(57)【要約】  本発明は、ヒアルロナンの合成量が増加した植物細胞および植物に関するものであり、ならびにこれらの植物を製造する方法、およびこれらの植物細胞または植物を利用してヒアルロナンを製造する方法に関する。本発明による植物細胞または遺伝子組み換え植物は、ヒアルロナン合成酵素活性を有しており、また野生型植物細胞または野生型植物と比較して、UDP−グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)活性が増加している。本発明はまた、ヒアルロナンおよびヒアルロナンを含む食品および飼料を製造するための、ヒアルロナン合成が増加している植物の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノム中に安定して組み込まれているヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を有している、遺伝子組み換え植物細胞であって、前記植物細胞が、対応する非遺伝子組み換え野生型植物細胞と比較して、UDP−グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)活性を有するタンパク質の活性がさらに増加している、植物細胞。
【請求項２】
UDP−グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)活性を有する該タンパク質の活性の増加を、植物細胞への外来核酸分子の導入によって引き起こす、請求項１で請求された遺伝子組み換え植物細胞。
【請求項３】
該外来核酸分子が、UDP−グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)の酵素活性を有するタンパク質をコードする、請求項１で請求された遺伝子組み換え植物細胞。
【請求項４】
ヒアルロナン合成酵素の活性を有し、かつUDP−グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)の活性は増加していない植物細胞と比較して、増加した量のヒアルロナンを合成する、請求項１、２または３のいずれか１項で請求された遺伝子組み換え植物細胞。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項で請求された、遺伝子組み換え植物細胞を含む植物。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項で請求された、遺伝子組み換え植物細胞を含む、請求項５において請求された植物の増殖材料。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項で請求された、遺伝子組み換え植物細胞を含む、請求項５において請求された植物の、収穫可能な植物部位。
【請求項８】
ヒアルロナンを合成する植物を製造する方法であって：
ａ）遺伝子組み換えが、以下のiからiiのステップを含む、植物細胞の遺伝子組み換えを行うステップ、
i)ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子を、植物細胞への導入するステッ
プ、
ii) 遺伝子組み換えを植物細胞へ導入するステップにおいて、遺伝子組み換えにより、対応する
非遺伝子組み換えの野生型植物細胞と比較して、UDP−グルコース脱水素酵素
(UDP-Glc-DH)の酵素活性を有するタンパク質の活性が結果として増大する
ステップ、
ここでステップiからiiは、任意の順序で、個々に行うことができ、又はステップiからiiの任意の組み合わせを同時に行うこともでき；
ｂ）ステップａ）からの植物細胞から植物を再生するステップ；適切な場合、ステップｂ）による植物を用いて、さらに植物を生成するステップ；
ｃ）適切な場合、ステップｂ）iまたはｂ）iiによって得られる植物から、植物細胞を単離し、およびヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸を有し、かつ対応する非遺伝子組み換え野生型植物細胞と比較して、ＧＦＡＴの酵素活性を有するタンパク質の活性が増加している植物が生成されるまで、ステップａ）からｃ）を繰り返す、
を含む、方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか１項で請求された遺伝子組み換え植物細胞から、請求項５で請求された植物から、請求項６で請求された増殖材料から、請求項７で請求された収穫可能な植物部位から、または請求項８で請求された方法によって得られた植物から、ヒアルロナンを抽出するステップを含む、ヒアルロナンを調製する方法。
【請求項１０】
ヒアルロナンを調製するための、請求項１から４のいずれか１項で請求された遺伝子組み換え植物細胞、請求項５に請求された植物、請求項６で請求された増殖材料、請求項７で請求された収穫可能な植物部位、または請求項８で請求された方法によって得ることができる植物、の使用。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか１項に請求された、遺伝子組み換え植物細胞を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１から４までのいずれか１項に請求された遺伝子組み換え植物細胞、請求項５で請求された植物、請求項６で請求された増殖材料、請求項７で請求された収穫可能な植物部位、または請求項８で請求された方法によって得られる植物を使用する、ヒアルロナンを含む組成物を調製する方法。
【請求項１３】
請求項１１で請求された組成物を調製するための、請求項１から４までのいずれか１項に請求された遺伝子組み換え植物細胞、請求項５で請求された植物、請求項６で請求された増殖材料、請求項７に請求された収穫可能な植物部位、または請求項８で請求された方法によって得られる植物、の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロナンの合成量が増加した植物細胞および植物に関し、および該植物を製造する方法、およびこれらの植物細胞または植物を利用してヒアルロナンを製造する方法に関する。本発明による植物細胞または遺伝子組み換え植物は、ヒアルロナン合成酵素活性を有しており、また野生型植物細胞または野生型植物と比較して、UDP−グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)活性が増加している。さらに、本発明はヒアルロナン、およびヒアルロナンを含む食品、または飼料を製造するための、ヒアルロナン合成が増加している植物の使用に関する。
【０００２】
ヒアルロナンは、天然に存在する非分岐、直鎖のムコ多糖類（グルコサミノグルカン）であって、グルクロン酸およびN-アセチル-グルコサミン分子の交互分子から構成されている。ヒアルロナンの基本的な構成単位は、二糖グルクロン酸-ベータ-1,3-N-アセチル-グルコサミンから成っている。ヒアルロナンにおいてはこれらの繰り返しユニットが、ベータ-1,4-結合を介して互いに結合している。薬学においては、用語ヒアルロン酸がしばしば用いられる。ヒアルロナンは、ほとんどの場合、遊離酸としてではなく、ポリアニオンとして存在することから、以下においては、用語ヒアルロナンを好ましくは用いるが、それぞれの用語は両方の分子型を包含すると理解されたい。
【０００３】
ヒアルロナンは、例えば、多価電解質、粘弾性、水に結合する高い能力、ゲル形成能、のような珍しい物理化学的特性を有しており、ヒアルロナンのさらなる特性に加えて、それらはLapic等の総説に記載している（1998, Chemical Review 98(8), 2663-2684）。
【０００４】
ヒアルロナンは、脊椎動物の細胞外結合組織および体液の成分である。ヒトにおいては、ヒアルロン酸は、全身の細胞、特に間葉系細胞の細胞膜によって合成され、体内において、結合組織、細胞外マトリックス、臍帯、滑液、軟骨組織、皮膚および目の硝子体で、特に高濃度で遍在する(Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural- Dissertation, Virchow-Klinikum Medizinische Fakultat Charite der Humboldt Universitat zu Berlin; Fraser ら, 1997, Journal of Internal Medicine 242, 27-33)。
最近、ヒアルロナンはまた、非脊椎動物(軟体動物)においても発見されている(Volpi and Maccari, 2003, Biochimie 85, 619-625)。
さらに、いくつかの病原性グラム陽性バクテリア(Streptococcus group A and C)、およびグラム陰性バクテリア(Pasteurella)は、ヒアルロナンが非免疫原性物質であるために、これらのバクテリアを宿主の免疫系による攻撃から保護するエキソ多糖類としてヒアルロナン合成する。
Chloerella属の単細胞緑色藻類に感染するウイルスは、その内のいくつかがParamecium種において内部共生体として存在するが、単細胞緑色藻類にウイルスによる感染後、ヒアルロナンを合成する能力を与える (Graves ら, 1999, Virology 257, 15-23)。しかしながら、ヒアルロナンを合成する能力は、問題となる藻類を特徴付ける特性では無い。該藻類がヒアルロナンを合成する能力は、そのゲノムがヒアルロナン合成酵素をコードする配列を有するウイルスによる感染を介している(DeAngelis, 1997, Science 278, 1800-1803)。さらに、該ウイルスゲノムはUDP-グルコース脱水素酵素(UDP-Glc-DH)をコードする配列を有している。UDP-Glc-DHは、ヒアルロナン合成酵素によって基質として用いられるUDP-グルクロン酸の合成を触媒する (DeAngelis ら, 1997, Science 278, 1800-1803, Graves ら, 1999, Virology 257, 15-23)。ヒアルロナン合成に関する、ウイルス感染Chlorella細胞におけるUDP-Glc-DHの発現の役割およびそれらがヒアルロナン合成に必要かどうかについては、知られていない。
天然に存在する植物は、ヒアルロナンの合成を触媒するタンパク質をコードするいかなる核酸もそのゲノム中に持たないし、植物炭水化物の多数が記述され特徴付けられているが、今まで、非感染植物においてヒアルロナンまたはヒアルロナン関連分子を検出することはできなかった(Graves ら, 1999, Virology 257, 15-23)。
【０００５】
ヒアルロナン合成酵素触媒は、単一の、膜に取り込まれた、または膜結合酵素、ヒアルロナン合成酵素（hyaluronan synthase）によって行われる。今まで研究されてきたヒアルロナン合成酵素は二つの群、クラスIヒアルロナン合成酵素およびクラスIIヒアルロナン合成酵素、に分類することができる(DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56, 670-682)。脊椎動物のヒアルロナン合成酵素は、同定されたアイソザイムによってさらに識別する。アイソザイムが異なると、アラビア数字を用いて、それらの同定順に名付ける（例えば、hsHAS1、hsHAS2、hsHAS3）。
【０００６】
細胞を囲んでいる培地への、細胞質膜を通しての合成されたヒアルロナン分子の輸送機構は、完全には解明されてはいない。初期の仮説は、細胞質膜を通しての輸送は、ヒアルロナン合成酵素それ自体によって行われると考えられた。しかしながら、より最近の研究結果は、細胞質膜を通してのヒアルロナン分子の輸送は、この反応を担う輸送タンパク質を介したエネルギー依存性の輸送によって起こることを示している。従って、突然変異によって能動輸送タンパク質の合成が阻害されている、Streptococcus株が産生された。これらの株は、対応する野生型のバクテリア株よりもヒアルロナンの合成量はすくなかった(Ouskova ら, 2004, Glycobiology 14(10), 931-938)。ヒト線維芽細胞において、既知の輸送タンパク質を特異的に阻害する薬剤を用いて、ヒアルロナンの生産量とヒアルロナン合成酵素の活性の両方を減少させることが可能であることを示すことができた(Prehm and Schumacher, 2004, Biochemical Pharmacology 68, 1401-1410)。植物中にヒアルロナンを輸送できる輸送タンパク質がどれほどの量存在するかは、もし存在するとしても、不明である。
【０００７】
ヒアルロナンの独特の性質により、例えば、薬学、化粧品産業、食品や飼料の生産、技術的な応用（例えば潤滑剤）、等のような種々の分野における応用について多様な可能性が与えられる。現在ヒアルロナンが使用されている最も重要な応用は、医薬品および化粧品の分野である（例えば、Lapcik ら, 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684, Goa and Benfield, 1994, Drugs 47(3), 536-566を参照)。
医学分野においては、ヒアルロナン含有産物は、関節症の関節内治療および眼科において眼の手術のために現在使用されている。ヒアルロナンはまた、競走馬における関節障害の治療のためにも使用されている。さらに加えて、ヒアルロン酸はいくつかの鼻薬の成分であり、例えば点眼薬、点鼻薬の型で乾燥した粘膜を潤すために用いられている。ヒアルロナンを含有する注射用溶液は鎮痛剤および抗リウマチ剤として使用されている。ヒアルロナンまたはヒアルロナン誘導体を含むパッチは傷の治癒のために使用されている。皮膚薬としては、ヒアルロナン含有ゲルインプラントが、形成手術において皮膚の変形を修正するために使用されている。
薬理学的応用に関しては、高分子量を有するヒアルロナンの使用が望ましい。
化粧用薬剤においては、ヒアルロナン製剤は、最適な皮膚充填物質の中の一つである。ヒアルロナンを注入することにより、ある一定期間皺を伸ばし、唇の容積を増やすことが可能である。
化粧品においては、特にスキンクリームおよびローションにおいて、ヒアルロナンはその高い水結合性のおかげで、湿潤剤としてしばしば用いられる。
【０００８】
さらに、ヒアルロナンを含有する製品は、関節症の予防と軽減のために、動物（たとえばイヌ、ウマ）にも使用できる、いわゆる栄養補助食品（食品サプルメント）としても販売されている。
【０００９】
商業目的で使用されるヒアルロナンは、現在動物組織（鶏冠）から単離するか、またはバクテリア培養を用いて発酵により調製している。US4,141,973は鶏冠からまたは代わりに臍帯からヒアルロナンを単離する方法を記載している。ヒアルロナンに加えて、動物組織（例えば鶏冠、臍帯）はまた、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンのようなヒアルロナンに関連したさらなるムコ多糖類を含んでいる。さらに動物体は、ヒアルロナンと特異的に結合するタンパク質（ヒアルドヘリン（hyaladherins））を含んでおり、このタンパク質は、例えば肝臓におけるヒアルロナンの分解、細胞移動のための主要な構造としてのヒアルロナンの機能、エンドサイトーシスの調節、細胞表面上のヒアルロナンの固着またはヒアルロナンネットワークの形成、のような生体における非常に異なった機能のために必要である(Turley, 1991 , Adv Drug Delivery Rev 7, 257 ff.; Laurent and Fraser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff.; Stamenkovic and Aruffo, 1993, Methods Enzymol. 245, 195 ff; Knudson and Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.)。
【００１０】
ヒアルロナンのバクテリア生産のために使用するStreptococcus株は、もっぱら病原性のバクテリアである。培養中もこれらのバクテリアは、培地に放出される（発熱性の）菌体外毒素および溶血毒素を（ストレプトリシン、特にアルファおよびベータヘモリシン）(Kilian, M.: Streptococcus and Enterococcus. In: Medical Microbiology. Greenwood, D.; Slack, RCA; Peutherer, J. F. (Eds.). Chapter 16. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK: pp. 174-188, 2002, ISBN 0443070776) を生産する。このことは、Streptococcus株からのヒアルロナンの精製および単離をより困難にする。特に医薬としての応用にとっては、製剤中の菌体外毒素およびヘモリシンの存在は問題である。
US 4,801,539は突然変異バクテリア株(Streptococcus zooedemicus)の発酵による、ヒアルロナンの調製について記載している。使用された突然変異バクテリアは、もはやベータヘモリシンを合成しない。達成された収率は、培養液１リットル当りヒアルロナン3.6gであった。
EP0694616は、Streptococcus zooedemicusまたはStreptococcus equiを培養する方法を記述し、用いられた培養条件下ではストレプトリシンは合成されず、ヒアルロナンの合成量が増加していた。達成された収率は、培養液１リットル当りヒアルロナン3.5gであった。
培養中Streptococcus株は酵素ヒアルロニダーゼを培養液中に放出し、その結果この生産システムにおいては、分子量が精製過程において減少する。ヒアルロニダーゼ陰性Streptococcus株の使用、または培養中のヒアルロニダーゼの生産が阻害されているヒアルロナンの製造方法がUS4782,046に記載している。達成された収率は、培養液１リットル当りヒアルロナン2.5gであり、2.4x106から4.0x106の分子量分布で、達成された最大平均分子量は、3.8x106Daであった。
US20030175902およびWO03 054163は、Bacillus subtilis におけるStreptococcus equisimilisからのヒアルロナン合成酵素の異種発現によるヒアルロナンの調製を記載している。ヒアルロナンの十分量の生産を達成するために、ヒアルロナン合成酵素の異種発現に加えて、Bacillus の細胞におけるＵＤＰ-グルコース脱水素酵素の同時発現もまた必要とされた。US20030175902およびWO03 054163は、Bacillus subtilisを用いた生産において得られたヒアルロナンの絶対量は、述べてはいない。達成された最大平均分子量は約4.2ｘ106であった。しかしながら、この最大平均分子量は、Streptococcus equisimilisからのヒアルロナン合成酵素をコードする遺伝子とBacillus subtilisからのＵＤＰ-グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子が、Bacillus subtilisゲノムに組み込まれて、amyQプロモーターの支配下にあり、かつ同時にBacillus subtilis内在のcxpY遺伝子（チトクロームP450オキシダーゼをコードする）が失活している、組み換えBacillus株を用いた時のみ達成された。
