(57)【要約】  一態様では、本発明は、ＤＮＡのサンプルのリアルタイムの増幅および解析のためのシステムおよび方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体チャネルであって、ＰＣＲゾーンおよびＤＮＡ溶解ゾーン、前記チャネルと流体伝達する第１の試薬ウェル、ならびに前記チャネルと流体伝達する第２の試薬ウェルを有するマイクロ流体チャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
前記マイクロ流体デバイスに接続され、前記チャネルと流体伝達するストローと、
前記チャネルを通してサンプルを強制的に流すためのポンプと、
緩衝液を保管するための緩衝液ウェルおよびＤＮＡサンプルを含むサンプル溶液を保管するためのサンプルウェルを備えるウェルプレートと、
前記ウェルプレートの前記緩衝液ウェルと流体伝達であって緩衝液を保管するための緩衝液保管容器と、
前記ウェルプレートを位置決めするように動作可能な位置決めシステムと、
サンプルが前記チャネルの前記ＰＣＲゾーンにある間、前記サンプルの温度を循環させ、前記サンプルが前記ＤＮＡ溶解ゾーンにある間、前記サンプルに含まれる前記ＤＮＡを溶解するために加熱するための温度制御システムと、
前記ＰＣＲゾーンおよび前記ＤＮＡ溶解ゾーンからの発光を検出するための結像システムであって、励起源ならびに前記ＰＣＲゾーンおよび／または前記ＤＮＡ溶解ゾーンからの発光を検出するように構成され配置された検出器を備える結像システムと、
（ａ）前記温度制御システム、（ｂ）前記位置決め装置、（ｃ）前記結像システム、および（ｄ）表示デバイスと通信する主コントローラとを備える、リアルタイムＰＣＲを実行し、ＤＮＡを溶解するためのシステム。
【請求項２】
前記位置決めシステムが位置決め装置を備える請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記位置決めシステムが、前記位置決め装置を駆動するように動作可能なステップ駆動をさらに備える請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記位置決めシステムが、前記ステップ駆動を制御するためのコントローラをさらに備える請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記結像システムが、前記チャネルの前記ＰＣＲゾーンへ向けられた第１の発光ダイオードと、前記チャネルの前記ＰＣＲゾーンへ向けられた第２の発光ダイオードと、前記チャネルの前記溶解ゾーンへ向けられたレーザとを備える請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記結像システムが、前記ＰＣＲゾーンからの発光を検出するように構成された第１の検出器と、前記ＤＮＡ溶解ゾーンからの発光を検出するように構成された第２の検出器とをさらに備える請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記第２の検出器が電子を増殖する電荷結合デバイスＥＭＣＣＤを備える請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記結像システムが、前記第１の検出器および前記第２の検出器とインターフェイスされた検出器コントローラをさらに備える請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
前記検出器コントローラが前記主コントローラと通信接続される請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記検出器コントローラが、イーサネット（登録商標）のハブを介して前記主コントローラと接続される請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記温度制御システムが、前記ＰＣＲゾーン内のサンプルを加熱するように構成された第１の加熱器および前記ＤＮＡ溶解ゾーン内のサンプルを加熱するように構成された第２の加熱器を備える請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第１の加熱器が第１の熱電冷却機ＴＥＣを備え、前記第２の加熱器が第２の熱電冷却機ＴＥＣを備える請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記温度制御システムが、前記第１のＴＥＣに結合された第１の温度コントローラおよび前記第２のＴＥＣに結合された第２の温度コントローラをさらに備える請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１の温度コントローラおよび前記第２の温度コントローラが前記主コントローラに結合される請求項１３に記載システム。
【請求項１５】
前記第１の温度コントローラが電力増幅器から成る請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記温度制御システムが、前記ＰＣＲゾーンを照射するように配置された電磁放射源をさらに備える請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記放射源が赤外線放射を生成するように構成される請求項１１に記載のシステム。
【請求項１８】
コンフィギュレーション情報を含むスクリプトを生成することと、
ＰＣＲゾーンおよびＤＮＡ溶解ゾーンを有するマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体のデバイスを作製することと、
前記コンフィギュレーション情報を得るために前記スクリプトを読み取ることと、
前記デバイスに対して、緩衝液を含む緩衝液ウェルおよびＤＮＡサンプルを含むサンプル溶液を含むサンプルウェルを有するウェルプレートを位置決めすることと、
サンプル溶液を流す（前記サンプルは前記ＤＮＡ溶解ゾーンを通る前に前記ＰＣＲゾーンを通って流れる）ために圧力差を生成するように構成されたポンプを起動することと、
前記サンプルが前記チャネルを通って流れている間に、
前記ＤＮＡサンプルを増幅するために、前記スクリプトに含まれたコンフィギュレーション情報に従って、前記ＰＣＲゾーンを通って前記サンプルが流れるとき前記サンプルの温度を循環させ、
前記サンプルが前記ＰＣＲゾーンを通って流れるとき前記サンプルの像を取得し、
前記像を処理し、かつ
前記増幅されたＤＮＡを溶解することとを含む、ＤＮＡを増幅し解析する方法。
【請求項１９】
前記デバイスを作製するステップが、
前記デバイス内に配置された第１のウェルを第１の試薬で充填することと、
前記デバイス内に配置された第２のウェルを第２の試薬で充填することとを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記チャネルを通って前記サンプルが流れる速度を求め、前記速度が速すぎるか遅すぎるとき、前記ポンプを調整することをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記チャネルを通って前記サンプルが流れる前記速度を求める前記ステップが、前記サンプルが前記チャネルを流れている間に得られた前記サンプルの像を処理することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルの前記像を得る前に、前記像を得るために使用される結像システムを構成することをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記結像システムを構成する前記ステップが、
