(57)【要約】  本発明はヒトの治療に有用な組換えドメイン抗体(dAb)に関係する。より詳しくは、ヒトTNF-αに結合するドメイン抗体(dAb)、およびヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病の治療における前記抗体の使用に関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトTNF-αに結合し、イムノグロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインが新世界ザルに由来する配列を有する少なくとも1種類の相補性決定領域(CDR)を含み、前記CDRが、YAATKLQS（配列番号１）、YEASSLQS（配列番号２）、YEASKLQS（配列番号３）、およびYSASNLET（配列番号４）からなる群より選択される、組換えドメイン抗体(dAb)。
【請求項２】
前記CDRがCDR2である、請求項１に記載の組換えdAb。
【請求項３】
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号７）；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号８）；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号９）；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号１０）；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号５０）；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号５１）；および
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号５２）：
からなる配列より選択される配列を有する、請求項１または２に記載の組換えdAb。
【請求項４】
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号１０）：
の配列を有する、請求項３に記載の組換えdAb。
【請求項５】
CDR1および/またはCDR3を改変して抗原結合を改善する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えdAb。
【請求項６】
ヒトで低い免疫原性を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換えdAb。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のdAbをコードする、単離核酸分子。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えドメイン抗体(dAb)を有効量、薬剤として許容しうる担体または希釈剤とともに含む、薬剤組成物。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えdAb有効量と試料を接触させること、および結合したdAbの量を検出することを含む、試料中のヒトTNF-αを検出する方法。
【請求項１０】
前記試料が生物試料である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の薬剤組成物の有効量をヒト被験者に投与することを含む、前記被験者のヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病を治療する方法。
【請求項１２】
ヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病が、
炎症、炎症疾患、ならびに敗血症性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌敗血、および有毒ショック症候群を含む敗血症；関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、および痛風性関節炎を含む自己免疫疾患、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、およびネフローゼ症候群；感染による発熱および筋肉症を含む伝染病、ならびに感染に続いておこる悪液質；移植片対宿主拒絶反応；腫瘍増殖または転移；成人呼吸窮迫症候群、ショック肺、慢性肺炎症性疾患、肺サルコイドーシス、肺線維症、および珪肺症を含む肺疾病；クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；心臓疾病；炎症性骨疾病、肝炎、凝固障害、火傷、再かん流傷害、ケロイド形成、および瘢痕組織形成
からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの治療に有用な組換えドメイン抗体(dAb)に関係する。より詳しくは、ヒトTNF-αに結合するドメイン抗体(dAb)、およびヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病の治療における前記抗体の使用に関係する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子α (TNF-α)は、ショックを和らげること、ならびに敗血症、感染症、自己免疫疾患、移植の拒絶反応、および移植片対宿主拒絶反応を含む、種々のヒトの疾患および疾病の病態生理学に関係している、単球およびマクロファージを含む無数の細胞タイプにより生産されるサイトカインである。
【特許文献１】国際出願PCT91/17271号
【特許文献２】米国特許第5,427,908号
【特許文献３】欧州特許第527,839号
【特許文献４】国際出願PCT第99/36569号
【特許文献５】米国特許第5,627,052号
【非特許文献１】Ehrlich PH et al, Clin Chem. 34:9 pg 1681-1688 (1988)
【非特許文献２】Ehrich PH et al, Hybridoma 1987; 6:151-60
【非特許文献３】von Budingen H-C et al., Immunoogcnetics 2001; 53:557-563
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトTNF-αにより仲介される有害効果に対抗する努力の中で、ヒトTNF-αに結合し、およびそれを中和する抗体が、TNF-α活性を阻害する手段として求められてきた。ヒトTNF-αに対する最初期の抗体の一部は、ヒトTNF-αに免疫性を与えられたマウスより採取されるリンパ球より調製されるハイブリドーマ細胞系統より分泌されるマウスモノクローナル抗体であった。そのような抗体はヒトTNF-αに結合し、およびそれを中和することに効果的であったが、マウス抗体のヒトへの投与に関わる問題、特にヒト抗マウス抗体(HAMA)反応と呼ばれる、マウス抗体に対する望まれない免疫応答のヒトにおける誘出により、in vivo治療におけるそれらの使用は制限されてきた。
【０００４】
