(57)【要約】  本発明は、T、Bリンパ球およびNK細胞を遺伝子的に奪われ、マウスMHCクラスIおよび／またはMHCクラスII分子に欠陥があり、かつHLAクラスIおよび／またはHLAクラスII分子を発現するトランスジェニックであるマウス、およびヒトの適応免疫系の発達および機能をインビボで研究するための、ヒト造血前駆体の移植のための受容宿主としてのそれらの使用に関する。本発明はまた、病原体、癌および自己免疫疾患に対する免疫療法を改善するための、このヒト／マウス キメラモデルの応用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）マウスTリンパ球、Bリンパ球およびNK細胞の欠陥、
b）マウスMHCクラスIおよびMHCクラスII分子の欠陥、ならびに
c）異種の機能的MHCクラスI導入遺伝子および／または異種の機能的MHCクラスII導入遺伝子
を含む表現型を有することを特徴とする、トランスジェニックマウス。
【請求項２】
a）の欠陥が、Rag2遺伝子の欠陥および共通受容体γ鎖遺伝子の欠陥に関連するものである、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
マウスMHCクラスI分子の欠陥が、β2マイクログロブリン遺伝子の欠陥に関連するものである、請求項１または請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
マウスMHCクラスII分子の欠陥が、H-2b-Aβ遺伝子の欠陥に関連するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
異種のMHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子が、ヒトHLAクラスIおよび／またはHLAクラスII導入遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
HLAクラスI導入遺伝子がHLA-A2導入遺伝子であり、HLAクラスII導入遺伝子がHLA-DR1導入遺伝子である、請求項５に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-A2+/+、HLA-DR1+/+、
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-A2+/+、および
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-DR1+/+
からなる群より選択される遺伝子型を有する、請求項６に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
補体のC5タンパク質の欠陥をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか1項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
いずれの適切な手段により、請求項１〜８のいずれか1項に記載のトランスジェニックマウスに、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子との同種からの造血異種前駆細胞を移植する工程を含むことを特徴とする、異種の機能的免疫系を有するキメラマウスの作製方法。
【請求項１０】
- いずれの適切な手段により、請求項１〜８のいずれか1項に記載のトランスジェニックマウスに、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子との同種からの造血異種前駆細胞を移植する工程、および
- いずれの適切な手段により、移植されたマウスにおいて、異種の機能的T、Bまたは樹状細胞の存在をアッセイする工程
を含むことを特徴とする、異種の免疫系の発達をインビボで解析する方法。
【請求項１１】
- いずれの適切な手段により、請求項１〜８のいずれか1項に記載のトランスジェニックマウスに、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子と同種からの造血異種前駆細胞を移植する工程、
- 移植した細胞を興味対象の抗原と接触させる工程、および
- いずれの適切な手段により、該マウスにおいて、該抗原に対する体液性応答、ヘルパーT細胞応答または細胞傷害性T細胞応答の存在についてアッセイする工程
を含むことを特徴とする、抗原に対する異種の免疫応答をインビボで解析する方法。
【請求項１２】
異種の造血前駆細胞が、ヒト造血前駆細胞である、請求項８〜１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト造血前駆細胞が、異なるHLAハプロタイプのドナーからである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハプロタイプが、ヒト個体群の遺伝的多様性を反映する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
a）マウスTリンパ球、Bリンパ球およびNK細胞の欠陥、および
b）マウスMHCクラスIおよびMHCクラスII分子の欠陥
を含む表現型を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか1項に記載のトランスジェニックマウスの作製に有用なトランスジェニックマウス。
【請求項１６】
Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/- 遺伝子型を有することを特徴とする、請求項１５に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１７】
請求項１〜８、１５および１６のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスからの細胞であることを特徴とする、単離した細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T、Bリンパ球およびNK細胞を遺伝子的に奪われ、マウスMHCクラスIおよび／またはMHCクラスII分子に欠陥があり、かつHLAクラスIおよび／またはHLAクラスII分子を発現するトランスジェニックであるマウスに関するものである。本発明はまた、インビボでヒトの適応免疫系の発達および機能を研究するための、ヒト造血前駆体の移植のための受容宿主としての本発明のトランスジェニックマウスの使用に関するものである。本発明はまた、病原体、癌および自己免疫疾患に対する免疫療法を改善するための、このヒト／マウス キメラモデルの応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インビボでヒト免疫系の発達および機能を解析するために、小動物の異種移植モデルにおいて、ヒトの造血を再現するための多数の研究が試行されている。これらのモデルにおいて、ヒト／マウス キメラまたはヒト化マウスを作製するように、ヒト造血細胞および組織を、異種移植片を拒絶する能力が損なわれているマウスに移植する。
【０００３】
生着は、重症複合免疫不全マウスにおける成熟ヒト末梢血白血球の移入（huPBL-SCIDマウス；Mosierら, Nature, 1998, 335, 256-259）、ならびにSCIDマウスにおける造血性胎児肝細胞、胎児骨、胎児胸腺および胎児リンパ節の移植（SCID-huマウス； McCuneら, Science, 1988, 241, 1632-1639; McCuneら, Semin. Immunol., 1996, 8, 187-）の後に最初に報告された。TおよびBリンパ球欠陥SCIDマウス（Prkdcscid 変異マウス）における、これらの最初の報告の後に、あるレベルの生着もまた、組み換え活性化遺伝子（RAG）欠陥マウス（Rag1-/-、Rag2-/-変異マウス；Schultzら, J. Immunol., 2000, 164, 2496-2507；Goldmanら, Br. J. Haematol., 1998, 103, 335-342）における造血細胞の移植により達成された。しかしながら、これらのモデルにおける生着のレベルは、おそらく宿主動物の自然免疫の残存のために、まだ低かった。非肥満型糖尿病／重症複合免疫不全（NOD/SCID）マウスは、BALB/c/SCIDまたはC.B.17/SCIDマウスよりも、ヒトの前駆細胞の生着のより高いレベルを支持することを示してきた（Greinerら, Stem Cells, 1998, 16, 166-）。ベータ-2マイクログロブリン遺伝子でのヌル対立遺伝子（NOD/SCID/β2m-/-；O. Kolletら, Blood, 2000, 95, 3102-）または細胞質領域を欠損した切形の共通サイトカイン受容体γ鎖（γc）変異体（NOD/SCID/γc-/-；Itoら, Blood, 2002, 100, 3175-）のいずれかを有するNOD/SCIDマウスが作製された。β2mは主要組織適合複合体（MHC）クラスIが介する自然免疫にとって必要であり、かつγc（元々はIL-2Rγ鎖と呼ばれる）は、そのいくつかはリンパ系の生成／維持に必要な、多くのリンパ関連サイトカイン（IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15およびIL-21）のための受容体へテロ二量体に欠くことができない構成要素なので、これらのマウスにおいてNK細胞、T細胞およびB細胞の発達ならびに機能は阻害される。HLA-DR1トランスジェニックNOD/SCIDマウスおよびHLA-DR3トランスジェニックRag2-/-マウスもまた樹立された（Camachoら, Cellular Immunology, 2004, 232, 86-95；米国特許出願第2003/0028911号）。しかしながら、これらのモデルはヒトリンパ系細胞の限られた発達および維持を持続させるだけであり、かつ免疫応答をめったに引き起こさない。
【０００４】
