(57)【要約】  この発明は液体状の媒体からタンパク質を分離する方法に係り、タンパク質を含んだ液体状媒体を生成し、１５０ｍ２／ｇ超の比表面積と０．３５ｍｌ／ｇ超の細孔容積と４０ｍｅｑ／１００ｇ超のイオン交換容量と１５ｍｌ／２ｇ未満の水中における沈降容積を有する粘土材料を生成し、前記の粘土材料を３．５ないし９．０のｐＨ値に平衡化し、前記液体状媒体を前記平衡化された粘土材料によって処理し、浄化されタンパク質が削減された液体状媒体を粘土材料から分離することからなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  タンパク質を含んだ液体状媒体を生成し；
−  １５０ｍ２／ｇ超の比表面積と；０．３５ｍｌ／ｇ超の細孔容積と；４０ｍｅｑ／１００ｇ超のイオン交換容量と；１５ｍｌ／２ｇ未満の水中における沈降容積を有する粘土材料を生成し；
−  前記粘土材料を３．５ないし９．０のｐＨ値に平衡化し；
−  前記液体状媒体を前記平衡化された粘土材料によって処理し；
−  浄化されタンパク質が削減された液体状媒体を粘土材料から分離する、
ことからなる液体状の媒体からタンパク質を分離する方法。
【請求項２】
粘土材料は、無水の粘土材料（完全乾燥）に関して、１１％未満のＡｌ２Ｏ３含有率を有するものとされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
粘土材料は、無水の粘土材料（完全乾燥）に関して、６５重量％超のＳｉＯ２含有率を有するものとされる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
粘土材料の細孔容積の少なくとも４０％が少なくとも１４ｎｍの細孔直径を有する細孔から形成される請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
室温において水中に３日間放置された後の粘土材料の沈降容積が１５ｍｌ／２ｇ未満、特に１０ｍｌ／２ｇ未満である請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
粘土材料に酸による表面活性化を施さないものである請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
粘土材料を緩衝剤によって平衡化してなる請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
緩衝剤は３０ないし１００ミリモルの範囲の濃度を有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
粘土材料がアルカリ金属含有化合物、特にナトリウム含有化合物を用いた処理によって活性化される請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質を分離するために少なくとも部分的に前記粘土材料から形成されているフィルタパッケージを介して液体状媒体を誘導してなる請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質を分離するためにその内容物が主に前記粘土材料から形成されているクロマトグラフィカラムを介して液体状媒体を誘導してなる請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
浄化されタンパク質が削減された液体状媒体の分離後に粘土材料上に結合されたタンパク質を溶出剤によって溶出する請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
溶出剤が液体状媒体とは異なったｐＨ値を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
粘土材料は４５μｍ超の粒子大を有する請求項１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
粘土材料混合物をさらに別の吸着材料と共に使用する請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記さらに別の吸着材料はシリカゲル、セルロース、およびポリビニルピロリドンからなる一群の中から選択してなる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記粘土材料と前記さらに別の吸着材料は重量に関して１：１０ないし１０：１の比率で存在してなる請求項１５または１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体状の媒体からタンパク質を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日生物活性物質の製造は細胞培養技術の補助に大きく依存して実施される。確立されている方法によって例えば食品製造等の技術的な用途のための酵素の製造ならびに医薬目的において有意義な再結合されたタンパク質の製造の両方が可能である。そのため、目的タンパク質を微生物あるいは哺乳動物細胞によって生成し、その後培養媒体あるいは細胞から隔離する。この製造プロセスは、予め貯蔵された媒体準備物を使用した発酵と、その後の目的タンパク質の浄化のための後続プロセスに区分される。タンパク質浄化のプロセス工程のコストはしばしば全コストの８０％を超えるものとなる。浄化のため、一方で目的タンパク質を濃縮し他方で不要タンパク質ならびに内毒素、ウィルスあるいはＤＮＡ等の不純物を分離するために大抵はクロマトグラフィ式の方法が使用される。クロマトグラフィ材料を複数回使用する場合、その分離能力あるいは場合によって生じる微生物汚染を常に検査する必要がある。使い捨て材料を使用することによって検査および洗浄のためのコストを部分的に節約することができる。効果的な使用のためにはその種の使い捨てクロマトグラフィ材料が再現可能で高い分離能力を有する必要があり、また低い単位使用量当たりの設備費用で充分であることが求められる。必要とされる目的タンパク質あるいは有害な不純物に対して高い結合容量および高速な結合速度を有する必要がある。
