(57)【要約】本発明は、種々の表面上の細菌バイオフィルムの形成を予防及び／又は阻害できる成分を提供する。特に、本発明は、細菌の付着及び／又は細菌バイオフィルムの発達を予防又は阻害する組成物の製造のための細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体の使用に関する。抗バイオフィルム組成物、及びバイオフィルム形成を予防するように処理されたデバイスも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の付着及び／又は細菌バイオフィルムの発達を予防又は阻害する組成物の製造のための、細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体の使用。
【請求項２】
前記可溶性グループII様莢膜多糖体が、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌の培養物の上清で得られる請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記可溶性グループII様莢膜多糖体が、精製画分として得られる請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体を含むことを特徴とする、細菌の付着及び／又は細菌バイオフィルムの発達を阻害するための組成物。
【請求項５】
大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌の培養物の上清の精製画分を含む請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
以下の：
(i) グループII様莢膜を発現する細菌株の培養物の上清を細菌細胞から分離し、
(ii) 得られた上清中に存在する多糖体を沈殿させ、
(iii) 沈殿物を任意に再懸濁する
工程を含む、細菌株から抗バイオフィルムグループII様莢膜多糖体を精製する方法。
【請求項７】
グループII様莢膜を発現する前記細胞株が、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞株が、尿路疾患性大腸菌である請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
工程(i)における分離が、培養物のフィルタ滅菌及び／又は遠心分離により行われる請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
工程(ii)における沈殿が、1容量の上清について3容量のエタノールを用いて行われる請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
工程(ii)で得られる沈殿物が、工程(iii)の前に、水に再懸濁され、脱イオン水に対して透析され、次いで凍結乾燥される請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
イオン交換クロマトグラフィーによる精製の追加の工程(iv)をさらに含む請求項6〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
工程(iv)が、DEAE-セファロースカラムを用いて行われる請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
工程(iii)における再懸濁が、25%プロパノール-1を含むTrisHCl 20 mM、pH 7.5中で行われ、かつ工程(iv)において用いられるカラムが、同じ緩衝液で平衡化される請求項12又は13に記載の方法。
【請求項１５】
遠心分離工程を工程(iii)と工程(iv)との間に行って、不溶性画分を廃棄する請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記グループII様莢膜多糖体が、TrisHCl 20 mM、pH 7.5、25%プロパノール-1中の300 mM NaClで溶出される請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記可溶性グループII様莢膜多糖体が、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法により得られる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用又は請求項4若しくは5に記載の組成物。
【請求項１８】
必要とする対象への予防的又は治療的投与用に処方された請求項4、5及び17のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１９】
細菌株からのグループII様莢膜多糖体を含むことを特徴とする抗バイオフィルムコーティング。
【請求項２０】
前記グループII様莢膜多糖体が、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌株からであることを特徴とする請求項19に記載の抗バイオフィルムコーティング。
【請求項２１】
請求項4、5及び17のいずれか1項に記載の組成物の使用により得られることを特徴とする請求項19又は20に記載の抗バイオフィルムコーティング。
【請求項２２】
請求項19、20及び21のいずれか1項に記載の抗バイオフィルムコーティングで少なくとも部分的に被覆されたことを特徴とする医療用又は工業用のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルムの予防の分野に関する。より具体的には、本発明は、種々の表面上での細菌バイオフィルム形成を予防及び／又は阻害できる新規な成分を提供する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、多糖体マトリクス中に埋め込まれた微生物の蓄積物であり、生物又は非生物性の表面に付着性である。多様な微生物(関連するバクテリオファージ及びその他のウイルスとともに細菌、真菌及び／又は原生動物)が、これらのバイオフィルム中に見出される。バイオフィルムは、天然に遍在し、家庭及び工業的な水系を含む広範囲の環境で見出される。
【０００３】
バイオフィルムは、哺乳動物におけるいくつかの疾患状態の原因物質でもある。その例は、口腔軟組織、歯、中耳、胃腸管、尿生殖路、気道／肺組織、腹膜及び眼の感染を含む。バイオフィルムは、歯科用インプラント材、尿生殖路人工器官、腹膜透析カテーテル、血液透析用及び化学療法剤の長期投与用(ヒックマンカテーテル)の留置カテーテル、ペースメーカー、人工心臓弁、心室支援デバイス(VAD)、合成人工血管及びステントのような心臓用インプラント、人工器官、内固定デバイス、経皮的縫合糸、並びに気管及び人工呼吸用の管のような医療用留置デバイス上でも発達する。
【０００４】
