(57)【要約】本発明は、肉加工製品の代表的な病原性菌及び品質阻害微生物１２種アエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、大腸菌O157 : H7 (Escherichia coil O157 : H7)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogens)、サッカロマイセス・セレビシエ(Sacromyces cerevisae)、サルモネラ ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)を抗原化させて鶏にそれぞれ接種して産卵の卵の卵黄で１２種の病原性菌などに対する特殊免疫蛋白質(Immunoglobulin in Yolk, IgYとする)を生産してこれを活用した肉原料ベース加工食品の微生物殺菌及び生育抑制用食品添加物の製造方法とその利用に関するものである。
2009529527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌及び品質阻害微生物のワクチン(vaccines)を産卵鶏に接種して特殊免疫蛋白質を含む卵を生産する第１段階;前記卵で分離した卵黄を低温殺菌する第２段階及び;前記低温殺菌された卵黄に酸性水溶液を添加して遠心分離する第３段階を含む特殊免疫蛋白質アイジワイ(IgY;Immunoglobulin in Yolk)の製造方法。
【請求項２】
前記第２段階の低温殺菌は、５０〜７５℃で１５分ないし１時間の間遂行することを特徴とする請求項１記載の特殊免疫蛋白質アイジワイの製造方法。
【請求項３】
前記第３段階の遠心分離は、低温殺菌された卵黄に酸性水溶液を添加して最終酸度５.２〜５.５で合わせた後遂行することを特徴とする請求項１記載の特殊免疫蛋白質アイジワイの製造方法。
【請求項４】
前記病原性菌及び品質阻害微生物は、アエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、大腸菌O１５７:H７(Escherichia coil O１５７:H７)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogens)、サッカロマイセス・セレビシエ(Sacromyces cerevisae)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)及び、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)であることを特徴とする請求項１記載の特殊免疫蛋白質アイジワイの製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載した製造方法によって製造された特殊免疫蛋白質アイジワイ(IgY;Immunoglobulin in Yolk)。
【請求項６】
病原性細菌及び品質阻害微生物のワクチンを産卵鶏に接種して特殊免疫蛋白質を含む卵を生産する第１段階及び;前記卵で分離した卵黄を低温殺菌する第２段階を含む製造方法に製造された特殊免疫蛋白質アイジワイ(IgY;Immunoglob ulin in Yolk)含有卵黄。
【請求項７】
請求項６記載の卵黄を凍結乾燥して製造された特殊免疫蛋白質アイジワイ含有卵黄粉末。
【請求項８】
請求項５記載の特殊免疫蛋白質アイジワイ、請求項６記載の特殊免疫蛋白質アイジワイ含有卵黄及び、請求項７記載の特殊免疫蛋白質アイジワイ含有卵黄粉末で構成されたグループから選択されるどれか一つ以上を含む肉ベース加工食品の殺菌または腐敗抑制用食品添加剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵の卵黄(yolk)由来の特殊免疫蛋白質であるアイジワイ(IgY; Immunoglobulin in Yolk)を含む肉ベース製品での病原性微生物に対する生育抑制効果を現わす食品添加組成物の製造方法とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、豚肉、牛肉、鶏肉など多様な肉を原料にして加工されるハム、ソーセージ、成形肉、料理肉など肉加工製品で品質を進めるためには多くの分野の核心技術が必要だった。新しい香辛料を活用した味品質向上、保水力向上機能を持った蛋白素材を活用した原価低減、酵素、蛋白素材などを活用した新しい組織感と食感を再現する組織化技術、熱による品質損傷を最小化させることができる非加熱殺菌技術など多様な技術がここに当たる。この中でも品質向上を持って来ることができる一番重要な技術が熱処理を最小化して殺菌する非加熱殺菌工法(non-thermal sterilization)である。現在研究開発されている方法が天然抗菌素材を利用した化学的(chemical)処理法と電場、磁場、超高圧、光エネルギーなどを利用した物理的(physical)処理法があるのに現在技術水準と費用などの側面で天然抗菌剤を利用した非加熱殺菌が現場適用面で有利だと言える。
