(57)【要約】【課題】  本発明において、５０％より多い中鎖脂肪酸又はその脂肪酸アルキルエステルを含み、低融点を有する、ブレンドオイル又は脂肪酸が提供される。【解決手段】  該ブレンドは、燃料として、又は、例えば、バイオディーゼルの生産のための出発物質として有用である。また、植物によって生産される中鎖脂肪酸の量が増加するように修飾された、遺伝子組み換え又は改変植物が提供される。さらに、脂肪酸メチルエステルブレンドの融点の予測方法、及び、例えば、バイオディーゼルとして使用するために適当であるブレンドを同定するための該方法の使用が提供される。【選択図】図５【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０％〜１００％の８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸及び１２〜１８個の炭素を有する一価不飽和脂肪酸、
５％〜８０％のカプリル酸（Ｃ８：０）及びカプリン酸（Ｃ１０：０）、並びに
２０％未満のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含む、脂肪酸混合物であって、
前記一価不飽和脂肪酸が、前記混合物の５重量％〜９５重量％を占め、
前記混合物が、１２個より多い炭素を有する２０％未満の多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸を含む、
脂肪酸混合物。
【請求項２】
６％〜２０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）が合計で、前記混合物の２０％〜４０％を占める、請求項１又は２に記載の混合物。
【請求項４】
オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）が合計で、前記混合物の５０％〜８５％を占める、請求項１又は２に記載の混合物。
【請求項５】
オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）が合計で、前記混合物の５０％〜８５％を占める、請求項１〜４のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項６】
ステアリン酸（１８：０）及びパルミチン酸（１６：０）が、前記混合物の４％未満を占める、請求項１〜５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項７】
ミリスチン酸（１４：０）が、前記混合物の２％未満を占める、請求項１〜６のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項８】
リノール酸（１８：２）及びリノレン酸（１８：３）が合計で、前記混合物の３％未満を占める、請求項１〜７のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項９】
アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が、前記混合物の１％未満を占める、請求項１〜８のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１０】
５５％〜６５％のオレイン酸（Ｃ１８：１）、
５％〜１５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）、
１５％〜２５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）、及び
５％〜１５％のカプリル酸（Ｃ８：０）、
を含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項１１】
カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）が合計で、混合物の６０％〜８５％を占める、請求項１に記載の混合物。
【請求項１２】
オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）が合計で、混合物の１５％〜４０％を占める、請求項１に記載の混合物。
【請求項１３】
オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）が合計で、混合物の５０％〜８５％を占める、請求項１２に記載の混合物。
【請求項１４】
ステアリン酸（１８：０）及びパルミチン酸（１６：０）が、混合物の４％未満を占める、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１５】
ミリスチン酸（１４：０）が混合物の２％未満を占める、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１６】
リノール酸（１８：２）及びリノレン酸（１８：３）が合計で、混合物の３％未満を占める、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１７】
アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）で、混合物の１％未満を占める、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１８】
５５％〜６５％のオレイン酸（Ｃ１８：１）、
５％〜１５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）、
１５％〜２５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）、及び
５％〜１５％のカプリル酸（Ｃ８：０）、
を含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項１９】
一価不飽和脂肪酸が混合物の少なくとも１０％を占める、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２０】
一価不飽和脂肪酸が混合物の少なくとも２０％を占める、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２１】
一価不飽和脂肪酸が混合物の少なくとも３０％を占める、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２２】
一価不飽和脂肪酸が混合物の少なくとも４０％を占める、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２３】
一価不飽和脂肪酸が混合物の少なくとも５０％を占める、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２４】
一価不飽和脂肪酸が混合物の少なくとも６０％を占める、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２５】
１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸が合計で、混合物の１５％未満を占める、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２６】
１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸が合計で、混合物の１０％未満を占める、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２７】
１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸が合計で、混合物の５％未満を占める、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２８】
１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸が合計で、混合物の３％未満を占める、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２９】
前記脂肪酸が、示された脂肪酸のアルキルエステルを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項３０】
前記脂肪酸が本質的に、示された脂肪酸のアルキルエステルからなる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項３１】
混合物がオイルである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項３２】
混合物が少なくとも２つの異なるオイルのブレンドである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の脂肪酸混合物からなる脂肪酸組成を有するオイルを生産するために改変された遺伝子改変植物。
【請求項３４】
ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、クフェア、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項３３に記載の遺伝子改変植物。
【請求項３６】
ナタネである、請求項３３に記載の遺伝子改変植物。
【請求項３７】
前記ナタネが、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ））からなる群より選択される、請求項３３に記載の遺伝子改変植物。
【請求項３８】
ダイズである、請求項３３に記載の遺伝子改変植物。
【請求項３９】
トウモロコシである、請求項３３に記載の遺伝子改変植物。
【請求項４０】
綿である、請求項３３に記載の遺伝子改変植物。
【請求項４１】
中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）を含み、前記カプリル酸がブレンドの最大約２５重量％を含む、少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、及び一価不飽和長鎖脂肪酸、並びに
１０重量％未満のミリスチン酸（Ｃ１４：０）及び飽和長鎖脂肪酸、
を含む、２又はそれ以上のオイルのブレンド。
【請求項４２】
前記中鎖脂肪酸がカプリン酸（Ｃ１０：０）を含み、前記カプリン酸がブレンドの約３０〜約６０重量％を含む、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項４３】
前記中鎖脂肪酸がラウリン酸（Ｃ１２：０）を含み、前記ラウリン酸がブレンドの約５〜約２０重量％を含む、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項４４】
８％未満のミリスチン酸及び飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項４５】
６％未満のミリスチン酸及び飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項４６】
約１５％〜約４０％の飽和中鎖脂肪酸及び約６０％〜約８５％の一価不飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項４７】
約６０％〜約８５％の飽和中鎖脂肪酸及び約１５％〜約４０％の一価不飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項４８】
前記一価不飽和長鎖脂肪酸が、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４１〜４７に記載のブレンド。
【請求項４９】
内燃機関内の燃料として使用するために適当である、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項５０】
前記オイルが、カノーラ、ナタネ、パームオイル、パーム核、ココナッツ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、クフェア、オリーブ、マカダミア、ババス、ヒマ、ピーナッツ、綿、亜麻種子、亜麻仁、コフネヤシ、及びジャトロファからなる群より選択される、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項５１】
前記オイルのうちの１つ又はそれ以上が遺伝子改変植物に由来し、該植物が飽和中鎖脂肪酸を生産するように改変されている、請求項４１に記載のブレンド。
【請求項５２】
−１０℃未満又は−１０℃の融点を有する、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載のブレンド。
【請求項５３】
−２０℃未満又は−２０℃の融点を有する、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載のブレンド。
【請求項５４】
脂肪酸が該脂肪酸のアルキルエステルに変換されている、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載のブレンド。
【請求項５５】
前記脂肪酸アルキルエステルが、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、及びブチルエステルからなる群より選択される、請求項５４に記載のブレンド。
【請求項５６】
前記脂肪酸アルキルエステルがメチルエステルである、請求項５５に記載のブレンド。
【請求項５７】
飽和中鎖脂肪酸がカプリル酸（Ｃ８：０）を含み、前記カプリル酸がブレンドの最大約２５重量％を含む、少なくとも５０重量％の中鎖脂肪酸、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、及び一価不飽和長鎖脂肪酸、並びに
１０重量％未満のミリスチン酸（Ｃ１４：０）及び飽和長鎖脂肪酸、
を含む、脂肪酸混合物。
【請求項５８】
前記中鎖脂肪酸がカプリン酸（Ｃ１０：０）を含み、前記カプリン酸がブレンドの約３０〜約６０重量％を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項５９】
前記飽和中鎖脂肪酸がラウリン酸（Ｃ１２：０）を含み、前記ラウリン酸がブレンドの約５〜約２０重量％を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項６０】
前記中鎖脂肪酸が、１２個又はそれ未満の炭素を有する脂肪酸を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項６１】
８％未満のミリスチン酸及び飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項６２】
６％未満のミリスチン酸及び飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項６３】
約１５％〜約４０％の飽和中鎖脂肪酸及び約６０％〜約８５％の一価不飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項６４】
約６０％〜約８５％の中鎖脂肪酸及び約１５％〜約４０％の一価不飽和長鎖脂肪酸を含む、請求項５７に記載の混合物。
【請求項６５】
前記一価不飽和長鎖脂肪酸が、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項５７〜６４のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項６６】
−１０℃又はそれ未満の融点を有する、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項６７】
−２０℃又はそれ未満の融点を有する、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項６８】
脂肪酸が該脂肪酸のアルキルエステルに変換されている、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項６９】
前記脂肪酸アルキルエステルが、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、及びブチルエステルからなる群より選択される、請求項６８に記載の混合物。
【請求項７０】
少なくとも５０重量％の飽和中鎖脂肪酸アルキルエステル、ミリストレイン酸アルキルエステル、及び一価不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステル、並びに、
１０重量％未満のミリスチン酸アルキルエステル及び飽和長鎖脂肪酸アルキルエステル、
を含む、脂肪酸アルキルエステルの混合物。
【請求項７１】
前記中鎖脂肪酸アルキルエステルがカプリル酸アルキルエステル（Ｃ８：０）を含み、前記カプリル酸アルキルエステルがブレンドの最大約２５重量％を含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７２】
前記中鎖脂肪酸アルキルエステルがカプリン酸アルキルエステル（Ｃ１０：０）を含み、前記カプリン酸アルキルエステルがブレンドの約３０〜約６０重量％を含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７３】
前記中鎖脂肪酸アルキルエステルがラウリン酸アルキルエステル（Ｃ１２：０）を含み、前記ラウリン酸アルキルエステルがブレンドの約５〜約２０重量％を含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７４】
前記中鎖脂肪酸アルキルエステルが、１２個又はそれ未満の炭素を有する脂肪酸アルキルエステルを含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７５】
８％未満のミリスチン酸アルキルエステル及び飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７６】
６％未満のミリスチン酸アルキルエステル及び飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７７】
約１５％〜約４０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル及び約６０％〜約８５％の一価不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７８】
約６０％〜約８５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル及び約１５％〜約４０％の一価不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルを含む、請求項７０に記載の混合物。
【請求項７９】
前記一価不飽和長鎖脂肪酸アルキルエステルが、パルミトレイン酸脂肪酸アルキルエステル（Ｃ１６：１）、オレイン酸脂肪酸アルキルエステル（Ｃ１８：１）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項７０〜７８のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項８０】
前記脂肪酸アルキルエステルが、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、及びブチルエステルからなる群より選択される、請求項７０〜７９のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項８１】
前記脂肪酸アルキルエステルがメチルエステルである、請求項８０に記載の混合物。
【請求項８２】
−１０℃又はそれ未満の融点を有する、請求項８０〜８１のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項８３】
−２０℃又はそれ未満の融点を有する、請求項８０〜８１のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項８４】
１５％〜２５％のカプリル酸メチルエステル（Ｃ８）、２５％〜３５％のカプリン酸メチルエステル（Ｃ１０）、５％〜２０％のラウリン酸メチルエステル（Ｃ１２）を含む、請求項８１に記載の混合物。
【請求項８５】
５％〜１５％のカプリル酸メチルエステル（Ｃ８）、３０％〜４０％のカプリン酸メチルエステル（Ｃ１０）、５％〜２０％のラウリン酸メチルエステル（Ｃ１２）を含む、請求項８１に記載の混合物。
【請求項８６】
５％〜１０％のカプリル酸メチルエステル（Ｃ８）、３０％〜４０％のカプリン酸メチルエステル（Ｃ１０）、５％〜２０％のラウリン酸メチルエステル（Ｃ１２）を含む、請求項８１に記載の混合物。
【請求項８７】
５％〜１０％のカプリル酸メチルエステル（Ｃ８）、２５％〜３５％のカプリン酸メチルエステル（Ｃ１０）、５％〜２０％のラウリン酸メチルエステル（Ｃ１２）を含む、請求項８１に記載の混合物。
【請求項８８】
内燃機関内の燃料として使用するために適当である、請求項７０に記載の混合物。
【請求項８９】
燃料添加剤、機能液、又は凝固点降下剤として使用するために適当である、請求項７０に記載の混合物。
【請求項９０】
請求項７０に記載の混合物及び石油ディーゼルを含むバイオディーゼルブレンド。
【請求項９１】
前記混合物が、１％、２％、５％、１０％、１５％、及び２０％からなる群より選択されるブレンドの一部を含む、請求項９０に記載のバイオディーゼルブレンド。
【請求項９２】
１つ又はそれ以上の設計された変異を有する１つ又はそれ以上の改変酵素を発現する遺伝子組み換え植物であって、該１つ又はそれ以上の設計された変異が該酵素内の規定された位置に存在し、天然の植物と比較して、増加した量の１２個又はそれより少ない炭素を有する中鎖脂肪酸を生産する、前記遺伝子組み換え植物。
【請求項９３】
クフェア種ではない、請求項９２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項９４】
ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、パーム、ヒマ、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項９２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項９５】
ナタネである、請求項９４に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項９６】
前記ナタネが、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ））からなる群より選択される、請求項９５に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項９７】
ヒマである、請求項９２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項９８】
前記改変酵素がアシルＡＣＰチオエステラーゼである、請求項９２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項９９】
前記修飾アシルＡＣＰチオエステラーゼが、配列番号２の９１〜３９７位に相当する領域内の１ヶ所又はそれ以上の位置における変異を含む、請求項９８に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１００】
前記修飾アシルＡＣＰチオエステラーゼが、配列番号２のアミノ酸残基１２８〜１４７位、配列番号２のアミノ酸残基１７５〜２０６位、配列番号２のアミノ酸残基２５４〜２９７位、配列番号２のアミノ酸残基３３３〜３３５位、及び配列番号２のアミノ酸残基３６５〜３９７位からなる群より選択される領域に相当する領域に１ヶ所又はそれ以上の位置における変異を含む、請求項９９に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０１】
前記修飾アシルＡＣＰチオエステラーゼが、配列番号２の位置に相当する１ヶ所又はそれ以上の位置における変異を含む、請求項９９に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０２】
前記改変酵素がケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）である、請求項９２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０３】
前記修飾ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）が、配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３８５位に相当する領域内の１ヶ所又はそれ以上の位置における変異を含む、請求項１０２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０４】
前記修飾ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）が、配列番号３の３２５〜３４０位に相当する領域内の１ヶ所又はそれ以上の位置における変異を含む、請求項１０３に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０５】
修飾ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をさらに含む、請求項９８に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０６】
前記変異を含む遺伝子修復オリゴ核酸塩基を用いることにより変異が達成される、請求項１０２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０７】
ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、クフェア、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項１０６に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１０８】
