(57)【要約】本発明は、花茎組織を用いたハクサイの形質転換体の製造方法、及びそれによって生産される軟腐病抵抗性の向上した形質転換体に係り、花茎組織を用いてハクサイの形質転換を行った結果、形質転換率が２．８％であり、既存の子葉及び胚軸を利用する方法である０．４ないし０．８％に比べて、その効率が２倍以上向上した。本発明の花茎組織を用いた形質転換方法をハクサイ以外の植物の形質転換に適用すれば、既存の方法より高効率の植物形質転換システムを構築することができると期待される。また、本発明は、前記形質転換方法によってハクサイを形質転換させることによって、軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体を提供することができる。
2009516524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハクサイの形質転換体の製造方法であって、
外来遺伝子の導入された植物形質転換用のベクターを含む微生物を、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養するステップを含むことを特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
ハクサイの形質転換体の製造方法であって、
ＢｃＰＧＩＰ２（Polygalacturonase-inhibiting protein 2）遺伝子の導入された植物形質転換用のベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株を、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養するステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載のハクサイの形質転換体の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法によって製造される軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花茎組織を用いたハクサイの形質転換体の製造方法及びそれから生産される軟腐病抵抗性の向上した形質転換体に関する。さらに詳細には、ハクサイの花茎組織に外来の遺伝子を導入して組織培養することによって形質転換体を得る方法と、外来の遺伝子として、軟腐病抵抗性に関連した遺伝子を導入することによって軟腐病抵抗性の向上した形質転換体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハクサイは、涼しい気候を好む好冷性野菜であって、韓国でキムチの主材料として使用される最も重要な野菜作物である。ハクサイは、年平均野菜消費量の２５％を占め（Ministry of Agriculture and Forest, 2002）、栽培歴史が長く、かつ全国的に広範に栽培されている。
【０００３】
ハクサイの主な構成成分は水分であり、カルシウム及びビタミンＣを多量に含む葉を食用部位とする葉菜類である。ハクサイは、生育適温が１８ないし２２℃である、比較的に涼しい気候を好む好冷性野菜であるので、耐暑性が弱く、弱光下でも生育が良好であり、根群分布が広い。葉序は、２／５であり、螺旋形に着生し、幹は、短縮してロゼット状を有し、自家不和合性があって他家受精をし、自殖劣勢と雑種強勢で示される。
【０００４】
既存のハクサイの品種改良は、主にＦ１雑種強勢を用いた典型的な交雑育種によって行われているが、利用可能な遺伝資源が限られており、品種改良の幅を広げるに当って限界がある。最近、組織培養及び遺伝工学技術の発展によって、それを克服するための技術開発が試みられている。
【０００５】
組織培養技術は、優良個体を選抜するか、または特殊な形質を有する個体が発見された場合、その個体を維持及び増殖させるのにその目的がある。最近には、多様な植物形質転換技術が開発されて、植物体の形質転換による新品種の開発が活発に行われているが、低い再分化率が改善されねばならない。したがって、植物形質転換技術を効果的に利用するために、再分化率の高い組織培養技術の確立が求められている。
【０００６】
植物の形質転換は、タバコにおいて最初に成功し、その後、特定の遺伝子の機能究明のための非常に強力な方法として利用され、さらに、有用な遺伝子を植物体内に導入して、新たな形質の作物を開発するための方法として利用されている。植物体内に有用な遺伝子を導入する形質転換技術としては、エレクトロポレーション（electroporation）、遺伝子直接導入（direct gene transfer）、マイクロ−インジェクション（micro-injection）、組織インジェクション（tissue injection）、ＰＥＧ、Ｃａ＋２、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いた技術などが開発され、有用遺伝子の導入された細胞の選抜及び植物体の再分化過程を経た後に形質転換植物体を得ることができる。
