(57)【要約】  本発明は、インスリンの前駆体を遺伝子工学的に操作することによって、そしてリシンアミド若しくはアルギニンアミドとの、又は保護基によって修飾されるリシン若しくはアルギニンによる酵素触媒連結反応でそれぞれのインスリンに上記前駆体を変換することによって、並びに場合により続いて加水分解する、あるタイプのインスリンの生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド化され、若しくは保護基でＣ末端が保護された天然の塩基性アミノ酸、又は天然の塩基性アミノ酸、若しくはその類似体若しくは誘導体からなりかつＣ末端でアミド化され、若しくは保護基で保護されたペプチドを、
Ａ鎖及び／若しくはＢ鎖のＣ末端アミノ酸が天然の塩基性アミノ酸、若しくはその類似体若しくは誘導体を含む群より選択される出発インスリン類似体、若しくはその誘導体に、トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で上記１つのＣ末端アミノ酸に、付加し、
そして得られる修飾されたインスリン類似体を精製し、そして場合により付加されたアミノ酸の又は付加されたペプチドのアミド基又はＣ末端保護基を除去する、
インスリン類似体又はその誘導体を調製するための方法。
【請求項２】
インスリン類似体が、一般式Ｉ
【化１】
2009542235.tif 000019
［式中、
（Ａ１−Ａ５）ヒトインスリン又は動物インスリンのＡ鎖の位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基、
（Ａ１２−Ａ１９）ヒトインスリン又は動物インスリンのＡ鎖の位置Ａ１２〜Ａ１９のアミノ酸残基、
Ａ２１         天然のアミノ酸残基、
（Ｂ８−Ｂ１８）ヒトインスリン又は動物インスリンのＢ鎖の位置Ｂ８〜Ｂ１８のアミノ酸残基、
（Ｂ２０−Ｂ２６）ヒトインスリン又は動物インスリンのＢ鎖の位置Ｂ２０〜Ｂ２６のアミノ酸残基、
（Ａ８−Ａ１０）ヒトインスリン又は動物インスリンのＡ鎖の位置Ａ８〜Ａ１０のアミノ酸残基、
Ｂ３０    化学結合又は天然のアミノ酸残基、
Ｂ１      化学結合又は天然のアミノ酸残基、
Ｂ３      天然のアミノ酸残基、
Ｂ２７、Ｂ２８
及びＢ２９     天然のアミノ酸残基、
Ｒ１      アミノ基又は１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ２      カルボキシ基又は１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ３      アミノ基又は１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ４      化学結合、又はＣ末端に存在するアミノ酸残基が塩基性アミノ酸を表す１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ５      Ｃ末端が遊離であるか又はアミド化されたかの何れかである１又は２個の塩基性アミノ酸残基
であり、
ここで、Ｃ末端でＲ５のＮ末端に連結されるアミノ酸残基が、天然の塩基性アミノ酸を含む群より選択される］
によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
出発インスリン類似体が、一般式ＩＩ
【化２】
2009542235.tif 000020
［式中、Ｒ１、（Ａ１−Ａ５）、（Ａ８−Ａ１０）、（Ａ１２−Ａ１９）、Ａ２１、Ｒ２、Ｒ３、Ｂ１、Ｂ３、（Ｂ８−Ｂ１８）、（Ｂ２０−Ｂ２６）、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０及びＲ４が、請求項１で定義される通りであり、かつＢ鎖のＣ末端アミノ酸残基が、天然の塩基性アミノ酸を含む群より選択される］
によって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アミド化され、又は保護基でＣ末端が保護された天然の塩基性アミノ酸が、Ｃ末端でアミド化されたアルギニン、又は保護基でＣ末端が保護されたアルギニンである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
修飾されたインスリン類似体が、Ｂ鎖のＣ末端がアミド化されたＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンである、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
出発インスリン類似体が、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
出発インスリン類似体が、出発インスリン類似体のＡ鎖及びＢ鎖を含む前駆体タンパク質の組換え発現によって調製される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
レプリコンの部分である遺伝子を発現する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細菌又は酵母を、宿主細胞として使用する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前駆体タンパク質が発現後に分泌される、請求項７〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前駆体タンパク質が細菌又は酵母の細胞上清から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前駆体タンパク質が、細菌の周辺質から単離される、請求項９に記載の修飾されたインスリン類似体を調製するための方法。
【請求項１３】
請求項７〜１０の何れか一項に記載のとおり得られる前駆体タンパク質を、フォールディングプロセス及び酵素的切断にかける、請求項７〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
出発インスリン類似体が、組換え体直接発現によって調製される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
トリプシンの生物活性を有する酵素が、ヒトトリプシン、ブタトリプシン、ウシトリプシン、並びにヒトトリプシン、ブタトリプシン及びウシトリプシンの変異体を含む群より選択される、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
酵素が、リシルエンドペプチダーゼ活性を有する、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
修飾されたインスリン類似体のＢ鎖のＣ末端が、その後加水分解反応において脱保護される、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
得られるインスリン類似体が、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンである、請求項１〜１７の何れか一項にに記載の方法。
【請求項１９】
Ａ鎖及び／又はＢ鎖のＣ末端アミノ酸がアミド化された、請求項１〜１６に記載のように調製されるインスリン類似体又はその誘導体の、薬剤としての使用。
【請求項２０】
