(57)【要約】  本発明は、リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、（ａ）上記第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットにある反応基が反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットを上記第２単量体ユニットと反応させる工程と、（ｂ）上記付着部分を介して、上記第１単量体ユニットを担体に固定化する工程とを含んでおり、工程（ａ）は工程（ｂ）よりも前に、または工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後におこなわれることを特徴とする作製方法に関する。
2009519433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、
上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、
上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、
上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、
上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含んでおり、
（ａ）上記第１単量体ユニットにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程、
（ｂ）上記付着部分を介して、上記第１単量体ユニットを担体上に固定化する工程、
工程（ａ）は、工程（ｂ）よりも前に、または工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後におこなわれることを特徴とする作製方法。
【請求項２】
リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、
上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、
上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、
上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、
上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、
上記第１単量体ユニットにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程を含んでいることを特徴とする作製方法。
【請求項３】
上記多量体型捕捉剤を、上記付着部分を介して担体上に固定化する工程をさらに含んでいることを特徴とする請求項２に記載の作製方法。
【請求項４】
少なくとも上記第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、合成されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項５】
上記第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、ペプチドであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項６】
第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から生成されることを特徴とする請求項５に記載の作製方法。
【請求項７】
上記第１アミノ酸群と第２アミノ酸群とは、異なるものであることを特徴とする請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
各アミノ酸残基は、実質的に鏡像異性的に単一であることを特徴とする請求項５〜７の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項９】
実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、２０種未満のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項５〜８の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１０】
実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、４種のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項５〜９の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１１】
実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体からなる群より選択されることを特徴とする請求項５〜１０の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１２】
実質的に鏡像異性的に単一である上記アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項５〜１１の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１３】
上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、互いに異なるアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１４】
上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、２〜５０個のアミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項５〜１３の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１５】
上記反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジン活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項５〜１４の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１６】
上記反応基は、チオール基であることを特徴とする請求子５〜１５の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１７】
上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基によって活性化されていることを特徴とする請求項５〜１６の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１８】
上記捕捉剤は、上記担体に共有結合していることを特徴とする請求項５〜１７の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項１９】
上記ペプチドは、上記捕捉剤のリガンド結合領域において、１アミノ酸おきにのみアミノ酸が異なるように合成されていることを特徴とする請求項５〜１８の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２０】
上記捕捉剤は、チオエステル誘導化捕捉剤とシステイン誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションによって、上記担体に付着していることを特徴とする請求項５〜１９の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２１】
上記捕捉剤は、Ｎ末端システインを有する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションによって、上記担体に付着していることを特徴とする請求項５〜１９の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２２】
上記捕捉剤は、疎水性相互作用によって上記担体上に固定化されていることを特徴とする請求項５〜１７の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２３】
上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を含んでおり、
上記疎水性アミノ酸残基および上記リガンド結合部分は、疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を有する捕捉剤を形成するように、上記ペプチドの一次構造中に配置されていることを特徴とする請求項２２に記載の作製方法。
【請求項２４】
上記第１ペプチドおよび上記第２ペプチドの上記疎水性面が、上記付着部分を形成していることを特徴とする請求項２３に記載の作製方法。
【請求項２５】
各ペプチドは、上記付着部分を形成している複数の疎水性アミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項２２〜２４の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２６】
上記第１ペプチドは、４〜４０個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項２３〜２５の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２７】
上記第１ペプチドは、６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項２３〜２６の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２８】
上記第１ペプチドは、疎水性アミノ酸を２０％〜８０％含んでいることを特徴とする請求項２３〜２７の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項２９】
上記第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を有していることを特徴とする請求項２３〜２８の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３０】
上記第２ペプチドは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項２３〜２９の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３１】
上記疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項２３〜３０の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３２】
上記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであることを特徴とする請求項２３〜３１の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３３】
上記第１ペプチドにある上記反応基は、一次アミノ酸構造において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面上であり、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、上記第２ペプチドにある上記反応基は、上記疎水性面内であり、リガンド結合部位のＮ末端側に位置していることを特徴とする請求項２３〜３２の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３４】
上記第１ペプチドは、１０個以下のリガンド結合残基を含んでいることを特徴とする請求項５〜３３の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３５】
上記第２ペプチドは、１０個以下のリガンド結合残基を含んでいることを特徴とする請求項５〜３４の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３６】
上記第１ペプチドは、配列番号１に示される配列を有していることを特徴とする請求項２１〜３５の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３７】
上記第２ペプチドは、配列番号２に示される配列を有していることを特徴とする請求項２１〜３６の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３８】
上記捕捉剤は、上記担体上にてアセンブルされていることを特徴とする請求項１〜３７の何れか１項に記載の作製方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８の何れか１項に記載の方法によって生成されることを特徴とする捕捉剤。
【請求項４０】
請求項１〜３８の何れか１項に記載の方法によって生成される少なくとも１つの捕捉が固定化されていることを特徴とする担体。
【請求項４１】
請求項１〜３８の何れか１項に記載の方法によって生成される多数の捕捉剤が固定化されていることを特徴とするアレイ。
【請求項４２】
個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることを特徴とする請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４３】