（ａ）検出器を使用して前記ＰＣＲゾーンの像を得るステップと、
（ｂ）前記ＰＣＲゾーンの像を表示し、かつ基準画像を表示するステップと、
（ｃ）前記検出器が適切に合焦されたかどうか判断するステップと、
（ｄ）前記検出器が十分に合焦されていなければ、前記検出器の前記焦点を調整し、かつステップ（ａ）からステップ（ｄ）を繰り返すステップとを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウェルプレートを位置決めする前記ステップが、
前記スクリプトに基づいて前記ウェルプレートのウェルを求めることと、
前記デバイスに接続されたストローが前記求められたウェルに配置されるように、前記ウェルプレートを位置決めすることとを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウェルプレートの位置決めおよび／または前記ポンプの起動の後に、所定の時間が経過した後、前記デバイスに対して前記ウェルプレートを再度位置決めすることをさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウェルプレートを再度位置決めするステップが、前記ストローが緩衝ウェルに配置されるように前記デバイスに対して前記ウェルプレートを位置決めすることを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルの温度を循環させる前記ステップが、
前記ＰＣＲゾーンの温度を変性ステージ温度に到達させることと、
一旦、前記ＰＣＲゾーンの温度が前記変性ステージ温度に到達したら、第１の所定期間、前記ＰＣＲゾーンをほぼ前記変性ステージ温度に保つことと、
前記第１の所定期間が経過したら直ちに前記ＰＣＲゾーンの温度をアニール・ステージ温度に到達させることと、
一旦、前記ＰＣＲゾーンの温度が前記アニール・ステージ温度に到達したら、第２の所定期間、前記ＰＣＲゾーンをほぼ前記アニール・ステージ温度に保つことと、
前記第２の所定期間が経過したら直ちに前記ＰＣＲゾーンの温度を伸長ステージ温度に到達させることと、
一旦、前記ＰＣＲゾーンの温度が前記伸長ステージ温度に到達したら、第３の所定期間、前記ＰＣＲゾーンをほぼ前記伸長ステージ温度に保つこととを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲゾーンを通って前記サンプルが流れるとき前記サンプルの像を得る前記ステップが、
像トリガ・ポイントに到達したかどうか判断することと、
像トリガ・ポイントに到達していたら、
（ａ）所定の時間が経過するのを待つステップと、
（ｂ）一旦、所定の時間が経過したら、第１の励起源を作動させるか、またはその出力を増加させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後に前記サンプルの像を取得するステップと、
（ｄ）前記第１の励起源を停止させるか、またはその出力を低下させるステップとを実行することとを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の励起源が青色または赤色の発光ダイオードである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８のステップ（ｄ）の後、およびステップ（ｂ）の後に、
（ｆ）第２の励起源を作動させるか、または出力を増加させるステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の後に前記サンプルの像を取得するステップと、
（ｈ）前記第２の励起源を停止させるか、またはその出力を低下させるステップとが実行される請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ溶解ゾーンの像を得るステップと、
表示画面に前記像を表示するステップと、
ユーザが対象領域を規定するために前記像を使用するのを可能にするステップと、
対象領域を含むピクセル窓を求めるステップと、
検出器を動作させて前記ＤＮＡ溶解ゾーンの像を１秒当りいくつか取得し、かつ、各像について、前記求められたピクセル窓の中にあるピクセルだけを記録するステップとをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ溶解ゾーンの前記像に含まれる情報を用いて、測定された蛍光強度対温度を表示するグラフを作成することをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロチャネル内の核酸を増幅する方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、定常流のマイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実施する方法およびそのようなシステムでリアルタイムＰＣＲを監視する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出は、医学、法科学、生産加工、作物および動物育種、ならびに他の多くの分野の中核をなす。疾病症状（例えば癌）、感染性微生物（例えばＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝標識などの検出能力は、疾病診断および予後、マーカ利用選択、犯罪現場の特徴の正確な識別、工業生物を繁殖させる能力ならびに他の多くの技法を促進することができる。対象の核酸の完全性の測定が、感染または癌の病理学に関連することがある。
【０００３】
少量の核酸を検出する最も強力かつ基本的な技術の１つに、核酸配列のうちのいくらかまたはすべてを何度も複製し、次いで増幅産物を解析するものがある。ＰＣＲは、複数の様々な増幅法のなかで恐らく最も周知のものである。
【０００４】
ＰＣＲは、ＤＮＡの短い部分を増幅するための強力な技法である。ＰＣＲを用いると、単一のテンプレートＤＮＡ分子から始めて、ＤＮＡの何百万ものコピーを急速に生成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの単一ストランドへの変性、プライマーの変性ストランドへのアニール、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長の３段階の温度サイクルを含む。十分なコピーを検出して解析するように、このサイクルを繰り返す。
【０００５】
原理的には、各ＰＣＲサイクルがコピー数を２倍にすることができる。実際には、各サイクルの後に実現される増殖は常に２倍未満である。その上、ＰＣＲサイクルが続くと、必要とされる反応物質の濃度が低下するので、増幅されたＤＮＡ産物の形成は、最終的には停止する。
【０００６】
ＰＣＲに関する一般的な詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓの間の合弁事業（２００５年まで補足された）、および「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい。
【０００７】
