(57)【要約】多能性の胚性幹（ES）細胞に基づく、胚毒性／催奇形性スクリーニングを目的とした、ならびに、成長および組織促進因子のような医薬品の同定のための、胚の発生および分化に対する化学的に誘導された効果のインビトロおよびインビボ検出のための手段と方法が提供される。アッセイは、トランスジェニックES細胞と、そのようなES細胞またはその派生物からなる非ヒト動物との使用に基づき、前記ES細胞が、分泌レポータータンパク質、特に分泌胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）の分化依存性発現を特徴とする。【選択図】  図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）細胞の分化を許容する条件下で、細胞分化の際に分泌される産物をコードするレポーター遺伝子からなる少なくとも一つの組換え核酸分子を含有する少なくとも一つの特定の細胞タイプへと分化する能力のある細胞を培養すること、または、そのような細胞からなる非ヒト動物を維持することと、
（b）前記トランスジェニック非ヒト動物の体液または細胞培養培地のいずれかの中のレポーター遺伝子産物の量または活性を決定することと、
からなる、細胞分化を監視する方法。
【請求項２】
前記組換え核酸分子が、前記レポーター遺伝子に作動的に連結された少なくとも一つの細胞タイプ特異的調節配列からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、幹細胞であるかまたは該幹細胞由来である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または複能性の成体前駆細胞（MAPC）である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子産物が、分泌リーダー配列からなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記調節配列が、プロモーターおよび／またはエンハンサー要素からなる、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞タイプが、結合線維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経系細胞、神経細胞、造血細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、上皮細胞および心臓細胞からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、αMHC、MLC2V、VE-カドヘリン、Tie-2、Flk-1、Flt-1、GFAP、アルファ-1-チューブリン、コラーゲン2のプロモーターまたはエンハンサーからなる群から選択される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子産物が、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）またはアルファ−アミラーゼである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え核酸分子が、複能性または多能性の細胞によって発現される選択可能マーカーをさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、種々の細胞タイプから派生した細胞凝集物または組織様凝集物を形成する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が胚様体（EB）を形成する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載された組換え核酸分子からなる、細胞分化を監視するためのレポーター遺伝子構築物。
【請求項１４】
請求項1から12のいずれか一項に記載された、または請求項13のレポーター遺伝子構築物からなる細胞であって、少なくとも一つの細胞タイプに分化する能力がある細胞。
【請求項１５】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって得られる少なくとも一つの細胞タイプの細胞凝集物。
【請求項１６】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって得られる組織、あるいは、請求項14に記載の細胞または請求項15に記載の細胞凝集物からなる組織。
【請求項１７】
請求項16に記載の組織、請求項14に記載の細胞、または請求項15の細胞凝集物からなる器官。
【請求項１８】
請求項17に記載の器官、請求項16に記載の組織、請求項14に記載の細胞、または請求項15に記載の細胞凝集物からなるインプラントまたはトランスプラント。
【請求項１９】
請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物、請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、請求項16に記載の組織、または請求項17に記載の器官からなる非ヒト動物。
【請求項２０】
請求項13に記載のレポーター遺伝子、請求項16に記載の組織、請求項14に記載の細胞、または請求項15に記載の細胞凝集物からなる、物質の組成物。
【請求項２１】
固体支持体と、それに付着したまたはそれに吊した、請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、または請求項16に記載の組織と、からなるアレイ。
【請求項２２】
請求項21に記載のアレイを解析するための装置。
【請求項２３】
（a）請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、請求項16に記載の組織、または請求項17に記載の器官からなる、あるいは、請求項19に記載の非ヒト動物からなる試験サンプルを試験物質に接触させることと、
（b）前記レポーター遺伝子産物または活性の量に対する前記試験物質の影響を、コントロールサンプルまたは動物に比較して決定することと、
からなる、細胞分化のモジュレーターを得るおよび／またはプロファイルする方法。
【請求項２４】
前記接触ステップが、前記試験サンプルまたは動物を、前記第1試験物質の存在下で少なくとも一つの第2試験物質に接触させることをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
分化プロセスを活性化するまたは阻害すると知られている化合物が前記培地または動物に加えられる、請求項1から12または23から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験物質が治療薬である、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験物質が治療薬の混合物である、請求項23から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
好適には、第1のスクリーニングにて前記試験物質が試験物質の集まりの中に包含されるとともに該集まりとして対象となる、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験物質の集まりが、約103から約105の多様性を持つ、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記試験物質の集まりの多様性が連続的に低減される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
アレイ上で行われる、請求項23から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記一つまたは複数の細胞が、標的遺伝子を（過剰）発現するように、またはその発現を阻害するように遺伝子操作される、請求項1から12または23から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記一つまたは複数の細胞または組織が容器内に内包されている、請求項1から12または23から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
任意で前記容器内の種々の位置にて3つ以上の測定値を取ることからなる、請求項1から12または23から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記容器がマイクロタイタープレートのウェルである、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロタイタープレートが24、96、384または1586ウェルプレートである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
請求項23から36に記載のいずれか一項のステップからなる、特定の細胞タイプの形成を促進または阻害する薬物を得るとともに製造するための方法であって、前記レポーター遺伝子産物の増大したまたは減少したレベルまたは活性が、前記薬物を示唆するものである、方法。
【請求項３８】
請求項23から37のいずれか一項に記載の方法のステップからなる、創傷治癒および／または損傷組織治癒を支援する薬剤を製造する方法であって、レポーター遺伝子産物の増大されたレベルまたは活性が、前記薬剤を示唆するものである、方法。
【請求項３９】
請求項23から37のいずれか一項に記載の方法のステップからなる、化合物の毒性、好適には、催奇形、胚毒性、慢性または急性毒性を決定する方法であって、前記レポーター遺伝子産物の低減されたまたは増大されたレベルまたは活性が、前記化合物の毒性を示唆するものである、方法。
【請求項４０】
毒性を引き起こし、生体利用度、溶解度および／または半減期を増やす疑いがある前記物質の部分を改変、除去および／または派生化すべく前記物質を修飾することをさらに含む、請求項23から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離されたまたは修飾された前記物質を製薬的に許容可能なキャリアと混合することをさらに含む、請求項23から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
例えば、請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物と、請求項14に記載の細胞と、細胞培養培地、選択薬剤、レポーター分子のための検出薬剤、およびコントロールサンプルのような標準化合物とからなる、請求項1から12または23から41のいずれか一項に記載の方法を行うために有用なキット。
【請求項４３】
（a）細胞分化のモジュレーターを同定するための請求項1から12または23から41のいずれか一項に記載の一つまたは複数のアッセイシステムを提供すること、および／または、
（b）請求項19に記載の動物における効力と毒性について、ステップ（a）で同定されたモジュレーターまたはさらなる類似物の治療的プロファイリングを行うことと、
（c）容認できる治療的プロファイルを有するとしてステップ（b）で同定された一つまたは複数のモジュレーターを含む医薬品調製物を製剤することと
からなる、創薬事業を行う方法。
【請求項４４】
（a）細胞分化のモジュレーターを同定するための請求項1から12または23から41のいずれか一項に記載の一つまたは複数のアッセイシステムを提供することと、
（b）（任意で）請求項19に記載の動物における効力および毒性について、ステップ（a）で同定されたモジュレーターの治療的なプロファイリングを行うことと、
（c）ステップ（a）で同定されたモジュレーターまたはその類似物のためのさらなる薬剤開発および／または販売の権利を第三者に実施許諾することと、
からなる、標的発見事業を行う方法。
【請求項４５】
請求項23から41のいずれか一項に記載の方法により同定される成長および組織形成促進のような細胞分化のモジュレーター。
【請求項４６】
請求項23から41のいずれか一項に記載の方法により同定されるモジュレーターからなる、細胞分化の調節に使用するための薬剤組成物。
【請求項４７】
請求項23から41のいずれか一項に記載の方法により同定される細胞分化のモジュレーターを、適切な希釈剤またはキャリアと混合することからなる、細胞分化を調製するのに使用するための薬剤組成物を作る方法。
【請求項４８】
創薬または薬物動態学的なまたは薬理学的なプロファイリングにおける、請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物、請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、請求項16に記載の組織、請求項17に記載の器官、請求項18に記載のインプラントまたはトランスプラント、請求項19に記載の非ヒト動物、請求項20に記載の組成物、請求項21に記載のアレイ、または請求項22に記載の装置の使用。
【請求項４９】
マウスアルファミオシン重鎖遺伝子の、または心室型ミオシン調節軽鎖遺伝子のプロモーター領域と、それに作動的に連結された異種性DNA配列とからなるベクター。
【請求項５０】
前記プロモーターが、配列番号1または2のヌクレオチド配列またはその断片からなる、請求項49に記載のベクター。
【請求項５１】
前記異種性DNA配列が、レポーターまたは選択可能マーカーをコードする、請求項49または50に記載のベクター。
【請求項５２】
前記DNA配列が、分泌性アルカリホスファターゼタンパク質（SEAP）をコードする、請求項49から51のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５３】
配列番号3のヌクレオチド配列からなる請求項49から52のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５４】
胚形成または細胞発生の間における異種性DNA配列の特異的発現のための、マウスアルファミオシン重鎖遺伝子の、または心室型ミオシン調節軽鎖遺伝子のプロモーター領域の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、細胞発生中に細胞タイプ特異的なレポーターとして細胞膜を通して分泌される能力のあるタンパク質の用途に関する。詳細には、本発明は、細胞および／または発生依存性プロモーターに作動可能に連結された分泌タンパク質をコードするDNA配列を含むDNA構築物を安定的に形質移入した胚性幹（ES）細胞と、このようなES細胞を調製するための方法と、前記ES細胞の培養によって得ることができる細胞培養物と、このような細胞培養物を用いる物質の毒物学的な検査のための方法、ならびに、組織移植片の源として用いることができる選択的に分化した細胞の誘導のための分化または成長因子の同定のための方法と、前記ES細胞を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法と、前記方法によって得ることができるトランスジェニック非ヒト哺乳動物と、このような非ヒト哺乳動物の細胞を用いて細胞の発生の段階を検査するための方法に関する。本発明はまた、所望の細胞タイプへの分化を促進する培養条件および物質を同定するための、または或る細胞タイプに対する化合物の毒性を決定するためのアッセイに関連する。それらのアッセイは、胚形成中において可能性がある発生および分化の障害について示唆を与えるべく適合されている。
【背景技術】
【０００２】
前駆細胞は、医療研究において中心的な関心事になっている。前駆体は、一方では、老化した、あるいは傷害または疾患によって損傷を受けた細胞に取って代わり、また他方ではこれらの細胞は、発生および分化、ならびにこれらの過程に影響を与える因子を研究するための理想モデルを代表する。これらの研究のために従来の細胞系を使用することは、個々の細胞系が、無傷の生物体の複雑な生物学的仕組みを十分に代表するものでない可能性がある、という短所を有する。さらに、多数の細胞系において試験を繰り返しても、生物体内に存在する組織や細胞の複雑な相互作用が再現または説明されることはない。
【０００３】
これは、細胞系での毒性試験が従来の動物試験に取って代われない主要な理由である。新たな化学化合物は、絶えず開発され動物で試験されている。産業用および家庭用化学物質に加えて、多くの化学組成物が、医薬品としての用途のために毎年開発されている。潜在的な医薬品の試験に関する規則は食品医薬品局（「FDA」）によって公布されるが、FDAは、薬の候補のヒト臨床試用への使用を可能とする前に、少なくとも2つの生物種において、毒性、変異原性および他の効果を包括的に試験することを現在では要求している。前臨床の毒性試験だけでも数十万ドルの費用がかかる。この莫大な投資にもかかわらず、将来に可能性を持つ全てのヒト治療薬のうちほぼ3分の1が、予想外の毒性のためにヒト臨床試用の第1段階において不合格になっている。現在利用可能な毒物学的なスクリーニングアッセイが、ヒトの治療や、環境内の化学物質への曝露に関連した毒性の全てを検出するものではないことは、はっきりしている。潜在的な治療薬または化学物質一般を潜在的な毒性についてスクリーニングするためのより良い手段によって、例えば、医療用装置またはヒトが毎日曝露される他の装置または物品における使用のための、新たな治療薬および材料の開発の費用と不確定さが低減されるであろう。
【０００４】
化学薬剤の催奇形のおよび／または胚毒性の性質の検出は、現在では、妊娠実験哺乳動物に対する単一または多数回投与に続く試験物質の生殖毒性の決定によって、および妊娠の早い段階における胚毒性の試験によって行われる。さらに催奇形試験のために、インビトロ試験は、哺乳動物の胚を用いて（NeubertとMerker、de Gruyter、ベルリン−ニューヨーク（1981））および胚の器官を用いて行われる。しかしこれらの試験手順は、多数の生きた哺乳動物、特にラットとマウスの使用を必要とするという短所を有する。インビトロ試験手順は、胚ラットの肢芽（例えば「Limb Buds」、Kochhar, Teratology 11（1975）、273〜287）または脳の一部（FlintとOrton、Toxicol.Appl.Pharmacol.76（1984）、383〜395）の初代細胞培養物、または卵巣の腫瘍細胞または胚性口蓋細胞のような胚または成体の哺乳動物組織の永久細胞系が使用されるが、厳密に言えば、胚形成中の催奇形試験に課せられた要求事項を満たしていない、すなわち、発育不全または発生障害が起こりうるということを示唆する。
【０００５】