上記アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の実質的に全てが、実質的に同一であることを特徴とする請求項４１または４２に記載のアレイ。
【請求項４４】
自アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれていることを特徴とする請求項４３に記載のアレイ。
【請求項４５】
請求項４１〜４４の何れか１項に記載のアレイを作製する作製方法であって、
アドレス可能な空間符号化アレイを形成するために、請求項１〜３８の何れか１項に記載の方法により生成した捕捉剤を、適した担体上に供給する工程を含むことを特徴とするアレイの作製方法。
【請求項４６】
関心のあるリガンドに結合している多量体型捕捉剤の検出方法であって、
請求項１〜３８の何れか１項に記載の方法により生成したコンビナトリアル捕捉剤のアレイを作製する工程と、
上記関心のあるリガンドを上記アレイに接触させる工程と、
上記リガンドが結合している捕捉剤を検出する工程と、を含むことを特徴とする検出方法。
【請求項４７】
請求項２、４〜１７の何れか１項に記載の方法により生成した多量体型捕捉剤と、固定化に適した担体とを含んでいることを特徴とするキット。
【請求項４８】
請求項１、２、４〜１７の何れか１項に記載の方法により生成した第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでいることを特徴とするキット。
【請求項４９】
適した担体をさらに含んでいることを特徴とする請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、二量体型、またはより高次である多量体型捕捉剤を表面に作製する新規な方法、その新規な方法により製造される捕捉剤、およびその捕捉剤のアレイに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ペプチドなどの分子のコンビナトリアル生成（combinatorial production）は周知の技術である。この技術は強力なツールを提供し、ハイスループットスクリーニングなどの技術に用いることができる分子の巨大ライブラリーの作製を可能にしている。このような技術の例、およびこれらを関心のある分子の同定に利用している例は、例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３，８９６９，（１９９８）に開示されている。この文献においては、３ｍｅｒの１，０００ペプチドライブラリーを、ダンシル「ピンセット」（dansyl ‘tweezer’）分子と水中で反応させている。ライブラリー中の３％が、「ピンセット」と結合している。Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，５，７９４，（２００３）には、スプリットおよび混合合成のための、三脚シクロトリベラトリレン骨格（tripodal cyclotriveratrylene scaffold）が記載されており、〜２，０００の構成を含むライブラリーが記載されている。
【０００３】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，５６８，（２００４），Ｄａｒｉｏ  Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌには、ＤＮＡタグが付着した有機分子結合剤の二つのライブラリーが記載されている。より多様性に富んだライブラリーを作製するために、ＤＮＡの相補性が用いられている。さらなるライブラリーがまた、三重らせん形成を用いて作製されている。２４ｍｅｒオリゴが、複合体アセンブリに用いられている。有機分子の解析は、付着しているＤＮＡタグの配列を調べることにより、または、オリゴヌクレオチドアレイに結合させることによりおこなわれている。結合剤は、ｎＭのアフィニティを有するタンパク質となるように産出される。
【０００４】
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｍｅ．，１２，３４６，（２００１）には、ペプチドマイクロアレイおよび低分子マイクロアレイの作製についての記載がある。この文献にはまた、化学選択的ライゲーションが、ペプチドおよびスライド表面に用い得ることが開示されている。この技術においては、Ｎ末端システイン残基が、スライド表面のアルファケトアルデヒドと反応してチアゾリジン環を形成する。他にも、遊離チオールとマレイミドとの間での遊離ラジカルマイケル付加が用いられている。
【０００５】
さらに、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５８１，（２００５）には、フォトリソグラフィー合成により、環状ペプチドの複合体ライブラリーを表面上に構築するストラテジーが記載されている。あらかじめ作製されているコアに側鎖をコンビナトリアル付加するために、ディファレンシャルプロテクション（differential protection）ストラテジーが利用されている。
【０００６】
有意義なライブラリーに必要とされる多様性を獲得するためには、公知の技術では、多数の合成をおこなう必要があり、それにより要する時間およびライブラリー作製のコストが増加する。
【０００７】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、必要とされる多様性を有する分子のライブラリーを、高速かつ安価に作製する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含んでおり、
（ａ）上記第１単量体ユニッにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程、
（ｂ）上記付着部分を介して、上記第１単量体ユニットを担体上に固定化する工程、
工程（ａ）は、工程（ｂ）よりも前に、または工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後におこなわれることを特徴とする作製方法が提供される。
【０００９】
捕捉剤は、担体上にてアセンブルされることが好ましい。
【００１０】
本発明に係る捕捉剤の可能な作製方法の概略は、図１、２および３に示されており、また実施例１において説明されている。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、（ａ）上記第１単量体ユニッにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程、を含んでいることを特徴とする作製方法もまた提供される。
【００１２】
この別の実施形態においては、上記捕捉剤を担体上に固定化する工程をさらに含むことが好ましい。
【００１３】
本発明の様々な実施形態は、以下に、より詳細に明確にされる。明確にされた各実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができ、また、明らかに反対のことが示されていない限り複数の実施形態を組み合わせることができる。とりわけ、好ましいまたは有利であると示されたいかなる特徴も、好ましいまたは有利であると示された他の任意のまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００１４】
ある好ましい実施形態において、第１単量体ユニットと第２単量体ユニットとは、共有結合している。
【００１５】
付着部分は、捕捉剤を担体上に固定化する任意の適した手段を含んでいることが、理解される。固定化は、例えば、共有結合相互作用、イオン相互作用、疎水性相互作用、極性相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、アビジン−ビオチン相互作用、または他の高アフィニティな非共有結合相互作用によるものであることが理解される。
【００１６】
好ましくは、付着部分は、捕捉剤を担体上に固定化するために、共有結合による手段または疎水性相互作用による手段を含んでいる。
【００１７】
単量体ユニットが任意の適した種類の分子であり得ることは、理解される。好ましくは、単量体ユニットは、ヌクレオチドまたはアミノ酸である。より好ましくは、単量体ユニットは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。最も好ましくは、単量体ユニットは、ポリペプチドである。
【００１８】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについては、それぞれ２つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の鎖を意味している。
【００１９】
第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、合成されることが好ましい。第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは固相上に合成され、互いに同じかまたは異なるものであることがより好ましく、単量体ユニットは、第１の態様における使用の前に固相から切り離されることがさらに好ましい。
【００２０】
ポリヌクレオチド合成およびポリペプチド合成は当業者にとって周知の技術である。
【００２１】
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、十分に確立されている。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（例えば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。例えば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
【００２２】
捕捉剤がペプチド多量体を含んで構成されている場合に、第１ペプチドおよび第２ペプチドが、同じかまたは異なる一次アミノ酸配列を有し得ることは、一見して明白である。
【００２３】
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成され得ること、ならびに、各アミノ酸群は、同じであってもよくまたは異なるものであってもよいことは、さらに明白である。
【００２４】
第１ペプチドおよび第２ペプチドは、２〜１００アミノ酸の長さであることが好ましく、２〜５０アミノ酸の長さであることがより好ましく、５〜２５アミノ酸の長さであることが最も好ましい。
【００２５】
リガンド結合部分を形成する各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群から選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群から選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群から選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群から選択される。
【００２６】
群（set）に含まれている各アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物（amino acid mimetic）、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体であり得ることが理解される。好ましくは、アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかである。
【００２７】
好ましくは、群に含まれている各アミノ酸は、実質的に鏡像異性的に単一である。
【００２８】
本発明に係る方法に用いる第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、好ましくは１０個以下のリガンド結合残基を含んでおり、より好ましくは８個以下のリガンド結合残基を含んでおり、より好ましくは６個以下のリガンド結合残基を含んでおり、さらに好ましくは４個以下のリガンド結合残基を含んでおり、最も好ましくは３個以下のリガンド結合残基を含んでいる。
【００２９】
好ましい実施形態においては、反応基は、ペプチド合成の間は保護されており、第１の態様における捕捉剤の生成に使用する前に、保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、例えば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリが挙げられる。この技術によれば、側鎖が保護されているとともにアミノ末端がフリーである樹脂結合ペプチドを産出できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準的なペプチド合成条件下において、共役できるカルボン酸反応基共役の任意のものと反応し得る。例えば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を有するシステインが、組み込まれ得る。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが、溶液中に生じる。
【００３０】
本発明の任意の実施形態に用いる上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールから選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。上記反応基としては、チオール基がより好ましい。好ましくは、反応基がチオール基である場合には、少なくとも１つのチオール基は活性化チオールである。好ましくは、チオール基は、ニトロチオピリジル基またはチオピリジル基で活性化されている。
【００３１】