【０００７】
特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いた植物の形質転換方法は、アグロバクテリウムが自身のＤＮＡの一部を植物に転移させる機作を利用することにより、有用遺伝子を最も安定的に転移させる方法として知られており、遺伝学的、生化学的、発生学的、生理学的な基礎研究及び実際の農業への応用など、植物分野研究の全般にわたって広範に使用されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、グラム陰性の土壌微生物であり、植物組織において傷の部位を感染させて、自身の遺伝子を植物に形質転換させることにより、根頭癌腫病（crown gall）及び毛状根（hairy root）のような癌組織を誘発させるものと知られている。
【０００８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスによって誘導される形質転換システムは、その微生物が持っているプラスミドによって行われる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの場合は、Ｔｉ（tumor inducing）プラスミドによって行われ、アグロバクテリウム・リゾゲネスの場合は、Ｒｉ（root inducing）プラスミドによって行われる。このようなＴｉまたはＲｉプラスミドによる癌組織の誘発は、微生物が持っているＴｉプラスミドに存在する特定のＤＮＡ断片（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞に転移されることによって発生し、Ｔ−ＤＮＡ（transfer DNA）の転移は、Ｔｉプラスミドに位置した病原性遺伝子（vir genes）の発現によって調節されると知られている。
【０００９】
有用遺伝子を植物体内に安定的に転移させるためには、比較的に高効率の形質転換方法の確立が何より重要である。また、アグロバクテリウムを用いた形質転換の場合には、植物組織の切片からの再分化能の高い組織培養体系の確立が、形質転換効率を向上させるのに最も大きな影響を及ぼす要因の一つとして知られている。
【００１０】
アブラナ属（Brassica）植物のうち、アグロバクテリウムのベクターを用いた形質転換は、アブラナ（B. napus）で最も多く研究されているが、形質転換に利用される植物組織の部位は、幹、切片組織、表皮組織、胚軸、花粉由来の胚、子葉など、多様な組織部位が使用されている。また、キャベツ（B. oleracea）、カラシナ（B. juncea）、ブラシカ・カリナタ（B. carinata）、ブラシカ・ニグラ（B. nigra）などからも形質転換体を得ることができたと報告されているが、ハクサイ（B. campestris）の形質転換は、他のアブラナ属植物に比べてその研究成果が相対的に低いのが実情である。
【００１１】
ブラシカ・カムペストリス・バライアティ・パラ（B. campestris var. para）の根にアグロバクテリウム・リゾゲネスを感染させて、毛状根が発生することを最初に観察した後、田中（Tanaka, 1985）ら及びパスコフスキー（Paszkowski, 1986）らは、カブ（B.campestris var. rapa）の葉原形質体にカリフラワー・モザイク・ウイルス（cauliflower mosaic virus）遺伝子を直接に形質転換して、遺伝子の挿入された植物体の獲得に成功したと報告し、オールソン（Ohlsson）及びエリクソン（Eriksson, 1988）は、ブラシカ・カムペストリス・バライアティ・オレイフェラ（B. campestris var. oleifera）の胚軸由来原形質体にアグロバクテリウムを感染させて、カナマイシン抵抗性カルスを得たと報告したが、形質転換された植物体を得ることはできなかった。
【００１２】