Ａ鎖及び／又はＢ鎖のＣ末端アミノ酸がアミド化された、請求項１〜１６の何れか一項に記載のように得られるインスリン類似体又はその誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二塩基性鎖末端を有するインスリンの前駆体の生物工学的調製、及びリシンアミド若しくはアルギニンアミドとの、又は保護基によって修飾されるリシン若しくはアルギニンとの酵素触媒連結反応におけるその後の変換によって、並びに場合によりその後の加水分解によって二塩基性末端を有するインスリンを得る、該インスリンの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で約１億７千７百万人の人が、糖尿病に罹患している。これらには、現在のところ欠損している内分泌性インスリン分泌のその置換が唯一の可能な治療法である約１７００万人のＩ型糖尿病患者が含まれる。患者は、通常１日に何度ものインスリン注射に、生涯を通じて依存している。ＩＩ型糖尿病は、インスリンの欠乏が必ずしも存在しない点でＩ型糖尿病と対照的であるが、多くの症例では、特に進行した段階において、経口抗糖尿病薬と適切に組み合わせたインスリンによる治療が、最も好ましいタイプの治療法であるとされている。
【０００３】
健常者において、インスリンの放出は、血中グルコース濃度に厳密に結びついている。食後に生じる高血糖レベルなどの高血糖レベルは、インスリン分泌の対応した上昇によって、迅速に補償される。空腹状態において、血漿インスリンレベルは、インスリン感受性の器官及び組織へのグルコースの継続的な供給を保証し、夜間に肝臓グルコース生産を低く維持するのに十分であるベースライン値にまで低下する。外来性インスリンによる、通常インスリンの皮下投与による内在性インスリン分泌の置換は、通常は上述の血中グルコースの生理学的レギュレーションの質に近づくことはない。血中グルコースレベルの上向き又は下向きの再構成（rearrangement）がしばしば起り、最も重症型では生命を脅かしかねない。しかしながら、さらに、何年間も続く高血中グルコースレベルは、初期症状がないのに、健康上のかなりの危険を呈する。米国における大規模なＤＣＣＴ研究（The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986）は、慢性的に上昇した血中グルコースレベルが、実質的に後期糖尿病合併症の発症の原因になることを明快に証明した。後期糖尿病合併症は、微小血管及び大血管の損傷であり、これは幾つかの状況において、網膜症、腎症又は神経障害として現れることになり、そして失明、腎不全及び四肢の喪失に至り、さらに心臓血管障害の増大した危険と関連する。糖尿病の改善された治療法が、生理学的範囲内に可能な限りきっちりと血中グルコースを維持することを何よりもまず目的としなければならないことは、そこから推定すべきである。強化インスリン療法の方針は、速効性及び遅効性インスリン製剤を１日に何度も注射することによって、これを達成しようとするものである。速効性製剤は、血中グルコースの食後の上昇を補償するために食事の時に与えられる。遅効性の基礎インスリンは、特に夜間低血糖に至らしめることなく、インスリンの基礎供給を保証しようとするものである。
【０００４】
インスリンは、２個のアミノ酸鎖に分割される、５１個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸を、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸を有する。鎖は、２個のジスルフィド架橋によって一緒に連結される。インスリン製剤は、糖尿病の治療のために長年使用されてきた。さらに、天然のインスリンだけでなく、より最近ではインスリン誘導体及び類似体も使用される。
【０００５】
インスリン類似体は、天然インスリン、すなわちヒトインスリン又は動物インスリンの類似体であり、これは少なくとも１つの天然アミノ酸残基の他のアミノ酸残基による置換によって、及び／又は対応する、さもなくば同一の、天然のインスリンからの少なくとも１つのアミノ酸残基の付加／欠失によって、異なる。米国特許第５,６５６,７２２号には、例えば、ｄｅｓ−Ｐｈｅ(B1)−インスリン誘導体が記載されている。また、付加された及び／又は置換されたアミノ酸残基は、天然では生じないアミノ酸残基であってよい。
【０００６】
インスリン誘導体は、天然インスリン又はインスリン類似体の誘導体であって、ここで１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基、並びに／又はＡ鎖及び／若しくはＢ鎖のＮ末端若しくはＣ末端が、官能基によって置換される。官能基は、アミド残基、アミン残基、カルボキシル残基、アルキル残基、アルコール残基及びアルコキシ残基を含む群より選択される。
【０００７】
効率的なインスリン療法は、いわゆる基礎インスリンを活用する。基礎インスリンは、外来投与インスリンのゆっくりとした継続的な放出を可能にする製剤を意味する。この療法で、糖尿病に罹患しているヒトの生理学的状態に及ぼす有利な効果を有する、身体のベースラインインスリン濃度を、長期にわたって達成する。
【０００８】
組換えインスリン類似体Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリン（インスリングラルギン）は、これに関連して、基礎効果を達成するために、わずかに２４時間ごと、すなわち１日に１回のみ身体に供給する必要があることにとって重要である。１日１回の投与は、生活の質の改善をもたらす。改善された生理機能によって、例えばＨｂａ１ｃレベルの低下につながり、この改善によって、糖尿病の後期続発症は、たとえ現れるとしてもかなり遅延して現れ、従って関連する糖尿病患者の平均余命の長期化を可能にすることが期待され得る。
【０００９】
このインスリン類似体の需要は、相応して高い。糖尿病患者数が持続的に増加しているので、対応する類似体を調製するための経費を最小化する経済的な関心がさらにある。米国特許第５,６５６,７２２号には、融合部分（「プレ部分」）とサルプロインスリン変異体とからなるプレプロインスリン融合タンパク質を介したインスリン類似体の可能な調製が記載されている。記載される類似体の１つは、位置Ａ（２１）においてアスパラギン酸の代わりにグリシンを含む。対応する融合タンパク質は、インスリングラルギンを調製するためのペプチド前駆体変異体である。この方法は、トリプシンとの反応によるこの融合タンパク質からのプレ部分及びＣペプチドの欠失を提供する。欧州特許第０,６６８,２９２（Ａ）号には、同一の原理に従うが、米国特許第５,６５６,７２２号を上回る改善である方法によってインスリングラルギンの調製を可能にする融合タンパク質が記載されている。これに関連して、部分的な切断が、二塩基性構造Ａｒｇ−Ａｒｇによって定義される、インスリンＢ鎖及びＣ鎖の境界で特に起こり、そしてＢ３１モノａｒｇヒトインスリン類似体をもたらし得ることは、当業者には明らかである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この欠陥のある産物は、関心対象の実際の化合物から除去されなければならない。これによって、収量が顕著に損なわれる。この問題は、プロインスリンの組換え調製、及び該プロスリンの、例えばリシルエンドペプチダーゼ等の特異的なエンドプロテアーゼとの反応、並びに半合成ペプチド化学アプローチで得られるｄｅｓ−Ｂ３０ヒトインスリン（類似体）のトリペプチドＴｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇとの反応によって、回避できる。欧州特許第０,１３２,７６９（Ａ）号及びＷＯ２００３／０４４２１０には、反応中トリペプチドの反応基を保護する必要性が記載されている。保護基は、反応後に除去される。この経路は、化学合成及び保護基の導入によるトリペプチドの製造から生じる経費と関係している。従って、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−インスリン類似体の、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン前駆体からの調製を可能にする方法を有することが望ましいことになる。
