(57)【要約】  本発明は、動物及び哺乳動物患者における血清リン酸塩レベルを治療上制御並びに／或いは低減するための改善された方法及び組成物を提供する。上記方法は、上記患者のＧＩ管からの相当量のリン酸塩の吸収を防止するのに有効な量のデンドリマー組成物を当該患者へ投与することを含む。好ましい形態では、１日あたり２．５〜１５グラムの用量は、上記患者のＧＩ管中に存在する８０％を上回るリン酸塩が吸収されるのを防止するのに有効である。上記デンドリマー組成物は、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロアセテート又はヒドロアニオン形態を含み得る。【選択図】図１Ａ
2009507928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における血清リン酸塩レベルを制御する方法であって、該哺乳動物のＧＩ管からの相当量のリン酸塩の吸収を防止するのに有効な量のデンドリマー組成物を該哺乳動物へ投与することを含み、該哺乳動物の血清リン酸塩レベルが制御される、哺乳動物における血清リン酸塩レベルを制御する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物のＧＩ管中のリン酸塩の少なくとも５０％が、吸収されるのを防止される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物のＧＩ管中のリン酸塩の少なくとも８０％が、吸収されるのを防止される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の哺乳動物に投与されるデンドリマー組成物の量が、１日あたり２．５〜１５グラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロアニオン形態のデンドリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロクロリド形態のデンドリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロブロミド形態のデンドリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロアセテート形態のデンドリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒドロクロリド、ヒドロブロミド又はヒドロアセテート形態のデンドリマーを含むデンドリマー組成物。
【請求項１０】
前記デンドリマー組成物が、エリスロ−１，２，３，４−テトラアミノブタンテトラヒドロクロリド又はジアミノブタンから成る群から選択される、請求項９に記載のデンドリマー組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、構造４に従う構造を含む、請求項９に記載のデンドリマー組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、構造５に従う構造を含む、請求項９に記載のデンドリマー組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、構造６に従う構造を含む、請求項９に記載のデンドリマー組成物。
【請求項１４】
動物における腸内リン酸塩吸収を低減する方法であって、該動物のＧＩ管からの相当量のリン酸塩の吸収を防止するのに有効な量のデンドリマー組成物を該動物へ投与することにより該動物の腸内リン酸塩吸収が低減される、動物における腸内リン酸塩吸収を低減する方法。
【請求項１５】
前記動物のＧＩ管中のリン酸塩の少なくとも５０％が、吸収されるのを防止される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物のＧＩ管中のリン酸塩の少なくとも８０％が、吸収されるのを防止される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記の動物に投与されるデンドリマー組成物の量が、１日あたり２．５〜１５グラムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロクロリド形態のデンドリマーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロブロミド形態のデンドリマーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記デンドリマー組成物が、ヒドロアセテート形態のデンドリマーを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年９月１４日に出願された米国仮出願第６０／７１７，０７２号（これは、参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
［連邦支援の研究又は開発に関する記述］
該当なし。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は概して、以下で規定するように、好ましくはデンドリマーの使用による哺乳動物患者における治療上のリン酸塩結合のための方法及び組成物に関する。最も好ましくは、本発明の方法及び組成物は、リン酸塩を排出することができない透析患者等に使用される。
【背景技術】
【０００４】
［背景］
腎臓は、血液からの毒素及び過剰な栄養分を濾過するその能力にとってだけでなく、ビタミンＤ3の活性形態である１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3［１，２５(ＯＨ)2Ｄ3］を合成するその能力にとっても必須である。慢性腎臓疾患を伴う患者においては、これらの機能はともに低下している。その結果、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3のレベルは減少して、低カルシウム血症を招く。その一方で、栄養分、特にリンは血中に蓄積する。低カルシウム血症及び高リン酸塩血症はともに、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）分泌の強力な刺激物質である。時間とともに、微量の１，２５(ＯＨ)2Ｄ3の存在下であっても副甲状腺機能亢進症は過剰な骨吸収を引き起こし、腎性骨ジストロフィーとして知られる状態を招く（１）。この状態を防止するには、透析治療のほかに、過度のＰＴＨレベルを抑制し、血中のリンを低減することが必須である。
【０００５】
１，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ2（１９−ノル−Ｄ2、Ｚｅｍｐｌａｒ（登録商標）、Abbott  Laboratories，Abbott  Park，IL）及び１α−ヒドロキシビタミンＤ2［１α−(ＯＨ)Ｄ2、Ｈｅｃｔｏｒｏｌ（登録商標）、Genzyme  Corporation/Bone  Care  International，Middleton，WI］のようなビタミンＤ類似体(analog)は、副甲状腺機能亢進症を抑制するために患者に投与される。これらの類似体は、ＰＴＨレベルを抑制するのに有効であるが、それらは依然として、腸カルシウム及びリン酸塩吸収を刺激する能力を幾らか保持しており、これは、類似体が高用量で又はカルシウムベースの経口リン酸塩結合剤と併用して投与される場合に問題となり得る（１）。
【０００６】
食品からのリンの吸収を低減することもまた、魅力的な課業である。リンに関する現行の推奨食事許容量（ＲＤＡ）は、１日につき７００ｍｇである（２）が、ほとんどの米国人は、毎日１０００〜１６００ｍｇのリンを消費している（３）。食餌性リン制限は、乳製品、肉、魚、卵、木の実、穀物、焼き菓子及び清涼飲料のような食品中にリンが豊富に含まれるのであまり有効ではない。さらに、消費したリンの６５〜７５％が吸収されると推定される（４）。結果として、リンの吸収を低減するために、経口リン酸塩結合剤が、食事とともに投与される場合が多い。
【０００７】
１９７０年代では、アルミニウムベースの結合剤が、食品からのリン酸塩を結合するのに広範囲にわたって使用されたが、アルミニウムが患者に蓄積し、骨疾患、脳障害及び貧血のような中毒性副作用を引きおこすことが示された後に、その使用が大幅に低減された（５）。次に、酢酸カルシウム(ＰｈｏｓＬｏ，Nabi  Pharmaceuticals，Boca  Raton，FL)が、アルミニウムベースの結合剤の代替物として開発されたが、有効となるには高レベルで投与されなければならない。さらに、１，２５(ＯＨ)2Ｄ3又はビタミンＤ類似体と併用して投与すると、経口カルシウムは、高カルシウム血症の一因となり得る（５）。近年、炭酸ランタン（Ｆｏｓｒｅｎｏｌ（登録商標）、Shire  US  Incorporated，Wayne，PA）が、経口リン酸塩結合剤としての使用に関してＦＤＡにより認可された。有効であるが、炭酸ランタンの吸収の低速が、毒性問題が長期使用に伴って生じ得るという幾らかの憶測をもたらす（６）。