ハクサイ（B.campestris）から形質転換植物体を得た例としては、ムコパディヤイ（Mukhopadhyay, 1992）らが、ブラシカ・カムペストリス・バライアティ・サーソン（B. campestris var. sarson）の胚軸に、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（neomycin phosphotransferase II gene, NPT II gene）及びベータ‐グルクロニダーゼ‐イントロン遺伝子（β-glucuronidase-intron gene）を含んでいるアグロバクテリウムを感染させた結果、前記遺伝子の含まれたハクサイの形質転換体の得ることに成功したことと、ジュン（June）らが、ブラシカ・カムペストリス・サブスペシス・ペキンハシドイ（B. campestris ssp. pekinensis）の子葉をアグロバクテリウムに感染させて、タバコ・モザイク・ウイルス（tobacco mosaic virus）の外被タンパク質遺伝子（coat protein gene）及びｎｐｔＩＩ遺伝子の含まれた７個の形質転換植物体の獲得に成功したことが挙げられる。このように、ハクサイに外来遺伝子を形質転換させることにより、新たな形質を有する再分化植物体を獲得した例は、他のアブラナ属植物に比べてその研究成果が不十分であることが実情である。
【００１３】
ハクサイの組織培養は、ハクサイの子葉、胚軸、薬、葉切片などを用いた組織培養を通じて再分化植物体を獲得したという報告があるが、他のアブラナ属植物に比べて効率が低いと知られており、それについての研究が不足しているのが実情である。最近には、培地組成、植物生長調節剤の組成、培地内にＡｇＮＯ３を添加するなど、培養効率を改善するための研究が行われている。
【００１４】
既存のハクサイの形質転換は、子葉及び胚軸組織を用いる方法が主に利用されてきたが、その効率が低いため、本発明者らは、それを改善するために、組織採取が容易であり、かつ置床方法の簡単な花茎組織を用いてハクサイの形質転換を行った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ハクサイの花茎組織を用いて形質転換率が高く、さらに改善されたハクサイの形質転換体の製造方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記方法によって製造される軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題を解決するために、本発明は、軟腐病抵抗性に関連した遺伝子を形質転換用のベクターに導入してアグロバクテリウム属菌株に導入し、ハクサイの軟腐病抵抗性を向上させるために、ハクサイの花茎組織に前記菌株を感染させ、前記花茎組織を組織培養することにより再分化させて、形質転換率を調査し、前記再分化された形質転換体の葉組織からゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ、ＤＮＡゲルブロット及びＲＴ−ＰＣＲを通してハクサイが形質転換したか否かを確認し、形質転換されたハクサイで軟腐病抵抗性を調査することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
下記実施例及び実験例から分かるように、本発明は、花茎組織を用いたハクサイの形質転換体の製造方法、及びそれによって生産される軟腐病抵抗性の向上した形質転換体に係り、花茎組織を用いてハクサイの形質転換を行った結果、形質転換率が２．８％であり、既存の子葉及び胚軸を利用する方法である０．４ないし０．８％に比べて、その効率が２倍以上向上した。
【００１８】
本発明の花茎組織を用いた形質転換方法をハクサイ以外の植物の形質転換に適用すれば、既存の方法より高効率の植物形質転換システムを構築することができると期待される。また、本発明は、前記形質転換方法によってハクサイを形質転換させることによって、軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体を提供することができる。したがって、本発明は、作物産業上、非常に有用な発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の具体的な構成及び作用について、実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の権利範囲がそれらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明のハクサイの形質転換体の製造方法は、形質転換のためのベクターの構築及びアグロバクテリウム属菌株に導入するステップと、ハクサイの花茎組織に前記菌株を感染させるステップと、前記花茎組織を組織培養するステップと、前記再分化された形質転換体の葉組織からゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ、ＤＮＡゲルブロット及びＲＴ−ＰＣＲを通してハクサイが形質転換したか否かを確認するステップと、形質転換されたハクサイの軟腐病抵抗性を調査するステップと、からなる。
【００２１】
