(57)【要約】  本発明は、反発誘導分子（ＲＧＭ）タンパク質ファミリー並びにそれに由来するポリペプチド断片のメンバーのネオゲニン受容体−結合ドメインの特定及び使用に関する。本発明のドメイン、すなわち、ペプチド断片は、個々の能動又は受動免疫のための薬剤、並びにその発現又は進行に、ＲＧＭファミリーのメンバー及びこの分子に割り当てられる細胞受容体が関与する疾患又は病的状態のために用いられる診断及び治療薬として適している。本発明はまた、本発明の結合ドメイン、それから誘導されるポリペプチドに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに本発明のドメイン、ポリペプチド及び抗体の生成方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反発誘導分子（ＲＧＭ）のネオゲニン受容体結合ドメイン。
【請求項２】
ほ乳類のＲＧＭに由来する、請求項１記載のネオゲニン受容体結合ドメイン。
【請求項３】
配列番号２に示される、ヒトＲＧＭ  Ａ、配列番号４に示されるヒトＲＧＭ  Ｂ、又は配列番号６に示されるヒトＲＧＭ  Ｃに由来する、請求項１又は２記載のネオゲニン受容体結合ドメイン。
【請求項４】
ＲＧＤ切断部位に対するＲＧＭのＣ末端、及びＧＰＩアンカー領域に対するＮ−末端のアミノ酸配列領域からの１５０個以下の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載のネオゲニン受容体結合ドメイン。
【請求項５】
配列番号７に示される、以下の部分配列を特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載のネオゲニン受容体結合ドメイン。
ＧＸ１Ｘ２ＶＥＸ３Ｘ４ＡＸ５ＹＩＧＴＴＸ６Ｘ７Ｘ８ＲＱ
［式中、Ｘ１〜Ｘ８はいずれかのアミノ酸残基である］
【請求項６】
配列番号２に示される２００〜３５０位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２００〜３２５位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２００〜３００位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２００〜２８５位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２５０〜２８５位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２６０〜２８５位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２１５〜３４０位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２６０〜３４０位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２５０〜３００位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２６０〜２９１位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２１０〜２６０位のアミノ酸、又は配列番号２に示される２９０〜３５０位のアミノ酸のアミン酸配列を含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は、それらの機能的なネオゲニン受容体結合断片。
【請求項７】
配列番号２に示される２６０〜２９１又は２６７〜２８５位の配列領域、配列番号４に示される２６０〜３２５位の配列領域、又は配列番号６に示される２５０〜３００位の配列領域に由来する、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含む、ネオゲニン受容体結合ドメイン又はその結合断片。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載のネオゲニン受容体結合ドメインの抗原性ポリペプチド断片。
【請求項９】
ＲＧＭのネオゲニン受容体への結合を調節する免疫グロブリン分子を製造するために用い得る、請求項８記載の抗原性ポリペプチド断片。
【請求項１０】
配列番号７、８、９、１０又は２３〜２９又は３１〜３４のいずれかに示す配列の１種のペプチドの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含む、請求項８記載の抗原性ポリペプチド断片。
【請求項１１】
ＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を製造するための、請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項７から９までのいずれか１項記載のポリペプチド断片の使用。
【請求項１２】
前記抗血清又は抗体が、ＲＧＭのネオゲニン受容体への結合を調節する、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
診断又は治療において用いるための、請求項１１又は１２記載のＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ネオゲニン受容体と、ＲＧＭ又はＲＧＭ断片との相互作用によって媒介される疾患又は病的状態の診断又は治療のための医薬組成物を製造するための、請求項１３記載のポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体の使用。
【請求項１５】
疾患又は病的状態が、
ａ）頭蓋骨、脳及び脊髄の機械的損傷、
ｂ）神経変性、炎症性及び自己免疫疾患等の慢性的疾患
ｃ）神経再生、軸索発芽、軸索伸長、及び神経可塑性の機能障害、
ｄ）腫瘍性疾患及び腫瘍転移
から選択される、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
ＲＧＭ又はＲＧＭ断片と関連受容体との相互作用を妨害又は損なうことにより媒介される疾患又は病的状態の診断又は治療のための組成物を製造するための、請求項１から６までのいずれか１項に記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項に記載のポリペプチド断片の使用。
【請求項１７】
疾患又は病的状態が、
ａ）精神異常に関連する軸索形成過程の変化、及び過度の軸索発芽及び／又は病的シナプス形成によって引き起こされる慢性的な痛みの状態、
ｂ）正常な機能が損なわれた鉄代謝に関連する障害、
ｃ）正常な機能が損なわれた骨成長に関連する障害、
ｄ）変性軟骨変形に関連する障害、
ｅ）椎間板及び椎骨に対する損傷に関連する障害、
ｆ）調節されない、制御されない細胞移動過程に関連する障害
から選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
ＲＧＭ結合リガンドの検出又は同定のための標的としての、請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片の使用。
【請求項１９】
能動又は受動免疫のための免疫原としての、請求項１から７のいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片の使用。
【請求項２０】
請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片の抗原量を用いてほ乳類を免疫することにより得ることのできるポリクローナル抗血清。
【請求項２１】
ヒト化された形態であってよい、請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片、又はその抗原結合断片に対するモノクローナル抗体。
【請求項２２】
ａ）請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片、
ｂ）請求項２０又は２１記載のモノクローナル又はポリクローナル抗体
から選択される少なくとも１種の活性成分を、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項２３】
くも膜下腔内、静脈内、皮下、経口又は非経口、経鼻及び吸入投与のための、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
少なくとも１種の制御性核酸配列に動作可能に結合した、請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片をコードする、少なくとも１種のコード化された核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４記載の少なくとも１種のベクターを含む組換え微生物。
【請求項２６】
請求項２１記載のモノクローナル抗体を生産する、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項２７】
請求項２５記載の組換え微生物を培養し、生産されたタンパク質産物を培養物から分離することを含む、請求項１から７までのいずれか１項記載のネオゲニン受容体結合ドメイン、又は請求項８から１０までのいずれか１項記載のポリペプチド断片を製造する方法。
【請求項２８】
請求項２６記載のハイブリドーマ細胞系を培養し、生産されたタンパク質産物を培養物から分離することを含む、請求項２１記載のモノクローナル抗体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反発誘導分子（ＲＧＭ）タンパク質ファミリーのメンバーの受容体結合ドメイン、並びにそれから誘導されるポリペプチド断片の特定及び使用に関する。本発明のドメイン及びペプチド断片は、能動又は受動免疫のための薬剤、並びにその発現又は進行に、ＲＧＭファミリーのメンバー及びこの分子に割り当てられる細胞受容体が関与する疾患又は病的状態のために用いられる診断及び治療薬として適している。更に、本発明は、本発明の結合ドメイン、それから誘導されるポリペプチドに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに本発明のドメイン、ポリペプチド及び抗体の製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
ＲＧＭタンパク質ファミリーのメンバーの機能は、最初はＭｏｎｎｉｅｒ，Ｐ．Ｐ．らによって、Ｎａｔｕｒｅ，４１９，ｐ３９２−３９５，２００２に開示された。このファミリーには、今までに開示されている、ＲＧＭ  Ａ、ＲＧＭ  Ｂ（ＤＲＡＧＯＮとも呼ばれる）及びＲＧＭ  Ｃ（ヘモジュベリンとも呼ばれる）と呼ばれる３種のメンバーが含まれる（Ｎｉｅｄｅｒｋｏｆｌｅｒ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，８０８−１８，２００４）。これらは、脂質アンカーによって形質膜に結合している糖タンパク質である（グリコシル−ホスファチジルイノシトールアンカー＝ＧＰＩアンカー）。このタンパク質ファミリーのメンバーは、他のタンパク質に対して広範囲な配列相同性を有さず、特定されている構造上の特色は実質的に以下の領域、すなわち、Ｎ−末端シグナルペプチド；ＲＧＤ配列；アミノ酸配列ＧＤＰＨの周囲のタンパク分解的切断部位；フォンウィルブランド因子ドメイン（ｖＷＦ  Ｄ）の構造的相同体；Ｃ末端及びＣ−末端ＧＰＩアンカーコンセンサス配列の近傍における疎水性配列（図２も参照）である。
【０００３】
ヒトにおいては、ＲＧＭ  Ａについてのコード配列は第１５染色体に、ＲＧＭ  Ｂについては第５染色体に、ＲＧＭ  Ｃについては第１染色体上に位置している。特徴的な発現パターンが観察される。ＲＧＭ  Ａ及びＢは、特に成人の脳及び脊髄に、ＲＧＭ  Ｃは、特に骨格筋、肝臓及び心筋に、ＲＧＭ  Ｂは更に軟骨組織で発現する。
【０００４】
ＲＧＭタンパク質は、もとは局所的ニューロン投射の形成において重要な役割を演じる候補タンパク質として同定された（Ｓｔａｈｌ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５：ｐ７３５−４３，１９９０；Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，ｐ．１４９７−１５０２，１９９６；Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｂ．Ｋ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｘｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｊａｐａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，２１５−２２９，１９９７）。増殖する神経線維における反発又は阻害様式において作用するそれらの能力は、神経線維の分離、クローニング及び特徴づけにおける重要な役割を演じる決定的な機能的特色であった。その活性は、簡単な細胞測定系において容易に検出することができる。ＲＧＭタンパク質は、２種の異なる細胞アッセイにおいて、阻害又は反発効果を有する。虚脱アッセイにおいては、ＲＧＭタンパク質は増殖する神経線維に添加される。ＲＧＭのＲＧＭ受容体への結合は、神経細胞成長円錐の全ての膜成分が関与する活発な反応を誘導する。その結果、最初の広がった手のような成長した円錐状物体が細い糸状に変換される。ＲＧＭの存在下で、神経線維は阻害されたままであり、非常に縮小し、もはや成長を続けることはできない。
【０００５】
ＲＧＭタンパク質は、ＲＧＭ受容体ネオゲニンと結合することによりそれらの効果の一部を発揮する（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６，ｐｐ．７５６−６２，２００４）。ネオゲニンは、ＤＣＣ受容体（結腸直腸癌における除去）と密接に関係する。両方の受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、細胞外、膜貫通及び細胞内ドメインを有する。両方は、更なるリガンド、ネトリン−１の受容体として開示されているが、ネオゲニンのみがＲＧＭタンパク質と結合し、ＤＣＣは結合しない。これらの受容体の細胞外ドメインは、４個の免疫グロブリン様ドメイン、それに続く６個のフィブロネクチン繰り返しドメインを含む。
【０００６】
神経系におけるＲＧＭ  Ａの機能は、ほとんど理解されており、非常に低い濃度で神経線維の増殖を阻害する効果は特に顕著である。成人のヒト及びおとなのラットにおける中枢神経系に対する損傷は、損傷部位におけるＲＧＭタンパク質の蓄積をもたらす（Ｓｃｈｗａｂ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，２００５；Ｓｃｈｗａｂ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：ｐ．３８７−９８，２００５）。損傷した神経線維の増殖の再開が阻止され、その結果、永久に、損傷部位の位置に依存し、多少の重篤な機能障害が発生する。この、神経線維の増殖のためのＲＧＭの阻害活性はネオゲニン受容体への結合によって媒介される（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。しかし、同じ受容体は、ネトリン−１の結合によって、神経線維の増殖を促進する反対の効果も媒介する。
【０００７】
最近の結果は、ＲＧＭタンパク質が、腫瘍性疾患、炎症過程、骨及び軟骨組織の形成における鉄代謝の制御において、中枢及び末梢神経系において重要な課題をも実行することを示す。
【０００８】
ＲＧＭ  Ａ、Ｂ及びＣがネオゲニン受容体に高親和性により結合するという観察に基づき、本発明の目的は、これらの分子、特にＲＧＭ  Ａの機能的結合ドメインの特徴づけを詳細に行うことである。これは、ＲＧＭの阻害活性を高い可能性で中和し、その結果、神経線維の再生及び増殖再開を促進するドメイン、及び活性ＲＧＭに由来する活性ＲＧＭペプチドに対する抗体を生成することを可能にする。更に、結合ドメイン、及び活性ＲＧＭに由来する活性ＲＧＭドメインは、それ自体、治療に有効な薬剤として提供され得る。
【０００９】
意外なことに、前記目的は、ヒトＲＧＭタンパク質、特にＲＧＭ  Ａの結合ドメイン、及びその活性ポリペプチド断片を分離し、特徴づけることによって達成することができる。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、ヒト型のＲＧＭ  Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃  ＮＰ＿０６４５９６．１）、ＲＧＭ  Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃  ＮＰ＿００１０１２７７９）及びＲＧＭ  Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃  ＮＰ＿９９８８１８．１）の配列である。
【００１１】
図２は、ＲＧＭ分子の構造の図表示である。Ｎ−末端シグナルペプチドとＣ−末端ＧＰＩアンカーとの間に、ＲＧＤ配列、フォンウィルブランド因子ドメイン（ＶＷＦ  Ｄ）及びアンカー領域の前のＣ−末端の領域における疎水性配列がある。本発明の興味深い結合ドメイン領域は、ｖＷＦＤ及び疎水性領域の間であると推定される。図の下は、アミノ酸１６８及び１６９の間のタンパク分解的切断部位のヒトＲＧＭ  Ａに対応するアミノ酸部位である。
【００１２】
図３Ａは、蛍光顕微鏡写真を用いた、ラット神経細胞の神経線維増殖における、種々のＲＧＭ  Ａペプチド断片の影響である。ペプチド１は１０μｇ／ｍＬの濃度で阻害活性を示すが、ペプチド４は同じ濃度で不活性である。緩衝液又はＰＢＳを用いた対応するコントロール混合物を比較のために示す。図３Ｂは、本発明のＲＧＭ  Ａペプチド１の軸索増殖−阻害活性の濃度依存性を示すための、測定した軸索増殖指数（細胞凝集サイズに対する、軸索により覆われた面積の割合、平均及び標準偏差を示す）の棒グラフを示す。ＲＧＭ  Ａペプチド４についての対応する棒グラフを図３Ｃに示す。
【００１３】
図４Ａは、ヒト神経ＮＴｅｒａ細胞の神経線維増殖におけるＲＧＭ  Ａペプチド１及び４（それぞれ、３０μｇ／ｍＬの濃度における）の影響を説明するヒト神経ＮＴｅｒａ細胞の蛍光顕微鏡写真である。同様に示すコントロール画像（ペプチドに代えＰＢＳとインキュベーション）と比較し、ペプチド１が神経線維増殖において阻害効果を有することが示される。図４Ｂは、ペプチド１、ペプチド４及びコントロール（ＰＢＳ）を用いた試験シリーズについて、対応して測定された軸索増殖指数を示す（上の図：各測定値及び平均、下の図：平均及び標準偏差を示す棒グラフ）。
【００１４】
図５Ａは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおけるＲＧＭ  Ａ断片の解析の結果である。ＲＧＭ  Ａ断片２（２１８−２８４）及び６（１６８−４２２）の両方を、ＮＴｅｒａニューロンに９０ｎＭの濃度で加えた。両方の断片は、ＮＴｅｒａニューロンの神経線維増殖を強く阻害する。＊＊＊＝ｐ＜０．００１  ＰＢＳコントロールに対する有意性。
【００１５】
図５Ｂは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおけるＲＧＭ  Ａ断片のアッセイ結果の蛍光顕微鏡写真である。ＲＧＭ  Ａ断片２（２１８−２８４）、３（２６６−３３５）、４（３１６−３８６）及び６（１６８−４２２）を、ＮＴｅｒａニューロンに示した濃度で、ピペットで取った。軸索増殖について阻害活性を示したものは、断片２、３及び６であり、断片４は不活性であった。
【００１６】
図５Ｃは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおけるＲＧＭ  Ａ断片の解析の追加結果である。ＲＧＭ  Ａ断片３（２８６−３３５）及び６（１６８−４２２）の両方をＮＴｅｒａニューロンに６μｇ／ｍＬの濃度で加えた。両方の断片は、ＮＴｅｒａニューロンの神経線維増殖を強く阻害する。＊＊＝ｐ＜０．０１  バッファー制御に対する有意性、＊＊＊＝ｐ＜０．００１  バッファー制御に対する有意性。
【００１７】
図６Ａは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおける、ＲＧＭ  Ａペプチド１及びそれと部分的に重複する２個のペプチド（Ｄｏｗｎ−１及びＵｐ−１）の解析結果である。ペプチドを、ＮＴｅｒａ凝集体に１０μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。２４〜３６時間後、培養物を固定化し、染色して解析した。３種全てのＲＧＭ  Ａペプチドは、３０μｇ／ｍＬの濃度で活性であり、神経線維増殖を非常に顕著に阻害した。
【００１８】
図６Ｂは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおける、更に３種のＲＧＭ  Ａペプチドの解析結果である。ＲＧＭ  Ａペプチドを、ＮＴｅｒａ凝集体に１０μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。２４〜３６時間後、培養物を固定化し、染色して解析した。３種全てのＲＧＭ  Ａペプチド（５−ＡＫ、６−ＡＫ、７−ＡＫ）は、１０μｇ／ｍＬの濃度で不活性であり、ペプチド７−ＡＫ及び６−ＡＫのみが、高濃度で、神経線維増殖を阻害する明確な傾向を示した。
【００１９】
図７Ａは、ＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン結合アッセイの結果である。このアッセイにおいては、ペプチドＤｏｗｎ１に対するポリクローナル抗体は、非常に強力であり、最も低い濃度であっても（Ｄｏｗｎ  １  ８６４１及びＤｏｗｎ  １  ８６４０）、ＲＧＭ  Ａリガンドと、その受容体ネオゲニンタンパク質との相互作用を遮断した。コントロール抗体（ウサギコントロール）は効果がなく、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＡＢ抗ＲＧＭ）から市販されているコントロールのポリクローナル抗体は、同様にＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン相互作用を遮断したが、実質的に低い効率であった。
【００２０】
図７Ｂは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおいて、Ｄｏｗｎ−１特異的ポリクローナル抗体が、強力なＲＧＭ  Ａ断片２の阻害活性をどのように中和するのかを示す。増殖アッセイにおいて、ＮＴｅｒａ培養物を、ＰＢＳ、断片２（２μｇ／ｍＬ）、又は断片２（２μｇ／ｍＬ）及び同時にポリクローナル抗体Ｄｏｗｎ−１（０．６μｇ／ｍＬ）で処理した。
【００２１】
発明の詳細な説明
Ｉ．一般用語の説明
「受容体」は、特に本発明との関連において、細胞膜に結合し、例えば、可溶性リガンドと相互作用することができ、この相互作用の結果として、例えば、細胞内部に配向するシグナル、又はシグナルカスケード（シグナル伝達とも呼ばれる）を誘導する表面分子を表す。
【００２２】
「リガンド」は、天然、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏで形成された、又は人工的に生成された、「受容体」に対する、低分子量又は高分子量の結合パートナーを表す。リガンドは、好ましくは細胞外の環境において自由に移動することができる。
【００２３】
「免疫原」は、免疫原に対する抗体の形成を誘導するのに好適な、グリコシル化された又はグリコシル化されていない形態における本発明のペプチド断片を表す。適当な場合には、免疫原（ハプテンとしての）の高分子担体への結合は有利である。
【００２４】
