(57)【要約】  本発明は、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を産生する組換え大腸菌宿主細胞を提供する。宿主細胞は、大腸菌の染色体、および組換え染色体外ベクターの少なくとも１つのコピーを含み、組換え染色体外ベクターは、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素をコードし、宿主細胞の染色体もまた、同じＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素をコードし、宿主染色体は、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩの他のイソ型のいずれもコードしない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌の染色体および組換え染色体外ベクターの少なくとも１つのコピーを含んでなる、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を産生するための組換え大腸菌宿主細胞であって、
前記組換え染色体外ベクターが、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットをコードし、
前記宿主細胞の染色体もまた、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素の同じサブユニットをコードし、
前記宿主染色体が、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩの他のいずれのイソ型もコードしないことを特徴とする、
組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項２】
前記染色体外ベクターが、プラスミドであることを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項３】
前記コード化Ｌ−アスパラギナーゼＩＩのサブユニットが、配列番号１を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項４】
前記組換え染色体外ベクターが、好適なプロモーターに機能的に連結されているＬ−アスパラギナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項５】
前記プロモーターが、Ｔ７、ａｒａＢ、ＰR／ＰL、ｐｈｏＡ、ｔｒｃ、およびｔｒｐプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項６】
前記組換え染色体外ベクターが、オペレーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、転写ターミネーター、抗生物質選択マーカー、複製の起点、およびレプレッサーの制御コピーをさらに含んでなることを特徴とする請求項４に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項７】
前記Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質ＩＩのサブユニットをコードするＤＮＡ分子が、配列番号２を含んでなることを特徴とする請求項４に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項８】
前記染色体が、配列番号３に従ったＤＮＡ分子を含んでなることを特徴とする請求項４に記載の組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項９】
配列番号２および配列番号３に従った核酸分子からなる群より選択される配列番号１のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットをコードすることを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号２である請求項９に記載の核酸を含んでなることを特徴とする染色体外ベクター。
【請求項１１】
プラスミドであることを特徴とする請求項１０に記載の染色体外ベクター。
【請求項１２】
プラスミドｐＥＮ５３７であることを特徴とする請求項１１に記載の染色体外ベクター。
【請求項１３】
ＥＮ５３８と指定され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ７４９０として寄託されていることを特徴とする請求項１２に記載のプラスミドを含んでなる大腸菌宿主細胞。
【請求項１４】
組換えＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素の産生方法であって、
請求項１３に記載の宿主細胞を培養し、
産生されたＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を単離する、
各工程を有してなり、
他のＬ−アスパラギナーゼＩＩ異性体が実質的に存在しないことを特徴とする、
産生方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を含んでなることを特徴とするポリアルキレンオキシド複合体。
【請求項１６】
請求項１４に記載のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を有効量で投与する工程を有してなる、
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素反応性の疾患または障害を有する患者を治療する方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリアルキレンオキシド複合化Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を有効量で投与する工程を有してなる、
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素反応性の疾患または障害を有する患者を治療する方法。
【請求項１８】
配列番号２を含んでなるＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットをコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１９】
配列番号１の同一のサブユニットを有する四量体酵素を含んでなることを特徴とする単離された組換えタンパク質分子。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００６年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／８１７，８１７号明細書の利益を主張しており、全体を参照することにより、その内容を本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、均一な純度の特異的な組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を産生する、新規のベクター、宿主細胞および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｌ−アスパラギナーゼは、アミノ酸Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン酸とアンモニアとに加水分解する酵素であり、すなわち、それは脱アミノ化酵素である。大腸菌は、２種のアスパラギナーゼイソ酵素：Ｌ−アスパラギナーゼＩおよびＬ−アスパラギナーゼＩＩを含有する。Ｌ−アスパラギナーゼＩは、サイトゾルに位置し、アスパラギンに対して低親和性を有する。Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、ペリプラズムに位置し、Ｌ−アスパラギンに対して高親和性を有する。
【０００４】
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、細胞外アスパラギンを除去することにより、タンパク質合成をＬ−アスパラギンに依存する腫瘍または癌を治療するのに有用である。Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、急性リンパ性白血病などの白血病を治療するのに特に有用である。Ｌ−アスパラギナーゼは、特定の臨床的症状において単独で使用することができるが、一般には、他の抗腫瘍療法または抗癌療法と併用される。Ｌ−アスパラギナーゼは当初、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（「Ｅ．ｃｏｌｉ」））およびエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）など、数種の有機体から精製された。Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、哺乳動物の中でも、モルモット（テンジクネズミ上科（Ｃａｖｉｏｉｄｅａ））および特定の新世界サルにのみ、微量よりも多い量で見出されている。
【０００５】
大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、優れたｋcatおよびＫmを示す同一のサブユニットの四量体である。大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ（Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラーゼ、タイプＥＣ−２、ＥＣ３．５．１．１としても当該技術分野で知られている）は、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）（メルク社（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．））として市販されており、また、協和発酵工業株式会社（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）からも入手できる。
【０００６】
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩはそれ自体により、患者にとって異質なタンパク質の高いクリアランス率、およびこの酵素で治療を受けた患者に免疫応答を誘導する可能性など、タンパク質療法の通常の不利益を受ける。これらの欠点に対処するために、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩのポリエチレングリコール複合化誘導体が開発され、エンゾン・ファーマシューティカルズ社（Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）によりペガスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）またはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）として市販されている。ペガスパルガーゼは、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社により供給される、大腸菌から抽出されたＬ−アスパラギナーゼＩＩを用いて産生される。ペガスパルガーゼ（モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルＬ−アスパラギナーゼとしても知られている）は、実質的に非抗原性であり、循環系からのクリアランス率の減少を示すという利点を有する。
【０００７】
