(57)【要約】  本発明は、ａ）（ｉ）モノマーを（ｗ＋ｚ）モル当量；（ｉｉ）式（ＩＸ）の開始剤化合物を１モル当量、その中のＢ３はハロゲンを表し、Ｂ２はＨまたはハロゲンを表し、Ｙ１は抗体またはその断片の残基を付着できるか、そのような基に転換できる基を表し、Ｌはリンカー基を表し、ｙは１，２か３、ｗは少なくとも１でｚは０以上；（ｉｉｉ）複数のモノマーの重合を触媒作用して櫛形ポリマーにすることができる触媒を供与し；そしてｂ）当該触媒につき当該開始剤との組合せで複数のモノマー（ｉ）の重合を触媒させ櫛形ポリマーを製造する工程を含んでいる、櫛形ポリマーを製造するための製造方法を提供する。
2009507980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
櫛形ポリマーを作り出す製造方法であって、
ａ）以下を供与する工程：
（ｉ）（ｗ＋ｚ）モル当量のモノマー；
（ｉｉ）式（ＩＸ）の開始剤化合物の１モル当量、
【化１】
2009507980.tif 000084
式中Ｂ３はハロゲンを表し、Ｂ２はＨまたはハロゲンを表し、Ｙ１は抗体若しくはその断片の残基を付着できる基又はそのような基に転換されうる基を表し、Ｌはリンカー基を表し、ｙは１，２または３で、ｗは少なくとも１そしてｚは０以上であり；
（ｉｉｉ）複数のモノマーの重合を触媒して櫛形ポリマーを作り出すことができる触媒；そして、
ｂ）当該触媒につき当該開始剤との組合せで複数のモノマー（ｉ）の重合を触媒させ櫛形ポリマーを製造する工程を含んでいる上記製造方法。
【請求項２】
請求項１の製造方法で得ることができる櫛形ポリマー。
【請求項３】
Ｂ３、Ｂ２、Ｙ１、Ｌおよびｙが請求項１で定義したものである、式（ＩＸ）
【化２】
2009507980.tif 000085
の開始剤化合物。
【請求項４】
工程（ｂ）で製造された櫛形ポリマーを１つ以上のエフェクター分子のｗ当量および１つ以上の可溶化部分のｚ当量と反応させる工程（ｃ）を更に含み、ｗとｚは請求項１で定義した通りである、請求項３による製造方法。
【請求項５】
請求項４の製造方法で得ることができる櫛形ポリマー。
【請求項６】
少なくとも１つの抗体またはその断片に請求項２または請求項５の櫛形ポリマーを付着させることを含む、少なくとも１つの抗体またはその断片に櫛形ポリマーを付着させるための方法。
【請求項７】
請求項６の方法により得ることができる抗体−櫛形ポリマー複合体。
【請求項８】
式（Ｉａ）または（Ｉｂ）
【化３】
2009507980.tif 000086
を有し、式中ｙ、Ｂ２およびＬは請求項１で定義した通りであり；
ｍは１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０であり、
Ｂ１はハロゲンを示し、
Ａは抗体またはその断片の残基を示し、
Ｙはスペーサー基を示し、
Ｘは１つ以上のエフェクター分子をｗ当量と１つ以上の可溶化部分のｚ当量を含んだ櫛形ポリマー部分を表し、ｗとｚは請求項１で定義した通りである、請求項７による抗体−櫛形複合体。
【請求項９】
Ｘは式ＩＩＩおよびＩＶの成分を順不同で含み、
【化４】
2009507980.tif 000087
式中：ｗとｚは請求項１で定義した通りであり；
Ｔは不在またはリンカー基であり、
Ｗはエフェクター分子であり、
Ｚは水可溶化部分であり、
ＭはＮＨまたはＯであり、
Ｒ１はメチルまたはＨである、
請求項８による抗体−櫛形ポリマー複合体。
【請求項１０】
１種類以上の薬学的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤を伴った請求項７〜９のいずれか一項による抗体−櫛形ポリマー複合体を含んでいる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景および概要）
本発明は抗体にエフェクター分子を結合させる際に使用する化合物に関する。より詳しくは、本発明はエフェクター分子および可溶化部分を付着させた抗体−櫛形ポリマー複合体を含む分子に関する。それに当該分子を製造する方法およびそれらを含む医薬組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
抗体の結合選択性は薬物のようなエフェクター分子をガン細胞のような特定の治療目標に送達するのに使用できる。エフェクター分子は、例えば直接付着（例えば米国特許第５，６７７，４２５号；欧州特許第０９４８５４４号を参照）またはリンカーを介しての付着（例えば米国特許第６，２１４，３４５号を参照）を含む種々な方法を用いて抗体に付着させてもよい。
【０００３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はタンパク質またはポリペプチドに付着させて免疫原性を低下させ、生体内の循環半減期を増加させそして当該タンパク質の溶解性を向上させてもよい。ＰＥＧは櫛形ポリマーとして当該タンパク質に付着させてもよい（例えばＷＯ２００４／１１３３９４を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はエフェクター分子および可溶化部分の両方が付着する新規抗体−櫛形ポリマー複合体を提供する。
【０００５】
本発明はこうして本質的に１つ以上の櫛形ポリマーに結合した１つ以上の抗体からなる化合物を提供し、その中では当該櫛形ポリマーは１つ以上のエフェクター分子および場合により１つ以上の可溶化基を含んでいる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を提供するが：
【０００７】
【化１】
2009507980.tif 000003
式中：ｙは１，２または３
ｍは１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０
Ｂ１はハロゲンを表し
Ｂ２はＨまたはハロゲンを表し
Ａは抗体の残基またはその断片の残基を表し
Ｙはスペーサー基を表し
Ｌはリンカー基を表し
Ｘは１つ以上のエフェクター分子をｗ当量および１つ以上の可溶化部分をｚ当量含んでいる櫛形ポリマー部分を表し、そこではｗは少なくとも１およびｚは０以上である。
【０００８】
好ましくは、式（Ｉａ）は式（ＩＩａ）を有する化合物である。
【０００９】
【化２】
2009507980.tif 000004
【００１０】
好ましくは式（Ｉｂ）は式（ＩＩｂ）を有する化合物である。
【００１１】
【化３】
2009507980.tif 000005
適切にはｍは１または２である。
１つの実施形態ではｙは１である。
好ましくは、本発明で使用されるハロゲンは臭素または塩素である。好ましくは塩素である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書で使用される場合、用語“残基”は当技術分野の当事者であれば良く知っている専門用語のように、抗体の一部または置換反応をしたときに残存するその断片を意味すると理解される。
【００１３】
当該残基Ａには抗体全体の残基およびその機能的に活性断片またはその誘導体が含まれ、それはポリクローナル、モノクローナル、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ’）２断片と前記のいずれかのエピトープ結合断片でありうるがそれだけに限らない。
【００１４】
当該残基Ａには架橋抗体の残基が含まれることは理解されるであろう。当該架橋抗体は当技術分野では良く知られている（例えば米国特許第５，２６２，５２４号を参照）。本明細書で使用される用語“架橋抗体”は接続構造で結合した２，３または４個の抗体またはその断片を称する。当該接続構造は、当該抗体またはその断片を互いに結合することができる分子構造のいずれであってもよいが、例えば接続構造で互いに結合したＦａｂ’断片を含んでいる三および四価単一特異性抗原結合タンパク質につき記述しているＷＯ９２／２２５８３を参照。１つの実施形態では、当該架橋抗体は３個の抗体断片、好ましくは２００５年１２月１日に開示されたＷＯ２００５１１３６０５に記述されているようにＦａｂ’断片を含む。他の実施形態では、当該架橋抗体はＷＯ２００５／０６１００５に記述されているように接続された２つの抗体断片を含む。
【００１５】
抗体には免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子はいずれかのクラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＡ）または免疫グロブリン分子のサブクラスでありうる。
【００１６】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ手法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５〜４９７）、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１９８３，４，７２）およびＥＢＶハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅ等，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｐｐ．７７〜９６、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）”のような技術で知られている方法のいずれかで調製してもよい。
【００１７】
本発明で使用する抗体は、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３（１５）７８４３〜７８４８、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８およびＷＯ２００４／１０６３７７が記述した方法による特異抗体の製造用に選ばれた単一リンパ球から生じた免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡｓのクローニングおよび発現による単一リンパ球抗体法を用いて作り出してもよい。
【００１８】
