(57)【要約】【課題】Ｂ型肝炎ワクチンを増強するタンパク質およびそれをコードする遺伝子、それを発現する方法およびそのタンパク質の応用を提供する。【解決手段】ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから、このタンパク質のｃＤＮＡをスクリーニングし、配列決定し、およびそれをこのｃＤＮＡでコードされるタンパク質の発現のために原核細胞あるいは真核（動物あるいは植物）細胞にクローン化し、得られたタンパク質を精製する。得られたタンパク質は、ＨＢワクチンと共に用いる場合、ワクチンの効果を顕著に増強し、ＨＢＶキャリアの免疫力を高め、そして、抗体の力価を高める。このタンパク質はまた、ＨＢワクチンのアジュバントとして用いられ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、Ｂ型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の配列である、Ｂ型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をスクリーニングする方法であって、ヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ウエスタンブロットにてＨＢｓＡｇをプローブ分子として使用してスクリーニングすること、ポジティブｃＤＮＡクローンを得て、塩基配列を決定すること、その結果１０３５ｂｐの独立したオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡを得ることを含む、方法。
【請求項４】
請求項１記載のＢ型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質を発現する方法であって、該タンパク質のＮ末端上にある６×ヒスタグ領域およびエンテロキナーゼ開裂部位をクローンし、ｐＢＶ２２０発現システム中にサブクローンし、大腸菌中でタンパク質を発現させ、大腸菌を集菌し、溶菌し、混合体を単離し、粗精製を行い、標的タンパク質を、最終的に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲルおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いて集中的に精製し、最終的に透析を行ってタンパク質を得る工程を含む、方法。
【請求項５】
請求項１記載の配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質のＨＢワクチンのアジュバントとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に、高い特異性で結合し、そしてＢ型肝炎ウイルスワクチンの免疫応答を促進するタンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、およびそのタンパク質を、関連する疾患の予防、診断、および治療に応用すること、に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、高頻発で、重大な結果をもたらす伝染性の疾患であり、公共の健康にとって、重大な脅威である。ワクチン接種が、ＨＢＶ感染予防およびＨＢＶのキャリアの割合を減少させる最も効果的な対策である。しかし、Ｂ型肝炎ワクチンへの免疫反応は、個人により様々である。標準の６ヶ月３用量を受ける多くの人の中で、保護できるほどの多くの抗体が産生されない。従って、Ｂ型肝炎ワクチンの免疫原性を効果的に増強し、免疫応答を高める分子を見つけることは、この問題を解決するのに重要な方法である。
【０００３】
原核発現システム（例えば大腸菌）または真核発現システム（例えば哺乳類細胞）のいずれかを用いた遺伝子操作は、特定のタンパク質を大量に得る為に最も効果的な方法である。遺伝子は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることで、同定される。その遺伝子によりコードされるタンパク質は、遺伝子クローニング、発現および精製によって得られる。得られたタンパク質は、Ｂ型肝炎ワクチンとの組合せで、動物を免疫するのに用いる。免疫された動物におけるＢ型肝炎表面抗体の力価は、ＥＬＩＳＡで検出される。これは、タンパク質が、ＨＢＶワクチンへの免疫応答を促進できるかを決めるのに都合がよく、従って、ヒトへの使用の可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明では、Ｂ型肝炎ワクチンを強化するタンパク質、その遺伝子、およびこのタンパク質の発現および利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＨＢワクチンを強化するタンパク質の遺伝子配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列表の配列番号１および２である。
【０００６】
本発明者は、遺伝子操作方法を用いて、上記の遺伝子を、ヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーから得て、それを発現させた。アプローチは、以下の通りである。
【０００７】
