(57)【要約】本発明は、ＡＤＤＬとしても知られている、Ａβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識する抗体に関する。本発明の抗体は、アルツハイマー病の、および対照のヒト脳抽出物を区別することができ、これは、ＡＤＤＬを検出し、アルツハイマー病を診断する方法において有用である。本発明の抗体はまた、ＡＤＤＬのニューロンへの結合、ＡＤＤＬの構築およびタウリン酸化を遮断し、したがってアミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーと関連する疾患を防止し、処置するための方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が、Ａｒｇ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号９）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここでＸａａ１がＧｌｎまたはＡｌａであり；Ｘａａ２がＳｅｒまたはＧｌｙであり；Ｘａａ３がＰｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＴｈｒであり；Ｘａａ４がＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘａａ５がＧｌｙ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり；Ｘａａ６がＶａｌ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＡｒｇである、前記単離された抗体またはその断片。
【請求項２】
抗体の重鎖および軽鎖可変部がそれぞれ、配列番号１０８および配列番号１１２で定めるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
抗体の重鎖および軽鎖がそれぞれ、配列番号１３８および配列番号１４０で定めるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、請求項１に記載の単離された抗体またはこの断片を、薬学的に許容し得る担体との混合物において含む、医薬組成物。
【請求項５】
Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を防止するための方法であって、前記ニューロンを請求項１に記載の抗体と接触させて、Ａβ由来拡散性リガンドの前記ニューロンへの結合を防止するようにすることを含む、前記方法。
【請求項６】
Ａβ由来拡散性リガンドの構築を阻害するための方法であって、アミロイドβ１−４２ペプチドを含有する試料を請求項１に記載の抗体と接触させて、これによりＡβ由来拡散性リガンドの構築を阻害することを含む、前記方法。
【請求項７】
タウタンパク質のＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるリン酸化を遮断するための方法であって、タウタンパク質を含有する試料を請求項１に記載の抗体と接触させて、これによりＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を遮断することを含む、前記方法。
【請求項８】
Ａβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を予防的に、または治療的に処置するための方法であって、有効量の請求項４に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を防止する治療剤を同定するための方法であって、ニューロンをＡβ由来拡散性リガンドと、薬剤の存在下で、また請求項１に記載の抗体を用いて接触させて、前記薬剤の存在下でＡβ由来拡散性リガンドの前記ニューロンへの結合を決定することを含む、前記方法。
【請求項１０】
試料中のＡβ由来拡散性リガンドを検出するための方法であって、試料を請求項１に記載の抗体と接触させて、Ａβ由来拡散性リガンドを検出するようにすることを含む、前記方法。
【請求項１１】
Ａβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を診断するための方法であって、試料を請求項１に記載の抗体と接触させて、Ａβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を診断するようにすることを含む、前記方法。
【請求項１２】
Ａβ由来拡散性リガンドを検出するためのキットであって、請求項１に記載の単離された抗体またはその断片を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
導入
本出願は、２００５年１０月２１日出願のＰＣＴ出願番号PCT/US2005/0038125の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病は、進行性および変性認知症である（Terryら(1991)、Ann. Neurol. 30:572-580；Coyle (1987)、Encyclopedia of Neuroscience, Adelman（編）、Birkhaeuser, Boston-Basel-Stuttgart, ２９〜３１頁中）。初期段階において、アルツハイマー病は、報告されたところではアミロイドベータ（Ａβ）から由来する神経毒のために、新たな記憶の形成の深刻な不能として出現する(Selkoe (2002)、Science 298:789-791)。Ａβは、存在量がアルツハイマー病に関連する変異や危険因子により増加する、両親媒性ペプチドである。Ａβから形成される原繊維は、アミロイドプラークの核を構成し、これは、アルツハイマー病の脳の特徴である。インビトロで産生された類似する原繊維は、培養した脳ニューロンに対して致命的である。これらの所見により、記憶喪失が、原繊維状Ａβにより生じたニューロン死の結果であることが、示される。
【０００３】
原繊維状Ａβおよび記憶喪失に対する強力な実験的支持にもかかわらず、認知症とアミロイドプラーク負荷との間の、関連性は乏しい(Katzman (1988)、Ann. Neurol. 23:138-144)。さらに、年齢依存性アミロイドプラーク、そして最も重要なことには年齢依存性記憶障害を展開するトランスジェニックｈＡＰＰマウス(Dodartら(2002)、Nat. Neurosci. 5:452-457；Kotilinekら(2002)、J. Neurosci. 22:6331-6335)は、Ａβに対するモノクローナル抗体をワクチン接種してから２４時間以内に、記憶喪失がプラークレベルの変化を伴わずに逆行し得ることを示す。このような所見は、アミロイド原繊維により生じたニューロン死に依存する記憶喪失に対するメカニズムと整合しない。
【０００４】
Ａβ自己構築により形成した追加の神経学的に活性な分子が、示唆された。これらの分子は、Ａβ由来拡散性リガンド(Ａβ-derived diffusible ligand)またはＡＤＤＬとも呼ばれる可溶性Ａβオリゴマーを含む。オリゴマーは、準安定性であり、低濃度のＡβ１−４２において形成する(Lambertら(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-6453)。Ａβオリゴマーは、長期間増強（ＬＴＰ）、即ち記憶およびシナプスの柔軟性に対する古典的な実験的パラダイムを迅速に阻害する。このように、記憶喪失は、原線維ではなく、Ａβオリゴマーによるニューロン死およびシナプス不全に先立つ、シナプス不全に起因する(HardyおよびSelkoe (2002)、Science 297:353-356)。可溶性オリゴマーは、脳組織において見出され、アルツハイマー病において(Kayedら(2003)、Science 300:486-489；Gongら(2003)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10417-10422)、およびｈＡＰＰトランスジェニックマウスアルツハイマー病モデルにおいて(Kotilinekら(2002)、J. Neurosci. 22:6331-6335；Changら(2003)、J. Mol. Neurosci. 20:305-313)、顕著に上昇している。
【０００５】
種々のアルツハイマー病処置の選択肢が、示唆されている。ワクチン臨床試験により、ワクチンに対する活発な免疫応答を備えているヒトが認知の利得を呈することが、明らかになった(Hockら(2003)、Neuron 38:547-554)；しかし、ＣＮＳ炎症の頻発により、試験の一部の早期の終了が生じた(BirminghamおよびFrantz (2002)、Nat. Med. 8: 199-200)。ワクチンの代替として、単量体または原繊維に結合せずにＡＤＤＬを標的する治療的抗体が、示唆された(Klein (2002)、Neurochem. Int. 41:345-352)。ＡＤＤＬは、高度に抗原性であり、〜５０μｇ／ｍＬの濃度でウサギにおいてオリゴマー選択性ポリクローナル抗体を産生する(Lambertら(2001)、J. Neurochem. 79:595-605)。トランスジェニックマウスモデルからの結果により、また、抗体が、記憶の低下を成功的に逆行させ得ることを示唆する(Dodartら(2002)、Nat. Neurosci. 5:452-457；米国特許出願通番第11/194,989号)。したがって、当該分野において、アルツハイマー病の予防および処置のためのＡＤＤＬ選択性治療的抗体に対する必要性がある。本発明は、この必要性を充足する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、単離された抗体またはその断片である。特に、本発明の抗体は、Ａｒｇ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号９）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、ここでＸａａ１はＧｌｎまたはＡｌａであり；Ｘａａ２はＳｅｒまたはＧｌｙであり；Ｘａａ３はＰｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＴｈｒであり；Ｘａａ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘａａ５はＧｌｙ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり；Ｘａａ６はＶａｌ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＡｒｇである。特別な態様において、本発明の抗体は、薬学的に許容し得る担体との混合物においてである。他の態様において、本発明の抗体は、キットにおいてである。さらに他の態様は、配列番号１０８および配列番号１１２に定める重鎖および軽鎖の可変部配列を有する抗体を包含する。配列番号１３８および配列番号１４０に定める重鎖および軽鎖配列を有する抗体を、また、提供する。
【０００７】
１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造に結合する抗体または抗体断片を用いる、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を防止し、Ａβ由来拡散性リガンドの構築を阻害する方法もまた、提供する。
【０００８】
本発明はさらに、本発明の抗体を用いた、Ａβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を予防的に、または治療的に処置する方法を包含する。本発明の抗体の投与により、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合が防止され得、これによりＡβ由来拡散性リガンドと関連する疾患が防止または処置される。
【０００９】
本発明はまた、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を防止する治療剤を同定するための方法である。本発明のこの方法は、ニューロンをＡβ由来拡散性リガンドと、剤の存在下で、また本発明の抗体を用いて接触させて、当該剤の存在下でのＡβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を決定することを含む。
【００１０】
本発明はまた、試料中のＡβ由来拡散性リガンドを検出する方法およびＡβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を診断する方法を包含する。このような方法は、試料を本発明の抗体と接触させて、Ａβ由来拡散性リガンドを検出することができ、またＡβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を診断することができるようにすることを含む。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、マウス抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２の重鎖可変部（図１Ａ）および軽鎖可変部（図１Ｂ）の核酸配列を示す。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００１２】
図２は、マウス抗体２０Ｃ２並びにヒト化抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）およびＨｕ２０Ｃ２Ａ３（ベニア化(veneered)）の重鎖可変部（図２Ａ）および軽鎖可変部（図２Ｂ）アミノ酸配列の比較を示す。配列を、２０Ｃ２マウス配列、最も相同的なヒトゲノム配列とヒト化配列との間の比較として、提示する。マウス２０Ｃ２とヒト化Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３との間のフレーム領域中の配列の差異を、ボールド体とする。ヒト化Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３とマウス２０Ｃ２との間の下線を付したＣＤＲ領域における配列の差異を、ボールド体とし、＊で示す。ＣＤＲに下線を付す。
【００１３】
図３は、ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）の重鎖可変部（図３Ａおよび３Ｂ）並びに軽鎖可変部（図３Ｃ）（それぞれＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）の核酸配列を示す。位置２４において１つのアミノ酸により異なる、Ｈｕ２０Ｃ２の重鎖の２種のヒト化されたバージョン（ＨＣＶＲＡおよびＨＣＶＲＢ）を、生成させた。Ｈｕ２０Ｃ２  ＨＣＶＲＡにおいて、ヒトアミノ酸を用い、Ｈｕ２０Ｃ２  ＨＣＶＲＢにおいて、マウスアミノ酸を用いた。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【００１４】
