(57)【要約】本発明の実施例は、水性または有機媒体中においてポリヒドロキシ置換有機分子の濃度を測定する、改善された光学的方法および／またはセンサーに関連する。一適用において、前記方法およびセンサーは、インビトロにおいて、水溶液中の糖質、すなわちグルコースまたはフルクトースの濃度を監視する。特に、前記方法およびセンサーは、経脈管的に埋め込まれ、糖質、すなわちグルコースまたはフルクトースの、監視をするために採用されている。
2009519053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的に被分析物濃度を決定するための装置であって、
被分析物透過成分と、
前記被分析物透過成分と結合し、第１波長で光を吸収し、第２波長で光を放出するように設定されているフルオロフォアと、
前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアにより放出された光を前記被分析物濃度と相関した量まで変更するように設定されているクエンチャーとを含み、
前記クエンチャーは、
ボロン酸置換ビオロゲンと、
光源と、
検出器とを、含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記被分析物透過成分は、ポリマーマトリックスを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ポリマーマトリックスは、ヒドロゲルであることを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記ヒドロゲルは、親水性単量体の重合、あるいは、架橋結合された親水性ポリマーによって形成されていることを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記親水性単量体は、２−ヒドロキシエチル−メタアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ‘−ジメチルアクリルアミド、メタアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、およびエチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、メチレン−ビス‐アクリルアミドおよびトリメチロールプロパントリアクリレートから選択される架橋剤が随意に結合しているソジウムスルホプロピルメタクリレートからなる群より選択される１種またはこれらの組合せであることを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記ポリマーマトリックスは、水に不溶性であることを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項７】
前記水に不溶であるポリマーマトリックスは、ＨＰＴＳ(Ｌｙｓ−ＭＡ)３、ＨＰＴＳ−ＭＡ、ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡ、ＡＰＴＳ−ＢｕＭＡ およびＡＰＴＳ−ＤｅｇＭＡからなる群より選択される単量体から形成されることをと特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記水に不溶であるポリマーマトリックスは、共重合体ＨＥＭＡ、ポリエチレングリコールジメタクリレートまたは、Ｎ,Ｎ‘−ジメチルアクリルアミド、およびメチレンビスアクリルアミドを含むことを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記被分析物透過成分は、前記フルオロフォアおよびクエンチャーをとじこめる膜を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記フルオロフォアは、置換ピレンを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記置換ピレンは、ピラニンスルホン酸塩誘導体を含むことを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記ピラニンスルホン酸塩誘導体は、下記の構造式から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【化１】
2009519053.tif 000101
（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ‐ＮＨＲ４であり、Ｒ４は、‐ＣＨ２‐ＣＨ２（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｘ１、Ｘ１は、−ＯＨ、ＯＣＨ３−ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、−ＳＯ３Ｈまたは‐ＮＨ２であり、そして、ｎは、約７０〜１０，０００である。）
【請求項１３】
前記ボロン酸置換ビオロゲンは、さらに、芳香族ボロン酸部分を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記クエンチャーは、下記の群から選択される前駆体からつくられていることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【化２】
2009519053.tif 000102
（ここで、Ｘは、臭化物または塩化物である。）
【請求項１５】
前記ビオロゲンは、下記の群から選択される前駆体からつくられたことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【化３】
2009519053.tif 000103
【請求項１６】
前記クエンチャーは、前記被分析物量と結合するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記クエンチャーは、前記フルオロフォアによって、発光される光を減少させるように構成されていることを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記クエンチャーは、さらに、前記フルオロフォアによって発光される光を、結合した被分析物の量と逆相関した量になるまで減少させるように構成されていることを特徴とする請求項１６に記載の装置。
【請求項１９】
前記被分析物は、ポリヒドキシル置換の有機分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
前記被分析物は、グルコースであることを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記光源は、青色発光ダイオード（ＬＥＤ）であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
生理液中で、被分析物濃度を光学的に決定するための装置であって、
被分析物透過成分と、
前記被分析物透過成分と結合し、第１波長で光を吸収し、第２波長で光を発光するように構成され、置換ピレンを含むフルオロフォアと、
前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアによる光の発光を被分析物に相関した量まで変更するように構成されたクエンチャーと、
光源と、
検出器と、を含むことを特徴とした装置。
【請求項２３】
第１波長で光を吸収し、第２波長で光を放出するように構成されたフルオロフォアと、
前記フルオロフォアによって発光される光を、前記被分析物濃度と相関する量まで変更するクエンチャーであって、ボロン酸置換のビオロゲンを含むクエンチャーと、を含むことを特徴とする被分析物センサー。
【請求項２４】
前記フルオロフォアは、置換ピレンを含むことを特徴とする請求項２３に記載の被分析物センサー。
【請求項２５】
前記置換ピレンは、下記構造から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の被分析物センサー。
【化４】
2009519053.tif 000104
（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ‐ＮＨＲ４であり、Ｒ４は、‐ＣＨ２‐ＣＨ２（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｘ１、Ｘ１は、−ＯＨ、ＯＣＨ３−ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、−ＳＯ３Ｈまたは‐ＮＨ２であり、そして、ｎは、約７０〜１０，０００である。）
【請求項２６】
第１励起波長で光を吸収し、第２発光波長で発光するように設定されたピレン誘導体を含むフルオロフォア色素と、
被分析物に結合するように設定されたクエンチャーと、を含み、
前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素に結合可能であり、そして、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素により発光される光を被分析物の結合と関連して調整するように設定されていることを特徴とする被分析物センサー。
【請求項２７】
試料中の被分析物の濃度を光学的に決定する方法であって、
請求項２３から２６のいずかに記載の被分析物センサーと接触させる工程と、
前記センサーに光を照射する工程と、
発光した光を検出する工程と、
前記被分析物の濃度を決定する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記被分析物の濃度は、継続した一定期間にわたって決定されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、流体であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、生理液であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、生きている哺乳動物の生理液であること特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記光は、第１励起波長で照射されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記光は、発光ダイオード（ＬＥＤ)により照射されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記光は、第２発光波長で検出されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記光は、実質的に連続して照射されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記光は、周期的に照射されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記被分析物は、ポリヒドロキシル置換された有機分子を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリヒドロキシル置換された有機分子は、グルコースであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記接触させる工程は、さらに、前記被分析物センサーを皮下に埋め込むことを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記接触させる工程は、さらに、前記被分析物センサーを血管中に注入することを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記血管は、動脈であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記血管は、静脈であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記被分析物センサーは、人間に埋め込まれることを特徴とする請求項３９から４２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
前記被分析物センサーは、さらに、生体適合性のある被覆物をふくむことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
ジピリジルをアリールボロン酸を含むアルキル化剤と反応させ、Ｎ，Ｎ’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンを製造する工程と、
ビオロゲンによって、消光されることが可能なフルオロフォアと、Ｎ，Ｎ’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンとを結合する工程と、を含むことを特徴とする被分析物センサーの形成方法。
【請求項４６】
前記アルキル化剤は、ハロメチルフェニルボロン酸であり、ハロはブロモまたはクロロであることを特徴とする請求項４５に記載の形成方法。
【請求項４７】
下記化学式から選択させる組成物。
【化５】
2009519053.tif 000105
ｍおよびｎは、それぞれ、１−６で定義され、遊離酸、またはそれらの共役塩であることを特徴とする組成物。
【請求項４８】
下記から選択されることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【化６】
2009519053.tif 000106
ｍおよびｎは、それぞれ、１であり、遊離酸、またはそれらの共役塩であることを特徴とする組成物。
【請求項４９】
前記被分析物透過成分は、量子ドット部分を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５０】
前記被分析物透過成分は、ＨＥＭＡ，ＰＥＧＭＡ，メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド，メタアクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、メチレンビスアクリルアミド、トリメチルロールプロパントリアクリレートを含む架橋結合を有するソディウムスルホプロピルメタアクリレートからなる群より独立して選択されるポリマーまたはこれらの組合せであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５１】
前記ビオロゲンは、２以上のボロン酸部分を含むことを特徴とする請求項２７に記載の装置。
【請求項５２】
前記フルオロフォアは、少なくとも１以上の負電荷を有する請求項１に記載の装置。
【請求項５３】
下記に示される組成物。
【化７】
2009519053.tif 000107
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０００年１２月５日に出願された前米国出願第０９／７３１，３２３号であり、２００３年９月３０日に交付された現米国特許第６，６２７，１７７号明細書の一部継続出願である、２００３年６月５日に出願された、米国出願第１０／４５６，８９５の明細書の一部である、２００５年１２月７日出願された、米国出願第１１／２９６，８９８明細書の一部継続出願であり、これらすべては、本明細書に参照することにより、組み込まれる。
【０００２】
［政府の支援に関する声明］
本発明は、政府の支援を受けていない。
【０００３】
［配列表、コンピュータープログラム、またはコンパクトディスクの参照］
なし
【背景技術】
【０００４】
［発明の分野］
本発明の実施例は、水性、または有機媒体中のポリヒドロキシ置換有機分子の濃度を測定する、改善された光学的方法、および／またはセンサーに関連する。一応用において方法およびセンサーは、インビトロにおいて水溶液中の糖質、すなわち、グルコースまたはフルクトースなどの濃度を監視する。特に前記方法およびセンサーは、経脈管的に埋め込まれ、血中のグルコースまたはフルクトースなどの糖質の監視に採用されている。
【０００５】
［関連技術の説明］
体液中のポリヒドロキシ化合物（例：グルコース）濃度の測定のため、蛍光技術を用いる努力が長年続けられてきた。「グルコース」という用語が以下に使用されているが、水溶液中のほとんどのポリヒドロキシル含有有機化合物（糖質、１，２−ジオール、１，３−ジオール等）の濃度が決定されることが理解されること。懸命な努力に関わらず、インビトロにおける監視のための実用的システムが開発、商業化されていなかった。ボロン酸基が付着される色素を使用した蛍光によりグルコースを検出する試みが幾度もなされてきた。ボロン酸は糖質を可逆的に結合すると知られている。ボロン酸機能化色素が糖質に結合する場合、色素の性質が影響を受ける。これらの変化が従来糖質の濃度測定に使用されてきた。
【０００６】
グルコースセンサーへのこのアプローチの一用途は、グルコースに結合し、グルコース濃度によりシグナルを発生する、ボロン酸官能化色素の使用を開示するＲｕｓｓｅｌの米国特許第５，１３７，８３３により報告されている（ＲｕｓｓｅｌおよびＺｅｐｐによる米国特許第５，５１２，２４６も参照）。Ｊａｍｅｓ他による米国特許第５，５０３，７７０では、同じ原理を使用しているが、単鎖体部分に蛍光色素、アミンのクエンチング機能、およびボロン酸を結合し、そこからの蛍光発光はグルコース結合の範囲により変化する。Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐ他による、米国特許第６，００２，９５４および第６，０１１，９８４は、前記に引用した参照の特徴とを組み合わせ、また組み込み可能にすることを目的とした装置の製造を教示した。Ａ．  Ｅ  ．Ｃｏｌｖｉｎ，  Ｊｒ．は米国特許第６，３０４，７６６で、特に人体中の現場検出用の光学ベースの検知装置を開示している。
【０００７】
目的とする特許は以下を含むがこれらに限られない：
【表１】
2009519053.tif 000003
【０００８】
関連する、目的の米国特許は以下を含むが、これらに限られない：
【表２】
2009519053.tif 000004
【０００９】
関連する記事、および出版物は以下を含む：
【表３】
2009519053.tif 000005
【００１０】
ポリビオロゲンに関する一般的参照は以下を含む
【表４】
2009519053.tif 000006
【００１１】
一般的性質の参照は以下を含む：
【表５】
2009519053.tif 000007
【００１２】
量子ドットの技術に関する参照は以下を含む；
【表６】
2009519053.tif 000008
【００１３】
本願に参照されるすべての特許、記事、参照、基準等は、本書にその全体を参照して援用するものである。
【００１４】
これらすべての従来センサーは、生理的環境下での操作性、操作の安定性、設計の簡素化、信頼性、埋め込み性、および感度などの、一以上の面を欠いている。本発明はこれらの欠点を克服するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
好適な実施例において、本発明は、水性媒体中のポリヒドロキシル化合物、特に生理的媒体中のグルコースまたはフルクトースなどの糖質の濃度を決定する、特にインビボにおける決定するための光学的方法および光学的装置に関連する。これらの化合物、被分析物は、光源、検出器、およびフルオロフォアＤ（蛍光色素等）、クエンチャー、および任意のポリマーマトリクスＭを含む、活性成分からなる、蛍光検知装置を備えた系中にある。適切な波長の光により励起された場合、フルオロフォアは光を放出する（蛍光）。光の強度はクエンチングの範囲に依存する。フルオロフォア、およびクエンチャーＱは、独立した構成要素でもよく、検出および定量化する目的の化合物を透過、または接触するポリマーマトリクスに随意に固定、または、共有結合される。別の実施例において、フルオロフォアＤおよびクエンチャーＱは、互いに共有結合されていてもよい。
【００１６】
一態様において、本発明は、生理的ｐＨにおける、またはそれに近い水性媒体中のグルコースなどの、ポリヒドロキシル化合物の存在に反応する、蛍光クエンチング化合物群を含む。言い換えれば、クエンチング効率は、媒体中のこれらの化合物の濃度によって制御される。クエンチャーは、少なくとも一つのボロン酸基と置換されたビオロゲンからなり、前記付加体はポリマーと固定される、あるいは共有結合している。クエンチャー、色素、およびポリマーも互いに共有結合されていても良い。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ビオロゲン／ボロン酸付加体による、クエンチングに影響されやすい、ポリマー蛍光色素の一群である。有用な色素には、ピラニン誘導体（例、ヒドロキシピレントリスルホンアミド（「ＨＴＰＳ」）誘導体等）およびアミノピレントリスルホン酸誘導体（「ＡＰＴＳ」）（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１７参照）。
【００１８】
一実施例において、色素は、ポリマーに結合した、ヒドロキシピレントリスルホンアミド部分である。スルホン酸基をスルホンアミド基に変換することは、ピラニンのｐＫａを生理的ｐＨにおける測定により好適になりうる範囲に変化させる。この変換はまた、色素の吸光度をより長い波長に変化させることにより、埋め込みセンサーの光源として好適な光源の一つである、青色ＬＥＤの光によって、より効果的に励起することができる。これらの誘導体は、通常塩化トリスルホニル中間物を、１）ポリアミン、２）、付加体が後に重合される、アミン官能エチレン含有不飽和単量体、３）または、アミン官能ポリマーと反応させることにより、生成される。一実施例において、色素はピレン環に遊離残留スルホン酸群のない完全に置換された誘導体である。
【００１９】
別の態様において、本発明は、色素およびクエンチャー部分を構成する、複合水相溶性ポリマーマトリクス、好ましくはヒドロゲルである。前記マトリクスは、膨潤性共重合体であり、好ましくは、色素とクエンチャー部分が、結合基Ｌにより共有結合している、架橋結合である。一実施例において、前記マトリクスは、色素が一方のネットワークに、クエンチャーがもう一方のネットワークに組み込まれている、相互貫入重合体ネットワーク（ＩＰＮ：Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）である。別の実施例において、前記マトリクスは半ＩＰＮであり、色素成分は、クエンチャー単量体、および好適な親水性共単量体からなる、架橋結合ネットワークに閉じ込められている、高分子量水溶性または水分散性ポリマーである。あるいは、前記クエンチャーは水相溶性または水分散性成分、およびネットワーク内の色素中にあってもよい。さらに、色素とクエンチャーの両方が水溶性または水分散性ポリマーに個別にくわえられてもよく、ここで色素とクエンチャーのいずれも不活性ポリマーマトリクスに閉じ込められている。あるいは、前記成分は、前記成分を不透過であるが、被分析物を透過する、膜によって被分析物溶液から分離される。あるいは、前記マトリクスは、色素とクエンチャーの結合に有利に働くため、また他のポリヒドロキシ化合物に対し、グルコースなどの特定の糖質への選択性を高めるため、分子インプリントされている。色素とクエンチャーの相互作用を高める好適な一実施例においては、色素部分を、カルボン酸塩、スルホン酸塩、ホスホン酸塩、およびリン酸塩などの、負に帯電した基で官能化することである。
【００２０】
好適な一実施例において、本発明は光学的センサーの手段でインビボにおいてグルコース濃度の測定をする装置に関連する。好ましくは、前記装置は、可視光源、好ましくは青色ＬＥＤ光源、光検知器、光ファイバー組立などの光導管（光学導波管）、およびビオロゲン、ビオロゲン／ボロン酸クエンチャー、およびグルコース透過性ポリマーによるクエンチングに影響を受けやすいフルオロフォアからなる水に不溶性のポリマーマトリクスからなり、前記マトリクスは前記導管、および被分析物を含む媒体に接触している。
【００２１】
一実施例において、光学的に被分析物濃度を決定するため、装置が開示されている。前記装置は、被分析物透過成分と、  前記被分析物透過成分と結合し、第１波長で光を吸収し、第２波長で光を放出するように設定されているフルオロフォアと、前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアにより放出された光を前記被分析物濃度と相関した量まで変更するように設定されているクエンチャーとを含み、前記クエンチャーは、ボロン酸置換ビオロゲンと、光源と、検出器とを、含む。
【００２２】
前記分析物透過成分は、ポリマーマトリクスが含まれてもよい。好適な変形例においては、ポリマーマトリクスは、ヒドロゲルである。前記ヒドロゲルは、親水性単量体の重合、あるいは親水性ポリマーの架橋結合によって形成されても良い。好ましくは、前記親水性単量体は、２−ヒドロキシエチル−メタアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ‘−ジメチルアクリルアミド、メタアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、およびエチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、メチレン−ビス−アクリルアミドおよびトリメチロールプロパントリアクリレートから選択される架橋剤が随意に結合されている、ソジウムスルホプロピルメタクリレートからなる群より選択される１種またはこれらの組合せから形成されても良い。
【００２３】
一実施例において、前記ポリマーマトリクスは、水に不溶性である。前記水に不溶であるポリマーマトリクスは、ＨＰＴＳ（Ｌｙｓ−ＭＡ）３、ＨＰＴＳ−ＭＡ、ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡ、ＡＰＴＳ−ＢｕＭＡおよびＡＰＴＳ−ＤｅｇＭＡからなる群より選択される単量体から形成される。
【００２４】
一実施例において、前記水に不溶であるポリマーマトリックスは、共重合体ＨＥＭＡ、ポリエチレングリコールジメタクリレートまたは、Ｎ，Ｎ‘−ジメチルアクリルアミド、およびメチレンビスアクリルアミドを含む。
【００２５】
別の変形例において、前記被分析物透過成分は、前記フルオロフォアおよびクエンチャーを閉じ込める膜を含む。
【００２６】
好適な実施例において、フルオロフォアは、置換ピレンからなる。置換ピレンは、ピレンスルホン酸塩誘導体からなってもよい。前記ピレンスルホン酸誘導体は、下記の構造式から選択されてもよい：
【化１】
2009519053.tif 000009
ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ‐ＮＨＲ４であり、Ｒ４は、‐ＣＨ２‐ＣＨ２（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｘ１、
Ｘ１は、−ＯＨ、ＯＣＨ３−ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、−ＳＯ３Ｈまたは‐ＮＨ２であり、そして、ｎは、約７０〜１０，０００である。
【００２７】
前記装置の好適な一実施例において、ボロン酸置換ビオロゲンは、さらに芳香族ボロン酸部分をさらに含む。
【００２８】
ボロン酸クエンチャーは、下記の群から選択される前駆体からつくられても良い：
【化２】
2009519053.tif 000010
【００２９】
前記ビオロゲンは、下記の群から選択される前駆体からつくられても良い：
【化３】
2009519053.tif 000011
【００３０】
好適な実施例において、前記クエンチャーは、前記被分析物量と結合するように構成される。一変形例においては、前記クエンチャーは、前記フルオロフォアによって、発光される光を減少させるように構成されている。別の変形例においては、前記クエンチャーは、さらに前記フルオロフォアによって発光される光を、結合した被分析物の量と逆相関した量になるまで減少させるように構成されてもよい。
【００３１】
開示装置の好適な実施例において、被分析物は、ポリヒドロキシル置換の有機分子を含む。より好ましくは、前記分析物はグルコースである。
【００３２】
開示装置の別の好適な実施例において、光源は青色発光ダイオード（ＬＥＤ）である。
【００３３】
別の好適な実施例によると、装置は、生理液中の被分析物濃度を光学的に決定するため開示されている。前記装置は、被分析物透過成分と、  前記被分析物透過成分と結合し、第１波長で光を吸収し、第２波長で光を発光するように構成され、置換ピレンを含むフルオロフォアと、前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアによる光の発光を被分析物に関連した量まで修正するように構成されたクエンチャーと、光源と、検出器と、を含む。
【００３４】
別の好適な実施例によると、被分析物センサーが開示されている。前記被分析物センサーは、第１波長で光を吸収し、第２波長で光を放出するように構成されたフルオロフォアと、前記フルオロフォアによって発光される光を、前記被分析物濃度と関連する量まで変更するクエンチャーであって、ボロン酸置換のビオロゲンを含むクエンチャーと、を含む。
【００３５】
別の好適な実施例によると、開示された被分析物センサーは、第１励起波長で光を吸収し、第２発光波長で発光するように設定されたピレン誘導体を含むフルオロフォア色素と、被分析物に結合するよう構成されたクエンチャーと、を含み、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素に結合可能であり、そして、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素により発光される光を被分析物の結合と関連して調整するように設定されている。
【００３６】
また、サンプル中における、被分析物の濃度を光学的に決定する方法が開示されている。前記方法は、上記の被分析物センサーを飼料と接触させる工程、前記センサーに光を照射する工程、発光した光を検出する工程と、前記被分析物の濃度を決定する工程を含む。
【００３７】
被分析物の濃度は、継続した一定期間にわたって決定されてもよい。
【００３８】
前記サンプルは流体であり、好ましくは生理液である。さらに好ましくは、前記サンプルは生きている哺乳動物の生理液である。
【００３９】
開示された方法の一変形例において、前記光は、第一励起波長で照射される。好ましくは、前記光は発光ダイオード（ＬＥＤ）によって照射される。別の変形例では、前記光は、第二発光波長で検出される。開示された方法の変形例において、前記光は、実質的に連続して照射されてもよく、また、周期的に照射されてもよい。
【００４０】
好適な実施例において、前記方法は、ポリヒドロキシル置換された有機被分析物の濃度を光学的に決定するため採用されている。さらに好ましくは、被分析物はグルコースである。
【００４１】
一実施例において、前記接触させる工程は、さらに被分析物センサーを皮下に埋め込むことを含んでも良い。また、前記接触させる工程は、さらに被分析物センサーを血管中に注入することを含んでも良い。前記血管は、動脈あるいは、静脈でも良い。好ましくは、前記被分析物センサーは、人間に埋め込まれる。
【００４２】
一実施例において、前記被分析物センサーは、さらに生体適合性のある被覆物も含む。
【００４３】
本発明の好適な一実施例に従い、被分析物センサーの作成方法が開示されている。前記方法は、ジピリジルをアリールボロン酸を含むアルキル化剤と反応させ、Ｎ，Ｎ’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンを製造する工程と、ビオロゲンによって、消光されることが可能なフルオロフォアと、Ｎ，Ｎ’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンとを結合可能にする工程と、を含む。
【００４４】
前記アルキル化剤は、好ましくはハロメチルフェニルボロン酸であり、ハロはクロロ、もしくはブロモである。
【００４５】
本発明の別の好適な実施例において、組成物が開示されている。前記組成物は、以下の化学式から選択することが出来る：
【化４】
2009519053.tif 000012
ｍ＝０−６；ｎ＝０−１０；色素は、遊離酸、またはそれらの共役塩を含むことを特徴とする組成物。上述の組成物の具体例は以下の式を含む。
【化５】
2009519053.tif 000013
