(57)【要約】  本発明は、乳癌または結腸直腸癌に特異的に過剰発現するＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、およびＫＩＡＡ０１０１の診断用マーカーを提供するものである。該マーカの検出することにより当該ガンを診断する方法、および前記マーカの発現および活性を阻害することで予防または治療する方法を開示する。
2009507515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＨＲＣ１（コラーゲン  トリプル  ヘリックス  リピート  コンテイニング  １）、ＣＡＮＰ（癌結合核タンパク質）、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカー。
【請求項２】
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカー。
【請求項３】
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定しうる薬剤を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーの検出キット。
【請求項４】
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子のタンパク質レベルを測定しうる薬剤を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーの検出キット。
【請求項５】
テスト用生体サンプルおよびコントロールサンプルの間のＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現レベルを対比することを含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーを検出する方法。
【請求項６】
前記生体サンプルは、組織、細胞、全血、血清、唾液、痰、脳脊髄液、および尿からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
所定の遺伝子に特異的なＲＮＡインターフェランスを誘導でき、所定の遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖及び対応するセンスＲＮＡ鎖から構成される、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉  ＲＮＡ）配列を含み、ここで、所定の遺伝子はＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、乳癌または結腸直腸癌の予防および治療用薬剤組成物。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．：１７および１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．：１９および２０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．：２１および２２で示されるヌクレオチドの対を構成する、請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に特異的な抗体を含む、乳癌または結腸直腸癌の予防および治療用薬剤組成物。
【請求項１０】
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の細胞内のｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させることを有する、乳癌もしくは結腸直腸癌の細胞増殖を抑制するまたは乳癌もしくは結腸直腸癌細胞のアポトーシスの誘導する方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の薬剤組成物を投与することを含む、乳癌もしくは結腸直腸癌の細胞増殖を抑制するまたは乳癌もしくは結腸直腸癌細胞のアポトーシスの誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は癌の診断用マーカーに関する。さらに詳しくは、本発明は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、およびＫＩＡＡ０１０１の癌に対する診断用マーカー、それは乳癌と結腸直腸癌の場合に過剰発現されるものに関する。また、本発明は、診断マーカーの活性および発現の阻害を含み、診断マーカーの発現を検出することによる診断方法、ならびに癌の予防および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
世界の３００万人以上の人が２００３年に新たに癌を発生したことが報告された。韓国においては癌の発生率は毎年増加しており、そして、２００２年では数十万人もの数にのぼる。肺癌、結腸直腸癌および乳癌は、概算で全ての癌患者の約４０％を占める。食生活の欧米化に伴い、韓国において結直腸癌、乳癌と肺癌の発生が段階的に増加する傾向にある。
【０００３】
長い間、癌に対する広範囲および重点的な研究にもかかわらず、確実に癌を治療する有用な方法は、いまだ開発されていない。初期段階の癌を除去する手術は、長期生残の可能性をあげる最も効果的方法であることが知られている。
【０００４】
その作用メカニズムに応じて、従来の抗癌剤は、主に補助的な治療、細胞傷害能、およびホルモンに分類される。補助的な治療は、直接、腫瘍細胞を対象とするものではなく、初期の治療の手助けするために使用されており、抗催吐薬、ビスホスホネート、造血成長因子、鎮痛剤などが挙げられる。細胞障害能の治療は、急速な増殖型の細胞をアポトーシスに誘導するよう作用する。ホルモンは、それらの活性機構に従い、アルカリ化剤、抗代謝体、ビカアルカロイド（ｖｉｋａａｌｋａｌｏｉｄｓ）、およびアントラサイクリン／エトポシドに分けられる。第一の抗癌剤、細胞障害性治療としての使用は、この５０年間でさまざまな癌の治療において広く使われていた。しかしながら、非特異的な活性作用は、細胞障害性治療が細胞毒の治療が腫瘍細胞だけに対する阻害活性だけではなく、他の正常な細胞増殖に対しても強力な細胞毒性を示し、その結果、深刻な副作用を招来する。ホルモン剤は、例えば乳房、胸部、前立腺などのホルモンに敏感な組織の腫瘍を無くすために開発された。胸部または前立腺のような組織における腫瘍細胞の細胞分裂は、特定のホルモンによって促進される傾向がある。したがって、これらのホルモン作用の抑制は、癌の進行を阻害する結果となる。
【０００５】
ホルモン療法は、毒性は小さいが、副作用もある。加えて、長期間ホルモン剤を投与すると、ホルモン剤に耐性を示す不治の癌を引き起こす。
【０００６】
従来の抗癌剤の問題、すなわち、副作用および耐性ができることを解決するための代替手段として、特に癌を標的とする新規な機構を示す新規な治療法が開発されている。治療的機構は様々であるが、革新的な治療は、正常細胞の腫瘍形成中に現れる、特異的マーカーまたは遺伝的異常を利用して、腫瘍を特異的に治療するという点で、共通点がある。近年開発されている治療法は、大きくは、癌治療的機構に関し、血管形成阻害薬、免疫賦活剤および腫瘍標的薬剤に分類することができる。最近、抗癌剤の毒性を最小限化するための代替手段として生じている癌標的療法の最も重要なポイントは、癌細胞に対し特異的な遺伝子を発見することである。それを達成すべく、世界的に非常に著名なバイオ企業が、必死になり、遺伝子発現プロファイル、遺伝子マッピング、プロテオミクス、コンピュータ解析などを通じて、新しい標的遺伝子を調査している。例えば、世界におけるリーディングバイオ企業の一つであるジェネンテックは、最近２７年間で、ゲノミクスを使った新規な標的発見計画を向上させ、約１，２００の疾患に関連する遺伝子の特許権を有している。近年では、ＳＰＤＩ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）計画が、行われ（１９９６−２００１）、新規な２５０のタンパク質を含む１，０００以上の分泌タンパク質を入手した。このような背景から、乳癌、結腸直腸および肺癌細胞ならびに正常細胞の間の発現レベルの差異をスクリーニングすることを目的として、本発明者らは、鋭意徹底的な癌診断および治療を行い、その結果、３つの新規な遺伝子  ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよびＫＩＡＡ０１０１は、乳癌または結腸直腸癌細胞において、特異的に過剰発現することを見出し本発明に至った。また、これら遺伝子の発現が抑制されると、癌細胞は、細胞自然死を遂げ、増殖を遅らせることになることも観察された。すなわち、この遺伝子  ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよびＫＩＡＡ０１０１は、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーとして使用することができるだけではなくて、癌治療の標的としても使用することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
開示
【課題を解決するための手段】
【０００８】
技術的課題
すなわち、本発明の目的は、ＣＴＨＲＣ１（コラーゲン  トリプル  ヘリックス  リピート  コンテイニング  １）、ＣＡＮＰ（癌結合核タンパク質）、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーを提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定しうる薬剤を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーの検出キットを提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子のタンパク質レベルを測定しうる薬剤を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーの検出キットを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、テスト用生体サンプルおよびコントロールサンプルの間のＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現レベルを対比することを含む、乳癌または結腸直腸癌の診断的マーカーを検出する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、所定の遺伝子に特異的なＲＮＡ干渉を誘導でき、所定の遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖及び対応するセンスＲＮＡ鎖から構成される、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉  ＲＮＡ）配列を含み、ここで、所定の遺伝子はＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、乳癌または結腸直腸癌の予防および治療用薬剤組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に特異的な抗体を含む、乳癌または結腸直腸癌の予防および治療用薬剤組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の細胞内のｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させることを有する、乳癌もしくは結腸直腸癌の細胞増殖を抑制するまたは乳癌もしくは結腸直腸癌細胞のアポトーシスの誘導する方法を提供することである。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、ＤＤＲＴ  ＰＣＲゲルに分離されたＤＮＡを示す。
図２は、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション画像を示す。
図３は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフを示す。
図４は、動物における腫瘍形成プロセスを示す。
図５は、ｍＲＮＡレベルの変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
図６は、アポトーシスの誘起および細胞増殖の変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
