(57)【要約】試料に含まれる少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの核酸を検出する方法が提供される。また、この方法を行うための試薬が提供される。種々の態様では、細胞において、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核酸を検出する方法が提供される。種々の態様では、細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解して細胞溶解物を生成し、近接検出アッセイを用いて、この細胞溶解物内の少なくとも１つの標的分析物を検出し、定量的核酸検出アッセイを用いて、この細胞溶解物内の少なくとも１つの標的核酸を検出する工程を含む方法が提供される。種々の態様では、少なくとも１つの標的分析物の検出と少なくとも１つの標的核酸の検出は、同一の容器で起こる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、
ａ）該細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解させて、細胞溶解物を生成する工程；
ｂ）近接検出アッセイを用いて、該細胞溶解物内の少なくとも１つの標的分析物を検出する工程；
ｃ）定量的核酸検出アッセイを用いて、該細胞溶解物内の少なくとも１つの標的核酸を検出する工程
を含み、ここで、（ｂ）および（ｃ）は同一の容器で行われる、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの標的分析物が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、およびホルモンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの標的分析物が、タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記近接検出アッセイが、
ａ）第１の近接検出プローブと第２の近接検出プローブとの間の相互作用を可能にする条件下で、該第１の近接検出プローブおよび該第２の近接検出プローブとともに前記細胞溶解物をインキュベートする工程；
ｂ）該第１の近接検出プローブと該第２の近接検出プローブとの間の相互作用を検出する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の近接検出プローブが、第１のオリゴヌクレオチド部分および第１の分析物結合部分を含み、ここで、前記第２の近接検出プローブが、第２のオリゴヌクレオチド部分および第２の分析物結合部分を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の分析物結合部分および前記第２の分析物結合部分が、同一の標的分析物に結合することができる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の分析物結合部分および前記第２の分析物結合部分が、異なった標的分析物に結合することができる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の近接検出プローブと前記第２の近接検出プローブとの間の相互作用が、前記第１のオリゴヌクレオチド部分と前記第２のオリゴヌクレオチド部分との間のハイブリダイゼーション、該第１のオリゴヌクレオチド部分と該第２のオリゴヌクレオチド部分との連結から選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の近接検出プローブと前記第２の近接検出プローブとの間の相互作用が、前記第１のオリゴヌクレオチド部分と前記第２のオリゴヌクレオチド部分との連結を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インキュベートする工程が、少なくとも１つのスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの標的核酸が、少なくとも１つのｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記定量的核酸検出アッセイが、逆転写およびリアルタイムＰＣＲを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの標的核酸のうちの少なくとも１つが、前記少なくとも１つの標的分析物のうち少なくとも１つをコードしている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記多機能性溶解緩衝液が、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記多機能性溶解緩衝液が、ＮＤＳＢ−２０１を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの標的分析物を検出する工程が第１のリアルタイムＰＣＲ反応を含み、前記少なくとも１つの標的核酸を検出する工程が第２のリアルタイムＰＣＲ反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞において、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、
ａ）該細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解させて、細胞溶解物を生成する工程；
ｂ）該細胞溶解物を
ｉ）少なくとも１つの近接検出プローブセットであって、ここで、各々の近接検出プローブセットは、少なくとも２つの近接検出プローブを含み、各々の近接検出プローブは、少なくとも１つの分析物結合部分および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分を含む、近接検出プローブセット；と
ｉｉ）少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチド；と
ｉｉｉ）少なくとも１つのリガーゼ
とともにインキュベートし、少なくとも１つの連結された近接検出プローブセットを形成する工程；
ｃ）該細胞溶解物を少なくとも１つのプロテアーゼとともにインキュベートする工程；
ｄ）該少なくとも１つの連結された近接検出プローブセットを検出する工程；ならびに
ｅ）少なくとも１つの標的核酸を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの標的分析物が、タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｄ）および（ｅ）が同一の容器で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
細胞において、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、
ａ）該細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解させて、細胞溶解物を生成する工程；
ｂ）該細胞溶解物を少なくとも１つの近接検出プローブセットとともにインキュベートし、少なくとも１つのハイブリダイズされた近接検出プローブセットを形成する工程であって、ここで、各々の近接検出プローブセットは、少なくとも２つの近接検出プローブを含み、各々の近接検出プローブは少なくとも１つの分析物結合部分および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分を含む、工程；
ｃ）該細胞溶解物を少なくとも１つのプロテアーゼとともにインキュベートする工程；
ｄ）該少なくとも１つのハイブリダイズされた近接検出プローブセットを検出する工程；
ｅ）少なくとも１つの標的核酸を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの標的分析物が、タンパク質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｄ）および（ｅ）が同一の容器で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記（ｂ）におけるインキュベートする工程が、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む多官能性溶解緩衝液。
【請求項２５】
ＮＤＳＢ−２０１を含む、請求項２４に記載の多官能性溶解緩衝液。
【請求項２６】
少なくとも１つの化学物質が、０．０５％〜５％の濃度で存在する、請求項２４に記載の多官能性溶解緩衝液。
【請求項２７】
ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む少なくとも１つの多官能性溶解緩衝液を含む、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核酸を検出するためのキット。
【請求項２８】
前記キットが、少なくとも１つのリガーゼを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記キットが、少なくとも１つの近接検出プローブセットを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記キットが、少なくとも１つのプロテアーゼを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３１】
前記キットが、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの検出プローブ、および少なくとも１つのポリメラーゼを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３２】
ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質、および少なくとも１つの近接検出プローブセットを含む多官能性溶解緩衝液を含む溶解物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００６年８月１日に出願された、米国仮出願第６０／８３５，１１８号の利益を主張する。米国仮出願第６０／８３５，１１８号は、あらゆる目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
分野
試料に含まれる少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの核酸を検出する方法が提供される。また、この方法を行うための試薬が提供される。
【背景技術】
【０００３】
ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどを含む、細胞溶解物に含まれるタンパク質を検出する様々な方法が、当該技術分野において知られている。また、ＲＴ−ＰＣＲなどを含む、細胞溶解物に含まれる核酸を検出する様々な方法が、当該技術分野において知られている。しかしながら、試料中の検出されるタンパク質および検出される核酸の相対量は比較することが困難であり、それは、それらの試料が、一般に、別々に、異なる方法によって調製されるためである。さらに、また、タンパク質および核酸に用いられる種々の検出法は、結果として、それらの相対量を相互に関連付けることを困難にする場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
種々の態様では、細胞において、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核酸を検出する方法が提供される。種々の態様では、細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解して細胞溶解物を生成し、近接検出アッセイを用いて、この細胞溶解物内の少なくとも１つの標的分析物を検出し、定量的核酸検出アッセイを用いて、この細胞溶解物内の少なくとも１つの標的核酸を検出する工程を含む方法が提供される。種々の態様では、少なくとも１つの標的分析物の検出と少なくとも１つの標的核酸の検出は、同一の容器で起こる。
【０００５】
種々の態様では、細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解して細胞溶解物を生成し、この細胞溶解物を、（ｉ）各々の近接検出プローブセットが少なくとも２つの近接検出プローブを含み、各々の近接検出プローブが少なくとも１つの分析物結合部分および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１つの近接検出プローブセット；（ｉｉ）少なくとも１つのスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）少なくとも１つの連結された近接検出プローブセットが形成されるように少なくとも１つのリガーゼとともにインキュベートする工程；この細胞溶解物を少なくとも１つのプロテアーゼとともにインキュベートする工程；少なくとも１つの連結された近接検出プローブを検出する工程；少なくとも１つの標的核酸を検出する工程を含む方法が提供される。
【０００６】
種々の態様では、細胞を多官能性溶解緩衝液に溶解して細胞溶解物を生成し、各々の近接検出プローブセットが少なくとも２つの近接検出プローブを含み、各々の近接検出プローブが少なくとも１つの分析物結合部分および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分を含み、その結果、少なくとも１つのハイブリダイズされた近接検出プローブセットが形成されるように少なくとも１つの近接検出プローブセットとともにインキュベートする工程；この細胞溶解物を少なくとも１つのプロテアーゼとともにインキュベートする工程；少なくとも１つのハイブリダイズされた近接検出プローブセットを検出する工程；少なくとも１つの標的核酸を検出する工程を含む方法が提供される。
【０００７】
種々の態様では、多官能性溶解緩衝液が提供される。種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む。
【０００８】
種々の態様では、少なくとも１つの標的分析物および少なくとも１つの標的核を検出するキットが酸提供される。種々の態様では、キットは、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む少なくとも１つの多官能性溶解緩衝液を含む。
【０００９】
種々の態様では、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む多官能性溶解緩衝液を含む溶解物、少なくとも１つの近接検出プローブセットを含む組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１に記載されている近接連結アッセイの結果を示す。各々の反応応に対する閾値サイクル数（「ａｖｇ  ＣＴ」）が示される。
【図２】実施例１に記載される蛍光の相対的増加（ΔＲｎ）対ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応についてのサイクル数のプロットを示す。ＦＡＭ層だけが図２に示される。
【図３】実施例１に記載されている実験に対して、閾値サイクル数対プレート位置（即ち、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応）のプロットを示す。ＦＡＭ層だけが図３に示される。
【図４】実施例１に記載されている蛍光の相対的増加（ΔＲｎ）対ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応についてのサイクル数を示す。ＶＩＣ層だけが図４に示される。
【図５】実施例１に記載されている実験に対して、閾値サイクル数対プレート位置（即ち、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応）のプロットを示す。ＶＩＣ層だけが図５に示される。
【図６】実施例２に記載されているように、プロテアーゼの有無による、緩衝液Ｎａ、緩衝液Ｎｂ、および緩衝液Ｎｃにおいて調製された溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図７】実施例２に記載されている実験に対して、閾値サイクル数対プレート位置（即ち、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応）のプロットを示す。
【図８】実施例３に記載されているように、種々の化合物を用いて調製された溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。レーン１〜８は、それぞれ、ＮＭＰ、マッケルニウム（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ）、エムピゲン（Ｅｍｐｉｇｅｎ）、ＮＤＳＢ−２０１、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、ＴＭＡＣＬ、およびＤＤＭＡＢである。レーン９〜１６は、それぞれ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＬＤＡＯ、ザルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）、ＣＴＡＢ、ＤＥＤＴＡＢ、ＤＬＳ、およびＤＴＡＢである。
【図９】実施例３に記載されているように、２％  ＮＤＳＢ−２０１または５ｍＭ  ＣＡＰＳＯのいずれかを用いて調製された溶解物の種々の希釈物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１０】実施例４に記載されているように、緩衝液Ｎ溶解物の種々の希釈物を用いて、平均の閾値サイクル数（「ａｖｇ  ＣＴ」）対近接連結アッセイのプロットを示す。
【図１１】実施例４に記載されているように、ＲＮａｓｅ阻害剤の有無による、様々な時間、３７℃でインキュベートされた細胞溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１２】実施例４に記載されているように、Ｔｗｅｅｎの有無による、緩衝液Ｎａ、緩衝液Ｎｂ、および緩衝液Ｎｃにおける細胞溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１３】実施例４に記載されているように、種々の濃度のＲＮａｓｅ  Ａとともにインキュベートされた細胞溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１４】実施例４に記載されているように、種々の処理条件下で、緩衝液Ｎにおける細胞溶解物のＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動を示す。
【図１５】実施例５に記載されているように、種々のプロテアーゼとともにインキュベートされた緩衝液Ｎａにおける細胞溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１６】実施例５に記載されているように、種々のプロテアーゼとともにインキュベートされた０．２％のＬＤＡＯを含む緩衝液Ｎａにおける細胞溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１７】実施例５に記載されているように、種々のプロテアーゼとともにインキュベートされた緩衝液Ｎｃにおける細胞溶解物のアガロースゲル電気泳動を示す
【図１８】本明細書に記載されているある種の近接検出アッセイ／標的核酸検出アッセイに関する非制限的な提示的なワークフロー図を示す。そのワークフロー設計では、ＰＤＡ生成物およびｍＲＮＡは、多重増幅反応において同時に検出される。
【図１９】本明細書に記載されているある種の近接検出アッセイ／標的核酸検出アッセイに関する非制限的な例示的なワークフロー図を示す。そのワークフロー設計では、ＰＤＡ生成物の検出のためにプロテアーゼ処理前に試料が取り出され、残りの試料はプロテアーゼ処理され、ｍＲＮＡの検出のために用いられる。
【図２０】０．１％魚ゼラチンまたは１％ＢＳＡのいずれかを含む緩衝液における種々の濃度のＶＥＧＦを検出するために実行される近接連結アッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：ＰＬＡ）からの例示的なデータを示す。例示的なデータは、平均の閾値サイクル（ａｖｇ  ＣＴ）対ｐＭ  ＶＥＧＦとしてプロットされる。
【図２１】０．１％魚ゼラチンおよび種々の核酸ブロッキング剤を含む緩衝液における種々の濃度のＶＥＧＦを検出するために行われる近接連結アッセイ（ＰＬＡ）からの例示的なデータを示す。パネルＡは、少なくとも２週間４℃で保存されたポリＡ（対照）、ポリＡ、ポリｄＣ、およびポリｄＣ＋ポリｄＧを含む近接連結アッセイからの例示的なデータを示す。パネルＢは、少なくとも２週間４℃で保存されたポリＡ（対照）、ポリＡ、ポリｄＣ、および切断されたウシ胸腺ＤＮＡ（ＣＦＤ）を含む近接連結アッセイからの例示的なデータを示す。例示的なデータは、平均の閾値サイクル（ａｖｇ  ＣＴ）対ｐＭ  ＶＥＧＦとしてプロットされる。
【図２２】デオキシ−ウラシル（ｄＵ）を含むスプリントオリゴヌクレオチドを用いた種々の濃度のＭＣＰ−１を検出するために行われた近接連結アッセイからの例示的なデータを示す。これらのアッセイは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼによる処理の有無、連結生成物の検出前の凍結融解サイクルのある場合（破線）およびない場合（実線）で行われた。例示的なデータは、平均の閾値サイクル（ａｖｇ  ＣＴ）対ｐＭ  ＭＣＰ−１としてプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で用いられている節の見出しは、組織的な目的のためだけにあり、記載されている主題を限定するものとして構成されるべきではない。本明細書に引用されている全ての書類、または書類の一部には、限定されないが、特許、特許出願、記事、本、および論文を含み、これらは、いずれかの目的のために、参照により全体として明示的に援用される。導入されている書類または書類の一部が、本出願における用語の定義と矛盾している用語を定義している場合には、本明細書が支配する。
【００１２】
単数形の使用は、特に他に記述がなければ、複数形を含む。単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、特に他に記述がなければ、「少なくとも１つの」を意味する。「または」の使用は、他に記述がなければ、「および／または」を意味する。多重に従属している請求項との関連での「または」の使用は、択一的なものだけを意味する。句「少なくとも１つの」の意味は、句「１以上の」の意味に等しい。さらに、用語「含んでいる」、並びに他の形態、例えば「含む」および「含んだ」の使用は、限定していない。また、「要素」または「成分」などの用語は、特に他に記述がなければ、１つの単位、１つの単位を超えるものを含む複数の要素または複数の成分を含む複数の要素または複数の成分の両方を含む。
【００１３】
