(57)【要約】本明細書に記載する形態は、アルファヘリックス構造を欠くストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）表面タンパク質Ａおよび表面タンパク質Ｃの免疫原性部分を提供する。
2009525047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファヘリックス構造を欠くストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）または表面タンパク質Ｃ（ＰｓｐＣ）の精製した免疫原性ポリペプチド。
【請求項２】
アルファヘリックス構造を欠くＰｓｐＡまたはＰｓｐＣ分子の非−プロリン・ブロックのアミノ酸配列を有する精製した免疫原性ポリペプチド。
【請求項３】
DLKKAVNEPEKPAEEPENPAPAPKPAPAPQPEKPAPAPAPKPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKAEKPAPAPVPKPEQPAPAPKTGWGQENGMW [配列番号：1]; 
DLKKAVNEPETPAPAPAPAPAPAPTPEAPAPAPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPAPAPKPEKPAEKPAPAPKPETPKTGWKQENGMW [配列番号：2]; 
MAKKAELEKTPEKPAEEPENPAPAPQPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKA [配列番号：3]; 
EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号：4]、および前記のいずれかの免疫原性ホモログ、部分、フラグメント、変異型または誘導体
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するストレプトコッカス・ニューモニエ表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）または表面タンパク質（ＰｓｐＣ）の精製した免疫原性ポリペプチド。
【請求項４】
アルファヘリックス構造を欠く（ＰｓｐＡ）または（ＰｓｐＣ）の免疫原性ポリペプチドを含むワクチン。
【請求項５】
該部分が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４、またはそれらの免疫原性ホモログ、部分、フラグメント、変異型、または誘導体のアミノ酸を有するポリペプチドからなる請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
ＰｓｐＡまたはＰｓｐＣポリペプチドの免疫原性非−アルファヘリックス領域をコードする精製した核酸。
【請求項７】
ＤＮＡ配列：
GACCTTAAGAAAGCAGTTAATGAGCCAGAAAAACCAGCTGAAGAGCCTGAGAATCCAGCTCCTGCACCAAAACCAGCGCCGGCTCCTCAACCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCTGCACCAAAACCAGAGAAGTCAGCAGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAACCGCTTGACTCAACAGCAACCGCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCTGTACCAAAACCAGAGCAACCAGCTCCCGCACCAAAAACGGGCTGGGGACAAGAAAACGGTATGTGG [配列番号：10]; 
GACCTTAAGAAAGCAGTTAATGAGCCAGAAACTCCAGCTCCGGCTCCAGCCCCAGCTCCAGCTCCAGCTCCAACTCCAGAAGCCCCAGCTCCAGCTCCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGCTCCAGCTCCAGCTCCGGCTCCTAAACCAGAAAAGCCAGCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCTAAACCAGAAACTCCAAAAACAGGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGG [配列番号：11];
ATGGCTAAAAAAGCTGAATTAGAAAAAACTCCAGAAAAACCAGCTGAAGAGCCTGAGAATCCAGCTCCAGCACCACAACCAGAGAAGTCAGCAGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACCCAACAGCAACCGCCAAAAGCA [配列番号：12];
GAGAAGTCAGCAGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACCCAACAGCAACCG [配列番号：13];または
GAGAAGTCAGCAGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAACCGCTTGACTCAACAGCAACCG [配列番号：14]
を有する請求項６記載の核酸。
【請求項８】
請求項６または７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項６記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
該ポリペプチドを産生する請求項９または請求項１０記載の宿主細胞からポリペプチドを調製する肯定を含む、ＰｓｐＡまたはＰｓｐＣポリペプチドの非−アルファヘリックス領域を構成する免疫原性ポリペプチドを製造する方法。
【請求項１２】
請求項３記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生することができる宿主細胞。
【請求項１３】
ＰｓｐＡまたはＰｓｐＣポリペプチドの非−アルファヘリックス領域を構成する少なくとも１の有効量の免疫原性ポリペプチドを投与することを含む、患者を免疫化する方法。
【請求項１４】
アミノ酸配列：EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号：4]を含む精製した免疫原性ポリペプチド。
【請求項１５】
MEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号：5];
EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQP [配列番号：8];
DLKKAVNEPEKPAEEPENPAPAPKPAPAPQPEKPAPAPAPKPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKAEKPAPAPVPKPEQPAPAPKTGWGQENGMW [配列番号：1];および
MAKKAELEKTPEKPAEEPENPAPAPQPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKA [配列番号：3]
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１４記載の免疫原性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦財政支援
本発明は、一部、NIH/NIAID契約番号ROl AI21543の下で連邦政府による資金供給を受けた。
【０００２】
本明細書に記載する態様は、分子免疫学、細菌学およびワクチン開発に関連する。より詳細には、種々の態様は、アルファヘリックス構造を欠いたストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）表面タンパク質Ａおよび表面タンパク質Ｃの抗原性および免疫原性部分に関する。
【背景技術】
【０００３】
ストレプトコッカス・ニューモニエはよく知られたヒト病原菌であり、主として若年の子供および高齢の成人の中で、肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症の主な病因因子である。被膜多糖（ＰＳ）に対する抗体は、同一の被膜血清型を発現している肺炎レンサ球菌に対して保護を提供し得る。最近の利用可能な肺炎レンサ球菌ワクチンは、複数の血清型の被膜ＰＳの混合物を含んでいる。例えば、１の肺炎レンサ球菌ワクチンは、２３の通常見出される血清型からの被膜ＰＳを含んでいる。最も近年に開発されたタイプのワクチンは、タンパク質分子にコンジュゲートした１１ないし１３の血清型からの被膜ＰＳを含んでいる。７価のコンジュゲートワクチンが合衆国において臨床的用途のために２０００人に導入され、子供および成人における侵襲性の肺炎レンサ球菌疾患の発病率を低下した。
【０００４】
肺炎レンサ球菌感染から子供および高齢者を保護するための別のアプローチでは、保護免疫応答を誘起し得るタンパク質抗原を用いる。かかるタンパク質はそれ自体でワクチンとして作用し得、首尾よい多糖−タンパク質コンジュゲートと結合して使用することができ、または、多糖成分の担体として作用することができる。肺炎レンサ球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）は、肺炎レンサ球菌ワクチンの潜在能力を有する免疫原性タンパク質として同定された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質ベースの肺炎レンサ球菌ワクチンの潜在能力としてのＰｓｐＡに関する研究の大部分は、コイル化したコイルタンパク質コンフォメーションを有すると予想される領域であるＰｓｐＡタンパク質のアルファヘリックス領域内に存在する交差保護エピトープに焦点を当てている。しかしながら、このアルファヘリックス領域は、ヒトの心臓および骨格筋のタンパク質と交差反応する抗体を誘起する潜在能力を有するかもしれないことが示唆されている。一方、成人が、幼少の間に自然に誘起された、リウマチ心疾患または自己免疫症候群に何ら関連しないＰｓｐＡ抗体を有する場合がある。それにもかかわらず、自己反応性の応答の危険性を最小限にする免疫原性である肺炎レンサ球菌表面ポリペプチドに対する要望が存在しつづけている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本明細書に記載する態様は、免疫応答を誘起することができるＰｓｐＡおよびＰｓｐＣポリペプチドの非アルファヘリックス領域を提供する。いくつかの形態において、これらのポリペプチドは、ワクチンの成分として用いた場合、肺炎レンサ球菌疾患に対する保護免疫を提供する。
【０００７】
他の形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
【０００８】
【化１】
2009525047.tif 000003
【０００９】
およびいずれか前記したものの抗原性または免疫原性ホモログ、部分、フラグメント、変異型または誘導体を有する。
【００１０】
