(57)【要約】本発明は、栄養補助剤として使用するための乳製品含有組成物の産生に関する。より詳細には、乳清生長因子抽出物を含有する組成物の他にも、レジスタンス運動トレーニングに取り組む個体の栄養要求を補う方法に関する。本発明の一態様によると、乳製品より陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物を含む組成物の、骨格筋の強度を増加させるための使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳製品から陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物（whey growth factor extract; WGFE）を含む筋力増幅組成物。
【請求項２】
以下の段階を含む工程により乳製品より分離された乳清生長因子抽出物を含む筋力増幅組成物。
a) 乳製品をSPセファロース陽イオン交換カラムにアプライする段階
b) 低イオン強度の緩衝液でカラムを洗浄する段階
c) 0.4〜0.5Mの範囲のNaClを含むか、または同等のイオン強度の緩衝液でWGFE画分を、pH6.5で溶出する段階
【請求項３】
以下の段階を含む工程により乳製品より分離された乳清生長因子抽出物を含む筋力増幅組成物。
a) 乳製品をSPセファロース陽イオン交換カラムにアプライする段階
b) 0.008Mまたはそれより少ないNaClの緩衝液でカラムを洗浄する段階
c) 0.4M NaClを含む緩衝液でWGFE画分をpH6.5で溶出する段階
【請求項４】
さらに追加の蛋白質源を含む、請求項１、２または3記載の筋力増幅組成物。
【請求項５】
タンパク質源が乳清蛋白質である、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
乳清蛋白質が乳清蛋白質分離物（whey protein isolate; WPI）である、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
乳清蛋白質分離物が、
水分                    5.0％
脂質                    0.5％
pH（5％溶液）          6.3
灰分                    3.7％
ラクトース              0.5％
蛋白質(TN×6.38)        90.0％
ナトリウム              0.7％
リン                    0.3％
カルシウム              0.15％
を含む、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
乳清生長因子抽出物が、全乳、チーズ乳清、レンネットカゼイン乳清、酸カゼイン乳清またはスキムミルクより分離される、請求項1乃至7いずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
乳清生長因子抽出物がスキムミルクより分離される、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
筋力増幅剤として使用される、請求項1乃至9いずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象において筋力、及び/または筋肉の大きさを増加させる方法であって、請求項1、２または3に記載される乳清生長因子抽出物の有効量を含む組成物を該対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
少なくとも5mg/kg体重から12.5mg/kg体重の乳清生長因子抽出物、好ましくは少なくとも25mg/kg体重の乳清生長因子抽出物の日用量で該組成物が投与される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
組成物が追加の蛋白質源を含む、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象において筋力、及び/または筋肉の大きさを増加させる方法であって、乳製品から陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物の有効量を含む組成物、及び別に摂取される追加の蛋白質源を該対象に投与することを含む方法。
【請求項１５】
少なくとも5mg/kg体重から12.5mg/kg体重の乳清生長因子抽出物、好ましくは少なくとも25mg/kg体重の乳清生長因子抽出物、及び、少なくとも225mg/kg体重の追加の蛋白質源の日用量で該組成物が投与される、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
