(57)【要約】組み換えヒトエリスロポエチン療法に対する患者の反応性を決定するための方法を開示している。一手法では、前記方法は、患者の血液サンプルからＭＣＶおよびＨｇｂの積の関数として定義される容積Ｈｇｂ係数（ＶＨｆ）を取得する工程と、ＶＨｆを所定の基準と比較する工程と、ＶＨｆが所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。前記方法は、ＭＣＶ、ＭＲＶおよびＨｇｂの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさ−ヘモグロビン係数（ＲＳＨｆ）を使用する工程、または反応性を決定するためにＶＨｆおよびＲＤＷの関数を使用する工程をさらに含む。その他の手法では、前記方法は、エリスロポエチン療法に対する反応性を決定するために、トランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）と併用し、ＭＣＶおよびＭＲＶの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を使用する工程を含む。
2009510402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えヒトエリスロポエチン療法に対する患者の反応性を決定する方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて該患者の第一の血液サンプルを分析し、該第一の血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、
（ｂ）該ＭＣＶおよび該ＭＲＶの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を取得する工程と、
（ｃ）臨床化学分析装置にて該患者の第二の血液サンプルを分析し、該第二の血液サンプルのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、
（ｄ）該ＴＳＡＴおよびＲＳｆと所定の基準と比較する工程と、
（ｅ）該ＴＳＡＴおよび該ＲＳｆが該所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応者を規定するＲＳｆ１および前記ＴＳＡＴの前記所定の基準は、該ＲＳｆ１が１０５．１未満、該ＴＳＡＴが２０％未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反応者を規定するＲＳｆ２および前記ＴＳＡＴの前記所定の基準は、該ＲＳｆ２が１１０．５未満、該ＴＳＡＴが２０％未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組み換えヒトエリスロポエチン療法に対する患者の反応性を決定する方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて該患者の血液サンプルを分析し、該血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、
（ｂ）該ＭＣＶおよび該Ｈｇｂの積の関数として定義される容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を取得する工程と、
（ｃ）該ＶＨｆを所定のＶＨｆ基準と比較する工程と、
（ｄ）該ＶＨｆが該所定のＶＨｆ基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項７】
前記ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における前記分析から赤血球分布幅（ＲＤＷ）を取得する工程と、前記ＭＣＶ、前記Ｈｇｂおよび該ＲＤＷの関数として定義される容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を取得する工程と、該ＶＨＤＷｆを所定のＶＨＤＷｆ基準と比較する工程と、該ＶＨＤＷｆが該所定のＶＨＤＷｆ基準を満たす場合は、前記反応者である兆候を報告する工程と、をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＨＤＷｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
臨床化学分析装置にて前記患者のさらなる血液サンプルを分析し、該さらなる血液サンプルのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者の反応性を決定する際に、ＶＨｆと併用し前記ＴＳＡＴを使用する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＳＡＴを使用して治療プロトコルを決定する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）における前記分析から網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、前記ＭＣＶ、該ＭＲＶおよび前記Ｈｇｂの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさ−ヘモグロビン係数（ＲＳＨｆ）を取得する工程と、該ＲＳＨｆを所定のＲＳＨｆ基準と比較する工程と、該ＲＳＨｆが該所定のＲＳＨｆ基準を満たす場合は、前記反応者である兆候を報告する工程とをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＳＨｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ×Ｈｇｂ）／１０００の式によって定義される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者の反応性を決定する際に、ＲＳＨｆと併用し前記ＴＳＡＴを使用する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＳＡＴを使用して治療プロトコルを決定する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
組み換えヒトエリスロポエチン療法に対する患者の反応性を決定する方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて該患者の第一の血液サンプルを分析し、該第一の血液サンプルの総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、
（ｂ）臨床化学分析装置にて該患者の第二の血液サンプルを分析し、該第二の血液サンプルのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、
（ｃ）該ＴＳＡＴおよびＨｇｂと所定の基準とを比較する工程と、
（ｅ）該ＴＳＡＴおよび該Ｈｇｂが該所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記反応者を規定する前記所定の基準は、前記ＴＳＡＴが２０％と３０％との間、前記Ｈｇｂが１０．０ｇ／ｄｌ未満である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、赤血球および網状赤血球パラメータの特定の関数を使用して、エリスロポエチン／静脈内鉄治療に対する患者の反応性を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
組み換えヒトエリスロポエチン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）は比較的新しい治療法であり、血液透析を伴う治療下にある腎不全患者における貧血治療に有用であるが、ｒ−ＨｕＥＰＯを投与すると鉄および他の栄養素の需要が高まるので、患者に鉄および他の栄養素を供給することが必要となる。通常、ｒ−ＨｕＥＰＯに加えて、必要な鉄供給を提供するために、患者の鉄状態に応じて一定用量の鉄を静脈内投与する。しかしながら他方では、過剰鉄の毒性は、患者に命にかかわる危険をもたらす可能性がある。鉄状態の慎重な評価は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法前および療法中に末期腎不全患者において極めて重要であり、適切な治療プロトコルを決定するのに役立つ。