「エピトープ」又は抗原決定基は、例えばタンパク質等の抗原の抗体特異性を決定する領域を表す。このエピトープがタンパク質の部分で新規に形成され、又は例えば、タンパク質とリガンドの相互作用により、例えば、外部の影響を通じて、接触可能な分子表面で発現される場合、用いられる用語は「ネオエピトープ」である。
【００２５】
タンパク質又は抗体の「ドメイン」は、α−ヘリックス及び／又はβプリーツシート成分によって形成され、タンパク質内で区切られる複雑な構造を表す。
【００２６】
特に示さない限り、「本発明のＲＧＭタンパク質」なる用語は、ネオゲニン結合ドメイン及びＲＧＭ分子のファミリーのメンバー、特にＲＧＭ  Ａ、Ｂ及びＣに由来のポリペプチドを表す。また、特に、「阻害活性を有する」機能的ポリペプチドも含まれる。
【００２７】
「阻害」ポリペプチド又は「阻害活性を有する」ポリペプチドは、本明細書に開示される神経細胞増殖アッセイにおいて神経細胞の増殖を減少又は完全に阻害することである。
【００２８】
特に示さない限り、「ＲＭＧ］は、ＲＧＭ  Ａ、Ｂ及びＣ、特にＲＧＭ  Ａを意味する。
【００２９】
「ネオゲニン」又は「ネオゲニン受容体」は、同義語である。
【００３０】
ＩＩ．本発明の特定の態様
本発明の第一の態様は、好ましくはヒト、ラット又はマウス等のほ乳類、又はニワトリ等の家禽由来のＲＧＭ由来の、グリコシル化された、又は特にグリコシル化されていない形態における反発誘導分子（ＲＧＭ）の受容体結合、特にネオゲニン受容体結合ドメインに関する。
【００３１】
好ましい実施態様は、配列番号２に示されるヒトＲＧＭ  Ａ、配列番号４に示されるヒトＲＧＭ  Ｂ、配列番号６に示されるヒトＲＧＭ  Ｃに由来のネオゲニン受容体結合ドメインに関する。これに関連し、結合ドメインは、ＲＧＭのアミノ酸配列領域、特にＲＧＤ切断部位に関連する、特にＣ−末端、及びＲＧＭ、例えば、特にＲＧＭ  ＡのＧＰＩアンカー領域に関連するＮ−末端から、特に、１５０個以下、例えば、１２５以下、１００個以下、８０個以下、３０個以下、又は２０個以下、例えば、１０〜２０個、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個の長さの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む。
【００３２】
特に、本発明は、配列番号７に示される、以下の部分配列によって特徴づけられるネオゲニン受容体結合ドメインに関する。
【００３３】
ＧＸ１Ｘ２ＶＥＸ３Ｘ４ＡＸ５ＹＩＧＴＴＸ６Ｘ７Ｘ８ＲＱ
［式中、Ｘ１〜Ｘ８はいずれかのアミノ酸残基である］
特に、
Ｘ１はＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｓｎであり；
Ｘ２はＨｉｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ３はＩｌｅ又はＭｅｔであり、
Ｘ４はＧｌｎ又はＨｉｓであり、
Ｘ５はＬｙｓ、Ａｒｇ又はＡｌａであり、
Ｘ６はＩｌｅ又はＶａｌであり、
Ｘ７はＶａｌ、Ｐｈｅ又はＩｌｅであり、
Ｘ８はＶａｌ又はＩｌｅである。
【００３４】
言及すべき具体例は
ＧＱＨＶＥＩＱＡＫＹＩＧＴＴＩＶＶＱＲ（配列番号８）
ＧＨＹＶＥＭＨＡＲＹＩＧＴＴＶＦＶＱＲ（配列番号９）
ＧＮＨＶＥＩＱＡＡＹＩＧＴＴＩＩＩＲＱ（配列番号１０）
である。
【００３５】
ネオゲニン受容体結合ドメインの具体例には、配列番号２に示される２００〜３５０位のアミノ酸配列、配列番号４に示される２００〜３３０位のアミノ酸、又は配列番号６に示される１８０〜３５０位のアミノ酸、又はそれらの機能的なネオゲニン受容体結合断片が含まれる。
【００３６】
このようなドメイン又は断片には、特に、
配列番号２に示される２００〜３２５、２００〜３００、２００〜２８５、２５０〜２８５、又は２６０〜２８５、又は２６０〜２８０、又は断片２１５〜３４０、２６０〜３４０、２５０〜３００、２６０〜２９１、２１０〜２６０又は２９０〜３５０位のアミノ酸；又は
配列番号４及び６を有する配列番号２の配列アラインメントに由来し（添付の図１参照）、配列番号２の前述したアミノ酸位置と関連する配列番号４及び６の配列断片；及び
配列番号４に示される２００〜３００、２８０〜３４０、２４０〜３００、２６０〜３００又は２４０〜２８０位のアミノ酸：又は
配列番号６に示される２００〜３５０、２００〜３２０、２２０〜３１０、２５０〜２９０又は２６０〜２８０位のアミノ酸が含まれる。
【００３７】
本発明に好適な結合ドメインの更なる特定の具体例は：
ＲＧＭ  Ａ由来のＫＩＴＥＫＶＳＧＱＨＶＥＩＱＡＫＹＩＧＴＴＩＶＶＲＱＶＧＲＹＬＴ（配列番号２３）；
ＲＧＭ  Ｂ由来のＲＩＶＥＲＥＳＧＨＹＶＥＭＨＡＲＹＩＧＴＴＶＦＶＲＱＶＧＲＹＬＴ（配列番号２４）；
ＲＧＭ  Ｃ由来のＳＩＱＴＡＮＰＧＮＨＶＥＩＱＡＡＹＩＧＴＴＩＩＩＲＱＴＡＧＱＬＳ（配列番号２５）；
ＲＧＭ  Ａ由来のＫＩＴＥＫＶＳＧＱＨＶＥＩＱＡＫ（配列番号２６）；
ＲＧＭ  Ａ由来のＹＩＧＴＴＩＶＶＲＱＶＧＲＹＬＴ（配列番号２７）；
ＲＧＭ  Ａ由来のＶＶＮＡＶＥＤＷＤＳＱＧＬＹＬＣ（配列番号２８）；
ＲＧＭ  Ａ由来のＴＩＩＦＫＮＦＱＥＣＶＤＱＫＶＹＱＡ（配列番号２９）
ＲＧＭ  Ｂ由来のＲＩＶＥＲＥＳＧＨＹ  ＶＥＭＨＡＲ（配列番号３１）；
ＲＧＭ  Ｂ由来のＹＩＧＴＴＶＦＶＲＱ  ＶＧＲＹＬＴ（配列番号３２）；
ＲＧＭ  Ｃ由来のＳＩＱＴＡＮＰＧＮＨ  ＶＥＩＱＡＡ（配列番号３３）；及び
ＲＧＭ  Ｃ由来のＹＩＧＴＴＩＩＩＲＱ  ＴＡＧＱＬＳ（配列番号３４）である。
【００３８】
ネオゲニン受容体結合ドメイン又はその結合断片の更なる具体例には、前述のペプチドの１種から、又は配列番号２に示される２６０〜２９１位、又は２６７〜２８５位の配列領域から、配列番号４に示される２６０〜３２５位の配列領域から、又は配列番号６に示される２５０〜３００位の配列領域から、少なくとも１０個、例えば、１０〜３０個、１０〜２５個、１０〜２０個、又は１０〜１５個、例えば、特に１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続したアミノ酸残基が含まれる。
【００３９】
本発明の更なる態様は、前記に定義したような、ネオゲニン受容体結合ドメインの抗原性ポリペプチド断片に関する。本発明は、特に、免疫グロブリン分子の生成に使用することができ、ＲＧＭのネオゲニン受容体への結合を調節、特に部分的又は完全に拮抗する抗原性ポリペプチド断片に関する。例えば、配列番号７、８、９、１０、２３〜２９又は３１〜３４に示されるペプチドの、少なくとも１０個、例えば、１０〜３０個、１０〜２５個、１０〜２０個、又は１０〜１５個、例えば、特に１０、１１、１２、１３、１４、１５個の連続したアミノ酸残基を含む抗原性ポリペプチド断片に言及されてもよい。
【００４０】
本発明の更なる態様は、ＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体（抗血清又は抗体が、好ましくは部分的又は完全に拮抗する、特に、ＲＧＭのネオゲニンへの結合を調節する）の生成のための、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片の使用に関する。
【００４１】
本発明は、また、診断又は治療に用いるための、前記に定義したＲＧＭに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体に関する。
【００４２】
本発明は、また、ネオゲニン受容体と、ＲＧＭ又はＲＧＭ断片との相互作用によって媒介される疾患及び病的状態の診断又は治療のための医薬組成物を生成するための、本発明のポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体の使用に関する。これらの疾患又は病的状態は、特に、
ａ）頭蓋骨、脳及び脊髄の機械的損傷、
ｂ）神経変性、炎症性及び自己免疫疾患等の慢性的疾患、
ｃ）神経再生、軸索発芽、軸索伸長、及び神経可塑性の障害、
ｄ）腫瘍性疾患及び腫瘍転移から選択される。
【００４３】
本発明は、更に、ＲＧＭ又はＲＧＭ断片と関連受容体（例えば、ネオゲニン受容体）との相互作用を損なうことにより媒介される疾患又は病的状態の診断又は治療のための組成物を生成するための、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片の使用に関する。これらの疾患又は病的状態は、特に、
ａ）精神異常に関連する軸索形成過程の変化、及び過度の軸索発芽及び／又は病的シナプス形成によって引き起こされる慢性的な痛みの状態、
ｂ）正常な機能が損なわれた鉄代謝に関連する障害、特に若年性ヘモクロマトーシス、
ｃ）正常な機能が損なわれた骨成長に関連する障害、
ｄ）変性軟骨変形に関連する障害、
ｅ）椎間板及び椎骨に対する損傷に関連する障害、
ｆ）調節されない、制御されない細胞移動過程に関連する障害から選択される。
【００４４】
本発明の更なる態様は、ＲＧＭ結合リガンドを検出又は同定するための、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片の使用に関する。
【００４５】
本発明の更なる態様は、能動又は受動免疫のための免疫原としての、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片の使用に関する。
【００４６】
本発明は、また、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片の抗原量を用いてほ乳類を免疫することにより得ることのできるポリクローナル抗血清、及びヒト化された形態において好適である、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又はポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体、及びその抗原結合断片に関する。
【００４７】
本発明は、また、
ａ）前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又はポリペプチド断片、又は
ｂ）前記に定義したモノクローナル又はポリクローナル抗体から選択される少なくとも１種の活性成分を、薬学的に好適な担体中に含む医薬組成物に関する。
【００４８】
このタイプの医薬組成物は、特に、くも膜下腔内、静脈内、皮下、経口又は非経口、経鼻及び吸入投与において用いられる。
【００４９】
本発明は、更に、少なくとも１種の制御性核酸配列に動作可能に結合した、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片のための少なくとも１種のコードされた核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【００５０】
本発明は、更に、
−前記に定義された、少なくとも１種のベクターを含む組換え微生物、
−前記に定義された、モノクローナル抗体を生産する、ハイブリドーマ細胞系、
−前記に定義された、組換え微生物を培養し、生産されたタンパク質産物を培養物から分離することを含む、前記に定義したネオゲニン受容体結合ドメイン、又は前記に定義したポリペプチド断片を生成する方法に関する。この場合、前記に定義されたハイブリドーマ細胞系を培養し、生産されたタンパク質産物を培養物から分離する。
【００５１】
ＩＩＩ．本発明の実施のための更なる情報
１．ポリペプチド
本発明は、特に、ＲＧＭファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びこれらのドメイン由来のペプチド断片に関する。ＲＧＭ  Ａ及びその結合ドメイン及びそれ由来の断片は、本発明により特に詳細に調べられたが、本発明は、相同的なタンパク質、例えば、特にＲＧＭ  Ｂ及びＲＧＭ  Ｃ等のＲＧＭファミリーの相同的なメンバーの関連ドメイン及び断片にも関する。
【００５２】
具体的に開示されたＲＧＭドメイン又はペプチドの「機能的等価物」又は類似体は、本発明の文脈において、例えば、配列番号２、４又は６に示すタンパク質のネオゲニン結合ドメインに対して１００％未満の相同性の程度を有するが、所望の生物学的活性を有している、ＲＧＭドメイン又はペプチドとは異なるポリペプチドである。特に、それらは、ネオゲニン受容体と結合することができ、及び／又は本明細書に開示される神経線維増殖アッセイにおいて阻害効果を示すことができるべきであり、更に、神経繊維の増殖を統計的に有意に（ｐ＜＝０．０５）、部分的又は完全に阻害すべきである。
【００５３】
本発明による「機能的等価物」は、特に、前記の特定の配列の配列位置の少なくとも１個において、特に言及されたアミノ酸と異なるが、本明細書において言及する１種の生物学的活性を有する変異体を意味する。従って、「機能的等価物」は、１個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は逆位によって得ることのできる変異体を含み、前記変化は、それらが、本発明の特性のプロフィールを有する変異体をもたらす限り、あらゆる配列位置において発生することが可能である。反応性パターンにおいて変異体及び未修飾のポリペプチドの間に定性的一致がある場合、機能的等価物が特に存在し、すなわち、例えば、同一の生物学的効果が観察されるが、発現のレベルにおいて非常に異なっている。アミノ酸残基の好適な置換の具体例は以下の通りである。
【００５４】
【表１】
2009510002.tif 000002
【００５５】
また、前記の意味における「機能的等価物」は、記載されたペプチドの前駆体、及びポリペプチドの機能的誘導体及び塩である。「塩」なる用語は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩、及びアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で生成することができ、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩等の無機塩、及びトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等のアミン等の有機塩基との塩が含まれる。例えば、塩酸又は硫酸等の鉱酸との塩、及び酢酸及びシュウ酸等の有機酸との塩等の酸付加塩は、同様に本発明の態様である。本発明のポリペプチドの「機能的等価物」は、同様に、公知の技術を用いて、機能的アミノ酸側基、又はそのＮ−又はＣ−末端により調製することができる。これらのタイプの誘導体には、例えば、アンモニア、又は一級又は二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；又はアシル基との反応によって生成される遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００５６】
また、「機能的等価物」には、当然に、他の生物から得られるポリペプチド、及び天然の変異体が含まれる。例えば、相同配列の領域の範囲は、配列比較によって見出すことができ、対応する酵素は、本発明の特定の要件を基礎として確立することができる。
【００５７】
「機能的等価物」は、更に、前記ポリペプチド配列又はそれに由来する機能的等価物の１種、及び機能的Ｎ−又はＣ−末端結合（すなわち、融合タンパク質の一部の取るに足らない相互機能障害を有する）においてそれらと機能的に異なる、少なくとも１種の更なる異種配列を有する融合タンパク質である。このような異種配列の非限定的な具体例は、例えば酵素及び免疫グロブリンである。
【００５８】
また、本発明の「機能的等価物」には、具体的に開示されるタンパク質及びペプチドの相同体が含まれる。それらは、例えば、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、例えば、少なくとも７５％、又は特に少なくとも８５％、例えば、９０％、９５％又は９９％の、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（８），１９８８，２４４４−２４４８のアルゴリズムによって計算される、具体的に開示される配列の１種に対する相同性を有する。本発明の相同ポリペプチドの相同性の割合は、特に、本明細書に具体的に開示されるアミノ酸配列の１種の完全長に基づく、アミノ酸残基の同一性の割合を意味する。
【００５９】
本発明の「由来する」アミノ酸配列は、特に示さない限り、最初の配列と、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、特には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【００６０】
２個の配列の間の「同一性」は、各ケースにおいて配列の完全長にわたるアミノ酸残基の同一性、例えば、クラスタル法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｓｈａｒｐ  ＰＭ．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９  Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）を用いたＩｎｆｏｒｍａｘ（米国）社製のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアを用いた比較により計算した同一性を意味し、下記のパラメータ：
複数の配列パラメータ
ギャップオープニングペナルティ                  １０
ギャップエクステンションペナルティ              １０
ギャップセパレーションペナルティ  範囲８
ギャップセパレーションペナルティ                切
アラインメントディレイについての同一性の割合    ４０
残基特異的ギャップ                              切
親水性残基ギャップ                              切
遷移計量                                        ０
ペアワイズ配列パラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム                            入
Ｋ−チュプルサイズ                              １
ギャップペナルティ                              ３
ウィンドウサイズ                                ５
最良のダイアゴナルの数                          ５
を設定する。
【００６１】
本発明に含まれる相同体の更なる説明のために、本発明の特に興味深い、完全長タンパク質及び特定の部分配列領域についてのＲＧＭ  Ｂ及びＣとＲＧＭ  Ａとの一致の割合を示す以下の表を参照する。
【００６２】
【表２】
2009510002.tif 000003
【００６３】
１）ＲＧＭ  Ａ配列（配列番号２）に基づく位置を示すアミノ酸残基
２）％で表す、全長タンパク質及びペプチド断片のアミノ酸の同一性
３）方法：ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．５  ［２００２年１１月１６日］
マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２（ギャップオープン：１１ギャップエクステンション：１）
【００６４】
タンパク質のグリコシル化が可能である場合、本発明の等価物には、グリコシル化パターンを変えることにより得られる、脱グリコシル化又はグリコシル化された形態、及び修飾形態における前記に示すタイプのタンパク質が含まれる。
【００６５】
本発明のペプチドの相同体は、例えば、切断変異体等の変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素連結により、核酸のレベルでコンビナトリアル変異誘発によるペプチド変異体の多様なライブラリーを生成することが可能である。退化したオリゴヌクレオチド配列由来の潜在的な相同体のライブラリーを生成することのできる、多数の方法がある。退化した遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーにより実施することができ、次いで、合成遺伝子は、適当な発現ベクターに連結することができる。退化した遺伝子のセットの使用は、１種の混合物における潜在的なタンパク質配列の所望のセットをコードする全ての配列を供給することを可能にする。退化したオリゴヌクレオチドを合成するための方法は当業者に公知である（Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【００６６】
２．核酸
本発明は、更に、ＲＧＭ結合ドメイン及び前記ポリペプチドをコードする核酸配列、特に、配列番号１、３及び５、及びそれらに由来する核酸配列又は部分的配列に示す配列に関する。
【００６７】
本発明の全ての核酸配列（一本鎖及び二重鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）は、二重らせんの個々に重複する、相補的な核酸単位のフラグメント縮合によってヌクレオチド単位から化学的合成によってそれ自体公知の方法で生成することができる。オリゴヌクレオチドの化学的合成は、例えばホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ８９６−８９７）により公知の方法で実施することができる。合成的オリゴヌクレオチドの追加、及びＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片及び連結反応を用いた、ギャップ内の補充、及び一般的クローニング法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに開示されている。
【００６８】
本発明による「由来する」核酸配列は、特に示さない限り、もとの配列と、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【００６９】
２個の核酸間の「同一性」は、各ケースにおける核酸の全長にわたる核酸の同一性、特に、クラスタル法（前述）を用いたＩｎｆｏｒｍａｘ（米国）社製のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアを用いた比較により得られる同一性を意味する。
【００７０】
また、本発明は、例えば、人工ヌクレオチド類似体を用いて得ることのできる、前記ペプチドの１種及びその機能的等価物をコードする核酸配列に関する。
【００７１】
本発明は、本発明のペプチド又はその生物学的に活性な断片をコードする分離された核酸分子、及びハイブリダイゼーションプローブ、又は本発明のコードされた核酸を同定又は増幅するためのプライマーとして用いることのできる核酸断片の両方に関する。
【００７２】
本発明の核酸分子は、更に遺伝子のコーディング領域の３’及び／又は５’末端からの非翻訳配列を含む。
【００７３】
「分離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離され、更に、組換え技術によって生成される場合、他の細胞物質又は培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を含まない。
【００７４】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準的技術、及び本発明により提供される配列情報を用いて好適なｃＤＮＡライブラリーから分離することができる。例えば、ｃＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブとして具体的に開示された完全な配列又はその断片を用い、標準的ハイブリダイゼーション技術を用いて分離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に開示されているように）。更に、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、本発明の配列又はその断片を含む核酸分子を分離することが可能である。この方法で増幅された核酸を適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析により特徴づけすることができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、標準合成方法により、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて生成することができる。