図７は、ＤＮＡ断片化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
図８は、カスパーゼ活性の変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
図９は、膜変性によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
図１０は、細胞周期の変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
ベストモード
一実施形態によれば、本発明は、乳癌または結腸直腸癌の診断用のマーカーに関し、該マーカーは、ＣＴＨＲＣ１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １）、ＣＡＮＰ（Ｃａｎｃｅｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＫＩＡＡ０１０１およびこれらの組合わせからなる群から選ばれる遺伝子を含む。
【００１７】
本明細書において用いられる「診断」という用語は、兆候および症状により、また種々の診断的方法から、病状または病気を特定する過程を意味する。
【００１８】
本発明の目的に対し、乳癌または結腸直腸癌の診断マーカーが発現するかどうかを調べることにより、乳癌および結腸直腸癌の発生を決定することを意味するために、「診断」は用いられる。
【００１９】
本明細書において用いられる「診断用のマーカー」（ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）、「診断のマーカー」（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ）または「診断マーカー」（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｍａｒｋｅｒ）という用語は、正常細胞と、乳癌または結腸直腸癌細胞とを区別することができる物質を指す。正常細胞と比較して乳癌または結腸直腸癌細胞において発現レベルが増加する限り、または減少する限り、ポリペプチド、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、脂質、糖脂質、糖蛋白質および単糖類（単糖、二糖、オリゴ糖）等の有機生体分子を、乳癌または結腸直腸癌の診断マーカーとして用いることができる。本発明において有用な乳癌または結腸直腸癌の診断用マーカーは、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびこれらの組合わせから選ばれる遺伝子、または対応する蛋白質であり、該蛋白質の発現レベルは、正常細胞と比較して乳癌または結腸直腸癌細胞において増加する。
【００２０】
ＣＴＨＲＣ１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １；ＧｅｎｅＩＤ  １１５９０８  ＮＭ＿１３８４５５）（これはヒトゲノムプロジェクト（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｚｅｌ，２００４）が完了した後の２００３年にクローン化された）は、動脈損傷の際に発現レベルが上昇し、細胞遊走を促進するためにコラーゲンマトリックスの蓄積を阻害することが報告されている（Ｐｙａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。しかしながら、その詳細な機能は不明なままである。
【００２１】
ＣＡＮＰ（Ｃａｎｃｅｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＧｅｎｅＩＤ  ３７４３９３  ＮＭ＿１９８９４７）はヘパトーマ細胞からＬｉｕらによってクローン化された遺伝子として登録された。ＣＡＮＰの全長クローンは、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇらによってクローン化された（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。機能および癌との関係に関するＣＡＮＰについての情報は現在までのところなされていない。
【００２２】
ＫＩＡＡ０１０１（ＫＩＡＡ０１０１；ＧｅｎｅＩＤ  ９７６８  ＮＭ＿０１４７３β）については、（ＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）のみが報告されている（Ｎａｇａｓｅ  ｅｔ  ａｌ，．１９９５）。ＫＩＡＡ０１０１の機能はいまだ決定されていない。Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．が、前立腺癌（米国第６，３５５，４３０号）のマーカーとしてのこれらの使用に対する特許権を有する。Ｍｉｚｕｔａｎｉらは、悪性前立腺癌においてＫＩＡＡ０１０１を過剰発現させたことを報告した（Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。しかしながら、乳癌または結腸直腸癌においてＫＩＡＡ０１０１の過剰発現は報告されておらず、また、ＫＩＡＡ０１０１の発癌性はこれまで観察されていない。
【００２３】
本願発明者は、ＣＴＨＲＣ１のｍＲＮＡレベルが正常細胞と比較して、乳癌細胞において１０．９倍、結腸直腸癌において２２倍に増加し、ＣＡＮＰのｍＲＮＡレベルが正常細胞と比較して、乳癌細胞において１１倍、結腸直腸癌において２倍に増加し、そしてＫＩＡＡ０１０１のｍＲＮＡレベルが正常細胞と比較して、乳癌細胞において１２．８倍、結腸直腸癌において２．２倍に増加したことを見出した。
【００２４】
したがって、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよびＫＩＡＡ０１０１の発現レベルの定量化は、乳癌または結腸直腸癌の発生を決定することに用いられうる。
【００２５】
他の実施形態によれば、本発明は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびこれらの組合わせから選択される遺伝子のｍＲＮＡレベルに基づいて、乳癌または結腸直腸癌の診断マーカーを検出するためのキットに関する。
【００２６】
詳細には、本発明による乳癌または結腸直腸癌の診断マーカーを検出するキットは、遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する試薬を含む。
【００２７】
遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する試薬は、好ましくは一対のプライマーまたはプローブである。ＣＴＨＲＣ１についてはＮＭ＿１３８４５５（ＮＣＢＩ）、ＣＡＮＰについてはＮＭ＿１９８９４７（ＮＣＢＩ）、そしてＫＩＡＡ０１０１についてはＮＭ＿０１４７３６（ＮＣＢＩ）において、ヌクレオチド配列が既に見つかっているので、当業者であればヌクレオチド配列に基づいて、遺伝子の予め定められた領域を特異的に増幅することに用いられるプライマーやプローブを設計することができる。
【００２８】
本明細書において、「プライマー」という用語は、３’ヒドロキシ末端を有する短い核酸鎖を指し、新たに鋳型鎖を生成させるための開始点としての役割を果たすように相補的な鋳型と塩基対を形成する。ＤＮＡ合成または複製には、プライマーに加えて、適切なバッファー、適切な温度、重合酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）および４種のヌクレオチド三リン酸が必要となる。マーカー遺伝子のＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１に対して特異的で、本発明に有用なプライマーは、ヌクレオチドが７〜５０の長さの範囲であるセンスおよびアンチセンス核酸である。プライマーは、開始点としてプライマーの基本的役割を変えない限り、追加の特性が加えられてもよい。
【００２９】
必要であれば、本発明のプライマー配列は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的方法を用いて直接的にまたは間接的に検出しうる標識を有していてもよい。標識の例としては、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ）、ラジオアイソトープ（例えば、３２Ｐ）、蛍光分子、および化学基（例えば、ビオチン）などが挙げられる。
【００３０】
本発明において、「一対のプライマー」という用語は、プライマーペアの全ての組み合わせから選択される１種を指し、各々はセンスヌクレオチド配列とアンチセンスヌクレオチド配列から構成される。好適には、分析結果に特異性と感受性を与えうる一対のプライマーである。プライマーのヌクレオチド配列が、サンプル中に存在する非標的配列に結合せず、非特異的増幅のない、標的遺伝子配列のみを増幅するために用いられうる場合、プライマーは高い特異性を示しうる。本明細書において「非特異的増幅」という用語は、プライマーの非標的配列のハイブリダイゼーションおよび引き続いてのハイブリダイズしたプライマーの伸長に起因する、標的とするヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列の増幅を意味する。
【００３１】
本明細書中に使用される、「プローブ」ということばは、数個から数百個の塩基長の、ｍＲＮＡに特異的に結合できる核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を意味する。本発明で使用できるプローブは、特異的なｍＲＮＡの存在または不存在を検出できるように標識される。プローブは、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡの形態であってもよい。
【００３２】
本発明で使用できるプライマーまたはプローブは、ホスホルアミダイト固体担体または他の既知の技術を用いて化学合成されうる。そのヌクレオチド配列は、当該分野において既知の様々な手段を用いて修飾されてもよい。例えば、修飾方法は、以下に限られないが、メチル化、「キャッピング」、天然ヌクレオチドの１以上の相同体による置換、および非荷電リンカー（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、カルバメートなど）または非荷電リンカー（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などの、ヌクレオチド間の変更が挙げられる。
【００３３】
標的遺伝子の配列が開示されているおかげで、当業者は、既存のデータベースによって標的遺伝子内の配列のうちのハイブリダイゼーションの程度を考慮して非常に特異的でかつ感受性の高いプライマー対の組み合わせを容易に決定できる。本発明の具体的な実施形態においては、ＣＴＨＲＣ１の発現は、配列番号：５及び６のプライマーを用いたｍＲＮＡレベルで検出され、ＣＡＮＰの発現は、配列番号：７及び８のプライマーを用いたｍＲＮＡレベルで検出され、さらに、ＫＩＡＡ０１０１の発現は、配列番号：９及び１０のプライマーを用いたｍＲＮＡレベルで検出される。
【００３４】
本発明に係る検出キットは、一以上の成分からなる組成物、溶液または装置を含む。
【００３５】
好ましくは、乳癌または結腸直腸癌の検出用キットは、ＲＴ−ＰＣＲに必要な要素を含む。このＲＴ−ＰＣＲキットは、詳細には、マーカー遺伝子に特異的なそれぞれのプライマー対に加えて、試験管または他の適当な容器、反応バッファー（様々なｐＨやＭｇ濃度を有する）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ、逆転写酵素やＤＮａｓｅ等の酵素、ＲＮＡａｓｅインヒビター、ＤＥＰＣ−水、及び脱イオン水を含んでもよい。必要であれば、定量用のコントロール遺伝子に特異的なプライマー対をキットに含ませてもよい。
【００３６】
加えて、乳癌または結腸直腸癌の診断マーカーの検出用キットは、ＤＮＡチップ機能に必要な要素を有していることが好ましい。本発明の好ましい実施形態においては、ＤＮＡチップキットは、基質、基質にプローブとして結合する遺伝子または対応するｃＤＮＡを有してもよく、さらに必要であれば、基質に結合する定量用のコントロール遺伝子または対応するｃＤＮＡを有していてもよい。
【００３７】
さらなる実施形態によると、本発明は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の発現レベルを定量できる材料を含む、乳癌または結腸直腸癌の診断用キットに関するものである。
【００３８】
