)、DOM4-1(配列番号8)、DOM4-2(配列番号9)、DOM4-3(配列番号10)、DOM4-4(配列番号11)、DOM4-5(配列番号12)、DOM4-6(配列番号13)、DOM4-7(配列番号14)、DOM4-8(配列番号15)、DOM4-9(配列番号16)、DOM4-10(配列番号17)、DOM4-11(配列番号18)、DOM4-12(配列番号19)、DOM4-13(配列番号20)、DOM4-14(配列番号21)、DOM4-15(配列番号22)、DOM4-20(配列番号23)、DOM4-21(配列番号24)、DOM4-22(配列番号25)、DOM4-23(配列番号26)、DOM4-25(配列番号27)、DOM4-26(配列番号28)、DOM4-27(配列番号29)、DOM4-28(配列番号30)、DOM4-29(配列番号31)、DOM4-31(配列番号32)、DOM4-32(配列番号33)、DOM4-33(配列番号34)、DOM4-34(配列番号35)、DOM4-36(配列番号36)、DOM4-37(配列番号37)、DOM4-38(配列番号38)、DOM4-39(配列番号39)、DOM4-40(配列番号40)、DOM4-41(配列番号41)、DOM4-42(配列番号42)、DOM4-44(配列番号43)、DOM4-45(配列番号44)、DOM4-46(配列番号45)、DOM4-49(配列番号46)、DOM4-50(配列番号47)、DOM4-74(配列番号48)、DOM4-75(配列番号49)、DOM4-76(配列番号50)、DOM4-78(配列番号51)、DOM4-79(配列番号52)、DOM4-80(配列番号53)、DOM4-81(配列番号54)、DOM4-82(配列番号55)、DOM4-83(配列番号56)、DOM4-84(配列番号57)、DOM4-85(配列番号58)、DOM4-86(配列番号59)、DOM4-87(配列番号60)、DOM4-88(配列番号61)、DOM4-89(配列番号62)、DOM4-90(配列番号63)、DOM4-91(配列番号64)、DOM4-92(配列番号65)、DOM4-93(配列番号66)、DOM4-94(配列番号67)、DOM4-95(配列番号68)、DOM4-96(配列番号69)、DOM4-97(配列番号70)、DOM4-98(配列番号71)、DOM4-99(配列番号72)、DOM4-100(配列番号73)、DOM4-101(配列番��74)、DOM4-102(配列番号75)、DOM4-103(配列番号76)、DOM4-104(配列番号77)、DOM4-105(配列番号78)、DOM4-106(配列番号79)、DOM4-107(配列番号80)、DOM4-108(配列番号81)、DOM4-109(配列番号82)、DOM4-110(配列番号83)、DOM4-111(配列番号84)、DOM4-112(配列番号85)、DOM4-113(配列番号86)、DOM4-114(配列番号87)、DOM4-115(配列番号88)、DOM4-116(配列番号89)、DOM4-117(配列番号90)、DOM4-118(配列番号91)、DOM4-119(配列番号92)、DOM4-120(配列番号93)、DOM4-121(配列番号94)、DOM4-123(配列番号166)、DOM4-124(配列番号167)、DOM4-125(配列番号168)、DOM4-126(配列番号169)、DOM4-127(配列番号170)、DOM4-128(配列番号171)、DOM4-129(配列番号172)、DOM4-129-1(配列番号173)、DOM4-129-2(配列番号174)、DOM4-129-3(配列番号175)、DOM4-129-4(配列番号176)、DOM4-129-5(配列番号177)、DOM4-129-6(配列番号178)、DOM4-129-7(配列番号179)、DOM4-129-8(配列番号180)、DOM4-129-9(配列番号181)、DOM4-129-10(配列番号182)、DOM4-129-11(配列番号183)、DOM4-129-12(配列番号184)、DOM4-129-13(配列番号185)、DOM4-129-14(配列番号186)、DOM4-129-15(配列番号187)、DOM4-129-16(配列番号188)、DOM4-129-17(配列番号189)、DOM4-129-18(配列番号190)、DOM4-129-19(配列番号191)、DOM4-129-20(配列番号192)、DOM4-129-21(配列番号193)、DOM4-129-22(配列番号194)、DOM4-129-23(配列番号195)、DOM4-129-24(配列番号196)、DOM4-129-25(配列番号197)、DOM4-129-26(配列番号198)、DOM4-129-27(配列番号199)、DOM4-129-28(配列番号200)、DOM4-129-29(配列番号201)、DOM4-129-31(配列番号202)、DOM4-129-32(配列番号203)、DOM4-129-33(配列番号204)、DOM4-129-34(配列番号205)、DOM4-129-35(配列番号206)、DOM4-129-37(配列番号207)、DOM4-129-38(配列番号208)、DOM4-129-39(配列番号209)、DOM4-129-40(配列番号210)、DOM4-129-41(配列番号211)、DOM4-129-42(配列番号212)、DOM4-129-43(配列番号213)、DOM4-129-44(配列番号214)、DOM4-131(配列番号347)、DOM4-132(配列番号348)、及びDOM4-133(配列番号349)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項30記載のリガンド。
【請求項３２】
TNFR1に対する結合特異性を有する前記dAb単量体は、TNFR1への結合について、TAR2h-12(配列番号785)、TAR2h-13(配列番号786)、TAR2h-14(配列番号787)、TAR2h-16(配列番号788)、TAR2h-17(配列番号789)、TAR2h-18(配列番号790)、TAR2h-19(配列番号791)、TAR2h-20(配列番号792)、TAR2h-21(配列番号793)、TAR2h-22(配列番号794)、TAR2h-23(配列番号795)、TAR2h-24(配列番号796)、TAR2h-25(配列番号797)、TAR2h-26(配列番号798)、TAR2h-27(配列番号799)、TAR2h-29(配列番号800)、TAR2h-30(配列番号801)、TAR2h-32(配列番号802)、TAR2h-33(配列番号803)、TAR2h-10-1(配列番号804)、TAR2h-10-2(配列番号805)、TAR2h-10-3(配列番号806)、TAR2h-10-4(配列番号807)、TAR2h-10-5(配列番号808)、TAR2h-10-6(配列番号809)、TAR2h-10-7(配列番号810)、TAR2h-10-8(配列番号811)、TAR2h-10-9(配列番号812)、TAR2h-10-10(配列番号813)、TAR2h-10-11(配列番号814)、TAR2h-10-12(配列番号815)、TAR2h-10-13(配列番号816)、TAR2h-10-14(配列番号817)、TAR2h-10-15(配列番号818)、TAR2h-10-16(配列番号819)、TAR2h-10-17(配列番号820)、TAR2h-10-18(配列番号821)、TAR2h-10-19(配列番号822)、TAR2h-10-20(配列番号823)、TAR2h-10-21(配列番号824)、TAR2h-10-22(配列番号825)、TAR2h-10-27(配列番号826)、TAR2h-10-29(配列番号827)、TAR2h-10-31(配列番号828)、TAR2h-10-35(配列番号829)、TAR2h-10-36(配列番号830)、TAR2h-10-37(配列番号831)、TAR2h-10-38(配列番号832)、TAR2h-10-45(配列番号833)、TAR2h-10-47(配列番号834)、TAR2h-10-48(配列番号835)、TAR2h-10-57(配列番号836)、TAR2h-10-56(配列番号837)、TAR2h-10-58(配列番号838)、TAR2h-10-66(配列番号839)、TAR2h-10-64(配列番号840)、TAR2h-10-65(配列番号841)、TAR2h-10-68(配列番号842)、TAR2h-10-69(配列番号843)、TAR2h-10-67(配列番号844)、TAR2h-10-61(配列番号845)、TAR2h-10-62(配列番号846)、TAR2h-10-63(配列番号847)、TAR2h-10-60(配列番号848)、TAR2h-10-55(配列番号849)、TAR2h-10-59(配列番号850)、TAR2h-10-70(配列番号851)、TAR2h-34(配列番号852)、TAR2h-35(配列番号853)、TAR2h-36(配列番号854)、TAR2h-37(配列番号855)、TAR2h-38(配列番号856)、TAR2h-39(配列番号857)、TAR2h-40(配列番号858)、TAR2h-41(配列番号859)、TAR2h-42(配列番号860)、TAR2h-43(配列番号861)、TAR2h-44(配列番号862)、TAR2h-45(配列番号863)、TAR2h-47(配列番号864)、TAR2h-48(配列番号865)、TAR2h-50(配列番号866)、TAR2h-51(配列番号867)、TAR2h-66(配列番号868)、TAR2h-67(配列番号869)、TAR2h-68(配列番号870)、TAR2h-70(配列番号871)、TAR2h-71(配列番号872)、TAR2h-72(配列番号873)、TAR2h-73(配列番号874)、TAR2h-74(配列番号875)、TAR2h-75(配列番号876)、TAR2h-76(配列番号877)、TAR2h-77(配列番号878)、TAR2h-78(配列番号879)、TAR2h-79(配列番号880)、TAR2h-15(配列番号881)、TAR2h-131-8(配列番号882)、TAR2h-131-24(配列番号883)、TAR2h-15-8(配列番号884)、TAR2h-15-8-1(配列番号885)、TAR2h-15-8-2(配列番号886)、TAR2h-185-23(配列番号887)、TAR2h-154-10-5(配列番号888)、TAR2h-14-2(配列番号889)、TAR2h-151-8(配列番号890)、TAR2h-152-7(配列番号891)、TAR2h-35-4(配列番号892)、TAR2h-154-7(配列番号893)、TAR2h-80(配列番号894)、TAR2h-81(配列番号895)、TAR2h-82(配列番号896)、TAR2h-83(配列番号897)、TAR2h-84(配列番号898)、TAR2h-85(配列番号899)、TAR2h-86(配列番号900)、TAR2h-87(配列番号901)、TAR2h-88(配列番号902)、TAR2h-89(配列番号903)、TAR2h-90(配列番号904)、TAR2h-91(配列番号905)、TAR2h-92(配列番号906)、TAR2h-93(配列番号907)、TAR2h-94(配列番号908)、TAR2h-95(配列番号909)、TAR2h-96(配列番号910)、TAR2h-97(配列番号911)、TAR2h-99(配列番号912)、TAR2h-100(配列番号913)、TAR2h-101(配列番号914)、TAR2h-102(配列番号915)、TAR2h-103(配列番号916)、TAR2h-104(配列番号917)、TAR2h-105(配列番号918)、TAR2h-106(配列番号919)、TAR2h-107(配列番号920)、TAR2h-108(配列番号921)、TAR2h-109(配列番号922)、TAR2h-110(配列番号923)、TAR2h-111(配列番号924)、TAR2h-112(配列番号925)、TAR2h-113(配列番号926)、TAR2h-114(配列番号927)、TAR2h-115(配列番号928)、TAR2h-116(配列番号929)、TAR2h-117(配列番号930)、TAR2h-118(配列番号931)、TAR2h-119(配列番号932)、TAR2h-120(配列番号933)、TAR2h-121(配列番号934)、TAR2h-122(配列番号935)、TAR2h-123(配列番号936)、TAR2h-124(配列番号937)、TAR2h-125(配列番号938)、TAR2h-126(配列番号939)、TAR2h-127(配列番号940)、TAR2h-128(配列番号941)、TAR2h-129(配列番号942)、TAR2h-130(配列番号943)、TAR2h-131(配列番号944)、TAR2h-132(配列番号945)、TAR2h-133(配列番号946)、TAR2h-151(配列番号947)、TAR2h-152(配列番号948)、TAR2h-153(配列番号949)、TAR2h-154(配列番号950)、TAR2h-159(配列番号951)、TAR2h-165(配列番号952)、TAR2h-166(配列番号953)、TAR2h-168(配列番号954)、TAR2h-171(配列番号955)、TAR2h-172(配列番号956)、TAR2h-173(配列番号957)、TAR2h-174(配列番号958)、TAR2h-176(配列番号959)、TAR2h-178(配列番号960)、TAR2h-201(配列番号961)、TAR2h-202(配列番号962)、TAR2h-203(配列番号963)、TAR2h-204(配列番号964)、TAR2h-185-25(配列番号965)、TAR2h-154-10(配列番号966)、TAR2h-205(配列番号967)、TAR2h-10(配列番号968)、TAR2h-5(配列番号969)、TAR2h-5d1(配列番号970)、TAR2h-5d2(配列番号971)、TAR2h-5d3(配列番号972)、TAR2h-5d4(配列番号973)、TAR2h-5d5(配列番号974)、TAR2h-5d6(配列番号975)、TAR2h-5d7(配列番号976)、TAR2h-5d8(配列番号977)、TAR2h-5d9 (配列番号978)、TAR2h-5d10(配列番号979)、TAR2h-5d11(配列番号980)、TAR2h-5d12(配列番号981)、及びTAR2h-5d13(配列番号982)よりなる群から選択されるdAbと競合する、請求項29〜31のいずれか1項記載のリガンド。
【請求項３３】
TNFR1に対する結合特異性を有する前記dAb単量体は、TAR2h-12(配列番号785)、TAR2h-13(配列番号786)、TAR2h-14(配列番号787)、TAR2h-16(配列番号788)、TAR2h-17(配列番号789)、TAR2h-18(配列番号790)、TAR2h-19(配列番号791)、TAR2h-20(配列番号792)、TAR2h-21(配列番号793)、TAR2h-22(配列番号794)、TAR2h-23(配列番号795)、TAR2h-24(配列番号796)、TAR2h-25(配列番号797)、TAR2h-26(配列番号798)、TAR2h-27(配列番号799)、TAR2h-29(配列番号800)、TAR2h-30(配列番号801)、TAR2h-32(配列番号802)、TAR2h-33(配列番号803)、TAR2h-10-1(配列番号804)、TAR2h-10-2(配列番号805)、TAR2h-10-3(配列番号806)、TAR2h-10-4(配列番号807)、TAR2h-10-5(配列番号808)、TAR2h-10-6(配列番号809)、TAR2h-10-7(配列番号810)、TAR2h-10-8(配列番号811)、TAR2h-10-9(配列番号812)、TAR2h-10-10(配列番号813)、TAR2h-10-11(配列番号814)、TAR2h-10-12(配列番号815)、TAR2h-10-13(配列番号816)、TAR2h-10-14(配列番号817)、TAR2h-10-15(配列番号818)、TAR2h-10-16(配列番号819)、TAR2h-10-17(配列番号820)、TAR2h-10-18(配列番号821)、TAR2h-10-19(配列番号822)、TAR2h-10-20(配列番号823)、TAR2h-10-21(配列番号824)、TAR2h-10-22(配列番号825)、TAR2h-10-27(配列番号826)、TAR2h-10-29(配列番号827)、TAR2h-10-31(配列番号828)、TAR2h-10-35(配列番号829)、TAR2h-10-36(配列番号830)、TAR2h-10-37(配列番号831)、TAR2h-10-38(配列番号832)、TAR2h-10-45(配列番号833)、TAR2h-10-47(配列番号834)、TAR2h-10-48(配列番号835)、TAR2h-10-57(配列番号836)、TAR2h-10-56(配列番号837)、TAR2h-10-58(配列番号838)、TAR2h-10-66(配列番号839)、TAR2h-10-64(配列番号840)、TAR2h-10-65(配列番号841)、TAR2h-10-68(配列番号842)、TAR2h-10-69(配列番号843)、TAR2h-10-67(配列番号844)、TAR2h-10-61(配列番号845)、TAR2h-10-62(配列番号846)、TAR2h-10-63(配列番号847)、TAR2h-10-60(配列番号848)、TAR2h-10-55(配列番号849)、TAR2h-10-59(配列番号850)、TAR2h-10-70(配列番号851)、TAR2h-34(配列番号852)、TAR2h-35(配列番号853)、TAR2h-36(配列番号854)、TAR2h-37(配列番号855)、TAR2h-38(配列番号856)、TAR2h-39(配列番号857)、TAR2h-40(配列番号858)、TAR2h-41(配列番号859)、TAR2h-42(配列番号860)、TAR2h-43(配列番号861)、TAR2h-44(配列番号862)、TAR2h-45(配列番号863)、TAR2h-47(配列番号864)、TAR2h-48(配列番号865)、TAR2h-50(配列番号866)、TAR2h-51(配列番号867)、TAR2h-66(配列番号868)、TAR2h-67(配列番号869)、TAR2h-68(配列番号870)、TAR2h-70(配列番号871)、TAR2h-71(配列番号872)、TAR2h-72(配列番号873)、TAR2h-73(配列番号874)、TAR2h-74(配列番号875)、TAR2h-75(配列番号876)、TAR2h-76(配列番号877)、TAR2h-77(配列番号878)、TAR2h-78(配列番号879)、TAR2h-79(配列番号880)、TAR2h-15(配列番号881)、TAR2h-131-8(配列番号882)、TAR2h-131-24(配列番号883)、TAR2h-15-8(配列番号884)、TAR2h-15-8-1(配列番号885)、TAR2h-15-8-2(配列番号886)、TAR2h-185-23(配列番号887)、TAR2h-154-10-5(配列番号888)、TAR2h-14-2(配列番号889)、TAR2h-151-8(配列番号890)、TAR2h-152-7(配列番号891)、TAR2h-35-4(配列番号892)、TAR2h-154-7(配列番号893)、TAR2h-80(配列番号894)、TAR2h-81(配列番号895)、TAR2h-82(配列番号896)、TAR2h-83(配列番号897)、TAR2h-84(配列番号898)、TAR2h-85(配列番号899)、TAR2h-86(配列番号900)、TAR2h-87(配列番号901)、TAR2h-88(配列番号902)、TAR2h-89(配列番号903)、TAR2h-90(配列番号904)、TAR2h-91(配列番号905)、TAR2h-92(配列番号906)、TAR2h-93(配列番号907)、TAR2h-94(配列番号908)、TAR2h-95(配列番号909)、TAR2h-96(配列番号910)、TAR2h-97(配列番号911)、TAR2h-99(配列番号912)、TAR2h-100(配列番号913)、TAR2h-101(配列番号914)、TAR2h-102(配列番号915)、TAR2h-103(配列番号916)、TAR2h-104(配列番号917)、TAR2h-105(配列番号918)、TAR2h-106(配列番号919)、TAR2h-107(配列番号920)、TAR2h-108(配列番号921)、TAR2h-109(配列番号922)、TAR2h-110(配列番号923)、TAR2h-111(配列番号924)、TAR2h-112(配列番号925)、TAR2h-113(配列番号926)、TAR2h-114(配列番号927)、TAR2h-115(配列番号928)、TAR2h-116(配列番号929)、TAR2h-117(配列番号930)、TAR2h-118(配列番号931)、TAR2h-119(配列番号932)、TAR2h-120(配列番号933)、TAR2h-121(配列番号934)、TAR2h-122(配列番号935)、TAR2h-123(配列番号936)、TAR2h-124(配列番号937)、TAR2h-125(配列番号938)、TAR2h-126(配列番号939)、TAR2h-127(配列番号940)、TAR2h-128(配列番号941)、TAR2h-129(配列番号942)、TAR2h-130(配列番号943)、TAR2h-131(配列番号944)、TAR2h-132(配列番号945)、TAR2h-133(配列番号946)、TAR2h-151(配列番号947)、TAR2h-152(配列番号948)、TAR2h-153(配列番号949)、TAR2h-154(配列番号950)、TAR2h-159(配列番号951)、TAR2h-165(配列番号952)、TAR2h-166(配列番号953)、TAR2h-168(配列番号954)、TAR2h-171(配列番号955)、TAR2h-172(配列番号956)、TAR2h-173(配列番号957)、TAR2h-174(配列番号958)、TAR2h-176(配列番号959)、TAR2h-178(配列番号960)、TAR2h-201(配列番号961)、TAR2h-202(配列番号962)、TAR2h-203(配列番号963)、TAR2h-204(配列番号964)、TAR2h-185-25(配列番号965)、TAR2h-154-10(配列番号966)、TAR2h-205(配列番号967)、TAR2h-10(配列番号968)、TAR2h-5(配列番号969)、TAR2h-5d1(配列番号970)、TAR2h-5d2(配列番号971)、TAR2h-5d3(配列番号972)、TAR2h-5d4(配列番号973)、TAR2h-5d5(配列番号974)、TAR2h-5d6(配列番号975)、TAR2h-5d7(配列番号976)、TAR2h-5d8(配列番号977)、TAR2h-5d9(配列番号978)、TAR2h-5d10(配列番号979)、TAR2h-5d11(配列番号980)、TAR2h-5d12(配列番号981)、及びTAR2h-5d13(配列番号982)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項32記載のリガンド。
【請求項３４】
半減期延長部分をさらに含む、請求項29〜33のいずれか1項記載のリガンド。
【請求項３５】
半減期延長部分は、ポリアルキレングリコール部分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、又はin vivoで半減期を高めるポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項34記載のリガンド。
【請求項３６】
半減期延長部分はポリエチレングリコール部分である、請求項35記載のリガンド。
【請求項３７】
半減期延長部分は、血清アルブミン又は新生児Fc受容体に対する結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである、請求項35記載のリガンド。
【請求項３８】
前記抗体または抗体フラグメントは抗体フラグメントであり、該抗体フラグメントは免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項37記載のリガンド。
【請求項３９】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト血清アルブミンへの結合について、DOM7m-16(配列番号723)、DOM7m-12(配列番号724)、DOM7m-26(配列番号725)、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、DOM7r-8(配列番号731)、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、DOM7h-27(配列番号745)、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)よりなる群から選択されるdAbと競合する、請求項38記載のリガンド。
【請求項４０】
ヒト血清アルブミンに結合する前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、DOM7m-16(配列番号723)、DOM7m-12(配列番号724)、DOM7m-26(配列番号725)、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、DOM7r-8(配列番号731)、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、DOM7h-27(配列番号745)、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項39記載のリガンド。
【請求項４１】
請求項1〜40のいずれか1項記載のdAb単量体又はリガンドをコードする単離された核酸。
【請求項４２】
請求項1〜40のいずれか1項記載のdAb単量体又はリガンドをコードする組換え核酸。
【請求項４３】
請求項1〜40のいずれか1項記載のdAb単量体又はリガンドをコードする核酸を含むベクター。
【請求項４４】
発現ベクターである、請求項43記載のベクター。
【請求項４５】
請求項42記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項43又は44記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４７】
請求項45に記載の宿主細胞を前記組換え核酸の発現に適した条件下で維持することを含む、IL-1R1に対する結合特異性を有し、かつ該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないリガンドのdAb単量体を作製する方法。
【請求項４８】
請求項46に記載の宿主細胞を前記ベクターの発現に適した条件下で維持することを含む、IL-1R1に対する結合特異性を有し、かつ該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないリガンドのdAb単量体を作製する方法。
【請求項４９】
請求項1〜40のいずれか1項記載のdAb単量体又はリガンドと生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５０】
静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下送達器具、関節内、又は皮下投与用である、請求項49記載の医薬組成物。
【請求項５１】
肺、鼻内送達器具、膣、又は直腸投与用である、請求項49記載の医薬組成物。
【請求項５２】
請求項49記載の医薬組成物を含む薬剤送達器具。
【請求項５３】
非経口送達器具、静脈内送達器具、筋肉内送達器具、腹腔内送達器具、経皮送達器具、肺送達器具、動脈内送達器具、くも膜下送達器具、関節内送達器具、皮下送達器具、鼻内送達器具、膣送達器具、及び直腸送達器具よりなる群から選択される、請求項52記載の薬剤送達器具。
【請求項５４】
注射器、経皮送達器具、カプセル、錠剤、ネブライザー、吸入器、噴霧器、エアロゾル器、霧吹き器、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量スプレイヤー、定量霧吹き器、定量噴霧器、カテーテルよりなる群から選択される、請求項52記載の薬剤送達器具。
【請求項５５】
請求項1〜40のいずれか1項記載のdAb単量体又はリガンドの治療上有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、炎症性疾患の治療方法。
【請求項５６】
炎症性疾患は関節炎である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
治療、診断、及び／又は予防に使用するための、プロテアーゼ分解に対して耐性であるドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項５８】
炎症性疾患、関節炎、又は呼吸器疾患の治療用の医薬を製造するための、プロテアーゼ分解に対して耐性であるドメイン抗体（dAb）単量体の使用。
【請求項５９】
肺投与用の医薬を製造するための、プロテアーゼ分解に対して耐性であるドメイン抗体（dAb）単量体の使用。
【請求項６０】
プロテアーゼ分解に対して耐性であるドメイン抗体（dAb）単量体の治療上有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、炎症性疾患、関節炎、又は呼吸器疾患を治療する方法。
【請求項６１】
dAbは肺投与を介して投与される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
dAb単量体はエラスターゼに対して耐性である、請求項57〜61のいずれか1項記載のdAb単量体、使用、又は方法。
【請求項６３】
dAb単量体は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、請求項57〜62のいずれか1項のdAb単量体、使用、又は方法。
【請求項６４】
dAb単量体はVκである、請求項63のdAb単量体、使用、又は方法。
【請求項６５】
dAbはインターロイキン1受容体I型（IL-1R1）に対する結合特異性を有する、請求項57〜64のいずれか1項のdAb単量体、使用、又は方法。
【請求項６６】
dAb単量体は、IL-1R1に対する結合について抗IL-1R1 dAbと競合し、該抗IL-1R1 dAbは、配列番号1〜配列番号349よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項65記載のdAb単量体、使用、又は方法。
【請求項６７】
dAb単量体は、IL-1R1への結合について抗IL-1R1 dAbと競合し、該抗IL-1R1 dAbは配列番号1又は配列番号2よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項66記載のdAb単量体、使用、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第60/742,062号（2005年12月1日出願）の利益を主張する。上記出願の全教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インターロイキン1（IL-1）は、いくつかの細胞種に対する生物学的作用を有する免疫応答の重要なメディエーターである。インターロイキン1は2種の受容体、インターロイキン1受容体1型（IL-1R1、CD121a、p80）（これはIL-1に結合すると細胞にシグナルを伝達する）と、インターロイキン1受容体2型（IL-1R1、CDw121b）（これはIL-1に結合してもシグナルは伝達せず、IL-1の内因性レギュレーターとして作用する）に結合する。IL-1とIL-1R1との相互作用を調節する他の内因性タンパク質は、インターロイキン1受容体アンタゴニスト（IL-1ra）である。IL-1raはIL-1R1に結合するが、IL-1R1を活性化してシグナルを伝達することは無い。
【０００３】
IL-1（例えばIL-1α又はIL-1β）との結合によりIL-1R1を介して伝達されるシグナルは、病原性であり得る広範囲の生物学的活性を誘導する。例えば、IL-1の結合によりIL-1R1を介して伝達されるシグナルは、局所性又は全身性の炎症、追加の炎症メディエーター（例えば、IL-6、IL-8、TNF）の同化、発熱、免疫細胞（例えば、リンパ球、好中球）活性化、食欲不振、低血圧、白血球減少、及び血小板減少を引き起こすことがある。IL-1の結合によりIL-1R1を介して伝達されるシグナルはまた、非免疫細胞に対する作用を有し、例えば軟骨細胞を刺激してコラゲナーゼや軟骨を分解する他の酵素を放出させたり、破骨細胞前駆細胞の骨吸収に導く成熟破骨細胞への分化を刺激する（例えば、非特許文献１を参照）。従って、IL-1のIL-1R1との相互作用は、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、骨関節炎）や炎症性腸疾患のような、いくつかの疾患の病因に関与している。
【０００４】
インターロイキン1受容体1型（IL-1R1）に結合し、その活性を中和するいくつかの物質（例えば、IL-1ra）は、特定の炎症性症状、例えば軽度〜重度の活動性慢性関節リウマチなど、の有効な治療薬であることが証明されている。しかし、IL-1R1に結合する他の物質（例えば、抗IL-1R1抗体AMG108（Amgen）など）は、臨床試験において主要評価項目を満たし損なっている。
【非特許文献１】Hallegua and Weisman, Ann. Theum. Dis. 61:960-967 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
IL-1R1に拮抗する改良された物質、及び疾患へのかかる物質の投与法に関するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明は、IL-1R1に結合し、かつ該受容体へのIL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）の結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないドメイン抗体（dAb）単量体、並びにかかるdAb単量体を含むリガンドに関する。かかるリガンドとdAb単量体は、IL-1のIL-1R1への結合により誘導される生物学的機能により全体的に又は部分的に仲介される炎症、疾患もしくは他の症状（例えば、局所性又は全身性炎症、炎症性メディエーター（例えば、IL-6、IL-8、TNF）の同化、発熱、免疫細胞（例えば、リンパ球、好中球）活性化、食欲不振、低血圧、白血球減少、及び血小板減少）を治療するための治療薬として有用である。本発明のリガンド又はdAb単量体はIL-1R1に結合し、IL-1R1機能を、内因性のIL-1R1阻害経路（例えば内因性IL-1raの内因性IL-1R1への結合など）を干渉することなく阻害することができる。したがって、そのようなリガンド又はdAb単量体は、in vivoでIL-1R1又はIL-1の活性を阻害する内因性の調節経路を補充するために被験体に投与することができる。さらに、IL-1R1に結合し、かつIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないリガンド又はdAb単量体は、これらが試料中のIL-1R1に結合し、かつこれを検出、定量又は測定するために使用でき、試料中でIL-1R1への結合についてIL-1raと競合しないため、診断薬としての使用に有利である。したがって、IL-1R1が試料中に存在しているか否か、又はどの程度存在しているかを正確に判断することができる。
【０００７】
IL-1R1に結合し、かつ該受容体へのIL-1(例えば、IL-1α及び/又はIL-1β)の結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体は、研究ツールとしても有用である。例えば、そのようなdAb単量体は、IL-1R1に結合するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しない物質（例えば他のAb、小さな有機分子）を同定するために使用することができる。ある具体例において、IL-1R1へのIL-1の結合を阻害する能力について試験されるべき物質又は物質の集合物は、競合IL-1R1受容体結合アッセイ、例えば本明細書に記載される受容体結合アッセイでアッセイされる。次いで、そのようなアッセイでIL-1R1へのIL-1の結合を阻害する物質は、IL-1R1に結合するがIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体とそれらが競合するかを確かめるために、同様の競合IL-1R1受容体結合アッセイで試験することができる。そのようなアッセイにおける競合的結合は、その物質がIL-1R1に結合し、かつ該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、該受容体へのIL-1raの結合を阻害しないことを示す。
【０００８】
1つの態様において、本発明は、インターロイキン1受容体1型（IL-1R1）に対する結合特異性を有し、該受容体へのインターロイキン1（IL-1、例えばインターロイキン1α（IL-1α）及び／又はインターロイキン1β（IL-1β））の結合を阻害するが、インターロイキン1受容体アンタゴニスト（IL-1ra）のIL-1R1への結合を阻害しない、dAb単量体に関する。
【０００９】
好ましくは、dAb単量体は、IL-1のIL-1R1への結合を、1μM以下のIC50で阻害する。いくつかの実施形態において、dAb単量体は、in vitroアッセイにおいて、MRC-5（ATCC受託番号CCL-171）によるIL-1により誘導されるインターロイキン8放出を、1μM以下の、好ましくは1nM以下のND50で阻害する。他の実施形態において、dAb単量体は、全血アッセイにおいて、IL-1により誘導されるインターロイキン6放出を1μM以下のND50で阻害する。他の実施形態において、dAb単量体は、全血アッセイにおいて、IL-1に誘導されるインターロイキン6放出を1μM以下のND50で阻害する。
【００１０】
dAb単量体中の1つ又はそれ以上のフレームワーク領域（FR）は、(a)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列、(b)ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも8つの連続アミノ酸、又は(c)ヒト生殖細胞系（human germline）抗体遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列（該フレームワーク領域はKabatにより規定される）を含むことができる。
【００１１】