【０００３】
健常人では、様々な組織内の鉄濃度は、正確な平衡状態を維持する。鉄の日常摂取および損失は少量であり、体内鉄は再利用される。しかしながら、末期腎不全（ＥＳＲＤ）を有する患者では、骨髄への鉄の供給は、正常な赤血球生成を持続するのに十分でない場合がある。鉄欠乏はまた、鉄の需要の増加によって起こる場合もある。ＥＳＲＤに付随する重症貧血は主として、エリスロポエチン、健全な腎臓によって生成されるホルモンの欠乏に起因する。組み換えヒトエリスロポエチンの代償療法、ＲＢＣ形成の興奮誘発剤は、透析患者におけるこの型の貧血を解消することができる。しかしながら、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法は鉄に対する需要を増加させる。鉄貯蔵が、新しいＲＢＣの生成のために鉄が必要である骨髄に輸送するのに十分迅速に結集することができない場合は、十分な鉄供給にもかかわらず、機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）が発生する場合がある。この機能的鉄欠乏は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法の反応を遅延させる、または減退させる可能性がある。鉄添加は、適当な鉄平衡性を回復し維持するために、またｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する最適な治療反応を保証するために必要となる。
【０００４】
ごく最近、ｒ−ＨｕＥＰＯは、機能的鉄欠乏を治療するのに役立つサイトカインでもあることが報告された。Ｗｅｉｓｓらは、ＥＳＲＤ患者の血清フェリチンを１５０ｎｇ／ｍｌより高く維持し、鉄を伴わずｒ−ＨｕＥＰＯのみを投与することは、３ヶ月の追跡治療の間では、ｒ−ＨｕＥＰＯ／ｉｒｏｎを投与された患者のグループと有意差がないことを明らかにした。これは、ｒ−ＨｕＥＰＯが炎症過程に起因して鉄貯蔵内に閉塞された鉄を放出するのに役立つという効果によるものであると考えられている（非特許文献１）。
【０００５】
現在のところ最も一般に使用される鉄状態パラメータは、トランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）および血清フェリチン（ＳＦ）である。しかしながら、双方とも鉄状態の間接的尺度である。トランスフェリンは、貯蔵部位から赤血球前駆細胞へ鉄を輸送する、２つの鉄結合部位を含有する輸送タンパクである。ＴＳＡＴ（すなわち、鉄が占める総結合部位のパーセンテージ）は、赤血球生成が得られる鉄の尺度である。ＴＳＡＴは血清鉄を総鉄結合能（ＴＩＢＣ）、循環トランスフェリンの量で除し、１００で乗じて計算する。フェリチンは、いくらかの量が血清中で遊離した状態で、細網内皮系（ＲＥＳ）内に主に含有される貯蔵タンパクである。鉄過剰の条件下で、フェリチン産生は血漿鉄における増加を相殺するために増加する。従って、血清中のフェリチン濃度は、貯蔵部での鉄の量を反映する。
【０００６】
正常人では、ＳＦ濃度は２２から２２０ｎｇ／ｍｌに及び、ＴＳＡＴレベルは２０％から４０％に及ぶ（非特許文献２）。腎臓機能障害のない患者では、ＳＦ濃度が２２ｎｇ／ｍｌ未満およびＴＳＡＴが１６％未満であることは、枯渇鉄貯蔵および絶対的鉄欠乏の指標である。慢性腎疾患を有する患者においては、絶対的鉄欠乏は、ＳＦ濃度が１００ｎｇ／ｍｌ未満およびＴＳＡＴが２０％未満であることによって特徴付けられる。鉄状態パラメータが適切な鉄貯蔵を示すので、機能的鉄欠乏は診断がより困難な場合がある。ＦＩＤを定義する際に異なる基準があり、以下の表に示すように、それらのうち１つは、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ−Ｋ／ＤＯＱＩ  （Ｅｋｎｏｙａｎ  Ｇら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ：ＤＯＱＩ  ｂｅｃｏｍｅｓ  Ｋ／ＤＯＱＩ  ａｎｄ  ｉｓ  ｕｐｄａｔｅｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ’ｓ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２００１年１月；３７（１）：１７９−１９４）によって刊行されている。
【０００７】
（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｋ／ＤＯＱＩ（米国）による機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）および絶対的鉄欠乏（ＡＩＤ）の定義）
【０００８】
【化１】
2009510402.tif 000003
ｒ−ＨｕＥＰＯ療法中の患者は十分な鉄貯蔵を有する（ＳＦが１００ｎｇ／ｍｌ以上であることにより反映されるように）が、それでも機能的鉄欠乏を有するので、例えば、単独または血清フェリチンと併用する血清トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）など、代替の鉄パラメータの使用がこれらの患者に推奨されてきた。（非特許文献３）。
【０００９】
血清フェリチンはまた反応相タンパクであり、疾病の過程で頻繁に上昇するので、鉄状態を判定するための血清フェリチンの使用に関する信頼性は批判されてきた。血清鉄測定の信頼性の欠如のために、トランスフェリン飽和もまた批判されてきた。さらに、トランスフェリン飽和は、肝不全、栄養不良、タンパク尿、滲出性腸症および急性期反応など、特定の疾病によって影響を受ける。過去数年間で、多数の論文が、鉄状態を判定する生化学的パラメータのみを使用することは、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法を管理するために十分ではないと報告している。
【００１０】
近年、赤血球および網状赤血球パラメータが、鉄欠乏の検出およびｒ−ＨｕＥＰＯ療法を管理する際の支援用として推奨されてきた。これら新しいパラメータには、網状赤血球ヘモグロビン含有量（ＣＨｒ）および低色素性赤血球のパーセンテージが含まれる。つい最近では、ＲＢＣ−Ｙ（成熟赤血球集団内の前方光散乱ヒストグラムの平均値）、およびＳｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００血液学分析装置での網状赤血球測定にて取得した、ＲＥＴ−Ｙ（網状赤血球集団内の前方光散乱ヒストグラムの平均値）もまた推奨されてきた。
【００１１】
ＲＢＣ前駆体の細胞表面上のトランスフェリン受容体は、鉄結合トランスフェリンを結合し、血漿から細胞への鉄の輸送が可能となる。鉄欠乏の状態下では、これら受容体の上方調節があり、トランスフェリンのより効率的な摂取が可能となる。細胞表面上のトランスフェリン受容体の濃度は、トランスフェリンの摂取と相関関係を有する。ｒ−ＨｕＥＰＯ療法で治療を受けない血液透析患者では、ｓＴｆＲレベルは、鉄過剰の人々より鉄欠乏の人々の間で高かった。しかしながら、いくつかの研究では、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法で治療を受けている血液透析患者は、鉄状態にかかわらず同様のｓＴｆＲレベルを有した。従ってｓＴｆＲは、血液透析患者において鉄状態の正確なマーカーとなり得ない場合がある。
【００１２】