より最近では、放射線照射した新生Rag2-/-/γc-/-マウスへのCD34+ヒト臍帯血細胞の肝臓内注射によって、B、T、および樹状細胞の新たな発達；組織化した1次および2次リンパ器官の形成；ならびに機能的な免疫応答の発生が示すように、定量的かつ機能的に完全な免疫系が形成された（Traggai, Science, 2004, 304, 104-107）。この異種移植系の有効性は、同じ系統のマウス（Gimenoら, Blood, 2004, 104, 3886-3883）および共通サイトカイン受容体γ鎖の完全ヌル変異を有するNOD/SCIDマウス（NOD/SCID/γcnull；Ishikawaら, Blood, 2005, 106, 1565-1573）において、さらに確認された。
【０００５】
しかしながら、他の研究（Wangら, J.Exp.Med., 2005, 201, 1603-1614）では、hES胚性体に由来し、かつ放射線照射したNOD/SCIDマウスへ静脈内注射されたCD34+ヒト前駆体が、マウス血清の凝集のせいで引き起こされた肺塞栓により生着マウスの死亡を導くことが報告された。
【０００６】
それにもかかわらず、これらのモデルはいくつかの不利な点を示す：キメラリンパ系器官におけるT細胞の数が非常に限られていることと共に定量的なT細胞の再構成がかなり乏しい。さらに、抗原提示細胞の性質（マウス対ヒト）が不明確なままであるので、機能的研究はこれらの系においては困難であり、かつマウスMHCによるヒトT細胞応答の拘束の可能性を排除することを可能にしない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの制限を克服するために、本発明は：
a）マウスTリンパ球、Bリンパ球およびNK細胞の欠陥、
b）マウスMHCクラスIおよびMHCクラスII分子の欠陥、および
c）異種の機能的MHCクラスI導入遺伝子および／または異種の機能的MHCクラスII導入遺伝子
を含む表現型を有することを特徴とする、トランスジェニックマウスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、トランスジェニックマウスにおけるT、BおよびNK細胞の不在を示す。C57Bl/6マウス、Rag-/- γc-/-β2m-/- IAβb-/-（RGBI-/-と称する）、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-A2+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+ HLA-A2+マウスからの脾臓細胞を、マウスCD19およびマウスCD3（A）ならびにマウスNK1.1およびマウスDX5（B）について染色した。パネルは、各グループの3匹のマウスおよび2人のヒトドナーの代表である。
【図２】図２は、トランスジェニックマウスにおけるMHC分子発現の解析を示す。C57Bl/6マウス、Rag-/- γc-/-β2m-/- IAβb-/-（RGBI-/-と称する）、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-A2+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+ HLA-A2+マウスからのヒトPBLおよび脾臓細胞を、HLA-DR/DP/DQ（A）、HLA-A/B/C（B）、IAb（C）、H-2Db/Kb（D）について染色した。  Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-A2+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+ HLA-A2+マウスについて、HLA-DR/DP/DQ（A）、およびHLA-A/B/C（B）の発現プロフィール（塗りつぶしていないヒストグラム）を、Rag-/- γc-/-β2m-/- IAβb-/-対照マウスについて得られた発現プロフィール（塗りつぶしたヒストグラム）とともに示す。  Rag-/- γc-/-β2m-/- IAβb-/-、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-A2+、Rag-/-γc-/-β2m-/- IAβb-/- HLA-DR1+ HLA-A2+マウスについて、IAβb（C）およびH-2Db/Kb（D）の発現プロフィール（塗りつぶしていないヒストグラム）を、C57Bl/6対照マウスについて得られた発現プロフィール（塗りつぶしたヒストグラム）とともに示す。  パネルは、各グループの3匹のマウスおよび2人のヒトドナーの代表である。
【図３】図３は、H9ヒト胚性幹（hES）細胞のCD34分化を示す。未分化H9細胞は、過集密な（over-confluent）OP-9細胞の層上で培養された。共培養の異なる日において、ヒトCD34および段階特異的胚性抗原4（SSEA-4）の発現を、フローサイトメトリにより単一細胞懸濁物においてモニターした。パネルAは、マウス胚性線維芽（MEF）およびOP-9細胞の両方についての対照のネガティブ染色を示す。パネルBおよびCは、2つの異なる時点において、「材料と方法」に記載される2つの別個のOP-9細胞株とともにそれぞれ実行された、2つのH9/OP-9共培養から得られた結果を示す。
【図４】図４は、OP-9細胞株によるH9分化の異なる効率を示す。H9/OP-9共培養におけるCD34発現（A）またはCD34/SSEA-4の二重発現（B）の動態をフローサイトメトリにより調査した（AおよびB）。目盛りは、OP-9細胞株および得られたCD34+の割合に依存して異なることに注意されたい。
【図５】図５は、H9由来CD34+細胞による、生着した免疫欠陥マウスのヒト造血系再構成を示す。6匹の放射線照射したRAG-/-、γc-/-、mβ2m-/-、I-Aβb-/-、C5-/-、HLA-DR1+、HLA-A2+新生マウスに、「材料と方法」に記載されるように、CD34+細胞が豊富なH9/OP-9共培養細胞を生着させた。6週間後、キメラの脾臓（A下段）および骨髄（B右）におけるCD45+細胞の存在をフローサイトメトリにより評価した。陰性対照として、非生着免疫欠陥マウスの脾臓（A上段左）および骨髄（B左）から得られた結果を示す。ヒト臍帯血のCD45発現レベルを示す（A上段右）。全ての細胞は、FSC/SSCの基準による赤血球およびデブリスを排除する細胞のゲーティングの後、少なくとも3.106の取得イベントから解析される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
従来のトランスジェニックマウスモデルで得られた結果とは反対に、本発明のトランスジェニックマウスへのCD34+由来のヒト胚性幹細胞（hES細胞）の肝臓内注射は、いかなる死も引き起こさなかっただけではなく、トランスジェニックマウス受容者の骨髄および脾臓へのヒトCD45+細胞の移動を引き起した。
【００１０】
異種のMHCクラスIおよび／またはMHCクラスII機能的導入遺伝子は、ヒトHLAクラスIおよび／またはHLAクラスII機能的導入遺伝子であり得る。あるいは、それらはPatrクラスIおよび／もしくはクラスIIチンパンジー遺伝子またはMamuクラスIおよび／もしくはクラスIIマカク遺伝子のようなサルの機能的MHCクラスIおよび／またはMHCクラスII導入遺伝子であり得る。該サルMHC遺伝子は、AIDS感受性のいくつかの違いを理解するのに有用である（Bontrop, R. E.; and D. I. Watkins, Trends in Immunol., 2005, 26: 227-233）。
【００１１】
本発明によるトランスジェニックマウスにおける、HLA分子による宿主マウスのMHC分子の置換は、最初のモデルを顕著に改善する。HLAの状況（context）において、従来モデルにおいて主に遭遇する異種間の相互作用よりも強い、ヒトCD4/MHCクラスIIの相互作用およびCD8/MHCクラスIの相互作用は、ヒト胸腺細胞のポジティブセレクションおよび産生されたヒトT細胞の末梢での生存の両方を促進することにより、T細胞数を劇的に増加させる。さらに、HLA分子による宿主マウスのMHC分子の置換は、ヒトMHCの状況においてヒトT細胞応答の拘束を確実にする。
【００１２】
本発明のマウスは、新しいヒト／マウス キメラを作製するために、ヒト造血前駆細胞移植のための受容宿主として用いられる。これらのマウスは、完全なヒト化モデルで、準備が容易で、ヒト免疫適応系の発達を研究するために用いることができる。これらのマウスは、ヒトへの使用のためにインビボで最大効力を持つワクチンまたは免疫療法の開発および最適化に有用なモデルを提供する。特に、そのようなマウスは、単一の動物におけるヒト抗原（病原体、腫瘍、自己抗原）に対する適応免疫応答（抗体、ヘルパーおよび細胞溶解）の構成要素の完全な解析、および予防接種により特に授けられる、抗原性攻撃に対する防御の評価を可能にする。このモデルにおいて、抗原特異的抗体、抗原特異的HLAクラスII拘束性CD4+T細胞応答、および抗原特異的HLAクラスI拘束性CD8+T細胞応答の存在の検出が可能である。これらの応答が、どのように協調するのかについての研究もまた可能である。それゆえ、このモデルは、ヒトの病原体、癌および自己免疫疾患に対するより効果的な予防または治療的免疫療法の創作に有用である。これらのマウスは、基本および応用の免疫学研究のための最適化されたツールである。
【００１３】
定義
「の欠陥」とは、分子または細胞の機能の欠乏を指す。
「変異」とは、ポリヌクレオチド配列における1つまたはそれより多いヌクレオチドの置換、挿入、削除を指す。
「欠陥遺伝子」、「不活性化遺伝子」、「ヌル対立遺伝子」とは、野生型遺伝子の分子機能を欠く変更された遺伝子産物をもたらす、自発的または指向された変異を含む遺伝子を指す。
「破壊された遺伝子」とは、相同組み換えまたは当該技術で知られるその他のアプローチを用いて不活性化された遺伝子を指す。
【００１４】