リアルタイムＰＣＲは、一般にＰＣＲサイクルごとに１回、反応の進行に従って、増幅されたＤＮＡ産物の形成を測定する発展中の一連の技法を指す。時間にわたって産物の蓄積を監視すると、反応の効率を求めること、ならびにＤＮＡテンプレート分子の初期濃度を推定することが可能になる。リアルタイムＰＣＲについての一般的な詳細は、「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）を参照されたい。
【０００８】
増幅されたＤＮＡの存在を示すために、現在、いくつかの異なるリアルタイム検出化学がある。これらのうち大部分は、ＰＣＲ処理の結果として特性が変化する蛍光指示薬に依存する。これらの検出化学のなかに、２本鎖のＤＮＡに結合して螢光効率を向上させるＤＮＡ結合染料（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）がある。他のリアルタイム検出化学にフェルスターの共鳴エネルギー移動ＦＲＥＴを利用するものがあり、この現象によって、染料の螢光効率が、別の光吸収部分または消光剤への接近に強く依存する。これらの染料および消光剤は、一般にＤＮＡ配列専用プローブまたはプライマーに付加される。ＦＲＥＴベースの検出化学のなかに、加水分解プローブおよび構造プローブがある。加水分解プローブ（ＴａｇＭａｎ（登録商標）プローブなど）は、ポリメラーゼ酵素を使用して、オリゴヌクレオチド・プローブに付加された消光剤色素分子からレポータ色素分子を切断する。構造プローブ（分子指標など）は、オリゴヌクレオチドに付加された染料を利用するが、この染料の螢光発光は、対象ＤＮＡに交雑するオリゴヌクレオチドの構造変化に際して変化する。
【０００９】
リアルタイムＰＣＲを実施する市販の器具は複数ある。入手可能な器具の例には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７５００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｌｃｅｒおよびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０が含まれる。これらの器具向けのサンプル容器は閉管であり、これは、一般に少なくとも１０μｌのサンプル溶液を必要とする。特定の分析によって検出できるテンプレートＤＮＡの最低濃度が、およそ１マイクロリットル当り１分子であるなら、入手可能な器具についての検出限界は、１本のサンプルチューブ当りおよそ数十のターゲットになる。したがって、１分子の感知性を実現するためには、１〜１０００ｎｌの範囲で小さなサンプル体積を実験することが望ましい。
【００１０】
最近になって、ＰＣＲおよび他の増幅反応を実施するための複数の高スループット手法が開発されており、例えば、マイクロ流体デバイス中の増幅反応、ならびにデバイス内またはデバイス上で増幅核酸を検出して解析する方法を含む。増幅のための供試体の熱サイクルは、通常２つの方法のうちの１つで行われる。第１の方法では、デバイスにサンプル溶液が充填され、従来のＰＣＲ器具によく似て、温度は時間で循環される。第２の方法では、サンプル溶液は、空間的に、様々な温度領域を通って連続的に送られる。
【００１１】
例えば、Ｌａｇａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３、５６５〜５７０頁（２００１））は、２８０ｎｌのＰＣＲチャンバ内で１個のテンプレートＤＮＡの増幅および検出を実証した。産物の検出は、ＰＣＲ後にキャピラリ電気泳動法を用いて行われた。一方、Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０、１０４６〜１０４８頁（１９９８））は、９５℃（変性）、７２℃（伸長）および６０℃（アニール）の３つの定温ゾーンの上を通る蛇行チャネルを有するガラス基材を使用して定常流ＰＣＲを実証した。７２℃のゾーンを中央部に配置し、９５℃のゾーンから６０℃のゾーンへ進む際に、簡単にこれを通過する必要があった。
【００１２】
検出は、ＰＣＲ後にゲル電気泳動法を用いて行われた。このＰＣＲ技法は、反応槽の全表面の加熱に基づくものではないため、反応速度は、加熱速度／冷却速度ではなく流速によって求められる。これらの参照には、ＰＣＲ反応のリアルタイム監視を説明するものがない。
【００１３】
Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５、６０２９〜６０３３頁（２００３））は、温度制御された３つのブロックの周りに螺旋状に巻き付けられたポリイミド被覆の溶解石英キャピラリを使用する定常流ＰＣＲデバイスを説明している。サンプル体積は２μｌであった。検出は、ＰＣＲ後にゲル電気泳動法を用いて行われた。不透明なポリイミドの代わりにＰＴＦＥで被覆されたキャピラリを使用することにより、この器具をリアルタイムＰＣＲに適応する可能性に言及している。Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第２００５／０７５６８３号）も参照されたい。
【００１４】
Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，９６０，４３７号）は、３つの温度ゾーンを有する回転式チャネルを含むマイクロ流体デバイスを説明している。サンプルを導入し、これらのゾーンを通して回転式に送るために、複数の一体化されたバルブとポンプが使用される。
【００１５】
Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）は、１個の分子の増幅が可能なマイクロ流体デバイスを説明している。いくつかの真っすぐな並列チャネルを有する平面状のガラスデバイスが開示されている。対象のＤＮＡとＰＣＲ試薬の混合物が、これらのチャネルに噴射される。第１の実施形態では、チャネルはこの混合物で充填され、流れは止められる。次いで、チャネルの全長が熱的に循環される。熱サイクルが終了した後、ＤＮＡが増幅されている螢光領域を検出するために、チャネルが結像される。第２の実施形態では、温度が循環されるときにＰＣＲ混合物が増幅ゾーンを通って連続的に流れ、増幅ゾーンの下流で螢光が検出される。循環に費やされる時間、循環で移動する距離などを変更することにより、様々な度合いの増幅が実現される。この方法が、個々のサンプル要素の進行を時間にわたって監視するのでなく、連続する別個のサンプル要素に対して条件（経験される循環など）を変化させることは注目に値する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／８０６，４４０号
【特許文献２】米国特許出願第１１／５０５，３５８号
【特許文献３】国際公開第２００５／０７５６８３号
【特許文献４】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）
【非特許文献２】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓの間の合弁事業（２００５年まで補足された）
【非特許文献３】「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）
【非特許文献４】「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）
【非特許文献５】Ｌａｇａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３、５６５〜５７０頁（２００１）