ヒト化抗体は非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子（例えば米国特許第５，５８５，０８９号）からのフレームワーク領域を含んでいる抗体分子である。
【００１９】
キメラ抗体は、当該軽鎖と重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子区域から構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子でコード化されている抗体である。
【００２０】
本発明で使用する抗体は当技術分野で知られている種々なファージ提示法を用いて生成させることもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２，４１〜５０；Ａｍｅｓ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４，１７７〜１８６；Ｋｅｔｔｅｌｂｏｒｏｕｇｈ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，２４，９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃ等，Ｇｅｎｅ，１９９７，１８７，９〜１８およびＢｕｒｔｏｎ等，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７，１９１〜２８０；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２およびＷＯ９５／２０４０１；そして米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号で開示されたものを含む。単一鎖抗体の製造に関する手法、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているようなものは単一鎖抗体を製造するのに適用することもできる。同じようにトランスジェニックマウスまたは他の哺乳類を含む他の生物はヒト化抗体を発現するのに使用してもよい。
【００２１】
１つの例では、当該抗体断片はＦａｂ’断片で、これは野生型または修飾されたヒンジ領域を保有する。多くの修飾ヒンジ領域は既に例えば米国特許第５，６７７，４２５号、ＷＯ９９１５５４９およびＷＯ９８２５９７１に記述されており、それらは参考で本明細書に組み込まれている。
【００２２】
他の抗体断片にはＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０およびＷＯ２００５００３１７１に記述されたものが含まれる。
【００２３】
適当であれば、本発明で使用する当該抗体断片は単一遊離チオールを、好ましくはヒンジ領域に含有する。
【００２４】
本発明の抗体またはその断片は一般的に抗原へ選択的結合ができる。当該抗原は、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞のような細胞上の細胞表面抗原のような細胞随伴性抗原のいずれでもよく、可溶性抗原でもよい。抗原は、病気または感染の間に上昇制御される抗原のような医学関連抗原のいずれかでもよく、例えば受容体および／またはそれらの相当する配位子のようなものが挙げられる。細胞表面抗原の特定の例には、例えばβ１インテグリンのような接着分子が含まれ、それは例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンまたはＬ−セレクチン、ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原およびＶＥＧＦおよび適切であればその受容体である。可溶性抗原にはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６かＩＬ−１７のようなインターロイキン、例えば呼吸器合胞体ウイルスまたはサイトメガロウイルス抗原のようなウイルス抗原、ＩｇＥのような免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγのようなインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、およびＰＤＧＦ−αとＰＤＧＦ−βのような血小板由来成長因子並びに適したその受容体が含まれる。
【００２５】
本発明で使用するスペーサー基は、当該リンカーと当該抗体またはその断片の間に橋を形成することができる当技術分野の当事者では良く知られた任意の部分（ｍｏｉｅｔｙ）を適切に含む。特に当該スペーサー基Ｙは当該リンカーＬと残基Ａの間に橋を形成することができる当技術分野の当事者に良く知られた任意の部分を適切に含む。１つの例ではＡがシステイン残基を含む抗体またはその断片の残基であれば、相当するスペーサー基Ｙはスクシンイミドが適切である（即ちマレイミド残基のチオール結合を介してのシステイン含有ポリペプチド残基Ａおよびマレイミド窒素原子を通しての当該リンカーとの反応生成物）。
【００２６】
当該リンカー基Ｌは、当該スペーサ基Ｙおよびアミド基のＮ原子の間に橋を形成することができる当技術分野の当事者には知られた任意の部分を適切に含む。Ｌは直鎖または分岐でもよい。典型的なＬの例には：
−（ＣＨ２）ｎ−で、ｎは１，２，３，４，５または６である；
【００２７】
【化４】
2009507980.tif 000006
従って１つの実施形態では、Ｌは−（ＣＨ２）ｎ−である。好ましくは、ｎは２である。他の実施形態では、Ｌは
【００２８】
【化５】
2009507980.tif 000007
を表す。
【００２９】
本発明では、Ｘは１つ以上のエフェクター分子のｗ当量および水可溶化部分のｚ当量を含んでいる櫛形ポリマーを表す。
【００３０】
すなわち、Ｘは式ＩＩＩおよびＩＶの成分を任意の順番で適切に含む。
【００３１】
【化６】
2009507980.tif 000008
式中：
ｗは少なくとも１である。
ｚは０以上である。
Ｔは不在或いはリンカー基である。
Ｗはエフェクター分子である。
Ｚは水可溶化部分である。
ＭはＮＨまたはＯである。
Ｒ１はメチルまたはＨである。
適しているＭはＮＨである。
【００３２】
通常ではｗは１と３００の間である。適切であるのはｗが１と２００の間である。１つの実施形態ではｗは１と１００の間である。１つの実施形態ではｗは１と５０の間である。１つの実施形態ではｗは１と２０の間である。
【００３３】
通常ではｚは０と３００の間である。適切であるのはｚが０と２００の間である。適切であるのはｚが少なくとも１である。１つの実施形態ではｚは１と２００の間である。１つの実施形態ではｚは１と１００の間である。１つの実施形態ではｚは１と５０の間である。１つの実施形態ではｚは１と２０の間である。
【００３４】
Ｘ中に存在する化合物ＩＩＩとＩＶ（即ちｗ＋ｚ）の全数量は少なくとも１つである。通常ではｗ＋ｚは１と３００の間である。１つの実施形態ではｗ＋ｚは１５である。１つの実施形態ではｗ＋ｚは１３である。１つの実施形態ではｗ＋ｚは４１である。１つの実施形態ではｗ＋ｚは９６である。１つの実施形態ではｗ＋ｚは１６５である。１つの実施形態ではｗ＋ｚは２６２である。ｗ＋ｚが４１のとき好ましくはｗは６であり、好ましくはｚは３５である。
【００３５】
適切なリンカーＴ（存在する場合）は当技術分野では良く知られている。特に好ましいリンカーは自壊的リンカーである。自壊的リンカーの例は米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。特に好ましいのは以下の式（Ｖ）を有するリンカーである：
【００３６】
【化７】
2009507980.tif 000009
式中Ｔ１は［ＣＨ２］ｔまたはＣＨ２ＣＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎを表し、ｔは１と１０の間で、ｎは５と１００の間である。１つの実施形態では、Ｔ１は［ＣＨ２］ｔを表す。１つの実施形態では、ｔは５である。１つの実施形態では、Ｔ１はＣＨ２ＣＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎを表す。１つの実施形態では、ｎは５と３０の間で、好ましくは１２または２４である。他の実施形態では、ｎは４０と１００の間で、好ましくは４０と８０の間である。
【００３７】
当該エフェクター分子Ｗは単一エフェクター分子または単一部分を形成するように結合した２個以上の当該分子を含むのが良いことは理解されるであろう。当該部分の例には分岐接続構造で結合したエフェクター分子が含まれる。
【００３８】
Ｗが１より大きい場合、各Ｗは同じであるかまたは異なる場合がありうるのも理解されるであろう。
【００３９】
本発明で使用されるエフェクター分子にはヒトを含む動物の治療において薬効のある、または診断に使用するのに適した生物活性化合物が含まれる。当該分子には核酸（例えばＤＮＡやＲＮＡ）、炭化水素、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子および米国特許第６，２１４，３４５号、欄８、列４９から欄９列１３中に一覧表とされたような他の薬物が含まれる。
【００４０】
エフェクター分子の例には細胞に害（例えば殺す）となる薬剤のいずれかを含む細胞毒または細胞毒性薬剤が含まれてもよい。例としては、副溝結合剤（例えばＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ，２００４，１４，１６９３〜１７２４における専門家の意見で与えられた化合物を参照）、コンブレスタチン、ドラスタチン、アウリスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体または同族体が含まれる。１つの実施形態では、当該細胞毒物はＷＯ０３０９７６３５に記載されている３−置換１−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−［縮環インドール−５−イル（アミン誘導）］化合物またはその類似体の残基である。１つの実施形態では、当該細胞毒物は１−（クロロメチル）−３−［（２Ｅ）−３−（４−メトキシフェニル）−２−プロペノイル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−アミンの残基である。
