(57)【要約】  【課題】  【解決手段】本発明は、バイオマーカ又はこの成分の存在又は欠乏に基づいて、生物試料の酸化ストレスを検出する方法、酸化損傷の累積記録を決定する方法、及び心疾患など老齢疾患の診断方法に関する。本発明は、また、生物試料の酸化ストレスを検出するキットに関するものであり、安定性反応物質及び抗体から構成されている。【選択図】図１
2009513953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料を使用して酸化ストレスを検出する方法において：
（ａ）測定可能な成分を有する酸化ストレスのバイオマーカを具える生物試料を取得するステップと；
（ｂ）前記試料中の前記バイオマーカを化学的に安定させるステップと；
（ｃ）前記測定可能な成分を分離するステップと；
（ｄ）前記測定可能な成分を抽出するステップと；
（ｅ）前記測定可能な成分の量を測定するステップ；
とを具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記酸化ストレスのバイオマーカは、アルデヒドタンパク付加体及びアルデヒド代謝産物タンパク付加体から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記アルデヒドは、４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、前記アルデヒドは、１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記測定可能な成分は、ＤＨＮ及び[２Ｈ］ＤＨＮから選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法が、前記アルデヒドをアルコールに還元することによって前記試料中の前記バイオマーカを化学的に安定させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記アルデヒドをアルコールに還元する前記ステップが、前記生物試料へＮａＢＨ４及びＮａＢ２Ｈ４の一方を加えるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法において、前記アルデヒドをアルコールに還元する前記ステップが、ＨＮＥをＤＨＮに還元するステップ、および／または、ＨＮＥを重水素アルコール[２Ｈ］ＤＨＮに還元するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、前記生物試料が、ＨＮＥ、ＨＮＥタンパク付加体、ＤＨＮ、ＤＨＮタンパク付加体、ＨＮＥの代謝産物およびこれらの組み合わせから選択された分子を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法が、タンパク質結合を開裂することによって、前記測定可能な成分を分離するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記タンパク質結合を開裂するステップが、ラネーニッケル触媒反応を使用して、タンパク質チオエーテル結合を開裂するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記ラネーニッケル触媒反応が、約５乃至約２０時間、約４５℃乃至約６０℃で行われることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、前記酸化ストレスのバイオマーカの前記測定可能な成分が、脂肪酸の過酸化によって生産される代謝産物であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記酸化ストレスのバイオマーカの前記測定可能な成分が：４−ヒドロキシノネナール、４−オキソノネナール、４−ヒドロキシヘキセナール及び４−オキソヘキセナールから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、前記生物試料が、全血、血液派生物及びその組み合わせから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記血液派生物が、血漿、アルブミン及び酸化リポタンパク質から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、前記測定可能な成分の前記量は、質量分析に連結されたガスクロマトグラフィを使用して測定されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
生物試料を使用して酸化ストレスを検出する方法において：
（ａ）酸化ストレスのバイオマーカを具える生物試料を取得するステップと；
（ｂ）前記試料中の前記バイオマーカを化学的に安定させるステップと；
（ｃ）前記安定化したバイオマーカに結合する抗体と前記試料を接触させるステップと；
（ｄ）前記試料中の前記結合抗体の存在を検出するステップと；
を具える方法。
【請求項１９】
哺乳動物の酸化損傷の累積記録を経時的に決定する方法において：
（ａ）第１時点で、アルデヒド代謝産物タンパク付加体を具える血液試料である第１血液試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｂ）前記第１血液試料中の前記アルデヒド代謝産物の量に基づいて、前記第１血液試料中の酸化ストレスレベルを検出するステップと；
（ｃ）第２時点で、アルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体を具える血液試料である第２血液試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｄ）前記第２血液試料中の前記アルデヒド代謝産物の量に基づいて、前記第２血液試料中の酸化ストレスレベルを検出するステップと；
（ｅ）前記第１及び第２血液試料中の測定されたアルデヒド代謝産物の量を使用して、前記哺乳動物の酸化損傷の累積記録を決定するステップと；
と具える方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記アルデヒド代謝産物は、４−ヒドロキシノネナール、４−オキソノネナール、４−ヒドロキシヘキセナール、４−オキソヘキセナール、４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）及び１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
哺乳動物の心疾患のリスクを評価する方法において：
（ａ）ＨＮＥタンパク付加体とＤＨＮタンパク付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｂ）前記試料中のＨＮＥタンパク付加体とＤＨＮタンパク付加体の量を測定するステップと；
（ｃ）前記ＨＮＥタンパク付加体と前記ＤＨＮタンパク付加体との間の所定の関係を決定するステップと；
（ｄ）前記所定の関係に基づいて前記哺乳動物の心疾患のリスクを評価するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法が、前記ＨＮＥタンパク付加体とＤＨＮタンパク付加体の量の割合及び請求項１９に記載の方法に従って測定された前記哺乳動物の酸化損傷の累積記録に基づいて、前記哺乳動物の心疾患の前記リスクを評価するステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項２３】
哺乳動物の心疾患又はそのリスクを診断する方法において：
（ａ）アルデヒド代謝産物タンパク付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｂ）前記試料中の前記アルデヒド代謝産物付加体の量を測定するステップと；
（ｃ）アルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体の量が所定の閾値より大きい場合に、心疾患又はそのリスクを有する哺乳動物を診断するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記心疾患又はそのリスク因子が、高血圧、インスリン耐性、高血糖症、脂質異常症、拡張機能障害、心筋線維症、及び不整脈、心臓肥大、頻拍、糖尿病、肥満及びメタボリック・シンドロームから選択されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法において、前記アルデヒド代謝産物タンパク付加体が、アルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法において、前記アルデヒド代謝産物が、４−ヒドロキシノネナール、４−オキソノネナール、４−ヒドロキシヘキセナール、４−オキソヘキセナール、４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）及び１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
哺乳動物の心疾患又はそのリスクを診断する方法において、