【０００３】
現在商業的に活用することができる天然抗菌剤は、バクテリオシン(bacteriocine)系統抽出物、キトサン(chitosan)製剤、リソチーム(lysozyme)酵素製剤、カルシウム(calcium)製剤、各種有機酸(organic acid)、グレープフルーツ(grapefruit)種子抽出物、ポリリシン(polylysine)、ビタミンB１誘導体(vitamin B1 derivative)など多様な製品が開発されて現在販売されているのに、この中で乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどのような有機酸応用製品が肉加工製品の微生物安全性確保のために２〜３％程度使われている。ところで商業的抗菌剤の大部分は抗菌物質が保有している疎水性、親和水性領域の界面活性作用で微生物の細胞膜構造を損傷させて菌が死滅されるインアクティベイションメカニズム(Inactivation mechanism)を持っているのにこのような界面活性による抗菌力は蛋白質、脂肪などの極性基をたくさん含んでいる肉加工製品のような蛋白質系統の食品では殺菌効果が非常に阻害される。すなわち食品に含有された蛋白質などの極性基によって抗菌物質の界面活性作用が前もって封鎖されて微生物の細胞膜に効果的に到達、結合することができないから有効な殺菌効果を現わすことができないことである。培地上で卓越な殺菌効果や生育抑制効果を現わす商業的抗菌剤も実際製品特に蛋白質素材食品ではその効果が大きく阻害されて現われるという致命的欠陥で現在まで有機酸系統以外の天然抗菌素材外には使うことができる素材が肉ベース加工食品では非常に限定されると言える。
【０００４】
したがって、蛋白質が主成分である肉加工製品の効果的な殺菌、生育抑制などの微生物制御機能を持った天然抗菌剤の開発、確保が何より重要であり、非加熱殺菌の根幹になる。すなわち有効な天然抗菌剤の開発、確保は２次熱処理殺菌の時発生する熱による品質損傷と収率低下を最小化することができる差別化技術になることである。
【０００５】
本発明は、前記のような点を勘案して既存の天然抗菌剤の抗菌メカニズムと違う作用を持って肉加工製品で効果的な天然保存料で使われることができるアイジワイ(IgY)ベース食品添加組成物を研究開発して実際肉加工製品での微生物生育抑制効果を観察、分析して完成するようになった。
【０００６】
アイジワイ(IgY)は、母鶏が獲得した抗体が卵黄(yolk)に蓄積されて幼い鶏に伝わる原理を利用した特殊免疫蛋白質の一種である抗体として界面活性剤系統の天然抗菌物質とはその生産方法や作用メカニズムが完全に違う。アイジワイ(IgY)の生産方法は母鶏にヘリコバクター(Helicobacter)、大腸菌、黄色葡萄状球菌、サルモネラ(Salmonella)など殺菌または生育抑制を目標にするターゲット(target)病原性菌を注入させた後、生産された卵の卵黄にこれら菌を沮止することができる特殊免疫蛋白質(抗体)が生成されるようにすることでこのような方法で作られる卵の卵黄に蓄積される特殊免疫蛋白質をアイジワイ(IgY)と言い、一般的な抗生剤とは違い細菌に対する耐性と人体に対する副作用が全然ないということが大きい特徴である。
【０００７】
このような抗菌特性を持ったアイジワイ(IgY)を主に活用した分野は機能性卵及び乳製品、豆乳などの加工食品と機能性飼料、機能性化粧品などに過ぎなく、本発明によって提案されるような、肉ベース製品で安全性と品質に影響を及ぼす多様な病原性菌に対する殺菌及び生育抑制を目的に粉末、液状形態で製造して活用した事例は全くない。関連国内外研究開発事例を特許及び研究文献を通じてよく見れば次のようだ。先に特許としては、大韓民国特許登録番号第０４３７５００号に口腔疾患を起こす連鎖状球菌突然変異体(Streptococcus mutants)、イスラエル放線菌(Actinomyces israelii)を抗原化させて鶏にそれぞれ接種して関連病原性菌に対して免疫蛋白質を生産して食品添加物で活用して、またこれを混合した機能性アイスクリームに関する内容が記載されているし、大韓民国特許登録番号第０４１５９１１号には腸炎と胃炎を起こす大腸菌(E.coli)と腸炎菌であるヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)菌を抗原化させて幼いひよこに同時に接種して腸炎を予防することができる特殊抗体卵生産方法に対する内容が掲示されている。