dAb単量体中の1つ又はそれ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、又は1つ又はそれ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域と比較して最大で計5個のアミノ酸の相違を含むことができる。
【００１２】
dAb単量体中のFR1、FR2、FR3、及びFR4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、又はFR1、FR2、FR3、及びFR4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域と比較して最大で計10個のアミノ酸の相違を含むことができる。
【００１３】
dAb単量体は、FR1、FR2、及びFR3領域を含むことができ、該FR1、FR2、及びFR3のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであることができる。いくつかの実施形態において、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントはDPK9及びJK1である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、dAb単量体はIL-1R1への結合について、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、DOM4-122-73(配列番号165)、DOM4-1(配列番号8)、DOM4-2(配列番号9)、DOM4-3(配列番号10)、DOM4-4(配列番号11)、DOM4-5(配列番号12)、DOM4-6(配列番号13)、DOM4-7(配列番号14)、DOM4-8(配列番号15)、DOM4-9(配列番号16)、DOM4-10(配列番号17)、DOM4-11(配列番号18)、DOM4-12(配列番号19)、DOM4-13(配列番号20)、DOM4-14(配列番号21)、DOM4-15(配列番号22)、DOM4-20(配列番号23)、DOM4-21(配列番号24)、DOM4-22(配列番号25)、DOM4-23(配列番号26)、DOM4-25(配列番号27)、DOM4-26(配列番号28)、DOM4-27(配列番号29)、DOM4-28(配列番号30)、DOM4-29(配列番号31)、DOM4-31(配列番号32)、DOM4-32(配列番号33)、DOM4-33(配列番号34)、DOM4-34(配列番号35)、DOM4-36(配列番号36)、DOM4-37(配列番号37)、DOM4-38(配列番号38)、DOM4-39(配列番号39)、DOM4-40(配列番号40)、DOM4-41(配列番号41)、DOM4-42(配列番号42)、DOM4-44(配列番号43)、DOM4-45(配列番号44)、DOM4-46(配列番号45)、DOM4-49(配列番号46)、DOM4-50(配列番号47)、DOM4-74(配列番号48)、DOM4-75(配列番号49)、DOM4-76(配列番号50)、DOM4-78(配列番号51)、DOM4-79(配列番号52)、DOM4-80(配列番号53)、DOM4-81(配列番号54)、DOM4-82(配列番号55)、DOM4-83(配列番号56)、DOM4-84(配列番号57)、DOM4-85(配列番号58)、DOM4-86(配列番号59)、DOM4-87(配列番号60)、DOM4-88(配列番号61)、DOM4-89(配列番号62)、DOM4-90(配列番号63)、DOM4-91(配列番号64)、DOM4-92(配列番号65)、DOM4-93(配列番号66)、DOM4-94(配列番号67)、DOM4-95(配列番号68)、DOM4-96(配列番号69)、DOM4-97(配列番号70)、DOM4-98(配列番号71)、DOM4-99(配列番号72)、DOM4-100(配列番号73)、DOM4-101(配列番号74)、DOM4-102(配列番号75)、DOM4-103(配列番号76)、DOM4-104(配列番号77)、DOM4-105(配列番号78)、DOM4-106(配列番号79)、DOM4-107(配列番号80)、DOM4-108(配列番号81)、DOM4-109(配列番号82)、DOM4-110(配列番号83)、DOM4-111(配列番号84)、DOM4-112(配列番号85)、DOM4-113(配列番号86)、DOM4-114(配列番号87)、DOM4-115(配列番号88)、DOM4-116(配列番号89)、DOM4-117(配列番号90)、DOM4-118(配列番号91)、DOM4-119(配列番号92)、DOM4-120(配列番号93)、DOM4-121(配列番号94)、DOM4-123(配列番号166)、DOM4-124(配列番号167)、DOM4-125(配列番号168)、DOM4-126(配列番号169)、DOM4-127(配列番号170)、DOM4-128(配列番号171)、DOM4-129(配列番号172)、DOM4-129-1(配列番号173)、DOM4-129-2(配列番号174)、DOM4-129-3(配列番号175)、DOM4-129-4(配列番号176)、DOM4-129-5(配列番号177)、DOM4-129-6(配列番号178)、DOM4-129-7(配列番号179)、DOM4-129-8(配列番号180)、DOM4-129-9(配列番号181)、DOM4-129-10(配列番号182)、DOM4-129-11(配列番号183)、DOM4-129-12(配列番号184)、DOM4-129-13(配列番号185)、DOM4-129-14(配列番号186)、DOM4-129-15(配列番号187)、DOM4-129-16(配列番号188)、DOM4-129-17(配列番号189)、DOM4-129-18(配列番号190)、DOM4-129-19(配列番号191)、DOM4-129-20(配列番号192)、DOM4-129-21(配列番号193)、DOM4-129-22(配列番号194)、DOM4-129-23(配列番号195)、DOM4-129-24(配列番号196)、DOM4-129-25(配列番号197)、DOM4-129-26(配列番号198)、DOM4-129-27(配列番号199)、DOM4-129-28(配列番号200)、DOM4-129-29(配列番号201)、DOM4-129-31(配列番号202)、DOM4-129-32(配列番号203)、DOM4-129-33(配列番号204)、DOM4-129-34(配列番号205)、DOM4-129-35(配列番号206)、DOM4-129-37(配列番号207)、DOM4-129-38(配列番号208)、DOM4-129-39(配列番号209)、DOM4-129-40(配列番号210)、DOM4-129-41(配列番号211)、DOM4-129-42(配列番号212)、DOM4-129-43(配列番号213)、DOM4-129-44(配列番号214)、DOM4-131(配列番号347)、DOM4-132(配列番号348)、及びDOM4-133(配列番号349)よりなる群から選択されるdAbと競合する。
【００１５】
好ましくは、dAb単量体は、IL-1R1への結合について、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、及びDOM4-122-73(配列番号165)よりなる群から選択されるdAbと競合する。
【００１６】
別の実施形態において、dAb単量体は、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、DOM4-122-73(配列番号165)、DOM4-1(配列番号8)、DOM4-2(配列番号9)、DOM4-3(配列番号10)、DOM4-4(配列番号11)、DOM4-5(配列番号12)、DOM4-6(配列番号13)、DOM4-7(配列番号14)、DOM4-8(配列番号15)、DOM4-9(配列番号16)、DOM4-10(配列番号17)、DOM4-11(配列番号18)、DOM4-12(配列番号19)、DOM4-13(配列番号20)、DOM4-14(配列番号21)、DOM4-15(配列番号22)、DOM4-20(配列番号23)、DOM4-21(配列番号24)、DOM4-22(配列番号25)、DOM4-23(配列番号26)、DOM4-25(配列番号27)、DOM4-26(配列番号28)、DOM4-27(配列番号29)、DOM4-28(配列番号30)、DOM4-29(配列番号31)、DOM4-31(配列番号32)、DOM4-32(配列番号33)、DOM4-33(配列番号34)、DOM4-34(配列番号35)、DOM4-36(配列番号36)、DOM4-37(配列番号37)、DOM4-38(配列番号38)、DOM4-39(配列番号39)、DOM4-40(配列番号40)、DOM4-41(配列番号41)、DOM4-42(配列番号42)、DOM4-44(配列番号43)、DOM4-45(配列番号44)、DOM4-46(配列番号45)、DOM4-49(配列番号46)、DOM4-50(配列番号47)、DOM4-74(配列番号48)、DOM4-75(配列番号49)、DOM4-76(配列番号50)、DOM4-78(配列番号51)、DOM4-79(配列番号52)、DOM4-80(配列番号53)、DOM4-81(配列番号54)、DOM4-82(配列番号55)、DOM4-83(配列番号56)、DOM4-84(配列番号57)、DOM4-85(配列番号58)、DOM4-86(配列番号59)、DOM4-87(配列番号60)、DOM4-88(配列番号61)、DOM4-89(配列番号62)、DOM4-90(配列番号63)、DOM4-91(配列番号64)、DOM4-92(配列番号65)、DOM4-93(配列番号66)、DOM4-94(配列番号67)、DOM4-95(配列番号68)、DOM4-96(配列番号69)、DOM4-97(配列番号70)、DOM4-98(配列番号71)、DOM4-99(配列番号72)、DOM4-100(配列番号73)、DOM4-101(配列番号74)、DOM4-102(配列番号75)、DOM4-103(配列番号76)、DOM4-104(配列番号77)、DOM4-105(配列番号78)、DOM4-106(配列番号79)、DOM4-107(配列番号80)、DOM4-108(配列番号81)、DOM4-109(配列番号82)、DOM4-110(配列番号83)、DOM4-111(配列番号84)、DOM4-112(配列番号85)、DOM4-113(配列番号86)、DOM4-114(配列番号87)、DOM4-115(配列番号88)、DOM4-116(配列番号89)、DOM4-117(配列番号90)、DOM4-118(配列番号91)、DOM4-119(配列番号92)、DOM4-120(配列番号93)、DOM4-121(配列番号94)、DOM4-123(配列番号166)、DOM4-124(配列番号167)、DOM4-125(配列番号168)、DOM4-126(配列番号169)、DOM4-127(配列番号170)、DOM4-128(配列番号171)、DOM4-129(配列番号172)、DOM4-129-1(配列番号173)、DOM4-129-2(配列番号174)、DOM4-129-3(配列番号175)、DOM4-129-4(配列番号176)、DOM4-129-5(配列番号177)、DOM4-129-6(配列番号178)、DOM4-129-7(配列番号179)、DOM4-129-8(配列番号180)、DOM4-129-9(配列番号181)、DOM4-129-10(配列番号182)、DOM4-129-11(配列番号183)、DOM4-129-12(配列番号184)、DOM4-129-13(配列番号185)、DOM4-129-14(配列番号186)、DOM4-129-15(配列番号187)、DOM4-129-16(配列番号188)、DOM4-129-17(配列番号189)、DOM4-129-18(配列番号190)、DOM4-129-19(配列番号191)、DOM4-129-20(配列番号192)、DOM4-129-21(配列番号193)、DOM4-129-22(配列番号194)、DOM4-129-23(配列番号195)、DOM4-129-24(配列番号196)、DOM4-129-25(配列番号197)、DOM4-129-26(配列番号198)、DOM4-129-27(配列番号199)、DOM4-129-28(配列番号200)、DOM4-129-29(配列番号201)、DOM4-129-31(配列番号202)、DOM4-129-32(配列番号203)、DOM4-129-33(配列番号204)、DOM4-129-34(配列番号205)、DOM4-129-35(配列番号206)、DOM4-129-37(配列番号207)、DOM4-129-38(配列番号208)、DOM4-129-39(配列番号209)、DOM4-129-40(配列番号210)、DOM4-129-41(配列番号211)、DOM4-129-42(配列番号212)、DOM4-129-43(配列番号213)、DOM4-129-44(配列番号214)、DOM4-131(配列番号347)、DOM4-132(配列番号348)、及びDOM4-133(配列番号349)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
好ましくは、dAb単量体は、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、及びDOM4-122-73(配列番号165)よりなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
好ましくは、dAb単量体は、表面プラズモン共鳴により測定される約300nM〜約5pMの親和性（KD）でヒトIL-1R1に結合する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、インターロイキン1受容体1型（IL-1R1）に対する結合特異性を有し、かつ該受容体へのインターロイキン1（IL-1、例えばインターロイキン1α（IL-1α）及び／又はインターロイキン1β（IL-1β））の結合を阻害するが、インターロイキン1受容体アンタゴニスト（IL-1ra）のIL-1R1への結合を阻害しないdAb単量体、並びに半減期延長部分を含む、リガンドに関する。半減期延長部分は、ポリアルキレングリコール部分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、又はin vivoで半減期を高めるポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントであることができる。いくつかの実施形態において、半減期延長部分は、血清アルブミンもしくは新生児Fc受容体に対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである。具体的な実施形態において、半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンへの結合について、本明細書に開示の抗血清アルブミンdAbと競合する免疫グロブリン単一可変ドメインである。他の具体的な実施形態において、半減期延長部分は、本明細書に開示の抗血清アルブミンdAbのアミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【００２０】
さらに具体的な実施形態において、本発明は、IL-1R1に対する結合特異性を有し、かつその受容体へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないdAb単量体を含むリガンドであり、ここで該dAb単量体は、DOM4-122-23及びDOM4-122-24よりなる群から選択される。リガンドは、例えばdAb単量体、又は該dAb単量体のホモ二量体、ホモ三量体もしくはホモオリゴマーであることができる。リガンドはさらに、血清アルブミンに結合するdAb単量体、例えばDOM7h-8を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、リガンドは、DOM4-122-23及びDOM7h-8を含むか、又はDOM-122-24及びDOM7h-8を含む。
【００２１】
別の具体的な実施形態において、本発明は、IL-1R1に対する結合特異性を有し、かつ該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないdAb単量体と、腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）に対する結合特異性を有するdAb単量体とを含むリガンドである。所望であれば、リガンドは、半減期延長部分をさらに含むことができる。
【００２２】
好ましくは、TNFR1に対する結合特異性を有するdAb単量体は、TNFR1への結合について、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbと競合する。いくつかの実施形態において、TNFR1に対する結合特異性を有するdAb単量体は、本明細書に記載の抗TNFR1 dAbのアミノ酸配列と少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、dAb単量体又はリガンドをコードする単離された核酸もしくは組換え核酸、及び該組換え核酸を含むベクター（例えば発現ベクター）に関する。本発明はまた、組換え核酸又はベクターを含む宿主細胞、及び本発明のリガンドもしくはdAb単量体をコードする核酸の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を維持することを含む、リガンドもしくはdAb単量体の製造する方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、dAb単量体又はリガンドと生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下、関節内、皮下、肺、鼻内、膣、又は直腸投与用の医薬組成物。
【００２５】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む薬剤送達器具に関する。例えば、薬剤送達器具は、非経口送達器具、静脈内送達器具、筋肉内送達器具、腹腔内送達器具、経皮送達器具、肺送達器具、動脈内送達器具、くも膜下送達器具、関節内送達器具、皮下送達器具、鼻内送達器具、膣送達器具、又は直腸送達器具であることができる。かかる送達器具の例には、注射器、経皮送達器具（例えばパッチ）、カプセル、錠剤、ネブライザー、吸入器、噴霧器、エアゾル器、霧吹き器、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量スプレイヤー、定量霧吹き器、定量噴霧器、及びカテーテルなどがある。
【００２６】
本発明はまた、本発明のdAb単量体又はリガンドの治療上有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、炎症性疾患の治療方法に関する。
【００２７】
本発明はまた、治療、診断、及び／又は予防で使用するための本発明のdAb単量体又はリガンド、並びに本明細書に記載の疾患（例えば、炎症性疾患、関節炎、呼吸器疾患）を治療するための医薬を製造するための本発明のdAb単量体もしくはリガンドの使用に関する。
【００２８】
本発明はまた、プロテアーゼ分解に対して耐性のdAb単量体の治療上有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、疾患（例えば、炎症性疾患、関節炎、呼吸器疾患）の治療方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、治療、診断、又は予防に使用するための、プロテアーゼ分解に対して耐性のdAb単量体、及び本明細書に記載の疾患（例えば、炎症性疾患、関節炎、呼吸器疾患）を治療するための医薬を製造するための、本発明のdAb単量体の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
この明細書において、本発明は、実施形態を参照して、明瞭で簡潔な明細書となるように記載されている。実施形態を本発明から逸脱することなく種々に組合せる又は分けることができることが意図され、かつ理解されるべきである。
【００３１】
本明細書で使用される用語「リガンド」は、所望の標的に対する結合特異性を有するドメインを含むポリペプチドを指す。好ましくは、結合ドメインは、所望の標的抗原（例えば受容体タンパク質）に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、VH、VL、VHH）である。結合ドメインはまた、結合ドメインが標的抗原に対して結合特異性を有するように、適切なフォーマット（format）で所望の標的抗原に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインの1つ又はそれ以上の相補性決定領域（CDR）を含むことができる。例えばCDRは、適切なタンパク質足場（scaffold）又は骨格、例えばアフィボディ(affibody)、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、又はEGFドメインに融合することができる。さらにリガンドは、本明細書に記載のように1価（例えば、dAb単量体）、2価（ホモ2価、ヘテロ2価）、又は多価（ホモ多価、ヘテロ多価）であることができる。すなわち「リガンド」は、dAbからなるポリペプチド、実質的にかかるdAbからなるポリペプチド、適当なフォーマット（例えば抗体フォーマット（例えば、IgG様フォーマット、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2）で又は適当なタンパク質足場もしくは骨格（例えばアフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、又はEGFドメイン）に、dAb（又はdAbのCDR）を含むポリペプチド、第1の標的タンパク質、抗原、もしくはエピトープ（例えばIL-1R1又はTNFR1）に結合するdAbと、別の標的タンパク質、抗原、もしくはエピトープ（例えば、血清アルブミン）に結合する第2のdAbとを含む二重特異性リガンド、並びに本明細書に記載されるような多重特異性リガンドを含む。結合ドメインはまた、所望の標的に対する結合部位を含むタンパク質ドメインであることができ、例えばタンパク質ドメインは、アフィボディ、SpAドメイン、LDL受容体クラスAドメイン、EGFドメイン、アビマー（avimer）から選択される（例えば、米国特許出願公報第2005/0053973号、2005/0089932号、2005/0164301号参照）。
【００３２】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、他のV領域もしくはドメインとは独立に抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体可変領域（VH、VHH、VL）を指すが、この用語を本明細書で使用するとき、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域又はドメインが免疫グロブリン単一可変ドメインによる抗原結合に必要でない場合（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインが追加の可変ドメインとは独立に抗原と結合する場合）、他の可変領域もしくは可変ドメインを含むフォーマット（例えばホモもしくはヘテロ多量体）で存在することができる。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけではなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1つ又はそれ以上の単量体を含むより大きなポリペプチドも包含する。「ドメイン抗体」又は「dAb」は、本明細書で使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」ポリペプチドと同じである。本明細書で使用される免疫グロブリン単一可変ドメインは、哺乳動物（好ましくはヒト）の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドを指すが、げっ歯動物（例えば、その内容を参照により全体的に本明細書に組み入れるWO 00/29004に開示されているもの）又はラクダ科VHH dAbも含む。ラクダ科dAbは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含む種から得られる免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、軽鎖が天然に欠如している重鎖抗体（VHH）を含む。VHH分子は、IgG分子より約10倍小さく、単一のポリペプチドとして、これらは非常に安定で、極端なpHや温度条件に耐性である。
【００３３】
本明細書において用語「用量」は、被験体に全てが一回で（単位用量）又は規定の間隔にわたって2回またはそれ以上の投与で投与される薬剤（例えば、抗1L-1R1 dAb、TNFR1のアンタゴニスト）の量を指す。例えば用量は、1日（24時間）（1日量）、2日、1週間、2週間、3週間、又は1ヶ月以上の期間にわたって被験体に投与される（例えば単回投与、又は2回またはそれ以上の投与）薬剤（例えば、抗1L-1R1 dAb、TNFR1のアンタゴニスト）を指すことができる。投与間の間隔は、任意の所望の時間であることができる。
【００３４】
2つの免疫グロブリンドメインは、これらが同族の対もしくは群を形成する構造ファミリーに属するか、又はかかるファミリーに由来しその特徴を保持するとき、「相補的」である。例えば抗体のVHドメインとVLドメインは相補的であるが、2つのVHドメイン同士は相補的ではなく、2つのVLドメイン同士は相補的ではない。相補的ドメインは免疫グロブリンスーパーファミリーの別のメンバーで見出すこともできる（例えばT細胞受容体のVα及びVβ（又はγとδ）ドメイン）。人工的なドメイン、例えば特に操作しない限りはエピトープに結合しないタンパク質足場に基づくドメインは非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメイン及びフィブロネクチンドメインに基づく2つのドメインは相補的ではない。
【００３５】
「免疫グロブリン」は、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンの折り畳み構造（これは2つのβシートと、通常は保存されたジスルフィド結合とを含む）を保持するポリペプチドのファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系における広範な役割（例えば、抗体、T細胞受容体分子など）、細胞接着への関与（例えばICAM分子）及び細胞内シグナル伝達（例えば、PDGF受容体のような受容体分子）を含む、in vivoでの細胞性及び非細胞性相互作用の多くの局面に関与する。本発明は、結合ドメインを有するすべての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。好ましくは、本発明は、抗体に関する。
【００３６】
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分には無関係にその3次構造を保持している折り畳まれたタンパク質構造である。一般にドメインは、タンパク質の独立した機能的性質を担っており、多くの場合、タンパク質の残り部分及び／又はそのドメインの機能を喪失することなく、付加、除去、又は他のタンパク質に移すことができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。従ってこれは、完全な抗体可変ドメイン及び改変された可変ドメイン、例えば1つ又はそれ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置換されたもの、又はトランケート型又はN末端もしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに完全長ドメインの結合活性と特異性とを少なくとも部分的に保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントが含まれる。
【００３７】
用語「レパートリー」は、その一次配列が異なる多様な変異体の集合、例えばポリペプチド変異体を指す。本発明で使用されるライブラリーは、少なくとも1000のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを包含する。
【００３８】
用語「ライブラリー」は、不均質なポリペプチド又は核酸の混合物を指す。ライブラリーは、そのそれぞれが単一のポリペプチド又は核酸配列を有するメンバーからなる。その限りにおいては、「ライブラリー」は「レパートリー」と同義である。ライブラリーのメンバー間の配列差により、ライブラリーに存在する多様性がもたらされる。ライブラリーは、ポリペプチド又は核酸の単純な混合物の形を採ることもあるし、又は核酸のライブラリーで形質転換された生物又は細胞（例えば、細菌、ウイルス、動物細胞もしくは植物細胞など）の形を採ることもある。好ましくは、各個々の生物又は細胞は、唯一の又は限定された数のライブラリーメンバーを含有する。核酸が核酸にコードされるポリペプチドの発現が可能となるように発現ベクター中に組み込まれていることが有利である。従って好適な態様において、ライブラリーは宿主生物の集団の形を採ってもよく、その各生物が、核酸形態（これは発現されてその対応のポリペプチドメンバーを産生することができる）でライブラリーの単一のメンバーを含有する発現ベクターの1つ又はそれ以上のコピーを含有する。すなわち宿主生物の集団は、遺伝子的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有する。
【００３９】
「抗体」（例えば、IgG、IgM、IgA、IgD、又はIgE）又はフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合型Fv、svFv、閉鎖型コンフォメーション多重特異性抗体、ジスルフィド結合型scFv、ダイアボディ）は、天然に抗体を産生する任意の種から得られ、組換えDNA技術により作製され；血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、又は細菌から単離される。
【００４０】
「二重特異性リガンド」は、本明細書で定義するように、第1の免疫グロブリン単一可変ドメインと第2の免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むリガンドであって、可変領域が通常は単一特異性の免疫グロブリンによっては結合されない2つの異なる抗原又は同じ抗原上の2つのエピトープに結合することができるものである。例えば2つのエピトープは同じハプテン上にあってもよいが、それらは同一のエピトープではなく、単一特異性リガンドが結合するのに十分な程度に隣接しているものではない。本発明の二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する可変ドメインからなり、同じ特異性を有する互いに相補的な可変ドメイン対を含有しない。二重特異性リガンドと二重特異性リガンドを作製するための適当な方法は、WO 2004/058821号、WO 2004/003019号、及びWO 03/002609号（これらの公開された各国際出願の全教示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００４１】
「抗原」は、本発明のリガンドにより結合される分子である。典型的には抗原は、抗体リガンドにより結合され、in vivoで抗体応答を生じることができる。これはポリペプチド、タンパク質、核酸、又は他の分子でもよい。一般に本発明の二重特異性リガンドは、特定の抗原に対する標的特異性について選択される。従来の抗体及びそのフラグメントの場合、可変ループ（L1、L2、L3、及びH1、H2、H3）により規定される抗体結合部位は、抗原に結合することができる。
【００４２】
「エピトープ」は、免疫グロブリンVH/VL対と常法で結合する構造の単位である。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を規定し、従って抗体の特異性の標的となる。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは単離された可変ドメインによって結合される構造の単位である。
【００４３】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Kabat（「免疫学の対象となるタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Intere）、US Department of Health and Human services）により規定されるような配列が保存された抗体の領域に対応するか、又はChothia及びLesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917で規定されるヒト生殖細胞系免疫グロブリンレパートリー又は構造に対応する、単一抗体フレームワーク配列である。本発明は、単一のフレームワーク又はそのようなフレームワークのセットの使用を提供し、これは、超可変領域のみでの変異により実質的に全ての結合特異性を誘導できることが見出されているものである。
【００４４】
「半減期」は、例えば自然の機構によるリガンドの分解及び／又はリガンドのクリアランスもしくは分離(sequestration)により、in vivoで該リガンドの血清濃度が50％低下するのに必要な時間である。本発明のリガンドはin vivoで安定化され、分解及び／又はクリアランスもしくは分離に耐性を有する分子と結合することによりその半減期が延長される。典型的には、かかる分子は、それ自身がin vivoで長い半減期を有する天然に存在するタンパク質である。リガンドの半減期は、その機能活性が半減期延長分子に特異的ではない類似のリガンドより長期間in vivoで保持される場合には、延長されている。すなわち、HSA及び標的分子に特異的なリガンドは、HSAに結合しないが別の分子に結合するHSAに対する特異性を有しない同種のリガンドと比較される。例えばこれは、標的分子上の第2のエピトープに結合することができる。典型的には、半減期は、10％、20％、30％、40％、50％、又はそれ以上延長される。半減期の2ｘ、3ｘ、4ｘ、5ｘ、10ｘ、20ｘ、30ｘ、40ｘ、50ｘ、又はそれ以上の範囲の延長が可能である。あるいは又はさらに、半減期の30ｘ、40ｘ、50ｘ、60ｘ、70ｘ、80ｘ、90ｘ、100ｘ、150ｘまでの延長が可能である。
【００４５】
本明細書において言及される用語「競合する」は、第１のエピトープのその同種エピトープ結合ドメインへの結合が、第2のエピトープがその同種エピトープ結合ドメインに結合すると、阻害されることを意味する。例えば結合は、例えば結合ドメインの物理的妨害により、又はエピトープに対するその親和性もしくは結合力が低下するような結合ドメインの構造もしくは環境の変化により、立体的に阻止され得る。
【００４６】
本明細書で定義されるように、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列のアライメント及び相同性、類似性、又は同一性は、好ましくは、アルゴリズムBLAST2 Sequencesを使用し、デフォルトパラメータを使用して作成及び決定される（Tatsusova, T.A. et al, FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)）。あるいは、配列アライメントのために、パラメータがデフォルト値に設定されたBLASTアルゴリズム（バージョン2.0）が使用される。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、及びtblastx（これらのプログラムは、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8の統計的方法を使用してその知見に意味づけを行う）により使用される発見的な検索アルゴリズムである。
【００４７】
本発明は、IL-1R1に結合し、かつ該受容体へのIL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）の結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないdAb単量体、ならびにかかるdAb単量体を含むリガンドに関する。かかるリガンドとdAb単量体は、IL-1のIL-1R1への結合により誘導される生物学的機能により全体が又は一部が仲介される炎症、疾患もしくは他の症状（例えば、局所性又は全身性炎症、炎症性メディエーター（例えば、IL-6、IL-8、TNF）の同化、発熱、免疫細胞活性化（例えば、リンパ球、好中球）、食欲不振、低血圧、白血球減少、及び血小板減少）を治療するための治療薬として有用である。本発明のリガンド又はdAb単量体は、IL-1R1に結合することができ、かつ、内因性のIL-1R1阻害経路（例えば内因性IL-1raの内因性IL-1R1への結合など）を干渉することなくIL-1R1の機能を阻害することができる。したがって、そのようなリガンド又はdAb単量体は、in vivoでIL-1R1又はIL-1の活性を阻害する内因性の調節経路を補充するために被験体に投与することができる。さらに、IL-1R1に結合し、かつIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないリガンド又はdAb単量体は、これらが試料中のIL-1R1に結合し、かつこれを検出、定量又は測定することができ、試料中でIL-1R1への結合についてIL-1raと競合しないため、診断薬としての使用に有利である。したがって、IL-1R1が試料中に存在しているか否か、又はどの程度存在しているかを正確に判断することができる。
【００４８】
IL-1R1に結合し、かつ該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体は、研究ツールとしても有用である。例えば、そのようなdAb単量体は、IL-1R1に結合するが、IL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しない物質（例えば他のdAb、小さな有機分子）を同定するために使用することができる。ある具体例において、IL-1R1へのIL-1の結合を阻害する能力について試験されるべき物質又は物質の集合物は、競合IL-1R1受容体結合アッセイ、例えば本明細書に記載される受容体結合アッセイなどでアッセイされる。次いで、そのようなアッセイにおいてIL-1R1へのIL-1の結合を阻害する物質は、IL-1R1に結合するがIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないdAb単量体とそれらが競合するかを確かめるために、同様の競合IL-1R1受容体結合アッセイで試験することができる。そのようなアッセイにおける競合的結合は、その物質がIL-1R1に結合し、該受容体へのIL-1の結合を阻害するが、該受容体へのIL-1raの結合を阻害しないことを示す。