本発明のハクサイの形質転換体の製造方法は、外来遺伝子の導入された植物形質転換用のベクターを含む微生物を、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養するステップを含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明のハクサイの形質転換体の製造方法で使用した前記外来遺伝子は、軟腐病抵抗性の向上のためのＢｃＰＧＩＰ２（Polygalacturonase-inhibiting protein 2）遺伝子であるが、必要及び目的によって他の遺伝子を導入することができる。
外来遺伝子を導入するために、本発明の実施例で使用した微生物は、アグロバクテリウム属菌株であり、効率に応じて他の菌株を使用することができる。
【００２３】
本発明は、外来遺伝子として軟腐病抵抗性に関連した遺伝子を導入して、前記ハクサイの形質転換体の製造方法によって製造された軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体を提供することを特徴とする。
【実施例】
【００２４】
実施例１：花茎組織を用いたハクサイの形質転換体の製造
ハクサイの花茎組織を用いたハクサイの形質転換体を製造するために、まず、形質転換のためのベクターを構築し、それをアグロバクテリウム属菌株に導入した後、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養し、その形質転換率を調査した。
形質転換のためのベクターの構築
ハクサイのＪ３−１１Ｍ−５４系のＰＧＩＰ２遺伝子を植物形質転換用のベクターであるｐＣＡＭＢＩＡ２３００に、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩサイトを用いて導入させた後、それをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入してハクサイの形質転換に利用した。
【００２５】
Ｊ３−１１Ｍ−５４系のＢｃＰＧＩＰ２を植物形質転換用のベクターであるｐＣＡＭＢＩＡ２３００に、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩサイトを用いて導入させた後、それをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入してタバコ及びハクサイの形質転換に利用した（図１）。
図１は、バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００−ＢｃＰＧＩＰ２のＴ−ＤＮＡ部位を示す図である。このとき、ｎｐｔＩＩは、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ（Neomycin phosphotransferase II）を示し、３５ＳＰｒｏは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを示し、ＮＯＳは、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネータ（Nopaline synthase gene terminator）を示す。
【００２６】
ハクサイの形質転換
中央大学校の植物応用科学科の園芸作物品質実験室で育成して保有しているＪ３−１１Ｍ−３系、Ｊ３−１１Ｍ−４４系及びＪ３−１１Ｍ−５４系において、ＢｃＰＧＩＰ２遺伝子の発現を通じて軟腐病抵抗性を向上させるためにハクサイを形質転換した。形質転換のための組織培養は、ハクサイの花茎組織を用いた。Ｊ３−１１Ｍ−３系、Ｊ３−１１Ｍ−４４系及びＪ３−１１Ｍ−５４系を種まきしてから４週目になった幼苗を４℃で４週間ないし６週間低温処理して、温室で栽培して抽台させた。抽台した花茎の幼組織を５ｍｍの円筒形の切片に切って、７０％のＥｔＯＨで３０秒間消毒した。その後、滅菌水で１回洗浄し、１％の次亜塩素酸ナトリウム（sodium hypochloride）溶液に１０分間浸漬した後、滅菌水で３回洗浄した。
【００２７】
滅菌された花茎組織の切片を、３６時間振蕩培養したアグロバクテリウム培養液に１０分間浸漬させた後、滅菌されたろ過紙で培養液を除去した。接種の終わった切片は、共同培養培地であるＢＩ培地（ＭＳ培地４．４ｇ／Ｌ、ＮＡＡ １．０ｍｇ／Ｌ、ＢＡＰ ４．０ｍｇ／Ｌ、ＡｇＮＯ３ ４．０ｍｇ／Ｌ、フィト−アガー（Phyto-agar）８ｇ／Ｌ、ｐＨ ５．７）に置床した後、２８℃の暗条件下で７２時間共同培養した。その後、切片の組織を洗浄した培地（ＭＳ培地４．４ｇ／Ｌ、ＮＡＡ １．０ｍｇ／Ｌ、ＢＡＰ ４．０ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム（Cefotaxime）２００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ ５．７）で５分間３回洗浄し、滅菌水で３回洗浄した後、濾過紙で滅菌水を除去した。