追加の蛋白質源が、請求項5乃至7のいずれか一項に記載されるものである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
対象への投与が、2日または3日に一回から、最多で少なくとも一日一回行われる、請求項11乃至16いずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
対象への投与が、レジスタンス運動トレーニングの前、及び/または直後に行われる、請求項11乃至16いずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
投与がレジスタンス運動トレーニングの直後に行われる、請求項11乃至16いずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
投与が運動の20分から2時間後に行われる、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
乳製品から陽イオン交換クロマトグフラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物の、レジスタンス運動トレーニングを行っている対象における筋力、及び/または筋肉の大きさを増加させるための薬剤の産生における使用。
【請求項２２】
請求項2または3に記載の工程により乳製品より分離された乳清生長因子抽出物の、レジスタンス運動トレーニングを行っている対象における筋力、及び/または筋肉の大きさを増加させるための薬剤の産生における使用。
【請求項２３】
請求項（1乃至10）いずれか一項記載の組成物の、レジスタンス運動トレーニングを行っている対象における筋力、及び/または筋肉の大きさを増加させるための薬剤の産生における使用。
【請求項２４】
請求項11乃至20いずれか一項記載の方法において使用するための、請求項（１乃至10）いずれか一項記載の組成物を含む食品、飲料、錠剤またはカプセル。
【請求項２５】
栄養バーまたはスナック食品の形体である、請求項24記載の食品。
【請求項２６】
請求項（1乃至10）いずれか一項記載の組成物の、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における筋力、及び/若しくは筋肉の大きさを改善するための食品、飲料、錠剤またはカプセルの製造における使用。
【請求項２７】
実質的に、実施例と関連して前述される筋力増幅組成物。
【請求項２８】
実質的に、実施例と関連して前述される乳清生長因子抽出物の使用。
【請求項２９】
実質的に、実施例と関連して前述される、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における筋力、及び/または筋肉の大きさを増幅させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、栄養補助剤として使用するための、乳製品を含む組成物の産生に関する。より詳細には、本発明は、乳清生長因子抽出物を含む組成物、及び、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる個体の栄養要求を補う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、当分野において従来成されてきたことを鑑みて理解される。しかしながら、以下の議論は、言及される材料のいずれかが、本出願の優先日当時、オーストラリアにおいて公開されていたこと、使用されていたこと、または技術常識の一部であったことを認知するものでも、容認するものでもない。
【０００３】
ヒト、さらには動物においてすら、全般的な健康を増進、または、例えば、運動能力を向上させるために栄養補助剤を使用されることが知られている。栄養補助剤は、完全な食餌に必要とされる全ての栄養素を提供することを意図するものではなく、むしろ一般には、食餌摂取がより栄養的に完全なものとなるように補足することを意図している。このような補助剤に見受けられるビタミン、ミネラル及び他の物質が、生理学的に重要な役割を果たしていることが認識されており、且つ、補助剤の或るビタミン、ミネラル及び/または他の成分の欠乏が、或る疾病の発現、全般的な健康の衰退または運動家におけるより低いパフォーマンスに結び付けられてきた。
【０００４】
逆にいえば、栄養補助剤は、種々の条件下で、多様な生理学的状態を増進することが知られている。例えば、病気の患者、回復期患者、年配の人、並びに、パフォーマンスを改善すること及び/または運動からの回復を願う、激しい運動レジームを行っている人のように、栄養補助剤には沢山の対象がある。
【０００５】
