(57)【要約】  本発明は、特に薄層クロマトグラフィーを用いた分離後の、アミノ酸、ペプチドおよび類似の化合物の染色、そして可視化のための方法および試薬混合物に関する。染色を、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のためのニンヒドリンを少なくとも１つのイオン性液体と組み合わせて用いることにより行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物。
【請求項２】
アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための試薬が、ニンヒドリンまたはその誘導体の１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の試薬混合物。
【請求項３】
試薬混合物が、
ａ）少なくとも１つの溶媒にニンヒドリンまたはその誘導体の１つを少なくとも含む試薬、および
ｂ）少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬
を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の試薬混合物。
【請求項４】
試薬混合物が、
ａ）０．０１〜１０重量％のニンヒドリンを少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬、
ｂ）０．１〜１０重量％の少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬、
を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の試薬混合物。
【請求項５】
試薬混合物が、イオン性液体として、１−ペンチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘプチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ノニル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム塩化物、エチルジメチルペンチルアンモニウム臭化物、エチルジメチルプロピルアンモニウム塩化物、１−メチル−１−オクチルピロリジニウム塩化物、ｎ−ブチルピリジニウム塩化物、ｎ−オクチルピリジニウム塩化物、４−メチル−４−ペンチルモルホリニウム臭化物または１−メチル−１−ペンチルピペリジニウム臭化物を含む試薬を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の試薬混合物。
【請求項６】
試薬混合物が、少なくとも１つのＴＬＣプレートをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の試薬混合物。
【請求項７】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための方法であって、
ａ）薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣプレート）上での試料のクロマトグラフ分離
ｂ）アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物を用いた、ＴＬＣプレート上での分離した試料の染色
による前記方法。
【請求項８】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための方法であって、
ａ’）薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣプレート）上での試料のクロマトグラフ分離、ここで移動相は少なくとも１つのイオン性液体を含む、
ｂ’）アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬を少なくとも含む試薬混合物を用いた、ＴＬＣプレート上での分離した試料の染色
による前記方法。
【請求項９】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための方法であって、
薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣプレート）上での試料のクロマトグラフ分離、ここで移動相はアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬および少なくとも１つのイオン性液体を含む、
による前記方法。
【請求項１０】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質の検出のための試薬が、ニンヒドリンまたはその誘導体の１つであることを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）またはａ’）において用いられるＴＬＣプレートが、無極性相またはセルロース相を有するプレートであることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）における染色を、ＴＬＣプレートをステップｂ１）においてまずイオン性液体を少なくとも含む試薬で処理し、続けてステップｂ２）においてアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬を少なくとも含む試薬で処理することにより行うことを特徴とする、請求項７〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬およびイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物で処理した後、ＴＬＣプレートを、ステップｂ）において、５０〜２００℃の温度まで０．５〜１０分間熱することを特徴とする、請求項７〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
０．０１〜１０重量％のニンヒドリンを少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬、および０．１〜１０重量％の少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬を含む試薬混合物を用いることを特徴とする、請求項７〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を可視化するための方法であって、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を、イオン性液体およびアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬を少なくとも含む試薬組み合わせで処理することを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質をまずイオン性液体を少なくとも含む試薬で処理し、続けてニンヒドリンまたはその誘導体の１つを少なくとも含む試薬で処理することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