反応スキームの概略を示す図４には、さまざまな反応基を含むペプチドを産出する、可能な反応経路が示されている。
【００３２】
多量体型捕捉剤を形成するために、任意の適した反応を本発明の方法に用いることができることは理解され、例えば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（例えば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。
【００３３】
ペプチド内にあるアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有するようになることは明白である。例えば、側鎖はリガンド結合のための正電荷を提供し得る。正電荷は、好ましくは、リシン残基（ペプチド鎖と正電荷との間に四つのＣＨ２基）、オルニチン残基（ペプチド鎖と正電荷との間に三つのＣＨ２基）によってもたらされ、最も好ましくは、ジアミノブチリル残基（ペプチド鎖と正電荷との間に二つのＣＨ２基を有する）によってもたらされる。
【００３４】
アミノ酸は、あるいは、リガンド結合のための水素結合供与体および／または受容体としての役割を果たすことができる水酸基を提供し得る。水酸基は、好ましくは、セリン残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間に一つのＣＨ２基）によってもたらされ、より好ましくは、ホモセリン残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間に二つのＣＨ２を有する）によってもたらされる。
【００３５】
アミノ酸は、リガンド結合のための疎水性部分を提供し得る。好ましくは、アラニン残基（ペプチド鎖とメチル基との間に一つもＣＨ２基がない）が疎水性部分をもたらし、より好ましくは、アミノブチリル残基（ペプチド鎖とメチル基との間に一つのＣＨ２基を有する）が疎水性部分をもたらす。
【００３６】
また、アミノ酸は、リガンド結合のための負電荷を提供し得る。負電荷は、好ましくは、グルタミン酸残基（ペプチド鎖とカルボキシレート基（carboxylate group）との間に二つのＣＨ２基）によってもたらされ、より好ましくは、アスパラギン酸残基（ペプチド鎖とカルボキシレート基との間に一つのＣＨ２基）によってもたらされる。
【００３７】
好ましくは、当業者において周知のように、ペプチドは、コンビナトリアル方式（combinatorial manner）によりアミノ酸の群（set）から生成され、それにより群内にあるアミノ酸の可能な組み合わせの全てを生成することができる。例えば、群内にＮ種のアミノ酸があり、ペプチドの長さがＬである場合には、完全な群は、ＮＬ種類のペプチドを含むことになる。
【００３８】
好ましい実施形態において、任意の所定のアミノ酸群から生成され得る可能なコンビナトリアルペプチドの、副群（subset）を用いることができる。副群は、ペプチド合成において特定のルールを含めて決定することができ、例えば、群内における各アミノ酸の最大レベルおよび最小レベルを規定することができ、または、組み込まれる疎水性アミノ酸の割合の最大レベルおよび最小レベルを規定することができる。
【００３９】
本発明の方法により、多様性が増大した捕捉剤が生成される。これは、本方法により生成されるコンビナトリアル作製捕捉剤は、多量体型であるという事実によるものである。例えば、多量体型捕捉剤が二量体の場合には、リガンド結合部分の任意の所定の長さにおける可能な多様性は、二つのペプチド鎖があることにより、二乗した数になる。したがって、初期合成の数を減らして合成することが必要である。
【００４０】
好ましい実施形態において、リガンド結合に好ましいように側鎖が配置するように、ペプチドを固定化する。
【００４１】
捕捉剤が共有結合相互作用によって固定化されている場合には、これは、例えば、図５に示すように、Ｌ型アミノ酸とＤ型アミノ酸とを交互に有するペプチドを合成することによって実現する。
【００４２】
または、図６に示すように、ベータアミノ酸を含む群を用いてペプチドを合成してもよく、または、ペプチドの繰り返し単位あたり偶数個の原子を有する他のキラルアミノ酸単量体を用いて合成してもよい。
【００４３】
ある好ましい実施形態においては、図７に示すように、リガンド結合領域にあるアミノ酸が一アミノ酸おきにのみ異なるようにペプチドを合成する。
【００４４】
この実施形態は、リガンド結合にとって最も自然で最も有利な間隔にて側鎖が配置されている点において有利である。
【００４５】
各ペプチドは、上述した種類のアミノ酸の一つ以上を含み得ること、および、用いられる特定の組み合わせが、様々なペプチド鎖を含む捕捉剤の特性に影響を与えることは、当業者にとって明らかである。
【００４６】
担体への捕捉剤の固定化が共有結合によりなされている場合には、捕捉剤を担体上に「配列」させることができ、また、アレイは任意の使いやすい形態をとることができる。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、「高密度」アレイの全ての種類に適用できる。
【００４７】
好ましくは、第１の態様の方法によって生成され、共有結合により固定化されている捕捉剤は、アレイ上の個別の空間符号化部位（spatially encoded loci）に配置されている。好ましくは、アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の全ては、ペプチドの同じ対を含んで構成されている。より好ましくは、アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれている。
【００４８】
分子（例えばペプチド）の担体への固定化に関して、用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書および本実施形態において、交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な、共有結合を包含することを意図している。
【００４９】
本発明の特定の実施形態では、「官能化された」不活性な担体またはマトリクス（例えばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている担体を使用しており、官能化は、例えば、ペプチドなどの生体分子への共有結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。そのような支持体の例としては、ガラスなどの不活性担体上に支持されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これに限定されるものではない。そのような実施形態においては、生体分子（例えばペプチド）は介在物質（例えばヒドロゲル）に直接共有結合をしているが、介在物質そのものは担体またはマトリクス（例えばガラス担体）に非共有結合で結合していてもよい。用語「担体に共有結合」には、適宜、この種の処理を包含していると解釈すべきである。
【００５０】
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチド二量体が多コピー含まれている。
【００５１】
捕捉剤を担体に共有結合させるための好ましい反応スキームとしては、スルフヒドリル（sulfhydryls）とマレイミド誘導化表面との間の反応、マレイミド誘導化表面とジエン官能化捕捉剤との間のディールス−アルダー反応、アジドおよびアセチレン３＋２付加環化反応、チアゾリジン環形成、ならびに改変シュタウディンガーライゲーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、担体への捕捉剤の共有結合は、入れ換えた方法、例えば、チオール誘導化表面とマレイミド置換ペプチドとの間の反応によっても、成立し得る。
【００５２】
特に好ましい実施形態においては、捕捉剤を担体に共有結合させるために、チオエステル誘導化捕捉剤と、アミノ基およびシステインのスルフヒドリル基の両方が存在するシステイン誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションが用いられる。
【００５３】
最も好ましい反応スキームでは、図８に示すように、Ｎ末端システインを有する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションを用いている。
【００５４】
ネイティブケミカルライゲーションでは、ペプチド上のＮ末端システインと表面付着チオエステルとの間のペプチド結合が形成される。本発明のこの実施形態における特に有利な点は、ペプチド側鎖の保護が必要ないという点である。本発明のこの実施形態におけるさらに特に有利な点は、形成される表面付着ペプチドが、ジスルフィド結合形成による二量体レセプターの形成に利用され得る内部システイン、またはチオールとマレイミド官能化ペプチドとの間の反応に利用され得る内部システインを保持する点である。
【００５５】
チオエステル官能化ガラス表面の調製における好ましい反応スキームを図９に示す。
【００５６】
捕捉剤を担体表面にてアセンブルさせる場合における、好ましい反応スキームは図１０に示されている。この実施形態においては、第１ペプチドは、チオエステル基とＮ末端システイン残基との間のネイティブケミカルライゲーション反応を介して、官能化担体に共有結合している。多量体型捕捉剤は、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することによって生成される。
【００５７】
チオエステル表面を調製するためのより好ましい経路としては、アミノ化表面と下記種類のチオラン２，４−ジオンとの間の反応が挙げられる。
【００５８】
【化１】
2009519433.tif 000003
チオエステル表面は、下記種類のチオエステルシリルクロライド共役を用いた水酸化表面の誘導化によっても形成できる。
【００５９】
【化２】
2009519433.tif 000004
共有結合によって捕捉剤が担体に固定化されている場合には、二量体が形成されており、第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、リガンド結合部位のＮ末端側もしくはリガンド結合部位のＣ末端側にあるペプチド配列中に、または二分されたリガンド結合部位に挟まれた内側に、チオール基（活性化されていても、活性化されていなくてもよい）を保持している。これらの実施形態のいずれにおいても、チオール基部分はリガンド結合残基と同じ配向性または反対の配向性を有していてもよく、また、第１ペプチドおよび第２ペプチド内の各チオール基の位置は独立であることは、明らかである。
【００６０】
別の一実施形態において、捕捉剤は、捕捉剤と担体との間の疎水性相互作用によって、担体に固定化されている。
【００６１】
本実施形態において、本発明の方法に従って作製された捕捉剤は、少なくとも２つの単量体ユニットを含んでおり、第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、それぞれ、少なくとも１つの疎水性部分と、少なくとも１つの反応基と、少なくとも１つのリガンド結合部分とを含んでいる。
【００６２】
好ましくは、本発明に従って作製した捕捉剤は、少なくとも２つのペプチドを含んでおり、上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基と、少なくとも１つの反応基と、少なくとも１つのリガンド結合部分とを含んでおり、上記少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および上記少なくとも１つのリガンド結合部分は、疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を形成するように、上記ペプチドの一次構造中に配置されている。
【００６３】
本発明に係る方法の本実施形態において、上記ペプチドの上記疎水性面が、上記付着部分を形成していることが理解される。
【００６４】
好ましくは、各ペプチドは、付着部分を形成している複数の疎水性アミノ酸を含んでいる。
【００６５】
好ましくは、本発明の本方法に用いる上記第１ペプチドは４〜４０個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、６〜２５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
【００６６】
好ましくは、リガンド結合部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含んでいる。より好ましくは、リガンド結合部分は、複数のアミノ酸を含んでいる。
【００６７】
リガンド結合面に位置しているアミノ酸は、例えばアミノ酪酸残基などの疎水性残基もまた含まれていてよいことが理解される。
【００６８】
図１１に示すように、本実施形態に用いている各ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を含んで構成されていることが好ましい。
【００６９】
疎水性面および実質的な非疎水性面となるような側鎖の配置となる他のペプチド配列を容易に設計できることは、当業者によって理解される。例えば、疎水性残基の間にある３つの非疎水性アミノ酸残基、または奇数個のアミノ酸の任意の組み合わせが挙げられる。または、ペプチドは、結果として疎水性面および実質的な非疎水性面となるように、例えば、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸およびベータアミノ酸の組み合わせを含んでいてもよい。
【００７０】