体脂肪を減らし脂肪のない筋量/筋肉の大きさ、若しくは筋力を増加させる、速度及び/若しくは持久力を向上する、並びに/または激しい運動からの回復の何であろうとも、ボディービルダー及び激しい肉体的運動に携わる人の栄養要求はかなり特徴的である。筋組織を修復し、そして筋肉成長を助長するように、筋肉蛋白質の合成を促進するため、前述のグループの人々により蛋白質補給は広く行われている。栄養補給は、飲料または食品の形体で提供され、そして、使用時に液体と混合される蛋白質粉末、栄養バー及びスナック食品、錠剤、カプセル並びに他の調製物が含まれる。好適な市販される蛋白質源には、加水分解乳蛋白質、カゼイネート(caseinates)、大豆蛋白質分離物、及び限外濾過スキムミルクから調製された乳蛋白質濃縮物が含まれる。乳清蛋白質等の他の蛋白質源を素にした栄養補助剤も利用でき、フルーツジュースの形で提供され得るが、脂質源は提供しないため不適当であると考えられている（特許文献１）。さらに、いくつかの乳由来蛋白質は容易に腸で吸収されない、または治療効果を有するよう消化器系の過酷な環境に耐えないと考えられてきた。乳清生長因子抽出物は、当該抽出物中のいずれの生物学的に活性な蛋白質も一度摂取されると活性を失うと予想されていたので、これまで栄養補助剤として有用でないと考えられてきたそのような乳産物の一つである。
【０００６】
それにも拘らず、レジスタンス運動トレーニングに携わる人の筋量/筋肉の大きさ、及び筋力の有益な獲得を提供する乳清蛋白質補助剤の能力は、利益をもたらすものであると報告されてきた。乳清蛋白質分離物（WPI）及び乳蛋白質分離物（milk protein isolate; MPI）は、ボディービルダーが、脂肪のない筋量/筋肉の大きさを迅速に獲得しながら、体脂肪を減らすのに効果があると報告されてきた。MPIが主にカゼインであり、よりゆっくり代謝されて筋肉生長を促進するのに効果がされているのに対して、WPIは、側鎖アミノ酸が豊富であり、「急速」に作用すると考えている。卵アルブミンは、高品質アミノ酸源を提供する代替物である。
【０００７】
最近のデータは、運動前及び/または運動後の蛋白質としての補給が、筋量の獲得は少なく、変動的であるものの、より多い蛋白質生成を刺激することができるとの証拠を提供している（非特許文献１）。
【０００８】
本発明者らは、乳清生長因子抽出物を含む組成物が、WPIのみを含む組成物を含む従来の組成物により達成される場合よりも筋力獲得を有意に増加させることを発見した。
【０００９】
【特許文献１】WO02/15720（非特許文献１）Andersenら、Metabolism, 2005, 54(2): 151-156
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、レジスタンス運動トレーニングを行っている人達がさらに筋力を増加させることを可能にする組成物、及び方法に関する。
【００１１】
従って、従来技術よりも筋力を増加させることについて改善された組成物及び方法を提供することが本発明の目的である。
【００１２】
本発明の一態様によると、乳製品より陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物を含む、骨格筋の強度を増幅させる組成物が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によると、以下の段階を含む工程により乳製品より分離された乳清生長因子抽出物を含む、骨格筋の強度を増幅させる組成物が提供される：
a) 乳製品をSPセファロース陽イオンカラムに適用する段階、
b) カラムを低イオン強度の緩衝液で洗浄する段階、
c) 0.4〜0.5Mの範囲のNaClを含むか、または同等のイオン強度の緩衝液でWGFE画分をpH6.5で溶出する段階。
【００１４】
本発明の別の態様によると、以下の段階を含む工程により乳製品より分離された乳清生長因子抽出物を含む、骨格筋の強度を増幅させる組成物が提供される：
a) 乳製品をSPセファロース陽イオン交換カラムにアプライする段階、
b) 0.008Mまたはそれ以下のNaClの緩衝液でカラムを洗浄する段階、
c)0.4M NaClを含む緩衝液でWGFE画分をpH6.5で溶出する段階。
【００１５】
さらなる本発明の態様では、乳清生長因子抽出物が全乳、チーズ乳清、レンネットカゼイン乳清、酸カゼイン乳清またはそれらの濃縮物またはスキムミルクより分離される上述の組成物が提供される。
【００１６】
さらなる本発明の態様では、筋力及び/または筋肉の大きさを増幅させる剤として使用される、上述の組成物が提供される。
【００１７】
さらなる本発明の態様では、乳製品から陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/または大きさを向上させる方法が提供される。
【００１８】
さらなる本発明の態様では、乳製品から以下の段階を含む工程により分離された乳清生長因子抽出物を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/または大きさを向上させる方法が提供される：
