(57)【要約】本発明は、著しい量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の産生ならびにそれら個々の脂肪酸の中間体をＤＨＡに加えて蓄積する、未報告のスラウストキトリウム菌株のスクリーニングに関するものである。この生物はゴアの入江から花粉釣り餌法によって単離された。この脂肪酸プロファイルとそれぞれの生物の１８Ｓリボソーム配列が、その分子系統を示すものとして開示されている。この生物のさらなる研究は、ＤＨＡの商業的産生へのこれらの利用において大きな意義を持つことになり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラウストキトリウム属を含む群から選択される、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および他のオメガ‐３脂肪酸／脂肪酸中間体を産生する微生物。
【請求項２】
配列番号１で示される１８Ｓ ＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のオメガ‐３脂肪酸産生微生物。
【請求項３】
３０％を超えるドコサヘキサエン酸を産生する、請求項２に記載のオメガ‐３脂肪酸産生微生物。
【請求項４】
２５％を超えるドコサヘキサエン酸を産生する、請求項２に記載のオメガ‐３脂肪酸産生微生物。
【請求項５】
２０％を超えるドコサヘキサエン酸を産生する、請求項２に記載のオメガ‐３脂肪酸産生微生物。
【請求項６】
１５％を超えるドコサヘキサエン酸を産生する、請求項２に記載のオメガ‐３脂肪酸産生微生物。
【請求項７】
１０％を超えるドコサヘキサエン酸を産生する、請求項２に記載のオメガ‐３脂肪酸産生微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、匹敵し得る量のドコサヘキサエン酸を産生する、ゴア（Goa）の入江から花粉釣り餌法（Pollen baiting method）によって単離された、新規な未報告のスラウストキトリウム（Thraustochytrid）菌株‐ＳＣ１のスクリーニングに関する。著しい量のオメガ‐３脂肪酸の産生を示す、単離生物の脂肪酸プロファイルが開示されている。また、それらの分子系統樹を示す単離生物の１８Ｓ ｒＲＮＡシークエンスも明らかにされている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ここ１０年間、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）の栄養上の重要性に対する関心は顕著に増加している。多価不飽和脂肪酸は、２または３以上の二重結合を含む長鎖の脂肪酸である。それらに対する興味は、その治療的、食料および栄養上の適用における潜在力に起因する。それらは、選択された種子植物およびいくつかの海産の供給源から商業的に産生される。しかし、現在の供給源からの精製されたＰＵＦＡｓの産生は、拡大した市場を充足させるのには不十分になる（Gill and Valivety 1977）。予測される需要の拡大に適合し、魚油の欠点を回避するために、ＰＵＦＡｓの代替的産生プロセスが現在開発されている。
【０００３】
ＰＵＦＡｓは、脂肪酸鎖の末端炭素原子から３Ｃまたは６Ｃにある末端二重結合の位置に基づいて、２種類に分類される。それらは一般的に、オメガ‐６（ω６またはｎ‐６）とオメガ‐３（ω‐３またはｎ‐３系列）の２つのメイングループに分類される。オメガ‐６脂肪酸についてはアラキドン酸が、多くのプロスタグランジンやエイコサノイドの主要な前駆体であることを理由に、特に重要性が増加していて、オメガ−３脂肪酸の中ではドコサヘキサエン酸が現在多大な注目を集めていて、「必須脂肪酸」と称されている。
【０００４】
不飽和で２２炭素長のオメガ‐３脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、通常、魚および海藻において見出される。ヒトの脳組織の主要な構成要素であり、脳灰白質や網膜における主な構成脂肪酸であるという事実によって重要な意義を得ている。最近の知見では、低レベルのＤＨＡと、認知症、抑うつ症、健忘、視覚障害などの老化に関係したある行動や神経疾患との相関関係が示され、ヒトにとってのＤＨＡの生理学的重要性が立証された。
【０００５】