【００４９】
IL-1R1に結合するリガンドおよびdAb単量体
本発明は、表面プラズモン共鳴により測定するとき、300nM〜5pM(すなわち、3ｘ10-7〜5ｘ10-12M)、好ましくは50nM〜20pM、さらに好ましくは5nM〜200pM、そして最も好ましくは1nM〜100pM、例えば1ｘ10-7M以下、好ましくは1ｘ10-8M以下、さらに好ましくは1ｘ10-9M以下、有利には1ｘ10-10M以下、そして最も好ましくは1ｘ10-11M以下のKdで；及び／又は5ｘ10-1s-1〜1ｘ10-7s-1、好ましくは1ｘ10-2s-1〜1ｘ10-6s-1、さらに好ましくは5ｘ10-3s-1〜1ｘ10-5s-1、例えば5ｘ10-1s-1以下、好ましくは1ｘ10-2s-1以下、有利には1ｘ10-3s-1以下、さらに好ましくは1ｘ10-4s-1以下、さらに好ましくは1ｘ10-5s-1以下、最も好ましくは1ｘ10-6s-1以下のKoff速度定数で、IL-1R1に結合するdAbを含むリガンド（例えば、かかるdAb、dAb単量体を含む二重特異性リガンド）を提供する。
【００５０】
好ましくは、リガンド又はdAb単量体は、IL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）のIL-1R1への結合を、例えば受容体結合アッセイにおいて、約1μM又はそれ以下である阻害濃度50（IC50）で、例えば約500nM〜約50pM、好ましくは約100nM〜約50pM、さらに好ましくは約10nM〜約100pM、有利には約1nM〜約100pM；例えば、約50nM又以下、好ましくは約5nM以下、さらに好ましくは約500pM以下、有利には約200pM以下、最も好ましくは約100pM以下のIC50で阻害する。
【００５１】
好ましくは、リガンド又はdAbはヒトIL-1R1に結合し、ヒトIL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）のヒトIL-1R1への結合を阻害し、かつIL-1結合に応答したヒトIL-1R1を介するシグナル伝達を阻害する。
【００５２】
好ましくは、リガンド又はdAb単量体は、標準的アッセイ（例えば、MRC-5細胞によるIL-1により誘導されるインターロイキン8放出、全血細胞によるIL-1により誘導されるインターロイキン6放出）において、IL-1又はIL-1R1を、約1μM以下の中和用量50（ND50）で、例えば約500nM〜約50pM、好ましくは約100nM〜約50pM、さらに好ましくは約10nM〜約100pM、有利には約1nM〜約100pM；例えば約50nM以下、好ましくは約5nM以下、さらに好ましくは約500pM以下、有利には約200pM以下、そして最も好ましくは約100pM以下のND50で、中和する。例えば、リガンド又はdAb単量体は、in vitroアッセイにおいて、MRC-5細胞（ATCC受託番号CCL-171）によるIL-1により誘導される（例えば、IL-1α又はIL-1βにより誘導される）インターロイキン8放出を、10μM以下、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、500pM以下、300pM以下、100pM以下、又は10pM以下のND50で阻害することができる。別の例において、リガンド又はdAb単量体は、in vitro全血アッセイにおいて、IL-1により誘導される（例えば、IL-1α又はIL-1βにより誘導される）インターロイキン6放出を、10μM以下、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、500pM以下、300pM以下、100pM以下、又は10pM以下のND50で、阻害することができる。
【００５３】
リガンドは、本明細書に記載されるように、1価（例えばdAb単量体）又は多価（例えば二重特異性、多重特異性）であることができる。具体的な実施形態において、リガンドは、ヒトIL-1R1に結合するdAb単量体であり、ポリエチレングリコール部分のような半減期延長部分（本明細書に記載される）を含む。
【００５４】
別の実施形態において、リガンドは多価であり、IL-1R1に結合する2つまたはそれ以上のdAb単量体を含む。多価リガンドは、IL-1R1に結合する特定のdAb単量体の2つまたはそれ以上のコピーを含有するか、又はIL-1R1に結合する2つまたはそれ以上のdAbを含有することができる。例えば、本明細書に記載されるように、リガンドは、IL-1R1に結合する特定のdAb単量体の2つまたはそれ以上のコピーを含む二量体、三量体又は多量体であることができるし、又はIL-1R1に結合する2つまたはそれ以上の異なるdAbを含むことができる。いくつかの例では、リガンドは、それぞれIL-1R1に結合する特定のdAbの2つ又は3つのコピーを含む、ホモ二量体又はホモ三量体である。好ましくは、多価リガンドは、標準的細胞アッセイでIL-1R1に実質的にアゴナイズしない（IL-1R1のアゴニストとして作用する）（すなわち、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM、又は5,000μMの濃度で存在するとき、このアッセイでIL-1（100pg/ml）により誘導されるIL-1R1仲介活性の約5％以下を与える）。
【００５５】
特定の実施形態において、多価リガンドは、IL-1R1の所望のエピトープ又はドメインに結合する2つまたはそれ以上のdAbを含有する。例えば多価リガンドは、IL-1R1への結合についてIL-1raと競合するdAbの2つまたはそれ以上のコピーを含むことができる。別の例では、多価リガンドは、IL-1R1への結合についてIL-1raと競合しないdAbの2つまたはそれ以上のコピーを含むことができる。
【００５６】
別の実施形態において、多価リガンドは、IL-1R1の異なるエピトープ又はドメインに結合する2つまたはそれ以上のdAbを含有する。ある例において、多価リガンドは、IL-1R1の第1のエピトープに結合する第1のdAbと、IL-1R1の第2の異なるエピトープに結合する第2のdAbとを含む。このタイプのリガンドは高結合力でIL-1R1に結合することができ、他のリガンドフォーマット（例えばdAb単量体）より高密度でその表面上にIL-1R1を過剰発現するか又はIL-1R1を発現する細胞への結合についてより選択的であることができる。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明のリガンド又はdAb単量体は、有効量が投与されるとき、モデル疾患（例えば炎症性疾患）において有効である。一般に炎症性疾患のモデルにおける有効量は、約1mg/kg〜約10mg/kg（例えば、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、又は約10mg/kg）である。本明細書に記載の慢性炎症性疾患のモデルは、ヒトでの治療効果を予測するものとして当業者により認識されている。先行技術は、本明細書に記載のように、リガンド又はdAb単量体をこれらのモデルで使用することを示唆していないか、又はこれらが有効であろうということも示唆していない。
【００５８】
呼吸器疾患のいくつかの適切な動物モデルが当該分野で公知であり、ヒトでの治療効果を予測するものとして当業者により認識されている。例えば、呼吸器疾患の適切な動物モデルには、慢性閉塞性肺疾患のモデル（Groneberg, DA et al., Respiratory Research 5:18 (2004)参照)、及び喘息のモデル（Coffman et al., J. Exp. Med. 201(12):1875-1879 (2001)参照）などがある。例えばリガンド又はdAb単量体は、タバコの煙により誘導される慢性閉塞性肺疾患（COPD）のマウスモデル（例えば、Wright JL and Churg A., Chest 122:301S-306S (2002)参照）において有効であることができる。例えばリガンド又はdAb単量体の有効量を投与することにより、適当な対照と比較して、COPD症状の症状を低減するか又はその開始を遅らせることができる。
【００５９】
特定の実施形態において、リガンド又はdAb単量体は、関節炎（例えば、炎症性関節炎、骨関節炎）の標準モデルにおいて有効である。いくつかの適切なモデルが当該分野で公知であり、例えばマウスコラーゲン誘導関節炎モデル（例えば、Juarranz, et al., Arthritis Research and Therapy, 7:R1034-R1045 (2005)参照）、ラットアジュバント誘導関節炎（例えば、Halloran, M. et al., J. Immunol., 65:7492 (1999）、Halloran, M. et al., Arthritis Rheum., 39:810 (1996)参照）、ウサギ実験的骨関節炎（例えば、Spriet, et al. Osteoarthritis and Cartilage, 13:171-179 (2005)参照)、及びいくつかの骨関節炎マウスモデル（例えば、Helminen, et al., Rheumatology, 41:848-856 (2002)参照）などがある。
【００６０】
例えば、関節炎は、DBA/1マウスで、Arthrogen-CIAアジュバントとArthrogen-CIAコラーゲン（MD-biosciences）とのエマルジョンを注射することにより誘導することができる。注射の約21日後、試験すべきリガンド又はdAb単量体を投与することができる（例えば、腹腔内注射により）。動物の四肢のそれぞれについて0から4のスケールの臨床的関節炎スコアを測定し、正常なものには0を割り当て、複数の関節が関与する最も炎症した肢には4を割り当てる。リガンド又はdAb単量体の有効量を投与すると、このマウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて四肢の合計の平均関節炎スコアを低下させることができ、例えば四肢の合計の平均関節炎スコアを適切な対照と比較して、約1〜約16、約3〜約16、約6〜約16、約9〜約16、約12〜約16低下させることができ、又は関節炎症状の開始を、適切な対照と比較して、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日、又は約28日遅らせることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、標準マウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて、0〜約3、約3〜約5、約5〜約7、約7〜約15、約9〜約15、約10〜約15、約12〜約15、又は約14〜約15の四肢合計平均関節炎スコアをもたらし得る。
【００６１】
別の実施形態において、リガンド又はdAb単量体は、関節炎のマウスΔAREモデル（Kontoyiannis et al., J Exp Med 196:1563-74 (2002)）において有効である。例えば、リガンドの有効量を投与すると、関節炎のマウスΔAREモデルにおける平均関節炎スコアを、適切な対照と比較して、例えば約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、又は約2〜約2.5だけ低下させることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、関節炎のマウスΔAREモデルにおける関節炎症状の開始を、適切な対照と比較して、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日、又は約28日遅らせることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、関節炎のマウスΔAREモデルにおいて、0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、又は約2〜約2.5の平均関節炎スコアを生じさせることができる。
【００６２】
別の実施形態において、リガンド又はdAb単量体は、炎症性腸疾患（IBD）のマウスΔAREモデル（Kontoyiannis et al., J Exp Med 196:1563-74 (2002)）において有効である。例えば、リガンドの有効量を投与すると、IBDのマウスΔAREモデルの平均急性及び／又は慢性炎症スコアを、適切な対照と比較して、例えば約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、又は約2〜約2.5だけ低下させることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、IBDのマウスΔAREモデルにおいて、IBDの症状の開始を、適切な対照と比較して、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日、又は約28日遅らせることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、IBDのマウスΔAREモデルにおいて、0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、又は約2〜約2.5の平均急性及び／又は慢性炎症スコアを生じさせることができる。
【００６３】
別の実施形態において、リガンド又はdAb単量体は、IBDのマウスデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導モデル（Okayasu I. et al., Gastroenterology 98:694-702 (1990)； Podolsky K., J Gasteroenterol. 38 suppl XV:63-66 (2003)参照）において有効である。例えば、リガンドの有効量を投与すると、IBDのマウスDSSモデルにおける平均重症度スコアを、適切な対照と比較して、例えば約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、又は約2〜約2.5だけ低下させることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、IBDのマウスDSSモデルにおけるIBD症状の開始を、適切な対照と比較して、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日、又は約28日遅らせることができる。別の例では、リガンドの有効量を投与すると、IBDのマウスDSSモデルにおいて、0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、又は約2〜約2.5の平均重症度スコアを生じさせることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、リガンドは、IL-1R1に特異的に結合し、該受容体へのIL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）の結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないdAbを含み、かつIL-1R1への結合について、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)及びDOM4-122-73(配列番号165)よりなる群から選択されるdAbと競合する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、リガンドは、IL-1R1に特異的に結合し、該受容体へのIL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）の結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないdAbを含み、かつDOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、及びDOM4-122-73(配列番号165)よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、リガンドは、IL-1R1に結合するdAbを含み、IL-1R1（例えばヒトIL-1R1）への結合について本明細書に開示の任意のdAbと競合する。
【００６７】
好適な実施形態において、リガンドは、DOM4-122-23及びDOM4-122-24よりなる群から選択されるdAb単量体を含む。例えばリガンドは、これらのdAbの単量体、又はヘテロ二量体もしくはホモ二量体、三量体、又はオリゴマーであることができる。所望であれば、リガンドはさらに、半減期延長部分、例えばポリエチレングリコール部分を含有することができる。いくつかの実施形態において、リガンドは、DOM4-122-23及びDOM4-122-24よりなる群から選択されるdAb単量体、及び血清アルブミンに結合するdAb単量体を含む。例えばリガンドは、DOM4-122-23とDOM7h-8とを含むか又はDOM4-122-24とDOM7h-8とを含む、二重特異性リガンドであることができる。
【００６８】
dAb単量体は、任意の適切な免疫グロブリン可変ドメインを含むことができ、好ましくはヒト可変ドメイン、又はヒトフレームワーク領域を含む可変ドメインを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるように、dAb単量体はユニバーサルフレームワークを含む。
【００６９】
ユニバーサルフレームワークは、VLフレームワーク（Vλ又はVκ）、例えばヒト生殖細胞系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26、又はDPK28免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークなど、を含むことができる。所望であれば、VLフレームワークはさらに、ヒト生殖細胞系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、又はJκ5免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含むことができる。
【００７０】
別の実施形態において、ユニバーサルフレームワークは、VHフレームワーク、例えばヒト生殖細胞系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68、又はDP69免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークなど、を含むことができる。所望であれば、VHフレームワークはさらに、ヒト生殖細胞系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5、及びJH6免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含むことができる。
【００７１】
特定の実施形態において、dAb単量体は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む1つ又はそれ以上のフレームワーク領域を含むか、又は1つ又はそれ以上の該フレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる該対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、最大で計5個のアミノ酸の相違を含む。
【００７２】
別の実施形態において、dAb単量体のFW1、FW2、FW3、及びFW4のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、又はFW1、FW2、FW3、及びFW4のアミノ酸配列は、該ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、最大で計10個のアミノ酸の相違を含む。
【００７３】
別の実施形態において、dAb単量体は、FW1、FW2、及びFW3領域を含み、該FW1、FW2、及びFW3領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応のフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである。
【００７４】
具体的な実施形態において、dAb単量体リガンドは、DPK9 VLフレームワーク、又はDP47、DP45、及びDP38よりなる群から選択されるVHフレームワークを含む。dAb単量体は一般的リガンド（例えばプロテインA、プロテインL、及びプロテインG）の結合部位を含むことができる。
【００７５】
特定の実施形態において、リガンド又はdAb単量体は、凝集に対して実質的に耐性である。例えば、いくつかの実施形態において、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョンのような薬剤の製剤化に慣用的に使用される溶媒、及びFDAに認可されているような許容される賦形剤を含むこれらの任意の溶媒中で、リガンド又はdAbの1〜5mg/ml、5〜10mg/ml、10〜20mg/ml、20〜50mg/ml、50〜100mg/ml、100〜200mg/ml又は200〜500mg/ml溶液を、約22℃、22〜25℃、25〜30℃、30〜37℃、37〜40℃、40〜50℃、50〜60℃、60〜70℃、70〜80℃、15〜20℃、10〜15℃、5〜10℃、2〜5℃、0〜2℃、-10℃〜0℃、-20℃〜-10℃、-40℃〜-20℃、-60℃〜-40℃、又は-80℃〜-60℃で、例えば10分間、1時間、8時間、24時間、2日間、3日間、4日間、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、1年、又は2年程度の時間維持すると、リガンドもしくはdAb単量体の約10％未満、約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、又は約1％未満が凝集する。
【００７６】
凝集は、任意の適切な方法を用いて、例えば顕微鏡により、目視検査もしくは分光法又は他の適当な方法による溶液の濁度を評価することにより、評価することができる。好ましくは、凝集は動的光散乱により評価される。凝集に耐性のリガンド又はdAb単量体はいくつかの利点がある。例えば、かかるリガンド又はdAb単量体は、大腸菌（E. coli）のような適切な生物学的産生系を使用して発現することにより、可溶性タンパク質として高収量で産生させることができ、従来のポリペプチドより高濃度で、かつ少ない凝集及び活性喪失で、調製及び／又は保存することができる。
【００７７】
さらに、凝集に耐性のリガンド又はdAb単量体は、他の抗原又はエピトープ結合性ポリペプチド（例えば従来の抗体）より経済的に産生させることができる。例えば一般的にin vivo用途の目的とした抗原又はエピトープ結合性ポリペプチドの調製は、凝集ポリペプチドを除去する工程（例えばゲルろ過）を含む。そのような凝集物を除去しないと、例えばアンタゴニストとして作用することを目的とした抗原結合性ポリペプチドの凝集物は、標的抗原の架橋又はクラスター形成を誘導することによりアゴニストとして機能することができるため、in vivo用途に適さない調製物を生じ得る。タンパク質凝集物はまた、これらが投与される被験体で免疫応答を誘導することにより治療用ポリペプチドの効力を低下させることがある。
【００７８】
これに対して、本発明の凝集耐性リガンド又はdAb単量体は、凝集物を除去する工程を含める必要なく、in vivoでの用途のために調製することができ、かつポリペプチド凝集物が引き起こす上記欠点なくin vivo用途で使用することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、リガンド又はdAb単量体は、ある温度（Ts）まで加熱し、ある温度（Tc）まで冷却すると可逆的に立体構造が解かれる（アンフォールディング）（その際、TsはdAbの融解温度（Tm）より高く、TcはdAbの融解温度より低い）。例えばdAb単量体は、80℃まで加熱し、ほぼ室温まで冷却するとき、可逆的にアンフォールディングすることができる。可逆的にアンフォールディングされたポリペプチドは、アンフォールディングされるとその機能を消失し、再度折り畳まれる（リフォールディングされる）と機能を回復する。かかるポリペプチドは、アンフォールディングされると凝集するポリペプチド又は不適当にリフォールディングされる（すなわち異常に折り畳まれる）ポリペプチドとは区別される。
【００８０】
ポリペプチドのアンフォールディング及びリフォールディングは、例えば任意の適切な方法を使用してポリペプチドの構造を直接的または間接的に検出することにより評価することができる。例えばポリペプチド構造は、円偏光二色性（CD）（例えば、遠UV CD、近UV CD）、蛍光（例えば、トリプトファン側鎖の蛍光）、タンパク質分解に対する感受性、核磁気共鳴（NMR）により、又は適当な折り畳みに依存するポリペプチドの機能（例えば、標的リガンドへの結合、一般的リガンドへの結合）を検出もしくは測定することにより、検出することができる。ある例では、ポリペプチドのアンフォールディングは、結合機能（例えば、一般的リガンド及び／又は標的リガンド結合、基質結合）の消失がポリペプチドがリフォールディングされたことを示す機能アッセイを使用して評価される。
【００８１】
リガンド又はdAb単量体のアンフォールディング及びリフォールディングの程度は、アンフォールディング又は変性曲線を使用して決定することができる。アンフォールディング曲線は、温度を縦軸にプロットし、折り畳まれたポリペプチドの相対濃度を横軸にプロットすることにより作成することができる。折り畳まれたリガンド又はdAb単量体の相対濃度は、任意の適切な方法（例えば、CD、蛍光、結合アッセイ）を使用して直接的または間接的に測定することができる。例えばリガンド又はdAb単量体溶液を調製し、溶液の楕円率をCDにより測定する。得られる楕円率値は、100％の折り畳まれたリガンド又はdAb単量体の相対濃度を示す。次に溶液中のリガンド又はdAb単量体は、溶液の温度を少しずつ上げることによりアンフォールディングされ、適当な増加分で楕円率が測定される（例えば、1℃の温度増加ごとに）。次に溶液中のリガンド又はdAb単量体は、溶液の温度を少しずつ低下させることによってリフォールディングされ、適当な増加分で楕円率が測定される。データをプロットして、アンフォールディング曲線とリフォールディング曲線とを作成することができる。アンフォールディング及びリフォールディング曲線は、特徴的なS字形状を有しており、これはリガンド又はdAb単量体分子の折り畳まれる部分、リガンド又はdAb単量体分子が種々の程度までアンフォールディングされるアンフォールディング/リフォールディング遷移、及びリガンド又はdAb単量体分子がアンフォールディングされる部分を含む。リフォールディング曲線のy軸切片は、回復されるリフォールディングされたリガンド又はdAb単量体の相対量である。少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％の回復は、リガンド又はdAb単量体が可逆的にアンフォールディングされることを示す。
【００８２】
好適な実施形態において、リガンド又はdAb単量体のアンフォールディングの可逆性は、リガンド又はdAb単量体溶液を調製し、加熱アンフォールディング及びリフォールディング曲線をプロットすることにより決定される。リガンド又はdAb単量体溶液は、任意の適切な溶媒、例えばリガンド又はdAb単量体の溶解を可能にするのに適したpH（例えば、等電点（pI）より約3ユニット上又は下のpH）を有する水性緩衝液などで調製することができる。リガンド又はdAb単量体溶液は、アンフォールディング／フォールディングの検出を可能にするのに十分に濃縮される。例えば、リガンド又はdAb単量体溶液は、約0.1μM〜約100μM、又は好ましくは約1μM〜約10μMであることができる。
【００８３】
リガンド又はdAb単量体の融解温度（Tm）が既知の場合、溶液をTmの約10℃下（Tm−10）まで加熱して、フォールディングを楕円率又は蛍光（例えば、200nm〜250nmの遠UV CD走査、235nm又は225nmでの固定波長CD；298nmの励起による300〜450nmのトリプトファン蛍光発光スペクトル）により評価して、100％の相対的フォールディングリガンド又はdAb単量体が得られる。次にこの溶液をあらかじめ決められた増加分（例えば、約0.1〜約1℃の増加分）でTmの少なくとも10℃上（Tm＋10）まで加熱し、各増加分で楕円率又は蛍光が測定される。次にリガンド又はdAb単量体をあらかじめ決められた増加分で少なくともTm−10まで冷却することによってリフォールディングし、各増加分で楕円率又は蛍光が測定される。リガンド又はdAb単量体の融解温度が未知の場合、溶液を約25℃から約100℃まで少しずつ加熱してアンフォールディングし、次に少なくとも約25℃まで少しずつ冷却することによってリフォールディングし、各加熱及び冷却の増加分で、楕円率又は蛍光を測定する。得られたデータをプロットしてアンフォールディング曲線とリフォールディング曲線とを作成することができる（ここで、リフォールディング曲線のy軸切片は、回復されるリフォールディングタンパク質の相対量である）。いくつかの実施形態において、dAb単量体は、ラクダ科免疫グロブリン可変ドメインを含まないか、又はラクダ科生殖細胞系抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに固有の1つ又はそれ以上のフレームワークアミノ酸を含まない。
【００８４】
好ましくは、リガンド又はdAb単量体は、大腸菌（E. coli）又はピキア（Pichia）種（例えばP.パストリス（P.pastoris））で発現されるとき、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される。別の好適な実施形態において、dAb単量体は、大腸菌又はピキア種（例えばP.パストリス）で発現されると、少なくとも約0.75mg/L、少なくとも約1mg/L、少なくとも約4mg/L、少なくとも約5mg/L、少なくとも約10mg/L、少なくとも約15mg/L、少なくとも約20mg/L、少なくとも約25mg/L、少なくとも約30mg/L、少なくとも約35mg/L、少なくとも約40mg/L、少なくとも約45mg/L、又は少なくとも約50mg/L、又は少なくとも約100mg/L、又は少なくとも約200mg/L、又は少なくとも約300mg/L、又は少なくとも約400mg/L、又は少なくとも約500mg/L、又は少なくとも約600mg/L、又は少なくとも約700mg/L、又は少なくとも約800mg/L、少なくとも約900mg/L、又は少なくとも約1g/Lの量で分泌される。別の好適な実施形態において、dAb単量体は、大腸菌又はピキア種（例えばP.パストリス）で発現されると、少なくとも約1mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約1mg/L〜少なくとも約750mg/L、少なくとも約100mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約200mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約300mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約400mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約500mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約600mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約700mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約800mg/L〜少なくとも約1g/L、又は少なくとも約900mg/L〜少なくとも約1g/Lの量で分泌される。本明細書に記載のリガンド及びdAb単量体は、大腸菌又はピキア種（例えばP.パストリス）で発現されると分泌可能であるが、これらは任意の適切な方法、例えば合成化学法、又は大腸菌もしくはピキア種を使用しない生物学的産生法を使用して作製することができる。
【００８５】
血清アルブミンに結合するdAb単量体
本発明のリガンドは、1nM〜500μM（すなわち、ｘ10-9〜5ｘ10-4）、好ましくは100nM〜10μMのKdで血清アルブミン（SA）に結合するdAb単量体を含むことができる。好ましくは、第1の抗SA dAbと別の標的に対する第2のdAbとを含む二重特異性リガンドについて、その標的に対する第2のdAbの親和性（例えばBiaCoreを使用して表面プラズモン共鳴により測定されるKd及び／又はKoff）は、SAに対する第1のdAbの親和性の1〜100000倍（好ましくは100〜100000、さらに好ましくは1000〜100000、又は10000〜100000倍）である。例えば、第1のdAbはSAに約10μMの親和性で結合し、第2のdAbはその標的に100pMの親和性で結合する。好ましくは、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（HSA）である。一実施形態において、第1のdAb（又はdAb単量体）はSA（例えばHSA）に、約50、好ましくは70、さらに好ましくは100、150、又は200nMのKdで結合する。
【００８６】
特定の実施形態において、SAに結合するdAb単量体は凝集に耐性であり、可逆的にアンフォールディングし、及び／又はIL-1R1に結合するdAb単量体について上記したようなフレームワーク領域を含む。
【００８７】
具体的な実施形態において、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合フラグメントは、ヒト血清アルブミンに結合するdAbである。特定の実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンに結合し、アルブミンへの結合について、DOM7m-16(配列番号723)、DOM7m-12(配列番号724)、DOM7m-26(配列番号725)、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、DOM7r-8(配列番号731)、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、DOM7h-27(配列番号745)、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)よりなる群から選択されるdAbと競合する。
【００８８】
特定の実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンに結合し、DOM7m-16(配列番号723)、DOM7m-12(配列番号724)、DOM7m-26(配列番号725)、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、DOM7r-8(配列番号731)、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、DOM7h-27(配列番号745)、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)よりなる群から選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも約80％、又は少なくとも約85％、又は少なくとも約90％、又は少なくとも約95％、又は少なくとも約96％、又は少なくとも約97％、又は少なくとも約98％、又は少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８９】
例えばヒト血清アルブミンに結合するdAbは、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、DOM7r-14(配列番号748)、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、及びDOM7h-27(配列番号745)と、少なくとも約90％、又は少なくとも約95％、又は少なくとも約96％、又は少なくとも約97％、又は少なくとも約98％、又は少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００９０】
アミノ酸配列同一性は、好ましくは、適切な配列アライメントアルゴリズム及びデフォルトのパラメータ、例えばBLAST Pを使用して決定される（Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-2268 (1990)）。
【００９１】
さらに具体的な実施形態において、dAbは、ヒト血清アルブミンに結合し、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、DOM7h-7(配列番号737)、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、及びDOM7r-14(配列番号748)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVκ dAbであるか、又はDOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、及びDOM7h-27(配列番号745)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH dAbである。別の実施形態において、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合フラグメントは、ヒト血清アルブミンに結合し、前記アミノ酸配列のいずれかのCDRを含むdAbである。
【００９２】
血清アルブミンに結合する適切なラクダ科VHHには、WO 2004/041862（Ablynx N.V.）及び本明細書に開示される(配列番号768〜784)ものが挙げられる。特定の実施形態において、ラクダ科VHHは、ヒト血清アルブミンに結合し、配列番号768、配列番号769、配列番号770、配列番号771、配列番号772、配列番号773、配列番号774、配列番号775、配列番号776、配列番号777、配列番号778、配列番号779、配列番号780、配列番号781、配列番号782、配列番号783、又は配列番号784と、少なくとも約80％、又は少なくとも約85％、又は少なくとも約90％、又は少なくとも約95％、又は少なくとも約96％、又は少なくとも約97％、又は少なくとも約98％、又は少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、適切な配列アライメントアルゴリズム及びデフォルトパラメータ、例えばBLAST Pを使用して決定される（Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-2268(1990)）。
