(57)【要約】  本発明はペプチジル化合物を用いたα−シヌクレイン凝集の阻害に関し、そのペプチジル化合物α−シヌクレイン配列のレトロエンチオマー、特に１から６０の残基又は６１から９６の残基の間の領域内の配列のレトロエンチオマーである。本発明のペプチジル化合物を、必要に応じてドパミン作動性標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）、及び／又は、血液脳関門輸送部分と連結してもよく、パーキンソン病などのα−シヌクレイノパチーの治療において有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−シヌクレインの１−９６の残基の間の領域の中の連続したアミノ酸配列の逆配列を有する４個から１０個のＤ−アミノ酸からなるペプチド。
【請求項２】
α−シヌクレインの凝集を阻害する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
α−シヌクレインの１−６０の残基の間の領域の中の連続したアミノ酸配列の逆配列を有する、請求項１又は請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
１−７、１４−２０、３６−４２及び４７−５７の残基からなる群から選択されたα−シヌクレインの領域からの、１個又はそれより多くの残基を含む連続したアミノ酸配列の逆配列を有する、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
gkmfvdm、sgvylvg及びvtavghvからなる群から選択されたＤ−アミノ酸の配列からなる、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
６１から９６の残基の間の領域の中の連続したアミノ酸配列の逆配列を有する、請求項１又は請求項２記載のペプチド。
【請求項７】
６４−７６及び８６−９６の残基からなる群から選択されたα−シヌクレインの領域からの１個又はそれより多くの残基を含む連続したアミノ酸配列の逆配列を有する、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
tvvaggv、atvgtvv、taaaisg、fgtaaai及びkvfgtaaからなる群から選択されたＤ−アミノ酸の配列からなる、請求項６又は請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれか１項記載のペプチドのＤ−アミノ酸配列に、１個から３個のＤ−アミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を伴う配列からなるペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドの１個又はそれより多くのＤ−アミノ酸残基がプロリンで置き換えられている、請求項９記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチド配列の２番目の位置又は３番目の位置のＤ−アミノ酸残基がプロリンで置き換えられている、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
sgpylvgの配列からなる、請求項１１記載のペプチド。
【請求項１３】
vapgvnt、gapevtk、tpaaisg、tapaisg、fptaaai、kpfgtaa、kvfptaa、sptvvags及びgpvntvqからなる群から選択された配列からなる、請求項１１記載のペプチド。
【請求項１４】
α−シヌクレインの６１−６６の残基（EQVTN）と相互作用する、４個から１０個のＤ−アミノ酸からなるペプチド。
【請求項１５】
QYSVLIのＤ−アミノ酸配列からなる、請求項１４記載のペプチド。
【請求項１６】
QYSVLIのＤ−アミノ酸配列に、１個、２個又は３個のアミノ酸置換を伴う配列を含む、請求項１４記載のペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドの１個又はそれより多くのＤ−アミノ酸残基がプロリンで置き換えられている、請求項１６記載のペプチド。
【請求項１８】
qykvli、qysvpi、qyspli、qypvli、qpsvli、qytvli、pysvli、qysvlv及びrysvliからなる群から選択された配列からなる、請求項１６又は請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１５から請求項１８のいずれか１項記載のペプチドのＤ−アミノ酸配列に、１個、２個、又は３個の付加的なＮ末端残基を伴う配列からなるペプチドからなる、請求項１４記載のペプチド。
【請求項２０】
ekysvli、drysvliからなる群から選択された配列からなる、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
α−シヌクレインの７１−７６の残基（VTGVT）と相互作用する４個から１０個のＤ−アミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２２】
hhvivaのＤ−アミノ酸配列からなる、請求項２１記載のペプチド。
【請求項２３】
hhvivaのＤ−アミノ酸配列に、１個、２個、又は３個のアミノ酸置換を伴う配列を含む、請求項２１記載のペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドの１個又はそれより多くのＤ−アミノ酸残基がプロリンで置き換えられている、請求項２３記載のペプチド。
【請求項２５】
Ｎ−末端のヒスチジン残基が置換されていない、請求項２３又は請求項２４記載のペプチド。
【請求項２６】
hhvvva、hhvlva、hhvkva、hhveva、hpviva、hhvivp、hhvivv、hhvivt、hhvivy、hhvivw、hhtivv、hhtivk、hhtvva、hhtlva、hhtlvv、hhtevy及びhhttvyからなる群から選択された配列からなる、請求項２３から請求項２５のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項２７】
請求項２１記載のペプチドであって、請求項２２から請求項２６のいずれか１項記載のペプチドのＤ−アミノ酸配列に、１個、２個、又は３個の付加的なＮ末端残基を伴う配列からなる、上記ペプチド。
【請求項２８】
α−シヌクレインと相互作用し、kgegk、rdr、egkgegk又はrgdgdのＤ−アミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２９】
α−シヌクレインと相互作用し、kgegk、rdr、egkgegk又はrgdgdのＤ−アミノ酸配列に、１個、２個又は３個のアミノ酸置換を伴う配列からなるペプチド。
【請求項３０】
α−シヌクレインと相互作用し、請求項２８又は請求項２９記載のペプチドに、１個、２個又は３個の付加的なＮ−アミノ末端残基を伴う配列からなるペプチド。
【請求項３１】
１個又はそれより多くのカップリングパートナーと連結している、請求項１から請求項３０のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項３２】
カップリングパートナーが保護基である、請求項３１記載のペプチド。
【請求項３３】
保護基がアセチル基又は炭素数３から２０のアルキル基である、請求項３２記載のペプチド。
【請求項３４】
保護基がアミド基である、請求項３２記載のペプチド。
【請求項３５】
カップリングパートナーがドパミン作動性のニューロン標的化部分である、請求項３１から請求項３４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項３６】
ドパミン作動性のニューロン標的化部分が、ドパミン類似体又はＤＯＰＡアゴニストである、請求項３５記載のペプチド。
【請求項３７】
ドパミン作動性のニューロン標的化部分が、Ｌ−ＤＯＰＡ又はピログルタミン酸である、請求項３６記載のペプチド。
【請求項３８】
カップリングパートナーが血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分である、請求項３１から請求項３８のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項３９】
血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分が、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）である、請求項３８記載のペプチド。
【請求項４０】
１個から５個のＮ−メチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）部分を含んでいる、請求項３９記載のペプチド。
【請求項４１】
請求項１から請求項４０のいずれか１項記載のペプチドを１個又はそれより多く含む化合物。
【請求項４２】
１個若しくはそれより多くの請求項１から請求項４０のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項４１記載の化合物、並びに医薬として許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４３】
１個若しくはそれより多くの請求項１から請求項４０のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項４１記載の化合物を、医薬として許容される賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を製剤する方法。
【請求項４４】