【００１１】
独国特許出願第１０,２００５,０４６,１１３．１号（非刊行）には、Ｃ末端のアミド化されたアミノ酸の、Ｃ末端のアミノ酸がリシン又はアルギニンからなるペプチドへのトリプシンにより触媒される連結を含む方法が記載されている。この場合に観察される収量は、驚くべきことに高く、さらに保護基でマスキングすることなくカップリング反応を行うことが可能である。反応は、非水性媒体中で生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
いまや驚くべきことに、アルギニンアミド又はリシンアミドのＢ３１インスリン類似体へのカップリングが、高い収量で可能であることを発見した。さらに驚くべきことに、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−ヒトインスリンアミドの形態の、又はＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）−ヒトインスリンアミドの形態のインスリン類似体が優先的に形成されるよう、反応を調節することが可能である。さらに、収率は、６０％を超える。アミド基は、反応の終了時に酸性加水分解によって除去できる。同様に驚くべきことに、リシンアミド又はアルギニンアミドの代替物として、保護基を場合により有するアルギニン又はリシンを反応に使用できることを発見した。例として言及し得る保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）又はジメトキシフェニルプロピルオキシカルボニル（ＤＺＺ）である。特に保護されたアルギニン誘導体が、様々な溶媒に不安定であり得ることが文献に記載されているので、ペプチド化学における改善された安定性の効果を有する新たな保護基の継続的な開発が存在することは、当業者に明らかである。収量に及ぼす正の影響は、保護基又はアミド基に従って反応条件を変えることによって可能である。このことは、当業者によく知られており、本発明はそれにも関する。従って、インスリングラルギン又はプレプロインスリン前駆体由来の匹敵するＡｒｇ（Ｂ３１），Ａｒｇ（Ｂ３２）インスリン類似体の調製における部分的な切断産物Ｂ（３１）ヒトインスリン（米国特許第５,６５６,７２２号）は、価値のある産物を調製するために利用可能となる。対応する融合タンパク質は、この場合、細胞内で調製される必要はない。また、プロインスリン類似体が、続いて周辺質への及び／又は培養上清への分泌を伴う細菌発現によっても調製され得ることは当業者に明らかである。欧州特許出願第１,３６４,０２９（Ａ）号には、一例としてこれが記載されている。本発明は、このような細菌法からの発現後に直接的に得られるＡｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン前駆体の使用にも関する。
【００１３】
さらに、本発明が同様に関係する方法のさらなる技術的な側面がある。欧州特許出願第０,３４７,７８１（Ａ）号並びに欧州特許出願第１,３６４,０３０（Ａ）号及び第１,３６４,０３２（Ａ）号には、高い収量でミニプロインスリンを調製するための酵母ベースの方法が記載されていする。このような方法、又は米国特許第５,６５６,７２２号に記載されるアミノ酸残基、すなわち、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕを位置Ａ２１に有するミニプロインスリンの調製と類似の方法を拡張することによって、これらのミニプロインスリンを、２つの鎖のインスリンへの切断直後にＡｒｇ（Ｂ３１），Ａｒｇ（Ｂ３２）インスリン類似体に変換できる。
【００１４】
融合タンパク質を介して欧州特許第１,３６４,０３２（Ａ）号に記載のとおり発現が生じる場合、トリプシン又は類似のエンドプロテアーゼでプレ部分を除去するのは有利ではない。代わりに、プレ部分又は融合部分を適切に除去するためにインスリン誘導体を切断しない特異的エンドプロテアーゼで認識される切断部位を組み込む。例証としてエンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ）又は活性化第Ｘ因子（ＩＥＧＲ）を記載する。本発明はそれにも関する。さらに、その２つの切断反応を、１容器反応において進め得ることは当業者には明らかである。さらなる可能性は、次の工程でのみ融合部分を除去することである。この場合、融合タンパク質部分を、効率的に分泌される多数のタンパク質の誘導体であるよう選択することが可能である。細菌に関して言及し得る例は、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、グルタチオンＳ転移酵素及びヒルジンである。酵母分泌に使用され得る例は、アルブミン又はその誘導体、スーパーオキシドジスムターゼ又はその誘導体、インターロイキン２又はその誘導体及びヒルジン又はその誘導体である。本願において、例証として、ヒルジン誘導体を、細菌発現及び酵母発現の両者のための融合部分として使用する。これに関連して驚くべきことに、ミニプロインスリン部分のフォールディングに負の影響を及ぼすことなく、ヒルジン配列を、連続したヒスチジンのペプチド配列及び／又はエンテロキナーゼの認識部位を表すペプチド配列ＤＤＤＤＫを導入することによってさらに修飾できることを発見した。従って、アフィニティクロマトグラフィーの方法が利用可能となる。本発明は、それにも関する。
【００１５】
さらに、例証として記載した発現システムが、タンパク質の組換え調製のために開発された宿主／ベクター系の小さなセグメントのみを表すという事実は当業者にはよく知られている。従って、標的ペプチドの調製を可能にする宿主／ベクター系も、本発明の一部を形成する。
【００１６】
従って、本発明は、トリプシンにより触媒されるアルギニン又はリシンとの連結反応を経由してインスリン類似体のＡｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリン前駆体からのアミノ酸残基Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）又はＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）の存在によって特徴付けられるインスリン類似体の調製に関する。これに関連して、反応の驚くべき選択性のため、連結反応を複数の反応サイクルにわたって反復させることもでき、位置Ｂ３１及びＢ３２以外にさらなる塩基性アミノ酸リシン又はアルギニンを有するインスリン類似体が利用可能となることは、当業者に明らかである。このことは、カップリング反応、末端アミノ酸の脱アミド化又は脱保護を行うこと、及び適切なその後の反応サイクルにおいてその生産物を再度使用することによって達成される。同様に、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）又はＡｒｇ（３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）を既に有する類似体を前駆体として使用することによってこのような生産物を得ることが可能である。同様に、位置Ｂ３１に、そして、その後遺伝子的にコード可能な任意のアミノ酸（これは、配列中のアルギニン又はリシンである必要はないが、そのＣ末端が二塩基性配列Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ａｒｇで特徴付けられる）を含む類自体を調製することが可能である。さらに、本反応は、触媒としてのトリプシンの使用に限定されない。公知市販のラット、ウシ、ブタ若しくはヒトトリプシン又は他のアイソザイム、又はその誘導体若しくは変異体のほかに、以下の酵素：カテプシン、フザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来及びストレプトミセス属（Ｓ．グリセウス、Ｓ．エクスフォリアタス、Ｓ．エリスラエウス(ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ)、Ｓ．フラジアエ（ｆｒａｄｉａｅ）及びＳ．アルビドフラブス（ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ））由来のトリプシン、トリプターゼ、マスチン、アクロシン、カリクレイン、ヘプシン、プロスタシンＩ、リシルエンドペプチダーゼ（リシン−Ｃ）及びエンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（クロストリパイン）を使用することも可能である。