【００９３】
いくつかの実施形態において、リガンドは、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）への結合について本明細書に開示の抗血清アルブミンdAbのいずれかと競合する抗血清アルブミンdAbを含む。
【００９４】
腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1）に結合するdAb単量体
本発明のリガンドは、TNFR1に結合するdAb単量体を含むことができる。TNFR1は、リガンドに結合する細胞外領域と、内在のシグナル伝達活性が欠如しているがシグナル伝達分子と会合することができる細胞内ドメインとを含有する膜貫通受容体である。TNFR1と結合したTNFとの複合体は、3つのTNFR1鎖と3つのTNF鎖とを含有する（Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)）。TNFリガンドは三量体として存在し、これは3つのTNFR1鎖によって結合している（同上）。3つのTNFR1鎖は受容体−リガンド複合体中で共に密接にクラスター形成しており、このクラスター形成がTNFR1介在シグナル伝達の必要条件である。実際、TNFR1に結合する多価物質（例えば抗TNFR1抗体）は、TNFの非存在下でTNFR1クラスター形成とシグナル伝達とを誘導することができ、一般にTNFR1アゴニストとして使用される（例えば、Belka et al., EMBO, 14(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)を参照）。従って、TNFR1に結合する多価物質は、一般的に、これらがTNFR1へのTNFαの結合を阻止する場合でさえ、TNFR1の有効なアンタゴニストではない。
【００９５】
TNFR1の細胞外領域は、13個のアミノ酸アミノ末端セグメント(配列番号996（ヒト）のアミノ酸1〜13；配列番号997（マウス）のアミノ酸1〜13）、ドメイン1(配列番号996（ヒト）のアミノ酸14〜53；配列番号997（マウス）のアミノ酸14〜53）、ドメイン2(配列番号996（ヒト）のアミノ酸54〜97；配列番号997（マウス）のアミノ酸54〜97）、ドメイン3(配列番号996（ヒト）のアミノ酸98〜138；配列番号997（マウス）のアミノ酸98〜138)、及びドメイン4(配列番号996（ヒト）のアミノ酸139〜167；配列番号997（マウス）のアミノ酸139〜167）を含み、これに続いて、膜近傍領域(配列番号996（ヒト）のアミノ酸168〜182；配列番号997（マウス）のアミノ酸168〜183）を含む（Banner et al., Cell 73(3) 431-445 (1993)及びLoetscher et al., Cell 61(2) 351-359 (1990)参照）。ドメイン2と3は、結合したリガンド（TNFβ、TNFα）と接触される（Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)）。TNFR1の細胞外領域はまた、プレリガンド結合アセンブリードメイン（pre-ligand binding assemblyDOMain）又はPLADドメイン(配列番号996（ヒト）のアミノ酸1〜53；配列番号997（マウス）のアミノ酸1〜53））（アメリカ合衆国政府、WO 01/58953; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)）とも称する領域を含む。
【００９６】
TNFR1は、ドメイン4又は膜近傍領域（それぞれ配列番号213のアミノ酸168〜182、配列番号215のアミノ酸168〜183）におけるTNFR1のタンパク質分解を含むプロセスを介してin vivoで細胞表面から除かれ、可溶性形態のTNFR1を生じる。可溶性TNFR1はTNFαに結合する能力を保持し、その結果、TNFαの活性の内因性インヒビターとして機能する。
【００９７】
ヒトTNFR1の細胞外領域は以下のアミノ酸配列を有する。
【化１】
2009519011.tif 000002
【００９８】
ミューリン（ムス・ムスクルス（Mus musculus））TNFR1の細胞外領域は以下のアミノ酸配列を有する。
【化２】
2009519011.tif 000003
【００９９】
本発明（例えば本明細書に記載のリガンド）での使用に適した抗TNFR1 dAbは、腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1；p55；CD120a）に対する結合特異性を有する。好ましくは、TNFR1のアンタゴニストは、腫瘍壊死因子2（TNFR2）に対する結合特異性をもたないか、又はTNFR2に実質的に拮抗しない。TNFR1のアンタゴニスト（1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、又は100μM）が標準的細胞アッセイでTNFα（100pg/ml）により誘導されるTNFR2介在活性の約5％以下の阻害を引き起こすとき、該アンタゴニストは実質的にTNFR2に拮抗しない。特定の実施形態において、TNFR1に結合するdAb単量体は、凝集に抵抗し、可逆的にアンフォールディングし、及び／又はIL-1R1に結合するdAb単量体について上記したようなフレームワーク領域を含む。
【０１００】
かかるdAbを含む適当な抗TNFR1 dAb及びリガンドは、受容体の活性化及びシグナル伝達に導くことができる細胞の表面でのTNFR1の架橋又はクラスター形成を誘導しない。具体的な実施形態において、リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合する抗TNFR1 dAbを含む。さらに具体的な実施形態において、リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合する抗TNFR1 dAbを含み、マウスTNFR1への結合についてTAR2m-21-23と競合するか、又はヒトTNFR1への結合についてTAR2h-205と競合する。
【０１０１】
特定の実施形態において、抗TNFR1 dAbはTNFR1のドメイン2及び／又はドメイン3に結合する。具体的な実施形態において、抗TNFR1 dAbは、TNFR1（例えばヒト及び／又はマウスTNFR1）への結合について、TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10、又はTAR2h-185-25と競合する。
【０１０２】
好ましくは、本発明のリガンドでの使用に適した抗TNFR1 dAb単量体は、表面プラズモン共鳴で測定する際、300nM〜5pM（すなわち、3ｘ10-7〜5ｘ10-12M）、好ましくは50nM〜20pM、さらに好ましくは5nM〜200pM、そして最も好ましくは1nM〜100pM、例えば1ｘ10-7M以下、好ましくは1ｘ10-8M以下、さらに好ましくは1ｘ10-9M以下、有利には1ｘ10-10M以下、最も好ましくは1ｘ10-11M以下のKdで；及び／又は5ｘ10-1s-1〜1ｘ10-7s-1、好ましくは1ｘ10-2s-1〜1ｘ10-6s-1、さらに好ましくは5ｘ10-3s-1〜1ｘ10-5s-1、例えば5ｘ10-1s-1以下、好ましくは1ｘ10-2s-1以下、有利には1ｘ10-3s-1以下、さらに好ましくは1ｘ10-4s-1以下、より好ましくは1ｘ10-5s-1以下、そして最も好ましくは1ｘ10-6s-1以下のKoff速度定数で、TNFR1に結合する（Kd=Koff/Kon）。本発明での使用に適した特定の抗TNFR1 dAb単量体は、表面プラズモン共鳴により測定する際、50nM〜20pMのKd、そして5x10-1s-1〜1x10-7s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1に特異的に結合する。
【０１０３】
いくつかの抗TNFR1 dAb単量体は、TNFαのTNFR1への結合を阻害する。例えば、いくつかの抗TNFR1 dAb単量体は、TNFαのTNFR1への結合を、500nM〜50pM、好ましくは100nM〜50pM、さらに好ましくは10nM〜100pM、有利には1nM〜100pM；例えば50nM以下、好ましくは5nM以下、さらに好ましくは500pM以下、有利には200pM以下、そして最も好ましくは100pM以下の阻害濃度50（IC50)で阻害する。好ましくは、TNFR1はヒトTNFR1である。
【０１０４】
他の抗TNFR1 dAb単量体はTNFαのTNFR1への結合を阻害しないが、TNFR1を介するシグナル伝達を阻害する。例えば抗TNFR1 dAb単量体はTNFα誘導性のTNFR1クラスター形成を阻害することができ、これはTNFR1を介するシグナル伝達の前に起きる。例えば特定の抗TNFR1 dAb単量体はTNFR1に結合し、TNFR1介在シグナル伝達を阻害することができるが、TNFαのTNFR1への結合を実質的に阻害しない。例えば抗TNFR1 dAb単量体は、細胞の表面上でのTNFα誘導性のTNFR1の架橋又はクラスター形成を阻害する。かかるdAb（例えば本明細書に記載のTAR2m-21-23）は、細胞表面TNFR1に拮抗できるため有利であるが、内因性の可溶性TNFR1の阻害活性を実質的には低下させない。例えば抗TNFR1 dAbはTNFR1に結合できるが、受容体結合アッセイにおいて、TNFαのTNFR1への結合を約10％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、又は約1％以下で阻害する。またこれらの実施形態において、抗TNFR1 dAbは、標準的細胞アッセイにおいて、TNFαに誘導されるTNFR1の架橋及び/又はTNFR1介在シグナル伝達を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％阻害する。従って、かかるdAb単量体を含むリガンドをそれを必要とする哺乳動物に投与することにより、TNFαの活性及びTNFR1の活性をin vivoで阻害する内因性調節経路を補うことができる。
【０１０５】
好ましくは、リガンド又はdAb単量体は標準的アッセイ（例えば、本明細書に記載の標準的L929又は標準的HeLa IL-8アッセイ）でTNFR1を、500nM〜50pM、好ましくは100nM〜50pM、さらに好ましくは10nM〜100pM、有利には1nM〜100pM；例えば50nM以下、好ましくは5nM以下、さらに好ましくは500pM以下、有利には200pM以下、最も好ましくは100pM以下の中和用量50（ND50）で中和（その活性を阻害）する。別の実施形態において、抗TNFR1 dAb単量体は、TNFR1に結合し、標準的細胞（例えば、本明細書に記載の標準的L929又は標準的HeLa IL-8アッセイ）でTNFR1の活性に100nMのND50で拮抗し、10μM以下の濃度で、dAbはTNFR1の活性をこのアッセイにおいて5％以下だけアゴナイズする。
【０１０６】
別の実施形態において、抗TNFR1 dAb単量体は、本明細書に記載のKdでTNFR1に特異的に結合し、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導型敗血症性ショックモデルにおける致死率を抑制する（すなわち、致死を防ぎ、適切な対照と比較して致死率を少なくとも約10％低下させる）。好ましくは、抗TNFR1 dAb単量体は、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導型敗血症性ショックモデルで、約5mg/kg又はそれ以上、好ましくは約1mg/kgを投与したとき、適切な対照と比較して、致死率を少なくとも約25％、又は少なくとも約50％抑制する。
【０１０７】
具体的な実施形態において、本発明の抗TNFR1 dAb単量体又はかかるdAb単量体を含むリガンドは、標準的細胞アッセイ（本明細書に記載の標準的L929又は標準的HeLa IL-8アッセイなど）においてTNFR1を実質的にアゴナイズしない（TNFR1のアゴニストとして作用する）（すなわち、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM又は5,000μMの濃度で存在するとき、このアッセイにおいてTNFα（100pg/ml）で誘導されるTNFR1介在活性の約5％以下を生じる）。
【０１０８】
別の実施形態において、リガンドは、300nM〜5pMのKdで腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1、p55、CD120a）に特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、かつTAR2h-12(配列番号785)、TAR2h-13(配列番号786)、TAR2h-14(配列番号787)、TAR2h-16(配列番号788)、TAR2h-17(配列番号789)、TAR2h-18(配列番号790)、TAR2h-19(配列番号791)、TAR2h-20(配列番号792)、TAR2h-21(配列番号793)、TAR2h-22 (配列番号794)、TAR2h-23(配列番号795)、TAR2h-24(配列番号796)、TAR2h-25(配列番号797)、TAR2h-26(配列番号798)、TAR2h-27 (配列番号799)、TAR2h-29(配列番号800)、TAR2h-30(配列番号801)、TAR2h-32(配列番号802)、TAR2h-33(配列番号803)、TAR2h-10-1(配列番号804)、TAR2h-10-2(配列番号805)、TAR2h-10-3(配列番号806)、TAR2h-10-4(配列番号807)、TAR2h-10-5(配列番号808)、TAR2h-10-6(配列番号809)、TAR2h-10-7(配列番号810)、TAR2h-10-8(配列番号811)、TAR2h-10-9(配列番号812)、TAR2h-10-10(配列番号813)、TAR2h-10-11(配列番号814)、TAR2h-10-12(配列番号815)、TAR2h-10-13(配列番号816)、TAR2h-10-14(配列番号817)、TAR2h-10-15(配列番号818)、TAR2h-10-16(配列番号819)、TAR2h-10-17(配列番号820)、TAR2h-10-18(配列番号821)、TAR2h-10-19(配列番号822)、TAR2h-10-20(配列番号823)、TAR2h-10-21(配列番号824)、TAR2h-10-22(配列番号825)、TAR2h-10-27(配列番号826)、TAR2h-10-29(配列番号827)、TAR2h-10-31(配列番号828)、TAR2h-10-35(配列番号829)、TAR2h-10-36(配列番号830)、TAR2h-10-37(配列番号831)、TAR2h-10-38(配列番号832)、TAR2h-10-45(配列番号833)、TAR2h-10-47(配列番号834)、TAR2h-10-48(配列番号835)、TAR2h-10-57(配列番号836)、TAR2h-10-56 配列番号837)、TAR2h-10-58(配列番号838)、TAR2h-10-66(配列番号839)、TAR2h-10-64(配列番号840)、TAR2h-10-65(配列番号841)、TAR2h-10-68(配列番号842)、TAR2h-10-69(配列番号843)、TAR2h-10-67(配列番号844)、TAR2h-10-61(配列番号845)、TAR2h-10-62(配列番号846)、TAR2h-10-63(配列番号847)、TAR2h-10-60(配列番号848)、TAR2h-10-55(配列番号849)、TAR2h-10-59(配列番号850)、TAR2h-10-70(配列番号851)、TAR2h-34(配列番号852)、TAR2h-35(配列番号853)、TAR2h-36(配列番号854)、TAR2h-37(配列番号855)、TAR2h-38(配列番号856)、TAR2h-39(配列番号857)、TAR2h-40(配列番号858)、TAR2h-41(配列番号859)、TAR2h-42(配列番号860)、TAR2h-43(配列番号861)、TAR2h-44(配列番号862)、TAR2h-45(配列番号863)、TAR2h-47(配列番号864)、TAR2h-48(配列番号865)、TAR2h-50(配列番号866)、TAR2h-51(配列番号867)、TAR2h-66(配列番号868)、TAR2h-67(配列番号869)、TAR2h-68(配列番号870)、TAR2h-70(配列番号871)、TAR2h-71(配列番号872)、TAR2h-72(配列番号873)、TAR2h-73(配列番号874)、TAR2h-74(配列番号875)、TAR2h-75(配列番号876)、TAR2h-76(配列番号877)、TAR2h-77(配列番号878)、TAR2h-78(配列番号879)、TAR2h-79(配列番号880)、TAR2h-15(配列番号881)、TAR2h-131-8(配列番号882)、TAR2h-131-24(配列番号883)、TAR2h-15-8(配列番号884)、TAR2h-15-8-1(配列番号885)、TAR2h-15-8-2(配列番号886)、TAR2h-185-23(配列番号887)、TAR2h-154-10-5(配列番号888)、TAR2h-14-2(配列番号889)、TAR2h-151-8(配列番号890)、TAR2h-152-7(配列番号891)、TAR2h-35-4(配列番号892)、TAR2h-154-7(配列番号893)、TAR2h-80(配列番号894)、TAR2h-81(配列番号895)、TAR2h-82(配列番号896)、TAR2h-83(配列番号897)、TAR2h-84(配列番号898)、TAR2h-85(配列番号899)、TAR2h-86(配列番号900)、TAR2h-87(配列番号901)、TAR2h-88(配列番号902)、TAR2h-89(配列番号903)、TAR2h-90(配列番号904)、TAR2h-91(配列番号905)、TAR2h-92(配列番号906)、TAR2h-93(配列番号907)、TAR2h-94(配列番号908)、TAR2h-95(配列番号909)、TAR2h-96(配列番号910)、TAR2h-97(配列番号911)、TAR2h-99(配列番号912)、TAR2h-100(配列番号913)、TAR2h-101(配列番号914)、TAR2h-102(配列番号915)、TAR2h-103(配列番号916)、TAR2h-104(配列番号917)、TAR2h-105(配列番号918)、TAR2h-106(配列番号919)、TAR2h-107(配列番号920)、TAR2h-108(配列番号921)、TAR2h-109(配列番号922)、TAR2h-110(配列番号923)、TAR2h-111(配列番号924)、TAR2h-112(配列番号925)、TAR2h-113(配列番号926)、TAR2h-114(配列番号927)、TAR2h-115(配列番号928)、TAR2h-116(配列番号929)、TAR2h-117(配列番号930)、TAR2h-118(配列番号931)、TAR2h-119(配列番号932)、TAR2h-120(配列番号933)、TAR2h-121(配列番号934)、TAR2h-122(配列番号935)、TAR2h-123(配列番号936)、TAR2h-124(配列番号937)、TAR2h-125(配列番号938)、TAR2h-126(配列番号939)、TAR2h-127(配列番号940)、TAR2h-128(配列番号941)、TAR2h-129(配列番号942)、TAR2h-130(配列番号943)、TAR2h-131(配列番号944)、TAR2h-132(配列番号945)、TAR2h-133(配列番号946)、TAR2h-151(配列番号947)、TAR2h-152(配列番号948)、TAR2h-153(配列番号949)、TAR2h-154(配列番号950)、TAR2h-159(配列番号951)、TAR2h-165(配列番号952)、TAR2h-166(配列番号953)、TAR2h-168(配列番号954)、TAR2h-171(配列番号955)、TAR2h-172(配列番号956)、TAR2h-173(配列番号957)、TAR2h-174(配列番号958)、TAR2h-176(配列番号959)、TAR2h-178(配列番号960)、TAR2h-201(配列番号961)、TAR2h-202(配列番号962)、TAR2h-203(配列番号963)、TAR2h-204(配列番号964)、TAR2h-185-25(配列番号965)、TAR2h-154-10 配列番号966)、TAR2h-205(配列番号967)、TAR2h-10(配列番号968)、TAR2h-5(配列番号969)、TAR2h-5d1(配列番号970)、TAR2h-5d2(配列番号971)、TAR2h-5d3(配列番号972)、TAR2h-5d4(配列番号973)、TAR2h-5d5(配列番号974)、TAR2h-5d6(配列番号975)、TAR2h-5d7(配列番号976)、TAR2h-5d8(配列番号977)、TAR2h-5d9(配列番号978)、TAR2h-5d10(配列番号979)、TAR2h-5d11(配列番号980)、TAR2h-5d12(配列番号981)、及びTAR2h-5d13(配列番号982)よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
別の実施形態において、リガンドは、300nM〜5pMのKdで腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1、p55、CD120a）に特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、ヒトTNFR1への結合について、TAR2h-12(配列番号785)、TAR2h-13(配列番号786)、TAR2h-14(配列番号787)、TAR2h-16(配列番号788)、TAR2h-17(配列番号789)、TAR2h-18(配列番号790)、TAR2h-19(配列番号791)、TAR2h-20(配列番号792)、TAR2h-21(配列番号793)、TAR2h-22(配列番号794)、TAR2h-23(配列番号795)、TAR2h-24(配列番号796)、TAR2h-25(配列番号797)、TAR2h-26(配列番号798)、TAR2h-27(配列番号799)、TAR2h-29(配列番号800)、TAR2h-30(配列番号801)、TAR2h-32(配列番号802)、TAR2h-33(配列番号803)、TAR2h-10-1(配列番号804)、TAR2h-10-2(配列番号805)、TAR2h-10-3(配列番号806)、TAR2h-10-4(配列番号807)、TAR2h-10-5(配列番号808)、TAR2h-10-6(配列番号809)、TAR2h-10-7(配列番号810)、TAR2h-10-8(配列番号811)、TAR2h-10-9(配列番号812)、TAR2h-10-10(配列番号813)、TAR2h-10-11(配列番号814)、TAR2h-10-12(配列番号815)、TAR2h-10-13(配列番号816)、TAR2h-10-14(配列番号817)、TAR2h-10-15(配列番号818)、TAR2h-10-16(配列番号819)、TAR2h-10-17(配列番号820)、TAR2h-10-18(配列番号821)、TAR2h-10-19(配列番号822)、TAR2h-10-20(配列番号823)、TAR2h-10-21(配列番号824)、TAR2h-10-22(配列番号825)、TAR2h-10-27(配列番号826)、TAR2h-10-29(配列番号827)、TAR2h-10-31(配列番号828)、TAR2h-10-35(配列番号829)、TAR2h-10-36(配列番号830)、TAR2h-10-37(配列番号831)、TAR2h-10-38(配列番号832)、TAR2h-10-45(配列番号833)、TAR2h-10-47(配列番号834)、TAR2h-10-48(配列番号835)、TAR2h-10-57(配列番号836)、TAR2h-10-56（配列番号837)、TAR2h-10-58(配列番号838)、TAR2h-10-66(配列番号839)、TAR2h-10-64(配列番号840)、TAR2h-10-65(配列番号841)、TAR2h-10-68(配列番号842)、TAR2h-10-69(配列番号843)、TAR2h-10-67(配列番号844)、TAR2h-10-61(配列番号845)、TAR2h-10-62(配列番号846)、TAR2h-10-63(配列番号847)、TAR2h-10-60(配列番号848)、TAR2h-10-55(配列番号849)、TAR2h-10-59(配列番号850)、TAR2h-10-70(配列番号851)、TAR2h-34(配列番号852)、TAR2h-35(配列番号853)、TAR2h-36(配列番号854)、TAR2h-37(配列番号855)、TAR2h-38(配列番号856)、TAR2h-39(配列番号857)、TAR2h-40(配列番号858)、TAR2h-41(配列番号859)、TAR2h-42(配列番号860)、TAR2h-43(配列番号861)、TAR2h-44(配列番号862)、TAR2h-45(配列番号863)、TAR2h-47(配列番号864)、TAR2h-48(配列番号865)、TAR2h-50(配列番号866)、TAR2h-51(配列番号867)、TAR2h-66(配列番号868)、TAR2h-67(配列番号869)、TAR2h-68(配列番号870)、TAR2h-70(配列番号871)、TAR2h-71(配列番号872)、TAR2h-72(配列番号873)、TAR2h-73(配列番号874)、TAR2h-74(配列番号875)、TAR2h-75(配列番号876)、TAR2h-76(配列番号877)、TAR2h-77(配列番号878)、TAR2h-78(配列番号879)、TAR2h-79(配列番号880)、TAR2h-15(配列番号881)、TAR2h-131-8(配列番号882)、TAR2h-131-24(配列番号883)、TAR2h-15-8(配列番号884)、TAR2h-15-8-1(配列番号885)、TAR2h-15-8-2(配列番号886)、TAR2h-185-23(配列番号887)、TAR2h-154-10-5(配列番号888)、TAR2h-14-2(配列番号889)、TAR2h-151-8(配列番号890)、TAR2h-152-7(配列番号891)、TAR2h-35-4(配列番号892)、TAR2h-154-7(配列番号893)、TAR2h-80(配列番号894)、TAR2h-81(配列番号895)、TAR2h-82(配列番号896)、TAR2h-83(配列番号897)、TAR2h-84(配列番号898)、TAR2h-85(配列番号899)、TAR2h-86(配列番号900)、TAR2h-87(配列番号901)、TAR2h-88(配列番号902)、TAR2h-89(配列番号903)、TAR2h-90(配列番号904)、TAR2h-91(配列番号905)、TAR2h-92(配列番号906)、TAR2h-93(配列番号907)、TAR2h-94(配列番号908)、TAR2h-95(配列番号909)、TAR2h-96(配列番号910)、TAR2h-97(配列番号911)、TAR2h-99(配列番号912)、TAR2h-100(配列番号913)、TAR2h-101(配列番号914)、TAR2h-102(配列番号915)、TAR2h-103(配列番号916)、TAR2h-104(配列番号917)、TAR2h-105(配列番号918)、TAR2h-106(配列番号919)、TAR2h-107(配列番号920)、TAR2h-108(配列番号921)、TAR2h-109(配列番号922)、TAR2h-110(配列番号923)、TAR2h-111(配列番号924)、TAR2h-112(配列番号925)、TAR2h-113(配列番号926)、TAR2h-114(配列番号927)、TAR2h-115(配列番号928)、TAR2h-116(配列番号929)、TAR2h-117(配列番号930)、TAR2h-118(配列番号931)、TAR2h-119(配列番号932)、TAR2h-120(配列番号933)、TAR2h-121(配列番号934)、TAR2h-122(配列番号935)、TAR2h-123(配列番号936)、TAR2h-124(配列番号937)、TAR2h-125(配列番号938)、TAR2h-126(配列番号939)、TAR2h-127(配列番号940)、TAR2h-128(配列番号941)、TAR2h-129(配列番号942)、TAR2h-130(配列番号943)、TAR2h-131(配列番号944)、TAR2h-132(配列番号945)、TAR2h-133(配列番号946)、TAR2h-151(配列番号947)、TAR2h-152(配列番号948)、TAR2h-153(配列番号949)、TAR2h-154(配列番号950)、TAR2h-159(配列番号951)、TAR2h-165(配列番号952)、TAR2h-166(配列番号953)、TAR2h-168(配列番号954)、TAR2h-171(配列番号955)、TAR2h-172(配列番号956)、TAR2h-173(配列番号957)、TAR2h-174(配列番号958)、TAR2h-176(配列番号959)、TAR2h-178(配列番号960)、TAR2h-201(配列番号961)、TAR2h-202(配列番号962)、TAR2h-203(配列番号963)、TAR2h-204(配列番号964)、TAR2h-185-25(配列番号965)、TAR2h-154-10 配列番号966)、TAR2h-205(配列番号967)、TAR2h-10(配列番号968)、TAR2h-5(配列番号969)、TAR2h-5d1(配列番号970)、TAR2h-5d2(配列番号971)、TAR2h-5d3(配列番号972)、TAR2h-5d4(配列番号973)、TAR2h-5d5(配列番号974)、TAR2h-5d6(配列番号975)、TAR2h-5d7(配列番号976)、TAR2h-5d8(配列番号977)、TAR2h-5d9(配列番号978)、TAR2h-5d10(配列番号979)、TAR2h-5d11(配列番号980)、TAR2h-5d12(配列番号981)、及びTAR2h-5d13(配列番号982)よりなる群から選択されるdAbと競合する。
【０１１０】
別の実施形態において、リガンドは、300nM〜5pMのKdで腫瘍壊死因子受容体1（TNFR1、p55、CD120a）に特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、かつTAR2m-14(配列番号983)、TAR2m-15(配列番号984)、TAR2m-19(配列番号985)、TAR2m-20(配列番号986)、TAR2m-21(配列番号987)、TAR2m-24(配列番号988)、TAR2m-21-23(配列番号989)、TAR2m-21-07(配列番号990)、TAR2m-21-43(配列番号991)、TAR2m-21-48(配列番号992)、TAR2m-21-10(配列番号993)、TAR2m-21-06(配列番号994)、及びTAR2m-21-17(配列番号995)よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、リガンドは、TNFR1に結合するdAb単量体を含み、TNFR1（例えばマウス及び／又はヒトTNFR1）への結合について本明細書に開示のdAbのいずれかと競合する。
【０１１２】
プロテアーゼ耐性dAb
本発明はまた、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、カテプシン（例えばカテプシンG）、プロテイナーゼ3）分解に対して耐性であるdAb単量体、並びにプロテアーゼ耐性dAbを含むリガンドに関する。プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ）は、タンパク質の正常なターンオーバー及び代謝で機能する。しかし、特定の生理学的状態（例えば、炎症状態（例えばCOPD)、及び癌）では、組織、臓器、又は動物（例えば、腫瘍中の又はこれに隣接する肺）中に存在するプロテアーゼの量は増加し得る。このプロテアーゼの増加は、内因性タンパク質や投与される治療用ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質の分解の促進と不活性化を引き起こし得る。実際、in vivo用途（例えば、疾患の治療、診断、又は予防における使用）の可能性を有するいくつかの物質は、プロテアーゼにより迅速に分解され不活性化されるため、限定された効力のみを有している。
【０１１３】
本発明は、プロテアーゼ分解に耐性のdAb、又はdAbを含むリガンドに関する。本発明のプロテアーゼ耐性dAbはいくつかの利点を与える。例えば、プロテアーゼ耐性dAbは被験体に投与することができ、プロテアーゼ感受性物質より長くin vivoで活性を維持することができる。従って、プロテアーゼ耐性dAbは、生物学的作用を生じるのに十分な期間機能性を維持する。
【０１１４】
プロテアーゼ分解に耐性のdAbは、プロテアーゼ活性に適した条件下で、少なくとも約2時間、少なくとも約3時間、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、又は少なくとも約48時間インキュベートするとき、実質的にプロテアーゼにより分解されない。プロテアーゼと共に少なくとも約2時間インキュベーションした後に、dAbが、プロテアーゼにより約25%以下、約20%以下、約15%以下、約14%以下、約13%以下、約12%以下、約11%以下、約10%以下、約9%以下、約8%以下、約7%以下、約6%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、約1%以下のタンパク質が分解されるか、又は実質的に分解されない場合に、該タンパク質は実質的に分解されない。タンパク質分解は、任意の適切な方法、例えば本明細書に記載のSDS-PAGEによって評価することができる。
【０１１５】
プロテアーゼ耐性は任意の適切な方法を使用して評価することができる。例えばプロテアーゼを適切なバッファー（例えばPBS）中のdAb溶液に加えて、dAb／プロテアーゼ溶液、例えば少なくとも約0.01％(w/w)プロテアーゼ、約0.01％〜約5％(w/w)プロテアーゼ、約0.05％〜約5％(w/w)プロテアーゼ、約0.1％〜約5％(w/w)プロテアーゼ、約0.5％〜約5％(w/w)プロテアーゼ、約1％〜約5％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.01％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.02％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.03％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.04％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.05％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.06％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.07％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.08％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.09％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.1％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.2％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.3％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.4％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.5％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.6％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.7％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.8％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約0.9％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約1％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約2％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約3％(w/w)プロテアーゼ、少なくとも約4％(w/w)プロテアーゼ、又は約5％(w/w)プロテアーゼの溶液を作製する。dAb／プロテアーゼ混合物はプロテアーゼ活性に適切な温度（例えば37℃）でインキュベートすることができ、サンプルをある時間間隔（例えば1時間、2時間、3時間など）で採取し、プロテアーゼ反応を停止させることができる。次にサンプルを、任意の適切な方法（例えばSDS-PAGE分析）を使用してタンパク質分解について分析することができる。結果は、分解の経時変化を確立するのに使用することができる。
【０１１６】
具体的な実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは、エラスターゼによる分解に対して耐性である。例えばエラスターゼ耐性dAbは、0.04％(w/w)のエラスターゼ溶液中37℃で少なくとも約2時間インキュベートしたとき、実質的に分解されない。好ましくは、エラスターゼ耐性dAbは、0.04％(w/w)のエラスターゼ溶液中37℃で少なくとも約12時間インキュベートしたとき、実質的に分解されない。より好ましくは、エラスターゼ耐性dAbは、0.04％(w/w)のエラスターゼ溶液中37℃で少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、又は少なくとも約48時間インキュベートしたとき、実質的に分解されない。
【０１１７】