胚毒性および変異原性の物質の検出のための全能性の／多能性の胚性幹細胞（ES細胞）の永久培養物を使用するために、数年間努力が為されてきた。例えば、Laschinskiら、Reproductive Toxicol.5（1991）、57〜65；NewallとBeedles、Toxicol.in Vitro 8（1994）、697〜701；SehlmeyerとWobus、Mutation Res.324（1994）、69〜76を参照されたい。
【０００６】
それらシステムの全ては、試験ES細胞の生物学的な性質、または該細胞内に導入されたレポーターシステムを利用している。
【０００７】
例えば、US-A-6,498,018は、細胞培養物を生物学的薬剤に接触させることによって生物学的薬剤の効果を決定するための方法を記述している。該細胞培養物は、初代CNS神経組織と、予め選択した成長因子を有する培地とから派生するヒト複能性のCNS神経幹細胞を内包する。該細胞培養に帰せられる生物学的な機能または性質の存在時または不在時の生物学的薬剤の効果によって検出が提供される。このシステムの主要な短所は、或る細胞の培養物に固有の特定の生物学的な機能または性質が測定困難であり、該アッセイに十分な材料を入手するためには培養物の多くの破壊をしばしば伴うという事実である。
【０００８】
WO02／086073は、核移転胚性幹細胞から分化した神経細胞のポジティブ選択のための方法を開示している。この方法は、天然にネクチンを発現する神経細胞タイプに限定される。
【０００９】
US-A-6,007,993は、始原生殖細胞から確立された胚性生殖（EG）細胞を用いた、マウスおよびラットからの分化した多能性胚性幹（ES）細胞に基づく化学的に誘導された胚毒性（例えば、また、催奇形）効果の検出のためのインビトロ試験手順を記述している。安定したトランスジェニックESまたはEG幹細胞クローンを作成し、該クローンにおいては、細菌性のレポーター遺伝子、LacZまたはルシフェラーゼ遺伝子が、組織特異的プロモーターまたは発生コントロール遺伝子のコントロール下に置かれた。催奇形物質の存在下でES細胞が種々の胚発生経路派生物へと分化した後に続いて、該細胞内で分化依存性発現が、組織特異的プロモーターの活性によって起きる。これら組織特異的な遺伝子の活性化、抑圧または調節は、X-Galアッセイなどの使用されるレポーター遺伝子に依存する反応に基づいて検出される。
【００１０】
WO99／01552は、非損傷細胞の蛍光タンパク質と、それに作動的に連結された、細胞または発生に依存性のプロモーターとがコードされたDNA構築物を安定的に形質移入した胚性幹（ES）細胞を開示している。また、これらのES細胞培養物を用いた物質の毒物学的な監視のための方法も開示されている。
【００１１】
上述の方法は、半定量的であるとともに相対的に簡素で堅牢なアッセイを使用するが、それらのアッセイは通常、被試験細胞の破壊を伴う。記述した従来のアッセイシステムの多くが必要とする細胞可溶化物の調製は、アッセイ内ならびにアッセイ間の高いばらつきという結果をもたらす。分化の過程における反復測定のために、多くの並行培養物を、ばらつきという関連問題を抱えたままアッセイせねばならない。面倒な細胞溶解物の調製もまた、該アッセイを高速処理方式に馴染みにくいものにしている。蛍光レポータータンパク質を用いることで、それらの問題の幾つかを克服できる。しかしながら、GFP発現は既に幾つかの毒性効果を示している（Liuら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 260（1999）、712〜717）。もう一つの短所は、蛍光測定において高いバックグラウンドを与えるES細胞の凝集物（胚様体）の自己蛍光である。
【００１２】
或る細胞タイプへ分化する細胞を容易に監視し、それによって、毒性スクリーニング、分化促進薬剤および／または適当な培養条件、培地補給物のための、信頼できる高感度の試験システムを提供するという技術的課題は、特許請求の範囲において特徴付けられるとともに下記にさらに説明される実施形態を提供することによって達成される。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、少なくとも一つの特定の細胞タイプへと分化する能力のある細胞であって、該細胞の分化を許容する条件下で細胞分化の際に分泌される産物をコードするレポーター遺伝子からなる少なくとも一つの組換え核酸分子を含有する細胞を培養すること、または、適当な条件下でそのような細胞からなる非ヒト動物を維持することと、前記トランスジェニック非ヒト動物の体液またはその細胞培養培地またはサンプルのいずれかの中のレポーター遺伝子産物の量または活性の量を決定することとからなる、細胞分化を監視する方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、細胞分化を監視するための上記レポーター遺伝子構築物、ならびに、そのような遺伝子構築物からなることを特徴とする下記のもの全て、すなわち、細胞、少なくとも一つの細胞タイプの凝集物、それらの細胞または凝集物からなる組織、前記細胞または組織からなる器官、前記器官からなるインプラントおよびトランスプラントに関連する。
【００１５】
さらに本発明は、非ヒト動物および物質の組成物に関し、両者とも、ここに説明されるレポーター遺伝子、細胞、細胞凝集物、組織および／または器官からなることを特徴とするものである。
【００１６】
加えて、本件発明は、固体支持体に付けられた、またはそれにぶらさがる発明の細胞、細胞凝集物、または組織を内包するアレイまたはチップに、ならびに、前記アレイまたはチップを解析するための装置に関する。
【００１７】
特に、本発明は、細胞の或る細胞タイプへの分化に影響を与える物質を同定するための試験システムに関する。したがって、本発明は、細胞分化のモジュレーターを手に入れるおよび／またはプロファイルするための方法を提供する。この方法は、上で定義したような細胞、細胞凝集物、組織、器官または非ヒトトランスジェニック動物を内包する試験サンプルを、試験すべき物質と接触させること；および、その後、コントロールのサンプルまたは動物と比較したレポーター遺伝子産物または活性の量に対するその試験物質の効果を決定することからなる。
【００１８】
本発明によって提供される試験システムは、薬物スクリーニングの目的において有用である。上述した方法を用いて前記特定の細胞タイプの形成を促進または阻害する薬物を入手することや製造することが予見され、この場合、そのレポーター遺伝子産物の増大または減少したレベルまたは活性が、該薬物としての指標となる。該レポーター遺伝子産物の増大または減少したレベルまたは活性はまた、創傷治癒および／または損傷組織あるいは化合物の毒性の治癒を支援する薬剤または化合物として、それぞれ指標となりうる。
【００１９】
本発明は、加えて、上述の方法を実行するために有用なキットに関連し、該キットは例えば、上で定義されたようなレポーター遺伝子構築物および／または細胞と、細胞培養培地、選択薬剤、上記レポーター分子のための検出薬剤およびコントロールサンプルのような標準的化合物とを内包するものである。
【００２０】
さらに、創薬および／または標的発見事業を行うための方法が開示される。両方法は、細胞分化のモジュレーターの同定のために上述の方法のうち一つまたは複数のアッセイシステムを提供すること；および／または、本発明によって提供されるトランスジェニック動物における効力と毒性のために、同定されたモジュレーターまたはそのさらなる類似物の治療的プロファイリングを行うことを伴う。本発明によって提供される方法を用いて同定されるモジュレーターは、その後、医薬組成物に調剤されるか、またはさらなる薬剤開発および／または販売のために第三者に実施許諾される。
【００２１】
本発明はまた、該発明の方法を用いて同定された細胞分化のモジュレーター、ならびに、細胞分化の調節および対応する疾患の処置において用いられるモジュレーターからなる医薬組成物に関する。
【００２２】
さらに本発明は、薬物発見や、薬物動態学的または薬理学的なプロファイリングにおいてここで提供されるレポーター遺伝子構築物、細胞、細胞凝集物、組織、器官、インプラントまたはトランスプラント、非ヒト動物、組成物、アレイまたは装置の使用に関する。
【００２３】
定義
この明細書の目的において、「幹細胞」は、幹細胞または生殖細胞、例えば、それぞれ胚性幹（ES）および生殖（EG）細胞のいずれかを指して言う。最小限、幹細胞は、増殖して複数の異なる表現型の細胞を形成する能力を持ち、かつ、同じ培地の部分としても、または種々の条件下で培養されたときにも自己複製の能力がある。胚性幹細胞はまた、典型的にテロメラーゼ陽性およびOCT-4陽性である。テロメラーゼ活性は、TRAP活性アッセイを用いて（Kimら、Science 266（1997）、2011）商業的に入手可能なキット（TRAPeze（登録商標）XKテロメラーゼ検出キット、Cat.s7707；Intergen Co.、ニューヨーク州パーチェス；またはTeloTAGGG（商標）テロメラーゼPCR ELISAプラス、Cat.2,013,89；Roche Diagnostics、インディアナポリス）を使用して決定される。hTERT発現もまた、RT-PCRによってmRNAレベルで評価できる。LightCycler TeloTAGGG（商標）hTERT定量キット（Cat.3,012,344；Roche Diagnostics）は、研究目的のために商業的に入手可能である。
【００２４】
本発明に従って、胚性幹（ES）細胞という用語は、受精後のいかなる時点の前胚性、胚性または胎仔性組織に由来するいかなる複または多能性の幹細胞、かつ、標準技術的に容認される試験によれば、8〜12週齢のSCIDマウスにおいてテラトーマを形成する能力のような、3つの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の全ての派生物である数種の異なる細胞タイプの子孫を適当な条件下で産生する能力があるという特徴を有するいかなる複または多能性の幹細胞をも含む。
【００２５】
「胚性生殖細胞」または「EG細胞」は、始原生殖細胞から派生する細胞である。「胚性生殖細胞」という用語は、胚性多能性の細胞表現型を示す本発明の細胞を記述するために用いる。「ヒト胚性生殖細胞（EG）」または「胚性生殖細胞」という用語は、ここに定義されるような多能性の胚性幹細胞表現型を示す本発明の哺乳動物、好ましくは、ヒトの細胞またはその細胞系を記述するために、ここでは交換可能に使用できる。このようにEG細胞は、外胚葉、内胚葉および中胚葉の細胞へ分化する能力がある。EG細胞はまた、特定の抗体の結合によって同定される特異的エピトープ部位と関連づけられたマーカーの存在または不在と、或る抗体の結合の欠如によって同定される或るマーカーの不在とによって特徴づけることができる。
【００２６】
「多能性」とは、生殖系を含む広範囲の細胞系統に分化するための発生上の潜在能力を保持している細胞を指して言う。「胚性幹細胞表現型」および「胚性幹様細胞」という用語もまた、ここでは、未分化でありそれゆえに多能性細胞である細胞を記述するために交換可能に使用される。
【００２７】
ES細胞の定義には様々な胚性細胞が含まれ、その例には、Thomsonらによって記述されたヒト胚性幹細胞（Science 282（1998）、1145）；アカゲザルの幹細胞（Thomsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）、7844）、マーモセット幹細胞（Thomsonら、Biol.Reprod.55（1996）、254）およびヒト胚性生殖（hEG）細胞（Shamblottら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95（1998）、13726）のような、他の霊長類からの胚性幹細胞がある。他のタイプの多能性細胞もこの用語に含まれる。胚葉の3層全ての派生物である子孫を産生する能力がある哺乳動物起源のいかなる細胞も含まれ、それら細胞が胚の組織、胎仔の組織または他の源から派生したか否かに関わらない。本発明にしたがって使用される幹細胞は、好ましくは（しかし必ずしも必要ではないが）染色体的に正常である。しかし、悪性の源から派生したES細胞を用いないことが好適である。
【００２８】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、或る一つのタイプの細胞が成長できる環境を提供するために該タイプの細胞とともに共培養される別のタイプの細胞を記述するために用いられる用語である。フィーダー細胞は、任意で、該細胞が支持する細胞とは異なる種類からのものである。例えば或るタイプのES細胞は、プライマリーマウス胚性線維芽細胞、不死化マウス胚性線維芽細胞（例として、ネズミSTO細胞、例えば、MartinとEvans、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72（1975）、1441〜1445）、または、この開示において後述するようなヒトES細胞から分化したヒト線維芽細胞様細胞によって、支持されることができる。「STO細胞」という用語は、商業的に入手可能であり、ATCC CRL 1503として寄託された細胞を含む胚性線維芽細胞マウス細胞を指して言う。
【００２９】
「胚様体」（EB）という用語は、「凝集体」と同義の技術用語である。該用語は、ES細胞が単層培養で過成長したとき、または懸濁培養で維持されたときに現れる未分化のまたは分化した細胞の凝集物を指して言う。胚様体は、種々の細胞タイプ、典型的には幾つかの胚葉からの細胞タイプの混合物であり、形態学的な判定基準によって識別可能である。下記も参照されたい。ここで用いられているように、「胚様体」、「EB」または「EB細胞」は、典型的には、分化を経た胚性幹（ES）細胞からの派生細胞が主要部分である細胞の集団からなる形態学的構造を指して言う。EB形成に適した培養条件（例えば白血病抑制因子または他の類似ブロッキング因子の除去）の下で、ES細胞が増殖して、分化を始める細胞の小塊を形成する。通常はヒトの場合の分化の約1日目から4日目に対応する分化の第1相において、細胞の小塊は、外側層上に一層の内胚葉性の細胞を形成し、「単純胚様体」とみなされる。通常はヒトの場合の分化後の約3〜20日目に対応する第2相において、「複合胚様体」が形成されるが、これは、外胚葉性および中胚葉性の細胞と派生組織の広範な分化とを特徴とする。ここに用いられるように、「胚様体」または「EB」は、文脈から他の要求がない限り、単純および複合胚様体の両方を包囲する。ES細胞の培養においていつ胚様体が形成したかの判定は、当業者によって、例えば、形態学的な目視検査で日常的に行われる。約20個以上の細胞の浮遊塊は、胚様体であるとみなされる；例えば、Schmittら、Genes Dev.5（1991）、728〜740；Doetschmanら、J.Embryol.Exp.Morph.87（1985）、27〜45、を参照されたい。また、ここで用いられるような「胚様体」、「EB」または「EB細胞」という用語は、適当な条件下で培養されると種々の細胞系統へと分化する能力のある多能性細胞が主要部分である細胞の集団をも包含する。ここで用いられるように、該用語はまた、胚性生殖腺領域から抽出された原始細胞である始原生殖細胞から派生した同等の構造を指して言う；例えば、上記のShamblottら（1998）を参照されたい。始原生殖細胞は、ときには当該技術分野でEG細胞または胚性生殖細胞とも言われるが、適当な因子で処置されると、胚様体の派生が可能な多能性のES細胞を形成する；例えば、米国特許US-A-5670372；上記のShamblottらを参照されたい。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーのことを指して言う。含まれるのは、遺伝子、遺伝子断片、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離DNAおよびRNA、核酸プローブ、およびプライマーである。この開示において用いられるように、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖の分子のことを交換可能に指して言う。他に特定または要求されない限り、発明の、ポリヌクレオチドであるいかなる実施形態も、二本鎖形態と、該二本鎖形態を作ると予測されまたは知られている2つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方からなる。含まれるのは、ホスホラミデートおよびチオホスホラミデートのような核酸類似物である。
【００３１】
ポリヌクレオチドが、人工的な操作のどのような適当な手段によって細胞内に移されたときにも、または細胞が、該ポリヌクレオチドを受け継ぐ原初に改変された細胞の子孫である場合に、該細胞は、「遺伝的に改変された」、「形質移入された」または「遺伝的に形質転換された」と言われる。該ポリヌクレオチドは、しばしば、関心対象のタンパク質をコードする転写可能な配列を包含し、これによって該細胞が該タンパク質を上昇したレベルで発現することを可能にする。遺伝的な改変は、改変細胞の子孫が同一の改変を有するならば、「遺伝性」であると言われる。
【００３２】
「調節配列」または「コントロール配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節、例えば、該ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、ポリアデニル化、翻訳または分解に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。転写コントール要素は、プロモーター、エンハンサー、およびリプレッサーを含む。
【００３３】
「αMHC」または「コラーゲン」プロモーターのように、プロモーターとして言及される特定の遺伝子配列は、作動的に連結された遺伝子発現産物の転写を促進する該言及された遺伝子から派生したポリヌクレオチド配列である。上流およびイントロンの非翻訳配列の様々な部分は、或る場合には、プロモーター活性に寄与することもあり、これら部分の全てまたはいかなるサブセットも該言及された遺伝子操作構築物内に存在することがあるということが認識されている。プロモーターは、明示的に制限されていない限り、該遺伝子を有するいかなる種の遺伝子配列に基づいていてもよく、そして、標的組織において転写を促進することができる限り、いかなる望ましい付加、置換または欠失を取り込んでいてもよい。ヒトの処置のために設計された遺伝子構築物は、典型的には、或るヒト遺伝子のプロモーター配列と少なくとも90％同一であるセグメントからなる。或る特定の配列は、例えば、レポーター遺伝子に作動的に連結することによって、活性および特異性について試験できる；図1を参照されたい。
【００３４】