（ａ）ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体とＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｂ）前記生物試料中のＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体とＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体の量を測定するステップと；
（ｃ）ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体とＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体の存在量の割合が所定の割合より大きい場合に、心疾患又はそのリスクを有する前記哺乳動物を診断するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法において、前記心疾患又はそのリスク因子が、高血圧、インスリン耐性、高血糖症、脂質異常症、拡張機能障害、心筋線維症、及び不整脈、心臓肥大、頻拍、糖尿病、肥満及びメタボリック・シンドロームから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法において、前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項３１】
生物試料を使用して酸化ストレスに関する事象を検出するキットにおいて、前記生物試料は、全血及び血液派生物から選択され、アルデヒドを具えるものであり、当該キットが：
（ａ）前記アルデヒドをアルコールに安定させるための安定反応剤と；
（ｂ）前記安定化したアルコールと特に結合する抗体と；
を具えることを特徴とするキット。
【請求項３２】
請求項３１に記載のキットにおいて、前記安定反応剤が、前記アルデヒドをアルコールに変換するのに適していることを特徴とするキット。
【請求項３３】
請求項３２に記載のキットにおいて、前記安定反応剤が、ＮａＢ２Ｈ４及びＮａＢ２Ｈ４の一方を含むことを特徴とするキット。
【請求項３４】
ヒト対象の心疾患の進行を遅らせる又は止める方法において：
（ａ）請求項２８に記載の方法に従って、ヒト対象の心疾患又はそのリスクを診断するステップと；
（ｂ）心疾患の進行を遅らせる又は止めるために知られている所定の処置を施すステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記所定の処置が、治療的に有効量のプロブコールを投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法において、前記所定の処置が、心疾患の進行を遅らせる又は止めるために有効な運動プログラムを推奨するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法において、前記所定の処置を施すステップが、心疾患の進行を遅らせる又は止めるために有効な治療食を与えるステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項３８】
ヒト対象の所定の処置に対する心疾患の進行の反応を評価する方法において：
（ａ）アルデヒド代謝産物タンパク付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｂ）前記試料中の前記アルデヒド代謝産物タンパク付加体の量を測定するステップと；
（ｃ）前記試料中の前記アルデヒド代謝産物タンパク付加体の前記測定量に基づいて、所定の処置に対する心疾患の進行の反応を評価するステップとを具える；
ことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、前記所定の処置に対する前記心疾患の進行の前記反応を評価するステップが、提案された処置の起こりうる結果を評価するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法において、前記所定の処置に対する前記心疾患の進行の前記反応を評価するステップが、前記所定の処置に応じて前記心疾患の前記進行を評価するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項４１】
哺乳動物の酸化損傷の累積記録を決定する方法において：
（ａ）血液試料がアルデヒド代謝産物タンパク付加体を具える血液試料を哺乳動物から取得するステップと；
（ｂ）請求項１に記載の方法に従って測定された前記アルデヒド代謝産物の量に基づいて、前記血液試料を使用して酸化ストレスレベルを検出するステップと；
（ｃ）前記血液試料中で測定されたアルデヒド代謝産物の量及び前記アルデヒド代謝産物の所定の基準量を使用して、前記哺乳動物の酸化損傷の累積記録を決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカ又はその成分の存在又は欠乏に基づいて、生物試料の酸化ストレスを検出する方法、酸化損傷の累積記録を決定する方法、及び心疾患など老齢疾患の診断方法に関する。本発明は、また、生物試料の酸化ストレスを検出するキットに関するものであり、安定性反応物質及び抗体から構成されている。
【背景技術】
【０００２】
過去３０年以上にわたって、老化と心疾患（ＣＶＤ）の病因における酸化ストレスの関連性を証明する多くの実験的証拠が蓄積されている〔１−３〕。「天然酸化防止剤」を用いた無作為化臨床試験は、明らかに気体を裏切るものであり（ＨＯＰＥ、ＨＰＳ、ＧＩＳＳＩ−ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、いくつかの疑問点は、酸化ストレス仮説に関連している〔４−６〕。しかしながら、これらの研究の大多数は、酸化ストレス状態への抗酸化剤の関与の影響を評価していないが、もしくは、非常に批判されているチオバルビツール酸反応物方法（ＴＢＡＲＳ）〔７−９〕を使用している。これは、人体研究に利用可能な液体中の酸化ストレスバイオマーカを評価する方法を検証する際に直面する問題点によって、ある程度説明することができ、これは、しばしば、高価で複雑な質量分析技術を必要とする。近年では、インビボで酸化ストレス誘導脂質過酸化物の比較的良いマーカとして、イソプロスタンが明らかにされつつある〔７、９〕。しかしながら、単一のバイオマーカを測定することは、ＣＶＤの進行に寄与しうる事象に関連する、様々な酸化ストレスの総合的な状態を提供するものではない。
【０００３】
過去１０年以上、かなり研究的関心がもたれている酸化ストレスに関連する分子の一つが、４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）である〔１０〕。ＨＮＥは、最も多いクラスのｎ−６ポリ不飽和脂肪酸の過酸化によって作り出されるアルデヒド最終生成物である〔１１〕。フリーラジカルと同様に、アルデヒドは、タンパク質、ヌクレイン酸及び脂質の求核残基と容易に反応する求電子剤であり、比較的長い半減期によって、これらは近隣細胞へ損傷を伝搬する対象となる。アルデヒドの中では、α、β二重結合によって、ＨＮＥなどの４−ヒドロキシ−２−アルケナールが最大反応種と考えられる〔１１〕。
【０００４】
ＨＮＥステムに対する関心は、酸化ストレスを誘発する脂質過酸化物（ＬＰＯ）のバイオマーカとしての使用可能性から生じているのみではなく、ＨＮＥが、ＣＶＤを特徴付ける細胞増殖、アポトーシス及び炎症に伴うシグナル経路を調節できることを示す証明が数多くなされているためでもある〔１２、１３〕。しかしながら、ＣＶＤにおける酸化ストレスに関する事象の活性バイオマーカとしてのＨＮＥの役割については、多く知られている。ＨＮＥは、１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）への還元、４−ヒドロキシノネン酸への酸化、又はグルタチオンとの結合のいずれかによって急速に細胞代謝してしまうので〔１４〕、最近の研究は、遊離ＨＮＥよりも尿〔１５〕又は血漿〔１６〕中のジヒドロキシノネンメルカプツール酸などのＨＮＥ代謝物を測定する潜在的有用性を強調している。
【０００５】
また、ＨＮＥタンパク付加体も同定されている。免疫学的及びガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣＭＳ）方法によって評価される、これらの付加体の増加レベルは、心筋組織中の〔１７−２０〕、血中アルブミン〔２１〕及び酸化リポタンパク質〔２２〕中の酸化ストレス条件の下で、報告された。しかしながら、血中ＨＮＥタンパク付加体が、全身又は組織特異酸化ストレスの増加を反映できる可能性は、これまで研究されておらず、全血、血漿又は他の血液派生試料中のこれらの付加体の定量方法はこれまで述べられていない。
【０００６】
このように、酸化ストレスは心疾患を含む多くの老化変性疾患にかかわっており、特にヒトに関するこれらの疾患においては、脂質過酸化生成物である４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）及びそのタンパク質チオエーテル付加体などの、酸化ストレスに関連する事象のバイオマーカの同定がさらに必要である。上記事項を考慮すると、産業上、好適なバイオマーカを使用し、生物試料の酸化ストレスを検出及び定量する新しい方法を提供する必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の広い態様では、本発明は、酸化ストレスのバイオマーカを具える生物試料を使用して酸化ストレスを検出する方法に関する。この方法は、生物試料を取得するステップと、酸化ストレスのバイオマーカを化学的に安定させて酸化ストレスの安定化したバイオマーカを作り出すステップと；酸化ストレスのバイオマーカを安定させた後に、試料中の酸化ストレスの安定化したバイオマーカの存在を評価するステップとを具える。
