(57)【要約】  本発明は、受精能問題の処理のために好都合である、一般式（I）の９−クロロプロスタグランジン誘導体に関する。
2009516665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式I：
【化１】
2009516665.tif 000021
〔式中、R1は、CH2OH、-COOR2、-CONHR2 又は-CONHR3基であり、
R2は、水素；線状又は枝分かれであり、任意には、単〜多不飽和であり、そして次の置換基：ハロゲン、C1-C4−アルコキシ、置換されたC3-C10−アリール又は任意に置換されたC3-C10−アロイル、ジ−C1-C5−アルキルアミノ又はトリ−C1-C5−アルキルアミノにより単〜多置換されているC1-C10−アルキル基；C1-C4−アルキルにより任意に置換されているC3-C10−シクロアルキル；C3-C10−アリール（これはフェニル、１−ナフチル又は２−ナフチルにより任意に置換されていてもよく、これらは位置３及び４で、弗素、塩素、アルコキシ又はトリフルオロメチルにより、又は位置４で、ヒドロキシ、ハロゲン、フェニル、１又は複数のC1-C4-アルキル基、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、カルボキシ、ヒドロキシ又はC1-C4−アルコキシにより置換され得る）；又はC3-C7−ヘテロシクロアルキルであり、
R3は、C1-C15−カルボン酸又はC1-C15−スルホン酸であり、
Aは、シス-CH=CH- 又は-CH2-CH2-基であり、
Bは、トランス-CH=CH-又は-CH2-CH2-基であり、
Wは、C2-C6−アルキレンであり、
R4は、ヒドロキシ基、基O-R6又はO-R7であり、ここでR6はテトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル又はトリベンジルシリル基であり、そしてR7はC1-C15−カルボン酸であり、
R5は、水素、C1-C10−アルキル又はC1-C10−アルケニル基であり、
nは数値１〜４である〕
で表される化合物、生理学的に耐性の塩基とのその塩及びそのシクロデキストリンクラスレート化合物。
【請求項２】
R1が、CH2OH、-COOR2、-CONHR2 又は-CONHR3基であり、
R2が、水素又は線状又は枝分かれであり、任意には、単〜多不飽和であり、そして次の置換基：弗素、塩素又は臭素、C1-C4−アルコキシ、置換されたC3-C10−アリール又は任意に置換されたC3-C10−アロイル、ジ−C1-C5−アルキルアミノ又はトリ−C1-C5−アルキルアミノにより任意に単置換されているC1-C10−アルキル基；C1-C4−アルキルにより任意に置換されているC5-C6−シクロアルキル；C3-C10−アリール基（このC3−C10−アリール基は位置３及び４で、弗素、塩素、アルコキシ又はトリフルオロメチルにより、又は位置４で、ヒドロキシにより任意に置換され得る）；窒素、酸素又は硫黄により、1又は複数回、中断され得るC5-C6−ヘテロシクロアルキルであり、
R3が、C1-C10−カルボン酸又はC1-C10−スルホン酸であり、
Aが、シス-CH=CH- 又は-CH2-CH2-基であり、
Bが、トランス-CH=CH-又は-CH2-CH2-基であり、
Wが、C2-C6−アルキレンであり、
R4が、ヒドロキシ基であり、
R5が、水素、C1-C6−アルキル又はC1-C10−アルケニル基であり、
nが数値１〜４である、
請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R1が、-CH2OH、-COOR2、-CONHR2 又は-CONHR3基であり、
R2が、水素又はフェニルにより任意に置換されるC1-C4−アルキル基； C5-C6−シクロアルキル；フェニルにより任意に置換されるC3-C6−アリールであり、
R3が、C1-C6−カルボン酸又はC1-C6−スルホン酸であり、
Aが、シス-CH=CH- 又は-CH2-CH2-基であり、
Bが、トランス-CH=CH-又は-CH2-CH2-基であり、
Wが、C2−アルキレンであり、
R4が、ヒドロキシ基であり、
R5が、水素、飽和C1-C4−アルキル又はC1-C5−アルケニル基であり、そして
nが数値１〜４である、
請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の少なくとも１つの式Iの化合物を含んで成る薬剤。
【請求項５】
前記一般式Iのプロスタグランジン誘導体が有効量で存在することを特徴とする請求項４記載の薬剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物、及び適切な配合物質及びキャリヤーを含んで成る請求項４及び５記載の薬剤。
【請求項７】
薬剤としての使用のためへの請求項１〜３のいずれか１項記載の一般式Iのプロスタグランジン誘導体。
【請求項８】
受精能を促進するための請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
インビトロ受精のための請求項７記載の薬剤。
【請求項１０】
排卵を促進するための請求項７記載の薬剤。
【請求項１１】
損なわれた丘（cumulus）拡張及びその後遺症を排除するための請求項７記載の薬剤。
【請求項１２】
障害を処理するための請求項７記載の薬剤。
【請求項１３】
前記障害が受精能障害を包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項１４】
前記障害が痛みを伴う月経を包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項１５】
前記障害が子宮内膜症を包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項１６】
前記障害が高められた多眼内圧を包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項１７】
前記障害がオステオポローシスを包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項１８】
前記障害が高められた多血圧を包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項１９】
前記障害が自己免疫疾患を包含することを特徴とする請求項12記載の薬剤。
【請求項２０】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、二次進行性多発性硬化症、乾癬、リウマチ性関節炎、クローン病、及び円形脱毛から成る群から選択される請求項19記載の薬剤。
【請求項２１】
前記自己免疫患者が、多発性硬化症である請求項19記載の薬剤。
【請求項２２】
腸内、非経口、膣内及び経口投与のために医薬製品の形で存在する請求項１〜３のいずれか１項記載の一般式Iのプロスタグランジン誘導体。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物の調製方法であって、下記一般式II：
【化２】
2009516665.tif 000022
〔式中、R1は、基-COOR2, -CONHR3の意味を有し、そしてA及びR4は、上記に示される意味を有し、ここでR4における遊離OH基は保護されている〕で表されるアルデヒドを、下記一般式III ：
【化３】
2009516665.tif 000023
で表されるスルホンのカルバニオンと反応せしめ、そして得られるヒドロキシスルホンをアセチル化し、次に還元的除去によりオレフィンを得、そして適切な場合、いずれかの順序で保護されているヒドロキシ基を脱保護し、そして適切な場合、二重結合のエステル化、エーテル化及び/又は水素化、及び/又はエステル化されたカルボキシ基（R1=COOR2）及び/又は遊離カルボキシ基（COOR2, R2=H）のエステル化及び/又は遊離カルボキシ基（COOR2, R2=H）のアミド（R1=CONR2）への転換及び/又は遊離又はエステル化されたカルボキシ基（R1=CONHR3）の還元を行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、９−クロロ−15−デオキシプロスタグランジン誘導体類、それらの調製方法及び薬剤としてのそれらの使用に関する。
プロスタグランジンが女性の生殖生物学の工程、例えば排卵、受精、着床、脱落（例えば、胎盤形成）及び月経の調節におけるキー分子であることは長く知られている。プロスタグランジンは同様に、生殖路における病理学的変化、例えば月経過多症、月経困難症、子宮内膜症及び癌において重量な部分を演じる。プロスタグランジンがそれらの変化をもたらす機構はまだ完全には解明されていない。最近の結果は、プロスタグランジン、それらの受容体及びそのシグナルトランスダクション経路が脈管形成、アポプトシス及び増殖のような工程に関与されることを示す。
【０００２】
プロスタグランジンの効果は、細胞表面上に位置するそれらのGタンパク質結合受容体により介在される。機能的に異なる受容体サブタイプ、すなわちEP1, EP2, EP3及びEP4受容体への結合を通して広範囲の種類の細胞効果を有するプロスタグランジンE2(PGE2)が特に興味の対象である。従って、生殖機能がEP2−バックアウトマウス（EP2-/-）において損なわれ、そしてそれらの動物がより小さな“出産サイズ”を有することを示すことが可能である（Matsumoto et al., 2001 , Biology of Reproduction 64, 1557-1565）。
【０００３】
同様に、それらのEP2−ノックアウトマウス（Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 1999 Aug 31 ; 96(18):10501-10506）が明確に低められた丘拡張及び重度の生殖能力低下を示すことが可能であり、このことは、この工程のためのプロスタグランジンEP2受容体の有意性を示す。従って、EP2受容体は、女性用受精能を調節するための薬剤の開発のための重要な標的を提供する。EP2の４種のサブクラスが、選択的に活性なPGE2化合物の標的化された開発の可能性を開く。しかしながら、いずれの選択的EP2受容体リガンドもほとんど知られておらず、そして既知化化合物のほとんどはまた、他のEP2受容体サブタイプ、例えばEP4受容体に結合する。