【００４６】
開示された装置の一変形例においては、前記被分析物透過成分は、量子ドット部分を含んでも良い。
【００４７】
更なる装置の変形例において、前記被分析物透過成分は、ＨＥＭＡ，ＰＥＧＭＡ，メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド，メタアクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、メチレンビスアクリルアミド、トリメチルロールプロパントリアクリレートを含む架橋結合を有するソディウムスルホプロピルメタアクリレートからなる群より独立して選択されるポリマーまたはこれらの組合せでもよい。
【００４８】
本発明の別の好適な実施例において、前記ビオロゲンは２つ以上のボロン酸部分を含んでもよい。
【００４９】
別の好適な実施例において、前記フルオロフォアは少なくとも１以上の負電荷を含んでもよい。
【００５０】
別の実施例において、本発明は、被分析物を決定するため、共に作用する上記に一覧された成分を含む装置である。
【００５１】
本発明において、フルオロフォアが付着される、用語「ポリマー」には、ボロン酸化合物と反応する、または化合するポリヒドロキシポリマーを除外する。有用なポリマーは、アニオン性、陽イオン性、または非イオン性であり、また加水分解に安定で、インビボ液と相溶性である。
【００５２】
一態様において、本発明は、水性溶液中のグルコースなどのポリヒドロキシ化合物の存在に反応する、蛍光クエンチング化合物の一群であり、言い換えればクエンチング効率は前記媒体中の化合物の濃度によって制御される。前記クエンチャーがフルオロフォアと化合されると、血液などの生理液中のグルコースの濃度測定に有用である。フルオロフォアは、蛍光有機色素、蛍光有機金属化合物または金属キレート、蛍光共役ポリマー、蛍光量子ドット、またはナノ粒子、またはその組み合わせでもよい。前記クエンチャーは、２以上のボロン酸基で置換したビオロゲンからなる。一実施例において、クエンチャーは、窒素をオルトベンジルボロン酸基で置換した、３，３‘−ジピリジル由来のビオロゲンからなり、前記付加体は、随意で１以上の付加的な陽性基を含み、前記付加体は好ましくは、ポリマーに共有結合する。グルコース認識する受容体は、芳香族ボロン酸である。本発明のボロン酸は、ビオロゲンに結合し、ボロン酸を形成するため、６．８から７．８のｐＨ範囲において、体温で、血液中、または他の体液中のグルコースと可逆的に反応する。反応の範囲は、媒体中のグルコース濃度に相関し、濃度範囲が約５０から４００ｍｇ／ｄｌ以上である。好ましくは、２以上のボロン酸基が、ビオロゲン分子に付着し、グルコースへの共同的結合のため、間隔をあける。フルオロフォアとクエンチャーは、平衡が１０分未満で成立するよう、ヒドロゲルに組み込まれる、または、グルコースを適切に透過させる膜に閉じ込められる。ビオロゲンボロン酸部分は、ポリマー骨格、またはポリマー鎖のペンダント基の単位でも良い。あるいは、自己組織化単分子層または、多分子層として表面に付着してもよい。他の態様では、本発明はポリマーマトリクスであり、好ましくは、フルオロフォアおよびクエンチャー部位からなるヒドロゲルである。前記マトリクスは、水溶性または膨潤性共重合体であり、好ましくは、フルオロフォアとクエンチャーが共有結合している、架橋結合であり、より好ましくは、前記マトリクスは、フルオロフォアが一方のネットワークに、クエンチャーがもう一方のネットワークに組み込まれている、相互貫入重合体ネットワーク（ＩＰＮ：Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）である。あるいは、前記マトリクスは、フルオロフォアとクエンチャーの結合に有利に働くため、また他のポリヒドロキシ化合物に対するグルコースの選択性を高めるため、分子インプリントされている。前記マトリクス作成に有用な単量体には、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリルアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどが含まれる。ビオロゲンと検知ポリマーの一般的な合成と、グルコース検知の実証が本書に示されている。
【００５３】
別の態様では、本発明はインビボにおいて血液中のグルコース濃度を測定する装置であり、前記装置は、ＬＥＤ光源、光検出器、光ファイバーなどの光導管、およびビオロゲン、オルトベンジルボロン酸置換ビオロゲンクエンチャー、およびグルコース透過性ポリマーによるクエンチングに反応する、フルオロフォアよりなるポリマーマトリクスからなり、前記マトリクスは前記導管および、被分析物を含む媒体と接触している。通常前記センサーは、血管に挿入される、カテーテルに含まれる。
【００５４】
前記方法の別の態様において、色素Ｄは離散分子Ｄ１，または以下の構造を持つピラニン誘導体のポリマーＤ２から選択される：
【化６】
2009519053.tif 000014
ここで、Ｒ１，Ｒ２，およびＲ３はそれぞれ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｘ１である。
【化７】
2009519053.tif 000015
ここで、Ｘ１は，−ＣＨ２  −ＣＨ３，−Ｃｏ２Ｈ  −ＣＯＮＨ２，  −ＳＯ３Ｈ  または−ＮＨ２から選択され、またｎは、約７０から１０，０００の間であり、好ましくは１００から１，０００の間である。
【００５５】
前記方法の別の態様において、色素Ｄ１またはＤ２は、以下の構造を持つピラニン誘導体から作成される：
【化８】
2009519053.tif 000016
あるいは、以下の群からなる色素単量体から作成される：
【化９】
2009519053.tif 000017
ここで、Ｒ４＝−Ｈであり、また
Ｒ５は、−Ｒ６−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（Ｃ＝ＣＨ２）−Ｒ７，  −Ｒ６−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（Ｃ＝ＣＨ２）−Ｒ７，
−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ＝ＣＨ２、または−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２
Ｒ６は、炭素２から６の低級アルキレンであり、またＲ７＝−Ｈ，またはＣＨ３
ここでＺは以下から選択される加水分解により取り除かれる保護基であり、
−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ８−Ｙ
ここで、Ｒ８は、炭素原子１から４の低級アルキレンであり、また、
Ｙは、−Ｈ，  −ＯＨ，  −ＣＯ２Ｈ，  ＳＯ３Ｈ，  −（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ９，  あるいはＣＯ２−Ｒ９
ここで、Ｒ９は、炭素原子１から４の低級アルキレンである。
【００５６】
好ましくは、離散化合物、またはペンダント基である、色素部位Ｄ１は、以下から選択されるピラニン誘導体から作成される：
【化１０】
2009519053.tif 000018
ここで、Ｒ１８は、―ＨまたはＬ−Ａであり、Ｌは連結基であり、Ａは、−ＣＯＯＨおよびＳＯ３Ｈから選択される、また、
Ｒ１９は、−Ｈあるいは、色素が、少なくともＲ１８またはＲ１９のいずれかが重合可能基で、各スルホンアミド基が、一つの−Ｈで置換されるＤ２であるという条件で、上記Ｒ５から選択される。
【００５７】
別の態様において、Ｑ１は分子量（ＭＷ）が、少なくとも一つのボロン酸を持つ水溶性、または分散性の被分析物のＭＷのすくなくとも二倍である遊離化合物であり、前記化合物は、半透過性膜により、本体から分離される。好ましくは、遊離化合物としてのＱ１は、二つのボロン酸置換基を含む。
【００５８】
別の態様において、前記クエンチャーＱ１は、下記から選択される：
【化１１】
2009519053.tif 000019
上記構造において、オルト誘導体が含まれないという条件で、また：
【化１２】
2009519053.tif 000020
ここで、ボロン酸基は、オルト−、メタ−、および、パラ−部位にある。
【００５９】
色素Ｄにおいて、色素Ｄ１およびＤ２がジアゾ連鎖―Ｎ＝Ｎ−を含まない条件で、Ｄ１およびＤ２が定義されることに注意すること。
【００６０】
クエンチャーＱ、Ｑ１、およびＱ２において、クエンチャーＱ１およびＱ２がジアゾ連鎖−Ｎ＝Ｎ−を含まない条件で決定されることに注意すること。
【００６１】
本書に記述されたインビボの適用において、ポリマー存在下での４．４‘−ジピリドリルのＮ−ベンジル−２−ボロン酸付加体であるビオロゲンは除外される。
【００６２】
好適な実施例において、少なくとも１以上の負の電荷を持つフルオロフォアが、存在しても良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
［定義］
本文中に使用されている：
【００６４】
「ビス−ビオロゲン」は、二つのビオロゲンが互いに連結する化合物を示す。
【００６５】
「ボロン酸」は、−Ｂ（ＯＨ）２の構造を示す。当業者は、本発明のクエンチャーの合成における、様々な段階で、ボロン酸がボロン酸エステルとして存在する可能性を認識する。ボロン酸にはそのようなエステルを含むことが意図されている。
【００６６】
「検知器」は、光ダイオードなどの光度を測定する装置を示す。
【００６７】
「フルオロフォア」は、特定の波長の光で照射されるとより長い波長で発光する、すなわち蛍光を発する物質を示す。フルオロフォアには、有機色素、有機金属化合物、金属キレート、蛍光共役ポリマー、量子ドット、またはナノ粒子、または上述組み合わせを含む。フルオロフォアは、離散部分またはポリマーに付着する置換基でもよい。「蛍光色素」または「色素」は、離散化合物、または第二の遊離化合物に、あるいは前記反応性中間物または重合可能な化合物から生成されたポリマーペンダント基または単位鎖である、重合可能な化合物Ｄ１またはＤ２に、可逆性な反応性中間物、から選択され、ポリマーは、水溶性、または水拡散性、あるいは水に不溶なポリマーであり、また前記ポリマーは随意で架橋結合される。
【００６８】
「蛍光共役ポリマー」は、構造全体がフルオロフォアとして作用するポリマーを示す。その一般的な例は、ポリフェニレンビニレンであり、すなわち共役炭素−炭素二重結合が存在し、ポリマーが蛍光特性を持つに十分な共役である。
【００６９】
「ＨＥＭＡ」は、２−ヒドロキシエチルメタクリレートを示す。
【００７０】
「光源」または「励起光源」は、好ましくは選ばれた波長で光を照射する装置を示す。前記「光源」は、そのすべてが商用で入手可能な、キセノンランプ、中圧水銀ランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの電磁放射を放出するいずれの装置を包含してもよい。
【００７１】
「連結基」とは、検知部分をポリマーまたはマトリクスに共有結合させる、二価部分であり、Ｌ、Ｌ１，または、Ｌ２を示す。Ｌ、Ｌ１，または、Ｌ２の例としては、直接結合、あるいは、スルホンアミド（−Ｓｏ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝０）Ｎ−、エステル‐（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル‐Ｏ−、硫化物‐Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレンーＣ６Ｈ４−、ウレタンーＮＨ（ＣＯ＝Ｏ）＝Ｏ−、尿素ーＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオ尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド‐（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン‐ＮＲ‐（ここで、Ｒは、１から６炭素原子を持つアルキルとして定義される）等から選択される二価の連結基により、終端または中断される、１から８炭素原子を持つ低級アルキレンから、それぞれ独立して選択されるものを含む。
【００７２】
「ポリビオロゲン」は、一般的に、ビス−ビオロゲンを含む、連結した２以上のビオロゲン単位を含む化合物を示し、還元電位で測定された結合した化合物の電子親和力が、単一ビオロゲンより高まるに十分なほどビオロゲン環が近接している。
【００７３】
「ポリビオロゲンボロン酸」は、少なくとも２のボロン酸基と置換されたポリビオロゲンを示す。
【００７４】
「クエンチャー」（「Ｑ」）フルオロフォアに結合される場合、フルオロフォアの放出を低減させる化合物を示す。一実施例においては、クエンチャーとフルオロフォアが相互作用に十分な近接する場合、フルオロフォアは結合されるとみなされてよく、相互作用は結果として、還元蛍光となる。好適な実施例においては、Ｑはさらに、被分析物、好ましくはグルコースを結合し、被分析物結合は、Ｑのクエンチング活動を調節する。クエンチャーＱは、遊離化合物、離散化合物、または第二の遊離化合物に、あるいは前記反応性中間物または重合可能な化合物から生成されたポリマーペンダント基または単位鎖である、重合可能な化合物Ｄ１またはＤ２に、可逆性な反応性中間物、から選択され、ポリマーは、水溶性、または水拡散性ポリマーであり、また前記ポリマーは随意で架橋結合される。
【００７５】
「量子ドットは、（「ｑｄ」）は、電子と材料の孔が空間の超微小な領域に（通常１−２５ｎｍ）に閉じ込められるとき、材料構造は、サイズ量子化の構造に入り、システムの電子エネルギーレベルは、準連続よりも、離散的になり、材料の光学的、電子的特性が、サイズに強く依存する。そのような構造はその形状と、量子閉じ込めの次元により、、量子ドット、またはナノクリスタル、量子ロッド、または量子井戸と呼ばれる。それには、直径数ナノメートルで、水分散性にするために通常表面を官能基で処理された、半導体クリスタルを含む。
【００７６】
「インビボ」は、生きている哺乳類、好ましくは人体中における解析を示す。インビボ測定は、例えば、人体中に見られる、温度、圧力、媒体、分析物濃度およびｐＨの生理的状況下において実施される。
【００７７】
「ＩＰＮ」または、「相互貫入重合体ネットワーク」は、並置において合成された２以上のネットワークポリマーの組み合わせを示す（Ｌ．Ｈ．  Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，  Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，  ＡＣＳ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２３９，  １９９４，  ｆｒｏｍ  Ａｕｇｕｓｔ  ２５−３０，  １９９１  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＡＣＳ  Ｍｅｅｔｉｎｇ参照）。
【００７８】
「ピリジニウム」は、構造に言及する（単位からなる、すなわちピリジン環が窒素で置換されており、随意で環のほかの位置で炭素と置換されている、連結基またはペンダント基）。カーボンの置換基には、ビニル基を含み、窒素の置換基には、ベンジルボロン酸のメチレン基を含む。
【００７９】
「半ＩＰＮ」または「半相互貫入重合体ネットワーク」は、一方の成分が水溶性で、他方のポリマーがネットワークであるポリマーの組み合わせを示す（上記Ｓｐｅｒｌｉｎｇ参照）。
【００８０】
「オニウム」は、ビオロゲンが窒素の場合、ヘテロ原子に形式正電荷のある、芳香族複素環イオン化合物を示す。
【００８１】
「ＰＥＧ」あるいは、ポリエチレングリコールは、オキシエチレン（−ＯＣＨ２−ＣＨ２−）反復単位を含む、ポリマーまたは鎖セグメントを示す。
【００８２】
「ＰＥＧＤＭＡ」は、２つのメタクリレート基で終端された、ポリエチレングリコールを示す。
【００８３】
「ＰＥＧＤＭＡ」は、１つのメタクリレート基で終端された、ポリエチレングリコールを示す。
【００８４】
「生理的ｐＨ」は、健康的な生存中の人間の血液中に通常存在する、７．３−７．５のｐＨ範囲を示す。重病患者においては、約６．８から７．８の生理ｐＨがしばし見られる。
【００８５】
「可視光範囲」は、約４００から８００ｎｍの間のスペクトルの光を示す。
【００８６】
ビオロゲンは、一般的に２−２‘−、３，３’−または４，４‘−Ｎ，Ｎ’ビス−（ベンジル）ビピリジウムジハロゲン（すなわち、ジクロライド、ブロマイドクロライド）等の、共役Ｎ置換複素環芳香族ビスオニウム塩を含む、窒素の基本的構造を持つ化合物を示す。
【００８７】
数々の重要な発展に関する本発明の好適な実施例に数々の重要な発展が包含される。これらには、水性または有機液中、またはその組み合わせ、あるいは生理液中の糖質、１，２ジオール、または１，３、ジオールレベルを決定する方法、およびインビボ装置が含まれるが、これに限定されない。フルオロフォア色素群、ボロン酸置換クエンチャー群、およびの相互作用する、水相溶性、水溶性、有機溶剤相溶性および有機溶剤溶性の組み合わせの有機ポリマーが使用されている。これらの態様に関しては、下記に詳細に述べられている。先ず成分について述べられ、方法と装置を生成するその組み合わせの記述が続く。
【００８８】
［クエンチャー］
本発明において、グルコース認識をもたらす部分は、芳香族ボロン酸である。さらに具体的には、本発明のボロン酸は、共役窒素含有複素環芳香族ビスオニウム構造、例えばビオロゲンに（図３Ａから３Ｉの例を参照）共有結合しており、ボロン酸は、ｐＨ約６．８から７．８で、水性媒体中のグルコースと可逆的に反応しボロン酸エステルを生成する。特定のｐＨにおける反応の範囲はグルコース濃度と、ボロン酸の酸性度（ｐＫａによって測定される）に関連する。
【００８９】
本発明のビスオニウム塩は、共役複素環芳香族ジニトロゲン化合物から作成される。共役複素環芳香族ジニトロゲン化合物は、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン、ジアザフルオレンから、選択され、窒素原子は異なる芳香環にあり、オニウム塩を生成することが出来る。両方の窒素を置換することの出来る、共役複素環芳香族二窒素化合物のすべての異性体は、本発明において有用であることが理解されること。４，４’−ジピリジル、および４，７−フェナントロリン由来のビスオニウム塩が含まれる。ビオロゲンボロン酸付加体は、離散化合物、あるいは水相溶性ペンダント基、または分子量１０，０００を上回る水溶性、または水分散性ポリマーの鎖の単位系であり、あるいは、不溶性ポリマーマトリクスに結合している。一以上のボロン酸基がビオロゲン部分に付着している。
【００９０】
ポリマークエンチャー前駆体においては、中心に位置した複素環式芳香族基中の２つの異なる窒素に付着するボロン酸部分には、複数選択肢がある
これらは：
ａ）第一の芳香族部分の重合可能な基は、一方の窒素に付着し、少なくとも一つの−Ｂ（ＯＨ）２期を含む第二の芳香族基は、第二の窒素に付着する。
ｂ）一つ以上のボロン酸は、一つの窒素および一つのボロン酸に付着した、第一の芳香族部分に付着し、重合可能な基は、第二の芳香族基が第二の窒素に付着した、第二の芳香族基に付着する。
ｃ）一つのボロン酸基と、一つの重合可能な基が、第一の芳香族基が一つの窒素に付着した第一の芳香族部分と付着し、またボロン酸基と重合可能な基が、第二の窒素と付着している第二の芳香族部分に付着する。
ｄ）一つのボロン酸が各窒素に付着し、重合可能あるいは連結基が複素芳香族環に付着している。好適な実施例においては、２ボロン酸部分、および１重合可能な基あるいは、連結基がある。
ボロン酸基がひとつの代表ビオロゲンには、次のものを含む：  
１．     構造のボロン酸置換ビオロゲン
【化１３】
2009519053.tif 000021
ここで、ｎ＝１−３、好ましくは、ｎは１、また、Ｌは連結基、すなわちここで定義されるＬ１またはＬ２、また、Ｍはここに定義されるポリマーマトリクスである。また
ここで、Ｙ２は、フェニルボロン酸（ｍ−およびＰ−異性体）またはナフチルボロン酸、好ましくはフェニルボロン酸である。また、
２．     ビオロゲンの複素環の置換基として
【００９１】
ビオロゲンは、上記の組み合わせを含むことが意図される。ビオロゲン／ボロン酸が抽出される前駆体は、一端をボロン酸官能基で、またもう一端をビニル基などの重合可能な基で非対称的に置換されたビオロゲンである（図３Ａから３Ｉ参照）。ビオロゲン／ボロン酸部分（すなわちクエンチャー）は、ペンダント基、水溶性あるいは水分散性ポリマーの単位鎖、または、架橋構造親水性ポリマー、または平衡が確立するよう、グルコースを十分透過するヒドロゲルにおけるユニットである。好適な実施例において、ビオロゲンが２つ以上のボロン部分からなる場合、より強度なシグナルが見られる。
【００９２】
別の実施例においては、クエンチャーＱ１またはＱ２は、ｏ−，  ｍ−  またはｐ−ボロン酸からなる一群から選択されるクエンチャー前駆体から生成される：
【化１４】
2009519053.tif 000022
ここで、Ｖは、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン、またはジアザフルオレンから選択される、共役複素環式芳香族基を含む二窒素であり、２つの窒素原子が、それぞれ異なる芳香族環にあり、窒素は、オニウム塩の精製が可能なすべての位置にあり、またＺ１またはＺ２は、窒素上の独立した置換基であり、重合可能なエチレン含有不飽和基または、随意でボロン酸置換キシリレン連結基のいずれかである。
【００９３】
重合可能な基は、以下から選択されるが、これらに限られない：
（ｉ）−Ｒ１０−ＣＯ２−Ｃ（Ｒ１１）＝＝ＣＨ２，  −Ｒ１０−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ（Ｒ２）＝ＣＨ２  または−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ＝ＣＨ２
ここでＲ１０は、２から６炭素原子の下級アルキレンまたはヒドロキシアルキレンであり、また
Ｒ１１＝−Ｈまたは−ＣＨ３である。
（ｉｉ）前記結合基は、以下から選択されるがこれらに限られない：
−Ｒ１２−Ｚ３
ここで、Ｒ１２は、結合基で、好ましくは、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２または、２から６炭素原子のアルキレンであり、また
Ｚ３は、共反応物質と、共有結合を形成が可能な、反応性官能基である。このような基には、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２，Ｈ、または−ＮＨ２を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
Ｑ１は、離散化合物、あるいは、水溶性または水分散性ポリマーのペンダント基、または単位鎖（直鎖、または分岐鎖）である。Ｑ２は、水不溶性ポリマーマトリクスＭ１−Ｌ２−Ｑ２のペンダント基あるいは、単位鎖である。好ましくは、マトリクスは、架橋構造ヒドロゲルである。
【００９５】
別の態様では、Ｑ１またはＱ２は、以下から選択される前駆体から生成される：
【化１５】
2009519053.tif 000023
ここで、Ｖ１は、Ｖと同一で、またＺ４およびＺ５は、Ｚ１およびＺ２など、さらにクエンチャー前駆体でメチレン基に結合する、Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムおよびピリジウムを含む、第四級窒素基に共有結合する重合可能な基、または結合基である。
【００９６】
よって、Ｚ４またはＺ５は、２，３または４−（ＣＨ２＝ＣＨ）−ピリジニウム、２，３または４−（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ピリジニウム、−Ｎ−（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）ｗ−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｗ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）ｗ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ２、および‐Ｏ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２を含み、Ｗは２から６の整数、あるいは、Ｚ４とＺ５は、ヘテロ原子、好ましくは、−Ｏ−を通してビオロゲン前駆体でメチレン基に結合するＺ１およびＺ2である。重合可能な基、または結合基のその後の反応は、クエンチャー前駆体が水溶性または水分散性ポリマーへ、または、前記ポリマーのペンダント基、単位鎖、または終端基としての、ポリマーマトリクスＭへ結合する結果となる。
【００９７】
好適なクエンチャーＱ２は、窒素においてベンジルボロン酸基と、またジピリドリル間のほかの位置で重合可能な基、または結合基と置換した、３．３‘−ジピリドリルから抽出されたビオロゲンからなる前駆体から生成される。代表ビオロゲンには以下を含む：
【化１６】
2009519053.tif 000024
ここで、Ｌ４は、ここに定義されるＬ、Ｌ１またはＬ２から独立して選択され、Ｚ６は、ここに定義されるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４またはＺ５から独立して選択され、Ｒ’は−Ｂ（ＯＨ）２、またＲ”は、ここに定義される、重合可能な、または結合基である。
【００９８】
新規クエンチャー前駆体の他の例には、以下を含む：
【化１７】
2009519053.tif 000025
【００９９】
Ｒ１は、ベンジル環のオルト−、メタ−、またはパラ部位におけるボロン酸である。Ｒ２は、ヒドロゲン、あるいは随意で、ここで定義される重合可能な基または結合基、またはボロン酸の酸性度を調整するために特に使用される置換基である。
【０１００】
ボロン酸置換のポリビオロゲンは、好適なクエンチャーの別の類である。ビオロゲンという用語には、連結基により共有結合した２以上のビオロゲンからなる離散化合物、鎖におけるビオロゲン反復単位からなるポリマー、鎖に釣り下がるビオロゲン基を備えるポリマー、好ましくはビオロゲン終端基を含む、ビオロゲン単位をからなるデンドリマー、好ましくはビオロゲン終端基を含むビオロゲン単位からなるオリゴマー、およびこれらの組み合わせを含む。モノビオロゲン基がその中で微量成分であるポリマーは含まれない。好適なクエンチャーは、少なくとも２のボロン酸と置換され、また水溶性、または分散性ポリマー、またはポリビオロゲンボロン酸からなるヒドロゲルである。あるいは、ポリビオロゲンボロン酸は、不活性基質に直接結合されている。  クエンチャー前駆体は、さらに重合可能な基または結合基と置換される、低分子量ポリビオロゲンボロン酸を含む、ポリビオロゲンボロン酸からなる。
【０１０１】
具体的な一実施例においては、ポリビオロゲンボロン酸前駆体は、２ビオロゲン単位を共有結合させることにより生成されたビスビオロゲン誘導体であり、前記付加体は、ボロン酸、および重合可能な基または結合基とさらに置換されている。好ましくは、前駆体は、連結基に直接結合しているそのような重合可能な基、または結合基の一つのみと置換される。連結基は、各ビオロゲン単位の複素芳香族環における１つの窒素へ、各ビオロゲン単位の環における炭素に結合する、あるいは、一方のビオロゲンにおける環炭素へ一つの結合をし、窒素へもう一方の結合をする。２以上のボロン酸基がクエンチャー前駆体に結合している。好ましくは、連結基はボロン酸基のグルコースへの協同的結合を高めるため選択される。
【０１０２】
２つのビオロゲン単位を連結する部分は、連結基Ｌであり、連結基Ｌは、ボロン酸基、重合可能な基、あるいは、結合基、あるいは、その組み合わせによって随意にさらに置換される、という条件で、以前に定義されている。一部の例では、連結基は、ビオロゲンはペンダント基または鎖の単位であるポリマー鎖のセグメントでもよい。
【０１０３】
［フロロフォア色素］
本発明の実施例において有用な色素（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ参照）は、約４００ｎｍ以上（好ましくは４３０ｎｍ）の波長の光で、ストークスの変化が波長の励起および放出が分離するに十分な大きさ、少なくとも１０ｎｍ、また好ましくは約３０ｎｍ以上で励起される。これらの色素は、ビオロゲンなどの電子受容体分子によるクエンチングに感受性があり、光漂白に体制があり、光酸化、加水分解、および生分解に安定である。本発明において有用な色素は、約５０以上、好ましくは１００以上のメチルビオロゲンで試験される場合、見かけのスターンウォリメルクエンチング定数をもつ。スターンウォリメル試験の一般的記述は、下記の手順Ａに見られる。好適な色素には、ヒドロキピレントリスルホン酸およびアミノピレントリスルホン酸のポリマー誘導体である。一部の例では、色素はスルホンアミド官能基を通してポリマーに結合する。ポリマー色素は、水溶性、不溶性だが、膨潤性、水分散性であり、また架橋結合されていてもよい。ポリマーとしての好適な色素は、例えば、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，−トリス（メトキシポリエトキシルエチル（ｎ〜１２５）スルホンアミド）（アセトキシピレントリスルホニルクロライドをアミノエチルＰＥＧモノメチルエーテルで反応させ生成した）水溶性ＰＥＧ付加体である。結果として生じる色素ポリマーは、少なくとも約１０，０００の分子量を持ち、ヒドロゲルまたはネットワークポリマーマトリクスに閉じ込められる場合、マトリクスから周辺の水性媒体に拡散できない。
【０１０４】
拡散化合物としての代表色素は、８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルフォニルクロライド（ＨＰＴＳ−ＣＬ）をアミノブチル酸などの、アミノ酸で反応させることにより形成したトリス付加体である。ポリマーと結合し、１以上のアニオン基をもつ、ヒドロキシピレントリスルホンアミド色素が好ましく、それらには、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡなどと、８−ヒドロキシピレン−１−Ｎ（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）−Ｎ‘，Ｎ“−３，６−ビス（カルボキシプロピルスルホンアミド）ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡとの共重合体である。
【０１０５】
他の例には、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、または他の親水性驚嘆量対と、８−アセトオキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ‘，Ｎ“−トリス（メタクリルアミドプロピルスルフォンアミド）の共重合体である。色素におけるフェノール置換基は、重合中、重合の完了後に加水分解によって取り除くことが出来る、保護基によって保護されている。アセトキシ、トリフロロアセトキシなどの例に好適なそのような保護基が技術的に良く知られている。他の好適な色素には、ペンダント基、またはポリマー鎖の単位としてのポリマーに色素が結合している、アミノピレントリスルホン酸［ＡＰＴＳ］のポリマー誘導体が含まれる。色素は、スルホンアミド連結を通して、また好ましくは、アミン連結基を通して、ポリマーに結合している。重合可能ないくつかのＡＰＴＳ誘導体には、以下を含む：
【化１８】
2009519053.tif 000026
【０１０６】