本発明によれば、「細胞および／または発生依存性プロモーター」という用語は、細胞培養（胚様体）と、該発明によるES細胞から派生したトランスジェニック非ヒト哺乳動物とのどちらにおいても、特定の細胞タイプでのみおよび／または細胞発生の特定の段階でのみ、そのプロモーター活性を示すプロモーターを意味することが意図されている。加えて、他の知られているどのような細胞特異的プロモーターも、例えば、神経細胞、心臓細胞、ニューロン、グリア細胞、造血細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、線維芽細胞および上皮細胞に対して、使用できる。
【００３５】
遺伝要素は、該要素の予想される機能にしたがった方法での該要素の作動を許可する構造的関係にある場合に、「作動的に連結され」ていると言われる。例えば、もしプロモーターが、コード配列の転写の開始を援助するならば、該コード配列は、該プロモーターに作動的に連結されている（または、該プロモーターのコントロール下にある）として言及される。この機能的関係が維持される限りにおいて、該プロモーターとコード配列との間に介在配列があってもよい。
【００３６】
エンコード配列、プロモーターおよび他の遺伝要素の文脈において、「異種性の」という用語は、該要素が、比較対象としての実体の他の部分とは遺伝子型的に区別された実体から派生することを示す。例えば、異なる種の動物の中に遺伝子工学手法によって導入された遺伝子またはプロモーターは、異種性ポリヌクレオチドと言われる。「内在性の」遺伝要素は、他の要素が隣接する位置に人工的に導入されていたとしても、染色体中において該要素が天然に存在する場所と同じ場所にある要素である。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、この開示において、交換可能に用いられて、どのような長さのアミノ酸のポリマーのことをも指して言う。該ポリマーは、修飾されたアミノ酸を包含してもよく、それは、線形でも分岐していてもよく、そして、非アミノ酸によって分断されていてもよい。
【００３８】
他に記載が無ければ、「化合物」、「物質」及び「（化学）組成物」という用語は、ここでは交換可能に用いられ、治療薬剤（または潜在的な治療薬剤）、神経毒、肝臓毒、造血細胞の毒、筋肉毒、発癌物質、催奇形物質、または、一つまたは複数の生殖器に対する毒のような、知られている毒性の薬剤を含むが、これに限定されない。上記化学組成物はさらに、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤および肥料のような農業化学物質、いわゆる「美容用薬品」を含む化粧品、産業廃棄または副産物、または環境混入物質でもありうる。それらはまた、動物治療薬または潜在的な動物治療薬でもありうる。
【００３９】
本発明の方法で試験が可能な産業製品は、漂白剤、トイレ、ブロック、洗浄液、石鹸粉および液、布地柔軟仕上げ剤、窓、オーブン、床、風呂、台所および絨毯用クリーナー、食器用洗剤および濯ぎ補助剤、水軟化剤、脱スケール剤、染み抜き剤、研磨剤、油製品、塗料、塗料除去剤、糊、溶剤、ワニス、芳香剤、虫よけ玉および殺虫剤を含む。
【００４０】
家庭用品の新たな成分は、絶えず開発されており、試験される必要がある。例えば、近年新たな（しみを分解するための）酵素、および（洗濯物をより白く見せる）「光学的増白剤」が、洗濯粉および液への使用のために開発されている。新たな（染みこんだ汚れを除去するために油脂を貫通する）界面活性剤、および（水軟化剤として作用して、界面活性剤をより効率的に働かせる）化学「ビルダー」が、洗濯粉および液、洗浄液、および様々な清浄剤への使用のために開発されている。また、医療用材料も試験しなければならず、例えば、新たな充填ポリマー、合金、および生理活性セラミックのような歯科用材料がある。さらに、カテーテル、電極、接着剤、ペースト、ゲルまたはクリームのような、装置のどのような部分の化学組成物でも、本発明の方法で、種々の濃度で、種々の成分および不純物の存在する状態で試験してもよい。
【００４１】
ここで用いられるように、化学組成物または化合物の「分子プロファイル」または「プロファイル」は、該化学組成物が接触したES細胞、胚様体、組織などにおいて、培地のみと接触している同様の細胞、胚様体、組織などと比較した、遺伝子またはタンパク質発現における改変のパターン、またはその両方を指して言う。
【詳細な説明】
【００４２】
様々な種類の幹細胞が、再生医療において非常に魅力的なモダリティーとなっている。幹細胞は、培養で増殖させることができ、そしてインビトロまたはインサイチュで、必要とされる細胞タイプへと分化させることができる。この柔軟性は、それら幹細胞をして、毒性試験ならびに組織特異的促進因子のような医薬品の調査のための理想的なモデルとならしめている。特に、互いに相互作用する3つの胚葉の種々の細胞タイプからなる胚様体は、高感度の試験システムを提供する。試験物質の存在下で該種々の細胞タイプへ分化する幹細胞の能力は、分化を促進する該物質の能力および／または前記物質の毒性に依存するかもしれない。
【００４３】
本発明にしたがった、分化を監視する方法は：
・細胞分化の際に分泌される産物をコードするレポーター遺伝子からなる少なくとも一つの組換え核酸分子を、少なくとも一つの特定の細胞タイプへと分化する能力のある細胞に形質移入すること；
・該細胞を非ヒト動物へ導入すること、または該細胞の分化を許可する条件下で該細胞を培養すること；および
・前記トランスジェニック非ヒト動物の体液内または前記培養培地内のいずれかで前記レポーター遺伝子産物の量または活性を決定すること、からなる。
【００４４】
本発明は、分泌されるレポーター遺伝子の使用に基づいている。驚くべきことに、分泌されるレポーター分子は、例えば緑蛍光タンパク質（GFP）およびその派生物のよう蛍光レポーターの使用に対して、或る有利な点を有することが見出された。例えば、Liuら（Biochem.Biophys.Res.Comm.60（1999）712〜717）は、GFPレポーターを用いるときの毒性効果を観察した。そのような毒性効果は、分泌レポーター分子が用いられれば、定期的に培養培地を交換し、それによってそれぞれのレポーター分子の毒性濃度の蓄積を防ぐだけで、回避または少なくとも最小化することができる。
【００４５】
また、細胞の分化のための好適な方法は、細胞を胚様体（EB）として成長させることであるが、これは該細胞が溶解されたときでさえ高い自己蛍光率を示す。このバックグラウンドは、細胞分化の監視のための蛍光レポーター遺伝子の使用をかなり非効率なものにする可能性がある。
【００４６】
例えば、ベータガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのような他の日常的に使用されるレポーター分子は、該細胞を或る決まったアッセイ緩衝液中で試験することを必要とするが、これは、酵素活性を決定するために該細胞を破壊せねばならないことを意味する。発明によるシステムは、分泌レポーター分子を使用することによってこの破壊を回避するので、該分化している細胞の培地または該細胞を含む動物の体液をアッセイすれば、レポーター活性を十分に監視でき、それによって該分化も十分に監視できる。
【００４７】
これは、実施例3に示すように、一方で発明のレポーターシステムであれば、心筋細胞のような幹細胞派生細胞タイプを定量することが可能であり、他方で、または加えて、個々の幹細胞の分化過程を監視できる。それゆえに、本発明にしたがって細胞分化を監視することは、両方、すなわち、分化した細胞の定量によって細胞分化を監視することおよび／または一つまたは複数の対応する未分化の細胞、例えば、幹細胞の分化過程を追うことを含む。
【００４８】
該レポータータンパク質をコードする核酸分子の形質移入のためには、当業者に知られているいかなる標準的方法も使用できる。この目的のためのいかなる適した発現ベクターも用いることができる。この発明にしたがって改変された幹細胞を産生するための適したウイルス性ベクターは、商業的に入手可能なウイルス成分を用いて調製できる。単数または複数のベクター構築物の細胞への導入は、知られている様式、すなわち、ウイルス性ベクターの助けを得た形質移入または形質導入によって起こる。ベクタープラスミドの細胞への形質移入は、例えば、電気穿孔法またはリポフェクション、すなわち、脂質／DNA複合体を用いることによって達成できる。Gibco/Life Technologiesから入手可能な製剤物Lipofectamine 2000（商標）は好例である。別の好例の試薬は、80％エタノール中における非リポゾーム形状の脂質と他の化合物のブレンド物であるFuGENE（商標）6 Transfection Reagentであり、Roche Diagnostics Corporationから入手できる。エフェクター遺伝子からなるウイルス性ベクターは、一般的に、先のセクションで参照した出版物に記述されている。
【００４９】
形質移入される細胞は、少なくとも一つの特定の細胞タイプに分化できなくてはならない。これは、該所望の細胞タイプのための前駆細胞にあてはまることである。前駆細胞は、例えば、ヒトニューロンの前駆物質細胞系NTERA-2cl.D1.（Leypoldtら、J.Neurochem.76（2001）、806〜814）、ヒトレチナール前駆物質細胞系KGLDMSM（Ezeonuら、DNA細胞Biol.19（2000）、527〜537）、T細胞前駆体表現型のマーカーを担持するヒト白血病性細胞系、PER-117（Kees、Blood 72（1988）、1524〜1529）、またはHL60、すなわち成熟好中球に分化する前骨髄球性の白血病細胞系（Fontana、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77（1980）、3664〜3668）を含むが、これに限定されない。
【００５０】
これらの前駆体細胞系は限られた範囲の発生能力しか持たないので、複能性または多能性の細胞を用いることが好ましい。これは、前記細胞が、幹細胞または始原生殖細胞であるかまたはそれらから派生したものであるときにあてはまることであり、始原生殖細胞は、本発明の実施形態において好適である。
【００５１】
該発明は、いかなる脊椎動物種の幹細胞を用いても実施しうる。ヒトからの幹細胞ならびに非ヒト霊長類、家畜動物、家畜類、および非ヒト哺乳動物が含まれる。幹細胞の好適な源は、齧歯動物、特にマウスおよびラットである。この発明における使用に適した幹細胞の中には、胚盤胞のような、妊娠の後で形成される組織から派生する霊長類の多能性幹細胞、または妊娠中のいかなる時点でも取りだされる胎仔性または胚性組織がある。非限定的な例は、胚性幹細胞の初代培養物または確立された系である。該発明はまた、成体の幹細胞、例えば複能性の成体前駆細胞（MAPC）にも適用可能である；例えば、ReyesとVerfaillie,Ann.、N Y Acad.Sci.938（2001）、231〜235、およびWeissmanとAnderson、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17（2001）、387〜403を参照されたい。また、Andersonら、Nat.Med.7（2001）、393〜395、およびProckop、Science 276（1997）、71〜74も参照されており、成体幹細胞の抽出と培養が記述されている。
【００５２】
幹細胞を単離し増殖させるための培地は、得られる細胞が所望の特徴を持つとともにさらに増殖させることができる限り、種々の配合のいずれを有していてもよい。適した源は、Iscove改変Dulbecco培地（IMDM）、Gibco,#12440-053；Dulbecco改変Eagles培地（DMEM）、Gibco #11965-092：ノックアウトDulbecco改変Eagles培地（KO DMEM）、Gibco#10829-018；200mM  L−グルタミン、Gibco#15039-027；非必須アミノ酸溶液、Gibco 11140-050；［ベータ］−メルカプトエタノール、Sigma#M7522；ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Gibco#13256-029である。幹細胞を培養するための好例の血清含有ES培地および条件は、既知であり、細胞タイプにしたがって適切に最適化できる。前節で言及された特定の細胞タイプのための培地および培養手法は、ここに引用された参考文献において提供されている。
【００５３】
その広範囲な発生能力を理由に、前記幹細胞は、この発明の特に好適な実施形態においては胚性幹（ES）細胞である。
【００５４】
先に記したように、ES細胞のいくつかの源は、熟練者の裁量に任されており、そのヒト幹細胞は、本発明のほとんどの実施形態について好適である。種々の細胞および組織のタイプを調製するためのヒト胚性幹細胞およびその使用は、Reprod.Biomed.Online 4（2002）、58〜63に記述されている。胚性幹細胞は、霊長類種の一員の胚盤胞から単離できる（Thomsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）、7844）。ヒト胚性生殖（EG）細胞は、最終月経後の約8〜11週で取られたヒト胎仔材料に存在する始原生殖細胞から調製できる。適した調製方法は、Shamblottら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95（1998）、13726に記述されている。ヒト胚性組織から、例えばヒト胚の生殖隆起から単離された始原生殖細胞から派生する形態および多能性において胚性幹細胞または胚性生殖細胞に似た細胞を作るための方法は、米国特許US-A-6,245,566号に記述されている。
【００５５】
最近、比較できるほど入手が非常に容易な組織である剥脱したヒト乳歯が、神経の細胞、脂肪細胞および象牙質芽細胞を含む多様な細胞タイプへと分化する能力のある増殖性の高いクローン原性の細胞の集団であると同定された、複能性の幹細胞を内包することが報告されている；Miuraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100（2003）、5807〜5812を参照されたい。インビボ移植の後で、それらの細胞は骨形成を誘導し、象牙質を産生し、マウスの脳において神経性マーカーを発現しつつ生存することが見出された。さらに、第2分裂中期卵母細胞から派生したホモ接合性の幹細胞の複系統潜在能力が、Linらによって、Stem Cell 21（2003）、152〜161に記述されている。出生後の筋肉における前駆細胞の様々な源、およびインビボでの新たな骨格および心臓の筋肉の形成における幹細胞の参加を強化するかもしれない因子が、Groundsら、J.Histochem.Cytochem.50（2002）、589〜610にレビューされている。骨髄に戻る希少な造血幹細胞（HSC）の精製は、米国特許出願US2003/0032185に記述されている。これらの成体骨髄細胞は、肝臓、肺、胃腸管、および皮膚の上皮細胞に分化することもできるため、大変な分化能力を有すると記述されている。この知見は、遺伝病の臨床処置や組織修復に貢献するかもしれない。さらに、胚再構築のための核移転のような、二倍体のドナー核を除核MII卵母細胞内に移植する手法を使用してもよい。この技術は、レシピエントの細胞系と遺伝的に同じであるカスタマイズされた胚性幹（ES）細胞系の確立において助けとなる他の手順とともに、ColmanとKindによって、Trends Biotechnol.18（2000）、192〜196にレビューされている。
【００５６】
幹細胞技術の分野は、KiesslingとAnderson、Harvard Medical Schoolによって、Human Embryonic Stem Cell:An Introduction to the Science and Therapeutic Potential;(2003)  Jones and Bartlett Publishers;ISBN:076372341Xにおいてレビューされつつある。
【００５７】
例えば、幹細胞のドナーとしてのヒト胚の使用を避ける（これは、しかしながら、少なくとも一定の状況下では正当化されうるようであるが）ために、トランスジェニック非ヒト動物、特に哺乳動物を、胚性幹細胞の源として使用することさえ可能であるかもしれない。例えば、異種移植片ドナーとして用いられるトランスジェニックブタを作るための組成物および方法が、米国特許US-A-5,523,226に記述されている。同様に、WO97／12035は、異物移植のためのトランスジェニック動物を産生する方法を記述している。さらに、ヒト患者への異種移植に適した、免疫学的に適合する動物組織が、WO01／88096に記述されている。ブタから胚性生殖細胞を作るための方法が、例えば米国特許US-A-6,545,199に記述されている。免疫学的にヒトに適合する細胞もまた、本発明の目的のために使用できる。
【００５８】
幹細胞は、分化を促進することなく増殖を促進する培養条件の組合せを用いて、継続して増やすことができる。従来より、幹細胞は、一層のフィーダー細胞上で、典型的には、しばしば胚または胎仔組織から派生した線維芽細胞タイプの細胞上で培養される。該細胞系を、ほぼコンフルエンスまでプレートし、通常は増殖を妨げるために放射線照射し、そして或る細胞によって馴化された（例えばKoopmanとCotton、Exp.Cell 154（1984）、233〜242；SmithとHooper、Devel.Biol.121（1987）、1〜91）、または白血病抑制因子（LIF）の外来性添加によって馴化された培地での培養の際に支持するために用いる。そのような細胞は、適切な培養条件を用いて、分化なしで相対的に無限に成長させることができる。
【００５９】
フィーダー細胞、外来性の白血病抑制因子（LIF）または馴化培地の非存在下では、ESまたはEG細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉のそれぞれに見られる細胞を含む多様な細胞タイプに自発的に分化する。しかしながら、成長および分化因子の適切な組合せで、細胞分化をコントロールできる。例えば、マウスESおよびEG細胞は、インビトロで造血性系統の細胞を産生できる（Kellerら、Mol.Cell Biol.13（1993）、473〜486；Palaciosら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  92（1995）、7530〜7534；Rich、Blood  86（1995）、463〜472）。加えて、マウスES細胞は、ニューロン（Bainら、Developmental Biology 168（1995）、342〜357；Fraichardら、J.Cell Science 108（1995）、3161〜3188）、心筋細胞（心筋細胞）（Klugら、Am.J.Physiol. 269（1995）、H1913〜H1921）、骨格筋細胞（Rohwedelら、Dev.Biol.164（1994）、87〜101）、血管細胞（Wangら、Development 114（1992）、303〜316）のインビトロ培養を産生するために用いられてきた。米国特許US-A-5,773,255は、グルコース応答性インシュリン分泌膵臓ベータ細胞系に関するもので、米国特許US-A-5,789,246は肝細胞の前駆細胞に関するものである。ネズミ胚性幹細胞の肝臓分化も、Jonesら、Exp.Cell Res.272（2002）、15〜22に記述されている。