しかしながら、これらの成功にもかかわらず、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩタンパク質が、好適な染色体外発現ベクター、例えば、プラスミドを使用して組換え宿主細胞により産生され得る場合は、さらにより効率的かつ経済的であると考えられる。このような発現ベクターは、天然の大腸菌株からの産生により入手可能なものよりも効率的にタンパク質を産生するように設計することができる。このような組換え産生の利点の可能性にもかかわらず、現在まで、商業的Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素に関して正確なポリペプチド配列が公表されておらず、その酵素をコードするポリヌクレオチドに関する核酸配列もまた公表されてないと考えられる。例えば、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩのペプチド配列は、以前に非特許文献１、および非特許文献２により報告された。しかしながら、下記に検討されるように、この初期の研究では、配列決定について多くの誤りがあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】マイタ（Ｍａｉｔａ）ら、１９８０年、Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６１（２）、１０５−１１７頁
【非特許文献２】マイタ（Ｍａｉｔａ）ら、１９７４年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６、１３５１−１３５４頁［Ｔｏｋｙｏ］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットのプラスミド発現に対して障害となる別の可能性は、宿主細胞として使用される可能性のある大腸菌株の染色体に特有のＬ−アスパラギナーゼＩＩサブユニットをコードする遺伝子の存在である。したがって、染色体外発現ベクターを保持する大腸菌宿主細胞から回収されたＬ−アスパラギナーゼＩＩは、Ｌ−アスパラギナーゼの２種以上のイソ型を表すサブユニットを含み得るという懸念がある。十分に特性化された酵素産物でなければならないことを考えると、臨床目的および制御目的の双方にとって、この可能性は、今まで、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩタンパク質の産生効率改善に対する重大な技術的な課題となっていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、組換え形態で効率的かつ経済的に産生される大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩに必要とされる上記の要求を満たし、一方では、検出できる量の別のＬ−アスパラギナーゼＩＩのイソ型もまた存在せず、「Ｏｎｃａｓｐａｒ」として市販されている大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩと同じペプチド構造を有する酵素産物を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、大腸菌の染色体および組換え染色体外ベクターの少なくとも１つのコピーを含んでなる大腸菌宿主細胞を提供し、ここで、染色体外ベクターは、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩタンパク質のサブユニットをコードし、大腸菌宿主細胞の染色体は、Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質の同じサブユニットをコードし、大腸菌宿主の染色体は、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩの他のいずれのイソ型もコードしない。染色体外ベクターは、大腸菌における複製および発現に好適なプラスミドであることが好ましい。
【００１２】
発現されたＬ−アスパラギナーゼタンパク質は、「Ｏｎｃａｓｐａｒ」を製造するのに用いられたＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットの配列に相当する配列番号１に従ったポリペプチド配列を有する４つのサブユニットを含んでなり、プラスミドベクターは、好適なプロモーターに機能的に連結されるＬ−アスパラギナーゼタンパク質のサブユニットをコードする核酸分子を含んでなることが好ましい。プロモーターは、任意の好適なプロモーターであるが、場合によってはＴ７、ａｒａＢ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、λＰＬ、λＰＲ、ａｒｏＨおよびｐｈｏＡのプロモーターからなる群より選択される。プラスミドベクターは、随意的に、効率的発現および／または産物精製の必要に応じて、Ｌ−アスパラギナーゼのオープンリーディングフレームおよび／またはプロモーターに機能的に連結される、さらなるベクター要素を含む。これらのベクター要素としては、例えば、適合性オペレーター配列、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、シグナル配列、薬物耐性マーカー、および複製の起点が挙げられる。関連するレプレッサー遺伝子、例えば、ｌａｃＩのプラスミド由来のコピーもまた存在し得る。
【００１３】
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩタンパク質のサブユニットをコードするプラスミドＤＮＡ分子は、配列番号２を含んでなり、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩタンパク質をコードする染色体ＤＮＡ分子は、配列番号３を含んでなることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＥＮ５３７プラスミドベクターのマップを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
したがって、「Ｏｎｃａｓｐａｒ」に対応するＬ−アスパラギナーゼＩＩおよび協和発酵のＬ−アスパラギナーゼの産生における所望の改良を提供するために、酵素をコードするベクターを得ること、また、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩの単一のイソ型のみを発現する宿主細胞を提供することが必要である。したがって、メルク社からのＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素、ならびに協和発酵工業株式会社から入手したＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素の配列を決定し、得られた配列を、参照することにより本明細書に援用される、ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、１９９０年、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７２：１４９１−１４９８頁により報告されている大腸菌Ｋ−１２から得られたＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素の配列と比較した。Ｋ１２Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素は、ａｎｓＢ遺伝子（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎｅＢａｎｋ番号Ｍ３４２７７）にコードされている。
【００１６】
上記のとおり、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素が４つの同一サブユニットを含んでなることは、当業者に認識されよう。したがって、この酵素をコードする遺伝子またはＤＮＡ分子およびこの酵素タンパク質配列への言及は、これら同一のサブユニットの１つをコードする遺伝子のことを指している。
【００１７】
ペプチドの配列決定は、下記の実施例１に要約されるように、当該技術分野における標準的方法により実施された。メルク社および協和発酵工業株式会社双方のサブユニットのタンパク質配列は、意外にも、同一であることが判明した（配列番号１を参照）。このデータにより、非特許文献１および非特許文献２によるメルク社のＬ−アスパラギナーゼ配列についての以前の報告が、実際に多くの誤りを含んでいたことを、今現在、認識することができる。
【００１８】
得られた配列についても、Ｋ１２Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニット構造と比較した。Ｋ１２Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットは、４つの特異的な残基位置においてメルク社のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットとは異なることが判明した。メルク社のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素と比較して、Ｋ１２酵素のサブユニットは、Ａｌａ27の代わりにＶａｌ27、Ａｓｐ64の代わりにＡｓｎ64、Ｔｈｒ252の代わりにＳｅｒ252およびＡｓｎ263の代わりにＴｈｒ263を有する。
【００１９】
前述のように、大腸菌の宿主細胞の染色体は、染色体外ベクター、すなわちプラスミドによって発現されるＬ−アスパラギナーゼＩＩのイソ型と異なるイソ型を発現しないことが好ましい。この望ましい結果は、幾つかの別法のうちの１つにより達成することができる。例えば、大腸菌の宿主染色体上に存在するＬ−アスパラギナーゼＩＩ遺伝子を、完全にまたは部分的に欠失させるか、またはノックアウトすることができよう。あるいは、染色体外ベクターにコードされたＬ−アスパラギナーゼＩＩのイソ型の発現に好都合な同じ培養条件下で発現させない、天然プロモーターの固有の制御特性によって、宿主染色体上に存在する別のＬ−アスパラギナーゼＩＩ遺伝子発現を抑制し得る。しかしながら、染色体および染色体外のＬ−アスパラギナーゼＩＩ遺伝子は、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素の同じイソ型を発現することが好ましい。
【００２０】
この目的のため、幾つか利用できる大腸菌株により産生されたＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットの配列を決定し、市販の酵素製品と比較した。大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株［ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製；カタログ番号６９２０８−３］は、予想外にも市販の酵素と構造が同一の、染色体にコードされたＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素を産生することが判明したが、一方、試験に供された大腸菌ＧＸ１２１０株および大腸菌ＧＸ６７１２株は、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素の異なるイソ型を産生することが判明した。
【００２１】
好ましい大腸菌宿主の同定により、染色体外発現ベクター、すなわち染色体外に独立して存在するベクターであって、その複製が染色体の複製とは独立しているものを構築することができる。大腸菌での使用に好適な染色体外ベクターとしては、例えば、ｐＵＣまたはｐＢＲ３２２由来のプラスミドが挙げられる。これらには、ｐＥＴおよびｐＢＡＤなどのプラスミド、ならびにＴ７、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｔｒｃ、ＯＬ、ＯＲ、ＰＬ、ＰＲからの発現要素を有する種々のプラスミドを含む。