また、大韓民国特許登録番号第０４０６８７０号は、卵黄での有用水溶性成分である抗体(IgY)を分離精製する方法、大韓民国特許登録番号第０３９２５６４号は、にきび原因菌であるプロピオニバクテリウムアクネス(Propionibacterium acnes)に対する特殊免疫蛋白質を生産保有するようにした機能性卵生産方法、そして、ヘリコバクター菌に対する免疫抗体(IgY)を含む卵黄液を含む機能性豆乳、ヨーグルトに対しては大韓民国特許出願第２００１-００４６６３４号に掲示されている。このような特許外にも関連研究文献の内容をよく見れば大部分卵の卵黄でアイジワイ(IgY)抗体生産及び特性に関する研究が大部分であり、殺菌及び生育抑制ターゲット(target)も病原性大腸菌、ヘリコバクター菌、サルモネラ(Salmonella)菌などいくつの特定菌に限定されて研究が進行された。
【０００８】
本発明は、従来の研究及び開発、商品化が主に機能性素材及び機能性食品に集中されているという点と肉加工製品で効果的な商業的天然抗菌素材がないという事実に着眼して発明したこととして殺菌及び生育抑制ターゲット(target)微生物に対して選択的に確かな抗菌力を現わすことができる商業的天然抗菌素材を発明することで包装後、熱処理殺菌をしない無菌包装製品と成形、クッキング(cooking)後、すぐトレー(tray)に包装することができる多様な形態の高品質製品の商品化ができるようにする進歩された非加熱殺菌技術を開発して完成することができた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、アイジワイ(IgY)を含む肉ベース加工食品の病原性菌殺菌及び生育抑制組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記組成物を処理して肉ベース加工食品での病原性菌を殺菌及び生育抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アイジワイ(IgY)含有卵黄を生産する段階と;生産された前記卵黄からアイジワイ(IgY)を分離精製する段階と;前記アイジワイ含有卵黄液状及び粉末を製造する段階と;前記段階で取得したアイジワイの安全性を測定する段階と;前記アイジワイ含有卵黄粉末と液状の抗菌力を測定して評価する段階で構成される。
【００１２】
本発明は、病原性細菌及び品質阻害微生物のワクチン(vaccines)を産卵鶏に接種して特殊免疫蛋白質を含む卵を生産する第１段階;前記卵で分離した卵黄を低温殺菌する第２段階及び;前記低温殺菌された卵黄に酸性水溶液を添加して遠心分離する第３段階を含む特殊免疫蛋白質アイジワイ(IgY;Immunoglobulin in Yolk)の製造方法を提供する。
【００１３】
前記第２段階の低温殺菌は、５０〜７５℃で５分ないし１時間の間遂行することを特徴にする。もし殺菌温度が５０℃より低ければ殺菌が充分になされてなく、７５℃より高ければ卵黄が熱によって変性になる短所がある。また、１５分より少ない時間の間殺菌処理すれば充分に殺菌がなされてなく、１時間より長く殺菌してもこれ以上の殺菌効果の上昇がないので不必要である。
【００１４】
前記第３段階の遠心分離は低温殺菌された卵黄に酸性水溶液を添加して最終酸度５.２〜５.５で合わせた後遂行することを特徴にする。
【００１５】
また、本発明は、病原性細菌及び品質阻害微生物のワクチンを産卵鶏に接種して特殊免疫蛋白質を含む卵を生産する第１段階及び;前記卵で分離した卵黄を低温殺菌する第２段階を含む製造方法に製造された特殊免疫蛋白質アイジワイ(IgY;Immunoglobulin in Yolk)含有卵黄を提供する。
【００１６】
前記低温殺菌された卵黄は、凍結乾燥して特殊免疫蛋白質アイジワイ含有卵黄粉末の形態に製造されることができる。
【００１７】
一歩進んで本発明は、前記特殊免疫蛋白質アイジワイ、前記特殊免疫蛋白質アイジワイ含有卵黄及び前記特殊免疫蛋白質アイジワイ含有卵黄粉末で構成されたグループから選択されるどれか一つ以上を含む肉ベース加工食品の殺菌または腐敗抑制用食品添加剤組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明で用語"アイジワイ(IgY、Immunoglobulin in Yolk)"は、母鶏が獲得した抗体が卵黄に蓄積されて幼い鶏に伝わる原理を利用した特殊免疫蛋白質(抗体)を意味して、これの液状またはこれを利用して剤形化された粉末などすべての形態を含む。