【００６０】
他の関心対象の祖先細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、レチナール色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、樹状細胞、毛包細胞のような皮膚細胞、尿細管上皮細胞、平滑および骨格筋細胞、精巣祖先細胞、および血管内皮細胞を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
発明の或る実施形態では、未分化細胞の成長を促進する、または分化の抑制物として作用する一つまたは複数の培地成分を除くことによって分化が促進される。そのような成分の例は、或る成長因子、分裂促進因子、白血球抑制因子（LIF）、および塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。分化はまた、所望の細胞系統への分化を促進する、または望まない特徴を有する細胞の成長を抑制する培地成分を加えることによって促進してもよい。
【００６２】
本発明の好適な実施形態において、上述した組換え核酸分子内の前記レポーターは、少なくとも一つの細胞タイプ特異的な調節配列に作動的に連結されている。この実施形態は、分化そのものの監視システムを提供するという利点を有するのみならず、或る細胞タイプへの分化を観察することを可能にする。調節配列は、分化によって所望の細胞タイプを獲得する細胞においてのみ、レポーター分子の発現を駆動する。通常、前記調節配列は、そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサーからなる。加えて、または代わりに、前記細胞タイプ特異的調節配列のコントロール下にある第2のレポーター遺伝子を用いることができる。第2レポーター遺伝子は、分化依存性発現のために使用されるものと同じでも、異なっていてもよく、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような従来のレポーター遺伝子を含む。さらに、該第2レポーター遺伝子は、上記の組換え核酸分子内に、または異なるベクター構築物上に存在してもよく、後者の選択肢は、両分子の細胞内への同時形質移入を必要とする。
【００６３】
別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子を含み、任意で上述のベクター構築物のような外来DNAを含む分化した細胞は、濃縮されて、未分化細胞から、および／または非所望の細胞タイプから分離される。このように、この発明によれば、分化した細胞の集団から、相対的に未分化の細胞および／または非所望の細胞タイプを、該非所望の細胞および細胞タイプに対して致命的である選択システムを用いることで、枯渇させる。これは例えば、選択可能マーカー遺伝子を、所望の細胞タイプ内でおよび／または発生の或る段階で該遺伝子を優先的に発現させる調節配列のコントロール下で発現させることによって達成でき、このことによって、特定の細胞タイプの細胞が外来の薬剤の致命的な効果に対して耐性になる。これを達成するために、該細胞は、該細胞を所望の系統に分化させるために用いられるプロセスの前に、選択可能マーカー遺伝子からなる組換え核酸分子で遺伝的に改変される。選択システムは、本発明の組換え核酸分子内に、または同時形質移入に用いられる異なるベクター構築物上に存在してもよい。
【００６４】
上記分化の対象となる細胞タイプは、結合線維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経系細胞、ニューロン細胞、造血細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、上皮細胞および心臓細胞を含む。これら特定の細胞タイプにおける分化を監視するために、調節配列は、該細胞タイプに特異的なレポーターの発現を与えるレポーター遺伝子配列に作動的に連結されていなければならない。
【００６５】
発明の方法の好適な実施形態において、前記プロモーターまたはエンハンサーは、αMHC、MLC2V、VE-カドヘリン、Tie-2、Flk-1、Flt-1、GFAP、アルファ-1チューブリン、およびコラーゲン2プロモーターまたはエンハンサーからなる群から選ばれる。プロアルファ1（II）コラーゲン鎖（コラーゲン2）プロモーター／エンハンサー（Zhouら、J.Cell Sci.108（1995）、3677〜3684）が軟骨細胞に特異的である一方で、内皮細胞での発現は、VE-cadプロモーター（Goryら、Blood93（1999）、184〜192）、Flt-１プロモーター（Quinnら、Biochem.Biophys.Res.Commun.276（2000）、1089〜1099）、Tie-2（Schlaegerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94（1997）、3058〜3063）、およびFlk-1プロモーター／エンハンサー（Kappelら、Blood 93（1999）、4284〜4292）のそれぞれによって駆動されうる。アルファ1チューブリンプロモーター（Glosterら、J.Neurosci.14（1994）、7319〜7330）、および線維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーター（Besnardら、J.Biol.Chem.266（1991）、18877〜18883）は、神経性細胞に特異的である。平滑筋重鎖（SMHC）最小プロモーターは、平滑筋に特異的である（Kallmeierら、J.Biol.Chem.270（1995）、30949〜30957）。中脳での、長期及び細胞タイプ特異的発現の両方における使用のための、ラットのチロシンヒドロキシラーゼプロモーターからなるHSV-1ベクターが、Songらによって、J.Neurochem．68（1997）、792〜803に記述されている。アルファ−ミオシン重鎖プロモーター（αMHC）およびミオシン軽鎖2v（MLC2v）プロモーターのような心臓特異的プロモーターをさらに下に記述する。後者は心室の心筋に特異的である。
【００６６】
組織特異的プロモーターのさらなる例は、造血性細胞、軟骨細胞または表皮細胞、ならびにインシュリン分泌β細胞のプロモーターである。
【００６７】
「組織特異的」は、「細胞特異的」という用語の下に包摂されるものとする。上述の細胞タイプおよび他の細胞タイプ特異的プロモーターの調節配列は、文献から入手できる。例えば、「medline」およびNCBIを参照されたい。
【００６８】
心臓血管疾患は、西側工業国において依然として最も高頻度の死因のうちに入っている。この分野の集中的な基礎研究を通じてのみ、その病態生理学的な原因を見つけることができ、新たな治療的アプローチを工夫し、毒物学的な変化を記述できる。心臓血管疾患の病因を研究するために、かつ新たな薬理学的および毒物学的な物質を試験するために、一方ではヒトに移転でき、他方では、時間がかかり費用のかさむ動物モデルを代替できるモデルが必要とされている。1991年においては依然として、旧西ドイツ連邦だけでも200万頭を超える動物が動物実験に使用された。
【００６９】
近年ますます重要になっている薬理学的および毒物学的研究の一つの出発点は、心臓分化である。ステレオタイプ的に進行する心臓細胞発生から、心筋細胞の病理学的および毒物学的変化に対して結論を引き出すことができる。このように、例えば、受容体の状態と間細胞シグナルカスケードとが、心肥大（Yamazakiら、J. Mol. Cell Cardiol. 27（1995）、133〜140）および心不全（Johnsonら、Biochem. Pharmacol. 45（1993）、2365〜2372）において乱されることが知られている。これらの病理学的に改変された心筋細胞は、部分的にはやはり早期の分化段階の心臓細胞に似ている。したがって、毒物学的な試験の他に、心臓再造形を促進する能力のある物質の同定と単離のためのアッセイが必要とされており、それらは、例えば、病的な肥大および線維症を特徴とする心臓機能障害の患者の処置における治療的介入のために用いることができる。
【００７０】
しかし、早期の分化段階における心臓細胞の性質を解明するために必要な検査は、生きた動物で行うことが技術的に困難であり、仮に行うことができたとしても、非常に複雑な研究においてのみである。すなわち、早くとも12〜13日目に、ネズミ胚から心筋細胞を調製することが可能になるが、そのような細胞は、もはや早期心臓分化段階に対応しない。様々な分化段階での受容体発現の詳細な解析は、動物材料のために非常に高額な費用を必要とするとともに、上述したように実行することが技術的に困難である。同様に、相対的に未分化の心臓の発生の数日間または数週間にわたる観察は、動物モデルでは可能ではない。新規の治療薬、例えば筋収縮性物質または抗不整脈薬、または毒性物質（例えば重金属またはレチノイド）の使用を試験するためには、動物、例えばブタの非侵襲的な監視を、動物実験において数週間行わねばならない。
【００７１】
さて本発明の目的は、遺伝子の発現が、細胞固定の後にのみ、かつ特異的な基質を手段とすることで検出できる先行技術の方法のようにLac-Zのようなレポーター遺伝子に基づく（Niwaら、Gene 108（1991）、193〜199；Wobusら、J. Mol. Cell Cardiol. 29（1997）、1525〜1539；Metzgerら、Circ. Res. 78（1996）、547〜552）のではなく、むしろ心筋形成に及ぼす化合物の影響を簡単に特徴づけることを可能にするとともに、機能検査を可能にする、細胞に基づくアッセイを提供することである。
【００７２】
驚くべきことに、分泌性レポータータンパク質をコードする遺伝子を心筋細胞特異的な細胞依存性プロモーターと発生依存性プロモーターとに繋いだDNA構築物をES細胞に安定的に形質移入できることが見出された。配列番号3で図示される例とベクター配列を参照されたい。この構築物は、天然のDNA内に組み入れられ、細胞内シグナルの特異的活性化の後で、該プロモーターが活性化され、そしてレポータータンパク質が発現されて培地中へ分泌される。このように、分化の或る時点で細胞特異的転写因子を活性化するES細胞は、細胞培養培地中でのレポータータンパク質のレベルまたはその活性を決定することによって認識できる。
【００７３】
実施例に説明されるような本発明の方法の目的は、使用されるレポーター分子が好ましくは正確に細胞培養培地中へ分泌される、またはトランスジェニック非ヒト動物の場合にはその体液中へ分泌されることで、達成される。そうでないときには、一旦分泌されたレポーター分子がそれぞれ培地および体液から再捕獲されると、細胞培養上清液または体液中の活性タンパク質、あるいは活性の測定量が、分化した細胞の実際の数および／または分化の状態に適正に対応しないかまたは全く対応しないかもしれないので、分化した細胞を定量することが殆ど不可能になる。したがって、正確にグリコシル化されると、細胞によってマンノース−6−リン酸受容体を介して取り込まれることができるヒトアルファガラクトシダーゼのようなレポーター分子は、本発明の目的のためには、おそらく、少なくとも天然の形態では、適したレポーター分子ではないであろう。にもかかわらず、この酵素は、例えば該酵素をコードしている基本DNAにおける対応する突然変異という手段で、例えばグリコシル化されるその能力を消失させることによって、本発明の目的に適したものにしてもよい。
【００７４】
発明の特に好適な実施形態において、前記分化している細胞タイプは心筋細胞である。この実施形態では、前記細胞タイプ特異的調節配列は、好ましくは心房および／または心室特異性である。対応する調節配列、すなわち、心臓特異的プロモーターは、先行技術文献に記述されている。上記も参照されたい。例えば、それぞれ、非常に早期の心筋細胞および中胚葉前駆細胞に特異的なNkx-2.5（Lintsら、Development 119（1993）、419  431）；心臓組織に特異的なヒト心臓−α−アクチン（Sartorelliら、Genes Dev.4（1990）、1811〜1822）、および心室心筋細胞に特異的なMLC-2V（O’Brienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90（1993）、5157  5161；Leeら、Mol.Cell Biol.14（1994）、1220〜1229；Franzら、Circ.Res.73（1993）、629〜638、およびWO96／16163）である。心臓特異的アルファ−ミオシン重鎖プロモーターは、Palermoら、Cell Mol.Biol.Res.41（1995）、501〜519、およびGulickら、J.Biol.Chem. 266（1991）、9180〜91855に記述されている。心房特異的ミオシン重鎖AMHC1の発現、および発生しているニワトリ心臓における前後方向の極性の確立が、Yutzeyら、Development 120（1994）、871〜883に記述されている。
【００７５】
確実で高感度な特異的アッセイが存在するレポーター分子を用いることによって検出が補助されるので、特に好適な実施形態とは、前記レポーター遺伝子産物が、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）、アルファ−アミラーゼまたはインベルターゼである、該発明による方法である。
【００７６】
SEAPは耐熱性を有し、L-ホモアルギニンによって阻害されない。このレポーター分子のさらなる利点は、その低毒性、および分泌されるタンパク質レベルが細胞内mRNAの量と直接対応するという事実である。このように、SEAPレポーターアッセイは、細胞タイプ特異的発現およびそれによる分化のための直接的な測定を提供する。このアッセイはまた、非常に高感度であり、10−13gのSEAPタンパク質の検出が可能である（Yangら、Biotechniques  23（1997）、1110〜1114）。これは、希少な細胞タイプへの分化を検出することを可能にする。
【００７７】
レポーター分子としてのアルファ−アミラーゼの使用は、例えば、WO98／49320に記述されている。このレポーター分子は、該酵素が広範囲の条件にわたって極めて安定的であるため、特に魅力的である。アルファ−アミラーゼの測定は、簡素で、定量的で、安全かつ安価である。また、この測定は、SEAPレポーターシステムに適合すると示された（Schlatterら、Gene 282（2002）、19〜31）。マーカータンパク質としてのインベルターゼの使用は、例えば、Maceら、Virology 188（1992）、869〜874に記述されている。
【００７８】
特にレポーター分子としてアルカリホスファターゼを包含し、それゆえに本発明によるベクター構築物を調製するための源として用いることができるレポーター遺伝子構築物は、例えば、WO00／34435およびWangら、Gene 279（2001）、99〜108に記述されており、後者はネズミSEAPを記述している。SEAPレベルの検出は、本実施例において、かつ先行技術文献において記述されているように実行できる；例えば、Bronsteinら、Biotechniques 17（1994）、172〜177；Yangら（1997）およびWangら（2001）、上記。卵巣腫瘍の成長と治療薬に対する反応を監視するためのインビボマウスレポーター遺伝子モデルにおけるヒト分泌アルカリホスファターゼの使用は、Nilssonら、Cancer Chemother. Pharmacol.49（2002）、93〜100に記述されている。このモデルは、本発明の実施形態に適合させることができる。長期間のあいだ哺乳動物において発現される能力のある、操作された分泌アルカリホスファターゼレポーター遺伝子と、該導入遺伝子を持つ細胞を内包する哺乳動物からの血清または組織サンプルのアルカリホスファターゼレベルまたはＡＰ活性を測定する、または該導入遺伝子を内包する培養細胞からの培地を測定することによるそのタンパク質活性の検出とについても、WO02／095068に記述されている。
【００７９】
レポーター活性またはタンパク質量、特にSEAP活性は、母乳、羊水、精漿、血清および尿のような、いかなる体液においても検出できる。
【００８０】
レポーターとして用いることができる分子の全てが天然に分泌されるわけではないので、細胞内に導入される核酸分子は、排出されるタンパク質をコードするように遺伝的に操作してもよい。特に好ましいのは、前記レポーター遺伝子産物が分泌性リーダー配列からなる上述の方法である。分泌性リーダー配列の例は、アデノウイルス三分裂リーダー配列（Chuら、Biotechniques 5（1995）、890〜896）、免疫グロブリン分泌シグナル（Schlatterら、Gene 282（2002）、19〜31）、SUC2シグナル配列ならびにヒトインターロイキン2受容体α鎖シグナル配列（Kamiyaら、Tohoku J.Exp.Med.180（1996）、297〜308）であるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明による組換え核酸分子を内包する細胞を選択し、かつ任意で以下に記述されるもののような他のベクター構築物を内包する細胞を選択するために、前記組換え核酸分子およびベクター構築物は、それぞれ、好適には複または多能性の細胞によって発現される選択可能マーカーをさらに包含する。選択可能マーカーは、当業者に既知であり、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐性を与える、例えば、ヌクレオシドおよびアミノグリコシド抗生物質耐性遺伝子を含む。耐性遺伝子のさらなる例は、アミノプテリンおよびメトトレキセートに対する耐性を与えるデヒドロ葉酸−レダクターゼ、ならびに数多くの抗生物質に対する（例えばビンブラスチン、ドキソルビシンおよびアクチノマイシンＤに対する）耐性を与える復薬剤耐性遺伝子である。例えば、優勢な選択可能マーカーとしての多剤耐性遺伝子1（MDR1）遺伝子の使用を記述したBlauら、Blood 89（1997）、146〜154を参照されたい。