網状赤血球は、寿命が１から２日だけの未成熟赤血球（ＲＢＣ）である。これらが最初に骨髄から遊離するとき、それらのヘモグロビン含有量の測定により、赤血球生成が直ちに得られる鉄の量を示すことができる。これらの網状赤血球における正常より少ないヘモグロビン含有量は、需要に対して不十分な鉄供給の兆候である。これらの網状赤血球におけるヘモグロビンの量はまた、成熟ＲＢＣでのヘモグロビンの量に相当する。ＣＨｒは式（ＣＨｒ＝ＭＣＶｒ×ＣＨＣＭｒ）によって定義され、式中ＭＣＶｒは平均網状赤血球細胞容積であり、ＣＨＣＭｒは、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ  １２０血液学分析装置にて光学的細胞間ヘモグロビン測定によって取得される、網状赤血球の平均ヘモグロビン濃度である。ＣＨｒは機能的鉄欠乏のための試験としていくつかの研究で評価されてきており、高感度および高度に特異的であることが発見されている。しかしながら、正確な閾値は設定されていない。閾値は研究所および使用する機器に応じて異なる。
【００１３】
エポエチンは赤血球の刺激的生産において有効であるが、ヘムに結合するための適切な鉄供給がなければ、赤血球は低色素、すなわち、ヘモグロビン含有量が不十分となるであろう。従って、鉄欠乏の状態では、骨髄を離れる赤血球の大幅なパーセンテージが、低いヘモグロビン値となるであろう。ヘモグロビン含有量が２８ｇ／ｄｌ未満の赤血球のパーセンテージを測定することによって、鉄欠乏を検出することができる。パーセンテージが１０％より高い低色素性赤血球は、鉄欠乏と相関関係を有してきた。低色素性赤血球のパーセンテージ（％Ｈｙｐｏと称する）は、光学的細胞間ヘモグロビン測定の基づくＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ（Ｒ）１２０血液学分析装置によって報告される。
【００１４】
さらに、赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、貧血の分類ための他のパラメータと組み合わせて使用されてきている。それは赤血球の大きさにおけるばらつきを反映し、赤血球不同症の微妙な度合いを検出するために使用することができる。ＲＤＷはＲＢＣヒストグラムから直接算出される。血液学分析装置にて２つの異なる算出値が提供された。ＲＤＷ−ＣＶは、ＭＣＶで除した一標準偏差での分布曲線の幅の比率として測定される。ＲＤＷ−ＳＤは、２０％の頻度レベルでの分布幅の直接測定である。通常、赤血球のための大きさの分布曲線は、１０±１．５％のＲＤＷ−ＣＶ値および４２±５（ｆｌ）のＲＤＷ−ＳＤと非常に対称的である。細胞の大きさにおける比較的大きなばらつきを意味する高ＲＤＷは、大赤血球性か、または小赤血球性細胞の出現によりもたらされる。赤血球分布幅の増加は、鉄欠乏の最も初期の血液学的徴候であると見られる。
【００１５】
上記から理解できるように、鉄状態、とりわけＦＩＤを決定することは、適切な治療プロトコルを決定するのに重要である。しかしながら、実際的な観点から、医者が、これらの利用可能な臨床化学的および血液学的パラメータに基づき、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療に対する患者の反応性を効果的に確実に予測できるならば、これは不要な費用のかかるｒ−ＨｕＥＰＯ療法を回避し、非反応者に投与する不適切なｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療に関連する命にかかわる危険を緩和することができるので、さらにより重要であり望ましい。
【非特許文献１】Ｗｅｉｓｓ  Ｇら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ＥＳＲＤ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ（２００３）６４：５７２−８
【非特許文献２】Ｓｕｏｍｉｎｅｎ，Ｐら、Ｓｅｒｕｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｆｅｒｒｉｔｉｎ  Ｉｎｄｅｘ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｒｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ，  Ｂｌｏｏｄ、（１９９８）第９２巻、第８号、ｐｐ２９３４−２９３９
【非特許文献３】Ｗｅｉｓｓ，Ｇ．ら、Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｒｔｉｃｌｅ、  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ：Ａｎｅｍｉａ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００５）３５２：１０１１−２３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
一側面では、本発明は、組み換えヒトエリスロポエチン療法に対する患者の反応性を決定するために、血液学分析装置に提供される赤血球および網状赤血球パラメータのいくつかの関数を使用する方法を提供する。
【００１７】
一実施態様では、前記方法は、血液学分析装置にて前記患者の第一の血液サンプルを分析する工程、ならびに前記第一の血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、ＭＣＶおよびＭＲＶの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を取得する工程と、臨床化学分析装置にて前記患者の第二の血液サンプルを分析する工程、および前記第二の血液サンプルのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、前記ＴＳＡＴおよびＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、前記ＴＳＡＴおよび前記ＲＳｆが前記所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。本明細書では、ＲＳｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆ１か、または（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２であってもよい。
【００１８】
さらなる実施態様では、前記方法は、血液学分析装置にて前記患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに前記血液サンプルのＭＣＶおよび総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、前記ＭＣＶおよび前記Ｈｇｂの積の関数として定義される容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を取得する工程と、前記ＶＨｆを所定のＶＨｆ基準と比較する工程と、前記ＶＨｆが前記所定のＶＨｆ基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。好ましい実施態様では、ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される。
【００１９】
さらに、前記方法は、前記分析から赤血球分布幅（ＲＤＷ）を取得する工程と、ＭＣＶ、ＨｇｂおよびＲＤＷの関数として定義される容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を取得する工程と、前記ＶＨＤＷｆを所定のＶＨＤＷｆ基準と比較する工程と、前記ＶＨＤＷｆが前記所定のＶＨＤＷｆ基準を満たす場合は、前記反応者である兆候を報告する工程とをさらに含むことができる。一実施態様では、ＶＨＤＷｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される。
【００２０】
さらに、前記方法は、臨床化学分析装置にて前記患者の第二の血液サンプルを分析する工程と、トランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、前記患者の反応性を決定する際に、ＶＨｆと併用しＴＳＡＴを使用する工程をさらに含むことができる。
【００２１】