【０００８】
リン酸塩結合ポリマーである塩酸セベラマー（Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）、Genzyme  Corporation，Cambridge，MA）は、アルミニウム又はカルシウムよりも少ない副作用で、食餌性リンの吸収を低減するのに首尾よく使用されている（７）。残念なことに、塩酸セベラマーは、値段が高く（２００２年では１年につき平均費用４４００ドル）、また有効となるには大量に摂取しなくてはならない（１日当たり平均用量６．５ｇ）（８）。
【０００９】
デンドリマー類は、既知の治療用ツールである。デンドリマー類は、造影剤、ナノスキャフォールド、抗腫瘍薬、遺伝子トランスフェクション剤、ナノスケール容器及びバイオミメティック人工タンパク質を含む用途で使用されている（１４）。しかしながら、リン酸塩を結合し、それにより低カルシウム血症、高リン酸塩血症及び慢性腎臓疾患を治療する治療用デンドリマー組成物は知られていない。
【００１０】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸塩を結合し、且つその吸収を阻害することができる様々な量の遊離アミンを含有するデンドリマー組成物が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
［発明の簡単な説明］
本発明は、哺乳動物のＧＩ管からの相当量のリン酸塩の吸収を防止するのに有効な量のデンドリマー組成物を哺乳動物へ投与すること（ここで、当該哺乳動物の血清リン酸塩レベルが制御される）を含む哺乳動物における血清リン酸レベルを制御する改善された方法を提供する。１日あたり２．５〜１５グラムの用量は、哺乳動物のＧＩ管中に存在するリン酸塩の少なくとも５０％が吸収されるのを防止するのに有効である。好ましい態様では、リン酸塩の少なくとも８０％が、吸収されるのを防止される。上記デンドリマー組成物は、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロアセテート又は幾つかのヒドロアニオン形態を含み得る。
【００１２】
好ましい態様では、上記デンドリマーは、エリスロ−１，２，３，４−テトラアミノブタンテトラヒドロクロリド又はジアミノブタンから成る群から選択される。さらに好ましい形態では、上記デンドリマー組成物は、構造４、構造５又は構造６（図１Ｄ〜図１Ｆ）に従うデンドリマーを含む。
【００１３】
別の形態では、本発明は、動物のＧＩ管からの相当量のリン酸塩の吸収を防止するのに有効な量のデンドリマー組成物を動物へ投与すること（ここで、当該動物の血清リン酸塩レベルが低減される）により動物において腸内リン酸塩吸収を低減する方法を提供する。好ましい形態では、１日あたり２．５〜１５グラムの用量は、動物のＧＩ管中に存在するリン酸塩の少なくとも５０％が吸収されるのを防止するのに有効である。好ましい形態では、リン酸塩の少なくとも８０％が、吸収されるのを防止される。上記デンドリマー組成物は、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、若しくはヒドロアセテート又は他のヒドロアニオン形態を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本発明は、以下で規定するように、好ましくはデンドリマーの使用による動物又は哺乳動物患者における治療上のリン酸塩結合の改善された方法を提供する。最も好ましくは、本発明の方法は、リン酸塩を排出することができない透析患者等に使用される。
【００１５】
本発明はまた、治療用デンドリマー組成物を提供する。好ましくは、本発明は、米国特許第５，５３０，０９２号及び同第５，６１０，２６８号（本明細書中に援用される）に記載されるヒドロクロリド、ヒドロブロミド又はヒドロアセテート形態のデンドリマーである。最も好ましくは、本発明は、ヒドロクロリド形態のＤＡＢ−１６及びＤＡＢ−６４である（図１Ｅ及び図１Ｆ）。
【００１６】
本発明は、患者における血清リン酸塩レベルを制御するのに有効な量のデンドリマー組成物で患者を治療することを包含する。「制御する」とは、本発明者等は、患者へ投与されるデンドリマーの用量及び組成物に応じて、患者のＧＩ管により吸収されるリン酸塩の量を増加及び／又はより好ましくは減少させることを意味する。例えば、患者が、低減されたレベルの血清リン酸塩を要する場合、本発明は、ＧＩ管からの相当量のリン酸塩の吸収を防止する。「相当」とは、本発明者等は、本発明が、リン酸塩の少なくとも５０％がＧＩ管中に吸収されるのを防止することを意味する。最も好ましくは、本発明は、リン酸塩の少なくとも８０％がＧＩ管中に吸収されるのを防止する。
【００１７】
本発明の有効性は、当該技術分野で既知の任意の従来試験により、患者の血清リン酸塩レベルを測定することにより確定される。本発明は、患者の血清リン酸塩レベルが少なくとも１０％低減される場合に、しかしより好ましくは患者の血清リン酸塩レベルが少なくとも２０％低減される場合に有効である。
【００１８】
デンドリマーは、１日あたり２．５〜１５グラムの範囲の量で投与される。この用量は好ましくは、２回以上の食事で等しく分割される。好適な投与経路は、飲料又はカプセルのような液体形態である。デンドリマー組成物が可溶性であることは本発明の利点である。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物における血清リン酸塩レベルを低減及び／又は制御するように意図される薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせたデンドリマー組成物を含む薬学的組成物を包含し得る。上記組成物は、哺乳動物、細胞又は摘出臓器へ投与され得る。
【００２０】
適切な薬学的キャリアの例は当該技術分野で既知であり、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、各種の湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。かかるキャリアを含む組成物は、既知の従来の方法により配合され得る。これらの薬学的組成物は、適切な用量で哺乳動物へ投与することができる。
【００２１】
適切な組成物の投与は、種々の方法により、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所又は皮内注射により、或いは吸入又は頭蓋内注射により達成され得る。
【００２２】
「デンドリマー組成物」とは、本発明者等は、米国特許第５，５３０，０９２号及び同第５，６１０，２６８号（参照により本明細書に援用される）に記載される分子を包含することを意味する。これらの分子は、コア及びコアから生じた分岐を含む高分子を包含し、ここで分岐はシアン化ビニル及び／又はフマリルジナトリル（dinatrile）単位に基づく。最も好ましくは、デンドリマーは、ジアミノブタン（ＤＡＢ）デンドリマーを含む。
【００２３】
「デンドリマー組成物」とは、本発明者等はまた、上記で列挙した特許に記載されるデンドリマーの中和形態を包含することを意味する。最も好ましくは、ジアミノブタンデンドリマーは、以下で記載されるようなヒドロクロリド形態で存在する。他の好適な中和形態としては、ヒドロブロミド（又は任意のハロゲン化物若しくは有機酸）形態及びヒドロアセテート形態が挙げられる。
【００２４】
この種のデンドリマー組成物は、米国特許第５，５３０，０９２号及び同第５，６１０，２６８号（参照により本明細書に援用される）並びにBuhleier著「分子空洞トポロジーの「カスケード」及び「ノンスキッドチェーン様」合成（"Cascade"  and  "Non-skid-Chain-Like"  Synthesis  of  Molecular  Cavity  Topologyies）」  Synthesis，155-158（Feb．1978）に記載されるものを含む従来の技法に従って合成され得る。
【実施例】
【００２５】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様について記述する。しかしながら、これらの実施例は、実例として提供されるものであり、実施例内の事項は、本発明の全般的な範囲に対する限定と解釈されるべきではないことが理解されよう。
【００２６】
材料及び方法
動物。
およそ１２０グラムの重さの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Harlan  Sprague-Dawley，Madison，WI）を全ての実験で使用した。
【００２７】
33Ｐ吸収を測定する実験では、ラットに、実験に先立って１週間未満、随意に１％カルシウム及び０．７％リンを含有する研究室食餌（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  ５０１２，Richmond，IN）を供給した。
【００２８】