これらの問題を克服する試みの中で、マウス抗ヒトTNF-α抗体が、よりヒトに類似するように遺伝的に操作されてきている。例えば、ヒト/マウスキメラ抗体が製作されており、そこでマウスゲノム由来の抗体可変領域配列がヒトゲノム由来の抗体定常領域配列と組み合わされている。前記キメラ抗体は、親であるマウス抗体における結合の特徴、およびヒト定常領域と関連するエフェクター機能を提示する。これらのキメラ抗体はヒトの治療に使用されてきているにもかかわらず、それらは一部のマウス配列をいまだ保持し、それゆえ特に長期の期間投与されてそれゆえその治療適用が限られている場合、抗キメラ抗体反応をいまだにヒト受容者に引き出すかもしれない。
【０００５】
ヒトTNF-αに対するヒトモノクローナル抗体が、ヒトハイブリドーマ技術を使用して開発されている。しかしこのアプローチは、ヒト被験者の免疫化について倫理的、臨床的および免疫学的制限をこうむる。
【０００６】
非ヒト霊長類抗体は構造的にヒト抗体に類似しているため、それらはヒトで耐用性があるのであろうと推測されている(Ehrlich PH et al、in vivo治療のためのヒトおよび霊長類モノクローナル抗体Clin Chem. 34:9 pg 1681-1688 (1988))。さらに、ヒト抗体はアカゲザルにおいて非免疫原性であるため(Ehrich PH et al, アカゲザルはヒトモノクローナル抗体の多注入に反応する Hybridoma 1987; 6:151-60)、逆もまた適用され、霊長類抗体はヒトで非免疫原性であろうことは確からしい。
【０００７】
新世界ザルのように、進化的に距離がある霊長類は、ヒト抗原に対する抗体を作製させられるために十分にヒトと異なるだけでなく、そのような霊長類由来抗体をヒトに導入した際に、抗抗体免疫反応を宿主が発生させないような、ヒト抗体に類似した抗体を有するために十分ヒトに類似している。新世界ザル(infraorder- Platyrrhini)は少なくとも53種を含み、それは旧キヌザル科(Callithricidae、現マーモセット亜科Callitrichinae)、および旧オマキザル科(Cebidae、現マーモセット科)の2個のファミリーに分割される。旧キヌザル科はマーモセットおよびタマリンからなる。旧オマキザル科はリスザル、ティティモンキー、クモザル、コモンウーリーモンキー、オマキザル、ヨザルまたはフクロウサル、およびホエザルを含む。
【０００８】
以前の研究により、コモンマーモセット(Callthrix jacchus)マーモセットの発現イムノグロブリン(IGHV)重鎖レパートリーが特徴づけられている (von Budingen H-C et al., 新世界マーモセット、コモンマーモセットにおける発現イムノグロブリン重鎖レパートリーの特徴づけ Immunoogcnetics 2001; 53:557-563)ヒトIGHV対応物に対して、高度な配列類似を示す6種類のIGHV下位群が同定された。相補性決定領域(CDR)と比較された際に、フレームワーク領域はより保存されていた。コモンマーモセットとヒトIGHV配列の間の類似性の程度は、旧世界ザルとヒトの間よりも小さかった。
【０００９】
＜ドメイン抗体＞
ドメイン抗体(dAb)は、抗体の最小機能結合単位であり、抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)いずれかの可変領域に相当する。ドメイン抗体は、およそ13 kDaの分子量を有し、あるいは全長抗体のサイズの10分の1よりも小さい。
【００１０】
イムノグロブリン軽鎖はカッパκまたはラムダλ軽鎖と呼ばれ、重鎖はガンマγ、ミューμ、デルタδ、アルファα、またはイプシロンεと呼ばれる。可変領域により抗体にその特異性が与えられる。各可変領域の中に超可変(hypervariability)の領域があり、フレームワーク領域と呼ばれるより保存される領域に隣接した相補性決定領域(CDR)として別途知られる。各可変領域の中に、3個のCDRおよび4個のフレームワーク領域がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
＜発明の概要＞
第一の態様において、ヒトTNF-αに結合する組換えドメイン抗体(dAb)を本発明は提供し、前記dAbはイムノグロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは新世界ザルに由来する配列を有する少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み、ここで前記CDRは、YAATKLQS（配列番号１）、YEASSLQS（配列番号２）、YEASKLQS（配列番号３）、YSASNLET（配列番号４）からなる群より選択される。
【００１２】
第二の態様において、薬剤として許容しうる担体または希釈剤とともに、本発明の第一の態様による有効量のdAbを含む医薬組成物を本発明は提供する。
【００１３】
第三の態様において、ヒトTNF-αを検知するための診断適用で、本発明の第一の態様による有効量のdAbを使用することを本発明は提供する。
【００１４】
第四の態様において、本発明の第二の態様による薬剤組成物を被験者に投与することを含む、ヒト被験者でヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病を治療する方法を本発明は提供する。
【００１５】
第五の態様において、本発明の第一の態様のdAbをコードする核酸配列を本発明は提供する。
【発明の効果】
【００１６】
第一の態様において、ヒトTNF-αに結合する組換えドメイン抗体(dAb)を本発明は提供し、前記dAbはイムノグロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインを含み、前記可変ドメインは新世界ザルに由来する配列を有する少なくとも1種類の相補性決定領域(CDR)を含み、ここで前記CDRは、YAATKLQS（配列番号１）、YEASSLQS（配列番号２）、YEASKLQS（配列番号３）、YSASNLET（配列番号４）からなる群より選択される。
【００１７】
好ましくは、CDRはCDR2である。
【００１８】
好ましい実施態様において、dAbは以下より選択される配列を有する：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１４５；配列番号７］
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１２３；配列番号８］
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１００；配列番号９］
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１９６；配列番号１０］
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１３４；配列番号５０］
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１３７；配列番号５１］
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
［化合物１２１；配列番号５２］
【００１９】
さらなる態様において、本発明の第一の態様のdAbをコードする核酸配列を本発明は提供する。
【００２０】
ここで「に結合する」の語は、例えばBIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴システムおよびBIAcore(登録商標)動力学的評価ソフトウェア（例えばバージョン2.1）を使用する表面プラズモン共鳴解析により測定される1 μMまたはそれより低い解離定数(Kd)を有する、イムノグロブリン可変領域による抗原の結合を指すと意図されている。特異的結合相互作用の対する親和性および解離定数(Kd)は、好ましくは約500 nMまたはより低い、より好ましくは約300 nMまたはより低い、および好ましくは少なくとも300 nMから50 pM、200 nMから50 pM、およびより好ましくは少なくとも100 nMから50 pM、75 nMから50 pM、10 nMから50 pMである。