ヒト又は動物の体の治療方法に使用するための、請求項１から請求項４０のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項４１記載の化合物、又は請求項４２記載の組成物。
【請求項４５】
α−シヌクレイノパチーの治療において使用するための、請求項４４記載のペプチド、化合物、又は組成物。
【請求項４６】
α−シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、ＬＢ変異型のアルツハイマー病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レービー小体（ＬＢ）型認知症、及びハレルフォルデン・スパッツ病からなる群から選択される、請求項４５記載のペプチド、化合物、又は組成物。
【請求項４７】
α−シヌクレイノパチーの治療において使用するための医薬の製造における、請求項１から請求項４０のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項４１記載の化合物、又は請求項４２記載の組成物の使用。
【請求項４８】
個体においてα−シヌクレイノパチーを治療する方法であって、請求項１から請求項４０のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項４１記載の化合物、又は請求項４２記載の組成物を、前記個体に投与することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質の凝集の阻害、特にα−シヌクレインの凝集の阻害に関する。これは例えば、パーキンソン病のようなα−シヌクレイノパチーの治療に有益でありうる。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は最も重大な神経変性疾患の一つであり、６５歳を超えた人口の３％を侵している。これは休止時振戦、動作緩慢、硬直、および姿勢の不安定により特徴付けられる（Lang, A.E & Lozano, A.M.N Engl J Med 339, 1044-53 (1998)）。この疾患における１次的な病理的変化は、黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるドパミン作動性ニューロンの変性である（Jenner, P. & Olanow, C. W. Ann Neurol 44, S72-84 (1998)）。パーキンソン病は２番目に最も一般的な神経変性疾患であり、その基となる疾患の機構は解明されていないままである。このことの理由の一部は、該疾患自体の慢性的な性質による（１０年から２０年間持続することも普通である）。散発性パーキンソン病の病因は未だ十分に理解されていないが、遺伝的な異常を含む幾つかの潜在的に寄与している因子と、内因性および環境的な因子が提案されている（Calne, D. Parkinsonism Relat. Disord. 7 3-7 (2000)）。
【０００３】
パーキンソン病の病理的な顕著な病変は、レビー小体（ＬＢ）と呼ばれている線維状細胞質内封入体の沈着であると見なされており、この沈着が観察された神経変性の基にあるかもしれない。α−シヌクレイン（α−ＳＮ）は１８から２０ｋＤａの、遍在する１４０アミノ酸の蛋白質であって、それはニューロン、特にシナプス前ニューロンにおいて豊富に存在し（Goedert, M. Nat Rev Neurosci 2, 492-501 (2001), Iwatsubo, T. J Neurol 250 Suppl 3, III11-4 (2003)）、かつ、レービー小体の中の主要な蛋白質成分であることも見出された（Spillantini, M. G. et al. Nature 388, 839-40 (1997)）。レービー小体の病変はレービー小体型認知症（ＤＬＢ）、ＬＢ変異型のアルツハイマー病、および鉄蓄積型Ｉの神経変性（ハレルフォルデン・スパッツ病）においても特徴的である。更に多系統萎縮症の患者の（オリゴデンドロ）グリア細胞質封入体（ＧＣＩ）において、α−ＳＮ線維が沈着している。これらの疾患は一般的に、α−シヌクレイノパチーと言われている（Spillantini, M. G et a; Ann N Y Acad Sci 920, 16-27 (2000), Golbe, L. I. Mov Disord 14, 6-9 (1999), Goedert, M. et al. Biochem Soc Trans 26, 463-71 (1998), Goedert, M. et al Mol Psychiatry 3, 462-5 (1998)）。
【０００４】
パーキンソン病におけるα−シヌレインの重要性を支持する更なる証拠は、α−シヌクレインに関連する遺伝的な変化と、幾つかの早期発症型のパーキンソン病との関連にある。これらの変異には、Ａ３０Ｐ、Ａ５３Ｔ、Ｅ４６Ｋおよびα−シヌクレインのトリソミーが含まれる（Vila, M. et al Nat Med 10 Suppl, S58-62 (2004), Farrer, M. et al. Ann Neurol 55, 174-9 (2004), Zarranz, J. J. et al. Ann Neurol 55, 164-73 (2004)）。
【０００５】
他の蛋白質、特にユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）の成分に影響する遺伝的な変異は、幾つかの型の家族型パーキンソン病の原因であるようである。
【０００６】
現在においては、パーキンソン病の有効な治療法は無く、対症療法が利用できるのみである（例えば、レボドパおよびドパミン作動性アゴニスト）。
【０００７】
パーキンソン病の治療のために現在、幾つかの新たなアプローチの研究がなされている。疾患の早期の段階の間に失われた細胞を置き換えるために、幹細胞療法を用いた黒質の再生が試みられている（Lindvall, O. et al Nat Med 10 Suppl, S42-50 (2004)）。しかしながら、現在においては顕著な成功は達成されていない。遺伝子療法（幾つかのケースでは幹細胞と組み合わせて使用された）が試みられて、ドパミンの合成に関与する生合成酵素が置き換えられ、又は、ドパミン作動性ニューロン（ＧＤＮＦ）の保護と回復のために神経栄養因子が添加された（Behrstock, S. et al Ann N Y Acad Sci 1019, 5-14 (2004), Azzouz, M. et al. Neuroreport 15, 985-90 (2004), Fraix, V. Rev Med Interne 25, 524-7 (2004)）。神経栄養因子に関連する幾つかの試みが開始された（Oransky, I. Lancet 362, 712 (2003), Howard, K. Nat Biotechnol 21, 1117-8 (2003)）。例えばβ−シヌクレイン(Windisch, M. et al. J Mol Neurosci 19, 63-9 (2002), Park, J. Y. et al, Biochemistry 42, 3696-700 (2003), Windisch, M. et al J Mol Neurosci 24, 155-66 (2004))、あるいはα−シヌクレイン自身のＮＡＣ領域（El-Agnaf, O. M. et al. Faseb J 18, 1315-7 (2004)）に基づいて、ペプチジル阻害剤を用いたα−シヌクレイン凝集の阻害も試みられた（Bodles, A. M. et al Neurosci Lett 359, 89-93 (2004)）。しかしながら、阻害は高濃度においてのみ示され、報告された細胞死阻害の実験のデータは解釈が困難であり、かつ、採用された細胞モデルとアッセイは必ずしもパーキンソン病と関連していない。更なる問題は、血漿中でのペプチド阻害剤の変性から生じる。一本鎖抗体がα−シヌクレインのフィブリル化に干渉し、インビトロで早期のオリゴマー形成を遅延させることが報告されている(Emadi, S. et al. Biochemistry 43, 2871-8 (2004))。類似したアプローチがハンチントン病（ハンチントン凝集が関与する）において試みられている。この後者の場合には、単一ドメインＬＶイントラボディー（細胞内抗体）が、哺乳類細胞内でハンチントン凝集を阻害するようである（Colby, D. W. et al. J Mol Biol 342, 901-12 (2004)）。イントラボディーを用いた市販薬の例はないが、遺伝子療法における付加的な道具としてイントラボディーを用いて、幾つかの臨床試験が開始された（Alvarez, R. D. et al. Clin Cancer Res 6, 3081-7 (2000)）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lang, A.E & Lozano, A.M.N Engl J Med 339, 1044-53 (1998)
【非特許文献２】Jenner, P. & Olanow, C. W. Ann Neurol 44, S72-84 (1998)
【非特許文献３】Calne, D. Parkinsonism Relat. Disord. 7 3-7 (2000)
【非特許文献４】Goedert, M. Nat Rev Neurosci 2, 492-501 (2001)
【非特許文献５】Iwatsubo, T. J Neurol 250 Suppl 3, III11-4 (2003)
【非特許文献６】Spillantini, M. G. et al. Nature 388, 839-40 (1997)
