(57)【要約】  高収率で非変性の二重ウイルス不活性化静注ヒト免疫ガンマグロブリン（ＩｇＧ）産物を産生する、効果的な大規模アルコール不含血漿分画生成プロセス。本プロセスは、２つの最初の分画段階で、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む塩の群からの１以上の塩を使用し、続いて、使用した塩を除去するために透析ろ過を行う。開示する本発明の方法のプロセスを介したアルコールを用いるプロセスも開示する。
2009507015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）処理するための血液ベースの材料の予め定められた量を得て；
（ｂ）処理するための血液ベースの材料の前記の量を調製する、
段階を含み；次の段階（ｃ）から（ｊ）：
（ｃ）複数の有機塩を含む化合物の群、アルコールベースの化合物を含む群及び複数の無機塩を含む群から選択される少なくとも１つの第一の化合物を選択し；
（ｄ）第一の分離可能な産物及び第一の残留産物を形成させるために、血液ベースの材料の前記量を用いて溶液中に第一の予め定められた重量濃度を生成させるため、前記選択された少なくとも１つの第一の化合物の第一の予め定められた量を添加することによって、第一の分画段階を行うことも特徴とし、前記第一の分離可能な産物が実質的にエーグロブリン不含であることを特徴とし；
（ｅ）第一の分画段階を完了するために、前記第一の残留産物から前記第一の分離可能な産物を分離し；
（ｆ）複数の有機塩を含む化合物の群、アルコールベースの群及び、複数の無機塩を含む群から選択される第二の少なくとも１つの化合物を選択し；
（ｇ）第二の分離可能な産物及び第二の残留産物を形成させるために、前記第一の分離可能な産物を用いて溶液中に第二の予め定められた重量濃度を得るため、第一の分離可能な産物へ前記第二の選択された少なくとも１つの化合物の第二の予め定められた量を添加することにより、第二の分画段階を行い；
（ｈ）第二の分画段階を完了するために、前記第二の残留産物から前記第二の分離可能な産物を分離し；
（ｉ）透析ろ過のために前記第二の分離可能な産物を調製し；
（ｊ）実質的に少なくとも１つの第一の選択された化合物及び少なくとも１つの第二の選択された化合物不含である、より小さい体積の第三の産物を形成させるために、前記第二の分離可能な産物を透析ろ過すること、
を特徴とする、有用な非変性静注免疫グロブリン（ＩｇＧ）製品を産生するための、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２】
段階（ａ）が、血液ベースの材料として血漿の量を選択することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３】
段階（ａ）が、血液ベースの材料として血液分画産物の量を選択することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項４】
段階（ｂ）が、血液ベースの材料の前記量を凍結融解することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５】
段階（ｃ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びグルコン酸ナトリウムを含む有機塩の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項６】
段階（ｃ）が、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む無機塩の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項７】
段階（ｃ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムの塩を含む群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項８】
段階（ｄ）が、１２％の、少なくとも１つの化合物の重量濃度を生成させるために、選択された少なくとも１つの化合物の量を添加することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項９】
段階（ｄ）が、１１％から１３％の範囲内の、少なくとも１つの化合物の重量濃度を生成させるために、選択された少なくとも１つの化合物の量を添加することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１０】
段階（ｃ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む塩の群から複数の化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１１】
段階（ｄ）が、１２％の、複数の化合物の総重量による合わせた濃度を生成させるために、各選択された複数の化合物の量を添加することを特徴とする、請求項１０に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１２】
段階（ｄ）が、１１％から１３％の範囲内の、複数の化合物の総重量による合わせた濃度を生成させるために、各選択された複数の化合物の量を添加することを特徴とする、請求項７に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１３】
段階（ｄ）が、第一の上清液として、第一のペースト残留産物としての前記第一の残留産物と組み合わせて、第一の予め定められた少なくとも１つの化合物濃度を有する前記第一の分離可能な産物を形成させることを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１４】
段階（ｄ）が、第一の上清液として、第一のペースト残留産物としての前記第一の残留産物と組み合わせて、１２％の少なくとも１つの化合物濃度を有する前記第一の分離可能な産物を形成させることを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１５】
段階（ｄ）が、第一の上清液として、第一のペースト残留産物としての前記第一の残留産物と組み合わせて、１１％から１３％の第二の範囲内の、少なくとも１つの化合物濃度を有する前記第一の分離可能な産物を形成させることを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１６】
第ＶＩＩＩ、ＩＸ及びフォンビレブランド因子及びフィブリノーゲンを含む血液因子を含有する産物の群へと前記第一の残留産物を分画するさらなる段階を特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１７】
段階（ｅ）が、遠心することにより前記第一の残留産物から前記第一の分離可能な産物を分離することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１８】
段階（ｅ）が、前記第一の分離可能な産物を第一の上清液として取ることを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項１９】
段階（ｆ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びグルコン酸ナトリウムを含む有機塩の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２０】
段階（ｆ）が、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む無機塩の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２１】
段階（ｆ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む塩の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２２】
段階（ｇ）が、２２％の、少なくとも１つの化合物の総重量による濃度を生成させるために、選択された少なくとも１つの化合物の量を添加することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２３】
段階（ｇ）が、２１から２３％内の、少なくとも１つの化合物の総重量による濃度を生成させるために、選択された少なくとも１つの化合物の量を添加することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２４】
段階（ｆ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む塩の群から複数の化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２５】
段階（ｇ）が、２２％の、複数の化合物の総重量による合わせた濃度を生成させるために、各選択された複数の化合物の量を添加することを特徴とする、請求項２４に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２６】
段階（ｇ）が、２１％から２３％の範囲内の、複数の化合物の総重量による合わせた濃度を生成させるために、各選択された複数の化合物の量を添加することを特徴とする、請求項２５に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２７】
段階（ｇ）が、第二の予め定められた少なくとも１つの化合物の重量濃度を有する前記第二の上清残留産物と組み合わせて、第二の沈殿物として前記第二の分離可能な産物を形成させることを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２８】
段階（ｇ）後の、アルブミン及びα−１−アンチトリプシンを含む産物の群へと前記第二の残留産物を分画するさらなる段階を特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項２９】
段階（ｈ）が、遠心することにより前記第二の残留産物から前記第二の分離可能な産物を分離することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３０】