図４は、Ｆａｂファージ提示ベクターｐＦａｂ４におけるＨｕ２０Ｃ２ヒト化抗体の注釈付きアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。Ｆａｂファージ提示ベクターｐＦａｂ４中のＨｕ２０Ｃ２ヒト化抗体の重鎖バージョンＡ（図４Ａ）、重鎖バージョンＢ（図４Ｂ）および軽鎖（図４Ｃ）のアミノ酸配列を、イタリック体とし、下線を付した領域は、示したとおりである。ｐＦａｂ４ベクター中のＨｕ２０Ｃ２の軽鎖と融合した重鎖バージョンＡのヌクレオチド配列を、小文字で示すＨｕ２０Ｃ２抗体配列をコードする配列と共に、図４Ｄ〜４Ｅに示す。
【００１５】
図５は、それぞれ親和性成熟Ｈｕ２０Ｃ２軽鎖および重鎖ＣＤＲ３を生成させるための、２種の軽鎖ＣＤＲ３ライブラリー、即ちＬＣ３−１およびＬＣ３−２（図５Ａ）並びに３種の重鎖ＣＤＲ３ライブラリー、即ち２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−１、２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−２および２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−３（図５Ｂ）を作成するに用いられる、設計およびプライマーを示す。クローニングのために用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、イタリックで示す。大文字は、抗体可変部配列をコードする核酸を示す。ＣＤＲをコードする核酸に、下線を付す。ビオチンで標識したプライマーを、示す。
【００１６】
図６は、ヒト抗体定常部のアミノ酸配列とＩｇＧ２ｍ４の配列との比較を示す図である。アスタリスクは、Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化部位を示す。ＦｃＲｎ結合の領域を示す。ＩｇＧ２ｍ４がＩｇＧ２と異なる配列に、下線を付す。
【００１７】
図７は、抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖（図７Ａおよび７Ｂ）並びにヒト化カッパ軽鎖（図７Ｃおよび７Ｄ）に対するアミノ酸（図７Ａおよび７Ｃ）並びにヌクレオチド（図７Ｂおよび７Ｄ）配列を示す。下線は、可変部配列を示す。残りの配列は、定常部配列である。
【００１８】
図８は、ＥＬＩＳＡにより決定した、２種の異なる系、即ちＣＨＯ（図８Ａ）またはPichia（図８Ｂ）により産生された、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３とのＡβ４０単量体またはＡＤＤＬの間の相互作用を示す。
図９は、一次海馬ニューロンに結合するｂＡＤＤＬのＨｕ２０Ｃ２Ａ３阻害を示す。
図１０は、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の蛍光熱溶融分析を示す。
【００１９】
図１１は、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３、即ち無関係の対照またはビヒクルの静脈内注射後のＡＰＰ−ＹＡＣマウスの血漿Ａβｘ−４０レベル（ｐＭ）を示す。Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３を、ＣＨＯ細胞またはPichiaの安定なトランスフェクションにより作成した。Ａβｘ−４０を、４Ｇ８／Ｇ２−１０  ＥＬＩＳＡを用いて決定した。＊＊＊、テューキー・クレーマーＨＳＤ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によりｐ＜０．００１。エラーバー＝ＳＥＭ；Ｎ＝６／群。
【００２０】
発明の詳細な説明
Ａβ由来拡散性リガンド（即ちＡＤＤＬ）の多次元立体構造を差別化的に認識するモノクローナル抗体が、ここで生成された。本発明の抗体は、マウスモノクローナル抗体２０Ｃ２に由来する。マウス２０Ｃ２は、当該分野において、以下の特徴を示すものと知られている。マウス２０Ｃ２は、培養海馬細胞に結合した合成ＡＤＤＬと内因性ＡＤＤＬとの両方に結合するＩｇＧ１抗体である。さらに、この抗体は、培養した細胞に結合する内因性ＡＤＤＬと合成ＡＤＤＬとの両方を遮断し、ビオチン化ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）のニューロンへの結合を弱め、タウリン酸化を防止し得る。２０Ｃ２のコアの直線状エピトープは、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１）であり、これは、Ａβ１−４２のアミノ酸残基３〜８に相当し、Ａβの残基１７〜４２内からの要素に依存する立体構造的エピトープを有するが、これは、構築された場合のみである。
【００２１】
この抗体は、ヒト化されており、またいくつかの態様において、マウス２０Ｃ２の親和性成熟(affinity-matured)誘導体である。マウス２０Ｃ２抗体と同様に、本明細書中に開示した抗体は、ＡＤＤＬの多次元立体構造に対する高度な選択性を示し、単量体Ａβペプチドの最小の検出を伴う。有利には、本抗体は、アルツハイマー病脳切片における内因性オリゴマーを特定し、ｂＡＤＤＬのニューロンへの結合を阻害する。さらに、本抗体は、血漿Ａβｘ−４０レベルの顕著かつ着実な増大、脳Ａβの最終的な低下と関連すると知られている増大をもたらす。したがって、本発明の抗体は、ニューロンへのＡＤＤＬ結合の防止およびＡＤＤＬの構築およびアルツハイマー病を含むＡＤＤＬ関連疾患の処置において、用途が見出される。
【００２２】
したがって、本発明は、ＡＤＤＬの１種または２種以上の多次元立体構造を差別化的に認識する、単離された抗体である。本発明の抗体は、これが、同一のタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な不存在において存在する場合に、単離されたと言われる。従って、「単離された抗体」は、他の抗体が実質的にない抗体を意味する；しかし、分子は、抗体の基本的な特徴（例えば結合特異性、中和活性など）に有害に影響しない数種の追加の剤または部分を含んでもよい。
【００２３】
ＡＤＤＬの１種または２種以上の多次元立体構造に特異的に結合することができる抗体は、Ａβ１−４２のオリゴマー化に由来する特定のＡＤＤＬに結合するが、ウエスタンブロット分析により決定されたように、マウス２０Ｃ２と同様に、他のＡβペプチド、即ちＡβ１−１２、Ａβ１−２８、Ａβ１−４０およびＡβ１２−２８と交差反応せず；優先的に溶液中でＡＤＤＬに結合する。２つの実体間の特異的な結合は、一般的に、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の親和性を表す。１０８Ｍ−１より大きい親和性が、特定の結合を達成するに望ましい。
【００２４】
特定の態様において、１種または２種以上のＡＤＤＬの多次元立体構造に特異的に結合できる抗体をまた、ＡＤＤＬの多次元立体構造に対して産生させる（即ち、動物をこれで免疫する）。他の態様において、１種または２種以上のＡＤＤＬの多次元立体構造に特異的に結合することができる抗体を、低いｎ量体形成ペプチド、例えばＡβ１−４２［Ｎｌｅ３５−Ｄｐｒｏ３７］に対して産生させる。
【００２５】
用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位または抗体が産生される、および／または抗体が結合する分子上の部位を意味する。例えば、エピトープを、該エピトープを定義する抗体により認識することができる。
【００２６】
直線状エピトープは、アミノ酸一次配列が認識されたエピトープを含むエピトープである。直線状エピトープは、典型的には、少なくとも３つ、および最も普通には少なくとも５つ、例えば約６〜約１０個のアミノ酸を、独自配列に含む。
【００２７】
立体構造エピトープは、直線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されたエピトープの単一の規定成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、必ずしもエピトープを定める抗体により認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープに対して増加数のアミノ酸を包含する。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合には、立体構造エピトープを形成するあるアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構造を決定する方法には、例えばＸ線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的なスピン標識および電磁常磁性共鳴分光学を、限定なく含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第６６巻、Morris（編）を参照。
【００２８】
Ａβ由来拡散性リガンド、即ちＡＤＤＬは、望ましくは８つまたは９つより少ないアミロイドβ１−４２ペプチドの凝集体から構成されており、アルツハイマー病と関連すると見出されている、アミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーを意味する。これは、高分子量凝集中間体とは対照的であり、これは原繊維形成をもたらすミセルの針を形成する。
【００２９】
本明細書中に例示するように、本抗体は、ＡＤＤＬの少なくとも１つの多次元立体構造に結合する、またはこれを認識する。特定の態様において、本抗体は、ＡＤＤＬの少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの多次元立体構造に結合する。ＡＤＤＬの多次元立体構造は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により定義したように、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体などを包含することを意図する。三量体、四量体などの指定が、用いるアッセイ方法に伴って変化し得るため（例えばBitanら(2005)、Amyloid 12:88-95を参照）、本明細書中で用いる三量体、四量体などの定義は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による。
【００３０】
このように、本発明の抗体は、オリゴマー特異性特性を有する。特定の態様において、ＡＤＤＬの多次元立体構造は、本発明の抗体により認識される立体構造エピトープを生じる特定のポリペプチド構造と関連する。他の態様において、本発明の抗体は、＞５０ｋＤａを超える分子量を有する、およそ三量体または四量体の大きさの範囲を有する多次元立体構造ＡＤＤＬに特異的に結合する。
【００３１】
ある態様において、多次元立体構造への結合に加えて、この抗体は、アミロイドβ１−４２の選択された直線状エピトープに結合する。ＡＤＤＬの直線状エピトープは、アミロイドβ１−４２のＮ末端１０、１１、１２、１５または２０のアミノ酸残基に位置する４つ、５つ、６つまたは７つ以上のアミノ酸残基ペプチドとして意図される。特定の態様において、本発明の抗体は、アミロイドβ１−４２の残基１〜１０、１〜８、３〜１０または３〜８内の直線状エピトープに特異的に結合する。本発明のヒト化された抗体が結合するアミロイドβ１−４２の例示的な直線状エピトープは、アミノ酸残基Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１）である。
【００３２】
本発明の抗体が、同様の直線状エピトープを有し得る一方、このような直線状エピトープは、この抗体の結合特性（即ち、ニューロンに結合するＡＤＤＬを遮断し、タウリン酸化を防止し、ＡＤＤＬ構築を阻害する能力）を完全には示さない。その理由は、当業者に十分知られているように、直線状エピトープが、抗原のエピトープの一部に相当し得るに過ぎないからである（例えば、BreitlingおよびDuebel (1999)、Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pg. 115中を参照）。例えば、マウス２０Ｃ２は、２０Ｃ２についての直線状エピトープ（即ちアミノ酸残基３〜８）を欠いており、Ａβの残基７〜１６に相当する全く異なった配列を含む、電荷が反転し、切断されたＡβ７−４２ペプチドの構築物に結合することが、知られている。
【００３３】
したがって、２０Ｃ２、ならびにそのヒト化された誘導体と同様に、Ａβの残基１７〜４２内からの要素に依存する立体構造エピトープに結合するが、これは多次元立体構造における場合のみである。本発明の抗体を、当該分野のものと、多次元ＡＤＤＬを区別して認識し、したがってニューロンに結合するＡＤＤＬを差別的に遮断し、タウリン酸化を差別的に防止し、ＡＤＤＬ構築を区別して阻害することができるものとして区別することができる。
【００３４】
本発明において用いられる抗体には、モノクローナル抗体、およびキメラ、ヒト（例えばＢ細胞から単離された）、ヒト化、中和、二重特異性またはこの一本鎖抗体を、限定なく含む。１つの態様において、本発明の抗体は、モノクローナルである。抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ラット、マウス、ヒトおよび他のものを含む種々の宿主を、合成または天然ＡＤＤＬでの注射により免疫することができる。抗体を産生するための方法は、当該分野において十分知られている。例えば、KohlerおよびMilstein ((1975) Nature 256:495-497)並びにHarlowおよびLane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988))を参照。
【００３５】
宿主種に依存して、種々のアジュバントを用いて、免疫学的応答を増大させることができる。本発明において用いられるアジュバントは、望ましくは、応答の定性的形態に影響する免疫原の立体構造的変化を生じずに、ＡＤＤＬに対する固有の応答を増大する。特に好適なアジュバントには、随意に免疫刺激物質、例えばモノホスホリルリピドＡ（Stouteら(1997)、N. Engl. J. Med. 336:86-91を参照）、ムラミルペプチド（例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（Ｅ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ））と随意に組み合わせての、３脱Ｏアシル化モノホスホリルリピドＡ（MPL（登録商標）; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT;GB 2220211を参照）および水中油エマルジョン、例えばスクアレンもしくはピーナッツ油、または他の細菌細胞壁成分が含まれる。
【００３６】