【００８２】
本発明の特に好適な実施形態において、前記選択可能マーカーは、ピューロマイシンに対する耐性を与える。ピューロマイシンは、トランスジェニックEBの接着性培養における非心臓細胞の迅速な除去に特に適している。さらに、心臓細胞の薬物選択は、トランスジェニックEBの懸濁培養において全体的に実行できる。それゆえ、精製ES細胞由来心筋細胞は、培養内において無処置のものよりも長く生存する。その上、薬物選択プロセス中の未分化ES細胞の除去は、心筋細胞のような分化したES細胞由来の細胞の生存度および寿命に対して明白な正の効果を持つことが示された。加えて、驚くべきことに、周囲の非分化型細胞からの放出物が心筋細胞の増殖を誘導することを示すことができる。このように、薬物選択は、精製および増殖の両方の効果を有する。例えば、WO02／051987を参照されたい。このように該選択は、レポーター遺伝子および選択可能な標識遺伝子が、同じ細胞タイプ特異的調節配列によって駆動されているならば、レポーター遺伝子を持っていないために監視することができない細胞を除去するための手段を提供するだけでなく、それはまた、所望のタイプに分化しなかった細胞の除去を可能にする。
【００８３】
前記細胞が、種々のES細胞タイプから派生する細胞凝集物または組織様凝集物を形成する本発明による方法は、好適な実施形態であり、特に好適なのは、胚様体（EB）を形成する前記細胞である。先に記したように、胚様体は、種々の組織へ分化しつつある細胞の複雑な群を代表する。一つの実施形態において胚様体内の細胞は、それらの分化のために実質的に同期されている。よって、公知の間隔で、同期化細胞のほとんどが3つの胚葉に分化し、そして軟骨、骨、平滑筋と横紋筋、および胚神経節を含む神経性組織のような多数の組織タイプへさらに分化する。SmithとSacher編、Peripheral Blood Stem Cells American Association of Blood Banks、メリーランド州ベセズダ（1993）の、Snodgrassらによる「Embryonic Stem Cells：Research and Clinical Potentials」も参照されたい。このように胚様体内の細胞は、従来の単細胞または酵母アッセイよりも、生物体全体の複雑さにずっと近いモデルを提供するとともに、さらに、マウスまたはラットおよびより大型の動物の使用に関連した費用や困難を回避する。その上、最近ヒト胚様体の入手が可能であることから、ヒト器官システムおよびヒト体内での心臓障害の処置のために有用な薬剤の同定と毒性のモデル化のためのより近い媒体を提供することによって、本発明の予測能力が改善される。
【００８４】
本発明の胚様体は、細胞集団を包含し、その大多数は、適切な条件下で培養されると種々の細胞系に分化する能力のある多能性の細胞である。該胚様体が、全能性のES細胞から派生した少なくとも51％の多能性細胞からなることが好適である。さらに好ましくは、該胚様体は、全能性のES細胞から派生した少なくとも75％の多能性細胞からなる。そしてまたさらに好ましくは、該胚様体は、全能性のES細胞から派生した少なくとも95％の多能性細胞からなる。
【００８５】
最も簡素な形では、本発明による分子プロファイルを作り出す方法は、胚様体を関心対象の化学組成物に接触させること、およびその後に、該化学組成物に曝された胚様体（「試験胚様体」）において、該薬剤に曝されなかった胚様体（「コントロール胚様体」）と比べたレポーター活性またはレポータータンパク質の量、あるいは両方の変化を決定することを伴う。
【００８６】
このように本発明の方法は、その方法が凝集物または組織様構造物への細胞の自己集合を許容するように、実行されることができる。「胚様体」（EB）という用語は「凝集体」と同義の技術用語である。該用語は、ES細胞が単層で過剰増殖した場合、または懸濁培地に維持された場合に現れる、分化した細胞および未分化細胞の凝集物を指して言う。胚様体は、形態学的な判定基準によって識別可能な種々の細胞タイプ、典型的には、いくつかの胚葉の混合物である。WO02／051987は、胚様体を得るためのプロトコルを記述している。製造は、好ましくは「懸滴」方法で、またはメチルセルロース培養によって行われる（Wobusら、Differentiation 48（1991）、172〜182）。
【００８７】
この方法の代わりに、スピナフラスコ（撹拌培養）を培養方法として用いることができる。したがって未分化のES細胞は、確立された手順によって、撹拌培養内に導入されて永久的に混合される。したがって、10万のES細胞が、20％FCSを有する150ml培地内に導入され、そして絶えず20rpmの速度で撹拌される。ここで、該撹拌運動の方向は定期的に変更される。ES細胞導入した24時間後の時点で、さらに血清の入った培養液100mlが加えられ、その上で、100から150mlの培地を毎日交換する（Wartenbergら、FASEB J.15（2001）、995〜1005）。これらの培養条件で、大量のES細胞から派生した細胞、すなわち、培地組成によって、心筋細胞、内皮細胞、ニューロンなどが、大量に入手できる。該細胞は、撹拌培養内のまま、またはプレーティングの後でも、それぞれ耐性遺伝子の手段によって選択される。
【００８８】
本発明の特に好適な実施形態において、胚様体は、最近開発された「大量培養」システムにしたがって調製される。該システムは、添付の実施例において使用し、かつ、出願人の同時係属出願であり本件出願と同日、すなわち2004年7月8日に提出され、欧州特許出願第03015401．7号および米国仮出願第60／485,463号に基づく優先権を主張している「胚様体（EB）調製のための新たな方法およびその使用」に詳細に記述されおり、それらの開示内容はここに参照として組み入れられている。
【００８９】
化学組成物を試験するために用いられる胚様体は、いかなる脊椎動物種でも可能である。胚様体が派生させられる特定の種の選択は、典型的には、いくつかの因子のバランスを反映する。第1に、研究の目的によって一つまたは複数の種を特定の関心対象としてもよい。例えばヒト胚様体は、潜在的なヒト治療薬として試験中の組成物とともに使用するための、および産業用化学物質を含む物質に対する毒物学的試験のための、特定の関心対象であろう。一方で、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、またはヒツジの胚様体は、潜在的な獣医学の治療薬のための、より大きな関心対象であるかもしれない。モルモット、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌのような、前臨床試験において用いられる他の種の胚様体も好適である。典型的に、これらの種の胚様体は、「初回通過」スクリーニングのために、またはヒトにおける毒性についての詳細な情報が必要ない場合に用いられるか、または、ネズミまたはこれら実験動物種のうち他のものにおける結果が、ヒトにおける、既知の毒性または他の効果と関連付けられている場合に用いられるであろう。さらにヒト治療に関して、規制機関は一般的に、ヒト試用を始める前に動物データを必要する。前臨床動物研究において用いられる種の胚様体を用いることが、一般的に望ましいであろう。胚様体における毒性試験の結果は、その後、動物試用中の予測される毒性の程度とタイプについて研究者の助けとなることができる。或る動物種は、他のものよりも、種々のタイプのヒト毒性のより良いモデルとなることが当該技術分野において知られており、また、薬物を代謝する能力も種によって異なっている。例えば、Williams、Environ.Health Perspect.22（1978）、133〜138；Duncan、Adv.Sci.23（1967）、537〜541を参照されたい。このように、特定の前臨床毒性研究における使用のために好まれる特定の種は、薬物候補の意図された使用によって異なるかもしれない。例えば、生殖システムに影響を与えることを意図した薬物のための適当なモデルを提供する種は、神経システムに影響を与えることを意図した薬剤のための適当なモデルではないかもしれない。前臨床試験のための適当な種を選択するための基準は、当該技術分野においてはよく知られている。
【００９０】
胚様体培養が一度開始されれば、化学組成物と接触させることができる。都合の良いことに、該化学組成物は、水溶液中に、好ましくは、従来から細胞培養に用いられている溶媒、例えばDMSOの中に存在しており、培養培地に導入される。実施例も参照されたい。該導入は、いかなる好都合な手段によってもよいが、通常はピペット、マイクロピペッターまたはシリンジを用いる。高処理量スクリーニングのようないくつかの適用例において、化学組成物は、ロボットアーム上に置かれていることもある自動化ピペッティングシステムのような自動化手段によって導入される。化学組成物はまた、医薬品賦形剤、バインダー、および医薬組成物に一般的に用いられる他の材料を伴って、または伴わずに、あるいは意図された用途において使用されるかもしれない他のキャリアを伴って、粉末または固形形状のものとして培地内に導入できる。例えば、農業用化学薬品としての、または石油化学薬剤としての使用を意図した化学組成物は、それら化学物質または薬剤の毒性を試験するために、それら自身によって培地中に導入されることができ、あるいは、それらが共に用いられうる、または環境中で見られる他の材料との組合せで導入して、該化学物質または薬剤の組合せが相乗効果を有するかどうかを決定することもできる。典型的には、培養物は、化学組成物の導入後に少なくとも短時間は振盪して、確実に該組成物が培地全体にわたって分散するようにする。
【００９１】
化学組成物を培養物に加える時期は、実施者の裁量内のことであり、特定の研究目的に応じて変わる。都合の良いことに、該化学組成物は、胚様体が幹細胞から発生するとすぐに加えられるので、該胚様体の全ての組織の発生についてタンパク質または遺伝子発現における変化を決定することが可能となる。しかしながら、該組成物の或る特定の組織タイプへの効果に研究の焦点を合わせることは、関心対象であるかもしれない。先に述べたように、筋肉、神経および肝臓組織のような個々の組織が、胚様体が形成した後の特定の時点で発生することが知られている。化学組成物の添加は、したがって、関心対象の組織における遺伝子またはタンパク質発現の改変への効果を観察するために、関心対象の組織が発生を開始する時点で、またはその発生が開始した後の選択した時点で起きるようにすることができる。
【００９２】
組成物の毒性について知られている情報の量、研究の目的、利用できる時間、および実施者の資源にしたがって、種々の量の化学組成物が、胚に接触させるために用いられる。化学組成物は特に、該化合物を使用した他の研究または過去の仕事、あるいはフィールド経験により或る特定の濃度が体内で見られる最も一般的な濃度であることが示されている場合に、一つの濃度のみで投与されることも可能である。さらに一般的には、該化学組成物は、並行して進められる複数の胚様体培養へ種々の濃度で添加され、その結果、遺伝子またはタンパク質発現への濃度差の効果を査定でき、したがって種々の濃度での該組成物の毒性における差を査定できる。典型的には、例えば該化学組成物は、或る標準のまたは中間的な濃度で添加され、かつ所望の精度にしたがって、2倍または5倍に増大および低減した濃度によって区分される。
【００９３】
該組成物が未知の毒性である場合には、好適には予備研究をまず行って、該組成物が試験される濃度範囲を決定する。用量濃度を決定するための多様な手順が、当該技術分野において知られている。例えば、一つの一般的な手順は、該薬物が直接的に毒性となる容量を決定することである。そして実施者は該容量を半分に減らして、典型的には、該関心対象の薬剤を5倍から2倍の希釈濃度で、該関心対象のタイプの細胞の並行培養に投与することによって、投薬研究を行う。環境汚染物質については、該組成物は通常それが環境内で見られる濃度でも試験されるであろう。食物に残留物を残す殺虫剤のような農業用化学薬品については、該薬剤は通常、該残留物が見られる濃度で試験される。ただし、他の濃度でも試験される可能性もある。このように、試験化合物の希釈は、別々の試験管で、DMSO中に50または100倍濃縮された化合物の一連の希釈物を作ることで行われる。各希釈物の1または2μlを、細胞懸濁分配の前に各ウェルに分配する。実施例3においてレチノイン酸について記述された貯蔵および希釈系列は、特に好ましい。
【００９４】
化合物のEBとの接触や接触時間などに関する上記考慮事項は、適用可能ならば、例えば、ES細胞、組織および非ヒト動物に対して実行される本発明のアッセイにも適用される。
【００９５】
本発明はまた、先に定義した組換え核酸分子からなる細胞分化を監視するためのレポーター遺伝子構築物に関し、かつ、前記レポーター遺伝子構築物を内包する、またはここに記述される方法によって得られる少なくとも一つの特定の細胞タイプへと分化する能力のある細胞に関する。同様に、ここに記述された方法によって得られる、あるいは前記細胞、細胞凝集物、組織、器官、インプラントまたはトランスプラントから構成される、前記レポーター遺伝子構築物からなる細胞凝集物、組織、器官、インプラントまたはトランスプラントは、本発明の主題である。
【００９６】
さらに別の実施形態において、本発明は、記述したES細胞とES細胞由来細胞タイプと細胞凝集物とから産生されうるトランスジェニック非ヒト動物に関連する。上記を参照されたい。本発明によって包囲されるトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスの生産のための方法は、上述のようなレポーター遺伝子を、該動物から派生する生殖細胞、胚性細胞、幹細胞または卵または細胞に導入することからなる。該非ヒト動物は、ここに記述される発明のスクリーニング方法にしたがって用いることができる。トランスジェニック胚の生産およびそれらのスクリーニングは、例えば、A.L.Joyner Ed、Gene Targeting、A Practical Approach（1993）、Oxford University Pressに記述されたように実行できる。トランスジェニック非ヒト動物を作る一般的な方法は、従来技術に記述されている。例えば、WO94／24274を参照されたい。トランスジェニック非ヒト生物体（相同的に標的にされた非ヒト動物を含む）を作るには、胚性の幹細胞（ES細胞）が好適である。実質的に記述されたような（Robertson、in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach.E.J.Robertson編（Oxford:IRL Press）（1987）、71〜112）、有糸分裂的に不活性なSNL76／7細胞フィーダー細胞層（McMahonとBradley、Cell  62（1990）、1073〜1085）上で成長したAB−1系のようなネズミES細胞を、相同遺伝子標的のために用いてもよい。他の安定的なES細胞系は、E14系（Hooperら、Nature 326（1987）、292〜295）、D3系（Doetschmanら、J.Embryol.Exp.Morph.87（1985）、27〜45）、CCE系（Robertsonら、Nature 323（1986）、445〜448）、AK-7系（Zhuangら、Cell 77（1994）、875〜884）およびその他も含むが、これに限定されない。上記も参照されたい。特定の標的突然変異を有するES細胞からのマウス系の産生の成功は、ES細胞の多能性（すなわち、胚盤胞または桑実胚のような宿主発生胚の中に一旦注入されると、胚形成に参加して結果として得られる動物の生殖細胞に寄与する能力）に依存する。注入ES細胞を内包する胚盤胞は、偽妊娠の非ヒトメスの子宮内で発生することを許容され、キメラマウスとして生まれる。結果として生じるトランスジェニックマウスは、もどし交配され、子孫の尾バイオプシーDNAについてのPCRまたはサザンブロット解析によって、正しく標的された導入遺伝子の存在によりスクリーニングされて、トランスジェニックマウスの一つのまたは複数のレポーター遺伝子座を同定する。例えば、前核注入によって受精卵に直接導入されたリコンビナーゼ遺伝子の一過性の発現は、標的遺伝子において所望の欠失または転位を有する変異体マウスを産生する迅速で効率的な方法を提供する。受精卵におけるCreリコンビナーゼの一過性の発現による遺伝子標的座位におけるloxP隣接DNA配列の効率的な除去は、Sunagaら、Mol.Reprod.Dev.46（1997）、109〜113によって記述されている。
【００９７】
キイロショウジョウバエのようなトランスジェニックハエを生産する方法もまた、従来技術に記述されている；例えば、US-A-4,670,388、BrandとPerrimon、Development 118（1993）、401〜415；およびPhelpsとBrand、Methods 14（1998）、367〜379を参照されたい。線虫（C.elegans）のようなトランスジェニック虫は、Melloら、EMBO J．10（1991）、3959〜3970、Plasterk、Methods Cell.Biol.48（1995）、59〜80に記述されたように産生できる。
【００９８】
上に記述した実施形態の全ては、モジュレーターをその純粋な形状で用いて細胞分化を監視し培養条件を最適化するために用いることができるだけでなく、有効な薬剤が組成物内に内包されていてもよい。それゆえ、ここに記述される本発明の組換え核酸分子、細胞、細胞凝集物または組織のいずれか一つからなる物質の組成物は、本発明の範囲内に包含される。ここに記述されるように、本発明の組成物および方法は、多様な目的、例えば、胚発生中の組織形成の早期段階または因子および化合物のこのプロセスへの影響を解析するために用いることができる。
【００９９】
特に好適な実施形態において、本発明は、固体支持体と、それに付着したまたはそれに吊した、本発明の方法で得られたまたは分化プロセス中の細胞、細胞凝集物または組織とからなるアレイとチップに関する。そのようなアレイは一般的に、試験細胞、凝集物または組織が或る特定のパターンで固着されたガラス、プラスチックまたはシリコンの基質からなる。アレイのタイプによっては、これらはさらに伝導体、例えば、金、白金、インジウム−錫−酸化物、イリジウムなどで覆われていてもよく、これによって、細胞の伝導性を使用することによる直接測定が許容される。そのような平面マイクロ電極アレイを培養細胞および細胞凝集物のためにバイオセンサーとして用いることは、特別の関心対象である。
【０１００】
さらに、本発明は前記アレイを解析するための装置に関し、使用されたアッセイの特定の検出、例えばSEAP反応生成物を定量的な様式で測定するとともに、その結果をアレイ上の位置に割り当てることができる。
【０１０１】