【０００３】
ベントナイトおよび特にその鉱物主成分であるモンモリロナイトはタンパク質の可逆的な結合に適している。その際ベントナイトならびにその他の同様な層状珪酸塩が天然の陽イオン交換体として作用し、その等電点未満のｐＨ値でタンパク質を吸着する。しかしながらナトリウムベントナイトは水中で強度に膨潤する性質を有している。数グラムのナトリウムベントナイトを水性の溶液中に付加すると、それによって粘性の大幅な上昇がもたらされ、その結果液体状の媒体の取り扱いが大幅に困難になる。さらに、強度の膨潤のためフィルタパッケージあるいはカラムパッケージの容積が増大しそれによってフィルタあるいはカラムが閉塞するため、ナトリウムベントナイトは高コストのフィルタ媒体あるいはパッケージとしてのみクロマトグラフィカラム内に使用することができる。従って産業上の利用については従来、ナトリウムベントナイトをいずれも洗浄される液体状媒体にバッチ式に添加しタンパク質の吸着後にベントナイトを再度濾過するかあるいは洗浄された液体状媒体を圧搾によってベントナイトから分離する可能性のみが存在していた。
【０００４】
濾過された均質甜菜果汁から酵素を分離するための層状珪酸塩の使用について、Ｃ．バターサック、Ｋ．ノビコフ、Ａ．シェーパー、およびＫ．ブフホルツ氏等が報告している（製糖工業第１１９巻（１９９４年）、第４版、第２８４ないし２９１頁）（非特許文献１）。ナトリウムベントナイト上の吸着と後続するｐＨ緩衝剤による脱離により簡便な方式で酵素を純粋な形態に分離することができた。この作業によってタンパク質の分離あるいは濃縮における層状珪酸塩の高い適用性が証明された。しかしながら、層状鉱物は水中においてスラリの粘性の大幅な上昇をもたらし層状鉱物が極めて細かい粒子に分解されるため、その層状鉱物の取扱いは複雑なものとなる。従って、層状材料をカラム内に収容しそれを介してタンパク質を含有する液体を誘導する方式でタンパク質の濃縮を行うことは極めて困難である。層状鉱物が強度に膨潤するため補助的な処置を施さなければカラムが比較的急速に閉塞する。それにもかかわらずカラム中における酵素の分離を可能にするため、前記の研究者等はナトリウムベントナイトをアルギン酸カルシウムゲル内に注入することを提案している。固定化されたベントナイトのペレットを充填したカラムを介して水化されたホモジェネートをｐＨ＝５．０でポンピングする。吸着されていない成分がカラムから流出した後、ｐＨ＝８に調節した緩衝剤溶液によって酵素を溶出する。前記の研究者等によって報告されたようにアルギン酸カルシウム中で固定されたナトリウムベントナイトの使用は、その高いコストのため大量生産的なタンパク質の分離にはあまり適していない。
【０００５】
独国特許出願公開第１１６０８１２号Ａ１明細書（特許文献１）には大口径の孔を有するシリカゲルを吸着剤として使用したビールのタンパク質安定性の向上方法が記載されている。その際ビールを、２００ないし４００ｍ２／ｇの比表面積と０．６ｍｌ／ｇ超の細孔容積と６０Å（オングストローム）超の細孔直径を有する微細に粉砕したシリカゲルで処理する。
【０００６】
英国特許第７５２６６９号明細書（特許文献２）にはインシュリンを含んだ溶液から珪素を含有する不純物を分離する方法が記載されている。インシュリンの製造に際しては二酸化珪素あるいは粘土上でそれを吸着することによって有機溶液から分離することができ、それによって溶媒を分離することができる。その後インシュリンを強アルカリの水性溶液によって再び溶出することができる。しかしながら、強アルカリのｐＨ値のため水性のインシュリン溶液が珪素を含んだ不純物によって汚染され、それが吸着剤によって析出される。その不純物はコロイド状の形態で存在し、従って濾過によるそれの分離は困難である。その不純物を分離するために、水性の溶液を６．５ないし９．０のｐＨ値に調節しその後放置することが提案されている。濾過によって容易に分離することができる沈殿物が形成される。
【０００７】
米国特許第４６０５６２１号明細書（特許文献３）には、有機改質された粘土によって酵素を転化する酵素の固定化方法が記載されている。粘土としてはその陽イオンの少なくとも一部がオニウムイオンおよび／または有機金属陽イオンによって置換されるスメクタイト、ヘクトライト、あるいは蛭石が使用され、従って粘土は疎水性の特性を有する。
【０００８】
米国特許第４１２６６０５号明細書（特許文献４）には、血しょうから得られたガンマグロブリンの留分を浄化するガンマグロブリンの製造方法が記載されている。そのためまずヒドロキシエチル澱粉、ゼラチン、ブドウ糖、あるいはアルブミン等の親水コロイドを含み緩衝剤によって３．５ないし８．０のｐＨ値に調節された水性の溶液内にガンマグロブリンを吸収させる。さらに浄化するためにこの溶液を粘土鉱物のスラリと混合する。粘土鉱物としては例えばベントナイトあるいは蛭石を使用することができる。例えばポリエチレングリコール等の有機溶媒を約１０重量％の分量で添加することによって、実質的に不純物を含んでいる第１の留分が生成される。これは例えば遠心分離によって分離することができる。その後約７．０ないし７．２のｐＨ値において別の有機溶媒を１６ないし２４重量％の割合で添加する。その際極めて純粋なガンマグロブリンの留分が生成され、それを例えば遠心分離によって分離することができる。
【０００９】
欧州特許出願公開第００７１６４７号Ａ１明細書（特許文献５）には、水性溶液からインターフェロンを分離する方法が記載されている。そのため、珪酸を含んだ組成物と溶液を混合する。その種の組成物としては例えばベントナイト、酸性粘土、カオリン、あるいはアルミニウムマグネシウム珪酸塩を使用することができる。インターフェロンは組成物から吸着され非イオン表面活性物質を含んだ水性溶液によって溶出することができる。好適な表面活性化合物は例えばソルビタンモノアルキルエステル、ポリアルキルエーテル、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体である。
【００１０】