具体的な実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbはトリプシンによる分解に対して耐性である。例えばトリプシン耐性dAbは、0.04％(w/w)のトリプシン溶液中37℃で少なくとも約2時間インキュベートしたとき、実質的に分解されない。好ましくは、トリプシン耐性dAbは、0.04％(w/w)のトリプシン溶液中37℃で少なくとも約3時間インキュベートしたとき、実質的に分解されない。さらに好ましくは、トリプシン耐性dAbは、0.04％(w/w)のトリプシン溶液中37℃で少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、又は少なくとも約12時間インキュベートしたとき、実質的に分解されない。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明は、WO 2004/081026に開示されたTAR1-5-19を含まない。
【０１１９】
好ましくは、プロテアーゼ耐性dAbは軽鎖可変ドメインである。例えばプロテアーゼ耐性dAbはVκ又はVλであることができる。
【０１２０】
dAbのプロテアーゼ耐性は、dAbの融解温度（Tm）と相関し得る。一般に、より高い融解温度がプロテアーゼ耐性と相関する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは、約40℃〜約95℃、約40℃〜約85℃、約40℃〜約80℃、約45℃〜約95℃、約45℃〜約85℃、約45℃〜約80℃、少なくとも約40℃、少なくとも約45℃、少なくとも約50℃、少なくとも約55℃、少なくとも約60℃、少なくとも約65℃、少なくとも約70℃、少なくとも約75℃、少なくとも約80℃、少なくとも約85℃、少なくとも約90℃、又は少なくとも約95℃のTmを有する。
【０１２１】
プロテアーゼ耐性dAbは、任意の所望の標的、例えばヒト又は動物タンパク質（サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素（例えばプロテアーゼ）、酵素及びDNA結合タンパク質の補助因子、脂質、及び炭水化物を含む）に対する結合特異性を有することができる。適切な標的（サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、及び他のタンパク質を含む）には、特に限定されないが、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カージオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エキソダス-2、FAPα、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルキン（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体I型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ムレリアン阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘因タンパク質、M-CSF、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄前駆細胞阻害因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニューツリン（Neurturin）、神経増殖因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドアルファ）、MMP12、PDK1、IgE、及び本明細書に開示の他の標的などがある。このリストが網羅的ではないことは理解されよう。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは肺組織中の標的、例えば、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、キマーゼ、FGF、フリン（Furin）、エンドセリン-1、エオタキシン（例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、alphavbeta6、alphavbeta8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、MMP12、PDK1、及びIgEよりなる群から選択される標的、と結合する。
【０１２３】
本発明のプロテアーゼ耐性dAbは、in vivoで投与することができ、プロテアーゼ分解に対して同様に耐性ではない化合物より長く機能を維持する。プロテアーゼ分解に耐性の本発明のdAbは、炎症性疾患を治療するのに使用することができる（例えば、肺投与、例えば鼻内投与、例えば吸入、による肺への局所投与）。例えば、プロテアーゼ分解に耐性のdAb単量体の治療上有効量をそれを必要とする被験体に投与することによる。本発明はまた、治療、診断、及び／又は予防において使用するための、プロテアーゼ分解に耐性のdAb単量体、並びに本明細書に記載の疾患（例えば炎症性疾患、関節炎、呼吸器疾患）を治療するための医薬の製造のための、本発明に係るdAb単量体の使用に関する。
【０１２４】
具体的な実施形態において、プロテアーゼ耐性dAb単量体は、肺投与を介して、炎症性疾患、関節炎、又は呼吸器疾患を治療するために使用することができる。プロテアーゼ耐性dAb単量体はまた、炎症性疾患、関節炎、又は呼吸器疾患を治療するための医薬の製造において使用することができ、その際、dAb単量体は肺投与を介して投与される。エラスターゼとトリプシンは肺にみられる最も一般的なプロテアーゼである。好ましくは肺投与のためのプロテアーゼ耐性dAbは、エラスターゼ耐性、トリプシン耐性、又はエラスターゼ耐性かつトリプシン耐性である。
【０１２５】
具体的な実施形態において、プロテアーゼ耐性dAb単量体（例えば、エラスターゼ耐性dAb単量体）はIL-1R1に結合し、IL-1（例えばIL-1α及び／又はIL-1β）のその受容体への結合を阻害するが、IL-1raの、IL-1R1への結合及びかかるdAb単量体を含むリガンドへの結合を阻害しない。かかるdAb単量体は、IL-1のIL-1R1への結合により誘導される生物学的機能により全体的に又は部分的に仲介される炎症、疾患もしくは他の症状（例えば、局所性又は全身性炎症、炎症性メディエーター（例えば、IL-6、IL-8、TNF）の同化、発熱、免疫細胞（例えば、リンパ球、好中球）活性化、食欲不振、低血圧、白血球減少、及び血小板減少）を治療するための治療薬として有用である。プロテアーゼ耐性dAb単量体はIL-1R1に結合して、内因性IL-1R1阻害経路（例えば内因性IL-1raの内因性IL-1R1への結合）に干渉することなく、IL-1R1機能を阻害することができる。従って、かかるdAb単量体は、IL-1R1又はIL-1の活性をin vivoで阻害する内因性調節経路を補うために投与することができる。さらに、IL-1R1に結合しIL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないプロテアーゼ耐性dAb単量体は、サンプル中のIL-1R1に結合し、これを検出、定量、又は測定するのに使用でき、IL-1R1への結合についてサンプル中のIL-1raと競合しないため、診断薬としての使用できる利点を提供する。従って、サンプル中にIL-1R1がどれだけあるかの正確な測定を行うことができる。
【０１２６】
IL-1R1に結合し、IL-1（例えばIL-1α及び／又はIL-1β）のその受容体への結合を阻害するが、IL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないプロテアーゼ耐性dAb単量体（例えば、エラスターゼ耐性dAb単量体）は、有用な研究手段でもある。例えばかかるdAb単量体は、IL-1R1に結合するがIL-1raのIL-1R1への結合を阻害しない物質（例えば、他のdAb、小有機分子）を同定するのに使用することができる。ある実例では、IL-1のIL-1R1への結合を阻害する能力について試験すべき物質又は物質の集合は、競合的IL-1R1受容体結合アッセイ、例えば本明細書に記載の受容体結合アッセイでアッセイされる。そのようなアッセイではIL-1のIL-1R1への結合を阻害する物質は次に、同様の競合的IL-1R1受容体結合アッセイで試験して、IL-1R1に結合するがIL-1raのIL-1R1への結合を阻害しないdAb単量体と競合するかどうかを調べる。そのようなアッセイにおける競合的結合は、その物質がIL-1R1に結合し、その受容体へのIL-1の結合を阻害するが、その受容体へのIL-1raの結合を阻害しないことを示す。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは、IL-1R1に結合し、IL-1R1（例えばヒトIL-1R1）への結合について本明細書に開示のdAbのいずれかと競合する。いくつかの実施形態において、dAbは少なくともエラスターゼ及び／又はトリプシンに対して耐性である。
【０１２８】
別の実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbはIL-1R1への結合について抗IL-1R1 dAbと競合し、その際、抗IL-1R1 dAbは、配列番号1〜配列番号349よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
別の実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは、IL-1R1への結合について抗IL-1R1 dAbと競合し、その際、抗IL-1R1 dAbは、配列番号1又は配列番号2よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
別の実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは、IL-1R1への結合について抗IL-1R1 dAbと競合し、その際、抗IL-1R1 dAbは、配列番号3〜配列番号7よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
別の実施形態において、プロテアーゼ耐性dAbは、IL-1R1への結合について抗IL-1R1 dAbと競合し、その際、抗IL-1R1 dAbは、アミノ酸配列DOM4-130-54(配列番号7)を含むか、又はDOM4-130-54(配列番号7)と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
リガンドフォーマット
リガンド及びdAb単量体は、単一特異性もしくは多重特異性抗体もしくは抗体フラグメントとして形式化（format）されるか、又は単一特異性もしくは多重特異性非抗体構造体中に形式化される。適切なフォーマットには、抗体可変ドメイン又はそのCDRの1つ又はそれ以上が、構造体上の抗原に対する結合特異性を付与するように組む込むことができる、任意の適切なポリペプチド構造体などがある。種々の適切な抗体フォーマットが当該分野で公知であり、例えばIgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、Fv断片（例えば、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合Fv）、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片）、単一可変ドメイン（例えば、VH、VL、VHH）、dAb、及び前記のいずれかの改変型（例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）又は他の適当な重合体の共有結合により改変されたもの）などがある。PEG化単一可変ドメイン及びdAb単量体、これらを調製するための適切な方法、PEG化単一可変ドメイン、dAb単量体及び多量体のin vivo半減期の延長、適切なPEG、PEGの好適な流体力学的サイズ、並びにPEG化単一可変ドメイン、dAb単量体及び多量体の好適な流体力学的サイズに関しては米国を指定するPCT/GB03/002804（2003年6月30日出願）(WO 2004/081026)を参照されたい。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)の全教示（上記に関する部分を含む）は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
リガンドは、例えば（Gly4Ser)n（ここでn＝1〜8、例えば2、3、4、5、6、又は7である）のような適切なリンカーを使用して、所望のdAb単量体の二量体、三量体、又は重合体として形式化することができる。所望であれば、リガンド（dAb単量体、二量体、及び三量体を含む）は、抗体Fc領域（CH2及びCH3ドメインの1つまたは両方、及び場合によりヒンジ領域を含む）と結合することができる。例えば単一のヌクレオチド配列としてFc領域に結合したリガンドをコードするベクターを使用して、かかるポリペプチドを調製することができる。
【０１３４】
リガンド及びdAb単量体はまた、組合せて及び／又は非抗体マルチリガンド構造体中に形式化されて、標的分子に結合する多価複合体を形成することもでき、その結果、優れた結合力を備える。例えば天然の細菌受容体（例えばSpA）を、CDRグラフトのための足場として使用して、1つ又はそれ以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを作製することができる。この方法の詳細は、US5,831,012に記載されている。他の適切な足場には、フィブロネクチンやアフィボディに基づくものが挙げられる。適切な方法の詳細はWO 98/58965に記載されている。他の適切な足場には、van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310:591-601 (2001)に記載されるようなリポカリン及びCTLA4、WO 00/69907(Medical Research Council)に記載されるような足場などが挙げられ、これらは例えば、細菌のGroEL又は他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づく。タンパク質足場を組合せてもよい。例えばCDRをCTLA4足場にグラフトし、免疫グロブリンVH又はVLドメインと共に使用してリガンドを形成させてもよい。同様にフィブロネクチン、リポカリン、及び他の足場も組合せることができる。
【０１３５】
所望のフォーマットのいずれかを調製するための種々の適切な方法が当該分野で公知である。例えば抗体鎖及びフォーマット（例えば、IgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体）を、適切な発現構築物の発現により、及び／又は適切な細胞（例えば、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、フォーマットをコードする組換え構築物を含有する組換え宿主細胞）の培養により調製することができる。さらに、抗体又は抗体鎖の抗原結合フラグメント（例えば、Fv断片（例えば、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合したFv）、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片）などのフォーマットを、適切な発現構築物の発現により、又はパパイン若しくはペプシンを使用する抗体の酵素消化により調製することができる。
【０１３６】
リガンドは、例えばWO 03/002609（その全教示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、二重特異性リガンド又は多重特異性リガンドとして形式化することができる。二重特異性リガンドは、異なる結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。かかる二重特異性リガンドは、重鎖および軽鎖ドメインの組合せを含むことができる。例えば二重特異性リガンドは、VHドメイン及びVLドメインを含むことができ、これらはscFvの形態で一緒に結合（例えば、Gly4Serのような適切なリンカーを使用して）されるか、又は二重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、F(ab')2断片）中に形成されてもよい。二重特異性リガンドは、抗原又はエピトープに同時に機能的に結合する従来の二本鎖抗体抗原結合部位を形成する相補的VH/VL対を含まない。その代わりに、二重フォーマットリガンドは、VH/VL相補対を含み、その際、Vドメインは異なる結合特異性を有する。
【０１３７】
さらに、二重特異性リガンドは、所望であれば1つ又はそれ以上のCH又はCLドメインを含有してもよい。所望であればヒンジ領域ドメインも含まれ得る。ドメインのかかる組合せは、例えば天然の抗体、例えばIgG又はIgM、またはそのフラグメント、例えばFv、scFv、Fab、もしくはF(ab')2分子を模倣してもよい。他の構造体、例えばVH、VL、CHl、及びCLドメインを含むIgG分子の単一アームなど、が意図される。好ましくは、本発明の二重特異性リガンドは2つの可変ドメインのみを含むが、いくつかのそのようなリガンドが同じタンパク質中に一緒に組み込まれてもよく、例えば2つのそのようなリガンドはIgG又は多量体免疫グロブリン（例えばIgM）に組み込むことができる。あるいは、別の実施形態において、複数の二重特異性リガンドが組合わされて多量体を形成する。例えば2つの異なる二重特異性リガンドが組合わされて、4重特異性分子が作製される。本発明の方法に従って作製される二重特異性リガンドの軽鎖及び重鎖可変領域が同じポリペプチド鎖上に存在しても、又は異なるポリペプチド鎖上に存在してもよいことは、当業者に理解されるであろう。可変領域が異なるポリペプチド鎖上にある場合、これらはリンカー、一般的にはフレキシブルなリンカー（例えばポリペプチド鎖）、化学結合基、又は当該分野で公知の他の任意の方法により結合することができる。
【０１３８】
多重特異性リガンドは2以上のエピトープ結合特異性を有する。一般に、多重特異性リガンドは、2つまたはそれ以上のエピトープ結合ドメインを含み、そのようなdAb又は非抗体タンパク質ドメインは、エピトープの結合部位、例えばアフィボディ、SpAドメイン、LDL受容体クラスAドメイン、EGFドメイン、アビマーを含む。多重特異性リガンドはさらに本明細書に記載されるように構成することができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、リガンドはIgG様フォーマットである。かかるフォーマットはIgG分子の従来の4鎖構造（2つの重鎖と2つの軽鎖）を有し、ここで、1つ又はそれ以上の可変領域（VHとVL）は、所望の特異性のdAb又は単一可変ドメインで置換されている。好ましくは、各可変領域（2つのVH領域と2つのVL領域）は、dAb又は単一可変ドメインで置換される。IgG様フォーマット中に含まれるdAb又は単一可変ドメインは、同じ特異性又は異なる特異性を有することができる。いくつかの実施形態において、IgG様フォーマットは4価であり、1、2、3、又は4つの特異性を有することができる。例えば、IgG様フォーマットは単一特異的で、かつ同じ特異性を有する4つのdAbを含むことができ；二重特異性で、同じ特異性を有する3つのdAbと、異なる特異性を有する1つのdAbを含むことができ；二重特異性で、同じ特異性を有する2つのdAbと、共通であるが異なる特異性を有する2つのdAbを含むことができ；三重特異性で、同じ特異性を有する第1のdAbと第2のdAb、異なる特異性を有する第3のdAb、及び第1、第2、及び第3のdAbとは異なる特異性を有する第4のdAbを含むことができ；あるいは、4重特異性で、それぞれが異なる特異性を有する4つのdAbを含むことができる。IgG様フォーマットの抗原結合フラグメント（例えばFab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv）を調製することができる。好ましくは、IgG様フォーマット又はその抗原結合フラグメントはTNFR1を架橋しない。
【０１４０】
半減期延長型フォーマット
リガンド（例えばdAb単量体）は、そのin vivo血清半減期を延長するように形式化することができる。in vivoの半減期の延長は免疫グロブリン、特に抗体、特にサイズの小さい抗体フラグメント（例えばdAb）のin vivo用途に有用である。かかる断片（Fv、ジスルフィド結合型Fv、Fab、scFv、dAb）は身体から迅速に除去され、これが臨床用途を制限し得る。
【０１４１】
小リガンド（例えばdAb単量体）は、抗体のより大きな抗原結合フラグメントとして、又は抗体（例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとして形式化された）として形式化することができる。リガンド（例えばdAb単量体）は、抗体のより大きな抗原結合フラグメントとして、又はより大きな流体力学的サイズを有する抗体（例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとして形式化される）として形式化することができる。リガンドはまた、例えばポリアルキレングリコール基（例えばポリエチレングリコール（PEG）基、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、又は少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域の結合により、又は抗体ドメインへのコンジュゲートにより、より大きな流体力学的サイズを有するように形式化することができる。いくつかの実施形態では、リガンド（例えばdAb単量体）はPEG化される。好ましくは、PEG化リガンド（例えばdAb単量体）は、PEG化されていない同じリガンドと実質的に同じ親和性でIL-1R1に結合する。例えばリガンドは、IL-1R1に結合するPEG化dAb単量体であって、非PEG化形態のdAbの親和性とは約1000倍以下、好ましくは約100倍以下、さらに好ましくは約10倍以下だけ異なる親和性で、又は非PEG化形態と比較して実質的に変わらない親和性で、IL-1R1に結合するものであることができる。単一可変ドメイン及びdAbのPEG化、これらを調製するための適切な方法、PEG化単一可変ドメイン、dAb単量体及び多量体のin vivo半減期の延長、適切なPEG、PEGの好適な流体力学的サイズ、PEG化単一可変ドメイン、dAb単量体及び多量体の好適な流体力学的サイズについては、米国を指定するPCT/GB03/002804（2003年6月30日出願）(WO 2004/081026)を参照されたい。PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)の全教示（上記に関連する部分を含む）は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
本発明のリガンド（例えばdAb単量体及び多量体）の流体力学的サイズは、当該分野で公知の方法を使用して測定することができる。例えばリガンドの流体力学的サイズを測定するためにゲルろ過クロマトグラフィーを使用してもよい。リガンドの流体力学的サイズを測定するための適切なゲルろ過マトリクス（例えば架橋アガロースマトリクス）は、周知であり容易に入手できる。
【０１４３】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、dAb単量体に結合したPEG部分のサイズ）は、所望の用途により変化し得る。例えば、リガンドが循環流を離れて末梢組織に入ることが意図される場合、血流からの血管外遊出を促進するためにリガンドの流体力学的サイズを小さく維持することが好ましい。あるいは、リガンドを全身循環流中により長期間維持することが好ましい場合、リガンドのサイズは、例えばIg様タンパク質として形式化するか、又は30〜60kDaのPEG部分を付加（例えば、線状又は分岐PEG30〜40kDa PEG、例えば2つの20kDa PEG部分を付加）することにより、増加させることができる。
【０１４４】
リガンド（例えばdAb単量体）の流体力学的サイズ及びその血清半減期はまた、本明細書に記載のように、in vivoでの半減期を延長させる抗原又はエピトープに結合する結合ドメイン（例えば抗体又は抗体フラグメント）にリガンドをコンジュゲート又は結合することにより、増加させることができる。例えばリガンド（例えばdAb単量体）は、抗血清アルブミン若しくは抗新生児Fc受容体抗体又は抗体フラグメント、例えば抗SAもしくは抗新生児c受容体dAb、Fab、Fab'、又はscFvに、又は抗SAアフィボディもしくは抗新生児Fc受容体アフィボディに、コンジュゲート又は結合することができる。
【０１４５】
本発明のリガンドで使用するための適切なアルブミン、アルブミン断片、又はアルブミン変異体の例は、WO2005/077042A2（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。特に以下のアルブミン、アルブミン断片、又はアルブミン変異体が本発明で使用することができる：
・配列番号1（WO2005/077042A2に開示されているように、この配列は参照により明確に本明細書に組み込まれる）；
・WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸1-387を含むか又はこれらからなるアルブミン断片又は変異体；
・(a) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸54〜61；(b) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸76〜89；(c) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸92〜l00；(d) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸170〜176；(e) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸247〜252；(f) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸266〜277；(g) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸280〜288；(h) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸362〜368；(i) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸439〜447；(j) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸462〜475；(k) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸478〜486；及び(l) WO2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸560〜566、よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アルブミン又はその断片もしくは変異体。
【０１４６】
本発明のリガンドで使用するための適切なアルブミン、断片、及び類似体のさらなる例はWO 03/076567A2（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。特に以下のアルブミン、断片、又は変異体が本発明で使用することができる：
・WO 03/076567A2、例えば図3に記載のヒト血清アルブミン（この配列情報は参照により明確に本明細書に組み込まれる）；
・公式的な分子量66,500である585アミノ酸の単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（HA）（Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)参照）；
・Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)に記載されたアルブミンの多型変異体又は類似体若しくは断片；
・EP322094に記載のアルブミン断片又は変異体、例えばHA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)、及びHA(1-419)、及び1-369と1-419との間の断片；
・EP399666に記載のアルブミン断片又は変異体、例えばHA(1-177)及びHA(1-200)、及びHA(1-X)間の断片（ここでXは178〜199の任意の数である）。
【０１４７】
（1つ又はそれ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリン、及びこれらの断片及び類似体）が本発明のリガンドで使用される場合、これは任意の適切な方法、例えばIL-1R1結合部分（例えば抗IL-1R1 dAb又は抗体フラグメント）への直接的な融合によって、例えば融合タンパク質をコードする単一のヌクレオチド構築物を使用することによって（その際、融合タンパク質がIL-1R1結合部分のN末端又はC末端に位置する半減期延長部分を有する単一のポリペプチド鎖としてコードされる）、コンジュゲートすることができる。あるいはコンジュゲーションは、部分間でペプチドリンカー（例えばWO 03/076567A2又はWO 2004/003019に記載のペプチドリンカー）を使用することにより行うことができる（これらのリンカーの開示は、本発明で使用するための例を与えるために、本開示で参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１４８】
典型的には、in vivoでの血清半減期を高めるポリペプチドは、in vivoで天然に存在し、かつ不要な物質を生体（例えばヒト）から除去する内因性のメカニズムによる分解又は除去に抵抗するポリペプチドである。例えばin vivoでの血清半減期を高めるポリペプチドは、細胞外マトリクスからのタンパク質、血液中に存在するタンパク質、血液脳関門又は神経組織に存在するタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、又は骨に局在化しているタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、又はFc輸送に関与するタンパク質よりなる群から選択することができる。
【０１４９】
in vivoでの血清半減期を高める適切なポリペプチドには、例えばトランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬剤融合タンパク質（米国特許第5,977,307号を参照、この教示は参照により本明細書に組み込まれる）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様増殖因子1（IGF1）受容体、インスリン様増殖因子2（IGF2）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子X、α1-アンチトリプシン、及びHNF1αなどがある。血清半減期を高める適切なポリペプチドには、α-1グリコプロテイン（オロソムコイド；AAG）、α-1アンチキモトリプシン（ACT）、α-1マイクログロブリン（タンパク質HC；AIM）、アンチトロンビンIII（ATIII）、アポリポタンパク質A-1（Apo A-1）、アポリポタンパク質B（Apo B）、セルロプラスミン（Cp）、補体成分C3（C3）、補体成分C4（C4）、C1エステラーゼインヒビター（C1 INH）、C-反応性タンパク質（CRP）、フェリチン（FER）、ヘモペキシン（HPX）、リポタンパク質(a)（Lp(a)）、マンノース結合性タンパク質（MBP）、ミオグロビン（Myo）、プレアルブミン（トランスチレチン；PAL）、レチノール結合性タンパク質（RBP)、及びリウマチ因子（RF）などもある。
【０１５０】
細胞外マトリクスからの適切なタンパク質には、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリン、及びフィブロネクチンなどがある。コラーゲンは細胞外マトリクスの主要なタンパク質である。現在約15種類のコラーゲン分子が知られており、身体の異なる部分で発見されており、I型コラーゲン（身体コラーゲンの約90％を占める）は骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓に存在し、II型コラーゲンは、軟骨、椎間板、脊索、及び目の硝子体液に存在する。
【０１５１】
血液からの適切なタンパク質には、例えば血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB）、血清アミロイドタンパク質A、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、子宮グロブリン（uteroglobulin)、及びβ2マイクログロブリン）、酵素及び酵素インヒビター（例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1-アンチトリプシン、及び膵臓トリプシンインヒビター）、免疫系のタンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質（例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合性タンパク質、α-1マイクログロブリン）、デフェンシン（例えば、β-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、好中球デフェンシン2、及び好中球デフェンシン3）などがある。
【０１５２】
血液脳関門又は神経組織に存在する適切なタンパク質には、例えばメラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体などがある。
【０１５３】
in vivoでの血清半減期を高める適切なポリペプチドには、腎臓に局在化するタンパク質（例えば、ポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオン輸送体K1、ハイマンの抗原）、肝臓に局在化するタンパク質（例えば、アルコール脱水素酵素、G250）、肺に局在化するタンパク質（例えば、IgAに結合する分泌成分）、心臓に局在化するタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関与するHSP27）、皮膚に局在化するタンパク質（例えばケラチン）、骨特異的タンパク質、例えば形態形成タンパク質（BMP）（これは、骨形成活性を示すトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのタンパク質のサブセットである（例えばBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8））、腫瘍特異的タンパク質（例えば、トロホブラスト抗原、ヘルセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、肝臓と脾臓に存在し得るカテプシンB））などがある。
【０１５４】
適切な疾患特異的タンパク質には、例えば活性化T細胞でのみ発現される抗原（LAG-3（リンパ球活性化遺伝子）を含む）、オステオプロテゲリンリガンド（OPGL；Nature 402, 304-309 (1999)参照）、OX40（TNF受容体ファミリーのメンバー（活性化T細胞で発現され、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）産生細胞で特異的にアップレギュレートされる）；Immunol. 165 (1):263-70 (2000)参照）。適切な疾患特異的タンパク質はまた、メタロプロテアーゼ（関節炎／癌に関連する）、例えばCG6512キイロショウジョウバエ（Drosophila）、ヒトパラプレギン（paraplegin）、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、ミューリンftsH；及び血管新生増殖因子、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（FGF-1）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（VEGF/VPF）、トランスフォーミング増殖因子-α（TGFα）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、アンギオゲニン、インターロイキン-3（IL−3）、インターロイキン-8（IL-8）、血小板由来内皮細胞増殖因子（PD-ECGF）、胎盤成長因子（P1GF）、ミドカイン血小板由来増殖因子-BB（PDGF)、及びフラクタカインなどがある。
【０１５５】
in vivoでの血清半減期を高める適切なポリペプチドにはまた、ストレスタンパク質、例えば熱ショックタンパク質（HSP）などがある。HSPは通常細胞内に存在する。これらが細胞外で見つかるとき、細胞が死滅してその内容物を洩れたことを示している。外傷、疾患、又は損傷の結果として、この非プログラム化細胞死（壊死）が起き、細胞外HSPは免疫系からの応答を開始させる。細胞外HSPへの結合は、疾患部位への本発明の組成物の局在化を引き起こすことができる。
【０１５６】
Fc輸送に関与する適切なタンパク質には、例えばBrambell受容体（FcRBとしても知られている）などがある。このFc受容体は2つの機能を有し、その両方が送達に潜在的に有用である。その機能は、（1）胎盤を介した母から子へのIgGの輸送、（2）分解からIgGを保護することでその血清半減期を延長すること、である。受容体はエンドソームからIgGを再生利用すると考えられている（Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)参照）。
【０１５７】
薬物動態学的分析法とリガンド半減期の測定法は、当業者に公知である。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists、及びPeters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)中でみることができる。また「Pharmacokinetics」M Gibaldi & D Perron（Marcel Dekkerにより刊行）、2nd Rev. ex edition (1982)（これはtα及びtβ半減期、並びに濃度曲線下面積などの薬物動態学的パラメーターを記載する）も参照されたい。