１つ又はそれ以上の設計された変異を有する１つ又はそれ以上の改変酵素を発現する遺伝子組み換え植物であって、該１つ又はそれ以上の設計された変異が該酵素内の規定された位置に存在し、天然の植物と比較して、増加した量の１６個の炭素、１８個の炭素、又はその組み合わせを有する一価不飽和脂肪酸を生産する、前記遺伝子組み換え植物。
【請求項１０９】
ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、パーム、ヒマ、トウモロコシ、及びクフェアからなる群より選択される、請求項１０８に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１００】
ナタネである、請求項１０９に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１１】
前記ナタネが、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ））からなる群より選択される、請求項１０９に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１２】
前記改変酵素がデサチュラーゼである、請求項１０８に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１３】
前記デサチュラーゼがΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼである、請求項１１２に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１４】
前記改変酵素がΔ１２デサチュラーゼである、請求項９２〜１０５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１５】
前記修飾が、Δ１２デサチュラーゼの活性又は発現を減少させる、請求項１０５に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１６】
トランスジーンをさらに含む、請求項９２又は１０８に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１１７】
請求項３１に記載のいずれかのオイルを生産する、遺伝子組み換え植物。
【請求項１１８】
請求項９２〜１１７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え植物を生産するための種子。
【請求項１１９】
請求項９２〜１１７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え植物の種子、果実、又は葉から抽出されたオイル。
【請求項１２０】
１つ又はそれ以上の設計された変異を有する１つ又はそれ以上の改変酵素を発現する遺伝子組み換え植物であって、４０％よりも多い長鎖脂肪酸を有するオイルを天然の状態で生産する植物に由来し、該１つ又はそれ以上の設計された変異が該酵素内の規定された位置に存在し、且つ、天然の植物と比較して、増加した量の１２個又はそれより少ない炭素を有する中鎖脂肪酸を生産する、前記遺伝子組み換え植物。
【請求項１２１】
前記長鎖脂肪酸が、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２２】
クフェア種ではない、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２３】
ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、パーム、ヒマ、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２４】
ナタネである、請求項１２３に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２５】
前記ナタネが、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ））からなる群より選択される、請求項１２４に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２６】
前記改変酵素がアシルＡＣＰチオエステラーゼである、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２７】
前記改変酵素がケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）である、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２８】
修飾ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をさらに含む、請求項１２６に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２９】
前記変異を含む遺伝子修復オリゴ核酸塩基を用いることにより変異が達成される、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１３０】
ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、クフェア、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１３１】
トランスジーンをさらに含む、請求項１２０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１３２】
請求項１に記載のオイルを生産する遺伝子組み換え植物。
【請求項１３３】
請求項１２０〜１３２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え植物を生産するための種子。
【請求項１３４】
請求項１２０〜１３２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え植物の種子、果実、又は葉から抽出されたオイル。
【請求項１３５】
Ｃ８及びＣ１０脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する第一のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする発現トランスジーン、及びＣ１２脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する第二のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする発現トランスジーンを含むトランスジェニック植物。
【請求項１３６】
前記第一のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、及びアルマス・アメリカーナ（Ｕｌｍｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）からなる群より選択される植物から取得することができる配列によりコードされている、請求項１３５に記載の植物。
【請求項１３７】
前記第二のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（カリフォルニア・ベイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｂａｙ））から取得することができる配列によりコードされている、請求項１３５に記載の植物。
【請求項１３８】
ナタネ、クフェア、綿、亜麻、ピーナッツ、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項１３５に記載の植物。
【請求項１３９】
ナタネである、請求項１３８に記載の植物。
【請求項１４０】
前記ナタネが、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ））からなる群より選択される、請求項１３９に記載の植物。
【請求項１４１】
請求項１３５〜１４０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物を生産するための種子。
【請求項１４２】
請求項１３５〜１４０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物の種子、果実、又は葉から抽出されたオイル。
【請求項１４３】
脂肪酸アルキルエステルを含むバイオディーゼルを生産するために、遺伝子組み換え植物又はトランスジェニック植物の種子、果実、又は葉から抽出されたオイルをエステル交換する工程を含む、該遺伝子組み換え植物又は該トランスジェニック植物のオイルからバイオディーゼルを生産する方法。
【請求項１４４】
前記エステル交換が、前記オイルをアルコール及び塩基性触媒と反応させることにより達成される、請求項１４３に記載のバイオディーゼルを生産する方法。
【請求項１４５】
前記脂肪酸アルキルエステルを精製する工程をさらに含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
予測される融点ＰTmを計算する工程を含む、脂肪酸メチルエステルのブレンドの融点を予測する方法であって、
ＰTm＝［（Ａ＊ＭＰA＊ＦA）＋（Ｂ＊ＭＰB＊ＦB）＋（Ｃ＊ＭＰC＊ＦC）＋（Ｄ＊ＭＰD＊ＦD）＋（Ｅ＊ＭＰE＊ＦE）＋（Ｆ＊ＭＰF＊ＦF）＋（Ｇ＊ＭＰG＊ＦG）＋（Ｈ＊ＭＰH＊ＦH）＋（Ｉ＊ＭＰI＊ＦI）＋（Ｊ＊ＭＰJ＊ＦJ）＋（Ｋ＊ＭＰK＊ＦK）＋（Ｌ＊ＭＰL＊ＦL）＋（Ｍ＊ＭＰM＊ＦM）］＊（０．０１）
であり、
式中、
Ａは前記ブレンド中のカプロン酸ＭＥ（６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｂは前記ブレンド中のカプリル酸ＭＥ（８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｃは前記ブレンド中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｄは前記ブレンド中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｅは前記ブレンド中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｆは前記ブレンド中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｇは前記ブレンド中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｈは前記ブレンド中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｉは前記ブレンド中のリノール酸ＭＥ（１８：２）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｊは前記ブレンド中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｋは前記ブレンド中のアラキジン酸ＭＥ（２０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｌは前記ブレンド中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｍは前記ブレンド中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
ＭＰAは、−８１℃〜−６１℃であり；
ＭＰBは、−５０℃〜−３０℃であり；
ＭＰCは、−２８℃〜−８℃であり；
ＭＰDは、−５℃〜１５℃であり；
ＭＰEは、９℃〜２９℃であり；
ＭＰFは、２１℃〜４１℃であり；
ＭＰGは、２８℃〜４８℃であり；
ＭＰHは、−３０℃〜−１０℃であり；
ＭＰIは、−４５℃〜−２５℃であり；
ＭＰJは、−６７℃〜−４７℃であり；
ＭＰKは、４５℃〜６５℃であり；
ＭＰLは、４３℃〜６３℃であり；
ＭＰMは、４８℃〜６８℃であり；
ＦAは、８〜１２であり；
ＦBは、３．５〜５．５であり；
ＦCは、１．０〜１．４であり；
ＦDは、０．８〜１．２であり；
ＦEは、０．５〜０．７であり；
ＦFは、１．１〜１．６であり；
ＦGは、１．８〜２．６であり；
ＦHは、０．９〜１．３であり；
ＦIは、０．５〜０．８であり；
ＦJは、０．１５〜０．２５であり；
ＦKは、８〜１２であり；
ＦLは、１．６〜２．４であり；且つ
ＦMは、１．６〜２．４である、
前記予測方法。
【請求項１４７】
ＰTm＝［Ａ（−７１．０）（１０．０）＋Ｂ（−４０．０）（４．５）＋Ｃ（−１８．０）（１．２）＋Ｄ（５．２）（１．０）＋Ｅ（１９．０）（０．６０）＋Ｆ（３０．７）（１．３５）＋Ｇ（３７．８）（２．１５）＋Ｈ（−１９．９）（１．１０）＋Ｉ（−３５．０）（０．６５）＋Ｊ（−５７）（０．２）＋Ｋ（５４．５）（１０．０）＋Ｌ（５３．０）（２．０）＋Ｍ（５７．４）（２．０）］＊（０．０１）である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
以下の工程ａ）及びｂ）を含む、バイオディーゼルとしての使用に適している脂肪酸メチルエステルブレンドの同定方法であって、
工程ａ）は、予測される融点ＰTmを計算する工程であって、
ＰTm＝［（Ａ＊ＭＰA＊ＦA）＋（Ｂ＊ＭＰB＊ＦB）＋（Ｃ＊ＭＰC＊ＦC）＋（Ｄ＊ＭＰD＊ＦD）＋（Ｅ＊ＭＰE＊ＦE）＋（Ｆ＊ＭＰF＊ＦF）＋（Ｇ＊ＭＰG＊ＦG）＋（Ｈ＊ＭＰH＊ＦH）＋（Ｉ＊ＭＰI＊ＦI）＋（Ｊ＊ＭＰJ＊ＦJ）＋（Ｋ＊ＭＰK＊ＦK）＋（Ｌ＊ＭＰL＊ＦL）＋（Ｍ＊ＭＰM＊ＦM）］＊（０．０１）
であり、
式中、
Ａは前記ブレンド中のカプロン酸ＭＥ（６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｂは前記ブレンド中のカプリル酸ＭＥ（８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｃは前記ブレンド中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｄは前記ブレンド中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｅは前記ブレンド中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｆは前記ブレンド中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｇは前記ブレンド中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｈは前記ブレンド中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｉは前記ブレンド中のリノール酸ＭＥ（１８：２）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｊは前記ブレンド中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｋは前記ブレンド中のアラキジン酸ＭＥ（２０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｌは前記ブレンド中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｍは前記ブレンド中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
ＭＰAは、−８１℃〜−６１℃であり；
ＭＰBは、−５０℃〜−３０℃であり；
ＭＰCは、−２８℃〜−８℃であり；
ＭＰDは、−５℃〜１５℃であり；
ＭＰEは、９℃〜２９℃であり；
ＭＰFは、２１℃〜４１℃であり；
ＭＰGは、２８℃〜４８℃であり；
ＭＰHは、−３０℃〜−１０℃であり；
ＭＰIは、−４５℃〜−２５℃であり；
ＭＰJは、−６７℃〜−４７℃であり；
ＭＰKは、４５℃〜６５℃であり；
ＭＰLは、４３℃〜６３℃であり；
ＭＰMは、４８℃〜６８℃であり；
ＦAは、８〜１２であり；
ＦBは、３．５〜５．５であり；
ＦCは、１．０〜１．４であり；
ＦDは、０．８〜１．２であり；
ＦEは、０．５〜０．７であり；
ＦFは、１．１〜１．６であり；
ＦGは、１．８〜２．６であり；
ＦHは、０．９〜１．３であり；
ＦIは、０．５〜０．８であり；
ＦJは、０．１５〜０．２５であり；
ＦKは、８〜１２であり；
ＦLは、１．６〜２．４であり；且つ
ＦMは、１．６〜２．４であり、
工程ｂ）は、カットオフ値に対して予測される融点ＰTmを比較する工程であって、カットオフ値より低い又は等しいＰTmを有するブレンドがバイオディーゼルとしての使用に適している、
前記予測方法。
【請求項１４９】
前記カットオフ値が−１０℃である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記カットオフ値が−２０℃である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
ＰTm＝［Ａ（−７１．０）（１０．０）＋Ｂ（−４０．０）（４．５）＋Ｃ（−１８．０）（１．２）＋Ｄ（５．２）（１．０）＋Ｅ（１９．０）（０．６０）＋Ｆ（３０．７）（１．３５）＋Ｇ（３７．８）（２．１５）＋Ｈ（−１９．９）（１．１０）＋Ｉ（−３５．０）（０．６５）＋Ｊ（−５７）（０．２）＋Ｋ（５４．５）（１０．０）＋Ｌ（５３．０）（２．０）＋Ｍ（５７．４）（２．０）］＊（０．０１）である、請求項１４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年６月２８日に出願された、脂肪酸ブレンド及びその使用と題された米国特許仮出願第６０／８１７，５５８号に対する優先権を主張するものであり、該文献は、図面を含みその全体を参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
オイル、オイル又は脂肪酸のブレンド、燃料としての使用を含む、かかるブレンドの使用、及びオイル又は脂肪酸のブレンドを得るための方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景に関する以下の記載は、単に、発明の理解を助けるものとして提供され、本発明の先行技術を記載又は構成すると認めるものではない。
【０００４】
植物性オイルは、代替燃料及びバイオディーゼルの製造のための原料として使用されている。通常、使用されるオイルは、特定の地域で大量に栽培されている植物から抽出される。したがって、ダイズオイルは、米国において、バイオディーゼルの供給源として関心をもたれており、一方、ナタネオイルは、ヨーロッパ諸国において関心をもたれており；熱帯性気候を示す国々はココナッツオイル又はパームオイルを利用している（Ｋｎｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｗｗｗ．ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｐｏｒｔｓｄａｔａｂａｓｅ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｅｎ／１９９６１２０１＿ｇｅｎ−１６２．ｐｄｆにてオンライン公開）。
【０００５】
ＶＳ−３２０、すなわち変異クフェア・ビスコシマ（Ｃｕｐｈｅａ  ｖｉｓｃｏｓｓｉｍａ）、からのオイルを模倣したトリグリセリド組成物がＧｅｌｌｅｒらにより開示されている（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  ４２：８５９−８６２，１９９９）。Ｇｅｌｌｅｒ中に開示されている「ＶＳ−３２０オイルを模倣したアナログ」は、４．２％のＣ６：０；４０．２０％のＣ８：０；３６．９０％のＣ１０：０；４．８０％のＣ１２：０；６．８０％のＣ１４：０；３．３３％のＣ１６：０；０．００％のＣ１８：０；１．３７％のＣ１８：１；２．０５％のＣ１８：２；及び０．００％のＣ１８：３のトリグリセリド組成を有する（表１参照）。Ｇｅｌｌｅｒら（１９９９）は、「このモデルは、植物性オイル中のＣ８：０含量の増大が、その結果生じる中鎖及び長鎖トリグリセリドの低減とともに、代替ディーゼル燃料のより効率的で、優れた実行をもたらし得ることを示唆している。」と結論付けた。
【０００６】
Ｓｔｏｕｒｎａｓら（ＪＡＣＯＳ，１９９５，７２：４３３−４３７）は、燃料としての各種オイルの特性を開示しており、「流動点測定の併行精度±３℃を考慮した場合、添加される成分の大部分は、燃料主成分の−１２℃という流動点に有意な程度の影響を及ぼしているとは思われなかった。主な例外は、Ｃ12及びより長いアルキル鎖を有する飽和脂肪アルコールであり、これらは流動点を実質的に増大させる；より長い鎖のエステルのうちには、わずかに負の影響が観察されたものもあった。全てのオレエート誘導体中における二重結合の存在が、対応するステアレートと比較して、そのコールドフロー特性を明らかに向上させることは注目に値すべきことである。」こと、及び「点火特性とコールドフロー特性の両方を考慮した場合、３級ジメチルアミンが最も優れており；しかしながら、いくつかの最近の研究が示しているように、天然の植物性オイルのグリセリドからの調製が、アミンの調製よりもずっと容易であり得るという点において、３級アミドも興味深い候補であると思われる。」ことを記載している。
【０００７】
Ｍｉｔｔｅｌｂａｃｈ（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，５６：７−１１）は、「植物性油由来のディーゼル燃料の特性及び品質管理」を論じており、「ＲＭＥに対するオーストリア基準にはまだ含まれていないが、脂肪酸メチルエステルに対する一般的基準を規定する場合に必要となり得る一つのパラメーターがヨウ素価であり、これは、不飽和脂肪酸の含量を表し、植物性油の起源にのみ依存する。ドイツでは、１１５の値が規定されており、これはナタネオイルに相当するが、ヒマワリオイル及びダイズオイルのような異なる種類のオイルは除外し得る。不飽和脂肪酸の限界は、より不飽和度の高い脂肪酸の加熱はグリセリドの重合化をもたらすという事実から、必要となり得る。このことは、潤滑油の沈着形成又は劣化につながり得る。この影響は脂肪酸鎖中の二重結合の数と共に増大する。したがって、ヨウ素価を用いて不飽和度を制限するよりも、リノレン酸のような不飽和度の高い脂肪酸の含量で制限した方がよいと思われる。」と記載している。
【０００８】
Ｇｒａｂｏｓｋｉ（Ｐｒｏｇ．Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ  Ｓｃｉ，１９９８，２４：１２５−１６４）は、「燃料特性、エンジン性能、及び排気に関しての脂肪及びオイル由来ディーゼル燃料の特性」を論じており、「鎖長の低減及び／又は鎖の分岐の増大は、燃料のコールドフロー特性を向上させ得る。鎖長及び分岐度は、植物育種又は遺伝子操作手法の両方により、並びに、特定の二重結合を切断するため、又は、分岐異性体を形成させるためにバイオディーゼルの化学的処理を行うことにより、改変し得る。化学処理分野においては、非常に少ない実用的研究のみが行われている。バイオディーゼル燃料のコールドフロー特性は、明らかに、多くの研究を必要としている分野である。」ことを記載している。
【０００９】
Ｇｏｏｄｒｕｍら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，５６：５５−６０）は、「バイオディーゼル燃料モデル開発のための低分子量トリグリセリドの物理学的特性」を論じており、「多量の低分子量トリグリセリド画分を含むオイルは、燃料増量剤としての直接的使用に適し得る。実際、クフェア種由来の原料（Ｇｒａｈａｍ，１９８９）は、これらのトリグリセリド（特に、トリカプリリン及びトリカプリン）から主として構成されるオイルを含む。最新のＤＮＡ輸送技術は、クフェア等の種に由来する低分子量トリグリセリドの合成を制御する遺伝子を、他の既知の油料種子作物中へ輸送することも可能にし得る。その結果、最適な所望のバイオディーゼル特性のために、オイル組成を遺伝的に改変し得る。」ことを記載している。
【００１０】
Ｋｎｏｔｈｅ（Ｆｕｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，８６：１０５９−１０７０）は、「飽和脂肪化合物は不飽和脂肪化合物よりも有意に高い融点を有し（表１）、混合物中でそれらは不飽和物よりも高い温度で結晶化する。したがって、大量の飽和脂肪化合物を含む脂肪又はオイル由来のバイオディーゼル燃料は、より高い曇り点及び流動点を示し得る。」と記載している。
【００１１】
Ｋｉｎｎｅｙら（Ｆｕｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，８６：１１３７−１１４７）は、性能が向上したバイオディーゼルブレンドのためのダイズ油の改変に関する問題について記載している。この文献は、Ｇｅｌｌｅｒら，１９９９に開示されているブレンドについて言及しており、「これらの短鎖脂肪酸由来のバイオディーゼルの融点はかなり高いことから、コールドフロー特性を向上させるために、さらなる脱ろう工程が必要となり得る。」ことを記載している。Ｋｉｎｎｅｙらは、「飽和脂肪酸含量を増加させる脂肪酸プロファイルの変更は、酸化安定性を増大させ得るが、コールドフローを悪化させ得……脂肪酸中の二重結合の存在はセタン価を低下させ得る；したがって、植物性油からなる脂肪プールを飽和成分に変更する方法は、得られるバイオディーゼルの点火特性を向上させ得るが、酸化安定性に関してと同様に、コールドフロー特性に悪影響を及ぼし得る。」ことも記載している。
【００１２】
米国特許第４，３６４，７４３号（「７４３特許」）は、「単独で又は他の既知の燃料と組み合わせて燃焼させた場合に、新規エネルギー供給源を提供する合成脂肪酸エステル燃料」と「エステルは、好ましくは、ダイズオイル、パームオイル、ベニバナオイル、ピーナッツオイル、トウモロコシオイル、綿実オイル、亜麻仁オイル、オイチシカオイル、キリオイル、ココナッツオイル、ヒマシオイル、ペリーラオイル、ナタネオイル、ヒマワリオイル、豚脂、獣脂、魚油、鯨油、海生動物及び陸生動物由来の脂質並びに植物源由来の脂質等の各種オイルを用いてエステル交換反応により調製される。」ことを開示している。
【００１３】