「導入遺伝子」とは、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞にとって、部分的または全体的に非相同である、つまり外来性の核酸配列、あるいはそれが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子と相同であるが、それが挿入される細胞のゲノムを変更するような様式で動物のゲノムに挿入されるように設計されるか、または挿入される核酸配列（例えば、それが本来の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入によりノックアウトとなる）を指す。導入遺伝子は、選択される核酸の最適な発現にとって必要となり得る、1つまたはそれより多い転写調節配列、およびイントロンのようなその他の核酸に作動可能に連結されることが可能である。
【００１５】
「機能的導入遺伝子」とは、導入遺伝子を含むマウスの少なくとも1つの細胞において、mRNA転写産物を生じ、これが次に適当にプロセシングされたタンパク質を生ずる導入遺伝子を指す。当業者は、既知の転写制御要素および転写後修飾を指令する配列の様々の組が、宿主マウスにおける導入遺伝子の発現を指令するための選択肢のライブラリーを提供することを理解するであろう。本発明の多くの実施形態において、H-2遺伝子調節要素の制御下のHLA導入遺伝子の発現が好ましい。
【００１６】
「HLA」とは、ヒトMHC複合体を指し、「H-2」とは、マウスMHC複合体を指す。
「異種の」、「異種」とは、マウスではない脊椎動物を指す。
【００１７】
マウスTおよびBリンパ球、ならびにNK細胞に欠陥のある、本発明によるトランスジェニックマウスは、自発的または指向された変異（欠陥遺伝子）により不活性化された、T、Bおよび／またはNK細胞の発達に必須の2つの遺伝子を含む。当業者に公知のこれらの変異は、例えば、マウスscid変異（Prkdcscid；Bosmaら, Nature 1983, 301, 527-530；Bosmaら, Curr. Top. Microbiol., Immunol., 1988, 137, 197-202）または組み換え活性化遺伝子の破壊（Rag1-/-またはRag2-/-；Mombaertsら, Cell, 1992, 68, 869-877；Takedaら, Immunity, 1996, 5, 217-228）である第1の変異、およびベージュ変異（Lystbg；Mac Dougallら, Cell. Immunol., 1990, 130, 106-117）またはβ2-マイクログロブリン遺伝子（β2m-/-；Kolletら, Blood, 2000, 95, 3102-3105）、IL-2受容体γ鎖（または共通サイトカイン受容体γ鎖（γc））遺伝子（IL-2Rγ-/-またはγc-/-；DiSantoら, P.N.A.S., 1995, 92, 377-381）、もしくはIL-2受容体β鎖（IL-2Rβ）遺伝子（IL-2Rβ-/-；Suzukiら；J. Exp. Med., 1997, 185, 499-505）の破壊である第2の変異を含む。
【００１８】
さらに、これらの変異は、当業者に公知の適切な遺伝子背景にある。例えば、SCID変異はNOD背景（糖尿病になりやすい非肥満型糖尿病性背景、NOD/SCID；Prochazkaら, P.N.A.S., 1992, 89, 3290-3294）にあるものが好ましい。
【００１９】
例えば、本発明によるマウスは、T、BおよびNK細胞の欠陥に相当する下記の遺伝子型の1つを含む：SCID/Beige（scid/scid, bg/bg；Mac Dougallら, Cell. Immunol., 1990, 130, 106-117)、NOD/SCID/IL2-Rγnull（Ishikawaら, Blood, 106, 1565-1573；Schultzら, J. Immunol., 2005, 174, 6477-6489）、NOD/SCID/β2m-/-（Zijlstarら, Nature, 1990, 344, 742-746）、Rag2-/-/γc-/-（Goldmanら, Br. J. Haematol., 1998, 103, 335-342）。
【００２０】
第1の実施形態において、本発明は、a）の欠陥が、Rag2遺伝子の欠陥および共通受容体γ鎖遺伝子の欠陥と関連するトランスジェニックマウスを提供する。両方の遺伝子が相同組み換えにより破壊されること（Rag2およびγcノックアウトまたはRag2-/-/γc-/-）が好ましい。
【００２１】
MHCクラスI分子は、β2-マイクログロブリン（β2-m）軽鎖と非共有結合的に会合するα-鎖（重鎖）を含む。MHCクラスII分子は、α-鎖およびβ-鎖を含むヘテロ二量体である。ヒト複合体は3つのクラスI α-鎖遺伝子：HLA-A、HLA-B、およびHLA-CならびにMHCクラスII α-およびβ-鎖遺伝子の3つの対、HLA-DR、-DPおよび-DQを含む。多くのハプロタイプにおいて、HLA-DRクラスターは、その生成物がDRα鎖と対をなし得る、余分のβ鎖遺伝子を含み、そして遺伝子の3つの組は4つのタイプのMHCクラスII分子を生む。マウスにおいて、3つのクラスI α-鎖遺伝子は、H-2-L、H-2-D、およびH-2Kである。マウスMHCクラスII遺伝子は、H-2-AおよびH-2-Eである。H-2-Eαは、H2bハプロタイプにおける偽遺伝子である。
【００２２】
第2の実施形態において、本発明は、マウスMHCクラスI分子の欠陥が、β2-マイクログロブリン遺伝子の欠陥、好ましくはβ2-マイクログロブリン遺伝子の破壊（β2mノックアウト、β2m-/-）に関連するトランスジェニックマウスを提供する；マウスでのβ2-マイクログロブリン鎖の欠如は、マウスMHCクラスI分子（H-2-L、H-2-D、およびH-2K）の細胞表面発現の欠乏を導く。
【００２３】
好ましい実施形態において、β2-マイクログロブリン遺伝子および少なくとも1つのクラスI α-鎖遺伝子、例えば、H2-Dbおよび／またはH2-Kb遺伝子は破壊されている。
【００２４】
β2mノックアウトマウスは、当業者に公知である。例えば、β2m-/-マウスは、Zijlstarら, Nature, 1990, 344, 742-746に記載され、かつβ2m-/-、H2-Db-/-および／またはH2-Kb-/-マウスは、Pascoloら, J. Exp. Med., 1997, 185:2043-2051に記載のように得ることが可能である。
【００２５】
第3の実施形態において、本発明は、マウスMHCクラスII分子の欠陥が、H-2-Aβ遺伝子の欠陥、および最終的にH-2-Eβ遺伝子の欠陥に関連するトランスジェニックマウスを提供する。
【００２６】
H2bハプロタイプにおいて、マウスMHCクラスII分子の欠陥は、H-2b-Aβ遺伝子の破壊（I-AβbノックアウトまたはI-Aβb -/-)のみにより得られる；H-2 I-A β-鎖の欠如は、このハプロタイプにおいてH-2-Eα遺伝子は偽遺伝子であるので、通常のH-2 I-AおよびI-EクラスII分子の細胞表面発現の欠乏を導く。他のH-2ハプロタイプにおいて、マウスMHCクラスII分子の欠陥は、H-2-AβおよびH-2-Eβ遺伝子の両方の破壊によって得られる。
【００２７】
I-Aβb ノックアウトマウスは、当業者に公知である。例えば、I-Aβb -/-マウスは、Takedaら, Immunity, 1996, 5, 217-228に記載される。H-2-Aβ遺伝子およびH-2-Eβ遺伝子の両方をノックアウトしたマウスは、Madsenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96:10338-10343に記載される。
【００２８】
Tリンパ球を標的にするT-エピトープに基づくワクチンの設計を妨げる困難の1つは、HLAクラスI／クラスII分子の多型である。多型のHLA抗原および別個のHLA対立遺伝子の両方の結果として、異なる個体のHLA遺伝子の間に遺伝的多様性が存在することは、当該技術において知られている。HLA分子の高度の多型のせいで、2つの個体により提示される抗原からのエピトープの組は、前記個体を特徴付けるHLA分子またはHLAタイプに依存して異なり得る。しかしながら、大多数のHLA分子はその配分が世界中で同質ではないにもかかわらず、いくつかの対立遺伝子がヒト個体群において優勢である（HLA-DR1、-DR3、-B7、-B8、-A1、-A2）。例えば、HLA-A2.1およびHLA-DR1分子は、それぞれ個体の30〜50％および6〜18％に発現する。さらに、HLAクラスIアイソタイプの、または対立遺伝子の変異体間の提示されるペプチドの組の重複があり、かつペプチドのHLAクラスII分子への結合が、クラスI分子への結合よりも厳密ではない。それゆえ、HLA-A2.1およびHLA-DR1分子により提示されるペプチドは、個体群中の最多数の個体により提示されるエピトープの典型となるはずである。それにもかかわらず、ヒト個体群全体をカバーするために、他のHLAアイソタイプの、または対立遺伝子の変異体により提示される最適なエピトープを同定することが望ましい。このことは、免疫応答において偏りがある場合においても重要であり得るので、抗原が他のHLAハプロタイプによって提示されることが好ましい。このことは、HLAハプロタイプが疾患、例えば、自己免疫疾患（Jonesら, Nature Reviews Immunol, 2006, 6:271-282）またはHCV（Yee L.J., Genes and Immunity, 2004, 5:237-245）もしくはHIV（Bontrop R.E. およびD.I. Watkins, Trends in Immunol., 2005, 26:227-233）のようなウィルス感染の発達および結果に関連する場合においても、適切であり得る。
【００２９】
本発明によるトランスジェニックマウスは、1つまたはそれより多い、異種の機能的MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子を含み得る。MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子のアロタイプが、異種個体群の遺伝子の多様性を反映することが好ましい。例えば、異種個体群で最も頻出のアロタイプが、異種個体群の全体をカバーするように選択される。