近年、生物分子の吸着において極めて良好な性質を示す別の等級の粘土材料が発見された。この材料は、従来使用されていた粘土と同様に風化性材料である。しかしながら、これは結晶性の性質を示さず、従ってＸ線非晶質である。これは、従来使用されていた粘土と比べて極めて高いＳｉＯ２含有率と極めて高い細孔容積を有する。ナトリウムベントナイトと異なって水中で膨潤しない。本出願の優先日の後に公開された独国特許出願公開第１０２００５０１２６３９号Ａ１明細書（特許文献６）には、前記の種類の粘土材料を液体状の媒体から有害な生物分子を分離するために使用する方法が記載されている。その粘土材料は例えばワインの浄化またはビールの安定化に適している。
【００１１】
【非特許文献１】Ｃ．バターサック、Ｋ．ノビコフ、Ａ．シェーパー、およびＫ．ブフホルツ氏等、製糖工業第１１９巻（１９９４年）、第４版、第２８４ないし２９１頁
【特許文献１】独国特許出願公開第１１６０８１２号Ａ１明細書
【特許文献２】英国特許第７５２６６９号明細書
【特許文献３】米国特許第４６０５６２１号明細書
【特許文献４】米国特許第４１２６６０５号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０２００５０１２６３９号Ａ１明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明の目的は、大量生産レベルにおいても液体状の媒体からのタンパク質を分離に適している方法を提供することであり、ここで好適な一実施形態において大きな活性化損失を伴うことなく分離されたタンパク質を再生することを可能にするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の課題は請求項１に記載の特徴を有する方法によって解決される。従属請求項の対象は好適な追加構成形態である。
【００１４】
本発明に係る方法において液体状の媒体からタンパク質を分離するために：
−  タンパク質を含んだ液体状媒体を生成し；
−  １５０ｍ２／ｇ超の比表面積と；０．３５ｍｌ／ｇ超の細孔容積と；４０ｍｅｑ／１００ｇ超のイオン交換容量と；１５ｍｌ／２ｇ未満の水中における沈降容積を有する粘土材料を生成し；
−  前記粘土材料を３．５ないし９．０のｐＨ値に平衡化し；
−  前記液体状媒体を前記平衡化された粘土材料によって処理し；
−  浄化されタンパク質が削減された液体状媒体を粘土材料から分離する。
【００１５】
意外なことに、上記の性質を有する粘土材料は産業上の利用において好適な量でタンパク質を結合し得ることが判明した。粘土材料の３．５ないし９．０のｐＨ値への平衡化によって粘土材料上に吸着されたタンパク質の不可逆的な不活性化あるいは変性が防止され、それによってその活性化の大幅な喪失を伴うことなく必要に応じて再生することができる。平衡化は、必要とされるタンパク質も安定するかまたは顕著な不活性化が生じないようなｐＨ値を有する緩衝剤によって粘土材料を処理するような方式で実施することが好適である。その後の液体状媒体あるいは目的タンパク質の洗浄のためにも使用される緩衝剤を平衡化のために使用することが好適である。この緩衝剤は液体状媒体において設定されるものと略同等なｐＨ値に調節することが好適である。平衡化時間は例えば粘土材料の量に依存するか、あるいは粘土材料がパッケージあるいはカラムの形態で用意されている場合その寸法に依存する。極めて小さなカラムの場合、平衡化時間は僅か数秒のみとなり、他方極めて大きなカラムあるいはフィルタパッケージの場合より長い時間間隔が必要とされることも可能である。平衡化は少なくとも１０秒、特に少なくとも３０秒、特に好適には１ないし６０分の時間間隔で実施する。平衡化は、洗浄される液体状媒体あるいは洗浄されるタンパク質が未だ添加されていない緩衝剤溶液によって行うことが好適である。
【００１６】
本発明に係る方法において使用される粘土材料は別の利点として１５ｍｌ／２ｇ未満、特に１０ｍｌ／２ｇ未満の低い沈降容積を有し、すなわち水中において顕著には膨潤しない。その低い膨潤性のため、洗浄される液体状媒体に粘土材料を添加する際にタンパク質を含有する媒体に顕著な粘性の上昇は観察されない。さらに、比較的多量の粘土材料を液体状媒体中に付加することができ、従って比較的高い濃度で目的タンパク質を含んでいる媒体からそのタンパク質を分離することが容易に可能になる。液体状媒体からの使用される粘土材料の分離も濾過によって容易に可能になる。低い膨潤容量のため粘土材料はフィルタを閉塞するような作用をもたらさない。それによってタンパク質が剥脱された媒体の濾過に際して比較的低い圧力のみが必要とされる。
【００１７】
液体状媒体として生物原料から得られたあるいはタンパク質を含んでいる任意の液体を使用することができる。この方法は特に、大きな液体分量の中から必要とされる生物効果物質を分離し濃縮するために生物反応炉からの沈着物を処理することに適している。別の使用可能性は、例えば尿あるいはその他の生物試料等の体液からのタンパク質の分離である。そのことによって例えば体液等の試料からのタンパク質の迅速な分離および洗浄が可能になる。そのため、体液あるいはその他のタンパク質含有試料を予め適宜なｐＨ値に平衡化された粘土材料に付加する。タンパク質は粘土材料上で吸着され、他方液体相は分離される。その後粘土材料を水洗浄し、そのために緩衝剤溶液を使用し、そのｐＨ値はタンパク質を含有する液体状媒体が粘土材料上に付加される前に設定されるｐＨ値に略相当する。それによって不純物が洗浄され、他方タンパク質は粘土材料上に吸着されて滞留し、この方式によってさらに浄化される。この洗浄工程の後タンパク質が溶出され、従って濃縮された形態で存在する。
【００１８】
