(57)【要約】本明細書は、Ｎｏｒｒｉｎ活性がＷｎｔ経路シグナル伝達に関する時に、Ｎｏｒｒｉｎ活性を調整する試薬をスクリーニングし、同定するための物質および方法を開示する。好ましくは、それによって同定された作用物質は、骨リモデリングおよび／または脂質レベルを調整し、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体およびＮｏｒｒｉｎアゴニストならびにＬＲＰ５／Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体の他のアゴニストおよび模倣体とすることができる。
2009525754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨または脂質を調整する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）作用物質の存在下で、ＬＲＰ５タンパク質または生物学的活性ＬＲＰ５タンパク質と共に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質または生物学的活性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４ポリペプチド断片を提供するステップおよび
（ｂ）前記作用物質が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片および／またはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片と相互作用し、骨および／または脂質の少なくとも１つのパラメーターを調整するかどうかを決定するステップを含む方法。
【請求項２】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片は、前記ＬＲＰ５タンパク質またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片に連結される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作用物質は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
骨代謝または脂質代謝を調整する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）前記作用物質の存在下で、ＬＲＰ５タンパク質および／もしくはＬＲＰ６タンパク質またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６の生物学的活性ポリペプチド断片に融合されたＮｏｒｒｉｎタンパク質または生物学的活性Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド断片およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片を提供するステップおよび
（ｂ）骨調整および／または脂質調整の少なくとも１つのパラメーターを、骨代謝または脂質代謝を調整する前記作用物質を同定するために測定するステップを含む方法。
【請求項５】
前記骨調整のパラメーターは、骨密度、骨強度、骨梁数、骨の大きさ、もしくは組織結合性またはそれらの任意の組合せである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質調整のパラメーターは、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、コレステロール、トリグリセリド、ａｐｏＥ、またはＬＤＬのレベルの変化である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定される骨パラメーターは、調整されるＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、ｅＮＯＳ、Ｗｎｔ１０Ｂ、サイクリンＤ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２、およびＷＩＳＰ２のうちの１つまたは複数の発現の変更である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記測定される骨パラメーターは、調整されるＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、およびｅＮＯＳのうちの１つまたは複数の発現の変更である、請求項１〜４および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｄｋｋタンパク質または生物学的活性Ｄｋｋポリペプチド断片をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｋｒｅｍｅｎタンパク質または生物学的活性Ｋｒｅｍｅｎポリペプチド断片をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｄｋｋタンパク質または生物学的活性Ｄｋｋポリペプチド断片をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｗｎｔタンパク質または生物学的活性Ｗｎｔポリペプチド断片をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性を調整する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）前記作用物質、ＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６の生物学的活性ポリペプチド断片に融合した、またはＬＲＰ５のポリペプチド断片を含有するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に融合したＮｏｒｒｉｎタンパク質またはＮｏｒｒｉｎの生物学的活性ポリペプチド断片およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片ならびに
（ｉ）Ｋｒｅｍｅｎタンパク質および／または
（ｉｉ）Ｄｋｋタンパク質
を提供するステップおよび
（ｂ）前記作用物質が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性を調整するかどうかを決定するステップを含む方法。
【請求項１４】
前記作用物質は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｄｋｋアンタゴニスト、またはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１つまたは複数のタンパク質は基体上に添加される請求項１〜４および１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
骨調整または脂質調整を調節する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５を発現する細胞に前記作用物質を投与するステップであって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質または生物学的活性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４ポリペプチドであり、ＬＲＰ５は、ＬＲＰ５タンパク質またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチドであるステップ、
（ｂ）前記作用物質の投与が、ＬＲＰ５−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用を調整するかどうかを決定するステップ、および
（ｃ）前記作用物質が、骨パラメーターまたは脂質パラメーターを調整するかどうかを決定するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記作用物質は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｄｋｋアンタゴニスト、またはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、Ｎｏｒｒｉｎを発現しない請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、非内在性のＦｒｉｚｚｌｅｄ４、ＬＲＰ５、および／またはＮｏｒｒｉｎを発現する請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
骨調整または脂質調整を調節する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＬＲＰ５、Ｎｏｒｒｉｎ、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４を発現する細胞に前記作用物質を投与するステップであって、ＬＲＰ５は、ＬＲＰ５タンパク質または生物学的活性ＬＲＰ５ポリペプチドであり、Ｎｏｒｒｉｎは、Ｎｏｒｒｉｎタンパク質または生物学的活性Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチドであるステップ、
（ｂ）前記作用物質の投与が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用を調整するかどうかを決定するステップ、および
（ｃ）前記作用物質が、骨調整または脂質調整のパラメーターを調整するかどうかを決定するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記細胞は、非内在性のＮｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４を発現する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、内在性Ｎｏｒｒｉｎを発現しない請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記作用物質は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｄｋｋアンタゴニスト、またはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストである請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＲＰ５は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と共に融合ポリペプチドとして同時発現される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は、脊椎動物細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞は、骨細胞、腎臓細胞、間葉系細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、またはアフリカツメガエル細胞である請求項２０および２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質調整のパラメーターは、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、コレステロール、ａｐｏＥ、および／もしくはＬＤＬまたはそれらの任意の組合せのレベル変化である請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨調整のパラメーターは、骨密度、骨強度、骨梁数、骨の大きさ、もしくは組織結合性またはそれらの任意の組合せである請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨調整のパラメーターは、ＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、ｅＮＯＳ、Ｗｎｔ１０Ｂ、サイクリンＤ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２、およびＷＩＳＰ２のうちの１つまたは複数の前記作用物質の投与により誘発された発現の変更であり、前記作用物質の前記投与により調整される請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記骨調整のパラメーターは、ＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、およびｅＮＯＳのうちの１つまたは複数の前記作用物質の投与により誘発された発現の変更である請求項２０および２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
他の一連の細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＤｋｋを同時発現し、前記作用物質がＮｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４のＤｋｋによる阻害を調整するかどうかを決定する請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
他の一連の細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、およびＫｒｅｍｅｎを同時発現し、前記作用物質がＮｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４のＫｒｅｍｅｎによる阻害を調整するかどうかを決定する請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
他の一連の細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｋｒｅｍｅｎ、およびＤｋｋを発現し、前記作用物質が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４のＫｒｅｍｅｎおよび／またはＤｋｋによる阻害を調整するかどうかを決定する請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
他の一連の細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｗｎｔ、およびＤｋｋを発現し、前記作用物質が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４のＤｋｋによる阻害を調整するかどうか決定する請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｄｋｋは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、もしくはＤｋｋ４またはＤｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、もしくはＤｋｋ４の生物学的活性ポリペプチドである請求項９、１１、１３〜１５、１７、２３、３１、３３、および３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
Ｋｒｅｍｅｎは、Ｋｒｅｍｅｎ１もしくはＫｒｅｍｅｎ２またはＫｒｅｍｅｎ１もしくはＫｒｅｍｅｎ２の生物学的活性ポリペプチドである請求項１０、３２、および３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞におけるＬＲＰ５活性の増大について前記作用物質をスクリーニングするステップをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞は、骨細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、幹細胞、または腎臓細胞である請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記骨細胞は、ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞、ＫＨＯＳ−２４０Ｓ細胞、ＫＨＯＳ−３２１Ｈ細胞、ＤＳＤｈ細胞、ＶＡ−ＥＳ−ＢＪ細胞、７Ｆ２細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨＯＳＴＥ８５細胞、ＲＯＳ細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ６細胞、ＵＭＲ−１０６細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＧ６３細胞、またはＨＯＢ細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記骨細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞である請求項３８および３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記間葉系幹細胞は、ヒト成人間葉系幹細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記腎臓細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
動物に前記作用物質を投与するステップ、および前記作用物質が、前記動物における骨量の変化を誘発するかどうかを決定するステップをさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項４５】
前記動物は、トランスジェニック動物である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記トランスジェニック動物は、ＬＲＰ５またはＨＢＭトランスジェニック動物である請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記トランスジェニック動物は、Ｎｏｒｒｉｎノックアウト動物またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４ノックアウト動物である請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記動物は、マウスである請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
Ｗｎｔは、Ｗｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である請求項１２または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
Ｗｎｔは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、またはＷｎｔ１０ｂである請求項１２、３４、および４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ＬＲＰ５−Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性を調整する作用物質を同定するためのキットであって、
（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片をコードする核酸で同時形質移入された、Ｎｏｒｒｉｎを発現することができない一連の細胞、
（ｂ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５またはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＤｋｋ核酸、
（ｃ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５もしくはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのならびに／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４、ＬＲＰ５、およびＤｋｋもしくはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＫｒｅｍｅｎ核酸、
（ｄ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５または生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＬＲＰ６核酸、および
（ｅ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５またはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＷｎｔ核酸、
を含むキット。
【請求項５２】
前記細胞は、脊椎動物細胞である請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
ＬＲＰ５−Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性の調整を測定するためのレポーター系をさらに含む請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
Ｄｋｋは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、またはＤｋｋ４であり、Ｋｒｅｍｅｎは、Ｋｒｅｍｅｎ１またはＫｒｅｍｅｎ２である請求項５１に記載のキット。
【請求項５５】
前記脊椎動物細胞は、骨細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、アフリカツメガエル細胞、または幹細胞である請求項５２に記載のキット。
【請求項５６】
前記骨細胞は、ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞、ＫＨＯＳ−２４０Ｓ細胞、ＫＨＯＳ−３２１Ｈ細胞、ＤＳＤｈ細胞、ＶＡ−ＥＳ−ＢＪ細胞、７Ｆ２細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨＯＳＴＥ８５細胞、ＲＯＳ細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ６細胞、ＵＭＲ−１０６細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＧ６３細胞、およびＨＯＢ細胞である請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記腎臓細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞である請求項５５に記載のキット。
【請求項５９】
前記骨細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞である請求項５５および５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
Ｗｎｔは、Ｗｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である請求項５１に記載のキット。
【請求項６１】
Ｗｎｔは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、またはＷｎｔ１０ｂである請求項５１および６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６２】
前記作用物質が、脊椎動物中の脂質を調整するかどうかを決定するステップを含む請求項１〜４、１３、１６、または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記作用物質が、脊椎動物中の骨を調整するかどうかを決定するステップを含む請求項１〜４、１３、１６、または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
天然Ｎｏｒｒｉｎを欠き、非天然ＬＲＰ５および非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４を発現する細胞または細胞株であって、前記非天然ＬＲＰ５は、非天然ＬＲＰ５タンパク質またはその生物学的活性断片であり、前記非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはその生物学的活性断片である細胞または細胞株。
【請求項６５】
前記非天然ＬＲＰ５および／または非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は安定的に発現される請求項６４に記載の細胞株。
【請求項６６】
非天然Ｄｋｋおよび／もしくは非天然Ｋｒｅｍｅｎまたは非天然Ｄｋｋもしくは非天然Ｋｒｅｍｅｎの生物学的活性ポリペプチド断片をさらに発現する請求項６４に記載の細胞株。
【請求項６７】
前記非天然Ｄｋｋは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、またはＤｋｋ４であり、前記非天然Ｋｒｅｍｅｎは、Ｋｒｅｍｅｎ１またはＫｒｅｍｅｎ２である請求項６４の細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表への参照）
本明細書とともに提出される配列番号１〜２８を含む配列表は、全ての目的のために参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｎｏｒｒｉｎ遺伝子もしくはＮｏｒｒｉｎタンパク質を調節する物質および方法、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、またはＮｏｒｒｉｎと相互作用し、それによってＬＲＰ５／Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体におけるその活性を調整する作用物質に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ＮｏｒｒｉｎまたはＮｏｒｒｉｅ疾患タンパク質（ＮＤＰもしくはＮｄｐｈ）における突然変異は、Ｘ連鎖劣性神経症候群であるＮｏｒｒｉｅ疾患（ＮＤ）につながる（非特許文献１；および非特許文献２；たとえば、ヒト配列については、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ２９９０１、ＢＣ０２９９０１、およびＣＡＡ４６６３９ならびにハツカネズミ配列については、ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＡ５８７２５、ＣＡＡ６３１３４、およびＸ８３７９４）。ＮＤＰをコードする遺伝子は、ヒトゲノム上のＸｐｌ１．４に位置する。疾患の特徴は、網膜形成異常、失明、および精神遅滞を含む。ＮＤＰノックアウトマウスは、ヒトＮｏｒｒｉｅ疾患に似ている眼表現型を有し（非特許文献３）、網膜血管形成における不全を示す。この遺伝子はまた、コーツ病（網膜毛細管拡張症）、Ｘ連鎖滲出性硝子体網膜症（ＥＶＲＸ）、および進行した未熟児網膜症（ＲＯＰ）にも関係づけられる。
【０００４】
ＮＤＰ突然変異はまた、ＮＤ症状のいくつかを隠し持つ、Ｘ連鎖型の家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）を引き起こし得る。ＦＥＶＲはまた、Ｗｎｔシグナル伝達の１０種の蛇行している７回膜貫通型受容体の１つをコードするＦｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚ４）遺伝子における突然変異によっても引き起こされる（非特許文献４）。
【０００５】
Ｗｎｔファミリーは、１９種のメンバーから成り、それらは、１０種のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）タンパク質との高親和性相互作用を示す。異なるＷｎｔは、種々のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に対して異なる親和性を有し、異なる経路に従事する可能性がある（非特許文献５）。Ｗｎｔ標準経路は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよびその共受容体であるリポタンパク質関連受容体タンパク質５または６（ＬＲＰ５／ＬＲＰ６）との相互作用を介したベータ−カテニン安定化を伴う。患者およびマウスでは、ＬＲＰ５における機能喪失型突然変異もまた、骨粗鬆症に加えて血管の眼異常を示し、骨粗鬆症偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）を起こす（非特許文献６；および非特許文献７）。
【０００６】
Ｎｏｒｒｉｎは、Ｗｎｔベータ−カテニン経路を誘発することができる（非特許文献８）。Ｎｏｒｒｉｎは、Ｗｎｔと同様に機能する、なぜなら、両者は、シグナル伝達のために、Ｆｚ受容体およびＬＲＰ５／ＬＲＰ６共受容体を必要とし、両者は、ナノモルの親和性で、Ｆｚのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に主に結合するからである（非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献８）。Ｎｏｒｒｉｎは、分泌されるシステインリッチ低分子タンパク質であり、Ｎｏｒｒｉｎは、ジスルフィド連結型オリゴマーを形成し、細胞表面および細胞外マトリックスと関連し続ける（非特許文献１１）。配列比較およびモデリング研究から、Ｎｏｒｒｉｎは、ＴＧＦ−ベータ（非特許文献１２）、フォンウィルブランド因子、およびムチン（非特許文献１３）との三次構造類似性を有することが提唱された。Ｎｏｒｒｉｎ遺伝子は、脳および網膜中で主に発現される（非特許文献１４；および非特許文献２）。
【０００７】
骨リモデリングに関する疾患を処置するための薬剤候補は、絶えず求められている。ヒト成人骨格は、動的状態にあり、絶え間なく分解され、骨梁骨（海綿骨とも呼ばれる）表面上およびハバース系における破骨細胞および骨芽細胞の協調的な作用により再編成される。骨リモデリングの破壊は、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、移植誘発性骨粗鬆症、および若年性）、くる病、骨軟化症、腫瘍誘発性骨軟化症、低ホスファターゼ血症、パジェット病、ならびに他のもの等の疾患および状態につながり得る。したがって、骨リモデリングを制御する経路をより十分に解明することおよびそれらのカスケードにおける標的を同定することは、標的を調整する作用物質を開発するのに有用であり、必要とされる。
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｒら、１９９２年  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １号：１９９〜２０３頁
【非特許文献２】Ｃｈｅｎら、１９９２年  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １号：２０４〜２０８頁
【非特許文献３】Ｒｈｅｍら、２００２年  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２号：４２８６〜４２９２頁
【非特許文献４】Ｒｏｂｉｔａｉｌｌｅら、２００２年  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３２号：３２６〜３３０頁
【非特許文献５】Ｗｕら、２００２年  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７号：４１７６２〜４１７６９頁
【非特許文献６】Ｇｏｎｇら、２００１年  Ｃｅｌｌ  ２０７号：５１３〜５２３頁