【００２８】
洗浄の終わった切片は、選択培地（ＭＳ培地４．４ｇ／Ｌ、スクロース  ３０ｇ／Ｌ、フィト−アガー  ８ｇ／Ｌ、ＡｇＮＯ３ ４．０ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ １．０ｍｇ／Ｌ、ＢＡＰ ４．０ｍｇ／Ｌ、ＫＭ ２５ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム  ２００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ ５．７）においてシュートが形成されるまで、２３℃の温度条件、１６時間の光条件、８時間の暗条件で培養した。１５日間隔で継代培養を実施し、Ｊ３−１１Ｍ−４４で形成されたカルス組織を切って、４回ないし６回継代培養を実施した後、カナマイシンの濃度を低下させた選択培地（ＭＳ培地４．４ｇ／Ｌ、スクロース  ３０ｇ／Ｌ、フィト−アガー  ８ｇ／Ｌ、ＡｇＮＯ３  ４．０ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ  １．０ｍｇ／Ｌ、ＢＡＰ  ４．０ｍｇ／Ｌ、ＫＭ  １０ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム  ２００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ  ５．７）において４回ないし６回継代培養を実施した。
【００２９】
シュートが形成されたとき、発根（rooting）培地（ＭＳ培地  ４．４ｇ／Ｌ、スクロース  ３０ｇ／Ｌ、フィト−アガー  ８ｇ／Ｌ、ＡｇＮＯ３  ４．０ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム  ２００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ  ５．７）に移植して発根を誘導し、完全な幼植物体に分化させた。２週間ないし３週間後、発根された幼植物体をクリーン・ベンチで滅菌された床土の入れられた直径７ｃｍのビニール鉢に移植した後、湿度を維持するために、ビニールラップでカバーをかけて、２３℃の温度条件、１６時間の光条件、８時間の暗条件で５日間ないし７日間放置した。地上部の生育が正常に行われることを確認して、根の活着を点検した後、直径２５ｃｍの鉢に定植し、温室で栽培して実験に利用した。
【００３０】
ハクサイのＪ３−１１Ｍ−３系、Ｊ３−１１Ｍ−４４系及びＪ３−１１Ｍ−５４系の花茎組織の切片を、３回にかけてそれぞれ３７３、７８２、４２８個の組織を形質転換アグロバクテリウムを用いて接種させた結果、 Ｊ３−１１Ｍ−３系及びＪ３−１１Ｍ−５４系ではカルスの形成後、全系で白化現象が発生して、全然シュートが形成されなかった。Ｊ３−１１Ｍ−４４系で形成されたカルスを１５日間隔で４回ないし６回選択培地で継代培養する間に、薄緑の状態を維持しつつ持続的に体積生長したが、シュートが誘導されることはなかった。その後、選択培地のカナマイシンの濃度を１０ｍｇ／Ｌに低下させて、１５日間隔で４回及び５回継代培養を実施する間に、カルスからシュートが誘導された。シュートを発根培地に移植して発根を誘導し、完全な幼植物体に分化させた。
【００３１】
２週間及び３週間後、発根された幼植物体をそれぞれ名づけてＴ０−１、Ｔ０−２、Ｔ０−３、Ｔ０−４，Ｔ０−６、Ｔ０−８、Ｔ０−９、Ｔ０−１０、Ｔ０−１１、Ｔ０−１２、Ｔ０−１５、Ｔ０−１６、Ｔ０−１７、Ｔ０−１９、Ｔ０−２０、Ｔ０−２１、Ｔ０−３１、Ｔ０−３４、Ｔ０−３６、Ｔ０−３７、Ｔ０−３８、Ｔ０−３９とし、それぞれを純化させて、温室で栽培して実験に利用した。その結果を表１及び図２に示した。特に、図２は、ハクサイの培養された花茎組織の切片において形成された不定芽と、形質転換された植物との再分化を示す。このとき、Ａは、培養５週及び６週後に切片で形成されたシュートを示し、Ｂは、発根の間に培地に移植したシュートを示し、Ｃは、形質転換の幼植物体を示し、Ｄは、花芽が形成された形質転換植物体を示す。
【００３２】
表１及び図２に示しているように、シュートは総５２個体が誘導され、この中３９個体が発根されて２２個体が純化された。即ち、形質転換率が2.8％で、既存の子葉及び胚軸を利用する方法の0.4〜0.8％に比べて、その効率を2倍以上向上させることができた。
【表１】
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【００３３】
実施例２：ハクサイの形質転換体へ外来遺伝子が導入されたか否かの確認