水系のような工業用デバイス又は農産食品プラントでのバイオフィルムの発達も、安全性の問題を提起する。
【０００５】
プランクトン様細菌(すなわち、液体媒体に懸濁された単細胞細菌)は、研究及び抗生物質の設計用のモデルとして通常用いられる。しかし、バイオフィルム中の細菌は、それらのプランクトン様の対応物よりもはるかに抗生物質に対して耐性があり、免疫系が近づくことがより難しい。さらに、プランクトン様細胞同士よりもバイオフィルム中の細胞同士で接合が起こる速度がより大きい。このように細菌間での遺伝子導入の機会が多いことは、抗菌剤又は化学的殺生物剤に抵抗性の細菌が隣にある感受性の細菌に耐性についての遺伝子を移入できるので、重要である。遺伝子導入は、従前の無毒性の共生生物を、高毒性の病原菌に変換することもできる。
【０００６】
バイオフィルムの形成は、表面への細菌の接着に限定されない。実際に、深部にまで増殖すると、バイオフィルム細菌は、バイオフィルムが最初に発達した実際の物理的な基層とよりも細菌同士で互いに相互作用する。バイオフィルム中では、細菌は、化学的シグナル伝達機構により通信できるので、集団は、バイオフィルム中で最少密度（クオラム）に達したときに、表現型の変化を受ける。「クオラムセンシング」と呼ばれるこの現象は、毒性因子の発現の原因であり得る。
【０００７】
コラン酸(colanic acid)ポリマー、セルロース及び(1-6)β-N-アセチルグルコサミンのような大腸菌(E. coli)バイオフィルム関連多糖体のほかに、大腸菌単離株は、2つの血清型特異的表面多糖体も生成する：リポ多糖体(LPS) O抗原及び莢膜多糖体K抗原。表面露出多糖体ポリマーのこれらの2つのクラスは、細菌表面のアドヘシンを遮蔽することによりバイオフィルム内で間接的な役割を演じることが示されている(Schembriら, 2004)。
【０００８】
バイオフィルムの予防及び／又は破壊のための今日までに記載されている方策は、クオラムセンシング阻害剤に主に基づく(Schachter, 2003)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、混合種の細菌バイオフィルムをインビトロで用いて、いくつかの細菌が培養上清中に、広範囲のグラム陰性及びグラム陽性細菌によるバイオフィルム形成を妨げる可溶性グループII莢膜多糖体を放出することを示したので、本発明は、バイオフィルム形成を阻害するための新規な方策を提供する。以下の実施例の部分に記載するように、これらの莢膜成分は、表面の物理化学的変化を誘導し、最初の付着及び細菌バイオフィルム発達をともに制限する細胞表面及び細胞−細胞の接触の低下を導く。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の目的は、よって、微生物の付着及び／又はバイオフィルムの発達、特に細菌の付着及び／又は細菌バイオフィルムの発達を予防又は阻害する組成物を製造するための、細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体(soluble group II-like capsular polysaccharide)の使用である。以下において、用語「多糖体」は単数形で用いても、種々の多糖体の混合物のことを示し得る。細菌により生成される莢膜多糖体は、実際は種々のサイズのものである。実際に、細胞表面の最外層の保護層を構成する大腸菌の莢膜は、遺伝子的及び生合成の基準に基づいて、4つの群に分類される。グループII莢膜は、大腸菌について記載される4つの莢膜のタイプの1つであり、ほとんどの尿路疾患性大腸菌(uropathogenic Escherichia coli (UPEC))及びその他の腸外大腸菌により生成される高分子量かつ荷電された多糖体ポリマーで構成される。グループII莢膜は、3つの機能的領域を特徴とする保存されたモジュール性の遺伝子機構を示す。領域1 (kpsFEDCUS)及び領域3 (kpsMT)は、全てのグループII莢膜形成細菌で保存され、ABC-依存性排出に必要なタンパク質をコードする。領域2は、K1、K2 (CFT073)、K5及びK96莢膜血清型のような多様な多糖体の構造成分をコードする(Whitfield, 2006; Whitfield及びRoberts, 1999)。グループII様莢膜は、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)及び髄膜炎菌(Neisseria meningitides)でも記載されている(Roberts, 1996)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、可溶性グループII様莢膜多糖体は、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌の培養物の上清で得られる。しかし、本明細書では、「グループII様莢膜多糖体」との語は、上記の株により生成される莢膜多糖体で観察される抗バイオフィルムの特性を保持するという条件で、他の細菌により生成される莢膜多糖体のことでもあり得る。例えば、ECORコレクションの株47により生成される莢膜多糖体(Ochman及びSelander, 1984)は、この株はハイブリッドグループII/グループIII莢膜を生成することが明らかではあるが、本明細書において「グループII様莢膜多糖体」と考えられる。
【００１２】
本発明は、種々の精製レベルの多糖体を用いて行うことができる。例えば、細菌培養物の粗製上清(フィルタ滅菌又は遠心分離により細菌から分離された)を、本発明に従って、可溶性グループII様莢膜多糖体を含む組成物として用い得る。しかし、組成物の抗バイオフィルム活性及び安全性を増加させるために、可溶性グループII様莢膜多糖体は、精製画分として得ることができる。精製の3つのレベルが、限定しない実施例として以下の実施例の部分に記載される。或いは、本発明による組成物は、例えば細菌の溶解後のように、細菌培養物から直接得ることができる。
【００１３】
本発明の別の目的は、細菌株からの可溶性グループII様莢膜多糖体を含む、細菌付着及び／又は細菌バイオフィルムの発達を阻害するための組成物である。このような組成物は、種々の精製レベルの多糖体を含み得る。好ましい実施形態において、このような組成物は、可溶性グループII様莢膜多糖体を含む、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌の培養物の上清の精製画分を含む。
【００１４】
本発明は、以下の
(i) グループII様莢膜を発現する細菌株の培養物を、細菌細胞から分離し、
(ii) 得られた上清中に存在する多糖体を沈殿させ、
(iii) 沈殿物を任意に再懸濁する
工程を含む、細菌株から抗バイオフィルムグループII様莢膜多糖体を精製する方法にも関する。
【００１５】