【００４１】
エフェクター分子には、これだけに限らないが代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシンまたはデュオカルマイシン）および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含まれる。
【００４２】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎと９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８のようなキレート化放射性核種；またはこれに限らないがアルキルホスフォコリン、トポアイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンのような薬物が含まれてもよい。
【００４３】
他のエフェクター分子にはタンパク質、ペプチドおよび酵素が含まれる。関心のある酵素には、これだけに限らないがタンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。関心があるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドには、これだけに限らないが免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素のような毒素、インスリンのようなタンパク質、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子または組織プラスミノーゲン活性化因子、例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチンのような血栓性溶解剤または血管新生阻害剤、またはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）または他の成長因子および免疫グロブリンのような生物反応修飾因子が含まれる。
【００４４】
他のエフェクター分子には例えば診断に有用な検出可能な物質が含まれても良い。検出可能な物質の例には種々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影法にて使用）および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断法として使用する抗体に複合することができる金属イオンについては一般的に米国特許第４，７４１，９００号を参照。適した酵素には西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適した補欠分子族にはストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンが含まれる；適した蛍光物質にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルおよびフィコエリスリンが含まれる；適した発光物質にはルミノールが含まれる；適した生物発光物質にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれる；そして適した放射活性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが含まれる。
【００４５】
他のエフェクター分子には本発明の化合物の半減期を延長および／または免疫原性を低下させるのに用いることができるタンパク質またはポリマー或いは他の化合物が含まれても良い。適したタンパク質の例にはアルブミンおよびアルブミン結合タンパク質或いはアルブミン結合脂肪酸が含まれる。適しているポリマーの例には以下に記したもので、特に随意に置換された直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリ（エチレングリコール）のようなポリオキシアルキレンポリマーが含まれる。
【００４６】
本発明で使用する水可溶化部分Ｚには、酸、アミン、四級アミンのような荷電種（陽および陰）、アミノ酸のような両性イオン種、ポリエチレングリコールのようなポリマー、モノまたはポリヒドロキシアルカン、アルコール類（モノ、ジおよびトリ）および糖類のように当技術分野では既知の適した可溶化部分のいずれもが含まれる。
【００４７】
適したポリマーの例には、例えば随意に置換された直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー或いは分岐か非分岐多糖類、例えば乳糖、アミロース、デキストランまたはグリコーゲンのようなホモ−またはヘテロ−多糖類、が含まれる合成または天然由来の実質的に水可溶性で、実質的に非抗原性ポリマーが含まれる。上記合成ポリマー上に存在できる特定の随意的置換基には１個以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例には随意的置換した直鎖または分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）のような随意的置換ポリ（エチレングリコール）が含まれる。
【００４８】
好ましくは、当該ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレンオキシドである。一般的に付着するＰＥＧ部分に関しては、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｔｏｎ  ＤＣ；ａｎｄ  “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで参照できる。
【００４９】
当該ポリマーの大きさは望みに従って変化してよいが、一般的には平均分子量は１５０から１００，０００Ｄａ、好ましくは２，０００から５０，０００Ｄａ，より好ましくは１０，０００から４０，０００Ｄａ、そして更により好ましくは２０，０００から４０，０００Ｄａの範囲である。
【００５０】
ｚが１より大きいとき、各Ｚは同じまたは異なる場合がありうることは理解されるであろう。
【００５１】
１つの実施形態では、当該水可溶化部分Ｚは：
【００５２】
【化８】
2009507980.tif 000010
である。
【００５３】
１つの実施形態では、当該水可溶化部分Ｚは：
【００５４】
【化９】
2009507980.tif 000011
である。
【００５５】
１つの実施形態では、当該水可溶化部分Ｚは：
【００５６】
【化１０】
2009507980.tif 000012
である。
【００５７】
１つの実施形態では、当該水可溶化部分Ｚは：
【００５８】
【化１１】
2009507980.tif 000013
である。
【００５９】
１つの実施形態では、当該水可溶化部分Ｚは：
【００６０】
【化１２】
2009507980.tif 000014
である。
【００６１】
同じように本発明で提供されるのは抗体の付着に適した有益な中間体化合物である。前記化合物は本質的に以下の要素からなる：１つ以上のエフェクター分子および随意的に１つ以上の可溶化基および残基Ａを付着できるか、そのような基に転換することができる基を含んでいる櫛形ポリマー。
【００６２】
従って本発明は式（ＶＩ）による化合物を提供する：
【００６３】
【化１３】
2009507980.tif 000015
式中：Ｙ１は当該残基Ａを付着することができるか、当該基に転換できる基を表す。
Ｌ、Ｘ、Ｂ１、Ｂ２およびｙは本明細書にて前記したようなものである。
Ｙ１はＬとＡを結合するのに適し、当技術分野で知られている基或いはそのような基に転換するのに適した基である。例えばＹ１は保護された誘導体、即ち当該化合物に存在する他の基とＹ１が反応するのを防ぐもう１つの基、‘保護基’で覆われたものでよい。当該保護された誘導体はＡを付着できる基に容易に転換できる。そのような基の例は保護されたチオールで、当該保護基は簡単に除去できて残基Ａと反応するように遊離チオールを供する。当該保護基の除去の条件は、櫛形ポリマーの成分の生物的活性が影響されないようなものが好ましい。適切な保護チオールは当技術分野で知られており、チオールエーテル類（例えばトリチル保護）、チエステル類（例えばアセチルまたはプロピニル保護）、チオカーボネート類、チオカルバメート類およびスルフェニル類が含まれる。
【００６４】
当該Ｙ１は抗体またはその断片中に位置するアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシまたはカルボキシル基のいずれかを通じて残基Ａに付着してもよい。当該アミノ酸は自然、例えば抗体断片に存在するものでよく、組換えＤＮＡ法を用いた操作で抗体またはその断片に入れたものでもよい（例えば米国特許第５，２１９，９９６号および米国特許第５，６７７，４２５号を参照）。本発明の好ましい態様では、２つの基は抗体またはその断片中、好ましくはヒンジに位置するシステイン残基のチオール基を通じて共有結合する。当該共有結合は一般的にジスルフィド結合または硫黄−炭素結合、好ましくは後者であろう。１つの例では、付着点としてチオール基を利用する場合、適当に活性化された基、たとえばマレイミドのようなチオール選択性誘導体を使用するのがよい。
【００６５】
Ｙ１はＷＯ２００４／１１３３９４のページ９から１１に一覧表とされたもののいずれかを含んだ適切な基であってもよい。
【００６６】
Ｙ１は−Ｓ−Ｓ−Ｒ２でよく、Ｒ２は直鎖か側鎖Ｃ１〜６アルキルまたは置換芳香族のいずれかである。
【００６７】
【化１４】
2009507980.tif 000016
【００６８】
本明細書で使用する用語“Ｃ１〜６アルキル”は１から６個の炭素原子を含む直鎖および分岐アルキル基を称する。当該基はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルである。好ましくはＲ２はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、二級ブチルおよび三級ブチルから選ばれる。好ましいＲ２は三級ブチルである。
【００６９】
好ましい特徴は、Ｙ１が
【化１５】