【００１９】
肉加工製品で問題とされる病原性菌及び品質阻害微生物はアエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、大腸菌O１５７: H７(Escherichia coil O１５７: H７)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogens)、サッカロマイセス・セレビシエ(Sacromyces cerevisae)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、ビブリオ系統(Vibro spp)、ペニシリウム(Penicillium)など２０余種がある。
【００２０】
前記２０余種の微生物の中でも本発明ではグラム陽性菌、グラム陰性菌、耐熱性胞子形成微生物を含んでいる１２種の病原性菌で、比較的熱処理が強い製品はもちろん熱処理が弱い製品と後殺菌しない無菌トレー包装製品で腐敗、ガス発生、粘質物形成、食中毒毒素形成などの潜在危険性がある病原性系統微生物１２種を最終殺菌ターゲット微生物で選定した。
【００２１】
すなわち、本発明での殺菌及び生育抑制対象病原性菌及び品質阻害微生物は、大きくグラム陰性菌である大腸菌O１５７; H７(Escherichia coil O１５７: H７)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobac ter jejuni)とグラム陽性菌であるスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogens)そしてグラム陽性菌ながら耐熱性胞子形成菌であるバチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)その外代表的な品質阻害微生物であるサッカロマイセス・セレビシエ(Sacromyces cerevisae)であり、本発明は前記のような幅広い病原性菌、品質阻害微生物に対して優秀な抗菌力を持っているアイジワイ含有卵黄またはアイジワイを提供することができる。
【００２２】
本発明では選定した殺菌及び生育抑制ターゲットバクテリアを母鶏に注入させて母鶏が産卵する卵の卵黄に入れ込んだバクテリア１２種を防御することができる特異的な抗体物質であるアイジワイを１次的に作り上げた製造品の化学的造成は蛋白質含量が一番高く、その次脂肪、灰分、水分順序であり、１２種の病原性菌に対するアイジワイ抗体の総含量は１５.５mg/g水準である(図１)。卵黄に形成されたアイジワイのバクテリア１２種に対する殺菌及び生育抑制効果を肉加工製品で直接検証する前に先に間接的に酵素免疫反応法であるエライサー(ELISA、Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)方法を介して抗原抗体反応の時オディ値(OD value)変化観察実験を進行した。オディ値(OD value)の増加は特定病原性菌に対するアイジワイの選択的反応が高いということを意味して、これは殺菌及び生育抑制効果が高いという間接的指標になる。テスト結果、本発明でのアイジワイは１２種の病原性菌の中でスタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)外では大部分高いオディ値(OD value)を有効的な数値で現わして特定病原性菌に対する生育抑制活性を持っていることが現われた。アイジワイの抗菌メカニズム(inactivation mechanism)は抗体とバクテリア細胞膜の結合による反応で解釈することができ、具体的な内容は次のようだ。卵黄特異抗体であるアイジワイはモノクローナル(monoclonal)抗体ではなくポリクローナル(polyclonal)抗体としてバクテリアとの培養期間６時間の間特異抗体の量が増加することによってバクテリアの成長が抑制される特異な抗菌(bactericidal)作用を現わす。一定時間バクテリアの増殖が抑制される効果は、アイジワイ抗体の吸着部位(Fab)の二つのサイトがバクテリアの細胞膜に存在する主要膜成分である細胞膜蛋白質(out membrane protein、fimbriae)あるいはリポポリサッカライド(lipopolysaccharide)に付着してお互いに凝り固まる(agglutination)効果でバクテリアの細胞膜機能が損傷されるメカニズムで、発生する。
【００２３】