【００１１】
WO 05 012529は、クロレラ（Chlorella）−感染ウイルス由来のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を用いて、形質転換したトランスジェニックタバコの調製について記載している。WO 05 012529ではタバコ植物を形質転換するために、一方ではChlorellaウイルス株CVHI１の、他方ではChlorellaウイルス株CVKA1の、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列を用いた。ヒアルロナンの合成は、Chlorellaウイルス株CVKA1から単離したヒアルロナン合成酵素をコードする核酸で形質転換された植物においてのみ示された。Chlorellaウイルス株CVHI1から単離したヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列で形質転換されたタバコ植物については、対応するトランスジェニック植物において、ヒアルロナン合成を検出することは、不可能であった。WO 05 012529では、唯一のヒアルロナン産生トランスジェニックタバコによって合成されるヒアルロナンの量は、測定体積のml当りヒアルロナン約4.2μgと述べているが、問題となる実験を実施するための説明を考慮に入れると、植物材料の新鮮な重さグラム当り生産されるヒアルロナンは多くとも12μgの量に相当する。
【００１２】
ヒアルロナン合成酵素は、出発物質UDP-N-アセチルグルコサミンおよびUDP-グルクロン酸からのヒアルロナンの合成を触媒する。上述の両出発物質は植物細胞中に存在する。
【００１３】
植物細胞において、UDP-グルクロン酸は、アスコルビン酸の可能ないくつかの合成経路の一つの代謝物として (Lorence et la., 2004, Plant Physiol 134, 1200-1205)また植物細胞の小胞体において合成される細胞壁の成分であるペクチンおよびヘミセルロースの合成のための中心的な代謝物として、働く(Reiter, 1998, Plant Physiol Biochem 36(1), 167-176)。最も重要なそして最もしばしば見出されるペクチンのモノマーは、D-ガラクツロン酸であって（2004, H.W.Heldt in Plant Biochemistry, 3rd Edition, Academic Press, ISBN 0120883910）、それはUDP-グルクロン酸を用いて合成する。さらに、とりわけ、ヘミセルロースおよびペクチンの合成のための代謝物である、UDP-キシロース、UDP-アラビノース、UDP-ガラクツロン酸およびUDP-アピオースをUDP-グルクロン酸を用いて合成することも可能である(Seitz ら., 2000, Plant Journal, 21(6), 537-546)。植物細胞においては、UDP-グルクロン酸は、ヘキソースリン酸代謝（中でも、UDP-Glc-DHによるUDP-グルコースのUDP-グルクロン酸への転換を含む）または酸化ミオイノシトール代謝経路（グルクロン酸1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼによるグルクロン酸１リン酸のUDP-グルクロン酸への転換を含む）のいずれかを介して合成することができる。グルクロン酸の合成のための二つの代謝経路は、互いに独立して存在するか、またはその代わりにArabidopsis 植物の異なった組織／発生段階に存在するように思われる(Seitz ら., 2000, Plant Journal, 21(6), 537-546)。上述の二つの代謝経路（ヘキソースリン酸および酸化ミオイノシトール代謝経路）のUDP-グルクロン酸の合成に関するそれぞれの寄与は、今まで解明されていない（Kaerekoenen, 2005, Plant Biosystems 139(1), 46-49）。
【００１４】
酵素UDP-Glc-DHは、UDP-グルクコースのUDP-グルクロン酸への転換を触媒する。Samac等は(2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116, Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182)、Alfalfaの師部細胞における大豆からのUDP-Glc-DHの組織特異的な過剰発現を記述しているが、これはこれらの植物の茎におけるペクチン含有量を増加させる目的を持って行ったものである。対応する野生型植物と比較して、UDP-Glc-DHの活性は200％を越えて増加させることができたが、しかしながらその植物によって産生されるペクチンの量は、対応する野生型の植物によって産生されるペクチン量よりも低かった。問題となるトランスジェニック植物の細胞壁画分におけるキシロースおよびラムノースモノマーの量は、増加していたが、一方細胞壁画分におけるマンノースモノマーの量は減少していた。
【００１５】
Arabidosis植物におけるUDP-Glc-DHの構成的過剰発現により、結果として、対応する野生型の植物と比較して、異常な増殖を示し、矮型の表現型を有する問題の植物ができる。その植物の細胞壁画分は、対応する野生型の植物と比較して、マンノースとガラクトースは増量し、およびキシロース、アラビノースおよびウロン酸が減量していた(Roman, 2004, 「多糖類生合成におけるUDP-Glc-DHの役割の研究」学位論文、Acta Universitatis Upsaliensis, ISBN 91-554-6088-7, ISSN 0287-7476)。従って、これらの結果は、対応するトランスジェニック植物の細胞壁分画におけるマンノースの量の減少とキシロースの量の増加を発見したSamac等(2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116, Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182)の結果と少なくとも部分的に矛盾する。
【００１６】
バクテリア株の発酵によるヒアルロナンの生産は、高コストの問題が付いて来る。なぜなら、バクテリアは、高価な制御された培養条件下、密閉無菌容器内で発酵しなければならないからである（例えばUS4,897,349を参照）。さらに、バクテリア株の発酵によって生産できるヒアルロナンの量は、各場合に存在する生産設備によって制限される。ここで、発酵装置は、物理的法則の結果、過大な培養容積用に構築することはできないことを考慮にいれておかねばならない。外側から与えられる物質（例えばバクテリアのための必須栄養源、ｐH制御のための試薬、酸素）と、効率よい生産のために必要となる培養液との均一混合について、特に言っておいてもよいが、効率良い生産は大きな発酵器においては、たとえあったとしても、大きな技術的な経費によってのみ保証される。
【００１７】
動物生体からのヒアルロナンの精製は、動物組織中に他のムコ多糖類およびヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質が存在するために、複雑である。患者において、動物タンパク質によって汚染されたヒアルロナン含有医薬製剤の使用は、特に患者が動物タンパク質（例えば鶏卵卵白）に対してアレルギーである場合、体内で望ましくない免疫反応を引き起こす可能性がある(US 4,141,973)。さらに、満足できる品質と純度で、動物組織から得ることができるヒアルロナンの量(収率)は低く（鶏冠：0.079%w/w、EP0144019、US 4,782,046）、大量の動物組織の処理が必要となる。動物組織からのヒアルロナンの単離のさらなる問題は、動物組織にはまた、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ）をも含まれることから、精製中にヒアルロナンの分子量が事実上減少することにある。
【００１８】
上述したヒアルロニダーゼおよび外毒素に加えて、Streptococcus株はまた、医薬品に存在すれば患者の健康に危険をおよぼす内毒素も産生する。科学的な研究において、市販のヒアルロナン含有医薬品でさえ、バクテリアの菌体内毒素を検出可能量含んでいることが示された(Dick ら., 2003, Eur J Opthalmol. 13(2), 176-184)。Streptococcus株によって製造したヒアルロナンのさらなる不利な点は、単離ヒアルロナンは、鶏冠から単離されたヒアルロナンよりも分子量が小さい事実である(Lapcik ら. 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684)。US 20030134393は、特に強いヒアルロナンカプセル（スーパーカプセル化）を合成する、ヒアルロナン産生Streptococcus株の使用について記載している。発酵後単離されたヒアルロナンは、9.1x106の分子量を有していたが、収率はリットル当り350mgに過ぎなかった。
【００１９】
バクテリア発酵、または動物組織からの単離によるヒアルロナン生産のいくつかの不利な点は、トランスジェニック植物を用いたヒアルロナン生産によって避けることができる；しかしながら、トランスジェニック植物を用いて生産できるヒアルロナンの現在達成された収量では、ヒアルロナンの比較的大量を生産するためには、比較的広い面積の耕作を必要とする。さらに、ヒアルロナン含有量が低い植物からのヒアルロナンの単離または精製は、よりヒアルロナン含有量が高い植物からの単離または精製よりも、かなり複雑であり、コストがかかる。
【００２０】
ヒアルロナンは、通常では無い特性を有しているが、その希少さと高価のために、工業的な応用で使用されることは、あったとしても稀である。
【００２１】
従って、本発明の目的は、十分な量と品質のヒアルロナンの供給を可能にし、工業的な応用、ならびに食品および飼料分野への応用のためにさえもヒアルロナンの供給を可能にする、手段および方法を提供することである。
【００２２】
この目的は、請求項に要約した実施態様によって達成される。
【００２３】
従って、本発明は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、安定的にそれらのゲノムに組み込こまれた、核酸分子を有する、遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物に関するものであって、前記植物細胞または前記植物は、対応する非遺伝子組み換え野生型の植物細胞、または非遺伝子組み換え野生型の植物と比較して、UDP-グルコース脱水素酵素（UDP-Glc-DH）の(酵素)活性を有するタンパク質の活性が増加していることを特徴とする。
【００２４】
ここで、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物の遺伝子組み換えは、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を植物細胞、または植物に安定した組み込みをもたらし、対応する非遺伝子組み換え野生型の植物細胞、または非遺伝子組み換え野生型の植物と比較して、遺伝子組み換え植物細胞又は遺伝子組み換え植物におけるUDP-Glc-DH (酵素)活性を有するタンパク質の活性を増加させる、任意の遺伝子組み換えであり得る。
【００２５】
本発明との関連で、用語「野生型植物細胞」は、本発明による遺伝子組み換え細胞の調製のための出発材料として働く植物細胞を意味すると理解すべきであり、すなわちそれらの遺伝的情報は、導入されて、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子の安定した組み込み、およびUDP-Glc-DH活性を有するタンパク質の活性の増加をもたらす遺伝子組み換えは別として、本発明による遺伝子組み換え植物細胞の遺伝的情報に相当する。
【００２６】
本発明との関連で、用語「野生型植物」は、本発明による遺伝子組み換え植物の調製のための出発材料として働く植物を意味すると理解すべきであり、すなわちそれらの遺伝的情報は、導入されて、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子の安定した組み込み、ならびにUDP-Glc-DH活性を有するタンパク質の活性の増加をもたらす遺伝子組み換えは別として、本発明による遺伝子組み換え植物の遺伝的情報に相当する。
【００２７】
本発明との関連で、用語「対応する」は、複数の対象を比較する場合、互いに比較する問題となる対象が、同条件下に保たれたことを意味する。本発明との関連で、野生型植物細胞または野生型植物という背景における用語「対応する」は、互いに比較する植物細胞または植物は、同じ栽培条件下で栽培され、かつそれらは同じ（培養）齢を有していることを意味する。
【００２８】
本発明との関連で、用語「ヒアルロナン合成酵素」（EC 2.4.1.212）は、基質UDP-グルクロン酸(UDP-GlcA)およびN-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)からヒアルロナンを合成するタンパク質を意味するとして、理解するべきである。ヒアルロナン合成は、下の反応スキームに従って触媒される：
nUDP-GlcA + nUDP-GlcNAc → beta-1,4-[GlcA-beta-1,3-GIcNAc]n + 2 nUDP
【００２９】
ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列は、中でも、次の生物に関して記述されている：ウサギ(Oryctolagus cuniculus) ocHas2 (EMBL AB055978.1 , US 20030235893), ocHas3 (EMBL AB055979.1 , US 20030235893)；ヒヒ(Papio anubis) paHasi (EMBL AY463695.1 )；カエル(Xenopus laevis) xIHasi (EMBL M22249.1, US 20030235893), xlHas2 (DG42) (EMBL AF168465.1 ), xlHas3 (EMBL AY302252.1)；ヒト(Homo sapiens) hsHAS1 (EMBL D84424.1 , US 20030235893), hsHAS2 (EMBL U54804.1 , US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1 , US 20030235893);マウス(Mus musculus), mmHasi (EMBL D82964.1, US 20030235893), mmHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3 (EMBL U86408.2, US 20030235893)；ウシ(Bos taurus) btHas2 (EMBL AJ004951.1 , US 20030235893)；ニワトリ(Gallus gallus) ggHas2 (EMBL AF106940.1,US 20030235893)；ラット(Rattus norvegicus) rnHas 1 (EMBL AB097568.1 , ltano ら., 2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), rnHas2 (EMBL AF008201.1 ); rnHas 3 (NCBI NM_172319.1 , ltano ら., 2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678)；ウマ (Equus caballus) ecHAS2 (EMBL AY056582.1 , Gl:23428486)；ブタ (Sus scrofa) sscHAS2 (NCBI NM_214053.1 , Gl:47522921), sscHas 3 (EMBLAB159675), ゼブラフィッシュ (Danio rerio) brHasi (EMBL AY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1) brHas3 (EMBL AF190743.1); Pasteurella multocida pmHas (EMBL AF036004.2); Streptococcus pyogenes spHas (EMBL, L20853.1 , L21187.1 , US 6,455,304, US 20030235893); Streptococcus equis seHas (EMBL AF347022.1, AY173078.1); Streptococcus uberis suHasA (EMBL AJ242946.2, US 20030235893)；Streptococcus equisimilis seqHas (EMBL AF023876.1 , US 20030235893); Sulfolobus solfataricus ssHAS (US 20030235893); Sulfolobus tokodaii stHas (AP000988.1); Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 , cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893)。
【００３０】
本発明との関連で、用語「UDP-グルコース脱水素酵素（UDP-Glc-DH）」（E.C.1.1.1.22）は、UDP-グルコース(UDP-Glc)とNAD+から、UDP-グルクロン酸(UDP-GlcA)およびNADHを合成するタンパク質を意味すると理解されたい。この触媒は以下の反応スキームに従って進行する。
UDP-Glc + 2NAD+  →  UDP-GlcA + 2NADH
【００３１】
本発明との関連で、用語「UDP-Glc-DHの(酵素)活性を有するタンパク質の活性増加」は、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子の増加したという印象、および／または内UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする転写物量の増加、および／または細胞におけるUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の量の増加、および／または細胞におけるUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の酵素活性の増加、を意味する。
【００３２】