【非特許文献７】Ｋａｔｏら、２００２年  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５７号：３０３〜３１４頁
【非特許文献８】Ｘｕら、２００４年  Ｃｅｌｌ  １１６号：８８３〜８９５頁
【非特許文献９】Ｈｓｉｅｈら、１９９９年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９６号：３５４６〜３５５１頁
【非特許文献１０】Ｗｕら、２００２年  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７号：４１７６２〜４１７６９頁
【非特許文献１１】Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌａｒら、１９９７年  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２号：３３４１０〜３３４１５頁
【非特許文献１２】Ｍｅｉｔｉｎｇｅｒら、１９９３年  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５号：３７６〜３８０頁
【非特許文献１３】Ｍｅｉｎｄｌら、１９９２年  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２号：１３９〜１４３頁
【非特許文献１４】Ｂｅｒｇｅｒら、１９９２年  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １号：１９９〜２０３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書に記載される物質ならびに方法は、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６ならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ４とのその相互作用を介した、骨リモデリングおよび脂質代謝調整のための、Ｗｎｔ経路へのＮｏｒｒｉｎの関与について、より多くの解明を提供し、一般に、ＮｏｒｒｉｎおよびＮｏｒｒｉｎと相互作用する化合物（たとえばＮｏｒｒｉｎアゴニスト）を使用した、骨障害の調整および脂質調整に有用な化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。Ｎｏｒｒｉｎ模倣体およびＬＲＰ５／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／Ｎｏｒｒｉｎ複合体の他の模倣体を同定するための方法および物質もまた企図される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、一態様は、骨または脂質を調整する作用物質を同定する方法であって、（ａ）作用物質の存在下で、ＬＲＰ５タンパク質または生物学的活性ＬＲＰ５タンパク質と共に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質または生物学的活性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４ポリペプチドを提供するステップおよび（ｂ）上述の作用物質が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４および／もしくはＬＲＰ５またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４もしくはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチドと相互作用する作用物質であり、作用物質の存在下で、骨および／または脂質の少なくとも１つのパラメーターを調整するかどうかを決定するステップを含む方法を対象とする。一態様は、ＬＲＰ５タンパク質またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片に連結されたＦｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質または生物学的活性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４ポリペプチド断片を有し、これは、融合タンパク質の形態とすることができる。この方法によりスクリーニングされる作用物質は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体ならびにＮｏｒｒｉｎのアゴニストおよびアンタゴニストとすることができる。
【００１０】
他の態様は、骨代謝または脂質代謝を調整する作用物質を同定する方法であって、（ａ）作用物質の存在下で、Ｎｏｒｒｉｎタンパク質または生物学的活性Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド断片ならびにＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６タンパク質またはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片に融合されたＦｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質または生物学的活性ポリペプチド断片を提供するステップおよび（ｂ）骨調整および／または脂質調整の少なくとも１つのパラメーターを、骨代謝または脂質代謝を調整する作用物質を同定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定するステップを含む方法を対象とする。
【００１１】
論じられる方法のいずれかについての、骨調整のパラメーターは、骨密度、骨強度、骨梁数、骨の大きさ、もしくは組織結合性またはそれらの任意の組合せのうちの任意の１つまたは複数とすることができる。これらのスクリーニング方法のいずれかにおいて論じられる脂質調整のパラメーターは、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、コレステロール、トリグリセリド、ａｐｏＥ、またはＬＤＬのレベルの変化を含むことができる。これらの方法における作用物質をスクリーニングする他の態様は、作用物質が、脂質代謝または骨代謝に関連する遺伝子の発現パターンを変更させるかどうかを確かめることである。たとえば、作用物質は、ＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、ｅＮＯＳ、Ｗｎｔ１０Ｂ、サイクリンＤ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２、およびＷＩＳＰ２のうちの１つまたは複数の発現を変更し、発現が調整される。
【００１２】
この方法は、Ｄｋｋタンパク質もしくは生物学的活性Ｄｋｋポリペプチド断片および／またはＫｒｅｍｅｎタンパク質もしくは生物学的活性Ｋｒｅｍｅｎポリペプチド断片ならびに／またはＷｎｔタンパク質もしくは生物学的活性Ｗｎｔポリペプチド断片をさらに含むことができる。
【００１３】
他の態様では、方法は、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性を調整する作用物質を同定するための方法であって、（ａ）作用物質、ＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６の生物学的活性ポリペプチド断片に融合したまたはＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６のポリペプチド断片を含有するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に融合したＮｏｒｒｉｎタンパク質またはＮｏｒｒｉｎの生物学的活性ポリペプチド断片およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片ならびに
（ｉ）Ｋｒｅｍｅｎタンパク質もしくはＫｒｅｍｅｎの生物学的活性ポリペプチド断片および／または
（ｉｉ）Ｄｋｋタンパク質もしくはＤｋｋの生物学的活性ポリペプチド断片
を提供するステップおよび
（ｂ）作用物質が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性を調整するかどうかを決定するステップを含む方法が企図される。作用物質は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、Ｄｋｋアンタゴニスト、またはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストとすることができる。この方法はまた、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４アゴニストおよびＬＲＰ５アゴニストを評価するためのものとすることができる。
【００１４】
これらの方法のいくつかについて、タンパク質またはタンパク質の生物学的活性ポリペプチド断片は、ＰＶＤＦまたはニトロセルロース等の基体上に添加することができる。
【００１５】
さらなる態様は、骨調整または脂質調整を調節する作用物質を同定する方法であって、（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５を発現する細胞に作用物質を投与するステップであって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片であり、ＬＲＰ５は、ＬＲＰ５タンパク質またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片であるステップ、（ｂ）上述の試験薬の投与が、ＬＲＰ５−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用を調整するかどうかを決定するステップ、および（ｃ）作用物質が、骨パラメーターおよび／または脂質パラメーターを調整するかどうかを決定するステップを含む方法を企図する。この方法の一態様は、細胞が、Ｎｏｒｒｉｎを発現せず、細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体を同定するのに有用であることを企図する。他の態様は、非内在性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、および／またはＮｏｒｒｉｎを発現する細胞ならびにたとえばＮｏｒｒｉｎアゴニストを同定するために細胞を使用することを有する。
【００１６】
他の態様は、骨調整または脂質調整を調節する作用物質を同定する方法であって、（ａ）ＬＲＰ５、Ｎｏｒｒｉｎ、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４を発現する細胞に試験薬を投与するステップであって、ＬＲＰ５は、ＬＲＰ５タンパク質またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片であり、Ｎｏｒｒｉｎは、Ｎｏｒｒｉｎタンパク質または生物学的活性Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片であるステップ、（ｂ）上述の試験薬の投与が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用を調整するかどうかを決定するステップ、および（ｃ）試験薬が、骨調整または脂質調整のパラメーターを調整するかどうかを決定するステップを含む方法を企図する。これは、非内在性Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４を任意選択で発現する細胞を企図する。あるいは、細胞は、内在性Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４を発現しなくてもよい。
【００１７】
試験した作用物質のいずれも、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｄｋｋアンタゴニスト、またはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ４アゴニストおよび模倣体、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、ならびにＬＲＰ５アゴニストとすることができる。
【００１８】
企図される方法または細胞のいずれにおいても、細胞は、脊椎動物細胞とすることができる。脊椎動物細胞は、骨細胞、腎臓細胞、間葉系細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、またはアフリカツメガエル細胞を含むことができるが、これらに限定されない。
【００１９】
論じられる方法、キット、細胞／細胞株のいずれにおいても、Ｄｋｋは、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、もしくはＤｋｋ４またはＤｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、もしくはＤｋｋ４の生物学的活性ポリペプチドとすることができる。同様に、Ｋｒｅｍｅｎについては、Ｋｒｅｍｅｎが任意の態様において記載される場合、Ｋｒｅｍｅｎは、Ｋｒｅｍｅｎ１もしくはＫｒｅｍｅｎ２またはＫｒｅｍｅｎ１もしくはＫｒｅｍｅｎ２の生物学的活性ポリペプチドとすることができる。Ｗｎｔもまた、Ｗｎｔ１〜Ｗｎｔ１９のいずれか（たとえば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、もしくはＷｎｔ１０ｂ）またはこれらのいずれかの生物学的活性断片とすることができる。
【００２０】
方法およびキットのいずれかでの使用のための細胞株は、ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞、ＫＨＯＳ−２４０Ｓ細胞、ＫＨＯＳ−３２１Ｈ細胞、ＤＳＤｈ細胞、ＶＡ−ＥＳ−ＢＪ細胞、７Ｆ２細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨＯＳＴＥ８５細胞、ＲＯＳ細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ６細胞、ＵＭＲ−１０６細胞、Ｓａｏｓ２細胞、ＭＧ６３細胞、ＨＯＢ細胞、間葉系幹細胞（たとえばヒト成人間葉系幹細胞）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
動物もまた、骨代謝および脂質代謝を調整するための試薬のスクリーニングにおける使用のために企図される。動物モデルは、トランスジェニック動物を含む。たとえば、動物は、ＬＲＰ５またはＨＢＭを発現するトランスジェニック動物とすることができる。あるいは、動物は、ノックアウト動物であってもよく、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｗｎｔ、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４のうちの１つまたは複数がノックアウトされる。あるいは、動物はまた、ノックアウトの組合せおよび遺伝子の導入も企図する。動物は、アフリカツメガエルまたはマウス等の任意の脊椎動物とすることができる。
【００２２】
他の実施形態は、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性を調整する作用物質を同定するためのキットであって、（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片およびＬＲＰ５またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片をコードする核酸で同時形質移入した、Ｎｏｒｒｉｎを発現することができない一連の細胞、（ｂ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片およびＬＲＰ５またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＤｋｋ核酸、（ｃ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片およびＬＲＰ５もしくはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのならびに／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片、ＬＲＰ５もしくはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片、およびＤｋｋもしくはＤｋｋの生物学的活性断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＫｒｅｍｅｎ核酸、（ｄ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片およびＬＲＰ５またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＬＲＰ６核酸、ならびに（ｅ）任意選択で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片およびＬＲＰ５またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片を同時発現する一連の細胞における同時発現のためのＷｎｔ核酸を含むキットを企図する。
【００２３】
企図される他の態様は、天然Ｎｏｒｒｉｎを欠き、非天然ＬＲＰ５および非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４を発現する細胞または細胞株であり、非天然ＬＲＰ５は、非天然ＬＲＰ５タンパク質であり、非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、非天然Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質であり、ＬＲＰ５は、完全タンパク質またはＬＲＰ５の生物学的活性ポリペプチド断片であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４は、完全タンパク質またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチド断片であり、Ｎｏｒｒｉｎは、完全タンパク質またはＮｏｒｒｉｎの生物学的活性ポリペプチド断片である。これらのタンパク質の発現は、一過性または安定性の発現とすることができる。他の態様は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｄｋｋ、および／またはＫｒｅｍｅｎの非天然の（非内在性）発現を企図し、これらのいずれも全タンパク質またはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片とすることができる。
【００２４】
他の態様は、上記の方法のいずれかにより、単独でまたは適した薬学的に許容し得る賦形剤および／もしくは担体を有する医薬組成物中で同定される作用物質を企図する。作用物質は、脂質障害および／もしくは骨障害を処置するために使用することができるまたはこれらの障害の１つの処置における使用のための医薬を製剤するために使用することができる。
【００２５】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方は、例示的で説明的なものであり、請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図されることを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
添付の図面は、開示される物質および方法についてのさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、実施形態を示す。
（詳細な説明）
３つの遺伝子、ＮＤＰ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚ４）、およびリポタンパク質関連受容体タンパク質５（ＬＲＰ５）が網膜の血管新生に関与することが分かったことが興味深かったので、これらの系に関する調査により、それらが分子レベルで相互作用し、ＮｏｒｒｉｎがＬＲＰ５−Ｆｚ４複合体のリガンドであることを明らかにした。ＬＲＰ５／６のＮｏｒｒｉｎ媒介性の活性化は、Ｆｚ４を必要とし、Ｆｚファミリーの他の５種のメンバー（つまりｍＦＺ３、ｈＦＺ５、ｍＦｚ６、ｍＦｚ７、およびｍＦｚ８）を必要としないことに注目するのは興味をそそるものである。しかしながら、Ｎｏｒｒｉｎは、Ｆｚ４に対する特異性を有し、Ｗｎｔに対するいかなる著しい配列相同性も示さない。
【００２７】
ヒトおよびマウスにおけるＬＲＰ５突然変異は、ＬＲＰ５およびＷｎｔシグナルが骨代謝において果たす中心的な役割を明らかにした（Ｇｏｎｇら、２００１年  Ｃｅｌｌ  ２０７号：５１３〜５２３頁；Ｋａｔｏら、２００２年  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５７号：３０３〜３１４頁；Ｂｏｙｄｅｎら、２００２年  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６号：１５１３〜１５２１頁；およびＬｉｔｔｌｅら、２００２年  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７０号：１〜１９頁）。Ｇ１７１Ｖ（高骨量または「ＨＢＭ」型）突然変異およびＬＲＰ５の第１のプロペラドメインにおける他の同様な突然変異は、野性型ＬＲＰ５を用いた親和性と比較して、Ｄｉｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ１）タンパク質に対するＨＢＭ変異体の親和性の減少をもたらす（Ｂｏｙｄｅｎら、２００２年  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６号；およびＡｉら、２００５年  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５号：４９４６〜４９５５頁）。ＨＢＭ突然変異は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤｋｋ１による阻害の減少およびＨＢＭ突然変異体媒介性Ｗｎｔ−ベータ−カテニンシグナルの活性化につながる。この現象は、ＨＢＭ型突然変異を有するヒトおよびトランスジェニックマウスにおける高骨量（ＨＢＭ）表現型にとって重要な、根底にある分子機構であることが推測される（Ｂａｂｉｊら、２００３年  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．  １８号：９６０〜９７４頁）。
【００２８】
Ｄｋｋ１は、ＬＲＰ５／６−Ｗｎｔシグナルの分泌型アンタゴニストの１つである（Ｇｌｉｎｋａら、１９９８年  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１号：３５７〜３６２頁；Ｋａｗａｎｏら、２００３年  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１６号：２６２７〜２６３４頁；およびＢａｆｉｃｏら、２００１年  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３号：６８３〜６８６頁）。そのうえ、他の種類の１回貫通膜貫通型受容体であるＫｒｅｍｅｎ１／２の存在下でのＤｋｋ１は、Ｗｎｔを介して媒介されるＬＲＰ５／６−ＴＣＦシグナルの阻害を、ＬＲＰ５−Ｄｋｋ１−Ｋｒｅｍｅｎ三元複合体のインターナリゼーションにより増大させる（Ｍａｏら、２００２年  Ｎａｔｕｒｅ  ４１７号：６６４〜６６７頁）。Ｋｒｅｍｅｎは、ＬＲＰ５／６およびＤｋｋ１と細胞表面で三元複合体を形成し、それらのインターナリゼーションまたはエンドサイトーシスを促進する。Ｋｒｅｍｅｎは、細胞膜からの、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の迅速なエンドサイトーシスを促進し、それによって、ＬＲＰ５／６−Ｗｎｔシグナル伝達をブロックする。本明細書に開示される物質および方法は、所定の細胞型におけるこれらの相互関係物の発現パターンが、Ｗｎｔ−シグナル伝達を調節するまたは骨芽細胞等の細胞におけるＬＲＰ５／６機能に対するさらなる特異性をもたらすことができるといった推測から生じた。特に記載されていない限り、Ｄｋｋ１について言及されるすべての場合において、他のＤｋｋのいずれかを、単独でまたは組み合わせて代わりに用いてもよいことに留意されたい。
【００２９】
Ｋｒｅｍｅｎ２（Ｋｒｍ２）の４種のスプライス変異体の分析により、ＬＲＰ５／６のＤｋｋ１媒介性阻害を増大させることができる、カルボキシ末端で４４個のアミノ酸を欠く変異体が明らかにされた（Ｂ．  Ｍａｏら、「Ｋｒｅｍｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、２００２年  Ｎａｔｕｒｅ  ４１７号（６８８９）：６６４〜６６７頁）。Ｄｋｋ１増大の最大の効果は、完全長Ｋｒｍ２クローンを用いて確かめられる。Ｋｒｍ２活性は、Ｄｋｋ１の第２のシステインリッチドメインとのその相互作用により媒介される。Ｋｒｍ２はまた、ＬＲＰ６−Ｗｎｔシグナル活性化因子Ｄｋｋ２をＨＥＫ−２９３Ａ細胞において阻害因子に変換することができる。特に記載されていない限り、Ｋｒｅｍｅｎ２について言及されるすべての場合において、Ｋｒｅｍｅｎ１を、単独でまたはＫｒｅｍｅｎ２と組み合わせて、代わりに用いてもよいことに留意されたい。
【００３０】
本明細書に開示される物質および方法は、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＬＲＰ５、またはＬＲＰ５のＨＢＭ変異体、たとえばＧ１７１Ｖの間の機能的相互作用を対象とする。本明細書に記載されるように、Ｎｏｒｒｉｎは、Ｕ２ＯＳ骨細胞において、Ｇ１７１Ｖ−ＬＲＰ５突然変異体のＴＣＦ−シグナルを、ＬＲＰ５を用いて観察されたシグナルに対して適度に増大させる。Ｎｏｒｒｉｎはまた、Ｄｋｋ１および／またはＫｒｅｍｅｎ２による、経路の阻害の減少ももたらす。Ｎｏｒｒｉｎ模倣体およびＮｏｒｒｉｎアゴニストである試薬を発見するためのスクリーニング剤としてのＮｏｒｒｉｎの使用のための物質および方法が本明細書に開示される。上記Ｎｏｒｒｉｎ調整剤およびＮｏｒｒｉｎ模倣体は、骨調整のために有用である可能性がある。Ｎｏｒｒｉｎ調整因子およびＮｏｒｒｉｎ模倣体は、低分子化学分子、ポリペプチド、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、および免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
１．略語および定義
１．１  略語
以下の略語が明細書において使用される。これらの頭文字および略語は、他の技術において異なる意味を有する可能性があるけれども、それらは、下記に示されるとおりまたは明細書で個別に区別されるとおりである。
ＡＣＰ５  酸性ホスファターゼ５
Ａｋｔ−３  プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）またはＲＡＣ−ＰＫ
ＡｌＰＡＳＥ  アルカリ性ホスファターゼ
ＡＬＰＨＡ  増幅発光近接ホモジニアスアッセイ
ＡＰＥ  アダプター関連タンパク質１
ＡＰ１Ｂ１  アダプタータンパク質複合体ＡＰ−１、ベータ１サブユニット
ＡＸＩＮ  アキシン
ｂ．ｉ．ｄ．  １日２回（毎日２回）
ＢＧＮ  骨特異性バイグリカン
ＢＭＣ  骨ミネラル含量
ＢＭＤ  骨ミネラル密度
ＢＭＰ１  骨形態形成タンパク質１
ＢＭＰ４  骨形態形成タンパク質４
ＢＭＵ  骨リモデリングユニット
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＢＴＧ２  Ｂ細胞転座遺伝子２、抗増殖性
ＣＢＦＢ  コア結合因子ベータ
ＣＣＮＤ１  サイクリンＤ１
ＣＣＮＤ３  サイクリンＤ３
ＣＣＮＩ  サイクリンＩ
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ
ＣＥＬＳＲ２  カドヘリンＥＧＦ  ＬＡＧ  ７回貫通Ｇ型受容体２
ＣＦＰ  シアン蛍光タンパク質
ＣＨＵＫ／ＩＫＫ  アルファ保存ヘリックス−ループ−ヘリックス遍在性キナーゼ、ＩｋＢキナーゼアルファ
ＣＫ１アルファ  カゼインキナーゼ１、アルファ１
ＣＫＢ  クレアチンキナーゼ、脳
ＣＮＫ１  ＫＳＲ様のコネクターエンハンサー
Ｃｏｌ１Ａ１  コラーゲン、１型、アルファ１
Ｃｏｌ３Ａ１  コラーゲン、３型、アルファ１
Ｃｏｌ６Ａ３  コラーゲン、ＶＩ型、アルファ３
Ｃｏｎｎｘ４３  コネキシン４３
ＣＯＸ−２  シクロオキシゲナーゼ−２
ＣＲＡＢＰ２  細胞内レチノイン酸結合タンパク質ＩＩ
ＣＲＤ  システインリッチドメイン
ＣＳＦ１Ｒ  コロニー刺激因子１受容体
ＣＳＰＧ２  コンドロイチン硫酸プロテオグリカン
ＣＴＧＦ  結合組織成長因子
ＣＴＳＫ  カテプシンＫ
ＣＸ３ＣＲ１  ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃ）受容体１
サイクリンＤ１  ＣＣＮＤ１もまた参照されたい
ＤＥＬＴＥＸ  ｄｅｌｔｅｘホモログ２（ショウジョウバエ）、ＥｐｈＢ２を参照されたい
Ｄｋｋ  Ｄｉｋｋｏｐｆ
Ｄｋｋ１  Ｄｉｋｋｏｐｆ１
Ｄｋｋ２  Ｄｉｋｋｏｐｆ２
Ｄｋｋ３  Ｄｉｋｋｏｐｆ３
Ｄｋｋ４  Ｄｉｋｋｏｐｆ４
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ｄｓＲＮＡ  二本鎖ＲＮＡ
ＤＶＬ１  ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ、ｄｓｈホモログ（ショウジョウバエ）
ＤＸＡ  二重Ｘ線吸収法
ＥＤＴＡ  エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥＧＴＡ  エチレングリコール−Ｏ−Ｏ’−ビス（２−アミノ−エチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸
ｅＮＯＳ  興奮性一酸化窒素合成酵素
ＥＰＨＢ２  ＫＳＲ様のコネクターエンハンサー（ｒａｓのショウジョウバエキナーゼサプレッサー）
ＥＰＨＢ６  Ｅｐｈ受容体Ｂ６
ＥＲＢＢ３  ＧＲＯ１癌遺伝子
ＥＲＫ  マイトジェン活性化プロテインキナーゼｐ４４／４２（ＭＡＰＫ）としても知られている
ＥＶＲＸ  Ｘ連鎖滲出性硝子体網膜症
ＦＡＰ  線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ
ＦＢＬＮ１  フィブリン１
ＦＢＳ  ウシ胎児血清
ＦＥＶＲ  家族性滲出性硝子体網膜症
ＦＧＦ−２  線維芽細胞成長因子２（塩基性）
ＦＧＦ−７  線維芽細胞成長因子７（ケラチノサイト成長因子）
ＦＯＳ  ＦＢＪネズミ骨肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ
ＦＯＳＬ１  Ｆｏｓ様抗原１
ＦＲＥＴ  蛍光共鳴エネルギー移動
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ショウジョウバエ）ホモログ２、ＦＺＤ２とも呼ばれる
Ｆｚ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ
Ｆｚ４  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４
ＦＺＤ２  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ショウジョウバエ）ホモログ２
ＦＺＤ４  Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ４