段階（ｈ）が、ろ過することにより前記第二の残留産物から前記第二の分離可能な産物を分離することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３１】
段階（ｈ）が、結果として生じる測定可能な重量を有するペーストとして、前記第二の分離可能な産物を分離することを含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３２】
段階（ｉ）が、前記結果として生じる重量の４倍の水の体積と前記分離可能なペースト産物の前記結果として生じる体積を合わせることにより、分離可能なペーストの希釈液を形成させることを含む、請求項３１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３３】
段階（ｈ）が、実質的に少なくとも１つの化合物不含の第三の産物を提供するために、添加された少なくとも１つの化合物から第三の産物の一部を分離する目的のためにろ過膜に希釈液を通すことを特徴とする、請求項３２に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３４】
段階（ｊ）が、実質的に少なくとも１つの化合物不含の第三の産物を提供するために、添加された少なくとも１つの化合物から第三の産物の一部を分離する目的のために３０ＫＤ透析ろ過膜に希釈液を通すことを特徴とする、請求項３３に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３５】
段階（ｊ）が、透析ろ過前に、第一の予め定められた伝導度について第三の産物の伝導度を試験すること及び、実質的に少なくとも１つの化合物不含の第三の産物を第二の予め定められた伝導度について試験することを含む、請求項３３に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３６】
段階（ｊ）が、実質的に少なくとも１つの化合物不含の第三の産物の伝導度が５００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）±４００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）の範囲であることを確認するために伝導度を試験することを含む、請求項３５に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項３７】
次のさらなる段階を特徴とする、請求項３６に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｋ）ＩｇＧウイルス不活性化溶液を生成させるために、実質的に少なくとも１つの化合物不含の第三の産物中に含有されるウイルスを不活性化する目的で、溶媒界面活性剤及び増強溶媒界面活性剤（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含む界面活性剤の群から選択される界面活性剤の予め定められた濃度の予め定められた体積を添加すること。
【請求項３８】
次のさらなる段階を含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：ＩｇＧ不活性化溶液を２から８℃の範囲まで冷却すること。
【請求項３９】
次のさらなる段階を含む、請求項３８に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｌ）樹脂結合ＩｇＧ及び流出液を生成させるためにＩｇＧウイルス不活性化溶液においてカラムクロマトグラフィーを行うことと；
（ｍ）樹脂結合ＩｇＧを流出液から分離することと；
（ｎ）ウイルス不活性化化学物質不含のＩｇＧに富む溶液を生成させるために、塩化ナトリウムの予め定められた濃度で、カラム樹脂結合ＩｇＧを洗浄すること。
【請求項４０】
段階（ｌ）が、精製ＩｇＧ溶液を生成させるために、ウイルス不活性化化学物質不含のＩｇＧに富む溶液を精製する目的で弱陽イオン交換樹脂を使用することを含む、請求項３９に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項４１】
段階（ｌ）が、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５０Ｃ樹脂を使用することを含む、請求項３９に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項４２】
段階（ｌ）が、ウイルス不活性化化学物質不含のＩｇＧ濃縮溶液が１００から９００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）の範囲の伝導度を有することを確認するために、ウイルス不活性化化学物質不含のＩｇＧに富む溶液の伝導度を試験することを含む、請求項３９に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項４３】
次のさらなる段階を含む、請求項３９に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｏ）精製ＩｇＧ溶液を限外ろ過することにより、ＩｇＧ溶液の予め定められた濃度まで精製ＩｇＧ溶液を濃縮すること。
【請求項４４】
段階（ｏ）が、精製ＩｇＧ溶液を限外ろ過することにより、ＩｇＧ溶液の１２％濃度まで精製ＩｇＧ溶液を濃縮することを含む、請求項４２に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項４５】
次のさらなる段階を特徴とする、請求項３９に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｐ）安定化ＩｇＧ濃縮溶液を生成させるために、マルトース及びソルビトールを含む化学物質の群から選択される安定化化学物質を添加することにより、ＩｇＧ溶液の予め定められた濃度を安定化させること。
【請求項４６】
次のさらなる段階を含む、請求項３７に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｑ）ナノフィルトレーションされた安定化ＩｇＧ濃縮溶液を生成させるために、安定化ＩｇＧ濃縮溶液をナノフィルトレーションすること。
【請求項４７】
次のさらなる段階を含む、請求項３７に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｒ）注射用滅菌水を使用し、バルク精製ＩｇＧの予め定められた濃度に安定化ＩｇＧ濃縮溶液を希釈すること。
【請求項４８】
次のさらなる段階を含む、請求項４５に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｓ）注射用滅菌水を使用し、１０％バルク精製ＩｇＧの濃度に安定化ＩｇＧ濃縮溶液を希釈すること。
【請求項４９】
次のさらなる段階を含む、請求項４８に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｔ）バルク精製ＩｇＧ濃縮溶液を滅菌する目的でろ過すること。
【請求項５０】
次のさらなる段階を含む、請求項４９に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｕ）滅菌済みバルク精製濃縮ＩｇＧ溶液を販売のために滅菌バイアルに分配すること。
【請求項５１】
次のさらなる段階を含む、請求項５０に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法：
（ｖ）安全及び効力について滅菌バイアルの中身の試料を試験し、バイアルが予め定められた試験基準に合格した場合、販売チャネルに向けてバイアルを発売すること。
【請求項５２】
段階（ｉ）の後のさらなる段階が、アルブミン及びα−１−アンチトリプシンを分離するために、前記第二の残留産物を処理する、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５３】
血液ベースの材料の前記量の前記調製が、血漿を凍結し、次いで、懸濁液中で沈殿を形成させるために０から４℃で制御凍結融解し、血液ベースの材料の結果として得られた量を与えるために沈殿物を分離することにより、寒冷沈降物を得るさらなる段階を含む、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５４】
段階（ｃ）が、エタノールを含むアルコール化合物の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５５】
段階（ｃ）が、（ｉ）クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムの塩及び（ｉｉ）エタノールを含む群からのアルコールベース化合物から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５６】
段階（ｃ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムの塩及びアルコールベースの化合物を含む群から複数の化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５７】
段階（ｆ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムの塩及びアルコールベースの化合物を含む化合物の群から少なくとも１つの化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【請求項５８】
段階（ｆ）が、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムの塩及びアルコールベースの化合物を含む化合物の群から複数の化合物を選択することを特徴とする、請求項１に記載の、血液ベースの材料の分画のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全般的に、免疫血清グロブリン精製の方法、より具体的には、アルコールを用いずに血漿又はその他の血液ベースの材料から免疫グロブリンを分離するための方法に関する。興味深いことに、本発明の方法はまた、アルコールを用いても使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