本明細書では、「１つの」部分、例えば１つの標的分析物を検出する検討には、特に他に記述がなければ、１以上のその部分を含む。
【００１４】
本明細書において検討されている全ての範囲には、端点、端点間の全ての値が含まれる。
【００１５】
定義
用語「ヌクレオチド塩基」とは、置換もしくは未置換の芳香族環または複数の芳香族環を指す。ある種の態様では、この芳香族環または複数の芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含む。ある種の態様では、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基とワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型および／またはホッグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型水素結合を形成することができる。例示的なヌクレオチド塩基およびそれらの類似体には、限定されないが、天然に存在するヌクレオチド塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、およびチミン、並びに天然に存在するヌクレオチド塩基の類似体、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン類（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号、並びにＰＣＴ国際公開第ＷＯ０１／３８５８４号を参照されたい）、エテノアデニン、インドール類、例えばニトロインドールおよび４−メチルインドール、並びにピロール類、例えばニトロピロールが挙げられる。ある種の例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５−３９４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．、および本明細書に引用されている参考文献に見出すことができる。
【００１６】
用語「ヌクレオチド」とは、リボース、アラビノース、キシロース、およびピラノース、並びにそれらの糖類似体などの糖のＣ−１’炭素に連結されたヌクレオチド塩基を含む化合物を指す。また、ヌクレオチドという用語は、ヌクレオチド類似体も含む。この糖は、置換されているかまたは未置換であってもよい。置換されたリボース糖には、限定されないが、１以上の炭素原子、例えば２’−炭素原子が、１以上の同じであるかまたは異なっているＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２またはハロゲン基で置換されたリボースが挙げられ、ここで、各々のＲは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ５−Ｃ１４アリールである。例示的なリボースには、限定されないが、２’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、並びに２’−アルキルリボース、例えば２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−および３’−４’−連結並びに他の「固定された（ｌｏｃｋｅｄ）」または「ＬＮＡ」の二環式糖変性剤（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／２２４８９号、同第ＷＯ９８／３９３５２号、および同第ＷＯ９９／１４２２６号を参照されたい）が含まれる。ポリヌクレオチド内の例示的なＬＮＡ糖類似体には、限定されないが、構造：
【００１７】
【化１】
2009545317.tif 000002
（式中、Ｂは、任意のヌクレオチド塩基である）
が含まれる。
【００１８】
リボースの２’−または３’−位での修飾には、限定されないが、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリロキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモが含まれる。ヌクレオチドには、限定されないが、天然のＤ光学異性体、並びにＬ光学異性体が挙げられる（例えば、Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０を参照されたい）。このヌクレオチド塩基がプリン、例えばＡまたはＧである場合には、リボース糖は、該ヌクレオチド塩基のＮ９−位に結合される。ヌクレオチド塩基がピリミジン、例えばＣ、ＴまたはＵ）である場合には、ペントース糖は、該ヌクレオチド塩基のＮ１−位に結合され、ペントース糖がウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位に結合されるプソイドウリジンを除く（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，カリフォルニア州サンフランシスコ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｏ，ＣＡ）を参照されたい）。
【００１９】
ヌクレオチドの１以上のペントース炭素は、式：
【００２０】
【化２】
2009545317.tif 000003
（ここで、αは０〜４の整数である）
を有するリン酸エステルで置換されてもよい。ある種の態様では、αは２であり、リン酸エステルは、前記ペントースの３’−または５’−の炭素に結合される。ある種の態様では、前記ヌクレオチドは、該ヌクレオチド塩基がプリン、７−デアザプリン、ピリミジン、またはそれらの類似体であるものである。「ヌクレオチド５’−三リン酸」は、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、特にリボース糖の構造的特徴を示すために、時には「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と示される。該三リン酸エステル基には、種々の酸素のための硫黄置換、例えばα−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸を含むことができる。ヌクレオチド化学の総説については、例えば、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，ニューヨーク，１９９４を参照されたい。
【００２１】
用語「ヌクレオチド類似体」とは、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオチドの１以上のリン酸エステルが、その個別の類似体で置換され得る態様を指す。ある種の態様では、例示的なペントース糖類似体は、上述されるものである。ある種の態様では、ヌクレオチド類似体は、上述されるヌクレオチド塩基を有する。ある種の態様では、例示的なリン酸エステル類似体には、限定されないが、アルキルホスホネート類、メチルホスホネート類、ホスホラミダート類、ホスホトリエステル類、ホスホロチオネート類、ホスホロジチオネート類、ホスホロセレネート類、ホスホロジセレネート類、ホスホロアニロチオネート類、ホスホロアニリダート類、ホスホロアミデート類、リン酸ホウ素（ｂｏｒｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などが含まれ、関連する対イオンが含まれてもよい。
【００２２】
また、「ヌクレオチド類似体」の定義には、ＤＮＡ／ＲＮＡのリン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル骨格が、異なる種類のヌクレオチド間連結によって置換されるポリヌクレオチド類似体に重合され得るヌクレオチド類似体モノマーが含まれる。例示的なポリヌクレオチド類似体には、限定されないが、ペプチド核酸が挙げられ、そこでは、前記ポリヌクレオチドの糖リン酸エステル骨格は、ペプチド骨格によって置換される。
【００２３】
本明細書中で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」とは、互換可能に用いられ、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを指し、例えば、ヌクレオチド間のリン酸エステル結合連結によって連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはヌクレオチド間類似体、および例えばＨ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などが含まれる。ポリヌクレオチドは、全てがデオキシリボヌクレオチド、全てがリボヌクレオチド、またはそのキメラな混合物から構成されてもよい。ヌクレオチドモノマー単位には、限定されないが、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む、本明細書に記載されているヌクレオチドのいずれかで構成されてもよい。ポリヌクレオチドは、１以上の病変（ｌｅｓｉｏｎ）を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、例示的には、大きさにして、多くの場合、当該技術分野において、オリゴヌクレオチドとして意味される場合には数個のモノマー単位、例えば５〜４０個から、数千のモノマーヌクレオチド単位の範囲である。他に記述がなければ、ポリヌクレオチド配列が表されるときはいつでも、他に記述がなければ、ヌクレオチドは左から右へ５’から３’であり、「Ａ」がデオキシアデノシンまたはその類似体を示し、「Ｃ」がデオキシシチジンまたはその類似体を示し、「Ｇ」がデオキシグアノジンまたはその類似体を示し、「Ｔ」がチミジンまたはその類似体を示すことは理解される。
【００２４】
ポリヌクレオチドは、例えばＲＮＡおよびＤＮＡの場合のような単一型の糖部分、または、例えばＲＮＡ／ＤＮＡキメラの場合のような異なる糖部分の混合体から構成されてもよい。ある種の態様では、核酸は、以下の構造式：
【００２５】
【化３】
2009545317.tif 000004
に従うリボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドであり、ここで、各Ｂは、独立して、ヌクレオチドの塩基部分、例えばプリン、７−デアザプリン、またはその類似体であり；各ｍは、それぞれの核酸の長さを定義し、かつゼロから数千、数万またはさらにそれを超える範囲であり得て；各Ｒは、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、−−Ｒ’’、−−ＯＲ’’、および−−ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここで、各Ｒ’’は、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルもしくは（Ｃ５−Ｃ１４）アリールであり、または２つの隣接するＲｓは一緒になって、リボース糖が２’３’−ジデヒドロリボースとなるように結合を形成し、各Ｒ’は、独立して、ヒドロキシルまたは下記
【００２６】
【化４】
2009545317.tif 000005
であり、ここで、αは、０、１もしくは２である。
【００２７】
上記で例示されたリボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドのある種の態様では、ヌクレオチド塩基Ｂは、前述されるように該糖成分のＣ１’炭素に共有結合的に結合される。
【００２８】
また、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」には、核酸類似体、ポリヌクレオチド類似体、およびオリゴヌクレオチド類似体が含まれてもよい。用語「核酸類似体」、「ポリヌクレオチド類似体」および「オリゴヌクレオチド類似体」は、互換可能に用いられ、少なくとも１つのヌクレオチド類似体および／または少なくとも１つのリン酸エステル類似体および／または少なくとも１つのペントース糖類似体を含むポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド類似体は、１以上の病変を含んでもよい。また、ポリヌクレオチド類似体の定義の内には、前記リン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル連結が他の種類の連結で置換されるものが含まれ、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミド類および他のアミド類（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００；国際公開第ＷＯ９２／２０７０２号；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，６９８，６８５号を参照されたい；）；モルホリノ類（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，３７８，８４１号；米国特許第５，１８５，１４４号を参照されたい）；カルバメート類（例えば、ＳｔｉｒｃｈａｋおよびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５２：４２０２を参照されたい）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：４００６を参照されたい）；３’−チオホルマセタール類（例えば、Ｊｏｎｅｓら，１９９３，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照されたい）；スルファメート類（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照されたい）；一般にＰＮＡと呼ばれる２−アミノエチルグリシン（例えば、Ｂｕｃｈａｒｄｔ，国際公開第ＷＯ９２／２０７０２号；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００を参照されたい）；その他（例えば、米国特許第５，８１７，７８１号；ＦｒｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４４２９および本明細書に引用されている参考文献を参照されたい）が挙げられる。リン酸エステル類似体には、限定されないが、（ｉ）Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネート；（ｉｉ）ホスホロアミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオネート；および（ｖ）ホスホロジチオネートが挙げられる。
【００２９】
用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」とは、互換可能に用いられ、１つの核酸と、二重、三重、または他のより高次の構造を結果として形成させる別の核酸との塩基対相互作用を指す。ある種の態様では、この一次相互作用は、ワトソン／クリックおよびホッグスティーン型の水素結合による塩基特異的、例えばＡ／ＴおよびＧ／Ｃである。また、塩基重積および疎水性相互作用は、二重鎖の安定性に貢献し得る。
【００３０】
本出願では、１つの配列が別の配列と同じであるかまたはそれに相補的であるという記述は、両方の配列が互いに完全に同じであるかまたは相補的であるという状況、これらの配列のうちの１つの一部だけが他の配列の一部または全部と同一であるかまたはそれに相補的である状況を含む。ここで、用語「配列」には、限定されないが、核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、プライマー特異的部分、および標的特異的部分が含まれる。
【００３１】
本明細書では、１つの配列が別の配列に相補的であるという記述は、これらの２つの配列がミスマッチを含む状況を含む。ミスマッチに関わらず、これらの２つの配列は、適切な条件下で互いに選択的にハイブリダイズされなければならない。
【００３２】
用語「選択的にハイブリダイズする」とは、特定の同一の配列に対して、その特定の同一の配列の実質的な部分が所定の望ましい配列または複数の配列にハイブリダイズし、その特定の同一の配列の実質的な部分が他の望ましくない配列にはハイブリダイズしないことを意味する。各々の場合における「その特定の同一配列の実質的な部分」とは、その特定の同一配列の総数の一部を指し、個別の特定の同一配列の一部を指していない。ある種の態様では、「その特定の同一配列の実質的な部分」とは、その特定の同一配列の少なくとも７０％を意味する。ある種の態様では、「その特定の同一配列の実質的な部分」とは、その特定の同一配列の少なくとも８０％を意味する。ある種の態様では、「その特定の同一配列の実質的な部分」とは、その特定の同一配列の少なくとも９０％を意味する。ある種の態様では、「その特定の同一配列の実質的な部分」とは、その特定の同一配列の少なくとも９５％を意味する。
【００３３】
ある種の態様では、存在してもよいミスマッチの数が、組成物の複雑性を考慮して変化してもよい。したがって、ある種の態様では、組成物がより複雑になれば、望ましくない配列がハイブリダイズする可能性が高くなる。例えば、ある種の態様では、所定数のミスマッチがあると、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が両方の組成物に用いられる場合、より少ないＤＮＡ配列を含む組成物よりも、全ゲノムＤＮＡを含む組成物において望ましくない配列にプローブがハイブリダイズする可能性が高くなる場合がある。このようにして、ミスマッチの所定数は、より少ないＤＮＡ配列を含む組成物に対して適切であってもよいが、より少ないミスマッチは、全ゲノムＤＮＡを含む組成物に対してはより最適であり得る。
【００３４】
ある種の態様では、配列は、それらが２０％未満でミスマッチしたヌクレオチドを有する場合に相補的である。ある種の態様では、配列は、それらが１５％未満でミスマッチしたヌクレオチドを有する場合に相補的である。ある種の態様では、配列は、それらが１０％未満でミスマッチしたヌクレオチドを有する場合に相補的である。ある種の態様では、配列は、それらが５％未満でミスマッチしたヌクレオチドを有する場合に相補的である。種々の態様では、配列は、それらが０％、１％、２％、または３％でミスマッチしたヌクレオチドを有する場合に相補的である。
【００３５】
本出願では、１つの配列が別の配列とハイブリダイズするかまたはそれに結合するという記述は、両方の配列の全体が互いにハイブリダイズするかまたは結合する状況、配列の１つまたは両方の一部だけが、他の配列の全体またはその他の配列の一部にハイブリダイズするかまたは結合する状況を含む。ここで、用語「配列」には、限定されないが、核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、プライマー特異的部分、及び標的特異的部分が含まれる。
【００３６】
用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、本明細書中で使用するとき、プライマー伸張生成物が適切な条件下で合成され得るオリゴヌクレオチドを指す。ある種の態様では、このような適切な条件は、相補的核酸にハイブリダイズし、例えばヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなどの重合誘導剤の存在下で、適切な温度、ｐＨ、金属濃度、塩濃度などでインキュベートされるプライマーを含む。種々の態様では、プライマーは５〜１００ヌクレオチドの長さである。種々の態様では、プライマーは、８〜７５、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、または１０〜３５ヌクレオチドの長さである。
【００３７】
用語「連結」とは、本明細書中で使用するとき、２つのポリヌクレオチド末端の共有結合的接合を指す。種々の態様では、連結は、第１のポリヌクレオチドの３’末端から第２のポリヌクレオチドの５’末端への共有結合的接合を伴う。種々の態様では、連結は、これらのポリヌクレオチド末端間で形成されるリン酸ジエステル結合をもたらす。種々の態様では、連結は、任意の酵素、化合物、またはポリヌクレオチド末端の共有結合的接合をもたらすプロセスによって媒介されてもよい。ある種の態様では、連結は、リガーゼ酵素によって媒介される。
【００３８】
用語「分析物」とは、本明細書中で使用するとき、１以上の近接検出プローブを用いて検出されるべき物質を指す。このような物質には、限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、炭水化物、ホルモン、小分子、細胞、微生物、分析物結合部分が生じ得る任意の他の物質が挙げられる。分析物は核酸ではない。
【００３９】
用語「標的核酸」とは、本明細書中で使用されるとき、検出のために選択されたＲＮＡまたはＤＮＡを指す。例示的なＲＮＡには、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、レトロウイルス、小非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡが挙げられる。例示的なＤＮＡには、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、核小体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（「ＹＡＣ」）、細菌人工染色体ＤＮＡ（「ＢＡＣ」）、他の染色体外ＤＮＡ、およびプライマー伸長生成物が挙げられる。例えば、ステムループプライマーおよび／または短鎖プライマーを用いる、短鎖核酸を検出する例示的な方法は、例えば、Ｃｈｅｎらによる米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６６４１８号、Ｌａｏらによる米国特許公開第ＵＳ２００６／００５７５９５号に見出すことができる。
【００４０】
用語「多官能性溶解緩衝液」とは、本明細書中で使用するとき、標的核酸を実質的に分解せずに、選択された生物試料を溶解し、ホモジナイズし、および／または抽出することができる緩衝液を指し、その際、近接検出プローブはこの溶解物中の分析物に結合することができるように、適切な分析物構造を維持している。種々の態様では、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、または５０％未満の標的核酸が分解される。種々の態様では、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、または少なくとも５０％の標的分析物は、近接検出プローブが溶解物に含まれる分析物に結合することができるように、適切な構造を保持している。
【００４１】