その他の実施態様では、前記方法は、ＭＣＶ、ＭＲＶおよびＨｇｂの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさ−ヘモグロビン係数（ＲＳＨｆ）を取得する工程と、前記ＲＳＨｆを所定のＲＳＨｆ基準と比較する工程と、前記ＲＳＨｆが前記所定のＲＳＨｆ基準を満たす場合は、前記反応者である兆候を報告する工程とを含むことができる。一実施態様では、ＲＳＨｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ×Ｈｇｂ）／１０００として定義される。前記方法は、前記患者の反応性を決定する際に、ＲＳＨｆと併用しＴＳＡＴを使用する工程をさらに含むことができる。
【００２２】
その上さらなる実施態様では、前記方法は、前記患者のＴＳＡＴが２０％と３０％との間である場合、組み換えヒトエリスロポエチン療法に対する患者の反応性を決定するために、Ｈｇｂを使用する工程を含む。
【００２３】
さらなる側面では、本発明の前記方法は、治療プロトコルの決定を支援するためにこれらの関数を使用する工程をさらに含む。
【００２４】
本発明の利点は、本発明の例となる実施態様を示す添付図面と併せて、以下の説明から明白となるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
一側面では、本発明は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する患者の反応性を決定する方法を提供する。通常、患者はまた、静脈内に鉄を投与され、治療はまた、本明細書では、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄（ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄）治療と称する。
【００２６】
一実施態様では、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療するための患者の反応性を決定する方法は、血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）の積の関数を使用し、本明細書ではそれは、ＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を指す。より具体的には、方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の第一の血液サンプルを分析する工程、ならびに第一の血液サンプルのＭＣＶおよびＭＲＶを取得する工程と、（ｂ）第一の血液サンプルのＲＳｆを取得する工程と、（ｃ）臨床化学分析装置にて患者の第二の血液サンプルを分析する工程、ならびに第二の血液サンプルからトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、（ｄ）取得したＴＳＡＴおよびＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、（ｅ）取得したＴＳＡＴおよびＲＳｆが所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。
【００２７】
本明細書では、反応者は、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療中、次の血液分析において、総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）の１０％以上の増加を達成する患者として定義され、それは、直前の血液分析から通常、１ヶ月である。非反応者は、次の血液分析において、総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）の増加のレベルに達成していない患者として定義される。
【００２８】
好ましい一実施態様では、ＲＳｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義され、本明細書ではＲＳｆ１と称する。例となる一実施態様では、さらに十分に以下に記載されるように、反応者を定義するための所定のＲＳｆ１基準は、ＴＳＡＴが２０％未満およびＲＳｆ１が１０５．１未満である。代替の実施態様では、ＲＳｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義され、本明細書ではＲＳｆ２と称する。例となる一実施態様では、さらに十分に以下に記載されるように、反応者を定義するための所定のＲＳｆ２基準は、ＴＳＡＴが２０％未満およびＲＳｆ２が１１０．５未満である。
【００２９】
ＭＣＶを測定する場合、測定するものは、血液サンプルを採取する前の１２０日間に生成された赤血球の平均の大きさまたは容積である（赤血球の平均寿命が縮まる場合を除く）ことが理解することができる。他方では、ＭＲＶを測定する場合、測定するものは、血液サンプルを採取する前の３日未満の期間内の、つい最近生成された赤血球の大きさまたは容積である。成熟赤血球および網状赤血球の双方において、９０％を超える細胞内含有量はヘモグロビンであるので、これらの赤血球の大きさは、細胞のヘモグロビン含有量と直接相関関係を有する。従って、ＭＣＶおよびＭＲＶの双方の積の関数として、ＲＳｆは網状赤血球および成熟赤血球の双方の細胞ヘモグロビン含有量を間接的に反映する。
【００３０】
通常、血液学分析装置にて、血液サンプルのいくつかのアリコートは、さらに十分に以下に記載されるように、赤血球および網状赤血球パラメータ、およびヘモグロビン濃度などの異なる血液学的パラメータで取得するために、同時に分析する。血液サンプルは、ＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝血剤を含む試験管内に収集される。通常、血液学的分析および臨床化学分析に使用される血液サンプルは、保存料が異なる場合、異なる試験管内に収集される。当技術分野で知られているＴＳＡＴの測定のための既存の方法は、本発明の目的のために使用することができる。
【００３１】
赤血球を測定するためには、血液サンプルは通常、サンプルチャンバまたは槽の中で希釈剤により実質上希釈する。非集中フロー開口を有するインピーダンス測定を使用して、血液サンプルは約６２５０：１の希釈比で希釈することができる。測定に集中フロー用フローセルを使用する場合は、希釈比は２９０：１など、大幅に低くてもよい。血液学分析装置にて測定する間に赤血球細胞容積および形態を維持するために、血液サンプルを希釈するのに等張希釈剤を使用する。通常、希釈剤は１つ以上のアルカリ性金属塩を含有する。様々な市販の等張血液希釈剤が、血液サンプルを希釈するために使用することができる。適切な例には、米国特許第４，５２１，５１８号、第４，５２８，２７４号、第５，９３５，８５７号および第６，７０６，５２６号に記載の希釈剤が含まれるが、それらに限定されない。
【００３２】
伝導液中で懸濁される粒子または血球がフローセルまたは開口に浸透する場合は、電気信号またはパルスは、インピーダンスの増加に起因して測定することができる。電気パルスは、血液サンプルの血球の数を計数するために使用されてきた。他方では、パルス波形、パルス高およびパルス幅は、粒子の容積または大きさに直接関連し、測定された細胞の容積に換算することができる。ＤＣインピーダンス測定装置を装備した血液分析装置による、血球の計数およびサイジングのために使用される検出方法および装置は、米国特許第２，６５６，５０８号、第３，８１０，０１１号および第５，１２５，７３７号に概して記載されており、それらの全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。本明細書では、句「血球のサイジング」とは、細胞容積の測定を指す。
【００３３】
別法として、低角光散乱測定もまた、血球の計数およびサイジングのために使用することができる。本明細書では、用語「低角光散乱測定」とは、入射光線から１０度未満の範囲で測定される光散乱信号を指す。
【００３４】