糞便のカルシウム及びリンのレベルを測定する実験では、ラットに９日間、従来記載される精製食餌（９）を供給した。この食餌は、卵白タンパク質（Harlan  Teklad，Madison，WI）と混合され、０．２０％無機リン及び０．４７％カルシウムを含有した。精製食餌に、α−トコフェロール５００μｇ、メナジオン６０μｇ、β−カロテン４０μｇ及びコレカルシフェロール１．８７５μｇを含有するダイズ油（Ｗｅｓｓｏｎ油、ConAgra  Foods，Irvine，CA）１００μＬを毎週３回補給した。
【００２９】
ラットは全て、１２時間の光／１２時間の暗闇のサイクル下でハンギングワイヤケージ中に収容し、蒸留水へは自由に近づけた。実験方法は全て、ウィスコンシン・マディソン大学にある動物資源調査センター（the  Research  Animal  Resources  Center）により認可された。
【００３０】
腸内リン酸塩吸収。
一晩の絶食後、ラットに、水０．５ｍＬ又は水中に溶解させた経口リン酸塩結合剤を胃強制補給(gastric  gavage)により投与した。ｐＨ７．４での１０ｍＭ、５０ｍＭ又は１００ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液中に３μＣｉ  33Ｐ（Ｈ3ＰＯ4として、比活性１５５．８  Ｃｉ／ｍｇ、New  England  Nuclear/Perkin  Elmer，Boston，MA）を含有する０．５ｍＬの第２の用量を胃強制補給により即座に投与した。ラットは、経口投薬の直後又は６０分後にＣＯ2窒息により死滅させた。即座に死滅させたラット（図中では「０分対照」と呼ばれる）を使用して、経口33Ｐ用量が適正に投与されて、完全に回収されたか否かを確定した。
【００３１】
血液を心臓穿刺により回収して、２２℃で１５分間１５００×ｇで遠心分離させて、血清を得た。続いて、食道の頭蓋末端に縫合糸を縛り、胃の内部に液体を含有させた。続いて、消化管全体を取り出して、濃ＨＮＯ3（組織１ｍｇ当たりＨＮＯ3およそ１ｍＬ）中で数日間溶解させた。溶解した消化管の正確な容積は、溶解した組織を水で等容積へ希釈させることにより確定した。
【００３２】
総体内血清及び溶解した組織の総容積中の放射能の量を、分取量５０μＬの液体シンチレーション計数を受けて三重反復で確定した（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ液体シンチレーション分析器、Perkin-Elmer/Packard，Boston，MA）。総体内血清は、血清４０ｍＬ／ｋｇ（体重）であると推定した（１０）。
【００３３】
糞便のカルシウム及びリンの測定。
ラットに、上述する精製食餌或いは１．２％カルシウム、０．１５％Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）又は０．１５％ＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８若しくはＤＡＢ−１６を有する同じ食餌を７日間供給した。続いて、ラットを代謝ケージへ移動させて、糞便を４８時間回収した。糞便サンプルを凍結させて、凍結乾燥させて、マッフル炉中で一晩６００℃超に加熱した。次に、残存灰分を６Ｎ  ＨＣｌ  ２５ｍＬ中に一晩溶解させた。酸のカルシウム濃度は、１ｇ／ＬのＬａＣｌ3で１：４０に希釈した溶解灰分の一定分量を使用してフレーム原子吸光分析（モデル３１１０、Perkin  Elmer，Norwalk，CT）により確定された。溶解灰分の一定分量のリン濃度は、従来記載される比色アッセイにより確定された（１１）。
【００３４】
統計分析。
データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。処理群は、完全要因(fully  factorial)分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較されて、平均値をTukey、Scheffe及びFisherの最小有意差（ＬＳＤ）検定（Ｓｙｓｔａｔ  ５．２．１、Systat  Software，Inc.，Point  Richmond，CA）に付した。別記しない限り、検定の少なくとも２つが０．０５未満のｐ値を伴う有意性を検出した場合に、差は有意であるとみなされた。
【００３５】
構造１であるＦＣの合成。
図６に見られるように、構造１であるＦＣ（図６中の化合物１７）の合成は、３工程プロセスである。工程１では、乾燥ピリジン４ｍＬ（４９．４ｍｍｏｌ）中のＤ−マンニトール（化合物１４）１７４ｍｇ（０．９５ｍｍｏｌ）の懸濁液をアルゴン下で室温にて０．５時間攪拌した。次に、乾燥ジクロロメタン（１４ｍＬ）を添加して、混合物を−１０℃（塩氷浴）まで冷却して、トリフルオロメタンスルホン酸（triflic）無水物（１．１５ｍＬ、６．８６ｍｍｏｌ）を０．５時間かけて滴下した。攪拌を４℃（低温室）で１２時間続けた。溶液をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈して、水（６×７ｍＬ）、ＣｕＳＯ4の飽和水溶液（７ｍＬ）、再び水（３×７ｍＬ）で洗浄して、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、濾過した。溶媒の蒸発、続いて非常に敏速なカラムクロマトグラフィ（３０％ヘキサン／酢酸エチル）により、不安定なクリーム色半固体化合物１５（１３９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、収率１５％）を得た。［α］D  ＋９７．９（ｃ．１．０、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ  ４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．７７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、５．２１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ７０．９、８０．４、８０．４５、１１８．５（ｑ、ＪC,F＝３１８．９８Ｈｚ）。
【００３６】
工程２では、化合物１５  １２０ｍｇ（０．１２３ｍｍｏｌ）及びＮａＮ3  ７２ｍｇ（１．１０７ｍｍｏｌ）を乾燥ベンゼン（２ｍＬ）中に溶解させた。１８−クラウン−６（０．９５６ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物をアルゴン下で４０℃にて３時間攪拌した後、室温まで冷却して、ＣＨ2ＣＬ2（１０ｍＬ）で希釈して、水（６×４ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、濾過して、減圧下で非常に慎重に濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製した。クロマトグラフィ後、溶媒を減圧下で、また最終的にはアルゴン流を１時間パージすることにより除去して、無色油状物質として化合物１６（２０ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ、収率８３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ  ３．８９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ）、３．９３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ）、４．６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝３．８Ｈｚ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ６５．７、７１．９、８６．０。
【００３７】