米国特許第５，３８９，１１３号（「１１３特許」）は、「ａ）１２〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸及び１〜４個の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールに由来し、５０〜１５０のヨウ素価を有する、５８〜９５重量％の少なくとも１つのエステル、ｂ）６〜１４個の炭素原子を含む脂肪酸及び１〜４個の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールからなる４〜４０重量％の少なくとも１つのエステル、及びｃ）０．１〜２重量％の少なくとも１つのポリマー性エステル、を含む混合物」を開示している。
【００１４】
米国特許出願公開第２００６０２６９６３号は、「改変された種子油組成物を製造するための核酸構築物及び製造方法」を開示しており、「ｉ）同様の遺伝的背景及び第２の異種ＦＡＤ２配列を含み、第２の異種ＦＡＤ２配列が第１の異種ＦＡＤ２配列よりも内因性であるＦＡＤ２配列からなる植物細胞における、ＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較して、第１の異種ＦＡＤ２配列によって形質転換された植物におけるＦＡＤ２遺伝子抑制の量が少なくとも部分的に低減するまで、第１の異種ＦＡＤ２配列の長さを短くする工程；ｉｉ）同様の遺伝的背景を有するが、異種ＦＡＴＢ配列を有さない植物細胞におけるＦＡＴＢと比較して、植物細胞中でのＦＡＴＢ遺伝子の発現を少なくとも部分的に低減し得る異種ＦＡＴＢ配列を発現させる工程；ｉｉｉ）第１の異種ＦＡＤ２配列及び異種ＦＡＴＢ配列を有するゲノムを含む植物を生育する工程；及び、ｉｖ）同様の遺伝的背景を有するが、第１の異種ＦＡＤ２配列及び異種ＦＡＴＢ配列を欠如する植物由来の種子と比較して低減した飽和脂肪酸含量を有する種子を生産する植物を栽培する工程、を含む、植物種子中のオレイン酸含量を増大し、飽和脂肪酸含量を低減する方法」を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，３６４，７４３号
【特許文献２】米国特許第５，３８９，１１３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６０２６９６３号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｋｎｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｗｗｗ．ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｐｏｒｔｓｄａｔａｂａｓｅ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｅｎ／１９９６１２０１＿ｇｅｎ−１６２．ｐｄｆにてオンライン公開
【非特許文献２】Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  ４２：８５９−８６２，１９９９
【非特許文献３】Ｓｔｏｕｒｎａｓら（ＪＡＣＯＳ，１９９５，７２：４３３−４３７）
【非特許文献４】Ｍｉｔｔｅｌｂａｃｈ（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，５６：７−１１）
【非特許文献５】Ｇｒａｂｏｓｋｉ（Ｐｒｏｇ．Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ  Ｓｃｉ，１９９８，２４：１２５−１６４）
【非特許文献６】Ｇｏｏｄｒｕｍら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，５６：５５−６０）
【非特許文献７】Ｋｎｏｔｈｅ（Ｆｕｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，８６：１０５９−１０７０）
【非特許文献８】Ｋｉｎｎｅｙら（Ｆｕｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，８６：１１３７−１１４７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
出願人らは、代替燃料として、又は、バイオディーゼル製造のための原料として使用するための所望の特性をブレンドが示すように、植物性オイルのブレンドを選択し得ることを見出した。例えば、寒冷な気候において燃料として使用した場合、ブレンドが凍結しにくいように、かかるブレンドは選択され得る。また、より高い温度でブレンドが安定であるように、ブレンドを選択してもよい。さらに、乗り物の燃料として使用した場合に所望の点火特性が達成されるようにブレンドを選択してもよい。本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドの特徴のいくつかの具体例を以下に記載する。本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドは、以下の実施形態に記載される特徴の任意の組み合わせを有し得ることが理解される。特に、本発明者らは、特定の脂肪酸混合物が、バイオ燃料生産のための驚くべきほど有利な特性を有することを見出した。例えば、本発明者らは、特定のバランスの中鎖脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸が、例えば、低温気候耐性に関する、驚くべき有利な特性を有し得ることを見出した。バランスのとれた量の中鎖脂肪酸（例えば、Ｃ８、Ｃ１０及びＣ１２）及び一価不飽和脂肪酸（好ましくは、Ｃ１６：１及びＣ１８：１）を有する脂肪酸混合物の特定の実施形態において、Ｃ１６：０及びＣ１８：０の存在が低温気候耐性に対して特に望ましくない影響を及ぼし得、したがって、バイオディーゼル中の低減したレベルのＣ１６：０及びＣ１８：０は低温気候耐性に関して有利となり得；Ｃ１４：０、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０、Ｃ２２及びＣ２４も低温気候耐性に対して悪影響を及ぼし得；したがって、バイオディーゼル中においてこれらの脂肪酸を低減することも有利となり得ることを、本発明者らは見出した。
【００１８】
本明細書において使用する場合、用語「オイル」とは、主として脂肪酸のトリグリセリドからなる物質のことをいう。植物性オイルは、植物の種子、果実、又は葉を含む植物の各種の部分から抽出することができる。室温で、通常は液体である。いくつかの実施形態において、オイルは、カノーラ、ナタネ、パーム、パーム核、ココナッツ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブ、マカダミア、ババス、ヒマ、ピーナッツ、綿、亜麻種子、亜麻仁、コフネヤシ、及びジャトロファに由来する。さらなる実施形態において、オイルは、遺伝子改変植物に由来してもよい。
【００１９】
トリグリセリドは植物性オイル及び動物性脂肪の主要成分である。トリグリセリドは、室温で固体又は液体であり得る。トリグリセリドは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とも呼ばれ、１分子のグリセロールと３分子の脂肪酸から形成される化合物である。グリセロールは、それぞれ１個、２個又は３個の脂肪酸と結合した場合に、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドを形成するように最大３個の脂肪酸と結合し得る三価のアルコール（３つの水酸基を含む）である。モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドは、エステルとして分類され、副生成物として水を放出する、酸とアルコールの反応によって生成される化合物である。脂肪酸は、エステル結合を形成し、多様な化合物を生成するために、３つの水酸基のいずれかと結合し得る。さらに、異なる長さを有する脂肪酸が、個々のグリセロール分子と結合し得る。したがって、得られるジグリセリド又はトリグリセリドは、同じトリグリセリド分子内で異なる脂肪酸を含み得る。
【００２０】
脂肪酸は、一方の端にカルボキシル基を有する炭素鎖骨格として配列された炭素、水素、及び酸素からなる。脂肪酸は、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）であって炭素−炭素二重結合を有しないか、一価不飽和（ＭＵＦＡ）であって１つの炭素−炭素二重結合を有するか、又は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）であって１つより多い炭素−炭素二重結合を有し得る。脂肪酸鎖における炭素数及び炭素−炭素二重結合数は、通常、「炭素数：炭素−炭素二重結合数」として表現される。例えば、オレイン酸は、１８個の炭素と１つの二重結合を有し、「Ｃ１８：１」又は「１８：１」として表現し得る。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「中鎖脂肪酸」とは、６〜１４個の炭素、好ましくは、８〜１２個の炭素を含む脂肪酸のことをいう。
【００２２】
本明細書において使用する場合、「長鎖脂肪酸」とは、１４個より多い炭素、又は１６個より多い炭素、又は１８個より多い炭素を含む脂肪酸のことをいう。
【００２３】
一態様において、脂肪酸の混合物が提供される。
【００２４】
本発明において提供される脂肪酸混合物の特定の好ましい実施形態において、ラウリン酸は、混合物の６％〜２０％を占め、より好ましくは混合物の６％〜１０％を占める。
【００２５】
本発明において提供される脂肪酸混合物の特定の好ましい実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の２０％〜４０％；又は混合物の２０％〜３０％；又は混合物の３０％〜４０％；又は混合物の２５％〜３５％を占める。本発明において提供される脂肪酸混合物の別の実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の６０％〜８５％；又は混合物の６０％〜７０％；又は混合物の７０％〜８５％；又は混合物の６５％〜７５％を占める。本発明において提供される脂肪酸混合物のさらに別の実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の４０％〜６０％；又は混合物の４０％〜５０％；又は混合物の５０％〜６０％；又は混合物の４５％〜５５％を占める。
【００２６】
本発明において提供される脂肪酸混合物のいくつかの好ましい実施形態において、一価不飽和脂肪酸は混合物の５％〜９５％を占め、好ましくは、一価不飽和脂肪酸は、混合物の、１０％より多く；又は１５％より多く；又は２０％より多く；又は２５％より多く；又は３０％より多く；又は３５％より多く；又は４０％より多く；又は４５％より多く；又は５０％より多く；又は６０％より多く；又は６５％より多く；又は７０％より多く；又は８０％より多く；又は８５％より多くを占める。
【００２７】
本発明において提供される脂肪酸混合物の特定の好ましい実施形態において、オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）は合計で、混合物の２０％〜８５％；又は混合物の２０％〜４０％；又は混合物の２０％〜３０％；又は混合物の３０％〜４０％；又は混合物の２５％〜３５％；又は混合物の４０％〜６０％；又は混合物の３５％〜５５％；又は混合物の５５％〜６５％；又は混合物の６０％〜８５％；又は混合物の６０％〜７０％；又は混合物の７０％〜８５％；又は混合物の６５％〜７５％を占める。
【００２８】
本発明において提供される脂肪酸混合物のいくつかの好ましい実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）は合計で、混合物の５０％より多く；又は混合物の５５％より多く；又は混合物の６０％より多く；又は混合物の６５％より多く；又は混合物の７０％より多く；又は混合物の７５％より多く；又は混合物の８０％より多く；又は混合物の８５％より多く；又は混合物の９０％より多くを占める。
【００２９】
本発明において提供される脂肪酸混合物のいくつかの好ましい実施形態において、ステアリン酸（１８：０）及びパルミチン酸（１６：０）は合計で、混合物の２５％未満；より好ましくは混合物の１５％未満；より好ましくは混合物の１０％未満；より好ましくは混合物の８％未満；より好ましくは混合物の６％未満；より好ましくは混合物の５％未満；より好ましくは混合物の４％未満；より好ましくは混合物の３％未満；より好ましくは混合物の２％未満；又は混合物の１％未満；又は混合物の０．５％未満を占め；或いは、いくつかの好ましい実施形態において、脂肪酸混合物は、ステアリン酸（１８：０）とパルミチン酸（１６：０）を実質的に含まない。
【００３０】
本発明において提供される脂肪酸混合物のいくつかの好ましい実施形態において、ミリスチン酸（１４：０）が、混合物の２５％未満；より好ましくは混合物の１５％未満；より好ましくは混合物の１０％未満；より好ましくは混合物の８％未満；より好ましくは混合物の６％未満；より好ましくは混合物の５％未満；より好ましくは混合物の４％未満；より好ましくは混合物の３％未満；より好ましくは混合物の２％未満；又は混合物の１％未満；又は混合物の０．５％未満を占め；或いは、いくつかの好ましい実施形態において、脂肪酸混合物は、ミリスチン酸（１４：０）を実質的に含まない。
【００３１】
本発明において提供される脂肪酸混合物のいくつかの好ましい実施形態において、リノール酸（１８：２）及びリノレン酸（１８：３）は合計で、混合物の２５％未満；より好ましくは混合物の１５％未満；より好ましくは混合物の１０％未満；より好ましくは混合物の８％未満；より好ましくは混合物の６％未満；より好ましくは混合物の５％未満；より好ましくは混合物の４％未満；より好ましくは混合物の３％未満；より好ましくは混合物の２％未満；又は混合物の１％未満；又は混合物の０．５％未満を占め；或いは、いくつかの好ましい実施形態において、脂肪酸混合物は、リノール酸（１８：２）とリノレン酸（１８：３）を実質的に含まない。
【００３２】
本発明において提供される脂肪酸混合物のいくつかの好ましい実施形態において、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）は合計で、混合物の２５％未満；より好ましくは混合物の１５％未満；より好ましくは混合物の１０％未満；より好ましくは混合物の８％未満；より好ましくは混合物の６％未満；より好ましくは混合物の５％未満；より好ましくは混合物の４％未満；より好ましくは混合物の３％未満；より好ましくは混合物の２％未満；又は混合物の１％未満；又は混合物の０．５％未満を占め；或いは、いくつかの好ましい実施形態において、脂肪酸混合物は、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を実質的に含まない。
【００３３】
特定の態様において、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸及び１２〜１８個の炭素を有する一価不飽和脂肪酸が混合物の８０％〜１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）及びカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％〜８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸で混合物の２０％未満を占める、脂肪酸混合物が提供される。上記脂肪酸混合物の特定の実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の２０％〜４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜１０％を構成する。混合物のいくつかの好ましい実施形態において、オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）は合計で、混合物の５０％〜８５％を占める。
【００３４】
特定の態様において、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸及び１２〜１８個の炭素を有する一価不飽和脂肪酸が混合物の８０％〜１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）及びカプリン酸（Ｃ１０：０）が混合物の５％〜８０％を占め、ラウリン酸が混合物の２０％未満を占め、１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸で混合物の２０％未満を占める、脂肪酸混合物が提供される。上記脂肪酸混合物の特定の実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の２０％〜４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜１０％を構成し、オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）は合計で、混合物の５０％〜８５％を占める。上記混合物の別の好ましい実施形態において、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の６０％〜８５％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜１０％を構成し、オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）は合計で、混合物の２０％〜４０％を占める。
【００３５】
一態様において、本発明は、２つ又はそれ以上のオイルのブレンドを特徴とし、少なくとも５０重量％の脂肪酸は中鎖脂肪酸であり、カプリル酸（Ｃ８：０）は最終ブレンドの最大２５％を構成し、２０％未満が長鎖脂肪酸である。
【００３６】
関連する態様において、本発明は、脂肪酸のブレンドを特徴とし、少なくとも５０重量％の脂肪酸は中鎖脂肪酸であり、カプリル酸（Ｃ８：０）は最終ブレンドの最大２５％を構成し、２０％未満が長鎖脂肪酸である。
【００３７】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドのいくつかの実施形態において、ブレンドは、少なくとも６０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも６５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも７０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも７５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも８０％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも８５％の中鎖脂肪酸、好ましくは少なくとも９０％の中鎖脂肪酸、又は好ましくは少なくとも９５％の中鎖脂肪酸を含む。
【００３８】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドの特定の実施形態において、このブレンドは、５〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）、１０〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）、１０〜２０％のカプリル酸（Ｃ８：０）、又は１５〜２５％のカプリル酸（Ｃ８：０）を含む。
【００３９】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドの特定の実施形態において、このブレンドは、３０〜６０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）、２５〜５５％のカプリン酸（Ｃ１０：０）、３０〜５０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）、又は４０〜５０％のカプリン酸（Ｃ１０：０）を含む。
【００４０】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドの特定の実施形態において、このブレンドは、５〜３５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；１０〜２０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；１５〜２５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；２０〜３０％のラウリン酸（Ｃ１２：０）；又は、２５〜３５％のラウリン酸（Ｃ１２：０）を含む。
【００４１】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドの別の実施形態において、ブレンドは、１５％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは１０％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは７％未満の長鎖脂肪酸、好ましくは５％未満の長鎖脂肪酸、又は好ましくは３％未満の長鎖脂肪酸を含む。
【００４２】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドのさらに別の実施形態において、ブレンドは、１５％未満の一価不飽和脂肪酸、好ましくは１０％未満の一価不飽和脂肪酸、好ましくは７％未満の一価不飽和脂肪酸、好ましくは５％未満の一価不飽和脂肪酸、又は好ましくは２％未満の一価不飽和脂肪酸を含む。
【００４３】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドのさらに別の実施形態において、ブレンドは、１０％未満の多価不飽和脂肪酸、好ましくは７％未満の多価不飽和脂肪酸、好ましくは５％未満の多価不飽和脂肪酸、好ましくは３％未満の多価不飽和脂肪酸、又は好ましくは１％未満の多価不飽和脂肪酸を含む。
【００４４】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドの特定の実施形態において、カプロン酸（６：０）はブレンドの０〜約５重量％であり得；カプリル酸（８：０）はブレンドの約５〜約２５重量％であり得；カプリン酸（１０：０）はブレンドの約３０〜約６０重量％であり得；ラウリン酸（１２：０）はブレンドの約５〜約３０重量％であり得；ミリスチン酸（１４：０）はブレンドの０〜約５重量％であり得；パルミチン酸（１６：０）はブレンドの０〜約５重量％であり得；パルミトレイン酸（１６：１）はブレンドの０〜約１０重量％であり得；ステアリン酸（１８：０）はブレンドの０〜約５重量％であり得；オレイン酸（１８：１）はブレンドの０〜約１０重量％であり得；リノール酸（１８：２）はブレンドの０〜約５重量％であり得；リノレン酸（１８：３）はブレンドの０〜約１重量％であり得；アラキジン酸（２０：０）はブレンドの０〜約３重量％であり得；ベヘン酸（２２：０）はブレンドの０〜約３重量％であり得；エルカ酸（２２：１）はブレンドの０〜約５重量％であり得；及び、リグノセリン酸（２４：０）はブレンドの０〜約３重量％であり得る。
【００４５】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドのいくつかの実施形態において、オイル又は脂肪酸のトリグリセリドは、脂肪酸アルキルエステルに変換されている。特定の実施形態において、アルキルエステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、又はブチルエステルである。好ましい実施形態において、アルキルエステルは、メチルエステルである。
【００４６】
本発明のオイルブレンドの特定の実施形態において、オイルは植物性オイル又は動物性脂肪に由来する。好ましい実施形態において、オイルは、カノーラ、ナタネ、パームオイル、パーム核、ココナッツ、ホシダネヤシ、ヒマワリ、ベニバナ、クフェア、オリーブ、マカダミア、ババス、ヒマ、ピーナッツ、綿、亜麻種子、亜麻仁、コフネヤシ、及びジャトロファからなる群より選択される。本発明のオイルブレンドのいくつかの実施形態において、オイルは遺伝子改変植物に由来する。特定の実施形態において、オイルは、天然の植物と比較して増加した量の中鎖脂肪酸を生産するように改変された遺伝子改変植物に由来する。さらなる実施形態において、天然の植物又は複数の天然の植物に由来する１つ又はそれ以上のオイルは、遺伝子改変植物から取得される１つ又はそれ以上のオイルとブレンドしてもよい。
【００４７】
本発明のオイル又は脂肪酸のブレンドのいくつかの実施形態において、オイルブレンド又は脂肪酸ブレンドは、内燃機関に動力を供給するための燃料として有用である。別の実施形態において、オイルブレンド又は脂肪酸ブレンドは、燃料添加剤、機能液、凝固点降下剤、バイオディーゼル、航空燃料、家庭用灯油、又は灯油代替物の調製における原料として使用される。
【００４８】
関連する態様において、本発明は、少なくとも５０％の脂肪酸アルキルエステルが中鎖脂肪酸アルキルエステルであり、２０％未満が長鎖脂肪酸アルキルエステルである、脂肪酸アルキルエステルブレンドを特徴とする。
【００４９】
本発明の脂肪酸アルキルエステルブレンドの特定の実施形態において、かかるブレンドは、少なくとも６０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも６５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも７０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも７５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも８０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも８５％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは少なくとも９０％の中鎖脂肪酸アルキルエステル、又は好ましくは少なくとも９５％の中鎖脂肪酸アルキルエステルを含む。
【００５０】