場合によって、例えば粗濾過を実施するかまたは試料を緩衝処理する等の一般的な方式で試料を前処理する必要がある。粘土材料の平衡化に際して設定されたｐＨ値に試料を緩衝処理することが好適である。この種の試料準備は当業者において周知である。本発明に係る方法において使用される粘土材料は陽イオン交換体として作用することが推定され、ここでアルカリおよびアルカリ土イオンが粘土材料から放出されタンパク質と交換される。タンパク質は帯電したアミノ酸残留物をタンパク質表面上に含み、それが帯電した基によって粘土材料の表面上で交換作用を成すことができる。タンパク質の正味電荷はそのタンパク質を包囲している溶液のｐＨ値とタンパク質のｐＩ値とから得られる。タンパク質のｐＩ値はそのタンパク質の正味電荷が０である際のｐＨ値に相当する。これはアミノ酸合成物ならびにタンパク質の三次構造から得られる。酸性のｐＨ領域においてアミノ酸（好適には強塩基のアミノ酸アルギニン、ライシン、およびヒスチジン）がプロトン化され、タンパク質は陽イオンの性質を示す。塩基性のｐＨ領域において酸基のアスパラギンおよびグルタミンが負に帯電し、タンパク質は陰イオンとして存在する。等電位点付近においてタンパク質と粘土材料との間の交換作用は小さくなり、それはｐＨ値とｐＩ値との差が大きくなるに従って増大する。従って分離されたタンパク質の等電位点から少なくとも１単位相違しているｐＨ値に媒体を調節することが好適である。例えばタンパク質が５．５のｐＩ値を有する場合、タンパク質の分離は約４．５未満のｐＨ値において実施することが好適である。
【００１９】
本発明に係る方法において使用される粘土材料は０．３５ｍｌ／ｇ超、特に０．５ｍｌ／ｇ超の細孔容積（ＢＪＨ法（１．７ないし３００ｎｍの範囲の直径を有する細孔に対する累積細孔容積）によって判定）と、１５０ｍ２／ｇ超、特に１８０ｍ２／ｇ超、特に好適には２００ｍ２／ｇ超の比表面積（ＢＥＴ法）と、４０ｍｅｑ／１００ｇ超のイオン交換容量とを有する。さらに、この粘土材料は極めて低い膨潤能力を有することを特徴とする。膨潤容積は沈降容積に相当するものであることが好適である。細孔容積、比表面積、イオン交換容量、ならびに膨潤容積を判定するために適した分析方法は後述する実施例の項目において記述する。
【００２０】
イオン交換容量が４０ｍｅｑ／１００ｇ超、特に４５ないし７５ｍｅｑ／１００ｇの範囲である粘土材料を使用することが極めて好適である。粘土材料が１５０ないし２８０ｍ２／ｇの範囲、特に１７０ないし２６０ｍ２／ｇの範囲の比表面積（ＢＥＴ）を有することが好適である。使用される粘土材料の細孔容積は０．３５ｍｌ／ｇ超、特に０．５ｍｌ／ｇ超、さらに好適には０．７ないし１．１ｍｌ／ｇ、特に好適には０．８０ないし１．０ｍｌ／ｇの範囲にあることが好適である。
【００２１】
前述したように、本発明に係る方法において使用される粘土材料は極僅かなレベルでしか膨潤せず、そのため例えばナトリウムベントナイトにおいて一般的に観察されるような水性の懸濁液の粘性の上昇の問題は発生しない。粘土材料を３日間室温下において水中に放置した後の沈降容積は１５ｍｌ／２ｇ未満、特に１０ｍｌ／２ｇとなることが好適である。室温とは１５ないし２５℃、特に約２０℃であると理解される。
【００２２】
粘土材料としては、好適には未だ化学的改質が施されていない、特に強酸によって脱アルミニウム化されていない、天然に存在する自然活性あるいは非自然活性粘土材料が使用される。この粘土材料を場合によって乾燥させ、適宜な粒子大に粉砕する。その粒子大は当業者において目的としている用途から自明である。
【００２３】
天然に存在する粘土材料の他に、上述したような性質を有する合成製造された粘土材料を使用することもできる。その種の粘土材料は例えば水ガラスおよび例えばベントナイト等の適宜な層状珪酸塩から製造することができる。しかしながら、天然の原料から得られた粘土材料を使用することが好適である。
【００２４】
そのアルミニウム含有量がＡｌ２Ｏ３として計算して無水の粘土材料に対して１１重量％未満である粘土材料を使用することが特に好適である。アルミニウム含有率は２重量％超、特に４重量％超、特に好適には６重量％超となる。アルミニウム含有率は８ないし１０重量％の範囲となることが特に好適である。強酸を使用した抽出によって得られた粘土材料は本発明に係る方法において使用される粘土材料と比べて低いＡｌ２Ｏ３含有率を示す。
【００２５】
極めて低い結晶化度を有する、すなわち層状珪酸塩の等級には所属しない粘土材料を使用することが極めて好適である。その低い結晶化度は例えばＸ線回折法によって判定することができる。極めて好適な粘土材料は極めて非晶質であり、すなわちＸ線回折グラフにおいて鋭敏なピークは示されない。従ってそれは純粋なアタパルジャイトあるいはスメクタイトの等級には所属しない。
【００２６】
その仮説に拘束されるものではないが、発明者等は本発明に係る方法において使用される粘土材料がシリカゲルから形成された骨組を含むと推定している。その比較的硬質の骨組内に層状珪酸塩が蓄積される。シリカゲルの骨組内への固定化によって、鉱物がそれ全体として大きく容積増加することなく層状鉱物が大きく膨潤することが可能になる。膨潤した層状珪酸塩は高いレベルでタンパク質の吸着のために使用することができる。シリカゲルが主相を形成し、粘土層は粘土材料中で少ない構成要素を形成する。この粘土材料が陽イオン交換能力をもたらすものと推定される。
【００２７】
好適な実施形態において本発明に係る方法において使用される粘土材料は特殊な細孔半径分布を有している。ここで粘土材料の細孔容積の大部分は少なくとも１４ｎｍの直径を有する細孔によって形成される。
【００２８】
総細孔容積の少なくとも４０％（ＢＪＨ法によって判定、後述参照）が１４ｎｍ超の直径を有する細孔から形成されることが極めて好適である。総細孔容積の少なくとも５０％超、特に６０％超が１４ｎｍ超の直径を有する細孔から形成されることが極めて好適である。細孔半径分布ならびに総細孔容積は窒素多孔度測定（ＤＩＮ６６１３１）によって判定され、吸着等温線の評定はＢＪＨ法（後述参照）によって実施される。
【００２９】
タンパク質の変性を防止するために、液体状媒体の付加前に粘土材料を約３．５ないし９．０、特に４．０ないし６．０の範囲のｐＨ値に平衡化する。そのため粘土材料を適宜な緩衝剤、特にクエン酸エステル緩衝剤中で懸濁するか、例えば粘土材料から形成されたフィルタパッケージまたはカラムにその種の緩衝剤を付加する。その緩衝剤は３０ないし１００ミリモル／ｌの範囲の濃度を有することが好適である。
【００３０】