検出が行われるには、検出部分（被分析物、色素、クエンチャー）が、相互作用を可能にするよう、例えば、分子レベルで混合し、検出される種と平衡が確立するよう、物理的に近接することが好ましい。いずれの理論または、構造に拘束されない中で、色素とクエンチャーのイオン相互作用は、基底状態色素／ビオロゲン複合体へ導き、色素から放出された蛍光の光度が減衰されたようである。クエンチャーへのグルコースの結合は、複合体を弱くする負に帯電したボロネートエステルを生成し、グルコース結合の範囲により、光度を上昇させる。シグナルに影響する被分析物結合からの立体相互作用により、複合種の分子配座における変化もまた起こりえる。さらに、ボロネートエステルは、ビオロゲンと相互作用する場合があり、それよりクエンチング有効性を変化させる。この相互作用の特定な性質はまだ確立されていないが、ボロネートの形成がビオロゲンの還元電荷を変化させることがある。還元電荷は、ビオロゲンの電荷受容能力の指標である。大幅に強化されたポリビオロゲン／ボロニック付加体のクエンチング効率、およびグルコース結合から得られた増大した変化は、酸化還元機構が関わっている可能性を示す。色素とクエンチャーのレドクッス結合の後、色素を非励起状態に保つ支援をする、ビオロゲン部分の電子交換が続く。ボロン酸エステル形成は、この工程に干渉する。
【０１０７】
［量子ドット（ｑｄ）実施例］
蛍光量子ドット半導体ナノ粒子は、生分子標識、組織像、およびイオン検出などの適用において、従来有機フルオロフォアの代替として使用の増加が見られてきた。蛍光量子ドット（ｑｄ）への関心は、広い吸収性、狭い発光、強い光度、および有機色素に対する良好な光安定性から由来している。しかし驚くべきことに、多くの多様な蛍光ベースのグルコース検出系の一式にも関わらず、本質的に蛍光なｑｄを使用したグルコース検出方法が報告されていなかった。本文に記載されているグルコース検出への二成分アプローチは、検出適用の特定な要求事項によりクエンチャー／受容体およびフルオロフォア成分の選択にかなりの柔軟性を可能にする。例えば、特定のクエンチャー／受容体がその単糖結合の選択性が理由で選ばれている可能性があると同時に、フルオロフォア成分は、いずれの範囲の希望する励起、または発光波長を提供するために選択されている。ｑｄの利点のいくつかは、水性溶液中のグルコース濃度の変化を検出する、二成分系において実現されている。
【０１０８】
蛍光ｑｄは、希望する表面の化学的性質をもたらすため、ＺｎＳなどの絶縁ジェル材料で被覆され、さらに処理された、ＣｄＴｅおよびＳｄＳｅなどの無機半導体コア材料で、構成されている。水溶性コアシェルｑｄの生成には、ホスホン酸塩、カルボキシル、またはアミン基での表面機能化がしばし用いられる。特定の表面の化学的性質が、たんぱく質などの関心ある分子へｑｂの結合、また、溶解度、凝集挙動、およびクエンチング工程への感応性の決定を可能にする。メチルビオロゲン（ＭＶ２＋）を使用したｑｄ蛍光のクエンチングをいくつかのグループが、観察した。工程は、励起状態の電子がｑｄからビオロゲンに異動し、結果としてビオロゲンからＭＶ●＋へ還元されることから起こると考えられている。過去の研究は、ビオロゲンが、フルオロフォアとの複合形成を通し、多くの有機色素の蛍光の静的クエンチングにおいて、非常に効率的であることを示している。カルボキシ、およびアミンなどの極性表面基を持つ、コアシェル量子ドットの蛍光は同様に、ボロン酸置換ビオロゲンクエンチャーとの複合形成を通し、同様にクエンチされている。
【０１０９】
商業的に入手可能なコアシェルＣｄＳｅ量子ドットの２組が表面機能化を除き、同じように生成された：一方は、表面がカルボキシ基で、もう一方はアミン基で生成された。両方の組は、６０４ｎｍで集中した、比較的狭い蛍光発光であった。これらｑｄは、実に有機色素と同様にこの系において機能した、つまり、ビオロゲンクエンチャーを追加すると蛍光の減少が見られた。消光されたｑｄ溶液にグルコースを追加すると、強固な蛍光回復が見られた（図１８）。
【０１１０】
ボロン酸置換ビオロゲンｏ−ＢＢＶ２＋による、両方の量子ドット組の蛍光クエンチングに対する感受性は、ｐｈ７．４の水溶液中で決定された（図２０）。カルボキシルおよびアミンの両方で置換されたｑｄの蛍光は、カルボキシ置換ドットが、アミン置換ドットに比べ、より強い感受性で、ｏ−ＢＢＶ２＋によるクエンチングに感受性があった。両方のｑｄの組の蛍光は、またボロン酸置換ビオロゲンより低い度合いではあるが、単純非置換ベンジルビオロゲン（ＢＶ２＋）によって、同様にクエンチされている。顕著に、表面基のイオン化の度合いが決定されていない一方で、アミンドットは中性になりそうなであるのに対し、カルボキシル置換ドットは、主にｐＨ７．４において、アニオン型において存在することが期待される。カルボキシ置換ｑｄの増幅された感受性は、ｑｄの陽イオンビオロゲンクエンチャーと、陰イオン表面基の間の静電気引力による場合がある。
【０１１１】
過去の研究は、生理グルコース範囲全体の強く線形なシグナル応答に対し、クエンチャーとフルオロフォアの適切な割合の選択が重要であることを示した。数々の異なるクエンチャー対量子ドット比率で実験を行う場合、一般的に、グルコースの追加に対応し、より高い比率のときは、より大きな線形の蛍光シグナルであるという、従来有機色素と同じ反応が見られた（図３）。
【０１１２】
ｑｄの両方の組の、５０、２００、５００、および１０００対１のクエンチャー：ｑｄ比率でのグルコース反応を調べた。アミンおよびカルボキシル置換ｑｄの両方で、１０００：１のクエンチャー対量子ドット比を使用して、最適な結果が得られた。著しく、量子ドットの使用が、大きなシグナル応答と、相当な、１００ｎＭグルコースの追加の後、非クエンチ量子ドット蛍光の回復を可能にした（図２１）。
【０１１３】
二成分検出系におけるヒドロゲル中の糖質の検出に、量子ドットを使用した結果が実施例６０に示されている。
【０１１４】
インビボでの適用において、センサーは流動する生理液、例えば、一つ以上のポリヒドロキシル有機化合物を含む血管内において使用されること、または、前記化合物を含む筋肉などの組織に埋め込まれることが好ましい。したがって、センサー集合より、いずれの検出部分が漏れないことが望ましい。よって、インビボでの使用においては、検出成分は、有機ポリマー検出集合体の一部である。水溶性色素およびクエンチャーは、被分析物の透過を許すが、検出部分の透過をブロックする半透過性膜によって、閉じ込めることが出来る。これは、被分析物分子より実質的に大きい（分析物の少なくとも二倍の分子量、または１０００より大きい、好ましくは、５０００より大きい分子量）、検出部分溶性分子を使用することで実現でき、また二つの間で特定の分子量を削除する、透析、または限外ろ過膜などの、選択半透過性膜を使用することによって、検出部分は量的に維持できる。
【０１１５】
好ましくは、検出部分は、グルコースに自由に透過可能な、不溶ポリマーマトリクスに固定化される、図８参照。ポリマーマトリクスは、有機、無機、またはその組み合わせのポリマーからなってもよい。マトリクスは、生体適合性材料から構成されても良い。あるいは、マトリクスは、目的の被分析物に透過性のある、第二生体適合性ポリマーにより被覆されても良い。
【０１１６】
ポリマーマトリクスの一つの機能は、フルオロフォアとクエンチャー部分をまとめ、固定し、これらの部分の間を結合可能にすることであり、同時に、被分析物との接触と、被分析物のボロン酸への結合を許す。この効果を達成するには、マトリクスは、媒体において不溶であること、またマトリクスと被分析物溶液とを結合する高表面積を確立することにより、それと近接結合することが好ましい。例えば、超薄膜、または細孔サポートマトリクスが使用されても良い。また、マトリクスは被分析物溶液において膨潤性であり、例えば、ヒドロゲルマトリクスが、水溶液系に使用される。ある場合においては、検出ポリマーは、光導管の表面などの表面に結合している、または細孔膜に含浸している。すべての場合において、マトリクスは被分析物の結合部位への運搬に干渉しないことが望ましく、よって、二つの相間において平衡が確立される。超薄膜、細孔ポリマー、細孔ソルゲル、およびヒドロゲルを生成する技術は、当技術分野において確立している。有用なマトリクスのすべてが、透過性の分析物として定義されている。
【０１１７】
ヒドロゲルポリマーが本発明の実施例に好ましい。本書に使用されている用語ヒドロゲルは、実質的に膨潤するが、水に溶けないポリマーを言及する。そのようなポリマーは、線形、分岐、またはネットワークポリマー、または水溶性または浸出性分画を含まないという、規定の高分子電解質複合体であっても良い。一般的に、ヒドロゲルネットワークは、架橋結合工程により生成され、この工程は水性ポリマーで行われることにより、膨潤するか、水性媒体に溶解しない。また、水溶性ポリマーは、水膨潤性ネットワークポリマーを得るため、親水性および架橋構造単量体の混合を重合化することにより生成される。そのようなポリマーは、付加、または縮合重合、または組み合わせ工程によって形成される。これらの場合において、検出部分はネットワーク形成単量体との組み合わせによる、単量体誘導体を使用した重合によりポリマーに含まれる。または、感応性部分重合化後反応を使用して既に生成されているマトリクスに結合される。前記検出部分はポリマー鎖または前記鎖に付着するペンダント基の単位である。
【０１１８】
本発明に有用なヒドロゲルは、色素とクエンチャーの両方が共有結合する、単ネットワークなどの、モノリシックポリマー、または相互貫入ネットワーク多成分ヒドロゲルでもよい。多成分ヒドロゲルには、ヒドロゲルマトリクスおよび交互マイクロレイヤー集合中の、第二のポリマーの分散を含む、水膨潤性合成物を得るために、相互貫入ネットワーク、ポリ電解質複合体、他の様々な二つ以上のポリマーのブレンドを含む。
【０１１９】
モノリシックポリマーヒドロゲルは、通常、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドなどのが含まれるが、これに限られない、親水性単量体の混合による、フリーラジカル重合により形成され、イオン単量体には、メタクリルロイルアミノプロピルトリメチルクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、ソジウムスルホプロピルメタクリレート等を含み、架橋剤には、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドトリメチルオルプロパントリアクリレートなどが含まれる。単量体の比率は、当技術分野において、よく確立された、透過性、膨潤指数、およびゲル強度を含む、ネットワーク特性を最適化するよう選択される。一実施例において、色素部分は、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ‘，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルフォンアミド）などの、色素分子のエチレン含有不飽和誘導体に由来し、クエンチャー部分は、４−Ｎ−ベンジル−３−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル−４エテニル）−ジピリジニウムジハロゲン（ｍ−ＳＢＢＶ）などのエチレン含有不飽和ビオロゲンに由来しており、また、マトリクスは、ＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡから生成される。色素濃度は、発光強度を最適化するため選択される。クエンチャー対色素の比率は、望ましい測定可能なシグナルを生成するために十分な消光を提供するよう調整される。
【０１２０】
また、モノリシックヒドロゲルは、縮合重合によって形成することが出来る。例えば、アセトキシピレントリスルフォニルクロライドは、未反応ジアミンに溶解した、トリス−（アミノＰＥＧ）付加体を得るために、ＰＥＧジアミンの余剰と反応する。余剰のトリメソイルクロライドおよび酸受容体は、ビオロゲンの酸クロライド機能性生テルを得るため、４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（２ヒドロキシエチル）ビピリジニウムジハロゲンに反応する。二つの反応性混合物は、互いに接触され、例えば、一つの混合物で成膜し、もう一つに浸漬することにより、ヒドロゲルを形成するため反応することを許される。
【０１２１】
本方法の条件下でボロネートエステルを形成するため、ボロン酸と反応することの出来るポリマーは、マトリクスポリマーとして好まれない。セルロース誘導体ポリマー、多糖、ポリビニルアルコール、およびその共重合体が含まれるが、これらに限定されない、そのようなポリマーは、１，２−またア１，３−ジヒドロキシ置換基を持つ。
【０１２２】
一つの成分に色素が含まれ、他方にクエンチャーが含まれる、多成分ヒドロゲルが、本発明のセンサーを作成するために好まれる。また、これらの系は、成分間の相互作用を高めるため、また他のポリヒドロキシ被分析物より、グルコースの選択性を提供するため、随意で、分子インプリントされる。好ましくは、多成分系は、相互貫入重合体ネットワーク（ＩＰＮ）または、半相互貫入重合体ネットワーク（半ＩＰＮ）である。
【０１２３】
ＩＰＮポリマーは、通常逐次重合によって生成される。先ず、クエンチャーを含むネットワークが形成される。そして、ネットワークは、色素単量体を含む単量体の混合物で膨潤され、ＩＰＮヒドロゲルを得るため第二の重合が行われる。
【０１２４】
半ＩＰＮヒドロゲルは、色素部分を含む可溶性ポリマーを、クエンチャー単量体を含む、単量体混合物に溶解し、重合することにより形成される。あるいは、可溶性クエンチャーポリマーを色素単量体に含む、単量体混合物に溶解し、混合物を重合する。いずれの場合においても、可溶性成分の分子量は、ネットワークの外に拡散できないよう、すなわち、物理的にマトリクスに結合、または閉じ込められないよう、十分高く（約１０，０００以上）なくてはならない。
【０１２５】
図４Ａにおいて、ポリマー鎖４１、４２、および４４の一群は、クエンチャー、例えばクエンチャーＱ２を含む。第二のポリマー鎖４５、４６、および４７の群は、色素、例えばほぼ同時または、逐次形成された色素Ｄ２を含む。ポリマーの架橋点は、４８と、４９として指定されている。図４Ｂにお低は、ポリマー鎖５１、５２、５３、および５４は、クエンチャー、例えばクエンチャーＱ２を含む。色素Ｄ１は、第二ポリマー５６のペンダント基にある。架橋点５７が指定されている。
【０１２６】
［分子インプリント］
随意で、本発明のポリマーは、分子インプリントされる。一実施例において、有機塩は、単量体クエンチャーカチオン、および単量体色素アニオンにより形成される。そして有機塩は、モノリシックヒドロゲルマトリクスを形成するため、少なくともイオン対が部分的に結合され続けるような、条件下において、共重合される。あるいは、クエンチャー単量体は、第一のポリマーを形成するため重合され、次にアニオン色素対イオンのある高分子電解質を得るため、イオン交換される。後者は次に、イオン結合を通し、クエンチャーと結合される、相互貫入色素ポリマーを形成するため、好適な単量体と共重合される。  この組み合わせが、ＩＰＮポリマーまたは半ＩＰＭポリマーのいずれかである。別の実施例において、本発明のポリマーは、最初に、重合可能ビオロゲンボロン酸のある、グルコースのビスボロネートエステルを形成することにより、フルクトースなどの、他のポリヒドロキシ化合物に対する、グルコースの選択性を高めるため、分子インプリントされる。そしてこのエステルは、グルコースインプリントポリマーを得るため、共重合され、加水分解される。このポリマーは、次に、色素ポリマーのあるＩＰＭを形成するために使用される。
【０１２７】
別の態様において、ｍ−ＳＢＢＶは、例えば水／ジオキサンなどの水性有機溶剤に約２：１の分子比で、グルコースと混合される。この生成ビスボロネートエステルは、真空化において、溶液を留去することにより再生される。生成物は、次に、例１４に記述される手順に従い、第一のヒドロゲルを得るため、ＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡと共重合される。そしてグルコースは、希釈塩酸中で調整することにより、ヒドロゲルから漉し出される。脱イオン水で調整した後、ヒドロゲルは例２８の色素単量体と接触し、アニオン色素とカチオンクエンチャーポリマーの間に、複合体を形成する。そして、更なるＨＥＭＡとＰＥＧＤＭＡでの第二段階重合が、分子インプリントＩＰＮヒドロゲルを形成するために実行される。
【０１２８】
多成分ヒドロゲルの個別成分は、同じまたは異なる重合スキームにより作られる。例えば、ＩＰＮポリマーにおいては、第一のネットワークは、フリーラジカル重合により形成され、第二のネットワークは、縮合重合により形成される。同様にして、半ＩＰＮポリマーにおいては、溶解性成分は縮合重合により形成され、ネットワークは、フリーラジカル重合によって形成される。例えばポリ４，４‘−Ｎ，Ｎ’−ビス（１，３−キシレン−５−ボロン酸）ビピリジニウムジハロンなどの、クエンチャーポリマーは、４，４’−ジピドリルを３，５−ビス−ブロモメチルフェニルボロン酸と凝縮することにより形成される。クエンチャーポリマーは、上述の８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’、Ｎ”−  トリス（メタクリルアミドプロピルスルフォンアミド）を含む反応混合物に溶解され、溶液は半ＩＰＮヒドロゲルを得るために重合される。
【０１２９】
上述のクエンチャーポリマーは、ポリビオロゲンボロン酸の一例である。
【０１３０】
具体的な実施例においては、８−ヒドロキシピレン−１，３，６、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（ｎ〜１２５）スルホンアミド）を得るため、アセトキシピレントリスルフォニルクロライドをアミノエチルＰＥＧモノエチルエーテルで凝縮することにより、高分子量水溶性色素が生成される。ＰＥＧ色素ポリマーは、半ＩＰＮヒドロゲルを得るため、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＤＭＡ、４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムジハロン（ｍ−ＳＢＢＶ）、水性アルコール、フリーラジカル開始剤からなる混合物に溶解され、重合される。希釈塩基で加水分解し、脱イオン水でろ過した後、ヒドロゲルは、体液に露出され、また体液と平衡になるよう、分岐光学ファイバー光導管に装着される。光導管は適切なフィルターと共に青色発光ダイオード（ＬＥＤ）光源と、電子コントローラーと関係する測定機器共に、シリコン光検出器に接続される。センサーは、体の望む場所へ挿入される、カテーテルの先端に設置される。センサーは、約４７５ｎｍの光、および５２０ｎｍで監視される蛍光度の光に励起される。体液中のグルコースのレベルが発光の強度から決定される。
【０１３１】
［単成分ビオロゲンセンサー］
本発明の別の実施例は、フルオロフォアに共有結合する、ボロン酸置換ビオロゲンである。遊離化合物としての単成分ビオロゲンセンサーの例は、実施例３９として示されている。好ましくは、付加体は重合可能化合物、またはポリマーの一単位である。そのような付加体の一つは、先ず、ベンジル−３−ボロン酸基を一つの窒素と、またアミノエチル基ともう一方を付着させることにより、４，４‘−ジピドリルから非対称ビオロゲンを形成することにより生成される。ビオロゲンは、プリポリマー混合物を得るため、順次に、先ず８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルフォニルクロライドを１：１のモル比で、次に余剰ＰＥＧジアミンの反応によって凝縮される。すべての酸受容体は、副生成物酸を除去するために、両方の工程に含まれる。プレポリマー混合物は、ヒドロゲルを得るため、ポリイソシアネートと反応させることによって架橋結合される。生成物は、保護基を取り除くため、塩基で処理される。不完全反応性生物、および未反応開始物は、更なる使用の前に、脱イオン水で完全抽出することにより、ヒドロゲルからろ過することが出来る。生成物は、本書に記述されるとおり、検出成分として使用される場合、グルコースに反応する。
【０１３２】
あるいは、前記付加体は、エチレン含有不飽和単量体、例えばジメチルビス‐ブロモメチルベンゼンボロネートで、半ビオロゲン付加体を形成するために余剰４，４−ジピリドリルと反応される。余剰ジピリドリルを取り除いた後、付加体はさらにブロモエチレンアミドヒドロクロライドの余剰と反応され、ビス‐ビオロゲン付加体を生成する。この付加体は、酸受容体の存在下で、１：１のモル比で、８−アセトキシピレントリスルフォニルクロライドと反応し、その後、余剰アミノプロピルメタクリルアミドと反応することにより、ピラニン色素に結合される。最後に、いずれの残留アミノ基はメタクリルクロライドと反応される。精製後、色素／ビオロゲン単量体は、ヒドロゲルを得るため、ＨＥＭＡとＰＥＧＤＭＡと共重合化される。
【０１３３】
このビオロゲンの一群の利点の一つは、色素とクエンチャーが、共有結合により、近接していることで（すなわち、結合可能な構造に固定されて）、感度の上昇につながることがある。欠点は、これらの付加体を作ることは、困難な合成の課題で、組成の変更の実施が難しいことである。生成物の特性化と精製は同様に困難である。よって、色素とクエンチャーが独立した構成要素である、実施例が好ましい。本書に記載された成分の組み合わせは、生理液中のポリヒドロキシ置換有機分子の決定のための装置を生成する。
【０１３４】
［グルコースの解析のバッチ光学法］
測定は従来発光分光計によって実施される。本発明の色素とクエンチャーを含む溶液は、ｐＨ＝７．４に緩衝され、生成され、クベットに搭載される。使用される色素に好適な波長の光でサンプルは励起され、蛍光強度が測定される。定量の未知のグルコースが含まれる溶液が、前記溶液に追加され、測定が繰り返される。グルコース溶液の標準系を測定し、濃度の関数として、強度が変化するごとに結果をプロットすることにより、個別に決定された校正曲線に参照することによって、強度の変化がグルコース濃度の計算に使用される。この方法においては、検出成分は試験のときにだけ安定する必要があり、グルコースと反応は可逆的ある必要がない。
【０１３５】
［プロセスストリーム解析の光学的方法］
蛍光分光計のために、貫流セルが作製される。一方の面が励起光に、他方がプロセスストリームにさらされるように、検出ポリマーがセルに取り付けられる。グルコースの無いプロセスストリームをセルを通して通過し、蛍光の安定状態を測定することによって、ベースラインを確立する。そしてプロセスストリームは、セルを通して通過され、時間の関数として蛍光強度が監視される。グルコース濃度は、上述のとおり構成曲線を参照することにより決定される。この方法においては、センサーは動作の間にわたり安定していなければならず、またグルコースとの反応も可逆的でなくてはならない。検出部分は、固定されなければならず、プロセスストリームに浸出してはならない。
【０１３６】
［装置設定］
図８は、一回、または継続的な糖質、すなわちグルコースの監視に使用される装置の概略図である。色素を含み、クエンチされた、検出ポリマー８１は、オプショナルサポート８２に付着されてもよい。いくつかの実施例においては、随意半透過性ポリマー膜８３が存在する。他の適用においては、最適生体適合被膜８３Ｂに集合体を被覆することが有用な場合がある。光源８４は、光学フィルター８８から、光ファイバー８６を通し検知ポリマー８１に接続されている。検出器８７は、光フィルターをから、検出ポリマー８１に接続する光ファイバー８９に接続されている。光源８４および検出器８７双方とも、電子制御器９０に接続されている。光ファイバーは、とりわけ光源によって随意である。よって、系は、生理液中のグルコース含有量に基づき、検知ポリマーの変化を検出できる。装置は、図９および１０に示されるとおり、プロセスストリームにおいて、およびインビボ埋め込み及び監視に有用である。図９は、光学機器を示す。図１０は、プローブの断面図である。図９では、光源１１（可視）が光ファイバー１２によって活性セル１３に接続されている。半透過性膜１４は、被分析物がセル１３から自由に出入りすることを可能にする。光ファイバー１５は、変化した光をフィルター１６と、分析を行うための被分析物スペクトルを生成するため、随意の光電子増倍管１７に運搬する。
【０１３７】
図９、および１０に示すように、セル１３は、解析の条件化で、セル１３にポリマー２１、色素２２、およびクエンチャー２３の混合物が維持されるように、選択的透過性膜を含む。光は、光ファイバー１２を通して進入する。セルの１４Ａの活性部分の中で、選択的にセルに侵入した、ポリマー２１、色素２２およびクエンチャー３３、接触被分析物２４が、スペクトルに量的で、再現可能な変化をもたらす。  この変更された光シグナルは、解析のため、光電子増倍管１７まで光ファイバー１５を進行する。当業者は、本発明の検知部分が当該技術分野で公知の、他の埋め込み可能蛍光検知装置においてしようできることを認識するであろう。クエンチャー、フルオロフォアの成分、および被分析物透過成分（マトリクスとしても知られる）は、本文および、請求項に記載されている。これらすべては、本明細書に参照することにより、組み込まれる。
［実験項］
【０１３８】
特に言及がない限り、市販されている試薬および溶媒を使用した（年１回公表されているＣｈｅｍ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ＵＳＡを参照のこと）。
【０１３９】
以下実施例について説明するが、これらは具体例として記載されているだけであって、本発明がこれらいずれかの手段、方法に限定されるわけではない。
【０１４０】
［手順Ａ］
蛍光色素を用いたメチルビオロゲンの見かけのスターンウォリメル（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ）クエンチング定数の蛍光分光分析
【０１４１】
見かけのスターンウォリメル（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ）クエンチング定数は、クエンチ濃度（Ｍ）に対する相対的蛍光強度（Ｆｏ／Ｆ）のスターンウォリメルプロットのスロープに由来している（Ｊ．Ｒ．  Ｌａｋｏｗｉｃｚ，  （１９９９）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２３７−２８９を参照のこと）。当業者は通常、目的とする特定の溶媒中で、蛍光色素／クエンチペアー（ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｐａｉｒ）のために本分析を実行することができる。この一般的なスターンウォリメル分析は、０．１イオン強度ｐＨ７．４リン酸緩衝液中で、スターンウォリメルクエンチング定数を決定するために使用される。
【０１４２】
濃度クエンチング効果を避けるため、色素の濃度は一般的に、励起λｍａｘ＜０．５吸収単位で、色素の光学密度になるように調整される。一度所望の色素濃度が決定されると、ストック色素溶液は、最終計測において濃度が所望の濃度の５倍より大きくなるように調製される。例えば、励起λｍａｘ＜０．５吸収単位の光学密度を与える所望の最終濃度が１×１０−５Ｍである色素は通常、濃度が５×１０−５Ｍである原液を必要とする。
【０１４３】
上述のように一旦決定されると、適切な濃度を有する１０ｍＬの色素原液は、色素の適切な質量を測ること、および１０ｍＬの容量分析フラスコ中に固体を配置することによって作られる。そして、そのフラスコは、０．１イオン強度ｐＨ７．４リン酸緩衝液を用いて、１０ｍＬマークのところまで満たされる。
【０１４４】
メチルビオロゲンの原液（２５  ｍＬ，  ０．００２５  Ｍ）は、１０ｍＬの容量分析フラスコ中で、ｐＨ７．４リン酸緩衝液（０．１イオン強度）を用いて調製される。メチルビオロゲンを含む７つの異なる溶液は、下記の表１で示されるようにｐＨ７．４リン酸緩衝液中で調製される。
【表７】
2009519053.tif 000027
【０１４５】
各サンプルは、対応色素に対する適切な励起波長および適切な放出波長の範囲でセットされた発光分光計で順番に分析された。機器セッティング（スリット幅、スキャンスピード、光学フィルター、励起波長、放出波長範囲）は、一連のサンプル分析を通して一定に保たれた。放出蛍光強度は、台形規則近似法（ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ  ｒｕｌｅ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって放出波長範囲を超える蛍光強度の積分として決定された。積算値はＹ軸上にプロットされ、クエンチ濃度はＸ軸上にプロットされ、その結果生じたラインのスロープは、スターンウォリメルクエンチング定数として、直線回帰によって計算された。当業者は、スターンウォリメルクプロットは直線関係を生じることはないというクエンチングメカニズムに基づいていることを理解するだろう。しかしながら、当業者によって知られ、理解されている適切な数学的関係の使用を通じて、見かけのスターンウォリメルククエンチング定数は、計算され、そして比較として使用される。
【０１４６】
［調製Ａ］
ジメチル−（４−ブロモメチル）ベンゼンボロナートの合成
【０１４７】
炉で乾燥した１００ｍＬの丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、（４−ブロモメチル）ベンゼンボロン酸（１２．４９ｍｍｏｌｓ，  ２．６８４  ｇ）を仕込んだ。そのフラスコをセプタムで密閉し、ペンタン（５５ｍＬ）を仕込んだ。そして、懸濁液を室温にて撹拌し、新たに蒸留したＣＨ３ＯＨ（３．１６ｇ，４ｍＬ、９７ｍｍｏｌｓ）を加え、溶液はすぐに浄化された。２０分間の撹拌後、溶液はＭｇＳＯ４を用いて乾燥され、さらにＣａＣｌ２で乾燥された（余分なＣＨ３ＯＨを取り除くため）。ガラスフリット付漏斗（ｇｌａｓｓ−ｆｒｉｔｔｅｄ  ｆｕｎｎｅｌ）（中型）を通して、アルゴン下、浮遊物にカニューレを挿入し、ペンタンを真空内で除去した。残った黄色状油を、さらに減圧下（０．１ｔｏｒｒ、１時間）で乾燥した。収率：１．６ｇ，６．５９ｍｍｏｌｓ（５６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，ｐｐｍ）：４．５  （ｓ，２Ｈ），７．４（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ）．１１Ｂ−ＮＭＲ（ＣＨ３ＯＨ，  ｐｐｍ）：２９（ｓ）。類似の手順が、対応する２−および３−異性体を調製するために使用された。生成物は、実施例１−３、５および６のボロン酸ビオロゲン化合物を作るために使用された。
【０１４８】
［調製Ｂ］
８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルホニルクロライドの合成
【０１４９】
トリナトリウム−８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルホナート（アセトキシ−ＨＰＴＳ、１１．３３  ｇ、２０  ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのチオニルクロライドに懸濁し、５滴のジメチルホルムアミドを加えた。懸濁液が茶色溶液になるまで３時間懸濁液を還流した。そして、その反応溶液をアルゴン雰囲気下２５℃まで冷却した。チオニルクロライドを真空下（２  Ｔｏｒｒ）蒸留し、黄色状残渣を得た。黄色状残渣を、ジクロロメタン（６０ｍＬ）とともに、３つに分かれた遠心分離管に移した。そして、懸濁液を遠心分離し、浮遊物溶液を乾燥丸底フラスコに移した。遠心分離管に残った残渣を、１０ｍＬのジクロロメタンで追加的に４回洗浄した。浮遊物溶液を混ぜ、アルゴン雰囲気下一晩放置すると、沈殿物が観察された。大量の黄色状固体沈殿物の原因であるペンタン（２５０ｍＬ）に、ジクロロメタンを加えた。浮遊物を両頭針で取り除き、黄色状固体を高真空（０．２  Ｔｏｒｒ）で乾燥した。収率：  ８．６２  ｇ，  １５．５  ｍｍｏｌ  （７８  ％）。
【化１９】
2009519053.tif 000028
この生成物は、実施例７，９，１３，１４および１５で使用された。
【０１５０】
［調製Ｃ］
４−（４−ピリジル）−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）ピリジニウムクロライドの合成
【０１５１】
