(57)【要約】本発明は、抗旋毛虫抗体によって認識される新規なポリペプチドに関するものである。さらに、本発明は、抗旋毛虫抗体の検出ならびに旋毛虫症の予防を目的とする前記ポリペプチドの利用法にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体標本において抗旋毛虫抗体を検出する試薬としての、抗旋毛虫抗体によって認識される抗原ポリペプチドの利用方法であり、前記ポリペプチドがＮＢＬ１抗原の免疫優性のエピトープを含み、該エピトープが配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）によって定義されることを特徴とする利用法。
【請求項２】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２５〜１７５番目のアミノ酸を含むかまたは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２５〜１７５番目のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む一つもしくは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項１で定義した一つまたは複数のポリペプチドを含む混合物を用いることを特徴とする、請求項１に記載の利用方法。
【請求項３】
アクセス番号ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＫ１６５２０で特定されるポリペプチドおよびアクセス番号ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＲ３６９００で特定されるポリペプチドを除く、請求項１で定義した抗旋毛虫抗体によって認識される抗原ポリペプチド。
【請求項４】
配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＹＴＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、配列ＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の一つまたは複数の配列を含む、請求項３に記載の抗原ポリペプチド。
【請求項５】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３６３〜４０９番目のアミノ酸を含む、請求項４に記載の抗原ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１で定義したポリペプチドの一つまたは複数のコピーを、場合によっては一つまたは複数の異種配列と融合している、請求項２で定義したポリペプチドの一つまたは複数のコピーと随意に組み合わせて含んでいるキメラポリペプチドで構成されることを特徴とする、請求項３に記載の抗原ポリペプチド。
【請求項７】
請求項３〜請求項６のいずれか一つに記載の抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを一つまたは複数含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
抗体の産生に利用可能な組成物を得るための、請求項１で定義したポリペプチドの利用方法。
【請求項１１】
請求項１で定義したポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１２】
エピトープＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を認識することを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
生体サンプル中で抗旋毛虫抗体の存否を検出する方法であり、
−前記生体サンプルを、前記サンプルの中に場合によっては存在する抗旋毛虫抗体との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件のもとで、請求項２で定義した一つまたは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項１で定義した一つまたは複数のポリペプチドと接触させることと、
−あらゆる適切な手段によって、場合によっては形成される抗原／抗体複合体を検出すること、
を含んでいることを特徴とする検出方法。
【請求項１４】
生体サンプル中で抗旋毛虫抗体の存否を検出するために必要な物のセットであり、請求項２で定義した一つまたは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項１で定義した一つまたは複数のポリペプチドを含み、そして、場合によっては、抗原／抗体複合体の形成を可能にする反応培地を構築するための適切な緩衝液および試薬、そして随意に前記抗原／抗体複合体の検出手段を含んでいることを特徴とするセット。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが固体の担体上に固定されていることを特徴とする、請求項１４に記載のセット。
【請求項１６】
免疫応答を向上させることを可能にする一つまたは複数のアジュバントと結びついている、
請求項２で定義した一つまたは複数のポリペプチドと随意に組み合わせた、請求項１で定義した一つまたは複数のポリペプチド、
あるいは、請求項２で定義した前記ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドと随意に組み合わせた、請求項１で定義した前記ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチド
を含む免疫原性組成物。
【請求項１７】
ワクチンであることを特徴とする、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、旋毛虫症の診断および予防の分野における、寄生虫である「旋毛虫」において同定された新規の抗原の利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
旋毛虫症は、寄生虫である「旋毛虫」に感染した肉の消費に関連した人獣共通感染症の一つである（ＭＵＲＲＥＬＬ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０００３】
「双器綱」のこの線虫は、旋毛虫科に属し、該旋毛虫科は、系統発生学的に異なる二つのグループと関連する８つの種と３つの遺伝子型を含んでおり、該二つのグループとは、一つは哺乳動物に感染する、被嚢を形成する旋毛虫であり（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔ．ｎａｔｉｖａ、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉ、Ｔ．ｍｕｒｒｅｌｌｉ、Ｔ．ｎｅｌｓｏｎｉ）、もう一つは、哺乳動物、鳥類および爬虫類に感染する、被嚢を形成しない旋毛虫（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔ．ｐａｐｕａｅ、Ｔ．ｚｉｍｂａｂｗｅｎｓｉｓ）である（ＧＡＳＳＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらすべての種は人に感染する可能性がある。
【０００４】
寄生虫の生活環は自動異宿主性である。該生活環は、連続的に終宿主（成長した寄生虫のキャリア）でもあり中間宿主（感染幼虫のキャリア）でもある、同一の宿主で全て展開される（ＢＯＩＲＥＡＵ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。感染幼虫の一つの宿主からもう一つ宿主への移行は、新しいサイクルを行うために必要である。この移行は、幼虫に感染した生の肉または十分に焼かれていない肉を摂取することによって起こる。消化の際、該幼虫は解放され、そして腸上皮に侵入し、そこで性別のある成虫（Ａｄ）へと脱皮する。受精した雌は、次に新生Ｌ１幼虫（Ｌ１ＮＮ）を生み出し、該幼虫はリンパおよび血液の流れを介して横紋筋に達する。これらのＬ１ＮＮ幼虫は筋肉細胞に侵入し（Ｌ１Ｍ：筋肉Ｌ１幼虫の感染進行段階）、被嚢を形成する旋毛虫の場合には厚い保護性のコラーゲン嚢で、被嚢を形成しない旋毛虫の場合には非常に薄い保護性のコラーゲン嚢で覆われている、フィーダー細胞への脱分化を引き起こす。
【０００５】
旋毛虫症は動物においては無症状であるが、ヒトへの感染は、初期の腸の段階では嘔吐感を伴う下痢、嘔吐および激しい腹痛として現れるのに対し、筋肉への侵入段階に関連する症状は、熱、顔のむくみおよび筋肉痛の合併を特徴としている（ＣＡＰＯ  ＆  ＤＥＳＰＯＭＭＩＥＲ、１９９６）。目、肺、胃腸、心臓および神経系での発症も、進行が致死的となり得る旋毛虫症のこの診断指標に加えることができる。患者における筋肉痛の持続を代表とする感染の慢性的な特徴は、フィーダー細胞内部で寄生虫が生存していることに関連している。
【０００６】
駆虫薬によるヒトの旋毛虫症の特異的な治療は、あらゆる寄生段階に対する対処、特にＬ１Ｍ幼虫の周りにコラーゲンの保護嚢が形成される前の対処が可能になるよう感染の診断が早期に行われると、より効果的である（ＦＯＵＲＥＳＴＩＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【０００７】
疫学的なデータによって、ブタに代表される家畜における感染のサイクルも支えている野生動物の数多くの種を伴う伝染様式に関連する、あらゆる地帯における寄生虫の地理的分布が示されている（ＤＵＰＯＵＹ−ＣＡＭＥＴ，２０００）。
【０００８】
ヒト旋毛虫症の流行、すなわち突発的または再発的な人獣共通感染症の流行は、食習慣および必ずしも有効ではない衛生管理の問題のために、世界中の公衆衛生における現実的な問題となっている（ＭＵＲＲＥＬＬ  ＆  ＰＯＺＩＯ，２０００）。これらの流行は、豚およびイノシシの肉ならびに馬肉に主として関与している（ＢＯＩＲＥＡＵ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０００９】