上記の方法は、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌株、より好ましくは尿路疾患性大腸菌を用いて行われるのが好ましい。
【００１６】
本方法において、工程(i)は、細菌細胞を除去するために、細菌培養物の遠心分離及び／又はフィルタ滅菌により行うことができる。例えば、工業的な方法において、予備的な遠心分離を行うことなく、タンジェンシャルろ過を行うことができる。タンジェンシャルろ過は、連続的に行うことができる。
【００１７】
当業者は、上記の方法の第2工程を行うために、当該技術において知られる任意の沈殿方法を行い得る。例えば、工程(ii)の沈殿は、1容量の上清について3容量のエタノールを用いて行い得る。
本発明による方法の有利な変動において、工程(ii)で得られる沈殿物は、工程(iii)の前に、まず水に再懸濁され、脱イオン水に対して透析され、次いで凍結乾燥される。
【００１８】
工程(iii)における再懸濁は、水又は意図する使用に適する任意の緩衝液中で行い得る。用い得る緩衝液の例は、25%プロパノール-1を含むTrisHCl 20 mM、pH 7.5である。
工程(iii)の最後に、抗バイオフィルム多糖体が、半精製生成物として得られ、これは、特に医療グレードの製品を必要としない用途において、本発明によりそのまま用い得る。
【００１９】
多糖体をさらに精製するために、精製方法は、クロマトグラフィー、特に、例えばDEAE-セファロースカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる精製の追加の工程(iv)を含み得る。本発明のこの実施形態において、不溶性画分を捨てるために、工程(iii)と工程(iv)の間に、任意の遠心分離工程を行い得る。
【００２０】
当業者は、工程(iv)を行うために任意の適切な緩衝液を選択できる。用い得る緩衝液の例は、25%プロパノール-1を含むTrisHCl 20 mM、pH 7.5である。このプロセスの有利な実施形態によると、沈殿物は、工程(iii)において25%プロパノール-1を含むTrisHCl 20 mM、pH 7.5に再懸濁され、工程(iv)で用いられるカラムは同じ緩衝液で平衡化される。
【００２１】
イオン交換クロマトグラフィーにより精製工程を行う場合、グループII様莢膜多糖体は、塩勾配、例えばNaCl勾配を用いて溶出できる。実施例の部分に記載されるこのプロセスの効率的な実施形態において、グループII様莢膜多糖体は、TrisHCl 20 mM、pH 7.5、25%プロパノール-1中の300 mM NaClで溶出される。
【００２２】
もちろん、上記の方法により得られる可溶性グループII様莢膜多糖体は、本発明に従って、細菌の付着及び／又は細菌バイオフィルムの発達を予防又は阻害する組成物の調製のために用い得る。このような精製された多糖体を含む抗バイオフィルム組成物も、本発明の一部分である。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、必要とする対象への予防的又は治療的投与用に処方される。本発明のこの態様による組成物の限定しない例は、口腔溶液、耳への注入のための溶液、洗眼剤、練り歯磨き又は治療的歯磨剤などである。これらの組成物を用いて、例えば病原細菌による腸、肺、耳、副鼻腔(sinus)又は任意の他の器官若しくは腔への(再)コロニー形成を予防できる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明による組成物は、表面上のバイオフィルムの形成を予防するために任意の種類の表面に塗布できる液体又はペースト、例えばペイントである。
【００２５】
本発明の別の態様は、細菌株からのグループII様莢膜多糖体を含む抗バイオフィルムコーティングである。このようなコーティングにおいて、グループII様莢膜多糖体は、上記のように種々の精製レベルであり得る。本発明によるコーティングの好ましい実施形態において、グループII様莢膜多糖体は、大腸菌、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌から選択される細菌株からである。このコーティングは、例えば、上記の組成物の塗布により得ることができる。これは、バイオフィルムの形成を避けるべき任意の種類のデバイス上に用い得るシートの形でもあり得る。
【００２６】
よって、細菌株からのグループII様莢膜多糖体を含む抗バイオフィルムコーティングで少なくとも部分的に被覆された医療用又は工業用デバイスも、本発明の一部分である。このような物体は、例えば、デバイスの一部分又は全体を、上記のような組成物に浸漬することにより得ることができる。当業者は、材料、グループII様莢膜多糖体中の構成物の濃度、意図する使用などに応じて、インキュベーション時間を選択できる。典型的には、上記のインキュベーションは、10秒〜30分継続し得る。短いインキュベーション(≦1〜5分)で、通常は充分である。必要であれば、次いで、被覆されたデバイスを、コーティングを損なうことなく、多様な処理により滅菌できる。例えば、これは、集中的に洗浄及び／又はオートクレーブされ得る。ガラス、パイレックス、PVC、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどでつくられた任意の種類のデバイスを、本発明のこの態様に従って有利に被覆できる。
【００２７】
本発明のこの態様に従って有利に被覆できる非限定的な医療用デバイスは、メス、ドリル及びその他の使い捨てでない外科用及び／又は歯科用ツール、並びに歯科用インプラント材、尿生殖路人工器官、腹膜透析カテーテル、血液透析用及び化学療法剤の長期投与用(ヒックマンカテーテル)の留置カテーテル、ペースメーカー、人工心臓弁、心室支援デバイス(VAD)、合成人工血管及びステントのような心臓用インプラント、人工器官、内固定デバイス、経皮的縫合糸、並びに気管及び人工呼吸用の管のような医療用留置デバイスである。
【００２８】
本発明のこの態様に従って有利に被覆できる非限定的な工業用デバイスの例は、パイプ、チューブ、バルブなどの配管工事材料、空冷式の塔、温水システム、原子力プラントの冷却材循環路、特に2次系及び3次系循環路、サイロ、発酵槽及び水切りのような農産食品材料、特にクリーンルームなどのための実験室テーブル、カウンタートップのような調度要素などである。
【００２９】
本発明は、以下の図面及び実施例により、さらに詳細に説明される。
図面の凡例