【００７５】
本発明は、更に、具体的に開示されたヌクレオチド配列又はその断片に相補的な核酸分子を含む。
【００７６】
本発明のヌクレオチド配列は、他のタイプの細胞及び生物において、相同配列を同定及び／又はクローニングするために用いることのできるプローブ及びプライマーを生産することを可能にする。このようなプローブ及びプライマーは、通常、厳しい条件下で、本発明の核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、例えば、約４０、５０又は７５個の連続したヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００７７】
本発明の更なる核酸配列は、本発明のＲＧＭドメイン及びペプチドをコード配列に由来し、１個以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失により、それらとは異なるが、所望の特性プロフィールを有するペプチドをコードする。
【００７８】
また、本発明は、いわゆるサイレント変異を含む核酸配列を含み、特定のオリジナル、又は具体的に言及された配列と比較した宿主生物、並びに天然の変異体、例えばスプライス変異又はその対立遺伝子多型のコドン使用頻度に従って修飾される。保存的ヌクレオチド置換により得られる配列（すなわち、関連するアミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性及び／又は溶解性のアミノ酸によって置換されている）は、同様に本発明の態様である。
【００７９】
また、本発明は、配列多型を介する、具体的に開示される核酸に由来の分子に関する。これらの遺伝的多型は、集団における個体の間の自然変異のために存在する。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変異をもたらす。
【００８０】
また、本発明は、更に、前記コード配列とハイブリダイズするか、それに相補的である核酸配列を含む。これらのポリヌクレオチドは、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより見出すことができ、適当なものが、好適なプライマーを用いたＰＣＲを用いてそれらから増幅される場合、それに続いて、例えば好適なプローブが分離される。更なる可能性は、微生物、それによりポリヌクレオチドを増加させ、それに続いてポリヌクレオチドを分離するために、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを用いた好適な微生物の形質転換である。更なる可能性は、化学的経路による本発明のポリヌクレオチドの合成である。
【００８１】
ポリヌクレオチドに「ハイブリダイズ」することのできる特性は、厳しい条件下で、ほとんど相補的な配列に結合するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの能力を意味するが、これらの条件下で、非相補的パートナーとの間の非特異的結合がある。この目的のため、配列は、７０〜１００％、特に９０〜１００％、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相補的であるべきである。相互に特異的に結合することのできる相補的配列の特性は、例えば、ノーザン又はサザーンブロッティング法において、又はＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において用いられる。この目的のために、３０塩基対又はそれ以上の長さを有するオリゴヌクレオチドが通常に用いられる。厳しい条件は、例えば、ノーザンブロッティング法においては、非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブ又はオリゴヌクレオチドを溶出するための５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃における、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）等の洗浄溶液の使用を意味する。前述したように、この場合においては、相補性の程度の高い核酸のみがお互いに結合したままである。厳しい条件のセットアップは当業者に公知であり、例えば、Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に開示されている。
【００８２】
本発明の更なる態様はアンチセンス核酸に関する。これは、コードセンス核酸に相補的であるヌクレオチド配列を含む。アンチセンス核酸は、完全なコード鎖又はその一部とのみ相補的である。更なる実施態様においては、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の非コーディング領域に対してアンチセンスである。「非コーディング領域」なる用語は、５’−及び３’−非翻訳領域として言及される配列部分に関する。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長であってもよい。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において公知の方法を用いて、化学的合成及び酵素連結反応により構築することができる。アンチセンス核酸は、それらが分子の生物学的安定性を向上し、又はアンチセンス及びセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を向上するように、天然のヌクレオチド、又は構築された多様に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。用いることのできる具体例は、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン−置換ヌクレオチドである。アンチセンス核酸を生成するために用いることのできる修飾ヌクレオチドの具体例は、特に、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノエチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、メチルウラシル−５−オキシアセテート、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）−ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンである。また、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを用いることにより、生物学的に生成することもできる。
【００８４】
３．発現構築物及びベクター
更に、本発明は、調節性核酸配列の遺伝的制御下に本発明のＲＧＭタンパク質又は機能的等価物又は免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む発現構築物、及びこれらの発現構築物を少なくとも１種含むベクターに関する。
【００８５】
このような本発明の構築物は、好ましくは、特定のコード配列からの５’−上流のプロモーター、及び３’−下流のターミネーター配列を、必要であれば、特に、コード配列にそれぞれ動作可能に結合した他の通常の調節要素を含む。「動作可能な結合」は、各調節要素が、コード配列の発現を意図するような機能に適合し得るような方法で結合した、プロモーター、コード配列、ターミネーター、必要であれば他の調節要素の連鎖配列を意味する。動作可能に結合することのできる配列の具体例は、標的配列及びエンハンサー、ポリアデニル化シグナル等である。他の調節要素には、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点等が含まれる。好適な調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に開示されている。
【００８６】
人工的調節配列に加え、実際の構造遺伝子の前に天然の調節配列を存在させることが可能である。必要であれば、この天然調節は遺伝的修飾によってスイッチを切ることができ、遺伝子の発現は増加又は減少し得る。しかし、遺伝子構築物は、また、より簡単な構造を有している。すなわち、構造遺伝子の前に、追加の調節シグナルは挿入されず、調節される天然のプロモーターは除去されない。その代わり、もはや調節されず、遺伝子発現が向上又は減少するように、天然の調節配列が変異する。核酸配列は、遺伝子構築物内で１個以上のコピーで存在し得る。
【００８７】
用いることのできるプロモーターの具体例は：グラム陰性菌において用いるのに好都合なｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ又はλ−ＰＬプロモーター；グラム陽性菌プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦα  、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、Ｉｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｔ又はユビキチン又はファセオリンプロモーターである。誘導性プロモーター、例えば、光、及び特に、ＰｒＰｌプロモーター等の温度誘導性プロモーターの使用は特に好ましい。原則として、調節配列を有する全ての天然プロモーターを用いることが可能である。更に、合成プロモーターを用いることも有利である。
【００８８】
前記調節配列は、核酸配列の特定の発現及びタンパク質発現が可能になることを意図する。これは、例えば、宿主生物に依存して、遺伝子が誘導後にのみ発現又は過剰発現するか、直ちに発現及び／又は過剰発現することを意味する。
【００８９】
更に、調節配列又は因子は、好ましくはプラスに影響し、それによって発現を増加又は減少する。従って、調節要素の増強は、プロモーター及び／又はエンハンサー等の強力な転写シグナルを用いることにより、転写レベルで有利に実施することができる。しかし、例えば、ｍＲＮＡの安定性を向上することにより、転写を増強することも可能である。
【００９０】
好適なプロモーターを好適なコードヌクレオチド配列、及びターミネーターシグナル又はポリアデニル化シグナルに融合することにより、発現カセットを生成する。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ（１９８９）、及びＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に開示されたような、組換え及びクローニングの従来技術がこの目的に用いられる。
【００９１】
好適な宿主生物における発現のため、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物が、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクター内に有利に挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば、"Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ"（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に見出すことができる。また、ベクターは、プラスミドのみならず、当業者に公知の他の全てのベクター、例えば、ファージ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス等のウイルス、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミド、及び直鎖又は環状ＤＮＡを意味する。これらのベクターは、宿主生物における自発的複製又は染色体複製を受ける。
【００９２】
言及される好適な発現ベクターは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ−結合タンパク質及びプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）等の従来の融合発現ベクター、
ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）  ６０−８９）等の非融合タンパク質発現ベクター、
ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４），ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）  及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のための酵母発現ベクターである。糸状菌等の他の真菌において用いるのに好適なベクター及びベクターを構築する方法は、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆  Ｐｕｎｔ，ＰＪ．（１９９１）"Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，  ｉｎ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，ｐｐ．１−２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに詳細に開示されている。
【００９３】
培養した昆虫細胞（例えばｓｆ９細胞）内でのタンパク質の発現を可能にするバキュロウィルスベクターには、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）、
Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．（１９９２）"Ｎｅｗ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ"，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１１９５−１１９７；及びＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．（１９８４）"Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ"，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）に詳細に開示されたような植物発現ベクター、
ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）等のほ乳類発現ベクターが含まれる。
【００９４】
原核及び真核細胞についての更なる好適な発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６及び１７章に開示されている。
【００９５】
４．組換え宿主生物
本発明のベクターは、例えば、本発明の少なくとも１種のベクターを用いて形質転換される組換え生物を生産するために用いることができ、本発明のドメイン又はポリペプチドを生産するために用いることができる。前述した本発明の組換え構築物は、好適な宿主系に有利に導入され発現する。当業者によく知られているクローニング及びトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等は、特定の発現系における前記核酸の発現を誘発するために好ましく用いられる。好適な系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７，又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９に開示されている。
【００９６】
原則として、好適な宿主生物は、本発明の核酸、その対立遺伝子多型、その機能的等価物又は誘導体を発現することのできる全ての生物である。宿主細胞は、例えば、細菌、真菌、酵母、植物又は動物細胞を意味する。好ましい生物は、例えば、大腸菌、放線菌、バシラス属又はシュードモナス属等のエシェリキア属、サッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス属等の真核微生物等の細菌、Ｓｆ９、ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞等の、動物又は植物由来の高等真核細胞である。
【００９７】
首尾よく形質転換された生物は、ベクター又は発現カセット内に同様に存在するマーカー遺伝子によって選択することができる。このようなマーカー遺伝子の具体例は、抗生物質耐性についての遺伝子、及び形質転換細胞の染色を生じる発色反応を触媒する酵素である。次いで、それらは自動細胞選別によって選択される。好適な抗生物質耐性遺伝子（例えば、Ｇ４１８又はハイグロマイシン）を有するベクターで首尾よく形質転換された微生物は、好適な抗生物質を含有する培地又は培養液により選択することができる。細胞表面に存在するマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた選択に用いることができる。
【００９８】
所望であれば、遺伝子産物を、例えば、特に、マウス、ヒツジ等の遺伝子導入動物、又は遺伝子導入植物等の遺伝子導入生物中で発現することができる。
【００９９】
本発明は、更に、ペプチド産生組換え宿主生物を培養し、必要であればポリペプチドの発現を誘導し、ポリペプチドを培養物から分離することを含む、本発明のＲＧＭドメイン又はポリペプチド、又はその機能的、生物学的活性断片の組換え生産方法に関する。所望であれば、ペプチドは、この方法により工業的スケールで生成することもできる。
【０１００】
組換え宿主は、公知の方法で培養し発酵させることができる。細菌は、例えば、２０〜４０℃の温度及び６〜９のｐＨで、ＴＢ又はＬＢ培地中で増殖することができる。好適な培養条件の詳細は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に開示されている。
【０１０１】
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合、細胞を破壊し、公知のタンパク質分離方法により溶解物から生成物を得る。また、細胞は、例えば、フレンチプレッシャーセル等の高圧による高周波数超音波により浸透圧溶解により、界面活性剤、溶解酵素又は有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、又は前記方法の複数の組み合わせにより破壊してもよい。
【０１０２】
ペプチドは、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー等の分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィー法、超遠心、結晶化、塩析、透析及び天然ゲル電気泳動等の他の通常の方法によって精製することができる。好適な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  又はＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに開示されている。
【０１０３】
組換えペプチドの分離のために、例えば、より簡単な精製もたらす、特定のヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを伸長し、それによって修飾ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする、ベクター系又はオリゴヌクレオチドを用いることが特に有利である。このタイプの好適な修飾は、例えば、ヘキサ−ヒスチジンアンカーとして知られる修飾、又は抗体により抗原として認識され得るエピトープ等のアンカーとして作用する、いわゆるタグである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに開示されている）。これらのアンカーは、ペプチドを、例えば、クロマトグラフィーカラム中に充填することのできるポリマーマトリクス等の固相担体に付着するために用いることができ、また、マイクロタイタープレート又は他の担体上で用いることができる。
【０１０４】
これらのアンカーは、同時にペプチドの認識のために用いることもできる。それは、単独で、又はペプチドを誘導体化するためのアンカーと組み合わせて、蛍光色素等の従来のペプチドマーカー、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、又は放射標識の認識のために用いることも可能である。
【０１０５】
５．免疫グロブリン
５．１定義
本発明は、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物と特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、すなわち、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対して特異性を有する抗体に関する。また、本発明は、これらの抗体の一部、特にその抗原結合部位、すなわち、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物と結合する抗体断片に関する。
【０１０６】
本発明の抗体は、好ましくは、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対して特異的に結合するために、特定の結合キネティクス（例えば、高親和性、低解離、低い速度（ｋｏｆｆ）、強い中和活性）を有するように選択される。
【０１０７】
従って、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対し、ＫＤ＝１０−６〜１０−１２Ｍの親和力を有する抗体が提供され得る。
【０１０８】
更なる態様によれば、本発明の抗体は、０．１ｓ−１以下のＫｏｆｆでＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に結合するように選択することができる。
【０１０９】
抗体は好ましくは分離された抗体である。更なる態様によれば、抗体は中和抗体である。本発明の抗体には、特にモノクローナル及び組換え抗体が含まれる。本発明の抗体は、完全に単一の種に由来し、それ故、例えばヒト抗体又はマウス抗体であってもよい、アミノ酸配列を含んでもよい。更なる実施態様によれば、抗体は、キメラ抗体又はＣＤＲグラフト抗体又は他のタイプのヒト化抗体であってもよい。
【０１１０】
「抗体」なる用語は、４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖から形成される免疫グロブリン分子であることを意味すると意図される。鎖は、通常、ジスルフィド結合によって結合している。各重鎖は、重鎖の可変領域（本明細書においてＨＣＶＲ又はＶＨと省略される）、及び重鎖の定常領域からなる。重鎖の定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書においてＬＣＶＲ又はＶＬと省略される）、及び軽鎖の定常領域からなる。軽鎖の定常領域は、ＣＬドメインからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分割され、フレームワーク領域と呼ばれる更に保存領域（ＦＲ）により分散されている。各ＶＨ及びＶＬ領域は、３個のＣＤＲｓ及び４個のＦＲｓから形成され、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置している。