リガンド結合面に存在するように配置されている各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群より選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群より選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群より選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群より選択される。
【００７１】
本実施形態に用いる各ペプチドは、好ましくは、疎水性アミノ酸残基を１０％〜９０％含んでおり、より好ましくは、２０％〜８０％含んでおり、さらに好ましくは、３０％〜７０％含んでおり、最も好ましくは、４０％〜６０％含んでいる。
【００７２】
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、５０％の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
【００７３】
疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン（norleucine）、バリン、ノルバリン（norvaline）、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンである。
【００７４】
好ましい実施形態においては、捕捉剤は、実質的に非疎水性であるリガンド結合面がリガンド結合に好ましいように、疎水性担体上に配置している。
【００７５】
本方法に用いる担体としては任意の適した疎水性担体、例えば、疎水性有機チオール処理によって修飾された金、表面処理により修飾されたガラスまたはプラスチックが使用可能であることが理解される。好ましくは、担体はプラスチックである。
【００７６】
または、実質上水性である溶媒の存在下において、捕捉剤を自身に固定化できる疎水性化合物によって、担体をコートしてもよい。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明の本実施形態に用いる第２ペプチドは、第１ペプチドよりもアミノ酸の数が少なく、また、ペプチドと疎水性面との間の相互作用が相対的に弱くなるように、疎水性残基の数がより少なくなっている。
【００７８】
第１ペプチドおよび第２ペプチドの長さならびに担体上に保持されるのに必要な疎水性アミノ酸残基の数は、表面の疎水性ならびに第１ペプチドおよび第２ペプチド内の疎水性アミノ酸次第であり、また結合されるリガンドの性質にもよることは、当業者にとって明白である。
【００７９】
担体に保持されるペプチドの量は、担体が供される洗浄のストリンジェンシー次第であることは、当業者にとって、一見して明白である。ペプチドの固定化の後、担体を例えば、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１．０Ｍ  ＮａＣｌにより洗浄することが好ましい。
【００８０】
第２ペプチドは、疎水性面に、好ましくは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、２〜５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、２〜４個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
【００８１】
好ましくは、リガンド結合残基は、実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置している。
【００８２】
捕捉剤が疎水性相互作用によって担体に固定化されている場合に、反応基は、第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中において、任意の適した場所に位置することができる。例えば、反応基は、一次ペプチド配列中において、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置するように、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、配置され得る。
【００８３】
または、反応基がペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に配置され、第１ペプチドにおいては、反応基がリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、また第２ペプチドにおいては、反応基がリガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置され得る。
【００８４】
さらなる実施形態では、第１ペプチドにおいては、反応基がペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置するように、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、また第２ペプチドにおいては、反応基がリガンド結合部位に対して反対側の（疎水性の）面に位置するように、かつリガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置され得る。
【００８５】
好ましい実施形態においては、図１０に示すように、第１ペプチドの反応基は、一次アミノ酸構造中において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面上、リガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、第２ペプチド中において、疎水性面中、リガンド結合部位のＮ末端側に位置している。
【００８６】
好ましくは本実施形態において、捕捉剤は、アレイを形成するように担体に結合している。アレイが任意の使いやすい形態をとることができることは理解される。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、「高密度」アレイの全ての種類に適用できる。
【００８７】
アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の各部位には、異なる捕捉剤が含まれており、より好ましくは、各部位には、多コピーの捕捉剤が含まれている。
【００８８】
分子（例えばペプチド）の担体への固定化に関して用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書において交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、疎水性相互作用を包含することを意図している。通常、分子（例えばペプチド）は、例えばペプチドリガンド結合を必要とする用途などに、担体の使用を意図している条件下において、担体に固定化されている状態または付着している状態にとどまりさえすればよい。
【００８９】
本発明の特定の実施形態では、「官能化された」不活性な担体またはマトリクス（例えばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている固体支持体を使用してもよい。この官能化は、例えば、ペプチドなどの疎水性結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。
【００９０】
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチドが多コピー含まれている。
【００９１】
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、配列番号１に示される構造を有している；
（Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）ｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｐｈｅ−Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
ここでＸ、ＹおよびＺはリガンド結合残基であり、Ｃｙｓは二量体形成に用いられる求核チオールを提供する。
【００９２】
第２ペプチドは、配列番号２に示される好ましい構造を有している；
ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐ−Ｘ’−Ｐｈｅ−Ｙ’−Ｐｈｅ−Ｚ’−Ｐｈｅ
ここで、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はリガンド結合残基であり、ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐは二量体形成に用いられる活性化チオール（最も好ましくは、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基のいずれかで活性化されているチオール）である。
【００９３】
上記の好ましい実施形態は、例示のみを目的としており、限定して解釈すべきではないことは理解すべきである。多くの他の反応基および活性化基を本発明の方法に採用できることは、当業者にとって明白である。
【００９４】
最も好ましい実施形態においては、本発明の方法により作製された捕捉剤は、組み合わせが多様な二量体の、アドレス可能な空間符号化アレイを形成するために、適した担体上に分配される。好ましくは、ペプチドは、非接触型ディスペンサー（例えばＰｉｅｚｏｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて個々に担体上に分配され、ｉｎ  ｓｉｔｕでアセンブルされる。
【００９５】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様の方法により作製された捕捉剤が提供される。
【００９６】
本発明の第３の態様によれば、第１の態様の方法により作製された少なくとも１つの捕捉剤が固定化されている、担体が提供される。
【００９７】
上記捕捉剤は、共有結合相互作用または疎水性相互作用によって固定化されていることが好ましい。
【００９８】
本発明は、本発明の方法により作製した多量体型捕捉剤と、固定化に適した担体とを含んでいるキットもまた提供する。
【００９９】
あるいは、キットは、本発明の方法に使用するために生成された第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでいてもよい。キットには、適した担体がさらに含まれていることが好ましい。
【０１００】
本発明によれば、関心のあるリガンドを結合している、本発明の方法により作製された多量体型捕捉剤の検出方法であって、上述した任意の態様に係るコンビナトリアル捕捉剤のアレイを作製する工程と、上記関心のあるリガンドを上記アレイに接触させる工程と、上記リガンドが結合している捕捉剤を検出する工程と、を含むことを特徴とする検出方法もまた提供される。
【０１０１】
任意の実施形態において、固定化したペプチドへのリガンドの結合に関して用語「結合」とは、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な、共有結合または非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態においては、共有結合が好ましい。しかしながら、例えばリガンド−レセプター相互作用を必要とする用途などの、担体の使用を意図している条件下において、リガンドが、固定化されているペプチドに結合している状態に通常とどまりさえすればよい。
【０１０２】
捕捉剤へのリガンドの結合を当該技術分野において周知であるさまざまな方法によって同定できることは、当業者にとって明白であり、例えば、リガンドが結合しているアレイ上の位置を同定できるように、リガンドまたは捕捉剤を標識してもよい。この標識は、例えば、放射性標識、または、例えば蛍光体（fluorophore）を用いた蛍光標識であり得る。または、関心のあるリガンドの捕捉剤への結合を、当該技術分野において周知の他のさまざまな技術を用いて検出してもよく、例えば、熱量測定、吸光光度法、ＮＭＲ法、原子間力顕微鏡および走査型トンネル顕微鏡を用いた方法、電気泳動またはクロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴検出、弾性表面波検出ならびにマイクロカンチレバーに基づく多くのアプローチがある。
【０１０３】
捕捉剤が結合する特定のリガンドは、捕捉剤を形成しているペプチドの長さおよび配列によって決まるので、本発明の方法により作製した多量体型捕捉剤および多量体型捕捉剤のアレイは、選択した任意の検出物質（analyte of choice）の同定に使用できる。好ましい実施形態においては、リガンドとしては、真核細胞、原核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、プリオン、胞子、花粉粒、アレルゲン、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、有機化合物または無機化合物が含まれる。リガンドは、好ましくは、生理代謝産物または薬理代謝産物であり、最も好ましくは、診断または予後医療マーカーとして用いることができる、人もしくは動物の体液中にある生理代謝産物または薬理代謝産物である。
【０１０４】
本発明のさらなる目的、特徴および長所は、以下の記述で明らかになるであろう。さらに、本発明の利点は、図面を参照する以下の説明によって明らかになる。
【０１０５】
〔発明を実施するための最良の形態〕
ここで使用される用語「スペーサーアミノ酸」は、側鎖がリガンド結合に関与しないアミノ酸であって、アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸類似物またはアミノ酸模倣物を意図する。
【０１０６】
ここで使用される用語「捕捉剤」は、リガンドが当該捕捉剤に接触したとき、リガンドと結合するような構造を有する多量体分子を意図する。