本発明のもう１の態様は、ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣポリペプチドの非−アルファヘリックス領域を含むワクチンを提供する。他の態様において、ワクチンは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する１またはそれを超えるペプチド、ならびにその抗原性もしくは免疫原性ホモログ、部分、フラグメント、変異型または誘導体を含むことができる。
【００１１】
もう１の形態は、ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣポリペプチドの免疫原性非−アルファヘリックス領域をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、およびこれらの核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。もう１の形態は、ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣポリペプチドの免疫原性非−アルファヘリックス領域を産生する宿主細胞を提供する。
【００１２】
さらなる態様は、ＰｓｐＡまたはＰｓｐＣポリペプチドの非−アルファヘリックス領域を構成する免疫原性ポリペプチドを発現する宿主細胞から該ポリペプチドを調製する工程を含む該免疫原性ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１３】
もう１の態様は、ＰｓｐＡまたはＰｓｐＣポリペプチドの非−アルファヘリックス領域を構成する少なくとも１の免疫原性ポリペプチドの有効量を投与することを含む患者を免疫化する方法を提供する。
【００１４】
（図面の簡単な説明）
図１は、すべての知られている科およびクレードのＰｓｐＡ（および幾つかの例においてＰｓｐＣ）に共通する領域のマップを示す。それは、また、組換えＰｓｐポリペプチドＭＢ００１、ＰＡＣ００３、ＰＡＣ００１およびＮＰＢも示す。
図２Ａ−Ｅは組換えＰｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図３Ａ−Ｄは組換えタンパク質免疫原の態様のＰｓｐＡ−特異的部分を示す。
図４は本明細書に例示するマウス敗血症攻撃の結果のグラフ表示である。
図５Ａ−Ｃは、ＰｓｐＡ−特異的免疫原性ポリペプチドのChou−Fasman構造確率プロットを示す。
図６は、免疫原性ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドの実施例態様のアライメントを示す。
図７は、ＰｓｐＡのプロリンに富む領域で免疫化し、３型被膜３ＪＹＰ２６７０株で攻撃した後のデータを示す。
図８は、ｍＡｂ  ＫＬ６７がＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドのプロリンに富む領域の非−プロリンブロックに特異的であることを示す染色ゲルおよび対応するウエスタンブロットを示す。
図９は、肺炎レンサ球菌の幾つかの菌株に対するｍＡｂ  ＫＬ６７の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）結合からのデータを示す。
図１０は、ＷＵ２野生型およびＰｓｐＡおよびＨｉｅまたは被膜を欠く突然変異株に対するｍＡｂ ＫＬ６７のＦＡＣＳ結合からのデータを示す。
図１１は、ＴＩＧＲ４野生型株および被膜、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣまたはＰｓｐＡおよびＰｓｐＣの両方を欠く突然変異株に対するｍＡｂ  ＫＬ６７のＦＡＣＳ結合からのデータを示す。
図１２Ａ−Ｂは、多様なｐｓｐＡおよびｐｓｐＣ遺伝子中の非−ｐｒｏブロックの配列における類似性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明が、本明細書に記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬ほかに限定されるものでないことは理解され、それ自体変化し得る。本明細書で用いる用語は特定の形態を記載する目的のみのためであって、特許請求の範囲によって唯一定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲で用いる単数形の用語は、文章が明らかに示していない限り、複数の指示を含む。したがって、例えば、ポリペプチドに対する指示は、当業者に知られているその等価物を含む、１またはそれを超えるかかるポリペプチドに対する指示である。作動する例以外においてまたは別段指摘しない限り、本明細書において用いる成分の量または反応条件を表すすべての数字は、「約」なる用語によってすべての例において修飾されていると理解すべきである。「約」なる用語は、パーセンテージと結合して用いる場合、±１％を意味し得る。
【００１７】
同定したすべての特許および他の刊行物は、例えばかかる刊行物に記載された方法を本発明と結合して使用することができることを説明または開示することを目的として、出典明示して本明細書の一部とみなす。これらの刊行物は、本願の出願日以前のそれらの開示について唯一提供される。これに関して、発明者は先行技術またはいずれの他の理由によってかかる開示が前に起こることの資格を何ら与えるものでないことを意図する。現在までのすべての陳述またはこれらの書類の内容についての表示は、出願人に入手可能な情報に基づき、これらの書類の日付または内容の正確さとしていずれの承認も構成するものではない。
【００１８】
別段定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。いずれの知られている方法、デバイスおよび材料も抗原性または免疫原性非−アルファヘリックスＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリヌクレオチドの形態を実施または試験するのに用いることができるが、これに関する幾つかの方法、デバイスおよび材料を本明細書に記載する。
【００１９】
ストレプトコッカス・ニューモニエはグラム陽性の、槍状形状をした球菌（わずかに尖った外側の曲線を有する細長い球菌）である。通常、それらは一対の球菌（双球菌）のように見えるが、それらは単独で短い鎖でも生息し得る。血液寒天培地で培養した場合、それらはα溶血的である。個々の細胞は０.５マイクロメートルないし１.２５マイクロメートル径である。それらは胞子を形成せず、非運動性である。他の連鎖球菌と同様に、それらはカタラーゼを下記、グルコースを乳酸に発酵する。他のレンサ球菌とは異なり、それらはＭタンパク質を提示せず、それらはインスリンを加水分解し、それらの細胞壁組成はそれらのペプチドグルカンおよびそれらのテイコ酸組成の両方の観点から特徴的である。
【００２０】
エス・ニューモニエは、主に若年の子供および高齢の成人のなかで、よく知られたヒト病原菌であり、肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症の主要な病因因子である。FedsonおよびMusher，VACCINES 第2版. (PlotkinおよびMortimer編, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1994)。多糖からなる被膜は、肺炎レンサ球菌の細胞を完全に覆っている。侵入の間、被膜は必須の病原決定因子である。被膜は、細菌細胞のＣ３ｂオプソニン作用を妨害することによってファゴサイトーシスを妨げる。抗−肺炎レンサ球菌ワクチンは、非常に流行している菌株に由来する種々の被膜（多糖）抗原の処方に基づいている。
【００２１】
エス・ニューモニエは、血清学的に異なる炭水化物被膜の発現に基づいて９０の血清型に分けられている。Henrichsen, 33 J. CLlN. MICROBIOL. 2759-62 (1995)。被膜多糖（ＰＳ）に対する抗体は、同一の被膜血清型を発現している肺炎レンサ球菌に対して保護を提供し得る。最近利用可能になった肺炎レンサ球菌ワクチンは、複数の血清型の被膜ＰＳの混合物を含んでいる。例えば、１の肺炎レンサ球菌ワクチン（ＰＳワクチンと呼ばれる）は、２３の一般的に見出される血清型からの被膜ＰＳを含んでいる。Robbinsら, 148 J. INFECT. DlS. 1136-59 (1983)。最近開発された型のワクチン（コンジュゲートワクチンと呼ばれる）は、タンパク質分子にコンジュゲートした７ないし１３の血清型からの被膜ＰＳを含んでいる。WuorimaaおよびKayhty, 56 SCAND. J. IMMUNOL. 111-29 (2002)。７価のコンジュゲートワクチンが合衆国における臨床使用のために２０００年に紹介され、子供における侵襲性の肺炎レンサ球菌疾患の発病率を低下している。Whitney, 348 N. ENGL. J. MED. 1737-46 (2003)。
【００２２】
肺炎レンサ球菌感染から子供も高齢者も保護する別のアプローチは、保護免疫応答を誘起し得るタンパク質抗原を用いる。かかるタンパク質はそれ自体でワクチンとして作用することができ、首尾よい多糖−タンパク質コンジュゲートと結合して用いることができ、または多糖成分のキャリアーとして作用し得る。肺炎レンサ球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）は、肺炎レンサ球菌ワクチンの可能性を有するタンパク質として同定されている。例えば、米国特許第6,592,876号;第 6,500,613号;および第5,997,882号を参照されたい。実際、ＰｓｐＡタンパク質または該タンパク質の部分は、特にコレラ毒素のようなアジュバントと一緒に、粘膜または経口投与した後に保護免疫応答を誘起した。米国特許第6,042,838号および第6,232,116号を参照されたい。
【００２３】
また、ＰｓｐＡは、それがマウスにおいて保護的なマウス、サルおよびヒト抗体を誘起し；すべての肺炎レンサ球菌によって生成され；補体沈殿を妨害し；ラクトフェリンを結合し（アポラクトフェリン殺菌を阻害する）；および血清学的に変わりやすく、なお交差反応性であるため、魅力のある標的でもある。
【００２４】
潜在的なタンパク質に基づく肺炎レンサ球菌ワクチンとしてのＰｓｐＡを使用するアプローチは、しばしば、ＰｓｐＡタンパク質のアルファヘリックス領域（コイル化したコイルタンパク質コンフォメーションを有すると予想される領域）内に見出される交差保護エピトープに焦点が当てられている。しかしながら、このコンフォメーションは、骨格筋および／または心臓からの損傷したヒト筋肉タンパク質と交差反応する抗体を誘起する可能性を有するかもしれない。例えば、Cunningham, 8 FRONT. BIOSCI., 533-43 (2003); Cunningham, 40 MOL. IMMUNOL., 1 121-27 (2004); KrishnerおよびCunnimgham, 227, SCIENCE, 413-15 (1985)を参照されたい。したがって、これは、肺炎レンサ球菌ワクチン中の免疫原としてＰｓｐＡを用いることに関心を生じた。しかしながら、このことは、おそらく、成人がストレプトコッカス・ニューモニエに遭遇した幼少期の過程で自然に生じたＰｓｐＡに対する存在する抗体を有し得るという知見と均衡をとらなければならない。これらの本来の抗体は、リューマチ心疾患または自己反応性免疫症候群と関係がないことが示されている。
【００２５】
