(57)【要約】  四炭素アルコールの発酵生産方法が提供される。具体的にはブタノール、好ましくは１−ブタノール生合成経路を発現する組み換え細菌の発酵的生育によって、１−ブタノールが生成される。
2009509541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ、
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ、
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ、
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ、および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへ、よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組み換え微生物宿主細胞であって、
少なくとも１つのＤＮＡ分子が前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞が１−ブタノールを生成する、上記組み換え微生物宿主細胞。
【請求項２】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがクロトナーゼである請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがブタノールデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
細胞が、細菌、ラン藻、糸状菌、および酵母よりなる群から選択される請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項９】
細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属のメンバーである請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
細胞がアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
細胞がバチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
細胞がパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細胞がロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
細胞がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
細胞が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
細胞がラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
細胞が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）よりなる群から選択される請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
細胞がサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号１２９、配列番号１３１、および配列番号１３３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号６、配列番号１３５、配列番号１３７、および配列番号１３９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
クロトナーゼが、配列番号８、配列番号１４１、配列番号１４３、および配列番号１４５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号１０、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、および配列番号１８７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１２、配列番号１５３、および配列番号１８９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
ブタノールデヒドロゲナーゼが、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１５３、配列番号１５５、および配列番号１５７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞が通性嫌気性菌である請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ｉ）ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ、
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ、
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ、
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ、および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへ
よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードして、微生物宿主細胞に対して異種である、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組み換え微生物宿主細胞を提供し、そして
ｉｉ）１−ブタノールが生成される条件下で、（ｉ）の宿主細胞と発酵性炭素基質とを接触させる
ことを含んでなる１−ブタノールの生成方法。
【請求項２８】
発酵性炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、および多糖類よりなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
炭素基質が、グルコース、スクロース、およびフルクトースよりなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１−ブタノールが生成される条件が嫌気性条件である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
１−ブタノールが生成される条件が微好気的条件である請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が最少培地中で炭素基質と接触する請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドが３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがクロトナーゼである請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼである請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドがブタノールデヒドロゲナーゼである請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
宿主細胞が、細菌、ラン藻、糸状菌、および酵母よりなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
宿主細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属のメンバーである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
宿主細胞がアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
宿主細胞がバチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
宿主細胞がパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
宿主細胞がロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
宿主細胞がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
細胞がラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
細胞が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）よりなる群から選択される請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
細胞がサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号１２９、配列番号１３１、および配列番号１３３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号６、配列番号１３５、配列番号１３７、および配列番号１３９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
クロトナーゼが、配列番号８、配列番号１４１、配列番号１４３、および配列番号１４５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、配列番号１０、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、および配列番号１８７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１２、配列番号１５３、および配列番号１８９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
ブタノールデヒドロゲナーゼが、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１５３、配列番号１５５、および配列番号１５７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
宿主細胞が通性嫌気性菌である請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条に基づく、２００５年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／７２１６７７号明細書、および２００６年６月１６日に出願された米国仮出願第６０／８１４４７０号明細書からの優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、工業微生物学分野およびアルコールの生成に関する。より具体的には、組み換え微生物の工業発酵を通じて１−ブタノールが生成される。
【背景技術】
【０００３】
ブタノールは重要な工業化学物質であり、燃料添加剤として、プラスチック工業における原材料化学物質として、および食物および香料工業における食物等級抽出剤として有用である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生成され、この汎用化学物質に対する需要は増大すると思われる。
【０００４】
オキソ法、レッペ法、およびクロトンアルデヒドの水素付加などの１−ブタノールの化学合成法が知られている（非特許文献１）。これらの方法は、石油化学物質に由来する出発原料を使用し、一般に高価であり環境を損なう。植物由来原料からの１−ブタノール生成は温室効果ガス排出を最小化し、当該技術分野における進歩に相当する。
【０００５】
その他の有機化学物質の生体内変換によって１−ブタノール製造する方法もまた、知られている。例えばムラモト（Ｍｕｒａｍｏｔｏ）らは特許文献１で、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌株を使用して、アルデヒドからブタノールをはじめとするアルコールを生成する方法について述べている。さらにクーンレ（Ｋｕｅｈｎｌｅ）らは特許文献２で、ロドコッカス・ルバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）の様々な株による炭化水素の酸化によって、１−ブタノールおよび２−ブタノールを調製する方法について述べている。
【０００６】
発酵によってブタノールを製造する方法もまた知られており、最も普及している方法はアセトン、１−ブタノール、およびエタノールの混合物を生成し、ＡＢＥ法と称される（ブラチェク（Ｂｌａｓｃｈｅｋ）らに付与された特許文献３）。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）によるアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵は、最古の既知の工業発酵の一つであり、これらの溶剤の生成を担う経路および遺伝子について報告されている（非特許文献２）。しかし実際の発酵はかなり複雑で、制御が困難であった。ＡＢＥ発酵は１９５０年代以来継続して衰退し、現在ほとんど全てのブタノールは上述のように石油化学的経路によって生産されている。典型的なＡＢＥ発酵では、最初に酪酸、プロピオン酸、乳酸、および酢酸がＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）によって生成され、培養ｐＨが下がって代謝「バタフライ」シフトを被り、次に１−ブタノール、アセトン、イソプロパノール、およびエタノールが形成される。従来のＡＢＥ発酵では、グルコースからの１−ブタノールの収率は低く、典型的に１５％前後で２５％を超えることは稀である。したがって従来のＡＢＥ発酵中の１−ブタノール濃度は、通常１．３％よりも低い。
【０００７】
その他の全ての溶剤副産物の排除によって、ＡＢＥ法からの１−ブタノール生成を最大化する試みは完全に成功しておらず、したがって方法はガソリン添加剤として有用でない顕著な量のアセトンを生じる。１−ブタノールが唯一の産物であるブタノールの発酵的生産方法は、当該技術分野における進歩に相当する。
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−０１７６９５号公報
【特許文献２】欧州特許第１１４９９１８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３５８，７１７号明細書
【非特許文献１】「ウルマンの工業化学百科事典（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第６版、第５巻、７１６〜７１９頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ、２００３年
【非特許文献２】ギルバル（Ｇｉｒｂａｌ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１１〜１６頁、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって単一産物としての１−ブタノール生成のための、環境的に責任を持てる、対費用効果の高い方法が必要とされている。本発明は、１−ブタノール生合成経路を発現する組み換え微生物生成宿主の発見を通じて、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、改変された１−ブタノール生合成経路を有する組み換え微生物を提供する。改変された微生物を１−ブタノールの商業的生成のために使用してもよい。したがって本発明は、
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ、
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ、
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ、
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ、および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへ
よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組み換え微生物宿主細胞を提供し、少なくとも１つのＤＮＡ分子は前記微生物宿主細胞に対して異種であり、前記微生物宿主細胞は１−ブタノールを生成する。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、
ｉ）ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ、
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ、
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ、
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ、および
ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへ
よりなる群から選択される、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードして、前記微生物宿主細胞に対して異種である、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでなる組み換え微生物宿主細胞を提供し、そして
ｉｉ）１−ブタノールが生成される条件下で、（ｉ）の宿主細胞と発酵性炭素基質とを接触させる
ことを含んでなる１−ブタノールの生成方法を提供する。
【００１２】
配列説明
本願明細書の一部を形成する次の詳細な説明、図、および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００１３】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１４】
【表１】
2009509541.tif 000003
【００１５】
【表２】
2009509541.tif 000004
【００１６】
配列番号１７〜４４は、１−ブタノール生合成経路の遺伝子を増幅するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号４５〜７２は、配列決定のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号７３〜７５は、実施例９で述べられる形質転換ベクターを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号７６は、ここでＣａＴＥＲと称されるコドン最適化ＣＡＣ０４６２遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号７７は、ここでＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）と称されるコドン最適化ＥｇＴＥＲ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号７８は、ここでａｌｄ（ｏｐｔ）と称されるコドン最適化ａｌｄ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号７９は、プラスミドｐＦＰ９８８のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号８０〜１２７、１６０〜１８５、および１９０〜２０７は、ここで述べられ表４および５でより詳細に述べられる、１−ブタノール生合成経路の遺伝子のクローニング、配列決定、またはスクリーニングのために使用される、クローニング、配列決定、またはＰＣＲスクリーニングプライマーの核酸配列である。
【００２４】
配列番号１５６は、ｃｓｃＢＫＡ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号１５７は、スクロースヒドロラーゼ（ＣｓｃＡ）のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１５８は、Ｄ−フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１５９は、スクロースパーミアーゼ（ＣｓｃＢ）のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号１８６は、実施例１７で述べられるコドン最適化ｔｅｒｙ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１８７は、コドン最適化ｔｅｒｙ遺伝子（配列番号１８６）によってコードされるブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｔｅｒ）のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１８８は、実施例１７で述べられるコドン最適化ａｌｄｙ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１８９は、コドン最適化ａｌｄｙ遺伝子（配列番号１８８）によってコードされるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号２０８は、実施例１４で使用されるテンプレートＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、組み換え微生物を使用した１−ブタノール生成方法に関する。本発明は、いくつかの商業的および工業的ニーズを満たす。ブタノールは多様な用途がある重要な汎用工業化学物質であり、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は特に顕著である。四炭素のみのアルコールでありながら、ブタノールはガソリンに類するエネルギー含量を有してあらゆる化石燃料と混合できる。ブタノールを標準内燃エンジン内で燃焼させるとＣＯ２のみが生じ、ＳＯＸまたはＮＯＸは微量または全く生じないので、それは燃料または燃料添加剤として好まれている。さらにブタノールは、今までのところ最も好ましい燃料添加剤であるエタノールよりも腐食性が低い。
【００３４】
生物燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加えて、ブタノールは、新興の燃料電池産業における水素流通問題に影響を及ぼす可能性を有する。今日の燃料電池は、水素輸送および流通に関連した安全性への懸念に悩まされている。ブタノールはその水素含量を容易に改善でき、既存の給油所を通じて、燃料電池または車両のいずれかのために必要な純度で流通させることができる。
【００３５】
最後に本発明は植物由来炭素源からブタノールを生成し、ブタノール生成のための標準石油化学法に関連する環境への悪影響を回避する。
【００３６】
次の定義および略語が、特許請求の範囲および明細書の解釈のために使用される。
【００３７】
「発明」または「本発明」という用語は、ここでの用法では非限定的用語であり、特定の発明のいかなる単一実施態様を指すことも意図されず、明細書および特許請求の範囲で述べられるような全ての可能な実施態様を包含する。
【００３８】
「ＡＢＥ」は、アセトン−ブタノール−エタノール発酵法の略語である。
【００３９】
「１−ブタノール生合成経路」という用語は、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成するための酵素経路を意味する。
【００４０】
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、２個のアセチル−ＣｏＡ分子からアセトアセチル−ＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒する酵素を指す。より幅広い基質範囲の酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）もまた機能できるが、好ましいアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、短鎖アシル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡに対して基質優先傾向がある（順方向反応）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９と分類される［酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、Ａａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９２年、］。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１６７２８（配列番号１２９）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号１２８）；ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９４７６．１（配列番号２）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号１）；ＮＰ＿１４９２４２（配列番号４）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号３）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３９０２９７（配列番号１３１）、ＮＣ＿０００９６４（配列番号１３０））、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１５２９７（配列番号１３３）、ＮＣ＿００１１４８（配列番号１３２））などのいくつかの供給源から入手できる。
【００４１】
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対して基質選好性があり、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０と分類される。さらに３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対して基質選好性があり、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６と分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えばＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９３１４（配列番号６）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号５））、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＢ０９６１４（配列番号１３５）、Ｕ２９０８４（配列番号１３４））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿２９４４８１（配列番号１３７）、ＮＣ＿００７３４７（配列番号１３６））、およびアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２１９７３（配列番号１３９）、Ｊ０４９８７（配列番号１３８））などのいくつかの供給源から入手できる。
【００４２】
「クロトナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡおよびＨ２Ｏへの変換を触媒する酵素を指す。クロトナーゼは（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選好性を有してもよく、それぞれＥ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５と分類される。クロトナーゼは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１５９１１（配列番号１４１）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号１４０））、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９３１８（配列番号８）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号６））、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１３７０５（配列番号１４３）、Ｚ９９１１３（配列番号１４２））、およびアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＢＡＡ２１８１６（配列番号１４５）、Ｄ８８８２５（配列番号１４４））などのいくつかの供給源から入手できる。
【００４３】
「ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性のいずれかであってもよく、それぞれＥ．Ｃ．１．３．１．４４およびＥ．Ｃ．１．３．１．３８と分類される。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、例えばＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４７１０２（配列番号１０）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号９）））、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：Ｑ５ＥＵ９０配列番号１４７）、ＡＹ７４１５８２配列番号１４６））、ストレプトミセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ９２８９０（配列番号１４９）、Ｕ３７１３５（配列番号１４８））、およびストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク番号：ＣＡＡ２２７２１（配列番号１５１）、ＡＬ９３９１２７（配列番号１５０））などのいくつかの供給源から入手できる。
【００４４】
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用して、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。ＮＡＤＨに対する選好性があるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼはＥ．Ｃ．１．２．１．５７として知られており、例えばクロストリジウム・バイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク番号：ＡＡＤ３１８４１（配列番号１２）、ＡＦ１５７３０６（配列番号１１））、およびＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９３２５（配列番号１５３）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号１５２））から入手できる。
【００４５】
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを使用して、ブチルアルデヒドから１−ブタノールの変換を触媒する酵素を指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えばＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９３２５（配列番号１５３）、ＮＣ＿００１９８８配列番号１５２；注記：この酵素はアルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の双方を有する）；ＮＰ＿３４９８９１（配列番号１４）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号１３）；およびＮＰ＿３４９８９２（配列番号１６）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号１５））、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号１５５）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号１５４））から入手できる。
【００４６】
「通性嫌気性菌」という用語は、好気性および嫌気性環境の双方において生育できる微生物を指す。
【００４７】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることができる炭素源を指し、特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。
【００４８】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現されることができ、場合によりコード配列に先行し（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）、制御配列を含む核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列を含んでもよく、または同一供給源に由来するが天然に見られるのとは異なる様式に配列された制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」または「異種遺伝子」とは、常態では宿主生物中に見られないが、遺伝子移入により宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【００４９】