一般に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を血漿又はその他の血液ベースの材料から分離するための現在の方法は、Ｅｄｗｉｎ  Ｊ．Ｃｏｈｎによる初期の研究による。米国特許第５，１７７，１９４号（Ｍａｒｉａ  Ｅ．Ｓａｒｎｏら（ＳＡＲＮＯ）に対して１９９３年１月５日発行）で見出されるように、「広く使用されているあるスキームは、周知のＣｏｈｎ分画法であり、これは、冷エタノールを用いた分別沈殿に基づくものである。」。Ｃｏｈｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８，４５９（１９４６）。
【０００３】
米国特許第２，３９０，０７４号（Ｅｄｗｉｎ  Ｊ．Ｃｏｈｎ（Ｃｏｈｎ）に対して１９４５年１２月４日発行）は、このような分画プロセスにおける、沈殿剤としての、アルコール、アセトン、ジオキサンの使用を開示した。引き続き、沈殿剤としてアルコールに依存しており、これは、米国特許第６，８９３，６３９  Ｂ２号（Ｊｏｓｈｕａ  Ｌｅｖｙら（Ｌｅｖｙ）に対して２００５年５月１７日発行）でさらに述べられており、ここで、「血漿からの免疫グロブリン精製の従来の工業的方法は、０℃以下の温度にて、あるアルコール濃度で、等電点に基づきタンパク質の群を共沈殿させる、冷エタノール分画に基づく。」と述べられている。
【０００４】
Ｃｏｈｎらの研究は、凍結乾燥血漿の代わりとなるものとして、第二次世界大戦中に血漿増量剤としての使用のための安定した溶液が軍隊で必要とされたことにより刺激を受けた。結果として、Ｃｏｈｎ法は、血漿増量剤に必要な浸透圧を与えるアルブミン分画を分離するための方法を最適化することに焦点を当てたものであった。
【０００５】
とは言え、Ｃｏｈｎにより次のように説明されるように、アルコール沈殿剤の使用には困難な点がある：「アルコールなどのいくつかのタンパク質沈殿剤は、それらと接触する多くのタンパク質を変性させる傾向があり、変性のリスクはアルコール濃度に伴い上昇し、温度を上昇させる。多くのタンパク質に対して、タンパク質の変性を避けるために、血漿又はその他のタンパク質溶液と沈殿剤の混合において細心の注意を払う必要があることが分かっている。」。このため、ＩｇＧ精製を含む、血漿及びその他の血液ベースの材料の分画のためのアルコール不含の方法を提供することが賢明であると考えられる。
【０００６】
タンパク質の変性に対して、エタノールと水との組み合わせに対してさらに考慮すべき事柄があり得る。例えば、水５００ｍＬにエタノール（１００％）５００ｍＬを添加する場合、５０％エタノール１０００ｍＬを得られない。それどころか、最終体積はおよそ９５６ｍＬとなる。体積の減少はエタノールと水分子との間の強力な結合によると推測される。このような結合は、タンパク質立体配置の変化の原因となり得、結果として、ある永久的なタンパク質分子の変性が起こり得、これはエタノールが除去され水が戻された後もなお残る。
【０００７】
１９７０年代に、クロマトグラフィーが血漿タンパク質の分離及び精製において有用であることが分かった。クロマトグラフィーは、分子サイズ（ゲルろ過）、電荷（イオン交換クロマトグラフィー）及び特定の分子との既知の相互作用（アフィニティークロマトグラフィー）を含む、ユニークなそれぞれの性質を特異的に標的にすることによって血漿タンパク質を分離する。
【０００８】
Ｃｏｈｎ又はＣｏｈｎ法の変法により、血漿由来の、第ＶＩＩＩ因子など、低重量の高値タンパク質の単離のために、及び、血漿からの分離後のガンマグロブリンの最終精製のために、工業スケールでの様々なクロマトグラフィー法が採用されてきた。しかし、工業スケールでの、アルブミン及びガンマグロブリンなどの、高重量、低値分画のクロマトグラフィー分離は実際的でないことが分かっている。
【０００９】
それぞれ、２００３年１月３０日及び２００３年７月１０日に出願された、２つの米国特許出願（Ｅｄｗａｒｄ  Ｓｈａｎｂｒｏｍにより出願、出願番号２００３００２２１４９（Ｓｈａｎｂｒｏｍの１４９）及び２００３０１２９１６７（Ｓｈａｎｂｒｏｍの１６７）は、血漿からの寒冷沈降物の形成を促進するための試薬としてカルボン酸塩（例えばクエン酸三ナトリウム）の使用を教示する。Ｓｈａｎｂｒｏｍの方法は、全般的に、寒冷沈降物からの血液凝固因子の生成を促進するための試薬としてクエン酸三ナトリウム及びその他のクエン酸塩を含む。
【００１０】
Ｓｈａｎｂｒｏｍの’１４９は、段落０００９において、「本発明の目的は、寒冷沈降物の高収率を提供することである。」と教示する。Ｓｈａｎｂｒｏｍはまた、段落００１１において、寒冷沈降物からの血液凝固因子の生成を促進するためにカルボン酸が効果的な試薬であることを教示する。Ｓｈａｎｂｒｏｍの１４９は、血漿へのクエン酸の添加、特に２から１０重量％の濃度での添加により、不安定なタンパク質を感知できるほどには変性させないと述べている。さらに、Ｓｈａｎｂｒｏｍの１４９において、クエン酸が、熱処理による微生物の殺菌を可能にするか又は促進することが述べられている。
【００１１】
Ｓｈａｎｂｒｏｍの’１６７は、段落００１５において、「クエン酸の添加により寒冷沈降物の量が増えるだけでなく、寒冷沈降物を回収するために血漿を凍結する必要が減少することによりプロセスが単純化される。」と述べている。Ｓｈａｎｂｒｏｍは、２から１０％の濃度のクエン酸三ナトリウムの使用によって寒冷沈降物から産物を分画する目的で寒冷沈降物の生成を使用することを明確に教示する。
【００１２】
Ｓｈａｎｂｒｏｍの’１４９及び’１６７は、クエン酸化合物、特にクエン酸三ナトリウムの使用により形成される寒冷沈降物からの不安定な凝固産物の抽出及びクエン酸化合物を用いた寒冷沈降物中の微生物の殺菌を直接行うが、一方で、本発明は、塩化合物の使用により形成される上清からの不安定でない産物（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン及びα−１アンチトリプシン）の抽出を直接行う。Ｓｈａｎｂｒｏｍは、上清を使用することを何ら教示していないし、取り組んでいない。
【００１３】
１９５０年代に、様々な因子を含有する血液ベースの材料由来の「寒冷沈降物」が、血友病などの凝固疾患を治療するのに有用であることが発見された。このような寒冷沈降物は、その名前が示すように、血漿を凍結し、次いで沈殿の懸濁液を形成させるために０から４℃で制御凍結融解することにより得られた。次に、アルブミン及びガンマグロブリンを生成させるためのＣｏｈｎによる方法を用いた分画のために、寒冷沈降プロセス由来の上清が利用可能であった。続く展開により、寒冷沈降物の分画から第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子及びその他の凝固因子の純粋な濃縮物が得られた。これらは、非アルコール性の分離及びクロマトグラフィー精製を使用することにより行われ得る。
【発明の開示】
【００１４】
概要において、本発明は、血漿からガンマグロブリンを単離し、それを静注可能な製剤に処方する、新規の効果的な方法を提供する。したがって、「超高収率静注免疫グロブリン製剤」であると定義され得る本発明は、非変性沈殿剤（クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びグルコン酸ナトリウムを含む有機塩の群から、及び硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムを含む無機塩の群から、選択的に選ばれ得る。）を用いて血漿から直接及び迅速にガンマグロブリンを分離することにより、非常に優れた品質のガンマグロブリンを高収率で回収することを達成する。これらの塩の使用の驚くべき２つの性質は、（１）分画が、効果的な重量％溶液を用いることに依存すること及び（２）これらの塩が、単独で使用される場合、及び２以上の塩の組み合わせ（この組合せは、同じ効果的な重量％を有する。）で使用される場合、このような分画において効果的であることである。
【００１５】
また、溶液中のタンパク質へのこれらの塩の添加は、以前の方法によるエタノールの添加ほど水の除去に対する反応性がないことが分かっている。これらの塩を用いた迅速な単離、得られた分画の除去とそれに続く得られた分画からの塩の除去及びタンパク質の内部の水分子の素早い回復は、現在利用されている方法を用いたエタノール分画よりも優れていることが分かった。
【００１６】
本発明の方法は、次の重要な段階を含む、有用な非変性免疫グロブリン（ＩｇＧと呼ばれることがある。）産物を生成させるために血液ベースの産物を分画するためのものである：
（ａ）添加される第一の選択された塩又は塩の組み合わせを、エーグロブリン不含の上清産物（上清は残留産物ペーストから分離可能であり、この２つに分離する。）を形成する第一の予め定められた濃度レベルにするために、分画されるべき血液ベースの材料の量に、選択された塩又は塩の組み合わせの十分な第一の量を添加することと；
（ｂ）選択された塩又は塩の組み合わせを第二の予め定められた濃度レベルにするために、分離された上清産物に同じ又は別の選択された塩もしくは選択された塩の組み合わせの第二の量を添加することにより第二の分画段階を行い、それによりペーストである第二の分離可能な産物及び、上清である第二の残留産物を形成させ、その後産物を分離することと；
（ｃ）第二の分離可能なペースト産物の希釈液を形成させることと；
（ｄ）実質的に選択塩不含であり、有用な非変性ＩｇＧの生成を完遂するために現在知られている及び実施されている手法により処理できる状態になっている、低体積の結果として生じる産物を形成させるために、第二の分離され、液化されたペースト産物を透析ろ過すること。
【００１７】
段階（ａ）において、第一の体積は、血液ベースの材料に対する、添加された濃縮塩溶液又は乾燥塩の添加を利用して、血液ベースの材料の量に混合される場合、１１から１３重量％溶液を得る。この濃度において、添加された塩により、上清及び沈殿残留産物ペーストを形成させるために、血液ベースの材料の一部が選択的に脱水される。上清が、結果として、選択された塩又は塩の組み合わせの１１から１３重量％濃度の範囲の塩濃度を有することに注意。好ましくは、この濃度は、およそ１２％であるべきである。必要に応じて、第ＶＩＩＩ、ＩＸ及びフォンビレブランド因子及びフィブリノーゲンを含む血液因子へと残留産物ペーストをさらに分画し得る。遠心するか又は化学の技術分野で周知の既存の方法により、この産物の分離を行い得る。さらなる処理のために上清を確保する。