したがって、ヒトの汚染の予防は、肉の中心まで火を入れることと、飼育条件および／または動物（豚、馬、イノシシおよび旋毛虫に敏感なその他の野生動物種）の旋毛虫症の管理を向上させることを介して行われる（ＢＯＩＲＥＡＵ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１０】
旋毛虫症のスクリーニング技術は二つに分けられる。すなわち、１）トリキノスコープ（肉片の顕微鏡観察）による、すなわち筋肉サンプルの人工的な消化の後の、Ｌ１Ｍ幼虫の直接的な検出と、２）旋毛虫抗原に対する抗体の検出を可能にする、さまざまな免疫学的方法による間接的な検出である。
【００１１】
寄生虫の各発達段階、すなわち成虫（Ａｄ）、新生幼虫（Ｌ１ＮＮ）および筋肉幼虫（Ｌ１Ｍ）は、特定の抗原プロフィールに対応している。
【００１２】
現状で免疫診断に用いられているものは、Ｌ１Ｍ段階の幼虫に由来する抗原調製物である。実際、二つの先行する段階ＡｄおよびＬ１ＮＮの抗原成分は精製するのが難しく、これら二つの段階の一方および／または他方に関連する免疫優性の抗原は現在までに特定できていない。
【００１３】
主として、幼虫の溶解、溶解物の遠心分離、そして上清の回収によって得られた全可溶性抗原の調製物、あるいは、より頻繁には、排泄／分泌抗原（Ｅ／Ｓ抗原）が用いられている。
【００１４】
排泄−分泌抗原はＬ１Ｍ幼虫を培地で生育させる際に産生される。該抗原はスティコソームと称される特定の器官に由来し、該器官は、およそ５０の円盤状の細胞であるスティコサイトで構成されている。スティコサイトは粒状物を含んでおり、その内容物は寄生虫の食道の管腔にある小管によって排出されるものである。この内容物は非常に抗原性が高く、排泄分泌抗原の一部を構成する。これらの抗原はタンパク質の複雑な混合物を形成し、該混合物はとりわけ、特定の糖分子を有する糖タンパク質の群（ＴＳＬ１抗原と称される）を含んでおり、該糖分子は、旋毛虫のみで知られておりかつこの寄生虫のすべての種に存在しているベータ・チベロースである。
【００１５】
排泄−分泌抗原の調製物は、現状では旋毛虫症の免疫診断材料の基準として用いられており、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍ幼虫の培地から得られる。１８〜２０時間の培養の後、培地を濾過によって回収し、そして濃縮する（ＧＡＭＢＬＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、ＧＡＭＢＬＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【００１６】
全可溶性抗原の調製物は、主な不都合としては特異性が欠けている。その他の寄生虫症と交差した抗原性反応が頻繁に観察されている。排泄−分泌抗原によってより良い特異性を得ることが可能となる。しかし、いずれの場合にも、抗原の標準化されたロットを大量に生産するのは難しい。
【００１７】
ベータ・チベロースを含む糖の構造は、Ｅ／Ｓ抗原調製物の免疫優性のエピトープに相当し（ＲＥＡＳＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、米国特許第５５４１０７５号明細書および米国特許第５７０７８１７号明細書）、化学的に合成されており、旋毛虫の免疫診断のために利用することが提案されている。
【００１８】
この試薬は良好な特異性を有しているが、その感度はＥ／Ｓ抗原調製物よりも低いようである。さらに、化学的方法によるこの構造の合成は、実施するのにコストが高く、負担の大きいものになっている。
【００１９】
旋毛虫の血清学的診断の領域でぶつかるもう一つの問題は、検出の「ブラインド・ウィンドウ」が存在することであり、該ブラインド・ウィンドウは感染の早い段階に対応し、偽陰性の結果として現れる。さらに、馬では、感染後の２５週目には抗体の漸次的な消失が観察されている。
【特許文献１】米国特許第５５４１０７５号明細書
【特許文献２】米国特許第５７０７８１７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明者らは、旋毛虫による感染の早い段階に関連し、旋毛虫症の血清学的診断に利用可能な免疫優性の抗原を特定することで、ヒトだけでなく動物において、早期の、特異的な、かつ旋毛虫への感染に敏感な検出が得られる手段を提供することに取り組んだ。この目的において、本発明者らは、Ｌ１ＮＮ段階および／またはＡｄ段階の旋毛虫によって発現される遺伝子産物の中に、所望の抗原特性を有するタンパク質が存在するかどうか研究した。
【００２１】
この枠組みにおいて、本発明者らは、旋毛虫のＬ１ＮＮ段階で特異的に発現するタンパク質の一部をなすＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓのタンパク質が免疫優勢性の抗原を構成し、該タンパク質によって、旋毛虫に対する液性応答の早期検出が可能になることと、該タンパク質がさらに、旋毛虫のさまざまな種の間で保持されていることを発見した。
【００２２】
このタンパク質を以下ではＮＢＬ１と称することにする。このタンパク質をコードしているｃＤＮＡの完全な配列ならびにこの配列から推定されるポリペプチド配列は、それぞれＡＦ３３１１６０およびＡＡＫ１６５２０という番号のもと、Ｇｅｎｂａｎｋでアクセス可能であり（あるいはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｑ９ＢＪＬ７）、これらの配列は「セリンプロテアーゼＳＳ２、新生幼虫に固有」という註が付けられている。また、これらの配列は、添付の配列表において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２という番号で再掲されている。このタンパク質をコードしているｃＤＮＡの部分配列ならびにこの配列から推定されるポリペプチド配列は、ＡＹ４９１９４１およびＡＡＲ３６９００という番号のもと、それぞれＧｅｎｂａｎｋでアクセス可能である（あるいはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｑ６ＲＵＪ３）。
【００２３】
さらに、本発明者らは、ＮＢＬ１に対する液性応答に関連する免疫反応性がこのタンパク質のＣ末端部分に局在していることを示し、この反応性を担う免疫優性のエピトープを特定した。
【００２４】
他方では、本発明者らは、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＡｄとＬ１ＮＮを混合した早期段階のｃＤＮＡライブラリーから、以下では４１１と称する新たな遺伝子を特定した。
【００２５】
この遺伝子の配列は、添付の配列リストにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３という番号で示されており、該遺伝子配列の翻訳産物の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４という番号で示されている。この遺伝子の翻訳産物は、タンパク質Ｔｐ２１−３と称され、Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓで同定されているＥ／Ｓ抗原（ＡＡＦ７９２０６、ＮＡＧＡＮＯ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）と関連性を有し（７８．７％の同一性）、さらに、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓの推定ＯＲＦ１７．２０の翻訳産物（ＡＡＢ４８４８９）とも関連性を有し、該産物とは８６．６％の同一性を有する。
【００２６】
また、４１１遺伝子の翻訳産物によって、早期段階で、旋毛虫のさまざまな種に対する液性応答を検出することが可能となる。
【００２７】
さらに、実験を行ったところ、他の抗原によってもＥ／Ｓ抗原によっても少なくとも感染後（ｐｉ）１５日〜３０日の間には検出されなかった旋毛虫に感染した動物を、ＮＢＬ１抗原および４１１抗原のそれぞれによって検出することが可能であった。
【００２８】
したがって、ＮＢＬ１抗原（または該抗原の免疫優性のエピトープ）と４１１抗原を組み合わせることによって、診断の感度、とりわけ感染の初期段階（感染後１５日〜２０日）に対する感度を向上させることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
したがって、本発明は生体標本において抗旋毛虫抗体を検出するための試薬としての、抗旋毛虫抗体によって認識される抗原ポリペプチドの利用法を対象としており、該使用法は、前記ポリペプチドが、
ａ）配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）によって定義されるＮＢＬ１抗原の免疫優性のエピトープを含んだポリペプチドと、
ｂ）以下で４１１抗原とも称されるポリペプチドであり、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２５〜１７５番目のアミノ酸を含むか（４１１タンパク質の成長した形に相当する）、あるいは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２５〜１７５番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくはより高く、少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含むポリペプチド、
から選択されることを特徴としている。
【００３０】
より特徴的には、本発明は、生体サンプルにおける抗旋毛虫抗体の存否の検出方法を対象としており、該方法は、
−前記生体サンプルを、前記生体サンプルに場合によっては存在する抗旋毛虫抗体との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件のもとで、上記で定義した一つもしくは複数のポリペプチドａ）および／または一つもしくは複数のポリペプチドｂ）と接触させることと、