【非特許文献６】Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０、１０４６〜１０４８頁（１９９８）
【非特許文献７】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５、６０２９〜６０３３頁（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
効率的かつ正確に実施することができるリアルタイムＰＣＲの堅固で高スループットの方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明はマイクロチャネル内の核酸を増幅するためのシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、定常流のマイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲを実施するためのシステム方法およびそのようなシステムでリアルタイムＰＣＲを監視するためのシステムおよび方法に関する。
【００２０】
したがって、第１の態様では、本発明は、リアルタイムＰＣＲを実施し、ＤＮＡを溶解するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、このシステムは、マイクロ流体チャネルであって、ＰＣＲゾーンおよびＤＮＡ溶解ゾーン、このチャネルと流体伝達する第１の試薬ウェル、ならびにこのチャネルと流体伝達する第２の試薬ウェルを有するマイクロ流体チャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、このマイクロ流体デバイスに接続され、このチャネルと流体伝達するストローと、このチャネルを通してサンプルを強制的に流すためのポンプと、緩衝液を保管するための緩衝液ウェルおよびＤＮＡサンプルを含むサンプル溶液を保管するためのサンプルウェルを備えるウェルプレートと、ウェルプレートの緩衝液ウェルと流体伝達であって緩衝液を保管するための緩衝液保管容器と、ウェルプレートを位置決めするように動作可能な位置決めシステムと、サンプルがチャネルのＰＣＲゾーンを通って流れる間サンプルの温度を循環させ、サンプルがＤＮＡ溶解ゾーンを通って流れる間サンプルに含まれるＤＮＡを溶解するために加熱するための温度制御システムと、ＰＣＲゾーンおよびＤＮＡ溶解ゾーンからの発光を検出するための結像システムであって、励起源ならびにＰＣＲゾーンおよび／またはＤＮＡ溶解ゾーンからの発光を検出するように構成され配置された検出器を備える結像システムと、（ａ）温度制御システム、（ｂ）位置決め装置、（ｃ）結像システム、および（ｄ）表示デバイスと通信する主コントローラとを含む。
【００２１】
第２の態様では、本発明は、リアルタイムＰＣＲを実施し、ＤＮＡを溶解する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、コンフィギュレーション情報を含むスクリプトを生成することと、ＰＣＲゾーンおよびＤＮＡ溶解ゾーンを有するマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを作製することと、コンフィギュレーション情報を得るためにスクリプトを読み取ることと、デバイスに対して、緩衝液を含む緩衝液ウェルおよびＤＮＡサンプルを含むサンプル溶液を含むサンプルウェルを有するウェルプレートを位置決めすることと、サンプル溶液を流す（サンプルはＤＮＡ溶解ゾーンを通る前にＰＣＲゾーンを通って流れる）ために圧力差を生成するように構成されたポンプを起動することと、サンプルがチャネルを通って流れている間に、ＤＮＡサンプルを増幅するために、スクリプトに含まれたコンフィギュレーション情報に従って、ＰＣＲゾーンを通ってサンプルが流れるときサンプルの温度を循環させ、サンプルがＰＣＲゾーンを通って流れるときサンプルの像を取得し、この像を処理し、かつ増幅されたＤＮＡを溶解することとを含む。
【００２２】
本発明の上記実施形態および他の実施形態が、添付図面を参照しながら以下で説明される。
【００２３】
添付図面は、本明細書に組み込まれて本明細書の一部を形成し、本発明の様々な実施形態を示す。図では、同じ参考番号は、同一の要素または機能的に類似した要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のいくつかの実施形態によるシステムを示すブロック図である。
【図２】本発明のいくつかの実施形態による温度制御システムを示すブロック図である。
【図３】本発明のいくつかの実施形態による結像システムを示すブロック図である。
【図４】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図５】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図６】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図７】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図８】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図９】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図１０】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図１１】本発明のいくつかの実施形態による処理を示す流れ図である。
【図１２】ＤＮＡ溶解ゾーンの像を示す図である。
【図１３】対象のユーザ定義領域を示す図である。
【図１４】ピクセル窓を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書で用いられる語「一」および「ある」は、「１つまたは複数」を意味する。
本発明は、リアルタイムＰＣＲおよび高分解能の熱溶解向けのシステムおよび方法を提供する。図１を参照すると、図１は、本発明のいくつかの実施形態によるシステム１００の機能ブロック図を示す。図１に示されるように、システム１００は、マイクロ流体デバイス１０２を含んでよい。マイクロ流体デバイス１０２は、１つまたは複数のマイクロ流体チャネル１０４を含んでよい。示された例では、デバイス１０２は、チャネル１０４ａおよびチャネル１０４ｂの、２つのマイクロ流体チャネルを含む。例示的実施形態では２つのチャネルだけが示されているが、デバイス１０２が２チャネル未満または２チャネル以上を有してよいように企図されている。例えば、いくつかの実施形態では、デバイス１０２は８つのチャネル１０４を含む。
【００２６】
デバイス１０２は、２つのＤＮＡ加工ゾーン、ＤＮＡ増幅ゾーン１３１（別称ＰＣＲゾーン１３１）およびＤＮＡ溶解ゾーン１３２を含んでよい。ＰＣＲゾーン１３１を通って進むＤＮＡサンプルはＰＣＲを受けることができ、溶解ゾーン１３２を通過するＤＮＡサンプルは高分解能熱溶解を受けることができる。図１に示されるように、ＰＣＲゾーン１３１はチャネル１０４の第１の部分を含み、溶解ゾーン１３２は、チャネル１０４の第１の部分から下流にある第２の部分を含む。
【００２７】
デバイス１０２は、ストロー１０８も含んでよい。ストロー１０８は、中空チューブの形でよい。ストロー１０８は、注入口１０９に接続される近位端を有し、この注入口は、チャネル１０４にストロー１０８の近位端を結合する。