発現増加は、例えば、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする転写物の量を、例えば、ノーザンブロット分析またはRT-PCRによって測定することによって、決定することができる。ここで、増加とは、対応する、非遺伝子組み換え野生型の植物細胞、または非遺伝子組み換え野生型の植物に比較して、転写物質の量の増加が少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％および特に好ましくは少なくとも１００％であることを意味することが好ましい。UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする転写物の量の増加はまた、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする転写物の検出可能な量を有しない植物または植物細胞が、本発明による遺伝子組み換えの後、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする転写物の検出可能な量を有することも意味する。
【００３３】
問題となる植物細胞中でのこれらタンパク質の活性増加を引き起こす、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質量の増加は、例えばウエスタンブロット分析、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）またはRIA（放射免疫検定法）のような免疫学的方法によって測定することができる。特定のタンパク質と特異的に反応する、すなわち前記タンパク質と特異的に結合する、抗体を調製する方法は、当業者には知られている（例えば、Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik [Bioanalysis], Spektrum akad. Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4を参照)。いくつかの会社は（例えばEurogenetec, Belgium）は、注文によってそのような抗体の調製品を提供する。ここでは、タンパク質量の増加は、対応する、非遺伝子組み換え野生型の植物細胞または非遺伝子組み換え野生型の植物に比較して、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質量の増加が少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％および特に好ましくは少なくとも１００％であることを意味することが好ましい。UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の量の増加はまた、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の検出可能な量を有しない植物または植物細胞が、本発明による遺伝子組み換えの後、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の検出可能な量を有することも意味する。
【００３４】
植物抽出物におけるUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性増加は、例えばWO 00 1192に記載したような、当業者には公知の方法によって説明することができる。UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性の量を測定する好ましい方法は、一般法第５項に与えられる。
【００３５】
UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の増加した(酵素)活性の量は、対応する非遺伝子組み換え野生型の植物細胞、または非遺伝子組み換え野生型の植物に比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、および特別に好ましくは少なくとも１００％だけ該タンパク質の活性が増加することを意味することが好ましい。UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性量の増加は、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の検出可能な活性を有しない植物、または植物細胞が、本発明による遺伝子組み換えの後、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の検出可能な量を有することも意味する。
【００３６】
本発明との関連で、用語「ゲノム」は、植物細胞に存在する全遺伝物質を意味すると理解されたい。核に加えて、他の区画（例えばプラスチド、ミトコンドリア）もまた遺伝物質を含んでいることは、当業者に周知である。
【００３７】
本発明との関連で、用語「安定して組み込まれた核酸分子」は、植物のゲノムへの核酸分子の組み込みを意味すると理解されたい。安定して組み込まれた核酸分子は、対応する組み込み部位の複製化の間、組み込み部位と接する宿主の核酸配列と共に増幅し、複製DNA鎖における組み込み部位が、複製のためのマトリックスとして機能する読み取り鎖上にあると同じ核酸配列によって囲まれている。
【００３８】
植物宿主細胞へ核酸分子を安定して組み込ませるための、非常に多くの技術が利用できる。これらの技術としては、形質転換の手段としてAgrobacterium tumefacientsまたはAgrobacterium rhizogenesを用いた、t-DNAでの植物細胞の形質転換、プロトプラスト融合、注入、DNAの電気穿孔、微粒子銃によるDNAの導入、およびさらなる選択肢が挙げられる(総説 "Transgenic Plants", Leandro ed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7)。
植物細胞のアグロバクテリアを介しての形質転換の使用は、大きな研究課題であり、以下に詳細に記述している：EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley ら, Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 and in An ら, EMBO J. 4, (1985), 277-287。ジャガイモの形質転換に関しては、例えば、Rocha-Sosa ら, EMBO J. 8, (1989), 29-33)を参照、トマト植物の形質転換に関しては、例えば、US 5,565,347を参照。
【００３９】
アグロバクテリア形質転換に基づくベクターを用いた、単子葉植物の形質転換についても記述が存在する(Chan ら, Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei ら, Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng ら, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink ら., Plant Cell Reports 11 , (1992), 76-80; May ら, Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie ら, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265)。単子葉植物の形質転換の代替システムとしては、微粒子銃法を用いた形質転換 (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil ら, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala ら, Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer ら, Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631)、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性にした細胞の電気穿孔、ガラス繊維を用いたDNAの導入が挙げられる。特に、トウモロコシの形質転換は、文献に数回記述されている(例えば、 WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm ら, Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm ら, Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel ら, Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc ら, Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726を参照)。例えばスイッチグラス(Panicum virgatum)のような、他の草類の形質転換もまた記述されている(Richards ら, 2001 , Plant Cell Reporters 20, 48-54)。
他の穀類種の成功した形質転換もまた、例えばオオムギ(Wan and Lemaux, s.o.; Ritala ら, s.o.; Krens ら, Nature 296, (1982), 72-74)およびコムギ(Nehra ら, Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker ら, 1994, Plant Journal 5, 299-307)についても記述されている。上記の全ての方法は、本発明との関係において適切である。
【００４０】
先行技術と比較して、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物は、一つのヒアルロナン合成酵素の活性のみを有する植物よりも、より多量のヒアルロナンを産生するという利点を提供する。このことから、高いヒアルロナン含有量の植物からのヒアルロナンの単離はより単純で、対費用効果がより高いことから、ヒアルロナンを安価に生産することが可能になる。さらに、該先行技術において記述した植物と比較して、本発明による遺伝子組み換え植物を用いてヒアルロナンを生産するためには、必要とする耕作面積はより狭くなる。このことから、その希少さと高価さのために現在では用いられていない、工業的な応用にさえも十分な量のヒアルロナンを提供する可能性が与えられる。Chlorella属のウイルス感染植物体は、比較的大量のヒアルロナンを生産するためには不適当である。ヒアルロナンの生産において、ウイルス感染藻類は、ヒアルロナン合成に必要な遺伝子がそのゲノムに安定して組み込まれていないいう欠点を有しており(Van Etten and Meints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494)、それゆえにヒアルロナンの製造のためには、ウイルス感染を繰り返さなければならない。従って、ヒアルロナンの要求品質と要求量を連続して合成する、個々のChlorella細胞を単離することは不可能である。さらに、ウイルス感染Chlorella藻類においては、ヒアルロナンは、限られた期間のみ生産され、ウイルスに起因する溶菌によって、藻類は感染後たった約8時間で死ぬ(Van Etten ら, 2002, Arch Virol 147, 1479-1516)。対照的に、本発明は、本発明による遺伝子組み換え植物細胞および本発明による遺伝子組み換え植物が無性的にまたは有性的に、無制限に増殖可能であり、かつそれらがヒアルロナンを連続的に産生するという利点を提供する。
WO 05 012529に記述した、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を有するトランスジェニック植物は、比較的少量のヒアルロナンを合成する。対照的に、本発明は、本発明による遺伝子組み換え植物細胞および本発明による遺伝子組み換え植物が、ヒアルロナンをかなり大量に合成するという利点を提供する。
【００４１】
従って、本発明はまた、ヒアルロナンを合成する、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物を提供する。
【００４２】
発育時期において、ヒアルロナンは植物組織に蓄積することを観察した；従って、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物の、生重量または乾燥重量に対するヒアルロナン量を、特に好ましくは問題となる植物細胞、または問題となる植物の収穫中もしくは収穫する数（１または２）日前に測定するべきである。ここでは、ヒアルロナン量に関して、さらに処理するために用いることになる植物材料（例えば塊茎、種子、葉）を特に使用する。
【００４３】
ヒアルロナンを合成する、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物は、それらによって合成されるヒアルロナンを単離し、その構造を探査することにより、同定することができる。
【００４４】
植物組織はヒアルロニダーゼを含んでいないという利点を有していることから、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または本発明による遺伝子組み換え植物においてヒアルロナンの存在を確認するための、簡単で迅速な単離法を用いることができる。この目的のために、検査すべき植物組織に水を加え、植物組織を機械的に粉砕する（例えばビーズミル、ビーターミル、Warringブレンダージュース抽出器、等を使用して）。必要であれば懸濁液にさらに多くの水を加えてもよく、細胞残渣および水に不溶性の成分を遠心分離または篩によって除く。遠心分離の後に得られた上清中のヒアルロナンの存在は、その後、例えばヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質を用いて実証することができる。ヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質を用いてヒアルロナンを検出する方法は、例えば、US 5,019,498に記載している。US 5,019,498に記載した方法を実施する試験キットは、市販されている（例えば、Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001のヒアルロン酸（HA）試験キット）；一般方法４）項も参照。並行して、得られた遠心分離上清の一定分量をヒアルロニダーゼで最初に消化し、それから、上記のようにヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質を用いて、ヒアルロナンの存在を確認することが可能である。並行バッチにおけるヒアルロニダーゼの作用によって、完全な消化の後はヒアルロナンの有意な量を検出することがもはやできないように、そこに存在するヒアルロナンを分解する。
遠心分離上清中のヒアルロナンの存在は、さらにまた、例えばIR、NMRまたは質量分光分析のような他の分析法を用いて確認できる。
【００４５】
すでに上述の如く、今までの所、どの代謝経路（ヘキソースリン酸、または酸化ミオイノシトール代謝経路）が、植物細胞中でUDP-グルクロン酸を合成するために用いる主要な経路であるか、また両方の代謝経路が、植物の組織および／または発生段階によって、UDP-グルクロン酸の合成に対する異なる定量的な寄与をするのかについては解明されていない。さらに、トランスジェニック植物におけるUDP-Glc-DHの過剰発現は、一貫した結果を与えず、該方法を用いて細胞壁のペクチン含有量を増加させるという目標は、達成できなかった。さらに加えて、UDP-Glc-DHの活性を用いたタンパク質の活性の制御は、UDP-キシロースによって阻害される。このことは、原核生物(Campbell ら, 1997, J. Biol. Chem. 272(6), 3416-3422; Schiller ら, 1973, Biochim. Biophys Acta293(1), 1-10)、動物(Balduni ら, 1970. Biochem. J. 120(4), 719-724)、および植物(Hinterberg, 2002, Plant Physiol. Biochem. 40, 1011-1017)に由来する、問題となるタンパク質について実証された。
【００４６】
何が植物細胞中で合成されるヒアルロナンの量を制限するかについては、文献中には示唆されていない。
従って、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を有する遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物、およびヒアルロナン合成酵素活性のみを有する遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物と比較して、UDP-Glc-DH活性がさらに増加した遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物が、ヒアルロナンの有意に高い量を産生することを発見したのは驚きである。
【００４７】
好ましい一実施態様では、本発明は、ヒアルロナン合成酵素の活性（のみ）を有する遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物と比較して、もしくはヒアルロナン合成酵素の活性を有し、およびUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性が増加していない遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物と比較して、ヒアルロナンの生産量が増加していることを特徴とする本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に関する。
【００４８】
本発明との関連で、用語「ヒアルロナン合成酵素の活性（のみ）を有する植物細胞または植物」は、対応する非遺伝子組み換え野生型植物細胞または非遺伝子組み換え野生型植物と比較して、遺伝子組み換えがヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を含むという点において構成されている、遺伝子組み換え植物細胞または遺伝子組み換え植物を意味するとして理解されたい。
【００４９】
特に、「ヒアルロナン合成酵素の活性（のみ）を有する植物細胞または植物」は、それらがヒアルロナンを合成し、および非遺伝子組み換え野生型植物細胞または非遺伝子組み換え野生型植物にヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を導入する以外はどのような追加の遺伝子組み換えを有しないことを特徴とする。好ましくは、該植物では、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性は増加していない。
【００５０】