【０００４】
ヨーロッパ特許EP1306087号は、勃起機能不全の処理に使用されるEP2受容体アゴニストを記載する。同じ構造種類がヨーロッパ特許EP860430号に記載されており、そして免疫学的障害、喘息及び流産の処理のための薬剤の生成へのそれらの使用が請求されている。WO04/32965号は、虚血症により引起される器官機能不全により引起される障害の処理及び予防のために使用されるEP2受容体アゴニストを記載する。WO04/009117号は、子宮収縮により引起される障害、例えば痛みを伴った月経の処理のためのEP2及びEP4受容体アゴニストを記載する。
【０００５】
WO03/74483号及びWO03/09872号は、EP2及びEP4受容体に平等に結合するアゴニストを記載する（Ono Pharmaceuticals）。
EP2及びEP4受容体のアゴニストが、オステオポローシスの処理（WO 99/19300号、US 2003/0166631号、WO 03/77910号、WO 03/45371号、WO 03/74483 号及び WO 03/09872号）及び緑内障の処理（WO 04/37813号、 WO 04/37786号、WO 04/19938号、WO 03/103772号、 WO 03/103664号、 US 6747037号、 US 6410591号、WO 03/40123号、WO 03/47513号、WO 03/47417号）に関して時折記載されている。
【０００６】
特許出願WO04/12656号は、炎症に関するEP2受容体アゴニストを請求している。
特許出願WO03/77919号は、受精能の処理のためのEP4受容体アゴニストを請求している。着床及び脱落のために結果的に寄与し、そして従って、受精能を促進する工程を調節する選択的EP2受容体アゴニストは今日まで記載されたことはない。
【０００７】
新規薬剤の開発のためにEP2受容体に結合する、安定し、選択的な且つ効果的な化合物を供給する目的それらから生じる。
Ono Pharmaceuticalsの上記ヨーロッパ特許（EP 0030377号及びEP 1306087号）は、位置９に塩素原子を有するプロスタグランジン誘導体を開示する。しかしながら、それらの特許に請求される化合物は、中でも、低級側鎖、例えば位置15又は16にヒドロキシ基を含んで成る。
【０００８】
今や、驚くべきことには、下記一般式I：
【化１】
2009516665.tif 000003
【０００９】
〔式中、R1は、CH2OH、-COOR2、-CONHR2 又は-CONHR3基であり、
R2は、水素；線状又は枝分かれであり、任意には、単〜多不飽和であり、そして次の置換基：ハロゲン、C1-C4−アルコキシ、置換されたC3-C10−アリール又は任意には置換されたC3-C10−アロイル、ジ−C1-C5−アルキルアミノ又はトリ−C1-C5−アルキルアミノにより単〜多置換されているC1-C10−アルキル基；C1-C4−アルキルにより任意に置換れているC3-C10−シクロアルキル；C3-C10−アリール（これは、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルにより任意に置換されていてもよく、これらは位置３及び４で、弗素、塩素、アルコキシ又はトリフルオロメチルにより、又は位置４で、ヒドロキシ、ハロゲン、フェニル、１又は複数のC1-C4-アルキル基、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、カルボキシ、ヒドロキシ又はC1-C4−アルコキシにより置換され得る）；又はC3-C7−ヘテロシクロアルキルであり、
【００１０】
R3は、C1-C15−カルボン酸又はC1-C15−スルホン酸であり、
Aは、シス-CH=CH- 又は-CH2-CH2-基であり、
Bは、トランス-CH=CH-又は-CH2-CH2-基であり、
Wは、C2-C6−アルキレンであり、
R4は、ヒドロキシ基、基O-R6又はO-R7であり、ここでR6はテトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル又はトリベンジルシリル基であり、そしてR7はC1-C15−カルボン酸であり、
R5は、水素、C1-C10−アルキル又はC1-C10−アルケニル基であり、
nは数値１〜４である〕
で表される化合物、生理学的に耐性の塩基とのその塩及びそのシクロデキストリンクラスレート化合物が、既知欠点を克服し、そしてヒドロキシ基の除去を通して、EP2受容体についての良好な選択性及び良好な活性及び作用のより長い持続性が達成され得ることが見出された。
【００１１】
アルキル基は、線状又は枝分かれ鎖のアルキル基、すなわち１〜10個のC原子を有する飽和及び不飽和アルキル基である。言及され得る例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ブテニル、イソブテニル、プロペニル、ペンテニル、ベンジル、ｍ−及びｐ−クロロベンジル基である。
【００１２】
アルキル基は任意には、ハロゲン原子、例えば弗素、塩素又は臭素により、アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシにより、任意には置換されたアリール又はアロイル基、例えばフェニルにより、又はジアルキルアミノ、例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジメチルアミノプロピル及びトリアルキルアンモニウムにより単〜多置換され得る（ここでは単置換が好ましい）。
【００１３】
適切なアリール基は、置換された及び置換されていないアリール基、例えばフェニル、１−ナフチル及び２−ナフチルであり、それらの個々は１〜３個のハロゲン原子、フェニル基、１〜４個のC原子をそれぞれ有する１〜３個のアルキル基、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、カルボキシ、ヒドロキシ、又は１〜４個のC原子を有するアルコキシ基により置換され得る。
【００１４】
シクロアルキル基は、環に３〜10個の炭素原子を含んで成る。環は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基により置換され得る。言及され得る例は、シクロペンチル、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル及びアダマンチルである。適切な複素環式基は、少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは窒素、酸素又は硫黄を含んで成る５−及び６−員の複素環である。言及され得る例は、２−フリル、２−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４ｋ−ピリジル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、３−フリル、３−チエニル、２−テトラゾリルである。
【００１５】
生理学的に耐性酸残基は、酸残基として適切である。好ましい酸は、脂肪族、脂環式、芳香族及び複素環式シリーズに属する、１〜15個の炭素原子を有する有機カルボン酸及びスルホン酸である。言及され得る置換基の例は、C1-C15−アルキル、ヒドロキシ、C1-C15−アルコキシ、オキソ及びアミノ基、又はハロゲン原子である。言及され得るカルボン酸の例は、次のものである：蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、トリメチル酢酸、ジエチル酢酸、tert-ブチル酢酸、シクロプロピル酢酸、シクロペンチル酢酸、 シクロヘキシル酢酸、シクロプロパンカルボン酸、シクロへキサンカルボン酸、フェニル酢酸、フェノキシ酢酸、メトキシ酢酸、エトキシ酢酸、モノタ−、ジ−、及びトリクロロ酢酸、アミノ酢酸、ジエチルアミノ酢酸、ピペリジノ酢酸、モルホリノ酢酸、乳酸、琥珀酸、アジピン酸、ハロゲンにより置換された安息香酸、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アルコキシル又はカルボキシ基、ニコチン酸、イソニコチン酸、フラン-2-カルボン酸、シクロペンチルプロピオン酸。
【００１６】
適切なスルホン酸の例は、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、イソプロパンスルホン酸、β−クロロエタンスルホン酸、ブタンスルホン酸、シクロペンタンスルホン酸、シクロへキサンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、N, N−ジメチルアミノスルホン酸、N, N−ジエチルアミノスルホン酸、N, N−ビス（β−クロロエチル）アミノスルホン酸、N, N−ジイソブチルアミノスルホン酸、N, N−ジブチルアミノスルホン酸、ピロリジノ−、ピペリジノ−、ピペラジノ−、N−メチルピペラジノ−及びモルホリノスルホン酸である。
【００１７】
ヒドロキシ基は、例えばエーテル化又はエステル化により機能的に変性され得る。
適切なエーテル残基は、当業者に知られている残基である。容易に排除され得るエーテル残基、例えばテトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリル又はトリベンジルシリル残基が好ましい。
【００１８】
適切なアシル残基は、R7下で言及されたカルボン酸である。名称により言及され得るそれらの例は、アセチル、プロピオニル、ブチリル及びベンゾイルである。
【００１９】
生理学的に耐性の塩の形成について当業者に知られているような無機及び有機塩基が、塩形成のために適切である。言及され得る例は、アルカリ金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属水酸化物、例えば水酸化カルシウム、アンモニア、アミン、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N−メチルグルカミン、モルホリン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、等である。