ここでの用法では「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列上流（５’非コード配列）、その中、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響する。制御配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでもよい。
【００５０】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプにおいて、または異なる発生ステップにおいて、または異なる環境的または生理学的条件に応じて、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプで遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００５１】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）場合、そのコード配列と作動的に結合する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。
【００５２】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００５３】
ここでの用法では「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす宿主生物への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００５４】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を有することが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖または環状の自律的に複製される配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、それはその中で適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる独自の構成に、いくつかのヌクレオチド配列が結合または組み換えされるあらゆる供給源に由来する。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する、特定のベクターを指す。
【００５５】
ここでの用法では「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変更を可能にする遺伝コードにおける性質を指す。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００５６】
「コドン最適化」と言う用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコーディング領域について言及する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物体の典型的なコドン使用を反映させる、遺伝子中のコドンまたは核酸分子のコーディング領域の改変を指す。
【００５７】
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８４年；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、１９８７年、で述べられている。
【００５８】
１−ブタノール生合成経路
炭水化物利用微生物は、中心的代謝経路として、エムデン−マイヤーホフ−パーナス（ＥＭＰ）経路、エントナー−ドウドロフ経路、およびペントースリン酸回路を用いて、生育および維持のためのエネルギーおよび細胞前駆物質を提供する。これらの経路は共通して中間体グリセルアルデヒド−３−リン酸を有し、究極的にピルビン酸が直接に、またはＥＭＰ経路と組み合わさって形成される。続いてピルビン酸は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ、およびピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼとの反応をはじめとする多様な手段を通じて、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）に転換される。アセチル−ＣｏＡは、例えば脂肪酸、アミノ酸、および二次代謝産物を発生させる上で、重要な中間体の役割を果たす。アセチル−ＣｏＡへの糖変換反応の組み合わせは、エネルギー（例えばアデノシン−５’−三リン酸、ＡＴＰ）および還元等価物（例えば還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ、および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ）を生じる。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれらの酸化形態（それぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋）に再生されなくてはならない。無機電子受容体（例えばＯ２、ＮＯ３−、およびＳＯ４２−）の存在下で還元等価物を使用してエネルギープールを増強してもよく、あるいは還元炭素副産物を形成してもよい。炭水化物の発酵に起因するエタノールおよび１−ブタノール生成は、後者の例である。
【００５９】
本発明は、図１に示すようにアセチル−ＣｏＡから１−ブタノールへの完全な１−ブタノール生合成経路を提供することで、組み換え微生物によって炭水化物源から１−ブタノールが生成できるようにする。遺伝子の不在または適切な遺伝子制御の欠如のために、一般に微生物群生中に欠如しているこの生合成経路は、以下の基質から産物への変換を含んでなる。
ａ）例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されるようなアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへ、
ｂ）例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなアセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ、
ｃ）例えばクロトナーゼによって触媒されるような３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへ、
ｄ）例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなクロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへ、
ｅ）例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへ、および
ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されるようなブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換。
【００６０】
経路はＡＴＰを必要とせずＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋を発生させるので、アセチル−ＣｏＡを発生させる中央代謝経路と釣り合う。天然生物が発酵によって１−ブタノールを生成する能力は稀であり、最も顕著にはクロストリジウム・バイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）によって例証される。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の遺伝子構成および遺伝子制御については述べられている（Ｌ．ギルバル（Ｇｉｒｂａｌ）およびＰ．スーカイ（Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１６：１１〜１６頁、１９９８年）。しかしこれらの酵素活性の多くは、例えば炭化水素利用、脂肪酸酸化、およびポリヒドロキシアルカノアート代謝などの代案の経路とも結びついている。したがってアセチル−ＣｏＡから１−ブタノールへの組み換え経路を提供する上で、個々の反応ステップを満たすいくつかの選択があり、当業者は公的に入手可能な配列を利用して、関連する経路を構築できるであろう。当該技術分野で知られており、１−ブタノール生合成経路の構築において有用である、代表的ないくつかの遺伝子の一覧を下の表２に列挙する。
【００６１】
【表３】
2009509541.tif 000005
【００６２】
【表４】
2009509541.tif 000006
【００６３】
【表５】
2009509541.tif 000007
【００６４】
【表６】
2009509541.tif 000008
【００６５】
１−ブタノール生成のための微生物宿主
１−ブタノール生成のための微生物宿主は、細菌、ラン藻、糸状菌類、および酵母から選択されてもよい。１−ブタノール生成のために使用される微生物宿主は、ブタノール毒性によって収率が制限されないように、好ましくは１−ブタノールに耐性である。１−ブタノールの高力価レベルで代謝的に活性の微生物については、当該技術分野であまり知られていない。溶剤起源クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）からブタノール耐性突然変異体が単離さているが、その他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関する情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する研究のほとんどは、ブタノールがエタノールよりも毒性が高いことを示唆する（デ・カバルホ（ｄｅ  Ｃａｖａｌｈｏ）ら、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．６４：２１５〜２２頁、２００４年；およびカベリッツ（Ｋａｂｅｌｉｔｚ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２０：２２３〜２２７頁、２００３年）。トーマス（Ｔｏｍａｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２００６〜２０１８頁、２００４年、はクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）中での発酵におけるブタノールの収率が、ブタノール毒性によって制限されるかもしれないことを報告する。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対するブタノールの主要効果は、膜機能の破壊である（ヘルマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：１２３８〜１２４３頁、１９８５年）。
【００６６】
１−ブタノール生成について選択される微生物宿主は好ましくは１−ブタノールに対して耐性であり、炭水化物を１−ブタノールに転換できる。適切な微生物宿主選択のための判定基準としては、以下が挙げられる。１−ブタノールに対する内因的耐性、高率のグルコース使用、遺伝子操作のための遺伝的ツールの利用可能性、および安定した染色体の改変を発生させる能力。
【００６７】
１−ブタノールに対して耐性の適切な宿主株は、株の内因的耐性に基づいたスクリーニングによって同定してもよい。１−ブタノールに対する微生物の内因的耐性は、最少培地中で生育させた際に、生育速度の５０％阻害（ＩＣ５０）を引き起こす１−ブタノールの濃度を判定することで測定してもよい。ＩＣ５０値は、当該技術分野で既知の方法を使用して判定してもよい。例えば様々な量の１−ブタノールの存在下で対象とする微生物を生育させ、６００ナノメートルにおける光学濃度を測定することで生育速度をモニターしてもよい。生育曲線の対数部分から倍加時間を計算して、生育速度の尺度として使用してもよい。生育の５０％阻害を生じる１−ブタノールの濃度は、１−ブタノール濃度に対する％生育阻害のグラフから判定してもよい。好ましくは宿主株は、１−ブタノールに対して約０．５％重量／容積を超えるＩＣ５０を有するべきである。
【００６８】
１−ブタノール生成のための微生物宿主はまた、グルコースも高率で利用する。ほとんどの微生物は炭水化物を利用できる。しかし特定の環境的微生物は炭水化物を高い効率で利用できないので、適切な宿主ではない。
【００６９】
宿主を遺伝的に改変する能力は、あらゆる組み換え微生物の生成に必須である。遺伝子移入技術の様式は、電気穿孔、接合、形質導入または自然形質転換であってもよい。広範な宿主接合性プラスミドおよび薬剤抵抗性マーカーが利用できる。クローニングベクターは、宿主中で機能できる抗生物質抵抗性マーカーの性質に基づいて、宿主生物に合わせて調整される。
【００７０】
微生物宿主はまた、炭素流動について競合する経路を不活性化するために、様々な遺伝子を削除することで操作されなくてはならない。これは、不活性化を指示するトランスポゾンまたは染色体組み込みベクターのいずれかを利用可能であることが必要である。さらに内因的１−ブタノール耐性を改善する突然変異が得られるように、生成宿主は化学的突然変異誘発を容易に受け入るべきである。
【００７１】
上述の判定基準に基づいて、１−ブタノール生成のための適切な微生物宿主としては、限定されるものではないが、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバーが挙げられる。好ましい宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【００７２】
生成宿主の構築
発酵性炭素基質から１−ブタノールへの変換のための酵素的経路をコードする必要な遺伝子を含有する組み換え生物は、当該技術分野でよく知られている技術を使用して構築してもよい。本発明では、１−ブタノール生合成経路の酵素、すなわちアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、上述のように様々な供給源から単離してもよい。
【００７３】
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学技術分野で一般的であり、よく知られている。例えば遺伝子配列が既知であれば、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なゲノムのライブラリーを作り出し、所望の遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーンしてもよい。ひとたび配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応などの標準プライマー誘導増幅方法（マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）、米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を使用してＤＮＡを増幅し、適切なベクターを使用した形質転換に適した量のＤＮＡを得てもよい。異種の宿主中での発現のためのコドン最適化ツールは、容易に入手できる。コドン最適化のためのいくつかのツールは、宿主生物のＧＣ含量に基づいて利用できる。いくつかの例示的な微生物宿主のＧＣ含量を表３に示す。
【００７４】
【表７】
2009509541.tif 000009
【００７５】
ひとたび関連する経路遺伝子を同定および単離したら、それらを当該技術分野でよく知られている手段によって適切な発現宿主に形質転換してもよい。多様な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは一般的であり、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、カリフォルニア州ラホヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））、およびマサチューセッツ州ベヴァリーのニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））などの会社から市販される。典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を内部に有する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。どちらの制御領域も形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子に由来してもよいが、このような制御領域はまた、生成宿主として選択された特定の種に天然でない遺伝子に由来してもよいものと理解される。
【００７６】
所望の宿主細胞において関連する経路コード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。限定されるものではないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、およびＧＰＭ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）中での発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）中での発現に有用）；ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）中での発現に有用）；ｎｉｓＡ（グラム陽性細菌での発現に有用、アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（８）：２７６３〜２７６９頁、１９９８年）；および合成Ｐ１１プロモーター（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中での発現に有用、ラッド（Ｒｕｄ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５２：１０１１〜１０１９頁、２００６年）をはじめとする、これらの遺伝的要素を駆動できるあらゆるプロモーターが事実上、本発明に適する。
【００７７】
終結制御領域は、好ましい宿主に天然である様々な遺伝子に由来してもよい。場合により終結部位は不必要であってもよいが、含まれれば最も好ましい。
【００７８】
特定のベクターは広範な宿主細菌中で複製することができ、接合によって転移できる。ｐＲＫ４０４、および３つの関連ベクターｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全な注釈付き配列が入手できる。これらの誘導体は、グラム陰性細菌中の遺伝的操作のための有益なツールであることが証明されている（スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、Ｐｌａｓｍｉｄ  ５０（１）：７４〜７９頁、２００３年）。広宿主範囲Ｉｎｃ  Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０のいくつかのプラスミド誘導体もまた、グラム陰性細菌中で機能できるプロモーターと共に入手できる。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７は、複数クローニング部位と共に活性プロモーターを有し、グラム陰性細菌中での異種遺伝子の発現を可能にする。
【００７９】
染色体の遺伝子置換ツールもまた、広く入手できる。例えば広宿主範囲レプリコンｐＷＶ１０１の熱感受性変異型が改変されてプラスミドｐＶＥ６００２が構築されており、これは一連のグラム陽性細菌中に遺伝子置換を作り出すのに使用できる（モーガン（Ｍａｇｕｉｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（１７）：５６３３〜５６３８頁、１９９２年）。さらに生体外トランスポゾームを利用して、エピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）（登録商標）などの商業的供給源からの多様なゲノム中にランダム突然変異を作り出せる。
【００８０】
様々な好ましい微生物宿主中での１−ブタノール生合成経路の発現については、下でより詳細に述べる。
【００８１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の１−ブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に有用なベクターまたはカセットは一般的であり、上に列挙した会社から市販される。例えば実施例１１で述べられるように、１−ブタノール生合成経路の遺伝子を様々なクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）株から単離して、改変ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換してもよい。いくつかのその他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中での１−ブタノール生合成経路の発現については、実施例１３で述べられる。
【００８２】
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
ｐＲｈＢＲ１７およびｐＤＡ７１をはじめとするがこれに限定されるものではない、一連の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターが、Ｒ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中での発現のために利用できる（コスチクカ（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６２：６１〜６８頁、２００３年）。さらにＲ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中での異種の遺伝子発現のために、一連のプロモーターが利用できる（例えばナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５５５７〜５５６８頁、２００４年；およびタオ（Ｔａｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、ＤＯＩ１０．１００７／ｓ００２５３−００５−００６４を参照されたい）。タオ（Ｔａｏ）ら（前出）およびブランズ（Ｂｒａｎｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９〜２０３６、２０００年、で述べられる方法を使用して、Ｒ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）中の染色体遺伝子の標的を定めた遺伝子破壊を作り出してもよい。
【００８３】
上述のように１−ブタノール生成に必要な異種の遺伝子は、最初にｐＤＡ７１またはｐＲｈＢＲ７１中でクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換してもよい。次にコスチクカ（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ）ら（前出）が述べるように、ベクターを電気穿孔によってＲ．エリスロポリス（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に形質転換してもよい。組換え体はグルコースを含有する合成培地中で生育させてもよく、当該技術分野で既知の方法を使用した１−ブタノール生成がそれに続く。
【００８４】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での遺伝子発現および突然変異作成の方法もまた、当該技術分野でよく知られている。例えば実施例１２で述べられるように、１−ブタノール生合成経路の遺伝子を様々なクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）株から単離し、改変ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングして枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に形質転換してもよい。さらに実施例１４で述べられるように、１−生合成経路の６つの遺伝子を発現のために２つのオペロンに分割できる。経路の最初の３つの遺伝子（ｔｈｌ、ｈｂｄ、およびｃｒｔ）を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込む（ペイン（Ｐａｙｎｅ）およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８〜２２８２頁、１９９１年）。最後の３つの遺伝子（ＥｇＴＥＲ、ａｌｄ、およびｂｄｈＢ）は発現プラスミド中にクローニングされて、組み込まれた１−ブタノール遺伝子を保有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換される。
【００８５】
バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における１−ブタノール生合成経路の発現
プロトプラスト形質転換または電気穿孔のどちらかによって、Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換するのに、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で複製されるプラスミドおよびシャトルベクターのほとんどが使用できる。例えば１−ブタノール生成に必要な遺伝子をプラスミドｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体中でクローニングしてもよい（ナガラージャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）ら、Ｇｅｎｅ  １１４：１２１〜１２６頁、１９９２年）。Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換する方法は当該技術分野で知られている（例えばフレミング（Ｆｌｅｍｉｎｇ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６１（１１）：３７７５〜３７８０頁、１９９５年、を参照されたい）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現のために構築されたプラスミドは、Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に形質転換されて、１−ブタノールを生成する組み換え微生物宿主を生じる。
【００８６】
パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
上述のように枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現のためにプラスミドを構築し、プロトプラスト形質転換によってパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）に形質転換し、１−ブタノールを生成する組み換え微生物宿主を生成してもよい。
【００８７】
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））中での１−ブタノール生合成経路の発現
ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）中での遺伝子発現および突然変異発生の方法は、当該技術分野で知られている（例えばタガビ（Ｔａｇｈａｖｉ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０（１０）：３５８５〜３５９１頁、１９９４年、を参照されたい）。１−ブタノール生合成経路のための遺伝子を上述の広宿主範囲ベクターのいずれかの中でクローニングし、電気穿孔して１−ブタノールを生成する組換え体を発生させてもよい。ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）中のポリヒドロキシブチレート経路については詳細に記述され、ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ゲノムを改変する多様な遺伝子工学技術が知られており、１−ブタノール生合成経路を操作するためにこれらのツールが応用できる。
【００８８】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）中での遺伝子発現のための方法は、当該技術分野で知られている（例えば参照によって本明細書に援用するベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）らに付与された米国特許第６，５８６，２２９号明細書を参照されたい）。例えばブタノール経路遺伝子をｐＰＣＵ１８中に挿入してもよく、このライゲーションしたＤＮＡをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１Ｃ５ａＡＲ１細胞中に電気穿孔して、１−ブタノールを生じる組換え体を発生させてもよい。
【００８９】
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での遺伝子発現のための方法は、当該技術分野で知られている（例えばクリスティン・ガスリー（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ）およびジェラルドＲ．フィンク（Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ）編、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、「酵母の遺伝学と分子および細胞生物学ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（パートＡ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）２００４年、を参照されたい）。酵母中での遺伝子発現は、典型的にプロモーターとそれに続く対象とする遺伝子、および転写ターミネーターを必要とする。１−ブタノール生合成経路をコードする遺伝子のための発現カセットを構築する上で、構成的プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ、およびＧＰＭ、および誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＣＵＰ１をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの酵母プロモーターを使用できる。適切な転写ターミネーターとしては、限定されるものではないが、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、およびＧＡＬ１ｔが挙げられる。１−ブタノール生合成経路の適切なプロモーター、転写ターミネーター、および遺伝子は、実施例１７で述べられるように酵母２ミクロン（２μ）プラスミド中にクローニングしてもよい。
【００９０】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属は乳酸杆菌科に属し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換で使用される多くのプラスミドおよびベクターは、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のために使用してもよい。適切なベクターの非限定的例としては、ｐＡＭβ１およびその誘導体（ルノー（Ｒｅｎａｕｌｔ）ら、Ｇｅｎｅ  １８３：１７５〜１８２頁、１９９６年、およびオサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｇｅｎｅ  １３７：２２７〜２３１、１９９３年）；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１誘導体（ワイコフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１〜１４８６頁、１９９６年）；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（タニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００〜５８０４頁、２００２年）；ｐＮＺ９５２０（クレールベゼム（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１〜４５８４頁、１９９７年）；ｐＡＭ４０１（フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２〜１２６７頁、２００１年）；およびｐＡＴ３９２（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９〜１９０３頁、１９９４年）が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのいくつかのプラスミドもまた報告されている（例えばバンクラーネンブルクＲ（ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ  Ｒ）、ゴーリックＮ（Ｇｏｌｉｃ  Ｎ）、ボンジャースＲ（Ｂｏｎｇｅｒｓ  Ｒ）、レールＲＪ（Ｌｅｅｒ  ＲＪ）、デボスＷＭ（ｄｅ  Ｖｏｓ  ＷＭ）、シーゼンＲＪ（Ｓｉｅｚｅｎ  ＲＪ）、クレールベゼムＭ（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ  Ｍ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；７１（３）：１２２３〜１２３０頁、２００５年３月）。例えばラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中での１−ブタノール生合成経路の発現については、実施例１８で述べられる。