a) 乳製品をSPセファロース陽イオンカラムに適用する段階、
b) カラムを低イオン強度の緩衝液で洗浄する段階、
c) 0.4〜0.5Mの範囲のNaClを含むか、または同等のイオン強度の緩衝液でWGFE画分をpH6.5で溶出する段階。
【００１９】
さらなる本発明の態様では、乳製品から以下の段階を含む工程により分離された乳清生長因子抽出物を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/または大きさを向上させる方法が提供される：
a) 乳製品をSPセファロース陽イオン交換カラムにアプライする段階、
b) 0.008Mまたはそれ以下のNaClの緩衝液でカラムを洗浄する段階、
c) 0.4M NaClを含む緩衝液でWGFE画分をpH6.5で溶出する段階。
【００２０】
本発明の別の態様では、日用量当たり投与される乳清生長因子抽出物が、少なくとも5mg/kg体重から12.5mg/kg体重である、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/または大きさを向上させる方法が提供される。乳清生長因子抽出物の日用量は、好ましくは、少なくとも25mg/kg体重である。
【００２１】
さらなる本発明の態様では、乳製品より陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物の、骨格筋の強度及び/または大きさの向上を必要とする対象を処置するための薬剤の産生における使用が提供される。
【００２２】
さらなる本発明の態様では、上記工程により乳製品から分離された乳清生長因子抽出物の、骨格筋の強度及び/または大きさの向上を必要とする対象を処置するための薬剤の産生における使用が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様によると、乳製品より陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物、及び追加の蛋白質源を含む、骨格筋強度を増幅させる組成物が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様によると、追加の蛋白質源は乳清蛋白質、好ましくは乳清蛋白質分離物（WPI）,さらに好ましくは：
水分                    5.0％
脂質                    0.5％
pH（5％溶液）          6.3
灰分                    3.7％
ラクトース              0.5％
蛋白質(TN×6.38)        90.0％
ナトリウム              0.7％
リン                    0.3％
カルシウム              0.15％
を含む乳清蛋白質分離物である。
【００２５】
さらなる本発明の態様では、乳清生長因子抽出物、及び、好ましくはWPIである乳清等の追加の蛋白質源を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/または大きさを増加させる方法が提供される。
【００２６】
さらなる本発明の態様では、乳製品から陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された有効量の乳清生長因子抽出物を含む組成物、及び、別に摂取される追加の蛋白質源を対象に投与することを含む、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/または大きさを増加させる方法が提供される。
【００２７】
好ましくは各日用量として投与される追加の蛋白質源の量は、少なくとも225mg/kg体重（乾燥重量）、好ましくは、少なくとも435mg/kg体重（乾燥重量）である。
【００２８】
さらなる本発明の態様では、本発明の組成物の投与は、2または3日に1回から多くとも、少なくとも1日1回であり、好ましくはレジスタンス運動トレーニングの前及び/直後、より好ましくはレジスタンス運動トレーニングの直後、最も好ましくは運動の20分から2時間後の間に行われる。
【００２９】
さらなる本発明の態様では、乳製品から陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物、及び追加の蛋白質源の、骨格筋の強度及び/または大きさを向上する必要がある対象を処置するための薬剤の産生における使用が提供される。
【００３０】
さらなる本発明の態様では、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/若しくは大きさを増幅させる方法で使用するための、本発明の組成物を含む食物または飲料が提供される。
【００３１】