詳細には、本発明に係る乳癌または結腸直腸癌の診断用キットは、タンパク質レベルを測定できる物質を含む。
【００３９】
タンパク質レベルを測定するのに好ましい物質は、抗体であってもよい。マーカータンパク質ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ及びＫＩＡＡ０１０１が同定されているため、これらのタンパク質に対する抗体の生産は既知の技術を用いて容易に達成されうる。タンパク質ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１に特異的に結合する限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換抗体に関係なく、いずれの抗体を本発明で使用してもよい。
【００４０】
タンパク質ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１を宿主哺乳動物に注射し、ポリクローナル抗体をこの宿主哺乳動物から採取した血清から得る既知の方法を用いて、ポリクローナル抗体を生産してもよい。ポリクローナル抗体の生産に使用できる宿主哺乳動物の例としては、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌなどが挙げられる。
【００４１】
モノクローナル抗体の生産に関しては、既知のハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７６），  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５１１−５１９に言及される）、またはファージ抗体ライブラリー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８，  １９９１；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８，  １−５９７，  １９９１）を用いてなされてもよい。
【００４２】
加えて、本発明で使用できる抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖から構成される、完全抗体の形態であっても、または抗体分子の機能性断片であってもよい。「抗体分子の機能性断片」ということばは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ等に例示される、少なくとも抗原結合機能を有するセグメントを意味する。
【００４３】
好ましくは、本発明に係る診断マーカーの検出用キットは、ＥＬＩＳＡを実施するのに必要な要素を含む。このＥＬＩＳＡキットは、結合した抗体を検出するための試薬を含み、例えば、標識された二次抗体、発色団、ならびに酵素（例えば、抗体と共役した）およびこの基質を含む。必要であれば、キットは、定量用のコントロールタンパク質に特異的な抗体をさらに有していてもよい。
【００４４】
さらなる他の実施形態によると、本発明は、試験用生体サンプルとコントロールサンプルとの、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１及びこれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子の発現レベルを比較することを特徴とする、乳癌または結腸直腸癌の診断用マーカーの検出方法に関するものである。
【００４５】
本方法において、遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定されてもよい。その際、既知の方法を用いて、生体サンプルからｍＲＮＡまたはタンパク質を分離してもよい。
【００４６】
本明細書中に使用される、「生体サンプル」という用語は、マーカー遺伝子ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよび／またはＫＩＡＡ０１０１の発現レベルが乳癌または結腸直腸癌の発症時に変化する、生物物質を意味し、その例としては、組織、細胞、全血、血清、唾液、痰、脳脊髄液、及び尿があるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
ｍＲＮＡレベルの定量分析方法は、ＲＴ−ＰＣＲ、コンペティブＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ分解酵素アッセイ、ノーザンブロッティング、およびＤＮＡチップ方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
タンパク質レベルの定量化としては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、放射性同位元素標識免疫拡散、オークテロニ（Ａｕｃｈｔｅｒｏｎｉ）？、免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、ＦＡＣＳおよび／またはプロテインチップを使用することができるが、これらの方法に限定されるものではなく、あくまでも例示である。
【００４９】
検査法を介して、テストサンプルにおけるマーカー遺伝子の発現レベルを、乳癌または結腸直腸癌を診断するために通常のコントロールにおけるマーカー遺伝子の発現レベルと比較する。まだ更なる実施形態において、本発明は、特にＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１に作用するｓｉＲＮＡに関する。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明は、ＣＴＨＲＣ１−特異的ＲＮＡインターフェランスを誘導することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）配列を提供し、ＣＴＨＲＣ１のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡストランドおよび対応するセンスＲＮＡストランドを含む。
【００５１】
その他の好ましい実施形態において、本発明は、ＫＩＡＡ０１０１−特異的ＲＮＡインターフェランスを誘導することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）配列を提供し、ＫＩＡＡ０１０１のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡストランドおよび対応するセンスＲＮＡを含む。
【００５２】
本明細書中に使用される用語、「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡインターフェランス経路（ＲＮＡｉ）を含む二重鎖ＲＮＡをいい、当該経路において、ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡの分裂を介して目標の遺伝子の発現を妨げるものである。したがって、ｓｉＲＮＡは、目標の遺伝子のｍＲＮＡおよび相補的なアンチセンスＲＮＡストランドとして同一の配列であるセンスＲＮＡストランドから構成される。目標の遺伝子の発現を抑制する能力をともなって、ｓｉＲＮＡは、遺伝子ノックダウン技術または遺伝子治療において通常使用される。
【００５３】
ｓｉＲＮＡは、重複のＲＮＡストランドの完全塩基対の形態に制限されるものではなく、不整合（対応する塩基は相補性でなくともよい）または隆起（一本鎖の対応する塩基の欠如）に起因して部分的に対になっていない形態でもよい。ｓｉＲＮＡは、１０から８０塩基までの長さの範囲が好ましく、より好ましくは１５から６０塩基、さらに好ましくは２０から４０塩基である。ｓｉＲＮＡの末端構造は、平滑または付着（ｂｌｕｎｔ  または  ｃｏｈｅｓｉｖｅ）でもよい。後者の場合、コーヒシブの数にかかわらず、３’の突出端および５’の突出端を利用することができる。例えば、付着末端は１〜８の塩基、好ましくは２〜６の塩基から成る。さらに、目標の遺伝子における発現インターフェランス効果を維持する限り、ｓｉＲＮＡは低分子量ＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびウイルスのＲＮＡといった天然ＲＮＡ分子、または人工のＲＮＡ分子）を片末端の突出部位で有してもよい。ｓｉＲＮＡの末端構造に関しては、両端部におけて切断型であるというわけでなく、二重鎖ＲＮＡの一方の端における末端がリンカーＲＮＡを介して相互に結合しているステムループ構造であってもよい。ステムにおける対の構造を可能にするのに十分な限り、リンカーの長さは特に制限されない。
【００５４】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏで合成されたｓｉＲＮＡのトランスフェクションを介して、またはＰＣＲ由来のｓｉＲＮＡ発現カセットもしくはｓｉＲＮＡ発現ベクターのインフェクションもしくはトランスフェクションを介して、ｓｉＲＮＡは細胞内に導入される。また、当該ＰＣＲ由来のｓｉＲＮＡ発現カセットは細胞内部で設計されうる。本発明におけるｓｉＲＮＡに関連して使用される用語である「特異的」または「特異的に」は、細胞内において目標の遺伝子だけを抑制することができ、他の遺伝子を抑制するものではない。本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１の特異的である。ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１のｍＲＮＡレベルを特異的に減少させることができる限り、本発明のｓｉＲＮＡ、特に配列または長さは制限されるものではない。本発明の好ましい実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．：１７および１８の塩基配列は、ＣＴＨＲＣ１に対するｓｉＲＮＡを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．：１９および２０の塩基配列は、ＣＡＮＰに対するｓｉＲＮＡを提供し、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．：２１および２２の塩基配列は、ＫＩＡＡ０１０１に対するｓｉＲＮＡを提供する。各々のｓｉＲＮＡは、対応する遺伝子の細胞内における発現レベルを減少すること、アポトーシスを誘導すること、および細胞増殖を抑制することが観測される。それゆえに、本発明におけるｓｉＲＮＡは、乳癌または結腸直腸癌の予防または治療に有用である
さらにもう一つの実施形態において、本発明は、乳癌または結腸直腸癌の予防用または治療用製薬組成物に関するものであり、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびそれらの化合物の組み合わせの中から選択される遺伝子のｍＲＮＡに特に作用するｓｉＲＮＡを含む。
【００５５】
任意に、遺伝子に対するｓｉＲＮＡ特異性に基づく薬剤組成物は、以下の構成：アポトーシス抑止剤をさらに含む。また、細胞にｓｉＲＮＡの導入を促進する薬剤を、本発明に係る薬剤組成物にさらに含んでもよい。この薬剤は、核酸の導入のための促進因子であってもよい。例えば、リポソームを、リポソーム単独、またはコレステロールを含むステロール類、コール酸塩、およびデオキシコール酸から選択される脂肪親和性キャリアと組み合わせて使用してもよい。
【００５６】
ｓｉＲＮＡの細胞内導入において、例えばポリ‐Ｌ‐リジン、スペルミン、ポリシラザン、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）、ポリジヒドロイミダゾレニウム（ｐｏｌｙｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅｎｉｕｍ）、ポリアリルアミン、キトサンなどのカチオン性ポリマー、または、スクシニレートされた、ＰＬＬ、スクシにレートされたＰＥＩ、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、硫酸デキストラン、ヘパリン、ヒアルロン酸などのアニオン性ポリマーを使用してもよい。
【００５７】
さらに他の一つの実施形態において、本発明は、予防法のための製薬の組成または乳癌または結腸直腸癌の予防または治療用の薬剤組成物に関し、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびこれらの化合物の中から選択されるタンパク質への特異的抗体を含む。
治療において使用される際に、直接または間接的、すなわちリンカーを介して既存の薬剤と前記抗体とを結合（例えば共有結合）してもよい。抗体に結合される薬剤の例としては、放射性核種、医薬品、リンフォカイン、トキシンおよび異種機能性（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