【００２０】
特に効果的であることがわかっている一般式Iの化合物は、
R1が、CH2OH、-COOR2、-CONHR2 又は-CONHR3基であり、
R2が、水素；線状又は枝分かれであり、任意には、単〜多不飽和であり、そして次の置換基：弗素、塩素又は臭素、C1-C4−アルコキシ、置換されたC3-C10−アリール又は任意には置換されたC3-C10−アロイル、ジ−C1-C5−アルキルアミノ又はトリ−C1-C5−アルキルアミノにより単置換されているC1-C10−アルキル基；C1-C4−アルキルにより任意に置換れているC5-C6−シクロアルキル；C3-C10−アリール（このC3−C10−アリール基は位置３及び４で、弗素、塩素、アルコキシ又はトリフルオロメチルにより、又は位置４で、ヒドロキシにより任意に置換され得る）；又は窒素、酸素又は硫黄により、1又は複数回、中断され得るC5-C6−ヘテロシクロアルキルであり、
【００２１】
R3が、C1-C10−カルボン酸又はC1-C10−スルホン酸であり、
Aが、シス-CH=CH- 又は-CH2-CH2-基であり、
Bが、トランス-CH=CH-又は-CH2-CH2-基であり、
Wが、C2-C6−アルキレンであり、
R4が、ヒドロキシ基であり、
R5が、水素、C1-C6−アルキル又はC1-C10−アルケニル基であり、
nが数値１〜４であるそれらである。
【００２２】
非常に効果的であることがわかっている一般式Iの化合物は、
R1が、CH2OH、-COOR2、-CONHR2 又は-CONHR3基であり、
R2が、水素；フェニルにより置換されるC1-C4−アルキル基； C5-C6−シクロアルキル；フェニルにより任意に置換されるC3-C6−アリールであり、
R3が、C1-C6−カルボン酸又はC1-C6−スルホン酸であり、
Aが、シス-CH=CH- 又は-CH2-CH2-基であり、
Bが、トランス-CH=CH-又は-CH2-CH2-基であり、
Wが、C2−アルキレンであり、
R4が、ヒドロキシ基であり、
R5が、水素、飽和C1-C4−アルキル又はC1-C5−アルケニル基であり、そして
nが数値１〜４であるそれらである。
【００２３】
本発明はさらに、一般式Iの本発明のプロスタン誘導体の調製方法に関し、
下記一般式II：
【化２】
2009516665.tif 000004
【００２４】
〔式中、R1は、基-COOR2, -CONHR3の意味を有し、そしてA及びR4は、上記に示される意味を有し、ここでR4における遊離OH基は保護されている〕で表されるアルデヒドを、下記一般式III ：
【００２５】
【化３】
2009516665.tif 000005
【００２６】
で表されるスルホンのカルバニオンと反応せしめ、そして得られるヒドロキシスルホンをアセチル化し、次に還元的除去によりオレフィンを得、そして適切な場合、いずれかの順序で保護されているヒドロキシ基を脱保護し、そして適切な場合、二重結合のエステル化、エーテル化及び/又は水素化、及び/又はエステル化されたカルボキシ基（R1=COOR2）及び/又は遊離カルボキシ基（COOR2, R2=H）のエステル化及び/又は遊離カルボキシ基（COOR2, R2=H）のアミド（R1=CONR2）への転換及び/又は遊離又はエステル化されたカルボキシ基（R1=CONHR3）の還元を行うことを特徴とする。
【００２７】
一般式IIのアルデヒドと、スルホンIIから生成されるカルバニオンとの反応は、不活性溶媒、例えばテトラヒドロフラン又はジエチルエーテルを用いて、−100℃〜24℃、好ましくは−100℃〜−70℃の温度で、それ自体既知の態様で生じる。スルホンIII のカルバニオンは、塩基、例えばブチルリチウム、メチルリチウム、カリウムtert−ブトキシド、水素化ナトリウム、リチウムジイソプロピルアミド、好ましくはブチルリチウムにより、従来の手段で生成される。カルバニオン形成は、−70℃〜25℃、好ましくは−78℃の温度で実施される。
【００２８】
生成されるヒドロキシ基のアセチル化は、適切な場合、塩基、例えばピリジンの存在下で、−78℃〜25℃の温度で、無水酢酸により既知態様で生じる。
一般式Iのトランス−オレフィンを得るための中間体アセトキシスルホンの還元性排除は、触媒量のクロロトリメチルシランの添加を伴って、メタノール中、マグネシウム粉末により生じる。その反応は、0℃〜60℃、好ましくは15℃〜25℃の温度で行われる。他方では、還元性排除はまた、ナトリウムアマルガムにより実施され得る。
【００２９】
R1が-CH2OHである一般式Iの化合物を得るための還元は、エステル又はカルボン酸を還元するために適切な還元剤、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、等により行われる。適切な溶媒は、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、トルエン、等である。還元は、−30℃〜使用される溶媒の沸点、好ましくは0℃〜30℃の温度で行われる。
【００３０】
機能的に変性されたヒドロキシ基は、既知方法により生成される。例えば、ヒドロキシ保護基、例えばテトラヒドロピラニル基の排除は、有機酸、例えばショウ酸、酢酸、プロピオン酸の水溶液において、又は無機酸、例えば塩酸の水溶液において行われる。溶解性を改良するために水相溶性不活性有機溶媒を添加することが好都合である。適切な有機溶媒の例は、アルコール、例えばメタノール及びエタノール、及びエーテル、例えばジメトキシエタン、ジオキサン及びテトラヒドロフランである。好ましくは、テトラヒドロフランが使用される。その排除は好ましくは、20℃〜80℃の温度で行われる。
【００３１】
アシル基は、アルコール又はアルコールの水溶液においてアルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物により加水分解される。適切なアルコールは、脂肪族アルコール、例えばメタノール、エタノール、ブタノール、等、好ましくはメタノールである。言及され得るアルカリ金属の炭酸塩及び水酸化物は、カリウム及びナトリウム塩である。カリウム塩が好ましい。
適切なアルカリ土類炭酸塩及び水酸化物の例は、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム及び炭酸バリウムである。反応は、−10℃〜＋70℃、好ましくは＋25℃で生じる。
【００３２】
R1についてのエステル基−COOR2（ここでR2は、１〜10個のC原子を有するアルキル基である）は、当業者に知られている方法により導入される。１−カルボキシ化合物は例えば、それ自体知られている態様においてジアゾ炭化水素と反応せしめられる。ジアゾ炭化水素によるエステル化は、不活性溶媒、好ましくはジエチルエーテル中、ジアゾ炭化水素の溶液と、同じか又は異なった不活性溶媒、例えば塩化メチレン中、１−カルボキシ化合物とを混合することにより生じる。反応が１〜30分で完結した後、溶媒が除去され、そしてエステルが従来の手段で精製される。ジアゾアルカンは、知られているか、又は既知方法により調製され得る（Org. Reactions Vol. 8, pages 389-394 (1954)）。
【００３３】
R1についてのエステル基COOR2（ここで、R2は、置換された又は置換されていないアリール基である）は、当業者に知られている方法により導入される。例えば、１−カルボキシ化合物は、不活性溶媒中、適切な塩基、例えばピリジン、DMAP、トリエチルアミンの存在下でジシクロヘキシルカルボジイミドと共に、適切なアリールヒドロキシ化合物と反応される。適切な溶媒は、塩化メチレン、塩化エチレン、クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、好ましくはクロロホルムである。反応は、−30℃〜＋50℃、好ましくは10℃で行われる。
【００３４】
初期生成物に存在するC=C二重結合を還元することが意図される場合、水素化がそれ自体知られている方法により生じる。
５，６二重結合の水素化は、貴金属触媒の存在下で水素雰囲気下で、低温、好ましくは約−20℃で、それ自体知られている態様で行われる。適切な触媒の例は、炭素上10％パラジウムである。
【００３５】
５，６二重結合及び13、14二重結合の両者が水素化される場合、より高い温度、好ましくは約20℃の温度が使用される。
一般式I（R2が水素原子である）のプロスタグランジンは、適切な量の適切な無機塩基を用いての中和により、塩に転換され得る。例えば、理論量の塩基を含む水への適切なプロスタグランジン酸の溶解が、水が蒸発されるか、又は水相溶性溶媒、例えばアルコール又はアセトンが添加された後、固体有機塩をもたらす。
【００３６】
アミン塩は、プロスタグランジン酸を、例えば適切な溶媒、例えばエタノール、アセトン、ジエチルエーテル、アセトニトリル又はベンゼンに溶解し、そしてこの溶液に、少なくとも理論のアミンを添加することにより従来の手段で調製される。これは通常、固体形で塩をもたらすか、又はそれは、溶媒の蒸発の後、通常の手段で単離される。
【００３７】
R1についてのアミド基−CONHR3は、当業者に知られている方法により導入される。一般式I（R2=H）のカルボン酸は最初に、第三アミン、例えばトリエチルアミンの存在下でイソブチルクロロホルメートにより、混合された無水物に転換される。適切なアミンのアルカリ金属塩又はアンモニア（R3＝H）と前記混合された無水物との反応は、−30℃〜＋60℃、の温度で、不活性溶媒又は溶媒混合物、例えばテトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミドにおいて生じる。
【００３８】
R1についてのアミド基−CONHR3を導入するための追加の可能性は、一般式I（R2=H）の１−カルボン酸（ここで、遊離ヒドロキシ基の中間体保護が任意には存在する）と、下記一般式IV：
O=C=N-R3      IV
〔式中、R3は、上記に示される意味を有する〕で表される化合物との反応から成る。
【００３９】
