(57)【要約】  表面増進ラマン散乱ナノタグ（ＳＥＲＳナノタグ）を用いて、均一（無洗浄）、不均一または配列検出アッセイ基盤を生成するための方法およびシステム。特定の態様において、磁気粒子と組み合わせてＳＥＲＳナノタグを用いる。多重化アッセイ基盤もまた開示する。特定の態様において、アッセイは、臨床的プロテオミクスに有用である。生物学的マトリックス内、例えば全血または血清内で使用するのに適したアッセイ基盤もまた開示する。本明細書に記載するアッセイ形式を用いて、限定されるわけではないが、全血または血清、潜在性の（ｏｃｃｕｌｔ）試料、尿、糞便、空気、飲料水、ファージ、任意の生物、細胞の多細胞塊、例えば癌組織ホモジネートを含む、任意のタイプの生物学的（動物界または植物界）試料または環境試料において、限定されるわけではないが、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または小分子の検出を含めて、関心対象の任意の分析物を検出してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象のヌクレオチドを検出する方法であって：
磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列を含む捕捉プローブを提供し；
捕捉分子にコンジュゲート化された検出配列を含む検出プローブを提供し；
捕捉分子に選択的に結合可能な相補ターゲットにコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグを提供し；
関心対象のヌクレオチドの存在下で、捕捉プローブおよび検出プローブをハイブリダイズさせ；
ハイブリダイズした捕捉プローブおよび検出プローブを、ＳＥＲＳナノタグ複合体と接触させ；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
磁気粒子を磁気的に選択する工程をさらに含む、請求項１の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項３】
関心対象のヌクレオチドを検出する方法であって：
磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列を含む捕捉プローブを提供し；
ＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化された検出配列を含む検出プローブを提供し；
関心対象のヌクレオチドの存在下で、捕捉プローブおよび検出プローブをハイブリダイズさせ；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項４】
磁気粒子を磁気的に選択する工程をさらに含む、請求項３の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項５】
関心対象のヌクレオチドを検出する方法であって：
関心対象のヌクレオチドを多数のセクションに切断し；
関心対象のヌクレオチドの別々の部分に対する別個のハイブリダイゼーション・アフィニティーを有する多数の捕捉プローブを提供し、多数の該捕捉プローブが、磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列で構成され；
関心対象のヌクレオチドの別々の部分に対する別個のハイブリダイゼーション・アフィニティーを有する多数の検出プローブを提供し、該検出プローブが、ＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化された検出配列で構成され；
切断された関心対象のヌクレオチドの存在下で、捕捉プローブおよび検出プローブをハイブリダイズさせ；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項６】
ヌクレオチドを制限酵素で多数のセクションに切断する、請求項５の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項７】
磁気粒子を磁気的に選択する工程をさらに含む、請求項５の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項８】
関心対象のヌクレオチドを検出する方法であって：
磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列を含む捕捉プローブを提供し；
ＲＣＡプローブを提供し；
関心対象のヌクレオチドの存在下で、捕捉プローブおよびＲＣＡプローブをハイブリダイズさせ；
最初のハイブリダイゼーション産物に対して、ローリングサークル増幅を実行し；
ＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化された検出配列を含む検出プローブを提供し；
検出プローブの存在下で、最初のハイブリダイゼーション産物をインキュベーションし；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項９】
最初のハイブリダイゼーション産物に対してローリングサークル増幅を実行した後、磁気粒子を磁気的に選択する工程をさらに含む、請求項８の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１０】
検出プローブの存在下で、最初のハイブリダイゼーション産物をインキュベーションした後、磁気粒子を磁気的に選択する工程をさらに含む、請求項８の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１１】
検出プローブの存在下で、最初のハイブリダイゼーション産物をインキュベーションした後、磁気粒子を磁気的に選択する工程をさらに含む、請求項９の関心対象のヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１２】
ヌクレオチドを検出するためのアッセイであって：
磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列を含む捕捉プローブ；
捕捉分子にコンジュゲート化された検出配列を含む検出プローブ；および
捕捉分子に選択的に結合可能な相補ターゲットにコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ
を含む、前記アッセイ。
【請求項１３】
ヌクレオチドを検出するためのアッセイであって：
磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列を含む捕捉プローブ；および
ＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化された検出配列を含む検出プローブ
を含む、前記アッセイ。
【請求項１４】
ヌクレオチドを検出するためのアッセイであって：
関心対象のヌクレオチドを多数のセクションに切断するための手段；
関心対象のヌクレオチドの別々の部分に対する別個のハイブリダイゼーション・アフィニティーを有する多数の捕捉プローブであって、磁気粒子にコンジュゲート化された捕捉配列で構成される、前記の多数の捕捉プローブ；および
関心対象のヌクレオチドの別々の部分に対する別個のハイブリダイゼーション・アフィニティーを有する多数の検出プローブであって、ＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化された検出配列で構成される、前記検出プローブ
を含む、前記アッセイ。
【請求項１５】
関心対象の分子を検出する方法であって：
分子にコンジュゲート化された磁気ビーズを提供し；
磁気ビーズを、該分子に選択的に結合可能な相補ターゲットとハイブリダイズさせ、該ターゲットが検出部分とさらに会合しており；
検出部分に結合可能なＳＥＲＳナノタグと、ハイブリダイズした磁気ビーズを接触させ；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
ターゲットが核酸分子である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
関心対象の分子を検出する方法であって：
分子にコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグを提供し；
該分子に選択的に結合可能な相補ターゲットと、ＳＥＲＳナノタグをハイブリダイズさせ、該ターゲットが検出分子とさらに会合しており；
検出部分に結合可能な磁気粒子と、ハイブリダイズしたＳＥＲＳナノタグを接触させ；
磁気粒子を磁気的に選択し；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
ターゲットが核酸分子である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
関心対象の分子を検出する方法であって：
第一の分子にコンジュゲート化された第一のＳＥＲＳナノタグを提供し；
第二の分子にコンジュゲート化された第二のＳＥＲＳナノタグを提供し、第二のＳＥＲＳナノタグが、照合に際して第一のＳＥＲＳナノタグとは異なるラマンスペクトルを提示し；
第一および第二のＳＥＲＳナノタグを、第一および第二の分子の１つに選択的に結合可能な相補ターゲットとハイブリダイズさせ、該ターゲットが検出部分とさらに会合しており；
検出部分に結合可能な磁気粒子と、ハイブリダイズした第一および第二のＳＥＲＳナノタグを接触させ；
磁気粒子を磁気的に選択し；そして
第一および第二のＳＥＲＳナノタグの１つのラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
第一および第二の分子が核酸分子である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
関心対象の分析物を検出するための方法であって：
前記分析物に選択的に結合可能な第一の分子にコンジュゲート化された捕捉粒子を提供し；
前記分析物に選択的に結合可能な第二の分子にコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ検出粒子を提供し；
捕捉粒子および検出粒子と、関心対象の分析物を含有しうる試料を接触させ、それによって、分析物に結合した捕捉粒子および検出粒子から、２粒子複合体を形成し；
２粒子複合体を濃縮し；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
捕捉粒子が磁気粒子である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
濃縮工程が、磁気粒子濃縮装置上で実行される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
２粒子複合体が、試験容器の内壁上で濃縮される、請求項２１の方法。
【請求項２５】
２粒子複合体が、試験容器の内壁上で捕捉される、請求項２１の方法。
【請求項２６】
関心対象の分子を検出する方法であって：
分子にコンジュゲート化された磁気ビーズを提供し；
該分子に選択的に結合可能な相補ターゲットと、磁気ビーズをハイブリダイズさせ、該ターゲットが検出部分とさらに会合しており；
検出部分と結合可能なＳＥＲＳナノタグと、ハイブリダイズした磁気ビーズを接触させ；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２７】
ターゲットが核酸分子である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
関心対象の分子を検出する方法であって：
分子にコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグを提供し；
該分子に選択的に結合可能な相補ターゲットと、ＳＥＲＳナノタグをハイブリダイズさせ、該ターゲットが検出部分とさらに会合しており；
検出部分に結合可能な磁気粒子と、ハイブリダイズしたＳＥＲＳナノタグを接触させ；
磁気粒子を磁気的に選択し；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２９】
ターゲットが核酸分子である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
関心対象の分子を検出する方法であって：
第一の分子にコンジュゲート化された第一のＳＥＲＳナノタグを提供し；
第二の分子にコンジュゲート化された第二のＳＥＲＳナノタグを提供し、第二のＳＥＲＳナノタグが、照合に際して第一のＳＥＲＳナノタグとは異なるラマンスペクトルを提示し；
第一および第二のＳＥＲＳナノタグを、第一および第二の分子の１つに選択的に結合可能な相補ターゲットとハイブリダイズさせ、該ターゲットが検出部分とさらに会合しており；
検出部分に結合可能な磁気粒子と、ハイブリダイズした第一および第二のＳＥＲＳナノタグを接触させ；
磁気粒子を磁気的に選択し；そして
第一および第二のＳＥＲＳナノタグの１つのラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項３１】
第一および第二の分子が核酸分子である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
関心対象の分析物を検出する方法であって：
前記分析物に選択的に結合可能な第一の分子にコンジュゲート化された捕捉粒子を提供し；
前記分析物で誘導体化されたＳＥＲＳナノタグ検出粒子を提供し；
関心対象の分析物を含有しうる試料と、捕捉粒子およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子を接触させ、それによって、分析物／捕捉粒子複合体およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子／捕捉粒子複合体の両方を形成し；
捕捉粒子複合体を濃縮し；そして
ＳＥＲＳナノタグ検出粒子と会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
捕捉粒子が磁気粒子である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
濃縮工程が、磁気粒子濃縮装置上で実行される、請求項３３の方法。
【請求項３５】
関心対象の分析物を検出する方法であって：
前記分析物で誘導体化された捕捉粒子を提供し；
前記分析物と選択的に結合可能な第一の分子にコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ検出粒子を提供し；
関心対象の分析物を含有しうる試料と、捕捉粒子およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子を接触させ、それによって、分析物／ＳＥＲＳナノタグ検出粒子複合体および捕捉粒子／ＳＥＲＳナノタグ検出粒子複合体の両方を形成し；
捕捉粒子／ＳＥＲＳナノタグ検出粒子複合体を濃縮し；そして