【００２２】
ベクターにおいて、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットをコードする核酸配列は、好適なプロモーター配列に機能的に連結される。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｔｒｃ、ＯＬ、ＯＲ、ＰＬおよびＰＲプロモーターが挙げられる。プロモーターは、Ｔ７ウィルスプロモーターであることが好ましい。
【００２３】
好適な誘導因子要素としては、例えば、アラビノース、乳糖、または加熱誘導、ホスフェート制限、トリプトファン制限が挙げられる。誘導因子要素は、イソプロピルチオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）により誘導できるＬａｃオペロンであることが好ましい。
【００２４】
好適なシグナル配列（シグナルペプチド）は、ｐｅｌＢ、ｆｄ  ｐＩＩＩ、またはｏｍｐＡから誘導することができる。シグナルペプチドは、ａｎｓＢから誘導されることが好ましい。
【００２５】
当該技術分野において周知である好適な抗生物質選択マーカーとしては、特に、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、リファンピシン、またはテトラサイクリン耐性のものが挙げられる。
【００２６】
好適な複製配列の起点としては、以下のプラスミド：ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、およびｐＳＣ１０１に見られるものが挙げられる。
【００２７】
好適な終結配列としては、例えば、ファージｆｄ主要ターミネーター、ＴΦ、およびｒｒｎＢが挙げられる。
【００２８】
一般に、大腸菌に使用するためのプラスミドが好ましい。従来のプラスミドベクターは、外因性ＤＮＡ配列、抗生物質選択性遺伝子、宿主細胞における自律的増殖のための複製起点、および組換え挿入ＤＮＡを含有するクローンの識別または選択のための遺伝子を挿入するために好適な酵素認識部位により操作された二本鎖環状ＤＮＡ分子であることが好ましい。利用できるプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＥＴ３、ｐＥＴ９、ｐＥＴ１１および拡張ｐＥＴシリーズ（ノバゲン社によりカタログに掲載）、ｐＢＡＤ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ、ｔｒｐ、およびＯL／R／ＰL／Rプラスミドが挙げられる。
【００２９】
下記に例示されるように、ｐＥＴ２７ｂ＋などのｐＥＴ発現系のプラスミドが好ましい。酵素の効率的かつ制御された発現を提供するために、発現ベクターとしては、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、転写ターミネーター、複製起点、レプレッサー遺伝子（例えば、ｌａｃＩ）の制御されたコピーもまた挙げられる。
【００３０】
宿主大腸菌株は、その染色体において適合性のある制御要素を有する。例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに関する遺伝子は、ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞に存在する。この株は、バクテリオファージＤＥ３のリソゲンである。ＢＬＲ（ＤＥ３）の培養物へのＩＰＴＧの添加により、Ｔ７  ＲＮＡポリメラ−ゼが誘導され、次にｐＥＴプラスミド上に標的遺伝子が転写される。ＢＬＲ（ＤＥ３）はまた、染色体外プラスミド上の遺伝子の安定性をさらに提供することができるｒｅｃＡ−である。
【００３１】
メルク社および協和発酵工業株式会社の酵素をコードする核酸分子を得るために、入手できるＬ−アスパラギナーゼＩＩを、好適な方法により修飾することができる。大腸菌Ｋ−１２  ａｎｓＢの３２６成熟アミノ酸配列のＬ−アスパラギナーゼＩＩのサブユニットは、ジェニングス  ＭＰ（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ＭＰ）およびビーチャム  ＩＲ（Ｂｅｅｃｈａｍ  ＩＲ）により報告された（１９９０年、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７２：１４９１−１４９８頁；ＧｅｎｅＢａｎｋ番号Ｍ３４２７７）９７８塩基対セグメントにおいてコードされる。成熟タンパク質の前の２２のアミノ酸シグナルペプチドを含むａｎｓＢ遺伝子は、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって別の大腸菌Ｋ−１２株（ＧＸ１２１０；ジェネックス社（Ｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手）からクローン化された。大腸菌Ｋ−１２  ａｎｓＢのＬ−アスパラギナーゼＩＩのサブユニットをコードするａｎｓＢ遺伝子を、部位特異的変異誘発（例えば、アマシャムスクルプター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｃｕｌｐｔｏｒ）法を用いて）により採用し、上記に検討された残基置換によりＬ−アスパラギナーゼＩＩを発現して以下の塩基置換：塩基５３０におけるＴからＣ；塩基６４０におけるＡからＧ；塩基１２０５におけるＴからＡ；および塩基１２３９におけるＣからＡ、を作製した。ナンバリングは、参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎｅＢａｎｋ番号Ｍ３４２７７により得られたものに基づいている。生じたコドン変化［対応する位置においてＧＴＧからＧＣＧ；ＡＡＴからＧＡＴ；ＴＣＴからＡＣＴおよびＡＣＣからＡＡＣ］により、ａｎｓＢ遺伝子を、メルク社および協和発酵工業株式会社から入手されたものと同一のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のサブユニットを発現する修飾遺伝子（以後ａｎｓＢ*；配列番号２）に変換した。
【００３２】
ａｎｓＢ*遺伝子は、上記に検討された大腸菌における効率的なタンパク質発現に好適な任意の染色体外ベクターに挿入することができる。下記に提供された実施例により詳述されるように、特にａｎｓＢ＊遺伝子を、プラスミドｐＥＴ−２７ｂ＋（ノバゲン社）に挿入し、電気穿孔法により大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）に導入して、ａｎｓＢ＊プラスミドを担持し、メルク社のＬ−アスパラギナーゼＩＩに合致する均一なイソ型としてＬ−アスパラギナーゼＩＩのサブユニットを発現する大腸菌を提供した。
【００３３】
株ＥＮ５３８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ７４９０として寄託された）として実施例により同定されたクローンを使用することが好ましく、大腸菌に好適な任意の当該技術分野に公知の方法を使用して培養する。好適な培養系としては、バッチ、フェドバッチおよび連続培養法が挙げられる。培養培地は、大腸菌に最適化された当該技術分野に公知の培地から選択される。培養物が、約２０ＯＤ660から約２００ＯＤ660の範囲で十分な密度に達したら、ＩＰＴＧなどの適切な誘導因子を培養培地に加える。約０．５時間から約２０時間の範囲の十分な時間後、培養培地および／または培養物から回収された細胞塊から標準的な方法により、産生されたＬ−アスパラギナーゼＩＩを精製する。
【００３４】
この細胞塊は、遠心分離および／またはろ過により回収し、当該技術分野に公知の任意の方法により溶解する。細胞体の溶解は、酵素的細胞壁溶解に次いで浸透圧溶解、凍結融解、音波処理、機械的破壊（例えば、ミクロ流動化）、溶解剤の使用などを含む方法によって達成することができ、次にろ過および／または遠心分離して溶解性タンパク質の内容物から破壊された細胞塊を分離する。数サイクルの溶解、洗浄および分離を用いて、回収を最適化できる。
【００３５】
次に酵素を回収して、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、等電点クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ＦＰＬＣ（登録商標）（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）、高性能液体クロマトグラフィーなどの周知の精製法によって、上澄液および／または培養培地から精製することができる。
【００３６】
発酵工程の幾つかのパラメータにより、アスパラギナーゼ発現を最適化するか、またはペリプラズムから増殖培地へのタンパク質の漏出程度を制御するために調整することができる。これらの変数としては、培地構成物（例えば、炭素源および窒素源、ならびに添加アミノ酸または他の栄養物）、温度、ｐＨ、誘導因子濃度、および発現時間が挙げられる。大腸菌の全遺伝子系列（遺伝子型）もまた、発現および産物漏出に影響を及ぼし得る。タンパク質発現および宿主細胞からの漏出結果に依って、細胞（ペリプラズム）からのみ、または培地からのみ、または発酵槽内容物の全体からアスパラギナーゼ産物を回収することが望ましいと考えられる。
【００３７】
ポリマー−Ｌ−アスパラギナーゼ複合体
本発明により調製されたＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素に関する好ましい実用性は、ポリマー複合化酵素の形態である。本発明のＬ−アスパラギナーゼ−ポリマー複合体は、一般に式（Ｉ）：
（Ｉ）（Ｒ）z−ＮＨ−（ＡＳＮ）
に相当し、
式中、
（ＡＳＮ）は、Ｌ−アスパラギナーゼまたはその誘導体もしくは断片を表し；
ＮＨ−は、ポリマーへの結合のためにＡＳＮ、その誘導体または断片に見られるアミノ酸のアミノ基であり；
ｚは、正の整数、好ましくは約１から約８０であり；および
Ｒは、遊離性または非遊離性の形態でＡＳＮに結合される、実質的に非抗原性のポリマー残基である。
【００３８】
複合体（Ｒ）の非抗原性ポリマー残基部分は、
【化１−１】
2009542219.tif 000002
【化１−２】
2009542219.tif 000003
【００３９】
などのポリマーベース系の非限定的リストの中から選択することができ、式中：
Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23は、同じであっても異なっていてもよく、非抗原性ポリマー残基から独立して選択され；
Ｒ3〜9、Ｒ12〜21、およびＲ24（下記を参照）は、同じかまたは異なり、各々独立して水素、Ｃ1〜6アルキル類、Ｃ3〜12分枝状アルキル類、Ｃ3〜8シクロアルキル類、Ｃ1〜6置換アルキル類、Ｃ3〜8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、Ｃ1〜6ヘテロアルキル類、置換Ｃ1〜6ヘテロアルキル類、Ｃ1〜6アルコキシ、フェノキシおよびＣ1〜6ヘテロアルコキシ類の中から選択され；
Ａｒは、多置換芳香族炭化水素基または多置換複素環基を形成する芳香族部分であり；
Ｙ1〜11およびＹ13は、同じであっても異なってもよく、Ｏ、ＳおよびＮＲ24から独立して選択され；
Ａは、水素、アルキル基、標的部分、脱離基、官能基、診断剤、および生物活性部分から選択され；
Ｘは、Ｏ、ＮＱ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2であり；式中Ｑは、Ｈ、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8分枝状アルキル、Ｃ1〜8置換アルキル、アリールまたはアラルキルであり；