一般式IVのイソシアネートと、一般式I（R2=H）の化合物との反応は、適切な場合、第三アミン、例えばトリエチルアミン又はピリジンの添加により生じる。反応は、−80℃〜100℃、好ましくは0℃〜30℃の温度で、溶媒なしで、又は不活性溶媒、好ましくはアセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルアセトアミド、塩化メチレン、ジエチルエーテル、トルエン下で行われ得る。
【００４０】
出発材料がプロスタン残基にOH基を含む場合、それらのOH基はまた、反応せしめられる。最終的に所望される最終生成物がプロスタン残基に遊離ヒドロキシ基を含む場合、好ましくは容易に除去され得るエーテル又はアシル基による出発材料の中間体保護を伴って、出発材料から開始することが好都合である。
【００４１】
出発材料として使用される、一般式IIのアルデヒドは、知られているか、又は一般式V（好ましくは、R1は-COOCH3基を意味する）の９−ハロプロスタグランジンの13、14二重結合の、−20℃での塩化メチレン中、tert−ブチルヒドロペルオキシド及びチタン（IV）イソプロポキシドによる、それ自体知られている態様での選択的エポキシ化により調製され得る：
【００４２】
【化４】
2009516665.tif 000006
【００４３】
ジエチルエーテル中、過ヨウ素酸による続くエポキシド分解、及び適切な場合、例えばジヒドロピランによる11−ヒドロキシ基の保護は、一般式IIのアルデヒドをもたらす。
出発材料として使用される一般式III のスルホンは、一般式VIII（R5は上記に示される意味を有し、そしてハロゲンはヨウ素、塩素又は臭素であり得る）のアルキルハロゲン化物によるアルキル化により、一般式VII （式中、ｎは上記に示される意味を有する）のシクロアルキルカルボン酸から調製され得る：
【００４４】
【化５】
2009516665.tif 000007
【００４５】
アセトン中、ヨウ化メチル及び炭酸カリウムによるIXのエステル化に続いて、ジエチルエーテル中、水素化リチウムアルミニウムによる前記得られるメチルエステルのアルコールへの還元を伴う。ジメチルスルホキシド及び塩化メチレンの混合物中、トリエチルアミンの存在下でのSO2−ピリジン複合体によるアルコールの酸化は、一般式Xのアルデヒドをもたらす。続くWittig-Horner反応及び適切な場合、XIを得るためへの二重結合の水素化は、水素化ジイソブチルアルミニウムによる還元の後、一般式XIIのアルコールを導く。しかしながら、二重結合の水素化がまた、エステルXIのアルコールXII（ここでWは二重結合を意味する）への還元の後、行われ得る。
【００４６】
ヒドロキシ基の続く置換は、トルエン中、チオフェノールとの反応により、中間体トシル化の後、生じる。この手段で得られるチオエーテルXIIIの最終的に、メタノール水溶液において、一般式III のスルホンに酸化される。
【００４７】
プロスタグランジンE2と比較して、新規EP2アゴニストは、高い選択性及び安定性により区別される。EP2型の新規プロスタグランジン類似体は例えば、受精能障害、感染性疾患、癌、ウィルス感染、心血管障害、高められた眼内圧、緑内障、骨格系の障害、脈管形成障害、子宮収縮の異常性、痛み及び腎臓学的障害を包含する障害の処理及び予防のために適切である。
【００４８】
受精能障害とは、排卵が生じないこと、排卵された卵母細胞/丘細胞複合体が受精できないこと、受精された卵母細胞の着床が生じず、そして脱落が生じないことで導く障害を意味し、感染性疾患とは単細胞寄生体により引起される疾病を意味し、癌とは固形腫瘍及び白血病を意味し、ウィルス感染とはサイトメガロウィルス感染、肝炎、B及びC型肝炎及びHIV障害を意味し、心血管障害とは虚血性再灌流障害、狭窄、動脈硬化及び再狭窄を意味し、脈管形成障害とは例えば子宮内膜症を意味し、高められた眼内圧とは緑内障を意味し、子宮収縮の異常性とは例えば痛みを伴った月経を意味し、骨格系の障害はオステオポローシスを意味し、そして肝臓学的障害とは糸球体腎炎を意味する。
【００４９】
薬剤としての本発明の化合物の使用のためには、それらの化合物は、活性成分の他に、腸内又は非経口投与のために適切な有機又は無機の医薬不活性キャリヤー材料、例えば水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクテート、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、等を含んで成る医薬製品の形に転換される。医薬製品は、固体形で、例えば錠剤、被覆された錠剤、坐薬、カプセルとして、又は液体形で、例えば溶液、懸濁液又はエマルジョンとして存在することができる。それらはさらに、適切な場合、賦形剤、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、浸透圧を変えるための塩、又は緩衝液を含んで成る。
【００５０】
本発明は同様に、それらの医薬製品にも関する。
エアロゾル溶液は都合上、吸入により生成される。
タルク及び/又は炭水化物キャリヤー又は結合剤、例えばラクトース、トウモロコシ澱粉又はジャガイモ澱粉を含む、錠剤、被覆された錠剤又はカプセルが特に経口使用のために適切である。使用はまた、液体形、例えば甘味剤が、適切な場合、添加されている流体形でも可能である。
【００５１】
無菌の注射できる、水性又は油性溶液が非経口投与のために使用される。注射用溶液又は懸濁液が、特に適切であり、特にポリエトキシル化されたヒマシ油中、活性化合物の巣溶液が適切である。
坐薬は例えば、膣内投与のために適切であり且つ通例である。
使用され得るキャリヤー系は、界面活性賦形剤、例えば胆汁酸の塩、又は動物又は植物リン脂質、又はそれらの混合物、及びリポソーム又はその構成成分である。
【００５２】
本発明は同様に、腸内、非経口、膣内及び経口投与に関する。
本発明の化合物は、その必要な患者に、有効量で投与される。“有効量”とは、特定の障害を処理するか又は予防するために必要な量又は投与を意味し、ここで前記量又は投与量は過度の実験を伴わないで、当業界において知られている方法により決定され得る。
【００５３】
活性成分の投与量は、投与の経路、患者の年齢及び体重、処理される障害の性質及び重症度、及び類似する要因に依存して変化することができる。毎日の用量は、0.5〜1000mg、好ましくは50〜200mgであり、１日１度、投与される単一用量として与えられるか、又は１日２度又はそれ以上、分割して投与することが可能である。
本発明は同様に、少なくとも１つの一般式Iの化合物を含んで成る、上記に列挙される障害の処理のための薬剤、及び適切な配合物質及びキャリヤーを有する薬剤に関する。
【００５４】
本発明は同様に、受精能障害、感染性疾患、癌、ウィルス感染、心血管障害、高められた眼内圧、緑内障、骨格系の障害、脈管形成障害、子宮収縮の異常性、痛み及び腎臓学的障害を包含する障害の処理及び予防のための薬剤の生成のためへの一般式（I）の化合物の使用に関する。
【００５５】
受精能障害とは、排卵が生じないこと、排卵された卵母細胞/丘細胞複合体が受精できないこと、受精された卵母細胞の着床が生じず、そして脱落が生じないことで導く障害を意味し、感染性疾患とは単細胞寄生体により引起される疾病を意味し、癌とは固形腫瘍及び白血病を意味し、ウィルス感染とはサイトメガロウィルス感染、肝炎、B及びC型肝炎及びHIV障害を意味し、心血管障害とは虚血性再灌流障害、狭窄、動脈硬化及び再狭窄を意味し、脈管形成障害とは例えば子宮内膜症を意味し、高められた眼内圧とは緑内障を意味し、子宮収縮の異常性とは例えば痛みを伴った月経を意味し、骨格系の障害はオステオポローシスを意味し、そして肝臓学的障害とは糸球体腎炎を意味する。
【００５６】
一般式Iの本発明の化合物は、EP2受容体に結合し、そして拮抗作用を有する。ヒトPGE2受容体のEP2サブタイプへのPGE2の結合は、膜結合されたアデニル酸シクラーゼの活性化を誘発し、そしてcAMPの形成を導く。
図１は、拮抗試験においていずれの阻害も伴わないで（IC50>２×10e-5M）、細胞作動試験において非常に高い活性（EC50 <9.5×10e-10M）を示す。
本発明は同様に、EP2受容体アゴニストとしての本発明の物質の使用に関する。
【００５７】
一般式（I）の本発明の化合物は、前受精効果を有する。卵母細胞は、卵母細胞の回りで細胞の濃環を形成する丘細胞により、前排卵性腔小胞において取り囲まれる。黄体ホルモンピーク（LHピーク）の後、一連の工程が活性化され、そして丘細胞から構成される細胞のこの環における大きな形態学的変化を導く。この場合、丘細胞は、いわゆる丘拡張を導く細胞外マトリックスを形成する（Vanderhyden et al. Dev Biol. 1990 Aug;140(2):307- 317）。この丘拡張は、排卵工程及び続く受精の可能性の重要な成分である。
【００５８】
プロスタグランジン及びプロスタグランジンE2（それらの合成はLHピークにより誘発される）は、丘拡張において決定的に重要なものである。プロスタノイドEP2ノックアウトマウス（Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Aug 31 ;96(18):10501-6）は、著しく減じられた丘拡張及び重度の亜受精能を示し、このことは、この工程のためのプロスタノイドEP2受容体の重要性を示す。
【００５９】
EP2アゴニストは、丘複合体における濃度依存性の大きな拡張を導く。この物質により誘発される丘拡張は、1μMの濃度での天然のEP2受容体アゴニストPGE2により誘発される丘拡張に、0.5μM＝1μMの濃度で同等である（ｎ＝グループ当たりの16個の丘−卵母細胞複合体；図１を参照のこと）。
【００６０】
EP2アゴニストは、排卵された卵母細胞における濃度依存性の有意な上昇を導く。排卵された卵母細胞におけるこの有意な上昇は、個々の場合、動物当たりわずか0.00015mgの投与に基づいて発生し、そして排卵のために使用されるHCGの標準用量によってさえ、排卵された卵母細胞の数を高めることが可能であることを示す（ｎ＝グループ当たり11〜12匹の動物；**P<0.005及び*P<0.05；図２）。
【００６１】
本発明は同様に、受精能障害、例えば損なわれた又は不在の排卵、卵母細胞/丘細胞不複合体の損なわれた受精、損なわれた移植及び損なわれた脱落の処理のためへの本発明の化合物の使用に関する。
