(57)【要約】ＧＬＰ−１ペプチドを合成する新規な方法が案出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アゴニストペプチドを製造する方法であって：ここでの前記ペプチドは次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｒ５−（Ｒ６）ｗ−（Ｒ７）ｚ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｂ；
または次式のものであり、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｇｌｙ−Ｂ
ここで、
Ｂ＝−ＯＨ、または−ＮＨ２；
Ａ＝Ｈ−、Ａｃ−、Ｂｏｃ−、Ｆｍｏｃ−
Ｒ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、ｄｅｓアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、アルファ−フルオロメチル−ヒスチジン、またはアルファ−メチル−ヒスチジン；
Ｒ２＝−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、−Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）；
Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐ、最も好ましくはＡｓｐ；
Ｒ４＝−Ｌｙｓ、またはＡｒｇ；
Ｒ５＝−Ｇｌｙ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ；
Ｒ６＝Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙ；
Ｒ７＝Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＧｌｙ、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｙ；
Ｒ８＝ＧｌｙまたはＡｉｂ
であり、
また、独立に、ｘ＝１の場合はｙ＝１で、またｚ＝１の場合はｗ＝１であることを条件として、ｘ、ｙ、ｗ、ｚは０または１であり、
個々のアミノ酸は任意に保護基を有していてよく、
前記方法は、
ａ．Ｆｍｏｃ保護され、更に任意に側鎖を適切に保護されたアミノ酸またはシュードプロリンジペプチドを含んでなるジペプチドを段階的に線型に結合させることによって固相上でペプチドを合成する工程であって、但し、一つの適切な配列位置において、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＨ，Ｈｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（ψＨ，Ｈｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択される第一のシュードプロリンジペプチドが成長するペプチド鎖に結合され、ここでのＰは、少なくとも８０％ＴＦＡの強酸性条件下で開裂する酸開裂性の保護基であり、好ましくは、Ｐはｔｅｒｔ−ブチルまたはトリチルである工程と；
ｂ．前記ペプチドを前記固相から開裂し、任意に該ペプチド鎖を脱保護する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、Ｆｍｏｃグリシジル残基としてまたはＦｍｏｃ−アミノアシルグリシジル残基としてカップリングされてよい少なくとも一つのグリシジル残基が、更に、その骨格Ｎα上でＮ−（ｏ，ｐ−ジアルコキシ−ベンジル）またはＮ−（ｏ−ヒドロキシ−ｐ−アルコキシ−ベンジル）またはＮ−（ｏ−アシロキシ−ｐ−アルコキシ−ベンジル）でＮ−保護されており、ここでのアシロキシおよびアルコキシは、それぞれ独立に、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシおよびＣ１〜Ｃ４−アシロキシであり、但し、前記グリシジル残基は、配列−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−または−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ψＨ，Ｈｐｒｏ）−の中に含まれておらず、またも憂い一つのシュードプロリンまたはＮα保護されたグリシジル残基から少なくとも二つの介在するアミノ酸残基によって離間されていることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、二つのシュードプロリンジペプチドが使用され、ここでの第二のシュードプロリンジペプチドは、第一のシュードプロリンジペプチドから少なくとも四つの介在アミノ酸残基だけ離間されており、且つ好ましくはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、合成において唯一のシュードプロリンジペプチド単位が使用され、好ましくは、成長するペプチド鎖にカップリングするためにＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨが使用されることを特徴とする方法。
【請求項５】
固相に結合されたＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アゴニストペプチドであって；ここでの前記ペプチドは次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｒ５−（Ｒ６）ｗ−（Ｒ７）ｚ−Ｓ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｓ
または次式のものであり、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｇｌｙ−Ｓ；
ここで、
Ｓ＝チオエステル、エステルまたはアミド基を介してＣ末端で、または該Ｃ末端アミノ酸がリジンであるときは任意に該リジンのε-アミノ官能基を介して共有結合的にペプチジル部分に結合された固相；
Ａ＝Ｈ−、Ａｃ−、Ｂｏｃ−、Ｆｍｏｃ−；
Ｒ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、ｄｅｓアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、アルファ−フルオロメチル−ヒスチジン、またはアルファ−メチル−ヒスチジン；
