(57)【要約】  本願発明は酵素解離による単細胞懸濁液へヒト胚盤胞（ｈＢＳ細胞）からの幹細胞を培養するための培養系に関する。ヒト胚盤胞からの幹（ｈＢＳ）細胞を培養するための培養系は、ｉ）  密度が５０，０００細胞／ｃｍ２以上のヒト支持細胞、ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および、ｉｉｉ）  有効な培養基、を含み、ｈＢＳ細胞の重要特徴を保全しながら長期間の各連続的な継代において、単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離することによってｈＢＳ細胞を培養することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの胚盤胞から幹（ｈＢＳ）細胞を培養する培養系は、
ｉ）  密度が５０，０００細胞／ｃｍ２以上のヒト支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
ｉｉｉ）  有効な培養基、を含み、
ｈＢＳ細胞の重要特徴を保全しながら長期間の各連続的な継代において、単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離することによってｈＢＳ細胞を培養できる培養系。
【請求項２】
ヒト支持細胞の密度が約５０，０００乃至約５００，０００細胞／ｃｍ２までの範囲、例えば、約５０，０００乃至約４００，０００細胞／ｃｍ２、約５０，０００乃至約３００，０００細胞／ｃｍ２、約５０，０００乃至約２００，０００細胞／ｃｍ２、６０，０００乃至約２００，０００細胞／ｃｍ２、７０，０００乃至約２００，０００細胞／ｃｍ２である、請求項１に記載の培養系。
【請求項３】
ヒト支持細胞がヒト組織に由来する、請求項１または２のいずれかに記載の培養系。
【請求項４】
ヒト組織が胚、胎児、新生児、少年又は成体組織から由来する、請求項３に記載の培養系。
【請求項５】
ヒト組織が包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは乳房を含む皮膚に由来する、請求項３または４のいずれかに記載の培養系。
【請求項６】
ヒト支持細胞が例えば、ｈＢＳ細胞またはｈＢＳ細胞由来の細胞から試験管に誘導される、請求項１−５のいずれかに記載の培養系。
【請求項７】
ヒト支持細胞がヒト線維芽細胞株維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型に由来する、請求項１−６のいずれかに記載の培養系。
【請求項８】
ヒト支持細胞が線維芽細胞である、請求項１−７のいずれかに記載の培養系。
【請求項９】
支持細胞がヒトの新生児包皮線維芽細胞に由来する、請求項８に記載の培養系。
【請求項１０】
ｈＢＳ細胞に由来する細胞が線維芽細胞であるかまたは間葉表現型を有する、請求項６に記載の培養系。
【請求項１１】
支持細胞が、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および／または胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤内皮細胞、出産後のヒト包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後のヒト包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞及び／または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成ヒト質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮細胞または成体ケラチン生成細胞に由来する、請求項１−１０のいずれかに記載の培養系。
【請求項１２】
ヒト支持細胞が成長不活性化された請求項１−１１のいずれかに記載の培養系。
【請求項１３】
ヒト支持細胞がマイトマイシン処理によって成長不活性化された請求項１２に記載の培養系。
【請求項１４】
ヒト支持細胞が放射によって成長不活性化された請求項１２に記載の培養系。
【請求項１５】
ｈＢＳ細胞の接種から、１日乃至１０日、例えば１日乃至５日、２日乃至４日の前に支持細胞が接種される請求項１−１４のいずれかに記載の培養系。
【請求項１６】
ｈＢＳ細胞の接種前に、培養基が１回以上、例えば２回以上、３回以上、４回以上または５回以上変わる請求項１５に記載の培養系。
【請求項１７】
一つ以上の解離薬品が酵素である請求項１−１６のいずれかに記載の培養系。
【請求項１８】
前記酵素がタンパク質分解酵素である請求項１７に記載の培養系。
【請求項１９】
前記酵素がコラーゲン分解酵素である請求項１７または１８のいずれかに記載の培養系。
【請求項２０】
酵素がトリプシン、トリプシン様、ディスパーゼ、ディスパーゼ様、プロナーゼ、プロナーゼ様、コラゲナーゼ、コラゲナーゼ様およびマトリックス・メタロプロテイナーゼからなる群から選択される請求項１７−１９のいずれかに記載の培養系。
【請求項２１】
酵素が組み換え酵素である請求項１７−２０のいずれかに記載の培養系。
【請求項２２】
一つ以上の解離薬品がキレート剤である請求項１−２１のいずれかに記載の培養系。
【請求項２３】
キレート剤が二価陽イオンのキレート化剤である請求項２２に記載の培養系。
【請求項２４】
キレート剤がＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸）およびＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸）からなる群から選択される請求項２２または２３のいずれかに記載の培養系。
【請求項２５】
前記解離薬品が二つ以上、例えば三つ以上、四つ以上、五つ以上の解離薬品の組合せである請求項１−２４のいずれかに記載の培養系。
【請求項２６】
前記解離薬品の組合せが一つ以上の酵素および一つ以上のキレート剤を含む請求項２５に記載の培養系。
【請求項２７】
前記解離薬品の組合せが異種動物由来成分不含である請求項２５または２６のいずれかに記載の培養系。
【請求項２８】
解離薬品の組合せがＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）から成る市販の組合せの群から選択される請求項２５−２７のいずれかに記載の培養系。
【請求項２９】
有効な培養基がＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）およびＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）からなる群から選択される請求項１−２８のいずれかに記載の培養系。
【請求項３０】
有効な培養基が、約０．５乃至約１０００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、例えば約１乃至約５００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、約２乃至約２００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ又は約４乃至約１００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦに補充される請求項１−２９のいずれかに記載の培養系。
【請求項３１】
前記培養基が約１乃至約４０％の血清、例えば約５乃至約２０％の血清、約１０％の血清に補充される請求項１−３０のいずれかに記載の培養系。
【請求項３２】
前記血清がＦＢＳまたはヒト血清である請求項３１に記載の培養系。
【請求項３３】
培養系は、
ｉ）  密度が少なくとも７０，０００細胞／ｃｍ２のヒト新生児包皮支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するためのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、
ｉｉｉ）  少なくとも４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦの有効な培養基で補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、を含み、
ｈＢＳ細胞の重要特徴を保全しながら長期間の各連続的な継代において、単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離することによってｈＢＳ細胞を培養することを可能にする請求項１−３２のいずれかに記載の培養系。
【請求項３４】
請求項１−３３のいずれかに定義される培養系においてｈＢＳ細胞を培養する方法は、細胞の重要特徴を保全しながらｈＢＳ細胞を培養するために、
ｉ）  万能細胞株から得られたｈＢＳ細胞を培養系に適合させるために任意に調整手順を実行し、
ｉｉ）  一つ以上の解離薬品を利用して単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を解離し、
ｉｉｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：４の単細胞懸濁液を分配し、
ｉｖ）  通常培養基変化において約３日乃至２５日間ｈＢＳ細胞を培養させ、
ｖ）  ステップｉｉ）からｎ回を繰り返し、ｎは１以上の整数である、前記ステップを含むｈＢＳ細胞を培養する方法。
【請求項３５】
培養方法が、さらに
ｖｉ）  ｈＢＳ細胞の重要特徴が保全されるかどうか確認するためにステップｉｖ）において得られる細胞を分析し、
ｖｉｉ）  ｈＢＳ細胞の重要な特徴が保全される場合、ステップｉｉ）から繰り返し実行する請求項３４に記載の培養方法。
【請求項３６】
ｎが例えば少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のように、少なくとも５である請求項３４または３５のいずれかに記載の培養方法。
【請求項３７】
ステップｉｉ）の単一細胞懸濁液へのｈＢＳ細胞コロニーの解離は、ｈＢＳ細胞コロニーを一つ以上の解離薬品で処理することによって実行される請求項３４−３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
一つ以上の解離薬品の効力がステップｉｉｉ）の前に軽減される請求項３４−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
一つ以上の解離薬品の物理的な除去、一つ以上の解離薬品の薄弱化、一つ以上の解離薬品の一つ以上の抑制剤の追加、過度の一つ以上の解離薬品に一つ以上の培養基の追加または一つ以上解離薬品の固有の自動抑制によって、一つ以上の解離薬品の効果を減弱させる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
分割比が約１：４乃至約１：５０００の間、例えば約１：２０の乃至約１：１０００、約１：５０の乃至約１：５００の範囲内である請求項３４−３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
分割比が１：２０である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップｉｉｉ）において得られたｈＢＳ細胞が約３日乃至約２５日間、例えば約４日乃至２０日間、６日乃至１２日間培養される請求項３４−４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
ステップｉｖ）の培養基の変化が一週間に約１回乃至約１４回、例えば約２回乃至約６回、約２回乃至約４回、約３回行われる請求項３４−４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記調整手順が、
ａ）  一つ以上の解離薬品を用いて単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離し、
ｂ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：３の単細胞懸濁液を分配し、
ｃ）  通常時間間隔の培養基変化において約５日乃至３０日間ｈＢＳ細胞を培養させ、
ｄ）  均一な未分化のｈＢＳ細胞コロニーを得るために、任意に、多くとも５回ステップａ）から繰り返す、ステップを含む請求項３４−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ステップｃ）において得られたｈＢＳ細胞が約５日から約３０日間、たとえば約７日から約１６日間、約７日から約１０日間培養される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップｄ）が含まれる請求項４４または４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ステップａ）からの繰り返しを多くて５回、例えば多くて４回、多くて３回、多くて２回実行される請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ステップｃ）の培養基の変更が一週間に約１回から１４回、例えば一週間に約２回から６回、一週間に約２回から４回、週約３回実行される請求項４４−４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