プロスタグランジンは、脈管形成において重要な部分を演じる（Sales, Jabbour, 2003, Reproduction 126, 559 - 567）。
【００６２】
子宮内膜症は、血管の損傷により引起される慢性の障害である。女性の約10％は、子宮内膜症の血管における変化により引き起こされる、月経間の重度の出血を通常有する。さらに、血管の構造的変化、例えば平滑筋細胞層の不完全な形成が観察されている（Abberton et al. 1999, Hum. Reprod. 14, 1072-1079）。月経の間の血液損失は血管の収縮により一部、調節されるので、平滑筋の欠陥は出血の実質的な寄与を引起す。
【００６３】
プロスタグランジン及びEP2受容体により介在される効果は同様に、子宮内膜損傷のホルモン調節を一部、演じる（Sun et al. 2003, Endocrinology 144, 3934-3942）。
【００６４】
増殖の証拠は、子宮内膜症が活性化されたマクロファージ及びリンパ球、及び高められたレベルのサイトカイン、ケモカイン及び成長因子により介在され得る有意な炎症応答に関連していることを示唆する。それらの炎症工程は、子宮内膜症に関連するいくつかの臨床学的特徴を介在することが判定される。子宮内膜症の女性の腹水は、多くの炎症細胞及びそれらの関連するサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を含むことが知られている（Murphy AA. Clinical aspects of endometriosis. Ann NY Acad Sci. March 2002;955:1-10）。その結果は、移植及び増殖を促進する環境である。
【００６５】
プロスタグランジン及びプロスタグランジンE2は、炎症サイトカイン、例えば活性化されたマクロファージからのTNFαの発現を低める。プロスタノイドEP2ノックアウトマウス（Shinomiya S et al. Regulation of TNFα and IL-10 production by prostaglandins I2 and E2: studies with prostaglandin receptor-deficient mice and prostaglandin E-receptor subtype-selective synthetic agonists. (Bioch Phar 2001 ; 61 1153）は、EP2アゴニストに応答せず、このことは、この工程に関してのプロスタノイドEP2受容体の重要性を示す。
【００６６】
表１は、EP2アゴニストが培養上清液において測定されるサイトカインレベルにおける阻害を導くことを示す。EP2アゴニストはまた、図３に示されるように、TNFαの有意な低下を引起す。
本発明は、子宮内膜症の処理のためへの一般式（I）の化合物の使用に関する。
プロスタグランジンは、子宮収縮において重要な部分を演じ、そして過度に強い収縮が痛みを伴っての月経の原因である（Sales, Jabbour, 2003, Reproduction 126, 559 - 567）。
【００６７】
本発明は、痛みを伴う月経の処理のためへの一般式（I）の物質の使用に関する。
EP2受容体アゴニストはさらに、眼内圧の調節において有意な部分を演じる。特に、EP2受容体が眼の小柱網（TM）の血管に高濃度で存在することを示すことが可能であった。涙はTM及びシュレム管を通して眼を離れ、そしてEP2受容体アゴニストは、涙流体の出流を刺激することにより涙流体の力学に影響を及ぼし、そして従って、眼内圧の低下を導く（W. Kamphuis et al. Current Eye Res. 2004, 29, 17-26）。本発明は、中でも、緑内障に関連する高められた眼内圧の処理のためへの本発明の物質の使用に関する。
【００６８】
プロスタグランジンはまた、オステオポローシスを妨げる工程において重要な部分を演じる。従って本発明は、オステオポローシスの処理のためへの本発明の物質の使用に関する。
プロスタグランジンはまた、血圧を調節する工程において重要な部分を演じる。従って、本発明は、高血圧の処理のためへの本発明の物質の使用に関する。
【００６９】
プロスタグランジンはまた、サイトカインの生成にも影響を及ぼす。多発性硬化症（MS）は、標的組織が中枢神経系である全身性Tリンパ球介在性自己免疫疾患として見なされる。Tリンパ球サイトカイン開放プロフィールは、Tヘルパー１又はTヘルパー２（Th−１又はTh−２）系統にゆがめられ得る。Th−１細胞は、サイトカイン、例えばインターフェロンγ（INF−γ）を分泌し、そして細胞介在性免疫応答を誘発し、ところがTh−２細胞はIL-4、IL-5及びIL-10を分泌し、そして体液性又は抗体−介在性応答を誘発する（Mossman et al. 1989, Annual Rev Immunol. 7: 145-173）。INF−γ発現はMSに関連し、そして障害の多因性測定を用いて、PLPペプチド及びMBPペプチドに応答してのINF−γの発現は障害と有意に相互関係される（Hirsch et al. 1985, J. Clin Immunol Nov; 5(6):386-389; Moldovan et al. 2003, J. Neuroimmunol. Aug; 141(1-2):132-140）。重要なことには、臨床学的研究は、IFN−γの投与がMS患者における再発を引起すことを示す（Panitch et al., Lancet, Apr 18; (8538):893-895）。
【００７０】
表２は、EP2アゴニストが活性化されたT細胞アッセイにおける活性化されたヒトドナーT細胞からのINF−γ発現の阻害を導くことを示す。表３は、EP2アゴニストの存在下で活性化されたヒトドナー単球由来の樹状突起細胞アッセイにおけるTh−１結合サイトカインのダウンレギュレーションを示す。従って、INF−γ発現を直接的に阻害することにより、及びINF−γを発現するTh−１系統からのCD4+T細胞の樹状突起細胞介在性分極化をゆがめることにより、EP2アゴニストは、MS患者におけるINF−γの発現を低めることが予測される。
【００７１】
本発明は同様に、自己免疫患者、例えば多発性硬化症、二次進行性多発性硬化症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、及び円形脱毛から成る群から選択された自己免疫患者の処理のためへの本発明の化合物の使用に関する。
出発化合物の調製が記載されていない場合、それらは知られているか、又は既知化合物、又は本明細書に記載される方法に類似して調製され得る。同目的の反応器において、又は組合わせ操作技法により、本明細書に記載されるすべての反応を実施することが、同様に可能である。
【００７２】
異性体の混合物は、従来の方法、例えば結晶化、クロマトグラフィー処理又は塩形成により、鏡像異性体又はE/Z異性体に分別され得る。
塩は、適切な場合、溶液に存在する、同等の量又は過剰の塩基又は酸を、式Iの化合物の溶液に添加し、そして従来の手段で沈殿物を分離するか、又は溶液を操作することにより、従来の手段で調製される。
従ってまた、本発明は、一般式Iの化合物及び従来の賦形剤又はキャリヤーに基づく薬剤にも関する。
次の例は本発明を詳細に説明するものであり、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００７３】
調製例：
例１：メチル（5Z, 13E）−（9R, 11R）−９−クロロ−11−〔（2H）−テトラヒドロピラン−２−イルオキシ〕−17, 17−テトラメチレン−20−ノル−5, 13−プロスタジエノエート
ヘキサン中、1.6Mのブチルリチウム溶液0.68mlを、2.4mlのテトラヒドロフラン中、290mgの１−フェニルスルホニル−４，４−（トリメチレン）へキサンの溶液に、窒素下で−78℃で滴下し、そしてその混合物を−78℃で1.5時間、撹拌する。次に、この溶液を、2.4mlのテトラヒドロフラン中、315mgのアルデヒド（例1cの）の溶液に−100℃で滴下する。次に、この混合物を、−100℃で30分間、及び−78℃で１時間、撹拌した。次に、0.16mlの無水酢酸を反応混合物に添加し、そしてその混合物を室温に１時間にわたって暖める。反応混合物を塩化アンモニウム溶液と共に混合し、そして酢酸エチルにより３度、抽出し、そして組合された有機相を水により１度及び飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。
【００７４】
中間体を6mlのメタノールに溶解し、そして窒素下で160mgのマグネシウム粉末を添加する。次に、その混合物を室温で15分間、撹拌する。次に１滴のクロロトリメチルシランを反応混合物に添加し、そして混合物をさらに３時間、室温で撹拌する。反応混合物を、5mlの氷冷却された塩化アンモニウム溶液に添加し、そして酢酸エチルにより３度、抽出し、そして組み合わされた有機相を、水により１度及び飽和塩化ナトリウムにより１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。ヘキサン/酢酸エチル（８：２）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理は、140mgのエステルをもたらす。
1H-NMR (CDCl3):δ= 0.75 (3H), 1.4-2.4 (30H), 3.44 (1H), 3.66 (3H)1 3.8-4.15 (3H), 4.63 (1H)1 5.15-5.65 (4H)。
【００７５】
出発アルデヒドを次の通りにして調製する：
1a）メチル（5Z）−（9R, 11R, 13RS, 14RS, 15S）−９−クロロ−11, 15−ジヒドロキシ−16, 16−ジメチル−13, 14−エポキシ−プロステノエート：
