(57)【要約】本開示内容は、遺伝子組換え型生物活性タンパク質またはポリペプチドを精製するためのアフィニティーポリペプチドを提供する。さらに、本開示内容は、生物活性ポリペプチドまたはタンパク質、すなわち対象となるタンパク質、およびアフィニティーポリペプチドという少なくとも２つの成分を含む、融合組換えタンパク質またはポリペプチドも提供する。生物活性ポリペプチドは、共有結合により直接的または間接的にアフィニティーポリペプチドに結合する場合がある。本開示内容は、宿主細胞内で前記融合組換えタンパク質を産生するための組換え発現ベクターを提供する。さらに、本開示内容は、宿主細胞から組換えタンパク質を精製する改良法も提供する。さらに、本開示内容は、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーにより遺伝子組換え型生物活性ポリペプチドまたはタンパク質を精製する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｒ１−Ｔ−Ｒ２のアフィニティーポリペプチドであって、式中、Ｒ１が１〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり；Ｔが一般式（Ｘｎ−Ｈｉｓ−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓｎ）２−６０（式中、ＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、およびＬｅｕからなる群から選択され；ＹがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒからなる群から選択され；ｎが１〜４までの範囲である）を有し；Ｒ２がＺ、Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−、またはＺ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（式中、Ｚが１〜３０個の範囲のアミノ酸ペプチドである）である、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する、Ｔで表されるポリペプチド。
【請求項７】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する、Ｔで表されるポリペプチド。
【請求項８】
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する、Ｔで表されるポリペプチド。
【請求項９】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する、Ｔで表されるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
配列番号９で示される、請求項２に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号１０で示される、請求項３に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号１１で示される、請求項４に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
配列番号１２で示される、請求項５に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
配列番号１３で示される、請求項６に記載のＴで表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
配列番号１４で示される、請求項７に記載のＴで表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号１５で示される、請求項８に記載のＴで表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
配列番号１６で示される、請求項９に記載のＴで表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
プロモーター、請求項１０に記載のポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ認識部位または化学的開裂部位、および対象となる異種ＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
【請求項２０】
プロモーター、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ認識部位または化学的開裂部位、および対象となる異種ＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
【請求項２１】
前記プロモーターが、ＡｒａＢ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｏｓｍＢ、ＣＭＶ、ＥＦ−ｌα、ＳＶ４０、およびＴ７からなる群から選択される、請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２２】
前記プロモーターが、ＡｒａＢ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｏｓｍＢ、ＣＭＶ、ＥＦ−ｌα、ＳＶ４０、およびＴ７からなる群から選択される、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２３】
前記プロテアーゼ認識部位が、エンテロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、Ｘａ因子、トリプシン、Ｖ８、およびキモトリプシンからなる群から選択されるプロテアーゼによって認識される、請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２４】
前記プロテアーゼ認識部位が、エンテロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、Ｘａ因子、トリプシン、Ｖ８、およびキモトリプシンからなる群から選択されるプロテアーゼによって認識される、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２５】
前記化学的開裂部位が、ハロゲン化シアン、ヒドロキシアミン、ギ酸、酢酸、塩酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される試薬によって認識される、請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２６】
前記化学的開裂部位が、ハロゲン化シアン、ヒドロキシアミン、ギ酸、酢酸、塩酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される試薬によって認識される、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２７】
前記対象となる異種ＤＮＡが、β−ガラクトシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒトインターロイキン、インターロイキン−２、血小板由来増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インシュリン、ウシエンテロキナーゼ、血管内皮増殖因子、神経成長因子、インターフェロン、および組織プラスミノゲン活性化因子をコードするＤＮＡからなる群から選択される、請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２８】
前記対象となる異種ＤＮＡが、β−ガラクトシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒトインターロイキン、インターロイキン−２、血小板由来増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インシュリン、ウシエンテロキナーゼ、血管内皮増殖因子、神経成長因子、インターフェロン、および組織プラスミノゲン活性化因子をコードするＤＮＡからなる群から選択される、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２９】
前記ベクターが、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦ、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、およびｐＤＡＣ−ＥＰＯからなる群から選択される、請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３０】
前記ベクターが、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦ、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、およびｐＤＡＣ−ＥＰＯからなる群から選択される、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３１】
前記ベクターがｐＤＡＣ−ＬａｃＺである、請求項２９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項３２】
請求項１９または２０に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項３１に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞がアクセッション番号ＭＴＣＣ５３１２を有する、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｅｕｌａ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、およびＣＯＳからなる群から選択される、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０、ＢＬ２１、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、およびＬＭＧ１９からなる群から選択される、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
組換えタンパク質の産生および精製プロセスであって、前記プロセスが、前記組換えタンパク質の前記産生に適した培地で、請求項１９または２０に記載の組換え発現ベクターを有する組換え細胞を入手し増殖することと；１段階方法により前記組換えタンパク質を回収することとを含む、プロセス。
【請求項３９】
前記組換え発現ベクターが、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦ、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、およびｐＤＡＣ−ＥＰＯからなる群から選択される、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記組換えタンパク質が、β−ガラクトシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒトインターロイキン、インターロイキン−２、血小板由来増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インシュリン、ウシエンテロキナーゼ、血管内皮増殖因子、神経成長因子、インターフェロン、および組織プラスミノゲン活性化因子からなる群から選択される、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記組換えタンパク質の回収が、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーを使用した精製によって行われる、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーが、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、およびＣｏからなる群から選択される金属イオンを使用する、請求項４１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示内容は、対象となる生物活性ポリペプチドまたはタンパク質、およびアフィニティーポリペプチドを含む融合組換えタンパク質の産生に関し、前記アフィニティーポリペプチドは、固定化金属イオンを有する金属キレート樹脂上でアフィニティークロマトグラフィーを使用する、組換えタンパク質の精製に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