【０１１１】
抗体の「抗原結合部位」（又は、単に抗体部位）なる用語は、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物についての特異性を有し、断片が、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に特異的に結合する能力を有し続けている１以上の抗体の断片を意味する。抗体の抗原結合機能が、完全な抗体の断片によって保証され得ることが示される。抗体の「抗原結合部位」なる用語の意味に含まれる結合断片の具体例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合する２個のＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを含むＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメイン又はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ１、ＤＨ３又はＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３を含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）である。Ｆｖ断片の２個のドメイン、すなわちＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされ、それらは、更に組換え法の使用により合成リンカーによって一緒に連結することができるが、ＶＬ及びＶＨ領域が一価の分子を形成するために一緒に存在する場合に、単一のタンパク質鎖として産生され得る（単一鎖ＦＶ（ＳｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。）。また、このような単一鎖抗体は、抗体の「抗原結合部位」なる用語によって包含されることが意図される。ダイアボディ等の、他のタイプの単一鎖抗体は、同様にその中に属する。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現し（同じ鎖上の２個のドメイン間に一緒に存在するには短すぎるリンカーを用いる）、それにより、これらのドメインの他の鎖の相補性ドメインと対を形成する、２抗原部位を形成する２価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【０１１２】
更なる可能性は、抗体又は抗体の一部の共有又は非共有結合により形成される、大きな免疫付着分子の一部である、１つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドに対する抗体又はその抗原結合部位についてである。このような免疫付着分子は、４量体ｓｃＦｖ分子を産生するために、ストレプトアビジンコア領域の使用を必要とし（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）、二価及びビオチニル化ｓｃＦｖ分子を生成するために、マーカーペプチド及びＣ−末端のポリヒスチジンタグのシステイン残基の使用を必要とする（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１０４７−１０５８）。
【０１１３】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片等の抗体部分は、例えば、パパイン又はペプシンを用いた消化等の通常従来の技術を用いて、全体の抗体から生成することができる。更に、標準化された組換えＤＮＡ技術を用いることにより、抗体、抗体部分及び免疫付着分子を得ることが可能である。「本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する特異性を有する、分離された抗体」は、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する特異性を有し、異なる抗原特異性を有する他の抗体に対して実質的にフリーである考抗体を表す。
【０１１４】
「中和抗体」なる用語は、特定の抗原に対するその結合が、抗原の生物学的活性の阻害をもたらす抗体を表す。この、抗原の生物学的活性の阻害は、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、抗原の生物学的活性の１以上の指標を測定することにより評価することができる。
【０１１５】
「モノクローナル抗体」なる用語は、ハイブリドーマに由来する抗体（例えば、ケーラー及びミルスタインの標準化されたハイブリドーマ法等のハイブリドーマ技術を用いて生成されるハイブリドーマにより分泌される抗体）を表す。従って、ハイブリドーマに由来し、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する特異性を有する抗体はモノクローナル抗体と呼ばれる。
【０１１６】
「組換え型抗体」なる用語は、組換え手段によって生成、発現、生成又は分離される抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターの使用により発現する抗体；組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから分離される抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子のために遺伝子導入された動物（例えば、マウス）から分離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい）；又は特定の免疫グロブリン遺伝子配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列等）を他のＤＮＡ配列と結合される、あらゆる他の方法において生成、発現、生成又は分離される抗体を表す。組換え抗体には、例えば、キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体が含まれる。
【０１１７】
「ヒト抗体」なる用語は、その可変及び定量領域が、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に対応するか（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ｕｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）、又はそれに由来する抗体を表す。しかし、本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム又は部位特異的変異誘発、又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異により導入される変異）、例えば、ＣＤＲ及び特にＣＤＲ３によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい。本発明の組換えヒト抗体は可変領域を有し、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来の定常領域を含んでもよい（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ｕｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。しかし、特定の実施態様によれば、ヒト生殖系列配列のＶＨ及びＶＬ配列に関連するか、それらに由来する、組換え型抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しない配列であるように、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変異誘発を受ける（又はヒトＩｇ配列のために遺伝子導入される動物が用いられる場合、体細胞）。特定の実施態様によれば、このような組換え型抗体は、選択的変異誘発又は復帰突然変異又はその両方の結果である。
【０１１８】
「復帰突然変異」なる用語は、ヒト抗体の体細胞変異したアミノ酸のいくつか又は全てが、相同的な生殖系列抗体配列の対応する生殖系列残基に置換される方法を意味する。本発明のヒト抗体の重鎖及び軽鎖の配列を、最大の相同性を有する配列を同定するために、ＶＢＡＳＥデータベースにおける生殖系列配列を、それぞれ別個に比較する。本発明のヒト抗体における逸脱は、このような逸脱したアミノ酸をコードする定義されたヌクレオチド位置における変異によって生殖系列配列に戻る。抗体結合についての復帰突然変異のための候補としてのこのように同定される、それぞれのアミノ酸の直接的又は間接的重要性を調査し、変異後に、ヒト抗体の所望の特性を害するアミノ酸は、最終のヒト抗体に含まれなかった。復帰突然変異のためのアミノ酸の数を最小化するために、第二の生殖系列配列が同一であり、本発明のヒト抗体の配列と、問題となるアミノ酸の両方の側で、少なくとも１０個、好ましくは１２個のアミノ酸と共直線化されるという条件で、最も近い生殖系列配列から逸脱するが、第二の生殖系列配列の対応するアミノ酸と同一である未変化のアミノ酸位置を残すことが可能である。復帰突然変異は、抗体最適化におけるあらゆる段階において実施することができる。
【０１１９】
「キメラ抗体」なる用語には、分子の個別の部分が異なる種に由来する抗体が含まれる。従って、キメラ抗体は、それに限定されないが、例えば、１つの種由来の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ由来のＣＤＲ領域の１個以上の配列が他の種のＣＤＲ配列に置換されている抗体である。このような抗体における可変領域は、マウスの重鎖及び軽鎖を有し、マウスＣＤＲｓ（例えば、ＣＤＲ３）の１個以上がヒトＣＤＲ配列に置換されていてもよい。
【０１２０】
「ヒト化抗体」なる用語は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ）由来の重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、「よりヒト様」になるように修飾されている、すなわち、ヒト生殖系列の可変領域のような抗体を表す。ヒト化抗体の１つのタイプは、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列中に挿入されているＣＤＲグラフト抗体である。
【０１２１】
抗体の結合反応キネティクスを測定するための方法は、いわゆる表面プラズモン共鳴に基づく。「表面プラズモン共鳴」なる用語は、例えばＢＩＡコアシステムを用いて、バイオセンサマトリックスを用いたタンパク質濃度における変化を検出することによる生物特異的相互作用を解析することを可能にする光学現象を意味する（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。更なる開示については、例えば、Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７）を参照されたい。
【０１２２】
「Ｋｏｆｆ」なる用語は、抗体／抗原複合体由来の抗体の解離についての解離速度定数（オフレート定数）を表す。
【０１２３】
「Ｋｄ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を表す。
【０１２４】
本発明の抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡコア解析等の、標準化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫アッセイを用いることにより評価することができる。
【０１２５】
５．２  免疫グロブリンの生産
５．２．１  ポリクローナル抗体の生産
本発明は、本発明のＲＧＭ及びポリペプチドに対するポリクローナル抗体、及びその生成に関する。
【０１２６】
この目的のため、少なくとも１種の本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物を宿主に免疫し、免疫に対する応答において形成された宿主の抗体含有血清を得る。
【０１２７】
用いられるＲＧＭポリペプチドが弱い免疫原性のみを有するか、免疫原性を有しない場合、それらの免疫原性は、担体、好ましくは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、リムラス・ポリフェムスヘモシアニン（ＬＰＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はオブアルブミン（ＯＶＡ）等の担体タンパク質とカップリングすることによって向上させることができる。多くのカップリングの可能性は当業者に利用可能であり、一般に公知である。目的にかなった可能性は、例えば、グルタルアルデヒドとの反応、例えば、水又は水性溶媒中におけるＲＧＭタンパク質と、好適なペプチド又はペプチド混合物とのインキュベーションによる反応である。この反応は、便利に大気温度（通常は室温を意味する）で実施することができる。しかし、冷却又は穏やかな加熱も好都合である。反応は、通常は数時間以内に所望の結果をもたらし、例えば、２時間の反応時間は標準的な範囲である。グルタルアルデヒド濃度は、通常はｐｐｍ〜％の範囲であり、好都合には１０ｐｐｍ〜１％、好ましくは１００ｐｐｍ〜０．５％である。反応パラメータの最適化は当業者の範囲内である。
【０１２８】
抗原に加え、組成物は、通常は、更に賦形剤、特に免疫化に通常に用いられるアジュバント、例えば、フロイントのアジュバントを含む。特に、最初の免疫のためにフロイントの完全アジュバントが用いられるが、全ての更なる免疫は、フロイントの不完全アジュバントを用いて実施される。免疫カクテルは、賦形剤に抗原（免疫原）を、好ましくは前述した成分混合物として加えることにより生成される。この場合、抗原は、通常、乳化される。
【０１２９】
宿主として適しているものは、特にげっし動物又はウサギである。これらの、又は他の好適な宿主は、免疫カクテルを、好ましくは皮下注射により注入される。抗体力価は免疫アッセイを用いて、例えば、宿主ＩｇＧに対するヒツジ抗血清及び標識されたＲＧＭタンパク質を用いて競合的に測定することができる。従って、免疫の終わりに向かって、特定の宿主が抗体を得るのに適しているかどうかを、決定することが可能である。例えば、４回の免疫が実施される場合、３回の免疫後に抗体力価を測定し、十分な抗体力価を示す動物から抗体を得ることができる。
【０１３０】
形成された抗体を得るために、数週間又は数ヶ月にわたり、宿主から血液を得ることが好ましい。最終的に宿主を全採血することが可能である。所望の抗体を含む血清を、このように得られた血液から、それ自体公知の方法で得ることができる。その中に存在する抗体画分、特にＲＧＭタンパク質認識抗体を濃縮するために、必要であれば、この方法により得られた全血清を、当業者に公知の方法で更に精製することができる。
【０１３１】
本発明の特定の実施態様においては、免疫原として用いられるＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物を特異的に認識する血清の少なくとも１種の抗体が選択される。これに関連し、特異性は、他のもの、特に、免疫原的に関連するタンパク質よりも免疫原について抗体のより高い結合親和性を意味する。
【０１３２】
５．２．２  モノクローナル抗体の生成
本発明に有用な免疫グロブリンは、それ自体公知の方法を用いて得ることができる。従って、ハイブリドーマ技術は、興味深い抗原についての単一特異性抗体を生成することを可能にする。更に、抗体ライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング等の組換え抗体技術が開発され、同様に、このような特異抗体を生成するために用いることができる。
【０１３３】
従って、例えば、興味深い抗原を用いて動物を免疫することができる。このｉｎ  ｖｉｖｏアプローチは、動物のリンパ球又は脾臓細胞由来のハイブリドーマ系を確立し、抗原と特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選択することを更に含む。免疫される動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ又はヒツジ、又は前記動物の遺伝子導入型、例えば、抗原刺激後にヒト抗体を生成するヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスであってもよい。免疫することのできる動物の更なるタイプには、ヒト末梢血単核球、又はリンパ球又はその前駆体で再構成された重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）を患っているマウス（ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤキメラマウス）、並びに致死的全身照射で処理し、次いで重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）を患っているマウス由来の骨髄細胞を用いて放射線から保護し、次いで機能的ヒトリンパ球を移植したマウス（いわゆるトリメラマウス系）が含まれる。免疫される更なる動物のタイプは、この動物が、抗原を用いて免疫した後に、抗原を外来物質として認識するように、例えば、相同組換えにより、興味深い抗原をコードする内在性遺伝子が不活性化されている（ノックアウト）動物（例えばマウス）である。これらの方法により生成されるポリクローナル又はモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ技術を含むが、これに限定されない、公知のスクリーニング方法を用いて特徴づけられ、選択されることは当業者に明らかである。
【０１３４】
更なる実施態様によれば、抗原を用いて組換え型抗体ライブラリーをスクリーニングする。組換え型抗体ライブラリーは、例えば、バクテリオファージの表面、酵母細胞の表面、又は細菌細胞の表面で発現し得る。組換え型抗体ライブラリーは、例えば、ｓｃＦｖライブラリー又はＦａｂライブラリーであり得る。更なる実施態様においては、抗体ライブラリーは、ＲＮＡ−タンパク質融体として発現し得る。
【０１３５】
本発明の抗体の生産の更なるアプローチには、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのアプローチの組み合わせが含まれる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて動物を抗原で免疫し、次いで、動物のリンパ球細胞から生産された組換え型抗体ライブラリー、又は単一ドメイン抗体ライブラリー（例えば、重鎖及び／又は軽鎖を有する）のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのためにこの抗原を用いることにより、抗原が抗体レパートリーにおいて作用することを可能にすることができる。
【０１３６】
更なるアプローチによれば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて動物を抗原で免疫し、次いで、動物のリンパ球細胞から生産された組換え型抗体ライブラリー、又は単一ドメインライブラリーを、親和性成熟にさらすことにより、抗原が抗体レパートリーにおいて作用することを可能にすることができる。更なるアプローチによれば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて動物を抗原で免疫し、次いで、単一の抗体を生産する、興味深い抗体を分泌する細胞を選択し、これらの選択された細胞から重鎖及び軽鎖の可変領域についてのｃＤＮＡを得（例えば、ＰＣＲにより）、ほ乳類宿主細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで重鎖及び軽鎖の可変領域を発現させ（リンパ球−抗体選択法、又は選択されたリンパ球抗体のためのＳＬＡＭ法と呼ばれる）、選択された抗体遺伝子配列を選択し、更に操作することを可能にすることにより、抗原が抗体レパートリーにおいて作用することを可能にすることができる。更に、モノクローナル抗体は、ほ乳類細胞内で重鎖及び軽鎖についての抗体遺伝子を発現させ、所望の結合親和性を有する抗体を分泌するほ乳類細胞を選択することによって、発現クローニングすることにより選択されることができる。
【０１３７】
本発明は、定義された抗体を、ＲＧＭ結合ドメイン又はポリペプチドの形態で、スクリーニング及びカウンタースクリーニングに利用可能にする。従って、本発明によれば、前述の本発明に従って所望である特性のプロフィールを示すポリクローナル及びモノクローナル抗体を選択することが可能になる。
【０１３８】
抗体を生成するための本発明の方法は、種々のタイプの抗体を生成するために用いることができる。これらには、実質的にヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びＣＤＲグラフト抗体、及びそれらの抗原結合部位が含まれる。
【０１３９】
本発明の抗体を生成するための方法を以下に記載する。この点について、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアプローチ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアプローチ、又は両者の組み合わせを区別する。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアプローチ：