【０００８】
利点として、この方法によれば、これらのプロセスの間、試料内のバイオマーカのレベルを確実にほぼ一定にしておいて、バイオマーカの存在を評価するときに、比較的複雑な、長いプロセスを行うことができる。
【０００９】
さらに、この方法は、標準の検査法を用いて、比較的簡単に行うことができる。
【００１０】
本発明のいくつかの実施例では、この方法は、キットを使用して行ってもよく、それゆえ、比較的効率的に、そして比較的少数の比較的簡単な実行ステップで簡単にこの方法を実行することができる。
【００１１】
この文献をさらに明確にするために、酸化ストレスのバイオマーカという用語は、例えば、限定することなく、老化と心疾患の発症及び進行に伴う酸化ストレス誘導ＬＰＯ事象のバイオマーカを含めて酸化ストレスのバイオマーカそれ自体及び酸化ストレスに関する事象のバイオマーカを包含するものである。
【００１２】
本発明のいくつかの実施例では、酸化ストレスのバイオマーカは、アルデヒドタンパク付加体及びアルデヒド代謝産物タンパク付加体から選択される。例えば、代謝産物タンパク付加体は、代謝産物タンパク質チオエーテル付加体である。他の例では、この代謝産物は、特に、ヒスチジン又はリジンなどのいずれかの好適なアミノ酸又はその他の好適な物質に共有結合している。
【００１３】
本発明の特定の実施例では、このアルデヒドは、４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）、１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）を含む。これらの２つの場合に、本発明のいくつかの実施例では、測定可能な成分は、ＤＨＮ及び[２Ｈ］ＤＨＮから選択することができる。他の実施例では、酸化ストレスのバイオマーカの測定可能な成分は、脂肪酸の過酸化によって生産される別の代謝産物、例えば非限定的に４−ヒドロキシノネナール、４−オキソノネナール、４−ヒドロキシヘキセナールと４−オキソヘキセナールである。
【００１４】
いくつかの実施例では、測定可能な成分の量は、質量分析に連結されたガスクロマトグラフィを使用して測定される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施例では、試料中のバイオマーカを化学的に安定化するステップは、例えば、生物試料へＮａＢ２Ｈ４又はＮａＢＨ４を加えることによってアルデヒドをアルコールに還元するステップを具える。この実施例の変形例では、アルデヒドをアルコールに還元するステップが、ＨＮＥをＤＨＮに還元するステップ、および／または、ＨＮＥを重水素アルコール[２Ｈ］ＤＨＮに還元するステップを具える。
【００１６】
本発明のいくつかの実施例では、生物試料は、ＨＮＥ、ＨＮＥタンパク付加体、ＤＨＮ、ＤＨＮタンパク付加体、ＨＮＥの代謝産物およびこれらの組み合わせから選択された分子を含んでいる。
【００１７】
本発明のいくつかの実施例では、測定可能な成分を分離するステップが、タンパク質結合を開裂するステップを具える。たとえば、このタンパク質結合を開裂するステップは、ラネーニッケル触媒反応を使用して、タンパク質チオエーテル結合を開裂するステップを具える。特定の例では、ラネーニッケル触媒反応は、約５乃至約２０時間、約４５℃乃至約６０℃で行われる。
【００１８】
本発明のいくつかの実施例では、この生物試料は、全血、血液派生物及び、この組み合わせから選択され、血液派生物は、例えば、特に、血漿、アルブミン、酸化リポタンパク質から選択される。
【００１９】
第２の広い態様では、本発明は、酸化ストレスのバイオマーカを具える生物試料を取得するステップと；試料中のバイオマーカを化学的に安定させるステップと；前記試料を安定化したバイオマーカに結合する抗体に接触させるステップと；前記試料中の結合抗体の存在を検出するステップと；を具える生物試料を使用した酸化ストレスを検出する方法に関する。
【００２０】
第３の広い態様では、本発明は、第１時点で、哺乳動物から第１血液試料を取得するステップであって、当該血液試料がアルデヒド代謝産物タンパク付加体を具えるステップと；アルデヒド代謝産物の量に基づいて、第１血液試料中の酸化ストレスレベルを検出するステップと；第２時点で、哺乳動物から第２血液試料を取得するステップであって当該血液試料がアルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体を具えるステップと；アルデヒド代謝産物の量に基づいて、第２血液試料中の酸化ストレスレベルを検出するステップと；第１及び第２血液試料中の測定されたアルデヒド代謝産物の量を使用して、前記哺乳動物の酸化損傷の累積記録を決定するステップとを具える、哺乳動物の酸化損傷の累積記録を経時的に決定する方法に関する。
【００２１】
第４の広い態様では、本発明は、ＨＮＥタンパク付加体とＤＨＮタンパク付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；試料中のＨＮＥタンパク付加体とＤＨＮタンパク付加体の量を測定するステップと；ＨＮＥタンパク付加体とＤＨＮタンパク付加体との間の所定の関係を決定するステップと；前記所定の関係に基づいて哺乳動物の心疾患のリスクを評価するステップとを具える、哺乳動物の心疾患のリスクを評価する方法に関する。
【００２２】
第５の広い態様では、本発明は、アルデヒド代謝産物タンパク付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；試料中のアルデヒド代謝産物付加体の量を測定するステップと；生物試料中のアルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体の存在量が所定の閾値より大きい場合に、心疾患又はそのリスクを有する哺乳動物を診断するステップとを具える、哺乳動物、例えばヒトの心疾患又はそのリスクを診断する方法に関する。心疾患又はそのリスク因子は、例えば、高血圧、インスリン耐性、高血糖症、脂質異常症、拡張機能障害、心筋線維症、及び不整脈、心臓肥大及び頻拍から選択される。また、本明細書において、心疾患に関連する場合のリスクの用語は、心疾患が糖尿病、肥満、メタボリック・シンドロームなどの合併症である他の疾患又は状態を含む。
【００２３】
第６の広い態様では、本発明は、ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体とＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体とＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体量の割合が、所定の割合より大きい場合に、心疾患又はそのリスクを有する哺乳動物を診断するステップとを具える、哺乳動物の心疾患又はそのリスクを診断する方法に関する。
【００２４】
本発明の他の実施例では、ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体の量とＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体量のその他の好適な関係、たとえば、これらの２つの量の合計などを用いて、心疾患又はそのリスクを診断する。
【００２５】
第７の広い態様では、本発明は、生物試料を使用して酸化ストレスに関する事象を検出するキットに関するものであり、ここで、生物試料は、全血及び血液派生物から選択され、アルデヒドを具え、このキットは、アルデヒドをアルコールに安定させるための安定反応剤と；この安定化したアルコールと特異的に結合する抗体とを具える。例えば、安定反応剤は、アルデヒドをアルコールに変換するのに好適である。
【００２６】
第８の広い態様では、本発明は、請求項２８の方法に従って、ヒト対象の心疾患又はそのリスクを診断するステップと；心疾患の進行を遅らせる又は止めるために知られている所定の処置を施すステップとを具える、ヒト対象の心疾患の進行を遅らせる又は止める方法に関する。例えば、この所定の処置は、特に、治療的に有効量のプロブコールを投与するステップと、心疾患の進行を遅らせる又は止めるために有効な運動プログラムを推奨するステップと、心疾患の進行を遅らせる又は止めるために有効な治療食を与えるステップとを具える。
【００２７】
第９の広い態様では、本発明は、哺乳動物から血液試料を取得するステップであって、血液試料がアルデヒド代謝産物タンパク付加体を具えるステップと；前記血液試料中に存在するアルデヒド代謝産物の量に基づいて、血液試料を使用して酸化ストレスレベルを検出するステップと；血液試料中で測定されたアルデヒド代謝産物の量とアルデヒド代謝産物の所定の基準量を用いて、哺乳動物の酸化損傷の累積記録を決定するステップとを具える、哺乳動物の酸化損傷の累積記録を経時的に決定する方法に関する。  
【００２８】