【００２１】
ここで「可変ドメイン」の語は、イムノグロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原に特異的に結合する折りたたまれるペプチドドメインが意味される。ドメイン抗体またはdAbは、単一可変ドメインポリペプチドと同等である。
【００２２】
当業者であれば、ヒトに対する進化的関連のために、ヒトの配列に高度な相同性を共有する、ヒト、新世界ザル、または旧世界ザルの可変ドメイン配列のいずれかに可変ドメイン配列の残りが由来してよいことを理解するであろう。それゆえ、例えば上基配列より選択されるCDRは、ヒトまたは霊長類可変領域配列に移植されて野生型CDRを置換してよい。
【００２３】
従って、本発明はさらに、新世界ザルイムノグロブリン可変ドメイン遺伝子を増幅する方法、例えば新世界ザルリンパ球より抽出される核酸からの、重および軽鎖可変ドメイン遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)にもとづく。例えば、重および軽鎖遺伝子(それぞれVHおよびVL)の境界に関する情報を使用して、所与の抗原に結合することが既知である抗体をコードする、クローン化重および軽鎖に由来する可変ドメインを増幅させるPCRプライマーを設計することができる。増幅される可変ドメインはその後、単独または別のポリペプチド配列との融合物としてのいずれかで適切な発現ベクターに挿入される。発現可変ドメインはその後、所望の抗原に対する高親和結合についてスクリーニングされる。
【００２４】
VHおよびVLドメインのレパートリーは、天然に存在するイムノグロブリン配列のレパートリー、または合成レパートリーであることができる。天然に存在するレパートリーは、例えば1種類またはそれ以上の霊長類より採取されるイムノグロブリン発現細胞より調製されるものである。そのようなレパートリーは、未使用である、すなわち新生イムノグロブリン発現細胞より調製される、または再配置される、すなわち例えば成獣霊長類B細胞より調製されることができる。所望であれば、その後天然レパートリー、または標的抗原に結合するレパートリーのいずれかより同定されるクローンを突然変異生成させ、改善される結合特性を有するバリアントを生産および選択するためにさらにスクリーニングにかける。
【００２５】
単一イムノグロブリン可変ドメインの合成レパートリーは、クローン化可変ドメインに多様性を人工的に導入することにより調製される。
【００２６】
VHおよびVLドメインのレパートリーを、所望の結合特異性および機能性質に対して、例えばファージディスプレイによりスクリーニングすることができる。バクテリオファージディスプレイライブラリおよびラムダファージ発現ライブラリを構築するための方法は、当業者に既知である。ファージディスプレイ技術は、当業者により詳細に記載されており、そのようなライブラリを作製し、スクリーニングするための方法および化合物、ならびにそれらの生産物を成熟させる親和性の例を、例えば以下に見出すことができる：Barbas et al . ( 1991 ) PNAS 88:7978-7982；Clarkson et al. (1991) Nature 352:624:628；Dower et al. 国際出願PCT91/17271号、米国特許第5,427,908号、米国特許番号第5,580,717号、および欧州特許第527,839号；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373:1377；Gamad et al. 国際出願PCT第92/09690号；Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580；Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725:734；Griffiths et al.米国特許第5,885,793号、および欧州特許第589,877号；Hawkins el al. (1992) J MoI Biol 226:889-896；Hay et al, (1992) Hum Autibod Hybridomas 3:81-85；Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137；Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281；Knappik et al (2000) J Mol Biol 296:57-86；Knappik et al. PCT国際公開第97/08320号；Ladncr et al.米国特許第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,698号、第5,837,500号、および欧州特許番号第436,597号；McCafferty et al. (1990) Nature 348:552- 554；McCafferty et al.国際出願PCT第92/01047号、米国特許番号第5,969,108号、および欧州特許番号第589,877号；Salfeld et al. 国際出願PCT第97/29131号、米国仮出願第60/126,603；およびWinter el al.国際出願PCT第92/20791号、および欧州特許番号第368,684号。
【００２７】
VHおよびVLドメインを発現する組換えライブラリを、例えば酵母または細菌（国際出願PCT第99/36569号、および第98/49286号を参照）のような微生物の表面に発現することができる。
【００２８】
選択的リンパ球抗体法（Selective Lymphocyte Antibody Method）、または当業者にそれが呼ばれるようにSLAMは、高親和性抗体を迅速に作製する別の方法である。ファージディスプレイのアプローチと異なり、抗体全てが完全に二価である。新世界ザル抗体を作製するために、ヒト抗原、例えばTNF-αポリペプチドで新世界ザルが免疫化される。免疫化に続き、細胞が除去され、個々の微小ウェル中で選択的に増殖させられる。ウェルから上清を除き、結合および機能両方について試験する。遺伝子配列を、それに続く操作、例えばヒト型化、Fabフラグメント、scFv、またはdAb作製のために回収することができる。それゆえ別の例は、SLAMおよびその派生法（Babcock, J.S. et al 1996, Proc.Natl. Acad.Sci, USA 93:7843-7848、米国特許第5,627,052号、および国際出願PCT第92/02551号）による本発明の抗体または抗体種の誘導体である。掬い取り(panning)のような上清を試験する代替法の使用のようなSLAMの応用は、本発明の範囲内にある。
【００２９】