Ｒ２＝−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、−Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）；
Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐ、最も好ましくはＡｓｐ；
Ｒ４＝−ＬｙｓまたはＡｒｇ；
Ｒ５＝−Ｇｌｙ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ；
Ｒ６＝Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙ；
Ｒ７＝Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＧｌｙ、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｙ；
Ｒ８＝ＧｌｙまたはＡｉｂ
であり、
また、独立に、ｘ＝１の場合はｙ＝１で、またｚ＝１の場合はｗ＝１であることを条件として、ｘ、ｙ、ｗ、ｚは０または１であり、ここで少なくともＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐの個々の側鎖は塩基に不安定でなく、好ましくは酸で開裂可能な保護基を有しており、ＴｈｒまたはＳｅｒの場合に該保護基はシュードプロリン保護基であってよく、ここで独特の配列切片−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒにおける一つのＳｅｒはセリンのシュードプロリン−オキサゾリジン誘導体であり、好ましくは−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ  ｐｒｏ）−または−Ｓｅｒ（ψＨ，Ｈ  ｐｒｏ）−からなる群から選択されるペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の固相に結合されたペプチドであって、前記Ｓｅｒ（ψ−ｐｒｏ）−シュードプロリンは、前記ペプチドにおける唯一のシュードプロリン保護された残基であることを特徴とするペプチド。
【請求項７】
請求項５に記載の固相に結合されたペプチドであって、該ペプチドは少なくとも一つのダイニノシュードプロリン保護された残基を含んでおり、これは−Ｔｈｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−であるか、またはＴｈｒ（ψＨ，Ｈｐｒｏ）−であり、また独特の配列切片−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−の中に位置しており、好ましくは、前記ペプチドは二つだけのシュードプロリン保護された残基を含んでおり、これらは前記第一および第二のシュードプロリン残基であることを特徴とするペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ペプチド薬物の合成、即ち、ＧＬＰ−１ペプチドアゴニストの合成の分野に関する。
【０００２】
新規な分類の糖尿病薬、即ち、ＧＬＰ−１またはグルカゴン様ペプチド１アゴニストは、有望な新規分類の治療用化合物である。しかし、標準の固相ペプチド合成技術によるそれらの調製は、全てが容易なものではない。基本的に、ヒトＧＬＰ−１は、配列において、天然に存在するグルカゴンに関連している。能力を増大することを目的として、天然のＧＬＰ−１の僅かに修飾された種々の操作された配列変異体が文献に記載されてきた。
【０００３】
斯かるＧＬＰ−１ペプチドの調製は、ＷＯ０５／０２７９７８およびＷＯ０２／９０３８８に記載されている；しかし、非常に基本的で且つ標準のＦｍｏｃ固相法が、ペプチド合成のために用いられてきたに過ぎない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の出願人は、先行技術のアプローチが良好な収量を可能にしないことを見出したが、これは工業的製造のためには許容され得ないものである。明らかに配列に依存して、個々のカップリング工程は高度に非効率的であることが分かった。
【０００５】
本発明の目的は、ＧＬＰ−１ペプチドアゴニストを合成するためのもう一つの、または改善された方法を案出することである。この目的は、固相合成の際の独特の内部配列位置において、単一のＦｍｏｃアミノ酸だけの代わりに、Ｆｍｏｃシュードプロリンジペプチド単位の使用を含んでなる本発明の方法によって解決される。
【０００６】
本発明に従えば、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アゴニストペプチドを製造する方法が案出され、ここでの前記ペプチドは次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｒ５−（Ｒ６）ｗ−（Ｒ７）ｚ−Ｂ；
または次式のものであるか
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｂ；
または次式のものであるか、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｂ；
または次式のものであり、
Ａ−（Ｒ１）ｘ−（Ｒ２）ｙ−Ｒ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｒ８−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｒ４−Ｇｌｙ−Ｂ
ここで、
Ｂ＝−ＯＨ、または−ＮＨ２；
Ａ＝Ｈ−、Ａｃ−、Ｂｏｃ−、Ｆｍｏｃ−
Ｒ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、ｄｅｓアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、アルファ−フルオロメチル−ヒスチジン、またはアルファ−メチル−ヒスチジン；
Ｒ２＝−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、−Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）；
Ｒ３＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐ、最も好ましくはＡｓｐ；
Ｒ４＝−Ｌｙｓ、またはＡｒｇ；