種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、この方法を行うために適切な温度および希釈条件下で、本明細書に記載されている方法と適合される。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１（３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート）、ＬＤＡＯ（ラウリルジメチルアミン−オキシド）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＤＥＤＴＡＢ（ドデシルエチルジメチルアンモニウム・ブロミド）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０（ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、およびＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）から選択される少なくとも１つの化学物質を含む。
【００４２】
用語「生物試料」とは、本明細書中で使用するとき、標的分析物および／または標的核酸を含むことが疑われる任意の試料を指す。例示的な生物試料には、限定されないが、原核細胞、有核細胞、組織試料、ウイルス粒子、バクテリオファージ、感染粒子、病原体、菌類、食物試料、体液（限定されないが、粘液、血液、血漿、血清、尿、唾液、および精液を含む）、水試料、並びに例えば水および空気由来のろ過物が挙げられる。
【００４３】
「近接検出プローブ」は、本明細書中で使用するとき、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分に、共有結合的または非供給結合的に接続された少なくとも１つの分析物結合部分を含むプローブである。ある種の態様では、このオリゴヌクレオチド部分は、結合対の第１メンバーを含み、分析物結合部分は、結合対の第２メンバーを含み、ここで、この結合対の第１メンバーおよび結合対の第２のメンバーは、近接検出プローブ結合並びにハイブリダイゼーションおよび／または連結のために用いられる条件下で安定に結合される。種々の態様では、当業者は、適切な結合対を選択することができる。ある種の態様では、近接検出プローブは、少なくとも１つの分析物結合部分と少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分とを接続する１以上のリンカーを含む。種々の態様では、当業者は、適切なリンカーを選択することができる。
【００４４】
「分析物結合部分」は、本明細書中で使用するとき、標的分析物に結合する部分を指す。分析物結合部分として用いることができる例示的な部分には、限定されないが、分析物に結合可能なモノクローナル抗体およびその断片、分析物、タンパク質、ペプチド、レクチン、核酸、アプタマー、炭水化物、可溶性細胞表面受容体、小分子、および標的分析に特異的な任意の他の結合分子に結合可能なポリクローナル抗体およびその断片が含まれる。
【００４５】
用語「近接検出アッセイ」または「ＰＤＡ」は、本明細書中で使用するとき、分析物と少なくとも２つの近接検出プローブとの接触を伴うアッセイを指し、ここで、各プローブは、分析物結合部分およびオリゴヌクレオチド部分を含む。各プローブの分析物結合部分は、同じであるかまたは異なっていてもよい。各プローブのオリゴヌクレオチド部分は、同じであるかまたは異なっていてもよい。ある種の態様では、分析物は、近接検出プローブのセットと接触される。種々の態様では、近接検出プローブのセットは、２、３、４、５、または５を超える近接検出プローブを含む。ある種の態様では、近接検出プローブのセットは、一対の近接検出プローブ、即ち、「近接検出プローブ対」である。ある種の態様では、近接検出プローブのセットにおける各プローブの分析物結合部分は、異なっている。ある種の態様では、近接検出プローブのセットにおける各プローブの分析物部分は、分析物内の異なるエピトープに結合することができる。本明細書中で使用するとき、異なるエピトープは、分析物配列および／または三次元空間において、重複しているエピトープであるかまたは重複していないエピトープであってもよい。ある種の態様では、近接検出プローブのセットにおける各プローブのオリゴヌクレオチドは、異なる配列を含む。
【００４６】
種々の態様では、分析物と少なくとも２つの近接検出プローブとの接触後、少なくとも２つの近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、互いに相互作用することができる。種々の態様では、このような相互作用は、１以上の追加のオリゴヌクレオチドによって媒介されてもよい。ある種の態様では、少なくとも２つの近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部は、互いにハイブリダイズする。ある種の態様では、近接検出プローブの各オリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部は、別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。例えば、ある種の態様では、少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチド（本明細書中では、「スプリントオリゴヌクレオチド」という）が添加され、各々の近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも１つの一部にハイブリダイズすることによって、少なくとも２つの近接検出プローブ間の相互作用を媒介する。また、オリゴヌクレオチド部分が互いにハイブリダイズするか、または少なくとも２つのオリゴヌクレオチド部分間の架橋を形成する別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする近接検出アッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：ＰＤＡ）であって、ここで、該オリゴヌクレオチドが互いに連結しない前記近接検出アッセイは、「近接相互作用アッセイ」またが「ＰＩＡ」と呼ばれてもよい。
【００４７】
ある種の態様では、少なくとも２つの近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチドリガーゼ酵素によって一緒に連結され得る。ある種の態様では、各オリゴヌクレオチド部分の連結可能な末端は、各々の近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチド（「スプリントオリゴヌクレオチド」とも呼ばれる）によって一緒にされる。また、近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分が一緒に連結される近接検出アッセイ（ＰＤＡ）は、「近接連結アッセイ」または「ＰＬＡ」と呼ばれてもよい。
【００４８】
種々の態様では、少なくとも２つの近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーションおよび／または連結後に、ハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、当該技術分野において知られている任意の方法によって検出されてもよい。ハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分を検出する例示的な手段には、限定されないが、直接的な検出、リアルタイムＰＣＲ（限定されないが、５’−ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲを含む）、ローリング・サークル増幅、連結およびＰＣＲの組合せ、前増幅、その後の検出工程（例えば、限定されないが、第２増幅、直接的な検出、連結など）が挙げられる。核酸を検出するある種の例示的な方法が本明細書中に記載されている。
【００４９】
例示的な近接検出アッセイは、例えば、米国特許第６，５１１，８０９Ｂ２号；米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００６４７７９号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号；Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２：１１５２−１１６０（２００６）に記載されている。
【００５０】
用語「定量的核酸検出アッセイ」とは、本明細書中で使用するとき、試料に含まれる特定の核酸配列の量を定量することができるアッセイを指す。ある種の例示的な定量的核酸検出アッセイは、本明細書では、「ある種の例示的なアッセイ」と題するセクションにおいて記載されている。
【００５１】
本明細書中で使用するとき、用語「検出（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）プローブ」とは、増幅産物の検出を促進する増幅反応において用いられる分子を指す。例示的な増幅反応には、限定されないが、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、およびエンドポイント分析増幅反応が挙げられる。種々の態様では、このような検出プローブを用いて、標的核酸および／または対照核酸の増幅をモニターすることができる。種々の態様では、増幅反応に存在する検出プローブは、時間を関数として生成されるアンプリコン（単数または複数）量のモニタリングに適切である。
【００５２】
種々の態様では、検出プローブは、「配列に基づく」ものであり、配列特異的に増幅産物を検出することを意味する。非制限的な例として、配列に基づく検出プローブは、特異的な増幅産物にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ある種の態様では、検出プローブは、「配列に依存しない」ものであり、増幅産物の配列に関わらずに増幅産物を検出することを意味する。
【００５３】
ある種の例示的な検出プローブには、限定されないが、５’−ヌクレアーゼアッセイに用いられるプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）プローブ、例えば、米国特許第５，５３８，８４８号に記載されている）；ステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号、並びにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８を参照されたい）；軸のないまたは線状なビーコン（例えば、国際公開第ＷＯ９９／２１８８１号を参照されたい）、ＰＮＡ分子ビーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）（商標）（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照されたい）；線状ＲＮＡビーコンズ（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａら，２００１，ＳＰＩＥ  ４２６４：５３−５８を参照されたい）；非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照されたい）；サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）（登録商標）／アンプリフルオアー（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）；ステムループおよび二重鎖スコルピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）（商標）プローブ（Ｓｏｌｉｎａｓら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：Ｅ９６、および米国特許第６，５８９，７４３号）；バルジ（ｂｕｌｇｅ）ループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）；疑似節（ｋｎｏｔ）プローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、サイクリコン（ｃｙｃｌｉｃｏｎ）（米国特許第６，３８３，７５２号）；ＭＧＢエクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ）（商標）プローブ（エポックバイオサイエンシーズ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））；ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）；ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＰＮＡ）ライトアップ（ｌｉｇｈｔ−ｕｐ）プローブ；自己集合ナノ粒子プローブ；およびフェロセン修飾プローブが挙げられる。ある種の例示的な検出プローブは、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａら，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎら，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋら，２０００，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓら，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇら，２００２  Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌら，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅら，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇら，２００２，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；Ｙｕら，２００１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １４：１１１５５−１１１６１に記載されている。
【００５４】
種々の態様では、検出プローブは、クエンチャーを含むことができる。例示的なクエンチャーには、限定されないが、ブラックホールクエンチャー（バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ））、アイオワブラック（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ）（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（モレキュラープローブズ）、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）およびダブセル（Ｄａｂｃｅｌ）スルホネート／カルボキシレートクエンチャー（エポック）が挙げられる。ある種の態様では、検出プローブは、２つのプローブを含んでもよく、ここで、例えば、１つのプローブは、蛍光部分を含み、別のプローブは、クエンチャーを含み、標的物上でのこれらの２つのプローブのハイブリダイゼーションは、シグナルをクエンチするか、または標的物上でのこれらの２つのプローブのハイブリダイゼーションは、蛍光変化を通じてシグナルを変更する。２つのプローブを含むある種の例示的な検出プローブは、例えば、Ｌａｏらによる米国特許出願公開第ＵＳ２００６／００１４１９１号に記載されている。また、ある種の例示的な検出プローブには、限定されないが、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有するフルオレセニン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホアミダイド形態、ＣＹ５のホスホアミダイド形態（例えばアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から市販されている）が挙げられる。
【００５５】
ある種の態様では、検出プローブは、インターカレーティング標識を含む。例示的なインターカレーティング標識には、限定されないが、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｉ（モレキュラープローブズ）、およびピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（登録商標）（モレキュラープローブズ）が挙げられ、これらは、核酸プローブが存在しない場合に増幅産物のリアルタイム、または終点で視覚化することができる。ある種の態様では、インターカレーティング標識を含む検出プローブは、配列に依存しない検出プローブである。ある種の態様では、リアルタイムの視覚化は、配列に依存しないインターカレーティング検出プローブおよび配列に基づく検出プローブを含み得る。
【００５６】
ある種の態様では、検出プローブは、増幅反応中の相補的配列にハイブリダイズしない場合に少なくとも部分的にクエンチされ、増幅反応中の相補的配列にハイブリダイズする場合に少なくとも部分的にクエンチされない。種々の態様では、検出プローブは、種々の改変剤、例えば、小溝結合剤（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号を参照されたい）をさらに含むことができ、さらに望ましい熱力学的特性を提供する。ある種の態様では、検出プローブは、ジップコードとも呼ばれる部分の同定、または部分成分の同定に対応することができる。部分の特定は、例えば、米国特許第６，３０９，８２９号（そこでは、「タグセグメント」と称する）；同第６，４５１，５２５号（そこでは、「タグセグメント」と称する）；同第６，３０９，８２９号（そこでは、「タグセグメント」と称する）；同第５，９８１，１７６号（そこでは、「グリッドオリゴヌクレオチド」と称する）；同５，９３５，７９３号（そこでは、「確認（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）タグ」と称する）；およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ０１／９２５７９号（そこでは、「指定可能な支持特異的配列」と呼ばれる）に記載されている。
【００５７】
検出プローブは、「検出可能に異なって」いてもよく、これは、検出プローブが少なくとも１つの検出法によって互いに区別し得ることを意味する。検出可能に異なっている検出プローブには、限定されないが、異なった波長の光を放出する検出プローブ、異なった波長の光を吸収する検出プローブ、異なった波長の光を分散する検出プローブ、異なった蛍光減衰存続期間を有する検出プローブ、異なった分光的特徴を有する検出プローブ、異なった放射性崩壊特性を有する検出プローブ。異なった電荷の検出プローブ、異なったサイズの検出プローブが挙げられる。ある種の態様では、検出プローブは、蛍光シグナルを放出する。
【００５８】
「エンドポイントポリメラーゼ連鎖反応」または「エンドポイントＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応法であり、核酸標的配列の存在または定量は、ＰＣＲ反応が完了した後に検出され、反応が進行中は検出されない。
【００５９】
「リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」または「リアルタイムＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応法であり、核酸標的配列の存在または定量は、反応が進行中に検出される。ある種の態様では、反応組成物に存在する１以上のプローブによって放出されるシグナルは、プライマー伸張生成物の合成の指標として、ポリメラーゼ連鎖反応の各サイクル中に観察される。ある種の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応の各サイクル中に放出される蛍光は、プライマー伸張生成物の合成の指標として観察される。
【００６０】
「多重増幅反応」とは、２以上の標的核酸配列が同じ反応で増幅される増幅反応である。「多重ポリメラーゼ連鎖反応」または「多重ＰＣＲ」は、２以上の標的核酸配列が同じ反応で増幅されるポリメラーゼ連鎖反応法である。
【００６１】
「一重増幅反応」は、たった１つの標的核酸配列が反応で増幅される増幅反応である。「一重ポリメラーゼ連鎖反応」または「一重ＰＣＲ」は、たった１つの標的核酸配列が反応で増幅されるポリメラーゼ連鎖反応法である。
【００６２】
「閾値サイクル」または「ＣＴ」は、定量的核酸検出アッセイから観察されるシグナルが、固定された閾値を上回るサイクル数として定義される。ある種の態様では、この固定された閾値は、標的核酸配列を欠如している反応で観察されたシグナルの量として設定される。ある種の態様では、固定された閾値は、バックグラウンドのノイズシグナルを超えるレベルで設定される。例えば、ある種の態様では、固定された閾値は、３倍を超える、バックグラウンドのノイズシグナルの二乗平均平方根と、バックグラウンドのノイズシグナルとの組み合わせに対応する値で設定される。ある種の態様では、観察されたシグナルは、蛍光標識に由来する。
【００６３】
用語「標準化対照」とは、近接検出アッセイにおいて検出される標的分析物および／または標的核酸の量を標準化するために用いることができる生物試料および／または生物試料の溶解物に存在する分子を意味する。ある種の態様では、標準化対照は分析物である。ある種の態様では、標準化対照は、核酸である。
【００６４】
標準化対照は、種々の態様では、「外因性」または「内因性」と用ばれてもよい。ある種の態様では、外因性標準化対照は、回収後の生物試料に添加される。ある種の態様では、外因性の標準化対照は、生物試料の溶解物に添加されている。種々の態様では、生物試料および／または生物試料の溶解物は、外因性の標準化対照として用いられる同じ分析物および／または核酸の量を必然的に含むが、標準化対照は、分析物および／または核酸が追加されているので外因性であると考えられる。
【００６５】
ある種の態様では、内因性標準化対照は、生物試料が分析のために回収されるときに、その試料にすでに存在している。ある種の態様では、内因性標準化対照は、生物試料の溶解物に添加されたことはなくてもその溶解物に存在している。標準化対照は、「ハウスキーピング」と呼ばれ、ある種の態様では、その際、添加されたことがなくても生物試料および／または溶解物に高レベルで存在する。ある種の態様では、ハウスキーピング標準化対照は、１を超える異なった種類の生物試料に高レベルで存在する。
【００６６】
ある種の態様では、標準化対照は、内因性分析物である。ある種の態様では、標準化対照は、内因性タンパク質である。ある種の態様では、標準化対照は、内因性ハウスキーピングタンパク質である。ある種の例示的な内因性のハウスキーピングタンパク質の標準化対照には、限定されないが、ＧＡＰＤＨ、酸性リボソームタンパク質、ベータ−アクチン、ＨＰＲＴ、ベータ−グルクロニダーゼ、シスタチンＢ、ＩＣＭＡ１、およびｐ５３が挙げられる。
【００６７】