【００９１】
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）中における１−ブタノール生合成経路の発現
腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属は乳酸菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属し、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターが、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）のために使用できる。適切なベクターの非限定的例としては、ｐＡＭβ１およびその誘導体（ルノー（Ｒｅｎａｕｌｔ）ら、Ｇｅｎｅ  １８３：１７５〜１８２頁、１９９６年、およびオサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｇｅｎｅ  １３７：２２７〜２３１、１９９３年）；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１誘導体（ワイコフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１〜１４８６頁、１９９６年）；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（タニモト（Ｔａｎｉｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００〜５８０４頁、２００２年）；ｐＮＺ９５２０（クレールベゼム（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１〜４５８４頁、１９９７年）；ｐＡＭ４０１（フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２〜１２６７頁、２００１年）；およびｐＡＴ３９２（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９〜１９０３頁、１９９４年）が挙げられる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）からのｎｉｓＡ遺伝子を使用したＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）のための発現ベクターもまた使用してもよい（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２７６３〜２７６９頁、１９９８年。さらにＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）染色体中での遺伝子置換のためのベクターを使用してもよい（ナラパレディ（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：３３４〜３４５頁、２００６年）。例えばエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）中での１−ブタノール生合成経路の発現については、実施例１９で述べられる。
【００９２】
発酵培地
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、限定されるものではないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類、またはそれらの混合物、および乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽などの再生可能原材料からの未精製混合物が挙げられる。さらに炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。メチロトローフ生物体はまた、一または二炭素基質に加えて、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミン、および多様なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えばメチロトローフ酵母菌は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（マレル，Ｊ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）、ケリー，ドンＰ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．）編、第７回国際シンポジウム、ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、「Ｃ１化合物上における微生物の生育（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．）」、４１５〜３２頁、１９９３年、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔによる出版、Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に様々なカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９頁、１９９０年）。したがって本発明で用いられる炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物体の選択によってのみ制限されることが考察される。
【００９３】
前述の全ての炭素基質およびそれらの混合物は、本発明で適切であることが考察されるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。
【００９４】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切な無機物、塩、補助因子、緩衝液、および培養物の生育と１−ブタノール生成に必要な酵素的経路の促進に適した、当業者に既知のその他の構成成分を含有しなくてはならない。
【００９５】
培養条件
典型的に細胞は、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度で適切な培地中で生育させる。本発明における適切な増殖培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロスまたは酵母培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的で商業的に調製された培地である。その他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地もまた使用してもよく、特定の微生物生育に適した培地は、微生物学または発酵科学当業者に知られている。例えば環式アデノシン２’：３’−一リン酸などの、異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている作用物質の使用もまた、発酵培地中に組み込んでもよい。
【００９６】
発酵に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の間であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。
【００９７】
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施してもよく、嫌気性または微好気条件が好ましい。
【００９８】
発酵培地中に生成する１−ブタノールの量は、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）などの当該技術分野で知られているいくつかの方法を使用して判定できる。
【００９９】
工業的バッチおよび連続発酵
本方法はバッチ発酵法を用いる。古典的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の最初に設定され、発酵プロセス中に人為的変化を受けない。したがって発酵プロセス開始時に培養液に所望の生物体または生物体群を接種して、システムには何も添加せずに発酵を生じさせる。しかし典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、発酵を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。一般に対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生成の大部分を担う。
【０１００】
標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵の進行と共に基質がステップ的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ発酵は当該技術分野で一般的で周知であり、実例は参照によってここに援用するトマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー：工業微生物学テキスト（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．１９８９年、またはデシュパンデ，ムカンドＶ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁、１９９２年、にある。
【０１０１】
本発明はバッチ様式で実施されるが、方法は連続発酵法に適応できることが考察される。連続発酵は開放系であり、合成発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されて、同時に処理のために当量の熟成培地が除去される。連続発酵は、一般に細胞が主として対数生育期にある一定の高密度に培養物を維持する。
【０１０２】
連続発酵は、細胞生育または最終産物濃度に影響する１つの要因またはいくつもの要因を調節できるようにする。例えば一方法は炭素源または窒素などの制限的栄養物質のレベルを定率に維持して、その他の全パラメーターを加減できるようにする。その他のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの要素を連続的に改変できる。連続システムは定常状態生育条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、発酵中の細胞生育速度に対して均衡を保たなくてはならない。連続発酵法のために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術については工業微生物学の技術分野でよく知られており、多様な方法が前出のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述されている。
【０１０３】
バッチ、流加または連続法のいずれを使用して本発明を実施してもよく、あらゆる既知の発酵様式が適切であることが考察される。さらにホールセル触媒として基質上に細胞を固定化し、１−ブタノール生成のための発酵条件に置いてもよいことが考察される。
【０１０４】
発酵培地からの１−ブタノール単離法
生物生産された１−ブタノールは、当該技術分野で知られている方法を使用して、発酵培地から単離してもよい。例えば遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって、固形物を発酵培地から除去してもよい。次に蒸留、液体−液体抽出、または膜ベースの分離などの方法を使用して、上述のように固形物を除去するように処理された発酵培地から１−ブタノールを単離してもよい。１−ブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留は、混合物がその共沸性組成物になるまで分離するためにのみ使用できる。蒸留を別の分離方法と組み合わせて使用して、共沸混合物周辺での分離を得てもよい。１−ブタノールを単離し精製するために蒸留と組み合わせて使用してもよい方法としては、限定されるものではないが、デカンテーション、液体−液体抽出、吸着、および膜ベースの技術が挙げられる。さらに１−ブタノールは、共留剤を使用した共沸蒸留を使用して単離してもよい（例えばドハーティ（Ｄｏｈｅｒｔｙ）およびマロン（Ｍａｌｏｎｅ）、「蒸留システムの概念設計（Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年、を参照されたい）。
【０１０５】
１−ブタノール−水混合物は不均一共沸混合物を形成するので、デカンテーションと組み合わせた蒸留を使用して、１−ブタノールを単離し精製してもよい。この方法では、１−ブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留する。次に共沸性混合物を濃縮し、デカンテーションによって１−ブタノールを発酵培地から分離する。デカントされた水相を還流として第１の蒸留カラムに戻してもよい。第２の蒸留カラム中での蒸留によって、１−ブタノールに富む有機相をさらに精製してもよい。
【０１０６】
１−ブタノールはまた、蒸留と組み合わせた液体−液体抽出を使用して発酵培地から単離してもよい。この方法では、適切な溶剤での液体−液体抽出を使用して、１−ブタノールが発酵ブロスから抽出される。次に１−ブタノール含有有機相を蒸留して、１−ブタノールを溶剤から分離する。
【０１０７】
発酵培地から１−ブタノールを単離するために、吸着と組み合わせた蒸留もまた使用してよい。この方法では、１−ブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くに蒸留し、次に分子ふるいなどの吸着材の使用によって残留水を除去する（アデン（Ａｄｅｎ）ら、「トウモロコシまぐさのための並流希釈酸前加水分解および酵素的加水分解を使用したリグノセルロース生物由来資源からのエタノール加工設計および経済学（Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ）」、ＮＲＥＬ報告／ＴＰ−５１０−３２４３８、国立再生可能エネルギー研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、２００２年６月）。
【０１０８】
さらに浸透気化法と組み合わせた蒸留を使用して、発酵培地から１−ブタノールを単離、精製してもよい。この方法では、１−ブタノール含有発酵ブロスを共沸性組成物近くまで蒸留し、次に親水性膜を通じた浸透気化法によって水を除去する（グオ（Ｇｕｏ）ら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５、１９９〜２１０頁、２００４年）。
【実施例】
【０１０９】
続く実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、あくまで例示のために提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須の特徴を見極められ、その趣旨と範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適合するように本発明の様々な変更および修正ができる。
【０１１０】
一般法
実施例で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年、（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８４年；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、１９８７年、で述べられている。
【０１１１】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、当該技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられる。フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９４年、またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、１９８９年。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限りウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティックス・システムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
【０１１２】
以下の実施例においてクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを表４に示す。クローニングされた遺伝子の配列決定またはスクリーニングのために使用されるプライマーを表５に示す。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、テキサス州ウッドランドのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））によって合成された。
【０１１３】
【表８】
2009509541.tif 000010
【０１１４】
【表９】
2009509541.tif 000011
【０１１５】
【表１０】
2009509541.tif 000012
【０１１６】
【表１１】
2009509541.tif 000013
【０１１７】
【表１２】
2009509541.tif 000014
【０１１８】
【表１３】
2009509541.tif 000015
【０１１９】
【表１４】
2009509541.tif 000016
【０１２０】
【表１５】
2009509541.tif 000017
【０１２１】
【表１６】
2009509541.tif 000018
【０１２２】
【表１７】
2009509541.tif 000019
【０１２３】
【表１８】
2009509541.tif 000020
【０１２４】
培養液中の１−ブタノール濃度を判定する方法
培養液中の１−ブタノール濃度は、当該技術分野で知られているいくつかの方法によって判定できる。例えば特定の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法では、どちらもマサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ、コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ））から購入される、ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＳＨ−Ｇガードカラム付きショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＳＨ−１０１１カラムと共に、屈折率（ＲＩ）検出を利用した。クロマトグラフィーの分離は、流速０．５ｍＬ／分の移動相として０．０１ＭＨ２ＳＯ４を使用してカラム温度５０℃で達成した。１−ブタノールは使用した条件下で５２．８分間の滞留時間を有した。あるいは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）方法が利用できる。例えば特定のＧＣ法では、デラウェア州ウィルミントンのアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））からのＨＰ−イノワックス（ＩＮＮＯＷａｘ）カラム（内径３０ｍ×０．５３ｍｍ、フィルム厚１μｍ）と共に水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を利用した。キャリアガスは、一定の上部圧力下、１５０℃における測定で流速４．５ｍＬ／分のヘリウムであり、注入器スプリットは２００℃で１：２５であり、オーブン温度は４５℃で１分間、１０℃／分で４５から２２０℃、および２２０℃で５分間であり、ＦＩＤ検出を２６ｍＬ／分のヘリウム補給ガスと共に２４０℃で用いた。１−ブタノールの滞留時間は５．４分間であった。カリフォルニア州パロアルトのバリアン・インコーポレーテッド（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのバリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＣＰ−ＷＡＸ５８（ＦＦＡＰ）ＣＢカラム（内径２５ｍ×０．２５ｍｍ×フィルム厚０．２μｍ）を使用した同様のＧＣ法もまた使用した。
【０１２５】
略語の意味は次のとおり。「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は波長６００ｎｍで測定される光学濃度を意味し、「ＯＤ５５０」は、波長５５０ｎｍで測定される光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は、重力定数を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容積％を意味し、「％ｖ／ｖ」は容積／容積％を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。
【０１２６】
実施例１
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、ここでアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼとも称される酵素アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子ｔｈｌＡをクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した。ｔｈｌＡ遺伝子は、ＰＣＲを使用してＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡから増幅され、１．２ｋｂｐの生成物中で得られた。
【０１２７】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からのゲノムＤＮＡは、バージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入され、あるいは下で述べられるようにクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）培養物から単離された。
【０１２８】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からのゲノムＤＮＡは、嫌気的に生育させた培養物から調製された。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）株は、３０℃の嫌気性チャンバー内で、ニュージャージー州バインランドのベルコ・ガラス・インコーポレーテッド（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｃ．（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ））からの栓をして圧着した１００ｍＬベルコ（Ｂｅｌｌｃｏ）血清ボトル内の１０ｍＬのクロストリジウム属増殖培地（ロペズ−コントレラス（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（２）、８６９〜８７７頁、２００３年）中で生育させた。接種材料はニューヨーク州ニューヨークの三菱ガス化学アメリカ・インコーポレーテッド（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））からの２．５Ｌ  ＭＧＣアナエロパック（ＡｎａｅｒｏＰａｋ）（商標）内で３７℃で生育させた２×ＹＴＧプレートからの単一コロニーであった（キシイ（Ｋｉｓｈｉｉ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、４７（１）、７７〜８１頁、２００３年。
【０１２９】
製造業者の使用説明書に修正を加えて、ミネソタ州ミネアポリスのジェントラシステムズ・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））からのジェントラ・ピュアジーン（Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）（登録商標）キット（カタログ番号Ｄ−６０００Ａ）を使用して、ゲノムＤＮＡを調製した（ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３２、３４９〜３５６頁、１９９６年）。それぞれ配列番号２１および２２で示されるプライマーＮ７およびＮ８（表４参照）を使用して、ＰＣＲによりクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｔｈｌＡ遺伝子を増幅した。その他のＰＣＲ増幅試薬は、例えばウィスコンシン州マディソンのノバジェン・インコーポレーテッド（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＫｏｄ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号７１８０５−３）などの製造業者のキット内で提供され、製造業者のプロトコルに従って使用した。カリフォルニア州フォスター・シティのＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのＤＮＡサーモサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００内で増幅を実施した。
【０１３０】
発現研究のために、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニング技術を使用した。エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯは定方向性クローニングを可能にし、対象とする遺伝子のためのシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を提供した。目的ベクターｐＤＥＳＴ１４は、タグのない遺伝子の発現のためにＴ７プロモーターを使用した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれてインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｔｈｌＡを発生させた。製造業者の推奨に従ってｐＥＮＴＲコンストラクトをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換して播種した。形質転換体を一晩生育させ、製造業者の推奨に従ってカリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）スピン・ミニプレップキット（カタログ番号２７１０６）を使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマー（表５参照）によってクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認して配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、それぞれ配列番号４７および４８で示される追加的配列決定プライマーＮ７ＳｅｑＦ１およびＮ７ＳｅｑＲ１（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列、および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２で示される。
【０１３１】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってｔｈｌＡ遺伝子をｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｔｈｌＡを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｔｈｌＡベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンで栄養強化されたＬＢ培地に接種して一晩生育させた。一晩培養物のアリコートを使用して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンで栄養強化された５０ｍＬのＬＢに接種した。培養物を振盪しながら、３７℃でＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまでインキュベートした。培養物を２つの２５ｍＬ培養物に分割し、フラスコの１つにアラビノースを添加して最終濃度を０．２重量％にした。負の対照フラスコはアラビノースで誘導しなかった。フラスコを振盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、細胞ペレットを５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞を超音波処理によって、またはフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ）を通過させることで破壊した。ホールセル溶解産物を遠心分離すると、上清または無細胞抽出物およびペレットまたは不溶性の画分が生じた。各画分のアリコート（ホールセル溶解産物、無細胞抽出物および不溶性画分）をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＳＤＳ（ＭＥＳ）ローディング緩衝液中に再懸濁し、８５℃で１０分間加熱してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）４−１２％ビス−トリスゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２Ｂｏｘ）を行った。核酸配列から推定されたような約４１ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
【０１３２】
無細胞抽出物中のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性は、３０３ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることで、Ｍｇ２＋−アセトアセチル−ＣｏＡ複合体の分解として測定された。標準アッセイ条件は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２であった。３７℃で５分間カクテルを平衡化し、次に無細胞抽出物を添加した。０．０５ｍＭのアセトアセチル−ＣｏＡと０．２ｍＭのＣｏＡの添加によって反応を開始した。ブラッドフォード法またはシグマ（Ｓｉｇｍａ）からのビシンコニン酸キット（カタログ番号ＢＣＡ−１）のどちらかによってタンパク質濃度を測定した。どちらの場合にもカリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））からのウシ血清アルブミンを標準として使用した。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＴｈｌＡタンパク質の比活性は、非誘導培養物の０．２７μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、１６．０μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１３３】
実施例２
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、ここでアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ酵素とも称されるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子ｔｈｌＢをＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した。ＰＣＲを使用して、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｔｈｌＢ遺伝子を増幅した。
【０１３４】
実施例１で述べられるｔｈｌＡ遺伝子と同一様式で、ｔｈｌＢ遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号２７および２８で示されるプライマーＮ１５およびＮ１６を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡを増幅して１．２ｋｂｐの生成物を作成した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＣＡＣ）が組み込まれて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｔｈｌＢを発生させた。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、それぞれ配列番号４９および５０で示される追加的配列決定プライマーＮ１５ＳｅｑＦ１およびＮ１６ＳｅｑＲ１（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４で示される。