図1：CFT073のバイオフィルム阻害効果。A, KS272 (灰色)又はCFT073 (黒色)細胞の1〜10 OD600nm相当物を植菌したマイクロ発酵槽(microfermentor)でのMG1655 F'のバイオフィルム形成。MG1655F'バイオフィルム単独(Φ、白色)。結果は、6回の反復の平均±s.dである。MG1655F'バイオフィルムと比較したP＜0.001。B, マイクロタイタープレートMG1655F'バイオフィルム単独(Φ)、又はKS272若しくはCFT073の上清(それぞれS.KS272及びS.CFT073)の存在下。C, 上清なし(Φ)又はS.KS272若しくはS.CFT073を含む媒体で潅流したマイクロ発酵槽でのMG1655F'バイオフィルム。D, MG1655F'単独(Φ)、又はS.KS272若しくはS.CFT073を加えた場合の増殖曲線。E, BacLight染色で視覚化したMG1655F'細胞単独(O)、又はS.KS272若しくはS.CFT073を加えた場合のMG1655F'の生存性。F, CFT073上清(S. CFT)の存在下での種々の細菌によるマイクロタイタープレートでのバイオフィルム形成の質的分析。
【００３０】
図2: グラム陽性及びグラム陰性細菌のバイオフィルム形成に対するCFT073上清の影響。A, 種々の細菌単独(Φ)、KS272 (S.KS)又はCFT073 (S.CFT)の上清を加えた場合の種々の細菌のマイクロタイタープレートバイオフィルム形成の定量。保持されたクリスタルバイオレットのレベルを、分光光度法により測定した(OD570nm)。B, S.CFT若しくはS.KSを補っていない(Φ)又は補った培地を用いてマイクロ発酵槽中でいくつかの病原菌により形成されたバイオフィルムの定量。誤差バーは、2つの独立した試験の標準偏差を示す。C, 大腸菌(MG1655F')の緑膿菌(P. aeruginosa) (PAK)、肺炎桿菌(K. pneumoniae) (KP21)、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis) (O-47)、黄色ブドウ球菌(S. aureus) (15981)、及び表皮ブドウ球菌(O-47)と黄色ブドウ球菌(15981)、並びにイー・フェカリス(E. faecalis) (54)との混合バイオフィルムでのCFT073上清(S.CFT073)の影響。いずれのグループII莢膜も分泌しない大腸菌CFT073ΔkpsD株の上清(S. ΔkpsD)を、陰性対照として用いる。D, CFT073上清を補充した又は補充していない培地を用いるマイクロ発酵槽中での黄色ブドウ球菌及び緑膿菌のバイオフィルム形成の定量分析。
【００３１】
図3：莢膜の生成と、CFT073上清の抗バイオフィルム活性との関係。A, CFT073莢膜R1、R2及びR3領域の遺伝子の機構。トランスポゾン挿入を有する遺伝子に、アスタリスクで印をつける。B, 莢膜変異体上清の存在下で培養されたMG1655F'のバイオフィルム形成。C, 上清中のヘキソースのレベル。kpsF、kpsU、c3692及びc3693は、莢膜生成が損なわれない変異体に相当する。D, フェリチンで染色され、透過型電子顕微鏡(X100000; バー = 0,2μm)で検査された(左のパネル)定常期CFT073又はCFT073Δ細菌細胞の莢膜。125個及び105個の細胞が、それぞれ観察された。染色されたCFT073莢膜は、矢印で示す。右のパネルにおいて：定常期CFT073又はCFT073ΔkpsDの走査型電子顕微鏡写真(X50,000; バー = 0.5μm)。45個及び37個の細胞が、それぞれ観察された。
【００３２】
図4. 抗バイオフィルム活性と、グループII莢膜との相関。(A) 抗バイオフィルム活性を示す大腸菌の上清(表1を参照) (47株の他に、試験した全ての株はグループII莢膜を生成する)、(B) CFT073株、U-9株、U-15株及びそれらのそれぞれのkpsD変異体とともに培養された大腸菌MG1655F'株及び1091株、並びに黄色ブドウ球菌15981株のバイオフィルムの形成。(C) M63B1gluで成長したUPEC株であるCFT073、U-9、U-15 (黒色)及びそれらのそれぞれのkpsD変異体(灰色)、並びにそれらの対応する野生型上清を補充した培地で成長したkpsD変異体(白色)のマイクロ発酵槽中でのバイオフィルムの形成。バイオフィルムは、37℃にて36時間成長させた。誤差バーは、平均の標準偏差を表す。単純な数字により同定される株は、EcoRコレクションのものに相当する(Ochman及びSelander, 1984)。
【００３３】
図5. 髄膜炎菌上清の抗バイオフィルム効果。S.Neisseriaの存在下でのMG1655F'のマイクロタイタープレートバイオフィルム形成の定量。クリスタルバイオレット色素のOD570nmを、(O'Toole及びKolter, 1998)に記載されるようにして決定した。
【００３４】
図6：CFT073上清の物理化学的特性。a, CFT073 (CFT)、U-9、IHE3034 (IHE)、EcoR72 (E-72) (濃い灰色)及びそれらのそれぞれの莢膜変異体(薄い灰色)からの透析された上清とインキュベートしたカチオン性コロイドのζ電位。(Φ)は、M63B1glu処理に相当する。b, CFT、U-9、IHE、E-72 (濃い灰色)及び莢膜変異体(薄い灰色)とインキュベートした表面上の水滴の接触角。c, CFT、U-9、IHE、E-72、FR2 (CFT073上清精製画分) (濃い灰色)、及びそれぞれの莢膜変異体(薄い灰色)とインキュベートしたカチオン性粒子へのプロピジウムアイオダイドの吸着。吸着の程度は、蛍光強度により示す(＞670nm)。d, CFT、S.CFT073ΔR1 (ΔR1)、FR2とインキュベートした、及びインキュベートしなかった(Φ)カチオン性粒子の蛍光顕微鏡観察。誤差バーは、平均の標準偏差を表す。
【００３５】
図7：被覆された表面に対するCFT073上清のバイオフィルム阻害効果。未処理のガラススライド(上のパネル)、CFT073上清で処理したガラススライド(中のパネル)、及びCFT073ΔkpsD上清で処理したガラススライド(下のパネル)を用いる、いくつかの細菌によるマイクロ発酵槽でのバイオフィルム形成。
【００３６】
図8. S.CFT073上清(S.CFT)で被覆したスパーテルの処理の影響。未処理のガラススライド、及びS.CFT又は沸騰させたS.CFTで処理し、オートクレーブしたか若しくは集中的に洗浄したガラススライドを用いるMG1655F'によるマイクロ発酵槽でのバイオフィルム形成。
【００３７】
図9：CFT073上清は細胞−細胞相互作用に影響する。A, 0時間、1時間、6時間(24時間の培養)及び24時間(48時間の培養)でのCFT073上清(S.CFT)を補充した培地を用いるマイクロ発酵槽でのMG1655F'バイオフィルム形成。Φ：S.CFTの添加なし。B, フローセルに接種され、共焦顕微鏡でモニターされたGFPタグ付加MG1655F'。CFT073又はKS272上清を培養の3時間後に補充し、バイオフィルムは合計で12時間成長させた。C, 異なる機構により凝集する株を用いる自己凝集アッセイ：MG1655F' (F接合繊毛発現); MG1655ompR234 (カーリ(curli)過剰発現); MG1655ΔoxyR (Ag43自己輸送体アドヘシン過剰発現); 1094 (セルロース生成)。細胞は、3 mlのM63B1 (三角)、CFT073上清(丸)及びΔkpsD上清(四角)中でOD600が2になるまで希釈した。