第１０の広い態様では、本発明は、アルデヒド代謝産物タンパク付加体を具える生物試料を哺乳動物から取得するステップと；試料中のアルデヒド代謝産物タンパク付加体の量を測定するステップと；試料中のアルデヒド代謝産物タンパク付加体の測定量に基づいて、所定の処置に対する心疾患の進行の反応を評価するステップとを具える、ヒト対象の所定の処置に対する心疾患の進行の反応を評価する方法に関する。  
【００２９】
例えば、所定の処置に対する心疾患の進行の反応を評価することは、提案された処置の起こりうる結果を評価すること又は所定の処置に応じて心疾患の進行を評価することを含む。
【００３０】
本発明の他の目的、利点及び特性は、図面を参照して、以下に非限定的に例示としてのみ記述されている好適な実施形態を読むことでさらに明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下の例は、上述した生物試料の酸化ストレスを検出する方法を説明するためのものであり、この方法は、例えば、脂肪酸の過酸化によって生産されるアルデヒドを使用して実行できることを示している。これらの実施例のいくつかの変形例では、酸化ストレスのバイオマーカを安定させることに、アルデヒドをアルコールに変換することが含まれている。
【００３２】
本発明のいくつかの実施例では、試料は、全血又は血液派生物を含む。ここでは「血液」という用語は、通常、全血及び血液派生物（例えば、血漿、アルブミンなど）を意味する。これらの試料は比較的簡単に得られ、本発明で使用する、酸化ストレスの好適なバイオマーカを含むことが分かっている。
【００３３】
提案されている方法に有用である酸化ストレスの好適なバイオマーカのいくつかの例には、：４−ヒドロキシ−２，３−ノネナール（ＨＮＥ）、１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）、４−ヒドロキシノネナール、４−オキソノネナール、４−ヒドロキシヘキセナールと４−オキソヘキセナールが含まれる。本発明のいくつかの実施例では、これらのバイオマーカは、アルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体など、アルデヒド代謝産物タンパク付加体の形をしている。これらの実施例のいくつかの変形例では、この方法は、アルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体からアルデヒド代謝産物を開裂（cliving）して、その後、生物試料からアルデヒド代謝産物タンパク質チオエーテル付加体を抽出するステップを具える。
【００３４】
本発明のいくつかの実施例では、例えばガスクロマトグラフィなどの好適な分析技術を用いて、試料中の酸化ストレスのバイオマーカの存在を評価するものであり、又、いくつかの実施例では、試料中に存在する酸化ストレスのバイオマーカの量を測定又は定量するものである。その他の実施例では、試料中の酸化ストレスのバイオマーカの存在を評価するステップに、抗体と酸化ストレスの安定化したバイオマーカが結合できる条件下で、試料を、酸化ストレスの安定化したバイオマーカに結合する抗体と接触させるステップ、及び試料中の抗体結合の存在を検出するステップが含まれる。
【００３５】
本発明は、また、ここに記載した方法に従って、心疾患又はそのリスクを診断することによって、哺乳動物（たとえば、ヒト）の心疾患の進行を遅らせる又は止める、及び心疾患の進行を遅らせる又は止めるために知られている所定の治療を施す方法に関連する。このような所定の治療の好適な例には、治療上有効量のプロブコールを投与するステップ、心疾患の進行を遅らせる又は止めるのに有効な運動プログラムを推奨するステップ、及び心疾患の進行を遅らせる又は止めるために治療食を与えて、治療上有効量のプロブコールを投与するステップとが含まれる。
【００３６】
動物モデル例
【００３７】
次に、動物モデルを使用して行った以下の例によって本発明を説明する。これらの例示した実験例及び明細書中の他のどの例も説明のためにのみ使用されており、本発明のもしくは形の範囲や意味を限定するものではない。さらに、本発明は、ここに記載された特に好適な実施例に限定されるものではない。実際に、この明細書を読んだ当業者が、本発明の改良及び変更をこの意図と範囲から外れることなくなしうることは自明である。それゆえ、本発明は、請求の範囲と均等の全範囲の請求の範囲の用語によってのみ限定される。
【００３８】
ＨＮＥタンパク付加体の血中レベルが、（ｉ）ＧＣＭＳの精度で評価することができるか、及び（ｉｉ）酸化ストレスが増加する心筋症モデル、すなわち、自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ）において、疾患の進行及び老化を伴う変化があるかどうかを評価する実験を行った。
【００３９】
これらの実験はラットを使用して行ったが、ここに記載されている実験は、ヒトもしくは他の哺乳動物における生物学的効果を予測する、、および／または、ヒトもしくは他の哺乳動物において、本発明を使用するためのモデルとして有用であることを述べていると考えられる。これらの例は、生物試料の酸化ストレスを検出する、酸化損傷の累積記録を決定する、心疾患を診断する及び心疾患活性を特徴付けるなどの上記方法を説明している。
【００４０】
例１
【００４１】
ＮａＢ２Ｈ４とラネーニッケルによる処理の後の、チオールタンパク付加体と結合した、ＨＮＥ及びその不活性代謝産物、１，４−ジヒドロキシノネン（ＤＨＮ）を定量する実験を行った。７、１５、２２及び３０週齢の、ＳＨＲ及び対照ウィスター系ラットから採取した血液及び血漿中のこれらの付加体レベルを測定した。血漿中ではなく血液中のナノモル範囲で比較的精度よく定量されたが、タンパク質結合ＨＮＥレベルが、疾患（ＳＨＲ）及び齢によって、有意に増加した（両方とも、ｐ＜０．０００１）。ウィスター系ラットと比較すると、ＳＨＲラットのＨＮＥタンパク付加体の血液レベルは、２２週及び３０週で、より大きかった。検出された血液及び血漿中のタンパク質結合ＤＨＮレベルは、疾病又は齢に影響されなかった。まとめると、心筋症の動物モデルを使用して行われたこの研究結果は、前述したＧＣＭＳ法によって、疾患の進行及び老化に伴う血液中のＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体の変化が、非常に精密に分析されることを証明している。この方法は、心疾患など、特にヒトの老齢疾患の生物活性ＨＮＥを伴う酸化ストレス関連事象の発現及び影響を評価するため有用である。
【００４２】
例２
【００４３】
酸化ストレスに関する疾患における４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）の役割の評価を行うために別の実験を行った。さらに、自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ）中の高血中ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体（ＨＮＥ−Ｐ）の測定に加えて、この研究は、心臓機能とＨＮＥ−Ｐの相関及び抗酸化治療の影響を試験することを目的とした。
【００４４】
脂質過酸化抑制プロブコール（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）又は賦形剤（コーンオイル）を、１８週齢ＳＨＲ（９ラット／グループ）に４週間、毎日投与した（腹腔内）。心機能を、心エコー検査によって評価し、ＨＮＥ−Ｐは、ＧＣＭＳによって評価した。
【００４５】
左心室の弛緩（等容性弛緩時間の増加）及びコンプライアンス（Ｅ波減速速度：ＥＤＲの増加）の指標の変化（ｐ＜０．０５）を反映するように、賦形剤を受けたＳＨＲの拡張機能障害は悪化した。高血中ＨＮＥ−Ｐは、拡張機能障害（ＥＤＲ：Ｒ２＝０．５１８；ｐ＜０．００１）及び心拍数（Ｒ２＝０．２２５；ｐ＜０．０５）と相関している。プロブコールは、拡張機能の低下を抑止する一方、血中ＨＮＥ−Ｐの平均値およびメジアンをそれぞれ２１％および３５％減少させた。まとめると、これらの結果は、ＳＨＲの疾患の進行に関連する病態生理学の事象におけるＨＮＥの役割を裏付けている。
【００４６】
例３
【００４７】
次の例では、心筋組織中のタンパク質結合ＨＮＥの定量ＧＣＭＳ分析を使用した方法〔１８〕を改良して、血液試料中のわずかなレベルのこれらの付加体を、精度の良い再現可能な一連の評価をできるようにした。特に、この方法は、チオールタンパクと結合したＨＮＥと不活性代謝産物、ＤＮＨを定量している。しかしながら、本発明の代替的な実施例において、酸化ストレスは、例えば脂肪酸の過酸化によって生産されるその他のアルデヒド代謝産物など他の好適な物質を使用して定量することができる。ＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体及びＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体は、アルデヒドタンパク付加体及びアルデヒド代謝産物タンパク付加体のクラスを代表するものと考えられる。
【００４８】