植物細胞または植物によって生産されるヒアルロナンの量は、例えば市販の試験キット(例えば、Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001のヒアルロン酸（HA）試験キット）を用いて上述の方法で測定することができる。本発明との関連で、植物細胞または植物におけるヒアルロナン含有量を測定する好ましい方法は、一般法第４項の下に記述する。
【００５１】
本発明のさらなる一実施態様では、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または本発明による遺伝子組み換え植物は、ヒアルロナンを合成する陸上植物（単数および複数）の植物細胞である。
【００５２】
本発明との関連で、用語「陸上植物(Embryophyta)」は、Strasburger, "Lehrbuch der Botanik" [Textbook of Botany], 34th ed., Spektrum Akad. Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6)に定義したものと理解されたい。
【００５３】
本発明の好ましい一実施態様は、多細胞植物の本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または多細胞生物である、本発明による遺伝子組み換え植物に関する。従って、この実施態様は、単細胞植物（原生生物）に由来したものではなく、または原生生物ではない、植物細胞または植物に関する。
【００５４】
本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物は、原則として、任意の植物種のそれぞれ植物細胞または植物である、すなわち単子葉および双子葉植物である。それらは好ましくは、作物植物である、すなわちヒトや動物の食物や飼料にする目的で、またはバイオマスを製造するために、および／または技術的、工業的な目的で物質を調製するために、ヒトが栽培する植物（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、アルファルファ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、マニオク、ジャガイモ、トマト、スイッチグラス(Panicum virgatum)、サゴヤシ、リョクトウ、pas、ソルガム、ニンジン、ナス、ダイコン、アブラナ、ダイズ、ピーナッツ、キウリ、カボチャ、メロン、ニラ、ニンニク、キャベツ、ホウレンソウ、サツマイモ、アスパラガス、クルゼット、レタス、チョウセンアザミ、スイートコーン、パースニップ、フタナミソウ、エルサレムアーティチョーク、バナナ、テンサイ、サトウキビ、ビートルート、ブロッコリ、キャベツ、タマネギ、イエロービート、タンポポ、イチゴ、リンゴ、アプリコット、プラム、モモ、ブドウ、カリフラワー、セロリ、ピーマン、スウェーデンカブ、ルバーブ）。トマト、またはジャガイモ植物が特に好ましい。
【００５５】
好ましい一実施態様では、本発明は、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が、ウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に関する。ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、藻類に感染するウイルスのヒアルロナン合成酵素を好ましくはコードする。
藻類に感染するウイルスに関して、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、好ましくはChlorellaに感染するウイルスのヒアルロナン合成酵素、特に好ましくは、Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のヒアルロナン合成酵素、さらに特に好ましくはParamecium bursaria Chlorella Virus 1のH1株のヒアルロナン合成酵素をコードする。
【００５６】
さらに好ましい一実施態様では、本発明は、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または本発明による遺伝子組み換え植物に関するもので、そこではヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、そのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子のコドンが、ヒアルロナン合成酵素が由来する生物のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子のコドンと比較して、組み換えされていることを特徴とする。ヒアルロナン合成酵素のコドンは、そのゲノムに組み込まれる、または組み込まれることになる植物細胞または植物のコドンの使用頻度に適応するように組み換えされていることが、特に好ましい。
【００５７】
遺伝コードの縮重のために、アミノ酸を一つ以上のコドンによってコードできる。異なった生物においては、アミノ酸をコードするコドンは、異なった頻度で使用する。コードする核酸配列のコドンを、そのゲノムに発現されるべき配列が組み込まれる植物細胞、または植物における使用頻度に適応させることは、翻訳されるタンパク質の増量、および／またはその特定の植物細胞または植物における問題となるｍRNAの安定性に寄与する可能性がある。問題となる植物細胞、または植物におけるコドンの使用頻度は、あるコドンがあるアミノ酸をコードするために使用する頻度に対し、問題となる生物のコードする核酸配列をできるだけ多く調べることにより当業者が決定できる。ある生物のコドンの使用頻度は、当業者に周知であり、コンピュータプログラムを用いて、簡単で迅速に決定することができる。適切なコンピュータプログラムは、公開されており、無料でとりわけインターネット上で提供されている(例えばhttp://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.jp/codon/; http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。
コードする核酸配列のコドンを、そのゲノムに発現されるべき配列が組み込まれる植物細胞、または植物における使用頻度への適応は、インビトロ突然変異誘発、または好ましくは、遺伝子配列のデノボ合成によって行うことができる。核酸配列のデノボ合成法は当業者に周知である。デノボ合成は、例えば、個々の核酸オリゴヌクレオチドを最初に合成し、DNAの二重鎖を形成するように、これらをこれらと相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そして欲する核酸配列が得られるように個々の二重鎖オリゴヌクレオチドを結合することにより、行うことができる。用いるコドンの使用頻度をある特定の標的生物に適応させることを含む、核酸配列のデノボ合成はまた、このサービスを提供する会社に委託することも可能である(例えば、Entelechon GmbH, Regensburg, Germany)。
【００５８】
ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、そのアミノ酸配列が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％、配列番号２に示されているアミノ酸配列と同一であることを特徴とすることが好ましい。特に好ましい一実施態様では、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする。
【００５９】
さらなる一実施態様では、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％、配列番号１または配列番号３に示される核酸配列と同一である。特に好ましい一実施態様では、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子は、配列番号３に示される核酸配列と同一であることを特徴とする。
【００６０】
2004年8月25日、Paramecium bursaria Chlorella ウイルスヒアルロナン合成酵素をコードする合成核酸分子を含む プラスミドIC 341-222をブダペスト条約に従ったthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (ドイツ微生物および培養細胞集積所)GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Germany, DSM16664番号で寄託された。配列番号2に示されるアミノ酸配列は、プラスミドIC 341-222に組み込まれた核酸配列のコード領域に由来することが可能であり、Paramecium bursaria Chlorella ウイルスヒアルロナン合成酵素をコードする。
【００６１】
従って、本発明はまた、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が、プラスミドDSM16664に挿入された核酸配列のコード領域に由来し得るアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすること、あるいはそのアミノ酸配列が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％、プラスミドDSM16664に挿入された核酸配列のコード領域に由来し得るアミノ酸配列と同一であることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に関する。
【００６２】
本発明はまた、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が、プラスミドDSM16664に組み込まれたヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列であること、あるいはプラスミドDSM16664に組み込まれた核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％、同一であることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に関する。
【００６３】
本発明はさらにまた、安定してゲノムに組み込まれた外来核酸分子を有し、前記外来核酸分子が、対応する非遺伝子組み換えの野生型の植物細胞、または対応する非遺伝子組み換えの野生型の植物と比較して、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を増加させることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に関する。
【００６４】
本発明との関連で、用語「外来核酸分子」は、対応する野生型植物細胞では天然には存在しない、または野生型の植物細胞では、具体的な空間的配置で天然には存在しない、または天然には存在しない野生型植物細胞のゲノムの部位に局在する分子を意味すると理解されたい。好ましくは、外来核酸分子は、それらの組み合わせ、または特定の空間的配置が植物細胞では天然には存在しない種々の要素を含む、組み換え分子である。
【００６５】
本発明との関連で、用語「組み換え核酸分子」は、ある組み換え核酸分子に存在するような組み合わせでは、天然に存在しない種々の核酸分子を含む、核酸分子を意味すると理解されたい。従って、組み換え核酸分子は、ヒアルロナン合成酵素および／またはUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に加えて、上述の核酸分子との組み合わせでは天然に存在しない核酸配列をさらに含む。ヒアルロナン合成酵素、またはUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子と組み合わせて、組み換え核酸分子上に存在する、上述のさらなる核酸配列は、任意の配列であってもよい。例えば、それらは、ゲノム植物核酸配列であってもよい。さらなる核酸配列は、好ましくは、制御配列（プロモーター、終止シグナル、エンハンサー）であり、特に好ましくは植物組織において活性を有する制御配列であり、特に好ましくは、植物組織において活性を有する組織特異的な制御配列である。組み換え核酸分子を産生する方法は、当業者に周知であり、例えば、核酸分子の結合による結合、遺伝的組み換え、または核酸分子のデノボ合成のような遺伝子工学の方法を含む(例えば Sambrok ら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel ら, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929を参照)。
【００６６】
一つの外来核酸分子がそのゲノムに安定して組み込まれ、または複数の外来核酸分子がそのゲノムに安定して組み込まれ、ヒアルロナン合成酵素をコードし、対応する非遺伝子組み換え野生型植物細胞または非遺伝子組み換え野生型植物と比較して、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性が増加している遺伝子組み換え植物細胞および遺伝子組み換え植物は、前記野生型植物細胞および該野生型植物から識別可能であるが、とりわけそれらが野生型植物細胞および野生型植物には天然には存在しない外来核酸分子を含むことから、またはそのような分子が本発明による遺伝子組み換え植物細胞のゲノムの、または本発明による遺伝子組み換え植物のゲノム上の、野生型の植物細胞または野生型の植物においては存在しない、つまり異なったゲノム環境のある部位に組み込まれていることによって識別可能である。さらに、該本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物は、それらがゲノムに安定して組み込まれた少なくとも外来核酸分子の少なくとも一つのコピーを含んでいるという点において（適切な場合、野生型の植物細胞、または野生型植物に天然に存在する該分子のコピーに加えて）、それぞれ非遺伝子組み換え野生型植物細胞、または非遺伝子組み換え野生型植物から識別できる。本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に導入された外来核酸分子が、野生型の植物細胞または野生型の植物に既に天然に存在する分子の追加のコピーである場合は、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物は、特にこの追加のコピー／これらの追加の複数のコピーは、野生型植物細胞、および野生型植物のそれぞれにおいては存在しないゲノムの部位に、局在化しているという事実によって、野生型の植物細胞、および野生型の植物からそれぞれ識別できる。
核酸分子の植物細胞または植物のゲノムへの安定した組み込みは、遺伝的な方法、および／または分子生物学的方法によって実証することができる。核酸分子の植物細胞または植物のゲノムへの安定した組み込みは、前記核酸分子を受け継いだ子孫において、安定して組み込まれた核酸分子は、親世代におけると同じ遺伝的環境に存在することを特徴とする。植物細胞のゲノムにおける、または植物のゲノムにおける核酸配列の安定した組み込みの存在を、当業者に周知の方法を用いて実証することができるが、その方法としてはとりわけ、RFLP分析（制限酵素断片長多型）のサザンブロット分析(Nam ら, 1989, The Plant Cell 1 , 699-705; Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750), 例えば増幅された断片の長さにおける差の分析のような、PCRに基づく方法、(増幅断片長多型、AFLP) (Castiglioni ら, 1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksem ら, 2001 , Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Meyer ら, 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160)または制限酵素を用いて切断した増幅断片を用いる方法(切断増幅多型配列) (Konieczny and Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis ら, 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachem ら, 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753)が挙げられる。
【００６７】
原則として、外来核酸分子は、植物細胞または植物において、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を増加させる、任意の核酸分子であってもよい。
【００６８】
本発明との関連で、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物はまた、挿入突然変異誘発法を用いても調製することができる(総説: Thomeycroft ら, 2001 , Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601)。本発明との関連で、挿入突然変異誘発法は、特にトランスポゾンまたはトランスファーDNA(ｔ-DNA)を遺伝子に、またはUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の近傍に挿入し、これにより、問題となる細胞内のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を増加させることを意味すると理解されたい。
トランスポゾンは、その細胞に天然に存在するトランスポゾン（内在性トランスポゾン）であってもよく、または前記細胞に天然に存在せず、例えば細胞の形質転換のような遺伝子工学によって、細胞中に導入されるトランスポゾンであつてもよい（外来トランスポゾン）。トランスポゾンによる遺伝子の発現の組み換えは、当業者に周知である。植物生物工学におけるツールとしての内在性および外来性トランスポゾンの使用の総説は、Ramachandran and Sundaresan (2001, Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252)にある。
ｔ-DNA挿入突然変異誘発は、アグロバクテリウムからのTiプラスミドのある部位(t-DNA)を植物細胞のゲノムに組み込まれることが可能であるという事実に基づいている。植物染色体の組み込み部位は固定されておらず、組み込みはいかなる場所でも起こり得る。もしt-DNAが遺伝子の機能を代表する染色体の部位またはその近傍に組み込まれるならば、これは結果として遺伝子発現を増加させる可能性があり、従って問題となる遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を変化させる可能性がある。