水中油エマルジョンの特定の例には、５％スクアレン、０．５％TWEEN（登録商標）８０および０．５％ＳＰＡＮ  ８５を含み（随意に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、微小流動化装置(microfluidizer)、例えばモデル１１０Ｙ微小流動化装置(Microfluidics, Newton, MA)を用いてサブミクロン粒子に処方されたＭＦ５９(WO 90/14837)；１０％スクアレン、０．４％TWEEN（登録商標）８０、５％PLURONIC（登録商標）遮断ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョン中に微小流動化されたか、またはボルテックスされて、一層大きい粒子の大きさのエマルジョンを発生するＳＡＦ；並びに２％スクアレン、０．２％TWEEN（登録商標）８０および１種または２種以上の細菌細胞壁成分、例えばモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート（trehalose dimycolate）（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含むRIBI（登録商標）アジュバント系（ＲＡＳ）(Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT)が含まれる。
【００３７】
他の群のアジュバントは、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびISCOMATRIX（登録商標）(CSL Ltd., Parkville, Australia)を含むサポニンアジュバントである。他の好適なアジュバントには、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および界面活性物質、例えばリソレシチン、PLURONIC（登録商標）ポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、ＣｐＧ(WO 98/40100)、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびサイトカイン類、例えばインターロイキン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。ヒトにおいて用いられるアジュバントの中で、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびCorynebacterium parvumが、特に好適である。
【００３８】
多次元立体構造ＡＤＤＬに対する抗体は、動物をＡＤＤＬで免疫することにより生成する。一般的に、ＡＤＤＬを、合成的に、または組換え断片発現および精製により生成させることができる。合成ＡＤＤＬを、本明細書中に開示したように、または米国特許第6,218,506号に、もしくは同時係属出願のUS通番第 60/621,776号、60/652,538号、60/695,528号および60/695,526号に開示されている方法に従って、調製することができる。さらに、ＡＤＤＬを、他のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと融合させて、キメラ分子に対する抗体を発生させることができる。ＡＤＤＬを、立体構造的に拘束して、本明細書中に記載したように有用なエピトープを形成することができ、さらに表面と会合させ、例えば表面に物理的に付着させるか、または化学的に結合させて、本発明の抗体により認識される立体構造の形成を可能にするようにすることができる。
【００３９】
ＡＤＤＬの多次元立体構造に対するモノクローナル抗体を、培養物中の連続的な細胞系により抗体分子の生成をもたらすすべての手法を用いて、調製することができる。これらには、ハイブリドーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法およびＥＢＶ−ハイブリドーマ手法(Kohlerら(1975)、Nature 256:495-497；Kozborら(1985)、J. Immunol. Methods 81:31-42；Coteら(1983)、Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Coleら(1984)、Mol. Cell Biol. 62:109-120)を、限定なく含む。
【００４０】
特定の態様において、本抗体は、ヒト化されている。ヒト化またはキメラ抗体を、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に対してスプライスして、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得ることにより、産生することができる（Morrisonら(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855；Neubergerら(1984)、Nature 312:604-608；Takedaら(1985)、Nature 314:452-454；Queenら(1989)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033；WO 90/07861を参照）。例えば、マウス抗体は、ファージ選択ベクター中でＦｖまたはＦａｂ断片として発現される。軽鎖に対する遺伝子（および平行した実験において、重鎖に対する遺伝子）を、ヒト抗体遺伝子のライブラリーに対して交換する。次に、尚抗原に結合するファージ抗体を、同定する。一般的に鎖混合として知られているこの方法により、これが由来するマウス抗体と同一のエピトープに結合するべきである、ヒト化された抗体が得られた(Jespersら(1994)、Biotechnology NY 12:899-903)。代替として、鎖混合を、タンパク質レベルで行うことができる（Figiniら(1994)、J. Mol. Biol. 239:68-78を参照）。
【００４１】
ヒト抗体をまた、ファージディスプレイ方法を用いて得ることができる。例えば、WO 91/17271およびWO 92/01047を参照。これらの方法において、要素がこれらの外面上で異なる抗体を表示するファージのライブラリーを、作成する。抗体は、通常ＦｖまたはＦａｂ断片として表示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージを、ＡＤＤＬに対するアフィニティー濃縮により、選択する。ＡＤＤＬに対するヒト抗体をまた、少なくともヒト免疫グロブリン座および不活性化された内因性免疫グロブリン座のセグメントをコードするトランスジーンを有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から産生することができる。例えば、WO 93/12227およびWO 91/10741を参照。ヒト抗体を、競合的結合実験または他の方法により、特定のマウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように、選択することができる。このような抗体は、一般的にマウス抗体の有用な機能的特性を維持する。ヒトポリクローナル抗体をまた、免疫原性剤で免疫したヒトからの血清の形態で、提供することができる。随意に、このようなポリクローナル抗体を、アフィニティー試薬としてＡＤＤＬを用いて、アフィニティー精製により濃縮することができる。
【００４２】
本明細書中で例示するように、ヒト化抗体をまた、マウス抗体をベニアリング(veneering)するかまたは新たな表面を形成することにより、産生することができる。ベニアリングは、マウス重および軽可変部における表面固定された領域のアミノ酸のみを、相同的なヒト抗体配列のもので置換することを含む。マウス表面アミノ酸を相同的なヒト配列からの同一の位置におけるヒト残基で置換することは、マウス抗体の免疫原性を低減する一方、このリガンド結合を保存すると示された。外部残基の置換は、一般的に、内部ドメインに対して、またはドメイン間接触に対して、影響をほとんどまたは全く有しない。（例えば米国特許第6,797,492号を参照）。
【００４３】
ヒトまたはヒト化された抗体を、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ定常部並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを有するように、設計することができる。特定の態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧもしくはＩｇＭまたはこれらの組み合わせである。本発明の他の態様は、ヒトＩｇＧ４配列を標準的なヒトＩｇＧ２定常部中に選択的に導入することにより形成した定常部を包含する。例示的な変異体ＩｇＧ２Ｆｃは、本明細書中に配列番号１４０として定めるＩｇＧ２ｍ４である。抗体を、別の重鎖および軽鎖として、または重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して結合している一本鎖抗体として、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、表すことができる。一本鎖抗体を産生するための手法は、当該分野において十分知られている。
【００４４】
ＣＤＲ移植およびベニアリングによるマウス２０Ｃ２モノクローナル抗体の例示的なヒト化抗体誘導体を、本明細書中に示す。ＩｇＧ２Ｍ４重鎖可変部および、ベニアリングにより産生されたヒト化２０Ｃ２（即ちＨｕ２０Ｃ２Ａ３）に対するカッパ軽鎖可変部に対するアミノ酸配列を、図７Ａおよび７Ｃに示し、本明細書中に配列番号１４１および配列番号１４３で定める。
【００４５】
二重特異性抗体もまた、検討する。二重特異性抗体は、結合する抗体の結合ドメイン（重鎖と軽鎖との両方）を単離し、同一のポリペプチド鎖上の重鎖および軽鎖に接合するかまたは作動可能に結合する結合部分を供給し、これにより結合機能を保存することにより調製された、操作された抗体構築物を意味する（Holligerら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444；Poljak (1994)、Structure 2:1121-1123を参照）。これは、本質的に、抗原に結合するのに必要な可変ドメインのみを有する根本的に短縮された抗体を形成する。同一の鎖上で２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインを、他の鎖の相補的なドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を作成させる。これらの二量体抗体断片または二重特異性抗体は、２価であり、二重特異性である。当業者は、二重特異性抗体を作成する任意の方法を用いることができることを認識する。好適な方法は、Holligerら(1993)、上記、Poljak (1994)、上記、Zhuら(1996)、Biotechnology 14:192-196および米国特許第6,492,123号により記載されており、これらを参照により本明細書中に導入する。
【００４６】
本発明の単離された抗体の断片はまた、本発明により明確に包含される。断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、並びにペプチドアプタマーを含むことを意図する。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、本発明の抗体分子のペプシン消化により産生され、一方Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより産生される。あるいはまた、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性を伴ってモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするように構成することができる（Huseら(1989)、Science 254:1275-1281を参照）。特定の態様において、本発明の抗体断片は、この可変部結合部位を保持する中和抗体の断片である。例示的なものは、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片およびＦａｂ断片である。一般的に、Immunology: Basic Processes (1985)、第２版、J. Bellanti（編）、９５〜９７頁を参照。
【００４７】
ＡＤＤＬの多次元立体構造を区別して認識するペプチドアプタマーを、アプタマーのライブラリー（例えばAptanomics SA, Lyon, Franceにより提供される）について合理的に設計するかまたはスクリーニングすることができる。一般的に、ペプチドアプタマーは、設計が抗体の構造に基づいている合成認識分子である。ペプチドアプタマーは、両方の末端においてタンパク質骨格に結合した可変ペプチドループからなる。この二重の構造的束縛により、ペプチドアプタマーの結合親和性が抗体の結合親和性（ナノモル範囲）に匹敵するレベルに大幅に増大する。
【００４８】
本発明の抗体および抗体断片を産生するにあたり用いるための重鎖および軽鎖可変部をコードする例示的な核酸配列を、それぞれ本明細書中で、図７Ｂおよび７Ｄ（即ち配列番号１４２および１４４）に開示する。当業者に理解されるように、本明細書中に開示した重鎖可変部を、本明細書中に開示した軽鎖可変部のいずれか１つと組み合わせて用いて、改良された親和性、解離定数、エピトープなどを有する抗体を産生することができる。
【００４９】
本発明の抗体または抗体断片は、これに結合した追加の部分を有することができる。例えば、米国特許第4,493,825号に記載されているように、細粒または微小粒子を、抗体または抗体断片に結合させることができ、この開示を、参照により本明細書中に導入する。
【００５０】
さらに、特定の態様は、突然変異しており、増大した抗原親和性、中和活性（即ち、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を遮断する能力もしくはＡＤＤＬ構築を遮断する能力）、または改良された解離定数について選択された抗体または抗体断片を包含する。大腸菌のミューテーター菌株(Lowら(1996)、J. Mol. Biol. 260:359-368)、チェーンシャッフリング(Figiniら(1994)、上記)およびＰＣＲ変異原性は、抗体をコードする核酸分子を突然変異させるための確立された方法である。例示により、増大した親和性を、多数のファージ抗体を少量のビオチン化抗原と接触させ、抗体が結合について競合するようにすることにより、選択することができる。
【００５１】
この場合、抗原分子の数は、ファージ抗体の数を超えているはずであるが、抗原の濃度は、解離定数よりもいくらか低いはずである。したがって、増大した親和性を有する優勢的に変異したファージ抗体は、ビオチン化抗原に結合し、一方比較的弱い親和性のファージ抗体の比較的大きい部分は、未結合のままである。次に、ストレプトアビジンは、一層高い親和性の突然変異したファージ抗体の混合物からの濃縮を補助し得る(Schierら(1996)、J. Mol. Biol. 255:28-43)。例示的な親和性成熟軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を、本明細書中に開示し（表６および７を参照）、特定の態様は、Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号２）の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を包含し、ここでＸａａ１は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘａａ２は、ＡｌａまたはＴｈｒである。