【０１５８】
核酸分子、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗IL-1R1リガンド及びdAb単量体（二重特異性リガンド（例えばIL-1R1及び血清アルブミンに結合するリガンド；IL-1R1及びTNFR1に結合するリガンド)、及び多重特異性リガンド（IL-1R1、血清アルブミン、及びTNFR1に結合するリガンド）を含む）をコードする単離された及び／又は組換え核酸分子を提供する。本発明はまた、プロテアーゼ（例えばペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、カテプシン（例えばカテプシンG)、及びプロテイナーゼ3）耐性dAb単量体、又は本明細書に記載されるようなプロテアーゼ耐性dAb単量体を含むリガンド、をコードする単離された及び／又は組換え核酸分子を提供する。
【０１５９】
特定の実施形態において、単離された及び／又は組換え核酸は、IL-1R1に特異的に結合し、IL-1（例えば、IL-1α及び／又はIL-1β）及びIL-1raのIL-1R1への結合を阻害し、かつDOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、及びDOM4-122-73(配列番号165)よりなる群から選択されるアミノ酸配列又はdAbと、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含むドメイン抗体（dAb）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
特定の実施形態において、単離された及び／又は組換え核酸は、IL-1R1に特異的に結合し、その受容体へのIL-1の結合を阻害するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで該ヌクレオチド配列は、DOM4-122-23(配列番号1)、DOM4-122-24(配列番号2)、DOM4-122(配列番号95)、DOM4-122-1(配列番号96)、DOM4-122-2(配列番号97)、DOM4-122-3(配列番号98)、DOM4-122-4(配列番号99)、DOM4-122-5(配列番号100)、DOM4-122-6(配列番号101)、DOM4-122-7(配列番号102)、DOM4-122-8(配列番号103)、DOM4-122-9(配列番号104)、DOM4-122-10(配列番号105)、DOM4-122-11(配列番号106)、DOM4-122-12(配列番号107)、DOM4-122-13(配列番号108)、DOM4-122-14(配列番号109)、DOM4-122-15(配列番号110)、DOM4-122-16(配列番号111)、DOM4-122-17(配列番号112)、DOM4-122-18(配列番号113)、DOM4-122-19(配列番号114)、DOM4-122-20(配列番号115)、DOM4-122-21(配列番号116)、DOM4-122-22(配列番号117)、DOM4-122-25(配列番号118)、DOM4-122-26(配列番号119)、DOM4-122-27(配列番号120)、DOM4-122-28(配列番号121)、DOM4-122-29(配列番号122)、DOM4-122-30(配列番号123)、DOM4-122-31(配列番号124)、DOM4-122-32(配列番号125)、DOM4-122-33(配列番号126)、DOM4-122-34(配列番号127)、DOM4-122-35(配列番号128)、DOM4-122-36(配列番号129)、DOM4-122-37(配列番号130)、DOM4-122-38(配列番号131)、DOM4-122-39(配列番号132)、DOM4-122-40(配列番号133)、DOM4-122-41(配列番号134)、DOM4-122-42(配列番号135)、DOM4-122-43(配列番号136)、DOM4-122-44(配列番号137)、DOM4-122-45(配列番号138)、DOM4-122-46(配列番号139)、DOM4-122-47(配列番号140)、DOM4-122-48(配列番号141)、DOM4-122-49(配列番号142)、DOM4-122-50(配列番号143)、DOM4-122-51(配列番号144)、DOM4-122-52(配列番号145)、DOM4-122-54(配列番号146)、DOM4-122-55(配列番号147)、DOM4-122-56(配列番号148)、DOM4-122-57(配列番号149)、DOM4-122-58(配列番号150)、DOM4-122-59(配列番号151)、DOM4-122-60(配列番号152)、DOM4-122-61(配列番号153)、DOM4-122-62(配列番号154)、DOM4-122-63(配列番号155)、DOM4-122-64(配列番号156)、DOM4-122-65(配列番号157)、DOM4-122-66(配列番号158)、DOM4-122-67(配列番号159)、DOM4-122-68(配列番号160)、DOM4-122-69(配列番号161)、DOM4-122-70(配列番号162)、DOM4-122-71(配列番号163)、DOM4-122-72(配列番号164)、及びDOM4-122-73(配列番号165)よりなる群から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％のヌクレオチド配列同一性を有する。
【０１６１】
別の実施形態において、単離された及び／又は組換え核酸は、本明細書に記載のプロテアーゼ（例えばペプシン、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、カテプシン（例えばカテプシンG)、及びプロテイナーゼ3）耐性dAbをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６２】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態において、ベクターは、本発明の組換え核酸に機能的に結合した1つ又はそれ以上の発現制御要素又は配列を含む発現ベクターである。本発明はまた、本発明の組換え核酸分子又はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。適切なベクター（例えば、プラスミド、ファジミド）、発現制御要素、宿主細胞、及び本発明の組換え宿主細胞を作製するための方法は当該分野で周知であり、その例は本明細書でさらに記載される。
【０１６３】
適切な発現ベクターは、多くの成分、例えば複製起点、選択マーカー遺伝子、1つ又はそれ以上の発現制御要素、例えば転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター)、及び／又は1つ又はそれ以上の翻訳シグナル、シグナル配列又はリーダー配列などを含むことができる。発現制御要素及びシグナル配列は、存在する場合は、ベクター又は他の供給源により提供することができる。例えば、抗体鎖をコードするクローンニング核酸の転写及び／又は翻訳制御配列を使用して発現を指令することができる。
【０１６４】
所望の宿主細胞で発現するためにプロモーターを備えることができる。プロモーターは構成性又は誘導性であることができる。例えばプロモーターは、抗体、抗体鎖又はその一部分をコードする核酸の転写を指令するように、該核酸に機能的に結合することができる。原核生物宿主（例えば、大腸菌（E. coli）用のlac、tac、T3、T7プロモーター）及び真核生物宿主（例えば、シミアンウイルス40早期又は後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）用の種々の適切なプロモーターが入手可能である。
【０１６５】
さらに発現ベクターは、典型的には、ベクターを保持する宿主細胞の選択のための選択マーカー、及び複製可能な発現ベクターの場合は、複製起点を含む。抗生物質又は薬剤耐性を付与する産生物をコードする遺伝子は一般的な選択マーカーであり、原核細胞（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性のためのTet遺伝子)、及び真核細胞（例えば、ネオマイシン（G418又はゲネチシン）、gpt（ミコフェノール酸）、アンピシリン、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）で使用することができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、種々の宿主でメソトレキセートを用いる選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、LEU2、URA3、HIS3）はしばしば酵母の選択マーカーとして使用される。ウイルスベクター（例えばバキュロウイルス）又はファージベクター、及び宿主細胞のゲノムに組み込むことができるベクター（例えばレトロウイルスベクター）もまた意図される。哺乳動物細胞、原核細胞（大腸菌（E. coli））、昆虫細胞（キイロショウジョウバエ（Drosophila）Schnieder S2細胞、Sf9)、及び酵母（P.メタノリカ（P.methanolica）、P.パストリス（P. pastoris）、S.セレビッシェ（S. cerevisiae））における発現に適切な発現ベクターは当該分野で周知である。
【０１６６】
適切な宿主細胞は原核生物であってもよく、細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis)、及び／又は他の適切な細菌；真核細胞、例えば真菌又は酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス・エスピー（Aspergillus. sp）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa））、又は他の下等な真核生物細胞、及び高等真核細胞、例えば昆虫由来（例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila）Schnieder S2細胞、Sf9昆虫細胞（WO94／26087（O'Connor））、哺乳動物由来（例えば、COS細胞、例えばCOS-1（ATCC受託番号CRL-1650）及びCOS-7（ATCC受託番号CRL-1651）、CHO（例えばATCC受託番号CRL-9096、CHO DG44（Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)））、293(ATCC受託番号CRL-1573）、HeLa（ATCC受託番号CCL-2）、CV1（ATCC受託番号CCL-70）、WOP（Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985)、3T3、293T(Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)）、NS0細胞、SP2/0、HuT 78細胞など）、又は植物由来（例えばタバコ）のものなどがある（例えばAusubel, F.M. et al.編. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)参照）。いくつかの実施形態において、宿主細胞は単離された宿主細胞であり、多細胞生物（例えば植物又は動物）の一部ではない。好適な実施形態において、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。
【０１６７】
本発明はまた、本発明のリガンド（例えば、dAb単量体、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド）の製造法であって、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を、該組換え核酸の発現に適した条件下で維持することにより、組換え核酸が発現され、リガンドが製造されることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、リガンドを単離することをさらに含む。
【０１６８】
免疫グロブリンベースのリガンドの調製
本発明のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、dAb単量体）は、scFv、「ファージ」抗体、及び他の操作された抗体分子の調製のために抗体操作の分野で一般に使用される、すでに確立された技術に従って調製することができる。抗体の調製技術は、例えば以下の総説とそこで引用された文献に記載されている：Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol.12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45,128-130。
【０１６９】
所望の特異性を有する抗体可変ドメインの選択のために使用される適切な技術は、当該分野で公知のライブラリー及び選択手法を使用する。ヒトB細胞から回収された再構成V遺伝子を使用する天然のライブラリー（Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309）は当業者に周知である。合成ライブラリー（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97）は、通常はPCRを使用して、免疫グロブリンV遺伝子をクローニングすることにより調製される。PCR工程のエラーにより、高度のランダム化が生じ得る。VH及び／又はVLライブラリーは、標的抗原又はエピトープに対して別々に選択することができ、この場合、単一のドメイン結合が直接選択されるか又は一緒に選択される。
【０１７０】
ライブラリーベクター系
種々の選択系が当該分野で公知であり、本発明での使用に適している。かかる系の例は後述される。
【０１７１】
バクテリオファージλ発現系をバクテリオファージプラークとして又は溶原菌のコロニーとして直接スクリーニングすることもできる。これはいずれも既に記載されており（Huse et al. (1989) Science, 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 2432）、本発明で使用される。かかる発現系は106個までの異なるライブラリーメンバーをスクリーニングするのに使用することができるが、これより大きな数（106個のメンバーを超える）をスクリーニングするのにあまり適していない。ライブラリーの構築において特に有用なのは選択提示系であり、これは、ポリペプチドと結合された核酸の発現を可能にする。本明細書で使用する選択提示系は、適当な提示手段により、一般的な及び／又は標的のリガンドの結合によるライブラリーの個々のメンバーの選択を可能にする系である。
【０１７２】
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは、ファージ提示技術に代表されるように、当該分野で公知である。多様なペプチド配列が線状バクテリオファージの表面上に提示される（Scott and Smith (1990) Science, 249: 386）そのような系は、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのin vitro選択と増幅のために、抗体フラグメント（及びこれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有用であることが証明されている（McCafferty et al., WO92/01047）。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、リーダーシグナルを大腸菌（E. coli）のペリプラズム間隙に導くリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、その結果、生じた抗体フラグメントは、典型的にはバクテリオファージ被覆タンパク質（例えばpIII又はpVIII）との融合体としてバクテリオファージの表面上に提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージカプシドの外側で提示される（ファージボディ）。ファージベースの提示系の利点は、これらが生物学的系であるため、選択されたライブラリーメンバーを、細菌細胞において選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを単に増殖させることにより増幅できることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列はファージ又はファジミドベクターに含有されるため、配列決定、発現、及び以後の遺伝子操作が比較的簡便である。
【０１７３】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリー及びλファージ発現ライブラリーの構築法は当該分野で周知である（McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) 前掲; Barbas et al. (1992) 前掲; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７４】
特に有利なアプローチの１つは、scFvファージライブラリーの使用である（Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) 前掲; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267）。バクテリオファージ被覆タンパク質上に提示されるscFvライブラリーの種々の実施形態が記載されてきた。ファージ提示アプローチの改良も公知であり、例えばWO96/06213及びWO92/01047(Medical Research Council et al.)及びWO97/08320(Morphosys)（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１７５】
ポリペプチドのライブラリーを作製するための他の系は、ライブラリーメンバーのin vitro合成のために無細胞酵素機器の使用を含む。ある方法においては、RNA分子は、標的リガンドに対する選択とPCR増幅を交互ラウンドにより選択される（Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818）。あらかじめ決められたヒト転写因子に結合するDNA配列を同定するために、同様の技術が使用できる（Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258及びWO92/14843）。同様に、大きなライブラリーを作製するための方法として、in vitro翻訳を使用してポリペプチドを合成することができる。一般的に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、さらにWO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058及びWO92/02536に記載されている。例えばWO95/22625やWO95/11922 (Affymax)に開示されるようなファージベースではない別の提示系は、選択のためにポリソームを使用してポリペプチドを提示する。
【０１７６】
さらに別のカテゴリーの技術は、人工コンパートメントのレパートリーの選択を含み、これは遺伝子とその遺伝子産物とを関連付けることを可能にする。例えば、所望の遺伝子産物をコードする核酸を油中水エマルジョンにより形成されるマイクロカプセル中で選択し得る選択系が、WO99/02671、WO00/40712及びTawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子要素はマイクロカプセル中にコンパートメント化され、次に転写及び／又は翻訳されて、マイクロカプセル内で各遺伝子産物（RNA又はタンパク質）が産生される。次に、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子要素が分類される。このアプローチは、種々の手段により所望の活性を検出することで目的の遺伝子産物を選択する。
【０１７７】
ライブラリー構築
選択を目的としたライブラリーは、例えば上記の当該分野で公知の方法を使用して構築してもよいし、又は市販品を購入してもよい。本発明で有用なライブラリーは、例えばWO99/20749に記載されている。いったんベクターが選択され、目的のポリペプチドをコードする1つ又はそれ以上の核酸配列がライブラリーベクターにクローニングされると、発現前に突然変異誘発を行うことで、クローニング分子内に多様性を生じさせることができる；あるいは、コードタンパク質は上記のように発現及び選択することができ、その後、突然変異誘発及び追加の選択ラウンドが行われる。構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異誘発は、標準的な分子的方法によって行われる。特に有用なのは、ポリメラーゼ連鎖反応又はPCRである（Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335、参照により本明細書に組み込まれる）。目的の標的配列を増幅するために、熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼにより触媒されるDNA複製の複数サイクルを使用するPCRは、当該分野で周知である。種々の抗体ライブラリーの構築物はWinter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55、及びそこで引用された文献で考察されている。
【０１７８】
PCRは鋳型DNA（少なくとも1fg；1〜1000ngであることがさらに有用）と少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる；プライマープールが極めて不均一であるとき、各配列は該プールのほんのわずかな画分でしか存在せず、後の増幅サイクルで量が制限的になるため、多量のプライマーを使用することが有利でり得る。典型的な反応混合物は以下を含む：2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10 X PCRバッファー1（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、0.4μlの1.25μM dNTP、0.15μl（又は2.5ユニット）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA)、及び総量を25μlにする脱イオン水。鉱油を重層し、プログラム可能サーマルサイクラーを使用してPCRを行う。PCRサイクルの各工程の長さと温度、ならびにサイクル数は、実際にはストリンジェンシー条件に従って調整される。アニーリング温度とその時間調整は、プライマーが鋳型にアニーリングすると予測される効率と許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される；明らかに、核酸分子を同時に増幅し、突然変異誘発するとき、少なくとも最初の合成ラウンドでミスマッチが必要である。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、十分に、適度な知識を有する当業者の知識の範囲内である。30℃〜72℃のアニーリング温度が使用される。鋳型分子の最初の変性は、通常92℃〜99℃で4分間行われ、次に変性（94〜99℃で15秒間〜1分間）、アニーリング（上記で決定される温度；1〜2分間)、及び伸長（増幅産物の長さに依存して、72℃で1〜5分間）からなる20〜40サイクルが行われる。最後の伸長は通常、72℃で4分間行い、その後、4℃で不定の（0〜24時間）工程を行ってもよい。
【０１７９】
単一可変ドメインの組合せ
本発明で有用な免疫グロブリン可変ドメインは、選択された時点で、当該分野で公知の種々の方法（共有結合法及び非共有結合法を含む）により組合せることができる。好適な方法は、例えばscFv分子の関連で記載されるような、ポリペプチドリンカーの使用を含む（Bird et al., (1988) Science 242:423-426）。適切なリンカーの考察は、Bird et al. Science 242, 423-426; Hudson et al , Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883に記載されている。リンカーは好ましくはフレキシブルであり、2つの単一のドメインが相互作用することを可能にするものである。リンカーの一例は(Gly4Ser)nリンカーである（ここでn=1〜8、例えば1、2、3、4、5、6、7、又は8である）。あまりフレキシブルではないダイアボディで使用されるリンカーも使用することができる（Holliger et al., (1993) Proc Nat Acad Sci (USA) 90:6444-6448）。ある実施形態において、使用されるリンカーは免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
【０１８０】
リンカー以外の方法を使用して、可変ドメインを組合せてもよい。例えば、天然に存在するか又は操作されたシステイン残基を介して提供されるジスルフィド架橋を使用してVH-VH,VL-VL又はVH-VL二量体を安定化させることができるし（Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704）、又は可変ドメイン間の境界面をリモデリングして「かみ合わせ（fit）」を改善することにより、相互作用を安定化してもよい（Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788）。免疫グロブリンの可変ドメイン（特に抗体VHドメイン）を結合又は安定化する他の技術も、適宜使用し得る。
【０１８１】
リガンドの性状解析
リガンド（例えば、dAb単量体、二重特異性リガンド）のその特異的抗原又はエピトープへの結合は、当業者に公知の方法（ELISAを含む）により試験できる。本発明の好適な実施形態において、結合はモノクローナルファージELISAを使用して試験される。ファージELISAは、任意の適切な方法に従って行うことができる。例示的なプロトコールを後述する。
【０１８２】
各ラウンドの選択で産生されるファージの集団を、ELISAにより、選択した抗原又はエピトープへの結合についてスクリーニングして、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定することができる。次に、これらの集団からの感染した単一の細菌コロニーに由来するファージをELISAによりスクリーニングして、「モノクローナル」ファージ抗体を同定することができる。また抗原又はエピトープへの結合について可溶性抗体フラグメントをスクリーニングすることが好ましく、これは、例えばC末端又はN末端タグに対する試薬を使用してELISAにより行うこともできる（例えばWinter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55、及びそこで引用された文献を参照）。
【０１８３】
選択されたファージモノクローナル抗体の多様性はまた、PCR産物のゲル電気泳動（Marks et al. 1991、前述; Nissim et al. 1994 前述)、プローブ結合（Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776）、又はベクターDNAの配列決定により評価することができる。
【０１８４】
リガンドの構造
免疫グロブリン可変ドメインが例えば本明細書に記載のファージ提示技術を使用してV遺伝子レパートリーから選択される場合、これらの可変ドメインは、これらが本明細書で規定されるような具体的な一般的リガンドにより認識され得るように、ユニバーサルフレームワーク領域を含む。ユニバーサルフレームワーク、一般的リガンドなどの使用はWO99/20749に記載されている。
【０１８５】
V遺伝子レパートリーが使用される場合、ポリペプチド配列のバリエーションは好ましくは可変ドメインの構造ループ内に位置する。いずれかの可変ドメインのポリペプチド配列はDNAシャフリング又は突然変異により変更して、各可変ドメインとその相補対との相互作用を増強してもよい。DNAシャフリングは当該分野で公知であり、例えばStemmer, 1994, Nature 370: 389-391及び米国特許第6,297,053号（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）により教示されている。他の突然変異誘発法は、当業者に周知である。
【０１８６】
一般に、リガンドの選択、調製、及び形式化（formatting）に必要な核酸分子及びベクター構築物は、標準的な実験室マニュアル、例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAなどに記載のように、構築し、操作することができる。
【０１８７】
本発明において有用な核酸の操作は、典型的には組換えベクターで行われる。本明細書で使用されるように、ベクターは、その発現及び／又は複製のために細胞中に異種DNAを導入するのに使用される別個の要素を指す。かかるベクターを選択し又は構築し、そして使用する方法は当業者に周知である。無数のベクターが公共的に入手可能であり、細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工的染色体、及びエピソームベクターなどがある。かかるベクターは、単純なクローニングと突然変異誘発のために使用してもよいし、あるいは遺伝子発現ベクターが使用される。本発明に従って使用するベクターは、所望のサイズ、典型的には0.25キロベース（kb）〜40kb又はそれ以上の長さのポリペプチドコード配列を収容するために選択することができる。in vitroクローニング操作後に、適切な宿主細胞がこのベクターで形質転換される。各ベクターは種々の機能成分を含有し、これは一般にクローニング（又は「ポリリンカー」）部位、複製起点、及び少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含む。所与のベクターが発現ベクターである場合、これはさらに以下の1つ又はそれ以上を含有する：エンハンサー要素、プロモーター、転写停止及びシグナル配列（これらは本発明のリガンドをコードする遺伝子に機能的に連結されるように、それぞれクローニング部位の近傍に位置する）。
【０１８８】
クローニングベクター及び発現ベクターはいずれも、一般に、ベクターが1つ又はそれ以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にするように核酸配列を含有する。典型的にはクローニングベクターにおいて、この配列は、宿主の染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製起点又は自立的複製配列を含む。かかる配列は、種々の細菌、酵母、及びウイルスについて周知である。プラスミドpBR322からの複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、2ミクロンプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルスの起点（例えば、SV40、アデノウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点は、これらが高レベルのDNAを複製することができる哺乳動物細胞（例えばCOS細胞）で使用される限り、哺乳動物発現ベクターにとって必要ではない。
【０１８９】
クローニングベクター又は発現ベクターは、選択マーカーとも呼ぶ選択遺伝子を含有することが有利であるかもしれない。この遺伝子は、選択培養培地で増殖される形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。従って、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存できないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質や他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メソトレキセート、又はテトラサイクリン）に対する耐性を付与し、栄養要求性欠陥を補足し、又は増殖培地中で利用可能でない重要な栄養物質を供給するタンパク質をコードする。
【０１９０】
本発明のリガンドをコードするベクターの複製は、大腸菌（E. coli）中で行うことが最も便利なため、大腸菌（E. coli）選択マーカー、例えば抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が有用である。これらは大腸菌（E. coli）プラスミド、例えばpBR322、又はpUCプラスミド（例えばpUC18又はpUC19）から得ることができる。
【０１９１】
発現ベクターは通常、宿主生物により認識され、かつ目的のコード配列に機能的に結合したプロモーターを含有する。かかるプロモーターは誘導性でも構成性でもよい。用語「機能的に結合した」は、記載の成分がそれらの意図する様式で機能することを可能にする関係にある並列状態を指す。コード配列に「機能的に結合した」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が行われるように連結される。
【０１９２】
原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、例えばβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター（例えばtacプロモーター）などがある。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、一般に、コード配列に機能的に結合したシャイン‐ダルガルノ配列を含有する。
【０１９３】
好適なベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。すなわち、第1及び／又は第2の抗原又はエピトープによる選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一のクローンの個々の増殖及び発現により、又は任意の選択提示系の使用により行うことができる。上記したように、好適な選択提示系はバクテリオファージ提示である。したがって、ファージ又はファジミドベクター、例えばpIT1又はpIT2を使用してもよい。本発明に有用なリーダー配列として、pelB、stII、ompA、phoA、bla及びpelAなどが挙げられる。1つの例は、大腸菌（E. coli）複製起点（二本鎖複製用）及びさらにファージ複製起点（一本鎖DNAの産生用）を有するファジミドベクターである。かかるベクターの操作と発現は当該分野で周知である（Hoogenboom and Winter (1992) 前述; Nissim et al. (1994) 、前述）。簡単に説明すると、ベクターは、ファジミドに選択性を付与するためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、pelBリーダー配列（これは発現されたポリペプチドをペリプラズム間隙に導く）からなる（N末端からC末端）発現カセットの上流のlacプロモーター、マルチプルクローニング部位（ライブラリーメンバーのヌクレオチド型のクローニング用）、場合により、1つ又はそれ以上のペプチドタグ（検出用）、場合により、1つ又はそれ以上のTAG終始コドン、及びファージタンパク質pIIIを含有する。したがって、大腸菌（E. coli）のサプレッサー及び非サプレッサー株を使用し、かつグルコース、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（IPTG）又はヘルパーファージ（例えばVCS M13）の添加により、ベクターは、発現しないプラスミドとして複製し、多量のポリペプチドライブラリーメンバーのみを産生し、又はファージ（その一部はポリペプチド-pIII融合物の少なくとも1コピーをその表面に含有する）を産生することができる。
【０１９４】
本発明のリガンドをコードするベクターの構築は、従来のライゲーション技術を使用する。単離されたベクター又はDNA断片は、必要なベクターを作製するのに好ましい形態で、切断、調整、及び再結合される。所望であれば、構築されたベクター中に正しい配列が存在することを確認するための分析を公知の様式で行うことができる。発現ベクターを構築し、in vitroで転写産物を調製し、宿主細胞へDNAを導入し、発現及び機能評価のための分析を実施するための適切な方法は、当業者に公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在が検出されるか、又はその増幅及び／又は発現が従来法（例えば、サザン又はノーザン分析、ウエスタンブロッティング、DNA、RNA若しくはタンパク質のドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、免疫細胞化学、又は核酸若しくはタンパク質分子の配列分析）により定量される。当業者は、これらの方法が所望であれば改変できることを容易に理解するであろう。
【０１９５】
骨格
骨格は、上記のように、免疫グロブリン分子に基づくものでも、又は非免疫グロブリン起源でもよい。本明細書で定義されるように、好適な免疫グロブリン骨格は、以下から選択される任意の1つ又はそれ以上を含む：少なくとも(i)抗体のCL（κ又はλサブクラス）ドメイン；又は(ii)抗体重鎖のCH1ドメイン、を含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1ドメインとCH2ドメインとを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1ドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む免疫グロブリン分子；又は(ii)抗体のCL（κ又はλサブクラス）ドメインと組合せた任意のサブセット。ヒンジ領域ドメインを含めてもよい。かかるドメインの組合せは、例えば、天然の抗体（例えばIgG又はIgM）またはそのフラグメント（例えばFv、scFv、Fab、又はF(ab')2分子）を模倣する。当業者は、このリストが網羅的であることを意図しないことを理解するであろう。
【０１９６】
タンパク質足場