2009507980.tif 000017
を示す。
【００７０】
従って、上記式（ＶＩ）の例示的化合物は式（ＶＩＩ）の化合物で示される：
【００７１】
【化１６】
2009507980.tif 000018
【００７２】
好ましい特徴は、Ｙ１はマレイミドの窒素原子を介して当該分子の残部に付着したマレイミド誘導体を示す。従って、上記式（ＶＩ）の１つの例示的化合物は式（ＶＩＩＩ）の化合物で表される。
【００７３】
【化１７】
2009507980.tif 000019
【００７４】
本発明の更なる態様によれば、１つ以上の薬学的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤との組合せた式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００７５】
本発明による医薬組成物は経口、口腔、非経口、鼻腔、局所、点眼または直腸投与に適した形状或いは吸入または吹入による投与に適した形状をとる。
【００７６】
経口投与に関して、当該医薬組成物は、例えば結合剤（例えば前ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば乳糖、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉またはグリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容できる賦形剤とともに従来手段で調製される錠剤、トローチまたはカプセルの形状をとるのがよい。当該錠剤は当技術分野では良く知られている方法で被覆するのがよい。経口投与用の液状製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形状をとってもよく、または使用前に水か他の適当な媒体で構成するための乾燥製品として供される。当該液状製剤は懸濁剤、乳化剤、非水系媒体または保存剤のような薬学的に許容できる添加剤とともに従来手段で調製するのがよい。当該調製物は緩衝塩、香味剤、着色剤または甘味剤を適宜、含有してもよい。
【００７７】
経口投与の調製は当該活性化合物の放出を制御するために適切に調合してよい。
【００７８】
口腔投与に関しては、当該組成物は従来のやり方で調合した錠剤またはトローチの形状をとるのがよい。
【００７９】
式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物は注射による非経口投与用、即ち急速静注または点滴用に処方されるであろう。注射用の処方は単位容量形、即ちガラスアンプルまたはマルチドーズ用容器、即ちガラスバイヤルで提供される。注射用の組成物は油状か水溶性媒体中で懸濁液、溶液または乳化物のような形状をとるか、懸濁剤、安定化剤、保存剤および／または分散剤のような製剤化剤を含むのがよい。或いは当該活性成分は使用前に適した媒体、例えば発熱物質のない滅菌水と組成物を作る粉体形状であってもよい。
【００８０】
上記処方に加えて、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物は持続性製剤としても処方化される。当該長期作用型処方は埋め込みまたは筋肉内注射で投与してもよい。
【００８１】
鼻腔投与または吸入投与用に関しては、本発明による化合物は、例えばジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガス或いはガス混合物のような適した推進剤を使用して、加圧したパックまたは噴霧器によるエアロゾル噴霧の形状で容易に送達することができる。
【００８２】
当該組成物は、希望により、当該活性成分を含有する１単位以上の単位服用量を含むパックまたはディスペンサー装置で提供されてもよい。当該パックまたはディスペンサー装置には投与に関する使用説明書をつけるのがよい。
【００８３】
局所投与に関しては、本発明による化合物は１種類以上の薬学的に許容できる担体中に懸濁または溶解した当該活性成分を含有する適切な軟膏に使いやすいように処方するのがよい。特定な担体には、例えば鉱油、液状石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化蝋および水が含まれる。或いは本発明による化合物は１種類以上の薬学的に許容できる担体中に懸濁または溶解した活性化合物を含有する適切なローション中に処方されるのがよい。特定な担体には、例えば鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノールおよび水が含まれる。
【００８４】
眼投与用では、本発明による化合物は、例えば硝酸フェニル水銀、塩化ベンジルアルコニウムまたは酢酸クロルヘキシジンとして挙げられる殺菌剤または殺真菌剤のような防腐剤の添加または無添加のどちらかにおいて、等張性で、ｐＨ調整した滅菌食塩水中でミクロイオン化した懸濁液として使いやすく処方されているのがよい。或いは点眼投与用では化合物はワセリンのような軟膏に処方されていてもよい。
【００８５】
直腸投与用では、本発明の化合物は座薬として処方されるのが都合よいであろう。これらは当該活性化合物を室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤と混合して調製でき、それ故直腸内では溶融して当該活性成分を放出することになる。当該物質には、例えばココアバター、ミツロウおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【００８６】
特定の疾患の予防または治療で要求される本発明の化合物の量は選んだ化合物および治療する患者の病状によって変動するであろう。しかしながら一般的に、１日投与量は薬１０ｎｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ、典型的には１００ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、例えば経口または口腔投与では約０．０１ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇ体重であり、約非経口投与では約１０ｎｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、そして鼻腔投与または吸引か吸入での投与では約０．０５ｍｇから約１０００ｍｇ、例えば約０．５ｍｇから約１０００ｍｇの範囲がよい。
【００８７】
本発明の化合物は本明細書で供した実施例におけるものと類似した方法を用いて調製できる。
【００８８】
典型的には式（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物は、式（ＶＩ）の化合物に当技術分野の当事者であれば良く知っている手順を用いる残基Ａの付着を含む製法で調製されるであろう。式（ＶＩ）の化合物を用いて式（Ｉｂ）の化合物を製造する場合、ｙ＝１であることは理解されよう。
【００８９】
当該櫛形ポリマー部分Ｘは当技術分野で知られた適切な重合方法のいずれかを用いて調製されるであろう。適切な方法にはリビングフリーラジカル重合系が含まれ、例えばＷＯ９６／３０４２１およびＷＯ９７／１８２４７を参照。好ましくは使用される重合方法は、ＷＯ２００４／１１３３９４、ＷＯ９７／４７６６１およびＷＯ９９／２８３６２に記載されているようなリビングラジカル重合である。場合により、当該重合には、例えばジスルフィドのような非重合性スカベンジャー剤も含まれてもよい。
【００９０】
従って本発明は：
ａ）以下を供し：
（ｉ）モノマーの（ｗ＋ｚ）モル当量
（ｉｉ）式（ＩＸ）の開始剤化合物の１モル当量
【００９１】
【化１８】
2009507980.tif 000020
式中、Ｂ３はハロゲンで、Ｙ１、Ｌ、Ｂ２、ｙおよび（ｗ＋ｚ）は前に定義したようなもの；
（ｉｉｉ）複数のモノマーの重合を触媒することができ櫛形ポリマーを製造する触媒；そして
ｂ）当該開始剤との組合せで当該触媒で複数の当該モノマー（ｉ）の重合を触媒して当該櫛形ポリマーを製造する工程を含んだ櫛形ポリマーを製造する製造方法も提供する。
【００９２】
式（ＩＸ）の化合物は新規化合物で、それゆえ本発明の更なる特徴を構成する。
【００９３】
式（ＩＸ）の化合物は式（Ｘ）の化合物と式（ＸＩ）の化合物を反応させることを含む製造方法で調製されるであろう：
【００９４】
【化１９】
2009507980.tif 000021
式中、Ｑは適している脱離基である。当該脱離基は典型的にはハロゲン原子で、例えばクロロである。
【００９５】
当該製造方法の工程（ｉ）で使用するモノマーは当該櫛の‘骨格’の製造に使用するいずれのモノマーでよく、それにエフェクターおよび可溶化部分をその後に付着させるのがよい。当該モノマーの例は：
【００９６】
【化２０】
2009507980.tif 000022
【００９７】
本発明はエフェクター分子および場合により可溶化部分を含んでいる櫛形ポリマーを製造する製造方法も提供するが、前記方法は更に工程（ｂ）で製造された櫛形ポリマーが１種類以上のエフェクター分子のｗ当量と１種類以上の可溶化部分のｚ当量を反応させる工程（ｃ）を含んでおり、ｗとｚは前に説明したものである。上記方法の工程（ｂ）と工程（ｃ）で製造される櫛形ポリマーは新規化合物で、本発明の更なる特徴を構成している。
【００９８】
本発明は少なくとも１つの抗体またはその断片を付着した櫛形ポリマーを製造する製造方法も提供するが、前記製造方法は工程（ｂ）または工程（ｃ）にて製造された櫛形ポリマーを少なくとも１つの抗体またはその断片に付着することを含んでいる。本製造方法で製造された抗体−櫛形ポリマー複合体は新規化合物で、本発明の更なる特徴を構成している。
【００９９】
好ましくは工程（ｃ）にて使用するエフェクター部分は式Ｈ２Ｎ−Ｔ−Ｗを有するが、そこでのＴおよびＷは前に定義したようなものである。ここで提示したＴは好ましくは上で表現したような式（Ｖ）を有する。
【０１００】
好ましくは、工程（ｃ）で使用する可溶化部分は式Ｈ２Ｎ−Ｚを有し、Ｚは上で定義したようなものである。
【０１０１】
好ましくは工程（ｃ）で使用する可溶化部分は以下の式を有する：
【０１０２】
【化２１】