ゲノムに挿入された配列（特にトランスポゾンまたはt-DNA）は、それらが、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の制御配列の活性化をもたらす配列を含むことを特徴とする（「活性化タギング」）。好ましくは、ゲノムに挿入された配列（特にトランスポゾン、またはt-DNA）は、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする、植物細胞または植物のゲノムにおける、内在性核酸配列の近傍に組み込まれることを特徴とする。
【００６９】
本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物は、例えば、活性化タギング法（例えば Walden ら, Plant J. (1991), 281-288; Walden ら, Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528を参照）を用いて産生できる。この方法は、内在性プロモーターのエンハンサー配列による活性化に基づいており、エンハンサーとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターのエンハンサー、またはオクトピン合成酵素エンハンサーが挙げられる。
【００７０】
本発明との関連で、用語「t-DNA活性化タギング」は、t-DNA断片がエンハンサー配列を含み、それを植物細胞のゲノムに組み込むことによりUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を増加させるt-DNA断片を意味すると理解されたい。
【００７１】
本発明との関連で、用語「トランスポゾン活性化タギング」は、トランスポゾンがエンハンサー配列を含み、それを植物細胞のゲノムに組み込むことによりUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を増加させるトランスポゾンを意味すると理解されたい。
【００７２】
本発明の特に好ましい一実施態様は、外来核酸分子がUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物に関する。
【００７３】
本発明によれば、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、任意の生物に由来してもよく；好ましくは、前記核酸分子は、バクテリア、菌類、動物、植物またはウイルス、特に好ましくは、バクテリア、植物またはウイルス、さらに特に好ましくはウイルスに由来するものである。
ウイルスに関しては、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、好ましくは藻類に感染するウイルスに由来し、好ましくはChlorella属の藻類に感染するウイルス、特に好ましくはParamecium bursaria Chlorellaウイルス、特別に好ましくはH1株のParamecium bursaria Chlorellaウイルスに由来する。UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする天然に存在する核酸分子の代わりに、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、あるいは本発明による遺伝子組み換え植物に、突然変異誘発によって産生した核酸分子を導入することも可能であって、前記突然変異誘発外来核酸分子は、代謝物（例えばグルクロン酸代謝の）による阻害が減少しているUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
【００７４】
UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、文献に記載しており、当業者に周知である。従って、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、ウイルスからは、例えばChlorellaウイルス１(NCB1 acc No: NC_000852.3)、バクテリアからは、例えば大腸菌(Escherichia coli)(EMBL acc No:AF176356.1)、菌類からは、例えばAspergillus niger (EMBL acc No: AY594332.1)、Cryptococcus neoformans (EMBL acc No: AF405548.1)、昆虫からは、例えばDrosophila melanogaster (EMBL acc No: AF001310.1)、脊椎動物からは、例えばHomo sapiens (EMBL acc No: AF061016.1)、Mus musculus (EMBL acc No: AF061017.1)、Bos Taurus (EMBL acc No: AF095792.1)、Xenopus laevis (EMBL acc No: AY762616.1)または植物からは、例えばポプラ(EMBL acc No: AF053973.1)、Colocasia esuculenta (EMBL acc No: AY222335.1)、Dunaliella salina (EMBL acc No: AY795899.1)、Glycine max (EMBL acc No: U53418.1)について記述している。
【００７５】
好ましい一実施態様では、本発明は、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子が、以下からなる群から選択される、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物に関する：
ａ）配列番号５で与えられるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列が、配列番号５で与えられるアミノ酸配列と少なくとも60%同一であるタンパク
質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列もしくはそれに相補的な配列、または配列番
号：６に示されるヌクレオチド配列もしくはそれに相補的な配列を含む核酸分子；
ｄ）ａ）またはｃ）に記載した核酸配列と少なくとも70％同一である核酸分子；
ｅ）ａ）またはｃ）に記載した核酸配列の少なくとも一つの鎖をストリンジェント条件下
でハイブリダイズする核酸分子；
ｆ）その核酸配列が、遺伝コードの縮重のために、ａ）またはｃ）に記載した核酸分子の
配列から逸脱した核酸分子；および
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に記載した核酸分子の、断片、対立遺伝子
の変異体および／または誘導体である核酸分子。
【００７６】
本発明との関連で、用語「ハイブリダイゼーション」は、通常のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを意味し、好ましくは、例えばSambrock ら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載したようなストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましくは、「ハイブリダイゼーション」は以下の条件下のハイブリダイゼーションを意味する：
ハイブリダイゼーションバッファー：
2xSSC；10xDenhardt溶液（フィコール400＋PEG＋BSA；比1:1:1）；0.1 % SDS;5 mM EDTA;50 mM Na2HPO4; 250μg/ml ニシン精子DNA；50μg/ml tRNA; または25 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.2; 1mM EDTA; 7% SDS
ハイブリダイゼーション温度：
Tは65から68℃
洗浄バッファー：    0.1xSSC；0.1% SDS
洗浄温度：    Tは65から68℃
【００７７】
UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイゼーションする核酸分子は、任意の生物に由来してもよい；従って、それらはバクテリア、菌類、植物またはウイルスに由来してもよい。UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイゼーションする核酸分子は、好ましくは藻類に感染するウイルスに由来し、好ましくはChlorella属の藻類に感染するウイルス、特に好ましくはParamecium bursaria Chlorellaウイルス、最も好ましくはParamecium bursaria ChlorellaウイルスのH1株に由来する。
上述の分子とハイブリダイゼーションする核酸分子は、例えばゲノムまたはｃDNAライブラリーから単離してもよい。そのような核酸分子は、上述の核酸分子を用いて、またはこれらの分子の部分、これらの分子の逆相補体（reverse complements）を用いて、例えば標準法に従ったハイブリダイゼーションによって (例えば Sambrook ら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照)またはPCRを用いた増幅によって、同定、単離することができる。UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を単離するためのハイブリダイゼーションサンプルとして、例えば、配列番号４または配列番号６に与えられる核酸配列と全く同じまたは本質的に同じ配列を有する核酸分子、もしくはその部分を用いることも可能である。
ハイブリダイゼーションサンプルとして用いられる断片はまた、その配列が本質的に本発明との関連で記述した核酸分子と本質的に同一である、通常の合成技術を用いて調製する合成断片またはオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明との関連で記述した核酸分子とハイブリダイゼーションする遺伝子がひとたび同定され、単離されたら、配列を決定し、この配列によってコードされるタンパク質の性質を分析し、それらがUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質であるかどうかを決定すべきである。タンパク質がUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を有するかどうかを決定する方法(例えば、De Luca ら, 1976, Connective Tissue Research 4, 247-254; Bar-Peled ら, 2004, Biochem. J. 381, 131-136; Turner and Botha, 2002, Archives Biochem. Biophys. 407, 209-216)は、当業者には知られており、文献に詳細に記述されている。
本発明との関連で記述した、核酸分子との分子ハイブリダイゼーションは、特に、上述の核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。本発明との関連で、用語「誘導体」は、これらの分子の配列が上記の核酸分子の配列から一つ以上の位置で異なっているが、これらの配列と高度の同一性を有していることを意味する。上述の核酸分子に対する相違は、例えば、欠損、付加、置換、挿入または組み換えによるものであってもよい。
【００７８】
本発明との関連で、用語「同一性」は、核酸分子のコード領域の全長にわたり、またはタンパク質をコードするアミノ酸配列の全長にわたり、少なくとも60%の配列同一性を意味し、特に少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、および特別に好ましくは少なくとも95％の配列同一性を意味する。本発明との関連で、用語「同一性」は、他のタンパク質／核酸と同一のアミノ酸／ヌクレオチドの数（同一性）を意味すると理解されたい。他のタンパク質／核酸について、コンピュータプログラムを用いて、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号５に与えられるアミノ酸配列との比較により決定され、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号４または配列番号６で与えられる核酸配列との比較で決定される。もし互いに比較されるべき配列の長さが異なっている場合、同一性は、短い配列が長い配列と共有するアミノ酸数の百分率で同一性を測定することとする。好ましくは、同一性は、既知の公表されているコンピュータプログラムClustalW(Thompson ら, Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680)を用いて決定される。ClustalWはJulie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) および Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1 , D 69117 Heidelberg, Germanyによって市販されるようになった。ClustalWはまた、種々のインターネットのページから、とりわけIGBMC(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 lllkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) およびEBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) およびすべてのEBI(European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK)の反映しているインターネットのページからダウンロードすることができる。本発明との関連で記述したタンパク質と他のタンパク質間の同一性を決定するためには、ClustalWコンピュータプログラムVersion1.8を使用するのが好ましい。ここで、パラメータは以下の如くセットしなければならない：KTUPLE=I , TOPDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=IO, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET,ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP。例えば、本発明との関連で記述した核酸分子の配列と他の核酸分子の配列間の同一性を決定するためには、ClustalWコンピュータプログラムVersion1.8を使用するのが好ましい。ここで、パラメータは以下の如くセットしなければならない：KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=IO, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted。
【００７９】
同一性は、さらに、問題となる核酸分子、およびそれらによってコードされるタンパク質の間に機能的および／または構造的な同等性が存在することを意味する。上記の分子と相同的であり、これらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般的に同じ生物学的機能を有する組み換えを表す、これらの分子の変種である。それらは、例えば他の種からの配列のような、天然に存在する変種であってもよく、もしくは突然変異が自然に起こったか、または標的突然変異誘発によって導入された、突然変異体であってもよい。さらに、変異は合成的に産生された配列であってもよい。これらの対立遺伝子変異体は、天然に存在する変異体、または合成的に産生された変異体、または組み換えＤＮＡ技術によって生成された変異体であってもよい。誘導体の特別な形としては、例えば、遺伝コードの縮重による、本発明との関連で記述した核酸分子とは異なる核酸分子が挙げられる。
【００８０】
UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の種々の誘導体は、ある共通の特徴を持っている。
これらは例えば、生物活性、基質特異性、分子量、免疫反応性、立体配置、等であり、そしてまた例えばゲル電気泳動における移動度特性、クロマトグラフィーにおける挙動、沈降係数、溶解度、分光学的な性質、安定性、至適pH、至適温度等のような物理的性質である。UDP-Glc-DHは、当業者に周知であり、既に上に記述しており、同様な方法で本明細書で応用されことになる。
【００８１】
さらなる好ましい実施態様では、本発明は、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、前記核酸分子のコドンが親生物のUDP-Glc-DHの酵素活性を有する前記タンパク質をコードする核酸のコドンとは異なっていることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物に関する。特に好ましくは、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子のコドンは、そのゲノムに組み込まれた、または組み込まれることになる植物細胞、または植物のコドンの使用頻度に適応するように変化されている。
【００８２】
本発明はさらに、ヒアルロナン合成酵素をコードしおよび／またはUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする植物細胞または植物のゲノムに安定して組み込まれた外来核酸分子が、植物細胞における転写を開始させる制御要素（プロモーター）に結合していることを特徴とする、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または本発明による遺伝子組み換え植物を提供する。これらは、同種または異種のプロモーターであってよい。プロモーターは、構成的、組織特異的、発生特異的または外部因子（例えば、化学物質を加えた後、熱および／または冷却、旱魃（draught）、病気等の非生物的な作用）によって制御されてもよい。ここで、ヒアルロナン合成酵素またはUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子であって、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物のゲノムに組み込まれている核酸分子は、それぞれ同じプロモーターに結合してもよく、または個々の配列は異なったプロモーターに結合してもよい。
【００８３】
好ましい一実施態様は、ヒアルロナン合成酵素、またはUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子からなる群から選択される、少なくとも一つの外来核酸分子、特に好ましくは少なくとも二つの外来核酸分子、特別に好ましくは三つの外来核酸分子が、組織特異的なプロモーターに結合している、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または遺伝子組み換え植物に関する。好ましい組織特異的なプロモーターは、植物の塊茎、葉、果実または種細胞中で特異的に転写を開始するプロモーターである。