【非特許文献７】Spillantini, M. G et a; Ann N Y Acad Sci 920, 16-27 (2000)
【非特許文献８】Golbe, L. I. Mov Disord 14, 6-9 (1999)
【非特許文献９】Goedert, M. et al. Biochem Soc Trans 26, 463-71 (1998)
【非特許文献１０】Goedert, M. et al Mol Psychiatry 3, 462-5 (1998)
【非特許文献１１】Vila, M. et al Nat Med 10 Suppl, S58-62 (2004)
【非特許文献１２】Farrer, M. et al. Ann Neurol 55, 174-9 (2004)
【非特許文献１３】Zarranz, J. J. et al. Ann Neurol 55, 164-73 (2004)
【非特許文献１４】Lindvall, O. et al Nat Med 10 Suppl, S42-50 (2004)
【非特許文献１５】Behrstock, S. et al Ann N Y Acad Sci 1019, 5-14 (2004)
【非特許文献１６】Azzouz, M. et al. Neuroreport 15, 985-90 (2004)
【非特許文献１７】Fraix, V. Rev Med Interne 25, 524-7 (2004)
【非特許文献１８】Oransky, I. Lancet 362, 712 (2003)
【非特許文献１９】Howard, K. Nat Biotechnol 21, 1117-8 (2003)
【非特許文献２０】Bodles, A. M. et al Neurosci Lett 359, 89-93 (2004)
【非特許文献２１】Windisch, M. et al. J Mol Neurosci 19, 63-9 (2002)
【非特許文献２２】Park, J. Y. et al, Biochemistry 42, 3696-700 (2003)
【非特許文献２３】Windisch, M. et al J Mol Neurosci 24, 155-66 (2004)
【非特許文献２４】El-Agnaf, O. M. et al. Faseb J 18, 1315-7 (2004)
【非特許文献２５】Emadi, S. et al. Biochemistry 43, 2871-8 (2004)
【非特許文献２６】Colby, D. W. et al. J Mol Biol 342, 901-12 (2004)
【非特許文献２７】Alvarez, R. D. et al. Clin Cancer Res 6, 3081-7 (2000)
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、α−シヌクレインの特定の領域のレトロエナンチオマーを同定したが、それはα−シヌクレインの凝集を阻害する活性があるので、パーキンソン病及び他のα−シヌクレイノパチーの治療において有用であろう。
【００１０】
本発明の１つの側面において、α−シヌクレインの１−９６の残基の間の領域内の連続したアミノ酸配列の逆配列（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する、４個から１０個のＤ−アミノ酸からなるペプチド又は他のペプチジル化合物を提供する。
【００１１】
本願明細書中で述べるペプチドはα−シヌクレインの凝集を阻害することがあり、例えば、４、５、６、７、８、９又は１０個のＤ−アミノ酸、好ましくは６、７又は８個のＤ−アミノ酸からなる。
【００１２】
ある好適な態様においてペプチドは、α−シヌクレインの１−６０の残基の間の領域内の連続したアミノ酸配列の逆配列を有する、４個から１０個のＤ−アミノ酸からなってもよい。言い換えれば、Ｎ末端からＣ末端方向におけるＤ−アミノ酸の配列は、Ｃ末端からＮ末端の方向におけるα−シヌクレインの連続したアミノ酸配列に相当する。Ｌ−アミノ酸配列と逆となるＤ−アミノ酸配列は一般的に、その配列の「レトロエナンチオマー」として知られている。
【００１３】
例えばペプチドは、α−シヌクレインの１−７、１４−２０、３６−４２、又は４７−５７の残基の間の領域からの、１個又はそれより多く、２個又はそれより多く、３個又はそれより多く、４個又はそれより多く、５個又はそれより多く、６個又はそれより多く、７個又はそれより多く、あるいは全ての残基を含む、連続したアミノ酸配列の逆配列からなってもよい。ある好適な態様においてペプチドは、gkmfvdm、sgvylvg、およびvtavghvからなる群から選択されたＤ−アミノ酸の配列からなってもよい。
【００１４】
他の態様においてペプチドは、α−シヌクレインの６１から９６の残基の間の領域内の連続したアミノ酸配列の逆である、４個から１０個のＤ−アミノ酸の配列からなってもよい。例えばペプチドは、α−シヌクレインの６４から７６又は８６から９６の残基の間の領域からの、１個又はそれより多く、２個又はそれより多く、３個又はそれより多く、４個又はそれより多く、５個又はそれより多く、６個又はそれより多く、７個又はそれより多く、８個又はそれより多く、９個又はそれより多く、あるいは１０個全ての残基を含む、連続したアミノ酸配列の逆配列からなってもよい。幾つかの好適な態様においてペプチドは、tvvaggv、atvgtvv、taaaisg、fgtaaai、およびkvfgtaaからなる群から選択されたＤ−アミノ酸の配列からなってもよい。
【００１５】
ある態様においてペプチドは、α−シヌクレインの６９−７２の残基の間の領域からの、１個、２個、３個、又は４個の残基（例えば、TVVA又はVVA）を含む、連続したアミノ酸配列の逆配列からなるものでないことがある。
【００１６】
ある態様においてペプチドは、α−シヌクレインの７６−７８の残基（AVA）の間の領域からの１個、２個、又は３個の残基を含む、連続したアミノ酸配列の逆配列からなるものでないことがある。
【００１７】
ある態様においてペプチドは、α−シヌクレインの８８−９１の残基の間の領域（AAAI）からの１個、２個、３個、又は４個の残基を含む、連続したアミノ酸配列の逆配列からなるものでないことがある。
【００１８】
本発明者らは更に、α−シヌクレインのレトロエナンチオマーではないペプチドもα−シヌクレインと相互作用し、凝集を減少するか又は阻害しうることを見出した。
【００１９】
本発明の他の側面は、α−シヌクレインの１−９６の残基の間の領域、例えばα−シヌクレインの１−６０の残基の間の領域、又はα−シヌクレインの６１−９６の残基の間の領域、と相互作用する４個から１０個のＤ−アミノ酸からなるペプチドを提供する。
【００２０】
そのペプチドは、好適にはα−シヌクレインのその領域と、例えば水素結合の形成を通じて結合し、α−シヌクレインのその領域のアミノ酸とβ−シートの２次構造を形成する。
【００２１】
上記のように、適切なペプチドはα−シヌクレインの凝集を阻害し、そして例えば４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のＤ−アミノ酸、好適には６個、７個、又は８個のＤ−アミノ酸からなってもよい。
【００２２】
ある態様においてペプチドは、α−シヌクレインの６１−６６の（EQVTN）の残基の間の領域と相互作用する、Ｄ−アミノ酸の配列からなってもよい。適切なペプチドはqysvli（ＺＰ−０１９５）のＤ−アミノ酸の配列を含むものであるか、又はそれからなるものであってもよく、あるいは１個、２個、若しくは３個のアミノ酸置換を有するqysvliのＤ−アミノ酸の配列を含むものであるか、又はそれからなるものでもよい。例えばペプチドは、qykvli、qysvpi、qyspli、qypvli、rysvli、qysvli、qytvli、pysvli、又はqysvlvからなる群から選択されたＤ−アミノ酸からなるものでもよい。
【００２３】
適切なペプチドを任意の便利な方法を用いて設計してもよい。コンピューターに基づく幾つかの適切な方法が、同時係属している米国特許出願６０／８２１５５３号の中に述べられている。
【００２４】
ペプチドは、１個、２個、又は３個の付加的なＮ末端残基を含んでもよい。例えばペプチドは、ekysvli及びdrysvliからなる群から選択された配列を含むものであるか、又はそれからなるものでもよい。
【００２５】
他の態様においてペプチドは、α−シヌクレインの７１−７６（VTGVT）の残基の間の領域と相互作用するＤ−アミノ酸の配列からなるものでもよい。例えばペプチドは、hhviva（ＺＰ−０１５８）のＤ−アミノ酸の配列からなるものでもよく、あるいは、１個、２個、若しくは３個のアミノ酸置換を有するhhvivaのＤ−アミノ酸の配列を含むものであるか、又はそれからなるものでもよい。好適にはＮ末端のヒスチジン残基は置換されない。
【００２６】
例えばペプチドは、hhvvva、hhvlva、hhvkva、hhveva、hpviva、hhvivp、hhvivv、hhvivt、hhvivy、hhvivw、hhtivv、hhtivk、hhtvva、hhtlva、hhtlvv、hhtevy及びhhttvyからなる群から選択された配列を含むものであるか、又はそれからなるものでもよい。
【００２７】
本発明者らはまた、α−シヌクレイン残基の２次ヘリカル構造を安定化するペプチドは、凝集を減少させるか又は阻害することを見出した。適切なペプチドはα−シヌクレインの配列のヘリックス又はターンを形成する傾向がある領域と相互作用し、そしてその領域内における２次構造を安定化する。これらの領域は、ＡＧＡＤＩＲなどの既知の蛋白質解析アルゴリズムを用いて同定できる(Munoz, V. & Serrano, L. (1994) Nature: Struct. Biol. 1, 399-409; Munoz, V. & Serrano, L. (1994) J. Mol. Biol 245, 275-296; Munoz, V. & Serrano, L. (1994) J. Mol. Biol 245, 297-308; Munoz, V. & Serrano, L. (1997) Biopolymers 41, 495-509; Lacroix, E. et al (1998) J. Mol. Biol. 284, 173-191)。