Ｇ１７１Ｖ  ヒトＬＲＰ５の位置１７１でのグリシンからバリンへの突然変異
ＧＡＤＤ４５Ａ  成長停止およびＤＮＡ損傷誘発型、アルファ
ＧＡＤＤ４５Ｂ  成長停止およびＤＮＡ損傷誘発型４５、ベータ
ＧＡＤＤ４５Ｇ  成長停止およびＤＮＡ損傷誘発型４５、ガンマ
ＧＡＳ６  成長停止特異的６
ＧＦＰ  緑色蛍光タンパク質
ＧＪＡ１  ギャップジャンクション膜チャネルタンパク質アルファ１（コネキシン４３としても知られている）
ＧＪＢ３  ギャップジャンクション膜チャネルタンパク質ベータ３
ＧＳＫ−３  グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３
ＧＳＫ−３α  グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３、アルファアイソフォーム
ＧＳＫ−３β  グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３、ベータアイソフォーム
ＨＢＭ  高骨量表現型
ＨＤＬ  高密度リポタンパク質
ＨＥＫ  ヒト胚性腎臓
ＨＥＲＰＵＤ１  ホモシステイン誘発型、小胞体ストレス誘発型、ユビキチン様ドメインメンバー１
ＨＲＴ  ホルモン補充療法
ｉ．ｍ．  筋肉内
ｉ．ｖ．  静脈内
ＩＤＢ２  ＤＮＡ結合の阻害因子２
ＩＤＢ３  インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ）
ＩＧＦ２Ｒ  インスリン様成長因子２受容体
ＩＧＦＢＰ６  インスリン様成長因子結合タンパク質６
ｉＧＳＫ  ＧＳＫ阻害因子
ｉＧＳＫ−３  ＧＳＫ−３阻害因子
ＩＬ−１  インターロイキン−１
ＩＬ１Ｒ１  インターロイキン−１受容体、１型
ＩＬ１ＲＬ１インターロイキン−１受容体様１
ＩＬ４ＲＡ  インターロイキン４受容体、アルファ
ＩＬ−６  インターロイキン−６
ＩＴＧＡ５  インテグリンアルファ５（フィブロネクチン受容体アルファ）
ＩＴＧＢ５  インテグリン、ベータ
ＩＴＧＢＬ１  インテグリン、ベータ様１
ＪＮＫ  ｃ−ｊｕｎアミノキナーゼ経路
ＪＵＮ  ｖ−ｊｕｎトリ肉腫ウイルス１７癌遺伝子ホモログ
ＪＵＮＤ１  Ｊｕｎ癌原遺伝子関連遺伝子ｄ１
Ｋｒｅｍｅｎ  眼および鼻を作るＫｒｉｎｇｌｅコード遺伝子
Ｋｒｍ１  Ｋｒｅｍｅｎ１
Ｋｒｍ２  Ｋｒｅｍｅｎ２
ＬＢＤ  ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭのリガンド結合ドメイン
ＬＤＬ  低密度リポタンパク質
ＬＤＬＲ  低密度リポタンパク質受容体
ＬＯＸ  リシルオキシダーゼ
ＬＲＰ５  低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５
ＬＲＰ６  低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６
ＬＳＰ１  リンパ球特異的タンパク質１
ＬＵＭ  ルミカン
ｍＡｂ  モノクローナル抗体
ＭＡＰＫ  マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ４２、４４）（ＥＲＫ）
ＭＡＰＫＡＰＫ２  マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２、ＭＫ２とも呼ばれる
ＭＣＣ  結腸直腸癌での突然変異
ＭＤＳＣ  間葉由来幹細胞
ＭＥＴ  ｍｅｔ癌原遺伝子（肝細胞成長因子受容体）
ＭＭＰ−１４  マトリックスメタロプロテイナーゼ１４
ＭＭＰ−９  マトリックスメタロプロテイナーゼ９
ＭＳＸ１  ホメオボックス、ｍｓｈ様１
ＭＹＢＬ１  ｖ−ｍｙｂ骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ）様１
ＭＹＣ  ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ
ＭＹＣＳ  Ｍｙｃ様癌遺伝子、ｓ−ｍｙｃタンパク質
ＮＣＡＭ１  神経細胞接着分子１
ＮＤ  Ｎｏｒｒｉｅ疾患
ＮＤＰ  Ｎｏｒｒｉｅ疾患タンパク質（またＮｄｐｈ）
ＮＦＡＴＣ１  活性化Ｔ細胞の核因子、細胞質内１
ＮＦＫＢ１  Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖遺伝子エンハンサーの核因子１、ｐ１０５
非ＴＧ  非トランスジェニック
ＮＯＳ３  一酸化窒素合成酵素３、ｅＮＯＳとしても知られている
ＮＲ４Ａ１  核受容体サブファミリー４、Ａ群、メンバー１
ＯＧＮ  オステオグリシン
ＯＰＧ  オステオプロテゲリン
ＯＰＰＧ  骨粗鬆症偽性神経膠腫症候群
ＯＳＭＲ  オンコスタチンＭ受容体
ＰＣＯＬＣＥ  プロコラーゲンｃ−プロテイナーゼエンハンサータンパク質
ＰＤＧＦＡ  Ｍ２９４６４を含むクラスター：血小板由来成長因子アルファ
ＰＤＧＦＲＡ  血小板由来成長因子受容体アルファポリペプチド
ＰＫＡ  プロテインキナーゼＡ
ＰＫＣ  プロテインキナーゼＣ
ＰＬＡＴ  組織型プラスミノーゲン活性化因子、ｔ−ＰＡ
ＰＮＡ  ペプチド核酸
ＰＲＤＣ  ＤＡＣおよびケルベロスに関するタンパク質
ＰＴＧＩＳ  プロスタグランジン合成酵素
ＰＴＧＳ  転写後遺伝子サイレンシング
ＰＴＧＳ１  プロスタグランジンエンドペルオキシド合成酵素１、ＣＯＸ−１とも呼ばれる
ＰＴＧＳ２  プロスタグランジンエンドペルオキシド合成酵素２（プロスタグランジンＧ／Ｈ合成酵素もしくはシクロオキシゲナーゼ２）またはＣＯＸ−２
ＰＴＨ  副甲状腺ホルモン
ＲＡＭＰ３  受容体（カルシトニン）活性修飾タンパク質３
ＲＡＮＫ  ＮＦ−ｋＢの受容体活性化因子
ＲＡＮＫＬ  ＮＦ−ｋＢの受容体活性化因子リガンド
ＲＬＵ  相対的ルシフェラーゼユニット
ＲＮＡｉ  ＲＮＡ干渉
ＲＯＰ  未熟児網膜症
ＲＵＮＸ１  ｒｕｎｔ関連転写因子１
ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１  ｒｕｎｔ関連転写因子２
Ｓ１００Ａ１０  カルパクチンに類似するカルシウム結合タンパク質
ＳＤＣ１  シンデカン１
ＳＤＦ１  ストローマ由来因子１
ＳＥＲＭ  選択的エストロゲン受容体調整因子
ＳＥＲＰＩＮＥ１  セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害因子、クレードＥ（ネキシン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１型）、メンバー１
ＳＦＲＰ１  分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１
ＳＦＲＰ４  分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４
ｓｈＲＮＡ  低分子ヘアピン型ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ  低分子干渉ＲＮＡ
ＳＰＡＲＣ  ｓｐａｒｃ／オステオネクチン
ＳＰＡＲＣＬ１  ＳＰＡＲＣ様１（ｍａｓｔ９、ｈｅｖｉｎ）
ＳＰＰ１  分泌型リンタンパク質１
ＳＰＲ  表面プラズモン共鳴
ＳＴＡＴ１  シグナルトランスデューサー転写活性化因子１
ＳＴＡＴ３  ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １１１００３４Ｃ０２遺伝子
ＴＡＮＫ  ＴＲＡＦファミリーメンバー関連Ｎｆ−カッパＢ活性化因子
ＴＣＦ  Ｔ細胞因子
ＴＧ  トランスジェニック
ＴＧＦＢ１  形質転換成長因子、ベータ１
ＴＧＦＢＲ２  形質転換成長因子、ベータ受容体ＩＩ
ＴＧＦ−β  腫瘍成長因子ベータ
ＴＨＢＤ  トロンボモジュリン
ＴＨＢＳ１  トロンボスポンジン１
ＴＩＥＧ  ＴＧＦＢ誘発型初期遺伝子
ＴＩＭＰ１  組織メタロプロテイナーゼ阻害因子
ＴＩＭＰ２  組織メタロプロテイナーゼ阻害因子２
ＴＩＭＰ３  組織メタロプロテイナーゼ阻害因子３
ＴＮＦ  腫瘍壊死因子
ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ  腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１０ｂ
ＴＮＦＲＳＰ１１Ｂ  腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ｂ（オステオプロテゲリン）
ＴＮＦＳＦ１１  腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１１（ＲＡＮＫＬを参照されたい）
ＴＯＢ１  ＥｒｂＢ−２．１のトランスデューサー
ＴＲＡＦ３  ＴＮＦ受容体関連因子３
ＴＵＮＥＬ  末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニックエンド標識
ＵＮＫ＿Ｄ８３４０２  プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）合成酵素
ＶＣＡＭ１  血管細胞接着分子１
ＶＥＨ  媒体
ＶＬＤＬ  超低密度リポタンパク質
ＷＩＦ  Ｗｎｔ抑制因子
ＷＩＳＰ１  ＷＮＴ１誘発型経路タンパク質１
ＷＩＳＰ２  ＷＮＴ１誘発型シグナル伝達経路タンパク質２
Ｗｎｔ３Ａ  ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み組織ファミリーメンバー
Ｗｎｔ  ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー（たとえばＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９）
Ｗｎｔ１０Ｂ  ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー１０Ｂ
Ｗｎｔ６  ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー６
ＹＦＰ  黄色蛍光タンパク質
１．２  定義
この詳細な記載に従って、以下の略語および定義が適用される。本明細書に使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に規定していない限り、複数形の指示物を含むことに留意されたい。したがって、たとえば、「模倣体」に対する言及は複数の上記模倣体を含み、「投薬量」に対する言及は、当業者に知られている１つまたは複数の投薬量およびその均等物に対する言及を含む、等である。
【００３２】
特に定義されていない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により共通して理解される意味と同じ意味を有する。以下の用語は下記に提供される。本明細書に言及される遺伝子は、言及される受託番号および指定されていない他の配列を含むことを意味する。
【００３３】
「動物」は、あらゆる脊椎動物を意味する。「動物」は「哺乳動物」を含む。好ましい哺乳動物は、家畜動物（たとえばウシ、バッファロー、ウマ、ヒツジ、ブタ、およびヤギ等の有蹄動物）ならびにげっ歯動物（たとえばマウス、ハムスター、ラット、およびモルモット）、イヌ科の動物、ネコ科の動物、霊長動物（たとえば、チンパンジー、オランウータン、ヒト）、オオカミ、ラクダ科の動物、ならびにシカ科の動物を含む。他の脊椎動物は、トリ（たとえば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、家禽）、両生動物（たとえばアフリカツメガエル）、および魚類（魚）を含む。
【００３４】
「Ｎｏｒｒｉｎ」は、Ｎｏｒｒｉｎのすべての脊椎動物形態ならびにすべてのそのポリペプチド形態および核酸形態を含むことを意味する。「Ｎｏｒｒｉｎ」はまた、ＮＤ、Ｎｏｒｒｉｅ疾患タンパク質、Ｎｏｒｒｉｎ前駆物質、ＮＤＰ、Ｎｄｐ、およびＮｏｒｒｉｅ疾患タンパク質相同体（Ｎｄｐｈ）とも称される。Ｎｏｒｒｉｎ変異体もまた企図される。
【００３５】
「Ｎｏｒｒｉｎ活性」は、Ｎｏｒｒｉｎ活性がＷｎｔシグナル伝達経路ならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ４およびＬＲＰ５／６とのその相互作用を伴う時のＮｏｒｒｉｎ活性であろう。これは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚ４）とのＮｏｒｒｉｎの相互作用およびＬＲＰ５活性のＮｏｒｒｉｎによる増大を含むであろう。Ｎｏｒｒｉｎが相互作用する唯一のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４である。しかしながら、本明細書に論じられるＷｎｔは、Ｗｎｔシグナル伝達系におけるＮｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４ならびにＬＲＰ５およびＬＲＰ６の相互作用を調整するであろう任意の分子の特異性を比較するためのアッセイ系において使用することができる。したがって、「Ｎｏｒｒｉｎ調整剤」は、Ｎｏｒｒｉｎ活性を調整する作用物質であり、Ｎｏｒｒｉｎ活性は、Ｗｎｔシグナル伝達の一部である。好ましいＮｏｒｒｉｎ活性は、骨リモデリングおよび／または脂質調整の調節である。脂質調整に関しては、米国特許出願第０９／５７８，９００号を参照されたい。米国特許出願第０９／５７８，９００号の内容は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｏｒｒｉｎ調整剤は、骨活性および／または脂質レベルのアゴニストおよびアンタゴニストを含む。Ｎｏｒｒｉｎアゴニストは、たとえば、投与されると、被検者における骨成長を増大させるであろう。
【００３６】
「Ｄｋｋ」は、Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、およびＤｋｋ４のすべての脊椎動物形態ならびにすべての核酸形態およびポリペプチド形態を含むことが意味される。「Ｄｋｋ１」はまた、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−１前駆物質、Ｄｋｋ−１、ＤＫＫ−１、ｈＤｋｋ−１（Ｄｋｋ１のヒト形態）、ＡＫ、およびＵＮＱ４９２／ＰＲＯ１００８とも称される。「Ｄｋｋ２」もまた、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−２、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−２前駆物質、Ｄｋｋ−２、ＤＫＫ−２、ｈＤｋｋ−２（Ｄｋｋ２のヒト形態）、およびＵＮＱ６８２／ＰＲＯ１３１６を含むことが意味される。「Ｄｋｋ３」もまた、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−３、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−３前駆物質、Ｄｋｋ−３、ｈＤｋｋ−３（Ｄｋｋ３のヒト形態）、ＲＥＩＣ、およびＵＮＱ２５８／ＰＲＯ２９５を含むことが意味される。「Ｄｋｋ４」は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−４  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−４前駆物質、Ｄｋｋ−４、ＤＫＫ−４、およびｈＤｋｋ−４（Ｄｋｋ４のヒト形態）を含むことが意味される。Ｄｋｋ変異体もまた企図される。Ｄｋｋ調整剤は、ＤｋｋアンタゴニストおよびＤｋｋアゴニストを含むであろう。
【００３７】
「Ｋｒｅｍｅｎ」により、Ｋｒｅｍｅｎ１およびＫｒｅｍｅｎ２のすべての脊椎動物形態ならびにすべての核酸形態およびポリペプチド形態を含むことが意味される。「Ｋｒｅｍｅｎ１」はまた、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ受容体、ＦＬＪ３１８６３、ＫＲＥＭＥＮ、眼および鼻を特徴づけるＫｒｉｎｇｌｅ含有タンパク質、Ｋｒｉｎｇｌｅ含有膜貫通型タンパク質１、ならびにＫＲＭ１とも称される。「Ｋｒｅｍｅｎ２」はまた、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ受容体２、Ｋｒｅｍｅｎタンパク質２前駆物質、眼および鼻を特徴づけるＫｒｉｎｇｌｅ含有タンパク質、ＫＲＭ２、ＭＧＣ１０７９１、ＭＧＣ１６７０９、ならびにｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＭＧＣ）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｅａｍ、２００２年  「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  １５，０００  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９号（２６）：１６８９９〜１６９０３頁に関連するＫｒｅｍｅｎ２形態とも称される。Ｋｒｅｍｅｎ変異体もまた企図される。Ｋｒｅｍｅｎ調整剤は、ＫｒｅｍｅｎアンタゴニストおよびＫｒｅｍｅｎアゴニストを含むであろう。
【００３８】
「ＬＲＰ５」または「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５」は、ＬＲＰ５のすべての脊椎動物の核酸形態およびポリペプチド形態を含むことを意味する。ＬＲＰ５および関係するホモログについての他の名称は、ＢＭＮＤ１、Ｚｍａｘ１、ＨＧＮＣ：８１５２、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５前駆物質、ＬＲ３、ＬＲＰ７、ＯＰＰＧ、ＯＰＳ、およびＶＢＣＨ２を含む。「ＬＲＰ５」はまた、ショウジョウバエにおける「ａｒｒ」としても知られており、以下のさらなる別名を有する：ＢＥＳＴ：ＣＫ００５３９、ＣＫ００５３９、１（２）ｋ０８１３１、ＬＤＬＲ様、ＬＲＰ、ＬＲＰ５／６、およびＬＲＰ６。たとえば、ＬＲＰ５の１つの「ＨＢＭ」変異体または「高骨量」変異体は、ヒトポリペプチド配列における位置１７１でのグリシンからバリンへの、ポリペプチド形態における単一のアミノ酸変化を有する。マウス配列の位置１７０での類似する突然変異がある。他の脊椎動物におけるさらなるホモログは、三次元プロペラドメインを考慮すると、他の種において決定することができる。ＨＢＭの使用は、他の脊椎動物種からのＧ１７１Ｖ変異体およびそのホモログの包含を企図する。あるＨＢＭ変異体は、高骨量表現型をもたらす変異体であり、Ｇ１７１Ｖ変化以外の、ＬＲＰ５における突然変異に起因する。Ｚｍａｘ１形態およびＨＢＭ形態については、米国特許第６，７７０，４６１号を参照されたい。この特許は、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ＬＲＰ５の野性型変異体またはホモログの例は、Ｚｍａｘ１である。ＬＲＰ５が言及される場合、野性型変異体またはホモログを含むＬＲＰ５のすべての形態が企図される。ＬＲＰ５の変異体およびＨＢＭもまた企図される。ＬＲＰ５調整剤は、ＬＲＰ５のアゴニストおよびアンタゴニストを含むであろう。ＬＲＰ５模倣体もまた企図される。
【００３９】
「ＬＲＰ６」または「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６」は、ＬＲＰ６のすべての脊椎動物の核酸形態およびポリペプチド形態を含むことを意味する。ＬＲＰ６はまた、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６前駆物質とも称される。ＬＲＰ６の変異体もまた企図される。ＬＲＰ６が言及される場合、野性型変異体またはホモログを含むＬＲＰ６のすべての形態もまた企図される。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５複合体が論じられる場合、複合体はまた、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ６およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５／ＬＲＰ６を含むことも意味する。ＬＲＰ６調整剤は、ＬＲＰ６アゴニストおよびＬＲＰ６アンタゴニストを含む。ＬＲＰ６模倣体もまた、骨成長を増大させる様式での、Ｗｎｔ経路の調整における使用のために本明細書において企図される。
【００４０】
「Ｗｎｔ」は、任意のＷｎｔ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー）タンパク質およびＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９の核酸を含む核酸を含むことを意味する。例示的なＷｎｔ形態は、Ｗｎｔ１（ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー１、ＩＮＴ１、およびＷｎｔ−１癌原遺伝子タンパク質前駆物質としても知られている）、Ｗｎｔ３（ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー３、ＩＮＴ４、およびＷｎｔ−３癌原遺伝子タンパク質前駆物質としても知られている）、Ｗｎｔ３ａ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー３ＡおよびＷｎｔ−３ａタンパク質前駆物質としても知られている）、ならびにＷｎｔ１０ｂ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリーメンバー１０Ｂ、Ｗｎｔ−１０ｂタンパク質前駆物質、ＷＮＴ−１２、Ｗｎｔ−１２、およびＷＮＴ−１２としても知られている）を含む。Ｗｎｔ形態のいずれかの変異体もまた企図される。Ｗｎｔ調整剤は、ＷｎｔアゴニストおよびＷｎｔアンタゴニストを含む。
【００４１】
「変異体」は、タンパク質をコードする核酸の形態を含むことを意味し、タンパク質は、Ｗｎｔカスケードにおいて生物活性を有し、骨代謝および脂質代謝の調整に関与する。これは、Ｇ１７１Ｖ変異体のタンパク質を発現するヒトにおいて高骨量をもたらすＧ１７１Ｖ変異体等の、ＬＲＰ５の増強した変異体を含むことができる。
【００４２】
「生物学的活性断片」、「ポリペプチド断片」、および「生物学的活性ポリペプチド」は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、Ｋｒｅｍｅｎ１、Ｋｒｅｍｅｎ２、任意のＤｋｋ、任意のＷｎｔ、およびＮｏｒｒｉｎの生物学的活性断片を意味し、上記活性は、Ｗｎｔ経路、好ましくは骨発達、骨調整、および／または脂質の代謝に関するＷｎｔ経路を調整する。これらは、Ｗｎｔシグナル伝達に関与する完全タンパク質のドメインであり、それによって、Ｗｎｔ経路は、脂質の調整および／または骨発達を誘発した。たとえば、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の生物学的活性ポリペプチドは、それらのタンパク質の細胞外部分（たとえばヒトＬＲＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３２６）、Ｚｍａｘ１、またはＨＢＭのアミノ酸１〜１３７６）とすることができる。さらに、１６１５アミノ酸長であるヒトＬＲＰ５については、生物活性を有する他のドメインは、膜貫通型ドメイン（アミノ酸１３８５〜１４０７）、細胞質ドメイン（アミノ酸１４０８〜１６１５）、および細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１３８４またはシグナルペプチドの最初の１９個のアミノ酸が除去される場合、２０〜１３８４）を含むことができる。１６１３アミノ酸長であるヒトＬＲＰ６については、以下の類似性のドメインを有するであろう：細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１３７０またはシグナルペプチドの最初の１９個のアミノ酸が除去される場合、２０〜１３７０）、膜貫通型ドメイン（アミノ酸１３７１〜１３９３）、および細胞質ドメイン（アミノ酸１３９４〜１６１３）。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４の細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）、すなわち、アミノ酸３６〜１６５（受託番号ＩＰＲ００００２４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３２５；Ｘｕら、２００４年  Ｃｅｌｌ  １１６号：８８３〜８９５頁）は、Ｎｏｒｒｉｎと相互作用することが示され、したがって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４の生物学的活性ポリペプチドはＣＲＤを含むことができる。Ｎｏｎｒｉｎの生物学的活性ポリペプチドは、ＮｏｒｒｉｎのＣＲＤのドメイン、たとえばアミノ酸１５〜１５０を含むことができる。他の実施例では、Ｄｋｋタンパク質がＫｒｅｍｅｎ１またはＫｒｅｍｅｎ２に結合するために、全細胞外ドメイン、たとえばヒトＫｒｅｍｅｎ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＣ００８７２）のアミノ酸１〜３６２が必要とされることが報告された。したがって、Ｋｒｅｍｅｎ１およびＫｒｅｍｅｎ２の生物学的活性部分は、少なくとも細胞外ドメインおよびそれよりも長いその配列を含有するであろう。Ｄｋｋ１については、たとえば、生物学的活性ポリペプチドは、少なくともＣ−末端システインリッチドメイン（ヒトＤｋｋ１のアミノ酸１８３〜２６６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ８９３６４）を含有するであろう。このＣ−末端システインリッチドメインは、Ｋｒｅｍｅｎ２に対するＬＲＰ５およびＬＲＰ６の結合に関与することが知られている。したがって、Ｄｋｋタンパク質の任意の生物学的活性ポリペプチドについては、ポリペプチドは、各Ｄｋｋの少なくともシステインリッチドメインを含有することができる。しかしながら、他の実施例は、Ｄｋｋタンパク質のシステインリッチドメインならびにたとえばＤｋｋ１では、��ｋｋ１のシステインリッチドメインのＮ末端側および／またはＣ末端側の両方に対する配列を含有するポリペプチドを含む。類似する配列が他のＤｋｋについて企図されるであろう。上記生物学的活性断片はまた、カルボキシ末端もしくはアミノ末端のいずれかまたはタンパク質を形成するポリペプチド内で１つまたは複数のアミノ酸がないが、完全長タンパク質と同じ活性を有する完全タンパク質を含むこともでき、上記生物学的活性ポリペプチド断片は、完全長ポリペプチドにより誘発される活性と比較した場合に、ブロッキング阻害因子として作用しない。
【００４３】
「脂質パラメーター」は、これに限定されないが、試薬に対する暴露に基づく、脂質濃度の変化を分析するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定されたパラメーターを含むことを意味する。脂質パラメーターは、ａｐｏＥ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、コレステロール、脂肪細胞の数、脂肪細胞遺伝子発現における変化、またはこれらのパラメーターの組合せの測定を含むことができる。脂質パラメーターはまた、たとえばＨＤＬ：ＶＬＤＬの比を含むことを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの変化を研究する場合、試験試薬の投与による脂質レベルの調整を評価するために、空腹時の脂質プロファイル（総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）等の脂質プロファイルを研究することができる。
【００４４】
Ｎｏｒｒｉｎにより媒介される可能性のある「脂質障害」、「脂質疾患」、および「脂質状態」は、これらに限定されないが、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性アポタンパク質ＣＩＩ欠損症、家族性３型高リポタンパク血症、家族性高コレステロール血症、家族性高トリグリセリド血症、多種リポタンパク質型高脂血症、透析および／または糖尿病による脂質レベルの上昇、ならびに知られていない病因についての脂質レベルの上昇を含むことが意味される。
【００４５】
「骨発達」は、一般に、長い間にわたる骨の変化に関与する任意のプロセスについて言及するものであり、たとえば、正常な発達、疾患状態の間の起こる変化、および老齢化またはホルモンパターンにおける変化の間に起こる変化を含む。これは、構造変化および成長率、吸収率、骨修復率等の動的な率の変化について言及するものであってもよい。「骨発達障害」は、骨発達における任意の障害について特に言及するものであり、たとえば、疾患状態の間に起こる変化および老齢化の間に起こる変化を含む。骨発達は、性質上、進行性または周期性のものであってもよい。発達の間に変化する可能性のある、骨の態様は、たとえば、鉱化作用、特異的解剖学的特色の形成、および種々の細胞型の相対数または絶対数を含む。発達に関係づけられない可能性のある、企図される他の骨障害は、骨の、加齢に関係した損失、骨折（たとえば、股関節部骨折、コリース骨折、椎骨圧迫骨折）、軟骨異栄養症、薬剤誘発性障害（たとえば、グルココルチコイドまたはヘパリンの投与による骨粗鬆症および水酸化アルミニウム、抗痙攣薬、またはグルテチミドの投与による骨軟化症）、高骨代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、パジェット病、骨関節炎、ならびにくる病を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
「骨調整」または「骨の形成の調整」は、当業者により十分に理解されるように、たとえば、数ある中で破骨細胞活性および骨芽細胞活性による骨吸収および付着成長による骨成長を含む骨リモデリングに関与する生理的なプロセスのいずれかに影響を及ぼす能力について言及するものであり、本明細書に使用される骨の形成および骨発達のいくつかまたはすべてを含んでいてもよい。
【００４７】
骨は、破骨細胞による古いまたは不必要な骨の更新および骨芽細胞による新しい骨の再建を介して、絶え間なくそれ自体を適応させ、更新している動的組織である。これらのプロセスの間の共役の性質は、成長の間の骨のモデリングならびに機械的な使用の日々の必要性を満たすためのリモデリングおよび修復を介した成人骨格の完全性の維持の両方を担う。骨吸収および形成の間のバランスが共役しないことに起因する多くの疾患がある。老齢化と共に、骨代謝回転が、緩やかに「生理学的に」アンバランスとなり、骨の進行性の損失をもたらす、エストロゲン支援の、閉経期での損失により、女性において特に悪化する。骨ミネラル密度が母集団基準より下に下がると、骨脆弱性および特発性骨折に対する感受性の増加が結果として起こる。失われる骨の１０パーセントごとに、骨折の危険性が２倍になる。脊椎または近位大腿骨における骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が２．５標準偏差以上、正常な最大骨量を下回る個人は、骨粗鬆症と分類される。しかしながら、ＢＭＤが１〜２．５の標準偏差の間で基準を下回る骨減少性の個人もまた危険な状態にある。
【００４８】
骨は、数種の異なる形態のＸ線吸収法により測定される。機器はすべて、骨の無機物含量または骨ミネラル含量を測定する。標準的なＤＸＡ測定により、面密度測定値である値が与えられ、密度（質量／単位体積）の古典的な定義による真密度測定値は与えられない。それにもかかわらず、これは、骨粗鬆症を診断するために臨床的に使用される測定の種類となっている。しかしながら、ＢＭＤが骨強度に対する主要な寄与因子である一方、４０％もの骨強度が、以下を含むが、これらに限定されない他の因子から生じる：（１）骨の大きさ（つまり、密度が低くても、直径が大きければ組織レベルで剛性を増加させる）；（２）骨梁の構造の結合性；（３）リモデリングのレベル（リモデリングの場所はひずみが局所的に集中している）；ならびに（４）骨の物質自体の本質的な強度、これは、言い換えると荷重履歴の（つまり蓄積された疲労損傷を介した）関数である、およびコラーゲン架橋の度合いおよび鉱化作用のレベル。多数の骨外性の影響（転倒パターン、軟部組織軟質物質、および中枢神経系反射応答性等を含むが、これらに限定されない）もまた役割を演ずるように、これらの強度因子／脆弱性因子のすべてが骨粗鬆症性骨折においていくつかの役割を演ずるという十分な証拠がある。