【００８４】
ヒアルロナン合成酵素、またはUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を発現するためには、これらは植物細胞における転写を確実にするための制御DNA配列に結合することが好ましい。これらとしては、特にプロモーターが挙げられる。一般的に、植物細胞中で活性を有する任意のプロモーターは発現に適している。ここでは、発現が、植物発生のある特定の時点で、または外部の因子によって決定されるある時点で、構成的に、あるいは特定の組織中だけにあるように、プロモーターを選択してもよい。植物細胞に関して、および発現される核酸分子に関しての両方について、プロモーターは同種であっても異種であってもよい。
適切なプロモーターとしては、構成的発現のためには、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNSのプロモーター、あるいはトウモロコシまたはCestrum YLCV(Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087; Stavolone ら, 2003, Plant Mol. Biol. 53, 703-713)からのユビキチンプロモーター、ジャガイモにおける塊茎特異的発現のためのPatatingenプロモーターB33(Rocha-Sosa ら, EMBO J. 8 (1989),23-29)、もしくは例えばトマトからのポリガラクトウロナーゼプロモーター(Montgomery ら, 1993, Plant Cell 5, 1049-1062)またはトマトからのE8プロモーター(Metha ら, 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618)のようなトマトの果実特異的プロモーター、またはモモからのACCオキシダーゼプロモーター(Moon and Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528)、または例えばST-LS1プロモーター(Stockhaus ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus ら, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451)のような光合成で活性な組織にのみ発現を確実にするプロモーター、または胚乳特異的発現のためのコムギのHMWGプロモーター、USPプロモーター、ファゼオリンプロモーター、トウモロコシのゼイン遺伝子のプロモーター(Pedersen ら, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio ら, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93)、グルテリンプロモーター(Leisy ら, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng ら, Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara ら, FEBS Lett. 383 (1996), 213-218)、shrunken-1プロモーター(Werr ら, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380)、グロブリンプロモーター(Nakase ら, 1996, Gene 170(2), 223-226)またはプロタミンプロモーター(Qu und Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125)が挙げられる。しかしながら、外部因子によって決定される時点においてのみ活性を有するプロモーターを使用することも可能である(例えば WO 9307279を参照)。ここで特に興味ある物は、簡単な誘導を可能にする熱ショックタンパク質のプロモーターであるかもしれない。例えば、Vicia fabaおよび他の植物の種子特異的な発現を確実にする、Vica fabaからのUSPプロモーターのような、種子特異的なプロモーター(Fiedler ら, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein ら, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467)を用いることもさらに可能である。
藻類に感染するウイルスのゲノムに存在するプロモーターの使用もまた、植物における核酸配列の発現のためには適している(Mitra ら, 1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1), 187-194; Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Etten ら, 2002, Arch Virol 147, 1479-1516)。
【００８５】
本発明との関連で、用語「組織特異的」は、ある組織に対する発現の実質的な制限（例えば転写の開始に対する）を意味すると、理解されたい。
【００８６】
本発明との関連で、用語「塊茎、果実または種子細胞」は、塊茎、果実または種子に存在するすべての細胞を意味すると理解されたい。
【００８７】
本発明との関連で、用語「同種（homologous）プロモーター」とは、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または遺伝子組み換え植物の調製に用いた植物細胞または植物中に天然に存在するプロモーターを意味する（植物細胞または植物に関して同種）か、または発現すべき配列が単離された生物における遺伝子の発現の制御を調節するプロモーター（発現されるべき核酸に関して同種）を意味すると理解されたい。
【００８８】
本発明との関連で、用語「異種（heterologous）プロモーター」は、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または遺伝子組み換え植物の調製に用いた植物細胞または植物中に天然に存在しないプロモーターを意味する（植物細胞または植物に関して異種）か、または発現すべき配列がそこから単離された生物における遺伝子の発現の制御を調節するプロモーター（発現されるべき核酸に関して異種）を意味すると理解されたい。
【００８９】
転写物にポリAテールを加えることに役立つ終止配列（ポリアデニル化信号）が存在してもよい。ポリAテールは転写物を安定化すると考えられている。そのような要素は、文献に記載してあり(cf. Gielen ら., EMBO J. 8 (1989), 23-29を参照)、要望に応じて交換可能である。
【００９０】
プロモーターとコード領域の間にイントロン配列が存在することもまた可能である。該イントロンは、発現の安定性を与え、植物中での発現を増加させることができる(Callis ら., 1987, Genes Devel. 1 , 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991 , Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier ら., 1997; Plant Journal 12(4), 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535- 542; Vasil ら., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU ら., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569)。適切なイントロン配列としては、例えば、トウモロコシのsh1遺伝子の第一イントロン、トウモロコシのポリ-ユビキチン遺伝子１の第一イントロン、コメのEPSPS遺伝子の第一イントロン、またはArabidopsisのPAT1遺伝子の最初の二つのイントロンが挙げられる。
【００９１】
本発明はまた、本発明による遺伝子組み換え植物細胞を含む植物に関する。該植物は、本発明による遺伝子組み換え植物細胞からの再生によって産生してもよい。
【００９２】
本発明はまた、本発明による遺伝子組み換え植物細胞を含む、本発明による遺伝子組み換え植物の加工可能部位または消費部位に関する。
【００９３】
本発明との関連で、用語「加工可能部位」は、食品または飼料を調製するために用いられる植物部位を意味すると理解すべきであり、それらは工業プロセスのための原材料として、医薬品の調製のための原材料として、または化粧品の調製のための原材料として用いられる。
【００９４】
本発明との関連で、用語「消費部位」は、ヒトの食料としてまたは動物の飼料として用いられる植物部位を意味すると理解されたい。
【００９５】
本発明はまた、本発明による遺伝子組み換え植物細胞を含む、本発明による遺伝子組み換え植物の増殖材料に関する。
【００９６】
ここで、用語「増殖材料」は、無性または生殖経路を介して、子孫を産生するために適した植物の成分を含む。無性増殖に適したものは、例えば、挿し木、カルス培養、根茎または塊茎である。他の増殖材料としては、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養物等が挙げられる。増殖材料は、塊茎、果実または種子の形を取るのが好ましい。
【００９７】
さらなる一実施態様では、本発明は、果実、貯蔵、および他の根、花、蕾、芽、葉、または茎、好ましくは種子、果実、または塊茎のような、本発明による遺伝子組み換え植物の収穫可能植物部位に関し、これらの収穫可能部位は本発明による遺伝子組み換え植物細胞を含む。
【００９８】
好ましくは、本発明は、ヒアルロナンを含む本発明による増殖材料、または本発明による植物の収穫可能部位に関する。ヒアルロナンを合成する、本発明による増殖材料、または本発明による植物の収穫可能部位は、特に好ましい。
【００９９】
本発明との関連で、用語「ジャガイモ植物」または「ジャガイモ」はSolanum属の植物種、特にSolanum属の塊茎を産生する種子および特別にSolanum tuberosumを意味すると理解されたい。
【０１００】
本発明との関連で、用語「トマト植物」または「トマト」は、Lycopersicon属特にLycopersicon esculentumを意味すると理解されたい。
【０１０１】
本発明のさらなる利点は、本発明による遺伝子組み換え植物の収穫可能部位、増殖材料、加工可能部位、または消費部位は、文献に記載のヒアルロナン合成トランスジェニック植物よりも多量のヒアルロナンを含んでいることである。従って、本発明による遺伝子組み換え植物は、そこからヒアルロナンを単離する原材料として用いるのに特に適しているだけでなく、予防または治療的性質（例えば、変形性関節炎の予防、US 6,607,745）を有する食料／飼料としても、あるいは食料／飼料を調製するためにも直接用いることができる。本発明による遺伝子組み換え植物は、文献に記載の植物よりもヒアルロナン含有量が高いことから、該食料／飼料を調製するには、本発明による遺伝子組み換え植物の収穫可能部位、増殖材料、加工可能部位、または消費部位は、より小量ですむ。本発明による遺伝子組み換え植物の消費部位が、例えばいわゆる「栄養補助食品」として直接消費される場合、比較的少量の物質を摂取することによりプラス効果を得ることが可能である。このことはとりわけ動物飼料の生産において特に重要である。なぜなら植物成分の含有量が高すぎる動物飼料は、種々の動物種にとっては飼料として不適切であるからである。
ヒアルロナンの高い水結合能のおかげで、本発明による遺伝子組み換え植物の収穫可能部位、増殖材料、加工可能部位、または消費部位は、固形化された食料／飼料を生産する時、より少量の増粘剤しか必要としない利点をさらに有している。従って、例えば、ゼリーの生産には砂糖はより少量しか必要とせず、健康に与えるさらなるプラス効果と関連している。粗植物材料の脱水を必要とする食料／飼料の生産においては、本発明による遺伝子組み換え植物の収穫可能な部位、増殖材料、加工可能部位、または消費部位を用いる利点は、問題となる植物材料から除かれるべき水がより少ないという事実であり、結果、製造コストが低下し、およびより温和な調製方法のおかげで（例えば加熱がより少なくおよび／あるいはより短時間）問題となる食料／飼料の栄養価が上昇する。従って、例えばトマトケチャップの製造において、欲する粘稠度を達成するために導入しなければならないエネルギーの量がより少なくなる。
【０１０２】
本発明はさらに、ヒアルロナンを合成する植物を製造する方法を提供するのであって、これは、
ａ）遺伝子組み換えが、以下のiからiiのステップを含む、植物細胞の遺伝子組み換えを行うステップ、
i)ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子を、植物細胞への導入するステップ、
ii)対応する非遺伝子組み換えの野生型植物細胞と比較して、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性が結果として増大する遺伝子組み換えを、植物細胞へ導入するステップ、
ここでステップiからiiは、任意の順序で、個々に行うことができ、又はステップiからiiの任意の組み合わせを同時に行うこともでき；
ｂ）ステップａ）からの植物細胞から植物を再生するステップ；
ｃ）適切な場合、ステップｂ）からの植物を用いてさらに植物を生成するステップ、ここで、適切な場合、ステップｂ）iまたはｂ）iiによって得た植物から、植物細胞を単離し、およびヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸を有し、かつ対応する非遺伝子組み換え野生型植物細胞と比較して、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性が増加している植物が生成されるまで、ステップａ）からｃ）の方法を繰り返す、
を含む。
【０１０３】
本発明は、好ましくは、ヒアルロナンを合成する植物を製造する方法に関するもので、これは、
ａ）遺伝子組み換えが、以下のiからiiのステップを、任意の順序で含むか、または以下のステップiからiiの任意の組み合わせを個々にもしくは同時に行うこともできる、植物細胞の遺伝子組み換えを行うステップ、
i)ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子を、植物細胞への導入するステップ、
ii)対応する非遺伝子組み換え野生型植物細胞と比較して、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性が結果として増大する遺伝子組み換えを、植物細胞へ導入するステップ、
ｂ）以下のステップに従った遺伝子組み換えを含む、植物細胞から植物を再生するステップ、
ｉ）ａ）ｉ
ii)  ａ）ii
iii)  ａ）ｉ、およびａ）ii
ｃ）以下のステップ
i)  ｂ）iに記載の植物の植物細胞にステップａ）iiに従った遺伝子組み換えを導入するステップ、
ii)  ｂ）iiに記載の植物の植物細胞にステップａ）iに従った遺伝子組み換えを導入するステップ、
および植物を再生するステップ、
ｄ）適切な場合、ステップｂ）iiiまたはｃ）iまたはｃ）iiのいずれかによって得た植物を用いてさらに植物を生成するステップ、
を含む。
【０１０４】
ステップａ）によって植物細胞に導入した遺伝子組み換えは、原則としてUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性を結果として増大させる、いかなるタイプの組み換えであってもよい。
【０１０５】
本発明による方法のステップｂ）および、適切な場合、ステップc）による植物の再生は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる（例えば、"Plant Cell Culture Protocols", 1999, edited by R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2に記載している)。
【０１０６】
本発明による方法の、さらなる植物の産生（ステップｃ）またはステップｄ）による方法に依存して）は、例えば無性増殖（例えば、挿し木、塊茎を介して、またはカルス培養を介して、および無傷の植物の再生）、または生殖増殖によって行われる。この関連で、生殖増殖は、制御された条件下で起こることが好ましい、すなわち特定の特性を有する選択された植物は、互いに交雑させ、増殖させる。選択は、さらなる植物が（ステップｃ）またはステップｄ）によって産生された方法に依存して）、先行するステップにおいて導入された組み換えを含むような方法で起こることが好ましい。
【０１０７】
ヒアルロナンを合成する植物を調製するための本発明による方法において、本発明による遺伝子組み換え植物の産生のための遺伝子組み換えは、同時に、または連続的ステップで行うことができる。ここで、植物細胞にヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子を導入する遺伝子組み換えのための方法と同じ方法を、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大をもたらす連続的遺伝子組み換えに用いるかどうかは、重要ではない。
【０１０８】
ヒアルロナンを合成する植物を調製するための、本発明による方法のさらなる一実施態様では、遺伝子組み換えは、外来核酸分子の植物細胞への導入にあり、植物細胞で外来核酸分子の存在または発現により、植物細胞におけるUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性が結果として増大する。
【０１０９】
既に上記のように、遺伝子組み換えのために植物細胞または植物に導入された外来核酸分子に関して、ヒアルロナンを合成する植物を調製するために、本発明による方法のステップａ）において導入される物は、一個の核酸分子、または複数の核酸分子であってもよい。従って、ヒアルロナン合成酵素をコードするおよび／またはUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、一緒に一つの核酸分子上に存在してもよく、もしくは別々の核酸分子上に存在してもよい。もしヒアルロナン合成酵素をコードするおよびUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、複数の核酸分子上に存在するならば、これらの核酸分子は、植物細胞に同時に導入されてもよく、または連続的ステップで導入されてもよい。
【０１１０】