−あらゆる適切な手段によって、場合によっては形成される抗原／抗体複合体を検出すること、
を含むことを特徴としている。
【００３１】
一般的には、前記生体標本は血清標本である。該血清標本は、旋毛虫に感染しうる種に属する、この寄生虫の存否を検出しようとするあらゆる対象（哺乳動物、鳥類または爬虫類）から得ることができる。有利には、哺乳動物、例えば飼育動物またはヒトの患者から得られる標本である。
【００３２】
有利には、上記で定義した一つもしくは複数のポリペプチドａ）および／または一つもしくは複数のポリペプチドｂ）を含む混合物が用いられる。
【００３３】
この組み合わせによって、とりわけ、個別に用いた各ポリペプチドに比べて反応性の幅を広げることが可能となる。
【００３４】
また、アクセス番号Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＫ１６５２０で識別される全ＮＢＬ１抗原と、アクセス番号Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＲ３６９００で識別されるその断片を除き、上記で定義したポリペプチドａ）はそれ自体で本発明の対象の一部をなす。
【００３５】
本発明にしたがったこれらのポリペプチドのうち、とりわけ、配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＹＴＧＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、配列ＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のうち一つまたは複数を含んだポリペプチドが挙げられる。
【００３６】
これには、例えばＮＢＬ１抗原のＣ末端領域の断片も含まれ、とりわけ、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３２６〜４５９番目のアミノ酸に対応する、
ＥＮＳＰＥＧＴＶＫＷＡＳＫＥＤＳＰＶＤＬＳＴＡＳＲＰＴＮＰＹＴＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＹＴＧＳＲＰＴＰＱＫＰＶＦＰＳＹＱＫＹＰＰＡＶＱＫＹＩＤＳＬＰＳＧＴＱＧＴＬＥＹＴＶＴＱＮＧＶＴＴＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
を含んだ断片が挙げられ、またこの配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の小断片、とりわけ、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３６３〜４０９番目のアミノ酸に対応する、
ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）という配列を含んだ小断片も含まれ、より特徴的には、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３４９〜４１５番目のアミノ酸に対応する、
ＳＲＰＴＮＰＹＴＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＹＴＧＳＲＰＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）という配列を含んだ小断片が含まれる。
【００３７】
上記で定義したポリペプチドｂ）は、アクセス番号ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＦ７９２０６およびＡＡＢ４８４８９で識別されるものを除いて、それ自体で本発明の対象の一部をなす。好ましいポリペプチドはとりわけ、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリペプチド、または、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２５〜１７５番目のアミノ酸に対応するポリペプチド、ならびに、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２５〜１７５番目のアミノ酸配列との間に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドである。
【００３８】
とりわけ、本発明は、配列ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の一つもしくは複数のコピー、またはこの配列を含むＮＢＬ１抗原の断片の一つもしくは複数のコピー、および／または、上記で定義したポリペプチドｂ）の一つもしくは複数のコピーを含む、場合によっては一つもしくは複数の他の異種配列と融合しているキメラポリペプチドを含む。
【００３９】
また、本発明は、本発明にしたがったポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、前記ポリヌクレオチドを含んだ組換えベクター、および前記ベクターによって形質転換した宿主細胞も対象としている。
【００４０】
また、本発明は上記で定義したような、一つまたは複数のポリペプチドａ）および一つまたは複数のポリペプチドｂ）を含んだ組成物、ならびに、前記ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含んだ組成物も対象としている。
【００４１】
上記で定義したポリペプチドａ）およびｂ）は、それ自体既知である、抗体検出のさまざまな方法の範囲で用いることができる。例えば、とりわけ、ＥＬＩＳＡタイプの方法（直接、間接またはサンドイッチ）、ビーズへのミクロ凝集方法、ならびに、免疫標識に組み合わせた電気泳動転写法などが挙げられる。
【００４２】
また、本発明は生体サンプルにおける抗旋毛虫抗体の存否を検出するために必要な物のセットも対象としており、これは、上記で定義した一つもしくは複数のポリペプチドａ）および／または一つもしくは複数のポリペプチドｂ）、ならびに場合によっては、抗原／抗体複合体の形成を可能にする反応培地を構築するための適切な緩衝液および試薬、ならびに選択的に、前記抗原／抗体複合体の検出手段を含むことを特徴としている。
【００４３】
有利には、前記セットは、固体の担体の上に固定されている、上記で定義したポリペプチドａ）および／またはポリペプチドｂ）を含んでいる。利用可能な固体の担体の非限定的な例としては、マイクロタイタープレート、ビーズ、マイクロビーズまたは微粒子、試験紙などが挙げられる。
【００４４】
また、前記セットは、一つまたは複数の陰性血清および一つまたは複数の陽性血清のような、コントロールサンプルも含むことができる。
【００４５】
また、本発明は、前記ポリペプチドに対する特異的な抗体を調製するための、上記で定義したポリペプチドａ）またはポリペプチドｂ）の利用法も対象としている。
【００４６】
これらのポリペプチドは、それ自体既知である、さまざまな抗体の調製方法の範囲で利用することができる。例えば、該ポリペプチドは（場合によっては適切なアジュバントの添加後に）動物の免疫付与に利用することができる。また、該ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーの担体にグラフトすることで、生体液から目的のポリペプチドに対する特異的な抗体を精製できるようにすることができる。生体液とは、例えば目的とするポリペプチドで事前に免疫付与した動物の血清あるいはハイブリドーマの上清とすることができ、また、旋毛虫に感染した動物の血清であり、目的とするポリペプチドに対する特異的な抗体の亜集団を単離するための血清とすることもできる。
【００４７】
また、本発明には、上記で定義したポリペプチドａ）またはポリペプチドｂ）に対するあらゆる特異的な抗体が含まれる。それはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とすることができる。好ましい抗体は、ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のエピトープを認識する抗体である。
【００４８】
ポリペプチドに対する特異的な抗体は、それ自体既知であるさまざまな技術によって、とりわけ、目的とするポリペプチドで動物を免疫付与すること（場合によっては適切なアジュバントを添加する）と、その血清（ポリクローナル抗体の産生用）またはリンパ球細胞（モノクローナル抗体の産生用）を回収することを含む、従来の方法によって得ることができる。
【００４９】
上記で定義したポリペプチドａ）およびｂ）ならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、免疫原性組成物、とりわけ抗旋毛虫ワクチンを調製するために利用することができる。
【００５０】
また、本発明は、上記で定義した一つもしくは複数のポリペプチドａ）および／または一つもしくは複数のポリペプチドｂ）を含んだ免疫原性組成物、あるいは、免疫応答の向上を可能にする一つまたは複数のアジュバントと結びついている、前記ポリペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含んだ免疫原性組成物も対象としている。
【００５１】
本発明にしたがった免疫原性組成物の好ましい実施態様によると、それはワクチンである。
【００５２】
ペプチドの免疫原性の向上を可能にする非常に多様なアジュバントはそれ自体当業者には知られており、例えば、ミョウバン（水酸化アルミニウム）、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、リポソーム、ならびにウィロソーム（再構成されたウイルスエンベロープ）、ムラミン酸のペプチド誘導体などが挙げられる。ワクチンの場合、当然、薬学的に許容可能なアジュバントが選択されることになり、好ましいアジュバントの例としては、例えばＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７０およびＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７７５という名称でＳＥＰＰＩＣ社によって市販されており、かつ欧州特許第４８０９８２号明細書、欧州特許第８２５８７５号明細書、米国特許第５４２２１０９号明細書、米国特許第６２５１４０７号明細書、米国特許第６６１０３０９号明細書にも記載されているアジュバントのような、「油中水型」エマルジョンタイプのアジュバントが挙げられる。