【０１３５】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってｔｈｌＢ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｔｈｌＢを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｔｈｌＢベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、アラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。核酸配列から推定されたような約４２ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。実施例１で述べられるようにして酵素アッセイを実施した。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＴｈｌＢタンパク質の比活性は、非誘導培養物の０．２８μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、１４．９μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１３６】
実施例３
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からのｈｂｄ遺伝子をクローンして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、ｈｂｄ遺伝子をＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡから増幅した。
【０１３７】
実施例１で述べられる方法を使用して、ｈｂｄ遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号１９および２０で示されるプライマーＮ５およびＮ６（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｈｂｄ遺伝子を増幅して８８１ｂｐの生成物を生成した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｈｂｄを発生させた。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、それぞれ配列番号５１および５２で示される追加的配列決定プライマーＮ５ＳｅｑＦ２およびＮ６ＳｅｑＲ２（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６で示される。
【０１３８】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってｈｂｄ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｈｂｄを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｈｂｄベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、実施例１で述べられるようにしてアラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。核酸配列から推定されたような約３１ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
【０１３９】
３４０ｎｍにおける吸光度の減少により測定されるＮＡＤＨの酸化速度を測定して、ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を判定した。標準アッセイ混合物は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．２ｍＭ  ＮＡＤＨを含有した。カクテルを３７℃で５分間平衡化し、次に無細胞抽出物を添加した。基質である０．１ｍＭアセトアセチル−ＣｏＡの添加により反応を開始した。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＢＨＢＤタンパク質の比活性は、非誘導培養物の０．８８５μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、５７．４μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１４０】
実施例４
クロトナーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からのｃｒｔ遺伝子をクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現するすることであった。ＰＣＲを使用して、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｃｒｔ遺伝子を増幅した。
【０１４１】
実施例１で述べられる方法を使用して、ｃｒｔ遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号１７および１８で示されるプライマーＮ３およびＮ４（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｃｒｔ遺伝子を増幅して７９４ｂｐの生成物を生成した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｃｒｔを発生させた。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および配列番号８で示される。
【０１４２】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってｃｒｔ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｃｒｔを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｃｒｔベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、実施例１で述べられるようにしてアラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。核酸配列から推定されたような約２８ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在し、その量は非誘導対照よりもはるかに多かった。
【０１４３】
スターン（Ｓｔｅｒｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１、５５９〜５６６頁、１９５４年、で述べられるようにして、クロトナーゼ活性をアッセイした。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のクロトナーゼタンパク質の比活性は、非誘導培養物中の４７μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて４４４μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１４４】
実施例５
ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、ここでトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼとも称される酵素ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。推定上のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ相同体であるＣＡＣ０４６２遺伝子をＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した。ＰＣＲを使用して、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからＣＡＣ０４６２遺伝子を増幅した。
【０１４５】
実施例１で述べられる方法を使用して、ＣＡＣ０４６２遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号２９および３０で示されるプライマーＮ１７およびＮ２１（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからＣＡＣ０４６２遺伝子を増幅して１．３ｋｂｐの生成物を生成した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯＣＡＣ０４６２を発生させた。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、追加的配列決定プライマーＮ２２ＳｅｑＦ１（配列番号５３）、Ｎ２２ＳｅｑＦ２（配列番号５４）、Ｎ２２ＳｅｑＦ３（配列番号５５）、Ｎ２３ＳｅｑＲ１（配列番号５６）、Ｎ２３ＳｅｑＲ２（配列番号５７）、およびＮ２３ＳｅｑＲ３（配列番号５８）（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９および配列番号１０で示される。
【０１４６】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってＣＡＣ０４６２遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ＣＡＣ０４６２を発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ＣＡ０４６２ベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、実施例１で述べられるようにしてアラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、負の対照または誘導培養物中に予想された分子量の過剰発現されたタンパク質を示さなかった。Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＣＡＣ０４６２遺伝子は、多くの稀な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドンを使用した。コドン使用頻度の問題を回避するために、ｐＤＥＳＴ１４ＣＡＣ０４６２ベクターを保有するＢＬ２１−ＡＩ細胞に、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのｐＲＡＲＥプラスミドを形質転換した。ｐＲＡＲＥベクターを保有する培養物でアラビノース誘導による発現研究を繰り返した。予想された約４６ｋＤａの分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
【０１４７】
ホフマイスター（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、４３２９〜４３３８頁、２００５年、で述べられるようにして、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性をアッセイした。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＴＥＲ  ＣＡＣ０４６２タンパク質の比活性は、非誘導培養物の０．０１２８μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて０．６９４μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１４８】
実施例６
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）のクローニングおよび発現
本実施例の目的は、Ｃ．ベイジリンキ（ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３５７０２）からのａｌｄ遺伝子をクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、ａｌｄ遺伝子をＣ．ベイジリンキ（ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３５７０２）ゲノムＤＮＡから増幅した。
【０１４９】
実施例１で述べられる方法を使用して、ａｌｄ遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号３１および３２で示されるプライマーＮ２７  Ｆ１およびＮ２８  Ｒ１（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．ベイジリンキ（ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３５７０２）ゲノムＤＮＡ（実施例１で述べられるように嫌気的に生育させた培養物から調製される）からａｌｄ遺伝子を増幅して１．６ｋｂｐの生成物を生成した。順方向プライマーには翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯａｌｄを発生させた。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、追加的配列決定プライマーＮ３１ＳｅｑＦ２（配列番号５９）、Ｎ３１ＳｅｑＦ３（配列番号６０）、Ｎ３１ＳｅｑＦ４（配列番号６１）、Ｎ３２ＳｅｑＲ１（配列番号７２）、Ｎ３１ＳｅｑＲ２（配列番号６２）、Ｎ３１ＳｅｑＲ３（配列番号６３）、Ｎ３１ＳｅｑＲ４（配列番号６４）、およびＮ３１ＳｅｑＲ５（配列番号６５）（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で示される。
【０１５０】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってａｌｄ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ａｌｄを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ａｌｄベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、実施例１で述べられるようにしてアラビノースの添加によって、Ｔ７プロモーターからの発現を誘導した。核酸配列から推定されたような約５１ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
【０１５１】
フーゼマン（Ｈｕｓｅｍａｎｎ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：４３５〜４４４頁、１９８９年、で述べられるように、３４０ｎｍにおける吸光度の増大によって測定されるＮＡＤＨの形成をモニタリングして、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を判定した。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＡｌｄタンパク質の比活性は、非誘導培養物中の０．０１μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、０．１０６μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１５２】
実施例７
ブタノールデヒドロゲナーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）からのｂｄｈＢ遺伝子をクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｂｄｈＢ遺伝子を増幅した。
【０１５３】
実施例１で述べられる方法を使用して、ｂｄｈＢ遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号２５および２６で示されるプライマーＮ１１およびＮ１２（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｂｄｈＢ遺伝子を増幅して１．２ｋｂｐの生成物を生成した。順方向プライマーには、翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｄｈＢを発生させた。翻訳開始コドンもまた、プライマー配列によって「ＧＴＧ」から「ＡＴＧ」に変更された。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、追加的配列決定プライマーＮ１１ＳｅｑＦ１（配列番号６６）、Ｎ１１ＳｅｑＦ２（配列番号６７）、Ｎ１２ＳｅｑＲ１（配列番号６８）、およびＮ１２ＳｅｑＲ２（配列番号６９）（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で示される。
【０１５４】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってｂｄｈＢ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｂｄｈＢを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｂｄｈＢベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、実施例１で述べられるようにしてアラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。核酸配列から推定されたような約４３ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
【０１５５】
フーゼマン（Ｈｕｓｅｍａｎｎ）およびパポウトサキス（Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ）（前出）で述べられるように、３４０ｎｍにおける吸光度の減少によって測定されるＮＡＤＨの酸化速度から、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を判定した。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＢｄｈＢタンパク質の比活性は、非誘導培養物中の０．０２２μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、０．１６９μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１５６】
実施例８
ブタノールデヒドロゲナーゼのクローニングおよび発現
本実施例の目的は、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）８２４からのｂｄｈＡ遺伝子をクローニングして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現することであった。ＰＣＲを使用して、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）８２４ゲノムＤＮＡからｂｄｈＡ遺伝子を増幅した。
【０１５７】
実施例１で述べられる方法を使用して、ｂｄｈＡ遺伝子をクローニングして発現した。それぞれ配列番号２３および２４で示されるプライマーＮ９およびＮ１０（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）８２４ゲノムＤＮＡからｂｄｈＡ遺伝子を増幅して１．２ｋｂｐの生成物を生成した。順方向プライマーには、翻訳開始コドンに隣接する４つの塩基（ＣＡＣＣ）が組み込まれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ中への定方向性クローニングを可能にし、プラスミドｐＥＮＴＲＳＤＤ−ＴＯＰＯｂｄｈＡを発生させた。それぞれ配列番号４５および４６で示されるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーでクローンを配列決定し、遺伝子が正しい方向に挿入されたことを確認し、配列を確認した。ＰＣＲ生成物を完全に配列決定するために、追加的配列決定プライマーＮ９ＳｅｑＦ１（配列番号７０）およびＮ１０ＳｅｑＲ１（配列番号７１）（表５参照）が必要であった。この遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および酵素の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で示される。
【０１５８】
発現クローンを作り出すために、遺伝子組み換えによってｂｄｈＡ遺伝子をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクター中に転移して、ｐＤＥＳＴ１４ｂｄｈＡを発生させた。ｐＤＥＳＴ１４ｂｄｈＡベクターをＢＬ２１−ＡＩ細胞に形質転換し、実施例１で述べられるようにしてアラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。核酸配列から推定されたような約４３ｋＤａの予想された分子量のタンパク質が誘導培養物中に存在したが、非誘導対照中には存在しなかった。
【０１５９】
フーゼマン（Ｈｕｓｅｍａｎｎ）およびパポウトサキス（Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ）（前出）で述べられるように、３４０ｎｍにおける吸光度の減少によって測定されるＮＡＤＨの酸化速度から、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を判定した。典型的な一アッセイでは、誘導培養物中のＢｄｈＡタンパク質の比活性は、非誘導培養物中の０．０２８μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、０．１０２μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１６０】
実施例９
１−ブタノール生合成経路（下流経路）中の遺伝子のための形質転換ベクターの構築
１−ブタノール生合成経路中の６ステップをコードする遺伝子を含んでなる形質転換ベクターを構築するために、経路中の６ステップをコードする遺伝子を２つのオペロンに分割した。上流経路は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、およびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される最初の４ステップを含んでなる。下流経路は、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される最後の２ステップを含んでなる。
【０１６１】
本実施例の目的は、下流経路オペロンを構築することであった。上流経路オペロンの構築については実施例１０で述べる。
【０１６２】
後のクローニングのための制限部位を組み込んだプライマー、および最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リボソーム結合部位（ＡＡＡＧＧＡＧＧ）を含有する順方向プライマーを用いたＰＣＲによって、個々の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ  ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター中にＴＯＰＯクローニングして、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製して、遺伝子配列を確認した。マサチューセッツ州ベヴァリーのニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））の制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを製造業者の推奨に従って使用した。クローニング実験のために、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キットを使用したゲル電気泳動法によって、制限酵素断片を精製した。
【０１６３】
配列確認後、クローニングプラットフォームとして改変ｐＵＣ１９ベクター中に、遺伝子をサブクローニングした。ｐＵＣ１９ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｐＩ消化によって改変し、ｐＵＣ１９ｄＨＳを作り出した。消化によってＭＣＳ（複数クローニング部位）に隣接するｌａｃプロモーターが除去され、ベクター中へのオペロンの転写が防止された。
【０１６４】
それぞれ配列番号４１および４２で示されるプライマーＮ５８およびＮ５９（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．ベイジリンキ（ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＡＴＣＣ  ３５７０２ゲノムＤＮＡからａｌｄ遺伝子を増幅し、１．５ｋｂｐの生成物を作り出した。順方向プライマーには制限部位ＡｖａＩおよびＢｓｔＥＩＩおよびＲＢＳ（リボソーム結合部位）が組み込まれた。逆方向プライマーにはＨｐａＩ制限部位が組み込まれた。ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ａｌｄを作り出した。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、プライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、Ｎ３１ＳｅｑＦ２（配列番号５９）、Ｎ３１ＳｅｑＦ３（配列番号６０）、Ｎ３１ＳｅｑＦ４（配列番号６１）、Ｎ３２ＳｅｑＲ１（配列番号７２）、Ｎ３１ＳｅｑＲ２（配列番号６２）、Ｎ３１ＳｅｑＲ３（配列番号６３）、Ｎ３１ＳｅｑＲ４（配列番号６４）、およびＮ３１ＳｅｑＲ５（配列番号６５）（表５参照）で遺伝子配列を確認した。
【０１６５】
それぞれ配列番号４３および４４で示されるプライマーＮ６４およびＮ６５（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｂｄｈＢ遺伝子を増幅し、１．２ｋｂｐの生成物を作り出した。順方向プライマーにはＨｐａＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれた。逆方向プライマーにはＰｍｅＩおよびＳｐｈＩ制限部位が組み込まれた。ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ｂｄｈＢを作り出した。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、プライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、Ｎ１１ＳｅｑＦ１（配列番号６６）、Ｎ１１ＳｅｑＦ２（配列番号６７）、Ｎ１２ＳｅｑＲ１（配列番号６８）、およびＮ１２ＳｅｑＲ２（配列番号６９）（表５参照）で遺伝子配列を確認した。
【０１６６】
下流経路オペロンを構築するために、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ｂｄｈＢからの１．２ｋｂｐのＳｐｈＩおよびＨｐａＩ断片、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ａｌｄからの１．４ｋｂｐのＨｐａＩおよびＳｐｈＩ断片、およびＡｖａＩおよびＳｐｈＩ消化されたｐＵＣ１９ｄＨＳからの大型断片を共にライゲートした。三元ライゲーションによって、ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ａｌｄ−ｂｄｈＢが作り出された。
【０１６７】
ｐＵＣ１９ｄＨＳ−ａｌｄ−ｂｄｈＢベクターをＢｓｔＥＩＩおよびＰｍｅＩで消化して２．６ｋｂｐの断片を放出し、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクターであるｐＢｅｎＢＰ中にクローニングした。ｐＢＥ９３ベクターの改変によって、ナガラージャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）の国際公開第９３／２４６３１号パンフレット（実施例４）で述べられるプラスミドｐＢｅｎＢＰを作り出した。ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）中性プロテアーゼプロモーター（ＮＰＲ）、シグナル配列、およびｐｈｏＡ遺伝子をｐＢＥ９３から除去した。それぞれ配列番号７３および７５で示されるプライマーＢｅｎＦおよびＢｅｎＢＰＲによって、ｐＢＥ９３からＮＰＲプロモーターをＰＣＲ増幅した。プライマーＢｅｎＢＰＲには、プロモーター下流のＢｓｔＥＩＩ、ＰｍｅＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が組み込まれた。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、断片をベクターｐＢＥ９３の対応する部位にクローニングしてｐＢｅｎＢＰを作り出した。下流オペロン断片をｐＢｅｎＢＰ中のＢｓｔＥＩＩおよびＰｍｅＩ部位にサブクローニングして、ｐＢｅｎ−ａｌｄ−ｂｄｈＢを作り出した。
【０１６８】
上述の方法を使用して、粗製抽出物について、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびブタノールデヒドロゲナーゼ活性のためのアッセイを行った。空のベクターを含有する対照株を超えるレベルで、双方の酵素活性が実証された。
【０１６９】
実施例１０（予測的）
１−ブタノール生合成経路（上流経路）中の遺伝子のための形質転換ベクターの構築
この予測的実施例の目的は、どのように上流経路オペロンをアセンブルするかを述べることである。一般アプローチは実施例９で述べられるのと同じである。
【０１７０】
それぞれ配列番号３３および３４で示されるプライマー対Ｎ４４およびＮ４５（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｔｈｌＡ遺伝子を増幅して、１．２ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＳｐｈＩ制限部位およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が組み込まれる。逆方向プライマーにはＡｓｃＩおよびＰｓｔＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｔｈｌＡを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製して、遺伝配列子をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、Ｎ７ＳｅｑＦ１（配列番号４７）、およびＮ７ＳｅｑＲ１（配列番号４８）（表５参照）で確認する。
【０１７１】
それぞれ配列番号３５および３６で示されるプライマー対Ｎ４２およびＮ４３（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｈｂｄ遺伝子を増幅し、０．９ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＳａｌＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれる。逆方向プライマーにはＳｐｈＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｈｂｄを作り出す。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、遺伝子配列をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、Ｎ５ＳｅｑＦ２（配列番号５１）、およびＮ６ＳｅｑＲ２（配列番号５２）（表５参照）で確認する。
【０１７２】
一次宿主として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、二次宿主として枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現のために、ＣＡＣ０４６２遺伝子をコドン最適化する。配列番号７６で示される新しい遺伝子はＣａＴＥＲと称され、ニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって合成される。遺伝子ＣａＴＥＲは、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片としてｐＵＣ５７ベクター中でクローニングされ、ＲＢＳを含み、プラスミドｐＵＣ５７−ＣａＴＥＲを生成する。
【０１７３】
それぞれ配列番号３９および４０で示されるプライマー対Ｎ３８およびＮ３９（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｃｒｔ遺伝子を増幅し、８３４ｂｐ生成物を作り出す。順方向プライマーにはＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれる。逆方向プライマーにはＢａｍＨＩ制限部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｃｒｔを作り出す。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、遺伝子配列をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）およびＭ１３リバース（配列番号４６）（表５参照）で確認する。
【０１７４】
配列確認後、クローニングプラットフォームとして改変ｐＵＣ１９ベクター中に遺伝子をサブクローニングする。ＳｐｈＩ／ＳａｐＩ消化によってｐＵＣ１９ベクターを改変し、ｐＵＣ１９ｄＳＳを作り出す。消化によって、ＭＣＳに隣接するｌａｃプロモーターを除去し、ベクター中へのオペロン転写を防止する。
【０１７５】