さらに加えて、ヒアルロナンを合成する植物を調製するための本発明による方法の実施において、野生型の植物細胞または野生型の植物の代わりに、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の活性がすでに増大しているという点で識別される突然変異細胞または突然変異体を用いることが可能である。対応する野生型の植物細胞または野生型の植物に比較して、突然変異細胞または突然変異体が、既にUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性を有するならば、前記突然変異細胞または突然変異体にヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子を導入することが、ヒアルロナンを合成する植物を産生するために、本発明の方法を実施するには十分である。
本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物の調製のための突然変異体の使用に関する全ての上記のことは、本明細書中で同様な方法にて応用される。
【０１１１】
好ましい実施態様では、本発明は、ステップａ）におけるヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が以下の群から選択される、ヒアルロナンを合成する植物を産生するための本発明による方法に関する：
ａ）ウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｂ）Chlorellaに感染するウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｃ）Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｄ）Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 H1株のヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｅ）ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子のコドンが、ヒアルロナン合成酵素の親生物におけるヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子のコドンと比較して、組み換えされていることを特徴とする核酸分子、
ｆ）ヒアルロナン合成酵素のコドンが、そのゲノムに組み込まれるべき、または組み込まれている、植物細胞または植物のコドンの使用頻度に適応するように組み換えされていることを特徴とする核酸分子、
ｇ）配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するヒアルロナン合成酵素をコードする、または配列番号２に示されたアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％および特別に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｈ）そのアミノ酸配列がプラスミドDSM16664に挿入された核酸配列のコード領域に由来しているタンパク質をコードする、またはプラスミドDSM16664に挿入された核酸配列のコード領域に由来しているアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％および特別に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｉ）配列番号１または配列番号３に示された核酸配列、又は配列番号１または配列番号３に示された核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％および特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む核酸分子、
ｊ）プラスミドDSM16664に挿入された核酸配列、又はプラスミドDSM16664に挿入された核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％および特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む核酸分子、
ｋ）ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が、植物細胞における転写を開始させる制御要素（プロモーター）に結合している、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子、又は
ｌ）プロモーターが組織特異的プロモーターであり、特に好ましくは植物の塊茎、果実または種細胞において特異的に転写開始を始めるプロモーターである、ｋ)に記載の核酸分子。
【０１１２】
好ましい実施態様では、本発明は、UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子が以下の群から選択される、ヒアルロナンを合成する植物を産生するための本発明による方法に関する：
ａ）ウイルス、バクテリア、動物またな植物に起源を持つUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｂ）Chlorellaに感染するウイルスのUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子、
ｃ）Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子。
ｄ）UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子のコドンが、親生物のUDP-Glc-DHの活性を有する対応するタンパク質をコードする核酸分子のコドンと比較して、組み換えされていることを特徴とする核酸分子、
ｅ）UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質のコドンが、そのゲノムに組み込まれるべきまたは組み込まれている、植物細胞または植物のコドンの使用頻度に適応するように組み換えされていることを特徴とする核酸分子、
ｆ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、
ｇ）配列番号５に示されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％の同一性の配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、
ｈ）配列番号４に示されたヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列、もしくは配列番号６に示されたヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含む核酸分子；
ｉ）ｈ）に記載した核酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％の同一である核酸分子、
ｊ）ｆ）またはｈ）に記載した核酸分子の少なくとも一つの鎖とストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする核酸分子；
ｋ）遺伝コードの縮重により、そのヌクレオチド配列がｆ）またはｈ）に言及された核酸分子の配列と異なる核酸分子；および
ｌ）ａ）、ｂ）、ｃ）ｄ）、ｅ）、ｆ）またはｈ）に言及された核酸分子の、断片、対立遺伝子変異種、および／または誘導体である核酸分子、
ｍ）UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸配列が、植物細胞において転写を開始する制御要素（プロモーター）に結合している、UDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子、もしくは
ｎ）プロモーターが組織特異的プロモーター、特に好ましくは植物の塊茎、葉、果実または種子細胞において、特異的に転写の開始を始めるプロモーターである、ｍ）に記載の核酸分子。
【０１１３】
さらなる好ましい一実施態様では、ヒアルロナンを合成する植物を産生するための本発明による方法は、本発明による遺伝子組み換え植物の産生のために用いる。
【０１１４】
本発明はまた、ヒアルロナンを合成する植物を産生するための本発明による方法によって得られる植物も提供する。
【０１１５】
本発明はさらに、本発明による遺伝子組み換え植物細胞から、本発明による遺伝子組み換え植物から、本発明による増殖材料から、本発明による収穫可能な植物部位から、もしくはヒアルロナンを合成する植物を産生する本発明による方法によって得ることができる植物またはこれらの植物部位から、ヒアルロナンを抽出するステップを含む、ヒアルロナンを製造する方法に関する。
【０１１６】
好ましくは、そのような方法はまた、ヒアルロナンの抽出に先立って、栽培した本発明による遺伝子組み換え植物細胞を、本発明による遺伝子組み換え植物を、本発明による増殖材料を、本発明による収穫可能な植物部位を、本発明による加工可能な植物部位を、収穫するステップを含み、さらにまた、本発明による遺伝子組み換え植物細胞または本発明による遺伝子組み換え植物を収穫前に栽培するステップを含むことが特に好ましい。
【０１１７】
細菌組織や動物組織と対照的に、植物組織はヒアルロニダーゼを有せず、ヒアルアドヘリンも全く含まない。従って、上述の如く、植物組織からのヒアルロナンの抽出は、比較的単純な方法を用いて可能である。必要であれば、上述の如く、ヒアルロナンを含む植物細胞、または組織の水様の抽出物は、例えばエタノールによる繰り返し沈殿のような、当業者には周知の方法を用いてさらに精製できる。ヒアルロナンを精製するための好ましい方法を、一般法、第３項に記述する。
【０１１８】
本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物からヒアルロナンを抽出するための、既に記述した方法はまた、本発明による増殖材料から、本発明による収穫可能な植物部位から、もしくはヒアルロナンを合成する植物を調製するための本発明による方法によって得ることができる、植物またはこれら植物の部位から、ヒアルロナンを単離するためにも適している。
【０１１９】
本発明はまた、ヒアルロナンを調製するために、本発明による遺伝子組み換え植物細胞の、本発明による遺伝子組み換え植物の、本発明による増殖材料の、本発明による収穫可能な植物部位の、本発明による加工可能な植物部位の、本発明による方法によって得ることができる植物の、使用を提供する。
【０１２０】
本発明はまた、さらに本発明による遺伝子組み換え植物を含む組成物に関する。ここで、植物細胞が無傷であるか、もはや無傷でないかは、それらが例えば加工によって破壊されているから重要ではない。組成物は、好ましくは食料または飼料、医薬品または化粧品である。
【０１２１】
本発明は、好ましくは本発明による遺伝子組み換え植物細胞の、本発明による遺伝子組み換え植物の、本発明による増殖材料の、本発明による収穫可能な植物部位の、または本発明による方法によって得ることができる植物の成分を含み、および組み換え核酸分子を含み、該組み換え核酸分子はヒアルロナン合成酵素およびUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むことを特徴とする、組成物を提供する。
【０１２２】
植物細胞または植物のゲノムへの外来核酸分子の安定な組み込みにより、外来核酸分子が植物細胞または植物のゲノムへの組み込み後、植物ゲノム核酸配列によって隣接される結果となる。従って、好ましい一実施態様では、本発明による組成物は、本発明による組成物中に存在する組み換え核酸分子が、植物ゲノム核酸配列によって隣接されることを特徴とする。
ここで、植物ゲノム核酸配列は、組成物を調製するために用いた植物細胞または植物のゲノムに天然に存在する、任意の配列であってもよい。
【０１２３】
本発明による組成物に存在する組み換え核酸分子は、個々のまたは種々の組み換え核酸分子であってよく、ヒアルロナン合成酵素およびUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードするその核酸分子は、一つの核酸分子上に存在するか、もしくはこれらの核酸分子は別の組み換え核酸分子上に存在してもよい。ヒアルロナン合成酵素をコードするまたはUDP-Glc-DHの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子がどのように本発明の組成物において存在するかに依存して、それらは同一の、または異なった植物ゲノム核酸配列によって隣接してもよい。
【０１２４】
本発明による組成物が組み換え核酸分子を含むことは、例えば、ハイブリダイゼーションに基づく方法などの当業者には周知の方法を用いて、または好ましくはPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく方法を用いて、明示することができる。
【０１２５】
好ましくは、本発明による組成物は、ヒアルロナンを少なくとも０．００５％、より好ましくは少なくとも０．０１％、特に好ましくは０．０５％および特別に好ましくは少なくとも０．１％含む。
【０１２６】
既に上述したように、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、本発明による遺伝子組み換え植物、本発明による増殖材料、本発明による収穫可能な植物部位、本発明による加工可能な植物部位、本発明による消費植物部位、または本発明による方法によって得ることができる植物を用いて、食料または飼料を調製することが可能である。しかしながら、ヒアルロナンを単離することなく、工業的な応用のために、原材料として使用することもまた、可能である。従って、例えば、本発明による遺伝子組み換え植物または本発明による遺伝子組み換え植物部位を、農業栽培下の領域に適用して土壌の水結合能を増加させることも可能である。さらに本発明による遺伝子組み換え植物、または本発明による遺伝子組み換え植物細胞は、乾燥剤（例えば、湿度の影響を受ける物品を輸送する時に使用するために）を調製するために、または液体の吸収剤（オムツまたはこぼれた水性液体を吸収するために）として用いることができる。該応用のためには、本発明による遺伝子組み換え植物の全部、本発明による遺伝子組み換え植物部位、または粉砕した本発明による遺伝子組み換え植物（例えば粉化）、または本発明による植物部位を、必要に応じて用いることができる。粉化した植物または植物部位が用いられる応用に適しているのは、ヒアルロナンを含んでいるが、水の割合が少ない特定の植物部位である。これらは、好ましくは穀類植物（トウモロコシ、コメ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、サゴヤシまたはソルガウム）の穀物である。本発明による遺伝子組み換え植物細胞、および本発明による遺伝子組み換え植物は、文献に記載したトランスジェニック植物よりもヒアルロナン含有量が高いことから、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、または本発明による遺伝子組み換え植物を利用する際、工業的応用のためには、他のトランスジェニック植物と比較して、用いる材料は少量である必要がある。
【０１２７】
本発明はまた、本発明による組成物を調製するための方法を提供し、そこでは本発明による遺伝子組み換え植物細胞、本発明による遺伝子組み換え植物、本発明による増殖材料、本発明による収穫可能な植物部位、本発明による加工可能な植物部位、本発明による消費植物部位、またはヒアルロナンを合成する植物を製造するため本発明による方法によって得ることができる植物、を使用する。本発明による組成物を調製するための方法は、好ましくは食料または飼料を調製する方法、医薬品を調製する方法、または化粧品を調製する方法である。
【０１２８】
食料または飼料を調製する方法は、当業者には周知である。工業分野において、本発明による遺伝子組み換え植物、または本発明による植物部位を用いる方法もまた、当業者には周知であり、とりわけ、本発明による遺伝子組み換え植物、または本発明による植物部位を粉砕または粉化する方法が挙げられる；しかしながらそれらは、それだけに限定されない。食料／飼料を調製するために本発明による対象物質を使用することに起因する利点、または工業分野において使用する利点は、既に上述した。
【０１２９】
組成物を調製するための本発明による方法は、特に好ましくは、ヒアルロナンを含む組成物を調製する方法である。
【０１３０】
本発明による組成物を調製するための方法によって得られる組成物は、同様に本発明によって提供される。
【０１３１】
本発明はまた、本発明の組成物を調製するための、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、本発明による遺伝子組み換え植物、本発明による増殖材料、本発明による収穫可能な植物部位、本発明による加工可能な植物部位、本発明による消費植物部位、またはヒアルロナンを合成する植物を産生する本発明による方法によって得ることができる植物、の使用に関する。食料または飼料を調製するための、医薬製剤を調製するための、あるいは化粧品を製造するための、本発明による遺伝子組み換え植物細胞、本発明による遺伝子組み換え植物、本発明による増殖材料、本発明による収穫可能な植物部位、本発明による加工可能な植物部位、本発明による消費植物部位、またはヒアルロナンを合成する植物を産生する本発明による方法によって得ることができる植物、の使用が優先される。
【０１３２】
配列の説明
配列番号１：Paramecium bursaria Chlorella ウイルス１のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列。
配列番号２：Paramecium bursaria Chlorella ウイルス１のヒアルロナン合成酵素のアミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は配列番号１から導くことができる。
配列番号３：Paramecium bursaria Chlorella ウイルス１のヒアルロナン合成酵素をコードする合成核酸配列。示した配列のコドンの合成は、植物細胞におけるコドンの使用に適応するように行った。示した核酸配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号４：Paramecium bursaria Chlorella ウイルス１のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号５：Paramecium bursaria Chlorella ウイルス１のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号４から導くことができる。
配列番号６：Paramecium bursaria Chlorella ウイルス１のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列。示した配列のコドンの合成は、植物細胞におけるコドンの使用に適応するように行った。示した核酸配列は、配列番号５に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号７：実施例１において用いられた合成オリゴヌクレオチド。