【０１０７】
ここで使用される用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸残基を含む鎖を意図し、合成アミノ酸、アミノ酸類似物、アミノ酸模倣物、またはこれらのいずれかの組み合わせを意図する。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中において、交換可能に使用される。
【０１０８】
ここで使用される用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、２つ以上のヌクレオチドを含む鎖を称し、本明細書中において、交換可能に使用される。
【０１０９】
ここで使用される用語「実質的に鏡像異性的に単一」は、残基が実質的に１種類の異性体を含み、他の種類の異性体は不純物としてのみ含むことを意図する。
【０１１０】
ここで使用される用語「リガンド結合に好ましいように配置する」は、多量体捕捉剤を形成するペプチドの側鎖が、リガンドに接触し相互作用し得るように配置することを意図する。
【０１１１】
ここで使用される用語「実質的に非疎水性」は、疎水性残基よりも親水性残基を実質的に多く含むことを意図する。
【０１１２】
〔実施例１〕
図１は、本発明に係る捕捉剤の生成方法の概略を示す図である。
【０１１３】
単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットはリガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。所望であれば、合成の間はＸを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
【０１１４】
単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでおり、上記反応基Ｙは合成の間は保護され、その後、使用する前に保護がはずされるものであってもよい。所望であれば、合成の間Ｚも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
【０１１５】
群（Ａ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。
【０１１６】
群（Ｂ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｄ）を得る。
【０１１７】
次いで、群Ｄの単量体ユニットのそれぞれを、アレイ上の空間符号化部位において、固体支持体（Ｅ）表面と接触させ、このときに上記表面への付着にＺが用いられるようにする。
【０１１８】
次いで、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｇ）を形成するように、群Ｄ由来の表面結合単量体ユニット（Ｆ）を、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）と反応させる。
【０１１９】
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
【０１２０】
図２は、本発明に係る捕捉剤のさらなる生成方法の概略を表す図である。
【０１２１】
この実施形態においては、単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。合成の間は反応基Ｘを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
【０１２２】
また、単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでいる。合成の間、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）および反応基Ｙを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。所望であれば、合成の間はＺも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
【０１２３】
単量体ユニット（Ｂ）のそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。次いで、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｄ）を形成するように、群（Ａ）由来の所定の固相結合単量体ユニットと、過剰量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）とを反応させる。
【０１２４】
次いで、固相に結合している各二量体構造（Ｄ）を固体支持体から切り離し、溶液中に二量体構造（Ｅ）を得る。
【０１２５】
二量体構造が部分Ｚを用いて固体表面（Ｆ）に付着するように、各液相二量体構造（Ｅ）を、最終的に、アレイの空間符号化部位にて固体表面（Ｆ）と接触させる。
【０１２６】
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
【０１２７】
図に示したＸ、ＹおよびＺの位置は説明のための単なる例示であり、本発明はこれに限定されない。
【０１２８】
図３は、第３の態様における捕捉剤のさらなる作製方法の概略を示す図である。
【０１２９】
単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。所望により、合成の間はＸを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
【０１３０】
単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでいる。合成の間は反応基Ｙを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。所望により、合成の間はＺも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
【０１３１】
群（Ａ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。
【０１３２】
群（Ｂ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｄ）を得る。
【０１３３】
次いで、二量体構造がＺを用いて固体表面（Ｆ）に付着するように、また、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｇ）を形成するように、群Ｄの単量体ユニットを、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）に接触させ、アレイの空間符号化部位において、固体支持体（Ｅ）の表面に接触させる。
【０１３４】
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
【０１３５】
本発明の最も重要な利点は、アレイ表面における単量体ユニットの対（またはさらに大きい数）のコンビナトリアル結合によって、配列の多様性が「二乗化」（またはさらに高い次数のべき乗化）されることである。
【０１３６】
〔実施例２〕
有機溶媒層中または疎水性表面上におけるペプチドのセルフアセンブリを実証するために、以下の一連のペプチドを合成した。ペプチドのセルフアセンブリは、上記有機溶媒層または疎水性表面に接触する水溶性溶媒中において、エントロピー効果により引き起こされる。
【０１３７】
全てのペプチドのＮ末端を、ローダミン色素ＴＡＭＲＡで標識した。５−ＴＡＭＲＡおよび６−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物を標識に用いた。
【０１３８】
【表１】
2009519433.tif 000005
以下では、紙面の前に突き出す残基の側鎖は、組み合わせ多様な「リガンド結合面」に相当する。紙面の後ろへ突き出す残基の側鎖は、「疎水性面（あるいはネガティブコントロール残基）」に相当する。
【０１３９】
ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−８の群において、４つの側鎖（アスパラギン酸、アラニン、セリン、およびリシン）の混合物を用いた。ペプチド２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１６の群において、４つの親水性（アスパラギン酸）の鎖を用いた。
【０１４０】
ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−４の群、およびペプチド２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１２の群において、５残基の側鎖を「疎水性面（またはネガティブコントロール残基）」に用いた。ペプチド２ＤＯＳ−５〜２ＤＯＳ−８の群、およびペプチド２ＤＯＳ−１３〜２ＤＯＳ−１６の群において、３残基の側鎖を「疎水性面（またはネガティブコントロール残基）」に用いた。
【０１４１】
ペプチド２ＤＯＳ−１、２ＤＯＳ−５、２ＤＯＳ−９、および２ＤＯＳ−１３においては、ノルロイシン残基を「疎水性面」に用いた。ペプチド２ＤＯＳ−２、２ＤＯＳ−６、２ＤＯＳ−１０、および２ＤＯＳ−１４においては、フェニルアラニン残基を「疎水性面」に用いた。ペプチド２ＤＯＳ−３、２ＤＯＳ−７、２ＤＯＳ−１１、および２ＤＯＳ−１５においては、セリン残基を、「疎水性面」に対する弱いネガティブコントロールとして用いた。ペプチド２ＤＯＳ−４、２ＤＯＳ−８、２ＤＯＳ−１２、および２ＤＯＳ−１６においては、アスパラギン酸残基を、「疎水性面」に対する強いネガティブコントロールとして用いた。
【０１４２】
【表２】
2009519433.tif 000006
【０１４３】
【表３】
2009519433.tif 000007
【０１４４】
【表４】
2009519433.tif 000008
標準ＦＭＯＣ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ペプチドを２μｍｏｌスケールで合成し、５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中に１０μＭになるように溶解した。
【０１４５】
疎水性面（ポリプロピレンマイクロタイタープレートのウェル）上におけるペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６の保持を調べた。
【０１４６】
５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡの溶媒として用いた。
【０１４７】
１０μＭのペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６および１０μＭのＴＡＭＲＡを、１００μｌずつ等分し、図１３に示すように、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウェルに入れた。
【０１４８】
このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さ（scan height）を＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
【０１４９】
ペプチドが乾燥するように、一晩中暗所で蒸発乾燥させ、マイクロタイタープレートを再び上述したようにスキャニングした。
【０１５０】
次いで、２５０μＬの水でウェルを１０回洗浄した。
【０１５１】
残りの表面結合ペプチドを、最後に、１００μｌの、５０％(ｖ／ｖ)アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、マイクロタイタープレートを、再び、上述したようにスキャニングした。
【０１５２】
蛍光画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
【０１５３】
３回の実験で得られた、６００Ｖ、５００Ｖ、４００Ｖおよび３００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図１４に示す。
【０１５４】
定量化データ（４００Ｖでスキャンしたときのデータを用いた）を表２に示し、グラフを図１５に示した。
【０１５５】
【表５】
2009519433.tif 000009
この結果は、フェニルアラニン残基は、ノルロイシン残基よりも強い保持を引き起こすことを示している。この結果は、さらに、５つの疎水性「アンカー残基」を有するペプチドの方が、３つの疎水性「アンカー残基」を有する同等ペプチドよりもよく保持されることを示している。リガンド結合残基を、アスパラギン酸、アラニン、セリンおよびリシンから、４つのアスパラギン酸残基が連続したものに変更すると、ポリプロピレン表面における保持の低下が引き起こされる。
【０１５６】
表３に示すペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびペプチドＰ２−１〜Ｐ２−２の、ポリプロピレン表面における保持を調べるために、さらなる実験を行った。
【０１５７】
【表６】
2009519433.tif 000010
ポリプロピレンシートを、使用前に５０％(ｖ／ｖ)アセトニトリル水溶液を用いて拭いた。
【０１５８】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５  １μＭ、およびペプチドＰ２−１〜Ｐ２−２  １μＭ、ならびにＴＡＭＲＡ  １μＭの、８×複製２０ｎｌ量を、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ)を用いて、１ｍｍ間隔で、３”×１”×１ｍｍポリプロピレンシートに分注した。「サイドシュート」オプションを用いて、前もって５００滴分注した。また、チューニングを３０μｓ、７２Ｖに設定した。