本発明の脂肪酸アルキルエステルブレンドの特定の実施形態において、ブレンドは、１５％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは１０％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステル、又は好ましくは３％未満の長鎖脂肪酸アルキルエステルを含む。
【００５１】
本発明の脂肪酸アルキルエステルブレンドのさらに別の実施形態において、ブレンドは、１５％未満の一価不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは１０％未満の一価不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満の一価不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満の一価不飽和脂肪酸アルキルエステル、又は好ましくは２％未満の一価不飽和脂肪酸アルキルエステルを含む。
【００５２】
本発明の脂肪酸アルキルエステルブレンドのさらに別の実施形態において、ブレンドは、１０％未満の多価不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは７％未満の多価不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは５％未満の多価不飽和脂肪酸アルキルエステル、好ましくは３％未満の多価不飽和脂肪酸アルキルエステル、又は好ましくは１％未満の多価不飽和脂肪酸アルキルエステルを含む。
【００５３】
本発明の脂肪酸アルキルエステルブレンドの特定の実施形態において、脂肪酸アルキルエステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、及びブチルエステルからなる群より選択される。別の実施形態において、脂肪酸アルキルエステルは、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｔ−ブチルエステル、又はｓｅｃ−ブチルエステルからなる群より選択される。好ましい実施形態において、脂肪酸アルキルエステルはメチルエステルである。いくつかの実施形態において、カプロン酸メチルエステル（６：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約５重量％であり得；カプリル酸メチルエステル（８：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の約５〜約３５重量％、又は約１０〜約３０重量％、又は約１５〜約２５重量％であり得；カプリン酸メチルエステル（１０：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の約２０〜約６０重量％、又は約３０〜約５０重量％、又は約４０〜約５０重量％であり得；ラウリン酸メチルエステル（１２：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の約５〜約３０重量％、又は約１０〜約３０重量％、又は約１５〜約２５重量％であり得；ミリスチン酸メチルエステル（１４：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約５重量％であり得；パルミチン酸メチルエステル（１６：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約５重量％であり得；パルミトレイン酸メチルエステル（１６：１）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約１０重量％であり得；ステアリン酸メチルエステル（１８：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約５重量％であり得；オレイン酸メチルエステル（１８：１）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約１０重量％であり得；リノール酸メチルエステル（１８：２）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約５重量％であり得；リノレン酸メチルエステル（１８：３）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約１重量％であり得；アラキジン酸メチルエステル（２０：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約３重量％であり得；ベヘン酸メチルエステル（２２：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約３重量％であり得；エルカ酸メチルエステル（２２：１）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約５重量％であり得；及び、リグノセリン酸メチルエステル（２４：０）は脂肪酸メチルエステルブレンド全体の０〜約３重量％であり得る。
【００５４】
本発明の上記態様のさらなる実施形態において、オイル、又は脂肪酸、又は脂肪酸アルキルエステルのブレンドは、０℃以下、好ましくは−１０℃以下、好ましくは−１５℃以下、好ましくは−２０℃以下、又は好ましくは−２５℃以下の融点を有する。
【００５５】
本発明の上記態様のさらなる実施形態において、オイル、又は脂肪酸、又は脂肪酸アルキルエステルのブレンドは、０℃以下、好ましくは−１０℃以下、好ましくは−１５℃以下、好ましくは−２０℃以下、又は好ましくは−２５℃以下の曇り点を有する。
【００５６】
本発明の上記態様のさらなる実施形態において、オイル、又は脂肪酸、又は脂肪酸アルキルエステルのブレンドは、０℃以下、好ましくは−１０℃以下、好ましくは−１５℃以下、好ましくは−２０℃以下、又は好ましくは−２５℃以下の流動点を有する。
【００５７】
本発明の上記態様のいくつかの実施形態において、オイル、又は脂肪酸、又は脂肪酸アルキルエステルのブレンドは、内燃機関における燃料として、燃料添加剤、機能液、凝固点降下剤、家庭用灯油、航空若しくはジェット燃料、又は灯油代替物としての使用に適している。
【００５８】
表現「内燃機関における使用に適している」とは、内燃機関に動力を供給するために使用されることを可能にする燃料の特性のことをいう。いくつかの実施形態において、適当な燃料は、４０〜１００；４０〜８０；又は好ましくは４０〜７０；又は好ましくは４０〜６０；又は好ましくは４０〜５５；又は好ましくは４０〜５０のセタン価を有する。別の実施形態において、適当な燃料は、２０〜１３０；好ましくは４０〜１００；好ましくは２０〜５０、又は好ましくは１０〜２０のヨウ素価を有する。さらなる実施形態において、適当な燃料は、０℃以下、好ましくは−１０℃以下、好ましくは−１５℃以下、好ましくは−２０℃以下、又は好ましくは−２５℃以下の融点を有する。さらにさらなる実施形態において、適当な燃料は、０℃以下、好ましくは−１０℃以下、好ましくは−１５℃以下、好ましくは−２０℃以下、又は好ましくは−２５℃以下の曇り点を有する。さらに別の実施形態において、適当な燃料は、０℃以下、好ましくは−１０℃以下、好ましくは−１５℃以下、好ましくは−２０℃以下、又は好ましくは−２５℃以下の流動点を有する。
【００５９】
本発明の上記態様の別の実施形態において、脂肪酸又は脂肪酸アルキルエステルのブレンドはバイオディーゼルとして使用され、燃料として使用するためのバイオディーゼルブレンドを製造するために、石油系ディーゼルとブレンドされる。特定の実施形態において、バイオディーゼルは、バイオディーゼルブレンドの、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は７５％を構成し、石油系ディーゼルが残りを構成する。米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）は、２つのグレードのディーゼル燃料、＃１ディーゼル燃料及び＃２ディーゼル燃料を分類している。特定の実施形態において、バイオディーゼルは、＃１ディーゼル燃料、＃２ディーゼル燃料とブレンドされるか、又は、＃１及び＃２ディーゼルの混合物とブレンドされる。
【００６０】
別の態様において、本発明は、天然の植物と比較して増大した量の中鎖脂肪酸を生成するように１つ又はそれ以上の変異を有する、１つ又はそれ以上の改変酵素を発現する遺伝子組み換え植物を特徴とする。好ましい実施形態において、遺伝子組み換え植物は、８個、１０個、又は１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に生産する。本明細書において使用する場合、用語「８個、１０個、又は１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に生産する」とは、遺伝子組み換え植物によって生産される脂肪酸のうちの少なくとも５０重量％が、８個、１０個、又は１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸であり；遺伝子組み換え植物によって生産される脂肪酸のうちの、より好ましくは少なくとも６０重量％；より好ましくは少なくとも７０重量％；より好ましくは少なくとも７５重量％；より好ましくは少なくとも８０重量％；より好ましくは少なくとも８５重量％；より好ましくは少なくとも９０重量％；より好ましくは少なくとも９５重量％；より好ましくは少なくとも９８重量％が８個、１０個、又は１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸であることを意味する。
【００６１】
本発明の上記態様の好ましい実施形態において、遺伝子組み換え植物は、４０％より多い長鎖脂肪酸を有するオイルを生産するその天然の状態の植物に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え植物は、クフェア種でない天然の植物に由来する。クフェアは、本発明の特定の実施形態において不利であり得る特定の形質を有する。例えば、「野生型のクフェア生殖質は粉々になる（ｓｈａｔｔｅｒ）ので、結果として、商業的に育成することはできない」（Ｓｅｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，１４２−１５４，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．，ＡＯＣＳ  印刷中、Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｅｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  Ｃｕｐｈｅａ：Ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ．”）。さらに、「クフェアは、霜に耐えられず、種子が容易に粉々になり、開花を予測することができず、茎、葉及び花は粘着性の弾性毛状物でおおわれており……［そして］発芽が遅い（１４〜２０日間）」（Ａｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｎｅｗｓ，Ｊｕｌ−Ｓｅｐｔ．２００３，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．３）。さらに、クフェアから十分量のオイルを取得することは、クフェアを商業的に実用化するために十分な量のオイルを生産する能力を妨害し得る。しかしながら、特定の実施形態においては、クフェアの特定のその他の特性は、改変に関して有利な植物を提供し得る。例えば、「この植物は迅速に生育して、種子はわずか６週間で成熟するので、短い季節の温暖な気候に対して理想的となる」（Ａｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｎｅｗｓ，Ｊｕｌ−Ｓｅｐｔ．２００３，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．３）。したがって、特定の実施形態において、本明細書において開示されるようなオイルブレンドを生産する遺伝子組み換えクフェア植物体が提供される。
【００６２】
本発明の上記態様のいくつかの実施形態において、改変酵素を発現する植物は、ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、及びトウモロコシからなる群より選択される植物である。好ましい実施形態において、植物は、ダイズ、より好ましくはパーム、又はより好ましくはヒマ、又は最も好ましくはナタネである。特定の実施形態において、植物は、ナタネ種であり、好ましくは、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナプシス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ・ラベン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ  Ｒａｂｅｎｈ））である。
【００６３】
本発明の上記態様の好ましい実施形態において、含まれる変異は、変異を含む遺伝子修復オリゴ核酸塩基を用いて、酵素中に導入される。
【００６４】
核酸塩基は、プリン、ピリミジン、又はその誘導体若しくはアナログである塩基を含む。ヌクレオシドは、五炭糖フラノース成分、例えば、置換されていてもよいリボシド又は２’−デオキシリボシドを含む核酸塩基である。ヌクレオシドは、いくつかの結合成分のうちの一つにより連結され得、該成分はリンを含んでいても含んでいなくてもよい。非置換ホスホジエステル結合により連結されるヌクレオシドは、ヌクレオチドと呼ばれる。本明細書において使用する場合、「核酸塩基」には、ヌクレオシド及びヌクレオチドばかりでなく、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、及びモルホリン核酸塩基も含まれる。
【００６５】
オリゴ核酸塩基は核酸塩基のポリマーであり、このポリマーは、相補的配列を有するＤＮＡに対してワトソン−クリック塩基対合することによりハイブリダイズすることができる。オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの最端の核酸塩基である一つの５’及び３’末端を有する。特定のオリゴ核酸塩基鎖は、全てのタイプの核酸塩基を含み得る。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的であり、且つ、ワトソン−クリック塩基対合によりハイブリダイズされる、１つ又はそれ以上のオリゴ核酸塩基鎖を含む、化合物である。核酸塩基は、デオキシリボ型又はリボ型のいずれかである。リボ型核酸塩基は、２’の炭素が水酸基、アルキルオキシ又はハロゲンで置換されているメチレンである、五炭糖フラノースを含む核酸塩基である。デオキシリボ型核酸塩基は、リボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、五炭糖フラノース成分を含まない全ての核酸塩基が含まれる。
【００６６】
オリゴ核酸塩基鎖は、一般的に、オリゴ核酸塩基鎖と、オリゴ核酸塩基鎖の断片又は領域との両方を含む。オリゴ核酸塩基鎖は、３’末端及び５’末端を有する。オリゴ核酸塩基鎖が、ある塩基鎖と同じ広がりをもつ場合、オリゴ核酸塩基鎖の３’及び５’末端は、そのある塩基鎖の３’及び５’末端でもある。
【００６７】
用語「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、本明細書において、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、及び以下に詳述されるような他の遺伝子修復分子を含むオリゴ核酸塩基を表すために使用される。
【００６８】
本発明の上記態様のさらなる実施形態において、改変される酵素は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。特定の実施形態において、改変アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、及びトウモロコシからなる群より選択される植物中に存在する。好ましい実施形態において、改変アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、多様なナタネ、好ましくは、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、シナプシス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ・ラベン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ  Ｒａｂｅｎｈ）、好ましくは、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）中に存在する。特定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸残基９１〜３９７位に相当する領域内に１つ又はそれ以上の変異が含まれ；好ましくは、配列番号２のアミノ酸残基１２８〜１４７位、配列番号２のアミノ酸残基１７５〜２０６位、配列番号２のアミノ酸残基２５４〜２９７位、配列番号２のアミノ酸残基３３３〜３３５位、又は配列番号２のアミノ酸残基３６５〜３９７位からなる群より選択される領域内に、１つ又はそれ以上の設計された変異が含まれる。特定の好ましい実施形態において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＰＴＥ）である。
【００６９】
本発明の上記態様のさらにさらなる実施形態において、改変される酵素はケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）である。特定の実施形態において、ＫＡＳ酵素は、その活性が減少又は排除されるように改変され得る。別の実施形態において、ＫＡＳ酵素は、その基質選択性が変化するように改変され得る。好ましい実施形態において、ＫＡＳ酵素はＫＡＳ  ＩＩであり、１つ又はそれ以上の変異が、アミノ酸残基３２８〜３８５位に相当する領域内に存在する。好ましい実施形態において、１つ又はそれ以上の変異が、配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３５２位又は配列番号３のアミノ酸残基３５５〜３８５位に相当する領域に存在する。より好ましい実施形態において、１つ又はそれ以上の変異が、配列番号３のアミノ酸残基３２５〜３４０位、又は配列番号３のアミノ酸残基３３１〜３３７位に相当する領域に存在する。いくつかの実施形態において、配列番号３の３３７位に保存されているロイシン残基に相当するアミノ酸は、変異されている。
【００７０】
本発明の別の態様において、各チオエステラーゼが異なる長さの中鎖脂肪酸に対する活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、２つの発現されるトランスジーンを含むトランスジェニック植物が提供される。したがって、かかるトランスジェニック植物は、チオエステラーゼを発現し、中鎖脂肪酸ブレンドを生成する。
【００７１】
特定の実施形態において、改変される酵素はΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼである。好ましい実施形態において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの活性又は発現が増大される。好ましい実施形態において、遺伝子改変植物におけるΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ活性の増大は、天然の植物と比較して増大したレベルのＣ１６：１及び／又はＣ１８：１；及び／又は低減したレベルのＣ１６：０及び／又は低減したレベルのＣ１８：０を生産する遺伝子改変植物をもたらす。特定の好ましい実施形態において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、遺伝子改変植物が低減したレベルのＣ１６：１を生産するように改変されている。Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの特定の実施形態においては、遺伝子が、パルミトイル−ＡＣＰの増大した活性を示すように改変されており；或いは、遺伝子改変植物は、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、ヒマ又はトウモロコシであり、Ｃ１６：０の増大した生産は、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、シーバックソーン（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）又はキャッツクロー（Ｄｏｘａｎｔｈａ  ｕｎｇｕｉｓ−ｃａｔｉ）由来のΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子を用いて、ナタネをエステル交換することにより達成される。
【００７２】
特定の実施形態において、改変される酵素はΔ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２遺伝子によりコードされている）である。好ましい実施形態において、Δ１２デサチュラーゼの活性又は発現は、抑制又は減弱される。好ましい実施形態において、遺伝子改変植物におけるΔ１２デサチュラーゼ活性又は発現の抑制又は減弱化は、天然の植物と比較して、低減したレベルのＣ１８：２及び／又はＣ１８：３；並びに、増大したレベルのＣ１８：１を生産する遺伝子改変植物をもたらす。
【００７３】
上記態様の特定の実施形態において、第１のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、Ｃ８及びＣ１０脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有し、発現されるトランスジーンがコードする第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、Ｃ１２脂肪アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する。特定の実施形態において、第１のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはクフェア種に由来し、第２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼはアルマス種に由来する。
【００７４】
本発明の特定の態様において、本明細書において開示される脂肪酸混合物を有するオイルを生産するように遺伝子組み換えされた遺伝子改変植物が提供される。例えば、特定の好ましい実施形態において、８〜１２個の炭素を有する飽和脂肪酸及び１２〜１８個の炭素を有する一価不飽和脂肪酸で混合物の８０％〜１００％を占め、カプリル酸（Ｃ８：０）及びカプリン酸（Ｃ１０：０）で混合物の５％〜８０％を占め、ラウリン酸で混合物の２０％未満を占め、１２個より多い炭素を有する多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸で混合物の２０％未満を占める脂肪酸混合物を生産する植物が提供される。遺伝子改変植物の特定の好ましい実施形態において、植物は、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）は合計で、混合物の２０％〜４０％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜１０％を構成し；オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）は合計で、混合物の５０％〜８５％を占める上記脂肪酸混合物を生産する。遺伝子改変植物の特定の好ましい実施形態において、植物は、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、及びラウリン酸（Ｃ１２：０）で混合物の６０％〜８５％を占め；好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜２０％を構成し、より好ましくは、ラウリン酸（Ｃ１２：０）が混合物の６％〜１０％を構成し；オレイン酸（Ｃ１８：１）及びパルミトレイン酸（１６：１）で混合物の２０％〜４０％を占める上記脂肪酸混合物を生産する。特定の特に好ましい実施形態において、約１０％のＣ８；約２０％のＣ１０；約１０％のＣ１２；及び、約６０％のＣ１６：１及び／又はＣ１８：１を有するオイルを生産する遺伝子改変植物が提供される。異なる特に好ましい実施形態において、約５％のＣ８；約５％のＣ１０；約１５％のＣ１２；約７０％のＣ１６：１及び／又はＣ１８：１；並びに、それぞれ約１％以下のＣ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２及びＣ１８：３を有するオイルを生産する遺伝子改変植物が提供される。
【００７５】
本発明の上記態様のいくつかの実施形態において、遺伝子改変植物は、ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、クフェア、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、ヒマ、及びトウモロコシからなる群より選択される植物から作製される。特定の実施形態において、植物は、各種ナタネであり、好ましくは、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ブラシカ・オレルアセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）、及びシナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）（ブラシカ・アルバ・ラベン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ａｌｂａ  Ｒａｂｅｎｈ））である。
【００７６】
上記態様の特定の特に好ましい実施形態において、遺伝子改変植物は遺伝子組み換え植物であり；別の好ましい実施形態において、遺伝子改変植物はトランスジェニック植物である。さらなる実施形態は、トランスジェニックと遺伝子組み換えの両方を含む植物である。