【００４９】
さらなる分析機器を、骨のこれらの特色を扱うために使用することができる。たとえば、ｐＱＣＴは、大きさおよび密度について、個々の骨梁区画および皮質区画の測定を可能にする。μＣＴ（マイクロＣＴ）は、骨梁結合性等の構成的な特色についての定量的な情報を提供する。μＣＴにより真の骨密度測定値もまた与えられる。これらの手法を用いると、重要な非ＢＭＤパラメーターを、疾患の度合いおよび処置の効力を診断するために測定することができる。骨粗鬆症のための現在の処置は、骨吸収を予防するまたは遅らせるための薬剤の能力に基づくものである。より新しい再吸収阻害薬が、骨粗鬆症の療法において有用であることが証明されているけれども、それらは、上述の骨量パラメーターおよび／または骨質パラメーターを増加させることとなる処置を開発するためのより最終的な難題に対する短期的な解決策と見なされている。したがって、骨調整は、ｐＤＸＡ  Ｘ線方法による骨ミネラル密度（ＢＭＤ）および骨ミネラル含量（ＢＭＣ）、Ｘ線により測定される骨の大きさ、厚さ、または体積、たとえばカルセイン標識により測定される骨の形成率、全体としての密度、骨梁密度、および骨幹中央の密度（ｐＱＣＴ方法および／またはμＣＴ方法により測定される）、結合性および他の組織学的パラメーター（μＣＴ方法により測定される）、機械的な曲げ強度および圧縮強度（好ましくは大腿骨および椎骨においてそれぞれ測定される）等のパラメーターの測定により評価されてもよい。したがって、測定可能なパラメーターは、骨密度、骨強度、骨梁数、骨の大きさ、および骨組織結合性を含むが、これらに限定されない。これらの測定の性質により、熟練の開業医が評価するように、それぞれ、所定の状況に対して多かれ少なかれ適切であるとしてよい。さらに、骨折のない病歴等のパラメーターおよび方法論、骨の形状、骨の形態、結合性、正常な組織構造、骨折修復率、ならびに他の骨質パラメーターが、当技術分野で知られており、使用されている。最も好ましくは、骨質は、上記の測定が適切な場合、椎骨の圧縮強度により評価されてもよい。骨調整はまた、種々のパラメーターにおける変化率により評価されてもよい。最も好ましくは、骨調整は、１回を超える年齢で評価される。化合物は、骨密度の調整を決定するために本明細書に列挙されるパラメーターのうちの任意の１つまたは複数に関して評価することができる。
【００５０】
「正常な骨密度」は、ＨＢＭ関連性研究という状況でＺスコアが０から２標準偏差内の骨密度について言及するものである。一般的な状況では、正常な骨密度パラメーターの範囲は、ルーチン的な統計的方法により決定される。正常なパラメーターは、年齢および性別の正規化パラメーターの約１または２標準偏差、好ましくは約２標準偏差以内である。有意味度の統計的尺度は、関連する測定値が平均値と著しく異なる可能性を表すことができるＰ値である。有意なＰ値は、Ｐ＜０．０５、０．０１、０．００５、および０．００１、好ましくは少なくともＰ＜０．０１である。
【００５１】
用語「力」、「荷重」、「応力」、および「ひずみ」は、区別なく本明細書で使用され、力の原理に関するものであり、力は、力学において、体の位置を維持するもしくは変更させるまたは体をねじる傾向がある任意の作用であり、この用語は、本文書中で荷重と区別なく使用される。単位面積当たりの尺度としての力は、「応力」として定義され、また「機械的応力」としても本明細書で言及され、力（荷重）がどのようにかかるかに依存して、圧縮、引っ張り、または剪断と分類することができる。特に、物質がより短くなるように荷重がかけられた場合に、圧縮応力は発生するのに対して、物質が引き伸ばされた場合に、引張応力は発生する。物質の一領域が隣接した領域に対して滑る場合に、剪断応力は発生する。応力の結果は、変形として定義され、相対的な変形または長さにおける変化の割合は「ひずみ」と名づけられる。たとえば、物質が、その原長の１０１％まで引き伸ばされた場合、物質は、０．０１または１％のひずみを有する。ひずみは単位を有していないので、０．０１のひずみが１％の変形と等しい相対的な変形としてまたは１０，０００マイクロひずみが０．０１のひずみもしくは１％の変形と等しいマイクロひずみによって報告される（Ｔｕｒｎｅｒら、１９９３年  Ｂｏｎｅ、１４号：５９５〜６０８頁）。
【００５２】
「試験薬」および「試験試薬」は、低分子化合物、組成物、ペプチド、模倣体、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、および免疫グロブリンを含むことを意味する。組成物は、２つ以上の活性化合物の組合せを含み、活性化合物のうちの１つまたは複数は、Ｗｎｔ経路（カスケード）調整因子である。
【００５３】
「免疫グロブリン」は、抗体および抗体断片を含むことを意味する。本明細書に使用されるように、用語「抗体」は、完全でそのままの抗体、二重特異性抗体、ならびにＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、およびＦ（ａｂ）２断片等の抗体断片について言及することを意味する。完全な抗体は、ネズミモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長動物化抗体、およびヒト抗体を含む。抗体および抗体の遺伝子的に操作されたまたは酵素的に産生された部分の産生ならびに上記分子をコードする遺伝子配列の構築は、よく知られており、たとえば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．  （１９８８年）；Ｈａｒｌｏｗら、ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）；およびＢｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  （Ｗｉｌｅｙ−Ｓｐｅｋｔｒｕｍ、１９９９年）に記載され、これらは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。免疫グロブリンはまた、ｓｃＦｖ等の断片も含む。
【００５４】
「免疫学的に活性の」は、抗原を認識して、それに結合する任意の免疫グロブリンタンパク質またはその断片を意味する。好ましくは、免疫学的に活性のタンパク質またはその断片は、それが結合する抗原を調整する。たとえば、それがＮｏｒｒｉｎまたはＮｏｒｒｉｎのリガンドに結合する場合、免疫学的に活性のタンパク質またはその断片は、Ｎｏｒｒｉｎ活性またはＮｏｒｒｉｎリガンドの活性を調整するであろう。
【００５５】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」）は、ポリペプチドリンカーにより互いに共有結合された可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のみから成る組換え抗体断片である。ＶＬまたはＶＨのいずれかは、ＮＨ２末端ドメインであってもよい。２つの可変ドメインが深刻な立体障害を伴わず架橋される限り、ポリペプチドリンカーは可変の長さおよび組成であってもよい。典型的に、リンカーは、主として、溶解性のために点在したいくつかのグルタミン酸残基またはリシン残基を有する、ある長さのグリシン残基およびセリン残基から構成される。
【００５６】
「二重特異性抗体」は、二量体のｓｃＦｖである。二重特異性抗体の成分は、ほとんどのｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを典型的に有し、それらは、二量体として会合することに対する選好を示す。
【００５７】
「Ｆｖ」断片は、非共有結合の相互作用により共に保持された１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインから成る抗体断片である。用語「ｄｓＦｖ」は、ＶＨ−ＶＬペアを安定化するための、操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖについて言及するために本明細書で使用される。
【００５８】
「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、ｐＨ４．０〜４．５での、酵素ペプシンを用いた消化により免疫グロブリン（典型的にＩｇＧ）から得られた抗体断片と本質的に等価な抗体断片である。断片はまた、組換えで産生されてもよい。
【００５９】
「Ｆａｂ」断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片における２本の重鎖片をつなぐ１つまたは複数のジスルフィド架橋の還元により得られる抗体断片と本質的に等価な抗体断片である。Ｆａｂ’断片もまた組換えで産生されてもよい。
【００６０】
用語「タンパク質捕捉剤」は、タンパク質をそれ自体に結合することができる分子または多分子複合体を意味する。タンパク質捕捉剤は、実質的に特異的な様式でそれらの結合パートナーに好ましくは結合する。約１０−６未満の解離定数（ＫＤ）を有するタンパク質捕捉剤が好ましい（たとえば１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０）。抗体または抗体断片は、タンパク質捕捉剤としてきわめて適している。抗原は抗体に結合することができるので、抗原もまた、タンパク質捕捉剤として働いてもよい。タンパク質リガンドに結合する受容体は、可能性として考えられるタンパク質捕捉剤の他の例である。タンパク質捕捉剤は、非共有結合の相互作用を介してそれらの結合パートナーと相互作用するのみの作用物質に限定されないことが理解される。タンパク質捕捉剤はまた、任意選択で、それらが結合するタンパク質に対して共有結合するようになってもよい。たとえば、タンパク質捕捉剤は、結合の後でその結合パートナーと光架橋結合されてもよい。
【００６１】
用語「結合パートナー」は、好ましくは実質的に特異的な様式で、特定のタンパク質捕捉剤が結合するタンパク質を意味する。いくつかの場合では、結合パートナーは、タンパク質捕捉剤であるタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで通常結合するタンパク質であってもよい。しかしながら、他の実施形態では、結合パートナーは、タンパク質捕捉剤が選択される（ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの選択を介して）または産生される（抗体の場合でのように）タンパク質またはペプチドであってもよい。結合パートナーは、１つを超えるタンパク質捕捉剤により共有されてもよい。たとえば、様々なポリクローナル抗体が結合する結合パートナーは、多くの異なるエピトープを持っていてもよい。１つのタンパク質捕捉剤はまた、多数の結合パートナーに結合してもよい（たとえば、結合パートナーが同じエピトープを共有する場合）。
【００６２】
「タンパク質結合に適した条件」は、溶液中での、タンパク質およびその結合パートナーの間に起こる結合を考慮に入れる条件（塩濃度、ｐＨ、界面活性剤、タンパク質濃度、温度等に関する）を意味する。好ましくは、条件は、著しい量の非特異的タンパク質の結合が起こるほど厳しくないものではない。
【００６３】
「アレイ」は、基体上にあるパターンで配置された実体である。パターンは、二次元パターンであることが多いけれども、パターンはまた、アレイ基体に対する物質のよりいっそうの適用のために三次元パターンであってもよい。
【００６４】
用語「基体」は、本発明のアレイの大量で、基礎となる、中心的な物質について言及するものである。基体は、核酸、抗体、免疫グロブリン、および他の化合物が添加される物質である。
【００６５】
「トランスジェニック動物」は、その生殖細胞系中に、ｃＤＮＡ技術により導入された遺伝子または核酸を収容する動物を意味する。これは、たとえば、げっ歯動物中へのヒト遺伝子の導入またはマウスにおけるマウス遺伝子の導入とすることができる。この用語は、ノックアウト動物およびノックイン動物ならびに組合せを含むことができ、たとえば、動物は、その野性型遺伝子がノックアウトされ、次いで交換される。交換される遺伝子は、天然野性型遺伝子、ヒト遺伝子等の他の動物からの同族遺伝子、またはＬＲＰ５等の変異体とすることができる。導入される遺伝子はまた、誘発型プロモーターの制御下とすることができる。ＨＢＭ変異体ｃＤＮＡは、天然変異体または非天然変異体とすることができる。たとえば、Ｇ１７１ＶのヒトＨＢＭ変異体は、マウス中に導入することができる。あるいは、Ｇ１７１Ｖに対するマウス対応物もまた、マウス中に導入し、天然ＨＢＭ変異体を発現するトランスジェニックＨＢＭマウスを得ることができる。トランスジェニック動物は、トランスジェニックヒトを含むことを意味しないが、非ヒト霊長動物および他の動物を含むことができる。トランスジェニック動物は、ノックアウトされたまたは導入された、任意の１つまたは複数のＤｋｋ、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｗｎｔ、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４を有することができる。トランスジェニック動物は、非ヒト動物であることが企図されるが、非ヒト霊長動物を含むことができる。
【００６６】
「ＬＲＰ５トランスジェニック動物」は、ＬＲＰ５の天然形態およびｃＤＮＡ形態の両方をまたは動物のＬＲＰ５の天然形態が除去されているもしくは機能できない（ノックアウトされている）場合、ＬＲＰ５のｃＤＮＡ形態のみを発現する動物を含むことを意味する。ＬＲＰ５のｃＤＮＡ形態は、誘発型要素下としてもよい。動物は、天然遺伝子がノックアウトされ、天然または非天然ＬＲＰ５が導入されたまたはノックインされた動物とすることができる。これらのノックイン動物は、遺伝子を、好ましくは誘発型制御の下でさらに有することができる。
【００６７】
「ＨＢＭトランスジェニック動物」は、天然ＬＲＰ５が存在するまたはノックアウトされており、ＨＢＭ変異体をコードするｃＤＮＡが存在する動物を意味する。
【００６８】
「有効量」または「用量有効量」または「治療的有効量」は、骨パラメーターおよび／または脂質パラメーターを調整するのに十分なＮｏｒｒｉｎの生物活性を調整する作用物質の量を意味する。
【００６９】
用語「認識し、結合する」は、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（低分子阻害ＲＮＡ）、またはｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）の、標的配列との相互作用を定義するために使用される場合、特定のアンチセンス配列、ｓｉＲＮＡ配列、またはｓｈＲＮＡ配列が、標的配列に対して実質的に相補的であり、したがってポリペプチドをコードするｍＲＮＡの部分に特異的に結合することとなることを意味する。そのため、典型的に、配列は、ｍＲＮＡ標的配列に対してきわめて相補的であり、せいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の塩基ミスマッチを配列にわたりを有することとなる。多くの場合では、配列は正確にマッチする、つまり、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に対して完全に相補的であり、したがって、相補的な範囲に沿ってミスマッチが０であることが望ましい可能性がある。きわめて相補的な配列は、典型的に、ｍＲＮＡの標的配列領域に対してかなり特異的に結合し、したがって、ポリペプチド産物への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を低下させることおよび／またはさらに阻害することにおいてきわめて効果的となる。
【００７０】
実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約８０パーセントを超えて相補的（または「％同一性」）となり、より好ましくは、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約８５パーセントを超えて相補的となる。ある種の態様では、上記のように、本発明の実施での使用のためのさらに実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ましいと考えられ、そして上記の場合では、オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡの標的配列に対して約９０パーセントを超えて相補的となり、そしてある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約９５パーセントを超えて相補的となってもよく、設計されたオリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的ｍＲＮＡに対してさらに９６％、９７％、９８％  ９９％まで、さらに１００％正確にマッチして、相補的となってもよい。
【００７１】
開示された配列のいずれかの類似性パーセントまたは相補的パーセントは、たとえば、ウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して、配列情報を比較することにより決定されてもよい。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８号（３）：４４３〜５３頁のアラインメント方法を活用する。手短に言えば、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうちの短い方の配列中の記号の総数で割った、類似する、整列化された記号（つまりヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターは、以下のものを含む：（１）ヌクレオチドについては、単項比較マトリックス（同一の場合には１、同一でない場合には０という値を含有する）ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ  （１９８６年  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４号（１）：３２７〜３４頁）の加重比較マトリックス、（２）各ギャップに３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号にさらに０．１０のペナルティー、ならびに（３）エンドギャップにペナルティーなし。
【００７２】
「模倣体」は、同じ機能を果たすまたは模倣された作用物質に対して類似して挙動するもしくは模倣されている作用物質の活性に対して増大した活性を有する分子を意味する。たとえば、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体は、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドが相互作用するように、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６ならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ４と相互作用するであろう、そして骨量および／または脂質のレベルを、Ｎｏｒｒｉｎと同様にまたはＮｏｒｒｉｎについて観察されたレベルに対して増大したレベルで調整するであろう。たとえば、模倣体は、ＨＢＭ表現型について観察される等の表現型と同様な高骨量を誘発することができる（この表現型は、たとえば、ヒトＬＲＰ５ポリペプチドにおけるＧ１７１Ｖ突然変異または他の脊椎動物ＬＲＰ５における同族の場に起因する）。模倣体分子は、ポリペプチド、ペプチド、免疫グロブリン、または低分子化学分子とすることができる。
【００７３】
「レポーター要素」は、スクリーニングアッセイにおいて検出することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。レポーター要素によりコードされるポリペプチドの例は、ｌａｃＺ、ＧＦＰ、ＹＦＰ（または他の蛍光性レポーター）、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００７４】
「細胞」または「宿主細胞」は、脊椎動物細胞および酵母細胞またはスクリーニングアッセイで使用されるある種の原核細胞を含むことを意味する。たとえば、適した細胞は、酵母２ハイブリッドアッセイにおける酵母細胞であってもよい。
【００７５】
「骨細胞」は、組織培養（「培養細胞」）からの細胞または骨組織から得られた細胞を含むことを意味する。上記細胞は、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨芽前駆細胞、破骨細胞、骨細胞、間葉系幹細胞、本明細書で論じられる細胞のいずれか、または任意のそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。骨組織は、骨生検から得られる可能性のある、これらの細胞の組合せを含むことを意味するであろう。
【００７６】
「Ｄｋｋアンタゴニスト」は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその免疫原性活性断片、ペプチドアプタマー、ＧＳＫ結合タンパク質、ＧＳＫ核酸に対するアンチセンス分子、ＲＮＡ干渉分子、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイム、およびＷｎｔ経路においてＤｋｋ活性を阻害することができるペプチドを含むが、これらに限定されないことを意味する。
【００７７】
同様に、「Ｋｒｅｍｅｎアンタゴニスト」は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその免疫原活性断片、ペプチドアプタマー、ＲＮＡ干渉分子、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイム、およびＷｎｔ経路においてＫｒｅｍｅｎ活性を阻害することができるペプチドを含むが、これらに限定されないことを意味する。
【００７８】
「Ｗｎｔ３Ａアゴニスト」は、Ｗｎｔ３Ａ合成および／または活性をアップレギュレートすることができる試薬を含むことが意味される。「Ｗｎｔ３Ａ模倣体」は、Ｗｎｔ３Ａ活性を模倣する分子を意味する。「Ｗｎｔ３Ａ変異体」は、荷重を伴って投与された場合に、Ｗｎｔ／β−カテニン応答を有する活性化を増大させることができる任意の機能的変異体を含むであろう。
【００７９】
用語「融合タンパク質」は、典型的に、それらの天然状態では共につながれていないけれども、それらのそれぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端により、ペプチド連結を介してつながれ、単一の連続的なポリペプチドを形成する、２つ以上のポリペプチドから構成されるタンパク質について言及するものである。２つ以上のポリペプチド成分は、ペプチドリンカー／スペーサーを介して、直接的につなぐまたは間接的につなぐことができることが理解される。
【００８０】
２．Ｎｏｒｒｉｎを調整する試験薬をスクリーニングするためのアッセイ
本明細書に開示される物質および方法は、ＮＤＰ遺伝子もしくはそれらの遺伝子によりコードされるＮｏｒｒｉｎタンパク質を調整する作用物質をスクリーニングするまたはＮｏｒｒｉｎ模倣体およびＮｏｒｒｉｎアゴニストを同定する方法を部分的に対象とする。アッセイはまた、Ｎｏｒｒｉｎタンパク質と相互作用する試薬を調整する作用物質をスクリーニングし、Ｎｏｒｒｉｎアゴニストを同定し、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体を同定する物質および方法を対象とする。これらは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４と結合することによりＮｏｒｒｉｎ活性を調整する試薬とすることができる。これらはまた、Ｄｋｋ１活性（遺伝子またはタンパク質のいずれか）を調整することによりＮｏｒｒｉｎ活性を調整する試薬とすることもできる。他の実施例は、Ｋｒｅｍｅｎ２であろう、Ｋｒｅｍｅｎ２（遺伝子またはタンパク質のいずれか）の調整はＮｏｒｒｉｎ活性を調整するであろう。Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎ２の場合では、好ましくは、これらの化合物の活性を調整する試薬は、Ｄｋｋ１またはＫｒｅｍｅｎ２のアンタゴニストであろう。好ましくは、アッセイにより、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＮｏｒｒｉｎの相互作用を介して、ＬＲＰ５活性もまた調整する試薬がもたらされるであろう。好ましいＬＲＰ５調整は、アゴニストまたは模倣体（たとえばＮｏｒｒｉｎ模倣体またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４模倣体）により産生された等の、活性が増大した形態であろう。
【００８１】
アッセイ系は、試験薬が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ２、ＬＲＰ５に対して結合するまたはＮｏｒｒｉｎ模倣体として作用するそれらの能力についてスクリーニングされるステップを含むことができる。これは、基体を必要とするまたは溶液中で遊離している任意の系とすることができ、前述の基体のいずれかに対する試験薬の結合が起こることが可能にされ、次いで、結合を決定するためにアッセイされる。試験薬は、生理学的条件下（たとえば、ｐＨ約７．０〜７．４；２４℃〜約４０℃）で、結合を可能にする十分な時間、たとえば約１分間〜６時間、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ２、またはＬＲＰ５と混合することができる。
【００８２】
試験薬は、上記に論じられるように、結合についてスクリーニングすることができるまたは任意の化学的ライブラリーからの候補とすることができる。次いで、試験薬は、細胞ベースのアッセイ系においてアッセイすることができる。上記の細胞ベースのアッセイ系は、細胞が、以下の少なくとも１つをコードする核酸で一過性にまたは安定的に形質移入されるアッセイ系とすることができる：Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ１、Ｋｒｅｍｅｎ２、もしくはＬＲＰ５またはそれらの任意の組合せ。したがって、細胞は、少なくともＦｒｉｚｚｌｅｄ４およびＮｏｒｒｉｎならびに残りの３つの遺伝子を個々に発現するであろう。核酸の以下の組合せで安定的にまたは一過性に同時形質移入された一連の細胞もまたあるであろう：
（ａ）ＮｏｒｒｉｎならびにＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６
（ｂ）Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ（たとえばＤｋｋ１〜Ｄｋｋ４）、ならびにＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６
（ｃ）Ｎｏｒｒｉｎ、Ｋｒｅｍｅｎ（たとえばＫｒｅｍｅｎ１もしくは２）、ならびにＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６
（ｄ）Ｎｏｒｒｉｎ、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｄｋｋ、ならびにＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６
（ｅ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＮｏｒｒｉｎ；
（ｆ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、およびＬＲＰ５
（ｇ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、およびＤｋｋ（たとえばＤｋｋ１〜Ｄｋｋ４）；
（ｈ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、ならびにＫｒｅｍｅｎ（たとえばＫｒｅｍｅｎ１および／もしくは２）；
（ｉ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ、およびＫｒｅｍｅｎ２；
（ｊ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、およびＤｋｋ１；
（ｋ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、およびＫｒｅｍｅｎ２ならびに／または
（ｌ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、Ｄｋｋ１、およびＫｒｅｍｅｎ２ならびに／または
（ｍ）または任意の組合せ。
上述の組合せのいずれかについて、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、他のＤｋｋ（たとえばＤｋｋ２、Ｄｋｋ３、および／もしくはＤｋｋ４）、Ｗｎｔ、ならびに／またはＫｒｅｍｅｎ１もまた企図される。
【００８３】
上記のアッセイ系はまた、ベクターコントロールを必要としてもよく、このベクターは、上述のタンパク質のいずれかをコードする核酸が細胞における発現のために操作可能に連結されるベクターであることが当業者により理解されるであろう。ベクターコントロールは、このベクターのみでのおよび／またはベクターなしでの、細胞の一過性または安定性の形質移入から成ることができる。細胞の一過性形質移入および安定性形質移入は、当技術分野で知られている技術を使用して実行することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、１〜３巻（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  ２００１年）またはＳａｍｂｒｏｏｋによる前の版のいずれかを参照されたい。同時形質移入は、当技術分野で知られているように、一過性にまたは安定的に調製することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１。
【００８４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、Ｄｋｋ１、およびＫｒｅｍｅｎをコードする核酸を、それらの関連するタンパク質配列と共に、一部、下記に列挙する。本出願の実施形態は、本明細書に開示される配列に限定されない。
【００８５】
【表１−１】
2009525754.tif 000003
【００８６】
【表１−２】
2009525754.tif 000004
さらなるＨＢＭ配列およびＬＲＰ５配列（たとえばＺｍａｘ１）は、米国特許出願第０９／５４４，３９８号（現在米国特許第６，７７０，４６１号）および第１０／２４０，８５１号に開示され、これらは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