【００５２】
親和性の成熟した重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列もまた、明細書中で提供する。例示的な重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を、本明細書中で、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号３）で定める。本発明はまた、このＣＤＲ３の誘導体、例えばＡｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号４）、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号５）、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号６）、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号７）、またはＡｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号８）を包含し、ここでＨｕ２０Ｃ２Ａ３重鎖ＣＤＲ３についての差異に、下線を付す。この点に関して、本発明は特に、Ａｒｇ−Ｘａａ１−Ｌｅｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号９）のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＡＤＤＬ抗体を包含し、ここでＸａａ１はＧｌｎまたはＡｌａであり；Ｘａａ２はＳｅｒまたはＧｌｙであり；Ｘａａ３はＰｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＴｈｒであり；Ｘａａ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘａａ５はＧｌｙ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり；Ｘａａ６はＶａｌ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＡｒｇである。
【００５３】
本発明の範囲内に包含される他の抗体誘導体には、軽鎖のフレーム領域（例えばＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、配列番号１０）における１つのアミノ酸残基の差異以外はＨｕ２０Ｃ２Ａ３の可変部と同一の任意のヒト化抗体が含まれる。
【００５４】
いくつかの治療的用途のために、抗体の抗原からの解離を低減することが、望ましい場合がある。これを達成するために、ファージ抗体を、ビオチン化抗原に結合させ、過剰のビオチン化されていない抗原を加える。ある期間の後に、主に一層低い解離定数を有するファージ抗体を、ストレプトアビジンと共に収穫することができる(Hawkinsら(1992)、J. Mol. Biol. 226:889-96)。
【００５５】
本明細書中に開示されたものを含む種々のイムノアッセイを、ＡＤＤＬの多次元立体構造に対する所望の特異性を有する抗体またはこの断片を同定するためのスクリーニングのために、用いることができる。競合的結合（例えばＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集アッセイ、免疫放射線測定法、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこの断片のいずれかを用いる動態学（例えばBIACORE（登録商標）分析）についての多数のプロトコルは、当該分野において十分知られている。このようなイムノアッセイは、典型的に、特定の抗体とこの同族の抗原との間の複合体形成の測定を含む。２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を用いる、２つの部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが好適であるが、競合的結合アッセイもまた、用いることができる。このようなアッセイをまた、試料中のＡＤＤＬの多次元立体構造の検出において用いることができる。
【００５６】
抗体または抗体断片にまた、他の生物学的活性アッセイ、例えばニューロンもしくは培養した海馬細胞に結合するＡＤＤＬの置換またはＡＤＤＬ構築の遮断を施して、中和または薬理学的活性および予防または治療剤としての可能性のある効能を評価することができる。このようなアッセイは、本明細書中に記載されており、当該分野において十分知られている。
【００５７】
抗体および抗体の断片を、ハイブリドーマとして産生および維持するか、あるいはまた、大腸菌、酵母（例えばSaccharomyces種およびPichia種）、バキュロウイルス、哺乳類細胞（例えば骨髄腫、ＣＨＯ、ＣＯＳ）、植物またはトランスジェニック動物を限定なく含む、任意の十分確立された発現系において組換え的に産生することができる（BreitlingおよびDuebel (1999)、Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY,１１９〜１３２頁中）。抗体および抗体の断片について、アフィニティークロマトグラフィー、免疫グロブリン結合分子（例えばプロテインＡ、Ｌ、ＧまたはＨ）、抗体または抗体断片に作動可能に結合したタグ（例えばＨｉｓタグ、FLAG（登録商標）タグ、Strepタグ、ｃ−ｍｙｃタグ）などを限定なく含む、任意の適切な方法を用いて、単離することができる。BreitlingおよびDuebel (1999)、上記を参照。
【００５８】
本発明の抗体および抗体断片は、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患の診断、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合の遮断または阻害、ＡＤＤＬ構築の遮断、ＡＤＤＬと関連する疾患を予防的に、または治療的に処置すること、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を防止する治療剤の同定、およびＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化の防止を含む、種々の使用を有する。
【００５９】
本発明の抗体および抗体断片はまた、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を遮断または阻害するための方法において、有用である。本発明のこの方法を、ニューロンを本発明の抗体または抗体断片とインビトロまたはインビボで接触させて、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断するようにすることにより、行う。特定の態様において、本発明の抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片の不存在におけるＡＤＤＬの結合と比較して、ＡＤＤＬの結合の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９７％の減少を達成する。抗体がＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断することができる程度を、本明細書中に開示した方法、即ち免疫細胞化学または細胞に基づくアルカリホスファターゼアッセイまたは任意の他の好適なアッセイに従って、決定することができる。ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を減少させるのに特に有用な抗体には、配列番号９で定めるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＡＤＤＬ抗体、並びにその誘導体および断片が含まれる。
【００６０】
本発明の抗体および抗体断片は、さらに、ＡＤＤＬの構築を遮断または阻害するための方法において有用である。この方法は、アミロイドβ１−４２ペプチドを含有する試料を本発明の抗体または抗体断片と接触させて、ＡＤＤＬの構築を阻害することを含む。抗体がＡＤＤＬの構築を遮断することができる程度を、本明細書中に開示した方法、即ちＦＲＥＴまたは蛍光偏光または任意の他の好適なアッセイに従って、決定することができる。ＡＤＤＬの構築を遮断するのに特に有用な抗体には、配列番号９で定めるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＡＤＤＬ抗体、並びにその誘導体および断片が含まれる。
【００６１】
本明細書中に開示した抗体はまた、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止するための方法において有用である。この方法は、タウタンパク質を含有する試料を本発明の抗体または抗体断片と接触させて、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断し、これによりタウタンパク質のリン酸化を防止することを含む。抗体がＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止することができる程度を、本明細書中に開示した方法またはすべての他の好適なアッセイに従って、決定することができる。
【００６２】
ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断するかまたは低減すること、ＡＤＤＬの構築を阻害することおよびＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止することはすべて、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を予防的に、または治療的に処置する方法において、用途が見出されている。したがって、本発明はまた、本発明の抗体または抗体断片を用いて、ＡＤＤＬの蓄積に関連する疾患（例えばアルツハイマー病または同様の記憶関連障害）を防止または処置することを包含する。
【００６３】
当該分野における証拠により、Ａβの、しかし必ずしも凝集したプラークではない上昇したレベルが、アルツハイマー病関連認知症およびその後のタウ異常の原因となることが示される。Ａβ誘導拡散性リガンドは、アルツハイマー病に関連する神経毒性に直接関係する。当該分野により、ＡＤＤＬは、トランスジェニックマウスおよびアルツハイマー病患者において上昇しており、動物モデルにおける記憶増進プロセスと関連する機能的活性を調節することが、示される。したがって、この形態のＡβを除去することにより、アルツハイマー病と関連する神経毒性からの緩和が得られ得る。このように、中枢神経系ＡＤＤＬ負荷を低減するこの抗体での処置は、アルツハイマー病の処置に有効であると、明らかになり得る。
【００６４】
処置の影響を受けやすい患者には、疾患のリスクにあるが症状を示さない個体、および現在症状を示している患者が含まれる。アルツハイマー病の場合において、十分長く生存している場合には、事実上誰もが、アルツハイマー病を罹患するリスクにある。したがって、本発明の抗体または抗体断片を、対象患者のリスクの評価を何ら必要とせずに、一般的集団に予防的に投与することができる。本方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的なリスクを有する個体に特に有用である。このような個体には、疾患を有すると診断された親類を有する個体、およびリスクが遺伝的または生化学的マーカーの分析により決定される個体が含まれる。アルツハイマー病に関するリスクの遺伝的マーカーには、ＡＰＰ遺伝子における突然変異、特にそれぞれHardy突然変異およびSwedish突然変異と呼ばれる、７１７位並びに６７０位および６７１位における突然変異が含まれる。
【００６５】
リスクの他のマーカーは、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における突然変異、アルツハイマー病の家族歴、高コレステロール血症またはアテローム硬化症である。現在アルツハイマー病を罹患している個体を、特徴的な認知症および上記の危険因子の存在から認識することができる。さらに、多くの診断試験が、アルツハイマー病を有する個体を同定するために利用可能である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ１−４２レベルの測定が含まれる。アルツハイマー病を罹患している個体をまた、ＡＤＲＤＡ基準または本明細書中に開示した方法により、診断することができる。
【００６６】
無症候性の患者において、処置を、すべての年齢（例えば１０歳、２０歳、３０歳の年齢）において開始することができる。しかし、通常、患者が４０歳、５０歳、６０歳または７０歳の年齢に達するまで処置を開始する必要はない。処置は、典型的に、ある期間にわたる複数の調剤を必要とする。処置を、ＡＤＤＬの存在について長期間にわたりアッセイすることにより、モニタリングすることができる。
【００６７】
治療的用途において、本発明の抗体または抗体断片を含有する医薬組成物または医薬を、ＡＤＤＬの蓄積に関連するこのような疾患が疑われる、またはすでに当該疾患に罹患している患者に、この合併症および当該疾患の進展における中間的な病理学的表現型を含む、当該疾患の症状（生化学的、組織学的および／または挙動性）を治癒させるかまたは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、投与する。予防的用途において、本発明の抗体または抗体断片を含む医薬組成物または医薬を、ＡＤＤＬの蓄積に関連する疾患が疑われるか、またはそうでなければこのリスクにある患者に、当該患者における受動的な免疫性を達成するのに十分な量で投与し、これにより当該リスクを解消するかもしくは減少させ、重篤度を低下させ、または当該疾患の生化学的、組織学的および／または挙動性症状、この合併症および当該疾患の進展の間提示される中間的な病理学的表現型を含む疾患の発生を遅延させる。
【００６８】
いくつかの方法において、薬剤の投与により、特徴的なアルツハイマー病の病理を未だ発現していない患者における筋認知性機能障害が低下するかまたは解消する。特定の態様において、本発明の抗体または抗体断片の有効量は、処置の不存在におけるＡＤＤＬの結合と比較して、ＡＤＤＬの患者におけるニューロンへの結合の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９７％の減少を達成する量である。このように、長期間の増強／記憶形成の機能障害が、低減される。
【００６９】
上記の状態の処置のための本発明による組成物の有効な用量は、投与手段、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳類、例えばイヌまたはトランスジェニック哺乳類もまた、処置することができる。
【００７０】