Ｒ５＝−Ｇｌｙ、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ；
Ｒ６＝Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙ；
Ｒ７＝Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＧｌｙ、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｙ；
Ｒ８＝ＧｌｙまたはＡｉｂ
であり、
また、独立に、ｘ＝１の場合はｙ＝１で、またｚ＝１の場合はｗ＝１であることを条件として、ｘ、ｙ、ｗ、ｚは０または１であり、
個々のアミノ酸は任意に保護基を有していてよく、
前記方法は、
ａ．Ｆｍｏｃ保護され、更に任意に側鎖を適切に保護されたアミノ酸またはシュードプロリンジペプチドを含んでなるジペプチドを段階的に線型に結合させることによって固相上でペプチドを合成する工程であって、但し、−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−および／またはＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒであり、上記の配列式において下線で強調した独特の一つの適切な配列位置において、第一のシュードプロリンジペプチドが成長するペプチド鎖に結合され、該シュードプロリンジペプチドはＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＨ，Ｈｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（ψＨ，Ｈｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択され、ここでのＰは、水中の少なくとも８０％ＴＦＡの強酸性条件下で開裂する酸開裂性の側鎖保護基であり、好ましくは、Ｐは下記で定義する弱酸性条件下では開裂せず、最も好ましくは、Ｐはｔｅｒｔ−ブチルまたはトリチルである工程と；
ｂ．前記ペプチドを前記固相から開裂し、任意に該ペプチド鎖を脱保護する工程
を含んでなるものである。
【０００７】
ＧＬＰ−１ペプチドの活性は、配列における変化、主として、残基のある種の保存性置換を可能にする周辺配列要素の変化に対して高度に敏感である。明らかに、マイナーな変化でさえも、生物学的安定性または受容体結合性、従って薬理学的活性に対して予期しない影響を有する可能性がある。このようなことについての良好な総説が、文献（Sarrauste de Menthiere et al, European J. Medicinal Chemistry 39, 2004:473-480）の中に与えられている。ＧＬＰ−１ペプチド科のコア配列部分は、文字通り如何なる変化も許容しない。
【０００８】
このコア部分を含んでなる全長ペプチドもしくは部分的ペプチドの線型固相合成は、個々のカップリング工程が全く非効率的であり、反復したカップリングが殆ど不可能になるという大きな問題に遭遇する。カップリング時間の延長や、カップリング温度の上昇などは、ラセミ化または望ましくない副生成物を増大させる可能性が高い。
【０００９】
様々な著者（Sarrauste, supra, and Adelhorst et al. J. Biol. Chem. 269 (1994), 6275-6278）が、円偏光二色性分光学によって水溶液中の天然のＧＬＰ−１ペプチドの二次構造を分析し（例えば、Chen et al.. (1974) 「円偏光二色性による水溶液中のタンパク質のへリックスおよびβ形態の決定」 Biochemistry 13, 3350−3359； Greenfield, N. and Fasman, G. D. (1969) 「タンパク質コンホメーションの評価のためのコンピュータ処理された円偏光二色性」Biochemistry 8, 4108−4116）、折りたたまれない螺旋構造の遥かに大きな領域を除き、極めて低い含量（１０％）に過ぎないβシート構造がペプチド骨格の凝集を生じることを見出した。適用されたこの分光学的方法は、対応するＧＬＰ−１配列部分を前記構造要素に割り当てることを可能にしなかった。凝集、即ち、固相合成における問題は、当該技術においては、βシート構造の延長領域の頻度に相関すると一般に信じられている。βシート構造の低含量は、少なくとも１０アミノ酸長の殆どのペプチドに共通しており、合成方法にける如何なる異常な問題とも相関しない。
【００１０】
Ｆｍｏｃ−シュードプロリンジペプチド単位は、現在では商業的に入手可能であり、それらの合成が記載されている（例えば、Ruckle et al., Tetrahedron 1999, 55(37): 11281-11288; Keller et al., 1998, J. Am. Chem. Soc. 120:2714-2720）。前記シュードプロリンペプチドは、前記独特の中心配列切片または配列位置または部分配列−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−の中に少なくとも一つの中心セリン残基を導入するために使用され、該配列位置において部分配列−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−または−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−の代わりにシュードプロリンジペプチドを使用することを可能にし、これは本発明の本質であるが、これに加えて、最終的には更に第二のシュードプロリン残基を、部分配列-Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−または-Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−、好ましくは部分配列-Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−の中に導入する。本発明の前記シュードプロリンは、ＳｅｒまたはＴｈｒから誘導されたＮ−Ｆｍｏｃ−ペプチジル−（４Ｓ）−１，３−オキサゾリジンカルボキシレートであり、本発明の状況においては次式Ｉの共通の構造を有する。
【化１】
2009525997.tif 000002
【００１１】