本発明による細胞分化を監視するためのシステムはまた、分化プロセスを変える物質を同定し特徴づけるために使用できる。高い腫瘍形成潜在力を持つ未分化細胞または特定の治療目的に必要とされない細胞に分化した細胞を投与することを回避するために、ヒト投与に適した分化した細胞の集団および組織を、分化プロセスの後で同定しなくてはならない。或る細胞タイプに分化した細胞の肯定的同定はまた、治療目的のために必要とされる分化した細胞を比較的大きい数だけ得るために必要な培養条件を最適化することを可能にする。このように、ES細胞の分化を所望の方向へ駆動する該細胞の培養条件を同定する必要がある。
【０１０２】
それゆえ、発明の好適な実施形態は、
・上で定義されたような細胞、細胞凝集物、組織または器官または非ヒト動物からなる試験サンプルを試験物質に接触させることと、
・コントロールサンプルまたは動物と比較した、レポーター遺伝子産物または活性の量に対する前記試験物質の効果を決定することと、
からなる、細胞分化のモジュレーターを得るおよび／またはプロファイルする方法である。
【０１０３】
特に本発明の方法は、毒物学的、胚毒性、変異原性、および／または催奇形性インビトロ試験のために用いることができる。上記を参照されたい。本発明のもう一つの重要な態様は、したがって、化合物の毒性、好ましくは、催奇形性、胚毒性、慢性または急性毒性を決定する方法であって、ここに記述される方法のステップを包含し、前記レポーター遺伝子産物の低減または増大されたレベルまたは活性が前記化合物の毒性を示唆する方法である。
【０１０４】
アッセイは、レポーター、例えば酵素活性またはレポータータンパク質の量を検出することによって、分泌レポータータンパク質の発現における変化があるかどうかを決定する単純な「イエス／ノー」アッセイでもよい。該アッセイは、試験サンプルにおけるレポーターの量および／または活性の量を、標準サンプルにおける量および／または活性のレベルと比較することによって、定量的なものとしてもよい。実施例に記述されているように、一つの試験化合物または複数の試験化合物を、種々の濃度または希釈系列で、試験細胞、好ましくは胚様体にさらし、好ましくは、対応する試験化合物のタイプの生理的レベルに対応する用量とする。実施例3も参照されたい。このように、WO00／34525に記述されているものと同様の化合物プロファイルを容易に意図的に産生可能である。例えば、二つ以上のアッセイを用いてもよく、各アッセイについて、試験細胞、または、例えば胚様体が、種々の細胞および／または発生特異的プロモーターが同じまたは異なるレポーターに作動的に連結された組換えDNA分子を包含し、好ましくは、各レポーターが分泌タンパク質、例えば酵素であり、最も好ましくは、一つのまたは各々のレポーターがSEAPである。それらのアッセイは、並行して、または続いて行うことができ、または一つのアッセイの結果を、他で行われた対応するアッセイの結果と比較してもよい。同様に、上に記したような異なるプロモーターおよびレポーターを持つ2つの上記組換え分子からなる細胞を提供し用いることが予見される。このように、例えば先のセクションで記述された試験化学組成物に接触された胚様体において、レポーター遺伝子活性またはレポータータンパク質の量における変化を検出することによって、試験化学組成物の分子的プロファイルを確立できる。試験組成物の分子的プロファイルが一旦決定されると、それは、所定の毒性を持つ或る化学組成物のプロファイルと比較でき、または、好ましくは所定の毒性を持つ化学組成物の分子的プロファイルのライブラリーと比較できる。そのような比較の結果は、該試験組成物が毒性であるかどうかの可能性や、どのタイプの毒性か、および、他の既知の毒性組成物と比較してそれがどの程度の毒性であるか、を予測するために情報を提供する。
【０１０５】
本発明を実施する目的において、ES細胞、組織など、好ましくはEB細胞における試験組成物の分子的プロファイルに基づいた毒性の予測は、100％正確でなくてもよい。薬物開発のコストおよび効率に大きな肯定的影響を持つためには、より低毒性でそれゆえにより成功する薬物候補が、例えば、新薬物優位の優先順位リストの上位半分にくる確率を適度に上げなければならない。
【０１０６】
さらに実施例3において、培養上清におけるレポーター分子活性への試験化合物の濃度依存性効果は、該試験化合物による分化細胞タイプの産生の濃度依存性阻害と調和することが実証されている。したがって、本発明の方法で産生された化合物プロファイルを、異なる手段で提供された化合物プロファイルと比較する、例えば両プロファイルがインビトロ分化細胞を定量化するかどうかについて比較することも可能である。
【０１０７】
本発明にしたがって得られた細胞および組織は、従来の細胞に基づいたアッセイに比較してインビボの状況により似ているので、本発明のアッセイによって得られる結果は、試験化合物のインビボ催奇形または胚毒性にも相関すると期待される。レポーター分子アッセイの単純な検出は、全ての態様および発生の種々の段階において胚性および出生後の発生を監視することで物質の影響を決定することよりも容易に測定され解釈される。これは、種々の段階での数多くの動物の犠牲を必要とするが、一方では、発生特異的様式で分泌されるレポーター分子を使用することによって、該動物からの体液のサンプルが繰り返し得られ、該動物の一生にまで長期化された時間にわたる監視を可能にする。これはまた、試験結果のばらつきを低減する。
【０１０８】
いくつかの試験物質を組み合わせ、同時にまたは順次加えて、可能なエンハンシングまたはクエンチング効果についての情報を得ることができる。このように、発明のさらなる側面は、前記接触ステップがさらに、前記試験サンプルまたは動物を、前記第1の試験物質の存在下で少なくとも一つの第2試験物質に接触させることをさらに含む、先に記述された方法に関する。組み合わせて試験される2つ以上の物質は、一般的にそれらの相互作用についての情報を提供するであろう。
【０１０９】
本発明による方法の好適な実施形態は、試験物質が治療薬剤またはその混合物であるならば、培養培地または動物において分化プロセスを活性化または阻害するとして知られている化合物を加えることを伴う。このスクリーニングを行ってもよい理由は、例えば、該化合物が、或る細胞タイプの分化に対して効果を有すると知られており、他の細胞タイプの分化を導くための該化合物の潜在力を決定するために試験されるからであり、または、他の効果を有するように設計された化合物が意図されない副作用効果を有するかもしれないからである。最後の態様は、特に治療薬剤に適用される。
【０１１０】
薬物スクリーニングの両態様は、化合物ライブラリースクリーニング方法ならびに市販の工業用化学物質のスクリーニングに適合されている。このように、発明のもう一つの実施形態は、好ましくは、第1のスクリーニングにて、前記試験物質が、試験物質の集まりの中に包含されるとともに該集まりとして対象となる、上に記述された方法である。そのような試験物質の集まり（通常は、コンビナトリアル化合物ライブラリーである）は、約103から約105の多様性を持つことができ、該方法を数回実行する中で連続的に低減され、最終的に該多様性は、所望の指数まで、好ましくは一つの化合物または一つの特定のクラスの化合物まで低減される。本発明の方法は、当該技術分野において知られている他のスクリーニング方法と任意で組み合わせることができる。ペプチド様のコンビナトリアルライブラリーの産生および使用のための方法は、先行技術、例えば、Ostresh、Methods in Enzymology 267（1996）、220〜234およびDorner、Bioorg.Med.Chem.4（1996）、709〜715に記述されている。ダイナミックコンビナトリアルライブラリーによる薬物発見は、例えば、Nat.Rev.Drug Discov.1（2002）、26〜36およびDrug Discov.Today 7（2002）、117〜125に記述されている。発明の方法を用いて同定された化合物は、本発明の他の方法を使用した単一の実験においてさらに評価されうる。
【０１１１】
化合物および候補薬剤は、合成および天然化合物のライブラリーまたは上記の工業化学物質を含む広く多様な源から得られる。上記を参照されたい。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広く多様な有機化合物および生体分子の、ランダムな、および方向付けられた合成のために、多数の手段が利用可能である。代わりに、細菌性および真菌性の、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、利用可能であり、または容易に作られる。例えば、伝統的な漢方薬に用いられる植物成分によって、胚様体と腫瘍球状体の対峙培養において腫瘍誘導血管形成および基質メタロプロテイナーゼ発現が阻害されることが、WartenbergらによってLab.Invest.83（2003）、87〜98に記述されている。
【０１１２】
スクリーニング方法の好適な実施形態は、本発明によって提供されるようなアレイ上で行われる。
【０１１３】
本発明のアッセイ方法は、従来の実験フォーマットで行われるか、またはハイスループットスクリーニングに適合させることができる。「ハイスループットスクリーニング」（HTS）という用語は、多数のサンプルの容易な解析を許容するアッセイ設計およびロボット操作の能力を指して言う。ハイスループットアッセイのもう一つの望ましい特色は、薬剤使用の低減、または所望の解析を達成するための操作の数の最小化のために最適化されたアッセイ設計である。アッセイフォーマットの例は、液体取り扱い実験のための96ウェル、384ウェル、またはより多数のウェルのプレート、浮揚液滴、および「lab on a chip」マイクロチャンネルチップを含む。プラスチック成型品および液体取り扱い装置の小型化が進むに連れて、または改良されたアッセイ装置が設計されるに連れて、より多くのサンプルが本発明の設計を用いて実行されてもよいことは、当業者によく知られている。
【０１１４】
発明の方法において、前記一つまたは複数の細胞または組織は、好ましくは容器に、例えばマイクロタイタープレートのウェルに内包される。該プレートは、24、96、384または1586ウェルのプレートでもよい。代わりに、該細胞は、Caliper(米国マサチューセッツ州ニュートン)によって提供されるもののような微小溶液装置に導入できる。もう一つの好適な実施形態において、本発明の方法は、3、4、5、7、10個またはより多くの測定値を、任意で容器内の種々の位置で取ることからなる。
【０１１５】
本発明による方法は、標的遺伝子を（過剰）発現するように、またはその発現を阻害するように遺伝子操作された細胞を用いて実行することもできる。遺伝子改変の幹細胞の例は、VEGF受容体VEGFR−1を発現する哺乳動物幹細胞を提供するWO03／014326に、またはシグナル伝達領域および抗原特異性領域を内包する組換え分子をコードする組換えDNA構築物を発現するヒト造血幹細胞を開示するWO95／06409に記述されている。既に改変された幹細胞を用いる代わりに、前記標的遺伝子を、分泌レポーター分子の発現を与える本発明の構築物と同時に形質移入できる。
【０１１６】
HTS、コンビナトリーライブラリースクリーニングならびに従来のアッセイフォーマットもまた、分化に効果を有する新規の化合物を同定するために使用できる。細胞分化を調節すると以前から知られている化合物および新規化合物は、この目的のための薬物の製造に用いることができる。このように、本発明の好適な実施形態は、特定の細胞タイプの形成を促進または阻害する薬物を入手および製造する方法であって、上に記述された方法のステップを包含し、該レポーター遺伝子産物の増大または低減されたレベルまたは活性が該薬物を示唆する方法である。
【０１１７】
関心対象の化合物は、典型的には有機分子であるが、無数の化学的なクラスを包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を包含し、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは、該官能化学基のうちの少なくとも2つを含む。該候補薬剤はしばしば、上記官能基の一つまたは複数で置換された環状炭素または複素環式構造および／または芳香環または多芳香環構造からなる。候補薬剤はまた、ペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、派生物、構造類似物またはそれらの組合せを含む生体分子の中にも見られる。
【０１１８】
加えて、天然または合成的に作られたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理学的および生化学的手段で容易に変更され、コンビナトリアルライブラリーを作るために用いてもよい。公知の薬理学的薬剤は、構造類似薬を作るために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのように方向付けられたまたはランダムな化学修飾の対象としてもよい。
【０１１９】
該化合物はまた、追加的な成分、例えばイオン強度、pH、全タンパク質濃度などに影響する成分が加えられた液体を含むサンプルに含まれてもよい。加えて該サンプルは、少なくとも部分的な分画または濃縮を達成するように処置されてもよい。生物学的なサンプルは、該化合物の劣化を低減するための注意が為されていれば、例えば窒素下、冷凍、またはその組合せの状態ならば、貯蔵してもよい。用いられるサンプルの体積とは、測定可能な検出を許容するのに十分な量であり、通常は、約0.1μlから1mlの生物的サンプルで十分である。
【０１２０】
分化プロセスは、胚発生において主要な役割を担うのみならず、成体の生物体においても重要である。なぜなら老化した、あるいは傷害または疾患によって損なわれた細胞の継続的な置換は、前駆細胞が必要とされる細胞へと分化することによって達成されるからである。本発明の重要な態様は、よって、創傷治癒および／または損傷組織の治癒を支援する薬剤を製造する方法であって、ここに記述されるステップを包含し、レポーター遺伝子産物の増大されたレベルまたは活性が前記薬剤を示唆する、方法である。
【０１２１】
上に記述した方法によって同定、単離および／または作成される化合物は、薬物発見および薬物またはプロドラッグの調製においてリード化合物として用いることができる。これは、通常、これまでに記述したような該リード化合物またはその派生物または単離された化合物を修飾すること、例えば、毒性を引き起こし、生体利用度、溶解度および／または半減期を増やす疑いがある前記物質の部分を改変、除去および／または派生化すべく前記物質を修飾することを伴う。よって、本発明の好適な実施形態は、前に記述され且つ毒性を引き起こし、生体利用度、溶解度および／または半減期を増やすとして疑われる前記物質の部分を改変、除去および／または派生化すべく前記物質を修飾することをさらに伴う。臨床化合物発見のための方法は、例えば、リード同定のための超ハイスループットスクリーニング（Sundberg、Curr.Opin.Biotechnol.11（2000）、47〜53）、および構造ベース薬物設計（VerlindeとHol、Structure 2（1994）、577〜587）、およびリード最適化のためのコンビナトリアル化学（Salemmeら、Structure 15（1997）、319〜324）を包含する。上に挙げた様々なステップは当技術分野において一般的に知られている。例えばこれらの手法を実行するためのコンピュータープログラムが利用可能であり、例えばRein、Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions（Alan Liss、ニューヨーク、1989）がある。化学的派生物および類似物の調製のための方法は、当業者者によく知られており、例えばBeilstein、Handbook of Organic Chemistry、Springer版New York Inc．、米国10010ニューヨーク州ニューヨーク五番街175、およびOrganic Synthesis、Wiley、米国ニューヨークに記述されている。さらに、適切な派生物および類似物のペプチド様体および／またはコンピューター支援設計は、例えば上記の方法により用いることができる。薬物発見におけるリード産生のための方法は、タンパク質を用いるとともに、質量分析（Chengら、J.Am.Chem.Soc.117（1995）、8859〜8860）および核磁気共鳴（NMR）方法（Fejzoら、Chem.Biol.6（1999）、755〜769；Linら、J.Org.Chem.62（1997）、8930〜8931）のような検出方法を用いることも含む。これらはまた、定量的構造作用関係（QSAR）解析（Kubinyi、J.Med.Chem.41（1993）、2553〜2564、Kubinyi、Pharm.Unserer Zeit 23（1994）、281〜290）、コンビナトリアル生化学、古典化学および他を含んでもよく、または依拠してもよい。例えば、HolzgrabeとBechtold、Pharm.Acta Helv.74（2000）、149〜155を参照されたい。
【０１２２】
一つの実施形態において、発明の方法は、単離されたまたは修飾された物質を製薬的に容認可能なキャリアと混合することをさらに包含する。キャリアおよび製剤の方法は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに見られるであろう。
【０１２３】
物質は、排出と、一つまたは複数の活性あるいは非活性代謝物への代謝とのどちらかによって除去されるために、該物質のインビボ投与の後に代謝される（Meyer、J.Pharmacokinet.Biopharm.24（1996）、449〜459）。よって、本発明の方法にしたがって同定され入手された実際の化合物または薬物を使うのではなく、患者の中で患者の代謝によって活性形に変換されるプロドラッグとしての対応製剤物を用いることができる。プロドラッグおよび薬物の適用のために取られる可能性がある予防策は、文献に記述されている。レビューのためにOzama、J.Toxicol.Sci.21（1996）、323〜329を参照されたい。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の上述の方法のいずれか一つを実行するために有用な、先に記述したもののような特性試薬を内包するキットであって、例えば先に記述したレポーター遺伝子構築物、複または多能性の細胞、標準化合物を内包し、任意で培養培地、組換え核そのような酸分子を内包し、ならびにEDTA、L-ホモアルギニン、NBT/BCIP、固定液、インキュベーション緩衝液、PBSなどのようなレポーター分子、特にSEAPのための検出手段を内包するキットに関する。そのようなキットは典型的に、少なくとも一つの入れ物を密封して保持するのに適した区画化されたキャリアを包含するであろう。該キャリアはさらに、前記方法を実行するために有用な試薬を包含する。該キャリアはまた、標識化した酵素基質などのような検出のための手段を内包してもよい。