細胞容積測定では、細胞容積分布ヒストグラムを取得する。赤血球測定については、取得したヒストグラムは、赤血球分布ヒストグラムと称する。正常な血液サンプルについては、幅が狭い明確な赤血球分布、通常ガウス分布が取得される。臨床的に異常な血液サンプルについては、高容積側か、または低容積側への分布のずれ、非対称分布、高容積側か、低容積側、または両側への人口拡張など、分布の様々なひずみが観察されてきた。平均細胞容積（ＭＣＶ）および赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、赤血球分布ヒストグラムから計算する。
【００３５】
血液サンプルの総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）は通常、血液サンプルのアリコートを細胞融解試薬と混合することによって、自動血液学分析装置にて測定される。細胞融解試薬に暴露した時点で赤血球は完全に融解し、またヘモグロビンはサンプル混合物へと遊離し、細胞融解試薬中のリガンドと接触した時点で色原体を形成する。ヘモグロビン色原体は次いで、所定の波長でＵＶ−ＶＩＳ分光学によって測定され、Ｈｇｂは前記測定から計算される。
【００３６】
Ｈｇｂを測定するために適切な一融解試薬には、米国特許第４，５２１，５１８号、第４，５２８，２７４号、第５，９３５，８５７号および第６，７０６，５２６号に記載の希釈剤などの等張血液希釈剤、および米国特許第５，７６３，２８０号、第５，８３４，３１５号および第６，５７３，１０２号に記載の融解試薬などの融解試薬が含まれ、これらはその全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。別法として、試薬システムはまた、米国特許第５，８８２，９３４号に記載の単一融解試薬であってもよく、その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。さらに、ヘモグロビンを測定するために当技術分野で知られている様々な細胞融解試薬は、本発明の目的のために使用することができる。
【００３７】
血液サンプル中の網状赤血球は、光散乱、吸収、インピーダンスおよび／またはそれらの組み合わせを使用する、ルーチンサンプル分析におけるいくつかの高性能血液学分析装置にて測定および報告される。最も一般に報告されるパラメータには、網状赤血球パーセント（ＲＥＴ％）および絶対数（ＲＥＴ＃）、網状赤血球容積（ＭＲＶ）、ならびに未成熟網状赤血球比（ＩＲＦ）が含まれる。具体的な測定方法にもよるが、他の網状赤血球パラメータもまた、血液学分析装置によって提供される。
【００３８】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧＥＮ＊ＳＴＭ血液学分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州、フラートン）にて、血液サンプルのいくつかのアリコートは、異なる分析形態で同時に分析する。ＣＢＣ形態では、血液サンプルの第一のアリコートは、第一のサンプル混合物を形成するために血液希釈剤によって希釈され、赤血球および血小板は第一のサンプル混合物から測定する。同時に、血液サンプルの第二のアリコートは、第二のサンプル混合物を形成するために、血液希釈剤および細胞融解試薬と混合し、第二のサンプル混合物からのヘモグロビンおよび白血球を測定する。様々な赤血球パラメータは、数ある中でも、平均細胞容積（ＭＣＶ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）、および平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）などの微分パラメータを含む測定から報告される。これらの血液学分析装置で報告されるＲＤＷは、ＭＣＶで除した一標準偏差での分布曲線の幅の比率として測定されるＲＤＷ−ＣＶである。
【００３９】
Ｒｅｔｉｃ形態では、血液サンプルの第三のアリコートを、メチレンブルーを含有する網状赤血球染色試薬と混合し、次いで第三のサンプル混合物を形成するために、融解試薬／定着試薬と混合する。メチレンブルー、非蛍光色素染料は、網状赤血球内の残留ＲＮＡを沈殿させることによって、成熟赤血球からの網状赤血球の分化を達成するために使用する。第三のサンプル混合物は次いで、ＶＣＳ検出方法によって測定する。網状赤血球パラメータのうちで、ＭＲＶ、平均球体化細胞容積（ＭＳＣＶ）、未成熟網状赤血球比（ＩＲＦ）、ならびに高光散乱網状赤血球パーセントおよび絶対数（ＨＬＲ％およびナンバー記号）が機器によって報告される。
【００４０】
本明細書では、ＶＣＳ検出方法または技術とは、集中フローセルに浸透する細胞によって生成される直流（ＤＣ）信号、高周波（ＲＦ）信号および中角光散乱（ＬＳ）信号の多次元測定を指す。これら３つの測定のうちで、ＤＣおよびＲＦ測定の双方は、伝導性媒質内に運ばれる細胞がフローセルに浸透するにつれて増加するインピーダンスを検出する、インピーダンス測定である。この技術は、米国特許第５，１２５，７３７号に十分に記載されており、その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００４１】
実施例は、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療への反応者と非反応者の識別におけるＲＳｆ１およびＲＳｆ２の有用性を例示する。示すように、腎不全を有する５９人の患者からの３２３の全血サンプルをＣｏｕｌｔｅｒ  ＧＥＮ＊Ｓ血液学分析装置にて取得した様々な赤血球および網状赤血球パラメータの関数を使用し、１日おきに血液透析の治療プログラムにおいて、５ヶ月間研究した。臨床化学分析パラメータのＴＳＡＴおよびＳＦをまた、臨床化学分析装置にて取得した。
【００４２】
表３に示すように、ｔ−スチューデント検定から、反応者と非反応者との間でＲＳｆ１とＲＳｆ２の双方に統計的有意差が存在した。ＲＳｆ１およびＲＳｆ２に対して受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を実行した。ＴＳＡＴが２０％未満である患者では、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方のＲＢＣの大きさの係数は、反応者と非反応者の識別において、最も有効なパラメータの一つであることが発見された。
【００４３】
図１Ａおよび１Ｂは、ＴＳＡＴが２０％未満である患者に対する、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２のそれぞれのＲＯＣ曲線を示す。Ｙ軸上で感度を描き（真陽性の比）、またＸ軸上で１００特異性（偽陽性の比）を描く。完全な差別化のある試験は、真陽性の比が１００％である（完全な感度）である場合、左上角を通過するＲＯＣ曲線を有し、差別化のない試験のための理論曲線は、左下角から上右角まで４５度の対角線である。曲線が上左角に接近するほど、試験の精度は高くなる。さらに、ＲＯＣ曲線の下の領域（ＡＵＣ）はまた、診断試験の臨床精度の公約数である。ＲＳｆ１のためのＲＯＣ分析からのＡＵＣは０．８９８であった。カットオフが１０５．１以下の状態で、ＲＳｆ１はそれぞれ、感度が１００％、特異性が７２．３％であった。ＲＳｆ２のＡＵＣは０．８９８であった。カットオフが１１０．５以下の状態で、ＲＳｆ２はまた、反応者および非反応者を決定するための感度が１００％、特異性が７２％であった。本明細書では、カットオフとは、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２のＲＯＣ分析のカットオフ値を指し、それぞれ上述したように、ＭＣＶおよびＭＲＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表す。本明細書では、これらの係数は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する反応性を決定するための指標として使用する。上記に記載された結果によると、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方は、反応者と非反応者の識別において、ほぼ同一の能力であった。これらの結果は、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する反応者と非反応者の識別において、有効なパラメータであることを示す。