本明細書における形態は、抗−ミオシン交差反応抗体を誘起しそうがなく、かつ、いずれかのこの型の予め存在する抗体を刺激しそうにないプロリンに富む領域またはコリン結合領域のような、ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣタンパク質の免疫原性非−コイル化コイル領域を提供する。本明細書において使用するＰｓｐＡおよびＰｓｐＣアミノ酸配列、ペプチド分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ならびにＰｓｐＡまたはＰｓｐＣ部分またはフラグメントは、（本発明のポリペプチドの二次または三次構造は確かに本発明の範囲にあるが）ミオシンのコイル化コイル構造をなお欠いている免疫応答を誘起することができるＰｓｐＡまたはＰｓｐＣ遺伝子（または複数の遺伝子）によってコードされるアミノ酸配列をいうのに類義的に使用することができる。事実、本明細書の形態は、保護抗体を誘起することができる、ＰｓｐＣにも見出されるＰｓｐＡの非−アルファヘリックス領域を提供する。アルファヘリックス領域内からのＰｓｐＡおよび／またはＰｓｐＣのこれらの小さな部分はコイル化コイルを形成する能力を欠いていてもよい。それらの小さなサイズでも保護を誘起する能力を保持しているからである。これらのポリペプチドは、肺炎レンサ球菌細胞から収集することができ、あるいは、当該技術分野でよく知られている組換え技術を用いて得ることができる。したがって、これらのＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ部分は、タンパク質−ベースの肺炎レンサ球菌ワクチン開発の良好な候補とし得る。
【００２６】
そのために、組換えＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドを用いてマウスを免疫した。マウスはつづいて致死容量の生エス・ニューモニエで攻撃した。保護応答は、延長した生存時間によって判定した。これらのデータは、プロリンに富む領域のコリン結合領域ならびに非−ｐｒｏブロックのプロリンに富む範囲が保護を誘起し得ることを示した。これらの領域は、可能な抗−ミオシン反応に関係しているコイル化コイル構造を欠いている。
【００２７】
本形態の範囲内に存在するのは、非−コイル化コイル抗原性ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣポリペプチドの誘導体である。「誘導体」とは、天然のポリペプチドの抗原性または免疫活性のいずれかを保持している本来のＰｓｐＡおよびＰｓｐＣ非−アルファコイル・ポリペプチドの修飾を包含することを意図する。該語は、限定するものではないが、そのアミノ酸配列がそのタンパク質のまたはその活性部分のものと同一または実質的に同一である（すなわち、望ましいレベルの抗原性を実質的に低下しない様式において異なる）、または、置換基を欠いているまたは異なる置換基を有している（例えば、グルコシル化を欠いているまたはグリコシル化において異なる）、組換えＤＮＡまたは他の精製技術によって作製した部分、フラグメント、またはタンパク質の複合体、ペプチド、ポリペプチド、または融合パートナータンパク質、および、タンパク質またはかかるフラグメント、オリゴマー、ポリペプチド、ならびに融合タンパク質およびキャリアータンパク質を包含することを意図する。かかるポリペプチドおよび誘導体の創製および使用は等外技術分野においてよく知られている。
【００２８】
また、本発明に用いるタンパク質コード領域も、本明細書に記載するペプチドの変異型（アゴニスト）を生じる標準的な分子生物学的技術を用いて存在するＰｓｐＡまたはＰｓｐＣ遺伝子を改変することによっても、本発明において使用するタンパク質コード領域を提供し得ることも意図される。かかる変異型には、限定するものではないが、当該技術分野でよく知られているＰｓｐＡ／ＰｓｐＣペプチドのアミノ酸配列における欠失、付加および置換が含まれる。
【００２９】
例えば、置換の１つのクラスは、同類アミノ酸置換である。かかる置換は、同様の特徴の他のアミノ酸によってペプチド中の所定のアミノ酸を置換するものである。典型的には、同類置換としては、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＨｅの中での１から他のものへの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの中での置換である。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントでありそうなことに関する案内は、Bowieら, 247 SCIENCE 1306-10 (1990)に見出される。
【００３０】
変異型またはアゴニストペプチドは、完全に機能的なものであっても、または１またはそれを超える活性で機能を欠いているものであってもよい。完全に機能的な変異型は、典型的には、同類変化または重要でない残基または重要でない領域の変化のみを含む。機能的変異型は、機能において全く変化を生じないかまたは重要でない変化を生じる同様なアミノ酸の置換も含むことができる。あるいは、かかる置換は、幾分かの程度で機能に対して正または負の影響を及ぼし得る。
【００３１】
非−機能的変異型は、典型的には、１またはそれを超える非−保存性アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、または切頭、あるいは極めて重要な残基または領域中の置換、挿入、逆位または欠失を含む。
【００３２】
機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的突然変異導入法またはアラニン−スキャニング突然変異導入法のような当該技術分野で知られている方法によって同定することができる（Cunninghamら, 244 SCIENCE 1081-85 (1989)）。後者の手法は、分子の各々の残基に単一のアラニン変異を導入する。ついで、得られた突然変異分子を、エピトープ結合性またはイン・ビトロ(in vitro)ＡＤＣＣ活性のような生物活性について試験する。リガンド−受容体結合に重要である部位は、結晶学、核磁気共鳴または光アフィニティーラベリング法のような構造解析によっても決定することができる（Smithら, 224 J. MOL. BIOL. 899-904 (1992); de Vos ら, 255 SCIENCE 306-12 (1992)）。
【００３３】
また、ポリペプチドは２０種類の「天然に生じる」アミノ酸以外のアミノ酸を含む場合がある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、当該技術分野でよく知られているプロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然方法、または化学修飾技術によって改変し得る。知られている修飾には、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘモ基の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が含まれる。
【００３４】
かかる修飾は当業者によく知られており、科学刊行物に非常に詳細に記載されている。幾つかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基の水酸化およびガンマ−リボシル化ならびにＡＤＰ−リボシル化は、例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties (第2版, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 1993)のような最も基本的なテキストに記載されている。この主題については、Wold, POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, 1-12 (Johnson編, Academic Press, New York 1983); Seifterら, 182 METH. ENZYMOL. 626-46 (1990);およびRattanら, 663 ANN. N.Y. ACAD. SCI. 48-62 (1992)のような多くの詳細なレビューが入手可能である。本発明のペプチドの二次および三次構造は、当該技術分野でよく知られている多くの技術のいずれかによって決定することができ、あるいは、例えば、図５Ａ−Ｃに示すようなChou-Fasman二次構造解析のようなよく知られた方法によって予想することができる。
【００３５】
したがって、本発明のペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされていない、置換基が以前に言及したように含まれる（peg化のような）誘導体またはアナログも含む。
【００３６】
同様に、アミノ酸配列の付加および置換ならびに変異、およびたった今記載した修飾は、当該技術分野でよく知られている方法によって本発明のタンパク質に対して生起し得る抗−ＰｓｐＡ抗体および／または抗−ＰｓｐＣ抗体のアミノ酸配列に等しく適用可能であり、したがって本発明に包含される。
【００３７】
本明細書に記載する非−アルファヘリックスＰｓｐＡペプチドおよび対応するＰｓｐＣペプチドは、免疫応答を生成し得る。「免疫応答」なる用語は、細胞傷害性Ｔ−細胞応答および／または抗原に特異的な抗体の血清レベルの上昇、または抗原に対する中和抗体の存在をいう。実際には、免疫応答は、ヒト肺炎レンサ球菌感染からヒト対象を保護するワクチンとして本発明の抗原が有用となるのに十分となり得る。また、本発明の抗原によって生成した抗体は抽出し、体液試料中の細菌を検出するために使用することができる。本明細書において「保護」または「保護免疫」なる用語は、感染因子、例えばヒトのエス・ニューモニエによって引き起こされる疾患に対して（部分的または全体的に）保護する、免疫化の間に誘導された血清抗体および／または細胞傷害性Ｔ−細胞応答の能力をいう。ワクチンにおける免疫原性ポリペプチドの使用は、重篤な臨床症状を防ぐことが知られている肺炎レンサ球菌に対する抗体を誘導することによって重篤な肺炎レンサ球菌感染症に対してヒトに保護免疫を提供することが予想される。
【００３８】
もう１の形態において、免疫原性非−アルファヘリックスＰｓｐＡ／ＰｓｐＣペプチドはもう１のハプテンにコンジュゲートし、その結果、そのハプテンの有効なタンパク質キャリアーまたはアジュバントとして作用する。ハプテンとは、生化学、遺伝学または計算的手段によって同定した疾患特異的な抗原性決定因子をいう。ハプテンは、エス・ニューモニエまたは細菌、ウイルス、細胞内寄生体、菌類およびトランスフォーム（ガン性または前ガン性の）細胞によって引き起こされる疾患症状と関連し得る。
【００３９】
本発明は、肺炎レンサ球菌−媒介疾患に対して患者に免疫応答および保護免疫を提供する方法を含む。方法には、本発明のＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ抗原を動物またはヒトに投与することが含まれる。本発明のＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ抗原は、好ましくは有効量の抗原を含む処方として投与する。種々の生理学的に許容し得るキャリアーが当該技術分野で知られており、それには、例えば、塩類溶液が含まれる。受容者対象に保護免疫を提供するための投与経路、投与量および投与頻度は、当業者に知られている。投与経路には受容者に保護免疫を付与するいずれの方法も含まれ、限定するものではないが、吸入、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮内および皮下が含まれる。好ましくは、本発明の抗原は、皮下または筋肉内注射によってヒト対象に供する。投与の量および頻度の範囲は、受容者の保護免疫が達成される限り容認し得る。例えば、５μｇないし２０μｇを、３ヶ月間にわたって１ないし４回筋肉内注射することによって投与し得る。