【００１７】
従って、本発明は、インスリン類似体又はその誘導体を調製するための方法であって、ここで、
アミド化され、若しくは保護基でＣ末端が保護された天然の塩基性アミノ酸を、又は天然の塩基性アミノ酸、若しくはその類似体若しくは誘導体からなりかつＣ末端でアミド化され、若しくは保護基で保護されたペプチドを、
Ａ鎖及び／若しくはＢ鎖のＣ末端アミノ酸が天然の塩基性アミノ酸、若しくはその類似体若しくは誘導体を含む群より選択される出発インスリン類似体、若しくはその誘導体に、
トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で上記１つのＣ末端アミノ酸に、付加し、
そして得られる修飾されたインスリン類似体を精製し、そして場合により付加されたア
ミノ酸の又は付加されたペプチドのアミド基又はＣ末端保護基を除去する、
方法に関する。
【００１８】
本発明はさらに、インスリン類似体が、一般式Ｉ
【化１】
2009542235.tif 000002
［式中、意味は、
（Ａ１−Ａ５）ヒトインスリン又は動物インスリンのＡ鎖の位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基、
（Ａ１２−Ａ１９）ヒトインスリン又は動物インスリンのＡ鎖の位置Ａ１２〜Ａ１９のアミノ酸残基、
Ａ２１         天然のアミノ酸残基、
（Ｂ８−Ｂ１８）ヒトインスリン又は動物インスリンのＢ鎖の位置Ｂ８〜Ｂ１８のアミノ酸残基、
（Ｂ２０−Ｂ２６）ヒトインスリン又は動物インスリンのＢ鎖の位置Ｂ２０〜Ｂ２６のアミノ酸残基、
（Ａ８−Ａ１０）ヒトインスリン又は動物インスリンのＡ鎖の位置Ａ８〜Ａ１０のアミノ酸残基、
Ｒ３０  化学結合又は天然のアミノ酸残基、
Ｂ１    化学結合又は天然のアミノ酸残基、
Ｂ３    天然のアミノ酸残基、
Ｂ２７、Ｂ２８
及びＢ２９     天然のアミノ酸残基、
Ｒ１    アミノ基又は１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ２    カルボキシ基又は１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ３    アミノ基又は１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ４    化学結合、又はＣ末端に存在するアミノ酸残基が塩基性アミノ酸を表す１〜３個の天然のアミノ酸残基、
Ｒ５    Ｃ末端が遊離又はアミド化されたの何れかである１又は２個の塩基性アミノ酸残基であり、
そこで、Ｃ末端でＲ５のＮ末端に連結されるアミノ酸残基が、天然の塩基性アミノ酸を含む群より選択される］
によって特徴付けられる上述の方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、出発インスリン類似体が、一般式ＩＩ
【化２】
2009542235.tif 000003
［式中、Ｒ１、（Ａ１−Ａ５）、（Ａ８−Ａ１０）、（Ａ１２−Ａ１９）、Ａ２１、Ｒ２、Ｒ３、Ｂ１、Ｂ３、（Ｂ８−Ｂ１８）、（Ｂ２０−Ｂ２６）、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０及びＲ４が、請求項１で定義される通りであり、かつＢ鎖のＣ末端アミノ酸残基が、天然の塩基性アミノ酸を含む群より選択される］
によって特徴付けられる上述の方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、アミド化され、又は保護基でＣ末端が、保護された天然の塩基性アミノ酸が、Ｃ末端でアミド化されたアルギニン、又はＢｏｃ保護基でＣ末端を保護されたアルギニンである、上述の方法に関する。
【００２１】
本発明はさらに、修飾されたインスリン類似体が、Ｂ鎖のＣ末端がアミド化されたＧｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンであり、出発インスリン類似体は特に、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）ヒトインスリンである上述の方法に関する。
【００２２】
本発明はさらに、出発インスリン類似体が、出発インスリン類似体のＡ鎖及びＢ鎖を含む前駆体タンパク質の組換え発現によって調製される、上述の方法、特に、レプリコンの部分である遺伝子を発現するこの種の方法に関する。
【００２３】
本発明はさらに、細菌又は酵母を宿主細胞として使用する、上述の方法に関する。
【００２４】
本発明はさらに、前駆体タンパク質が発現後に分泌される、特に、そこで前駆体タンパク質が細菌又は酵母の細胞上清から単離される、上述の方法に関する。
【００２５】
本発明はさらに、前駆体タンパク質が、細菌の周辺質から単離される、上述の方法に関する。
【００２６】
本発明はさらに、特許請求の範囲の何れかに記載のとおり得られる前駆体タンパク質を、フォールディングプロセス及び酵素的切断に供する、上述の方法に関する。
【００２７】
本発明はさらに、出発インスリン類似体が、組換え体直接発現によって調製される、上述の方法に関する。
【００２８】
本発明はさらに、トリプシンの生物活性を有する酵素が、ヒトトリプシン、ブタトリプシン、ウシトリプシン、並びにヒトトリプシン、ブタトリプシン及びウシトリプシンの変異体を含む群より選択される、上述の方法に関する。
【００２９】
本発明はさらに、修飾されたインスリン類似体のＢ鎖のＣ末端が、その後加水分解反応において脱保護される、上述の方法に関する。
【００３０】
本発明はさらに、得られたインスリン類似体が、Ｇｌｙ（Ａ２１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンである、上述の方法に関する。
【００３１】
本発明はさらに、Ａ鎖及び／又はＢ鎖のＣ末端アミノ酸がアミド化された、インスリン類似体又はその誘導体の薬剤としての使用に関する。
【００３２】
本発明は、Ａ鎖及び／又はＢ鎖のＣ末端アミノ酸がアミド化された、上述の方法によって得ることのできるインスリン類似体又はその誘導体に関する。
【実施例】
【００３３】
以下に、幾つかの手順的実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。これらの手順的実施例は、限定的な効果を有するよう意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
実施例１：インビトロでのフォールディング後の融合タンパク質からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリンの調製
米国特許第５,６６３,２９１号の実施例１には、構造
【化３】
2009542235.tif 000004
の正確に折りたたまれたインスリン融合タンパク質の取得が記載されている。
【００３５】