所望のタンパク質の遺伝子は、自然界で見出される遺伝子を含む生物から単離される場合もあれば、あるいは化学的に合成される場合もある。単離または化学的に合成された遺伝子は、ベクターに挿入され、宿主系で発現される場合があり、これにより所望のタンパク質が高レベルで産生される。組換えまたは合成タンパク質を得るのに効果的なプロセスを確立するには、適切な精製手順が不可欠である。組換え供給源からの適切な精製プロトコルの作成を容易にするには、タンパク質の疎水性およびイオン電荷などのいくつかの物理的性質を事前に把握することが有用であり得る。一方で、現在のところ、標的タンパク質の特性に関する知識がなくてもアフィニティー法により精製することができる融合タンパク質の精製方法がいくつかある。アフィニティーハンドルを融合パートナーとして使用し、粗抽出物から発現した外来遺伝子産物を急速に回収することができる効果的な精製法が使用される場合もある。異種タンパク質のコード遺伝子配列を、リガンドに対して高親和性を有するタンパク質断片のコード遺伝子配列に結合させることにより、アフィニティーペプチドを使用して、１手順で異種タンパク質を融合タンパク質の形態で精製することが可能である。ハイブリッド産物は、医薬品グレードの組換え体を精製するために、前駆体分子から目的タンパク質を遊離する開裂プロセスを必要とする。この開裂は化学的であってもよければ、酵素的であってもよいと考えられる。アフィニティータグとしての２〜６ヒスチジン（Ｈｉｓ）残基の使用については、特許文献１に記載されている。特許文献２に開示されている、ブドウ球菌プロテインＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｍａｌＥ遺伝子によってコードされたマルトース結合タンパク質、および日本住血吸虫のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含めた、他の細菌遺伝子産物も使用されてきた。
【０００３】
通常、出発材料は、多くの異なるタンパク質を含有しており、所望のタンパク質が、特に組換え発現の結果として産生される場合は、主成分となる場合がある。第１段階は、主に量を低減し、できるだけ多くの非タンパク質材料を除去することを目的とする必要がある。精製手順は一般的に以下の３つの段階に分類される：すなわち、ａ）原料中に存在するタンパク質および他の分子の粗混合物を処理する第１段階；ｂ）産物をほぼ均質に生成する第２段階；およびｃ）微量の汚染物質を除去する研磨段階である。
【０００４】
いずれかの供給源からの遺伝子を、発酵槽内で大規模に培養することができる異種細胞内で、クローン化かつ発現させることができる。したがって、いずれかのタンパク質を、原則として大量に産生することができる。その後、所望のタンパク質を、宿主細胞によって産生された総タンパク質量から単離かつ回収しなければならない。このプロセスは、非常に費用がかかり、タンパク質産物の変性を引き起こす可能性がある。したがって、極めて効率的かつ予測可能な方法で複合混合物からのこれらのタンパク質の精製を改善することが必要とされていた。タンパク質の精製に使用される方法で最も一般的なものは、イオン交換、疎水およびゲルろ過クロマトグラフィーである。これらの方法は、いずれも特異性が欠けていることから、高収率で純タンパク質を得るのには適さない。組換えＤＮＡ由来タンパク質の場合には、所与のタンパク質精製方法の選択を予測するのが困難であり、アミノ酸組成のわずかな変化により、タンパク質溶解度、形状、タンパク質間の相互作用、疎水性、および凝集特性が変化する場合があり、これによって精製プロトコルに影響を及ぼすことから、新規のタンパク質それぞれの精製方法を開発することが求められている。
【０００５】
所望のタンパク質は、サイズ、溶解度および電荷などのパラメータの差異に基づく方法により、複合混合物から単離させる場合がある。しかし、これらのいずれの方法でも、中等度のレベルを超える量のタンパク質を精製することができない。最も一般的な問題は、所期の画分に対して精製されたタンパク質の収率が低いことである。これは、カラムに充填したタンパク質が不十分であること、タンパク質がカラムに結合していないこと、タンパク質がカラムから溶出していないこと、または他のタンパク質がカラムへ非特異的に結合することが原因となる可能性がある。複合混合物からタンパク質を大幅に減少させることなく精製することができることから、共有的ではなく特異的に固定化リガンドと結合するタンパク質の能力に基づくアフィニティークロマトグラフィーがしばしば好まれる。この方法の欠点は、アフィニティークロマトグラフィーには、所望のタンパク質に対応するリガンドの入手が必要となるが、すべてのタンパク質にこのような特異的リガンドが存在しないことから、常に入手可能ではないことである。
【０００６】
この問題を解決するために、リンカーペプチドに対する抗体が、免疫親和性リガンドとして使用される場合がある。融合ペプチドは、抗原性リンカーペプチドと結合する固定化抗体を含有するカラムを通過し、それによって融合ペプチドが単離される（特許文献３に開示）。この方法の欠点は、所望のポリペプチドが、免疫原性複合体を許容するのに必要な緩衝条件、またはこれらの複合体を終結させるのに存在しなければならない緩衝条件のいずれかによって変性し、生物活性タンパク質の収率が低くなる場合があることである。
【０００７】
組換えタンパク質を精製するに当たってはしばしば困難に直面してきたことから、発現タンパク質が、精製を単純化するＮ末端ポリペプチドを含有する融合タンパク質である種々のベクター系（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，１９９０）が開発された。その後、このような「タグ」を、特異的なプロテアーゼの使用、または化学開裂によって除去することができる。使用されるタグには、特異的な抗体が存在するタンパク質およびポリペプチド、特異的リガンドを含有するカラムと相互に作用する結合タンパク質、固定化金属カラムに対する親和性を有するポリヒスチジンタグ、ならびに宿主によるビオチン化をもたらし、アビジンカラム上での精製を可能にする配列が含まれる。
【０００８】
タンパク質およびペプチドアフィニティータグは、組換えタンパク質を精製するごく一般的な手段になった。これらは、核酸または他の細胞物質を除去する事前手順がなくても、粗抽出物から百または千倍の精製を提供することができる。Ｊ．Ｐｏｒａｔｈが、タンパク質を分画するための固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を導入した（Ｐｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９７５）。ＩＭＡＣは、イミノジアセチック酸（ＩＤＡ）を有する樹脂の誘導体化、および金属イオンのＩＤＡ誘導体化樹脂へのキレート化からなる。タンパク質は、電子を供与することができるアミノ酸残基を介して金属イオンへ結合し、カラム上で固定化される。ヒスチジン、システイン、メチオニン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、トリプトファン、およびチロシンなどのアミノ酸は、遊離金属イオンのこれらのタンパク質への実際の結合に部分的に関与する。最も好ましい固定化金属イオンキレートペプチドは、ヒスチジンを含有するものである。タンパク質の遊離金属イオンへの結合を引き起こす実際の機序は、十分に理解されておらず、タンパク質の構造、固定化金属イオン上の使用できる配位部位数、タンパク質側鎖の金属イオンへの接近性、固定化金属イオンとの配位に使用できるアミノ酸の数などの多くの要因に左右される。結合が生じると、その結合に関連する金属イオン結合リガンドのプロトン化により、タンパク質を放出することができる。遊離は、周囲の緩衝培地のｐＨを低下させることにより、またはイミダゾールなどの拮抗的カウンターリガンドを使用することにより達成される。ＩＭＡＣが特異的かつ選択的な精製手順であることを示すために、タンパク質中でジペプチドまたはトリペプチドを含有するヒスチジンが使用されてきた（特許文献４および特許文献５）。
【０００９】
アフィニティータグを使用した組換えタンパク質の産生は、３つの目的を果たすことができる。第１の目的は、親和性相互作用を、タンパク質の事前精製がない場合でも、バイオセンサーまたは親和性カラムなどの固体支持体上で発現タンパク質を固定化するのに使用することができることである。第２の目的は、固定化融合タンパク質を溶出することができ、構造もしくは機能試験に直接使用するか、または抗体を生成するための免疫原として使用することができることである。第３の目的は、親和性精製した融合タンパク質を、所望の産物を放出する部位特異的な開裂により処理することができることである。融合システムがタンパク質の精製を促進するように設計される場合は、アフィニティーハンドルの構造だけでなくリガンドも、組換えタンパク質を変性させることなく融合タンパク質の溶出を可能にするのに適切な結合強度をもたらすように設計する必要がある。タンパク質の精製に使用される種々の遺伝子融合システムを、表１に示す。
【００１０】
【表１−１】
2009525749.tif 000002
【００１１】
【表１−２】
2009525749.tif 000003
融合パートナーから所望のタンパク質を特異的に開裂する方法は２つある：すなわち、化学的方法（例えば、臭化シアン、ギ酸、ヒドロキシルアミン等）と、酵素的方法（例えば、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、トリプシン、ヒトレニン、カルボキシペプチダーゼＡ、ジペプチジルペプチダーゼ等）。化学的方法では、ジペプチド配列中の単一アミノ酸の後または残基間で開裂される。
【００１２】
特異性が低いと、組換え産物がしばしば対応する残基またはペプチドを含有することから、これらの方法の使用が限定される。いくつかの酵素によって認識された配列は、より特異的である可能性がある。化学的方法に比べると、酵素的開裂はより立体因子による影響を受けやすいため、開裂部位は、酵素に構造的に接近できるように慎重に操作しなければならない。
【特許文献１】米国特許第５，３１０，６６３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９３５，８２４号明細書
【特許文献３】米国特許第４，７８２，１３７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，５６９，７９４号明細書
【特許文献５】米国特許第５，３１０，６６３号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の開示
本開示内容は、遺伝子組換え型生物活性タンパク質またはポリペプチドを精製するためのアフィニティーポリペプチドを提供する。本開示内容は、宿主細胞内で融合組換えタンパク質を産生するための組換え発現ベクターに関する。さらに、本開示内容は、融合組換えタンパク質またはポリペプチドを産生するプロセスであって、前記融合組換えタンパク質が、生物活性ポリペプチドまたはタンパク質（組換えタンパク質）、およびアフィニティーポリペプチドという少なくとも２つの成分を含む、プロセスも提供する。さらに、本開示内容は、宿主細胞から組換えタンパク質を精製する改良法も提供する。さらに、本開示内容は、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーにより遺伝子組換え型生物活性ポリペプチド／タンパク質を精製する方法も提供する。
【００１４】
本開示内容は、一般式Ｒ１−Ｔ−Ｒ２のアフィニティーポリペプチドであって、式中、Ｒ１が１〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり；Ｔが一般式（Ｘｎ−Ｈｉｓ−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓｎ）２−６０（式中、ＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、およびＬｅｕからなる群から選択され；ＹがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒからなる群から選択され；ｎが１〜４までの範囲である）を有し；Ｒ２がＺ、Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−、またはＺ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（式中、Ｚが１〜３０個の範囲のアミノ酸ペプチドである）である、ポリペプチドを提供する。
【００１５】
本開示内容は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００１６】
さらに、本開示内容は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＴで表されるアフィニティーポリペプチドも提供する。
【００１７】
本開示内容は、一般式Ｒ１−Ｔ−Ｒ２の前記アフィニティーポリペプチドであって、式中、Ｒ１が１〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり；Ｔが一般式（Ｘｎ−Ｈｉｓ−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓｎ）２−６０（式中、ＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、およびＬｅｕからなる群から選択され；ＹがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒからなる群から選択され；ｎが１〜４までの範囲である）を有し；Ｒ２がＺ、Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−、またはＺ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（式中、Ｚが１〜３０個の範囲のアミノ酸ペプチドである）である、ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１８】
さらに、本開示内容は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２で示されるヌクレオチド配列を有するアフィニティーポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列も提供する。
【００１９】
さらに、本開示内容は、Ｔで表されるアフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。
【００２０】