細胞の重要特徴を保全しながらｈＢＳ細胞を培養するために、前記方法が、
ｉ）  ａ）一つ以上の解離薬品を用いて単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離し、ｂ）密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：３の単細胞懸濁液を分配し、ｃ）通常時間間隔の培養基変化において約５日乃至３０日間、例えば約７日乃至１６日または約７日乃至１０日ｈＢＳ細胞を培養させ、ｄ）均一な未分化のｈＢＳ細胞コロニーを得るために、任意に、多くとも５回ステップａ）から繰り返す、ステップを含む適応手順を実行し、
ｉｉ）  一つ以上の解離薬品、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔの使用によって単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を解離し、
ｉｉｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：４の単細胞懸濁液を分配し、
ｉｖ）  通常培養基変更において約３日乃至２５日間ｈＢＳ細胞を培養させ、
ｖ）  ステップｉｉ）から少なくとも２０回を繰り返す、ステップを含む請求項３４−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
請求項３４−４９のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、１０％未満の細胞、例えば５％未満の細胞、２％未満の細胞、１％未満の細胞が細胞群として現れ、２０継代以上、例えば２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上、４０継代以上において細胞の重要特徴を存続及び保全するｈＢＳ細胞の単細胞懸濁液。
【請求項５１】
請求項３４−４９のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、１０％未満の細胞、例えば５％未満の細胞、２％未満の細胞、１％未満の細胞が細胞群として現れ、２０継代以上、例えば２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上、４０継代以上において細胞の重要特徴を存続及び保全するｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含単細胞懸濁液。
【請求項５２】
請求項３４−４９のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、２０継代以上、例えば２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上、４０継代以上においてｈＢＳ細胞の重要特徴を存続及び保全することができるｈＢＳ細胞からの改良細胞株。
【請求項５３】
ｈＢＳ細胞の大規模生産のための、請求項１−３３のいずれかにおいて定義した培養系の応用。
【請求項５４】
一つ以上の解離薬品がＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）の少なくとも一つを含む請求項５３に記載の培養系の使用。
【請求項５５】
ｈＢＳ細胞の大規模な生産のための、請求項３４−４９のいずれかに記載の方法の応用。
【請求項５６】
一つ以上の解離薬品がＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）の少なくとも一つを含む請求項５５に記載の方法の応用。
【請求項５７】
ｈＢＳ細胞の大規模な生産のための、ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）のようなタンパク質分解酵素の使用。
【請求項５８】
構成要素である、
ｉ）  請求項３４−４９のいずれかに記載の方法によって入手できる単一ｈＢＳ細胞集団、
ｉｉ）  ｈＢＳ細胞の培養方法を記載しているユーザー・マニュアルを少なくとも一つ、例えば少なくとも二つを含むキット。
【請求項５９】
ｈＢＳ細胞の培養方法が請求項３４−４９のいずれかにおいて定義されたとおりである請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
第１の構成要素として、
ｉ）  請求項３４−４９のいずれかに記載の方法によって入手できる単一ｈＢＳ細胞集団および、二つ以上または三つ以上の下記の構成要素、
ｉｉ）  ヒト支持細胞、
ｉｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、及び、
ｉｖ）  有効な培養基、
ｉｉ）−ｉｖ）  請求項２−３３のいずれかにおいて定義したとおりである、構成要素を含むキット。
【請求項６１】
単細胞集団が異種動物由来成分不含のｈＢＳ細胞株に由来し、その他の構成要素ｉｉ）−ｉｖ）の何れの一つ以上が異種動物由来成分不含である請求項５８−６０の何れかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は酵素解離により単細胞浮遊液へのヒト胚盤胞（ｈＢＳ細胞）由来の幹細胞を繁殖するための培養系および方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
伝統的に，ヒトの胚盤胞由来の幹細胞（ｈＢＳ細胞）は、ｍＥＦ（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（マウス胚線維芽細胞））の支持細胞層に保全されて、コロニー単片の転移及び手動カットによって繁殖される（ヘムセ他、国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット、Ｂｒｅｓａｇｅｎ）。この伝統的培養系は、極度に労働と時間を要するが、長期間にわたって安定及び通常状態にｈＢＳ細胞株を保全出来て、したがって、少量培養のための適切な培養系であり、従来からの好適な培養方法である。しかし、この従来培養系は多くの技術的な欠点を有する。たとえば、単片においてどれくらいの細胞が転移されているかを定量化することはほとんど不可能であり、それは後の再現性および標準化に負の影響をもたらす。この従来の培養系に基づく大量生産は、ロボットおよびバイオリアクタのようなオートメーション技術の低い互換性のために制約されており、その代わりに大量の労働時間、研究所スペースおよび器材（例えば顕微鏡）が必要となる。さらに、分類された二次培養および末端分析のための、密度勾配、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ，  細胞分類に自動化された蛍光発光）または電磁ビーズソーティングなどによる細胞分類技術および、エレクトロポレーションまたはウィルス薬品などによる細胞トランスフェクション技術は、部分細胞または細胞群から解離された単細胞においてもっとよく実行される。
【０００３】
酵素解離はしたがって、時間および労働の観点からみてより効率的なｈＢＳ細胞の培養を可能にする。さらに、継代においてｈＢＳ細胞を単細胞への解離は、これらをより正確に定量化させ、ｈＢＳ細胞用途の潜在的使用範囲を拡大させる多くの操作手順を容認させ、さらにオートメーション化の繁殖手順を容易にさせる。
【０００４】
いくつかのグループは、未遂の酵素解離を有するが、通過において単細胞懸濁液への解離によるｈＢＳ細胞の繁殖の成功例は極めて少なく、その代わりにコラゲナーゼＩＶなどを用いる通過に頼っている。それによって、特定のサイズのクラスタが得られる（Ｂｒｉｍｂｌｅ他、Ｂｒｅｓａｇｅｎ、Ｓｊｏｇｒｅｎ−Ｊａｎｓｓｏｎおよびその他）。例えば、Ｓｊｏｇｒｅｎ−Ｊａｎｓｓｏｎが非フィーダ培養系を継代している単細胞を回避における強化された粘着力および生存力を開示し、ＢｒｉｍｂｌｅおよびＢｒｅｓａｇｅｎはおよそ１０−１００細胞の細胞群サイズの使用していることを発表し、生存能力（ヒトの胚幹細胞プロトコル）に負の影響を及ぼすとして継代において単細胞への解離を回避するようにさらに推奨している。なお、他のグループは、ｈＢＳ細胞の酵素の解離に成功し、それが、細胞を酵素に適合させるために、ｈＢＳ細胞の非常に初期の継代段階または樹立の段階において細胞を酵素に露光させるためには不可欠であることもすでに理解していた（Ｃｏｗａｎ他）。それによって、ｈＢＳ細胞株だけが、最近の酵素のプロトコルに基づき樹立されたが、既存ｈＢＳ細胞（伝統的に樹立して培養された）の大多数は、酵素継代、潜在的オートメーション化の大規模の繁殖及び拡張に適用できない。さらに、継代における単細胞への酵素解離の使用において、比較的低い継代比率または分割比（１：３）だけが記録されていた（Ｃｏｗａｎ他）。それはより大規模な繁殖への培養が不可能であることを意味している。
【０００５】
継代における単細胞への酵素解離に関する上述の技術的な問題点に加えて、繁殖されたｈＢＳ細胞の品質及び安定性の問題点も開示されている。（Ｄｒａｐｅｒ他、Ｂｕｚｚａｒｄ他、ｍｌｔａｌｉｐｏｖａ，  Ｅｎｖｅｒ他，  Ａｎｄｒｅｗｓ他）
例えば、Ｄｒａｐｅｒ、Ｂｕｚｚａｒｄ及びＭｉｔａｌｉｐｏｖａは、１２および１７ｑの染色体獲得のような染色体異常の紹介を記載している。また、Ｃｏｗａｎは、明確に遺伝子の不安定性を指摘し、さらに定期的な染色体分析を提案している。ＥｎｖｅｒおよびＡｎｄｒｅｗｓは、培養適応の細胞株または試験管内適応の細胞株への転移を解説する。それは、ヒトの胎児性癌（ＥＣ）に似て来るか、または核型的後成変化および修正多分化能を呈している。ｈＢＳ細胞の酵素繁殖の間に観察されるこれらの変化はおそらく特に個体数圧力に抵抗する細胞に賛成する選択的な培養系を原因とし、それはおよそ１５−２０継代で起こり始める。
【０００６】
したがって、上述の問題点をもたらさずに、高い分割比率、即ち継代における高い細胞増殖率でも単細胞へのｈＢＳ細胞の酵素解離を可能にする培養系の開発は望ましい。このような培養系は、本発明の課題である。
【発明の概説】
【０００７】
本願発明は、長期間、例えば２０継代以上にわたって、細胞株の未分化、多能性および正常状態に影響を与えずに、各々の継代間において単細胞への酵素の解離を可能にするｈＢＳ細胞培養に非常に有効な培養環境を備える培養系を提供する。本願明細書において示された培養系の有効な環境は、単細胞継代の間の細胞により負せる選択的な圧力を補う。
本発明によって提供される培養系は、ヒトの胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞を繁殖するための培養系であり、本培養系は、
ｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２であるヒトの支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
ｉｉｉ）  有効な培養ミディアム、
を含み、本培養系は、ｈＢＳ細胞の重要な特徴を保全する拡張時間期間において各自の連続的な継代において単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離することによってｈＢＳ細胞を繁殖することを可能にする。
【０００８】
さらに、本願発明は本発明に基づく培養系におけるｈＢＳ細胞の繁殖方法を提供する。前記方法はその細胞の重要な特徴を保全しながら、ｈＢＳ細胞を培養するために次のステップを含む：
ｉ）  万能細胞株から得られたｈＢＳ細胞を培養系に適応させるために調整手順を選択的に実行し、
ｉｉ）  一つ以上の解離薬品を利用して単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を解離し、
ｉｉｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２のヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器へ分割比が少なくとも１：４の単細胞懸濁液、たとえば分割比が少なくとも１：５の単細胞懸濁液を配分し、
ｉｖ）  通常の培養基変化において、約３日乃至約２５日間にｈＢＳ細胞を培養し、
ｖ）  ステップｉｉ）をｎ回を繰り返し、ここでｎは、少なくとも１である整数である。
【０００９】
