(57)【要約】  本発明は、サンプル（１）をサンプリングしてサンプル（１）のデータセット（４）を形成する装置（１１）によって、生体サンプル、具体的には組織サンプルを自動的に分析する方法に関する。サンプル（１）の関連領域（ＲＯＩ）を迅速な方式で且つサンプル（１０）を損傷させることなく検出することを可能にする方法および／または装置（１０）を作製するために、サンプル（１）を損傷させることなく自己蛍光を使用することによって作成されたサンプル（１）のデータセット（４）から少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）が選択され、前記パラメータもしくはそのパラメータから導出された値またはパラメータ（Ｐ）もしくはそのパラメータから導出された値が、少なくとも１つのしきい値（Ｓ）と比較され、比較値が、サンプル（１）の関連領域（ＲＯＩ）を検出する基準として使用され、サンプル（１）の適切に定義された特徴（ＩＤ）と共に記憶される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル（１）を光で刺激し、サンプル（１）の得られた蛍光放射の画像をサンプル（１）のデータセット（４）として記録し記憶することにより、生体サンプル（１）、具体的には組織サンプルを自動分析する方法であって、
サンプル（１）を非破壊式で走査し、サンプル（１）の記憶されたデータセット（４）から少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）を選択し、このパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値（Ｓ）と比較し、比較値（Ｖ）を、サンプル（１）の対象領域（ＲＯＩ）を決定する基準として使用し、サンプルの固有識別（ＩＤ）と共に記憶する、方法。
【請求項２】
サンプル（１）は、レーザ光で刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプル（１）の得られた蛍光放射の画像は、フィルタリングされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル（１）は、異なる波長の合成光で刺激される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル（１）のデータセット（４）は、例えばＴＩＦＦ形式やＪＰＧ形式などの標準形式で記憶される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル（１）のデータセット（４）は、少なくとも１つのバイナリデータセットに変換される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
パラメータ（Ｐ）として、蛍光パラメータ、具体的には蛍光強度が使用される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのしきい値（Ｓ）は、少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）から導出される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
しきい値（Ｓ）は、サンプル（１）のタイプに基づいて選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
しきい値（Ｓ）は、比較値（Ｖ）に基づいて変更される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
しきい値（Ｓ）は、外部パラメータ（Ｐ’’）による影響を受ける、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
比較値が正であるサンプル（１）の任意の領域が対象領域（ＲＯＩ）と見なされる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
対象領域（ＲＯＩ）の幾何学形状が決定され、更に他の処理と分析のために記憶される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル（１）の得られたデータセット（５）において、サンプル（１）の対象領域（ＲＯＩ）の外側にある領域は、消去されるかまたは他の方法で選択的に示される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象領域（ＲＯＩ）の外側にあるサンプル（１）の領域は切り取られる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル（１）の対象領域（ＲＯＩ）のサイズが決定される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル（１）の全表面積に対する対象領域（ＲＯＩ）の大きさの比が作成され、サンプル（１）の固有識別（ＩＤ）と共に記憶される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル（１）の全表面積に対する対象領域（ＲＯＩ）の大きさの比が事前設定された境界値より小さいサンプル（１）は使用不能と見なされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのパラメータ（Ｐ’’，Ｐ’’’）は、サンプル（１）の少なくとも１つの追加のデータセット（６，７）に基づいて選択される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
いくつかのサンプル（１）は、自動的に連続または並列に処理され、サンプル（１）の識別された対象領域（ＲＯＩ）に関して得られたデータが記憶される、請求項１から１９項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの光源（１３）と、サンプル（１）のデータセット（４）を形成するためにサンプル（１）を走査するカメラまたは検出器とによって構成された装置（１１）を含み、生体サンプル（１）、具体的には組織サンプルを自動分析する装置（１０）であって、