前記実施例１で製造されたハクサイの形質転換体にｎｐｔＩＩ及びＢｃＰＧＩＰ２が導入されたか否かを確認するために、ＰＣＲ及びＤＮＡゲルブロットを行った。
【００３４】
実験例１：ＰＣＲ分析によるｎｐｔＩＩ遺伝子が導入されたか否かの確認
Ｊ３−１１Ｍ−４４系の花茎組織の切片にアグロバクテリウムを接種して再分化された個体を発根させた後、ビニール鉢に移植するとき、切り出した個体別の葉組織０．１ｇを、液体窒素及びすり鉢を用いて磨砕した後、ＤＮｅａｓｙプラント・ミニ・キット（DNeasy Plant mini kit 、キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡは、分光光度計（spectrophotometer）で定量した後、それを保管してＰＣＲ分析に使用した。
【００３５】
形質転換されたハクサイに、ＢｃＰＧＩＰ２と共に導入されたカナマイシン抵抗性遺伝子であるｎｐｔＩＩ遺伝子が導入されたか否かを検証するためにＰＣＲを行った。前記で抽出したゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、AccuPower PCR premix （バイオニア社製）を用いてＰＣＲを行った。nptII(forward)5'-ATGGGGATTGAACAAGATGGATTGC-3'及び(reverse)5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG-3'プライマーで９４℃で５分間鋳型ＤＮＡを前変性させた後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３０サイクルを繰り返して行い、最終的に７２℃で１０分間反応させた。
【００３６】
反応の終わった溶液に１．２％のアガロースゲル電気泳動を実施して、７９８ｂｐサイズのＤＮＡ断片を確認し、その結果を図３に示した。図３において、Ｍは、１ｋｂプラスＤＮＡラダーを示し、レーン１は、対照植物体から得た増幅産物を示し、レーン２ないし１５は、形質転換体から得た増幅産物を示す。特に、レーン２；Ｔ０−１、レーン３；Ｔ０−２、レーン４；Ｔ０−３、レーン５；Ｔ０−４、レーン６；Ｔ０−６、レーン７；Ｔ０−８、レーン８；Ｔ０−９、レーン９；Ｔ０−１０、レーン１０；Ｔ０−１１、レーン１１；Ｔ０−１２、レーン１２；Ｔ０−１５、レーン１３；Ｔ０−１６、レーン１４；Ｔ０−１７、レーン１５；Ｔ０−１９を示し、Ｐは、陽性対照群（ベクターpCAMBIA 2300-BcPGIP2）を示す。
ＰＣＲの結果、ｎｐｔＩＩの導入を確認することができた（図３）。
【００３７】
実験例２：ＤＮＡゲルブロットを用いたｎｐｔＩＩの導入確認
Ｊ３−１１Ｍ−４４系から再分化された形質転換個体のＤＮＡゲルブロット分析のために、温室で栽培されている個体の葉を採取した後、それぞれ２００ｍｇの試料を液体窒素及びすり鉢を用いて磨碎した後、６５℃に予熱した抽出用の緩衝液（１．２５％  ＳＤＳ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．３８％の重亜硫酸ナトリウム（sodium bisufite）、ｐＨ  ８．０）７００ｕｌを加えて、６５℃で２０分間混合して反応させた。反応後７００ｕｌのフェノール：クロロホルム（１：１＝ｖ：ｖ）溶液を添加して１０分間ゆっくり混合した後、１５℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を分離して、２ｕｌのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えて常温で１０分間反応させた。反応液と同量の−２０℃のＥｔＯＨを添加してゆっくり混合した後、−２０℃で沈澱させた。沈澱されたＤＮＡをパスツール・ピペットを用いて新たな１．５ｍＬのチューブに移した後、７０％のＥｔＯＨで２回洗浄した。洗浄後に乾燥させて、ＴＥ（１０ｍ  ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ８．０、１ｍ  ＭＥＤＴＡ）緩衝液に懸濁して、対照群ＤＮＡと電気泳動して定量した後、それを保管してＤＮＡゲルブロットに利用した。
【００３８】
ゲノムＤＮＡ１０ｕｇをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１．０％のアガロースゲルで３０Ｖ電圧で１６時間電気泳動した。展開されたＤＮＡを確認した後、０．２５Ｎ  ＨＣｌ溶液で１０分間脱プリン化（depurination）し、アルカリ化転換（alkaline transfer）方法でナイロン膜（nylon membrane）に一晩中転移させた。ＤＮＡが転移したか否かは、ブロッティングさせたゲルをＥｔＢｒで染色することにより確認した。ｎｐｔＩＩプローブは、ベクタープラスミドＤＮＡを鋳型とし、前記実験例１の方法によってＰＣＲを行って、生成されたＤＮＡ断片をＢｃａＢｅｓｔラベリングキット（BcaBest labelling kit、タカラ社製）を用いて準備し、６５℃で２４時間混成化させた。