イオン性液体が、１−ペンチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘプチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ノニル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム塩化物、エチルジメチルペンチルアンモニウム臭化物、エチルジメチルプロピルアンモニウム塩化物、１−メチル−１−オクチルピロリジニウム塩化物、ｎ−ブチルピリジニウム塩化物、ｎ−オクチルピリジニウム塩化物、４−メチル−４−ペンチルモルホリニウム臭化物または１−メチル−１−ペンチルピペリジニウム臭化物から選択されることを特徴とする、請求項７〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸、ペプチドおよび類似の化合物を、特に、薄層クロマトグラフィーを用いた分離の後に、染色しそして可視化するための方法および試薬混合物に関する。染色は、少なくとも１つのイオン性液体と組み合わせて、アミノ酸、ペプチドを検出のための少なくとも１つの試薬を用いて行う。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の分析は、細胞構造または細胞代謝または細胞機能の調査において重要な役割を果たす。タンパク質またはペプチドの分析は、本明細書において、例えば、構造解析、分子量の決定、分散パターン（ペプチドマッピング）の決定、特定のペプチドまたはタンパク質の同定も包含する。
【０００３】
一般的に、タンパク質またはペプチドの分析は、分離に先行されなければならない。このための周知の方法は、例えば、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動またはゲル電気泳動である。分析を、例えば、染色を用いて、または質量分析を用いて引き続き行う。
【０００４】
薄層クロマトグラフィーもまた、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の分離に適している。薄層クロマトグラフィーの主な利点は、安価であり、簡単であることにある。さらに、分離を一または多次元的に行うこともでき、これは分離の解明が分離問題に適合できることを意味する。
【０００５】
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸などのアミノ基を含む化合物のための、薄層クロマトグラフ分離（ＴＬＣ分離）の評価に、様々な染色方法が利用可能である。最も周知であるのは、ニンヒドリン（２，２−ジヒドロキシインダン−１，３−ジオン）、フルオレスカミンまたはイサチン−５−スルホン酸での染色である。ニンヒドリンと比較して、フルオレスカミンはより高い感度を提供する。しかしながら、ニンヒドリンもフルオレスカミンも、全ての化合物が同じ色に染色されるので、染色された化合物についてさらなる情報を提供しない。イサチン−５−スルホン酸は、アミノ酸を選択的に染色するが、調査される分子におけるアミノ酸の数が増加すると、感度が著しく低下するので、複数のアミノ酸からなる化合物には適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、したがって、特にＴＬＣ分離の後に用いることもできる、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の選択的な可視化、特に染色のための方法または試薬を提供することである。
【０００７】
アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための試薬、特に、ニンヒドリンまたはその誘導体の１つ、特に好ましくは、ニンヒドリンが、少なくとも１つのイオン性液体と組み合わせにおいて、アミノ酸および複数のアミノ酸からなる化合物を選択的に染色することが見出された。黄、緑、青、赤からピンクの範囲までの幅広い色のスペクトルにおいて着色が観察された。本明細書において、染色の感度は、従来のアミノ酸の染色、例えば、ニンヒドリンでのそれに相当する。
【０００８】
本発明は、したがって、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、特にニンヒドリンまたはその誘導体、およびイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物に関する。
【０００９】
本発明の最も単純な態様において、試薬混合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための試薬、特にニンヒドリンまたはその誘導体、およびイオン性液体のみからなる。ここでニンヒドリンは、例えば、イオン性液体がさらに溶媒として機能するように、イオン性液体に溶解される。
【００１０】
好ましい態様において、試薬混合物は少なくとも
ａ）  アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬を少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬、および
ｂ）  少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬
を含む。
【００１１】
好ましい態様において、試薬混合物は少なくとも
ａ）  ０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％のニンヒドリンを少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬
ｂ）  少なくとも１つのイオン性液体を、好ましくは少なくとも１つの溶媒に含む試薬
を含む。
【００１２】
イオン性液体または液体塩は、有機カチオン（Ｋ＋）および一般的には無機アニオン（Ａ−）からなるイオン種である。これらは、中性分子を含まず、通常は３７３Ｋより低い融点を有する。
【００１３】
イオン性液体の分野は、潜在用途が多種多様であるので、現在、集中的に研究されている。イオン性液体における総説は、例えば、R. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407; M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future”, Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasserscheid, W. Keim "Ionische Fluessigkeiten - neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids - Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945; T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis”, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083 or R. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227である。
【００１４】
一般式Ｋ＋Ａ−のイオン性液体は、可視化のための本発明の方法に重要である。アニオンＡ−は好ましくは、ハロゲン化物、特に、塩化物および臭化物、テトラフルオロホウ酸塩、スルホン酸塩、特に、トリフルオロメチルスルホン酸を含む群から選択される。
【００１５】
イオン性液体のカチオンＫ＋の選択事態には何の制限もない。しかしながら好ましくは、有機カチオン、特に好ましくは、アンモニウム、ホスホニウム、チオウロニウム、グアニジニウムまたは複素環カチオンである。
【００１６】
アンモニウムカチオンは、例えば、式（１）
［ＮＲ４］＋                        （１）
式中、
Ｒはそれぞれ互いに独立して、
Ｈ、ここで全ての置換基Ｒは同時にＨであることはできず、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００１７】