【００４０】
したがって、本明細書で提供する新規な免疫原性ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドは、ワクチンまたは肺炎レンサ球菌ワクチンの開発において有用になり得る。例えば、当該ポリペプチドは、単独で、成分として、または多糖コンジュゲートワクチン用のタンパク質キャリアーとしてのいずれかで、ワクチンに入れることができる。例えば、米国特許第5,866,135号; 第5,773,007号;および第6,936,252号を参照されたい。
【００４１】
本発明のＰｓｐＡ／ＰｓｐＣフラグメントに対して生起した抗体もここに包含される。例えば、ＫＬ６７と命名したモノクローナル抗体は、ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ非−アルファヘリックス・ポリペプチドの非−ｐｒｏブロック部分に結合する。交差保護（異なる被膜型を示し、固有のＰｓｐＡ／ＰｓｐＣがワクチンにおけるものとは同一でない領域を示すさらなる菌株に対する保護）を誘起する抗−ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣペプチド抗体の能力は、さらなる免疫化およびさらなる攻撃菌株を用いる攻撃実験によって決定して、広い交差保護を証明する。マウスおよびウサギのような免疫化した動物からの血清を、マウスを受動的に保護する能力について試験して、該保護が主に誘起した抗体を介したものであるかを決定する。保護はさらなるマウスモデル（肺炎およびキャリッジ（carriage）モデル）でさらに特徴付けし、Ｔ−細胞が保護に関与する可能性を決定する。
【００４２】
また、保護抗体を誘起し得るＰｓｐＡ／ＰｓｐＣの最小部分は、肺炎レンサ球菌感染症のマウスモデルで同定し得る。これは、存在する免疫原領域からの小さな組換え部分、フラグメントまたはポリペプチドを作製して最小有効エピトープを決定することによって行う。
【００４３】
免疫化マウスからの血清は、補体沈着を向上するおよび／またはラクトフェリン死滅を向上する能力、保護的であることが見出された他の抗−ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ抗体と関連付けられている活性についても試験する。両方の活性は、１のＰｓｐＡ／ＰｓｐＣフラグメントによって誘起されることが見出し得、１を超えるフラグメント、すなわち組み合わせて使用する異なるフラグメントが必要なのかもしれない。これらの実験は、ワクチン開発における保護の相関減少として使用する必要のあるアッセイを特定することを助けることができる。
【００４４】
したがって、例えば、コイル化−コイル構造を欠いている免疫原性ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドの特定の形態は、アミノ酸配列：
【００４５】
【化２】
2009525047.tif 000004
【００４６】
を有する。
配列EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号:4] は、ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣの非コイル化領域の他のプロリンに富む領域にプロリンアミノ酸残基を有さない非−ｐｒｏ−ブロック（ＮＰＢ）ともいう。このペプチドは、ＫＬ６７と命名したモノクローナル抗体との結合性によっても同定され、DLKKAVNEPEKPAEEPENPAPAPKPAPAPQPEKPAPAPAPKPEKSADQQAEEDYARR SEEEYNRLTQQQPPKAEKPAPAPVPKPEQPAPAPKTGWGQENGMW [配列番号:1]および
MAKKAELEKTPEKPAEEPENPAPAPQPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKA [配列番号:3]にも結合する。それ自体で、EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号:4]は、本明細書に開示する免疫原性ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣペプチドの例示的な部分として考えることができる。また、配列
MAKKAELEKTPEKPAEEPENPAPAPQPEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKA [配列番号:3]が、天然ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ配列の半−人工変異型または誘導体の例であり、天然配列ではそれに付加されたＳＭ−Ｉアミノ酸配列AAKKAELEKT [配列番号:5]を有することは注記する。後記する実施例１を参照されたい。
【００４７】
ＮＰＢのもう１の例示的な変異型は、アミノ酸配列
MEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 6]を有し、これは、発現ベクターにおいて発現し得る、アミノ末端にメチオニンを有する。
【００４８】
特定の形態は、アミノ酸配列MEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 6]を含む免疫原性組換えペプチドも提供する。ポジション５でＡがＶに置換されている同類アミノ酸置換を有するこの配列の変異型は、MEKSVDQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 7]である。
【００４９】
本明細書に記載する形態の前に、同様の構造を発現する多くのｐｓｐＡおよびｐｓｐＣ遺伝子が知られている（すなわち、EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 4]を有するか有しないＰＡＰ...反復性プロリンに富むストレッチ）。これらのペプチドのいずれかの末端のアミノ酸は、プロリンに富む領域の境界に印を付けている。領域のアミノ末端はDLKKA VNE... [配列番号: 8]であり、そのカルボキシ末端は (K/G)TGW(K/G)QENGMW [配列番号: 9]である。ＮＰＢを含むペプチドは免疫原性であり、ＮＰＢ（例えば、配列番号: 4）が重要なエピトープであり得ることを示唆している。アミノ酸のこの配列は、細菌の表面から抗体結合に近づき易いこともある。ＦＡＣＳデータを示す実施例３、図９を参照されたい。表面結合は保護に重要のようであり、将来のワクチン開発の因子である。
【００５０】
ＰＣＲに基づく事実は、アフリカ、アジアおよび南アメリカからの単離体におけるｐｓｐＣ遺伝子の約７７％、ｐｓｐＡ遺伝子の約５０％がＮＰＢ配列(例えば、EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 4]) またはこのペプチドの似たホモログであることを示している。したがって、これらのホモログは、別の形態を表す。また、ＮＰＢはワクチンが必要である大部分の細菌株の中に存在する共通エピトープを構成する。
【００５１】
非−アルファヘリックスＰｓｐＡ／ＰｓｐＣペプチド、ハイブリダイゼーション・プローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異誘発し、または増幅するためのＰＣＲプライマーの１またはそれを超えるものをコードする核酸も提供する。核酸はいずれの長さであってもよく、および／または、１またはそれを超えるさらなる配列、例えば調節配列を含むことができ、および／または、より長い核酸、例えばベクターの一部分となり得る。非−アルファヘリックスＰｓｐＡ／ＰｓｐＣペプチド、ハイブリダイゼーション・プローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異誘発し、または増幅するためのＰＣＲプライマーまたはシークエンシング・プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンス核酸、および前記のものの相補的配列の１またはそれを超えるものをコードする核酸も提供する。核酸はいずれの長さであってもよく、および／または１またはそれを超えるさらなる配列、例えば、調節配列を含むことができ、および／またはより長い核酸、例えばベクターの一部分となり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチドおよびその人工的変異型（例えば、ペプチド核酸）を含むことができる。
【００５２】
例えば、本明細書に包含される核酸（ＤＮＡ）には、以下の配列を有するＰＡＣ００１ペプチド（以下の実施例を参照されたい）をコードするものが含まれる。
【００５３】
【化３】
2009525047.tif 000005
【００５４】
ＰＡＣ００３ペプチドをコードする一例のＤＮＡは以下の配列を有する：
【００５５】
【化４】
2009525047.tif 000006
【００５６】
ＭＢ００１ペプチドをコードする一例のＤＮＡは以下の配列を有する：
【００５７】
【化５】
2009525047.tif 000007
【００５８】
（ＭＢ００１からの）ＮＰＢをコードする一例のＤＮＡは以下の配列を有する：
【００５９】
【化６】
2009525047.tif 000008
【００６０】
（ＰＡＣ００１における）ＮＰＢをコードする一例のＤＮＡは以下の配列を有する：
【００６１】
【化７】
2009525047.tif 000009
【００６２】
ここで、本発明を非限定的な実施例によってさらに記載する。
【実施例】
【００６３】
実施例１．組換えＰｓｐＡポリペプチド
幾つかの関連するＰｓｐＡポリペプチドを生成する組換えプラスミドを生成し、精製ｒＰｓｐＡタンパク質を提供するために使用した。生成したタンパク質を図１に示し、詳細なアミノ酸配列を図２Ａ−Ｅおよび図３Ａ−Ｄに提供する。簡単には、発現ベクターはマウスからのチオレドキシン遺伝子（ｔｒｘ）を含む。関心のあるペプチドをコードする遺伝子フラグメントは、チオレドキシンとのタンパク質融合物を生成する方法でクローン化する。図２Ａ−Ｅにおいて、下線を引いていないアミノ酸はベクターに由来するものである。下線を引いたアミノ酸はクローン化部分に由来するものである。ＰＥＴ３２ＡおよびＰＥＴ３２Ｂタンパク質は、「融合パートナー」という。
【００６４】
クローンｐＰＡＣ００１の構築およびＰｓｐＡ／ＡＣ９４ＡＡPro-richの精製
タンパク質はＰＡＣ００１（またはＰｓｐＡ／ＡＣ９４ｐｒｏ）と呼ぶ。この組換えタンパク質は、ＡＣ９４株からのｐｓｐＡ遺伝子のプロリンに富む領域を含む。これは、アミノ酸の２のプロリンに富むストレッチの中央にＮＰＢを有するプロリンに富む領域である。ＮＰＢはアミノ酸配列DQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 15]を有する。Robinsonら, 2001. 