ある種の態様では、標準化対照は、外因性分泌物である。ある種の態様では、標準化対照は、外因性タンパク質である。ある種の例示的な外因性タンパク質の標準化対照には、限定されないが、細菌タンパク質、タンパク質タグ、ウイルスタンパク質、無傷なビリオン、昆虫タンパク質、選択された生物試料には通常は発現しない哺乳動物のタンパク質、選択された生物試料において低レベルで通常発現されている哺乳動物のタンパク質が挙げられる。外因性タンパク質の標準化対照として用いられることができるある種の例示的な細菌タンパク質には、限定されないが、β−ガラクトシダーゼおよびクロロアンフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が含まれる。外因性タンパク質の標準化対照として用いられることができるある種の例示的なタンパク質タグには、限定されないが、ヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）、フル（ｆｌｕ）タグ、血球凝集素タグ、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、およびルシフェラーゼが挙げられる。ある種の態様では、外因性タンパク質の標準化物は、別のタンパク質に融合されたタンパク質タグを含む。
【００６８】
ある種の態様では、標準化対照は、内因性核酸である。ある種の態様では、標準化対照は、ゲノムＤＮＡの内因性ストレッチである。ある種の態様では、ゲノムＤＮＡの内因性ストレッチは、１コピー遺伝子の少なくとも一部を含む。ある種の態様では、ゲノムＤＮＡの内因性ストレッチは、１を超えるコピーでゲノムに存在する遺伝子の少なくとも一部を含む。ある種の例示的な内因性の１コピーのゲノムＤＮＡ標準化対照には、限定されないが、ＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子の少なくとも一部、短鎖タンデムリピート（ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ：ＳＴＲ）遺伝子座の少なくとも一部が含まれる。ある種の例示的なＳＴＲ遺伝子座には、限定されないが、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン（Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ）、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、およびＳ１５９が挙げられる。ある種のＳＴＲ遺伝子座は、例えば、米国特許第７，００８，７７１号に記載されている。
【００６９】
ある種の態様では、標準化対照は、内因性ＲＮＡである。ある種の態様では、標準化対照は、内因性ハウスキーピングＲＮＡである。ある種の例示的な内因性ハウスキーピングＲＮＡの標準化対照には、限定されないが、ＧＡＰＤＨ、１８Ｓ、ベータ−アクチン、酸性リボソームタンパク質、ＨＰＲＴ、ベータ−グルクロニダーゼ、シスタチンＢ、ＩＣＡＭ１およびｐ５３が挙げられる。ある種の態様では、標準化対照には、検出されるべき少なくとも１つの標的分析物をコードする内因性ＲＮＡである。
【００７０】
種々の態様では、標準化対照は、外因性核酸である。種々の態様では、外因性核酸は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含む。例示的なＲＮＡには、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、レトロウイルス、小非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡが挙げられる。例示的なＤＮＡには、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、核小体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（「ＹＡＣ」）、細菌人工染色体ＤＮＡ（「ＢＡＣ」）、他の染色体外ＤＮＡ、およびプライマー伸長生成物が挙げられる。ある種の態様では、外因性核酸は、ＰＮＡを含む。ある種の態様では、外因性核酸は、生物試料が回収される生物以外の生物に、通常見出される配列を含む。ある種の態様では、外因性核酸は、生物試料が回収される生物に、通常見出される配列を含む。ある種の態様では、外因性標準化対照は、知られている生物には通常見出されない配列を含む。ある種の態様では、外因性標準化対照は、一種の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に通常見出される配列を含むが、外因性標準化対照は、別の種類の核酸（例えば、ＤＮＡ）においてその配列を含む。ある種の態様では、外因性核酸の標準化対照は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）外因性内部ポジティブ対照試薬（アプライドバイオシステムズ、カタログ＃４３０８３２３）である。
【００７１】
種々の態様では、標的核酸の量は、ΔＣＴの計算を含む「デルタＣＴ法」または「ΔＣＴ法」を用いて標準化対照に標準化することができる。ある種の態様では、ΔＣＴは、標的核酸を検出するために用いられる定量的核酸検出アッセイのＣＴから標準化対照を検出するために用いられる定量的核酸検出アッセイのＣＴを差し引くことによって計算される。ある種の態様では、標準化対照および標的核酸の量における倍数差は、ΔＣＴから計算される。ある種の態様では、標準化対照および標的核酸の量の倍数差は、式２−ΔＣＴによるΔＣＴから計算される。
【００７２】
種々の態様では、標的分析物の量は、ΔＣＴを計算することを伴う「デルタＣＴ法」または「ΔＣＴ法」を用いた標準化対照に標準化され得る。ある種の態様では、ΔＣＴは、標的分析物を検出するために用いられる定量的核酸検出のＣＴから、標準化対照を検出するために用いられる定量的核酸検出アッセイのＣＴを差し引くことによって計算される。ある種の態様では、標準化対照および標的分析物の量における倍数差は、ΔＣＴから計算される。ある種の態様では、標準化対照および標的分析物の量における倍数差は、式２−ΔＣＴに従ってΔＣＴから計算される。
【００７３】
種々の態様では、標的核酸の量は、ΔΔＣＴを計算することを伴う「比較ＣＴ法」または「ΔΔＣＴ法」を用いて標的核酸に標準化されてもよい。種々の態様では、標的分析物の量は、ΔΔＣＴを計算することを伴う「比較ＣＴ法」または「ΔΔＣＴ法」を用いて標準化対照に標準化されてもよい。ある種の態様では、ΔΔＣＴは、「試験溶解物」のΔＣＴから「較正溶解物」のΔＣＴを差し引くことによって計算される。ある種の例示的な較正溶解物には、限定されないが、未処理の細胞から調製された溶解物、特定の組織から調製された溶解物が含まれる。ある種の例示的な試験溶解物には、限定されないが、較正溶解物が調製された組織以外の組織から調製された処理された細胞および溶解物から調製された溶解物が含まれる。ある種の態様では、ΔΔＣＴは、試験溶解物のΔＣＴから較正溶解物のΔＣＴを差し引くことによって計算される。
【００７４】
ある種の態様では、較正溶解物および試験溶解物の標的核酸の量の倍数差は、式２−ΔΔＣＴに従ってΔΔＣＴから産出される。ある種の態様では、較正溶解物および試験溶解物の標的分析物の量の倍数差は、式２−ΔΔＣＴに従ってΔΔＣＴから計算される。ΔΔＣＴ法の使用は、例えば、アプライドバイオシステムズの“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ”；アプライド・バイオシステムズ，使用者会報＃２：ＡＢＩプライム（Ｐｒｉｓｍ）７７００配列検出システム（１９９７年１２月１１日（２００１年１０月にアップデート））に記載されている。
【００７５】
用語「ブロッキング剤」とは、非特異的な相互作用を低下させるために、反応に含まれる物質を意味する。ある種の態様では、ブロッキング剤は、分析物に関わる非特異的な相互作用を低下させるために反応に含められる。ある種の態様では、ブロッキング剤は、核酸に関わる非特異的な相互作用を低下させるために反応に含められる。
【００７６】
ある種の態様では、ブロッキング剤は分析物である。分析物であるブロッキング剤は、「分析物ブロッキング剤」と呼ばれる場合がある。ある種の態様では、ブロッキング剤はタンパク質である。タンパク質であるブロッキング剤は、「タンパク質ブロッキング剤」と呼ばれる場合がある。ある種の例示的なタンパク質ブロッキング剤には、限定されないが、ＢＳＡ、カゼイン、ランダムペプチドライブラリー断片、哺乳動物のＩｇＧ画分の調製物、および脂肪を含まないドライミルクが挙げられる。ある種の態様では、ブロッキング剤はゼラチンである。ゼラチンであるブロッキング剤は、「ゼラチンブロッキング剤」と呼ばれる場合がある。ある種の例示的なゼラチンブロッキング剤には、限定されないが、魚由来のゼラチン（限定されないが、コールド魚ゼラチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）＃Ｇ７７６５）、ウシ由来ゼラチン、およびブタ由来ゼラチンが挙げられる。ある種の態様では、分析物ブロッキング剤は、０．０１〜５％の濃度で反応に含められる。ある種の態様では、分析物ブロッキング剤は、０．０１〜２％の濃度で反応に含められる。ある種の態様では、分析物ブロッキング剤は、．０５〜０．５％の濃度で多官能性溶解緩衝液に存在する。ある種の例示的なブロッキング剤は、例えば、Ｖｏｇｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０１（１）：４３−５（１９８７）に記載されている。
【００７７】
ある種の態様では、ブロッキング剤は核酸である。核酸であるブロッキング剤は、「核酸ブロッキング剤」と呼ばれる場合がある。種々の態様では、ブロッキング剤は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含む。種々の態様では、ブロッキング剤は、一本鎖および／または二本鎖核酸を含む。ある種の態様では、ブロッキング剤は、主に一本鎖核酸を含む。主に一本鎖核酸であるブロッキング剤は、「一本鎖核酸ブロッキング剤」と呼ばれる場合がある。ある種の態様では、ブロッキング剤は、主に二本鎖核酸を含む。主に二本鎖核酸であるブロッキング剤は、「二本鎖核酸ブロッキング剤」と呼ばれる場合がある。ある種の例示的な一本鎖核酸ブロッキング剤には、限定されないが、ポリＡおよびポリｄＣが挙げられる。ある種の例示的な二本鎖核酸ブロッキング剤には、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、切断されたゲノムＤＮＡ、ポリｄＣ＋ポリｄＧ、およびポリｄＩ＋ポリｄＣが挙げられる。ある種の例示的な剪断されたゲノムＤＮＡには、限定されないが、切断されたサケ精子ＤＮＡおよび切断された仔ウシ胸腺ＤＮＡが挙げられる。
【００７８】
ある種の例示的な試薬
ある種の例示的な近接検出プローブ
近接検出プローブは、少なくとも１つの分析物結合部分、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分を含む。分析物結合部分は、選択された分析物に結合することができる。ある種の態様では、近接検出プローブは、１つの分析物結合部分および１つのオリゴヌクレオチド部分を含む。ある種の態様では、近接検出プローブは、１を超える分析物結合部分を含む。ある種の態様では、近接検出プローブは、１を超えるオリゴヌクレオチド部分を含む。ある種の例示的な多価近接プローブは、例えば、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎによる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０００３３６１Ａ１号に記載されている。
【００７９】
種々の態様では、近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、１以上のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドの類似体、および類似体デオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。例示的なリボヌクレオチドの類似体およびデオキシリボヌクレオチドの類似体には、限定されないが、ヌクレオチド糖、リン酸塩、および／または塩基部分への１以上の修飾を含む類似体が挙げられる。例示的なオリゴヌクレオチド類似体には、限定されないが、ＬＮＡ（例えば、米国特許第６，３１６，１９８号を参照されたい）、ＰＮＡ（例えば、米国特許第６，４５１，９６８号を参照されたい）、本明細書において検討されているかまたは当該技術分野において知られている任意の他のヌクレオチド類似体（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｎ  １５；２９（１２）：２４３７−４７、Ｋａｒｋａｒｅら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ａｕｇ；７１（５）：５７５−８６．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｙ  ９を参照されたい）が挙げられる。
【００８０】
種々の態様では、近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、または少なくとも１００ヌクレオチドを含んでもよい。種々の態様では、近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、１０〜１０００ヌクレオチドを含んでもよい。種々の態様では、オリゴヌクレオチド部分は、１０〜５００ヌクレオチドを含んでもよい。種々の態様では、オリゴヌクレオチド部分は、１０〜２００ヌクレオチドを含んでもよい。種々の態様では、オリゴヌクレオチド部分は、１０〜１００ヌクレオチドを含んでもよい。
【００８１】
近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分および分析物結合部分は、互いに共有結合的であるかまたは非共有結合的に関連付けられてもよい。分析物結合部分とオリゴヌクレオチド部分を共有結合的および非共有結合的に関連付けるある種の方法は、当該技術分野において知られている。
【００８２】
ある種の態様では、オリゴヌクレオチド部分は、結合対の第１メンバーを含み、分析物結合部分は、結合対の第２メンバーを含み、ここで、該結合対の第１メンバーおよび該結合対の第２メンバーは、近接検出プローブ結合およびハイブリダイゼーションおよび／または連結のために用いられる条件下で安定に関連付けることができる。ある種の態様では、結合対は、ハイブリダイズおよび／または連結したオリゴヌクレオチド部分の検出中に安定に関連付けられる必要はない。ある種の例示的な結合対には、限定されないが、抗体／抗原、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ハイブリダイゼーションしている核酸、受容体／リガンド、葉酸／葉酸塩結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、タンパク質Ａ／Ｆｃ、タンパク質Ｇ／Ｆｃ、金属／キレート剤などが挙げられる。ある種の態様では、ストレプトアビジンは、スルホ−ＳＭＣＣ試薬（例えば、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）カタログ＃２２３２２を参照されたい）の使用によってオリゴヌクレオチド部分に結合されてもよい。ある種の態様では、分析物結合部分および近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、共有結合的に関連付けられている。種々の分子間に共有結合を形成させるある種の方法は、当該技術分野において知られ、例えば、ピアスのカタログに見出すことができる。近接検出プローブを作成するある種の例示的な方法は、例えば、Ｇｕｌｌｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１（２２）：８４２０−８４２４（２００４）に記載されている。
【００８３】
種々の態様では、オリゴヌクレオチド部分の３’末端または５’末端は、分析物結合部分と関連付けられている。ある種の態様では、オリゴヌクレオチド部分は、例えば、オリゴヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを介して、オリゴヌクレオチド部分の３’末端または５’末端以外の位置で分析物結合部分と関連付けられている。
【００８４】
種々の態様では、２以上の近接検出プローブを組み合わせて、近接検出プローブセットを形成する。種々の態様では、第１の近接検出プローブは、第２の近接検出プローブと対をなして、近接検出プローブ対を形成する。近接検出プローブ対の近接検出プローブは、各々、同じであるかまたは異なっている分析物に結合する。ある種の態様では、セットに含まれる近接検出プローブは、各々、同じ分析物に結合する。ある種の態様では、セットに含まれる近接検出プローブは、各々、異なっている分析物に結合する。ある種の態様では、セットに含まれる第１サブセットの近接検出プローブは、各々、第１分析物に結合し、セットに含まれる第２サブセットの近接検出プローブは、第２分析物に結合する。ある種の態様では、セットに含まれる第１サブセットの近接検出プローブは、第１分析物に結合し、セットに含まれる第２サブセットの近接検出プローブは、第２分析物に結合し、ここで、第１および第２分析物は、ある種の条件下で互いに関連付けることができる。種々の態様では、このような近接検出プローブセットは、例えば、ある種の条件下で第１および第２分析物の関連性を検出するために用いることができる。
【００８５】
ある種の態様では、近接検出プローブは、この近接検出プローブの同じ分析物結合部分を介してかまたは複数の分析物結合部分を介して、１を超える分析物に結合することができる。ある種の態様では、近接検出プローブは、関連する分析物のファミリーの２以上のメンバーに結合することができる。
【００８６】
種々の態様では、近接検出プローブセットの第１のメンバーのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部は、近接検出プローブセットの第２のメンバーのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる。種々の態様では、ハイブリダイズされた領域は、少なくとも５塩基対、少なくとも１０塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、または少なくとも１００塩基対を含む。
【００８７】
種々の態様では、近接検出プローブセットの第１のメンバーのオリゴヌクレオチド部分は、近接検出プローブセットの第２のメンバーのオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズすることができない。例えば、ある種の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドは、近接検出アッセイに添加されてもよく、ここで、該スプリントオリゴヌクレオチド（単数または複数）は、第１の近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、また、第２の近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる。種々の態様では、スプリントオリゴヌクレオチド（単数または複数）と近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分との間でハイブリダイズされた領域は、少なくとも５塩基対、少なくとも１０塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、または少なくとも１００塩基対を含む。種々の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは対称であり、例えば、等しい塩基数の各々のオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズする。種々の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、非対称であり、例えば、第２のオリゴヌクレオチド部分の塩基数よりも多い塩基数の第１のオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズする。ある種の例示的な非対称な非対称なスプリントは、例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００５／１２３９６３号に記載されている。
【００８８】
種々の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド部分の１つの３’末端が他のオリゴヌクレオチド部分の５’末端に隣接するように、第１と第２のオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズする。ある種の態様では、近接検出プローブ対のオリゴヌクレオチド部分の３’および５’末端は、互いに連結され得る。ある種の態様では、オリゴヌクレオチド部分の１つの３’末端は、１以上のヌクレオチドのギャップによって他のオリゴヌクレオチド部分の５’末端から分離されている。ある種の態様では、このギャップは、ポリメラーゼを用いて満たされ、その結果、満たされた（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ）末端が互いに連結され得るようになる。
【００８９】
種々の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、１以上のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドの類似体、および類似体デオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。例示的なリボヌクレオチドの類似体およびデオキシリボヌクレオチドの類似体には、限定されないが、ヌクレオチド糖、リン酸塩、および／または塩基部分に１以上の修飾を含む類似体が含まれる。例示的なオリゴヌクレオチド類似体には、ＬＮＡ（例えば、米国特許第６，３１６，１９８号を参照されたい）、ＰＮＡ（米国特許第６，４５１，９６８号を参照されたい）、本明細書において検討されているかまたは当該技術分野において知られている任意の他のヌクレオチド類似体（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｎ  １５；２９（１２）：２４３７−４７、Ｋａｒｋａｒｅら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ａｕｇ；７１（５）：５７５−８６．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｙ  ９を参照されたい）が挙げられる。ある種の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのデオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチドの代わりに少なくとも１つのデオキシ−ウラシル（ｄＵ）ヌクレオチドを含む。
【００９０】