Ｚは、標的細胞内に能動的に輸送された部分、疎水性部分、二官能性結合部分およびそれらの組合せから選択され；
Ｌ1〜6およびＬ８は、同じであっても異なってもよく、二官能性結合基から独立して選択され；
ａ、ｃ、ｄ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｊ’、ｋ、ｌ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｔは、同じであっても異なっていてもよく、独立して０または大部分の態様において正の整数であることが好ましく；
ｂ、ｅ、ｒ、ｒ’、ｓ、ｈ、ｈ’およびｍは、同じであっても異なってもよく、独立して０または１であり；
ｍＰＥＧは、Ｈ3ＣＯ（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−および
ｕは、好ましくは約１０から約２，３００、より好ましくは、約２００から約１０００の正の整数である。
【００４０】
上記の中で、Ｙ1〜11およびＹ13はＯであり；Ｒ3〜8、Ｒ12〜21、およびＲ24は、各々独立して水素またはＣ1〜6アルキル類であり、メチルおよびエチルが最も好ましいアルキル類であり、Ｒ9は、ＣＨ3であることが好ましい。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、複合体のポリマー部分は、Ｌ−アスパラギナーゼに対して複数の結合点を与えるものであり得る。このような系の非限定的なリストとしては：
【化２】
2009542219.tif 000004
【００４２】
が挙げられ、
式中全ての変数は、上記に説明されたものと同じである。
【００４３】
Ｌ−アスパラギナーゼ複合体を作製するために使用できる活性化ポリマー類は、本来、上記のポリマー部分と直接一致する。主な違いは、Ｌ−アスパラギナーゼに見られるアミノ基に対するポリマー系の遊離性結合を促進する脱離基または活性基の存在である。したがって、化合物（ｉ）−（ｘｉｉｉ）は、ｐ−ニトロフェノキシ、チアゾリジニルチオン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
【化３】
2009542219.tif 000005
【００４４】
などの脱離基もしくは活性基、またはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジル、イミダゾリル、Ｏ−アシル尿素、ペンタフルオロフェノールまたは２，４，６−トリクロロフェノールなどの他の好適な脱離基もしくは活性基、またはＬ−アスパラギナーゼが、複合化反応後に結合する位置に見られる、当業者にとって明白である他の好適な脱離基を含む。
【００４５】
幾つかの好ましい活性化ＰＥＧ類としては、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第５，１２２，６１４号明細書、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、米国特許第５，６１２，４６０号明細書および米国特許第５，８０８，０９６号明細書に開示されたものが挙げられ、それらの内容は、参照することにより本明細書に援用されている。当業者により認識されるように、このような複合化反応を、典型的には数倍モル過剰の活性化ＰＥＧを用いた好適な緩衝液中で実施する。上記のＳＣ−ＰＥＧのような線状ＰＥＧ類により作製された幾つかの好ましい複合体は、平均して１酵素当り約２０から約８０のＰＥＧ鎖を含有することができる。その結果、これらに関しては、数百倍、例えば、２００〜１０００倍過剰モルを使用することができる。分枝状ポリマー類および酵素に結合されるポリマー類に用いられる過剰モルはより低く、下記に説明されるものと同じ技法を記載する特許および特許出願に記載された技法を用いて測定することができる。
【００４６】
本発明の目的では、脱離基は、Ｌ−アスパラギナーゼ、例えばＬｙｓに見られるアミン基（求核性基）と反応できる基として理解するべきである。
【００４７】
本発明の目的では、前述のものは、活性化ポリマーリンカーとも称される。ポリマー残基は、好ましくは、ポリアルキレンオキシドベースであり、より好ましくは、線状または分枝状であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースである。
【００４８】
ここで上記の活性化ポリマー類を参照すると、Ａｒは、多置換芳香族炭化水素基または多置換複素環式芳香族基を形成する部分であることが分かる。重要な特徴は、Ａｒ部分が本質的に芳香族であることである。一般に、芳香族であるためには、π（パイ）電子は、環式分子の平面の上部および下部双方の「雲」内に共有しなければならない。さらに、π電子数は、ヒュッケル則（４ｎ＋２）を満たさなければならない。無数の部分が、その部分の芳香族の要件を満たし、当該技術分野に共通して理解される用語であるハロゲン（類）および／または側鎖での本明細書における使用に好適であることを当業者は認識するであろう。
【００４９】
本発明の幾つかの好ましい態様において、活性化ポリマーリンカーは、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第６，１８０，０９５号明細書、米国特許第６，７２０，３０６号明細書、米国特許第５，９６５、１１９号明細書、米国特許第６，６２４，１４２号明細書および米国特許第６，３０３，５６９号明細書に従って調製され、それらの内容は、参照することにより本明細書に援用されている。この文脈内で、以下の活性化ポリマーリンカーが好ましい：
【化４−１】
2009542219.tif 000006
【化４−２】
2009542219.tif 000007
【００５０】
本発明の別の一態様において、Ｌ−アスパラギナーゼポリマー複合体は、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第７，１２２，１８９号明細書および米国特許第７，０８７，２２９号明細書、ならびに米国特許出願第１０／５５７，５２２号明細書、米国特許出願第１１／５０２，１０８号明細書、および米国特許出願第１１／０１１，８１８号明細書に記載されたものなど、ある一定の分枝状またはビシン（ｂｉｃｉｎｅ）ポリマー残基を用いて作製される。このような特許出願の各開示は、参照することにより本明細書に援用されている。いくつかの好ましい活性化ポリマー類としては：
【化５】
2009542219.tif 000008
【００５１】
が挙げられる。
【００５２】
また、当然のことながら、上記に示された脱離基は、好適な基のうちの１つに過ぎず、本明細書に記載された他のものも、過度に実験することなく使用することができる。
【００５３】
別の態様において、活性化ポリマーリンカーは、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；および米国特許第６，５６６，５０６号明細書に記載されたものなど、分枝状ポリマー残基を用いて調製され、各々の開示は、参照することにより本明細書に援用されている。このような活性化ポリマー類は、以下の代表的な：
【化６】
2009542219.tif 000009
【００５４】
を有するポリマー系（ｖ）−（ｉｘ）に相当し、
式中Ｂは、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩであり、他の変数の全ては、先に定義されたとおりである。
【００５５】
実質的に非抗原性のポリマー類
上記のとおり、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23は、好ましくは、各々水溶性ポリマー残基であり、それらは、好ましくは、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）類、より好ましくは、ｍＰＥＧなどのポリエチレングリコール類などの実質的に非抗原性のものである。説明目的のために限定せずに、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は：
Ｊ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−、
Ｊ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、
Ｊ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−ＣＨ2ＣＨ2ＮＲ25−、および
Ｊ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ−、
の中から選択することができ、
式中：
ｕは、重合度、すなわち、約１０から約２，３００であり；
Ｒ25は、水素、Ｃ1〜6アルキル類、Ｃ2〜6アルケニル類、Ｃ2〜6アルキニル類、Ｃ3〜12分枝状アルキル類、Ｃ3〜8シクロアルキル類、Ｃ1〜6置換アルキル類、Ｃ2〜6置換アルケニル類、Ｃ2〜6置換アルキニル類、Ｃ3〜8置換シクロアルキル類、アリール類、置換アリール類、アラルキル類、Ｃ1〜6ヘテロアルキル類、置換Ｃ1〜6ヘテロアルキル類、Ｃ1〜6アルコキシ、フェノキシおよびＣ1〜6ヘテロアルコキシの中から選択され、
Ｊは、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端に見られる基であり、幾つかの態様において、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1〜6アルキル類、好ましくはメチルのいずれか、またはこのような基が当業者により理解される他のＰＥＧ末端活性基から選択することができる。
【００５６】
特に好ましい一実施形態において、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23は、
ＣＨ3−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−、ＣＨ3−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）u−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、およびＣＨ3−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−、およびＣＨ3−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ−の中から選択され、
式中ｕは、正の整数であり、重量平均分子量が、約２００Ｄａから約８０，０００Ｄａになるように選択されるのが好ましい。より好ましくは、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23は、独立して約２，０００Ｄａから約４２，０００Ｄａの平均分子量を有し、最も好ましくは、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの平均分子量を有する。他の分子量はまた、当業者のニーズに適応させるように考慮されている。
【００５７】
ＰＥＧは一般に、構造：
−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）u−
により表され、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23は、この式の残基を含んでなることが好ましい。ポリマーに関する重合度は、ポリマー鎖における反復単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。
【００５８】