ＳＥＲＳナノタグ検出粒子と会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
捕捉粒子が磁気粒子である、請求項３５の方法。
【請求項３７】
濃縮工程が、磁気粒子濃縮装置上で実行される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
関心対象の分析物を検出するための方法であって：
前記分析物に選択的に結合可能な第一の分子にコンジュゲート化された捕捉粒子を提供し；
前記分析物に選択的に結合可能な第二の分子にコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ検出粒子を提供し；
捕捉粒子および検出粒子と、関心対象の分析物を含有しうる試料を接触させ、それによって、分析物に結合した捕捉粒子および検出粒子から、２粒子複合体を形成し；
２粒子複合体を濃縮し；そして
ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
捕捉粒子が磁気粒子である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
濃縮工程が、磁気粒子濃縮装置上で実行される、請求項３９の方法。
【請求項４１】
２粒子複合体が試験容器の内壁上で濃縮される、請求項３８の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
［０００１］本発明は、表面増強ラマン散乱ナノタグ（ＳＥＲＳナノタグ）を使用して、多様なアッセイ基盤を生成するための方法およびシステムに対して向けられる。
【０００２】
発明の背景
［０００２］粒子、および特に磁気粒子は、固相捕捉種または検出種として、診断アッセイで広範囲に用いられている。微粒子に基づくアッセイは、２つの主なカテゴリー：均一（無分離）および不均一アッセイに分類可能である。
【０００３】
［０００３］均一（無分離）アッセイ形式では、結合性反応物質を混合し、そして検出前にいかなる続く洗浄工程も伴わずに測定する。こうしたシステムの利点は、アッセイ工程がより少なく、体積が少なく、そして無駄が少ないため、迅速な溶液相動力学で、アッセイ形式が単純であり、器具使用がより単純で、ならびにコストがより低いことである。均一なイムノアッセイは、結合した分析物および遊離の（ｆｒｅｅ）分析物の物理的分離を必要とせず、そしてしたがって、不均一イムノアッセイよりも実行がより迅速でそしてより容易でありうる。小さい試料サイズを用い、試薬体積が少なく、そしてインキュベーション時間が短い、均一イムノアッセイシステムは、迅速な入れ替え時間を提供する。このタイプのアッセイの不都合な点は、ダイナミックレンジおよび感度が限定されうることである。シグナル検出前に、遊離分析物の分離がないため、感度はさらに損なわれうる。また、試料および捕捉試薬または検出試薬間の相互作用による干渉によって、高いバックグラウンドが引き起こされうる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＰＡ、蛍光偏光およびフローサイトメトリーに基づくアッセイなどのハイスループット・スクリーニング基盤において、ならびに検出法として比濁分析または比濁法を用いた粒子凝集アッセイなどの診断アッセイにおいて、均一アッセイは好ましいアッセイ形式である。
【０００４】
［０００４］遊離分析物および未結合検出物質の分離を必要とする、ならびに特定の例における、不均一イムノアッセイは、均一アッセイよりも多用途でありうる。洗浄工程または物理的分離工程は、大部分の干渉物質を除去し、そして一般的に、検出／定量化工程に干渉しない。より大きい試料サイズを可能にし、これが次に感度を改善し、そして標準的なアッセイ曲線よりも広いダイナミックレンジを生じる、段階的な不均一アッセイが可能である。不均一イムノアッセイの不都合な点は、これらがはるかにより労働集約的であり、時間がかかり、そして典型的には専門の分析装置を必要とすることである。さらに、自動化不均一システムは、洗浄工程および分離工程を提供するために、より複雑な設計または多数の装置を必要とする。多くの臨床的分析装置は、不均一診断アッセイのため、磁気微粒子を用いて、関心対象の分析物と選択的に結合させ、そして次いで、磁場を用いて、取り巻くマトリックスから該分析物を分離する（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌ，  ロンドン）。この形式に基づく分析装置には、Ｂａｙｅｒ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＡＣＳ  １８０およびＩｍｍｕｎｏ  Ｉ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＡｃｃｅｓｓ、ならびにＲｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＥｌｅｃｓｙｓが含まれる。
【０００５】
［０００５］伝統的に、上述のものなどの不均一アッセイで疾患を診断するためには、１つのバイオマーカーしか用いられていない：例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、特異性が低い可能性があるにもかかわらず、前立腺癌のために選択されるマーカーである（Ｌｕ−Ｙａｏら（２００３）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９５：１７９２−１７９７）。プロテオミクスの出現で、いくつかのバイオマーカーを伴う診断アッセイが、正確さ、特異性を増加させ、そして類似の症状を提示する異なる疾患間を区別するのを補助するであろうと考えられている。ゲノミクス分野ですでに行われているように、いくつかのマーカーに関するスクリーニングは、１つのバイオマーカーのみに関するスクリーニングよりも、よりすぐれた診断または予後情報を提供する。例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ’ｓ  Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓａｙ（２００５）（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ）を参照されたい。
【０００６】
［０００６］試料採取から診断までの時間を短くするように設計したアッセイは、緊急治療室またはポイントオブケア設定で等しく重要である。例えば、Ｂｉｏｓｉｔｅ  Ｉｎｃ．は、心不全の重症度および急性冠動脈症候群のリスク層化の迅速診断および評価のため、側方流動イムノアッセイを提供する（Ｂｉｏｓｉｔｅ  Ｗｅｂｓｉｔｅ（２００５）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｉｔｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｒｄｉａｃ．ａｓｐｘ．）。したがって、プロテオミクス研究を通じて新規に同定された多くのバイオマーカーを臨床的に実行するには、より単純で、より正確で、そしてより迅速なアッセイ技術が必要である。迅速で、洗浄がなく、試料調製がないバイオアッセイにおいて、同時に３以上のタンパク質を定量化する能力は、疾患診断および予後における、ならびに疾患進行監視における、当該技術分野の技術状態を劇的に改善する。
【０００７】
［０００７］本発明は、上に論じる１以上の問題を克服することに向けられる。
発明の概要
［０００８］本発明は、表面増進ラマン散乱ナノタグ（ＳＥＲＳナノタグ）を用いて、均一（無洗浄）、不均一または配列検出アッセイ基盤を生成するためのいくつかの方法およびシステムを提供する。特定の態様において、磁気粒子と組み合わせてＳＥＲＳナノタグを用いる。多重化アッセイ基盤もまた開示する。特定の態様において、アッセイは、臨床的プロテオミクスに有用である。生物学的マトリックス内、例えば全血または血清内で使用するのに適したアッセイ基盤もまた開示する。本明細書に記載するアッセイ形式を用いて、限定されるわけではないが、全血または血清、潜在性の（ｏｃｃｕｌｔ）試料、尿、糞便、空気、飲料水、ファージ、任意の生物、細胞の多細胞塊、例えば癌組織ホモジネートを含む、任意のタイプの生物学的（動物界または植物界）試料または環境試料において、限定されるわけではないが、細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または小分子の検出を含めて、関心対象の任意の分析物を検出してもよい。
【０００８】
［０００９］以下の本発明の詳細な説明には、以下のサブセクションが含まれる：
Ａ．生物学的アッセイのためのＳＥＲＳナノタグの一般的な議論。
Ｂ．試験容器内壁と会合した捕捉抗体を特徴とする均一または不均一サンドイッチイムノアッセイの態様。
【０００９】
Ｃ．磁気捕捉粒子を特徴とする均一または不均一サンドイッチイムノアッセイの態様。
Ｄ．ＳＥＲＳ磁気ＤＮＡアッセイを補助するＳＥＲＳ／磁気ビーズハイブリダイゼーション。
【００１０】
Ｅ．競合的ＳＥＲＳ／磁気ビーズアッセイ。
Ｆ．ヌクレオチド配列検出アッセイ。
［００１０］以下に論じる特定のアッセイにおいて、磁気捕捉粒子の使用は、存在する臨床的分析装置との容易な統合を可能にするであろう。ＳＥＲＳナノタグの使用は（以下に詳述するように）、無洗浄の多重化アッセイ形式の使用を可能にするであろう。典型的にはマイクロ流体およびナノ流体技術の使用によって、小型化に向けた産業界全体で新たに起こりつつある傾向があることに注目することが重要であり、こうした技術は、各実験に関与する試薬および試料体積を減少させるとともに、反応時間を減少させることによって、診断分野に影響を及ぼすであろう。したがって、小型化は、実験あたりの総費用を潜在的に低下させうる。しかし、小型化の利点を達成するには、緻密で、そして正確な液体取り扱い法に関する必要性などの新たな一連の難問を克服しなければならない。多くの例において、本明細書に論じるアッセイ法および基盤は、液体取り扱いを必要とせず、したがってマイクロおよびナノ流体学的問題を回避する。本発明のアッセイ法および基盤は、いかなる体積サイズも等しくよく取り扱い、そして探査するであろう。
【００１１】
発明の詳細な説明
［００４８］Ａ．生物学的アッセイのためのＳＥＲＳナノタグの一般的考察。
［００４９］均一多重化アッセイ基盤は、典型的には、２粒子システムを中心として設計される。捕捉粒子を抗体にコンジュゲート化して、生物学的試料から関心対象の抗原を捕捉する。検出粒子は、やはり関心対象の抗原に対する結合アフィニティーを持つ検出抗体にコンジュゲート化された、以下に記載するようなＳＥＲＳナノタグ粒子であってもよい。ＳＥＲＳナノタグには、以下に記載するようなラマンレポーター分子が含まれる。関心対象の抗原の存在下で、捕捉粒子および検出粒子の両方が結合して、ＳＥＲＳ活性２粒子免疫複合体を形成する。ＳＥＲＳナノタグは、検出タグとして、少なくとも３つの内在性の利点を提供する。（１）これらは、近赤外で励起可能であり、そしてしたがって全血測定と適合する。（２）ＳＥＲＳナノタグは、光退色に耐性であり、より高い出力およびより長いデータ獲得時間を可能にし、より高感度の測定を生じる。（３）多数の別個のタグが存在し、非常に多重化されたアッセイが可能になる。
【００１２】
［００５０］ＳＥＲＳナノタグは、表面増進ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づく新規のナノ粒子光学検出タグである（Ｍｕｌｖａｎｅｙら（２００３）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９：４７８４−４７９０；  Ｎａｔａｎ、米国特許第６，５１４，７６７号）。ラマン散乱（Ｌｏｎｇ（２００２）Ｔｈｅ  Ｒａｍａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ；  Ａ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（１９９６）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（１９９９）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ，  マサチューセッツ州モールデン）。ＳＥＲＳは、レーザーに基づく光学分光であり、分子に関して、典型的な蛍光よりはるかに狭い特徴を持つ、フィンガープリント様の振動スペクトルを生じる。ラマン散乱は、単色性遠赤色または近赤外光を用いて励起可能であり、この際の光子エネルギーは非常に低く、生物学的試料中の内在性のバックグラウンド蛍光を励起しない。ラマン・スペクトルは、典型的には、３００〜３５００ｃｍ−１の振動エネルギーを含むため、１ダース（以上）のタグをすべて、単一の光源を用いて、同時に測定することが可能でありうる。しかし、通常のラマンスペクトルは非常に弱く、生物分析化学に関する有用性は限定される。ＳＥＲＳでは、貴金属表面（金、銀、銅）上のナノスケールの粗い特徴に非常に近接した分子が、散乱効率の数百万倍から数兆倍の増加（増強係数（ＥＦ）として知られる）を生じさせる（Ｍｏｓｋｏｖｉｔｓ（１９８５）Ｒｅｖ．  Ｍｏｄ．  Ｐｈｙｓ．  ５７：７８３−８２６；  Ｏｔｔｏら（１９９２）Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｏｎｄ．  Ｍａｔ．  ４：１１４３−１２１２；  ＣａｍｐｉｏｎおよびＫａｍｂｈａｍｐａｔｉ（１９９８）Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．  ２７：２４１−２４９；  Ｔｉａｎら（２００２）Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  １０６：９４６３−９４８３；  ＣＡＳ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｓｅａｒｃｈ，  ２００４年４月）。より重要なことに、ＳＥＲＳはまた、個々の金属ナノ粒子に吸着した分子を検出するためにも使用可能であり（Ｅｍｏｒｙら（１９９８）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０：８００９−８０１０；  Ｍｏｙｅｒら（２０００）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２：５４０９−５４１０）、そして単一分子の検出を示すために用いられてきている（ＮｉｅおよびＥｍｏｒｙ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１０２−１１０６；  Ｋｎｅｉｐｐら（１９９７）Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  ７８：１６６７−１６７０；  Ｍｉｃｈａｅｌｓら（１９９９）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１：９９３２−９９３９；  Ｘｕら（１９９９）Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  ８３：４３５７−４３６０；  Ｇｏｕｌｅｔら（２００３）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７５：１９１８−１９２３）。