工程３では、化合物１６  ２０ｍｇ（０．１０２ｍｍｏｌ）をエタノール２ｍＬ中に溶解させて、１０％Ｐｄ／Ｃ  １０ｍｇを添加した。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去した。ゆっくりとした水素流を使用して室温で３時間、混合物を水素添加した（ＴＬＣ制御、２０％酢酸エチル／ヘキサン）。その後、混合物をセライトに通して濾過した。フラスコ及びセライトをエタノール（１０ｍＬ）で洗浄した。粗製１，４：３，６−ジアンヒドロ−２，５−ジアミノ−２，５−ジデオキシ−Ｄ−イジトールを含有する濾液を、ＨＣｌの溶液（ＨＣｌ水溶液−３７．３％：３５μＬ、０．４３２ｍｍｏｌ；エタノール：１．２ｍＬ）で処理して、室温で２時間攪拌した。次に、沈殿物を濾別して、エタノール（１５ｍＬ）で洗浄して、空気中で１２時間、次に真空炉中で６０℃にて４８時間乾燥させて、化合物１７  １３ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、２工程後の収率５９％）を白色結晶として得た（融点は２７０℃を超え、２５０℃で化合物は濃灰色になる）。［α］D  ＋５５．２（ｃ．１．１、Ｈ2Ｏ）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  ４．０１〜４．０７（ｍ，４Ｈ）、４．２２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ）、５．０１（ｓ，２Ｈ）；，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ）、1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  ３．６８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、３．８８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ）、３．９８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ）、４．８５（ｓ，２Ｈ）、８．７１（ｂｒ  ｓ，６Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ  ５５．９、７０．１、８４．６；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  ５５．５、７０．２、８４．７；元素分析  Ｃ6Ｈ14Ｏ2Ｎ2Ｃｌ2に関する計算値：Ｃ  ３３．５２％、Ｈ  ６．５６％、Ｎ  １３．０３％、Ｃｌ  ３２．０３％；実測値  Ｃ  ３３．２４％、Ｈ  ６．４３％、Ｎ  １２．７２％、Ｃｌ  ３３．９８％。
【００３８】
構造２であるＫＢ−５４の合成。
図７に見られるように、構造２であるＫＢ−５４（図７中の化合物４）の合成は、３工程プロセスである。工程１は、１，２，３，４−テトラ−Ｏ−ベンゼンスルホニル−メソ−エリスリトール（化合物２）の合成を包含する。化合物３は、乾燥ピリジン（４００ｍｌ）中のメソ−エリスリトール（化合物１）１３ｇ（１０６ｍｍｏｌ）を溶解させることにより合成される。溶液を−１０℃（塩氷浴）まで冷却して、塩化ベンゼンスルホニル（８１．５ｍＬ、６４０ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。冷却浴を取り外して、混合物を室温で５時間攪拌した。沈殿物を回収して、酢酸エチル（２５０ｍｌ）、水（１Ｌ０及び再び酢酸エチル（２００ｍｌ）で洗浄した。次に、生成物を空気で１２時間、次に真空炉中で５０℃にて３０時間乾燥させて、白色結晶（化合物２）２７ｇ（３９ｍｍｏｌ、収率３７％）を得た（融点  １８４〜１８６℃。文献値融点  １８４〜１８５．５℃−R.L．Willer，J．Org．Chem.，1984，49，5150-5154）。有機濾液を合わせて、２００ｍＬまで濃縮して、室温で静置させて、結晶生成物の第２の部分を得た。洗浄手順及び乾燥手順を繰り返して、化合物２の第２の部分３０ｇ（４４ｍｍｏｌ、収率４１％）を得た（融点  １８３〜１８５℃）。総収量は５７ｇ（８３ｍｍｏｌ、収率７８％）であった。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  ４．０３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）、４．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）、５．０３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、７．６０〜７．８１（ｍ，２０Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  ６６．７、７６．７、１２７．５６、１２９．７、１２９．８、１３４．３、１３４．６、１３４．７、１３４．８；ＭＳ（ＥＳＩ）  Ｃ28Ｈ26Ｏ12Ｓ4Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］+）に関して計算した正確な質量  ７０５．０２０５、実測値  ７０５．１７５。
【００３９】
工程２は、エリスロ−１，２，３，４−テトラアジドブタン（化合物３）の合成を包含する。これは、還流冷却器を備えたフラスコ中で化合物２  ２７ｇ（３９ｍｍｏｌ）をＮａＮ3  １７．１７ｇ（２６４ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６  ０．５ｇ（１．８９ｍｍｏｌ）及び乾燥ＤＭＦ  ２２０ｍＬを組み合わせることにより達成される。反応混合物を１００℃で４８時間攪拌した後、室温まで冷却して、水（０．５Ｌ）で希釈して、ＣＨ2Ｃｌ2（７×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせて、水（８×１００ｍＬ）及びＮａＣｌ（３×１００ｍＬ）の飽和水溶液で洗浄して、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、濾過して、減圧下で非常に慎重に濃縮した。カラムクロマトグラフ（ヘキサン、５〜１０％酢酸エチル／ヘキサン）で濃褐色残渣（少量のＤＭＦを含有する）を精製して、無色液体の化合物３  ６．３６ｇ（０．０２８ｍｍｏｌ、収率７２％）を得た。ポリアジド化合物の既知の危険のために、生成物は、クロマトグラフィ後に減圧下で部分的に濃縮して、溶媒の残渣は、アルゴン流を２時間パージすることにより除去した(R.L.，Willer，J．Org．Chem.，1984，49，5150-5154)。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ  ３．５２〜３．８（ｍ，４Ｈ）、３．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ５２．０、６１．５。
【００４０】
工程３では、化合物３  ５．９３ｇ（２６．７ｍｍｏｌ）をエタノール１３０ｍＬ中に溶解させて、１０％Ｐｄ／Ｃ  １．５ｍｇを添加した。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去した。ゆっくりとした水素流を使用して室温で５時間、混合物を水素添加した（ＴＬＣ制御、１０％酢酸エチル／ヘキサン）。その後、混合物をセライトに通して濾過した。フラスコ及びセライトをメタノール（１２ｍＬ）で洗浄した。粗製エリスロ−１，２，３，４−テトラアミノブタンを含有する濾液を、ＨＣｌの溶液（ＨＣＬ水溶液−３６．３％：９．７３ｍｌ、１１７．４ｍｍｏｌ；メタノール：３４ｍＬ）で処理して、室温で１２時間攪拌した。淡桃色沈殿物を濾別して、メタノール（３００ｍＬ）で洗浄して、空気中で１２時間、次に真空炉中で６０℃にて４８時間乾燥させて、化合物４  ４．８４ｍｇ（８．３ｍｍｏｌ、２工程後の収率６８％）を得た（融点  ２５５℃；１５０℃で化合物４は褐色になる）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  ３．２０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ）、３．３５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ）、３．７５（ｂｒ  ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  ３．３１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ）、３．４７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）、４．０８（ｂｒ  ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、８．９８（ｂｒ  ｓ，１２Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ  ３９．０、５０．３；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ  ３８．２、４９．９；元素分析  Ｃ4Ｈ18Ｎ4Ｃｌ4に関する計算値：Ｃ  １８．１９％、Ｈ  ６．８７％、Ｎ  ２１．２１％、Ｃｌ  ５３．７１％；実測値  Ｃ  １８．３７％、Ｈ  ７．０１％、Ｎ  ２１．２９％、Ｃｌ  ５３．４６％。
【００４１】
構造３であるＤＡＢ−４−Ｃｌの合成。