配列番号８：実施例１において用いられた合成オリゴヌクレオチド。
【０１３３】
一般方法
以下に、本発明に関連して用いることのできる方法を記す。これらの方法は具体的な実施態様である：しかしながら、本発明はこれらの方法に限定される訳ではない。記載した方法を組み換えすることによって、および／もしくは個々の方法または方法の一部を代替方法、または代替方法の一部に置き換えることによって、同じ様式で本発明を実施できることは、当業者には周知である。
【０１３４】
１．ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物は、Agrobacteriumを用いて、Rocha-Sosa ら(EMBO J. 8, (1989), 23-29) に記載のように、形質転換を行った。
【０１３５】
２．植物組織からのヒアルロナンの単離
ヒアルロナンの存在を検出し、植物組織中のヒアルロナンの含有量を測定するために、植物材料を次のように処理した：200μlの水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）を塊茎材料約0.3gに加え、混合物を、実験室用振動ボールミル(MM200, Retsch由来, Germany)で破砕した（30Hzで30秒）。それからさらに800μlの水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）を加え、混合物をよく混合した（例えばボルテックスミキサーを用いて）。細胞残渣および不溶成分を16,000xg 5分間の遠心分離機にかけて上清から単離した。 
【０１３６】
３．ヒアルロナンの精製
塊茎の約100グラムの皮をむき、約1cm3のサイズに刻み、水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）100mlを加えた後、Warringブレンダー中で最大速度にて約30秒間破砕した。細胞残渣を茶漉しで除いた。除いた細胞残渣を水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）300mlに再懸濁し、再び茶漉しで除いた。二つの懸濁液(100ml＋300ml)をあわせ、13,000xgで15分遠心分離機にかけた。NaClを得られた遠心分離上清に、最終濃度1%に到達するまで加えた。NaClが溶液中に溶解した後、２容量のエタノールを加え、次によく攪拌し、-20℃に一夜保ち、沈殿させた。それから混合物を13,000xgで15分遠心分離機にかけた。この遠心の後得られた、沈降した沈殿物をバッファー（50mM、Tris HCl、pH8、1mM CaCl2）100mlおよびプロテイナーゼKを最終濃度100μg/mlを加え、溶液を42℃で2時間保温した。この後95℃で10分間保温した。もう一度NaClをこの溶液に加え、最終濃度が1%になるようにした。NaClが溶液中に溶解した後、２容量のエタノールを加え、よく攪拌し、-20℃に96時間保ち、再沈殿させた。それから13,000xgで15分遠心分離機にかけた。この遠心の後得られた沈降沈殿物を水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）30mlに溶解し、もう一度NaClを最終濃度1%に加えた。2容量のエタノールを加え、よく攪拌し-20℃に一夜保ち、さらなる沈殿を行った。その後の13,000xgで15分の遠心で得た沈殿物を水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）20mlに溶解した。さらなる精製を、遠心ろ過法で行った。この目的のために、それぞれの場合、溶解した沈殿物の5mlを、ろ過膜(CentriconAmicon, 孔径 10 000 NMWL, Prod. No. UCF8 010 96)に載せ、サンプルを2200xgで、フィルター上に溶液の約3mlのみが残るまで遠心分離機にかけた。さらに2回、それぞれの場合水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）3mlを膜上の溶液に加え、それぞれの場合同じ条件で、最後にフィルター上に溶液約3ml残るまで、再遠心分離機にかけた。遠心ろ過後に未だ膜上に存在する溶液を採取し、膜を繰り返し（３から5回）約1.5mlの水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）ですすいだ。膜上に未だ存在する全溶液とすすぎにから得た溶液を合わせ、NaClを最終濃度1%に加え、NaClが溶液中に溶解した後、２容量のエタノールを加え、サンプルを混合し、-20℃に一夜保ち、沈殿物を得た。その後の13,000xg、15分の遠心で得た沈殿物を水（脱ミネラル、導電率≧18MΩ）4mlに溶解し、凍結乾燥した（0.37ミリバールの圧力下で24時間、凍結乾燥機Christ Alpha 1-4 Christ由来, Osterode, Germany)。
【０１３７】
４．ヒアルロナンの検出およびヒアルロナン含有量の測定
ヒアルロナンは市販の試験キット(hyaluronic acid (HA) test kit, Corgenix Inc.由来, Colorado, USA, Prod. No. 029-001)を用いて、製造者の指示書に従って検出した。製造者の指示書は、本明細書に参照として取り込まれる。試験の原理は、ヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質（HABP）が得られることに基づいており、ELISAと同様に行われ、呈色反応は試験したサンプル中のヒアルロナン含有量を示す。従って、ヒアルロナンの定量的測定のためには、測定するサンプルは、規定された限度内にある濃度において用いられるべきである（例えば、濃度限度が過剰であるか、到達しないかに応じて、問題となるサンプルを希釈するかまたは植物組織からの抽出により少ない水を用いる）。並行したバッチにおいて、測定すべきサンプルの一定量を、最初にヒアルロニダーゼ消化に当て、それから市販の試験キット(hyaluronic acid (HA) test kit Corgenix Inc.由来, Colorado, USA, Prod. No. 029-001)を用いて測定した。ヒアルロニダーゼ消化は、ヒアルロニダーゼバッファー（0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH5.3；150mM NaCl）中のジャガイモ塊茎抽出物400μlにヒアルロニダーゼ(ヒアルロニダーゼタイプ III, Sigma由来, Prod. No. H 2251)5μg(〜3ユニット)を加え、37℃で30分間保温して行った。それぞれの場合希釈は1:10で、全サンプルは、それから、ヒアルロナン含有量を測定するために用いた。
【０１３８】
５．UDP-Glc-DHの活性の測定
UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質の活性を、Spicerl ら., (1998, J. Bacteriol. 273(39), 25117-25124)に記載したように測定した。
【０１３９】
実施例
１．植物発現ベクターIR 47-71の調製
プラスミドpBinARは、バイナリー成分ベクターpBin19(Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711 -8721)の誘導体であって、以下のようにして構成される：
カリフラワーモザイクウイルスの35S プロモーターのヌクレオチド6909-7437を含む529bp長の断片を、EcoRI/KpnI断片としてプラスミドpDH51(Pietrzak ら, 1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858)から単離し、pUC18のポリリンカーのEcoRIおよびKpnI制限酵素部位の間に結合した。このようにしてpUC18-35Sを形成した。制限酵素HindIIIおよびPvuIIを用いて、TiプラスミドpTiACH5( Gielen ら.,1984, EMBO Journal 3,835-846)のT-DNAのオクトピン合成酵素遺伝子（遺伝子３）のポリアデニル化シグナル(3'末端)を含む192bp長の断片(ヌクレオチド11749-11939)は、プラスミドpAGV40(Herrera-Estrella ら, 1983 Nature, 303, 209-213)から単離した。PvuII制限酵素部位にSphIリンカーを付加した後、pUC18-35SのSphIおよびHindIII制限酵素部位の間にその断片を結合した。これによってプラスミドpA7を得た。ここで、35SプロモーターおよびOcsターミネーターを含む全ポリリンカーを、EcoRIおよびHindIIIを用いて除き、適切に切断されたベクターpBin19に結合した。これにより、植物発現ベクターｐBinAR(Hofgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230)を得た。
【０１４０】
Solanum tuberosum由来のパタチン遺伝子B33のプロモーター(Rocha-Sosa ら., 1989, EMBO J. 8, 23-29)を、DraI断片（ヌクレオチド-1512-+14）として、末端をT4−DNAポリメラーゼを用いて平滑にしたSstI-切断ベクターpUC19 に結合した。これによってプラスミドpUC19-B33を得た。このプラスミドからB33 プロモーターを、EcoRIおよびSmaIを用いて除き、適切に制限酵素で切断されたベクターpBinARに結合した。これにより植物発現ベクターpBinB33を得た。さらなるクローニングステップを容易にするため、MCS（マルチプル・クローニング部位）を延長した。この目的のために、二つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、95℃で5分間熱し、良好なアニーリングをさせるために室温までゆっくり冷やし、pBinB33のSalIおよびKpnI制限部位にクローニングした。この目的のために用いるオリゴヌクレオチドは、次の配列を有している：
【表１】
2009509556.tif 000002
得られたプラスミドはIR 47-71と呼ばれる。
【０１４１】
２．植物発現ベクターpBinARHygの調製
制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIを用いてpA7から、35Sプロモーター、Ocsターミネーターおよび全マルチプルクローニング部位を含む断片を除き、同じ制限エンドヌクレアーゼを用いて切断したベクターpBIBHyg(Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203)にクローニングした。得られたプラスミドをpBinARHygと名づけた。
【０１４２】
３．核酸分子の合成
ａ）Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子の合成
Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列を、Medigenomix GmbH (Munich, Germany)で合成し、Invitrogen (Prod. No. K2000-01)からのベクターpCR2.1にクローニングした。得られたプラスミドをIC 323-215と名づけた。Paramecium bursaria Chlorella Virus 1からのHASタンパク質をコードする合成核酸配列を、配列番号３に示す。Paramecium bursaria Chlorella Virus 1から最初に単離した対応する核酸配列を、配列番号１に示す。
【０１４３】
ｂ）Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の合成
Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、Entelechon GmbH で合成しInvitrogen由来のベクター pCR4Topo (Prod. No. K4510-20)にクローニングした。得られたプラスミドをIC 339-222と名づけた。Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHタンパク質をコードする合成核酸配列を、配列番号６に示す。Paramecium bursaria Chlorella Virus 1から最初に単離した核酸の配列を、配列番号４に示す。
【０１４４】
４．Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列を含む植物発現ベクターIC 341-222の調製
BamHIおよびXhoIを用いた制限酵素消化を用いて、ヒアルロナン合成酵素のコード配列を含む核酸分子をプラスミIC 323-215から単離し、プラスミドIR 47-71のBamHIおよびXhoI制限酵素部位にクローニングした。得られた植物発現ベクターはIC 341-222と名づけた。
【０１４５】
５．Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクターIC 349-222の調製
BamHIおよびKpnIを用いた制限酵素消化を用いて、Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸分子をプラスミIC 339-222から単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼによって切断したプラスミドpA7にクローニングした。得られたプラスミドをIC 342-222と名づけた。XbaIおよびKpnIを用いた制限酵素消化を用いて、Paramecium bursaria Chlorella Virus 1のUDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸分子をプラスミIC 342-222から単離し、XbaIおよびKpnIによって切断した発現ベクターpBinARHygにクローニングした。得られたプラスミドをIC 349-222と名づけた。
【０１４６】
６．ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を含む植物発現ベクターを用いての植物の形質転換
ジャガイモ植物（cv Desiree）を、一般方法第１項に与えられた方法を用いて、Solanum tuberosum (Rocha-Sosa ら, 1989, EMBO J. 8, 23-29)由来のパタチン遺伝子B33 のプロモーターの制御下のParamecium bursaria Chlorella Virus 1由来のヒアルロナン合成酵素のコード核酸配列を含む、植物発現ベクターIC 341-222を用いて形質転換した。プラスミドIC 341-222で形質転換されて、得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、365ESと名づけた。
【０１４７】
７．ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を含む植物発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック植物の分析
ａ）検定曲線の構築
市販試験キット(hyaluronic acid (HA) test kit Corgenix Inc.由来, Colorado, USA, Prod. No. 029-001)に供給される標準溶液を用い、製造者が記述した方法によって検定曲線を構築した。ヒアルロナンの1600ng/mlにおける吸光度を測定するために、ヒアルロナン800ng/mlを含む、製造者によって指示された供給された標準の量に基づいて、２倍量を用いた。それぞれの場合、３回の独立した測定を実施し、対応する平均値を決定した。これが、次の検定曲線を与える。
【０１４８】
【表２】
2009509556.tif 000003
表１：植物組織におけるヒアルロナン含有量の定量的測定のための、検定曲線を構築するための数値。ソフトウエア(Microsoft Office Excel 2002, SP2)を用いて、得られた測定値をダイアグラムに入力し、傾向線の関数方程式を決定した（図１を参照）。E450nmは、波長450nmでの吸光度を言い、s.d.は個々の数値の計算された平均値の標準偏差である。
【０１４９】
365ES株のジャガイモ塊茎の分析
温室において、365ES株の個々の植物を、６cm鉢中で、土壌中で栽培した。それぞれの場合、個々の植物のジャガイモ塊茎物質の約0.3gを、一般方法第２項で記載した方法により、加工した。一般方法第４項で記載した方法を用いて、それぞれの植物抽出物に存在するヒアルロナンの量を、実施例７ａ)および図１に示した検定曲線を用いて測定した。ここでは、ヒアルロナン含有量を測定するために、遠心分離後得られた上清の１:１０の希釈を用いた。選択された植物について、以下の結果を得た。
【０１５０】
【表３】
2009509556.tif 000004
表２：365ES株の個々のトランスジェニック植物によって産生されたヒアルロナンの量（新鮮重量1g当りのヒアルロナンのμg）。第１列は、そこから塊茎材料が収穫された植物を言う（ここでは「野生型」は、形質転換されていない植物を言うが、それらは、しかしながら、形質転換のための出発材料として用いられた遺伝型を有する）。第２列は、ヒアルロナン含有量を測定するために用いた問題となる植物の塊茎材料の量を示す。第３の列は、それぞれの植物抽出物の1:10希釈の測定した吸光度を示す。第４の列は、希釈係数を考慮に入れて回帰直線(図１参照)を用いて計算したもので、次の式による：（（第３列の数値−0.149）/0.00185）x10。第５列は、使用した新鮮重量に基づいたヒアルロナンの量を示し、次のように計算される：（第４列の数値/第２列の数値）/1000。「n.d.」は検出可能でない量である。
【０１５１】
８．UDP-Glc-DHの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクターを用いてのヒアルロナン合成植物の形質転換
ジャガイモ植物365ES 13 および365ES 74株は、それぞれの場合、一般方法第１項で与えられた方法を用いて、植物発現ベクター349-222で形質転換された。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、植物組織中のヒアルロナン含有量を計算するための検定曲線および対応する回帰直線を示す。検定曲線は市販試験キット(Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001)およびそれに供給される標準溶液を用いて調製した。
【図１】
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【配列表】
2009509556000001.app
【国際調査報告】
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