【００６５】
ベクターの構築。ＰｓｐＡ／ＡＣ９４ProをコードするｐｓｐＡ.ＡＣ９４遺伝子の内部遺伝子フラグメント(Robinsonら, Clones of Streptococcus pneumoniae isolated from nasopharyngeal carriage and invasive disease in young children in Tennessee, 183 J. INFECT. DlS. (2001)を参照されたい）は、オリゴヌクレオチド5'GGGAGCCATGGCTGACCTTAAGAAAGCAGTTAATGAGCCA3' [配列番号: 16] (pspA27-Ncol)および5'CCGTCGACACCACATACCGTTTTCTTGTTTCCAGCC3' [配列番号: 17] (pspA22-Sall) (下線部は制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）認識部位)を用いてストレプトコッカス・ニューモニエからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。反応は、３.０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０ピコモルの各プライマー、および２.５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する合計体積５０ｍｌのカクテル中で３０サイクル行った。サイクルは、９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、５分とした。この増幅した遺伝子フラグメントをＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ついで、〜３００ｂｐのｐｓｐＡ遺伝子フラグメントを強力なＴ７プロモーターおよび翻訳シグナルを有するベクター（ｐＥＴ３２ａ, Novagen, Inc.）のＮｃｏＩおよびＳａｌＩ部位の間に組み入れた。ＤＮＡ配列は、組換えプラスミドｐＰＡＣ００１がベクターｐＥＴ３２ａ中のｔｒｘ遺伝子およびＨｉｓ−タグ部位の後に挿入された予想した３１５ｋｂｐのｐｓｐＡ遺伝子フラグメントを含むことを確認した。
【００６６】
プラスミドｐＰＡＣ００１はタンパク質生成用にイー・コリ（E．coli）ＢＬ２１ ＳＴＡＲ（ＤＥ３）株に形質転換した。この菌株は、誘導性ＵＶ５プロモーターの制御下のＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。ＩＰＴＧを用いて誘導すると、２８３のアミノ酸、そのうちの１０５はＰｓｐＡタンパク質のプロリンに富む領域に由来するもの、を含む組換えタンパク質が発現された。ｒＰＡＣ００１は、チオレドキシン（ベクターからの）とプロリンに富む領域との間のタンパク質融合物である。完全な組換えタンパク質の配列を以下に示す（イタリックはプロリンインサートのみを示す）。組換えタンパク質の中央に存在する６のヒスチジン残基を用いて、ニッケル・クロマトグラフィーによるその精製を単純化した。それはエンテロキナーゼによっても切断されて、ｔｒｘ融合パートナーからそれが遊離することが許容される。タンパク質は、ＰｓｐＡ−特異的部分の小さいサイズのために、免疫原性を確保するように作製した。ｒＰＥＴ３２ａタンパク質（ほとんどチオレドキシン）を免疫化プロトコールにおける陰性対照免疫原として用いる。
【００６７】
インサートのタンパク質配列は：
【００６８】
【化８】
2009525047.tif 000010
である。
【００６９】
チオレドキシン遺伝子およびＨｉｓタグ、ならびにＮ−末端およびＣ−末端のいくつかの配列はｐＥＴ３２ａベクター由来のものである。全アミノ酸の組成が本明細書に含まれており、１０５のアミノ酸はイタリックで、上段は本来のＰｓｐＡアミノ酸である。これらのアミノ酸の約１／４がプロリンであることは注目すべきである。ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで切断する前のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は以下のとおりである：
【００７０】
【化９】
2009525047.tif 000011
【００７１】
これには、プライマー上に存在していたＮｃｏＩ部位およびＳａｉＩ部位が含まれる（ＲＥ部位は上記配列中に下線を引いている）。ＰＡＣＯＯＩポリペプチドをコードする一例の核酸（ＤＮＡ）は以下の配列を有する：
【００７２】
【化１０】
2009525047.tif 000012
【００７３】
ＰＡＣ００１ポリペプチド内のＮＰＢをコードする一例の核酸配列は以下の配列を有する：
【００７４】
【化１１】
2009525047.tif 000013
【００７５】
計算分子量＝30531.77
概算ｐI＝5.56
アミノ酸組成：
非−極性              数              パーセント
A                      36              12.72
V                      8                2.83
L                      18               6.36
I                      9                3.18
P                      37              13.07
M                      7                2.47
F                      5                1.77
W                      4                1.41
【００７６】
極性                  数              パーセント
G                      21              7.42
S                      12              4.24
T                      11              3.89
C                      5               1.77
Y                      4               1.41
N                      8               2.83
Q                      13              4.59
【００７７】
酸性：                数              パーセント
D                      20              7.07
E                      22              7.77
【００７８】
塩基性：              数              パーセント
K                      24              8.48
R                      10              3.53
H                      9               3.18
【００７９】
ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＰｓｐＡのプロリンに富む部分に対する抗体価を決定する。ＥＬＩＳＡにおけるこの抗原の最初の試験、および融合パートナータンパク質（ｐＥＴ３２ａ）に指向された抗体応答を測定する。ＰｓｐＡ−特異的応答のデータを得るために、大部分のｐＥＴ３２ａ−特異的応答を阻害する阻害ＥＬＩＳＡを用いる。Ｂｉｏｒａｄプロテインアッセイによって決定した全タンパク質濃度に基づいて、Nunc MaxiSorpプレート(Nalge Nunc Int'l, Denmark)を、３μｇ／ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水中の組換えタンパク質で一晩コートする。対照ウェルは、同量のｐＥＴ３２ａ単独でコートする。１：１０００希釈のマウスをＥＬＩＳＡに用いる。非−特異的反応は、血清希釈を用いて３−１０μｇ／ｍＬのｐＥＴ３２ａタンパク質をそれに添加することによって阻害する。これは、血清希釈の全域において一定である。ＰｓｐＡクレードおよびファミリーに関するさらなる参考文献には、Hollingsheadら, 68 INFECT. IMMUN. 5889-900 (2000); Brilesら, 182 J. INFECT. DIS. 1694-1791(2000);およびBrilesら, 18 VACCINE 1707-11 (2000)が含まれる。ｐｓｐＣ遺伝子に関するさらなる情報は入手可能である。例えば、Brooks- Walterら, 67 INFECT. IMMUN. 6533-6542 (1999)を参照されたい。
【００８０】
クローンｐＰＡＣ００３の構築およびＰｓｐＡ／ＢＧ９７３９ＡＡPro-richの精製
タンパク質はＰＡＣ００３（またはＰｓｐＡ／ＢＧ９７３９Pro）と呼ぶ。この組換えタンパク質は、ＢＧ９７３９株からのｐｓｐＡ遺伝子のプロリンに富む領域を含む。これは、アミノ酸の２のプロリンに富むストレッチの中央にＮＰＢを有していないプロリンに富む領域である。ＮＰＢは配列番号：１５のものである。ＮＰＢはＰｓｐＡの免疫原性区画であり、したがって本発明者らは、この構築物を用いて、保護抗体がプロリンに富むエピトープまたはおそらくこの領域中の他のものと反応するかを区別した。
【００８１】
ベクターの構築において、ｐｓｐＡ／ＢＧ９７３９ＰｒｏをコードするｐｓｐＡ.ＢＧ９７３９遺伝子の内部遺伝子フラグメントを、配列番号：１６および配列番号：１７のオリゴヌクレオチドを用いてエス・ニューモニエＢＧ９７３９株からポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。反応は、ｐＰＡＣ００１の構築と同様に行った。ＤＮＡ配列は、組換えプラスミドｐＰＡＣ００３が、ベクターｐＥＴ３２ａ中のｔｒｘ遺伝子およびＨｉｓ−タグ部位の後に挿入された予想された３３４ｋｂｐのｐｓｐＡ遺伝子フラグメントを含むことを確認した。
【００８２】
プラスミドｐＰＡＣ００３はタンパク質生成のためにイー・コリ（E．coli）ＢＬ２１  ＡＩ（ＤＥ３）株に形質転換した。この菌株は、誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下のＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。アラビノースおよびＩＰＴＧで誘導すると、２８８アミノ酸を含む（そのうちの１１０はＰｓｐＡ  ＢＧ９７３９タンパク質由来である）組換えタンパク質が発現する。ｒＰＡＣ００３はチオレドキシン（ベクターからの）およびプロリンに富む領域の間のタンパク質融合物である。完全組換えタンパク質の配列を以下に示す（イタリックはプロリンインサートのみを示す）。組換えタンパク質の中央に存在する６のヒスチジン残基を用いて、ニッケル・クロマトグラフィーによるその生成を簡単にする。それはエンテロキナーゼによっても切断されて、ｔｒｘ融合パートナーからのその遊離を許容する。ＰｓｐＡ−特異的部分の小さいサイズのため、タンパク質をこのように作製して免疫原性を保証した。ｒＰＥＴ３２ａタンパク質（ほとんどチオレドキシン）を、免疫化プロトコールにおける陰性対照免疫原として用いる。
【００８３】
インサートのタンパク質配列は以下のとおりである：
【００８４】
【化１２】
2009525047.tif 000014
【００８５】
チオレドキシン遺伝子およびＨｉｓタグ、プラスＮ−末端の小部分およびＣ−末端の小部分は、ｐＥＴ３２ａベクター由来のものである。全アミノ酸組成は以下のとおりである。上記のアミノ酸配列のうち１０９（上方のイタリック）は本来のＰｓｐＡアミノ酸である。チオレドキシン遺伝子およびＨｉｓタグ、およびよりＮ−末端の小部分およびＣ−末端の小部分はｐＥＴ３２ａベクター由来のものである。全アミノ酸組成は以下のとおりである。上記のアミノ酸配列のうち１０９（上方のイタリック）は本来のＰｓｐＡアミノ酸である。その約１／３はプロリンである。ＮｃｏＩおよびＳａｉＩで切断する前のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は以下のとおりである：
【００８６】
【化１３】