さらに別の本発明の態様では、レジスタンス運動トレーニングに取り組んでいる対象における骨格筋の強度及び/若しくは大きさを増幅させるための食品または飲料を製造するための、本発明の組成物の使用が提供される。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、レジスタンス運動トレーニングを行っている人達が、筋力を増幅させることを可能ならしめる組成物及び方法に関する。
【００３３】
従って、本発明の目的は、筋力を増加させるための、従来技術よりも改善された組成物及び方法を提供することである。
【００３４】
本発明の一態様によると、乳製品から陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された乳清生長因子抽出物を含む骨格筋の強度を増幅させる組成物が提供される。
【００３５】
本発明中で使用されるための乳清生長因子抽出物は、乳、スキムミルク、乳由来物、乳清、初乳及び初乳由来物より、例えば、参照により本明細書に組み入れられるオーストラリア特許第645589（PCT/AU91/00303）に記載の方法により分離され得る。この方法は、乳清生長因子抽出物を構成するために、出発物質より塩基性蛋白質を選択的に抽出する強力な陽イオン交換クロマトグラフィーに本質的に依存している。
【００３６】
WGFE画分を産生するための工程
本発明において使用するためのWGFEを産生するための好ましい方法は、SP（スルフォプロピル）セファロースが詰められたカラムを使用することである。アプライされる乳容量がカラムに詰められた樹脂容量の1000倍となるまで、酪農製品、好ましくスキムミルクの流れがカラムにアプライされる。低イオン強度（<0.008M NaClまたはそれと均等）の緩衝液で10分間、カラム中に残存する乳を除去する。0.4〜0.5M NaCl（他の陽イオンも好適であるが）、より好ましくは0.4M NaClと均等なナトリウムイオンを含む緩衝液により、WGFE画分はカラムから溶出される。
【００３７】
移動相は、4.5〜9.0、好ましくは5.5〜7.5、最も好ましくは約6.5等の広範囲内のpHを有し得る。上限及び下限において、蛋白質の安定性、及び蛋白質の陽イオン交換樹脂に結合する能力の両方が影響される。5.5〜7.5の範囲内のpHにより、最も高いWGFE収量が得られる。
【００３８】
WGFE成分の吸着に適する陽イオン交換樹脂の型は、セファロース陽イオン交換樹脂ビーズ等の樹脂を含み得る。例えば、スルフォプロピル機能基、及び、カルボキシメチル基を各々含むSPセファロース大ビーズ(SP Sepharose Big Beads)及びCMセファロースビーズ（GE Healthcareの製品）が好適である。陽イオン交換樹脂ビーズの大きさは、好ましくは45〜300μmの範囲内である。本発明において、45〜165μmの範囲内、及び100〜300μmの範囲内のSPセファロースビーズが、WGFE精製に好適である。
【００３９】
WGFE画分がさらに付され得る処置の一つは、例えば、透析または限外濾過による脱塩である。
【００４０】
よって、本発明のさらなる態様では、乳清成長因子抽出が乳清またはスキムミルクから分離された、上述のような組成物が提供される。出発材料として使用される乳清は、チーズ乳清、レンネットカゼイン乳清、酸カゼイン乳清、またはそれらの濃縮物であり得る。本発明において使用される乳清生長因子抽出物、及び蛋白質源の量は、筋力及び/若しくは筋肉の大きさ、または治療効果の獲得を向上するのに十分な量である。
【００４１】
本発明の別の態様では、日用量当り投与される乳清生長因子抽出物の量が、少なくとも5mg/kg体重から12.5mg/kg体重である、投薬量レジームが提供される。好ましくは、乳清生長因子抽出物の日用量は、少なくとも25mg/kg体重である。
【００４２】
さらなる本発明の態様では、対象に乳清生長因子抽出物を含む組成物の十分量を投与することを含む、レジスタンス運動トレーニングに取り組む対象における骨格筋の強度及び/または大きさを向上する方法が提供される。
【００４３】
WPI等の消費に適した如何なる蛋白質源であり得る追加の蛋白質源を組成物が含む場合、蛋白質源を単独で投与された対象と比べて、運動後の筋力は増加している。蛋白質源は、全乳、好ましく乳清蛋白質、より好ましくは乳清蛋白質分離物（WPI）から得ることができる。このような乳清蛋白質分離物の一つは、Murray Goulburn Co-Op Company Ltd.のNatraPro(商標)の商標名で市販され、入手可能である。NatraPro(商標)WPIの典型的な組成物は：
水分                    5.0％
脂質                    0.5％
pH（5％溶液）          6.3
灰分                    3.7％
ラクトース              0.5％
蛋白質(TN×6.38)        90.0％
ナトリウム              0.7％