処置投与量は、一般的に、安全性および効能を最適化するように用量設定される。抗体または抗体断片での受動的免疫化のために、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、および一層通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲が、好適である。例えば、投与量を、１ｍｇ／体重１ｋｇもしくは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。いくつかの方法において、異なる結合特性を有する本発明の２種または３種以上の抗体を、同時に投与し、この場合において、投与される各々の抗体の投与量は、示した範囲内にある。抗体を、通常複数の機会において投与し、ここで単一の投与間の間隔は、毎週、毎月または毎年とすることができる。
【００７１】
例示的な処置の型は、隔週または毎月１回の皮下投薬を必要とする。有利には、皮下投与は、静脈内注入と関連するインフルエンザ様症状を低減すると、見出されている(Lundinら(2002)、Blood 100:768-773)。間隔をまた、患者中のＡＤＤＬに対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように、不規則とすることができる。いくつかの方法において、投与量を、１〜１０００μｇ／ｍＬおよびいくつかの方法においては２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するように、調整する。
【００７２】
あるいはまた、抗体または抗体断片を、持続放出処方物として投与することができ、この場合において、比較的低頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者中の抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒトおよびヒト化された抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を有する。上で示したように、投与量および投与頻度を、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して、変化させることができる。予防的適用において、比較的低い投与量を、比較的低い頻度の間隔で、長期間にわたり投与する。数人の患者は、当該患者の生命の残りの間、処置を受け続ける。治療的適用において、比較的短い間隔における比較的高い投与量が、時々疾患の進行が低減されるかまたは終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的な、または完全な回復を示すまで、必要である。その後、患者に、予的型を投与することができる。
【００７３】
本発明の抗体および抗体断片を、医薬組成物または医薬の成分として投与することができる。医薬組成物または医薬は、一般的に、活性治療剤および種々の他の薬学的に許容し得る成分を含む。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro編、第２０版、Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000を参照。好ましい形態は、投与の意図された方式および治療的適用に依存する。医薬組成物は、所望の処方に依存して、一般的に動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を処方するために用いられるビヒクルとして定義される、薬学的に許容し得る無毒性担体または希釈剤を含むことができる。希釈剤を、組み合わせの生物学的活性に影響しないように、選択する。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。
【００７４】
医薬組成物はまた、大きいゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸類、ポリグリコール酸類およびコポリマー類（例えばラテックス官能化SEPHAROSE（登録商標）、アガロース、セルロースなど）、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば油小滴またはリポソーム）を含むことができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物または医薬の投与を、種々の経路により行うことができ、これには、経口、局所的、肺、直腸、皮下、皮内、鼻腔内、頭蓋内、筋肉内、眼内または関節内注射などが限定なく含まれる。投与の最も典型的な経路は、静脈内、続いて皮下であるが、他の経路が、同等に有効であり得る。筋肉内注射をまた、腕または脚筋肉において行うことができる。いくつかの方法において、薬剤を、沈着物が蓄積している特定の組織中に直接注射し、これは例えば頭蓋内注射である。いくつかの態様において、抗体または抗体断片を、頭蓋中に直接注射する。他の態様において、抗体または抗体断片を、持続放出組成物またはデバイス、例えばMEDIPAD（登録商標）デバイスとして投与する。
【００７６】
非経口投与について、本発明の抗体または抗体断片を、無菌の液体、例えば水、油、生理食塩水、グリセロールまたはエタノールなどであってもよい薬学的担体との生理学的に許容し得る希釈剤中の当該物質の溶液または懸濁液の注射可能な調剤として、投与することができる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などを、組成物中に存在させることができる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油および鉱油である。一般的に、グリコール類、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが、特に注射可能な溶液に適する液体担体である。抗体を、活性成分の持続された放出を可能にするように処方することができるデポー注射または移植製剤の形態で、投与することができる。
【００７７】
例示的な組成物は、無菌の透明な液体として処方された本抗体または抗体断片を、等張緩衝生理食塩水（１０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）のPOLYSORBATE 80、ｐＨ６．０）中の少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度において含む。例示的な抗体処方物を、単一の用量として充填し、０．６ｍｌのガラスバイアルを、バイアルあたり３．３ｍｌの溶液で充填する。各々のバイアルに、テフロン（登録商標）で被覆した栓で栓をし、アルミニウムキャップで密封する。
【００７８】
典型的には、組成物を、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製する；液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適する固体形態をまた、注射前に調製することができる。製剤をまた、増強された送達のために、乳化させるか、またはリポソームもしくは微小粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリドもしくはコポリマー中にカプセル封入することができる。
【００７９】
坐剤について、結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコール類またはトリグリセリド類が含まれる；このような坐剤を、活性成分を０．５％〜１０％、または一層望ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から、形成することができる。
【００８０】
経口処方物は、賦形剤、例えば医薬階級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出処方物または散剤の形態を採り、１０％〜９５％、または一層好適には２５％〜７０％の活性成分を含む。
【００８１】
局所的な適用により、経皮的または皮内送達をもたらすことができる。局所的な投与を、当該剤をコレラ毒素または解毒した誘導体もしくはこのサブユニット、または他の類似の細菌性毒素と同時投与することにより、促進することができる（Glennら(1998)、Nature 391:851を参照）。同時投与を、当該成分を混合物として、または融合タンパク質として化学的架橋もしくは発現により得られた結合分子として用いることにより、達成することができる。
【００８２】
あるいはまた、経皮的送達を、皮膚経路を用いて、またはトランスフェロソーム(transferosome)を用いて、達成することができる(Paulら(1995)、Eur. J. Immunol. 25:3521-24；Cevcら(1998)、Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15)。
【００８３】
本発明の抗体または抗体断片を、随意に、アミロイド原性疾患の処置において少なくとも部分的に有効である他の剤と組み合わせて、投与することができる。例えば、この抗体を、アルツハイマー病のための既存の対症療法、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばARICEPT（登録商標）、EXELON（登録商標）およびREMINYL（登録商標）並びにＮＭＤＡアンタゴニスト、NAMENDA（登録商標）と共に、投与することができる。これらの承認された処置に加えて、この抗体を用いて、現在アルツハイマー病の処置のための開発中にあるいくつかの方法のいずれかに相乗的／付加的利益をもたらすことができ、これには、Ａβ産生および凝集の阻害剤が限定なく含まれる。
【００８４】
本発明の抗体および抗体断片はまた、ＡＤＤＬのニューロン（例えば海馬細胞）への結合を防止し、これによりＡＤＤＬに帰する下流の事象を防止する治療剤の同定において、用途が見出されている。このようなアッセイを、当該剤の存在下でニューロンをＡＤＤＬと接触させ、本発明の抗体または抗体断片を用いて、当該剤の存在下でのニューロンへのＡＤＤＬの結合を決定することにより、行う。当業者により理解されるように、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断する剤は、ニューロンに結合するＡＤＤＬの量；本発明の抗体または抗体断片を用いるイムノアッセイにおいて検出可能な量を、当該剤と接触していないニューロンと比較して減少させる。ニューロン結合ＡＤＤＬを検出するのに適するイムノアッセイを、本明細書中に開示する。
【００８５】
本明細書中に示した方法を用いてスクリーニングすることができる薬剤には、種々の化学的階級が包含されるが、典型的には、これらは有機分子、好ましくは１００ダルトンより大きく、約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小さい有機化合物である。薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは官能化学基の少なくとも２つを含む。当該薬剤はしばしば、上記の官能基の１個または２個以上で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含有する。薬剤をまた、ペプチド類、抗体、サッカリド類、脂肪酸類、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造的相同体またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中に見出すことができる。薬剤を、天然または合成化合物のライブラリーを含む広範囲の供給源から得る。
【００８６】
種々の他の試薬、例えば塩および中性タンパク質を、スクリーニングアッセイ中に包含させることができる。また、他の方法でアッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などを、用いることができる。成分の混合物を、所要の結合をもたらす任意の順序で、加えることができる。
【００８７】
本発明のスクリーニングアッセイにより同定される剤は、アミロイド形成的疾患および／またはタウオパチーの処置のために有益である。さらに、これらの概念を例示するために用いられる実験系は、タウリン酸化のアミロイドベータ誘発に関連する新規な薬剤標的を評価、同定およびスクリーニングするための研究手段を表すことを、意図する。
【００８８】
本発明はまた、本発明の抗体または抗体断片を用いて、ＡＤＤＬを検出し、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を診断するための方法を提供する。ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患は、ＡＤＤＬの蓄積の結果、長期間の増強／記憶形成の生理学的機能障害がもたらされる任意の疾患を含むことを意図する。このタイプの疾患には、アルツハイマー病および同様の記憶関連障害を限定なく含む。
【００８９】
これらの方法に従って、患者からの試料を、本発明の抗体または抗体断片と接触させ、抗体または抗体断片の試料への結合は、試料中のＡＤＤＬの存在を示す。本発明の文脈において用いる試料は、イムノアッセイを用いた分析の影響を受けやすいすべての体液または組織を意味することを意図する。本発明の方法により分析することができる好適な試料には、患者（例えば哺乳類、例えばヒト）からの脳の生検試料および液体試料を限定なく含む。インビトロ目的（例えばオリゴマー生成をモニタリングするアッセイ）のために、試料を、ニューロン細胞系または組織試料とすることができる。診断的目的のために、試料を、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を有することが疑われる個体から、またはＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を有するリスクにある個体、例えば個体をＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患に罹患させる家族歴を有する個体からとすることができることを、意図する。
【００９０】
試料における抗体または抗体断片のＡＤＤＬへの結合の検出を、任意の標準的なイムノアッセイ（例えば本明細書中に開示した）を用いて行うことができ、あるいはまた、抗体断片が例えばペプチドアプタマーである場合には、結合を、例えばアプタマーに融合した検出可能なマーカータンパク質（例えばβ−カラクトシダーゼ、ＧＦＰもしくはルシフェラーゼ）により、直接検出することができる。その後、ＡＤＤＬ−抗体複合体の存在または不存在を、それぞれ試料中のＡＤＤＬの存在または不存在およびしたがってそれぞれＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患の存在または不存在と相関させる。本発明の１種または２種以上の抗体または抗体断片を、現行の非侵襲性の免疫に基づくイメージング手法と組み合わせて用いて、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患の検出および早期の診断を大幅に増強することができることを、意図する。