【００７７】
一実施形態において、遺伝子改変植物は、増大したレベルの中鎖脂肪酸（好ましくは、本発明において提供される好ましい脂肪酸ブレンドにしたがう、増大したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０及びＣ１２：０）及び／又は低減したレベルのパルミチン酸（Ｃ１６：０）及び／又は低減したレベルのＣ１８：０を遺伝子改変植物が生産するように改変されている。別の好ましい実施形態において、遺伝子改変植物は、増大したレベルの一価不飽和脂肪酸、好ましくは、増大したレベルのＣ１６：１及びＣ１８：１一価不飽和脂肪酸を生産し；より低レベルの飽和及び多価不飽和脂肪酸、好ましくは、より低レベルのＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２及び／又はＣ１８：３を生産するように改変されている。特に好ましい実施形態において、遺伝子改変植物は、増大したレベルの中鎖脂肪酸（好ましくは、増大したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０及び／又はＣ１２：０）；低減したレベルのＣ１６：０及びＣ１８：０；及び増大したレベルのＣ１６：１及びＣ１８：１を生産するように改変されている。
【００７８】
上記態様の一つの特に好ましい実施形態において、本発明において提供される脂肪酸混合物を有するオイルを生産するように遺伝的に改変されたナタネ植物体が提供される。特定の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えナタネ植物体は、天然のナタネ植物体と比較して、増大したレベルの中鎖脂肪酸（好ましくは、本発明において提供される好ましい脂肪酸ブレンドにしたがう、増大したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０及びＣ１２：０）及び／又は低減したレベルのパルミチン酸（Ｃ１６：０）及び／又は低減したレベルのＣ１８：０を遺伝子組み換えナタネ植物体が生産するように改変されている。別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えナタネ植物体は、天然のナタネ植物体と比較して、増大したレベルの一価不飽和脂肪酸、好ましくは増大したレベルのＣ１６：１及びＣ１８：１一価不飽和脂肪酸を生産し、より低レベルの飽和及び多価不飽和脂肪酸、好ましくは、より低レベルのＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２及びＣ１８：３を遺伝子組み換えナタネ植物体が生産するように改変されている。特に好ましい実施形態において、遺伝子組み換えナタネ植物体は、増大したレベルの中鎖脂肪酸（好ましくは、増大したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０及び／又はＣ１２：０）；低減したレベルのＣ１６：０及びＣ１８：０；及び、増大したレベルのＣ１６：１及び／又はＣ１８：１を生産するように改変されている。
【００７９】
上記態様の別の特に好ましい実施形態において、本発明において提供される脂肪酸混合物を有するオイルを生産するように遺伝子組み換えされたダイズ植物体が提供される。特定の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えダイズ植物体は、天然のダイズ植物体と比較して、増大したレベルの中鎖脂肪酸（好ましくは、本発明において提供される好ましい脂肪酸ブレンドにしたがう、増大したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０及びＣ１２：０）及び／又は低減したレベルのパルミチン酸（Ｃ１６：０）及び／又は低減したレベルのＣ１８：０を遺伝子組み換えダイズ植物体が生産するように改変されている。別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えダイズ植物体は、天然のダイズ植物体と比較して、増大したレベルの一価不飽和脂肪酸、好ましくは増大したレベルのＣ１６：１及びＣ１８：１一価不飽和脂肪酸を生産し、より低レベルの飽和及び多価不飽和脂肪酸、好ましくは、より低レベルのＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２及びＣ１８：３を遺伝子組み換えダイズ植物体が生産するように改変されている。特に好ましい実施形態において、遺伝子組み換えダイズ植物体は、増大したレベルの中鎖脂肪酸（好ましくは、増大したレベルのＣ８：０、Ｃ１０：０及び／又はＣ１２：０）；低減したレベルのＣ１６：０及びＣ１８：０；及び、増大したレベルのＣ１６：１及び／又はＣ１８：１を生産するように改変されている。
【００８０】
本発明の上記態様のさらなる実施形態において、遺伝子組み換え植物又はトランスジェニック植物を生産するための種子が提供される。
【００８１】
本発明の上記態様のさらにさらなる実施形態において、上記遺伝子組み換え植物又はトランスジェニック植物の種子、果実、又は葉から抽出されたオイル又は脂肪酸混合物が提供される。
【００８２】
本発明の別の態様において、遺伝子組み換え植物又はトランスジェニック植物から得られるオイル由来のバイオディーゼルを生産する方法が提供される。特定の実施形態において、遺伝子組み換え植物又はトランスジェニック植物由来のオイルが、バイオディーゼル製造における唯一のオイルとして使用される。別の実施形態において、遺伝子組み換え植物由来のオイルは、天然の植物、トランスジェニック植物、又はその両方由来のオイルとブレンドされ、バイオディーゼルの製造に使用される。特定の実施形態において、オイルは、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を用いて、１つ又はそれ以上の変異が導入されている遺伝子組み換え植物に由来し、かかるオイルは、単独で、又は、トランスジェニック植物若しくは天然の植物若しくはその他の遺伝子組み換え植物から得られる１つ又はそれ以上のオイルと組み合わせて使用してもよい。特定の実施形態において、本方法は、脂肪酸アルキルエステルを含むバイオディーゼルを生産するために、１つ又はそれ以上の天然の植物から得られるオイルとブレンドされる、１つ又はそれ以上の遺伝子組み換え植物又はトランスジェニック植物の種子、果実、又は葉から抽出されたオイルのエステル交換を含む。いくつかの実施形態において、エステル交換は、該オイルをアルコール及び塩基性触媒と反応させることにより達成される。さらなる実施形態において、本方法はさらに、脂肪酸アルキルエステルを精製する工程を含み、かかる精製工程は、触媒、グリセリン、及び水の除去を含み得る。
【００８３】
さらに別の実施形態において、トランスジェニック植物由来のオイルは、遺伝子組み換え植物、天然の植物、又はその両方由来の１つ又はそれ以上のオイルとブレンドされ、バイオディーゼルの製造において使用される。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は１つ又はそれ以上のトランスジーンを発現する。特定の実施形態において、トランスジーンは、植物によって生産される中鎖脂肪酸の含有量を変化させるタンパク質を発現する。好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、天然の植物よりも多い量の中鎖脂肪酸を生産する。より好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、８個、１０個、又は１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸を優先的に生産する。より好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、天然の植物よりも少ない長鎖脂肪酸を含むオイルを生産する。
【００８４】
本発明のさらに別の態様において、脂肪酸メチルエステルブレンドの理論的融点の予測方法が提供される。この方法は、ブレンドに含まれる各脂肪酸ＭＥに対する、個々の脂肪酸メチルエステル（Ｘ）のパーセント（ｗ／ｗ）、そのエステルの融点（ＭＰX）、及び係数（ＦX）の積の和を計算する。したがって、例えば、（Ｘ＊ＭＰX＊ＦX）に対応する各メチルエステルについての数式項が提供される。本方法において使用される融点及び係数の数値的定義は変動し得るが、依然として、有効な中間値をもたらす。本明細書において使用する場合、用語「係数」とは、脂肪酸メチルエステルに対応する定値のことをいう。係数はその脂肪酸ＭＥに対するパーセント含量とその脂肪酸ＭＥに対する融点とに掛けられ、本方法において使用されるその脂肪酸ＭＥに対する数式項が得られる。例えば、個々の融点は、プラス又はマイナス２℃、又は５℃、又は１０℃変動し得、個々の係数は、５％又は１０％又は２０％変動し得るが、依然として、ブレンドに対する有効な予測される融点をもたらす。
【００８５】
特定の実施形態において、予測される融点ＰTmが以下の通り計算されるブレンドの融点の予測方法が提供される：
ＰTm＝［（Ａ＊ＭＰA＊ＦA）＋（Ｂ＊ＭＰB＊ＦB）＋（Ｃ＊ＭＰC＊ＦC）＋（Ｄ＊ＭＰD＊ＦD）＋（Ｅ＊ＭＰE＊ＦE）＋（Ｆ＊ＭＰF＊ＦF）＋（Ｇ＊ＭＰG＊ＦG）＋（Ｈ＊ＭＰH＊ＦH）＋（Ｉ＊ＭＰI＊ＦI）＋（Ｊ＊ＭＰJ＊ＦJ）＋（Ｋ＊ＭＰK＊ＦK）＋（Ｌ＊ＭＰL＊ＦL）＋（Ｍ＊ＭＰM＊ＦM）］＊（０．０１）
式中、
Ａはブレンド中のカプロン酸ＭＥ（６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｂはブレンド中のカプリル酸ＭＥ（８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｃはブレンド中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｄはブレンド中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｅはブレンド中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｆはブレンド中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｇはブレンド中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｈはブレンド中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｉはブレンド中のリノール酸ＭＥ（１８：２）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｊはブレンド中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｋはブレンド中のアラキジン酸ＭＥ（２０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｌはブレンド中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｍはブレンド中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
ＭＰAは、−８１℃〜−６１℃であり；
ＭＰBは、−５０℃〜−３０℃であり；
ＭＰCは、−２８℃〜−８℃であり；
ＭＰDは、−５℃〜１５℃であり；
ＭＰEは、９℃〜２９℃であり；
ＭＰFは、２１℃〜４１℃であり；
ＭＰGは、２８℃〜４８℃であり；
ＭＰHは、−３０℃〜−１０℃であり；
ＭＰIは、−４５℃〜−２５℃であり；
ＭＰJは、−６７℃〜−４７℃であり；
ＭＰKは、４５℃〜６５℃であり；
ＭＰLは、４３℃〜６３℃であり；
ＭＰMは、４８℃〜６８℃であり；
ＦAは、８〜１２であり；
ＦBは、３．５〜５．５であり；
ＦCは、１．０〜１．４であり；
ＦDは、０．８〜１．２であり；
ＦEは、０．５〜０．７であり；
ＦFは、１．１〜１．６であり；
ＦGは、１．８〜２．６であり；
ＦHは、０．９〜１．３であり；
ＦIは、０．５〜０．８であり；
ＦJは、０．１５〜０．２５であり；
ＦKは、８〜１２であり；
ＦLは、１．６〜２．４であり；且つ
ＦMは、１．６〜２．４である。
【００８６】
本発明の上記態様の特定の実施形態において、予測される融点は以下の通り計算される：
ＰTm＝［Ａ（−７１．０）（１０．０）＋Ｂ（−４０．０）（４．５）＋Ｃ（−１８．０）（１．２）＋Ｄ（５．２）（１．０）＋Ｅ（１９．０）（０．６０）＋Ｆ（３０．７）（１．３５）＋Ｇ（３７．８）（２．１５）＋Ｈ（−１９．９）（１．１０）＋Ｉ（−３５．０）（０．６５）＋Ｊ（−５７）（０．２）＋Ｋ（５４．５）（１０．０）＋Ｌ（５３．０）（２．０）＋Ｍ（５７．４）（２．０）］＊（０．０１）であり、Ａ〜Ｍは上記と同様に定義される。
【００８７】
上記態様の関連する実施形態において、バイオディーゼルとして使用するのに適している脂肪酸メチルエステルブレンドを同定するためのアルゴリズムが使用され、ブレンドの予測される融点が計算され、カットオフ値に対して比較される。本明細書において使用する場合、「カットオフ値」とは、所望の融点よりも低い又は等しいＰTmを有するブレンドがバイオディーゼルとして使用するのに適している場合の、その融点のことをいう。特定の実施形態において、カットオフ値は、０℃、好ましくは−５℃、好ましくは−１０℃、好ましくは−１５℃、好ましくは−２０℃、好ましくは０℃、又は好ましくは−２０℃である。
【００８８】
本明細書において使用する場合、用語「重量パーセント」とは、ブレンド又は混合物中のある成分の量のことをいう。通常、この用語は、混合物１００グラムあたりのある成分のグラム数のことをいう。例えば、「１０重量％の化合物Ｘ」を含む混合物とは、混合物１００グラム中に１０グラムの化合物Ｘを含むことをいう。
【００８９】
本明細書において使用する場合、用語「バイオディーゼル」とは、植物性オイル又は動物性脂肪に由来する燃料のことをいう。一般的に、バイオディーゼルは、主として脂肪酸アルキルエステルから構成される。好ましくは、バイオディーゼルは、内燃機関における使用に適している。
【００９０】
用語「バイオディーゼルブレンド」とは、バイオディーゼルと別の燃料のブレンドである燃料のことをいう。一般的に、バイオディーゼルは、石油系燃料（すなわち、石油系ディーゼル）とブレンドされる。バイオディーゼルブレンドはＢＸＸと呼ばれる。「ＸＸ」は、ブレンド中のバイオディーゼルの量を表す。Ｂ１００は、１００％バイオディーゼル、すなわち「ストレートの」バイオディーゼルである。Ｂ２０ブレンドは、例えば、８０％の石油系ディーゼルを含むバイオディーゼルの２０％容積ブレンドである。
【００９１】
用語「燃料」とは、熱又は力を得るために燃焼される物質のことをいう。例えば、ガソリン、家庭用暖房用油、航空燃料、灯油、ディーゼル、バイオディーゼル、植物性油、及びバイオディーゼルブレンド等の液体が挙げられる。いくつかの燃料、例えば、ガソリン、ディーゼル、バイオディーゼル、植物性オイル、又はバイオディーゼルブレンドは、内燃機関に動力を供給するために使用することができる。
【００９２】
表現「遺伝子改変植物」とは、トランスジェニック植物又は遺伝子組み換え植物のことをいう。
【００９３】
本明細書において使用する場合、用語「天然の植物」とは、遺伝的改変（すなわち、トランスジェニック又は遺伝子組み換え）されていない植物のことをいう。天然の植物には、野生型植物、並びに、特定の特性を獲得するために選択育種された植物、を含む。
【００９４】
表現「トランスジェニック植物」とは、別の植物種又は非植物種由来の遺伝子を有する植物のことをいう。かかる遺伝子は「トランスジーン」と呼ばれ得る。
【００９５】
表現「遺伝子組み換え植物」とは、１つ又はそれ以上の遺伝的改変、例えば、１つ又はそれ以上の設計された変異を含むトランスジーン及び／又は改変酵素、を有する植物のことをいう。かかる設計された変異は、天然の酵素と異なる活性を有する改変酵素をもたらし得る。かかる違いには、基質特異性又は活性レベルの違いが含まれ得る。本明細書において使用する場合、「トランスジェニック植物」は、「遺伝子組み換え植物」の一種である。
【００９６】
表現「燃料添加剤」とは、燃料に添加される液状物質のことをいい、最終的燃料の５重量％未満を構成する。
【００９７】
表現「脂肪酸混合物」又は「脂肪酸のブレンド」又は「脂肪酸ブレンド」は、同義的に使用することができ、各種脂肪酸を含む組成物のことをいう。特定の実施形態において、脂肪酸混合物はオイル又はオイルのブレンドであってもよく、別の実施形態において、脂肪酸混合物は、遊離脂肪酸の混合物、又は遊離脂肪酸及びオイルの混合物、又は複数のオイルのブレンドであってもよい。特定の実施形態において、脂肪酸混合物中のいくつかの又は全ての脂肪酸は、脂肪酸アルキルエステル、例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、脂肪酸プロピルエステル等を形成するように改変されてもよい。特定の好ましい実施形態において、脂肪酸アルキルエステルはメチルエステルを含む。したがって、特に指定されない限り、本明細書において使用する場合、表現「脂肪酸混合物」は、混合物中で特定された脂肪酸の脂肪酸アルキルエステルの混合物を包含する。同様に、特に指定されない限り、本明細書において使用する場合、用語「脂肪酸」は、脂肪酸のアルキルエステルを含む。
【００９８】
表現「機能液」とは、燃料に添加される液状物質のことをいい、最終的燃料の５重量％より多くを構成する。
【００９９】
表現「凝固点降下剤」とは、燃料の凝固点を下げるために燃料に添加される液状物質のことをいう。
【０１００】
「セタン価」又はＣＮとは、燃料の点火特性の尺度であり、点火遅延期間に関連する。例えば、高いセタン価を有する燃料は、シリンダー中に注入された直後に燃焼し始める（すなわち、短い点火遅延期間を有することになる）。反対に、低いセタン価を有する燃料は、より長い点火遅延期間を有する。さらに、より高いセタン価は、燃焼の改善、常温始動の改善、ノイズの減少、白煙の減少、ＨＣ、ＣＯ及び粒子の排出の減少と相関し、特に初期暖気運転時においてそうである。市販の石油系ディーゼルは、通常、２つのＣＮ範囲で見られる：レギュラーディーゼルに関して４０〜４６、プレミアムに関して４５〜５０。
【０１０１】
「ヨウ素価」は、植物性オイル及び脂肪における不飽和度を測定するための標準的な天然オイルアッセイによって調べられる。
【０１０２】
「曇り点」とは、最初にワックス状結晶が現れる温度のことをいい、この温度を調べるために、米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）により標準化された試験プロトコールが使用される。
【０１０３】
「流動点」とは、燃料がもはや流動し得ない温度のことをいう。流動点は、通常、曇り点よりも低い。いくつかのエンジンは曇り点で動かないが、通常、全てのエンジンが流動点で動かない。
【０１０４】
結晶性固体の「融点」とは、該固体が固体から液体へ状態を変化する温度のことをいう。逆方向への変化（すなわち、液体から固体へ）の温度を考えた場合、それは「凝固点」と呼ばれる。大部分の物質に関しては、融点と凝固点は同じである。融点又は凝固点は流動点より低い。
【０１０５】
本明細書において使用する場合、「原料」とは、バイオディーゼルの調製のための出発物質として使用され得る、脂肪、脂肪酸、又はトリグリセリドから構成される物質のことをいう。バイオディーゼルの生産で使用され得る原料の例としては、植物性オイル、廃植物性オイル、及び動物性脂肪が含まれる。他の原料としては、脂肪酸又は脂肪酸アルキルエステルの混合物が含まれる。
【０１０６】
本明細書において使用する場合、用語「約」とは、量的表現における、プラス又はマイナス１０％を意味する。例えば、「約３％」とは、２．７〜３．３％を包含し得るし、「約１０％」とは、９〜１１％を包含し得る。
【０１０７】
特に指定されない限り、本明細書において記載されるパーセンテージは重量パーセントである。
【０１０８】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の好ましい実施形態の記載及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ又はＰＴＥ）の部分的アミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ又はＰＴＥ）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿８４９８８８）由来のケトアシルシンターゼ  ＩＩ（ＫＡＳ  ＩＩ）のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図４】アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７９５５７）由来のケトアシルシンターゼ  ＩＩ（ＫＡＳ  ＩＩ）のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である。
【図５】バイオディーゼルがオイル又は脂肪から生成され得ることによる２つの経路を示す図である。
【図６】図６は、いくつかの例示的オイルの脂肪酸含有量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
オイルのブレンド
中鎖脂肪酸の所望のブレンドを達成するために、中鎖脂肪酸の各種組成を含むオイルをブレンドすることができる。オイルは重量ベースでブレンドされる。例えば、２５％のナタネオイルからなる１００グラムのブレンド中で使用されるナタネオイルの量は、最終ブレンド中のナタネオイルのグラム数をナタネオイルの比重で割ることにより決定される（すなわち、２５ｇｍ／０．９１５ｇｍ／ｍＬ＝２７．３ｍＬ）。
【０１１１】
図６は、いくつかの例示的なオイル及びそこに含まれる脂肪酸成分を含む表である。これらのオイルは各種の供給源由来のものが市販されている。脂肪酸成分の量が範囲で表現されていることが留意される。なぜなら、当該技術分野で知られるように、特定の植物中に存在する特定の脂肪酸の量は顕著に異なり得るためである。従って、それらの植物から抽出されるオイルは、バッチごとに異なる任意の又は全ての脂肪酸の量を呈示する場合がある。すなわち、ブレンド又はバイオディーゼルを製造するためには、実際に使用されるオイルにおける脂肪酸成分を調べることが通常必要である。
【０１１２】
脂肪酸アルキルエステルの調製
脂肪酸アルキルエステルは、脂肪酸又はトリグリセリドから製造され得る。通常、脂肪酸アルキルエステルは、脂質及びオイル中のトリグリセリドのエステル交換、又は、遊離脂肪酸のエステル化により製造される（図５）。あるいは、脂肪酸は、加水分解を介してトリグリセリドから分離され、次いで脂肪酸エステルを製造するためのエステル化に供され得る。
【０１１３】
脂肪酸アルキルエステルは、ダイズオイル、パームオイル、ベニバナオイル、ピーナッツオイル、トウモロコシオイル、綿種子オイル、亜麻仁オイル、ココナッツオイル、ヒマオイル、ナタネオイル、ヒマワリオイル等の各種植物由来のオイル、及び動物油脂由来の各種オイル中に見られるトリグリセリドのエステル交換反応によって調製することができる。これらのオイルを、ナトリウムアルコキシド、水酸化ナトリウム又はカリウム、又はチタンテトライソプロポキシド等の塩基性触媒存在下で、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）と反応させる。温度及び圧力等の反応条件は、使用される特定のアルコールに基づいて選択され得る。触媒の量は通常、脂肪酸に基づいて約０．１〜約０．５重量％の範囲である。この工程により脂肪酸アルキルエステルが得られ、そのアルキル基はアルコールに由来する。従って、アルコールとしてメタノールが使用される反応では、脂肪酸メチルエステルを生じることになる。その他の副生成物にはグリセリンを含む。エステル交換生成物は、分画カラムを通過させる蒸留による減圧分画によって単離される。
【０１１４】
脂肪酸アルキルエステルは、エステル化を介して遊離脂肪酸から調製することができる。遊離脂肪酸は、多数の供給元から市販されており、あるいは、例えば、前述のオイルから得ることができ、硫酸、アリールスルホン酸又はアルキルスルホン酸等の酸性触媒存在下でアルコールと反応させることができる。温度及び圧力等の反応条件は、使用される特定のアルコールに基づいて選択され得る。硫酸を中和し、次いで精製して反応物の水性成分を除去することによって、脂肪酸エステルが回収される。
【０１１５】
脂肪酸エステルのブレンド
脂肪酸エステルは市販されており、又は、上述のような脂肪酸のエステル化によって得ることができる。脂肪酸は、バイオディーゼル、燃料添加剤、機能液、航空機又はジェット機燃料、家庭用暖房オイル又は灯油として用いるために好適な特性を有する混合物を得るためにブレンドされる。ブレンドの評価において考慮する特性としては、融点、曇り点、流動点、ヨウ素価、セタン価、粘度、酸化安定性、及び摩擦磨耗特性を含む。
【０１１６】
ブレンドは、重量パーセントに基づいて製造される。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をブレンドするために、ＦＡＭＥ各成分の所望の重量パーセントをそのＦＡＭＥの比重で割る。これにより、１００グラムの最終ブレンドあたりのＦＡＭＥの量が得られる。例えば、１４％（ｗｔ％）のカプリン酸メチルエステル（比重０．８７７ｇ／ｍＬを有する）を含むブレンドを得るためには、１００グラムの最終ブレンドを製造するために使用されるカプリン酸メチルエステルの量は、以下のように決定される。
カプリン酸メチルエステルの量＝（１４ｇ／０．８７７ｇ／ｍＬ）＝１５．９６ｍｌ
すなわち、各１００グラムの最終ブレンドのために、１５．９６ｍｌのカプリン酸メチルエステルが必要とされるであろう。
【０１１７】
オイルブレンド中に含まれる脂肪酸を脂肪酸エステルに変換させて得られるＦＡＭＥのブレンド又はＦＡＭＥ混合物における重量パーセントの決定は、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたキャピラリーガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ６８９０）（ｃｏｌｕｍｎ−Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＳＰＢ−２２５、３０Ｍ×０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を用いて行う。サンプルピーク面積を、較正された標準ＦＡＭＥの重量がわかったピーク面積とピーク毎に比較して、サンプル中の各ＦＡＭＥの重量を決定する。全ての重量を合計し、総量に対する個々のＦＡＭＥ重量の比率（パーセントに換算後）が重量パーセントである。