ある発現システムにおいて、組換えペプチド/タンパク質ライブラリは、リボソーム（例えばRoberts, RW and Szostak, J.W.1997. Proc.NatL Acad.Sci. USA. 94:12297 - 123202、および国際出願PCT第98/31700号）上に提示される。それゆえ別の例は、（例えば抗体、または好ましくは抗原化細胞より調製される誘導体の、しかし限定されない）DNAライブラリの作製およびin vitro転写、タンパク質および「抗原化」mRNAがリボソーム上に残留するようなライブラリの翻訳、（例えばRSPへの結合による親和性選択、mRNA単離、（例えばポリメラーゼ連鎖反応または関連技術による）逆転写およびそれに続く増幅が関係する。さらに一連の選択および増幅を、このシステムにける体細胞変異の導入を通した親和性成熟、または当業者に既知である他の親和性成熟の方法に必要に応じて組み合わせることができる。
【００３０】
別の例において、本発明のドメイン抗体を作製するために、エマルジョン区画化技術を適用することが見られる。エマルジョン区画化において、in vitroおよび光学ソーティング法を、エマルジョン中にある油滴の中の水相中にある、翻訳されるタンパク質の共区画化および配列をコードするそのヌクレオチドの共区画化と組み合わせる（国際公開第99026711号および第0040712参照）。抗体の作製および選択のための主な要素は、リボソームディスプレイのin vitro方法に本質的に類似している。
【００３１】
複数の供給源、例えばデータベース、The National Centre for Biotechnology Information protein and nucleotide databases、The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological InterestよりCDRを取得してよい。あるいは、VHおよびVLドメインレパートリー（例えば、Kabat EA and Wu TT, 軽鎖および重鎖の可変部位における相補性決定残基を決定する試み、 Ann, NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)参照）よりCDR領域を予想することができる。CDR配列はゲノムDNAまたはcDNAであってよい。
【００３２】
置換CDRが可変領域配列に移植されてよい複数の方法が存在し、そのような方法は当業者に既知である。本発明の好ましい方法は、遺伝子変異導入に関するプライマーを介する可変領域ドメイン中のCDR2の置換に関係する。この方法は、所望の変異をコードする合成オリゴヌクレオチドを、DNA合成をin vitroで開始するためのプライマーとして役立つ標的領域にアニールし、オリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼにより伸張して所望の変異を保持する二本鎖DNAを作製し、適切な発現ベクター中に配列をライゲーションおよびクローニングすることからなる。
【００３３】
好ましくは、本発明によるドメイン抗体はヒトで低い免疫原性を有する。
【００３４】
「低い免疫原性」の語に言及することにより、治療上有効性を達成するのに十分な時間抗体を連続投与することによる有効性を減少させるのに十分な程度の免疫応答をドメイン抗体がヒトにおいて引き起こすことが無いことが意味される。
【００３５】
好ましくは、CDRが移植される可変領域配列は、図１で提供される「dAbアクセプター配列」（化合物１２８と示される）である。
【００３６】
dAbアクセプター配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIICRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号６）
【００３７】
この配列は配列番号５で示されるヌクレオチド配列によりコードされる：
【表１】
2009519720.tif 000002
【００３８】
本発明の好ましいある実施態様において、以下のdAb（化合物１４５と示される）を生産するために、dAbアクセプター配列のCDR2配列（YSASELQS；配列番号４９）を置換するように、マーモセットCDR配列YSASNLET（配列番号４）がdAbアクセプター配列に移植される：
＜化合物１４５＞
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号７）
【００３９】
それゆえ好ましいある実施態様において、ヒトTNF-αに結合するdAbは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
dAb配列が、その抗原結合特性を改善するために、親和性成熟にさらにかけられてよいことは本発明の範囲内である。これは、CDR1およびCDR3内のあるアミノ酸残基の改変を必要とする。
【００４１】
例えば、配列番号７で示されるマーモセットCDR移植dAbは、＜材料と方法＞で試みられ、TNF結合に対して試験されるように親和性成熟されていた。さらなる好ましい実施態様において、ヒトTNF-αに結合するdAbは、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む。これらはそれぞれ化合物１２３および化合物１００と示されており、それらの配列を以下に示す：
＜化合物１２３＞
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号８）
＜化合物１００＞
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSlDSYLflWYQQKPGKAPKLLlYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号９）
【００４２】
特に好ましい実施態様において、ヒトTNF-αに結合するdAbは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。これは化合物１９６と示されており、配列が以下に提供される：
＜化合物１９６＞
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR（配列番号１０）
【００４３】
本発明によるdAbはさらに、それに連結されるイムノグロブリン定常領域（Fc領域）を含んでよい。定常領域配列は、ヒトまたは霊長類配列に由来してよい。霊長類配列は、新世界ザルまたは旧世界ザル配列であってよい。適切な旧世界ザルは、または、ヒトに対して系統樹的に近接しているためにヒト定常領域配列に高度な相同性を共有する、チンパンジー、または他のヒト科の動物、例えばゴリラまたはオランウータンを含む。
【００４４】
（連結される定常領域を有するまたは有しない）dAbを、別の機能分子に誘導体化または結合することができる。例えば、化学共役、遺伝的融合、非共有結合またはその他により、他の抗体、検出剤、細胞毒性薬剤、医薬剤、および/あるいは（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジン標識のような）別の分子と抗体の結合を仲介することができるタンパク質またはペプチドのような1種類またはそれ以上の他の分子的実体に、dAbを機能的に結合することができる。dAbが誘導体化されてよい有用な検出剤は、蛍光化合物を含む。例示的な蛍光検出剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、およびその類似物を含む。dAbをまた、アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびその類似物のような検出剤で誘導体化してもよい。dAbを検出酵素で誘導体化する際、検出反応生成物を生産することが、酵素が使用する付加剤を添加することにより検出される。dAbはまたビオチンで誘導体化されてもよく、アビジンまたはストレプトアビジンの間接測定を通して測定される。