ここで、１または２以上のＲは、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲにおける１または２の非隣接炭素原は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’は、Ｈ、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであってもよく、Ｘはハロゲンであってもよい、
で表現することができる。
【００１８】
ホスホニウムカチオンは例えば式（２）
［ＰＲ２４］＋                        （２）
式中、
Ｒ２はそれぞれ互いに独立して、
Ｈ、ＮＲ’２、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００１９】
ここで、１または２以上のＲ２は、部分的または完全にハロゲン、特に、‐Ｆおよび／または‐Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲ２における１または２の非隣接炭素原は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
で表現することができる。
【００２０】
しかしながら、すべての４または３置換基ＲおよびＲ２が完全にハロゲンで置換されている、式（１）および（２）のカチオン、例えば、トリス（トリフルオロメチル）メチルアンモニウムカチオン、テトラ（トリフルオロメチル）アンモニウムカチオン、またはテトラ（ノナフルオロブチル）アンモニウムカチオンは除かれる。
【００２１】
好ましいチオウロニウムカチオンは、式（３）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋            （３）
式中、
Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ互いに独立して、
Ｈ、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００２２】
ここで、１または２以上の置換基Ｒ３〜Ｒ７は、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲ３〜Ｒ７における１または２の非隣接炭素原は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
で表現することができる。
【００２３】
グアニジニウムカチオンは式（４）
［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋            （４）
式中、
Ｒ８〜Ｒ１３はそれぞれ互いに独立して、
Ｈ、‐ＣＮ、ＮＲ’２、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００２４】
ここで、１または２以上の置換基Ｒ８〜Ｒ１３は、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲ８〜Ｒ１３における１または２の非隣接炭素原は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
で表現することができる。
【００２５】
さらに、一般式（５）
［ＨｅｔＮ］＋                        （５）
式中、
ＨｅｔＮ＋は、下記群から選択される複素環カチオンを示す：
【００２６】
【化１】
2009545728.tif 000002
【化２】
2009545728.tif 000003
【００２７】
式中、
置換基Ｒ１'〜Ｒ４'はそれぞれ独立して、
Ｈ、‐ＣＮ、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の非共役三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであって、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
飽和、部分的または完全に不飽和したヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ１'、Ｒ２'、Ｒ３'および／またはＲ４'は一緒に環を形成していてもよく、
【００２８】
ここで、１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は部分的にまたは完全に、ハロゲン、−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２、に置換されてもよいが、ここで、Ｒ１’およびＲ４’は同時にハロゲンで完全に置換されることはできず、ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロ原子に結合していない１または２以上の非隣接炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択される、原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
のカチオンを用いることも可能である。
【００２９】
置換基Ｒ２’として好ましいのは、特に、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘまたは−ＮＯ２から選択される原子団である。
本発明の目的のためには、完全不飽和置換基は芳香族置換基も意味するように用いられる。
【００３０】
本発明によれば、式（１）〜（４）で表される化合物の好適な置換基ＲおよびＲ２〜Ｒ１３は、水素以外には、好ましくは：Ｃ１〜Ｃ２０、特にＣ１〜Ｃ１４アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されていてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
【００３１】
式（１）または（２）で表される化合物中の置換基ＲおよびＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい。置換基ＲおよびＲ２は、好ましくは異なっている。
置換基ＲおよびＲ２は、特に好ましくは、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルまたはテトラデシルである。
【００３２】
グアニジウムカチオン［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
一般的な限定なしに、かかるグアニジウムカチオンの例は：
【００３３】
【化３】
2009545728.tif 000004
【００３４】
式中、置換基Ｒ８〜Ｒ１０およびＲ１３は、上記の意味または上記の特に好ましい意味を有することができる、
である。
所望の場合、上記グアニジウムカチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＲ’２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈ、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有し、置換もしくは非置換フェニル、または非置換もしくは置換複素環で置換されてもよい。
【００３５】
チオウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
【００３６】
一般的な限定なしに、かかるカチオンの例は、下記
式中、Ｙ＝Ｓである：
【化４】
2009545728.tif 000005
【００３７】
式中、置換基Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、上記の意味または上記の特に好ましい意味を有することができる、