各エピトープ結合ドメインは、タンパク質足場と、1つ又はそれ以上のCDR（これはドメインと1つ又はそれ以上のエピトープとの特異的相互作用に関与する）とを含む。本発明のエピトープ結合ドメインが3つのCDRを含むことが有利である。適切なタンパク質足場には、以下よりなる群から選択されるもののいずれかが含まれる：免疫グロブリンドメインに基づくもの、フィブロネクチンに基づくもの、アフィボディに基づくもの、CTLA4に基づくもの、GroELのようなシャペロンに基づくもの、リポカリンに基づくもの、及び細菌Fc受容体SpA及びSpDに基づくもの。当業者は、この列挙が網羅的であることを意図するものではないことを理解するであろう。
【０１９７】
リガンドの構築に使用するための足場
主鎖コンフォメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、そのポリペプチド鎖について類似の折り畳みを共有する。例えば、抗体はその1次配列が非常に多様であるが、配列と結晶構造の比較は、予測とは反対に、抗体の6つの抗原結合ループのうちの5つ（H1、H2、L1、L2、L3）が限定された数の主鎖コンフォメーション、又は基準構造を採用していることを明らかにした（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877）。従って、ループの長さと主要な残基の分析は、ヒト抗体の大部分に存在するH1、H2、L1、L2、及びL3の主鎖コンフォメーションの予測を可能にした（Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220）。H3領域は、配列、長さ、及び構造がさらにより多様である（Dセグメントの使用に起因する）が、これもまた、短いループ長さについて限定された数の主鎖コンフォメーションを形成し、これはループ及び抗体フレームワークにおける主要な位置での、特定の残基の長さ及び存在、又は残基の種類に依存する（Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1）。
【０１９８】
メンバーの主鎖コンフォメーションが既知であることを保証するために、特定のループ長と主要残基が選択されたリガンド及び／又はドメインのライブラリーを設計することができる。これらは、上記したように、これらが非機能性である確率を最小にするために、天然に存在する免疫グロブリンスーパーファミリー分子の実際のコンフォメーションであることが有利である。生殖細胞系V遺伝子セグメントは、抗体又はT細胞受容体ライブラリーを構築するための1つの適切な基本的フレームワークとして機能し；他の配列も有用である。変化が低頻度で生じることがあり、その結果として、機能的メンバーの少数が変化した主鎖コンフォメーションを保持することがあり、これはその機能に影響を与えない。
【０１９９】
基準構造理論はまた、リガンドによりコードされる異なる主鎖コンフォメーションの数を評価するために、リガンド配列に基づいて主鎖コンフォメーションを予測するために、及び基準構造に影響を与えない多様性の残基を選択するために、有用である。ヒトVκドメインでは、L1ループが4つの基準構造の1つを採り、L2ループが1つの基準構造を有し、ヒトVκドメインの90％がL3ループについて4つ又は5つの基準構造の1つを採ることは公知である（Tomlinson et al. (1995)、前述）。すなわち、Vκドメインのみにおいて、異なる基準構造が組合されて、様々なの異なる主鎖コンフォメーションを生成することができる。VλドメインがL1、L2、及びL3ループについて異なる範囲の基準構造をコードし、Vκ及びVλドメインがH1及びH2ループについていくつかの基準構造をコードすることができる任意のVHドメインと対になることができる場合、これらの5つのループについて観察される基準構造の組合せの数は膨大になる。これは、主鎖コンフォメーション中の多様性の生成が、広範囲の結合特異性の発生に必須であり得ることを意味する。しかし、単一の既知の主鎖コンフォメーションに基づいて抗体ライブラリーを構築することにより、予測に反して、実質的にすべての抗原を標的とするのに十分な多様性を生成するのに、主鎖コンフォメーション中の多様性は必要ないことがわかった。さらに驚くべきことに、単一の主鎖コンフォメーションはコンセンサス構造である必要は無く、単一の天然に存在するコンフォメーションは全ライブラリーの基礎として使用できる。すなわち、好適な態様において、本発明の二重特異性リガンドは単一の既知の主鎖コンフォメーションを有する。
【０２００】
選択される単一の主鎖コンフォメーションは、好ましくは、問題の免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子の中で一般的なものである。かなり多数の天然に存在する分子がそれを採用していることが観察されるとき、コンフォメーションは一般的である。従って、本発明の好適な態様において、免疫グロブリンドメインの各結合ループに関し、異なる主鎖コンフォメーションの天然発生は別々に考慮され、従って、異なるループについて主鎖コンフォメーションの所望の組合せを有する天然に存在する可変ドメインが選択される。利用できるものが無い場合は、最も近い同等物を選択することができる。異なるループについての主鎖コンフォメーションの所望の組合せが、所望の主鎖コンフォメーションをコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより作製されることが好ましい。選択された生殖細胞系遺伝子セグメントが実際に頻繁に発現されていることがより好ましく、これらが天然の全ての生殖細胞系遺伝子セグメントで最も頻繁に発現されていることが最も好ましい。
【０２０１】
リガンド（例えばdAb）又はそのライブラリーを設計する際、6つの抗原結合ループのそれぞれについて異なる主鎖コンフォメーションの発生率が別々に考慮される。H1、H2、L1、L2、及びL3について、天然に存在する分子の抗原結合ループの20％〜100％により採用される所与のコンフォメーションが選択される。典型的には、その観察される発生率は、35％を超え（すなわち、35％〜100％）、理想的には、50％を超え、さらに65％を超える。大多数のH3ループは基準構造をもたないため、基準構造を示すループの中で一般的な主鎖コンフォメーションを選択することが好ましい。従って、それぞれのループについて、天然のレパートリーで最も頻繁に観察されるコンフォメーションが選択される。ヒト抗体では、各ループについて最も一般的な基準構造（CS）は以下の通りである：H1-CS1（発現されるレパートリーの79％）、H2-CS3(46%)、L1-VκのCS2  (39%)、L2-CS1(100%)、L3-VκのCS1  (36%)（計算はκ:λ比が70:30であると仮定する、Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133）。基準構造を有するH3ループについて、残基94〜残基101までの塩架橋を有する7つの残基のCDR3長（Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services）が最も一般的なようである。EMBLデータライブラリー中に、このコンフォメーションを形成するために必要なH3長と主要な残基とを有する少なくとも16個のヒト抗体配列が存在し、抗体モデリングの基礎として使用することができる少なくとも2個の結晶構造（2cgr及び1tet）がタンパク質データバンクに存在する。最も頻繁に発現される生殖系遺伝子セグメントは、VHセグメント3〜23（Dp−47）、JHセグメントJH4b、Vκセグメント02/012（DPK9)、及びJκセグメントJκ1の基準構造の組合せである。VHセグメントDP45とDP38も適している。従って、これらのセグメントは、所望の単一主鎖コンフォメーションを有するライブラリーを構築するための基礎として組合せて使用することができる。
【０２０２】
あるいは、単離された各結合ループについての異なる主鎖コンフォメーションの自然発生に基づいて単一の主鎖コンフォメーションを選択する代わりに、主鎖コンフォメーションの組合せの自然発生が、単一の主鎖コンフォメーションを選択するための基礎として使用される。抗体の場合、例えば任意の2、3、4、5、又は6つすべての抗原結合ループについての基準構造の組合せの自然発生を決定することができる。ここで、選択されるコンフォメーションは天然に存在する抗体で一般的であることが好ましく、これが天然のレパートリーで最も頻繁に観察されることが最も好ましい。すなわち、ヒト抗体において、例えば、5つの抗原結合ループH1、H2、L1、L2、及びL3の天然の組合せが考慮されるとき、基準構造の最も頻繁な組合せが決定され、その後、単一の主鎖コンフォメーションを選択するための基礎として、H3ループの最も一般的なコンフォメーションと組合わされる。
【０２０３】
基準配列の多様化
いくつかの既知の主鎖コンフォメーション、又は好ましくは単一の既知の主鎖コンフォメーションを選択した後、分子の結合部位を変化させて構造的及び/又は機能的多様性を生じさせることによって、本発明で使用するためのリガンド（例えばdAb）又はライブラリーを構築することができる。これは、その構造及び／又は機能において十分な多様性を有する結果として様々なの活性を与えることができるように、変異体が作製されることを意味する。
【０２０４】
所望の多様性は、典型的には、選択された分子を1つ又はそれ以上の位置で変化させることにより生じる。変化させるべき位置はランダムに選択することができるし、又は好ましくは選択される。次に、存在するアミノ酸を任意のアミノ酸又はその類似体（天然又は合成）で置換して、膨大な数の変異体を作製する間に、又は存在するアミノ酸を1以上の規定のアミノ酸のサブセットで置換して、より限定された数の変異体を作製する間に、変異体をランダム化することができる。
【０２０５】
かかる多様性を導入するための種々の方法が報告されている。変異性（error-prone）PCR（Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889）、化学的突然変異誘発（Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533）、又は細菌突然変異誘発株（Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359）を使用して、分子をコードする遺伝子にランダム突然変異を導入することができる。選択された位置を突然変異させる方法も当該分野で周知であり、PCRの使用を伴うか又は伴わない、ミスマッチオリゴヌクレオチド又は縮重オリゴヌクレオチドの使用などがある。例えば、抗原結合ループに突然変異を標的化することにより、いくつかの合成抗体ライブラリーが作製されている。ヒト破傷風トキソイド−結合性FabのH3領域をランダム化して、様々なの新しい結合特異性が生じさせている（Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457）。ランダム又は半ランダムH3及びL3領域を生殖細胞系V遺伝子セグメントに付加して、非変異型フレームワーク領域を有する巨大なライブラリーが作製されている（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97）。かかる多様化は、他の抗原結合ループの一部又はすべてを含むように拡大されている（Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO 97/08320、前述）。
【０２０６】
ループランダム化は、H3のみに関して約1015を超える構造を作製する可能性を有し、他の5つのループについても同様に多数の変異体を作製する可能性を有するため、現在の形質転換技術を使用して又は無細胞系を使用して、すべての可能な組合せを示すライブラリーを作製することは適当ではない。例えば現在までに構築された最も大きなライブラリーの1つは、6ｘ1010種の異なる抗体（これはこの設計のライブラリーの可能な多様性のほんの一部である）が作製された（Griffiths et al. (1994)、前述）。
【０２０７】
好ましくは、分子の所望の機能を生じさせるか又は改変することに直接関与する残基のみが多様化される。多くの分子について、その機能は標的に結合することであり、従って、多様化は標的結合部位に集中させ、分子の全体的なパッキング（packing）や選択した主鎖コンフォメーションを維持するのに重要な残基を変化させるのは避けるべきである。
【０２０８】
抗体ドメインに適用する際の基準配列の多様化
抗体ベースのリガンド（例えばdAb）の場合、標的の結合部位は最も一般的には抗原結合部位である。すなわち、抗原結合部位中の残基のみを変化させることが好ましい。これらの残基はヒト抗体レパートリーで極めて多様であり、高分解能抗体／抗原複合体で接触することが知られている。例えばL2では、天然の抗体で50位と53位に多様性があることが知られており、抗原と接触することが観察されている。これに対して、従来のアプローチではKabat et al. (1991、前述)により規定される対応の相補性決定領域（CDR1）中のすべての残基、すなわちほぼ7個の残基を多様化していたが、本明細書で使用するライブラリー中では2個が多様化される。これは、様々なの抗原結合特異性を生じさせるために必要な機能的多様化の点でかなりの改善を示す。
【０２０９】
自然界では、抗体多様性は2つのプロセスの結果である：ナイーブな1次レパートリー（いわゆる生殖細胞系及び結合多様性）を作製するための生殖細胞系V、D、及びJ遺伝子セグメントの体細胞組換え、及び生じた再構成V遺伝子の体細胞超突然変異。ヒト抗体配列の分析は、1次レパートリー中の多様性が抗原結合部位の中心に集中している一方で、体細胞超突然変異は1次レパートリー中に高度に保存されている抗原結合部位の周辺領域に多様性を広げることを証明した（Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813）。この相補性はおそらく、配列の間隙を探索するための効率的な戦略として進化したものであり、明らかに抗体に固有であるが、これは他のポリペプチドレパートリーに容易に適用することができる。変化している残基は、標的の結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位中の残基の異なる（重複を含む）サブセットは、所望であれば、選択の異なる段階で多様化される。
【０２１０】
抗体レパートリーの場合、抗原結合部位中の一部（すべてではない）の残基が多様化される際に、最初の「ナイーブ」レパートリーを作製することができる。この関連で本明細書で使用されるように、用語「ナイーブ」は、あらかじめ決められた標的をもたない抗体分子を指す。これらの分子は、その免疫系が広範な抗原刺激によって依然としてチャレンジされていない胎児や新生児の個体の場合のように、免疫多様化を経ていない個体の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるものと似ている。次にこのレパートリーは、様々なの抗原又はエピトープに対して選択される。必要であれば、最初のレパートリー中で多様化された領域外にさらなる多様化を導入することができる。この成熟したレパートリーは、改変した機能、特異性、又は親和性について選択することができる。
【０２１１】
抗原結合部位中の一部又はすべての残基が変化しているリガンドを構築するための結合ドメインのナイーブレパートリーは、当該分野で周知である。（WO2004/058821、WO2004/003019及びWO03/002609を参照）。「1次」ライブラリーは天然の1次レパートリーを模倣し、その多様性は、生殖細胞系V遺伝子セグメントで多様である（生殖細胞系多様性）か又は組換えプロセス中に多様化される（結合多様性）抗原結合部位の中心の残基に限定される。多様化されるこれらの残基は、特に限定されないがH50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、L95、L96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94及びL96などがある。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換えプロセス中に多様化される（結合多様性）か、又は体細胞で高度に突然変異する残基に限定される。多様化されるこれらの残基は、特に限定されないがH31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34、及びL96などがある。これらのライブラリーでの多様化に適するとして上に列挙したすべての残基は、1つ又はそれ以上の抗体−抗原複合体中で接触することが知られている。いずれのライブラリーにおいても、抗原結合部位中のすべての残基が変化しているわけではないため、所望であれば、選択の間に残りの残基を変化させることにより追加の多様性が導入される。これらの任意の残基の任意のサブセット（又は抗原結合部位を含む追加の残基）が、抗原結合部位の最初の及び／又は以後の多様化のために使用できることは、当業者には明らかであろう。
【０２１２】
本発明で使用するためのライブラリーの構築において、選択される位置の多様化は、多くの可能なアミノ酸（全部で20、又はそのサブセット）をその位置で導入できるようにポリペプチドの配列を特定するコード配列を変化させることにより、典型的には核酸レベルで行われる。IUPAC命名法を使用して、最も汎用性であるコドンはNNKであり、これはすべてのアミノ酸ならびにTAG終始コドンをコードする。NNKコドンは、好ましくは、必要な多様化を導入するために使用される。同じ目的を達成する他のコドンも有用であり、追加の停止コドンTGAやTAAを生じさせるNNNコドンなどがある。
【０２１３】
ヒト抗体の抗原結合部位中の側鎖多様性の特徴は、特定のアミノ酸残基を好む顕著な偏りである。VH、Vκ、及びVλ領域それぞれの最も多様な10箇所のアミノ酸組成を合計すると、76％を超える側鎖多様性はわずかに7つの異なる残基からもたらされており、それらはセリン（24％）、チロシン（14％）、アスパラギン（11％）、グリシン（9％）、アラニン（7％）、アスパラギン酸（6％)、及びトレオニン（6％）である。主鎖に柔軟性を与えることができる親水性残基と小残基に対するこの偏りは、おそらく広範囲の抗原又はエピトープに結合する傾向が与えられた表面の進化を反映しており、1次レパートリー中の抗体の乱雑さの必要性を説明する助けとなり得る。
【０２１４】
このアミノ酸分布を模倣することが好ましいため、変化されるべき位置でのアミノ酸の分布は、好ましくは抗体の抗原結合部位にみられるものを模倣する。様々な標的抗原に対して特定のポリペプチド（抗体ポリペプチドだけではない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、任意のポリペプチドレパートリーに容易に適用される。変化させるべき位置でのアミノ酸分布に偏りを与えるために種々の方法があり（トリヌクレオチド突然変異誘発の使用を含む、WO97/08320を参照）、好適な方法は、合成の容易さから、従来の縮重コドンの使用である。縮重コドンのすべての組合せ（各位置において等しい比率で単一、二重、三重、及び四重の縮重性を有する）によりコードされるアミノ酸プロフィールを、天然のアミノ酸の使用と比較することにより、最も代表的なコドンを計算することが可能である。コドン(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C、及び(AGT)(AGC)(CT)（すなわち、IUPAC命名法を使用すればそれぞれDVT、DVC、及びDVY）は、所望のアミノ酸プロフィールに最も近いものである：これらは、22％のセリンと11％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、及びシステインをコードする。従って、好ましくは、多様化される各位置でDVT、DVC、又はDVYコドンのいずれかを使用してライブラリーが構築される。
【０２１５】
治療用及び診断用組成物ならびに用途
本発明は、本発明のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）と薬剤学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む組成物、並びに本発明のリガンド又は組成物を使用する治療法及び診断法を提供する。本発明の方法のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）は、in vivoでの治療及び予防用途で、in vivo診断用途などで使用することができる。
【０２１６】
本発明のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）の治療的及び予防的使用は、レシピエント哺乳動物（例えばヒト）への本発明のリガンドの投与を含む。二重特異性リガンド及び多重特異性リガンド（例えば二重特異性抗体フォーマット）は、強い結合力で多量体抗原に結合する。二重又は多重特異性リガンドは、例えば細胞毒性T細胞の動員において腫瘍細胞株の死滅を仲介するために、2つの抗原の架橋を可能にすることができる。
【０２１７】
少なくとも90〜95％の均一性の実質的に純粋なリガンド（例えばdAb単量体）が哺乳動物への投与に好適であり、特に哺乳動物がヒトである場合は、98〜99％又はそれ以上の均一性が医薬用途に最も好適である。必要に応じて部分的に又は均一になるまで精製した時点で、リガンドは診断又は治療のために（体外を含む）に、又はアッセイ法、免疫蛍光染色などを開発及び実施する際に、使用される（Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, 第I巻及び第II巻, Academic Press, NY）。
【０２１８】
例えば本発明のリガンド（例えばdAb単量体）は典型的には、炎症又は炎症状態（急性炎症性疾患及び／又は慢性炎症性疾患）を予防、抑制、又は治療する上での使用が見出される。本発明のリガンド（例えばdAb単量体）はまた、IL-1（例えばIL-1α及び／又はIL-1β）のIL-1R1への結合により誘導される生物学的プロセスを阻害するために投与することができる。
【０２１９】
本出願において、用語「予防」は、疾患が誘導される前の防御的組成物の投与を含む。「抑制」は、誘導的な事象後であるが疾患の臨床的所見前の、組成物の投与を指す。「治療」は、疾患症状が明らかになった後の防御的組成物の投与に関する。
【０２２０】
本発明のリガンド（dAb単量体を含む）は、慢性炎症性疾患、アレルギー性過敏症、癌、細菌もしくはウイルス感染、自己免疫疾患（これは、特に限定されないが、1型糖尿病、喘息、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）、重症筋無力症、及びベーチェット症候群を含む）、乾癬、子宮内膜症、及び腹部癒着（例えば腹部手術後）を予防、抑制、又は治療するために投与することができる。
【０２２１】
本発明のリガンド（dAb単量体を含む）は、肺の炎症、慢性閉塞性呼吸器疾患（例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、気腫）、喘息（例えば、ステロイド耐性喘息）、肺炎（例えば、細菌性肺炎、例えばブドウ球菌肺炎）、過敏性肺炎、好酸球増加症による肺浸潤、環境性肺疾患、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧、肺血栓塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、横隔膜の障害、換気過少、呼吸亢進、睡眠時無呼吸、急性呼吸窮迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺繊維症、浸潤性肺炎球菌疾患（IPD）、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスティス症、肺放線菌症、肺胞蛋白症、肺炭疽、肺水腫、胚塞栓、肺炎症、肺原因不明生組織球増殖症（好酸球性肉芽腫）、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈の閉塞性疾患、リウマチ肺疾患、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫症、及び非小細胞肺癌を予防、抑制、又は治療するために投与することができる。
【０２２２】
本発明のリガンド（dAb単量体を含む）は、インフルエンザ、RSV関連呼吸器疾患、及びウイルス性肺（呼吸器）疾患を予防、抑制、又は治療するために投与することができる。
【０２２３】
本発明のリガンド（dAb単量体を含む）は、変形性関節症又は炎症性関節炎を予防、抑制、又は治療するのに投与することができる。「炎症性関節炎」とは、免疫系が関節の炎症を引き起こすか又は悪化させる関節の疾患を指し、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、及び脊椎関節症、例えば強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、脊椎炎性乾癬、腸疾患に基づく関節炎、腸疾患に基づく脊椎炎、若年発症脊椎関節症、及び未分化脊椎関節症などがある。炎症性関節炎は、一般に白血球による滑膜組織及び/又は滑液の浸潤により特徴付けられる。
【０２２４】
エンドサイトーシスに関与する細胞外標的（例えばクラスリン）に結合する本発明のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）は、エンドサイトーシスを受けることができ、細胞内標的への接近が可能である。さらに、二重又は多重特異性リガンドは、細胞内標的に結合できる結合ドメイン（例えばdAb単量体）を細胞内環境に送達することができる手段を提供する。この方策は、例えば細胞内で機能性のまま維持されることを可能にする性質を有する二重特異性リガンドが必要である。あるいは、最終目的地である細胞内コンパートメントが酸化状態である場合、十分に折り畳まれているリガンドはジスルフィドを含まないものである必要はないかもしれない。
【０２２５】
二重又は多重特異性リガンドは、生物体内における治療的状況で相乗的に協働するサイトカイン受容体や他の分子を標的にすることが有利であり得る。従って本発明は、2つまたはそれ以上の分子（例えばサイトカイン受容体）に結合することができる二重又は多重特異性リガンドを投与することを含んでなる、サイトカイン受容体又は他の分子に結合する2つまたはそれ以上の結合ドメイン（例えばdAb）の活性を相乗的に作用させる方法を提供する。本発明のこの態様において、二重又は多重特異性リガンドはどのような二重又は多重特異性リガンドであってもよく、例えば本発明のこの態様は、VHドメインとVLドメインとの組合せ、VHドメインのみ、及びVLドメインのみに関する。
【０２２６】
治療の関連で相乗作用は多くの方法で達成することができる。例えば、標的の組合せは、両方の標的がリガンドにより標的化される場合にのみ治療的に活性されるが、1つの標的のみが標的化されても治療的に有効ではないものとしてもよい。別の実施形態において、1つの標的のみでは一部の治療効果を提供するが、第2の標的と一緒になるとこの組合せが治療効果の相乗的増加（相加作用を超える）を与える。
【０２２７】
疾患に対して防御又はこれを治療する上での本発明のリガンドの有効性をスクリーニングするのに使用できる動物モデル系は入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）の試験法は当該分野で公知である（Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515）。重症筋無力症（MG）は、SJL/Jメスマウスにおいて、別の種からの可溶性AchRタンパク質で疾患を誘導することにより試験される（Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233）。関節炎は感受性マウス系統でII型コラーゲンの注射により誘導される（Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233）。マイコバクテリアの熱ショックタンパク質の注射により感受性ラットでアジュバント関節炎が誘導されたモデルが記載されている（Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171）。既に記載されているように、サイログロブリンの投与によりマウスで甲状腺炎が誘導される（Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115）。インスリン依存性糖尿病（IDDM）は自然に発症するか、又はKanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113により記載されるようなマウスの特定の株で誘導することができる。マウス及びラットのEAEはヒトのMSのモデルとして適している。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄疾患が誘導される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al.編, Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478:及びSatoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179を参照）。他の適切なモデルは本明細書に記載される。
【０２２８】
一般に、リガンドは精製された形態で薬理学的に適切な担体とともに使用される。典型的には、これらの担体には、水溶液もしくはアルコール性／水性溶液、エマルジョンもしくは懸濁液（食塩水及び／又は緩衝化媒体を含む）などがある。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、並びに乳酸加リンガー溶液などがある。ポリペプチド複合体を懸濁状態に維持するのに必要であれば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギナートのような増粘剤から適切な薬理学的に許容されるアジュバントが選択することができる。
【０２２９】
静脈ビヒクルには、液体及び栄養物質補充液、及び電解質補充液、例えばリンガーデキストロースに基づくものなどがある。保存剤や他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスが存在してもよい。製剤化は投与経路に依存し、徐放性製剤を含む種々の適切な製剤を使用することができる（例えば、Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版を参照）。
【０２３０】
リガンド（例えばdAb単量体）は、1つ又はそれ以上の追加の治療薬又は活性物質とともに投与及び／又は製剤化することができる。リガンドが追加の治療薬とともに投与されるとき、リガンドは、追加薬剤の投与の前、同時、又は投与後に投与することができる。一般に、リガンド（例えばdAb単量体）及び追加の物質は、治療効果の重複を提供するように投与される。本発明のリガンドと共に投与又は製剤化することができる追加の物質には、例えば種々の免疫治療薬、例えばシクロスポリン、メソトレキセート、アドリアマイシン、又はシスプラチナム、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び免疫毒素などがある。例えば、肺炎症又は呼吸器疾患を予防、抑制、又は治療するためにアンタゴニストが投与されるとき、これはホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばホスホジエステラーゼ4の阻害剤）、気管支拡張剤（例えばβ2-アゴニスト、抗コリン作動薬、テオフィリン）、短時間作用性βアゴニスト（例えば、アルブテロール、サルブタモール、バムブテロール、フェノテロール、イソエテリン（isoetherine）、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、テルブタリン及びトルンレート（tornlate））、長時間作用性βアゴニスト（例えば、ホルモテロール及びサルメテロール）、短時間作用性抗コリン作動薬（例えば臭化イプラトロピウム及び臭化オキシトロピウム）、長時間作用性抗コリン作動薬（例えばチオトロピウム）、テオフィリン（例えば、短時間作用性製剤、長時間作用性製剤）、吸入ステロイド（例えば、ベクロメタゾン（eclomethasone）、ベクロメタゾン(beclometasone)、ブデソニド、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、及びトリアムシノロン）、経口ステロイド（例えば、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニソロンとプレドニゾン）、抗コリン作動薬と組合せた短時間作用性βアゴニスト（例えば、アルブテロール／サルブタモール／イプラトピウム、及びフェノテロール／イプラトピウム）、吸入ステロイドと組合せた長時間作用性βアゴニスト（例えば、サルメテロール／フルチカゾン、及びホルモテロール／ブデソニド)、及び粘液溶解薬（例えば、エルドステイン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、ギアフェネシン（guiafenesin)、及びヨウ化グリセロール）と組合せて投与することができる。
【０２３１】
関節炎（例えば、炎症性関節炎（例えば慢性関節リウマチ））を予防、抑制、又は治療するためにアンタゴニストが投与されるとき、これは、疾患改善抗リウマチ剤（例えば、メソトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、アザチオプリン、D-ペニシラミン、金（経口又は筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A）、非ステロイド抗炎症剤（例えば、COX-2選択性NSAIDS、例えばロフェコキシブ）、サリチラート、グルココルチコイド（例えばプレドニゾン（predisone）)、及び鎮痛剤と組合せて投与することができる。
【０２３２】
医薬組成物は、種々の細胞毒性剤又は他の薬剤を本発明のリガンドと組合せた「カクテル」、又は異なる特異性を有する本発明のリガンドの組合せ（例えば異なる標的抗原又はエピトープを使用して選択されたリガンド）（これらは投与前にプールされていてもされていなくても）を含むことができる。
【０２３３】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られる任意の経路であり得る。治療（特に限定されないが、免疫療法を含む）のために、本発明の選択されたリガンドを標準的技術に従って任意の患者に投与することができる。投与は任意の適切な様式によることができ、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下）、経皮、肺経路を介して、又は、適宜カテーテルを用いる直接注入によってもよい。投与量と投与頻度は、患者の年齢、性別、及び患者の症状、他の薬剤の同時投与、医師が考慮すべき禁忌及び他のパラメータに依存するであろう。投与は局所的（例えば、肺投与による肺への局所的送達、例えば鼻内投与）又は適応があれば全身性でもよい。
【０２３４】
本発明のリガンドは、保存して使用前に適切な担体で再構成するために凍結乾燥することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが証明されており、当該分野で公知の凍結乾燥法や再構成技術を使用することができる。凍結乾燥と再構成とが様々な程度で抗体活性の消失を導き得ること（例えば、慣用の免疫グロブリンであるIgM抗体はIgG抗体より活性消失が大きい傾向がある)、及びこれを補償するために使用レベルを高くしなければならない場合があることは当業者に理解されよう。
【０２３５】
本発明のアンタゴニスト（例えばリガンド）又はそのカクテルを含有する組成物は、予防及び／又は治療のために投与することができる。特定の治療用途において、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、又は他の測定可能なパラメータを達成するのに適当な量を「治療上有効な用量」と定義する。例えば、肺炎症及び／又は呼吸器疾患を治療するために、喀痰阻害量、気管支生検炎症阻害量、呼吸困難阻害量、1秒間努力呼気量（FEV(1)）増加量、健康状態改善量（St. George’s Respiratory Questionnaireのような適切なアンケートで定められる（例えば、4ポイントの改善スコア））を投与することができる。別の例では、関節炎（例えば炎症性関節炎（例えば、慢性関節リウマチ））を治療するために、米国リウマチ学会のコアセット測定値の少なくとも3つにおいて20％又はそれ以上の改善を達成するのに十分な量を投与することができる（Felson et al., Arthritis and Rheumatism, 38:727-735 (1995)）。
【０２３６】
この用量を達成するのに必要な量は、疾患の重症度と患者の一般的状態（患者の年齢、性別、体重、一般的健康状態（例えば患者の免疫系の状態）を含む）に依存する。これら及び他の適切な基準に基づいて、医師は投与すべきリガンドの適切な量を決定することができる。一般にこの量は、体重1kg当たり0.005〜5.0mgであり、0.05〜2.0mg/kg/回がより一般的に使用される用量である。予防的用途のために、本発明のリガンド又はそのカクテルを含有する組成物も、疾患の発症を予防、阻害、又は遅延させるために（例えば、寛解又は休止を維持するために、又は急性相を防ぐために）同様の又はやや少ない用量で投与することができる。医師は、疾患を治療、抑制、又は予防するために適切な投与間隔を決定できる。本発明のリガンドは、1日に最大4回、週2回、週1回、2週間に1回、1月に1回、又は2ヶ月毎に1回で、例えば約10μg/kg〜約80mg/kg、約100μg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約70mg/kg、約1mg/kg〜約60mg/kg、約1mg/kg〜約50mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約5mg/kg、約10μg/kg〜約2.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、又は約10mg/kgの用量で投与することができる。具体的な実施形態において、リガンドは、慢性炎症性疾患を治療、抑制、又は予防するために、2週間に1回、又は1月に1回、約10μg/kg〜約10mg/kg（例えば、約10μg/kg、約100μg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、又は約10mg/kg）の用量で投与される。
【０２３７】