当業者は、意図された使用に従って、近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分および／またはスプリントオリゴヌクレオチドの適切な配列および長さを選択することができる。近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分および／またはオリゴヌクレオチド部分を選択するための例示的な方法の検討は、例えば、米国特許第６，５１１，８０９Ｂ２号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号に見出すことができる。
【００９１】
ある種の例示的な多官能性溶解緩衝液
上記で検討されるように、多官能性溶解緩衝液は、標的核酸を実質的に分解することなく、近接検出プローブが溶解物に含まれる分析物に結合することができるように適切な分析物エピトープ構造を維持しながら、選択された生物試料を溶解し、ホモジナイズし、および／または抽出することができる。
【００９２】
ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質を含む。種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質の０．０１％〜２０％を含む。種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質の０．０５％〜１０％、０．０５％〜５％、０．１％〜５％、または０．１％〜２％を含む。種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、ＣＨＡＰＳ、ＤＥＤＴＡＢ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、およびＣＡＰＳＯから選択される少なくとも１つの化学物質の０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、５％、または１０％を含む
ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、生物学的緩衝液に適切な１以上の追加の成分を含む。例示的な追加の成分には、限定されないが、緩衝剤、二価陽イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、およびＥＧＴＡ）、一価の塩、二価の塩、還元剤、ＢＳＡ、酵素阻害剤（例えば、リン酸塩阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびＲＮＡｓｅ阻害剤）、核酸（例えば、ポリＡ、サケ精子ＤＮＡなど）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質などが挙げられる。種々の態様では、当業者は、意図された用途に従って、１以上の追加の成分を選択することができる。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの二価陽イオンキレート剤を含む。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥから選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む。
【００９３】
種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、１０ｍＭ〜２００ｍＭまたは２０ｍＭ〜１００ｍＭの少なくとも１つの緩衝剤を含む。
【００９４】
種々の態様では、多官能性溶解緩衝液は、意図された使用に適しているｐＨ、例えば、標的核酸および標的分析物に適しているｐＨを有してもよい。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ｐＨが５〜９である。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ｐＨが６〜８．５である。ある種の態様では、多官能性溶解緩衝液は、ｐＨが６．５〜８である。
【００９５】
ある種の例示的な多官能性溶解緩衝液は、ＮＤＳＢ−２０１、Ｔｒｉｓ、およびＥＤＴＡを含む。
【００９６】
ある種の例示的なプロテアーゼ
種々の態様では、溶解物は、分析用に核酸を放出するためにプロテアーゼで処理される。ある種の態様では、プロテアーゼは、１以上の下記の特徴に基づいて選択される：プロテアーゼが容易に不活性化され得る、プロテアーゼが活性に金属イオンを必要とするかどうか、プロテアーゼが活性に界面活性剤を必要とするかどうか、プロテアーゼ消化が核酸の分解をもたらすかどうか、プロテアーゼが標的核酸を放出するかどうかである。
【００９７】
ある種の態様では、熱によって不活性化され得るプロテアーゼが選択される。ある種の態様では、化学的に不活性化され得るプロテアーゼが選択される。プロテアーゼを不活性化するために用いることができるある種の例示的な化合物には、限定されないが、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、キモスタチン、Ｅ−６４、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、およびＰＭＳＦが挙げられる。ある種の態様では、１以上のセリンプロテアーゼが本方法に用いられる。ある種の態様では、１以上のプロテアーゼは、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇプロテアーゼ、ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫから選択される。ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓが選択された場合、ある種の態様では、このプロテイナーゼは、熱により不活性化される。プロテイナーゼＫが選択された場合、ある種の態様では、このプロテアーゼは、化学的に不活性化される。
【００９８】
ある種の態様では、１を超えるプロテアーゼは、本方法に用いられる。１を超えるプロテアーゼが用いられる場合、これらのプロテアーゼは、同じであるかまたは異なった時間で添加されてもよい。種々の態様では、１を超えるプロテアーゼが用いられる場合、この方法は、１つの不活性化工程または１を超える不活性化工程を含んでもよい。さらに、種々の態様では、不活性化工程は、同じであるかまたは異なっていてもよく、例えば、１以上の不活性化工程は熱処理であってもよく、１以上の不活性化工程は化学的な処理であってもよい。
【００９９】
種々の態様では、例えば、標的分析物がタンパク質またはペプチドである場合、プロテアーゼは、近接検出プローブセットのハイブリダイゼーションおよび／または連結後に添加される。
【０１００】
ある種の例示的な方法
本明細書に提供されている方法は、論理的に可能である列挙された事象の任意の順番で、並びに事象の列挙された順番で行ってもよい。
【０１０１】
標準的な技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養に用いられてもよい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、および／または当該技術分野において通常達成されているように、および／または本明細書に記載されているように行ってもよい。前述の技術および手法は、一般に、当該技術分野において知られている従来の方法、種々の一般的であり、より具体的な参考文献、例えば、限定されないが、本明細書に引用され、全体を通じて検討されている参考文献に記載されている従来の方法に従って行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版，Ｗｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）を参照されたい。特定の定義が与えられていなければ、本明細書に記載されている生物学、生化学、分析化学、および合成有機化学に関連して利用される命名、並びにそれらの実験室手法および技術は、当該技術分野において知られ、用いられているものである。
【０１０２】
生物試料に含まれる標的分析物および標的核酸を検討する方法が提供される。種々の態様では、この方法は、同じ容器内で少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの標的核酸の検出を可能にする。例えば、種々の態様では、少なくとも１つの分析物を検出するために行われるプロセス、少なくとも１つの核酸を検出するために行われるプロセスは、同じ試料に適用される。したがって、種々の態様では、この方法は、検出された標的分析物の量、検出された標的核酸の量との間のより良好な相関関係を可能にし、それは、この試料が分割されていないか、またはある種の検出法の効率に影響を及ぼす可能性のある、異なった条件およびプロセスに供されていないためである。
【０１０３】
種々の態様では、方法は、生物試料を溶解し、近接検出アッセイを用いて標的分析物を検出し、標的核酸を検出することを含む。種々の態様では、標的分析物の検出、標的核酸の検出は、同じ容器内で行われる。種々の態様では、１以上の近接検出プローブセット、および１以上の標的核酸は、同じ検出法を用いて検出される。種々の態様では、１以上の近接検出プローブセットおよび１以上の標的核酸は同時に検出される。種々の態様では、この方法は、１以上の近接検出プローブセットの検出および／または１以上の標的核酸の検出前に、核酸精製工程を含まない。例えば、ある種の態様では、第１の標識を用いて近接検出プローブセットを検出し、第２の標識を用いて標的核酸を検出する。ある種の態様では、異なった標識を用いて、各々異なった近接検出プローブセットおよび各々異なった核酸分子を検出する。
【０１０４】
ある種の態様に従って、生物試料に含まれる標的分析物および標的核酸を検出するためのある種の例示的なワークフロー図が、図１８および１９に示される。
【０１０５】
図１８は、ある種の方法についての下記の非制限的な例示のワークフローを示す。多官能性溶解緩衝液において生物試料の溶解、ホモジナイゼーション、および／または抽出後、少なくとも１つのセットの近接検出プローブはこの溶解物に添加される。次に、溶解物は、近接検出プローブの分析物結合部分による標的分析物への結合を可能にする条件下でインキュベートされる。種々の態様では、０℃〜４５℃の温度でインキュベーションが行われる。ある種の態様では、４５℃を超えてインキュベーションが行われる。種々の態様では、インキュベーションは、０℃〜１０℃、４℃〜１５℃、４℃〜３０℃、１０℃〜２０℃、１５℃〜３０℃、２０℃〜３０℃、または２０℃〜４０℃の温度で行われる。種々の態様では、インキュベーションは、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、または４２℃で行われる。種々の態様では、インキュベーションは、少なくとも一晩行われる。種々の態様では、インキュベーションは、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間行われる。種々の態様では、インキュベーションは、１〜４時間行われる。
【０１０６】
種々の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの近接検出プローブセットの添加前、添加と同時、または添加後に溶解物に添加される。種々の態様では、連結ミックスは、少なくとも１つの近接検出プローブセットの添加後に溶解物に添加される。ある種の態様では、連結ミックスは、適切な緩衝液中で、近接検出プローブセットのオリゴヌクレオチド部分の末端を互いに連結するのに適切なリガーゼ酵素を含む。ある種の態様では、連結ミックスは、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドの添加後に添加される。ある種の態様では、連結ミックスは、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドと同時に添加される。
【０１０７】
連結ミックスを溶解物に添加後、種々の態様では、この溶解物は、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、または少なくとも１時間インキュベートされる。ある種の態様では、溶解物は、５〜１０分間インキュベートされる。種々の態様では、連結ミックスの添加後、０℃〜２５℃の温度で溶解物をインキュベートする。ある種の態様では、２５℃を超える温度で溶解物をインキュベートする。種々の態様では、溶解物は、０℃〜１０℃、４℃〜１５℃、４℃〜２０℃、１０℃〜２０℃、または１５℃〜２５℃の温度でインキュベートされる。ある種の態様では、連結反応は終了される。ある種の態様では、連結反応は、少なくとも１つのプロテアーゼを反応に添加することによって終了される。スプリントオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのｄＵヌクレオチドを含む場合、ある種の態様では、連結反応は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを添加することによって終了される。
【０１０８】
種々の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの近接検出プローブセットが溶解物に添加される前、それと同時に、またはその後に溶解物に添加される。種々の態様では、上記で検討されている連結工程は省略される。例えば、ある種の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドが近接検出プローブセットの添加及びインキュベーション後に添加される場合、溶解物は、さらに、少なくとも１つの近接検出プローブへの少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度および時間でインキュベートされる。種々の態様では、当業者は、このようなハイブリダイゼーションのための適した時間および温度を選択することができる。種々の態様では、ハイブリダイゼーション条件には、０℃〜７５℃の温度が含まれる。種々の態様では、インキュベーションは、０℃〜６５℃、４℃〜５０℃、１０℃〜４５℃、または１５℃〜４０℃で行われる。種々の態様では、インキュベーションは、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４２℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃で行われる。種々の態様では、インキュベーションは、少なくとも４時間行われる。種々の態様では、インキュベーションは、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、または少なくとも２時間行われる。
【０１０９】
種々の態様では、溶解物は、少なくとも１つのプロテアーゼで処理される。種々の態様では、少なくとも１つのプロテアーゼを添加後、溶解物は、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、または少なくとも４時間インキュベートされる。種々の態様では、溶解物は、０℃〜６５℃でインキュベートされる。種々の態様では、溶解物は、０℃〜５５℃、４℃〜５０℃、１０℃〜４５℃、または１５℃〜４０℃でインキュベートされる。種々の態様では、インキュベーションは、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、または４２℃で行われる。ある種の態様では、少なくとも１つのプロテアーゼは、インキュベーション後に不活性化される。ある種の態様では、少なくとも１つのプロテアーゼは、熱により、例えば、少なくとも５分間、少なくとも５０℃で溶解物をインキュベートすることによって不活性化される。ある種の態様では、溶解物を少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、または少なくとも７５℃でインキュベートして、プロテアーゼを熱により不活性化する。ある種の態様では、少なくとも１つのプロテアーゼは、例えば、少なくとも１つの化合物の添加によって不活性化される。ある種の態様では、少なくとも１つのプロテアーゼは、ＰＭＳＦの添加によって不活性化される。
【０１１０】
種々の態様では、少なくとも１つのプロテアーゼの不活性化後、標的核酸およびハイブリダイズされたおよび／または連結された近接検出プローブセットが検出される。種々の態様では、少なくとも１つの標的核酸および少なくとも１つのハイブリダイズされたおよび／または連結された近接検出プローブセットの検出は、多重定量的ＰＣＲを含む。ある種の態様では、標的核酸がＲＮＡである場合、このＲＮＡは、検出前に、または検出の一部として逆転写される。
【０１１１】
図１９は、ある種の方法についての下記の非制限的な例示のワークフローを示す。図１９に示される方法は、連結工程を介して、図１８について上記で検討される方法と同じである。しかしながら、プロテアーゼ処理前に、溶解物のアリコートが、少なくとも１つのハイブリダイズしたおよび／または連結した近接検出プローブセットの検出のために取り出される。
【０１１２】
アリコートを取り出した後、残りの溶解物を図１８について上述されるように処理する。残りの溶解物は、少なくとも１つの標的核酸の検出のために用いられ、取り出されたアリコートは、少なくとも１つのハイブリダイズされたおよび／または連結された近接検出プローブセットの検出のために用いられる。ある種の態様では、少なくとも１つの標的核酸の検出および／または少なくとも１つのハイブリダイズされたおよび／または連結された近接検出プローブセットの検出は、定量的ＰＣＲを含む。ある種の態様では、１を超える標的核酸および／または１を超えるハイブリダイズされたおよび／または連結された近接検出プローブセットが検出されるべき場合、この検出は、多重定量的ＰＣＲを含む。ある種の態様では、標的核酸がＲＮＡである場合、このＲＮＡは、検出前に、または検出の一部として逆転写される。
【０１１３】
ある種の方法のある種の局面は、下記にさらに詳細に記載される。
【０１１４】
ある種の例示的な溶解物
種々の態様では、選択された生物試料は、標的分析物および標的核酸が検出される前に、溶解され、ホモジナイズされ、および／または抽出される。ある種の態様では、この溶解、ホモジナイゼーション、および／または抽出は、多官能性溶解緩衝液中で行われる。
【０１１５】
選択された生物試料が個々の細胞の形態である場合、種々の態様では、これらの細胞は、１μｌ当たり１００〜２００，０００細胞の濃度で多官能性溶解緩衝液に懸濁されてもよい。種々の態様では、これらの細胞は、１００個未満の細胞／μｌまたは２００，０００個を超える細胞／μｌの濃度で再懸濁される。種々の態様では、細胞は、５００〜１００，０００細胞／μｌ、１，０００〜１００，０００細胞／μｌ、５，０００〜７５，０００細胞／μｌ、または１０，０００〜７５，０００細胞／μｌの濃度で再懸濁される。種々の態様では、細胞は、少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、または５０，０００細胞／μｌの濃度で再懸濁される。
【０１１６】
選択された生物試料が組織の形態である場合、種々の態様では、溶解された組織細胞の濃度が、組織がホモジナイズされ得る効率を考慮して、個々の細胞について上記で検討された濃度におよそ等しくなるように、組織は多官能性溶解緩衝液にホモジナイズされてもよい。例えば、ある種の態様では、２０％の組織がホモジナイズしない場合、残りの８０％は、細胞濃度を測定することを目的としてカウントされる。当業者は、多官能性溶解緩衝液における組織試料について適切な濃度を選択することができる。
【０１１７】
同様に、選択された生物試料が、食品、または水もしくは空気のろ過物などの別の形態である場合、当業者は、試料に含まれる細胞（例えば、病原体）の期待される数を推測することができ、したがって、多官能性溶解緩衝液を調節することができる。種々の態様では、選択された生物試料は、多官能性溶解緩衝液を用いた溶解、ホモジナイゼーションおよび／または抽出前に当該技術分野において知られている任意の方法によって濃縮されてもよい。
【０１１８】
種々の態様では、多官能性溶解緩衝液に選択された生物試料を懸濁させた後、この試料の溶解を促進するために溶解物を物理的に処理する。このような物理的な処理には、限定されないが、ボルテックス、凍結融解サイクル（例えば、ドライアイス、液体窒素の使用など）、選択された温度での回転、超音波処理などが挙げられる。当業者は、選択された生物試料の溶解を促進するために適切な物理的処理を選択することができる。
【０１１９】
溶解後、ある種の態様では、溶解物を遠心分離して、固体材料をペレットにする。種々の態様では、次に、保存のための新しい容器に澄んだ溶解物を移してもよい。種々の態様では、この溶解物を４℃または凍結して、例えば、標準的な冷凍庫中で、−８０℃の冷凍庫中で、または液体窒素中で保存する。
【０１２０】
ある種の例示的な近接検出アッセイ
例示的な近接検出アッセイは、例えば、米国特許第６，５１１，８０９Ｂ２号；米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００６４７７９号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号；米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０００３３６１Ａ１号；米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００２６４３０号；Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４７３−４７７（２００２）；Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２：１１５２−１１６０（２００６）に記載されている。
【０１２１】
種々の態様では、近接検出アッセイは、少なくとも１つの近接検出プローブセットと少なくとも１つの標的分析物との間の相互作用を可能にする条件下で、少なくとも１つの近接検出プローブセットを用いて生物試料または溶解物をインキュベートすることを含む。近接検出アッセイが近接連結アッセイである場合、種々の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドは、各々の近接検出プローブセットに対して混合物に添加され、この混合物は、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドと近接検出プローブセットのオリゴヌクレオチド部分との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートされる。ある種の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド部分の３’末端が第２のオリゴヌクレオチド部分の５’末端に隣接されるように２つのオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズする。ある種の態様では、第１のオリゴヌクレオチド部分の３’末端および第２のオリゴヌクレオチド部分の５’末端は一緒に連結される。ある種の態様では、連結は、リガーゼ酵素によって媒介される。