【０１１８】
融点
脂肪酸エステルブレンドが低融点であることは、係るブレンドがより低温の気候で使用される場合の凍結を防止するためには望ましい。脂肪酸メチルエステルのブレンドにおいて低融点を達成するための手段には、通常、従来のディーゼル燃料をブレンドする、分岐鎖エステルを有する添加剤を入れる、及び／又は、アルキル鎖中の大きさの置換、及び／又はブレンドの脱ろうを含む。本発明のブレンドは、中鎖脂肪酸メチルエステル、特にＣ８及びＣ１０メチルエステルを含むことによって低融点を達成する。すなわち、特定の融点及び融点を達成するために脂肪酸エステルをブレンドすることができ、得られるブレンドを調べることができる。
【０１１９】
融点は、当該技術分野でよく知られた方法により調べることができる。ひとつの方法としては、脂肪酸メチルエステルブレンドの融点は、そのブレンドのアリコートを、末端を密閉したガラスキャピラリーチューブの中に入れ、水浴又はエチレングリコール浴中、そのブレンドにおける予測される融点よりも低い温度に保持して平衡化することによって調べる。一定の時間を十分に経過させてチューブ及びその内容物を平衡化後に、水浴の温度をゆっくりと上昇させる。目視又は光散乱測定装置（分光光度計）を用いてチューブを観察する。固体から液体への遷移が観察される又は光散乱が小さくなる温度を、サンプルの融点として記録する。
【０１２０】
上記に説明されるような単純な融点とは異なるものが、「スリップ融点」である。この方法においては、少量のサンプルを、サンプルがチューブの縦方向の中心で懸濁するように、末端を密閉したガラスキャピラリーチューブの中に入れる。水浴中で平衡化後、温度をゆっくりと上昇させ、懸濁したサンプルがちょうど落下し始めるか、又はキャピラリー中で「スリップ」し始める温度を、スリップ融点として記録する。
【０１２１】
固体油の融点を調べる方法は、米国穀物化学者学会（ＡＡＣＣ）の方法番号５８−４０「融点キャピラリーチューブ法」、及び、方法番号５８−５３「スリップ融点」では認められていない方法においても詳述されている。さらに、方法は、アメリカ油化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （ＡＯＣＳ））公定法Ｃｃ１−２５「融点キャピラリーチューブ法」及びＡＯＣＳ公定法Ｃｃ３−２５「スリップ融点ＡＯＣＳ標準オープンチューブ融点」からも入手される。
【０１２２】
あるいは、本明細書中に含まれるアルゴリズムを用いて、予測される融点を計算することもできる。
【０１２３】
曇り点及び流動点
曇り点及び流動点は、単一の装置を用いた同様の実験により決定することができる。手短に言えば、曇り点及び流動点装置中でサンプルを冷却し、冷却しながら定期的に調べる。曇りが観察される最も高い温度が曇り点である。オイルの動きが観察される最も低い温度が流動点である。この方法は、ＡＳＴＭ  Ｄ９７、Ｄ２５００及び関連する規格に合致する必要がある。このような装置（Ｋ４６１００  Ｃｌｏｕｄ  Ｐｏｉｎｔ＆Ｐｏｕｒ  Ｐｏｉｎｔ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｃｌｏｕｄ  ａｎｄ  Ｐｏｕｒ  Ｐｏｉｎｔ  Ｃｈａｍｂｅｒ）は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．，  １５９５  Ｓｙｃａｍｏｒｅ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｂｏｈｅｍｉａ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １１７１６，  ＵＳＡから購入可能である。
【０１２４】
セタン価
ディーゼル燃料（ＤＦ）の発火性は、一般的に米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）の試験方法であるＡＳＴＭ  Ｄ６１３により測定され、セタン価（ＣＮ）として報告される。発火性は、エンジン中の燃料の着火遅れ時間により規定される。着火遅れ時間が短いほど、ＣＮは高くなる。化合物はセタンスケール（ｃｅｔａｎｅ  ｓｃａｌｅ）に従ってランク付けされる。セタン（Ｃ16Ｈ34又はヘキサデカン）の着火遅れ時間は非常に短く、ＣＮは１００が割り当てられている。スケールにおけるもうひとつの末端には、発火性に乏しく、ＣＮが１５と割り当てられている２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（ＨＭＮ；Ｃ16Ｈ34ともいう）が位置する。通常、長鎖で、分岐がない、飽和炭化水素（アルカン）は、高いＣＮ及び良好な発火性有し、一方、分岐した炭化水素（及び芳香族化合物等の他の物質）は低いＣＮを有し、発火性に乏しい。さらに、二重結合の存在又は脂肪酸中の不飽和度は、セタン価を低下させるであろう。
【０１２５】
高すぎる及び低すぎるＣＮはいずれも、操作上の問題を引き起こす（ＣＮが高すぎる場合には、燃料及び空気が適切に混合される前に燃焼が起こって不完全燃焼及び煙を生じ、ＣＮが低すぎる場合には、エンジンの大きな振動、不発、空気の温度の過上昇、エンジンのウォームアップの遅さが生じ、不完全燃焼も生じる）ため、ほとんどのエンジン製造者は、エンジンに関し必要とされるＣＮの範囲を指定している。ほとんどの場合、この範囲はＣＮ４０〜５０周辺である。例えば、標準的なディーゼル燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ９７５）に関するＡＳＴＭの規格は、最低でＣＮ４０を必要とする。
【０１２６】
ヨウ素価
ヨウ素価は一般的に使用される飽和の尺度であり、すなわち、酸化安定性の指標である。先に述べたように、不飽和分子は飽和分子よりも酸化を受けやすい。この試験は、オイル又は燃料中の二重結合の数を測定するためにヨウ素を用いる。従って、ダイズオイル（ＩＮ＝１３０〜１３５）等の高いヨウ素価を有するオイルは、非常に酸化を受けやすい一方、牛脂（ＩＮ＝３０〜４８）等の低いヨウ素価を有する動物脂肪は、あまり酸化を受けにくい。ヨウ素価における主要な欠点は、いくつかの二重結合は他のものより迅速に酸化される点を認識しないことである。２個の二重結合を有するメチルリノレートは、１個の二重結合を有するメチルオレエートの約５０倍の速度で酸化される。３個の二重結合を有するメチルリノレネートは、同じレベルの増加度ではないが、さらに早く酸化されるであろう。従って、主として飽和された中鎖脂肪酸からなるブレンドは低いヨウ素価を有し、すなわち、良好な酸化安定性を呈示することが期待される。
【０１２７】
変化した脂肪酸組成を有するオイルを生産する遺伝子組み換え植物の作製
米国特許第６，１５０，５１２号は、「植物のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を改変する方法、及び、そのように製造された設計された植物のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが提供される」こと、特に、「相対的な１８：０活性が上昇したマンゴスチンＧａｒｍ  ＦａｔＡ１  １８：１チオエステラーゼ」を開示している。
【０１２８】
米国特許第５，９５５，３２９号は、「植物のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性を改変する方法、及び、設計された植物のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」を開示している。特に、「Ｃ１４及びＣ１２基質にほぼ同様の活性を有する植物チオエステラーゼを得るために、Ｃ１２を好む本明細書中に記載される植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを変異し得る」ことが開示されている。
【０１２９】
Ｃａｒｌｓｓｏｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２９（６）：７６１−７７０，  ２００２）は、「β−ケトアシル−［アシルキャリアタンパク質］シンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）の活性を部分的に欠くシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のｆａｂ１変異体」を開示する。このｆａｂ１変異体は、「Ｌｅｕ３３７Ｐｈｅ置換をもたらすＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＫＡＳ２の配列中の単一ヌクレオチド変異」として記載されている。
【０１３０】
Ｋｎａｐｐら（「Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｅｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  Ｃｕｐｈｅａ：  Ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ」、Ｓｅｅｄ  ｏｉｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，  １４２−１５４，  Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，  Ｉｌｌ．，  ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ）は、ランダム変異導入法により作製され、変化したトリグリセリド組成を有するオイルを生産するクフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａ  ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）変異体を開示する。
【０１３１】
米国特許第５，６６７，９９７号、同第５，４５５，１６７号、同第５，２９８，４２１号及び同第５，５１２，４８２号は、中鎖脂肪酸に対する特異性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのヌクレオチド及びアミノ酸配列及び、これらの各チオエステラーゼを発現する、相当するトランスジェニック植物を開示する。
【０１３２】
中鎖脂肪酸を生産する遺伝子組み換え植物は、脂肪酸生合成経路内の１又はそれ以上の酵素を変異又は改変することにより製造され得る。脂肪酸生合成は、植物の色素体中で生じる。脂肪酸の合成は、酵素ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）により触媒される反応における、逐次的な２炭素の付加を介してアシルタンパク質担体（ＡＣＰ）へと結合する２炭素の前駆体から進行する。この工程の間に、脂肪酸はエステル化を維持したままＡＣＰへと結合し、アシル部分の長さが様々であるアシル−ＡＣＰ中間体のプールをもたらす。色素体中に存在するチオエステラーゼは脂肪酸及びＡＣＰの間のチオ−エステル結合を加水分解し、すなわち脂肪酸を遊離させ、それが色素体を出てトリグリセリドへと構成される。
【０１３３】
ＫＡＳのいくつかの異性体は、特定の長さのアシル鎖に対する親和性を有する。例えば、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のＫＡＳ  Ｉ酵素は、１６炭素より長いアシル鎖にはほとんど親和性を示さないので、この酵素は１６炭素を超えるアシル鎖を延長させないであろう。ＫＡＳ  ＩＩは、１６炭素のアシル鎖〜１８炭素のアシル鎖を延長する反応を特異的に、触媒する。ＫＡＳ  ＩＩは、１６炭素より長い、又は短いアシル鎖には、ほとんど親和性を示さない。
【０１３４】
同様に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、特定の長さのアシル鎖に対し優先的な活性を有することが確認されている。例えば、１８炭素の脂肪酸（例えば、オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼ又はＯＴＥ）を有するアシル−ＡＣＰを主として加水分解するチオエステラーゼが存在する。同様に、１６炭素の脂肪酸（例えば、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ又はＰＴＥ）有するアシル−ＡＣＰに対して優先的な活性を有するチオエステラーゼが存在する。さらに、各種の中鎖脂肪酸に対し優先的な活性を有するチオエステラーゼが報告されている。特定鎖長の脂肪酸アシル担体基質に対する、植物チオエステラーゼの「優先的な活性」は、各種の鎖長の基質に関し得られる遊離脂肪酸生成物量の比較によって決定される。例えば、「Ｃ１２を好む」とは、酵素調製物の加水分解活性が、異なるアシル炭素長を有する他の基質よりも、ラウロイル、及びおそらくデカノイルに関して優先的であることが示されていることを意味する。同様に、「Ｃ１０を好む」活性を有する植物チオエステラーゼは、異なるアシル炭素長を有する他の基質よりも、デカノイル基質、及びおそらくオクタノイルに対して、より高いレベルの活性を示すであろう。他の鎖長の脂肪酸アシル基質に関して、顕著に低い程度で活性が観察される場合もあることに留意されたい。従って、優先性は実質的なものではあるが、絶対的なものではない場合がある。
【０１３５】
好ましい実施形態において、改変酵素を発現する遺伝子組み換え植物は、本明細書中に記載されるように遺伝子修復オリゴ核酸塩基を用いて酵素中に変異を導入することによって製造される。その方法は、対象の標的遺伝子に対し、特定の変異を含む遺伝子修復オリゴ核酸塩基を、当該技術分野でよく知られた多くの方法のうち任意のもの（例えば、マイクロキャリア、マイクロファイバー、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクション）を用いて植物細胞中に導入し、変異酵素を有する細胞、種子又は植物体を同定することを含む。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、用語「標的遺伝子」は、改変される酵素をコードする遺伝子をいう。
【０１３７】
遺伝子修復オリゴ核酸塩基
本発明は、以下に詳述される構造及び化学的性質を有する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」を用いて実践され得る。本発明の「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、以下に記載される特許及び特許刊行物中に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチドを含む分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド及び他の遺伝子修復分子の混合物を含む。本発明の「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、「遺伝子組換え型オリゴ核酸塩基」「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド」「キメラオリゴヌクレオチド」「二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）混合物」「ＲＮＡ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）」「ジーンターゲティングオリゴヌクレオチド」「ジェノプラスト（ｇｅｎｏｐｌａｓｔ）」「一本鎖改変オリゴヌクレオチド」「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異ベクター」「二本鎖変異ベクター」及び「ヘテロ二本鎖変異ベクター」等の他の名称を用いて、公表された科学文献及び特許文献中に記載されてもいる。
【０１３８】
Ｋｍｉｅｃらによる米国特許第５，５６５，３５０号（Ｋｍｉｅｃ  Ｉ）、及びＫｍｉｅｃらによる米国特許第５，７３１，１８１号（Ｋｍｉｅｃ  ＩＩ）中に記載される構造及び化学的性質を有し、参照によりここに組み入れられるオリゴ核酸塩基は、本発明の「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」として使用されるために好適である。Ｋｍｉｅｃ  Ｉ及び／又はＫｍｉｅｃ  ＩＩ中の遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、２つの相補的な鎖を含み、その一つは、もう一方の鎖におけるＤＮＡタイプのヌクレオチドと対になる塩基である、少なくとも一つのＲＮＡタイプヌクレオチドのセグメント（「ＲＮＡセグメント」）を含む。
【０１３９】
Ｋｍｉｅｃ  ＩＩは、プリン及びピリミジン塩基を含む非ヌクレオチドがヌクレオチドに置換され得ることを開示する。本発明に使用され得るさらなる遺伝子修復分子は、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号及び同第６，０１０，９０７号及び国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号、国際特許公開第ＷＯ９８／４９３５０号、同第ＷＯ９９／０７８６５号、同第ＷＯ９９／５８７２３号、同第ＷＯ９９／５８７０２号、及び同第ＷＯ９９／４０７８９号中に記載されるものであり得、それらの各々についてここにその全文を組み入れる。
【０１４０】
一実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、混合された二本鎖オリゴヌクレオチドであり、そこにおいて、混合された二本鎖オリゴヌクレオチドのうちＲＮＡタイプのヌクレオチドは、２’−ヒドロキシルをフルオロ、クロロ、又はブロモ官能基で置換するか、又２’−Ｏにおいて置換を入れることによりＲＮａｓｅ耐性であるようにされている。好適な置換は、Ｋｍｉｅｃ  ＩＩにより教示される置換を含む。別の置換は、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）により教示される置換、及び、特許公報ＥＰ６２９  ３８７及びＥＰ  ６７９  ６５７（まとめればＭａｒｔｉｎの出願）により教示される置換を含み、ここに参照により組み入れる。本明細書中に使用する場合、リボヌクレオチドの２−フルオロ、クロロ、又はブロモ誘導体又は、Ｍａｒｔｉｎ出願あるいはＳｐｒｏａｔ出願中に記載される置換で置き換えられた２’−ＯＨを有するリボヌクレオチドを、「２’−置換リボヌクレオチド」と称する。本明細書中に使用する場合、用語「ＲＮＡタイプヌクレオチド」は、２’−ヒドロキシル又は２’−置換ヌクレオチドであって、非置換のホスホジエステル結合又はＫｍｉｅｃ  Ｉ又はＫｍｉｅｃ  ＩＩにより教示される何らかの非天然の結合によって、二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物における他のヌクレオチドに結合したものを意味する。本明細書中に使用される場合、用語「デオキシリボタイプのヌクレオチド」は、２’−Ｈを有するヌクレオチドであって、非置換のホスホジエステル結合又はＫｍｉｅｃ  Ｉ又はＫｍｉｅｃ  ＩＩにより教示される何らかの非天然の結合によって、遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドに結合したものを意味する。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、不飽和のホスホジエステル結合によって単独で連結された二本鎖オリゴヌクレオチド混合物である。別の実施形態において、その結合は、Ｋｍｉｅｃ  ＩＩにより教示される置換されたホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体及び非リンをベースとする結合によるものである。さらに別の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチド混合物における各ＲＮＡタイプのヌクレオチドは、２’−置換ヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドの具体的な好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−プロピルオキシ、２’−アリルオキシ、２’−ヒドロキシルエチルオキシ、２’−メトキシエチルオキシ、２’−フルオロプロピルオキシ及び２’−トリフルオロプロピルオキシ置換されたリボヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−メトキシエチルオキシ、及び２’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチド混合物は、不飽和ホスホジエステル結合により連結される。
【０１４２】
ただ１つのタイプの２’−置換されたＲＮＡタイプのヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物は、より簡便に合成されるが、本発明の方法は、２つ又はそれ以上のタイプのＲＮＡタイプヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を用いて実践され得る。ＲＮＡセグメントの機能は、２つのＲＮＡタイプのトリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドを導入することによってもたらされる中断によっては影響を受けない場合があり得、従って、ＲＮＡセグメントという用語は、「中断されたＲＮＡセグメント」等を包含する。中断されないＲＮＡセグメントは、切れ目のないＲＮＡセグメントを用語化したものである。別の実施形態においては、ＲＮＡセグメントは、ＲＮａｓｅ−耐性変化及び無置換２’−ＯＨヌクレオチドを含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物は、好ましくは、１００ヌクレオチドより少なく、より好ましくは８５ヌクレオチドより少ないが、５０ヌクレオチドよりは多いヌクレオチドを有する。第一の及び第二の鎖はワトソン−クリック塩基対を形成する。一実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチド混合物における鎖は、第一及び第二の鎖が、ひとつの３’及びひとつの５’末端を有するひとつのオリゴヌクレオチド鎖におけるセグメントであるように、一本鎖のヘキサ、ペンタ、又はテトラヌクレオチド等のリンカーにより共有結合的に結合される。３’及び５’末端は「ヘアピンキャップ」の付加により保護されて、それにより３’及び５’末端ヌクレオチドが隣接するヌクレオチドとワトソン−クリック対を形成する。第二のヘアピンキャップがさらに、付加的に、第一及び第二の鎖の間におけるワトソン−クリック対を安定化するように、３’及び５’末端から離れた第一及び第二の鎖の間における接合点に位置する。
【０１４３】
第一の及び第二の鎖は、標的遺伝子の２つの断片と相同な、すなわち標的遺伝子と同じ配列を有する２つの領域を含む。相同な領域には、ＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含み、ＤＮＡセグメントに連結する１又はそれ以上のＤＮＡタイプのヌクレオチドを含み得、及び、ＤＮＡセグメントの間に入るＤＮＡの内部には含まれないＤＮＡタイプのヌクレオチドを含む。相同性を有する２つの領域は、標的遺伝子の配列とは異なる配列を有し、「非相同領域」と称される領域により分離され、且つ、それぞれがそれに隣接する。非相同領域は、１、２又は３個のミスマッチヌクレオチドを含み得る。ミスマッチのヌクレオチドは連続的であっても、あるいは、標的遺伝子と相同な１つ又は２つのヌクレオチドにより分離されていても良い。あるいは非相同領域はまた、挿入、又は、１、２、３又は５つ、もしくはより少ないヌクレオチド欠失を含み得る。あるいは、二本鎖オリゴヌクレオチド混合物の配列は、１、２、３又は５つ、もしくはより少ないヌクレオチドの欠失だけ二本鎖オリゴヌクレオチド混合物と異なっていても良い。この場合、非相同領域の長さ及び位置とは、非相同領域内部に二本鎖オリゴヌクレオチド混合物のヌクレオチドが存在しない場合であっても、欠失の長さであると考えられる。置換又は複数の置換が意図される場合に、２つの相同な領域に対し相補的な、標的遺伝子における断片間の距離は、非相補的な領域と同じ長さである。非相同な領域が挿入を含む場合、相同な領域は、それによって、二本鎖オリゴヌクレオチド混合物中で、前記遺伝子中でそれらの相補的な相同な断片がそうであるよりもさらに遠くに分離され、非相同領域が欠失をコードする場合には、逆のことが当てはまり得る。
【０１４４】
二本鎖オリゴヌクレオチド混合物のＲＮＡセグメントは、相同な領域、すなわち、標的遺伝子の断片と配列が同一である領域のそれぞれの一部であり、それらのセグメントは、共に好ましくは少なくとも１３個のＲＮＡタイプのヌクレオチド、好ましくは１６〜２５個のＲＮＡタイプのヌクレオチド、又はより好ましくは１８〜２２個のＲＮＡタイプのヌクレオチド、又は最も好ましくは２０ヌクレオチドを含む。一実施形態において、相同領域のＲＮＡセグメントは、間に入るＤＮＡセグメントにより分離され、隣接され、すなわち「連結され」る。一実施形態において、非相同領域の各ヌクレオチドは、間に入るＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。二本鎖オリゴヌクレオチド混合物の非相同領域を含む、間に入るＤＮＡセグメントは、「突然変異誘発セグメント」と称される。
【０１４５】