要約すると、この方法は、（ｉ）重水素化アルコール[２Ｈ］ＤＨＮへの還元によるＨＮＥの安定化、（ｉｉ）チオエーテル結合を開裂するためのラネーニッケルによる処理をして、タンパク質結合ＤＨＮと[２Ｈ］ＤＨＮ（ＨＮＥ）を遊離すること、及び、（ｉｉｉ）ＤＨＮクロマトグラフピークを確実に同定・定量できる重水素化内部標準[２Ｈ１１］ＤＨＮの使用を伴う。「[２Ｈ］ＤＨＮ（ＨＮＥ）」という用語は、ここに使用される場合、ＨＮＥの安定重水素化アルコールをいう。改良された方法を用いて、７、１５、２２及び３３週齢の自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ）及びコントロールウィスター系ラットの血中タンパク質結合ＨＮＥとＤＨＮのレベルが、評価されている。
【００４９】
ＳＨＲは、遺伝的高血圧の確立されたモデルであり、４週齢程の早期に血管壁および心筋中に〔２５−２７〕の抗酸化処理〔２３、２４〕に対応する高い酸化ストレスを示し、ＨＮＥタンパク付加体の蓄積を含む〔１９〕。まとめると、この例の結果は、ＤＨＮではなく、血中ＨＮＥの増加が、チオールタンパク質を疾患の進行とＳＨＲの老化に結びつけることを立証している。これらの結果は、これらの付加体の生物活性ＨＮＥを伴う酸化ストレスに関する事象の血中マーカとしての可能性を示唆している。
【００５０】
試料および方法（例３）
【００５１】
化学物質
【００５２】
化学物質、ラネーニッケル、２，６−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）、有機溶剤及び酸を、それぞれ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭＡＴ (Ｑｕｅｂｅｃ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ (Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、 Ｂｉｏ−Ｒａｄ(Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ(Ｎｅｐｅａｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。化学イオン化用の無水アンモニウム気体（Ｃｌ；最小純度９９．９９％）及び、ヘリウム気体（ＵＨＰ）は、Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｇａｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｎａｄａ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。非標識ＨＮＥは、ＢＩＯＭＯＬ(Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ、ＵＳＡ） から、誘導体化剤Ｎ−メチル−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルヂメチルシリル）−トリフルオロアセトアミド（ＴＢＤＭＳ）は、Ｒｅｇｉｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ(Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。ナトリウムボロデウテライド（ＮａＢ２Ｈ４）及びトランス−４−ヒドロキシ−２−ノネナール−（〔５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，９−２Ｈ１１〕[２Ｈ１１］ＨＮＥ）ジエチルアセタールは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅ（Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃｌａｉｒｅ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）によって供給された。出版物〔１８〕は、[２Ｈ１１］ＤＨＮ及びＤＨＮの原液の調整と、ＮａＢＨ４の還元前に、ＨＮＥ液の２２３ｎｍの吸光度測定によるこれらの濃度測定に関して詳細に述べている。すべての水溶液は、ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｓｙｓｔｅｍ(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）によって精製された水で調整した。他の試薬はすべて分析用試薬である。
【００５３】
動物及び試料収集
【００５４】
動物実験は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅのガイドラインに従って地方の動物管理委員会によって認可された。ラットは、屠殺前に１２時間明／１２時間暗周期施設の中で、少なくとも７日間、水および標準の飼料へのアクセスを制限されずに飼育された。雄ＳＨＲ及び年齢適合コントロールウィスター系ラット(Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）は、７（ｎ＝１１）、１５（ｎ＝１３）、２２（ｎ＝８）及び３０（ｎ＝８）週齢で屠殺された。屠殺時の体重は、それぞれ、ＳＨＲは１８７±１３ｇ、３３２±２２ｇ、３７５±９ｇ及び４０６±１５ｇであり、ウィスター系ラットは、２３９±２８ｇ、４４２±３１ｇ、５３３±３２ｇ及び６１２±１５ｇであった。ペントバルビタールナトリウム麻酔の下で（６５ｍｇ／ｇ、腹腔内；ＭＴＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＥＤＴＡ（１０．８ｍｇ）及びＢＨＴ（０．０４９６ｍｇ）でプリコートされた１０ｍｌシリンジを用いて心穿刺し、血液を回収した。全血（５００μｌ）の試料を、直ちに液体窒素で凍結した。残量を、１０分間、１，５００ｇで遠心分離し、回収した血漿試料も、直ちに液体窒素で凍結した。すべての試料は、分析するまで−８０℃で保存した。
【００５５】
分析手順
【００５６】
試料調整及び血液と血漿中のＨＮＥ及びＤＨＮタンパク付加体のＧＣＭＳ分析手順が、図１に概説されている。心筋組織中のタンパク質結合ＨＮＥを検出する前述の方法〔１８〕を変更して、感度を２０倍に増して、血液及び血漿試料中にあるより低量のタンパク質由来ＨＮＥ及びＤＨＮを検出することができるようにすると共に、再現性及び耐久性を改善した。定期的に、血液及び血漿試料（４００μｌ）を、Ｈｅｐｅｓ３９ｍＭ、ＥＤＴＡ０．４ｍＭ及びＢＨＴ０．９ｍＭを含むコールドバッファ１ｍｌ（ｐＨ７．０）で別々に混合して、処理の間の脂質過酸化反応を最小にし、直ちに１ＭＮａＢ２Ｈ４２００μｌで処理して、ＨＮＥを化学的に安定させたそのアルコール誘導体[２Ｈ］ＤＨＮに還元し、氷上に３０分間置いた。
【００５７】
次いで、飽和スルホサリチル酸を加えて（最終濃度８％（ｖ／ｖ））タンパク質を沈殿させた。氷上に３０分間置いた後、試料を、５０００ｇで４５分間遠心分離した。タンパク質ペレットを、メタノール：クロロホルム（２：１）３ｍｌで洗浄して、脂質を除去し、水で３回洗浄して、グアニジン８Ｍ、トリス１３ｍＭ（ｐＨ７．２）及びＥＤＴＡ１３３ｍＭを含む５００μｌ溶液中で再懸濁させ、０．１ｎｍｏｌの重水素内部標準[２Ｈ１１］ＤＨＮと混合した。溶液を超音波処理して（３×２０ｓｅｃ）タンパク質の溶解を最適化し、２０時間、５５℃でラネーニッケル２．５ｇの触媒処理を行う前に、水１ｍｌを加えた。この処理は、チオエーテル結合を開裂させて、Ｃ＝Ｃ結合を減らすので、[２Ｈ］ＤＨＮ及びＤＨＮの自由飽和誘導体が溶液中で遊離されて、次いでＧＣＭＳ分析用に処理される。従って、１７００ｇで３分間、室温で２回遠心分離を行った後、水溶性の上清を、濃縮塩酸によってｐＨ２以下にして、塩化ナトリウムで飽和し、３分間ボルテックスをして、エチルアセテート１０ｍｌを用いて２回抽出した。この抽出物を、窒素雰囲気下で蒸発させて、残留物は、ＴＢＤＭＳ５０ｍｌで処理した。誘導体化を最適にするために、試料を９０℃で、４時間加熱した。タンパク質測定は、標準のウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって行った〔２８〕。飽和スルホサリチル酸を用いて沈殿させた後のタンパク質の回収率は、上清のタンパク質測定に基づいて９９％以上であると評価された。
【００５８】
ＧＣＭＳ分析
【００５９】
試薬ガスとしてアンモニアを使用してＰＣｌモードで操作される５９７３質量選択検出器に連結され、モデル７６８３シリーズのインジェクタを具えるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のモデル６８９０Ｎガスクロマトグラフから構成される卓上標準設備形で、全ての試料を測定した。３００℃、パルススプリットレスモードで、注入（１μｌ）が行われた（注入パルス圧力３５ｐｓｉ）。キャリアガスは、一定流速０．７ｍｌ／ｍｉｎの高純度ヘリウムであった。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓタイプＨＰ−５キャピラリカラム（５０ｍ×内径０．２ｍｍ×面厚０．５μｍ）を以下の条件で用いた：１７０℃で１分間、２１０℃まで１０℃／ｍｉｎ、２８０℃まで５℃／ｍｉｎ、それから３２５℃まで２０℃／ｍｉｎで上昇させた。各運転の終わりには、カラムの温度を３２５℃に８分間保って洗浄した。ＧＣＭＳトランスファラインは３００℃であり、イオン源及び四重極温度はそれぞれ３００℃及び１７６℃であった。電子エネルギ及び放出電流は、それぞれ６５ｅＶ及び２４２ｍＡであり、アンモニア圧（１０ｔｏｒｒ）は、１ｍｌ／ｍｉｎに維持した。イオンセット２５７ｍ／ｚ、２５８ｍ／ｚ及び２６８ｍ／ｚをそれぞれ、イオンあたり５０ｍｓ滞留時間で観察して、ＤＨＮ、[２Ｈ］ＤＨＮ（還元ＨＮＥ）、及び内部標準[２Ｈ１１］ＤＨＮを分析した。代替的に、Ｍ＋Ｈ＋イオンに対応するイオンセット３８０、３９０及び４００を低イオン源温度を使用して〔１８〕観察して、ピークの同一性を確認することもできる。しかしながら、この例では、前者のイオンを使用して、より良好なＭＳ信号が得られた。