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生成された抗体を生産する細胞から開始し、最初はＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより開示されたハイブリドーマ技術等の標準化された技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（また、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５を参照されたい）によってモノクローナル抗体を生成することが可能である。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生産するための技術は十分に周知である（一般的に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−３６を参照されたい）。この目的のために、不死化細胞系（通常は骨髄腫）を、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物で免疫したほ乳類のリンパ球（通常、脾細胞又はリンパ節細胞又は末梢血リンパ球）と融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングし、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対して特異性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。この目的のために、リンパ球及び不死化細胞系を融合するための、多くの十分に周知のプロトコールのいずれかを用いることが可能である（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；前記で引用したＧｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，；前記で引用したＬｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，；前記で引用したＫｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，参照されたい）。当業者は、更に、同様に用いることのできる、このような方法の多くの異なる変形を知っている。通常、不死化細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じほ乳類種に由来する。例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウス由来のリンパ球を、不死化マウス細胞系と融合することにより、マウスのハイブリドーマを確立することが可能である。好ましい不死化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）に対して敏感であるマウス骨髄腫細胞系である。多くの骨髄腫細胞系のいずれか１種は、標準的な方法で、融合パートナー、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１，Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞系として用いられ得る。これらの骨髄腫細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから得ることができる。通常、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポチエチレングリコ��ル（ＰＥＧ）を用いてマウス脾細胞と融合される。次いで、融合により得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択することにより、非融合又は非生産融合骨髄腫細胞が死滅する（融合していない脾臓細胞は、形質転換されていないので、数日後に死滅する）。本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を、例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いることにより、このような抗体のハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより同定し、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物と特異的に結合することのできる抗体を選択する。
【０１４１】
所望の抗体の性質に依存し、種々の宿主動物をｉｎ  ｖｉｖｏ免疫のために用いることができる。自身で興味深い抗原の内因性の形態を発現する宿主を用いることができる。また、興味深い抗原の内因性の形態を欠く宿主を用いることができる。例えば、対応する内因性遺伝子（すなわち、ノックアウトマウス）における相同的組換えにより特定の内因性タンパク質を欠くマウスが、免疫されたタンパク質に対する液性応答を起こし、その結果、タンパク質に対する高親和性のモノクローナル抗体を生産するために用いられることが表される（例えば、Ｒｏｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：２３１−２３７；Ｌｕｎｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：４０４−４１２を参照されたい）。
【０１４２】
本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する非ヒト抗体を生産するための抗体生産のための宿主として、多くの非ヒトほ乳類が適している。これらには、マウス、ラット、ニワトリ、ラクダ、ウサギ及びヤギ（及びそれらのノックアウト形態）が含まれるが、ハイブリドーマの生産のためにはマウスが好ましい。更に、二重特異性を有するヒト抗原に対する、実質的にヒト抗体を生産するためのヒト抗体レパートリーを発現する非ヒト宿主動物を用いることが可能である。このような非ヒト動物には、以下に詳細に説明する、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子を有する遺伝子導入動物（例えば、マウス）（ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤキメラマウス）、及びヒト／マウス放射線キメラが含まれる。
【０１４３】
一実施態様によれば、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物で免疫される動物は、抗原刺激後に非ヒトほ乳類がヒト抗体を生成するように、非ヒトほ乳類、好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子のために遺伝子導入されているマウスである。ヒト生殖系列構成を有する重鎖及び軽鎖についての免疫グロブリン導入遺伝子は、このような、重鎖及び軽鎖についての内在性遺伝子座が不活性化するように修飾されている動物に導入される。抗原による（例えば、ヒト抗原で）このような動物の刺激は、ヒト免疫グロブリン配列（すなわち、ヒト抗体）由来の抗体の生産をもたらす。ヒトモノクローナル抗体は、標準化されたハイブリドーマ技術を用いて、このような動物のリンパ球から生成することができる。ヒト免疫グロブリンを有する遺伝子導入マウス、及びヒト抗体の生産におけるその使用についての更なる記述は、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号，ＷＯ９６／３３７３５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９８／２４８９３及びＷＯ９９／５３０４９（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．），及び米国特許第５，５４５，８０６号，第５，５６９，８２５号，第５，６２５，１２６号，第５，６３３，４２５号，第５，６６１，０１６号，第５，７７０，４２９号，第５，８１４，３１８号，第５，８７７，３９７号及びＷＯ９９／４５９６２（Ｇｅｎｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）を参照されたい。同様に、ＭａｃＱｕｉｔｔｙ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１８８；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．ｕｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．（１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：４０１−４１０；Ｇａｌｌｏ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５３４−５４０を参照されたい。
【０１４４】
更なる実施態様においては、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物で免疫される動物は、ヒト末梢血単核球又はリンパ球細胞又はそれらの前駆体で再構成された重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）を患っているマウスであり得る。ｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤキメラマウスと呼ばれる、このようなマウスは、抗原刺激後にヒト免疫グロブリン応答を引き起こすことが証明された。これらのマウス及び抗体を生成するためのそれらの使用の更なる記述については、例えば、Ｌｅａｄｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７６：２２９−２３４；Ｂｏｍｂｉｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９５：３６０−３７５；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３３−２４１；Ｈｅｒｚ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：１５０−１５２；Ａｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３９３−１４０３；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７；Ａｒａｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１７：７９−８５；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ａｒａｉ，Ｋ．（１９９８）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：４１−４５；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １８：１２１−１２９；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：２２−２７；Ｓｍｉｔｈｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１１３−１２４；Ｃｈａｍａｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８０：２６８−２７７；及びＨｅａｒｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．５：３５−４５を参照されたい。
【０１４５】
更なる実施態様においては、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物で免疫される動物は、致死的全身照射で処理し、次いで重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）を患っているマウス由来の骨髄細胞を用いて放射線から保護し、次いで、機能的ヒトリンパ球を移植したマウスである。トリメラ系と呼ばれるこのタイプのキメラは、興味深い抗原でマウスを免疫し、次いで、標準化されたハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を生成することにより、ヒトモノクローナル抗体を生成するために用いられる。これらのマウス及び抗体を生成するためのそれらの使用についての更なる記述については、例えば、Ｅｒｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：１５４−１６１；Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ  ａｎｄ  Ｄａｇａｎ，Ｓ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２−２４６；Ｉｌａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：５５３−５６２；及びＢｏｃｈｅｒ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９６：６３４−６４１を参照されたい。
【０１４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアプローチ：
免疫及び選択による本発明の抗体の生産についての代案として、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物を用いた、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングし、それによって、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対して特異的に結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを分離することにより、本発明の抗体を同定し分離することが可能である。ディスプレイライブラリーを生成しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。多くの実施態様においては、ディスプレイライブラリーはＳｃＦｖライブラリー又はＦａｂライブラリーである。組換え型抗体ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ技術は十分に開示されている。抗体ディスプレイライブラリーの生成及びスクリーニングにおいて特に有利に用いることのできる方法及び化合物の具体例は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９２／０１０４７，米国特許第５，９６９，１０８号及びＥＰ５８９８７７（特にｓｄＦｖのディスプレイを開示している）、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号，第５，４０３，４８４号，第５，５７１，６９８号，第５，８３７，５００号及びＥＰ４３６５９７（例えば、ＰＩＩＩ融合について開示されている）；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９１／１７２７１，米国特許第５，４２７，９０８号，米国特許第５，５８０，７１７号及びＥＰ５２７８３９  （特に、Ｆａｂのディスプレイを開示している）；  Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際出願公開ＷＯ９２／２０７９１及びＥＰ３６８，６８４（特に、免疫グロブリン可変ドメインについての配列のクローニングを開示している）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，８８５，７９３号及びＥＰ５８９８７７（特に、組換えライブラリーを用いたヒト抗原に対するヒト抗体の分離について開示している）；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９２／０９６９０（特にファージ発現技術を開示している）；Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９７／０８３２０（ヒト組換型抗体ライブラリーＨｕＣａｌを開示している）；Ｓａｌｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９７／２９１３１（ヒト抗原（ヒト腫瘍壊死因子α）に対する組換え型ヒト抗体の生産、及び組換え型抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏについて開示している），特許出願がＳａｌｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．米国特許仮出願第６０／親和性成熟１２６，６０３号及びそれに基づく特許出願（同様に、ヒト抗原（ヒトインターロイキン−１２）に対する組換え型ヒト抗体の生産、及び組換え型抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟を開示するに見出すことができる。
【０１４７】
組換え型抗体ライブラリーのスクリーニング更なる記載は、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６．等の科学出版物に見出される。
【０１４８】
バクテリオファージディスプレイシステムの使用の代案として、酵母細胞又は細菌細胞の表面上での組換え型抗体ライブラリーを発現させることが可能である。酵母細胞の表面上で発現するライブラリーを生産しスクリーニングする方法は、ＷＯ９９／３６５６９に開示されている。細菌細胞の表面上で発現するライブラリーを生産しスクリーニングする方法は、ＷＯ９８／４９２８６に詳細に開示されている。
【０１４９】
コンビナトリアルライブラリーから、興味深い抗体が確認されるとすぐに、分子生物学の標準化された技術、例えば、ライブラリーのスクリーニングの間に分離されるディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）からのＤＮＡのＰＣＲ増幅によって抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡが分離される。ＰＣＲプライマーを生成するために用いることができる軽鎖及び重鎖抗体についての遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者に公知である。これらの多くの配列は、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  第  ９１−３２４２号、及びヒト生殖系列ＶＢＡＳＥの配列についてのデータベースに開示されている。
【０１５０】
本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞内において、軽鎖及び重鎖免疫グロブリンについての遺伝子の組み換え発現によって生産することができる。宿主細胞内で、軽鎖及び重鎖が発現し、好ましくは宿主細胞が培養される培地中に分泌されるように、抗体の組換え発現について、宿主細胞は、抗体の軽鎖及び重鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡ断片を有する、１以上の組換え発現ベクターでトランスフェクトされる。抗体は、この培地から得ることができる。重鎖及び軽鎖抗体のための遺伝子を得、これらの遺伝子を、組換え発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入するために、標準化された組換えＤＮＡ法が用いられる。このタイプの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号に開示されている。
【０１５１】
興味深い抗体のＶＨ及びＶＬ断片をコードするＤＮＡ断片が得られるとすぐに、例えば、可変領域についての遺伝子を、全長抗体鎖についての遺伝子内、Ｆａｂ断片についての遺伝子内、又はｓｃＦｖ遺伝子内に変換するために、標準化された組換えＤＮＡ技術を用いて、これらのＤＮＡ断片を更に操作することができる。これらの操作は、ＶＬ−又はＶＨ−をコードするＤＮＡ断片の、更なるタンパク質、例えば、抗体の定常領域又は柔軟なリンカーをコードする更なるＤＮＡ断片への動作可能な結合をもたらす。本明細書において、「動作可能な結合」なる用語は、２個のＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がリーディングフレーム内に残留する（インフレーム）ような方法で、２個のＤＮＡ断片が一緒に連結することを意味することを意図される。
【０１５２】
ＶＨ領域をコードする、分離したＤＮＡを、重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）の定常領域をコードする更なるＤＮＡ分子に対するＶＨ領域をコードするＤＮＡの有効な連結のために、全長重鎖のための遺伝子に変換することができる。ヒトの重鎖の定常領域のための遺伝子配列は十分に周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域にわたるＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖の定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ由来の定常領域であってもよく、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来の定常領域が好ましい。重鎖のＦａｂ断片のための遺伝子は、重鎖の定常領域ＣＨ１のみをコードする更なるＤＮＡ分子を有するＶＨをコードするＤＮＡの有効な連結によって得ることができる。
【０１５３】
ＶＬ領域をコードする、分離したＤＮＡを、軽鎖の定常領域ＣＬをコードする更なるＤＮＡ分子を有するＶＬをコードするＤＮＡの有効な連結によって、全長の軽鎖（及びＦａｂ軽鎖のための遺伝子）のための遺伝子に変換することができる。ヒトの軽鎖の定常領域のための遺伝子配列は十分に周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域にわたるＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖の定常領域は、定常カッパ又はラムダ領域であってもよく、定常カッパ領域が好ましい。
【０１５４】
ＶＨ及びＶＬ配列が、連続的な単一鎖タンパク質として発現し、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーによって連結するように（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４を参照されたい）、ｓｃＦＶ遺伝子は、柔軟なリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする更なる断片に対するＶＨ−及びＶＬ−をコードするＤＮＡ断片の有効な連結によって生成することができる。
【０１５５】
本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する特異性を有する、ＶＨ及びＶＬの単一ドメインは、前述した方法を用いて単一ドメインライブラリーから分離することができる。所望の特異性を有する、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の、２個のＶＨ単一ドメイン鎖（ＣＨ１を有するか又は有しない）又は２個のＶＬ鎖又は組み合わせは、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物を結合するために用いることができる。
【０１５６】
本発明の組換え型抗体又は抗体部分は、部分的又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、発現ベクターに挿入し、転写及び翻訳制御配列に対する遺伝子の有効な連結をもたらすことにより、発現させることができる。これに関連し、「有効に連結」なる用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳の制御の意図される機能を満足するような方法で、抗体遺伝子がベクター内に連結することを意味することを意図する。
【０１５７】