従来技術で開示されたこととは対照的に、万能細胞株培養系から本発明の培養系へ移されるときに、ｈＢＳ細胞はいずれの場合でも単に短い調整手順を必要とするだけである。さらに、本発明は、継代において単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを酵素解離することによって培養されるときに、得られたｈＢＳ細胞の品質及び低い安定性に関する上述の問題点を解決することにより、本願発明の方法によって本願発明の培養系において培養されるｈＢＳ細胞は、例えば、３０継代以上のような２０継代以上の通過において、ｈＢＳ細胞の重要な特徴が保全されながら培養されることができる。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
上記のように、本発明の主な態様は、ｈＢＳ細胞の重要な特徴を失うことなく単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を酵素解離することによりｈＢＳ細胞の繁殖を可能にする培養系に関するものである。
【００１１】
本願発明に基づくｈＢＳ細胞を繁殖するための培養系は、
ｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２のヒトの支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
ｉｉｉ）有効な培養基、を含み、
本培養系は、ｈＢＳ細胞の重要な特徴を保全する長期間において各自の連続的な継代において単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞群を解離することによってｈＢＳ細胞を繁殖できる。ｈＢＳ細胞は、２０継代以上（例えば２５継代以上、又は３０継代以上、又は３５継代以上、又は４０継代以上）に渡って本願発明に基づく培養系で繁殖され、その主な特徴を保全する。
【００１２】
本願発明のもう一つの態様はｈＢＳ細胞繁殖および後の解離のための培養システムであり、前記システムは支持細胞をＢＢＳ細胞から解離するために以下を含む：
ｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２のヒトの支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および、
ｉｉｉ）  有効な培養基、
ｉｖ）  支持細胞に混合される磁性粒子。
【００１３】
前記培養系の解離効率は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％のような少なくとも５０％であることが可能である。ここの解離効率は、適用される磁力によって引きつけられる支持細胞の総数のパーセンテージを意味する。
ここで使用されるように、「繁殖」という用語はｈＢＳ細胞、即ち、ｈＢＳ細胞の数を拡大させるために、ｈＢＳ細胞が培養されることを意味する。しかも、本願明細書に記載されている繁殖のための培養系および方法は、簡単にｈＢＳ細胞株を保全するために使われることもできる。
ここで使用されているように、用語「ｈＢＳ細胞の重要な特徴」は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの以下の特徴を表すことを目的とする：
ｉ）  有糸核分裂抑制の支持細胞における成長時の未分化状態の繁殖能を示す。及び／又は
ｉｉ）  安定染色体核型を呈する。すなわちｈＢＳ細胞の繁殖の間に異常はない。および／または、
ｉｉｉ）  インビトロおよびインビボの両方の胚葉の全ての種類の派生物に進化させるための可能性を保全する。および／または、
ｉｖ）  ＯＣＴ−４，  アルカリホスファターゼ、炭水化物エピトープＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ  １−８１および、単クローン性抗体ＧＣＴＭ−２によって認識されるケラチン硫酸塩／コンドロイチン硫酸塩細胞周囲マトリックスタンパク質ケリカンのタンパクコアから少なくとも二つの分子標識を呈する。または／および、
ｖ）  分子マーカーＳＳＥＡ−１または他の解離マーカーを呈しない。および／または、
ｖｉ）  免疫不全のマウスに注入される時に多分化能を保持し、生体内で形状奇形腫を形成する。および／または、
ｖｉｉ）  分化可能である。
【００１４】
これらの特徴は、実施例７および８にて説明されるように、あらゆる１−２０代の継代、例えばあらゆる５−１５代の継代、またはあらゆる１０代の継代において一定の間隔で分析される。
【００１５】
出発原料：
本願発明の培養系は、ｈＢＳ細胞または、本願明細書で「万能細胞株」と呼ばれているものに保全される細胞株を繁殖することに使われることが可能である。ここで使用しているように、「万能細胞株」は、継代でｈＢＳ細胞コロニーの機械解離を使用する従来の培養系において保全されるｈＢＳ細胞株の親培養菌を意味し、「万能細胞株」はまたガラス化された親培養菌も指す。
【００１６】
フィーダ：
支持細胞の緻密層は、ｈＢＳ単細胞に十分に有効な前記システムを作るために本願発明の培養系において必要であり、クラスタのｈＢＳ細胞より、周囲環境に明らかに敏感である。したがって、本願発明に基づく培養系のヒトの支持細胞の密度は，約５０，０００細胞／ｃｍ２から約５００，０００細胞／ｃｍ２であり、例えば、約５０，０００細胞／ｃｍ２から約４００，０００細胞／ｃｍ２、約５０，０００細胞／ｃｍ２からの約３００，０００細胞／ｃｍ２まで、約５０，０００細胞／ｃｍ２から約２００，０００細胞／ｃｍ２まで、約６０，０００細胞／ｃｍ２から約２００，０００細胞／ｃｍ２まで、約７０，０００細胞／ｃｍ２から約２００，０００細胞／ｃｍ２までである。通常、支持細胞はｈＢＳ細胞が接種される前に培養容器に約１日から約１０日間、例えば、約１日から５日間、約２日から４日間接種される。選択的に、培養基はｈＢＳ細胞が接種される前に少なくとも１回、例えば少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回変化することが可能である。
【００１７】
本発明の培養系に用いられる適切なヒトの支持細胞は、ヒトの組織に由来することができ、または、それらはｈＢＳ細胞またはｈＢＳ細胞から由来する細胞などの試験管内で引き出されることができる。
【００１８】
ヒトの支持細胞が引き出されるヒトの組織は胚、胎児、新生児、少年または成体組織を含み、それは包皮、臍のコード、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは胸部を含む皮膚に由来する組織を更に含む。ヒトの支持細胞は、ヒトの線維芽細胞株維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および上皮細胞からなる群に関連する細胞タイプに由来することができる。ヒトの支持細胞を誘導するために使われる特定の細胞タイプの実施例は、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児の線維芽細胞および／または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮細胞、臍のコード間葉細胞、胎盤の線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出産後のヒトの包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成体皮膚線維芽細胞および／または線維細胞、成体筋細胞、成体卵管内皮細胞、成体腺子宮内膜細胞、成体間質子宮内膜細胞、成体乳ガン実質細胞、成体内皮細胞、成体上皮細胞または成体ケラチン生成細胞などを含む。
【００１９】
ヒトの支持細胞がｈＢＳ細胞に由来するときに、ｈＢＳ細胞に由来する細胞は線維芽細胞であってもよくて、または間充織表現型を有する。
【００２０】
本願発明の特定の実施例において、ヒトの支持細胞は線維芽細胞であり、好ましくはヒトの新生児包皮線維芽細胞から由来する。ヒトの包皮線維芽細胞支持細胞株は、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコの修正されたイーグルのミディアム）または、ＦＢＳまたはヒト血清のような哺乳類の血清、または血清代替物と１％のＰＥＳＴ（ｖ／ｖ）で補充されるＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）などのベース培養基を含んでいる培養容器に割礼を行われた男の赤ちゃんからの皮膚サンプルを配置することによって、樹立される。培養基は好ましくはヒトの１０％の（ｖ／ｖ）血清および１％の（ｖ／ｖ）ＰＥＳＴで補充されるＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。細胞の融合性単層は、約５日から約３０日後に得られる。支持細胞は、約２日から約１０日間、例えば、約４日から約９日間、約５日から８日間、酵素解離に継代されてもよく、例えばＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）などの解離薬品を使用する。細胞樹立の後、フィーダはそれらの健康を確実にするためにヒト病原体の適切な選択として検査されることができる。具体的には、下記の実施例３にて説明されるように、ヒトの包皮線維芽細胞の支持細胞株が得られる。
【００２１】
もう一つの実施例では、本発明の培養系において使用される支持細胞は、市販の支持細胞、例えばｈＦＦ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＣＲＬ−２４２９  ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）または、ヒト胎児線維芽細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＣＣＬ−１１０  ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）でもよい。
【００２２】
本発明において使用される支持細胞は、更に不死化または遺伝子組み替えられている。支持細胞の不死化は、培養により理論的に不特定な数へ成長する能力の獲得を意味する。そうするにはいくつかの方法があり、１つの方法は、例えばウイルス（レトロ・ウイルス）を有する細胞を転移することであり、および／または、テロメラーゼ後退転写酵素タンパク質（ＴＥＲＴ）の発現による。ＴＥＲＴは大部分の細胞において不活発である。しかし、ｈＴＥＲＴが外から発現されるときに、細胞は反復可能な老齢を避けるのに十分なテロメアの長さを保つことが可能である。
【００２３】
さらに、細胞タイプのうちのいずれの１つも、すなわち支持細胞またはｈＢＳ細胞は、磁力を適用することによって混合細胞集団の解離を許すために磁気的に修正されることができる。本発明の好適な実施例では、本発明において使用される支持細胞は磁気的に修正される。支持細胞の磁気修正は、細胞集団を磁性粒子に感光させることよって実行されることができる。それは、例えばエレクトロポレーション、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシス（ｆａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）等のいくつかの手段によって細胞に混合されることができる。
【００２４】
加えて、支持細胞は、ゲノムに混合される特定の遺伝子を有する遺伝子組み替えでもよい。これらの遺伝子は、重要なマーカー、またはｈＢＳ細胞に有益な公知の生体分子例えばｂＦＧＦ（基本的な線維芽細胞成長因子）のような成長因子の合成のためにコードすることができる。これらの遺伝子変更態様は、さらに支持細胞のアポトーシスを誘導することができ、それは、支持細胞の誘導除去を可能にする。
【００２５】
本発明の培養系において使用されるヒトの支持細胞は、成長抑制されるが、それは支持細胞が、ｈＢＳ細胞より大きくなることを防ぐために比較的固定数の支持細胞を保全するためである。ヒトの支持細胞の成長不活化は、細胞を細胞分裂阻止性の薬品、例えばマイトマイシン（例えば周知の方法または、下記の実施例１および４において実行される通りによれば）で処理することによって実行される。または、ヒトの支持細胞は、細胞を例えば周知の方法に基づくと細胞周期停止を引き起こすのに十分なγ照射に当たらせることによって無機能化させてもよい。
【００２６】