で示される。
所望の場合、上記カチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＲ’２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ，Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈ、あるいは置換もしくは非置換フェニル、または非置換もしくは置換複素環で置換されてもよく、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有する。
【００３８】
置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、それぞれ互いに独立して、好ましくは１〜１０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル基である。式（３）〜（４）の化合物における置換基Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ１０およびＲ１１、ならびに、Ｒ１２およびＲ１３は、同一であっても、異なっていてもよい。置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、特に好ましくは、それぞれ互いに独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フェニルまたはシクロヘキシルであり、極めて特に好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチルである。
【００３９】
本発明によれば、式（５）の化合物の好適な置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、水素以外には、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ２０、特にＣ１〜Ｃ１２アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
【００４０】
置換基Ｒ１’およびＲ４’は、それぞれ互いに独立して、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。これらは特に極めて好ましくは、メチル、エチル、ｎ−ブチルまたはヘキシルである。ピロリジニウム、ピペリジニウムまたはインドリニウム化合物において、２個の置換基Ｒ１’およびＲ４’は、好ましくは異なっている。
【００４１】
置換基Ｒ２’またはＲ３’は、それぞれ互いに独立して、特に水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。Ｒ２’は、特に好ましくは水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。Ｒ２’およびＲ３’は、極めて特に好ましくは水素である。
【００４２】
Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、さらにまたペンチル、１−、２−もしくは３−メチルブチル、１，１−、１，２−もしくは２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシル、任意にジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピルまたはノナフルオロブチルである。
【００４３】
二重結合が複数存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルケニルは、例えば、アリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに４−ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、−Ｃ９Ｈ１７、−Ｃ１０Ｈ１９〜−Ｃ２０Ｈ３９、好ましくはアリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに好ましくは４−ペンテニル、イソペンテニルまたはヘキセニルである。
【００４４】
三重結合が複数存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルキニルは、例えば、エチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、さらに４−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、−Ｃ９Ｈ１５、−Ｃ１０Ｈ１７〜−Ｃ２０Ｈ３７、好ましくはエチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、４−ペンチニル、３−ペンチニルまたはヘキシニルである。
【００４５】
アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、例えば、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチルまたはフェニルヘキシル、ここでフェニル環およびアルキレン鎖の両方は、上記の通り、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌで部分的または完全に、または−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２で部分的に置換されてもよい。
【００４６】
３〜７個のＣ原子を有する、非置換飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキル基は、したがって、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、フェニル、シクロヘプテニルであり、これらはそれぞれ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されていてもよく、ここでシクロアルキル基またはＣ１〜Ｃ６アルキル基により置換されているシクロアルキル基はまた同様に、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、特にＦもしくはＣｌなどのハロゲン原子、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよい。
【００４７】
置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’において、α位においてヘテロ原子に結合していない、１個または２個以上の非隣接炭素原子はまた、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルから選択される原子および／または原子団により置き換えられていてもよい。
【００４８】
一般的な限定なく、このように修飾された置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’の例は：
−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４ＳＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−Ｏ−Ｃ４Ｈ９、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−Ｃ４Ｆ９、−Ｃ（ＣＦ３）３、−ＣＦ２ＳＯ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ４Ｎ（Ｃ２Ｆ５）Ｃ２Ｆ５、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ２Ｈ３、−Ｃ３ＦＨ６、−ＣＨ２Ｃ３Ｆ７、−Ｃ（ＣＦＨ２）３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５またはＰ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２である。