（１）放射性核種、例えば１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、６７Ｇａ、１２５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１２３Ｉおよび１１１Ｉｎ、（２）生体反応修飾因子または生体反応修飾剤、例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、およびインターフェロンを含むリンフォカイン、（３）トキシン、例えばリシン、アブリンおよびジフテリア、（４）異種機能性抗体、具体的には相互異核抗体を結合した複合体、すなわち当該複合体は癌細胞および効果細胞（例えば、Ｔ細胞のようなキラー細胞）に対して結合しうるもの、ならびに（５）天然物、例えば関与しないまたは複合体化しない抗体を、本発明に係る抗体と結合してもよい。
更なる実施形態に従って、本発明は、乳癌または結腸直腸癌細胞の増殖を抑制する方法、または乳癌または結腸直腸癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法、または
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびこれら化合物の中から選択される遺伝子のタンパク質および細胞内のｍＲＮＡレベルの低下、もしくは対応するタンパク質活性の低下を促す方法に関する。
【００５８】
この方法で、乳癌または結腸直腸癌を、予防または治療することができる。本発明の発明者によって行われる実験において、ヌードマウスに遺伝子ＣＴＨＲＣ１、ＫＩＡＡ０１０１またはＣＡＮＰを発現させる細胞株の導入により腫瘍が形成することがわかった。そして、癌細胞の生残および増殖と同様に、遺伝子ＣＴＨＲＣ１、ＫＩＡＡ０１０１またはＣＡＮＰが腫瘍形成に直接および重要な役割を果たすことが示された。また、遺伝子の細胞内のｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルの減少、またはタンパク活性の抑制により、癌細胞のアポトーシスの誘起および細胞の増殖の縮小させることが確認された。
【００５９】
遺伝子の細胞内のｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルを減少、またはタンパクの活性を抑制しうる物質としては、単独の有機化合物または無機化合物であってもよく；高分子化合物、例えばタンパク質（例えば抗体）、炭水化物、核酸分子（例えばアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ）および脂質；リボザイム；ならびにＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１に特異的な複数の化合物からなる複合体であってもよい。
【００６０】
本発明の実施形態の好ましい一態様において、乳癌または結腸直腸癌の予防または治療法は、細胞増殖の抑制または癌細胞のアポトーシスの誘導のために、ｓｉＲＮＡまたはＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１に特異的に作用する抗体を含む組成物の投与を特徴とする。
【００６１】
前記ｓｉＲＮＡまたは抗体を含む組成物は、製薬上許容できるキャリアとともに、例えば錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、注射などの種々の剤形が考えられる。
【００６２】
前記遺伝子の細胞内のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少、またはタンパクの活性を抑制しうる物質は、治療または予防して効果的な量で投与されてもよい。前記活性物質の供与量は、疾患の重症度や種類、年齢、性別、体重、および患者の薬物過敏性、治療の種類、投与経路、目標となる細胞など含む種々の要因によって変えられるものであり、当業者によって直ちに決定されることができる。遺伝子の細胞内のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少、またはタンパクの活性を抑制しうる物質は、従来の医薬品と組み合わせてまたはそれ自体単独で使用されてもよい。後者の場合、物質および薬剤は、同時にまたは逐次投与してもよい。投与は、１回でも複数回でもよい。副作用がなく治療上または予防上の最大の効果を得るために適切な投与量における前記物質を投与することは重要である。上述の要因の全てを考慮して、最良の効果を得るのに十分な最小投薬量を当業者であれば直ぐに決定することができる。
【００６３】
本明細書において使用する用語、「投与」は、適切な方法で患者に対して所定の物質の供給することをいう。目標となる組織に投与された物質の輸送できる限りどのような投与経路であってもよい。例えば、本発明の薬剤組成物は、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、経口、局所的、鼻腔内、肺内、直腸内、または他の経路で投与してもよい。また、本発明の薬剤組成物は、活性物質を目標とされた細胞へ導くためのデバイスを用いて投与される。
【００６４】
本発明のより好ましい理解は、以下の明確な説明された実施例の観点から得られるが、本発明を制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
ベストモード
実施例
実施例１：ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）ＲＴ−ＰＣＲを利用した癌関連部分遺伝子の複製
乳癌、結腸直腸または肺癌に関連した新規な遺伝子の複製のために、癌組織の遺伝子の発現パターンを、ディファレンシャルディスプレイ技術を利用して正常組織の遺伝子のパターンと比較した。発現パターンにおける差異を示す遺伝子を、選択的に単離した（図１）。
その結果、１，４９５個の複製は乳癌に、１，１８３個の複製は結直腸癌に、５９７個の複製は肺癌に関することが検出された。
【００６６】
ステップ１）組織サンプリング
結腸直腸癌組織サンプルは、９人の韓国人の成人男性患者と６人の韓国人の成人女性患者から採取され、そして、これらの人はさまざまな進行期（聖メアリーの病院（韓国））であった。乳癌組織サンプルは、乳癌を患う（聖メアリーの病院（韓国））１４人の韓国人の成人男性患者から採取された。肺癌組織サンプルは、ＮＳＣＬＣ（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）を患う（聖メアリーの病院（韓国））７人の韓国の男性の患者から採取された。一組の生検サンプルは、それぞれの患者において腫瘍状組織周辺の腫瘍状組織および正常組織から回収した。
【００６７】
ステップ２）トータルＲＮＡ単離
トータルＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ，  ｃａｔ＃７５１４４；  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ，  ｃａｔ＃７４１０４）を利用して単離した。まず、液体窒素中で保存されている組織を、冷たい乳鉢および乳棒ですりつぶし、次いでβ−メルカプトエタノール１０μを混合した溶解緩衝液１ｍＬに溶解させた。エチルアルコール７０％等量を、前記溶解緩衝液に添加し、次いで、トータルＲＮＡを樹脂に付着させるような前記キットのカラムに当該液を注入した。ＲＮＡ分解酵素を含んでいない水１６０のμlの添加により、トータルＲＮＡを分離して溶出させた。トータルＲＮＡの量を測定する分光光度計で、トータルＲＮＡの吸光度が２６０ｎｍメートルであることが示された。
【００６８】
ステップ３）逆転写
各々のサンプルのトータルＲＮＡの２μｇ（ステップ２において調製された）を、混合して、ランダムなプライマーと７０℃で５分間反応させた。次いで、逆転写酵素混合［２．５ｍ  ＭｄＮＴＰ、５ＯＵ  ＲＮＡ分解酵素阻害剤、２００Ｕ  Ｍ−ＭｕＬＶ  逆転写酵素、ＭＢＩ  ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ｃａｔ＃ＥＰ０４４２）、ＩＸ  Ｍ−ＭｕＬＶ  反応緩衝液）］と４２℃、２時間で反応させてｃＤＮＡを合成した。
【００６９】
ステップ４）ＤＤ−ＰＣＲ（ディファレンシャルディスプレイポリメラーゼ連鎖反応）
癌細胞と正常細胞との間の発現レベルの異なる遺伝子を単離するために、各々のｃＤＮＡを、ＩＵ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、ｃａｔ＃Ｒ００１Ａ）の存在下で、任意のプライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、ｃａｔ＃Ｈ−ＡＰ）２０ＯｎＭおよびアンカープライマー（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、ｃａｔ＃Ｈ１０１−Ｓ）２０ＯｎＭによって増幅した。この際に［３５Ｓ］ｄＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ｃａｔ＃ＮＥＧ７３４Ｈ）を、標識化のために使用した。このように得られたＰＣＲ産生物を、３時間、１，７００Ｖで７Ｍウレア／６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する前に、９８％のホルムアミド色素に混合して、５分間、８０℃で加熱した。３ＭＭワットマンペーパーに転写された後に、前記ゲルを乾燥して、Ｘ線フィルムに露光した。Ｘ線フィルムの現像から測定値が確認された。
【００７０】
ステップ５）ＤＤ−ＰＣＲ産生物の塩基配列
ＤＤ−ＰＣＲの結果、正常組織と比較して、特に癌組織の遺伝子レベルを増減するために読み込まれたバンドを選択した。前記バンドをゲルから切除し、ＰＣＲ産生物を脱イオン水で洗浄し、エタノール中で沈殿した。前記ＤＤ−ＰＣＲにおいて使用された同じプライマーで、沈殿したＤＮＡを再増幅した。この増幅されたＤＮＡを、大腸菌（ＤＨ５．ａｌｐｈａ．）に形質転換された転写ベクターｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターシステム（プロメガ（ｃａｔ＃Ａｌ３６０））で複製した。ＬＢ−寒天で培養した形質転換された大腸菌のコロニーは分離されて、再度ＬＢ培養液で培養された。ＱＩＡＧＥＮキット（ＱＩＡｐｒｅｐプラスミドミニプレップキット、ｃａｔ＃２７１０４）を用いて、プラスミドは大腸菌から調製された。制限酵素ＥｃｏＲＩを用いる処理により、挿入のサイズを決定した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅシークエンシング反応混合（ＡＢＩ）を用いて、自動シーケンサー（ＡＢＩ  ３７００）で塩基配列を読み取った。相同性を、塩基配列から各々の複製の遺伝子情報を得られるＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０；  ｈｔｔｐ；  ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、およびＮＣＢＩ  ＧｅｎｅバンクおよびヒューマンＥＳＴデータベースのプログラムを利用して調べた。
【００７１】
実施例２：マイクロアレイを用いた遺伝子発現の解析
ＤＤ  ＲＴ−ＰＣＲにより複製された約３，０００種の遺伝子のうち、癌組織に対し高い特異性を示す発現遺伝子だけを選択するために、大規模患者群を対象で二次的選別を行なった。ＤＤ  ＲＴ−ＰＣＲにより複製された遺伝子フラグメントを組み込んだヒト３ＫｃＤＮＡチップでは、５８人の乳癌患者および３２人の結腸腸癌患者から得られた生検サンプルを選別するために設計されている。乳癌患者の５８例および結腸腸癌患者の３２例より得られた前記チップの結果から、正常細胞と癌細胞とを比較した際に、統計学的有意性で２倍以上増減している遺伝子発現レベルが選択された（図２）。
ステップ１）チップの構成