【００１３】
［００５１］典型的なＳＥＲＳナノタグ１０を図１に示す。例示するＳＥＲＳナノタグ１０には、金属ナノ粒子コア１２、およびＳｉＯ２（ガラス）シェル１４が含まれる。限定されるわけではないが、多様なタイプのポリマーを含む他の物質もまた、本発明に一致した被包物質またはシェルとして用いてもよい。典型的なＳＥＲＳナノタグの使用、製造および特性に関する詳細は、米国特許第６，５１４，７６７号、表題「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」に含まれ、この特許は本明細書に援用される。本発明は、単一ナノ粒子コア１２から調製されるＳＥＲＳナノタグに関して記載されるが、ＳＥＲＳナノタグの調製において、ナノ粒子コアクラスターまたは凝集体を用いてもよいことが理解されるものとする。金属コロイドの凝集体のクラスターを調製するための方法が、当業者に知られる。米国特許第６，８６１，２６３号に記載されるようなサンドイッチ型粒子の使用もまた意図され、この特許は本明細書に援用される。
【００１４】
［００５２］ナノ粒子コア１２は、ラマン増進性であることが当該技術分野に知られるいかなる物質であってもよい。ナノ粒子コア１２は等方性または異方性であってもよい。異方性ナノ粒子は、長さおよび幅を有してもよい。いくつかの態様において、異方性ナノ粒子の長さは、ナノ粒子が産生される開口部に平行な次元である。異方性ナノ粒子の場合、いくつかの態様において、ナノ粒子は、３５０ｎｍ以下の直径（幅）を有する。他の態様において、ナノ粒子は２５０ｎｍ以下の直径を有し、そしていくつかの態様において、１００ｎｍ以下の直径を有する。いくつかの態様において、幅は、１５ｎｍ〜３００ｎｍの間である。いくつかの態様において、ナノ粒子は、約１０〜３５０ｎｍの長さを有する。
【００１５】
［００５３］ＳＥＲＳナノタグのコアであるのに適しているナノ粒子には、コロイド金属、中空または充填ナノバー、磁気、常磁性、伝導性または絶縁性ナノ粒子、合成粒子、ヒドロゲル（コロイドまたはバー）等が含まれる。本発明で用いるナノ粒子は、単一ナノ粒子として、あるいはナノ粒子のクラスターまたは凝集体として存在してもよい。
【００１６】
［００５４］限定されるわけではないが、スフェロイド、ロッド、ディスク、ピラミッド、立方体、シリンダー、ナノらせん、ナノスプリング、ナノリング、ロッド型ナノ粒子、矢状ナノ粒子、ティアドロップ型ナノ粒子、テトラポッド型ナノ粒子、プリズム型ナノ粒子、ならびに複数の他の幾何学的および非幾何学的形状を含む、多様な形状で、ナノ粒子が存在してもよいことが、一般の当業者には認識されるであろう。記載されている別の種類のナノ粒子には、内部表面領域を持つものが含まれる。これらには、中空粒子および多孔または半多孔粒子が含まれる。さらに、これらの形状の粒子を調製する方法、および特定の場合、これらの形状のＳＥＲＳ活性粒子を調製する方法が、文献に記載されてきていることが理解される。粒子形状および縦横比は、ナノ粒子の物理的、光学的、および電気的特性に影響を及ぼしうることが認識されているが、特定の形状、縦横比、または内部表面領域の存在／非存在は、ナノ粒子としての粒子の性質に影響しない。
【００１７】
［００５５］ナノ粒子にはまた、金属が、コア−シェル粒子におけるように、さらなる構成要素を含むナノ粒子も含まれる。例えば、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００１，  １２３，  ７９６１に記載されるもののような、Ａｇコア／Ａｕシェル粒子、またはＡｕコア／Ａｇシェル粒子、またはＳＥＲＳ活性金属を伴う任意のコア−シェルの組み合わせが使用可能である。ＡｕまたはＡｇナノ粒子官能化シリカ／アルミナコロイド、ＡｕまたはＡｇ官能化ＴｉＯ２コロイド、Ａｕナノ粒子キャップ化Ａｕナノ粒子（例えば、Ｍｕｃｉｃら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９８，  １２０，  １２６７４を参照されたい）、Ａｕナノ粒子キャップ化ＴｉＯ２コロイド、銀キャップ化ＳｉＯ２コロイドまたは金キャップ化ＳｉＯ２コロイド（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら，  ２００４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０１（５２）：１７９３０−５；  Ｔａｌｌｅｙら，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５）を参照されたい）などの、金属シェル（「ナノシェル」）を伴うＳｉコアを有する粒子などの、コア−シェル粒子で使用するのに適した他の組み合わせが、本発明に含まれる。中空ナノ球体および中空ナノ結晶などの中空ナノ粒子もまた、ＳＥＲＳナノタグで利用可能である。
【００１８】
［００５６］各ＳＥＲＳナノタグは、ユニークなレポーター１６を伴ってコードされ、ナノ粒子コアおよびガラスまたは他の適切な被包物質のシェルの間の界面に、有機または無機分子を含む。検出タグに対するこのアプローチは、高解像度分子分光ツールとしてのラマン散乱の力およびＳＥＲＳに関連する増進を利用する一方、再現が困難であり、そして選択性がないなどの、独立ＳＥＲＳ支持体を作製する際にしばしば出会う欠点を回避する。ＳＥＲＳナノタグは、６３３および７８５ｎｍ励起波長で、強いスペクトルを示し（１０６を超える増強係数）、これらの波長は、全血などの生物学的試料における、ならびにガラスおよびプラスチックのようなマトリックスにおける、内在性のバックグラウンド蛍光を回避するのに優れている。本質的にＳＥＲＳ不活性であるガラスコーティングは、凝集に対して粒子を安定化させ、レポーターが拡散するのを防止し、望ましくない種の競合的吸着を防止し、そしてバイオアッセイ発展のために生体分子をコンジュゲート化可能な、非常に優れた、よく確立された表面を提供する（ＡｓｌａｍおよびＤｅｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｇｒｏｖｅ'ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，  ニューヨーク州ニューヨーク）。
【００１９】
［００５７］タグの多数のユニークなフレーバーが利用可能である。図２は、多重化アッセイに利用可能な、明らかに区別される特徴を持つ、５つのユニークなＳＥＲＳタグのスペクトルのグラフ１８を示す。多重化アッセイでは、単一のスペクトルが獲得され、そしてそのスペクトルを構成要素に定量的に分離することが必要であろう。個々の構成要素のスペクトル・デコンボリューションおよび定量化のため、改良された商業的ソフトウェアパッケージを用いて、標準として各タグ由来の純粋なスペクトルを用いて、線形最小二乗分析を実行してもよい。
【００２０】
［００５８］Ｂ．試験バイアル内壁上の、捕捉抗体でのサンドイッチイムノアッセイ。
［００５９］本発明と一致した不均一および均一イムノアッセイの特定の態様は、試験バイアルの内壁を捕捉抗体で誘導体化することを特徴とする。全血または血清アッセイは、特にラマンスペクトル獲得前に過剰な「未結合」タグを除去する場合、この形式で実現可能でありうる。この形式下で、無希釈（ｎｅａｔ）の血漿または全血の存在下、ＳＥＲＳタグが読取り可能であり、そして検出システムが適切に狭い被写界深度を提供する場合、過剰なタグの除去は必要ではない。
【００２１】
［００６０］以下の実施例１に詳述する方法にしたがって、試験バイアル壁に基づく代表的なアッセイが調製されてきている。本発明のこの側面に一致したアッセイを調製するかまたは実行するのに、他の方法が等しく適している。
【００２２】
［００６１］代表的な連続（不均一）試験バイアル壁アッセイを図３に図解的に例示する。捕捉抗体３０は容器の底に共有結合し、そして検出抗体３２は、ＳＥＲＳナノタグ３４に共有結合している。
【００２３】
［００６２］連続アッセイにおいて、試料をバイアルに添加し、そして２．５時間インキュベーションした。未結合分析物を洗い流した後、ＳＥＲＳナノタグとさらに２時間インキュベーションする。ガラスバイアルの底壁上に焦点を当ててラマンスペクトルを採取した後、未結合ＳＥＲＳナノタグを除去し、そして過剰なタグを洗い流した後に再び採取した。
【００２４】
［００６３］このアッセイ形式を用いて、抗体をスクリーニングし、そして抗体対を選択した。種々さまざまなものを組み合わせた一連の実験を行った後、捕捉抗体として、モノクローナル抗ＩＬ−２抗体を選択し、そして誘導体化バイアルにコンジュゲート化した。検出抗体としてポリクローナルを選択した。
【００２５】
［００６４］図４のグラフ４０および４２は、上述の連続形式アッセイで得た標準曲線を例示する。ブランク試料（各工程後の洗浄、分析物不含）の２０回の読取りに渡って採取したデータは、約１００ｐｇ／ｍｌの検出限界を生じた。
【００２６】
［００６５］各ＩＬ−４用量に関して、ラマンスペクトルを収集した。古典的最小二乗法を用いて、図４に示すラマンスペクトルを相対ラマン単位（ＲＲＵ）と称される数に数学的に換算した（ｒｅｄｕｃｅｄ）。この数は、ピーク強度に比例し、これを、同じＳＥＲＳナノタグの保存した参照スペクトルに対して標準化する。
【００２７】
［００６６］別の均一アッセイ形式を図５に図解的に例示する。試料（分析物）添加前に、検出コンジュゲート５０をバイアル内に装填した。１時間のインキュベーション後、バイアルを、１）未結合タグの存在下で、２）上清（未結合タグ）の除去後、そして再び３）バイアル洗浄（非特異的に結合したタグの除去）後に読み取った。
【００２８】
［００６７］図６のチャート６０は、過剰な未結合タグを除去する前の、図５の均一アッセイの用量反応曲線を例示する。連続洗浄アッセイと比較して、すべてのＩＬ−４濃度に関して、より高いシグナルが観察され、ダイナミックレンジの低下が伴い、これは、溶液中の未結合タグの寄与を示す。この「遊離タグ」干渉は、おそらく、ラマン読取り装置の広い被写界深度に起因する。
【００２９】
［００６８］高いバックグラウンドが、溶液中の遊離タグのためであることを立証するため、ポリリジンでコーティングしたガラスカバースリップに、単層未満（ｓｕｂｍｏｎｏｌａｙｅｒ）のＢＰＥタグを装填した。異なるタグ（ＤＰＹ）の懸濁物を、カバースリップに添加した。５０ｘ対物レンズ（〜２ミクロンの収集深度；Ｒｅｎｉｓｈａｗラマン顕微鏡）で、カバースリップ表面に焦点を当てて、異なる時間間隔でラマンスペクトルを収集した。
【００３０】
［００６９］図７のグラフ７０は、上述のように調製したカバースリップ表面の２分後（トレース７２）および１０分後（トレース７４）のラマンスペクトル、ならびにガラス表面上のＤＰＹタグの懸濁物のスペクトル（１１分後のバルクスペクトル７６）を例示する。「２分後の表面スペクトル」は、本質的にＢＰＥスペクトルであり、ＤＰＹタグからはほとんど寄与はなかった。予期されるように、ＤＰＹスペクトル寄与は、タグがイオン相互作用を介して表面に結合し始めるにつれて、時間とともに増加している。表面上の溶液から採取したスペクトルは、ＤＰＹタグの存在のみを明らかにする。これは、狭い被写界深度を持つ対物レンズを用いた場合、表面結合タグを、溶液中のタグから区別可能であることを立証する。図４のデータ収集に用いた、ラマン読取り装置収集深度（現在、５０ｘよりも１０００倍深い）は、表面および溶液タグの間の区別を可能にせず、したがって、ラマンスペクトルを取る前に、上清を除去（そして洗浄）することを必要とする。
【００３１】
［００７０］過剰なタグを洗い流したら、バックグラウンドシグナルは、図８のグラフ８０に示すように劇的に減少する。また、「洗浄バイアル」の全体のシグナルは、非常に多様であることが観察され、これは、「洗浄緩衝液」が最適化されていないことを示す。洗浄緩衝液最適化の努力はまったくなされなかった。
【００３２】
［００７１］アッセイ性能に対する生物学的マトリックスの効果を調べる前に、血漿または血液の存在下で、ＳＥＲＳナノタグが読取り可能であることを立証した。図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ポリリジンでコーティングしたガラスバイアルの底壁に結合したＳＥＲＳナノタグのスペクトル画像化に対する、水およびＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（図９Ａ）、全血漿（図９Ｂ）、ならびに血漿および全血混合物（図９Ｃ）の影響を記載する。無希釈血漿および全血両方が、波数７００〜１８００の間で、波数が増加するのに伴う散乱強度の不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）減少以外には、有意なラマン散乱強度を持たないことにまず注目すべきである。これは、ナノタグ励起のためのエネルギーの減少を生じる、試料によるエネルギー吸収に起因する可能性もある。あるいは、生物学的マトリックスは、バイアル表面から、いくつかのＳＥＲＳナノタグを洗い落とす可能性もある。
【００３３】
［００７２］アッセイ性能に対するヒト血漿および血液の影響もまた調べた。総アッセイ体積の３０％の血漿または血液濃度は、洗浄前および洗浄後、バックグラウンドシグナルが高く、そしてスパイク回収が劣っているかまたはまったくないことによって、アッセイ性能に負に影響を及ぼした。しかし、図１０のグラフ１００は、アッセイが、１６％全血または１６％血漿において、ＩＬ−４スパイク（５０ｎｇ）を回収する能力を示す。
【００３４】
実施例１：
［００７３］試験バイアル内壁上の検出タグの捕捉を特徴とするアッセイを調製するための代表的な方法。
【００３５】
［００７４］材料および試薬
・商業的に入手可能なラマンスペクトル検出デバイス上で読取りを行った。
・Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０カルボン酸、２．８μｍ、製品番号１４３．０５、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ノルウェイ・オスロ）。
【００３６】
・ＢｃＭａｇシリカ修飾磁気ビーズ、１μｍ、カタログ番号ＦＦ−１０１は、ＢｉｏＣｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）の製品であった。
・抗ヒトＩＬ−４モノクローナル（ＭＡＢ  ６０４）およびヤギ・ポリクローナル（ＡＦ  ２０４Ｎａ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から得た。
【００３７】
・抗ヒトＣＲＰ抗体、クローン２６５−１００３２および２６５−１００３６をＯＥＭ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ（ニュージャージー州トムズリバー）から得た。
・Ｎａｎｏｐｌｅｘ  ＲＥＦで開発された標準的プロトコルを用いて、検出抗体をＳＥＲＳナノタグに共有結合させた。