【００２８】
本発明の他の側面は、α−シヌクレインと相互作用し、そして、kgegk、rdr、egkgegk、又はrgdgdのＤ−アミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００２９】
好適にはそのようなペプチドは、α−ヘリックスになる傾向がある領域、例えば図１６に示されるような、１５−２３、２６−３１、５２−６２、７４−７９、又は８７−９３の残基と相互作用する（Ulmer et al (2005) J. Biol. Chem. 280 9595-903を見よ）。
【００３０】
本発明のペプチドは、本願明細書中で述べたアミノ酸配列において、１個、２個、３個、又は４個のＤ−アミノ酸の付加、欠失又は置換を有するものからなる配列も包含する。
【００３１】
例えば本願明細書中で述べたペプチド配列のＮ末端又はＣ末端から、１個、２個、３個又は４個のＤ−アミノ酸が付加されるか又は欠失したものでもよい。
【００３２】
本願明細書中で述べたペプチドに付加された、１個、２個、３個又は４個の付加的なＤ−アミノ酸は、α−シヌクレインの中の連続した配列の、Ｎ末端又はＣ末端に隣接するアミノ酸の逆の配列でもよい。あるいは１個、２個、３個又は４個の付加的なＤ−アミノ酸は、α−シヌクレインの中の連続した配列のＮ末端又はＣ末端に隣接するアミノ酸の、逆の配列ではない残基であってもよい（すなわち、それらは非相同のアミノ酸であってもよい）。ある態様において下記に述べるように、血液脳関門を通じた輸送を促進するために、１個またはそれより多くのＮ−メチル−フェニルアラニン残基をＮ末端に付加してもよい。
【００３３】
置換は、保存的又は非保存的置換であってもよい。例えばペプチドは、本願明細書の中で述べられた配列に対して、１個、２個、３個又はそれより多くの、保存的又は非保存的な置換を有する配列からなるものでもよい。保存的置換とはＤ−アミノ酸残基を、電荷、極性、及び／又は疎水性などの性質が類似している他の残基と置き換えることである。例えば天然のポリペプチド配列中のアミノ酸についての保存的置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。アミノ酸は下記の４つの群：（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性の極性アミノ酸、および（４）中性の非極性アミノ酸、に分けられる。これらの様々な群の中の代表的なアミノ酸には、これらに限定されるものではないが、（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性（負に荷電した）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン及びリジンなどの塩基性（正に荷電した）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンなどの中性の極性アミノ酸；及び（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンなどの中性の非極性（疎水性）アミノ酸が含まれる。機能が類似したアミノ酸を列挙した保存的な置換の表が、本技術分野において知られている(Altschul, S.F. 1991 Journal of Molecular Biology 219: 555-665, Crighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company)。例えば、１個、２個、３個又はそれより多くの保存的置換を有する配列からなるペプチドは、本願明細書の中で示した配列と９５％、９９％又は１００％の配列類似性を示すことがある。アミノ酸の類似性はアルゴリズムＧＡＰ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ）、又はAltschulらのＴＢＬＡＳＴＮプログラム（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10）に準拠して規定されることがある。
【００３４】
ペプチドは、本願明細書の中で示したものに１個、２個、３個又はそれより多くの置換を有する配列であって、ベータ鎖の会合を減少させるか又は防ぐものからなってもよい。例えばそのペプチド配列の中の１個又はそれより多く、２個又はそれより多く、３個又はそれより多く、又は４個のＤ−アミノ酸を、Ｄ−プロリンで置き換えてもよい。ある態様において、２番目の位置及び／又は３番目の位置の残基を、Ｄ−プロリンで置き換えてもよい。例えば、α−シヌクレインの１−６０の残基の間の領域の中の、又はα−シヌクレインの６１−９６の残基の間の領域の中の、連続したアミノ酸配列の逆配列の中の、１個又はそれより多くのＤ−アミノ酸をＤ−プロリンで置き換えてもよい。そのようなペプチドの例には、gapevtk、tpaaisg、tapaisg、fptaaai、kpfgtaa、kvfptaa、sptvvags及びgpvntvqからなる群から選択されたＤ−アミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。ある好適な態様においてペプチドは、gpvntvqのＤ−アミノ酸配列からなってもよい。
【００３５】
本発明のペプチドは、１個、２個、３個又は４個の修飾されたＤ−アミノ酸を有する、本願明細書中で示した配列からなる配列も包含する。本願明細書中で述べられたペプチドの中のＤ−アミノ酸は、例えば置換化学基の導入により、例えばＮの位置で修飾されてもよい。適切な置換基には、フッ素などのハロゲン、硝酸塩、及びメチルなどのアルキル基、又はアセチル基が含まれる。
【００３６】
アミノ酸修飾は、ベータ鎖の会合を低下させるか、又は防ぐことがある。例えば、ペプチド配列の中の１個又はそれより多くの、例えば２個、３個又は４個のＤ−アミノ酸がＮ−置換されてもよく、好適にはＮ−アルキル化（例えばＮ−メチル化）、又はＮ−アセチル化されてもよい。
【００３７】
ペプチドは全体として又は部分的に化学合成によって生成してもよい。レトロエンチオマーなどのＤ−アミノ酸ペプチドは化学合成において、Ｄ−型に誘導体化したアミノ酸残基を用いることにより生成することができる。固相ペプチド合成のための適切なＤ−アミノ酸は市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、 ルイビル；Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ；Ｓｉｇｍａ、セントルイス；Ｂａｃｈｅｍ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｃ．トランスなど）。例えば、よく確立された標準的な液相、又は好適には固相ペプチド合成法に従って、ペプチドを容易に調製することができ、その一般的な記載を広く入手することができるし（例えば、J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)の中、M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)の中; J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides Oxford University Press, Oxford 1991 の中; Applied Biosystems 430A ユーザーマニュアル, ABI Inc., Foster City, Californiaの中、 G. A. Grant, (Ed.) Synthetic Peptides, ユーザーガイド.  W. H. Freeman & Co., New York 1992, E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. IRL Press 1989 及び G.B. Fields, (Ed.) Solid-Phase Peptide Synthesis, (Methods in Enzymology Vol. 289). Academic Press, New York and London 1997の中を参照されたい）、又はそれらを、液相法により又は固相、液相及び溶液化学の任意の組み合わせにより溶液中で調製してもよく、例えば、最初に各々のペプチド部分を完了させることにより、そしてその後、もし必要とされ且つ適切ならば、存在している任意の保護基を除去した後に、各々の炭酸又はスルホン酸又はそれらの反応性誘導体の反応により残基Ｘを導入してもよい。
【００３８】
上記のペプチドを、α−シヌクレインの配列のレトロエナンチオマーではない、１個又はそれより多くの配列と融合させてもよい。上記述べたペプチドを含んでいるペプチドとオリゴペプチドも本発明の側面として提供され、特にここでそのペプチドは、α−シヌクレイン配列のレトロエナンチオマーではない１個またはそれより多くの配列（すなわち異種配列）と融合している。
【００３９】