さらに、本開示内容は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６で示されるＴで表されるアフィニティーポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列も提供する。
【００２１】
さらに、本開示内容は、プロモーターを含む組換え発現ベクター、前記アフィニティーポリペプチド、プロテアーゼ認識部位または化学的開裂部位をコードするポリヌクレオチド配列、および対象となる異種ＤＮＡも提供する。
【００２２】
さらに、本開示内容は、前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００２３】
さらに、本開示内容は、アクセッション番号ＭＴＣＣ５３１２を有する宿主細胞も提供する。
【００２４】
さらに、本開示内容は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）ＵＳＶＤＡＣ  Ｔｏｐ１０と指定されるｐＤＡＣ−ＬａｃＺ構築物を含有する組換えベクターを含むＥ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０の組換え株も提供する。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）ＵＳＶＤＡＣ  Ｔｏｐ１０に割り当てられたアクセッション番号は、ＭＴＣＣ５３１２である。
【００２５】
さらに、本開示内容は、融合組換えタンパク質の産生に適した培地で、前記組換え発現ベクターを有する組換え細胞を入手し増殖させた後、一段階方法で前記組換えタンパク質を回収することにより、融合組換えタンパク質を産生し、かつ組換えタンパク質を精製するプロセスも提供する。
【００２６】
さらに、本開示内容は、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーを使用した精製により前記組換えタンパク質を回収する方法であって、使用される固定化金属イオンに、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、およびＣｏなどのイオンが含まれる、方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本開示内容は、遺伝子組換え型生物活性タンパク質またはポリペプチドを精製するためのアフィニティーポリペプチドを提出する。本開示内容は、宿主細胞内で融合組換えタンパク質を産生するための組換え発現ベクターに関する。さらに、本開示内容は、融合組換えタンパク質またはポリペプチドを産生するプロセスであって、前記融合組換えタンパク質が、生物活性ポリペプチドまたはタンパク質（組換えタンパク質）、およびアフィニティーポリペプチドという少なくとも２つの成分を含む、プロセスも提供する。生物活性ポリペプチドは、共有結合によってアフィニティーポリペプチドに直接的または間接的に結合する場合がある。さらに、本開示内容は、宿主細胞から組換えタンパク質を精製する改良法も提供する。さらに、本開示内容は、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーにより遺伝子組換え型生物活性ポリペプチド／タンパク質を精製する方法も提供する。
【００２８】
定義
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、ベクターを含み、かつベクターの複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくは哺乳動物の細胞などの真核細胞である場合がある。
【００２９】
「発現ベクター」という用語は、外来ＤＮＡ配列を組換え分子として複製かつ増幅するために、外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するのに使用されるプラスミド、酵母、または動物ウイルスゲノムを意味する。発現ベクターが宿主細胞内に存在すると、この遺伝子によりコードされるタンパク質が細胞性転写および翻訳機序により産生される。
【００３０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、以下で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。ペプチドとは、ペプチド結合によって互いに化学結合されたアミノ酸で構成される有機化合物である。ペプチド結合とは、１つ目のアミノ酸のα−カルボキシル（酸素含有炭素）と、２番目のアミノ酸のアミノ窒素との間の単共有結合である。約１０個未満の構成アミノ酸を有する小ペプチドはオリゴペプチドと呼ばれ、１０個を超えるアミノ酸を有するペプチドはポリペプチドと呼ばれる。タンパク質は、身体が適切に機能するのに必要とされるアミノ酸で構成される分子である。
【００３１】
本明細書で使用される「異種遺伝子」または「異種ＤＮＡ」という用語は、外来種に由来する核酸またはＤＮＡ配列を意味し、同じ種に由来する場合は、ヒトの介入により、組成および／またはゲノム遺伝子座において天然型から大幅に遺伝子が組み換えられる。
【００３２】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子もしくは異種ＤＮＡの転写を開始かつ／または規制するための、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識、ならびに結合に関与する転写開始部位より上流のＤＮＡ領域を指す。
【００３３】
「アフィニティータグペプチド」または「アフィニティーポリペプチド」および「アフィニティーハンドル」は、本明細書で交換可能に使用され、組換えタンパク質の精製に使用されるポリペプチド配列を指す。
【００３４】
「融合組換えタンパク質」は、対象となる生物活性ポリペプチドまたはタンパク質（組換えタンパク質）、およびアフィニティーポリペプチドという少なくとも２つの成分を含むタンパク質を指す。
【００３５】
「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、対象となるタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００３６】
本明細書で使用される「固定化金属イオンキレートペプチド」という用語は、ニッケル、銅、亜鉛、およびコバルトからなる群から選択される金属の固定化２価金属イオンをキレートするアミノ酸配列を意味する。
【００３７】
本開示内容の実施形態は、一般式Ｒ１−Ｔ−Ｒ２のアフィニティーポリペプチドであって、式中、Ｒ１が１〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり；Ｔが一般式（Ｘｎ−Ｈｉｓ−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓｎ）２−６０（式中、ＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、およびＬｅｕからなる群から選択され；ＹがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒからなる群から選択され；ｎが１〜４までの範囲である）を有し；Ｒ２がＺ、Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−、またはＺ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（式中、Ｚが１〜３０個の範囲のアミノ酸ペプチドである）である、ポリペプチドを提供する。
【００３８】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００３９】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４０】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４１】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４２】
本開示内容のさらに別の実施形態は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＴで表されるアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４３】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＴで表されるアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４４】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＴで表されるアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４５】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＴで表されるアフィニティーポリペプチドを提供する。
【００４６】
本開示内容のさらに別の実施形態は、一般式Ｒｌ−Ｔ−Ｒ２の前記アフィニティーポリペプチドであって、式中、Ｒ１が１〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり；Ｔが一般式（Ｘｎ−Ｈｉｓ−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓｎ）２−６０（式中、ＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、およびＬｅｕからなる群から選択され；ＹがＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒからなる群から選択され；ｎが１〜４までの範囲である）を有し；Ｒ２がＺ、Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−、またはＺ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（式中、Ｚが１〜３０個の範囲のアミノ酸ペプチドである）である、ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００４７】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を有するアフィニティーポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００４８】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列を有するアフィニティーポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００４９】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を有するアフィニティーポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５０】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１２で示されるヌクレオチド配列を有するアフィニティーポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５１】
本開示内容のさらに別の実施形態は、Ｔで表わされる前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５２】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列を有するＴで表わされる前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５３】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１４で示されるヌクレオチド配列を有するＴで表わされる前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５４】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を有するＴで表わされる前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５５】
本開示内容の別の実施形態は、配列番号１６で示されるヌクレオチド配列を有するＴで表わされる前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００５６】
本開示内容のさらに別の実施形態は、プロモーターを含む組換え発現ベクター、前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ認識部位または化学的開裂部位、および対象となる異種ＤＮＡを提供する。
【００５７】
本開示内容の別の実施形態は、プロモーターを含む組換え発現ベクター、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２で示される前記アフィニティーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ認識部位または化学的開裂部位、および対象となる異種ＤＮＡを提供する。
【００５８】
本開示内容のさらに別の実施形態は、前記プロモーターが、ＡｒａＢ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｏｓｍＢ、ＣＭＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、またはＴ７である、組換え発現ベクターを提供する。