2009525047.tif 000015
【００８７】
これは、プライマー上に存在していたＮｃｏＩ部位およびＳａｌＩ部位（ＲＥ部位は上記配列に下線を引いている）を含む。ＰＡＣ００３ポリペプチドをコードする関連する核酸（ＤＮＡ）は以下の配列を有する：
【００８８】
【化１４】
2009525047.tif 000016
【００８９】
計算分子量＝29795.33
概算ｐＩ＝8.48
アミノ酸組成:
非−極性：            数              パーセント
A                      48              16.78
V                      7                2.45
L                      17               5.94
I                      9                3.15
P                      53              18.53
M                      7                2.45
F                      5                1.75
W                      4                1.40
【００９０】
極性：                数              パーセント
G                      20              6.99
S                      10              3.50
T                      13              4.55
C                      4               1.40
Y                      2               0.70
N                      6               2.10
Q                      6               2.10
【００９１】
酸性：                数              パーセント
D                      18              6.29
E                      14              4.90
【００９２】
塩基性：              数              パーセント
K                      27              9.44
R                      7               2.45
H                      9               3.15
【００９３】
この構築物を用いて、ＰｓｐＡのこの部分が動物モデル系およびヒトにおいて保護抗体を誘起することができるかを試験することができる。また、これは、保護がどのくらい広いか (例えば、異なるＰｓｐＡ／ＰｓｐＣタンパク質を有する菌株に対して保護することができるか）を試験するのに有用である。それは、プロリンに富むエピトープとＰｓｐＡタンパク質のこの領域に入り得る他のものとを区別することができる。
【００９４】
クローンｐＭＢ００１の構築およびＰｓｐＡＳＭ−１  Ｐｒｏ−ｒｉｃｈの精製
タンパク質はＭＢ００１（またはＰｓｐＡＳＭ−ｌ_非−ｐｒｏ−ブロック）と呼ぶ。この組換えタンパク質は、ペプチドＳＭ−１（Shaperら, 72 Infect. Immun. 5031-40 (2004))に沿ったｐｓｐＡ遺伝子の幾つかのプロリンに富む領域に存在する非−ｐｒｏ−ブロック(Brooks- Walterら, 1999)、およびプロリンに富むセグメントからの幾つかの小さな残存物の両方を含む。ＮＰＢは配列番号：１５のアミノ酸配列を有し、ＳＭ−１と呼ぶ配列はAAKKAELEKT [配列番号: 7]である。
【００９５】
これらの２の領域は以下の知見のために興味深い：
（１）非−ｐｒｏブロック：その多くがこのブロックを含む種々のｒＰｓｐＣタンパク質での免疫化において、発明者らは、ＰｓｐＣを欠くが非常に類似する非−ｐｒｏ−ブロックを有するＰｓｐＡを有する攻撃菌株に対して免疫化および保護することができた。ＥＬＩＳＡにおいてＵＡＢ０５５およびＵＡＢ１０３（非−ｐｒｏ−ブロックによってのみ異なる２のタンパク質）を用いると、ｒＰｓｐＣでの免疫化がＵＡＢ１０３における非−ｐｒｏ−ブロックと反応する抗体を誘起することを見出した。種々のＢＣ１００型抗血清の中の交差反応の幾つかのスクリーンは、非−ｐｒｏ−ブロックが、それを取り巻く特異的なプロリンに富むセグメントよりもより免疫原性であることを示唆した。ブロックは、配列決定した２４のＰｓｐＡ遺伝子の中の１５に存在し、配列決定した１２のＰｓｐＣ遺伝子の中の１０に存在し；（２）ＳＭ−１ペプチド：アポ−ラクトフェリンは肺炎レンサ球菌を殺菌し得るが、この殺菌はＳＭ−１ペプチドによって阻害し得る（しかし、他のペプチドによってはされない）ことが見出された。このペプチドは、ＰｓｐＡがラクトフェリンに結合する領域を表し得る（または表し得ない）。この小さな領域は、ＰｓｐＡの４のクレード間のアライメントの最良に保存されたセグメントである：
【００９６】
クレード 1   I.. AKKAELEKA...EAD [配列番号: 22]
クレード 2   A..AKKAELEKT...EAD [配列番号: 23]
クレード 3   A..TKKAELEKT...QKE [配列番号: 24]
クレード 4   A..TKKAELEKT...QKE [配列番号: 25]
【００９７】
（３）ｐＭＢ００１におけるプロリンに富むセグメントに関連する領域：この構築物も、ブラジル株に由来する以下の小セグメントPEKPAEEPENPAPAPQPEKS [配列番号: 26]を有する。各プロリンに富むセグメントは菌株間で異なり得るが、PAPAP [配列番号: 27]およびPEKPA [配列番号: 28] は反復パターンで見られる場合がある。もう１のクローン化したタンパク質、ＰＡＣ００３は、この領域の抗原性を取り扱う。
【００９８】
ベクターの構築においては、内部遺伝子フラグメントをＥｃｏＲＩを用いて先のクローンから切断した（後記を参照されたい）。ｐＥＴ３２ｂはＥｃｏＲＩおよびホスファターゼで切断した。この２つを一緒に連結し、適当な向きについて形質転換体をスクリーニングした。スクリーニングは、プライマー5'GGTACCTGCTTTTGGCGGTTGCTG3' [配列番号: 29] CLlprol.を用いて行った。Ｔ７promプライマーと一緒に用いた場合、適当な向きの７８３ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られた。この向きにおいては、以下に示す融合タンパク質を生成する。ｐＭＢ００１、ＰｓｐＡ特異的部分に関連する配列
【００９９】
【化１５】
2009525047.tif 000017
【０１００】
このフラグメントはｐＧｅｍ−ＴからのＥｃｏＲＩによって切断したため、このポリヌクレオチド片はＥｃｏＲＩで切断したｐＥＴ３２ｂにインサートしてｐＭＢ００１を作製した。Ｔ７ｐｒｏｍと一緒にプライマーＣＬ１ｐｒｏ１を用いて（７８３ｂｐのＰＣＲフラグメントを与える）向きをチェックした。この向きにおいては、以下に示す融合タンパク質を生成する。
【０１０１】
【化１６】
2009525047.tif 000018
【０１０２】
【化１７】
2009525047.tif 000019
【０１０３】
上記に示したアミノ酸のうち、イタリックはｔｒｘタンパク質を示し；下線部はＨｉｓ−タグ・トロンビンＳ−タグ・エンテロキナーゼ領域を示し；非装飾文字はｐＧＥＭ−Ｔから運ばれてきた部分であり；太字はＳＭ１ペプチドおよびプロリン領域の部分を含むＰｓｐＡ関連部分を示す。
【０１０４】
例えば、ＤＮＡ配列は組換えプラスミドｐＭＢ００１がベクターｐＥＴ３２ｂ中のｔｒｘ遺伝子およびＨｉｓ−ｔａｇ部位の後にインサートされたｐｓｐＡ遺伝子（２の非連続フラグメント）からの１６２ｂｐを含む。これらは、最終組換えタンパク質中のＰｓｐＡの５４のＡＡに通じることを確認した。
【０１０５】
ｐＭＢ００１は、タンパク質産生のためにイー・コリ（E．coli）ＢＬ２１  ＳＴＡＲ（ＤＥ３）株に形質転換した。この菌株は誘導性ＵＶ５プロモーターの制御下にＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。ＩＰＴＧで誘導すると、２７５アミノ酸（そのうちの５４はＰｓｐＡタンパク質由来）を含む組換えタンパク質を発現する。ｒＰＡＣ００１はチオレドキシン（ベクターからの）およびプロリンに富む領域の間の融合タンパク質である。完全な組換えタンパク質の配列を以下に示す（イタリックのプロリンインサートのみ）。組換えタンパク質の中位に存在する６のヒスチジン残基を用いて、ニッケル・クロマトグラフィーによるその精製を単純化した。それはエンテロキナーゼでも切断して、ｔｒｘ融合パートナーからのその遊離を許容する。タンパク質をこのように作製して、ＰｓｐＡ−特異的部分の小さいサイズのために免疫原性を確実にした。ｒＰＥＴ３２ａタンパク質（大部分チオレドキシン）を免疫化プロトコールにおける陰性対照免疫原として用いる。
【０１０６】
ＭＢ００１ポリペプチドをコードする例示的な核酸（ＤＮＡ）は以下の配列を有する：
【０１０７】
【化１８】
2009525047.tif 000020
【０１０８】
また、ＮＰＢペプチドをコードする例示的な核酸（ＤＮＡ）は以下の配列を有する：
【０１０９】
【化１９】
2009525047.tif 000021
【０１１０】
計算分子量＝30141.38
概算ｐＩ＝5.40
アミノ酸組成:
極性                  数              パーセント
G                      21              7.42
非−極性：            数              パーセント
A                      27              9.82
V                      7               2.55
L                      26              9.45
I                      13              4.73
P                      22              8.00
M                      7               2.55
F                      5               1.82
W                      3               1.09
【０１１１】
極性：                数              パーセント
G                      17              6.18
S                      19              6.91
T                      19              6.91
C                      2               0.73
Y                      4               1.45
N                      10              3.64
Q                      10              3.64
【０１１２】
酸性：                数              パーセント
D                      20              7.27
E                      22              8.00
【０１１３】
塩基性：              数              パーセント
K                      21              7.64
R                      11              4.00
H                      10              3.64
【０１１４】