リン                    0.3％
カルシウム              0.15％
を含む。
【００４４】
好ましくは、本発明における組成物は、さらに蛋白質源を含み、そして、投与される日用量当りの投薬量レジーム中の蛋白質源量は、少なくとも225mg/kg体重（乾重量）、及び好ましくは、少なくとも435mg/kg体重（乾重量）である。
【００４５】
筋力、及び/または筋肉の大きさが増加する結果となる投与レジームを提供するよう、このような組成物の投与が、トレーニングの日、または、トレーニングの日及び/若しくはその他の日に行われることが当業者には明らかである。好ましくは、投与は運動の日に行われ、より好ましくは、運動の直前及び/または直後に行われる。より好ましくは、投与は、運動後、20分と2時間の間に行われる。従って、本発明の好適な態様では、投与が運動の直後である、上述の方法が提供される。
【００４６】
本発明のさらなる態様では、骨格筋の強度及び/または大きさを増幅させる必要がある対象を処置するための薬剤の産生における、乳清生長因子抽出物の使用が提供される。例えば、筋消耗の患者または年配者は、彼等の筋力を再度築く為にレジスタンス運動トレーニングを必要とするかもしれない。本発明の組成物を含む薬剤はさらに、対象における筋力の回復を助けるかもしれない。さらに、本発明の組成物は、馬、グレーハウンド及びその他等の増加された筋力が望ましい非ヒト哺乳動物における筋肉強度を増幅させるのに使用し得る。
【００４７】
本発明のさらに別の態様では、レジスタンス運動トレーニングに取り組む対象における骨格筋の強度及び/または大きさを増幅させる方法において使用するための、本発明の組成物を含む食品または飲料が提供される。
【００４８】
さらに別の本発明の態様では、レジスタンス運動トレーニングに取り組む対象の骨格筋の強度及び/若しくは大きさを向上する食品、または、飲料の製造における、本発明の組成物の使用が提供される。本発明の組成物が、レジスタンス運動トレーニングに取り組む対象への投与のための錠剤またはカプセルの形体で産生され得ることが理解されるであろう。
【００４９】
WPIは、典型的には、約90％蛋白質（重量/容量）を含む。従って、20gのWPIは、約18g蛋白質（重量/容量）を栄養源として含む。
【００５０】
乳清生長因子抽出物は、典型的には、約85％蛋白質（重量/容量）を含む。従って、2gの乳清生長因子抽出物は、約1.7g蛋白質（重量/容量）を栄養源として含む。
【００５１】
本明細書中に記載される本発明は、開示される構成の特定の例に限定されないことが了解される。
【００５２】
実施例
実施例１：臨床試験
20人の若い男性が、3ヶ月の無作為、二重盲式レジスタンストレーニングプログラムに参加する臨床試験が行われた。乳清生長因子抽出物は、オーストラリア特許第645589号（PCT/AU91/00303）に大まかに記載される方法、より詳細には上記される方法に従って調製された。各蛋白質処方は人工甘味料（Nutrasweet(商標), Nutrasweet Company, USA）を含んでいた。乳清蛋白質処方は、各運動セッションの直後に消費され、各対象は、毎週3つの管理された運動セッションを完了した。
【００５３】
対象は3つのサプリメント群のどれかに無作為に割り当てられた：
A群：NatraPro(WPI);各用量20g; n=7
B1群：NatraPro(WPI)＋WGFE;各用量あたり 20g WPI＋1g WGFE;n=6
B2群：NatraPro(WPI)＋WGFE;各用量あたり 20g WPI＋2g WGFE;n=7
【００５４】
NatraPro(商標)WPIの典型的な組成物は：
水分                    5.0％
脂質                    0.5％
pH（5％溶液）          6.3
灰分                    3.7％
ラクトース              0.5％
蛋白質(TN×6.38)        90.0％
ナトリウム              0.7％
リン                    0.3％
カルシウム              0.15％
を含む。
【００５５】
本発明におけるWGFEの典型的な組成物は：
水分                    5.0％
脂質                    <0.5％
pH（5％溶液）          6.7
蛋白質(TN×6.38)        95.0％
灰分                    1.5％
pH（2％溶液）          5.5〜6.5
を含む。
【００５６】
筋力は、CybexNORM筋力計を用いて脚伸長強度を試験することにより分析した。
【００５７】
筋肉分析