【００３９】
０．１×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ溶液で６５℃で３０分間最終的に洗浄した後、Ｘ線フィルムに感光させて、その結果を図４に示した。図４において、Ｍは、ラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩを示し、Ｃは、野生型対照群Ｊ３−１１Ｍ−４４を示し、レーン１ないし１９は、形質転換体植物を示す。特に、レーン１；Ｔ０−１、レーン２；Ｔ０−２、レーン３；Ｔ０−３、レーン４；Ｔ０−６、レーン５；Ｔ０−８、レーン６；Ｔ０−９、レーン７；Ｔ０−１０、レーン８；Ｔ０−１１、レーン９；Ｔ０−１２、レーン１０；Ｔ０−１５、レーン１１；Ｔ０−１６、レーン１２；Ｔ０−１７、レーン１３；Ｔ０−１９、レーン１４；Ｔ０−２０、レーン１５；Ｔ０−２１、レーン１６；Ｔ０−３４、レーン１７；Ｔ０−３６、レーン１８；Ｔ０−３８、レーン１９；Ｔ０−３９を示す。また、Ｂは、ＢａｍＨＩで切断したサンプルを示し、Ｘは、ＸｂａＩで切断したサンプルを示す。
【００４０】
図４に示すように、ｎｐｔＩＩ遺伝子の導入が確認され、Ｔ０−１、Ｔ０−２、Ｔ０−３、Ｔ０−２０が、同じバンドパターンを表し、Ｔ０−６、Ｔ０−８、Ｔ０−９、Ｔ０−１０、Ｔ０−１１、Ｔ０−１２、Ｔ０−１５、Ｔ０−１６、Ｔ０−１７、Ｔ０−２１、Ｔ０−３４、Ｔ０−３６、Ｔ０−３８、Ｔ０−３９が、同じバンドパターンを表した。この結果は、遺伝子の挿入時に２種類の遺伝子の組み換えが行われ、その後に形成されたシュートは、その２種類のカルスから増殖されたと思われる。
【００４１】
実験例３：ＲＴ−ＰＣＲによるｎｐｔＩＩ及びＢｃＰＧＩＰ２の発現確認
ハクサイの形質転換体Ｔ０−６、Ｔ０−１０、Ｔ０−１２、Ｔ０−１５、Ｔ０−１６、Ｔ０−１７、Ｔ０−２０、Ｔ０−２１に導入されたｎｐｔＩＩ及びＢｃＰＧＩＰ２の発現を確認するために、得られた個体の葉を採取して、ＲＮｅａｓｙプラント・ミニ・キット（RNeasy Plant mini kit 、キアゲン社製）で総ＲＮＡを分離した後、分光光度計で定量した。５μｇの総ＲＮＡにおいて、スーパースクリプト・ファースト‐ストランド合成キット（Superscript 1st-Strand Synthesis Kit 、米国インビトロジェン社製）を用いて合成した第１次ｃＤＮＡ鎖（1st strand cDNA）を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｎｐｔＩＩの発現確認のためのＲＴ−ＰＣＲは、実験例１の方法によって行い、ＢｃＰＧＩＰ２の発現確認のために使用したＲＴ−ＰＣＲのプライマーは、次の通りである：
(forward): 5'-AGTCGGATCCATGGGTAAGACAACGACACTGCTTTTG-3'
(reverse): 5'-GGCTGCGGTACCCTTTTACTTGCAACTATCAAGAG-3'
【００４２】
前記プライマー対を用いて、９４℃で５分間鋳型ＤＮＡを前変性させた後、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３０サイクルを繰り返して行い、最終的に７２℃で１０分間反応させた。対照群としてハクサイのアクチン遺伝子を増幅するために使用したプライマーＢｃＡｃｔｉｎは、次の通りである：
(forward): 5'-ATGACATGGAGAAGATCTGG-3'
(reverse): 5'-TGAGCTTGTTTTGGAAGTCT-3'
【００４３】
前記プライマー対を用いて合成した第１次ｃＤＮＡ鎖（1st strand cDNA）を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間鋳型ＤＮＡを前変性させた後、９４℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３０サイクルを繰り返して行い、最終的に７２℃で１０分間反応させた。反応の終わった溶液に１．２％のアガロースゲル電気泳動を実施して、ＤＮＡ断片を確認した。
【００４４】
図５は、形質転換体植物でＲＴ−ＰＣＲを用いてｎｐｔＩＩ遺伝子発現を探知した結果を示す。図５において、Ｍは、１ｋｂプラスＤＮＡラダーを示し、レーン１は、野生型のＪ３−１１Ｍ−４４を示し、レーン２ないし９は、形質転換体植物を示す。特に、レーン２；Ｔ０−６、レーン３；Ｔ０−１０、レーン４；Ｔ０−１２、レーン５；Ｔ０−１５、レーン６；Ｔ０−１６、レーン７；Ｔ０−１７、レーン８；Ｔ０−２０、レーン９；Ｔ０−２１を示す。