ここで、Ｋは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、ここでのＳｅｒは更に、下記で定義する強酸性条件下で開裂する側鎖保護基Ｐを有しており；Ｒ１１、Ｒ１２は独立に、Ｈ、メチルまたはエチルであり、Ｒ１０はＨまたはメチルである。置換基Ｒ１１およびＲ１２の性質は、オキサゾリジンがその一部であるペプチドアミド結合のシス／トランス異性化に影響し、従って、合成の際に成長するペプチドの構造に積極的に作用するシュードプロリンの効果に影響する。
【００１２】
また、本発明の関連においてそれほど好ましいものではないが、シュードプロリン部分として、特別なカップリングおよび脱保護の化学を必要とするピログルタミン酸を使用することも可能である（Tomasini, C. et al. , Tetrahedron letters 2001, 42:5211-5214）。
【００１３】
更に好ましくは、上記で特定したＧＬＰ−１配列内の二つの中心Ｓｅｒ残基の何れか一つにおける前記第一の一つのシュードプロリン残基のみが、本発明の合成方法において用いられる。これは、合成の際に、第二のシュードプロリンジペプチド単位は用いられないことを意味している。最も好ましくは、本発明による固相合成に使用するための前記第一のシュードプロリンジペプチドは、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅ）−ＯＨである。
【００１４】
本発明の独特のシュードプロリンジペプチドの不存在下での、ＧＬＰ−１ペプチドの合成を探索する無益な比較例が実験セクションに記載されているが、これは本発明を動機付けた技術的問題を例示している。
【００１５】
ペプチド合成のためのカップリング試薬は、当該技術において周知である（Bodansky, M. , Principles of ペプチド Synthesis, 2nd ed. Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993; also see discussion of role of coupling additives or auxilliaries therein参照）。カップリング試薬は混合酸無水物（例えばＴ３Ｐ：プロパンホスホン酸無水物）、または活性化型エステルもしくは酸ハロゲン化物（例えばＩＣＢＦ、クロロギ酸イソブチル）のような他のアシル化剤であってよく、或いは、それらはカルボジイミド［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド］、活性化されたベンゾトリアジン誘導体［ＤＥＰＢＴ：３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン］、またはベンゾトリアゾールのウロニウムもしくはホスホニウム塩誘導体であってよい。
【００１６】
最良の収率、短い反応時間、および鎖延長の際のラセミ化に対する保護を考慮すると、カップリング試薬は、遊離カルボン酸官能基を活性化できるベンゾトリアゾールのウロニウム塩およびホスホニウム塩からなる群から選択されと共に、前記反応は塩基の存在下で行われるのがより好ましい。このようなウロニウムもしくはホスホニウムカップリング塩の適切且つ同様に好ましい例は、例えば、ＨＢＴＵ［Ｏ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルロニウム・ヘキサフルオロホスフェート］、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート］、ＰｙＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート］、ＰｙＡＯＰ、ＨＣＴＵ［Ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウム・ヘキサフルオロホスフェート］、ＴＣＴＵ［Ｏ−１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウム・テトラフルオロボレート］、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウム・ヘキサフルオロホスフェート］、ＴＡＴＵ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルロニウム・テトラフルオロボレート］、ＴＯＴＵ（Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−テトラメチルロニウム・テトラフルオロボレート）、ＨＡＰｙＵ［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシビス−（ピロリジノ）−ウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート］である。
【００１７】
好ましくは、前記塩基試薬は、ペプチドまたはアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のα−アミノ官能基を除き、その共役酸がｐＫａ７．５〜１５、より好ましくはｐＫａ７．５〜１０のｐＫａ値を有する弱塩基であり、また該塩基は、好ましくは三級の立体障害アミンである。このような更に好ましい例は、ヒューニッヒ塩基（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアニリン、２，４，６−トリアルキルピリジン、２，６−ジアルキルピリジン、またはＮ−アルキル−モルホリンであり（アルキルは直鎖もしくは分岐鎖のＣ１〜Ｃ４アルキルである）、より好ましくは、それはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）またはコリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）であり、最も好ましくはコリジンである。
【００１８】