支持細胞の成長活性化の前に、それらは支持細胞の特定細胞種類を支援する培養基で培養されることができる。支持細胞がヒト線維芽細胞であるときに、培養基はダルベッコの修正されたイーグルの媒体（ＤＭＥＭ）、ヒト血清またはＦＢＳのような哺乳類の血清で補充されるイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培養基（ＩＭＤＭ）、または更にＰＥＳＴで補充される血清代替物からなる群から選択されることができる。フィーダは、培養容器内において直接接種されることができるかまたは培養容器内の基質成分上へ接種されることができる。培地は、例えばＦＲＳまたは、濃度が約５から約２０％ｖ／ｖまたは１０％ｖ／ｖのような約１から約４０％ｖ／ｖのヒト血清のような血清、および／または例えばペニシリンおよびストレプトマイシンのような一つ以上の抗生物質で補充されることができる。特定の実施形態において、培養基は、濃度が約０．１％から約１０％ｖ／ｖまで、約０．５％から約２％ｖ／ｖまで、または好ましくは１％ｖ／ｖのペニシリン・ストレプトマイシンで補充される。支持細胞は、比例が１：２から１：１０の範囲，  １：２から１：８の範囲のような１：２から１：２０の範囲における一つ以上の解離薬品を用いて、例えば、約３日から約１０日間、約４日から約１０日間、例えば７日ごとのように約２日から約２１日間までの間隔で培養基に継代される。およそ２から１０継代、例えば３から１０継代の後に支持細胞は、上記の通りに成長抑制化される。
【００２７】
成長不活性化の後、細胞は培養容器に接種されることができ、以下のセクションに記述されるようにｈＢＳ細胞を支える培養基のなかで適切なマトリクス材料で被覆される。適切なマトリクス材料の実施例は、組み換えヒトフィブロネクチン、ヒトの胎盤細胞外マトリックスまたは組み換えヒトゼラチンのようなゼラチンを含むことができる。ゼラチンの適切な濃度は、約０．１％ｗ／ｖである。支持細胞は、濃度が約５０，０００〜約５００，０００細胞／ｃｍ２範囲、例えば、約６０，０００〜約２００，０００細胞／ｃｍ２、または約７０，０００〜約１００，０００の細胞／ｃｍ２において接種される。理想的には、支持細胞は、例えば２から１０継代まで、例えば３から８継代までの継代支持細胞として使われる。具体的には、支持細胞は、下記の実施例１および３にて説明されたように、培養されることができる。
【００２８】
本願発明の特定の実施例において、支持細胞は異種動物由来成分不含の支持細胞である。すなわち、それらは、直接または間接的に、ヒト以外の動物起源の材料（例えば細胞、組織、体液およびそれらの派生物）を投与されてない。実施例３および４は、共にヒトの包皮線維芽支持細胞の異種動物由来成分不含の細胞株の樹立および培養を記載する。
【００２９】
解離薬品：
本発明はｈＢＳ細胞コロニーが継代で単細胞懸濁液へ解離されることができる培養系に関するものである。ここで使用しているように、「単細胞懸濁液」は例えば本質的に１０％未満の単細胞から成るｈＢＳ細胞（例えば８％未満、６％未満、４％未満、２％未満）の懸濁を意味することを目的とし、または、１％未満の細胞実体はクラスタであってもよい。残留するいかなるクラスタは細胞濾過器を用いて任意に取り除かれることができる。細胞濾過器は孔サイズ有するメッシュとして機能し、それによりクラスタが集められ、単細胞が通される。上記において言及されるように、これは単細胞状況が粗いので重要な手順であり、それは、細胞生存、生存細胞の安定性および品質に関して複雑化を意味する。
【００３０】
本発明の培養系に関連して使われるときに、一つ以上の解離薬品は酵素、キレート試薬または一つ以上の酵素および／または一つ以上のキレート試薬の組合せであってもよい。したがって、１つ以上の解離薬品は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの解離薬品の組合せであってもよい。
【００３１】
本発明の培養系の使用に適する酵素は、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素（例えばトリプシン、トリプシン様、ディスパーゼ、ディスパーゼ様、プロナーゼ、プロナーゼ様、コラゲナーゼ、コラゲナーゼ様およびマトリックス・メタロプロテイナーゼ）などを含むことができる。特に適切な酵素は、組み換え酵素であってもよい。
【００３２】
適切なキレート試薬は、二価陽イオン（例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸）、ＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸））のキレート化剤であってもよい。
【００３３】
ステップｉｉ）のｈＢＳ細胞コロニーの解離において、破壊細胞から放出されるＤＮＡによって引き起される凝集を妨げるために、１つ以上の解離薬品に加えてＤＮＡ’ｓｅが加えられることができる。
【００３４】
解離薬品の組合せは、特に本発明の培養系ための使用に適切である。実施例は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロゲン）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ケミコン）およびＡｃｃｕｍａｘ（商標）（ケミコン）である。ＴｒｙｐＬＥ（商標）選択物（Ｓｅｌｅｃｔ）は、組み換えトリプシン様酵素およびＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含み、動物成分を含まない。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、タンパク質分解作用及びコラーゲン分解作用とＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含み、非哺乳類又はバクテリア由来の構成要素を含まない。構成要素Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）に加えて、ＤＮＡ’ｓｅ作用を更に含む。
【００３５】
さらに、一つ以上の解離薬品またはその組合せは異種動物由来成分不含である。すなわち、それらは、直接または間接的に、ヒト以外の動物起源の材料（例えば細胞、組織、体液およびそれらの派生物）が投与されない。
【００３６】
培養基：
本発明の培養系の使用に適する培養基は、ｈＢＳ細胞の成長に非常に有効とならなければならない。適切な培養基は、完全に周知の組成物を有する合成培地であってもよい。適切な支持培養基は、補充されたベース・メディア（例えばＯＭＥＭまたはＩＭＤＭ）を含む。有効な培養基は、以下の構成要素の一つ以上により補充されることができる：哺乳類の血清、例えば、ＦＢＳまたはヒトの血清、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）血清代替物、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノールおよびｈｒｂＦＧＦ（ヒトの組み換え塩基性線維芽細胞成長因子）。
【００３７】
また、他の培養基も、本発明において使われることができる。この種の培養基は、塩、ビタミン、エネルギー源（例えばブドウ糖）、ミネラルおよびアミノ酸を含むことができる。培養基に加えられる適切な成長因子は、例えば、ＧＡＢＡ、ピペコリン酸、塩化リチウムおよび形質転換成長因子β受容体（ＴＧＦβ）およびｂＦＧＦである。さらに、この種の培養基は、化学的に定められることができる。
【００３８】
培養基はまた、条件付きの培養基であってもよく、即ち、それはｈＢＳ細胞を繁殖するための培養基として使われる前に支持細胞（例えばヒトの支持細胞）と接触される。条件付きの培養基は因子を含み、それは支持細胞から放出されており、従ってそれはｈＢＳ細胞繁殖において無条件培養基より有効である。さらに、培養基は異種動物由来成分不含でもよい。それは、培養されたｈＢＳ細胞がいかなる医療応用及び臨床標準のために使われる場合に特に関連がある。
【００３９】
有効な培養基は、血清（例えばＦＢＳまたはヒトの血清）または血清代替品（例えばＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物、）で補充されることができる。有効な培養基は、約１％から約４０％血清、たとえば約５％から約２０％血清、１０％血清に補充されることができる。
【００４０】
有効な培養基は重要なｈＢＳ細胞特徴を保全するグループから選択される一つ以上の成長因子で補充されることができる。それはＥＧＦ（上皮細胞繁殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、神経栄養因子、線維芽細胞成長因子（例えば酸性ＦＧＦおよび／または塩基性線維芽細胞成長繁殖因子（ｂＦＧＦ））からなり、好ましくはヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長繁殖因子（ｈｒｂＦＧＦ）である。一実施例において、有効な培養基は、適切な濃度のｈｒｂＦＧＦで補充される。ｈｒｂＦＧＦの適切な濃度は、約０．５〜約１０００ｎｇ／ｍｌ範囲内のｈｒｂＦＧＦ、例えば約１から約５００ｎｇ／ｍｌ範囲のｈｒｂＦＧＦ、約２から約２００ｎｇ／ｍｌ又は約４から約１００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦである。
【００４１】
以下において、４つの適切な培養基が記載されている。しかし、液体状態においてｈＢＳ細胞に栄養的な成分を提供する限りその他の培養基も使用されることが可能である。すなわち、微量元素のような無機成分および、例えばアミノ酸、塩、ビタミン、エネルギー・プロバイダ、砂糖を含んでいる炭水化物などの有機成分である。
【００４２】
本発明で使用される１つの適切な培養基は、少なくとも４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基である。
【００４３】
本発明で使われるもう一つの適切な培養基は、ＤＭＥＭまたは他の基本培地、例えば、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ変法イーグル培地、補充された２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）血清代替品及び各自の最終濃度における下記の成分である：５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０，１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕＭのβ−メルカプトエタノール、少なくとも４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ。
【００４４】
本発明で使われるさらにもう一つの適切な培養基（ｈＢＳ細胞基）は、次のように構成される；ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ変法イーグル培地、補充された２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）血清代替品及び各自の最終濃度における下記の成分：
５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０，１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノール及び４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦにさらに補充された培養基。
【００４５】