発現ベクター及び発現制御配列は、それらが発現のために用いられる宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖のための遺伝子、及び抗体の重鎖のための遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、又は両方の遺伝子が、通常のケースである、同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準化された方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクターにおける相補的な制限切断部位の連結、又は制限切断部位が存在しない場合、ブラント末端の連結）により発現ベクターに挿入される。発現ベクターは、軽鎖及び重鎖のための配列の挿入前に、抗体の定常領域のための配列を既に有していてもよい。ベクター内のＣＨ断片とのＶＨ断片の有効な連結、及びベクター内のＣＬ断片とのＶＬ断片の有効な連結が存在するように、実施例のための１つのアプローチは、ＶＨ及びＶＬ配列を、それぞれ重鎖及び軽鎖の定常領域を既にコードする発現ベクターに挿入することによって、ＶＨ及びＶＬ配列を全長の抗体遺伝子に変換することである。追加又は他の可能性は、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードする組換え発現ベクターに関してである。抗体鎖のための遺伝子は、シグナルペプチドを抗体鎖のための遺伝子のＮ末端を有するリーディングフレーム内で結合させるような方法で、ベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。抗体鎖のための遺伝子に加え、本発明の発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖のための遺伝子の発現を制御する調節塩基配列を有していてもよい。「調節塩基配列」なる用語は、抗体鎖のための遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び更なる発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節塩基配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に開示されている。当業者は、調節塩基配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、タンパク質発現の所望の強度等の因子に依存するかもしれないことに気づく。ほ乳類宿主細胞における発現のための好ましい調節塩基配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサー等）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー等）、アデノウイルス（例えば、後期アデノウイルスの主要なプロモーター（アデノウイルスの主要な後期プロモーターについてＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー等の、ほ乳類細胞内で強力なタンパク質発現をもたらすウイルス成分が含まれる。ウイルス制御成分及びその配列についての更なる開示については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，５１０，２４５号、及び  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒらの米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１５８】
抗体鎖及び調節塩基配列のための遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子等の追加の配列を有していてもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、全てＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号，第４，６３４，６６５号及び第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、選択可能マーカー遺伝子が、ベクターが挿入された宿主細胞を、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセート等の活性物質に対して耐性にするのは通常である。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＲＦ）のための遺伝子（メトトレキセートを選択／増幅するｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）及びネオ遺伝子（Ｇ４１８の選択のため）が含まれる。
【０１５９】
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを、標準化された技術を用いて宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる用語の種々の形態は、外来性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために通常に用いられる、多くの技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等を含むことを意図する。原核又は真核宿主細胞のいずれでも、本発明の抗体を発現することは理論的には可能であるが、正確にフォールディングされ、構築され、分泌される免疫学的に活性な抗体は、このような真核細胞、特にほ乳類細胞において、原核細胞よりも高いという可能性のために、真核細胞、特にほ乳類宿主細胞における抗体の発現が好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は、活性抗体の大量生産のためには効率的でないことが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０１６０】
本発明の組換え型抗体の発現のために好ましいほ乳類宿主細胞には、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に開示されており、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に開示されているように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとして用いられる、ｄｈｆｒ−ＣＨＯを含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをほ乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞内で抗体が発現されるまで、又は、好ましくは、宿主細胞が増殖する培地内に抗体が分泌されるまで宿主細胞を培養することにより、抗体が生産される。抗体は、タンパク質を精製するための標準化された方法を用いることにより、培地から得ることができる。
【０１６１】
同様に、無傷抗体の一部、例えば、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子を生産するために宿主細胞を用いることも可能である。前記工程の変形は本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖（両方ではない）をコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましい。興味深い抗原の結合のために不必要である軽鎖又は重鎖が存在する場合、このような１つの軽鎖又はこのような１つの重鎖又はその両方をコードするＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術を用いて部分的又は完全に除去される。このように切断ＤＮＡ分子により発現する分子は、同様に本発明の抗体に属する。また、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体である、二官能性抗体を生成することが可能であり、他の重鎖及び軽鎖は、本発明の抗体を、標準化された化学的方法により二次抗体と架橋することにより、興味深い抗原以外の抗原に対する特異性を有している。
【０１６２】
本発明の抗体又はその抗原結合部位の組換え発現のための好ましいシステムにおいては、重鎖抗体及び軽鎖抗体の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウムが媒介するトランスフェクションにより、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。遺伝子の強力な転写を誘発するために、調節性ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターのいずれの場合にも、重鎖及び軽鎖抗体のための遺伝子の組換え発現ベクター内に動作可能な結合が存在する。また、組換え発現ベクターは、メトトレキセート選択／増幅を用いることにより、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選択するために用いることのできるＤＨＦＲ遺伝子を含む。重鎖及び軽鎖抗体が発現し、無傷抗体を培地から得ることができるように、選択された形質転換宿主細胞を培養する。組換え発現ベクターを生成し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を溶媒し、培地から抗体を得るために、分子生物学の標準化された技術が用いられる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を、本発明の抗体が合成されるまで好適な培地中で培養することによる、本発明の組換え型抗体の合成方法に関する。該方法は、更に、培地から組換え型抗体を分離することを含む。
【０１６３】
ファージディスプレイによる組換え型抗体ライブラリーのスクリーニングの代替え案として、本発明の抗体を同定するために、ラージコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングのために当業者に公知の更なる方法を用いることが可能である。他の発現系の１つのタイプにおいては、組換え型抗体ライブラリーは、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓのＷＯ９８／３１７００、及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に開示されたように、ＲＮＡ−タンパク質融体の形態で発現する。このシステムにおいては、共有結合融合体は、ｍＲＮＡ及びそれがコードするペプチド又はタンパク質の間の３’末端にピューロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質を輸送する合成ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成する。従って、コードするペプチド又はタンパク質（例えば、抗体又はその一部）の特性、例えば、抗体又はその一部の、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する結合に基づき、ｍＲＮＡの複合混合物由来の特異的ｍＲＮＡ（例えば、コンビナトリアルライブラリー）を濃縮することが可能である。抗体又はその一部をコードし、このようなライブラリーのスクリーニングから得られる核酸配列は、前述した方法（例えば、ほ乳類宿主細胞内で）による組換え手段により発現することができ、更なるラウンドにおいてｍＲＮＡ−ペプチド融合体をスクリーニングするか（この場合、当初の選択された配列に変異体が導入される）、又は前述した方法における組換え型抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟のための他の方法を用いることにより、更に、追加の親和性成熟にさらされる。
【０１６４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアプローチの組み合わせ：
本発明の抗体は、同様にｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアプローチの組み合わせ、例えば最初に本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物が、ＲＧＭタンパク質−又はその誘導体／等価物−結合抗体の生産を促進するために宿主動物内におけるｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体レパートリーにおいて作用することを可能にし、次いで、更なる抗体の選択及び／又は抗体成熟（すなわち、最適化）が、１以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術を用いて達成される方法を適用することにより生成することができる。一実施態様によれば、このような組み合わせ法は、最初に、抗原に対する抗体応答を刺激するために非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらの遺伝子導入形態又はキメラマウス）を、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物で免役し、次いで、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物の作用によりｉｎ  ｖｉｖｏで刺激されるリンパ球由来の免疫グログリン配列を用いてファージディスプレイ抗体ライブラリーを生成及びスクリーニングすることを含んでもよい。この組み合わせ法の最初の工程は、ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチに関連して前述した方法で実施することができるが、この手法の第二の工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチに関連して前述した方法で実施することができる。刺激されたリンパ球から生成されるファージディスプレイライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに続く、非ヒト動物の過剰免疫のための好ましい方法には、ＢｉｏＳｉｔｅ  Ｉｎｃ．，により開示された方法が含まれ、例えば、ＷＯ９８／４７３４３，ＷＯ９１／１７２７１，米国特許第５，４２７，９０８号及び米国特許第５，５８０，７１７号を参照されたい。
【０１６５】
更なる実施態様によれば、組み合わせ法は、最初に、ＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物を刺激するために非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらのノックアウト及び／又は遺伝子導入形態又はキメラマウス）を、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物で免役し、ハイブリドーマ（例えば、免疫された動物から生産される）をスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を産生するリンパ球を選択することを含む。抗体又は単一ドメイン抗体のための遺伝子は、選択されたクローンから分離され（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応等の、標準化されたクローニング法による）、それによって選択された抗体の結合特性を向上させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟を受ける。この組み合わせ法の最初の工程は、ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチに関連して前述した方法で実施することができるが、この手法の第二の工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチに関連して前述した方法、特に、ＷＯ９７／２９１３１及びＷＯ００／５６７７２に開示されたようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟法を用いることにより実施することができる。
【０１６６】
更なる組み合わせ法においては、組換え型抗体は、リンパ球抗体選択法（ＳＬＡＭ）として当業者に公知であり、米国特許第５，６２７，０５２号，ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に開示されている方法を用いることによって単一の分離されたリンパ球から生成される。この方法においては、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物に対する免疫応答を刺激するために、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらの遺伝子導入形態又はキメラマウス）を、最初に本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物でｉｎ  ｖｉｖｏで免疫し、興味深い抗体を分泌している単一細胞を、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて選択する。この目的のために、本発明のＲＧＭタンパク質又はその誘導体／等価物、又は構造的に関連のある興味深い分子を、ビオチン等のリンカーを用いてヒツジ赤血球と結合することができ、それによって、好適な特異性の抗体を分泌している個々の細胞を、溶血プラークアッセイを用いることによって同定することができる。興味深い抗体を分泌している細胞の同定に続き、軽鎖及び重鎖の可変領域のためのｃＤＮＡを逆転写酵素−ＰＣＲによって細胞から得、次いで、これらの可変領域を、好適な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）に関連して、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等のほ乳類宿主細胞内で発現することができる。次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏで選択されたリンパ球に由来の、増幅した免疫グロブリン配列でトランスフェクトされた宿主細胞を、更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査にかけ、所望の特異性を有する抗体を発現している細胞を分離するために、例えば、トランスフェクトされた細胞を広げることにより選択する。増幅した免疫グロブリン配列は、更にｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作することができる。
【０１６７】
６．医薬組成物
６．１  概略
本発明は、また、活性物質として、本発明のタンパク質（ＲＧＭタンパク質：抗−ＲＧＭタンパク質抗体等のＲＧＭタンパク質−結合リガンド）、又はＲＧＭタンパク質をコードする核酸配列、必要であれば、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の治療薬、例えば、本明細書に開示される障害の１種を治療するための１種以上の追加の治療薬を更に含む。
【０１６８】
薬学的に許容される担体には、それらが生理学的適合性である限りは、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤が含まれる。
【０１６９】
薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝整理食塩水、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、シロップ及びメチルセルロースが含まれる。製剤は、更に、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油等の滑沢剤；湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤；メチル及びプロピルヒドロキシ安息香酸等の保存剤；酸化防止剤；抗刺激剤；キレート剤；コーティング助剤；乳化安定剤；フィルム形成剤；ゲル形成剤、臭気マスキング剤；マスキングフレーバー；樹脂：親水コロイド；溶媒；可溶化剤；中和剤；浸透促進剤；顔料；四級アンモニウム化合物；リファット剤、及び過脂肪剤；軟膏、クリーム又は油基剤；シリコーン誘導体；展着助剤；安定化剤；滅菌剤；坐剤用基剤；バインダー、充填材、滑沢剤、崩壊剤又はコーティング等の錠剤用賦形剤；噴霧剤、乾燥剤；乳白剤；増粘剤、ワックス、可塑剤；ホワイトオイル等の、薬学的に許容される担体又は従来の賦形剤を含んでもよい。配列に関して、これは、例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，  Ｋｏｓｍｅｔｉｋ  ｕｎｄ  ａｎｇｒｅｎｚｅｎｄｅ  Ｇｅｂｉｅｔｅ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ：ＥＣＶ−Ｅｄｉｔｉｏ−Ｃａｎｔｏｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９６に示されているような熟練家の知識に基づく。また、Ｈａｇｅｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｏｓｃｈｅｎ  Ｐｒａｘｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい。
【０１７０】
医薬組成物は、例えば、非経口投与のために適している。この目的のために、活性物質、例えば抗体は、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ／ｍＬの活性物質含有量を含む注射剤として生成される。注射剤は、投与形態として、フリントグラス又はガラス瓶、アンプル又は充填注射器内の液体又は凍結乾燥形態で生成することができる。
【０１７１】
緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ）を含み、５．０〜７．０、好ましくは６．０のｐＨを有する。更に好適な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はコハク酸カリウムバッファーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
溶液の浸透圧を、０〜３００ｍＭ濃度（液体投与形態のために好ましくは１５０ｍＭ）調整するために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥投与形態のために、ショ糖（例えば、０〜１０％、好ましくは０．５〜１．０％（ｗ／ｗ））等の抗凍結剤を含むことができる。更に好適な抗凍結剤には、トレハロース及び乳糖が含まれる。凍結乾燥投与形態のために、マンニトール（例えば、１〜１０％、好ましくは２〜４％（ｗ／ｗ）等の充填剤を含むことができる。液体又は凍結乾燥投与形態の両方において、Ｌ−メチオニン（例えば、１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ）等の安定剤を用いることができる。更に好適な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれる。同様に、ポリソルベート８０（例えば、０〜０．０５％、好ましくは０．００５〜０．０１％（ｗ／ｗ）等の界面活性剤を用いることが可能である。更に界面活性剤には、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。
【０１７３】
本発明の組成物は、多くの種類の形態が想定される。これらには、溶液（例えば、注射用及び輸液用溶液、ローション、点眼薬及び点耳薬）、リポソーム、分散剤、又は懸濁液等の液体、半固体及び固体形態、経口用粉末、散布粉、顆粒剤、錠剤、芳香錠剤、サチェット、カプセル、コーティング錠剤、硬及び軟ゼラチンカプセル等のカプセル、坐剤又は膣用製剤、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、ペースト又はパッチ等の半固体製剤形態等の固体形態が含まれる。埋め込み送達装置も、本発明の活性物質を投与するために用いることができる。好ましい形態は、投与の意図する形態及び治療用途に依存する。通常、注射用又は輸液用溶液の形態における組成物が好ましい。好適な投与経路は、例えば、非経口投与（例えば、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。好ましい実施態様においては、活性物質は、静脈内注射又は注射によって投与される。更に好ましい実施態様によれば、活性成分は、筋肉内又は皮下注射により投与される。
【０１７４】