「異種」とは天然のα−シヌクレイン配列のレトロエンチオマーでないことを意味し、介在するアミノ酸なしでペプチド結合により、本願明細書中に述べられた連続的なα−シヌクレイン配列と結合している。通常は、異種アミノ酸がペプチドと融合している場合には、アミノ酸の全部の連続配列がα−シヌクレイン中に起こることはなく、１０個又はそれより多く、好適には１５個又はそれより多く、より好適には２０個又はそれより多く、２５個又はそれより多く、あるいは３０個又はそれより多くのアミノ酸でもよい。本願明細書中で述べられるペプチドと融合することがあるアミノ酸の異種配列には、本願明細書中で述べたように、抗体又は抗体断片、例えばFab、F(ab')2、dAb、Fv、および scFvなど、神経栄養因子、例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、及びＧＤＮＦなど、インスリン様成長因子、例えば、ＩＧＦ１及びＩＧＦ２など、トランスフェリン及びトランスフェリン受容体と結合する他のペプチド、及び血液脳関門の輸送又はドパミン作動性ニューロンの輸送に関与している他のカップリングパートナーを含んでもよい。
【００４０】
本願明細書中で述べるペプチド及びオリゴペプチドは、例えばカップリングパートナー又は部分（ｍｏｉｅｔｙ）の付加により、Ｎ末端及び／又はＣ末端で修飾されてもよい。ペプチドと結合するカップリングパートナーは、例えばインビボでペプチドの半減期の増加を助けるための保護基、及び標的基を含んでもよい。
【００４１】
適切な保護基は本技術分野で良く知られており（例えば、Greene e al., (1991) Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc. Somerset, N.J.）、そして、アセチル、アミド、及び炭素数３から２０のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基。ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォオニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルフォニル（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメンチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル、（ｔＢｕ）、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）、コーヒー酸、フォルミル−、ビオチン、及びカルボキシフルオレセインを含む。
【００４２】
ある態様において、アミノ末端を保護するのにアセチル基が使用されることがあり、及び／又は、カルボキシ末端を保護するのにアミド基が使用されることがある。アセチル化を、例えば、ペプチドが樹脂上にある時に無水酢酸を用いて、合成をしている間に達成してもよい。アミド保護を、例えば、合成のための適切な樹脂を選択することにより達成されてもよい。
【００４３】
保護基と結合する本願明細書中で述べられるペプチドの例には、図１０の中に示されるＺＰ００９１、ＺＰ００９２、及びＺＰ００９４が含まれる。
【００４４】
ペプチドと結合する適切な標的基には、ドパミン作動性ニューロン標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）が含まれ、それを、例えばペプチド配列のＮ又はＣ末端と結合してもよい。適切なドパミン作動性ニューロン標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）には、ドパミン類似体、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡ、ＤＯＰＡアゴニスト（Sever et al Tetehedron 2001 57 6139; Appell et al Biochem Phamacol 2004 67 293）、ピログルタミン酸、トランスフェリン及びＳＡＰが含まれる。
【００４５】
ドパミン作動性ニューロン標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）と結合する本願明細書中で述べられるペプチドの例には、図１０の中に示されるＺＰ００８９、ＺＰ００９０、及びＺＰ００９３が含まれる。
【００４６】
他のカップリングパートナーには、血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分（ｍｏｉｅｔｙ）が含まれ、それは例えば、ペプチド配列のＮ又はＣ末端と結合することがある。血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分は、血液脳関門を通過する能動的な拡散を促進する部分、及び受容体又は担体と相互作用して受容体又は担体を介したエンドサイトーシスにより血液脳関門を通過する部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含んでよく、例えば、スイートアロウペプチド（ＳＡＰ）（Fernandez-Carneado et al Angew Chem Int Ed Engl 2004 43 14 1811-1814）及びレトロウイルスＴＡＴ蛋白質（C. Foerg et al Biochemistry 2005 44 72）などがある。適切な血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分（ｍｏｉｅｔｙ）には、血液脳関門を通過する輸送を促進することが示されているＮ−メチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）（Conradi, R. A. et al Pharm. Res. (1992) 9, 435-439; Chikhale, E. G. et al Pharm. Res. 1994, 11, 412-419; Chikhale, E. G. et al J. Pharmacol. Exp. Ther. (1995) 273, 298-303）、トランスフェリン、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、及びレプチンが含まれる。標準的な合成技術を用いて、１個又はそれより多く、例えば１個、２個、３個又は４個のＮ−メチルフェニルアラニン残基を有するペプチドを合成することができる。
【００４７】
ペプチジル及び非ペプチジルカップリングパートナーの両者と、ペプチドをカップリングさせる技術は、本技術分野において良く知られている。
【００４８】
本発明の他の側面において、本願明細書中で述べるペプチドを含み、１個又はそれより多くのカップリングパートナーと結合している化合物が提供される。
【００４９】
本願明細書中で述べるペプチド又は化合物を、例えばα−シヌクレイノパチーの治療における使用のためなど、ヒト又は動物の体を治療するための方法において使用してもよく、又はα−シヌクレイノパチーの治療のための薬剤の製造において使用してもよい。
【００５０】
α−シヌクレイノパチーの治療方法は、本願明細書中に述べるペプチドを、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００５１】
α−シヌクレイノパチーはα−シヌクレインの凝集に伴う状態であり、パーキンソン病、ＬＢ変異型のアルツハイマー病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症、及びハレルフォルデン・スパッツ病を含む。
【００５２】
本願明細書中で述べるペプチド又は化合物の投与は、好適には「予防上有効な量」又は「治療上有効な量」におけるものであり（場合によるが、たとえ予防でも治療と見なされることがある）、これは個体に有益性を示すのに十分である。投与される実際の量、及び投与の速度と経時変化は、治療対象の性質と重篤度によるであろう。治療の処方、例えば投与量の決定などは、一般の開業医及び他の医師の責務の範囲内である。
【００５３】
本願明細書中で述べるペプチド又は化合物を、医薬組成物として投与してもよい。医薬組成物は、本ペプチド又は化合物に加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、又は本技術分野の当業者に良く知られている他の材料を含んでもよい。そのような材料は非毒性、且つ、活性成分の効力に干渉しないものでなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は投与経路に依存するであろうが、その投与経路は、経口、経鼻、又は注射、例えば、皮内、皮下又は静脈内注射によるものであってよい。
【００５４】
本発明の他の側面は、例えばα−シヌクレイノパチーの治療において使用するための医薬組成物を作製する方法を提供し、該方法は、本願明細書中で述べるペプチド又は化合物を、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、又は安定化剤と共に混合することを含む。
【００５５】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、又は液体の型であってもよい。錠剤にはゼラチン又は補助剤などの固体の担体が含有されてもよい。液体の医薬組成物は一般的に、水、石油、動物油若しくは植物油、鉱油、又は合成油などの、液体の担体を含有する。生理食塩水溶液、デキストロース又は他のサッカライド溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールなどのグリコール類を含有することがある。
【００５６】
経鼻投与のために適している医薬組成物では、担体は固体であって、例えば約２０から約５００マイクロの範囲内の粒子径を有する粗い粉末を含み、それは鼻から吸う様式により投与され、すなわち、鼻の近くまで持ち上げられた粉末の容器から鼻の経路を通じた迅速な吸入による。担体が液体である適切な製剤は、例えば鼻腔用スプレー、点鼻薬としての投与か、あるいは噴霧器によるエアロゾル投与であるが、活性化合物の水性又は油性の溶液を含む。