エライサー(ELISA)方法で抗菌力が間接検証されたアイジワイ含有卵を粉砕して卵黄部分だけ分離し出した後低速撹拌しながら５０〜７５℃で５分ないし１時間の間低温殺菌して液状のアイジワイ含有卵黄を製造することができる。前記のような低温殺菌を介して無菌状態の卵黄を提供することができる長所を持つようになる。
【００２４】
また、前記低温殺菌されたアイジワイ含有卵黄を１〜１０℃の冷蔵ルームでひと晩の間冷凍させた後無菌状態でスプレー乾燥(spray drying)乾燥させて粉末状態のアイジワイ含有卵黄を製造することができる。
【００２５】
一歩進んで、分離した卵黄の低温殺菌の後あらかじめ酸処理された酸度（ｐH）２〜５水溶液に６〜９倍に希薄して最終酸度を５.２〜５.５で合わせた後、１〜１０℃の冷蔵状態で６時間以上好ましくは６時間ないし２４時間の間保管した後遠心分離機を利用して３,０００〜６,０００rpmの高速で１５分ないし１時間の間遠心分離した後、上層のアイジワイを沈澱されたリポ(lipo)蛋白質と分離してアイジワイ水溶液を製造することができる。また、前記のアイジワイ水溶液を冷凍乾燥機を利用して凍結乾燥することでアイジワイ粉末を製造することができる。これはアイジワイを液状状態でも活用が可能だが保存性と流通便利性を勘案して粉末状態で使うのが多方面に有利だからだ。
【００２６】
前記のような本発明のアイジワイ分離方法は、遠心分離機と凍結乾燥器だけ使う簡単な工程と少ない設備で抗体活性役価（力価：タイター）９０％以上確保することができる長所を持つ。
【００２７】
このような方法で製造したアイジワイの微生物殺菌及び生育抑制効果を実際肉加工製品で観察して見た。１２種の病原性菌に対する抗菌力を持ったアイジワイミックス粉末及び液状をそれぞれモデル食品で選定したグリルウィンノ(商標名、CJ株式会社、大韓民国)ソーセージ製造の時に重量対比０.５％添加して１０℃、１５℃、２０℃、３５℃の温度で最小８日、最大５６日まで総菌数、官能品質、腐敗関連ガス発生可否などを分析した結果１０１の微生物殺菌効果と腐敗微生物の生育抑制によるガス未発生などの殺菌及び生育抑制効果を観察することができた。アイジワイは、このような効果的な抗菌効果外にも加工食品の味に全然影響を与えないから既存の商業的な天然抗菌体の使用制限を乗り越えることができるという大きい利点を持っている。
【００２８】
また他の様態として、本発明は前記組成物を処理して肉ベース加工食品の病原性菌及び品質阻害微生物を殺菌及び生育抑制する方法に関する。
【００２９】
この時組成物を有効量範囲内で使うようにして、処理方法は特別に限定されないが肉ベース加工食品製造の時添加することで遂行することができる。
【００３０】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい発明の態様を実施例を通じて提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより易しく理解するために提示するだけで、本発明が下記の実施例によって制限されるのではない。
実施例１: アイジワイ(IgY)含有卵黄及びその分離精製組成物の製造
アイジワイ含有卵黄粉末及び液状の製造工程は下記のように遂行された(図１)。全体的な製造工程は肉原料ベース加工食品の衛生及び品質阻害観点で問題になる１２種の病原性菌などを選定してランダム(Random)にサンプリングした母鶏にそれぞれ１２種のバクテリアワクチンを接種して形成される特異抗体であるアイジワイ(IgY)を分離、精製してその活性を測定した後、有効な抗菌効果が間接的に立証されれば低温殺菌、乾燥などの工程を通じて液状または粉末タイプの肉加工製品殺菌用アイジワイ含有卵黄を作り上げることである。本発明の工程別詳細な説明は次のようだ。
【００３１】
第１工程: アイジワイ含有卵の生産
本発明の好ましい実施態様でバチルス系統、クロストリジウム系統、サルモネラ菌、大腸菌など１２種の肉加工製品での殺菌ターゲットバクテリアのワクチンを生産し始める１９週齢〜２１週齢の間の白色産卵鶏(single comb white legh orn chickens)にそれぞれ接種して１２種類のバクテリア別抗菌アイジワイを含んだ卵の１２種をそれぞれ生産した。
【００３２】
この時接種したバクテリアのワクチンは病原性微生物を熱処理あるいは化学物質を使って細胞膜を変性させて非活性化されたバクテリアとして免疫刺戟物質と混合して産卵鶏の胸部位筋肉を通じて接種した。
【００３３】
本発明でのワクチン接種の時最大限多い量の特異抗体を生成させるために最小２回の接種を実施した。すなわち、本発明ではワクチンの一次接種の後記憶免疫細胞(memory B-cell)が活性化になった後二次接種して記憶免疫細胞が幾何級数的に分裂して大量の特異抗体を生産する方式を適用した。