【００４５】
本発明はまた、ペグ(PEG)化抗体ポリペプチドに対して相対的に、増強される半減期、および活性（例えば結合活性）において失活を伴わない分解に対する抵抗を提供する、（そこに結合される定常領域を有するまたは有しない）ペグ化dAbにも拡大適用する。
【００４６】
当業者に既知の方法を使用して、増強される半減期および分解抵抗特性を達成するために有用なポリマー分子（好ましくはペグ）にdAbを結合させることができる。本発明で利用されることができるポリマー部分は、合成的または天然存在であることができ、直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレンポリマー、あるいはホモまたはヘテロ多糖のような分枝または非分枝多糖を含むがそれに限定されない。本発明で使用されることができる合成ポリマーの好ましい例は、直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）（ペグ）、ポリ（プロピレングリコール）、またはポリ（ビニルアルコール）、および誘導体、ならびにそれらの置換形態を含む。dAbへの結合に特に好ましい置換ポリマーは、メトキシ（ポリエチレングリコール）を含む置換ペグを含む。ペグに加えてまたはペグの位置で使用されることができる天然存在ポリマー部分は、ラクトース、アミロース、デキストラン、またはグリコーゲン、ならびに当業者に認識されるであろうそれらの誘導体を含む。
【００４７】
ポリマー分子の誘導体化形態は、例えば、付加部分を有する誘導体または、ここで記載されるドメイン抗体ポリペプチドのアミノ酸残基との相互作用を許容するように存在する反応基を含む。そのような誘導体は、N-ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)活性エステル、スクシンイミジルプロピオナートポリマー、ならびにマレイミド、ビニルスルフォン、およびチオールのようなスルフヒドリル選択反応性薬剤を含む。本発明で有用なペグポリマーは直鎖分子であることができ、または複数のペグ部分が単一ポリマーに存在する分枝状であることができる。
【００４８】
反応基（例えばMAL、NHS、SPA、VS、またはチオール）を、ペグポリマーに直接結合してもよく、リンカー分子を介してペグに結合してもよい。
【００４９】
本発明で有用なポリマーのサイズは、500 Daから60 kDa、例えば1000 Daと60 kDaとの間、10 kDaと60 kDaとの間、20 kDaと60 kDaとの間、30 kDaと60 kDaとの間、40 kDaと60 kDaとの間、および50 kDaと60 kDaとの間までの範囲であることができる。本発明で使用されるポリマー、特にペグは、直鎖ポリマーであることができ、分枝構造を有してもよい。
【００５０】
本発明で有用なポリマー（ペグ）分子を、当業者に既知の方法を使用するドメイン抗体に結合することができる。ペグまたは他のポリマー部分を、本発明の抗体ポリペプチド単量体または多量体に結合する第一の工程は、ペグポリマーの水酸末端基を求電子含有官能基により置換することである。特に、ペグポリマーを、ドメイン抗体に存在するシステインまたはリジン残基のいずれかに結合する。システインまたはリジン残基は、天然に存在することができ、または抗体ポリペプチド分子中に設計されることもできる。例えば、システイン残基を、dAbポリペプチドのC末端に組換えて設計することができ、あるいはdAbまたは他の抗体ポリペプチド中の特異的溶媒接近可能位置の残基を、システインまたはリジンと置換することができる。
【００５１】
本発明によるdAbを、in vivoで半減期を増加させることができる1種類またはそれ以上の分子に結合させてよい。これらの分子を、抗原結合部位を妨げる/立体的に妨害するように、リンカーを介してdAbに結合させてよい。あるいは、それらを定常領域に結合させてよい。典型的には、そのような分子は、in vivoで天然に発生する、および内因性機構による分解または除去に抵抗するポリペプチドである。半減期を増加させる分子を、以下より選択してよい：
(a) 細胞外マトリックスからのタンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン；
(b) 血中に見出されるタンパク質、例えば
フィブリンα-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンA、フィブリノゲンB、血清アミロイド蛋白質A、ヘプタグロビン(heptaglobin)、タンパク質、ユビキチン、ユーテログロブリン(uteroglobulin)、β-2ミクログロブリン、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1抗トリプシンおよび膵臓キプシン(kypsin)阻害剤；
(c) 免疫血清タンパク質、例えばIgE、IgG、TgM；
(d) 輸送タンパク質、例えばレチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン
(e) デフェンシン、例えばβ-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、2、および3；
(f) 血液脳関門または神経組織中に見出されるタンパク質、例えばメラノコルチンレセプター、ミエリン、アスコルビン酸トランスポーター；
(g) トランスフェリンレセプター特異的リガンド-神経医薬融合タンパク質（米国特許第5977307号参照）；脳毛細血管内皮細胞、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター、インスリン、インスリン様増殖因子1(IGF 1)レセプター、インスリン様増殖因子2(IGF 2)レセプター、インスリンレセプター；
(h) 腎臓に位置されるタンパク質、例えばポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオントランスポーターK1、ヘイマンの抗原(Heymann's antigen)；
(i) 肝臓に位置されるタンパク質、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、G250；
(j) 血液凝固第X因子；
(k) α-1抗トリプシン；
(1) HKF 1α；
(m) 肺に位置されるタンパク質、例えば（IgAに結合する）分泌成分；
(n) 心臓に位置されるタンパク質、例えばHSP 27；
(o) 皮膚に位置されるタンパク質、例えばケラチン；
(p) 骨形態形成タンパク質(BMP)のような骨特異的タンパク質、例えばBMP-2、-4、-5、- 6、-7（骨形成タンパク質(OP-1)とも呼ばれる）、および-8 (OP-2)；
(q) 腫瘍特異的タンパク質、例えばヒトトロホブラスト抗原、ハーセプチンレセプター、エストロゲンレセプター、カテプシン、例えば（肝臓および脾臓で発見される）カテプシンB；