【００９１】
診断を容易にするために、本発明はまた、本発明の抗体または抗体断片を含むためのキットに関する。当該キットは、ＡＤＤＬの多次元立体構造を認識する１種または２種以上の抗体または抗体断片を保持する容器並びに、ＡＤＤＬに結合して抗体−抗原複合体を生成する目的のために抗体を用い、抗体−抗原複合体の形成を検出し、抗体−抗原複合体の存在または不存在を試料中のＡＤＤＬの存在または不存在と相関させるようにするための説明書を含む。容器の例には、複数の試料中のＡＤＤＬの同時の検出を可能にするマルチウェルプレートが含まれる。
【００９２】
本発明を、以下の非限定的例により、一層詳細に記載する。
【００９３】
例１：一般的な材料および方法
ＡＤＤＬ調製。Ｆ１２培地(Biosource, Camarillo, CA)中のＡＤＤＬを、確立された方法（Lambertら(2001)、上記）により、Ａβ１−４２から調製した。要するに、Ａβ１−４２ペプチド(American Peptide Co., Sunnyvale, CAまたはCalifornia Peptide Research, Inc., Napa, CA)を、秤量し、ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）の十分な量を保持することができるガラスバイアル中に配置して、１０ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度を達成した。ＨＦＩＰを、乾燥ペプチドに加え、バイアルを覆い、温和に回転させて混合し、ペプチド／ＨＦＩＰ溶液を、室温で少なくとも１時間貯蔵した。ペプチド溶液のアリコート（それぞれ５０または１００μＬ、０．５または１．０ｍｇ）を、一連の１．５ｍＬの円錐形遠心管中に分配した。この管を、SPEEDVAC（登録商標）中に一晩配置して、ＨＦＩＰを除去した。乾燥ペプチドフィルムを含有する管を覆い、乾燥剤を有する密閉した容器中で−７０℃で貯蔵した。
【００９４】
使用前に、Ａβ１−４２ペプチドフィルムを、−７０℃貯蔵庫から取り出し、室温まで放置して加温した。新鮮なＤＭＳＯ（４４μＬ／ｍｇのペプチドフィルム；５ｍＭ）を加え、ペプチド／ＤＭＳＯ混合物を、ボルテックスミキサー上で可能な最低の速度で１０分間インキュベートした。Ｆ１２培地（２ｍＬ／ｍｇペプチド）を、ＤＭＳＯ／ペプチドの各々の管中に分配し、この管を覆い、反転により混合した。１００μＭの調製物を、２〜８℃で１８〜２４時間貯蔵した。試料を、１４，０００×ｇにおいて１０分間２〜８℃で遠心分離した。上清を、新鮮な管に移送し、用いるまで２〜８℃で貯蔵した。
【００９５】
ビオチン化したＡＤＤＬ調製物（ｂＡＤＤＬ）を、ＡＤＤＬ調製に関して前に記載したのと同一の方法で、１００％Ｎ末端ビオチン化アミロイドベータペプチド(American Peptide Company, Sunnyvale, CA)を用いて調製した。
【００９６】
単量体の調製。アミロイドベータ（１−４０）ペプチド（Ａβ１−４０）のＨＦＩＰ乾燥調製物を、Ａβ（１−４２）ペプチドについて概説したように調製した。ペプチドフィルムを、ペプチド１ｍｇあたり２ｍＬの２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、アリコートに分割し、用いるまで−７０℃で凍結した。
【００９７】
一次ニューロン。一次海馬培養物を、凍結した分離した新生児ラット海馬細胞(Cambrex, Corp., East Rutherford, NJ)から調製し、これを融解させ、ウェルあたり２０，０００個の細胞の濃度で９６ウェルCOSTAR（登録商標）プレート中に蒔いた。細胞を、Ｌ−グルタミン(GIBCO-BRL（登録商標）、Gaithersburg, MD)を含まず、Ｂ２７(GIBCO-BRL（登録商標）、Gaithersburg, MD)を補完したNEUROBASAL（登録商標）培地中に、２週間維持し、次に結合の研究のために用いた。
【００９８】
免疫細胞化学。免疫細胞化学を、二次抗体をALEXAFLUOR（登録商標）588 (Molecular Probes, Eugene, OR)に結合させた以外は、確立された方法（Lambertら(2001)、上記）に従って行った。２１日間の海馬細胞培養への適用前に、抗体およびＡＤＤＬを、１時間室温で、１：４の抗体：ＡＤＤＬのモル比でプレインキュベートした。内因性ＡＤＤＬに関して、ヒト脳タンパク質（Lambertら(2001)、上記におけるように調製した）を、細胞と共に１時間インキュベートし、その後上記のように細胞を洗浄し、固定し、視覚化した。
【００９９】
アルツハイマー病の、および対照の海馬からのわずかに固定した凍結切片（４％パラホルムアルデヒドで４℃で３０時間、また４０μｍのスクロース中で凍結保護した）を、抗体（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：１０００）と共に、一晩４℃でインキュベートした。抗体を除去した後、切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、室温で二次抗体と共にインキュベートした。次に、結合を、ＤＡＢ(SIGMA（登録商標）、St. Louis, MO)で視覚化した。次に、切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、封入し、NIKON（登録商標）ECLIPSE（登録商標）E600光学顕微鏡上でSPOT（登録商標）INSIGHT（登録商標）デジタルビデオカメラ（バージョン３．２）を用いてイメージ化した。
【０１００】
ＥＬＩＳＡ。ポリクローナル抗ＡＤＤＬ  ＩｇＧ（Ｍ９０／１；Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX）を、０．２５ｍｇ／ウェルで、IMMULON（登録商標）3 REMOVAWELL（登録商標）ストリップ(Dynatech Labs, Chantilly, VA)上に、２時間室温で蒔き、ウェルを、ＴＢＳ中の２％ＢＳＡでブロックした。Ｆ１２中の１％ＢＳＡで希釈した試料を、ウェルに加え、２時間４℃で放置して結合させ、室温でＢＳＡ／ＴＢＳで３回洗浄した。ＢＳＡ／ＴＢＳに希釈したモノクローナル抗体を、９０分間室温でインキュベートし、マウスＩｇＧに対してVECTASTAIN（登録商標）ABCキットで検出した。ＨＲＰ標識を、BIO-RAD（登録商標）ペルオキシダーゼ基質で視覚化し、４０５ｎｍにおいてDynex MRX-TCマイクロプレートリーダー上で読み取った。
【０１０１】
例２：マウス抗体可変部配列の単離
２０Ｃ２マウス抗体の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを、クローン化し、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に従って、マウス定常部の５’末端に、およびＶ領域の上流のマウスリーダー配列にハイブリダイズする特別に設計されたプライマーを用いて配列決定した。これにより、得られたマウス可変部配列が、完全であり、正確であることが確実になった。要するに、ｍＲＮＡを、マウスハイブリドーマ細胞系から、QIAGEN（登録商標）OLIGOTEX（登録商標）Direct mRNA Mini Kitを用いて抽出し、その後一本鎖ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応における鋳型として用いて、抗体可変部配列を得た。
【０１０２】
軽鎖可変部配列を得るために、１１の独立したＰＣＲ反応を、１１種の軽鎖５’ＰＣＲプライマー（ＭＫＶ−１〜ＭＫＶ−１１）および３’ＰＣＲプライマーＭＫＣ−１の各々を用いて、企画した（表１）。
【０１０３】
【表１】
2009519895.tif 000002
下線を付した、およびイタリックの配列は、それぞれＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限部位を示す。Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｙ＝ＣまたはＴおよびＲ＝ＡまたはＧ。
【０１０４】
重鎖可変部配列を得るために、１２の独立したＰＣＲ反応を、１２種の重鎖５’ＰＣＲプライマー（ＭＨＶ−１〜ＭＨＶ−１２）および適切なアイソタイプ特異性３’プライマー（ＭＨＣＧ−１、ＭＨＣＧ−２Ａ、ＭＨＣＧ−２Ｂ、ＭＨＣＧ−３）の各々を用いて、企画した（表２）。
【０１０５】
【表２】
2009519895.tif 000003
下線を付した、およびイタリックの配列は、それぞれＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限部位を示す。Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｙ＝ＣまたはＴおよびＲ＝ＡまたはＧ。
【０１０６】
軽鎖ＰＣＲ反応の各々は、４６μＬのINVITROGEN（登録商標）PLATINUM（登録商標）PCR Super Mix、１．０μＬの１００μＭの５’プライマー（ＭＫＶ−１〜ＭＫＶ−１１）の１種、１．０μＬの１００μＭの３’プライマー（ＭＫＣ−１）および２．０μＬのハイブリドーマｃＤＮＡを含有した。同様のＰＣＲ反応を用いて、マウス重鎖可変部配列をクローン化した。反応物を、ＤＮＡ熱サイクラー中に配置し、９７℃での２．０分間の初期変性段階の後に：９５℃で３０秒間、５５℃で４５秒間、および７２℃で９０秒間のサイクルを３０回施した。最後のサイクルの後に、７２℃で１０分間の最終的な拡張段階を用いた。
【０１０７】
いずれのＰＣＲ反応により生成物が得られたかを決定するために、各々の反応物からの５μＬのアリコートを、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む１．５％（ｗ／ｖ）アガロース／１Ｘ  ＴＡＥ緩衝液ゲル上で分離した。次に、予測された大きさ（４２０〜５００ｂｐ）の断片を生成した反応からのＰＣＲ生成物を、ゲル精製し、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで切断し、プラスミドｐＮＥＢ１９３(New England Biolabs, Beverly, MA)のマルチクローニング領域中のＸｂａＩおよびＳａｃＩ部位中に連結した。あるいはまた、ＰＣＲ産生物を、プラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１中に、INVITROGEN（登録商標）TA CLONING（登録商標）キットを用いて直接連結した。次に、連結生成物を、ＸＬ−１細胞に形質転換し、形質転換した大腸菌のアリコートを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に蒔き、４０μＬのＸ−Ｇａｌストック（５０ｍｇ／ｍＬ）および４０μＬのＩＰＴＧ（１００ｍＭ）溶液で、青色／白色選択のために被覆した。
【０１０８】
プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、潜在性のあるクローンを、白色コロニーで同定した。各々のＰＣＲ生成物に対する少なくとも２４種の独立したクローンからのＤＮＡを、両方のらせんについて、ｐＮＥＢ１９３およびｐＣＲ（登録商標）２．１についての順方向および逆方向のユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。次に、得られた配列を、コンティグ中に構築して、各々の抗体軽鎖および重鎖可変部についてコンセンサス配列を発生させた。この方法を用いて、配列を、ハイブリドーマ２０Ｃ２の軽および重抗体可変部について決定した（図１Ａ〜１Ｂ）。図１Ａ〜１Ｂにおいて、抗原に相補的な構造を形成する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に、下線を付した。
【０１０９】
例３：マウス抗ＡＤＤＬ抗体可変部配列のヒト化
マウスハイブリドーマ細胞系２０Ｃ２から得られたマウス抗体重および軽可変ドメイン核酸を、ＣＤＲ移植方法を用いてヒト化した。当業者は、マウス抗体配列のヒト化は、この血清半減期およびＦｃエフェクター機能を改善し、これにより抗グロブリン応答を低減することにより、抗体の治療的効力を最大化することができることを、理解する。
【０１１０】
ＣＤＲ移植によるヒト化を、マウス可変ドメインに対する最高の相同性を有するＮＣＢＩタンパク質データベースからヒト軽鎖および重鎖可変部を選択することにより、行った。マウス可変部配列を、データベース中のすべてのヒト可変部配列と、タンパク質−タンパク質Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を用いて比較した。その後、マウスＣＤＲを、ヒトフレームワーク領域に接合し、先行するアミノ酸配列を分析した。フレームワーク領域におけるマウス配列とヒト配列との間のすべての差異を、特にこれらがループ構造についての基準の配列の一部であったかまたはＶＬ／ＶＨ界面に位置する残基であった場合に、評価した（O'BrienおよびJones (2001)、Antibody Engineering、Kontermann and Dubel（編）、Springer Laboratory Manuals中）。
【０１１１】
フレームワーク領域をまた、ヒト亜群についての、および可能性のあるグリコシル化部位についてのコンセンサス配列に対する比較において、普通ではない、またはまれなアミノ酸について走査した。アミノ酸配列の差異が、基準の配列に関与するとは見出されていないマウスおよびヒトフレームワーク領域配列の間に存在したか、またはＶＬ／ＶＨ界面に位置した場合において、ヒト残基を、当該位置において選択した。重要な残基の差異が存在した場合において、可変部配列の２つの方式を、評価のために発生させた。ＣＤＲ移植方策により、ヒトフレームワーク領域に最小数の変化がなされ、したがって良好な抗原結合が達成された一方、天然のヒト抗体からの配列と密接に整合するヒトフレームワーク領域が維持された。マウス２０Ｃ２のＣＤＲ移植により発生した、得られたヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変部アミノ酸配列を、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示す。この抗体を、本明細書中ではＨｕ２０Ｃ２と指定する。
【０１１２】
２０Ｃ２に関してヒト化された配列をまた、ベニアリング方策を用いて設計した（例えば米国特許第6,797,492号を参照）。ヒト化を、マウス可変ドメインおよび１または２以上のヒト抗体生殖系ファミリーに対して最も高度な相同性を有するＮＣＢＩタンパク質データベースからヒト軽鎖および重鎖可変部を選択することにより、実行した（Kabatら(1991)、Sequences of proteins of immunological interest、第５版、U.S. Dept. Health and Human Services、NIH、Washington DCを参照）。マウス可変部配列を、データベース中のすべてのヒト可変部配列に対して、タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴを用いて比較した。