【０１５９】
このスライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。このとき、６００ＶのＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテン（platen）に設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１６０】
スライドの下半分（テストアレイを含む）を１０ｍＭ  ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０)を含む１００ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ中で１分間洗浄し、上述したように再スキャニングした。
【０１６１】
同じスライドの半分を、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む１００ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ中で３０分間、２回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
【０１６２】
同じスライドの半分を、１００ｍｌの水で３０分間、３回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
【０１６３】
様々なアレイの蛍光画像を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。
【０１６４】
図１６Ａおよび図１６Ｂに示した、配列した様々なペプチドからの蛍光値を、以下の表４〜６に示す。
【０１６５】
１回目の洗浄後のデータを表４ａおよび４ｂに示す。
【０１６６】
【表７】
2009519433.tif 000011
【０１６７】
【表８】
2009519433.tif 000012
２回目の洗浄後のデータを表５ａおよび表５ｂに示す。
【０１６８】
【表９】
2009519433.tif 000013
【０１６９】
【表１０】
2009519433.tif 000014
３回目の洗浄後のデータを表６ａおよび表６ｂに示す。
【０１７０】
【表１１】
2009519433.tif 000015
【０１７１】
【表１２】
2009519433.tif 000016
これらの結果をグラフ化し、図１７に示す。
【０１７２】
この図は、ペプチド鎖長の増加に伴ってペプチドの保持が増加することを明確に示している。明確に示すように、１９アミノ酸の鎖長を有するペプチドＰ１−５が、最も高い保持を有する。
【０１７３】
〔実施例３〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着させたペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）のｐＨ耐性を調べた。
【０１７４】
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、ペプチド２ＤＯＳ−２を、５０μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウェル中で乾燥させた。
【０１７５】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
【０１７６】
最初の１１ウェル中にある乾燥したペプチドサンプルを、表３に示すスキームにしたがって、２００μｌの１００ｍＭ  リン酸緩衝液中で、室温にて３０分間インキュベートした。
【０１７７】
【表１３】
2009519433.tif 000017
上清を全てピペットで吸い取り、１２ウェルの全てにおいて残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  ５０μｌに再懸濁した。そして、このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ＢＰ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
【０１７８】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１７９】
ポリプロピレン上に付着した２ＤＯＳ−２のｐＨ耐性を示す蛍光画像を、図１９に示す。
【０１８０】
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表８に示し、グラフ化したものを図１９に示す。
【０１８１】
【表１４】
2009519433.tif 000018
この結果は、ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、幅広いｐＨ範囲において安定しており、低ｐＨおよび高ｐＨにおいて保持が最大となり、おおよそｐＨ６．５で保持が最小となることを示している。
【０１８２】
〔実施例４〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）の時間依存持続性を、水性バッファーの存在下で、以下に示すように調べた。
【０１８３】
７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、５μＭのペプチド２ＤＯＳ−２を、１００μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートの上部横列のウェルに分注した。
【０１８４】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
【０１８５】
ウェル１〜１０中で乾燥させたペプチドサンプルを、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、２５０μｌの１Ｍ  ＮａＣｌと共に、以下に示す時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、全ての上清を、ピペットにより８回出し入れし、その後取り出して、マイクロタイターの下横列のウェルに入れた。
【０１８６】
１２ウェル全てに残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  ５０μｌ中に再懸濁し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０  フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
【０１８７】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１８８】
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２の、水性バッファー存在下における時間依存持続性に対する蛍光データを、図２０に示す。
【０１８９】
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表９および図２１に示す。
【０１９０】
【表１５】
2009519433.tif 000019
この結果は、疎水性ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、１Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中への懸濁時間を増加させても、安定であることを示している。
【０１９１】
〔実施例５〕
異なる形状のポリプロピレンウェル上における、ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６（上記参照）の保持を調べた。
【０１９２】
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡのための溶媒として用いた。
【０１９３】
１０μＭのペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６、および１０μＭのＴＡＭＲＡを、１μｌずつ等分し、図２２に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ  Ｖ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、およびＧｒｅｉｎｅｒ平底ポリプロピレンマイクロタイタープレートにピペットで入れた。
【０１９４】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
【０１９５】
マイクロタイタープレートの上部横２列のペプチドサンプルを、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２５０μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ中で、室温で１５分間インキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウェル中で、洗浄バッファーをピペットにて８回出し入れした。
【０１９６】
洗浄ペプチドサンプルおよび非処理のペプチドサンプルを、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
【０１９７】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
【０１９８】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１９９】
ＰＭＴ電圧６００Ｖおよび５００Ｖにおいてスキャニングしたプレートの蛍光画像を、図２３に示す。
【０２００】
Ｖ底ウェルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１０および図２４に示す。
【０２０１】
【表１６】
2009519433.tif 000020
平底ウェルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１１および図２５に示す。
【０２０２】
【表１７】
2009519433.tif 000021
この結果は、異なる形状のポリプロピレンウェル上における、ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６の保持は同等であり、ペプチドの保持は、Ｖ底形状のウェルでの乾燥に依存しないことが示している。
【０２０３】
〔実施例６〕
ポリプロピレンおよびポリスチレン表面におけるペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６（上記参照）の保持を比較した。
【０２０４】
７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡのための溶媒として用いた。
【０２０５】
５μＭのペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６、および５μＭのＴＡＭＲＡを、２０μｌずつ等分し、Ｃｏｓｔａｒ  Ｖ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｖ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、およびＧｒｅｉｎｅｒ  Ｖ底ポリスチレンマイクロタイタープレートに、図２６に示すスキームに従って、ピペットで入れた。
【０２０６】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
【０２０７】
マイクロタイタープレートの横列の上部２列におけるペプチドサンプルを、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２５０μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ中において、１５分間、室温でインキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウェル中において、ピペットで８回洗浄バッファーを出し入れした。
【０２０８】
洗浄および非処理のペプチドサンプルを、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
【０２０９】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準解像度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ＢＰ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
【０２１０】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２１１】
６００Ｖ、５００Ｖおよび４００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたスライドの蛍光画像を図２７に示す。
【０２１２】
プレートの上側半分のペプチドサンプルを洗浄し、プレートの下側半分のペプチドサンプルを非処理とした。
【０２１３】
ＣｏｓｔａｒポリプロピレンＶ底ウェルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１２に示す。
【０２１４】
【表１８】
2009519433.tif 000022
ＧｒｅｉｎｅｒポリプロピレンＶ底ウェルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１３に示す。
【０２１５】
【表１９】
2009519433.tif 000023