本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第５，６４３，５７５号明細書（’５７５特許）に記載されたものなどのポリプロピレングリコール類、分枝状ＰＥＧ誘導体、シアウォーター社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の２００１年カタログ「生物医学適用のためのポリエチレングリコールおよび誘導体（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」に記載されたものなどの「スター型ＰＥＧ類」および多アームＰＥＧ類もまた有用である。前述の各開示は、参照することにより本明細書に援用されている。’５７５特許により得た分枝形成は、単一の結合点から生物活性分子上にポリマー添加を増加させる方法として第二級または第三級分枝形成を可能にする。当然のことながら、過度に実験することなく、必要に応じて、水溶性ポリマーを二官能性結合基への結合のために官能化することができる。
【００５９】
例えば、その開示が参照することにより本明細書に援用されるＮＯＦ社（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．）の「薬物送達系カタログ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｔａｌｏｇ）」、第８版、２００６年４月に記載されたものなどの多アームＰＥＧ−ＯＨまたは「スターＰＥＧ」製品を、前述の米国特許第５，１２２，６１４号明細書または米国特許第５，８０８，０９６号明細書に記載された活性化技法を用いて好適に活性化されたポリマーに変換することを含む方法により、本発明の複合体を作製することができる。具体的には、ＰＥＧは、式：
【化７】
2009542219.tif 000010
【００６０】
である可能性があり
式中：
ｕ’は、好ましくは、総分子量が約５，０００から約４０，０００のポリマー類を提供するために、約４から約４５５の整数であり；３までの残基の末端部分は、メチルまたは他の低級アルキルによりキャッピングされる。
【００６１】
幾つかの好ましい実施形態において、組換えタンパク質に対する結合を促進させるために、４つ全てのＰＥＧアームを、好適な脱離基、すなわち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）などに変換する。変換前のこのような化合物としては：
【化８−１】
2009542219.tif 000011
【化８−２】
2009542219.tif 000012
【００６２】
が挙げられる。
【００６３】
本明細書に含まれたポリマー物質は、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマー類の非限定的なリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール類などのポリアルキレンオキシドホモポリマー類、ポリオキシエチレン化ポリオール類、それらのコポリマー類、および水溶性が維持されるという条件のそれらのブロックコポリマー類が挙げられる。
【００６４】
さらなる実施形態において、ＰＡＯベースのポリマー類に対する代替物として、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、およびＲ22〜23は、デキストラン、ポリビニルアルコール類、炭水化物ベースのポリマー類、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド類、および／またはそれらのコポリマー類などの１種または複数種の事実上非抗原性の材料の中から、各々任意に選択される。また、その内容が参照することにより本明細書に援用される、本発明と同一の譲受人に譲渡された米国特許第６，１５３，６５５号明細書を参照されたい。ＰＥＧなどのＰＡＯ類に関して本明細書に記載されたものと同じ活性化タイプが使用されることは、当業者により理解されるであろう。前述のリストは単に説明するためのものであること、本明細書に説明された品質を有する全てのポリマー材料が考慮されること、ポリプロピレングリコール類などの他のポリアルキレンオキシド誘導体もまた考慮されることを当業者はさらに認識するであろう。
【００６５】
二官能性リンカー基：
本発明の多くの態様において、Ｌ1〜6およびＬ8は、ポリマー鎖、例えば、Ｒ1〜2、Ｒ10〜11、および／またはＲ22〜23の結合を促進させる結合基である。提供された結合は、直接的か、または当業者に公知のさらなる結合基を介し得る。本発明のこの態様において、Ｌ1〜6およびＬ8は、同じであっても異なってもよく、二官能性およびヘテロ二官能性脂肪族ならびに芳香族−脂肪族基、アミノ酸類など、当業者に周知の多種多様の基から選択することができる。したがって、Ｌ1〜6およびＬ8は、同じであっても異なってもよく：
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’（ＣＲ32Ｒ33）t’−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’Ｏ（ＣＲ32Ｒ33）t’Ｏ−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’Ｏ（ＣＲＲ32Ｒ33）t’ＮＲ36−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’Ｏ（ＣＲ32Ｒ33Ｏ）t’ＮＲ36−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33）t’−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33）t’Ｏ−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33Ｏ）t’−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33Ｏ）t’（ＣＲ34Ｒ35）y’−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33Ｏ）t’（ＣＲ34Ｒ35）y’Ｏ−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33）t’（ＣＲ34Ｒ35Ｏ）y’−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33）t’（ＣＲ34Ｒ35Ｏ）y’ＮＲ36−、
−［Ｃ（＝Ｏ）］v’ＮＲ31（ＣＲ32Ｒ33）t’ＮＲ36−、
【化９】
2009542219.tif 000013
【００６６】
式中：
Ｒ31〜Ｒ37は、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、Ｃ1〜6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換Ｃ1〜6アルキルチオ、Ｃ1〜6アルキル類、Ｃ2〜6アルケニル、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ3〜19分枝状アルキル、Ｃ3〜8シクロアルキル、Ｃ1〜6置換アルキル、Ｃ2〜6置換アルケニル、Ｃ2〜6置換アルキニル、Ｃ3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1〜6ヘテロアルキル、置換Ｃ1〜6ヘテロアルキル、Ｃ1〜6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1〜6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2〜6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2〜6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2〜6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2〜6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2〜6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ2〜6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシからなる群から独立して選択され、
置換基は、アシル、アミノ、アミド、アミジン、アラアルキル、アリール、アジド、アルキルメルカプト、アリールメルカプト、カルボニル、カルボキシレート、シアノ、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、イミノ、ニトロ、チオカルボニル、チオエステル、チオアセテート、チオホルメート、アルコキシ、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、シリル、スルフヒドリル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、およびスルホニルからなる群より選択され；
（ｔ’）および（ｙ’）は、ゼロまたは正の整数から独立して選択され、好ましくは、１から６であり；および
（ｖ’）は、０または１である。
【００６７】
Ｌ1〜6およびＬ8は：
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）−；
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＮＨＣＨ2Ｃ（Ｏ）−；
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＳＣＨ2Ｃ（Ｏ）−；
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−；および
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−；
の中から選択されることが好ましい。
【００６８】
あるいは、好適なアミノ酸残基は、任意の公知の天然Ｌ−アミノ酸類、例えば、いくつか例を挙げれば、アラニン、バリン、ロイシンなど、および／またはそれらの組合せから選択することができる。Ｌ1〜6およびＬ8としては、サイズが、例えば、約２から約１０のアミノ酸残基の範囲であるペプチドを挙げることもできる。
【００６９】
天然アミノ酸類、ならびに種々の当該技術分野に公知の非天然アミノ酸類（ＤまたはＬ）の疎水性または非疎水性の誘導体および類縁体もまた、本発明の範囲内に入るように考慮されている。
【００７０】
Ａ部分
１．脱離基または活性化基
Ａが活性化基である態様において、好適な部分としては、限定はしないが、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジル、ｐ−ニトロフェノキシル、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、チアゾリジニルチオン、Ｏ−アシル尿素、ペンタフルオロフェノキシル、２，４，６−トリクロロフェノキシルなどの基または当業者に明白である他の好適な脱離基が挙げられる。
【００７１】
本発明の目的では、脱離基は、所望の標的、すなわち、生物活性部分、診断剤、標的部分、二官能性スペーサー、中間体などに見られる求核剤と反応することができる基であると理解される。したがって標的は、タンパク質、ペプチド、酵素、ドキソルビシンなどの天然または化学的合成治療剤分子、モノ保護ジアミンなどのスペーサーに見られるＮＨ２基などの置換のための基を含有する。Ａに関して選択された部分は、生物活性求核剤の他にも他の分子とも反応できることは理解される。
【００７２】
２．官能基