カップリング添加剤、特に、ベンゾトリアゾール型のカップリング添加剤の使用もまた知られている（上記で挙げたBodansky参照）。それらの使用は、活性化の性質が高い先に述べたウロニウムもしくはホスホニウム塩カップリング試薬を使用するときに、特に好ましいものである。従って、更に好ましくは、カップリング試薬添加剤は、活性化されたエステルを形成でき、より好ましくは酸性の求核性Ｎ−ヒドロキシ官能基（ここでのＮはイミドまたはＮ−アシルもしくはＮ−アリル置換トリアゼンである）を有する求核性のヒドロキシ化合物であり、最も好ましくは、前記カップリング添加剤はＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体（もしくは１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体）またはＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン誘導体である。このようなカップリング添加剤のＮ−ヒドロキシ化合物は、ＷＯ９４／０７９１０およびＥＰ−４１０１８２に大規模に広く記載されており、そのそれぞれの開示を本明細書の一部として援用する。その例は、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）である。Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアジン誘導体が特に好ましく、最も好ましい実施形態においては、該カップリング試薬添加剤はヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンである。
【００１９】
カップリング添加剤のアンモニウム塩化合物が知られており、カップリング化学におけるそれらの使用は、例えばＵＳ４８０６６４１号に記載されている。
【００２０】
また、カップリング補助剤としてのその役割と同時に、合成の際のＡｒｇ側鎖保護のためのイオン対合試薬として、Ａｒｇの共有結合側鎖保護に対するオプションとして、例えばＨＯＢｔを用いることも可能である。その場合、固相合成の全ての周期的処理工程を通して、充分に高濃度のＨＯＢｔが維持されなければならない。
【００２１】
更なる特別に好ましい実施形態において、前記ウロニウムまたはホスホニウム塩カップリング試薬はウロニウム塩試薬であり、好ましくはＨＣＴＵ、ＴＣＴＵまたはＨＢＴＵであり、更に好ましくは、Ｎ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンまたはその塩との組合せにおいて当該反応に使用される。この実施形態は主に、塩基に不安定なＮα−保護基を除去した後の、ペプチド合成の鎖伸長工程での使用のために好ましいものであるが、側鎖を環化する際のラクタム化反応のために使用されてもよい。
【００２２】
本発明の関連において、ＨＣＴＵおよびＴＣＴＵは、結晶構造解析（O. Marder, Y. Shvo, and F. Albericio “HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications”, Chimica Oggi 2002, 20:37-41）によって、これらの化合物および可能な類似体がウロニウム部分ではなくイソニトロソ部分を含むことが示されており、またヘテロ環コア上のＮ−アミジノ置換基は代りにグアニジウム構造を生じるにもかかわらず、当該技術において通常理解されるように「ウロニウム塩試薬」の語に包含されるように定義されることに留意すべきである。この意味において、斯かる種類の化合物は、本発明によるウロニウム塩試薬の「グアニジウム型サブクラス」と称される。
【００２３】
塩基に不安定なＮαの脱保護は、例えば、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＰ）、ジクロロメタン（ＤＭＣ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンを用いて、当該技術において日常的に行われるように実施されてよい。固相合成の全ての工程について、当該技術においては、有機の無極性および非プロトン性溶媒の両方が日常的に適用される。
【００２４】
Ｆｍｏｃアミノ酸またはジペプチドは、カイザー試験によって決定可能な反応性固相結合アミノ官能基１当量あたり、好ましくは通常１〜３当量、より好ましくは僅か１〜２当量の斯かるＦｍｏｃアミノ酸試薬を用いて結合される。特に、ホスホニウムもしくはウロニウム型のカップリング試薬を使用する場合、カップリング温度は、通常は１５〜３０℃の範囲である。典型的には、カップリングのために約２０〜２５℃の温度が適用される。本発明の方法の利点は、過剰量の高価で且つ生物学的に危険な試薬を使用したり、本質的に反応流出物中の当該過剰物の殆どの浪費を余儀なくされたりすることなく、高収率の生成物または優れた純度のＧＬＰ−１生成物を可能にする合成方法を案出したことである。
【００２５】
主に、アミノ酸側鎖またはＮα−末端アミノ基の保護のための、保護基およびそれらの使用は当該技術において周知である（上記で挙げたBodanzsky参照）。Ｇｌｕ，Ａｓｐのために通常用いられるカルボキシ保護基は、例えば、Ｍｐｅ、Ｏ−１−アダマンチル、Ｏ−ベンジルであり、更に、通常はそれほど頻繁ではないが、単純なアルキルエステルを使用してよい。容易さのために、典型的に且つ好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチル基が使用される。チロシンは異なる保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチルエーテル、またはＺ−、更に好ましくは２−ブロモ−Ｚ−エステルによって保護されてよい。２−クロロ−トリチルまたは４−メトキシもしくは４，４’−メトキシ−トリチル基のようなトリチルアルコール保護基を使用することも等しく可能である。好ましくは、それはトリチル保護基またはｔｅｒｔ−ブチル保護基である。更に好ましくは、それは三級ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、これはチロシル側鎖が三級ブチルエステルに修飾されることを意味する。該ｔＢｕ基は、強酸性条件下でのみ効率的に除去される。アルギニン保護基は、好ましくは、２，２，４，６，７−ペンタメチレンジヒドロベンゾフラニルー５−スルホニル（Ｐｂｆ）、アダマンチロキシ−カルボニルおよびイソボルニル−オキシ−カルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチレンクロマンスルホニル−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）およびその４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３，５，６−テトラメチルホモログ（Ｔａｒｔ）またはＢｏｃからなる群から選択されてよく、これらは上記で定義した強酸性条件下でのみ開裂される。