第２工程: アイジワイの分離・精製
本発明ではアイジワイ含有卵の卵黄からアイジワイを分離してアイジワイの抗菌活性を免疫酵素反応法であるエライサー(ELISA)法で間接測定して製造したアイジワイ含有卵黄の適合性可否を判定した。
【００３４】
卵黄の脂質成分から効率的に水溶性成分である特異抗体アイジワイを分離することが非常に重要なので本発明では卵黄を９倍の酸性化された水溶液（酸性化された食塩水）(pH５.０〜５.５saline solution)と混合した後６時間経過させて低密度脂肪蛋白質は沈澱されるようにして水溶性であるアイジワイだけ遠心分離して分離した。
【００３５】
分離したアイジワイは、凍結乾燥して抗菌力の間接指標である免疫酵素反応法に基礎したエライサー法(４００ｎｍでの吸光度)を通じて特異病原性菌に対する抗菌力有無を確認することができる特異活性(specific activities)をオディ値(OD value)で分析した。
【００３６】
オディ値(OD value)が高い場合、病原性菌に対する抗菌力が高いという事実が間接的に分かった。測定結果を図２に示した。その結果１２種の病原性菌及び品質阻害微生物に対して有効な抗菌効果を示すことが分かったし、特に７種の病原性菌であるグラム陰性菌の大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)とグラム陽性菌のスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogens)そしてグラム陽性菌ながら耐熱性胞子形成菌のバチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、その外代表的な品質阻害微生物であるサッカロマイセス・セレビシエ(Sacromyces cerevisae)に対して抗菌効果が優秀に現われることを確認することができた。
【００３７】
本実施例による実験結果で本発明のアイジワイ組成物は１２種の病原性菌の中でスタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)を除き大部分高いオディ値を有効的な数値で現わして(表１参照)特定病原性菌に対する生育抑制活性を持っていることで現われた。
【００３８】
【表１】
2009529527.tif 000003
【００３９】
第３工程: アイジワイ含有卵黄液状及び粉末製造
本発明において卵黄内のアイジワイの抗菌活性を分析した結果有効な数値を現わしてその次の段階でアイジワイ含有卵黄液状及び粉末製造を実施した。前記エライサー(ELISA)方法で抗菌力が間接検証されたアイジワイ含有卵を粉砕して卵黄部分だけ分離した後低速撹拌しながら６２℃で３０分間低温殺菌して保存性を１次確保した。その次、液状卵黄を４℃の冷蔵ルームでひと晩の間冷凍させた後無菌状態でスプレー乾燥(spray drying)して粉末状態で製造した。粉末製造の時収率は８３％水準だったし、粉末卵黄内のアイジワイの活性は９０.７％水準で、相当に高い値が加工処理後にも維持された。
【００４０】
以下、本発明の前記実施例によって製造された組成物の実験結果は次のようだ。
【００４１】
実験例１: アイジワイの安全性測定
本発明のアイジワイを商業的天然抗菌物質で商品化するためには何より多くの条件での安全性確保が何より重要だ。したがって、本発明の前記実施例で述べられた酸度(pH)および温度における安全性（安定性）を観察した結果、酸度(pH)３以下で変性になって機能を喪失したことを確認したし、酸度(pH)９以上でも抗体の機能が減少された。一般的に加工食品の酸度はpH４〜pH７が水準なのでこの範囲内ではアイジワイの活性がよく維持されると評価された。
【００４２】
たいてい卵来由素材を食品で利用するためには先に滅菌過程(pasteurization)を経るに当たり加熱条件は６５℃で５分位として、実験結果この温度帯（条件下）から９９％の抗菌活性を見せた。しかし７５℃以上の温度で１時間加熱の時６０％以上の抗菌活性を喪失することが現われたので、非加熱殺菌製品に使われるのが妥当であることが分かった(図３)。
【００４３】
実験例２: １２種のアイジワイ含んだ卵黄粉末の抗菌力測定
本実験例では１２種の病原性菌に対する抗菌活性を持ったアイジワイを含んだ卵黄粉末の殺菌及び生育抑制効果を実際肉加工製品に適用して分析した。実験結果、アイジワイ含有卵黄粉末０.５％をモデル食品であるグリルウィンノ(商標名、CJ株式会社、大韓民国)ソーセージ製造の時重量対比添加した場合２０℃の保存温度で２１日保存の時１０１の殺菌効果を現わした(図４)。
【００４４】