【００５７】
静脈内、皮内、又は皮下注射、あるいは患部における注射のためには、活性成分は非経口的に許容される水性溶液の型であって、発熱物質を含まず、適切なｐＨを有し、等張性、及び安定性を有するであろう。関連技術の当業者は、例えば、注射用食塩水、注射用リンゲル液、又は注射用乳酸リンゲル液などの等張のベヒクルを用いて、適切な溶液を良く調製することができる。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加物を、必要に応じて含ませることができる。
【００５８】
本願明細書中で述べるペプチド又は化合物を含む組成物を、単独で又は他の治療薬と組み合わせて、治療するべき状態に依存し、同時又は逐次的のいずれかで投与してもよい。
【００５９】
本技術分野の当業者の通常の知識と予測の範囲内で、適宜にコントロールを採用することができる。
【００６０】
本発明の様々な更なる側面と態様は、本発明の態様を描く下記の実験及び添付の図を含む、本開示に鑑みて当業者に明らかとなるであろう。
【００６１】
この明細書中で言及されている全ての文献は全体として、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【００６２】
本願明細書中で用いられている「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、規定された整数又は整数の群を包含することを示すが、如何なる他の整数又は整数の群を排除するものではない。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、規定された整数又は整数の群が包含され、且つ、如何なる他の整数又は整数の群が排除される態様を包含し、そのような態様に言及する時には「からなる（ｃｏｎｃｓｉｓｔ  ｏｆ）」に置き換えられる。
【００６３】
全てのペプチドの構造及び配列は、標準的なアミノ酸一文字表記を用いて表記される。
【００６４】
本願明細書中で「及び／又は」が使用された場合には、２つの特定の特徴又は成分が他の有無に関わらず、具体的に開示されていると受け止めるべきである。例えば「Ａ及び／又はＢ」は（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々が、あたかも各々が本願明細書中に別個に述べられている如く、具体的に開示されていると受け止めるべきである。
【００６５】
文脈において指示しなければ、上記で述べられた特徴の記載と定義は、本発明の如何なる特定の側面又は態様に限定されず、述べられた全ての側面と態様に等しく適用する。
【００６６】
本発明のある側面と態様は今実施例を通じ、下記に述べる図を参照として描かれるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、参考文献１−３の中で述べられた方法を用いて計算されたα−シヌクレインの凝集プロファイルを示し、各残基について計算された凝集傾向がプロットされている。このプロットは、最も凝集傾向が高い領域は、１−７、１４−２０、３６−４２、及び６１−９５の残基からの配列の領域（ＮＡＣ領域としても知られている）中にあることを示す。
【図２】図２は、レトロエナンチオアプローチを示す。ＡとＢは、Ｌ−とＤアミノ酸の間での、側鎖の配向の比較を示す。Ｃは、Ｌ−アミノ酸の平行ベータシートの鎖を示し、黒丸で表示した側鎖はシートの上側で相互作用し、縞模様のものはシートの下側で相互作用していることを示す。相互作用しているシートの１つをＤ−アミノ酸と置き換えた時（Ｄ）、側鎖の配向は変化し、シートの上側にあったものが今は下側となり、そしてＣの中で見られた相互作用は維持されなくなる。Ｄ−アミノ酸を逆の配列（レトロエナンチオ）で用いることにより、正しい側鎖の相互作用は今、逆平行のベータシート配列で維持される。
【図３】図３は、Ａ１からＢ１２のデータを示す（ＺＰ−０００１からＺＰ−００２４）。図３から図６は、阻害剤の存在下における、ＡＳＹＮにより起こった凝集の程度を描くグラフを示す。エンドポイントのＴｈＴの蛍光を測定し、ＡＳＹＮ単独について測定されたエンドポイントの凝集のパーセントとして表した。比較のために、ＰＢＳとＰＥＧの実験の結果を同じグラフの上に示す。サンプルの名前をプレートの位置により名付け、それらの配列を表１の中で述べる。
【図４】図４は、Ｃ１からＤ１２のデータを示す（ＺＰ−００２５からＺＰ−００４８）。図３から図６は、阻害剤の存在下における、ＡＳＹＮにより起こった凝集の程度を描くグラフを示す。エンドポイントのＴｈＴの蛍光を測定し、ＡＳＹＮ単独について測定されたエンドポイントの凝集のパーセントとして表した。比較のために、ＰＢＳとＰＥＧの実験の結果を同じグラフの上に示す。サンプルの名前をプレートの位置により名付け、それらの配列を表１の中で述べる。
【図５】図５は、Ｅ１からＦ１２のデータを示す（ＺＰ−００４９からＺＰ−００６８）。図３から図６は、阻害剤の存在下における、ＡＳＹＮにより起こった凝集の程度を描くグラフを示す。エンドポイントのＴｈＴの蛍光を測定し、ＡＳＹＮ単独について測定されたエンドポイントの凝集のパーセントとして表した。比較のために、ＰＢＳとＰＥＧの実験の結果を同じグラフの上に示す。サンプルの名前をプレートの位置により名付け、それらの配列を表１の中で述べる。
【図６】図６は、Ｇ１からＨ１２のデータを示す（ＺＰ−００６９からＺＰ−００８８）。図３から図６は、阻害剤の存在下における、ＡＳＹＮにより起こった凝集の程度を描くグラフを示す。エンドポイントのＴｈＴの蛍光を測定し、ＡＳＹＮ単独について測定されたエンドポイントの凝集のパーセントとして表した。比較のために、ＰＢＳとＰＥＧの実験の結果を同じグラフの上に示す。サンプルの名前をプレートの位置により名付け、それらの配列を表１の中で述べる。
【図７】図７は、ＰＢＳ中でのＡＳＹＮの凝集から、成果が最もよい阻害剤を選択したことを示す。グラフは、阻害剤の存在下において、ＡＳＹＮにより起こった凝集の程度を描く。エンドポイントのＴｈＴの蛍光を測定し、ＡＳＹＮ単独について測定されたエンドポイントの凝集のパーセントとして表した。
【図８】図８は、一連の化合物によるα−シヌクレイン凝集の阻害を示す。データは、６つの別個の実験について、α−シヌクレイン単独により起こった凝集のパーセントとして測定した、凝集のエンドポイント値の合計に対応する。阻害剤の配列については、表１を参照されたい。
【図９】図９は、一連の化合物によるα−シヌクレインの阻害を示す。データは、α−シヌクレイン単独により起こった凝集のパ−セントを言及する。棒線は、６つの異なった実験条件下で測定された凝集の平均±標準誤差の値を反映している。対照が含まれ、α−シヌクレイン単独±標準誤差について測定された値に対応している。
【図１０】図１０は、表３に列挙されたペプチドの化学構造を示す。
【図１１】図１１と図１２は、阻害剤ＺＰ−００８９からＺＰ−００９４（表３及び図６）の存在下における、ＡＳＹＮについてのエンドポイントチオフラビンＴ測定を示す。各グラフは標準偏差を伴った３回の測定の平均を示し、ＡＳＹＮ単独の測定のパーセントとして表した。図１１は、１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ３３５０と共に、３７℃でｐＨ７．４のＴｒｉｓ−Ｃｌ中で行われた凝集アッセイの結果を示す。ＺＰ−００８９とＺＰ−００９０は、ＡＳＹＮと比較して顕著に低下したＴｈＴシグナルを示す。
【図１２】図１１と図１２は、阻害剤ＺＰ−００８９からＺＰ−００９４（表３及び図６）の存在下における、ＡＳＹＮについてのエンドポイントチオフラビンＴ測定を示す。各グラフは標準偏差を伴った３回の測定の平均を示し、ＡＳＹＮ単独の測定のパーセントとして表した。図１２は、１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ３３５０と共に、３７℃でｐＨ７．４のＴｒｉｓ−Ｃｌ中で行われた凝集アッセイの結果を示す。ＺＰ−００８９とＺＰ−００９０は、ＡＳＹＮと比較して顕著に低下したＴｈＴシグナルを示す。
【図１３】図１３は、ＺＰ−００８９とＺＰ−００９０（Ｌ-ドーパ-Ａ７及びＬ-ドーパ-Ｂ８）の存在下における、ＰＢＳ緩衝液でのα−シヌクレイン単独の凝集の動力学を示す。ａｓｙｎ：阻害剤のモル比は１：２である。両者について、エンドポイントＴｈＴの蛍光の減少と共に遅延時間の増加として、ＡＳＹＮの凝集阻害が観察された。
【図１４】図１４は、ＺＰ−０１５５の化学構造を示す。
【図１５】図１５は、ＺＰ−０１５４とＺＰ−０１５５によるＡＳＹＮ凝集の阻害を示す。
【図１６】図１６は、α−シヌクレイン中の配列の、アルファヘリックスのコンフォメーションとなる高い傾向を有する領域を示す。値はアガディール（Ａｇａｄｉｒ）を用いて、ｐＨ７．４と２５℃において計算された。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６８】
実験
実験材料及び方法
１０倍のＰＢＳをｐＨ７．４でＧｉｂｃｏから供給を受け、チオフラビンＴ、トリス緩衝液、及びＰＥＧ３３５０はＳｉｇｍａから供給を受けた。
【００６９】
ペプチド合成
全てのペプチドライブラリーを、Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（バーミンガム、英国）により、彼らのエピスキャン（Ｅｐｉｓｃａｎ）アレイ法を用いて合成した。ライブラリー中の９６個のペプチドを２マイクロモルのスケールで合成し、９６ウェルプレートの中に凍結乾燥した型で供給を受けた。ライブラリー中の各サンプルを、２ｍｌの５０％アセトニトリル中に溶解し、各ペプチドの０．１ｍｌを２０個のプレートの中にほぼ等分して凍結乾燥した。各プレートは各ペプチドを１００ｎｍｏｌ含んでいた。これらのペプチドの純度は未知であった。プレートを密封し、必要となるまで−８０℃で貯蔵した（ＺＰ−０００１からＺＰ−００８７の配列の詳細については、表１を参照されたい）。