図８に見られるように、ＤＡＢ−Ａｍ−４デンドリマーのヒドロクロリド（化合物６）への変換は、脱塩水（２００ｍＬ）中にＤＡＢ−Ａｍ−４、即ちポリプロピレンイミンテトラアミンデンドリマー、第１．０世代(DSM  product)（化合物５）８．４７ｇ（２６．７６ｍｍｏｌ）を溶解させることにより達成される。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去して、ＨＣｌの溶液（ＨＣＬ水溶液−３７．０％：１５．８５ｍＬ、１９３．０２ｍｍｏｌ；脱塩水：３０ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を脱塩水１００ｍＬ中に溶解させて、蒸発させて（この手順を５回繰り返した）、真空ポンプで（４８時間）、最終的には真空炉で６０℃にて２日間乾燥させて、ベージュ色結晶（化合物６）１４．３２ｇ（２６．７５ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た（融点  ２４２〜２４５℃）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  １．８９（ｓ，４Ｈ）、２．１４〜２．２４（ｍ，８Ｈ）、３．１５（ｔ，８Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、３．３６〜３．４０（ｍ，１２Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ  ２０．５、２１．６、３６．４、４９．９、５２．３；元素分析  Ｃ16Ｈ46Ｎ6Ｃｌ6に関する計算値：Ｃ  ３５．９０％、Ｈ  ８．６６％、Ｎ  １５．６９％、Ｃｌ  ３９．７３％；実測値  Ｃ  ３５．８８％、Ｈ  ８．７３％、Ｎ  １５．２８％、Ｃｌ  ３９．２５％。
【００４２】
構造４であるＤＡＢ−８−Ｃｌの合成。
図９に見られるように、ＤＡＢ−Ａｍ−８デンドリマー、第２．０世代のヒドロクロリド（化合物８）への変換は、脱塩水（３００ｍＬ）中にＤＡＢ−Ａｍ−８、即ちポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー、第２．０世代(DSM  product)１０ｇ（１２．９３ｍｍｏｌ）を溶解させることにより達成される。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去して、ＨＣｌの溶液（ＨＣＬ水溶液−３７．０％：１９．３ｍＬ、２３５．４４ｍｍｏｌ；脱塩水：４０ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を脱塩水１００ｍＬ中に溶解させて、蒸発させて（この手順を５回繰り返した）、真空ポンプで（２４時間）、最終的には真空炉で６０℃にて３日間乾燥させて、白色結晶化合物８  １６．４４ｇ（１２．８１ｍｍｏｌ、９９％）を得た（融点  １５３〜１５５℃）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  １．９４（ｓ，４Ｈ）、２．１８〜２．２３（ｍ，１６Ｈ）、２．２６〜２．３４（ｍ，８Ｈ）、３．１６（ｔ，１６Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、３．４１〜３．４３（ｍ，３６Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ  １９．０、２０．６、２１．６、３６．４、４９．８、４９．９、５０．０．５２．６；元素分析  Ｃ40Ｈ110Ｎ14Ｃｌ14に関する計算値：Ｃ  ３７．４２％、Ｈ  ８．６３％、Ｎ  １５．２７％、Ｃｌ  ３８．６６％；実測値  Ｃ  ３５．８１％、Ｈ  ９．２２％、Ｎ  １４．５２％、Ｃｌ  ３７．６６％。元素の比は、ヒドロクロリドへのアミノ基の完全な変換を示す：計算値  Ｃｌ／Ｃ  １．０３、Ｃｌ／Ｎ  ２．５３、Ｃ／Ｎ  ２．４５；実測値  Ｃｌ／Ｃ  １．０５、Ｃｌ／Ｎ  ２．５９、Ｃ／Ｎ  ２．４６。
【００４３】
構造５であるＤＡＢ−１６−Ｃｌの合成。
図１０に見られるように、ＤＡＢ−Ａｍ−１６デンドリマー、第３．０世代のヒドロクロリド（１０）への変換は、脱塩水（１５０ｍＬ）中にＤＡＢ−Ａｍ−１６デンドリマー、即ちポリプロピレンイミンヘキサデカアミンデンドリマー（９）５ｇ（２．９６ｍｍｏｌ）を溶解させることにより達成される。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去して、ＨＣｌ溶液（ＨＣＬ水溶液−３７％：９．５ｍＬ、１１５．５６ｍｍｏｌ；脱塩水：２０ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を脱塩水１５０ｍＬ中に溶解させて、蒸発させて（この手順を５回繰り返した）、真空ポンプで（２４時間）、最終的には真空炉で６０℃にて３日間乾燥させて、クリーム色結晶化合物（１０）８．２４ｇ（２．９６ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た（融点  ２６６℃）。1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  １．８１（ｓ，４Ｈ）、２．０７〜２．１０（ｍ，３２Ｈ）、２．１４〜２．１９（ｍ，２４Ｈ）、３．０６（ｔ，３２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、３．２８〜２．３７（ｍ，８４Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ  １９．０、１９．１、２０．７、２１．６、３６．４、４９．８、４９．９、５０．１、５０．３、５２．９；元素分析  Ｃ88Ｈ238Ｎ30Ｃｌ30に関する計算値：Ｃ  ３８．０１％、Ｈ  ８．６３％、Ｎ  １５．１１％、Ｃｌ  ３８．２５％；実測値  Ｃ  ３８．２５％、Ｈ  ９．１３％、Ｎ  １５．１１％、Ｃｌ  ３８．２５％。元素の比は、ヒドロクロリドへのアミノ基の完全な変換を示す：計算値  Ｃｌ／Ｃ  １．０１、Ｃｌ／Ｎ  ２．５３、Ｃ／Ｎ  ２．５１；実測値  Ｃｌ／Ｃ  １．０３、Ｃｌ／Ｎ  ２．６０、Ｃ／Ｎ  ２．５２。
【００４４】
構造６であるＤＡＢ−６４−Ｃｌの合成。
図１１に見られるように、ＤＡＢ−Ａｍ−６４デンドリマー、第５．０世代のヒドロクロリド（１２）への変換は、ＣＨ3Ｃｌ（２５ｍＬ）中にＤＡＢ−Ａｍ−６４、即ちポリプロピレンイミンテトラキサコンタアミンデンドリマー１．０６ｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を溶解させることにより達成される。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去して、ＨＣｌの濃溶液（ＨＣＬ水溶液−３７．３％：１．６６ｍＬ、１９．９９ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を脱塩水２０ｍＬ中に溶解させて、蒸発させて（この手順を５回繰り返した）、真空ポンプで（５時間）、最終的には真空炉で６０℃にて３日間乾燥させて、黄色結晶化合物（１２）１．５２５ｇ（０．１３ｍｍｏｌ、収率９５％）を得た（融点  ２７４〜２７６℃）。1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  １．７９３（ｓ，４Ｈ）、２．１１〜２．１９及び２．２３〜２．３４（２×ｍ，２４８Ｈ）、３．０９（ｔ，１２８Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、２．３２〜２．４７（ｍ，３７２Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）−容易に見て取れるシグナルのみ：δ  １９．２、１９．３、２０．９、２１．８、３６．７、４９．３、４９．７、４９．９、５０．３、５１．０；元素分析  Ｃ376Ｈ1006Ｎ126Ｃｌ126に関する計算値：Ｃ  ３８．３９％、Ｈ  ８．６２％、Ｎ  １５．００％、Ｃｌ  ３７．９７％；実測値  Ｃ  ３８．４３％、Ｈ  ９．２５％、Ｎ  １５．０５％、Ｃｌ  ３８．３５％。元素の比は、ヒドロクロリドへのアミノ基の完全な変換を示す：計算値  Ｃｌ／Ｃ  ０．９９、Ｃｌ／Ｎ  ２．５３、Ｃ／Ｎ  ２．５５；実測値  Ｃｌ／Ｃ  ０．９９、Ｃｌ／Ｎ  ２．５４、Ｃ／Ｎ  ２．５５。
【００４５】
構造７であるＤＡＢ−８−ＡｃＯＨの合成。
図１２に見られるように、ＤＡＢ−Ａｍ−８デンドリマー、第２．０世代のデカヒドロアセテートへの変換は、脱塩水（２６０ｍＬ）中にＤＡＢ−Ａｍ−８、即ちポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー、第２．０世代(DSM  product)  ６．９２ｇ（８．９５ｍｍｏｌ）を溶解させることにより達成される。アルゴンで１５分間パージすることにより空気を除去して、ＡｃＯＨの溶液（氷ＡｃＯＨ：８．０ｍＬ、１３７．８６ｍｍｏｌ；脱塩水：１６０ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で１２時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を脱塩水２５０ｍＬ中に溶解させて、蒸発させた（この手順を１６回繰り返した）。最終的に、サンプルを脱塩水１００ｍＬ中に溶解させて、凍結させて、凍結乾燥させて（４８時間）、化合物３  １１．７８ｇ（８．５７ｍｍｏｌ、９６％）を非常に粘着性の淡橙色油状物質として得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ  １．６３（ｓ，４Ｈ）、１．７４〜１．８５（ｍ，２４Ｈ）、１．８８（ｓ，３０Ｈ）、２．５２〜２．６２（ｍ，２４Ｈ）、２．８６〜３．０２（ｍ，２８Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ  ２０．９、２１．７、２３．２、２３．４、３７．７、４９．７、５０．３、５０．８、５２．６、１８１．３；元素分析  Ｃ60Ｈ136Ｎ14Ｏ20に関する計算値：Ｃ  ５２．４５％、Ｈ  ９．９７％、Ｎ  １４．２７％；実測値  Ｃ  ５２．０５％、Ｈ  １０．２８％、Ｎ  １４．４３％。