別の好適な実施形態によれば、例えばソーダ等のナトリウム含有化合物または例えば炭酸カリウム等のカリウム含有化合物によって処理することにより、タンパク質の分離前に粘土材料を活性化することもできる。そのため粘土材料の二価の陽イオンが部分的にあるいはより好適には完全にナトリウムイオンによって交換される。二価のイオンのナトリウムイオンに対する交換はカルシウムベントナイトの活性化において知られているような一般的な方式で実施される。湿性の粘土材料は１０ないし７０重量％、特に４５ないし６５重量％の湿度を有し、それが粘土材料の陽イオン交換容量の１．２ないし２．５倍に相当する量のソーダと混錬される。それに代えてソーダを溶液として粘土材料上に噴霧することもできる。粘土材料はその後乾燥させ必要に応じて粉砕することができる。その活性化によってタンパク質に対する粘土材料の吸着容量をさらに向上させることができる。
【００３１】
タンパク質を含有した液体状媒体の処理は最も単純な場合、粘土材料を直接あるいは懸濁液の形態で液体状媒体に付加し１ないし３０分、特に５ないし２０分の範囲の適宜な滞留時間後に例えば濾過あるいは遠心分離等の適宜な方法で液体状媒体から分離し、それによってタンパク質が剥脱される。
【００３２】
別の実施形態によれば、タンパク質の分離のために液体状媒体を少なくとも部分的に前記粘土材料から形成されたフィルタパッケージを介して誘導することができる。そのフィルタパッケージはその際任意の形状とすることができる。例えば前記粘土材料が充填されたフィルタカートリッジが適している。そのフィルタカートリッジの吸収容量が使い果たされた後新規のカートリッジに交換することができる。タンパク質が蓄積されたフィルタカートリッジは廃棄するかあるいはより好適には再処理工程に供給することができ、そこにおいて粘土材料上に吸着されたタンパク質を再生することができる。
【００３３】
一実施形態によればフィルタパッケージをプレコートフィルタリングとして形成する。その際粘土材料を珪藻土あるいはパーライト（Ｒ）等のフィルタ補助剤と混合することが好適である。さらに、粘土材料を例えばシリカゲル等のさらに別の吸着剤と混合することもできる。濾過に際して粘土材料は、前記フィルタ補助剤ならびに場合によってさらに別の吸着剤と共に、後続的に生じる汚濁物質およびフィルタ補助剤粒子に対して濾過作用を有する媒体を形成するフィルタケーキを形成する。この実施形態は特にタンパク質を有害物質として液体状媒体から除去する必要がある場合に好適である。
【００３４】
直接濾過の前にフィルタ補助剤を一次層としてフィルタ媒体上に塗付することが好適である。フィルタ媒体としては例えば適宜に小さな目幅を有する篩を使用することができる。一次層を形成するフィルタ補助剤としては例えば珪藻土を使用することができる。このプロセスは前置プレコートとも呼ばれる。後続する濾過相において懸濁液に前述した本発明に係る粘土材料を含んでいる別のフィルタ補助剤が適用される。このフィルタ補助剤は汚濁物質粒子と共に二次層と呼称されるフィルタケーキを形成する。
【００３５】
本発明に係る方法の別の好適な実施形態によれば、この方法はクロマトグラフィの形式で実施される。その際粘土材料をクロマトグラフィカラム内に収容し、それからタンパク質を分離するものである液体状媒体を全カラム内に付加する。そのカラムを介して溶出剤が通流することができ、その際吸着作用によって多様な留分へのタンパク質の分離が可能となる。このことは特に生物反応器内で生成されるタンパク質の分離に適している。ここで、極めて低い膨潤性を有するものである、本発明に係る方法において使用される粘土材料の利点が示される。
【００３６】
本発明に従って粘土材料をカラムパッケージ内に使用し得るようにするため、それを篩によって適宜な粒子大に調節することが好適である。ここで特に粘土材料の微細成分が除去されることが極めて好適である。
【００３７】
粘土材料を１０μｍ超、特に２０μｍ超、さらに好適には３０μｍ超、特に好適には４０ないし３００μｍの範囲の粒子大に調節する。全体として、粘土材料は、４５μｍの目幅の篩上において初期重量の９５％超の乾燥篩い残分、６３μｍの目幅の篩上においては８０％超の乾燥篩い残分、１５０μｍの目幅の篩上においては３０％超の乾燥篩い残分を有することが好適である。
【００３８】
本発明に係る方法は液体状媒体からタンパク質を抽出するために作用することが好適である。そのため、タンパク質を粘土材料上で吸着し必要に応じて後続の洗浄工程によって洗浄した後、再び粘土材料から溶出する。粘土材料上に吸着されたタンパク質の溶出は多様な方式によって実施することができる。例えば、タンパク質は塩分濃度の増加によって粘土材料の結合部分から除去することができる。さらに、吸着されたタンパク質の電荷を変化させ従ってそれ以上粘土材料と結合されていないように、溶出のために使用される溶液のｐＨ値を調節することも可能である。液体状媒体からのタンパク質の分離のために粘土材料をカラムの形態に形成してそれを介して液体状媒体を誘導する場合、吸着されたタンパク質を溶出するために例えばカラムに沿って塩分階調を付けることができ、それによって異なった塩分濃度においてそれぞれ異なったタンパク質を溶出することができ、従って吸着されたタンパク質の分溜が実施される。タンパク質は特に電気交換作用および／またはファンデルワールス力によって本発明に係る方法において使用される粘土材料内に結合される。高い塩分濃度を有する緩衝剤による溶出に際して、陽イオン交換体として機能する粘土材料とタンパク質との間の電気交換作用が低下する。従ってタンパク質を粘土材料から解放して溶出することができる。
【００３９】
別の実施形態によれば、結合されたタンパク質の溶出はｐＨ値の変更によって実施される。その際溶出剤は液体状媒体とは異なったｐＨ値を有する。
【００４０】