【００２８】
デバイス１０２は、注入口１０９に接続された共通の試薬ウェル１０６も含んでよい。デバイス１０２は、各チャネル１０４向けの遺伝子座特異の試薬ウェル１０５も含んでよい。例えば、示された実施形態では、デバイス１０２は遺伝子座特異の試薬ウェル１０５ａを含み、この試薬ウェルはチャネル１０４ａに接続され、また、チャネル１０４ｂに接続された遺伝子座特異の試薬ウェル１０５ｂを含んでよい。デバイス１０２は、各チャネル１０４向けの廃棄物ウェル１１０も含んでよい。
【００２９】
共通の試薬ウェル１０６に保管される溶液は、ｄＮＴＰｓ、ポリメラーゼ酵素、塩類、緩衝液、表面を不動態化する試薬、分子を検出する１つまたは複数の非特異的蛍光性のＤＮＡ、流体マーカなどを含んでよい。遺伝子座特異の試薬ウェル１０５に保管される溶液は、ＰＣＲプライマー、シーケンス特異的蛍光性のＤＮＡプローブすなわちマーカ、塩類、緩衝液、表面を不動態化する試薬などを含んでよい。
【００３０】
チャネル１０４へサンプル溶液を導入するために、システム１００は、複数のウェル１９８を含むウェルプレート１９６を含んでよく、それらのうち少なくともいくつかはサンプル溶液（例えば核酸サンプルを含む溶液）を含む。示された実施形態では、ウェルプレート１９６は、主コントローラ１３０に接続された位置決めシステム１９４に接続される。
【００３１】
主コントローラ１３０は、テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な、ＰＸＩ−８１０５コントローラを使用して実施することができる。位置決めシステム１９４は、ステッピング駆動の制御のためにウェルプレート１９６を位置決めするための位置決め装置（例えばＰａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＡ（「Ｐａｒｋｅｒ」）から入手可能なＭＸ８０位置決め装置）、位置決め装置を駆動するためのステップ駆動（例えばＰａｒｋｅｒから入手可能なＥ−ＡＣ  Ｍｉｃｒｏｓｔｅｐｐｉｎｇ  Ｄｒｉｖｅ）、およびコントローラ（例えばＰａｒｋｅｒから入手可能な６Ｋ４コントローラ）を含んでよい。
【００３２】
チャネル１０４へサンプル溶液を導入するために、位置決めシステム１９４は、ウェル１９８のうちの１つに保管されたサンプル溶液にストロー１０８の遠位端が沈められるようにウェルプレート１９６を移動するように制御される。図１は、ウェル１９８ｎに保管されたサンプル溶液中に沈められている１０８の遠位端を示す。
【００３３】
強制的にサンプル溶液を、ストローの上方へ、そしてチャネル１０４内へ移動させるために、真空マニホールド１１２およびポンプ１１４が利用されてよい。真空マニホールド１１２は、デバイス１０２の一部分に操作しやすく接続されてよく、ポンプ１１４は、マニホールド１１２に操作しやすく接続されてよい。ポンプ１１４が起動されるとき、ポンプ１１４は圧力差を生成し（例えばポンプ１１４は廃棄物ウェル１１０から空気を抜き取ることができる）、ウェル１９８ｎ内に保管されたサンプル溶液は、この圧力差によって、ストロー１０８を上方へ流れ、注入チャネル１０９を通ってチャネル１０４内へ流れる。その上、この圧力差によって、ウェル１０６および１０５内の試薬がチャネル内へ流れる。したがって、ポンプ１１４は、チャネル１０４を通してサンプル溶液およびリアルタイムＰＣＲ試薬を強制的に流すように機能する。図１に示されるように、溶解ゾーン１３２はＰＣＲゾーン１３１から下流に配置される。したがって、サンプル溶液は、まずＰＣＲゾーンを通って流れ、次いで溶解ゾーンを流れる。
【００３４】
戻ってウェルプレート１９６を参照すると、ウェルプレート１９６は緩衝液ウェル１９８ａを含んでよい。一実施形態では、緩衝液ウェル１９８ａは緩衝液１９７を収容する。緩衝液１９７は、従来のリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ緩衝液など、従来のＰＣＲ緩衝液を含んでよい。従来のＰＣＲ緩衝液は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ他を含む複数の製造業者から入手可能である。
【００３５】
緩衝液ウェル１９８ａに緩衝液１９７を補充するために、システム１００は、緩衝液保管容器１９０および容器１９０からウェル１９８ａへ緩衝液１９７を送るためのポンプ１９２を含んでよい。その上、ポンプ１９２は、ウェル１９８ａに溶液１９７を追加するだけでなくウェル１９８ａから溶液１９７を除去し、それによって溶液１９７を再循環させるように構成されてよい。
【００３６】
ＰＣＲゾーン１３１を流れるＤＮＡサンプル向けのＰＣＲを実現するためにサンプルの温度を循環させる必要があるが、これは当技術で周知のことである。したがって、いくつかの実施形態では、システム１００は温度制御システム１２０を含む。温度制御システム１２０は、温度センサ、加熱器／冷却器および温度コントローラを含んでよい。いくつかの実施形態では、主コントローラ１３０がＰＣＲゾーンおよび溶解ゾーンを流れるサンプルの温度を制御することができるように、温度制御システム１２０が主コントローラ１３０とインターフェイスされる。
【００３７】
主コントローラ１３０は、グラフィカル・ユーザ・インターフェイスを表示するために表示デバイスに接続されてよい。主コントローラ１３０はユーザ入力デバイス１３４に接続されてもよく、このデバイスによって、ユーザは、主コントローラ１３０へデータおよび命令を入力することができる。
【００３８】
ＰＣＲゾーン１３１で生じるＰＣＲ処理および溶解ゾーン１３２で生じる溶解処理を監視するために、システム１００は結像システム１１８を含んでよい。結像システム１１８は、励起源、像取込みデバイス、コントローラおよび像記憶装置を含んでよい。
【００３９】
次に図２を参照すると、図２は、本発明のいくつかの実施形態による温度制御システム１２０を示す。図２に示されるように、温度制御システム１２０は、複数の加熱デバイスおよび／または冷却デバイス（例えばペルティエ・デバイスとしても知られている熱電冷却機ＴＥＣまたは他の加熱／冷却デバイス）、複数の温度コントローラおよび複数の温度センサを含んでよい。
【００４０】
示された実施形態では、温度制御システム１２０は、注入口１０９を加熱し冷却するためのＴＥＣ  ２０１、ＰＣＲゾーンを加熱し冷却するためのＴＥＣ  ２０２、溶解ゾーンを加熱し冷却するためのＴＥＣ  ２０３、および廃棄物ウェル１１０を加熱し冷却するためのＴＥＣ  ２０４を含む。ＴＥＣ  ２０１〜２０４の各々は、温度コントローラに接続されてよい。
【００４１】
例えば、示された実施形態では、ＴＥＣ  ２０１は温度コントローラ２２１に接続され、ＴＥＣ  ２０２は温度コントローラ２２２に接続され、ＴＥＣ  ２０３は温度コントローラ２２３に接続され、ＴＥＣ  ２０４は温度コントローラ２２４に接続される。いくつかの実施形態では、温度コントローラ２２１〜２２４は、Ｍｏｄｅｌ  ３０４０  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（カリフォルニア州アービンのＮｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）を使用して実施されてよい。他の実施形態では、コントローラ２２１〜２２４は、単に電力増幅器から成ってよい。
【００４２】