Ａはまた、官能基であり得る。このような官能基の非限定例としては、アミン含有スペーサーを介してビシン部分に結合できるマレイミジル、ビニル、スルホン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、メルカプト、ヒドラジド、カルバゾールなどの残基が挙げられる。ビシン部分に結合したら、ポリペプチドのシステイン残基、アミノ酸またはペプチドスペーサーなどの標的に、ビシン−ポリマーを結合させるために官能基（例えば、マレイミド）を使用することができる。
【００７３】
３．アルキル基
Ａがアルキル基である式（Ｉ）の態様において、好適な基の非限定リストは、Ｃ1〜6アルキル類、Ｃ2〜6アルケニル類、Ｃ2〜6アルキニル類、Ｃ3〜19分枝状アルキル類、Ｃ3〜8シクロアルキル類、Ｃ1〜6置換アルキル類、Ｃ2〜6置換アルケニル類、Ｃ2〜6置換アルキニル類、Ｃ3〜8置換シクロアルキル類、アラルキル類、Ｃ1〜6ヘテロアルキル類、および置換Ｃ1〜6ヘテロアルキル類からなる。
【００７４】
Ｚ部分およびそれらの機能
本発明の一態様において、Ｚは、Ｌ７がＬ1〜6を定義する基の中から選択される二官能性リンカーであり、Ｙ12が、Ｙ1を定義するものと同じ基の中から選択されるＬ7−Ｃ（＝Ｙ12）である。本発明のこの態様において、Ｚ基は、Ｌ−アスパラギナーゼとポリマー送達系の残部との間の結合として役立つ。本発明の他の態様において、Ｚは、標的細胞、疎水性部分、およびそれらの組合せに能動輸送される部分である。存在する場合のＺ’は、標的細胞、疎水性部分、およびそれらの組合せに能動輸送される部分である二官能性リンカーとして役立ち得る。
【００７５】
本発明のこの態様において、インビボ加水分解は、Ｌ−アスパラギナーゼからポリマーを開裂し、Ｚ部分になお結合しながら酵素を細胞外液に遊離するように、遊離性ポリマー系を調製する。例えば、１つの可能性のあるＺ−Ｂの組合せは、ロイシン−Ｌ−アスパラギナーゼである。
【００７６】
Ｌ−アスパラギナーゼ複合体の調製
例示目的のために、好適な複合化反応は、Ｌ−アスパラギナーゼと、上記の好適に活性化されたポリマー系とを反応させることを含む。この反応は、ｐＨが約６．５〜８．５の範囲内でＰＢＳ緩衝系の使用などを含む、タンパク質修飾の当業者に周知の条件を用いて実施されることが好ましい。大部分の場合、過剰の活性化ポリマーをＬ−アスパラギナーゼと反応させることが考慮されている。
【００７７】
この種の反応は、しばしばＬ−アスパラギナーゼに結合された１種または複数種のポリマーを含有する複合体形成を生じる。認識されるように、しばしば、種々のフラクションを単離し、より均一性の高い産物を提供することが望ましい。本発明の大部分の態様において、反応混合物を集め、好適なカラム樹脂に負荷し、所望のフラクションを、緩衝液の濃度を増しながら連続的に溶出させる。フラクションは、好適な分析手段により分析して複合化タンパク質の純度を測定してから、さらに処理される。合成経路および選択された活性化ポリマーに関係なく、複合体は、本明細書に定義された式（Ｉ）に一致するであろう。本明細書に記載された合成技法から生成する好ましい幾つかの化合物としては：
【化１０】
2009542219.tif 000014
【００７８】
が挙げられ、
式中ＢはＬ−アスパラギナーゼである。
【００７９】
本発明に従って作製されたさらに別の複合体としては：
【化１１】
2009542219.tif 000015
【００８０】
が挙げられ、
式中全ての変数は、上記に説明されたものと同じである。例えば、複合体に含まれた幾つかの実施形態は：
【化１２】
2009542219.tif 000016
【００８１】
からなる群より選択され、
式中ＢはＬ−アスパラギナーゼである。
【００８２】
さらなる複合体としては：
【化１３】
2009542219.tif 000017
【００８３】
が挙げられ、
式中ＢはＬ−アスパラギナーゼである。複合体に使用される非限定リストは、
【化１４】
2009542219.tif 000018
【００８４】
の中にあり、
式中ＢはＬ−アスパラギナーゼである。
【００８５】
特に好ましい複合体は：
【化１５】
2009542219.tif 000019
【００８６】
であり、
ｍＰＥＧの分子量は、約１０，０００から約４０，０００である。
【００８７】
ビシンベースのポリマー系が用いられる場合、２種の好ましい複合体は：
【化１６】
2009542219.tif 000020
【００８８】
であり、
ｍＰＥＧの分子量は、上記と同じである。
【００８９】
Ｌ−アスパラギナーゼのＰＥＧ化は、１タンパク質当りの総ＰＥＧ結合体、ＰＥＧポリマーのサイズ、およびＰＥＧリンカー設計に関して経験的に最適化されることを注記する。ＰＥＧ化の最適化評価のために、ＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼの重要な特徴は、インビトロアッセイ（例えば、酵素活性および安定性）およびインビボアッセイ（例えば、薬物動態学および薬力学）の双方を含む。
【００９０】
治療方法
本明細書に記載されたＤＮＡ、ベクターおよび宿主細胞により産生されたＬ−アスパラギナーゼは、「Ｅｌｓｐａｒ」（メルク社）および「Ｏｎｃａｓｐａｒ」（エンゾン・ファーマシューティカルズ社（Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．））に関して当該技術分野に公知の方法および適応症の全てに有用である。したがって、本発明のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素は、ポリアルキレンオキシドが複合化されていても、またはタンパク質が複合化されていなくても、このような治療に反応する疾患または障害または他の病態などを治療するために有効な量で、それを必要とする患者に投与される。当業者は、「Ｅｌｓｐａｒ」および「Ｏｎｃａｓｐａｒ」の公知の性質から外挿された好適な量、投与経路および投与計画を認識するであろう。
【実施例】
【００９１】
下記に説明される以下の非限定的な実施例は、本発明のある一定の態様を例示している。
【００９２】
実施例１
Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラーゼ、タイプＥＣ−２、ＥＣ３．５．１．１：大腸菌−Ｌ−アスパラギナーゼＩＩタンパク質の配列決定
メルク社および協和発酵工業株式会社からそれぞれ市販されているＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素のアミノ酸配列を得るために、これらのタンパク質をタンパク質配列分析に供し、公表された大腸菌Ｋ−１２  ａｎｓＢの遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４２７７）と比較した。
【００９３】
Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、以下のとおり配列決定を行った。Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ（８０ｍｇ／ｍＬ、メルク）の２ｍＬの一定分量を試薬グレード水で希釈し、５．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の希釈溶液を得た。この希釈溶液を０．２２μｍフィルターを通してバイアルにろ過し、細菌汚染負荷を減じてからタンパク質配列分析を実施した。同様に１００ｍｇのＬ−アスパラギナーゼＩＩ（協和発酵工業）を２０ｍＬの試薬グレード水に溶解し、５．６ｍｇ／ｍＬの希釈溶液を得て滅菌ろ過した。定量的アミノ酸分析、Ｎ末端配列決定、ペプチドマッピング、および質量分析法を用いて２つのタンパク質の完全配列を決定した。トリプシン消化、キモトリプシン消化、Ｌｙｓ−Ｃ消化およびシアノーゲンブロミド（ＣｎＢｒ）断片を調製し、高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）により分離し、質量分析およびアミノ酸配列決定を、単離されたペプチドに対して実施した。この完了した分析により、２つの市販のＬ−アスパラギナーゼＩＩ酵素間で明らかに配列同一性を示した。しかしながら、４つのアミノ酸位置は、大腸菌Ｋ−１２から誘導されたアスパラギナーゼの遺伝子配列とは異なった。これら４つの異なる位置を、下表１に示す。
【表１】
2009542219.tif 000021
【００９４】
実施例２
組換えＬ−アスパラギナーゼＩＩを発現する大腸菌株ＥＮ５３８の構築
大腸菌Ｋ−１２  ａｎｓＢのＬ−アスパラギナーゼＩＩをコードする遺伝子を、以下のとおり、実施例１の表１により示された残基置換によりＬ−アスパラギナーゼＩＩを発現するよう構成した。大腸菌Ｋ−１２  ａｎｓＢの３２６の成熟アミノ酸配列Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、ジェニングス  ＭＰ（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ＭＰ）およびビーチャム  ＩＲ（Ｂｅｅｃｈａｍ  ＩＲ）により報告された（１９９０年、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７２：１４９１−１４９８頁；ＧｅｎｅＢａｎｋ番号Ｍ３４２７７）９７８塩基対セグメントにコードされる。次に成熟タンパク質より前の２２のアミノ酸シグナルペプチドを含むａｎｓＢ遺伝子が、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって別の大腸菌Ｋ−１２株（ＧＸ１２１０；ジェネックス社（Ｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手）からクローン化された。具体的には、オリゴヌクレオチド
５’−ＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡ−３’（配列番号４）および
５’−ＡＣＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号５）が、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ９６００サーモサイクラー、Ｔａｑポリメラーゼ、および標準試薬を用いて、３０秒９４℃、３０秒４０℃、１分７２℃を２５サイクルのサイクリングパラメータで、プライマーとして使用された。
【００９５】
増幅された約１ｋｂバンドを、ＴＢＥアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｅｃｏ  ＲＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、バクテリオファージベクターＭ１３ｍｐ８にクローン化した。ａｎｓＢ遺伝子のＤＮＡ配列［Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号Ｍ３４２７７］は、手動でのＤＮＡジデオキシ配列決定法により確認された。次にａｎｓＢ遺伝子の４つのコドンを変化させるために（塩基５３０においてＧＴＧからＧＣＧに；塩基６４０においてＡＡＴからＧＡＴに；塩基１２０５においてＴＣＴからＡＣＴに；および塩基１２３９においてＡＣＣからＡＡＣに）、クローン化ａｎｓＢ遺伝子を部位特異的変異に用い、ウィットロウ（Ｗｈｉｔｌｏｗ）およびフィルプラ（Ｆｉｌｐｕｌａ）［Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ、Ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇ．ガラガー（Ｇ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）、Ｒ．Ｃ．リース（Ｒ．Ｃ．Ｒｅｅｓ）、およびＣ．Ｗ．レイノルズ（Ｃ．Ｗ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）編、１９９３年、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２７９−２９１頁］により記載されたアマシャムＲＰＮ１５２３バージョン２変異キットを用いて代替のアミノ酸（Ｖａｌ２７Ａｌａ；Ａｓｎ６４Ａｓｐ；Ｓｅｒ２５２Ｔｈｒ；およびＴｈｒ２６３Ａｓｎ）をコードした。
