(57)【要約】  現在、個体における幹細胞の動員は、幹細胞の回収方法および人体内の疾病過程に治療的介入を施すための方法に使用されている。本発明は動員された幹細胞の数を増加させるための手段と方法を提供し、更に動員された幹細胞の用途も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における幹細胞の動員性を調節するための方法であって、幹細胞の近傍のエラスターゼ活性を調節することを包含する方法。
【請求項２】
幹細胞の近傍のエラスターゼ活性を増加させることによって、動員性を高めることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロテアーゼ阻害因子に対する阻害剤を個体に提供することにより、エラスターゼ活性の増加を達成することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤がプロテアーゼ阻害因子に特異的な結合体を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼ阻害因子がセルピンａ１またはα２−ＭＧを含むことを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が造血幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼ阻害因子に特異的な結合体、あるいは該結合体の機能的な部分、誘導体および類似体からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いて、幹細胞を保有する個体において、該幹細胞の動員性を促進する方法。
【請求項８】
個体の保有する幹細胞の動員性を促進するための成長因子またはサイトカインと共に、セルピンａ１の阻害剤を含有する組成物。
【請求項９】
成長因子がＣ−ＧＳＦを含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞集団内の細胞を同定するための方法であって、
細胞集団をＣＤ９７に特異的な結合体と接触させ、そして
細胞と会合する結合体の相対量に基づいて、細胞を同定する
ことを包含する方法。
【請求項１１】
細胞集団が幹細胞を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
同定した細胞を、該細胞集団内の他の細胞から分離するための工程を更に包含する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
該細胞の同定が、細胞と会合したＣＤ９７特異的結合体の量が大量である、中量である、または検出不能であるのいずれかに細胞集団内の細胞を分類することを包含する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
細胞に会合したＣＤ９７特異的結合体の量が中量であると分類することによって、細胞を同定することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該細胞集団を、ＣＤ３４またはそのホモログに特異的な結合体、ＣＤ３８またはそのホモログに特異的な結合体、およびｃ−Ｋｉｔまたはそのホモログに特異的な結合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と接触させるための工程を更に包含する、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
該細胞に会合した、ＣＤ３４またはそのホモログに特異的な結合体、ＣＤ３８またはそのホモログに特異的な結合体、およびｃ−Ｋｉｔまたはそのホモログに特異的な結合体からなる群より選ばれる少なくとも１種の相対量に基づいて、該細胞集団から該細胞を分離するための工程を更に包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞集団内の細胞からなるサブセットをマーキングするための、請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
幹細胞に富んだサブセットをマーキングするための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ９７またはそのホモログに特異的な結合体を包含する、幹細胞を細胞集団内の他の細胞から分離するためのキット。
【請求項２０】
結合体が固体表面に結合していることを特徴とする、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
細胞集団内の他の細胞から幹細胞を識別するための結合体を更に包含する、請求項１９または２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞技術、特に個体における幹細胞動員に関する。
【０００２】
ここ数年の間に、ヒトへの移植用の造血幹細胞／造血前駆細胞（ＨＳＣ／ＨＰＣ）の主な材料は、サイトカインで動員した血液幹細胞となった（１−３）。マウスにおいては、いくつものサイトカインとケモカイン、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、長期の投与後にはＨＳＣ／ＨＰＣの動員を誘導するが、しかし、１回の注射でＨＳＣ／ＨＰＣ動員を誘導するものは、ＩＬ−８などわずかである（４−６）。動員したＨＳＣ／ＨＰＣの用途は広いにもかかわらず、ＨＳＣ／ＨＰＣの末梢血への放出に寄与する機構については未だ完全には理解されていない。しかし、ＨＳＣ／ＨＰＣの動員が、複数種の細胞と分子の関与する複数工程からなる機構であることを示す証拠が蓄積されている。
【０００３】
定常条件下においてＨＳＣ／ＨＰＣは、細胞接着性分子を介して骨髄（ＢＭ）の微小環境に保持されている。接着ブロッキング実験は、最遅延抗原（ＶＬＡ）−４／細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１経路、ＶＬＡ−５／フィブロネクチン経路およびｂ２インテグリン／細胞接着因子−１（ＩＣＡＭ−１）経路が、ＣＤ３４+細胞の間質細胞への接着において役割を担うことを明らかにした（７，８）。ｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ経路、ＣＸＣＲ−４／間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１，ＣＸＣＬ１２）経路およびＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１経路の中断は、これら経路がＨＳＣ／ＨＰＣの動員に関与することを明らかにした（９−１５）。
【０００４】
本発明者らの過去の研究は、好中球の遊走因子と活性化因子であって、ＣＸＣケモカインの１種であるインターロイキン（ＩＬ）−８は、急激な（１５〜３０分で）ＨＰＣの動員とＨＳＣの再建活性を誘導することを明らかにした（６，１６）。好中球はこの工程になくてはならないものであるが、これは、好中球枯渇性である抗ＧＲ−１抗体の投与に続いて好中球減少症となったマウスにおいては、ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣの動員が完全に喪失していることからわかる（１７）。更に、ｂ２インテグリンであるリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ）−１およびＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）に対する中和抗体は、完全にＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を阻害した（１８）。ｂ２インテグリンは造血前駆細胞と造血幹細胞の表面に発現されていないため、この効果は、造血前駆細胞および幹細胞の直接的なターゲティングの結果ではない（１９，２０）。β２インテグリンは、好中球の内皮への強固な付着に密接に関与し、この工程は、ＩＬ−８による活性化に続く脱顆粒化を可能とするための必須工程となる。これらの観察結果は、ｂ２インテグリン抗体は、好中球の接着、付着および脱顆粒化を防止することで、ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を防止していることを示す。好中球の役割は、好中球減少症の宿主におけるＩＬ−８応答性のＨＳＣ／ＨＰＣの動員が、精製好中球の注入によって復帰したことからも明らかである（１７）。更に、好中球顆粒に存在するプロテアーゼは、Ｇ−ＣＳＦ誘導性およびＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員の際にも活性化されていることが知られている（１２，１３，２１）。
【０００５】