ＧｒｅｉｎｅｒポリスチレンＶ底ウェルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１４に示す。
【０２１６】
【表２０】
2009519433.tif 000024
これらのグラフを図２８に示す。
【０２１７】
この結果は、３つの全ての表面において、同様のペプチドの挙動が見られることを示しており、さらに、保持は、ある特定のプラスチック表面に特有の性質というよりもむしろ、ペプチドの配列特異的な性質であることを示している。
【０２１８】
〔実施例７〕
７つのフェニルアラニン残基からなる「表面結合面」を有する４つのペプチドを合成した。これらのペプチドはまた、帯電残基および非帯電残基からなる中央領域と、末端から２番目の可変残基とを有している。末端から２番目の可変残基は、アラニン、セリン、システイン、またはニトロピリジルチオ活性化システイン残基である。
【０２１９】
さらに、ＴＡＭＲＡ標識した４つの蛍光ペプチドもまた合成した。これらの蛍光ペプチドは、可変Ｃ末端残基に結合しているグリシン残基に結合しているＮ末端ＴＡＭＲＡ蛍光体を含んでいる。可変Ｃ末端残基は、アラニン、セリン、システイン、またはニトロピリジルチオ活性化システイン残基である。
【０２２０】
実施例１に示した５−ＴＡＭＲＡ異性体および６−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物を標識として用いた。
【０２２１】
８つのペプチドの全ての群を表１５および１６に示す。
【０２２２】
【表２１】
2009519433.tif 000025
【０２２３】
【表２２】
2009519433.tif 000026
ペプチドＳＢ−１〜ＳＢ−４、およびペプチドＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４を二量体形成の調査に用いた。
【０２２４】
２つの異なるプロトコールを使用した。「液相」プロトコールでは、ＳＢペプチドをポリプロピレン表面上で乾燥させた。次いで、水溶液中にＴＬＳＰペプチドを添加した後、ウェルを洗浄して、保持された蛍光材料を分析した。
【０２２５】
「共乾燥」プロトコールでは、ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを混合し、これらの両方をポリプロピレン表面上で共に乾燥させた後、ウェルを洗浄し、保持された蛍光材料を分析した。
【０２２６】
ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを水溶液中で混合して、ペプチド二量体を生成させるために反応させ、ポリプロピレン表面上で乾燥させる、さらに他のプロトコールは、当業者により容易に行い得る。
【０２２７】
「液相」プロトコールでは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのＳＢ−１ペプチド〜ＳＢ−４ペプチド  ５０μｌを、表１７に示す配列に従って、Ｃｏｓｔａｒ  Ｖ底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。
【０２２８】
【表２３】
2009519433.tif 000027
サンプルを一晩、暗所にて乾燥させた。１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の１００μＭのペプチドＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４  ５０μｌを、表１８に示すスキームに従って、ウェルに添加した。
【０２２９】
【表２４】
2009519433.tif 000028
サンプルを室温で１時間、暗所にてインキュベートした。上清を除去し、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌを用いて、ウエルを２回洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、最後にウェルに添加した。
【０２３０】
マイクロタイタープレートをＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２３１】
「共乾燥」プロトコールでは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのペプチドＳＢ−１〜ＳＢ−４  ５０μｌを、表１９に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ  Ｖ底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。
【０２３２】
【表２５】
2009519433.tif 000029
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのペプチドＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４  ５０μｌを、表２０に示すスキームに従って、ウェルに添加した。
【０２３３】
【表２６】
2009519433.tif 000030
サンプルを一晩、暗所で乾燥させた。
【０２３４】
ウェルを、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、最後にウェルに添加した。
【０２３５】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ＢＰ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２３６】
「液相」プロトコールを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図２９Ａに示す。
【０２３７】
「液相」プロトコールにより得られた蛍光データを表２１に示す。
【０２３８】
【表２７】
2009519433.tif 000031
結果をグラフ化し、図２９Ｂに示す。
【０２３９】
「共乾燥」プロトコールを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図３０Ａに示す。
【０２４０】
「共乾燥」プロトコールにより得られた蛍光データを表２２に示す。
【０２４１】
【表２８】
2009519433.tif 000032
結果をグラフ化し、図３０Ｂに示す。
【０２４２】
ポリプロピレン表面と蛍光標識したペプチドとの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在下で、蛍光標識されたペプチドの保持によって、二量体の収率を分析した。
【０２４３】
「液相」プロトコールにおける二量体の収率は、「共乾燥」プロトコールにおける二量体の収率よりも低いが、二量体の化学特異性はより優れていた。最大となる二量体形成は、表面ペプチドが遊離チオール基を有するとき、および溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに観察された。表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときの二量体形成、表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するときの二量体形成、および表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するときの二量体形成も観察された。
【０２４４】
遊離チオールによる遊離チオールへの結合は、ジスルフィド結合を形成する、単純な好気性酸化によるものであってよい。Ｓ−ニトロピリジル活性チオールによるＳ−ニトロピリジル活性チオールへの結合は、残りのＳ−ニトロピリジル活性チオールと反応し得るいくつかの遊離チオールを残すような、不完全なチオール活性の結果によるもの、またはいくつかの他のメカニズムによるものであってもよい。
【０２４５】
「共乾燥」プロトコールの結果は、上述した結果に酷似している。この方法においては、二量体の収率は徐々に高くなるが、非特異的結合もまた高くなる。特に、表面に付けられたヒドロキシル化ペプチドと、遊離チオール基およびＳ−ニトロピリジル活性チオール基の両方を含む溶液ペプチドとの間で、いくつかの反応性が観察された。
【０２４６】
〔実施例８〕
本実施例では、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）非接触ディスペンサーを用いて、平面プラスチック表面上においてペプチド二量体を形成した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）は、高密度アレイに、ナノリットル量をピペットで移すように厳密に設計されている。液量を、圧電性電動チップにより制御した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムは、ソースプレートホルダー、超音波ウォッシュボウル、コンピュータおよびモニタならびにシステム液体ボトルを含む。
【０２４７】
ポリプロピレンシートをＳＢＡプラスチック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂａ．ｃｏ．ｕｋ／，  Ｐｒｏｐｙｌｅｘ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｓｈｅｅｔ  ２４４０×１２２０×１ｍｍ）から得た。このポリプロピレンシートを、使用前に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液によりふき取った。
【０２４８】
表２３に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中またはコントロール溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのペプチドＳＢ−１〜ＳＢ−３  ５ｎｌの６つの１０×１０アレイを、３”×１”にカットされた１ｍｍポリプロピレンシートに、分配した。
【０２４９】
【表２９】
2009519433.tif 000033
表２４に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中、あるいは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中のいずれかにおける、１００μＭのペプチドＴＬＳＰ−４  ５ｎｌの６つの１０×１０アレイを、上記スポット上に分配した。
【０２５０】
【表３０】
2009519433.tif 000034
サンプルを室温で３０分間、暗所においてインキュベートした。スライドを、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、１００ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、スライド上に水道水を１分間流した。
【０２５１】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧４００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２５２】
ポリプロピレンスライドの蛍光画像を図３１に示した。
【０２５３】
ポリプロピレン表面および蛍光標識したペプチドの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在下にて、蛍光標識したペプチドの保持によって、二量体収率を分析した。
【０２５４】
表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに、二量体形成が観察された。単純なプロトコール（蒸発を防ぐためのグリセロールなしで）により、より高い二量体収率が得られた。
【０２５５】
〔実施例９〕
本実施例では、ペプチドＬ１−Ｐ１−１〜Ｌ１−Ｐ１−１６、およびペプチドＬ１−Ｐ２−１〜Ｌ１−Ｐ２−１６を含む二量体の、２０個の２５６成分マイクロアレイ（256-element microarrays）を、同時に作製した。
【０２５６】
１ｍｍポリプロピレンシートを、１３６ｍｍ×８０ｍｍにカットし、グラスペーパーで軽く研磨し、使用前に５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液でふき取った。
【０２５７】
Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて、表２５に示すように、Ｐ１ペプチドの１８×６ｎｌ等分を、０．７２ｍｍ間隔にて、ポリプロピレンスライドの縦列に配列した。
【０２５８】
【表３１】
2009519433.tif 000035
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）
ＴＣＥＰ＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（tris (2-carboxyethyl) phosphine）
Ｐ１ペプチドの配列：