目的のタンパク質およびそのタンパク質をコードするｃＤＮＡを得る。ヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、Ｂ型肝炎表面抗原に対するイムノブロットにてスクリーニングすることで、ポジティブｃＤＮＡクローンを得る。ｃＤＮＡ配列の分析により、１０３５ｂｐの独立したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在が明らかになった。さらなる実験により、ｃＤＮＡでコードされたタンパク質が、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的に結合することが証明された。このタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原結合タンパク質（ＨＢｓＡｇ結合タンパク質、ＳＢＰ）と名づけられる。
【０００８】
このｃＤＮＡのＯＲＦは、Ｎ末端上にある６×ヒス精製タグおよびエンテロキナーゼ開裂部位ＤＤＤＤＫに付加され、原核発現システムｐＢＶ２２０にクローン化した。タンパク質発現は、大腸菌中にて、最適温度で誘導された。大腸菌は、回収および溶菌に供され、封入体を抽出した。そして、大まかに精製し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。透析方法を用いてリフォールディングを行った後、標的タンパク質を得た。
【０００９】
ＳＢＰが、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答に与える影響：実験用動物は、テストグループおよびコントロールグループに分けられた。例えば、マウスに、従来の方法で、Ｂ型肝炎ワクチンを免疫した。2回のブーストワクチン接種を、最初の用量の10日後および17日後に皮下注射した。テストグループは、ＳＢＰを3日おきに皮下注射された。コントロールは、ＳＢＰを受けなかった。最初の用量の20日後に、尾静脈から血液を得た。血清中のＢ型肝炎表面抗原に対する抗体の力価をＥＬＩＳＡで検出した。ＳＰＳＳソフトウエアを、グループの相違の分析に用いた。その結果、このタンパク質は、マウスにおいて、抗体の力価を著しく増加させた。すなわち、タンパク質は、Ｂ型肝炎ワクチンの免疫応答を強化することができる。
【００１０】
従って、ＳＢＰは、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの免疫原性を促進することに用いられ得る。そして、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体の力価を高めることに用いられ得る。その結果、ＳＢＰは、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンのアジュバントとして用い得る。ＳＢＰのＢ型肝炎ウイルスワクチンとの組合せの使用により、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンに対する免疫反応を増強することができ、ワクチン接種の用量および頻度を減少させることができる。ＳＢＰが、高い特異性でＢ型肝炎表面抗原に結合することができ、抗表面抗体の力価を増加させるという事実は、ＳＢＰが、患者／キャリアーの治療の効率を高めるのに使用することができること、および治療的なワクチンとして開発できることを示す。さらに、ＳＢＰは、研究目的に使用することができる。例えば、これらのＳＢＰは、内因性のＳＢＰを免疫機能のインデックスとして検出する為のモノクローナル抗体の生産にも用い得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
遺伝子配列の調製
Ｂ型肝炎表面抗原結合タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンは、ヒト肝臓ｃＤＮＡファージ発現ライブラリーを、イムノブロッティングにより、ヒトプラズマから精製した完全Ｂ型肝炎表面抗原（プレＳ１、プレＳ２、およびＳゾーンを含む）でスクリーニングすることによって得られた。遺伝子配列決定の結果により、１０３５ｂｐの独立したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が解明された（配列表の配列番号１）。このｃＤＮＡでは、３４４個のアミノ酸残基がコードされ、理論上の分子量は、３８ｋｕであった。等電点（ＰＩ）は、８．０であった。推定配列により、典型的な膜貫通領域が示唆され、およびイムノグロブリンスーパーファミリーへの分類が示唆された。ＯＲＦによりコードされるタンパク質の配列は、配列表の配列番号２に示される通りである。
【００１２】
発現および精製
タンパク質の発現および精製は、上述の遺伝子が、原核または真核発現ベクター中でクローン化された後になされた。全遺伝子は、ｐＢＶ２２０原核発現ベクター中にクローン化された。大腸菌に組換えベクターをトランスフェクトした。ポジティブモノクローンを、液体培養培地中で培養した。タンパク質発現は、最初に３７℃にて、次に４２℃にて、５時間誘導した。タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティーカラムで精製された。精製されたタンパク質は、透析によって、リネイチャーされた。タンパク質とターゲットとの相互作用は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングにて確認された。
【００１３】
ＨＢワクチンでの調製されたタンパク質の影響の評価：Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週齢；半数は雄および半数は雌）を、テストグループとコントロールグループとに分ける。ＨＢワクチンは、マウスの皮下に、常法にて注入される。注入のプロトコールは、以下の表に示す。
【表１】
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血液を最初の免疫の20日後に尾静脈から得た。血清中のＢ型肝炎表面抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＳＰＳＳソフトウエアをグループの相違を分析する為に用いた。