【００５３】
場合によっては、とりわけ短いペプチド（３０個以下のアミノ酸）の場合、前記ポリペプチドはキャリアタンパク質と結合させることができる。
【００５４】
キャリアタンパク質の例としては、とりわけＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン、Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドが挙げられる。また、同一ペプチドの複数のコピーを互いに組み合わせることで、また場合によってはキメラポリペプチドの形でその他のペプチドエピトープと組み合わせることで、あるいは、例えばポリリジンのようなポリマー鎖を介して、マルチエピトープの組成物を形成することもできる。
【００５５】
免疫原としてポリヌクレオチドを使うのであれば、免疫原組成物は、投与すべきポリヌクレオチドが挿入された組換えベクターの形をとることができる。例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）などのウイルスベクターを用いることができる。また、該組成物は、前記ポリヌクレオチドを含む一つまたは複数の発現ベクターによって形質転換された、非病原性バクテリアの形をとることもできる。また、ポリヌクレオチドを裸のＤＮＡの形で直接投与するか、あるいは、リポソームに包入することもできる。ワクチンの場合、好ましくは非病原性バクテリア（例えば乳酸菌、あるいは大腸菌またはサルモネラ菌の非病原性株）、または、ワクチンウイルス株から派生したベクター、例えば仮性狂犬病（オーエスキー病）ウイルスのワクチン株から派生したベクターが用いられることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は、旋毛虫症の早期の免疫診断を目的とした、ＮＢＬ１抗原および４１１抗原の利用法を示した実施例に関する、以下の説明の補足によってよりよく理解されるものである。
【００５７】
図１：タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の配列。
ＮＢＬ１に由来する配列を太字で示し、ｐＥＴ１０２プラスミドに由来する配列は斜体で示している。
【００５８】
図２：タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の免疫反応性。
Ｍ：分子量マーカー、１：陰性のブタの血清、２：２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍで実験的に感染させたブタの血清。
【００５９】
図３：Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染させたブタの血清においてＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）またはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出された抗旋毛虫抗体の出現動態の比較。
Ａ：ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）による検出、Ｂ：ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによる検出。
横軸：感染後の日数、縦軸：反応性のパーセント。ＥＬＩＳＡによる検出限界は黒い線で示している（ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）については４４％、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓについては１４％）。サンプル／ポジティブコントロール比の平均および標準偏差は感染したブタの各群について示している。
【００６０】
図４：ＥＬＩＳＡ  ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の特異性。
横軸：産業用のブタと野外飼育のブタに由来する２３０の陰性サンプルのコホート。５つの陽性サンプルは実験的に感染させたブタの血清に由来している。限界値は陰性サンプルの平均値の２倍に等しい。縦軸：反応性のパーセント。
【００６１】
図５：タンパク質ＴＨＸ−４１１の配列。
４１１に由来する配列は太字で示している。プラスミドに由来する配列は斜体で示している。
【００６２】
図６：タンパク質ＴＨＸ−４１１の免疫反応性。
１：感染後５０日の陽性血清、２：感染後３０日の陽性血清、３：５日前の陰性血清、４：共役型コントロール。Ｍ：分子量マーカー。
【００６３】
図７：Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染したブタの血清においてＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１またはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出した抗旋毛虫抗体の出現動態の比較。
Ａ：ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１による検出、Ｂ：ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによる検出。
横軸：感染後の日数、縦軸：反応性のパーセント。ＥＬＩＳＡによる検出限界は黒い線で示している（ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１では５２％、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓでは１４％）。サンプル／ポジティブコントロール比の平均と標準偏差は感染したブタの各群について示している。
【実施例１】
【００６４】
実施例１：ＮＢＬ１のＣ末端部分を含んだ、組換えタンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の産生。
Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１ＮＮのｃＤＮＡライブラリーに対する免疫スクリーニングを、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓの１００００匹のＬ１Ｍによって実験的に感染させた後３５日目に得られたブタの血清を用いて行った。この血清によって認識されたクローンのシーケンシングによって、それらのうち大半が同一のタンパク質をコードしていることが判定できた。
【００６５】
このタンパク質は推定セリンプロテアーゼであり、そのｃＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列は、それぞれ、ＡＦ３３１１６０およびＡＡＫ１６５２０という番号のもとＧｅｎｂａｎｋで入手可能であり、また、ここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の番号で再掲している。該タンパク質はここではＮＢＬ１と称することにする。
【００６６】
タンパク質のＣ末端部分を、ＮＢＬ１ＣｔｅｒｍＦ（５’−ＣＡＣＣＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）とＮＢＬ１ＣｔｅｒｍＲ（５’−ＴＧＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＡＣＴＣＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）オリゴヌクレオチド、そしてＤＮＡポリメラーゼＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて増幅し、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の推奨にしたがって発現キット「Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ１０２  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ」を用いて、プラスミドｐＥＴ１０２Ｄ／ｔｏｐｏでクローニングした。
【００６７】
得られた組換えプラスミドはｐＥＴ１０２−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）と称するもので、２９１個のアミノ酸からなり、Ｃ末端の位置にポリヒスチジンタグを有している、チオレドキシンＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）（ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ））融合タンパク質をコードしている。この融合タンパク質の配列は図１に示している。
【００６８】
融合タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）は、プラスミドｐＥＴ１０２−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）によって形質転換した大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で発現させ、そして、提供者（Ｑｉａｇｅｎ）によって推奨される手順を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡスピン・カラム・キット、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ）上で、変性条件下でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００６９】