4.7mlのチタニウム（IV）イソプロポキシドを、窒素下で−20℃で、33mlの塩化メチレン中、6.52ｇのメチル（5Z, 13E）−（9R, 11R, 15R）−９−クロロ−11, 15−ジヒドロキシ−16, 16−ジメチル−5, 13−プロスタジエノエートの溶液に滴下し、そしてその混合物を−20℃で30分間、撹拌する。次に、6mlのtert−ブチルヒドロペルオキシドを反応混合物に添加する。100mlの水中、10gの硫酸鉄及び20gのクエン酸の溶液に続いて添加し、そしてその混合物を塩化メチレンにより３度、抽出する。組合された有機相を、飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。塩化メチレン/酢酸エチル（0〜40％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理は、無色油状物として3.55gのエポキシドをもたらす。
1H-NMR (CDCl3): δ = 0.75-1.05 (9H), 1.1-2.4 (18H), 2.9-3.0 (2H), 3.2 (1 H), 3.65 (3H), 4.0-4.15 (2H), 4.63 (1 H), 5.3-5.55 (2H)。
【００７６】
【化６】
2009516665.tif 000008
【００７７】
1b）メチル（5Z）−（9R, 11R）−９−クロロ−11−ヒドロキシ−14, 15, 16, 17, 18, 19, 20−ヘプタノール−12−オキソ−５−プロステノエート：
5gの過ヨウ素酸を、360mlのエーテルにおいて窒素下で１時間、激しく撹拌する。この溶液125mlを、5mlのエーテル中、2gのエポキシドの溶液に添加し、そしてその混合物を窒素下で室温で撹拌する。１時間後、追加の125mlの過ヨウ素酸溶液を、反応混合物に添加し、そして２時間後、過ヨウ素酸溶液の残りを添加する。濾過の後、濾液を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液により１度、水により1度及び飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。収量：1.9gのアルデヒド。
【００７８】
【化７】
2009516665.tif 000009
【００７９】
1c）メチル（5Z）−（9R, 11R）−９−クロロ−11−〔（2H）−テトラヒドロピラン−２−イルオキシ〕−14, 15, 16, 17, 18, 19, 20−ヘプタノル−12−オキソ−５−プロステノエート：
1.9gのアルデヒドを、20mlの塩化メチレンに溶解し、そして1.6mlのジヒドロピラン及び8.8mgのpTsOHと共に混合し、そして30分間、撹拌する。次に、その混合物をエーテルにより希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液により１度及び塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。シリカゲル上でのクロマトグラフィー処理〔第１カラム：塩化メチレン/酢酸エチル（２〜10％）、第２カラム：ヘキサン/酢酸エチル（0〜20％）〕は、720mgのテトラヒドロピラニルエーテルをもたらす。1H-NMR (CDCl3): δ= 1.35-2.7 (17H), 3.65 (3H), 3.4-4.1 (3H), 4.58 (2H), 5.3-5.55 (2H), 9.75 (1 H)。
【００８０】
【化８】
2009516665.tif 000010
【００８１】
スルホンの調製：
1d）２，２−（トリメチレン）ブタン酸：
180mlのテトラヒドロフラン中、61.6mlのジイソプロピルアミンの溶液を、窒素下で-10℃で275mlのブチリチウム（ヘキサン中、1M）に滴下し、そしてその混合物を-10℃で30分間、撹拌する。-20℃で、19.1mlのシクロブタンカルボン酸を、反応混合物に滴下し、そして反応混合物を４時間、撹拌し、この間、それは室温に暖まる。懸濁液を、300mlの氷水中に注ぎ、2Nの塩酸によりpH1に調節し、そして300mlのエーテルにより４度、毎回抽出し、そして組合された有機相を、飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。収量：30.1gのカルボン酸。1H-NMR (CDCl3): δ= 0.88 (3H), 1.75-1.95 (6H), 2.4 (2H)。
【００８２】
【化９】
2009516665.tif 000011
【００８３】
1e）２，２−トリメチレンブタン−１−オール：
62.2gの炭酸カリウム及び28mlのヨウ化メチルを、300mlのアセトン中、25.6gの1dの溶液に、窒素下で室温で添加し、そしてその混合物を12時間、撹拌する。次に、沈殿物を吸引により濾過し、そして濾液を室温で真空下で濃縮する。粗生成物を、500mlのエーテルに溶解し、そして水により１度及び飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、そして有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。残留物を、85mバール及び110℃（沸点85〜90℃）で真空下で蒸留する。収量：24.5gのエステル。
【００８４】
20gのエステルを40mlのエーテルに溶解し、この溶液を、窒素下で0℃で、390mlのエーテル中、4.8gの水素化リチウムアルミニウムの懸濁液に滴下し、そしてその混合物を、0℃で１時間及び室温で１時間、撹拌する。過剰の水素化リチウムアルミニウムを0℃で、11mlの水、11mlの15％水酸化ナトリウム溶液及び再び30mlの水により注意して分解する。20分間、撹拌し、続いて濾過し、そして次にエーテルにより十分に洗浄し、そして濾液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。収量：16.3gのアルコール。
【００８５】
48mlのトリエチルアミン及び22.27gのSO3−ピリジン複合体を、450mlの塩化メチレン及び100mlのジメチルスルホキシド中、8gのアルコールの溶液に、窒素下で室温で添加する。その混合物を１時間、撹拌し、次に300mlの飽和塩化アンモニウム溶液と共に混合し、そして再び15分間、撹拌する。次に、それを1.5Lのエーテルにより希釈し、相を分離し、そして有機相を、飽和塩化ナトリウム溶液により２度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。収量：9.5gのアルデヒド。
【００８６】
【化１０】
2009516665.tif 000012
【００８７】
1f）エチル4、４−（トリメチレン）−２−ヘキセンカルボキシレート：
20mlのテトラヒドロフラン中、18.3mlのトリエチルホスホノアセテートの溶液を、60mlのテトラヒドロフラン中、3.39gの水素化ナトリウムの懸濁液に、窒素下で0℃で添加し、そしてその混合物を室温で30分間、撹拌する。次に、アルデヒド（1eにおいて調製された）を、反応混合物に0℃で滴下し、そしてその混合物を室温で３時間、撹拌する。次に、それを飽和塩化アンモニウム溶液により急冷し、そしてエーテルにより３度、抽出し、そして組合された有機相を水により１度、飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。ヘキサン/エーテル（0〜10％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理は、9.81gのエステルをもたらす。1H-NMR (CDCl3): δ = 0.71 (3H), 1.27 (3H), 1.65 (2H), 1.78-2.1 (6H), 4.18 (2H), 5.75 (1 H), 6.97 (1 H)。
【００８８】
【化１１】
2009516665.tif 000013
【００８９】
1g）４，４−（トリメチレン）へキサン−１−オール：
78.5mlのDIBAHを、65mlの塩化メチレン中、1f）におけるようにして調製されたエステル7.8gの溶液に、窒素下で−70℃で、ゆっくり滴下する。30分後、20mlのイソプロパノール及び次に、36mlの水を、前記反応混合物にゆっくり滴下する。その混合物を室温で２時間、撹拌し、沈殿物を吸引により濾過し、そして塩化メチレンにより十分に洗浄し、そして濾液を真空下で濃縮する。ヘキサン/酢酸エチル（0〜40％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理は、5.4gのアリルアルコールをもたらす。5gのアリルアルコールを、200mlの酢酸エチルに溶解し、500mgのPd/Cと共に混合し、そして続いて、セライトを通して吸引により濾過し、そして酢酸エチルにより十分に洗浄する。真空下での濾液の濃縮により、4.5gの一次アルコールをもたらす。1H-NMR (CDCl3):δ= 0.8 (3H), 1.2-1.9 (12H), 3.6 (2H)。
【００９０】
【化１２】
2009516665.tif 000014
【００９１】
1h）１−フェニルチオ−４，４−（トリメチレン）へキサン：
7.4mlのトルエン中、6.19gのｐ−トルエンスルホニルクロリドの溶液を、1g）におけるようにして調製されたアルコール4.4g、25mlのトルエン、997mgのアンモニウムテトラブチルブロミド及び46mlの2NのNaOHの混合物に窒素下で0℃で滴下し、そしてその混合物を２時間、撹拌する。次に、相を分離し、そして有機相を、水により３度及び飽和塩化ナトリウム溶液により1度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。ヘキサン/エーテル（0〜20％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理により、4.6gのチオエーテルをもたらす。1H-NMR (CDCl3): δ= 0.75 (3), 1.39 (2H), 1.45-1.88 (10H), 2.88 (2H), 7.15-7.53 (5H)。
【００９２】
【化１３】
2009516665.tif 000015
【００９３】
１i）１−フェニルスルホニル−４，４−（トリメチレン）へキサン：