【００４６】
結果
カルシウム又はＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸塩と結合する。
腸内リン酸塩吸収の従来の測定では、33Ｐは、０．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液中で投与されていた。しかしながら、０．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4と１００ｍＭ  ＣａＣｌ2を混合した場合、その濃度のリン酸塩は沈殿しなかった。これにより、カルシウムがリン酸塩と結合するには、より高濃度のＫＨ2ＰＯ4が必要であることが示唆される。実際に、過剰なカルシウムによるリン酸塩の沈殿を検出するためには、リン酸塩のレベルを１０ｍＭに上げることが必要であった（データは示していない）。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで経口リン酸塩結合剤を試験するための最適条件を確定するために、水、カルシウム（酢酸カルシウムとして）２０ｍｇ又はＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇを、絶食ラットに投与した。ラットに、１０ｍＭ、５０ｍＭ又は１００ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4を含有する緩衝液中の経口用量の33Ｐを即座に投与して、６０分後に死滅させた。
【００４７】
図２Ａに示されるように、33Ｐに先立ってカルシウム２０ｍｇ又はＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇを投与したラットは、経口用量で非標識リン酸塩のレベルに関わらず33Ｐに先立って水を投与したラットよりも有意に多い33Ｐが６０分後に腸内に残存した。さらに、カルシウム２０ｍｇは、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇよりも、腸内でより多くの33Ｐと結合し、33Ｐが１０又は１００ｍＭリン酸塩中で投与された場合に、この差は有意性に達した。血清33Ｐレベルの有意な減少もまた、カルシウム１０ｍｇを投薬したラットで検出されたが、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇを投与したラットで観察される血清33Ｐレベルの減少は、統計学的に有意ではなかった（図２Ｂ）。
【００４８】
新規経口リン酸塩結合剤の比較。
図１に示される新規経口リン酸塩結合剤の結合能力を、カルシウム及びＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）と比較した。表１は、この実験及び次の実験で使用する化合物全ての重量及びモル量を列挙する。まずラットに、水０．５ｍＬ或いはカルシウム（酢酸カルシウムとして）１０ｍｇ、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）又は新規リン酸塩結合剤１４．４ｍｇを含有する水０．５ｍＬを投与した。１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液中の経口用量の33Ｐを即座に投与して、ラットを６０分後に死滅させた。カルシウム１０ｍｇ及びＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇはともに、消化管中に残存する33Ｐの量を有意に増加させ（図４Ａ）、血清33Ｐレベルを有意に低減させた（図４Ｂ）。
【００４９】
新規結合剤ＫＢ−５４（構造２、図１Ｂ）、ＤＡＢ−４（構造３、図１Ｃ）、ＤＡＢ−８（構造４、図１Ｄ）、ＤＡＢ−１６（構造５、図１Ｅ）及びＤＡＢ−６４（構造６、図１Ｆ）もまた、消化管中に残存する33Ｐの量を有意に増加させて、血清33Ｐレベルを有意に低減させた。さらに、ＤＡＢ−８−Ｃｌ（構造４、図１Ｄ）及びＤＡＢ−１６−Ｃｌ（構造５、図１Ｅ）は、同等量のＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）と比較して、消化管中に残存する33Ｐの量を有意に増加させて、血清33Ｐレベルを有意に低減させた。ＦＣ（構造１、図１Ａ）は、消化管中に残存する33Ｐの量に影響を及ぼさなかったが、血清33Ｐレベルのわずかであるが有意な減少を引き起こした。
【００５０】
【表１】
2009507928.tif 000003
【００５１】
デンドリマー化合物の用量応答。
ＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８、ＤＡＢ−１６及びＤＡＢ−６４の、リン酸塩と結合する能力を用量応答研究で比較した。まずラットに、水０．５ｍＬ、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇ又はデンドリマーを含有する水０．５ｍＬを投与した。１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液中の経口用量の33Ｐを即座に投与して、ラットを６０分後に死滅させた。デンドリマー化合物は全て、用量依存的様式で、消化管中に残存する33Ｐを増加させ（図４Ａ）、対応して血清33Ｐレベルを減少させた（図４Ｂ）。
【００５２】
消化管中に残存する33Ｐのほぼ全ての増加、及び血清33Ｐレベルの減少の多くが、統計学的に有意であった。さらに、ＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６の２つの最高レベル、並びにＤＡＢ−６４の最高レベルが、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）と比較して、腸内に残存する33Ｐを有意に増加させて、血清33Ｐレベルを有意に低減させた。
【００５３】
リン酸塩と結合するデンドリマー化合物の能力の基盤となるメカニズム。
デンドリマー化合物中の遊離アミノ基の数がそのリン酸塩結合能力に関与するか否かを確定するために、ＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６由来の等しい数のモル又は遊離アミノ基を投与した。１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液中の経口用量の33Ｐを即座に投与して、ラットを６０分後に死滅させた。
【００５４】
図５Ａに見られるように、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）及び全てのレベルのデンドリマーが、有意な程度で消化管中に残存する33Ｐの量を増加させることが可能であった。しかしながら、ＤＡＢ−１６−Ｃｌ  １３．９ｍｇが、血清33Ｐレベルを有意に低減させることが可能な結合剤の唯一のレベルであった（図５Ｂ）。興味深いことに、ＤＡＢ−４及びＤＡＢ−１６由来の等量の遊離アミノ基が添加された場合、ＤＡＢ−１６は、消化管中に有意により多くの33Ｐを保持することが可能であった。さらに、等モル量のＤＡＢ−８−Ｃｌ及びＤＡＢ−１６−Ｃｌをラットに投与した場合、ＤＡＢ−１６−Ｃｌは、消化管中に有意により多くの33Ｐを保持した。
【００５５】
ラットに、０．４７％カルシウム及び０．２０％リンを含有する精製対照食餌、又はカルシウム或いは０．１５％  Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）、ＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８又はＤＡＢ−１６を添加した同じ食餌を１週間供給した。次に、糞便サンプルを４８時間回収して、乾燥させて、灰化させた。灰分を酸中に溶解させて、カルシウムレベル及びリンレベルを確定した。糞便カルシウムレベルは、１．２０％カルシウム食餌を供給したラット中で有意に増加し、食餌が正確に混合及び投与されたことが確認された。糞便リンは増加したが、１．２０％カルシウム又は０．１５％  ＤＡＢ−４を含有する食餌を供給したラットでは有意に増加しなかった。表２に示されるように、０．１５％  ＤＡＢ−８又はＤＡＢ−１６を供給したラットは、FisherのＬＳＤ検定のみに従って、対照食餌又は０．１５％  Ｒｅｎｇｅｌ（登録商標）を有する食餌を供給したラットと比較して、糞便リンレベルを有意に増加させた。