【００９６】
具体的には、使用された変異オリゴヌクレオチドは、
Ｖａｌ２７Ａｌａの変換に関して５’−ＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＧＴＴＡＧ−３’（配列番号６）；
Ａｓｎ６４Ａｓｐの変換に関して５’−ＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＣＡＴＧＴＣ−３’（配列番号７）；
Ｓｅｒ２５２Ｔｈｒの変換に関して５’−ＧＴＣＧＡＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＡＣＡＧＧＴＴＧＣ−３’（配列番号８）；
Ｔｈｒ２６３Ａｓｎの変換に関して５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＧＴＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＧ−３’（配列番号９）
であった。４つの変換の全ては、単一バッチ中で行われ、ＤＮＡ配列決定は、修飾ａｎｓＢ遺伝子配列［本明細書においてａｎｓＢ*遺伝子（配列番号２）と称される］を確認した。
【００９７】
ａｎｓＢ＊遺伝子のプラスミドｐＥＴ−２７ｂ＋（ノバゲン社）へのクローニングは、ＰＣＲ増幅により、それぞれ遺伝子の５’および３’末端において、フランキング制限部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを導入することによって達成された。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによる合成ＤＮＡの消化後、１キロベースの遺伝子を、やはりこれら２つの酵素により消化されたプラスミドベクターｐＥＴ−２７ｂ（＋）プラスミドにＴ４  ＤＮＡリガーゼを介して結合させた。製造元の説明書に従ってＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００を用いた電気穿孔法により、組換えプラスミドを大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）に導入した。
【００９８】
ｐＥＴベクターの構築により、ＩＰＴＧ付加の結果誘導可能なＴ７プロモーターの後ろにａｎｓＢ＊遺伝子が置かれる。ＩＰＴＧは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下、染色体のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子発現を誘導し、次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、ａｎｓＢ＊遺伝子を転写して、高レベル発現のａｎｓＢ*タンパク質産物を得る。
【００９９】
この形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレートで平板培養し、プラスミドｐＥＴ−２７ｂ（＋）／ａｎｓＢ*を含有するコロニーの選択を可能にした。これは、図１に示されるようにプラスミドｐＥＮ５３７と称される。単離されたコロニーは、平板培養することによってさらに精製し、ノバゲン社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されたものなどの標準的な方法によりＩＰＴＧ誘導性遺伝子発現に関して分析した。遺伝子発現は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて検証された。
【０１００】
実施例３
組換えＬ−アスパラギナーゼＩＩの発現およびその酵素の部分的特性化
株ＥＮ５３８を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）と共にＬＢ培地中３７℃で培養した。約０．８のＯＤ600の時点でＩＰＴＧ（１ｍＭ）を培養物に加え、遺伝子発現の誘導を、２時間、３時間または４時間のいずれかで進行させた。培養物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、高レベル発現の３４．６ｋＤａのａｎｓＢ*ポリペプチドを確認した。抗大腸菌アスパラギナーゼＩＩウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で主に誘導されたタンパク質バンドがＬ−アスパラギナーゼＩＩであることを確認した。
【０１０１】
シグナルペプチド除去後、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩは、ペリプラズム空間に通常分泌されるので、細胞または培地中のアスパラギナーゼの所在を調べるために、さらに実験を実施した。培養物を遠心分離し、ペレット化された細胞をリゾチーム溶液中で再懸濁して細胞壁を破壊してから、可溶性および不溶性細胞関連タンパク質、さらに培養時に増殖培地に遊離されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。
【０１０２】
これらの分析により、３７℃で３時間または４時間の誘導は、総細胞タンパク質の約３０％においてほぼ最大のａｎｓＢ*発現を提供することが示された。少なくとも７０％のアスパラギナーゼは、リゾチーム処理により細胞ペレットから溶解することができる。培養中に増殖培地内に遊離されたアスパラギナーゼの量は、発現された全アスパラギナーゼの約２５％である。
【０１０３】
リゾチーム処理によりペリプラズムから遊離された可溶性アスパラギナーゼは、基質であるアスパラギンからのアスパラギナーゼ反応産物であるアスパラギン酸を測定するＲＰ−ＨＰＬＣアッセイを用いて、酵素活性に関してさらに調べた。ＩＰＴＧ誘導サンプルからの粗抽出物中の酵素活性は約６０ＩＵ／ｍｇであったが、一方、非誘導培養物から調製されたサンプル中の酵素活性はわずか約２ＩＵ／ｍｇであった。タンパク質は、この段階では約２０％しか純粋でなかったことから、これは、純粋なアスパラギナーゼＩＩ（約２５０〜３００ＩＵ／ｍｇ）の報告された比活性に十分に匹敵する。このアスパラギナーゼ調製物のＮ末端配列分析もまた、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）のＰＲＯＣＩＳＥタンパク質シーケンサーを用いて達成された。Ｎ末端配列のＬＰＮＩＴＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＧＧＤＳＡ（配列番号１０）は、成熟した、正しくプロセシングされたアスパラギナーゼの予測されたＮ末端タンパク質の配列と正確に一致する。ＬＣ−ＭＳ分析（ジュピター（Ｊｕｐｉｔｅｒ）Ｃ−１８逆相カラム）もまたこのサンプルに対して実施した。主要タンパク質種は、成熟ａｎｓＢ*アスパラギナーゼとして予測された質量と正確に合致する３４，５９２の質量を示した。ノルロイシン置換を有するタンパク質種の証拠は見られなかった。
【０１０４】
実施例４
ｐＥＮ５３７プラスミドおよび大腸菌ＢＬＲ染色体からのＬ−アスパラギナーゼＩＩ（ａｎｓＢおよびａｎｓＢ*遺伝子）のタンパク質コード配列
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）［ノバゲン社；カタログ番号６９２０８−３から入手］から、染色体ＤＮＡを調製した。カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培地中、３７℃で増殖させたＢＬＲの２ｍｌの培養物を、微量遠心管中２分間遠心分離し、細胞ペレットを０．５ｍｌのＳＴＥＴ緩衝液中で再懸濁した。フェノール／クロロホルム（０．５ｍｌ）を加えてボルテックスし、室温で５分間遠心分離した。上澄液を集めて、５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１ｍｌのエタノールと混合した。氷上で１０分間インキュベートした後、ＤＮＡを遠心分離によりペレットにし、１００μｌの水中で再懸濁した。ＰＣＲをサンプルに対して実施し、染色体ａｎｓＢ遺伝子を単離した。ＰＣＲ反応混合物は、５μｌの１０×高フィデリティーＰＣＲ緩衝液、５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μｌの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．５μｌ（５０ｐｍｏｌ）のオリゴヌクレオチド
５’−ＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＣ−３’（配列番号１１）、
０．５μｌ（５０ｐｍｏｌ）のオリゴヌクレオチド
５’−ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）、
１μｌのＢＬＲ  ＤＮＡ、３６μｌの蒸留水、および１μｌの白金Ｔａｑ高フィデリティーポリメラーゼを含有した。インビトロゲン社から入手した市販のＴＯＰＯクローニングシステムを用いてクローン化し、製造元により記載されたとおり実施した。
【０１０５】
ＰＣＲ産物およびＴＯＰＯ  ＴＡベクターを用いるクローン化反応を、６μｌ中室温で３０分間実施した。反応のライゲーション産物を、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞内で形質転換し、カナマイシン選択と共にＬＢ寒天プレート上で平板培養した。クローン化ａｎｓＢ  ＢＬＲ染色体遺伝子およびｐＥＮ５３７ａｎｓＢ*遺伝子のＤＮＡ配列分析を、アプライドバイオシステムズのＰｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてプラスミドに対して実施した。双方の鎖を配列決定した。ＢＬＲ  ａｎｓＢ遺伝子およびｐＥＮ５３７  ａｎｓＢ*遺伝子のコード配列は、成熟タンパク質コード配列において２９のミスマッチ塩基の配置によって異なる。しかしながら、これらの塩基置換のいずれも、コドン縮退のためのアミノ酸配列における変性を生じなかった。ＢＬＲからのコード化ａｎｓＢタンパク質およびｐＥＮ５３７からのコード化ａｎｓＢ*タンパク質は、アミノ酸配列において同一であることが確認された。３２６位置の全ては、これら２つのアスパラギナーゼタンパク質において同一であることが示された。
【０１０６】
実施例５
細胞および培養培地からの精製
以下の処理は、ハームス（Ｈａｒｍｓ）ら、１９９１年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：１４４−１５０頁から適合させた。
【０１０７】
上記のとおり大腸菌株ＥＮ５３８の培養物は、シェーカーインキュベーター内で、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）の存在下、Ｌｕｒｉａブロス中３７℃で増殖させる。０．８のＯＤ660の時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで加え、さらに４時間増殖を続けた。細胞を遠心分離により回収した。分析目的のために、２ｍｌの培養物を用いる。
【０１０８】