【００６０】
この研究で報告されているＤＨＮ及びＨＮＥタンパク付加体の量は、二回もしくは三回の試料注入における平均値を表している。コンピュータ統合によって測定されたＤＨＮ及び[２Ｈ］ＤＨＮピークのＧＣピーク領域を、内部標準[２Ｈ１１］ＤＨＮの軽同位体不純物、及び自然発生の重同位体についてそれぞれ補正した。ＤＨＮ及び[２Ｈ］ＤＨＮの量は、補正した領域を使用して、上述の各試料に加えられた内部標準の量〔２９〕から計算した。
【００６１】
方法の検証
【００６２】
以下の方法検証パラメータを測定した。（ｉ）正確度を：〔１−（ＧＣＭＳ測定量／標準量）〕×１００で計算した。（ｉｉ）精度又は相対標準偏差（ＲＳＤ）をＳＤ＊１００／ｍｅａｎで計算した。（ｉｉｉ）検出限界（ＬＯＤ）は、正確かつ高精度に処理して評価した標準ＤＨＮ溶液の最小量を表す。（ｉｖ）定量限界（ＬＯＱ）は、適正な精度で血液又は血漿試料中で分析できるタンパク質由来ＤＨＮ及びＨＮＥの最小量を表している。それは、控え見本中の血液及び血漿の量（５０、１００、２５０、４００及び５００μｌ）を増やして、分析することによって決定した。（ｖ）ＧＣＭＳ分析用の分析内及び分析間ＲＳＤは、１日８回、１試料を、（ｉｉ）３日間で５試料を注入することによってそれぞれ決定した。全ての分析手順についての分析内及び分析間ＲＳＤを、（ａ）ウィスター系ラットから回収してプールした血液試料から得た９試料を、同日に、及び（ｂ）ウィスター系ラットから回収して、別々にアリコートで凍結した血液試料を３日間、処理して決定した。また、−８０℃で凍結した試料が９ヶ月経過する前後に、ウィスター系ラットの４種の異なる血液試料の分析用に分析間ＲＳＤ値を得た。最後に、ＨＮＥに対応する信号の特異性を検証するため、血液試料をプールして６画分に分割し、３画分を、ＮａＢＨ４で処理し、３画分を、ＮａＢ２Ｈ４で処理した。
【００６３】
統計分析
【００６４】
データは、平均値±ＳＤ又はＳＥで表されている。２元配置ＡＮＯＶＡを用いて、（ｉ）ＳＨＲの疾患の発症及び進行（ｉｉ）齢（ｉｉｉ）疾患及び齢の相互作用の影響の有意差を試験し、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較ポストテストを行った。
【００６５】
結果（例３）
【００６６】
方法の検証
【００６７】
図１に示すＧＣＭＳ法を、次のパラメータ：ＬＯＤ、ＬＯＱ、精度、再現性及びロバストネスについて評価した。ＤＨＮ標準溶液で決定した検出限界（ＬＯＤ）を、５０乃至５００ｐｍｏｌ間の量の正確度が９０％以上であるのに対し、５０ｐｍｏｌより少ない量を分析したときに得られた正確度は、１６乃至７６％と不十分であることに基づいて、５０ｐｍｏｌであると予測した（表１）。較正曲線は、４％未満のＲＳＤ値で、試験を行ったＤＨＮ濃度の範囲では直線であった（図２）。
表１：本発明の実施例による、生物試料中の酸化ストレスバイオマーカを検出する方法に使用したＤＨＮ標準溶液のＧＣＭＳ分析用に得た較正データ
2009513953.tif 000003
１乃至５００ｐｍｏｌの標準液を、ＧＣＭＳ分析用に２重に処理した。
【００６８】
この方法のＬＯＱに関し、全血中のタンパク質結合ＨＮＥ及びＤＨＮの分析（図３Ａ）において、ｙ切片の正の値はＬＯＤ範囲にあり、一定の偏りを示したが、直線関係を示した。ｙ切片の値をバックグラウンドとして得て、計算された実験測定値のすべてから差し引いた。血漿中のタンパク質結合ＤＨＮの分析（図３Ｂ）により同様の結果を得たが、血漿中のタンパク質結合ＨＮＥの値は、この方法のＬＯＤ以下であった。良好な精度（ＲＳＤ＜１２％）が、血液中のタンパク質結合ＨＮＥ及びＤＨＮ及び血漿中のＤＨＮの測定値用に得られた。この方法のＬＯＱは、約２５０μｌ試料に対し６０ｐｍｏｌと評価した。しかしながら、定期的アプリケーションでは、確実に最適な精度にするため、実用的な、この方法のＬＯＱは、４００μｌ試料に対し８０ｐｍｏｌ以上とされた。
【００６９】
表２は、４００μｌ血液中のタンパク質結合ＨＮＥ及びＤＨＮの分析用の再現データをまとめたものである。図４は、３０週齢ＳＨＲから回収した代表的な４００μｌ血液試料の典型的なＳＩＭクロマトグラムを示している。分析内及び分析間ＲＳＤは、全血試料のＧＣＭＳ分析については１１％以下であり、全方法については１０％乃至２０％間の範囲であった。最終的に、また、以下の追加データが、我々の方法のロバストネスを裏付けている。第１に、９ヶ月後の、ウィスター系ラットの血液試料中のタンパク質結合ＨＮＥ及びＤＨＮの分析用に得たＲＳＤ値は、−８０℃で凍結されている試料のこれらの付加体の安定性を示している（表２）。第２に、ＨＮＥシグナル（イオン２５８）の特異性は、ＨＮＥをそれぞれ、ＤＨＮ（イオンｍ／ｚ２５７）及び[２Ｈ］ＤＨＮ（イオンｍ／ｚ２５８）へ転化する、ＮａＢＨ４及びＮａＢ２Ｈ４による平行試料の処理によって明らかにされている。我々は、ＮａＢＨ４処理を行ったタンパク質由来ＨＮＥシグナル（イオン２５８）量を、全く検出しなかったが、ＮａＢ２Ｈ４で処理を行ったＤＨＮプラスＨＮＥの測定量に対応するタンパク質由来ＤＨＮ（イオン  ｍ／ｚ２５７）の測定量を評価した（図５）。
表２：本発明の実施例による４００μｌ血液中のＨＮＥ及びＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体のＧＣＭＳ分析用の再現データの概要
2009513953.tif 000004
試料及び方法に記載した通りに、ＧＣＭＳ注入及び異なった日の全血試料の処理の分析内及び分析間ＲＳＤを決定した。示されているデータは、４乃至９の個々の測定の平均値±ＳＤである。
【００７０】
ＳＨＲ及びウィスター系ラットのＨＮＥ及びＤＨＮタンパク付加体の血中レベル
【００７１】
図６に示すタンパク質結合ＨＮＥレベルのデータは、様々な齢のＳＨＲ及びウィスター系ラットから回収した血液を評価したものである。２元配置ＡＮＯＶＡによると、ＨＮＥタンパク付加体の血液レベルは、疾患の進行及び齢とともに著しく増加した。ウィスター系ラットと比較して、ＳＨＲは２２週から、ＨＮＥタンパク付加体の血液レベルが著しく大きくなった。齢に伴う、又はＳＨＲとウィスター系ラット間のタンパク質結合ＨＮＥの血中レベルに観察された差は、いつも同様であった血液タンパクレベルの変化（２３０乃至２７４ｍｇ／ｍｌの間）に起因するものではない。タンパク質結合ＨＮＥと対照的に、血液中（図７）又は血漿中（図示せず）のタンパク質結合ＤＨＮのレベルは、疾患又は齢と共に変化しなかった。
【００７２】
考察
【００７３】
本研究では、血中チオール含有タンパク質に結合したＨＮＥ及びＤＨＮを比較的精度良く定量するＧＣＭＳ法が実証された。この方法には、重水素アルコール[２Ｈ］ＤＨＮへの還元、ラネーニッケルによる試料の処理及び重水素内部標準、[２Ｈ１１］ＤＨＮの使用によるＨＮＥの安定化が含まれている。提案された方法は、次のパラメータＬＯＤ、ＬＯＱ、精度、再現性及びロバストネスについて特徴を有する。現在評されているように、一人の技術者が、１週間あたり、約８０乃至１００試料を処理することができる。異なる分析間の偏差（１０乃至２０％）は、対象間の偏差（３０乃至４０％）より小さい。さらに、ＬＯＱ測定で観察された精度は、それぞれ酸化及びニトロソ化ストレスのマーカとして使用される、血漿イソプロスタン〔３０〕又はニトロチロシン〔３１〕のＧＣ／ＬＣ−ＭＳ分析に匹敵するほどに良好なものである。さらに、生物試料中のＬＰＯ由来生産物の安定性がしばしば重要問題として考えられているが〔３２〕、我々は、ＨＮＥ及びＤＨＮタンパク付加体のレベルが、−８０℃で、９ヶ月間の試料を保存することによってほとんど影響を受けないということを発見した（表２）。これは、遊離ＨＮＥと比較してこれらのタンパク付加体のより優れた安定性に起因するものであるが、Ｓｐｉｅｓ−Ｍａｒｔｉｎら（２００２）は、貯蔵前と−８０℃で２２ヶ月貯蔵した後の組織試料の遊離ＨＮＥが同じレベルであることを報告した〔３３〕。とはいえ、我々は、ＥＤＴＡ中のすべての回収した血液試料に、直ちに凍結又は処理のどちらかを行うことと、ＨＮＥを安定させるためにＮａＢ２Ｈ４で試料を迅速に処理することが比較的重要であると考察している。
【００７４】
本研究では、改良されたＧＣＭＳ法をうまく適用して、ラットの血中ＨＮＥ及びＤＨＮタンパク付加体を分析している。ＨＮＥタンパク付加体は、血液試料中で検出されたが、血漿試料中には検出されなかった。この結果は、ＧＣＭＳによって、オキシム誘導体としてのシッフ(Schiff)塩基残基中の遊離又は結合ＨＮＥを評価したＫｉｎｔｅｒら〔３６〕の見解に一致する。さらに、Ｏｌｉｖｅｒらは、赤血球中の酸化修飾タンパク質の蓄積を立証している〔３７〕。最後に、ＨＮＥは、水相より生体膜中で主に検出され〔１４〕、Ｍｉｃｈａｅｌ付加体を形成する赤血球膜のシステイン残基のスルフヒドリル基とインビトロで急速に反応する。血液ＨＮＥ変性タンパクの半減期については、ほとんど知られていないが、遊離ＨＮＥより大きいと考えられる。実際に、ＨＮＥ変性タンパクは、このＬＰＯ生産物の血中レベルよりフラックスを反映する〔２２〕。この酸化損傷の累積記録は、生物活性ＨＮＥを伴う酸化ストレスに関する事象の高感度測定を提供できる。類推すると、グリコシル化血色素は、長時間の血糖コントロールを反映している〔３８〕。