【００３０】
第4の実施形態において、本発明は、異種MHCクラスI導入遺伝子がヒトHLAクラスI導入遺伝子であり、かつ異種MHCクラスII導入遺伝子がヒトHLAクラスII導入遺伝子であるトランスジェニックマウスを提供する。
好ましくは、ヒトHLAクラスIおよびクラスII導入遺伝子は、ヒト個体群に最も頻出のアロタイプに相当する。
例えば、HLAクラスI導入遺伝子がHLA-A2導入遺伝子であり、かつHLAクラスII導入遺伝子がHLA-DRA1導入遺伝子である。より好ましくは、HLA-A2導入遺伝子は、HLA-A2.1重鎖にヒトβ2mがペプチドの腕によって共有結合的に連結されている、HLA-A2.1単鎖をコードする。HLA-DR1αおよびβ鎖は、それぞれHLA-DRA*0101およびHLA-DRB1*0101遺伝子をコードし得る。
【００３１】
HLAクラスIおよびHLAクラスIIトランスジェニックマウスは、当業者に公知である。例えば、キメラ単鎖（そのN末端にてヒトβ2mのC末端に15アミノ酸のペプチドリンカーによって連結されるHLA-A2.1のα1-α2ドメイン（HLA-A*0201遺伝子によりコードされる）、H-2 Dbの細胞質ドメインまでのα3）を発現するHLA-A2.1トランスジェニックマウスは、Pascoloら, J. Exp. Med., 1997, 185, 2043-2051に記載される。HLA-DRA*0101およびHLA-DRB1*0101遺伝子によってコードされるDR1分子を発現するHLA-DR1トランスジェニックマウスは、Altmannら, J. Exp. Med., 1995, 181, 867-875に記載される。
【００３２】
よって、本明細書に開示される本発明の実施形態は、1つの多型HLA抗原を別のものに、または1つのHLA対立遺伝子を別のものに置換し得る。HLA多型および対立遺伝子の例は、例えば、http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/data.htmlおよびhttp://www.ebi.ac.uk/imgt/hlaならびにHLAの遺伝子の多様性は：Functional and Medical Implication、Dominique Charon (編)、EDK Medical and Scientific International Publisher、およびThe HLA FactsBook, Steven G.E. Marsh、Peter Parham and Linda Barber、AP Academic Press, 2000において見ることが可能である。
【００３３】
ヒトHLAクラスIおよびクラスII導入遺伝子は、疾患、例えば、自己免疫疾患（Jonesら, Nature Reviews Immunol, 2006, 6:271-282）またはHCV（Yee L.J., Genes and Immunity, 2004, 5:237-245）もしくはHIV（Bontrop R.E. およびD.I. Watkins, Trends in Immunol., 2005, 26:227-233）のようなウィルス感染の発達および結果に関連するアロタイプにも相当し得る。
【００３４】
あるいは、他の脊椎動物からのMHCクラスIおよびクラスII分子は、本発明によるトランスジェニックマウスにおいて発現できる。MHC遺伝子配列は、NCBIデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のようなデータベースでアクセスできる。
【００３５】
第5の実施形態において、本発明は、以下の遺伝子型：
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-A2+/+、HLA-DR1+/+、
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-A2+/+、および
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-DR1+/+
のうちの1つを有するトランスジェニックマウスを提供する。
【００３６】
第6の実施形態において、本発明は、補体のC5タンパク質の欠陥（C5-/-）をさらに含むトランスジェニックマウスを提供する。系統129またはFBVのマウスは、補体のC5タンパク質の欠陥を有するマウスの例である。これらの系統は、本発明によるトランスジェニックマウスの作製に有利に用いられる。
【００３７】
本発明のトランスジェニックマウスは、二重変異体および二重トランスジェニック体が得られるまで、上記で定義した興味対象の変異／導入遺伝子を1つまたはそれより多く有するマウスの継続的な交配、および子孫のスクリーニングをすることにより作製できる。
【００３８】
それらは、H-2クラスI-／クラスII-KO免疫欠陥マウスと、上記で定義したHLA-I+および／またはHLA-II+トランスジェニックマウスとの交配により有利に作製される。
【００３９】
それゆえ、本発明はまた：
a）マウスTおよびBリンパ球、ならびにNK細胞の欠陥、および
b）マウスMHCクラスIおよびMHCクラスII分子の欠陥
を含む表現型を有することを特徴とする、トランスジェニックマウスに関連する。
好ましくは、前記H-2クラスI-／クラスII-KO免疫欠陥マウスが、Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/- 遺伝子型を有する。
【００４０】
本明細書の開示内容に基づいて、付加的なMHCクラスI／MHCクラスII-トランスジェニック、H-2クラスI／クラスII-KO免疫欠陥マウスを、従来の相同組み換え技術を用いることにより構築することが可能である。例えば、付加的なMHCクラスIトランスジェニックおよび付加的なMHCクラスIIトランスジェニックを、従来の相同組み換え技術を用いることにより構築することが可能である。これらのトランスジェニック体を、上記で定義したH-2クラスI-／クラスII-KO免疫欠陥マウスと交配することができる。
【００４１】
「相同組み換え」は、トランスジェニック動物を作製するために、細胞の予め選択した所望の遺伝子配列に変異を導入するための一般的なアプローチである（Mansourら, Nature, 1998, 336:348-352; Capecchi, M. R., Trends Genet., 1989, 5:70-76; Capecchi, M. R., Science, 1989, 244:1288-1292;,Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (Capecchiら編)中の, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), pp. 45-52; Frohmanら, Cell, 1989, 56:145-147）。現在では、マウスのいずれの遺伝子も計画的に変えることができる（Capecchi, M. R., Trends Genet., 1989, 5:70-76 ; Frohmanら, Cell, 1989, 56:145-147）。遺伝子ターゲティングは、選択される遺伝子座のクローン化したDNA配列に所望の変異を導入するための標準的な組み換えDNA技術の使用を伴う。「遺伝子ターゲティング」法を利用するために、興味対象の遺伝子を予めクローン化し、かつイントロン-エクソン境界を決定しなければならない。該方法は、特定の興味遺伝子の翻訳される領域へのマーカー遺伝子（例えば、nptll遺伝子）の挿入をもたらす。このように、遺伝子ターゲティング法の使用は、興味遺伝子の全体の破壊という結果になる。意義深いことに、細胞の遺伝子を変えるための遺伝子ターゲティングの使用は、その遺伝子配列の全体の変更の形成をもたらす。そしてその変異は、相同組み換えを通じて多能性の胚由来幹（ES）細胞のゲノムへと移行される。この変更された幹細胞は、マウスの胚盤胞へマイクロインジェクションされ、そして発生しているマウス胚へ合体させて、キメラ動物へ最後には発達させる。いくつかの場合において、キメラ動物の生殖細胞（germ line cells）は、遺伝子的変更のされたES細胞由来のものであり、かつその変異体の遺伝子型は繁殖を通じて遺伝することができる。
【００４２】
本発明のキメラまたはトランスジェニック動物の細胞を、ES細胞のような多能性前駆細胞または同等物であり得る、細胞への1つまたはそれより多いDNA分子の導入により調製し得る（Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (Robertson, E. J編)中の, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), pp. 39-44）。「前駆体」という用語は、多能性細胞が、本発明の教示に従って調製される、所望の（「トランスフェクションされた」）多能性細胞であることのみを意味する。該多能性（前駆体またはトランスフェクションされた）細胞は、キメラまたはトランスジェニック動物を作り上げるために、当該技術で既知の様式（Evansら, Nature, 1981, 292:154-156）でインビボにおいて培養することができる。本発明にしたがって、いずれのES細胞も用いることができる。しかしながら、ES細胞の初めての単離物を用いることが望ましい。そのような単離物は、Robertson, E. J.（Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R.（編）中の, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), pp. 39-44）により開示されたCCE細胞株のような胚から直接、またはCCE細胞株からES細胞のクローン化単離（Schwartzbergら, Science, 1989, 246:799-803, この文献は参照により本明細書に取り入れられる）から得ることができる。