本発明においては、低線量全身照射（ＴＢＩ）がＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を阻害することを観察した。我々は、低線量ＴＢＩ後に得た骨髄細胞外抽出物（ＢＭＥＥ）は、活性化好中球の放出する酵素であるエラスターゼを阻害することを明らかにした。我々はこの現象が、ＢＭに存在するプロテアーゼ阻害因子であるセルピンａ１（α−１アンチトリプシンまたはα−１プロテナーゼとも呼ばれる）の誘導と関連することを示す。我々は、セルピンａ１が、外因性の投与に伴うＨＳＣ／ＨＰＣ動員に対する強力な阻害因子であり、放射線誘導性のセルピンａ１が低線量ＴＢＩの後に観察される動員阻害の原因であることを示す。更に我々は、セルピンａ１に特異的な結合体を個体に提供すると、幹細胞動員が向上することを示す。従って、本発明の１つの態様においては、個体における幹細胞の動員性を調節するための方法であって、幹細胞の近傍のエラスターゼ活性を調節することを包含する方法を提供する。エラスターゼを活性化することによって幹細胞の動員性は高まるが、一方、エラスターゼ活性の阻害は、動員性の低下に繋がる。個体における幹細胞の動員性は、循環血中の幹細胞の存在量を測定することによって測定することが好ましい。循環血中の幹細胞数の増加は動員性の上昇を意味するが、一方、幹細胞数の減少は、動員性の低下を意味する。幹細胞はその機能的な特性、即ち、未分化で、多能性であり、広範に渡る自己複製性であることに基づいて測定することが好ましい。幹細胞は、他の方法、例えば、細胞表面の特異的なマーカーまたはマーカーの組み合わせによって検出することもできる。細胞集団に含まれる幹細胞は少ないこともあるので、細胞集団における存在とその量を推定するための誘導体アッセイも開発されている。このような誘導体アッセイは、当然ながら、本発明で使用することもできる。このような誘導体アッセイの例としては、幹細胞の種々の分化ステージにおける子孫を検出するアッセイが挙げられるが、これに限定されるものではない。典型的な例としては、コロニー形成細胞、敷石状領域形成細胞または長期培養開始細胞を誘導体アッセイに使用する。このような細胞を使用する典型的な例は、幹細胞の存在を試験する細胞原料が身近なものであり、このような誘導体アッセイを幹細胞の量を推定するために慣例的に実施する場合である。身近な原料の具体例としては、正常な個体または細胞動員を処置する個体から得た血液が挙げられる。
【０００６】
本発明においては、個体における幹細胞の動員は、数ある因子の中でも、エラスターゼとその阻害因子とのバランスによって調節されていることが判明した。例えば、エラスターゼ阻害因子が上方制御されると、幹細胞の動員性が低下する。幹細胞近傍のエラスターゼ活性を増加させることによって、動員性を高めることが好ましい。エラスターゼ活性の増加は種々の方法で達成することができる。好ましい態様においては、プロテアーゼ阻害因子に対する阻害剤を個体に提供することで達成する。エラスターゼのプロテアーゼ活性は数々の異なるプロテアーゼ阻害因子によって阻害することができる。エラスターゼに関連するかどうかに関係なく、個体においてこのような阻害因子を阻害することが、その個体における幹細胞の動員性の向上をもたらすことが観察されている。従って、本発明の別の態様においては、個体における幹細胞の動員性を向上するための方法であって、個体にプロテアーゼ阻害因子に対する阻害剤を提供することを包含する方法を提供する。
【０００７】
プロテアーゼ阻害因子に対する数種の阻害剤を作製することができる。好ましい態様において阻害剤は、プロテアーゼ阻害因子に特異的な結合体である。近年では、多数の異なる結合体が存在する。結合体は、抗体のような大きなものでも、小分子のような小さなものでもかまわない。このような小分子の例としては、単鎖Ｆｖ断片、単一抗体（monobodies）、ＶＨＨドメインやＶＨドメインなどの他の単一可変ドメイン分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明で使用する結合体は、タンパク性の結合体であることが好ましい。抗体とその機能的部位、誘導体や類似体が、本発明における好ましい結合体である。抗体の機能的部位、誘導体および／または類似体は、本発明で使用する抗体と同種の結合特異性を示すが、結合特異性の程度は必ずしも同じではない。抗体の結合特異性は可変領域に位置づけられる。これら領域には、高度に可変な部位（ＣＤＲ領域）と比較的保存された部位（フレームワーク領域）がある。抗体の結合特異性は、ＣＤＲ領域の特徴的なアミノ酸配列、特にＣＤＲ３領域のアミノ酸配列と大きく相関している。抗体のＣＤＲ３および／または他のＣＤＲは、種々のアミノ酸配列にグラフトすることができる。グラフトを受ける側のアミノ酸配列が、元の抗体のフレームワーク領域と同じ構造環境を提供する場合には、新たに合成した分子は、１種または数種のＣＤＲを提供した抗体と同種の結合特異性を有する。この新たに合成した分子は、ＣＤＲの１種または数種を提供した抗体の少なくとも機能的部位を含んでいる。抗体から他の色々な部位を作製することもできる。このような部位の例としては、ＦＡＢ断片（１または２）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）および単一抗体またはＶＨＨと呼ばれるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらはいずれも、供与抗体の少なくともＣＤＲ３領域を含んでいるという共通点がある。ＣＤＲは他の抗体や、抗体の一部分にグラフトすることができる。ＣＤＲは、抗体（またはその一部）の三次元構造に似ているが、広範に渡る配列の相同性は共有しない構造体にグラフトすることもできる。後者の構造体は、例えば、抗体の三次元モデリングによって得ることができる。分子全体の三次元構造の維持について、アミノ酸置換を試験することができる。モデリングは、少なくともフレームワーク領域の三次元構造が実質的に変化しないことを確認するために使用する。このような誘導体も本発明で使用する結合体である。ＣＤＲ（フレームワーク領域）の構造環境を提供する一般的な構造とは、種々の異なるタンパク質が使用する構造である。特に他のタンパク質と相互作用するタンパク質の使用する構造である。この一般的な構造は、Ｉｇ折りたたみ構造とも呼ばれる。このようなＩｇ折りたたみ構造を有するタンパク質にグラフトしたＣＤＲは、受容タンパク質に供与抗体と同種であるがその程度は必ずしも同じではない結合特異性を付与する。このようなＩｇ折りたたみ構造含有分子は、本発明で使用する抗体の少なくともＣＤＲ３を含んでいるため、本発明で使用する抗体と機能的に類似している。最近の方法は、抗体を初めに作製することなく、抗体の誘導体の特異的選択が可能である。このような誘導体は、��次元モデルにおいて抗体のＣＤＲ３領域が位置する場所と同じ場所に、特異的結合性ペプチドを有する。本発明においては、これら特異的結合性ペプチドもＣＤＲ３領域とみなす。
【０００８】
理論に拘束されるものではないが、セルピンａ１に特異的な結合体の結合は、幹細胞近傍のプロテアーゼ阻害因子とプロテアーゼの相互作用を防止し、プロテアーゼをより活性化すると考えられる。結合体は、プロテアーゼ阻害因子のプロテアーゼ相互作用部位（の一部）を単純にブロックするおよび／または、プロテアーゼ阻害因子の生体内分布を変化させることによって相互作用を防止する。本発明の好ましい態様においては、特異的結合体を提供するプロテアーゼ阻害因子は、セルピンａ１および／またはα２−ＭＧによって同定されるグループに属する。本発明で使用する結合体は、セルピンａ１に特異的であることが好ましい。セルピンａ１に特異的な結合体を提供することは、特に効率的に幹細胞を動員させる。好ましい態様においては、幹細胞は骨髄由来幹細胞であり、好ましくは造血幹細胞である。従って、本発明は更に、プロテアーゼ阻害因子に特異的な結合体、あるいはこの結合体の機能的な部分、誘導体および／または類似体を用いて、幹細胞を保有する個体において、幹細胞の動員性を促進する方法を提供する。個体は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類であり、更に好ましくはヒトである。
【０００９】
好ましい態様においては、動員された幹細胞を回収するための準備をしている個体にプロテアーゼ阻害因子に対する阻害剤を提供する。当業界においては、幹細胞を動員するための多数の方法が知られている。好ましい態様においては、個体に成長因子／サイトカインを投与することで動員する。従って、好ましい態様においては、幹細胞動員法の一部として、個体に阻害剤を提供する。好ましい態様においては、幹細胞を収穫する少なくとも１日前に個体に阻害剤を投与する。別の好ましい態様においては、成長因子／サイトカイン処理を開始するのと同じ日に、個体に阻害剤を提供する。本発明は更に、１種または数種の成長因子／サイトカインと共に阻害剤を包含するキットを提供する。キットは、少なくともＣ−ＧＳＦと阻害剤を包含することが好ましい。更に、個体の保有する幹細胞の動員性を促進するための成長因子またはサイトカインと共に、セルピンａ１の阻害剤を含有する組成物を提供する。成長因子はＣ−ＧＳＦであることが好ましい。
【００１０】
本発明の他の態様においては、個体における成長因子／サイトカイン仲介性幹細胞動員の応答時間を短縮するための方法を提供する。
【００１１】