治療用組成物は、通常、無菌であり、生成及び保存条件下で安定でなければならない。組成物は、高活性成分濃度のために安定である、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム又は更に規則正しい構造として製剤化され得る。無菌注射剤は、必要であれば、前記配合剤の１種又は組み合わせと共に、必要量の活性化合物（例えば、抗体）を好適な溶媒に導入することによって、必要であれば、次いでろ過により滅菌することによって生成することができる。分散剤は、通常、活性化合物を、基本的な分散媒体を含み、必要により更に必要な成分を含む無菌の媒体に導入することによって生成される。無菌注射剤を生成するための無菌の凍結乾燥粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分、及び必要であれば、ろ過により予め滅菌された溶液由来の所望の追加成分の粉末をもたらす真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の正しい流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを、分散剤の場合には必要な粒子サイズ又は用いられる界面活性剤を用いることによって維持することができる。注射用組成物の長期吸収は、モノステアリン酸塩及びゼラチン等の、吸収を遅延する薬剤を組成物に導入することによって達成することができる。
【０１７５】
本発明の活性物質は、当業者に公知である多種類の方法を用いて投与することができるが、皮下注射、静脈注射又は輸液が、多くの治療用途のための好ましい投与様式である。当業者は、投与の経路及び／又は様式が所望の結果に依存することに気づく。特定の実施態様によれば、埋め込み、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出を用いた製剤を含む、急速な放出から化合物を保護する担体と共に活性化合物を調製することができる。エチレン−酢酸ビニル、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることが可能である。このような製剤の調製方法は一般に当業者に公知であり、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｕｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１７６】
特定の実施態様によれば、本発明の活性物質は、例えば、不活性希釈剤、又は吸収可能な食用担体中で、経口的に投与することができる。活性成分（及び所望であれば他の成分）は、硬又は軟ゼラチンカプセル中に包含させるか、錠剤に圧縮されるか、又は食物に直接加えてもよい。経口的治療投与のために、活性物質を賦形剤と混合し、嚥下可能な錠剤、口腔錠剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ等の形態で用いることができる。本発明の活性成分が、非経口以外の経路により投与される場合、その不活性化を防止する材料のコーティングを選択することが必要であるかもしれない。
【０１７７】
本発明の活性物質は、前述した障害の治療に用いることのできる１種以上の追加の治療薬と一緒に投与することができる。
【０１７８】
本発明の医薬組成物は、通常、少なくとも１種の本発明の活性物質の治療に有効な量、又は予防に有効な量を含む。投与量は、所望の処置、例えば、治療的又は予防的処置が要求されるかどうかに依存して選択及び適合することができる。例えば、治療状況の要求性に依存した、１回の投与、時間をかけて複数に分割された投与、又は上昇又は減少する投与量を管理することができる。投与を促進し投与の均一性を確実にするために、単一投与形態における非経口的組成物を製剤化することが特に有利である。
【０１７９】
治療する医師は投与形態、特定の治療及び特定の活性物質のために最も好適な投与形態、投与の様式及び投与量を容易に決定することができる。
【０１８０】
本発明の活性物質の治療又は予防に有効な量は、例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、これに限定されない。当然、軽減すべき病状の性質及び重症度に依存してこれらの量を変えることは可能である。
【０１８１】
６．２  ワクチン
本発明のＲＧＭタンパク質及びその誘導体／等価物は、治療される患者のワクチン接種のための免疫原として用いることができる。
【０１８２】
この目的のために用いることのできるワクチンは、一般に少なくとも１種の本発明のＲＧＭタンパク質及び／又は少なくとも１種のそれらの誘導体／等価物を含む医薬組成物を意味する。組成物は、生理学的に許容される担体、及び必要であれば、更に賦形剤、例えば免疫賦活剤を更に含んでもよい。
【０１８３】
原則として、好適な担体は所望のように選択することができるが、担体の性質は、一般に投与経路によって決定される。従って、本発明のワクチンは、特に、非経口、例えば、静脈内投与、筋肉内投与及び皮下投与に好適な形態で製剤化することができる。これらの場合、担体は、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス及び／又は緩衝液を含む。
【０１８４】
本発明のワクチンにおいては、多種の免疫促進剤のいずれか１種を用いることが可能である。例えば、アジュバントが含まれる。ほとんどのアジュバントは、急速な分解から抗原を保護することを意図する物質、例えば、水酸化アルミニウム又は鉱油、及び脂質Ａ、百日咳菌又はヒト結核菌由来のタンパク質を含む。好適なアジュバントは、通常市販されており、例えば、完全又は不完全フロイントのアジュバント；ＡＳ−２；水酸化アルミニウム（必要であればゲルとして）又はリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液、アシル化糖；カチオン化又はアニオン化した誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリル−脂質Ａである。ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２、−７又は−１２等のサイトカインは、同様にアジュバントとして用いることができる。
【０１８５】
７．治療法
７．１．  神経性障害の治療
中枢神経系に対する損傷の場合に、損傷部位にＲＧＭタンパク質の蓄積が観察されることが先行技術（Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．（前出）を参照）において開示されている。同時に、損傷した神経線維の新たな増殖が防止される。神経線維の増殖における、この有害な効果は、受容体分子ネオゲニンに対するＲＧＭの結合によって媒介される。従って、ＲＧＭと受容体分子ネオゲニンとの間の相互作用の調節、特に阻害は、神経線維の増殖におけるＲＧＭの阻害活性を抑制するのに適している。
【０１８６】
７．２．  腫瘍性疾患の治療
長い間、ネオゲニンが、腫瘍性疾患の発現及び／又は進行に原因として関係していることが示されてきた。従って、例えば、Ｍｅｙｅｒｈａｒｄｔらは、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９７）１４，１１２９−１１３６において、研究された、膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫細胞系を含む５０種以上の癌細胞系、及び結腸直腸、胸部、膵臓及び子宮癌由来の細胞系においてネオゲニンが検出されたことを報告している。ネオゲニンの過剰発現は、更に食道癌細胞系においても観察される（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）７，２２１３−２２２１）。２１１人の肺腺癌患者における３５８８個の遺伝子の発現プロフィールの組織的な研究は、最近、腫瘍性疾患の発現及び進行におけるネオゲニンの関与を更に指摘した（Ｂｅｒｒａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．（２００５）１２（５），５３４−５４４）。
【０１８７】
更に、腫瘍細胞に関連するネオゲニン受容体への結合を通じて細胞死を防止することができるという潜在的な発癌促進効果を示すことが知られているので（Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６，７４９−７５５，２００４）、腫瘍性疾患の治療のための新規治療的アプローチは、ＲＧＭ−ネオゲニン相互作用を調節することにより、特に、特異的抗−ＲＧＭ抗体を用いてこの相互作用を妨害することによって開発することができる。
【０１８８】
７．３．  鉄代謝障害の治療
ヘモジュベリンとも呼ばれるＲＧＭ  Ｃは、ヒト及び動物の体内における鉄代謝のために非常に重要な意味を有する。若年性ヘモクロマトーシスは、体内の鉄の過負荷によって明らかになる遺伝的に比較的まれな鉄代謝性障害である。この疾患は、ヘモジュベリン分子における突然変異によって起こる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２００５），１１５，２０８７−２０９１）。従って、本発明の機能ＲＧＭタンパク質又はその活性ドメインの投与は、このような鉄代謝障害を緩和する有用な治療的アプローチを示す。
【０１８９】
７．４．  骨組織形成の促進
先行技術において、ＤＲＡＧＯＮの命名としても知られているタンパク質のＲＧＭファミリーの１つのメンバー、特にはＲＧＭ  Ｂが、骨の形態形成に関与していることが示されている。従って、例えば、Ｓａｍａｄらは、２０００５年１月２５日に発行される、印刷中のＪＢＣにおいて、ＤＲＡＧＯＮと、タイプＩ及びタイプＩＩの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体の相互作用を開示している。従って、本発明のＲＧＭポリペプチドを投与することにより、骨成長促進効果、及びそのための骨成長の損傷又は骨損傷を有する障害の治療のための新規な治療的アプローチがあり得る。
【０１９０】
８．診断方法
本発明によって言及されるべき診断薬は、特に、前記で定義されたような、ＲＧＭタンパク質及び誘導体／等価物、及びそれらに対する抗体である。
【０１９１】
従って、本発明は、疾患に典型的な抗原又は抗体を検出することにより、前記で定義した病的状態を、質的又は量的改善をもって決定することを可能にする。
【０１９２】
前記決定は、好ましくは免疫学的方法を用いて実施される。原則として、抗体が用いられる、あらゆる分析的又は診断的試験方法を用いて可能となる。これらには、凝集及び沈降技術、免疫学的アッセイ、免疫組織化学法、及びウェスタンブロッティング又はドットブロット法等のイムノブロッティング技術が含まれる。また、例えば画像検査法等のｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法も含まれる。
【０１９３】
免疫アッセイにおける使用が有利である。適切には、競合的免疫アッセイ、すなわち、抗体結合のための抗原及び標識抗原（トレーサー）の競合、及びサンドウィッチ免疫アッセイ、すなわち、特異的抗体の抗原への結合を、二次抗体、通常は標識抗体を用いて検出するアッセイの両方である。これらのアッセイは、均一、すなわち、固相及び液相に分離しないアッセイ、又は不均一、すなわち、結合した標識を、結合していないもの、例えば、固相−結合抗体から分離するアッセイのいずれかである。種々の不均一及び均一な免疫アッセイ形式、例えば、ＲＩＡｓ（放射免疫アッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫アッセイ）、ＦＩＡ（蛍光免疫アッセイ）、ＬＩＡ（発光免疫アッセイ）、ＴＲＦＩＡ（時間分解ＦＩＡ）、ＩＭＡＣ（免疫活性化）、ＥＭＩＴ（酵素多型免疫試験）、ＴＩＡ（免疫比濁法）、Ｉ−ＰＣＲ（免疫−ＰＣＲ）が、標識及び測定方法に依存して、特定のクラスに対して割り当てられる。
【０１９４】
競合的免疫アッセイは、本発明の抗原の検出に好ましい。この場合、標識された抗原（トレーサー）は、用いられる抗体に対する結合について定量化される試料の抗原と競合する。試料中の抗原量、すなわち抗原の量は、検量線を用いて置換されたトレーサーの量から決定することができる。
【０１９５】
これらの目的のために利用できる標識のうち、酵素が有利であることが照明された。例えば、ペルオキシダーゼ、特にセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼをベースとするシステムを用いることが可能である。これらの酵素について特異的な基質が利用可能であり、それらの変換は、例えば測光法により実施することができる。好適な基質システムは、アルカリホスファターゼについてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＰＴ）、ファーストレッド／ナフトール−ＡＳ−ＴＳホスフェート；ペルオキシダーゼについて２，２−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）；β−Ｄ−ガラクトシダーゼについてｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド（ｏ−ＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド及び４−メチルウンベリフェルβ−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）に基づく。これらの基質システムは、多くの場合、使える状態で、例えば、都合のよい緩衝剤等の追加の試薬をも含む錠剤の形態で市販されている。
【０１９６】
トレーサーを調製するためのペプチド又は抗体への標識のカップリングは、それ自体公知の方法で実施することができる。更に、タンパク質に対する結合のための都合よく修飾された多くの標識、例えば、ビオチン−、アビジン−、エクストラビジン−、又はストレプトアビジン−結合酵素、マレイミド−活性化酵素等が利用可能である。これらの標識は本発明に従って使用される分子と直接反応させることができる。
【０１９７】
不均一免疫アッセイ形式を選択した場合、分離の目的のために、抗原−抗体複合体を、例えば、抗−イディオタイプ抗体、例えば、担体に結合した、ウサギＩｇＧに対する抗体を通じて担体に結合することができる。好適な抗体によりコーティングされる担体、特にマイクロタイタープレートは公知であり、市販されている。
【０１９８】
更に、本発明は、前述した少なくとも１個の抗体及び追加の成分を含む免疫アッセイセットに関する。これは、本発明の検出を実施するための手段のパックユニットとしてのコレクションを含む。使用を最大限にするため、これらの手段は、好ましくは、実質的に使える状態で供給される。有利な配置は、キットの形態における免疫アッセイによって供給される。キットは、通常、成分の配置を分離するための複数の容器を含む。全ての成分はすぐに使える希釈剤として、又は乾燥状態、又は凍結乾燥状態、又は希釈状態又は懸濁状態として供給することができ、単一成分又は全ての成分は凍結してもよく、又は使用するまで室温に保存してもよい。血清は、これらのケースにおいて、使用前に免疫アッセイを好ましくは凍結温度に保存できるように、例えば−２０℃で、ショックフリーズすることが好ましい。
【０１９９】
免疫アッセイに加えられる追加の成分は、標準タンパク質、トレーサー；コントロール血清、好ましくは抗体でコーティングされたマイクロタイタープレート、例えば、試験用、洗浄用、又は基質反応用バッファー、及び酵素基質自身である。
【０２００】
研究室及び臨床目的としての免疫アッセイ、抗体の生成及び使用の一般的原理は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）に見出される。
【０２０１】
９．スクリーニング法
また、本発明は、エフェクターが疑わしい試料をＲＧＭタンパク質又はポリペプチドとインキュベートし、エフェクター−ＲＧＭ複合体の形成について混合物を調べる、ＲＧＭ受容体ネオゲニンのエフェクターを検出するための方法に関する。
【０２０２】
このようなエフェクターは、アゴニスト作用、部分的作用、拮抗作用又は逆アゴニスト作用を有していてもよい。それらは、例えば、合成低分子量物質、合成ペプチド、天然又は合成抗体分子又は天然物質であってもよい。
【０２０３】
本発明のこのような方法は、通常、将来の使用に関して最も普及されると思われる多くの異なる物質から選択することが可能な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法として実施される。
【０２０４】
例えば、コンビナトリアルケミストリーを用いて、多数の潜在的な活性物質を含む広範囲の物質ライブラリーを提供することができる。所望の活性を有する物質についてのコンビナトリアル物質ライブラリーのスクリーニングは自動化することができる。好ましくはマイクロタイタープレート上に配置した個々のアッセイの効率的な評価のためにロボットスクリーニング装置が用いられる。従って、本発明は、スクリーニング法、すなわち、好ましくは、後述する少なくとも１種の方法が用いられる、一次及び二次スクリーニング法の両方にも関する。複数の方法が用いられる場合、物質の１種の及び同じ試料、又は異なる試料について、連続的又は同時に調べることが可能である。
【０２０５】
このような方法を実施するための効率的な技術は、活性物質のスクリーニングの分野において公知である、ＳＰＡと省略される、シンチレーション近接アッセイである。このアッセイを実施するためのキット及び成分は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入することができる。原則として、可溶化された、又は膜結合受容体が、シンチラントを含む小さい蛍光ミクロスフェアに固定化される。例えば、放射性リガンドが固定化受容体に結合する場合、シンチラント及び放射性リガンドは空間的に近接しているので、シンチラントが励起され発光する。
【０２０６】
このような方法を実施するための更なる効率的な技術は、活性物質のスクリーニングの分野において公知である、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅＲ技術である。このアッセイを実施するためのキット及び成分は、例えば、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入することができる。この原理は、同様にシンチラントでコーティングされたマイクロタイタープレート（９６又は３８４ウェル）をベースとする。
【０２０７】
同様に、本発明は、これらの方法により同定することのできる、物質又は物質の混合物の一部に関する。
【０２０８】
以下の非限定的な生成及び使用の実施例を参照し、本発明を更に詳細に説明する。
【０２０９】
実験の部
１．一般情報
アッセイ方法１：ラット皮質ニューロンを用いた神経増殖試験におけるＲＧＭタンパク質の効果の証明
神経増殖試験を実施することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＧＭタンパク質の効果を調べた。この目的のために、ラットの皮質ニューロンを以下の媒体を用いて調製した。
【０２１０】
ストック媒体（１Ｌあたり）；９０ｍＬのＧＢ５、１００ｍＬの最小必須培地−Ｅａｇｌｅ（１０×；Ｇｉｂｃｏ，オーダー番号２１４３０．０２０）、ｐＨ７．０、２８０〜３１０ｍｏｓｍのミリポア水で１０００ｍｌにする。
【０２１１】
ＧＢＳ（１Ｌあたり）：２２．６ｇのＮａＨＣＯ３、４４．４ｇのグルコース、ろ過により滅菌。
【０２１２】
植え付け培地（ＰＭ）（１Ｌあたり）：０．８ｍＭのグルタミン、１００ｍＬの加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｍＬの加熱不活性化ウマ血清、ストック媒体で１０００ｍＬにする。
【０２１３】
維持媒体（ＭＭ）（１Ｌあたり）：０．８ｍＭのグルタミン、１００ｍＬの加熱不活性化ウマ血清、ストック媒体で１０００ｍＬにする。
【０２１４】
トリプシン溶液：カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ中、０．１％トリプシン、０．０４％ＥＤＴＡ、ろ過により滅菌。
【０２１５】
皮質ニューロンは、妊娠しているラット（胚日齢１８日（Ｅ１８））を、頸椎脱臼により犠牲にし、腹腔を開き、胎児を含む子宮を除去し、ＰＢＳで洗浄することにより得た。顕微解剖鋏を用いて子宮を縦方向に切り開き、胎児を取り出した。喉を切ることにより胎児を犠牲にし、脳を除去し、前脳皮質を解剖した。皮質を、それぞれ１ｍＬの０．１％濃度のトリプシン溶液中で３７℃で５分間インキュベートし、維持媒体（ＭＭ）を用いて反応を停止し、合計１０ｍＬのＭＭ中で５分間インキュベートした後、先端熱加工してオリフィス直径が小さくなったパスツールピペットを用いて粉砕した。細胞懸濁液を、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引して捨てた。細胞ペレットを、８ｍＬのＭＭに回収し、慎重に再懸濁した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計算板中で細胞の数を数え、細胞数を、ＭＭ中、約４０００００細胞／０．２ｍＬに調整し、再凝集させた。この目的のために、ウェルあたり２００μＬの細胞懸濁液をグラスチャンバースライド（ＬａｂＴｅＫ，オーダー番号１７７４０２）に置き、３７℃で２４時間インキュベートした。この間にニューロンの凝集体が形成された。１０〜８０μＬのこれらの凝集体を、ポリ−Ｄ−リジンをコーティングした９６ウェルのプレート（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ  ＃３５４６４０）の各ウェルに入れ、適切な場合、ＭＭを用いて約７０〜９０μＬにした。１時間後、１０μＬ容量中の種々の濃度でＲＧＭペプチドを加え、適切な場合、ＭＭを用いて１００μＬにした。２４〜４８時間後、軸索の成長を、光学顕微鏡下の試験により最初に評価し、次いで、１００μＬの４％パラホルムアルデヒド溶液を加えることにより培養物を固定し、４℃に、少なくとも１２時間保存した。一次抗体とのインキュベーションを除き、免疫蛍光染色によるチューブリン細胞骨格の調製のための全ての工程は室温で実施した。ウェルを、１００〜３００μＬのＰＢＳで５〜１５分間、１回洗浄し、細胞を１００μＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１０〜２０分間インキュベートすることにより透過化処理した。ウェルを、３００μＬのＰＢＳで５〜１５分間、２回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン溶液１００μＬで６０分間インキュベートした。一次抗体（例えば、Ｓｉｇｍａ、モノクローナル抗−β−チューブリンイソタイプＩＩＩクローンＳＤＬ  ３Ｄ１０、＃Ｔ８６６０；Ａｂｃａｍ、ＴｕＪＩ  ＃ａｂ１４５４５）をＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン溶液で１：１０００に希釈し、ウェルあたり５０μＬで４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、１００〜３００μＬのＰＢＳで５〜１５分間、３回洗浄した。蛍光標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ，Ｃｙ３  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｅ  Ｄｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＃  ７１５−１６５−１５１）を、細胞核を可視化するために、０．５μｇ／ｍＬのビスベンズイミド（Ｈ３３２５８）を更に含むＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン溶液で１：５００に希釈し、この希釈液の５０μＬをウェルあたり室温で１〜２時間、又は４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、１００〜３００μＬのＰＢＳで５〜１５分間、２回洗浄し、ＰＢＳを吸引し、１滴（約５０μＬ）のＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ＃０１０００１）を各ウェルに加えた。倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ）中に画像を記録し、各ケースにおいて、標識された二次抗体蛍光及びビスベンズイミド蛍光を検出した。２種の蛍光によって覆われた領域を、画像解析プログラム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ）を用いて確認した。軸索増殖指数（ＡＧ−Ｉ）を確認するために、二次抗体染色（軸索増殖及び細胞凝集の染色）及びビスベンズイミド染色（細胞凝集の生殖）の領域の相違を形成し、ビスベンズイミドの領域によって分割した。従って、この指数は、細胞凝集サイズに対する軸索により覆われた領域の指標を表す。