細胞抽出物を作製するために、ペレットを、１ｍｌの破壊用緩衝液（５０ｍＭ  ＫＰＯ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオトレイトール）中に懸濁し、細胞をミクロ流動化により破壊する。細胞デブリを遠心分離により除去し、上澄液をＬ−アスパラギナーゼＩＩ活性に関してアッセイし、また、ポリアクリルミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）により酵素産生を評価するために使用する。浸透圧性ショック分画化は、参照することにより本明細書に援用されるボイド（Ｂｏｙｄ）ら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：８５２５−８５２９頁により記載されたとおり実施する。手短に言うと、ペレットを、２ｍｌのスフェロブラスト緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５Ｍショ糖、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、氷上で５分間インキュベートし、遠心分離する。ペレットを室温に温めて、０．３ｍｌの氷水中に再懸濁し、５分間氷上でインキュベートし、再度遠心分離する。上澄液のペリプラズムフラクションはさらに処理せずに、活性判定および電気泳動に用いる。
【０１０９】
酵素精製
大スケールＬ−アスパラギナーゼＩＩの調製のために、細胞をバッチ培養（１０リットル）中で増殖させ、上記の浸透圧性ショックに供する。培養容量１リットル当り５０〜１００ｍｌのスフェロブラスト緩衝液および３０〜４０ｍｌの水を使用する。以下のプロトコルは、２リットルの培養物から得られたペリプラズム抽出物から開始する。全てのステップを５〜１０℃で実施する。
【０１１０】
硫酸アンモニウムによる分画化
１００ｍｌの上澄液に、２９．５ｇの固形硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和を得る。２時間後、沈殿物を遠心分離により除去し、ペレットを廃棄する。上澄液を、硫酸アンモニウムにより９０％飽和（１００ｍｌに対して２７．２ｇ）にする。ペレットを一晩放置後、遠心分離によりこれを集め、数ミリリットルの２５ｍＭのピペラジン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ５．５に溶解し、同じ緩衝液に対して透析する。この同じ処理をまた、残りの細胞培養物にも適用して分泌Ｌ−アスパラギナーゼＩＩを回収する。
【０１１１】
等電点クロマトグラフィー
１×３０ｃｍカラムのポリ緩衝液交換器ＰＢＥ９４を、２００ｍｌの上記のピペラジン−ＨＣｌ緩衝液（開始緩衝液）により平衡にした。サンプル溶液（１０ｍｌ）を適用した後、カラムを、３０ｍｌ／時間の流速で２００ｍｌの溶出用緩衝液（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ  ７４、Ｈ２Ｏで１０倍希釈し、ＨＣｌによりｐＨ４．０に調整）により溶出する。２ｍｌのフラクションを集め、２０μｌのサンプルの適切な希釈後、Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ活性に関してアッセイする。アスパラギナーゼ含有フラクションをプールし、飽和硫酸アンモニウム溶液に対して透析する。酵素ペレットを９０％の飽和硫酸アンモニウムで洗浄し、この媒体中懸濁液として保存する。
【０１１２】
実施例６
細胞および培養培地からの精製
上記のとおり大腸菌株ＥＮ５３８の培養物を、発酵槽中２５℃から３７℃でカナマイシンの存在下、培養培地中で増殖させる［例えば、フィルプラ，Ｄ．（Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｄ．）、マクガイア，Ｊ．（ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｊ．）、およびウィットロウ，Ｍ．（Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．）（１９９６年）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ，Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｊ．マッカファーティ（Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、Ｈ．フーゲンブーム（Ｈ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）、およびＤ．Ｊ．キスウェル（Ｄ．Ｊ．Ｃｈｉｓｗｅｌｌ）編；オックスフォード大学プレス、オックスフォード、英国））２５３−２６８頁］。ＯＤ660が２０から２００の時点で、ＩＰＴＧを０．１〜１ｍＭの最終濃度まで加え、さらに１〜１２時間増殖を継続した。遠心分離により細胞を回収し、マントン−ガウリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）細胞ホモジナイザーを通過させた。細胞溶解液を６℃で３０分間２４，３００ｇで遠心分離し、上澄液を集め、限外ろ過／ダイアフィルトレーションに供し、導電度を３ｍＳに調整する。溶解液のｐＨを、２５％酢酸により４．１に調整し、５ｍＭ酢酸ナトリウム、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．１の緩衝液によりダイアフィルトレーションする。
【０１１３】
Ｓ−セファロースカチオン交換カラムクロマトグラフィー上でアスパラギナーゼを捕捉する。結合アスパラギナーゼを、１２．５ｍＭリン酸カリウム、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．４（緩衝液ＮＫ６４）により溶出する。
【０１１４】
Ｓ−セファロースクロマトグラフィーから集められたアスパラギナーゼピークフラクションをプールし、０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を加えて室温で２０分間インキュベートする。１容量の緩衝液ＮＫ６４を加え、サンプルをＱ−セファロースカラム上に負荷する。Ｑカラムを、Ｑ−２５緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４）により洗浄し、次いで緩衝液Ｑ−１３５（１０ｍＭリン酸カリウム中１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）により溶出する。
【０１１５】
プールされた酵素フラクションに、０．２５Ｍの最終濃度まで硫酸マグネシウム粉末を加え、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８中の０．２５Ｍ  ＭｇＳＯ４により予め平衡にしたフェニル疎水性相互作用カラム上に負荷する。アスパラギナーゼを流液フラクション中に集め、３０ｋＤａ分子量カットオフポリスルホン膜を用いたＦｉｌｔｒｏｎユニット中、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２の緩衝液によりダイアフィルトレーションする。
【０１１６】
アスパラギナーゼのフラクションを、等容量の水で希釈し、ヒドロキシアパタイトカラム上に負荷する。緩衝液Ｈ１５（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８）で溶出して不純物を除去する。精製されたアスパラギナーゼを、緩衝液Ｈ１５０（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８）で溶出する。
【０１１７】
実施例７
細胞および培養培地からの精製
実施例６に記載されたとおり、増殖、誘導、およびホモジナイズされた大腸菌株ＥＮ５３８の培養物を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．６に対して、Ａ280が０．１未満、導電度が５ｍＳになるまで、２．９Ｌ／分の流速、１６ｐｓｉで５０ｋＤａのＭｉｃｒｏｇｏｎホローファイバーで８つの産物容量を用いてダイアフィルトレーションする。０．２２μｍ膜を用いて産物をろ過する。
【０１１８】
カチオン交換クロマトグラフィーを、Ｐｏｒｏｓ−ＨＳカラムにより実施する。カラムを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、４０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡にする。ダイアフィルトレーションした清澄媒体を、０．５カラム容量（ＣＶ）／分で負荷し、カラムを５ＣＶの２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、４０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄する。アスパラギナーゼを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、１３５ｍＭ  ＮａＣｌで溶出する。
【０１１９】
上記の産物に、０．２Ｍの二塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ９．２を加えて６．３にｐＨを調整する。次に０．７４Ｌ／分の流速、１６．５ｐｓｉで５０ｋＤａのＭｉｃｒｏｇｏｎホローファイバーフィルターを用いて１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．３に対してサンプルをダイアフィルトレーションする。
【０１２０】
アニオン交換クロマトグラフィーを、ＴＭＡＥ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌに対して実施する。このカラムを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．４中で平衡にする。ダイアフィルトレーションしたカチオンカラム溶出液を０．５ＣＶ／分で負荷し、このカラムを、５ＣＶの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．４で洗浄する。さらにこのカラムを、５ＣＶの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．４、２５ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄する。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌでアスパラギナーゼを溶出する。
【０１２１】
産物は、４０ｍｇ／ｍｌの濃度まで５０ｋＤａ膜を用いて１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に対してダイアフィルトレーションし、０．２２μｍ膜を通してろ過する。
【受託番号】
【０１２２】
寄託に関する記載
特許手続きの目的のために、微生物の寄託に関して国際認識に対するブダペスト条約の要件を満たす条件下、以下の生物学的材料の培養物は、以下の国際寄託機関に寄託されている：
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）
（米国２０１１０−２２０９、バージニア州、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ１０８０１所在）  
国際寄託登録
生物／ベクター：大腸菌／ＥＮ５３８
ＡＴＣＣ番号  ：ＰＴＡ７４９０
寄託日        ：２００６年４月１１日
【図１】
2009542219.tif 000022
【配列表】
2009542219000001.app
【国際調査報告】
2009542219.tif 000023
2009542219.tif 000024
2009542219.tif 000025