2009507980.tif 000023
【０１０３】
或いは、本発明の製造方法では工程（ｉ）で使用されるモノマーはエフェクターおよび／または可溶化部分を既に含んでいてもよい。適切であるモノマーは当技術分野では良く知られていて、前に定義したＺ、ＴおよびＷ部分を含むであろう。当該モノマーが当該エフェクター部分を含む１つの例では、当該モノマーは以下の式を有する：
【０１０４】
【化２２】
2009507980.tif 000024
【０１０５】
当該モノマーが当該可溶化部分を含む１つの例では、当該モノマーは以下の式を有する：
【０１０６】
【化２３】
2009507980.tif 000025
式中Ｒ１、Ｍ、Ｔ、ＷおよびＺは全て前に定義したようなものである。
【０１０７】
当該製造方法の工程（ａ）で使用する触媒は当技術分野で知られた適切な触媒のいずれかである。当該触媒の例はＷＯ９６／３０４２１、ＷＯ９７／１８２４７、ＷＯ２００４／１１３３９４、ＷＯ９７／４７６６１およびＷＯ９９／２８３６２に供せられている。典型的には当該触媒は遷移金属塩で、その遷移金属は１式量の酸化状態と有機ジイミンにより酸化させられることができる酸化状態を有する。当該触媒は混合物でありうることは理解されるであろう。適切には触媒はＣｕ（Ｉ）ＣｌおよびＮ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン（ＮＭＰＩ）の混合である。適切には当該触媒は式（ＩＸ）の開始剤化合物：Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ：ＮＭＰＩが１：１：２の比率で使用される。
【０１０８】
当該製造方法の工程（ｉ）で必要なモノマーの量は当該ポリマーで必要とされる単位の数に依存する。例えば、１５単位ポリマーが必要とされる場合、モノマーの開始剤との比は１５：１を使用してもよい。ポリマーの典型的な長さは１〜３００単位範囲にある。１つの好ましい実施形態では当該単位長さは４１である。
【０１０９】
本発明による化合物の調製用に前に説明した製造方法のいずれから得られる混合生成物の場合、望ましい生成物は沈殿、透析、分子量ろ過、ゲル浸透クロマトグラフィー；カチオンまたはアニオン交換；分取用ＨＰＬＣ、または適切な溶媒系と組合せたシリカかアルミナを用いるカラムクロマトグラフィーのような従来法により、適切な段階にてそれらから分離できる。
【０１１０】
上記合成順序のいずれかにおいて、関与する分子のいずれかにある感受性または反応性基を保護するのが必要および／または望ましいであろう。これはＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｅｄ．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９７３およびＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ＆  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９９に記載されているような従来の保護基により達成されるであろう。当該保護基は当技術分野で知られている方法を用いていずれか都合の良い後続段階で除去されるであろう。
【０１１１】
本発明は本質的に以下の要素からなる化合物も提供する：エフェクターおよび場合により可溶化部分と抗体の付着に適した櫛形ポリマー。そこで他の態様では、本発明はエフェクター分子、可溶化部分およびＡが残基である抗体またはその断片の付着のための有益な中間体である新規化合物を提供する。そこで、本発明は式（ＸＩＩ）の化合物も提供する：
【０１１２】
【化２４】
2009507980.tif 000026
【０１１３】
適切には式（ＸＩＩ）の化合物は式（ＸＩＩＩ）を有している。
【０１１４】
【化２５】
2009507980.tif 000027
【０１１５】
適切には式（ＸＩＩＩ）の化合物は式（ＸＩＶ）を有している。
【０１１６】
【化２６】
2009507980.tif 000028
【０１１７】
式ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶの化合物は上記方法の工程（ｂ）の生成物の例である。
【０１１８】
以下の非限定的実施例が本発明を表している。
【実施例】
【０１１９】
開始剤の合成
【０１２０】
【化２７】
2009507980.tif 000029
【０１２１】
塩酸２−（ｔ−ブチルジチオ）−エチルアミン（ＪＡＣＳ、（１９６１）、８３、４４１４〜１７に記載された合成法）（５．１０１ｇ、０．０２５モル）およびジイソプロピルエチルアミン（８．１６ｇ、０．０６３モル）のジクロロメタン（１００ｍｌ）の溶液に０℃で１０分間かけて塩化３−（ジクロロメチル）ベンゾイル（５．９２９ｇ、０．０２７モル）のジクロロメタン（２０ｍｌ）溶液を添加した。当該溶液を０℃で半時間攪拌し、そののち室温まで温めた。当該反応物を０．１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍｌ）および水（１００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、当該溶媒を真空下で除去した。得られた残留物は酢酸エチル２０％とヘキサン８０％で溶出するシリカクロマトグラフィーで精製すると、無色固体８．５２ｇ、９６％で生成物を生じた。
【０１２２】
【化２８】
2009507980.tif 000030
【０１２３】
重合の手順
【０１２４】
【化２９】
2009507980.tif 000031
【０１２５】
ポリマーＣについて典型的な合成を説明する。
反応はゴム製隔膜で封鎖したシュレンク管中で行った。Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ（０．１６ｇ、０．００１６４モル）を当該反応管に加え、次に３回の連続的な真空、窒素吹き込み循環で脱酸素を行った。二番目のシュレンク管に開始剤（０．５８ｇ、０．００１６４モル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレート（ＮＨＳＭＡ）（１５．０ｇ、０．０８１９モル）、メシチレン（３．０ｍＬ）およびジメチルスルホキシド（３０ｍＬ）を加え、当該混合物を窒素吹き込み３０分間で脱酸素を行った。メシチレン（１ｍｌ）は１ＨＮＭＲから転換を計算する際の標準標識として入れる。当該溶液を１回完全に脱ガスし、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン（０．５１ｍＬ、０．００３２８モル）を事前に乾燥した気密性注射器で塩化銅を含有するシュレンク管に添加した。二番目のシュレンク中の溶液をそののち窒素パージしたステンレス鋼製カニューレを介して当該触媒含有シュレンクに加え、当該反応混合物を直ちに前もって加熱して１００℃に設定した油浴に設置した。試料は脱酸素した気密注射器を用いて取出し、直ちに液体窒素中にて冷凍して冷やした。当該反応は急速な冷却で停止し、次いで空気に曝した。ポリマーは大量のアセトンを用いるアセトンからの数多い沈殿によりジメチルスルホキシドを洗い流して精製した。
【０１２６】
ポリマーＡ
Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ  ０．５４ｇ、０．００５４６モル、開始剤１．９２ｇ、０．００５４６モル、ＮＨＳＭＡ  １５．０ｇ、０．０８１９モル、ＤＭＳＯ  ３０ｍＬ、メシチレン  ３ｍＬ、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン  １．７０ｍＬ、０．０１０９モル。
ポリマーＢ
Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ  ０．２０ｇ、０．００２０４モル、開始剤  ０．７２ｇ、０．００２０４モル、ＮＨＳＭＡ  １５．０ｇ、０．０８１９モル、ＤＭＳＯ  ３０ｍＬ、メシチレンン  ３ｍＬ、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン  ０．６４ｍＬ、０．００４０９モル。
ポリマーＣ
Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ  ０．１６ｇ、０．００１６４モル、開始剤  ０．５８ｇ、０．００１６４モル、ＮＨＳＭＡ  １５．０ｇ、０．０８１９モル、ＤＭＳＯ  ３０ｍＬ、メシチレン  １ｍＬ、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン  ０．５１ｍＬ、０．００３２８モル。
ポリマーＤ
Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ  ０．０８ｇ、０．０００８２モル、開始剤  ０．２９ｇ、０．０００８２モル、ＮＨＳＭＡ  １５．０ｇ、０．０８１９モル、ＤＭＳＯ  ３０ｍＬ、メシチレン  １ｍＬ、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン  ０．２６ｍＬ、０．００１６４モル。
ポリマーＥ
Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ  ０．０７ｇ、０．０００７３モル、開始剤  ０．２６ｇ、０．０００７３モル、ＮＨＳＭＡ  ２０．０ｇ、０．１０９２モル、ＤＭＳＯ  ４０ｍＬ、メシチレン  １ｍＬ、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン  ０．２３ｍＬ、０．００１４６モル。
ポリマーＦ
Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ  ０．０３６ｇ、０．０００３６モル、開始剤  ０．１３ｇ、０．０００３６モル、ＮＨＳＭＡ  ２０．０ｇ、０．１０９２モル、ＤＭＳＯ  ４０ｍＬ、メシチレン  １ｍＬ、Ｎ−（ｎ−プロピル）−２−ピリジルメタンイミン  ０．１１ｍＬ、０．０００７３モル。
【０１２７】
【表１】
2009507980.tif 000032
【０１２８】
【化３０】