【００３８】
・ＡＰＴＭＳ、ＥＤＣおよび無水コハク酸をＳｉｇｍａから得た。
・（３−グリシドキシプロピル）−トリメトキシシラン。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。
【００３９】
・ウシ血清アルブミンはＰｉｅｒｃｅの製品であった。
・ガラスバイアル、１２ｘ３２ｍｍ、パーツ番号ＣＴＶ−１００２はＣｈｒｏｍＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．（ミネソタ州）の製品である。
【００４０】
［００７５］緩衝液
・ＭＥＳ  ５０ｍＭ、ｐＨ４．５
・ＰＢＳ
・磁気粒子保存緩衝液：０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ
・バイアルに基づくアッセイのためのアッセイ緩衝液：１％ＢＳＡ、０．５％ＰＥＧ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＰＢＳ
・磁気ビーズに基づくアッセイのためのアッセイ緩衝液：５％ＢＳＡ、０．５％ＰＥＧ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ
・洗浄緩衝液：１％ＢＳＡ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ
［００７６］方法およびプロトコル
［００７７］Ｄｙｎａｂｅａｄｓへの抗体コンジュゲート化のための一般的な方法
１．  ２００μｌ  ＭＥＳで１ｍｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０カルボン酸を洗浄する（２回）。
【００４１】
２．  １００μｌ  ＭＥＳでエッペンドルフ試験管（５００μｌ）内に再懸濁する。
３．  ３０μｌの抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を添加する。
４．  試験管に１００μｌ  ＭＥＳを添加する。
【００４２】
５．  よく混合し、そしてゆっくり傾斜回転させながら室温で３０分間インキュベーションする。
６．  使用直前に、冷１００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５にＥＤＣを溶解して、１００ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
【００４３】
７．  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ／リガンド懸濁物に１０μｌ  ＥＤＣ溶液（１ｍｇ）を添加する。よく混合する。
８．  ゆっくり傾斜回転させながら室温で２時間インキュベーションする。
【００４４】
９．  ２００μｌエタノールアミン５０ｍＭ、ＰＢＳ（３ｍｇ／ｍｌ）でブロッキングする。
１０．  ゆっくり傾斜回転させながら室温で０．５時間インキュベーションする。
【００４５】
１１．  ３００μｌ  １％ＢＳＡ、ＰＢＳで１回洗浄する。
１２．  １％ＢＳＡ、ＰＢＳで、４℃で一晩ブロッキングする。
１３．  ＰＢＳ中の０．１ＢＳＡ、０．０５Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。
【００４６】
１４．  １％ＢＳＡ、ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌでコンジュゲートを保存する。
［００７８］ガラスバイアル誘導体化：ＡＰＴＭＳ
１．  ＥｔＯＨ中の２％  ＡＰＴＭＳ／２％水の８０μｌ溶液をバイアルに添加する。底面を覆うのにちょうど十分な体積−最大体積＝８０μｌ。
【００４７】
２．  室温で３０分間反応させる。
３．  溶液を取り除く。
４．  ＥｔＯＨ、５００μｌを添加して、そしてホットプレート上に３０分間セットする（最低の設定）。
【００４８】
５．  ＥｔＯＨで洗浄し、そして１回リンスする。
６．  ＤＩ水で３回洗浄する。
７．  ２００μｌの水中で保存する。
【００４９】
［００７９］ＡＰＴＭＳ誘導体化バイアルの無水コハク酸誘導体化
１．  ＡＰＴＭＳコーティング粒子の水をホウ酸緩衝液と交換する。
２．  ＤＭＳＯ中の無水コハク酸（４０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製する。
【００５０】
３．  １ｍｌホウ酸中の４０μｌの無水コハク酸溶液の１００μｌを添加する。室温で３０分間インキュベーションする。
４．  工程３を反復する。
【００５１】
５．  ＤＩ水で３回洗浄する。
６．  １ｍｇ／ｍｌで、ＤＩ水中で保存する。
［００８０］チオール化ＳＥＲＳタグへの抗体コンジュゲート化
１．  水中、１ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＳＭＣＣ溶液を調製する。
【００５２】
２．  抗体５０μｇあたり、１００μｌのスルホ−ＳＭＣＣを添加する。
３．  混合物をボルテックスして、そして３０〜４５分間反応させる。
４．  製造者の指示にしたがって、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５マイクロスピン脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、マレイミド活性化抗体溶液を精製する。
【００５３】
５．  チオール化タグ（１ｍｌ水中、４ｘ１０１１粒子）に１００μｌのＰＢＳを添加して、１ｍＭ  ＰＢＳ溶液を生じる。
６．  精製マレイミド活性化タンパク質を溶液に添加する。よく混合し、そして室温で２時間反応させる。粒子を穏やかに攪拌するか、または時々ボルテックスして、反応を促進する。
【００５４】
７．  水中で、ＭＥＳＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する。タグに５０μｌを添加し、そして２０〜３０分間反応させる。
８．  ５％ＢＳＡ溶液２５μｌをタグに添加し、そして遠心分離して精製する。〜１５００ＲＣＦ（Ｊｏｕａｎ  １４微量遠心分離装置上、３８００ＲＰＭ）で、１２分間スピンする。
【００５５】
９．  １ｍｌの０．１ｘＰＢＳ＋２５μｌの５％ＢＳＡ中に粒子を再懸濁する。再び遠心分離する。さらに１または２回反復する（総数３または４回の遠心分離工程）。
１０．  ０．１％ＢＳＡを含有する所望の緩衝液中、所望の濃度まで粒子を再懸濁する。
【００５６】
［００８１］ＡＰＴＭＳおよびカルボキシ−ＡＰＴＭＳコーティングバイアルに対する抗体コンジュゲート化
１．  １０μｌの抗体ストックを取り、そして１ｍｌ  ＰＢＳ中に希釈する−バイアルへのコンジュゲート化を１０μｇ／ｍｌで行う。
【００５７】
２．  １００μｌをバイアルに添加する。
３．  ３０分間インキュベーションする。
４．  ＥＤＣ溶液を調製する（１Ｍ、２００ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＳＯ）。
【００５８】
５．  抗体を含有するバイアル内に、ＥＤＣ溶液１０μｌを添加する。
６．  ４℃で一晩保存する。
７．  １００μｌ（ＰＢＳ、ＢＳＡ１％）を添加する−ブロッキング。
【００５９】
８．  １時間、軌道振盪する。
９．  ２００μｌ  ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで３回洗浄する。
［００８２］連続ＩＬ−４アッセイ法−バイアルアッセイ
１．  ＩＬ４を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈する−１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４ストック溶液。
【００６０】
２．  関連するバイアルに１００μｌ添加する。
３．  プレート振盪装置上で、室温で２．５時間インキュベーションする。
４．  溶液を吸引する。
【００６１】
５．  ２００μｌ  ＰＢＳ、０．０５％ＢＳＡ、０．２５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
６．  １０ｘＩＬ４−ＳＥＲＳコンジュゲートを適切な濃度に希釈する。
【００６２】
７．  １００μｌを関連するバイアルに添加する。
８．  プレート振盪装置上で、２時間インキュベーションする。
９．  吸引し、そしてＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ読取り装置上で読み取る。
【００６３】
［００８３］均一ＩＬ−４アッセイ法−バイアル
１．  ０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて、１０ｘＩＬ４−ＳＥＲＳコンジュゲートを適切な濃度に希釈する。
【００６４】
２．  １００μｌを関連するバイアルに添加する。
３．  １００μｌ試料−反応緩衝液、血漿または血液を添加する。
４．  ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ中でＩＬ−４を希釈する。
【００６５】
５．  １００μｌを関連するバイアルに添加する。
６．  プレート振盪装置上で、室温で１時間インキュベーションする。
７．  溶液を取り除く。
【００６６】
８．  Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ読取り装置上でスペクトルを読み取る。
９．  所望により：２００μｌ  ＰＢＳ、０．０５％ＢＳＡ、０．２５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。
【００６７】
１０．  Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ読取り装置上でスペクトルを読み取る。
［００８４］Ｃ．磁気捕捉粒子を使用するサンドイッチイムノアッセイ
［００８５］本発明と一致する不均一および均一イムノアッセイの特定の態様は、磁気捕捉粒子の使用を特徴とする。磁気捕捉粒子およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子を組み合わせた特性は、ロボットの使用、大規模なまたは複雑な試料調製および分析分離を回避する一方、単純で定量的な、迅速（リアルタイム）で、そして多重化されたタンパク質測定を可能にする、生物分析基盤を生じる。図１１は、１つのアッセイ形式を図解的に例示する。捕捉抗体１００を磁気粒子１０２に共有結合させ、そして検出抗体１０４をＳＥＲＳナノタグ１０６に共有結合させる。捕捉粒子および検出粒子の両方を、容器、たとえばポリプロピレン試験管内に装填し（適切な希釈緩衝液であらかじめ希釈する）、その後、試料を装填する。化学薬品、タンパク質または関心対象の物質と会合した抗原１０８は、捕捉粒子および検出粒子と結合することによって、２粒子免疫複合体の形成を引き起こす。例えば回転混合ホイール上でのインキュベーション後、試験管を磁気粒子濃縮装置上に置いて、２粒子免疫複合体に加えて遊離磁気粒子を試験管の底にプルダウンする。次いで、試験管をＳＥＲＳ読取り装置上に置いて、そしてレーザーの焦点を磁気粒子上に当てた後、ＳＥＲＳナノタグと会合したレポーター分子由来のラマンスペクトルを記録する。したがって、別個の工程において、磁気粒子を分離および洗浄することなく、捕捉された分析物および複合体化した検出粒子を、試料マトリックスおよび過剰な遊離検出粒子がなお存在する間に、反応容器内の特定の位置で濃縮する、本発明の１つの側面を実行する。磁気粒子およびＳＥＲＳナノタグを用いて実行するアッセイは、全血または血清中のタンパク質の検出に特に有用でありうる。調製の変動およびこの生物分析基盤アッセイの使用を示す例を、以下のセクションで論じる。
【００６８】
［００８６］以下の実施例２に詳述する方法にしたがって、代表的な磁気捕捉粒子に基づくアッセイを調製した。本発明のこの側面に一致したアッセイを調製するかまたは実行するための他の方法が等しく適切である。
【００６９】
［００８７］実施例２の方法にしたがって、捕捉粒子および検出粒子の両方を、ポリプロピレン試験管内に装填し（適切な希釈緩衝液であらかじめ希釈する）、その後、試料を装填する。回転混合ホイール上でのインキュベーション後、試験管を磁気粒子濃縮装置上に置いて、磁気粒子を試験管の底にプルダウンする。次いで、試験管をＳＥＲＳ読取り装置上において、そしてレーザーの焦点を磁気粒子上に当てた後、ラマンスペクトルを記録する。
【００７０】
［００８８］上述のように、捕捉抗体で誘導体化された磁気粒子、およびレポーターとしてのＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化された検出抗体を用いて、Ｃ反応性タンパク質に関する無洗浄（均一）サンドイッチイムノアッセイを調製した。結果は、洗浄を伴わず、そして低コスト検出システムを用いて、生物学的マトリックスの存在下で、２粒子複合体を分析可能であることを示す。
【００７１】
［００８９］ＩＬ−４磁気ガラスコーティングビーズに基づくアッセイの結果を、図１２の用量反応曲線１２０によって例示する。高濃度の粒子および１時間の比較的長いインキュベーション時間を用いて、これらのＩＬ−４予備的結果を得た。好ましくは、ＩＬ−４アッセイの感度を最適化した結果、インキュベーション時間を３０分間または実質的により少なく減少させてもよい。図１３のグラフ１３０に示すように、インキュベーション時間を３０分間に減少させ、そして検出粒子を１０倍減少させても、シグナルの大きさおよび試験のダイナミックレンジの予期される変化以外には、アッセイ性能に負の影響はなかった。検出粒子濃度をさらに２倍減少させると、図１４のグラフ１４０に示すように、１ｍｌあたり１フェントグラムのアッセイ感度範囲を生じる。図１４の例において、粒子量の減少に伴って、非特異的なシグナルが減少したが、それに応じて全体のシグナル強度もまた減少する。にもかかわらず、これらの結果は、１００フェントグラム／ｍｌに近いアッセイ感度が達成可能であることを示す。
【００７２】
［００９０］上述の１工程３０分間無洗浄アッセイは、同じ抗体を用いるが、多数の洗浄工程および２００μｌの試料体積を含めて、全日に渡る、多数の工程を行うことを必要とする、商業的に入手可能なアッセイの感度（〜１００ｆｇ／ｍｌ）に非常に好都合に匹敵する。
【００７３】
［００９１］限定されるわけではないが、以下を含む多くの要因が、アッセイ感度に影響を及ぼしうる：
・捕捉粒子および検出粒子表面上の生体適合性コーティング、
・粒子にコンジュゲート化された抗体量、
・アッセイ緩衝液組成、
・捕捉粒子および検出粒子濃度、ならびに
・読取り装置感度。
これらの要因の特定のもの、およびこれらの要因の最適化を、以下に詳細に論じる。
【００７４】
［００９２］生体適合性コーティング：
［００９３］通常、異なる長さ、電荷および極性の天然または合成ポリマーから選択される、生体適合性コーティングの賢明な選択によって、非特異的粒子−粒子相互作用の減少を達成してもよい。
【００７５】