【００１８】
段階（ｂ）において、第二の体積は、確保された上清の一部を選択的に脱水するための、確保上清へのより濃縮度の高い塩溶液の添加又は乾燥塩の十分量の添加を利用して、第二のペースト産物及び残留産物である第二の上清産物を得る。第二のペースト及び第二の上清の両方の総重量濃度は、およそ２１から２３％の範囲となるべきである。選択された塩又は塩の組み合わせの重量濃度がおよそ２２％となることが好ましい。段階（ａ）のように、必要に応じて、アルブミン、α−１−アンチトリプシン及びその他のタンパク質を含む成分の群へと、残留産物（この場合、第二の上清）をさらに処理し得る。遠心、ろ過又は化学の技術分野で周知のその他の方法により、産物を分離し得る。
【００１９】
驚くべきことに、塩を用いた沈殿は、ある種のモル反応に依存しないと思われる。むしろ、沈殿は、（ａ）及び（ｂ）の両段階において、単純な重量％関係に基づくものと思われる。次の表（表１）において、有機塩及び無機塩両方の効果的な濃度を示す。効果的な重量濃度は、列挙される各塩に対して実質的に同じ％であることに注意。
【００２０】
【表１】
2009507015.tif 000003
【００２１】
また、驚くべきことに、総重量濃度が段階（ａ）及び（ｂ）に対して引用されたように維持されるならば、何らかの組合せで上記で挙げた塩を使用し得る。
【００２２】
段階（ｃ）において、ペースト産物の重量のおよそ４倍の水でペースト産物を希釈することが好ましいが、本発明の範囲内で水のその他の体積を思慮深く選択し得る。
【００２３】
段階（ｄ）において、工業スケールにおいてさらなる処理を可能にするように、得られた産物から選択された塩及び過剰な水を分離するために、３０ＫＤろ過膜を有する透析ろ過系を使用し得る。このようなろ過は、段階（ａ）の上清からエーグロブリンを抽出することにより容易かつ可能になることに注意。本明細書中で使用される場合、エーグロブリンは、水中で不溶性であるが、食塩水中で可溶性であるグロブリンと定義される。
【００２４】
最も重要なこととして、エーグロブリンが溶液から除去されない場合、及びその溶液のイオン強度が脱イオン水と比較して低い場合（例えば、本発明の場合）、エーグロブリンは、透析ろ過系に付着し、それにより透析ろ過系が使用できなくなる。
【００２５】
クエン酸ナトリウムは血漿の回収、保存及び保管中に低濃度で長く使用されてきたことがよく知られている。沈殿剤としての、クエン酸ナトリウム及び／又はその他の塩の高濃度を使用した後の続く透析ろ過により、イオン強度及びガンマグロブリン溶液の体積が実質的に低下するが、これにより、工業スケールでのクロマトグラフィー精製を行うことができるようになる。
【００２６】
この方法により血漿からガンマグロブリンを分離した後、Ｃｏｈｎ又はその他からの利用可能な方法により、残存タンパク質からアルブミン及びα−１−アンチトリプシンが実質的に除去される。本発明による方法によって、Ｃｏｈｎの方法で使用されるエタノールの変性の影響にガンマグロブリンを曝すことなく、ガンマグロブリンを分離することができるので、ガンマグロブリンはネイティブの状態のままである。アルコールの変性の影響には、分子における、ガンマグロブリン分子の、ポリマー、凝集物及び断片の形成が含まれる。しかし、既に述べた選択塩の１つ又は組み合わせを使用することにより、凝固タンパク質の実質的に全ての沈殿が起こり、したがって、酵素活性化因子及びタンパク質分解酵素の生成を妨げながら、血漿が安定化される。
【００２７】
エタノールの変性効果の欠如、選択された塩による血漿の安定化及び選択された塩による凝固タンパク質のその後の除去の結果、抗補体活性が非常に低いガンマグロブリン製剤が得られる。
【００２８】
要約すると、本発明の方法は、１以上の予め選択された塩の高濃度を使用することと、続く透析ろ過（１９８０年代に工業スケールで実用化された技術）によってガンマグロブリン濃縮物からこれらの塩を除去することを組み合わせたものである。次に、既知のクロマトグラフィー精製技術の使用によって、得られたガンマグロブリンの最終精製を実際的かつ効果的に行う。本発明により、収率が高くなり、分画段階が少なくなり、全体の処理時間が短くなり、エネルギーコストが低くなり、化学物質コストが低くなる結果として、生産コストが低下する。必要なスペースが小さくなり、仕掛け品が少なくなり、処理時間が短くなり、エタノール処理に必要な防爆環境が不要なので資本コストがより低くなる。
【００２９】
驚くべきことに、本発明の方法は、上述の塩の濃度と同様の濃度でアルコールを使用し得る。エタノールの使用に伴い変性の心配がある一方、実験結果は興味深いものであった。以前からのエタノール法との間の基本的な相違は、本方法による手法の終了後、エタノールが迅速に除去されることであり、その結果、現在のエタノール法よりも以前の静注ガンマグロブリンよりも変性が少なく、収率が高くなる。また、本発明によるアルコール法は、０から２５℃の範囲の温度で行われ得る。
【００３０】
したがって、主たる目的は、現行の方法より安いコストで、効果的な静注ガンマグロブリン製剤を提供することである。
【００３１】
したがって、基本的な目的は、ガンマグロブリンを調製するためのアルコール不含の方法を提供することである。
【００３２】
重要な目的は、このような方法及び高収率である調製を提供することである。
【００３３】
さらなる目的は、アルコールを用いる伝統的な方法により生成されたガンマグロブリンよりも患者の耐容性が高い、迅速に注入可能なガンマグロブリン製剤を提供することである。
【００３４】
目的は、収率が高く、現在の方法よりも変性度が低い、アルコールを用いる、以前は使用されなかった方法を提供することである。
【００３５】
目的は、伝統的なアルコールに基づく方法を用いて生成された同様の製剤と比較して、処理中に、ポリマー、凝集物、断片、酵素活性化因子及びタンパク質分解酵素の生成が少ない、ガンマグロブリンを生成させることである。
【００３６】
さらなる目的は、分画により、第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子及びその他の凝固因子が生成される寒冷沈降物の懸濁液を形成させるために、本発明による任意の方法として寒冷沈降物を得ることである。
【００３７】
添付の図面を参照して行う詳細な説明から、本発明の、これら及びその他の目的及び特性が明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
図１−４で示される流路の印についてここで述べる。全般的に、各長方形ボックスは、手順の段階を説明するために使用し；各菱型は分離段階を表すために使用し；各楕円円筒は、前述の手順又は分離段階から得られる産物を指し；各丸は、出発点又はこの図の外の延長経路点の何れかを示すために使用する。
【００３９】
好ましいＩｇＧ処理流路の最初の部分１０−１（通常、番号１０）が示される図１をここで述べる。最初の出発点２０の後に示されるように、処理すべき血漿３０の体積を処理のために選択する。図入りの実施形態のこの説明において血漿３０を例に挙げて使用するが、本発明の範囲内でその他の血液ベースの産物を処理し得ることに注意すべきである。また、本明細書中で後により詳細に開示するように、使用のための調製後、調製した脱クリオ血漿５０からペースト４４を分離するために、分離段階４２を使用する。
【００４０】
手順４０の一部として、調製血漿を形成するために、選択された凍結血漿３０をおよそ５℃に温める。標的となる血漿３０の処理温度は５℃であるが（これは、プロセス１０の続く段階の間中維持されるべきである。）、２℃から８℃のリミットの範囲の温度は本発明の範囲内に入り得る。凍結状態で選択されない場合（例えば、慣習的方法により低温沈降物を除去するプロセスの間に凍結融解される場合）、血漿３０を直接使用し得る。
【００４１】
手順５２による血漿５０への添加に対して、塩の量（これは、上述の表Ｉで挙げる塩から選択し得る。）を選択する。１種類の塩又は塩の組み合わせを選択し、使用し得るので、使用する量が、上述のように、段階（ａ）及び（ｂ）それぞれで１種類の塩又は塩の組み合わせを含有し得るように、添加される塩の量を「少なくとも１つの塩」とみなすことが賢明である。一般に、塩又は塩の組み合わせを溶液中で調製するか、乾燥塩として添加するか又は脱水及び乾燥塩の組み合わせとして添加し得る（手順５４）。いずれにせよ、最も重要なことは、添加する塩の総濃度を予め定められた重量濃度にすることである。
【００４２】
例として、クエン酸ナトリウムを選択し使用する場合、クエン酸ナトリウム５００ｇを精製水６００ｍＬへと撹拌することにより５０％クエン酸ナトリウムを調製する。撹拌時間は、３０分から６０分か、あるいは、クエン酸ナトリウムが溶解するまでとなるはずである。この点で、１０００ｍＬになるように純水で混合液を希釈する。ｐＨ７．０に到達するまでこの混合液に５０％クエン酸溶液を添加する。
【００４３】
有機化学分野で周知のように、５０％クエン酸溶液を得るために次の段階を使用し得る。クエン酸５０グラムを精製水６０ｍＬに添加する。撹拌時間は、約３０分か、あるいはクエン酸が溶液になるまでとなるはずである。クエン酸が溶液となった後、体積が１００ｍＬとなるまで十分な精製水を添加し、よく混合する。この溶液の一部をクエン酸ナトリウム１０００ｍＬに添加し、ｐＨが７．０になるように調整する。したがって、ｐＨが７．０になるまでクエン酸ナトリウム溶液にクエン酸を添加する。ｐＨが７．０になるように調整するために添加する必要があるクエン酸量はごく少量であることに注意。
【００４４】
第一の分画段階（クエン酸ナトリウムに対する手順５４）を行うための準備として、血漿５０に添加すべき分画溶液の体積を計算する。塩濃度（この場合、クエン酸ナトリウム分画溶液）が１２重量％となることが目標である。また、分画溶液のｐＨはおよそ７．０となるはずである。
【００４５】
分画溶液（クエン酸ナトリウム）及び血漿５０のそれぞれの体積を計算するための式（式Ｉ）は次のとおりである：ｘ＝（Ｃ＊Ｖ）／（０．５−Ｃ）（式中、ｘは５０％クエン酸ナトリウム溶液の所望の体積であり；Ｃはクエン酸ナトリウムの所望の分画重量濃度であり；（例えば０．１２又は１２％）：Ｖは希釈する溶液の体積である（例えば血漿５０の体積）。