ＷＨＯは最近、２０００キロカロリーの食事の摂取をベースに、一日あたり約２．２ｇから４．４ｇに相当する、一日あたりのエネルギーの摂取の１〜２％をオメガ‐３脂肪酸からカバーすることを推奨している。オメガ‐３ＰＵＦＡｓの食物を通じての摂取は、おもに魚介食品の消費によって起こり、それらはオメガ‐３ＰＵＦＡｓが特徴的に豊富である。平均摂取量は母集団によって様々である。この強い要望が、大規模海洋魚養殖場の導入の原因となり、ある種の幼生海洋魚の正常な成長、発達はオメガ‐３多価不飽和脂肪酸、特にＤＨＡとエイコサペンタエン酸の食餌による補充に依存している（Rodriguez et al., 1998）。
【０００６】
現在では、選択された魚油および微細藻類がＤＨＡの主な工業原料である。高レベルのＥＰＡおよびＤＨＡを有する魚油には、サバ、ニシン、サケが含まれる。タラやコダラなどのいくつかの魚は、ほとんどの脂肪を肝臓に蓄えている。しかしながら一番の供給源は、マグロ、サバ、イワシ、ニシンおよびレイクトラウトなどの冷水魚である。しかし魚油からＤＨＡの最大の恩恵を得るためには、生魚または煮魚を食すことが望ましく、さらにはえらの後部、ひれの周りから腹部にかけての皮に最も多くの脂が貯蓄されているので、その部分を食すべきである。光、熱、酸素はどれも魚油中のＥＰＡとＤＨＡを減少させることを適切に記しておくべきである。なぜなら魚油は高度に多価不飽和であるため、すぐに悪臭がしてくるからである。悪臭がする魚は魚臭いので、あまり食欲をそそらない。魚油由来のＰＵＦＡｓを乳幼児の粉ミルクに利用することにも多くの不都合がある。魚油は、乳幼児のアラキドン酸レベルの低下を招くために乳幼児用の粉ミルクの構成物としては望ましくないエイコサペンタエン酸を通常多量に含んでいる。このことは乳幼児の体重増加率の低減と相関している。
【０００７】
また、多様な漁業の失敗や変動性により、魚油の供給量は信頼性に欠ける。このことは、十分な魚油では地球規模のＤＨＡの需要に対処できなくなることに関係する。
【０００８】
魚油に代わって、ＰＵＦＡｓは微生物から得ることができる。特に海藻は、海の食物連鎖において、オメガ‐３多価不飽和脂肪酸の主要な生産者であると考えられている。これらの海洋微生物は、記述されていない海洋種の膨大なパーセンテージに相当し（Colwell 1997）、海洋微小藻類はドコサヘキサエン酸の莫大な潜在的供給源を形成する。
【０００９】
ｎ‐３油脂の潜在的供給源はスラウストキトリウムと呼ばれる微小従属栄養生物群である。これらは卵菌綱、ラビリンチュラとともに、現在はストラメノパイル界（Stramenophila kingdom）に分類される、非光合成、従属栄養性生物のグループに属する。シゾキトリウム属（Schizochytrium）とスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）のメンバーは、その高脂質含有量と高レベルのＤＨＡによって、工業的使用のための潜在的オメガ‐３の生産者として研究されている。これらの種は、あるときは海洋菌類としても分類される。スラウストキトリウムは、腐生菌または時として寄生菌として生活する微小従属栄養生物の正式名称である。スラウストキトリウムは南極大陸、北海、インド、日本およびオーストラリアから菌株が単離されているように、広域に地理的分布している（Lewis et al., 1999参照）。それらは生きている植物からはほとんど発見されず、植物の抗微生物剤によって阻害されるように見受けられる。これらのグループのメンバーは、自生種植物の死骸だけでなく、大藻類や水没したマングローブの葉など外来種の植物性物質からも豊富に発見される。これらは通常浅海ならびに大洋の水柱中、および深海を含む堆積物中に存在する。
【００１０】
魚油と比較して微生物は、容易に大量生産が可能なので、脂肪酸の安定供給が可能であり、魚臭い臭いもなく、高度に精製されたＤＨＡや他のＰＵＦＡｓを得られる。
【００１１】
最近のいくつかの研究で
１．カルチャー内の高バイオマス
２．このバイオマスの一部として高比率の脂質
３．脂質中の高比率のＰＵＦＡｓ
を産生する能力を持つスラウストキトリウム菌株のカタログが作られた。
【００１２】
スラウストキトリウムによるＰＵＦＡｓの産生に関する報告のほとんどは、もっぱらＤＨＡの産生を対象としたものであって、それはこの化合物が、これまで報告された多くのスラウストキトリウム菌株によって産生される最も多くのＰＵＦＡであるからである。
【００１３】