【００３８】
図10. FR2画分の抗バイオフィルム活性。CFT073上清精製画分(FR2)を、MG1655F'培養物に、0.5〜500μg/mlの範囲の濃度で加えた。MG1655F'のバイオフィルム形成を、24時間後に視覚化した。50〜100μg/mlの濃度は、MG1655 F'バイオフィルムを阻害した。
【００３９】
図11. CFT073及びCFT073ΔR1による腸でのコロニー形成。a, バーは、糞便1グラム当たりのCFU のlog10平均数の標準誤差を表す。マン-ホイットニー検定を、統計分析に用い、統計的有意性のレベル(*)を、＜0.016のP値に設定した。b, CFT073 (丸)及びCFT073ΔR1 (三角)による結腸及び盲腸でのコロニー形成。DL: 検出限界。
【００４０】
図12. CFT073上清の抗バイオフィルム特性における成長期及びクオラムセンシングの影響。対数期、定常期にある細胞及びΔluxS 変異体から精製した上清の存在下でのマイクロタイタープレートでのMG1655F'のバイオフィルム形成。対数期(OD600nm=0.4)及び定常期(OD600nm=2) にある1010細胞を遠心分離し、上清を、3容量のエタノールで沈殿させた。ΔluxS変異体の上清は、一晩培養物から精製した。
【実施例】
【００４１】
実施例1：方法
細菌株、成長条件及び顕微鏡分析
細菌株を、以下の表1に列挙する。グラム陰性細菌は、0.4%グルコースを含むM63B1最少培地(M63B1glu)又はLBリッチ培地中で、37℃にて成長させた。グラム陽性細菌は、 0.25%グルコースを含むTSB (TSBglu)中で、37℃にて成長させた。細菌の成長及び生存率に対するCFT073上清の影響を、成長曲線の決定、LBプレート上でのコロニー形成単位の計数、及びBacLight Live/Dead生存性染色(Molecular Probes)を用いて評価した。フェリチン染色及び走査型電子顕微鏡観察を、(Bahrani-Mougeotら, 2002)に記載されるようにして行った。落射蛍光及び透過光顕微鏡法は、Nikon E400顕微鏡を用いて獲得した。自己凝集アッセイは、(Beloinら, 2006)に記載されるようにして行った。
【００４２】
【表１−１】
2009542618.tif 000002
【００４３】
【表１−２】
2009542618.tif 000003
【００４４】
【表１−３】
2009542618.tif 000004
【００４５】
バイオフィルム形成手順
マイクロ発酵槽実験：バイオフィルムを、以前に記載されたようにして行った(Ghigo, 2001)。混合バイオフィルム培養：マイクロ発酵槽内部のガラススライド(internal microfermentors glass slide)で形成された8時間MG1655F'バイオフィルムに、1 OD600nm相当のCFT073-gfp一晩培養物を感染させた。M63B1glu中での24時間の連続培養の後に、ガラススライドの写真を撮影した。バイオフィルムのバイオマスを、内部のガラススライド上に形成されたバイオフィルムを再懸濁したもののOD600nmを決定することにより評価した(Ghigo, 2001)。バイオフィルム阻害アッセイ：得られた培地を、ろ過した上清と1:1の比で混合し、細菌の接種の後の異なる時間でマイクロ発酵槽に入れた(0、1、6又は24時間)。バイオフィルムは、バイオマスの決定の前に、さらに24時間培養した。処理表面との細菌の相互作用の分析：ガラススライドを、ろ過したCFT073上清と1分間インキュベートし、脱イオン水で1回リンスした後に、マイクロ発酵槽に接種した。スライド上のバイオフィルムの形成を、24時間後に決定した。
【００４６】
マイクロタイタープレート実験：静的バイオフィルム形成アッセイを、(O'Toole及びKolter, 1998)に記載されるようにして、96ウェルPVCマイクロタイタープレート(Falcon)で行った。バイオフィルム阻害アッセイ：一晩培養物を、OD600=0.04に調節した後に、50μlの上清の存否で、100μlを96ウェルに接種した。フローチャンバ実験：バイオフィルムを、M63B1glu中で、3×チャネルフローセル(1×4×40 mm)中にて37℃で行った。フローシステムは、(Christensenら, 1999)に記載されるようにして組み立てて準備した。接種材料は、次のようにして調製した：M63B1glu中の16〜20時間後の一晩培養物を採集し、標準化された希釈で再懸濁した(OD600=0.005)。300μlを、各フローチャネルに注入した。投入培地を、ろ過した上清と1:1の比で混合した。接種の1時間後に、フローを3 ml h-1の一定速度で、Watson Marlow 205Sペリスタポンプを用いて開始した。全てのアッセイは、少なくとも3重で行った。
【００４７】
CFT073又は抗バイオフィルム活性を示す他のグループII莢膜形成株の上清の精製
3つの精製レベルを試験した。
(i) 活性上清のろ過(滅菌) (S.CFT、マイクロタイタープレート又はマイクロ発酵槽での全ての実験で用いた)
・M63B1glucose 0.4%中の一晩培養物を、5000 rpm、4℃にて30分間遠心分離し、0.25μmフィルタでろ過して細菌を除去した。
(ii) 活性上清に含まれる多糖体の沈殿
・ろ過された上清に含まれる多糖体を、3容量のエタノールを用いて沈殿させ、脱イオン水に再懸濁し、脱イオン水に対して10 kDaカットオフ透析カセット(Pierce biochemical)中で透析した。
【００４８】
(iii) 莢膜多糖体活性画分の精製(莢膜活性画分FR2)
・工程(ii)で得られた部分的に精製された上清の活性画分を凍結乾燥し、25%のプロパノール-1を含有する80 mlのTris HCl 20 mM pH 7.5緩衝液に再懸濁した。
・この再懸濁物を、3000 rpmにて10分間遠心分離して、不溶性粒子を除去した。
・可溶性の上清を、DEAE-セファロースカラムに装填し(30 ml、2.6×6 cm、Amersham)、Tris HCl 20 mM pH 7.5、25%プロパノール-1緩衝液で平衡化した。
・カラムを、Tris HCl 20 mM pH 7.5、25%プロパノール-1緩衝液で、20 ml/hの速度で洗浄した。
・洗浄の後に、カラムを、NaCl勾配(400 ml中に0〜1 M)を用いて溶出し、各溶出画分(4.5 ml)の多糖体濃度を、Dubois法(Duboisら, 1956)：100μlの5%フェノール及び500μlの濃硫酸、続いて、ボルテックス撹拌及び492 nmでの読み取り) により試験した。
・陽性の画分(4.5 mlの画分が約10個)をまとめてプールし、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。
・1 mgの凍結乾燥物を1 mlの脱イオン水に再懸濁した。