ＣＤ９７はＩＩ型七回膜貫通型受容体のＥＧＦ−ＴＭ７ファミリーの一員であり、リンパ球、顆粒球、単球を含む造血細胞全般で発現されている。本発明においては、ＣＤ９７は骨髄由来幹細胞で発現されており、骨髄由来細胞集団から幹細胞に富んだ一群を識別するためにＣＤ９７が使用可能であることを示した。従って本発明は、細胞集団内の細胞を同定するための方法であって、細胞集団をＣＤ９７に特異的な結合体と接触させ、そして細胞と会合する結合体の相対量に基づいて、細胞を同定することを包含する方法を提供する。上記同定は、細胞と会合したＣＤ９７特異的結合体の量が「大量である」、「中量である」、または「検出不能である」のいずれかに細胞集団内の細胞を分類することを包含することが好ましい。ＣＤ９７の不存在、その存在またはその相対的な検出量を、細胞を分離するための基準として使用することができる。従って、好ましい態様においてこの方法は、同定した細胞を、細胞集団内の細胞の少なくとも一部から分離するための工程を更に包含する。分類方法に則って、細胞に会合したＣＤ９７特異的結合体の量が中量であると分類することによって、細胞を同定することが好ましい。幹細胞の含有するＣＤ９７は中量である。従って好ましい態様においては、分離した細胞は幹細胞、好ましくは骨髄由来幹細胞である。
【００１２】
本発明の好ましい態様においては、上記方法を、造血幹細胞を他の骨髄由来細胞から分離するために使用する。従って、好ましい態様においては、細胞集団を、ＣＤ３４またはそのホモログに特異的な結合体、ＣＤ３８またはそのホモログに特異的な結合体、および／またはｃ−Ｋｉｔまたはそのホモログに特異的な結合体と接触させるための工程を更に包含する。上記方法は、細胞に会合した、ＣＤ３４、ＣＤ３８、および／またはｃ−Ｋｉｔあるいはこれらのホモログに特異的な結合体の相対量に基づいて、細胞集団から細胞を分離するための工程を更に包含することが好ましい。別の好ましい態様においては、本発明の方法は、細胞集団内の細胞をマーキングする、細胞集団に存在する他の集団を区別する、または経時的なＣＤ９７発現レベルの変化を検出するために使用する。従って本発明の方法は、細胞集団内の細胞からなるサブセットをマーキングするための、ＣＤ９７に特異的な結合体の使用を包含する。更に別の態様においては、本発明は、ＣＤ９７またはそのホモログに特異的な結合体を包含する、幹細胞を細胞集団内の他の細胞から分離するためのキットを提供する。細胞と他の細胞との分離は、種々の方法で行うことができる。大量の細胞を分離するための特に簡便な方法は、細胞集団の細胞の一部を固体表面と会合させる工程を導入した方法である。典型的な固体表面は、細胞集団の細胞サブセットに特異的な結合体と会合している。所望の細胞は、固体表面に保持されても、されなくてもよい。従って上記キットは、細胞を分離するために準備された固体表面を更に包含することが好ましい。固体表面の形態としては、カラム、（磁性）ビーズまたは他の表面が挙げられる。特に好ましい態様においては、結合体は固体表面と会合している。従って、好ましい態様においては、キット中の結合体は、固体表面と会合している。キットは、細胞集団内の他の細胞から幹細胞を識別するための結合体を更に包含することが好ましい。
【実施例】
【００１３】
実施例１ 
結果 
造血幹細胞の動員は、０．５ＧｙのＴＢＩの２４時間後に阻害される
低線量照射がＨＳＣ／ＨＰＣ動員に与える影響を検討するために、マウスのコホートに０．５ＧｙのＴＢＩを施し、ＴＢＩから２４時間後にＩＬ−８を注射した。ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣの末梢血への動員は、偽照射対照と比べて、照射マウスにおいて有意に低下しており（ＩＬ−８投与群が３８８．１±２３３．３ ＣＦＵ−ＧＭであるのに対して、０．５Ｇｙ／ＩＬ−８投与群は３７．１±５１．５ ＣＦＵ−ＧＭであり、ｐ＜０．０００１、図１ａ）、一方、ＢＭ内の前駆細胞数は全ての群において同等だった（ｐ＞０．５、図１ｂ）。０．５ＧｙのＴＢＩ後の、計３回（１日１回）のＧ−ＣＳＦ注射によって誘導されるＨＳＣ／ＨＰＣ動員は、ＴＢＩ後２４時間で開始したが、これも偽照射対照と比べて、照射（０．５Ｇｙ）マウスにおいて有意に阻害されていた（Ｇ−ＣＳＦ投与群が８００±５１３．６ＣＦＵ−ＧＭであるのに対し、０．５Ｇｙ／Ｇ−ＣＳＦ投与群は９１．９±９６．７ ＣＦＵ−ＧＭであり、ｐ＜０．０００１、図１ａ）。低線量ＴＢＩが末梢血とＢＭの好中球数に与える影響は観察されなかった（データは示さない）。
【００１４】
ＢＭ細胞外抽出物はエラスターゼ活性を阻害する
サイトカイン誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員が０．５ＧｙのＴＢＩ後に阻害されるメカニズムを明らかにするために、マウスのコホートに低線量（０．５Ｇｙ）のＴＢＩまたは偽照射を施した。ＴＢＩ後２４時間でマウスを屠殺し、ＢＭ細胞外抽出物（ＢＭＥＥ）を収穫した。続いて、ＢＭＥＥのエラスターゼ活性を、エラスターゼ活性の検出用に設計された発色性基質転換アッセイで評価した。照射したマウスのＢＭＥＥからはエラスターゼ活性は検出されなかった（図２ａ）。３．１２５μｇ／ｍｌまたは６．２５μｇ／ｍｌのエラスターゼを低線量（０．５Ｇｙ）照射マウスから得たＢＭＥＥに添加すると、偽照射対照マウスから得たＢＭＥＥと比べ、エラスターゼ活性は有意に（ｐ＜０．０５）減少した（それぞれ６０．３％と４４．１％）（図２ａ）。この結果は、低線量ＴＢＩ後のＢＭＥＥにはエラスターゼ阻害因子が存在することを示している。
【００１５】
エラスターゼ活性の阻害は、セルピンａ１中和抗体によって逆転することができる
低線量照射マウスから得たＢＭＥＥにおけるエラスターゼ活性の阻害が、ＢＭＥＥに含まれるセルピンａ１によって説明できるのか調べるために、中和抗セルピンａ１抗体を低線量（０．５Ｇｙ）照射マウス（ｎ＝２）から得たＢＭＥＥと共にインキュベートし、外因性エラスターゼ活性を評価した。予想したように、３．１２５μｇ／ｍｌのエラスターゼを０．５Ｇｙ照射マウスのＢＭＥＥに添加した後には、未照射マウスから得たＢＭＥＥと比べて、エラスターゼ活性が阻害されていた。しかし、抗セルピンａ１抗体の添加に続いて、エラスターゼ活性が復帰した（図２ｂ）。この結果は、低線量照射マウスから得たＢＭＥＥの阻害活性の一因が、セルピンａ１であることを示している。
【００１６】
低線量ＴＢＩによる、セルピンａ１ ｍＲＮＡとタンパク質の誘導
セルピンａ１に対する抗体は照射マウス由来ＢＭＥＥの阻害効果を完全に取り除くため、セルピンａ１を、我々のin vitro系においてエラスターゼ活性を阻害するセリンプロテアーゼ阻害因子の第一候補と考えた。低線量（０．５Ｇｙ）ＴＢＩに続いてセルピンａ１ ｍＲＮＡが誘導されるかどうかを調べるために、ＴＢＩから２４時間後の０．５Ｇｙ照射マウス（ｎ＝２）からｍＲＮＡを単離した。ＨＰＲＴ発現と比べて、ＴＢＩから２４時間後にはセルピンａ１ ｍＲＮＡは７倍に増加し（図３ａ）、３Ｇｙの照射後には５０倍に増加した（データは示さない）。より豊富に発現されているハウスキーピング遺伝子であるｂ−アクチンおよびＧＡＰＤＨと比較すると、０．５ＧｙのＴＢＩに続くセルピンａ１ ｍＲＮＡの増加は、それぞれ２０倍と７倍だった。これらの結果は、セルピンａ１ ｍＲＮＡ濃度は、低線量ＴＢＩに続いて増加することを示している。セルピンａ１ ｍＲＮＡの上方制御は、セルピンａ１タンパク質濃度の増加をもたらすか調べるために、ＢＭＥＥ中のセルピンａ１タンパク質の存在をウエスタンブロッティングで検討した。０．５Ｇｙ照射マウスまたは偽照射マウスから収穫したＢＭＥＥから誘導したタンパク質１０μｇをアクリル／ビスアクリルアミドゲルにロードし、セルピンａ１を化学発光によって可視化した（図３ａ）。次に、各レーンのバンドを定量化し、同一ブロット上の偽照射対照と相関させた。セルピンａ１タンパク質の相対量は、偽照射対照群と比べて、低線量照射（０．５Ｇｙ）マウスのＢＭＥＥにおいて２８％も有意に増加していた（図３ｂ、ｐ＜０．０００１）。更に、８．０ＧｙのＴＢＩによって、偽照射対照と比べたセルピンａ１タンパク質の相対濃度は、６３％も増加した（データは示さない）。これらの結果は、低線量ＴＢＩによってセルピンａ１タンパク質が誘導されることを示している。
【００１７】
ＩＬ−８誘導性の動員はセルピンａ１によって阻害される
ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員において考えられるセルピンａ１のin vivoの役割を更に検討するために、ＩＬ−８投与の２時間前および５分前に、マウス（ｎ＝１４）をセルピンａ１（３００μｇ／マウス）で処理し、末梢血のコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の発生頻度を評価した。ＩＬ−８注射前のセルピンａ１投与は、完全にＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を防止した（ＰＢＳ／ＩＬ−８： ６８５．１±５２２．１ＣＦＵ−ＧＭ／ｍｌの血液（ｎ＝７）、セルピンａ１／ＰＢＳ： ３１．５±５１．９ＣＦＵ−ＧＭ／ｍｌの血液（ｎ＝９）、およびセルピンａ１／ＩＬ−８： １３１．１±１８０．９ＣＦＵ−ＧＭ／ｍｌの血液（ｎ＝１４）、ｐ＜０．０５、図４ａ）。一方、熱不活化セルピンａ１はＨＳＣ／ＨＰＣの動員を阻害しなかった（７７９．３±３６３．０、ｎ＝４）。更に、セルピンａ１単独では、ＨＳＣ／ＨＰＣの動員を誘導せず、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性のin vitroコロニー形成にも影響を与えなかった（データは示さない）。更にＢＭ中のコロニー形成細胞の数に変化はなく、これはセルピンａ１投与はin vivoのコロニー形成細胞に影響しないことを示している（図４ｂ）。