【００４９】
Ｒ’において、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルは、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。
Ｒ’において、置換フェニルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＲ’２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈで置換されたフェニルであり、ここで、Ｘ’はＦ、ＣｌまたはＢｒであり、Ｒ’’は、Ｒ’について定義したように、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、例えばｏ−、ｍ−もしくはｐ−メチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメチル）フェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメチルスルホニル）フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヨードフェニル、
【００５０】
特に好ましくは、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジヒドロキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジブロモフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメトキシフェニル、５−フルオロ−２−メチルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニルまたは２，４，５−トリメチルフェニルである。
【００５１】
Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロアリールは、５〜１３員環を有する、飽和もしくは不飽和の単−もしくは二環ヘテロ環ラジカルを意味するように用いられ、ここで、１、２もしくは３Ｎおよび／または１もしくは２ＳまたはＯ原子が存在してもよく、ヘテロ間ラジカルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＲ’２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’２またはＳＯ３Ｈにより、単−もしくは多置換されてもよく、ここでＸ’およびＲ’は、上記の意味を有する。
【００５２】
ヘテロ環ラジカルは、好ましくは置換または非置換２−もしくは３−フリル、２−もしくは３−チエニル、１−、２−もしくは３−ピロリル、１−、２−、４−もしくは５−イミダゾリル、３−、４−もしくは５−ピラゾリル、２−、４−もしくは５−オキサゾリル、３−、４−もしくは５−イソオキサゾリル、２−、４−もしくは５−チアゾリル、３−、４−もしくは５−イソチアゾリル、２−、３−もしくは４−ピリジル、２−、４−、５−もしくは６−ピリミジニル、フルテルモルプレフェラブリ１，２，３−トリアゾール−１−、−４−もしくは−５−イル、１，２，４−トリアゾール−１−、−４−もしくは−５−イル、１−もしくは５−テトラゾリル、１，２，３−オキサジアゾール−４−もしくは−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−もしくは−５−イル、１，３，４−チアジアゾール−２−もしくは−５−イル、１，２，４−チアジアゾール−３−もしくは−５−イル、１，２，３−チアジアゾール−４−もしくは−５−イル、２−、３−、４−、５−もしくは６−２Ｈ−チオピラニル、２−、３−もしくは４−４Ｈ−チオピラニル、３−もしくは４−ピリダジニル、
【００５３】
ピラジニル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチエニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−１Ｈ−インドリル、１−、２−、４−もしくは５−ベンゾイミダゾリル、１−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾピラゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾオキサゾリル、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾイソオキサゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチアゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾイソチアゾリル、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾ−２，１，３−オキサジアゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キノリニル、１−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−イソキノリニル、１−、２−、３−、４−もしくは９−カルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−もしくは９−アクリジニル、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−シンノリニル、２−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キナゾリニルまたは１−、２−もしくは３−ピロリジニルである。
【００５４】
ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルと類似であり、例えば、ピリジニルメチル、ピリジニルエチル、ピリジニルプロピル、ピリジニルブチル、ピリジニルペンチル、ピリジニルヘキシルを意味するように用いられ、ここで上記のヘテロ環ラジカルは、このようにさらにアルケニル鎖に繋がっていてもよい。
【００５５】
ＨｅｔＮ＋は好ましくは、
【化５】
2009545728.tif 000006
式中、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、それぞれ独立して、上記の意味を有する、
である。
【００５６】
本発明のイオン性液体のカチオンは、好ましくは、アンモニウム、イミダゾリウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ホスホニウム、モルホリニウムまたはピペリジニウムカチオンである。
【００５７】
特に好ましいイオン性液体は、１−ペンチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘプチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ノニル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム塩化物、エチルジメチルペンチルアンモニウムブロミド、エチルジメチルプロピルアンモニウム塩化物、１−メチル−１−オクチルピロリジニウム塩化物、ｎ−ブチルピリジニウム塩化物、ｎ−オクチルピリジニウム塩化物、４−メチル−４−ペンチルモルホリニウム臭化物または１−メチル−１−ペンチルピペリジニウム臭化物である。