70mlの水中、18gのオゾンの溶液を、70mlのメタノール中、1h）におけるようにして調製された生成物4.6gの溶液に、窒素下で0〜10℃で滴下し、そしてその混合物を２時間、撹拌する。次に、それを100mlの水により希釈し、そして酢酸エチルにより４度、抽出し、そして組合された有機相を水により１度、飽和チオスルフェート溶液により２度、及び飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。ヘキサン/酢酸エチル（0〜20％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理により、2.55gのスルホンをもたらす。1H-NMR (CDCl3): δ= 0.7 (3H), 1.3-1.85 (12H), 3.08 (2H), 7.5-7.7 (3H), 7.9 (2H)。
【００９４】
【化１４】
2009516665.tif 000016
【００９５】
例２：メチル（5Z, 13E）−（9R, 11R）−９−クロロ−11−ヒドロキシ−17, 17−テトラメチレン−20−ノル−5, 13−プロスタジエノエート
2.5mgのpTsOHを、1.5mlのメタノール中、例１において調製された生成物140mgの溶液に窒素下で0℃で添加し、そしてその混合物を３時間、撹拌する。次に、その反応混合物を、3mlの飽和炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ、そして酢酸エチルにより３度、抽出し、そして組合された有機相を、飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。ヘキサン/酢酸エチル（0〜50％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理により、105mgのアルコールをもたらす。1H-NMR (CDCl3): δ= 0.75 (3H), 1.38-2.4 (24H), 3.65 (3H), 3.9-4.13 (2H), 5.2- 5.63 (4H)。
【００９６】
例３：（5Z, 13E）−（9R, 11R）−９−クロロ−11−ヒドロキシ−17, 17−テトラメチレン−20−ノル−5, 13−プロスタジエン酸
2Nの水酸化ナトリウム溶液0.2mlを、1mlのメタノール中、例２において調製されたアルコール68mgの溶液に、窒素下で添加し、そしてその混合物を５時間、撹拌する。次に、それを1mlの水により希釈し、2Nの塩酸によりpH3に調節し、そして酢酸エチルにより３度、抽出し、そして組合された有機相を、飽和塩化ナトリウム溶液により１度、洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして真空下で濃縮する。ヘキサン/酢酸エチル（50〜80％）を用いてのシリカゲル上でのクロマトグラフィー処理により、50.3mgのカルボン酸をもたらす。1H-NMR (CDCl3): δ= 0.75 (3H), 1.38-2.4 (24H), 3.9-4.1 (2H), 5.2-5.62 (4H)。
【００９７】
生物学的例：
１．ヒトプロスタグランジンE2（サブタイプEP2）受容体シグナルの拮抗性の検出：
１．１．検出の原理：
ヒトPGE2受容体のEP2サブタイプへのPGE2の結合は、膜結合されたアデニル酸シクラーゼの活性化を誘発し、そしてcAMPの形成を導く。ホスホジエステラーゼインヒビターIBMXの存在下で、この刺激のために蓄積し、そして細胞溶解により開放されるcAMPは、競争検出方法に使用される。このアッセイおいては、溶解物におけるcAMPが、Euクリプテート−ラベルされた抗−cAMP抗体の結合のためにcAMP-XL665と競争する。
【００９８】
これは、細胞cAMPの不在下で、cAMP-XL665分子へのこの抗体のカップリングに由来する最大のシグナルをもたらす。337nmでの励起の後、これは、665nm（及び620nm）で、FRET(蛍光共鳴エネルギー移行)に基づく長期生存発光シグナルをもたらす。それらの２種のシグナルを、タイムラグを伴って、すなわちバックグラウンド蛍光が低下した後、適切な測定装置により測定する。プロスタグランジンE2添加により引起される低FRETシグナルのいずれかの上昇（ウェル比率変化＝発酵665nm/発光620nm*10000として測定される）は、アンタゴニストの効果を示す。
【００９９】
１．２．検出方法：
１．２．１．拮抗アッセイ（384−ウェルプレートの個々のウェルについてのデータ）：
アッセイプレート中に導入される物質溶液（0.75μl）及び30％DMSOを、16μlのKRSB＋IBMX刺激溶液（1X Krebs- Ringer Bicarbonate Buffer; Sigma-Aldrich # K-4002; 750μM 3- isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich # 1-7018）に溶解し、そして次にその15μlを、直前にKRSBにより洗浄された、培地のない細胞培養プレート中に移す。
【０１００】
室温（RT）での30分間のプレインキュベーションの後、5μlの４×PGE2溶液（11nM）を添加し、そしてインキュベーションを、RTでさらに60分間、アゴニストの存在下で行い（体積：約20μl）、その後、反応を、5μlの溶解緩衝液の添加により停止し、そしてRTでさらに20分間インキュベートする（体積：約25μl）。次に、細胞溶解物を、測定プレートに移し、そして製造業者の説明書に従って測定する（cyclic AMPキットCisbio International #62AMPPEC）。
【０１０１】
１．２．２．作用性アッセイ（384ウェルプレートの個々のウェルについてのデータ）：
アッセイプレート中に導入される物質溶液（0.75μl）及び30％DMSOを、16μlのKRSB＋IBMX刺激溶液（1X Krebs- Ringer Bicarbonate Buffer; Sigma-Aldrich # K-4002; 750μM 3- isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich # 1-7018を含む）に溶解し、そして次にその15μlを、直前にKRSBにより洗浄された、培地のない細胞培養プレート中に移す。
【０１０２】
室温（RT：体積：〜15μl）での60分間のインキュベーションの後、反応を、５μlの溶解緩衝液の添加により停止し、そしてRTでさらに20分間インキュベートする（体積：〜20μl）。次に、細胞溶解物を、測定プレートに移し、そして製造業者の説明書に従って測定する（cyclic AMPキットCisbio International #62AMPPEC）。
試験化合物は、拮抗アッセイにおけるいずれの阻害も伴わないで（IC50>2×10e-5M）、細胞作用性アッセイにおいては、非常に高い活性（EC50<9.5×10e-10M）を示した。
【０１０３】
２．PGE2受容体のEP2サブタイプ及び前排卵性丘拡張：
２．１．バックグラウンド：
卵母細胞は、卵母細胞の回りで細胞の濃環を形成する丘細胞により、前排卵性腔小胞において取り囲まれる。黄体ホルモンピーク（LHピーク）の後、一連の工程が活性化され、そして丘細胞から構成される細胞のこの環における大きな形態学的変化を導く。この場合、丘細胞は、いわゆる丘拡張を導く細胞外マトリックスを形成する（Vanderhyden et al. Dev Biol. 1990 Aug;140(2):307- 317）。この丘拡張は、排卵工程及び続く受精の可能性の重要な成分である。
【０１０４】
プロスタグランジン及びプロスタグランジンE2（それらの合成はLHピークにより誘発される）は、丘拡張において決定的に重要なものである。プロスタノイドEP2ノックアウトマウス（Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Aug 31 ;96(18):10501-6）は、著しく減じられた丘拡張及び重度の亜受精能を示し、このことは、この工程のためのプロスタノイドEP2受容体の重要性を示す。
【０１０５】
２．２．インビトロでの丘拡張アッセイ：
小胞形成を、生後20〜24日での未熟雌マウス（株：Charles RiverからのCD1（ICR））において、単一用量（腹腔内）の7.5I.U. のPMSG（妊娠雌ウマゴナドトロピン; Sigma G-4877, Lot 68H0909）により誘発する。注射の47〜50時間後、卵巣を除き、そして丘−卵母細胞複合体を除く。その丘複合体はこの段階で拡張されない。
【０１０６】
次に、丘−卵母細胞複合体を、プロスタグランジンE2（PGE2）(1μM)、ビークル対照（エタノール）又は試験物質と共に20〜24時間インキュベートする。培地：0.1mMのIBMX、ピルベート（0.23mM）、グルタミン（2mM）（pen/strep 100IU/ml pen. 及び100μg/ml strep.）及びHSA（8mg/ml）を含むα−MEM培地。次に、丘拡張を、４段階への分割を通して確立する（Vanderhyden et al. Dev Biol. 1990 Aug;140(2):307-317に従って）。
試験物質は、丘複合体において濃度依存性の高い拡張を導く。0.5μM及び１μMの濃度でのこの試験物質により誘発される丘拡張は、1μMの濃度での天然のEP2受容体アゴニストPGE2により誘発された丘拡張に等しい（ｎ＝グループ当たり16の丘−卵母細胞複合体；図１を参照のこと）。
【０１０７】
２．３．インビボでの排卵アッセイ：
小胞形成を、生後16〜20日での未熟雌マウス（株：Charles Riverからの(B6D2F1)）において、単一用量（腹腔内）の10I.U. のPMSG（妊娠雌ウマゴナドトロピン; Sigma G-4877, Lot 68H0909）により誘発する。PMSG刺激の47〜50時間後、10IUのHCG（ヒト絨毛ゴナドトロピン）の用量を用いて、最終小胞成熟及び排卵を誘発する。試験物質を、HCG用量の10、5及び0時間前、投与する（ベンジルベンゾエート/ヒマシ油におけるs．c. 1＋４v/v）。HCG投与の14時間後、検死を行い、そしてFollopian管における排卵された卵母細胞の数を決定する。
【０１０８】
EP2アゴニストは、排卵された卵母細胞における濃度依存性の有意な上昇を導く。排卵された卵母細胞におけるこの有意な上昇は、個々の場合、動物当たりわずか0.00015mgの投与に基づいて発生し、そして排卵のために使用されるHCGの標準用量によってさえ、排卵された卵母細胞の数を高めることが可能であることを示す（ｎ＝グループ当たり11〜12匹の動物；**p<0.005及び*p<0.05）。