【００１８】
考察 
本報告において、我々は、低線量（０．５Ｇｙ）ＴＢＩがＩＬ−８誘導性およびＧ−ＣＳＦ誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を阻害することを示した。ＨＳＣ／ＨＰＣ動員は低線量ＴＢＩの５日後には復帰した（データは示さない）ことから、ＨＳＣ／ＨＰＣの動員阻害の基礎となるメカニズムは可逆的であった。更に、ＢＭ内部の前駆細胞含量も末梢血リンパ球数も、この低線量照射の影響を受けなかった。好中球エラスターゼとカテプシンＧを含むプロテアーゼの放出は、サイトカイン誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員における最終経路であるため（１０，１２，１３）、我々はセリンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ阻害因子のこの過程において考えられる役割を調査した。未照射移植マウスから得た好中球の移植によって、ＨＳＣ／ＨＰＣ動員の阻害は部分的に逆転し、これは好中球または好中球誘導性プロテアーゼがこの過程に関与していることを示している（データは示さない）。更に、低線量（０．５Ｇｙ）照射マウスから得たＢＭＥＥは、基質転換アッセイにおいて、エラスターゼの生物活性を阻害することが判明した。また、抗セルピンａ１抗体のＢＭＥＥへの添加も阻害を逆転したことから、低線量照射マウスから得たＢＭＥＥの阻害活性の一因がセルピンａ１であることを明らかにした。
【００１９】
エラスターゼなどのセリンプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）であるセルピンａ１とα２−ＭＧ（２８−３０）によって不可逆的に阻害される。セルピンは、高度に保存された二次構造エレメントを有する単一のスーパーファミリーに属し、共有結合することによって標的プロテアーゼを阻害する。この阻害は不可逆的であり、わずか数種のプロテアーゼ分子の放出によって開始されうるタンパク質分解カスケードの効果的な制御に必要である。哺乳動物においてセルピンは、血液凝固、炎症および細胞外マトリクスのターンオーバーを含む、広範に渡るタンパク質分解過程において役割を担っている（３１）。α２−ＭＧは、開裂することが可能なドメイン残基からプロテアーゼを誘引する。これによってα２−ＭＧ分子が活性化され、立体構造の変化が生じてプロテアーゼを内包し、プロテアーゼが他の基質を攻撃するのを防止する。しかし、数アミノ酸からなる分子はこのエンベロープに侵入し、続いてプロテアーゼによって分解される（３０）。セルピンａ１は、共有結合と、それに続く標的プロテアーゼの機能阻害によって機能する。セルピンａ１とその標的との相互作用を指揮するのは、セルピンａ１ポリペプチドの本体から伸長し、阻害因子の特異性を決定する、反応中心ループ（ＲＣＬ）と呼ばれる約２０残基のドメインである。セルピンａ１は、ネズミ捕り法と同様に、準安定状態で存在し、ＲＣＬの開裂によってそのエネルギーが放出される。エラスターゼがセルピンａ１のＲＣＬに結合してＲＣＬを開裂すると、セルピンａ１はプロテアーゼ分子を反対の末端に移動する。この過程によってプロテアーゼはセルピンに対して押しつぶされ、その結果、プロテアーゼの破壊性を保障する完全な構造が失われる（３２）。
【００２０】
α２−ＭＧで阻害されたエラスターゼには、我々が基質阻害アッセイで使用する基質を分解する能力が残っているので、α２−ＭＧによるエラスターゼの阻害を計測することはできなかった（３０）。従って、セルピンａ１を、我々のin vitro系においてエラスターゼ活性を阻害するセリンプロテアーゼ阻害因子の第一候補と考えた。総ＢＭ細胞の定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、低線量ＴＢＩに続いてセルピンａ１ ｍＲＮＡが、ハウスキーピング遺伝子と比べて増加することを確認した。更に、ウエスタンブロット解析は、低線量照射マウスから誘導したＢＭＥＥにおける相対的セルピンａ１タンパク質濃度が増加していることを示した。しかし、in vivoの使用に十分な抗体が存在しないため、ＨＳＣ／ＨＰＣ動員の照射誘導性阻害がin vivoの抗セルピンａ１抗体処置によって逆転するかどうかを検討することはできなかった。最後に、in vivoのセルピンａ１投与時の、ＩＬ−８誘導性ＨＳＣ／ＨＰＣ動員の不存在によって、ＨＳＣ／ＨＰＣ動員におけるセルピンａ１の重要性が明らかとなった。熱不活化セルピンａ１はＩＬ−８誘導性ＨＳＣ／ＨＰＣ動員に何の影響も与えない。この結果は、非特異的効果が見られなかったことから、人為結果というよりは、ＨＳＣ／ＨＰＣ動員の阻害における活性化セルピンａ１の特異的な役割を指し示していると考えられる。
【００２１】
プロテアーゼは、サイトカイン誘導性ＨＳＣ／ＨＰＣ動員における調節仲介物質であることが知られている。我々の研究室におけるアカゲザルの研究によって、好中球のアズール顆粒に保存されているマトリクスメタロプロテナーゼ９（ＭＭＰ−９、ゼラチナーゼＢ）の重要な役割が明らかとなった。ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員は、ザイモグラフィーで測定した循環ＭＭＰ−９の誘導と一致していた。更に、ＭＭＰ−９に対する中和抗体は、ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を防止した（２１）。また、Levesque et al.は、好中球エラスターゼとカテプシンＧがＧ−ＣＳＦ誘導性およびシクロホスホアミド誘導性のＨＰＣ動員に関与していることを示した。このグループは、Ｇ−ＣＳＦ動員患者の血漿におけるＶＣＡＭ−１開裂産物の濃度上昇を見出した。これに付随して、ＶＣＡＭ−１発現は低下し、ＢＭ中の好中球エラスターゼおよびカテプシンＧの濃度が上昇した（１２，１３）。好中球エラスターゼとカテプシンＧの別の基質が２つのグループによって個別に発見され、それはＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）が開裂されると、ＢＭの保持する幹細胞が減少するというものである（１０，１１）。更に、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテナーゼ３およびマトリクスメタロプロテナーゼ９も、初期の造血細胞が発現するｃ−Ｋｉｔを開裂することができる（９）。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦ誘導性の動員は、好中球顆粒中に存在するプロテアーゼによる開裂を介したＶＣＡＭ−ｌ／ＶＬＡ−４経路の中断によって仲介されることを示唆している。
【００２２】
本研究において、我々はＨＳＣ／ＨＰＣ動員の誘導において、セリンプロテアーゼ（エラスターゼとカテプシンＧを含む）のみならず、セリンプロテアーゼ阻害因子も重要な役割を担うことを明らかにした。Winkler et al.の知見は、セルピンａ１（と場合によっては他のセリンプロテアーゼ阻害因子）がＨＳＣ／ＨＰＣの動員において重要な役割を担うという我々の知見を増強するものであり、その知見は、マウスモデルにおけるＧ−ＣＳＦ誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を定量的ＲＴ−ＰＣＲとイムノブロッティングを用いて解析すると、セルピンａ１ ｍＲＮＡとセルピンａ３ ｍＲＮＡが７０分の１〜１，０００分の１に減少するというものである（３３）。更にＡＫＸＬ組み換え近親交配マウス種の動員に関する遺伝子連鎖解析は、セルピンａ１遺伝子の位置する場所の近くの染色体１２の領域（５０ｃＭ付近）が、幹細胞の動員性に関与する可能性を示した（３４）。最近、セルピンａ１とセルピンａ３は造血前駆細胞の動員に関与することが明らかになった（３５）。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦ投与後数時間で生じる現象であるプロテアーゼの誘導が、なぜ天然のプロテアーゼ阻害因子、即ち、セルピンａ１、の濃度がそれに付随して低下した時にのみＨＳＣ／ＨＰＣの動員を誘導するのかを説明する。その後プロテアーゼとプロテアーゼ阻害因子の比は、プロテアーゼ側に劇的に傾き、その結果、ＢＭの微小環境における幹細胞と間質エレメントとの間の接着性相互作用が断ち切られる。
【００２３】