2009507980.tif 000033
【０１２９】
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．８ｍＬ、１０．３５ミリモル）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中で攪拌しているＮ−Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロン酸（２ｇ、５．６７ミリモル）（Ｂａｃｈｅｍ社より）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７８ｇ、６．７８ミリモル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（１．４ｇ、６．８ミリモル）の混合物に加え、２時間攪拌した。当該反応混合物はセライトを通過させてろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。当該生成物はエーテルから結晶化し、ろ過し、エーテルで数回洗浄して乾燥すると２．５ｇ（９８％）が生じた。
【０１３０】
【化３１】
2009507980.tif 000034
【０１３１】
【化３２】
2009507980.tif 000035
【０１３２】
ＤＣＭ−ＭｅＯＨ、２：１（１５０ｍＬ）中にあるＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ（５．３２ｇ、１０．７０ミリモル）（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，２００２，１３，８５５〜８６９に記載されているように調製），ＥＥＤＱ（５．３２ｇ，２１．５４ミリモル）およびｐ−アミノベンジルアルコール（２．６５ｇ、２１．５０ミリモル）の混合物を終夜攪拌した。当該反応混合物を酢酸エチルで希釈し、当該固体生成物を粉末化、ろ過し、酢酸エチルで数回の後ＤＣＭで洗浄し、乾燥すると５．０５（７８％）を生じた。
【０１３３】
【化３３】
2009507980.tif 000036
【０１３４】
【化３４】
2009507980.tif 000037
【０１３５】
２０％のピペリジン−ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を攪拌している中間体１ｂ（１ｇ、１．６６ミリモル）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に加え、当該混合物を２時間攪拌した。当該溶媒を除去し、当該残留物を水とＤＣＭ間で分配した。当該水相はＤＣＭで３回洗浄したのち濃縮し、凍結乾燥すると０．６２ｇ（９８％）を生じた。
【０１３６】
【化３５】
2009507980.tif 000038
【０１３７】
【化３６】
2009507980.tif 000039
【０１３８】
中間体１ｃ（０．５ｇ、１．３１６ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、室温で攪拌し、そして中間体１ａ（０．５９２ｇ、１．３１６ミリモル）およびＤＩＰＥＡを連続的に加えた。当該反応混合物を３時間攪拌し、当該混合物を氷水中に攪拌しながら投入し、そして沈殿生成物をろ過分離し、水で数回洗浄し、乾燥すると０．７３ｇ（７８％）生じた。
【０１３９】
【化３７】
2009507980.tif 000040
【０１４０】
【化３８】
2009507980.tif 000041
【０１４１】
中間体１ｄ（０．５ｇ、０．７０ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）中で、当該懸濁物を加温して溶解した。当該透明溶液をそののちＮ２下で攪拌し、７−イソシアナト−４−メチル−クロメン−２−オン（０．２２ｇ、１．０９ミリモル）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９２，２００，４００〜４０４に記載されているように調製）を加え、そして当該反応混合物をＮ２下暗中で一夜攪拌した。当該固化した反応混合物をＤＣＭ中で完全にダイジェストし、ろ過し、ＤＣＭそののちエーテルで数回洗浄し、そして乾燥すると０．５７ｇ（９０％）を生じた。
【０１４２】
【化３９】
2009507980.tif 000042
【０１４３】
【化４０】
2009507980.tif 000043
【０１４４】
中間体１ｅ（０．５７ｇ、０．６２ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に懸濁し、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液（３ｍＬ）を加え、当該混合物を室温で２．５時間攪拌した。その間、当該出発原料は次第に溶解して透明な溶液を形成する。当該混合物を減圧下ロータリーエバポレーターにかけ、当該粗残留物をＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ、９：１で粉末化し、ろ過し、同じ溶媒で洗浄して乾燥すると０．４２ｇ（９７％）を生じた。
【０１４５】
【化４１】
2009507980.tif 000044
【０１４６】
【化４２】
2009507980.tif 000045
【０１４７】
アセトニトリル中の１−（クロロメチル）−３−［（２Ｅ）−３−（４−メトキシフェニル）−２−プロペノイル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−アミン（５５ｍｇ、０．１４ミリモル）（ＷＯ０３０９７６３５に記載されたように調製）をトルエン中２０％ホスゲン（１．５ｍＬ）で１．５時間処理した。当該得られた透明溶液を減圧下蒸発させて乾燥物とし、２回無水ＤＣＭで共沸させ、真空系に１時間放置した。当該粗生成物をアセトニトリル（４ｍＬ）中に再溶解し、１ｄ（１００ｍｇ、０．１４ミリモル）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液に滴下で加えたあと、水酸化ナトリウム上真空で乾燥しておいたＤＭＡＰ（１７０ｍｇ、１．３９ミリモル）を加え、当該反応混合物を２．５時間攪拌した。Ｔｌｃ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ、９：１）は当該生成物の形成および幾つかの未反応出発原料ペプチドを示した。当該半固体を氷水中に投入し、当該黄色固体をろ過して集め、氷水で数回洗浄し、そして空気吸引で乾燥した。当該粗生成物のＬＣ／ＭＣは生成物と未反応ペプチドの比が２：１であることを示した。これをＤＭＦに溶解し、目的生成物は分取用ＴＬＣ（シリカゲル厚さ１ｍｍ）を用いＤＣＭ−ＭｅＯＨ、９：１で分離すると、黄色固体の生成物を生じた（６０ｍｇ、３８％）。
【０１４８】
【化４３】
2009507980.tif 000046
【０１４９】
【化４４】
2009507980.tif 000047
【０１５０】
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中２０％ピペリジンを２ａ（６０ｍｇ、５２．９８ミリモル）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に加え、当該反応混合物を２時間攪拌するとＴｌｃ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ、９：１）が当該出発原料は全て消費されたことを示した。全ての揮発分をロータリーエバポレーションで除去し、当該残留物をＤＣＭ−エーテル、１：１でダイジェストし、ろ過し、同じ溶媒で数回洗浄して乾燥すると４５ｍｇ（９３％）が生じた。
【０１５１】
【化４５】
2009507980.tif 000048
【０１５２】
【化４６】
2009507980.tif 000049
【０１５３】
Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから得たＮ−Ｆｍｏｃ−アミド−ｄＰＥＧ（登録商標）１２Ａｃｉｄ（１．０ｇ、１．１９ミリモル）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１５０ｍｇ、１．３ミリモル）、ＤＣＣ（２７０ｍｇ、１．３１ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（５１７μＬ、２．９７ｍｍｌ）を加え、当該反応混合物を終夜攪拌した。ＬＣ／ＭＳは５０％のみ反応で、より多くの試薬の添加および攪拌の延長では改善しなかった。そこで、当該固体をろ過して分離し、濾液を重炭酸塩溶液で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）して濃縮した。ＤＣＭ−ＭｅＯＨの２０：１を用いたカラムクロマトグラフィーが純粋な生成物（０．３５５ｇ、３２％および回収した出発原料に基づくと６０％）を与えた。そののち当該カラムをＭｅＯＨで溶出すると未反応出発原料（０．４７ｇ）が回収された。
【０１５４】
【化４７】
2009507980.tif 000050
【０１５５】
【化４８】
2009507980.tif 000051
【０１５６】
３ａ（０．３５５ｇ、０．３７９ミリモル）のＤＭＦ溶液に１ｃ（０．１４４ｇ、０．３７９ミリモル）、次にＤＩＰＥＡ（１６５μＬ、０．９５ミリモル）を加え、当該反応混合物を一夜攪拌した。ＬＣ／ＭＳは塩基性媒質が当該生成物の幾らかについてＦｍｏｃ保護基の加水分解を起こし、目的の生成物とともに幾らかの無保護化アミンの混合物を与えたことを示した。氷水を加え少量の白色固体をろ過して分離し、当該濾液を凍結乾燥した。当該半固体物を水−アセトニトリル、１：１（１０ｍＬ）に溶かし、重炭酸ナトリウム（５０ｍｇ、０．６ミリモル）およびＦｍｏｃ−Ｏ−Ｓｕ（１５０ｍｇ、０．４５ミリモル）とともに２０分間攪拌した。ＬＣ／ＭＳは反応の終了を示し、１種類の主なる生成物を示した。全ての非溶解性物質をろ過で除去し、当該濾液は濃縮し、Ｃ１８カラムに載せ、最初に水その後２０％、４０％、６０％および８０％のＭｅＯＨで溶出した。目的の生成物は８０％ＭｅＯＨ画分に溶出し、これらを濃縮して凍結乾燥すると２２０ｍｇ（４８％）を生じた。