例えば、タンパク質はそれが帯電した状態で存在するようなｐＨ値で放出されることができる。その際溶液のｐＨ値は、それがタンパク質の等電位点の下方にあって従ってタンパク質が正の総電荷を有するように調節することが好適である。粘土材料の陽イオン交換体作用によってタンパク質が結合される。従って本発明に係る方法において使用される粘土材料は陽イオン交換体材料として機能する。ここでタンパク質の等電位点に到達するかあるいはそれを超過する程ｐＨ値が上昇させられると、殆どの場合においてタンパク質が負の総電荷を有する。従ってタンパク質が再び粘土材料から解放され、溶出されることが可能になる。
【００４１】
場合によって溶出剤にグリセリンまたはポリグリコールを添加することができる。これらの化合物は粘土材料に対して極めて高い親和性を有し、従って粘土材料からのタンパク質の解放を容易にする。
【００４２】
液体状媒体は水を溶媒として含むことが好適である。
【００４３】
本発明に係る方法において使用される粘土材料は単独または別の吸着材料との組み合わせによって使用することができる。前記の別の吸着材料は、シリカゲル、セルロース、およびポリビニルピロリドンからなる一群の中から選択することが好適である。
【００４４】
前記の粘土材料と別の吸着材料は１：１０ないし１０：１の比率で存在することが好適である。しかしながら、意図される適用形態に応じて前記の範囲以外の比率を使用することもできる。
【００４５】
本発明に係る方法において使用される粘土材料は、水に対して極めて高い蓄積能力を有するが、それにもかかわらず流動性を保持する。この粘土材料は３０重量％超、特に４０重量％超、特に好適には５０重量％超の水分含有率を有することが好適である。
【００４６】
次に、本発明に係る方法について、後述する実施例および添付図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
分析方法
表面積／細孔容積：
比表面積はミクロメトリクス社製のＡＳＡＰ２０１０型全自動窒素多孔度測定装置によってＤＩＮ６６１３１に従って判定した。細孔容積はＢＪＨ法を使用して測定した（Ｉ．Ｐ．バレット氏、Ｊ．Ｇ．ジョイナー氏、Ｐ．Ｐ．ハイエンダ氏等による米国化学会誌第７３版（１９５１年）第３７３号参照）。特定の細孔寸法範囲の細孔容積は、ＢＪＨ法に従った吸着等温線の分析によって得られた細孔容積増分の累積によって判定される。ＢＪＨ法に従った総細孔容積は１．７ないし３００ｎｍの直径を有する細孔に関するものである。
【００４８】
水分含有率：
１０５℃における製品の水分含有率はＤＩＮ／ＩＳＯ−７８７／２の方法を使用して判定した。
【００４９】
元素分析：
この分析は粘土材料あるいは同様な製品の完全分解に基づいたものである。固形成分の分解後に個別の成分を例えばＩＣＰ等の特殊な分析方法によって分析および定量化する。
【００５０】
イオン交換容量：
イオン交換容量を判定するために、検査する原料粘土を１０５℃において２時間乾燥させる。その後乾燥した材料を充分な水性２Ｎ  ＮＨ４Ｃｌ溶液と共に還流しながら１時間反応させる。室温中における１６時間の放置後に濾過し、その後フィルタケークを洗浄、乾燥、ならびに粉砕し、粘土材料中のＮＨ４含有量を製造者（レコ社製のＣＨＮ分析機）の指示に従って窒素測定法によって判定する。交換された金属イオンの比率と種類を濾過液中においてＩＣＰ分光分析によって判定する。
【００５１】
Ｘ線回折法：
フィリップス社製のＣｕ陽極を備えた高解像度粉末回折計（Ｘ′−ペルトＭＰＤ（ＰＷ３０４０）によってＸ線画像が作成された。
【００５２】
沈降容積の判定
目盛付けされた１００ｍｌメスシリンダに１００ｍｌの蒸留水を充填する。２ｇの測定すべき物質を遅速かつそれぞれ０．１ないし０．２ｇに分割して杓子を使って水の表面に付加する。付加した分片が沈降した後次の分片を付加する。２ｇの物質を全て付加しそれがメスシリンダの底部に沈降した後、シリンダを１時間室温中に放置する。その後メスシリンダの目盛上で沈降容積の高さをｍｌ／２ｇの単位で読み取る。沈降容積を判定するために３日間の貯蔵後に試料をパラフィルム（Ｒ）によって被覆し、室温中において３日間無振動で放置する。その後メスシリンダの目盛上で沈降容積を読み取る。
【００５３】
乾燥篩残留物の測定
約５０ｇの空気乾燥させた検査される粘土材料を４５μｍの目幅の篩上で計量する。この篩は吸引機に接続されていて、これは篩の下側に開口した吸引口によって篩よりも細かい全ての成分をその篩を介して吸引するものである。篩をプラスチック蓋部材によって遮蔽し、吸引機を点入する。５分後に吸引機を停止して、篩上に残留した大粒の成分を重量差によって判定する。
【００５４】
湿式篩残留分の測定：
適宜な量の検査される粘土材料を水中において約９３０ｒｐｍで約５分攪拌することによってまず５％の懸濁液を生成する。懸濁液をさらに１５分間１８６５ｒｐｍで攪拌した後所要の目幅を有する篩に注入する。残留物を流れている水道水によって叩きながら洗浄水が透明になるまで洗浄する。残留している微細粒子分を除去するために、残留分を伴っている篩を５分間超音波槽内に曝す。残留成分を水道水で短時間後洗浄し、必要に応じて超音波処理中に微細成分が水中に発生しなくなるまで超音波処理を繰り返す。その後重量が一定になるまで篩を乾燥させる。計量のために篩上に滞留している残留分を計量されているセラミックシャーレ内に移転する。
【００５５】
粘土材料の特徴判定：
（ａ）粘土材料Ａ：
本発明に係る方法に適した粘土材料（ドイツ国、モースブルグ市のズードケミー社より市販のトンシル（Ｒ）ＥＸ１２２１Ｉ（原料粘土貯蔵番号：０３０５１））をその物理化学特性に関して検査した。それによって得られた結果は表１にまとめられている。
【００５６】
【表１】
2009519285.tif 000002
【００５７】
本発明に係る珪酸塩が良好にカラム内に収容し得るような形態で存在するように、４５μｍ未満の粒子大に篩分けた。篩分けられた材料は、４５μｍの目幅の篩上において９５％超の乾燥篩い残留分を有していた。６３μｍにおける乾燥篩い残留分は８５％、１５０μｍでは３０％であった。
【００５８】
次に、表１によって特徴付けられている粘土材料について、細孔容積中の特定の半径を有する細孔から形成された割合を検査した。そのデータは表２ａないし表２ｃに示されている。
【００５９】
【表２ａ】
2009519285.tif 000003
【００６０】
【表２ｂ】