ある種の態様では、連結された生成物は、本明細書において検討された少なくとも１つの方法によって検出される。ある種の態様では、連結された生成物およびハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドは、検出法の一部として、またはその前にプライマー伸張反応に供される。ある種の態様では、プライマー伸張反応は、二本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。ある種の態様では、プライマー伸張反応は、連結された生成物に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。ある種の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドプライマーとともに、プライマー伸張反応におけるプライマーとして機能を果たす。ある種の態様では、スプリントオリゴヌクレオチド以外の２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー伸張反応に含められる。ある種の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドを産生するプライマー伸張反応後、二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖は、連結されたオリゴヌクレオチド部分を含み、第２鎖は、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部に相補的である第１配列に連結され、同時に、（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部に相補的である第２配列に連結されたスプリントオリゴヌクレオチドの配列を含む。
【０１２２】
種々の態様では、検出法が１以上のオリゴヌクレオチド（例えば、１以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドを含む検出プローブ）のハイブリダイゼーションを伴う場合、当業者は、オリゴヌクレオチドが連結された生成物を特異的に検出するために用いることができるように適切なヌクレオチド配列を選択することができる。例えば、ある種の態様では、連結されたオリゴヌクレオチド部分がプライマー伸張反応に供される場合、プライマー伸張生成物にハイブリダイズするが、オリゴヌクレオチド部分およびスプリントオリゴヌクレオチドにはハイブリダイズしない１以上のオリゴヌクレオチドを選択することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、種々の態様では、直接的な検出法および／または増幅工程に関わる検出法に用いられてもよい。ある種の態様では、１以上のオリゴヌクレオチドは、連結されたオリゴヌクレオチド部分を増幅するために選択され得て、その結果、部分が一緒に連結される場合にだけ増幅が生じる。
【０１２３】
種々の態様では、近接検出アッセイが近接相互作用アッセイである場合、第１の近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分は、第２の近接検出プローブのオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズすることができる。あるいは、ある種の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドは、各々の近接検出プローブセットについて混合物に添加される。種々の態様では、次に、この混合物は、ハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド部分間、および／またはオリゴヌクレオチド部分と少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートされる。
【０１２４】
ある種の態様では、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、検出法の一部として、またはその前にプライマー伸張反応に供される。ある種の態様では、オリゴヌクレオチド部分が互いにハイブリダイズする場合、プライマー伸張反応は、各々のオリゴヌクレオチド部分の末端から伸張して、第２のオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部に相補的である配列に接続された第１のオリゴヌクレオチド部分を含む第１鎖と、第１のオリゴヌクレオチド部分の少なくとも一部に相補的である配列に接続された第２のオリゴヌクレオチド部分を含む第２鎖とを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを生じる。ある種の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、更なるプライマー伸長反応に供される。ある種の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、更なるプライマー伸長反応に供される。
【０１２５】
ある種の態様では、少なくとも１つのスプリントオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド部分にハイブリダイズする場合、スプリントオリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドを生じるために、第２のオリゴヌクレオチドプライマーとともに、プライマー伸長反応においてプライマーとして機能を果たす。ある種の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、各々のオリゴヌクレオチド部分オリゴヌクレオチド部分の配列の少なくとも一部を含む第１鎖と、オリゴヌクレオチド部分の１つの少なくとも１つに相補的である（配列に接続されたスプリントオリゴヌクレオチドの配列を含む第２鎖とを含む。
【０１２６】
ある種の態様では、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、本明細書において検討されている少なくとも１つの方法によって検出される。種々の態様では、検出法が１以上のオリゴヌクレオチド（例えば、１以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドを含む検出プローブ）のハイブリダイゼーションを伴う場合、当業者は、１以上のオリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイズされた生成物を特異的に検出することができるように、適切なヌクレオチド配列を選択することができる。例えば、ある種の態様では、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド部分がプライマー伸長反応に供される場合、プライマー伸長生成物にハイブリダイズするが、オリゴヌクレオチド部分にはハイブリダイズしない１以上のオリゴヌクレオチドを選択することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、種々の態様では、直接的な検出法および／または増幅工程を伴う検出法において用いられてもよい。
【０１２７】
近接検出アッセイのためのある種の例示的な標準化対照
種々の態様では、標的核酸の量は、少なくとも１つの標準化対照に対して標準化されてもよい。種々の態様では、標的分析物の量は、少なくとも１つの標準化対照に対して標準化されてもよい。ある種の例示的な標準化対照は、例えば、本明細書、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号に記載されている。種々の態様では、当業者は、特定の用途のために１以上の標準化対照を選択することができる。
【０１２８】
種々の態様では、試料は、少なくとも１つの標準化対照、少なくとも２つの標準化対照、少なくとも３つの標準化対照、少なくとも４つの標準化対照、または少なくとも５つの標準化対照を含む。ある種の態様では、試料は、少なくとも１つの分析物標準化対照および少なくとも１つの核酸標準化対照を含む。ある種の態様では、試料は、少なくとも１つの内因性標準化対照および少なくとも１つの外因性標準化対照を含む。ある種の態様では、試料に含まれる全ての標準化対照は、外因性である。ある種の態様では、分析物標準化対照を用いて、標的分析物を標準化する。ある種の態様では、核酸標準化対照を用いて、標的分析物を標準化する。ある種の態様では、核酸標準化対照を用いて、標的核酸を標準化する。ある種の態様では、分析物標準化対照を用いて、標的核酸を標準化する。ある種の態様では、標的核酸および標的分析物は、同じ標準化対照について標準化される。ある種の態様では、標的核酸および標的分析物は、同じ標準化対照について標準化される。ある種の態様では、標的核酸および標的分析物は、異なる標準化対照について標準化される。
【０１２９】
ある種の態様では、標準化対照は、標的分析物および／または標的核酸が検出される同じ溶解物において検出される。ある種の態様では、標準化対照は、同じであるかまたは異なった方法を用いて、標的分析物および／または標的核酸が検出される同じ容器で検出される。種々の態様では、溶解物は分配されるかまたは分割され、標準化対照並びに少なくとも１つの標的分析物および標的核酸は、同じであるかまたは異なった方法を用いて、別々の容器で検出される。種々の態様では、標準化対照は、少なくとも１つの標的分析物と標的核酸とが検出されるのと同時に検出される。
【０１３０】
ある種の態様では、標的分析物の量は、ΔＣＴ法を用いて標準化対照に対して標準化されてもよい。ある種の態様では、標的分析物の量は、ΔΔＣＴ法を用いて、標準化対照に対して標準化されてもよい。ある種の態様では、標準化対照の使用は、分析物を用いる外部標準曲線を作成する必要性を排除する場合があり、ここでは、溶解物に個々のレベルの分析物が存在する場合に観察されるＣＴ値とは異なるＣＴ値を得てもよい。
【０１３１】
ある種の態様では、標的核酸の量は、ΔＣＴ法を用いて標準化対照に対して標準化されてもよい。ある種の態様では、標的核酸の量は、ΔΔＣＴ法を用いて標準化対照に対して標準化されてもよい。ある種の態様では、標準化対照の使用は、溶解物に含まれる核酸の個々のレベルによって観察されるＣＴ値とは異なるＣＴを生じ得る、核酸を用いて外部標準曲線を作成する必要性を排除する。
【０１３２】
種々の態様では、標準化対照の使用は、近接検出アッセイにおける可変体（ｖａｒｉａｂｌｅ）に対して調節してもよい。近接検出アッセイにおけるある種の例示的な可変体には、限定されないが、核酸の分解、分析物の分解、分析物のエピトープ構造が維持されている程度、近接検出プローブが分析物に結合する効率、連結反応の効率、およびリアルタイムＰＣＲ反応の効率が含まれる。
【０１３３】
種々の態様では、分析物標準化対照は、近接検出アッセイを用いて検出される。ある種の例示的な近接検出アッセイは、本明細書に記載されている。ある種の態様では、分析物標準化対照は、標的分析物と同じ方法（適切な近接検出プローブを用いる）、同じ容器を用いて検出される。ある種の態様では、分析物標準化対照は、標的分析物と同じ方法（適切な近接検出プローブを用いる）を用いるが、異なった容器を用いて検出される。
【０１３４】
種々の態様では、分析物標準化対照を検出するために用いられる核酸標準化対照および／または近接検出プローブは、直接的な検出法によるかまたは増幅工程を伴う検出法によって検出される。ある種の例示的な核酸を検出する方法および／または近接検出プローブは、本明細書に記載されている。ある種の態様では、異なった標識を用いて、核酸標準化対照、標的核酸、分析物標準化対照を検出するために使用される近接検出プローブ、および／または標的物を検出するために用いられる近接検出プローブを検出する。
【０１３５】
種々の態様では、核酸標準化対照がＲＮＡである場合、核酸標準化対照は、近接検出プローブ、標的核酸、および／または第２の核酸標準化対照を検出するために用いられる同じ方法を用いて検出することができる形態にそれを変換するための前処理に供される。
【０１３６】
ある種の態様では、分析物標準化対照を検出するために用いられる核酸標準化対照および／または近接検出プローブは、リアルタイムＰＣＲを用いて検出される。ある種の態様では、分析物標準化対照を検出するために用いられる核酸標準化対照および／または近接検出プローブは、ＰＣＲおよび連結の組合せを用いて検出される。例えば、ある種の態様では、分析物標準化対照を検出するために用いられる核酸標準化対照および／または近接検出プローブは、初めにＰＣＲによって増幅され、次に連結調査（ｉｎｑｕｉｒｙ）を適用することによって検出される。ある種の例示的なこのような方法は、当該技術分野において知られ、例えば、Ｃｈｅｎら，“Ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８（５）：５４９−５６（１９９８）に記載されている。
【０１３７】
ある種の態様では、核酸標準化対照は、初めに連結反応、その後にＰＣＲ増幅を伴う方法を用いて検出される。ある種の例示的なこのような方法は、当該技術分野において知られ、例えば、米国特許第４，７９７，４７０号に記載されている。例えば、ある種の態様では、核酸標準化対照は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。ある種の態様では、この少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは、連結によって接合されることができる。ある種の態様では、オリゴヌクレオチドの各々の連結可能な末端が核酸標準化対照によって一緒にされる。ある種の態様では、２つのオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接するように連結鋳型にハイブリダイズする。ある種の態様では、各々のオリゴヌクレオチドの連結可能な末端は、連結によって接合される。ある種の態様では、連結は、リガーゼ酵素によって媒介される。連結を伴う方法による核酸標準化対照の検出は、ある種の態様では、近接検出アッセイにおいて連結反応工程の効率に対して調節されてもよい。
【０１３８】
ある種の例示的なブロッキング剤
ある種の態様では、近接検出アッセイは、少なくとも１つのブロッキング剤の存在において行われる。種々の態様では、近接検出アッセイは、分析物ブロッキング剤および／または核酸ブロッキング剤の存在下で行われる。ある種の態様では、分析物ブロッキング剤は、タンパク質である。ある種の態様では、タンパク質ブロッキング剤は、ゼラチンである。ある種の態様では、核酸ブロッキング剤は、主に、一本鎖核酸である。ある種の態様では、核酸ブロッキング剤は、主に、二本鎖核酸である。
【０１３９】
ある種の態様では、少なくとも１つのブロッキング剤は、多官能性溶解緩衝液に添加される。ある種の態様では、少なくとも１つのブロッキング剤は、溶解物に添加される。少なくとも１つのブロッキング剤は、１以上の近接検出プローブの添加前またはそれと同時に溶解物に添加される。ある種の態様では、少なくとも１つのブロッキング剤は、ハイブリダイズされたおよび／または連結されたヌクオチド部分および／または標的核酸の検出前に溶解物に添加される。ある種の態様では、少なくとも１つの分析物ブロッキング剤および少なくとも１つの核酸ブロッキング剤が添加される。種々の態様では、１を超えるブロッキング剤が添加される場合、それらは、同時であるかまたは別の時間で添加されてもよい。
【０１４０】
図２０は、ある種の分析物ブロッキング剤、０．１％冷凍魚ゼラチンおよび１％ＢＳＡの存在下で行われたＶＥＧＦを検出するための近接連結アッセイの例示的な結果を示す。それらの例示的な結果においては、近接連結反応は、０．１％コールド魚ゼラチンおよび１％ＢＳＡにおいて同様に等しく行う。
【０１４１】
図２１は、ある種の核酸ブロッキング剤、ポリＡ、ポリｄＣ、ポリｄＧ＋ポリｄＣ、および切断されたウシ胸腺ＤＮＡ（「ＣＦＤ」）の存在下で行われたＶＥＧＦを検出するための近接連結アッセイの例示的な結果を示す。図２１の対照は、少なくとも２週間、４℃で保存されたポリＡの存在下で行われる。それらの例示的な結果において、二本鎖核酸ブロッキング剤（ポリｄＧ＋ポリｄＣおよび切断されたウシ胸腺ＤＮＡ）の存在下で行われた近接連結アッセイは、一本鎖核酸ブロッキング剤（ポリＡ、およびポリｄＣ）の存在下で行われた近接連結アッセイよりも大きな検出範囲を示した。
【０１４２】
ある種の例示的な連結反応の終了
ある種の態様では、近接連結アッセイにおける連結反応は、連結された生成物の検出前に終了される。ある種の態様では、連結反応は、近接連結アッセイを保存する前に終了される。近接連結アッセイは、連結された生成物の検出前または検出後に保存されてもよい。ある種の態様では、連結反応の終了は、例えば、近接連結アッセイの保存中に、経時的に蓄積されてもよい追加の連結された生成物の量を減少させる。
【０１４３】
ある種の態様では、連結反応は、プロテアーゼを用いた処理によって終了される。ある種の例示的なプロテアーゼは、本明細書に記載されている。ある種の態様では、連結反応は、スプリントオリゴヌクレオチドを変更することによって終了される。ある種の態様では、近接検出アッセイに用いられるスプリントオリゴヌクレオチドは、デオキシ−チミン（ｄＴ）の代わりにデオキシ−ウラシル（ｄＵ）を含む。ある種の態様では、ｄＵを含むスプリントオリゴヌクレオチドは、連結工程の後にウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）を近接検出アッセイに添加することによって変更される。ある種の態様では、スプリントオリゴヌクレオチドの変更は、連結された生成物の検出中に形成される場合がある望ましくないプライマー伸長生成物を減少させる。
【０１４４】
図２２は、ｄＵを含むスプリントオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＣＰ−１を検出する近接連結アッセイの例示的な結果を示す。このアッセイは、連結反応後にＵＮＧ処理しておよび処理しないで、連結産物の検出前に凍結融解サイクルを伴っておよび伴わないで行われた。０Ｕ、０．００２Ｕ、０．０２Ｕ、および０．２ＵのＵＮＧを用いた例示的な処理を示す。ＵＮＧ処理は、その例示的な実験において、３７℃で１５分間、その後、９５℃で３分行われる。さらに、ｑＰＣＲは、ＵＮＧ処理の直後（実線）、凍結融解の１サイクルを伴うＵＮＧ処理の２４時間後（点線）にその例示的な実験において連結産物を検出するために行われた。例示的なデータは、ＵＮＧインキュベーション工程を含めることが、ある種の態様では、経時的な連結産物の蓄積を減少させることを示す。
【０１４５】
近接検出プローブおよび標的核酸のある種の例示的な検出
種々の態様では、近接検出プローブおよび標的核酸のハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、種々の態様では、別々におよび／または同時に検出されてもよい。ある種の態様では、近接検出プローブおよび標的核酸のハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、同時または異なった時間のいずれかで、同じ容器で検出される。ある種の態様では、例えば、標的核酸がＲＮＡである場合、標的核酸は、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分と同じ方法を用いて検出され得る形態に該標的核酸を変換するための前処理に供される。このような前処理には、限定されないが、逆転写が含まれる。
【０１４６】
ある種の態様では、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、標的核酸を検出するのと同じ方法を用いて検出され得る形態にそれらを変換するための前処理に供される。このような前処理には、限定されないが、連結およびプライマー伸長反応が含まれる。ある種の態様では、ハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分の検出が増幅を伴う場合に、前処理のプライマー伸長反応を必要としない場合があり、それは、増幅条件が増幅前、またはそれと同時にプライマー伸長反応が生じ得るためである。
【０１４７】
ある種の態様では、溶解物は分配されるかまたは分割され、同じであるかまたは異なった方法を用いて、近接検出プローブの標的核酸およびハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は別々の容器で検出される。ある種の態様では、溶解物は、近接検出プローブがハイブリダイズされたおよび／または連結された後に分割される。ある種の態様では、溶解物は、検出をもたらすプロセスの全てが行われた後に分割される。例えば、ある種の態様では、溶解物は、例えば同じ検出プローブが各々の検出法に用いられてもよいように、近接検出プローブセットおよび標的核酸の別々の検出を促進するためだけに分割される。種々の態様では、溶解物は、溶解後、近接検出プローブを結合した後、近接検出プローブのハイブリダイゼーションおよび／または連結の後、またはプロテアーゼ処理の後に分割されてもよい。
【０１４８】
ある種の態様では、標的核酸がＲＮＡである場合、標的核酸は、選択された検出法の前またはその最中のいずれかで逆転写に供される。また、標的核酸のＤＮＡコピーは、標的核酸（ＲＮＡコピーが標的ＲＮＡ核酸と呼ばれる場合があり、ＤＮＡコピーが標的核酸と呼ばれる場合があるが）とも呼ばれる。種々の態様では、標的核酸ＲＮＡが標的核酸ＤＮＡに逆転写された後、標的核酸ＤＮＡは、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分と同じ方法によって検出される場合がある。ある種の態様では、標的核酸ＤＮＡおよび近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、同じ容器内で、同じ検出法によって同時に検出される。
【０１４９】
ある種の態様では、近接検出プローブの複数のハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分、および／または複数の標的核酸は、同じ容器内で同時に検出される。ある種の態様では、異なる標識を用いて、異なった近接検出プローブセットおよび異なった標的核酸を同定する。例えば、ある種の態様では、５つの標的分析物および５つの標的核酸が生物試料において検出され、１つの検出法を用いて、５つの異なった近接検出プローブセットおよび５つの異なった標的核酸を検出する場合、１０個の異なる標識を用いて、異なった生成物を別々に同定してもよい。種々の態様では、このような標識は、本明細書で検討されている検出プローブの形態、または検出法での使用に適切である当該技術分野において知られている任意の他の標識の形態であってもよい。当業者は、種々の態様に従って、適切な標識または複数の標識を選択することができる。
【０１５０】