【０１５７】
【化４９】
2009507980.tif 000052
【０１５８】
【化５０】
2009507980.tif 000053
【０１５９】
３ｂ（１６４ｍｇ、０．１３６ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をＮ２下で攪拌し、７−イソシアナト−４−メチル−クロメン−２−オン（５５ｍｇ、０．２７３ミリモル）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９２，２００，４００〜４０４に記載のように調製）を加え、４５℃にて３時間攪拌した。ＬＣ／ＭＳは約６０％反応を示したので、更なる７−イソシアノ−４−メチル−クロメン−２−オン（３０ｍｇ、０．１４９ミリモル）を加え、当該反応混合物を同じ温度で更に２時間攪拌した。ＬＣ／ＭＳは未反応３ｂの痕跡のみを示し、溶媒はロータリーエバポレーターで除去し、当該残留物はＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ，４：１中で粉末化し、ろ過して同じ溶媒で数回洗浄して乾燥すると１８０ｍｇ（９４％）を与えた。
【０１６０】
【化５１】
2009507980.tif 000054
【０１６１】
【化５２】
2009507980.tif 000055
【０１６２】
３ｃ（６０ｍｇ、４２．８ミリモル）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に懸濁し、２０％ピペリジンのＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を加えて透明な溶液を形成させ、１．５時間攪拌した。当該反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、当該残留物をＥｔＯＡｃ中で粉末化して当該固体をろ過し、ＥｔＯＡｃで数回洗浄し、真空下で乾燥すると４０ｍｇ（７９％）を与えた。
【０１６３】
【化５３】
2009507980.tif 000056
【０１６４】
【化５４】
2009507980.tif 000057
【０１６５】
アセトニトリル中の１−（クロロメチル）−３−［（２Ｅ）−３−（４−メトキシフェニル）−２−プロペノイル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−アミン（３６ｍｇ、９１．７２μモル）（ＷＯ０３０９７６３５に記載されたように調製）を２０％ホスゲンのトルエン（６００μＬ）溶液で４時間処理し、そののち蒸発させて乾燥物とし、アセトニトリルで２回共沸させ、真空系に０．５時間放置した。得られた粗生成物をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶解し、他の３ｂ（１１２ｍｇ、９３．２μモル）のアセトニトリル（３ｍＬ）溶液へ窒素下で添加し、次いでＤＭＡＰ（３６０ｍｇ、２．９５ミリモル、３２当量）を添加した。ＤＭＦ（２００μＬ）を加えて透明な溶液とし、そののちそれを暗中窒素下で０．５時間攪拌した。ＬＣ／ＭＳは目的の生成物が形成されたことを示したが、それはＦｍｏｃ保護基を失い遊離末端アミン（ＲＴ＝２．９２５分）を生じたが、それに対して保護化アミン生成物はＲＴ＝３．３７７分であった。当該反応混合物は先ず過剰なアセトニトリルを除去することにより濃縮し、そののち水で希釈してＣ１８カラムに載せ、最初に水、次いでＭｅＯＨ−水の１：１で溶出すると全てのＤＭＡＰは除去され、そのあと目的の生成物は２：１比を用いると溶出した。これらの画分を濃縮し、凍結乾燥すると７５ｍｇ（５８％）を与えた。
【０１６６】
【化５５】
2009507980.tif 000058
【０１６７】
【化５６】
2009507980.tif 000059
【０１６８】
Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入したＮ−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｄｏ−ｄＰＥＧ（登録商標）２４ａｃｉｄ（１００ｍｇ、７３．１ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１８ｍｇ、０．１５６ミリモル）、ＤＣＣ（３３．１ｍｇ、０．１６ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（６５μＬ）の混合物をＤＣＭ（２ｍＬ）中で一夜攪拌した。ＬＣ／ＭＳは出発原料の酸（ＲＴ＝２．９６２分）と比較して新規生成物（ＲＴ＝３．０４２分）を示した。当該固体をろ過して分離し、当該濾液を濃縮し、そしてエーテルで数回粉末化して乾燥すると２１０ｍｇ（９３％）を生じた。
【０１６９】
【化５７】
2009507980.tif 000060
【０１７０】
【化５８】
2009507980.tif 000061
【０１７１】
１ｃ（２７．２ｍｇ、７１．５８μモル）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液を５ａ（１０５ｍｇ、７１．６７μモル）に加え、次いでＤＩＰＥＡ（５０μＬ、２８７．６μモル）を加えて一夜攪拌した。ＬＣ／ＭＳは生成物（ＲＴ２．８８１分）の形成および幾らかの未反応出発原料を示した。当該反応混合物を濃縮し、当該生成物を３ｂに関して説明したような逆相クロマトグラフィーで単離すると６８ｍｇ（５５％）を与えた。
【０１７２】
【化５９】
2009507980.tif 000062
【０１７３】
【化６０】
2009507980.tif 000063
【０１７４】
アセトニトリル（１．５ｍＬ）中の１−（クロロメチル）−３−［（２Ｅ）−３−（４−メトキシフェニル）−２−プロペノイル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−アミン（２０ｍｇ、５０．９６μモル）（ＷＯ０３０９７６３５に記載されたようにして調製）を２０％ホスゲンのトルエン（１００μＬ）溶液で４時間処理し、そののちロータリーエバポレーターで濃縮して真空系に０．５時間放置した。当該粗生成物をアセトニトリル（１ｍＬ）に再溶解し、窒素下で５ｂ（６０ｍｇ、３４．７μモル）の他のアセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液に加え、次いでＤＭＡＰ（２１２ｍｇ、１．７３８ミリモル）を加えた。当該反応混合物を暗中で攪拌し、ＬＣ／ＭＳで測定すると当該生成物が形成し、それに次いでＦｍｏｃ保護基が失われＦｍｏｃ保護物と非保護アミンの混合物を生じたことを示した。そこで当該反応混合物を濃縮し、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで３時間処理した。これをそののち再び濃縮し、当該粗生成物を水−ＭｅＯＨで溶出する逆相カラムクロマトグラフィーで処理すると当該生成物（１２ｍｇ、１８％）を与えた。
【０１７５】
【化６１】
2009507980.tif 000064
【０１７６】
【化６２】
2009507980.tif 000065
【０１７７】
１ｂ（２５０ｍｇ、０．４１５ミリモル）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液に７−イソシアナト−４−メチル−クロメン−２−オン（１６７ｍｇ、０．８３ミリモル）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，２００，４００〜４０４に記載されているように調製）を加え、ＬＣ／ＭＳが当該反応の終了（２時間）を示すまで当該反応混合物を５０℃で攪拌した。溶媒を真空下で除去し、当該粗生成物をＤＣＭ−ＭｅＯＨ、９：１を使用するカラムクロマトグラフィーで処理すると当該生成物（１０９ｍｇ、３３％）を生じた。
【０１７８】
【化６３】
2009507980.tif 000066
【０１７９】
【化６４】
2009507980.tif 000067
【０１８０】
６ａ（１０５ｍｇ、０．１３１ミリモル）をＤＭＦ（２ｍＬ）に懸濁し、２０％ピペリジンのＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を加えて１時間攪拌した。当該透明な溶液をロータリーエバポレーターで乾燥させ、当該残留粗生成物をＤＣＭ中で粉末化し、ろ過し、ＤＣＭで繰返し洗浄して乾燥すると６９ｍｇ（９１％）を生じた。
【０１８１】
【化６５】
2009507980.tif 000068
【０１８２】
【化６６】
2009507980.tif 000069
【０１８３】
５ａ（１００ｍｇ、６８．２６ミリモル）、６ｂ（３９．７ｍｇ、６８．３μモル）およびＤＩＰＥＡ（３０μＬ、１７２．６μモル）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）中で一夜攪拌すると、ＬＣ／ＭＳが当該反応完結を示した。全ての揮発分をロータリーエバポレーターで除去し、残留物をエーテル−ＤＣＭ、９：１で数回粉末化し、ろ過し、同じ溶媒で洗浄して乾燥すると８０ｍｇ（５４％）を与えた。
【０１８４】
【化６７】
2009507980.tif 000070
【０１８５】
【化６８】
2009507980.tif 000071
【０１８６】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の６Ｃ（７４ｍｇ、３４．２４μモル）を２０％ピペリジンのＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で２時間処理した。当該溶液を蒸発させて乾燥物とし、エーテル−ＤＣＭ，４：１中で繰返し粉末化し、同じ溶媒で洗浄して乾燥すると３８ｍｇ（５７％）を与えた。
【０１８７】
【化６９】
2009507980.tif 000072
【０１８８】
【化７０】
2009507980.tif 000073
【０１８９】