これらの知見に基づき、我々は以下の一連の事象を、ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員の過程として提案する。ＩＬ−８注射に際し、肺と、おそらくは他の臓器（例えばＢＭ）における循環好中球の捕捉によって、瞬間的な好中球減少症が発生する。この捕捉の基礎となるのは、ＩＬ−８誘導性のＬ−セレクチンの分泌と、ｂ２インテグリン、ＬＦＡ−１およびＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）の上方制御に続く、好中球の内皮への強固な接着である。内皮に一度接着すると、ＩＬ−８による活性化に応答して好中球は脱顆粒化し、ＭＭＰ−９とセリンプロテアーゼ（即ち、好中球エラスターゼとカテプシンＧ）を放出する。セリンプロテアーゼの他に、セリンプロテアーゼ阻害因子もＢＭに存在する。その１種であるセルピンａ１はＭＭＰ−９の基質であることが知られている（３６）。ＭＭＰ−９によるセルピンａ１の開裂は、セリンプロテアーゼ阻害因子であるセルピンａ１の不活化をもたらす。更に、セルピンａ１に結合する塩素化酸化物の大量放出も、セルピンａ１の阻害能を低下させる（３７）。我々は、ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員の際には、セルピンａ１の不活化に繋がる現象である、好中球によるＭＭＰ−９の放出が生じると仮定した（図５）。そうでなければ、セルピンａ１は好中球エラスターゼに結合し、不可逆的にセリンプロテアーゼを阻害するはずである。しかし、ＭＭＰ−９による不活化は、エラスターゼとセルピンａ１との比を増加させ、ＢＭの微小環境における好中球エラスターゼ活性の純増加をもたらす。これは、接着性相互作用の崩壊に繋がり、おそらくは造血幹細胞が微小環境において付着している基底膜とマトリクス分子の分解にも繋がると考えられる。定常状態において、セリンプロテアーゼ／セリンプロテアーゼ阻害因子比がプロテアーゼ阻害因子側に傾いていると、ＨＳＣ／ＨＰＣの動員は生じない。
【００２４】
従って我々は、セリンプロテアーゼとその阻害因子との繊細なバランスが、サイトカイン誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員の開始に欠くことのできないものであることを提案する。
【００２５】
材料と方法 
動物
８〜１２週齢のオスのＢａｌｂ／ｃマウスをCharles River（オランダ国、マーストリヒト）より購入し、全ての動員研究に使用した。動物はライデン大学医療センター（Leiden University Medical Center）の動物飼育施設内で、一般的な条件下で飼育した。全ての実験プロトコルが動物実験に関する学内倫理委員会の承認を受けていた。
【００２６】
幹細胞の動員
０．１％ウシ血清を含むエンドトキシンなしのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した３０μｇのＩＬ−８（オーストリア国、ウイーン、Novartis Research Institute）の１回の腹膜内（ｉ．ｐ．）注射によって、ＨＳＣの動員を誘導した。２０分後にＣＯ2で窒息させることによりマウスを屠殺し、末梢血とＢＭ細胞を得た。
【００２７】
Ｇ−ＣＳＦ誘導性動員は、ＴＢＩの２４時間後から、各マウスに１日当たり１０μｇのＧ−ＣＳＦ（フィルグラスチム、ノイポゲン）（オランダ国、ブレダ、Amgenより寄贈）を３日間連続してｉ．ｐ．投与することで達成した。阻害実験においては、３００μｇのヒト セルピンａ１（αｌ−アンチトリプシン）（ドイツ国、ハイデルベルク、Serva Electrophoresis）をＩＬ−８投与の２時間前および５分前に投与した。セルピンａ１は９６℃で６分間煮沸することで熱不活化した。熱不活化セルピンａ１は、エラスターゼ基質転換アッセイにおいてエラスターゼ活性を阻害しなかった。コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）は公知の方法（２４）に従って培養した。
【００２８】
照射プロトコル 
線形加速器付のパースペックス製チャンバー（Philips SL 75-5/6 mV）（オランダ国、ベスト、Philips Medical Systems）内で、９８ｃＧｙ／分の線量をマウスに照射した。合計線量が０（偽照射）または０．５Ｇｙとなるように照射した。
【００２９】
エラスターゼ活性アッセイ
ＢＭＥＥは、大腿骨に２５０μｌの冷たいＰＢＳを流すことで得た。細胞懸濁液を２，３００ｇで５分間遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。エラスターゼ活性は、発色性基質であるＮ−サクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐ−ニトロアニリド（オランダ国、ヅビンドレヒト、Sigma）を用いて測定した。プロテアーゼ阻害因子の存在を試験するために、エラスターゼ基質を添加する直前に、標準的な量の精製ブタ膵臓エラスターゼ（Sigma）をＢＭＥＥに加えた。エラスターゼ活性は、それぞれ個別の試験の際にエラスターゼ標準を使用することで定量した。
【００３０】
抗セルピンａ１抗体の調製
抗セルピンａ１抗体は、プールした正常マウス血清（Ｂａｌｂ／Ｃ、Ｃ５７ＢＬ／１０とＢ１０）（ベルギー国、Janssen Biochimica）からセルピンａ１を精製することで調製した。血清に１等量の０．５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を加えることでｐＨを５．５に調整し、１．９５Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加えることで塩析した。室温で２時間後には遠心分離（４０００ｇ、２０分）で上清を回収し、沈殿は１．９５Ｍの硫酸アンモニウムで洗浄した。集めた上清を１．７５Ｍの硫酸アンモニウムに対して４℃で徹底的に透析し、１．７５Ｍの硫酸アンモニウムで平衡化した親チオ性の吸着材（Affi-Tアガロース）（デンマーク国、Kem En Tec）にアプライした（２５，２６）。流速を約０．５ｍｌ／分とし、同じバッファーで吸着材をその基準線まで洗浄し、１．５Ｍの硫酸アンモニウムと続く０．１ＭのＮａＣｌで溶出した。画分を、マウスセルピンａ１とわずかに交差反応を示した抗ヒトセルピンａ１抗体（抗α−１アンチトリプシン、Dako A012)を用いた交差免疫電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、セルピンａ１は高純度で１．５Ｍの硫酸アンモニウム画分に存在し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて５３ｋＤに移動するシャープな単一バンドとして検出された。コントラプシンとアルブミンが主要なタンパク性不純物だった。残留アルブミンは調製物をBlue Sepharose (米国、カリフォルニア州、リッチモンド、BioRad）に吸収させることで取り除いた。
【００３１】
この調製物を、ウサギを免疫するために使用した。所望の抗体反応性を有する放血をプールし、公知の塩析法（２７）で抗体を部分精製した。得られた抗体を、マウス血清のブロットに対して試験し、分子量が５３ｋＤのバンドと反応させた。免疫に使用したセルピンａ１がプールした正常マウス血清から得たものであるため、抗体は５種類のマウスセルピンａ１タンパク質を全て認識する傾向にある。
【００３２】
ウエスタンブロッティング
１０μｇのタンパク質を１４％アクリル／ビスアクリルアミドゲルにロードし、Immobilon-P転写メンブランフィルター（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード、Millipore）に移した。メンブランを１％のブロッキング試薬（ドイツ国、マンハイム、Roche Diagnostics）とインキュベートし、次に、ポリクローナルウサギ抗マウスセルピンａ１抗体とインキュベートし、更に西洋ワサビペルオキシダーゼポリクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体（米国、ウイスコンシン州、マディソン、Promega）とインキュベートし、増強化学発光法で視覚化した。デンシトメトリーをEagle-sightソフトウエアを使用して実施し、照射抽出物対偽照射抽出物の比を各サンプルについて計算した。
【００３３】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ実験のために、ＢＭ細胞を回収し、Qiagen RNAeasyミニキット（オランダ国、ルースデン、Westburg）を用いて５×１０6個の細胞からＲＮＡを単離した。続いてｃＤＮＡを合成した。以下のプライマーペアを使用した。セルピンａ１用（フォワード（Ｆ）：CAACACCTCCTCCAAACC、リバース（Ｒ）：CAGAAACTTCTCCACCAGC）、ハウスキーピング遺伝子である、ＨＰＲＴ用（Ｆ：GACTTGCTCGAGATGTCA、Ｒ：TGTAATCCAGCAGGTCAG）、β−アクチン用（Ｆ：AGACCTCTATGCCAACACAG、Ｒ：TAGGAGCCAGAGCAGTAATC）とＧＡＰＤＨ用（Ｆ：ATGGCCTTCCGTGTTCCTAC、Ｒ：CCTGCTTCACCACCTTCTT）。データは、製造者のソフトウエアを用いて解析し、ハウスキーピング遺伝子の発現量と比べた発現量の変化を計算する比較ＣＴ法（２−ＤＤＣｔ）で定量した。全ての反応について、反応の溶融曲線を解析することで非特異的産物についてチェックした。
【００３４】
統計解析
Studentのｔ検定で差異を評価した。ｐ値が０．０５未満のものを、統計的に有意とした。
【００３５】
実施例２ 
材料と方法 
動物