上流経路オペロンを構築するために、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｃｒｔをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、０．８ｋｂｐのｃｒｔ断片を放出する。ｐＵＣ１９ｄＳＳベクターもまたＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、２．０ｋｂｐベクター断片を放出する。ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からのＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ｃｒｔ断片およびベクター断片を共にライゲートしてｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔを形成する。ｐＵＣ５７−ＣａＴＥＲをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して、１．２ｋｂｐのＣａＴＥＲ断片を放出し、ＣａＴＥＲ遺伝子をｐＣＵ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ中に挿入する。ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、大型ベクター断片をＣａＴＥＲ断片とライゲートしてｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲを作り出す。オペロンを完成させるために、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｈｂｄからの８８４ｂｐのＳａｌＩおよびＳｐｈＩ断片、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｔｈｌＡからの１．２ｋｂのＳｐｈＩおよびＰｓｔＩｔｈｌＡ断片、およびｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲのＳａｌＩおよびＰｓｔＩ消化からの大型断片をライゲートする。三元ライゲーションの生成物は、ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲ−ｈｂｄ−ｔｈｌＡである。
【０１７６】
ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲ−ｈｂｄ−ｔｈｌＡベクターをＭｌｕＩおよびＡｓｃＩで消化して４．１ｋｂｐの断片を放出し、それをｐＢｅｎＭＡと称される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクターであるｐＢＥ９３の誘導体中にクローニングする（カイミ（Ｃａｉｍｉ）の国際公開第２００４／０１８６４５号パンフレット、３９〜４０頁）。ｐＢＥ９３ベクターの改変によって、プラスミドｐＢｅｎＭＡを作り出した。ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）中性プロテアーゼプロモーター（ＮＰＲ）、シグナル配列およびｐｈｏＡ遺伝子をｐＢＥ９３から除去する。それぞれ配列番号７３および７４で示されるプライマーＢｅｎＦおよびＢｅｎＭＡＲによって、ｐＢＥ９３からＮＰＲプロモーターをＰＣＲ増幅する。プライマーＢｅｎＭＡＲには、プロモーター下流のＭｌｕＩ、ＡｓｃＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が組み込まれる。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、断片をベクターｐＢＥ９３中の対応する部位にクローニングしてｐＢｅｎＭＡを作り出す。上流オペロン断片をｐＢｅｎＭＡ中のＭｌｕＩおよびＡｓｃＩ部位にサブクローニングして、ｐＢｅｎ−ｃｒｔ−ｈｂｄ−ＣａＴＥＲ−ｔｈｌＡを作り出す。
【０１７７】
実施例１１（予測的）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
この予測的実施例の目的は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でどのように１−ブタノール生合成経路を発現するかについて述べることである。
【０１７８】
それぞれ実施例１０および９で述べられるようにして構築されるプラスミドｐＢｅｎ−ｃｒｔ−ｈｂｄ−ＣａＴＥＲ−ｔｈｌＡおよびｐＢｅｎ−ａｌｄ−ｂｄｈＢを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２（ＡＴＣＣ  ４７０００）に形質転換して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、酵素アッセイおよびウェスタン分析によって各オペロン中の遺伝子発現をモニターする。ウェスタン法では、テキサス州ザ・ウッドランズのシグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））からの合成ペプチドに対する抗体を生じさせる。全遺伝子の発現確認後、ｐＢｅｎ−ａｌｄ−ｂｄｈＢをＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで消化して、ＮＰＲプロモーター−ａｌｄ−ｂｄｈＢ断片を放出させる。断片のＥｃｏＲＩ消化物は、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からのＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｍ０２１０Ｓ）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して平滑末端化する。プラスミドｐＢｅｎ−ｃｒｔ−ｈｂｄ−ＣａＴＥＲ−ｔｈｌＡをＰｖｕＩＩで消化して、直線化された平滑末端化ベクター断片を作り出す。ベクターおよびＮＰＲ−ａｌｄ−ｂｄｈＢ断片をライゲートして、向きが反対であるＮＰＲプロモーター−ａｌｄ−ｂｄｈＢ断片と共に、完全な１−ブタノール生合成経路を含有するｐ１Ｂ１  Ｏ．１およびｐ１Ｂ１  Ｏ．２を作り出す。プラスミドｐ１Ｂ１  Ｏ．１およびｐ１Ｂ１  Ｏ．２を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換し、前述のようにして遺伝子発現をモニターする。
【０１７９】
５０ｍＬの培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２／ｐ１Ｂ１  Ｏ．１またはＮＭ５２２／ｐ１Ｂ１  Ｏ．１株を接種し、２５０ｒｐｍおよび３５℃で振盪する。培地は、５ｇ／Ｌのデキストロース、０．０５ＭのＭＯＰＳ、０．０１Ｍの硫酸アンモニウム、０．００５Ｍのリン酸二水素カリウム、１％（ｖ／ｖ）のＳ１０金属ミックス、０．１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物、０．１％（ｗ／ｖ）のカザミノ酸、０．１ｍｇ／Ｌのチアミン、０．０５ｍｇ／Ｌのプロリン、および０．００２ｍｇ／Ｌのビオチンから構成され、ＫＯＨでｐＨ７．０に滴定する。Ｓ１０金属ミックスは２００ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＦｅＣｌ３、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、０．２ｍＭの塩酸チアミン、１７２μＭのＣｕＳＯ４、２５３μＭのＣｏＣｌ２、および２４２μＭのＮａ２ＭｏＯ４を含有する。１８〜２４時間後に一般法セクションで述べるようにして、ＨＰＬＣまたはＧＣ分析によって１−ブタノールを検出する。
【０１８０】
実施例１２（予測的）
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
この予測的実施例の目的は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でどのように１−ブタノール生合成経路を発現するかについて述べることである。実施例１１で述べられるのと同一アプローチを使用する。
【０１８１】
それぞれ実施例１０および９で述べられるようにして構築される上流および下流オペロンを使用する。プラスミドｐ１Ｂ１  Ｏ．１およびｐ１Ｂ１  Ｏ．２を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８−２２８２（１９９１））に形質転換し、各オペロンの遺伝子発現を実施例１１で述べるようにモニターする。
【０１８２】
５０ｍＬの培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０／ｐ１Ｂ１  Ｏ．１またはＢＥ１０１０／ｐ１Ｂ１  Ｏ．２株を接種し、２５０ｒｐｍおよび３５℃で１８時間振盪する。培地は、５ｇ／Ｌのデキストロース、０．０５ＭのＭＯＰＳ、０．０２Ｍのグルタミン酸、０．０１Ｍの硫酸アンモニウム、０．００５Ｍのリン酸二水素カリウム緩衝液、１％（ｖ／ｖ）のＳ１０金属ミックス（実施例１１で述べられる）、０．１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物、０．１％（ｗ／ｖ）のカザミノ酸、５０ｍｇ／Ｌのトリプトファン、５０ｍｇ／Ｌのメチオニン、および５０ｍｇ／Ｌのリジンから構成され、ＫＯＨでｐＨ７．０に滴定する。１８〜２４時間後に一般法セクションで述べるようにして、ＨＰＬＣまたはＧＣ分析によって１−ブタノールを検出する。
【０１８３】
実施例１３
組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用したグルコースからの１−ブタノール生成
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での１−ブタノール生成について述べる。１−ブタノール生合成経路の６つのステップをコードする遺伝子の発現を３つのオペロンに分割した。上流経路は、１つのオペロン中のｔｈｌＡ、ｈｂｄ、ｃｒｔ、およびＥｇＴＥＲによってコードされる最初の４つのステップを含んでなった。ａｌｄによってコードされる次のステップは、第２のオペロンにより提供された。ｙｑｈＤによってコードされる経路の最後のステップは、第３のオペロン中で提供された。３つのオペロンを含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で、１−ブタノール生成を実証した。
【０１８４】
テキスト中特に断りのない限り、本実施例で述べられるクローニングプライマーは、表４中のそれらの配列番号によって参照され、配列決定およびＰＣＲスクリーニングプライマーは、表５中のそれらの配列番号によって参照される。
【０１８５】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ
それぞれ配列番号３３および３４で示されるプライマー対Ｎ４４およびＮ４５（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｔｈｌＡ遺伝子を増幅し、１．２ｋｂｐの生成物を作り出す。順方向プライマーにはＳｐｈＩ制限部位およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が組み込まれた。逆方向プライマーにはＡｓｃＩおよびＰｓｔＩ制限部位が組み込まれた。ＰＣＲ産物をカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｔｈｌＡを作り出す。プラスミドＤＮＡをＴＯＰＯクローンから調製し、遺伝子配列をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、Ｎ７ＳｅｑＦ１（配列番号４７）、およびＮ７ＳｅｑＲ１（配列番号４８）（表５参照）で確認した。
【０１８６】
３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
それぞれ配列番号３５および３６で示されるプライマー対Ｎ４２およびＮ４３（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｈｂｄ遺伝子を増幅し、０．９ｋｂｐ生成物を作り出した。順方向プライマーにはＳａｌＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれた。逆方向プライマーにはＳｐｈＩ制限部位が組み込まれた。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｈｂｄを作り出した。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、遺伝子配列をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、Ｎ５ＳｅｑＦ２（配列番号５１）、およびＮ６ＳｅｑＲ２（配列番号５２）（表５参照）で確認した。
【０１８７】
クロトナーゼ
それぞれ配列番号３９および４０で示されるプライマー対Ｎ３８およびＮ３９（表４参照）を使用したＰＣＲによって、Ｃ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからｃｒｔ遺伝子を増幅し、８３４ｂｐ生成物を作り出す。順方向プライマーにはＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ制限部位およびＲＢＳが組み込まれた。逆方向プライマーにはＢａｍＨＩ制限部位が組み込まれた。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｃｒｔを作り出した。ＴＯＰＯクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、遺伝子配列をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）およびＭ１３リバース（配列番号４６）（表５参照）で確認した。
【０１８８】
ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ）
一次宿主として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および二次宿主として枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でのコドン使用頻度向上のためにＣＡＣ０４６２遺伝子を合成した。新しい遺伝子（ＣａＴＥＲ、配列番号７６）は、ニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって、ｐＵＣ５７ベクター中でＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片として合成され、クローニングされてＲＢＳを含む。
【０１８９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でのコドン使用頻度向上のために、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＴＥＲ、ジェンバンク番号Ｑ５ＥＵ９０）からのブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのための代案の遺伝子を合成した。遺伝子は、ジェンスクリプト・コーポレーション（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって合成され、ｐＵＣ５７中にクローニングされてｐＵＣ５７：：ＥｇＴＥＲが作り出された。プライマーＮ８５およびＮ８６（それぞれ配列番号８０および８１）は、テンプレートＤＮＡとしてｐＵＣ５７：：ＥｇＴＥＲと共に、ｐＵＣ５７：：ＥｇＴＥＲ  ＤＮＡからの１２２４ｂｐを含んでなるＰＣＲ断片を提供した。１２２４ｂｐの配列は配列番号７７で示され、そこでｂｐ１〜１２１８はＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）のコード配列（ｃｄｓ）である。ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）はコドン最適化ＴＥＲ遺伝子であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能できるように正常なミトコンドリアプレ配列を欠いている（ホフマイスター（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、４３２９頁、２００５年）。
【０１９０】
ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、その配列をプライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）およびＭ１３リバース（配列番号４６）で確認した。ＰＣＲ産物を完全に配列決定するために、追加的配列決定プライマーＮ６２ＳｅｑＦ２（配列番号１１４）、Ｎ６２ＳｅｑＦ３（配列番号１１５）、Ｎ６２ＳｅｑＦ４（配列番号１１６）、Ｎ６３ＳｅｑＲ１（配列番号１１７）、Ｎ６３ＳｅｑＲ２（配列番号１１８）、Ｎ６３ＳｅｑＲ３（配列番号１１９）およびＮ６３ＳｅｑＲ４（配列番号１２０）が必要であった。次に１．２ｋｂｐのＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）配列をＨｉｎｃＩＩおよびＰｍｅＩで切除して、ＨｉｎｃＩＩで直線化したノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのｐＥＴ２３＋中にクローニングした。プライマーＴ７プライマーおよびＮ６３ＳｅｑＲ２（それぞれ配列番号８２および１１８）でのコロニーＰＣＲスクリーニングによって、プロモーターに対するＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）遺伝子の配向性を確認した。得られたプラスミドｐＥＴ２３＋：：ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）を発現研究のためにノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【０１９１】
ホフマイスター（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、４３２９頁、２００５年、で述べられるようにして、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性をアッセイした。典型的な一アッセイでは、誘導ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２３＋：：ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）培養物中のＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）タンパク質の比活性は、非誘導培養物中の０．５４７μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と比べて、１．９μｍｏｌ  ｍｇ−１  分−１と判定された。
【０１９２】
次にｔｒｃプロモーターの制御下にあるｐＴｒｃ９９ａベクター中に、ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）遺伝子をクローニングした。ｐＥＴ２３＋：：ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）からの１２８７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片として、ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）遺伝子を単離した。４．２ｋｂｐベクターｐＴｒｃ９９ａをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで直線化した。ベクターおよび断片をライゲートして、５．４ｋｂｐのｐＴｒｃ９９ａ−ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）を作り出した。０．５ｋｂ生成物を生成するプライマーＴｒｃ９９ａＦおよびＮ６３ＳｅｑＲ３（それぞれ配列番号８３および１１９）でのコロニーＰＣＲによって、陽性のクローンを確認した。
【０１９３】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ｔｈｌＡ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）、クロトナーゼ（ｃｒｔ）、およびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ））をコードする遺伝子を含んでなるプラスミドｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔの構築
上流経路（ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）、ｃｒｔ、ｈｂｄ、およびｔｈｌＡ）を含んでなる４つの遺伝子オペロンの構築を開始するために、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｃｒｔをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、０．８ｋｂｐのｃｒｔ断片を放出した。ｐＵＣ１９ｄＳＳベクター（実施例１０で述べられる）もまた、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、２．０ｋｂｐベクター断片を放出した。ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からのＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ｃｒｔ断片およびベクター断片を共にライゲートして、ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔを形成した。ｐＵＣ５７−ＣａＴＥＲをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して１．２ｋｂｐのＣａＴＥＲ断片を放出し、ＣａＴＥＲ遺伝子をｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ中に挿入した。ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、大型ベクター断片をＣａＴＥＲ断片とライゲートして、ｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲを作り出した。オペロンを完成するために、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｈｂｄからの８８４ｂｐのＳａｌＩおよびＳｐｈＩ断片、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｔｈｌＡからの１．２ｋｂＳｐｈＩおよびＰｓｔＩｔｈｌＡ断片、およびｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲのＳａｌＩおよびＰｓｔＩ消化からの大型断片をライゲートした。三元ライゲーションの生成物をｐＵＣ１９ｄＳＳ−ｃｒｔ−ＣａＴＥＲ−ｈｂｄ−ｔｈｌＡまたはｐＵＣ１９ｄｓｓ：：Ｏｐｅｒｏｎ１と命名した。
【０１９４】
より高いブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、ＣａＴＥＲコンストラクトよりもｐＴｒｃ９９ａ−ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）から得られたので、ｐＴｒｃ９９ａ−ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）に由来するオペロンを構築した。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、５３２７ｂｐベクター断片をゲル精製して、ｐＵＣ１９ｄｓｓ：：Ｏｐｅｒｏｎ１からＣａＴＥＲ遺伝子を除去した。ベクターをクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、再度ライゲートしてｐＵＣ１９ｄｓｓ：：Ｏｐｅｒｏｎ１ΔＣａＴｅｒを作り出した。次にｐＵＣ１９ｄｓｓ：オペロン１ΔＣａＴｅｒからのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片として、２９３４ｂｐのｃｒｔ−ｈｂｄ−ｔｈｌＡ（Ｃ−Ｈ−Ｔ）断片を単離した。Ｃ−Ｈ−Ｔ断片をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理して、平滑末端化した。ベクターｐＴｒｃ９９ａ−ＥｇＴＥＲ（ｏｐｔ）をＳａｌＩで消化し、末端をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理した。平滑末端化されたベクターおよび平滑末端化されたＣ−Ｈ−Ｔ断片をライゲートして、ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔを作り出した。プライマーＮ６２ＳｅｑＦ４およびＮ５ＳｅｑＦ４（それぞれ配列番号１１６および８４）でコロニーＰＣＲ反応を実施して挿入断片の向きを確認した。
【０１９５】
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄおよびａｌｄ（ｏｐｔ））をコードする遺伝子を含んでなるプラスミドｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄおよびｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）の構築
ｐＤＥＳＴ１４−ａｌｄ（実施例６）からのＰＴ７−ａｌｄオペロンをドイツ国ゲッティンゲンのモビテック（ＭｏＢｉｔｅｃ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの広宿主域プラスミドｐＢＨＲ  １中にサブクローニングして、ｐＢＨＲ  １ＰＴ７−ａｌｄを作り出した。ｐＢＨＲ  １プラスミドはｐＵＣ１９またはｐＢＲ３２２プラスミドと適合性であるため、ｐＢＨＲ  １ＰＴ７−ａｌｄは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での１−ブタノール生成のための上流経路オペロンを保有するｐＵＣ１９またはｐＢＲ３２２誘導体と組み合わせて使用できる。ｐＤＥＳＴ１４−ａｌｄプラスミドをＢｇｌＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理して平滑末端を作った。次にプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、２，２４５ｂｐのＰＴ７−ａｌｄ断片をゲル精製した。プラスミドｐＢＨＲ  １をＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、４，８８３ｂｐの断片をゲル精製した。ＰＴ７−ａｌｄ断片をｐＢＨＲ  １ベクターとライゲートしてｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄを作り出した。プライマーＴ−ａｌｄ（ＢａｍＨＩ）およびＢ−ａｌｄ（ＥｇＴＥＲ）（それぞれ配列番号８５および８６）での形質転換体のコロニーＰＣＲ増幅によって、予想された１．４ｋｂのＰＣＲ産物を確認した。ＥｃｏＲＩおよびＤｒｄＩでのｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄクローンの制限酵素マッピングにより、予想された４，７５７および２，４０５ｂｐの断片を確認した。
【０１９６】
ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイのために、プラスミドｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）細胞に形質転換し、実施例１で述べられるように、Ｌ−アラビノースの添加によってＴ７プロモーターからの発現を誘導した。実施例６で述べられるようにして、３４０ｎｍでの吸光度増大によって測定されるＮＡＤＨ形成をモニタリングして、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を判定した。
【０１９７】
ニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって、クロストリジウム・バイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＡＴＣＣ  ３５７０２からのａｌｄ遺伝子のための代案のＤＮＡ配列が合成され（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でのコドン使用頻度に最適化された）、ｐＵＣ５７中にクローニングされて、プラスミドｐＵＣ５７−ａｌｄ（ｏｐｔ）が作られた。ｐＵＣ５７−ａｌｄ（ｏｐｔ）をＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化して、コドン最適化された遺伝子ａｌｄ（ｏｐｔ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためのＲＢＳを含んでなる１４９８ｂｐの断片を放出した。１４９８ｂｐの断片の配列は、配列番号７８で示される。
【０１９８】
ｐＴｒｃ９９ａをＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化して４１５３ｂｐベクター断片を得て、それを１４９８ｂｐａｌｄ（ｏｐｔ）断片とライゲートしてｐＴｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）を作り出した。合成遺伝子、ａｌｄ（ｏｐｔ）の発現は、ＩＰＴＧ−誘導性Ｐｔｒｃプロモーターの制御下にある。
【０１９９】
上述の上流経路プラスミドと適合性であるために、Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）オペロンをモビテック（ＭｏＢｉｔｅｃ）からの広宿主域プラスミドｐＢＨＲ１中にサブクローニングした。対応するプライマー内にＢｓｐＥＩおよびＳｃａＩ制限部位を組み込む、Ｔ−Ｐｔｒｃ（ＢｓｐＥＩ）およびＢ−ａｌｄｏｐｔ（ＳｃａＩ）（それぞれ配列番号８７および８８）で、Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）断片をｐＴｒｃ９９Ａ：：ａｌｄ（ｏｐｔ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＢｓｐＥＩおよびＳｃａＩで消化した。プラスミドｐＢＨＲ１をＳｃａＩおよびＢｓｐＥＩで消化して、４，８８３ｂｐの断片をゲル精製した。Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）断片をｐＢＨＲ１ベクターとライゲートして、ｐＢＨＲ−ＰｃａｔＰｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）を作り出した。ＳｃａＩおよびＢｓｐＥＩでのｐＢＨＲ−ＰｃａｔＰｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）クローンの制限酵素マッピングによって、予想された４，８８３および１，７０４ｂｐの断片を確認した。プラスミド由来のｃａｔプロモーター（Ｐｃａｔ）領域を除去するために、プラスミドｐＢＨＲ−ＰｃａｔＰｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）をＢｓｐＥＩおよびＡａｔＩＩで消化して、６，１７２ｂｐの断片をゲル精製した。５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．９）を含有する溶液中に、Ｔ−ＢｓｐＥＩＡａｔＩＩおよびＢ−ＢｓｐＥＩＡａｔＩＩ（それぞれ配列番号８９および９０）を最終濃度１００μＭに混合し、７５℃で５分間インキュベートして室温に緩慢に冷却してハイブリダイズした。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを６，１７２ｂｐの断片とライゲートして、ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）を作り出した。
【０２００】
ブタノールデヒドロゲナーゼ（ｙｑｈＤ）を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（米国特許第６，５１４，７３３号明細書）として同定された天然遺伝子（ｙｑｈＤ）を含有する。ｙｑｈＤ遺伝子は、有望なＮＡＤＨ−依存ブタノールデヒドロゲナーゼであるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）中の遺伝子ａｄｈＢと４０％同一性を有する。λレッド技術（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６６４０頁、２０００年）を使用して、ｙｑｈＤ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株（国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレット）中のグルコースイソメラーゼプロモーター１．６ＧＩ（配列番号９１）変異型の構成的発現下に置いた。同様に天然プロモーターを１．５ＧＩプロモーター（国際公開第２００３／０８９６２１号パンフレット）（配列番号９２）によって置換してＭＧ１６５５  １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株を作り出し、したがってＭＧ１６５５  １．６ｙｑｈＤ：：Ｃｍの１．６ＧＩプロモーターを１．５ＧＩプロモーターで置換する。
【０２０１】