(r) 疾患特異的タンパク質、例えば活性化T細胞のみで発現される抗原：LAG-3（リンパ球活性化遺伝子）を含む；破骨細胞形成抑制因子リガンド(OPGL)、Nature 402, 304- 309, 1999を参照；OX40（TNFレセプターファミリーの一員で、活性化T細胞のみで発現され、ヒトT細胞白血病ウィルスI型(HTLV-l)-生産細胞で特異的に発現上昇することが知られている唯一の副刺激T細胞分子である、J. Immunol. 2000 Jul (1;16561), 263-70参照）；キイロショウジョウバエのCG6512、ヒトパラプレギン(paraplegin)、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsMを含む、（関節炎/癌に関連する）メタロプロテアーゼ、；酸性線維芽細胞増殖因子(FGF-1)、塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)、血管内皮増殖因子/血管透過因子(VEGF/VPF)、形質転換増殖因子-α (TGF-α)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、アンギオジェニン、インターロイキン3 (IL-3)、インターロイキン8 (IL-8)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD- ECGF)、胎盤増殖因子(PlGF)、ミッドカイン血小板由来増殖因子-BB(PDGF)、フラクタルカイン；
(s) ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）；
(t) Fc輸送に関するタンパク質；および
(u) 内因性タンパク質、例えば血清アルブミンに関する抗体、フラグメント、または誘導体。
【００５２】
本発明のさらなる実施態様において、第一の態様によるdAbは、例えばヘテロまたはホモ二量体、ヘテロまたはホモ三量体、ヘテロまたはホモ四量体、あるいはそれ以上の数のヘテロまたはホモ多量体に多量体化されてよい。多量体化は抗原結合の強さを増強することができ、ここで結合の強さは、多数の結合部位における結合親和性の総計に関係づけられる。
【００５３】
それゆえ、第一の態様によるドメイン抗体を本発明は提供し、ここでドメイン抗体は少なくとも1種類のさらなるドメイン抗体に結合されている。各dAbは、同一または異なる抗原に結合してよい。
【００５４】
dAb多量体は、さらに1種類またはそれ以上の結合されるdAbを含んでよく、ここで各dAbは異なる抗原、いわゆる「二重特異的リガンド(dual- specific ligands)」を含む多重特異的リガンド(multi-specific ligands)に結合する。例えば、二重特異的リガンドは、一対のVHドメインまたは一対のVLドメインを含んでよい。そのような二重特異的リガンドは、Domantis Ltd.の名で国際公開2004/003019号(PCT/GB2003/002804)に記載されている。
【００５５】
第二の態様において、本発明の第一の態様による有効量のdAbを、薬剤として許容しうる担体または希釈剤とともに含む薬剤組成物を本発明は提供する。
【００５６】
「薬剤として許容しうる担体」は、生理学的に両立しうる、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌および抗細菌薬剤、等張および吸収遅延剤、ならびに類似物を含む。薬剤として許容しうる担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその類似物、ならびにそれらの組み合わせの1種類またはそれ以上を含む。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。湿潤または微量の補助基質のような薬剤として許容しうる基質は、乳化剤、保存剤またはバッファーである。
【００５７】
組成物は、液体溶液（例えば注射可能および注入可能溶液）、分散液、または懸濁液のような液体、半固体および固体服用形態、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、および坐薬を含む種々の形態であってよい。好ましくは組成物は、免疫化のために注射可能溶液の形態である。服用は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経皮、髄腔内、および動脈内であってよい。
【００５８】
薬剤組成物は典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌および安定でなければならない。溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、および高薬剤濃度に適する指示される他の構造として組成物を配合することができる。無菌注射可能溶液を、活性化合物（すなわちdAb）を適切な溶媒中に必要とされる量、上に列記された成分の1種類または組み合わせとともに調製し、その後ろ過滅菌することができる。
【００５９】
無菌注射可能溶液を調製するためにまた無菌粉末としても組成物を配合してよい。例えばレシチンおよび/または界面活性剤のような被覆剤を使用することにより、溶液の適切な流動性を維持することができる。
【００６０】
ある実施態様において、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御徐放配合のように、急速徐放に対して化合物を保護するであろう担体とともに活性化合物を調製してよい。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸のような、両立しうるポリマーを使用してよい。
【００６１】
組成物をまた、経口投与のために配合してもよい。この実施態様において、錠剤中に圧縮して、硬質または軟質殻ゼラチンカプセル中に、または被験者の食事に直接取り込んで、dAbを封入してよい。
【００６２】
組成物をまた直腸投与のために配合してもよい。
【００６３】
補助活性化合物もまた組成物中に取り込むことができる。1種類またはそれ以上の付加治療薬、例えば抗炎症化合物、可溶性TNF-αレセプターまたはヒトTNF-α生産を阻害する化学薬剤、あるいはサイトカインまたは細胞表面分子のような他の標的に結合する抗体とともに、ドメイン抗体を共配合および/または共投与してよい。あるいは、タンパク質A、タンパク質C、タンパク質G、またはタンパク質Lのような可溶性免疫化学薬剤とドメイン抗体を共投与してよい。
【００６４】
有効量は、本発明におけるdAbの薬剤としての有効量または予防的有効量を含んでよい。薬剤としての有効量は、所望の治療結果を達成するために、服用時および必要な時間の間、有効な量を指す。予防的有効量は、所望の予防結果を達成するために、服用時および必要な時間の間、有効な量を指す。
【００６５】
好ましい実施態様において、組成物を哺乳類、好ましくはヒトまたは霊長類に投与してよい。
【００６６】
第三の態様において本発明は、ヒトTNF-αを検出するための診断上の応用における、本発明の第一の態様によるdAbの使用を提供する。
【００６７】
例えば、本発明による抗ヒトTNF-α dAbを、例えば酵素免疫測定吸着法(ELlSA)、放射免疫測定、または組織免疫化学のような伝統的な免疫アッセイを使用して、血清または血漿のような生物学的検体中のヒトTNF-α dAbを検出するために使用することができる。本発明による抗ヒトTNF-α dAbを、検出可能な基質で標識される組換えヒトTNF-αスタンダード、および非標識抗ヒトTNF-α抗体を使用する競合免疫アッセイにより生物学的液体中で測定することができる。
【００６８】
本発明による抗ヒトTNF-α dAbをまた、ヒト以外の種、例えばチンパンジー、マーモセット、アカゲザル、マウス、ブタからのTNF-αを検出するために使用してもよい。
【００６９】
本発明による抗ヒトTNF-α dAbをまた、TNF-α活性を阻害することが望まれる細胞培養の応用で使用してもよい。