【００４６】
式Ｉによる計算の例は：
５００リットルの血漿５０の体積（Ｖｐ）に対して、クエン酸ナトリウムの所望の分画重量濃度は１２％である。
【００４７】
ｘ＝（０．１２＊５００）／（０．５−０．１２）＝１５８リットル
Ｃに対して式Ｉを解くことにより、血漿５０及びクエン酸ナトリウムの体積の値を次のように当てはめ得る式ＩＩが得られる。
Ｃ＝（０．５００＊１５８）／（５００＋１５８）＝０．１２
【００４８】
手順５４に対して、およそ５分間にわたり、調製したクエン酸ナトリウム分画溶液（室温、すなわちおよそ２０℃であり得る。）を５℃の出発温度を有する血漿５０に添加する。クエン酸ナトリウム溶液を添加しながら穏やかに撹拌する。クエン酸ナトリウム溶液を血漿５０に添加し終えたら、得られるスラリーをおよそ６０分間穏やかに撹拌し続けるが、この間、スラリーの温度を２から８℃の範囲内に下げる。（このスラリーのｐＨはおよそ７．０から７．１に維持されるはずである。）。
【００４９】
手順５４が終了したら、手順５６として遠心する。当業者にとって通常の手順によりスラリーの成分を上清液６０とペースト６２とに分離するために、フロースルー遠心（例えばＷｅｓｔｐｈａｌｉａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を使用することを推奨する（この間、スラリーの温度は２から８℃の範囲に維持する。）。
【００５０】
本発明方法の不可欠な部分として、さらなる処理のために、元の血漿のＩｇＧの実質的に全てを含有する上清液６０を取っておき、一方で、第ＶＩＩＩ、ＩＸ及びフォンビレブランド因子及びフィブリノーゲンを含む血液因子を回収するためにペースト６２をさらに処理し得る。
【００５１】
クエン酸ナトリウムを用いる第二の分画フェーズに対して、さらなるクエン酸ナトリウム分画溶液を上清液６０に添加する処理段階６４を行う。クエン酸ナトリウムの重量濃度を１２％から２２％に向上させるために、十分な５０％クエン酸ナトリウムを液体６０に添加する。段階６４で使用するその他の塩に対して、使用する少なくとも１つの塩の重量総濃度が２１から２３％の範囲、好ましくは２２％の範囲となるべきことに注意。
【００５２】
添加すべき５０％クエン酸ナトリウムの体積を計算するために、次のように式ＩＩＩが与えられる：
Ｃｅ＝（（Ｖ６０＊Ｃ６０）＋（ＶＸ＊Ｃ０．５０））／（Ｖ６０＋ＶＸ）（式中、Ｃｅはクエン酸ナトリウムの所望の最終重量濃度であり；Ｖ６０は上清液６０の体積であり；Ｃ６０は上清液６０中のクエン酸ナトリウム濃度であり；ＶＸは添加すべき５０％クエン酸ナトリウムの体積であり；Ｃ０．５０は５０％クエン酸ナトリウムの濃度（すなわち０．５０）である。）。
【００５３】
溶液中のクエン酸ナトリウムの所望の最終重量濃度が０．２２又は２２％であることに注意。
【００５４】
ＶＸに対して解くことにより、添加すべきクエン酸ナトリウムの体積を計算するために使用し得る式ＩＶが得られる。
【００５５】
ＶＸ＝Ｖ６０＊（Ｃｅ−Ｃ６０）／（Ｃ０．５０−Ｃｅ）
例として、Ｖ６０の体積が５５２リットル；Ｃｅの重量濃度が０．２２；Ｃ６０の重量濃度が０．１２；Ｃ０．５０の重量濃度が０．５０である場合、ＶＸ＝１９７リットルである。
【００５６】
クエン酸ナトリウムの体積ＶＸを添加した後、この混合物の温度を２から８℃に維持しながら２時間から４時間（体積が小さい場合、１から２時間で十分な場合が多い。）撹拌する。さらなるクエン酸ナトリウムを添加し、この混合物を撹拌するにしたがい、この溶液の色が淡黄色に変化することに注意。
【００５７】
撹拌後、段階６６により、混合物を遠心し、温度を２から８℃の範囲に維持しながら連続フロー遠心を用いて、上清７２からペースト７０を分離する。得られた上清（上清７２）は、基本的にＩｇＧ不含である。血漿５０の実質的に全てのＩｇＧはこの段階ではペースト７０中で見られる。
【００５８】
流路１０の流路部分１０−２に対してポイント８０がポイント８０’に続くように、図２についてここで述べる。ペースト７０の内容には、ＩｇＧ、その他の血清タンパク質及びクエン酸ナトリウムが含まれる。クエン酸ナトリウム（及び／又はその他の使用される塩）は、ＩｇＧがイオン交換クロマトグラフィーにより単離できるように、ペースト７０から除去されねばならない。最初に、段階９０として、精製水（ペースト７０の体積の約４倍）を用いてペースト７０を液化する。段階９０の産物はＩｇＧに富む溶液１００である。溶液１００の最初の伝導度はおよそ２０ミリシーメンス／ｃｍ（ｍＳ／ｃｍ）である。
【００５９】
クエン酸ナトリウム（及び／又はその他の使用塩）の除去は、段階１０２（除去したクエン酸ナトリウム１１０及び脱塩ＩｇＧ保持液１１２へと溶液１００を分離する。）において、溶媒として精製水を用いた連続的透析ろ過により行われる。この段階は常に、選択された少なくとも１つの塩と独立して行われるべきことに注意。保持液１１２の伝導度が１００−９００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）に低下したら、段階１０２の終了となる。段階１０２の透析ろ過に対して、３０ＫＤカットオフ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（又は同等のもの）透析ろ過系を使用し得る。
【００６０】
第一の溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）法と、それに続く増強（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ）Ｓ／Ｄ法を含む二重ウイルス不活性化段階として、段階１２０に付随して、ＩｇＧに富む保持液１１２のウイルス不活性化を行い得る。第一の方法では、保持液１１２の温度をおよそ２７℃に上げる（温度は２４から３０℃の範囲であり得る。）。次に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ８０の十分な体積を添加して１％溶液を調製し、十分なＴｒｉ−Ｎ−ブチルホスフェートを添加して、０．３％溶液を調製し、第一のＳ／Ｄ添加混合液を調製する。脂質エンベロープを有するウイルスが不活性化される間、第一のＳ／Ｄ添加混合液を２７℃にて３時間インキュベートすることにより、第一の方法を続ける。この点から、現在利用可能な不活性化及び分画プロセスの手順を利用し得る。しかし、本明細書中で以後、完全を期すために現在好ましいプロセスを提供する。
【００６１】
段階１２０に対して、次のようにＳ／Ｄ濃縮物を調製し得る。
【００６２】
Ｔｒｉ−Ｎ−ブチルホスフェート３０ｍＬを精製水８００ｍＬに添加する。よく混合する。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ８０の何れか１００ｍＬを混合溶液に添加する。再びよく混合し、最終的な混合Ｓ／Ｄ溶液を得る。十分な精製水を添加して、最終混合溶液の総体積を１０００ｍＬにする。もう一度よく混合する。このように準備したら、最終溶液は１０ｘ濃縮液となる。この濃縮液１００ｍＬを保持液１１２の各９００ｍＬに添加し、第一のＳ／Ｄ添加混合物を形成する。
【００６３】
３時間インキュベートした後、第一のＳ／Ｄ法から得られた溶液に十分なホルムアルデヒドを添加し、０．３％溶液を調製し、十分なフェノールを添加して、０．３％溶液を調製し、増強混合物を形成し、段階１２０の増強法フェーズを開始する。およそ２７℃にてさらに３時間インキュベートし、その後、エンベロープのない、及びエンベロープのあるウイルスを不活性化する。
【００６４】
段階１２０に対して、次のようにして「増強」濃縮液を調製し得る。
【００６５】
３７．５％ホルムアルデヒド溶液１３．４ｍＬを精製水９００ｍＬに添加する。よく混合する。フェノール（試薬グレード）５０ｇをこの混合物に添加する。再びよく混合する。十分な精製水を添加し、「増強」調製物の総体積が１０００ｍＬになるようにする。もう一度よく混合する。この調製物はホルムアルデヒド及びフェノールそれぞれを５０，０００ｐｐｍ含有する（各５％）。第一のＳ／Ｄ添加混合物の体積を測定する。第一のＳ／Ｄ添加混合物の各８３３ｍＬに増強濃縮液１６７ｍＬを添加し、増強混合物を形成させる。
【００６６】
処理した増強混合物を２から８℃の温度に冷却することにより、段階１２０を終了する。このように冷却し、増強混合物はＩｇＧウイルス不活性化（ＶＩ）溶液１２２となる。
【００６７】
あるいは、必要に応じてその他の方法（例えば、クロマトグラフィー、ナノフィルトレーション、低温殺菌）によりウイルスを除去し得る。
【００６８】
段階１２４は、ウイルス不活性化化学物質を除去するためのカラムクロマトグラフィーの使用を含む。次の段階により、これを行い得る：
１．Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５  ＯＣ樹脂が詰まった短く幅が広いカラムを用意する。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂は、溶液１２２中のＩｇＧを捕捉するために使用される弱陽イオン交換樹脂であり、一方、溶液１２２からのその他のタンパク質に対してはこのカラムを通過させる。溶液１２２の伝導度が１００から９００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）の範囲になることが重要である。（このような伝導度が４００から６００マイクロシーメンス／ｃｍの範囲になることが好ましい。）。血漿５０からのＩｇＧは、低イオン強度の溶液中でこの交換樹脂に結合する。
【００６９】