【０１１３】
マウス可変配列およびこれらの最も近いヒト相同体を、当該分野において実践されているコンピューターモデル化により決定したように、最も近い結晶化されたヒト抗体に対してモデル化した。マウスＶＨおよびＶＬ配列のモデルから、表面領域マップを構築し、これは、マウス重可変部および軽可変部におけるアミノ酸の溶媒接触性に影響した。モデル化を確認するために、これらの露出した残基を、既知の表面接触性残基と、位置どうし(position-by-position)で比較した（例えば、Padlan (1994)、Mol. Immunol. 31(3):169-217を参照）。記録を、確立された方法に従って、これを指定する配列における各々の残基について、露出している、ほとんど露出している、部分的に包埋されている、ほとんど包埋されている、および包埋されていると割り当てた（米国特許第6,797,492号を参照。この全体にわたり参照により本明細書中に導入する）。露出している、またはほとんど露出していると記録され、相同的なヒト配列と異なるマウスフレームワーク残基を、当該位置において、ヒト残基と交換した。
【０１１４】
設計されたベニア化された配列は、マウスＣＤＲ、ＣＤＲに隣接する残基、基準の配列に関与すると知られている残基、ＶＬ／ＶＨ界面に位置する残基、並びにマウス重鎖および軽鎖のＮ末端配列における残基を維持した。Ｎ末端配列は、ＣＤＲ表面と近接すると知られており、リガンド結合に有効に関与している。ベニアリングした配列を仕上げた後に、これらを、再びモデル化して、すべての可能性のある明らかな構造的問題点を探索した。合計で１２個および９個のアミノ酸残基が、それぞれ重鎖および軽鎖フレームにおいて変化した。マウス２０Ｃ２のベニアリングにより発生した、得られたヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変部アミノ酸配列を、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示す。この抗体を、本明細書中ではＨｕ２０Ｃ２Ａ３と指定する。
【０１１５】
２０Ｃ２と比較して、重鎖置換ではなく、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３において生じた軽鎖置換が、Ｈｕ２０Ｃ２と共通であることを、注記する（図２）。特に、重鎖可変部ＣＤＲ３は、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３に対して独特である。
【０１１６】
ヒト化されたアミノ酸配列を選択した後に、配列を、逆翻訳して、対応するＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ配列を、当該分野で確立されている方法(Lathe (1985)、J. Mol. Biol. 183(1):1-12)を用いて、コドン最適化し、ヒト抗体発現ベクター中にクローン化するために、フランキング制限酵素部位を用いて設計した。Ｈｕ２０Ｃ２に対する軽鎖可変部および重鎖可変部の２つのバージョンをコードするヌクレオチド配列を、図３Ａ〜３Ｃに示す。当該２つの重鎖可変部のバージョンは、２４位における単一のアミノ酸置換で異なる；Ｈｕ２０Ｃ２のバージョンＡについての重鎖可変部は、２４位においてＰｈｅであり、Ｈｕ２０Ｃ２のバージョンＢの重鎖可変部は、２４位においてＬｅｕである。
【０１１７】
例４：親和性成熟
親和性成熟を、Ｈｕ２０Ｃ２抗体において実行した。ヒト化Ｈｕ２０Ｃ２バージョンＡおよびＢ可変重鎖のみ、軽鎖のみ、または重鎖バージョンＡおよび軽鎖を一緒にコードする核酸分子を、Ｆａｂファージ提示ベクターｐＦａｂ４中でクローン化した。核酸配列分析により、ｐＦａｂ４における配列および配向が確認された。ｐＦａｂ４中の注釈付きのＨｕ２０Ｃ２  Ｆａｂ配列を、図４Ａ〜４Ｃに示し、本明細書中で重鎖バージョンＡについて配列番号１１６で、重鎖バージョンＢについて配列番号１１７で、また軽鎖について配列番号１１８で定める。ｐＦａｂ４ベクターにおける重鎖バージョンＡおよび軽鎖の一緒についてのヌクレオチド配列を、図４Ｄ〜４Ｅに示す。これらの構築を、当該分野において確立されたファージ提示Ｆａｂライブラリー法を用いて、Ｈｕ２０Ｃ２成熟プログラムで用いた。
【０１１８】
軽鎖成熟。２種のライブラリーを設計して、Ｈｕ２０Ｃ２の軽（カッパ）鎖のＣＤＲ３の９種の野生型アミノ酸（即ち、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ；配列番号３９）を変異させた。これらのライブラリーを、ＬＣ３−１およびＬＣ３−２と指定し、これらはそれぞれ、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号４０）およびＰｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号４１）の軽鎖ＣＤＲ３配列を表す。ビオチン化逆方向プライマーである２０Ｃ２ＬＣ３−１（配列番号１２３）および２０Ｃ２ＬＣ３−２（配列番号１２６）を、順方向プライマーである２０Ｃ２ＬＣ３Ｆ（配列番号１２０）と組み合わせて用いて、ＬＣ３−１およびＬＣ３−２ライブラリーを産生させた（図５Ａを参照）。プライマーを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、一方ベクターＤＮＡを、ゲル電気泳動および電子溶出により精製した。２種の軽鎖ライブラリーを設計して、ランダム変異させた。３種の１０Ｇ５Ｈ６  ＬＣ３ライブラリーの最終的な多様性は、それぞれ４．７６×１０８および７．４５×１０８であった（表３）。ライブラリーからの約１００種のクローンの配列分析により、設計されたアミノ酸位置における突然変異クローンの１００％の多様性が示された。
【０１１９】
【表３】
2009519895.tif 000004
＊比較的高いタイターが、濃縮またはファージレスキューにより達成される。
【０１２０】
高分子量ｂＡＤＤＬに対する２種の軽鎖ライブラリーの可溶性パニングを、完了した。要するに、４ラウンドのパニングを、ビオチン化高分子量ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）を用いて行った。最初の３ラウンドを、約１．５μＭの抗原濃度（投与量＝１×１０１０〜１×１０１１）を用いて行った。第３ラウンドの完了の際に、２種のライブラリーの産物を組み合わせ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび約１．５μＭの抗原での分析のために３つの群に分けて、パニングのストリンジェンシーを増大させた。このように、合計５８個の産出プレート、即ち第１ラウンドにおいてライブラリーあたり２つのプレート（合計で４つのプレート）、第２ラウンドにおいてライブラリーあたり６つのプレート（合計で１２個のプレート）、第３ラウンドにおいてＬＣ３−１ライブラリーについて８つのプレートおよびＬＣ３−２ライブラリーについて１０個のプレート（合計で１８個のプレート）並びに第４ラウンドにおいて各々の抗原濃度について８つのプレート（合計で２４個のプレート）を、ファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。
【０１２１】
パニングの結果１０００個のヒットが得られ、このうち４３６個を配列決定した（表４）。
【０１２２】
【表４】
2009519895.tif 000005
ａ２０Ｃ２ＬＣ３−１対高分子量１０％ｂＡＤＤＬ。
ｂ２０Ｃ２ＬＣ３−２対高分子量１０％ｂＡＤＤＬ。
ｃ２０Ｃ２ＬＣ３−１＋２０Ｃ２ＬＣ３−２対高分子量１０％ｂＡＤＤＬ。
＊コロニーの合計数あたりのヒット。
【０１２３】
高度に富化されたクローンの配列および頻度を、表５に示す。
【０１２４】
【表５】
2009519895.tif 000006
【０１２５】
【表６】
2009519895.tif 000007
【０１２６】
富化頻度に基づく１０個の最上部のクローンからのＦａｂ断片を調製し、合計１５個のクローンを、ＩｇＧ１ヒト化Ａバージョンに変換し、２個のクローン、即ち２０Ｃ２−６および２０Ｃ２−８を、ＩｇＧ１ヒト化Ｂバージョンに変換した。これらのクローンに対するＫＤ値を、BIACORE（登録商標）により、ビオチン−Ａβ１−２０（表６）およびｂＡＤＤＬ（表７）を抗原として用いて測定した。親和性における劇的な改善が、母体のヒト化２０Ｃ２Ａおよび２０Ｃ２Ｂ並びにマウス２０Ｃ２抗体と比較して観察された。特に、低ナノモルないしピコモル未満のＫＤが、配列Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号２）、Ｘａａ１は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘａａ２は、ＡｌａまたはＴｈｒである、の軽鎖ＣＤＲ３で達成された。。さらに、ビオチン−Ａβ１−２０およびｂＡＤＤＬを用いてBIACORE（登録商標）で得られたＫＤ値間の比較により、抗ＡＤＤＬ抗体、例えばＨｕ２０Ｃ２が、ＡＤＤＬの多次元立体構造に、単量体Ａβペプチドよりも優先的に結合することが、さらに示される。
【０１２７】
【表７】
2009519895.tif 000008
【０１２８】
【表８】
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【０１２９】
重鎖成熟。Ｈｕ２０Ｃ２の重鎖にまた、重鎖ＣＤＲ３（ＲＱＬＧＬＲＳＩＤＡＭＤＹ；配列番号９９）に及ぶ３つのライブラリーの産生により、最適化を施した。これらのライブラリーを、２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−１、２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−２および２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−３と指定し、これらはそれぞれ、ＸＸＸＸＸＲＳＩＤＡＭＤＹ（配列番号１００）およびＲＱＬＧＬＲＳＩＸＸＸＸＸ（配列番号１０１）およびＲＱＬＧＸＸＸＸＸＡＭＤＹ（配列番号１０２）の重鎖ＣＤＲ３配列を表す。ビオチン化逆方向プライマーである２０Ｃ２ＨＣ３−１（配列番号１３０）、２０Ｃ２ＨＣ３−２（配列番号１３３）および２０Ｃ２ＨＣ３−３（配列番号１３６）を、順方向プライマーである２０Ｃ２ＨＣ３Ｆ（配列番号１２７）と組み合わせて用いて、３つのライブラリーを発生させた（図５Ｂを参照）。当該ライブラリーは、＞１０８の機能的多様性を含んでおり、各々の組において無秩序化されたすべての位置において、アミノ酸のすべての組み合わせに及んでいた（表８を参照）。
【０１３０】
【表９】
2009519895.tif 000010
【０１３１】
４ラウンドのパニングからの合計１８の産出プレートを、ファージＥＬＩＳＡアッセイで試験した。合計で１２３５個のヒットが見出され、このうち７０４個を配列決定した。ビオチン化Ａβ１−２０およびビオチン化ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）抗原に対するＦａｂ断片のBIACORE（登録商標）ＫＤ値、並びに一点BIACORE（登録商標）3000分析（表９）に基づいて、合計で６個のＦａｂクローンを、ＣＤＲ移植またはベニアリングヒト化手法のいずれかを用いて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｍ４に変換した。４ａ−Ａ３と指定するこれらの６個のＦａｂのうちの１つを、ライブラリー２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−３から単離し、これは、重鎖の中心セクション中に３個のアミノ酸置換（ＲＱＬＧＴＲＧＴＤＡＭＤＹ；配列番号３）を有していた。図２Ｂから明らかなように、この重鎖ＣＤＲ３配列は、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３のものである。
【０１３２】
【表１０】
2009519895.tif 000011
【０１３３】
例５：ＩｇＧ２ｍ４抗体の発生
ＩｇＧ２ｍ４抗体誘導体を製造して、Ｆｃレセプター会合、Ｃ１ｑ結合、不要な細胞毒性または免疫複合体生成を低減し、同時に典型的なヒト抗体の長い半減期および薬物動態特性を共に維持した。ＩｇＧ２ｍ４の基本的な抗体様式は、ＩｇＧ２のものであり、これは、実験的モデルにおいて優れた半減期を有すると示されている(Zuckierら(1994)、Cancer Suppl. 73:794-799)。ＩｇＧ４配列の選択的な導入により、ＩｇＧ２の構造を改変して、Ｃ１ｑ結合を解消し、一方典型的な低レベルのＦｃγＲ結合を維持した(CanfieldおよびMorrison (1991)、J. Exp. Med. 173:1483-1491)。これは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の配列が同一である交差点を用いることにより達成され、これにより、すべての人工的な突然変異配列よりもむしろ、天然のＦｃ配列を含む抗体が得られた。最小のエフェクター関連活性を示すこのＩｇＧ２ｍ４抗体を用いることの利点は、Wilcockら((2006) J. Neurosci. 26:5340-6)により開示されている脱グリコシル抗体に相当する。
【０１３４】
ヒト抗体定常部のＩｇＧ２ｍ４形態を、図６に示すように、ヒトＩｇＧ４配列を標準的なヒトＩｇＧ２定常部中に選択的に導入することにより、形成した。概念的に、ＩｇＧ２ｍ４は、図６に示すように、ＣＨ２ドメイン内の１対の鎖交換から得られた。４つの単一の突然変異を、ＩｇＧ４からの配列に対応して生じさせた。ＩｇＧ２において突然変異したＦｃ残基は、Ｈｉｓ２６８Ｇｌｎ、Ｖａｌ３０９Ｌｅｕ、Ａｌａ３３０ＳｅｒおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒを含んでおり、これにより、ネオエピトープ(neoepitope)についての効能が最小になった。ＩｇＧ２定常部中に配置された特定のＩｇＧ４アミノ酸残基を、基本的構造からの他の代替と共に、表１０に示す。
【０１３５】
【表１１】
2009519895.tif 000012
＊アスタリスクでマークした位置は、対立遺伝子変化の傾向がある。
aHougsら(2001)、Immunogenetics 52(3-4):242-8。
bWO 97/11971。
cMedgyesiら(2004)、Eur. J. Immunol. 34:1127-1135。
dTaoら(1991)、J. Exp. Med. 173:1025-1028。
eArmourら(1999)、Eur. J. Immunol. 29:2613。
fXuら(1994)、J. Biol. Chem. 269:3469-3474。
gCanfieldおよびMorrison (1991)、J. Exp. Med. 173:1483。
【０１３６】
ヒト化Ｈｕ２０Ｃ２およびＨｕ２０Ｃ２Ａ３抗体のヒトＩｇＧ１／カッパおよびＩｇＧ２ｍ４／カッパ種を、構成した。軽鎖および重鎖Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３  ＩｇＧ２ｍ４抗体の完全なアミノ酸配列を、図７Ａおよび７Ｃに示す。
【０１３７】