チップ構成に用いられるｃＤＮＡプローブは、ＰＣＲによって合成された。フォワードプライマー、５’−ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＧＡＡＴＴＣ  ＧＡＴ  Ｔ−３．ｐｒｉｍｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：  １）  とリバースプライマー５’−ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＧＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）との一組をＰＣＲに使用した。等しく遺伝子の全てを増幅するために、ＰＣＲ混合（０．３ｐｍｏｌｅフォワードプライマー、０．３ｐｍｏｌｅリバースプライマー、２００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｕｎｉｔ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ、超純水）を、９６穴のＰＣＲプレートのそれぞれのウェルに等分し、次いで各々の遺伝子クローンを担持しているプラスミド鋳型ＤＮＡそれぞれ０．５ｍｌを添加した。ＤＮＡサーマルサイクラーにおいて、ＰＣＲは、９４℃で前変性５分間から始めて、変性温度９４℃で３０秒間４０サイクル維持し、アニーリング温度５５℃で３０秒間、および維持温度７２℃で３０秒行い、最終的にさらに５分間７２℃で維持した。このようして得られたＰＣＲ産生物は、ミリポアにより製造されている３８４の穴のＰＣＲ純化濾過器でクリーンアップされた。
【００７２】
フィルターをかけた後に、ｃＤＮＡを、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓにより製造されている（ＤＮＡ構成は  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｍｐａｎｙに委託している））Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ  ＩＩ  スポッターを使用したＧＡＰＳＩＩスライド（Ｃｏｒｎｉｎｇにより製造）に組み込んだ。
【００７３】
前記チップの性質は、ｓｙｔｏ．ｂｅｔａ．ｌ染色により決定された。染色された前記スライドは、過剰のプローブを除去するために０．１％のＳＤＳで処理された。１００℃で２分間の処理によって、ｓｙｔｏ．ｂｅｔａ．ｌ色素を内部に十分に挿入できるようなプローブが変性された。前記スライドは、５分間でｓｙｔｏ．ｂｅｔａ．ｌ色素により染色された。次いで、過剰な色素を蒸留水で二度洗浄した。前記染色されたスライドは、Ａｘｏｎレーザスキャナ６３５ｎｍで測定されて、チップを正しく構成されたかどうか確認するために視覚的分析を行なった。
【００７４】
ステップ２）組織サンプリング
結腸直腸癌組織サンプルは２０人の韓国の成年男性患者と１２人の韓国の成年女性患者とから採取された。そして、前記患者の年齢は４０〜７７歳（ＬａｂＧｅｎｏｍｉｃｓ）であった。乳癌組織サンプルは、５８人の韓国人の成年女性患者２８〜７１歳（ＬａｂＧｅｎｏｍｉｃｓ）から採取された。一組の生検は、それぞれの患者の腫瘍状の組織周辺で、腫瘍組織と正常組織からサンプルを採取した。
ステップ３）トータルＲＮＡ単離
液体窒素（ＬＮ２）中で保存されている組織を、冷たい乳鉢および乳棒ですりつぶし、次いで１００ｍｇの組織サンプルをトリゾール試薬  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃  １５５９６−  ０１８）１  ｉｒｉＬと混合した。次のＲＮＡ単離工程は、ＴｒｉＺｏｌ試薬の製造業者によって提供される手順に従って行なった。このようにして得られたＲＮＡは、当該製造業者によって提供される手順に従ってＱＩＡＧＥＮキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ，  ｃａｔ＃７５１４４；  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ，  ｃａｔ＃７４１０４）を利用して洗浄した。前記ＲＮＡを、２６０ｎｍで分光光度計により吸光度を測定することで定量した。
【００７５】
ステップ４）、サンプル調製と標識化
ＤＮＡチップハイブリダイゼーションは、テストＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、スライド上に、換言するとチップに合成されたＤＮＡと反応させる工程である。上記マイクロアレイにとって、高純度のＤＮＡ２０〜５０μｇを、Ｃｙ３またはＣｙ５蛍光染料で標識化して逆転写させた。標識化は、ＰＣＲの間ずっとＣｙ色素−結合ｄＵＴＰによって行なわれた。正常組織および腫瘍組織間のハイブリダイゼーションにおけるコントロールとしての使用のために、レファレンスＲＮＡを調製した。種々の乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、および肺癌細胞から得られた細胞株を、癌組織の特徴を考慮して各々の癌（乳癌細胞株  ＳＫ−ＢＲ−３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ−７，ＺＲ−７５−１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、結腸直腸癌細胞株  ＣＯＬＯ２０５、ＬｏＶｏ、ＷｉＤｒ、ＨＴ−２９、およびＤＬＤ−Ｉ、ならびに肺癌細胞株  ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＩＨ２２６、およびＡ５４９）として選択した。トータルＲＮＡは、各々の細胞株から分離された。トータルＲＮＡの同等の量を混合し、コントロールとしてリファレンスＲＮＡを調製した。このリファレンスＲＮＡをＣｙ３で標識化し、一方乳癌、結腸直腸癌、および正常組織から得られたＲＮＡを、Ｃｙ５で標識化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（ｃａｔ＃２８１０．ｂｅｔａ．））を用いて、塩、プライマー、洗浄剤、タンパク（酵素）、およびＰＣＲに使用される鋳型ＲＮＡを、逆転写を介して得られたｃＤＮＡから除去した。精製され、かつ標識化されたｃＤＮＡは、６５℃、１６時間で３Ｋチップ上のＤＮＡとハイブリダイズされた。これについては、標識化されていないヌクレオチド、例えばＣｏｔ−１ＤＮＡとポリＡ−ＲＮＡを、非特異的ハイブリダイゼーションを阻害するために非特異的競合として加えた。ＤＮＡチップは、ＳＳＣ含有洗浄溶液で洗浄し非特異的ハイブリッドを除去した。
【００７６】
ステップ５）チップ画像の取得と制限
チップのハイブリダイゼーションの後、前記チップを、Ａｘｏｎ製ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナで測定し、それぞれのスポットから蛍光データを得た。Ｔ前記蛍光データは、ＴＩＦＦファイルとして保存した。Ｃｙ３およびＣｙ５領域から各々得られた緑色および赤色の波長で示された数値の相対比は、対照群と比較してテスト群は遺伝子発現を増減させたことにより、多発性を測定するのに使用した。
【００７７】
ステップ６）遺伝子発現の解析
ＤＮＡチップの結果を分析しまたは説明するために、各々の遺伝子に対する強度値が、必要になる。Ａｘｏｎから取得したＧｅｎｅＰｉｘ  プログラムは、スキャナから得られるイメージを数値に変換する際に使用された。各々の点の強度値が読み込んだ後、遺伝子スポットに対する数値の統計値は、エラースポットが自動的または手動で削除される手法を利用して得られた。また、アレイ品質管理（ＱＣ）操作は、ＰＭＴ、Ｃｙ３およびＣｙ５のレーザ出力、シグナルとバックグラウンドとの相違、強度値の平均偏差、ブロック間の強度値、全てのスポットの強度値、およびＮＦ（特徴無し）に関して行なった。
【００７８】
Ｃｙ５／Ｃｙ３（クリーブランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）  ｅｔ．ａｌ（１９９２））、解析された２，２１３の乳癌遺伝子および１，９４０の結腸直腸癌遺伝子間で色素の偏りが生じないように、遺伝子２０％またはより大きい不整合の部分を除いて、トータルデータはローズ（Ｌｏｗｅｓｓ）正常化方法を使用して修正された。ＢＲＢアレイツールプログラムを用いて（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）、組織サンプル間のクラスタリング解析は、組織サンプルオリジンとチップ実験との正当性を証明する。その結果、一つの乳癌組織サンプルと二つの結腸直腸組織サンプルを除いてほとんどすべての組織サンプルが、二つのノード：癌組織と正常組織とに分割されるのを観測された。これらのデータから、この研究に使用される臨床サンプルが、明確に正常と癌組織とに分けられ、かつこのチップ実験が正しく行われたことを裏づけるものであることが示された。乳癌または結腸直腸癌組織と正常組織との間で有意な発現の相違を示す遺伝子を選択するために、ＳＡＭ（マイクロアレイ有意差解析；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ）で実行した。誤りの許容範囲を超える統計的有意性において発現相違を示し、かつ単純なバリエーションによりむしろ実験結果に主に起因する遺伝子だけが選択されうることによるため、ＳＡＭは有益な技術である。この際、統計誤差に基づく遺伝子を選択する可能性が除外されたように、９９％以上の信頼性に基づいてＦＤＲ（仮の発見率）はゼロになった。
【００７９】
実施例３：リアルタイムＰＣＲを用いた癌特異的遺伝子発現アッセイ
ＤＮＡチップを使用して識別される遺伝子の中で、癌組織に対して高い特異性を想定したＣＡＮＰ、ＣＴＨＲＣ１、およびＫＩＡＡ０１０１が選択された。胸部および結腸直腸癌および種々の正常細胞や癌細胞株におけるそれらの胸部および結腸直腸癌特異的発現（図３）を確認するために、これらの候補遺伝子の発現レベルの測定を行なった。この点に関して、乳癌組織、結腸直腸癌組織、２０種類の正常組織（副腎、脳、胎児の脳、胎児の肝臓、心臓、腎臓、肝臓、肺臓、胎座、前立腺、唾液腺、骨格筋、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、気管、子宮、小腸、および脊髄）、乳癌細胞株、結直腸癌細胞株、および肺癌細胞株における相対的遺伝子発現を検査した。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
リアルタイムＰＣＲのデータから、ＣＴＨＲＣ１の場合は、乳癌組織および結腸直腸癌組織において、平均して１０倍もの過剰な発現がみられるが、正常組織のではほとんど発現されなかったことが示された。乳癌または結腸直腸癌を患った被験者の８０％以上は、正常組織と比較して癌組織においてＣＴＨＲＣ１が２倍の過剰な発現をすることがわかった。ＣＡＮＰは、乳癌および結腸直腸癌の組織と細胞株において過剰に発現されるが、正常組織ではほとんど発現が見られなかった。乳癌を患った被験者の８０％以上は、正常組織と比較して癌組織において（平均して１１倍）ＣＮＡＰが２倍以上の過剰な発現をすることがわかった。ＣＡＮＰが２倍以上発現したことが確認された結腸直腸癌の患者は、５０％以上にも達した。遺伝子の発現レベルが癌組織および種々の癌細胞株において高いとい事実から推測すると、ＣＡＮＰは、細胞増殖に関与していると考えられる。
【００８２】
ＫＩＡＡ０１０１は、乳癌および結腸直腸癌の組織の細胞株において非常高い発現率を示した。胸部または結直腸癌患者の５０％以上は、正常組織と比較して癌組織においてＫＩＡＡ０１０１が２倍以上過剰に発現していることが確認された。胸腺、胎児の肝臓、および正常者の小腸におけるこの遺伝子の発現レベルは、結腸直腸癌患者の正常組織のレベルにほぼ等しかった。ＫＩＡＡ０１０１は、他の正常組織において発現しなかった。通常、ＫＩＡＡ０１０１の発現挙動は、ＣＡＮＰの発現挙動に類似していることがわかっており、前記発現挙動が、ＫＩＡＡ０１０１およびＣＡＮＰ相互において機能的に関与していることを暗示している。
【００８３】
ステップ１）サンプル調製
癌の生成部位、癌の進行、および生化学的見地ならびにＤＮＡチップの発現結果における、乳癌ＲＮＡサンプル５６対および結腸直腸癌ＲＮＡサンプル３２対に対してスクリーニングしたＤＮＡチップから得られた臨床情報に基づいて、乳癌サンプル２６対および結腸直腸癌サンプル２０対を選択した。癌が生成している器官以外の正常器官の遺伝子の発現レベルを定量するために、２０の異なる正常組織のＲＮＡから構成される組織パネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ．＃  ６３６６４３）を用いた。乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＭＣＦ７、結腸直腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５、ＬＯＶＯおよびＷｏＤｒ、ならびに肺癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１４６、およびＮＩＨ２２６から得られたＲＮＡは、種々の癌細胞株の遺伝子発現の測定に使用された。