【００７５】
血液試料中の測定されたタンパク質結合ＨＮＥ濃度は、０．０７ｍＭ乃至０．２２ｍＭ間で変化した。これらの値は、血漿遊離ＨＮＥについて報告された濃度範囲（０．０２６ｍＭ乃至０．８５ｍＭ）〔３２、３３、３６、３９〕にあり、ＨＮＥ由来２ペンチルピロールについての濃度範囲（８ｍＭ乃至３５ｍＭ）〔２２〕よりも小さいが、イソプロスタン（３５ｐｇ／ｍｌ乃至３５６ｐｇ／ｍｌ）〔４０乃至４２〕又はニトロチロシン（２ｎＭ乃至５ｎＭ）の濃度範囲よりも大きかった〔３１、４３、４４〕。平均タンパク質含量２５０ｍｇ／ｍｌに基づいて、及び平均タンパク質分子量を３０，０００、血液中タンパク質結合ＨＮＥ濃度を０．０７ｍＭ乃至０．２５ｍＭと仮定すると、ＨＮＥ修飾血液タンパクは、０．０００８％乃至０．００３％の間であることが示唆される。このパーセンテージは、先に測定した虚血心中のＨＮＥタンパク付加体レベルから計算されたパーセンテージ（およそ０．０２５％）より低い〔１８〕。しかしながら、これは、１μＭ未満である血中遊離ＨＮＥ濃度を考慮するならば、哺乳動物細胞をＨＮＥ１００μＭで培養した場合にインビトロで観察されるタンパク質修飾１％乃至８％〔４５〕に対応する。
【００７６】
この研究の結果、疾患の進行及び老化に伴って、ＳＨＲの血液中ＨＮＥタンパク付加体レベルが増加し、これらのタンパク付加体は、動物モデルで生物活性ＨＮＥに関連する酸化ストレス関連事象の血中バイオマーカであることを示唆するということが立証された。ＳＨＲは、９週乃至１４週の間に高血圧及び左心室肥大を発症した〔４６、４７〕。１５週で、肥大は代償されるが、３０週で、ＳＨＲは、アポトーシスによる心筋細胞死が増加したことを示し、後者は、代償性から非代償性肥大へ変わることと関連している〔４８〕。ＳＨＲに見られた血中タンパク付加体の増加は、増加した酸化ストレスの存在と一致し、４週齢と早くに報告されている〔２７〕。この増加は、機能不全酸化窒素シンターゼ活性〔２７〕、および／または、血管壁のアンジオテンシンＩＩの刺激によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性〔４９〕によって、スーパーオキシドアニオン生成物が増加したことに起因する。また、コントロールラットと比較して、ＳＨＲの心筋ＨＮＥタンパク付加体の累積は持続的により大きなものであり、疾患の進行及び年齢の影響による作用が見られた〔１９〕。血液中のＨＮＥタンパク付加体の増加が、血管壁又は心臓中よりも遅い年齢（２２週対７週）で起こるという事象は、ＳＨＲではＨＮＥが主に細胞内部位で形成されることを示唆している。組織中のＨＮＥタンパク付加体は、間質液と比較すると、より高濃度であることが他者によって報告されており〔１３〕、血中ＨＮＥタンパク付加体の蓄積により、身体全体の組織及び器官の中の解毒作用に対するＨＮＥ生成物の総合的な状態を示すことができることを示唆している。このことに関連して、タンパク質結合ＤＨＮの血中レベルは、アルドース・レダクターゼによるＨＮＥタンパク付加体の酵素の減少によって生じうるものであり〔５０〕、疾患又は齢によって影響されないことが分かった（図７）。それゆえ、ＨＮＥと血中チオールタンパク質に結合したＤＨＮの割合が増加することは、前者のプロセスによる、疾患進行及び年齢に伴うＨＮＥ生産物対解毒作用間の不均衡を示唆している。
【００７７】
要約すると、ここに記述され特徴付けられたＧＣＭＳ法は、比較的、精度及び再現性よく、血液中のＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体を定量する。この方法を使用して、血中タンパク付加体は、増加した酸化ストレスを示す心筋症の動物モデルであるＳＨＲの疾患の進行及び齢に伴って増加することが示された〔１９、２６〕。まとめると、この研究結果によって、心臓疾患及び老化に生物活性ＨＮＥを伴う酸化ストレス誘導ＬＰＯ事象のマーカとして、全血中で測定されたＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体の潜在的な有用性が示唆されている。
【００７８】
試料中の酸化ストレスのバイオマーカの存在を評価するキットを上述の方法の代わりとして用いることができるという仮説が立てられる。また、代替的な方法を、酸化ストレスのバイオマーカを検出するために用いることができるという仮説が立てられる。このような方法の１例では、方法は、酸化ストレスの安定化したバイオマーカと抗体が結合可能な状態下で、酸化ストレスの安定化したバイオマーカに結合する抗体を試料に接触させるステップ及び試料中の結合抗体の存在を検出するステップとを具える。
【００７９】
例４
【００８０】
インビボでＨＮＥと心機能間の潜在的リンクを研究する基礎を提供する自然発生高血圧ラット（５５乃至５７）で、一連の研究を行った。ＳＨＲは、インスリン耐性に関する遺伝的高血圧性心筋症で確立されたモデルである（５８）。それは、９乃至１２週間で高血圧及び左心室肥大を発症する（５９）。１５週で、肥大が代償され、１８乃至２４月齢後に、非代償の機能症状が現れる。ＳＨＲは、抗酸化処理に反応する（６１）、血管壁中の増加した酸化ストレスを示す（６０）。７週で開始したＳＨＲの心筋ＨＮＥタンパク付加体の蓄積の発見（５７）後、ＧＣＭＳ法を検証して、血液中のＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体（ＨＮＥ−Ｐ）を定量し、２２週齢で開始したＳＨＲの血中ＨＮＥ−Ｐが比較的高いことを見いだした（５５）。それゆえ、この例では、インビボで、血中ＨＮＥ−Ｐは心機能と相関し、そして、試験を行ってプロブコールでの抗酸化処理の影響を評価した（６２）。
【００８１】
方法（例４）
【００８２】
動物
【００８３】
カナダ動物管理協会（ＣＣＡＣ）のガイドラインに従って地方の動物管理委員会によって実験が認可された。１８週齢雄ＳＨＲ(Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｃａｎａｄａ）は、１週間順応させた後に、１体あたり重量１０ｍｇ・ｋｇのコーンオイルで溶解したプロブコール（Ｐ）または賦形剤（Ｖ）を、毎日、腹腔内投与を受けるよう無作為投与された。体重を毎日測定した。２２週でラットを屠殺した。ＥＤＴＡ（１０．８ｍｇ）及びブチル化ヒドロキシトルエン（０．０４９６ｍｇ）でプリコートした５ｍｌシリンジを用いて、頸静脈穿刺によって、ケタミン／キシラジン麻酔（筋肉内、８７．５ｍｇ／１２．５ｍｇ・ｋｇ−１）をして血液を収集し、直ちに液体窒素で凍結した。
【００８４】
血圧及び心機能
【００８５】
非侵襲的収縮期血圧を測定し、イソフルラン麻酔下で、ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法及びスタンダード心エコーシステムを具えるＳ１２フェーズドアレイトランスデューサ（Ｓｏｎｏｓ  ５５００、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ａｎｄｏｖｅｒ、Ｍａｓｓ．）を使用して、治療開始前及び治療の終わりの時に、それぞれ、経胸腔心エコー評価を行った。ＳＨＲの収縮機能は、１８週乃至２２週で変化しないことが報告されているので（１３）、我々は、ここに拡張機能を反映する心エコーパラメータのみを報告する。心尖部４腔像で、貫壁性Ｅ波減速時間（ＥＤＴ）及び減速率（ＥＤＲ）を、パルスドプラ法を用いて測定し、僧帽弁伝搬速度（Ｖｐ）は、カラーＭモードスペクトルを通して調べた。ＬＶ等容性弛緩時間（ＩＶＲＴ）は、連続波ドプラを使用して、５腔像で測定し、同時に記録したＥＣＧから得たＲ−Ｒ間隔で補正した（ＩＶＲＴｃ）。胸骨左縁長軸像で大動脈弁レベルのＭモードを使用して、心臓拡張期（ＬＡＤｄ）と収縮期（ＬＡＤｓ）の両方の左心房（ＬＡ）径を測定し、それからＬＡ短縮率（ＬＡＦＳ）を計算した。各測定には、３回の連続心臓サイクルの平均を使用した。
【００８６】
例１で記述したＧＣＭＳによって、処理の終わりに回収した全血４００μｌ中の血中ＨＮＥ−Ｐ、ＨＮＥ−Ｐを定量した。
【００８７】
データ表示及び統計分析
【００８８】
データは、平均値±ＳＥＭである。測定した様々なパラメータ（体重、収縮期血圧及び心臓機能）の値は、処理前の値のパーセンテージとして報告されている。グループ（処理前対処理後）間及びグループ内の統計的有意差は、それぞれ対応のないｔ−検定及び対応のあるｔ−検定により評価された。相関係数を線形回帰分析によって計算した。ｐ≦０．０５の値が有意であると考えた。
【００８９】
結果（例４）
【００９０】
血行動態及び心臓機能
【００９１】