【００５８】
特に極めて好ましいイオン性液体は、１−ペンチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ヘプチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−ノニル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、エチルジメチルペンチルアンモニウム臭化物および１−メチル−１−オクチルピロリジニウム塩化物である。
【００５９】
他の好ましい態様において、試薬混合物はさらに少なくとも１つのＴＬＣプレートを含む。
【００６０】
本発明はさらに、
ａ）薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣプレート）における試料のクロマトグラフ分離
ｂ）アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物を用いた、ＴＬＣプレートにおける分離された試料の染色
による、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための方法に関する。
【００６１】
本発明はさらに、
ａ’）薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣプレート）における試料のクロマトグラフ分離、ここで、移動相は少なくとも１つのイオン性液体を含む、および
ｂ’）アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬を少なくとも含む試薬混合物を用いた、ＴＬＣプレートにおける分離された試料の染色による、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための方法に関する。
【００６２】
本発明は、同様に、薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣプレート）における試料のクロマトグラフ分離によって、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための方法に関し、ここで移動相は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質、好ましくはニンヒドリンまたはその誘導体の１つ、および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む。
【００６３】
好ましい態様において、ステップａ）またはａ’）で用いられるＴＬＣプレートは、無極性相またはセルロース相を有するプレートである。
【００６４】
他の好ましい態様において、ステップｂ）における可視化を、ＴＬＣプレートをステップｂ１）において、まず、イオン性液体を少なくとも含む試薬で、そして引き続きステップｂ２）において、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリンまたはその誘導体の１つを少なくとも含む試薬で処理することにより行う。ステップｂ）における可視化を、まずアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくは、ニンヒドリンでの処理（ｂ２）により行い、そして、イオン性液体（ｂ１）での処理によって行うことも可能である。しかしながら、ステップｂ）における可視化を、好ましくはＴＬＣプレートを、ステップｂ１）においてまずイオン性液体を少なくとも含む試薬で、そして引き続きステップｂ２）において、ニンヒドリンまたはその誘導体の１つを少なくとも含む試薬で処理することにより行う。
【００６５】
好ましい態様において、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリン、および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物による処理の後、またはステップｂ’）の後に、ＴＬＣプレートを、ステップｂ）において、５０〜２００℃の温度まで、０．５〜１０分間熱する。
【００６６】
好ましい態様において、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％のニンヒドリンを少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬、および０．１〜１０％の少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬を含む試薬混合物が使用される。
【００６７】
本発明は、イオン性液体およびアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリンまたはその誘導体の１つを少なくとも含む、試薬組み合わせで、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を処理することを特徴とする、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質の可視化、特に染色のための方法にもさらに関する。
【００６８】
好ましい態様において、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質をまずイオン性液体を少なくとも含む試薬で処理し、そしてニンヒドリンを少なくとも含む試薬で処理する。
さらなる組み合わせまたは好ましい態様を特許請求の範囲に記載する。
【００６９】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料は、本発明にしたがって、少なくとも１つのアミノ酸および／またはペプチドを含むと考えられる試料である。試料は天然または合成起源でもよく、例えば細胞抽出物、体液、ペプチド合成からのタンパク質消化または反応混合物である。一般的に、これは液体試料であり、ここで検体は典型的に有機溶媒もしくは水、または有機溶媒の混合物もしくは有機溶媒および水の混合物中に存在する。試料は、所望のさらなる固体、乳化または溶解成分を含むことができ、これらはしかしながら、検体（アミノ酸および／またはペプチド）のＴＬＣ分離も後の染色も妨げるべきではない。
【００７０】
固形試料を一般的には、ＴＬＣプレートに適用できるように、まず上述の溶媒の１つに入れる。濃縮試料の場合には、まず希釈することが必要とされることもある。薄層クロマトグラフィーの分野における当業者には、可能な限り理想的に評価することができるバンドを得るために、用いられるＴＬＣプレートおよび特定の分離問題に依存して、試料の量のおよび試料の濃度がどれくらいであるべきか、またはどのくらいでなければならないのかは周知である。
【００７１】
本発明によれば、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質は、例えば、従来のニンヒドリン染色で染色することのできる、全ての天然または合成アミノ酸、２または３以上の天然または合成アミノ酸を含む化合物、およびアミノ含有化合物である。２または３以上の天然または合成アミノ酸を含有する化合物は、好ましくはオリゴアミノ酸またはペプチド、特には１５０アミノ酸までの鎖長を有する、好ましくは２〜１００、特に好ましくは２〜２５アミノ酸の鎖長を有するペプチドである。従来のニンヒドリン染色で染色することのできるアミノ含有化合物の例は、アミノ酸、アミンまたはアミノ糖である。アミノ酸合成または天然アミノ酸でもよい。これらは好ましくは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｐ、ＴｙｒまたはＶａｌなどの天然アミノ酸である。