温度コントローラ２２１〜２２４は、主コントローラ１３０とインターフェイスされてよい。これによって、主コントローラ１３０は、デバイス１０２の様々な領域の温度を制御することができるようになる。温度制御システム１２０は、注入口１０９の温度を監視するための温度センサ２１１、ＰＣＲゾーン１３１の温度を監視するための温度センサ２１２、溶解ゾーン１３２の温度を監視するための温度センサ２１３、および廃棄物ウェル１１０の温度を監視するための温度センサ２１４も含んでよい。図２に示されるように、温度センサ２１１〜２１４は、温度コントローラおよび／または主コントローラ１３０と通信してよい。
【００４３】
温度制御システム１２０は、ＰＣＲゾーン１３１の温度を監視するための赤外線センサ２５０およびＰＣＲゾーン１３１を加熱するための電磁放射源２５１（例えば赤外線、ＲＦ、マイクロ波などの放射源）をさらに含んでよい。最後に、温度制御システム１２０は、１つまたは複数のＴＥＣ  ２０１〜２０４を冷却するために、ブロワおよびヒートシンクの２９０を含んでよい。
【００４４】
次に図３を参照すると、図３は、本発明のいくつかの実施形態による結像システム１１８を示す。図３に示されるように、結像システム１１８は、第１の検出器３１０、第２の検出器３０２、青色ＬＥＤ  ３４１、赤色ＬＥＤ  ３４２、第１のレーザ３１１、第２のレーザ３１２、および第３のレーザ３１３を含んでよい。２つの検出器が示されているが、結像システム１１８が１つの検出器だけを使用してよいように企図されている。
【００４５】
検出器３１０は、ＰＣＲゾーン１３１からの発光（例えば蛍光発光）を検出し、かつ検出された発光に対応する像データを出力するように構成され配置されてよい。検出器３１０は、Ｃａｎｏｎ  ５Ｄデジタル一眼レフカメラなど従来のデジタルカメラを使用して実施することができる。青色ＬＥＤ  ３４１および赤色ＬＥＤ  ３４２は、起動されたときＰＣＲゾーン１３１を照射するように構成され配置される。
【００４６】
検出器３０２は、溶解ゾーン１３２からの発光を検出し、かつ検出された発光に対応する像データを出力するように構成され配置されてよい。検出器３０２は、デジタルビデオカメラを使用して実施されてよい。一実施形態では、検出器３０２は電子を増殖する電荷結合デバイスＥＭＣＣＤを使用して実施される。
【００４７】
レーザ３１１〜３１３は、溶解ゾーンを照射するように構成され配置される。各レーザは、異なった波長の光を出力することができる。例えば、レーザ３１１は４８８ナノメートルの波長を有する光を出力することができ、レーザ３１２は４４５ナノメートルの波長を有する光を出力することができ、レーザ３１３は６２５ナノメートルの波長を有する光を出力することができる。
【００４８】
結像システム１１８は、検出器３１０、３０２、および励起源３４１、３４２、３１１、３１２、および３１３を制御するためのコントローラ３３０を含んでよい。コントローラ３３０は、検出器によって生成された像データを処理するように構成されてよい。コントローラ３３０は、従来のマイクロプロセッサを使用して実施されてよい（例えば、コントローラ３３０は、従来のパーソナルコンピュータから成ってよい）。コントローラ３３０に、検出器３１０および３０２によって収集された像データを保存するための像記憶装置３３１が結合されてよい。コントローラ３３０は、主コントローラ１３０と通信してよい。コントローラ３３０は、主コントローラに直接接続されるか、あるいはスイッチ３９０または他の通信装置（例えばイーサネット（登録商標）・ハブ）を介して主コントローラに接続されてよい。
【００４９】
次に図４を参照すると、図４は、本発明のいくつかの実施形態によってＤＮＡを増幅し溶解する処理４００を示す流れ図である。ユーザが主コントローラ１３０を作動させたとき、処理４００が４０２で始まってよく、次いで、この処理は自動的にシステム・チェックを実行し、システム１００の他の要素を初期化する。
【００５０】
ステップ４０４で、ユーザは「スクリプト」を生成してよい（すなわち、ユーザはコンフィギュレーション情報を入力してよい）。ステップ４０６で、ユーザは、デバイス１０２を作製してシステム１００内へデバイス１０２を設置する。ステップ４０８で、ユーザは、結像システム１１８を構成し、かつ／または調整してよい。ステップ４１０で、主コントローラ１３０は、安全チェックを実行してよい。ステップ４１２で、主コントローラ１３０は、ユーザによって生成されたスクリプトを読み取ってコンフィギュレーション情報を得る。
【００５１】
ステップ４１４で、位置決めシステム１９４はウェルプレート１９６を位置決めし、その結果ストロー１０８の遠位端がプレート１９６のウェル１９８のうち１つの中に含まれるサンプル溶液に沈められ、主コントローラ１３０がサンプル・ポンプ１１４へ信号を送って汲み出し始める。サンプル・ポンプ１１４を起動することにより、サンプル溶液がチャネル１０４を通って流れる。ステップ４１６で、サンプル溶液がチャネル１０４を通って流れている間、ＰＣＲゾーン１３１の温度は、ユーザによって生成されたスクリプト中のコンフィギュレーション情報に従って循環される。
【００５２】
ステップ４１８で、ＰＣＲゾーン１３１の温度が循環されている間に、結像システム１１８はＰＣＲゾーンの像を得る。ステップ４２０で、ＤＮＡ増幅が成功したかどうか判断するために像データが処理される。ステップ４２２で、ＰＣＲが成功したかどうか判定する。成功しなかった場合、処理はステップ４２４に進んでよく、そこでユーザは警告を受ける。ＰＣＲが成功していると、次いで処理はステップ４２６に進んでよく、そこで溶解ゾーン１３２の温度がスクリプトに従って制御され、その間に像が得られて保存される。ステップ４２６の後、処理はステップ４１６へ戻ってよい。
【００５３】
図４が示すように、ユーザは、システム１００を使用して、ＤＮＡのサンプルを増幅し、増幅処理を監視し、増幅されたＤＮＡを溶解し、かつ溶解処理を監視することができる。したがって、システム１００は、ＤＮＡ解析向けの有益なツールを提供することができる。
【００５４】
次に図５を参照すると、図５は、本発明のいくつかの実施形態によって処理４００のステップ４０２を実施するための処理５００を示す流れ図である。
【００５５】
処理５００はステップ５０１で始まってよく、そこで主コントローラ１３０はシステム１００の他の要素に電力を供給する。ステップ５０２で、主コントローラ１３０は、他の要素が適切に機能しているかどうか判断してよい。１つまたは複数の他の要素が適切に機能していないと判断される場合、処理はステップ５０３に進んでよく、そこで主コントローラ１３０は問題があるかもしれないことをユーザに知らせる。そうでなければ、処理はステップ５０４に進んでよい。
【００５６】
ステップ５０４で、主コントローラ１３０は上部ポンプ１９２を起動する。これによって、緩衝液１９７がウェル１９８ａを充填する。ステップ５０６で、主コントローラ１３０はヒートシンクおよびブロワの２９０を起動する。ステップ５０８で、温度制御システム１２０は試薬ウェルの温度を２５℃に設定するように操作される。ステップ５１０で、この温度制御システムは廃棄物ウェルの温度を２５℃に設定するように操作される。ステップ５１２で、この温度制御システムはＰＣＲゾーン１３１の温度を５５℃に設定するように操作される。ステップ５１４で、この温度制御システムは溶解ゾーン１３２の温度を２５℃に設定するように操作される。ステップ５１６で、ウェルプレート１９６を定位置に移動させるために位置決めシステム１９４が使用される。ステップ５１８で、主コントローラ１３０は、圧力値がすべてそれらの初期設定値に等しくなるのを待つ。