【００５６】
図１３及び図１４に見られるように、ヒドロアセテートデンドリマー（例えば、構造７、図１Ｇ）は、ヒドロクロリドデンドリマーとまさに同程度有効に作用する。
【００５７】
【表２】
2009507928.tif 000004
【００５８】
結論
血液リン酸塩を管理することは、慢性腎臓疾患患者における二次性副甲状腺機能亢進症の治療における難しいが必須の要素である。透析治療のほかに、患者は多くの場合、ＰＴＨレベルを抑制するためのビタミンＤ類似体及び食品からのリン酸塩の吸収を低減するための経口リン酸塩結合剤が投与される。幾つかのタイプの経口リン酸塩結合剤が開発されているが、潜在的な毒性、低い結合能力又は高い費用に起因して、全て有効性が限られている。
【００５９】
本文書は、ラットで経口投与される場合のリン酸塩と結合する可能性に関して、遊離アミノ基を含有する様々な新規化合物を比較している。これらの化合物の１つであるＦＣは、経口33Ｐ用量と結合しないようである。しかしながら、ＫＢ−５４並びに第１世代、第２世代、第３世代及び第５世代のＤＡＢデンドリマーは、経口33Ｐ用量の吸収を低減させた。各世代のデンドリマー化合物は、用量依存的様式で経口33Ｐと結合し、またＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６は、等量のＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）よりも有意により多くの33Ｐと結合した。
【００６０】
デンドリマー化合物がリン酸塩と結合するメカニズムは、ＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６由来の等しいモル数及び等しい数の遊離アミノ基の、33Ｐの吸収を低減する能力を測定することにより研究した。等しい数の遊離アミノ基が、ＤＡＢ−４及びＤＡＢ−１６の形態で投与された場合、ＤＡＢ−１６は、有意により多くの33Ｐと結合し、遊離アミノ基が、リン酸塩と結合するデンドリマーの能力に専ら関与するとは限らないことを示唆した。しかしながら、等モル量のＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６をラットに投与した場合、ＤＡＢ−１６は、消化管中に有意により多くの33Ｐを保持し、遊離アミノ基の数が、リン酸塩と結合するデンドリマー化合物の能力に幾分関与し得ること暗示した。
【００６１】
続いて、許容レベルのＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６デンドリマーは、ラットに供給されて、糞便リンレベルを増加させることがわかった。差は、FisherのＬＳＤ検定のみにより有意であったが、ＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６による糞便リンの増加は、過剰のカルシウム又は等量のＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）由来の増加よりも有意に高かった。
【００６２】
残念なことに、経口投与される場合のＤＡＢデンドリマーの毒性に関してあまり知られていない。従来の研究により、ＤＡＢデンドリマーがｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞障害性であり（１２）、また静脈内投与される場合、ＤＡＢデンドリマーは致命的である（１３）ことが示されている。しかしながら、本発明者等の実験では、ＤＡＢデンドリマーは、経口投与された場合にラットにより良好に許容された。ヒドロクロリドとしてのＤＡＢ−４、ＤＡＢ−８及びＤＡＢ−１６は、食餌の０．１５％で許容されたが、０．３％又は０．６％程度と高いレベルで供給された場合には、５日後に軟便が観察されたに過ぎなかった（データは示していない）。
【００６３】
参照文献
１．Brown，A.J.，Dusso，A.S.，and  Slatopolsky，E．2002．二次性副甲状腺機能亢進症のためのビタミンＤ類似体(Vitamin  D  analogues  for  secondary  hyperparathyroidism)．Nephrol  Dial  Transplant  17  Suppl  10:10-19。
２．Food  and  Nutrition  Board，Institute  of  Medicine．1997．カルシウム、リン、マグネシウム、ビタミンＤ及びフッ化物に関する食餌摂取基準(Dietary  reference  intakes  for  calcium，phosphorus，magnesium，vitamin  D，and  fluoride)．Washington，D.C.：National  Academy  Press。
３．Wardlaw，G.M.，and  Kessel，M.W．2002．栄養摂取の展望(Perspectives  in  Nutrition)．New  York，NY：McGraw-Hill  Higher  Education。
４．Tenenhouse，H.S．2005．ＩＩａ型Ｎａ／リン酸塩共輸送体によるリンホメオスタシスの調節(Regulation  of  phosphorus  homeostasis  by  the  Type  IIa  Na/Phosphate  cotransporter)．Annu  Rev  Nutr  25:197-214。
５．Goodman，W.G．2003．慢性腎不全における二次性副甲状腺機能亢進症の医療管理(Medical  management  of  secondary  hyperparathyroidism  in  chronic  renal  failure)．Nephrol  Dial  Transplant  18  Suppl  3:III2-8。
【００６４】
６．Coladonato，J.A．2005．ＥＳＲＤを伴う患者間での高リン酸塩血症の管理(Control  of  hyperphosphatemia  among  patients  with  ESRD)．J  Am  Soc  Nephrol  16  Suppl  2:S107-114。
７．Amin，N．2002．改善されたリン制御の影響：慢性腎不全を伴う患者における塩酸セベラマーの使用(The  impact  of  improved  phosphorus  control：use  of  sevelamer  hydrochloride  in  patients  with  chronic  renal  failure)．Nephrol  Dial  Transplant  17:340-345。
８．Cizman，B．2003．血液透析患者における高リン酸塩血症及びセベラマーによる治療(Hyperphosphataemia  and  treatment  with  sevelamer  in  haemodialysis  patients)．Nephrol  Dial  Transplant  18  Suppl  5:v47-49。
９．Suda，T.，DeLuca，H.F.，and  Tanaka，Y．1970．ラットにおける２５−ヒドロキシエルゴカルシフェロールの生物活性(Biological  activity  of  25-hydroxyergocalciferol  in  rats)．J  Nutr  100:1049-1052。
１０．Hawk，T.，and  Leary，S.L．1999．研究室動物に関する処方集(Formulary  for  laboratory  animals)．Ames，Iowa：Iowa  State  University  Press。
【００６５】
１１．Itaya，K.，and  Ui，M．1966．無機リン酸塩の比色定量に関する新たなミクロ法(A  new  micromethod  for  the  colorimetric  determination  of  inorganic  phosphate)．Clin  Chim  Acta  14:361-366。
１２．Duncan，R.，and  Izzo，L．2005．デンドリマー生体適合性及び毒性(Dendrimer  biocompatibility  and  toxicity)．Adv  Drug  Deliv  Rev  57:2215-2237。
１３．Schatzlein，A.G.，Zinselmeyer，B.H.，Elouzi，A.，Dufes，C.，Chim，Y.T.，Roberts，C.J.，Davies，M.C.，Munro，A.，Gray，A.I.，and  Uchegbu，I.F．2005．ポリプロピレンイミンデンドリマーによる優先的な肝臓遺伝子発現(Preferential  liver  gene  expression  with  polypropylenimine  dendrimers)．J  Control  Release  101：247-258。