より好ましくは、それはＰｂｆ、Ｐｍｃ、Ｍｔｒであり、最も好ましくは、それはＰｂｆである；通常は水性媒質中における強酸性条件下での側鎖の全般的な脱保護に際し、Ｐｍｃ、Ｍｔｒおよび特にＰｂｆを用いると、脱保護されたチロシンの無関係なアルキル化は観察されない。Ｐｂｆの開裂速度は最も高い。ＨＯＢｔを用いた任意のイオン対合保護モードに対するヒントに留意されたい。Ｓｅｒ、Ｔｈｒは、典型的に且つ好ましくはｔｅｒｔ−ブチルまたはトリチル、最も好ましくはｔｅｒｔ−ブチルによって保護される。例えばベンジルを用いた他の保護モードが等しく可能であるが、これは結局、等しく望ましくない強酸性での水素化分解除去または長期インキュベーションを必要とするので、あまり好ましくない。同様の考察が、ＬｙｓまたはＮｏｒ−もしくはＨｏｍｏ−リジンに適用される；典型的且つ好ましくは、ＬｙｓはＢｏｃで保護される。Ｔｒｐは必ずしも保護されねばならないものではないが、典型的にはＢｏｃでの保護が好ましい。側鎖保護基に関しては、天然のＬアミノ酸並びにそれらのＤ−ホモログの両者について、上記で述べたものが有効である。
【００２６】
固相Ｓは、制御された孔サイズのガラス、シリカ、または更に一般的にはポリマー有機樹脂、例えばペプチドをそれに結合させるためのヒドロキシベンジル−フェニルの一体的リンカー部分と共にメリフィールド社によって使用される古典的なポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（ＰＳ樹脂）、またはヒドロキシ−ベンジル−ｐベンジロキシ部分と共にワング社（Ｗａｎｇ）により使用されるＰＳ樹脂のような、固体の不溶性支持体材料に等しいものとして理解される。ペプチドの結合のためのこのような官能基部位は、本発明においてはリンカーと称され、本発明に関しては、「固相」の用語により必須の特徴として暗黙のうちに意味されるものと理解される。もし必要であれば、他のリンカー部分、例えばより特殊化された、例えば酸に対してより不安定なリンカーが、予め作製された固相上の前記第一の一体的リンカーにグラフトされてよく、当該技術においては屡々「ハンドル」と称される。このようなリンカーまたはハンドル−樹脂複合体の更なる例は、それぞれのペプチド部分へのＯ−連結もしくはＮ−連結における、（４−メトキシフェニル）−アミノメチル−もしくは−ヒドロキシメチル−、および（４−メチルフェニル）−アミノメチル−もしくは−ヒドロキシメチル−ＰＳ固相（Atkinson et al., 2000, J. Org. Chem. 65, 5048）であり、樹脂からのペプチドの最終開裂の際に、Ｃ末端の酸またはカルボキサミド基の発生の両方を可能にする。本発明の目的について、合成に使用するための固相樹脂は、必ず、固相コア材料の一部である少なくとも一つの一体リンカーまたはハンドルを具備する；このようなリンカーまたはハンドルは、固相化された保護基と看做されてよい（Guillier et al., Chem.Rev.100,2091-2157,2000）。典型的には、不活性な固体支持体または樹脂を含んでなる所定の固相は、アミノ酸またはペプチドと共にアシル化を可能にするハンドル基のリンカーの化学的性質によって扱われる。
【００２７】
更に複雑なＰＥＧ−グラフトポリスチレン樹脂、例えば、異なるグラフト化ハンドルまたはリンカーを備えた入手可能なテンタゲル（tentagel）に基づくノバシン（Novasyn）ＴＧ（Novabiochem, Merck Biosciences, Germany）は、標準のＰＳ樹脂よりも両親媒性であり、また合成効率に影響する。本発明の内容において、リンカーもしくはハンドル部分、およびＰＥＧもしくは他のポリオキシアルキレン切片を欠いた、ＰＳ樹脂製ＰＥＧ固相の使用が好ましい。一体のまたはグラフトされたＰＥＧまたはポリオキシアルキレン樹脂、従って固相はそれほど好ましくなく、好ましくは本発明では権利放棄される。
【００２８】
本発明において使用される樹脂は標準のメッシュサイズ（ＵＳ標準局）のものであり、これは約５０〜５００メッシュ、より好ましくは１００〜４００メッシュである。
【００２９】
例えば文献（Holmes et al., 1995, J. Org. Chem. 60, 2318）に記載されたカルボキサミド発生性の光開裂可能なリンカーのような、光開裂可能なリンカーを使用することが可能である。もう一つの好ましい実施形態において、本発明の固相は、強酸性条件下での固相からのペプチドの開裂を可能にする。本発明に従う定義によって、弱酸性条件の逆である強酸性条件は、溶媒中の少なくとも５０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を適用することを意味する。更には、逆に、除去のために強酸性条件を必要とする保護基は、少なくとも８０％ＴＦＡによって除去できる保護基である。従って、ＨＦのような更に強い酸を必要とする保護基は、本発明に関して上記で述べた定義の支配を受けない。
【００３０】
弱酸性条件は、０．０１％（ｖ／ｖ）から５０％未満のＴＦＡ、好ましくは０．１％〜３０％のＴＦＡを有することによって定義される。「酸に不安定な」の用語は、ジクロロメタン中の２〜１０％ＴＦＡにおいて、周囲温度において少なくとも１時間で本質的に定量的に開裂することを意味する。
【００３１】
本発明の特別な内容において、固相から開裂され且つ殆どまたは完全に脱保護された上記で特定したＧＬＰ−１ペプチドは、主として共通に用いられる溶媒または溶媒混合物と共に、泡状でゲル状の溶液を生じる。このようなゲル状溶液を取り扱うことは、特に固相から分離させるための濾過操作に伴って、材料の顕著な喪失を容易に生じる。好ましい実施形態において、該固層は、上記で定義した弱酸性条件下で、酸に不安定な固相を使用して、未だ保護されているペプチドから開裂される固相である。斯かるモードにおいて、最初に、当該ペプチドは固相から開裂され、次いで第二の工程において、上記で定義した強酸性条件下で側鎖が脱保護される。
【００３２】
一つの更なる好ましい実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、Ｃ末端カルボキサミドとして樹脂から遊離される。斯かるカルボキサミド発生樹脂の例は、例えばＰＡＬ樹脂［５−（４−アミノ−メチル−３，５−ジヒドロキシフェノキシ）バレリン酸エステル］、ジーベル樹脂（Sieber, P. 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2107）、または関連のキサンテニルアミド型樹脂（例えばＵＳ５３０６５６２）、リンクアミド樹脂（Rink, H. 1987, Tetrahedron Lett. 28:3787）、ＢＡＬ樹脂［4-(4-ホルミル-3,5-ジメトキシフェノキシ)-酪酸エステル, Tetrahedron Lett. 43:3543］であり、好ましくは、ジーベル樹脂または他のキサンテニルアミド型樹脂またはＢＡＬ樹脂のような酸に不安定なカルボキシミド発生樹脂が使用され、これらはまた最も好ましい実施形態である。