【００５７】
次に図６を参照すると、図６は、いくつかの実施形態によって処理４００のステップ４０６を実施するための処理６００を示す流れ図である。
【００５８】
処理６００はステップ６０２で始まってよく、そこでユーザは遺伝子座特異の試薬ウェル１０５を充填し、共通の試薬ウェル１０６を充填し、次いでデバイス保持具（図示せず）にデバイスを配置する。ステップ６０４で、ユーザは、ウェルプレート１９６を所望の位置に位置決めするように、位置決めシステム１９４を手動で制御してよい。例えば、ユーザは、ストロー１０８がウェルプレート１９６の所望のウェル１９８内に配置されるようにウェルプレート１９６を位置決めしてよい。
【００５９】
ステップ６０６で、ユーザは、所望のチャネル圧力を入力してよく、また、サンプル・ポンプ１１４を起動してよい。サンプル・ポンプ１１４を起動すると、ストロー１０８が配置されたウェル１９８内にあるサンプル溶液が流入し、チャネル１０４を通って流れる。また、サンプル・ポンプ１１４を起動することによって、ウェル１０６および１０５にある試薬液がチャネルに流入する。ステップ６０８で、ユーザは、チャネル１０４を通るサンプル溶液の流れを監視してよい。例えば、結像システム１１８によって得られた像が表示デバイス１３２に表示されることになり、これらの像は、チャネル１０４を通って移動しているサンプル溶液を示すことができる。
【００６０】
ステップ６１０で、ユーザは、チャネルの圧力を調整するべきかどうか決定してよい。チャネルの圧力を調整すると、サンプル溶液がチャネルを流れる速度が増加するかまたは低下することになる。圧力を調整した後に、サンプル・ポンプ１１４は、ユーザが昇圧または減圧の調整をしたかどうかに従って、より強く、またはより弱く、運転することになる。
【００６１】
次に図７を参照すると、図７は、いくつかの実施形態によって処理４００のステップ４０８を実施するための処理７００を示す流れ図である。
【００６２】
処理７００は、ステップ７０２で始まってよく、そこでユーザは、ＰＣＲゾーン１３１を結像する検出器３１０向けにフィルタを選択してよい。ステップ７０４で、ユーザは、主コントローラ１３０へ、選択されたフィルタを識別する識別子を入力する。ステップ７０６で、検出器３１０は、ＰＣＲゾーン１３１の像を得てよい。ステップ７０８で、この像が表示デバイス１３２に表示されてよい。主コントローラ１３０は、表示デバイス１３２に、７０６で得られた像を表示するとともに基準画像も表示してよい。
【００６３】
ステップ７１０で、ユーザは、ステップ７０６で得られた像をステップ７０８で表示された基準画像と比較してよい。比較によって検出器３１０の焦点が適切に調整されていないことが示されたなら、処理７００はステップ７１４に進んでよく、そうでなければ、ステップ７１６に進んでよい。ステップ７１４で、ユーザは、検出器３１０の焦点を調整してよい。例えば、ユーザは、検出器３１０をＰＣＲゾーン１３１に近づけるかまたは検出器から遠ざけてよい。ステップ７１４の後、処理７００はステップ７０６へ戻ってよい。ステップ７１６で、ステップ７０６で得られた像は、正規化計算のために保存され、使用されてよい。
【００６４】
ステップ７１８で、ユーザは、溶解ゾーン１３２を結像する検出器３０２の前に、選択されたフィルタを位置決めしてよい。ステップ７２０で、ユーザは、レーザ３１１〜３１３のうち選択された１つを作動させてよく、選択されたレーザの出力を調整してよい。ステップ７２２で、溶解ゾーン１３２上の像が得られ、表示デバイス１３２に表示される。ステップ７２４で、ユーザは、必要に応じて、チャネル１０４を横切るようにレーザを調整してよい。例えば、ステップ７２２で得られた像が、レーザが適切に位置合わせされていないことを示すなら、ユーザは、チャネル１０４を横切るように適切にレーザを位置合わせしてよい。
【００６５】
ステップ７２６で、ユーザは、検出器３０２の焦点が正確かどうか判断してよい。焦点が不適切であれば、処理７００は、ステップ７２８に進んでよく、そうでなければステップ７３０に進んでよい。ステップ７２８で、ユーザは、検出器３０２の焦点を調整する。ステップ７２８の後、処理はステップ７２２へ戻ってよい。ステップ７３０で、最新の正規化計算のために、ステップ７２２で得られた像が保存される。
【００６６】
次に図８を参照すると、図８は、いくつかの実施形態によって処理４００のステップ４１４を実施するための処理８００を示す流れ図である。
【００６７】
処理８００は、ステップ８０２で始まってよく、そこで主コントローラ１３０は、ウェルプレート１８６を所定の「ホーム」位置へ移動する。ステップ８０４で、主コントローラ１３０は、サンプル・ポンプ１１４を所定の圧力に設定する。ステップ８０６で、主コントローラ１３０はユーザによって生成されたスクリプトを読み取って、ウェルプレートのどのウェルを最初に使用するべきか判断する。ステップ８０８で、主コントローラ１３０は、ステップ８０６で求めたウェルにストロー１０８を配置するように、位置決めシステム１９４でウェルプレート１９６を移動させる。ステップ８０９で、主コントローラ１３０は、設定された流れモードが可変流モードか固定流モードか、判断してよい。設定されている流れモードが可変流モードであれば、次いで、処理８００は、ステップ８１０に進んでよく、そうでなければステップ８１２に進んでよい。
【００６８】
ステップ８１０で、主コントローラ１３０は、チャネル１０４を通って移動しているサンプルの速度の計算に少なくとも部分的に基づいてサンプル・ポンプ１１４を調整する。この速度計算は、例えば参照によって本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／５０５，３５８号に開示されたものなどのように、とりわけサンプルがチャネル１０４を通って移動するのにつれて様々な時刻に得られたサンプル像に基づいてよい。ステップ８１２で、主コントローラ１３０は所定の時間待つ。この所定の時間は、ユーザによって生成されたスクリプト中に設定されていてよい。所定の時間が終了した直後、処理８００はステップ８１２からステップ８１４に進んでよい。ステップ８１４で、主コントローラ１３０は、緩衝液ウェル１９８ａにストロー１０８を配置するように、位置決めシステム１９４でウェルプレート１９６を移動させる。
【００６９】
ステップ８１６で、主コントローラ１３０は、設定されている流れモードが可変流モードか固定流モードか判断する。設定されている流れモードが可変流モードであれば、次いで、処理８００はステップ８１６からステップ８１８に進んでよく、そうでなければ、処理８００はステップ８１６からステップ８２０に進んでよい。ステップ８１８で、主コントローラ１３０は、チャネル１０４を通って移動しているサンプルの速度の計算に少なくとも部分的に基づいてサンプル・ポンプ１１４を調整する。ステップ８２０で、主コントローラ１３０は所定の時間待つ。ステップ８２２で、主コントローラ１３０は、別のサンプルがチャネル１０４へ導入されるべきかどうか判断する。チャネル１０４へ他のサンプルを導入する必要がないなら、処理はステップ８２２からステップ８１６に進んでよく、そうでなければ、処理はステップ８２２からステップ８０６に進んでよい。
【００７０】
次に図９を参照すると、図９は、いくつかの実施形態によって処理４００のステップ４１６を実施するための処理９００を示す流れ図である。
【００７１】