そのようなクローン化単離は、E. J. Robertsonの方法（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (E. J. Robertson編)中の, IRL Press, Oxford, 1987、この文献と方法は参照により本明細書に取り入れられる）によって成し遂げることができる。そのようなクローン化増殖の目的は、動物への分化のためにより大きい効果を有するES細胞を得ることである。クローンとして選択されたES細胞は、トランスジェニック動物の作製において、前駆細胞株CCEよりも約10倍よりも高い効力を持つ。本発明の組み換え方法の目的のために、クローン化選択は利点を提供しない。クローンとして胚から由来するES細胞株の例は、ES細胞株ABI（hprt+）またはAB2.1 （hprt"）である。該ES細胞は、E. J. Robertson（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach中の（E. J. Robertson編, IRL Press, Oxford, 1987, pp 71-112）、この文献は参照により本明細書に取り入れられる）に記載されるように、（STO細胞（特にSNC4 STO細胞）および／または初代胚性線維芽細胞のような）間質性細胞上に培養されることが好ましい。キメラマウスの作製と解析の方法は、Bradley, A.により開示される（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach中の (E. J. Robertson編), IRL Press, Oxford, 1987, pp 113-151、この文献は参照により本明細書に取り入れられる）。間質性（および／または線維芽）細胞は、異常なES細胞のクローンの過増殖を排除することに役立つ。最も好ましくは、該細胞を白血球阻害因子（「lit」）の存在下で培養する（Goughら, Reprod. Fertil. Dev., 1989, 1:281-288; Yamamori, Y.ら, Science, 1989, 246:1412-1416）。lifをコードする遺伝子はクローン化されているので（Gough, N. M.ら, 1989, Reprod. Fertil. Dev. 1:281-288）、当該技術において既知の方法により、この遺伝子で間質性細胞を形質転換し、そして培養培地中へlifを分泌する形質転換した間質性細胞上でES細胞を培養することが特に好ましい。
【００４３】
本発明はまた、上記で定義したトランスジェニックマウスから単離された細胞に関連する。前記細胞が、以下の遺伝子型：
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-A2+/+、HLA-DR1+/+、
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-A2+/+、
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-、HLA-DR1+/+、および
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb -/-
のうちの1つを有することが好ましい。
【００４４】
本発明はまた、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子との同種からの造血異種前駆体、例えばヒト造血前駆体を移植するための受容宿主としての、上記で定義したトランスジェニックマウスの使用に関連する。
【００４５】
本発明はまた、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子との同種からの造血異種前駆体、例えばヒト造血前駆細胞を、上記で定義したトランスジェニックマウスへ移植する工程を含む、異種の機能的免疫系を有するキメラマウスの作製方法に関連する。
【００４６】
マウス宿主のMHCハプロタイプは、ドナー細胞の1つに前記機能（previous function）を確実にすることを強制しない。それゆえ、異種のMHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子は、前駆細胞に存在する対立遺伝子の配列または前駆細胞に存在しない他の対立遺伝子の配列を有し得る。マウス宿主とドナー細胞との間のMHCハプロタイプが異なる場合、ドナーT細胞は宿主とそのMHCの状況の両方に教育されるであろう。
【００４７】
造血前駆細胞、例えばヒト造血前駆体、およびそのような細胞をマウスへ移植する方法は、当該技術において公知である（Traggiaiら, Science, 2004, 304, 104-107; Ishikawaら, Blood, 2005, 106, 1565-1573; Gimenoら, Blood, 2004, 104, 3886-3893; Vodyanikら, Blood, 2005, 105, 617-626）。ヒト前駆体は、臍帯血、胎児肝臓、成人または胚性肝細胞のような異なる源から生じ得る。該細胞を、トランスジェニックマウスへの造血前駆細胞の生着率を改善するために、移植前に適切な時間で培養し得る。移植される細胞数は、トランスジェニックマウスへの最適な移植を得るように測定される。例えば、臍帯血または胎児肝臓から単離したヒトCD34+細胞（104〜106個）は、腹腔内、肝臓内、または静脈内、例えば顔面の血管を介して、致死量未満の放射線照射された新生マウスに移植される。
【００４８】
さらに、造血前駆細胞は、遺伝子的に改変され得る。それらは、機能的T、Bおよび樹状細胞へ造血前駆体が分化することを改善する遺伝子改変を有利に含み得る。これら改変は、当業者に公知である。例えば、造血前駆細胞でのSTAT5の条件的発現は、Kyba, M.およびDaley, G. Q., Experimental hematology, 2003, 31, 994-1006に記載のように得ることができる。
【００４９】
造血前駆体は、異種のMHC多型を考慮に入れるために、好ましくは異なるMHCハプロタイプ、より好ましくは異種において最も頻出のハプロタイプのドナーからである。例えば、マウスは、ヒト個体群に最も頻出のHLAハプロタイプのトランスジェニックである。これらヒト化マウスは、ヒト個体群の遺伝子の多様性を反映するHLA分子を有する。それゆえ、それらの免疫系は、該個体群のほとんどの個体の免疫系を反映する。
【００５０】
前駆細胞のハプロタイプはまた、疾患、例えば、自己免疫疾患（Jonesら, Nature Reviews Immunol., 2006, 6:271-282）またはHCV（Yee L.J., Genes and Immunity, 2004, 5:237-245）もしくはHIV（Bontrop R.E.およびD.I. Watkins, Trends in Immunol., 2005, 26:227-233）のようなウィルス感染の進展または結果に関連するハプロタイプに相当し得る。
【００５１】
本発明はまた、異種の適応免疫系、例えば、ヒトの適応系の発達をインビボで研究するためのモデルとしての、上記で定義したキメラマウスの使用に関連する。
【００５２】
本発明はまた、インビボでの異種の免疫系、例えば、インビボでのヒトの免疫系の発達を解析するための方法に関連し：
- いずれの適切な手段により、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子と同種からの造血異種前駆細胞、例えば、ヒト造血前駆細胞を、上記で定義したトランスジェニックマウスへ移植する工程、および
- いずれ適切な手段により、移植されたマウスにおける、異種、例えば、ヒトの機能的T、Bまたは樹状細胞の存在をアッセイする工程
を含む。
機能的T、Bおよび樹状（DC）細胞の存在は、当該技術において公知のいずれの技術によりアッセイされる。
【００５３】
移植から数週間（4週間〜約12週間）後に、骨髄、脾臓、胸腺および末梢血を、適切なマーカーの発現に基づき、フローサイトメトリおよび／または免疫組織化学法により解析し得る。生着のレベルは、異なるリンパ器官における、ヒト白血球（CD45+）細胞数ならびにT細胞（CD45+、CD3+）、B細胞（CD45+、CD19+）および樹状細胞（CD45+、CD11+ およびCD45+、CD11-CD123+）の割合の測定により決定される。
【００５４】
機能的ヒトT細胞の存在を、例えばアロ抗原（混合リンパ球反応）へのT細胞の増殖能またはサイトカイン産生能（ELISPOT、細胞間フローサイトメトリ）の測定でアッセイし得る。T細胞レパートリーの多様性を免疫検鏡解析（immunoscope analyses）によりアッセイし得る。
【００５５】
機能的ヒトB細胞の存在を、ELISAによるマウス血清における全ヒト免疫グロブリン、hIgGおよびIgMの測定またはELISPOTによる免疫グロブリン分泌細胞の測定によりアッセイし得る。
【００５６】
機能的DCの存在を、同種T細胞の増殖を誘導する能力（CD11-細胞）または刺激後のIFN-α産生能（CD11+細胞）の測定により生体外（ex vivo）でアッセイし得る。
【００５７】
本発明はまた、インビボでの抗原に対する異種の免疫応答、例えば、インビボでの抗原に対するヒトの免疫応答を解析する方法に関連し：
- いずれの適切な手段により、MHCクラスIおよび／またはクラスII導入遺伝子と同種からの造血異種前駆細胞、例えば、ヒト造血前駆細胞を、上記で定義したトランスジェニックマウスへ移植する工程、
- 移植した細胞を興味対象の抗原と接触させる工程、および
- いずれの適切な手段により、マウスにおいて、該抗原に対する体液性応答、ヘルパーT細胞応答または細胞傷害性T細胞応答の存在をアッセイする工程
を含む。
【００５８】
機能的免疫系の再構成を可能にするのに十分な時間の後に、抗原を注射することが好ましい。あるいは、免疫の発達、例えば、T細胞の成熟に対する抗原の効果を評価することは、興味深い。