本発明において使用されるのに適切なさらに別の培養基は異種動物由来成分不含の培養基であり、ｈＢＳ細胞の繁殖に適している培養基を含む。１つの適切な基本培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。しかし、他の培養基も同様に効果を有する。異種動物由来成分不含の基本培地に加えて、異種動物由来成分不含の培養基はヒトの血清、ｈｒｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミンまたはグルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）、非必須アミノ酸、３−メルカプトエタノール、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシンから構成される。異種動物由来成分不含の培養基のヒト血清の濃度は、好ましくは、約１％ｖ／ｖから約３０％ｖ／ｖヒト血清、約１０％ｖ／ｖから約３０％ｖ／ｖヒト血清、約１５％ｖ／ｖから約２５％ｖ／ｖヒト血清であり、２０％のｖ／ｖヒト血清がさらに好ましい。異種動物由来成分不含の培養基のヒト血清の濃度は、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、例えば約５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、約５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、例えば少なくとも４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦである約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦである。異種動物由来成分不含の培養基のグルタマクス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（登録商標）は、好ましくは約０．５ｍＭから約２０ｍＭまでであり、例えば約０．７５ｍＭから約１０ｍＭまで、約１ｍＭから約１０ｍＭまで、約１ｍＭから約１０ｍＭまで、例えば２ｍＭである。異種動物由来成分不含の培養基の非必須アミノ酸の濃度は、好ましくは約０．０１ｍＭから約１ｍＭまでであり、例えば、約０．０３ｍＭから約０．８ｍＭまで、約０．０５ｍＭから約０．６ｍＭまで、約０．０７ｍＭから約０．４ｍＭまで、約０．０９ｍＭから約０．２ｍＭまで、たとえば０．１ｍＭである。異種動物由来成分不含の培養基におけるベータ−メルカプトエタノールの濃度は、好ましくは１０μＭから約２００μＭまで、例えば約２５μＭから約１７５μＭまで、約５０μＭから約１５０μＭまで、７５μＭから１２５μＭまで、たとえば１００μＭである。異種動物由来成分不含の培養基におけるペニシリンの濃度は、好ましくは約５単位／ｍｌから約２００の単位／ｍｌまで、例えば、約１０単位／ｍｌから約１５０単位／ｍｌまでであり、約２５単位／ｍｌから１００単位／ｍｌ、約２５単位／ｍｌから約７５単位／ｍｌまで、例えば５０単位／ｍｌである。異種動物由来成分不含の培養基のストレプトマイシンの濃度は好ましくは、約５μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌまでであり、約１０μｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌまで、約２５μｇ／ｍｌから７５μｇ／ｍｌまで、例えば約５０μｇ／ｍｌである。特定の実施例において、培養基は１−３０％ｖ／ｖヒト血清および２−１００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦで補充されるＤＭＥＭである。別の実施例において、基本培地は、２０％ｖ／ｖヒト血清を含む。もう一つの実施例で、基本培地は、少なくとも４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦを含む。
【００４６】
上述の異種動物由来成分不含の培養基に用いられる優良なヒト血清は、我々の研究所において繰り返し生産されてきた。血液は、病院の血液センターで、多くの標準の病原体を見つけるため検査された（Ｂ型肝炎、Ｃ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶおよび梅毒）。したがって、異種動物由来成分不含の培養基で使用されるヒトの血清は、好ましくは次の工程によって調合される：
１）  健康なヒトの血液を非ヘパリンの被覆袋に収集する。
２）  非ヘパリンの被覆袋を約０．５から約５時間、たとえば約０．５から約２時間揺り動かす。
３）  非ヘパリンの被覆袋を少なくとも１０時間、最高で５０℃の温度で培養する。
４）  凝結品質、例えば非凝固のフィブリンの欠如、液体の不透明度に基づく任意的な選択。
５）  血清を凝固された材料から解離する。
６）  血清を除菌する。
７）  少なくとも１５人の提供者から血清をプールする。
８）  使用の前に血清を凍らせる。
【００４７】
好適な培養系：
本発明に係る好適な実施例において、培養系は、
ｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２のヒトの新生児包皮支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するためのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、および
ｉｉｉ）  ４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦに補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、
を含み、ｈＢＳ細胞の重要な特徴を保全すると共に、培養系は、各自の延長される連続的な継代において単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離することによってｈＢＳ細胞を繁殖可能である。
【００４８】
（ｈＢＳ細胞の繁殖方法）
その他の重要な態様において、本発明は上記の培養系におけるｈＢＳ細胞を繁殖する方法に関連する。そして、細胞の重要な特徴を保全すると共に、ｈ８Ｓ細胞を培養するために、方法は次のステップを含む：
ｉ）  万能細胞株から得られたｈＢＳ細胞が培養系に適応するための調整処置を選択的に実行する。
ｉｉ）  一つ以上の解離薬品を使用して単細胞懸濁液にｈＢＳ細胞を解離する。
ｉｉｉ）  少なくとも密度が５００００細胞／ｃｍ２のヒトの支持細胞を含む一つ以上の培養容器へ、例えば１：５のような、少なくとも１：４の分割比の単細胞懸濁液を配分する。
ｉｖ）  通常の培養基において約３〜約２５日間ｈＢＳ細胞を培養する。
ｖ）  ステップｉｉ）からｎ回を繰り返し、そこにおいて、ｎは少なくとも１の整数である。
【００４９】
この方法によって提供される利点のうちの１つはｈＢＳ細胞の重要な特徴を保全しながら単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを酵素解離することによってｈＢＳ細胞の重複継代が可能になる。したがって、ｎは少なくとも５であり、例えば少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０である。ステップｉｉ）を繰り返す前に、すなわちｈＢＳ細胞を継代させる前に、ＢＳ細胞の重要な特徴が保全されているかを調べるために、前記方法はさらに、次のステップを含む。
ｖｉ）  ステップｉｖ）において得られた細胞を分析することが可能である。
ｖｉｉ）  ｈＢＳ細胞の重要な特徴が保全される場合、ステップｉｉ）から繰り返す。
【００５０】
解離手順：
ｈＢＳ細胞コロニーを一つ以上の解離薬品で処理することによって、ステップｉｉ）における単細胞懸濁液へのｈＢＳ細胞の解離が実行されることができる。使用された培養基を除去した後、ｈＢＳ細胞コロニーはＰＢＳで洗われることができる。それはカルシウムおよびマグネシウムにより劣化され得る。一つ以上の解離薬品がコロニーに加えられ、適切な期間内、すなわちｈＢＳ細胞がフィーダ層からかき集め始める期間まで、例えば３７℃のような適切な温度により効果を発揮される。一つ以上の解離薬品が一つ以上の酵素を含む場合に、酵素活性範囲の好ましい量は約１０単位／ｍＬから約５０００単位／ｍＬ、たとえば約１００単位／ｍＬから約５００単位／ｍＬである。培養の後、ピペットを有する重複粉砕が実行され、それはｈＢＳ単細胞を得るために細胞シートを粉砕する際の１つ以上の解離薬品を援助するためである。１つ以上の解離薬品の存在がステップｉｉｉ）においてヒトフィーダ細胞上へ接種されるコロニーを形成するｈＢＳ細胞の性能に影響を及ぼすことがあるので、１つ以上の解離薬品の効果は、ステップｉｉｉ）の前に減弱させられる。１つ以上の解離薬品の効果は、例えばｈＢＳ細胞を一つ以上の解離薬品からの解離、１つ以上の解離薬品の希弱化、１つ以上の解離薬品に一つ以上の抑制剤の追加または過度の１つ以上の解離薬品へ一つ以上の培養基を追加するための遠心解離、濾過または沈殿のような物理的な除去によって減弱させることができる。あるいは、一つ以上の解離薬品は、自動抑制ができてもよく、すなわち、それらは特定の時間の後、自身の機能を低下させる固有の能力を有してもよく、例えばＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（商標）の場合である。１つ以上の解離薬品の除去の後、ｈＢＳ細胞の単一の細胞懸濁を得るために、得られたｈＢＳ単細胞は、本発明による有効な培養基の中で再懸濁される。
【００５１】
分割比：
上記方法のステップｉｉｉ）において、単細胞懸濁液の中のｈＢＳ細胞は上記のように準備されたヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器の中へ分散され、すなわち、ｈＢＳ細胞は、支持細胞に接種される。この接種の重要な特徴は、本方法および培養系がｈＢＳ細胞を例えば少なくとも１：４の分割比のような少なくとも１：５の分割比に分散させ、それはｈＢＳ細胞がステップｉｉ）の前に解離された面積より５倍大きいフィーダ細胞の面積上に分配されることを意味する。特定の分割比を選択するための基準は、密集度、成長率および、解離後の細胞計数および形態的点検に基づく培養容器内のｈＢＳ細胞コロニーの均質性に基づく。上記の基準、より高い分割比は安定性およびｈＢＳ細胞の品質に損害を与えることはなく、ｈＢＳ細胞数の繁殖が達成可能である。適切な分割比は、約１：４または約１：５から１：５０００の範囲内であり、例えば１：２０から１：１０００、１：５０から１：５００の範囲内である。ここにおいて、しばしば使用される分割比は、約１：２０である。
【００５２】
培養：
特定の分割比でｈＢＳ細胞を接種した後に、細胞は湿っぽい空気（すなわち好ましくは約９５％の湿度）の中で、約３７℃の気温で、約３日〜約２５日間、例えば、約４日〜約２０日間、または約６日〜約１２日間培養される。ステップｉｖ）の培養期間中、培養基は１週間に約１から１４回、例えば、１週間に２回から４回、１週間に３回である一定の間隔で変えられる。
【００５３】
調整手順：
単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを酵素解離するために、本願発明の重要な要素は、圧力と関連するｈＢＳ細胞のための大きな変化、潜在的低い粘着力および低い繁殖、自然発生の分化、さらに、潜在的な細胞死であり、それらを一つ以上の継代においてより穏やかな条件に適合させることによってｈＢＳ細胞を本願発明の培養系に適合させるのに必要である。穏やかな条件は、より小さい分割比および培養方法で定められたより長い培養時間を意味する。したがって、本発明の調整手順は、次のステップから成る：
ａ）  一つ以上の解離薬品を用いて単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離する。
ｂ）  少なくとも１：３の分割比の単細胞懸濁液を密度が少なくとも５０，０００の細胞／ｃｍ２であるヒトの支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分散させる。
ｃ）  規則的な時間間隔で培養基を変えながらｈＢＳ細胞を約５日から約３０日間、例えば約７日から約１６日間、または約７日から約１０日間培養する。
ｄ）  均一な未分化のｈＢＳ細胞コロニーを得るために、任意に、ステップａ）を最大５回繰り返す。均一なコロニーは、細胞密度を有するコロニーが蓄積構造のない面積にわたっていることを意味する。
【００５４】
ステップａ）の解離およびステップｃ）の培養基の変化は、上記方法のステップｉｉ）およびステップｉｖ）の解離として本質的に実行される。
【００５５】
本願発明によって提供される利点の１つは、必要な調整手順が（必要であれば）短く、例えば国際公開第０３／０５５９９２号パンフレットによって樹立、培養されるような既存のｈＢＳ細胞株により実行されることができる。したがって、ステップｄ）が含まれる場合、５回以内、たとえば、４回、３回、２回以内に実行される。
【００５６】
本発明の好ましい実施例において、上記の培養系でｈＢＳ細胞を繁殖する方法は以下の内容を含む：
ｉ）  以下のステップを含んでいる調整処置を実行する。
ａ）  一つ以上の解離薬品を用いて単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離する。
ｂ）  少なくとも密度が５０，０００細胞／ｃｍ２のヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：３の単細胞懸濁液を配分する。
ｃ）  一定時間ごとの培養基の変化において、約５日から約３０日間、たとえば７日から１６日間又は７日から１０日間、ｈＢＳ細胞を培養する。
ｄ）  均一的な未分化のｈＢＳ細胞コロニーを得るために、ステップａ）から多くとも５回を繰り返す。
ｉｉ）  例えば、一つ以上の解離薬品、例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔの使用によって単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を解離する。
ｉｉｉ）  少なくとも密度が５０，０００細胞／ｃｍ２のヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：４、例えば１：５のような単細胞懸濁液を配分する。
ｉｖ）  一定時間ごとの培養基の変化において、約３日から約２５日間ｈＢＳ細胞を培養する。