ＭＧ１６５５  １．５ＧＩ  ｙｑｈＤ：：ＣｍからＰ１溶解産物を調製し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５株およびインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのλＤＥ３溶原化キットから調製される発現株ＭＧ１６５５  （ＤＥ３）にカセットを移動させ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＢＬ２１（ＤＥ３）は、それぞれＭＧ１６５５  （ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：ＣｍおよびＢＬ２１（ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍを作り出す。
【０２０２】
組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの１−ブタノール生成の実証
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株をプラスミドｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−ＴおよびｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄで形質転換し、ＭＧ１６５５  （ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ／ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ／ｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄ株を生成した。最初に５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ培地中で、２つの独立した単離物を生育させた。細胞を使用して、それぞれ高、中、および低酸素条件に相当する、１５、５０、および１５０ｍＬのＴＭ３ａ／グルコース培地を含有する（適切な抗生物質を添加した）振盪フラスコ（総容積およそ１７５ｍＬ）に接種した。ＴＭ３ａ／グルコース培地は１Ｌあたり、１０ｇのグルコース、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇのクエン酸一水和物、３．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、１．０ｍｇのチアミン・ＨＣｌ、０．５０ｇの酵母抽出物、および１０ｍＬの微量元素溶液を含有し、ＮＨ４ＯＨでｐＨ６．８に調節した。微量元素溶液はクエン酸・Ｈ２Ｏ（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３．０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．０１０ｇ／Ｌ）、およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）を含有した。≦０．０１単位の開始ＯＤ６００でフラスコを接種し、３００ｒｐｍで振盪しながら３４℃でインキュベートした。１５および５０ｍＬの培地を含有するフラスコは通気式キャップでキャッピングし、１５０ｍＬを含有するフラスコは非通気式キャップでキャッピングして、空気交換を最小化した。ＩＰＴＧを０．０４ｍＭの最終濃度に添加した。添加時のフラスコのＯＤ６００は≧０．４単位であった。
【０２０３】
誘導のおよそ１５時間後に一般法セクションで述べられるようにして、１−ブタノール含量について、屈折率（ＲＩ）検出付きＨＰＬＣ（ショウデックス・シュガー（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ）ＳＨ１０１１カラム）、および炎光イオン化検出（ＦＩＤ）付きＧＣ（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＣＰ−ＷＡＸ５８（ＦＦＡＰ）ＣＢカラム、内径２５ｍ×０．２５ｍｍ×フィルム厚０．２μｍ）によって、ブロスのアリコートを分析した。１−ブタノールの判定結果を表６に示す。
【０２０４】
【表１９】
2009509541.tif 000021
【０２０５】
培地が５ｇ／Ｌ酵母抽出物を含有したこと以外は同一の様式で、ＭＧ１６５５  （ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ／ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ／ｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄの２つの独立した単離物を１−ブタノール生成について試験した。結果を表７に示す。
【０２０６】
【表２０】
2009509541.tif 000022
【０２０７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株をプラスミドｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−ＴおよびｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄで形質転換し、ＢＬ２１（ＤＥ３）１．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ／ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ／ｐＢＨＲ  Ｔ７−ａｌｄ株を生成した。上述したのと全く同じようにして、２つの独立した単離物を１−ブタノール生成について試験した。結果を表８および９に示す。
【０２０８】
【表２１】
2009509541.tif 000023
【０２０９】
【表２２】
2009509541.tif 000024
【０２１０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株をプラスミドｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−ＴおよびｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）で形質転換して、ＭＧ１６５５  １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ／ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ／ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）株を生成した。５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有するＬＢ培地中で、２つの単離物を最初に生育させた。細胞を使用して、５０および１５０ｍＬのＴＭ３ａ／グルコース培地（適切な抗生物質を添加した）を含有する振盪フラスコ（総容積およそ１７５ｍＬ）に接種した。フラスコを≦０．０４単位の開始ＯＤ５５０で接種し、誘導ありまたはなしで上述のようにインキュベートした。ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度に添加した。添加時のフラスコのＯＤ５５０は、０．６〜１．２単位の間であった。この場合、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの漏出および１．５ＧＩプロモーターの構成的性質のため、１−ブタノール経路遺伝子発現のために誘導は必要でなかった。しかし誘導はより幅広い発現を提供した。
【０２１１】
誘導のおよそ１５時間後、上述のように１−ブタノール含量について、炎光イオン化検出付きＧＣによってブロスのアリコートを分析した。結果を表１０に示す。組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株では、全例で１−ブタノールが生成された。別の実験では、野性型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、検出可能な１−ブタノールを生成しないことが示された（データ示さず）。
【０２１２】
【表２３】
2009509541.tif 000025
【０２１３】
実施例１４
組み換え枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用したグルコースからの１−ブタノール生成
本実施例は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での１−ブタノール生成について述べる。６つの酵素活性をコードする１−生合成経路の６つの遺伝子を発現のための２つのオペロンに分割し、経路の最初の３つの遺伝子（ｔｈｌ、ｈｂｄ、およびｃｒｔ）を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０染色体中に組み込んだ（ペイン（Ｐａｙｎｅ）およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：２２７８〜２２８２頁、１９９１年）。最後の３つの遺伝子（ＥｇＴＥＲ、ａｌｄ、およびｂｄｈＢ）を発現プラスミド中にクローニングして、組み込まれた１−ブタノール遺伝子を保有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換した。
【０２１４】
テキスト中特に断りのない限り、本実施例で述べられるクローニングプライマーは、表４中のそれらの配列番号によって参照され、配列決定およびＰＣＲスクリーニングプライマーは、表５中のそれらの配列番号によって参照される。
【０２１５】
組み込みプラスミド
プラスミドｐＦＰ９８８は、ｐＢＲ３２２からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）レプリコンと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での選択のためのアンピシリン抗生物質マーカーと、相同的組換えによってベクターおよび介在配列の組み込みを指示するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体中のｓａｃＢ遺伝子に対する相同性がある２つのセクションとを含有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）組み込みベクターである。ｓａｃＢ相同性領域の間に、クローニングされた遺伝子の合成および分泌を指示できるＰａｍｙプロモーターおよびシグナル配列、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の選択可能なマーカーとしてのエリスロマイシンがある。Ｐａｍｙプロモーターおよびシグナル配列は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼに由来する。プロモーター領域はまた、ｌａｃＩリプレッサータンパク質による発現調節のためのｌａｃＯ配列を含有する。ｐＦＰ９８８（６５０９ｂｐ）の配列は配列番号７９で示される。
【０２１６】
１−ブタノール経路遺伝子は細胞質中で発現させる予定であったため、アミラーゼシグナル配列を消去した。プラスミドｐＦＰ９８８をプライマーＰａｍｙ／ｌａｃＯ  ＦおよびＰａｍｙ／ｌａｃＯ  Ｒで増幅して、Ｐａｍｙ／ｌａｃＯ  プロモーターを含有する３１７ｂｐ（０．３ｋｂｐ）生成物を作り出した。Ｐａｍｙ／ｌａｃＯ  Ｆの５’末端にはＢｓｒＧＩ制限部位が組み込まれ、ＥｃｏＲＩ部位がそれに続いた。Ｐａｍｙ／ｌａｃＯ  Ｒプライマーの５’末端にはＢｓｒＧＩ制限部位が組み込まれ、ＰｍｅＩ制限部位がそれに続いた。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にＴＯＰＯクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｐａｍｙ／ｌａｃＯを作り出した。一晩培養物からプラスミドＤＮＡを調製して、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマー（それぞれ配列番号４５および配列番号４６）で配列決定して、突然変異がプロモーター中に導入されなかったことを確実にした。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｐａｍｙ／ｌａｃＯのクローンをＢｓｒＧＩで消化して、０．３ｋｂｐの断片をゲル精製した。ベクターｐＦＰ９８８をＢｓｒＧＩで消化して、５’ｓａｃＢ相同性領域からの１１ｂｐの欠失、およびＰａｍｙ／ｌａｃＯプロモーターおよびシグナル配列およびＨｉｓ−ｔａｇの除去をもたらした。６ｋｂｐのＢｓｒＧＩ消化ベクターをゲル精製して、Ｐａｍｙ／ｌａｃＯ  ＢｓｒＧＩ挿入断片とライゲートした。得られたプラスミドをプライマーＰａｍｙ  ＳｅｑＦ２およびＰａｍｙ  ＳｅｑＲでスクリーンし、プロモーターの方向を判定した。正しいクローンは、Ｐａｍｙ／ｌａｃＯ  プロモーターをその元の方向に復元し、ｐＦＰ９８８Ｄｓｓと命名された。
【０２１７】
ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）によって、遺伝子ｔｈｌ−ｃｒｔのカセットを構築した。テンプレートとしてｐＵＣ１９ｄｓｓ：：Ｏｐｅｒｏｎ１を使用して、遺伝子を増幅した。ｔｈｌプライマーは、０．９ｋｂｐ生成物を増幅するトップＴＦおよびＢｏｔ  ＴＲであった。ｃｒｔプライマーは、１．３ｋｂｐ生成物を増幅するトップＣＦおよびＢｏｔ  ＣＲであった。プライマートップＴＦおよびＢｏｔ  ＣＲを使用したＰＣＲ増幅でＳＯＥによって２つの遺伝子を結合し、２．１ｋｂｐ生成物を発生させ、それをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にＴＯＰＯクローニングしてｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｔ−Ｃを作り出した。クローンを配列決定して配列確認した。プラスミドｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｔ−ＣをＢｓｔＥＩＩおよびＰｍｅＩで消化して、２．１ｋｂｐの断片を放出し、それをゲル精製した。挿入断片をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで処理して、ＢｓｔＥＩＩ部位を平滑化した。ベクターｐＦＰ９８８ＤｓｓをＰｍｅＩで消化し、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からの仔ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理して自己ライゲーションを防止した。２．１ｋｂｐｔｈｌ−ｃｒｔ断片と消化されたｐＦＰ９８８Ｄｓｓとをライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。Ｐａｍｙ  ＳｅｑＦ２およびＮ７ＳｅｑＲ２でのＰＣＲ増幅によって、０．７ｋｂｐ生成物について形質転換体をスクリーンし、正しい生成物をｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｃと称した。
【０２１８】
ｔｈｌ−ｃｒｔカセットの構築は、２つの遺伝子間に固有のＳａｌＩおよびＳｐｅＩ部位を作り出した。ｈｂｄ遺伝子をカセットに付加するために、ｈｂｄ遺伝子をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｈｂｄから０．９ｋｂｐＳａｌＩ／ＳｐｅＩ断片としてサブクローニングした。ベクターｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−ＣをＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化し、８ｋｂｐベクター断片をゲル精製した。ベクターとｈｂｄ挿入断片とをライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。プライマーＰａｍｙ  ＳｅｑＦおよびＮ３ＳｅｑＦ３でのＰＣＲ増幅によって形質転換体を３．０ｋｂｐの断片についてスクリーンした。得られたプラスミドをｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｈ−Ｃと命名した。
【０２１９】
続いてＰａｍｙプロモーターをプラスミドｐＭＵＴＩＮ４からのＰｓｐａｃプロモーターで置換した（ヴァグネル（Ｖａｇｎｅｒ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：３０９７〜３１０４頁、１９９８年）。プライマーＳｐａｃＦおよびＳｐａｃＲでＰｓｐａｃプロモーターをｐＭＵＴＩＮ４から０．４ｋｂｐ生成物として増幅し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にＴＯＰＯクローニングした。Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーでのＰＣＲ増幅によって、形質転換体を０．５ｋｂｐ挿入断片の存在についてスクリーンした。同一プライマーで陽性クローンを配列決定した。プラスミドｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ＰｓｐａｃをＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、０．３ｋｂｐの断片をゲル精製した。ベクターｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｈ−ＣをＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、９ｋｂｐベクターをゲル精製によって単離した。消化されたベクターとＰｓｐａｃ挿入断片とをライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。プライマーＳｐａｃＦ  ＳｅｑおよびＮ７ＳｅｑＲ２でのＰＣＲ増幅によって形質転換体をスクリーンした。陽性クローンは０．７ｋｂｐの生成物を与えた。陽性クローンからプラスミドＤＮＡを調製し、プライマーＳｐａｃＦ  ＳｅｑおよびＮ３ＳｅｑＦ２でのＰＣＲ増幅によってさらにスクリーンした。陽性クローンは３ｋｂｐＰＣＲ産物を与えて、ｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−Ｔ−Ｈ−Ｃと命名された。
【０２２０】
外来性ｔｈｌ、ｈｂｄ、およびｃｒｔ遺伝子を含んでなる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８を形成するための枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０中への組み込み
Ｄｏｙｌｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：９５７〜９６６頁、１９８０年、で述べられるようにして、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０のコンピテント細胞を調製した。コンピテント細胞を遠心分離によって収集し、細胞ペレットを少容量の細胞上清に再懸濁した。１容積のコンピテント細胞に対して、２容積のＳＰＩＩ−ＥＧＴＡ培地（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔら編「一般および分子細菌学方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、１９９４年）を添加した。細胞の０．３ｍＬのアリコートを試験管内に分配して、プラスミドｐＦＰ９８８ＤｓｓＰｓｐａｃ−Ｔ−Ｈ−Ｃを試験管に添加した。細胞を振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートし、その後０．１ｍＬの１０％酵母抽出物を各試験管に添加して、細胞をさらに６０分間インキュベートした。二重寒天オーバーレイ法を使用して、形質転換体を選択のためにＬＢエリスロマイシンプレート上に播種した（「一般および分子細菌学方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、前出）。プライマーＰａｍｙ  ＳｅｑＦおよびＮ５ＳｅｑＦ３でのＰＣＲ増幅によって、形質転換体を最初にスクリーンした。予想された２ｋｂｐＰＣＲ産物を増幅した陽性クローンをＰＣＲ増幅によってさらにスクリーンした。ダブルクロスオーバー事象を通じて、染色体中へのカセットの挿入が起きた場合、プライマーセットｓａｃＢＵｐおよびＮ７ＳｅｑＲ２、およびプライマーセットｓａｃＢＤｎおよびＮ４ＳｅｑＲ３は、それぞれ１．７ｋｂｐおよび２．７ｋｂｐ生成物を増幅する。陽性クローンを同定して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８と命名した。
【０２２１】
ＥｇＴＥＲ、ａｌｄ、およびｂｄｈＢ遺伝子のプラスミド発現
残る３つの１−ブタノール遺伝子をモビテック（ＭｏＢｉｔｅｃ）からのプラスミドｐＨＴ０１から発現した。プラスミドｐＨＴ０１は、シータ機序を通じて複製するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターである。クローニングされたタンパク質は、ｌａｃＯ配列に縮合したＧｒｏＥＬプロモーターから発現される。ｌａｃＯの下流はｇｓｉＢ遺伝子からの効率的なＲＢＳであり、ＭＣＳがそれに続く。テンプレートとしてｐＵＣ１９ｄＨＳ−ａｌｄ−ｂｄｈＢ（実施例９で述べられる）を使用し、プライマーＡＦＢａｍＨＩおよびＡＲＡａｔ２でのＰＣＲによってａｌｄ遺伝子を増幅して、１．４ｋｂｐ生成物を作り出した。生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ中にＴＯＰＯクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。形質転換体をＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーでスクリーンした。陽性クローンは、１．６ｋｂｐ生成物を増幅した。クローンをプライマーＭ１３フォワードおよびＭ１３リバース、Ｎ３１ＳｅｑＦ２、Ｎ３１ＳｅｑＦ３、Ｎ３２ＳｅｑＲ２、Ｎ３２ＳｅｑＲ３、およびＮ３２ＳｅｑＲ４で配列決定した。プラスミドをｐＣＲ４ＴＯＰＯ−Ｂ／Ａ−ａｌｄと命名した。
【０２２２】
ベクターｐＨＴ０１およびプラスミドｐＣＲ４ＴＯＰＯ−Ｂ／Ａ−ａｌｄをどちらもＢａｍＨＩおよびＡａｔＩＩで消化した。７．９ｋｂｐベクター断片と１．４ｋｂｐａｌｄ断片とを共にライゲートして、ｐＨＴ０１−ａｌｄを作り出した。ライゲーションを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、プライマーＮ３１ＳｅｑＦ１およびＨＴ  ＲでのＰＣＲ増幅によって、形質転換体を１．３ｋｂｐ生成物についてスクリーンした。
【０２２３】
ｐＨＴ０１ベクターへの経路の最後の２ステップに付け加えるために、２つのクローニングスキームをデザインした。どちらのスキームでも、ＳＯＥによってＥｇＴＥＲおよびｂｄｈＢが共に増幅された。続いて、ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈ断片をｐＨＴ０１−ａｌｄ中にクローニングしてｐＨＴ０１−ａｌｄ−ＥＢを作り出し、あるいはｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂ／Ａ−ａｌｄ中にクローニングしてｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ａｌｄ−ＥＢを作り出した。次にＴＯＰＯベクターからのａｌｄ−ＥｇＴｅｒ−ｂｄｈＢ断片をｐＨＴ０１中にクローニングして、ｐＨＴ０１−ＡＥＢを作り出した。
【０２２４】
配列番号２０８で示されるテンプレートＤＮＡを使用して、プライマーフォワード  １（Ｅ）およびリバース  ２（Ｂ）を使用して、ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈＢ断片をＰＣＲ増幅した。得られた２．５ｋｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にＴＯＰＯクローニングして、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｅ−Ｂを作り出した。ＴＯＰＯ反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーでのＰＣＲ増幅によって、コロニーをスクリーンした。陽性クローンは２．６ｋｂｐ生成物を発生させた。プライマーＭ１３フォワードおよびリバース、Ｎ６２ＳｅｑＦ２、Ｎ６２ＳｅｑＦ３、Ｎ６２ＳｅｑＦ４、Ｎ６３ＳｅｑＲ１、Ｎ６３ＳｅｑＲ２、Ｎ６３ＳｅｑＲ３、Ｎ１１ＳｅｑＦ１およびＮ１１ＳｅｑＦ２、Ｎ１２ＳｅｑＲ１およびＮ１２ＳｅｑＲ２で、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｅ−Ｂのクローンを配列決定した。
【０２２５】
プラスミドｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｅ−ＢをＨｐａＩおよびＡａｔＩＩで消化して、２．４ｋｂｐの断片を放出した。Ｅ−Ｂ断片をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで処理して平滑末端化し、次にゲル精製した。プラスミドｐＨＴ０１−ａｌｄをＡａｔＩＩで消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで処理して平滑末端化した。次にベクターを仔ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理してゲル精製した。Ｅ−Ｂ断片を直線化ベクターｐＨＴ０１−ａｌｄにライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢプレート上で選択した。プライマーＮ３ＳｅｑＦ１およびＮ６３ＳｅｑＲ１でのＰＣＲ増幅によって形質転換体をスクリーンし、２．４ｋｂｐ生成物を得た。得られたプラスミドｐＨＴ０１−ａｌｄ−ＥＢをｒｅｃＡ＋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であるＪＭ１０３細胞に形質転換した。ｒｅｃＡ＋株から調製されたプラスミドは、ｒｅｃＡ−株よりも多くの多量体を形成する。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、プラスミド単量体よりもむしろ多量体でより効率的に形質転換する（「一般および分子細菌学方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、前出）。プラスミドＤＮＡをＪＭ１０３から調製してコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８に形質転換し、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８／ｐＨＴ０１−ａｌｄ−ＥＢ株を形成した。前述のようにして、コンピテント細胞を調製し形質転換した。形質転換体を５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有ＬＢプレート上で選択し、プライマーＮ３１ＳｅｑＦ１およびＮ６３ＳｅｑＲ４でコロニーＰＣＲによって、１．３ｋｂｐ生成物についてスクリーンした。
【０２２６】
代案のクローニング手法では、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｅ−ＢをＨｐａＩおよびＡａｔＩＩで消化して２．４ｋｂｐの断片を放出し、それをゲル精製した。プラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂ／Ａ−ａｌｄをＨｐａＩおよびＡａｔＩＩで消化し、５．４ｋｂｐベクター断片をゲル精製した。ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂ／Ａ−ａｌｄからのベクター断片とＨｐａＩ−ＡａｔＩＩＥ−Ｂ断片とをライゲートして、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ａｌｄ−ＥＢを作り出した。ライゲーションを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、プライマーＮ１１ＳｅｑＦ２およびＮ６３ＳｅｑＲ４でのＰＣＲ増幅によって得られた形質転換体を２．１ｋｂｐ生成物についてスクリーンした。プラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ａｌｄ−ＥＢをＢａｍＨＩおよびＡａｔＩＩおよびＳｐｈＩで消化した。ＢａｍＨＩ／ＡａｔＩＩ消化によって３．９ｋｂｐａｌｄ−ＥＢ断片を放出し、それをゲル精製した。ＳｐｈＩ消化の目的は、残るベクターがａｌｄ−ＥＢ挿入断片と共にゲル上で共遊走しないように、それをより小さな断片に切断することであった。ベクターｐＨＴ０１をＢａｍＨＩおよびＡａｔＩＩで消化し、７．９ｋｂｐベクター断片をゲル精製した。ベクターとａｌｄ−ＥＢ挿入断片とをライゲートしてプラスミドｐＨＴ０１−ＡＥＢを形成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。プライマーＮ６２ＳｅｑＦ４およびＨＴ  ＲでのＰＣＲ増幅によって、コロニーを１．５ｋｂｐ生成物についてスクリーンした。プラスミドを調製してＪＭ１０３に形質転換した。プラスミドＤＮＡをＪＭ１０３から調製し、コンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８に形質転換して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８／ｐＨＴ０１−ＡＥＢ株を形成した。コンピテントＢＥ１０１０細胞を調製し、前述のようにして形質転換した。プライマーＮ３１ＳｅｑＦ１およびＮ６３ＳｅｑＲ４でのＰＣＲ増幅によって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）形質転換体を１．３ｋｂｐ生成物についてスクリーンした。
【０２２７】
組み換え枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの１−ブタノール生成の実証
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８／ｐＨＴ０１−ａｌｄ−ＥＢおよび枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８／ｐＨＴ０１−ＡＥＢの各株の３つの独立した単離物を１５ｍＬの培地を含有する振盪フラスコ（総容積およそ１７５ｍＬ）に接種した。外来性の１−ブタノールの６つの遺伝子経路を欠く枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０株もまた、負の対照として含めた。培地は（１Ｌあたり）１０ｍＬの１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＬの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ／ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍＬの１Ｍ  Ｌ−グルタミン酸カリウム塩、１０ｇのグルコース、各１０ｍＬの５ｇ／ＬのＬ−メチオニンとＬ−トリプトファンとＬ−リジン、各０．１ｇの酵母抽出物とカザミノ酸、２０ｍＬの金属ミックス、および適切な抗生物質（組み換え株のための５ｍｇのクロラムフェニコールおよびエリスロマイシン）を含有した。金属ミックスは、２００ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＦｅＣｌ３、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、０．２ｍＭの塩酸チアミン、１７２μＭのＣｕＳＯ４、２５３μＭのＣｏＣｌ２、および２４２μＭのＮａ２ＭｏＯ４を含有した。≦０．１単位の開始ＯＤ６００でフラスコに接種して、非通気式キャップで密封し、およそ２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。
【０２２８】
接種のおよそ２４時間後に、一般法セクションで述べられるようにして、屈折率（ＲＩ）検出付きＨＰＬＣ（ショ−デックス・シュガー（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ）ＳＨ１０１１カラム）、および炎光イオン化検出（ＦＩＤ）付きＧＣ（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＣＰ−ＷＡＸ  ５８（ＦＦＡＰ）ＣＢカラム、０．２５ｍｍ×０．２μｍ×２５ｍ）で、ブロスのアリコートを１−ブタノール含量について分析した。１−ブタノールの判定結果を表１１に示す。
【０２２９】
【表２４】
2009509541.tif 000026
【０２３０】
実施例１５
組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるグルコースまたはスクロースからの１−ブタノール生成
１−ブタノール生成のために炭素およびエネルギー源としてスクロースを使用する能力を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に与えるために、プラスミドｐＳｃｒＩからのスクロース使用遺伝子クラスター（ｃｓｃＢＫＡ）（下述）をこの生物中のｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）（実施例１３で述べられる）中にサブクローニングした。スクロース使用遺伝子（ｃｓｃＡ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＢ）は、配列番号１５７で示されるスクロースヒドロラーゼ（ＣｓｃＡ）、配列番号１５８で示されるＤ−フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）、および配列番号１５９で示されるスクロースパーミアーゼ（ＣｓｃＢ）をコードする。それらの天然プロモーターからの３つの遺伝子の構成的発現を可能にするために、遺伝子クラスターを調節するスクロース特定リプレッサー遺伝子ｃｓｃＲはコンストラクト中に存在しない。