2009519285.tif 000004
【００６１】
【表２ｃ】
2009519285.tif 000005
【００６２】
（ｂ）粘土材料Ｂ：
本発明に係る方法を実施するために適した別の粘土材料の物地化学特性が表３に示されている。
【００６３】
【表３】
2009519285.tif 000006
【００６４】
（ｃ）粘土材料Ａのアルカリ活性化
総イオン交換容量（ＩＵＦ）を判定するために溶出液中のイオン濃度から総陽イオン交換容量中におけるＮａ＋とＫ＋の割合が３２％（Ｎａ＋：２３％，Ｋ＋：９％）となることを判定することができる。それから、一価のイオンによる化学量論的活性化を達成するために一定量の２％ソーダが必要であることを計算することができる。
【００６５】
表１に特徴が示されている粘土材料Ａをまず直径３ｃｍ未満の分片に破砕する。水分含有率は、必要に応じて破砕された粘土材料上に水を噴霧することによって約４５ないし６５重量％の水分含有率に調節する。３５０ｇの破砕された粘土材料Ａを混合装置（例えばウェルナー＆フライダラーミキサ）内に供給し１分間混錬する。その後混合装置を引き続き稼働させながら２重量％（無水の粘土材料Ａに対して）の固形ソーダを添加し、混合物をさらに１０分間混錬する。混合物が充分に柔軟にならないうちは、充分に高い剪断効果を得るために蒸留水を付加することができる。
【００６６】
混錬材料を小さな分片に破壊し、それを空気循環式乾燥庫内で１０±２％の水分含有率になるまで約７５℃の温度で２ないし４時間乾燥させる。乾燥物をその後回転ハンマ粉砕機（例えばレッチュミル）内において０．１２ｍｍの篩を介して粉砕する。
【００６７】
使用された見本タンパク質
タンパク質の吸着試験のために以下の見本タンパク質が使用された：
【００６８】
α−キモトリプシン（ＣＨＹ）：
α−キモトリプシンは牛の腹内消化腺から採取される消化酵素である。この酵素は２５．３ｋＤａの質量を有する。等電位点はｐＨ８．１ないし８．６の間にある。
【００６９】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）：
ＨＳＡは、血液から周囲の細胞への脂肪酸および両親媒性物質のキャリアとして機能する球状の搬送タンパク質である。ＨＳＡは３つの領域から形成され、それらの領域が６６．４ｋＤａの総質量を有する５８５個のアミノ酸からなる。分子の等電位点はｐＨ４．９である。
【００７０】
アルカリ性フォスファターゼ（ＡＰ）：
アルカリ性フォスファターゼは不特定のリン酸モノエステラーゼであり、大腸菌から人間までの全ての核種において同一のサブユニットの二量体として存在する。アルカリ性フォスファターゼは、２個のＺｎ２＋イオンと１個のＭｇ２＋イオンを含んでいる金属タンパク質である。例において使用されたアルカリ性フォスファターゼは子牛の腸粘膜から分離したものである。等電位点はｐＨ６．０である。二量体の分子量は１４０ｋＤａである。
【００７１】
例１：  固定式システム中におけるタンパク質の吸着
粘土材料の平衡化
いずれも２５．０ｍｇの上記の特徴を有する粘土材料Ａを５０ｍｌ反応容器（ドイツ国ニュブレヒト市のサーシュテットＡＧ社製）内に計り入れる。いずれも１０ｍｌの表４に示されている試料前処理緩衝剤を添加し、反応容器を３０分間超音波槽内で処理する。続いて懸濁液を含んだ反応容器を振盪台上で室温において１時間１００ｒｐｍで振盪する。試料をいずれも１０分間４０００Ｇで遠心分離し、透明な上澄みをピペットで吸引する。沈殿物を１０ｍｌの二回蒸留（ｂｉｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ）されたＨ２Ｏ内に再懸濁し、１００ｒｐｍで５分間振盪する。この懸濁液を４０００Ｇで１０分間遠心分離し透明な上澄みをピペットで吸引する。平衡化された粘土材料をその後１６時間６０℃で乾燥させる。
【００７２】
【表４】
2009519285.tif 000007
【００７３】
見本タンパク質の準備
見本タンパク質からいずれも２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する母液を２回蒸留されたＨ２Ｏ中に付加する。このタンパク質溶液を１：１の比率で表４に示されているｐＨ値３ないし８の１００ｍＭ緩衝剤と共に２０ｍｌの総量に希釈する。
【００７４】
タンパク質濃度の紫外線測光判定のための較正曲線の作成
タンパク質の測光定量化は、芳香族アミノ酸チロシン（フェノール基、２７５ｎｍ）、トリプトファン（インドール基、２７９ｎｍ）、および僅かなレベルのフェニルアラニン（２５７ｎｍ）の２８０ｎｍにおける紫外線吸収測定に基づいている。アミノ酸組成に従って２０ないし３０００μｇ・ｍｌの濃度のタンパク質を判定することができる。
【００７５】
未知のタンパク質濃度を求めるために、既知のタンパク質濃度の溶液の較正用連続サンプルの吸収を２８０ｎｍにおいて判定する。吸収とタンパク質濃度との間の直線的な相関性から未知のタンパク質濃度を求めることができる。
【００７６】
測光定量化評定のために見本タンパク質から表５に示されている適宜なｐＨ値の５０ｍＭ緩衝剤における標準列が作成される。それらの標準サンプルを振盪テーブル上で４℃および１００ｒｐｍで３時間培養する。培養終了後に試料を１０分間４０００Ｇで遠心分離し、透明な上澄みの吸光度を測定する。判定された数値から較正曲線を作成する。
【００７７】
【表５】
2009519285.tif 000008
【００７８】
（ａ）タンパク質吸着のｐＨ依存性の検査
２５ｍｇの平衡化された粘土材料に対していずれも２０ｍｌの上記のように準備された見本タンパク質の溶液を付加する。試料を振盪テーブル上で４℃および１００ｒｐｍで３時間培養する。培養終了後に試料を１０分間４０００Ｇで遠心分離する。試料の上澄み内の見本タンパク質の濃度を、２８０ｎｍにおいて各緩衝剤におけるタンパク質の標準サンプル列と比較して測光判定する。粘土材料の積荷は、培養前と後における上澄み中のタンパク質濃度の差と、粘土材料の質量およびタンパク質溶液の容積とから算定される。測定結果は二度測定の平均値として図１中にｐＨ値に対して表記されている。粘土材料Ａの積荷は全ての見本タンパク質についてクエン酸エステル緩衝剤中でｐＨ４において最高となる。