ｖ）  この種の細胞の重要な特徴を保全すると共に、ｈＢＳ細胞を繁殖するために、ステップｉｉ）から少なくとも２０回を繰り返す。
【００５７】
解離：
本発明に基づく支持細胞およびｈＢＳ細胞の各自解離の適切な方法は、次の工程を含むことができる：
ｉ）  接種の前に磁気的に修復された支持細胞を得るために磁性粒子に支持細胞を感光させる。
ｉｉ）  任意の培養基の変化後に、１日以上磁気的に修正された支持細胞上にｈＢＳ細胞を接種、培養する。
ｉｉｉ）  支持細胞の混合細胞集団およびｈＢＳ細胞を培養容器から解離し、一つ以上の解離薬品、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔの使用により前記細胞集団を単細胞懸濁液へ解離する。そして、
ｉｖ）  磁力を用いて、支持細胞をｈＢＳ細胞から解離する。
【００５８】
前記方法の解離効率は、少なくとも５０％であり、たとえば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％である。そこにおいて、解離効率は、印加される磁力によって引きつけられる支持細胞の総数のパーセンテージを意味する。
【００５９】
重要な特徴の分析：
本発明によって得られるｈＢＳ細胞がｈＢＳ細胞の重要な特徴を保全するかどうかを調べるために、セルアーティス（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ）社のｈＢＳＣ株ＳＡ００１およびＳＡ１２１は、本発明の培養系へ転移され、本発明の方法に基づいて連続的に２０−４０継代培養される。２０継代において、ｈＢＳ細胞は、完全に特徴づけられる。個々の細胞形態およびコロニー形態は、ｈＢＳ細胞及びそのコロニーの通常の形態（図１）が顕微鏡的に明かして評価される。マーカー発現は、免疫組織化学／組織化学（Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−１）（実施例７、図２および図５）を使用しているタンパク質表現レベルで分析された。染色体分析およびＦＩＳＨ分析によって実行された遺伝子の特徴描写は２０継代以上に保全される核型を表す（実施例８、図３および図５）。多分化能は、２０を超える継代（実施例９、図４および図５）の後に多能性未分化されるｈＢＳ細胞を表すＳＣＩＤマウスの奇形腫の形成によって、本発明によって得られるｈＢＳ細胞のために評価される。
【００６０】
本願発明によって培養されるｈＢＳ細胞の追加的特徴の実施例は、例えば異なる培養の組合せ、または支持種類および密度、解離薬品、解離薬品に対する感光時間のようなパラメータにおいて、接種される単細胞の等価数のコロニー形成分析の実行のような栄養系の生存分析であってもよい。本発明において識別される２つの重要なパラメータは以下である：
ｉ）  形成されるコロニーの数に対して重要な解離薬品の選択、および
ｉｉ）  形成されるコロニーの未分化に関する品質に重要なシード種類の選択である。分化の等級は、形態顕微鏡によって順番に分析され、周知の未分化及び実分化マーカーに表現されるマーカー発現分析に潜在的に関連づける。
【００６１】
幹細胞および胚盤胞から派生した幹細胞は、酵素テロメラーゼ活性の特徴を有し、テロメラーゼＰＣＲエリサ・キット（ロシュ）を用いて検出可能である。キットは、免疫吸収剤分析（ＥＬＩＳＡ）を連結した酵素を有する検出及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による製品の拡大によってテロメラーゼの内部活動を使用する。テロメラーゼ活性化は、ＱＰＣＲで測定される。
【００６２】
本発明における細胞の分化状態は、特定の遺伝子のＱＰＣＲによってさらに試験される。これがどのように実行されるかは以下に記載されている：
未分化又は分化されたｈＢＳ細胞コロニーは全コロニーとして自動的に培養プレートから解離されることができて、ＰＢＳで洗浄され、−８０℃で保管される。ＲＮＡは製造業者の指示に従い、例えばＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ・キットを使用して、更に抽出されることができる。逆転写は、適切なキット、例えばＲｏｔｏｒｇｅｎｅ  ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）内で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  キットを用いて実行され（製造業者の指示に従って）、適切な条件の下でＱＰＣＲが実行される。全ての遺伝子は、同じ種類に定量化可能であり、可能であれば、いくつかのサンプルの分化状態は、遺伝マーカーに基づく個々のサンプルの算出数学的インデックスによって比較される。（より詳細なプロトコルは、国際公開第２００６／０９４７９８号パンフレットに記載されている。）
【００６３】
本願明細書において使用される個々の構成要素、例えば支持細胞、培養基および使用前の胚盤胞、本願発明によって培養されるｈＢＳ細胞株は、ヒト免疫欠乏症ウイルスタイプ１および２、肝炎ＢおよびＣ、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルスタイプ１および２、イプシュタイン−バーウイルスおよびヒト乳頭腫ウイルスのようなヒト病原体のために検査される。ヒト病原体の非存在は、ｈＢＳ細胞株、分化細胞またはこの種の細胞株から由来のその他の生物材料のあらゆる臨床応用において重要である。
【００６４】
（本発明の更なる態様）
下に記載されている本発明の更なる態様において、上の主態様で議論される詳細および特徴は準用される。
【００６５】
更なる手順：
本発明によって得られたｈＢＳ細胞は、操作および／またはｈＢＳ細胞分析のために更なる工程を受ける。例えば、本発明によって得られるｈＢＳ細胞株は、分化細胞の準備のために使われることができる。さらに、発明のｈＢＳ細胞または細胞株は、凍結融解を受けることができる。特定の実施例において、本発明において得られたｈＢＳ細胞株は、凍結されることが可能で、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓの国際公開第２００４／０９８２８５号パンフレットによってすでに示されるガラス化方法によって融解されることも可能である。ｈＢＳ細胞培養の均質性を増やすために、本発明において得られる細胞は、国際公開第２００５／０５９１１６号パンフレットにて説明したように、クローン由来の対象になり得る。また、本願発明に基づいて得られたｈＢＳ細胞は国際公開第２００４／０９９３９４号パンフレットにて説明したように、無支持培養系へ転換することが可能である。出願人によって他の場所で記載されているｈＥＳ細胞の分化状態を判定するためのＱＰＣＲ方法は、本発明で得られた例えばｈＢＳ細胞、または例えば本発明によって得られる細胞の誘導体に使用されることが可能であり、細胞分化手順に従う。このパラグラフにおいて参照される特許出願は、参照として援用される。
【００６６】
本発明によって可能になる継代での単細胞へのｈＢＳ細胞コロニーの解離は、既存の培養系及び方法に対していくつかの利点を提供する。以下において、本願発明によって得られるｈＢＳ細胞が特に適切のいくつかのアプリケーションは、更なる利点及び本発明によって提供される改良を強調するために概説される。
【００６７】
本願発明は本発明によって可能にされる大きい分割比により既存培養系及び方法と比較してｈＢＳ細胞の繁殖を容易にし、そして、既存の方法と比較してより高いｈＢＳ細胞数の繁殖度を可能にする。これは、本発明が、ｈＢＳ細胞の繁殖の改善可能性を提供することを意味する。取得する単細胞懸濁液の継代における組合せおよび、本発明によって可能になる高い分割比は、ｈＢＳ細胞の大量可能な生産を可能にし、さらに、自動化も可能にする。
【００６８】
したがって、大量可能な製造は、発明手順の完全的または部分的自動化によって成し遂げることができ、時間およびコストを抑えることが可能なｈＢＳ細胞培養系及び方法を提供する。したがって、本願発明の実施例の一つはここで開示されるｈＢＳ細胞の繁殖方法および／または培養系を用いるｈＢＳ細胞の大量製造に関連する。本発明の本実施例において使用される一つ以上の解離薬品は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（商標）の少なくとも一つを含むことが可能である。本願発明の別の実施例はｈＢＳ細胞の大量的製造のためのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）および／またはＡｃｃｕｍａｘ（商標）の応用である。拡大された培養系のためのｈＢＳ細胞の製造および操作は、バルク培養、例えばｍｕｌｔｉｗｅｌｌプレート、多層フラスコおよびバイオリアクタ・モジュールのための新しい培養系を使用することができる。本願培養系による、ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌフォーマット・プレート、多層フラスコまたはバイオリアクタ・モジュールに由来するｈＢＳ細胞の調整、治療および分析は、手動選択または極微操作を不要とし、ロボット化により自動化、規模化が可能である。適切なロボットは、液体操作ステーションのような培養容器へまたは培養容器からのピペット操作を可能にするＸＹＺ分配ヘッドに基づくことが可能で、培養容器とピペットハンドリングとの間において、ヒトの動きを模倣するロボット腕に基づくことも可能である。例えば温度、栄養分供給、ｐＨ、圧力、剪断力および酵素のようなロボット・システム環境パラメータの範囲内で最適限度の範囲内で保全されなければならない。
【００６９】
本発明によって得られた単細胞懸濁液の単細胞としてのｈＢＳ細胞の達成は、例えば、血球計算器、フローサイトメータ（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）計算器，  核酸塩計算器のような周知の細胞定量化装置および手順を使用してｈＢＳ細胞の正確な定量化を可能にする。この種の定量化は、ｈＢＳ細胞が受ける手順の全タイプの標準化および改善を可能にするために重要である。
【００７０】
さらに、継代における単細胞としてのｈＢＳ細胞を有することは、これらが異なる細胞解離または細胞分類の公知技術を適用可能を意味し、その技術は、例えば支持細胞の残留からｈＢＳ細胞を解離するためである密度勾配メディア、クロマトグラフィに基づく抗体、または抗体がコーティングされた磁気ビーズなどである。あるいは、ステップｉｉ）において得られるｈＢＳ細胞の単細胞懸濁は、その他の選別技術を応用可能であり、その技術は、例えば非トランスフェクトｈＢＳ細胞からトランスフェクトｈＢＳ細胞を分別するためのＦＡＣＳ（蛍光自動化細胞選別）又は磁気ビーズ・ソート、密度勾配遠心解離、（類似性）クロマトグラフィ解離などである。
【００７１】
本発明において記載、生成されるｈＢＳ細胞の細胞溶液は、ｈＢＳ細胞株からユニークな特徴を有するクローンを生成するために、希薄クローニングを制限するための良い原点になり得る。
【００７２】
しかも、更に本発明によって培養されるｈＢＳ細胞の応用を容易にするために、ｈＢＳ細胞は、支持細胞から解離されることができる。以下では、他の方法に対して範囲を制限する意図のない解離方法が記載されている。
【００７３】
支持細胞からｈＢＳ細胞を解離する一つの潜在的方法は、１つの細胞タイプに小さい鉄粒子の編入を可能にする。この種の編入は、例えばエンドサイトーシスまたはｆａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、またはエレクトロポレーションによって自発的に実行されることができる。細胞は、接種の前に培養基懸濁液の鉄粒子に感光させる。鉄粒子に感光できる支持細胞は、鉄粒子に感光させる前にマイトマイシンＣで処理されるかまたは代わりに有糸分裂的に抑制されるでもよい。鉄粒子は、何種類またはブランドのものでもよい。それらはさらに、Ｆｅ２＋イオンまたはＦｅ３＋イオンまたはそれの混合物でも良い。本願発明の一つの実施例において、Ｅｎｄｏｒｅｍ（商標）が使われる。鉄粒子は、直径が１．０ナノメートルから５０ナノメートルまでの寸法を有することができ、例えば４．０から３０ナノメートル、２．０から４０ナノメートルの間である。鉄粒子の濃度は、０．１ｕｇ／ｍｌから５６０のｕｇ／ｍｌまでであり、具体的に、０．２ｕｇ／ｍｌから３００ｕｇ／ｍｌまで、０．５ｕｇ／ｍｌから１００ｕｇ／ｍｌまで、０．７５ｕｇ／ｍｌから１０ｕｇ／ｍｌまで、１．０ｕｇ／ｍｌから３．０ｕｇ／ｍｌまでである。細胞は、約１分乃至約４８時間鉄を含む溶液に感光できるが、具体的に約２０分から約１２時間、約６０分から約５時間、約２時間から３時間の範囲内である。磁性粒子への感光の後、支持細胞は培養容器および交換した培養基に接種される。支持細胞の接種後の少なくとも一周間に細胞層が形成および成長すると、すぐにｈＢＳ細胞の単一細胞溶液が支持細胞に接種されることが可能である。ｈＢＳ細胞は、少なくとも１日間の含鉄支持細胞の培養系に保たれることができるが、具体的に少なくとも２日間、少なくとも４日間、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間である。