本明細書に記載の組成物を使用して行われる治療又は療法は、治療前に存在していた症状と比較して、かかる組成物で治療されていない個体（ヒト又はモデル動物）の症状と比較して、又は他の適切な対照と比較して、1つ又はそれ以上の症状が（例えば、少なくとも10％又は臨床的評価スケールで少なくとも1ポイント）低減している場合に、「有効」とみなされる。症状は標的化される疾患又は障害に依存して明らかに変化するが、医師又は技師はこれを判断することができる。かかる症状は、例えば疾患または障害の1つ又はそれ以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患に相関する酵素又は代謝物のレベル、罹患した細胞数など）をモニタリングすることにより、又は肉体的兆候（例えば、炎症、腫瘍サイズなど）をモニタリングすることにより、又は承認されている臨床的評価スケール、例えば総合障害度評価尺度（Expanded Disability Status Scale」、Irbine炎症性腸疾患アンケート（32ポイント評価、クオリティオブライフを腸機能、全身症状、社会的機能、および感情状態の点で評価する−スコアは32〜224の範囲、スコアが高いほどより良いクオリティオブライフを示す）、クオリティオブライフ慢性関節リウマチスケール、米国リウマチ学会のコアセット測定値、又はこの分野で公知の承認された他の臨床評価スケールにより、判断できる。疾患又は障害症状において、少なくとも10％の又は所与の臨床スケールでの1ポイント以上の持続的（例えば、1日又はそれ以上、好ましくはそれ以上）低下は、「有効」な治療を示す。同様に、本明細書に記載の組成物を使用することにより行われる予防は、1つ又はそれ以上の症状の発症又は重症度が、該組成物で治療されていない同様の個体（ヒト又は動物モデル）の症状と比較して、遅延、低減、又は排除されている場合に「有効」である。
【０２３８】
本発明のリガンド又はそのカクテルを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、死滅、又は除去を助けるために予防及び治療の場で利用することができる。さらに、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーは、細胞の不均一集合から標的細胞集団を死滅、枯渇、又は有効に除去するために体外で又はin vitroで選択的に使用することができる。哺乳動物からの血液をリガンド（例えば抗体、その細胞表面受容体又は結合タンパク質）と体外で組合せて、不要な細胞を死滅させるか又は血液から除去して、標準的技術に従って哺乳動物に戻することができる。
【０２３９】
本発明のアンタゴニスト（例えばリガンド）を含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、死滅、又は除去を助けるために予防及び治療の場で利用することができる。
【０２４０】
ある実施形態において、本発明は、本発明のリガンドの治療上有効な用量又は量をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、慢性炎症性疾患を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０２４１】
ある実施形態において、本発明は、本発明のリガンドの治療上有効な用量又は量をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、関節炎（例えば、炎症性関節炎（例えば慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、及び脊椎関節炎、例えば強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、脊椎炎性乾癬、腸疾患に基づく関節炎、腸疾患に基づく脊椎炎、若年発症脊椎関節炎、及び未分化脊椎関節炎））を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０２４２】
別の実施形態において、本発明は、本発明のリガンドの治療上有効な用量又は量をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）を治療、抑制、又は予防する方法である。
【実施例】
【０２４３】
実施例1
方法
選択とスクリーニング
1次選択のために、Vκ dAbの4G-K2ライブラリーをIL-1R1−Fc融合タンパク質（Axxora, Nottingham, UK）に対してパニングした。1次選択からのドメイン抗体をさらに3ラウンドの選択に付した。ラウンド1は、プロテインG被覆磁性ビーズ（Dynal, Norway）と100nM IL-1R1−Fcを使用して行った；ラウンド2は、抗ヒトIgGビーズ（Novagen, Merck Biosciences, Nottingham, UK）と10nM IL-1R1−Fcとを使用して行った；そして、ラウンド3は、プロテインGビーズと1nM IL-1R1−Fc（Henderikx et al., Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display : Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press (2002)）を使用して行った。各段階での溶出は1mg／mlトリプシン−リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いて行った。親和性成熟選択のために、上記方法を使用したが、以下の変更を加えた：プロテインGビーズを使用して2ラウンドの選択を行い、ラウンド1では1nM IL-1R1−Fcを使用し、ラウンド2では100pM IL-1R1−Fcを使用した。選択アウトプット（ラウンド2と3）からのファージベクターをプラスミドプレップ（Qiagen）により単離し、SalIとNotIを用いる制限消化によりdAbインサートを解離させた。このインサートをファージ発現ベクター（SalI/NotI切断pDOM5）に連結し、dAbの可溶性発現とスクリーニングのためにこれを用いて大腸菌（E. coli）HB2151株を形質転換した。
【０２４４】
上清受容体結合アッセイ（RBA）
単一の形質転換大腸菌（E. coli）コロニーを、100μg/mlカルベニシリンと0.1％(w/v)グルコースとを補充した2ｘTYを含有する96ウェルプレートに取り入れ、37℃で約OD600＝約0.9まで増殖させ、1mM IPTGで誘導した。30℃で一晩誘導したものからの上清を、受容体結合アッセイにおいて、ELISAプレート上に捕捉されたIL-1R1へのIL-1βの結合を阻害する能力についてスクリーニングした。簡単に説明すると、MaxiSorpＴＭイムノアッセイプレート（Nunc, Denmark）を抗IL-1R1マウスモノクローナル抗体（R&D Systems, Minneapolis, USA)）と共に一晩インキュベートした。ウェルを0.1％(v/v)Tween20を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、次にPBS中の1％(w/v)BSAでブロックした後、組換えIL-1R1（500ng/ml, R&D Systems）と共にインキュベートした。スクリーニングすべきdAbを含有する大腸菌（E. coli）培養物上清をアッセイプレートの洗浄済みウェルに入れ、プレートを室温で30分間インキュベートし、次にIL-1β（4ng/ml, R&D Systems）を各ウェルに加え、混合した。IL-1β結合をビオチン化抗IL-1R1β抗体（R&D Systems）を使用し、次にペルオキシダーゼ標識した抗ビオチン抗体（Stratech, Soham, UK）を使用し、その後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）基質（KPL, Gaithersburg, USA）と共にインキュベートすることにより検出した。HClを加えて反応を停止させ、450nmで吸光度を読み出した。抗IL-1R1 dAb活性は、IL-1β結合の減少を引き起こし、従って、IL-βのみの対照と比較して吸光度は減少した。
【０２４５】
細胞アッセイ
単離されたdAbを、培養したMRC-5細胞（ATCCカタログ番号CCL-171）からの、IL-1により誘導されるIL-8放出を阻害する能力について試験した。簡単に説明すると、RPMI培地中の5000個のトリプシン処理済みMRC-5細胞を組織培養マイクロタイタープレートのウェルに入れ、IL-1α又はβ（R&D Systems, 200pg/mlの終濃度）及び試験されるdAbの希釈物と混合した。混合物を37℃で一晩インキュベートし、細胞により培養培地中に放出されたIL-8をELISA（DuoSet（登録商標）, R&D Systems）で定量した。抗IL-1R1 dAb活性はIL-1結合の減少とそれに対応するIL-8放出の減少を引き起こした。
【０２４６】
ヒト全血アッセイ
ヒト全血を試験すべきdAbの希釈シリーズと共にインキュベートし、混合物を37℃／5％／CO2で30分間インキュベートした。次に、270又は900pM（終濃度）のIL-1α又はIL-1βを混合物に加え、次に混合物を37℃／5％／CO2でさらに20時間インキュベートした。次に血液を遠心分離（500ｘg、5分）し、上清中に放出されたIL-6をELISA（DuoSet（登録商標）, R&D Systems）で定量した。抗IL-1R1 dAb活性はIL-1結合の減少とそれに対応するIL-6放出の減少を引き起こした。
【０２４７】
オフレートスクリーニング
これらの実験は、BIACORE3000表面プラズモン共鳴装置で、約600RUのIL-1R1（R&D Systems）と連結したCM5チップ（Biacore）を使用して行った。ブランクのフローセルに対してインラインで参照しながら、アナライトをHBS-EPランニングバッファー（Biacore）中30μl/分の流速でIL-1R1被覆フローセルを通過させた。可溶性dAbを含有する10μlの上清をランニングバッファーで1：1希釈し、10μl/分の流速で注入（Kinject）し、バッファー中で解離させた。親クローンと比較して改善したオフレートを有するクローンを肉眼で、又はBIAevaluationソフトウェアv4.1を使用して測定することにより同定した。
【０２４８】
表面プラズモン共鳴によるIL-1raの競合
これらの実験は、BIACORE3000表面プラズモン共鳴装置で、約600RUのIL-1R1（R&D Systems）と連結したCM5チップ（Biacore）を使用して行った。ブランクのフローセルに対してインラインで参照しながら、アナライトをHBS-EPランニングバッファー（Biacore）中30μl/分の流速でIL-1R1被覆フローセルを通過させた。IL-1ra（100nM、R&D Systems）を60秒間注入し、その後直ちに同時注入装置を使用して200nMのDOM4-130-3 dAb又は100nM IL-1αを60秒間注入した。
【０２４９】
IL-1ra競合ELISA
MaxiSorpＴＭイムノアッセイプレート（Nunc, Denmark）を1μg/mlのIL-1R1-Fcで一晩被覆し、次にPBSで3回洗浄した後、PBS中1％(v/v)Tween20でブロックした。プレートを再度洗浄した後、DOM4-130-3又はIL-1αの希釈シリーズと混合した500pMのIL-1raを加えた。受容体へのIL-1raの結合をビオチン化抗IL-1ra抗体（DuoSetお（登録商標）, R&D Systems）を用い、次にストレプトアビジン−HRPを使用し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）基質（KPL, Gaithersburg, USA）を使用して上記のように検出した。IL-1R1への結合についてのIL-1raとの競合は、IL-1raを含まない対照ウェルと比較したA450の低下により示された。
【０２５０】
親和性成熟ファージライブラリーの構築
以下の2種類のライブラリーを構築した：CDR再多様化ライブラリー及び変異性(error-prone)ライブラリー。前者のライブラリーについては、NNK又はNNSコドンを含有する縮重オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、親和性が成熟されるべきdAb中の必要な位置を多様化させた。次にアセンブリPCRを使用して、完全長の多様化インサートを作製した。変異性ライブラリーについては、親和性が成熟されるべきdAbをコードするプラスミドDNAを、GeneMorph(登録商標)II Random Mutagenesisキット（Stratagene）を用い、PCRによって増幅した。いずれかの方法で作製されたインサートをSalIとNotIで消化し、切断したファージベクターとの連結反応で使用した。次にこの連結物を使用して、電気穿孔法により大腸菌（E. coli）TB1株を形質転換し、形質転換細胞を15μg/mlテトラサイクリンを含有する2ｘTY寒天上にプレーティングし、1ｘ108個を超えるクローンのライブラリーサイズを得た。
【０２５１】
結果
1次選択とスクリーニング
4G-K2ライブラリーを使用して1次ファージ選択を行い、アウトプットを可溶性発現ベクター（pDOM5）中にサブクローニングした。IL-1R1へのIL-1の結合を阻害したdAbクローンを上清RBAにより同定し、次に発現させ、プロテインLにより精製し、MRC-5細胞アッセイにおいてIL-1に誘導されるIL-8放出を阻害する能力について試験した。図1は、かかる細胞アッセイにおける、抗IL-1R1 dAb DOM4-122及びDOM4-129の用量応答曲線を示す。各dAbについての中和用量50(ND50)はこのアッセイで約1μMであった。DOM4-122及びDOM4-129はCDR1及びCDR2において同じアミノ酸配列を有し、CDR3において5つのアミノ酸残基のうちの2つが同一であるため、受容体上の同一のエピトープに結合することが予測された。
【０２５２】
親和性成熟
ステージ1成熟
DOM4-122を鋳型として使用して、28、30、31、92、及び93位で20種すべてのアミノ酸をコードする多様性を有する成熟ライブラリーを構築した。平行して、DOM4-129を変異性PCR突然変異誘発によって親和性を成熟させた。得られたファージライブラリーをIL-1R1-Fcに対する可溶性選択で使用した。ラウンド2及び3選択のアウトプットをファージ発現ベクター（pDOM5）中にクローニングし、dAbを大腸菌（E. coli）で発現させ、発現上清中のdAbを、親dAbと比較して改善したオフレートについてスクリーニングした。改善したオフレートを有するクローンを発現させ、精製し、MRC-5／IL-8細胞アッセイで試験した。図2は、改変された変異体DOM4-122-6及びDOM4-129-1（いずれも約10nMのND50値を有した）の用量応答曲線を示した。
【０２５３】
ステージII成熟
抗IL-1R1 dAb DOM4-122（ND50 約μM）のステージI親和性成熟はCDR1及び3の再多様化によってDOM4-122-6(約10nM)を生じた。DOM4-129(約1μM)の成熟は変異性PCRによってDOM4-129-1(約10μM)を生じた。DOM4-129-1及びDOM4-122-6は、成熟の間に共通してL46Fの一突然変異を得たが、DOM4-129-1は追加の突然変異S56Rを有する。いずれの変化も成熟選択から単離されたクローンにおいて頻繁に見られ、したがってS56R突然変異がDOM4-122-6に導入されてDOM4-122-3が生じた。この組合せ突然変異型dAbは約1nMのND50を有した（図2）。DOM4-122及びDOM4-129の両者で得られた追加の点突然変異K45Mは不可欠ではないことが示された（DOM4-122-23において生殖細胞系に復帰させる際、DOM4-122-24を生じる）。
【０２５４】
dAbのエピトープ特異性
抗IL-1R1 dAbのエピトープ特異性を判定するために、競合結合アッセイを行った。BIOCORE表面プラズモン共鳴装置を使用する試験で、IL-1R1と結合したチップ上にIL-1raを注入し、その後直ちにDOM4-122-23又はIL-1aを注入した。結果を図3Aと3Bに示す。図3Aは、すでにIL-1raが結合したIL-1 RIにDOM4-122-23が結合したことを示す。IL-1raの注入後にIL-1αを注入すると（受容体への結合について競合することが知られている2つの分子）、IL-1αも受容体に結合できなかった（図3B）。この結果は、DOM4-122-23又はIL-1a（一連の濃度）の存在下でIL-1R1へのIL-1raの結合を測定した競合ELISAを使用して確認した。ELISAの結果は、DOM4-122-23は、最大1μMの濃度で存在するときでさえ、IL-1R1へのIL-1ra(500pM)の結合を阻害せず、その際、IL-1aはIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害したことを示す（図4）。この結果により、DOM4-122-23はIL-1R1へのIL-1の結合を阻害するが、IL-1R1への結合についてIL-1raとは競合しないことが確認された。
【０２５５】
実施例2. プロテアーゼ安定性
プロテアーゼ安定性
dAb及びdAbを含むリガンドは、種々の症状（例えば炎症性症状）を治療するのに有用である。さらに、本明細書に記載のように、dAb及びリガンドの半減期は、例えばPEG化により調整することができる。すなわち、dAb及びリガンドは、例えば全身的に（例えば、関節炎を治療するためにPEG化dAbを）に又は局所的に（例えば、COPDを治療するためにdAb単量体を）に投与することができる。
【０２５６】
IL-1R1に結合する2つのdAbの、エラスターゼ又はトリプシンの作用に対する安定性を調べた。これらのプロテアーゼはいずれも本来は肺内に低レベルで存在するが、COPDのような症状ではプロテアーゼ（例えばエラスターゼ）のレベルは高くなることがある。dAb単量体DOM4-130-54及び、PEGの特異的結合のためのシステイン残基を与える点突然変異を含むDOM4-130-54の変異体をこの試験で使用した。
【０２５７】
PBS中1mg/mlのDOM4-130-54溶液を0.04％w／wのトリプシン又はエラスターゼ（Elastin Products Company Incから購入したヒト喀痰白血球エラスターゼ）のいずれかとともにインキュベートした。次にdAb／プロテアーゼ混合物を30℃でインキュベートし、SDS-PAGE分析のためにサンプルを一定の時間間隔（0、1、3、及び24時間）で取り上げた。所与の時点で、SDS-PAGEローディングバッファー（ｘ10濃縮ストック溶液）を添加して反応を停止させ、次に液体窒素でサンプルを瞬間冷凍した。サンプルをSDS-PAGEで分析し、タンパク質バンドを視覚化して、dAbのプロテアーゼ分解の経時変化を明らかにした。
【０２５８】
結果
エラスターゼの作用に対する安定性について2つの形態のDOM4-130-54を試験した；大腸菌（E. coli）で発現された単量体と、Ｐ．パストリス（P. pastoris）から発現されたシステイン操作した変異体P80C。DOM4-130-54のP80C点突然変異は、PEGの特異的結合のためのシステイン残基を与える。
【０２５９】
エラスターゼ分解の経時変化は、24時間後でもDOM4-130-54が分解の兆候を示さないことを明らかにした。この結果はまた、P80C突然変異の導入が、DOM4-130-54と比較してタンパク質の安定性に影響がないことを明らかにした。これらの結果は、P80C変異体の3次構造が、DOM4-130-54の3次構造と実質的に異ならないことを示す。
【０２６０】
トリプシンの存在下での単量体dAbDOM4-130-54の安定性も試験した。トリプシン分解の経時変化は、DOM4-130-54が少なくとも3時間は安定であり、分解は24時間の時点でのみ認められることを明らかにした。
【０２６１】
この試験の結果は、dAbが安定であり、エラスターゼ又はトリプシンが介在する分解に対して耐性であることを明らかにした。プロテアーゼ分解に対するdAbの証明された安定性は、dAbをin vivoで投与できること、及びdAbは有意な生物学的作用を生じるのに十分な時間、機能的なまま維持されることを示す。例えばこの結果は、dAbを肺に投与すると、これらはプロテアーゼ分解に対して耐性であり、従って、有意な生物学的作用を示す（例えば、IL-1R1のような標的タンパク質に結合しその活性を阻害する）のに十分な時間、機能的であることを示す。
【０２６２】
本発明はその好適な実施形態を参照しながら具体的に示され記載されているが、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態や詳細を様々に変更し得ることを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】図1は、培養MRC-5細胞（ATCCカタログ番号CCL-171）からのIL-1により誘導されるIL-8放出を阻害する能力についてdAbを試験したin vitroアッセイの結果を示すグラフである。図1は、そのような細胞アッセイにおけるDOM4-122及びDOM4-129と呼ぶ抗IL-1R1 dAbの用量応答曲線を示す。両dAbのND50値は約1μMであった。
【図２】図2は、親和性成熟を受けたdAbを、培養MRC-5細胞（ATCCカタログ番号CCL-171）からのIL-1により誘導されるIL-8放出を阻害する能力について試験したin vitroアッセイの結果を示すグラフである。図2は、DOM4-122-6、DOM4-129-1、DOM4-122-23、及びIL-1raの用量応答曲線を示す。DOM4-122-6及びDOM4-122-23はDOM4-122の親和性成熟型変異体であり、DOM4-129-1はDOM4-129の親和性成熟型変異体である。このアッセイにおいて、DOM4-122-6及びDOM4-129-1はいずれも約10nMのND50を有し、このアッセイにおいてDOM4-122-23は約1nMのND50を有した。
【図３】図3A及び3Bは、すでにIL-1raが結合したIL-1R1に、DOM4-122-23（図3A）は結合したが、IL-1α（図3B）は結合しなかったことを示すセンサーグラムである。固定化IL-1R1上にIL-1raを注入し、IL-1raを固定化受容体に結合させた（注入1、図3A及び3Bの0〜60秒）。次にDOM4-122-23又はIL-1αのいずれかを注入した（注入2、図3A及び3Bの60〜120秒）。センサーグラムから明らかなように、すでにIL-1raが結合したIL-1R1にDOM4-122-23は結合したが、IL-1αは結合しなかった。
【図４】図4は、競合結合ELISAで、増加する濃度のDOM4-122-23はIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害しないが、このアッセイにおいてIL-1αはIL-1R1へのIL-1raの結合を阻害したことを示すグラフである。増加する濃度のDOM4-122-23又はIL-1αを500pMのIL-1raと混合し、混合物をIL-1R1で被覆したELISAプレートにアプライした。
【図５Ａ】図5A〜5Zは、ヒトIL-1R1に結合するいくつかのヒトdAbのアミノ酸配列を示す。いくつかの配列で、CDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸に下線を引いてある。
【図５Ｂ】図５Ａの続き。
【図５Ｃ】図５Ｂの続き。
【図５Ｄ】図５Ｃの続き。
【図５Ｅ】図５Ｄの続き。
【図５Ｆ】図５Ｅの続き。
【図５Ｇ】図５Ｆの続き。
【図５Ｈ】図５Ｇの続き。
【図５Ｉ】図５Ｈの続き。
【図５Ｊ】図５Ｉの続き。
【図５Ｋ】図５Ｊの続き。
【図５Ｌ】図５Ｋの続き。
【図５Ｍ】図５Ｌの続き。
【図５Ｎ】図５Ｍの続き。
【図５Ｏ】図５Ｎの続き。
【図５Ｐ】図５Ｏの続き。
【図５Ｑ】図５Ｐの続き。
【図５Ｒ】図５Ｑの続き。
【図５Ｓ】図５Ｒの続き。
【図５Ｔ】図５Ｓの続き。
【図５Ｕ】図５Ｔの続き。
【図５Ｖ】図５Ｕの続き。
【図５Ｗ】図５Ｖの続き。
【図５Ｘ】図５Ｗの続き。
【図５Ｙ】図５Ｘの続き。
【図５Ｚ】図５Ｙの続き。
【図６Ａ】図6A〜6Z、6AA〜6ZZ、6AAAと6BBBは、図5A〜5Zに示すヒトdAbをコードする核酸のヌクレオチド配列を例示する。いくつかの配列で、CDR1、CDR2、及びCDR3をコードするヌクレオチドに下線を引いてある。
【図６Ｂ】図６Ａの続き。
【図６Ｃ】図６Ｂの続き。
【図６Ｄ】図６Ｃの続き。
【図６Ｅ】図６Ｄの続き。
【図６Ｆ】図６Ｅの続き。
【図６Ｇ】図６Ｆの続き。
【図６Ｈ】図６Ｇの続き。
【図６Ｉ】図６Ｈの続き。
【図６Ｊ】図６Ｉの続き。
【図６Ｋ】図６Ｊの続き。
【図６Ｌ】図６Ｋの続き。
【図６Ｍ】図６Ｌの続き。
【図６Ｎ】図６Ｍの続き。
【図６Ｏ】図６Ｎの続き。
【図６Ｐ】図６Ｏの続き。
【図６Ｑ】図６Ｐの続き。
【図６Ｒ】図６Ｑの続き。
【図６Ｓ】図６Ｒの続き。
【図６Ｔ】図６Ｓの続き。
【図６Ｕ】図６Ｔの続き。
【図６Ｖ】図６Ｕの続き。
【図６Ｗ】図６Ｖの続き。
【図６Ｘ】図６Ｗの続き。
【図６Ｙ】図６Ｘの続き。
【図６Ｚ】図６Ｙの続き。
【図６ＡＡ】図６Ｚの続き。
【図６ＢＢ】図６ＡＡの続き。
【図６ＣＣ】図６ＢＢの続き。
【図６ＤＤ】図６ＣＣの続き。
【図６ＥＥ】図６ＤＤの続き。
【図６ＦＦ】図６ＥＥの続き。
【図６ＧＧ】図６ＦＦの続き。
【図６ＨＨ】図６ＧＧの続き。
【図６ＩＩ】図６ＨＨの続き。
【図６ＪＪ】図６ＩＩの続き。
【図６ＫＫ】図６ＪＪの続き。
【図６ＬＬ】図６ＫＫの続き。
【図６ＭＭ】図６ＬＬの続き。
【図６ＮＮ】図６ＭＭの続き。
【図６ＯＯ】図６ＮＮの続き。
【図６ＰＰ】図６ＯＯの続き。
【図６ＱＱ】図６ＰＰの続き。
【図６ＲＲ】図６ＱＱの続き。
【図６ＳＳ】図６ＲＲの続き。
【図６ＴＴ】図６ＳＳの続き。
【図６ＵＵ】図６ＴＴの続き。
【図６ＶＶ】図６ＵＵの続き。
【図６ＷＷ】図６ＶＶの続き。
【図６ＸＸ】図６ＷＷの続き。
【図６ＹＹ】図６ＸＸの続き。
【図６ＺＺ】図６ＹＹの続き。
【図６ＡＡＡ】図６ＺＺの続き。
【図６ＢＢＢ】図６ＡＡＡの続き。
【図７Ａ】図7Aは、マウス血清アルブミン（MSA）への結合により選択した3つのVκのアミノ酸配列のアライメント整列である。整列されたアミノ酸配列は、MSA16（これはDOM7m-16(配列番号723)とも呼ばれる）、MSA12（これはDOM7m-12(配列番号724)とも呼ばれる)、及びMSA26（これはDOM7m-26(配列番号725)とも呼ばれる）で表されるVκ由来である。
【図７Ｂ】図7Bは、ラット血清アルブミン（RSA）への結合により選択した6つのVκのアミノ酸配列のアライメントである。整列されたアミノ酸配列は、DOM7r-1(配列番号726)、DOM7r-3(配列番号727)、DOM7r-4(配列番号728)、DOM7r-5(配列番号729)、DOM7r-7(配列番号730)、及びDOM7r-8(配列番号731)で表されるVκ由来である。
【図７Ｃ】図7Cは、ヒト血清アルブミン（HSA）への結合により選択した6つのVκのアミノ酸配列のアライメントである。整列されたアミノ酸配列は、DOM7h-2(配列番号732)、DOM7h-3(配列番号733)、DOM7h-4(配列番号734)、DOM7h-6(配列番号735)、DOM7h-1(配列番号736)、及びDOM7h-7(配列番号737)で表されるVκ由来である。
【図７Ｄ】図7Dは、ヒト血清アルブミンへの結合により選択した7つのVHのアミノ酸配列とコンセンサス配列(配列番号738）のアライメントである。整列された酸配列は、DOM7h-22(配列番号739)、DOM7h-23(配列番号740)、DOM7h-24(配列番号741)、DOM7h-25(配列番号742)、DOM7h-26(配列番号743)、DOM7h-21(配列番号744)、及びDOM7h-27(配列番号745)で表されるVH由来である。
【図７Ｅ】図7Eは、ヒト血清アルブミンとラット血清アルブミンへの結合により選択した3つのVκのアミノ酸配列のアライメントである。整列されたアミノ酸配列は、DOM7h-8(配列番号746)、DOM7r-13(配列番号747)、及びDOM7r-14(配列番号748)で表されるVκ由来である。
【図８】図8は、ラット血清アルブミン（RSA）への結合により選択したVκのアミノ酸配列の例示である。例示された配列は、DOM7r-15(配列番号749)、DOM7r-16(配列番号750)、DOM7r-17(配列番号751)、DOM7r-18(配列番号752)、DOM7r-19(配列番号753)で表されるVκ由来である。
【図９Ａ】図9A-9Bは、ラット血清アルブミン（RSA）に結合するVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列の例示である。例示された配列は、DOM7r-20(配列番号754)、DOM7r-21(配列番号755)、DOM7r-22(配列番号756)、DOM7r-23(配列番号757)、DOM7r-24(配列番号758)、DOM7r-25(配列番号759)、DOM7r-26(配列番号760)、DOM7r-27(配列番号761)、DOM7r-28(配列番号762)、DOM7r-29(配列番号763)、DOM7r-30(配列番号764)、DOM7r-31(配列番号765)、DOM7r-32(配列番号766)、及びDOM7r-33(配列番号767)で表されるVH由来である。
【図９Ｂ】図9Aの続き。
【図１０】図10は、WO 2004/041862に開示されたマウス血清アルブミンに結合するいくつかのラクダ科（Camelid）VHHのアミノ酸配列を示す。配列A(配列番号768)、配列B(配列番号769)、配列C(配列番号770)、配列D(配列番号771)、配列E(配列番号772)、配列F(配列番号773)、配列G(配列番号774)、配列H(配列番号775)、配列I(配列番号776)、配列J(配列番号777)、配列K(配列番号778)、配列L(配列番号779)、配列M(配列番号780)、配列N(配列番号781)、配列O(配列番号782)、配列P(配列番号783)、配列Q(配列番号784）。
【図１１Ａ】図11A〜11Vは、ヒトTNFR1に対する結合特異性を有するいくつかのヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列を示す。記載したアミノ酸配列は、ギャップが無く連続的である；記号〜は、相補性決定領域（CDR）の位置を示すために配列中に挿入されている。CDR1は〜により、CDR2は〜〜により、CDR3は〜〜〜により挟まれる。
【図１１Ｂ】図１１Ａの続き。
【図１１Ｃ】図１１Ｂの続き。
【図１１Ｄ】図１１Ｃの続き。
【図１１Ｅ】図１１Ｄの続き。
【図１１Ｆ】図１１Ｅの続き。
【図１１Ｇ】図１１Ｆの続き。
【図１１Ｈ】図１１Ｇの続き。
【図１１Ｉ】図１１Ｈの続き。
【図１１Ｊ】図１１Ｉの続き。
【図１１Ｋ】図１１Ｊの続き。
【図１１Ｌ】図１１Ｋの続き。
【図１１Ｍ】図１１Ｌの続き。
【図１１Ｎ】図１１Ｍの続き。
【図１１Ｏ】図１１Ｎの続き。
【図１１Ｐ】図１１Ｏの続き。
【図１１Ｑ】図１１Ｐの続き。
【図１１Ｒ】図１１Ｑの続き。
【図１１Ｓ】図１１Ｒの続き。
【図１１Ｔ】図１１Ｓの続き。
【図１１Ｕ】図１１Ｔの続き。
【図１１Ｖ】図１１Ｕの続き。
【図１２Ａ】図12A〜12Bは、マウスTNFR1に対する結合特異性を有するいくつかのヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列を示す。記載したアミノ酸配列は、ギャップが無く連続的である；記号〜は、相補性決定領域（CDR）の位置を示すためにいくつかの配列中に挿入されている。CDR1は〜により、CDR2は〜〜により、CDR3は〜〜〜により挟まれる。
【図１２Ｂ】図12Aの続き。
【図１】
2009519011.tif 000004
【図２】
2009519011.tif 000005
【図３】
2009519011.tif 000006
【図４】
2009519011.tif 000007
【図５Ａ】
2009519011.tif 000008
【図５Ｂ】
2009519011.tif 000009
【図５Ｃ】
2009519011.tif 000010
【図５Ｄ】
2009519011.tif 000011
【図５Ｅ】
2009519011.tif 000012
【図５Ｆ】
2009519011.tif 000013
【図５Ｇ】
2009519011.tif 000014
【図５Ｈ】
2009519011.tif 000015
【図５Ｉ】
2009519011.tif 000016
【図５Ｊ】
2009519011.tif 000017
【図５Ｋ】
2009519011.tif 000018
【図５Ｌ】
2009519011.tif 000019
【図５Ｍ】
2009519011.tif 000020
【図５Ｎ】
2009519011.tif 000021
【図５Ｏ】
2009519011.tif 000022
【図５Ｐ】
2009519011.tif 000023
【図５Ｑ】
2009519011.tif 000024
【図５Ｒ】
2009519011.tif 000025
【図５Ｓ】
2009519011.tif 000026
【図５Ｔ】
2009519011.tif 000027
【図５Ｕ】
2009519011.tif 000028
【図５Ｖ】
2009519011.tif 000029
【図５Ｗ】
2009519011.tif 000030
【図５Ｘ】
2009519011.tif 000031
【図５Ｙ】
2009519011.tif 000032
【図５Ｚ】
2009519011.tif 000033
【図６Ａ】
2009519011.tif 000034
【図６Ｂ】
2009519011.tif 000035
【図６Ｃ】
2009519011.tif 000036
【図６Ｄ】
2009519011.tif 000037
【図６Ｅ】
2009519011.tif 000038
【図６Ｆ】
2009519011.tif 000039
【図６Ｇ】
2009519011.tif 000040
【図６Ｈ】
2009519011.tif 000041
【図６Ｉ】
2009519011.tif 000042
【図６Ｊ】
2009519011.tif 000043
【図６Ｋ】
2009519011.tif 000044
【図６Ｌ】
2009519011.tif 000045
【図６Ｍ】
2009519011.tif 000046
【図６Ｎ】
2009519011.tif 000047
【図６Ｏ】
2009519011.tif 000048
【図６Ｐ】
2009519011.tif 000049
【図６Ｑ】
2009519011.tif 000050
【図６Ｒ】
2009519011.tif 000051
【図６Ｓ】
2009519011.tif 000052
【図６Ｔ】
2009519011.tif 000053
【図６Ｕ】
2009519011.tif 000054
【図６Ｖ】
2009519011.tif 000055
【図６Ｗ】
2009519011.tif 000056
【図６Ｘ】
2009519011.tif 000057
【図６Ｙ】
2009519011.tif 000058
【図６Ｚ】
2009519011.tif 000059
【図６ＡＡ】
2009519011.tif 000060
【図６ＢＢ】
2009519011.tif 000061
【図６ＣＣ】
2009519011.tif 000062
【図６ＤＤ】
2009519011.tif 000063
【図６ＥＥ】
2009519011.tif 000064
【図６ＦＦ】
2009519011.tif 000065
【図６ＧＧ】
2009519011.tif 000066
【図６ＨＨ】
2009519011.tif 000067
【図６ＩＩ】
2009519011.tif 000068
【図６ＪＪ】
2009519011.tif 000069
【図６ＫＫ】
2009519011.tif 000070
【図６ＬＬ】
2009519011.tif 000071
【図６ＭＭ】
2009519011.tif 000072
【図６ＮＮ】
2009519011.tif 000073
【図６ＯＯ】
2009519011.tif 000074
【図６ＰＰ】
2009519011.tif 000075
【図６ＱＱ】
2009519011.tif 000076
【図６ＲＲ】
2009519011.tif 000077
【図６ＳＳ】
2009519011.tif 000078
【図６ＴＴ】
2009519011.tif 000079
【図６ＵＵ】
2009519011.tif 000080
【図６ＶＶ】
2009519011.tif 000081
【図６ＷＷ】
2009519011.tif 000082
【図６ＸＸ】
2009519011.tif 000083
【図６ＹＹ】
2009519011.tif 000084
【図６ＺＺ】
2009519011.tif 000085
【図６ＡＡＡ】
2009519011.tif 000086
【図６ＢＢＢ】
2009519011.tif 000087
【図７Ａ】
2009519011.tif 000088
【図７Ｂ】
2009519011.tif 000089
【図７Ｃ】
2009519011.tif 000090
【図７Ｄ】
2009519011.tif 000091
【図７Ｅ】
2009519011.tif 000092
【図８】
2009519011.tif 000093
【図９Ａ】
2009519011.tif 000094
【図９Ｂ】
2009519011.tif 000095
【図１０】
2009519011.tif 000096
【図１１Ａ】
2009519011.tif 000097
【図１１Ｂ】
2009519011.tif 000098
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2009519011.tif 000100
【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
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【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
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【図１１Ｒ】
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【図１１Ｓ】
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【図１１Ｔ】
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【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
2009519011000001.app
【国際調査報告】
2009519011.tif 000121
2009519011.tif 000122
2009519011.tif 000123
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