炉で乾燥した１００ｍＬの丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、４，４’−ジピリジル（１２．５０  ｇ，  ８０  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。フラスコをセプタムで密閉し、ＣＨ３ＯＨ（２０ｍＬ）を仕込んだ。４−（クロロメチル）スチレン（２．８２  ｍＬ，  ２０  ｍｍｏｌｓ）をシリンジを用いて滴下して加えながら、均一溶液を室温にて撹拌した。室温にて４８時間撹拌した後、溶媒を真空下にて除去した。無水テトラヒドロフラン（５０  ｍＬ）をカニューレ経由で反応フラスコに加え、撹拌するのを止め、固体が安定することを可能とし、できる限りカニューレで溶媒を除去し、混合物は３日間硬くなった。各混合時間を２４時間まで減らして、この工程を２回以上繰り返した。３番目の粉砕後、混合物を窒素下にてろ過し、カニューレ経由で無水ジエチルエーテル（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、１時間減圧下にて固形物にドライ窒素を通し、最後に真空下（０．１  Ｔｏｒｒ，  １時間）に置くことによって固形物を乾燥した。収率：５．５６  ｇ，  １８  ｍｍｏｌｓ  （９０％）。
【化２０】
2009519053.tif 000029
この化合物は、実施例５および６にて使用された。
【０１５２】
［調製Ｄ］
Ｎ−ベンジル−４−エテニル−４，７−フェナントロリニウムクロライド（４，７−フェン  ＳＶ）の合成
【０１５３】
炎で乾燥した、１００ｍＬ枝付丸底フラスコに磁気撹拌子を取り付け、アルゴン下にて冷却し、４，７−フェナントロリン（２．１４  ｇ，  １  １．８６  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。そのフラスコにアルゴン（ｇ）ラインに取り付けられた還流コンデンサーを取り付け、フラスコの枝から（クロロメチル）スチレン（０．９０５  ｇ，  ０．８３６  ｍＬ，  ５．９３  ｍｍｏｌｓ）および無水ＣＨ３ＣＮ  （２０  ｍＬ）を仕込んだ。反応溶液を１７時間アルゴン（ｇ）下にて還流のため加熱した後、室温まで冷却し、ジエチルエーテル（３０  ｍＬ）を用いて固形物を沈殿させた。縣濁液を安定させた後、カニューレを通して浮遊物を除去した。残った残渣を溶媒（１５ｍＬ）を用いてカニューレを通して遠心分離管へ移し、アセトン（２０ｍＬ）を用いて粉砕し、遠心分離した（この工程は４回繰り返された）。茶色がかったピンク色の固体をジエチルエーテル（３×２０ｍＬ）を用いて粉砕し、減圧下にて乾燥した。収率０．３７６  ｇ，  １．１３  ｍｍｏｌｓ  （１９％）。
【化２１】
2009519053.tif 000030
【０１５４】
この化合物は、実施例２５で使用された。
【０１５５】
［実施例１］
４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）ジピリジニウムジブロマイドの合成
【０１５６】
炉で乾燥した５０ｍＬの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、４，４’−ビピリジル（０．４６９ｇ，３ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、ＣＨ３ＯＨ（７ｍＬ）を仕込んだ。そして、新たに調製したジメチル−（３−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（１．８２ｇ，７．５ｍｍｏｌｓ）をシリンジを用いて仕込んだ均一溶液に加えながら、室温で撹拌した。１５時間溶液を撹拌した後、反応容器を遠心分離し（３２００ＲＰＭで４分間）、ＣＨ３ＯＨをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン：水（２４：１，Ｖ／Ｖ，２５ｍＬ）を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、粉砕工程を２回以上繰り返した。そして、その固体を前記と同じ工程でジエチルエーテルを用いて粉砕した。遠心分離管中で薄黄色の固体を高圧下（０．６ｔｏｒｒ，２時間）で乾燥した。収率：０．９５６ｇ、１．６３ｍｍｏｌｓ（５４％）。ＭＰ：分解＞２３０℃。
【化２２】
2009519053.tif 000031
【０１５７】
この化合物を、下記の実施例１６〜１８および図６で使用した。
【０１５８】
［実施例２］
４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−４−ボロン酸）ジピリジニウムジブロマイドの合成
【０１５９】
炉で乾燥した５０ｍＬの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、４，４’−ジピリジル（０．２３４  ｇ，  １．５  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、無水ＣＨ３ＯＨ（７ｍＬ）を仕込んだ。そして、新たに調製したジメチル−（４−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（ｌ  ．０９  ｇ，  ４．５  ｍｍｏｌｓ）をシリンジを用いて仕込んだ均一溶液に加えながら、室温で撹拌した。１５時間溶液を撹拌した後、反応容器を遠心分離し（３２００ＲＰＭで４分間）、ＣＨ３ＯＨをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン：水（２４：１，Ｖ／Ｖ，２５ｍＬ）を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、粉砕工程を２回以上繰り返した。そして、その固体を前記と同じ工程でジエチルエーテルを用いて粉砕した。遠心分離管中で薄黄色の固体を減圧下（０．６ｔｏｒｒ，２時間）で乾燥した。収率：０．７２３  ｇ，  １．６３  ｍｍｏｌｓ  （８２％）。ＭＰ：２３０℃より大きい分解。
【化２３】
2009519053.tif 000032
実施例１７および１８、図６を参照。
【０１６０】
［実施例３］
４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−２−ボロン酸）ジピリジニウムジブロマイドの合成
【０１６１】
(ａ)  炉で乾燥した５０ｍＬの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、４，４’−ビピリジル（１．５  ｍｍｏｌ，  ０．２３４  ｇ）を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、ＣＨ３ＯＨ（７ｍＬ）を仕込んだ。均一溶液を混合しながら、室温で撹拌した。新たに調製したジメチル−（２−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（４．５  ｍｍｏｌｓ，  １．２  ｍＬ，  １．０９  ｇ）をシリンジを用いて反応管に加え、生じた茶色／オレンジ色の溶液を１５時間室温（周囲の）で撹拌した。そして、反応容器を遠心分離し（３２００ＲＰＭで４分間）、ＣＨ３ＯＨをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、ジエチルエーテル（２５ｍＬ）を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてエーテル溶液を取り除き、粉砕工程を３回以上繰り返した。遠心分離管中で薄黄色の固体を減圧下（０．６ｔｏｒｒ，２時間）で乾燥した。収率は７０％であった。
【化２４】
2009519053.tif 000033
【０１６２】
この化合物は、実施例８の色素の蛍光を消し、グルコースに応答するために検出された。実施例１７を参照。
【０１６３】
［実施例４］
１，    ７−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）フェナントロリニウムジブロマイドの合成
【０１６４】
炉で乾燥した５０ｍＬの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、１，７−フェナントロリン（０．２８８  ｇ，  １．６  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、ＣＨ３ＯＨ（４ｍＬ）を仕込んだ。そして、新たに調製したジメチル−（３−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（０．９７２  ｇ，  ４  ｍｍｏｌｓ）をシリンジを用いて加えた。その均一溶液を１５時間室温で撹拌し、２時間還流を行った。反応混合物をアルゴン下で室温まで冷却し、真空下でＣＨ３ＯＨを除去した。黄色／オレンジ色の固体を、アセトン：水（４０ｍＬ，  ２４：１，  Ｖ／Ｖ）を用いて、さらにジエチルエーテル（２×４０ｍＬ）を用いて一晩かけて粉砕した。その縣濁液をガラスフリット付漏斗（中型）を通してろ過し、アルゴン下で固体を単離した。収率：０．４９５ｇ，  ０．８１２  ｍｍｏｌｓ（５１％）。ＭＰ：＞２３０℃。
【化２５】
2009519053.tif 000034
【０１６５】
この化合物は、実施例８の色素の蛍光を消し、グルコースに応答するために検出された。
【０１６６】
［実施例５］
４−Ｎ−（ベンジル−４−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムブロマイドクロライド（Ｐ−ＳＢＢＶ）の合成炉で乾燥した５０ｍＬの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、４−（４−ピリジル）−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）ピリジニウムクロライド  （０．４６３  ｇ，  １．５  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、アセトニトリル（６ｍＬ）を仕込んだ。生じたピンク色／オレンジ色の縣濁液に、新たに調製したジメチル−（４−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（０．４８６  ｇ，  ２  ｍｍｏｌｓ）をシリンジを用いて加えながら、室温で撹拌した。懸濁液を２３時間撹拌した後、反応容器を遠心分離し（３２００ＲＰＭで４分間）、アセトニトリルをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン：水（２４：１，Ｖ／Ｖ，２５ｍＬ）を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、粉砕工程を２回以上繰り返した。そして、その固体を前記と同じ工程でジエチルエーテルを用いて粉砕した。遠心分離管中ではっきりとした黄色の固体を減圧下（０．５ｔｏｒｒ，１時間）で乾燥した。収率：０．４３１  ｇ，  ０．８２４  ｍｍｏｌｓ  （５５％）。ＭＰ：  ＞  ２００℃。
【化２６】
2009519053.tif 000035
【０１６７】
この化合物は、実施例８の色素の蛍光を消し、グルコースに応答するために検出された。
【０１６８】
［実施例６］
４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムブロマイドクロライド（Ｍ−ＳＢＢＶ）の合成
【０１６９】
炉で乾燥した５０ｍＬの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、４−（４−ピリジル）−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）ピリジニウムクロライド（０．４６３  ｇ，  １．５  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、アセトニトリル（６ｍＬ）を仕込んだ。生じたピンク色／オレンジ色の縣濁液に、新たに調製したジメチル−（３−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（０．４８６  ｇ，  ２  ｍｍｏｌｓ）をシリンジを用いて加えながら、室温で撹拌した。懸濁液を２３時間撹拌した後、反応容器を遠心分離し（３２００ＲＰＭで４分間）、アセトニトリルをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン：水（２４：１，Ｖ／Ｖ，２５ｍＬ）を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、一晩放置した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、ジエチルエーテル（３×２５ｍＬ）を用いて固体を粉砕した；粉砕ごとにカニューレを用いて除去を行った。遠心分離管中ではっきりとした黄色の固体を減圧下（０．０１５ｔｏｒｒ，３時間）で乾燥した。収率：０．５８４ｇ，  １．１２  ｍｍｏｌｓ  （７４％）。ＭＰ：１５０℃より大きい分解。
【化２７】
2009519053.tif 000036
【０１７０】
この化合物は、実施例１０、１１、１２および１４のポリマーを合成するために使用された。
【０１７１】
［実施例７］
８−アセトキシピレン  −  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”  −トリス−  （メトキシポリエトキシエチル（Ｎ〜１２５）  スルホンアミド）  の合成
【０１７２】
２５０ｍＬ丸底フラスコに磁気撹拌子を取り付け、１７０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を仕込んだ。メトキシ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−アミン（５．６５  ｇ，  ５６３０  ｇ／ｍｏｌ，  １  ｍｍｏｌ）を０．５ｇの粒状のＣａＨ２と共にフラスコに加えた。その混合物を３０℃で２４時間撹拌しながら加熱した。ジイソプロピルエチルアミン（０．６  ｍＬ，  １２９．２４  ＭＷ、  ０．７４２  ｇ／ｍＬ，  ３．４  ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、さらに混合物を１時間撹拌した。フラスコを室温まで冷やし、空気に敏感なガラス溶解フィルター器具を通してろ過し、余分なＣａＨ２とＣａ（ＯＨ）２を除去した。磁気撹拌子を有する２５０ｍＬ丸底フラスコにＴＨＦ溶液を加え、撹拌しながら３０℃まで加熱した。８−アセトキシピレン  −  １，３，６−トリスルホニルクロライド（０．  １８５  ｇ，  ６２４．８  ｇ／ｍｏｌ，  ０．３  ｍｍｏｌ）を暖めたＴＨＦ溶液に加えた。溶液はすぐに深い青色に変化し、１５分以上赤ワイン色に一時的に変化した。反応は３０℃で２４時間撹拌して行われた。溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、残渣を１００ｍＬの１  Ｍ  ＨＣｌで溶解した。メチレンクロライド（３  ｘ  １００  ｍＬ）を用いて水溶液を抽出した。メチレンクロライドのフラクションを混ぜ、減圧エバポレーションによって溶媒を除去し、赤色の固体である化合物を得た。収率：  約５．５  ｇ  （〜９７％）
【化２８】
2009519053.tif 000037
この化合物は、実施例８、１１、１６および１７で使用された。
【０１７３】
［実施例８］
８−ヒドロキシピレン  −  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”  −トリス−  （メトキシポリエトキシエチル（Ｎ〜１２５）  スルホンアミド）  
【０１７４】
８−アセトキシピレン  −  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ−トリス−  （メトキシポリエトキシエチル（ｎ〜１２５）  スルホンアミド）  （５．５  ｇ，  ０．３２  ｍｍｏｌｓ）を、１００ｍＬの１  Ｍ  ＮａＯＨに溶かし、２時間撹拌した。その水溶液をｐＨ７まで中和し、メチレンクロライド（３  ｘ  １００  ｍＬ）を用いて抽出した。メチレンクロライドのフラクションを混ぜ、ロータリーエバポレーションによって約１０ｍＬまで還元した。濃縮されたメチレンクロライド溶液を、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で強く撹拌されているジエチルエーテル（４００ｍＬ）中に滴下して加えた。ジエチルエーテルをＢｕｃｈｎｅｒ漏斗を使用してろ過した。生成物は、オレンジパウダーとして単離された。収率５．４２５  ｇ，  ０．３１  ｍｍｏｌ  （９４％）。ＦＴＩＲ  （ＫＢｒ  ペレット，  ｃｍ−１）：  ８４２，  ９６３，  １０６０，  １１１０，  １１５０，  １２４２，  １２８１，  １３４３，  １３６０，  １４６８，  ２８８８。この化合物は、Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  （ＦＴＩＲ）を用いて三置換スルホンアミド誘導体として同定された。スルホニックアシッドＩＲストレッチは、１１９５．７  ｃｍ−１で生じる。この化合物のＦＴＩＲでは、１１９５．７  ｃｍ−１ストレッチは存在していない。代わりに、スルホンアミドに割り当てられる１１１０  ｃｍ−１ストレッチが観察されている。ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に溶かしたとき、この化合物の蛍光は、３１９Ｍ−１の見かけのスターンウォリメルクエンチング定数を有するメチルビオロゲンによってクエンチされている。
【０１７５】
これは、実施例１，２および３の生成物によってクエンチされ、実施例１１、１６、１７，１８および１９で使用された。
【０１７６】
［実施例９］
８−アセトキシピレン−  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”  −トリス−  （メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）  （アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）
【０１７７】
１００ｍＬの丸底フラスコにアミノプロピル−３−メタクリルアミドＨＣｌ塩（２．６８  ｇ，  １５  ｍｍｏｌ）と５０ｍＬのアセトニトリルを仕込み、白色懸濁液を得た。そして、白色懸濁液の２層が消えるまで撹拌しながら水を滴下して加えた。炭酸カリウムを加え、懸濁液を１５分撹拌した。浮遊物を５００ｍＬ丸底フラスコに移し、炭酸カリウムを５０ｍＬのアセトニトリルで洗浄し、その５００ｍＬ丸底フラスコ中で混合した。アセトキシ−ＨＰＴＳ−Ｃｌ  （１．０３  ｇ，  １．８  ｍｍｏｌ）の黄色溶液、２００ｍＬのアセトニトリルおよび２０ｍＬのジクロロメタンを、沈殿物形成と共に深い赤色に変化する溶液を生じるアセトニトリル中の遊離アミンを含む５００ｍＬ丸底フラスコ中にアルゴン下で加えた。その溶液を１時間撹拌し、浮遊物を移し、真空下にて濃縮し、暗い残渣を得た。この残渣を水（１０００  ｍＬ）と５０：５０アセトニトリル／酢酸エチル溶液（７００  ｍＬ）で抽出した。有機抽出液を水（１０００  ｍＬ）で洗浄した。有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮して赤色残渣を得、その残渣をメタノールに溶かした。そのメタノール溶液を濃縮し、生じた赤色残渣を高真空下にて乾燥し、保護されていないＨＰＴＳ−ＭＡである赤色固体を得た。収率：  ４２０  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ，  ２８  ％。
【化２９】
2009519053.tif 000038
保護されていないＨＰＴＳ−ＭＡ（１００  ｍｇ，  ０．  １  ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの無水酢酸に懸濁し、触媒量の酢酸ナトリウムを加え、２時間還流した。無水酢酸と酢酸を真空下にて除去し、生じた茶色残渣を２０ｍＬのアセトニトリルで抽出した。抽出液を１５０ｍＬのジエチルエーテルに滴下し、茶色固体の沈殿物を得た。収率：  ７５  ｍｇ，  ０．０９  ｍｍｏｌ  （８６  ％）。
【０１７８】
この単量体は、実施例１３、１４および１５で使用された。
【０１７９】
［実施例１０］
４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムブロマイドクロライドと水溶性ポリマーの共重合
【０１８０】
５０ｍＬコーン型丸底フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（１．５Ｏｇ，  １１．５  ｍｍｏｌｓ）と４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）  ジピリジニウムブロマイドクロライド  （０．  １  ｇ，  ０．  １９１  ｍｍｏｌｓ）と、３−（（メタクリロイルアミノ）プロピル））トリメチルアンモニウムクロライド  （０．５０  ｇ，  ２．２７  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。フラスコをセプタムで密封した後、溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌した。そして、その容器にイソプロピルアルコール：水（８  ｍＬ，  １：１，  Ｖ／Ｖ）を加え、１時間アルゴンで酸素を除去した。同時に、別の１００ｍＬ枝付丸底フラスコで、イソプロピルアルコール：水（５  ｍＬ）中に２，２’アゾビスイソブチロニトリル  （ＡＩＢＮ，  １００  ｍｇ，  ０．６０９  ｍｍｏｌｓ）を調製した。そのフラスコに磁気撹拌子とコンデンサーを取り付け、１時間アルゴンで酸素を除去した。すべてのマノメータ溶液をシリンジで取り除き、その１ｍＬをフラスコの枝からＡＩＢＮ溶液に加えた。ＡＩＢＮ反応容器を７０℃オイルバス中に設置し、残ったマノメータ混合物を６時間以上かけてシリンジポンプで加えた（１．５  ｍＬ／１時間）。生じたオレンジ色溶液をアルゴン下で室温まで冷やし、溶媒を真空化で慎重に取り除いた。非晶質固体をＣＨ３ＯＨ  （２０  ｍＬ）中に溶かし、カニューレを通して定量的に遠心分離管に移した。ジエチルエーテル（２０  ｍＬ）の添加と白色沈殿物の形成後、生成物を遠心分離（３２００  ＲＰＭで４分間）で単離した。それをジエチルエーテル（３０  ｍＬ）で洗浄し、減圧下（０．５  ｔｏｒｒ、３時間）で乾燥し、不活性ガスアルゴン下で単離した。収率：  １．３４５ｇ，  （６７  Ｗｔ  ％）。ポリマーに取り込まれたビオロゲン部位の量はＵＶ吸収を用いて決定され、それは期待値の９９％より大きい値であった。
【０１８１】
この生成物は、実施例１９で使用された。
【０１８２】
［実施例１１］
ＳＥＭＩ−ＩＰＮ：  ＨＰＴＳ−ＰＥＧを使用した４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）  ジピリジニウムブロマイドクロライドの薄膜共重合
【０１８３】
１０ｍＬ容積測定フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（３．５２５  ｇ，  ２７．０８  ｍｍｏｌｓ），  ４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）  ジピリジニウムブロマイドクロライド  （０．０３９  ｇ，  ０．０７５  ｍｍｏｌｓ），  ３−（（メタクリロイルアミノ）プロピル）  トリメチルアンモニウムクロライド  （０．３  ｇ，  １．３６  ｍｍｏｌｓ），  ポリエチレングリコールジメタクリレート  （１．１１  ｇ，  １．  １１  ｍｍｏｌｓ），  ２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（０．０２５  ｇ，  ０．０７７  ｍｍｏｌｓ）および８−ヒドロキシピレン−１，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（ｎ〜１２５）  スルホンアミド）  （０．０１３  ｇ，  ７．５  ｘ  １０−４  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ；それをイソプロピルアルコール：水（１：１，  Ｖ／Ｖ）を用いて１０ｍＬの目盛りまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌した後、ピペットで５０ｍＬコーン型丸底フラスコに移し、１時間アルゴンで酸素を除去した。単量体溶液をシリンジで取り出し、そのシリンジを重合チャンバーに取り付けた。そして、溶液をアルゴン下セルへ挿入し、セルの空洞全体を満たした。チャンバーをテフロン（商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）栓で密封し、２つのＺＩＰＬＯＣ  （商標）冷凍用バッグで包んだ。全ユニットを４０℃のウォーターバス中に沈め、１７時間加熱した。共重合チャンバーをバスとバッグから取り除き、続いて薄い緑色の高分子フィルムを提供するために分解した。その高分子フィルムを濾し、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に保存した。この生成物は、実施例１２で使用された。
【０１８４】
重合チャンバーは、（１）ＩＲセル保持部材：セルおよびＬＵＥＲ  ＬＯＣポートを含むために形作られた２つのステンレススチールプレート；（２）セル：トッププレートとスペーサを通じて開けられた穴を有し、その間にＴＥＦＬＯＮ（商標）  ０．０２”スペーサを含む２つのガラスプレート；および（３）ガスケット：セル保持部材に対してセルをしっかり閉じるために使用される、正確にカットされたゴム状スペーサ、から成る。
【０１８５】
［実施例１２］
ＨＰＴＳ−ＰＥＧを使用する４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムブロマイドクロライドのＳＥＭＩ−ＩＰＮ共重合の蛍光分光分析
【０１８６】
両側面に開口部を有する、１０ｍｍ経路長、５ｍＬガラスクベットに、２つの使い捨てポリエチレンクベットキャップを取り付けた。１０／３２スタンダード糸の糸、１／８”  Ｉ．Ｄ．ホースエンドアダプターが箇所にねじ込まれるように、キャップを通じた穴を開けた。そして、薄いプラスチックシートを３５  ｘ  ９  ｍｍの長方形に切り、窓６  ｘ  １５  ｍｍを中心に切り取った。クベットの箇所中のポリマーを保持するためのプラスチックマスクに圧力をかけるための小さなセプタムから２つの接続部材を構成した。セプタムの高さは９  ｍｍとした。窓を有するフィルムを効果的に形成するそれ上に、直接的にポリマーフィルムをクベットとプラスチックマスクの中心に配置できるように、貫流セルを組み立てた。そして、圧縮接続部材をピンセットを使用し、位置に置いた。１つはセルの底で、１つは頂上部である。クベット内部にあるクベットキャップの外壁を、真空グリースでコートし、セルを閉じるためにクベット内に挿入した。前方表面アダプターを取り付けたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ分光光度計中にセルを置いた。ポリマーに接しているその側面が機器（前方表面アダプター中の第一面）の励起ビームに面するようにセルを配置した。１／８”  ＴＹＧＯＮ  ＰＴＦＥ管を貫流セルのホースアダプターに接続した。放出検出器がポリマーの表面だけをセンシングできるように前方表面アダプターの配置を最適化した。１分間に３０ｍＬの割合でセルを通してｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中（イオン強度０．１）を循環させるように蠕動｛ぜんどう｝ポンプを使用した。２秒間の積分時間に対する１０秒間ごとの蛍光強度読み取りを実行するためにＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂソフトウェアのタイムドライブ機能を使用した。励起波長を４７５  ｎｍにセットし、放出スリット幅を５３６  ｎｍにセットした。励起および放出スリット幅を２．５  ｎｍにセットした。３５８（蛍光強度）のベースライン値を緩衝液と共に規定した。蠕動｛ぜんどう｝ポンプを止め、ポンプ溶液をｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中の１８００  ｍｇ／ｄｌグルコースに変更した。
【０１８７】
蛍光強度は、３５％シグナル増加に対応する４８５  の値まで１２７  単位増加した（Ｓ／Ｎ  比率  ＝  ７２）。緩衝液に変更した後、シグナルは期待値であるベースライン値３５８に近づいた。
【０１８８】
［実施例１３］
８−ヒドロキシピレン−ｌ，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）  ヒドロゲルポリマー
【０１８９】
雌１４／２０底ガラス結合部（ｆｅｍａｌｅ  １４／２０  ｇｒｏｕｎｄ  ｇｌａｓｓ  ｊｏｉｎｔ）を用いて改善された１６−ｍｍ  ＮＭＲに、イソプロピルアルコール／水（１：１，  １．５  ｍＬ）、ＨＥＭＡ  （７５０  ｍｇ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ，  ｎ〜２５）  （２００ｍｇ）、３−（メタクリルアミド）  プロピルトリメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）  （５０  ｍｇ），  ８−アセトキシピレン−ｌ，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−  トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）  （アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）  （１  ｍｇ，  １．２  ｘ  １０−６  ｍｏｌｓ）および  （２，２’−アゾビス−２（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）  ヒドロクロライド  （ＶＡ−０４４  フリーラジカル開始剤）  （５  ｍｇ）の混合物を仕込んだ。すべての固体をボルテックスミキサーで溶解した。雄１４／２０底ガラス結合部（ｍａｌｅ  １４／２０  ｇｒｏｕｎｄ  ｇｌａｓｓ  ｊｏｉｎｔ  ）ＴＥＦＬＯＮ（商標）  ストップコックを用いて、ＮＭＲチューブを真空アダプターに取り付けた。そして、４冷凍／ポンプ／解凍サイクル（−７８℃，  １  ｔｏｒｒ，  ５分間）で混合物の酸素を除去し、窒素下にて解かした。ＮＭＲチューブをウォーターバス中で４０℃（１２時間０．５℃）で加熱した。ガラスＮＭＲチューブは、ポリマープラグを開放するため、慎重に壊された。トリエチルアミン（５滴）を含む脱イオン化水２００ｍＬでポリマーを透析し（脱イオン化水およびアミン溶液は、２４時間ごと、７日間変えられた）、アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡのアセトキシ保護基を除去した。生じたポリマープラグを薄さ約５ｍｍにカットして、蛍光分光法によって分析した。
【０１９０】
ゲルの励起および放出スペクトルは実質的にＰＥＧ付加物（実施例１２）に対して得られたスペクトルと同一である。ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に懸濁されたポリマーゲルのサンプルについて、日中実験したときには、蛍光発光を見ることができた。ｍ−ＳＢＢＶ，  ｏ−ＳＢＢＶあるいはｐ−ＳＢＢＶが水相に加えられたとき、蛍光発光は著しく消えた。グルコースが溶液に加えられたときには、蛍光発光は回復した。色素濃度０．０５〜５  ｍｇ／ｇのポリマー（乾燥重量）を用いて類似のゲルを調製した。すべて黄色−緑色からオレンジ色であり、日光中（自然光）で実験したときには蛍光を観察することができた。
【０１９１】
ヒドロゲルを水性ｏ−、ｍ−，  あるいはｐ−ＢＢＶ（ベンジルボロン酸ビオロゲン）にさらしたときには、蛍光発光はクエンチされた。
【０１９２】
［実施例１４］
ＩＰＮ：ＨＰＴＳ−ＭＡ  ポリマーを使用した４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライドの共重合
【０１９３】