【０２１６】
アッセイ方法２：ヒト皮質ニューロンを用いた神経増殖試験におけるＲＧＭペプチドの効果の証明
ヒト多能性癌細胞系Ｎｔｅｒａ（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ５２７）は、確立された細胞培養モデルである。このケースにおいては、軸索は細胞集合体から成長し、各凝集体の周囲に軸索のコロナを形成する。
【０２１７】
この目的のために、２．５×１０６個のＮｔｅｒａ細胞を１７５ｃｍ２の瓶に播種し、１０μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）（培地：Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ３１９６６−０２１）、１０％ウシ胎児血清、１００ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（両方ともＧｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で３週間分化させた。次いで、分化した細胞を新しい瓶に１：６に分割し、レチノイン酸なしで更に２日間培養した。得られた細胞に接着する神経細胞を、キャッピングにより剥離し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２１１０３−０４９）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２５０３０−０２４）、１００ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（両方ともＧｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中、振盪したフラスコ内で一晩振盪（培養器で）することにより凝集させた。
【０２１８】
次の日に、Ｎｔｅｒａ凝集体を、９６ウェルのプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ  ポリ−Ｄ−リジンＣｅｌｌｗａｒｅ  ９６ウェルＢｌａｃｋ／Ｃｌｅａｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＃  ３５  ６６４０））中のポリ−Ｄ−リジン及びラミニン（Ｓｉｇｍａ）（１０μｇ／ｍＬ）中に播種した。ＲＧＭペプチド及び断片の阻害効果を、種々の濃度の試験物質を加えることにより解析した。
【０２１９】
アッセイ方法３：ＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン結合アッセイ：
ａ）材料
・イムノプレート：Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｆ９６（ＮＵＮＣ，４３９４５４）
・組換え型ヒトＲＧＭ  Ａ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｐｒｏｄ．＃２４９５−ＲＭ（２６０μｇ／ｍＬ）
・組換え型ヒトネオゲニンＦｃ、Ａｂｂｏｔｔ；Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ（ＡＬＵ  １５１４／１２２；４２５μｇ／ｍＬ）
・ペルオキシダーゼ−結合、アフィニティ精製マウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｏｄｅ：２０９−０３５−０９８）（０．８ｍｇ／ｍＬ）
・現像剤基質：Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３４０２１）
・硫酸（Ｍｅｒｃｋ，＃４．８０３５４．１０００）
ｂ）方法：
１．ＲＧＭ  Ａのイムノプレートへの結合：
・５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３中の２．５μｇ／ｍＬのＲＧＭ  Ａ（Ｒ＆Ｄ）（５０μＬ／ウェル）
・３７℃で１時間インキュベート
２．洗浄工程：
・ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄（１００μＬ／ウェル）
３．非特異的結合部位のブロッキング：
・ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ中の３％ＢＳＡでブロッキング（２００μＬ／ウェル）
・３７℃で１時間インキュベート
４．ネオゲニンの結合：
・ＢＳＡ  ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ中の１％ＢＳＡ中の希釈液中にネオゲニンを追加（初期濃度  １μｇ／ｍＬ）
・３７℃で１時間インキュベート
５．洗浄工程：
・ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄（１００μＬ／ウェル）
６．結合したネオゲニンの抗体による検出：
・ＨＲＰをカップリングしたマウス抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片Ａｂ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に１：２５００に希釈）の添加（５０μＬ／ウェル）
・３７℃で１時間インキュベート
７．洗浄工程：
・ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄（１００μＬ／ウェル）
８．現像
・５０μＬ／ウェルの現像基質の追加（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ基質、Ｐｉｅｒｃｅ）
・室温で１〜３０分間インキュベート
・５０μＬの２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４／ウェルを用いて反応の停止
【０２２０】
２．調製例
調製例１：ほ乳類細胞内におけるＲＧＭ  Ａタンパク質断片の調製
軸索の増殖及びネオゲニン結合アッセイ法における活性ＲＧＭ  Ａドメインの特徴づけを行なうため、ＲＧＭ  Ａ（ＡＡ１６８−４２２）、及びサイズにおいて７０〜８０アミノ酸のＲＧＭ  Ａ断片（断片１：１６９−２３８；断片２：２１８−２８４；断片３：２６６−３３５；断片４：３１６−３８６；断片５：３６９−２３８；及び断片６：（１６８−４２２））をほ乳類細胞（ＨＥＫ２９３）内でＡＰ融合タンパク質として発現させた。
【０２２１】
この目的のために、それぞれの断片をコードするＤＮＡを、ベクターｐＤＥＳＴ  ＡＰ／ｃｃｄｂ／Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｋｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）にクローニングした（ＡＰ−アルカリホスファターゼ；ＰＰＣ−ＰｒｅＳｃｉｓｓｏｎプロテアーゼ）。それぞれの断片領域をコードするＤＮＡを、この目的のためにＲＺＰＤクローン（クローンＡＬ１３６８２６（ＤＫＦＺｐ４３４Ｄ０７２７）；公開されたＲＺＰＤ（配列ＢＣ０１５８８６、ＡＬ１３６８２６）からＰＣＲによって増幅した。これを実施するため、以下のヌクレオチドを用いた。
【０２２２】
2009510002.tif 000004
【０２２３】
得られたＰＣＲ産物を、特異的組換え（ａｔｔＬ  ｘ  ａｔｔＲ）によってベクターｐＤＥＳＴ  ＡＰ／ｃｃｄｂ／Ｍｙｃ／Ｈｉｓ内にクローニングし、配列が正しいことを配列決定により確認した。
【０２２４】
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）をプラスミドでトランスフェクトした。これを実施するために、トランスフェクションの前日に、１５ｃｍのプレートに、８０％の密度で細胞を播種した。次の日に、生成業者のプロトコールに従い、ＤＮＡをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、細胞を、それと共に１２時間インキュベートした。選択的培養条件（Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ３１９６６−０２１）、１０％ウシ胎児血清、１００ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（両方ともＧｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μｇ／ｍＬのゼオシン／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下での更に４週間の培養後、安定に発現するクローンを、増殖培地内でアルカリホスファターゼの検出により選択した。
【０２２５】
タンパク質生産のために、安定に発現する細胞を増殖培地内で増殖させ、７０％集密に達した時に、生産用培地（Ｐｒｏ２９３培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃａｍｂｒｅｘ，１２−７６４Ｑ）、２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に移した。更に４日間培養した後、細胞の破片から分離して生産用培地を集め、膜濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ３０）により濃縮した。
【０２２６】
次いで、Ｎｉ−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより、発現したＡＰ−ＲＧＭ融合タンパク質を上清から精製した。この目的のために、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、１００ｍＭ  ＮａＣＬ、１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール）で平衡化した。次いで、濃縮した上清を、４℃で１時間回転させながらＮｉ−ＮＴＡ−アガロースとインキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースを３回洗浄し、結合したタンパク質を溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾールを含むバッファーＡ）で溶出した。
【０２２７】
ドット−ブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析を用いて、タンパク質の解析を実施した。濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質検出法及びＡＰ濃度のＥＬＩＳＡ測定により定量した。
【０２２８】
実施例
実施例１：ネオゲニンを発現するＨＥＫ２９３細胞の断片解析
ａ）概略：
ニワトリ由来のＲＧＭ  Ａタンパク質の活性な成長阻害活性が、アミノ酸の１５０〜３５０位の間に位置することは既に知られている。
【０２２９】
従って、この範囲をカバーするヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の断片を調製した。次いで、個々のタンパク質断片を産生し、それらを培地中に放出するクローン性細胞培養を調製するために、その表面に内在的にＲＧＭ受容体を有するＨＥＫ２９３細胞を、これらの断片でトランスフェクトした。全ての断片を、アルカリホスファターゼ酵素と結合した融合タンパク質として生成した。細胞増殖の減少、細胞死の増加及び／又は細胞基質接着の変化によって、これらの細胞内の活性ドメインの存在は注目すべきである。
【０２３０】
細胞死の増加及び増殖の減少は、当然、活性断片の生産量による直接の影響を有する。産生される断片の量を、半定量的ドット−ブロット分析を用いて評価した。
【０２３１】
ｂ）方法：
調製例１において調製されたＲＧＭ  Ａ断片をＨＥＫ２９３に導入した。安定にトランスフェクトされた細胞を、増殖培地（Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ３１９６６−０２１）、１０％ウシ胎児血清、１００ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（両方ともＧｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で密集するまで培養した。次いで、培養上清の１ｍＬを、スロット−ブロットチャンバー内でニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過した。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｒｏｃｈｅ）と共にニトロセルロース膜をインキュベートすることによって、膜に固定化されたＡＰ−ＲＧＭ融合タンパク質を、アルカリホスファターゼ活性を検出することにより検出した。活性断片の産生量を、半定量的ドット−ブロット分析を用いて検出した。
【０２３２】
このアッセイに基づき、安定な細胞クローンは以下のカテゴリーに分類された。
【０２３３】
−多量に産生する細胞クローン（Ｓプロデューサ）
−中程度に産生するクローン
−弱く産生する細胞クローン
−産生しないクローン（０プロデューサ）
更に、産生しないクローンに対する多量に産生するクローンの比を決定した。
【０２３４】
ｃ）結果：
評価した個々のＲＧＭ  Ａ断片について以下の値が得られた。
【０２３５】
【表３】
2009510002.tif 000005
【０２３６】
このアッセイにおいて、断片３及び６は特に顕著な活性を示した。
【０２３７】
実施例２：神経線維増殖アッセイにおける、合成ＲＧＭ  Ａペプチドの研究
この目的のために、以下のＲＧＭ  Ａペプチドを合成し、種々の濃度において、前記神経線維増殖アッセイ（アッセイ方法１及びアッセイ方法２）において評価した。
【０２３８】
ペプチド１：ＡＡ２６７−２８５
ペプチド２：ＡＡ３０８−３２５
ペプチド３：ＡＡ３５８−３７７
ペプチド４：ＡＡ３７８−４００
（配列番号２に基づく番号付け）
今日までにアッセイされたペプチドのうち、ペプチド１が、確実に、及び再現可能に阻害活性を示した。従って、ペプチド１（ＡＡ２６７−２８５）が、ＲＧＭタンパク質の活性ドメインの一部を形成すると思われる。
【０２３９】
試験結果を、図３Ａ、Ｂ、Ｃ及び４Ａ、Ｂに示す。
【０２４０】
図３Ａは、ペプチド４と比較し、ペプチド１が、ラット神経細胞を用いた試験（アッセイ方法１）において、１０μｇ／ｍＬの濃度で、顕著に神経線維の増殖を阻害することを示す。図３Ｂは、皮質ニューロンの神経線維増殖における、種々の濃度（０〜３０μｇ／ｍＬ）のペプチド１の効果を示す。３μｇ／ｍＬ以上の濃度で、顕著な阻害活性が検出された。これに対し、ペプチド４は同じ濃度において活性を示さない（図３Ｃを参照）（Ａｇ−Ｉ＝軸索増殖指数、関連する軸索を有する神経凝集体の全面積−凝集体の面積に相当する。）。
【０２４１】
図４Ａは、ペプチド１が３０μｇ／ｍＬの濃度で、ヒトＮｔｅｒａ細胞の神経線維増殖を顕著に阻害するが、ペプチド４は阻害しないことを示す（アッセイ方法２）。図４Ｂは、観察されたペプチド１の阻害効果の統計的有意性を示す。
【０２４２】
実施例３：神経線維増殖アッセイにおける、合成ＲＧＭ  Ａ断片の研究
調製例１で調製された、６種のＲＧＭ  Ａ断片（再度、以下に示す）を、ヒトＮｔｅｒａ神経細胞を用いた軸索増殖アッセイ（前記アッセイ方法２を参照）における阻害活性についてアッセイした。
【０２４３】
断片１：アミノ酸１６９−２３８
断片２：アミノ酸２１８−２８４
断片３：アミノ酸２６６−３３５
断片４：アミノ酸３１６−３８６
断片５：アミノ酸３６９−４２２
断片６：アミノ酸１６８−４２２
（それぞれのケースにおいて、配列番号２に基づく番号付け）
結果を、添付する図５Ａ、Ｂ及びＣに示す。
【０２４４】
全体として、６種のＲＧＭ  Ａ断片を、Ｎｔｅｒａ増殖アッセイにおいてアッセイした。断片２、３及び６は活性であるが、断片１、４及び５が不活性であった。
【０２４５】
断片６は、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現される、そのままの、活性な完全に処理されたＲＧＭ  Ａに相当する。それは、ヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の重要な神経線維増殖−阻害ドメインが、断片２及び３の領域、すなわちアミノ酸２１８位及び３３５位の間に位置するというこれらのデータから得られる。従って、更に正確にこの阻害ドメインを特徴づけるために、次に工程で、断片２及び３の領域由来の短いＲＧＭ  Ａペプチドをアッセイする。
【０２４６】
実施例４：神経線維増殖アッセイにおける、合成ＲＧＭ  Ａペプチドの研究
以下の表に示すペプチドを、軸索増殖アッセイ（アッセイ方法２を参照）においてアッセイした。
【０２４７】
表：ペプチド１由来の隣接するＲＧＭ  Ａペプチドを合成し、軸索増殖アッセイにおいて用いた。
【０２４８】
【表４】
2009510002.tif 000006
【０２４９】
ペプチド１は、実施例２で既にアッセイした。
【０２５０】
試験結果を図６Ａ及びＢに示す。
【０２５１】
アッセイしたＲＧＭ  Ａペプチドのうち３種は、ＮＴｅｒａ増殖アッセイにおける神経線維増殖の大きな減少をもたらす（図６Ａ）。これらの活性なＲＧＭ  Ａペプチドは以下のペプチド、すなわちペプチド１、ペプチドｄｏｗｎ−１及びペプチドｕｐ−１である。不活性又は弱い活性のみのペプチドは以下のペプチド、すなわちペプチド５−Ａｋ、ペプチド６−Ａｋ及びペプチド７−Ａｋである（図６Ｂ）。これは、ＲＧＭ  Ａの阻害ドメインの１つが３つの活性ＲＧＭ  Ａペプチドによって固定される領域、すなわち、約２５０〜３００、特に約２６０〜２９１位に伸長し、従って、２６７〜２８５位のコア領域を含むヒトＲＧＭ  Ａタンパク質の領域に位置することを示す（配列番号７、８を参照）。高濃度のペプチド成長を阻害する傾向を示す２種のペプチド６−ＡＫ及び７−ＡＫの活性を基準として（図６Ｂ）、同様に、ＲＧＭ  Ａが更なる阻害ドメインを有し、それ故、本発明が約２１０〜２６０及び約２９０〜３５０位の領域におけるドメインに関することが完全に考えられる。
【０２５２】
実施例５：抗体を用いた、ＲＧＭ  Ａの阻害ドメインの中和
この実験における意図は、ＲＧＭ  Ａの阻害ドメインの活性ペプチドに対して生じたポリクローナル抗体が、ＲＧＭ  Ａとその受容体ネオゲニンとの相互作用を遮断することができるかどうか、及び活性、及び最も強力なＲＧＭ  Ａ断片２のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経線維増殖阻害を中和することができるかどうかをチェックすることであった（実施例２を参照）。
【０２５３】
従って、ペプチドｄｏｗｎ−１は活性ＲＧＭ  Ａ断片２の一部を形成するので、実施例の目的で用いた。キャリアタンパク質（ＬＰＨ）と結合し、このペプチドを以下のスキームに従い、２匹のウサギを免疫するために用いた。
【０２５４】
【表５】
2009510002.tif 000007
【０２５５】
数回の免疫後、上昇したｄｏｗｎ−１に特異的な抗体を精製し、種々のアッセイ系において用いた。
【０２５６】
ａ）ＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン結合アッセイ：
アッセイ方法３に従い、方法を実施した；試験結果を図７Ａに示す。
【０２５７】
ｂ）軸索増殖アッセイにおける活性ＲＧＭ  Ａ断片の中和：
ペプチドｄｏｗｎ−１に対して生じたポリクローナル抗体は、ＲＧＭ  Ａタンパク質とその受容体ネオゲニンとの相互作用を非常に効率的に遮断した。従って、次のアッセイにおいては、ｄｏｗｎ−１に特異的な抗体が、非常に強力なＲＧＭ  Ａ断片２を中和することができるかどうかを調べた（実施例３を参照）。
【０２５８】
アッセイ方法２に従い、方法を実施した；試験結果を図７Ｂに示す。
【０２５９】
要約すると、ペプチドｄｏｗｎ−１に対するポリクローナル抗体が、ＲＧＭＡネオゲニン結合アッセイにおいて、ネオゲニンとＲＧＭ  Ａとの相互作用を阻止し、軸索増殖アッセイにおいてＲＧＭ  Ａ断片の阻害活性をほとんど完全に中和することが示される。従って、ＲＧＭ  Ａタンパク質のアミノ末端アミノ酸２５０〜３００、特に２６０〜２９１間の領域が阻害活性に特に重要であり、新規な機能的関連ドメインとして本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１は、ヒト型のＲＧＭ  Ａ、ＲＧＭ  Ｂ及びＲＧＭ  Ｃの配列である。
【図２】図２は、ＲＧＭ分子の構造の図表示である。
【図３Ａ】図３Ａは、ラット神経細胞の神経線維増殖における、種々のＲＧＭ  Ａペプチド断片の影響を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のＲＧＭ  Ａペプチド１の軸索増殖−阻害活性の濃度依存性を示すための、測定した軸索増殖指数の棒グラフを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＲＧＭ  Ａペプチド４についての対応する棒グラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト神経ＮＴｅｒａ細胞の神経線維増殖におけるＲＧＭ  Ａペプチド１及び４の影響を説明するヒト神経ＮＴｅｒａ細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ペプチド１、ペプチド４及びコントロール（ＰＢＳ）を用いた試験シリーズについて、対応して測定された軸索増殖指数を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおけるＲＧＭ  Ａ断片の解析の結果である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおけるＲＧＭ  Ａ断片のアッセイ結果の蛍光顕微鏡写真である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおけるＲＧＭ  Ａ断片の解析の追加結果である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおける、ＲＧＭ  Ａペプチド１及びそれと部分的に重複する２個のペプチドの解析結果である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおける、更に３種のＲＧＭ  Ａペプチドの解析結果である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＲＧＭ  Ａ−ネオゲニン結合アッセイの結果である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＮＴｅｒａ神経線維増殖アッセイにおいて、Ｄｏｗｎ−１特異的ポリクローナル抗体が、強力なＲＧＭ  Ａ断片２の阻害活性をどのように中和するのかを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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