【００８４】
臨床の組織サンプル、種々の癌細胞株および種々の正常組織から得られたＲＮＡから、ｃＤＮＡは、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）２０ＶＮ（ｄＴ）プライマーおよびスーパースクリプトＩＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．＃１８０８０−０４４）を用いて合成された。逆転写は、１ｍｇのＲＮＡサンプル、Ｏｌｉｇｏ  ２０ＶＮ（ｄＴ）プライマー  ２．５Ｍ、ｄＮＴＰ  ０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、ＤＴＴ  １ＯｍＮ、５ＯＵ  ＲＮＡ分解要素５０Ｕ、スーパースクリプト  ＩＩＩ  ２００Ｕ、およびＩＸ  ＲＴ緩衝液（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキットにおいて包含されている）で行なわれた。１時間、５０℃での反応により、ｃＤＮＡの合成を行なった。８５０℃、５分の加熱により合成を終了した。このように得られたｃＤＮＡを、少量等分されて、−７０℃で保存した。
【００８５】
ステップ２）プライマーの調製
ＣＡＮＰ、ＣＴＨＲＣ１、およびＫＩＡＡ０１０１のｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、およびＫＩＡＡ０１０１に対して各々特異的なプライマーのセットを合成した。内因性のコントロールとしての用途のために、β−アクチン遺伝子（ＡＣＴＢ）に対する一組のプライマーを、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースにより検索されたｍＲＮＡ塩基配列（ＮＭＪＤＯＩｌＯｌ）に基づいて合成した。アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって提供されているプライマーエクスプレスプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて、一般的なＰＣＲプライマーの要件を満たし、約８０℃のＴｍ値を有し、かつＰＣＲ生産物が１００ｂｐ．の鎖長を有するように、プライマーの全てのセットを設計した。特に遺伝子に用いられるプライマーは、以下の通りである。
【００８６】
【化１】
2009507515.tif 000004
【００８７】
ステップ３）反応条件
ＳＹＢＲグリーンアッセイ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙ）は、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．＃  ４３０９１５５）１２．５μｌを含む溶液２５μｌ、ｃＤＮＡ、フォワードプライマー、およびリバースプライマーで行なわれた。
【００８８】
逆転写に使用するトータルＲＮＡが５０ｎｇの量になるようにｃＤＮＡを添加した。前記プライマーに関しては、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを、１００ｎＭ、３００ｎＭおよび９００ｎＭの３×３の濃度の組み合わせの中から選択した合計を使用した。また、当該組み合わせは、不特定の合成がないように最良の遺伝子増幅を示した。β−アクチン、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、およびＫＩＡＡ０１０１に対する各々のプライマー特性は、３００ｎＭの濃度で使用された。ｃＤＮＡを有しない陰性コントロールサンプルを、また非特異的生産物の生産を評価するプライマーの全てのセットを調製した。ウェル間の違いおよびピペット操作エラーに起因した実験誤差を減らすために、前記の同じ実験を、２または３回繰り返した。ＰＣＲは、５０℃でアニーリング１分間から始めて、９５℃で変性に１０分間行い、変性温度９５℃で１５秒、およびアニーリング温度６０℃で１分間４０〜５０サイクル行なった。ＰＣＲ終了後、分離実験は、非特異的増幅を検討するために装置により提供される手順に従って行なった。
【００８９】
ステップ４）相対的遺伝子発現レベルの測定
ｃＤＮＡの濃度は、標準曲線から検討された臨床のサンプルのＣｔ（閾値サイクル）値から逸脱しない範囲内で決められた。標準曲線のためのサンプルとして、組織サンプルから調製されたＲＮＡの混合液からｃＤＮＡが使用された。標準曲線を算出する実験は、各々の反応で同一のプレートの範囲内で三度繰り返し行なった。各々の反応におけるＣｔ値が著しく他と異なる場合、一つの反応のＣｔ値が除外された。残りの２つまたは３つの反応のＣｔ値の平均値を用いて、標準曲線をプロットした。この際、標準曲線がほぼ１の相関係数（Ｒ２）およびほぼ３．３の傾きを有するように閾値をコントロールした。
【００９０】
標準曲線を目的としたｃＤＮＡ内の特異的な遺伝子の正確な量は知られていないため、このアッセイ実験で測定される遺伝子の量は、標準サンプルに関連する発現レベルであったかもしれない。各々のサンプルにおけるＣｔ値は、標準曲線を描く際に閾値群を利用して決められた。Ｃｔ値と標準曲線との比較により、遺伝子レベルが得られた。サンプルによるｃＤＮＡ濃度の変化量を、各々のサンプルの相対的な遺伝子発現レベルを決定するために規格化した。
【００９１】
サンプル間におけるｃＤＮＡ濃度の相違は、主に逆転写効率の違いに起因すると考えられる。逆転写が同じ条件の下で行なわれるにもかかわらず、合成されるｃＤＮＡの総量がＰＣＲ装置の孔間の変化量に起因して異なる。なぜなら、ｃＤＮＡだけを単離する工程または逆転写の後におけるｃＤＮＡの濃度を測定する工程がなく、逆転写効率に起因しているサンプル間のｃＤＮＡ濃度差が、内因性のコントロールに規格化されうるからである。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンを、内因性のコントロールとして使用した。各々のｃＤＮＡにおける内因性のコントロールの相対濃度は、上述の方法を利用して決定され、そして、各々のサンプルへの規格化層（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｌｄ）を計算することによっておこなった。内因性のコントロールが全てのサンプルにおいて同じレベルで発現する仮定の下に、各々のｃＤＮＡの相対的な量は、内因性のコントロールの発現レベルに比例する。したがって、ｃＤＮＡ相違を修正するための規格化層（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｌｄ）は、内因性のコントロールの相対量とは相反するものである。
【００９２】
ＤＮＡの濃度差が正確だと、与えられた標準曲線を利用して得られた遺伝子量は、相対的な遺伝子発現レベルを得るための規格化層（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｌｄ）により乗じられる。
【００９３】
実施例４：細胞における過剰発現の効果の解析
腫瘍形成における癌特異性ＣＴＨＲＣ１、ＫＩＡＡ０１０１とＣＡＮＰの過剰発現の効果を検討するために、対応している遺伝子を過剰発現した細胞株を調製した。形質転換細胞株をヌードマウスへの注入することにより、注入部位で異なった腫瘍１．５−２ｃｍの長さの異なる腫瘍が形成される（図４）。これらのデータは、過剰発現される際、各々の遺伝子が腫瘍形成においての重要な役割を果たすことを示している。
【００９４】
ステップ１）全長遺伝子複製
１−１．全長ＣＴＨＲＣ１の複製
ＣＴＨＲＣ１は、単一のＯＲＦ（オープン・リーディングフレーム）７３２ｂｐ長から構成されている。ＣＴＨＲＣ１の増幅を用いて、ＣＴＨＲＣ１に対して特異的なプライマー一対は、全長ＯＲＦを構成するＰＣＲのようなヌクレオチド配列ＮＭ＿１３８４５５（ＮＣＢＩ）に基づいて設計された。
【００９５】
【化２】
2009507515.tif 000005
【００９６】
乳癌組織のトータルＲＮＡから合成されたｃＤＮＡライブラリーは、鋳型としての機能を果たすと同時にＰＣＲが行なわれた。３’と５’プライマーのそれぞれが、鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇにつき、１０ｐｍｏｌｅ量使用された。ＰＣＲは、変性温度９４℃で３０分間、３５のサイクル、アニーリング温度６８℃で２分間、伸長温度７２℃で７分間行なった。ＰＣＲ産生ＤＮＡは、１．５％のアガロースゲルで電気泳動して前記サイズを測定した。制限酵素を伴う処理は、機能遺伝子の正確な増幅を検査するのに有益であった。増幅された全長ｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ  Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｃａｔ＃Ａ１３６０））で複製して全長遺伝子を保護した。
【００９７】
１−２．全長ＣＡＮＰの複製
ＣＡＮＰは、単一ＯＲＦ  ２２０５ｂｐから構成されている。ＣＡＮＰ増幅を用いて、ＣＡＮＰに対して特異的なプライマー一対は、全長ＯＲＦを構成するＰＣＲのようなヌクレオチド配列ＮＭ＿１９８９４７（ＮＣＢＩ）に基づいて設計された。
【００９８】
【化３】
2009507515.tif 000006
【００９９】
乳癌組織のトータルＲＮＡから合成されたｃＤＮＡライブラリーは、鋳型としての機能を果たすと同時にＰＣＲが行なわれた。それぞれのプライマーが、鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇにつき、１０ｐｍｏｌｅ量使用された。ＰＣＲは、変性温度９４℃で３０分間、３５のサイクル、アニーリング温度６８℃で２分間、伸長温度７２℃で７分間行なった。ＰＣＲ産生ＤＮＡは、１．５％のアガロースゲルで電気泳動して前記サイズを測定した。制限酵素を伴う処理は、機能遺伝子の正確な増幅を検査するのに有益であった。増幅された全長ｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ  Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｃａｔ＃Ａ１３６０））で複製して全長遺伝子を保護した。
【０１００】
１−３．ＫＩＡＡ０１０１の複製
ＫＩＡＡ０１０１は、単一ＯＲＦ  ３３６ｂｐから構成されている。ＫＩＡＡ０１０１増幅を用いて、ＫＩＡＡ０１０１に対して特異的なプライマー一対は、全長ＯＲＦを構成するＰＣＲのようなヌクレオチド配列ＮＭ＿０１４７３６（ＮＣＢＩ）に基づいて設計された。
【０１０１】
【化４】
2009507515.tif 000007
【０１０２】
乳癌組織のトータルＲＮＡから合成されたｃＤＮＡライブラリーは、鋳型としての機能を果たすと同時にＰＣＲが行なわれた。３’および５’プライマーのそれぞれが、鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇにつき、１０ｐｍｏｌｅ量使用された。ＰＣＲは、変性温度９４℃で３０分間、３５のサイクル、アニーリング温度６８℃で２分間、伸長温度７２℃で７分間行なった。ＰＣＲ産生ＤＮＡは、１．５％のアガロースゲルで電気泳動して前記サイズを測定した。制限酵素を伴う処理は、機能遺伝子の正確な増幅を検査するのに有益であった。増幅された全長ｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ  Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｃａｔ＃Ａ１３６０））で複製して全長遺伝子を保護した。
【０１０３】
ステップ２）発現ベクターの設計
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、およびＫＩＡＡ０１０１の複製のために、特定されている制限酵素部位、ｐＤＯＲ２２１  ベクター  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｔ＃  １２５３５−０１９）で２９ｂｐ長  ａｔｔＢ部位が、ＰＣＲ産生物の両端に付けた。ゲイトウェイテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００３年９月２２日、２５−０５２２）に従って、ＰＣＲを二度行なって、ａｔｔＢアダプターをＰＣＲ産生物の両端に結合させた。ａｔｔＢ−ＰＣＲ産生物は、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（Ｃａｔ＃  ２８１０６））によって洗浄されて、ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃  １１７８９−０１３））を用いてａｔｔＰ含有ドナーベクター（ｐＤＯＮＲ２２１）に複製した。塩基配列の解析は、各々の遺伝子のコード領域が正確に複製されたか否かを検査するために全体遺伝子に対して行なった。ｐＤＯＮＲ２２１ベクターに複製された遺伝子を、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃  １１７９１−０１９））を用いて、形質転換のためにｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃  １２２７４−０１５））ゲートウェイベクターにトランスファーした。