【００５９】
本開示内容の別の実施形態は、前記プロテアーゼ認識部位が、エンテロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、Ｘａ因子、トリプシン、Ｖ８、およびキモトリプシンなどのプロテアーゼによって認識される、組換え発現ベクターを提供する。
【００６０】
本開示内容の別の実施形態は、前記プロテアーゼがエンテロキナーゼである、組換え発現ベクターを提供する。
【００６１】
本開示内容の別の実施形態は、前記化学的開裂部位が、ハロゲン化シアン、ヒドロキシルアミン、ギ酸、酢酸、塩酸およびトリフルオロ酢酸などの試薬によって認識される、組換え発現ベクターを提供する。
【００６２】
本開示内容の別の実施形態は、対象となる前記異種ＤＮＡが、β−ガラクトシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒトインターロイキン、インターロイキン−２、血小板由来増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インシュリン、ウシエンテロキナーゼ、血管内皮増殖因子、神経成長因子、インターフェロン、および組織プラスミノゲン活性化因子などのタンパク質をコードする、組換え発現ベクターを提供する。
【００６３】
本開示内容の別の実施形態は、前記ベクターが、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦ、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、またはｐＤＡＣ−ＥＰＯである、組換え発現ベクターを提供する。
【００６４】
本開示内容のさらに別の実施形態は、前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６５】
本開示内容の別の実施形態は、前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｅｕｌａ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＣＯＳである宿主細胞を提供する。
【００６６】
本開示内容の別の実施形態は、前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、宿主細胞を提供する。
【００６７】
本開示内容の別の実施形態は、前記Ｅ．ｃｏｌｉが、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０、ＢＬ２１、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、またはＬＭＧ１９である、宿主細胞を提供する。
【００６８】
本開示内容の別の実施形態は、アクセッション番号ＭＴＣＣ５３１２を有する宿主細胞を提供する。
【００６９】
本開示内容の別の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）ＵＳＶＤＡＣ  Ｔｏｐ１０と指定されるｐＤＡＣ−ＬａｃＺ構築物を含有する組換え発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０の組換え株を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）ＵＳＶＤＡＣ  Ｔｏｐ１０に割り当てられたアクセッション番号は、ＭＴＣＣ５３１２である。
【００７０】
本開示内容のさらに別の実施形態は、組換えタンパク質の産生に適した培地で、前記組換え発現ベクターを有する組換え細胞を入手し増殖させた後、一段階方法で前記組換えタンパク質を回収することにより、組換えタンパク質を産生し、かつ組換えタンパク質を精製するプロセスを提供する。
【００７１】
本開示内容の別の実施形態は、前記組換え発現ベクターが、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦ、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、またはｐＤＡＣ−ＥＰＯである、プロセスを提供する。
【００７２】
本開示内容の別の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒトインターロイキン、インターロイキン−２、血小板由来増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インシュリン、ウシエンテロキナーゼ、血管内皮増殖因子、神経成長因子、インターフェロン、および組織プラスミノゲン活性化因子などのタンパク質から選択される組換えタンパク質を提供する。
【００７３】
本開示内容のさらに別の実施形態は、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーを使用した精製による、前記組換えタンパク質の回収を提供する。
【００７４】
本開示内容の別の実施形態は、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、およびＣｏなどの金属イオンの使用による前記固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーを提供する。
【００７５】
本開示内容は、生物活性ポリペプチドまたはタンパク質（組換えタンパク質）、およびアフィニティーポリペプチドという少なくとも２つの成分を含む融合組換えタンパク質を産生する方法を提供する。さらに、本開示内容はまた、組換えタンパク質および不純物を含有する混合物から組換えタンパク質を精製する方法も提供する。組換えタンパク質の精製方法は、固定化金属イオンを含有する樹脂に融合組換えタンパク質を十分な時間にわたり接触させることと、所望のタンパク質をアフィニティーポリペプチドから分離させるために場合により開裂することにより、組換えタンパク質をこの樹脂から選択的に溶出することとからなる。
【００７６】
本開示内容による融合組換えタンパク質が、固定化金属イオンを含有する樹脂に接触すると、融合組換えタンパク質が固定化され、これにより融合組換えタンパク質を不純物から分離させることができる。本開示内容に記載された精製に必要とされる条件により、融合タンパク質が変性することはない。したがって、いくつかの手順で、最終的な組換えタンパク質産物を高収率で精製することが可能である。
【００７７】
精製は、タンパク質（ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニン）の表面で電子供与体として機能する特定のアミノ酸が、固体支持体に共有結合されたキレート群によって固定化された遷移金属イオンに、可逆的に結合する能力に基づく。これらのアミノ酸の中では、ヒスチジンが、ほとんどのタンパク質の固定化金属イオンへの結合を媒介する際に、量的に最も重要である。銅およびニッケルイオンは、ヒスチジンに対する親和性が最も大きい（Ｎａｇａｋａｗａ＆Ｐｏｒａｔｈ，１９８９）。一般的に使用されるキレート群は、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のいずれかである。また、ペプチドハンドル中でＨｉｓ残基の前にプロリン残基が存在すると、アフィニティーハンドルの立体的特性が生じる。
【００７８】
本開示内容は、金属キレートペプチドハンドル（アフィニティーポリペプチド）と対象となる異種タンパク質との融合、および固定化金属イオンを含有するカラム上の汚染物質からの異種タンパク質の分離を記載する。融合組換えタンパク質は、金属キレートペプチドリンカーを介して固定化金属イオンへキレートされる。汚染物質はカラムを自由に通過し、除去することができる。イオン電荷およびｐＨなどのカラムの条件を変更することにより、融合組換えタンパク質は純粋な形態で放出かつ採取することができる。融合組換えタンパク質は化学的に開裂することができる。あるいは、タンパク分解的開裂部位が、所望の組換えタンパク質およびアフィニティーポリペプチドを含有する融合組換えタンパク質の一部の間に、場合により挿入される場合もある。これらはプロテアーゼを使用して開裂することができ、これにより対象となる異種タンパク質（組換えタンパク質）が効果的に精製される。アフィティークロマトグラフィー法の選択は、工業用途の任意の大量バッチ精製をより少ない精製手順で行うのに役立ち、対象となる最終産物の損失を低減させ、それによってプロセス全体の費用が効率的になる。アフィニティーポリペプチドおよび本開示内容の方法を使用して、対象となる異種タンパク質のみが高収率で回収される場合がある。例えば、β−ガラクトシダーゼでは、他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質が除去された場合に、１手順で７０％の収率が得られるのに対し、細菌溶解物からは７４％の収率が得られた。他の細菌タンパク質から分離する間に１手順で得られたＩＬ−２の収率は７８％であった。
【００７９】
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ中のアフィニティーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、エンテロキナーゼ（ＥＫ）認識部位であるプロテアーゼ開裂部位に結合する。カルボキシペプチダーゼ、Ｘａ因子、トリプシン、Ｖ８、およびキモトリプシンなどの他のプロテアーゼ開裂部位も使用することができる。さらに、アフィニティーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合する化学的開裂部位へ挿入することもでき、前記化学的開裂部位は、ハロゲン化シアン、ヒドロキシルアミン、ギ酸、酢酸、塩酸およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択された試薬によって認識される。
【００８０】
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクター中でアフィニティーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＡｒａＢプロモーターの制御下で、さらにＬａｃＺ遺伝子へ結合する。ＬａｃＺ遺伝子もまた、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｏｓｍＢ、ＣＭＶ、ＥＦ−ｌα、ＳＶ４０およびＴ７からなる群から選択される他のプロモーターによって操作することができる。ＬａｃＺ遺伝子は、ｒｒｎＢ転写ターミネーターを有する。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターはまた、アンピシリンＯＲＦ、ｐＭＢｌ（ｐＵＣ由来の）起点、およびＡｒａＣ  ＯＲＦを含む。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺを構築する詳細な手順については、実施例４に示す。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターの概略マップ（７．１６ｋｂ）は図１に示す。アフィニティーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列部位３１９〜４４４に位置し、これにヌクレオチド配列部位４４８〜４６２に位置するＥＫ認識部位が続く。これに、ヌクレオチド配列部位４６９〜３４２８へ開始するＬａｃＺ遺伝子が続く。ＬａｃＺ遺伝子は、ヌクレオチド配列部位４５２６〜３６７３に位置するｒｒｎＢターミネーターによって終結する。
【００８１】
アフィニティーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＥＫ認識部位、ＬａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の一部を含む挿入物のポリヌクレオチド配列は配列番号３３に示す。本開示内容は、配列番号３３に示すポリヌクレオチド配列を有する挿入物を含む組換えｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターを提供する。配列番号３３は、ヌクレオチド配列部位１〜１２６のアフィニティーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供し、これにヌクレオチド配列部位１２９〜１３３のＥＫ認識部位が続く。これに、ヌクレオチド配列部位１５１以降に開始するＬａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ配列が続く。ＬａｃＺ遺伝子をコードする完全な配列は、当該技術分野で周知であるため、配列番号３３には示さない。ＬａｃＺ遺伝子に、当該技術分野で周知の終止配列が続く。
【００８２】
融合組換えタンパク質を産生するための組換えベクターは、アフィニティーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、ＥＫ認識部位、ＬａｃＺ遺伝子などの対象となるタンパク質、またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる。アフィニティーポリペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示すヌクレオチド配列からなる群から選択される場合がある。ＥＫ認識をコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野で周知である。対象となる異種ＤＮＡをコードするＤＮＡは、β−ガラクトシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒトインターロイキン、インターロイキン−２、血小板由来増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インシュリン、ウシエンテロキナーゼ、血管内皮増殖因子、神経成長因子、インターフェロン、および組織プラスミノゲン活性化因子、またはその他いずれかの生物活性ポリペプチドまたはタンパク質、すなわち対象となるタンパク質をコードするＤＮＡからなる群から選択される。