１４．Svenson，S.，Tomalia，D.A．2005．生物医学的応用におけるデンドリマー−その分野での省察(Dendrimers  in  biomedical  applications  -  reflections  on  the  field)．Advanced  Drug  Delivery  Reviews  57：2016-2129。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造１：１，４：３，６−ジアンヒドロ−２，５−ジアミノ−２，５−ジデオキシ−Ｄ−イジトールジヒドロクロリド（ＦＣ）。
【図１Ｂ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造２：エリスロ−１，２，３，４−テトラアミノブタンテトラヒドロクロリド（ＫＢ−５４）。
【図１Ｃ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造３：ジアミノブタンデンドリマー第１世代（ＤＡＢ−４−Ｃｌ）。
【図１Ｄ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造４：ジアミノブタンデンドリマー第２世代（ＤＡＢ−８−Ｃｌ）。
【図１Ｅ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造５：ジアミノブタンデンドリマー第３世代（ＤＡＢ−１６−Ｃｌ）。
【図１Ｆ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造６；ジアミノブタンデンドリマー第５世代（ＤＡＢ−６４−Ｃｌ）。
【図１Ｇ】本発明の治療用リン酸塩結合剤を示す図である。構造７：ＤＡＢ−８−ＡｃＯＨ。
【００６７】
【図２】カルシウム又はＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）がｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸塩と結合することを示す図である。絶食ラットに、水０．５ｍＬ或いは水中に溶解させたカルシウム（酢酸カルシウムとして）２０ｍｇ又はＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇを胃強制補給により投与した。ラットに、１０ｍＭ、５０ｍＭ又は１００ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4を含有する緩衝液０．５ｍＬ中の３μＣｉ  33Ｐの用量を即座に投与して、６０分後に死滅させた。図２Ａ）消化管中に残存する経口33Ｐ用量のパーセント。*同レベルの非標識リン酸塩で33Ｐに先立って水を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。**同レベルの非標識リン酸塩で33Ｐに先立ってＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇを投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。図２Ｂ）血清中で検出される経口33Ｐ用量のパーセント。*同レベルの非標識リン酸塩で33Ｐに先立って水を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【００６８】
【図３】本明細書中で開示する新規経口リン酸塩結合剤を比較する図である。絶食ラットに、水０．５ｍＬ或いは水中に溶解させたカルシウム（酢酸カルシウムとして）１０ｍｇ、Ｒｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇ又は新規リン酸塩結合剤（表１に記載される）を胃強制補給により投与した。ラットに、１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4を含有する緩衝液０．５ｍＬ中の３μＣｉ  33Ｐの第２の用量を即座に投与して、６０分後に死滅させた。図３Ａ）消化管中に残存する経口33Ｐ用量のパーセント。図３Ｂ）血清中で検出される経口33Ｐ用量のパーセント。*33Ｐに先立って水を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。**33Ｐに先立ってＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【００６９】
【図４】デンドリマー化合物に対する用量応答を示す図である。絶食ラットに、水０．５ｍＬ或いは水中に溶解させたＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇ又は新規リン酸塩結合剤を胃強制補給により投与した。ラットに、１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4を含有する緩衝液０．５ｍＬ中の３μＣｉ  33Ｐの用量を即座に投与して、６０分後に死滅させた。図４Ａ）消化管中に残存する経口33Ｐ用量のパーセント。図４Ｂ）血清中で検出される経口33Ｐ用量のパーセント。*33Ｐに先立って水を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。**33Ｐに先立ってＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
【図５】リン酸塩と結合するデンドリマーの能力の基盤となるメカニズムを示す図である。絶食ラットに、水０．５ｍＬ或いは水中に溶解させたＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）１４．４ｍｇ又は新規リン酸塩結合剤を胃強制補給により投与した。ラットに、１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4を含有する緩衝液０．５ｍＬ中の３μＣｉ  33Ｐの用量を即座に投与して、６０分後に死滅させた。図５Ａ）消化管中に残存する経口33Ｐ用量のパーセント。図５Ｂ）血清中で検出される経口33Ｐ用量のパーセント。*33Ｐに先立って水を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。**33Ｐに先立ってＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）を投与したラットと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＮＤ＝検出不可能。
【００７１】
【図６】構造１、即ちＦＣの合成を示す図である。
【図７】構造２、即ちＫＢ−５４の合成を示す図である。
【図８】構造３、即ちＤＡＢ−４−Ｃｌの合成を示す図である。
【図９】構造４、即ちＤＡＢ−８−Ｃｌの合成を示す図である。
【図１０】構造５、即ちＤＡＢ−１６−Ｃｌの合成を示す図である。
【図１１】構造６、即ちＤＡＢ−６４−Ｃｌの合成を示す図である。
【図１２】構造７、即ちＤＡＢ−８−ＡｃＯＨの合成を示す図である。
【図１３】腸内33Ｐ吸収に対するヒドロアセテートデンドリマーの影響を示す図である。
【図１４】血清への33Ｐの吸収に対するヒドロアセテートデンドリマーの影響示す図である。
【図１Ａ】
2009507928.tif 000005
【図１Ｂ】
2009507928.tif 000006
【図１Ｃ】
2009507928.tif 000007
【図１Ｄ】
2009507928.tif 000008
【図１Ｅ】
2009507928.tif 000009
【図１Ｆ】
2009507928.tif 000010
【図１Ｇ】
2009507928.tif 000011
【図２】
2009507928.tif 000012
【図３】
2009507928.tif 000013
【図４】
2009507928.tif 000014
【図５】
2009507928.tif 000015
【図６】
2009507928.tif 000016
【図７】
2009507928.tif 000017
【図８】
2009507928.tif 000018
【図９】
2009507928.tif 000019
【図１０】
2009507928.tif 000020
【図１１】
2009507928.tif 000021
【図１２】
2009507928.tif 000022
【図１３】
2009507928.tif 000023
【図１４】
2009507928.tif 000024
【国際調査報告】
2009507928.tif 000025
2009507928.tif 000026
2009507928.tif 000027
2009507928.tif 000028