【００４９】
培養上清の取り扱い及び多糖体の分析
37℃でのM63B1glu中の一晩培養物を、5000 rpm、4℃にて30分間遠心分離した。0.2μmフィルタでの上清のろ過の後に、巨大分子を3容量のエタノールを用いて沈殿させ、脱イオン水に対して10kDaカセット(Pierce)を用いて透析した。ホスフェート及び中性糖の合計量を、それぞれモリブデン酸アンモニウム/アスコルビン酸法及びフェノール/硫酸法により決定した。多糖体の組成は、(d'Enfert及びFontaine, 1997; Fontaineら, 2000)のように、HPLC (イオン排除カラム)及び気液クロマトグラフィーにより決定した。CFT073上清の活性画分であるFR2を、DEAE-セファロースカラム(Amersham)を用いて精製し、25%プロパノール-1、20 mM TrisHCl pH7.5中の300 mM NaClを用いて溶出した。ポリマーの分子量は、Superdex-200 (Amersham)でのゲルろ過クロマトグラフィーにより、デキストランを標準物質として用いて判断した。多糖体の分解は、全酸加水分解(トリフルオロ酢酸、4N、4H、100℃)又はフッ化水素酸水溶液(48% aq. HF、氷水上に2日間)により行った。
【００５０】
突然変異誘発及び分子学的技術
大腸菌CFT073のマリナートランスポゾン突然変異誘発を、(Da Re及びGhigo, 2006)に記載されるようにして行った。96ウェルマイクロタイタープレート中に、LB中で37℃にて24時間インキュベートした10,000個のトランスポゾン変異体の上清を、プレートを10000rpmにて15分間遠心分離した後に抽出し、MG1655F'バイオフィルム形成に対するそれらの影響を分析した。トランスポゾン挿入部位を、(Da Re及びGhigo, 2006)に記載されるようにして決定した。相同性の探索は、Blast 2.0を用いて行った。欠失変異体を、http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Ggb/3SPCRprotocol.htmlに詳細に説明されるようにして、表2に示すプライマーを用いて作製した。
【００５１】
【表２−１】
2009542618.tif 000005
【表２−２】
2009542618.tif 000006
【表２−３】
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【００５２】
活性化画分の物理化学的特性の分析
ゼータ電位は、(Carusoら, 1999)に記載されるようにして、透析し沈殿させた上清(すなわち、上記の精製のレベル(ii))と、直径10μmのカチオン性コロイドラテックス粒子とを20分間インキュベーションした後に測定した。ラテックス粒子は、そのポリエチレンイミン(PEI)コーティングにより、永久実効正電荷を有する。PEIの層は、分子に安定な正電荷を与える約50%のメチル化第4級官能基を有する分岐で6400ダルトン分子量のポリマーである。このポリマーを、最初にカルボキシル化しておいた粒子上に水相中で堆積させた(Decher, 1997)。上清の親水性の特性を、上清中で20分間予めインキュベートしたガラス平面を用いて、2.5μlの超純水の水滴により形成される接触角を決定することにより調べた。表面相互作用を、上清で処理したカチオン性コロイド上でのプロピジウムアイオダイドの吸着をモニターすることにより分析した。蛍光プローブについての処理表面の親和性は、フローサイトメトリ(Leboeuf及びHenry, 2006)及び蛍光顕微鏡法を用いて試験した。上清との粒子のインキュベーションは全て、活性種による表面の飽和を導く可能性がある低い粒子/容積比率(約0.2%)で行った。
【００５３】
インビボマウス実験
CFT073及びCFT073ΔR1のインビボコロニー形成を、以前に記載されたようにして行った(Maroncleら, 2006)。マウスを、1010 CFUで胃内に供給した。糞便試料中に含まれる細菌を、寒天プレート上で計数した。宿主内での細菌の成長を調べるために、接種の後の種々の時間でマウスを犠牲にした。結腸及び盲腸を、生理的な水の中でホモジナイズし、組織1グラム当たりのcfuを決定するために培養した。
【００５４】
実施例2：CFT073上清の抗バイオフィルム活性
多細胞バイオフィルム(Hall-Stoodleyら, 2004)細菌集団内のUPEC相互作用を研究するために、マイクロ発酵槽中のインビトロ混合細菌バイオフィルムモデルを開発した(Ghigo, 2001)。このモデルを用いて、共生大腸菌K12株MG1655F'により形成された8時間バイオフィルムに、異なる力価のUPEC CFT073株を接種し、さらに24時間培養した。CFT073の力価の増加に伴い、大腸菌K12株MG1655F'バイオフィルムの発達の強い低下が観察され、これは共生大腸菌KS272株を用いた場合には観察されなかった(図1A)。このことは、CFT073が、MG1655F'バイオフィルムの形成を、直接の接触又は阻害分子の分泌のいずれかにより妨げ得ることを示唆した。これらの2つの可能性を区別するために、CFT073定常期培養物の上清をフィルタ滅菌し、大腸菌バイオフィルム形成に対するその影響を試験した。CFT073上清の存在下では、MG1655F'バイオフィルムは大きく影響を受けた(図1B、C)。このバイオフィルムの阻害は、殺菌又は静菌活性による成長欠陥をもたらさなかった。なぜなら、MG1655F'成長速度及び細胞生存性は、CFT073上清により影響されなかったからである(図1D、E)。
【００５５】
CFT073上清の抗バイオフィルム活性のスペクトルを決定するために、いくつかの付着性細菌(大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及びエンテロコッカス・フェカリス)に対するその効果を試験した。この分析は、CFT073上清が、混合培養物であっても、驚くほど広範囲の細菌に対して活性であったことを示した(図1F及び図2)。
【００５６】
実施例3：抗バイオフィルム活性とII型莢膜の相関関係
抗バイオフィルム効果の遺伝子的な根本的原理を明らかにするために、約10,000個のCFT073ランダムマリナートランスポゾン挿入変異体の上清の活性を試験した。本発明者らは、MG1655F'バイオフィルム形成を阻害する能力が損なわれた7個の候補を同定した。これらの全ての変異体は、最外層の細菌細胞表面構造であるグループII莢膜多糖体の発現に関与する遺伝子についてマッピングされた(Whitfield及びRoberts, 1999)。グループII莢膜は、3つの機能的領域を特徴とする保存されたモジュール性遺伝子機構を示す(Roberts, 1996) (図3A)。領域1 (kpsFEDCUS)及び領域3 (kpsMT)は、全てのグループII莢膜形成細菌において保存され、ABC依存性多糖体排出に必要なタンパク質をコードする。領域2は可変であり、K1、K2 (CFT073)、K5、K96のような多糖体血清型をコードする(Roberts, 1996)。R1、R2若しくはR3領域、又はそれぞれ個別のkps遺伝子を欠失させ、kpsU、c3692及びc3693以外の全ての変異体が、大腸菌バイオフィルム形成を阻害する能力を喪失し、このことは上清中の沈殿された糖の量の減少に相関したことが観察された(図3B、3C)。フェリチン染色莢膜は、CFT073細胞の周囲でまだ検出され得たが(図3D)、これらの結果は、それにもかかわらずCFT073莢膜が、培地上清への著しい放出を受け、このことが、観察された抗バイオフィルム効果の原因であることを示した。