【００３３】
もう一つの好ましい実施形態において、前記固相は、固相からの保護されたペプチドの開裂に際してＣ末端カルボン酸を放出する、酸に不安定な固相である。両方の例およびこのような更に好ましい実施形態は、２’−クロロ−トリチル、４−メトキシもしくは４，４’−ジメトキシ−トリチル，４−メチルトリチル樹脂、またはベイヤーの4-カルボキシトリチルリンカーを用いたアシル化によってアミノ−もしくはヒドロキシ官能化樹脂から誘導可能で、且つ例えばノバシンＴＧ樹脂（Novasyn TG resin）のブランドで販売されている、関連してはいるが異なる２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２，２−ジフェニル−アセチル樹脂である。更なる例は、例えば、酸に不安定なリンク酸樹脂（Rink acid resin）［4-(2’,4’-diメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ, Rink et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28,3787］、およびＨＭＰＢ樹脂［Sieber et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 6147; HMPB：4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシブチリル, 通常はリンクアミド樹脂またはその誘導体への二次ハンドルとして結合される］である。
【００３４】
最も好ましくは、本発明によるペプチドは、樹脂または樹脂ハンドルに対して、カルボキシ末端に結合される（Ｓ＝固相または樹脂、任意にハンドルを備えた樹脂）
更に好ましいのは、下記に列記した特別なペプチド配列、およびそれぞれのペプチド−固相複合体であり、これらは単独でも、または上記の更に好ましい実施形態との組合せであってもよい。
【００３５】
１．Ａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓ、またはＡ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２
２．Ａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓ、またはＡ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨもしくは−ＮＨ２
３．A−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓ、またはＡ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨもしくは−ＮＨ２
４．Ａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓ、またはＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ２
５．Ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＮｏｒＶａｌ−Ａｒｇ−Ｓ、またはＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＮｏｒＶａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ２；但し、ＮｏｒＶａｌはＮｏｒ−Ｌ−バリンであり、これはα−アミノイソ酪酸またはα−メチルアラニンであり、通常はアクロニム（akronym）−略語ではＡｉｂにより参照される。
【実験】
【００３６】
実施例１：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨを用いた、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨの合成
上記ペプチドは、線型Ｆｍｏｃ合成によって得られた。合成の過程で、シュードプロリンジペプチドＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ψＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ（Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Germany, Novabiochem brand productsから入手した)がＮ末端配列Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−にカップリングされる一つのカップリング工程を除き、カップリングされた全てのアミノ酸は、商業的に入手可能なＦｍｏｃ−モノアミノ酸であった。更なる例外として、最後のＨｉｓ残基はＢｏｃ−Ｈｉｓ残基としてカップリングされた；Ｈｉｓ側鎖には保護が与えられなかった。側鎖保護基が用いられた；列記の容易さのために、Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護の使用については更に言及しない：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｐ（ｔｂｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ｔｂｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔｂｕ）、Ｔｈｒ（ｔｂｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔｂｕ）。
【００３７】