ある種の態様では、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分、および／または標的核酸は、リアルタイムＰＣＲを用いて検出される。リアルタイムＰＣＲを行う例示的な方法には、限定されないが、５’ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲ、およびその多重バージョンが挙げられる。５’ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲのある種の例示的な方法は、当該技術分野において知られ、例えば、Ｌｉｖａｋ，“ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ５’−ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１２：１２９−４７（２００３）；Ｌｅｅら，“Ｓｅｖｅｎ−ｃｏｌｏｒ，ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｘ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７（２）：３４２−９（１９９９）；Ｌｉｖａｋ，“Ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ５’ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ，”Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ．１４（５−６）：１４３−９（１９９９）；Ｈｅｉｄら，“Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（１０）：９８６−９４（１９９６）；Ｌｅｅら，“Ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１；２１（１６）：３７６１−６（１９９３）に記載されている。例示的な定量的ＰＣＲは、例えば、Ａ−Ｚ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＩＵＬ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ（２００４）に記載されている。また、リアルタイムＰＣＲのある種の例示的な方法は、例えば、Ｗａｔｓｏｎら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００５  Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ；２４（３）：１３９−４５，米国特許第６，８９０，７１８号；同第６，７７３，８１７号；及び同第６，２５８，５６９号に記載されている。ある種の態様では、標的核酸は、ＴａｑＭａｎ（ＴａｑＭａｎ）ワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて検出される。
【０１５１】
種々の態様では、受動参照色素は、定量的ＰＣＲ法に用いられてもよい。ある種の例示的な受動参照色素は、米国特許第５，７３６，３３３号に記載されている。種々の態様では、外部対照は、定量的ＰＣＲ法において用いられてもよい。ある種の例示的な定量的対照は、例えば、米国特許第６，８９０，７１８号に記載されている。
【０１５２】
ある種の態様では、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分、および／または標的核酸は、ＰＣＲおよび連結の組合せを用いて検出される。非制限的な例として、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、初めにＰＣＲによる増幅、次に連結調査の適用によって検出され得る。ある種の例示的なこのような方法は、当該技術分野において知られ、例えば、Ｃｈｅｎら，“Ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ，  ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８（５）：５４９−５６（１９９８）に記載されている。更なる非制限的な例として、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分は、初めに連結反応、その後のＰＣＲ増幅によって検出されてもよい。ある種の例示的なこのような方法は、当該技術分野において知られ、例えば、米国特許第４，７９７，４７０号に記載されている。
【０１５３】
種々の態様では、連結アッセイは、例えば、米国特許第６，５１１，８１０号に記載されているフラップエンドヌクレアーゼを含んでもよい。
【０１５４】
ある種の態様では、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分、および／または標的核酸は、第１の「前増幅反応」（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００４／０５１２１８号に記載される）において増幅され、次に、第２の増幅反応において解読される。ある種の例示的なこのような方法は、当業者に知られ、例えば、米国特許第６，６０５，４５１号；Ｌａｏらによる米国特許出願第１１／０９０，４６８号；およびＡｎｄｅｒｓｅｎらの米国特許出願第１１／０９０，８３０号に記載されている。
【０１５５】
また、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分、および／または標的核酸を検出するある種の例示的な方法は、例えば、米国特許第６，５１１，８０９Ｂ２号；米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００６４７７９Ａ１号；およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号に記載されている。ある種の例示的な多重検出法は、例えば、Ｂｏｄｅａｕらによる米国特許出願第１１／３７２，２４２号に記載されている。
【０１５６】
種々の態様では、検出プローブを用いて、近接検出プローブのハイブリダイズされたおよび／または連結されたオリゴヌクレオチド部分、および／または標的核酸、および／または増幅産物の検出を促進する。ある種の例示的な検出プローブは、本明細書において検討されている。種々の態様では、当業者は、意図された用途に従って、１以上の適切な検出プローブを選択することができる。
【０１５７】
例示的なキット
種々の態様では、本発明を実施するための少なくとも１つの成分を含むキットが提供される。種々の態様では、キットは、少なくとも１つの多官能性溶解緩衝液を含む。種々の態様では、キットは、少なくとも１つの近接検出プローブセットを含む。種々の態様では、キットは、少なくとも１つのプロテアーゼを含む。種々の態様では、キットは、少なくとも１つのリガーゼを含む。種々の態様では、キットは、少なくとも１つの標準化対照を含む。
【０１５８】
種々の態様では、キットは、近接検出プローブおよび／または標的核酸を検出するための少なくとも１つの成分を含む。種々の態様では、キットは、標準化対照を検出するための少なくとも１つの成分を含む。例示的な成分には、限定されないが、検出プローブ、プライマー、ポリメラーゼ、および逆転写酵素が挙げられる。
【実施例】
【０１５９】
（実施例１）
細胞溶解物に含まれるタンパク質およびｍＲＮＡの定量的検出
ＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞は、１０００×ｇで５分間遠心分離することによってペレットにした。ＰＢＳの１μｌ当たり５０，０００細胞の濃度で細胞を懸濁させた。等量の２×緩衝液Ｎ（２×緩衝液Ｎは、０．２％ＮＤＳＢ−２０１、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０である）を懸濁液に添加し、５秒間ボルテックスすることによって十分に混合した。
【０１６０】
近接連結アッセイ
５つの標的分析物は、近接連結アッセイによって検出するために選択された。標的分析物は、ＡＤＡＭ９（ＡＤＡＭ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＤＡＭ９＆ｓｅａｒｃｈ＝ＡＤＡＭ９）；ＣＣＬ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＣＣＬ５＆ｓｅａｒｃｈ＝ｃｃｌ５）；ＣＳＴＢ（シスタチンＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＣＳＴＢ＆ｓｅａｒｃｈ＝ｃｙｓｔａｔｉｎ＋Ｂ）；ＳＭＡＤ４（ＤＤＰホモログに対する母体４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＳＭＡＤ４＆ｓｅａｒｃｈ＝ｓｍａｄ４）；およびＲＵＮＸ１（ラント関連転写因子（Ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＲＵＮＸ１＆ｓｅａｒｃｈ＝ｒｕｎｘ１）であった。本実験では、各標的分析物に対する近接連結アッセイは、別々に行われた。
【０１６１】
近接検出プローブは、Ｓｉｍｏｎ  Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎによって提供された。例示的な近接検出プローブおよび近接検出プローブを設計するための方法は、ＰＣＴ国際公開第２００５／１２３９６３号に記載されている。各標的分析物について、２つのオリゴヌクレオチドは、第１に５’−結合ストレプトアビジンを用いて、第２に３’−結合ストレプトアビジンを用いて合成された。２００ｎＭストックの第１のストレプトアビジン結合したオリゴヌクレオチドの５μｌは、緩衝液Ｃ（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％  ＢＳＡ、５ｎＭ  ＥＤＴＡ）中で選択された標的分析物に対する２００ｎＭストックのビオチン化されたポリクローナル抗体（ビオチン化されたポリクローナル抗体の全てはＲ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）からのものである）の５μｌと混合された。同様に、２００ｎＭストックの第２のストレプトアビジン結合のオリゴヌクレオチドの５μｌは、緩衝液Ｃ中で選択された標的分析物に対するビオチン化された２００ｎＭストックのポリクローナル抗体の５μｌと混合された。混合物を１時間、室温でインキュベートした。各々の近接検出プローブは、緩衝液Ｄ（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、１％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ビオチン、および１６μｇ／ｍｌ  ポリＡ）の１ｎＭまで、９９μｌの緩衝液Ｄを１μｌの近接検出プローブに添加することによって希釈された。これは、５つの標的分析物の各々に対する第１および第２の近接検出プローブ（即ち、近接検出プローブセット）をもたらした。
【０１６２】
５つの異なる近接検出プローブセットの１つを各々用いて、５つの別々の溶液を形成するために、プローブセットの第１および第２の近接検出プローブを各々の近接検出プローブについて１００ｐＭの濃度で緩衝液Ｄにおいて組合わせた。細胞溶解物の３つの濃度を緩衝液Ｄによる希釈によって調製し、１μｌ当たり５０００、５００、または５０細胞に相当していた。ホスファターゼ阻害剤カクテル（１００×ＨＡＬＴホスファターゼ阻害剤カクテル、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）カタログ＃７８４２０）は、第２の近接検出プローブの５’ホスフェートを保護するために、１×の濃度までの細胞溶解物希釈物に添加された。緩衝液Ｎ中の１μｌの細胞溶解物は１μｌの近接検出プローブ対溶液と混合され、１時間、３７℃でインキュベートされた。プローブ結合混合物に含まれる各々の近接検出プローブの濃度は、５０ｐＭであった。
【０１６３】
プローブ連結について、スプリントオリゴヌクレオチド（単数または複数）は、Ｓｉｍｏｎ  Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎによって提供された。例示的なスプリントオリゴヌクレオチドおよびスプリントオリゴヌクレオチドを設計する方法は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号に記載されている。各々のスプリントオリゴヌクレオチドは、近接検出プローブセットにおける第１のオリゴヌクレオチド部分の遊離した３’末端が近接検出プローブセットに含まれる第２のオリゴヌクレオチド部分の遊離した５’末端に隣接するように、近接検出プローブセットの各々のオリゴヌクレオチド部分の一部にハイブリダイズすることができた。各スプリントオリゴヌクレオチドは非対称であった（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号を参照されたい）。１２０μｌの連結溶液（１×ＰＣＲ  ＩＩ緩衝液（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、１００ｎＭのスプリントオリゴヌクレオチド、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３ｍＭのＮＡＤ、１０ｍＭのＤＴＴ、および２．５ユニットのアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（エピセントレ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））をプローブ結合混合物に添加した。各々の近接検出プローブセットに対する３つの連結混合物中のＲａｊｉ細胞の相当の濃度は、約４１．７細胞／μｌ、４．１７細胞／μｌ、および０．４１７細胞／μｌであった。連結混合物は、３０℃で１０分間インキュベートされた。４１．７細胞／μｌおよび４．１７細胞／μｌを含む２０μｌの連結混合物を取り出し、ｍＲＮＡ検出のために保存した（後述される）。
【０１６４】
連結された近接検出プローブセットは、下記のようにリアルタイムＰＣＲを用いて検出された。１０μｌの連結混合物は、１０μｌの２×パワーＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ；カタログｎｏ．４３６７２１８）、並びに連結されていない近接検出プローブではなく、近接検出プローブ対の連結されたオリゴヌクレオチド部分を増幅させるために設計された、各々０．０４μｌのフォワードおよびリバースプライマー（最終のプライマー濃度は各プライマーについて４００ｎＭであった）に混合された。フォワードおよびリバースプライマーは、Ｓｉｍｏｎ  Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎによって提供された。例示的なフォワードおよびリバースプライマー配列は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００５／１２３９６３号に記載されている。リアルタイムＰＣＲは、パワーＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスプロトコール（アプライドバイオシステムズ；カタログｎｏ．４３１０２５１）に従って行われた。
【０１６５】
ｍＲＮＡ検出
連結混合物の２０μｌ試料は、６０分間、３７℃で５μｌのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ（フルカ（Ｆｌｕｋａ）カタログｎｏ．８１７４８；６．３４Ｕ／ｍｇ）を用いて処理された。次に、混合物を１０分間、７５℃に加熱し、プロテアーゼ活性を低下させまたは排除した。プロテアーゼ処理した連結混合物は、「ｍＲＮＡ試料」と呼ばれる。各々の近接検出プローブについて、２つのｍＲＮＡ試料中のＲａｊｉ細胞の相当濃度は、約３３．３細胞／μｌおよび３．３３細胞／μｌであった。
【０１６６】
２５μｌのｍＲＮＡ試料は、１００μｌの水および５μｌの５０μｇ／μｌのＢＳＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）；カタログｎｏ．２６１６）を添加することによって、約１：５に希釈された。したがって、希釈されたｍＲＮＡ試料に含まれるＢＳＡの最終濃度は、約２μｇ／μｌであり、各々の近接検出プローブセットについて２つの希釈されたｍＲＮＡ試料に含まれるＲａｊｉ細胞の相当濃度は、約６．６細胞／μｌおよび０．６６細胞／μｌであった。希釈されたｍＲＮＡ試料の５μｌを２５μｌのＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。各々の近接検出プローブセットについてＲＴ−ＰＣＲ反応のＲａｊｉ細胞の相当な総数は、約３３細胞および３．３細胞であり、約０．５ｎｇの総ＲＮＡおよび０．０５ｎｇの総ＲＮＡに等しく、約１５ｐｇ／細胞のＲＮＡ濃度であると推測された。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイプライマーおよびプローブ（アプライドバイオシステムズ；カタログｎｏ．ＳＭＡＤ４：Ｈｓ００２３２０６８ ｍ１；ＣＣＬ５：Ｈｓ００１７４５７５ ｍ１；ＣＳＴＢ：Ｈｓ００１６４３６８ ｍ１；ＡＤＡＭ９：Ｈｓ００１７７６３８ ｍ１；ＲＵＮＸ１：Ｈｓ００２３４０７９ ｍ１）は、１×濃度で用いられ、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応は、製造業者のプロトコール（アプライドバイオシステムズ；キットカタログｎｏ．４３０９１６９；プロトコールカタログｎｏ．４３１０２９９）に従ってアプライドバイオシステムズのＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス試薬キットを用いて行われた。連結混合物に含まれる１８Ｓ  ＲＮＡの検出は、対照（１８Ｓ  ＲＮＡ対照試薬；アプライドバイオシステムズ、カタログｎｏ．４３０８３２９）として用いられた。最後に、Ｒａｊｉ細胞から精製された１００ｎｇのＲＮＡは、各々の選択された標的について、正の対照として用いられた。各々の反応は、正の対照を除いて、３点測定で行われ、１つのウェル中でなされた。５つの選択された標的分析物は全て、ＦＡＭを用いて検出され、１８Ｓは、ＶＩＣを用いて検出された。
【０１６７】
この実験の近接連結アッセイおよびｍＲＮＡ検出アッセイの結果は下記の通りである。図１は、試験された３つのＲａｊｉ細胞溶解物濃度での各々の標的分析に対する平均的な閾値サイクル（Ｃｔ）を示す。そのデータは、この近接連結アッセイ実験が、投薬量に依存して、首尾よくＣＳＴＢを検出したことを示している。
【０１６８】
図２は、上記で検討されたように、標的ｍＲＮＡを検出するために用いられたＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応の各々についての蛍光における相対的な増加（ΔＲｎ）対サイクルを示す。ＦＡＭ層だけが図２において検出され、そのため、ＶＩＣを用いた１８Ｓ反応は検出できない。そのデータは、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応のほぼ全てが検出可能な増幅産物を生成したことを示した。蛍光における急な相対増加は、相対的にしっかりした増幅が各々の標的ｍＲＮＡについて達成されたことを示唆する。
【０１６９】
図３は、反応が行われる９６ウェルプレートのウェル位置によって、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応の各々について閾値サイクル（Ｃｔ）のプロットを示す。ＦＡＭ層だけが、図３において検出され、そのため、ＶＩＣを用いる１８Ｓ反応は検出できない。反応のウェル位置は下記の通りである。ウェルＡ１〜Ａ１２（図３では１〜１２）は、５つのうち４つの標的ｍＲＮＡ（ウェルＡ１〜Ａ３にはＡＤＡＭ９、ウェルＡ４〜Ａ６にはＣＣＬ５、ウェルＡ７〜Ａ９にはＣＳＴＢ、ウェルＡ１０〜Ａ１２にはＳＭＡＤ４）については、より高いＲａｊｉ細胞相当濃度（１反応当たり３３細胞）を用いる３点測定反応を含んだ。ウェルＢ１〜Ｂ６（図３では１３〜１８）は、ＲＵＮＸ１（ウェルＢ１〜Ｂ３）および対照ＲＮＡ、１８Ｓ（ウェルＢ４〜Ｂ６）について最大のＲａｊｉ細胞相当濃度（１反応当たり３３細胞）を用いて３点測定反応を含んだ。ウェルＢ７〜Ｂ１２（図３では１９〜２４）は、各々の選択された標的（ウェルＢ７〜Ｂ１１には、それぞれＡＤＡＭ９、ＣＣＬ５、ＣＳＴＢ、ＳＭＡＤ４、ＲＵＮＸ１）および１８Ｓ  ＲＮＡ（ウェルＢ１２）を検出するためにＲａｊｉ細胞から精製したＲＮＡの１００ｎｇを用いて、正の対照反応を含んだ。ウェルＣ１〜Ｃ１２（図３では２５〜３６）は、５つの標的ｍＲＮＡのうち４つ（Ｃ１〜Ｃ３にはＡＤＡＭ９、ウェルＣ４〜Ｃ６ではＣＣＬ５、ウェルＣ７〜ＣＣ９ではＣＳＴＢ、ウェルＣ１０〜Ｃ１２ではＳＭＡＤ４）についてより低いＲａｊｉ細胞相当濃度（１反応当たり３．３細胞）を用いる３点測定反応を含んだ。ウェルＤ１〜Ｄ６（図３では１３〜１８）は、ＲＵＮＸ１（ウェルＤ１〜Ｄ３）および対照ＲＮＡ、１８Ｓ（ウェルＤ４〜Ｄ６）についてより低いＲａｊｉ細胞相当濃度（１反応当たり３．３細胞）を用いて３点測定反応を含んだ。これらのデータは、選択された標的の全てに関するｍＲＮＡが、１反応当たり３３細胞を用いてＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応において検出されたことを示す。
【０１７０】
１反応当たり３３細胞が１反応当たり約０．５ｎｇに相当することを想定すれば、正の対照反応は、１００ｎｇの精製したＲａｊｉ  ＲＮＡを用いた場合、約２００×を超えるＲＮＡを含んだ。２００×を超えるＲＮＡを用いると、閾値サイクル（ΔＣｔ）の相違は、約７．６であることが期待され、これは、およそ、（ウェル１〜３とウェル１９、ウェル４〜６とウェル２０、ウェル７〜９とウェル２１、ウェル１０〜１２とウェル２２、ウェル１３〜１５とウェル２３と比較して）観察されたものである。測定された平均のΔＣｔは、ＡＤＡＭ９については６．９９、ＣＣＬ５については６．００、ＣＳＴＢについては５．２１、ＳＭＡＤ４については４．９７、ＲＵＮＸ１については３．０３であった。
【０１７１】
図４は、１８Ｓ  ＲＮＡを検出するために用いられたＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応の各々についての蛍光の相対的増加（ΔＲｎ）対サイクルを示す。ＶＩＣ層だけが、図４において検出され、それにより、標的ｍＲＮＡ反応は、ＦＡＭを用いた場合、検出できない。各々の反応は、正の対照を除いて、３点測定で行われた。このデータは、１８Ｓ  ＲＮＡを検出する全てのＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応が検出可能な増幅産物を生じたことを示す。蛍光における急な相対増加は、しっかりした増幅が全ての１８Ｓ  ＲＮＡについて達成されたことを示唆する。
【０１７２】
図５は、反応が行われた９６ウェルプレートのウェル位置によって、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応の各々について閾値サイクル（Ｃｔ）のプロットを示す。ＶＩＣ層だけが、図３において検出され、それにより、１８Ｓ反応だけが検出可能である。反応のウェル位置は、図３について上記で検討される通りである。これらのデータは、１８Ｓ  ＲＮＡが各々の反応において検出可能であることを示した。