サンプル（１）を非破壊式に走査するように設計された走査装置（１１）は、データセット（４）から少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）を選択し、このパラメータ（Ｐ）もしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータ（Ｐ）もしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値と比較するコンピュータユニット（１６）に接続され、
サンプル（１）の比較値から決定された対象領域（ＲＯＩ）を表示する装置（１７）と、この領域（ＲＯＩ）をサンプル（１）の固有識別（ＩＤ）と共に記憶するメモリ（１８）とが設けられた、装置（１０）。
【請求項２２】
少なくとも１つの光源（１３）は、レーザによって構成された、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
少なくとも１つの光源（１３）は、紫外線ランプによって構成された、請求項２１または２２に記載の装置。
【請求項２４】
いくつかの光源（１３）は、異なる波長範囲で提供される、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
走査装置（１１）は、顕微鏡を含む、請求項２１から２４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
走査装置（１１）は、スキャナを含む、請求項２１から２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
サンプル（１）のデータセット（４）を少なくとも１つのバイナリデータセットに変換する装置が設けられた、請求項２１から２６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２８】
サンプル（１）のデータセット（４）をフィルタリングするフィルタ装置が設けられた、請求項２１から２７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
追加のデータセット（６）を作成するためにサンプル（１）を記録する顕微鏡（１５）が設けられた、請求項２１から２８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３０】
サンプル（１）を自動的に供給し排出する装置（１９）が設けられた、請求項２１から２９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３１】
いくつかのサンプル（１）を収容するためのマガジン（２０）が設けられ、そのマガジンから、サンプル（１）が、分析のために自動化された方式で取り出され再び戻される、請求項２１から３０のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルを光で刺激し、サンプルの得られた蛍光放射の像をサンプルのデータセットとして記録し記憶することにより、生体サンプル、具体的には組織サンプルを自動分析する方法に関する。
【０００２】
更に、本発明は、少なくとも１つの光源と１台のカメラまたは検出器とによって構成され、サンプルを走査してサンプルのデータセットを作成する装置を含む、生体サンプル、具体的には組織サンプルを自動分析する装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
医学では、診断や研究のため、一般に、様々なサンプル（例えば、組織サンプル）が収集され、そのサンプルが様々な検査にかけられる。人間や動物の生体から取り出された組織サンプルの場合は、一般に、個別の大きな組織片がパラフィンに埋め込まれ、更なる研究のために、ガラスサポート上の薄い組織標本片内に移される。更に、パラフィンブロックは、組織のいくつかの小片を含むことができる。他のパラフィンブロックから、組織サンプルの円筒状コア（いわゆるコア）を特定の選択した場所から抽出し、対応するパラフィンブロックの大きな円筒状の穴に導入することができる。次に、そのような組織サンプルアレイ（組織マイクロアレイ，ＴＭＡ）は、通常、ミクロトームを利用して切断され、組織標本（preparation）は、例えば組織学的に研究される。
【０００４】
具体的には診断または治療のための重要な情報をできる限り迅速に取得するために、多数の切片による前述の組織標本片または組織サンプルアレイと個別サンプルが、高度な自動分析に送られる。研究は、顕微鏡で行われるが、分子レベルでも行われることがあり、それによって初期物質の正確な内容と組成がきわめて重要である。比較を容易にし、且つ物質選択を妥当なものに絞るために、前述の組織サンプルアレイ（ＴＭＡ）が作成される。例えば、米国特許出願公開第２００３／０２１５９３６号は、できる限り迅速且つ効率的に組織サンプルアレイを研究する方法および装置について述べている。
【０００５】
後の説明では、主に組織サンプルについて検討するが、本発明はそのようなサンプルに限定されない。人間、動物および植物組織の他に、様々な出所のほとんどの異なる組織の組み合わせが、本発明で使用するのに適している。また、例えばタンパク質や核酸など、組織から抽出され、ガラスサポートに一滴ずつ加えられた物質が、本発明で検査される。更に、生体からの血液や唾液などの体液を分析することができる。最後に、サンプルとして、培養細胞またはその一部分さらには有機または無機物質もある。
【０００６】
多数のサンプルでは、組織標本内の個別サンプルの妥当性を評価できることが特に重要である。一方、これは、具体的には医療分野の診断のためにサンプルの分析後に行われる評価の信頼性に特に重要である。他方、組織標本の個別サンプルの妥当性を評価できれば、組織標本は、経済的価値を大幅に高めることができる。
【０００７】
また、サンプルの妥当性を評価する他に、後の研究に有利なサンプルの領域を評価できることが重要である。例えば、組織学的サンプルの場合、例えば特定の臓器に関連するサンプルの領域だけが重要であり、周囲の脂肪組織は重要ではない。現在に至るまで、そのような対象領域（ＲＯＩ）は、適切な専門家により顕微鏡下で厄介な手作業で決定されていた。
【０００８】