精製された融合タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）は、変性条件下での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の後、３１．１ｋＤａの予期されたサイズのバンドの形で現れた。
【００７０】
旋毛虫症に感染していないブタの血清、および感染後６０日目に採取された、２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍ幼虫で感染させたブタの血清に対する、タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の免疫反応性を、ウェスタンブロッティングによって分析した。
【００７１】
変性条件下の電気泳動の後（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、提供者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の指示にしたがってタンパク質をＨｙｂｏｎｄ  Ｐ膜（ＰＶＤＦ）でエレクトロブロッティングした。膜は、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）と５％の脱脂乳において１時間にわたってプレハイブリダイゼーションした。１分間にわたるＴＢＳ−Ｔによる２回の洗浄の後、そして５分間にわたるＴＢＳ−Ｔでの３回の洗浄の後、膜を、ＴＢＳで１／２００に希釈したブタの血清を用いて１時間インキュベートした。洗浄後、膜を、１／３００００に希釈した、アルカリフォスファターゼ（Ａ１１９２、Ｓｉｇｍａ社）で標識した抗ブタＩｇＧウサギ二次抗体を用いて２０分間インキュベートし、次に、標識を視認できるようにするために、３０分間にわたって純粋なＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｅ１１６、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社）を用いてインキュベートした。
【００７２】
結果は図２に示している。
【００７３】
Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染したブタの血清によるＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の非常に強い免疫反応性が観察される。
【実施例２】
【００７４】
実施例２：旋毛虫に対する液性応答を検出するためのＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の利用法。
上記実施例１に記載したように調製したタンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）を、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓの排泄／分泌抗原（Ｅ／Ｓ）と比較して、旋毛虫に感染したブタに由来する血清に対する間接ＥＬＩＳＡ法によって評価した。
【００７５】
対照のＥ／Ｓ抗原をＧＡＭＢＬＥら（１９８８）に記載の手順にしたがって調製した。該抗原は、１％のピルビン酸塩、１５％のウシ胎児血清（ＳＶＦ）、１％のＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０において２４時間にわたって維持されたＬ１Ｍ幼虫の培養物の上清から得た。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ検定のために、Ｅ／Ｓ抗原については１．２５μｇ／ｍｌ、ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）については２μｇ／ｍｌの割合で１×ＰＢＳ緩衝液で希釈した抗原を、９６ウェルプレート（ＭｅｄｉＳｏｒｐプレート、ＮＵＮＣ社）において４℃で一晩インキュベートした。３回の洗浄後（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）、プレートを、洗浄液で２％に希釈した脱脂乳溶液で１時間にわたって室温で飽和させた。
【００７７】
各ウェルに、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた、１×ＰＢＳ緩衝液で１／２０に希釈した１００μｌのブタの血清を置いた。３７℃での３０分間のインキュベーションと、続く３回の洗浄の後（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）、各ウェルに、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた、１×ＰＢＳ緩衝液で１／３２０００に希釈した１００μｌの共役溶液（Ｇタンパク質−ペルオキシダーゼ（Ｐ−８１７０、Ｓｉｇｍａ社））を置いた。３７℃での３０分間の新たなインキュベーションと、続く３回の洗浄の後（１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）、各ウェルに１００μｌの基質溶液（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン−過酸化水素：ＴＭＢ３）を置いた。暗闇において室温で２０分にわたるインキュベーションの後、１００μｌ／ウェルで０．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加することで反応を止めた。プレートの読み取りは４５０ｎｍでの吸光度の測定によって行った。
【００７８】
ＥＬＩＳＡのプレートの読み取り結果は、
Ｅ／Ｐ％＝（サンプルのＯＤ−ネガティブコントロールのＯＤ／ポジティブコントロールのＯＤ−ネガティブコントロールのＯＤ）×１００
という、ポジティブコントロールの血清に対するサンプル血清の反応性のパーセントの形で示される。
【００７９】
陽性の限界値（基準となる陰性サンプルの平均値の２倍に等しい）は、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓについては１４％、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）については４４％である。
【００８０】
２００、１０００または２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍ幼虫で実験的に感染させた通常のブタの血清において、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）またはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出された抗旋毛虫抗体の出現動態を比較した。
【００８１】
結果は図３に示している。
【００８２】
ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）抗原によって、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに対する液性応答の容量依存的な検出が可能となった。また、ウェスタンブロッティングによるリニアエピトープの検出に伴うＥＬＩＳＡ検定による立体構造エピトープの検出は、旋毛虫のＮＢＬ１タンパク質の免疫優性を証明している。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）は感染後２５日からセロコンバージョンを検出したのに対し、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓは１０日遅れてしかセロコンバージョンを検出しなかった。
【００８４】
また、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓおよび欧州で特定されている旋毛虫の他の三種、Ｔ．ｎａｔｉｖａ、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉおよびＴ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによって誘発された液性応答のＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによる検出とＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）による検出も比較した。
【００８５】
結果は以下の表Ｉにまとめている。
【００８６】
【表１】
2009525740.tif 000002
【００８７】