２．低速でこの交換樹脂に溶液１２２を導入する。カラムから流出液を回収し、高品質分光光度計において１ｃｍシリカキュベットで２８０ｎｍにて流出液を測定する。（例として重水素光源付きのＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−７を使用し得る。）。樹脂カラムにタンパク質が導入されると流出液の光学密度が上昇することに注意。ウイルス不活性化溶液（使用する場合）中のフェノールでもまた、測定光学密度が上昇し得る。溶液１２２全てが樹脂カラムを通過し、滅菌液がカラムから洗い流された後、その元の値からの光学密度の上昇を測定する場合、流出液の回収を開始する。光学密度の上昇は、流出液中のタンパク質の指標である。この時間の後、光学密度は、溶液中にあるタンパク質がごく少量であるか又は存在しない指標であるレベルに低下する。この時点で回収を停止し得る。この時点で、脱イオン水で樹脂を完全に洗浄することが好ましい。結合物質はＩｇＧであり、結合ＩｇＧ１３０として、経路１０−２に従って同定される。カラムから回収した流出液は、ＩｇＧ以外の血漿５０からの全タンパク質を含む。この流出液は流出液１３２である。ＩｇＧが溶液１３２中に殆ど又は全く放出されていないことを確認するために流出液１３２において血清タンパク質電気泳動を行うことを推奨する。
【００７０】
樹脂カラムのサイズによって、塩化ナトリウムの２％溶液の体積を調製する。結合したＩｇＧを樹脂粒子から放出させるために、塩化ナトリウムの添加を行う。化学分野で周知のように、塩化ナトリウム２０ｇを脱イオン水１Ｌに混合することによって、２％溶液を調製する。樹脂カラムの体積の約１０倍となるように２％塩化ナトリウム溶液の十分な体積を調製すべきである。
【００７１】
段階１３４に対して、塩化ナトリウム溶液をカラムに添加し、カラムから流出液を回収する。同時に、１ｃｍシリカキュベットで分光光度計を用いて２８０ｎｍにて流出液の光学密度を測定する。ＩｇＧが樹脂からはずれ、流出液に入るにつれて、得られる光学密度（ＯＤ）が急激に上昇するのが分かるであろう。全ての高ＯＤ測定溶液を回収する。流出液のＯＤが低い（通常）範囲に低下したら、溶液の回収を停止する。得られる溶液はＩｇＧ溶液１４０である。高ＯＤは溶液中にタンパク質が含有されている指標であり、溶液１４０が、さらに除去する必要がある、少量のＩｇＭ及びＩｇＡを含有し得ることに注意。さらに、溶液１４０は、純粋なＩｇＧを単離し得る前に除去しなければならない塩化ナトリウムを含有する。
【００７２】
ここで、図２の継続点１５０（流路１０の流路部分１０−３に対する図３の継続点１５０’に続く。）について述べる。塩化ナトリウムは、好ましくは、透析ろ過系を用いる連続透析ろ過によって溶液１４０から除去する。このようなものは、３０ＫＤカットオフ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（又は同等物）透析ろ過系から構成され得る。段階１５２で行われる場合、透析ろ過溶媒は精製水である。述べられ得るように、溶液１４０の最初の伝導度は、およそ５０ミリシーメンス／ｃｍ（ｍＳ／ｃｍ）である。透析ろ過の終了時に、伝導度は１００−９００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）まで低下する。
【００７３】
透析ろ過の産物は、ＩｇＧに富む保持液１６０であり、塩化ナトリウム１６４が除去されている。保持液１６０のタンパク質分画を確認するために、本プロセスのこの段階で血清電気泳動を行うことを推奨する。
【００７４】
段階１６６は、ＩｇＧに富む保持液１６０を精製するための最終段階である。段階１６６に対して、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ−５５０Ｃ樹脂を備えた短く幅広い樹脂カラムを準備することが好ましい。このような樹脂は、ＩｇＧに富む保持液１６０中のその他のタンパク質を捕捉するために強い陰イオン交換を行い、一方、溶液中のＩｇＧについてはこのカラムを通過させる。保持液１６０の伝導度が１００から９００マイクロシーメンス／ｃｍの範囲であることが重要であり、４００から６００マイクロシーメンス／ｃｍの範囲内であることが好ましい。このようにして、段階１６６で保持液１６０中のＩｇＧは結合せずにこの樹脂カラムを通過し、一方、ＩｇＭ及びＩｇＡを含むその他のタンパク質はこのカラムにおいて樹脂に結合し、したがって、溶液から除去される。このようにして、夾雑残存タンパク質１７０が精製ＩｇＧ溶液１７２から効率的に分離される。
【００７５】
プロセスが続く際、ＩｇＧ溶液１７２を回収し、２８０ｎｍでＯＤを測定することを推奨する。高ＯＤ流出液を回収する。測定ＯＤが低下したら、回収を停止する。プール溶液は比較的希薄である。
【００７６】
限外ろ過を介して段階１８０を用いてプール溶液を濃縮する。このような限外ろ過に対して、１２％ＩｇＧ溶液１８２を濃縮するために、中空糸フィルターを使用するか、又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過システム（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）もしくは同等物（１０Ｋから３０Ｋダルトンの保持性）を使用し得る。段階１８０のプロセスで過剰な水１８４を除去する。得られる１２％濃縮液に含まれる塩化ナトリウムはごく微量のみであるはずであり、ｐＨはおよそ７となるはずである。伝導度は約１００から９００マイクロシーメンス／ｃｍとなるはずである。
【００７７】
１２％ＩｇＧ溶液１８２を安定化するために、マルトース又はソルビトール溶液を添加して（段階１９０）、１２％溶液を正確に１０％に希釈する。最終１０％溶液（ＩｇＧ溶液１９２）は、およそ５％マルトース又はソルビトール（何れか使用したもの）を含有するはずである。
【００７８】
場合によっては、ＩｇＧ溶液１９２からウイルス２０４を除去するために、１０％溶液１９２をウイルス保持膜に通すことにより、ナノフィルトレーションを行い得（段階２００）、ナノフィルトレーション済み濃縮液２０２を生成させる。
【００７９】
流路１０の流路部分１０−４に対する図４の継続点２１０’についてここで述べるが、これは、図３の継続点２１０から続く。標準的手順のように、（前の任意の段階２００の実行による。）安定化ＩｇＧ濃縮液１９２又はナノフィルトレーション済みＩｇＧ濃縮液２０２の何れかを段階２２０において脱イオン水で希釈し、バルク精製ＩｇＧ溶液２２２を生成させる。段階２３０で溶液２２２を滅菌フィルターに通すことにより混入細菌を除去し、滅菌バルクＩｇＧ溶液２３２を生成させ得る。当技術分野で現在知られている方法により、除去した混入細菌２３４を廃棄し得る。
【００８０】
段階２４０において標準的手順を介し、得られた滅菌溶液２３２をバイアルに満たして、溶液２３２のバイアルのロット２４２を生成させ得る。品質保証の必要に応じて、段階２４６と組み合わせて、段階２４４においてロット２４２の最終試験及び検査を行い、廃液２５２が除かれた溶液２３２の有効バイアルのロット２５０を生成させ得る。
【００８１】
ここで、フローチャート１０−１が、その他の産物（例えば第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子及び、分画され得るその他の凝固因子）が見られるペーストを分離する段階を開示する、図１について述べる。図１で見られる産物４４に付随する段階は任意であり、第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子及びその他の凝固因子が除去され得る寒冷沈降物を生成させるために行われ得る。この場合、手順４０は、血漿３０を０から４℃に徐々に温めるものと定義される。
【００８２】
このような加温の結果、寒冷沈降物が懸濁される血漿が凍結融解される。段階４２により、凍結融解血漿を遠心し、ペースト４４の形態で寒冷沈降物を得る。次いで、ペースト４４を分離し、既知の方法により処理して、第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子及びその他の凝固因子を得る。残りの分離された物質は、脱クリオ血漿５０と呼び、上記で開示したように処理する。
【００８３】
本発明に従い行われる分画手順の結果：
本明細書中で開示した本発明の段階の効率及び精度を示すために、２００５年８月８日の日付の実験報告からクエン酸ナトリウムを用いた次の結果を抽出した。
【００８４】
この手順において、新鮮な凍結ヒト血漿を使用した。このような手順における典型であるように、凍結融解血漿の４から８バッグからプールを作った（段階４０、図１参照。）。Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒより入手可能な市販の装置を使用して、入手できたとき、様々な分画を評価した。Ｐａｒａｇｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍの一部として、Ｂｅｃｋｍａｎ、「Ａｐｐｒａｉｓｅ」密度計を使用して、血清タンパク質電気泳動に対して、Ｂｅｃｋｍａｎアガロースゲルをスキャンした。プールから生成された各分画に対して、３から５のゲルスリットの間に、産物５μＬを載せた。各分画に対してより良い典型的な結果を得るために、結果を平均した。本明細書中で後に提供する表においてこのような結果を示す。
【００８５】
２５分間、１００ＶＤＣで、ｐＨ８．６で、ゲルを電気泳動にかけ、後でＰａｒａｇｏｎ青色染色により染色した。Ａｐｐｒａｉｓｅ密度計を使用して、各ゲルスリットに対して２回、染色し乾燥したゲルを６００ｎｍの波長でスキャンした（ゲルあたり１０のゲルスリットを使用した。）。付着した色素の密度ならびに各分画の数値での表示に基づく、５種類の異なるタンパク質分画の分布の平均グラフ表示を得た。数値での表示は、各ゲルの陽極と陰極との間で生じるようなゲルパターン内の選択した位置での、生成グラフのピーク及び谷のコンピュータ分析を基とした。表示値を総計し、総色素量で色素％を割り、評価のための％を与えた。各個別の血液分画を合計した総計は必ず１００％に等しくなることに注意。
【００８６】
下記表ＩＩで見られるように、５種類の異なるタンパク質分画は、アルブミン、アルファ１、アルファ２、ベータ及びガンマグロブリンと同定される。分画前に、試料をプールから採取し、電気泳動にかけて、分画開始前に各分画の平均分画値を出した。平均ベースプール物質に対する代表的結果を全血漿の％として下記で挙げる。
【００８７】
【表２】
2009507015.tif 000004
【００８８】
５０％クエン酸ナトリウムの体積を血漿の体積に添加することによりプールからの血漿（すなわち血漿５０）を処理し、クエン酸ナトリウムの１２％溶液を調製した（段階５４）。この混合物を２から８℃にて６０分間撹拌し、次いで、２から８℃にて６０分間遠心した（段階５６）。得られた上清液６０を測定した。残りのペースト６２の重量を測定し、脱イオン水を添加することにより溶液にした。