高レベルＤＨＡはクリプテコディニウム・コニ（Crypthecodenium cohni）やアンフィディニウム（Amphidinium）属などの、渦鞭毛藻においても見受けられる。科学文献において利用可能なデータは、異なるスラウストキトリウム菌株から得られる、バイオマス、脂質、および最大ＤＨＡ産生量の多くのバリエーションを明示している。例えば、シゾキトリウム・アグリゲータム（Schizochytrium aggregatum）は１０日後に１リットルあたり０．９ｇのバイオマスを産生し（Vazhappilly and Chen, 1998）、シゾキトリウム属ＳＲ２１株を使うと４日後に１リットルあたり４８ｇのバイオマスが得られる（Yaguchi et al., 1997）。微生物によるＰＵＦＡ産生プロセスの開発には、適切な微生物の選択と最適化された培養技術が求められることははっきりしている。
【００１４】
ＰＵＦＡの豊富な産生物の増大した産生を得るには、後述の鍵となる手法を取り決めることが必要である。
１．ＰＵＦＡ産生株のさらなる単離、スクリーニングおよび維持：ＤＨＡの豊富な油脂の商業的産生のための潜在能力を持つ数種の株は既に単離されている。しかしながらより高いＰＵＦＡ産生量および／またはより魅力的なプロファイルのＰＵＦＡを産生するスラウストキトリウムの単離および最適化が可能である。それらの単離物と複合物に対する要求は増加する。
【００１５】
２．ＰＵＦＡ産生物の効率の最適化：スラウストキトリウム単一株から産生されるＰＵＦＡｓの種類と量は、培養の状態変化による操作に影響されやすい。分子的な技術を利用したＰＵＦＡ産生の増加も考慮される。異なる市場で、バイオマス（つまりＰＵＦＡ産生量と細胞量の重量／重量比）または体積（つまり産生量と発酵培地の重量／体積比）で測定された、高レベルのＰＵＦＡｓを産生する菌株に対する要求が提供される。
【００１６】
３．シゾキトリウム属は従属栄養的培養（OmegaTech, Boulder, Colorado, USA）によってＤＨＡを産生するのに用いられる。シゾキトリウム菌株の主な欠点は、ＤＨＡに加えて、微生物の油脂の中でオメガ‐６ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の産生も行うことである（Nakahara et al. 1996、Yokochi et al. 1998、Ratledge et al. 2001）。ＤＰＡの栄養補助的性質は現在のところよく分かっておらず、したがって食品や薬剤への利用において、ＤＰＡの脂中の存在は望まれない。ＤＨＡからＤＰＡを取り除くことは難しく、高価である。
【００１７】
本発明はいくつかのスラウストキトリウム菌株の単離に関するものであり、ゴアの入江から採取されたマングローブと呼ばれる海洋維管束植物の葉や樹状突起の死骸からスクリーニングされたいくつかの菌株は、著しい量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６、ｎ‐３）を産生する。これらの菌株はドコサヘキサエン酸の商業的産生において主な重要性がある。
【００１８】
従来の技術
Huangらは、新規に単離されたドコサヘキサエン酸産生スラウストキトリウムの、多価不飽和脂肪酸プロファイルと１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の比較解析に基づく分類法について記述した。特徴的な量のＤＨＡを産生する７種の海洋微生物の菌株が、日本とフィジーの沿岸部で採取された海水からスクリーニングされた。それらはＤＨＡに加えて中間脂肪酸もその呼吸の途中で蓄積する。それらの単離菌株は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中のそれら固有の挿入配列によって、新規のスラウストキトリウムであることが証明された。単離菌株と典型的なスラウストキトリウムの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分子解析によって作られた系統発生樹は、同一のＰＵＦＡプロファイルを持つ菌株は単一系統群を形成することを示している。この結果は、Ｃ２０〜２２のＰＵＦＡプロファイルがスラウストキトリウムの分類のための効果的な特徴として感知可能であることを示唆している。
【００１９】
Fanらは、Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001)にて、９種のスラウストキトリウム菌株によって産生されたエイコサペンタエン酸ならびにドコサヘキサエン酸と、スラウストキトリウムのオカラ利用性能について記述した論文を発表した。これらのスラウストキトリウム菌株は亜熱帯のマングローブから単離され、グルコース酵母培地中での上記脂肪酸の産生性能によってスクリーニングされたものである。それらの、オカラ（豆乳残渣）を成長とＥＰＡならびにＤＨＡを産生するために利用する能力も見積もられた。ＥＰＡ産生量はほとんどの菌株の中でも低いが、ＤＨＡレベルはグルコース酵母エキス培地上で総脂肪酸量の２８．１〜４１．１％を産生し、Ulkenia sp. KF13を例外として、全ての菌株の中でも高かった。シゾキトリウム・マングロービエ（Schizochytrium mangrovie）のＤＨＡ産生量は、２５℃で５２時間培養後に７４７．７〜２７７８．９ｍｇ／Ｌに分布する。