本発明の別の実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異ベクター（ＳＳＯＭＶ）であり、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号、米国特許第６，２７１，３６０号、同第６，４７９，２９２号、及び同第７，０６０，５００号中に開示され、参照によりその全体を組み入れる。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号、及び同第６，０１０，９０７号及び国際出願公開第ＷＯ９８／４９３５０号、同第ＷＯ９９／０７８６５号、同第ＷＯ９９／５８７２３号、同第ＷＯ９９／５８７０２号、及び同第ＷＯ９９／４０７８９号中に記載される変異ベクターと同様の原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、突然変異誘発領域と称される所望の遺伝子変異を含む領域により隔てられた標的配列を伴う相同な２つの領域を含む。突然変異誘発領域は、標的配列中の相同な領域を分離する配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する配列を有し得る。係る突然変異誘発領域は、置換をもたらし得る。あるいは、ＳＳＯＭＶ中の相同な領域は互いに連続している場合もあり得、一方で、同じ配列を有する標的遺伝子中の領域が１、２、又はそれ以上のヌクレオチドにより分離されている場合もあり得る。係るＳＳＯＭＶは、ＳＳＯＭＶ中に存在しないヌクレオチドを標的遺伝子から欠失させることをもたらす。最後に、相同な領域と同一の標的遺伝子の配列は、標的遺伝子に隣接はしているが、ＳＳＯＭＶの配列中で１，２、又はそれ以上のヌクレオチドにより分離されている場合がある。係るＳＳＯＭＶは、標的遺伝子の配列における挿入をもたらす。
【０１４６】
ＳＳＯＭＶにおけるヌクレオチドは、３’末端及び／又は５’末端のヌクレオチド間結合を除いて改変されないホスホジエステル結合により連結されているか、又は、２つの３’末端及び／又は５’末端のヌクレオチド間結合がホスホロチオエート又はホスホアミデートであり得るデオキシリボヌクレオチドである。本明細書中に使用される場合、ヌクレオチド間結合とは、ＳＳＯＭＶにおけるヌクレオチド間の結合であり、３’末端ヌクレオチド又は５’末端ヌクレオチドの間の結合及びブロック置換を含まない（上記参照）。特定の実施形態において、ＳＳＯＭＶの長さは２１〜５５デオキシヌクレオチドであり、相同領域の長さはそれに応じて、少なくとも全長で２０デオキシヌクレオチド、且つ、少なくとも２つの相同領域はそれぞれ少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さを有する必要がある。
【０１４７】
ＳＳＯＭＶは、標的遺伝子のコード鎖又は非コード鎖のいずれかに相補的であるよう設計することができる。所望の変異が単独塩基の置換である場合、好ましい突然変異誘発ヌクレオチドはいずれもピリミジンである。所望の機能的な成果の達成に合致する範囲で、相補鎖において突然変異誘発ヌクレオチド及び標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、塩基置換変異をコードするＳＳＯＭＶ、すなわちＣ又はＴ突然変異誘発ヌクレオチドが、相補鎖におけるＣ又はＴヌクレオチドとそれぞれミスマッチするＳＳＯＭＶである。
【０１４８】
オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、ＳＳＯＭＶは、リンカーを介して５’末端の炭素に結合した５’ブロック置換を含み得る。リンカーの化学的特性は、その長さ以外は重大性を有さないが、好ましくは少なくとも６原子の長さを有し、且つ、リンカーは柔軟性を有する必要がある。ビオチン、コレステロール又はその他のステロイド、又は非インターカレート陽イオン蛍光色素等の各種の非毒性置換が用いられ得る。ＳＳＯＭＶを作製する試薬として特に好ましいものは、Ｃｙ３（商標）及びＣｙ５（商標）としてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｖａ．により販売されている試薬であり、これらはブロック化されたホスホロアミダイトであり、オリゴヌクレオチド中への取り込みにより、３，３，３’，３’−テトラメチル  Ｎ，Ｎ’−イソプロピル置換されたインドモノカルボシアニン及びインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生じる。Ｃｙ３が最も好ましい。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換される場合、それは５’末端リン酸を有するホスホジエステルを介して、オリゴデオキシヌクレオチド５’末端へとたやすく連結され得る。色素及びオリゴデオキシヌクレオチドの間の色素リンカーにおける化学的特性は重大なものではなく、合成の利便性に関して選択される。市販のＣｙ３ホスホロアミダイトが指示通りに使用される場合、得られる５’の改変は、ブロック置換及びリンカーが一緒になって、Ｎ−ヒドロキシプロピル、Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンを構成する。
【０１４９】
好ましい実施形態において、インドカルボシアニン色素はインドール環の３及び３’の位置に４つの置換を有する。理論として限定されることはないが、これらの置換は色素がインターカレート色素であることを妨げる。これらの置換位置の同一性は、重大なものではない。ＳＳＯＭＶはさらに、３’ブロック置換を有し得る。再度述べるが、３’ブロック置換の化学的特性は重大なものではない。
【０１５０】
改変酵素
脂肪酸生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子は、変異のための好ましい標的である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子はアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする。別の実施形態において、標的遺伝子はケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）をコードする。変異は、酵素の活性を低減させるか又は失わせるように、あるいは酵素の活性を変化させる（例えば、基質選択性の変化等）ように設計され得る。いくつかの実施形態において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子が改変される。特定の実施形態においては、Δ１２デサチュラーゼをコードするＦＡＤ２遺伝子が、リノレン酸（１８：３）及びリノール酸（１８：２）のレベルを低減させ、オレイン酸（１８：１）のレベルを増加させるための標的とされる。
【０１５１】
本発明の特定の実施形態においては、天然型アシルＡＣＰチオエステラーゼが変異される。一実施例においては、ブラシカ・ナパスのアシルＡＣＰチオエステラーゼが、配列番号２におけるアミノ酸残基の９１〜３９７番目に相当する領域中で変異される。好ましい実施形態において、配列番号２におけるアミノ酸残基の１２８〜１４７番目、配列番号２におけるアミノ酸残基の１７５〜２０６番目、配列番号２におけるアミノ酸残基の２５４〜２９７番目、配列番号２におけるアミノ酸残基の３３３〜３３５番目、又は配列番号２におけるアミノ酸残基の３６５〜３９７番目に相当する領域中に１又はそれ以上の変異が存在する。
【０１５２】
本発明の他の実施形態においては、天然型ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳ）酵素が変異される。一例を挙げれば、ＫＡＳ酵素はＫＡＳ  ＩＩ酵素であり、配列番号３におけるアミノ酸残基の３２５〜３８５番目に相当する領域中で変異される。好ましい実施形態において、配列番号３におけるアミノ酸残基の３２５〜３５２番目、又は配列番号３におけるアミノ酸残基の３５５〜３８５番目に相当する領域中に、１又はそれ以上の変異が存在する。より好ましい実施形態において、配列番号３におけるアミノ酸残基の３２５〜３４０番目、又はさらには配列番号３におけるアミノ酸残基の３３１〜３３７番目に相当する領域中に、１又はそれ以上の変異が存在する。いくつかの実施形態においては、配列番号３におけるアミノ酸残基の３３７番目の保存されているロイシンに相当するアミノ酸残基が変異される。特定の実施形態において、配列番号３におけるアミノ酸残基の３３７番目の保存されているロイシンに相当するアミノ酸残基は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン又はヒスチジンに変異される。別の実施形態において、配列番号３におけるアミノ酸残基の３３１番目の保存されているフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基が変異される。特定の実施形態において、配列番号３におけるアミノ酸残基の３３１番目の保存されているフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、又はバリンに変異される。
【０１５３】
遺伝子修復オリゴ核酸塩基の植物細胞への送達
本発明の方法においては、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を用いて植物細胞を形質転換するために、一般的に知られた任意の方法を用いることができる。例示的な方法としては、以下に記載されるマイクロキャリア又はマイクロファイバー、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションの使用が挙げられる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡの大きな断片を穿刺的な浸透（バイオリスティックデリバリー）によってセルロース細胞壁を有する植物細胞へと導入するために、金属性マイクロキャリア（マイクロスフェア）が使用され、それは関連技術分野の当業者によりよく知られている。マイクロキャリアの選択及びそれを穿刺するための装置に関する一般的な手法は、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１００，７９２号、及び同第５，２０４，２５３号中に記載されている。
【０１５５】
本発明の方法においてマイクロキャリアを用いるための特定の条件は、国際出願公開第ＷＯ９９／０７８６５号、同第ＵＳ０９／１２９，２９８号中に記載されている。例えば、氷冷マイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ）、二本鎖オリゴヌクレオチド混合物（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５ＭのＣａＣｌ2及び０．１Ｍのスペルミジンをその順で加え；例えば、１０分間ボルテックスに供する等により、混合物を静かに撹拌し、室温に１０分間静置して、その後直ちにそのマイクロキャリアを５倍量のエタノールにて希釈し、遠心分離して１００％エタノール中に再懸濁する。付着溶液中の例示的な濃度を有する成分には８〜１０μｇ／μＬのマイクロキャリア、１４〜１７μｇ／μＬの二本鎖オリゴヌクレオチド混合物、１．１〜１．４ＭのＣａＣｌ2及び１８〜２２ｍＭのスペルミジンを含む。一例を挙げれば、成分の濃度は８μｇ／μＬのマイクロキャリア、１６．５μｇ／μＬの二本鎖オリゴヌクレオチド混合物、１．３ＭのＣａＣｌ2及び２１ｍＭのスペルミジンである。
【０１５６】
本発明の実践に関し、細胞壁及び細胞膜に浸透させるためにマイクロファイバーを用いて、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞へと導入することもできる。Ｃｏｆｆｅｅらの米国特許第５，３０２，５２３号は、ブラックメキシカンスイート種のトウモロコシ培養物の懸濁液における形質転換を助けるための、３０×０．５μｍ及び１０×０．３μｍのシリコンカーバイド製ファイバーを記載している。植物細胞の形質転換のためにマイクロファイバーを用いてＤＮＡを導入する任意の機械的技術を、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達するために使用することができる。
【０１５７】
遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバー送達における１実施例は、以下の通りである。滅菌したマイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの二本鎖オリゴヌクレオチド混合物を含む１５０μＬの植物培養培地中に懸濁する。懸濁培養物を静かに置いて、等量の高濃度の細胞及び滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間ボルテックスで混合し、プレートに撒く。選択培地を直ちに、又は、特定の特性に関して適当であるように１２０時間までの間に利用する。
【０１５８】
別の実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、植物の部分に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションによって植物細胞へと送達され得る。プロトプラストは、植物の部分、特に葉を、当業者によく知られた技術に従って酵素的に処理することにより形成される（例えば、Ｇａｌｌｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５５：８９−１０７，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．  Ｊ．；  Ｋｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３３：２１３−２２１，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ．参照）。プロトプラストは、エレクトロポレーション前に生育培地中で培養される必要がない。エレクトロポレーションに関する例示的な条件は、０．６〜４μｇ／ｍＬの間の濃度で遺伝子修復オリゴ核酸塩基を含む総容量０．３ｍＬ中に３×１０5個のプロトプラストを含む条件である。
【０１５９】
さらに別の実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、植物細胞のウィスカー法又はマイクロインジェクションにより、植物細胞へと送達され得る。いわゆるウィスカー法は、原則的にＦｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：９４１−９４８中に記載されるように実行される。遺伝子修復オリゴ核酸塩基をウィスカーに添加し、植物細胞を形質転換するために用いる。オリゴヌクレオチド及び標的遺伝子中の標的配列の間で遺伝子修復が触媒されるように、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を、植物細胞でリコンビナーゼ及び／又は遺伝子修復複合体を形成可能なタンパク質をコードする配列を含むプラスミドと共にインキュベートすることができる。
【０１６０】
改変酵素を有する植物の選択
改変酵素を発現する植物又は植物細胞は、多数の手段を介して同定することができる。１つの方法においては、同じ試験において、選択可能な変換（すなわちマーカー）及び選択不可能な変換（例えば、対象の標的遺伝子）の両方を標的とするための、遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＲＯＮ）を用いた共変換ストラテジーである。例えば、カノーラ中のＡＬＳ（又はＡＨＡＳ）遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイミダゾリノン（ＩＭＩ）分類の除草剤耐性（遺伝子変換を介して）を提供するための単一のアミノ酸変化により改変され得る。ＡＬＳ遺伝子及びその他の標的遺伝子／アレルの変換を標的とする遺伝子修復オリゴ核酸塩基の同時送達、及び、得られるＩＭＩ上の再生カルスの選択は、変換能力を有する集団を同定する。この方法により、ＲＯＮが送達されなかったか、又はＲＯＮにより特定される変換を送達できなかった細胞が振り落とされることになるであろう。未処理の遺伝子を標的とするＲＯＮの送達は、選択的であることが期待されないため、ある程度の頻度で、ＡＬＳ変換を有するカルスを再生することも、その他の標的とされる遺伝子のひとつにおける変換を有することが期待されるであろう。変換事象は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析により解決されるであろう。
【０１６１】
従って、変換能力を有するとみなされたプロトプラストから再生した個々の植物体に由来する葉原料、及び、例えば、各標的に関するアレル−特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＰＣＲ）等のＳＮＰ検出技術を用いた個々のＤＮＡサンプルのスクリーニングから、ゲノムＤＮＡを抽出する。各標的に関し陽性と推定される植物を、土に慣らして移植する。陽性植物中の配列変化を独立的に確認するために、標的遺伝子における適当な領域をＰＣＲ増幅し、得られる単位複製配列を直接配列決定するか、又はクローニングして複数の挿入部を配列決定することができる。複数の変化が同一の遺伝子内で起こるであろう場合には、その転換体をその親と戻し交配して、標的遺伝子由来の変換されたＡＬＳ耐性遺伝子の分離を可能にすることができる。
【０１６２】
あるいは、変異を対象遺伝子へと取り込ませることは、抽出された核酸中の単一ヌクレオチド変異を検出するために設計された多くの分子生物学的手法における任意のもの（例えば、ＰＣＲ等の増幅方法及び単一ヌクレオチドプライマー延長分析）を用いて同定することができる。より大きな変異は、変異される標的遺伝子の増幅及び配列決定により検出することができる。
【０１６３】
あるいは、改変酵素を含む植物又は植物細胞は、植物により製造される脂肪酸の組成分析によって同定することができる。すなわち、植物を生育させてオイルを抽出し、当該技術分野で知られた方法（例えば、ガスクロマトグラフィー）を用いて分析することができる。
【０１６４】
２種のチオエステラーゼトランスジーンを発現するトランスジェニック植物の作製
各種の長さの中鎖脂肪酸のアシル基質を好むチオエステラーゼをコードする２種のトランスジーンを発現するトランスジェニック植物は、当該技術分野でよく知られた方法により作製することができる。
【０１６５】
従って、植物チオエステラーゼは、各種の供給源から入手することができる。顕著な量の中鎖脂肪酸を生産する植物は、中鎖を好む植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列の好ましい供給源である。例えば、プロクンベンス（ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）、ルテア（ｌｕｔｅａ）、フッケリアナ（ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）、ヒソピフィリア（ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）、リーティ（ｗｒｉｇｈｔｉｉ）及びインフラータ（ｉｎｆｌａｔａ）等のクフェア属の数種の種は、中鎖脂肪酸を含むトリグリセリドを種子中に蓄積する。さらに、ニレ（Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）は、顕著な中鎖脂肪酸を含むことが示されている。さらに、クスノキ科に属するもの：例えば、ピサ（Ａｃｔｉｎｏｄｏｐｈｎｅ  ｈｏｏｋｅｒｉ）、ゲッケイジュ（Ｌａｕｒｕｓ  ｎｏｂｉｌｉｓ）、及びカリフォルニアベイ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）は、中鎖脂肪酸を有する種子を作る。さらなる供給源には、Ｃ１４脂肪酸を蓄積すると報告されているニクズク科（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｅａｅ）、ニガキ科（Ｓｉｍａｒｕｂａｃｅａｅ）、ウォキシア科（Ｖｏｃｈｙｓｉａｃｅａｅ）及びサルバドラ科（Ｓａｌｖａｄｒａｃｅａｅ）、及びエリスマ（Ｅｒｉｓｍａ）、ピクランニア（Ｐｉｃｒａｍｎｉａ）およびビロラ（Ｖｉｒｏｌａ）の雨林の種を含む。中鎖を好むチオエステラーゼを有する植物のいくつかの例、及びそれらの好ましい基質を表１に示す。
【０１６６】
【表１】
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【０１６７】
その他の植物もまた、特定の脂肪酸アシル鎖長に関する選択性を有する所望のチオエステラーゼの供給源となり得る。係るさらなる植物チオエステラーゼは、各種植物オイルのトリアシルグリセリド組成を分析することにより同定し得る。特定のチオエステラーゼの存在は、適当なアシル−ＡＣＰ基質を用いた分析により確認することができる。例えば、Ｃ１０を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼに関するアッセイは、ＷＯ９１／１６４２１号中に記載され、係るアッセイに関し用いられる。
【０１６８】
対象の植物チオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む植物発現構築物は、広範な各種の植物、特に、食用及び工業用途に関する植物性オイルの生成に利用される植物中で使用され得る。好ましい植物は油料種子作物であり、限定するものではないが、ナタネ（カノーラ及び高エルカ酸品種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、クフェア、ダイズ、ピーナッツ、ココナッツ及びオイルパーム、及びトウモロコシである。
【０１６９】
そのための宿主細胞が植物細胞である植物発現構築物は、植物中で機能を発揮する調節領域（例えば、プロモーター及び終結領域）を含むこととなる。従って、トランスジェニック植物をもたらす、発現されるべきタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＰ）は、５’末端が転写開始調節領域又は、天然の遺伝子中に見られるプロモーター等のプロモーターの末端に連結される。構造遺伝子の機能における、各種の本質的なもしくは誘導的な転写を引き起こす、多数のその他の転写開始領域が利用可能である。植物に関し使用される転写開始領域の中には、ＣａＭＶ  ３５Ｓ及びノパリン及びマンノピンシンターゼ、ナピン、ＡＣＰプロモーター等に関する、構造遺伝子内に会合する係る領域がある。係る構造遺伝子に相当する転写／翻訳開始領域は、各開始コドンの５’側のすぐ上流に見られる。対象の植物宿主を原産とするプロモーター又は改変されたプロモーター、すなわち、１つの遺伝子供給源に由来する転写開示領域及び、対象の植物チオエステラーゼをコードする配列を含む別の遺伝子供給源に由来する翻訳開始領域を有するプロモーター、又は、２倍の３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター等の強化されたプロモーター等、特定のプロモーターが所望される場合、その配列は標準的な技術を用いて一緒に連結され得る。植物中で中鎖チオエステラーゼを発現することが望まれるほとんどの適用に関しては、種子特異的なプロモーターの使用が好ましい。さらに、組換え体構築物を宿主細胞へと導入するための方法によっては、発現構築物中にさらなる要素が必要とされ得る。例えば、形質転換細胞に対する選択マーカーをコードするＤＮＡを発現構築物中に含ませることが可能である。従って、この構築物は細胞毒性物質（例えば抗生物質、重金属、毒物等）に対する耐性や、栄養要求性の宿主に対し原栄養を与える相補性、ウィルス免疫等を付与し得る。異なる宿主種の数に応じて、発現構築物又はその要素が導入され、１又はそれ以上のマーカーが利用され得、そこにおいては、異なる宿主に関し、各種の選択条件が使用される。
【０１７０】
植物の形質転換における各種の方法が当該技術分野において良く知られている。例えば、アグロバクテリウム感染を介した形質転換、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子粒子衝突及びエレクトロポレーションが一般的に使用される。さらに、作物を形質転換するための、より新しい方法が利用可能であり、係る方法も使用することができる。植物の形質転換の例は、米国特許第５，６６７，９９７号中に見ることができる。
【０１７１】
２以上のトランスジーンを発現するために、発現構築物を各トランスジーンについて作製することができる。植物を次いで、一番目のトランスジーン及び植物を選択可能なマーカーを含む第一の発現構築物を用いて形質転換する。選択培地上で生育させた再生物（Ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔ）を、例えば、ウェスタンブロッティング法を用いて、トランスジーンの発現に関しスクリーニングすることができる。トランスジーンを発現する植物を生育させて成熟させ、種子を作らせて、そこから第二世代の植物（Ｔ２）を作製することができる。
【０１７２】
そこで、二番目のトランスジーン及び第二の植物選択マーカーを含む第二の発現構築を用いた第二ラウンドの形質転換のために、Ｔ２世代を用いる。（植物選択マーカーの除去又は不活化方法は、（例えば、ＷＯ９２／０１３７０中に開示されたように）当該技術分野で知られている。）選択培地上で再生物を生育させて成熟させ、種子を作らせて、次世代の植物（Ｔ３）を生育させる。このＴ３世代を、野生型植物と比較した中鎖脂肪酸の増加に関し、スクリーニングする。
【０１７３】
中鎖脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸が所望のバランスを有するオイルを有している遺伝子改変植物の作製
いくつかの実施形態において、Δ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２遺伝子）の発現又は活性を低減させることにより、遺伝子改変植物中のリノレン酸（１８：３）及びリノール酸（１８：２）のレベルの減少ならびにオレイン酸（１８：１）の増加が達成され；好ましくは、標的とされるＦＡＤ２遺伝子はナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、又はトウモロコシＦＡＤ２遺伝子である。好ましい実施形態において、ＦＡＤ２の発現又は活性は、前記遺伝子をコードする配列中に停止コドンを作製することにより；又はヌクレオチドを欠失又は付加することによりフレームシフト変異を作製することによって低減される。
【０１７４】