【００５９】
抗原は、天然物、組み換え体または合成物であり得る。抗原は、ポリペプチド配列またはRNA、DNA、もしくは両方を含み得るポリヌクレオチド配列を含み得る。ある実施形態において、抗原は、1つまたはそれより多い抗原性ポリペプチドを発現可能にコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。この文脈で用いられる、「含む」という語は、少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、少なくとも1つの抗原性ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドに従って機能する、宿主細胞の転写および／または翻訳装置により供給されることを意味する。本発明の抗原は、いずれの抗原性分子でもあり得る。
【００６０】
抗原性分子は：アルブミン、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、細菌外膜タンパク質（髄膜炎菌外膜タンパク質を含む）、RSV-Fタンパク質、マラリア由来ペプチド、B-ラクトグロブリンB、アプロチニン、卵白アルブミン、リゾチームのような、ウィルス、細菌、寄生虫、動物、および真菌のタンパク質を含む、タンパク質、リポタンパク質、および糖タンパク質、ならびに癌胚抗原（CEA）、CA 15-3、CA 125、CA 19-9、前立腺特異的抗原（PSA）のような腫瘍関連抗原；天然発生および合成ポリサッカリドを含む炭水化物、ならびにフィコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アガロース、ポリアクリルアミドおよびその他のアクリル樹脂、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）、ポリビニルアルコール、部分的に加水分解されたポリビニルアセテート、ポリビニルピロリジン（polyvinylpryrolidine）、B群連鎖球菌および肺炎双球菌の莢膜ポリサッカリド（III型を含む）、緑膿菌ムコエキソポリサッカリド（Pseudomonas aeruginosa mucoexopolysaccharide）、ならびに莢膜ポリサッカリド（フィッシャーI型を含む）、およびインフルエンザ菌ポリサッカリド（Haemophilus influenzae polysaccharides）（PRPを含む）のようなその他のポリマー；ハプテン、ならびにTNP、サッカリド、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、ペプチド、毒素、薬物、化学物質、およびアレルゲンのような低分子量分子を含むその他の成分；ならびにハプテンおよび細菌、真菌、ウィルス、寄生虫およびプリオン由来の抗原を含む。
【００６１】
細菌は、例えば：ジフテリア菌（C. diphtheriae）、百日咳菌（B.pertussis）、破傷風菌（C. tetani）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、肺炎双球菌（S. pneumoniae）、大腸菌（E. Coli）、莢膜桿菌（Klebsiella）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、髄膜炎菌（N. meningiditis）、炭疽菌（B. anthracis）、リステリア菌、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）および肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、リケッチア、A群連鎖球菌（Group A Streptococcus）、B群連鎖球菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、サルモネラ菌、赤痢菌（Shigella）、マイコバクテリア（結核菌（Mycobacterium tuberculosis））およびマイコプラズマを含む。ウィルスは、例えば：ポリオ、おたふくかぜ、麻疹、風疹、狂犬病、エボラ、A、B、C、DおよびE型肝炎、水痘-帯状疱疹、単純ヘルペス1および2型、パラインフルエンザ1、2および3型、ヒト免疫不全ウィルスIおよびII、RSV、CMV、EBV、ライノウィルス、AおよびB型インフルエンザウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、ロタウィルスおよび腸内ウィルスを含む。真菌は、例えば：カンジダ（Candida sp.）（カンジダアルビカンス（Candida albicans））を含む。寄生虫は、例えば：マラリア原虫（熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum)）、ニューモシスチスカリニ（Pneumocystis carinii）、リーシュマニア、およびトキソプラズマを含む。
【００６２】
抗原に対する免疫応答の存在は、当該技術において公知のいずれの技術によりアッセイされる。
抗原に対する体液性応答の存在は、ELISAによるマウス血清中の抗原特異的抗体の力価の測定、またはELISPOTによる抗体分泌細胞数の測定によりアッセイされる。
抗原に対するヘルパーT細胞応答の存在は、T細胞増殖アッセイまたはサイトカイン産生アッセイ（ELISPOTまたは細胞間フローサイトメトリ）によりアッセイされる。
抗原に対する細胞傷害性T細胞応答の存在は、インビトロまたはインビボでのCTLアッセイによりアッセイされる（Barberら, J. Immunol., 2003, 171:27-31）。
【００６３】
本発明の方法は、抗原のマッピングのために、新しい抗原のスクリーニングのために、およびヒトワクチン用の異なる抗原調製物の免疫原性を評価するために用い得る。
【００６４】
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、導入遺伝子生物学、微生物学、組み換えDNA、および免疫学の従来技術を使用する。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); DNA Cloning, IおよびII巻 (D. N. Glover編, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Mulliら、米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins編, 1984); Transcription And Translation (B. D. HamesおよびS. J. Higgins編, 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGY (J. AbelsonおよびM. Simon,編集主任, Academic Press, Inc., New York) のシリーズ, 特に154巻および155巻 (Wuら編) ならびに185巻, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. MillerおよびM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayerおよび Walker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, I巻〜IV巻 (D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編, 1986);および Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【００６５】
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるトランスジェニックマウスおよびその使用を説明する実施例、および添付図面を参照する以下の記載から明らかになる他の特徴をさらに含む。
【実施例】
【００６６】
実施例１：トランスジェニックマウスの作製および特徴決定
１）材料と方法
a）マウス
トランスジェニックマウスは、異なるマウス系統を交配することにより作製した：
- Rag2-/-マウス（Takedaら, Immunity, 1996, 5, 217-228）とγc-/-マウス（DiSantoら, P.N.A.S., 1995, 92, 377-381）との交配により得られたRag2-/-、γc-/-（129背景）。
- Zijlstraら, Nature, 1990, 344, 742-746に記載されるβ2m-/-（C57Bl/6背景）。
- Takedaら, Immunity, 1996, 5, 217-228に記載されるI-Aβb -/-（C57Bl/6背景）。
- HLA-DRA*0101およびHLA-DRB1*0101遺伝子によりコードされるDR1分子を発現する、Altmannら, J. Exp. Med., 1995, 181, 867-875に記載されるHLA-DR1トランスジェニックマウス（DR1+、FVB背景）。
- キメラ単鎖（そのN末端にてヒトβ2mのC末端に15アミノ酸のペプチドリンカーによって連結されるHLA-A2.1のα1-α2ドメイン（HLA-A*0201遺伝子によりコードされる）、H-2 Dbの細胞質ドメインまでのα3）を発現する、Pascoloら, J. Exp. Med., 1997, 185, 2043-2051に記載されるHLA-A2.1トランスジェニックマウス。
【００６７】
より明確には、Rag2-/-、γc-/-マウス（129背景）をI-Aβb -/-（C57Bl/6背景）と交配し、該F1子孫をβ2m-/-（C57Bl/6背景）、HLA-DR1トランスジェニックマウス（DR1+、FVB背景）およびHLA-A2.1トランスジェニックマウスと連続的に交配した。I-Aαb+（マウスMHCクラスII-/-表現型に必須）およびC5-/-子孫（129およびFVB系統の両方が構成的にC5-/-）は、各交配から選択した。