これらの結果の全体は、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）によって、強く感染した動物については感染後１５日目から液性応答の特に早い検出が可能となり、中間的な量である１０００匹のＬ１Ｍで感染させた動物についてはわずかに遅い検出（感染後２５日目）が可能となることを示している。同様の結果は、同じ手順にしたがって感染した微生物を有するブタでも得られた。ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓで検出された最も早いセロコンバージョンは感染後２５日目だった。２つのＥＬＩＳＡ検定で得られた結果の比較は、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の利用によるＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓの診断が早さという点で５〜２０日有利であることを証明している（表Ｉ）。さらに、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）で一度に診断したＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染させた動物では、すべてについて、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）での血清の検出ウィンドウが縮小した。ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の感度は、この動物実験のうちの７／９の通常のブタ、すなわち２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍで感染させた３／３のブタ、１０００匹のＬ１Ｍで感染させた３／３のブタ、そして２００匹のＬ１Ｍによってのみ感染した１／３のブタに対する有効なスクリーニングによって証明された。検出は、これらの動物におけるＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓの筋肉寄生虫の量に関連しており、その量は、２００匹のＬ１Ｍで実験的に感染させたブタについては平均でグラムあたり３匹の幼虫（ＬｐＧ）、１０００匹のＬ１Ｍで実験的に感染させたブタについては４３ＬｐＧ、そして２００００匹のＬ１Ｍで実験的に感染させたブタについては５３８ＬｐＧの変動がある。
【００８８】
欧州で特定されている旋毛虫の他の三種、Ｔ．ｎａｔｉｖａ、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉおよびＴ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによって誘発された液性応答も、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）によって容量依存的に検出されており、このことは、旋毛虫属におけるＮＢＬ１の遺伝子的保存および抗原的保存（免疫優性）、ひいては旋毛虫症の広い範囲での診断に対する利点を証明している。診断の感度と早さ（感染後１５日目）が確認されている。セロコンバージョンのウィンドウは、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）では５日〜４５日で縮小し、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓの感染と同様に、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）で一度に診断した動物の全体では、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）での血清の検出ウィンドウが縮小した。さらに、Ｔ．ｎａｔｉｖａ種による感染分析では、筋肉寄生虫の量が平均して７×１０−４〜０．１ＬｐＧでしかなかったにも関わらず６／９の動物（そのうち２頭のブタはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓではスクリーニングされていない）を診断したＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の強い感度が証明された（対するＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓでは５／９である）。
【００８９】
ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の特異性は、各感染実験の前および感染後１０日までに動物の全体から採取した血清によって証明された。野外飼育のブタの２００以上の血清を、分子の特異性を示すために用いた。旋毛虫に対して陰性のブタはいずれもＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）に反応しなかった。
【００９０】
これらの結果は図４に示している。
【実施例３】
【００９１】
実施例３：ＮＢＬ１の免疫優性のエピトープの特定。
ＮＢＬ１のＣ末端部分から推定されるアミノ酸配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析を行い、最も抗原性の強い領域を予測できるようにした。
【００９２】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析の結果によって、ＮＢＬ１のＣ末端部分の１１３アミノ酸（３２７番アミノ酸から４４０番アミノ酸）をカバーするオーバーラップした１１のペプチドを選択することになった。これらのペプチド配列を以下に示す。
Ｎ５ＥＭ１：ＮＨ２−ＮＳＰＥＧＴＶＫＷＡＳＫＥＤＳ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｎ５ＥＭ２：ＮＨ２−ＡＳＫＥＤＳＰＶＤＬＳＴＡＳＲ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
Ｎ５ＥＭ３：ＮＨ２−ＬＳＴＡＳＲＰＴＮＰＹＴＧＳＲ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
Ｎ５ＥＭ４：ＮＨ２−ＰＹＴＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
Ｎ５ＥＭ５：ＮＨ２−ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳＳＧＳＲ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
Ｎ５ＥＭ６：ＮＨ２−ＰＳＳＧＳＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｎ５ＥＭ７：ＮＨ２−ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＹＴＧＳＲ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
Ｎ５ＥＭ８：ＮＨ２−ＰＹＴＧＳＲＰＴＰＱＫＰＶＦＰ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
Ｎ５ＥＭ９：ＮＨ２−ＱＫＰＶＦＰＳＹＱＫＹＰＰＡＶ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
Ｎ５ＥＭ１０：ＮＨ２−ＫＹＰＰＡＶＱＫＹＩＤＳＬＰＳ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
Ｎ５ＥＭ１１：ＮＨ２−ＲＰＴＳＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰＳ−ＣＯＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
【００９３】
前もってビオチン化したペプチドを、ストレプトアビジンで事前に処理したプレートでインキュベートすることを除き（１×ＰＢＳ内で２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）、実施例２で記載したものと同一の手順を用いて、２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍ幼虫で感染させ、感染後６０日目に回収したブタの血清に対するＮ５ＥＭペプチドの抗原性を間接ＥＬＩＳＡ法によって評価した。
【００９４】
三つの免疫反応性ペプチド（Ｎ５ＥＭ５、７および１１）が検出された。免疫反応性ペプチドの一次配列の分析によって、共通した１０個のアミノ酸モチーフ（ＰＳＳＧＳＲＰＴＹＰ）の存在が明らかになった（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。また、このモチーフはＮＢＬ１タンパク質の全配列において４回現れる。他方では、６アミノ酸のオーバーラップしたペプチドを介したエピトープマッピングによって、ペプチド内部のリニアエピトープの免疫反応性に関して、単一のアミノ酸、チロシンが最も重要であることを明らかにすることができた。
【００９５】
最後に、補助実験によって、感度および早さという点で、Ｎ５ＥＭ１１がＮ５ＥＭ５およびＮ５ＥＭ７と比べて最も反応が良いペプチドであることが証明された。
【００９６】
このペプチドを、ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）について実施例２で記載したように、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＥ／Ｓ抗原と比較した。
【００９７】
結果は以下の表ＩＩにまとめている。
【００９８】
【表２】
2009525740.tif 000003
【００９９】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡ  Ｎ５ＥＭ１１によってＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓへの穏やかな感染を検出することが可能となることを示している。さらに、感染後２０日目以降の早期検出、すなわち、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓで可能であるよりも５〜１０日早い検出が得られた。
【０１００】
また、検出ピーク後に抗Ｎ５ＥＭ１１抗体の割合の減少も観察されており、このことは、この早い性質を裏付けており、また、最近の感染日を判定するために有効である。Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓで感染させ、ＥＬＩＳＡ  Ｎ５ＥＭ１１ペプチドによって診断したブタの全体は、部分的にはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓで観察されたウィンドウと類似しているが、ほとんどの場合に縮小したセロコンバージョンのウィンドウを呈している。
【０１０１】