マノメータクエンチ溶液：１０ｍＬ容積測定フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（２７．０８  ｍｍｏｌｓ，  ３．５２５  ｇ），  ４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムブロマイドクロライド（０．１９７  ｍｍｏｌｓ，  ０．１０３  ｇ），  ３（（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロライド（１．３６  ｍｍｏｌｓ，  ０．３０  ｇ），  ポリエチレングリコールジメタクリレート（１．  １１  ｍｍｏｌｓ，  １．  １１  ｇ）および２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（０．０７７  ｍｍｏｌｓ，  ０．０２５  ｇ）を仕込んだ；そのフラスコをイソプロピルアルコール／水（１  ：  １  ，  Ｖ／Ｖ）で１０ｍＬ目盛りのところまで満たした。その溶液が均一になるまで、ボルテックスミキサーで強く撹拌した。
【０１９４】
高分子色素粉末：１０ｍＬ容積測定フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート  （２７．０８  ｍｍｏｌｓ，  ３．５２５  ｇ），  ３−（（メタクリロイルアミノ）  プロピル）トリメチルアンモニウムクロライド（１．３６  ｍｍｏｌｓ，  ０．３  ｇ），  ポリエチレングリコールジメタクリレート（１．  １１  ｍｍｏｌｓ，  １．  １１  ｇ），  ２，２’−  アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（０．０７７  ｍｍｏｌｓ，  ０．０２５  ｇ）および８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）  （７．５  ｘ  １０−４ｍｍｏｌｓ，  ６．６  ｘ  １０−４ｇ）  を仕込んだ；そのフラスコをイソプロピルアルコール：水（１  ：  １  ，  Ｖ／Ｖ）で１０ｍＬ目盛りのところまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌し、それをピペットで５０−ｍＬ丸底フラスコに移し、そのフラスコをゴムセプタムで密封した。そこから３０分間アルゴンを用いて酸素を取り除いた。シリンジを用いてマノメータ溶液を取り、その針をゴムストッパーを用いてキャップした。そして、それを重合チャンバー備え、アルゴンで満たされたグローブボックスに移した。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをＴＥＦＬＯＮ  （商標）栓を用いて密封し、ＺＩＰＬＯＣ  （商標） 冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体をオーブンに移し、１４時間４０℃で加熱した。重合チャンバーをオーブンおよびバッグから取り出した後、薄い緑色重合フィルムを提供するために分解した。そのフィルムを６時間蒸留した５００ｍＬの水（ｐＨ  ５）を用いてろ過した；２時間ごとに新しい水と取り替えた。そして、薄いフィルムを減圧下にて乾燥し（４０℃、Ｈｇ中２０、３時間）、−１９６℃に移し、乳鉢および乳棒を用いて細かい粉末にした。
【０１９５】
相互貫入ネットワーク重合体：５０ｍＬ丸底フラスコに、マノメータクエンチ溶液（５．２  ｍＬ）および高分子色素粉末（０．１６９  ｇ）を仕込んだ。混合液を１０分間ボルテックスミキサーで強く撹拌し、色素粒子によって液体が吸収されるようにし、１５分間アルゴンで酸素を除去した。不均一溶液をシリンジで取り出し、その針をゴムストッパーを用いてキャップした。そして、それを重合チャンバーを用いてアルゴンで満たされたグローブボックスに移した（実施例１１を参照）。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをＴＥＦＬＯＮ（商標） 栓を用いて密封し、ＺＩＰＬＯＣ  （商標） 冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体をオーブンに移し、１４時間４０℃で加熱した。重合チャンバーをオーブンおよびバッグから取り出した後、薄いオレンジ色、ゲル合成された重合フィルムを提供するために分解した。そのフィルムを１２時間ｐＨ  ８−ＮａＯＨ溶液中に置き、ろ過した後、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に保存した。
【０１９６】
この生成物を実施例２０で使用した。
【０１９７】
［実施例１５］
２成分系：  ＨＰＴＳ−ＭＡ  を使用した４−Ｎ−  （ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）  ジピリジニウムブロマイドクロライド  （Ｍ−ＳＢＢＶ）の薄膜重合
【０１９８】
１０ｍＬ容積測定フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（３．５２５  ｇ，  ２７．０８  ｍｍｏｌｓ），  ４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウムブロマイドクロライド（０．０３９  ｇ，  ０．０７５  ｍｍｏｌｓ），  ３−（（メタクリロイルアミノ）  プロピル）トリメチルアンモニウムクロライド（０．３  ｇ，  １．３６  ｍｍｏｌｓ），  ポリエチレングリコールジメタクリレート（１．１１  ｇ，  １．１１  ｍｍｏｌｓ），  ２，２’−  アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド  （０．０２５  ｇ，  ０．０７７  ｍｍｏｌｓ）および８−アセトキシピレン−ｌ，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）  （６．６  ｘ  １０−４ｇ  ，  ７．５  ｘ  １０−４ｎｍｏｌｓ）を仕込んだ。そのフラスコをイソプロピルアルコール／水（１  ：  １  ，  Ｖ／Ｖ）で１０ｍＬ目盛りのところまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌し、それをピペットで５０−ｍＬコーン型丸底フラスコに移し、そのフラスコをゴムセプタムで密封した。そこから３０分間アルゴンを用いて酸素を取り除いた。シリンジを用いてマノメータ溶液を取り、その針をゴムストッパーを用いてキャップした。そして、それを重合チャンバーを備えたアルゴンで満たされたグローブボックスに移した（実施例１１参照）。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをＴＥＦＬＯＮ（商標）栓を用いて密封し、ＺＩＰＬＯＣ  （商標） 冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体を４０℃ウォーターバスに浸し、１２時間加熱した。重合チャンバーをバスとバッグから取り除いた後、薄い緑色重合フィルムを提供するために分解した。その重合フィルムを１２時間ｐＨ  ８  ＮａＯＨ溶液中に置き、ろ過し、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に保存した。この生成物を実施例２１で使用した。
【０１９９】
［実施例１６］
８−ヒドロキシピレン−１，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”  −トリス−（メトキシポリエトキシエチル（Ｎ−１２５）スルホンアミド）  ＨＰＴＳ−ＰＥＧを用いた４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−２，  ３または  ４−ボロン酸）ビピリジニウムジブロマイドの蛍光分光分析
【０２００】
ＨＰＴＳ−ＰＥＧ  （１０  ｍＬ，  ５  ｘ  １０−５  Ｍ）原液を、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液（０．１イオン強度）と共に１０ｍＬ容積測定フラスコ中に準備した。同様に、ｍ−ＢＢＶ溶液（２５  ｍＬ，  ０．００２５  Ｍ）を準備した。ＨＰＴＳ−ＰＥＧおよびｍ−ＢＢＶを含む７つの異なる溶液を、以下の表２で示されるようにｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に準備した。
【表８】
2009519053.tif 000039
【０２０１】
そして、各サンプルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０−Ｂ発光分光計で分析した。機器セッティングは：
励起波長−４７３  ｎｍ
放出波長範囲  −  ４８０−６３０  ｎｍ
励起スリット幅  −  ０  ｎｍ  （機器依存最小値）
放出スリット幅  −  ０  ｎｍ  （機器依存最小値）
光学フィルター  &#8211;  なし
スキャン速度  −  １００  ｎｍ／秒
【０２０２】
機器セッティング（スリット幅，  スキャン速度，  光学フィルター，  励起波長，  放出波長範囲）を一連の分析を通じて一定に保った。そして、放出蛍光強度を、４８０と６３０  ｎｍの間の蛍光強度曲線の積分（台形公式近似法）によって定量化した。見かけのスターンウォリメルクエンチング定数を、５２０  Ｍ−１とした（図７参照）。
【０２０３】
［実施例１７］
蛍光分光法によって分析した８−ヒドロキシピレン−  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”  −トリス−（メトキシポリエトキシエチル（Ｎ−１２５）スルホンアミド）  （ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）を用いた４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−２，  ３または  ４−ボロン酸）ビピリジニウムジブロマイドのグルコース検知能力
【０２０４】
（ａ）ＨＰＴＳ−ＰＥＧ  （１０  ｍＬ，  ５  ｘ  １０−５  Ｍ）  原液を、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中（０．１イオン強度）と共に１０ｍＬ容積測定フラスコ中に準備した。同様に、ｍ−ＢＢＶ溶液（２５  ｍＬ，  ０．００２５  Ｍ）およびＤ−グルコース溶液（１０  ｍＬ．  ０．２５０  Ｍ）を準備した。ＨＰＴＳ−ＰＥＧ、ｍ−ＢＢＶおよびＤ−グルコースを含む７つの異なる溶液を、以下の表３で示されるようにｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に準備した。
【表９】
2009519053.tif 000040
【０２０５】
各サンプルのｐＨをそれぞれ、ｐＨメーターを使用して決定し、ｐＨが０．０２  ｐＨユニット内で一連を通じて一定となるようにした。
【０２０６】
そして、各サンプルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０−Ｂ発光分光計で分析した。機器セッティングは、実施例１６と同じにした。
【０２０７】
そして、相対的な積算値を、較正曲線を構成するために使用した：Ｆ／Ｆｏ対グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）をプロットした、ここで、Ｆｏは、０  ｍｇ／ｄＬグルコースを含む表３中の第一サンプルの積分蛍光強度である。
【０２０８】
（ａ）  ＨＰＴＳ−ＰＥＧを用いたグルコース感度の評価。ＨＰＴＳ−ＰＥＧ色素の存在下において、ベンジルビオロゲンのグルコース検知能力を４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−ビピリジニウムジブロマイドのそれに対して比較した。ＨＰＴＳ−ＰＥＧを用いたベンジルビオロゲンに対する見かけのスターンウォリメルクエンチング定数は、手順Ａで述べられているように決定され、それは５５９Ｍ−１であると決定された。ＨＰＴＳ−ＰＥＧの存在下において、ベンジルビオロゲンのグルコース感度は、同じ手法で決定された。ベンジルビオロゲン／ＨＰＴＳ−ＰＥＧ溶液からのシグナルは、グルコース濃度の変化に反応しなかった。４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−ビピリジニウムジブロマイドのグルコース感度は、ベンジルビオロゲンのグルコース感度と共に図５に示されている。
【０２０９】
（ｂ）  ４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−ジピリジニウムジブロマイドに代えて４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−４−ボロン酸）−ビピリジルジブロマイドを使用する以外は、（ａ）と同様のことを繰り返した。オルト（ｏｒｔｈｏ）およびパラ（ｐａｒａ）異性体を同じ方法で分析した。グルコース感度の結果は同等である。結果を図６にプロットした。
【０２１０】
［実施例１８］
ＨＰＴＳ−ＰＥＧを用いたベンジルビオロゲン対４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−ビピリジニウムジブロマイドのグルコース感度の比較
【０２１１】
ＨＰＴＳ−ＰＥＧ色素の存在下において、ベンジルビオロゲンのグルコース検知能力を４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−ビピリジニウムジブロマイドのそれに対して比較した。ＨＰＴＳ−ＰＥＧを用いたベンジルビオロゲンに対する見かけのスターンウォリメルクエンチング定数は、手順Ａで述べられているように決定され、それは５５９Ｍ−１であると決定された。ＨＰＴＳ−ＰＥＧの存在下において、ベンジルビオロゲンのグルコース感度は、実施例１７と同じように決定された。ベンジルビオロゲン／ＨＰＴＳ−ＰＥＧ溶液からのシグナルは、グルコース濃度の変化に反応しなかった。実施例１７で見られたように、４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−ビピリジニウムジブロマイドのグルコース感度は、ベンジルビオロゲンのグルコース感度と共に図５に示されている。
【０２１２】
［実施例１９］
４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライド（Ｍ−ＳＢＢＶ）の水溶性共重合体の蛍光分光分析
【０２１３】
実施例１０からｍ−ＳＢＢＶ  （５０  ｍＬ，  ２．５  ｍＭ）  共重合体をｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に準備し、ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを調整した（  ０．０２  ｐＨユニット）。ＨＰＴＳ−ＰＥＧ  （色素，  １  ｘ  １０−５Ｍ）を含むポリｍ−ＳＢＢＶ  （被分析物０，  ０．１０，  ０．１５，  ０．２５，  ０．５０，  ０．７５，  １．０  ｍＭ）の６つの異なる溶液を調製し、分光光度計で分析した。被分析物／色素溶液を、基準１０−ｍｍ経路長、石英クベットに含ませ、分光光度計を励起および放出波長をそれぞれ４７３および５３３にセットした。励起および放出スリット幅は、０ｎｍにセットした。蛍光スペクトルを上記した溶液に対して得た後、被分析物／色素溶液のさらなるスペクトルをグルコースおよびフルクトースの存在下および非存在下で得た。スペクトルの表面的な差異は、曲線下の領域として数量化された。領域の差異を、グルコースまたはフルクトースへのポリマー応答の典型として判断した（例えば、グルコースまたはフルクトースの非存在下で、曲線下の典型領域は、２６４７９．４５であると決定された）。異なるグルコース濃度の追加に関して、領域は表４に示されるように、適宜変化した。
【表１０】
2009519053.tif 000041
【０２１４】
このように、蛍光強度は、１８００  ｍｇ／ｄｌのグルコースの追加で１１％、１８００  ｍｇ／ｄｌのフルクトースの追加で１４．６％だけ増加した。
【０２１５】
［実施例２０］
ＩＰＮの蛍光分光分析：分散させたＨＰＴＳ−ＭＡヒドロゲルを使用した４−Ｎ（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライド（Ｍ−ＳＢＢＶ）の共重合体
【０２１６】
手順は実施例１２を参照のこと。  
【０２１７】
蠕動ポンプを１分間に３０ｍＬの割合でセルを通じてｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中（イオン強度０．１）を循環させるために使用した。
【０２１８】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂソフトウェアのタイムドライブ機能を、２秒の積分時間を用いて１０秒ごとの蛍光強度読み込みを取得するために使用した。励起波長を４７５  ｎｍにセットし、放出波長を５３６  ｎｍにセットした。励起および放出スリット幅は、それぞれ１５  ｎｍおよび２０  ｎｍにセットした。ベースライン値２４９（蛍光強度）を緩衝液を用いて定めた。蠕動ポンプをストップし、ポンプ溶液をｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中の１８００  ｍｇ／ｄｌグルコースに交換した。
【０２１９】
蛍光強度は、１０％のシグナル増加に対応する２７４の値まで、２５ユニット増加した（Ｓ／Ｎ  比＝４３）。緩衝液に戻した後、シグナルは期待ベースライン値２４９に近づいた。
【０２２０】
［実施例２１］
２成分系の蛍光分光分析：アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡを使用した４−Ｎ（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライド（Ｍ−ＳＢＢＶ）の薄膜共重合体ヒドロゲル
【０２２１】
分析手順は実施例１２を参照のこと。
【０２２２】
蠕動ポンプを１分間に３０ｍＬの割合でセルを通じてｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中（イオン強度０．１）を循環させるために使用した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂソフトウェアのタイムドライブ機能を、２秒の積分時間を用いて１０秒ごとの蛍光強度読み込みを取得するために使用した。励起波長を４７５  ｎｍにセットし、放出波長を５３６  ｎｍにセットした。励起および放出スリット幅は、７  ｎｍにセットした。ベースライン値４９０（蛍光強度）を緩衝液を用いて定めた。蠕動ポンプをストップし、ポンプ溶液にｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中の４００  ｍｇ／ｄｌグルコースを仕込んだ。
【０２２３】
蛍光強度は、１．５％のシグナル増加に対応する４９９の値まで、９ユニット増加した（Ｓ／Ｎ  比＝６．５）。溶液の交換工程を繰り返した。緩衝液は、期待ベースライン値４９０を与えた。ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中１８００  ｍｇ／ｄｌグルコースに換えた後、蛍光強度は、７．６％のシグナル増加に対応する５２５の値まで、３５ユニット上昇した（Ｓ／Ｎ  比＝１５．０）。最終的に、緩衝液がシステムを通じて汲み上げられると、ベースラインは４９０の期待値まで落ちた。
【０２２４】
［実施例２２］
４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）ビピリジニウムジブロマイド（Ｍ−ＢＢＶ）および８−ヒドロキシピレン−１，３，６−Ｎ，  Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（Ｎ−１２５）スルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）を含む水溶性サンプル中のグルコース濃度の蛍光分光決定
【０２２５】
ＨＰＴＳ−ＰＥＧ  （１０  ｍＬ，  ５  ｘ  １０−５  Ｍ）  原液を、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中（０．１イオン強度）と共に１０ｍＬ容積測定フラスコ中に準備した。同様に、ｍ−ＢＢＶ溶液（２５  ｍＬ，  ０．００２５  Ｍ）およびＤ−グルコース溶液（１０  ｍＬ、  ０．２５０  Ｍ）を準備した。ＨＰＴＳ−ＰＥＧ、ｍ−ＢＢＶおよびＤ−グルコースを含む７つの異なる溶液を、以下の表５で示されるようにｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に準備した。
【表１１】
2009519053.tif 000042
【０２２６】
各サンプルのｐＨをそれぞれ、ｐＨメーターを使用して決定し、ｐＨが±０．０２  ｐＨユニット内で一連を通じて一定となるようにした。
【０２２７】
分析手順については実施例１７を参照のこと。
【０２２８】
濃度が特定されていない２ｍＬ含水グルコースを５−ｍＬ容積測定フラスコに入れ、そこに１  ｍＬのＨＰＴＳ−ＰＥＧ原液および２  ｍＬのｍ−ＢＢＶ原液を加えた。サンプルを混ぜ、適切なクベットの中に入れ、そのサンプルの蛍光放出強度を前記で述べたのと同様にして分析した。そして、４８０ｎｍと６３０  ｎｍの間の蛍光放出強度曲線の積分によって、蛍光放出強度を数量化した（台形公式近似法を使って）。Ｙ軸上の較正曲線に対し、分かっていないグルコース濃度のサンプルの蛍光放出強度に対して定量化された値を比較し、Ｘ軸上の対応するグルコース濃度を読み取ることによって、分かっていないグルコース濃度を決定した。較正曲線から読み取られたグルコース濃度を５／２希釈係数に対して調整し、分からないサンプルのグルコース濃度を決定した。
【０２２９】
［実施例２３］
ＨＰＴＳ−ＰＥＧ  （半ＩＰＮ薄膜）を使用した４−Ｎ−  （ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライドの薄膜共重合体を含む水溶性サンプル中のグルコース濃度の蛍光分光決定
【０２３０】
薄膜共重合体を実施例１１で述べたのと同様にして調製し、実施例１２で述べたのと同様にして蛍光分光計を取り付けた。Ｄ−グルコースの７つの１００  ｍｌ原液（０，  １８，  ３６，  １８０，  ３６０，  ９００，  および  １８００  ｍＬ／ｄＬ）をｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中で調製した。そして、７つの溶液を貫流セルを通して循環させ、蛍光放出強度を実施例１３で述べたのと同様にして分析した。各ケースにおいて、蛍光放出強度は、溶液を換える前に安定した。安定した蛍光強度値対対応するグルコース濃度をプロットすることで較正曲線を作成した。濃度の分からない含水グルコースのｐＨ値をｐＨメーターを用いて決定し、濃酸あるいは濃塩基を用いてｐＨ  ７．４  ±０．０２に調整した。分からないサンプルを貫流セルを通じて循環させ、それが安定するまで蛍光放出強度を観察した。分からないグルコース濃度のサンプルをセル中の流れを通じて循環させ、それが安定するまで蛍光放出強度を観察した。Ｙ軸上の較正曲線に対し、安定した蛍光放出強度に対して定量化された値を比較し、Ｘ軸上の対応するグルコース濃度を読み取ることによって、分かっていないグルコース濃度を決定した。最終的に決定された分からないサンプルのグルコース濃度を、サンプルのｐＨを調整することによって生じた希釈係数に対して調整した。
【０２３１】
［実施例２４］
４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４，７−フェナントロリニウムブロマイド（４，７−フェン−Ｍ−ＢＶ）の合成
【化３０】
2009519053.tif 000043
【０２３２】
炉で乾燥した２５０ｍＬの丸底フラスコに磁気撹拌子を取り付け、アルゴン下で冷却した。そして、そのフラスコに４，７−フェナントロリン  （６．１６  ｇ，  ３４．２  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。フラスコをアルゴン（ｇ）ラインに接続された還流コンデンサーに取り付け、Ｎ，Ｎ−  ジメチルホルムアミド  （３０  ｍＬ）を仕込んだ。懸濁物を加熱して溶かし、新たに調製したジメチル−（３−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（５．５６２  ｇ，  ２２．８  ｍｍｏｌｓ）をシリンジで加える間、９０℃に保った。反応液をＴＬＣでモニターし、３時間後ボロナートエステルの消失を観察した。反応混合物をアルゴン下で室温まで冷却し、カニューレを用いてオレンジ色の懸濁液を感湿フリット付漏斗に移した。鮭肉色固体を収集し、アセトン（４  ｘ  ５０  ｍＬ）で洗浄し、減圧下で一晩乾燥した。収率：３．６５２  ｇ，  １７．７  ｍｍｏｌｓ  （７８％）。
【化３１】
2009519053.tif 000044
【０２３３】
この化合物は実施例３１で使用された。
【０２３４】
［実施例２５］
４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）  −Ｎ−７−（ベンジル−４−エテニル）  −４，７−  フェナントロリニウムブロマイドクロライド（４，７−フェン−Ｍ−ＳＢＢＶ）の合成
【化３２】
2009519053.tif 000045
【０２３５】
炎で乾燥した２５ｍＬの枝付丸底フラスコに磁気撹拌子および還流コンデンサーを取り付け、ＣＨ３ＣＮ  （２  ｍＬ）中にＮ−ベンジル−４−エテニル−  ４，７−フェナントロリニウムクロライド（０．２４３  ｇ，  ０．７３０  ｍｍｏｌｓ）を懸濁した。ジメチル−（３−ブロモメチル）ベンゼンボロナート（２．８  ｇ，  １１．５  ｍｍｏｌｓ）を側面からシリンジで加え、懸濁液をアルゴン（ｇ）下で６４時間還流した。その溶液を室温まで冷却し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で沈殿させた。懸濁液を安定させ、カニューレで浮遊物を取り除いた。３  ｍＬの溶媒を用いて残留物をカニューレで遠心分離管に移し、アセトン：水（５０／５０，  Ｖ／Ｖ，  ２０  ｍＬ）を用いて粉末化し、遠心分離した（この工程を４回繰り返した）。ベージュ色／黄色固体をジエチルエーテル（３  ｘ  ２０  ｍＬ）で粉末化し、減圧下で乾燥した。収率：０．３５４  ｇ，  ０．６１５  ｍｍｏｌｓ  （８４％）。
【化３３】
2009519053.tif 000046
この化合物は実施例２６で使用された。
【０２３６】
［実施例２６］
２成分系：４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−７−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−４，７−フェナントロリニウムブロマイドクロライド（４，７−フェン−Ｍ−ＳＢＢＶ）およびアセトキシ−  ＨＰＴＳ−ＭＡの薄膜共重合
【化３４】
2009519053.tif 000047
【０２３７】
１０ｍＬ容積測定フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（３．５２５  ｇ，  ２７．０８  ｍｍｏｌｓ），  ４，７−フェナントロリニウム−（ベンジル−３−ボロン酸）−  Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）  ブロマイドクロライド（ｍ−ＳＢＢＶ）  （０．０８６ｇ，  ０．１５ｍｍｏｌｓ），  ３−（（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロライド（０．３  ｇ，  １．３６  ｍｍｏｌｓ），  ポリエチレングリコールジメタクリレート（１．１１  ｇ，  １．１１  ｍｍｏｌｓ），  ２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（０．０２５  ｇ，  ０．０７７  ｍｍｏｌｓ）および８−アセトキシピレン−ｌ，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）  （６．６  ｘ  １０−４  ｇ，  ７．５  ｘ  １０−４  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ；そのフラスコをイソプロピルアルコール／水（１  ：  １  ，  Ｖ／Ｖ）で１０ｍＬ目盛りのところまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌し、それを重合チャンバーを備え、アルゴンで満たされたグローブボックスに移した（実施例１１参照）。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをＬＵＥＲ−ＬＯＣ  栓を用いて密封し、２つのＺＩＰＬＯＣ  （商標）  冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体を４０℃オーブンに移し、１８時間加熱した。重合チャンバーをオーブンから取り出し、室温まで放置した。それを分解し、そのオレンジ色フィルムを、効率的に緑色にするために、７時間ｐＨ  ８−ＮａＯＨ溶液でろ過した。緑色フィルムを１４時間ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中に保存した。
【０２３８】
このポリマーは実施例３２で特性化された。
【０２３９】
［実施例２７］
８−アセトキシピレン−１−メタクリロイルアミノプロピル−３，５−  ビス−カルボキシプロピルスルホンアミド（ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡ）  ジナトリウム塩の調製
【化３５】
2009519053.tif 000048
【０２４０】
１００ｍＬ丸底フラスコに撹拌子およびゴムセプタムを取り付け、（１−アセトキシ−３，  ６，  ８−ピレントリスルホニルクロライド）  （０．５  ｍｍｏｌｓ，  ２７２．９１  ｍｇ）および４０  ｍｌのＴＨＦを仕込んだ。ナトリウム４−アミノブチレート（１  ｍｍｏｌ，  １２５．１０  ｍｇ）のサンプルを、２  ｍｌのＴＨＦおよび０．２６  ｍｌの脱イオン水と共に小試験管に入れた。懸濁液を短時間ボルテックスし、３ｍｌのプラスチックシリンジの中に取り入れた。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドＨＣｌのサンプルを、５  ｍｌのＴＨＦと０．５５  ｍｌ，  Ｉ  ＭのＮａＯＨ水溶液と共に小試験管の中に入れた。懸濁液を短時間ボルテックスし、１０ｍｌのプラスチックシリンジの中に取り入れた。１００ｍＬ丸底フラスコ中の溶液を素早く撹拌し、５．２  ｍｌ脱イオン水を入れ、そしてナトリウム４−アミノブチラート懸濁液を追加的に滴下し、１０分間の撹拌後、一時的に黄色くなった鮮やかな赤色溶液を得た。そして、そのフラスコに、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドを仕込んだ。ＨＣｌ懸濁液を滴下し、一時的に黄色くなった鮮やかな赤色溶液を再び得た。その溶液を４時間撹拌した。その時間経過後、その溶液をロトエバポレーションと高真空によって取り除いた。そのフラスコの固体を最小量のメタノールに入れ、ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって収集し、沈殿を繰り返し、最終生成物を得た。
【化３６】
2009519053.tif 000049
これらは、特異異性体の混合物であった。
【０２４１】
この生成物は実施例３７で使用された。
【０２４２】
［実施例２８］
８−アセトキシ−１，３，６−ピレネトリカルボキシプロピルスルホンアミド（アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＣＯ２）の調製
【化３７】
2009519053.tif 000050
【０２４３】