好ましい実施形態において、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）及び／又はオレイン酸（１８：１）のレベルを増加させるために、遺伝子改変植物中でΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子が改変され；好ましくは、前記遺伝子改変植物は、ナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、クフェア、及びトウモロコシからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現及び又は活性が増加されて、一価不飽和脂肪酸の生産の増加及び飽和脂肪酸の減少を助ける；より好ましくは、天然の植物と比較して、遺伝子組み換え植物中でのＣ１６：１及び／又はＣ１８：１のレベルが増加され、Ｃ１６：０及び／又はＣ１８：０のレベルが低減される。別の実施形態において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、その遺伝子改変植物が増加されたレベルのＣ１６：１を生産するように改変される。特定の実施形態において、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子は、パルミトイル−ＡＣＰに関する増加された活性を示すように改変される。例えば、Ｃａｈｏｏｎ，  Ｅ．  Ｂ．  及び  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，  Ｊ，  ２０００．  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９７（２２）：１２３５０−１２３５５を参照されたい。関連する実施形態において、マカダミア（マカダミア・インテグリフォリア）、シーバックソーン（ヒッポファエ・ラムノイデス）又はキャットクロー（ドキサンタ・アンギス−カティ）由来のΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子を用いてナタネを形質転換することにより、Ｃ１６：０の増加された生成が達成される。特定の実施形態において、本明細書中に開示されるように、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子の改変に加えてＫＡＳＩＩ遺伝子の活性又は発現は低減し、１８：１及び１６：１脂肪酸のさらに高いレベルが達成される；より好ましい実施形態においては、本明細書中に開示されるように遺伝子改変植物中のＰＴＥ酵素も改変され、短鎖脂肪酸のレベルも増加され；より好ましい実施形態においては、遺伝子改変植物中のΔ１２デサチュラーゼも、低減された活性又は発現を有するように改変される。
【０１７５】
特定の好ましい実施形態において、植物（好ましくはナタネ、綿、亜麻、ピーナッツ、パーム、ベニバナ、ダイズ、ヒマワリ、又はトウモロコシ植物）を、本明細書中に開示されたように、増加されたレベルの短鎖／中鎖脂肪酸を有するように、以下の方法によって遺伝子を改変する：（１）パルミトイルチオエステラーゼ（ＰＴＥ）の基質特異性を変化させてカプリロイル−ＡＣＰ（Ｃ８）、カプロイル−ＡＣＰ（Ｃ１０）、及びラウロイル−ＡＣＰ（Ｃ１２）を伴う活性を増加させるか、又は短鎖長への特異性を有するクフェア、ココナッツ、パーム、ババス、ホシダネヤシ（Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ニレ（Ｕｌｍｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ケヤキ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｚｅｌｋｏｖａ（Ｚｅｌｋｏｖａ  ｓｅｒｒａｔａ））又はマートル（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｂａｙ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ））由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いた形質転換を行う；及び（２）ＫＡＳＩＩ遺伝子の活性を低減させる。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に開示されるようにＰＴＥ及び／又はＫＡＳＩＩ遺伝子を変化させることにより、増加されたレベルの短鎖／中鎖脂肪酸を有するように植物を遺伝子改変し；Δ１２デサチュラーゼの発現又は活性を低減させることにより、低減されたレベルの多価不飽和脂肪酸（好ましくは低減されたレベルのＣ１８：２及びＣ１８：３）を有するよう、さらに改変し；より好ましくは、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を改変することにより、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）及び／又はオレイン酸（１８：１）のレベルを増加させ、かつＣ１６：０及び／又はＣ１８：０のレベルを低減させるように植物をさらに改変する。
【０１７６】
脂肪酸メチルエステルの予測される融点の計算
脂肪酸メチルエステルブレンドにおける、予測される融点ＰTmは、各脂肪酸メチルエステルの量を用いて、重量／１００ｇとして表現され、以下の式で表される。
ＰTm＝［Ａ（−７１．０）（１０．０）＋Ｂ（−４０．０）（４．５）＋Ｃ（−１８．０）（１．２）＋Ｄ（５．２）（１．０）＋Ｅ（１９．０）（０．６０）＋Ｆ（３０．７）（１．３５）＋Ｇ（３７．８）（２．１５）＋Ｈ（−１９．９）（１．１０）＋Ｉ（−３５．０）（０．６５）＋Ｊ（−５７）（０．２）＋Ｋ（５４．５）（１０．０）＋Ｌ（５３．０）（２．０）＋Ｍ（５７．４）（２．０）］＊（０．０１）
であり、
Ａは前記ブレンド中のカプロン酸ＭＥ（６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｂは前記ブレンド中のカプリル酸ＭＥ（８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｃは前記ブレンド中のカプリン酸ＭＥ（１０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｄは前記ブレンド中のラウリン酸ＭＥ（１２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｅは前記ブレンド中のミリスチン酸ＭＥ（１４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｆは前記ブレンド中のパルミチン酸ＭＥ（１６：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｇは前記ブレンド中のステアリン酸ＭＥ（１８：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｈは前記ブレンド中のオレイン酸ＭＥ（１８：１）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｉは前記ブレンド中のリノール酸ＭＥ（１８：２）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｊは前記ブレンド中のリノレン酸ＭＥ（１８：３）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｋは前記ブレンド中のアラキジン酸ＭＥ（２０：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｌは前記ブレンド中のベヘン酸ＭＥ（２２：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）であり；
Ｍは前記ブレンド中のリグノセリン酸ＭＥ（２４：０）の重量パーセント（ｗ／ｗ）である。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、予測される融点は、バイオディーゼルに使用するために好適なブレンドを予測するために使用され得る。これらの実施形態において、予測される融点は、カットオフ値（すなわち、バイオディーゼルのために所望される融点）と比較される。カットオフ値より小さいあるいはそれと同等な予測される融点を有するそれらのブレンドは、バイオディーゼルとしての使用に対し好適である。
【０１７８】
以下の実施例は、本発明を説明するための役割を果たす。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例１】
【０１７９】
脂肪酸メチルエステルブレンド１
以下の表中に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する、脂肪酸メチルエステルのブレンド（「ブレンド１」）を調製する。下表に記載の量を用いて、脂肪酸メチルエステルを共に混合することにより、１００ｇのブレンド１を調製する。
【０１８０】
【表２】
2009542847.tif 000003
【０１８１】
発明の方法により計算した場合の、ブレンド１の予測される融点ＰTmは−４１．６℃である。
【実施例２】
【０１８２】
脂肪酸メチルエステルブレンド２
以下の表中に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する、脂肪酸メチルエステルのブレンド（「ブレンド２」）を調製する。上記の表に記載の量を用いて、脂肪酸メチルエステルを共に混合することにより、１００ｇのブレンド２を調製する。
【０１８３】
【表３】
2009542847.tif 000004
【０１８４】
発明の方法により計算した場合の、ブレンド２の予測される融点ＰTmは−２４．３℃である。
【実施例３】
【０１８５】
脂肪酸メチルエステルブレンド３
以下の表中に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する、脂肪酸メチルエステルのブレンド（「ブレンド３」）を調製する。上記の表に記載の量を用いて、脂肪酸メチルエステルを共に混合することにより、１００ｇのブレンド３を調製する。
【０１８６】
【表４】
2009542847.tif 000005
【０１８７】
発明の方法により計算した場合の、ブレンド３の予測される融点ＰTmは−１５．０℃である。
【実施例４】
【０１８８】
脂肪酸メチルエステルブレンド４
以下の表中に示す脂肪酸メチルエステルの組成を有する、脂肪酸メチルエステルのブレンド（「ブレンド４」）を調製する。上記の表に記載の量を用いて、脂肪酸メチルエステルを共に混合することにより、１００ｇのブレンド４を調製する。
【０１８９】
【表５】
2009542847.tif 000006
【０１９０】
発明の方法により計算した場合の、ブレンド４の予測される融点ＰTmは−１１．９℃である。
【実施例５】
【０１９１】
オイルブレンドＡ
下表に示す脂肪酸組成を有するココナッツオイル及びクフェア・ランセオラータオイルを混合することにより、下表に示す脂肪酸組成を有する、２種のオイルのブレンド（「ブレンドＡ」）を調製する。
【０１９２】
【表６】
2009542847.tif 000007
【０１９３】
ブレンドＡは、７５重量％の上記ココナッツオイルを２５重量％の上記クフェア・ランセロラータオイルと混合することにより調製することができる。２５グラムのクフェア・ランセロラータオイル（２５ｇｍ／０．９２ｇｍ／ｍｌ＝２７．２ｍＬ）を７５グラムのダイズオイル（７５ｇｍ／０．９２４ｇｍ／ｍＬ＝８１．２ｍＬ）とあわせ、１００グラムのブレンドＡを調製する。
【実施例６】
【０１９４】
オイルのＦＡＭＥへの変換
各種のタイプの市販の植物オイル（ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、マカダミア、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、クルミ、ヤシ、ココナッツ及びヒマのオイル）を販売元から入手した。２００グラムの各オイルをガラス製のスクリューボトル中で秤量し、２倍量（ｗ／ｖ）のナトリウムメトキシド試薬（５％ｗ／ｖのナトリウムメトキシド／メタノール）とあわせた。２時間室温にて混合後、５０ｍｌのヘキサンを添加し、力強く混合して相を分離させた。下側のグリセロール含有層を除去し、廃棄した。上層を真空下でロータリーエバポレーターにて処理し、ヘキサン及びなんらかの残留する揮発性物質を除去した。ＦＡＭＥの最終溶液を、きつく蓋をしたガラス製ボトル中、窒素ガスの下で室温にて保存した。
【実施例７】
【０１９５】
脂肪酸のＦＡＭＥへの変換
１００グラムの各種脂肪酸、又は脂肪酸混合物をガラス製ボトル中に秤量し、２００ｍｌの無水メタノール／１％硫酸とあわせた。各混合物を窒素ガスで被覆し、きつく蓋をした容器中に入れた。この反応ボトルをインキュベーター中、５０℃、４時間置いた。インキュベーション中、混合物を時々振って反応物を混合した。混合物をガラス製液漏斗に移し、１００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液とあわせた。混合物を力強く振って、静置することにより相を分離させた。下側の水層を除去し、廃棄した。上層を清浄な乾燥したボトル中に移し、５グラムの無水硫酸ナトリウムとあわせた。この混合物を、全ての目に見える水滴が除去されるまで力強く振った。混合物を次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  １濾紙を通過させて濾過した。硫酸ナトリウム及び濾過装置をヘキサンですすぎ、さらなるＦＡＭＥを回収し、洗浄液を非水性画分に加えた。あわせた濾液及び洗浄液を真空下でロータリーエバポレーター中に入れ、ヘキサン及び残留する揮発性物質を除去した。ＦＡＭＥの最終溶液を、窒素ガスで被覆してきつく蓋をしたテフロン(登録商標)で裏打ちされたキャップを有する褐色ガラス製ボトル中に移し、４℃にて保存した。、上記に使用されるメタノールに代えて、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、又はｔ−ブタノールを代用するこのプロトコルを用いて、他のエステルを合成した。
【実施例８】
【０１９６】
アルキルエステル混合物の低温試験
アルキルエステル及びエステル混合物の低温特性を、上述のオイル又は脂肪酸から得られた純粋なアルキルエステル又はエステル混合物のアリコートを１０ｍｍ×１００ｍｍのガラス製試験管にピペットで入れ、最終溶積１．０ｍｌとすることによって試験した。ポリプロピレン製のスナップキャップを用いて試験管に蓋をし、プラスチック製のラック中に置いた。次いで、ラック中に置かれた試験管を、サンプルの頂部から上の深さが１〜２ｃｍとなるように、５０％エチレングリコール／水の冷溶液中に沈めた。サンプルを０、−１０、−１５、−２０及び−２５℃にて連続的に試験するために、一連のウォーターバスを使用した。サンプルは試験温度にて１時間保持し、各チューブを引き上げて、曇り、固化、及び、注ぎ／流れ特性を調べた。さらに、選ばれたサンプルを独立した試験研究所（Ｉｎｔｅｒｔｅｋ−Ｃａｌｅｂ−Ｂｒｅｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に送って、ディーゼル燃料に関する好適なＡＳＴＭ標準法（ＡＳＴＭ  Ｄ−９７−０６、ＡＳＴＭ  Ｄ−２５００−０５、及びＡＳＴＭ  Ｄ６３７１）を用いた、流動点、曇り点及び目詰まりを評価した。エステル及びエステル混合物の曇り点は、携帯型ディーゼル燃料曇り点分析機、モデルＣＰＡ−Ｔ３０（Ｐｈａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）を用いて測定することも可能であった。１０ｍｌのプラスチック製注射器をエステル又はエステル混合物で満たし、装置に注入した。１０分後、装置は、正確な曇り点温度の読みを示した。
【実施例９】
【０１９７】
Ｂ１００種子オイル及び＃２ディーゼルの融点
一連のＢ１００バイオディーゼル溶液（脂肪酸アルキルエステル）を、実施例６記載の手順に従って、ダイズ、カノーラ、トウモロコシ、マカダミア、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、クルミ、パーム、ココナッツ、及びヒマのオイルを含む植物性オイルから調製した。これらの燃料を、実施例８に記載される手順に従って、低温流量特性に関して市販の石油をベースとしたディーゼル＃２（Ｓｈｅｌｌ  Ｏｉｌ  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）と比較した。各流体を＋２０〜−２０℃の各種温度でインキュベートした効果を下表に示し、それは、所定の温度で１時間インキュベーション後にその流体が液体か固体かを示した（流動点）。ディーゼル燃料は−１５℃までは液体であったが、−２０℃で１時間置いた後は固体であった。対照的に、植物性オイルをベースとする脂肪酸メチルエステルは、より低い温度で固化した。パームオイルメチルエステルは＋５℃で固体であった。最も性能の良い植物性オイルをベースとしたエステルはカノーラ及びヒマであり、両方とも−１５℃で固体であった。従って、植物性オイルメチルエステルはいずれも、ディーゼル燃料と同等の低温特性を有さず、すなわち、−２０℃より低い曇り点という目安を満たさなかった。
【０１９８】
【表７】
2009542847.tif 000008
【実施例１０】
【０１９９】
Ｃ８及びＣ１０ＦＡＭＥはダイズ及びカノーラＢ１００の融点を低下させる
植物性オイル由来メチルエステルの低温特性は、短鎖脂肪酸メチルエステルの添加により向上した。ダイズオイルメチルエステルは、−１０℃で固体であった。３０％（ｖ／ｖ）のＣ８メチルエステル（メチルオクタノエート）をダイズオイルメチルエステルに加えた場合、その混合物は−１０℃で液体のままであった。Ｃ８メチルエステルを６０％（ｖ／ｖ）に増加させた場合、混合物は−２０℃で液体のままであった。さらなるＣ１０メチルエステル（メチルデカノエート）は、ダイズ由来メチルエステルの流動点に同じ効果を与えた。カノーラオイル由来メチルエステルの低温での性能は、短鎖メチルエステルを加えることによっても向上した。４０％のＣ８メチルエステルをカノーラメチルエステルに加えることは、観察される流動点を−２０℃まで低下させた。Ｃ１０メチルエステルをカノーラに添加することは、観察される流動点に同様の効果を有した。Ｃ８／Ｃ１０エステルの混合物をカノーラ又はダイズメチルエステルへと加えることも、混合物の流動点を低下させる。
【０２００】
【表８】
2009542847.tif 000009
【実施例１１】
【０２０１】
各種の全オイルＢ２−Ｂ１００バイオディーゼルブレンドの溶融特性
ディーゼル燃料と植物性オイル由来メチルエステルとの混合物もまた、低温特性に関し試験された。ディーゼル燃料を、２％（Ｂ２）、５％（Ｂ５）、２０％（Ｂ２０）（ｖ／ｖ）の植物性オイル由来メチルエステル、純粋な植物性オイル由来メチルエステル（Ｂ１００）と共に試験した。植物性オイル由来メチルエステルをディーゼル燃料に加えることは、Ｂ２０ブレンドを用いたもの以外の混合物の流動点に観察可能な影響を及ぼさなかった。カノーラ、ヒマ及びダイズはＢ２０流動点に影響を及ぼさず、一方、トウモロコシ、オリーブ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、パーム、及びココナッツは全て、純粋なディーゼル燃料と比較して、Ｂ２０ブレンドにおいて観察される流動点を上昇させた。
【０２０２】
【表９】
2009542847.tif 000010
【実施例１２】
【０２０３】
融点における長鎖飽和物の効果
脂肪酸メチルエステルを、上記に詳述したような低温性能に関して試験した。表は、長鎖飽和脂肪酸をＣ１８：１メチルエステル（メチルオクタデセノエート）に添加する効果を示す。純粋なＣ１８：１メチルエステルは−２０℃において液体であるが、Ｃ１８：０（メチルオクタデカノエート）の添加は、わずか２％のＣ１８：０によって、観察される流動点を＋５℃上昇させ；１％のＣ１８：０において、混合物の流動点は０℃である。同様に、Ｃ１８：１により、Ｃ１６混合物は劇的に流動点が上昇する。９％（ｖ／ｖ）のＣ１６メチルエステル（メチルヘキサデカノエート）と９１％のＣ１８：１の混合物は−５℃で固体である。わずか３％のＣ１６：０は、−１５℃で固体状態をもたらす。１％という低濃度のＣ１４：０メチルエステル（メチルテトラデカノエート）は、−２０℃において固体状態をもたらし、３０％のＣ１４：０は−１０℃で固体であった。Ｃ１２：０（メチルドデカノエート）との混合物は、興味深く、かつ予期せぬ結果を示した。１％〜５％のレベルのＣｌ２において、混合物は−２０℃で固体であるが、Ｃ１８：ｌと６％〜２０％のＣ１２との混合物は、−２０℃においてなお液体のままである。すなわち、バイオディーゼル中に６〜２０％、又は、より好ましくは６〜１０％であるＣ１２：０の存在は、低温特性に及ぼす驚くべき有益な効果を有している。従って、より長鎖の飽和ＦＡＭＥが、Ｃ１８：１によって顕著に混合物の流動点を上昇させる一方、Ｃ１４の効果はあまりに小さすぎ、Ｃ１２は、２０％（ｖ／ｖ）までの間でほぼ効果を有さなかった。
【０２０４】
【表１０】
2009542847.tif 000011
【実施例１３】
【０２０５】
遺伝子改変ナタネ植物体
本明細書中に論じられるように、所望のバランスの中鎖脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を有するオイルを生産するために、ナタネ植物は遺伝子改変される、すなわち、ナタネ植物は相対的に増加したレベルの短鎖／中鎖脂肪酸；相対的に増加したレベルの一価不飽和Ｃ１６：０及びＣ１８：０脂肪酸；及び相対的に減少したレベルの多価不飽和Ｃ１８：２及びＣ１８：３脂肪酸を有するように遺伝子改変される。以下の遺伝子改変が行われる：（１）ＦＡＤ２遺伝子をコードする配列中に停止コドンを導入するための遺伝子修復オリゴヌクレオチド塩基を用いることによりΔ１２デサチュラーゼの活性が低減され、リノレン酸（１８：３）及びリノール酸（１８：２）のレベルが低減され、ならびにオレイン酸（１８：１）のレベルが増加される；（２）マカダミア（マカダミア・インテグリフォリオ）由来のΔ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰ遺伝子を用いてナタネ植物を形質転換することにより、Δ9−ステアロイルアシル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子が改変されてパルミトレイン酸（１６：１）のレベルが増加される；（３）ＫＡＳＩＩ遺伝子をコードする配列中に停止コドンを導入するための遺伝子修復オリゴヌクレオチド塩基を用いることにより、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳＩＩ）の活性が低減される；（４）パルミトイルチオエステラーゼ（ＰＴＥ）の基質特異性が変化され、カプリロイル−ＡＣＰ（Ｃ８）、カプロイル−ＡＣＰ（Ｃ１０）及びラウロイル−ＡＣＰ（Ｃ１２）を伴う活性が増加される、言い換えると、短鎖長への特異性を有するクフェアのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子によりナタネ植物を形質転換することにより、短鎖及び中鎖脂肪酸のレベルが増加される。遺伝子改変ナタネ植物は、以下の脂肪酸組成物を有するオイル：Ｃ８がオイルの約５％を占め；Ｃ１０がオイルの約５％を占め；Ｃ１２がオイルの約１５％を占め；Ｃ１６：１及びＣ１８：１でがオイルの約７０％を占め；かつ、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：２及びＣ１８：３のそれぞれがオイルの１％未満を占めるオイル、を生産する。そのオイルにおけるメチルエステルは約−２０℃において液体である。
【０２０６】
特に他の規定がない限り、本明細書中に使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同様の意味を有する。
【０２０７】
本明細書中に説明的に記載される本発明は、本明細書中に具体的に開示されなくとも、任意の要素又は複数の要素、限定又は複数の限定がない状態で好適に実践され得る。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡張的で、かつ限定されないものと理解されるべきである。さらに、本明細書中に用いられる用語及び表現は、記述用語として限定されることなく用いられ、かかる用語及び表現の使用によって、示され記載される特徴又はその一部における任意の均等物を除外することは意図されず、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で各種の変更が可能であることが認識される。
【０２０８】
従って、本発明は好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されるけれども、その中で本明細書中に実施形態が開示される本発明における改変、改良及び変形物が当業者によって講じられ得、かかる改変、改良及び変形物は本発明の範囲内に含まれるものと考えられると理解されるべきである。ここで提供される材料、方法及び実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。
【０２０９】
本発明は、本明細書中に、広範かつ一般的に記載されている。より狭い種、及び、属の開示内における属以下の分類のそれぞれもまた、本発明の部分を構成する。これは、除かれる材料が本明細書中に具体的に引用されているか否かによらず、属から何らかの対象を排除する条件又は否定的な限定を伴う本発明の属の記載を含む。
【０２１０】
さらに、本発明の特徴又は態様は、マーカッシュグループの表現にて記載され、当業者は、本発明がそれにより、マーカッシュグループの任意の個々の構成要素又は構成要素のサブグループの語によって記載されることを認識するであろう。
【０２１１】
全ての刊行物、特許出願、特許、及びその他の本明細書中に言及される参考文献は、それらの各々を個々に参照により組み入れるのと同程度に、その全体を参照により明確に組み入れるものとする。不一致の場合には、定義を含む本明細書が優先されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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