また、Ｎ５ＥＭ１１は、Ｔ．ｎａｔｉｖａ、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉおよびＴ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓに感染したブタの血清と交差した抗原反応を呈しており、このことは、旋毛虫のＬ１ＮＮ段階におけるこのペプチドの免疫優性を証明している。交差したこれらの抗原反応により、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓより５〜３０日早く検出を得ることができる。
【０１０２】
しかし、Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによって感染させ二つのテストで同時に検出した動物では検出が遅いという点において、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓと比べて感度の低下が見られた。逆に、ＥＬＩＳＡ  Ｎ５ＥＭ１１によって、Ｔ．ｎａｔｉｖａによって感染し、筋肉寄生虫の量が残っているにも関わらずＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓではスクリーニングされなかった動物を診断することが可能となっている。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ  Ｎ５ＥＭ１１の特異性は感染実験の前および感染後１０日目までの３００頭の動物から採取した血清によって評価した。この特異性は９９％を超えている（結果は図示せず）。
【実施例４】
【０１０４】
４１１抗原の同定と単離。
４１１のｃＤＮＡクローンをＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓの早期侵入段階ＡｄおよびＬ１ＮＮのｃＤＮＡライブラリーから選別した。
【０１０５】
このｃＤＮＡクローンの核酸配列ならびに推定されたポリペプチド配列を判別し、それぞれ、配列表においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４という番号で示した。４１１のオープンリーディングフレームは２０ｋＤａの推定タンパク質をコードしている。シグナルペプチドを除いて、いかなるタンパク質領域も同定されなかった。
【０１０６】
４１１の完全なオープンリーディングフレームとＧｅｎｂａｎｋで入手可能な配列との比較は、その４１１が、Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓで同定されている排泄／分泌タンパク質Ｔｐ２１−３（ＡＡＦ７９２０６、ＮＡＧＡＮＯ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）とは７８．７％の同一性があり、ＰｏｌｖｅｒｅおよびＤｅｓｐｏｍｍｉｅｒによって提示されているＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓの推定ＯＲＦ１７．２０（ＡＡＢ４８４８９）の配列とは８６．６％の同一性があることを示している。この配列の比較によって、４１１は旋毛虫属に共通したこの遺伝子ファミリーの新しいメンバーとして同定される。
【０１０７】
４１１の完全なオープンリーディングフレームを、オリゴヌクレオチド４１１Ｆ（５’−ＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＡＴ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）および４１１Ｒ（５’−ＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＤＮＡポリメラーゼＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて増幅し、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の推奨にしたがって発現キット「Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ１０２  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ」を用い、プラスミドｐＥＴ１０２Ｄ／ｔｏｐｏにおいてクローニングした。
【０１０８】
得られた組換えプラスミドはｐＥＴ１０２−４１１と称するものであり、予測分子量が３６．７ｋＤａの３３０アミノ酸のチオレドキシン−４１１融合タンパク質（ＴＨＸ−４１１）をコードし、Ｃ末端の位置にポリヒスチジンタグを有している。この融合タンパク質の配列は図５に示している。
【０１０９】
融合タンパク質ＴＨＸ−４１１は、プラスミドｐＥＴ１０２−４１１によって形質転換した大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の中で発現させ、提供者（Ｑｉａｇｅｎ）によって推奨される手順を用い、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡスピン・カラム・キット、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ）上で、変性条件下でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１１０】
精製された融合タンパク質ＴＨＸ−４１１は、変性条件下での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の後、予想された３６．７ｋＤａのサイズのバンドの形で現れた。
【０１１１】
旋毛虫症に感染していないブタの血清と、２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍ幼虫による感染後３０日目および５０日目の同一のブタの血清に対するタンパク質ＴＨＸ−４１１の免疫反応性を、対照のＥ／Ｓ抗原（上記実施例２に記載したように調製）の免疫反応性と比較した。分析はウェスタンブロッティングにより、上記実施例１に記載したものと同一の手順を用いて行った。
【０１１２】
結果は図６に示している。
【０１１３】
Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染したブタの血清に対するＴＨＸ−４１１の非常に強い免疫反応性と、抗４１１抗体の早期検出（感染後３０日目）が観察される。軽いノイズも観察されるが、該ノイズは、ＴＨＸ−４１１の調製物中に残留していた高分子量の細菌タンパク質と、血清中に存在する抗大腸菌抗体との間の交差反応に起因している。
【実施例５】
【０１１４】
旋毛虫に対する液性応答を検出するためのＴＨＸ−４１１の利用法。
上記実施例４に記載したように調製したタンパク質を、旋毛虫で感染させたブタに由来する血清に対する間接ＥＬＩＳＡ法により、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓの排泄／分泌抗原（Ｅ／Ｓ）との比較で評価した。
【０１１５】
Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓの２００、１０００、２００００匹のＬ１Ｍ幼虫で実験的に感染させた通常のブタの血清において、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１またはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出された抗旋毛虫抗体の出現動態を比較した。また、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１による、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓと、欧州で特定されている他の三種の旋毛虫、Ｔ．ｎａｔｉｖａ、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉおよびＴ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによって誘発された液性応答の検出も比較した。
【０１１６】
用いた手順は実施例２で記載したものと同一である。ＴＨＸ−４１１抗原は２μｇ／ｍｌ、そしてＥ／Ｓ抗原は１．２５μｇ／ｍｌで用いた。
【０１１７】
陽性の限界はＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓでは１４％、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１では５２％である。
【０１１８】
結果は図７および下の表ＩＩＩに示している。
【０１１９】
【表３】
2009525740.tif 000004
【０１２０】
これらの結果の全体は、４１１抗原によってＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓに対する液性応答の容量依存的な検出が可能となることを示している。また、ウェスタンブロッティングによるリニアエピトープの検出に伴うこのＥＬＩＳＡ検定による立体構造エピトープの検出は、旋毛虫の４１１タンパク質の免疫優性を証明している。
【０１２１】