この物質は、米国特許第５,２２７,２９３号の実施例５に従いトリプシンとの反応によって、２つの鎖のインスリンに変換され、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリン及びＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリンが単離された。
【００３６】
従って、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリン類似体は直接的に得ることが可能であり、一方Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）副産物は修飾されたアルギニン又はリシンとのトリプシン触媒連結反応における前駆体として使用することができた。
【００３７】
実施例２：分泌によって得られており、かつ正確に折りたたまれたプロインスリンを含む融合タンパク質からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリンの調製
実施例１に対する代替として、融合タンパク質は、また細菌系における分泌によって調製することが可能であった。この場合、融合タンパク質の部分としてのプロインスリン構造は正確に折りたたまれており、「インビトロ」でのリフォールディング工程なしで済ますことができた。国際特許出願公開ＷＯ０２／０６８６６０は、この種類の系を提案している。例えば、Ａｓｎ（Ａ２１）についてのコドンが、この国際特許出願の実施例１において記載されているプラスミドｐＢｐｆｕＨｉｒ＿ＩｎｓにおけるＧｌｙ（Ａ２１）についてのコドンによって置換される場合、結果として、一例としてインスリングラルギンを得ることができる融合タンパク質が生じ、そしてさらにＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを、実施例１に記載したように、副産物として単離することが可能であった。
【００３８】
その配列を調製するために、以下の構造
【化４】
2009542235.tif 000005
を有する新たなプライマーｉｎｓｕ＿ａ２１＿ｇｌｙ＿ｒｅｖが必要であった。
【００３９】
このプライマーを、ＰＣＲにおいてプラスミドｐＢｐｆｕＨｉｒ＿ｉｎｓのＤＮＡに関してプライマーｐｆｕ１を使用する国際特許出願公開ＷＯ０２／０６８６６０と同様に使用した。国際特許出願公開ＷＯ０２／０６８６６０の実施例に従ってクローニングすることが可能であるＢａｍＨ１／Ｈｉｎｄ３断片をＰＣＲ産物から単離することができた。発現後、融合タンパク質を単離し、本願の実施例１に従ってさらに処理した。
【００４０】
前駆体Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを、融合タンパク質の細菌分泌によって直接的に得られ得ることも、当業者に明らかである。本発明は、それにも関する。
【００４１】
実施例３：アルギニンアミドとのカップリングによるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）前駆体からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリンの調製
２１Ａ−Ｇｌｙ−３０Ｂ  ａ  Ｌ−Ａｒｇ−インスリン１００ｍｇをアルギニンアミド溶液０.９５ｍＬ（４４６ｇ／Ｌ）に溶解し、Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.８）０.１３ｍＬ及びＤＭＦ２ｍＬを添加した。反応混合物を１２℃に冷却し、トリプシン０.０９４ｍＬ（０.０７５ｍｇ、Roche Diagnostics）を添加することによって開始した。
８時間後、ＴＦＡをｐＨ２.５まで添加することによって反応を停止させ、ＨＰＬＣによって分析した。６０％を超えるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンが生成した。トリプシン阻害剤溶液を添加した後、米国特許第５,６５６,７２２号と同様に、アミド化された類似体を精製した。次に、アミド化されたインスリン類似体を、酸の存在下で数時間加水分解して、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）、−Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを得た。
【００４２】
実施例４：リシンアミドとのカップリングによるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン前駆体からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの調製
２１Ａ−Ｇｌｙ−３０Ｂ  ａ  Ｌ−Ａｒｇ−インスリン１００ｍｇをリシンアミド溶液０.９３ｍＬ（４００ｇ／Ｌ）に溶解し、Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.８）０.１３ｍＬ及びＤＭＦ２ｍＬを添加した。反応混合物を１２℃に冷却し、トリプシン０.０９４ｍＬ（０.０７５ｍｇ、Roche Diagnostics）を添加することによって開始した。
８時間後、ＴＦＡをｐＨ２.５まで添加することによって反応を停止させ、ＨＰＬＣによって分析した。Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）−ＮＨ2、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを生成させ、米国特許第５,６５６,７２２号と同様に、トリプシン阻害剤溶液の添加後に精製した。次に、酸の存在下で、アミド化されたインスリン類似体を数時間加水分解し、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを得た。
【００４３】
実施例５：Ｈ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨとのカップリングによるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）前駆体からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリンの調製
Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン０.２５ｍｇをエッペンドルフ容器中で０.１Ｍピリシン酢酸緩衝液（ｐＨ５.６）１１μＬ、０.１Ｍピリシン酢酸緩衝液（ｐＨ５.６）中のＨ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ×ＨＣｌ１３０ｇ／Ｌ溶液６０μＬ及びＤＭＦ１１９μＬと混合し、トリプシン（Roche Diagnostics）と共に１２℃で数時間インキュベートした。
２５％水、２５％アセトニトリル及び５０％トリフルオロ酢酸の混合物を添加することによって、反応を停止させた。混合物を凍結乾燥し、保護基を除去するために、ＴＦＡ１ｍＬに溶解し、室温で約３時間放置した。Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）−ＮＨ2、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの精製は、例証として、米国特許第５,６５６,７２２号と同様に行った。
【００４４】
実施例６：Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕとのカップリングによるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）前駆体からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリンの調製