【００４４】
さらなる実施態様では、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療に対する患者の反応性を決定するための本発明の方法は、ＭＣＶおよびＨｇｂの積の関数を使用し、本明細書ではそれは、容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を指す。より具体的には、方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに血液サンプルのＭＣＶおよびＨｇｂを取得する工程と、（ｂ）血液サンプルからＶＨｆを取得する工程と、（ｃ）ＶＨｆを所定の基準と比較する工程と、（ｄ）ＶＨｆが所定のＶＨｆ基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。
【００４５】
好ましい実施態様では、ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される。表３に示すように、ＴＳＡＴが２０％未満である患者では、反応者と非反応者との間でＶＨｆに統計的有意差が存在した。図２Ａは、ＴＳＡＴが２０％未満である患者のＶＨｆのＲＯＣ曲線を示す。ＶＨｆのＲＯＣ分析から、ＡＵＣは０．８８９であった。カットオフが９．９以下の状態で、ＶＨｆは、反応者と非反応者の識別に対して、感度が９１．７％、特異性が６８．５％であった。本明細書では、カットオフとは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義されるＶＨｆのＲＯＣ分析のカットオフ値であり、ＭＣＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはデシリットル当たりのグラム（ｇ／ｄｌ）で表す。本明細書では、この係数は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する反応性を決定するための指標として使用される。
【００４６】
さらに、ＶＨｆは、ＴＳＡＴが２０％より高い患者の反応者と非反応者の識別に有効であることが発見された。図２Ｂは、ＴＳＡＴが２０％より高い患者のＶＨｆのＲＯＣ曲線を示す。患者のこのグループにおけるＶＨｆのＲＯＡ分析から、ＡＵＣは０．７８９であった。カットオフが１０．５以下の状態で、ＶＨｆは、反応者と非反応者の識別に対して、感度が７７．８％、特異性が７４．２％であった。
【００４７】
これらの結果は、反応者および非反応者を決定するためにＶＨｆを単独で使用してもよいことを示す。さらに、ＶＨｆのためのカットオフ値が、ＴＳＡＴが２０％未満である患者とＴＳＡＴが２０％より高い患者とで異なる可能性があるので、ＴＳＡＴは、反応者および非反応者をさらに正確に決定するためにＶＨｆと併用して使用することができる。
【００４８】
本発明のさらなる側面では、以下に記載されるように、本方法は、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療プロトコルを決定するための上記に記載されるパラメータの使用をさらに含む。このために、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療への患者の反応性を決定するためにＶＨｆを使用する方法は、臨床化学分析装置にて患者のさらなる血液サンプルを分析する工程と、トランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、治療プロトコルを決定するためにＶＨｆと併用してＴＳＡＴを使用する工程とをさらに含むことができる。
【００４９】
さらに、ＶＨｆとＲＤＷ（赤血球分布幅）の関数は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する患者の反応性を決定するために使用することができることも発見された。より具体的には、前記関数は、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義され、本明細書では容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）と称する。従って、上記に記載される方法には、工程（ａ）での分析から（ＲＤＷ）を取得する工程、ＶＨＤＷｆを取得する工程、ＶＨＤＷｆを所定のＶＨＤＷｆの基準と比較する工程と、ＶＨＤＷｆが所定のＶＨＤＷｆの基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とをさらに含むことができる。
【００５０】
さらに、様々なその他の研究では、ＶＨｆはまた鉄欠乏を検出するために使用できることが発見されたことが留意される。小球性貧血は鉄欠乏に起因する典型的な病態であるので、この関数は小球性貧血関数（ＭＡｆ）とも称する。
【００５１】
その他の実施態様では、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療への患者の反応性を決定するための本発明の方法は、ＭＣＶ、ＭＲＶおよびＨｇｂの積の関数を使用し、本明細書ではそれは、ＲＢＣの大きさ−ヘモグロビン係数（ＲＳＨｆ）を指す。より具体的には、方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の第一の血液サンプルを分析する工程、ならびに第一の血液サンプルのＭＣＶ、ＭＲＶおよびＨｇｂを取得する工程と、（ｂ）第一の血液サンプルのＲＳＨｆを取得する工程と、（ｃ）取得したＲＳＨｆを所定の基準と比較する工程と、（ｄ）ＲＳＨｆが所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。
【００５２】
好ましい実施態様では、ＲＳＨｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ×Ｈｇｂ）／１０００の式によって定義される。表３に示し、実施例に記載されるように、ＲＳＨｆは、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療への反応者と非反応者の識別において、有効なパラメータであることがわかった。図３Ａおよび図３Ｂは、ＴＳＡＴが２０％未満である患者およびＴＳＡＴが２０％より高い患者のＲＳＨｆのＲＯＣ曲線を示す。ＴＳＡＴが２０％未満である患者では、ＲＳＨｆのためのＲＯＣ分析からのＡＵＣは０．９２７であった。カットオフが１１１．５以下の状態で、ＲＳＨｆは、反応者と非反応者を決定するために、感度が１００％、特異性が８１．９％であった。ＴＳＡＴが２０％より高い患者では、ＲＳＨｆのためのＡＵＣは０．７６６であった。カットオフが１２２．５を超える状態で、ＲＳＨｆはそれぞれ、感度が６６．７％、特異性が７８．０％であった。本明細書では、カットオフとは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ×Ｈｇｂ）／１０００の式によって定義されるＲＳＨｆのＲＯＣ分析のカットオフ値であり、ＭＣＶおよびＭＲＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはデシリットル当たりのグラム（ｇ／ｄｌ）で表す。本明細書では、この係数は、ｒ−ＨｕＥＰＯ療法に対する反応性を決定するための指標として使用される。
【００５３】
これらの結果は、ＲＳＨｆは、反応者および非反応者を決定するために単独で使用してもよいことを示す。さらに、ＲＳＨｆのためのカットオフ値が、ＴＳＡＴが２０％未満である患者とＴＳＡＴが２０％より高い患者とで異なる可能性があるので、ＴＳＡＴは、反応者および非反応者をさらに正確に決定するためにＲＳＨｆと併用して使用することができる。さらに、ＴＳＡＴレベルはまた、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療への治療プロトコルを決定するためにＲＳＨｆと併用して使用することもできる。
【００５４】