【００４５】
また、図６は、形質転換体植物において、ＢｃＰＧＩＰ２遺伝子の発現を探知した結果を示す。図６において、Ｍは、１ｋｂプラスＤＮＡラダーを示し、レーン１ないし３は、野生型の植物を示し、レーン４ないし１１は、形質転換体植物を示す。特に、レーン４；Ｔ０−６、レーン５；Ｔ０−１０、レーン６；Ｔ０−１２、レーン７；Ｔ０−１５、レーン８；Ｔ０−１６、レーン９；Ｔ０−１７、レーン１０；Ｔ０−２０、レーン１１；Ｔ０−２１を示す。
図５及び図６に示すように、ｎｐｔＩＩ及びＢｃＰＧＩＰ２が正常に発現されていることを確認することができた。
【００４６】
実施例３：ハクサイの形質転換体の軟腐病抵抗性の確認
前記実施例１で形質転換されたハクサイの軟腐病に対する抵抗性を測定するために、ＰＣＲ及びＤＮＡゲルブロット及びＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＢｃＰＧＩＰ２遺伝子の導入及び発現を確認し、定植してから６０日目になったＪ３−１１Ｍ−４４系の形質転換ハクサイ及び野生型の葉を採取して、軟腐病に対する罹病性を調査した。葉基部接種方法（point inoculation method, Park et al., 2004）によって軟腐病原菌を１．２ｘ１０５ｃｆｕ／μｌ接種した後、６時間間隔で０、６、１２、１８、２４、３０、３６時間に病斑の進展程度を調査し、その結果を図７に示した。図７Ａの結果は、４個の反復区（replicates）の平均±標準偏差で示したグラフである。図７Ｂは、接種後１２時間目のハクサイ葉を示す写真である。
【００４７】
図７に示すように、対照群である野生型に比べて、形質転換体であるＴ０−２１は、接種後１２時間目から病斑が観察され、１２時間には５４．６％、１８時間には５２．５％、２４時間には２９．１％、３０時間には１９．７％、３６時間には２０．３％の病抵抗性が向上した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００−ＢｃＰＧＩＰ２のＴ−ＤＮＡ部位を示す図である。
【図２】ハクサイの培養された花茎組織の切片で形成された不定芽（adventitious shoot）及び形質転換された植物の再分化を示す写真である。
【図３】ハクサイの形質転換体において、ｎｐｔＩＩ遺伝子を確認するためのＰＣＲ増幅産物にアガロースゲル電気泳動を実施した結果を示す写真である。
【図４】Ｔ０形質転換体の植物において、ｎｐｔＩＩ遺伝子の断片を用いてゲノムＤＮＡを追跡したサザン・ブロットの分析結果を示す写真である。
【図５】形質転換体の植物において、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｎｐｔＩＩ遺伝子の発現を探知した結果を示す写真である。
【図６】形質転換体の植物において、ＢｃＰＧＩＰ２遺伝子の発現を探知した結果を示す写真である。
【図７】野生型ハクサイと形質転換体のハクサイにおいて、軟腐病の程度を比較した結果を示すグラフ及び写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月22日(2008.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いてハクサイの形質転換体の製造方法であって、
前記菌株を、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養するステップを含むことを特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌株であることを特徴とする、請求項１に記載のハクサイの形質転換体の製造方法。
【請求項３】
ハクサイが、Ｊ３−１１Ｍ−３系、Ｊ３−１１Ｍ−４４系及びＪ３−１１Ｍ−５４系のうち一つであることを特徴とする、請求項１に記載のハクサイの形質転換体の製造方法。
【請求項４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスが、外来遺伝子が導入されたことを特徴とする、請求項１に記載のハクサイの形質転換体の製造方法。
【請求項５】
外来遺伝子が、ＢｃＰＧＩＰ２（Polygalacturonase-inhibiting protein 2）またはｎｐｔＩＩ遺伝子であることを特徴とする、請求項４に記載のハクサイの形質転換体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって製造されるハクサイの形質転換体。
【国際調査報告】
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