［００９４］ＳＥＲＳナノタグ上の抗体濃度：
［００９５］コンジュゲート化プロセス中、１０倍および１００倍少ない抗体を用いて、一連の抗体ＳＥＲＳナノタグ・コンジュゲートを調製した。生じたコンジュゲートを試験し、そして減少していない濃度のコンジュゲートと比較した。どちらのコンジュゲートも活性を示さず、これはおそらく、システムにおける検出抗体濃度の全体の減少のためである可能性が最も高い。しかし、有効なアッセイの調製に適した抗体の最小量はまだ決定されていない。
【００７６】
［００９６］アッセイ緩衝液組成：
「００９７」緩衝液組成および緩衝液添加物は、アッセイ性能に劇的な影響を有しうる。アッセイブロッキング剤のいくつかの性質を調べた。ＣＲＰアッセイに好ましいアッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、０．０５％ＰＥＧ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する。ＩＬ−４アッセイには、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液が適切である。
【００７７】
［００９８］捕捉粒子および検出粒子濃度：
［００９９］多次元マトリックス実験を実行して、アッセイ性能に対する捕捉粒子および検出粒子濃度の影響を主に調べた。図１５のグラフ１５０は、この最適化プロセス中に得られた最適な用量反応曲線を例示する。図１４に記載する実験に比較して、試薬濃度がさらに減少し、そしてしたがってアッセイのダイナミックレンジがさらに減少したことに注目されたい。図１５のアッセイの結果は、商業的に入手可能な製品に比較して「無洗浄アッセイ」に効果的であり、そして１０フェントグラム／ｍｌの感度が達成可能であることを示す。
【００７８】
［００１００］ゼロ較正物質（ブランク）の１８の複製物の平均値プラス２標準偏差から計算した検出限界として、アッセイ感度を定義してもよい。あるいは、計時の適切な管理下で、６つの「ゼロ較正物質」を平行して分析してもよい。以下の表１は、（「ブランク」または「ゼロ較正物質」の６つの複製物の多数の測定から得た）非特異的シグナルを提供する。〜３１％の変動係数（ｃｖ）を決定したが、これは、独立の実験実行に渡って定期的に見られる平均非特異的シグナル変動と一致する。
【００７９】
［００１０１］表１：「ブランク」試料の６つの複製物の相対的強度（恣意的単位）
（各試料に関して最低３回測定）。
【００８０】
【表１】
2009525763.tif 000002
【００８１】
［００１０２］表１に示す、この相対的に高い変動係数は、２粒子間の非特異的相互作用のより十分な対照が望ましいことを示すが、これらの量を減少させると、非特異的結合のため、全体のシグナルが最小化されるようである。
【００８２】
［００１０３］このｃｖがすべてのアッセイ実行に渡って適用可能であると仮定して、大部分の用量反応曲線に関して、５００フェントグラム／ｍｌ未満の検出限界を決定してもよい。ここで、決定を行うために、１８複製物でなく６複製物を用いたため、ゼロ較正物質（ブランク）の平均値プラス３標準偏差から、検出限界を概算した。
【００８３】
［００１０４］以下に詳細に記載するように、さらに最適化することなく、生物学的マトリックスの存在下で、ＩＬ−４アッセイを実行してもよい（例えば１５％および３０％の全血および血清中、中程度の範囲のＩＬ−４スパイクが回収可能である）。図１６のグラフ１６０に例示するように、磁気捕捉粒子と免疫複合体を形成するＳＥＲＳタグは、血清および全血の両方で、検出可能である。「１５％血清−スパイクなし」結果は、５００ｆｇのＩＬ−４とほぼ同じシグナルを生じ、血清試料において、およそ１０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４濃度が得られた（５０μｌ血清中、〜５００ｆｇ）。５ｐｇ／ｍｌでスパイク処理したＩＬ−４の回収は非常に低く、そして試料濃度を増加させると、特異的および非特異的シグナルの両方が劇的に減少した。「１５％血清」試料中で、最適な回収（〜３２％）が得られた。
【００８４】
［００１０５］磁気捕捉粒子およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子を用いて調製したアッセイは、多重化アッセイの実行に特によく適している。ＩＬ−４およびＣＲＰの組み合わせに関して、多重化用量反応曲線を実行するため、各分析物に関するユニークな検出タグを調製しなければならない。さらに、２つのアッセイは、同じ緩衝液中で機能する必要がある（アッセイ条件の調和）。第一のＢＰＥ  ＳＥＲＳナノタグを用いて、例のアッセイを調製した。第二のタグとしてＤＰＹを選択し、そしてＩＬ−４およびＣＲＰ両方に対する検出抗体を両方のタグにコンジュゲート化した。さらに、ＣＲＰに関する好ましいアッセイ緩衝液は、５％ＢＳＡ、０．０５％ＰＥＧおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳであり、一方、ＩＬ−４に関する好ましい緩衝液は、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡであるため、調和した緩衝液条件を同定する必要がある。
【００８５】
［００１０６］図１７のグラフ１７０は、多重化アッセイのＩＬ−４部分に関する検出タグおよび緩衝液スクリーニング結果を要約し、そしてＢＰＥおよび１％ＢＳＡがこのアッセイに関して選択される条件であることを確認する。ＩＬ−４  ５０ｐｇ／ｍｌおよび非存在の間のシグナル強度の相違は、１％ＢＳＡ中のＢＰＥタグで最大である。ＤＰＹタグコンジュゲートは、５％ＢＳＡ（５％ＢＳＡ、０．０５％ＰＥＧおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中で十分な陽性シグナルを生じない。
【００８６】
［００１０７］図１８のグラフ１８０は、多重化アッセイのＣＲＰ部分に関する検出タグおよび緩衝液スクリーニング結果を要約し、両方の検出タグおよび両方のアッセイ条件は、適度によく働き、最適条件は、５％ＢＳＡ中のＢＰＥタグである。適切な多重化アッセイは、ＩＬ−４に関するＢＰＥタグ、および緩衝液の好ましい選択肢としての１％ＢＳＡに基づいてもよい。したがって、ＣＲＰに関しては、ＤＰＹタグを選択してもよい。図１９のグラフ１９０に示すように、アッセイのＣＲＰ部分は、これらの理想的な条件より劣る条件下で、依然として機能する。図２０のグラフ２００は、ＣＲＰおよびＩＬ−４両方に関する陰性対照および陽性対照のシグナル強度（単一）、その後、多重化実験（二重陰性および二重陽性）を示す。多重化アッセイにおいて、４つのアッセイシグナルのうち３つでシグナル強度が減少していることが注目された。ＩＬ−４（０）シグナル強度のみが、単一アッセイで示したものと類似のままであった。にもかかわらず、陽性読取り値の回収は、ＣＲＰアッセイに関しては依然として同じであり（単一および多重化アッセイ両方で、〜４００単位の相違）、一方、ＩＬ−４の場合、回収は強く抑制された。これは、アッセイ間干渉を示す。例えば、ＣＲＰに基づく複合体が過剰に存在すると、はるかに少数のＩＬ−４特異的複合体の正確な読取りが妨げられうる。ＩＬ−４スパイクの全体のシグナル抑制および低い回収の根底にある理由を理解し、そして解明するには、さらなる研究が必要である。
【００８７】
実施例２：
［００１０８］磁気捕捉粒子を用いて調製したアッセイの以下の実施例を例示目的のためのみに提供し、そしてこれは、本発明の範囲を限定することを意図しない。出願者らは、図１１に示すものなどのアッセイに関して実験を行った。
【００８８】
［００１０９］１．チオール化ＳＥＲＳナノタグに対する抗体コンジュゲート化
［００１１０］スルホ−ＳＭＣＣの溶液（１００μｌ、水中、１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中の抗体の溶液（５０μｇ、５０μｌ）に添加した。３０分後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５マイクロスピン脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、マレイミド活性化抗体を精製した。次いで、精製したコンジュゲートをチオール化ＳＥＲＳタグ（１００μｌ  ＰＢＳ中、４ｘ１０１０粒子）に添加した。室温で２時間後、ＭＥＳＡの溶液（５０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）、その後、５％ＢＳＡ溶液（２５μｌ）で、反応を３０分間停止した。タグコンジュゲートを洗浄し、遠心分離によって精製し、そして所望の緩衝液中、所望の濃度で、０．１％ＢＳＡに再懸濁した。
【００８９】
［００１１１］２．磁気ガラスコーティングビーズのカルボキシル化
［００１１２］Ｂｉｏｃｌｏｎｅの磁気ガラスコーティングビーズ（４ｍｇ）をエタノール（１ｍｌ）で２回洗浄した後、エタノール中の２％  ＡＰＴＭＳ（３−アミノプロピルトリメトキシシラン）（１ｍｌ）の溶液で、室温で３０分間処理した。磁気的プルダウンを介してビーズを洗浄し、そしてホットプレート（５０℃）上、エタノール（５００μｌ）で３０分間処理した。エタノールおよび水で洗浄した後（３回）、４ｍｇ／ｍｌで、水中で磁気粒子を保存した。ＤＭＳＯ中の無水コハク酸（２０μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理することによって、ホウ酸緩衝液中、カルボキシル化を行った。カルボキシル化ビーズを洗浄し、そして水中で保存した。
【００９０】
［００１１３］３．カルボキシル化磁気ガラスコーティングビーズおよびＤｙｎａｂｅａｄｓへの抗体コンジュゲート化のための一般的な方法
［００１１４］ＰＢＳ（１００μｌ）中のカルボキシル化磁気ガラスコーティングビーズまたはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０カルボン酸（１ｍｇ）を、ＥＤＣ溶液（１０μｌ、１ｍｇ）の添加前に、抗体（３０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。混合物を室温で２時間、ゆっくり傾斜回転させながらインキュベーションした後、ＰＢＳ中のエタノールアミン（２００μｌ、３ｍｇ／ｍｌ）で０．５時間ブロッキングした。次いで、コンジュゲートを洗浄し、そしてＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で、一晩さらにブロッキングし、そして同じ緩衝液中、４℃で保存した。
【００９１】
［００１１５］４．Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に関する、磁気ビーズに基づく均一アッセイ
［００１１６］エッペンドルフ試験管（ポリプロピレン、５００μｌ）に以下の試薬を連続して装填した。
【００９２】
Ａ．  １０μｌ磁気ガラスビーズ−抗ＣＲＰコンジュゲート（１０μｇビーズ）
Ｂ．  １００μｌ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）
Ｃ．  ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中の１００μｌ抗ＣＲＰ−ＳＥＲＳコンジュゲート
Ｄ．  １００μｌ分析物溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）
［００１１７］混合ホイール上で３０分間穏やかに混合することによって、混合物を室温でインキュベーションした。磁気粒子濃縮装置を用いて、試験管の底に磁気粒子を引っ張った。試験管をラマン読取り装置上に置き、そして光学検出システムの焦点面内に、試験管の底（すなわち磁気ビーズ）が置かれるように調整した。１秒間の読取り時間後、獲得したデータを、分析物濃度測定を可能にする私有のソフトウェアパッケージで換算した。
【００９３】
［００１１８］緩衝液中のＣＲＰを検出するため、Ｄｙｎａｌの１μｍガラスコーティング磁気粒子、およびビス（４−ピリジル）エチレン（ＢＰＥ）ＳＥＲＳナノタグを用いて、データを収集した。Ｄｅｌｔａ  Ｎｕ社のＩｎｓｐｅｃｔｏｒラマン装置上でラマンスペクトルを収集した。Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒラマンシステムは、４０ｍＷ、７８５ｎｍレーザー励起、自由空間光通信を使用し、持ち運び可能であり、そしてラップトップコンピュータにインターフェースで接続可能である。スペクトルの最小二乗適合を実行して、複雑な混合物における構成要素を定量化するソフトウェアプログラムを用いて、データを分析した。図２１のグラフ２１０は、炎症および心臓血管疾患の診断のための生物学的に適切なターゲットである、ＣＲＰに関する用量反応曲線を示す。したがって、アッセイは、約２５分間で行われる、１工程均一無洗浄法である。１μｇ／ｍｌ  ＣＲＰでのＳＥＲＳ反応が、１００ｎｇ／ｍｌでの反応より低いという観察は、過剰な分析物が、捕捉抗体および検出抗体部位の両方を飽和させ、したがって免疫サンドイッチの形成を禁じる、阻止帯または「フック効果」に起因する。
【００９４】
［００１１９］上述の緩衝液中の用量反応を数回反復すると、同じ試験管の３つ組読取りに関する１５％未満の変動係数（ｃｖ）を持つ標準偏差を生じることによって、優れたアッセイ再現性があった。ブランクを２０回読み取って、２０％のｃｖおよび２００ｐｇ／ｍｌのアッセイ内検出限界を得た。この検出限界は、ヒトＣＲＰの平均の正常生理学的濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）より５００倍よりも低い。
【００９５】
［００１２０］血漿または血液などの生物学的マトリックスのバックグラウンド中で、ＳＥＲＳナノタグを読み取ることも可能である。図９Ｃは、ガラスバイアル中、全血および血漿の７０：３０混合物のＳＥＲＳスペクトルを示す。無希釈血漿および全血が、どちらも、７００〜１８００波数の間で、有意なラマン散乱強度を持たないことに注目することが重要である。図９Ａの上部のトレース９０は、ＳＥＲＳナノタグを同じ生物学的カクテルに添加した際と、同じスペクトルを示す。これは、生物学的マトリックスにおいて、適切なシグナル対ノイズ比を持つＳＥＲＳナノタグの読取りが実現可能であることを例示する。
【００９６】
［００１２１］すべてのコンジュゲート化抗体が、活性のままではないし、そしてすべての粒子がコンジュゲート化後、コロイド的に安定なままであるわけではない。各分析物に関して、多数の付着化学反応、多数のタイプの磁気粒子（サイズ、組成および表面官能性が異なる）、多数のＳＥＲＳタグ官能性および多数の抗体を調べてもよい。
【００９７】