この場合、対象領域をより容易に検出できるように、通常、研究に使用されるサンプルが組織学的に着色される。そのようなサンプルは、着色のため、後の研究に利用できなくなる。したがって、例えば組織などの一連の切片では、サンプルの切片は、ランダムサンプル方式でのみに着色される。しかしながら、これらのランダムサンプル分析では、切片ごとに異なる可能性があるサンプルの実際の対象領域に関する情報が得られない。この情報は、特にランダムサンプルの数が多い場合に強化されるが、後の研究に利用できるサンプルの数が少なくなる。更に、通常手動で行われる制御は、極めて時間がかかり、従って高コストである。
【０００９】
特定波長の光で刺激される要素に生じる放射である自己蛍光の使用は、サンプルを破壊しない適切な検査方法である。ほとんどの物質は、特に光で刺激することができ多少の蛍光放射を放射することができる化学構造を含む。自己蛍光は、物質の組成の像を示し、また生物学的または生化学的プロセスを示すために使用することができる。組織の場合、細胞成分と細胞外成分の両方が蛍光放射を放射する。例えば、主にミトコンドリア内に配列されているニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはフラビンアデニンジヌクレチオドジヌクレオチド（ＦＡＤ）は、蛍光ビームの主な放射源であると考えられる。様々な物質の量と組成は、特定の刺激で特定の自己蛍光パターンを生成し、それにより蛍光放射を検出することにより、組織の組成の違いと機能的な違いの識別が可能になる。自己蛍光は、生体物質の生体内と生体外の両方の特性決定に使用される。例えば、血液循環により、赤血球染料のヘモグロビンは、本質的に人体中で見られる。ヘモグロビンは、強い蛍光性を有し、それにより、ヘモグロビンの量が変化すると組織の自己蛍光パターンが変化する。血液循環を研究するために、これは、体内で分光法（ヨシノリ，ホリエらによる「Role of Nitric Oxide in Good Ischemia-Reperfusion-Induced Hepatic Microvascular Dysfunction」American Physiological Society (1997) : G1007-G1013）によって測定することができる。また、眼科では、網膜を研究するために自己蛍光が使用される（アンソニーＧ．ロブソン（Anthony G.Robson）らによる「Comparison of Fundus Autofluorescence with Photopic and Scotopic Fine-Matrix Mapping in Patients with Retinitis Pigmentosa and Normal Visual Acuity」Investigative Ophthalmology & Visual Science 45 (11) (2004): 4119-4125)。自己蛍光の生体内または生体外分光法の応用例は多数あるが、自己蛍光は、顕微鏡切片の研究には確立できないこともある。これと対照的に、蛍光顕微鏡検査法における組織の蛍光放射は、欠点として記載されている（ウェルナー，バショング（Werner, Baschong）らによる「Control of Autofluorescence of Archival Formaldehyde-fixed, Paraffin-embedded Tissue in Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)」The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 49 (12) (2001): 1565-1571）。微視的構造の研究への自己蛍光分光法の使用は、きわめてまれにしか記述されていない（ルイジ リガッシ（Luigi Rigacci）らによる「Multispectral Imaging Autofluorescence Microscopy for the Analysis of Lymph-Node Tissues」Photochemistry and Photobiology 71(6) (2000): 737-742)、およびエリンＭ．ギル（Erin M.Gill）らによる「Relationship Between Collagen Autofluorescence of the Human Cervix and Menopausal Status」Photochemistry and Photobiology 77 (6) (2003): 653-658)。
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０２１５９３６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、生体サンプルを自動分析するための上述の方法を作製することであって、サンプルを破壊せずにできる限り迅速且つできる限り多く実行することができ、これにより、サンプルの対象領域またはサンプルの有益な性質に関するできる限り信頼性の高い結果が得られる方法を作製することである。この方法は、できる限り短時間で且つできる限り低コストでサンプルの対象領域に関する情報を提供する。先行技術の欠点は、回避されるかまたは少なくとも軽減される。
【００１２】
本発明の別の目的は、生体サンプルを自動分析する前述の装置の作製にあって、できる限り迅速で且つ確実な分析を可能にし、できる限り単純で且つ丈夫に設計され、またできる限り低コストで作成することができる装置の作製にある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明による第１の目的は、サンプルが非破壊式に走査され、サンプルの記憶されたデータセットから少なくとも１つのパラメータが選択され、このパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値と比較され、比較値が、サンプルの対象領域を決定する基準として使用され、サンプルの固有識別と共に記憶されることにより達成される。
【００１４】