【００２０】
「スラウストキトリウム種ＫＫ１７‐３株によって産生された多価不飽和脂肪酸のプロファイル（Profiles of polyunsaturated fatty acids produced by Thraustochytrium sp KK17-3）」と題された出版物は、日本の瀬戸内海および西表島沿岸の海水から釣り餌法によって新規に単離された、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を産生する３００菌株以上の微生物に関するものである。ＤＨＡ産生菌株から得られたＰＵＦＡのプロファイルは４タイプに分類される。ＫＫ１７‐３と命名された菌株は、その高いＤＨＡ含有量（総脂肪酸量の５２．１％）と、ＤＨＡとともにアラキドン酸、エイコサペンタエン酸、およびドコサペンタエン酸を含む他の脂肪酸が広く存在することによって、さらなる研究に選ばれた。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の分子系統分析は、ＫＫ１７‐３がスラウストキトリウムであることを示している。
【００２１】
それにもかかわらず、Bowlesらによる他の出版物は、スラウストキトリウムの海洋原生動物群の一員による長鎖ｎ‐３多価不飽和脂肪酸の産生に関するものである。単離菌のスクリーニングが行われた後、ＤＨＡ産生の最適化が行われた。単離プログラムは３つの異なる地域から行われ、５７種の単離菌がそのバイオマス、油脂、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）産生によってスクリーニングされた。ＤＨＡが総脂肪酸量の５０％に相当するものも、この単離菌の中に存在した。いくつかの研究も、高いＣ：Ｎ比率の培地がＤＨＡ産生を促進することを示唆していた。最適化されたＤＨＡ産生は、１０７時間の培養でリットルあたり２．１７ｇであった。
【００２２】
「海洋微小藻類シゾキトリウム・マングロービエの脂肪酸組成とスクアレン含有量（Fatty acid composition and the Squalene content of the Marine micro algae Schizochytrium mangrovie）」と題された出版物がある。この出版物は、香港のマングローブ生息域において腐敗したメヒルギ（Kandelia candel）の葉から新規に単離された、スラウストキトリウムＳ．マングロービエの脂肪酸組成とスクアレン含有量の同定に関するものである。マングロービエ菌株全３種の主な脂肪酸構成物は、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸であった。ＤＨＡが最も顕著な多価不飽和脂肪酸で、（総脂肪酸量に対する）ＤＨＡのパーセンテージは全ての菌株で３２．２９〜３９．１４％に変化した。
【００２３】
特許番号WO9801536は、短期培養でドコサヘキサエン酸を産生可能な、シュワネラ属またはシュードアルテロモナス属に属する微生物について記述している。
【発明の開示】
【００２４】
本発明は、ゴアの入江で採取したマングローブと呼ばれる海洋維管束植物の葉および樹状突起の死骸に生息するスラウストキトリウムの、１０種の未報告菌株の同定に関するものである。単離に続いて、総脂肪酸含有量を決定するために、生物のＧＣ‐ＭＳ分析を行った。これらの生物の１８Ｓ ｒＲＮＡ配列はその系統発生を示唆する。さらなる研究によって、これらの生物はドコサヘキサエン酸の大量生産者として効果的であり得ることが分かった。
【００２５】
〔配列表〕
配列番号１：ＳＣ１の１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を表す。
配列番号２：ＡＶＥ１の１８Ｓリボソーム配列を表す。
配列番号３：ＡＶＥ２の１８Ｓリボソーム配列を表す。
配列番号４：ＡＶＥ３の１８Ｓリボソーム配列を表す。
配列番号５：ＡＶＥ４の１８ＳリボソームＤＮＡ配列を表す。
【００２６】
配列番号６：ＡＶＥ５の１８ＳリボソームＤＮＡ配列を表す。
配列番号７：ＡＶＥ６の１８Ｓリボソーム配列を表す。