【００７４】
前記の混合細胞集団の単細胞懸濁液の生成及び、前記細胞懸濁液を磁力への感光による解離は、更に実行されることができる。磁力は、細胞解離が行われる容器または管の寸法に合う適切な磁石から生じることができる。解離の１つの潜在的概略は、実施例１３に記載されている。
【００７５】
本発明によって得られるｈＢＳ細胞は特に細胞トランスフェクション処理を受けることに適し、それはｈＢＳ細胞の単細胞状態がエレクトロポレーションにおいて細胞融合を回避するからであり、それにより、混合クローンを回避するとともにトランスフェクションの効率を改善する。したがって、本発明の一実施例で、遺伝子組み替えられたｈＢＳ細胞を得るために、例えば、ウィルス薬品、リポフェクタミン、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介を用いて、得られたｈＢＳ細胞は細胞トランスフェクション処理を受ける。ｈＢＳ細胞の遺伝子の変更態様は、リポータ遺伝子としての用途、創薬の開発分析及び実験に使われるノックインおよびノックアウトの用途、毒性試験用途、疾患モデル用途のようないくつかの応用に役立つ。
【００７６】
さらに、本発明で取得するｈＢＳ細胞は、マルチウエルプレート分析用に適切であり、それは取得した単細胞懸濁液がマルチウエルプレートにおいて均一に容易に配布されるからである。従ってｈＢＳ細胞の本願発明の単細胞懸濁液は、例えば異なる化合物の毒性テストを実行するためにマルチウエルプレート分析に使われることができ、または、薬剤候補の識別する創薬手順に使われることができる。
【００７７】
単細胞懸濁液：
本願発明は、更にｈＢＳ細胞の単一細胞懸濁に関し、上記にて説明したように、この種の細胞を培養する方法に応用される場合に、その単細胞懸濁液は、例えば、２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上または４０継代以上のような２０継代以上の間でｈＢＳ細胞の重要な特徴を存続、保全することができる。
【００７８】
ｈＢＳ細胞株
本願発明は、更にｈＢＳ細胞株に関し、上記にて説明したように、この種の細胞を培養する方法に応用される場合に、そのｈＢＳ細胞株は、例えば、２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上または４０継代以上のような２０継代以上の間でｈＢＳ細胞の重要な特徴を存続して、保全することができる。
【００７９】
特定の使用のための低支持密度の単細胞解離されたｈＢＳ細胞の接種は、本発明の単細胞懸濁液を支持細胞に接種する場合に利点を有する。支持細胞は、例えば約５０，０００細胞／ｃｍ２、約１０，０００細胞／ｃｍ２、約１５，０００細胞／ｃｍ２、約２０，０００細胞／ｃｍ２、約２５，０００細胞／ｃｍ２より低い密度に存在する。これは、例えば中間のステップに関係があり、すなわち、毒性テストのための解離応用の用途または、ｈＢＳ細胞株から細胞タイプに分別され、派生のシステムに用いる前の本発明に記載されている手順の最後または最終ステップに関連する。この種の応用において、ｈＢＳ細胞が支持細胞から解離されるときに、低いフィーダ密度は利点を有する。
【００８０】
本願発明のキット
一実施例において、本発明は本発明の培養系の一つ以上の構成要素を含む一つ以上のキットを関連づける。したがって、本発明のキットは以下の構成要素のうち一つ以上を含む。
ｉ）  単一のｈＢＳ細胞集団
ｉｉ）  ｈＢＳ細胞の繁殖方法を記載しているユーザー・マニュアル。
【００８１】
さらに、本発明は以下を含んでいる第１の構成要素から成るキットにも関する：
ｉ）  単一細胞集団および、少なくとも一つ（例えば少なくとも２または少なくとも３つ）の以下の構成要素、
ｉｉ）  ヒトの支持細胞、
ｉｉｉ）  単細胞懸濁液へのｈＢＳ細胞コロニー解離のための一つ以上の解離薬品、および、
ｉｖ）  有効な培養基。
【００８２】
上記のキットにおいて、単細胞集団は異種動物由来成分不含のｈＢＳ細胞株に由来することができ、そして、構成要素ｉｉ）−ｉｖ）以外の一つ以上は異種動物由来成分不含でも可能である。
【００８３】
好ましくは、本願発明のキットの更なる構成要素は、本発明の方法のために記述される詳細及び特徴に従う解離方法を記述するユーザー・マニュアルまたは磁気でも可能である。
【実施の形態】
【００８４】
実施例１
人体包皮線維芽細胞の培養と支持細胞層としての使用
市販で入手可能なｈＦＦｓはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，（ＣＲＬ−２４２９  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から得られ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ペイズリー、スコットランド；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に培養され、１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンに補充される。トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞は比率が１：２から１：８の間で規則的に（毎週）継代する。ｈＦＦの融合性単層はマイトマイシン−Ｃ（シグマ）（２．５時間に１０μｇ／ｍｌ）で処理され、４ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｈｒｂＦＧＦ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地の濃度が７０，０００−８０，０００  細胞／ｃｍ２で、０．１％のゼラチン（シグマ）にコーティングされた体外受精膜皿に載せる。ｈＦＦ細胞は継代４から継代１２までのフィーダとして用いられる。
【００８５】
実施例２
人体胎児線芽細胞の培養及び支持細胞層としての使用
市販で入手可能な人体胎児線芽細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，（ＣＣＬ−１１０  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から得られ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ペイズリー、スコットランド；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に培養され、１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンに補充される。トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞は比率が１：２から１：８までの範囲内で規則的に（毎週）継代する。人体胎児線芽細胞はマイトマイシン−Ｃ（シグマ）（２．５時間に１０μｇ／ｍｌ）で処理され、４ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｈｒｂＦＧＦ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地の濃度が７０，０００−８０，０００細胞／ｃｍ２で、０．１％ゼラチン（シグマ）にコーティングされた体外受精膜皿に載せる。ｈＦＦ細胞は継代４から継代１２までの、図８のフィーダとして用いられる。
【００８６】
実施例３
人体包皮線維芽細胞支持細胞株の樹立（例えば細胞株ｈＦＦ００３）
人体の包皮サンプルは割礼された８週間の少年から２Ｘゲンタマイシンを含む無菌ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で無菌採取された。皮膚外植体は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び１０％のヒト血清を含有する２５ｃｍ２の一次性組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の中に入れられる。約１０日後に、融合性単層が樹立された。細胞はＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）を用いて、連続的に継代される。増殖後に、細胞は人体病原体の標準パネル（マイコプラズマ、ＨＩＶのタイプ１と２、肝炎ウィルスのタイプＢとＣ、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウィルスのタイプ１と２、エプスタイン・バーウイルス、人体パイロマウイルス）すべての不面結果がテストされる。
【００８７】
実施例４
室内樹立した包皮線維芽細胞株由来の支持細胞層の調合液
異種動物由来成分不含の人体線維芽細胞フィーダを被覆する前に、組織培養処理されたウェルズが室温で最低１時間０．１％の組換え型人体ゼラチン（ｆｉｂｒｏｇｅｎ）に覆われる。ＩＭＤＭに培養された異種動物由来成分不含のｈＦＦ００３の融合体単層（５継代から８継代）細胞、１０％のヒト血清および１％のペニシリン−ストレプトマイシンがマイトマイシン−Ｃ（シグマ）で処理される（１０μｇ／ｍｌ、２．５時間）。マイトマイシン−Ｃに処理されたフィーダは、１０％（ｖ／ｖ）のヒト血清、１％のペニシリン・ストレプトマイシン、１％のグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノール及び非本質アミノフェノ−ル酸（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に補充されたＤＭＥＭ（上記のように）に基づく培養基の中のＶＩＦウェルズ（ベクトン・ディッキンソン）の上に２．８９ｃｍ２あたり２００，０００細胞の比例で被覆される。内側細胞塊細胞及び、それ又はｈＢＳ細胞に由来する細胞に胚盤胞を配置する前に、培養基は、ＤＭＥＭに変えられ（上記のように）、代わりに、２０％（ｖ／ｖ）のヒト血清、４ｎｇ／ｍＬのｈｒｂＦＧＦ、１％のペニシリン・ストレプトマイシン、１％のグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノール及び非必須１％のアミノ酸で補充される（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。（実施例３にて説明したとおりの同じ培養基）
【００８８】
実施例５
酵素培養系へのｈＢＳＣの転送
ｈＢＳ細胞株ＳＡ００１、ＳＡ００２、ＳＡ００２．５、ＳＡ１２１、ＳＡ１６７、ＳＡ３４８、ＳＡ４６１及びＳＡ５０２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）が樹立され、前記（ハインズ、Ｎｏａｋｓｓｓｏｎ）および国際公開第０３／０５５９９２号パンフレットにて記述されたように特徴づけられる。この種の素材は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢから得られることができて、また、ＮＩＨ幹細胞レジストリ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／）を通して可能である。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢは、二つのｈＢＳ細胞株（ＳＡ００１およびＳＡ００２）及びＮＩＨを通して可能なＳＡ００２（ＳＡ００２．５）の１つのサブクローンを有する。それらのｈＢＳ細胞株は、本発明において多用された。使用する全てのｈＢＳ細胞株は承認されて、英国の幹細胞バンク運営委員会によって登録され、ＳＡ００１、ＳＡ００２およびＳＡ００２．５はＭＥＸＴ（日本）に承認される。実験の前に、細胞株は、４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ．ｃｏｍ）のマイトマイシン−Ｃ抑制ｍＥＦフィーダ層上のＩＶＦ皿で保全され、カットおよび転送ツールとしてのミクロの毛細管を用いて手動で切られる。ｈＢＳ細胞を従来の培養系から酵素解離へ移すために、使用された培養基は除去され、そして、培養皿はＰＢＳ（インビトロゲン）で一度洗われる。０．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロゲン）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ケミコン）またはＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（インビトロゲン）はそれから各々のＩＶＦ皿に加えられる。ｈＢＳ細胞はコロニーがフィーダ層からかき集め始まる範囲内で皿は３７℃で温められる。細胞層は、次にピペットによる重複粉砕によって単一の細胞懸濁液に別々に壊され、遠心解離機管へ移されて、５分間４００ｇで遠心解離機で解離される。上澄みは廃棄され、ｈＢＳ細胞ペレットは新しいＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基で再懸濁され、単細胞懸濁液は不活性化ｈＦＦの高密度フィーダ層を含むＩＶＦ皿に接種される。