【００５７】
バイオフィルム阻害が大腸菌CFT073上清に限られた特性であるかを決定するために、本発明者らは、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、エンテロバクター(Enterobacter)、モルガネラ(Morganella)、シトロバクター(Citrobacter)及びセラチア(Serratia)のいくつかの臨床的尿路疾患性細菌単離株、並びに多様な起源の110種の大腸菌株のコレクションをスクリーニングした。本発明者らは、17 UPECを含む40種の大腸菌のろ過された上清のみが、成長速度に影響せずに、広範囲の細菌のバイオフィルム形成を阻害したことを見出した(図4A)。さらに、CFT073大腸菌株のように、全ての活性株は、大腸菌以外の付着性細菌のバイオフィルム形成を阻害可能である(図4Aの15981黄色ブドウ球菌のバイオフィルムデータを参照)。特異的PCRプローブを用いて(Johnson及びO'Bryan, 2004)、本発明者らは、40種の活性大腸菌株のうち39種が、グループII莢膜遺伝子を有していたことを示した。40番目の細菌であるEcoR47は、実は、ハイブリッドグループII/グループIII莢膜を生成しているようである。この株は、グループII KPS遺伝子を有することが示されている(Boyd及びHartl, 1998)。一貫して、臨床UPEC単離株であるU-9及びU-15へのkpsD変異の導入は、それらの上清のバイオフィルム阻害効果を破壊した(図4B)。興味深いことに、CFT073、U-9及びU-15株はマイクロ発酵槽バイオフィルムモデルにおいて非常に限られたバイオフィルム形成能力を示したが、それらのそれぞれのkpsD変異体は、増加したバイオフィルム表現型を示した。この表現型は、CFT073上清の添加により復帰可能であり、このことは、これらの株がそれら自体の付着を自己阻害可能でもあることを示唆する(図4C)。
【００５８】
バイオフィルム形成阻害試験を、その莢膜が大腸菌のグループII莢膜に生化学的に非常に似ている髄膜炎菌の株を用いても行った。興味深いことに、結果は、髄膜炎菌の上清も、大腸菌MG1655F'のバイオフィルム形成を阻害したことを示し(図5)、このことは、抗バイオフィルム活性が、大腸菌からのグループII莢膜のみの特性ではなく、該莢膜に類似の莢膜(すなわちグループII様莢膜)の特性でもあることを示す。
【００５９】
実施例4：CFT073上清の物理化学的特性
本発明者らが、CFT073 (K2)、U-9 (非K2)及びIHE3034 (K1)を含む異なるグループII莢膜大腸菌血清型の活性上清から沈殿させた多糖体画分の組成を分析したときに、以前の研究と同様に(Jannら, 1980; Silver及びVimr, 1984)、これらの画分が著しく異なる組成を示すことが観察された(データは示さず)。このことは、生化学的には異なるが、これらの株により放出されるグループII莢膜が、バイオフィルム阻害に導く類似の作用形態を有し得ることを示唆した。グループII莢膜が細菌バイオフィルム形成を阻害する機構をさらに研究するために、これらの画分を、それらのポリエチレンイミンコーティングにより永久実効正電荷を有する直径10μmのラテックス粒子で構成されるカチオン性コロイドと接触させた。界面のζ(ゼータ)電位を決定することにより、野生型上清がカチオン性コロイドの強い電荷反転を誘導することが示され、これは、該上清が、それらのそれぞれの莢膜変異体の上清に比較して、非常にアニオン性の性質であることを示した(図6a)。さらに、酸洗浄ガラススライドの活性上清での処理により、水−スライド界面エネルギーが低減され、このことは、それらの親水性の性質を示した(図6b)。
【００６０】
グループII莢膜が表面修飾を誘導でき、処理表面の分子間力に影響し得るかを分析するために、本発明者らは、蛍光両親媒性カチオンであるプロピジウムアイオダイドの、活性又は不活性な上清で被覆したコロイド上での吸着をモニターした。本発明者らは、非グループII莢膜形成大腸菌EcoR72のアニオン性であるが不活性な上清が、カチオン性蛍光プローブに強い親和性を示すことを、まず示した(図6c)。高い負電荷にもかかわらず、活性上清は、不活性であるが負電荷がより低い莢膜変異体上清よりも、かなり低いプローブ親和性を示した(図6c及び6d)。この効果は、CFT073から、ガラクトース、グリセロール、ホスフェート及びアセテートを1：2：1：1のモル比で含むアニオン交換クロマトグラフィー(Jannら, 1980)により精製された500 kDa K2 莢膜活性画分(FR2)において、より明白であった(図6c及び6d)。よって、これらの結果は、強い静電的修飾の他に、活性上清が、表面水和及び立体斥力をおそらくは含むコロイド表面特性の重大なリモデリングも誘導したことを示した。これらの分析により、グループII 莢膜により誘導された表面修飾が、莢膜の1次的な組成よりも、バイオフィルム阻害活性についてより重大であることが確認される。
【００６１】
実施例5：バイオフィルムの発達の予防
グループII莢膜の物理化学的特性は、表面と相互作用する細菌の能力を大きく変更させ、よって付着を劇的に低下させるはずである(Neu, 1996)。この仮定を試験するために、MG1655F'及び黄色ブドウ球菌が、CFT073上清で予め処理されたガラス表面に付着する能力を分析した。インキュベーションの1時間後に、大腸菌MG1655 F'及び黄色ブドウ球菌15981は、処理表面へのそれらの最初の付着の3倍の低下を示した(データは示さず)。一貫して、CFT073上清でのマイクロ発酵槽の内部のガラススライドの前処理は、大腸菌、並びに広範囲のグラム陽性及びグラム陰性細菌によるバイオフィルムの形成を劇的に低下させた(図7)。CFT073上清でマイクロ発酵槽を潅流した場合に、同じ効果が観察された(図2B)。CFT073ΔkpsD上清を用いて同様の処理を行った場合に、その効果は観察されなかった(図7)。よって、これらの結果は、CFT073上清中に放出される莢膜多糖体により誘導される表面の修飾が、初期の細菌−表面相互作用を損なうことによりバイオフィルムの形成を妨げ得ることを示唆した。
【００６２】