８〜１２週齢のオスのＢａｌｂ／ｃマウスをCharles River（オランダ国、マーストリヒト）より購入し、全ての動員研究に使用した。動物には、齧歯動物用の飼料と酸性水を自由に与え、ライデン大学医療センターの動物飼育施設内で、一般的な条件下で飼育した。全ての実験プロトコルが動物実験に関する学内倫理委員会の承認を受けていた。
【００３６】
セルソーティングおよび解析用の抗体
ＣＤ９７の発現は、ｍＣＤ９７の第一ＥＧＦ様ドメインに対する、ビオチン化ハムスター抗マウスＣＤ９７ ｍＡｂ（クローン１Ｂ２）（１）を用いたフローサイトメトリーで評価し、ストレプトアビジン−ＡＰＣまたはストレプトアビジン−ＰＥで染色した。ＣＤ９７サブ集団の表現型を分析するために、ＦＩＴＣで標識した、抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、抗ＴＥＲ１１９（クローンＴｅｒ−１１９）、抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、抗Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＣＤｌｌｂ（クローンＭｌ／７０．１５．１１．５）と抗ＧＲ−１（クローンＲＢ６−８Ｃ５）、およびＰＥで標識した抗ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ、クローン．．．）（全てカリフォルニア州、サンディエゴ、Pharmingenより購入）で染色した。ビオンチン化抗ＣＤ９０．２（Ｔｈｙｌ．２、クローン５３−２．１）は市販の抗体で染色した。
【００３７】
細胞懸濁液の調製
滅菌操作を用いて、移植マウスの大腿骨、脛骨と上腕骨に２％熱不活化ウシ胎児血清、１０％ヘパリン、ペニシリンとストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地（スコットランド、ペイズリー、Life Technologies）を流すことでＢＭＣを得た。ＤＮＡ分解酵素（１．３３ｍｇ／ｍｌ）とのインキュベーションの後、赤血球を溶解した。続いて、細胞を直接実験に使用するか（総骨髄細胞）、あるいは解析前にFACS Vantage（Beckton Dickinson）でソートした。実験に使用した全ての集団の純度は９５％を超えていた。
【００３８】
前駆細胞の解析
コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）を公知の方法（２）で培養した。簡単に説明すると、組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（１．２５ｎｇ／ｍｌ、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Pharmingen）の存在下で、５×１０5細胞／ｍｌの末梢血単核球を、３．５ｃｍのシャーレ中の半固形培地で培養した。骨髄細胞は、５×１０4細胞／ｍｌの濃度で培養した。３７℃、５％ＣＯ2を含む完全加湿雰囲気下で６日間培養した後、倒立型光学顕微鏡でコロニー（２０個以上の細胞からなる凝集隗と定義）の数をスコアした。
【００３９】
敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）の解析
平底９６穴プレート（オランダ国、エテン・ルール、Falcon）内の、ＦＢＭＤ−１細胞からなるコンフルエントな基底層に、種々の濃度のソート直後ＣＤ９７ＨＩ細胞、ＣＤ９７ＩＮＴ細胞、ＣＤ９７ＮＥＧ細胞または未分離のＢＭＣを重層し、基底層の下で造血性クローンを形成する前駆細胞の限界希釈解析を行った。特定の細胞の懸濁液を解析するために、我々は、１２個の２．５倍希釈段階を使用し、各希釈に付き１５個のウェルを使用した。細胞を３３℃、１０％ＣＯ2雰囲気で培養し、培地の半分を交換することで栄養を毎週与えた。重層後７日〜４２日の間に、全てのウェルを週１回の間隔で観察し、少なくとも１相の暗い造血性クローン（敷石状領域、少なくとも５個の細胞からなる）が観察された時に陽性とした。ＣＡＦＣ頻度は、ポアソン統計を用いて計算した。
【００４０】
ＢＭＣ移植
線形加速器付のパースペックス製チャンバー（Philips SL 75-5/6 mV）（オランダ国、ベスト、Philips Medical Systems）内で、９８ｃＧｙ／分の線量を被移植マウスに照射した。合計線量が９．５Ｇｙ（致死量照射）となるように行った。全身照射の４〜８時間後に、０．２％のウシ血清アルブミンを含む０．２ｍｌの生理食塩水中の骨髄細胞を尾状静脈に注射した。
【００４１】
結果 
造血前駆細胞の大部分がＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞画分に存在する
マウス骨髄細胞によるＣＤ９７の発現を評価するために、初代ＢＡＬＢ／ｃ骨髄細胞を抗ＣＤ９７モノクローナル抗体で染色した。ＦＡＣＳ解析によって、３種の主な集団、即ち、ＣＤ９７ＨＩ細胞、ＣＤ９７ＩＮＴ細胞とＣＤ９７ＮＥＧ細胞（それぞれの総ＢＭ細胞中の平均濃度は７１．５％、２４．４％と４．４％、図１ａ）が明らかとなった。ＣＤ９７発現に基づいて、骨髄細胞をＣＤ９７ＨＩ集団、ＣＤ９７ＩＮＴ集団とＣＤ９７ＮＥＧ集団にソートした（図１ｂ）。続いて、ＣＦＵ−ＧＭのコロニー形成能を、種々のＣＤ９７サブセット（ｎ＝６）について解析した。総骨髄細胞と比べて、ＣＤ９７ＮＥＧ集団においてコロニー形成（ＣＦＵ−ＧＭ）能が２．７倍に増加していた（１０6個の骨髄細胞当たり、８６６０．６±７６９２．０ ＣＦＵ−ＧＭに対して、３２０３．７±１５２７．２ ＣＦＵ−ＧＭ）。ＣＤ９７ＨＩはわずかなＣＦＵ−ＧＭ形成細胞（１０6個の骨髄細胞当たり、１７８．４±１６９．６ ＣＦＵ−ＧＭ）しか含んでいないが、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞は、総骨髄細胞と同等のコロニー形成能を示した（１０6個の骨髄細胞当たり、３０４７．０±２９０２．０ＣＦＵ−ＧＭ、図１ｃ）。これらの結果は、造血前駆細胞の大部分がＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞画分に存在することを示している。
【００４２】
再建造血幹細胞はＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞サブセットに存在する
ＣＤ９７ＨＩ集団、ＣＤ９７ＩＮＴ集団とＣＤ９７ＮＥＧ集団における初代前駆細胞の長期再建能の頻度を求めるために、ソートしたＢＡＬＢ／ｃ骨髄細胞を敷石状領域形成細胞アッセイで試験した。ＣＤ９７ＨＩ画分、ＣＤ９７ＩＮＴ画分および総骨髄細胞と比べて、ＣＤ９７ＮＥＧ画分に、前駆細胞活性を有する細胞のみからなる７日目のＣＡＦＣの大部分が存在していた（７日目の結果は、ＣＤ９７ＮＥＧ画分が８５２±６０．７ ＣＡＦＣ／１０5細胞であるのに対し、ＣＤ９７ＨＩ画分、ＣＤ９７ＩＮＴ画分と総骨髄細胞はそれぞれ０．２３±０．０ ＣＡＦＣ／１０5細胞、２０１．２±２６０．０ ＣＡＦＣ／１０5細胞と１０７．６±１７．９ ＣＡＦＣ／１０5細胞であった、図２ａ）。しかし、数週間に渡る培養の最中にＣＡＦＣの頻度は低下し、２８日目には、ＣＤ９７ＮＥＧ画分からＣＡＦＣは検出されなかった。ＢＭのＣＤ９７ＨＩ画分は、全培養期間を通じて非常に少量のＣＡＦＣしか含んでおらず、培養２８日後には、ＣＡＦＣは検出されなかった。一方、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞は、総骨髄細胞と比べて高頻度のＣＡＦＣを７日目に示し、この頻度は全培養期間を通じて高いまま維持された（培養開始７日、１４日、２１日、２８日と３５日目のＣＡＦＣは、それぞれ、２０１．２±２６０．０ ＣＡＦＣ／１０5細胞、１８６．７±２３．９ ＣＡＦＣ／１０5細胞、１１８．２±８．９ ＣＡＦＣ／１０5細胞、３６．５±１２．２ ＣＡＦＣ／１０5細胞と３．１±０．１ ＣＡＦＣ／１０5細胞（図２ａ））。
【００４３】
続いて、種々のＣＤ９７ソート骨髄細胞画分の再建能を調べるために、致死量照射（９．５Ｇｙ）を受けた同系の被移植マウスに、１×１０5個のＣＤ９７ソート骨髄細胞を移植した。ＣＤ９７ＨＩ骨髄細胞またはＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞を移植したマウス（各群のｎ＝１０）と、対照の全身照射（ＴＢＩ）のみを受けたマウス（ｎ＝６）は、移植後８週目には一匹も生存していなかった。しかし、１×１０5個のＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞を移植したマウス（ｎ＝１０）は、移植後１２０日を経過しても生存していた（図２ｂ）。ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞が一生を通じた再建能を有することを確認するために、致死量照射（９．５Ｇｙ）を受けた二次被移植マウスに、以前に１×１０5個のＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞の移植を受けたマウス、または１×１０5個の総骨髄細胞の移植を受けた被移植体から得た１×１０5個の総骨髄細胞を移植した。移植から１００日目には、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞の二次被移植体であるマウスの４／５と、１×１０5個の総骨髄細胞の二次被移植体の４／５が生存していた（図２ｃ）。この結果は、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞画分は、長期再建能を有する造血幹細胞を含むことを示している。