Ａｒｇ（Ｂ３１）、−Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン５０ｍｇをＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ溶液（０.５ｇ／ｍＬ、ｐＨ５）０.６２ｍＬに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬを添加した。混合物を１２℃に冷却し、トリプシン（Roche Diagnostics）２ｍｇを添加した。
１０時間を超えた後、５０％濃度のアセトニトリル／水混合物２ｍＬ及びＴＦＡ（１００％）１ｍＬを添加することによって、反応を停止させた。混合物を凍結乾燥し、Ｂｏｃ保護基を除去するために、ＴＦＡ１ｍＬに溶解し、室温で約３時間放置した。Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）、ＯＨの精製は、例証として、米国特許第５,６５６,７２２号と同様に行った。
【００４５】
実施例７：パン酵母によるヒルジンＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリン融合タンパク質の分泌のための遺伝子配列
欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号により、酵母における価値のある医薬的に関心のある他のタンパク質の発現及び分泌のための融合パートナーとしてのヒルジンの使用が提唱された。
【００４６】
欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号の実施例１には、ヒルジン誘導体とミニプロインスリンとからなる融合タンパク質を調製するための宿主−ベクター系が記載されている。この系は、一例として、位置Ａ２１でアミノ酸アスパラギンが米国特許第５,６５６,７２２号において記載されるようなアミノ酸によって置換したミニプロインスリンを調製するために使用することができる。
【００４７】
プライマーｉｎｓｎｃｏ１ｒｅｖが置換され、位置Ａ２１におけるコドンが変化するよう設計される場合、発現ベクターを、欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号の例と同様に構築することが可能である。
【００４８】
Ａｒｇ（Ｂ３１）、ＧｌｙＡ（２１）ヒトインスリンをコードする配列を調製するために、例えば、次のプライマーを合成した。
【化５】
2009542235.tif 000006
【００４９】
この場合、プライマーは、インスリン類似体のアミノ酸Ａ１５〜Ａ２１をコードする遺伝子セグメントを完全にカバーする。このプライマーと前記出願の実施例１由来の配列番号４のプライマーとの組み合わせ、及びテンプレートとしてのプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓの使用によって、制限酵素Ｋｐｎｌ及びＮｃｏＩによる消化後それに伴って開かれる発現ベクター中に挿入されるＤＮＡ断片のＰＣＲによる生成が可能となり、所望の融合タンパク質が構成される。
【００５０】
本ベクターを、ｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１と命名した。欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号に従って、融合タンパク質を発現させ及び処理して、Ｇｌｙ（Ａ２１）−ミニプロインスリンを得、実施例２に従って、Ｇｌｙ（Ａ２１）−ミニプロインスリンをＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンに変換した。
【００５１】
実施例８：パン酵母によるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）前駆体の直接的な分泌のための遺伝子配列
実施例７に記載したプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡを使用して、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの直接的な分泌のためのベクターコンストラクトを調製した。
次のプライマーを合成した。
【化６】
2009542235.tif 000007
【００５２】
それは、α要素のＣ末端、Ｌｙｓ−Ａｒｇのためのコドン及びミニプロインスリン配列のＮ末端をカバーする。
【化７】
2009542235.tif 000008
【００５３】
このプライマーは、プラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１中にクローニングされたインスリン類似体配列の３’末端とハイブリダイズする。ＰＣＲ（標準的な条件）によって、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩによる消化後に、開かれる発現ベクター中に挿入されるＤＮＡ断片を生成させ、所望の融合タンパク質を構成した。酵母Ｙ７９系のコンピテント細胞において形質転換した。その後、形質転換体を実施例７に記載されるとおり発現させた。Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）−ミニプロインスリンを公知の方法（欧州特許出願公開第０,２２９,９９８（Ａ）号）によって単離し、実施例２のとおり、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｌｙｓ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンに変換した。
【００５４】
実施例９：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）によるヒルジン−Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリン融合タンパク質の分泌のための遺伝子配列
発現ベクターのクローニングは、欧州特許出願公開第１,３６４,０３２号（Ａ）の実施例４と同様に行った。この場合、配列プライマーｐｉｃｈｉａ＿Ｈ＿Ｉｒｅｖ２の代わりに、プライマーｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ｒｅｖ２を使用し、その後、そのＰＣＲ産物
【化８】
2009542235.tif 000009
でのＧｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの発現の見込みが可能となった。
【００５５】
得られたプラスミドを、ｐＰｉｃｈ＿Ｈｉｒ＿Ｉｎｓ−ＧｌｙＡ２１と命名した。二塩基性鎖末端を有する類似体を生成させるための出発材料としてのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）−ミニプロインスリンの精製を、記載されるとおり行った。
【００５６】
実施例１０：ピキア・パストリスによるＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）前駆体の直接的な分泌のための遺伝子配列
適切な発現ベクターを、実施例７と同様に構築した。プラスミドｐＰｉｃｈ＿Ｈｉｒ＿ｉｎｓ−ＧｌｙＡ２１並びに２つのプライマーｐｉｃｈ＿ｉｎｓｇｌｙ＿ｄｉｒｆ及びｐｉｃｈ＿ｉｎｓｇｌｙ＿ｄｉｒｒｅｖのＤＮＡ
【化９】
2009542235.tif 000010
【００５７】
実施例１１：酵母分泌によって得られ、正確に折りたたまれたプロインスリンを含み、その融合部分がＨｉｓ6アミノ酸配列を含む融合タンパク質からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）−インスリンの調製
プラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡは、テンプレートとして機能する。２つのプライマーを合成した。
【化１０】
2009542235.tif 000011
【００５８】
プライマーは、Refludan(R)配列の連続した６個のヒスチジン及びアミノ酸３〜８及び９（部分的）のためのコドンを含んだ。
【化１１】
2009542235.tif 000012
【００５９】
プライマーは、連続した６個のヒスチジンのコドン、レピルジン配列のアミノ酸１及び２のコドン、及びＬｙｓ−Ａｒｇプロセッシング部位を含み、制限酵素Ｋｐｎ１のための認識部位をカバーする、α要素の配列コドンを含む。プラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡは、本願の実施例７由来のプライマーａｌｐｈａ＿ＬＴ＿Ｈ６＿ｈｉｒｆ１及びｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖを使用する標準的なＰＣＲにおいてテンプレートとして機能する。反応産物を単離し、アリコートをプライマーａｌｐｈａ＿ＬＴ＿Ｈ６＿ｈｉｒｆ２及びｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖを使用する第二のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。記載されるとおり、反応産物をＫＰＮ１及びＮｃｏ１で処理した後、クローニングした。結果としてプラスミドｐＡＤＨ２＿ＬＴ＿Ｈ６＿Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１が生じた。Ｙ７９をプラスミドＤＮＡで形質転換した後、融合タンパク質を発現させた。遠心分離によって細胞を上清から分離し、そして上清を例えばSartorius製のメンブレンフィルターを通し、Invitrogen ProBond TM精製システムのためのプロトコルに従ったＮｉ2+アフィニティクロマトグラフィーによって濃縮した。代替法としての透析及び／又は濾過若しくはゲル濾過によって溶出緩衝液を除去した後、融合タンパク質を公知の方法で処理して、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを得、次いでインスリングラルギンに変換することができた。
【００６０】
実施例１２：酵母分泌によって得られ、正確に折りたたまれたプロインスリンを含む融合タンパク質で、その融合タンパク質が酵素エンテロキナーゼによって除去される、該融合タンパク質からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの調製
プラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡは、出発材料として機能する。本願の実施例７由来のプライマーｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖ及び出願公開ＷＯ０２／０７０７２２Ａ１の実施例１由来のｈｉｒｆ１を使用した。この目的のために、２つの新たなプライマーを調製した。
【化１２】
2009542235.tif 000013
【００６１】
プライマーは、ミニプロインスリン配列のアミノ酸Ｂ１〜Ｂ７及びＢ８（部分的）をカバーし、エンテロキナーゼのための認識部位を表すアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのコドンを含む。
【化１３】
2009542235.tif 000014
【００６２】
逆方向プライマーは、レピルジン配列のアミノ酸６０〜６５をカバーし、エンテロキナーゼの認識部位を表すアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号
１３）のコドンを含む。第一に、プライマーペア、ｈｉｒｆ１／Ｈｉｒ＿ｅｎｔｅｒｏ＿ｉｎｓｒｅｖ及びＨｉｒ＿ｅｎｔｅｒｏ＿ｉｎｓｆ／ｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖを使用して、２回のＰＣＲを行った。反応産物を単離した。その材料のアリコートを混合し、その混合物をプライマーペアｈｉｒｆ１／ｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖのためのテンプレートとして、第三のＰＣＲにおいて使用した。記載のとおり、反応産物をクローニングした。その結果、ベクターｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１が生じた。記載のとおり、融合タンパク質を調製した。
【００６３】
エンテロキナーゼを使用して、融合タンパク質を切断した。該酵素は、市販されている。
【００６４】
特定の製造元の情報に従った酵素の量を使用する切断反応を、エンテロキナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７.４）で行った。切断は通常、宿主細胞の除去及びその後の後処理工程後に実施した。しかしながら、切断は、最適な反応条件が調整された後、発酵後の上清で直接行うことも可能である。
【００６５】
実施例１３：酵母分泌によって得られ、及び正確に折りたたまれたプロインスリンを含む融合タンパク質で、その融合部分が酵素エンテロキナーゼによって除去され、かつ及びポリヒスチジン配列を含む、該融合タンパク質からのＡｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンの調製
プラスミドｐＡＤＨ２＿ＬＴ＿Ｈ６＿Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡ及びプライマーＨｉｒ＿ｅｎｔｅｒｏ＿ｉｎｓｒｅｖ、Ｈｉｒ＿ｅｎｔｅｒｏ＿ｉｎｓｆ及びｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖを使用し、以下の配列を有するプライマーａｌｐｈａ＿ｌｔ＿ｅｎｔｅｒｏｆによってプライマーｈｉｒｆ１を置換した。
【化１４】
2009542235.tif 000015
【００６６】
次に、実施例１２と同様に、ヒルジン融合部分が、位置３においてＮ末端で開始する６個のヒスチジンによって伸長され、及び配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１４）によって位置７２からＣ末端で伸長された融合タンパク質をコードするベクターｐＡＤＨ２＿ＬＴ＿Ｈ６＿Ｈｉｒ＿ｅｔｅｒｏ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１を構築した。
【００６７】
次に、実施例１１及び１２に記載した方法を組み合わせることによって、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）ヒトインスリンを調製した。
【００６８】
実施例１４：パン酵母によるヒルジンｄｅｓ−Ｐｈｅ（Ｂ１）、Ａｒｇ（Ｂ３１）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリン融合タンパク質の分泌のための遺伝子配列
形質転換及び発現は、実施例７と同様に行った。
２つのプライマー配列を合成した。
【化１５】
2009542235.tif 000016
【００６９】