【００８３】
３Ｄ  ＰＳＳＭ分析に基づいた、配列番号５を有するアフィニティーポリペプチドの最初の１１個のアミノ酸であるＤＡＣに対して生成されたＳｔｉｃｋ＆Ｂａｌｌモデルを、図２に示す。図中の３本の矢印はＨｉｓ側鎖面を示し、太い矢印はプロリン環面に垂直な方向を示す。このモデルは、２価金属陽イオンの結合のために生成される、予測されるステレオ部位を示す。したがって、Ｓｔｉｃｋ＆Ｂａｌｌモデルから、アフィニティーポリペプチドの構造が、当該技術分野で既知の他のアフィニティータグに比べて、融合組換えタンパク質を精製するためのアフィニティーハンドルとしての使用に最も適していることが確認される。本開示内容のアフィニティーポリペプチドは、対象となる組換えポリペプチドまたはタンパク質の精製に対してより有効である。さらに、アフィニティーポリペプチドは、組換えタンパク質の精製への使用が容易でもある。
【００８４】
本開示内容は、融合組換えタンパク質を産生するための組換え発現ベクターの異なる構築方法を提供する。アフィニティーポリペプチド（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を、当該技術分野で既知の方法を使用して、最初に合成的に産生し、次いで、プラスミドベクターに挿入し、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺなどの組換え発現ベクターを産生する。アフィニティーポリペプチド（配列番号２、配列番号３、および配列番号４）をコードする他のヌクレオチド配列（配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２）を、当該技術分野で既知の方法を使用してプラスミドベクターに挿入し、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺなどの組換え発現ベクターを産生することもできる。
【００８５】
組換えベクターｐＤＡＣ−ＬａｃＺを、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０、ＢＬ２１、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、およびＬＭＧ１９などのＥ．ｃｏｌｉ細胞株を形質転換するのに使用し、組換えＥ．ｃｏｌｉ株を産生した。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺなどの所望の組換え発現ベクターを使用したＥ．ｃｏｌｉ株の形質転換を、実施例７に示す。このベクターを、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｅｕｌａ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、および哺乳動物の細胞などの他の宿主細胞へ形質転換することもできる。
【００８６】
組換えｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターは、このベクターを含有する組換え細胞によって産生された、アフィニティーポリペプチドおよびβガラクトシダーゼタンパク質という少なくとも２つの成分を含む融合組換えタンパク質の産生に関与する。
【００８７】
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターを含有する組換え細胞を、適した培地かつ当該技術分野で周知の条件下で増殖させ、融合組換えタンパク質を産生した。実施例８は、組換え細胞増殖の詳細を示す。融合組換えタンパク質を、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーを使用して精製した。実施例９に精製の詳細を示す。プロテアーゼまたは化学的開裂方法を使用して、融合組換えタンパク質から純βガラクトシダーゼタンパク質を得た。
【００８８】
プラスミドＤＮＡをｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターから単離し、ベクター構築物を確認するために、種々の酵素を使用した制限により分析した。実施例７に詳細を示す。組換えベクターｐＤＡＣ−ＬａｃＺから得られたβ−ガラクトシダーゼタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を実行した。実施例８に詳細を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３）では、ｐＤＡＣ−ＬａｃＺから得られたβ−ガラクトシダーゼタンパク質の結合能力および発現分析が示される。フロースルーおよび洗浄画分にはβ−ガラクトシダーゼタンパク質の存在が認められる。しかし、Ｃｕ−ＩＤＡの場合、フロースルーおよび洗浄画分にはより少量のβ−ガラクトシダーゼタンパク質しか認められず、Ｃｕ−ＩＤＡおよびＮｉ−ＩＤＡのカラムの方がＮｉ−ＩＤＡカラムよりも結合効率が高いことを示していた。
【００８９】
同様に、ｐＤＡＣ−ＩＬ２およびｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢなどの組換え発現ベクターを上述のように構築した。ｐＤＡＣ−ＩＬ２ベクター（４４９９ｂｐ）の概略マップを図４に示し、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢベクター（４４７９ｂｐ）を図６に示す。これらのベクターは、当該技術分野で周知の方法により構築することもできる。組換えベクターｐＤＡＣ−ｌＬ２は、ヌクレオチド配列部位３２２〜４４４の化学的開裂部位に結合するアフィニティーポリペプチド（ＡｒａＢプロモーターにより制御されたＩＬ−２遺伝子のＤＮＡ配列に結合する）をコードするヌクレオチド配列を有する。組換えｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢベクターは、ヌクレオチド配列部位３２２〜４４４のＥＫ部位に結合するアフィニティーポリペプチド（ＡｒａＢプロモーターにより制御されたＰＤＧＦＢ遺伝子のＤＮＡ配列に結合する）をコードするヌクレオチド配列を有する。これらの組換え発現ベクターを、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０、ＢＬ２１、ＨＢ１０１、ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ、およびＬＭＧ１９などのＥ．ｃｏｌｉ細胞株に形質転換し、組換えＥ．ｃｏｌｉ株を産生した。これらのベクターを含む組換え細胞を、固定化金属イオンキレートクロマトグラフィーの使用により、適した培地かつ当該技術分野で既知の条件下で増殖させ、対象となるタンパク質（組換えタンパク質）の精製に使用される融合組換えタンパク質を産生した。さらに、化学的および／またはプロテアーゼ開裂によって、所望のタンパク質を精製した。ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢの発現および結合分析を実施し、実施例８〜１２に詳細を記載する。ｐＤＡＣ−ＩＬ２中での発現インターロイキンの結合能力を示す、Ｎｉ−ＩＤＡ精製のクマシー染色ゲルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを図５に示す。さらに、発現ＤＡＣ−ＩＬ２タンパク質はＮｉ−ＩＤＡに結合し、イミダゾールで溶出する。さらに、結合タンパク質の溶出は、イミダゾール濃度に敏感である。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉからのゲノムＤＮＡ抽出
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｏｐ１０、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、およびＪＭ１０９株）からゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉからの単離の詳細を実施例１に示す。
【００９１】
アフィニティーポリペプチド配列を含有するプラスミドベクターの構築
特別に設計されたプライマー（配列番号１７および１８（２５μＭ））、鋳型としての細菌のゲノムＤＮＡ（Ｔｏｐ１０、ＨＢ１０１、およびＪＭ１０９株）、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素（１〜２．５単位／μＬ）を使用して、以下の増幅条件で増幅を行った：すなわち、９５℃における１〜５分間２５〜３５サイクルの変性、５４〜６３℃における１〜５分間のアニーリング、および７２℃における１〜１０分間の伸長。精製されたＰＣＲ産物（断片Ａと指定）を、配列番号１９および配列番号２０（詳細については実施例１を参照）で示すヌクレオチド配列を有する特別に設計されたプライマーを使用した増幅用の鋳型として使用した。増幅方法を実施例２で説明する。
【００９２】
増幅断片（断片Ｂと指定）、およびｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＥＴシリーズ、ｐＲＡ、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｍｙｃ／Ｈｉｓなどの原核生物の発現ベクターを、制限酵素Ａｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、１Ｘバッファー中で、２５〜５５℃にて一晩かけて消化した。消化された断片（断片１と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用し、次いで制限ベクター（断片２と指定）を使用して、消化された産物を連結反応させて精製し、アフィニティーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する中間ベクター（ｐＴａｇ−Ｉ）を生成した（詳細については実施例２を参照）。
【００９３】
中間タグベクター（ｐＴａｇ−Ｉ）を、特異的プライマー（配列番号２１および配列番号２２）を使用した増幅用のテンプレートＤＮＡとして使用した。増幅断片を、制限酵素Ａｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、１Ｘバッファー中で、２５〜５５℃にて一晩かけて消化し、断片３を生成し、ｐＲＡなどの原核生物の発現ベクターを同酵素、すなわちＡｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して消化し、断片４を生成した。制限された断片３および断片４を、ＰＣＲ精製キットを使用して抽出かつ精製し、次いで連結反応させ、別の増幅周期のための鋳型として使用される２番目の中間ベクター（ｐＲＡ−Ｔａｇ  Ｉ）を産生した（詳細については実施例３を参照）。
【００９４】
上述の手順を２回繰り返し、ＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素Ａｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、それぞれ１Ｘバッファー中で、２５〜５５℃にて一晩かけて消化した。
【００９５】
これを、当該技術分野で既知のｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＥＴシリーズ、原核生物の発現ベクターｐＲＡ、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｍｙｃ／Ｈｉｓ、または他のベクターなどの消化された発現ベクターに連結反応させ、プロテアーゼ開裂部位に結合するアフィニティーポリペプチドに対するＤＮＡ配列を有する、所望の発現ベクターを生成した。対象となるタンパク質をコードする（β−ガラクトシダーゼ、ヒト成長ホルモン、ヒトＧＣＳＦ、ヒトＰＤＧＦＢ、ウシエンテロキナーゼ、ヒトインスリン、ヒトインターロイキン、インターフェロン、および他の臨床治療用タンパク質またはペプチドなどのタンパク質をコードする）ＤＮＡ配列をプロテアーゼ開裂部位に結合した。生物活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ｐＲＡ−ＬａｃＺ、ｐＲＡ−ｈＧＨ、ｐＲＡ−ＧＣＳＦ、ｐＲＡ−ＰＤＧＦＢ、ｐＲＡ−ＥＫ、ｐＲＡ−Ｉｎｓｕｌｉｎ、およびｐＲＡ−ＩＬ２などの当該技術分野で既知のベクターから単離することができる。
【００９６】
より多くのアフィニティーポリペプチドの複製をタンデムに有するために、上述の手順を何回も繰り返すことができる（１〜１０個のアフィニティーポリペプチドの複製をタンデムに有することが可能である）。
【００９７】
本開示内容は、ＡｒａＢプロモーターによって制御されたＬａｃＺに対するＤＮＡ配列に結合するＥＫ部位に結合するアフィニティーペプチドを有する、組換え発現ベクターｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターの構築物を提供する（詳細については実施例４を参照）。
【００９８】
同様に、アフィニティーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターｐＤＡＣ−ＩＬ２が、さらにＩＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合するＥＫ部位に結合する。ベクターｐＤＡＣ−ＩＬ２中のＤＮＡ配列は、ＡｒａＢプロモーターの制御下にある。当該技術分野で既知の他のプロモーターが、融合組換えタンパク質の発現に使用される場合もある。発現ベクター産生の詳細については実施例５に示す。