従って、本発明による方法は、サンプルのデータセットから選択される特定のパラメータを必要とし、このデータセットは、サンプルの非破壊走査による蛍光放射を使用して作成され記憶され、そこからサンプルの対象領域が自動的に決定され、サンプルの固有識別と共に記憶される。この場合、対象領域の決定は、単一のプロセスステップで行われてはならず、むしろ対象領域を閉ループで繰り返し決定することができる。この繰り返し決定は、生体サンプルまたは任意に選択され既にあらかじめ分類されたサンプルの手作業の検査によって得られた情報からの学習法に基づく。少なくとも１つのパラメータの選択をサンプルに基づく経験値から行うことができる。本発明による方法の結果として、サンプルごとに対象領域を提案するデータセットが存在する。このデータセットは、特に、後の研究と支援の選択（例えば、対応するサンプルを選択する組織学者）にとって重要である。その結果、いくつかのサンプルの分類を比較的高速で自動的に行うこともでき、追加の処理のための提案として提供することができる。生体サンプルを分析する方法は、実行されたサンプルの研究のすぐ前または早期に実行することができ、得られたデータは、追加情報およびサンプルの固有識別と共に、例えば後の研究に利用可能な方法でデータベースに記憶される。データをデータベースに記憶する代わりに、前記データは、いわゆるフラットファイル形式で保存されてもよい。基本的に、得られた情報は任意の記憶媒体に保存することができる。しかしながら、データベースは、主に、分類と文書化に関してプロセスを構造化し、最適化する。本発明による方法により、診断と治療のためだけでなく研究のための重要な情報を得ることができる。得られた情報によって、発見的問題解決（heuristic）に基づいて生体サンプルを特定のクラスに割り当てることができる。この方法は、サンプル、具体的には組織サンプルの非破壊式顕微鏡描写のために自己蛍光を使用する。それにより得られるサンプルの蛍光放射のパターンは、サンプルのどの部分が特定の研究に関係し、またサンプルのどの部分が特定の研究に無関係かを自動的に分析または決定することを可能にする。従って、更に、自己蛍光を使用して、サンプル（例えば、組織または組織部分）を周囲の物質（例えば、パラフィン）と自動的に区別したり、他の組織部分と機能的な違いを有する特定の組織部分を指摘したりすることができる。従って、自己蛍光は、サンプルを破壊したり更に他の反応を引き起こしたりすることなく、サンプル（具体的には組織要素）の構成要素の自動決定を可能にする。また、当然ながら、本発明による非破壊的方法と、サンプルまたはその一部分が損なわれるか更には破壊される他の方法との組み合わせも可能であり、それにより重要な追加情報を得ることができる。
【００１５】
蛍光放射は、サンプルをレーザ光で刺激することにより生成されることが好ましい。しかしながら、レーザ光の他に、自己蛍光を発生させることができる水銀灯や他の光源も使用することができる。
【００１６】
本発明の別の特徴によれば、得られたサンプルの蛍光放射の画像をフィルタリングすることができる。サンプルの記録されたデータセットまたは画像は、様々な基準に従ってフィルタリングされてもよい。この場合、画像を記録するカメラなどの前に配置された機械的フィルタと、画像データが通る電子フィルタが使用される。蛍光顕微鏡の場合、例えば以下の特性を有する例えば紫外線ランプと３つの異なるフィルタを使用することができる。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
蛍光スキャナの場合は、例えば、例えばＣＹ３（インドカルボシアニン）またはＣＹ５（インドジカルボシアニン）などの極めて特殊な蛍光染料と共に２つの異なる波長を有するレーザが使用される。ＣＹ３は、例えば、５３０ｎｍで刺激され、５９５ｎｍの波長の光を放射する。ＣＹ５は、６３０ｎｍで刺激され、６８０ｎｍの蛍光放射を放射する。
【００１９】
また、よい結果は、サンプルを異なる波長の混合光で刺激することにより達成することができる。そのような「マルチスペクトルイメージング」により、様々な光源が使用され、より多くの情報が得られる。光源として、例えば、アルゴンイオンレーザやヘリウムネオンレーザなどのレーザが利用可能である。更に、レーザの代わりに広い波長範囲を有する光源を使用することができる。例えば、水銀灯や光ファイバ素子を光源として使用することができる。
【００２０】
データセットの後処理を容易にするために、データセットは、例えばＴＩＦＦ形式やＪＰＧ形式などの標準形式で記憶されることが好ましい。これは、また、既存の画像処理プログラムの利用を可能にし、研究前のデータセットの変換を必要としない。
【００２１】
サンプルのデータセットは、少なくとも１つのバイナリデータセットに変換されると有利である。バイナリデータセットは、分析することができる論理０と論理１のマトリクスから構成される。そのようなバイナリデータセットは、特定のパラメータが、１つのしきい値またはいくつかのしきい値と比較されるように作成される。複数のパラメータを使用する場合は、例えば重ね合わせおよび／または重み付けによって、アルゴリズムにおいて後で組み合わせることができるいくつかのバイナリデータセットを蓄積することができる。基本的には、いくつかの二値画像によって任意の画像を描写することができる。例えば、８ビット解像度（即ち、２５６色階調）を有するカラー画像は、２５６の二値画像の重ね合せによって明瞭に描写することができる。
【００２２】
データセットから選択され、サンプルの対象領域の分析に使用されるパラメータとして、蛍光パラメータ（具体的には、蛍光強度）を使用することができる。データは、事前設定されたしきい値と比較され、次に比較値が、サンプルの対象領域を決定する基準として使用される。それぞれのしきい値は、経験値に由来するものでもよく、標準化された統計的手法（例えば、いわゆるボックスプロット法）によって自動的に決定されてもよい。このボックスプロット法は、ランダムサンプルの蓄積の情報ならびに分位点情報を使用し、例えば生体サンプルに関する追加の知識を必要とすることなくしきい値を単純に決定することができる。パラメータとして蛍光強度を使用するとき、値は、周囲の画素の強度との比で表されることが好ましく、蛍光強度の分布は、画像の画素によって作成される。得られるパラメータの値として、例えば蛍光強度の変動を使用することができる。蛍光強度は、蛍光放射を放射する各分子の分布に大きく依存し、従って以下の自動分析に使用することができる。
【００２３】
１．微小分子レンジ（Micromolecular range）（均質性）：細胞中の小さい分子（例えば、ＮＡＤ、ＦＡＤ、トリプトファンなど）が、超顕微鏡的蛍光を放射し、その全体の量から不明瞭な細胞内画像が得られる。他の蛍光源による分断が生じない場合、蛍光放射は均質である。
【００２４】