丸底フラスコに４−アミノ酪酸（５．１５６ｇ，  ５０  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。メタノール（５０  ｍＬ）を加え、さらに水酸化ナトリウム（２ｇ，  ５０  ｍｍｏｌｓ）を加えた。その溶液が均一になるまで（メタノールがロータリーエバポレーターで取り除かれたことを示すまで）撹拌した。黄褐色固体をさらにアセトニトリルを用いて同時蒸着によって乾燥し、水を取り除いた。
【０２４４】
［ＨＰＴＳ−ＣＯ２の調製］
オーブンで乾燥し、磁気撹拌子を取り付けた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、８−アセトキシ−ｌ，３，６−ピレントリスルホニルクロライド（４６０  ｍｇ，  ０．８３  ｍｍｏｌｓ）を仕込み、セプタムで密封した。ＤＭＳＯ（２０  ｍＬ）を加え、均一の黄色溶液を得た。第二オーブンで乾燥し、磁気撹拌子を取り付けた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、４−アミノソジウムブチレート（４１５  ｍｇ，  ３．３２  ｍｍｏｌｓ）を仕込み、セプタムで密封した。両頭針でＤＭＳＯ（２０  ｍＬ）を加え、数分撹拌した後、ＤＭＳＯ中に８−アセトキシ−ｌ，３，６−ピレントリスルホニルクロライドを含む第一溶液をカニューレで滴下し、濃い赤色均一溶液を得た。約６時間後、その溶液の三分の一を取り除き、ＤＭＳＯを真空下で蒸留した。生じた茶色物質を少量のアセトニトリルで洗浄し、綿を通してろ過し、Ｅｔ２Ｏ中に滴下し、少量の茶色／赤色の吸湿性固体（４８  ｍｇ）を沈殿物として得た。
【化３８】
2009519053.tif 000051
【０２４５】
アセトキシ保護基をＮａＯＨ水溶液を用いて処理することによって除去した。そのｐＫａ値は約６．８と決定された。
【０２４６】
そして、ヒドロキシル物質を、ｍ−ＢＢＶを用いたスターンウォリメルクエンチング研究に使用し、２５４１９のスターンウォリメルクエンチング定数を得た。
【０２４７】
スターンウォリメル研究に続き、ＨＰＴＳ−ＣＯ２／ｍ−ＢＢＶ混合物をグルコース反応研究に使用した。この混合物は、生理学的範囲（０−４００  ｍｇ／ｄＬ）におけるグルコースにかなり線形で、グルコース濃度の少しの変化に対して検出感度を示した。
【０２４８】
コンピューター制御装置ＡＤＣ  １０００  Ｒｅｖ  Ｂを用いたＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．  Ｍｏｄｅｌ＃  ＳＦ  ２０００．  Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ，  ３８０  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｄｕｎｅｄｉｎ，  ＦＬ  ３４６９８蛍光分光光度計を利用して、４，  ７−フェン−ＢＢＶを有するＨＰＴＳ−ＣＯ２を使用して、グルコース濃度解析を行った。そして、増加グルコース濃度が増加蛍光強度を与えたことが観察された。
【０２４９】
［実施例２９］
２−（３，５−ビス−ブロモメチル−フェニル）−（ｌ，３，２）−ジオキサボリナンの調製
【化３９】
2009519053.tif 000052
【０２５０】
［ボロン酸エステルの調製］
オーブンで乾燥し、磁気撹拌子を取り付けた枝付丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、３，５−ジメチルフェニルボロン酸（５  ｇ，  ３３  ｍｍｏｌ）、続いてペンタンを加え、０．５Ｍ不均一溶液を調製した。  そして、そのフラスコをオーブンで乾燥した還流コンデンサーに取り付け、セプタムで密封し、窒素で浄化した。１，３−プロパンジオール（１４．５  ｍＬ）を両頭針で加えながら、その溶液を撹拌した。そして、その溶液が均一になるまで（約２０分間）還流した。その溶液を窒素雰囲気下で室温まで冷やした。硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムを素早く加え、装置を窒素で浄化し、そしてその溶液を１時間徐々に加熱した。そして、その溶液を窒素下で室温まで冷やし、撹拌を止めた。浮遊物をオーブンで乾燥した別の丸底フラスコに移し、窒素下で冷やし、セプタムで密封した。残った固体をペンタンで洗浄し、それを第一ペンタン層と混ぜた。ペンタンをアルゴンブリードを有するロータリーエバポレーター真空下で取り除き、黄色の固体を得た。ＭＰ：５８−６０℃。
【０２５１】
［ジブロモ化］
オーブンで乾燥し、磁気撹拌子を取り付けた枝付丸底フラスコを窒素下で冷却し、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１３．４  ｇ，  ７３．２６  ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ  （１．０９４  ｇ，  ６．６６  ｍｍｏｌ）を仕込み、還流コンデンサーに取り付け、セプタムで密封し、数分間窒素で浄化した。ボロン酸エステルをクロロホルム（２５０  ｍＬ，  ＣａＨ２で蒸留）で溶解し、Ｎ−ブロモスクシンイミドおよびＡＩＢＮを含む丸底フラスコにカニューレで注入した。亜硫酸ナトリウム水溶液からなるＨＢｒ防臭弁に接続された窒素気泡管を通して装置に通気孔をつけた。そして、その溶液を撹拌しながら強く熱して還流した。３．５時間後、薄黄色の液体の加熱を止め、窒素下で室温まで冷却した。その溶液を、アルゴンブリードを有するロータリーエバポレーター真空下で濃縮し、スクシンイミド副生成物をアルゴン下でろ過することによって取り除いたオレンジ色溶液を得た。アルゴンブリードを有するロータリーエバポレーターでろ過物をさらに濃縮し、粘着性のある濃いオレンジ色液体を得た。ペンタン（〜２５０  ｍｌ）を撹拌しながら粘着性のある液体にゆっくり加え、粗生成物を沈殿物として得た。ペンタン浮遊物をろ過し、その固体をアルゴン下で中度の荒さのガラスフィルターに収集した。その固体を真空下（６０  ｍｉｌｌｉｔｏｒｒ）で乾燥した。収率：７１％。ＭＰ：  １２４−１２５℃。
【化４０】
2009519053.tif 000053
【０２５２】
この化合物を実施例３０および３５で使用した。
【０２５３】
［実施例３０］
３−（３−ブロモメチル−５−（１，３，２）ジオキサボリナン−２−イル−ベンジルオキシ）プロパン−１−オールの合成
【化４１】
2009519053.tif 000054
【０２５４】
オーブンで乾燥し、磁気撹拌子および還流コンデンサーを取り付けた２５０ｍＬ丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、ＮａＨ  （ミネラルオイル中６０％の０．８００ｇ，  ２０  ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。粉末をペンタン（３  ｘ  １００  ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥した。アセトニトリル（５０  ｍＬ）をシリンジで加え、混合物を室温で撹拌した。１，３−プロパンジオール（１０  ｍＬ）を１０分以上滴下して加え、白色不溶性沈殿物が形成された。その懸濁液を１時間強く撹拌し、それを２０  ｍＬシリンジで取り出し、２−（３，５−ビス−ブロモメチルフェニル）−（１，３，２）ジオキサボリナン（２．８６５  ｇ，  ８．２  ｍｍｏｌｓ）およびアセトニトリル（５０  ｍＬ）を仕込んだ２５０ｍＬ丸底フラスコに滴下して加えた。その混合液を室温で１２時間撹拌した。還流コンデンサーを真空アダプターに接続し、反応混合液を２時間アルゴン下で還流した。アセトニトリルを真空下で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン，  ２：１）。溶媒を除去して、黄色オイル中に白色固体の懸濁物を得、薄膜クロマトグラフィーで分析した結果、出発物質ではなかった。１，３−プロパンジオールを含む粗混合物をさらに精製することなく使用した。
【０２５５】
この化合物は実施例３１で使用された。
【０２５６】
［実施例３１］
４−Ｎ−（ベンジル−３−（ジメチル）ボロナート）−７−Ｎ−（ベンジル−３−（ｌ，３，２，））ジオキサボリナン−２−イル）−５−メチレンオキシ−プロパノール−４，７−フェナントロリニウムジブロマイド（４，７−フェン−Ｍ−ＢＢＶＯＨ）の合成
【化４２】
2009519053.tif 000055
【０２５７】
実施例３０の物質を、１００ｍＬ枝付丸底フラスコに保存し、そのフラスコに磁気撹拌子および還流コンデンサーを取り付けた。そのフラスコに、４−Ｎ−（ベンジル−３−（ジメチル）ボロナート）−４，７−フェナントロリニウムブロマイド  （４，７−フェン−ｍ−ＢＶ）  （０．７９７，  １．８８  ｍｍｏｌｓ），  ＤＭＦ  （４  ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ  （３  ｍＬ）を仕込んだ。その懸濁液を４８時間１００℃で加熱し、反応を通じてアルゴン下に保持した。その反応混合物をアルゴン下で室温まで冷やし、撹拌を続けた。その懸濁液を氷で冷やされたジエチルエーテル（１００  ｍＬ）にカニューレで入れ、１時間を超えて沈殿物を生成した。浮遊物を別の容器にカニューレで移し、ベージュ色／赤色の残渣をＴＨＦ  （５０  ｍＬ）を用いて粉末化した。その混合物を１２０分間４０℃で超音波分解し、生じた鮮やかな粉末をジエチルエーテル（３  ｘ  ５０  ｍＬ）で洗浄した。アルゴンで固体をフリット付漏斗に集め、減圧下にて乾燥した（０．９２９  ｇ，  ４９．４％  収率）。
【０２５８】
この化合物を実施例３４で使用した。
【０２５９】
［実施例３２］
２成分系の蛍光分光分析：ＨＰＴＳ−ＭＡを使用した４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−７−Ｎ−（ベンジル−４−エテニル）−４，７−フェナントロリニウムクロライドブロマイド（４，７−フェン−Ｍ−ＳＢＢＶ）の薄膜共重合体ヒドロゲル
【化４３】
2009519053.tif 000056
【０２６０】
この蛍光性を実施例１７の手順に準じて測定した。
【０２６１】
４４１のベースライン値（蛍光強度）を緩衝液を用いて確立した。蠕動ポンプを止め、ポンプ溶液をｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中の４００  ｍｇ／ｄｌグルコースに交換した。蛍光強度は２．７％シグナル増加に対応する値４５３まで、１２ユニット増加した。溶液の交換工程を繰り返した。溶液をｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中の４００  ｍｇ／ｄｌフルクトースに交換した。緩衝液は、ベースライン４４３を与えた。蛍光強度は、３．２％シグナル増加に対応する値４５７まで、１４ユニット増加した。最終的に、ｐＨ  ７．４リン酸緩衝液中は、システムを通して汲み出され、ベースライン４４６を達成した。
【０２６２】
これら結果は、図１１で参照できる。
【０２６３】
［実施例３３］
４，７−Ｎ，Ｎ−ビス（ベンジル-３−ボロン酸）−４−７−フェナントロリニウムジブロマイド（４，７−フェン‐Ｍ−ＢＢＶ）の合成
【化４４】
2009519053.tif 000057
【０２６４】
炉で乾燥し、磁気攪拌子および還流コンデンサーを備えた１００ｍＬの丸底フラスコをアルゴン下で冷却した。そして、４，７−フェン‐ｍ−ＢＶ（０．８１４ｇ，１．９２ｍｍｏｌｓ）および３−ブロモエチルフェニルボロン酸（１．７７ｇ，８．２４ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。反応系は、アルゴンでパージされ、乾燥したＤＭＦ（３５ｍＬ）を投入した。懸濁液は、アルゴン雰囲気下において、８０℃で４８時間加熱された。混合物は、アルゴン下で室温まで冷やされ、冷却された１Ｍ塩酸（１０滴）を含むジエチルエーテル：アセトン（１：１，５００ｍＬ）中に滴下された。沈殿物をろ別し、冷アセトンで複数回洗浄し、引き続いて、減圧下で乾燥した。収率：０．９１３ｇであり、１．５０ｍｍｏｌｓ（７８％）。
【化４５】
2009519053.tif 000058
この化合物は、実施例２８の色素をクエンチし、グルコースに応答した。
【０２６５】
この化合物は、実施例１７の手順に従い評価された。スターンウォリメルクエンチ定数は、２５９８Ｍ−１であった。
【０２６６】
グルコース反応は、１８０ｍｇ／ｄＬを用いて測定し、蛍光強度は２５７から２９１まで変化した。
【０２６７】
［実施例３４］
４−Ｎ−（ベンジル‐３−（ボロン酸）−７−Ｎ−[ベンジル‐３−（メチレン‐（１−オキシ‐３−（オキシベンジルビニル）‐プロパン））−５−ボロン酸]−４，７−フェナントロリニウムジブロマイドの合成
【化４６】
2009519053.tif 000059
【０２６８】
炉乾燥し、磁気攪拌子を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、４，７−フェン‐ｍ  ＢＢＶＯＨ（０．４９１ｇ，０．６４１ｍｍｏｌｓ）および４−ビニルベンジルクロライド（０．１３７ｇ，０．９ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。活性化されたばかりのＮａＨ（０．０８４ｇ，２ｍｍｏｌｓ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に懸濁させ、カニューレで１００ｍＬのフラスコに注入した。混合物を、室温で４６時間攪拌した。その後、アセトン（３０ｍＬ）と、１ＭＨＣｌ（１０滴）とでクエンチし、一晩中攪拌した。懸濁液を冷ジエチルエーテル（２００ｍＬ）に滴下し、そして、沈殿物を析出させた。遠心分離をした後に、浮遊物を取り除き、残留物を最小量のメタノールに溶解した。アセトン：ジエチルエーテル（１：１，２０ｍＬ）を加え、沈殿物を４℃で一晩中維持した。懸濁液をろ過し、その後、ジエチルエーテルで複数回洗浄し、減圧下で乾燥した。収率：０．２０１ｇ，０．２４７ｍｍｏｌｓ，３８．５％。
【化４７】
2009519053.tif 000060
この化合物は、実施例２８の色素を消光し、そして、グルコースに対する応答を示した。
【０２６９】
［実施例３５］
４，４‘−Ｎ，Ｎ−ビス‐[ベンジル‐（３−ブロモメチル）−５−（ボロン酸）]−ジピリジニウムジブロマイド（Ｍ‐ＢＢＶＢＰ）の調製
【化４８】
2009519053.tif 000061
【０２７０】
炉で乾燥させられ、磁気攪拌子を備えた１００ｍＬの丸底フラスコを、アルゴン下で冷却し、４，４’−ジピリジル（０．３９４ｇ，２．５２ｍｍｏｌｓ）および２‐（３，５−ビス‐ブロモメチル‐フェニル）‐[１，３，２] ジオキサボリナン（２．６３ｇ，７．５６ｍｍｏｌｓ）を仕込み、セプタムで密閉した。フラスコは、アルゴンでパージされ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を加えた。溶液は、室温で７２時間攪拌され、そして、得られた懸濁液は、プラスチックのカニューレを介して、アセトン：ジエチルエーテル溶液（１：１，３００ｍＬ）に挿入される。沈殿物は、大気に感受性のあるフリット付漏斗（ａｉｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｒｉｔｔｅｄ  ｆｕｎｎｅｌ）を介してろ別され、アルゴン雰囲気下でジエチルエーテルを用いて複数回洗浄した。明るい黄色の固体がアルゴン下で減圧乾燥され、単離された。収率：１．６３２ｇ，１．９２ｍｍｏｌｓ，７６％
【０２７１】
この化合物は、実施例３６で使用された。
【０２７２】
［実施例３６］
４，４’‐Ｎ，Ｎ−ビス‐[ベンジル‐（３−メチレン‐４−ビニル‐ピリジニウムブロマイド）‐５−（ボロン酸）]−ジピリジニウムジボロマイド）（Ｍ−ＢＢＶＢＰ）の合成
【化４９】
2009519053.tif 000062
【０２７３】
炉で乾燥され、磁気攪拌子および還流コンデンサーを備えた、５０ｍＬの枝付の丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、ｍ−ＢＢＶＢＢｒ（５００ｍｇ，０．５８７ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。固体を最小量の無水ＣＨ３ＯＨ（６ｍＬ）に溶解し、そして、４−ビニルピリジン（６３ｇ，０．６０ｍｍｏｌｓ）をフラスコの枝を介して添加した。溶液は、室温で１５時間攪拌され、その後、加熱され６時間還流した。追加の４−ビニルピリジン（６３ｇ，０．６０ｍｍｏｌｓ）を添加し、混合物を４日間還流した。暗緑色の溶液をアルゴン下で室温まで冷却し、ＣＨ３ＯＨを減圧下で除去した。粗油を１Ｍ塩酸（５滴）を含むアセトン：水（４０：１）溶液で、勢いよく１０分間攪拌し（４×３０ｍＬ）、上澄みを静かに除去した。残留物を沸騰したメタノール：エタノール（１：１，５０ｍＬ）で再結晶して、暗緑色の結晶を得た。固体を、フリット付漏斗上で回収し、氷冷したエタノール（水中、９５％）およびジエチルエーテルで洗浄した。引き続き、減圧下で乾燥し、薄緑色の粉末を得た。収率：０．４４６ｇ，０．５０６ｍｍｏｌｓ，８６％。
【化５０】
2009519053.tif 000063
【０２７４】
この化合物を、実施例３７および４０で使用した。
【０２７５】
［実施例３７］
二成分系：ｍ−ＢＢＶＢＰのＨＰＴＳ‐ＣＯ２ＭＡとの薄膜共重合
【０２７６】
１０ｍＬの容量フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（３．５２５ｇ，２７．０８ｍｍｏｌｓ）、ｍ−ＢＢＶＢＰ（０．６１７ｍｇ，７．５×１０−４ｍｍｏｌｓ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（１．１１ｇ，１．１１ｍｍｏｌｓ）、２，２’−アゾビス[２−（２−イミダゾリン‐２−イル）プロパン]ジヒドロクロライド（０．０２５ｇ，０．０７７ｍｍｏｌｓ）およびＨＰＴＳ  ＣＯ２ＭＡ（１．２６ｍｇ，１．５×１０−３ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。そして、１０ｍLになるまで、メタノール：水（１：１，Ｖ／Ｖ）を加えた。溶液をボルテックスミキサーで強く攪拌した後、５０ｍＬの丸底フラスコに移動した。そして、フラスコをゴムのセプタムで密閉した。アルゴンを２０分間通じることにより、脱酸素を行った。マノメータ溶液は、シリンジにより取り出され、針はゴムのストッパーでキャップされた。その後、実施例１６中で述べられた重合チャンバーが備えられ、アルゴンで満たされたグローブボックスに移動された。
【０２７７】
緑色の膜は、実施例３８で使用されるまで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中で保持された。
【０２７８】
［実施例３８］
二成分系の蛍光分光分析：ＨＰＴＳ−ＣＯ２ＭＡを用いた４，４’−Ｎ，Ｎ−ビス‐（ベンジル‐（３‐（メチレン‐４‐ビニルピリジニウムブロマイド）‐５−（ボロン酸））−ジピリジニウムジブロマイドの薄膜共重合ヒドロゲル
【化５１】
2009519053.tif 000064
【０２７９】
蛍光は、実施例１２の手法に従って測定された。
【０２８０】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂソフトウェアのタイムドライブ機能を、積分時間が２秒で１０秒毎に蛍光強度の取得に用いた。励起波長は、４６３ｎｍに設定され、発光波長は５１８ｎｍに設定されている。励起スリット幅は１５ｎｍであり、発光スリット幅は４．３ｎｍである。ベースラインの値の４５１（蛍光強度）は、緩衝液により確立された。蠕動ポンプを停止し、流れでる溶液をｐＨ７．４の３６０ｍｇ／ｄＬ溶液に変更した。蛍光強度は、１．６％のシグナルの増加に対応して、値４５８の２９ユニットに増加した。溶液を交換するプロセスを繰り返した。緩衝液は、４５１の予期されたベースラインを維持した。
【０２８１】
［実施例３９］
単一成分のビオロゲンセンサーＨＰＴＳ−ｍ−ＢＳ
【化５２】
2009519053.tif 000065
【０２８２】
（ａ）炉で乾燥され、磁気攪拌子が取り付けらた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、４−クロロメチルベンゾイルクロライド（１．８９ｇ，１０ｍｍｏｌｓ）を仕込み、ゴムのセプタムで密閉した。ジクロロメタン（２５ｍＬ）を添加し、溶液を攪拌し、氷浴して冷却した。１，３−プロパンジアミン（０．８９ｇ，１２ｍｍｏｌ）が滴下により加えられ、すぐに、白い沈殿物が生じた。白い固体は、アルゴン下で回収され、中間粗さのガラスフィルター上に回収され、冷ジクロロメタンで洗浄された。白い固体は、減圧下（１００ｍｔｏｒｒ，３ｈ）で乾燥され、２．６１ｇ（収率９９％）の４−クロロメチルベンゾイル‐（１‐アミドプロピル‐３‐アンモニウムクロライド）が回収された。
【化５３】
2009519053.tif 000066
【０２８３】
（ｂ）（ｍ−ＢＶ）  炉乾燥され、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、３−ブロモメチルフェニルボロン酸（０．６４ｇ，３ｍｍｏｌｓ）を仕込み、ゴムのセプタムで密閉した。わずかに濁った黄色の溶液が得られるように、ＴＨＦ（５０ｍＬ）を加えた。炉乾燥され、磁気攪拌子を備えた第２の丸底フラスコに、４，４’−ビピリジン（１．８７ｇ，１２ｍｍｏｌｓ）を仕込み、ゴムのセプタムで密閉した。ＴＨＦ（５ｍＬ）を両頭針を介して加えた。そして、数分の攪拌の後に、ＴＨＦ中に４，４’−ビピリジン（１．８７ｇ，１２ｍｍｍｏｌｓ）を含む溶液を３−ブロモメチルフェニルボロン酸溶液に滴下した。３０分後に、黄色の沈殿物が形成し始め、溶液を一晩中室温で攪拌した。そして、大量の沈殿物が形成された。その後、溶液は、遠心分離され、両頭針を介して上澄みを移動した。黄色の固体を、ＴＨＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、減圧下（１００ｍｔｏｒｒ，３時間）で乾燥した。その結果、０．８８ｇ（収率７９％）のｍＢＶが得られた。
【化５４】
2009519053.tif 000067
【０２８４】
（ｃ）ｍ−ＡＢＢＶ  炉乾燥され、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、４−クロロメチルベンゾイル‐（１−アミドプロピル‐３−アンモニウムクロライド）（２６３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を仕込み、ゴムのセプタムで密閉した。メタノール（３０ｍＬ）を加えて、溶液を攪拌した。ｍＢＶ（３７１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を、メタノール（１０ｍＬ）に溶解し、４−クロロメチルベンゾイル‐（１−アミドプロピル‐３−アンモニウムクロライド）を含む溶液中に滴下した。溶液を、加熱還流した。４８時間後に、アルゴン下で溶液を室温まで冷やした。１０ｍＬの溶液をシリンジで除去し、アセトン（１００ｍＬ）中で沈殿させた。上澄みを取り除き、白い固体を回収し、減圧下で乾燥し４４ｍｇのｍ−ＡＢＢＶが得られた。
【化５５】
2009519053.tif 000068
【０２８５】
（ｄ）ＡＩＯ  炉乾燥され、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、ｍ−ＡＢＢＶ（４４ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）を仕込み、ゴムのセプタムで密閉した。メタノール（１０ｍＬ）に続き、水（２ｍＬ）を加えた。Ｋ２ＣＯ３を加えて、そして溶液を攪拌した。１−アセトキシ‐３，６，８−トリスルホニルクライド（アセトキシ‐ＨＰＴＳ−Ｃｌ）（３８ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に加えて、黄色の懸濁液を得た。均一な溶液をえるためにアセトン（５ｍＬ）を添加した。アセトキシ‐ＨＰＴＳ−Ｃｌ溶液を、ｍ−ＡＢＢＶに、シリンジを介して滴下した。溶液は即座に赤色になり、数分の攪拌の後には、沈殿物が形成され始めた。溶液は、室温で一晩中攪拌され、その後、遠心分離管に移された。遠心分離の後、上澄みは、丸底フラスコに移され、ロータリーエバポレーターで濃縮された。残留した水は、アセトニトリルとの同時蒸発により除去された。その結果、黒い固体が得られ、減圧下で乾燥され、５５ｍｇ（７０％収率）の８−アセトキシ‐１−ｍ−ＡＢＢＶ−ピレン‐３，６−ビススルホン酸（ＡＩＯ）が得られた。
【０２８６】
【化５６】
2009519053.tif 000069
（ｅ）その後、最終的に得られた物質を実施例１７で述べたようなグルコース分析のために使用した。はじめに、５×１０−４ＭのＡＩＯ原液を２５ｍＬの容量フラスコに準備した。しかし、溶液は、すべてのアセトキシ保護基の除去を確認した後にｐＨ７．４（イオン強度１）のリン酸緩衝液で希釈した。そして溶液を、ｐＨ７．４に調整し２５ｍＬに薄めた。次に、異なるグルコース量を有する７つの５ｍＬのサンプルを作成するために、５×１０−５Ｍの原液を使用した。分析は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０−Ｂ発光分光計で、下記の条件により行われた。
励起波長        ４６３ｎｍ
発光波長幅      ４５０−６５０ｎｍ
励起スリット幅  １５ｎｍ
発光スリット幅  １５ｎｍ
発光フィルター  １％  Ｔ減衰器
スキャン速度    １００ｎｍ／ｓｅｃ
【０２８７】
この化合物は、高いグルコース応答であった。１８ｍｇ／ｄＬの追加により、シグナルが８２７から９０８に増加した。さらなる濃縮グルコース溶液の追加は、少量のグルコースにより物質が飽和されたため、さらなる蛍光強度の増加をもたらさなかった。
【０２８８】
［実施例４０］
二成分系：ｍ−ＢＢＶＢＰとＨＰＴＳ  ＭＡとの薄膜共重合
【化５７】
2009519053.tif 000070
【０２８９】
１０ｍＬの容量フラスコに、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（３．５２５ｇ，２７．０８ｍｍｏｌｓ）、ｍ−ＢＢＶＢＰ（１２．３ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌｓ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（１．１１ｇ，１．１１ｍｍｏｌｓ）、２，２”−アゾビス[２−（２−イミダゾリン‐２−イル）プロパン]ジハイドロクロライド（０．０２５ｇ，０．０７７ｍｍｏｌｓ）およびＨＰＴＳ  ＭＡ（１．３２ｍｇ，１．５×１０−３ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。そして、１０ｍLになるまで、メタノール：水（１：１，Ｖ／Ｖ）を加えた。溶液をボルテックスミキサーで強く攪拌した後、溶液を５０ｍＬの丸底フラスコに移し、フラスコをゴムのセプタムで密閉した。アルゴンを２０分間通じることにより、脱酸素を行った。マノメータ溶液は、シリンジにより取り出され、針は、ゴムのストッパーでキャップされた。その後、重合チャンバー（実施例１１参照）が備えられ、アルゴンで満たされたグローブボックスに移動された。シリンジは、重合チャンバーに取り付けられ、アルゴン下でその空洞の全体を満たすように溶液がセル中に注入された。チャンバーを、ＬＵＥＲ−ＬＯＣＫ（商標）プラグで密閉され、ＺＩＰＬＯＣ  （商標）冷凍用バッグ中で覆った。ユニット全体を、４０℃のオーブンに移し１０時間加熱した。重合チャンバーを、オーブンから取り出し、室温になるまで放置した。チャンバーを分解し、ｐＨ８のＮａＯＨ溶液に４時間おくことで膜を溶出した。実施例４１で使用されるまで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中で膜を保持した。
【０２９０】
［実施例４１］
二成分系の蛍光分光分析：ＨＰＴＳ−ＭＡを用いた４，４’−Ｎ，Ｎ−ビス‐（ベンジル‐（３‐（メチレン‐４‐ビニルピリジニウムブロマイド）‐５−（ボロン酸））−ジピリジニウムジブロマイド（Ｍ−ＢＢＶＢＰ）の重合ヒドロゲルの薄膜
【化５８】
2009519053.tif 000071
【０２９１】
蛍光は、実施例１２の手法に従って測定された。
【０２９２】
セルの中で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（イオン強度０．１）を毎分３０ｍＬで循環するために、蠕動ポンプを使用した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂソフトウェアのタイムドライブ機能を、蛍光強度の読み取りに使用した。サンプルは、パルス機能を用いて照射され（２分毎に）、そして、２秒の積算時間で１０分毎に読み出しを記録した。励起波長は４７５ｎｍであり、発光波長は、５２５ｎｍである。励起スリット幅は１５ｎｍ、発光スリット幅は４ｎｍであった。ベースラインの値は、４６４（蛍光強度）は、緩衝溶液により確立された。蠕動ポンプを停止し、そして、流れている溶液をｐＨ７．４リン酸緩衝液中の３６０ｍｇ／ｄＬグルコースに変更した。蛍光強度は、６．３％のシグナル強度の増加に対応し、４９３の値まで２９ユニットで増加した。溶液の交換工程を繰り返した。緩衝液は、４６４のベースラインを提供した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中の１００ｍｇ／ｄＬグルコースに変更した後、４．３％のシグナル強度の増加に対応して、４８４の値まで２０ユニット上昇した。最終的に、緩衝液を系を通じて流した時に、基準は、予期された数値である４６４まで低下した。図１４に結果を示す。
【０２９３】
［実施例４２］
ＰＭＭＡの調製
【０２９４】
１ｍｍの厚さのＰＭＭＡを、重合チャンバーの大きさにドレメルツールを用いて切断し、その後、金ワイプのヘキサンで洗浄した。その後、キムワイプのイソプロパノールで洗浄し、ついで、イソプロパノール中に置き、２時間浸した。ＰＭＭＡ片は、その後、窒素雰囲気下の真空オーブン中４０℃で乾燥させた。
【０２９５】
［実施例４３］
アミド溶液の調製
【化５９】
2009519053.tif 000072
【０２９６】
磁気攪拌子およびゴム製セプタムが備えられた５０ｍＬの丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、１，２−エタンジアミンを仕込んだ。フラスコは、アルゴンで２０分間パージされた。ブチルリチウム（シクロヘキサン中、２．０ＭのｎＢｕＬｉ）を室温でシリンジを介して３０分間かけて滴下した。ｎＢｕＬｉを追加した後、溶液を３時間攪拌した。
【０２９７】
［実施例４４］
ＰＭＭＡ表面のアミン官能基化
【化６０】
2009519053.tif 000073
【０２９８】
乾燥したＰＭＭＡおよびリチウムアミド溶液をドライボックスに移し、その後、乾燥容器にはアルゴンを流した。そして、アミド溶液をパスツールピペットでＰＭＭＡ上に滴下することにより、ＰＭＭＡ表面をリチウムアミド溶液にさらす。アミド溶液がＰＭＭＡと接触した状態で２分間放置し、その後、ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水でクエンチする。その後、アミドで処理されたＰＭＭＡを真空オーブンに移し、４０℃で１時間乾燥する。
【０２９９】
［実施例４５］
ＰＭＭＡ表面のメタクリレート官能基化
【化６１】
2009519053.tif 000074
【０３００】
その後、アミン官能基化されたＰＭＭＡをドライボックスに移す。ドデカン、メタクリロイルクロライドおよびトリエチルアミンがドライボックス中に収納される。ついで、ドライボックス中にはアルゴンが流される。５ｍＬドデカン（２５ｍｍｏｌｅ），５ｍＬメタアクリロイルクロライド（５１ｍｍｏｌｅ）および０．５ｍＬトリエチルアミン（３．５ｍｍｏｌｅ）が混合され、そして、異種混合物をアミン官能基化されたＰＭＭＡ表面に滴下する。溶液がＰＭＭＡと接触した状態を１５分間維持し、その後、イソプロパノールで洗い流した。
【０３０１】
［実施例４６］
ＰＭＭＡ表面への検出ヒドロゲルポリマーの共有結合
【化６２】
2009519053.tif 000075
【０３０２】