［００１２２］捕捉粒子および検出粒子の両方に対するバイオコンジュゲート化の頑強でそして調節可能な方法を発展させることが重要である。適切なＳＥＲＳナノタグおよび磁気粒子は、ガラス被包であってもよいため、同じバイオコンジュゲート化化学反応を用いることが可能でありうる。商業的に入手可能なカルボキシ−、メルカプト−、およびアルデヒド−シランで表面シラノール基を容易に誘導体化させて、広い最適化空間を研究することを可能にしてもよい。表面修飾のための好ましいプロトコルは、チオール化ＳＥＲＳナノタグに頼る。カルボキシレート、アミンおよびアルデヒド官能性は、より安定な中間産物を生じうる。異なる付着化学反応（異なる反応条件に対応する）を調べてもよい。これは、表２に示すように、大部分の生物学的分子に関する緩衝液必要性（Ｐｉ）を含み、そしてコンジュゲート化中の凝集および変性の可能性を回避すべきである（Ｋｒｉｃｋａ（２００５）Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ，  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，  ｂｉｏｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｃｈｉｐｓ−  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｆｃｃ．ｏｒｇ／ｅｊｉｆｃｃ／ｖｏｌ１２ｎｏ４／ｖｏｌ１２ｎｏ４ａ２．ｈｔｍ；  ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３；  ＫｕｓｎｅｚｏｗおよびＨｏｈｅｉｓｅｌ（２００３）Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １６：１６５−１７６；  Ｎｅｍｚｅｋら（２００１）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５５：１４９−１５７）。例えば、還元的アミノ化は、カルボジイミド反応（ＥＤＣ）より広いｐＨ範囲に渡って働き、そしてしたがって、ｐＨを調節し、そして抗体安定性／緩衝液必要性に適応させることが可能であるため、いくつかの利点を提供する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．）。この方式で、抗体沈降または粒子凝集を回避することも可能である。他の利点は、アミン結合がアミド結合よりも安定であり、抗体の全体の電荷が還元的アミノ化後にそのままであり、そしてカルボジイミド反応中に、非常にしばしば観察されるようには、抗体架橋がまったく起こらないことである。
【００９８】
［００１２３］表２：表面官能化およびコンジュゲート化化学反応のリスト
【００９９】
【表２】
2009525763.tif 000003
【０１００】
［００１２４］主な変化点は、非特異的結合（ＮＳＢ）の排除、ならびに磁気粒子およびＳＥＲＳナノタグ間の相互作用の理解にある。異なるコンジュゲート化プロトコル、および表面被覆の各々がＮＳＢに影響を及ぼすレベルを調べてもよい。標準的ブロッキング剤および洗浄緩衝液（異なるｐＨおよび緩衝液に加えて、例えば、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎおよびカゼイン）の使用を調べてもよい。反応時間および粒子の濃度もまた重要であろう。粒子が非特異的に凝集しないことが重要であろう。磁気粒子およびＳＥＲＳナノタグが同じ表面特性を有する際に、非特異的結合が最小限になると予期される。ＮＳＢが克服不能であると証明されたら、すべて低いＮＳＢを有することが知られる、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールおよびデキストラン、ポリエチレンイミン（Ｌｅｅら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  １３：９７−１０３）、ならびにデンドリマー（Ｌｅ  Ｂｅｒｒｅら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：ｅ８８）などのポリマーに基づく、ＳＥＲＳナノタグガラスシェルの誘導体化を調べる。対のアッセイ性能を評価し；緩衝液中の感度、ダイナミックレンジおよび特異性を決定することによって、ＳＥＲＳナノタグおよび磁気粒子の生体機能化（ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の最適化プロトコルを選択してもよい。
【０１０１】
［００１２５］ガラスコーティングした超常磁性粒子を捕捉粒子として用いてもよい。分子生物学において、磁気分離に一般的に利用され、そしてＤｙｎａｌ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＰＧ  Ｉｎｃ．およびＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの企業を通じて容易に入手可能な他の粒子もまた、考慮してもよい。これらの典型的な磁気化可能粒子は、広いサイズ範囲で（５０ｎｍ〜数マイクロメートル）、酵素イムノアッセイ（８）において、そして他の結合アッセイのため、広範囲で用いられてきている。Ｄｙｎａｌの２．８ミクロンのカルボキシル化ポリスチレンでコーティングした磁気粒子を、Ｂｉｏｃｌｏｎｅの１ミクロンのガラスコーティング磁気粒子（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（２００５）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｌｏｎ．ｃｏｍ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｍａｇｎｅｔｉｃ−ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ−ＮＨ２−ＣＯＯＨ−ｓｉｌｉｃａ−ｅｐｏｘｙ−ＩＤＡ−ｂｅａｄｓ．ｈｔｍｌ）と比較し、そしてＣＲＰ用量反応データにおいて、より多孔性でないガラスコーティング粒子が、ＳＥＲＳナノタグのより低い非特異的相互作用を生じることを見出した。アミン、カルボキシ、アルデヒド、エポキシ、シリカ、ヒドラジド、および抗体の安定でそして共有的な結合に用いられている他のものなどの異なる表面官能基を伴う粒子を得てもよい。
【０１０２】
［００１２６］非常に再現性がある方式で、スペクトル的に別個のＳＥＲＳナノタグを製造する（図２に例を示す）。より明るく、そして均一な強度を有する、将来の粒子を用いて、よりよい検出限界を達成することも可能である。
【０１０３】
［００１２７］ポリプロピレンで作製されたエッペンドルフ試験管中で、上に論じるデータを得た。ラマン分析の主な利点は、バイオアッセイ・コミュニティーで用いるアッセイ容器の多くの材料が、ラマン光散乱に対して透過性であり、そしてこれらの材料のバックグラウンド・ラマンシグナルが、一般的に最小限であることである。多くの提唱されるアッセイ形式は、（蛍光の場合に非常にしばしばそうであるようには）アッセイ容器の性質によって限定されず、より重要なことに、多くのアッセイ容器の壁材料を通じて、ＳＥＲＳシグナルを読み取ることも可能である。唯一の限定は、容器壁が、レーザー光エネルギー（典型的には６５０または７８３ｎｍ）に干渉せず／これを吸収しないことである。９６ウェルプレート、試験管、バイアル、バキュテナーおよびカップを含む、非常に多様な、安価でそして一般的に用いられるアッセイ容器が、記載するアッセイに適している可能性もある。以下の材料タイプ：ガラス、シリカ、シリコン、シラン化ガラス、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、テフロン、ポリスチレン、ニトロセルロース、セルロース、ポリエステル、およびポリカーボネートが、アッセイ容器で使用するのに適している可能性もある。
【０１０４】
［００１２８］Ｄ．  ＳＥＲＳ／磁気ビーズハイブリダイゼーションおよびＤＮＡアッセイ。
［００１２９］ＳＥＲＳ磁気ＤＮＡアッセイとして機能するように、ＳＥＲＳナノタグおよび磁気ビーズをハイブリダイズさせてもよい。図２２は、ＳＥＲＳ磁気ビーズハイブリダイゼーションの１つの方法を例示する模式図である。より明るい球体２２００およびより暗い球体２２０２は、カルボキシル表面を持つ、ガラスコーティング磁気ビーズを代表する。標準的ＥＤＣ化学反応を用いて、ビーズの２つの集団を、２つの異なるオリゴヌクレオチド配列２２０４および２２０６にコンジュゲート化する。ビオチン部分２２０８を含有する相補的／非相補的オリゴヌクレオチド配列２２０７に、各集団を別個にハイブリダイズさせる。したがって、この時点では真の多重化は起こらず、むしろ各配列を、別個のエッペンドルフ試験管中で反応させる。記載するプロセスは、多重化試験のためのビーズハイブリダイゼーションにもまた適用可能である。ストレプトアビジンにコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ２２１０を反応に添加し、そして磁場を用いてペレットを単離する。最初の実験において、Ｒｅｎｉｓｈａｗ  ＩｎＶｉａラマン顕微鏡などのラマン読取り装置２２１２を用いて、ペレットを読み取った。あるいは、より安価なまたは持ち運び可能なラマン検査デバイスを利用してもよい。代表的なアッセイを以下の実施例３に記載する。他の方法が、本発明のこの側面と一致するアッセイを調製するかまたは実行するのに等しく適している。
【０１０５】
［００１３０］ビオチン：ストレプトアビジン・ハイブリダイゼーション・アプローチの利点は、照合中のターゲット配列をＳＥＲＳタグで標識する必要がなく、その代わり、ビオチンで標識してもよいことである。しかし、多重化は困難である。３片連結を使用して、多重化を可能にすることが望ましい可能性もある。あるいは、コンジュゲート化の順番を逆にして、元来の配列をまず、異なる「フレーバー」のＳＥＲＳナノタグに付着させ、その後、磁気粒子をストレプトアビジン・コーティングしてもよい。
【０１０６】
［００１３１］図２３のグラフ２３００は、上述のようなＳＥＲＳ磁気ビーズシステムでのｐ５３突然変異体ＤＮＡの検出を例示する。図２２および２３のアッセイは最適化されていないアッセイである。ｐ５３遺伝子中のＬ３４４Ｐ突然変異体から選択したオリゴヌクレオチド配列の２つの変異体を設計し、Ｎ３０ＡおよびＮ３０Ｂと名付けた。Ｎ３０ＡおよびＮ３０Ｂ変異体のターゲット配列は以下のとおりである：
［００１３２］表３
【０１０７】
【表３】
2009525763.tif 000004
【０１０８】
［００１３３］試験管１において、Ｎ３０Ａターゲットを、Ｎ３０Ａ配列にコンジュゲート化した磁気ビーズに添加し（図２３のＮ３０Ａと示す結果の左に示す）、そして試験管２において、Ｎ３０Ａターゲットを、Ｎ３０Ｂ配列にコンジュゲート化した磁気ビーズに添加した（右に示す）。Ｎ３０ＡおよびＮ３０Ａターゲットの両方が存在している場合にのみ、有意なシグナルが観察され、非相補的Ｎ３０Ｂ配列からはより小さいシグナルが生じた。試験管３において、Ｎ３０Ｂターゲットを、Ｎ３０Ａ配列にコンジュゲート化した磁気ビーズに添加し（図２３のＮ３０Ｂと示す結果の左に示す）、そして試験管４において、Ｎ３０Ｂターゲットを、Ｎ３０Ｂ配列にコンジュゲート化した磁気ビーズに添加した（右に示す）。Ｎ３０ＢおよびＮ３０Ｂターゲットの両方が存在している場合にのみ、有意なシグナルが観察され、非相補的Ｎ３０Ａ配列からはより小さいシグナルが生じた。ターゲットをまったく添加しない対照実験を実行し（グラフ２３００中の３番目の２本のバー）、そして予期されるように、低いシグナルが観察された。
【０１０９】
［００１３４］図２４のグラフ２４００は、上述のようなＳＥＲＳ  ＤＮＡ磁気アッセイの滴定結果をグラフで例示する。Ｎ３０Ａコンジュゲート化磁気ビーズ内にドーピングしたＮ３０Ａオリゴヌクレオチドターゲットの滴定を実行して、潜在的な検出限界を決定した。
【０１１０】
実施例３：
［００１３５］ＳＥＲＳ磁気ビーズハイブリダイゼーションおよびＤＮＡアッセイ
［００１３６］コンジュゲート化
１．  ４０μｌの磁気ビーズを取る（８ｘ１０７）。５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）でビーズを２回洗浄する。
【０１１１】
２．  １６３μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）でビーズを再懸濁し、そして２μｌの５０μＭオリゴ（１００ｐｍｏｌ）を添加し、氷上に置く。
３．  ５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）中、２０％ＥＤＣを作製する（５０μｌ  ＭＥＳで１０ｍｇ  ＥＤＣ）。
【０１１２】
４．  １５μｌの２０％ＥＤＣをビーズ／オリゴに添加し、よく混合し、そして４℃で１時間振盪する。
５．  ５００μｌの１０ｍＭ  ＰＢＳで４回洗浄する。すべてのコンジュゲート化されていないオリゴを洗い流すことが非常に重要である。
【０１１３】
６．  ４０μｌ  ＰＢＳ中に再懸濁する（ビーズ８ｘ１０７）。
［００１３７］ハイブリダイゼーション
７．  ３３μｌの２ｘＴＭＡＣ緩衝液を取り、５μｌの１０μＭオリゴおよび５μｌの磁気ビーズプローブ（４ｘ１０６）を添加する。５５℃で１時間ハイブリダイズする。
【０１１４】
８．  １ｘＳＳＣで、室温で５分間洗浄し、そして０．１ｘＳＳＣで、５５℃で５分間洗浄する。
９．  １ｘニュートラアビジン−ＢＰＥ（ＳＥＲＳタグ）を添加し、そして３０分間インキュベーションする。
【０１１５】
１０．  １０ｍＭ  ＰＢＳで２回洗浄する。
１１．  Ｒｅｉｎｓｈａｗ  ＩｎＶｉａラマン顕微鏡によってラマンシグナルを獲得する。
【０１１６】
［００１３８］Ｅ．競合的ＳＥＲＳ／磁気ビーズアッセイ。
［００１３９］ＳＥＲＳナノタグ検出粒子および別個の捕捉粒子を使用して、本発明と一致する均一２粒子競合的アッセイもまた実行してもよい。捕捉粒子が磁性であるならば、以下に記載する特定の利点が達成されるが、本発明のこの側面の範囲は、磁気捕捉に限定されない。競合的アッセイ形式を選択して、任意のタイプのバイオアッセイ診断試験を実行してもよい。しかし、競合的形式は、上述のような、サンドイッチ型免疫複合体を形成可能な２つの異なる抗体に対応するには小さすぎる分析物の検出に、特に好適である。本明細書に記載するような競合的アッセイ形式を利用して、限定されるわけではないが、療法的薬剤、非療法的薬剤（薬剤乱用監視）、ペプチド、ホルモン、タンパク質、または関心対象の他の分析物を含む、任意のタイプの分析物を検出してもよい。競合的アッセイ形式はまた、関心対象の分析物に関して、１つの結合剤しか容易に入手可能でない場合にも、特に好適である。
【０１１７】
［００１４０］捕捉粒子およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子を特徴とする特定の特異的競合的アッセイ形式を以下に詳細に記載する。しかし、一般的に、すべての競合的アッセイ形式は、分析物またはその類似体での捕捉粒子または検出粒子いずれかの標識を必要とする。検出粒子は、蛍光、着色またはＳＥＲＳ活性粒子など、光学的に標識されていてもよい。分析物またはその類似体で標識されていない粒子を、分析物に結合するのに適した結合剤にコンジュゲート化させる。例えば、図２５Ａに示すように、捕捉粒子２５００を、関心対象の分析物２５０２で誘導体化してもよい。さらに、ＳＥＲＳナノタグ検出粒子２５０４を、分析物２５０２に選択的に結合可能な結合剤２５０６にコンジュゲート化してもよい。図２５Ａに示すように、遊離分析物２５０２を含有する試料を、上述のように調製した捕捉粒子およびＳＥＲＳナノタグ検出粒子と接触させた結果、捕捉粒子／ＳＥＲＳ検出粒子複合体２５０８に加えて、遊離分析物２５１０に結合したＳＥＲＳ検出粒子が形成されるであろう。