経皮針生検技術を用い、右脚外側広筋より筋肉試料を集めた。摘出された筋肉組織は、視覚的に検査され、あらゆる脂肪または結合組織から切り取られ、そして過剰な血液を除くため吸い取られ、そして続いての分析のために液体窒素中で直に凍結された。筋肉組織の一部を、続いての免疫組織化学分析のため、水性マウント培地にマウントし、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結した。
【００５８】
RNA抽出＆遺伝子発現分析
ToTALLY RNAキット及び試薬（Ambion Inc.）を用いて骨格筋試料よりRNAを製造者の指示に従って抽出した。総RNA濃度及び品質はAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc.）を用いて決定した。続いて、AMVリバーストランスクリプターゼキットプロトコル及び試薬（Promega）を使用してRNAをcDNAに逆転写した。遺伝子発現の分析は、ソフトウェアPrimer Express 2.0を用いて設計した遺伝子特異的プライマーを使用して、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systemにより行った。
【００５９】
免疫組織化学
各試料の連続切片（10μm)を、ミオシン重鎖線維型を分析するために、顕微鏡スライド上にマウントした。Behanのプロトコルに基づき線維型分布及び筋肉横断面領域を調べる為、ミオシンの速筋型及び遅筋型アイソフォームに基づく免疫組織化学技術を用いた。蛋白質の細胞局在は、標準的な免疫組織化学技術及び所望の蛋白質に対して産した抗体を用いて行った。
【００６０】
結果
結果は、平均±SEM、及び、Bonforoni多重比較試験を用いた2要因の分散分析により計算された有意性として示される。年齢、体重、身長またはBMI値については、トレーニングの前及び後のどちらでも、有意な差は観察されなかった。
（表１）対象の特徴
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全ての対象は、12週間に亘る強度トレーニングによって、骨格筋の強度の向上を示した。
【００６１】
NatraPro WPI（B1）群は、（A）群と比べて、およそ23％高いレッグプレス強度獲得を示したのに対し、NatraPro WPI（B2）群は、蛋白質源のみを受けた対象（NatraPro WPI（A）、図1）と比べて、およそ35％高いレッグプレス強度獲得を示した。
【００６２】
骨格筋線維型変化
1型（遅/酸化)または2型(速/解糖)に分類される筋肉線維の割合は、乳清生長因子抽出物の投与により変化し、2B型（最も解糖型）の線維型の割合の増加、及びそれに伴う1型（遅）の線維型の減少へと帰した（図2）。
【００６３】
遺伝子発現分析
遺伝子の増加した発現及び協調は、筋床(muscle bed)中に局在する幹細胞（衛星細胞）を活性化する必須の工程である（Anderson&Wozniak, Can J Physiol Pharmacol. 2004; 82(5): 300-10）。衛星細胞は、成熟する前に迅速に増殖し、既存の筋肉線維と終局的には融合する、または、新たな筋肉線維を造るために接合する成体幹細胞の集団である。衛星細胞の活性化のレギュレーターは、シンデカン3（衛星細胞増殖に必須の膜貫通ヘパリン硫酸プロテオグリカン）、Pax-7（衛星細胞の活性化に必須で、かつ筋組織修復に必要な、未知の機能の蛋白質）を含む（Sealeら,Dev Biol. 2004; 15; 275(2): 287-300、Cornelisonら,Dev Biol. 2001; 239(1): 79-94）。
【００６４】
Pax7及びシンデカン3の発現は、12週間のトレーニングの後、そして、乳清生長因子抽出物を投与した場合にはより一層、増加する傾向があった（図３）。
【００６５】
WGFEが、レジスタンス運動トレーニング後の筋肉の強度及び/または大きさを増加させることをデータは裏付けている。データはまた、WGFEが、WPI等の追加の蛋白質源と組み合わせた場合、レジスタンス運動トレーニングに取り組む対象により使用されていることが知られている蛋白質源であるWPIを単独で投与した時に観察される場合よりも大きな割合で強度獲得を増加させることを裏付けている。
【００６６】
これをさらに裏付けるように、乳清生長因子抽出物の投与が、筋肉線維型の遅筋（1型）から速筋（2型）への切換えを促進し、かつ筋肉幹細胞活性化遺伝子Pax7及びシンデカン3の発現を増幅させることが観察された。
【００６７】
実施例２：WGFEのL6筋芽細胞生長に対する効果
WGFE（LP）、初乳、10％ウシ胎児血清（FCS）または培地のみ（未刺激）の存在下でL6筋芽細胞を生育させるin vitro筋肉細胞生長試験を行った。乳清生長因子抽出物は、実施例1の場合と同様に調製した。
【００６８】