【００６８】
b）遺伝子型決定
各子孫の遺伝子型は、標準的なプロトコルおよび異なる遺伝子のための以下のプライマーを用いる、尾のDNA へのPCR法により決定された。
【００６９】
【表１】
2009542253.tif 000002
【００７０】
c）フローサイトメトリ解析
ヒトPBL、C57Bl/6、Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-、HLA-A2+/+、HLA-DR1+/+、Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-、HLA-A2+/+、Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-、HLA-DR1+/+、およびRag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-マウスの脾臓細胞を引き裂き、そして抗FcR抗体とともにインキュベートした。それから、細胞を0.05 %アジ化物、2% FCS、および適切な蛍光色素でコンジュゲートした抗HLA-DR/DP/DQ、抗HLA-A/B/C、抗H-2 IAb、抗H-2Db + 抗Kb、抗マウスCD19、抗マウスCD3、抗マウスNK1.1モノクローナル抗体（mAb）を含むPBS中で染色した。染色後、細胞を2回洗浄し、そして同じ緩衝液に再懸濁した。標識は、CellQuestソフトウェアを有するLSRフローサイトメータで解析された。
【００７１】
２）結果
4つのマウス系統が得られた：
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-、HLA-A2+/+、HLA-DR1+/+、
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-、HLA-A2+/+、
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/-、HLA-DR1+/+、および
- Rag2-/-、γc-/-、β2m-/-、I-Aβb-/--。
4つのタイプのマウスにおける、マウスT、B（図１A）およびNK細胞（図１B）の不在は、蛍光活性化細胞選別により評価された。HLA-A2.1、H-2 Kb/Db、HLA-DR1およびH-2 IAb分子の細胞表面発現は、フローサイトメトリにより評価された。内因性H-2クラスIおよびクラスII分子の細胞表面発現は、該4つのマウスにおいて存在しなかった（図２Cおよび２D）。同様のレベルのHLA-A2.1発現（図２B）が、HLA A2.1 /HLA-DR1トランスジェニックH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスおよびHLA A2.1トランスジェニックH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスにおいて観察されたが、HLA-DR1トランスジェニックH-2 クラスI-/クラスII-KOマウスおよびH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスにおいては、HLA-A2.1が存在しなかった。同様のレベルのHLADR1発現（図２A）が、HLA A2.1 /HLA-DR1トランスジェニックH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスおよびHLA-DR1トランスジェニックH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスにおいて観察された一方で、HLA A2.1トランスジェニックH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスおよびH-2 クラスI-/クラスII-KO免疫欠陥マウスにおいては、発現は検出されなかった。しかしながら、トランスジェニックマウスにおいてHLA-DR1および-A2分子は、ヒトPBLにおいてよりも低かった。
【００７２】
実施例２：ヒト／マウス キメラの作製と特徴決定
１）材料と方法
a）細胞株
H9ヒト胚性幹細胞株は、WICELLから得た。H9細胞は、WICELLの推奨に従って、0.5 % グルタミン（GIBCO）、1 %非必須アミノ酸（GIBCO）、20 % Knockout（商標）血清代替物 （KSR；（GIBCO）、4 ng/ml bFGF（INVITROGEN）および100 μM β-メルカプトエタノール（GIBCO）を補ったF12培地（GIBCO）中において、継代23〜39回で使用され、かつ放射線照射されたMEF（マウス胚性線維芽）上で維持された。2つのOP-9マウス骨髄間質性細胞株が用いられた：「OP-9パスツール研究所」と呼ばれる1つは、標準的な手順により得られ、他方はATCC（＃CRL-2749（商標））から得た。どちらのOP-9細胞株も、1 % グルタミンおよび20 %合成（defined）血清（HYCLONE）を補ったα-MEM（SIGMA）を含むOP-9培地中で維持された。
【００７３】
b）CD34+細胞へのH9分化
手順は、Voldyanikらの記載から改変した（Blood 2005, 105, 617-626）。OP-9細胞は、集密になるまで15 cm直径ペトリディッシュ中に培養し、そして半分の培地を交換し、該細胞をさらに4日間培養した。この時、培地を100μM モノチオグリセロール（SIGMA）を補ったOP-9培地50 mlに取り換えた。コラゲナーゼ処理された100〜200万個の未分化H9細胞群を、OP-9層を含むペトリディッシュに加えた。半分の培地を4日目に交換し、そしてその後2日ごとに交換した。異なる日に、共培養物の一定量をコラゲナーゼIV（INVITROGEN）で5分間処理し、続いて15分間のトリプシン-EDTA（GIBCO）処理をした。処理された細胞を、APCコンジュゲート抗ヒト段階特異的胚性抗原4（SSEA-4；R&D SYSTEM）mAbおよびPEコンジュゲート抗CD34 (STEMCELL、クローン8G12) mAbを用いて共染色した。細胞は、FlowJoソフトウェアとインターフェイスで接続されたCyanサイトメータ（DAKO）で解析した。
【００７４】
c）免疫欠陥宿主のH9由来CD34+細胞との生着
H9/OP-9共培養の9日後、単一細胞懸濁物を5分間のコラゲナーゼIV（INVITROGEN）消化と続く15分間のトリプシン-EDTA（GIBCO）消化により作製した。CD34+画分は、製造者の推奨に従って、ダイレクトCD34前駆細胞単離キット（MYLTENYI BIOTECH）を用いる抗CD34磁性ビーズとのインキュベーションと、続くAutomacsソータ（MYLTENYI BIOTECH）での選別の後に濃縮された。該濃縮物は、30％のCD34+ H9細胞であった。6匹のRAG-/-、γc-/-、mβ2m-/-、I-Aβ-/-、C5-/-、HLA-DR1+、HLA-A2+ 新生マウスに、4 Gy／分でセシウム137源から、致死に近いと滴定される線量の3 Gyの放射線を4時間の間隔で2回照射した。20μlのPBS中の該細胞（3.104個のCD34+細胞に相当する計105個の細胞）を、以前に記載された（Traggiaiら, Science, 2004, 304, 104-107）ように、30ゲージの針を用いて、12時間後に肝臓内に生着させた。6週間後にマウスを犠牲にし、そして骨髄、脾臓および肝臓の単一細胞懸濁物を調製し、そしてFITCコンジュゲート抗CD45 mAb（BECTON DICKINSON）を用いて、ヒト造血細胞の存在についてフローサイトメトリで解析した。さらに、異なるリンパ系の再構成は、T（CD3+ CD4+ およびCD8+）、B（CD19）、NK（CD16）、DC（CD11c+ CD123+/-）およびマクロファージ（CD11b+）のフローサイトメトリ検出により解析された。各サンプルについて、少なくとも3.106イベントをLSR（BECTON DICKINSON）またはFlowJoソフトウェアとインターフェイスで接続されたCyanサイトメータ（DAKO）のどちらかで取得した。解析は、FSC/SSCの基準によるデブリスおよび赤血球を除く、全ての細胞について実行された。
【００７５】
Tレパートリーの多様性を、免疫検鏡法を用いて解析した。T細胞の機能性を、CFSE標識技術の使用による、増殖についてのMLRアッセイ、ならびに細胞間IL-2およびIFN-γサイトカインフローサイトメトリアッセイにおいて解析した。B細胞の機能性を、ELISAによる、全IgGおよびIgMのレベルについての血清の試験により評価した。
【００７６】
２）結果
a）全てのOP-9細胞がCD34+前駆体へのhES細胞分化を等しく支援するわけではない
H9ヒト胚性幹（hES）細胞をCD34+造血前駆体へ分化させるために、以前に記載（Voldyanikら, Blood 2005, 105, 617-626）されたように、未分化H9細胞をOP-9マウス骨髄（BM）由来間質性細胞株と共培養した。2つの異なるOP-9細胞株を用いた。両方のOP-9細胞株を用いるOP-9との共培養において、CD34+ヒト細胞をフローサイトメトリ細胞により確認した（図３Bおよび３C）。予期していたように、両方の細胞株と一緒にした場合、H9由来CD34+細胞は、未分化のマーカーSSEA-4を発現しなかった（図３Bおよび３C）。それにもかかわらず、CD34+を、第1のOP-9細胞株（パスツール研究所；図３B）を用いる8日目においては検出できなかったが、第2のOP-9細胞株（ATCC；図３C）を用いる8日目においては、第1のOP-9細胞株についての11日目（0.37％；図３B）よりも高いパーセンテージ（1.49％）で、それらはすでに産生されていた。対照として、MEF細胞とOP-9細胞のどちらも、用いた抗CD34 mAbおよびSSEA-4 mAbで標識しなかった（図３A）。そして、両方のOP-9細胞株を用いるH9分化の動態を比較した（図４Aおよび４B）。第2のOP-9細胞株を用いるH9細胞の分化は、より急速なだけでなく（14日目（図４A）に対して9日目（図４B）でピークに達した）、より効率的に起こった（0.69％（図４A）に対して5.41％（図４B））。CD34+細胞へのH9細胞の進行的分化は、8日目における未分化SSEA-4+ H9細胞のほとんど完全な喪失（0.8％；図４B）と相関した。このように、これらの結果より、H9 hES細胞をCD34+ 細胞へと分化させる、OP-9細胞の能力を確認した。さらに、これらの結果は、全てのOP-9細胞が、CD34+細胞へのhES細胞の分化を等しく支援するのではないことも示した。