【００８９】
上述の手順を用いて２種類の溶液（６０及び６２（溶解済み））を電気泳動にかけたが、その結果を下記表ＩＩＩでまとめる。
【００９０】
【表３】
2009507015.tif 000005
【００９１】
ペースト６２（溶解済み）においてガンマグロブリンは見られなかった。しかし、上清６０においてガンマグロブリンが見られた。
【００９２】
次に、十分な５０％溶液クエン酸ナトリウムを上清６０に添加し（段階６４）、２２％クエン酸ナトリウムを含有する最終混合物を得た。この溶液もまた２から８℃にて６０分間撹拌した。２から８℃にて６０分間遠心した後（段階６６参照。）、得られた上清液７２を測定した。残存ペースト７０の重量を測定し、脱イオン水を添加することにより溶液にして（段階９０）（ｍＬでのペースト７０の４倍重量）、ＩｇＧに富む溶液１００を形成させた。上述の手順により上清７２及びＩｇＧに富む溶液１００の試料を電気泳動にかけたが、その結果を下記表ＩＶでまとめる。
【００９３】
【表４】
2009507015.tif 000006
【００９４】
上清７２においてガンマグロブリンは見られなかった。しかし、ＩｇＧに富む溶液１００においてガンマグロブリンが見られた。
【００９５】
２２％上清液（殆どアルブミンを含有する。）は、基本的にベータ及びガンマグロブリンを含有しなかった（すなわち、このようなものは検出されなかった。）。２２％ペースト溶液１００は、注射用の静注ガンマグロブリンを得るためのさらなる分画化に対して重要なガンマグロブリンを含有していた。段階９０において、電気泳動を行う前にこのペーストが溶媒和される時間をとるべきことにも注意。実験プロセスにおいて、この単離手順において使用するために、１２％と２２％クエン酸ナトリウムとの間の血漿分画を選択的に単離した。
【００９６】
２２％ペースト溶液において捕捉されたクエン酸ナトリウムを除去するために（段階１０２）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎユニットを選択して、溶液１００を透析ろ過した。何らかのカラムワークを行う前に、クエン酸ナトリウムを透析ろ過し、得られる溶液の伝導度を４００から８００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）の間に低下させるために、平均で、溶液１００の体積の約７倍が必要であった。
【００９７】
透析ろ過後、脱塩タンパク質溶液１１２を電気泳動にかけ、透析ろ過段階１０２の結果として何らかの変化又は損失があるかを調べた。クエン酸ナトリウムを除去したので、含有される塩との相互作用がなくなることにより電気泳動パターンにおけるタンパク質移動度が幾分変化した。得られたパターンは、高塩濃度パターンよりも幾分長かった。このようにパターンが伸びることにより、ベータグロブリンからＩｇＧがより容易に分離できるようになり、下記で与える表Ｖで見られるように測定％が結果として上昇した。
【００９８】
【表５】
2009507015.tif 000007
【００９９】
表Ｖで見られるように、溶液１１２のおよそ４５％がガンマグロブリンであり、溶液１１２では、電気泳動パターンにおいてより良く分離していた。ベータ分画が下に移動し、電気泳動パターンでの分離が良くなったことに注意。
【０１００】
この点において、溶液１１２中のガンマグロブリンを精製するために、現在利用されている様々な方法を使用することができた。このため、この実験の完了は、図２−４で見られる段階と異なり得た。この実験の場合、この溶液を最初に溶媒／界面活性剤溶液で２７℃にて３時間処理した。次に、増強滅菌溶液（米国特許第６，８８１，５７３号、題名「ＡＵＧＭＥＮＴＥＤ  ＳＯＬＶＥＮＴ／ＤＥＴＥＲＧＥＮＴ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＩＮＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ  ＥＮＶＥＬＯＰＥＤ  ＡＮＤ  ＮＯＮ−ＥＮＶＥＬＯＰＥＤ  ＶＩＲＵＳＥＳ」（Ａｌｌａｎ  Ｌ．Ｌｏｕｄｅｒｂａｃｋに対して発行、２００３年９月１２日出願に従い行われる。）を混合物に添加し、２７℃にてさらに３時間、さらにインキュベートした。透析透析ろ過溶液のこの二重不活性化処理により、エンベロープを有するウイルス及びエンベロープのないウイルスの両方が不活性化される。
【０１０１】
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５０Ｃ樹脂を搭載したイオン交換カラムに滅菌処理済み溶液を移した。この樹脂は、ガンマグロブリンを吸着し、溶液中に存在するその他の全てのタンパク質をカラムから流出液中で通過させた。この溶液をカラムに添加し、流出液エンドを通してゆっくり滴下するようにカラムの流れを調整した後、全ての遊離タンパク質及び滅菌物がいつカラムを通ったかを調べるために、２８０ｎｍにて流出液を測定した。後に、流出液の２８０ｎｍで測定した光学密度が非常に低くなるようにカラムを精製水２倍体積で洗浄した。
【０１０２】
次に、塩化ナトリウムの２％溶液をカラムの上端に置き、カラムに染み込ませた。樹脂粒子が吸着したガンマグロブリンを遊離させてカラムから受容容器へと流出させた。
【０１０３】
樹脂粒子からのガンマグロブリンの選択された単離及び放出の結果を示すために、精製水を用いてカラムから回収した流出液（精製水としてラベルされる。）及び２％溶液を用いたカラムからの流出液（２％ＮａＣｌとしてラベルされる。）を電気泳動により試験した。この段階の結果を下記の表ＶＩで示す。
【０１０４】
【表６】
2009507015.tif 000008
【０１０５】
ガンマグロブリンの９８％を超えるものが第一の樹脂処理で単離されたことに注意。１．９％のベータグロブリンの値は、溶液をゲルに適用した場合の適用スポットの結果であり得る。２％塩化ナトリウム溶液はガンマグロブリン（ＩｇＧ）を含有し、おそらく、より大きい血漿のプールを用いると、除去されるべきＩｇＡ及びＩｇＭグロブリンを幾分含有し得る。
【０１０６】
したがって、次のカラム処理のために、２％塩化ナトリウム溶液を透析ろ過して塩化ナトリウムを除去した。塩を除去するＰｅｌｌｉｃｏｎユニットに溶液を通すことにより、透析ろ過を再び行い、伝導度が４００から８００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）である最終産物を得た。２％溶液を透析ろ過するために、脱イオン精製水約６体積を要するであろうことに注意。
【０１０７】
最終段階として、カラムにＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ５６０−Ｃ樹脂を充填し、脱塩溶液をカラムの上端に添加し、カラムにゆっくりと染み込ませた。このカラムにおいて、ＩｇＧは樹脂を通過して流れ、全てのその他のタンパク質は樹脂に結合し（例えばＩｇＡ及びＩｇＭ）、カラムから液体ベースで１００％ＩｇＧである最終流出液（溶液１７２）が得られた。この流出液の試験を行い、下記表ＶＩＩで示す。
【０１０８】
【表７】
2009507015.tif 000009
【０１０９】
チャート１０−１及び１０−２の経路に従い、新鮮な凍結血漿を分画化する際に様々な塩を用いてその他の実験を行った。上記で概説するように２段階で分画手順を完了するために、様々な塩を用いて段階５２、５４及び６４を繰り返した。下記表ＶＩＩで見られるように、及び、クエン酸ナトリウムに対して開示した方法に従い、第一の段階５２及び５４には、濃縮塩溶液（可能であれば）の第一の予め定められた体積と一連の体積の血漿を混合することが含まれた。水中で塩を溶解することにより塩の必要な濃縮を達成できなかった場合は、所望の重量濃度を得るために、乾燥塩を単純に添加した。
【０１１０】
塩溶液の第一の予め定められた体積は１２重量％であった。２から８℃にて１時間、反応混合を行った。反応混合後、得られた混合物を２から８℃にて４５００ｒｐｍで１時間沈降させた。ペースト沈殿剤６２の上に重なった第一の上清液６０を穏やかに注ぎ出し、回収した。第一の上清液６０が、使用した塩の１２重量％溶液を含有したことに注意。一般に、得られたペースト沈殿剤６２を脱イオン水（通常、回収した沈殿剤６２の重量の４倍）の重量％で希釈し、さらなる分析のために２から８℃にて一晩保存した。
【０１１１】
段階６４により、上清６０の体積を測定し、濃縮塩溶液の量を添加して、塩の濃度を２２重量％のレベルに上げた。２から８℃にて１時間、得られた組成物を混合し、次いで一晩冷蔵した。翌朝、この組成物を短時間、約５分、再び混合し、次いで２から８℃にて４５００ｒｐｍで１時間遠心した。全上清、上清７２を注ぎ出し何らかの所望のさらなる処理のために保存した。上清７２からの分離後、この手順の目標であるペースト７０の重量を測定し、希釈した（ペースト７０の重量の約４倍であると計算される脱イオン水の量を添加することにより、段階９０により再溶解）。
【０１１２】
様々な組み合わせで、有機塩及び無機塩の両方に対して、上記で開示した手順を繰り返した。下記で示される表ＶＩＩＩは、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒシステムを用いて行われる血清電気泳動により調べた場合の本手順の結果を与える。この電気泳動の結果をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒスキャナーでスキャンし、アルブミン、アルファ−１、アルファ−２、ベータ及びＩｇＧという５種類のレベルそれぞれでのタンパク質の％として示す。Ｂｅｃｋｍａｎアルゴリズムによる、各スキャンに対する総計は、合計した場合１００％になると概算される。
【０１１３】
【表８】
2009507015.tif 000010
【０１１４】
ペースト６２及び上清７２の何れでもＩｇＧは見られなかった。ＩｇＧは全てペースト７０で見られた。混合有機塩（クエン酸ナトリウム）及び無機塩（硫酸アンモニウム）の場合、ＩｇＧに対して値が高くなるので混乱しないはずである。血漿からのその他のタンパク質の分別抽出の結果はこのようなものである。ある一部のタンパク質の沈殿パターンは塩によって異なる。重要な結果は、実質的に全てのＩｇＧがペースト７０で見出されるということである。