図４A：0.04から5mg/mlの範囲の濃度でのWGFE、または初乳のどちらかの刺激に対する48時間に亘るL6筋芽細胞生長の分析。各点は、3連の測定の相加平均±SEMを表す。
【００６９】
48時間に亘って5mg/mlのWGFEで刺激された場合、細胞数は、およそ2倍増加した。陽性コントロールとして10％FCSを含めた。Murray Goulburn Co-Op Company Ltd.により産生された初乳も比較目的で含めた。
【００７０】
図４B：最大10mg/mlまでのWGFEに対する用量応答を測定する48時間に亘るL6筋芽細胞生長の分析。各点は、3連の測定の相加平均±SEMを表す。
【００７１】
2.5〜5mg/ml付近で最大応答が達成されるようであり、応答は10mg/mlまでWGFE濃度が増加すると減退する。
【００７２】
図４C：5mg/mlのWGFE対無刺激に対する48時間に亘るL6筋芽細胞生長の分析。プロットされた値は、3つの個別の実験により得られた平均応答の相加平均±SEMを表す。
【００７３】
これらのデータは、同じ濃度範囲に亘って初乳が非常に少しの刺激効果しか有さないのに対し、WGFEが筋芽細胞の生長を、至適刺激効果1.25〜5.0mg/mlで、刺激することを示す。さらに、WGFE処理された筋芽細胞の生長速度は、未処理の細胞の約2倍高かった。
【００７４】
実施例３：WGFE及びWPIの線維芽細胞生長に対する効果
WGFE、WPI、初乳、及び、他の乳画分、10％FCS（陽性(‘+ve’)コントロール）または培地のみ（無(‘Nil’)）の存在下でBalbC 3T3線維芽細胞を生育させるin vitro線維芽細胞生長試験を行った。乳清生長因子抽出物は、実施例1の場合と同様に調製した。WPIは、Murray Goulburn Co-Op Company Ltd.のNatraPro（商標）との商標名で市販されており入手可能である。
【００７５】
BalbC 3T3線維芽細胞を上述のように、初乳、100mg/mlのWPI、100mg/mlのWGFE、または種々の乳画分に対して48時間に亘って生育させた。プロットされた値は、3つの個別の実験により得られた平均応答の相加平均±SEMを表す。この分析は、細胞生長の刺激において、WGFEが、WPI単独より一層強力であることを示している（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】休息時及びトライアルの最初[トレーニング前]、並びに、3時間のレジスタンス運動トレーニングの直後に投与される20g WPI（A群）、1g WGFE+20g WPI（B1群）、または2g WGFE+20g WPI（B2群）による6及び12週間の処置に続いて[トレーニング後]行った、成人対象のレッグプレスについてのCybexNORM筋力計反復最大強度試験結果。結果は平均±SEMで表される。
【図２】12週間のレジスタンス運動トレーニング、及び20g WPI（A群）、1g WGFE+20g WPI（B1群）、または2g WGFE+20g WPI（B2群）による処置[トレーニング後]における、成人対象の外側広筋の線維型組成におけるパーセント変化。結果は平均±SEMで表される。
【図３】休息時、並びに、トライアルの最初[トレーニング前]、及び12週間の20g WPI（A群）、1g WGFE+20g WPI（B1群）、または2g WGFE+20g WPI（B2群）による処置に続いて[トレーニング後]行われた3時間のレジスタンス運動トレーニング後の成人対象の外側広筋中でのPax7及びシンデカン3遺伝子（mRNA）発現における倍率変化。結果は平均±SEMで表される。
【図４】4A: 0.04から5mg/mlの範囲の濃度でのLP（WGFE）、または初乳のどちらかの刺激に対する48時間に亘るL6筋芽細胞生長の分析。各点は、3連の測定の相加平均±SEMを表す。陽性コントロールとして、10％FCSを含めた。初乳は、Murray Goulburn Co-Op Pty Ltd.により産生された。4B: 最大10mg/mlまでのLP（WGFE）に対する用量応答を測定する、48時間に亘るL6筋芽細胞生長の分析。各点は、3連の測定の相加平均±SEMを表す。4C: 5mg/mlのLP（WGFE）対無刺激に対する48時間に亘るL6筋芽細胞生長の分析。プロットされた値は、3つの個別の実験により得られた平均応答の相加平均±SEMを表す。
【図５】100mg/mlのCPI（WPI）、または100mg/mlのFMP（WGFE）、または初乳、ラクトフェリン（LF）及び10％FCS（陽性コントロール(‘+ve’)）等の他の乳画分に対する、48時間に亘るBalbC 3T3線維芽細胞生長の分析。プロットされた値は、3つの個別の実験により得られた平均応答の相加平均±SEMを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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