【００７０】
「ジラルト（Ｇｉｒａｌｔ）シリーズ」と称される一群のペプチドを標準的なＦｍｏｃ合成により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＺＰ−００８９からＺＰ−００９４の配列の詳細については、表３を参照されたい。
【００７１】
ＡＳＹＮの凝集阻害につき陽性であると判ったバルセロナライブラリーからの阻害剤の幾つかは、Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより５μｍｏｌの規模で合成され、逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。ＭＡＬＤＩマススペクトル法を用いてそれらの同一性を確認し、それらの純度は８０％より高かった。
【００７２】
エンドポイントチオフラビンＴアッセイ
チオフラビンＴは蛋白質の凝集状態について報告するために広範囲に使用されており、アミロイド線維と迅速に会合して４８２ｎｍにおける蛍光強度の増加を引き起こす（Le Vine, H. (1993) Protein Sci. 2, 404-410）。そこでそれは、所定のペプチドがアミロイドに変化する量を定量するために使用することができる。２．５ｍＭのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の貯蔵液をその中でアッセイの凝集が行なわれるのと同じ緩衝液中で調製し、ミリポアの０．２２μＭのＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルターを通じて濾過した。この貯蔵液を更に希釈して凝集したサンプルへ添加し、ＴｈＴの最終濃度を６２．５μＭとした。４４０／３０ｎｍでの励起と４８５／２０ｎｍでの放射のためのカットオフフィルターを有するＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴリーダーの中で、蛍光を測定した。
【００７３】
動力学的チオフラビンＴアッセイ
動力学的ＴｈＴアッセイを、ゼロ時間においてＴｈＴをサンプルへ直接に添加することによって行った。２．５ｍＭのＴｈＴの貯蔵溶液を、凝集実験の中で使用される緩衝液中で作り、０．２２μＭのＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルターを通じて濾過し、９６ウェルのポリプロピレンプレート中で５μｌを最終サンプル容量の２００μｌへ添加することにより、６２．５μＭに希釈した。アミロイド形成の結果としての、時間による蛍光の増加を、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダーの中で、３７℃で振盪しながら測定した。４４０／３０ｎｍでの励起と４８５／２０ｎｍでの放射のために、カットオフフィルターを使用した。各読み取りの前に５００秒間振盪しながら、１０分毎に読み取りを行なった。
【００７４】
化合物ＺＰ−００８９からＰ−００９４について、２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌの中、３７℃で動力学的ＴｈＴ実験を行ない、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４中でのＺＰ−００８９からＰ−００９４の阻害特性を試験した。９６ウェルプレート上の各２００μｌのサンプルは、５０μＭのＡＳＹＮ、１００μＭの阻害剤と１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧを、緩衝液のみとＡＳＹＮのみのコントロールと共に含んでいた。サンプルを３連で測定した。ＴｈＴ蛍光を経時的に４８時間モニターした。
【００７５】
ＰＢＳ中でのＡＳＹＮ凝集の阻害
ＧｉｂｃｏからｐＨ７．４で供給された１０倍の貯蔵液から、１倍のＰＢＳを作った。アジ化ナトリウムを添加して０．０１％とし、サンプル中の細菌の増殖を防止した。凍結乾燥したＡＳＹＮをＰＢＳ中で１００μＭとし、０．２２μＭのＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルターを通じて濾過した。各阻害剤を１００ｎｍｏｌ含んでいるプレートを冷凍庫から取り、室温に戻した。各阻害剤を溶解し、５００μｌのＰＢＳ中での最終濃度を２００μＭとした。１００μｌのＡＳＹＮを、９６ウェルのポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェル中の１００μｌの阻害剤へ添加し、ＡＳＹＮ：阻害剤の理論上のモル比を１：２とした。プレートをシールで覆い、振盪台の上で１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で最大２０日間インキュベートした。
【００７６】
サンプルの凝集の程度を経時的にモニターするために、各サンプルの１０μｌの等分をゼロ時間及び１日後から２日後毎に採取し、−８０℃で凍結して実験の最後にアッセイをした。実験のエンドポイントにおいて、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の結合を測定することにより、各サンプルについて凝集の程度を定量した（上を参照されたい）。各サンプルにつき、ＴｈＴ中で希釈されたＡＳＹＮの最終濃度は３．４５μＭであった。各アッセイについて、遅延時間（蛋白質の凝集が始まるまでにかかる時間）、線維会合の速度、及び最終のＴｈＴ蛍光を、変化の量と関連しているとして注目し、阻害剤の非存在下でのＡＳＹＮと比較した。
【００７７】
異なった日に同様にして２つの実験を行った。図３から６は、実験１と２の結果を示す。エンドポイントＴｈＴの読み取りを、ＡＳＹＮに生じた全凝集の指標として使用し、阻害剤を含んでいる反応液についてのエンドポイントを、ＡＳＹＮ単独の凝集のパーセントとして表した。結果を、ＡＳＹＮ凝集の阻害剤として過去に述べられた２つのコントロールペプチドと比較した（ＡＳＩ１とＡＳＩ３）（El-Agnaf, O. M. et al. Faseb J 18, 1315-7 (2004)）。
【００７８】
上記で述べたように、化合物ＺＰ−００８９からＺＰ−００９４について動力学的な実験を行ない、ｐＨ７．４のＰＢＳの中で阻害特性を試験した。サンプルを３連でアッセイし、２００μＭのＡＳＹＮを５０μｌ、４００μＭの阻害剤を５０μｌ含む各サンプルを、ウェル中の１００μｌのＰＢＳへ添加し、混合し、５０μＭのＡＳＹＮと１００μＭの阻害剤を含む２００μｌのサンプル量を得た。コントロールのウェルは緩衝液のみ、又はＡＳＹＮのみ、の何れかを含んでいた。図１２は、２５８時間後のエンドポイントＴｈＴの蛍光を、ＡＳＹＮ単独の蛍光のパーセントとして表したものを示す。
【００７９】
クライディング剤の中でのＡＳＹＮ凝集の阻害（ＰＥＧ３３５０）
上記で述べたような動力学的なＴｈＴアッセイを用いて、１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ３３５０の存在下で４つの実験を更に実施したところ、それは反応を加速し、２日という時間でアッセイが可能となった。全てのアッセイを、５０μＭのＡＳＹＮを用いて、ＡＳＹＮ：阻害剤のモル比を１：２とし、３７℃で実施した。３つのアッセイをｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）の中で、１つのアッセイを２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）の中で、３７℃で実施した。
【００８０】
結果
ＰＢＳとＰＥＧ３５００の２つの実験と多くの阻害剤の間で、凝集の程度が２０％より大きく減少しているという再現性を有する傾向が示された（図３から６を参照されたい）。
【００８１】
図７から９は、実験１の中でエンドポイントＴｈＴの蛍光が最も減少した候補者の概要を示す。
【００８２】
スクリーニングの第１ラウンドで選択されたペプチドを、それらの阻害特性を改良するように修飾し、ペプチドを脳内のドパミン作動性ニューロンへ標的化するための部分（ｍｏｉｅｔｙ）を付加した。設計の２つに修飾が行なわれ、標準的な技術を用いて合成した（表３を参照されたい）。ＺＰ−００８９とＺＰ−００９０はＡ７（ＺＰ−０００７）とＡ８（ＺＰ−００２０）の修飾体であり、ペプチドのＮ末端にＬ−ＤＯＰＡを有している。ＺＰ−００９３は、Ａ７のＮ末端にピログルタミン酸を有している。図１０は、ＺＰ−００８９からＺＰ−００９４の化学構造を示す。
【００８３】
阻害剤ＺＰ−００９１、ＺＰ−００９２及びＺＰ−００９４について、ＴｈＴの蛍光を４８時間経時的にモニターし、その結果を図１１と１２に示す。Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４の中でのエンドポイントＴｈＴの読み取りの減少は、平均で１８±２％であった。ＺＰ−００９３については、如何なる想定をするにもこの時には誤差が大きすぎ、その実験は繰り返されるであろう。ＰＢＳ中の阻害剤ＺＰ−００９１からＺＰ−００９４について差の顕著さは小さく、平均で６±２％であった。しかしながらＺＰ−００８９とＺＰ−００９０については、ペプチドの阻害効果は両者の緩衝液条件において目覚しいものであった。ＡＳＹＮ単独と比較して、ＺＰ−００８９の阻害は６０％より大きく、そしてＺＰ−００９０の阻害は３０％より大きかった。図１３は、反応全体での経時的なＴｈＴ蛍光の変化を示す。ＺＰ−００８９とＺＰ−００９０について、アミロイド形成の速度が減少し、ＺＰ−００８９については遅延相の大きな増加が見られる。これは反応の開始から、線維の形成が始まる時までの時間である。これは、阻害剤がＡＳＹＮの核形成を生じ、線維形成の最初の工程が起こるのを阻害していることの示唆を提供する。