２．巨大分子レンジ（細分性）：分子錯体（例えば、ポルフィリン、脂肪色素、凝固タンパク質など）は、顕微鏡またはデジタル画像で観察することができる強い粒状蛍光パターンを示す。これは、細胞内分子と細胞外分子の両方で起こることがあり、その結果自己蛍光強度の変動が生じる。
【００２５】
３．組織組成（配向性）：固有の分子組成を有するより大きな構造では、例えば、長手方向に向けられた並列構造（ファイバ）を有するコラーゲンを多く含む結合組織の場合のように、自己蛍光が特有の向きになる。その結果、サンプル内の特定の構造物の輪郭を自動的に決定し、それにより対象領域（ＲＯＩ）を識別することができる。
【００２６】
少なくとも１つのパラメータから少なくとも１つのしきい値を得ることができる。例えば、適切なパラメータを見つけたときに中心値によってしきい値を決定することができ、その結果、それらのパラメータの分布が安定し、したがって、中間値の例では、パラメータの安定した単峰型分布のままである。
【００２７】
これに対応して、サンプルのタイプに基づいてしきい値を選択することもできる。例えば、サンプルの組成および経験や他の方法から決定された対応するしきい値に関する情報が、サンプルと一緒にファイルできる。例えば、重みは、例えば傾斜法から決定されたデータベース内の固有の情報から二値画像によって割り当てることができる。
【００２８】
また、比較値に基づいてしきい値を変更することができる。従って、本発明による方法は、繰り返しまたは適応性アルゴリズムによって強化することができる。
【００２９】
しきい値は、例えば専門家によって決定された外部パラメータによる影響を受けてもよい。
【００３０】
本発明の別の特徴によれば、比較値が正であるサンプルの任意の領域が対象領域として見なされる。これは、対象領域を非対象領域と区別する単純な方法を提供する。
【００３１】
サンプルの対象領域の幾何学形状が決定され、更に他の処理と分析のために記憶されると有利である。幾何学形状は、例えば事前設定された幾何学的本体との重ね合せによって、または例えば重心、最大膨張、最小膨張、主膨張方向などの特徴を記憶することによって分類することができる。従って、これらの幾何学形状を後で示し、後の研究に使用することができる。
【００３２】
サンプルのデータセットにおいて、対象領域の外側にあるサンプルの領域を消去するか他の方法で選択的に描写することができる。その結果、対象外のサンプル部分に関する研究の実行が防止される。
【００３３】
対象領域の外側にあるサンプルの領域を切断することもでき、具体的には切断にレーザを使用することができる。
【００３４】
サンプルの品質を評価できるように、サンプルの対象領域のサイズを決定することができる。更に、得られたサイズに基づいて、後の研究のための判断を容易にすることができる。
【００３５】
この場合、サンプルの全表面積に対する対象領域の大きさの比を作成し、サンプルの固有識別と共に記憶することができる。この比は、サンプルの対象領域の割合の大きさに関する情報を提供する。
【００３６】
最終的に、自動的な方法で、サンプルの全表面積に対する対象領域の大きさの比が事前設定された境界値よりも低いサンプルが、使用不可として見なされる。その結果、対象領域の比が小さすぎるサンプルを自動的に除去することができる。
【００３７】
自動分析のために、他のソースから送出された追加のデータセットを使用することができる。これらのデータセットから、対象領域を決定する少なくとも１つの追加のパラメータを選択することができる。そのような追加のデータセットは、例えば、追加の有利な情報を含むサンプルの有色の顕微鏡画像でよい。サンプルの自動分析は、更に、例えば蛍光放射から得られたデータセットと顕微鏡データセットの重ね合せによって強化することができる。
【００３８】
分析をできる限り迅速に行なうことができるようにするため、いくつかのサンプルが自動的に連続または並列に処理され、サンプルの対象領域の得られたデータは、サンプルの識別と共に記憶されることが好ましい。従って、早ければサンプルを作製した後で、サンプルの対象領域のデータを収集し記憶することができる。次に、これらのデータは、後の特定の研究のためのサンプルの選択に利用可能である。
【００３９】
本発明による第２の目的は、また、生体サンプル、具体的には組織サンプルを自動分析する前述の装置によって達成され、サンプルのデータセットを作成するためにサンプルを走査する装置が設けられ、それにより、サンプルを非破壊式に走査するように設計された走査装置は、データセットから少なくとも１つのパラメータを選択し且つこのパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータもしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値と比較するコンピュータユニットに接続され、また比較値から決定されたサンプルの対象領域を表示する装置と、この領域をサンプルの固有識別と共に記憶するメモリとが設けられる。記録装置は、少なくとも１つの光源と１台のカメラまたは検出器によって構成される。自己蛍光の場合、対応する光源で刺激されたサンプルの蛍光放射をデータセットとして記録する蛍光スキャナまたは蛍光顕微鏡が使用される。従って、本発明により生体サンプルを自動分析する装置は、通常、少なくとも１つの光源と１台のカメラまたは検出器から構成された走査装置に接続され、対応して、得られた情報を処理するコンピュータユニットからなる。
【００４０】
光源は、例えば、レーザ、紫外線ランプまたはこれらの組み合わせによって構成することができる。
【００４１】
異なる波長範囲のいくつかの光源が設けられてもよく、あるいは極めて幅広い波長範囲の光を放射する１つの光源が設けられてもよい。
【００４２】
走査装置は、例えば顕微鏡および／またはスキャナを含む。
【００４３】
更に、サンプルのデータセットを少なくとも１つのバイナリデータセットに変換する装置が設けられてもよい。
【００４４】
データの妥当性を高めるために、サンプルのデータセットをフィルタリングするフィルタ装置を設けることができる。既に前述したように、この場合、フィルタ装置は、記録装置の前にハードウェアとして配置されるフィルタでもよいが、得られるデータのソフトウェア調整を試みるフィルタでもよい。
【００４５】
更に、追加のデータセットを作成するためにサンプルを記録する顕微鏡を設けることができる。