【０１２５】
本発明さらにもう一つの態様は、
・細胞分化のモジュレーターを同定するための、ここに記述されるような一つまたは複数のアッセイシステムを提供すること、および／または、
・本発明による、動物における効力および毒性について、先のステップで同定されたモジュレーターまたはそのさらなる類似物の治療的なプロファイリングを行うことと、
・容認できる治療的プロファイルを有するとして先のステップで同定された一つまたは複数のモジュレーターを含む医薬品調製物を製剤することと、
からなる、創薬事業を行う方法に関する。
【０１２６】
上記の方法を利用して、分化のモジュレーターまたはその派生物のアイデンティティが決定される。薬剤は、分泌レポーター分子のレベルを改変する能力によって同定される。同定された適したリード化合物に対して、該薬剤またはその類似物のさらなる治療的プロファイリングを、動物における効力および毒性を査定するために実行できる。動物試験後の治療的プロファイルを有する化合物は、ヒトにおける使用のための、または獣医学の使用のための医薬品調製物に製剤できる。本主題の事業方法は、上記医薬品調製物を販売目的で流通させるための流通システムを確立する追加的ステップを含むとともに、任意で、上記医薬品調製物を市場で売るために販売グループを確立することを含んでもよい。
【０１２７】
上記同定された細胞分化調節薬剤を自社で開発する代わりに、さらなる薬物開発が、異なる会社によって達成されてもよい。このように、本発明のさらなる態様は、
・細胞分化のモジュレーターを同定するための、ここに記述される一つまたは複数のアッセイシステムを提供することと、
・（任意で）本発明による、動物における効力および毒性について、先のステップで同定されたモジュレーターの治療的なプロファイリングを行うことと、
・上記第1のステップで同定されたモジュレーターまたはその類似物のためのさらなる薬剤開発および／または販売の権利を第三者に実施許諾することと、
からなる、標的発見事業を行う方法に関する。
【０１２８】
同定された適したリード化合物について、該薬剤またはそのさらなる類似物のさらなるプロファイリングを、それぞれの第三者との合意の様式に依拠して、動物における効力および毒性を査定するために実行できる。ヒトにおける使用のための、または獣医学の使用のための化合物のさらなる開発は、該第三者によって行われる。該主題である事業方法は、通常、前記化合物を開発する権利の販売または実施許諾のどちらかを伴うが、料金と引き替えに薬物開発会社へ提供されたサービスとして行われてもよい。
【０１２９】
本発明はまた、上記の方法により同定された細胞分化のモジュレーターに関し、ならびにそのようなモジュレーターからなる、細胞分化の調節における使用のための医薬組成物に関する。
【０１３０】
本発明によるモジュレーターは、適した希釈剤またはキャリア、好ましくは製薬的に容認可能なものと組み合わせることができる。そのようなキャリア、希釈剤および製剤の方法の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesにおいて見られるであろう。効果的な投与に適した、製薬的に容認可能な組成物を形成するために、そのような組成物は効果的な量の上記モジュレーターを内包する。キャリアまたは希釈剤は通常、無菌かつ無毒であり、動物またはヒト投与のための医薬組成物を製剤するために一般的に用いられる媒体として定義される。該希釈剤は、上記組み合わせの生物活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンク溶液である。加えて、上記薬剤組成物または製剤は、他のキャリア、アジュバント、または無毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。治療的かつ効果的な用量とは、標的細胞の分化に所望の効果を達成するために十分なモジュレーターの量を指して言う。
【０１３１】
適した医薬品キャリアのさらなる例は、当該技術分野においてよく知られており、リン酸塩緩衝食塩水、油／水乳濁液のような乳濁液、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などを含む。そのようなキャリアからなる組成物は、よく知られた従来方法によって製剤できる。よって、本発明はまた、細胞分化の調節において使用するための医薬組成物を作る方法であって、本発明の方法により同定された細胞分化のモジュレーターを、適した希釈剤またはキャリアと混合することからなる方法を提供する。
【０１３２】
創薬または薬物動態学的または薬理学的なプロファイリングにおいて、ここに定義されるレポーター遺伝子構築物、細胞、細胞凝集物、組織、器官、インプラントまたはトランスプラント、非ヒト動物、組成物、アレイ、または装置を使用することは、本発明の好適な実施形態である。それゆえ、先に記述された本発明の手段および方法は、特定の遺伝子のホモ接合性の突然変異を内包するES細胞を使った「機能の喪失」アッセイ、外来性の遺伝子を過発現するES細胞を使った「機能の獲得」アッセイ、インビトロでの催奇形性／胚毒性化合物の発生的解析、薬理学的アッセイと病理学的な細胞機能のためのモデルシステムの確立、および組織移植片のための源として用いることができる、選択的に分化した細胞の誘導のための分化および成長因子の適用を含むがこれらに限定されない多様な適用例において用いることができる。例えば、Guanら、Altex16（1999）、135〜141をレビューのために参照されたい。
【０１３３】
実施例に記述されたように、分泌ヒト胎盤性アルカリホスファターゼタンパク質（SEAP）の発現のために、特定のプロモーター、すなわちマウスアルファミオシン重鎖遺伝子でのプロモーター領域が用いられている；NCBI GenBank受入番号U71441（配列番号1）を参照されたい。本発明によると、このプロモーター領域は、レポーター遺伝子の細胞タイプ特異的発現のために、特に本発明の目的のために特に適していることを示すことができる。加えて、本発明にしたがって実行されるさらなる実験は、驚くべきことに、マウス心室のミオシン調節軽鎖遺伝子プロモーター（NCBI GenBank受入番号AF302688；配列番号2を参照されたい）が、レポーター遺伝子の発現にも特に適していることを明らかにした。このように、本発明はまた、細胞タイプ特異的レポーターシステムにおける先に記述したような組換えDNA分子であって、マウスアルファミオシン重鎖遺伝子および／またはマウス心室のミオシン調節軽鎖遺伝子のプロモーター、特にNCBI GenBank受入番号U71441（配列番号1）およびAF302688（配列番号2）それぞれに図示される配列、またはその断片からなる組換えDNA分子に関する。典型的に、上記組換えDNA分子はベクターであり、ori、細菌性選択可能マーカー、ポリアデニル化シグナル、マルチクローニング部位などのような他の機能的DNA配列からなる。それゆえ、そのようなベクターは、例えば成長因子など、または標的cDNAを特異的に発現させて、細胞発生中のそれらの機能を解明するために用いてもよい。このように、本発明は、レポータータンパク質または選択可能マーカーをコードするDNA配列の発現のための上記プロモーター領域の使用を伴う。上記を参照されたい。特に本発明は、配列番号3に図示されたヌクレオチド配列からなる実施例1に記述された発現ベクターに関し、かつ、対応するベクターであって、上記マウスアルファミオシン重鎖遺伝子プロモーターが、上記マウス心室のミオシン調節軽鎖遺伝子プロモーターによって置換されたベクター、および上述した実施形態におけるそれらの使用に関する。
【０１３４】
これらおよびその他の実施形態は、本発明の明細書と実施例によって開示され、包含される。本発明にしたがって使用される材料、方法、用途および化合物に関するさらなる文献は、例えば、電子的な装置を用いて、公共の図書館およびデータベースから取得できる。例えば、公共データベース「medline」を利用してもよく、これは、National Institutes of HealthのNational Center for Biotechnology Informationおよび／またはNational Library of Medicineによって提供されている。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えばEuropean Molecular Biology Laboratory（EMBL）の一部であるthe European Bioinformatics Institute（EBI）のものは、当業者に知られており、またインターネットのサーチエンジンを用いて得ることもできる。生物工学における特許情報の概観および遡及的な検索にとって有用な、およびカレントアウェアネスにとって有用な特許情報の関連源の調査は、Berks、TIBTECH 12(1994)、352〜364に記されている。
【０１３５】
上記開示は、一般的に本発明を記述している。下記の具体的実施例および図を参照することによってさらなる完全な理解が得られるが、これらの実施例および図は、ここに例示の目的のために提供されており、本発明の範囲を限定するよう意図されてはいない。全ての引用された参照文献（参照文献、発行特許、この出願を通して引用されている公開特許出願、および製造者の仕様書、指示書など）の内容は、ここに参照によって明白に組み入れられるが、引用された文献が確かに本発明に関する先行技術であるとの理解はできない。
【０１３６】
本発明の実施は、他の示唆がない限り、当技術分野の技能の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来からの手法を使用する。
【０１３７】
幹細胞技術に関する一般的な手法のさらなる詳細については、実務者は、標準的な教科書およびレビュー、例えば、Teratocarcinomas and embryonic stem cells：A practical approach（E.J.Robertsonら編、IRL Press Ltd.1987）；Guide to Techniques in Mouse Development(P.M.Wassermanら編、Academic Press 1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro(Wiles、Meth.Enzymol.225（1993）、900，)；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (Rathjenら、Reprod.Fertil.Dev.10（1998）、31，)を参照できる。幹細胞の分化は、Robertson、Meth.Cell Biol.75（1997）、173；およびPedersen、Reprod.Fertil.Dev.10（1998）、31にレビューされている。既に上で記述された幹細胞の源に加えて、さらなる参照文献が提供される；EvansとKaufman、Nature 292（1981）、154〜156；Handysideら、Roux’s Arch.Dev.Biol.、196（1987）、185〜190；Flechonら、J.Reprod.Fertil.Abstract Series  6（1990）、25；Doetschmanら、Dev.Biol.127（1988）、224〜227；Evansら、Theriogenology 33（1990）、125〜128；Notarianniら、J.Reprod.Fertil.Suppl．、43（1991）、255〜260；Gilesら、Biol.Reprod.44（Suppl.1）（1991）、57；Strelchenkoら、Theriogenology  35（1991）、274；Sukoyanら、Mol.Reprod.Dev.93（1992）、418〜431；Iannacconeら、Dev.Biol.163（1994）、288〜292を参照されたい。
【０１３８】
分子遺伝学および遺伝子工学における方法は、現行版のMolecular Cloning：A Laboratory Manual（Sambrookら（1989）  Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press）；DNA Cloning、IおよびII巻（D.N.Glover編、1985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編、1984）；Nucleic Acid Hybridization (B.D.HamesとS.J.Higgins編、1984)；Transcription And Translation (B.D.HamesとS.J.Higgins編、1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.、1987)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller&Calos編)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology、第3版（F.M.Ausubelら編）；および、Recombinant DNA Methodology（R.Wuら、Academic Press）一般的に記述されている。Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.MillerとM.P.Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology、154および155巻（Wuら編）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press、1986）；B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）；論文、Methods In Enzymology (Academic Press,Inc．、ニューヨーク州)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (MayerとWalker編、Academic Press、ロンドン1987)；Handbook Of Experimental Immunology、I〜IV巻（D.M.WeirとC.C.Blackwell編、1986）。この開示において言及される遺伝的操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、およびClontechのような商業的供給業者から得られる。細胞培養および培地コレクションの一般的な技術の概略は、Large Scale Mammalian Cell Culture（Huら、Curr.Opin.Biotechnol.8（1997）、148）；Serum-free Media（Kitano、Biotechnology 17（1991）、73）；Large Scale Mammalian Cell Culture（Curr.Opin.Biotechnol.2（1991）、375）；およびSuspension Culture of Mammalian Cells（Birchら、Bioprocess Technol．19（1990）、251）に述べられている。培地およびその培養環境への影響についての他の観察が、Marshall McLuhanとFred Allenによって為されている。
【実施例】
【０１３９】
実施例1：心臓特異的SEAP発現のためのベクターの産生
標準的なクローニング手順を用いて、SEAP発現ベクターを下記のようにして得た。α−マウスミオシン重鎖遺伝子（Genbank番号U71441）のプロモーター領域を含む5．4kb断片を、pEGFP−1ベクター（Clontech）のポリリンカー内に挿入した。α−ミオシン重鎖遺伝子は、分化しつつあるES細胞において心筋細胞によって特異的に発現される（Gulickら、J.Biol.Chem.266（1991）、9180〜91855；Palermoら、Cell Mol.Biol.Res. 41（1995）、501〜519；Morkin、Microsc.Res.Tech.50（2000）、522〜531；Bohelerら、Circ.Res.91（2002）、189〜201）。その後、EGFPコード配列を除去して、SEAPコード配列に置き換えた（Bergerら、Gene 66（1988）、1〜10）。
【０１４０】
指定されたαMHC−SEAPである、結果として得られたベクターは、したがって、心臓特異的プロモーターの転写コントロール下のSEAP遺伝子を内包する。該ベクターのさらなる特色は、SEAP  mRNAの効率的な翻訳を許容するコザック共通配列の存在と、SEAP  mRNAの適正なプロセシングを指示するSV40ポリアデニル化信号の存在と、SV40初期プロモーターからなるネオマイシン耐性カセットの存在と、安定的に形質移入されたES細胞の選択を許容する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子からのポリアデニル化およびTn5のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子と、大腸菌内でカナマイシン耐性を与えるためのこのカセットの上流の細菌性のプロモーターの存在とを含む。
【０１４１】
実施例2：ES細胞形質移入体の産生
αMHC−SEAPベクターを制限エンドヌクレアーゼ消化によって直線化して、電気穿孔法によってD3マウス胚性幹（ES）細胞（American Type Culture Collection）に導入した。ネオマイシン選択の後で、単ES細胞コロニーを単離して、拡張した。ES細胞培養および形質移入、ならびに安定した形質移入体の選択は、標準的手順を用いて行った（TorresとKuhn、Laboratory protocols for conditional gene targeting.Oxford University Press（1997）ニューヨーク）。
【０１４２】
実施例3：レチノイン酸の存在下でのES細胞の心臓細胞への分化