【０１０４】
ステップ３）細胞の形質転換
前記プラスミドｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０／ＣＡＮＰ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０／ＫＩＡＡ０１０１およびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０／ＣＴＨＲＣ１は、それぞれが特異性遺伝子として作用し、リポフェクタミン  ＴＭ  ２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃１１６６８））を用いてヒト胎児腎臓細胞株２９３（ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃ＣＲＬ１５７３））にトランスフェクションさせて、ジェネティチン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃１１８１１−０２３））と約３週間処理させてプラスミドを取り込ませた前記細胞を選択した。単細胞由来の単一コロニーを採取し、以下の９６穴プレートで培養した。
【０１０５】
新しく取り込まれた発現ベクターのタンパク発現を特定するために、タンパク質を形質転換細胞株から抽出してウェスタンブロッティング解析を行なった。その理由は、対象タンパク質の各々が会合することによるものであり、Ｖ５エピトープおよび６ｘＨｉｓ  Ｔａｇは、間接的に対象タンパク質の細胞内の発現を確認するために、それぞれ抗−Ｖ５−ＨＲＰ抗体  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃  Ｒ９６１−２５）  および抗−Ｈｉｓ  （Ｃ−ｔｅｒｍ）−ＨＲＰ抗体  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃  Ｒ９３１−２５）を用いて発現レベルを測定された。
【０１０６】
均一な発現率を維持された細胞株を確保するために、１つの細胞に対して１つの穴を割り当てられる方法で、選択された過剰発現細胞を希釈し、９６穴プレートに等分された。２〜３日間のインキュベーションの後、各穴の複製数を顕微鏡で測定した。一つの穴に対して一つの複製を形成した穴ごとにマーキングし、さらに一週間インキュベートした。トリプシン処理で分離した後、クローンをマークされた穴から取り出し、さらに多数の細胞を得るために４８の穴、２４穴および６穴プレートに移した。
【０１０７】
ステップ４）動物における発癌性
上記ステップ３）から得た過剰発現細胞を、１０匹の５週間目ヌードマウスの皮下に注入した。注入後２０日において、１０匹全てのハツカネズミからサイズの異なる腫瘍１．５〜２ｃｍが注入部位において観察された。
【０１０８】
実施例５：ＲＮＡｉ（ＲＮＡインターフェランス）を用いた癌特異的遺伝子の機能のための解析
癌細胞の機能における癌組織で特異的に発現する遺伝子の効果を検討した。この際、癌−特異的発現を示すことが確認された遺伝子は、ＲＮＡインターフェランス（ＲＮＡｉ）を用いることにより発現が阻害され、細胞がリアルタイムＰＣＲを通してどのようにして影響を与えたかについて検討した。
【０１０９】
１．ＲＮＡｉを使用した遺伝子発現の特異的抑制
ｓｉＲＮＡの導入は、リアルタイムＰＣＲ（図５）を通して対応する遺伝子の特定のノックダウンを引き起こすことが確認された。ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１に対して特異的なｓｉＲＮＡが取り込まれたテスト群、前記遺伝子に対して非特異的な混合されたネガティブｓｉＲＮＡが取り込まれたコントロール、および非ｓｉＲＮＡ処理されたコントロールが比較される。内部に注入された遺伝子特異性ｓｉＲＮＡを有するテスト群だけが、対応する遺伝子の特異的な阻害を示す。ＣＴＨＲＣ１のｓｉＲＮＡ処理の６時間経過後、テスト群がコントロールと比較してＣＴＨＲＣ１のｍＲＮＡの発現が３０％以上のノックダウンを示した。前記処理の２４時間経過後、テスト群がコントロールと比較してＣＴＨＲＣ１のｍＲＮＡの発現が８０％以上のノックダウンを示した。ＣＡＮＰのｓｉＲＮＡに関しては、前記処理の６時間経過後、テスト群がコントロールと比較してＣＡＮＰのｍＲＮＡの発現が７０％以上のノックダウンを示していた。ＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡでは、前記処理の１２時間経過後、ＫＩＡＡ０１０１発現が８０％のノックダウンを示していた。ｓｉＲＮＡ−特異性遺伝子発現のノックダウン効果は、少なくとも４８時間維持された。目標とされた遺伝子のメッセンジャーＲＮＡレベルの有意差が、ネガティブｓｉＲＮＡなしとありでのコントロール群の処理においては、対象の遺伝子のｍＲＮＡレベルの差がほとんどみられなかった。
【０１１０】
２．細胞死誘起と細胞増殖の減退における遺伝子発現の抑制効果
遺伝子のノックダウン効果およびトランスフェクションの毒性を検討するために、ＥｔｈＤ−１蛍光染料を用いて細胞の生死を観察した。そして、前記観察した死細胞を抜粋した（図６Ａ）。また、生存細胞を時間とともにモニターし、細胞増殖における遺伝子抑圧の効果を計数した（図６Ｂ）。
【０１１１】
死細胞であると判断したＥｔｈＤ−１蛍光色素から得た蛍光画像で、死細胞の計数を、確認した際に、ＣＴＨＲＣ１遺伝子の抑制により、コントロールと比較して細胞の総数の５０％以上が、細胞死を引き起こした。未処置のコントロールでは細胞数が７２時間で３倍に増加したのに対して、ＣＴＨＲＣ１遺伝子の発現が抑制されたテスト群では、７２時間経過してもほとんど増殖しなかった。これらの結果から、ＣＴＨＲＣ１の抑制は、細胞死の誘起および細胞増殖の抑制を促すことがわかった。
【０１１２】
ＣＡＮＰ遺伝子の発現が抑制された場合、コントロールと比較すると、細胞死を受けた細胞の数は、ｓｉＲＮＡ処理から６時間経過した後増大し、かつ前記処理の後２４時間経過後では、４０％以上であるとわかった。未処置のコントロールでは細胞数が７２時間で３倍に増加したのに対して、ＣＡＮＰ遺伝子の発現が抑制されたテスト群では、７２時間経過してもほとんど増殖しなかった。これらの結果から、ＣＡＮＰ遺伝子の抑制は、細胞死の誘起および細胞増殖の抑制を促すことがわかった。これらの結果から、ＣＡＮＰの抑制は、細胞死の誘起および細胞増殖の抑制を促すことがわかった。
【０１１３】
ＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡの場合は、ＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡ処理の１２時間経過後、ｍＲＮＡレベルでは顕著な変化が確認されたが、前記処理の６時間経過後から細胞死が進んだことがＥｔＤ−１染色により確認された。ＫＩＡＡ０１０１遺伝子の抑制では、細胞数の３０％以上が細胞死を引き起こし、７２時間以内では細胞増殖が観察されなかった。これらの結果から、ＫＩＡＡ０１０１の抑制は、細胞死の誘起および細胞増殖の抑制を促すことがわかった。
【０１１４】
ネガティブｓｉＲＮＡ処理されたコントロール群に関しては、ｓｉＲＮＡの導入に従って細胞死を引き起こさなかったが、未処置のコントロール群などでは同じ範囲で細胞増殖を示した。これらをもとに、上記の実験において得られたデータから、細胞死の誘起およびＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡの導入に伴う細胞増殖の抑制が、特に各々の遺伝子の抑制に起因することが立証される。
【０１１５】
３．遺伝子抑圧によるアポトーシスの誘起
遺伝子抑制、カスパーゼ活性、アポトーシス関連の酵素（図８）、ＤＮＡ断片化（図７）および膜変性によって誘導される細胞死のタイプを決定することを解析した、またアポトーシスおよびネクローシスが発生した度合いを時間でモニターした（図９）。
【０１１６】
ＣＴＨＲＣ１遺伝子が抑制されると、ｓｉＲＮＡの導入の直後から、カスパーゼ活性が増大し始めて、コントロールと比較すると４倍に増大し、導入から２４時間経過後が最大値を示すことわかった。ＤＮＡの断片化は徐々に増大し、またコントロールと比較すると、導入から７２時間経過後、５倍に増大するとわかった。アポトーシスが進行すると、細胞膜のＰＳ（ホスファチジルセリン）が外部にさらされた。
【０１１７】
ＣＡＮＰ遺伝子が抑制されると、ｓｉＲＮＡの導入から６時間経過後からカスパーゼ活性が増大し始めて、導入から２４時間経過後、コントロールと比較すると４倍に増加することわかった。ＤＮＡの断片化は徐々に増大し、コントロールと比較すると、導入から７２時間経過後、８倍に増大するとわかった。アポトーシスが進行すると、細胞膜のＰＳ（ホスファチジルセリン）が外部にさらされた。
【０１１８】
ＫＩＡＡ０１０１遺伝子が抑制されると、ｓｉＲＮＡの導入直後からカスパーゼ活性が増大し始めて、導入から２４時間経過後、コントロールと比較すると４５倍に増加することわかった。ＤＮＡの断片化は徐々に増大し、コントロールと比較すると、導入から７２時間経過後、３倍に増大するとわかった。アポトーシスが進行すると、細胞膜のＰＳ（ホスファチジルセリン）が外部にさらされた。
【０１１９】
カスパーゼ活性、ＤＮＡの断片化および膜変性の機構を特定したアポトーシスの頻度は、ほぼＫＩＡＡ０１０１、ＣＡＮＰおよびＣＴＨＲＣ１と同程度の増大が観察される。ネガティブｓｉＲＮＡ処理された群については、ほとんど全くｓｉＲＮＡ導入に起因した細胞死を誘起されず、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡの導入に従った細胞アポトーシスの誘起は、特に各々の遺伝子の抑制から生じる結果となった。また、これらの結果から、新規な癌−特異性遺伝子ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよびＫＩＡＡ０１０１の発現抑制によって、細胞死（おそらくアポトーシス）が生じることが示され、新規な癌−特異性遺伝子ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよびＫＩＡＡ０１０１が細胞の生存に対して重要な役割を担うことも示された。
【０１２０】
４．細胞分裂における遺伝子抑圧の効果
遺伝子抑圧によって誘導される細胞増殖−抑圧効果を検討するために、細胞周期変化は、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）により測定した（図１０）。コントロールと比較すると、ＣＴＨＲＣ１のｓｉＲＮＡ処理された細胞は、当該処理から３時間経過した後では、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の比率において約２０％減少させ、ＧＯ／Ｇ１期の細胞の比率が約２０％増大させた。コントロールと比較すると、ＣＡＮＰのｓｉＲＮＡ処理された細胞により、ＧＯ／Ｇ１期の細胞の比率を５〜３０％増大させる一方で、Ｓ期における細胞比率を最大で１２０％減少させ、かつＧ２／Ｍ期の細胞の比率において６０％減少させた。コントロールと比較すると、ＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡ処理された細胞により、Ｓ期における細胞比率を最大で１２５％減少させ、かつＧ２／Ｍ期の細胞の比率において５０％減少させ、さらにＧＯＧ１期の細胞の比率を１０〜４０％増大させたことがわかった。
【０１２１】
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよび／またはＫＩＡＡ０１０１が低いレベルで発現している際に、アポトーシスは、Ｇｌ期の細胞を抑えるように誘導され、それによって細胞増殖を抑制すると考えられている。ネガティブｓｉＲＮＡ処理された細胞は、細胞増殖の抑制でもなくｓｉＲＮＡの導入による細胞死でもないことが示された。従って、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰまたはＫＩＡＡ０１０１のｓｉＲＮＡの導入による細胞周期における変化により、特に各々の遺伝子の抑制を促す。