ＴＨＸ−４１１組換えタンパク質によって、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに対する抗体の特に早い検出が可能となる（２００００匹のＬ１Ｍで強く感染させた動物については感染後２０日目から）。セロコンバージョンは液性応答のプロファイルを伴っており、該液性応答は高い力価を有し、感染後６０日まで保持される。中程度のおよび少ない寄生虫の量で感染させた動物のセロコンバージョンはもっと遅く、それぞれ感染後３０日目と６０日目に検出された。ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出された最も早いセロコンバージョンは感染後２５日目である。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１によって同時に診断された、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓで感染させた動物は、それらのうち２／５については、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１での血清の検出ウィンドウが縮小し、早さという点で５〜１０日有利である。ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１の感度は、この動物実験のうちの５／９の通常のブタ、すなわち、２００００匹のＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓのＬ１Ｍで感染させた３／３のブタ、１０００匹のＬ１Ｍで感染させた１／３のブタ、そして２００匹のＬ１Ｍのみで感染させた１／３のブタに対する有効スクリーニングによって証明された。検出はこれらの動物におけるＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓの筋肉寄生虫の量に関連しており、その量は、２００匹のＬ１Ｍで実験的に感染させたブタについては平均でグラムあたり３匹の幼虫（ＬｐＧ）、１０００匹のＬ１Ｍで感染させたブタについては４３ＬｐＧ、そして２００００匹のＬ１Ｍで感染させたブタについては５３８ＬｐＧの変動がある。
【０１２３】
Ｔ．ｎａｔｉｖａ、Ｔ．ｂｒｉｔｏｖｉおよびＴ．ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによって誘発された液性応答もＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１によって検出されており（２００００匹のＬ１Ｍで感染させた動物の１０／１２）、このことは、旋毛虫属における４１１の遺伝子的保存と抗原的保存、ひいては旋毛虫症の広い範囲での診断に対する利点を証明している。診断の早さは感染後２０日目以降で確認されている。セロコンバージョンのウィンドウはＥＬＩＳＡ  ４１１では５日〜２０日で縮小し、Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓによる感染と同様に、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１で同時に診断した動物の５０％〜１００％は、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１での血清の検出ウィンドウが縮小した。Ｔ．ｎａｔｉｖａ属による感染の分析は、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１の鋭い感度を証明しており、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１は、筋肉寄生虫の量が平均で７×１０−４〜０．１ＬｐＧしかなかったにも関わらず、６／９の動物を診断している（対するＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓでは５／９である）。さらに、Ｔ．ｎａｔｉｖａ属によって発生した感染力が顕著に弱いにも関わらず、同様の液性応答のプロファイルがＴ．ｓｐｉｒａｌｉｓとＴ．ｎａｔｉｖａによって感染された動物で得られており、このことは、Ｔ．ｎａｔｉｖａの４１１タンパク質の非常に強い免疫原性と、凍結に対して耐性のあるこの種を検出するための該タンパク質の利用性を示唆している。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１の特異性を、感染実験の前および感染後１０日までに１５０頭の動物から採取した血清を用いて評価した。この特異性は９９％を超える（結果は図示せず）。
【０１２５】
結論。
ＮＢＬ１抗原および４１１抗原は免疫優性の抗原を構成し、旋毛虫属内に保持されている。これらの抗原（ＮＢＬ１のＣ末端、ＮＢＬ１のペプチドエピトープＮ５ＥＭ１１、４１１抗原）を用いたＥＬＩＳＡ検定は、旋毛虫に対する９９％を超える特異性を有し、また該検定によって、欧州で特定されている４種の旋毛虫によって引き起こされるブタの旋毛虫症に対する早い診断が可能となる（感染後１５〜６０日）。
【０１２６】
精製され、タンパク質のＣ末端部分に位置するＮＢＬ１の免疫優性のエピトープを含有する組換えタンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）を用いたＥＬＩＳＡ検定は、旋毛虫に特異的で感度があり、また該検定によって、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓと比べて５〜４５日という鋭い早さでブタの旋毛虫症を診断することが可能となる。さらに、この検定によって、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）によって同時に診断した動物の１００％で、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓに比べて縮小された血清の検出ウィンドウを得ることが可能となった。
【０１２７】
精製された組換えタンパク質ＴＨＸ−４１１を用いるＥＬＩＳＡ検定は、現状では少し低い感度で（診断した動物の１７／３６）、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出される液性応答の動態を再現する。しかし、この新しいＥＬＩＳＡの感度によって、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによってスクリーニングされないブタの診断が可能となった。ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１によって、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓと比べて５〜２０日という鋭い早さでブタの旋毛虫症を診断することを可能にすることができる。さらに、ＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／ＳとＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１によって同時に診断した動物の５０％〜１００％で、ＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１によって血清の検出ウィンドウが縮小した。
【０１２８】
これらの結果の全体は、ＮＢＬ１抗体および４１１抗体をＥ／Ｓ抗原の代わりに、あるいはＥ／Ｓ抗原を補完するものとして、旋毛虫症の早期の血清診断に用いることができることを示している。さらに、旋毛虫のこれら二つの新しい抗原を組み合わせることにより、追加の動物診断によって、ＥＬＩＳＡの感度を向上させることが可能となる。
【０１２９】
Ｎ５ＥＭ１１タイプの免疫優性のペプチドを伴うＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）と４１１の組み合わせによって、旋毛虫の診断感度を向上させることが可能となる（検出された動物の２４／３６）。
【０１３０】
４１１を伴うＮＢＬ１の追加の効果は、４１１によって得られる動物検出の利点、ならびに、４１１によって得られる動物のより速い検出として現れる。これら三種（ＮＢＬ１、４１１、Ｎ５ＥＭ１１）は、２つまたは３つの抗原を介した抗体の同時検出によってＥＬＩＳＡ検定を時間の上で安定させるが、動物の数という点では追加の利点はない。
【０１３１】
しかし、感染後３０日未満という早期診断が二つの抗原ＮＢＬ１と４１１によって得られる。
【０１３２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の配列を示す図である。
【図２】タンパク質ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の免疫反応性を示す図である。
【図３】Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染させたブタの血清においてＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）またはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出した抗旋毛虫抗体の出現動態の比較を示す図である。
【図４】ＥＬＩＳＡ  ＮＢＬ１（Ｃｔｅｒｍ）の特異性を示す図である。
【図５】タンパク質ＴＨＸ−４１１の配列を示す図である。
【図６】タンパク質ＴＨＸ−４１１の免疫反応性を示す図である。
【図７】Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓに感染したブタの血清においてＥＬＩＳＡ  ＴＨＸ−４１１またはＥＬＩＳＡ  Ａｇ  Ｅ／Ｓによって検出した抗旋毛虫抗体の出現動態の比較を示す図である。
【図１】
2009525740.tif 000005
【図２】
2009525740.tif 000006
【図３】
2009525740.tif 000007
【図４】
2009525740.tif 000008
【図５】
2009525740.tif 000009
【図６】
2009525740.tif 000010
【図７】
2009525740.tif 000011
【配列表】
2009525740000001.app
【国際調査報告】
2009525740.tif 000012
2009525740.tif 000013
2009525740.tif 000014
2009525740.tif 000015
2009525740.tif 000016
2009525740.tif 000017
2009525740.tif 000018
2009525740.tif 000019