【００９９】
ＡｒａＢプロモーターにより制御されたＰＤＧＦＢ遺伝子のＤＮＡ配列にさらに結合するＥＫ部位に結合するアフィニティーポリペプチドを有するｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢを構築した（詳細については実施例６を参照）。
【０１００】
上述の３つの構築物のすべてがＡｒａＢプロモーターを有し、エンテロキナーゼプロテアーゼ開裂部位に、異種遺伝子、ｒｒｎＢ転写終結領域、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＭＢｌ（ｐＵＣ由来）起点、およびＡｒａＣ遺伝子が続く。これらの構築物（ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０、ＬＭＧ１９、ＪＭ１０９株）のコンピテント細胞内で形質転換した。ベクター構築物を確認するために、プラスミドＤＮＡを、種々の酵素を使用した制限によって単離かつ分析した。詳細を実施例７に示す。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢの発現分析を行った。融合組換えタンパク質の結合を行った。詳細を実施例８〜１２で説明する。
【０１０１】
アフィニティーポリペプチド配列のゲノム注釈の増強を、プログラム３Ｄ−ＰＳＳＭの構造プロファイルを使用して行った（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。データは、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｇｒｏｕｐ，  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国）の３Ｄ−ＰＳＳＭウェブサーバによって作成した。金属（例えば、ニッケル）に結合する少なくとも３つのアミノ酸残基を含む予測２次構造を、この配列のＥスコアによる予測２次構造から選択した。Ｅスコアは有望な構造予測因子である。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析から、金属結合に含まれる２個のアミノ酸残基が外見上αヘリックス領域に属し、１個の残基はターンに属することが明らかである。
【０１０２】
アフィニティーポリペプチドの物理化学的特性の分析を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアのプロテウスのモジュールを使用して行った。プロテウスのモジュール（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア、ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用した、アフィニティーポリペプチドのプロテアーゼ開裂部位のＳＤＳ−ＰＡＧＥシミュレーション解析から、アフィニティーポリペプチドは、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、トリプシン、およびエンドペプチダーゼなどのプロテアーゼによって開裂されず、したがって、これらのプロテアーゼの上流または下流のいずれかの開裂部位を有する遺伝的構築物中で、アフィニティーポリペプチドを使用することができると考えられる。詳細を実施例１３に示す。
【実施例】
【０１０３】
本開示内容で記載される以下の実施例は、単に例示的なものであり、種々の改変または変更が当業者に暗示され、また種々の改変または変更が本出願の趣旨および適用範囲内、および添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解しなければならない。
【０１０４】
（実施例１）
ゲノムＤＮＡの単離およびＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９から単離した。１．５ｍＬのｏ／ｎ細菌培養（Ｔｏｐ１０、ＨＢ１０１、ＤＨ５−α、およびＪＭ１０９）をミクロ遠心分離管に移入し、６０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上清み液をデカントし、このペレットをＴＥバッファー中で再懸濁させた。ＳＤＳ（最終０．３％）およびプロテイナーゼＫを添加し、よく混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。同量のフェノール／クロロホルムを添加し、相が完全に混合されるまで、チューブを反転させてよく混合した。ＤＮＡ／フェノール混合物を、ミクロ遠心分離管へ慎重に移入し、室温にて１４Ｋｒｐｍで２分間遠心分離した。上部水相を新品のチューブに移入し、同量のフェノール／クロロホルムを添加し、よく混合し、室温にて１４Ｋｒｐｍで２分間遠心分離した。１０分の１の量の酢酸ナトリウムを、新品のミクロ遠心分離管へ移入した上部水相に添加した。ＤＮＡを、０．６容量のイソプロパノールを添加することにより、氷上で５〜８分間沈殿させた。ＤＮＡを、室温にて１４Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離することによってペレット化し、７０％のエタノールで洗浄した。ＤＮＡを、３７℃に維持した１００〜２００μＬのＴＥバッファー中で、１０〜１５分間溶解した。
【０１０５】
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株由来の細菌のゲノムＤＮＡを、特別に設計されたプライマーＵ−１およびＬ−１（配列番号１７および１８）、ならびに２０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．８、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＫＣｌをそれぞれ１０ｍＭ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、および２ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する１Ｘ  ＰＣＲバッファー（ＭＢＩ）中のＰｆｕポリメラーゼ酵素（１〜２．５単位／μＬ、ＭＢＩ）を、以下のサイクル条件で、増幅用の鋳型として使用した：すなわち、９５℃における１分間で４サイクルの変性、６０℃における２分間のアニーリング、および７２℃における１分間の伸長、続いて９５℃における１分間で３０サイクルの変性、６３℃における２分間のアニーリング、および７２℃における１分間の伸長。ＰＣＲ産物の分析のために、５〜１０μＬの試料を１〜１０μＬの１Ｘ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅと混合し、１．０％のアガロースゲル上で電気泳動させた。
【０１０６】
【化１】
2009525749.tif 000004
１０９９ｂｐのＰＣＲ産物（以下、断片Ａと指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。この精製された断片を、次の増幅の鋳型として使用した。
【０１０７】
（実施例２）
ｐＴａｇ中間ベクターの調製
制限酵素部位をプライマーの合成時に導入し、それによって増幅産物の５’末端および３’末端にて制限酵素部位の導入が可能となる。断片Ａを、プライマーＵ−２（Ａｇｅ  Ｉ部位を有する、配列番号１９）、およびＬ−２（Ｓａｌ  Ｉ部位を有する、配列番号２０）を使用した増幅用の鋳型として使用した。実施例１に記載の条件下で増幅を行った。
【０１０８】
【化２】
2009525749.tif 000005
８２０ｂｐの増幅産物を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、制限酵素Ａｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、ｌ００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化した。８０２ｂｐの断片（以下、断片１と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ＤＮＡ試料を、キットで提供される３〜５容量のバッファーＰＢを使用して混合し、カラムに添加した。これを１４Ｋｒｐｍにて３０〜６０秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。提供される洗浄バッファーで、膜を洗浄し、ヌクレアーゼを含まない遊離蒸留水を使用してＤＮＡを溶出した。
【０１０９】
ｐＲＡ  ＤＮＡベクターＤＮＡを、Ａｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化した。より小さい２７５ｂｐ断片ではなく、３７８４ｂｐ断片（以下、断片２と指定）を、実施例１に記載されるように精製した。断片１および断片２の連結反応を、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含むバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃にて一晩かけて行い、ＰＣＲ精製キットを使用して精製したｐＴａｇ中間ベクター（ｐＲＡ−ＴＡＧ−Ｉ）を得た。
【０１１０】
（実施例３）
ｐＲＡ−ＴＡＧ−Ｉベクターの調製
ｐＴａｇ中間ベクターを、サーマルサイクラー機内で、プライマーＵ−３（Ｎｃｏ  Ｉ部位、配列番号２１）、およびＬ−３（Ｐｖｕ  Ｉ部位を有する、配列番号２２）を使用した増幅用の鋳型として使用した。
【０１１１】
【化３】
2009525749.tif 000006
この１１６０ｂｐの増幅産物を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、Ｎｃｏ  ＩおよびＰｖｕ  Ｉを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化した。１０８０ｂｐ断片（以下、断片３と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１１２】
ｐＲＡベクターＤＮＡを、Ｎｃｏ  ＩおよびＰｖｕ  Ｉを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より小さい１０４７ｂｐ断片ではなく、３０１２ｂｐ断片（以下、断片４と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。断片３と断片４の連結反応を、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含有するバッファーの存在下で、３７℃にて２時間、その後４℃にて一晩かけて設定し、ｐＲＡ−ＴＡＧ−Ｉベクターを産生した。
【０１１３】
（実施例４）
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターの調製
ｐＲＡ−Ｔａｇ−ＩベクターＤＮＡを、サーマルサイクラー機中で、プライマーＵ−４（Ａｇｅ  Ｉ部位を有する、配列番号２３）、およびＬ−４（タグ中にさらに６塩基のコドンを有する、配列番号２４）を使用した増幅用の鋳型として使用した。３０２ｂｐ断片の増幅産物（以下、断片５と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１１４】
【化４】
2009525749.tif 000007
ｐＲＡ−Ｔａｇ−ＩベクターＤＮＡを、プライマーＵ−５（タグ中に１１塩基コドンを有する、配列番号２５）およびＬ−５（配列番号２６）を使用した増幅用の鋳型として使用した。８７０ｂｐ断片の増幅産物（以下、断片６と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１１５】
【化５】
2009525749.tif 000008
精製された断片５および断片６を、Ａｇｅ  Ｉ部位を有するプライマーＵ−６（配列番号２７）、およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有するＬ−６（配列番号２８）を使用した増幅用の鋳型として使用した。６３０ｂｐの増幅産物を精製し、Ａｇｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用して、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化した。より小さな２４８ｂｐ断片ではなく、消化された３８２ｂｐ断片（以下、断片７と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１１６】
【化６】
2009525749.tif 000009
ｐＲＡベクターＤＮＡをＡｇｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用して、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より小さな３４９ｂｐ断片ではなく、３７１０ｂｐ断片（以下、断片８と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。断片７の断片８との連結反応を、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含有するバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃にて一晩かけて行い、４０９２ｂｐサイズのｐＲＡ−Ｔベクターを産生した。
【０１１７】