重合チャンバーは、通常の方法で組み立てられ、表面修飾されたＰＭＭＡは、チャンバーの内部で、メタクリレート官能基化された背面板として、重合チャンバーに配置された。トップガラス板を、ジメチルシラン（１％トルエン中）で処理し、組み立てる前にヘキサンで十分に洗浄する。ついで、単量体混合体を１：２０  色素体／クエンチャー比を使用するという通常の方法により準備する。重合チャンバーをドライボックスに詰め、真空オーブンに移動し、４０℃で１８時間維持する。その後、重合チャンバーを移動させ解体する。サンドイッチされた膜は、ｐＨ１０に調整された水浴に移され、１２時間攪拌する。検出ヒドロゲルが共有結合したＰＭＭＡをｐＨ７．４緩衝液中に浸し、冷蔵庫に移動する。
【０３０３】
検出ヒドロゲルが結合したＰＭＭＡを、流水式キュベットに合うように切断される。この膜は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ  分光光度計を使用している貫流式の検査装置、またはグラス光ファイバを使用しているＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＳＦ２０００分光光度計により試験される。双方の分光光度計において、蛍光中の測定可能な変化は、グルコース濃度の変化により観測される。
【０３０４】
［実施例４７］
ＨＰＴＳ（ＬＹＳ−ＭＡ）３の合成
【０３０５】
磁気攪拌子を備えた５００ｍＬの丸底フラスコに、３．０ｇのＢｏｃ保護されたリジンと、１０ｍＬのmilliQ水を仕込み、攪拌を開始した。０．８０ＧのＮａＯＨを加え、溶解し、８５ｍＬのアセトニトリルを滴下した。１０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解した０．６００ｇのＡｃＯＨＰＴＳＣｌを滴下して加え、赤橙食になるよう攪拌した。フラスコをセプタムで密閉し、そして一晩攪拌を続けた。２２時間後、反応が停止した後、混合物が、下層である深紅の水層と、上層である鮮やかな緑色の有機層からなる２層になるまで静置した。下層の水層を、パスツールピペットで取り出し、そして、黄色の沈殿物を生じさせるために、３０ｍＬの３ＭＨＣｌで満たされた５０ｍＬの遠心分離管に滴下した。沈殿物が遠心分離により凝縮され、酸性の上澄み液が静かに移された。この工程を、全ての赤い水溶性物質が沈殿するまで５回繰り返した。この粗物質の収率と純度は求められなかった。合わせた固体を３０ｍＬの５０％ＭｅＯＨ／５０％ｐＨ７．４緩衝液溶液に溶解した。
【０３０６】
次に、この物質を、水／メタノール溶出を使用した３つの注入器中にあるＵＶ−ｖｉｓ検出器を有するＣ１８逆相Ｂｉｏｔａｇｅクロマトグラフィカラムにより分離した。目的物の留分をあわせたものを、ロータリーエバポレーターで蒸発させ乾燥させた。この赤い物質を８ｍＬのメタノールに再溶解し、そして、１．０μｍシリンジフィルターでろ過し、再びロータリーエバポレーターで乾燥し、高真空で一晩完全に乾燥させた。ＨＰＴＳ（Ｌｙｓ−Ｂｏｃ）３と同定される乾燥したオレンジ色の物質は、０．８１５ｇであった。１ＨＮＭＲ分析から、Ｂｏｃ保護基が大部分残っていることが明らかになった。
【０３０７】
次に、生成物を、２０ｍＬのジフルオロ酢酸に再溶解し、そして、Ｂｏｃ保護基を除去するために一晩中攪拌した。脱保護の後、トリエチルアミンおよびｐＨ７．４のリン酸緩衝液の追加により過剰の酸を中和し、その全量が３０ｍＬとなった。この物質の一部分を、水／メタノール溶出を使用しているＣ１８逆相Ｂｉｏｔａｇｅカラムクロマトグラフィカラムに積んだ。目的物の留分をあわせ、ロータリーエバポレーターおよび高真空で乾燥し、６６ｍｇの高純度な（ＨＰＴＳ（Ｌｙｓ）３を得た。
【０３０８】
高純度化された色素を、磁気攪拌子を備えた１００ｍＬの丸底フラスコにいれ、１ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水および３ｍＬの３Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。ついで、明るい緑色の溶液を攪拌した。１０ｍＬのテトラヒドロフランを加え、フラスコはセプタムで密閉された。０．２ｍＬのメタアクリロイルクロライドを、シリンジを介して加えた。その結果、色は、緑から深い赤茶色に変わった。反応を、一晩中継続させ、２４時間後に停止した。生成物のナトリウム塩を形成するために、１２ｍＬの３Ｍ  ＮａＯＨを加え、ｐＨを１０に調整した。攪拌子を取り出し、生成物を、真空下で一晩乾燥した。さらに、Ｃ１８カラムクロマトグラフィの後に、最終生成物がピンク色のナトリウム塩として単離された。質量＝８７ｍｇ。生成物は、１Ｈ−ＮＭＲを使用して特定され、スペクトルは、適切なシグナルと強度をもって、純度の高い生成物であることを示した。その構造を図１７に示す。
【０３０９】
［実施例４８］
ＨＰＴＳ（ＬＹＳ−ＭＡ）３の合成：ＢＢＶＢＰ０．０２”ヒドロゲル
【０３１０】
（ａ）単量体混合物の準備（１：２０  色素：クエンチャー比）
【０３１１】
２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、０．５６０ｇのＰＥＧ−ＤＭＡ、１．７６７ｇのＨＥＭＡ、１２ｍｇのＶＡ−４４（重合開始剤）、１ｍＬの水に溶解した２ｍｇのＨＰＴＳ（Ｌｙｓ−ＭＡ）３、および、１ｍＬの水に溶解した１００ｍｇのＢＰ（クエンチャー）を仕込んだ。混合物を全ての物質が溶解するまでボルテックスミキサーにかけた。そして、全体の量が５ｍＬになるまで、ｍｉｌｌｉＱ水を加えた。氷浴につけられる前にセプタムで密閉され、かつ氷浴中にある２５ｍＬの丸底フラスコに溶液を移した。シリンジ針を、窒素ラインに取り付け、そしてフラスコに差し込み、溶液を１５分間脱気した。３ｍＬの脱気した溶液をシリンジを使って取り出し、コルク栓をして、重合チャンバーへの追加のためにドライボックスにおいた。
【０３１２】
（ｂ）単量体混合物の重合
【０３１３】
同時に、重合チャンバーを、従来の方法で準備し、脱気し、ドライボックス中に置いた。アルゴン下、ドライボックス中で、単量体混合物を重合チャンバーに入れた。チャンバーを密閉し、４０℃の真空オーブン中に一晩おいた。１６時間加熱した後、１時間かけて温度を７０℃まで上昇し、その後、チャンバーを真空オーブンから取り出し、大気まで冷やした。冷却後、チャンバーを解体し、フィルムが貼り付けられたガラス板をｐＨ１０の水浴中においた。水浴中で１日置いた後、薄膜をキュベットサイズの片にカットし、そして、ｐＨ７．４緩衝液につけて冷蔵した。
【０３１４】
（ｃ）薄膜化の実行
【０３１５】
薄膜の一片を、溶液は流水式キュベットの内部に差し込んだ。キュベットは、蛍光強度を測定している間、異なる溶液がキュベット内を通過できるように、ラインを有する。ｐＨ７．４緩衝液を薄膜の上を数時間流した後、一定のベースラインが確立された。その後、溶液をｐＨ７．４緩衝液中の９０ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更した。その結果、蛍光強度が１０％増加した。溶液を９０ｍｇ／ｄＬから１８０ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更することにより、さらに、３％蛍光強度が増加した。１８０ｍｇ／ｄＬから３６０ｍｇ／ｄＬに変更することにより、さらに、蛍光強度が２％増加した。最終的には、溶液をｐＨ７．４に戻し、蛍光強度が１０％減少した。
【０３１６】
［実施例４９］
検出ヒドロゲルを有する光ファイバー
【０３１７】
ＰＭＭＡ光ファイバーの組立
【０３１８】
１ｍｍの直径のＰＭＭＡ光ファイバー（Ｓｏｕｔｈ  Ｃｏａｓｔ  Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）を以下のようにして組み立てた。はじめに、ＳＭＡ−９０５（Ｔｈｏｒ  Ｌａｂｓ  部品番号１１０４０Ａ）コネクターに、Ｅｐｏｔｅｃのtwo partエポキシ樹脂を詰め、次に、コネクターを通して、約５ｍｍの光ファイバーがＳＭＡコネクターの反対側で突き出るように、光ファイバーを押すことにより、組み立てられた。ついで、ファイバー／コネクターは、４０℃で１４時間の間、真空オーブン中に置かれた。小さいガラスキャピラリーを、Ｅｐｏｔｅｃのtwo
partエポキシ樹脂で満たし、そして、約５ｍｍの光ファイバーがガラスキャピラリーから突き出るように、光ファイバーの終端を差し込んだ。そして、ファイバーは、４０℃で１４時間の間、真空オーブンにおかれた。ファイバーを真空オーブンから取り出した。ついで、ファイバーの近い端部をかみそりの刃で、ＳＭＡコネクターと同一面に近い位置で切断した。そして、５ミクロンのＡｌｕｍｉｎｕｍ  Ｏｘｉｄｅ  Ｆｉｂｅｒ研磨フィルムでＳＭＡコネクターと接触するまで研磨した。ついで、１ミクロンのＡｌｕｍｉｎｕｍ  Ｏｘｉｄｅ  Ｆｉｂｅｒ研磨フィルムで、バフまで研磨した。遠い端部をかみそりの刃により、ＳＭＡコネクターと同一面に近い位置で切断した。そして、５ミクロンのＡｌｕｍｉｎｕｍＯｘｉｄｅ  Ｆｉｂｅｒ研磨フィルムでＳＭＡコネクターと接触するまで研磨した。ついで、１ミクロンのＡｌｕｍｉｎｕｍ  Ｏｘｉｄｅ  Ｆｉｂｅｒ研磨フィルムで、バフまで研磨した。ファイバーの近い端部と遠い端部をイソプロパノールで洗い、そして、最終的に、所定の空気をブローして清浄および乾燥させた。
【０３１９】
［ヒドロゲルの準備］
ＢＢＶＢＰおよびＨＰＴＳ（ＬｙｓＭＡ）３を含む０．００１インチの検出ヒドロゲルは、実施例４８に述べているように準備した。
【０３２０】
［光ファイバーへのヒドロゲルの取り付け］
ＰＭＭＡ光ファイバーの終端に、少量のＶｅｔＢｏｎｄＴＭ（３Ｍ）が塗布された。その後、ＰＭＭＡ光ファイバーの終端を、金属スパチュラ上に置かれている検出ヒドロゲルと接触させた。
６０秒後、ファイバーは、検出ヒドロゲルが付着して、スパチュラから持ち上げられた。その後、検出ヒドロゲルは、かみそりの刃でＰＭＭＡ光ファイバーと同じ直径になるようにトリムされた。図１５および図１６を参照されたい。
【０３２１】
ガラス貫流セルが使用された。注入口は、パラフィルムに覆われたゴム製のセプタムを通りぬけて突き出ている小さい直径のＴＹＧＯＮ管を有する。排出口は、直接ガラスアームの上に配置された大きい直径のＴＹＧＯＮチューブを有する。検出ヒドロゲルが添加されたファイバーは、プラスティックキャップ中のゴム製ガスケットを突き出ていた。これは、ガラス貫流セルに取り付けられていた。ガラスセルと管の容量は１２０ｍＬであった。アクアリウム封止剤を、ファイバーがキャップを突き出たところを密封するように使用した。溶液は、Ｍａｓｔｅｒ  ｆｌｅｘ  蠕動ポンプを用いて、１４ｍＬ／分の速度で循環させた。
【０３２２】
［グルコース反応蛍光時間分析］
励起源は、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃ  ＳＦ２０００装置中に取り付けられた青色発光ダイオードであった。検出器もまた、Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃＳＦ２０００に取り付けられていた。Ｃａｌａｍｅｔフィルターの一片が、検出器につながるＳＭＡコネクターに置かれた。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃ  ＳＦ２０００は、ＵＳＢ２０００を介してラップトップコンピューターに取り付けられている。ガラスに分岐したケーブルが、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃ装置に取り付けられている。ＰＭＭＡ光ファイバーの終端が、ガラス光ファイバーの遠い端部に取り付けられている。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃ装置は、発光の捕獲のために、以下のように設定されている。Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ＝１０００ｍｓｅｃ．；Ａｖｅｒａｇｅ＝５；Ｂｏｘｃａｒ＝２５；Ｆｌａｓｈ  Ｄｅｌａｙ＝Ｉｍｅｓｅｃ；ストロボランプ／使用の確認；電気的暗闇の収集の確認；発光を５４６ｎｍで観測。初めに、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を計算した。６０４８７秒のときに、２０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中）溶液（１４０ｍＬ）をポンプで通した。その後、再循環させ、蛍光シグナルの１１％の強度の増加を得た。図１５に示すように、６７８７４秒のとき、ｐＨ７．４リン酸緩衝液（１４０ｍＬ）をポンプで通し、そして、再循環させ１１％のシグナルの蛍光シグナルの減少を得た。図１６は、図１５と類似しており、そして異なるグルコース濃度のサンプルの秒で示す時間に対するグルコース応答を示す。
【０３２３】
［実施例５０］
[３，３’]ビピリジニル‐５‐カルボニトリル
【０３２４】
５０ｍＬの炉乾燥された、還流器を備えた枝付丸底フラスコに、５−ブロモ‐３−シアノピリジン（２．２ｇ，１２ｍｍｏｌ），３−ピリジンボロン酸（１．２３ｇ，１０ｍｍｏｌ）および無水１Ａ−ジオキサン（１０ｍＬ）をアルゴン下で仕込んだ。そして、脱気したＮａ２ＣＯ３（２Ｍ，１０ｎｍL）をシリンジを介して加えた。混合物を強く攪拌しながら、Ｐｄ（ＯＡｃ２）（０．１１ｇ，０．５ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ３（０．５２ｇ，２ｍｍｏｌ）の添加に引き続いて、反応フラスコは、その後、５アルゴン／真空ｂａｃｋ−ｆｉｌｌサイクルを使用して脱気され、９５℃で２時間攪拌された。大気温度まで冷却した後、水（４０ｍL）を加え、そして、エチルアセトンで反応液を抽出した（３×１００ｍL）。化合した有機物をブラインで洗浄し（２×７５ｍＬ），硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル（１０％のトリエチルアミンで処理済み）ジクロロメタン中２０％のエチルアセトンを用いてクロマトグラフィし、０．６ｇの白い固形物を得た（収率：３４％）。
【化６３】
2009519053.tif 000076
【０３２５】
［実施例５１］
Ｃ−[３，３’]ビピリジニル‐５‐イル‐メチルアミン
【０３２６】
メタノール（２０ｍＬ）中、ＣｏＣｌ２（０．８６ｇ，６．６ｍｍｌ）を含む溶液に、ＮａＢＨ４（１．２５ｇ，３３ｍｍｏｌ）を加え、Ｈ２の発生を伴う発熱反応が生じた。反応液を１０分間攪拌し、そして、形成された黒い沈殿物をろ別し、メタノールで洗浄して、空気乾燥した。黒い固体をメタノール（４０ｍＬ）中に[３，３’]ビピリジニル‐５‐カルボニトリル（０．６ｇ，３．３ｍｍｏｌ）を懸濁させた懸濁液に加えた。０℃まで冷却した後、ＮａＢＨ４（１ｇ）加え、反応液を室温で１２時間攪拌した。その後、３ＭＨＣｌ（２００ｍＬ）を添加し、メタノールを減圧下で除去した。そして、酸性の水層は、エーテル（１００ｍＬ）で洗浄され、濃縮ＮａＯＨで中和された。その後、エチルアセテートで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し黄色のオイルを得た（０．１５ｇ）。
【０３２７】
［実施例５２］
Ｎ−[３，３’]ビピリジニル‐５‐イルメチル‐２メチル‐アクリルアミド
【０３２８】
冷却された、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中、Ｃ−[３，３’]ビピリジニル‐５‐イル‐メチルアミン（１．１６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を含む溶液に、メタクリロイルクロライドを滴下する。室温で、７時間攪拌した後、反応を１ＭＮａＯＨでクエンチされた。そして、ジクロロメタンで抽出した（２×１００ｍＬ）。抽出物をあわせた有機物を飽和ＮａＨＣＯ３、ブライン、洗浄され、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。そして、黄色のオイル（１．６５ｇ）を得た。これをシリカゲル（１０％トリエチルアミンで前処理済み）で、ジクロロメタン中のメタノール勾配（０-３％）を用いてクロマトグラフィをした。その結果、０．７６ｇの透明なオイルが得られた。
【０３２９】
［実施例５３］
Ｐ３，３’−ＯＢＢＮの合成
【０３３０】
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中、Ｎ−[３，３’]ビピリジニル‐５‐イルメチル‐２メチル‐アクリルアミド（０．１５ｇ、０．５９）を含む溶液に、ｏ‐ブロモメチルフェニルボロン酸（０．２９ｇ，１．３６ｍｍｌ）を加え、反応液を５５℃で４８時間攪拌した。室温まで冷却した後に、沈殿物を生じさせるために、黄色い水溶液にアセトン（１００ｍＬ）を加えた。白い固体が遠心分離により収集され、アセトンで洗い、アルゴン流下で乾燥させた。その結果、０．１ｇの生成物が得られた（収率２５％）。
【０３３１】
［実施例５４］
Ｐ３，３’−ｏＢＢＶおよびＡＰＴＳ−Ｌｙｓ‐ε‐ＭＡを含むヒドロゲル
【化６４】
2009519053.tif 000077
【０３３２】
Ｎε‐メタアクリロイル‐（Ｓ）‐リジン（２７）  水（８０ｍＬ）中にリジン一塩酸塩（８．０ｇ,４３．６ｍｍｏｏｌ）,ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（５．４６ｇ,２１．８ｍｍｏｌ）,ＮａＯＨ（３．６ｇ,９０ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（４．６ｇ,４３．６ｍｍｏｌ）を含み、０℃に冷却した溶液に、メタアクリロイルアミド（４．８ｍＬ,５０ｍｍｏｌ）をシリンジを介してゆっくり加えた。反応液を室温で２時間攪拌した。その結果得られた青い沈殿物をろ過し、水、アセトン、エーテル、そして再び水で洗浄した。空乾した後、青紫色の固体（２６）をイオン交換により精製した。具体的には、４０ｍＬのＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８−４００樹脂を１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（１００ｍＬ）で処理し、懸濁液をカラムの上に注ぎこみ、そして、濃ＮＨ４ＯＨで洗った。銅錯体（２６）を、濃ＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、カラムの上に注ぎこんだ。そして、５００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨで抽出した。溶液は、真空中で抽出され、高真空中で乾燥させ、精製された白い固体２７を得た（５．５ｇ,６０％）。
【化６５】
2009519053.tif 000078
【０３３３】
ＡＰＴＳ−Ｃｌ（３１）  乾燥した５０ｍＬの還流器を備えた枝付丸底フラスコに、アルゴン下で１‐アミノピレン（０．５０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を仕込んだ。透明な茶色の溶液に、クロロスルホン酸（２ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）をシリンジを介して滴下し、反応液を１６時間還流した。室温まで冷却した後、反応混合物は、クラッシュされた氷の入ったビーカーに注がれた。赤色の水溶液（固体を含む）を、ＣＨ２Ｃｌ２で何回か抽出し、すべてのＣＨ２Ｃｌ２部分（琥珀色）をあわせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過した、そして、暗赤色の固体として、３１が得られるよう濃縮した（０．４７ｇ,４０％）。
【化６６】
2009519053.tif 000079
【０３３４】
ＡＰＴＳ−Ｌｙｓ−ε‐ＭＡ（３２）  ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中に、３１（０．４７ｇ,０．９２ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ＣＨ３ＯＨ（２０ｍＬ）中に、Ｎε‐メタアクリロイル‐（Ｓ）‐リジン（０．６３ｇ,２．９ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（０．２３ｇ,５．５ｍｍｏｌ）を含む溶液を添加した。塩基性のリジンを添加したとき、透明な琥珀色の液体が緑がかり、そしてオレンジ色の沈殿物が形成された。この異種混合液を１６時間攪拌し、ろ別し、ＣＨ２Ｃｌ２で数回洗浄した。減圧下で乾燥した後、３２がオレンジ色の固体としてえられた（０．６３ｇ,９５％）。
【０３３５】
［Ｐ３，３’−ｏＢＢＶおよびＡＰＴＳ−Ｌｙｓ‐ε‐ＭＡを含むヒドロゲル］
１ｍＬの容量フラスコ中に、ＨＥＭＡ（３５４ｍｇ,２．４５ｍｍｏｌ）,ＰＥＧ-ＤＭＡ（ｍｗ＝１０００,１１１ｍｇ,０．１１１ｍｍｏｌ），ＳＰＭ（２８ｇ，０．１１４）、ＡＰＴＳ−Ｌｙｓ−ε‐ＭＡ（０．０１Ｍ溶液を０．２ｍＬ，０．００２ｍｍｏｌ）、Ｐ３，３’−ｏＢＢＶ（０．０１４ｇ，０．０２ｍｍｏｌ），ＶＡ−０４４（２．４ｍｇ，０．００７４ｍｍｏｌ）を加えた。４０℃で２４時間、重合した。図１８を参照されたい。
【０３３６】
Ｐ３，３’−ｏＢＢＶの構造は下記の通りである。
【化６７】
2009519053.tif 000080
【０３３７】
［Ｐ３，３−ｏＢＢＶを用いた観察］
Ｐ３，３’−ｏＢＢＶの水溶液は、長い期間（数時間）紫外線（２５４ｎｍまたは３６５ｎｍ）にさらされたときであっても、無色を維持していた。しかしながら、Ａ４，４’−ｏＢＢＶ誘導体は、同じ条件下でピンク色に変色することが観測された。
【０３３８】
Ｐ３，３’−ｏＢＢＶを含むヒドロゲルおよび重合可能な色素は、上記条件にさらされ場合に、変色しなかった。４６７ｎｍ（アルゴンレーザー）継続した照明にさらされた場合であっても、また、変色しなかった。
【０３３９】
［実施例５５］
ＡＰＴＳ−ＢＵＭＡの合成
【化６８】
2009519053.tif 000081
【０３４０】
［Ａ．化合物１の合成］
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中に、１，４‐ブタンジオール（５．３３ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）およびピリジン（３０ｍＬ）を含み、０℃に冷却された溶液に、メタアクリロイルクロライド（５．８６ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応液を室温で、２時間攪拌した。そして、１ＭＨＣｌ（５０ｍＬ）で反応を終了させ、ついで、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。抽出したＤＣＭ（ジクロロメタン）層の全てを３ＭＨＣｌで洗浄した（ＤＣＭ−３×１００ｍＬ）。そして、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮することでピンクオイルをえた。ピンクオイルを、シリカゲルでヘキサン／エチルアセテート（６：４）を用いクロマトグラフィをして、３．７ｇの精製された透明のオイルを得た（収率４０％）。
【０３４１】
［Ｂ．化合物２の合成］
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中、化合物１（３．７ｇ，２３ｍｍｏｌ）を含む溶液を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中、ピリジニウムクロロクロメート（７．４ｇ，３４．５ｍｍｏｌ）およびセリット（５ｇ）を含む懸濁液に加えた。反応液を４時間室温で攪拌した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）＿を加え、反応液は、セリットを介してろ過した。暗褐色のろ物を濃縮し、黒いオイルをえた。そして、それらは、シリカゲルで、１００％ジクロロメタンを用いて、クロマトグラフィをした。その結果、２ｇの透明なオイルを得た（収率５６％）。
【０３４２】
［Ｃ．ＡＰＴＳ−ＢｕＭＡの合成］
乾燥させたメタノール（２０ｍＬ）中に、８−アミノピレントリスルホン酸三ナトリウム塩（ＡＰＴＳ）（０．６ｇ，１．１５ｍｍｏｌ）を含む溶液中に、化合物２（０．１８ｇ，１．１５ｍｍｏｌ）および氷酢酸（１ｍＬ，１７ｍｍｏｌ）を加えた。乾燥したメタノール（１０ｍＬ）中に水素化シアノホウ素ナトリウム（０．３ｇ，４．７ｍｍｏｌ）を含む溶液をその後加え、室温で一晩中攪拌した。出発物質と生成物質は、ＴＬＣにより観測されたため、反応物を５５℃で４時間加熱した。反応混合物は濃縮され、結果的に得られた残留物を最小の水に再溶解し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィにより生成した（イソプロパノール／アンモニウムヒドロオキサイド９：１から３：１勾配）。０．１５ｇ（収率２０％）のオレンジ色の粉末が単離された（種々のＡＰＴＳ誘導体が、国際公開公報ＷＯ２００４／０２７３８８号に述べられている）。
【０３４３】
［実施例５６］
ＡＰＴＳ−ＤＥＧＭＡの合成
【化６９】
2009519053.tif 000082
【０３４４】
［Ａ．化合物３の合成］
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に、ジエチレングリコールモノメタクレート（４ｇ，２３ｍｍｏｌ）を含む溶液を、ジクロロメタン（４０ｍＬ）中に、ピリジウムクロロクロメート（７．４ｇ，３４．５ｍｍｏｌ）およびセリットを含む懸濁液に加えた。反応物は、室温で１時間攪拌された。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）が加えられ、反応物は、セリットを介してろ過された。暗褐色のろ液を黒いオイルになるまで濃縮した。そして、黒いオイルは、その後、シリカゲルでジ黒メタン中、０％から５％のエチルアセテートを使用して、クロマトグラフィされた。その結果、１．４ｇの明るい緑色のオイルを得た（収率３６％）。
【０３４５】
［Ｂ．ＡＰＴＳ−ＤｅｇＭＡの合成］
乾燥したメタノール（１０ｍＬ）中に、８−アミノピレントリスルホン酸三ナトリウム塩（ＡＰＴＳ）（０．２３ｇ，０．４４ｍｍｏｌ）を含む溶液に、化合物３（０．３ｇ，１．７７ｍｍｏｌ）および氷酢酸（０．４ｍＬ，６．６ｍｍｏｌ）を加えた。乾燥したメタノール（１０ｍＬ）中に水素化シアノホウ素ナトリウム（０．１２ｇ，１．７７ｍｍｏｌ）を含む溶液をその後加え、反応物を５０℃で２時間攪拌した。反応混合物は、濃縮され、その結果えられた残留物は、最小量のメタノールに溶解され、そして、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィにより生成された。オレンジ色の粉末０．１４５ｇが単離された（収率４８％）。
【０３４６】
［実施例５７］
１ＭＡ−ＢＰの合成
【化７０】
2009519053.tif 000083
【０３４７】
上記は、１−ＭＡＢＰの合成手順を示し、ジピリジルユニットに、一の重合可能基がついている。ＭＡＢＰは、２つの重合可能基を有する。化合物１１をステップｄで使用しない以外は、同じ方法で合成される。かわりに化合物９のユニット２は、ＭＡＢＰを形成するためにジピリジルユニットと結合している。
【０３４８】
［Ａ．化合物７の合成］
５００ｍＬの還流器を備えた枝付丸底フラスコに、３，５−ジメチルフェニルボロン酸（１０．５ｇ，７０ｍｍｏｌ）、カルシウムヒドリド（５．９ｇ，１４０ｍｍｏｌ）およびジクロロエタン（３００ｍＬ）を加えた。アルゴン下で十分間攪拌した後、１，３−プロパンジオール（５．６ｍＬ，７７ｍｍｏｌ）をシリンジを介して加えた。反応物を１．５時間還流した後、室温まで冷却した。透明なろ液をＮ−ブロモスクシンイミド（２７．４ｇ、１５４ｍｍｏｌ）および２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（２．３ｇ，１４ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流した。オレンジの溶液を一晩（〜１６時間）放置し、そして、形成されたコハク酸エステルの結晶をろ過して取り除いた。ろ液を濃縮し、オフホワイトの分厚い固体が得られるまで乾燥した。そして、それは、メタノール（ｃａ．３００ｍＬ）で再結晶され、１１ｇ（収率４６％）の精製された化合物７を得た。
【化７１】
2009519053.tif 000084
【０３４９】
［Ｂ．化合物８の合成］
メタアクリロイルクロライド（６．７ｍＬ，６９．６ｍＬ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中に、４−（２−アミノエチル）ピリジン（７．０ｍＬ，５８ｍｍｏｌ）を含み、冷却された（−１０℃）溶液に加えた。そして、反応物を室温で１６時間攪拌した。飽和Ｎａ２ＣＯ３（２００ｍＬ）を加え、有機層を分離した。水溶液をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出し、そして、有機層を合わせ、１ＭＮａＯＨで洗浄し（２×１００ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてオレンジオイルとして生成物が得られるまで濃縮した（７．０ｇ，６３％収率）。精製は、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（９：１）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィで行い、透明なオイルを得た。
【化７２】
2009519053.tif 000085
【０３５０】
［Ｃ．化合物９の合成］
化合物８（１．３ｇ，６．８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３７０ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（１８０ｍＬ）中に化合物７（９．５ｇ，２７．３ｍｍｏｌ）を含む溶液に加え、反応物を４０℃で２０時間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を真空中で除去し、メタノールにより沈殿した過剰の化合物７をろ過により取り除き、氷冷したメタノールで洗浄した。ろ液を、ｃａ．２０ｍＬまで濃縮し、アセトン（ｃａ．３０ｍＬ）を加え、その後、濁りが生じるまでエーテルを添加した。−４℃で２４時間保存したことにより、白い沈殿物が生じ、これを遠心分離により回収し、アセトンで複数回洗浄した。そしてアルゴン下で乾燥し、０．９１ｇの精製された化合物９（収率３３％）を得た。
【化７３】
2009519053.tif 000086
【０３５１】
［Ｄ．化合物１０の合成］
ＣＨ２Ｃｌ２（３７０ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（１８０ｍＬ）中に化合物７（９．７３ｇ，２８ｍｍｏｌ）を含む溶液にピリジン（０．５６ｍＬ，７ｍｍｏｌ）を、加え、反応物を４０℃で２２時間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を真空下で取り除き、メタノールにより析出する過剰の化合物７をろ過により取り除いた、そして、氷冷したメタノールで洗った。ろ液は、約２０ｍＬまで、濃縮され、アセトン（約３０ｍＬ）を加え、その後、濁りが生じるまでエーテルを添加した。−４℃で２４時間保存したことにより、白い針状の結晶が生じた。この固体を遠心分離により回収し、アセトンで複数回洗浄した。そしてアルゴン下で乾燥し、１．３ｇの精製された化合物１０（収率４８％）を得た。
【化７４】
2009519053.tif 000087
【０３５２】
［Ｅ．化合物１１の合成］
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に、化合物１０（０．４ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）を含む溶液に、４，４’−ジピリジル（０．８ｇ，５．２ｍｍｏｌ）を加え、反応物をオイルバスで加熱した。温度が８０℃に達すると（ｃａ５分）、少量の黄色い沈殿物が形成され始める。反応物を、熱ろ過し、綿状の白い沈殿物が形成されるまで、アセトン（約５０ｍＬ）を加えた。沈殿物を遠心分離により回収し、アセトンで複数回洗浄した。そしてアルゴン流下で乾燥し、乾燥された白い固体として精製された化合物１１を得た（０．４１ｇ，７４％収率）。
【化７５】
2009519053.tif 000088
【０３５３】