P1-5       TAMRA-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Phe-Ala-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-1    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-2    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-3    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-4    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-5    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-6    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-7    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-8    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-9    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-10   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-11   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-12   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-13   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-14   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-15   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-16   Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥させた後、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて、表２６に示すように、０．７２ｍｍ間隔にて、９０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、１ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＬ１−Ｐ２ペプチドの１８×１２ｎｌ等分を、ポリプロピレンスライドの横列に沿って配列した。
【０２５９】
【表３２】
2009519433.tif 000036
Ｐ２ペプチドの配列：
L1-P2-1    CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-2    CysSTP-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-3    CysSTP-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-4    CysSTP-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-5    CysSTP-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-6    CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-7    CysSTP-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-8    CysSTP-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-9    CysSTP-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-10   CysSTP-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-11   CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-12   CysSTP-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-13   CysSTP-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-14   CysSTP-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-15   CysSTP-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-16   CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-17   TAMRA-CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-18   TAMRA-CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-19   TAMRA-CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-20   TAMRA-CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥した後、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  ５０ｍｌ中で、スライドを１０分間洗浄した。
【０２６０】
スライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２６１】
二量体の１枚の１８×１８アレイの蛍光画像およびコントロールスポットを図３２に示す。
【０２６２】
配列させて分配した各Ｌ１−Ｐ１ペプチドの縦列の蛍光シグナルを観察することができる。この結果は、Ｌ１−Ｐ１ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であったことを示している。また、配列させて分配したＬ１−Ｐ２ペプチドの横列の蛍光シグナルも観察することができる。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であったことを示している。
【０２６３】
Ｌ１−Ｐ１ペプチドのチオール基と競合（compete）する、非標識Ｐ２ペプチドおよびＴＡＭＲＡ標識されたＰ２ペプチドの両方を用いて作製された１６×１６アレイの二量体蛍光と比較して、ＴＡＭＲＡ標識したＰ２ペプチドのみを有するサンプルの二量体蛍光はより強かった。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドは全て、ＴＡＭＲＡ標識されたそのカウンターパートと首尾よく競合し、それゆえに、１６個の全てのＬ１−Ｐ１ペプチドと、１６個の全てのＬ１−Ｐ２ペプチドとの間で、首尾よくペプチド二量体が形成されることを示している。
【０２６４】
上述した本発明は、同様の方法が、多くの方法に変更され得ることは明確である。このような変更は発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者にとって明白なこのような変更のすべてが、本発明の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０２６５】
本発明は、配列多様性が増大した合成捕捉剤を提供する。本発明に係る捕捉剤は、例えばガラスまたはシリコンのような様々な表面を機能化し得るので、上記表面へのリガンド結合を可能にし、または様々な種類のアレイを形成する。
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】本発明に係る捕捉剤の第１の作製方法の概略を示す図である。
【図２】本発明に係る捕捉剤の第２の作製方法の概略を示す図である。
【図３】本発明に係る捕捉剤のさらなる作製方法の概略を示す図である。
【図４】様々な反応基を含むペプチドを形成するための可能な経路を示す図である。
【図５】Ｌ型アミノ酸とＤ型アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。
【図６】ベータアミノ酸を含むペプチドを示す図である。
【図７】一アミノ酸おきにアミノ酸が異なるペプチドを示す図である。
【図８】Ｎ末端システインを保持する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションの方法を模式的に示す図である。
【図９】チオエステル官能化ガラスを調製するための好ましい反応スキームを示す図である。
【図１０】担体表面に二量体型捕捉剤を調製するための好ましい反応スキームを示す図である。
【図１１】疎水性アミノ酸と非疎水性アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。
【図１２】疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を有する二量体型捕捉剤の一例を示す図である。
【図１３】９６ウェルプレート中のさまざまな疎水性捕捉剤の場所を示す図である。
【図１４】ウェル中に様々なペプチドがあることを示している、図１１の９６ウェルプレートの蛍光画像を示す図である。
【図１５】図１４の４００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。
【図１６Ａ】ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。
【図１６Ｂ】ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。
【図１７】図１６Ａおよび図１６Ｂを定量化した結果を示すグラフである。
【図１８】ポリプロピレン疎水性表面上に分配したペプチド２ＤＯＳ−２のｐＨ抵抗性を示す蛍光画像である。
【図１９】図１８の３００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。
【図２０】水性バッファー存在下における、ポリプロピレン疎水性表面上に沈着させたペプチド２ＤＯＳ−２の時間依存持続性を示す蛍光画像である。
【図２１】図２０の３００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。
【図２２】平底９６ウェルプレートおよびＶ底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。
【図２３】洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図２２のプレートの蛍光画像である。
【図２４】図２３のＶ底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。
【図２５】図２３の平底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。
【図２６】ポリプロピレンおよびポリスチレンＶ底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。
【図２７】洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図２６のプレートの蛍光画像である。
【図２８】図２６のポリプロピレンプレートおよびポリスチレンプレートにおける、洗浄後のさまざまなペプチドの保持率をパーセント表示したグラフである。
【図２９Ａ】「液相」プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。
【図２９Ｂ】表２１に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。
【図３０Ａ】「共乾燥」プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。
【図３０Ｂ】表２２に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。
【図３１】ポリプロピレンシート上における二量体形成を示す蛍光画像である。
【図３２】ペプチド二量体の２５６成分マイクロアレイの蛍光画像である。
【図１】
2009519433.tif 000037
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009519433.tif 000044
【図９】
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【図１０】
2009519433.tif 000046
【図１１】
2009519433.tif 000047
【図１２】
2009519433.tif 000048
【図１３】
2009519433.tif 000049
【図１４】
2009519433.tif 000050
【図１５】
2009519433.tif 000051
【図１６Ａ】
2009519433.tif 000052
【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2009519433.tif 000062
【図２６】
2009519433.tif 000063
【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
2009519433.tif 000066
【図２９Ｂ】
2009519433.tif 000067
【図３０Ａ】
2009519433.tif 000068
【図３０Ｂ】
2009519433.tif 000069
【図３１】
2009519433.tif 000070
【図３２】
2009519433.tif 000071
【配列表】
2009519433000001.app
【国際調査報告】
2009519433.tif 000072
2009519433.tif 000073
2009519433.tif 000074