【０２３１】
プラスミドｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）中でのスクロース使用遺伝子クラスターｃｓｃＢＫＡのクローニングおよび発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ  １３２８１株に由来するスクロース−利用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のゲノムＤＮＡから、配列番号１５６で示されるスクロース使用遺伝子クラスターｃｓｃＢＫＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化した。アガロースゲルから約４ｋｂｐの平均サイズを有する断片を単離して、マサチューセッツ州ベヴァリーのニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））からのプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８にライゲートして、次にそれをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得られたＤＮＡをカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのウルトラコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’に形質転換した。１％スクロースおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有マッコンキー寒天プレート上に形質転換体を播種して、紫色のコロニーについてスクリーンした。紫色の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、プライマーＭ１３フォワード（配列番号４５）、Ｍ１３リバース（配列番号４６）、ｓｃｒ１（配列番号１６０）、ｓｃｒ２（配列番号１６１）、ｓｃｒ３（配列番号１６２）、およびｓｃｒ４（配列番号１６３）を使用して配列決定した。ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＡ（ｃｓｃＢＫＡ）遺伝子を含有するプラスミドをｐＳｃｒ１と称した。
【０２３２】
プラスミドｐＳｃｒＩをＸｈｏＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理して平滑末端を作った。次にプラスミドをＡｇｅＩで消化し、４，１７９ｂｐのｃｓｃＢＫＡ遺伝子クラスター断片をゲル精製した。実施例１３で述べられるようにしてプラスミドｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）を調製し、ＡｇｅＩおよびＮａｅＩで消化した。得られた６，００３ｂｐのｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）断片をゲル精製した。ｃｓｃＢＫＡ断片をｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）とライゲートして、ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＡＫＢを生じさせた。プラスミドｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＡＫＢをウィスコンシン州マディソンのノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＸＧエレクトロコンピテント細胞に形質転換し、形質転換体を２％スクロースおよび２５μｇ／ｍＬカナマイシン含有マッコンキー寒天プレートに播種して、スクロース使用を確認した。ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＡＫＢコンストラクトでは、スクロース使用遺伝子をｃｓｃＡ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＢの順に別個の断片として、Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）下流でクローニングした。
【０２３３】
あるいは、スクロース使用遺伝子をｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）中で反対方向にクローニングした。プラスミドｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）をＳｃａＩおよびＡｇｅＩで消化し、５，９７１ｂｐｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）断片をゲル精製した。上述のように調製された４，１７９ｂｐのｃｓｃＢＫＡ断片とｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）断片とをライゲートして、ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＢＫＡを生じさせた。プラスミドｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＢＫＡをウィスコンシン州マディソンのノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ  （Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＸＧエレクトロコンピテント細胞に形質転換し、２％スクロースおよび２５μｇ／ｍＬカナマイシン含有マッコンキー寒天プレートに形質転換体を播種して、スクロース使用を確認した。ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＢＫＡコンストラクトでは、スクロース使用遺伝子をｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、およびｃｓｃＡの順で別個の断片として、Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）下流でクローニングした。
【０２３４】
組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用したグルコースまたはスクロースからの１−ブタノール生成の実証
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ株（実施例１３で述べられる）をプラスミドｓｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ（実施例１３で述べられるようにして調製される）およびｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＡＫＢまたはｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＢＫＡで形質転換して、２つの株ＭＧ１６５５  １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ／ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ／ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＡＫＢ＃９、およびＭＧ１６５５  １．５ＧＩ−ｙｑｈＤ：：Ｃｍ／ｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ／ｐＢＨＲ−Ｐｔｒｃ−ａｌｄ（ｏｐｔ）−ｃｓｃＢＫＡ＃１を生成した。２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ培地中で細胞を生育させて、２つの株のスタータカルチャを調製した。次にこれらの細胞を使用して、実施例１３で述べられるように、それぞれ高、中および低酸素条件に相当する５０、７０、および１５０ｍＬのＴＭ３ａ／グルコース培地（適切な抗生物質を添加した）を含有する振盪フラスコ（総容積およそ１７５ｍＬ）に接種した。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＴＭ３ａ／グルコース培地内で生育させた、第３の株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５／ｐＳｃｒ１を負の対照として使用した。各株について、同一のフラスコセットをＴＭ３ａ／スクロース培地（適切な抗生物質を添加した）で調製した。ＴＭ３ａ／スクロース培地は、スクロース（１０ｇ／Ｌ）でグルコースを置換したこと以外は、ＴＭ３ａ／グルコース培地と同じである。実施例１３で述べるようにして、≦０．０３単位の開始ＯＤ５５０でフラスコを接種しインキュベートした。ただし負の対照フラスコでは、培養物が０．２〜１．８単位の間のＯＤ５５０に達したら、フラスコにＩＰＴＧを添加した（最終濃度０．０４ｍＭ）。培養物のＯＤ５５０が少なくとも３倍に増大したら、細胞を収集した。
【０２３５】
接種のおよそ２４時間後、一般法セクションで述べられるようにして、ブロスのアリコートを屈折率（ＲＩ）検出付きＨＰＬＣ（ショ−デックス・シュガー（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ）ＳＨ１０１１カラム）、および炎光イオン化検出（ＦＩＤ）付きＧＣ（ＨＰ−イノワックス（ＩＮＮＯＷａｘ）カラム、内径３０ｍ×０．５３ｍｍ、フィルム厚１μｍ）で１−ブタノール含量について分析した。
【０２３６】
グルコースおよびスクロース含有培地中での生育に続く培養物中の１−ブタノール濃度をそれぞれ表１２および表１３に示す。どちらの組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株も１−ブタノール生合成経路を含有し、全ての酸素条件下でグルコースおよびスクロースから１−ブタノールを生成するのに対し、負の対照株は検出可能な１−ブタノールを生成しなかった。
【０２３７】
【表２５】
2009509541.tif 000027
【０２３８】
【表２６】
2009509541.tif 000028
【０２３９】
実施例１６
組み換え枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用したスクロースからの１−ブタノール生成
本実施例は、組み換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用したスクロースからの１−ブタノール生成について述べる。本質的に実施例１４で述べるようにして、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ΔｓａｃＢ：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：ｅｒｍ＃２８／ｐＨＴ０１−ａｌｄ−ＥＢ株（実施例１４）の２つの独立した単離物を１−ブタノール生成について調べた。２０ｍＬまたは１００ｍＬの培地のどちらかを含有する振盪フラスコ（総容積およそ１７５ｍＬ）内に株を接種して、それぞれ高および低酸素条件をシミュレートした。培地Ａは、グルコースが５ｇ／Ｌスクロースで置換されたこと以外は、実施例１４で述べられるのと全く同じであった。培地Ｂは、グルコースが１０ｇ／Ｌスクロースで置換され、培地が（１Ｌあたり）各１０ｍＬの５ｇ／ＬのＬ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−リジン溶液で栄養強化されたこと以外は、実施例１３で述べられるＴＭ３ａ／グルコース培地と同一であった。≦０．１単位の開始ＯＤ５５０でフラスコを接種し、通気式キャップでキャッピングして３００ｒｐｍで振盪しながら３４℃でインキュベートした。
【０２４０】
接種のおよそ２４時間後、一般法セクションで述べられるようにして、ブロスのアリコートをＦＩＤ検出付きＧＣ（ＨＰ−イノワックス（ＩＮＮＯＷａｘ）カラム、内径３０ｍ×０．５３ｍｍ、フィルム厚１．０μｍ）で、１−ブタノール含量について分析した。１−ブタノールの判定結果を表１４に示す。１−ブタノール生合成経路を含有する組み換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、どちらの培地中でも高および低酸素条件下で検出可能なレベルの１−ブタノールを生成した。
【０２４１】
【表２７】
2009509541.tif 000029
【０２４２】
実施例１７
組み換えサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用したグルコースおよびスクロースからの１−ブタノール生成
本実施例は、酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での１−ブタノール生成について述べる。１−ブタノール生合成経路のステップを触媒する酵素をコードする６つの遺伝子の内、５つを３つの適合性酵母２ミクロン（２μ）プラスミド中にクローニングして、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で同時発現した。「上流経路」は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ｔｈｌＡ，チオラーゼ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）、およびクロトナーゼ（ｃｒｔ）によって触媒される最初の３つの酵素的ステップと定義した。下流経路は、経路の第４（ブチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ｔｅｒ）および第５（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ａｌｄ）の酵素的ステップと定義した。１−ブタノール経路の最後の酵素的ステップはアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され、それは例えばａｄｈＩおよびａｄｈＩＩなどの内在性酵母遺伝子によってコードされてもよい。
【０２４３】
酵母中での遺伝子発現は典型的にプロモーターを必要とし、対象とする遺伝子および転写ターミネーターがそれに続く。１−ブタノール生合成経路をコードする遺伝子発現カセットを構築する上で、ＦＢＡ、ＧＰＤ、およびＧＰＭプロモーターをはじめとする、いくつかの構成的酵母プロモーターを使用した。例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＣＵＰ１などのいくつかの誘導性プロモーターもまた中間体プラスミド構築で使用したが、最終実証株では使用しなかった。ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、およびＧＡＬ１ｔをはじめとするいくつかの転写ターミネーターも使用した。最初にプロモーターおよびターミネーターが側面にある酵母プラスミド中に、１−ブタノール生合成経路をコードする遺伝子をサブクローニングして、各遺伝子の発現カセットを生成した。発現カセットは下で述べられるように、場合によりギャップ修復クローニングによって単一ベクター中で組み合わせた。例えば上流経路をコードする３つの遺伝子カセットを酵母２μプラスミド中にサブクローニングした。ｔｅｒおよびａｌｄ遺伝子は、２μプラスミド中でそれぞれ個々に発現された。単一酵母株中での３つの全プラスミドの同時形質転換は、機能性１−ブタノール生合成経路をもたらした。あるいはギャップ修復クローニングによって、プロモーター、遺伝子、およびターミネーターをコードするいくつかのＤＮＡ断片を単一ベクター中で直接組み合わせた。
【０２４４】
酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中）でプラスミドおよび株を構築する方法
形質転換、細胞生育、遺伝子発現、ギャップ修復遺伝子組み換えなどをはじめとする基本的酵母分子生物学プロトコルについては、クリスティン・ガスリー（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ）およびジェラルドＲ．フィンク（Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ）編、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、「酵母の遺伝学と分子および細胞生物学ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  および  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（パートＡ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）２００４年、で述べられる。
【０２４５】
本実施例で使用されるプラスミドは、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクター、ｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６であり、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製基点（例えばｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、および栄養的選択のためのマーカーを含む。これらの４つのベクターの選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）、およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母株の双方の中での株増殖を可能にする。アラバマ州ハンツビルのリサーチ・ジェネティックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ））からの酵母半数体株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）（ＡＴＣＣ  ２０１３８８からもまた入手できる）、およびアラバマ州ハンツビルのリサーチ・ジェネティックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ））からの二倍体株ＢＹ４７４３（ＭＡＴａ／ａｌｐｈａ  ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０／ＬＹＳ２  ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０）（ＡＴＣＣ  ２０１３９０からもまた入手できる）を遺伝子クローニングおよび発現のための宿主として使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での標準分子クローニング技術、または酵母中でのギャップ修復遺伝子組み換え法のどちらかによって、１−ブタノール生合成経路酵素をコードする遺伝子のための発現ベクターの構築を実施した。
【０２４６】
ギャップ修復クローニングアプローチは、酵母中での高度に効率的な相同的組換えを活用する。典型的に酵母ベクターＤＮＡは消化されて（例えばその複数クローニング部位内に）、その配列中に「ギャップ」を作り出す。５’および３’末端の双方に≧２１ｂｐ配列を含有する、対象とするいくつかの挿入ＤＮＡが生じ、それは連続的に互いに重なり、ベクターＤＮＡの５’および３’末端と重なる。例えば「Ｇｅｎｅ  Ｘ」の酵母発現ベクターを構築するために、酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターを発現カセットのために選択する。プロモーターおよびターミネーターを酵母ゲノムＤＮＡから増幅し、Ｇｅｎｅ  Ｘをその生物源からＰＣＲ増幅し、あるいはＧｅｎｅ  Ｘ配列を含んでなるクローニングベクターから得る。直線化ベクター５’末端とプロモーター配列の間、プロモーターとＧｅｎｅ  Ｘの間、Ｇｅｎｅ  Ｘとターミネーター配列の間、およびターミネーターと直線化ベクター３’末端の間には、少なくとも２１ｂｐの重複配列がある。次に「ギャップド」ベクターおよび挿入ＤＮＡを酵母株に同時形質転換し、ＳＤ最小ドロップアウト培地上に播種して、コロニーを培養生育について選択し、プラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。正しい挿入断片組み合わせの存在は、ＰＣＲマッピングによって確認できる。次に酵母（通常低濃度）から単離されたプラスミドＤＮＡを例えばＴＯＰ１０などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換し、ミニプレップおよび制限酵素マッピングがそれに続いて、プラスミドコンストラクトをさらに確認する。最後に配列分析によってコンストラクトを確認できる。対象とする遺伝子によって発現される酵素活性を特性決定する酵素アッセイを実施するために、陽性プラスミドの酵母形質転換体をＳＤ培地中で生育させる。
【０２４７】
酵母培養物は、グルコース（ＳＤ培地）とプラスミド上の栄養選択マーカーの補完を可能にする適切な化合物混合物を含有する、ＹＰＤ天然培地または合成最小ドロップアウト培地中で生育させた（「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、「酵母の遺伝学と分子および細胞生物学ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  および  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（パートＡ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）２００４年）。ＳＤドロップアウト培地中の糖構成成分は、２％グルコースであった。１−ブタノール生成のために、酵母培養物を２％スクロース添加合成最小ドロップアウト培地（ＳＳ培地）中でも生育させた。
【０２４８】
酵素活性分析のために、各株の単一コロニーをＳＤ最小ドロップアウト培地を含有する新鮮なプレートに画線培養し、３０℃で２日間インキュベートした。このプレート上の細胞を使用して、２０ｍＬのＳＤドロップアウト培地に接種し、１２５ｍＬ振盪フラスコ内で、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩生育させた。一晩培養物の光学濃度（ＯＤ６００）を測定し、１．０Ｌ振盪フラスコ内の２５０ｍＬの同一培地で培養物をＯＤ６００＝０．１に希釈して、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で、０．８〜１．０の間のＯＤ６００に生育させた。次に２０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を収集し、２０ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に再懸濁した。酵素アッセイを上述のように実施した。
【０２４９】
ｔｈｌＡおよびｈｂｄの同時発現のためのプラスミドｐＮＹ１０２の構築
ｔｈｌＡおよびｈｂｄ遺伝子の同時発現のために、いくつかの二重発現ベクターを構築した。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＲＧ１０遺伝子は、ｔｈｌＡ遺伝子の機能性オルソログである。最初に酵母ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０分岐二重プロモーターである、ＧＡＬ１ターミネーター（ＧＡＬ１ｔ）およびＥＲＧ１０ターミネーター（ＥＲＧ１０ｔ）を使用して、ＥＲＧ１０およびｈｂｄの二重ベクターを構築した。プライマーＯＴ７３１（配列番号１６４）およびＯＴ７３２（配列番号１６５）を使用して、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株のゲノムＤＮＡから、ＥＲＧ１０遺伝子−ＥＲＧ１０ｔ  ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。酵母ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０分岐プロモーターはまた、プライマーＯＴ７３３（配列番号１６６）およびＯＴ７３４（配列番号１６７）を使用して、ＰＣＲによってＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲプライマーＯＴ７３５（配列番号１６８）およびＯＴ７３６（配列番号１６９）を使用して、ｈｂｄ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔ（実施例１３で述べられる）から増幅した。プライマーＯＴ７３７（配列番号１７０）およびＯＴ７３８（配列番号１７１）を使用して、ＧＡＬ１ｔをＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡから増幅した。このようにして各隣接するＰＣＲ断片間におよそ２５ｂｐの重複配列がある４つのＰＣＲ断片、ｅｒｇ１０−ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター、ｈｂｄ、およびＧＡＬ１ｔが得られた。ＧＡＬ１ｔおよびＥＲＧ１０−ＥＲＧ１０ｔ断片は、それぞれ酵母ベクターｐＲＳ４２５とおよそ２５ｂｐの重複配列を含有する。これらの配列をギャップ修復遺伝子組み換えによってアセンブルするために、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化したベクターｐＲＳ４２５と共に、ＤＮＡ断片を酵母ＢＹ４７４１株に同時形質転換した。ＳＤ−Ｌｅｕ最小プレートからコロニーを選択し、挿入断片があるクローンをＰＣＲ増幅によって同定した。新しいプラスミドをｐＮＹ６（ｐＲＳ４２５．ＥＲＧ１０ｔ−ｅｒｇ１０−ＧＡＬ１０−ＧＡＬ１−ｈｂｄ−ＧＡＬ１ｔ）と命名した。制限酵素マッピングによって、さらなる確認を実施した。
【０２５０】
プラスミドｐＮＹ６をＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１に形質転換して調製された酵母ＢＹ４７４１（ｐＮＹ６）株は、良好なＨｂｄ活性を示したが、チオラーゼ活性は示さなかった。チオラーゼ活性の欠損のために、ギャップ修復遺伝子組み換えによって、ＥＲＧ１０遺伝子をｔｈｌＡ遺伝子で置換した。ＳｐｈＩ制限部位を付加するプライマーＯＴ７９７（配列番号１７２）、およびＡｓｃＩ制限部位を付加するＯＴ７９８（配列番号１７３）を使用したＰＣＲによって、ｔｈｌＡ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｔから増幅した。プラスミドｐＮＹ６をＳｐｈＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、ゲル精製して、ｔｈｌＡのＰＣＲ産物と共に酵母ＢＹ４７４１に同時形質転換した。ｔｈｌＡのＰＣＲ産物と消化されたｐＮＹ６間の３０ｂｐの重複配列のために、ＧＡＬ１０プロモーターとＥＲＧ１０ｔターミネーターの間で、ｐＮＹ６にｔｈｌＡ遺伝子を遺伝子組み換えした。これによってプラスミドｐＮＹ７（ｐＲＳ４２５．ＥＲＧ１０ｔ−ｔｈｌＡ−ＧＡＬ１０−ＧＡＬ１−ｈｂｄ−ＧＡＬ１ｔ）が生じ、これはＰＣＲおよび制限酵素マッピングによって確認された。
【０２５１】
引き続くギャップ修復遺伝子組み換えに基づくクローニングステップでは、ｐＮＹ７中のＧＡＬ１０プロモーターをＣＵＰ１プロモーターで置換し、ＧＡＬ１プロモーターを強力なＧＰＤプロモーターで置換した。このプラスミドｐＮＹ１０（ｐＲＳ４２５．ＥＲＧ１０ｔ−ｔｈｌＡ−ＣＵＰ１−ＧＰＤ−ｈｂｄ−ＧＡＬ１ｔ）は、銅誘導性プロモーターであるＣＵＰ１下でのｔｈｌＡ遺伝子の発現、およびＧＰＤプロモーター下でのｈｂｄ遺伝子の発現を可能にする。プライマーＯＴ８０６（配列番号１７４）、およびＯＴ８０７（配列番号１７５）を使用して、酵母ＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡからＣＵＰ１プロモーター配列をＰＣＲ増幅した。プライマーＯＴ８０８（配列番号１７６）およびＯＴ８０９（配列番号１７７）を使用して、ＧＰＤプロモーターをＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡから増幅した。ＣＵＰ１およびＧＰＤプロモーターのＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＳｐｈＩ制限酵素で消化したｐＮＹ７プラスミドと組み合わせた。このギャップ修復クローニングステップから、プラスミドｐＮＹ１０を構築し、それをＰＣＲおよび制限酵素マッピングによって確認した。ｐＮＹ１０を含有する酵母ＢＹ４７４１株は、Ｈｂｄ活性を有したがＴｈｌＡ活性は有さなかった。ＧＰＤプロモーター下のＨｂｄ活性は、ＧＡＬ１プロモーター制御Ｈｂｄ活性と比べて顕著に改善された（１．８Ｕ／ｍｇ対０．４０Ｕ／ｍｇ）。配列決定分析からは、ｐＮＹ１０中のｔｈｌＡ遺伝子が３’末端近くで１塩基の欠失を有し、それが短縮タンパク質をもたらすことが明らかになった。これが株中のチオラーゼ活性欠損を説明する。
【０２５２】
プラスミドｐＮＹ１２を正しいｔｈｌＡ遺伝子配列で構築した。ＳｐｈＩおよびＡｓｃＩでの消化によってベクターｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−ＴからｔｈｌＡ遺伝子を切断した。プライマーＯＴ７９９（配列番号１７８）およびＯＴ７６１（配列番号１７９）を使用してＦＢＡ１プロモーターをＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩ制限酵素で消化した。ｔｈｌＡ遺伝子断片およびＦＢＡ１プロモーター断片をＡｓｃＩおよびＳａｌＩ部位でプラスミドｐＮＹ１０中にライゲートしてプラスミドｐＮＹ１２（ｐＲＳ４２５．ＥＲＧ１０ｔ−ｔｈｌＡ−ＦＢＡ１）を発生させ、それを制限酵素マッピングによって確認した。ｐＮＹ１２を酵母ＢＹ４７４１株に形質転換し、得られた形質転換体は１．６６Ｕ／ｍｇのＴｈｌＡ活性を示した。
【０２５３】
ｐＮＹ１２からのＦＢＡ１プロモーター−ｔｈｌＡ遺伝子断片をｐＮＹ１０中に再度サブクローニングした。ｐＮＹ１０ベクターをＡｓｃＩ制限酵素で切断し、プラスミドｐＮＹ１２から単離されたＡｓｃＩ消化されたＦＢＡ１プロモーター−ｔｈｌＡ遺伝子断片とライゲートした。これによって２つの可能な挿入断片方向がある新しいプラスミドを作り出した。互いに反対方向で隣接して位置するＦＢＡ１およびＧＰＤプロモーターによるクローンを選択し、このプラスミドをｐＮＹ１０２と命名した。ｐＮＹ１０２（ｐＲＳ４２５．ＥＲＧ１０ｔ−ｔｈｌＡ−ＦＢＡ１−ＧＰＤ−ｈｂｄ−ＧＡＬ１ｔ）を制限酵素マッピングによって確認した。ｐＮＹ１０２を酵母ＢＹ４７４１株に形質転換してＤＰＤ５２０６株を作った。ＤＰＤ５２０６のＴｈｌＡ活性は１．２４Ｕ／ｍｇであり、Ｈｂｄ活性は０．７６Ｕ／ｍｇであった。
【０２５４】
ｃｒｔ発現のためのプラスミドｐＮＹ１１の構築
酵母におけるギャップ修復遺伝子組み換えを使用して、ベクターｐＲＳ４２６中でＧＰＭ１プロモーター、ｃｒｔ遺伝子、およびＧＰＭ１ｔターミネーターを組み合わせて、ｃｒｔ遺伝子発現カセットを構築した。プライマーＯＴ８０３（配列番号１８０）およびＯＴ８０４（配列番号１８１）を使用して、酵母ＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡからＧＰＭ１プロモーターをＰＣＲ増幅した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｐＴｒｃ９９ａ−Ｅ−Ｃ−Ｈ−ＴからのＰＣＲプライマーＯＴ７８５（配列番号１８２）およびＯＴ７８６（配列番号１８３）を使用して、ｃｒｔ遺伝子を増幅した。ＯＴ７８７（配列番号１８４）およびＯＴ８０５（配列番号１８５）を使用して、酵母ＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡからＧＰＭ１ｔターミネーターをＰＣＲ増幅した。酵母ベクターｐＲＳ４２６をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化してゲル精製した。ＧＰＭ１プロモーターＰＣＲ産物、ｃｒｔ遺伝子、およびＧＰＭ１ターミネーターで、このＤＮＡを酵母ＢＹ４７４１コンピテント細胞に同時形質転換した。正しい挿入断片を有するクローンをＰＣＲおよび制限酵素マッピングによって確認し、得られた酵母ＢＹ４７４１（ｐＮＹ１１：ｐＲＳ４２６−ＧＰＭ１−ｃｒｔ−ＧＰＭ１ｔ）株は８５Ｕ／ｍｇのＣｒｔ活性を有した。
【０２５５】
ｔｈｌＡ、ｈｂｄ、およびｃｒｔの同時発現のためのプラスミドｐＮＹ１０３の構築
上流１−ブタノール経路酵素の同時発現のために、ｐＮＹ１１からのｃｒｔ遺伝子カセットをプラスミドｐＮＹ１０２中にサブクローニングして、ｈｂｄ、ｔｈｌＡ、およびｃｒｔ発現ベクターを作り出した。ＧＰＭ１プロモーター、ｃｒｔ遺伝子、およびＧＰＭ１ターミネーターを含有する２，３４７ｂｐのＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でプラスミドｐＮＹ１１から切断し、ベクターｐＮＹ１０２中にクローニングして、それをＮｏｔＩで消化し、部分的にＳａｃＩで消化し、発現ベクターｐＮＹ１０３（ｐＲＳ４２５．ＥＲＧ１０ｔ−ｔｈｌＡ−ＦＢＡ１−ＧＰＤ−ｈｂｄ−ＧＡＬ１ｔ−ＧＰＭ１ｔ−ｃｒｔ−ＧＰＭ１）を生成した。ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によるｐＮＹ１０３中の全３つのカセット存在の確認に続き、プラスミドを酵母ＢＹ４７４３細胞に形質転換し、ＤＰＤ５２００と命名された酵母株に形質転換した。標準条件下で生育させた場合、ＤＰＤ５２００は、それぞれ０．４９Ｕ／ｍｇ、０．２１Ｕ／ｍｇ、および２３．０Ｕ／ｍｇのＴｈｌＡ、Ｈｂｄ、およびＣｒｔ酵素活性を示した。