【００４６】
できる限り高速の分析を可能にするために、サンプルを自動的に供給し排出するための装置が設けられてもよい。
【００４７】
また、複数のサンプルを収容するマガジンが設けられてもよく、サンプルは、分析のためにマガジンから自動的に取り出され再び戻される。従って、サンプルの高速自動分析を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下では、添付図面に基づいて本発明を詳細に説明する。
【００４９】
図１は、生体サンプル１の自動分析方法の概略を示すブロック図である。生体サンプル１は、例えば、ミクロトームを利用して作製され組織学的に研究される臓器などの切片でよい。例えば、サンプル１は、ほとんどの場合ガラスサポート２に付着され、例えばバーコードの形の固有識別ＩＤを有する。ほとんどの場合、サンプル１の領域全体のうちの一部分しか有用な情報を含まない。例えば、ほとんどの場合、例えば肝臓などの特定の臓器から切除された組織切片の領域は対象となるが、周囲の脂肪組織または結合組織は対象ではない。通常、対象領域、いわゆる（ＲＯＩ）は、適切な専門家によって手作業で決定される。この場合、支援の役割で着色法が使用されることがあるが、これにより、サンプル１が影響を受け、その後の多くの研究には利用できなくなる。このため、１つの目標は、対象領域ＲＯＩを自動的に判定することができるようにサンプル１を自動的に分析することである。その結果、サンプル１に関するその後の研究に特に重要な情報が利用可能になる。サンプル１を破壊せず且つサンプル１に影響を及ぼさないように、サンプル１は、対応する装置３によって非破壊式に走査され、サンプル１の少なくとも１つのデータセット４が作成される。次に、このデータセット４から少なくとも１つのパラメータＰが選択され、このパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータＰもしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値Ｓと比較され、この比較値が、サンプル１の対象領域ＲＯＩを決定する基準として使用される。２つのしきい値Ｓまたは１つのしきい値Ｓの固有値を決定することによって、特定の分類に合うようにパラメータＰを拘束しなければならない間隔も、しきい値Ｓによって決定することができる。対応する計算の結果、すなわち、対象領域ＲＯＩつまりサンプル１の対象領域ＲＯＩの提案が明らかにされる。次に、サンプル１の固有識別ＩＤと共にサンプル１の決定された対象領域ＲＯＩを含むデータセット５が作成される。このデータセット５は、サンプル１と共に重要なユニットを構成し、これによりサンプル１に関するその後の研究をより迅速且つ効率的に行うことができる。また、本発明による方法は、各サンプル１をより迅速に識別するために、対象領域ＲＯＩがないか、または小さすぎる対象領域ＲＯＩを有する生体サンプル１の自動分析に使用される。従って、不適切なサンプル１に関する高コストな研究を省略することができ、またサンプル１を手作業で分類するための時間を節約することができる。
【００５０】
サンプル１から追加のデータセット６も作成することができ、このデータセット６から、対象領域ＲＯＩを決定するために使用される更に他のパラメータＰ’を選択することができる。そのようなデータセット６は、例えば、サンプル１の顕微鏡画像でよいが、サンプル１に関して例えば特定の着色法によって作成されるデータでもよい。これにより、サンプル１の自動分析を加速または強化する重要な追加情報が作成される。
【００５１】
そのような追加のデータセット６の他に、専門家の知識から実証されたデータセット７を使用することもできる。例えば、以前の研究から確認することができるようなデータセット７における様々なタイプのサンプル１に関する特定の仮説を収集することができる。これらのデータセット７は、サンプル１の対象領域ＲＯＩを計算し決定するために使用することができる追加のパラメータＰ’’を提供することができる。
【００５２】
図に破線で示したように、最適な結果になるまで変更されるデータセット４、６、７のパラメータによって、サンプル１の対象領域ＲＯＩを繰り返し決定することもできる。
【００５３】
最終的に、サンプル１の対象領域ＲＯＩの結果を受け取った後、対象領域ＲＯＩの外側にあるサンプル１のどの領域も除去することができる。このとき、自動的に決定された対象領域ＲＯＩとサンプル１の固有識別だけからなるサンプル１の組織標本８が得られる。従って、サンプル１の関心のない領域に複雑で高コストの研究が行われることが防止される。
【００５４】
図２は、本発明による生体サンプル１を自動分析する方法を更に説明するための流れ図である。ブロック１００に従ってサンプル１から始まり、この対応するブロック１０１は、非破壊式に走査される。この場合、非破壊走査は、自己蛍光放射を利用する光学的方法によって実行される。サンプル１を走査した後で、データセット（ブロック１０２）が作成され、このデータセットは、更にフィルタリングまたは変換することができる（ブロック１０３）。ブロック１０４により、データセットから少なくとも１つのパラメータＰが選択され、対応するブロック１０５は、少なくとも１つのしきい値Ｓを決定する。ブロック１０６により、少なくとも１つのパラメータＰもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータＰもしくはそのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値Ｓと比較されて、比較値からサンプル１の対象領域ＲＯＩ（１つ、または複数）が決定される（ブロック１０７）。決定された対象領域ＲＯＩは、サンプル１の識別ＩＤと共に記憶され（ブロック１０８）、いずれの場合も図で示される（ブロック１０９）。ブロック１０７に対応する対象領域ＲＯＩの決定前に、ブロック１１０により、特定の基準に基づいて結果が容易に出るかどうかに関して照会することができる。結果が容易に出る場合、ブロック１０７に対応するサンプル１の決定された対象領域ＲＯＩが決定される。しかしながら、結果が容易に出ない場合、ブロック１１１により少なくとも１つのしきい値Ｓを変更し適合させることができ、ブロック１１２により少なくとも１つのパラメータＰを変更し適合させることができ、またサンプル１の対象領域（ＲＯＩ）を決定することができる。このループは、照会１１０に対応する結果に満足でき、従ってブロック１０７によりサンプル１の対象領域ＲＯＩが決定されるまで繰り返されることが多い。