【０１１８】
［００１４１］捕捉粒子２５００は、磁気捕捉粒子または濃縮に適した他の粒子であってもよい。１つの非磁性態様において、捕捉粒子は、遠心分離によってプルダウンされる巨大なまたは高密度な粒子である。巨大でそして／または高密度な捕捉粒子には、関心対象の溶媒中での遠心分離によってプルダウンされるのに十分な比重、サイズ、および形状を持つ、限定されるわけではないが、ナノバーコード（登録商標）粒子、球状または異方性金属ナノ粒子、あるいは限定されるわけではないが、ラテックス、ポリスチレン、または他の物質からなる任意のタイプの粒子が含まれる。図２５Ａの例において、捕捉粒子／ＳＥＲＳ検出粒子複合体２５０８を濃縮して（捕捉粒子が磁気粒子である場合、磁気濃縮装置を用いて）、そしてＳＥＲＳナノタグ検出粒子と会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを獲得してもよい。遊離分析物２５０２は、コンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ検出粒子のいくぶんかに競合的に結合するであろうため、ラマンシグナル強度は、試料に存在する遊離分析物の濃度に反比例するであろう。遊離分析物の濃度が増加するに連れて、比例して、より少ないＳＥＲＳナノタグ検出粒子が、誘導体化された磁気捕捉粒子に結合する。
【０１１９】
［００１４２］あるいは、図２５Ｂに示すように、分析物２５０２またはその類似体で、ＳＥＲＳナノタグ検出粒子２５０４を誘導体化するかまたは別の方式で標識してもよい。こうした場合、磁気捕捉粒子であってもよい捕捉粒子２５００を、分析物に結合するのに適した結合剤とコンジュゲート化していてもよい。こうして調製された粒子が、関心対象の分析物を含有する試料と接触した際、捕捉粒子は、遊離分析物、または分析物で誘導体化されたＳＥＲＳナノタグ検出粒子のいずれかと自由に結合する。記載するような、捕捉された粒子の濃縮、およびラマンスペクトルの獲得に際してもまた、ラマンシグナル強度は、試料中に存在する遊離分析物の濃度に反比例する。
【０１２０】
実施例４：
［００１４３］Ａ．同時試薬添加を伴う競合的アッセイ形式
［００１４４］最初の競合的形式では、捕捉粒子および検出粒子を迅速な順序で、分析物含有試料に添加する。インキュベーション中、いずれかが「Ａ」と称される遊離分析物または分析物の類似体、および粒子にコンジュゲート化された分析物の両方が、コンジュゲート化された結合剤「Ｒ」に関して競合しうる。結合剤「Ｒ」は、内因性Ａに対するアフィニティーに比較して、類似体Ａに対して異なるアフィニティー（好ましくはより低いアフィニティー）を有してもよい。インキュベーション後、磁気粒子（どの粒子が結合剤とコンジュゲート化されたかに応じて、遊離ＭＰ粒子およびＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳまたはＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ複合体を含む）を、反応容器内の決定した位置で濃縮し、その後、ラマンスペクトルを獲得してもよい。ラマンシグナル強度は、試料中に存在する遊離（内因性）分析物の濃度（量）に反比例する。この競合的アッセイで形成される可能性がある複合体は、どの粒子が分析物または類似体で誘導体化されたかに応じて：
［００１４５］ＭＰ−Ａ＋Ａ＋ＳＥＲＳ−Ｒ→ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ＋ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ；または
［００１４６］ＳＥＲＳ−Ａ＋ＭＰ−Ｒ＋Ａ→ＭＰ−Ｒ：：Ａ＋ＭＰ−Ｒ＋ＳＥＲＳ−Ａ＋ＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳ
である。
【０１２１】
［００１４７］Ｂ．連続試薬添加を伴う偽競合アッセイ形式
［００１４８］第二の競合的アッセイ形式において、分析物を含有する試料をまず、結合剤「Ｒ」にコンジュゲート化された粒子（ＭＰ−ＲまたはＳＥＲＳ−Ｒ）と所定の時間、インキュベーションして、Ａにコンジュゲート化された粒子の添加前に、内因性分析物「Ａ」の捕捉を可能にする。次いで、後に添加される、分析物で誘導体化された粒子は、残った粒子−Ｒコンジュゲート（ＭＰ−ＲまたはＳＥＲＳ−Ｒ）に結合する。インキュベーション後、磁気粒子（遊離ＭＰ粒子およびＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳまたはＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ複合体）を反応容器内の決定した位置で濃縮し、その後、ラマンスペクトルを獲得する。分光的に決定されるＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳまたはＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰの数は、試料中に存在する遊離（内因性Ａ）の濃度に反比例する。２工程偽競合的プロセスには、どの粒子が結合剤にコンジュゲート化されたかに応じて、以下の反応が含まれる。
【０１２２】
［００１４９］ＳＥＲＳ−Ｒ＋Ａ→ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ＋ＳＥＲＳ−Ｒ
（ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ＋ＳＥＲＳ−Ｒ）＋ＭＰ−Ａ→ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ＋ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ；または
［００１５０］ＭＰ−Ｒ＋Ａ→ＭＰ−Ｒ：：Ａ＋ＭＰ−Ｒ
（ＭＰ−Ｒ：：Ａ＋ＭＰ−Ｒ）＋ＳＥＲＳ−Ａ→ＭＰ−Ｒ：：Ａ＋ＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳ
［００１５１］さらに別のアッセイ形式において、ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ（またはＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳ）をあらかじめ形成し、そして液体または凍結乾燥型のいずれかで、アッセイ容器中に保存してもよい。試料の添加に際して、この粒子−粒子複合体は、以下の反応にしたがって、分析物濃度に比例して、内因性Ａとの相互作用によって、解離する。
【０１２３】
［００１５２］ＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳ＋Ａ→ＭＰ−Ｒ：：Ａ＋ＭＰ−Ｒ：：Ａ−ＳＥＲＳ；または
［００１５３］ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ＋Ａ→ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ＋ＳＥＲＳ−Ｒ：：Ａ−ＭＰ
［００１５４］Ｆ．ヌクレオチド配列検出アッセイ
［００１５５］また、ＳＥＲＳナノタグ検出粒子および別個の捕捉粒子を用いて、ヌクレオチド配列検出のための多様なタイプのアッセイを実行してもよい。本明細書に記載するようなアッセイによる検出に適したヌクレオチド配列は、任意の供給源または生物由来であってもよい。例えば、ヌクレオチド供給源には、限定されるわけではないが、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスまたは他の遺伝物質が含まれる。捕捉粒子が磁性であるならば、以下に記載するような特定の利点が達成されるが、本発明のこの側面の範囲は、磁気捕捉粒子を特徴とする態様に限定されない。本明細書記載のヌクレオチド配列検出アッセイは、洗浄工程または試料混合物の除去の必要性を伴わずに、未精製溶解物および不純なＤＮＡ調製物において、ターゲットヌクレオチド配列の検出を可能にする。本明細書記載の特定のアッセイは、短時間で、例えば半時間以下で完了しうる。
【０１２４】
［００１５６］本発明と一致する１つのヌクレオチド配列検出アッセイを図２６に図解的に例示する。図２６のアッセイは、粒子にコンジュゲート化された捕捉ヌクレオチド配列２６０２を含む、少なくとも１つの捕捉プローブ２６００を特徴とする。粒子が磁気ビーズ、常磁性ビーズまたは他の磁気粒子２６０４であるならば、以下に記載する選択工程を最適化してもよい。このアッセイにはまた、捕捉分子２６１０にコンジュゲート化された検出配列２６０８を含むヌクレオチド配列検出プローブ２６０６も含まれる。捕捉配列および検出配列の両方が、関心対象のヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーション・アフィニティーを有するように選択する。捕捉分子は、相補ターゲットに結合するのに適したいかなる分子であってもよい。例えば、検出プローブ２６０６は、ビオチン化または別の方式でハプテン化した配列であってもよい。ビオチンなどの第一の捕捉分子２６１０にコンジュゲート化されている第一の検出配列２６０８、および別のハプテンなどの異なる捕捉分子２６１４にコンジュゲート化されている第二の検出配列２６１２を伴う別個の検出プローブ２６０６を提供することによって、多重化アッセイを調製してもよい。このアッセイは、相補ターゲットに結合可能な任意の捕捉分子２６１０で実行可能であることに注目することが重要である。ビオチンおよび別のハプテンを用いる前述の例は、例示目的のためのみに提示され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１２５】
［００１５７］関心対象のヌクレオチド配列の存在下で、捕捉プローブおよび検出プローブをハイブリダイズさせることによって、図２６に例示されるアッセイを実行してもよい。さらに、ハイブリダイズした複合体を、捕捉分子２６１０に選択的に結合可能な、相補ターゲット分子にコンジュゲート化されたＳＥＲＳナノタグ２６１６とインキュベーションするかまたは別の方式で接触させてもよい。例えば、捕捉分子としてビオチンを選択した場合、ＳＥＲＳナノタグをニュートラアビジンにコンジュゲート化してもよい。
【０１２６】
［００１５８］ＳＥＲＳナノタグ複合体とハイブリダイズしたプローブのインキュベーション後、ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを、ラマン分光計、ラマン顕微鏡または他の検出デバイス２６１８で検出してもよい。生じたハイブリダイズ複合体の濃縮または選択を達成して、未結合ナノタグからハイブリダイズしたナノタグを分離しなければならない。捕捉プローブを調製するのに磁気粒子２６０４を用いた場合、既知の磁気濃縮技術を用いて、磁気粒子の選択を達成してもよい。
【０１２７】
［００１５９］図２６のアッセイ有効性の実験的検証のデータを図２７〜３２に図で示す。実験的に決定したアッセイの検出限界は、およそ４ｐＭであった。
［００１６０］図２７は、ヌクレオチド配列検出アッセイで使用するのに適した詳細なプローブ設計である。Ｂ１プローブを磁気粒子２６０４にコンジュゲート化してもよいし、そしてＳ１プローブをＳＥＲＳタグ２６１６にコンジュゲート化してもよい。ハイブリダイゼーションは、Ｂプローブ、Ｓプローブおよびターゲットが、適切な条件、例えば５５℃で存在する場合、進行するであろう。
【０１２８】
［００１６１］図２８は、図２６に示すアッセイ概念の証拠を示すグラフ２８００を例示する。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ターゲット遺伝子Ｓｔｅｘ１オリゴを１０００ｐＭから１ｐＭに希釈した。データは、検出限界が約４ｐＭで９９．７％信頼性であることを示す。
【０１２９】
［００１６２］図２９は、ＨＩＶおよびＨＣＶ検出用に設計された、特定のＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブを例示する。例えば、ＨＣＶ  ５’ｐおよびＨＣＶ  ３’プローブをＲＴ−ＰＣＲに用いてもよい。例示したＢプローブを磁気ビーズ２６０４などの磁気粒子にコンジュゲート化し、そして例示したＳプローブをＳＥＲＳタグ２６１６にコンジュゲート化してもよい。図３０のグラフ３０００および３００２は、ＨＣＶ（３０００）およびＨＩＶ（３００２）の滴定結果を例示する。図３０でやはり例示するのは、ターゲット濃度およびシグナル間の直線相関である。ＨＣＶの検出限界は約４．１ｐＭであることが示され、そしてＨＩＶは約３．７ｐＭであることが示された。臨床試料に対するこのアッセイの有効性を確認するため、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＨＣＶまたはＨＩＶ  ＲＮＡ試料を増幅し、そしてこのシステムによって、これらの産物を検出した。結果は、本明細書に記載するようなＨＣＶプローブが、ＨＣＶ配列特異的ターゲットを検出するのに適していることを例示する。ＨＡＶまたは陰性対照などの間違ったターゲットの誤った検出は観察されなかった（図３１のグラフ３１００を参照されたい）。ＨＩＶを検出する際に、類似の結果を得た。例えば、図３２のグラフ３２００を参照されたい。結果は、ＲＴ−ＰＣＲ産物の検出限界が約０．２８〜２．８ｐＭであることを示した。これは、記載するアッセイが、０．２８〜４ｐＭ程度に低いＤＮＡターゲット濃度を検出可能であることを確認する。
【０１３０】
［００１６３］別のヌクレオチド配列検出アッセイを図３３に図解的に例示する。図３３のアッセイにおいて、磁気粒子であってもよい粒子３３０２を、捕捉配列３３０４または３３０５にコンジュゲート化することによって、１以上のタイプの捕捉プローブ３３００を提供する。さらに、検出配列３３０８、３３０９を、ＳＥＲＳナノタグ３３１０または３３１１に直接コンジュゲート化することによって、１以上のタイプの検出プローブ３３０６を提供してもよい。各場合で、捕捉配列および検出配列が、ターゲットヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーション・アフィニティーを有するように選択する。関心対象のヌクレオチド配列の存在下で、捕捉プローブ３３００および検出プローブ３３０６をハイブリダイズさせてもよい。続いて、生じた複合体を選択するかまたは濃縮した後、ＳＥＲＳナノタグと会合したラマンレポーター分子のラマンスペクトルを検出してもよい。捕捉プローブ３３００を調製するのに磁気粒子３３０２を用いる場合、既知の磁気濃縮技術を用いて、関心対象の複合体を選択するかまたは濃縮してもよい。別個の捕捉配列３３０４、３３０５を特徴とする多数の捕捉プローブ３３００、および別個のラマンレポーター分子を特徴とするＳＥＲＳナノタグ３３１０、３３１１のタイプにコンジュゲート化されている、各タイプの別個の検出配列３３０８、３３０９を伴う多数の検出プローブ３３０６を提供することによって、多重化試験を調製してもよい。