Ｎｅｋａｒ社から購入したＢｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ  ＭＷ３４００Ｄａ（１００ｍｇ、２９．４μモル）を２％のトリイソプロピルシランを含有する５０％ＴＦＡのＤＣＭ中で４０分間攪拌し、そののち当該溶液を蒸発させて乾燥させ、ＤＣＭで３回共沸させて真空系中に２時間放置した。当該粗生成物のＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）はＢｏｃ基の除去を明らかに示した。アセトニトリル−水、１：１（２ｍＬ）に溶解し、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１２ｍｇ、３５．６１μモル）およびＤＩＰＥＡ（５０μＬ、０．２９ミリモル）で１時間処理した。ＬＣ／ＭＳ（イオン化モードを受けて）は出発原料がＲＴ２．１８６分（イオン化モード）であるのに対して新規生成物ＲＴ２．１８６分に全て転換したことを示した。当該反応混合物を濃縮して有機物を取り除き、そののち水で希釈して凍結乾燥した。当該固体をエーテルで数回粉末化し、ろ過し、エーテルで繰返し洗浄すると１０４ｍｇを与えた。これを直ちにＤＣＭ（２．５ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４ｍｇ、３４．７８マイクロモル）に溶解し、ＤＣＣ（７ｍｇ、３４μモル）とＤＩＰＥＡ（１５μＬ、８６．３μモル）を連続して加え、当該反応混合物を３．５時間攪拌した。セライトの小さな栓を通過させてろ過し、ロータリーエバポレーターで乾燥させ、当該固体をエーテルから結晶化、ろ過し、エーテルで繰返し洗浄して真空中で乾燥させると１０５ｍｇ（全体で９２％）を生じた。当該結晶物質のＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は正確な解釈が困難であった。
【０１９０】
【化７１】
2009507980.tif 000074
【０１９１】
７ａ（１００ｍｇ、２８．３９３μモル）、６ｂ（１６．５ｍｇ、２８．４μモル）およびＤＩＰＥＡ（１５μＬ、８６．２８μモル）の混合物をＤＭＦ（１ｍＬ）中でＬＣ／ＭＳがＩＩの消費を示すまで（４８時間）攪拌した。これをそののち蒸発させて乾燥し、エーテル−ＤＣＭ，４：１でダイジェストし、ろ過して、同じ溶媒及びその後エーテルで洗浄して乾燥すると９６ｍｇ（８５％）を生じた。
【０１９２】
【化７２】
2009507980.tif 000075
【０１９３】
【化７３】
2009507980.tif 000076
【０１９４】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の７ｂ（８６ｍｇ、２１．５６μモル）を２０％ピペリジンのＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で２時間処理した。得られた溶液はロータリーエバポレーターで蒸発して乾燥させ、当該残留物をエーテル−ＤＣＭ、４：１中でダイジェストし、ろ過し、同じ溶媒で洗浄して乾燥した（３２ｍｇ、３９％）。
【０１９５】
【化７４】
2009507980.tif 000077
【０１９６】
可溶化種
（ｉ）３−アミノ−１，２−プロパンジオール
（ｉｉ）Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入したアミノ−ｄＰＥＧ（登録商標）４アルコール
（ｉｉｉ）Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入したｍ−ｄＰＥＧ（登録商標）１２アミン
（ｉｖ）Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入したｍ−ｄＰＥＧ（登録商標）４アミン
（ｖ）Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入したｍ−ｄＰＥＧ（登録商標）２４アミン
（ｖｉ）文献に記載されているように調製したエタナミニウム、２−［［（２−アミノエトキシ）ヒドロキシホスフィニル］オキシ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−、分子内塩
【０１９７】
ポリマー負荷用の一般的手順
目的のポリマー（Ａ〜Ｆの１つ）（通常１０〜２５ｍｇ）を無水ＤＭＦ（２〜２．５ｍＬ）に加温して溶解し、当該透明溶液をそののち室温にまで冷却する。当該エフェクター種（（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の１つ）を負荷するのに望ましいモル当量を加え、次いでＤＩＰＥＡのその２倍当量を加え、当該混合物を４５℃で攪拌する。当該反応の進行について当該反応混合物中のエフェクター種の消費をＬＣ／ＭＳで観測することで追跡する。当該反応の終了（通常２４〜４８時間）時に可溶化種（（ｉ）〜（ｖｉ）の１つ）の過剰量を加え、当該反応物を更に１６〜２４時間、再び４５℃で攪拌する。全ての揮発分を減圧下、ロータリーエバポレーターで除去し、当該残留物を水に溶解してセライトまたは０．２μメーターのフィルターのどちらかを通過させてろ過する。当該濾液をそののち５０００または１００００  ＮＭＣＯ膜を備えた遠心分離管（当該負荷したポリマーの分子量に依存する）に移して遠心ろ過を４０００ｒｐｍで行う。当該管を再び新鮮な水で満たして当該操作を４回繰返す。当該フィルターを通過できない全ての物質を集め、凍結乾燥させると目的の負荷したポリマーを生じる。
【０１９８】
【化７５】
2009507980.tif 000078
【０１９９】
【化７６】
2009507980.tif 000079
【０２００】
当該エフェクターおよび可溶化部分は当該櫛形ポリマー骨格ヘ不規則に付着することは理解されるであろう。
【０２０１】
当該負荷したポリマーのジスルフィド還元用の一般的手順
当該負荷したポリマー（通常５〜２０ｍｇ）をリン酸緩衝液ｐＨ７．８〜８．０（０．５〜１ｍＬ）中に溶解し、窒素下で攪拌する。当該還元剤の溶液、同じ緩衝液中トリヒドロキシプロピルホスフィン（通常５モル当量）をそののちに加え、当該反応混合物を室温で４時間攪拌する。そののち、当該反応混合物を炭酸水（約ｐＨ５）で希釈し、セライトまたは０．２μメートルのフィルターを通してろ過する。当該溶液はそののち炭酸水を用いて上記のように遠心ろ過を行い、凍結乾燥すると８０〜９５％の収率でチオール末端負荷したポリマーを生じる。
【０２０２】
【化７７】
2009507980.tif 000080
【０２０３】
当該エフェクターおよび可溶化部分が当該櫛形ポリマー骨格に不規則に付着することは理解されるであろう。
【０２０４】
当該負荷したポリマーのマレイミド誘導化に関する一般的手順
還元したポリマー（約５ｍｇ）のエタノール−水、１：１（２００μＬ）溶液に１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコールのようなビスマレイミドの同じエタノール−水、１：１（２００μＬ）の１０モル当量溶液を添加する。１．５時間攪拌後に当該反応物は水で希釈し、前に説明したような遠心ろ過にかける。
【０２０５】
【化７８】
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【化７９】
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【０２０６】
当該エフェクターおよび可溶化部分が当該櫛形ポリマー骨格に不規則に付着することは理解されるであろう。
【０２０７】
【表２】
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【０２０８】
ポリマー複合体１
方法１
ＤＭＦ中のマレイミドポリマー例１を０．１Ｍのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０緩衝液中で還元Ｆａｂ’（５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンにて３７℃で３０分間還元し、過剰の還元剤をＰＤ−１０カラムで除去して調製）と温置した。２、５、１０、１５、２０および２５：１のマレイミドポリマー例１：Ｆａｂ’のモル比を使用した。当該最終Ｆａｂ’濃度は２ｍｇ／ｍｌで、ＤＭＦは最終２０％で存在した。当該反応混合物を室温で１時間、４℃で一夜保持し、そののち当該反応の程度は非還元および還元の両条件でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析および０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０／１０％ＥｔＯＨでのＧＰＣ  ＨＰＬＣで測定した。
【０２０９】
方法２
還元Ｆａｂ’（前記のように調製）を５倍過剰量の１，１１−ビスマレイミドテトラエチレングリコールとともに室温で１時間および４℃で一夜反応した。過剰な１，１１−ビスマレイミドテトラエチレングリコールをＰＤ−１０カラムで除去し、得られたＦａｂ’−（１，１１−−ビスマレイミドテトラエチレングリコール）複合体を還元ポリマー例１と、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．０緩衝液中で中間体６：Ｆａｂ’複合体のモル比２，５，１０，１５，２０および２５：１で温置した。当該最終Ｆａｂ’複合体濃度は２ｍｇ／ｍｌでＤＭＦは最終２０％で存在した。
【０２１０】
ポリマー複合体１の精製
上記２つの方法のいずれかからの反応混合物を集めたものを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５０緩衝液でのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムに適用した。生成物は０〜２５０ｍＭの塩勾配を用いて２０カラム容量にわたり溶出した。当該生成物が単離されたことは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる画分の分析により証明され、それは正しい分子量イオンでその種が調製されており、単離されていることを示した。
【国際調査報告】
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