【００７０】
第四の態様において本発明は、本発明の第二の態様による薬剤組成物を被験者に投与することを含む、ヒト被験者におけるヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病を治療するための方法を提供する。
【００７１】
ヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病は、疾病に苦しむ被験者におけるTNF-αの存在が、疾病の病態生理学の原因である、または疾病の悪化に寄与する要素であるかのいずれかであると示されている、または推測される、疾患および他の疾病を含むことが意図されている。好ましくはヒトTNF-α活性により特徴づけられる疾病は、以下からなる群より選択される：炎症、炎症疾患、ならびに敗血症性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌敗血、および有毒ショック症候群を含む敗血症；関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、および痛風性関節炎を含む自己免疫疾患、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、およびネフローゼ症候群；感染による発熱および筋肉症を含む伝染病、ならびに感染に続いておこる悪液質；移植片対宿主拒絶反応；腫瘍増殖または転移；成人呼吸窮迫症候群、ショック肺、慢性肺炎症性疾患、肺サルコイドーシス、肺線維症、および珪肺症を含む肺疾病；クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；心臓疾病；炎症性骨疾病、肝炎、凝固障害、火傷、再かん流傷害、ケロイド形成、および瘢痕組織形成。
【００７２】
ここで「含む(comprise)」または「含む(comprises)」、「含んでいる(compring)」のような変化は、記述される要素、整数、または工程、あるいは要素、整数、または工程の群の含有を暗示するが、他のいずれかの要素、整数、または工程、あるいは要素、整数、または工程の群の排除を暗示しないと理解される。
【００７３】
ここで言及される全ての文献は、言及されてここに取り込まれる。ここに含まれている文献、行為、材料、装置、物品またはその類似物のいずれの議論も、本発明のための内容を提供するためのみにある。これらのもののいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成する、あるいは、本出願の優先日以前にオーストラリアまたは別のどこかに存在したために、本発明に関係する分野で普通の一般知識であったことを承認すると受け取られることはない。
【００７４】
本発明の性質をより明確に理解するために、その好ましい形態が以下の非限定的実施例に言及していま記述されるであろう。
【実施例】
【００７５】
＜実施例１  材料と方法＞
【００７６】
ヒトVκリーダー配列および組換えシグナル配列(RSS)に基づく縮重プライマーは、WalteおよびTomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996)に由来した。
生殖細胞Vκ DNAの増幅に使用されるプライマーは以下のとおりである：
＜プライマーVKlBL＞
AATCKCAGGTKCCAGATG（配列番号１１）
＜プライマーVK1BL35a＞
GTTYRGGTKKGTAACACT（配列番号１２）
＜プライマーVK1BL35b＞
ATGMCTTGTWACACTGTG（配列番号１３）。
【００７７】
ゲノムPCR（30サイクル）を、プライマー対VKlBLxVK1BL35aまたはVK1BLxVK1BL35bのいずれかと、Taqポリメラーゼを使用して実行した。クローン化される配列、および使用される前記2組のプライマーセットの間に重複が存在した。
【００７８】
PCR産物をInvitrogenのTOPO TAクローニングキット（カタログ番号 K4500-01）にクローニングし、ならびにM13フォワードおよびpUCリバースプライマーで配列解析した。フォワードおよびリバース方向で配列を確認した。鍵となる配列がPCRエラーを被らないために、PCRおよびクローニングプロセスを、マーモセット配列に対して2回繰り返した。ヌクレオチド（配列番号１４から２４および配列番号３６から４１）ならびにアミノ酸（配列番号２５から３５および配列番号４２から４７）は、図２に与えられる。マーモセット配列１、２、および３を確認した。配列４、５、６、７、および８が最初のPCRのみで見られた。配列９、１０、および１１が繰り返し（すなわち2番目の）PCRおよびクローニングで見られた。
【００７９】
＜オリゴ合成およびアクセプター配列へのクローニング＞
【００８０】
4つのCDR配列、すなわちフクロウサル配列１（配列番号４２）からのYAATKLQS（配列番号１）、フクロウサル配列２（配列番号４３）からのYEASSLQS（配列番号２）、マーモセット配列１（配列番号２５）からのYEASKLQS（配列番号３）、マーモセット配列２（配列番号２６）からのYSASNLET（配列番号４）が、図２に説明されて示されるアミノ酸配列より選択された。フクロウサル配列５、YYASSLQS（配列番号４８）が、アオテュス・ナンサイナアエ(Aotus nancyinaae)(マのヨザル、Ma's night monkey)cDNA配列と同一であることが発見され、他の全ての配列は独自のものであった。
【００８１】
発現ベクター(Domantis proprietary vector)中のアクセプター可変領域（抗TNFドメイン抗体）配列を、制限断片地図に示されるように、FR2ならびにCDR2の大部分を切除するKpnIおよびSanDIで順次切断した(25μg)。その後ベクターを精製し、野生型FR2およびCDR2配列を切除した。
【００８２】
オリゴ対（図４Ａおよび４Ｂに示される、各500 pmol）を95°Cで5分間、その後65°Cで5分間インキュベートし、そして熱ブロック上でゆっくりと室温に達するようにすることにより、オリゴのアニールを実行した。その後、dNTP存在下でクレノー反応の間に重複を埋め合わせた。
【００８３】
＜親和性成熟＞
【００８４】
マーモセットCDR移植dAb化合物１４５（配列番号７）を、配列番号７の配列を1アミノ酸残基でそれぞれ多様化した14種の別個のライブラリを構築することにより、親和性成熟させた。選択される残基を以下に影付で示す。
【表２】
2009519720.tif 000003
【００８５】
成熟ヒトIgレパートリーで多様化されることが既知であるCDR1およびCDR3中の残基、ならびに関係するdAb中で遺伝子変異導入後機能性タンパク質を生産することが観察されているフレームワーク残基に基づいて選択はなされる。選択される残基それぞれについて、相補的フォワードおよびリバースPCRプライマーはNKK縮重(NKK degeneracy)とともに設計され、2種類の最初のPCR反応をそれぞれ遺伝子変異導入プライマーおよび隣接プライマーで実行した。クリーンアップ後、前記2種類のPCR産物をアニールさせ、その後隣接プライマーのみを使用して増幅した（PCRの重複伸長によるスプライシング；Lowman H. L.およびClackson T. 編, Phage Display: A practical approach, Oxford University Press , Oxford, UK）。クローンを最初、固相TNFを使用するELIZAによりスクリーニングし、陽性クローンを配列解析した。dAbタンパク質を、最良のクローンより精製し、レセプター結合アッセイおよびL929細胞毒性アッセイで効能を評価した。化合物１００（配列番号９）および化合物１２３（配列番号８）において、親のdAb、化合物１４５（配列番号７）よりも相対的に改善されるTNF中和を有することが発見された。化合物１００（配列番号９）および化合物１２３（配列番号８）の親和性増強置換を組み合わせることにより、L929細胞毒性アッセイでさらに効能が改善した抗TNF dAbがもたらされた（化合物１９６（配列番号１０））。