この構築物を用いて、ＰｓｐＡの部分（詳細にはＳＭ−１）を付加することが動物モデル系およびヒトにおいてプロリンに富むサブ区画のみを含む免疫原（ＰＡＣ００１またはＰＡＣ００３のような）と比較して動物モデル系およびヒトにおいて優れた保護抗体を誘起し得るかを試験した。保護の幅（例えば、それが異なるＰｓｐＡを有する菌株に対して保護し得るか）も決定し得る。
【０１１５】
クローンｐＣＤ１  ＮＰＢの構築およびＧＳＴ  ＮＰＢペプチドの精製
この構築物から発現したものをＧＳＴ  ＮＰＢ（または、別にＮＰＢタンパク質）と呼ぶ。この組換えタンパク質は、幾つかのＰｓｐＡおよび幾つかのＰｓｐＣ遺伝子のプロリンに富む領域に横たわるＮＰＢを含む。この特別の構築物はｐＰＡＣ００１（ＡＣ９４株）からクローン化した。ＮＰＢというアミノ酸配列は、例えば、MEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 6]である。このＮＰＢはこのポリペプチドの中の非常に免疫原性のセクションのようであり、保護的であり、被膜化した細胞の表面に結合する抗体を生起し得るようである。
【０１１６】
ベクターは以下のように構築した：ＰｓｐＡ／ＡＣ９４ＰｒｏをコードするＰｓｐＡ／ＡＣ９４Ｐｒｏ遺伝子の内部遺伝子フラグメントを、オリゴヌクレオチド5'-GACGACGACAAGATGGAGAAGTCAGCAGATCAA-3'[配列番号：33] (非-pro-L5)および5'-GAGGAGAAGCCCGGTTTACCGTTGCTGTTGAGTCAAGCG-3'[配列番号：34] (非-pro-R3-修正済み)を用いてｐＰＡＣ００１プラスミドからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。修正した配列はTAAを加えて終止コドンを提供する。ＰＣＲ反応は、最終濃度３.０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０.４μｍｏｌの各プライマーおよび０.４ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含有するカクテル合計体積５０ｍｌで３０サイクル行った。この反応からのアンプリコンは、ｐＥＴ４１の製造業者のプロトコールに従ってＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。サイクルは、９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、５分とした。この増幅したフラグメントは、強力なＴ７プロモーターおよび翻訳シグナルを含むベクター（ｐＥＴ４１  ＥＫ／ＬＩＣ，Novagen, Inc.）のＥＫ／ＬＩＣにライゲーション・インディペンデント・クローニングによって取り込ませた。ＤＮＡ配列は、予想される〜１１７ｂｐのｐｓｐＡ遺伝子フラグメントを含む組換えプラスミドｐＣＤ  ＮＰＢがベクターｐＥＴ４１  ＥＫ／ＬＩＣのＧＳＴ遺伝子およびＨｉｓ−ｔａｇ部位の後に挿入されたことを確認した。
【０１１７】
プラスミドｐＣＤ  ＮＰＢは、タンパク質産生のためにイー・コリ（E．coli）ＢＬ２１  ＳＴＡＲ（ＤＥ３）株に形質転換した。この菌株は、誘導性ＵＶ５プロモーターの制御下のＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。ＩＰＴＧで誘導すると、３０７アミノ酸を含む組換えタンパク質（そのうちの２８はＰｓｐＡタンパク質のプロリンに富む領域に由来する）を発現した。ｒＣＤ  ＮＰＢは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−タグ）（ベクターからの）とプロリンに富む領域の非−pro−ブロックとの間のタンパク質融合体である。完全な組換えタンパク質の配列を以下に示す（下線部）。組換えタンパク質の中位に存在する６のヒスチジン残基を用いて、ニッケル・クロマトグラフィーによるその精製を単純化した。それはトロンビンまたはエンテロキナーゼを用いても切断することができ、ＧＳＴ融合パートナーからのその遊離を許容する。タンパク質をこの様に作製して、ＰｓｐＡ−特異的部分の小さいサイズのために、免疫原性を確認した。ｒＰＥＴ４１タンパク質（大部分がＧＳＴ）を免疫化プロトコールにおける陰性対照免疫原として用いた。
【０１１８】
【化２０】
2009525047.tif 000022
【０１１９】
ＧＳＴ遺伝子、Ｈｉｓタグ、トロンビン部位、Ｓ−タグ、およびよりＮ−末端の先端部分はｐＥＴ４１  Ｅｋ／ＬＩＣベクターから来たものである。全アミノ酸組成を示す。２８のアミノ酸（非装飾文字、非下線）は非−pro−ブロックからの天然ＰｓｐＡアミノ酸である。
【０１２０】
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端をエキソ型で消化する前のＬＩＣ末端を有するＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は以下のとおりであった：
【０１２１】
【化２１】
2009525047.tif 000023
【０１２２】
これは、プライマー上に存在したＬＩＣ部位を含む（上記配列の下線部のＲＥ部位）。
計算分子量＝34983.93
概算ｐＩ＝5.58
アミノ酸組成:
非−極性：            数              パーセント
A                      18              5.88
V                      10              3.27
L                      30              9.80
I                      14              4.58
P                      16              5.23
M                      12              3.92
F                      10              3.27
W                      4               1.31
【０１２３】
極性：                数              パーセント
G                      25              8.17
S                      18              5.88
T                      11              3.59
C                      4               1.31
Y                      16              5.23
N                      5               1.63
Q                      11              3.59
【０１２４】
酸性：                数              パーセント
D                      26              8.50
E                      24              7.84
【０１２５】
塩基性：              数              パーセント
K                      25              8.17
R                      14              4.58
H                      13              4.25
【０１２６】
複数ｐｓｐＡおよびｐｓｐＣ遺伝子中の非−pro−ブロックの類似性を図１２Ａ−Ｂに示す。類似する配列を有するこれらのポリペプチドも、本明細書に記載する免疫原性非−アルファコイル化ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドの範囲に入る。これらのアミノ酸配列中の変化も、本明細書に記載する免疫原性ポリペプチドの誘導体、変異型または部分と考えることができる。
【０１２７】
クローンｐＣＤ４２  ＮＰＢの構築およびＧＳＴ  ＮＰＢペプチドの精製
このクローンから発現したタンパク質をＧＳＴ  ＮＰＢ（またはＮＰＢタンパク質）と命名した。組換えタンパク質は、幾つかのｐｓｐＡおよび幾つかのｐｓｐＣ遺伝子のプロリンに富む領域に埋め込まれたＮＰＢを含む。この特定のものは、ｐＰＡＣ００１（ＡＣ９４株）からクローニングした。この構築物のＮＰＢのアミノ酸配列はMEKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ [配列番号: 6]である。ＮＰＢは免疫原性であり、それに対する抗体は保護的であり、被膜化した細胞の表面にも結合する。
【０１２８】
ベクターの構築。ＰｓｐＡ／ＡＣ９４ＰｒｏをコードするＰｓｐＡ／ＡＣ９４Ｐｒｏ遺伝子１を、オリゴヌクレオチド
5'GACGACGACAAGATGGAGAAGTCAGCAGATCAA3'[配列番号: 37](非-pro-L5)および5'GAGGAGAAGCCCGGTTTACCGTTGCTGTTGAGTCAAGCG3'[配列番号：38](非-pro-R3-修正済み)を用いてｐＰＡＣ００１プラスミドからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。修正はＴＡＡを付加して終止コドンを提供した。ＰＣＲ反応は、３.０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、最終濃度０.４ユニットの各プライマー、および０.４ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含有するカクテル中、合計体積５０ｍｌで３０サイクル行った。この反応からのアンプリコンを、ｐＥＴ４１製造業者のプロトコールに従ってＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。サイクルは９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、５分とした。この増幅した遺伝子フラグメントは、強力なＴ７プロモーターおよび翻訳シグナルを含むベクター（ｐＥＴ４１  ＥＫ／ＬＩＣ，Novagen, Inc.）のＥＫ／ＬＩＣ部位にライゲーション・インディペンデント・クローニングによって取り込ませた。ＤＮＡ配列決定は、予想される〜１１７ｂｐのｐｓｐＡ遺伝子フラグメントを含む組換えプラスミドｐＣＤ  ＮＰＢがベクターｐＥＴ４１  ＥＫ／ＬＩＣのＧＳＴ遺伝子およびＨｉｓ−タグ部位の後に挿入されたことを確認した。
【０１２９】
タンパク質産生のために、プラスミドｐＣＤ４２  ＮＰＢをイー・コリ（E．coli）ＢＬ２１  ＳＴＡＲ（ＤＥ３）株に形質転換した。この菌株は、誘導性ＵＶ５プロモーターの制御下のＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。ＩＰＴＧで誘導すると、３０７のアミノ酸を含む組換えタンパク質（そのうちの２８はＰｓｐＡタンパク質のプロリンに富む領域に由来する）が発現する。ｒＣＤ  ＮＰＢは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−タグ）（ベクターからの）およびプロリンに富む領域の非−ｐｒｏ−ブロックの間のタンパク質融合体である。完全組換えタンパク質の配列を以下に示す（イタリックはインサートのみ）。組換えタンパク質の中位に存在する６のヒスチジン残基を用いて、ニッケル・クロマトグラフィーによるその精製を単純化する。それはトロンビンまたはエンテロキナーゼでも切断して、ＧＳＴ融合パートナーからのその遊離を許容する。タンパク質をこのように作製して、ＰｓｐＡ−特定部位の小さいサイズのために、免疫原性を確保した。ｒＰＥＴ４１タンパク質（大部分ＧＳＴ）を、免疫化プロトコールにおける陰性対照免疫原として用いる。
【０１３０】
インサートのタンパク質配列は以下のとおりである：
【０１３１】
【化２２】
2009525047.tif 000024
【０１３２】
ＧＳＴ遺伝子、Ｈｉｓタグ、トロンビン部位、Ｓ−タグ、およびよりＮ−末端の先端部分は、ｐＥＴ４１／ＬＩＣベクターから来たものである。全アミノ酸組成の分析は後記する。太字で示す２８の上記のアミノ酸は、ＮＰＢからの天然ＰｓｐＡアミノ酸である。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端をエキソ型で消化する前のＬＩＣ末端（イタリックの）を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は以下のとおりである：