【００７９】
（ｂ）タンパク質吸着等温線の作成
上澄み中の見本タンパク質濃度の粘土材料Ａの平衡積荷との相関性において吸着等温線を検査する。
【００８０】
この実験は、各見本タンパク質に対して５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤中でｐＨ４において実施する。このことは、タンパク質吸着のｐＨ値依存性の実験において最大値が求められた条件に相当するものである。
【００８１】
吸着等温線の作成のためにまず５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤中における３ｍｇ／ｍｌのタンパク質含有率の該当する見本タンパク質の母液を作成する。その後このタンパク質母液を表６に示されている規則に従って５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤によって希釈する。
【００８２】
【表６】
2009519285.tif 000009
【００８３】
その後希釈された見本タンパク質の溶液を前述のように５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤によって平衡化したいずれも２５ｍｇの粘土材料Ａに付加する。
【００８４】
見本タンパク質の濃度の判定のために各見本タンパク質について標準サンプル列を５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤中において付加する。試料と標準溶液を振盪テーブル上で４℃および１００ｒｐｍで３時間培養し、その後１０分間４０００Ｇで遠心分離する。
【００８５】
タンパク質の標準サンプル列に対して吸光度を測定し、それから較正曲線を作成する。粘土材料の積荷は、遠心分離されたタンパク質の上澄み中のタンパク質の測光定量化によって判定される。測定結果は二度測定の平均値として図２中に表記されている。
【００８６】
例２：  動的システム中におけるタンパク質の吸着
粘土材料の平衡化
１ｍｌのエッペンドルフキャップ中でいずれも１００ｍｇの粘土材料Ａをいずれも１ｍｌの表５に示されている５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤によって懸濁し、ピペットを使用して懸濁液をピストンによって下方に向かって閉鎖されたクロマトグラフィカラム（１５×５０ｍｍ、１０μｍのＰＴＦＥストッパを有する）内に注入する。二番目のカラム端部が載置されていて、このカラムは流動相が下から上に通流するような方式でＦＰＬＣ装置と結合されている。ＦＰＬＣポンプは、それに対して吸着剤の容量を測定すべきである流速に設定される。カラムの可動式のピストンは２０ｍｌの５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤によって平衡化している間に低速かつ強力に牽引され、その後４分の１ネジ回転分解放される。
【００８７】
タンパク質結合容量の判定
５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤中のタンパク質の溶液いずれも２５ｍｌを、１００ｍｇの粘土材料Ａが収容されたカラムを介して可変の流速でポンプ駆動する。フロー中のタンパク質含有量を２８０ｎｍにおいて５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤における見本タンパク質の標準サンプル列と比較して測光判定する。粘土材料Ａに対して判定された流速に相関した見本タンパク質の積荷が二度測定の平均値として図３中に表記されている。
【００８８】
例３  ヒト血清アルブミンの溶出
粘土材料Ａ上に結合されたＨＳＡの溶出のために２つの異なった緩衝剤を使用する。全てのクロマトグラフィステップを１ｍｌ／分の流速で実施する。
【００８９】
溶出緩衝剤１：  ５０ｍＭのクエン酸エステル、二回蒸留されたＨ２Ｏ中における１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４
溶出緩衝剤２：  二回蒸留されたＨ２Ｏ中における５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２
【００９０】
１００ｍｇの粘土材料Ａを、５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤中においてｐＨ４で１ｍｇ／ｍｌの濃度を有する２５ｍｌのＨＳＡ溶液に流動させながら積荷させる。積荷の後カラムを２０ｍｌのｐＨ４の５０ｍＭクエン酸エステル緩衝剤で洗浄する。ＨＳＡの溶出のために３５ｍｌの溶出緩衝剤を、カラムを介して誘導する。フロー、洗浄留分および溶出留分のタンパク質含有量を２８０ｎｍにおいて測光測定する。両方の溶出緩衝剤に対する測定値が二度測定の平均値として表７中に示されている。
【００９１】
【表７】
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【００９２】
溶出緩衝剤２により、溶出緩衝剤１に比べて３倍の量のタンパク質を溶出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明に係る方法において使用される粘土材料上における見本タンパク質の吸着のｐＨ値依存性を示した説明グラフである。
【図２】５０ｍＭのクエン酸エステル緩衝剤中に吸収された、本発明に係る方法において使用される粘土材料上における多様な見本タンパク質の吸着等温線を示した説明図である。
【図３】多様な見本タンパク質の塗付速度に対しての本発明に係る方法において使用される粘土材料の積荷量を示した説明グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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