［Ｆ．１ＭＡ‐ＢＰの合成］
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中で化合物１１（０．８８ｇ，１．６ｍｍｏｌ）超音波分解し、不溶物をろ過により取り除いた。透明な黄色のろ液に、化合物９（０．８ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を７０℃で７２時間攪拌した。結果得られた暗橙色の沈殿物を遠心分離により回収し、ＤＭＦ、アセトンで洗浄し、アルゴン流下で乾燥した。そして精製された１ＭＡ−ＢＰ（０．６５ｇ，４４％収率）を得た。
【化７６】
2009519053.tif 000089
【０３５４】
［実施例５８］
Ｐ２−３，３−ＯＢＢＶの合成
【化７７】
2009519053.tif 000090
【０３５５】
［Ａ．[３，３’]ビピリジニル‐５−カルボキシリックアシッドエチルエステル化合物（４６）］
炉乾燥された、還流器を備えた５０ｍＬの枝付丸底フラスコに、エチル５−ブロモニコチネート（２．７６ｇ，１２ｍｍｏｌ）、３−ピリジンボロン酸（１．２３ｇ、１０ｍｍｏｌ）、および無水１，４−ジオキサン（２５ｍＬ）をアルゴン下で加えた。Ｎａ２ＣＯ３（２Ｍ  １０ｍＬ）の脱気水溶液をシリンジを介して加えて、強く反応物を攪拌した後、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．１１ｇ，０．５ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ３（０．６５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、反応フラスコを５アルゴン／真空ｂａｃｋ−ｆｉｌｌサイクルを使用して脱気し、９５℃で３時間攪拌した。大気温にまで冷却した後、水（５０ｍＬ）を加えた。そして、反応物は、エチルアセテート（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン洗浄し（２×１００ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲル（１０％トリエチルアミンで前処理済み）で、ジクロロメタン中１０％のエチルアセテートを使用してクロマトグラフィをした。その結果、１．０ｇの白い固体を得た（収率４４％）
【化７８】
2009519053.tif 000091
【０３５６】
Ｂ．[３，３’]ビピリジニル‐５−カルボキシリックアシッド化合物（４７）
トリフルオロアセティックアシッド（５ｍＬ）と、ＨＣｌ（７．５Ｍ，５ｍＬ）との混合物に、ジピリジルエチルエステル化合物（４６）（０．７５ｇ，３．３ｍｍｏｌ）を溶解し、そして、１６時間還流した。反応物は濃縮され、黄色の固体を得た。その後、アセトン中に超音波分解され、標記化合物のＨＣｌ塩（塩酸塩）を白い固体として、０．８４ｇ（収率９４％）を得た。
【化７９】
2009519053.tif 000092
【０３５７】
［Ｃ．３，３’‐ジピリジニル  ジアミド化合物（４８）］
ジピリジルカルボキシリックアシッド化合物（４７）（０．８３ｇ，３ｍｍｏｌ）をチオニルクロライドに懸濁させ、４時間還流した。反応混合物は、乾燥させられ、ジクロロメタン（２０ｍＬ）に再溶解し、０℃まで冷却した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）中にＮ−３−（アミノプロピル）メタアクリルアミドヒドロクロライド（０．５４ｇ、３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を含む溶液をその後滴下した。１６時間室温で拡販した後、ＫＯＨ（３Ｍ，１０ｍＬ）が添加された。混合物は、さらなるＤＣＭおよび水で希釈され、そして、ＤＣＭ（２×１００ｍＬ）により水層が抽出された。合わせた有機層をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。そして、黄色のオイルが得られるまで濃縮した。その後、黄色のオイルをシリカゲル（１０％のトリエチルアミンで前処理済み）を用いて、ジクロロメタン中０‐４％メタノール勾配の溶出液を使用してクロマトグラフィをした。その結果、０．５６ｇの白い泡状の物質が得られた（収率５８％）。
【化８０】
2009519053.tif 000093
【０３５８】
［Ｄ．Ｐ２‐３，３’−ｏＢＢＶ］
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中、化合物４８を含む溶液に、ｏ−モノメチルフェニルボロン酸（０．２９ｇ，１．３６ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応液を５５℃で７２時間攪拌した。室温まで冷却した後、沈殿物を生じさせるために、アセトン（５００ｍＬ）を黄色の溶液に加えた。白い沈殿物は、遠心分離により集められ、アセトンで洗浄され、アルゴン流下で乾燥した。その結果、３ｇの生成物がえられた（収率６７％）。
【０３５９】
［実施例５９］
ヒドロゲル合成およびグルコース反応
【０３６０】
［Ａ．１ＭＡＢＰおよびＡＰＴＳ−ＢｕＭＡを含むヒドロゲル］
１ｍｌの容量フラスコ中に、ＨＥＭＡ（３５４ｍｇ，２．４５ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＤＭＡ（ｍｗ＝１０００，１１１ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）、ＳＰＭ（２８ｍｇ、０．１１４）、ＡＰＴＳ−ＢｕＭＡ（０．０１Ｍ溶液を０．２ｍＬ、０．００２ｍｍｏｌ）、１ＭＡＢＰ（０．０２１ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、ＶＡ−０４４（２．４ｍｇ、０．００７４ｍｍｏｌ）を仕込んだ。混合物は、４０℃で２４時間、実施例４０に記載と同様のモールドと、手順に従って重合された。このようにして得られたヒドロゲルフィルムのグルコース反応は、実施例４に記載のように測定された。
【０３６１】
［Ｂ．Ｐ２−３，３−ｏＢＢＶおよびＡＰＴＳ−ＤｅｇＭＡを含むヒドロゲル］
１ｍｌの容量フラスコ中に、ＨＥＭＡ（３５４ｍｇ，２．４５ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＤＭＡ（ｍｗ＝１０００，１１１ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）、ＳＰＭ（２８ｍｇ、０．１１４）、ＡＰＴＳ−ＤｅｇＭＡ（０．０１Ｍ溶液を０．２ｍＬ、０．００２ｍｍｏｌ）、Ｐ２−３，３−ｏＢＢＶ（０．０３０ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、ＶＡ−０４４（２．４ｍｇ、０．００７４ｍｍｏｌ）を仕込んだ。混合物は、４０℃で２４時間、実施例４０に記載と同様のモールドと、手順に従って重合された。このようにして得られたヒドロゲルフィルムのグルコース反応は、実施例４に記載のように測定された。結果を図２１．Ａおよび図２１．Ｂに示す。グルコース反応は、図２２．Ａおよび図２２．Ｂに示す。      
【０３６２】
［実施例６０］
量子ドットベースのグルコースセンサー
【０３６３】
検出ヒドロゲルは、重合体色素粉末がカルボキシ化された量子ドット（Ｅｖｉｄｅｎｔｔｅｃｈ  ｏｆ  Ｔｏｒｙ，ＮＹの“Ｆｏｒｔ  Ｏｒａｎｇｅ”ＣｄＳｅコアシェルＱＤｓおよびクエンチャーポリマーが、等量のＰ３，３’−ｏＢＢＶ（実施例５３参照）に変更された以外は、上述の実施例１４と同様の方法で準備される。この検出ヒドロゲルは、このようにして、６０４ｎｍで観測される蛍光放射の増加を示す。１００ｍｇ／ｄＬ、ｐＨ＝７.４のグルコース溶液と接触したとき、そして、４６２ｎｍで励起される。
【０３６４】
［実施例６１］
ポリビオロゲンボロン酸クエンチャーの合成
（ポリ４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（１，３−キシレン‐５−ボロン酸）ビピリジニウム  ジブロマイド）
【化８１】
2009519053.tif 000094
【０３６５】
磁気攪拌子を備え、炉乾燥された５０ｍＬの丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、３，５−ビス−ブロモメチルフェニルボロン酸（１．５４ｇ，５ｍｍｏｌｓ）および、４，４−ジピリジル（０．７８１ｇ、５ｍｍｏｌｓ）を仕込んだ。フラスコをセプタムで密閉し、メタノール（２５ｍＬ）を仕込んだ。ついで、均一溶液を、５５℃で２４時間加熱した。混合物は、室温まで冷やされ、エーテル（約１００ｍＬ）内に注入された。黄色沈殿物が形成された。固体を遠心分離し、ついで、エーテルで洗浄した(５０ｍＬ×５）。固形物をアルゴン下で１２時間乾燥し、その後、真空乾燥した（０．１Ｔｏｒｒ、１ｈ）。収率：１．４９ｇ（６４％）。
【０３６６】
手順Ａにより作られた、ポリビオロゲンクエンチャーとヒドロキシピレントリスルフォニックアシッドのＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットは、非直線であり、静的または動的クエンチの双方を示した。計算された見かけのスターンウォリメルクエンチ定数は、それぞれ、Ｋｓｖ＝１９２０６ｖ（静的）およびＶ＝８２７５３（動的）であった。
【０３６７】
［実施例６２］
ビス‐ビオロゲン単量体ｓ[Ｐ−ＢＯＢ]の準備
１，１”−メタクリルアミド‐３，５−キシレン  ビス（１’−ベンジルボロン酸‐４，４’−ビピリジニウム  ジブロマイド）
【化８２】
2009519053.tif 000095
【０３６８】
メチルジクロライド（１００ｍＬ）中に、１（４５ｍｍｏｌｓ、９．４１ｇ）を含む懸濁液を０℃まで冷却し、メタクリロイルクロライド（５０ｍｍｏｌｓ、４．８９ｍＬ）をアルゴン下で滴下した。ＮＥｔ３（５０ｍｍｏｌｓ、６．９７ｍＬ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。反応は、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％メタノール）で監視した。溶液を、ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、そして、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶液をろ過し、シリカゲル（２０ｇ）をろ液に加えた。溶液は真空中で濃縮され、そして、シリカゲルカラムの上に、ドライロードした。ヘキサン中２０〜３５％のＥｔＯＡｃで勾配溶出した。その結果、７．００８ｇの２が白い固体として得られた。
【化８３】
2009519053.tif 000096
【０３６９】
ＬｉＮ（ＣＨ３）２ＢＨ３の溶液（１．０ＭＴＨＦ溶液、３７．５ｍＬ）を室温で攪拌しつつ、ジエステル２（７．５ｍｍｏｌｓ、２．０７ｇ）を全て一度に加えた。混合物は、１８時間攪拌し、そして、３ＭＨＣｌ  ７．５ｍＬで反応を終了させ、ｐＨ１０にするために３ＭＮａＯＨを用いた。混合物は、ＥｔＯＡｃで抽出され、ブラインで洗浄され、そして、ＭｇＳＯ４で乾燥させられ、真空中で濃縮させられた。残留物を、熱メタノール（２ｍＬ）中で溶解し、ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）で希釈した。そして、シリカゲルカラムの上に積んだ。ＣＨ２Ｃｌ２中、２から２０％のメタノールで勾配溶出をした。そして、放置の上、固化された黄色のオイルとして、０．８４０３ｇの３を得た。
【化８４】
2009519053.tif 000097
【０３７０】
０℃で、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の、ジオール３（３．８ｍｍｏｌｓ、０．８４０３ｇ）を、メチルクロライド（８．３６ｍｍｏｌｓ、０．６４７ｍＬ）およびＮＥｔ３（８．３６ｍｍｏｌｓ、１．１７ｍＬ）で処理し、そして、３０分間攪拌した。溶液は、同量のＥｔＯＡｃで希釈され、ＮＥｔ３塩はろ過により取り除かれた。そして溶液を、真空中で濃縮した。オイルをＣＨ２Ｃｌ２中で溶解し、そして、シリカゲルカラムの上に積んだ。ヘキサン中、１２％から１００％のＥｔＯＡｃを用いた勾配溶出により、１．２４２ｇのメシラート４を白い固体として得た。
【化８５】
2009519053.tif 000098
【０３７１】
ＤＭＦ中で、化合物５（０．５９９ｍｍｏｌｓ、０．２２２ｇ）と、メシラート４（０．２９９ｍｍｏｌｓ、０．１１３ｇ）とを５５℃で１８時間共に攪拌した。アセトン（３０ｍＬ）を沈殿物を生じさせるために加え、そして、物質をアセトンで洗浄した。そして真空下で乾燥し、黄色の固体である０．３１１ｇのメタ‐ｐＢＯＢ（６）を得た。
【化８６】
2009519053.tif 000099
【０３７２】
［実施例６３］
ＡＰＴＳ−ＤＥＧＭＡ：Ｐ−ＢＯＢ（０．００５”）ヒドロゲルの合成
【０３７３】
４ｍＬのシンチレーションバイアルに、０．４００ｇのＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＭＡ）、８．２ｍｇのＮ，Ｎ’−メチレン‐ビスアクリルアミド、１．３ｇのＡＰＴＳ−ＤｅｇＭＡＥｘ．５６、０．６００ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水、１滴の濃塩酸、１１．５ｍｇのＰ−ＢＯＢ、１．４ｍｇのＶＡ−０４４（重合開始剤）を仕込んだ。混合物は、全ての固体が溶解するまで、ボルテックスに配置され、バイアルの端部には、アルゴンをパージするための真空アダプターが取り付けられている。溶液をアルゴン下、ドライアイスのアセトン浴中で冷凍した。そして、重合溶液の脱気のために冷凍‐ポンプ‐解凍のサイクルを３回繰り返した。
【０３７４】
脱気プロセス中に、重合チャンバーを組み立てた。ガラスプレートは、洗剤および水で洗浄され、続いてエタノールでリンスした。その後、プレートは、トルエン中に２％ｖ/ｖのジクロロジメチルシランの溶液で処理され、ヘキサンでリンスされた。そして、モールドは、０．００５”ＴＥＦＬＯＮ（商標）スペーサーで組み立てられ、一定のアルゴン流下に配置された。
【０３７５】
三回目の解凍の後に、高分子溶液を含むバイアルに、アルゴンを通気し、ゴムのセプタムが取り付けられた。ついで、高分子溶液は、シリンジで取り出され、針が取り除かれる。そして、シリンジを、重合チャンバーに取り付けた。その後、溶液は、アルゴン下でキャビティの圧力を一定に保つため、プッシュプル法により、完全に空洞を満たすように重合モールドに装着された。チャンバーは、ゴムのセプタムで密閉され、そして、アルゴンで満たされたジッパー付のバッグに入れられた。ユニット全体を３３℃のオーブンに移動した。４８時間後、重合チャンバーは、オーブンから取り出され、そして、室温まで温度を下げ、チャンバーを分解し、ゲルを２４時間、リン酸緩衝液に浸した（イオン強度０．１）。その後、ヒドロゲルの一片を切断し、そして、貫流キュベットの上に配置した。
【０３７６】
還流設備は、蛍光光度計（実施例１２参照）に類似しており、定温浴に浸されたコンデンサーを介して３７℃に加熱されたｐＨ７．４のリン酸緩衝液（イオン強度０．１）を循環するために使用されている。励起源は、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＳＦ２０００装置中に収納されている青色ＬＥＤであり、そして、積分時間を２０００ｍｓｅｃに設定し、５３２ｎｍで観測したときに、初期強度の読み出しが９０カウントであった。発光ベースラインは、緩衝液を一晩中循環することにより確立された。その後、緩衝液は、ｐＨ７．４の２５ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液に変更され、そして、３８％の変更に対応して、強度が１２４カウントまで上昇した。グルコース溶液を、５０ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更し、１７％のさらなる蛍光強度の増加があった。ついで、グルコース溶液を、ｐＨ７．４の１００ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更し、その結果、蛍光強度が１５％増加した。ついで、ｐＨ７．４の２００ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更し、その結果、蛍光強度が１３％増加した。ついで、ｐＨ７．４の４００ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更し、その結果、蛍光強度が、さらに１０％増加した。ついで、グルコース溶液を、ｐＨ７．４緩衝液に変更し、その結果、蛍光強度を９６強度カウントにまで減少した。緩衝溶液は、その後、ｐＨ７．４緩衝液の１００ｍｇ／ｄＬグルコース溶液に変更された。その結果、７０％の蛍光強度の増加があった。相対的な強度の変化を時間の関数として（図２３参照）、および、グルコース濃度を関数としてプロットした（図２４参照）。
【０３７７】
［実施例６４］
ポリビオロゲンボロン酸クエンチャーのみかけのグルコース結合定数の決定
【０３７８】
［ポリビオロゲンクエンチャーの結合定数］
０．０２９ｇの１をｐＨ７．４のリン酸緩衝液（イオン強度０．１）に溶解することにより、１の原液（１ｍＬ、０．００６２５Ｍ（モノマー単位）を１−ｍＬの容量フラスコに準備した。１．８０３ｇのグルコースをｐＨ７．４のリン酸緩衝液（イオン強度０．１）に溶解することにより、グルコースの原液（１０ｍＬ、１．００Ｍ）を１０ｍＬの容量フラスコに準備した。２ｍＬのＨＰＴＳ色素（４×１０−６Ｍ）および５μＬの１の原液（０．００６２５Ｍ）を有する蛍光キュベットが使用され、グルコースの原液（１Ｍ）での滴定が下記表６に従って滴定した。
【表１２】
2009519053.tif 000100
【０３７９】
ついで、各サンプルは、順番に適切な励起波長（４６０ｎｍ）および発光波長（５１０ｎｍ）に設定された分光光度計で分析された。そして、機器設定（スリット幅、スキャン速度、光学フィルタ、励起波長、発光波長幅）は、サンプルシリーズの分析を通して一定に維持されていた。発光蛍光強度は、その後、台形法則の近似法により発光波長範囲の全体にわたっての蛍光強度を積分として得られた。ポリビオロゲンクエンチャーおよびｐＨ７．４の水溶液緩衝液中のＨＰＴＳを含む検出システムのグルコース応答を図２５に示す。
【０３８０】
積分値をｙ軸、グルコース濃度をｘ軸としてプロットし、そして、得られた線の勾配をグルコース結合定数の直線回帰により計算した。当業者は、結合定数に基づくならば、プロットは直線関係にならないということに気がつくだろう。しかしながら、当業者に知られ、また理解されている適切な数学的関係の使用を通して、見かけの結合定数が計算される。このクエンチャーの計算された値は、２２１Ｍ−１である。
【０３８１】
ここでは、本発明のほんのわずかな実施形態について述べているが、当業者にとって、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の改良および変更を、グルコースセンサー、およびフルオロフォア、クエンチャー、有機被分析物を含むポリヒドロキシルを監視する、光学的高分子マトリクス、を含むその構成要素に、加えることができることは明らかである。添付の請求項の範囲でなされるこのような改良および変更がなされることがここでは意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３８２】
【図１．Ａ】（８−ヒドロキシピレン  −  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス−  （メトキシポリエトキシエチル（ｎ〜１２５）  スルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）の構造式を示す。
【図１．Ｂ】８−アセトキシピレン−  １，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”−トリス−  （メタクリルプロピルアミドスルホンアミド）  （アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）の構造式を示す。
【図１．Ｃ】８−ヒドロキシピレン−１，３，６−Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ”  −トリス−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）の構造式を示す。
【図２．Ａ−２．Ｇ】ジハロゲン塩としてのクエンチャーＱ１の構造の概略図である。
【図２．Ａ】トランス−１，  ２−ビス（４，４‘−Ｎ，  Ｎ’−（ベンジル−４−ボロン酸）−ピリジニウム）エチレンジブロマイドを示す。
【図２．Ｂ】１，７−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−３−ボロン酸）−フェナントロリニウムジブロマイドを示す。
【図２．Ｃ】比較クエンチャーである、ベンジルビオロゲン（ＢＶ）を示す。
【図２．Ｄ】４，４‘−Ｎ，Ｎ’−ビス−（ベンジル−２−ボロン酸）−ジピリジニウムジブロマイド（οＢＢＶ）を示す。
【図２．Ｅ】４，４‘−Ｎ，Ｎ’−ビス−（ベンジル−３−ボロン酸）−ジピリジニウムジブロマイド（ｍＢＢＶ）を示す。
【図２．Ｆ】４，４‘−Ｎ，Ｎ’−ビス−（ベンジル−４−ボロン酸）−ジピリジニウムジブロマイド（ｐＢＢＶ）を示す。
【図２．Ｇ】Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル−２、３、または４）−ボロン酸−４，７−フェナントリニウムハロゲン（４，７−フェン−ｏ、ｍ、またはｐ−ＢＢＶ）を示す。
【図３．Ａ】は非対象グルコース応答ビオロゲンを示し、
【図３．Ｂ】から、
【図３．Ｉ】は  クエンチャー前駆体の構造の概略図である。
【図３．Ａ】４−Ｎ−（ベンジル−２−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル）−ジピリジニウムブロマイドクロライドを示す。
【図３．Ｂ】４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライド（ｍ−ＳＢＢＶ）を示す。
【図３．Ｃ】４−Ｎ−（ベンジル−２−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライド（ｏ−ＳＢＢＶ）を示す。
【図３．Ｄ】４−Ｎ−（ベンジル−４−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）−ジピリジニウムブロマイドクロライド（ｐ−ＳＢＢＶ）を示す。
【図３．Ｅ】トランス１，２−ビス−４−Ｎ−（ベンジル−４−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−（ベンジル−４−エテニル）ジピリジニウム−４−エチレンジブロマイドを示す。
【図３．Ｆ】４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４‘−Ｎ’−  （ベンジル−３−エテニル）−３フェナントロリニウムジブロマイドを示す
【図３．Ｇ】４，４‘−Ｎ，Ｎ−ビス−［ベンジル−（３−メチレン−４−ビニル−ピリジニウムブロマイド）−５−（ボロン酸）］−ジピリジニウムジブロマイド）（ｍ−ＢＢＶＢＰ）を示す。
【図３．Ｈ】４−Ｎ−（ベンジル−３−（ボロン酸）−７−ｎ−［ベンジル−３−（メチレン−１−オキシ−３−（オキシベンジルビニル）−プロパン））−５−ボロン酸］−４，７−フェナントロリニウムジブロマイドを示す。
【図３．Ｉ】４，４‘−Ｎ，Ｎ−ビス−［ベンジル−（３−メチレン−４−ビニルピリジニウムブロマイド）−５−（ボロン酸）］−−４，７−フェナントロリニウムジブロマイド示す。
【図４．Ａ】および
【図４．Ｂ】は、それぞれ本発明の相互貫入重合体ネットワーク（ＩＰＮ）ポリマーおよび半ＩＰＮポリマーの構造の概略図である。
【図５】グルコースの機能としてのＨＰＴＳ−ＰＥＧ（１Ｘ１０−５Ｍ）対するｍＢＢＶクエンチング効率の調節を示す、ベンジルビオロゲン（０．００１Ｍ）および４，４−Ｎ，Ｎ’−ビス−（ベンジル−３−ボロン酸）−ジピリジニウムジブロマイド（ｍＢＢＶ）の反応をグラフに示したものである。
【図６】グルコースの機能としてのＨＰＴＳ−ＰＥＧ（１Ｘ１０−５Ｍ）対するクエンチング効率の調節を示す、オルト、メタ、およびパラベンジルボロン酸ビオロゲン（ＢＢＶ）（０．００１Ｍ）の反応をグラフに示したものである。
【図７】ｐＨ７．４リン酸緩衝液中における、ＨＰＴＳ−ＰＥＧのｍ−ＢＢＶクエンチングのスターンウォリメルプロットである。
【図８】グルコースまたはフルクトースなどのポリヒドロキシル有機化合物を監視する工程の流れにおいて使用されるインビトロプローブの一実施例であり、検出ポリマー集合体の使用の一実施例を示す概略図である。
【図９】グルコースまたはフルクトースなどのポリヒドロキシル有機化合物を監視する工程の流れにおいて使用されるインビトロプローブの二つ目の実施例を示す概略図である。
【図１０】図９のインビトロプローブの概略断面図である。また、図９のインビボ検知ポリマー集合体も示す。
【図１１】４，７−フェン  ｍ−ＳＢＢＶおよびＨＰＴＳ−ＭＡの二成分系をグラフで示したものであり、ｐＨ７．４緩衝液中の蛍光強度対時間（秒）をプロットしている。
【図１２．Ａ】８−ヒドロキシピレン‐１−３，６−Ｎ，Ｎ’Ｎ”−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）と増加するｍ−ＢＢＶの蛍光発光スペクトルをグラフに示したものである。蛍光強度対０から１ｍＭの波長（ｎｍ）をプロットしている。
【図１２．Ｂ】８−ヒドロキシピレン‐１−３，６−Ｎ，Ｎ’Ｎ”−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）ｍ−ＢＢＶのグルコースへの蛍光発光反応をグラフに示したものである。０から１８００ｍｇ／ｄＬの蛍光強度対波長（ｎＭ）をプロットしている。
【図１３】８−ヒドロキシピレン‐１−３，６−Ｎ，Ｎ’Ｎ”−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）とｍ−ＢＢＶのグルコース反応をグラフで示したものである。Ｆ／Ｆｏ対グルコース（ｍｇ／ｄＬ）をプロットしている。
【図１４】ｍ−ＢＢＶＢＰおよびＨＰＴＳ−ＭＡの二成分系を蛍光強度対時間（秒）でグラフに示したものである。
【図１５】１ｍｍＰＭＭＡファイバーに接着された（ＶｅｔＢｏｎｄ）ヒドロゲルの蛍光強度対時間（秒）でのグルコース反応をグラフで示したものである。
【図１６】図１５と類似で、かつ異なるグルコース濃度対時間（秒）での反応をグラフで示したものである。
【図１７】実施例４７において生成されたＨＰＴＳ（Ｌｙｓ−ＭＡ）の構造を示す。
【図１８】実施例５４における、ヒドロゲルのグルコース反応をグラフに示したものである。
【図１９】量子ドット溶液の追加のあとに、ｐＨ７．４でクエンチャー溶液のグルコースにクエンチャーの追加された特性蛍光反応をグラフに示したものである。
【図２０】アミンの蛍光およびカルボキシル置換量子ドットをクエンチする０−ＢＢＶ２＋およびＢＶ２＋のスターンウォリメルプロットをグラフに示したものである。
【図２１】蛍光アミンおよびカルボキシル置換量子ドットをｐＨ７．４でクエンチングするｏ−ＢＢＶを使用した得られたグルコース反応曲線をグラフに示したものである。
【図２１．Ａ】Ｆ／Ｆｏに対し時間をプロットした、１−ＭＡＢＰおよびＡＰＴＳ−ＢｕＭＡを含むヒドロゲルのグルコース反応をグラフに示したものである。
【図２１．Ｂ】グルコースレベルｍＭＭに対しＦ／Ｆｏをプロットした、１−ＭＡＢＰおよびＡＰＴＳ−ＤｅｇＭａを含むヒドロゲルのグルコース反応をグラフに示したものである。
【図２２．Ａ】時間に対しＦ／Ｆｏをプロットした、Ｐ２−３，３’−ｏＢＢＶおよびＡＰＴＳ−ＤｅｇＭａを含むヒドロゲルのグルコース反応をグラフに示したものである。
【図２２．Ｂ】グルコースレベルｍＭに対しＦ／Ｆｏをプロットした、Ｐ２−３，３’−ｏＢＢＶおよびＡＰＴＳ−ＤｅｇＭａを含むヒドロゲルのグルコース反応をグラフに示したものである。
【図２３】時間の関数として、グルコース反応を示すＰ−ＢＯＢ−ＡＰＴＳ−ＤｅｇＭａを含むＤＭＡＡヒドロゲルをグラフに示したものである。
【図２４】Ｐ−ＢＯＢ：ＡＰＴＳ−ＤｅｇＭａヒドロゲルのグルコース濃度の関数として、光の相対強度をグラフに示したものである。
【図２５】Ｆ／Ｆｏ対  グルコース濃度ｍＭを示すポリビオロゲンクエンチャーのグルコース検出をグラフに示したものである。
【図１．Ａ】
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【図１．Ｂ】
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【図１．Ｃ】
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【図２．Ａ】
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【図２．Ｂ】
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【図２．Ｃ】
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【図２．Ｄ】
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【図２．Ｅ】
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【図２．Ｆ】
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【図２．Ｇ】
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【図３．Ａ】
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【図３．Ｂ】
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【図３．Ｃ】
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【図３．Ｄ】
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【図３．Ｅ】
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【図３．Ｆ】
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【図３．Ｇ】
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【図３．Ｈ】
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【図３．Ｉ】
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【図４．Ａ】
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【図４．Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２．Ａ】
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【図１２．Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２１．Ａ】
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【図２１．Ｂ】
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【図２２．Ａ】
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【図２２．Ｂ】
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【国際調査報告】
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