【０１３３】
【化２３】
2009525047.tif 000025
【０１３４】
計算分子量＝34983.93
概算ｐＩ＝5.58
アミノ酸組成：
非−極性：            数              パーセント
A                      18              5.88
V                      10              3.27
L                      30              9.80
I                      14              4.58
P                      16              5.23
M                      12              3.92
F                      10              3.27
W                      4               1.31
【０１３５】
極性：                数              パーセント
G                      25              8.17
S                      18              5.88
T                      11              3.59
C                      4               1.31
Y                      16              5.23
N                      5               1.63
Q                      11              3.59
【０１３６】
酸性：                数              パーセント
D                      26              8.50
E                      24              7.84
【０１３７】
塩基性：              数              パーセント
K                      25              8.17
R                      14              4.58
H                      13              4.25
【０１３８】
実施例２  マウス免疫化実験
組換えタンパク質ＰＡＣ００１、ＰＡＣ００３およびＭＢ００１を用いてマウスＭＢ００１（非−proブロックを含むＳＭ−１およびＰＡＣ００１の１／２を含む）を免疫化した。マウスは、アジュバントとしてアルミニウムを用いて１０日間隔で３回皮下的に免疫化した。対照はアルミニウム単独で免疫化するか、または、アルミニウムおよび組換えタンパク質（方法が非−特異的免疫を生じない対照としての融合パートナー）で免疫化した。この場合に融合パートナーを用いる理由は精製を促進すること、および、ペプチドが十分な免疫原性を有するのに十分に大きいかを確かめるためである。その後に、マウスを尾部静脈注射によって静脈内的に送達する致死容量の生エス・ニューモニエ３ＪＹＰ２６７０で攻撃する。攻撃株は３の組換えタンパク質のいずれかを有する非−コグネイトであるＰｓｐＡを有し、したがって交差保護について試験した。図４および図７に反映するように、マウスが瀕死になるまでの時間を記録した。試験した３の免疫原の各々について、生存時間によって判断されるように保護応答を誘起した。
【０１３９】
図４を参照して、ＭＢ００１の結果はＰ＝０.０２１でアルミニウム対照から統計学的に異なった。ＰＡＣ００１の結果はＰ＝０.０００６でアルミニウム対照から統計学的に異なった。ＰＡＣ００３については、結果はアルミニウムから全く有意でなかった（０.０５３７）が、アルミニウム対照について１４のうちの２に対して、５のマウスのうちの３が生存した。この差は、より多くのマウスを用いた場合にはより顕著になったかもしれない。融合パートナーを用いた結果は、試験したマウスの数ははるかに少ないが、アルミニウムによって得たものと一致した。この実験から、ＰｓｐＡのプロリンに富む配列が保護を誘起し得ることが明らかであった。
【０１４０】
ｐＣＤ４２  ＮＰＢからの組換えタンパク質（ＧＳＴ  ＮＰＢ）を作製し、ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣペプチドのこの部分が動物モデル系およびヒトにおいて保護抗体を誘起し得るか否かを試験した。この活性が見出されれば、実験はその保護がどの位広いか（すなわち、それは異なるＰｓｐＡを有する菌株に対して保護し得るか）を示すであろう。さらに、例えば、抗体が被膜化した細胞に結合し得るか、抗体が補体沈着を増大し得るか、および、抗体は増殖している細胞のみに結合するのかは、ついで調べる。
【０１４１】
プロリンに富む領域は、それが非−pro−ブロックを含むか否かにかかわりなく、図５Ａ−Ｃに示すようにコイル化したコイル配列の部分ではないため、ミオシン中のコイル化−コイルタンパク質配列を含むそれらの中のエピトープを有するいずれの抗体交差反応も誘起しないにちがいない。
【０１４２】
実施例３  抗体結合実験
ＫＬ６７と命名したモノクローナル抗体は、幾つかのＰｓｐＡおよびＰｓｐＣタンパク質内に取り囲まれたプロリンに富む領域の非−プロリンブロックと特異的に結合することが判定された。ＰｓｐＡおよびＫＬ６７特異性のペプチドは染色ゲルおよび図８に示す対応するウエスタンブロットに示す。
【０１４３】
マウスＩｇＧにコンジュゲートしたＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリー分析によって検出したストレプトコッカス・ニューモニエ株に対するＫＬ６７の抗体結合性を、図９に示す。抗体は１／３に希釈し、示すのは３回実験の平均である。縦軸スケールの値は「対照よりも大きな倍数」であり、これは二次抗体のみで標識した細菌の蛍光で除した標識細菌の蛍光の比率である。菌株は脚注に記載し、それは示すようにＤ３９野生株、ならびにＰｓｐＡおよびＰｓｐＣまたは被膜の発現を欠いている突然変異株を含む。最初の３株は被膜化されている。Ｄ３９株においては、ＰｓｐＡ遺伝子およびＰｓｐＣ遺伝子の両方がｍＡｂ  ＫＬ６７によって認識されるＮＰＢを含むプロリンに富む領域を有している。
【０１４４】
マウスＩｇＧにコンジュゲートしたＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリー解析によって検出したストレプトコッカス・ニューモニエ株に対するＫＬ６７の抗体結合性のもう１の実験を図１０に要約する。抗体は１／３に希釈し、３回実験の平均を示す。縦軸スケールの値は「対照よりも大きな倍数」であり、二次抗体のみで標識した細菌の蛍光で除した標識細菌の蛍光の比率である。菌株を脚注に記載し、それは示すようにＷＵ２野生株、および、ＰｓｐＡおよびＨｉｃまたは被膜の発現を欠くＷＵ２突然変異株を含む。最初の３株は被膜化されている。ＷＵ２株においては、ＰｓｐＡ遺伝子のみがＫＬ６７によって認識されるＮＰＢを含むプロリンに富む領域を有する。
【０１４５】
マウスＩｇＧにコンジュゲートしたＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリー解析によって検出した、ＫＬ６７ニューモニエ株の結合性に対するさらなる実験を図１１に要約する。抗体は１／３に希釈し、３回実験の平均を示す。縦軸スケールの値は「対照よりも大きな倍数」であり、二次抗体のみで標識した細菌の蛍光で除した標識細菌の蛍光の比率である。菌株を脚注に記載し、それは示すようにＴＩＧＲ４野生株、および、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣ、その両方、または被膜の発現を欠く突然変異株を含む。最初の５株は被膜化されている。ＴＩＧＲ４株においては、ＰｓｐＣ遺伝子のみがｍＡｂ  ＫＬ６７によって認識されるＮＰＢを含むプロリンに富む領域を有する。ＰｓｐＡは有しない。
【０１４６】
これらの実験は、ｍＡｂ  ＫＬ６７が、幾つかのＰｓｐＡおよびＰｓｐＣ分子のプロリンに富む領域に存在するＮＰＢ領域を特異的に認識することを示している。ＰｓｐＡまたはＰｓｐＣのいずれかに関連するＮＰＢは、被膜２、被膜３および被膜４血清型を有する生エス・ニューモニエ上へのｍＡｂ  ＫＬ６７抗体に近づきやすい。さらに、ＰｓｐＡ上のＮＢＰは、ＰｓｐＣ不存在下および被膜不存在下の抗体にわずかにより近づきやすい。また、構築物ＰＡＣ００１に対して生起したポリクローナル血清は、肺炎レンサ球菌細胞の表面に結合する。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、すべての知られている科およびクレードのＰｓｐＡ（および幾つかの例においてＰｓｐＣ）に共通する領域のマップを示す。それは、また、組換えＰｓｐポリペプチドＭＢ００１、ＰＡＣ００３、ＰＡＣ００１およびＮＰＢも示す。
【図２−１】図２Ａ−Ｂは組換えＰｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図２Ｃ−Ｅは組換えＰｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３Ａ−Ｄは組換えタンパク質免疫原の態様のＰｓｐＡ−特異的部分を示す。
【図４】図４は本明細書に例示するマウス敗血症攻撃の結果のグラフ表示である。
【図５】図５Ａ−Ｃは、ＰｓｐＡ−特異的免疫原性ポリペプチドのChou−Fasman構造確率プロットを示す。
【図６】図６は、免疫原性ＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドの実施例態様のアライメントを示す。
【図７】図７は、ＰｓｐＡのプロリンに富む領域で免疫化し、３型被膜３ＪＹＰ２６７０株で攻撃した後のデータを示す。
【図８】図８は、ｍＡｂ  ＫＬ６７がＰｓｐＡ／ＰｓｐＣポリペプチドのプロリンに富む領域の非−プロリンブロックに特異的であることを示す染色ゲルおよび対応するウエスタンブロットを示す。
【図９】図９は、肺炎レンサ球菌の幾つかの菌株に対するｍＡｂ  ＫＬ６７の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）結合からのデータを示す。
【図１０】図１０は、ＷＵ２野生型およびＰｓｐＡおよびＨｉｅまたは被膜を欠く突然変異株に対するｍＡｂ ＫＬ６７のＦＡＣＳ結合からのデータを示す。
【図１１】図１１は、ＴＩＧＲ４野生型株および被膜、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣまたはＰｓｐＡおよびＰｓｐＣの両方を欠く突然変異株に対するｍＡｂ  ＫＬ６７のＦＡＣＳ結合からのデータを示す。
【図１２】図１２Ａ−Ｂは、多様なｐｓｐＡおよびｐｓｐＣ遺伝子中の非−ｐｒｏブロックの配列における類似性を示す。
【図１】
2009525047.tif 000026
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009525047.tif 000031
【図６】
2009525047.tif 000032
【図７】
2009525047.tif 000033
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009525047.tif 000036
【図１１】
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【図１２】
2009525047.tif 000038
【図１２−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月9日(2008.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009525047000001.app
【国際調査報告】
2009525047.tif 000040
2009525047.tif 000041
2009525047.tif 000042
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