【０１０９】
３．PGE2受容体のEP2サブタイプ及びサイトカイン開放アッセイ：
３．１．バックグラウンド：
増殖の証拠は、子宮内膜症が活性化されたマクロファージ及びリンパ球、及び高められたレベルのサイトカイン、ケモカイン及び成長因子により介在され得る有意な炎症応答に関連していることを示唆する。それらの炎症工程は、子宮内膜症に関連するいくつかの臨床学的特徴を介在することが判定される。子宮内膜症の女性の腹水は、多くの炎症細胞及びそれらの関連するサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を含むことが知られている（Murphy AA. Clinical aspects of endometriosis. Ann NY Acad Sci. March 2002;955:1-10）。その結果は、移植及び増殖を促進する環境である。
【０１１０】
プロスタグランジン及びプロスタグランジンE2は、炎症サイトカイン、例えば活性化されたマクロファージからのTNFαの発現を低める。プロスタノイドEP2ノックアウトマウス（Shinomiya S et al. Bioch Phar 2001 ; 61 1153）は、EP2アゴニストに応答せず、このことは、この工程に関してのプロスタノイドEP2受容体の重要性を示す。
【０１１１】
３．２．インビトロでのサイトカイン開放アッセイ：
ヒトドナー単球由来の樹状突起の細胞を、10ng/mlのIL-4及び200ng/mlのGM-CSFの存在下で、10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640において６日間、培養する。細胞を、次の種々の活性化刺激物により、プロスタグランジンE2（PGE2）（１μM）、ビークル対照（DMSO）又は試験物質（１μM）の存在下で18時間、活性化する：10ng/mlのLPS（Sigma）、5μg/mlの組換えヒトCD−40リガンド（R＆D Systems）又は5μMのヒトCpG−DNA（Hycult Biotechnology）。個々のドナーのための細胞培養物上清液TNFαのレベルを、市販のELISAキットにより測定する。試験物質は、表１に示されるように培養物上清液において測定されるサイトカインレベルの阻害を導く。
【０１１２】
３．３．エクソビボでのサイトカイン開放アッセイ：
試験物質又はビークル対照を、それぞれ、30〜35gの体重のCD−１マウスの処理のグループに腹腔内投与する（ｎ＝５）。20分後、マウスを安楽死し、脾臓を除き、そして脾臓細胞を、RPMI＋10％ウシ胎児血清において培養する。細胞を、試験物質の不在下でPHA及びConAにより活性化し、そして18時間、培養する。個々のマウスについての細胞培養物上清液TNFαのレベルを、市販のELISAキットにより測定する。EP2アゴニストは、図３に示されるように、TNFαの有意な低下を引起す。
【０１１３】
４．Tリンパ球Th−１サイトカイン開放の阻害の証明：
４．１．原理：
抗原供給細胞、及びT細胞受容体を通しての抗原によるヒトTリンパ球の活性化は、レクチンコンカナビリンA（ConA）により、実験条件下で模倣される。ConAはT細胞受容体に結合し、そして細胞を刺激し、種々のサイトカインを開放することで知られている。Th−１開放サイトカインの１つは、INF−γである。INF−γの生化学及び生物学的活性は集中的に再考されて来た。
【０１１４】
４．２．検出方法：
INF−γは、発現される143個のアミノ酸タンパク質のダイマーである。INF−γに対して特異的な抗体に基づかれる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）は市販されている。標準及びサンプルをマイクロプレートのウェル中にピペットで入れる。ヒトINF−γに対して特異的な抗体をウェルに添加する。基質をウェルに添加し、そして色彩が結合されるINF−γの量に比例して進行する。色彩の強度を測定する。
【０１１５】
４．３．方法：
抹消血液リンパ球を、Ficoll密度グラジエントを用いて、ヒトドナーから単離し、そして残留赤血球を選択的溶解により除去する。リンパ球を、10％の追加のウシ胎児血清を有するRPMI1640において、ml当たり約106個の細胞で培養する。細胞培養物を、上記のようにして2μg/mlのConAにより活性化する。試験物質を、ConA活性化の間、種々の希釈度で添加する。細胞を37℃で約18時間インキュベートする。活性化の間、解放されるINF−γを、ELISAにより測定する。
【０１１６】
５．ヒト単球由来の樹状突起細胞サイトカイン開放の阻害の証明：
５．１．原理：
樹状突起細胞（DC）は、最も有能な抗原供給細胞であり、そして免疫応答において中心的役割を演じる。トール（toll）様受容体（TLR）を通しての刺激に続いて、DCは前炎症性サイトカイン及びケモカインを発現し、そして開放し、そして生来のT細胞の活性化及び増殖を誘発する。DC EP受容体へのEP2アンタゴニストの結合は、TLR4リガンド（LPS）刺激されたインターロイキン12（IL-12）開放を阻害する。DC EP受容体へのEP2アゴニストの結合は、TLR4リガンド（LPS）刺激されたインターロイキン10（IL−10）開放を阻害しない。従って、EP2アゴニストは、Th−系統からのCD4 T細胞分化を屈曲する。
【０１１７】
５．２．検出方法：
IL-12は、ジスルフィド結合により結合される、２種の遺伝子的に無関係のサブユニットから構成される、75kDaの糖タンパク質へテロダイマー（p70）である。IL-12 p70に対して特異的な抗体に基づかれる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）は市販されている。標準及びサンプルをマイクロプレートのウェル中にピペットで入れる。ヒトIL-12に対して特異的な抗体をウェルに添加する。基質をウェルに添加し、そして色彩が結合されるIL-12の量に比例して進行する。色彩の強度を測定する。
【０１１８】
最初、IL-10と呼ばれるサイトカイン合成阻害因子（CSIF）を、抗原供給細胞の存在下で抗原による刺激に対応するTh−１クローンによりサイトカインの生成を抑制するTh-２クローンの生成物として本来同定された。IL-10は、２種の同一の160個のアミノ酸サブユニットから構成されるダイマーである。IL-10に対して特異的な抗体に基づかれる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）は市販されている。標準及びサンプルをマイクロプレートのウェル中にピペットで入れる。ヒトIL-10に対して特異的な抗体をウェルに添加する。基質をウェルに添加し、そして色彩が結合されるIL-10の量に比例して進行する。色彩の強度を測定する。
【０１１９】
５．３．方法：
ヒト単球由来の樹状突起細胞を、Ficoll密度グラジエントを用いて、ヒトドナーから単離し、そして残留赤血球を、選択的溶解により除く。CD14 MicroBeadsを、CD14抗原の発現に基づいてのヒト細胞の分離のために使用する。樹状突起細胞を、ウシ胎児血清、200ng/mlのGM-CSF（ロイキン）及び10ng/mlのIL-4を有するRPMI1640において、ml当たり約1.5×106個の細胞で培養する。細胞を３日間、培養し、そして次に、培地を交換する。10ng/mlのLPSを用いて、細胞を活性化する。1μMの物質（EP2アゴニスト）及び1μMのPGE2を、LPS刺激の間、添加する。細胞を37℃で約18時間インキュベートする。活性化の間、開放されるIL-12及びIL-10を、ELISAにより測定する。
【０１２０】
表１は、インビトロでの活性化された単球細胞からのTNFα開放に対する試験物質の効果を示す。試験物質は、18μMの濃度で投与される。細胞を18時間、活性化する。試験物質は、Tリンパ球Th-1サイトカイン開放において用量応答して非常に高い阻害活性を示す。
【０１２１】
【表１】
2009516665.tif 000017
【０１２２】
表２は、Tリンパ球Th-1サイトカイン開放の阻害に対する試験物質の効果を示す。試験物質は、ConAによるそれらの活性化の間、細胞に用量依存的に添加される（0〜20nM）。細胞は18時間インキュベートされる。
【０１２３】
【表２】
2009516665.tif 000018
【０１２４】
表３及び表４は、ヒト単球由来の樹状突起細胞サイトカイン開放の阻害に対する試験物質の効果を示す。試験物質又はPGE2は、LPSによる細胞の刺激の間、1μMの濃度で添加される。細胞を18時間インキュベートする。試験化合物は、ヒト単球由来の樹状突起細胞（DC）サイトカイン開放アッセイにおいて高い免疫調節活性を示し、そしてTh-1促進サイトカインIL-12（表３）の抑制は、実際、Th-2促進サイトカインIL-10（表４）を高めた。
【０１２５】
【表３】
2009516665.tif 000019
【０１２６】
【表４】
2009516665.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、0.5μM及び１μMの濃度での試験物質により誘発される丘拡張を示す。この拡張は、1μMの濃度での天然のEP2受容体アゴニストPGE2により誘発される丘拡張と同等である（ｎ＝グループ当たり16の丘−卵母細胞複合体）。
【図２】図２は、インビボでの試験物質により誘発された排卵を示す。試験物質は、HCGの10、5及び0時間前、0.00015、0.0015及び0.015mg/動物の濃度で投与される。
【図３】図３は、エクスビボマウス脾臓細胞活性化に対する試験物質の効果を示す。細胞はPHA又はConAにより活性化される。試験物質は、殺害の20分まで、１及び２μg/動物の濃度で腹腔内投与される。
【図１】
2009516665.tif 000024
【図２】
2009516665.tif 000025
【図３】
2009516665.tif 000026
【国際調査報告】
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2009516665.tif 000028