【０１３１】
［００１６４］図３４のグラフ３４００は、図３３に例示するアッセイの実験的検証の結果の代表である。模倣オリゴヌクレオチドシステムにおける検出限界は、最適化されていないアッセイ条件下で、およそ１０ｐＭであった。モデルシステムにおける検出限界は、バックグラウンドとしての関連しないゲノムＤＮＡの存在下でハイブリダイゼーションが起こる場合に、減少する。オリゴヌクレオチドプローブが、所望の模倣オリゴターゲットの代わりに、メガ塩基ゲノムＤＮＡターゲットにハイブリダイズする場合、検出可能性はさらに減少しうる。したがって、特定の場合、アッセイの効率および感度を増加させることが望ましい可能性もある。
【０１３２】
［００１６５］ヌクレオチドアッセイ感度を増加させる１つの方法を、図３５に図解的に例示する。このアッセイには、関心対象のヌクレオチド配列３５００を多数のセクションにまず切断するかまたは破壊する工程が含まれる。この工程において、ヌクレオチドをセクションに切断するいかなる既知の技術を使用してもよい。例えば、頻繁に、そして迅速に作用する制限酵素を用いて、関心対象のヌクレオチドを小片に消化してもよい。ターゲットヌクレオチドのこうして調製したセクションを、次いで、多数の別個の捕捉プローブおよび多数の別個の検出プローブとハイブリダイズさせてもよく、プローブの各タイプは、関心対象のヌクレオチド配列の別個の部分に対する別個のハイブリダイゼーション・アフィニティーを有する。上述のように、検出プローブをＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化し、そして捕捉プローブを磁気粒子にコンジュゲート化してもよい。アッセイ試料に存在する所望のターゲットの多数の断片が、多数の検出粒子に別個に結合可能であり、これがシグナルを増加させ、そしてしたがってアッセイ感度を増加させるため、多数の小片へのターゲットＤＮＡの断片化は、ハイブリダイゼーション効率およびターゲット複合体濃度を効果的に増加させる。図３５に例示する方法と関連する利点は、この方法が、増幅バイアスの導入を伴わずに、アッセイ感度を増加させることである。
【０１３３】
［００１６６］あるいは、より大きいヌクレオチド断片（例えば消化を伴わないかまたは最小限の消化しか伴わない、ゲノムまたは遺伝子断片）を、捕捉粒子にコンジュゲート化された捕捉配列とハイブリダイズさせてもよい。さらに、巨大ヌクレオチド断片に相補的な多数の異なる検出配列を、各々、同じＳＥＲＳナノタグとコンジュゲート化させてもよい。したがって、単一のより大きいヌクレオチド配列上の検出プローブ数が増加することによって、アッセイ感度は増加するであろう。この場合、複数のＳＥＲＳナノタグを用いることによって、アッセイ特異性もまた増加しうる。あるいは、多数の異なる検出配列が、異なるＳＥＲＳナノタグにコンジュゲート化されている場合、関心対象の領域を検出する特異的検出配列を設計することによって、特定のゲノム欠失または突然変異を同定してもよい。さらに、関心対象の異なるヌクレオチド断片に相補的な多数の異なる捕捉配列に、磁気粒子をコンジュゲート化して、各磁気粒子に対して増進されたアッセイシグナルを生じてもよい。
【０１３４】
［００１６７］他の方法を用いて、核酸アッセイ感度を増加させてもよい。例えば、等温ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）関連増幅、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ駆動増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）または他の既知の増幅法を、上述のような捕捉プローブおよび検出プローブと組み合わせて用いてもよい。ＲＣＡを特徴とするアッセイ例を図３６に例示する。図３６のアッセイは、磁気粒子３６０４にコンジュゲート化された捕捉配列３６０２を特徴とする捕捉プローブ３６００、および関心対象のヌクレオチド配列３６１０の存在下でハイブリダイズ可能なＲＣＡ分子３６０８に各々コンジュゲート化された１以上のＲＣＡプローブ３６０６を有し、その後、既知の技術を用いたＲＣＡが続く。各々、ＳＥＲＳナノタグ３６１４にコンジュゲート化されている１以上の検出プローブ３６１２と、生じた複合体を接触させて、こうして各捕捉分子と会合しているナノタグの数を実質的に増加させてもよい。続いて、ラマン分光計、ラマン顕微鏡または他の装置３６１６を用いて、ＳＥＲＳナノタグと会合しているラマンレポーター分子のラマンスペクトルを獲得してもよい。図３７のグラフ３７００は、図３６にしたがって調製したアッセイの感度を例示する。図３７のアッセイ形式を以下の実施例５に詳細に記載する。当業者は、ＲＣＡ増進アッセイにおいて、捕捉プローブと会合している磁気捕捉粒子を用いて、ＲＣＡ後、およびＳＥＲＳナノタグ検出プローブの存在下での最初のハイブリダイゼーション産物のインキュベーション後に、選択および／または濃縮を促進しうることに注目するであろう。
【０１３５】
実施例５：
［００１６８］ＳＥＲＳタグガラスコーティングカルボキシル官能化
［００１６９］アミン官能化：
１．  ５００μｌの２０ｘガラスコーティングＳＥＲＳタグをＥｔＯＨ中で３回洗浄する。
【０１３６】
２．  ９３０μｌのＥｔＯＨ中に再懸濁する。５０μｌの水および２０μｌのＡＰＴＭＳを添加する。
３．  １時間混合する。
【０１３７】
４．  １ｍｌ  ＤＭＳＯ中で３回洗浄する。
カルボキシル官能化：
５．  １ｍｌ  ＤＭＳＯ中に０．０４ｇ無水コハク酸を溶解する。
【０１３８】
６．  ＤＭＳＯ中のＳＥＲＳタグに１０μｌの無水コハク酸溶液を添加する。１時間混合する。
７．  さらに１０μｌの無水コハク酸溶液を添加する。さらに１時間混合する。
【０１３９】
８．  ５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．５中で３回リンスする。
９．  ５００μｌ  ＭＥＳにＳＥＲＳタグを再懸濁し、そして４℃で保存する。
［００１７０］官能化ＳＥＲＳタグに対するオリゴのコンジュゲート化
１．  ４０μｌの２０ｘ官能化ＳＥＲＳタグを取る。５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）で２回洗浄する。
【０１４０】
２．  １６３μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）にＳＥＲＳタグを再懸濁し、そして２μｌの５０μＭオリゴ（１００ｐｍｏｌ）を添加し、氷上に置く。
３．  ５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）中の２０％ＥＤＣを作製する（５０μｌ  ＭＥＳで１０ｍｇ  ＥＤＣ）。
【０１４１】
４．  ＳＥＲＳタグ／オリゴに１５μｌの２０％ＥＤＣを添加する。よく混合し、そして４℃で１時間振盪する。
５．  ５００μｌの１０ｍＭ  ＰＢＳで４回洗浄する。すべてのコンジュゲート化されていないオリゴを洗い流すことが非常に重要である。
【０１４２】
６．  ４０μｌ  ＰＢＳ中に再懸濁する。
［００１７１］磁気ビーズに対するオリゴのコンジュゲート化
１．  ４０μｌの磁気ビーズを取る（８ｘ１０７）。５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）でビーズを２回洗浄する。
【０１４３】
２．  １６３μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）でビーズを再懸濁し、そして２μｌの５０μＭオリゴ（１００ｐｍｏｌ）を添加し、氷上に置く。
３．  ５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）中、２０％ＥＤＣを作製する（５０μｌ  ＭＥＳで１０ｍｇ  ＥＤＣ）。
【０１４４】
４．  １５μｌの２０％ＥＤＣをビーズ／オリゴに添加する。よく混合し、そして４℃で１時間振盪する。
５．  ５００μｌの１０ｍＭ  ＰＢＳで４回洗浄する。すべてのコンジュゲート化されていないオリゴを洗い流すことが非常に重要である。
【０１４５】
６．  ４０μｌ  ＰＢＳ中に再懸濁する（ビーズ８ｘ１０７）。
［００１７２］ハイブリダイゼーション
１．  ３３μｌの２ｘＴＭＡＣまたはＨＳ１１４緩衝液を取り、５μｌの１０μＭオリゴおよび５μｌの磁気ビーズプローブ（４ｘ１０６）を添加する。５５℃で３０分間ハイブリダイズする。ラマンシグナルを獲得するかまたは以下の工程を続けるかいずれかを行う。
【０１４６】
２．  １ｘＳＳＣで、室温で５分間洗浄し、そして０．１ｘＳＳＣで、５５℃で５分間洗浄する。
３．  １ｘニュートラアビジン−ＢＰＥ（ＳＥＲＳタグ）を添加し、そして３０分間インキュベーションする。
【０１４７】
４．  １０ｍＭ  ＰＢＳで２回洗浄する。
５．  Ｒｅｉｎｓｈａｗ  ＩｎＶｉａラマン顕微鏡またはＱＥ６５０００分光計でラマンシグナルを獲得する。
【０１４８】
［００１７３］ＳＥＲＳローリングサークル増幅：
１．  ４２μｌのＨＳ１１４緩衝液中、５μｌオリゴ、１μｌの５μＭ  ＲＣＡプローブおよび２μｌビーズ−プローブを添加して、最終体積５０μｌにして、そして５５℃で３０分間インキュベーションする。
【０１４９】
２．  ＰＢＳで１回洗浄し、そして４６μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および４μｌの１０μＭサークル１プローブをビーズに添加する。
３．  ３７℃で３０分間インキュベーションし、そしてＰＢＳで１回洗浄する。
【０１５０】
４．  ビーズに、２μｌのｐｈｉｌ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、１μｌ  ｄＮＴＰ（２０ｍＭ／各ｄＮＴＰ）、１０μｌの２ｘ緩衝液／１ｘＢＳＡおよび７μｌ  Ｈ２Ｏを添加して、総量２０μｌにする。
【０１５１】
５．  ３７℃で２時間から一晩インキュベーションする。ＰＢＳで１回洗浄する。
６．  ビーズに、５０μｌの２ｘＳＳＣ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中の０．５ｘＳＥＲＳタグ−プローブを添加し、そして３７℃で２０〜３０分間インキュベーションする。
【０１５２】
７．  １ｘＳＳＣで、室温で１分間洗浄する。
８．  ０．１ｘＳＳＣで、室温で１分間洗浄する。
９．  ＱＥ６５０００上でラマンシグナルを獲得する。
【０１５３】
［００１７４］いくつかの態様に関連して、本発明を特に示しそして記載するが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示する多様な態様に対して、形式および詳細を変化させてもよいことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】［００１１］図１は、本発明の選択した態様の実行に適したＳＥＲＳナノタグの模式図である。
【図２】［００１２］図２は、５つの異なるレポーター分子を有するＳＥＲＳナノタグのＳＥＲＳスペクトルのグラフ比較である。
【図３】［００１３］図３は、本発明の１つの態様と一致する連続アッセイの図解例である。
【図４】［００１４］図４は、ＩＬ−４用量反応曲線のグラフ表示である。
【図５】［００１５］図５は、本発明と一致した均一アッセイの図解例および写真例である。
【図６】［００１６］図６は、過剰なナノタグの存在下での、ＩＬ−４用量反応のグラフ表示である。
【図７】［００１７］図７は、表面に結合したＢＰＥタグのスペクトルのグラフ表示である。
【図８】［００１８］図８は、均一アッセイＩＬ−４用量反応のグラフ表示である。
【図９】［００１９］図９Ａ〜Ｃは、体液の存在下で得たラマンスペクトルの多様なグラフ表示である。
【図１０】［００２０］図１０は、体液におけるラマンスペクトル回収のグラフ表示である。
【図１１】［００２１］図１１は、本発明と一致したアッセイの図解例である。
【図１２】［００２２］図１２は、「無洗浄」ＩＬ−４アッセイの用量反応のグラフ表示である。
【図１３】［００２３］図１３は、インキュベーション時間が減少し、そして検出粒子が制限された、図１２のアッセイのグラフ表示である。
【図１４】［００２４］図１４は、インキュベーション時間が減少し、そして検出粒子が制限された、図１２のアッセイのグラフ表示である。
【図１５】［００２５］図１５は、最適化アッセイＩＬ−４用量反応曲線のグラフ表示である。
【図１６】［００２６］図１６は、生物学的マトリックスからのスペクトル回収のグラフ表示である。
【図１７】［００２７］図１７は、検出タグおよび緩衝液スクリーニング結果のグラフ表示である。
【図１８】［００２８］図１８は、検出タグおよび緩衝液スクリーニング結果のグラフ表示である。
【図１９】［００２９］図１９は、ＤＰＹ検出タグを用いたＣＲＰ用量反応曲線のグラフ表示である。
【図２０】［００３０］図２０は、多重化アッセイ結果のグラフ表示である。
【図２１】［００３１］図２１は、ＣＲＰの用量反応曲線である。
【図２２】［００３２］図２２は、ＳＥＲＳ磁気ビーズハイブリダイゼーションアッセイの模式図である。
【図２３】［００３３］図２３は、本発明と一致したＤＮＡの検出のグラフ表示である。
【図２４】［００３４］図２４は、ＳＥＲＳ  ＤＮＡ磁気アッセイ滴定の結果のグラフ表示である。
【図２５】［００３５］図２５Ａおよび２５Ｂは、２つの競合的アッセイ形式の図解例である。
【図２６】［００３６］図２６は、ヌクレオチド配列検出アッセイの模式図である。
【図２７】［００３７］図２７は、ヌクレオチド配列検出アッセイで使用するのに適した代表的プローブである。
【図２８】［００３８］図２８は、ヌクレオチド配列検出アッセイの結果のグラフ表示である。
【図２９】［００３９］図２９は、ヌクレオチド配列検出アッセイにおいて使用するのに適した代表的プローブの表示である。
【図３０】［００４０］図３０は、図２９のプローブを用いたアッセイ滴定のグラフ表示である。
【図３１】［００４１］図３１は、選択したＰＣＲ単位複製配列に関するアッセイ結果のグラフ表示である。
【図３２】［００４２］図３２は、連続希釈後のアッセイ結果のグラフ表示である。
【図３３】［００４３］図３３は、ヌクレオチド配列検出アッセイの模式図である。
【図３４】［００４４］図３４は、図３３のアッセイ結果のグラフ表示である。
【図３５】［００４５］図３５は、ヌクレオチド切断を特徴とするアッセイの図解例である。
【図３６】［００４６］図３６は、ＲＣＡを特徴とするアッセイの図解例である。
【図３７】［００４７］図３７は、図３６のアッセイの結果のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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