【００４４】
ＣＤ９７ＩＮＴ細胞はｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯＬｉｎＮＥＧＷＧＡ＋である
マウスにおいて造血幹細胞は、ｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯＬｉｎＮＥＧ（ref）と特徴付けられている。ＣＤ９７ＨＩ骨髄細胞画分、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞画分とＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞画分におけるｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯＬｉｎＮＥＧ細胞の存在を評価するために、総未分離骨髄細胞をｃ−Ｋｉｔマーカー、Ｔｈｙ−１マーカーと連鎖（Ｌｉｎ）マーカーで染色した。ＣＤ９７ＨＩ発現細胞の大部分がＬｉｎマーカーに対して陽性であり、Ｔｈｙ−１マーカーに対して陰性であり、ｃ−Ｋｉｔを発現していなかった。一方、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞とＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞のサブ集団はｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯであり、Ｌｉｎマーカーに対して陰性だった（図３ａ）。造血幹細胞の別の表現型マーカーの１つは小麦胚アグルチニン（ＷＧＡ）である。この分子は、糖タンパク質とそれを発現した造血幹細胞のシアル酸残基に結合する（ref）。ＦＡＣＳ解析によって、ＣＤ９７ＨＩ細胞はＷＧＡ染色に対して陰性であるが、ＣＤ９７ＩＮＴ骨髄細胞とＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞の両方がｃ−ＫｉｔＨＩＷＧＡ＋集団を含有することが明らかとなった（図３ａ）。別の実験では、ソートしていない骨髄細胞からｃ−ＫｉｔＨＩ細胞、Ｔｈｙ−１ＬＯ細胞とＬｉｎＮＥＧ細胞を選択した。続いて、この細胞集団におけるＣＤ９７の発現を解析した。Ｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯＬｉｎＮＥＧ骨髄細胞の大部分（５１．６％）がＣＤ９７ＩＮＴ画分に存在し、一方、ＣＤ９７ＮＥＧ骨髄細胞のわずか１５．３％と、ＣＤ９７ＨＩ骨髄細胞の３３．７％がｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯＬｉｎＮＥＧ集団に存在していた（図３ｂ）。
【００４５】
ＣＤ９７ＩＮＴｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯ細胞は造血幹細胞である
マウス造血幹細胞の単離は複数の工程からなるプロセスであり、磁気と蛍光の両方によるセルソーティング工程が含まれる（ref）。ＣＤ９７発現に対して選択することによって、造血幹細胞の単離を簡略化できないか検討するために、ＣＤ９７ＩＮＴｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯ骨髄細胞とＣＤ９７ＩＮＴｃ−ＫｉｔＨＩＴｈｙ−１ＬＯＬｉｎＮＥＧ骨髄細胞の前駆細胞含量と、in vitroおよびin vivoの再建能を解析した。
【００４６】
Ｃ５７ＢＬ／６のデータ
ＦＡＣＳ解析は、移植ＢＭ細胞が宿主の再構成を担うことを明らかにした。
【００４７】
長期再建能を有する造血幹細胞は、ＣＤ９７とｃ−Ｋｉｔの発現に基づいて単離可能である
長期再建能を有する造血幹細胞の単離が簡略化できないか検討するために、我々はＣＤ９７ＩＮＴｃ−ＫｉｔＨＩ骨髄細胞を単離し、これら集団のＨＳＣおよびＨＰＣ含量と共に、in vivoの再建能を解析した。
【００４８】
参照文献一覧 
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【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】実施例１、図１．  ＩＬ−８誘導性およびＧ−ＣＳＦ誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員は、低線量全身照射の後に阻害された。マウスは０．５ＧｙのＴＢＩまたは偽照射を受け、続いてＩＬ−８（３０ｍｇ／マウス、ｎ＝１２）またはＧ−ＣＳＦ（ｎ＝１０）、あるいは対照であるＰＢＳ（ｎ＝１１）で動員した。末梢血（ａ）とＢＭ（ｂ）のコロニー形成能を示した。結果は平均±ＳＤで表した。＊は、０Ｇｙ／ＩＬ−８と比べた時のｐ値が０．０００１未満、＊＊は、０Ｇｙ／Ｇ−ＣＳＦと比べた時のｐ値が０．０００１未満。
【図１−２】実施例１、図２．  （ａ）照射マウスから得たＢＭＥＥによるエラスターゼ活性の阻害。低線量（０．５Ｇｙ、ｎ＝９）照射マウスをＴＢＩから２４時間後に屠殺し、ＢＭＥＥを得た。ＢＭＥＥのエラスターゼ活性を、追加エラスターゼの不存在下および追加エラスターゼの存在下の両方で測定した。＊は、偽照射対照群から得たＢＭＥＥと比べた時のｐ値が０．０５未満。  （ｂ）エラスターゼ活性は、抗セルピンａ１抗体によって復帰する。低線量（０．５Ｇｙ）照射マウス（ｎ＝２）から得たＢＭＥＥを、抗セルピンａ１抗体の不存在下または存在下（Ａｂ、それぞれ黒い棒と斜線の棒）で、３．１２５ｍｇ／ｍｌのエラスターゼとインキュベートした。続いて、エラスターゼ活性を発色性基質アッセイで求めた。結果は、偽照射対照群から得たＢＭＥＥのエラスターゼ活性に相関させた。
【図１−３】実施例１、図３．  低線量ＴＢＩに続く、セルピンａ１ ｍＲＮＡとタンパク質の誘導。  （ａ）０．５ＧｙのＴＢＩから２４時間後の、リアルタイムＰＣＲによる総ＢＭ細胞のセルピンａ１ ｍＲＮＡの解析（白い棒、ｎ＝２）。０．５ＧｙのＴＢＩから２４時間後には、ＨＰＲＴ発現と比べて、セルピンａ１ ｍＲＮＡは７倍に増加した（左のＹ軸）。０．５Ｇｙ照射マウスから得たＢＭ上清（黒い棒、ｎ＝７）について、セルピンａ１タンパク質の存在をウエスタンブロッティングで解析した。セルピンａ１タンパク質の相対濃度は、各バンドの光学濃度測定によって求め、同じブロットの偽照射マウスと相関させた（右のＹ軸）。  （ｂ）偽照射マウスおよび０．５Ｇｙ照射マウスから得たＢＭ上清から、１０ｍｇの総タンパク質を取り出し、セルピンａ１タンパク質の存在をウエスタンブロッティングで解析した。セルピンａ１タンパク質の相対濃度は、各バンドの光学濃度測定によって求めた。
【図１−４】実施例１、図４．  セルピンａ１は、ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員を阻害する。ＨＳＣ／ＨＰＣ動員をＩＬ−８で誘導する２時間前および５分前に、ヒト セルピンａ１（３００ｍｇ）をｉ．ｐ．注射によってマウスに投与した。対照マウスにはＰＢＳまたは熱不活化セルピンａ１を投与した（ｎ＝４）。続いて、ＩＬ−８（３０ｍｇ／マウス、ｎ＝１４）でマウスを動員するか、対照としてＰＢＳを投与し（ｎ＝９）、コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の数を（ａ）末梢血と（ｂ）ＢＭで評価した。４回の個別の実験の結果を平均±ＳＤで表した。＊は、ＩＬ−８処置対照マウスと比べた時のｐ値が０．０５未満。
【図１−５】実施例１、図５．  ＩＬ−８誘導性のＨＳＣ／ＨＰＣ動員における、好中球、プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害因子の役割を表す模式図。ＩＬ−８注射に伴い、好中球はＬＦＡ−１とＭａｃ−１を含む細胞接着分子を上方制御し、続いてローリングと内皮への強固な接着が生じる。（Ｉ）一度内皮に付着すると、好中球はＩＬ−８による活性化に応答して脱顆粒し、ＭＭＰ−９と、好中球エラスターゼを含むセリンプロテアーゼを放出する。セルピンａ１を含むセリンプロテアーゼ阻害因子は、血漿に高濃度で存在する。（ＩＩ）プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害因子比がプロテアーゼ側に傾いている（プロテアーゼ過剰な）場合、ＨＳＣ／ＨＰＣと間質エレメントとの細胞接着性相互作用が分解される。（ＩＩＩ）続いて、ＨＳＣ／ＨＰＣが末梢血に動員される。（ＩＶ，Ｖ）ＢＭにおけるプロテアーゼ阻害因子の誘導は、阻害因子の過剰をもたらし（ＶＩ）、ＨＳＣ／ＨＰＣの動員は起こらない。  上のパネル。プロテアーゼ活性の陽性および陰性の調節。ＭＭＰ−９によるセルピンａ１（α−１アンチトリプシン、α−１ＡＴ）の開裂は、セリンプロテアーゼ阻害因子の不活化をもたらす。セルピンａ１は通常は好中球エラスターゼに結合してセリンプロテアーゼを阻害する。しかし、その不活化は、ＢＭ微小環境における好中球エラスターゼ活性の純増加をもたらす。これに対してエラスターゼは、ＭＭＰ−９を不活化し、結果として、セルピンａ１の阻害が低下する。セルピンａ１の不活化以外には、ＭＭＰ−９はＩＬ−８をより高い生物活性を示す分子に開裂する。より生物活性の高いＩＬ−８の存在は、ＭＭＰ−９レベルの上昇に繋がる。