配列番号８：ＡＶＥ７の１８Ｓリボソーム配列を表す。
配列番号９：ＡＶＥ８の１８ＳリボソームＤＮＡ配列を表す。
配列番号１０：ＡＶＥ９の１８Ｓリボソーム配列を表す。
【００２７】
発明の詳細な説明
スラウストキトリウム菌株はマングローブと呼ばれる海洋維管束植物の葉や樹状突起の死骸に生息する。これらの植物の葉の死骸はゴアの入江から採取し、花粉釣り餌法によって単離した。葉は、抗生物質（ストレプトマイシンとペニシリン）および少量のマツ花粉粒を入れた滅菌した海水で３日間培養した。この花粉を、新たな抗生物質入りの滅菌した海水に再接種した。３日間のインキュベーションの後、花粉を顕微鏡下で観察した。１０種の異なるスラウストキトリウム菌株が発見され、それらは抗生物質とともにＭＶ（岩塩‐３．４％、ペプトン‐０．１５％、酵母エキス‐０．１％、グルコース‐２％、ＫＨ２ＰＯ４‐０．０２５％、ｐＨ７）アガープレートに５日間プレート培養した。スラウストキトリウムはプレートの上にコロニー／層を形成する。これらのスラウストキトリウムを新たな抗生物質入りＭＶ培地へと接種した。３日間の増殖の後、純粋培養物が得られた。スラウストキトリウムは５日間培養され、総脂肪酸含有量を決定するために細胞をＧＣ‐ＭＳ分析にかけた。
【００２８】
ＤＨＡ高産生量菌株同定のためのスラウストキトリウムのスクリーニング
総脂質を、２：１体積／体積のクロロホルム：メタノールでのフォルク抽出法（Folch method of extracting）を用いて、培養物から抽出した。総脂質ならびに各脂肪酸の定量のために、内部標準（ヘプタデカン酸またはペンタデカン酸）を抽出前に加えた。脂肪酸を抽出し、エステル化して、Agilent6890NガスクロマトグラフィをAgilent5973マススペクトロメーターならびにHP6850シリーズガスクロマトグラフィにＦＩＤ探知機を装着したものに連結し、ＧＣ‐ＭＳ分析を行った。ＧＣ‐ＭＳ検出はキャピラリーカラム（３０ｍ、ＨＰ‐５ｍｓ、ＷＣＯＴ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚０．２５μｍ、１５０℃で２分、３００℃まで６℃／分、３００℃で２０分加熱、ヘリウムキャリアガス流１．０ｍｌ／分、分離比５０：１）を用いてＥＩ法により７０ｅＶ（ｍ／ｚ５０〜５５０、発射口部（source）２３０℃、四重極部（quadruple）１５０℃）で行った。ＧＣ‐ＦＩＤには、キャピラリーカラムＤＢ‐２３（３０ｍ、ＷＣＯＴ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚０．５μｍ）を用いた。加熱炉の温度は１６０℃で２分間、１８０℃まで６℃／分、１８０℃で２分間、２３０℃まで４℃／分、２３０℃で１０分間となるように設定し、Ｎ２キャリアガス流１．５ｍｌ／分、導入部温度が２３０℃ならびに検出部温度が２５０℃、分離比５０：１で行った。
【００２９】
１０種の菌株から単離された脂肪酸のプロファイルは図１に表されている。
【００３０】
これらの菌株の脂肪酸プロファイルは、ＡＶＥ５、ＡＶＥ７およびＳＣ‐１が同程度のＤＨＡを産生していることを示している。ＡＶＥ１もまたＤＨＡの良い産生者である。しかしながら、他の菌株は多量のＤＨＡは産生できなかった。
【００３１】
スラウストキトリウムの１８Ｓ ｒＲＮＡ配列解析
高ＤＨＡ含有量を持つＳＣ‐１、ＡＶＥ５およびＡＶＥ７の１．７ｋｂ１８Ｓ ｒＲＮＡ配列を遺伝子からプライマーを用いて保護領域まで増幅した。増幅された断片を配列分析した。配列は、配列表に表されている。上述のように３種の菌株−ＳＣ‐１、ＡＶＥ５、ＡＶＥ７はＤＨＡの産生者であると見受けられるので、これらの菌株はMicrobial Type Culture Collection and Gene Bank（ＭＴＣＣ）,Institute of Microbial Technology, Chandigarh, Indiaに寄託した。
【００３２】
これらの生物のさらなる研究によって、ＤＨＡの多量な商業的産生に非常に効果的であることが証明できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】種々のスラウストキトリウム菌株の脂肪酸プロファイルを示す。
【図１】
2009519032.tif 000002
【配列表】
2009519032000001.xml
【国際調査報告】
2009519032.tif 000023
2009519032.tif 000024
2009519032.tif 000025
2009519032.tif 000026