【００８４】
血液脳関門の浸透性のための修飾を有するペプチド
５０ｍＭのトリスと１５０ｍＭのＮａＣｌと２０μＭのチオフラビンＴを有する５０μＭのＡＳＹＮと１００μＭの阻害剤を用いて、凝集アッセイを実施した。反応容量は２００μＬであった。ＡＳＹＮのみと緩衝液のみのコントロールと共に、９６ウェルのポリプロピレンプレート中に各反応液を構成した。反応液を振盪しながら３７℃で４８時間インキュベートし、上記のようにチオフラビンＴの蛍光を読み取ることにより凝集をモニターした。
【００８５】
Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）は血液脳関門（ＢＢＢ）の輸送部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、ＢＢＢを通じた輸送を促進することが示されている。３及び４−Ｎメチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）部分（ｍｏｉｅｔｙ）を阻害剤ＺＰ−００６５（Ac-kvfgtaa-NH2）と、標準的な合成化学を用いて連結し、阻害剤ＺＰ−０１５４（H-ffff-kvfgtaa-NH2）とＺＰ−０１５５（H-fff-kvfgtaa-NH2）を得た。ここでｆはＮＭｅＰｈｅ部分（ｍｏｉｅｔｙ）である。ＺＰ−０１５５の化学構造を下記の図１３の中に示す。
【００８６】
ＺＰ−０１５４とＺＰ−０１５５の凝集阻害特性を、上記で述べたようなＴＢＳ中での動力学的ＴｈＴアッセイで試験した。この結果を図１４に示す。
【００８７】
ＡＳＹＮ単独との比較において、ペプチドＺＰ−０１５４とＺＰ−０１５５のいずれでも、アッセイの時間枠（４８時間）の中でＴｈＴシグナルの顕著な増加は観察されなかった。これは、ＺＰ−０１５４とＺＰ−０１５５の両者がＡＳＹＮの凝集の有効な阻害剤であるのみならず、ＢＢＢを通過するのに有効である潜在性を有していることを示している。
【００８８】
インタラクトマーペプチド
６１−６６（EQVTN）と７１−７６（VTGVT）の領域と相互作用するように、一連のペプチドを設計した。６１−６５の領域につき、Ac-qysvli-NH2（ＺＰ−０１９５）のペプチドを、相互作用して凝集を防ぐように設計した。この配列の変異体についても試験し、任意の所定の位置で１個又はそれより多くのアミノ酸を他のものと置換し、そして、追加のアミノ酸の付加やアセチル化などのＮ末端におけるバリエーションを作った（ＺＰ−０１９５からＺＰ−０２３０）。７１−７５の領域については、Ac-hhviva-NH2（ＺＰ−０１５８）のペプチドを、相互作用して凝集を防ぐように設計した。この配列のバリエーションについても試験し、任意の所定の位置で１個又はそれより多くのアミノ酸を他のものと置換した。試験した全てのペプチドはＮ−末端がアセチル化されており、配列の始めにある２個のヒスチジンは、全ての設計で変わらずに維持されていた（ＺＰ−０１５８からＺＰ−０１９４）。
【００８９】
全てのペプチドについて、上記で述べたようにＴＢＳ中でＡＳＹＮの凝集阻害について試験し、Ｚｙｅｎｔｉａｆｉｔソフトウェアを用いて動力学的トレースを適合させた。そのソフトウェアは、データをシグモイド関数（f(x)=k+A/(1+exp(-b(t-t0)))）に適合させ、そこから遅延時間、凝集速度、及びＴｈＴ蛍光における全変化を計算することができる。
【００９０】
ペプチドをそれらの有効性に従ってランク付けし、更なる研究のために選択されたこれらの配列を表４に示す。その選択はペプチドが、遅延時間の２０％より大きな増加、及び／又は、ＴｈＴの蛍光又は凝集速度における２０％より大きな減少を有することに基づいていた。
【００９１】
構造安定化ペプチド
天然の状態における２次構造を安定化させることによるα−シヌクレインの凝集を、減少させるか又は防ぐように、ペプチドを設計した。ヘリックスを形成するより高い傾向を有する配列の領域を、図１６の中に示すようにＡｇａｄｉｒを用いて同定し（EMBL 1997-2002, Lacroix E., Munoz V., Petukhov M. & Serrano, L）、配列の同定された領域と相互作用してその領域中の２次構造を安定化させるようにペプチドを設計した。ペプチドは３個から７個の残基の長さであり、極性と非極性の残基の混合物を含み、特定のヘリックスの表面に沿って相互作用するように設計されていた。
【００９２】
凝集を測定するための動力学的チオフラビンＴアッセイを、ＴＢＳ中の５０μＭのα−シヌクレインと共に、１：２のモル比（α−シヌクレイン：阻害剤）で構築した。反応液を振盪しながら３７℃で４８時間インキュベートし、チオフラビンＴの蛍光を１０分毎に測定した。Ｚｙｅｎｔｉａｆｉｔソフトウェアを用いて動力学的トレースを適合させた。そのソフトウェアは、データをシグモイド関数（f(x)=k+A/(1+exp(-b(t-t0)))）に適合させ、それから遅延時間、凝集速度、及びＴｈＴ蛍光における全変化を計算することができる。
【００９３】
表５は、種々の長さの我々が設計した様々な配列についての結果を示す。遅延相、凝集の速度、及びエンドポイントチオフラビンＴの蛍光における差の％を、α−シヌクレイン単独に対して計算した。これらのデータは、阻害剤との相互作用すると、１０％を上回る遅延相の増加が可能であることを示す。これは、α−シヌクレイン中の２次構造を安定化させることにより、核形成及び凝集へと至る事象がインビトロで遅延することを示す。このシリーズにおける最高の阻害剤であるＺＰ−０２４０について、エンドポイントチオフラビンＴの蛍光の顕著な減少も観察された。
【００９４】
【表１−１】
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【００９５】
【表１−２】
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【００９６】
【表１−３】
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【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【００９９】
【表４】
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【０１００】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月27日(2009.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−シヌクレインの８６−９６の残基の間の領域の中の連続したアミノ酸配列の逆配列を有する、４個から１０個のＤ−アミノ酸からなるペプチド。
【請求項２】
kvfgtaa、taaaisg及びfgtaaaiからなる群から選択されたＤ−アミノ酸の配列からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載のペプチドのＤ−アミノ酸配列に、１個から３個のＤ−アミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を伴う配列からなるペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドの１個又はそれより多くのＤ−アミノ酸残基がプロリンで置き換えられている、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
１個又はそれより多くのカップリングパートナーと連結している、請求項１から請求項４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項６】
カップリングパートナーが保護基又はドパミン作動性のニューロン標的化部分である、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
保護基がアセチル基、アミド基又は炭素数３から２０のアルキル基である、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
ドパミン作動性のニューロン標的化部分が、ドパミン類似体又はＤＯＰＡアゴニストである、請求項６記載のペプチド。
【請求項９】
ドパミン作動性のニューロン標的化部分が、Ｌ−ＤＯＰＡ又はピログルタミン酸である、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
カップリングパートナーが血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分である、請求項５記載のペプチド。
【請求項１１】
血液脳関門（ＢＢＢ）輸送部分が、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）である、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
１個から５個のＮ−メチルフェニルアラニン（ＮＭｅＰｈｅ）部分を含んでいる、請求項１１記載のペプチド。
【請求項１３】
α−シヌクレイノパチーの治療において使用するための、請求項１から請求項１２のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項１４】
１個若しくはそれより多くの請求項１から請求項１３のいずれか１項記載のペプチド、並びに医薬として許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
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