【図２−１】実施例２、図１．  マウス骨髄は、ＣＤ９７発現に基づいて、３種の主要な集団に分けることができる。  （ａ）マウス骨髄細胞を抗ＣＤ９７ ｍＡｂで染色し、ＣＤ９７の発現をフローサイトメトリー解析で評価した。  （ｂ）ＣＤ９７発現に基づいて、骨髄をＣＤ９７HI集団、ＣＤ９７INT集団とＣＤ９７NEG集団にソートした。パーセントは、図示したゲートで定義された細胞画分を表す。  （ｃ）解析した、各ＣＤ９７ソート骨髄細胞集団のコロニー形成能。６回の個別の実験の結果を平均±ＳＤで表した。
【図２−２】実施例２、図２．  造血幹細胞活性がＣＤ９７INT集団に存在した。  （ａ）ＣＤ９７発現に基づいて、骨髄細胞をＣＤ９７HI集団、ＣＤ９７INT集団とＣＤ９７NEG集団にソートした。ソートした集団それぞれのＣＡＦＣ形成能を５週間に渡って解析した。３回の個別の実験の結果を平均±ＳＤで表した。  （ｂ）ＣＤ９７でソートした１×１０5個の骨髄細胞による放射線防護効果。致死量照射を受けた被移植体（９．５Ｇｙ、各群はｎ＝１０）に、１×１０5個の総骨髄細胞または１×１０5個の精製ＣＤ９７HI骨髄細胞、ＣＤ９７INT骨髄細胞またはＣＤ９７NEG骨髄細胞を移植した。  （ｃ）二次被移植マウスにおける、１×１０5個のソートした骨髄細胞による放射線防護効果。致死量照射を受け、１×１０5個のＣＤ９７INT骨髄細胞を移植されたた被移植体を、骨髄移植の１２６日後に屠殺し、骨髄細胞を回収した。続いて、１×１０5個の総骨髄細胞を、致死量照射（９．５Ｇｙ）を受けた二次被移植体（各群はｎ＝５）に投与した。
【図２−３】実施例２、図３．  ソートしていないＢＡＬＢ／ｃ骨髄細胞の表現型解析。  （ａ）ＣＤ９７INT細胞とＣＤ９７NEG細胞は、造血幹細胞の表現型を示す。総骨髄細胞をＣＤ９７発現に基づいて、ＣＤ９７HIサブ集団、ＣＤ９７INTサブ集団とＣＤ９７NEGサブ集団に分けた。各サブ集団について、ｃ−Ｋｉｔと比べた、Ｔｈｙ−１マーカー、連鎖マーカー（Ｌｉｎ）およびコムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）の解析を行った。  （ｂ）ｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG細胞の大部分が、ＣＤ９７INT集団に存在する。総骨髄細胞を、ｃ−Ｋｉｔ、Ｔｈｙ−１マーカー、Ｌｉｎ−マーカーおよびＣＤ９７に対して染色した。ｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG細胞を取り出し、ＣＤ９７発現について解析した。
【図２−４】実施例２、図４．  ｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO骨髄細胞とＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO骨髄細胞の、in vitroおよびin vivoの再建能。  （ａ）ソートした骨髄細胞のＣＦＵ−ＧＭ解析。  （ｂ）総骨髄細胞と比較した、ｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO骨髄細胞とＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO骨髄細胞のＣＡＦＣ解析。ＫＴはｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO細胞である。  （ｃ）致死量照射（９．５Ｇｙ）とそれに続く骨髄細胞移植から６０日後の被移植体の生存率（各群のｎは３〜１０）。ＣＤ９７ＫＴはＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO細胞である。
【図２−５】実施例２、図５．  ｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG骨髄細胞とＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG骨髄細胞の、in vitroおよびin vivoの再建能。  （ａ）ソートした骨髄細胞のＣＦＵ−ＧＭ解析。  （ｂ）総骨髄細胞と比較した、ｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG骨髄細胞とＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG骨髄細胞のＣＡＦＣ解析。ＫＴＬはｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LOＬｉｎNEG細胞である。  （ｃ）致死量の全身照射（９．５Ｇｙ）とそれに続く骨髄細胞移植の後の被移植体の生存率（各群のｎは３〜５）。ＣＤ９７ＫＴＬはＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHIＴｈｙ−１LO細胞である。
【図２−６】実施例２、図６．  ＣＤ９７INT骨髄細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、in vitroおよびin vivoの再建能を有する。  （ａ）Ｃ５７ＢＬ／６骨髄細胞を抗ＣＤ９７ ｍＡｂで染色し、ＣＤ９７発現をフローサイトメトリー解析で評価した。  （ｂ）ＣＤ９７発現に基づいて、骨髄をＣＤ９７HI集団、ＣＤ９７INT集団とＣＤ９７NEG集団にソートした。ＣＤ９７でソートした各骨髄細胞集団のコロニー形成（ＣＦＵ−ＧＭ）能を解析した。  （ｃ）ＣＤ９７発現に基づいて、骨髄細胞をＣＤ９７HI集団、ＣＤ９７INT集団とＣＤ９７NEG集団にソートした。ソートした各集団のＣＡＦＣ形成能を５週間に渡って解析した。  （ｄ）１×１０5個のＣＤ９７ソートしたＣ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５．１）骨髄細胞による、放射線防護効果。致死量照射（９．５Ｇｙ）を受けた被移植体（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｌｙ５．２、各群はｎ＝５）に、１×１０5個の総骨髄細胞または１×１０5個の精製ＣＤ９７HI骨髄細胞、ＣＤ９７INT骨髄細胞またはＣＤ９７NEG骨髄細胞を移植した。
【図２−７】実施例２、図７．  ｃ−ＫｉｔHI骨髄細胞とＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHI骨髄細胞の、in vitroおよびin vivoにおける再建能。  （ａ）ソートした骨髄細胞のＣＦＵ−ＧＭ解析。  （ｂ）総骨髄細胞と比較した、ｃ−ＫｉｔHI骨髄細胞とＣＤ９７INTｃ−ＫｉｔHI骨髄細胞のＣＡＦＣ解析。  （ｃ）致死量の全身照射（９．５Ｇｙ）とそれに続く骨髄細胞移植の後の被移植体の生存率（各群のｎは３〜５）。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１：  セルピンａ１ ｍＲＮＡ検出用のフォワードＰＣＲプライマー
配列番号２：  セルピンａ１ ｍＲＮＡ検出用のリバースＰＣＲプライマー
配列番号３：  ＨＰＲＴ ｍＲＮＡ検出用のフォワードＰＣＲプライマー
配列番号４：  ＨＰＲＴ ｍＲＮＡ検出用のリバースＰＣＲプライマー
配列番号５：  β−アクチン ｍＲＮＡ検出用のフォワードＰＣＲプライマー
配列番号６：  β−アクチン ｍＲＮＡ検出用のリバースＰＣＲプライマー
配列番号７：  ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ検出用のフォワードＰＣＲプライマー
配列番号８：  ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ検出用のリバースＰＣＲプライマー
【図１−１】
2009525268.tif 000002
【図１−２】
2009525268.tif 000003
【図１−３】
2009525268.tif 000004
【図１−４】
2009525268.tif 000005
【図１−５】
2009525268.tif 000006
【図２−１】
2009525268.tif 000007
【図２−２】
2009525268.tif 000008
【図２−３】
2009525268.tif 000009
【図２−４】
2009525268.tif 000010
【図２−５】
2009525268.tif 000011
【図２−６】
2009525268.tif 000012
【図２−７】
2009525268.tif 000013
【配列表】
2009525268000001.app
【国際調査報告】
2009525268.tif 000014
2009525268.tif 000015
2009525268.tif 000016
2009525268.tif 000017
2009525268.tif 000018
2009525268.tif 000019