【０１７３】
（実施例２）
ＲＴを伴う場合および伴わない場合、プロテアーゼ処理を含む場合および含まない場合のｍＲＮＡ検出
ｍＲＮＡ検出実験は、逆転写酵素（ＲＴ）を用いておよび用いないで、反応の１８Ｓ  ＲＮＡレベルを測定するために行われた。また、反応は、プロテアーゼ処理を伴う場合および伴わない場合に行われた。ＲＴによるおよびよらない反応を行うことによって、ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを含む反応と、ゲノムＤＮＡだけを含む反応との間でのΔＣｔを測定することができる。
【０１７４】
この実施例では、Ｒａｊｉ細胞は、３種類の溶解緩衝液に最終濃度５０００細胞／μｌで溶解された。第１の緩衝液、緩衝液Ｎａは、１０％ＮＤＳＢ−２０１、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ；第２の緩衝液、緩衝液Ｎｂは、１％  ＮＤＳＢ−２０１、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ；第３の緩衝液、緩衝液Ｎｃは、０．１％  ＮＤＳＢ−２０１、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ。各Ｒａｊｉ細胞溶解物の半分は３７℃で３０分間、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ（２．５Ｕ／μｌ）で処理され、次に、７５℃で５分間、熱処理された。試料の他の半分は、３７℃で３０分間インキュベートされ、次に、７５℃で５分間、熱処理されたが、プロテアーゼを受けなかった。プロテアーゼ処理された試料は、粘性になったが、未処理の試料は粘性にはならなかった。
【０１７５】
図６は、各溶解物の１０μｌのアガロース電気泳動を示す。このゲルは、プロテアーゼ処理された試料がＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを放出したが、未処理の試料は放出しなかったことを示す。
【０１７６】
次に、３つのＲａｊｉ細胞溶解物（緩衝液Ｎａ、緩衝液Ｎｂ、および緩衝液Ｎｃ中）は、０．１％  ＮＤＳＢ−２０１の濃度に標準化するために、必要に応じて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡで希釈された。結果として、希釈された緩衝液Ｎａ溶解物は、１μｌ当たり５０細胞を含み、希釈された緩衝液Ｎｂ溶解物は、１μｌ当たり５００細胞を含む、緩衝液Ｎｃ溶解物は、１μｌ当たり５０００細胞を維持された。５μｌの溶解物を各２５μｌのＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴ−ＰＣＲ反応に用いて、１８Ｓ  ＲＮＡを検出した。各溶解物（各細胞濃度、プロテアーゼ処理および未処理）は、３点測定でＲＴの有無により試験された。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００システムを用いて分析された。
【０１７７】
図７は、その実験の結果を示す。反応のウェル位置は、下記の通りである。ウェルＡ１〜Ａ１２（図７では１〜１２）は、プロテアーゼ処理された溶解物：２５０細胞／反応（ウェルＡ１〜Ａ３）、２５００細胞／反応（ウェルＡ４〜Ａ６）、２５，０００細胞／反応（ウェルＡ７〜Ａ９）、及び鋳型不含対照（「ＮＴＣ」）（ウェルＡ１０〜Ａ１２）を用いて、ＲＴによる反応を含んだ。ウェルＢ１〜Ｂ１２（図７では１３〜２４）は、２５０細胞／反応（ウェルＢ１〜Ｂ３）、２５００細胞／反応（ウェルＢ４〜Ｂ６）、２５，０００細胞／反応（ウェルＢ７〜Ｂ９）、および鋳型不含対照（「ＮＴＣ」）（ウェルＢ１０〜Ｂ１２）を用いて、ＲＴによらない反応を含んだ。ウェルＣ１〜Ｃ９（図７では２５〜３３）は、プロテアーゼ未処理溶解物：２５０細胞／反応（ウェルＣ１〜Ｃ３）、２５００細胞／反応（ウェルＣ４〜Ｃ６）、および２５，０００細胞／反応（ウェルＣ７〜Ｃ９）を用いて、ＲＴによる反応を含んだ。ウェルＤ１〜Ｄ９（図７では３７〜４５）は、プロテアーゼ未処理溶解物：２５０細胞／反応（ウェルＤ１〜Ｄ３）、２５００細胞／反応（ウェルＤ４〜Ｄ６）、および２５，０００細胞／反応（ウェルＤ７〜Ｄ９）を用いて、ＲＴによる反応を含んだ。
【０１７８】
これらのデータは、溶解物のプロテアーゼ処理が、１８Ｓ  ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかを検出可能に像フルするためにその実験では必要であることを示した。さらに、ＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴＰＣＲ反応は、（図７のウェル１〜３および１３〜１５とウェル４〜９および１５〜２１とを比較して）１反応当たり２５００および２５，０００細胞ではなく、１反応当たり２５０細胞で１８Ｓ  ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するには十分に作用した。最後に、ＲＴを用いた反応（ウェル１〜３）とＲＴを用いない反応（ウェル１３〜１５）との間のΔＣｔは約８．５であった。このΔＣｔは、１８Ｓ  ＲＮＡと１８ＳゲノムＤＮＡの増幅との間のΔＣｔを表す。２倍体のＲａｊｉ細胞を確立し、これは、１８Ｓゲノム配列の約５４０コピー、１８Ｓ  ＲＮＡの約１，０００，０００コピーを含む。したがって、１８ＳゲノムＤＮＡよりも２，０００×多くの１８Ｓ  ＲＮＡが存在し、結果としてΔＣｔが約１１になると予測される。観察された８．５のΔＣｔと予測された約１１のΔＣｔとの間の違いは、１８Ｓ  ＲＮＡ増幅の低効率に起因していた可能性がある。
【０１７９】
（実施例３）
界面活性剤試験
種々の界面活性剤および疎水性化合物は、アガロースゲルによって測定されるように、Ｒａｊｉ細胞の溶解および無傷な核酸の放出におけるそれらの有効性について試験された。下記の化合物を試験した：ＮＭＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、マルケルニウム（Ｍａｃｋｅｒｎｉｕｍ）（ＣＪペトロウ（Ｐｅｔｒｏｗ））、エンピゲン（Ｅｍｐｉｇｅｎ）（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、ＮＤＳＢ−２０１（カルビオケム）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０（カルビオケム）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（カルビオケム）、ＴＭＡＣＬ（シグマ）、ＤＤＭＡＢ（カルビオケム）、ＣＡＰＳＯ（シグマ）、ＣＨＡＰＳ（カルビオケム）、ＬＤＡＯ（カルビオケム）、ザルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）（シグマ）、ＣＴＡＢ（カルビオケム）、ＤＥＤＴＡＢ（フルカ）、ＤＬＳ（シグマ）、およびＤＴＡＢ（シグマ）。各々の化合物は１μｌ当たり５０，０００Ｒａｊｉ細胞で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液において０．５％で溶解について試験された。
【０１８０】
溶解物に含まれる核酸のアガロースゲル電気泳動の例示的な結果を図８に示す。上段レーンは、それぞれ、ＮＭＰ、マルケルニウム、エンピゲン、ＮＤＳＢ−２０１、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、ＴＭＡＣＬ、およびＤＤＭＡＢを用いた溶解物である。下段レーンは、それぞれ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＬＤＡＯ、ザルコシル、ＣＴＡＢ、ＤＥＤＴＡＢ、ＤＬＳ、およびＤＴＡＢを用いた溶解物である。この実験から、ＮＭＰ、エンピゲン、ＮＤＳＢ−２０１、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、ＤＤＭＡＢ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＬＤＡＯ、ＣＴＡＢ、ＤＥＤＴＡＢ、およびＤＴＡＢは、本明細書に記載されている方法における使用のための可能性のある候補対象として特定された。
【０１８１】
さらに、スクリーニング試験は、各々の化合物を用いた溶解物が加熱後のアガロースゲル上に無傷なリボソームＲＮＡバンドを含むかどうか、これらの化合物が０．１％の濃度でＴａｑＭａｎワンステップｑＲＴＰＣＲ反応と適合され得るかどうかを測定するために行われた。（データを示さず。）これらの実験に続いて、ＮＤＳＢ−２０１（非界面活性剤スルホベタイン−２０１；３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート）、ＬＤＡＯ（ラウリルジメチルアミンオキシド）、ＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、およびＣＨＡＰＳ（［３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート］）が更なるスクリーニングのために選択された。また、近接連結アッセイの阻害を調べる実験は、ＤＥＤＴＡＢ（ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０（ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）も記載されている方法における使用のための候補対象であることを示唆した。（データを示さず。）
４つの化合物全ては、ＥＬＩＳＡアッセイにおける適合性について試験され、抗原／抗体相互作用が保存されることを示唆した。４つの化合物全てが、標的としてＶＥＧＦを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも部分的な適合性を示した。（データ示さず。）第２のＥＬＩＳＡ実験は、ＮＤＳＢ−２０１、ＬＤＡＯ、およびＣＡＰＳＯを用い、ＰＢＳを標準として含み、１００ｐｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、およびＲ＆ＤシステムズＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキットおよびＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて行われた。その実験では、ＣＡＰＳＯおよびＬＤＡＯは、適合性のあるバックグラウンド読み取りを示し、ＢＳＡに対する適合性のある試料読み取りを示した。また、ＮＤＳＢ−２０１は、適合性のあるバックグラウンド読み取りを示したが、ＢＳＡに対するより高い試料読み取りを示した。（データを示さず。）
別の実験では、Ｒａｊｉ細胞溶解物は、２％  ＮＤＳＢ−２０１または５ｍＭ  ＣＡＰＳＯのいずれかで生じさせた。次に、各々の溶解物を１：５および１：１０に希釈し、この溶解物および溶解希釈物は、３７℃で３０分間、続く５０℃で５分間のインキュベーション中のリボソームＲＮＡのＲＮａｓｅ分解を阻害するそれらの能力について評価された。結果を図９に示す。ＲＮＡは、試験された試料の全てにおいて分解されないままであるようである。ＬＤＡＯは、長期のインキュベーションに対するＲＮＡ保存に効果が弱いことが見出された。（データを示さず。）
ＮＤＳＢ−２０１は、関連化合物の大きなファミリーのメンバーであり、ＮＤＳＢ−１９５、−２１１、−２２１、−２５６および−２５６−Ｈが含まれる。例えば、カルビオケムカタログを参照されたい。これらの化合物の各々は、Ｒａｊｉ細胞の溶解およびＲＮＡの保存についてスクリーニングされた。ＮＤＳＢ−２０１が、それらの実験において試験された化合物のうちで最も良好に機能した。（データを示さず。）
（実施例４）
追加の試薬試験
近接連結アッセイは、緩衝液ＮのＲａｊｉ細胞溶解物の種々の希釈物を用いて行われた。緩衝液Ｎで１μｌ当たり５０，０００細胞のＲａｊｉ細胞溶解物から開始して、緩衝液Ｄでの１：５、１：１０、１：５０、および１：１００倍の希釈物をＶＥＧＦを検出するために近接連結アッセイに用いた。アッセイは、実施例１において上記で検討されるように行われた。結果を図１０に示す。この実験では、２μｌの結合反応において１，０００細胞をもたらす溶解物の１：５０の希釈物は、最も良好な結果（即ち、最も低い平均の閾値サイクル）を示した。
【０１８２】
緩衝液ＮのＲａｊｉ細胞溶解物に含まれるＲＮＡの安定性を測定するために実験を行った。８μｌの溶解物（１μｌ当たり５０，０００細胞）は、１μｌの抗ＲＮＡｓｅ阻害剤（ストックは２２ｕ／μｌ、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）；カタログｎｏ．２６９０）の有無により、０、１、または４時間、３７℃でインキュベートされた。インキュベーション後、０．５％  ＳＤＳおよび２μｇ／μｌのプロテイナーゼＫ（アンビオン；カタログｎｏ．２５４６）を含む３２μｌの溶液を５５℃で３０分間インキュベートした。次に、２×グリセロールローディング緩衝液（２×ＧＬＢ；５０％グリセロール、０．５×ＴＢＥ、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール色素を含む）の４０μｌを各々の溶解物に添加した。次に、この溶解物の１６μｌを１．４％アガロースゲル上に装填した。結果を図１１に示す。この実験では、ＲＮＡは、試験された全ての条件下でＲａｊｉ溶解物において安定であった。Ｒｎａｓｅ阻害剤は、この実験ではＲＮＡの保存には必要ではなかった。
【０１８３】
次に、Ｔｗｅｅｎ−２０の効果は、前段に記載されているアッセイに類似したＲＮＡ安定性アッセイにおいて試験された。この実験では、Ｒａｊｉ細胞溶解物は、１μｌ当たり５０，０００細胞で、上述される緩衝液Ｎａ（１０％  ＮＤＳＢ−２０１）、緩衝液Ｎｂ（１％  ＮＤＳＢ−２０１）、および緩衝液Ｎｃ（０．１％  ＮＤＳＢ−２０１）に調製された。８μｌの溶解物は、２０％  Ｔｗｅｅｎ−２０の０．２μｌ（溶解物中の最終濃度、０．５％）を含むまたは含まないで、４時間、３７℃でインキュベートされた。インキュベーション後、０．５％ＳＤＳおよび２μｇ／μｌのプロテイナーゼＫを含む溶液３２μｌを添加し、溶解物を５５℃で３０分間インキュベートした。次に、４０μｌの２×ＧＬＢを各々の溶解物に添加した。その後、１６μｌの溶解物を１．４％のアガロースゲル上に装填した。結果を図１２に示す。ＲＮＡは、ＮＤＳＢ−２０１だけを含む試料の各々において相対的に安定であったが、しかしながら、ＲＮＡは、Ｔｗｅｅｎ−２０も含む全ての試料において安定性が低かった。したがって、Ｔｗｅｅｎ−２０は、この実験での使用にはあまり適切ではないようである。
【０１８４】
次に、緩衝液Ｎは、ＲＮａｓｅ  Ａ活性を阻害する能力について試験された。１ｍｇ／ｍｌストックのＲｎａｓｅ  Ａ（アンビオン；カタログｎｏ．２２７０）は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５μｇ／μｌ  ＢＳＡで作製された。１０μｌ（５００ｎｇ）の精製されたＲａｊｉ細胞ＲＮＡ（ストックは、５０ｎｇ／μｌである；アプライドバイオシステムズのＴａｑＭａｎ対照総ＲＮＡ（ヒト）、カタログｎｏ．４３０７２８１）は、緩衝液Ｎまたは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０のいずれかで、ＲＮａｓｅ  Ａストックの１：１００，０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００倍希釈物５μｌと混合された。反応物は、１０分間、３７℃でインキュベートされた。次に、１μｌの抗ＲＮａｓｅ阻害剤（ストックは２２ｕ／μｌである；アンビオン）および４μｌの５×ＲＮＡローディング緩衝液（アンビオン；カタログｎｏ．８５５６；１０×ストックを５×として用いた）を添加し、１６μｌの反応物を１．４％アガロースゲル上に装填した。結果を図１３に示す。その実験では、ＲＮａｓｅ活性は、緩衝液Ｎを含む反応物、並びにＴｒｉｓ／ＥＤＴＡを含む反応物において同じであり、緩衝液ＮがＲＮａｓｅ  Ａ活性を阻害しないことを示唆した。しかしながら、緩衝液Ｎで作製された溶解物に含まれるＲＮＡの安定性に基づいて、緩衝液Ｎは、ＲＮａｓｅ  Ａの阻害以外にメカニズムを通じてＲＮＡを安定にする場合がある。
【０１８５】
図１４は、種々の処理条件下で緩衝液Ｎを用いて作製されたＲａｊｉ細胞溶解物においてタンパク質安定性を示す。種々の条件下で緩衝液Ｎで作製された１０μｌ溶解物（１μｌ当たり５０，０００細胞）を４時間、３７℃でインキュベートした。１０％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル上に装填する前に、溶解物を１×ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）ＳＤＳ変性ゲルローディング緩衝液（ノバジェン；カタログｎｏ．７０６０７）において９５℃で５分間処理した。１．５μｌの溶解物を各々のレーンに装填した。ゲルは、ピアスゲルコードステイン（ピアスケミカル；カタログｎｏ．２４５９０）を用いて一晩染色された。その実験では、Ｒａｊｉ細胞タンパク質は、少なくとも４時間、３７℃でインキュベートした場合を含む多数の条件下で緩衝液Ｎにおいて安定であった。
【０１８６】
（実施例５）
プロテアーゼ試験
実験は、実施例１で検討された近接連結アッセイおよびｍＲＮＡ検出アッセイにおいて種々のプロテアーゼの安定を測定するために行われた。プロテアーゼの選択に考慮された特徴には、プロテアーゼが熱により不活性化され得るかどうか、プロテアーゼが活性に金属イオンを要求するかどうか、プロテアーゼがＳＤＳなどの界面活性剤を必要とするかどうか、プロテアーゼ消化がＲＮＡを分解するかどうか、プロテアーゼがＲＮＡを十分に遊離するかどうかが含まれる。
【０１８７】
下記のプロテアーゼをスクリーニングした：ペプシン（シグマ）、コラゲナーゼ（シグマ）、粗Ｉ型プロテアーゼ（ウシ膵臓由来）（シグマ）、プロテアーゼ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（シグマ）、Ｘ型プロテアーゼ−ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ（カルビオケム）、ＸＩＩＩ型プロテアーゼ−ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ（シグマ）、ＸＸＩ型プロテアーゼ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（フルカ）、およびプロテイナーゼＫ（アンビオン）。各々のアッセイについて、ＰＢＳに含まれるＲａｊｉ細胞の２μｌの懸濁液（１μｌ当たり５０，０００細胞）を８μｌの緩衝液Ｎａ（１０％ＮＤＳＢ−２０１を含む）と混合して、細胞を溶解する。約２０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼの４μｌをＲａｊｉ細胞溶解物に添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。３０分後、溶解物の粘度を調べた。Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇプロテアーゼ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫの全てが溶解物を引き起し、粘性になった。また、ウシ膵臓の粗プロテアーゼは溶解物を引き起し、僅かに粘性になった。残りのプロテアーゼは、溶解物の粘性を有意に増加させなかった。
【０１８８】
次に、溶解物を１．４％アガロースゲル上で流し、プロテアーゼがＲＮＡおよびＤＮＡを放出するかどうか、プロテアーゼがＲＮＡおよびＤＮＡの分解を引き起こすかどうかを測定した。図１５は、その実験の結果を示す。データは、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇプロテアーゼ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫが、その実験において、溶解物にＲＮＡおよびＤＮＡを最も効果的に放出することを示す。ウシ膵臓の粗プロテアーゼは、その実験では、ＲＮＡではなく、ＤＮＡを放出するようであった。コラゲナーゼは、その実験では、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの分解を引き起こし得たようである。
【０１８９】
第２のプロテアーゼスクリーニングは、２種類の溶解緩衝液に溶解させたＲａｊｉ細胞を用いて行われた。第１の溶解緩衝液は、緩衝液Ｎａプラス０．２％  ＬＤＡＯであった。第２の調合物は、緩衝液Ｎｃであった。ＰＢＳに含まれるＲａｊｉ細胞の５μｌ（５０，０００細胞／μｌ）を５μｌの２×溶解緩衝液と混合し、室温で１５分間インキュベートした。４μｌの約２０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼをＲａｊｉ細胞溶解物に添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、５μｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加し、溶解物を７５℃で５分間インキュベートした。５μｌのＧＬＢを添加し、試料を１．４％アガロースゲル上で泳動した。下記のプロテアーゼをその実験で試験した：ペプシン、コラゲナーゼ、プロテアーゼ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、Ｘ型プロテアーゼ−ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＸＩＩＩ型プロテアーゼ−ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ、ＸＸＩ型プロテアーゼ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、およびプロテイナーゼＫ。
【０１９０】
その実験の結果を図１６および１７に示す。図１６は、０．２％  ＬＤＡＯを含む緩衝液Ｎａを用いた結果を示し、図１７は、緩衝液Ｎｃを用いた結果を示す。緩衝液を含むＮＤＳＢ−２０１へのＬＤＡＯの添加は、その実験では、プロテアーゼによる消化中にＲＮＡの安定性を増加させなかった（図１６を参照されたい）。
【０１９１】
開示された技術は、種々の用途、方法、および組み合わせと比較して記載されてはいるが、種々の変更および修飾は本明細書に記載される技術から逸脱することなしになされ得ることは承認される。前述の実施例は、本技術をより良く例証するために提供され、本明細書に記載される技術の範囲を限定することは意図しない。本技術のある種の局面は、さらに、下記の特許請求の範囲に照らして理解され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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