形質移入することができる細胞は、任意の哺乳動物細胞株とすることができる。好ましい細胞株は、とりわけ上述のいずれかのために、ヒトタンパク質をコードする核酸を使用する場合、ヒト細胞株とする。したがって、形質移入は、マウス核酸についてはマウス系においてまたはヒト核酸についてはヒト系において起こり得る。細胞株は、ヒトまたは他の脊椎動物からの骨細胞株、腎臓細胞株、幹細胞株とすることができる。例示的な腎臓細胞株は、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）およびＨｅｐＧ２細胞を含むが、これらに限定されない。例示的な骨細胞株は、ＫＨＯＳ／ＮＰ（Ｒ−９７０−５）（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−１５４４）、ＫＨＯＳ−２４０Ｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−１５４５）、ＫＨＯＳ−３２１Ｈ（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−１５４６）、ＤＳＤｈ（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−２１３１）、ＶＡ−ＥＳ−ＢＪ（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−２１３８）、７Ｆ２（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＣＲＬ−１２５５７）、Ｕ−２ＯＳ（Ｕ２ＯＳとしても知られている；ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．ＨＴＢ−９６）、ＨＯＳＴＥ８５、ＲＯＳ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ６、ＵＭＲ−１０６、Ｓａｏｓ２、ＭＧ６３、およびＨＯＢを含むが、これらに限定されない。例示的な幹細胞株は、ヒト成人間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびマウス幹細胞株、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ）を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
タンパク質のいずれかをコードする核酸は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ならびに転写および翻訳に必要な任意の転写情報を含むであろう。タンパク質をコードする核酸は、次には、細胞における安定性および／または一過性の形質移入に適したベクターに操作可能に連結されるであろう。適したベクターは、ＴＫ−ウミシイタケ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびｐＵＳＥ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を含むが、これらに限定されない。脊椎動物細胞における発現が可能な他の操作可能なベクターが使用されてもよい。
【００８９】
遺伝子およびそれらの関連するタンパク質の調節についての情報を提供する任意のレポーター系を活用することができ、これにはＴＫ−ウミシイタケ、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、アルカリ性ホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または他の蛍光タンパク質マーカーを含むが、これらに限定されない。好ましい系は、本明細書に記載されるように、実施例で記載される、ＴＣＦ−ｌｕｃｉおよびＴＫ−ウミシイタケの組合せである。脊椎動物細胞において効力のある、他のレポーターおよびベクターの組合せもまた活用されてもよい。
【００９０】
一態様では、試験されることになる作用物質に暴露された細胞集団のＮｏｒｒｉｎまたはＮｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質の相対量は、非暴露コントロール細胞集団と比較される。抗体は、異なる細胞集団におけるタンパク質の特異な発現を監視するために使用することができる。細胞株または細胞集団は、適切な条件および時間の下で、試験されることになる作用物質に暴露される。細胞溶解物は、暴露された細胞株または細胞集団およびコントロール、非暴露の細胞株、または非暴露の細胞集団から調製されてもよい。次いで、当技術分野で知られているであろうが、細胞溶解物はプローブを用いて分析される。たとえば、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８年）ならびにＥｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  １９９８年）を参照されたい。
【００９１】
たとえば、ＮｏｒｒｉｎのＮ−末端断片およびＣ−末端断片は、細菌で発現させ、これらの断片に結合するタンパク質を調査するために使用することができる。ＮｏｒｒｉｎのＮ−末端領域もしくはＣ−末端領域（またはＮｏｒｒｉｎの生物学的活性ドメインに対する）または全Ｎｏｒｒｉｎタンパク質に対するＨｉｓタグまたはＧＳＴの融合等の融合タンパク質を調製することができる。これらの融合タンパク質は、たとえばＴａｌｏｎビーズまたはグルタチオンセファロースビーズにカップルし、次いで、Ｎｏｒｒｉｎに結合する分子を同定するために細胞溶解物を用いて調べることができる。溶解より前に、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達またはＷｎｔ経路の下流要素と相互作用するタンパク質を調整する可能性のある精製Ｗｎｔタンパク質、ＲＮＡ、または薬剤を用いて処置されてもよい。融合タンパク質に結合している溶解物タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、当技術分野で知られているたとえばタンパク質配列決定または質量分析により単離し、同定することができる。たとえば、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｓｉｍｏｎ  Ｒｏｅ編、第２版  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）および「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  ｉｎ  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ    １８２巻  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）を参照されたい。
【００９２】
Ｎｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質（たとえばＮｏｒｒｉｎアゴニストもしくはＮｏｒｒｉｎアンタゴニスト）、またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭおよび／またはＫｒｅｍｅｎタンパク質もしくはＤｋｋタンパク質とのＮｏｒｒｉｎの複合体の活性は、ＮｏｒｒｉｎおよびＮｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質ならびに／もしくはＮｏｒｒｉｎおよびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭの間の相互作用、Ｎｏｒｒｉｎおよび／もしくはＦｒｉｚｚｌｅｄ４、Ｄｋｋタンパク質、またはＫｒｅｍｅｎタンパク質を調整する化合物により影響を及ぼされる可能性がある。これらの化合物の発見および特徴づけのための方法およびリサーチツールが本明細書に提供される。ＮｏｒｒｉｎもしくはＮｏｒｒｉｎ模倣体およびＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用タンパク質ならびに／またはＮｏｒｒｉｎおよびＬＲＰ５／６／ＨＢＭならびにＮｏｒｒｉｎ／ＤｋｋならびにＮｏｒｒｉｎ／Ｋｒｅｍｅｎの間の相互作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで監視されてもよい。類似するアッセイもまた、ＮｏｒｒｉｎアゴニストおよびＮｏｒｒｉｎアンタゴニストを評価するために使用することができる。Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４複合体の安定性を調整する化合物は可能性のある治療化合物である。
【００９３】
例となるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ＬＲＰ５／６／ＨＢＭ、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４、またはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４相互作用タンパク質を、プラズモン共鳴分光法による観察の実行のためにＢｉａｃｏｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）により作製されたような機器のために設計されたセンサーチップに結合することを含む。たとえば、この方法を使用して、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４相互作用タンパク質、またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６のうちの１つを有するチップは、それらが複合体を形成することを可能にする条件下で他のものに最初に暴露することができる。次いで、試験化合物が導入され、機器の出力シグナルは、試験化合物により及ぼされた任意の効果の指標を提供する。この方法により、化合物は速やかにスクリーニングされてもよい。この方法は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、任意のＤｋｋ、任意のＫｒｅｍｅｎ、任意のＷｎｔ、およびそれらの任意の組合せとの、任意のＮｏｒｒｉｎ／Ｆｚ組合せに使用することができる。
【００９４】
他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲ方法により例示される（Ｓｈｕｋｅｒら、１９９６年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４号：１５３１〜４頁）。たとえば、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４結合ドメインおよび／またはＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ  ＬＢＤは、標識培地中での発現により１５Ｎ−標識タンパク質として発現させ、精製することができる。標識タンパク質（複数可）は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）試料管において、溶液中で複合体を形成することが可能である。試験化合物の存在下および非存在下での異種核相関スペクトルは、試験化合物との相互作用に関する、個々の残基のレベルでのデータを提供し、複合体のタンパク質間の界面で変化する。この方法は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、任意のＤｋｋ、任意のＫｒｅｍｅｎ、任意のＷｎｔ、およびそれらの任意の組合せとの、任意のＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４組合せを用いて使用することができる。
【００９５】
当業者は、他の多くのプロトコール、たとえばアフィニティーキャピラリー電気泳動（Ｏｋｕｎら、２００１年  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６号：１０５７〜１０６２頁）、蛍光分光法、電子常磁性共鳴等を知っており、これらはまた、複合体の調整を監視するならびに／またはタンパク質もしくはその生物学的活性断片の上述の列挙された組合せのいずれかに対する、試験薬の存在下および非存在下での複合体形成のための結合親和性を測定するために使用することができる。
【００９６】
ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、Ｋｒｅｍｅｎ１、Ｋｒｅｍｅｎ２、任意のＤｋｋ、および任意のＷｎｔのうちの任意の１つまたは複数との、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用、Ｎｏｒｒｉｎ／ＬＲＰ５／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用、またはＮｏｒｒｉｎ模倣体の相互作用の調整を監視するためのプロトコールは、酵母ハイブリッドプロトコールを使用して実行することができる。酵母の２つ以上のハイブリッド方法は、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４の融合タンパク質の複合体および／または上述の列挙された他のタンパク質のいずれかの形成により活性化された遺伝子の発現を監視することにより、複合体の調整を監視するために使用されてもよい。ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＨＢＭを使用する場合、完全なタンパク質またはリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）もしくはＹＷＴＤ反復配列を含有するベータプロペラの部分を使用することができる。相互作用するＮｏｒｒｉｎおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ４またはＮｏｒｒｉｎおよびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＬＢＤドメインをコードする、本発明による核酸は、ベイトプラスミドおよびプレイプラスミド中に組み込まれる。酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）方法または３つ以上のタンパク質のための酵母ハイブリッド方法は、１つまたは複数の試験化合物の存在下で実行される。複合体の調整は、複合体により活性化された遺伝子の発現における変化により観察される。試験化合物は、アッセイに直接的に追加することができるまたは、タンパク質の場合には、ベイト化合物およびプレイ化合物と共に、酵母中で同時発現させることができることが当業者により十分に理解されることとなる。類似して、ＮｏｒｒｉｎおよびＮｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質の融合タンパク質もまた、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体を調整する他のタンパク質（Ｄｋｋ、Ｋｒｅｍｅｎ、他の負の調節因子、および正の調節因子等）を同定するために、Ｙ２Ｈスクリーンで使用することができる。酵母ハイブリッド技術は、当技術分野で知られている。たとえばＬＩ  ＺＨＵおよびＧＲＥＧＯＲＹ  Ｊ．  ＨＡＮＮＯＮ、ＹＥＡＳＴ  ＨＹＢＲＩＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  （２０００年）を参照されたい。
【００９７】
これら等のアッセイプロトコールは、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体を調整する化合物、薬剤、処置について、上記の調整が、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体としての競合的結合、作用によりまたはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体の構造を変更することによりまたはタンパク質間界面の安定化もしくは不安定化により起こるかどうかをスクリーニングするための方法において使用されてもよい。静的効果による結合部位構造の変更の誘発もまた可能性として考えられるけれども、ペプチドアプタマーが競合的に結合する可能性があることが期待されるかもしれない。本明細書に使用されるように、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４およびＮｏｒｒｉｎ／Ｆｚ４／ＬＲＰ５複合体により調整される生物学的プロセスまたは病理学的プロセスは、Ｎｏｒｒｉｎの、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４に対する結合またはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５複合体と相互作用するまたはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体のＤｋｋおよび／もしくはＫｒｅｍｅｎによるダウンレギュレーションを予防するタンパク質に対する結合を含んでいてもよい。これは、Ｎｏｒｒｉｎと相互作用するまたは複合体およびＮｏｒｒｉｎ模倣体に関与するタンパク質の合成を調整する化合物を含むことができる。
【００９８】
さらに、本明細書に論じられるように、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５複合体の調整の生化学分析と共に評価することができる他の骨関連因子に加えて、アルカリ性ホスファターゼ活性、オステオカルシン産生、または鉱化作用等の骨関連マーカーが観察されてもよい。
【００９９】
病理学的プロセスは、有害性の影響をもたらす生物学的プロセスのカテゴリーについて言及するものである。たとえば、ＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６ならびに／またはＤｋｋおよび／もしくはＤｋｋ相互作用タンパク質の発現または発現のアップレギュレーションは、ある種の疾患または病理学的状態に関連する可能性がある。本明細書に使用されるように、作用物質は、作用物質が、被検者におけるその基本的なレベルから統計的に有意なレベルまでプロセスを変更させる場合、病理学的プロセスを調整すると表現される。たとえば、作用物質は、作用物質が投与された被検者において、そのタンパク質により媒介されたプロセスの程度または重症度を低下させてもよい。たとえば、疾患または病理学的状態は、予防されてもよく、または疾患進行は、いくつかの方法において、本発明のタンパク質の発現もしくは少なくとも１つの活性を低下させるもしくは調整する作用物質の投与により調整されてもよい。
【０１００】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＮｏｒｒｉｎおよびＬＲＰ５／ＬＲＰ６（ならびにＫｒｅｍｅｎ、Ｄｋｋ、およびＷｎｔ）は、骨量調整に、直接的にならびに／または間接的に関与するので、本発明の一実施形態は、骨状態または骨疾患を診断する方法として、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体およびＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体リガンドを使用することである。ある種のマーカーは、特異的なＷｎｔシグナル伝達状態（たとえばＴＣＦ／ＬＥＦ活性化）に関連する。骨状態についての診断試験は、サンプルまたはその抽出物を、ＤｋｋもしくはＤｋｋ相互作用タンパク質の核酸（つまりＤＮＡもしくはＲＮＡ）、オリゴマーもしくはその断片、またはＴＣＦ／ＬＥＦにより調節された発現についてのタンパク質産物の存在について試験するステップを含んでいてもよい。たとえば、標準的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは他の画像技術は、Ｗｎｔシグナル伝達の産物を観察するために活用することができる。
【０１０１】
さらに、骨発達状態または骨損失状態を調整するための方法および物質が本明細書に論じられる。骨損失の阻害は、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体およびそれによってＷｎｔシグナル伝達経路における変化を阻害することまたは調整することにより達成されてもよい。たとえば、Ｎｏｒｒｉｎ活性の非存在またはＤｋｋ１活性の増加は、低骨量と関連する可能性がある。ＮｏｒｒｉｎおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の活性増加は、高骨量と関連する可能性がある。したがって、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４活性の調整は、次には、骨量を調整することとなる。アゴニストおよびアンタゴニストを介した、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体とのＤｋｋの相互作用の調整は、骨発達を調節するための方法の一実施形態である。
【０１０２】
本発明の作用物質は、単独でまたは特定の病理学的プロセスを調整する他の作用物質と組み合わせて提供することができる。本明細書に使用されるように、２つの作用物質は、２つの作用物質が、同時に投与されるまたは作用物質が並行して作用するように独立して投与される場合、組み合わせて投与されると表現される。
【０１０３】
本発明の作用物質は、たとえば非経口経路、皮下経路（ｓ．ｃ．）、静脈内経路（ｉ．ｖ．）、筋肉内経路（ｉ．ｍ．）、腹腔内経路（ｉ．ｐ．）、経皮経路、または口内経路を介して非ヒト試験動物に投与することができる。代わりにまたは併用的に、投与は、経口経路によるものであってもよい。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、併用処置の種類、もし併用処置があれば処置の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存性となる。
【０１０４】
本発明は、ＮｏｒｒｉｎもしくはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体の発現もしくは少なくとも１つの活性を調整するまたはＮｏｒｒｉｎ模倣体として作用する１つまたは複数の作用物質を含む組成物をさらに提供する。個々の必要性は変動するが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。Ｎｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質、またはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体（もしくはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５複合体、これは、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体が論じられる所で企図される）のリガンドの媒体となるＮｏｒｒｉｎ模倣体または作用物質を含む活性剤の典型的な投薬量は、約０．０００１〜約５０ｍｇ／体重ｋｇを含んでいてもよい。好ましい投与量は、約０．００１〜約５０ｍｇ／体重ｋｇを含んでいてもよい。最も好ましい投与量は、約０．１〜約１ｍｇ／体重ｋｇを含んでいてもよい。７０ｋｇの平均的なヒトでは、範囲は、約７μｇ〜約３．５ｇであり、好ましい範囲は、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇであろう（たとえばこの範囲内の任意の０．１ｍｇごとの値）。
【０１０５】
薬理学的活性剤に加えて、本発明の組成物は、適した薬学的に許容し得る担体を含有し、作用部位への送達のために薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤、担体、および佐剤を含んでいてもよい。非経口投与に適した製剤は、水溶性形態、たとえば水溶性の塩の、活性化合物の水性液剤を含む。そのうえ、適切な油性注射懸濁剤としての、活性化合物の懸濁剤が投与されてもよい。適した親油性溶媒または媒体は、脂肪油（たとえばゴマ油等の植物性油）または合成脂肪酸エステル（たとえばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）を含む。水性注射懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有していてもよく、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでいてもよいが、これらに限定されない。任意選択で、この懸濁剤はまた、安定剤を含有していてもよい。リポソームおよび他の非ウイルスベクターもまた、細胞中への送達のために、作用物質をカプセル化するために使用することができる。
【０１０６】
本発明による全身性投与のための医薬製剤は、腸内投与、非経口投与、局所（ｔｏｐ）投与のために製剤されてもよい。実際に、すべての３つの種類の製剤が、活性成分の全身性投与を達成するために同時に使用されてもよい。
【０１０７】
経口投与に適した製剤は、硬質もしくは軟質のゼラチンカプセル剤、丸剤、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤およびそれらの放出制御形態を含む。
【０１０８】
潜在的に、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎリガンド、またはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体に結合し、それによって調整する任意の化合物は、治療化合物としてもよい。本発明の一実施形態では、本発明によるペプチドまたは核酸アプタマーは、治療用組成物中に使用される。上記組成物は、無修飾もしくは修飾アプタマーまたはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４断片を含んでいてもよい。他の実施形態では、治療化合物は、Ｎｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質もしくはＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体相互作用タンパク質またはその生物学的活性断片を含む。
【０１０９】
核酸アプタマーは、たとえば取り込みを促進するまたはアプタマーを安定化させる可能性のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の担体分子への化学結合により、組成物中に使用されてきた。ＲＮＡに付いたジアルキルグリセロール部分は、リポソーム中にアプタマーを包埋するために使用し、それによって、化合物を安定化することができる。化学的置換（つまり、ＲＮＡ中での、リボースの２’−ＯＨ基の２’−ＮＨへの変化は、リボヌクレアーゼ抵抗性を付与する）の組み込みおよびキャッピング等は、崩壊を予防することができる。数種の上記技術は、ＲＮＡアプタマーについて、ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ、２０００年  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７４号：３〜１３頁に論じられている。
【０１１０】
ペプチドアプタマーは、たとえば、レトロウイルス送達による、送達複合体にＤＮＡをカプセル化することによる、または単に裸のＤＮＡ注射による等の、アプタマー発現を対象とする発現ベクターの罹患組織中への導入により、治療用途において使用されてもよい。あるいは、アプタマー自体または合成類似体は、薬剤として直接的に使用されてもよい。ポリマーおよび脂質におけるカプセル化は送達を援助する可能性がある。治療薬および診断薬としてのペプチドアプタマーの使用は、Ｈｏｐｐｅ−ＳｙｌｅｒおよびＢｕｔｚ、２０００年  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７８号：４２６〜４３０頁により検討されている。
【０１１１】
他の態様では、本発明の拘束されたペプチドアプタマーの構造は、ＮＭＲまたはＸ線結晶学により等で決定されてもよい（Ｃａｖａｎａｇｈら、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＮＭＲ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；Ｄｒｅｎｔｈ、ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ−ＲＡＹ  ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９９年）。好ましくは、構造は、標的タンパク質と複合させて決定することができる。次いで、低分子類似体は、アプタマーの３Ｄ構造の機能要素の位置に従って設計される（ＧＵＩＤＥＢＯＯＫ  ＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＩＮ  ＤＲＵＧ  ＤＥＳＩＧＮ、Ｃｏｈｅｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＳＩＧＮ  （ＴＯＰＩＣＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、ＶｉｎｔｅｒおよびＧａｒｄｎｅｒ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年）。Ｎｏｒｒｉｎの活性を調整し、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎ相互作用タンパク質、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用タンパク質、およびＮｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体のように作用する有効で特異的な薬剤を同定し、設計するための方法が、本明細書で提供される。ペプチドアプタマーの低分子模倣体もまた範囲内に包含される。
【０１１２】
２．１  細胞ベースのＮｏｒｒｉｎ機能レポーターアッセイ
実施例において下記に記載されるＴＣＦレポーターアッセイは、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体を同定するために（図１および２）またはＤｋｋ１／Ｋｒｅｍｅｎ２のアンタゴニスト等の、Ｎｏｒｒｉｎシグナル阻害因子のアンタゴニストを同定するために（図３）、スクリーニングアッセイに発展させることができる。両種類のアッセイにおいて、骨細胞型または非骨細胞型で実行された場合、活性分子は、ＴＣＦルシフェラーゼシグナルまたは他の適したシグナル法を増大させるであろう。
【０１１３】
２．２  Ｎｏｒｒｉｎ／ＬＲＰ５／ＬＲＰ６およびＤｋｋ／ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｋｒｅｍｅｎアッセイ
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５／ＬＲＰ６とのＮｏｒｒｉｎの相互作用を調整する試薬についてスクリーニングするために使用することができる他の方法は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを介したものである。このアッセイの２つの可能性として考えられる並べ換えが例示されるが、他の並べ換えもまた活用することができる。たとえば、ＬＲＰ５は、組織培養プレートウェル等の固体表面に固定することができる。当業者は、これらに限定されないが、ナイロン膜またはニトロセルロース膜、シリコーンチップ、スライドガラス、ビーズ等のような他の担体を代わりに用い、それらを活用することができることを認識するであろう。これを行う１つの様式は、融合タンパク質としての、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４の形態を有することができることであり、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４の細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧまたは他のＩｇＧのＦｃ部分に融合される。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４−Ｆｃ融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（または他の適した細胞株）中で産生することができ、融合タンパク質は、細胞株または培地から抽出される。単離されたＬＲＰ５／６／Ｆｚ４−Ｆｃ融合タンパク質は、たとえば、抗ヒトＦｃ抗体を介してまたはタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇをコーティングしたプレートにより固体表面に固定することができる。次いで、基体は、任意の非結合タンパク質を除去するために洗浄することができる。分泌型Ｎｏｒｒｉｎタンパク質もしくは分泌型Ｎｏｒｒｉｎエピトープタグ付きタンパク質（または精製Ｎｏｒｒｉｎ、精製Ｎｏｒｒｉｎエピトープタグ付きタンパク質、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体、もしくは骨調整に関与する、Ｎｏｒｒｉｎの生物学的活性部分を含有する断片）を含有する条件培地は、ウェルまたは容器中でインキュベートすることができる。代わりに、試験試薬は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体をスクリーニングするために、固定された融合タンパク質とインキュベートすることができる。ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４に対するＮｏｒｒｉｎまたはＮｏｒｒｉｎ模倣体の結合は、Ｎｏｒｒｉｎまたはエピトープタグのいずれかに対する抗体を使用して評価することができる。たとえば、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｖ５エピトープタグ付きタンパク質またはその断片は、抗Ｖ５抗体を用いて検出することができる。次いで、このアッセイ系は、たとえばＮｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、およびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４融合タンパク質に対するＮｏｒｒｉｎと同様な様式で結合する免疫グロブリンを同定するために使用することができる。アッセイは、たとえば、競合アッセイ、タグ付き試験試薬等の形態とすることができる。これらのアッセイ系はまたＨＢＭと共に活用することができる。アッセイはまた、これらのタンパク質およびポリペプチドの間の複合体の相互作用および形成を調整する試験薬についてスクリーニングする場合、Ｄｋｋ、Ｋｒｅｍｅｎ、および／もしくはＷｎｔタンパク質またはその生物学的活性断片を含む洗液を有するよう修正することもできる。
【０１１４】
代わりに、骨調整に関与するＮｏｒｒｉｎタンパク質もしくはその生物学的活性断片（Ｎｏｒｒｉｎタンパク質に対するすべての言及は、生物学的活性断片も使用することができることを想定する）またはＮｏｒｒｉｎ模倣体は、アルカリ性ホスファターゼ等の検出マーカーに直接的に融合することができる。ここで、Ｎｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４相互作用の検出は、続く抗体ベースの実験を伴わないで直接的に確かめることができる。結合したＮｏｒｒｉｎまたはＮｏｒｒｉｎ模倣体は、アルカリ性ホスファターゼアッセイまたは他の検出アッセイで検出される。Ｎｏｒｒｉｎ−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質が、固定されたＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４に結合する場合、アルカリ性ホスファターゼ活性は、比色定量読み出し、放射性読み出し、または蛍光性読み出しで検出されるであろう。結果として、この系を使用して、低分子化合物がＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４に対するＮｏｒｒｉｎの結合を変更させる能力または試験試薬が、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体もしくはＮｏｒｒｉｎアゴニストであるかどうかをアッセイすることができる。たとえば、化合物は、プレートの各ウェルに対してＮｏｒｒｉｎ（またはエピトープタグ付きＮｏｒｒｉｎ）が追加された場合、適したインキュベーション時間および洗浄の後の、ウェル中で結合したＮｏｒｒｉｎのシグナル強度に基づいて、ＮｏｒｒｉｎおよびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４の間の相互作用を調整するそれらの能力についてスコア化することができる。アッセイは、非標識Ｎｏｒｒｉｎまたは第２の種類のエピトープタグ付きＮｏｒｒｉｎを用いた競争実験を行うことにより較正することができる。Ｎｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｚ４相互作用を調整する（たとえば増大させる）ことができる任意の分子は、適した治療候補、好ましくは、骨形成治療候補または脂質（たとえば、ＡｐｏＥ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、コレステロール）を調整することができる候補となる可能性がある。上記分子は、低分子化学分子、ペプチド、および免疫グロブリン（抗体、抗体断片）を含み、すべて、上記アッセイ系を使用して検査することができる。
【０１１５】
２．３  Ｎｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５／６／Ｆｚ４ホモジニアスアッセイ
タンパク質間相互作用の調整を確かめるための他の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介したものである。ＦＲＥＴは、量子力学的プロセスであり、ドナーである蛍光分子は、近接しているアクセプター発色団分子に対してエネルギーを移動させる。類似して、さらに増幅発光近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡスクリーン）は、Ｎｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５／６またはＮｏｒｒｉｎ−Ｆｚ４相互作用ドメインおよびＦｚ４／ＬＲＰ５複合体におけるＮｏｒｒｉｎ模倣体の機能を評価するために使用することができる。上記系は、ＬＲＰ５およびアキシンの間の分子間相互作用を特徴づけるために、文献においてうまく使用されてきた（たとえば、Ｍａｉｏら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７号：８０１〜９頁を参照されたい）。上記研究のための入手可能な多くの異なる蛍光性タグがあり、興味のあるタンパク質に蛍光タグを付けるための数種の方法がある。たとえば、ＣＦＰ（つまりシアン蛍光タンパク質）およびＹＦＰ（つまり黄色蛍光タンパク質）は、ドナーおよびアクセプターとしてそれぞれ使用することができる。融合タンパク質は、ドナーおよびアクセプターと共に、操作する、発現させる、精製する、または特異的なドナービーズおよびアクセプタービーズに抱合することができる。
【０１１６】
たとえば、ＦＲＥＴ型アッセイでは、精製Ｎｏｒｒｉｎタンパク質もしくはその生物学的活性ポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎ模倣体としてスクリーニングされている作用物質は、ＣＦＰ（または他の蛍光タンパク質）に融合することができ、ＹＦＰに融合された精製ＬＲＰ５／６／Ｆｚ４タンパク質またはその生物学的活性ポリペプチド（たとえばＬＢＤもしくはベータプロペラ含有ドメイン）は、標準的なアプローチを使用して、生成し、精製することができる。Ｎｏｒｒｉｎ−ＣＦＰおよびＬＲＰ５／Ｆｚ４−ＹＦＰが近接している場合、ＣＦＰからＹＦＰへのエネルギーの移動は、ＣＦＰ発光の低下およびＹＦＰ発光における増加をもたらすこととなる。エネルギーは、４５０ｎｍの励起波長で供給され、エネルギー移動は、４８０ｎｍおよび５７０ｎｍの発光波長で記録される。ＹＦＰ発光とＣＦＰ発光の比は、Ｎｏｒｒｉｎ（またはＮｏｒｒｉｎ模倣体）およびＬＲＰ５／Ｆｚ４の間の相互作用における変化についての尺度を提供する。この系は、ＷｎｔカスケードにおけるＮｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５／Ｆｚ４タンパク質間の相互作用および活性を変更させる可能性のある低分子化合物をスクリーニングするために適用できる。相互作用を増大させるまたは破壊する化合物は、ＹＦＰ発光とＣＦＰ発光の比における増加または減少のそれぞれにより同定されるであろう。次いで、Ｎｏｒｒｉｎと同じ様式でＬＲＰ５／Ｆｚ４相互作用を調整する上記化合物は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体分子候補と考えられるであろう。作用物質はまた、Ｎｏｒｒｉｎ様活性を増大させる作用物質についてスクリーニングされるであろう。これらのアッセイ系は、種々の組合せでＫｒｅｍｅｎ、Ｄｋｋ、および／またはＷｎｔを含むよう、異なる蛍光タンパク質を用いてさらに修正することができる。化合物のさらなる特徴づけは、機能的Ｎｏｒｒｉｎシグナル伝達に対する化合物の効果を解明するために、ＴＣＦルシフェラーゼアッセイまたはアフリカツメガエル胚アッセイを使用して行うことができる。
【０１１７】
２．４  酵母ハイブリッドアッセイ
２ハイブリッド系、３ハイブリッド系、または他の酵母ハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用を研究するのに非常に有用である。たとえば、Ｃｈｉｅｎら、１９９１年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：９５７８〜８２頁；Ｆｉｅｌｄｓら、１９９４年  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０号：２８６〜９２頁；Ｈａｒｐｅｒら、１９９３年  Ｃｅｌｌ  ７５号：８０５〜１６頁；Ｖｏｊｔｅｋら、１９９３年  Ｃｅｌｌ  ７４号：２０５〜１４頁；Ｌｕｂａｎら、１９９３年  Ｃｅｌｌ  ７３号：１０６７〜７８頁；Ｌｉら、１９９３年  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ７号：９５７〜６３頁；Ｚａｎｇら、１９９３年  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４号：３０８〜１３頁；Ｇｏｌｅｍｉｓら、１９９２年  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２号：３００６〜１４頁；Ｓａｔｏら、１９９４年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１号：９２３８〜４２頁；Ｃｏｇｈｌａｎら、１９９５年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７号：１０８〜１１１頁；Ｋａｌｐａｎａら、１９９４年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６号：２００２〜６頁；Ｈｅｌｐｓら、１９９４年  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３４０号：９３〜８頁；Ｙｅｕｎｇら、１９９４年  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．  ８号：２０８７〜９頁；Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３年  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．  ７号：５５５〜５６９頁；Ｐａｅｔｋａｕら、１９９４年  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．  ８号：２０３５〜４５頁；Ｓｐａａｒｇａｒｅｎら、１９９４年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１号：１２６０９〜１３頁；Ｙｅら、１９９４  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１号：１２６２９〜３３頁；ならびに米国特許第５，９８９，８０８号；第６，２５１，６０２号；および第６，２８４，５１９号を参照されたい。
【０１１８】
多くの系は、相互作用タンパク質をクローニングするために酵母ファージミドｃＤＮＡライブラリー（たとえば、Ｈａｒｐｅｒ、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、１５３〜１７９頁（１９９３年）；およびＥｌｌｅｄｇｅら、１９９１年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８号：  １７３１〜５頁を参照されたい）またはプラスミドｃＤＮＡライブラリー（Ｂａｒｔｅｌ、１９９３年  Ｃｅｌｌ  １４号：９２０〜４頁）；Ｆｉｎｌｅｙら、１９９４年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１号：１２９８０〜４頁）をスクリーニングするのにならびに知られているタンパク質ペアを研究するのに利用可能である。
【０１１９】
２ハイブリッド系の成功は、ＧＡＬ４等の多くの転写因子ＤＮＡ結合ドメインおよびポリメラーゼ活性化が分離され、次いで、機能性を回復するために、再結合することができるという事実に依存する（Ｍｏｒｉｎら、１９９３年  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１号：２１５７〜６３頁）。これらの例は、酵母系における２ハイブリッドスクリーニングを記載するが、２ハイブリッドスクリーニングは、哺乳動物細胞株等の他の系において行われてもよいことが理解される。したがって、本発明は、酵母２ハイブリッド系の使用に限定されず、上記代替系を包含する。
【０１２０】
たとえばＧＡＬ→ＬａｃＺ、ＧＡＬ→ＨＩＳ３、またはＧＡＬ→ＵＲＡ３等の種々のレポーター遺伝子カセットの一体化されたコピーを有する酵母菌株（Ｂａｒｔｅｌ、ＩＮ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、１５３〜１７９頁  （１９９３年）；Ｈａｒｐｅｒら、１９９３年  Ｃｅｌｌ  ７５号：８０５〜１６頁；Ｆｉｅｌｄｓら、１９９４年  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０号：２８６〜９２頁）をそれぞれ異なる融合タンパク質を発現する２種のプラスミドで同時形質転換する。一方のプラスミドは、タンパク質「Ｘ」およびたとえばＧＡＬ４酵母転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインの間の融合物をコードし（Ｂｒｅｎｔら、１９８５年  Ｃｅｌｌ  ４３号：７２９〜３６頁；Ｍａら、１９８７年  Ｃｅｌｌ  ４８号：８４７〜５３頁；Ｋｅｅｇａｎら、１９８６年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１号：６９９〜７０４頁）、他方のプラスミドは、タンパク質「Ｙ」およびＧＡＬ４のＲＮＡポリメラーゼ活性化ドメインの間の融合物をコードする（Ｋｅｅｇａｎら、１９８６年）。これらのプラスミドは、調節領域がＧＡＬ４結合部位を含有するｌａｃＺ等のレポーター遺伝子を含有する酵母の菌株中に形質転換される。タンパク質ＸおよびＹが相互作用する場合、それらは、転写を活性化するために２つのＧＡＬ４成分を十分に近位にすることにより、機能的ＧＡＬ４転写活性化タンパク質を再構成する。代わりにベイトタンパク質およびプレイタンパク質の役割が切り替えられてもよく、したがって、本発明の実施形態は、両方の代替処理を企図し、包含することが十分に理解される。
【０１２１】
いずれかのハイブリッドタンパク質だけでは、レポーター遺伝子の転写を活性化することはできないはずである。ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないので、転写を活性化することはできないはずであり、活性化ドメインハイブリッドは、ＧＡＬ４結合部位の場所を突き止めることができないので、転写を活性化することはできないはずである。２種の試験タンパク質の相互作用は、ＧＡＬ４の機能を再構成し、レポーター遺伝子の発現をもたらす。レポーター遺伝子カセットは、それらのＴＡＴＡボックスに対して５’にクローニングされたＧＡＬ４  ＤＮＡ認識部位を含有する最小限のプロモーターから成る（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８４年  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４号：１４４０〜８頁；Ｌｏｒｃｈら、１９８４年  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８６号：８２１〜８２４頁）。転写活性化は、β−ガラクトシダーゼ（もしくは他のレポーター）の発現または転写産物のための栄養要求性の選択、たとえばＵＲＡ３（ウラシル選択）もしくはＨＩＳ３（ヒスチジン選択）を可能にする特定の栄養素を欠く最少培地上での形質転換体の成長のいずれかを測定することによりスコア化される。たとえばＢａｒｔｅｌ、１９９３年；Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３年  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．  ７号：５５５〜５６９頁；Ｆｉｅｌｄｓら、１９９４年  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １０号：２８６〜２９２頁；および米国特許第５，２８３，１７３号を参照されたい。
【０１２２】
一般に、これらの方法は、酵母細胞の核中でハイブリッドとして発現される、相互作用について試験されることになる２種のタンパク質を含む。一方のタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合され、他方は、転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合される。タンパク質が相互作用する場合、それらは、ＤＢＤのための結合部位を含有する１つまたは複数のレポーター遺伝子を活性化する機能的転写因子を再構成する。例示的な２ハイブリッドアッセイは、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４／ＬＲＰ５の融合物である。
【０１２３】
３．作用物質をアッセイするｉｎ  ｖｉｖｏ方法
本明細書で明らかにしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に加えて、方法および物質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析によりスクリーニングされ、同定された試験薬の効果を研究するために、動物の使用をさらに含むことができる。たとえば、トランスジェニック動物は、１つ（または複数）のＮｏｒｒｉｎ、Ｋｒｅｍｅｎ（Ｋｒｅｍｅｎ１および／もしくは２）、Ｄｋｋ（Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、および／もしくはＤｋｋ４）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、Ｗｎｔ（Ｗｎｔ１〜Ｗｎｔ１９）、ならびにＦｒｉｚｚｌｅｄ４の遺伝子がｃＤＮＡとして導入される。ＬＲＰ５およびＨＢＭのトランスジェニック動物の例は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１４８７６号および米国特許出願第１０／６８０，２８７号に見い出される。これらの出願の主題は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
したがって、一態様では、上記に論じられる形質移入細胞株のいずれかに対して試験薬をスクリーニングするステップの後でならびに／または作用物質が、Ｄｋｋ、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、Ｗｎｔ、および／またはＫｒｅｍｅｎのいずれかに結合するかどうかを確かめるために試験した後で、これらの試験薬はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでも評価することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで試薬を試験するステップの追加により、前掲のセクション２において論じられた手段のいずれかにより得られた試験に対する確証ステップが追加される。試薬は、化合物に適した投与の任意の手段、たとえば、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚等を介して動物に投与することができる。投与は、試験化合物の製剤に依存してもよい。たとえば、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および免疫グロブリンは、経口的にではなく静脈内に投与されてもよい。低分子化学分子は、経口的にまたは静脈内に投与されてもよい。試験化合物の量は、動物の重量ベースに基づいて投与されるであろう。
【０１２５】
動物は、化合物の生物学的利用能および分解産物を試験するために活用することができる。
【０１２６】
動物は、数日間、数週間、または数ヶ月間の期間にわたり試験化合物を投与されるであろう。投与は、毎日、毎週、隔月、毎月等とすることができる。動物に、作用物質を、単独でまたは動物の骨に対するひずみを引き起こす運動と共に投与することができる。動物の骨にどのようにひずみをかけることができるかについての解説が、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１７９５１号に記載される。この出願の内容は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
たとえば、ｐＤＸＡは、種々の投与量の作用物質が投与される野性型動物およびトランスジェニック動物において測定することができる。たとえば、野性型マウスおよびトランスジェニックマウスは、麻酔をかけられ、体重を量られ、ＬＵＮＡＲ社製の小動物ＰＩＸＩｍｕｓデバイスを使用して骨格の全身Ｘ線スキャンが生成される。スキャンは、マウスが離乳すると（つまり３週齢）、実行することができ、２週間の間隔で繰り返すことができる。野性型動物は、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、および２９週目にスキャンすることができる。トランスジェニック動物のスキャンは、１７週目までの期間、実行することができる。スキャンは、種々の体の領域についてのＢＭＤ（骨ミネラル密度）、ＢＭＣ（骨ミネラル含量）、ＴＴＭ（全組織質量）、および脂肪パーセント（％）について分析することができる。
【０１２８】
さらにまたは代わりに、上述の動物のｆａｘｉｔｒｏｎ社製Ｘ線像を得ることができる。たとえば、麻酔をかけた動物のｐＤＸＡスキャンの後で、さらなるＸ線を、骨の大きさの測定を可能にするＦａｘｉｔｒｏｎ社製デバイスを使用して撮ることができる。
【０１２９】
さらにまたは代わりに、カルセイン標識を上述の動物に対して実行することができる。たとえば、動物は、２回の連続する機会に、１５ｍｇ／動物体重ｋｇでカルセインを投薬することができる。第１の用量は、動物が安楽死させられる９日前に与えることができ、第２の用量は、動物の安楽死の２日前に与えることができる。次いで、骨の形成の測定値を決定することができる。
【０１３０】
上述の動物のある種類のｅｘ  ｖｉｖｏ分析もまた任意選択で実行することができる。たとえば、ＲＮＡ単離は、組織から単離することができ、ｐＱＣＴおよびマイクロＣＴ（μＣＴ）、組織検査、曲げ強度分析、椎骨の圧縮強度分析、および血清分析を実行することができる。たとえば、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ発現を決定するために、ＴＲＩｚｏｌ７を使用して、脛骨および他の組織から単離することができる。上述の動物のいずれかのｐＱＣＴ分析は、大腿骨を得て、大腿骨から軟部組織を取り除くことにより実行することができる。次いで、大腿骨は、遠位骨幹端の密度の全体としての密度および骨梁密度の決定のために７０％エタノール中で保存することができ、次いで、骨幹中央の皮質密度を決定することができる。
【０１３１】
動物の大腿骨の分析はまた、遠位骨幹端の骨梁指標を決定するために使用することができる。
【０１３２】
任意選択で、組織学的分析は、上述の動物のいずれかについて実行することができる。たとえば、マウスの大腿骨は、遠位骨幹端の骨面積ならびに静的パラメーターおよび動的パラメーターを決定するために使用することができる。代わりにまたはさらに、免疫組織化学法を実行することができる（たとえば骨形成マーカーのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびアポトーシスを受けている細胞のＴＵＮＥＬ染色）。
【０１３３】
上述の動物のいずれかはまた、椎骨の曲げ強度または圧縮強度について骨を検査することができる。曲げ強度については、動物の大腿骨（または他の適した骨）は、軟部組織を取り除き、骨幹中央の３点曲げ強度の分析より前に約−２０℃で保存することができる。圧縮強度は、たとえばマウスのＴ１０〜Ｌ６またはＬ７の脊椎を摘出することにより測定することができる。軟部組織は脊椎上に残され、次いで、脊椎は分析まで約−２０℃で凍結される。圧縮強度は、Ｌ５椎骨でよく測定される。
【０１３４】
脂質分析の目的については、動物からの血清を評価することができる。たとえば、動物を安楽死させることができ、血清は、総コレステロール、トリグリセリド、オステオカルシン、および他の生化学的代理マーカーを測定するために血液から調製することができる。
【０１３５】
遺伝子の転写調整および発現調整もまた動物について評価することができる。たとえば、骨に対する荷重は、以下のように遺伝子に影響を与えることで知られている。
【０１３６】
【表２−１】
2009525754.tif 000005
【０１３７】
【表２−２】
2009525754.tif 000006
上述の言及された遺伝子のうちの任意の１つまたは複数は、任意の組合せで、試験薬、コントロール薬の投与、骨または骨細胞に対する応力等による、発現における変化について評価することができる。次いで、作成した遺伝子プロファイルは、作用物質が、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４−ＬＲＰ５複合体およびＷｎｔ経路におけるその活性に対して有する影響と共に評価することができる。たとえば、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４−ＬＲＰ５複合体を調整した作用物質またはＮｏｒｒｉｎ模倣体により得られた遺伝子／タンパク質プロファイルは、ＤｋｋアンタゴニストもしくはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストの投与によりまたは骨もしくは骨細胞に対する応力により観察されたようなプロファイルをもたらす。
【０１３８】
骨荷重および作用物質による調整に対する骨荷重の比較は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも実行することができる。たとえば、重力荷重は、本明細書に論じられる骨細胞のいずれかに対する応力を誘発するために使用することができ、以下の遺伝子の任意の１つもしくは複数の遺伝子または任意の組合せの遺伝子発現のプロファイルもまた、骨応力プロファイルの一部として評価することができる。骨応力プロファイルは、たとえば、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体が、骨応力プロファイルの増大を誘発するまたは骨応力プロファイルの遺伝子に対するＤｋｋおよび／もしくはＫｒｅｍｅｎによる阻害を減少させるかどうかを確かめるために評価することができる。
【０１３９】
【表３−１】
2009525754.tif 000007
【０１４０】
【表３−２】
2009525754.tif 000008
投与された試験薬が骨調整効果を誘発することができるかどうかの決定は、米国出願第１０／６８０，２８７号および国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１７９５１号または本明細書に記載されるもしくは当技術分野で知られている方法のいずれかに記載されるように、骨密度の変化についてＸ線によりまたは動物の犠牲死および皮質骨の検査により評価することができる。これらの出願の内容は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
４．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨荷重を研究する方法
本発明の一態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨荷重の効果の研究およびその効果により骨荷重の利点を増大させることができる（つまり骨鉱化作用の増加）手段である。骨荷重増大の研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（上記に論じられる）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で行うことができる。骨荷重増大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまず実行することができ、次いで上記に論じられる実験等のｉｎ  ｖｉｖｏでの実験が後に続く。
【０１４２】
したがって、本発明の一態様は、荷重刺激をシミュレートする条件下に細胞を置くことを必要とする。ｉｎ  ｖｉｖｏで観察される骨荷重応答を模倣するための、細胞培養にひずみをかけるのに利用可能な数種の方法がある。これらの方法は、流体剪断、静水圧縮、一軸延伸、二軸延伸、重力荷重、およびＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）または等価なシステムを使用して誘発された荷重を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
４．１  骨荷重刺激
上述の方法のいずれかにより提供される骨荷重刺激等の骨荷重刺激により調整される好ましい遺伝子は、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、ＷＩＳＰ２、ＣＣＮＤ１、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、およびｅＮＯＳを含むが、これらに限定されない。本明細書の表の多くで反映されるように、さらなる遺伝子が、それらの活性における増加（たとえばｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の増加）について監視することができる。骨荷重に応じて一貫してアップレギュレートされることが示された少なくとも６つの遺伝子（つまりＪｕｎ、Ｆｏｓ、ｅＮＯＳ、ＳＦＲＰ１、ＣＯＸ−２、およびコネキシン４３）はまた、Ｗｎｔ経路を活性化する作用物質の追加によっても増大する。Ｗｎｔ２等の他の遺伝子は、Ｗｎｔ経路を活性化した試薬の追加により増大せず（たとえばＧＳＫ−３阻害因子およびＷｎｔ３Ａならびにそのアゴニスト、模倣体、および変異体）、骨荷重に対して応答するのみである。したがって、一態様は、たとえばＮｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４模倣体、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４模倣体に応じた応力プロファイル遺伝子の増大を研究するための上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用することを含むであろう。