【００５５】
サンプル１００に関して、ブロック１１３に対応する追加の分析を実行することができ、対応するデータセットを形成することができ（ブロック１１４）、いずれの場合も前処理することができる（ブロック１１５）。従って、決定されたデータは、ブロック１０４によりパラメータを選択するために使用することができる。また、ブロック１０４によりパラメータを選択するためのブロック１１６に対応する専門家による手動調整ならびに知識データベースからのデータ（ブロック１１７）を使用することができ、生物学的方法１の自動分析の結果が強化される。
【００５６】
図３は、２５個の個別サンプル９で構成される組織サンプルアレイ（ＴＭＡ）の形のサンプル１の画像の平面図を示す。サンプル１は、特定の標的組織（例えば、肝臓）の組織切片である。個別サンプル９’には、例えば、標的組織や組織の固有の着色反応がなく、従って対象領域ＲＯＩがない。個別サンプル９’’では、表面全体の約５０％が標的組織で覆われているか、反応を有する。個別サンプル９’’’は、また、強い固有の反応を示す約５０％の標的組織を有する。最後に、ほとんどの部分の個別サンプル９’’’’は、固有の反応を弱くしか示さない標的組織を示す。図は、通常時間のかかる手動走査で分析しなければならない様々な異なるサンプルを示す。
【００５７】
図４は、対象領域ＲＯＩの様々な構成とこのように様々なサイズを有する様々なサンプル１の自己蛍光画像の３つの図表を示す。この場合、これらは、実測結果の図表である。
【００５８】
最後に、図５は、手作業で決定された対象領域ＲＯＩが決定され識別された少数の組織サンプル１を示す。対象領域ＲＯＩは、例えば癌組織であり、これと逆に、対象領域ＲＯＩの外側の無関係の領域は、脂肪組織や結合組織などである。
【００５９】
最後に、図６は、生体サンプル１を自動分析するための可能な装置１０のブロック図を示す。装置１０は、サンプル１の非破壊走査ユニット１１を有する。走査ユニット１１は、サンプル１に関する情報を含むデータベース１２に接続することができる。走査ユニット１１は、少なくとも１つの光源１３、好ましくはレーザと、サンプル１の画像を記録するための装置１４とによって構成される。追加情報のために、サンプル１の画像を記録して追加のデータセットを作成するために顕微鏡１５を配置することができる。走査ユニット１１は、コンピュータユニット１６に接続され、コンピュータユニット１６は、これ対応して、走査されたサンプル１のデータを処理する。コンピュータユニット１６では、少なくとも１つのパラメータＰが、サンプル１のデータセットから選択され、このパラメータＰもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータＰもしくはそのパラメータから導出された値の組み合わせが、少なくとも１つのしきい値Ｓと比較され、比較値が、サンプル１の対象領域ＲＯＩを決定する基準として使用される。これらの対象領域ＲＯＩは、表示装置１７（例えば、画面）に示され、サンプル１の識別ＩＤと共にメモリ１８に記憶される。この方法をより効率的に実行するために、サンプル１を自動的に供給し排出する装置１９を設けることができ、この装置１９は、対応するストック２１から取り出されたいくつかのサンプル１を収容するマガジン２０に接続されることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明による方法を示すための概略ブロック図である。
【図２】生体サンプルを自動分析する方法を示す流れ図である。
【図３】いくつかの個別サンプルを含む組織サンプルの図である。
【図４】様々な割合の対象領域を有する様々な組織サンプルを例示する図である。
【図５】様々な組織サンプルの平面図である。
【図６】生体サンプルを自動分析する装置の実施形態のブロック図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月28日(2007.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル（１）を光で刺激し、サンプル（１）の得られた蛍光放射の画像をサンプル（１）のデータセット（４）として記録し記憶することにより、生体サンプル（１）、具体的には組織サンプルを自動分析する方法であって、
サンプル（１）の記憶されたデータセット（４）から少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）を選択し、このパラメータもしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータ（Ｐ）もしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値（Ｓ）と比較し、比較値（Ｖ）を、サンプル（１）の対象領域（ＲＯＩ）を決定する基準として使用し、サンプル（１）の固有識別（ＩＤ）と共に記憶し、サンプル（１）は、非破壊式に走査され、それにより後の検査に好適なままである、方法。
【請求項２】
サンプル（１）は、レーザ光で刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプル（１）の得られた蛍光放射の画像は、フィルタリングされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル（１）は、異なる波長の合成光で刺激される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル（１）のデータセット（４）は、例えばＴＩＦＦ形式やＪＰＧ形式などの標準形式で記憶される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル（１）のデータセット（４）は、少なくとも１つのバイナリデータセットに変換される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
パラメータ（Ｐ）として、蛍光パラメータ、具体的には蛍光強度が使用される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのしきい値（Ｓ）は、少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）から導出される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