顕著なことに、CFT073上清の抗バイオフィルム効果は、ガラススライドの厳しい処理の後でさえ維持され(図8)、このことは、グループII莢膜が、滅菌工程を必要とする用途において用い得ることを示唆する(例えば農産業又は医療用途)。
既に存在するバイオフィルムに対するCFT073上清の影響を調べるために、バイオフィルム成熟の種々の段階でMG1655 F'を接種したマイクロ発酵槽に、ろ過したCFT073上清を補充した。この分析は、成熟24時間バイオフィルムの処理はバイオフィルムの廃棄を誘導しなかったが、MG1655 F'バイオフィルムの開始の0、1及び6時間後のCFT073上清の添加は、そのさらなる発達を遮断したことを示した(図9A)。次いで、本発明者らは、CFT073上清の添加後のGFPタグ付加MG1655F'のインビトロバイオフィルムの特徴及び共焦点レーザ走査型電子顕微鏡(CLSM)を検討した。最初の接種の3時間後に、一様に被覆された表面への活性CFT073外因性上清の添加は、MG1655F'成熟バイオフィルム構造の発達に大きく影響した(図9B)。この影響は、対照のKS272上清での処置によっては観察されなかった。
【００６３】
3次元大腸菌バイオフィルム構造への細菌表面構造の直接の寄与は、充分に示されている(Beloinら, 2005)。これらの構造は、静置培養における細菌の凝集及びクランピングを媒介することも示されている。バイオフィルム成熟におけるグループII莢膜の役割をさらに特徴決定するために、本発明者らは、バイオフィルム形成にも関係するいくつかの異なる表面に曝露された因子により媒介される細菌凝集に対するその影響を試験した。CFT073上清が、種々のタイプの細菌表面構造により誘導される細菌凝集の形成を妨げることが示された(図9C)。
【００６４】
異なる濃度のFR2画分の抗バイオフィルム活性を、マイクロタイタープレートアッセイにおいて試験した。このことにより、精製FR2画分が、50μg/mlから始まる濃度で活性であることが示された(図10)。
【００６５】
まとめると、これらの結果は、グループII莢膜多糖体の物理化学的特性が細胞−表面の接触(初期付着)を弱めることによりバイオフィルムに影響するが、細胞−細胞相互作用(バイオフィルム成熟)を低下させることによっても影響することを示唆する。
【００６６】
結論として、本発明者らは、グループII様莢膜多糖体が、培養上清中に放出され、重要な院内病原菌を含む広い範囲の細菌に対して抗付着特性を示すことを証明した。本研究は、腸外大腸菌だけでなく、その上清が大腸菌バイオフィルムの形成を阻害し得る(データ示さず)髄膜炎菌(Kaijser, 1973; Sandbergら, 1988)のような他の病原菌によっても広く発現されるグループII莢膜多糖体の新規な特性を明らかにする。グループII莢膜は、食作用及びヒト血清の殺菌効果に対するそれらの耐性を増加することによりUPEC毒性に関係することが示されている(Crossら, 1986; Kaperら, 2004; Pluschkeら, 1983; Russoら, 1995)。莢膜は、生体(living)及び不活性表面とのUPEC相互作用における重要な生物学的役割も演じ得る。特に、細菌の競合の他に、グループII莢膜分泌によるUPEC自体の付着の阻害は、細菌−細菌相互作用を低下させることにより胃腸管でのコロニー形成に貢献し(Schembriら, 2004)、そのことによりクランプ形成による細菌のクリアランスを避ける(Favre-Bonteら, 1999)。このことと一貫して、非莢膜形成CFT073ΔR1変異体は、マウスの小腸でコロニー形成できないことが観察された(図11)。
【００６７】
インビトロ分析は、グループII莢膜が、カチオン性表面の電荷反転、表面ぬれ性及び分子斥力の増加のような表面修飾を誘導でき、非特異的な抗付着特性を導くことを示す。この阻害効果は、対数及び定常成長期の上清の両方、並びにCFT073のクオラムセンシングΔluxS変異体で観察されたので(図12)、このことは、抗バイオフィルム効果が、細胞シグナル伝達を伴わない(Waters及びBassler, 2005)が、むしろ、非生物又は細菌の表面のいずれかの物理化学的変更により作用することを示唆する。表面上に集合するポリマーは、それらの密度、サイズ、溶媒和作用及び構造に応じて強い物理的斥力を引き起こすことが知られている(de Gennes, 1987)。莢膜ポリマーにより創出されるこのような斥力は、最初の細菌の付着及びその後の細胞−細胞接触に干渉することによるバイオフィルムの発達を、制限し得る。最後に、本発明者らは、非生物表面に対するグループII莢膜多糖体の使用が、細菌の最初の付着を低下させ、広いスペクトルの細菌の成熟バイオフィルムの発達を著しく阻害するのに充分な長期持続性の効果を有することを示した。この知見は、例えば医療的インプラント上の病原性バイオフィルムの形成を制限する治療的方策の設計において広範囲に及ぶ意味を有するだろう。
【００６８】
【表３−１】
2009542618.tif 000008
【００６９】
【表３−２】
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【００７０】
【表３−３】
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【００７１】
【表３−４】
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【００７２】
【表３−５】
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【００７３】
【表３−６】
2009542618.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】CFT073のバイオフィルム阻害効果。
【図２】グラム陽性及びグラム陰性細菌のバイオフィルム形成に対するCFT073上清の影響。
【図３】莢膜の生成と、CFT073上清の抗バイオフィルム活性との関係。
【図４】抗バイオフィルム活性と、グループII莢膜との相関。
【図５】髄膜炎菌上清の抗バイオフィルム効果。
【図６】CFT073上清の物理化学的特性。
【００７５】
【図７】被覆された表面に対するCFT073上清のバイオフィルム阻害効果。
【図８】S.CFT073上清(S.CFT)で被覆したスパーテルの処理の影響。
【図９】CFT073上清は細胞−細胞相互作用に影響する。
【図１０】FR2画分の抗バイオフィルム活性。
【図１１】CFT073及びCFT073ΔR1による腸でのコロニー形成。
【図１２】CFT073上清の抗バイオフィルム特性における成長期及びクオラムセンシングの影響。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009542618.tif 000029
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