ｐＲＡ−ＴベクターＤＮＡをＡｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より大きな３７８４ｂｐ断片ではなく、３０８ｂｐ断片（以下、断片９と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ｐＲＡ−ＬａｃＺベクターＤＮＡを、Ａｇｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを使用して、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より小さい２７５ｂｐ断片ではなく、６７９１ｂｐ断片（以下、断片１０と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。断片９を断片１０とともに、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含有するバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃にて一晩かけて連結反応させ、ｐＴ−ＬａｃＺベクター（７０９９ｂｐ）を産生した。精製された連結反応産物を、特別に設計されたプライマーを使用した増幅用の鋳型として使用した。
【０１１８】
ｐＴ−ＬａｃＺベクターＤＮＡを、サーマルサイクラー機で、プライマーＵ−７（Ａｇｅ  Ｉ部位を有する、配列番号２９）およびＬ−７（Ｎｈｅ  Ｉ部位を有する、配列番号３０）を使用する増幅用の鋳型として使用した。
【０１１９】
【化７】
2009525749.tif 000010
３３９ｂｐの増幅産物を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、Ａｇｅ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウムおよび０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化した。３１１ｂｐ断片（以下、断片１１と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１２０】
ｐＴ−ＬａｃＺベクターＤＮＡを、プライマーＵ−８（Ｎｈｅ  Ｉ部位を有する、配列番号３１）およびＬ−８（Ａａｔ  ＩＩ部位を有する、配列番号３２）を使用した増幅用の鋳型として使用した。
【０１２１】
【化８】
2009525749.tif 000011
７３３ｂｐの増幅産物を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、Ｎｈｅ  ＩおよびＡａｔ  ＩＩを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、７０４ｂｐ断片を精製した（以下、断片１２と指定）。
【０１２２】
断片１１を断片１２とともに、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含有するバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃にて一晩かけて連結反応させ、１０１５ｂｐの連結反応した断片（以下、断片１３と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１２３】
ｐＴ−ＬａｃＺベクターＤＮＡを、Ａｇｅ  ＩおよびＡａｔ  ＩＩを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より小さな９５３ｂｐ断片ではなく、６１４６ｂｐ断片（以下、断片１４と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。断片１３および断片１４を、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび０．５ｍＭのアデノシン三燐酸（ｐＨ７．８）を含有するバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃にて一晩かけて連結反応させ、ＡｒａＢプロモーターによって制御されたＬａｃＺ遺伝子にさらに結合するＥＫ部位に結合するアフィニティータグペプチド（Ｔ）に対するＤＮＡ配列を有するｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクター（７１６２ｂｐ）を産生した。
【０１２４】
（実施例５）
ｐＤＡＣ−ＩＬ２ベクターの調製
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターＤＮＡを、Ｓａｌ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より小さな３０８１ｂｐ断片ではなく、４０８１ｂｐ断片（以下、断片１５と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。組換えベクターｐＲＡ−ＩＬ２を、Ｓａｌ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用して、３３ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より大きな３９８４ｂｐ断片ではなく、より小さな４１９ｂｐ断片（以下、断片１６と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。断片１５と断片１６との連結反応を、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含むバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃にて一晩かけて行い、ＡｒａＢプロモーターにより制御されたＩＬ２遺伝子にさらに結合するＥＫ部位にさらに結合するアフィニティーポリペプチドを有するｐＤＡＣ−ＩＬ２ベクター（４４９９ｂｐ）を産生した。
【０１２５】
（実施例６）
ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦベクターの調製
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺベクターＤＮＡを、Ｓａｌ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用して、３３ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より小さな３０８１ｂｐ断片ではなく、４０８１ｂｐ断片（以下、断片１５と指定）を、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。組換えベクターｐＲＡＺ−１−ＰＤＧＦＢ  ＤＮＡを、Ｓａｌ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用して、３３ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、および０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で、３７℃にて一晩かけて消化し、より大きな４１１０ｂｐ断片ではなく、より小さな４０２ｂｐ（以下、断片１７と指定）を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。断片１５を断片１７とともに、２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオトレイトール、および０．５ｍＭのアデノシン三燐酸を含有するバッファーの存在下で、３７℃にて２時間および４℃一晩かけて連結反応させ、ＡｒａＢプロモーターにより制御されたＰＤＧＦＢ遺伝子にさらに結合するＥＫ部位に結合するアフィニティーポリペプチドを有するｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢベクター（４４８３ｂｐ）を産生した。
【０１２６】
同様に、生物活性タンパク質またはペプチド、すなわち対象となるタンパク質を産生するために、本開示内容の教示を利用することにより、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、およびｐＤＡＣ−ＥＰＯなどの組換えベクターを得ることができる。
【０１２７】
（実施例７）
細胞の形質転換
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢ、およびＵＳＶＤＡＣ−ＬａｃＺなどの構築物を、ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０、ＬＭＧ１９、ＪＭ１０９などのＥ．ｃｏｌｉ株のコンピテント細胞内で形質転換した。必要量のコンピテント細胞を氷上で解凍した。連結反応混合物を、コンピテント細胞を含有するチューブへ移入し、ピペットで採取したり、ボルテックスしたりせずに優しく混合し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を４２℃／２分間の熱ショックにさらし、氷上で５分間インキュベートした。抗生物質を含まない適切な培地１ｍＬを添加し、細胞を３７℃にて１時間、振盪によって増殖させた。細胞を３０００ｒｐｍにて５分間ペレット化し、抗生物質を含まない適切な培地１００μＬ中で、再懸濁させ、抗生物質を有する適切な培地を含有する寒天プレート上に広げた。プレートをインキュベーター内で３７℃にて１２〜１８時間インキュベートした。寒天プレート上で得られたコロニーを、抗生物質を含有する液体培地３ｍＬ中で植菌し、３７℃ｏ／ｎで振盪によって増殖させた。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ構築物を含有する組換えベクターを含むＥ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０の組換え株を、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）ＵＳＶＤＡＣ  Ｔｏｐ１０と指定した。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）ＵＳＤＡＣ  Ｔｏｐ１０に割り当てられたアクセッション番号は、ＭＴＣＣ５３１２である。
【０１２８】
プラスミド単離および分析
プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶菌法にて先行技術の標準的な方法で１．５ｍＬのｏ／ｎ増殖培養物から単離した。ベクター構築物を確認するために、ＤＮＡを制限酵素で消化した。対象となるＤＮＡを、種々の制限エンドヌクレアーゼを使用して個別にあるいは組み合わせて開裂し、得られた産物を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。エンドヌクレアーゼの作用によって産生されるＤＮＡ断片のサイズを決定することにより、制限マップを、酵素がＤＮＡを１回または２回開裂する単純な状況から、開裂がより頻繁に起こるより複雑な状況まで、徐々に推定した。
【０１２９】
自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩプリズム３１０遺伝子アナライザー）を使用して、陽性クローンの配列を決定した。プラスミドは、カラムを介してまたはＰＥＧ沈殿法により精製した（Ｋｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８）。精製ＤＮＡ（５０ｎｇ〜５００ｎｇ）に、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを４〜８μＬ添加した。このＲｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘは、あらかじめ混合されたｄＮＴＰ、染色ターミネーター、タグＤＮＡポリメラーゼ、塩化マグネシウム、およびバッファーで構成される。プライマー１μＬ（５ｐｍｏｌｅｓ／μＬ）を添加し、試料にサーマルサイクラー内でサイクルシーケンシングを行った（９４℃にて１０秒間、５０℃にて５秒間、および６０℃にて４分間のサイクルを２５サイクル）。得られた産物を、２．７Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）およびエタノールで沈殿させ、７０％のエタノールで２回洗浄した。ＤＮＡペレットをホルムアミド中で溶解した。試料を自動シーケンサーで分析した。
【０１３０】
（実施例８）
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦの発現分析
細菌性細胞を、アフィニティーポリペプチドを含有する組換え発現ベクター（ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ、ｐＤＡＣ−ＩＬ２、ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦ、ｐＤＡＣ−ＧＣＳＦ、ｐＤＡＣ−ＥＫ、ｐＤＡＣ−ｈＧＨ、ｐＤＡＣ−ＩＦＮ、ｐＤＡＣ−ＥＰＯ）を使用して形質転換し、対象となるＤＮＡ配列（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＩＬ２、ＰＤＧＦ）を、液体培地で、適切な抗生物質の存在下で増殖させた。細胞を、１リットルの発酵槽内のインキュベーター振盪機を使用して３７℃にて、ｌｏｇ（Ｏ．Ｄ６ｏｏｎｍ約０．５）まで、または固定相で（１６時間の増殖）のいずれかで増殖させた。その後、適量のインデューサー（０〜７％）を培養物に添加し、さらに３７℃にて必要時間（０〜７２時間）振盪によってインキュベートした。細菌性細胞を、４℃にて１０分間４，０００ｒｐｍでペレット化することにより採取した。細菌ペレットを冷却した１Ｘ  ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬの１Ｘ  ＰＢＳ中で再懸濁した。細菌性細胞の抽出物を、液体窒素中で細胞に４サイクルの急速凍結を行い、その後３７℃にて解凍することによって調製した。細胞を５分間激しくボルテックス化し、４℃にて１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清み液を新品の１．５ｍＬエペンドルフ型チューブへ移入した。細胞抽出物の総タンパク質量をブラッドフォード法により推定した。β−ガラクトシダーゼタンパク質の比色評価を、４０５ｎｍＯ．Ｄ．で、Ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ，Ｓｉｇｍａ）を基質として使用して行った（表２）。