【００７２】
本発明の方法を用いて、１５０アミノ酸よりも大きい鎖長を有するタンパク質またはペプチドを分析することが望まれる場合、これらは、さらなる態様において、例えばトリプシン消化によって、１５０アミノ酸よりも少ない鎖長を有するペプチドを得るために切断することができる。
【００７３】
本発明によれば、ＴＬＣプレートは、薄層クロマトグラフ分離を行うことができる任意の媒体である。一般的に、ＴＬＣプレートは支持体からなり、例えば吸着剤相で覆われているか、または被覆されている、ガラスプレート、金属プレートまたはフォイル(foil)もしくはプラスティックフィルムの形状である。用いられる吸着剤は、典型的には、クロマトグラフィー目的で周知の塩基吸着剤である。これらは、例えば、シリカゲル、酸化アルミニウム、セルロース、珪藻土または他の有機もしくは無機ポリマーまたは有機／無機ハイブリッドポリマーである。これらの塩基吸着剤は、さらに、それらの分離特性を変える、官能基で誘導体化してもよい。
【００７４】
これらの例はＲＰ相であり、ここで例えば、シリカゲルは、Ｃ８またはＣ１８鎖を有するリガンドで誘導体化される（逆相材料）。他の例は、ＣＮまたはジオール修飾相である。ＴＬＣ用の一般的な吸着相の概要は、Klaus K. Unger, Packings and Stationary Phases in Chromatographic Techniques, M. Decker, New York 1990において与えられる。吸着相は、それらの表面の極性にしたがって、有極性、中極性および無極性に分けることができる。本発明による試薬混合物が、珪藻土または逆相材料などの無極性相において、アミノ酸および／またはペプチドを染色するために特に適していることを見出した。セルロース相もまた、優れた色品質および強度で染色することができる。
【００７５】
本発明の試薬混合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリン、および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む。試薬混合物は、試薬、典型的には液体試薬の形状でもよく、または異なる試薬または成分を複数含むことができる。アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリン、および少なくとも１つのイオン性液体は、１つの試薬または２つの異なる試薬もしくは試薬混合物の成分において、一緒に存在してもよい。
【００７６】
一態様において、試薬混合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリン、および少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む、少なくとも典型的な液体試薬からなる。
【００７７】
好ましい態様において、試薬混合物は、少なくとも
ａ）ニンヒドリンまたはその誘導体の１つを少なくとも含む試薬、
ｂ）イオン性液体を少なくとも含む試薬
からなる。
両方の試薬は典型的に液体である。
【００７８】
用いることのできる溶媒は、１または２以上の有機溶媒、あるいは１または２以上の有機溶媒の水との混合物、あるいは水である。イオン性液体自体が、例えば上記の態様にしたがってアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質の検出のための試薬用の溶媒として機能するために、溶媒として働くことも可能である。複数の溶媒が存在してもよいが、好ましくは単一の溶媒のみが用いられる。有機溶媒において低い溶解性を有するイオン性液体には、水または水＋アルコールの混合物が適し得る。
【００７９】
例えば、ニンヒドリンおよび少なくとも１つのイオン性液体を含む試薬の場合、アセトンまたはプロパノールが好ましく溶媒として働く。ニンヒドリンを含むが、イオン性液体を含まない試薬の場合、プロパノールまたはアセトンなどの有機溶媒が、好ましく溶媒として働く。少なくとも１つのイオン性液体を含むが、ニンヒドリンを含まない試薬の場合、アセトン、プロパノール、水および水／アルコール混合物が好ましく溶媒として働く。
【００８０】
さらに、試薬は、例えば１または２以上の追加のイオン性液体、溶媒、安定化剤、緩衝剤、さらなる染料などの、さらなる物質を任意に含んでもよい。
ニンヒドリンは典型的に、０．０１〜１０重量％の濃度、好ましくは、０．１〜１重量％の濃度において、本発明による試薬に存在する。
【００８１】
イオン性液体は、試薬混合物の本質に依存して、０．１〜１００重量％の濃度で存在することができる。イオン性液体が同時に溶媒として働く場合、または試薬混合物が例えば、ニンヒドリンおよびイオン性液体の、別々の試薬を含む場合、イオン性液体の割合は、典型的に８０〜１００％である。例えば、ニンヒドリンおよびイオン性液体が同時に存在する態様の場合は、言うまでもなく、イオン性液体の割合は、１００％になり得ないが、代わりに、ニンヒドリン含有量に対応して減少されるべきである。
【００８２】
さらに、もう１つの溶媒が用いられる場合、イオン性液体は典型的に０．１〜１５重量％の濃度、好ましくは０．１〜１０重量％の濃度、特に好ましくは１〜５重量％の濃度で存在する。試薬が、２または３以上の異なるイオン性液体を含む場合、上記の濃度データは、イオン性液体の合計量に適用される。
【００８３】
本発明の試薬組み合わせのさらなる任意成分は、例えば、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の検出のための少なくとも１つの試薬、好ましくはニンヒドリン、および／または１または２以上のイオン性液体を少なくとも含む１または２以上のさらなる試薬（例えば、これらの成分を異なる濃度で含む試薬、または他のイオン性液体を含む試薬）、１または２以上のＴＬＣプレート、代替の染色試薬（例えばフルオレスカミン染色用試薬）または染色結果を評価するためのカラーテーブルまたはカラーサンプルである。
【００８４】
本発明の試薬組み合わせの例：
１．０．０１〜１０％のニンヒドリンおよび０．１〜１０％の１または２以上のイオン性液体を溶媒に少なくとも含む試薬からなる試薬組み合わせ。
【００８５】
２．ａ）０．０１〜１０％のニンヒドリンを溶媒に少なくとも含む試薬
ｂ）０．１〜１０％の１または２以上のイオン性液体を溶媒に少なくとも含む試薬
を含む試薬組み合わせ。
【００８６】
３．１または２以上のイオン性液体を溶媒に少なくとも含むさらなる試薬を追加で含む、変形体２に対応する試薬組み合わせ、ここで、追加の試薬のイオン性液体の本質、濃度および／または組成は、１または２以上のイオン性液体を溶媒に少なくとも含むもう１つの試薬のそれと異なる。
【００８７】
４．１または２以上のＴＬＣプレートおよび／または代替の染色試薬（例えばフルオレスカミン染色用試薬）および／または染色結果の評価のために色テーブルまたは色パターンを追加で含む、変形体１，２または３に対応する試薬組み合わせ。
【００８８】
好ましい試薬組み合わせは、２または３以上の試薬を含み、ここで、一方にニンヒドリン、他方に１または２以上のイオン性液体が、異なる試薬において独立して存在する。
【００８９】
アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析のための本発明の方法において、試料をまずＴＬＣプレートに適用し、薄層クロマトグラフィーによって分離する。薄層クロマトグラフ分離の遂行は、例えばDuennschichtchromatographie, Praktische Durchfuehrung and Fehlervermeidung [Thin-Layer Chromatography, Practical Performance and Error Avoidance] by Elke Hahn-Deinstrop, Wiley-VCH (1998)から、当業者に周知である。分離は一次元的または多次元的に行うことができる。