このような殺菌効果は、特殊免疫蛋白質であるアイジワイがバクテリアの細胞膜に結合して細胞膜構造が変形するため、細胞膜機能低下及び一部喪失によって起きる(図５)。アイジワイはこのようなバクテリア機能の低下に由来する抗菌メカニズムを持っているから殺菌(sterilization、inactivation)作用よりは生育抑制機能側面でもっと有利だと言える。ハム、ソーセージのような肉加工製品は完全滅菌製品ではないから冷蔵条件で１０１〜１０２以上の病原性菌及び品質低下に係るバクテリア生育が起きないようにすることが微生物安全性確保目標なので、特定菌に対して選択的な生育抑制効果があるアイジワイは微生物安全性側面で有効だと言える。したがって病原性菌に対して選択的な抗菌力を持ったアイジワイ含有卵黄粉末を添加する場合、味に対する影響なしに効果的に殺菌及び生育抑制ターゲット微生物の生育を効果的に制御することができる。
【００４５】
実験例３: ２種のアイジワイ含んだ卵黄液状の抗菌力測定
本実験例では１２種の病原性菌に対する抗菌活性を持ったアイジワイを含んだ卵黄粉末の中で肉加工製品の中で最近汚染頻度が増加しているリステリア(listeria)とサルモネラ(salmonella)に、予備実験結果で効果の現われた２種のアイジワイを混合して、実際の肉加工製品に適用して殺菌及び生育抑制効果を分析した。実験結果、２種のアイジワイ含有卵黄液状０.５％をモデル食品であるグリルウィンノ(商標名、CJ株式会社、大韓民国)ソーセージ製造の時重量対比添加した場合、１５℃の保存温度で１４日保存の時総菌数での有意的な変化は観察されなかったが、アイジワイを無添加した対照群では腐敗状態を間接的に見せてくれる粘質物発生とガス生成による包装材膨脹などが観察されたが、アイジワイを添加した実験群では品質損傷と係わるどんな状態変化も観察されなかったし、良好な品質を現わした。本実験例３を通じて、アイジワイが特定微生物に対する生育抑制効果が非常に優秀だという前記実験例２の結果を、また確認することができた。
【００４６】
実験例４: 本発明のアイジワイの抗菌力測定
大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)及びサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)それぞれに対するワクチンを接種して、各微生物に対して抗菌効果(殺菌及び生育抑制)があるアイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)を含んだ液状のIgYを製造して、これを凍結乾燥して粉末状態で製造した後、免疫酵素反応法を基礎としたエライサー法を通じて、各抗原すなわち大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)及びサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)に対する特異病原性菌に抗菌力有無を確認して、その後大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)菌株がそれぞれ１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌ含有されている生理食塩水(Saline)溶液に、前記大腸菌O１５７：H７用粉末２.３４ｍｇ／ｍｌ、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)用IgY粉末０.９ｍｇ／ｍｌ、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)用IgY粉末０.６３ｍｇ／ｍｌをそれぞれ添加して、経過時間別で３種の病原性菌の殺菌及び生育抑制効果をそれぞれの菌数減少で観察及び分析した。
【００４７】
この時ターゲット微生物の選択を除き前記実施例１の方法によってアイジワイ粉末を製造した。その結果、大腸菌O１５７：H７用IgY粉末の場合１０２(ＣＦＵ／ｍｌ)の殺菌効果を持つことが現われたし(殺菌率９９％;図７)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)用IgY粉末の場合１０１(ＣＦＵ／ｍｌ)の殺菌効果を持つことが現われたし(殺菌率９０％;図８)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)用IgY粉末の場合１０１(ＣＦＵ／ｍｌ)の殺菌効果を持つことが現われた(殺菌率９０％;図９)。
【００４８】