【０１２２】
ステップ１）ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）構成
ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰおよびＫＩＡＡ０１０１の全長ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＢａｎｋプログラムを利用して得られた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）。ｓｉＲＮＡを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢｌｏｃｋ−ＩＴＴＭＲＮＡｉデザイナー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／）を用いて設計し、かつ合成した。それぞれの遺伝子のＳｓｉＲＮＡ塩基配列を以下に示す。
【０１２３】
【表２】
2009507515.tif 000008
【０１２４】
ステップ２）、ｓｉＲＮＡ  のトランスフェクション
乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＢＲ３、結腸直腸癌細胞株ＷｉＤｒおよびＨＣＴ１１６、ならびに肺癌細胞株Ａ５４９．を実験で使用した。各々の細胞株は、３Ｘ１０４細胞／ウェルの量の４８穴プレートに等分された。１６時間経過後、各々の遺伝子またはネガティブｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｃａｔ＃１２９３５−１００））に対する各々の遺伝子は、蛍光オリゴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｃａｔ＃１３７５０−０６２））に加えて、混合したリポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ）２０００  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃１１６６８−０２７）であり、これらの遺伝子を、既に細胞株が存在する培地に加えた。２４、４８および７２時間の間隔で、細胞株を、ｓｉＲＮＡの濃度に従ってモニターした。ｓｉＲＮＡおよび蛍光性オリゴの使用については、２０ｎＭ原液で貯蔵されて、１０ＯｍＭ  ＫＯＡｃ、３ＯｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、および２ｍＭ  ＭｇＯＡｃ．を含むｐＨ７．４の緩衝液で希釈した。
【０１２５】
ステップ３）遺伝子ノックダウンによるｍＲＮＡレベルの変化
ｍＲＮＡノックダウンを測定することは、ＲＮＡｉ技術を介することであり、細胞株を１２穴プレートに２Ｘ１０５細胞／穴の量で等分して、かつ１６時間培養された。その後、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭのｓｉＲＮＡを、１ｍｌのリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）に混合して、細胞が既に育った培地に添加した。次いで、添加し、６、１２、２４および４８時間経過した後トータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ（ｃａｔ＃７４００４））により抽出した。ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ（ｃａｔ＃７９２５４））処理により、ＲＮＡサンプルからゲノムＤＮＡのトレース量を除去した。
【０１２６】
定量リアルタイムＰＣＲを用いて、ＲＮＡｉに起因する遺伝子ノックダウン効果を測定した。抽出したＲＮＡは、スーパースプリクトＩＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）リバーストランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｃａｔ＃１８０８０−０４４））およびポリｄＴプライマーを用いて逆転写させた。ＰＣＲ産生物を、ＳＹＢＲ緑色アッセイによって検出した。このアッセイに対して、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ｃａｔ＃４３０９１５５）））１２．５μｌを、ｃＤＮＡ、フォワードプライマー、およびリバースプライマーと混合し最終体積を２５μｌにした。逆転写に使用されるトータルＲＮＡを５０ｎｇにするように、ｃＤＮＡを添加した。プライマーの各々を、３００ｎｇの量に添加した。逆転写効率に起因するサンプル間のｃＤＮＡ濃度差は、内因性のコントロールベータ−アクチンによって標準化された。
【０１２７】
ステップ４）遺伝子ノックダウンによる表現型における変化
トランスフェクションの毒性および遺伝子ノックダウンの効果を検討するために、ＥｔｈＤ−１蛍光染料（エチジウムホモダイマ−１、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｅ１１６９）を用いて細胞の生死を観察した。そして、当該蛍光染料は死細胞に選択的である。細胞を２ｍＭのＥｔｈＤ−１で処理した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション効果を、蛍光顕微鏡（オリンパス１Ｘ５１）によって観察した。蛍光性画像は、ＦＩＴＣ波長（ｅｘ＝４９４ｎｍ（ｅｍ＝５１９ｎｍ））における蛍光性オリゴおよびテキサス−レッド波長（ｅｘ＝５２８ｎｍ（ｅｍ＝６１７ｎｍ））におけるＥｔｈＤ−１から求められた。
【０１２８】
ステップ５）遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の変化
細胞株を３Ｘ１０３細胞／ウェルの量の９６穴プレートに等分して、１６時間培養した。
その後、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭおよび１０ＯｎＭのｓｉＲＮＡを、０．１ｍｌのリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）に混合して、細胞が既に育った培地に添加し、次いで、添加してから２４、４８、および７２時間経過した後、細胞計測アッセイを行なった。ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞を、トリプシン（ＧＩＢＣＯ，  ｃａｔ＃１５０９０−０４．ｂｅｔａ．）５０μｌで分離し、損傷細胞をトリパンブルー染料（ＧＩＢＣＯ，  ｃａｔ＃１５２５０−０６１）５０μｌで染色して、へもメーターで生存細胞を計測した。
【０１２９】
ステップ６）アポトーシス測定
６−１．ＤＮＡ断片化の測定
細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（ロシュ（ｃａｔ＃１７７４４２５））で、アポトーシスまたはネクローシスを受けた細胞のＤＮＡ断片化パターンを検討した。ｓｉＲＮＡを細胞株に導入してＲＮＡｉを行なった後、壊死の細胞死モードにおける細胞を含む上清を分離し、かつアポトーシスによる細胞死モードにおける細胞は、当該ＤＮＡを単離するために溶解された。ＤＮＡをストラプタビジン（ｓｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）を被覆したマイクロプレートに配置して、抗−ヒストンビオチン抗体（ａｎｔｉ−ｈｉｓｔｏｎ  ｂｉｏｔｉｎ）および抗−ＤＮＡ  ＰＯＤ抗体と反応させた。ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳで着色の後、４０５ｎｍの吸光度が測定された。測定された吸光度値からバックグラウンド値を予測した後に残った吸光度値を用いて、濃縮係数（細胞質にリリースされたモノ／オリゴヌクレオゾーム（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）の比）を算出した。これらのパラメータから、遺伝子ノックダウンに起因する細胞死を、定量的に分析した。
【０１３０】
６−２．カスパーゼ活性の測定
ホモジニウスカスパーゼアッセイキット（ロシュ（ｃａｔ＃３００５３７２））を用いて、アポトーシスが誘導された細胞のカスパーゼ活性を測定した。ｓｉＲＮＡを細胞株に導入して、ＲＮＡｉを行い、蛍光物質Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０を結合したカスパーゼ基質ＤＥＶＤ−ＲＩｌＯと反応した。蛍光を、５００−５６０ｎｍ（放出波長）がフィルターをかける４７０−５００ｎｍ（励起波長）フィルターと５００〜５６０ｎｍ（放出波長）フィルターとを備えた蛍光測定読取機で測定した。測定した吸光度値からブランク値を残した吸光度値（相対的な蛍光ユニット（ＲＦＵ））を用いて、誘導係数（ＩＦ、テスト群：コントロールのカスパーゼ活性比））を計算するといった方法で結果の解析を行なった。これらのパラメータから、遺伝子ノックダウンに起因したカスパーゼ活性変化を定量的に分析した。
【０１３１】
６−３．膜変性の測定
アポトーシスを受けた細胞において、ＰＳ（ホスファチジルセリン）を細胞膜の外部にさらした。さらされたＰＳを、特にＰＳに結合しているＡｎｎｅｘｉｎ−ＶでＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシスキット（ＢＤ（ｃａｔ＃Ｋ２０２５−ｌ））を用いて検出した。細胞死がその中にｓｉＲＮＡを促したことを介して細胞株で誘導された。細胞をＦＩＴＣ−結合アネキシン−Ｖ（  ＦＩＴＣ−ｃｏｕｐｌｅｄＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）と反応させて、ＢｅｃｔｏｎＣｏｕｌｔｅｒ製のフローサイトメータで計数した。この時に、壊死の細胞から後期段階においてアポトーシスを起こした細胞を区別するようにＤＮＡに対して特異的なＰＩ（ヨウ化プロピジウム）をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖに加えてインキュベートした。
【０１３２】
ステップ７）細胞周期変化の測定
ｓｉＲＮＡを細胞株にトランスフェクトして、対応する遺伝子をノックダウンした後、７０％エタノールで固化させた。前記ＤＮＡは、ＤＮＡ−特異性ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で染色されて、フローサイトメータで測定された。細胞周期の期は、ＤＮＡレベルによって区別された。
【０１３３】
産業上の利用分野
本明細書述べられているように、乳癌または結腸直腸癌は、ＣＴＨＲＣ１、ＣＡＮＰ、ＫＩＡＡ０１０１およびこれらの混合物からなる群から選択された遺伝子の発現を検出することではっきりと診断することができ、かつ遺伝子の発現および活性を阻害することによって、乳癌または結腸直腸癌を効果的に予防または治療されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、ＤＤＲＴ  ＰＣＲゲルに分離されたＤＮＡを示す。
【図２】図２は、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション画像を示す。
【図３】図３は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフを示す。
【図４】図４は、動物における腫瘍形成プロセスを示す。
【図５】図５は、ｍＲＮＡレベルの変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
【図６】図６は、アポトーシスの誘起および細胞増殖の変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
【図７】図７は、ＤＮＡ断片化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
【図８】図８はカスパーゼ活性の変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
【図９】図９は、膜変性によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
【図１０】図１０は、細胞周期の変化によるＲＮＡｉの特異的遺伝子抑制を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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