【００９０】
薄層クロマトグラフ分離が完了すると、試料に存在するアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質の可視化のために、ニンヒドリンおよび少なくとも１つのイオン性液体を少なくとも含む試薬混合物で染色を行う。この目的のために、ＴＬＣ分離に用いられる移動相を全部または部分的に取り除くために、ＴＬＣプレートを好ましくはまず若干、好ましくは完全に乾燥する。しかしながら、本発明の染色は、やはり移動相で浸されたＴＬＣプレートにおいて行うこともできる。
【００９１】
本発明の試薬組み合わせの適用、すなわち一般的に試薬混合物の試薬でＴＬＣプレートを湿らすことは、典型的にＴＬＣプレートを対応する液体試薬に浸すこと、または好ましくはＴＬＣプレートに試薬をスプレーすることによって行われる。
【００９２】
一態様において、ＴＬＣプレートをニンヒドリンおよび１または２以上のイオン性液体を溶媒に少なくとも含む試薬で湿らせる。この試薬は、その使用よりもしばらく前にすでに調製してもよく、また好ましくは、その使用よりも最低２４時間前に混合する。
【００９３】
好ましい態様において、ＴＬＣプレートをまず、イオン性液体を少なくとも１つの溶媒に少なくとも含む試薬で湿らせる。プレートを続けて、好ましくはＴＬＣプレートの完全な、または部分的な乾燥の後に、ニンヒドリンを少なくとも含む試薬で湿らせる。
【００９４】
染色されるアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質の本質に依存して、自然に、もしくは何時間ものインキュベーションの後に、または最も頻度の高い場合のように、単に加熱の後に、色反応は起こり得る。このために、本発明の試薬組み合わせの試薬の適用の後、ＴＬＣプレートを好ましくは３５℃より高い、好ましくは５０℃より高い温度まで熱する。特に好ましい態様において、プレートを５０〜２００℃の温度まで熱する。熱処理の長さは、一般的に０．５〜１０分である。
【００９５】
色形成は、視覚的にまたは対応する光学機器を用いて評価することができる。
本発明の試薬組み合わせは、他の媒体、例えば液体相における、または紙、ゲルもしくは膜などの他の支持体における、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質の染色に用いることもできる。試薬組み合わせは、一般的にまず、試料の中にアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質が存在するかを判断する迅速テストに、同等に用いることができる。この目的のために、クロマトグラフィーまたは他の分離を行う必要はない。試料を好ましくは支持体、例えばＴＬＣプレートを試薬組み合わせと接触させるだけで十分である。上記方法のステップｂ）に対応する手順。そして、発色から、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質が試料に存在するか否か、および可能であればどれが存在するかを判断することができる。
【００９６】
本発明の試薬混合物および本発明の方法の特別な利点は、異なるアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質に対して異なる色を形成することである。イオン性液体が添加されない従来のニンヒドリン染色の場合、プロリンは別にして、全てのアミノ酸および／またはペプチドが青からバイオレットの色を示すのに対し、本発明の染色における色は、色のスペクトル全体にわたる。さらに、用いられるイオン性液体（単数）または２もしくは３以上のイオン性液体の選択が、色スペクトルの形成を変えることを可能とする。したがって、必要であれば、異なるイオン性液体でのわずかな実験を参照して、どのイオン性液体またはどの混合物が、存在する分析問題に対して特に有利であるか、したがって、対象の検体を特に優れて、そして試料に存在する他のアミノ酸および／またはペプチドから区別する方法で染色するのかを見出すことが可能である。
【００９７】
アミノ酸およびペプチドもまた、それらの化学構造または組成に依存して、本発明の試薬組み合わせによる処理の後に異なる色を示す。これは両方、試料における特定のアミノ酸の同定だけでなく、例えばトリプチン消化後のペプチドマッピングのための、ペプチドの同定も相当簡素化する。
【００９８】
添付の表１および表２は、本発明による試薬組み合わせに対して、異なるイオン性液体での、いくつかのアミノ酸の染色において生じた色パターンを例示する。
【００９９】
【表１】
2009545728.tif 000007
【０１００】
【表２】
2009545728.tif 000008
【０１０１】
可視化は、通常１０〜５０ｎｇの量のアミノ酸またはペプチドによって、行うことができる。
ニンヒドリンに加えて、ニンヒドリンの対応する誘導体またはニンヒドリンの複合体、例えば、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｓｎとの組み合わせのそれらももちろん用いることができる。
【０１０２】
さらなるコメントがなくとも、当業者は上記の説明を広い範囲において利用することができると推測される。好ましい態様および例は、したがって、単に説明的な開示であり、全くこれらに限定されるものではないと考えられるべきである。
上記および下記の全ての出願、特許、文献の完全な開示の内容が、本出願に参照として組み込まれる。
本発明は、上記必須のまたは任意の成分または限定を、含むことも、これらから本質的になることも、またはこれらからなることも可能である。
【０１０３】
例
１．アミノ酸の選択的染色
【表３】
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【０１０４】
２．タンパク質のトリプチン消化からのペプチドの選択的染色
【表４】
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【０１０５】
方法説明：
試料適用：毛細管現象を利用して、または自動ＴＬＣアプリケーションデバイス（例えばLinomat V, Camag, Muttenz, Switzerland）を使用して、試料をＴＬＣプレートに適用する。典型的な試料は、１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度であり、１〜１０μｌを適用する。
【０１０６】
発現：発現をＴＬＣチャンバーにおいて行う。適用の後にプレートを簡単に乾燥し、そして、移動相で満たされたＴＬＣチャンバー（チャンバー飽和なし）に配置し、発現させる。発現距離は５ｃｍであり、５ｃｍの発現時間は約１時間である。
【０１０７】
乾燥：可能な限り完全に移動相を取り除くために、プレートを圧縮空気下で少なくとも３０分間乾燥する。
【０１０８】
染色：ＴＬＣスプレーデバイスを用いて、スプレーすることにより染色を行う。この目的のために、３．５％イオン性液体溶液および０．５％ニンヒドリン溶液を調製する。プレートにまずイオン性液体溶液をスプレーする。そして中間乾燥を５分間行う。そして、プレートにニンヒドリン溶液をスプレーし、直後に１１０℃で２分間熱する。プレートを簡単に冷却し、記録する。
【０１０９】
代替的に、完全自動スプレーデバイス、例えばDESAGA SARSTEDTグループ（ドイツ）からのChromaJet DS 20デバイスを用いることもできる。
【国際調査報告】
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