実施例７由来のプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡは、テンプレートとして機能する。互いに独立して２回のポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応１において、プライマーＤｅｓｐｈｅ＿ｒｅｖ１及び欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号の実施例１由来のプライマー配列番号４を使用し、反応２において、本願の実施例７由来のプライマーｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖ及びプライマーＤｅｓｐｈｅｆ１を使用した。２回の反応の反応産物を単離し、生産物のアリコートを第三の反応において組み合わせ、欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号の実施例１由来のプライマー配列番号４及びｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖからなるプライマーペアのテンプレートとして使用した。実施例７に記載のとおり、第三の反応の反応産物をクローニングし、形質転換し及び発現させた。得られた融合タンパク質は、二塩基性鎖末端を有する相応するインスリン類似体を調製するための出発材料として機能する。
【００７０】
実施例１５：パン酵母によるヒルジンＡｌａ（Ｂ３１）、Ａｒｇ（Ｂ３２）、Ｇｌｙ（Ａ２１）インスリン融合タンパク質の分泌のための遺伝子配列
２つのプライマー配列を合成した。
【化１６】
2009542235.tif 000017
【００７１】
実施例７由来のプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓ＿ｇｌｙＡ２１のＤＮＡは、テンプレートとして機能する。互いに独立して２回のポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応１において、プライマーＡｌａ＿ｂ３１ｒｅｖ１及び欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号の実施例１由来のプライマー配列番号４を使用し、反応２において、本願の実施例７由来のプライマーｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖ及びプライマーＡｌａ＿ｂ３１ｆ１を使用した。２回の反応の反応産物を単離し、生産物のアリコートを第三の反応において組み合わせ、欧州特許出願公開第１,３６４,０３２（Ａ）号の実施例１由来のプライマー配列番号４及びｉｎｓ＿ｇｌｙ＿ａ２１＿ｒｅｖからなるプライマーペアのテンプレートとして使用した。実施例７に記載のとおり、第三の反応の反応産物をクローニングし、形質転換し及び発現させた。得られた融合タンパク質は、二塩基性鎖末端を有する対応するインスリン類似体を調製するための出発材料として機能する。
【００７２】
実施例１６：パン酵母によるＬｙｓ（Ｂ３１）前駆体の直接的な分泌のための遺伝子配列
２つのプライマーを合成した。
【化１７】
2009542235.tif 000018
【００７３】
出願公開ＷＯ０２／０７０７２２Ａ１の実施例１由来のプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ｉｎｓのＤＮＡは、２回のポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして機能する。反応１において、プライマーＬｙｓ＿ｂ３１ｆ１及びｉｎｓｎｃｏ１ｒｅｖ（ＷＯ０２／０７０７２２Ａ１由来の配列番号６）を使用し、反応２において、本願の実施例７由来のプライマーＬｙｓ＿ｂ３１ｒｅｖ及びａｌｐｈａ＿ｉｎｓｆ１を使用した。標準的な反応を行い、得られたＰＣＲ断片を単離した。２つの生産物のアリコートは組み合わされ、プライマーｉｎｓｎｃｏ１ｒｅｖ及びＷＯ０２／０７０７２２Ａ１由来の配列番号６を使用する第三の反応のためのテンプレートとして機能する。実施例８に記載のとおり、得られたＰＣＲ断片をクローニングし、そして発現させた。結果として、リシルエンドペプチダーゼでＢ（１〜２９）−Ａ（１〜２１）スプリットインスリンに、そしてその後それぞれの二塩基性類似体に変換可能なＢ３０−アルギニンアミドインスリン又はＢ３０リシンアミド−インスリンを調製するための中間体として変換されるＬｙｓ（Ｂ３１）−ミニプロインスリンが生じた。
【００７４】
実施例１７：リシルエンドペプチダーゼによる切断
独国特許第３８４４２１１号に記載のとおり、インスリン前駆体をリシルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）と反応させた（実施例１）。この目的のため、Ｌｙｓ（Ｂ３１）−ミニプロインスリン１０ｍｇをトリス緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、リソバクター酵素前駆体（ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅ）由来のＬＥＰを添加した（１ｍｇ／ｍＬ濃度の水溶液０.０１ｍＬ、Merckbiosciences）。インキュベーションを室温で２時間行い、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Nucleosil  １２０−５カラム）によって精製した。結果としてＢ（１〜２９）−Ａ（１〜２１）スプリットインスリンが生成した。
【００７５】
実施例１８：アルギニンアミドとのカップリングによるＢ（１〜２９）−Ａ（１〜２１）スプリットインスリン前駆体からのＡｒｇ（Ｂ３０）−インスリンの調製
Ｂ（１〜２９）−Ａ（１〜２１）スプリットインスリン１００ｍｇをアルギニンアミド溶液０.９５ｍＬ（４４６ｇ／Ｌ）に溶解し、Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.８）０.１３ｍＬ及びＤＭＦ２ｍＬを添加した。反応混合物を１２℃に冷却し、トリプシン０.０９４ｍＬ（０.０７５ｍｇ、Roche Diagnostics）を添加することによって開始した。
【００７６】
８時間後、ＴＦＡをｐＨ２.５まで添加することによって反応を停止させ、ＨＰＬＣによって分析した。６０％を超えるＡｒｇ（Ｂ３０）−インスリンアミドが生成した。トリプシン阻害剤溶液を添加後、米国特許第５,６５６,７２２号と同様に、アミド化類似体を精製した。次いでアミド化類似体を酸の存在下で数時間加水分解してＡｒｇ（Ｂ３０）インスリンを得るか、又はアミドを薬剤として直接使用することが可能であった。
【００７７】
実施例１９：リシンアミドとのカップリングによるＢ（１〜２９）−Ａ（１〜２１）スプリットインスリン前駆体からのＬｙｓ（Ｂ３０）−インスリンの調製
Ｂ（１〜２９）−Ａ（１〜２１）スプリットインスリン１００ｍｇをリシンアミド溶液０.９３ｍＬ（４００ｇ／Ｌ）中に溶解し、Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.８）０.１３ｍＬ及びＤＭＦ２ｍＬを添加した。反応混合物を１２℃に冷却し、トリプシン０.０９４ｍＬ（０.０７５ｍｇ、Roche Diagnostics）を添加することによって出発した。８時間後、ＴＦＡをｐＨ２.５まで添加することによって反応を停止させ、ＨＰＬＣによって分析した。Ｌｙｓ（Ｂ３０）−インスリンアミドが生成し、米国特許第５,６５６,７２２号と同様に、トリプシン阻害剤溶液の添加後に精製した。次に、アミド化されたインスリンを酸の存在下で数時間加水分解してＬｙｓ（Ｂ３０）−インスリンを得るか、又は薬剤として直接使用することが可能であった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009542235.tif 000022
2009542235.tif 000023
2009542235.tif 000024
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