【０２５６】
ａｌｄ発現のためのプラスミドｐＮＹ８の構築
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の好ましいコドンを使用して、Ｔｅｒタンパク質（配列番号１８７）をコードするｔｅｒｙと命名されたコドン最適化遺伝子（配列番号１８６）、およびＡｌｄタンパク質（配列番号１８９）をコードするａｌｄｙ（配列番号１８８）と命名されたコドン最適化遺伝子を合成した。カリフォルニア州パロアルトのＤＮＡ２．０（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、コドン最適化ｔｅｒ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＥＲｙとコドン最適化ａｌｄ遺伝子を含有するｐＡＬＤｙが作られた。
【０２５７】
ｐＮＹ８（ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔ）をアセンブルするために、ギャップ修復遺伝子組み換えクローニングを通じて、ＧＰＤプロモーターのＰＣＲ産物（プライマーＯＴ８００（配列番号１９０）およびＯＴ７５８（配列番号１９１）、およびＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡから合成される）、ＮｃｏＩおよびＳｆｉＩでの消化によってｐＡＬＤｙから切除されたａｌｄｙ遺伝子断片（配列番号１８８）、およびＧＰＤターミネーターのＰＣＲ産物（プライマーＯＴ７５４（配列番号１９２）およびＯＴ７５５（配列番号１９３）、およびＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡから合成される）を含む３つの挿入断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＲＳ４２６ベクターと遺伝子組み換えした。酵母ＢＹ４７４１形質転換クローンをＰＣＲマッピングによって分析した。このようにして構築された新しいプラスミドｐＮＹ８を制限酵素マッピングによってさらに確認した。ｐＮＹ８を含有する酵母ＢＹ４７４１形質転換体をＡｌｄ活性について分析し、ブチリル−ＣｏＡに対する比活性はおよそ０．０７Ｕ／ｍｇであった。
【０２５８】
ｔｅｒ発現のためのプラスミドｐＮＹ９およびｐＮＹ１３の構築
ギャップ修復クローニングによって、ＦＢＡ１プロモーターの制御下で、コドン最適化ｔｅｒｙ遺伝子をベクターｐＲＳ４２６中にクローニングした。プライマーＯＴ７６０（配列番号１９４）およびＯＴ７９２（配列番号１９５）を使用して、酵母ＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡからＦＢＡ１プロモーターをＰＣＲ増幅した。ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩ制限酵素によるプラスミドｐＴＥＲｙの消化によってｔｅｒｙ遺伝子を得て、配列番号１８６で示される断片をもたらした。プライマーＯＴ７９１（配列番号１９６）およびＯＴ７６５（配列番号１９７）を使用したＰＣＲによって、酵母ＢＹ４７４３ゲノムＤＮＡからＦＢＡ１ターミネーターのＰＣＲ断片が発生した。ＦＢＡ１プロモーター、ｔｅｒ遺伝子、およびＦＢＡ１ターミネーターの３つのＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＲＳ４２６ベクターとを組み合わせ、ギャップ修復遺伝子組み換えによって酵母ＢＹ４７４１に形質転換した。得られたプラスミドｐＮＹ９（ｐＲＳ４２６−ＦＢＡ１−ｔｅｒｙ−ＦＢＡ１ｔ）をＰＣＲマッピングならびに制限酵素消化によって確認した。ｐＮＹ９の酵母ＢＹ４７４１形質転換体からは、０．２６Ｕ／ｍｇのＴｅｒ活性が生じた。
【０２５９】
最終１−ブタノール生合成経路株を作るために、それぞれが固有の栄養選択マーカーを有する、いくつかのプラスミドを含有する酵母発現株を構築することが必要であった。親ベクターｐＲＳ４２６はＵｒａ選択マーカーを含有したので、Ｈｉｓ３マーカーを含有するベクターｐＲＳ４２３中に、ｔｅｒ発現カセットをサブクローニングした。ＦＢＡ１−ｔｅｒｙ−ＦＢＡ１ｔカセットを含有する３．２ｋｂ断片をＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素での消化によってプラスミドｐＮＹ９から単離し、ベクターｐＲＳ４２３中にライゲートして、それを同じ２つの酵素で切断した。新しいプラスミドｐＮＹ１３（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ１−ｔｅｒｙ−ＦＢＡ１ｔ）を制限酵素消化によってマッピングした。ｐＮＹ１３をＢＹ４７４１株に形質転換し、形質転換体をＳＤ−Ｈｉｓ培地中で培養して、０．１９Ｕ／ｍｇのＴｅｒ活性がある株を生じさせた。
【０２６０】
１−ブタノール生成を実証するための１−ブタノール生合成経路遺伝子を含有する酵母株の構築
上述のように、プラスミドｐＮＹ１０３をＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株に形質転換して、ｔｈｌＡ、ｈｂｄ、およびｃｒｔ遺伝子の同時発現を可能にする酵母ＤＰＤ５２００株を構築した。上述のようにＤＰＤ５２００の酵母コンピテント細胞を調製し、プラスミドｐＮＹ８およびｐＮＹ１３をＤＰＤ５２００に同時形質転換して、ＤＰＤ５２１３株を生じさせた。ＤＰＤ５２１３は、１−ブタノール生合成経路中の５つの遺伝子であるｔｈｌＡ、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｔｅｒおよびａｌｄの同時構成的発現を可能にする。ＤＰＤ５２１２株（空のプラスミドｐＲＳ４２５およびｐＲＳ４２６で形質転換されたＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３株）を負の対照として使用した。２％グルコースまたは２％スクロースどちらかの存在下、ＳＤ−Ｕｒａ、−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓドロップアウト最少培地上でＤＰＤ５２１３株の４つの独立した単離物を生育させて、全３つのプラスミドの生育補完を可能にした。ＤＰＤ５２１２に単一単離物も同様に適切な培地中で生育させた。
【０２６１】
好気性培養物による１−ブタノール生成を実証するために、ＳＤ最小ドロップアウト増殖培地（含有する２％グルコース）またはＳＳ最小ドロップアウト増殖培地（含有する２％スクロース）を含有する新鮮な寒天プレート上に各株の単一コロニーを画線培養し、３０℃で２日間インキュベートした。これらのプレートからの細胞を使用して、１２５ｍＬプラスチック振盪フラスコ内の２０ｍＬの最小ドロップアウト培地（ＳＤまたはＳＳのどちらか）に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩生育させた。一晩培養物の光学濃度（ＯＤ６００）を測定し、１２５ｍＬ振盪フラスコ内の２５ｍＬの同一培地で培養物を０．１のＯＤ６００に希釈して、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で生育させた。
【０２６２】
一般法セクションで述べられるようにして、ＦＩＤ検出による１−ブタノール生成のＧＣ分析（ＨＰ−イノワックス（ＩＮＮＯＷａｘ）カラム、内径３０ｍ×０．５３ｍｍ、フィルム厚１μｍ）のために、培養物のアリコートを２４時間および４８時間除去した。ＧＣ分析の結果を表１５に示す。
【０２６３】
【表２８】
2009509541.tif 000030
【０２６４】
実施例１８（予測的）
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
この予測的実施例の目的は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）中でどのように１−ブタノール生合成経路を発現するかについて述べることである。６つの酵素活性をコードする１−ブタノール経路の６つの遺伝子を発現のために２つのオペロンに分割する。ホルス（Ｈｏｌｓ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４０１〜１４１３頁、１９９４年、で述べられる方法を使用した相同的組換えによって、経路の最初の３つの遺伝子（それぞれ酵素アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびクロトナーゼをコードするｔｈｌ、ｈｂｄ、およびｃｒｔ）をラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）染色体中に組み込む。最後の３つの遺伝子（それぞれ酵素ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびブタノールデヒドロゲナーゼをコードするＥｇＴＥＲ、ａｌｄ、およびｂｄｈＢ）を発現プラスミド中にクローニングして、組み込まれた上流経路１−ブタノール遺伝子を保有する乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換する。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からのＭＲＳ培地中で、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を３７℃で生育させる。モレイラ（Ｍｏｒｅｉｒａ）ら、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１５頁、２００５年、で述べられるようにして、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）から染色体ＤＮＡを単離する。
【０２６５】
組み込み
相同的組換えによって、合成Ｐ１１プロモーターの制御下にあるｔｈｌ−ｈｂｄ−ｃｒｔカセット（（Ｒｕｄ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１０１１〜１０１９頁、２００６年）をラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−７９３（ＮＣＩＭＢ８８２６）の染色体中にｌｄｈＬ１遺伝子座で組み込む。ｌｄｈＬ組み込み標的ベクターを構築するために、ｌｄｈＬと相同性があるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ジェンバンクＮＣ＿００４５６７）からのＤＮＡ断片をプライマーＬＤＨＥｃｏＲＶＦ（配列番号１９８）およびＬＤＨＡａｔＩＩＲ（配列番号１９９）でＰＣＲ増幅する。１９８６ｂｐのＰＣＲ断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして、配列決定する。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ｌｄｈＬ１クローンをＥｃｏＲＶおよびＡａｔＩＩで消化して１９８２ｂｐのｌｄｈＬ１断片を放出し、それをゲル精製する。実施例１４で述べられる組み込みベクターｐＦＰ９８８をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を平滑化する。次に直線化プラスミドをＡａｔＩＩで消化し、２９３１ｂｐベクター断片をゲル精製する。ＥｃｏＲＶ／ＡａｔＩＩｌｄｈＬ１断片とｐＦＰ９８８ベクター断片とをライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換する。アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択し、コロニーＰＣＲによってスクリーンして、ｐＦＰ９８８−ｌｄｈＬの構築を確認する。
【０２６６】
一体化ＤＮＡに選択可能なマーカーを付加するために、Ｃｍ遺伝子をそのプロモーターと共にｐＣ１９４（ジェンバンクＮＣ＿００２０１３）から、プライマーＣｍＦ（配列番号２００）およびＣｍＲ（配列番号２０１）でＰＣＲ増幅して、８３６ｂｐのＰＣＲ産物を増幅する。単位複製配列をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換して、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｃｍを作り出す。配列決定してＰＣＲによるエラーが導入されなかったことを確認した後、ＣｍカセットをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｃｍから８２８ｂｐのＭｌｕＩ／ＳｗａＩ断片として消化し、ゲル精製する。ｌｄｈＬ−相同性含有組み込みベクターｐＦＰ９８８−ｌｄｈＬをＭｌｕＩおよびＳｗａＩで消化し、４７４０ｂｐベクター断片をゲル精製する。Ｃｍカセット断片とｐＦＰ９８８−ｌｄｈＬベクターとをライゲートして、ｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：Ｃｍを作り出す。
【０２６７】
最後に実施例１４で述べられるｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｈ−Ｃからのｔｈｌ−ｈｂｄ−ｃｒｔカセットを改変して、アミラーゼプロモーターを合成Ｐ１１プロモーターで置換する。次にオペロン全体をｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：Ｃｍ中に移動させる。プライマーＰ１１Ｆ（配列番号２０２）およびＰ１１Ｒ（配列番号２０３）とのオリゴヌクレオチドアニーリングによって、Ｐ１１プロモーターを構築する。アニールされたオリゴヌクレオチドをカリフォルニア州サンディエゴのエンビ・テック（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からの６％ウルトラＰＡＧＥゲル上でゲル精製する。プラスミドｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｈ−ＣをＸｈｏＩおよびＳｍａＩで消化し、９ｋｂｐベクター断片をゲル精製する。単離されたＰ１１断片と、消化されたｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｈ−Ｃとをライゲートして、ｐＦＰ９８８−Ｐ１１−Ｔ−Ｈ−Ｃを作り出す。プラスミドｐＦＰ９８８−Ｐ１１−Ｔ−Ｈ−ＣをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、３０３４ｂｐＰ１１−Ｔ−Ｈ−Ｃ断片をゲル精製する。ｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ：：ＣｍをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、５５５８ｂｐベクター断片を単離する。上流経路オペロンと組み込みベクターとをライゲートして、ｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ−Ｐ１１−ＴＨＣ：：Ｃｍを作り出す。
【０２６８】
外来性ｔｈｌ、ｈｂｄ、およびｃｒｔ遺伝子を含んでなるＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ΔｌｄｈＬ１：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：Ｃｍを形成するためのＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＢＡＡ−７９３中へのｐＦＰ９８８−ＤｌｄｈＬ−Ｐ１１−ＴＨＣ：：Ｃｍの組み込み
ニコロフ（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ），Ｊ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」より、第４７巻、アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ），Ｔ．Ｗ．ら、「微生物のための電気穿孔プロトコル（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２０１〜２０８頁、１９９５年、で述べられるようにして、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のエレクトロコンピテント細胞を調製する。電気穿孔後、アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ）ら（前出）によって述べられるようにして、細胞をＭＲＳＳＭ培地（０．５Ｍスクロースおよび０．１ＭＭｇＣｌ２で栄養強化されたＭＲＳ培地）中で撹拌せずに３７℃で２時間増殖させる。電気穿孔された細胞を選択のためにクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）含有ＭＲＳプレート上に播種して、３７℃でインキュベートする。形質転換体を最初にコロニーＰＣＲ増幅によってスクリーンして組み込みを確認し、次に最初の陽性クローンを一群のプライマーでのＰＣＲ増幅によってより厳密にスクリーンする。
【０２６９】
ＥｇＴＥＲ、ａｌｄ、およびｂｄｈＢ遺伝子のプラスミド発現
Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｌｄｈＬプロモーター（フェライン（Ｆｅｒａｉｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５９６〜６０１頁、１９９４年）の制御下にあるプラスミドｐＴＲＫＨ３（オサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ＤＪおよびクラエンハマー（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ）ＴＲ，Ｇｅｎｅ  １３７：２２７〜２３１頁、１９９３年）から、残る３つの１−ブタノール遺伝子を発現する。Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−７９３のゲノムから、ｌｄｈＬプロモーターをプライマーＰｌｄｈＬＦ（配列番号２０４）およびＰｌｄｈＬＲ（配列番号２０５）でＰＣＲ増幅する。３６９ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローニングして配列決定する。得られたプラスミドｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ＰｌｄｈＬをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、３５９ｂｐのＰｌｄｈＬ断片を放出する。
【０２７０】
実施例１４で述べられるｐＨＴ０１−ａｌｄ−ＥＢをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１０５０３ｂｐベクター断片をゲル精製によって回収する。ＰｌｄｈＬ断片とベクターとをライゲートして、ｐＨＴ０１−Ｐｌｄｈｌ−ａｌｄ−ＥＢを作り出す。
【０２７１】
ｌｄｈＬプロモーター−ａｌｄ−ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈカセットをサブクローンするために、ｐＨＴ０１−Ｐｌｄｈｌ−ａｌｄ−ＥＢをＭｌｕＩで消化し、末端をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼで処理する。直線化ベクターをＳａｌＩで消化し、ＰｌｄｈＬ−ＡＥＢ断片を含有する４２７０ｂｐの断片をゲル精製する。プラスミドｐＴＲＫＨ３をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ゲル精製されたベクター断片とＰｌｄｈＬ−ＡＥＢ断片とをライゲートする。ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トップ１０細胞に形質転換し、形質転換体をエリスロマイシン（１５０ｍｇ／Ｌ）を含有するミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの脳心臓浸出物（ＢＨＩ）プレート上に播種する。形質転換体をＰＣＲによってスクリーンし、ｐＴＲＫＨ３−ａｌｄ−Ｅ−Ｂの構築を確認する。上述のように電気穿孔によって、発現プラスミドｐＴＲＫＨ３−ａｌｄ−Ｅ−ＢをＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ΔｌｄｈＬ１：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：Ｃｍに形質転換する。
【０２７２】
エリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加した５０ｍＬのＭＲＳ培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、ｐＴＲＫＨ３−ａｌｄ−Ｅ−Ｂを含有するＬ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ΔｌｄｈＬ１：：Ｔ−Ｈ−Ｃ：：Ｃｍを接種して、３７℃で振盪せずに１８〜２４時間生育させる。１８〜２４時間後、一般法セクションで述べられるようにしてＨＰＬＣまたはＧＣ分析により、１−ブタノールを検出する。
【０２７３】
実施例１９（予測的）
エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）中での１−ブタノール生合成経路の発現
この予測的実施例の目的は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）中でどのように１−ブタノール生合成経路を発現するかについて述べることである。本実施例において１−ブタノール生合成経路の発現のための宿主株として使用されるエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３株の完全なゲノム配列は公開されている（ポールセン（Ｐａｕｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：２０７１〜２０７４頁、２００３年）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／グラム陽性シャトルベクターであるプラスミドｐＴＲＫＨ３（オサリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ＤＪおよびクラエンハマー（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ）ＴＲ，Ｇｅｎｅ  １３７：２２７〜２３１頁、１９９３年）を、１オペロン中の１−ブタノール経路の６つの遺伝子（ｔｈｌＡ、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ＥｇＴＥＲ、ａｌｄ、ｂｄｈＢ）の発現のために使用する。ｐＴＲＫＨ３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｐ１５Ａ複製基点およびｐＡＭβ１レプリコン、および２つの抗生物質抵抗性選択マーカーであるテトラサイクリン抵抗性およびエリスロマイシン抵抗性を含有する。テトラサイクリン抵抗性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのみ発現し、エリスロマイシン抵抗性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびグラム陽性細菌の双方で発現する。プラスミドｐＡＭβ１誘導体はＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）中で複製できる（ポイヤー（Ｐｏｙａｒｔ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５６：１９３〜１９８頁、１９９７年）。エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）をはじめとする多様なグラム陽性細菌中でのナイシンによる遺伝子発現の効率的な制御のために使用される、誘導性ｎｉｓＡプロモーター（ＰｎｉｓＡ）（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２７６３〜２７６９頁、１９９８年）を使用して、１−ブタノール生合成経路の酵素をコードする６つの所望の遺伝子の発現を制御する。
【０２７４】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ゲノムＤＮＡから、ｎｉｓＡプロモーターを含有する線状ＤＮＡ断片（２１５ｂｐ）（チャンドラパティ（Ｃｈａｎｄｒａｐａｔｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（２）：４６７〜４７７頁、２００２年）をプライマーＦ−ＰｎｉｓＡ（ＥｃｏＲＶ）（配列番号２０６）およびＲ−ＰｎｉｓＡ（ＰｍｅＩＢａｍＨＩ）（配列番号２０７）でＰＣＲ−増幅する。２１５ｂｐのＰＣＲ断片をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＰｎｉｓＡ断片をゲル精製する。プラスミドｐＴＲＫＨ３をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクター断片をゲル精製する。直線化ｐＴＲＫＨ３とＰｎｉｓＡ断片とをライゲートする。電気穿孔によってライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上での３７℃での一晩の生育に続いて、形質転換体を選択する。次に形質転換体をプライマーＦ−ＰｎｉｓＡ（ＥｃｏＲＶ）およびＲ−ＰｎｉｓＡ（ＢａｍＨＩ）でコロニーＰＣＲによってスクリーンし、ｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡの正しいクローンを確認する。
【０２７５】
プラスミドｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡをＰｍｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターをゲル精製する。実施例１４で述べられるようにしてプラスミドｐＨＴＯ１−ａｌｄ−ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈＢを構築し、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２，９７３ｂｐのａｌｄ−ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈＢ断片をゲル精製する。２，９７３ｂｐのａｌｄ−ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈＢ断片をｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡベクター中にＰｍｅＩおよびＢａｍＨＩ部位でライゲートする。電気穿孔によってライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩のインキュベーションに続いて、形質転換体を選択する。次に形質転換体をプライマーａｌｄ  フォワードプライマーＮ２７Ｆ１（配列番号３１）およびｂｄｈＢ  リバースプライマーＮ６５（配列番号４４）でコロニーＰＣＲによってスクリーンする。得られたプラスミドをｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡ−ａｌｄ−ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈＢ（＝ｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂ）と命名する。
【０２７６】
形質転換体からプラスミドｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂを精製し、ｂｄｈＢ遺伝子下流に位置するＢａｍＨＩ部位中への残る遺伝子（ｔｈｌＡ、ｈｂｄ、ｃｒｔ）のさらなるクローニングのために使用する。プラスミドｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−ＢをＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理して平滑末端を作る。実施例１４で述べられるようにしてプラスミドｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−ｃｒｔ（＝ｐＦＰ９８８Ｄｓｓ−Ｔ−Ｈ−Ｃ）を構築し、ＳｍａＩおよびＢａｍＨで消化する。得られた２，９７３ｂｐのｔｈｌＡ−ｈｂｄ−ｃｒｔ断片をＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理して平滑末端を作り、ゲル精製する。２，９７３ｂｐのｔｈｌＡ−ｈｂｄ−ｃｒｔ断片と直線化ｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂとをライゲートする。電気穿孔によってライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上での３７℃での一晩生育に続いて、形質転換体を選択する。次に形質転換体をプライマーｔｈｌＡ  フォワードプライマーＮ７（配列番号２１）およびｃｒｔ  リバースプライマーＮ４（配列番号１８）でのコロニーＰＣＲによってスクリーンする。得られたプラスミドをｐＴＲＫＨ３−ＰｎｉｓＡ−ａｌｄ−ＥｇＴＥＲ−ｂｄｈＢ−ｔｈｌＡ−ｈｂｄ−ｃｒｔ（＝ｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂ−Ｔ−Ｈ−Ｃ）と命名する。プラスミドｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂ−Ｔ−Ｈ−Ｃを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から調製し、当該技術分野で既知の方法（ニコロフ（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ），Ｊ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」より、第４７巻、アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ），Ｔ．Ｗ．ら、「微生物のための電気穿孔プロトコル（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２１７〜２２６頁、１９９５年）を使用して、電気穿孔によりエレクトロコンピテントＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３細胞に形質転換し、Ｅ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３／ｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂ−Ｔ−Ｈ−Ｃを得る。
【０２７７】
ｎｉｓＡ調節遺伝子であるｎｉｓＲとｎｉｓＫ、ａｄｄ９スペクチノマイシン抵抗性遺伝子、およびｐＳＨ７１複製起点を含有する第２のプラスミドを、電気穿孔によってＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３／ｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂ−Ｔ−Ｈ−Ｃに形質転換する。ｐＳＨ７１複製起点含を有するプラスミドは、Ｅ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）中のｐＡＭβ１誘導体と適合性である（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、前出）。エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天プレート上で二重薬剤抵抗性形質転換体を選択する。
【０２７８】
酵母抽出物（０．２％）（フィシェッティ（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：１３８４〜１４０１頁、１９８５年）、ナイシン（２０μｇ／ｍＬ）（アイヘンバウム（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、前出）、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）で栄養強化された５０ｍＬのトッド−ヒューウィット・ブロスを含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに、２つのプラスミド、すなわち発現プラスミド（ｐＴＲＫＨ３−Ａ−Ｅ−Ｂ−Ｔ−Ｈ−Ｃ）および調節プラスミド（ｐＳＨ７１−ｎｉｓＲＫ）を保有する得られたＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３Ｂ株を接種する。フラスコを振盪せずに３７℃で１８〜２４時間インキュベートした後、一般法セクションで述べられるようにしてＨＰＬＣまたはＧＣ分析により１−ブタノール生成を測定する。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】１−ブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、および「ｆ」と標識されたステップは、下で述べられる基質から産物への変換に相当する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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