４週間の処理の間、両グループのＳＨＲの体重と収縮期血圧は、同様に７％乃至８％程度、増加した（Ｖ：７．６±０．２、Ｐ：７．９±０．７；及びＶ：８．２±２．４、Ｐ：８．３±２．０％、それぞれ；ｐ＜０．０５）。しかしながら、賦形剤を受けたＳＨＲは、拡張機能の悪化の兆候を示した。（ｉ）ＥＤＴ（減少；図９Ａ）及びＥＤＲ（増加；１８±６％；ｐ≦_０．０５）の変化は、ＬＶコンプライアンスの損失又は硬直の増加を反映しているが、一方で（ｉｉ）Ｖｐ（減少；図９Ｂ）及びＩＶＲＴｃ（減少：８．９±７．０％；ｐ≦０．０５）の変化は、減損ＬＶ弛緩を示した。また、心拍数も、２０％まで増加した（図９ｃ）。これらの有害な機能変化は全て、プロブコールグループでは観察されなかった。このグループでは、ＬＶ拡張機能は維持され、ＬＡ構造及び機能の再形成が減少した；これは、ＬＡＤｄ（減少：−１７．９±６．４％；ｐ≦０．０５）及びＬＡＦＳ（増加；１６．１±５．４％；ｐ≦０．０５）の変化によって反映されている。
【００９２】
血中ＨＮＥ−Ｐ
【００９３】
血中ＨＮＥ−Ｐは、処理の終わりに２２週齢のＳＨＲで評価され、拡張機能障害の指標（ＥＤＲ：Ｒ２＝０．５１８、ｐ＜０．００１；ＥＤＴ：Ｒ２＝０．３７１、ｐ＜０．０１（図８Ａ））及び心拍数（図８Ｂ）に相関がみられた。プロブコール処理は、血中ＨＮＥ−Ｐのメジアン〔最小乃至最大〕（Ｐ：１７０．５〔１２２．５−３７６．０〕；Ｖ：２６１．３〔１５７．０−４４１．５〕）及び平均値（Ｐ：２０８．２±３４．１；Ｖ：２６３．８±２７．４）をそれぞれ、３５％及び２１％ずつ低下させた（ｐ＝０．１）。
【００９４】
考察
【００９５】
この例では、ＳＨＲの血中ＨＮＥ−Ｐレベルと心臓機能の関連性を調べて、プロブコール処理による影響を調べた。１８乃至２２週齢ＳＨＲを、この齢のこれらのラットは血中ＨＮＥ−Ｐが高いという結果に基づいて使用した（５５及び例１）。１８乃至２２週齢で、ＳＨＲは、高血圧であり、代償性心臓肥大を発現している（６４）。賦形剤を４週間受けた１８週齢ＳＨＲの心臓拡張機能が悪化したという結果は、Ｓｌａｍａらによるデータと一致する（２００４）（６３）。この研究では、ＳＨＲのプロブコールの処理は、心臓拡張機能の低下を弱め、左心房機能を改良し、その作用は血圧に関係しなかった。
【００９６】
処理の終わりに評価した血中ＨＮＥ−Ｐレベルは、ＳＨＲの心臓拡張機能の悪化、特に、ＬＶコンプライアンスの減少と正の相関を示した。さらに、血中ＨＮＥ−Ｐと増加した心拍数の間に正の相関がみられた。心拍数の増加は、冠動脈疾患の患者の罹患率及び死亡率と関連する要因である（６８）。最近、免疫組織化学的に測定された肥大型心筋症の患者の右心室中のＨＮＥタンパク付加体と心機能異常の指標との相関が報告された（６９）。プロブコールは、血中ＨＮＥ−Ｐレベルを減少させたが、この結果には比較的小さい統計的有意性だけが観察された。これは、各グループの少数の動物に与えられる第２種の過誤によって生じたものと仮定される。
【００９７】
ここに上述した相関データは、拡張機能障害の発症原因及びＳＨＲの心拍数の調節におけるＨＮＥの潜在的な役割を示唆している。この結果を説明できる仮定の機構を以下に示す。ＨＮＥを含有する単離心臓は、血管拡張、収縮機能の低下及び収縮不全を現す（７０）。単離ラット心室筋細胞では、ＨＮＥは、おそらくイオンチャンネルタンパク質からのシステイン残基の修飾によって催不整脈作用を及ぼす（７１）。それは、また、おそらく、マイトジェン活性タンパク質キナーゼ活性化によって収縮を低下させる（７２）。多くの潜在的な発症機構の中で、この研究と特に関連があるように思われるものに、線維症がある。このプロセスは、ＳＨＲに含まれるＬＶ硬直の決定因子であると考えられ（７３乃至７５）、この因子はＴＧＦｂ１シグナリングを介してＨＮＥによって活性化される（５３）が、プロブコールによって減少する（６５）。
【００９８】
要約すると、この例の結果は、左心室拡張機能は１８週から２２週のコントロールＳＨＲで悪化し、プロブコール処理によって改良される拡張機能障害の限定的なパターンをもたらすことを示している。ＨＮＥ−Ｐと拡張機能障害及び心拍数の両方の間に観察された相関は、ＳＨＲの疾患の進行に関連する病態生理学の事象におけるこのアルデヒドの役割を裏付けるさらなる証拠を提供する。最終的に、血中ＨＮＥ−Ｐは、抗酸化治療の対象になりうる特定の病原性事象に相互に関係することがある。
【００９９】
ヒトの例
【０１００】
例５
【０１０１】
ＨＮＥタンパク付加体の血液レベルを、慢性心不全にかかっているヒト７１人を対象として、ここで上述したように評価した。ＨＮＥタンパク質濃度の平均は、２１４±６７ｎＭであった。レベルは、ニューヨーク心臓境界クラス（Ｒ２＝０．３３；ｐ＜０．０５）と相関があり、疾病重症度との関連性を示唆している。
【０１０２】
本発明は、好適な実施例によってここに上述したが、付記した請求の範囲に規定されるように、本発明の意図、範囲及び原理から外れることなく改良することができる。
【０１０３】
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【０１０４】
この明細書中に引用され、および／または、論じられている全ての参考文献は、参照によってここに全体を組み込んでおり、同程度に、各参考文献を参照によって個別に組み込んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、概略図であり、本発明の１の実施例に従った、同位体希釈ＧＣＭＳによって血液中のＨＮＥ及びチオエーテル結合を介してタンパク質と結合したその代謝産物ＤＨＮ結合を定量するための実験手順の概観を示しており、記号＊は、測定された分子を示している。
【図２】図２は、Ｘ−Ｙグラフであり、ＧＣＭＳ分析の線形性を証明するＤＨＮ用の標準曲線を示している；１乃至５００ｐｍｏｌのＤＨＮ標準液は、２重に分析処理した；９５％信頼区間を有する回帰直線が示されている（傾き：１．０７９±０．００９；ｙ切片：２．２±１．６；ｐ＜０．０００１；Ｒ２＝０．９９９）
【図３】図３は、Ｘ−Ｙグラフであり、血液（図Ａ）と血漿（図Ｂ）の量を増加させて、タンパク質由来ＨＮＥおよびＤＨＮのＧＣＭＳ分析用に得た較正曲線を示している。この分析は、本発明の実施例に従って行われている。様々な量の試料が、２重に分析処理され、９５％信頼区間を有する回帰直線が示されている。（パネルＡ）ＨＮＥ：傾き＝０．２３±０．０２；ｙ切片：１２±５；Ｒ２＝０．９４４；ｐ＜０．０００１；ＤＨＮ：傾き＝０．２６±０．０３；ｙ切片：３４±８；Ｒ２＝０．９２２；ｐ＜０．０００１；（パネルＢ）ＨＮＥ：傾き＝０．００８±０．００４；ｙ切片：４±１；Ｒ２＝０．３４６、ＮＳ；ＤＨＮ：傾き＝０．１９±０．０２；ｙ切片：２６±７；Ｒ２＝０．８９１；ｐ＜０．０００１。
【図４】図４は、Ｘ−Ｙグラフであり、本発明の実施例に従って処理された３０週齢自然発生高血圧ラット（ＳＨＲｓ）の代表的な血液試料の処理から得られた、それぞれＤＨＮ、ＨＮＥ及び重水素化内部標準[２Ｈ１１］ＤＨＮに対応する、イオンｍ／ｚ２５７（上側クロマトグラム）、ｍ／ｚ２５８（中間クロマトグラム）及びｍ／ｚ２６８（下側クロマトグラム）の選択イオン検出クロマトグラムを説明するグラフである。
【図５】図５は、棒グラフであり、本発明による方法を使用して得られたＨＮＥ信号の特異性を示しており、このＨＮＥ信号の特異性は、平行血液試料を、ＨＮＥをＤＨＮ（イオンｍ／ｚ２５７）に、[２Ｈ１１］ＤＨＮ（イオンｍ／ｚ２５８）にそれぞれ転化するＮａＢ２Ｈ４又はＮａＢＨ４で処理を行うことで示されている。ＮａＢＨ４処理をしたタンパク質由来ＨＮＥシグナル量は、まったく検出されなかったが、ＮａＢ２Ｈ４処理をして評価したＤＨＮプラスＨＮＥのシグナルに対応するタンパク質由来ＤＨＮ量は測定された。データは、３回測定した平均値±ＳＥである。
【図６】図６は、棒グラフであり、本発明の実施例による方法を使用して得た、様々な齢のＳＨＲ及びウィスター系ラットの血液中のＨＮＥタンパク質チオエーテル付加体レベルを示しており、７、１５、２２、３０週齢のＳＨＲ及びウィスター系ラットから回収した血液試料（４００ｍｌ）を、ＧＣＭＳ分析用に処理した。データは、８乃至１３ラットの平均値±ＳＥである。統計：Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較ポストテストによる２元配置ＡＮＯＶＡ法。疾患の影響：ＳＨＲ対ウィスター、φφｐ＜０．００１；φｐ＜０．０５老化作用、対７週、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、棒グラフであり、様々な齢のＳＨＲ及びウィスター系ラットの血液中のＤＨＮタンパク質チオエーテル付加体レベルを示しており、このレベルは、本発明の実施例による方法を使用して得た。データは、平均値±ＳＥである。統計：ＮＳ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較ポストテストによる２元配置ＡＮＯＶＡ法。
【図８】図８は、棒グラフであり、４週間プロブコール又は賦形剤を受けた後のＳＨＲの拡張機能（図Ａ＆Ｂ）及び心拍数（図Ｃ）の変化を示す。拡張機能は、ＬＶコンプライアンス（ＥＤＴ：Ｅ波減速時間）と弛緩（Ｖｐ：僧帽弁伝搬速度）指標の減少に反映されている。結果は、処理前の値のパーセントとして示されている。処理の影響：＊ｐ＜０．０５；
【図９】図９は、Ｘ−Ｙグラフであり、４週間プロブコール（・）又は賦形剤（○）を受けた後のＳＨＲの血中ＨＮＥ−Ｐと、（ＥＤＴに反映された）拡張機能の低下（Ａ）と心拍数の増加（Ｂ）の双方間の相関を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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