例６：ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体の結合親和性および特異性
親和性成熟を行って、親和性を改善し、ＡＤＤＬへの優先的な結合を改善した。ヒト化された抗体のＡＤＤＬ結合親和性を評価するために、BIACORE（登録商標）および滴定ＥＬＩＳＡを、本明細書中に開示したように行った。要するに、ストレプトアビジンを塗布した９６ウェルマイクロタイタープレート(Sigma, St. Louis, MO)に、１０％ビオチン化ＡＤＤＬ抗原（１μＭ）を塗布した。５００ｎｇ／ｍＬで開始した、精製した抗体の一連の２倍希釈を、ＡＤＤＬ捕獲プレートに加え、プレートを、２時間２５℃でインキュベートした。プレート洗浄機(Bio-Tek, Winooski, VA)を用いてＰＢＳ溶液で５回洗浄した後に、ポリクローナルヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体(Biomeda, Foster City, CA)を、３％脱脂乳ブロッカーでの１／２０００の希釈において加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)検出抗体を、遮断溶液での１／２０００の希釈において加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ基質、３，３’，５’，５−テトラメチルベンジジン（使用可能な状態のＴＭＢ；Sigma, St. Louis, MO）を加え、反応を、１０分後に０．５ＮのＨ２ＳＯ４で停止した。４５０ｎｍの波長における吸光度を、プレートリーダー（モデルVICTOR V; Perkin Elmer, Boston, MA）において読み取り、データを、EXCEL（登録商標）ワークシートを用いて加工した。プレート間のアッセイ変動は、２０％以内であると推定された。
【０１３８】
BIACORE（登録商標）により測定したＦａｂクローンＡ３のＫＤは、ビオチン化Ａβ１−２０に対して８４９ｐＭであった。同一のＦａｂクローンのＫＤは、ｂＡＤＤＬに対して８２ｐＭであり、これは、Ａ３  Ｆａｂにより、ＡＤＤＬへの優先的な結合が例証されたことを示す。クローンを、ベニアリングによりヒト化し、完全なＩｇＧ１分子または完全なＩｇＧ２ｍ４分子（即ちＨｕ２０Ｃ２Ａ３）に変換した際に、Ａβ１−２０およびＡＤＤＬに対するＫＤ値は、BIACORE（登録商標）装置の信頼性のある検出限界よりも低く、これは、Ｈｕ２０Ｃ２と比較して、Ａβ１−２０およびＡＤＤＬに対するＨｕ２０Ｃ２Ａ３の結合平衡定数の顕著な改善を示している。
【０１３９】
クローンＡ３のＩｇＧ２ｍ４アイソタイプでのベニアリング種であるＨｕ２０Ｃ２Ａ３を、ＣＨＯとピチア属との両方において発現させた。Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の２種の供給源を、Ａβ単量体およびＡＤＤＬと相互作用するこれらの能力について、ＥＬＩＳＡにより評価した。図８に示すように、ＣＨＯ（図８Ａ）またはピチア属（図８Ｂ）のいずれかにおいて産生されたＨｕ２０Ｃ２Ａ３は、Ａβ４０単量体結合に対する優先的なＡＤＤＬ結合を示した（６倍）。これらの曲線から決定された結合定数（ＩｇＧｋ５０値）により、ピチア属において産生されたＨｕ２０Ｃ２Ａ３について、それぞれＡＤＤＬおよびＡβ単量体について６４ｐＭおよび３７６ｐＭ、並びにＣＨＯ細胞において産生されたＨｕ２０Ｃ２Ａ３について、それぞれＡＤＤＬおよびＡβ単量体について５８ｐＭおよび３６１ｐＭの値が得られた。
【０１４０】
例７：ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体を用いたニューロンへのＡＤＤＬ結合の阻害
ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体をさらに、一次海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断するこれらの能力について、本明細書中に開示した方法を用いて評価した。Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３抗体または対照としてのＰＢＳを、種々のモル比でｂＡＤＤＬと混合し、低速ローテータ上で１時間３７℃でインキュベートした。プレインキュベーションの後、抗体／ｂＡＤＤＬ調製物を、一次ニューロン培養物に加え、さらに１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、ｂＡＤＤＬ／抗体混合物を除去し、プレートを、培地で６回洗浄した。次に、細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間室温で固定し、溶液を除去し、新鮮な固定液を加え、細胞を、さらに１０分間固定した。
【０１４１】
細胞を、０．１％TRITON（登録商標）Ｘ−１００を含む４％パラホルムアルデヒドで透過性にし（２回、各々室温で１０分間）、ＰＢＳで６回洗浄し、次にＰＢＳ中の１０％ＢＳＡで１時間３７℃で処理した。次に、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（１％ＢＳＡ中１：１，５００；Molecular Probes, Eugene, OR）を、細胞に１時間室温で加えた。細胞を、ＰＢＳで６回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（SAPPHIRE-II（登録商標）を含むCDP-STAR（登録商標）；Applied Biosystems, Foster City, CA）を、細胞に加え、３０分間インキュベートし、その後ＬＪＬ照度計(Analyst AD; LJL Biosystems, Sunnyvale, CA)上でルミネセンスを決定した。この分析において、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３は、準化学量論的な抗体対ペプチド比におけるニューロンへのｂＡＤＤＬ結合を有効に阻害すると、見出された（ＥＣ５０＝０．１６；図９）。
【０１４２】
ｂＡＤＤＬ結合の阻害により、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３がＡＤＤＬと、生物学的に関連する方式で相互作用することが、示された。Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３がヒトアルツハイマー病状態と関連するＡＤＤＬと相互作用することを例証するために、ビオチン化Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３がヒトアルツハイマー病脳組織中のプラークを含むＡβを免疫標識する能力を、評価した。免疫組織化学的局所化により、ヒトアルツハイマー病脳組織中の高密度の中心と拡散したプラークとの両方におけるＡβのアビド(avid)標識が示された。この結合の特異性を、増大するＡＤＤＬ：抗体の量でプレインキュベートした後に、免疫反応性の損失により、例証した。Ｈｕ２０Ｃ２と同様に、Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３は、高密度の中心と拡散したＡβ沈着物との両方を有効に標識する。
【０１４３】
例８：Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の熱安定性
Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３のタンパク質安定性の評価を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、蛍光熱溶融分析および粒径分析を用いて評価した。蛍光熱溶融分析により、ＦｃおよびＦａｂのアンフォールディング転移が、それぞれ約７０℃および８０℃において発生することが示され、これは、許容できる固有のタンパク質安定性と整合する（図１０）。
【０１４４】
例９：インビボ薬力学的および効能分析
従来技術により、モノクローナル抗Ａβ抗体の全身への注射は、Ａβの血漿レベルを急速に増大し得、一方脳Ａβの測定可能な低下には、慢性投与が必要であることが、示されている。測定可能なＡβでの種における受動的な免疫化の結果、脳と末梢分画との間のＡβの平衡における変化による血漿Ａβの上昇がもたらされることが、示唆されている。この「末梢のシンク」により、最終的に、脳Ａβの低下がもたらされる。しかし、認知の改善は、脳Ａβにおける顕著な変化の前の急激な抗体の投与に続いて動物において観察され、これは、脳Ａβの変化が、これらの変化を既知の手法を用いて測定することができる時点の前に、ある形態で起こり得ることを示す。あるいはまた、血漿Ａβの上昇が、抗体の投与の後の末梢Ａβの安定化により説明され得る。
【０１４５】
解説とは無関係に、早期の血漿の上昇は、動物モデルにおける脳Ａβのその後の低下のための必要条件であることが、確立された。したがって、血漿Ａβ上昇に対するＨｕ２０Ｃ２Ａ３抗体の効果を、標的の会合の指標として用いた。３０、１００および３００μｇ／マウスＩＶの用量におけるＨｕ２０Ｃ２Ａ３の注入に続いて、血漿Ａβｘ−４０における顕著であり、着実な増大が、注射の４時間後に、無関連抗体（８Ｂ４）対照群に対して観察された（図１１）。ＣＨＯ誘導材料についての血漿Ａβｘ−４０における観察された増大は、８Ｂ４レベルの４９１％（３０μｇ、ｐ＞０．００１）、８２６％（１００μｇ、ｐ＜０．００１）および７５５％（３００μｇ、ｐ＜０．００１）であった。同様に、ピチア属誘導材料についての血漿Ａβｘ−４０における増大は、８Ｂ４レベルの３９５％（３０μｇ、ｐ＞０．００１）、７２９％（１００μｇ、ｐ＜０．００１）および８３８％（３００μｇ、ｐ＜０．００１）であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１Ａ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２の重鎖可変部の核酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２の軽鎖可変部の核酸配列を示す図である。
【図２Ａ】マウス抗体２０Ｃ２並びにヒト化抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）およびＨｕ２０Ｃ２Ａ３（ベニアリング）の重鎖可変部アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図２Ｂ】マウス抗体２０Ｃ２並びにヒト化抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）およびＨｕ２０Ｃ２Ａ３（ベニアリング）の軽鎖可変部アミノ酸配列の比較を示す図である。
【０１４７】
【図３Ａ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）の重鎖可変部（ＨＣＶＲ）の核酸配列を示す図である。
【図３Ｂ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）の重鎖可変部（ＨＣＶＲ）の他の核酸配列を示す図である。
【図３Ｃ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２（ＣＤＲ移植）の軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）の核酸配列を示す図である。
【０１４８】
【図４Ａ】ＦａｂファージディスプレイベクターｐＦａｂ４におけるＨｕ２０Ｃ２ヒト化抗体の重鎖バージョンＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図４Ｂ】ＦａｂファージディスプレイベクターｐＦａｂ４におけるＨｕ２０Ｃ２ヒト化抗体の重鎖バージョンＢのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図４Ｃ】Ｆａｂファージ提示ベクターｐＦａｂ４におけるＨｕ２０Ｃ２ヒト化抗体の軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図４Ｄ】ｐＦａｂ４ベクター中のＨｕ２０Ｃ２の軽鎖と融合した重鎖バージョンＡのヌクレオチド配列を、小文字で示すＨｕ２０Ｃ２抗体配列をコードする配列と共に示す図である。
【図４Ｅ】ｐＦａｂ４ベクター中のＨｕ２０Ｃ２の軽鎖と融合した重鎖バージョンＡのヌクレオチド配列を、小文字で示すＨｕ２０Ｃ２抗体配列をコードする配列と共に示す図である。
【０１４９】
【図５Ａ】親和性成熟Ｈｕ２０Ｃ２軽鎖ＣＤＲ３を発生させるための、２種の軽鎖ＣＤＲ３ライブラリー、即ちＬＣ３−１およびＬＣ３−２を作成するにあたり用いられる設計およびプライマーを示す図である。
【図５Ｂ】親和性成熟Ｈｕ２０Ｃ２重鎖ＣＤＲ３を発生させるための、３種の重鎖ＣＤＲ３ライブラリー、即ち２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−１、２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−２および２０Ｃ２Ｂ−３９ＨＣ３−３を作成するにあたり用いられる設計およびプライマーを示す図である。
【図６】ヒト抗体定常部のアミノ酸配列とＩｇＧ２ｍ４の配列との比較を示す図である。
【０１５０】
【図７Ａ】抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図７Ｂ】抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図７Ｃ】抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化カッパ軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図７Ｄ】抗ＡＤＤＬ抗体Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化カッパ軽鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【０１５１】
【図８Ａ】ＥＬＩＳＡにより決定した、ＣＨＯにより産生されたＨｕ２０Ｃ２Ａ３との、Ａβ４０単量体またはＡＤＤＬの間の相互作用を示す図である。
【図８Ｂ】ＥＬＩＳＡにより決定した、ピチア属により産生されたＨｕ２０Ｃ２Ａ３との、Ａβ４０単量体またはＡＤＤＬの間の相互作用を示す図である。
【０１５２】
【図９】一次海馬ニューロンに結合するｂＡＤＤＬのＨｕ２０Ｃ２Ａ３阻害を示す図である。
【図１０】Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３の蛍光熱溶融分析を示す図である。
【図１１】Ｈｕ２０Ｃ２Ａ３、即ち無関係の対照またはビヒクルの静脈内注射後のＡＰＰ−ＹＡＣマウスの血漿Ａβｘ−４０レベル（ｐＭ）を示す図である。
【図１Ａ】
2009519895.tif 000013
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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