【０１１５】
エタノールを用いて本発明の方法を介して行った手順の結果
驚くことに、分画化合物として本発明の範囲内でエタノールを使用し得ることが分かった。このエタノールの使用は、血液分画でエタノールを使用する、現在の及び古典的な方法とは明らかに異なることに注意すべきである。
【０１１６】
上記で開示した実験と比較するために、１本の凍結ＦＦＰ−血漿ボトルを用いて、本方法を試験し、２００５年１２月８日の日付で実験ノートに記録した。この実験において、塩に対して開示された同様の方法で％により測定される濃度でエタノールを使用した。したがって、９５％エタノール溶液を希釈して、５０％エタノール溶液（９５％の１０５ｍＬを脱イオン水９５ｍＬに添加した。）を調製した。このように調製して、溶液を氷浴中に置き、温度を５℃に低下させた。
【０１１７】
段階５４により、５０％エタノール溶液６３ｍＬを５℃に維持したＦＦＰ−血漿（予備より）２００ｍＬに添加した。得られた溶液（即ち１２％エタノール）を氷浴中（２から８℃）で１時間撹拌した。撹拌後、段階５６により、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−６遠心機（４５００ｒｐｍ）を用いて１時間溶液の沈降を行い、その間、温度を２から８℃に維持した。上清６０を注ぎ出し、このように分離したペースト６２を測定した。
【０１１８】
上清６０の体積は２６０ｍＬであった。ペースト６２の重量は３．８２３グラムであった。ペースト６２を水で再水和し（４倍体積、即ち１５．３ｍＬ）、よく混合した。ペースト６２は、典型的な塊様の沈殿を示した。最終希釈体積は１８ｍＬであった。
【０１１９】
上清６０をすぐに氷浴に置いた。エタノール濃度を２２重量％に上げるために、さらなる５０％エタノール（９３ｍＬ）を上清６０に添加した（段階６４）。この得られた溶液を２から８℃にて１時間撹拌し、次に、冷蔵庫（２から８℃）で一晩保存した。
【０１２０】
冷蔵庫から取り出した際にこの保存溶液を約５分間撹拌し、次いで遠心管にすぐに入れ、２から８℃にて４５００ｒｐｍで１時間遠心した（段階６６による。）。上清７２を注ぎ出し、ペースト７０を回収した。ペースト７０が鮮黄色であることに注目した。（通常、塩を用いて生成される場合、ペースト７０は灰白色である。）。正確には分からないが、黄色であるのはビリルビン及びその他の色素がエタノールにより血漿から抽出されたためであると考えられた。ライブラリ試料を各分画段階で作製した。
【０１２１】
上清体積を測定し（３３６ｍＬ）、５℃で保存した。ペースト７０の重量は８．５８３ｇであった。脱イオン水４倍体積（３４．３ｍＬ）によりペースト７０を再水和し、よく混合し、２から８℃にて一晩保存した。溶媒和した場合に、ペースト７０中の予想外の大量のＩｇＧを認めたことは興味深い。
【０１２２】
測定結果を下記表ＩＸ、Ｘ及びＸＩでまとめる。
【０１２３】
【表９】
2009507015.tif 000011
【０１２４】
【表１０】
2009507015.tif 000012
【０１２５】
【表１１】
2009507015.tif 000013
【０１２６】
最初のベース材料において電気泳動を行わなかった。しかし、血漿１ＬあたりＩｇＧ約６．７グラムあることに注意。ペースト６２のＩｇＧをペースト７０のＩｇＧに加える場合、６．８の総量は、予想される６．７グラム／Ｌとよく一致する。
【０１２７】
本発明はその精神又は本質的な特徴から逸脱することなく、その他の具体的な形態で具体化され得る。したがって、本実施形態は、あらゆる点で、説明であり、限定ではないとみなされ、本発明の範囲は、先行する明細書ではなく、添付の特許請求の範囲により示され、したがって、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内である変更は全て、その中に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、本発明によるプロセスに付随する重要な一連の最初の段階の流れ図である。
【図２】図２は、図１で見られる段階のすぐ後の一連の段階を開示する流れ図である。
【図３】図３は、図２で見られる段階のすぐ後の手順の段階を開示する流れ図である。
【図４】図４は、有用な産物を提供するための、図３で見られる段階のすぐ後の段階を開示する流れ図である。
【図１】
2009507015.tif 000014
【図２】
2009507015.tif 000015
【図３】
2009507015.tif 000016
【図４】
2009507015.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月1日(2008.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液ベース材料を分画する方法であり、
前もって凍結処理した血液ベース材料の量に第一のクエン酸塩を添加して、第一の上清及び第一のペーストを形成することにより、第一の分画ステップを実施すること、
前記第一の上清に第二のクエン酸塩を添加して第二の上清及び第二のペーストを形成することにより、第二の分画ステップを実施すること、ならびに
前記第二のペーストをろ過すること
を含む、方法。
【請求項２】
第一及び第二のクエン酸塩の少なくとも1つがクエン酸ナトリウムを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
第一及び第二のクエン酸塩の少なくとも1つがクエン酸ナトリウムの５０重量／重量％溶液を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
凍結処理した血液ベース材料の量を解凍するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】
第一の上清が少なくとも１２重量／重量％のクエン酸塩濃度を有する、請求項１の方法。
【請求項６】
第一の上清が１０−１４重量／重量％のクエン酸塩濃度を有する、請求項１の方法。
【請求項７】
第一のペーストを処理して第ＶＩＩＩ、ＩＸ、フォンビレブランド及びフィブリノーゲンからなるリストから選択される血液製剤を回収することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項８】
遠心により第一のペーストから第一の上清を分離することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項９】
第二の上清が少なくとも２２重量／重量％のクエン酸塩濃度を有する、請求項１の方法。
【請求項１０】
第二のペーストが２２−２４重量／重量％のクエン酸塩濃度を有する、請求項１の方法。
【請求項１１】
第二のペーストが２１−２３重量／重量％のクエン酸塩濃度を有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
第二の上清を処理してアルブミン及びα−１−アンチトリプシンからなるリストから選択される血液製剤を回収することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
遠心により血液製剤を回収することをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ろ過により血液製剤を回収することをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
ろ過するステップが第二のペーストを透析ろ過することを含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
第二のペーストの希釈液を調製することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
ろ過するステップが希釈液から実質的に全ての第一及び第二のクエン酸塩を除去する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ろ過するステップが希釈液を３０ＫＤの透析ろ過膜を通すことを含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
ろ過するステップからの産物を試験して、産物が５００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）±４００マイクロシーメンス／ｃｍ（μＳ／ｃｍ）の伝導度を有することを確認することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
ろ過するステップからの産物に界面活性剤を添加してウイルス不活性化溶液を作製することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２１】
ウィルス不活性化溶液にカラムクロマトグラフィーを実施することをさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
カラムクロマトグラフィーを実施するステップにおいて、５０−１５０μｍの粒子径、０．０５−０．１１ｍ当量／ｍｌのイオン交換容量及び２５−４５ｍｇ／ｍｌの吸着容量の少なくとも１つを有する弱陽イオン交換樹脂を使用することをさらに含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
血液ベース材料から分画された血液要素から、後続する前記分離された血液要素に透析ろ過手法を実施する目的のため、ユーグロブリンを分離する方法であり、
（ａ）処理するための血液ベース材料の予め定められた体積を取得するステップ、
（ｂ）処理するための前記体積の血液ベース材料を用意するステップ、
（ｃ）用意した前記体積の血液ベース材料に第一の予め定められた濃度の第一の予め定めされた体積のクエン酸ナトリウムを添加して第一の分離可能な上清産物（前記第一の分離可能な上清産物は実質的にユーグロブリンを含まない。）及び第一の残留産物を形成させることにより第一の分画ステップを用意するステップ
（ｄ）前記第一の分離可能な上清産物に第二の予め定められた濃度のクエン酸ナトリウムの第二の予め定められた体積を添加して第二の分離可能な産物及び第二の残留産物を形成させることにより第二の分画を用意するステップ
を含む、方法。