【００７７】
b）RAG-/-、γc-/-、mβ2m-/-、I-Aβ-/-、C5-/-、HLA-DR1+、HLA-A2+ 免疫欠陥宿主のH9由来CD34+の生着
そして、少数のH9由来CD34+がRAG-/-、γc-/-、mβ2m-/-、I-Aβ-/-、C5-/-、HLA-DR1+、HLA-A2+ 免疫欠陥宿主に生着する能力を評価した。これのために、H9細胞におけるCD34+発現を、OP-9細胞との共培養後の異なる時間においてモニターした。9日目において、パーセンテージが６％付近に達したとき（図４B）、該共培養細胞を貯留し、そしてCD34+細胞の磁気的選別により濃縮した。6匹の放射線照射された免疫欠陥の新生マウスの肝臓内に、マウス1匹当たり3.104個のCD34+細胞に相当する105個のH9/OP-9細胞を注射した。6週間後、生着されたマウスの異なる器官におけるヒト造血CD45+細胞の存在を、フローサイトメトリによって解析した。結果の統計学的有意性について、各サンプルにおいて多数（少なくとも3.106個の細胞）が解析された（図５）。図５Aにおいて示したように、非生着の対照（0.01％）と比較して、ヒトCD45+細胞による生着の有意なレベルが、試験された全ての宿主（0.298％±0.121）のうち、移植を受けた免疫欠陥宿主の脾臓（0.54％および0.33％）において見られた。以前に観察したように、CD45発現のレベルは、H9由来造血ヒト細胞では、ヒト末梢臍帯血細胞よりも低かった。CD45+の有意なパーセンテージは、より低いレベルではあるが、キメラの骨髄においても見られた（非生着マウスにおける9.44 x 10-3に対して0.013％）。生着の有意なレベルが、6匹中2匹のキメラについて観察された（0.013％図５Cおよび0.011％）。CD45+細胞は、マウスの肝臓において検出されなかった。
【００７８】
重要なことに、受容マウスの極度に重症の免疫欠陥（T、BおよびNK細胞がなく、補体タンパク質C5がなく、致死量未満の放射線照射）および注射されたCD34+細胞の純度が30％だけである事実にもかかわらず、マウスにおいて奇形腫が検出されず、マウスは移植後の少なくとも6週間まで健康なままであった。これは、H9/OP-9共培養中でSSEA-4+未分化細胞のパーセンテージが進行的に減少するので、それらは共培養の8日目までにほとんど消失する（0.8％付近）という事実により説明し得る。さらに、この観察は、OP-9層上でのH9細胞分化の状況が本研究で用いられたものである場合は少なくとも、免疫欠陥マウスへの移植前のCD34+細胞の徹底的な細胞選別は、必ずしも必要ではないことを指摘する。
【００７９】
これらの結果は、OP-9細胞と共培養されたH9 hES細胞から規定されるCD34+は、肝臓に生着でき、かつリンパ系のない宿主の脾臓と骨髄の両方において少なくとも6週間はCD45+細胞として移動および生存できることを示した。放射線照射されたNOD/SCIDマウスで得た結果とは反対に（Wangら, J. Exp. Med., 2005, 201, 1603-1614）、本発明のRAG-/-、γc-/-、mMHC-/-、HLA+、C5-/-マウスへのヒト胚性幹細胞（hES細胞）由来CD34+の肝臓内への注射は、いかなる死も引き起こさなかっただけではなく、トランスジェニックマウス受容者の骨髄および脾臓へのヒトCD45+細胞の移動を引き起した。この違いは、本発明のマウスのC5欠陥もしくはhES細胞からのCD34+細胞の分化の異なる方法、またはその両方によるのであろう。遅延した発現および／またはそれらの内皮分化のため（Wangら, Immunity, 2004, 21, 31-41）、用いた共培養の時間において、CD34+細胞は、CD45+が発現しているとしてはほとんど記載されなかった（Voldyanikら, Blood 2005, 105, 617-626）。このことは、造血の潜在能力を示す、生着されたCD34+ CD45-細胞が、マウスでの生着においてインビボでCD45+細胞に分化できることを意味する。あるいは、注射されたCD34+ CD45+は、ほとんど広がることができない。両方の仮説は、CD34+ CD45+およびCD45-の選別ならびに移植後の両方のヒトサブセットの運命の比較により試験できる。
【００８０】
生着のレベルは、臍帯血（CB）CD34+を用いる以前に観察した生着（Ishikawaら, Blood, 2005, 106, 1565-1573）よりも明らかに低い。それにもかかわらず、全てのhES由来CD34+細胞は、CB CD34+細胞と比較して、生着、生存およびCD45+造血前駆体への分化の能力について同等でないだろう。これは、それらの「未成熟さ」およびそれらが内皮性に対する造血性の完全な分化潜在能力を未だに保存しているという事実によるのだろう。ヒト胎児CD34+前駆体を用い、かつRag-/-、γc-/-マウスの効率のよいヒト造血系再構成を導く研究において（Gimenoら, Blood, 2004, 104, 3886-3893）、CD34+サブセットはまた、造血前駆体の点から見ると臍帯血ほどに純粋でないだろう。しかしながら、これらの場合において、かなり多数のCD34+ドナー細胞（0.5〜2.106個）が生着した。
【００８１】
それゆえ、マウス1匹当たりにより多くのhES由来CD34+が、CFUを用いてインビトロ試験で示されたように（Galicら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 11742-11747；Voldyanikら, Blood 2005, 105, 617-626）、十分なH9由来胚性幹細胞が生着し、かつ骨髄系およびリンパ系へとさらに分化することを確実にするために必要とされ得る。生着率を改善するためのさらなる実験が目下、進行中である：1- より多数のH9由来CD34+細胞（マウス当たり1〜2.106個）の注射；2- OP-9層上での共培養の異なる時間の後の注射、3- より長時間の再構成、4- hES細胞の遺伝子改変、特にSTAT5の条件的発現、これはES/OP-9共培養物由来のマウス造血前駆体からのインビトロおよびインビボでの造血系への分化を加速させる（Kyba, M.およびDaley, G.Q., Experimental hematology, 2003, 31, 994-1006）；5- 異なる経路の注射（肝臓内に対する静脈内）。
【００８２】
実施例３：病原体に対する免疫応答の研究のためのヒト／マウス キメラの使用
ヒト／マウス キメラはHIV感染のモデルとして、特に対照および／またはこの感染の病変におけるCD8 T細胞の役割を研究するために使用される。
実施例２の記載のように、ヒト免疫系により既に再構成されたヒト／マウス キメラの腹腔内に、HIVウィルス単独（ウィルス株または初代単離物）または感染したPHA-芽性同種T細胞のいずれかを注射した。血液サンプルを感染後の異なる時点において採取し、フローサイトメトリによりヒトCD4およびCD8 T細胞のパーセンテージ、ならびに血漿のウィルス量（プロウィルス性DNAおよびウィルス性RNA）の両方をモニターした。
【００８３】
感染キメラにおける抗ウィルス性T細胞応答を、以下のアッセイにおいて、評価し、そして非感染キメラからのT細胞により得られる応答と比較した：
- キメラの脾臓およびリンパ節からの抗ウィルス性T細胞の広がりを、HLA-DR1またはHLA-A2に拘束される異なるHIVペプチド複合体の四量体を用いるフローサイトメトリにより測定した、
- HLA-DR1またはHLA-A2に拘束される異なるHIVペプチドによる脾臓およびリンパ節T細胞のインビトロでの再刺激後に、ELISPOTまたはフローサイトメトリ（細胞間染色法）を用いて、γIFN、αTNFおよびIL-2の産生を評価した、
- インビトロでの51Cr放出アッセイ、およびHLA-A2に拘束される異なるHIVペプチドを載せるか、または載せないCFSE標識した同系B細胞標的のインビボでの注射によって、抗ウィルス性細胞毒性を測定した。
【００８４】
HIV感染中のCD8 T細胞の役割を、CD8 T細胞の消耗および注入により評価した：
- 抗ヒトCD8抗体の注射を用いて、感染キメラのCD8 T細胞を消耗させた。該消耗を血液サンプルからフローサイトメトリにより確認した。そして、CD4 T細胞のパーセンテージならびに脾臓およびリンパ節のウィルス量を、CD8を消耗したものとCD4を十分に持ったHIV感染キメラとの間で比較した、
- HIV感染キメラからの同系CD8 T細胞を、CD8 T細胞消耗HIV感染キメラへ養子的に移行した。CD4 T細胞のパーセンテージならびに脾臓およびリンパ節のウィルス量を、CD8を注射したものとCD8を注射しなかったHIV感染キメラとの間で比較した。
【００８５】
HIV感受性に対するCD8 T細胞の役割を、HIVを注射された、CD8を消耗したものおよびCD8を十分持ったキメラで評価した。増殖性感染を評価し、そして注射後の異なる時点においてCD8を消耗したものとCD8を十分に持ったキメラとの間で比較した。それゆえに、血液、胸腺、脾臓およびリンパ節細胞を、PHA刺激の前後において、ウィルスの存在についてRT-PCR法（ウィルス量）により、およびプロウィルスについてPCR法（プロウィルス量）により試験した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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