【０１３１】
【表２】
2009525749.tif 000012
細胞ペレットを、溶解バッファー中で超音波処理して、遠心分離し、純細胞溶解物を得た。ブラッドフォード法によりタンパク質含有量を推定した後、必要量の試料を試料バッファーと混合し、９０℃にて５分間加熱した。試料をパルススピンさせ、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０〜２０％）に充填した。電気泳動の実行後、ゲルをクマシーブルーで染色した。
【０１３２】
（実施例９）
β−ガラクトシダーゼタンパク質の結合試験
細胞ペレットを、２５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）中で再懸濁し、１０分間超音波処理した（３０秒のオン／オフパルスモード）。細胞溶解産物を１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、上澄み液をアフィニティークロマトグラフィーに使用した。上澄み液２５ｍｇを、ＬａｃＺタンパク質とアフィニティーポリペプチドとの金属アフィニティービーズへの結合の試験に使用した。キレートセファロースビーズを１ｍＬのＰＤ−１０カラムに充填した。ビーズは、１０ｍＬの蒸留水で、次いで、１０ｍＬの１００ｍＭのＮｉＳＯ４またはＣｕＳＯ４で、次いで再び１０ｍＬの蒸留水で、最後に２０ｍＭのイミダゾールを有する場合と有さない場合の平衡バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）１０ｍＬで、沈降かつ洗浄することができた。
【０１３３】
非結合タンパク質を除去するために、試料（２０ｍＭのイミダゾールを有するものと有さないもの）を流速１ｍＬ／分にてカラムに充填し、各バッファー（２０ｍＭのイミダゾールを有するものと有さないもの）５ｍＬで洗浄した。すべての試験における結合タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する各バッファー２ｍＬで溶出した。すべての関連画分のタンパク質評価を、Ｐｉｅｒｃｅのブラッドフォードタンパク質分析キットを使用して行った。試料を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、次いでクマシー染色法を行った（表３）。
【０１３４】
【表３−１】
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【０１３５】
【表３−２】
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発現β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮｉ−ＩＤＡへの結合効率は、イミダゾールを含有していない平衡バッファーの存在下で結合した際により良くなることが明らかとなった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３）は、フロースルーおよび洗浄画分におけるβ−ガラクトシダーゼタンパク質の存在を示す。しかし、Ｃｕ−ＩＤＡの場合、フロースルーおよび洗浄画分ではより少ないβ−ガラクトシダーゼタンパク質しか認められず、Ｃｕ−ＩＤＡの方がＮｉ−ＩＤＡよりもカラムを介して高い結合効率を有することを示していた。このことは、本開示内容のアフィニティーポリペプチドが、組換えタンパク質またはポリペプチド、すなわち対象となるタンパク質の精製に極めて有効であることを示す。さらに、本開示内容のアフィニティーポリペプチドを、対象となる他のタンパク質の精製にも使用することができ、このような例のいくつかを以下の実施例に示す。
【０１３６】
（実施例１０）
ｐＤＡＣ−ＬａｃＺの発現および結合の分析
細胞ペレットを、２５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）中で再懸濁し、１０分間超音波処理した（３０秒のオン／オフパルスモード）。細胞溶解産物を、１５分間１５，０００ｒｐｍにて遠心分離し、上澄み液をアフィニティークロマトグラフィーに使用した。ｐＤＡＣ−ＬａｃＺ（５５ｍｇ）の上澄み液を結合分析に使用した。キレートセファロースの３ｍＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、空のＰＤ−１０カラムに充填した。カラムを１００ｍＭのＣｕＳＯ４で充填し、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾールで平衡に保った。試料にイミダゾールを添加し、２０ｍＭの終末濃度にした。試料を流速１ｍＬ／分にてカラムに充填した。充填が完了した後、非結合タンパク質を同バッファーで洗浄した。結合タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する上述のバッファーで溶出した。すべての関連画分のタンパク質の評価を、ブラッドフォードタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して行った。結果を表４に示す。試料を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて分析した。ゲルをクマシー染色法で染色した。
【０１３７】
【表４】
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（実施例１１）
ｐＤＡＣ−ＩＬ２の発現分析
発現ベクターｐＤＡＣ−ＩＬ２で形質転換された細菌性細胞を、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）を含有する液体培地で増殖させた。細胞をインキュベーター振盪機で、３７℃にて固定相（１６時間増殖）まで増殖させた。適量のＬ−アラビノース（０．２％の終末濃度）を培養物に添加し、さらに３７℃にて７時間振盪によってインキュベートした。細菌性細胞を、４℃１０分間４０００ｒｐｍにてペレット化することによって採取した。細胞ペレットを、１．５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）中で再懸濁した。細胞を破壊するために試料を超音波処理し、全溶解産物を１５，０００ｒｐｍにて１０分間スピンさせた。全溶解産物、上清み液、およびペレットからタンパク質を評価した。１０μｇのタンパク質を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、ゲルをクマシー染色法で染色した。
【０１３８】
（実施例１２）
発現ＤＡＣ−ＩＬ２タンパク質の結合試験
細胞ペレットを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの尿素、および２０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファー中で３時間可溶化した。１ｍＬのＮｉ−ＩＤＡビーズを充填し、５カラム体積０．１ＭのＮｉ−ＳＯ４を充填した。カラムを平衡バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの尿素、および２０ｍＭのイミダゾール）で平衡に保ち、約５．５ｍｇのタンパク質をカラムに充填した。フロースルーを採取した。カラムを２カラム体積の平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する溶出バッファーで溶出した。異なる画分中のタンパク質量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって評価かつ分析した（表５）。
【０１３９】
【表５】
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発現ＤＡＣ−ＩＬ２タンパク質は、Ｎｉ−ＩＤＡアフィニティーマトリックスに結合する。非特異性の結合タンパク質を、８０および２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーを使用して所望のタンパク質を溶出する間に、主に４０ｍＭのイミダゾール洗浄によって除去する。
【０１４０】
（実施例１３）
タグ配列のゲノム注釈の増強を、プログラム３Ｄ−ＰＳＳＭ中の構造プロファイルを使用して行った（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。データは、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｇｒｏｕｐ，  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（英国）の３Ｄ−ＰＳＳＭウェブサーバによって作成した。金属（例えば、ニッケル）に結合する少なくとも３つのアミノ酸残基を含む予測２次構造を、この配列のＥ−スコアによる予測２次構造から選択する。Ｅ−スコアは有力な構造予測因子である。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析から、金属結合に含まれる２つのアミノ酸残基は、外見上はαヘリックス領域に属し、１つの残基は、ターンに属することが明らかである。アフィニティータグペプチドの物理化学的特性を、プロテウスのソフトウェア（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）を使用して分析し、これを以下に示す。
【０１４１】
全タンパク質の予測構造分類：Ｒ（Ｄｅｌｅａｇｅ＆Ｒｏｕｘ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ＆Ｏｏｉ  １９８７）
分子量：４５８９．０６ｍ．ｗ．
長さ：４１アミノ酸
強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）：０
強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）：６
疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、およびＶ）：１６
極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）：３
１μｇ＝２１７．９１０ｐモル
モル吸光係数：０±５％
１Ａ（２８０）：ＣＹＷなし
等電点：６．３０
ｐＨ７での電荷：−４．０９
Ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎの結果（ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）から、以下のＭＡＸＨＯＭ配列が得られた。
（１）ｐｒｅｄｉｃｔ＿ｈ２６３０に関して計算された同一性：
着色：一致／７０％および物性
【０１４２】
【化９】
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上述の結果は、アフィニティータグペプチド（アフィニティーハンドル）の一部が、Ｅ．ｃｏｌｉｎｉｋ  ｃタンパク質に対して８７．５％の相同性を有することを示す。配列情報の一部を、断片Ａを構築するのに使用した。
【０１４３】
参考文献
【０１４４】
【化１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】組換えベクターｐＤＡＣ−ｌａｃＺのマップである。
【図２】３Ｄ  ＰＳＳＭ分析に基づいた、配列番号５のアフィニティーハンドルであるＤＡＣのＳｔｉｃｋ＆Ｂａｌｌモデルである。
【図３】β−ガラクトシダーゼタンパク質の結合能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および発現分析である。レーン１：ＨＭＷマーカーレーン２：総タンパク質量レーン３：上清み液レーン４：Ｎｉ−ＩＤＡ  ＦＴ（−イミダゾール）レーン５：Ｎｉ−ＩＤＡ洗浄（−イミダゾール）レーン６：Ｎｉ−ＩＤＡ溶出（−イミダゾール）レーン７：Ｎｉ−ＩＤＡ  ＦＴ（＋イミダゾール）レーン８：Ｎｉ−ＩＤＡ洗浄（＋イミダゾール）レーン９：Ｎｉ−ＩＤＡ溶出（＋イミダゾール）レーン１０：Ｃｕ−ＩＤＡ  ＦＴ（−イミダゾール）レーン１１：Ｃｕ−ＩＤＡ洗浄（−イミダゾール）レーン１２：Ｃｕ−ＩＤＡ溶出（−イミダゾール）レーン１３：Ｃｕ−ＩＤＡ  ＦＴ（＋イミダゾール）レーン１４：Ｃｕ−ＩＤＡ洗浄（＋イミダゾール）レーン１５：Ｃｕ−ＩＤＡ溶出  （＋イミダゾール）
【図４】組換えベクターｐＤＡＣ−ＩＬ２のマップである。
【図５】発現インターロイキンの結合能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１：ＬＭＷマーカーレーン２：総溶解タンパク質量レーン３：Ｎｉ−ＩＤＡ−フロースルーレーン４：Ｎｉ−ＩＤＡ−洗浄レーン５：Ｎｉ−ＩＤａ−４０ｍＭのイミダゾール溶出レーン６：Ｎｉ−ＩＤａ−８０ｍＭのイミダゾール溶出レーン７：Ｎｉ−ＩＤａ−２５０ｍＭのイミダゾール溶出
【図６】ｐＤＡＣ−ＰＤＧＦＢのマップである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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