過剰のレチノイン酸の存在は、インビボでの初期心臓発生への著しい効果を有する（Osmondら、Development 113（1991）、1405〜1417；Yutzeyら、Development 120（1994）、871〜883；DickmanとSmith、Dev.Dyn.206（1996）、39〜48；Drysdaleら、Dev.Biol.188（1997）、205〜215）。さらに、全−トランスレチノイン酸（CAS番号302−79−4）がインビトロでのES細胞からの心筋細胞の産生を阻害することが示された（Seilerら、ALTEX 19 Suppl.1（2002）、55〜63）。したがって、αMHC−SEAPベクターを安定的に形質移入したES細胞を、種々の濃度のレチノイン酸で処理して分化プロトコルの対象とすると、心臓細胞の産生が結果として生じた。分泌レポーター（ここではSEAP）の活性がES細胞派生の心筋細胞を定量するために実際に用いることができるのであれば、培養上清中でのSEAP活性の量は、培養物中に存在するレチノイン酸の濃度と逆相関するはずである。
【０１４３】
細胞培養の全てのインキュベーションは、37℃で、5％CO2を内包する加湿雰囲気中で行った。
【０１４４】
ES細胞凝集物
αMHC−SEAPベクターを安定的に形質移入したES細胞（実施例2を参照されたい）をトリプシン処理して単細胞懸濁液を得た。細胞を遠心分離（800ｇ、5分間）で集めて、20％（v/v）ウシ胎仔血清（FBS、Invitrogen）を補ったIscove変更Dulbecco培地（IMDM、Invitrogen）に2×106細胞／mlの密度で懸濁した。ES細胞を凝集させるために、この懸濁液の4mlを、ロッキングプラットフォーム（GFL 3006）上の6cm細菌学用皿（Greiner）上で撹拌（50rpm）しながらインキュベートした。6時間後、その培養物の2mlを、T25フラスコ（Falcon）内の20％FBSを内包する13mlのIMDMに加えた。該フラスコを、18時間ロッキング（50rpm；GFL 3006）しながらインキュベートした。この手順中に、ES細胞凝集物（胚様体；EB）が形成された。
【０１４５】
レチノイン酸の存在下でのES細胞分化
全−トランスレチノイン酸（Sigma）をジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma）に溶解して、10−4M、10−5M、10−6M、10−17M、10−8Mおよび10−9Mの貯蔵液を得た。10cmペトリ皿（細菌学グレード、Greiner）の中に、20％FBSおよび上記貯蔵液からのレチノイン酸を、それぞれレチノイン酸が10−7M、10−8M、10−9M、10−10M、10−11Mおよび10−12Mの終濃度になるように補ったIMDMからなる培地を調製した。一つの皿は、レチノイン酸無しのDMSO（終濃度0.1％（v/v））とした（溶媒コントロール）。各皿には10mlの培地を入れた。70個のEBを各ペトリ皿に移して、4日間インキュベートした。
【０１４６】
次に、EBを6ウェルプレート（組織培養グレード；Becton-Dickinson）に移した。各ウェルには、10cm皿での培養について上述したような、20％FBSとレチノイン酸とDMSOとを有する3mlのIMDMを入れた。2つのウェルを、レチノイン酸の各濃度に対して設定するとともに、2つのウェルを溶媒コントロールとした。各ウェルに、20個のEBをそれぞれの10cm皿から移転した。プレートを7日間インキュベートした。次に、培地を、20％（v/v）ノックアウト（商標）SR（Invitrogen）を補った2mlのノックアウト（商標）D-MEM（Invitrogen）と交換した。さらに2日間のEBインキュベーションの後で、細胞培養上清のサンプルを集めた。
【０１４７】
SEAP活性の決定
Great EscAPe SEAP蛍光検出キット（Becton−Dickinson）を製造元の取扱説明書にしたがって用いて、サンプルのSEAP活性についてアッセイした。蛍光は、マイクロプレートリーダーを用いて測定した（Safire、Tecan）。バックグラウンド活性を、新鮮な培地（20％（v/v）ノックアウト（商標）SRを補ったノックアウト（商標）D-MEM）のサンプルをアッセイすることで決定した。
【０１４８】
結果を図1に示す。10−9M未満のレチノイン酸の濃度は、コントロールと比較してSEAP活性に全く影響を持たない。SEAP活性は、10−8Mレチノイン酸で急激に減少した。より高い濃度では、全く活性が観察されなかった。
【０１４９】
このように、培養上清におけるSEAP活性へのレチノイン酸の濃度依存性効果は、はっきりと観察される。さらにこれらのデータは、先に記述したレチノイン酸による心筋細胞産生に対する濃度依存性阻害と一致する（Seilerら、2002、上記）。したがって、該結果は、ES細胞派生の心筋細胞を定量するためにここに提示されたレポーターシステムの適合性と、ES細胞の分化プロセスを監視するための該システムの有用性とを指し示している。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】レチノイン酸の存在下でES細胞から分化した細胞による、心臓特異的αMHCプロモーターによって駆動されるSEAP発現。（心臓特異的αMHCプロモーターのコントロール下にあるSEAP遺伝子を含む）αMHC−SEAPベクターを導入したES細胞を、示された濃度でのオールトランス型レチノイン酸の存在下で分化させた。13日後に、培地上清をSEAP活性についてアッセイした。バックグラウンドSEAP活性を差し引いた複製サンプルの平均値を示す。活性は、溶媒（DMSO）のみを含み、レチノイン酸を含まないサンプルにおけるSEAP活性の百分率として表される。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）細胞の分化を許容する条件下で、細胞分化の際に分泌される産物をコードするレポーター遺伝子からなる少なくとも一つの組換え核酸分子を含有する少なくとも一つの特定の細胞タイプへと分化する能力のある細胞を培養すること、または、そのような細胞からなる非ヒト動物を維持することと、
（b）該トランスジェニック非ヒト動物の体液または細胞培養培地のいずれかの中のレポーター遺伝子産物の量または活性を決定することにより分化した細胞を定量することと、
からなる、細胞分化を監視する方法。
【請求項２】
前記組換え核酸分子が、前記レポーター遺伝子に作動的に連結された少なくとも一つの細胞タイプ特異的調節配列からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、幹細胞であるかまたは該幹細胞由来である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または複能性の成体前駆細胞（MAPC）である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子産物が、分泌リーダー配列からなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記調節配列が、プロモーターおよび／またはエンハンサー要素からなる、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞タイプが、結合線維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経系細胞、神経細胞、造血細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、上皮細胞および心臓細胞からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーターまたはエンハンサーが、αMHC、MLC2V、VE-カドヘリン、Tie-2、Flk-1、Flt-1、GFAP、アルファ-1-チューブリン、コラーゲン2のプロモーターまたはエンハンサーからなる群から選択される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子産物が、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）またはアルファ−アミラーゼである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え核酸分子が、複能性または多能性の細胞によって発現される選択可能マーカーをさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、種々の細胞タイプから派生した細胞凝集物または組織様凝集物を形成する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が胚様体（EB）を形成する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載された組換え核酸分子からなる、分化した細胞を定量することによって細胞分化を監視するためのレポーター遺伝子構築物。
【請求項１４】
請求項1から12のいずれか一項に記載された、または請求項13のレポーター遺伝子作成物からなる細胞であって、少なくとも一つの細胞タイプに分化する能力がある細胞。
【請求項１５】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって得られる少なくとも一つの細胞タイプの細胞凝集物。
【請求項１６】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって得られる組織、あるいは、請求項14に記載の細胞または請求項15に記載の細胞凝集物からなる組織。
【請求項１７】
請求項16に記載の組織、請求項14に記載の細胞、または請求項15の細胞凝集物からなる器官。
【請求項１８】
請求項17に記載の器官、請求項16に記載の組織、請求項14に記載の細胞、または請求項15に記載の細胞凝集物からなるインプラントまたはトランスプラント。
【請求項１９】
請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物、請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、請求項16に記載の組織、または請求項17に記載の器官からなる非ヒト動物。
【請求項２０】
請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物、請求項16に記載の組織、請求項14に記載の細胞、または請求項15に記載の細胞凝集物からなる、物質の組成物。
【請求項２１】
固体支持体と、それに付着したまたはそれに吊した、請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、または請求項16に記載の組織と、からなるアレイ。
【請求項２２】
請求項21に記載のアレイを解析するための装置の使用。
【請求項２３】
（a）請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、請求項16に記載の組織、または請求項17に記載の器官からなる、あるいは、請求項19に記載の非ヒト動物からなる試験サンプルを試験物質に接触させることと、
（b）前記レポーター遺伝子産物または活性の量に対する前記試験物質の影響を、コントロールサンプルまたは動物に比較して決定することと、
からなる、細胞分化のモジュレーターを得るおよび／またはプロファイルする方法。
【請求項２４】
前記接触ステップが、前記試験サンプルまたは動物を、前記第1試験物質の存在下で少なくとも一つの第2試験物質に接触させることをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
分化プロセスを活性化するまたは阻害すると知られている化合物が前記培地または動物に加えられる、請求項1から12または23から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験物質が治療薬である、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験物質が治療薬の混合物である、請求項23から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
好適には、第1のスクリーニングにて前記試験物質が試験物質の集まりの中に包含されるとともに該集まりとして対象となる、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験物質の集まりが、約103から約105の多様性を持つ、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記試験物質の集まりの多様性が連続的に低減される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
アレイ上で行われる、請求項23から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記一つまたは複数の細胞が、標的遺伝子を（過剰）発現するように、またはその発現を阻害するように遺伝子操作される、請求項1から12または23から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記一つまたは複数の細胞または組織が容器内に内包されている、請求項1から12または23から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
任意で前記容器内の種々の位置にて3つ以上の測定値を取ることからなる、請求項1から12または23から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記容器がマイクロタイタープレートのウェルである、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロタイタープレートが24、96、384または1586ウェルプレートである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
請求項23から36に記載のいずれか一項のステップからなる、特定の細胞タイプの形成を促進または阻害する薬物を得るとともに製造するための方法であって、前記レポーター遺伝子産物の増大したまたは減少したレベルまたは活性が、前記薬物を示唆するものである、方法。
【請求項３８】
請求項23から37のいずれか一項に記載の方法のステップからなる、創傷治癒および／または損傷組織治癒を支援する薬剤を製造する方法であって、レポーター遺伝子産物の増大されたレベルまたは活性が、前記薬剤を示唆するものである、方法。
【請求項３９】
請求項23から37のいずれか一項に記載の方法のステップからなる、化合物の毒性、好適には、催奇形、胚毒性、慢性または急性毒性を決定する方法であって、前記レポーター遺伝子産物の低減されたまたは増大されたレベルまたは活性が、前記化合物の毒性を示唆するものである、方法。
【請求項４０】
毒性を引き起こし、生体利用度、溶解度および／または半減期を増やす疑いがある前記物質の部分を改変、除去および／または派生化すべく前記物質を修飾することをさらに含む、請求項23から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離されたまたは修飾された前記物質を製薬的に許容可能なキャリアと混合することをさらに含む、請求項23から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物と、請求項14に記載の細胞と、細胞培養培地、選択薬剤、レポーター分子のための検出薬剤、およびコントロールサンプルのような標準化合物とからなる、請求項1から12または23から41のいずれか一項に記載の方法を行うために有用なキット。
【請求項４３】
（a）細胞分化のモジュレーターを同定するための請求項1から12または23から41のいずれか一項に記載の一つまたは複数のアッセイシステムを提供すること、および／または、
（b）請求項19に記載の動物における効力と毒性について、ステップ（a）で同定されたモジュレーターまたはさらなる類似物の治療的プロファイリングを行うことと、
（c）容認できる治療的プロファイルを有するとしてステップ（b）で同定された一つまたは複数のモジュレーターを含む医薬品調製物を製剤することと
からなる、創薬を行う方法。
【請求項４４】
（a）細胞分化のモジュレーターを同定するための請求項1から12または23から41のいずれか一項に記載の一つまたは複数のアッセイシステムを提供することと、
（b）（任意で）請求項19に記載の動物における効力および毒性について、ステップ（a）で同定されたモジュレーターの治療的なプロファイリングを行うことと、
（c）ステップ（a）で同定されたモジュレーターまたはその類似物のためのさらなる薬剤開発および／または販売の権利を第三者に実施許諾することと、
からなる、標的発見事業を行う方法。
【請求項４５】
請求項23から41のいずれか一項に記載の方法により同定される成長および組織形成促進のような細胞分化のモジュレーター。
【請求項４６】
請求項23から41のいずれか一項に記載の方法により同定されるモジュレーターからなる、細胞分化の調節に使用するための薬剤組成物。
【請求項４７】
請求項23から41のいずれか一項に記載の方法により同定される細胞分化のモジュレーターを、適切な希釈剤またはキャリアと混合することからなる、細胞分化を調製するのに使用するための薬剤組成物を作る方法。
【請求項４８】
創薬または薬物動態学的なまたは薬理学的なプロファイリングにおける、請求項13に記載のレポーター遺伝子構築物、請求項14に記載の細胞、請求項15に記載の細胞凝集物、請求項16に記載の組織、請求項17に記載の器官、請求項18に記載のインプラントまたはトランスプラント、請求項19に記載の非ヒト動物、請求項20に記載の組成物、請求項21に記載のアレイ、または請求項22に記載の装置の使用。
【請求項４９】
マウスアルファミオシン重鎖遺伝子の、または心室型ミオシン調節軽鎖遺伝子のプロモーター領域と、それに作動的に連結された、分泌性アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする異種性DNA配列とからなるベクター。
【請求項５０】
前記プロモーターが、配列番号1または2のヌクレオチド配列またはその断片からなる、請求項49に記載のベクター。
【請求項５１】
配列番号3のヌクレオチド配列からなる請求項49または50に記載のベクター。
【請求項５２】
請求項1〜12、又は23〜41のいずれか一項に記載の方法において、胚形成または細胞発生の間における異種性DNA配列の特異的発現のための、マウスアルファミオシン重鎖遺伝子の、または心室型ミオシン調節軽鎖遺伝子のプロモーター領域の使用。
【国際調査報告】
2009513106.tif 000024
2009513106.tif 000025
2009513106.tif 000026
2009513106.tif 000027
2009513106.tif 000028
2009513106.tif 000029
2009513106.tif 000030