その上さらなる実施態様では、患者のＴＳＡＴが２０％と３０％の間にある場合、本発明は、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療に対する患者の反応性を決定するための本発明の方法を提供する。より具体的には、方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の第一の血液サンプルを分析する工程、ならびに第一の血液サンプルの総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、（ｂ）臨床化学分析装置にて患者の第二の血液サンプルを分析する工程、ならびに第二の血液サンプルのトランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）を取得する工程と、（ｃ）取得したＴＳＡＴおよびＨｇｂを所定の基準と比較する工程と、（ｅ）ＴＳＡＴおよびＨｇｂが所定の基準を満たす場合は、反応者である兆候を報告する工程とを含む。
【００５５】
例となる一実施態様では、反応者を定義するための所定の基準は、ＴＳＡＴが２０％と３０％の間にあり、Ｈｇｂが１０．０（ｇ／ｄｌ）未満であることである。実施例に示すように、ＴＳＡＴが２０％と３０％の間にある患者では、Ｈｇｂは、反応者と非反応者のグループの識別において有効である。図４は、ＨｇｂのためのＲＯＣ曲線示す。カットオフが９．９８（ｇ／ｄｌ）未満の状態で、その方法の感度および特異性はそれぞれ、８３．３％、７７．５％であった。
【００５６】
ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療への患者の反応性を決定するために、新しいパラメータＲＳｆ、ＶＨｆ、ＶＨＤＷｆ、ＲＳＨｆおよびＨｇｂを使用する本発明の方法は、低コスト的手法であることが理解されるであろう。上述のように、これらのパラメータは、追加費用を伴わず、自動網状赤血球測定から取得することができる。患者から血液を採取してから約１５分で血液学的分析結果を得ることができるので、ターンアラウンドタイムは非常に短い。さらに、治療プロトコルを決定するために、ＲＳｆ、ＣＲＰ、血清フェリチンおよびＴＳＡＴは、腎臓の断面図を伴い、３時間未満で取得でき、病院への患者の多数の訪問を避けることができる。
【００５７】
さらなる側面では、本発明は、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療プロトコルを決定するために、上記に記載される新しいパラメータを使用する方法を提供する。例となる一実施態様では、本発明は、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療プロトコルを決定するために、ＲＳｆ、ＴＳＡＴおよびＨｇｂを使用する方法を提供する。
【００５８】
（表１．ＴＳＡＴ、ＲＳｆ１およびＨｇｂを使用した推奨治療プロトコル）
【００５９】
【表１】
2009510402.tif 000004
表１に例示するように、患者はＲＳｆ１が１０５．１未満でＴＳＡＴが２０％未満の値を有する場合、ｒ−ＨｕＥＰＯおよび静脈内鉄の総量を患者に対して考慮することができる。患者はＴＳＡＴが２０％から３０％までで、Ｈｇｂが１０．０ｇ／ｄｌ未満の値を有する場合、ｒ−ＨｕＥＰＯおよび静脈内鉄の中間用量を考慮することができる。しかしながら、患者はＲＳｆ１が１０５．１より高い、またはＴＳＡＴが３０％よりも高い値を有する場合、静脈内鉄の用量は削減すべきであり、葉酸欠乏症、Ｂ１２欠乏性貧血、アルミニウム中毒、高いＣＲＰなどの貧血症のその他の原因を考慮するべきである。ＣＲＰが５０よりも高い、および／または血清フェリチンが５００ｎｇ／ｍｌよりも高い場合、ＴＳＡＴおよびＲＳｆ１の値にかかわらず、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療は中止すべきである。この状態で２つのアプローチを考慮することができる。一手法では、さらにｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療を与える前に、炎症／感染に対して患者を治療する。第二の手法は、ｒ−ＨｕＥＰＯは、赤血球増殖因子だけでなく、炎症性タンパク質の活性を中和するサイトカインである最新の認識に基づく。本手法では、炎症に対するマーカーおよびヘプシジン、インターフェロンγ、およびＩＬ−６などの鉄代謝の閉塞に関連するマーカーは、炎症および鉄閉塞をさらに識別するために使用される。これらが認められた場合、鉄供給を遮断しないために鉄を使用せず、抗炎症性の治療として、その通常用量の３倍より高いｒ−ＨｕＥＰＯの用量を使用することができる。第二の手法は、抗生物質で治療しなければならない感染により引き起こされる炎症の非存在下で使用されることが留意される。
【００６０】
以下の実施例は、本発明の実例となるものであり、特許請求の範囲で定義する、本発明の範囲を限定するよう解釈されるものでは決してない。手順の開示に従って、様々な他の要素および割合を用いてよいことが理解されるであろう。
【実施例】
【００６１】
１日おきに血液透析の治療プログラムにおいて、腎不全を有する５９人の患者が研究に関わった。ＥＰＯ／静脈内鉄補給治療（ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄）が、関連する貧血に対するプログラムに含まれた。患者は５ヶ月間追跡され、この間３つの病院、マーストリヒト（オランダ）、マルセイユ（フランス）およびベルン（スイス）の大学病院で、約１ヶ月間の通常の間隔で３２３の全血サンプルを収集した。
【００６２】
ＣＢＣおよびＲｅｔｉｃ形態を使用して、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧＥＮ＊Ｓ血液学分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州、フラートン）にて血液サンプルを分析した。血液学分析装置は、標準操作条件下で操作した。第一のサンプル混合物を形成するために、血液サンプルの１．６μｌの第一のアリコートを６２５０：１の希釈比でＩｓｏｔｏｎ３Ｅによって希釈し、前記混合物はＤＣインピーダンス測定によって測定し、赤血球パラメータを生成した。血液サンプルの２８μｌの第二のアリコートを６ｍｌのＩｓｏｔｏｎ３Ｅで希釈し、次いで第二のサンプル混合物を形成するために１ｍｌのＬｙｓｅ  Ｓ  ＩＩＩ  ｄｉｆｆと混合した。第二のサンプル混合物の吸収を約５４０ｎｍで測定し、Ｈｇｂを取得した。血液サンプルの３４μｌの第三のアリコートを０．２ｍｌのＲｅｔｉｃ  Ｓｔａｉｎ試薬と混合し、次いで第三のサンプル混合物を形成するために２．０ｍｌのＲｅｔｉｃ  Ｌｙｓｅと混合し、前記混合物はＶＣＳ検出方法によって測定し、網状赤血球パラメータを取得した。上述のすべての試薬はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃの製品であった。ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療に対する患者の反応を監視するために、機器から報告された赤血球パラメータおよび網状赤血球パラメータを使用した。
【００６３】
さらに、ＡｕｔｏＤｅｌｐｈｉａ免疫化学分析装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、フィンランド、トゥルク）およびＡｒｒａｙ比濁計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、フラートン）それぞれでの免疫蛍光分析にて、血清フェリチン（ＳＦ）およびトランスフェリンを測定した。トランスフェリン飽和（ＴＳＡＴ）は、鉄／トランスフェリンモル比を２で除して計算した（トランスフェリン分子当たりの２つ鉄結合部位の補正）。
【００６４】
この期間中の鉄添加は、Ｄｕｔｃｈ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎからの指針の基づき決定した（表２）。前記指針は、ＴＳＡＴが２０％未満およびＳＦが５００ｎｇ／ｍｌ未満の場合は２００ｍｇの鉄を投与、またＴＳＡＴが２０％未満およびＳＦが５００と８００ｎｇ／ｍｌとの間の場合は１００ｍｇの鉄を投与することを推奨していた。ＳＦが８００ｎｇ／ｍｌより高いいずれの場合も、鉄添加は公表されていない。