【００８６】
＜結果＞
＜レセプター結合アッセイ(RBA)および細胞毒性アッセイにおける抗TNF dAbクローンの効能＞
TNFがそのレセプターに結合するのを阻害する、およびL929細胞のTNF仲介細胞毒性を中和する、抗TNF dAbの能力を以下に示す：
【００８７】
＜レセプター結合アッセイ＞
【００８８】
選択される14の位置で多様化されるdAbを、組換えTNFレセプター1に対するTNFの結合を阻害する能力について試験した。簡単には、マキソープ(Maxisorp)プレートを、30 mg/mlの抗ヒトFcマウスモノクローナル抗体(Zymed, San Francisco, USA)と一晩インキュベートした。0.05% Twcen-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でウェルを洗浄し、その後PBS中の1% BSAでブロッキングし、100 ng/ml TNFレセプター1 Fc融合タンパク質(R&D Systems, Minneapolis, USA)とインキュベートした。洗浄されたウェルに最終濃度10 ng/mlで添加されるTNFと、各dAbを混合した。TNF結合を、0.2 mg/mlビオチン化抗TNF抗体(HyCult biotechnology, Uben, Netherlands)で検出し、ストレプトアビジンで標識されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ(Amersham Bioscicnces, UK)で1倍から500倍に希釈し、その後TMB基質(KPL, Gaithersburg, USA)とインキュベートした。HClの添加により反応を停止し、450nmで吸光度を計測した。抗TNF dAb活性により、TNF結合の低下、およびそれゆえにTNFのみの対照と比較される吸光度の減少がもたらされる（図５）。
【００８９】
＜L929細胞毒性アッセイ＞
【００９０】
化合物１００（配列番号９）および化合物１２３（配列番号８）を含む、小ライブラリ多様性アプローチ(minilibrary diversification approach)により同定される抗TNF dAbをまた、マウスL929線維芽細胞の細胞毒性を中和する能力について試験した(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248)。簡単には、マイクロリットルプレート中に設置されるL929細胞を、抗TNF dAb、100 pg/ml TNF、および1 mg/mlアクチノマイシンD (Sigma, Poole, UK)と一晩インキュベートした。490nmの吸光度を測定することにより細胞生存率を測定し、その後3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H- テトラゾリウム(Promega, Madison, USA)とインキュベートした。抗TNF dAb活性により、TNF細胞毒性の低下、およびそれゆえにTNFのみの対照と比較される吸光度の増加がもたらされる。親のdAb 化合物１４５（配列番号７）と比較した結果が図６に表される。
【００９１】
広く記述される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施態様で示される本発明に対して無数の変化および/または改変がなされてよいことが、当業者により理解されるであろう。それゆえ、本実施態様は、あらゆる点で例示的であり、制限的ではないと考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】アクセプターdAbのアミノ酸（配列番号６）、およびヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２−１】11種のマーモセットおよび6種のフクロウサルVκ遺伝子セグメントのヌクレオチド、およびアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図２―１のの続きを表す。
【図２−３】図２―２のの続きを表す。
【図２−４】図２―３のの続きを表す。
【図２−５】図２―４のの続きを表す。
【図３】アクセプターdAbのアミノ酸、およびヌクレオチド配列（両方の鎖）を示す。CDR2を含む領域を切除するKpnIおよびSanDIの制限酵素切断部位を図中に示す。切除されるCDR2残基を下線で示す。
【図４Ａ】図２で示されるヌクレオチドのクローニングおよび最終配列確認の間に使用されるオリゴヌクレオチドを示す配列アラインメントを示す。
【図４Ｂ】図２で示されるアミノ酸配列のクローニングおよび最終配列確認の間に使用されるオリゴヌクレオチドを示す配列アラインメントを示す。
【図５】TNFが組換えTNFレセプターに結合することを阻害するCDR2移植dAbの能力を示す。試験されるdAbは以下のとおりである：フクロウサル１（CDR= YAATKLQS；配列番号１）, フクロウサル２（CDR=YEASSLQS；配列番号２）、マーモセット１（CDR=YEASKLQS；配列番号３）、マーモセット２（CDR=YSASNLET；配列番号４）、およびアクセプター（CDR=YSASELQS；配列番号４９）。
【図６】アクセプターdAb（化合物１４５）に対して相対的な、マウスL929線維芽細胞に対するTNFの細胞毒性活性を中和する化合物１００および１２３の改善される能力を示す。
【図１】
2009519720.tif 000004
【図２−１】
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【図２−２】
2009519720.tif 000006
【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
2009519720.tif 000009
【図３】
2009519720.tif 000010
【図５】
2009519720.tif 000011
【図６】
2009519720.tif 000012
【図４Ａ】
2009519720.tif 000013
【図４Ｂ】
2009519720.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009519720000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2009519720.tif 000015
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ａ】
2009519720.tif 000016
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｂ】
2009519720.tif 000017
【国際調査報告】
2009519720.tif 000018
2009519720.tif 000019
2009519720.tif 000020