処理９００は、ステップ９０２で始まってよく、そこで主コントローラ１３０は、ＰＣＲゾーン１３１向けの初期温度を求めるために、ユーザによって生成されたスクリプトを読み取る。ステップ９０４で、主コントローラは、ＰＣＲゾーン１３１の温度を初期温度に到達させる。例えば、ステップ９０４で、主コントローラ１３０は、ＰＣＲゾーンの温度制御システムに対して、初期温度に達するように信号を送ってよい。
【００７２】
ステップ９０６（このステップはＰＣＲゾーンの初期温度到達後まで実行されなくてよい）で、主コントローラ１３０は、ＰＣＲゾーン１３１の温度を変性ステージ温度（例えば約９５℃）に到達させる。ＰＣＲゾーン１３１の温度が変性温度に到達した直後に、ステップ９０８で、主コントローラ１３０は所定の時間待つ。
【００７３】
所定の時間が経過した後、ステップ９１０で、主コントローラ１３０は、ＰＣＲゾーン１３１の温度をアニール・ステージ温度（例えば約５５℃）に到達させる。一旦ＰＣＲゾーンの温度がアニール温度に到達すると、ステップ９１２で、主コントローラ１３０は所定の時間待つ。
【００７４】
所定の時間が経過した直後、ステップ９１４で、主コントローラ１３０は、ＰＣＲゾーン１３１の温度を伸長ステージ温度（例えば約７２℃）に到達させる。ＰＣＲゾーンの温度が伸長ステージ温度に到達した直後、ステップ９１６で、主コントローラ１３０は所定の時間待つ。ステップ９１６の後、処理はステップ９１８に進んでよく、そこで主コントローラ１３０は別のＰＣＲサイクルが必要かどうか判断する。別のＰＣＲサイクルが必要であれば、処理９００はステップ９０６へ戻ってよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ステップ９０６は、電磁放射源２５１を作動させるかまたはその出力を増加させ、同時にＴＥＣ  ２０２を停止させるかまたはその熱出力を低下させるステップを含む。また、いくつかの実施形態では、ステップ９０８は、電磁放射源２５１を停止させるかまたはその出力を低下させ、同時に、できるだけ急速にアニール温度が達成されるようにＴＥＣ  ２０２を制御するステップを含む。
【００７６】
次に図１０を参照すると、図１０は、いくつかの実施形態によって処理４００のステップ４１８を実施するための処理１０００を示す流れ図である。
【００７７】
処理１０００は、ステップ１００２で始まってよく、そこで、結像トリガ・ポイントに到達したかどうか判断される。いくつかの実施形態では、ＰＣＲサイクルが伸長ステージを開始する時点に間に合って、結像トリガ・ポイントに到達する。
【００７８】
一旦結像トリガ・ポイントに到達すると、ステップ１００４で、主コントローラ１３０は、所定の時間待って温度が安定するのを可能にするが、この所定の時間は、ユーザによって生成されたスクリプト中に規定されていてよい。
【００７９】
ステップ１００６で、主コントローラ１３０は、スクリプトに基づいてＬＥＤ  ３４１または３４２のうち１つを選択し、選択されたＬＥＤを所定の時間オンにするが、この所定の時間はスクリプト中に規定されていてよく、次いで、所定の時間の終了後、選択されたＬＥＤを直ちにオフにする。
【００８０】
ステップ１００８で、コントローラ３４０は、スクリプトに従ってＰＣＲゾーン１３１検出器（例えば検出器３１０）を構成してよい。例えば、コントローラは、検出器開口およびシャッタ速度を設定してよい。
【００８１】
ステップ１０１０で、ＰＣＲゾーン１３１の像を得るために検出器３１０が使用される。ステップ１０１２で、この像が保存される。ステップ１０１４で、主コントローラ１３０は、２色が必要かどうか判断する。２色が必要であれば、処理は、ステップ１０１４からステップ１０１６へ進んでよく、そうでなければ、処理は、ステップ１０１４からステップ１００２へ戻ってよい。
【００８２】
ステップ１０１６で、主コントローラ１３０はステップ１００６で選択されたものとは異なるＬＥＤを選択し、次いで、選択されたＬＥＤを所定の時間オンにし、次いで、所定の時間の終了後直ちにＬＥＤをオフにする。ステップ１０１６の後、処理１０００はステップ１００８へ進んでよい。
【００８３】
次に図１１を参照すると、図１１は、いくつかの実施形態によって処理４００のステップ４２６を実施するための処理１１００を示す流れ図である。
【００８４】
処理１１００は、ステップ１１０２で始まってよく、そこで、溶解処理向けの温度プロファイルが求められる。例えば、温度プロファイルは、最高温度、最低温度およびランプ速度を含んでよい。ステップ１１０４で、溶解ゾーン１３２は、求められた温度プロファイルに従って加熱される。例えば、主コントローラ１３０は、温度制御システム１２０によって溶解ゾーン１３２の温度を最低温度に到達させてよく、一旦最低温度に到達したら、主コントローラ１３０は、温度制御システム１２０によって、ランプ速度と等しい速度で溶解ゾーンの温度を最高温度へ上昇させてよい。
【００８５】
ステップ１１０６で、溶解ゾーン１３２の像が取り込まれて表示デバイス１３２に表示される。図１２は、ステップ１１０６で表示デバイス１３２を使用して表示され得る像１２０１を示す。ドット１２０２の各々は、チャネル１０４を表わす（すなわち、ドット１２０２ａはチャネル１０４ａを表わし、ドット１２０２ｂはチャネル１０４ｂを表わす）。
【００８６】
像が表示された後、ステップ１１０８で、ユーザは各チャネル１０４についての対象領域を規定してよい。このステップは図１３に示され、これは、各チャネルについての対象領域１３０２を示す。
【００８７】
ユーザが対象領域を規定した後、ステップ１１１０で、主コントローラ１３０は、対象領域をすべて含むピクセル窓１４０２（図１４を参照されたい）を求めてよい。いくつかの実施形態では、ピクセル窓は、対象領域のすべてを含む、検出器３０２のセンサの最も小さな長方形のピクセル領域である。
【００８８】
ステップ１１１２で、溶解ゾーン１３２を結像する検出器３０２は、１秒当りいくつかの像（例えば１秒につき少なくとも約１０の像）を得ることができるように動作するが、各像に関して、ピクセル窓に含まれるピクセルだけを記録する。
【００８９】
ステップ１１１４で、記録された像データから、ユーザによって定義された対象領域が抽出される。ステップ１１１６で、各対象領域について蛍光強度が計算される。ステップ１１１８で、主コントローラ１３０は、相対的螢光単位量対温度をプロットする。ステップ１１２０で、主コントローラ１３０は、導関数対温度をプロットする。ステップ１１２２で、溶解処理が十分かどうか判断される。溶解処理が十分でないなら、処理はステップ１１１２へ戻ってよく、そうでなければ、処理は、処理４００のステップ４１６へ進んでよい。
【００９０】
上記に本発明の様々な実施形態／変形形態が説明されてきたが、それらが例としてのみ示され、限定するためではないことを理解されたい。したがって、本発明の広範さおよび範囲は、前述の例示的実施形態のうちのいかなるものによっても限定されるべきではない。
【００９１】
その上、前述の図示された処理は、一連のステップとして示されているが、これはもっぱら説明のためになされたものである。したがって、いくつかのステップを付加していくつかのステップを省くことができるように企図されており、ステップの順序は並べかえてよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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