しきい値（Ｓ）は、サンプル（１）のタイプに基づいて選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
しきい値（Ｓ）は、比較値（Ｖ）に基づいて変更される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
しきい値（Ｓ）は、外部パラメータ（Ｐ’’）による影響を受ける、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
比較値が正であるサンプル（１）の任意の領域が対象領域（ＲＯＩ）と見なされる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
対象領域（ＲＯＩ）の幾何学形状が決定され、更に他の処理と分析のために記憶される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル（１）の得られたデータセット（５）において、サンプル（１）の対象領域（ＲＯＩ）の外側にある領域は、消去されるかまたは他の方法で選択的に示される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象領域（ＲＯＩ）の外側にあるサンプル（１）の領域は切り取られる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル（１）の対象領域（ＲＯＩ）のサイズが決定される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル（１）の全表面積に対する対象領域（ＲＯＩ）の大きさの比が作成され、サンプル（１）の固有識別（ＩＤ）と共に記憶される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル（１）の全表面積に対する対象領域（ＲＯＩ）の大きさの比が事前設定された境界値より小さいサンプル（１）は使用不能と見なされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのパラメータ（Ｐ’’，Ｐ’’’）は、サンプル（１）の少なくとも１つの追加のデータセット（６，７）に基づいて選択される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
いくつかのサンプル（１）は、自動的に連続または並列に処理され、サンプル（１）の識別された対象領域（ＲＯＩ）に関して得られたデータが記憶される、請求項１から１９項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの光源（１３）と、サンプル（１）のデータセット（４）を形成するためにサンプル（１）を走査するカメラまたは検出器とによって構成された装置（１１）を含み、生体サンプル（１）、具体的には組織サンプルを自動分析する装置（１０）であって、
サンプル（１）を非破壊式に検査するように設計された走査装置（１１）は、データセット（４）から少なくとも１つのパラメータ（Ｐ）を選択し、このパラメータ（Ｐ）もしくはこのパラメータから導出された値またはパラメータ（Ｐ）もしくはこのパラメータから導出された値の組み合わせを少なくとも１つのしきい値と比較するコンピュータユニット（１６）に接続され、
サンプル（１）の比較値から決定された対象領域（ＲＯＩ）を表示する装置（１７）と、この領域（ＲＯＩ）をサンプル（１）の固有識別（ＩＤ）と共に記憶するメモリ（１８）とが設けられた、装置（１０）。
【請求項２２】
少なくとも１つの光源（１３）は、レーザによって構成された、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
少なくとも１つの光源（１３）は、紫外線ランプによって構成された、請求項２１または２２に記載の装置。
【請求項２４】
いくつかの光源（１３）は、異なる波長範囲で提供される、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
走査装置（１１）は、顕微鏡を含む、請求項２１から２４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
走査装置（１１）は、スキャナを含む、請求項２１から２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
サンプル（１）のデータセット（４）を少なくとも１つのバイナリデータセットに変換する装置が設けられた、請求項２１から２６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２８】
サンプル（１）のデータセット（４）をフィルタリングするフィルタ装置が設けられた、請求項２１から２７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
追加のデータセット（６）を作成するためにサンプル（１）を記録する顕微鏡（１５）が設けられた、請求項２１から２８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３０】
サンプル（１）を自動的に供給し排出する装置（１９）が設けられた、請求項２１から２９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３１】
いくつかのサンプル（１）を収容するためのマガジン（２０）が設けられ、そのマガジンから、サンプル（１）が、分析のために自動化された方式で取り出され再び戻される、請求項２１から３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３２】
蛍光強度として、サンプル（１）の自己蛍光強度が使用される、請求項７に記載の方法。
【国際調査報告】
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2009517665.tif 000013
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