【０１４４】
４．１．１  流体剪断刺激
骨荷重を誘発する一方法は、流体剪断によるものである。流体剪断は、攪拌機構により連続的な層流剪断を生成するコーンプレート粘度計を活用することができる。代わりに、流動ループ装置は、並流培養庫において上記剪断を産生することができる。後者の方法および機器は、Ｆｌｅｘｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社により製造されたＳｔｒｅａｍｅｒシステムにより例示される。流動ループ装置はまた、再現可能で一貫した刺激を産生することで知られている。唯一の欠点は、エンドポイントが典型的につかの間であり、これらの変化が、分化した骨芽細胞の機能に影響を与えるかどうか分からないことである（Ｂａｓｓｏら、２００２年  Ｂｏｎｅ  ３０号（２）：３４７〜５１頁）。
【０１４５】
４．１．２  静水圧縮刺激
骨荷重を誘発する第２の方法は、静水圧縮の使用である。静水圧縮は、連続的なまたは間欠的な力を生成するために圧縮空気を活用することができ、細胞が細胞外マトリックスタンパク質／接着タンパク質と相互作用する領域に力を特異的に局在化させると考えられている。
【０１４６】
４．１．３  一軸延伸刺激
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨荷重を誘発する第３の手段は、一軸延伸刺激の使用である。一軸延伸方法は、一方向の延伸力を活用する。方法は、ポリスチレンフィルムまたは他のフィルムで処置したストリップ上の、組織培養物中の成長細胞を必要とし、ストリップは、シリコーンの可撓性の層に対して固定される。シリコーンの層は、２本の金属棒にさらに付けられる。金属棒は、電磁石またはいくつかの他の移動手段を使用して、互いに対して操縦することができる。この方法は、いかなる流体剪断をも作り出さない。間質液の流動が、機械的な延伸よりも、骨リモデリングにおいて、より大きな役割を演じている可能性があるので、流体剪断が欠けているのは、この方法をそれほど好ましくないものにする。したがって、この方法は、産生される再現可能で一貫した刺激にもかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏで起こるものを完全には模倣しない可能性がある（Ｂａｓｓｏら、２００２年  Ｂｏｎｅ  ３０号（２）：３４７〜５１頁）。
【０１４７】
４．１．４  二軸延伸刺激
二軸延伸は、本質的に、本明細書に論じられるＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）システムである。この方法は、細胞が成長する、コラーゲンがコーティングされたサイラスティック膜を使用する。次いで、プレートを、特別なトレー中に置き、トレーを真空ポンプに付ける。真空ポンプは、細胞膜を引き伸ばすまたはその他の場合ではねじることにより、膜を引き伸ばしたり、緩めたりする。さらに、任意の培地または流体の動きにより流体剪断がさらに追加されることとなる。
【０１４８】
４．１．５  重力荷重刺激
重力荷重は、骨荷重をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発することができる他の方法である。本質的に、力を細胞にかけて、細胞を平らにする。さらなる詳細については、たとえばＨａｔｔｏｎら、２００３年  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ＆  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  １８号（１）：５８〜６６頁；およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄら、１９９６年  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  ２２８号：１６８〜７１頁を参照されたい。特に、細胞は、プレートまたはカバースリップ上で成長し、次いで、増加性のＧ力に暴露される。
【０１４９】
４．１．６  Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）刺激
Ｗｎｔ経路および骨鉱化作用の、試薬ベースの増大を評価する好ましい一方法は、Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）システムである、二軸延伸刺激を使用するものである。手短に言えば、骨細胞（たとえばＭＣ３Ｔ３細胞）は、約３，４００μεに暴露される。約５０με〜約５，０００με（およびその間の任意の値）の荷重は、機械荷重刺激として同様に使用することができる。この範囲における任意の刺激は生理的な骨荷重刺激を模倣する。５，０００μεより上の刺激は、病態生理学的荷重をもたらし、したがって、好ましくない。さらに細胞は、二軸延伸に対する暴露より前に、Ｗｎｔ経路調整因子（たとえばＧＳＫ阻害因子）に暴露することができる。
【０１５０】
単独でまたはＧＳＫ−３阻害因子と共に荷重をかけることによりアップレギュレートされる遺伝子は、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、コネキシン４３、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＷＩＳＰ２、Ｗｎｔ１０ｂ、サイクリンＤ１、およびＳＦＲＰ１を含むが、これらに限定されない。Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）研究からｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ荷重遺伝子発現プロファイル（つまり、ＨＢＭ  ＴＧマウス脛骨からの細胞について実行されたＲＮＡ分析、マウスは、４点系を使用して骨荷重にさらされた）を模倣する。したがって、この機械荷重アッセイまたは本明細書に開示される種々様々の細胞株を用いた他の機械荷重手段の使用は、標準Ｗｎｔ経路を調整し、好ましくは活性化し、ＨＢＭ表現型を模倣する低分子、ペプチド、免疫グロブリン等を同定するために使用することができる。Ｎｏｒｒｉｎ模倣体は、骨量の増加である、ＬＲＰ５のＨＢＭ変異体の応答の増大と同様に、Ｎｏｒｒｉｎと同じ応答または応答の増大をもたらすことができる。したがって、この系の使用は、ＨＢＭ様の様式で応力プロファイルの遺伝子のアップレギュレートを増大させ、野性型Ｎｏｒｒｉｎと等価な様式で作用する試薬をスクリーニングするのに役立つであろう。
【０１５１】
細胞に対して機械的応力刺激を誘発するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法はまた、細胞増殖およびアポトーシスを研究するためにも使用することができ、機械的応力刺激は、骨リモデリングならびに骨芽細胞および破骨細胞の増殖ならびに破骨細胞吸収にとっての必要性に関連する。たとえば、ＨＢＭおよび非罹患骨芽細胞の細胞を、ｂｉｏｆｌｅｘ６ウェルプレート中に接種し、細胞が約６０％コンフルエントとなるまで、１０％ＦＢＳを含有する成長培地中で２〜３日間培養することができる。機械的荷重の２４時間前に、培地を、約２〜約４％ＦＢＳ含有する１ｍＬ基本培地と交換する。次いで、細胞を、約１〜約５時間、約５０〜約５，０００μεの荷重にさらす。細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体であるまたはＬＲＰ５／Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体のアゴニスト（たとえばＮｏｒｒｉｎアゴニスト、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４アゴニスト、またはＬＲＰ５アゴニスト）およびそれらのアンタゴニストである試薬についてさらに研究することができる。
【０１５２】
荷重の後で、細胞を、さらなる時間、培養する。その後、細胞数および増殖は、［３Ｈ］−チミジン取り込み、５−臭素−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ（つまり末端デオキシヌクレオチド転移酵素ｄＵＴＰニックエンド標識）、またはアネキシンＶアッセイを含むが、これらに限定されない多くの市販のアッセイまたは当技術分野で知られているアッセイを使用して評価することができる。
【０１５３】
以下の遺伝子は、プロファイルに関して分析することができる。他の実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストは、スクリーニングするまたは骨鉱物質除去（たとえば大理石骨病）が必要とされる個人を処置するために使用することができる。Ｗｎｔアンタゴニストは、Ｄｋｋ１アンタゴニストおよびＫｒｅｍｅｎアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。ＮｏｒｒｉｎアゴニストならびにＮｏｒｒｉｎ模倣体もまた、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４アゴニストおよび模倣体、Ｗｎｔアゴニストおよび模倣体、ならびにＬＲＰ５およびＬＲＰ６のアゴニストおよび模倣体と共にこの系の下で評価することができる。
【０１５４】
【表４−１】
2009525754.tif 000009
【０１５５】
【表４−２】
2009525754.tif 000010
【０１５６】
【表４−３】
2009525754.tif 000011
骨荷重についてのタンパク質アレイおよび核酸アレイに関する物質および方法は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１７９５１号にさらに詳細に論じられ、この出願は、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
４．２  アフリカツメガエルにおけるＮｏｒｒｉｎの機能評価
アフリカツメガエル胚は、Ｗｎｔシグナル伝達の調整を評価するための、有益で十分に確立されたｖｉｖｏアッセイ系であり、これについては、たとえばＭｃＭａｈｏｎら、１９８９年  Ｃｅｌｌ  ５８号：１０７５〜８４頁；ＷｏｄａｒｚおよびＮｕｓｓｅ、１９９８年  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １４号：５９〜８８頁中で検討されたＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ  １９９１年  Ｃｅｌｌ  ６７号：７５３〜６５頁）を参照されたい。
【０１５８】
Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４−ＬＲＰ５複合体に影響を与えることによるＷｎｔシグナル伝達経路の修飾は、４または８細胞期での腹側割球へのＲＮＡ注射の後に、背側化表現型（体軸の重複）について胚を検査することにより可視化することができる。分子レベルにおいては、表現型は、１０．５日期胚における種々のマーカー遺伝子の発現を調査することにより分析することができる。上記マーカーは、一般的な内胚葉マーカー、中胚葉マーカー、および外胚葉マーカーならびに様々な組織に特異的な転写物を含むであろう。
【０１５９】
胚の分析は、ＲＴ−ＰＣＲ／ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用して行うことができ、全胚組織についてまたはより制限的な様式（顕微解剖）で行うことができる。この系は、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６、およびＦｚ４等の転写物の組合せの注射による、非常に柔軟で迅速なものなので、Ｎｏｒｒｉｎシグナル伝達経路の機構は詳細に分析することができる。従来の研究により、ＬＲＰ６が、単独でまたはＬＲＰ５＋Ｗｎｔ５ａと組み合わさって、この系における軸重複（背側化）を誘発することができたことが実証された（Ｔａｍａｉら、２０００年  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７号：５３０〜３５頁）。Ｎｏｒｒｉｎシグナル伝達が一度確立されると、このシグナル伝達は、ＤｋｋおよびＫｒｅｍｅｎのアンタゴニストならびにＮｏｒｒｉｎアゴニストおよびＮｏｒｒｉｎ模倣体により評価するために使用することができる。
【０１６０】
４．２．１  アフリカツメガエル発現のための構築物（ベクターｐＣＳ２＋）
Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５／６、Ｆｚ４、Ｄｋｋ（たとえばＤｋｋ１）、Ｗｎｔ、およびＫｒｅｍｅｎ１／２のｃＤＮＡは、ｐＣＳ２＋等のベクター中に、ベクターＳＰ６プロモーターに関してセンス配向でサブクローニングすることができる。ｐＣＳ２＋ベクターは、挿入物の下流に、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルおよびＴ３プロモーター配列（アンチセンスｍＲＮＡの生成のため）を含有する。他のベクターもまた、任意の組合せで、タンパク質の発現について活用することができる。
【０１６１】
４．２．２  ｍＲＮＡ合成および微量注射プロトコール
アフリカツメガエル胚中への微量注射のためのｍＲＮＡは、たとえば鋳型として上記に記載されるｐＣＳ２＋ベクター中のｃＤＮＡ構築物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成することができる。ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ社製ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ高収率キャップＲＮＡ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ社  カタログ＃１３４０）を使用して、Ｓｐ６ポリメラーゼ反応についてのメーカーの説明書に従って、合成される。ＲＮＡ産物は、滅菌ガラス蒸留水中５０μＬの最終容量までもたらすことができ、Ｇ５０−セファデックスカラム（ロシュ社、カタログ＃１２７４０１５）を使用して、放射標識ＲＮＡ精製のためのＱｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎでメーカーの説明書に従って精製される。結果としての溶出液は、最終的に、標準的なプロトコールを使用して、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、およびイソプロパノールを用いて抽出し、沈殿させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。最終ＲＮＡ容量は、普通約５０μＬである。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度により決定することができる。ＲＮＡの完全性は、変性（ホルムアルデヒド）アガロースゲル電気泳動の臭化エチジウム染色により可視化することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。種々の量のＲＮＡ（約２ｐｇ〜約１ｎｇ）が、４または８細胞アフリカツメガエル胚の腹側割球に注射される。これらのプロトコールは、Ｍｏｏｎら、１９８９年  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ−Ｊ．  Ｍｅｔｈ．  Ｃｅｌｌ．  ＆  Ｍｏｔ．  Ｂｉｏｌ．  １号：７６〜８９頁およびＰｅｎｇ、１９９１年  Ｍｅｔｈ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３６号：６５７〜６２頁に記載される。
【０１６２】
Ｎｏｒｒｉｎ機能を調整するとして同定されたまたは本明細書に記載されるアッセイのいずれかにおいてＮｏｒｒｉｎ模倣体分子として作用する分子は、動物モデルまたは他のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイを使用してさらに確証することができる。
【０１６３】
４．３  間葉系幹細胞における骨形成効果についてのＮｏｒｒｉｎの評価
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社、ＭＤ）およびマウス幹細胞（たとえばＣ３Ｈ１０Ｔ１／２、ＡＴＣＣ）は、それぞれ骨形成培地または脂肪生成培地によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、鉱化骨結節（Ｊａｉｓｗａｌら、１９９７年  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６４号：２９５〜３１２頁）または脂肪組織（Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒら、１９９９年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４号：１４３〜１４７頁）に分化するよう誘発することができる。Ｗｎｔシグナル活性化は、ｈＭＳＣにおいて、骨形成を増大させ、脂肪生成を阻害する。Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｚ４−ＬＲＰ５媒介性シグナル伝達は、ｈＭＳＣにおいて、類似する種類の分化パターンを提供することが期待される。したがって、ｈＭＳＣ（または他の脊椎動物からの他のＭＳＣ細胞）を使用するＮｏｒｒｉｎ模倣体およびＮｏｒｒｉｎアゴニストの同定は、企図されるスクリーニングアッセイである。
【０１６４】
ヒト間葉系幹細胞に加えて、他の脊椎動物からの幹細胞もまた使用することができる。間葉系幹細胞は、種々の骨細胞（たとえば骨芽細胞）および脂肪細胞に対する前駆細胞である（たとえば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、２００５年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２号（９）：３３２４〜３３２９頁）。代わりに、前骨芽細胞、骨細胞、および成熟骨芽細胞等のより分化した細胞を代わりに用いることができる。細胞株が、ヒト由来細胞株であることが示される場合、他の脊椎動物からの類似性の細胞を代わりに用いることができることに留意されたい。
【０１６５】
４．３．１  発現に対するＮｏｒｒｉｎによる骨形成活性の評価
手短に言えば、Ｎｏｒｒｉｎは、精製タンパク質もしくは条件培地の一部としてｈＭＳＣ（継代３〜６）に追加することができるまたはウイルスベクターを使用してｈＭＳＣに感染させることにより発現することができる。代わりに、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、およびＮｏｒｒｉｎ模倣体は、骨形成培地（１０ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸、および５ｍＭベータ−グリセロリン酸で補充した成長培地）と共にｈＭＳＣに追加することができる。適切なコントロール培地を用いた約３７℃での約１〜約３週間のインキュベーションの後に、Ｎｏｒｒｉｎありのまたはなしの新鮮な培地の毎週の補給により、骨形成活性は、標準的な技術により測定することができる。たとえば、骨形成活性は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡｌｋＰｈｏｓ）タンパク質発現についての細胞の染色、ＡｌｋＰｈｏｓの酵素活性の決定、ＡｌｋＰｈｏｓまたはオステオカルシンのｍＲＮＡの誘発、および適切なコントロールを用いたアリザリンレッド染色またはフォン−コッサ染色による鉱化作用の検出により測定することができる。
【０１６６】
４．３．２  発現に対する、Ｎｏｒｒｉｎによる脂肪生成の調整の評価
Ｎｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、またはＮｏｒｒｉｎ模倣体は、１〜３週間、脂肪生成分化培地（つまり１０ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸リン酸塩、５００μＭイソブチルメチルキサンチン、および６０μＭインドメタシンを含有する成長培地）と共に、ウイルスまたは他の種類のベクターを使用して発現することにより、ｈＭＳＣに追加することができる。脂肪細胞調整に対するＮｏｒｒｉｎ、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、またはＮｏｒｒｉｎ模倣体の効果は、脂肪生成マーカー遺伝子（たとえばアジプシン）の発現の変更によりまたはオイルレッドＯ試薬での細胞の染色により決定することができる。
【０１６７】
試験薬の投与による発現における変化は、ＤＮＡアレイ技術を使用して実行することができる。上記技術は、肥満症および糖尿病について試験するために既に使用されている。したがって、一態様は、肥満症のために開発されたＤＮＡアレイ技術を使用して試験薬をスクリーニングすることであろう。たとえば、Ｎａｄｌｅｒら、２０００年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９７号（２１）：１１３７１〜１１３７６頁ならびに脂質代謝、分泌型タンパク質について示された遺伝子および肥満症と関連して発現が減少したまたは増加した他の遺伝子を参照されたい。ＤＮＡアレイ技術と共に使用される細胞は、間葉系細胞、脂肪細胞、もしくは前脂肪細胞または本明細書に論じられる他の細胞とすることができる。
【０１６８】
脂質レベルおよび脂肪生成におけるｉｎ  ｖｉｖｏ変化は、様々な異なる試験により測定することができる。血液および血清は、血液化学分析のために、収集し、分析することができる。したがって、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体またはＮｏｒｒｉｎアゴニストは、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果についてスクリーニングすることができる。同様に、Ｄｋｋ阻害因子および／またはＫｒｅｍｅｎ阻害因子は、ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体とのＮｏｒｒｉｎの活性（Ｎｏｒｒｉｎアゴニストの存在下もしくは非存在下で）またはＮｏｒｒｉｎ模倣体の活性に対するそれらの影響力について、スクリーニングすることができる。
【０１６９】
４．３．３  Ｎｏｒｒｉｎ遺伝子ノックダウンによる骨形成および脂肪生成の調整の評価
骨形成培地または脂肪生成培地を使用することにより、ｈＭＳＣは、骨形成系統または脂肪生成系統に分化することとなる。Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、またはＬＲＰ５の低分子ヘアピン型ＲＮＡは、経路に対するＮｏｒｒｉｎおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の増大性の効果を実証するためにならびにこれらのタンパク質の阻害が脂肪生成および骨形成に対して有する影響力を示すためにコントロールとして使用することができる。たとえば、骨形成培地およびＮｏｒｒｉｎ  ｓｈＲＮＡを含有するウイルスベクターの感染体の存在下で、Ｎｏｒｒｉｎ遺伝子転写および骨芽細胞へのｈＭＳＣの分化または上記に示される種々の方法により検出することができる鉱化骨結節の産生は、ブロックされ得る。
【０１７０】
組織培養におけるおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子ノックダウンは、選択された一本鎖遺伝子配列の活性をブロックすることができる配列特異的なＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体により実現することができる。上記アプローチの例は、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術および転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とも呼ばれる、相同二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入を含む。これは、種々のウイルス遺伝子送達ベクターを使用してまたはプラスミドベクターの形質移入により、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）を介して、所定の標的遺伝子ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡを細胞に導入することにより達成することができる。ＲＮＡ干渉および遺伝子サイレンシングを実行するための方法は、たとえばＭｅｉｓｔｅｒおよびＴｕｓｃｈｌ、２００４年  「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４３１号：３４３〜３４９頁；ＤｏｒｓｅｔｔおよびＴｕｓｃｈｌ、２００５年  「ｓｉＲＮＡｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ４０〜５１頁ならびにそれらの中で引用される参考文献に論じられるように知られている。一度ｓｉＲＮＡが導入されると、標的遺伝子ノックダウンの度合いは、ＲＮＡについてはｑＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットを含む標準的な技術によりまたはタンパク質発現についてはウエスタンブロットにより測定される。
【０１７１】
５．Ｎｏｒｒｉｎを調整する作用物質を試験するためのキット
他の態様は、Ｎｏｒｒｉｎ活性を調整する作用物質を、好ましくは、Ｎｏｒｒｉｎ活性の調整を介してＷｎｔ経路を調整する作用物質について試験するためのキットを企図する。これらのキットは、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体およびＮｏｒｒｉｎアゴニストならびにＬＲＰ５／Ｎｏｒｒｉｎ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４複合体の他の模倣体およびアゴニストについてスクリーニングするために使用することができる。
【０１７２】
企図されるキットは、細胞ならびに少なくともＮｏｒｒｉｎおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ４をコードする核酸を含むであろう。好ましくは、ＬＲＰ５、Ｄｋｋ（Ｄｋｋのいずれか）、ＨＢＭ、ならびに／またはＫｒｅｍｅｎ（Ｋｒｅｍｅｎ１および２）ならびにＮｏｒｒｉｎおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ４ならびに／またはそれらの任意の組合せをコードする核酸があるであろう。ＬＲＰ６およびＷｎｔもまた含むことができる。上述のポリペプチドをコードする核酸は、ベクターに操作可能に連結されるであろう。ベクターのみもまた、コントロールとしての目的のために好ましくは含まれるであろう。一過性形質移入の使用のためにまたは安定的に細胞を形質移入するためにキットを考案することができる。
【０１７３】
代わりに、キットは、上述のタンパク質のいずれかの精製タンパク質を、本明細書で記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系等のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系での使用のために含有することができる。それらは、ニトロセルロース、ＥＬＳＡプレート、または他の適した基体等の基体を含むことができる。
【０１７４】
キットは、アルカリ性ホスファターゼ、１つまたは複数の蛍光タンパク質等のいずれにせよ、アッセイに適切なレポーター系を好ましくは含むであろう。
【０１７５】
一態様では、キットは、スクリーニングで使用される凍結細胞株を付属することができる。他の態様では、キットは、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに適した、適切な、前に試験された細胞を列挙する使用説明書を付属することができる。
【０１７６】
他の態様では、キットは、種々のレポーター、酵素、および調整を検出するために使用されるレポーターを検出するために必要な試薬を付属することができる。たとえば、ＴＣＦ−ｌｕｃｉおよびＴＫ−ウミシイタケアッセイ系を使用する場合、キットは、ＴＣＦ−ｌｕｃｉおよびＴＫ−ウミシイタケのルシフェラーゼおよび検出試薬を付属することができる。キットはまた、トランスジェニック動物も付属することができ、Ｄｋｋ、Ｎｏｒｒｉｎ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｗｎｔ、および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４についてのｃＤＮＡは動物（複数可）に導入される。キットは、特定の試験試薬についての活性の解明のために一連の上記動物を含むことができる。
【０１７７】
６．細胞株
他の態様は、Ｎｏｒｒｉｎおよび／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４を発現しない細胞株の調製である。次いで、これらの細胞株は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｄｋｋ、Ｋｒｅｍｅｎ、Ｗｎｔ、およびＮｏｒｒｉｎの一過性にまたは安定的に発現した非天然形態を本明細書に論じられる組合せのいずれかで有することができる。したがって、細胞株は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体またはＮｏｒｒｉｎアゴニストである試薬をスクリーニングするために使用することができる。たとえば、発現したＬＲＰ５およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の非天然（非内在性）形態を有し、Ｎｏｒｒｉｎを欠く細胞株では、ＬＲＰ５−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４−Ｎｏｒｒｉｎ機構を介してＷｎｔ経路を活性化するための手段はないであろう。しかしながら、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体を導入すると、経路は活性化されるであろう。上記細胞株は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体を同定するための有用なコントロールとなるであろう。次いで、細胞は、スクリーニングのために導入されたＤｋｋおよび／またはＫｒｅｍｅｎのさらなる非内在性転写物を、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４−ＬＲＰ５／６−Ｎｏｒｒｉｎ複合体との、Ｄｋｋおよび／またはＫｒｅｍｅｎの相互作用を調整する試験薬について、検査することができる。このプロセスを使用して、Ｄｋｋアンタゴニストおよび／またはＫｒｅｍｅｎアンタゴニストは同定することができる。これらのＮｏｒｒｉｎなしの株の１つにおける非内在性Ｎｏｒｒｉｎの導入は、Ｎｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４相互作用についてＮｏｒｒｉｎアゴニストを評価するために使用することができる。
【０１７８】
タンパク質またはそれらの生物学的活性ポリペプチド断片のいずれかをコードする核酸の安定性発現および一過性発現は、当技術分野で知られている手段により達成することができる。たとえば、Ｒ．  ＩＡＮ  ＦＲＥＳＨＮＥＹ、ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ  （２０００年）ならびにＪＯＳＥＰＨ  ＳＡＭＢＲＯＯＫおよびＤＡＶＩＤ  Ｗ．  ＲＵＳＳＥＬＬ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （第３版  ２００１年）を参照されたい。
【０１７９】