本発明のアイジワイが大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)に作用して死滅または生育抑制させる原理を調べようと電子顕微鏡で前記アイジワイを処理した大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)を観察した。その結果、図１０の拡大した姿を通じて分かるようにアイジワイが大腸菌O１５７：H７(Escherichia coli O１５７: H７)の細胞膜に付着して一定時間略４時間経過後、病原性菌の細胞膜が変形されて死滅または生育抑制効果が発生されることが確認された。
【００４９】
前記実施例１の第２工程によって分離したアイジワイ水溶液を凍結乾燥して得たアイジワイ粉末を、グリルウィンノ(商標名、CJ株式会社、大韓民国)ソーセージ製造の時、原料重量対比添加して０.０５％を添加して３５℃のインキュベーター(微生物培養器)で７日経過の後、微生物(病原性菌、品質阻害微生物)の生育による見掛け変化をそれぞれ比べて観察及び分析した。
【００５０】
その結果、３５℃で７日経過の時、アイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)無添加製品(A:無処理群)は図１１から分かるように品質損傷微生物の生育によって組職が完全に破壊されるが、アイジワイ添加群(B:アイジワイ処理群)の場合には微生物が殺菌されて生育が抑制されて形態が完全に維持される状態を現わしており、本発明のIgYの優秀な抗菌効果を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明１２種の病原性菌に対する抗菌活性を持ったアイジワイを含む病原性細菌殺菌用及び生育抑制用組成物は、肉ベース加工食品で食中毒及び腐敗を発生させる細菌に対してすぐれた抗菌効果があるだけではなく低温及び非熱処理条件で病原性菌及び腐敗菌を効果的に殺菌及び生育抑制することができるすぐれた効果があるので、商業的天然殺菌素材で多様に使われることができて食品殺菌産業上非常に優秀な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は本発明のアイジワイの製造工程を示した図面
【図２】図２は本発明のアイジワイの抗菌活性力価を示したグラフ
【図３】図３は本発明のアイジワイの酸度及び温度安全性を示したグラフ
【図４】図４は本発明のアイジワイのグリルウィンノソーセージ(Grill Winner sausa ge)での保存期間別(２０℃)殺菌及び生育抑制効果を示したグラフ
【図５】図５は本発明のアイジワイのサルモネラ(Salmonella)菌に対する細胞膜損傷メカニズムを示した図面
【図６】図６は本発明の液状アイジワイのグリルウィンノソーセージ(Grill Winner s ausage)での保存期間別(２０℃)殺菌及び生育抑制効果を観察した写真として、「A」は無処理区で、「B」はアイジワイ処理区を表示する。
【図７】図７は本発明のアイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)の大腸菌O１５７：H７(Escherichia coil O１５７: H７)に対する抗菌効果を示したグラフ
【図８】図８は本発明のアイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)のサルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)に対する抗菌効果を示したグラフ
【図９】図９は本発明のアイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)のサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)に対する抗菌効果を示したグラフ
【図１０】図１０はアイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)の大腸菌O１５７：H７(Escherichia coil O１５７: H７)に対する細胞膜損傷メカニズムを示したグラフ
【図１１】図１１は本発明の液状アイジワイ(IgY、特殊免疫蛋白質)をグリルウィンノソーセージ(Grill Winner sausage)に添加して製造して、３７℃で７日経過後の姿を観察したもので、「A」は無処理区で、「B」はアイジワイ処理区を表示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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