３ミリモル規模での合成は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−クロロトリチルポリスチレン樹脂（即ち、Ｆｍｏｃ−グリシンを前負荷された２−ＣＴＣ樹脂, order number RAA-1039, Loading: > 0.5 mmol/mL, 100-200 Mesh, obtained from CBL-Patras, Greece）上で開始された。最初に、樹脂をジクロロメタンで膨潤させた。標準のＦｍｏｃ合成は、カップリングのために２〜２．５当量のＦｍｏｃアミノ酸を使用し、ジクロロメタン−Ｎ−メチルモルホリン（ＤＣＭ：ＮＭＰ＝１：３）の溶媒系中のジイソプロピルアミン／ＨＯＢｔの存在下において、２５℃で３０分のアミノ酸のＨＢＴＵ活性化を用いる。前活性化は行わずに、全ての試薬は単一工程において単純に混合された。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＮＭＰ中の２０％（ｗ／ｗ）ピペリジンによって達成され、続いてＮＭＰ洗浄によって塩基試薬を完全に除去した。洗浄効率はクロラニル試験によって評価された；洗浄は、カップリング前に、もはや青の着色が観察されなくなるまで繰り返した。全てのカップリングは良好に進行し、再カップリングは必要とされなかったが、末端Ｂｏｃ−Ｈｉｓは例外であった。これは、恐らくはＤＣＭ中での溶解性の問題によるものであり、共溶媒として小量のＤＭＳＯを添加することによって減少し得るであろう。カップリング効率は、位置Ｇｌｎ−１７についてのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）の代わりに、側鎖保護されていないＦｍｏｃ−Ｇｌｎを使用することによって、穏やかに更に改善できるであろう。
【００３８】
最初の工程では、ＤＣＭ中の２％ＴＦＡにおいて、０℃で少なくとも１０〜３０分間、Ｂｏｃ保護されたペプチドが樹脂から開裂された。各サイクルの後にピリジン処理および濯ぎを伴って、３回反復される１５分のＴＦＡサイクルが最も良好に作用することが示された。１％（ｓｗ／ｗ）のトリエチルシラン（ＴＥＳ）がスカベンジャーとして使用された。該反応は窒素バブリングによって撹拌された。開裂の後、反応ブロスを希釈ピリジン（ピリジン／エタノール、１：９（ｖ／ｖ））の中に注ぐことによって、ＴＦＡはピリジンを使用して中和された。樹脂をＤＣＭで濯ぎ、濾過により溶媒をストリップ除去した。ＤＣＭを減圧下で蒸留除去することによりＤＣＭからエタノールへの濾液の溶媒交換を行い、最後に水の添加により保護されたペプチドを沈殿させて濾過した。そのケーキを水で３回洗浄し、ペプチドを減圧下に室温で乾燥した。この段階において、７７％の収率に相当する約７７．３％面積（ＨＰＬＣにより評価したもの）の純度の物質が得られた。ＨＰＣＬ−ＭＳで観察された分子量は、理論的な予測質量に対応した。ＤＣＭのような標準溶媒中におけるこの生成物の溶解度は完全であった。
【００３９】
第二の工程においては、全般的な脱保護が開裂カクテル（「ＣＣ」）で希釈されたＤＣＭ［ＤＣＭ：「ＣＣ」＝１：１０（ｖ／ｖ）］の中で行われた。ＧＬＰ−１ペプチドについては、脱保護の際のペプチドの溶解度を最適化するために、純粋なＤＣＭよりも、純粋なＤＣＭの１部当たり０．１〜１部のトリフルオロエタノールの添加が最適であることが分かった。「ＣＣ」は、混合率（％ｗ／ｗ）が８９：２．５：２．５：５．０：１．０のＴＦＡ／チオアニソール／フェノール／水／ＴＥＳで作成された。先の開裂工程からの乾燥生成物は、上記で述べたように「ＣＣ」を用いて希釈された１０ｍＬのＤＣＭ中に溶解され、室温で５時間撹拌された。次いで、５０ｍＬのメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（MTBE, Fluka Chemie, Buchs/Switzerland）を添加し、該反応を水浴中で３０分間０℃に冷却し、その間に形成された塩沈殿物を濾過することにより、該生成物を回収した。この濾過ケーキをＭＴＢＥで数回濯ぎ、次いで室温で乾燥して、ＨＰＬＣにより測定したときの純度が９５％の粗製生成物０．８ｇを得た。工程２および３の全体に亘る合計収率は、７５％であった。
【００４０】
実施例２（比較例）：シュードプロリンの不存在下での、Ｎ末端断片Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（断片１〜１６）の合成
最初に、より短い断片のみが合成されるように設定した点を除き、本質的には実施例１に記載したようにして、前記小断片の固相合成を実施した。各カップリング反応について２．５〜３当量のアミノ酸を使用して、１５〜９のアミノ酸を容易に全てカップリングした。しかし、以下のＦｍｏｃアミノ酸８〜１は幾つかの問題を提起した：二つの位置においてのみ、カップリングは同様の容易さで進行した。全ての他の位置は、少なくとも２回の反復したカップリングサイクルを必要としたが、それでも純度３０％を超える充分な収率を可能にしなかった。この問題の重要性を評価するために、また過度のラセミ化の普通に知られた側面を無視するために、剪断力カップリングアプローチは、４当量のアミノ酸を使用し、少なくとも一般にラセミ化傾向の低いアミノ酸のカップリングのための温度を３０〜４０℃に増大させ、代わりにより活性な６−Ｃｌ−ＨＯＢｔを使用した。しかし、それでも定常的な再カップリングが必要とされ、カップリング効率自身の改善は観察できなかった。樹脂からの開裂は、該断片が非常に独特な溶解挙動を有することが示されたことを除き、実施例１に記載したように第一の工程において２％ＴＦＡ中で進行した。保護された未開裂断片は、ピリジンの添加後にゲルを形成した。結局、ピリジンは、濾過工程の後、濾液にのみ添加することが必要とされた；ＤＣＭ蒸留は、ゲルを形成して至るところに固体を残し、収率を劇的に低下させるので、非常に困難であることが分かった。水を添加すると固体が形成され、これは単離することができた。しかし、前記固体生成物をその後に再度可溶化させることは困難であることが示された：この保護された断片は、ＤＣＭ、ＴＨＦ、アセトニトリル、およびこれらの混合物中において主として不溶性である。ＴＨＦ中のＬｉＣｌの添加は溶解度を改善しなかった。該ペプチドは、ＮＭＰ、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中に僅かしか溶解せずに、より合理的な濃度でゲル様の外観を与え、従って収率について最適未満であることが分かっている高度の希釈下で研究することが必須であることが示された。
【国際調査報告】
2009525997.tif 000003
2009525997.tif 000004
2009525997.tif 000005
2009525997.tif 000006