【００１４】
その結果、図１および図２に示す通り、最初の免疫の20日後のテストグループの抗表面抗体力価は、９．２４×１０４であり、コントロールの数値（２．６８×１０４）よりも顕著に高かった。この結果から、タンパク質が、マウス内での抗表面抗体のレベルを顕著にアップレギュレートし、Ｂ型肝炎ワクチンの免疫応答を増強することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
Ｂ型肝炎ワクチンの免疫応答は、異なる個人により様々である。標準の6ヶ月３用量ワクチン接種の処方を受けた多くの人において、保護が確保できるほどの十分な抗体が産生されない。本発明のタンパク質は、顕著にＢ型肝炎ワクチンの免疫応答を増強することができる。従って、これらのタンパク質は、Ｂ型肝炎ワクチンのアジュバントの開発に、あるいは、直接、現在市販されているＢ型肝炎ワクチンと組み合わせて、用いられ得る。Ｂ型肝炎ワクチンと同時にＳＢＰの一定量を使用することで、ワクチンの免疫原性が上がり、中和抗体の力価が増加する。ＳＢＰは、Ｂ型肝炎表面抗原に対して、特異的な親和性を有し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体の産生を増加させることができる。その結果、ＳＢＰは、Ｂ型肝炎ウイルスの患者およびキャリアの治療に用い得る。ＳＢＰは、治療目的のＢ型肝炎ワクチンの開発の研究にも価値を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｉ）中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価に与えるＳＢＰの影響。
【図２】Ｂａｌｂ／ｃマウス（□）中の抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価に与えるＳＢＰの影響。治療を受けない同年齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、コントロールとして用いた。コントロールの値（０．１３）と比較してＯＤ４９５値が１０倍高い場合には、ポジティブと考えられた。抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価は、１次元回帰を用いたＯＤ値および血清希釈率によって計算した。テストグループ（ｎ＝５）の、抗ＨＢｓＡｇ抗体の力価は、９．２４×１０４であった。コントロールマウス（ｎ＝５）の力価は、２．６８×１０４であった。独立サンプルのｔ−テストにおいて、違いは顕著であった（Ｐ＜０．０４）。従って、ＳＢＰは、マウス中で、ＨＢｓＡｇ抗体力価を増加させることができた。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月2日(2009.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、Ｂ型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の配列である、Ｂ型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をスクリーニングする方法であって、ヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ウエスタンブロットにてＨＢｓＡｇをプローブ分子として使用してスクリーニングすること、ポジティブｃＤＮＡクローンを得て、塩基配列を決定すること、その結果１０３５ｂｐの独立したオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡを得ることを含む、方法。
【請求項４】
請求項１記載のＢ型肝炎ワクチンの効果を増強するタンパク質を発現する方法であって、該タンパク質のＮ末端上にある６×ヒスタグ領域およびエンテロキナーゼ開裂部位をクローンし、ｐＢＶ２２０発現システム中にサブクローンし、大腸菌中でタンパク質を発現させ、大腸菌を集菌し、溶菌し、組み換え体を単離し、粗精製を行い、標的タンパク質を、最終的に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて集中的に精製し、最終的に透析を行ってタンパク質を得る工程を含む、方法。
【請求項５】
請求項１記載の配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の適用であって、ここで、該タンパク質は、ヒトおよび／または動物の使用のためのワクチンの開発におけるＢ型肝炎ウイルスワクチンのアジュバントとして使用されるか、あるいは該タンパク質の免疫機能の指標の決定の為のモノクローナル抗体の調製に使用される、適用。
【請求項６】
請求項５に記載の適用であって、配列表の配列番号１の遺伝子が、部位特異的変異による組換えで修飾され発現され、配列表の配列番号２に記載の配列と８０％より大きい相同性アミノ酸配列を有するタンパク質が得られ、該タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン用のアジュバントとして用いられる、適用。
【請求項７】
請求項５に記載の適用であって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、融合、ポリメライゼーション、あるいは混合によって他の抗原成分と共に使用され、抗原の免疫効果を高める、適用。
【国際調査報告】
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