【００６５】
文献（Ｆｒａｓｅｒ  ＣＧ．Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｇｏａｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｉｎ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．１９８８年４月；１１２（４）：４０４−１５．）に定義されているように、Ｈｇｂに対する対象者内生物学的平均偏差は４．４２％であるので、次の血液分析（典型的な間隔は約１ヶ月）においてＨｇｂの１０％以上の上昇を、本研究での反応者と定義するための基準として使用した。
【００６６】
（表２．Ｄｕｔｃｈ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの指標のよる鉄処方計画（ｍｇ／月））
【００６７】
【表２】
2009510402.tif 000005
これら５９人の患者からの３２３のサンプルのデータ分析から、ＴＳＡＴが２０％未満およびＳＦが１００ｎｇ／ｍｌと５００ｎｇ／ｍｌとの間のすべてのサンプルについては、次の血液分析において１０％以上のＨｇｂの上昇を伴う、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療に対した反応があったことが発見された。
【００６８】
血液学分析装置から報告される赤血球パラメータおよび網状赤血球パラメータを、反応者と非反応者との間で比較した。表３に示すように、ＭＣＶ、ＭＲＶ、ＭＳＣＶ、およびＨｇｂは、反応者と非反応者との間で統計的有意差を有することが発見された。サンプルのいくつかは網状赤血球パラメータを持たず、それらは分析に使用しなかったことが留意される。これらのパラメータの様々な関数もまた分析した。上述のＭＣＶ、ＭＲＶおよびＨｇｂの積の関数は、反応者と非反応者との間で統計的有意差があり、また臨床用途に優れた感度および特異性を有することが発見された。より具体的には、これらは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２（ｐ＜０．０００１）によって定義されるＲＳｆ１、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００（ｐ＜０．０００１）によって定義されるＲＳｆ２、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００（ｐ＜０．０００１）によって定義されるＶＨｆ、および（ＭＣＶ×ＭＲＶ×Ｈｇｂ）／１０００（ｐ＜０．０００１）であった。本明細書では、ＭＣＶおよびＭＲＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはデシリットル当たりのグラム（ｇ／ｄｌ）で表した。
【００６９】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｒ）Ｅｘｃｅｌ２０００の統計関数、Ｆｒａｎｋ  ＳｃｈｏｏｎｊａｎｓからのソフトウェアプログラムＭｅｄＣａｌｃ（Ｒ）Ｖｅｒｓｉｏｎ４．２０．０１４、およびＰｈｉｌｉｐｐｅ  Ｍａｒｑｕｉｓ、フランス、メスによるＭｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｏｒ（Ｃ）を統計分析のために使用した。
【００７０】
受信者動作特性（ＲＯＣ）分析をこれらの係数に対して実行した。ＴＳＡＴが２０％未満である患者では、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方のＲＢＣの大きさの係数、容積Ｈｇｂ係数（ＶＨｆ）、およびＲＢＣの大きさ−ヘモグロビン係数（ＲＳＨｆ）は、反応者と非反応者の識別において有効であることが発見された。
【００７１】
（表３．反応者対非反応者）
【００７２】
【表３】
2009510402.tif 000006
図１Ａおよび図１Ｂは、ＴＳＡＴが２０％未満である患者に対する、それぞれＲＳｆ１およびＲＳｆ２のＲＯＣ曲線を示す。ＲＳｆ１のＲＯＣ分析から、ＡＵＣは０．８８１であった。カットオフが１０５．１以下の状態で、ＲＳｆ１は、反応者と非反応者の識別に対して、感度が１００％、特異性が７０．１％であった。ＲＳｆ２のＲＯＣ分析から、ＡＵＣは０．８８１であった。カットオフが１１０．５以下の状態で、ＲＳｆ２もまたそれぞれ、感度が１００．０％、特異性が７０．１％であった。
【００７３】
図２Ａは、ＴＳＡＴが２０％未満の患者のＶＨｆのＲＯＣ曲線を示す。ＶＨｆのＲＯＣ分析から、ＡＵＣは０．８８９であった。カットオフが９．９以下の状態で、ＶＨｆは、反応者と非反応者の識別に対して、感度が９１．７％、特異性が６８．５％であった。
【００７４】
さらに、ＶＨｆは、ＴＳＡＴが２０％より高い患者の反応者と非反応者の識別に有効であることも発見された。本研究では、１５０の血液サンプルはＴＳＡＴが２０％より高かった。これらのうちで、上述の基準を使用すると、反応者が１８人および非反応者が１３２人となった。図２Ｂは、ＴＳＡＴが２０％より高い患者のＶＨｆのＲＯＣ曲線を示す。患者のこのグループにおけるＶＨｆのＲＯＣ分析から、ＡＵＣは０．７８９であった。カットオフが１０．５以下の状態で、ＶＨｆは、反応者と非反応者の識別に対して、感度が７７．８％、特異性が７４．２％であった。
【００７５】
図３Ａは、ＴＳＡＴが２０％未満の患者のＲＳＨｆのＲＯＣ曲線を示す。ＲＳＨｆのＡＵＣは０．９２７であった。カットオフが１１１．５以下の状態で、ＲＳＨｆはそれぞれ、感度が１００％、特異性が８１．９％であった。図３Ｂは、ＴＳＡＴが２０％より高い患者のＲＳＨｆのＲＯＣ曲線を示す。患者のこのグループについては、ＲＳＨｆのＡＵＣは０．７６６であった。カットオフが１２２．５を超える状態で、ＲＳＨｆはそれぞれ、感度が６６．７％、特異性が７８．０％であった。
【００７６】
さらに、ＴＳＡＴが２０％と３０％との間である患者については、Ｈｇｂは反応者と非反応者の識別するのに有効なパラメータであることが発見された。図４は、ＨｇｂのためのＲＯＣ曲線示す。カットオフが９．９８（ｇ／ｄｌ）未満の状態で、感度および特異性はそれぞれ、８３．３％、７７．５％であった。
【００７７】
とりわけ好ましい実施態様を参照して本発明を説明してきた。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、添付の特許請求の範囲内にかかる変更を含むことを意図していることが理解されるであろう。本発明を詳細に説明し、添付図面に絵画的に示してきたとはいえ、これらは本発明の範囲に関し限定するものとして解釈されるべきではなく、むしろその好ましい実施態様の適例であると解釈されるべきである。しかしながら、上記の明細書に記載し、添付の特許請求の範囲および法的同等物に定義した本発明の精神および範囲内で、様々な修正および変更を行うことができることが理解されるであろう。本明細書に引用した特許および他の刊行物のすべては、参照することにより明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＴＳＡＴが２０％未満である患者に対する、それぞれＲＳｆ１およびＲＳｆ２のＲＯＣ曲線である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれＴＳＡＴが２０％未満である患者、およびＴＳＡＴが２０％より高い患者に対する、ＶＨｆのＲＯＣ曲線である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれＴＳＡＴが２０％未満である患者、およびＴＳＡＴが２０％より高い患者に対する、ＲＳＨｆのＲＯＣ曲線である。
【図４】図４は、ＴＳＡＴが２０％と３０％との間である患者に対する、ＨｇｂのＲＯＣ曲線である。
【図１】
2009510402.tif 000007
【図２】
2009510402.tif 000008
【図３】
2009510402.tif 000009
【図４】
2009510402.tif 000010
【国際調査報告】
2009510402.tif 000011