内在性Ｎｏｒｒｉｎを有していない細胞は、腎臓細胞を含むが、これらに限定されない。したがって、腎臓細胞は、Ｎｏｒｒｉｎ模倣体をスクリーニングするための有用な手法を提供する。代わりに、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ、Ｄｋｋ、Ｋｒｅｍｅｎ、および／またはＦｒｉｚｚｌｅｄ４をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数が、内在性ポリペプチドをもはや合成することができないようにノックアウトされているノックダウン細胞株である細胞株を調製することができる。この手順は、これらに限定されないが脂肪細胞、前脂肪細胞、間葉系細胞、種々の骨細胞、および腎臓細胞等の任意の細胞に対して実行することができる。
【０１８０】
本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される物質および方法において種々の修正および変更を成すことができることは当業者にとって明白となる。したがって、修正および変更が添付の請求項および請求項の均等物の範囲に入るならば、本発明は、本発明の修正および変更を包含することが意図される。
【実施例】
【０１８１】
実施例１：Ｎｏｎｒｒｉｎ／Ｗｎｔ−ＴＣＦシグナルアッセイ
Ｎｏｒｒｉｎクローン単離．ｃＤＮＡを、ＩＭＡＧＥクローンから、標準的なＰＣＲ法によりクローニングした。特に、ＮＣＢＩ（ＮＭ＿０００２６６）からのＮｏｒｒｉｎオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を、入手可能なＩＭＡＧＥクローンを調査するために使用した。クローン＃５１７９５７８は、予想される完全長ｃＤＮＡとして同定された。ＩＭＡＧＥクローンは、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ハンツビル、ＡＬ）から購入した。ＯＲＦは、以下のプライマーを使用して、標準的なＰＣＲ技術により増幅した：
【０１８２】
【化１】
2009525754.tif 000012
（開始ＡＴＧの５’に隣接して、クローニングのためのＥｃｏＲＩ部位およびコンセンサスＫｏｚａｋがくる）および
【０１８３】
【化２】
2009525754.tif 000013
（停止コドンの後にＸｂａＩ部位およびＮｏｔＩ部位の両方がくる）。結果としてのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＥｃｏＲＩ部位およびＮｏｔＩの部位中にクローニングした。正の単離物を制限消化により同定し、公開配列（受託番号ＮＭ＿０００２６６）にマッチすることをＤＮＡ配列分析により確証した。
【０１８４】
Ｋｒｅｍｅｎクローン単離．ＰＣＲにより増幅した完全長断片は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１制限酵素部位にサブクローニングした。次いで、単離配列は、公開ヒトＫｒｅｍｅｎ２配列（受託番号ＮＭ＿１７２２２９／ＡＢ０８６４０５．１、およびＮＰ＿７５７３８４．１）にマッチすることを確認した。ｃＤＮＡは、ヒト骨芽細胞様Ｕ２ＯＳ細胞株全ＲＮＡから単離した。約２．５×１０６Ｕ２ＯＳ細胞からの全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を使用し、メーカーのプロトコールに従って精製した。Ｋｒｅｍｅｎ２  ｃＤＮＡ単離物は、標準的なＰＣＲ法に従って増幅した。使用されるＰＣＲプライマーは、以下のとおりであった：
【０１８５】
【化３】
2009525754.tif 000014
ＰＣＲにより増幅した完全長断片は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１制限酵素部位にサブクローニングし、全体の配列が、公開ヒトＫｒｅｍｅｎ２配列（受託番号ＮＭ＿１７２２２９／ＡＢ０８６４０５．１、ＮＰ＿７５７３８４）にマッチすることを確認した。
【０１８６】
Ｄｋｋクローン単離．ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１２７５６３を有するヒトｃＤＮＡは、公共データベースで入手可能であった。この配列を使用して、ＰＣＲプライマーを、開始ＡＴＧの上流に隣接してコンセンサスＫｏｚａｋ配列を有するオープンリーディングフレームを増幅するために設計した。
【０１８７】
【化４】
2009525754.tif 000015
をＰＣＲによりヒト子宮ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。結果としてのＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社）中にサブクローニングし、配列を確認し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化した。この挿入物は、ｐＣＳ２＋ベクター中にＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。
【０１８８】
ヒトＤｋｋ２をコードする完全長ｃＤＮＡは、Ｄｋｋファミリーの分子とのＺｍａｘ／ＬＲＰ５／ＨＢＭの相互作用の特異性を確かめるために単離した。Ｄｋｋ１は、Ｚｍａｘ／ＬＲＰ５／ＨＢＭの可能性のある結合パートナーとして酵母において同定された。Ｄｋｋ１はまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアンタゴニストであることが文献においても示されているが、Ｄｋｋ２は示されていない（Ｋｒｕｐｎｉｋら、１９９９年）。Ｄｋｋ２完全長ＤＮＡは、Ｄｋｋファミリー（たとえばＤｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、Ｄｋｋ４、Ｓｏｇｇｙ、それらのホモログ、およびそれらの変異体等）とのＺｍａｘ／ＬＲＰ５／ＨＢＭの相互作用の特異性および生物学的意義を識別するための手法として働く。Ｄｋｋ２についてのヒトｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４４２１）は公共データベースで入手可能であった。この配列を使用して、ＰＣＲプライマーを、開始ＡＴＧの上流に隣接してコンセンサスＫｏｚａｋ配列を有するオープンリーディングフレームを増幅するために設計した。
【０１８９】
【化５】
2009525754.tif 000016
をＰＣＲによりヒト胚ｃＤＮＡライブラリーおよび脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。結果としてのＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ中にサブクローニングし、配列を確認し、ＢａｍＨ１／ＥｃｏＲＩで消化した。この挿入物は、ＢａｍＨ１−ＥｃｏＲＩ部位に、ｐＣＳ２＋ベクター中にサブクローニングした。Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２のクローンに関するさらなる解説については、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１５９８２を参照されたい。Ｄｋｋ３およびＤｋｋ４についての類似する構築は、本明細書に言及される配列を使用して調製することができる。
【０１９０】
ＬＲＰ６クローン．完全長ＬＲＰ６は、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化により、ｐＥＤ６ｄｐｃ４ベクターから単離した。完全長ｃＤＮＡは、ｐＣＳ２＋のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位中に新たに組み合わせた。挿入物の配向は、ＤＮＡ配列決定により確証した。
【０１９１】
ＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）およびＨＢＭ．挿入物ｃＤＮＡは、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化により、完全長ｃＤＮＡレトロウイルス構築物（最適化Ｋｏｚａｋ配列を有する）から単離し、ｐＣＳ２＋ベクターのＢａｍＨ１−ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングした。ＬＲＰ５およびＨＢＭの構築物についてのより詳細な事柄については、米国特許第６，７７０，４６１号および「Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｚｍａｘ１  ｏｒ  ＨＢＭ  ｇｅｎｅ」と題する国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１６９４６号を参照されたい。
【０１９２】
Ｗｎｔクローン．本明細書に示される実験で活用されたＷｎｔ遺伝子は、以下のとおり得た。１０種の異なる完全長Ｗｎｔ  ｃＤＮＡは、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（レークプラシッド、ＮＹ）からベクターｐＵＳＥａｍｐ（＋）中にある状態で購入した。遺伝子は以下のとおりである：Ｗｎｔ１（カタログ番号２１〜１２１）、Ｗｎｔ２（カタログ番号２１〜１２２）、Ｗｎｔ３（カタログ番号２１〜１２３）、Ｗｎｔ３ａ（カタログ番号２１〜１２４）、Ｗｎｔ４（カタログ番号２１〜１２５）、Ｗｎｔ５ａ（カタログ番号２１〜１３３）、Ｗｎｔ５ｂ（カタログ番号１２〜１２６）、Ｗｎｔ６（カタログ番号２１〜１２７）、Ｗｎｔ７ａ（カタログ番号２１〜１２８）、およびＷｎｔ７ｂ（カタログ番号２１〜１２９）。挿入物は、ＸｂａＩ消化により遊離し、アフリカツメガエル発現のためにｐＣＳ１０５ベクターのＸｂａＩ部位中にサブクローニングした。配向は、配列分析により確証した。
【０１９３】
完全長Ｗｎｔ１１  ｃＤＮＡは、ＧＣＲｉｃｈキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、マウンテンビュー、ＣＡ）および以下の特定のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより１×１０６ヒト骨芽細胞細胞（ＨＯＢ、継代＃１３）から単離した：（順方向）：
【０１９４】
【化６】
2009525754.tif 000017
（ＥｃｏＲＩ部位を含む）および（逆方向）：
【０１９５】
【化７】
2009525754.tif 000018
（ＮｏｔＩ部位を含む）。ＲＴ−ＰＣＲにより生成したＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩの作り出された部位に挿入した。完全長配列は、公開Ｗｎｔ１１配列（受託番号Ｙ１２６９２）にマッチすることを確認した。
【０１９６】
他のＷｎｔ遺伝子についての完全長ｃＤＮＡは、プライマーを設計して、遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅し、ｐＣＳ１０５ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１型哺乳動物ベクターもしくは他の適した哺乳動物ベクター中にサブクローニングすることを促進するために、公共の配列を使用して、種々のヒトｃＤＮＡライブラリー源から標準的なＰＣＲ技術により得ることができる。他のＷｎｔ遺伝子に適したプライマーは、表１において下記に提示される。「Ｆ」は「順方向」プライマー、「Ｒ」は「逆方向」プライマーを表す。
【０１９７】
【表５−１】
2009525754.tif 000019
【０１９８】
【表５−２】
2009525754.tif 000020
レポーターアッセイ．ＴＣＦアッセイは、１６ｘＴＣＦレポーター（基本的なＴＫプロモーターを有するＷｎｔ−ベータ−カテニンシグナル応答性ＴＣＦ要素の１６個のコピーを含有する）およびルシフェラーゼ遺伝子を必要とする。構築物は、ｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ）中に、最小限のＴＫ（チミジンキナーゼ）プロモーターの上流に配置されるＴＣＦ結合部位の１６個のコピーおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有する。４つのＴＣＦ結合部位（下記のペアの配列を参照されたい）の配列は、オリゴヌクレオチド合成アプローチにより生成し、５’側および３’側にそれぞれＮｈｅＩおよびＸｈｏＩの制限酵素部位を有する以下の配列を含有する。下線を引いたドメインはＴＣＦ結合部位を示す。両鎖が提供される。２本の鎖がアニールすると、ＮｈｅＩ（５’）およびＸｈｏＩ（３’）の適合性制限部位は、さらなるクローニングのために導入され、それらは、ＴＣＦ結合部位（それぞれ配列番号：２７および２８）を含有する：
【０１９９】
【化８】
2009525754.tif 000021
内部アッセイ標準化コントロールとしてのＴＫ−ウミシイタケ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社、ＷＩ）ならびに上記に論じられるＮｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｄｋｋ１、およびＫｒｅｍｅｎ２のｃＤＮＡのｐｃＤＮＡベクターベースの構築物およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４構築物  （Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈ．  Ｉｎｃ．社；ロックビル、ＭＤ）もまた、アッセイの一部である。脊椎動物Ｎｏｒｒｉｎ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｄｋｋ１、およびＫｒｅｍｅｎ２の異なる形態を発現することができる他のベクターを代わりに用いることができる。
【０２００】
これらの遺伝子を個々に含有するクローンは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）−２９３Ａ細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）またはヒト骨肉腫由来骨／骨芽細胞様細胞株、Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ）中に同時形質移入される。細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で補充されたダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。
【０２０１】
ＨＥＫ−２９３Ａ細胞（１ウェル当たり５０，０００個の細胞）またはＵ２ＯＳ細胞（１ウェル当たり２５，０００個の細胞）を、９６ウェルプレート中で平板培養した。平板培養後の２４時間のインキュベーションの後に（約８０〜９０％コンフルエント）、培地を、１００μＬの新鮮な無血清ＯＰＴＩＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）と交換した。両細胞型は、１６ｘＴＣＦ（ＴＫ）−ホタルルシフェラーゼ（０．３μｇ／ウェル）およびＴＫ−ウミシイタケ−ルシフェラーゼ（０．０６μｇ／ウェル）を用い、リポフェクタミン２０００形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社；マディソン、ＷＩ）を使用して、メーカーの使用説明書に従って形質移入した。実験は二通り実行した。
【０２０２】
試験ｃＤＮＡ構築物は、必要に応じて異なる濃度で形質移入した。構築物のそれぞれの約０．０００５μｇ／ウェル〜０．０５μｇ／ウェルのｃＤＮＡを使用した。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、メーカーの使用説明書に従って実行した。ＤＮＡ混合物および試薬は３０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのＤＮＡ試薬混合物を１００μＬのＯＰＴＩＭ培地に追加した。次いで、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。形質移入培地は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞およびＵ２ＯＳ細胞それぞれについて、新鮮な１５０μＬのＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ培地と交換した。ＣＯ２インキュベーター中での３７℃での２０〜２４時間のインキュベーションの後、培地を除去した。形質移入した細胞単層を、１５０μＬの、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．社）の１×溶解バッファーを追加することにより溶解した。
【０２０３】
１０分後、２０μＬの溶解物を、新しい９６ウェル白色プレート（Ｐａｃｋａｒｄ社／Ｃｏｓｔａｒ社）中に移動した。細胞溶解物を、１００μＬ／ウェルのＬＡＲＩＩ緩衝液（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉ試薬）と混合し、相対的ルシフェラーゼユニット（ＲＬＵ）を、Ｐａｃｋａｒｄ社製Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ（商標）発光カウンター（メリデン、ＣＴ）を使用して測定した。この後に、１００μＬ／ウェルの「ｓｔｏｐ＆ｇｌｏ」試薬（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉ試薬）を追加し、内部アッセイコントロールウミシイタケルシフェラーゼを、Ｐａｃｋａｒｄ社製Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ（商標）発光カウンターを使用して測定した。
【０２０４】
ＴＣＦ−ホタル−ｌｏｃｉとウミシイタケの比を算出した、また、図１〜４中に棒グラフとして提示する。実験は、４回繰り返して行い、示される誤差の程度について標準偏差を計算した。
【０２０５】
図１は、Ｎｏｒｒｉｎ  ｃＤＮＡがヒトＵ２ＯＳ細胞中に形質移入された場合、Ｎｏｒｒｉｎ  ｃＤＮＡは、Ｗｎｔ  ｃＤＮＡ形質移入非存在下で、ＴＣＦシグナルの約２〜３倍の誘発（ピンク色の傾線の棒）を引き起こしたことを示す。しかしながら、ＨＥＫ−２９３Ａ形質移入細胞は、いかなる著しいＴＣＦ−シグナル活性化をも産生しなかった。図１はまた、Ｎｏｒｒｉｎおよびその共受容体の１つであるＬＲＰ５のＨＥＫ−２９３Ａ細胞中への同時形質移入は、ＴＣＦ−シグナルを活性化しなかったことを示す（紫色の格子縞模様の棒）。
【０２０６】
興味深いことには、Ｎｏｒｒｉｎ（Ｎｒ）またはＬＲＰ５（Ｌ５）についての遺伝子を含有するベクターがＵ２ＯＳ細胞中に同時形質移入された場合、ＴＣＦ−シグナルは増大した。活用された物質および方法は上記に記載されるとおりである。図１の右側を参照されたい。ＮｏｒｒｉｎおよびＬＲＰ５の両方がＵ２ＯＳ細胞に同時形質移入された場合、ＴＣＦシグナルは、ベクターのみに対して（コントロール）、約６倍相乗的に増大した（最も右の棒、図１）。Ｎｏｒｒｉｎは、ＬＲＰ５／６共受容体に加えてＦｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚ４）受容体を必要とするので、データは、Ｕ２ＯＳ細胞がＦｚ４を含有し、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞がＦｚ４を欠くことを示唆する。Ｆｚ４なしでは、Ｎｏｒｒｉｎは、ＴＣＦ−シグナルを誘発することができず、したがって、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞では応答を欠く（図１左側）。
【０２０７】
実施例２：Ｆｚ４は、Ｎｏｒｒｉｎシグナル伝達に必要とされる
Ｆｚ４−Ｎｏｒｒｉｎ相互作用を評価するために、Ｎｏｒｒｉｎで形質移入した両方の細胞型中に、Ｆｚ４およびＬＲＰ５のｃＤＮＡを形質移入した。実施例１において上記に論じられるように、形質移入を実行した。ＴＣＦの検出を実行した、また、使用される構築物は実施例１で論じられるとおりである。データは、４回繰り返して得、標準偏差を算出し、統計分析により確かめた。
【０２０８】
ＨＥＫ−２９３Ａ細胞は、ベクターのみ（Ｖ）、ＬＲＰ５のみ（Ｌ５）、Ｆｚ４のみ（Ｆ４）、またはＬＲＰ５およびＮｏｒｒｉｎ（Ｌ５＋Ｎｒ）についてＴＣＦ応答がないことを示す。ＮｏｒｒｉｎおよびＦｚ４（Ｆ４＋Ｎｒ）の追加により、ベクターのみまたはＦｚ４のみに対してＴＣＦにおいて約６倍の増加が得られる。図２中のデータは、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞において、機能的Ｆｚ４は、Ｎｏｒｒｉｎ−ＴＣＦ−シグナル活性化のために制限因子であったことを実証する。図２中のデータはまた、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞において、Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｚ４相互作用は、おそらく、細胞の内在性ＬＲＰ５／６受容体を活用することも示す。そのうえ、ＨＥＫ−２９３細胞における、Ｆｚ４およびＮｏｒｒｉｎとＬＲＰ５の同時形質移入（Ｌ５＋Ｆ４＋Ｎｒ）は、ＬＲＰ５のみ（Ｌ５）およびＮｏｒｒｉｎのみ（Ｎｒ）を形質移入したＨＥＫ２９３Ａ細胞に対して１６倍まで、ＴＣＦ−シグナルの増大をさらにもたらす。図２の左側を参照されたい。
【０２０９】
対照的に、同じ試験をＵ２ＯＳ細胞を用いて行った。Ｕ２ＯＳ細胞は、Ｆｚ４およびＮｏｒｒｉｎの同時形質移入（Ｆ４＋Ｎｒ）により、ベクターのみ（Ｖ）、ＬＲＰ５のみ（Ｌ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４のみ（Ｆ４）、ならびにＬＲＰ５およびＮｏｒｒｉｎ（Ｌ５＋Ｎｒ）で同時形質移入したＵ２ＯＳ細胞に対して、著しく高いＴＣＦ活性を生じた。図２を参照されたい。Ｕ２ＯＳ細胞における応答は、Ｆｚ４、ＬＲＰ５、およびＮｏｒｒｉｎ（Ｆ４＋Ｌ５＋Ｎｒ）すべてが、細胞中に同時形質移入された場合、さらに増大した（約２倍〜約６倍）。Ｕ２ＯＳ細胞における上記データは、おそらく、Ｆｚ４およびＬＲＰ５／６の受容体を含む内在性Ｗｎｔシグナル成分の存在を示す。
【０２１０】
実施例３：Ｎｏｒｒｉｎにより誘発されたＬＲＰ５−Ｆｚ４−ＴＣＦシグナルは、Ｕ２ＯＳ細胞において、Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎ２により相乗的に阻害され得る
Ｕ２ＯＳ細胞は、実施例１に記載されるアッセイ手順に従って、図３中で示されるように、ブランクベクター（Ｖ）、ＬＲＰ５（Ｌ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚ４）、Ｎｏｒｒｉｎ（Ｎｒ）、Ｋｒｅｍｅｎ２（Ｋｒｍ２）、またはＤｋｋ１で形質移入したまたは同時形質移入した。結果は、４回繰り返して得、標準偏差をそれらから算出した。
【０２１１】
図３は、種々のｃＤＮＡ構築物で形質移入した場合の、Ｕ２ＯＳ−ＴＣＦアッセイにおける、ＴＣＦ−ｌｕｃｉとウミシイタケのシグナル調整の比を示す。図３の右側について、棒は、ＬＲＰ５（Ｌ５）、Ｆｚ４（Ｆｚ４）、またはＮｏｒｒｉｎ（Ｎｒ）の形質移入は、ベクターコントロールに対して約２〜５倍までの誘発を引き起こしたことを示す。しかしながら、Ｆｚ４およびＮｏｒｒｉｎ（Ｆｚ４＋Ｎｒ）の両方の同時形質移入は、ＴＣＦシグナルの約１５倍の誘発をもたらした。
【０２１２】
Ｆｚ４およびＮｏｒｒｉｎの効果は、ＬＲＰ５（Ｌ５）ｃＤＮＡの発現によりさらに増大した（つまり最も高く最も濃い棒）。Ｆｚ４＋Ｎｒ＋Ｌ５の最大活性は、Ｄｋｋ１を用いた細胞の同時形質移入により部分的に阻害された。Ｄｋｋ１およびＫｒｍ２の両方が、ＬＲＰ５、Ｆｚ４、およびＮｏｒｒｉｎ（Ｌ５＋Ｆｚ４＋Ｎｒ）を用いて同時形質移入された細胞に追加された場合、ＴＣＦ−シグナルは、ほぼ完全に阻害される（右側、一番右の棒）。
【０２１３】
図３で示された結果は、Ｎｏｒｒｉｎ−ＬＲＰ５−Ｆｚ４媒介性ＴＣＦ−シグナルがＤｋｋ１により阻害され得ることを示す。Ｄｋｋ１は、Ｗｎｔ−ＬＲＰ５−Ｆｚにより誘発されたＷｎｔ標準経路の効果的な阻害因子であると考えられる。興味深いことには、Ｋｒｅｍｅｎ２（Ｋｒｍ２）追加は、Ｄｋｋ１と相乗作用を示し、次には、Ｗｎｔ経路を増大させるＮｏｒｒｉｎ作用のブロックをもたらした。
【０２１４】
実施例４：ＨＢＭおよびＬＲＰ５を用いたＮｏｒｒｉｎ媒介性ＴＣＦ−シグナルは、Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎ２により異なって阻害される
ＬＲＰ５または機能獲得型突然変異体であるＨＢＭによるＮｏｒｒｉｎ−ＴＣＦ−シグナル調整の比較は、ｃＤＮＡ形質移入Ｕ２ＯＳ細胞において研究した。結果を図４に示す。ＨＢＭ  ｃＤＮＡを用いたＵ２ＯＳ細胞の形質移入は、ＬＲＰ５  ｃＤＮＡを用いた形質移入よりもわずかに高いＴＣＦ−シグナルを生じた。図４の左側を参照されたい、左側は、ベクターのみ（Ｖ）、ＬＲＰ５のみ（Ｌ５）、ＨＢＭのみ（Ｈ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４のみ（Ｆｚ４）、およびＮｏｒｒｉｎ（Ｎｒ）のみを示す。構築および条件は、実施例１に記載されるとおりである。実験は４回繰り返して実行し、標準誤差は、それから算出した。
【０２１５】
ＮｏｒｒｉｎおよびＦｚ４ならびにＬＲＰ５（Ｎｒ＋Ｆｚ４＋Ｌ５）またはＨＢＭ（Ｎｒ＋Ｆｚ４＋Ｈ）によるＵ２ＯＳ細胞の同時形質移入は、ＬＲＰ５およびＨＢＭの両方のｃＤＮＡで、最大の、すなわち基本的な活性に対して約２５倍のＴＣＦ−シグナルをもたらした。Ｎｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、ＬＲＰ５またはＮｏｒｒｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４、およびＨＢＭの組合せによるＤｋｋ１同時形質移入は、ＴＣＦシグナルの約３８〜４０％の阻害をもたらした。Ｄｋｋ１阻害は、Ｋｒｅｍｅｎ２（Ｋｒｍ２）の追加によりさらに増大した。図２の右側、最も右の２本の棒を参照されたい。
【０２１６】
相対的なＮｏｒｒｉｎ−ＴＣＦ−シグナル分析は、ＬＲＰ５突然変異Ｇ１７１Ｖ媒介性Ｎｏｒｒｉｎ−Ｆｚ４−ＴＣＦシグナルは、Ｋｒｅｍｅｎ２およびＤｋｋ１の阻害作用に対する部分的な抵抗性を与えることを示唆する。この興味をそそる観察は、Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎ２の存在下での、ＬＲＰ５およびＨＢＭを用いた、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ１媒介性のＴＣＦ−シグナルで以前に観察された結果にかなり類似する。ＬＲＰ５−Ｗｎｔ−ＴＣＦシグナル伝達は骨形成を調整することが報告されており、一方、ＨＢＭ突然変異は、ヒトおよびトランスジェニックマウスにおいて高骨量表現型をもたらす。これらの結果に基づいて、Ｎｏｒｒｉｎは、ＬＲＰ５−Ｆｚ４複合体の、Ｗｎｔよりも特異的なリガンドとして、骨代謝において重要な役割を演ずると思われる。
【０２１７】
上述の実施例のそれぞれにおいて、Ｄｋｋ１は、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３、および／またはＤｋｋ４を代わりに用いることができる。さらに、Ｋｒｅｍｅｎ２を使用する実施例では、同じアッセイにおいて、Ｋｒｅｍｅｎ１を代わりに用い、使用することができることが理解されるであろう。さらに、タンパク質または生物学的活性ポリペプチドは、同時形質移入によりまたは精製タンパク質ならびに／またはタンパク質および／もしくは生物学的活性ポリペプチドを含有する条件培地の追加により導入することができる。
【０２１８】
前掲の論じられたｉｎ  ｖｉｔｒｏデータにより、Ｎｏｒｒｉｎは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４の形質移入を伴わないで、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞においてではなく、Ｕ２ＯＳ骨細胞においてＴＣＦレポーター活性化することにより、ＬＲＰ５−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４媒介性Ｗｎｔ標準経路を増大させることを示した。ＬＲＰ５媒介性Ｗｎｔシグナル伝達は、ヒトおよびトランスジェニック動物におけるＬＲＰ５−Ｇ１７１Ｖ突然変異での高骨量（「ＨＢＭ」）表現型により証明されるように、骨の形成／維持において重要である。提示されるデータはまた、ＬＲＰ５−Ｇ１７１Ｖ（ＨＢＭ）突然変異体の存在下でのＮｏｒｒｉｎ媒介性ＴＣＦ−シグナルは、ＬＲＰ５を用いたシグナルと比較して、Ｄｋｋ１媒介性の阻害に対してそれほど敏感ではないことも示す。ＬＲＰ５におけるＧ１７１Ｖ突然変異による阻害の減少は、ＨＢＭ表現型の原因の１つであると仮定されるので、我々は、Ｎｏｒｒｉｎ、その発現、その誘発、および／またはＮｏｒｒｉｎ模倣体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨の形成または維持を増大させることができることを期待するであろう。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮｏｒｒｉｎノックアウトは骨減少症を示し得る。上述のアッセイは、とりわけＮｏｒｒｉｎ模倣体、Ｎｏｒｒｉｎアゴニスト、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４アゴニストのスクリーニングに使用される代表的なアッセイである。
【０２１９】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、すべての目的のためにそれらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】Ｎｏｒｒｉｎは、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞ではなくＵ２ＯＳ骨芽細胞様細胞におけるＴＣＦ−シグナル伝達を活性化する。一過性の同時形質移入アッセイは、ＴＣＦ−ｌｕｃｉレポーターおよびウミシイタケレポーターを用いて、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）ＨＥＫ−２９３Ａ細胞およびＵ２ＯＳ細胞中で行った。棒グラフは、ｐｃＤＮＡベクター中の異なるｃＤＮＡ構築物を使用した種々の形質移入の間の応答を標準化する、ＴＣＦ−ｌｕｃｉの発光シグナルとウミシイタケシグナルの比を表す。
【図２】Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚ４）同時形質移入は、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞におけるＮｏｒｒｉｎ媒介性ＴＣＦ−シグナルを誘発し、Ｕ２ＯＳ細胞においてそれを増大させる。棒グラフは、ｃＤＮＡの種々の組合せを用いた、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞およびＵ２ＯＳ細胞の一過性形質移入を使用して得られたＴＣＦ−ｌｕｃｉ応答の結果を示す。
【図３】Ｎｏｒｒｉｎに誘発されたＬＲＰ５−Ｆｚ４−ＴＣＦ−シグナルは、Ｕ２ＯＳ細胞において、Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎ２により相乗的に阻害され得る。
【図４】Ｄｋｋ１およびＫｒｅｍｅｎ２の存在下で、ＬＲＰ５−Ｇ１７１Ｖ突然変異体（ＨＢＭ表現型）を用いたＮｏｒｒｉｎ媒介性ＴＣＦシグナルは、ＬＲＰ５を用いたＮｏｒｒｉｎ媒介性ＴＣＦシグナルほど阻害されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2009525754000001.xml
【国際調査報告】
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