【００８９】
実施例６
単細胞懸濁液としての継代を使用しているｈＢＳ細胞の酵素培養
酵素培養のために、ｈＢＳ細胞は、高密度のｈＦＦ支持細胞及び４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦで補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基からなる培養系で保全される。酵素解離は、ＰＢＳ（インビトロゲン）で培養皿を洗う培養基を除去することによって始められる。０．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロゲン）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ケミコン）又はＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（インビトロゲン）は、それから各々の皿に加えられる。ｈＢＳ細胞はコロニーがフィーダ層からかき集め始まる範囲内で皿は３７℃で温められる。細胞層は、次にピペットによる重複粉砕によって単一の細胞懸濁液に別々に壊される。その後、細胞懸濁液は遠心解離機管へ転送され、５分間４００ｇで遠心解離機で解離された。上澄みは廃棄され、そして、ｈＢＳ細胞ペレットは新しいＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培養基で再懸濁された。単細胞懸濁液は、分割比の範囲が１：４又は１：５から１：５００までである不活性化ｈＦＦの高密度フィーダ層を含むＩＶＦ皿に接種される。我々が新規培養系の第１継代で調整手順期間と称する期間で低い分割比が使われる。５継代以下の後にｈＢＳ細胞株は、分割比が１：２０から１：５００の範囲で分割される。培養系は、３７℃で９５％湿度の保育器で保全される。使用された培養基は、新しいＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）＋４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦに２−３日ごとに取り替えられる。個々ｈＢＳ細胞株の成長速度に従い、細胞は６−１２日ごとに継代される。本出願を出願する時に各株ＳＡ００１およびＳＡ１２１は、通常核型を保全しながら２０継代以上培養され、更に従来の緩慢凍結方法に基づいて、１０％ＤＭＳＯで補充される通常培養基の中で、凍死され、そして、解凍される。
【００９０】
実施例７
ｈＢＳ細胞の免疫組織化学上及び組織化学上の分析
ｈＢＳ細胞培養は、１５分間４％のパラホルムアルデヒドにおいて固定され、０．５％のｔｒｉｔｉｏｎ溶液（シグマ−オールドリッチ）で５分間透過され、その後、ＰＢＳ（インビトロゲン）中の５％ＦＢＳでブロックされる。細胞は、一晩４℃のプライマリ抗体溶液で培養される。使用するプライマリ抗体は、Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４（サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）に特有である。ＦＩＴＣ−またはＣｙ３−共役第２の抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒａｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）での培養は室温で６０分間実行される。細胞核はＤＡＰＩ（シグマ）で対比染色剤で着色される。アルカリホスファターゼの活動は、製造業者の指示（シグマ−オールドリッチ）によるアルカリホスファターゼ活動検出キットを使用して測定される。染色は、ニコン・エクリプス  ＴＥ−２０００  Ｕ蛍光顕微鏡を使用して、評価され、整理される。ＳＡ００１およびＳＡ１２１は、２０継代以上の後に、上記すべてのｈＢＳ細胞特徴を示した。
【００９１】
実施例８
遺伝子の特徴づけ
核型分析のために、ｈＢＳ細胞は、コルセミドがある場合に培養され、ガラス・スライドの上で載置、固定、トリプシン処理される。染色体は、ＤＡＰＩ染色によって視覚化され、適切なフィルタおよびソフトウェアを備えている倒立顕微鏡を使用して、配列され、文書化される（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ；サンタクララＣＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｉｍａｇｉｎｇｃｏｒｐ．ｃｏｍ））。
【００９２】
蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）分析のために、染色体１２，  １３，  １７，  １８，  ２１，  Ｘ  および  Ｙの探測機を含んでいる市販キットは、製造業者の軽微な変更指示によって使われる。スライドは、適切なフィルタおよびソフトウェア（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ）を備えている倒立顕微鏡で分析される。ＳＡ００１およびＳＡ１２１は、現在培養系２０継代以上培養された後に通常核型を示した。ＦＩＳＨは、より高い継代でさえ正常であると確認された。
【００９３】
実施例９
生体内多分化能の分析
前に記載されている［ハインズ他］ように、多分化能は免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）の奇形腫形成によって評価される。手短に言えば、未分化のｈＢＳ細胞コロニーが機械的に２００ｘ２００−μｍ単片に切られ、外科的に、重症複合免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓カプセルの下で配置される（Ｃ．Ｂ−１７／ｌｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄＢＲ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。マウスは８週後に殺され、腫瘍は切除されて、４％のパラホルムアルデヒドに取り付けられる。ヘマトキシリン及び、パラフィン断片に染色したエオシンは、例えば、神経外胚葉、軟骨および腸様皮覆組織のような３つの全ての胎児胚葉に由来する分化ヒト組織の存在のために組織学的に評価された。全ての３つの胚葉は、現在の培養系で２０継代以上後まで培養されるＳＡ００１およびＳＡ１２１からの奇形腫の中で確認された。
【００９４】
実施例１０
酵素継代培養系における追加的ｈＢＳ細胞株の培養および特性解析
前述のｈＢＳ細胞株ＳＡ００１およびＳＡ１２１に加えて、さらにｈＢＳ細胞株ＳＡ１６７およびＳＡ００２が、上記の酵素継代培養系において成功的に転移、培養された。
【００９５】
酵素継代培養系で培養されるｈＢＳ細胞株の特徴は下記表において明らかにされる。
【００９６】
【表１】
2009529859.tif 000002
【００９７】
実施例１１
方法の健全さ、再現性及び適用性
ｈＢＳＣ株の酵素培養のための発明方法の大きな利点は、幾つかのｈＢＳＣ株が安定、頑丈であり、再生が容易であることが判明した。７つの異なるｈＢＳＣ株は、方法の評価および樹立のために繰り返し使われた。その上、次の培養方法へのｈＢＳ細胞株樹立のための発明調整手順は、異なるいくつかのｈＢＳ細胞株に安定、急速であることが判明した。各株のために作られた設立回数は、括弧内に示され、ＳＡ００１  （６）、ＳＡ００２  （５）、ＳＡ００２．５  （＞３）、ＳＡ１６７  （３）、ＳＡ３４８  （＞４）、ＳＡ４６１  （＞１０）およびＳＡ５０２  （２）である。本発明に従う連続樹立は、工業細胞培養製品におけるｈＢＳ細胞株の大規模培養のために作られる。
【００９８】
実施例１２
コロニー形成分析
酵素継代および培養系の支えとなる潜在能力を試験するために、伝統的に培養されたｈＢＳ細胞（機械的継代を用いるｍＥＦｓ上で）は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）またはＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡの何れかを用いて単細胞に解離される。ｈＢＳ細胞は希釈され、ｈＦＦｓまたはｍＥＦｓのどちらかの上に、密度がおよそ３５０および７００ｈＢＳ細胞／ｃｍ２になるように新規なＩＶＦ皿に接種される。
【００９９】
培養基は、２−３日ごとに変更される。ほぼ１週後で、培養基は取り外され、細胞は、製造業者の明細書（シグマ−オールドリッチ）に基づくアルカリホスファターゼ染色が続く１ｘ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）によって洗われた。全ての４つの試験グループから得られたｈＢＳ細胞コロニーの数は計数された。未分化のｈＢＳ細胞コロニー数の半定量的評価のために、倒立顕微鏡において視覚的に検査され、コロニーの５０％以上が未分化の場合に、コロニーは陽性記録である。実験は、二重に実行され、３回を繰り返した。ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２．５は、これらの実験に使用された。
【０１００】
どの酵素が使用されたかに関係なく、ｈＦＦｓ上のコロニーのほぼ９０％は未分化として選別された（図６を参照）。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）  １９１で処理されるそのうちの２００評価コロニーが、未分化として判断された。比較するために、解離されたｈＢＳ細胞がｍＥＦｓで平板培養される場合に、良いコロニーの数かなり減少された。コロニーの約６０％だけが未分化として類別された（図６）。質的な違いは、試験される両方の希薄物において同様だった。このように、フィーダとしてのｈＦＦｓおよび解離のためのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔを使用することは、未分化、多能性ｈＢＳ細胞のクローンの生存を容易にするために最も有利な組合せである。
【０１０１】
実施例１３
ｈＢＳ細胞からｈＦＦを解離するための磁性粒子の応用
細胞増殖を抑制するために、融合性ｈＦＦ細胞を有する１つのＴ−７５フラスコが、２−３時間マイトマイシン  Ｃで処理される。マイトマイシン  Ｃ処理の後、ｈＦＦｓは、それらが１Ｘ  トリプシン−ＥＤＴＡ又は１Ｘ  ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔを使用することによって単細胞に解離された後に１Ｘ  ＰＢＳで数回洗浄される。細胞約数は、血球計算器において計数され、そして、細胞は適当な濃度に希釈された。磁性粒子（Ｅｎｄｏｒｅｍ（商標））の異なる濃度が試験されることになっている場合に、細胞懸濁液は異なる管に分けられ、そして、磁性粒子の異なる量は、それから管に加えられた。懸濁液がゼラチン被覆ＩＶＦ皿（ファルカン）に平板培養される前に、ｈＦＦｓおよび磁性粒子はそれから管に混合される。ＩＶＦ皿に約２００，０００ｈＦＦ細胞が接種された。
【０１０２】
試験されたＥｎｄｏｒｅｍ（商標）の濃度は、２００，０００細胞以上に対して５．６ｕｇから５６０のｕｇまでの範囲であり、それは、２．８ｕｇ／ｍｌから２８０ｕｇ／ｍｌまでと一致する。
【０１０３】
接種後の１−２日後に１００％培養基変化が実行され、それは、解放された鉄分子または非取り込み鉄分子の大多数を取り除いた。培養基変化のほぼ２４時間後に、ｈＢＳ細胞は、ｈＦＦフィーダ細胞を有するプレートに加えられた。
【０１０４】
磁石上でｈＦＦｓを集めるために、細胞は、１ｘ  ＰＢＳで一度すすがれ、トリプシン−ＥＤＴＡ又は１ｘ  ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔによって単細胞に解離された。細胞懸濁液は、それからエッペンドルフ管へ転送され、磁石と近いところに配置された。細胞は、数分間磁石に付着し、そして、残留する溶液は、それから管から除去された。その後、チューブは磁石から取り外され、そして、適切な培養基または１ｘ  ＰＢＳがチューブに加えられ、溶液を含んでいるフィーダ細胞は、細胞計算、解離効率の確認のために再懸濁された。
【０１０５】
ｈＦＦｓの少なくとも９０％は、磁石に引っかけられ（９０％解離効率）（図７を参照）、異なる濃度に関係なく試験される。酵素で継代培養されたｈＢＳ細胞が磁気ｈＦＦｓ上へ接種されるときに、ｈＢＳ細胞は付着して、増殖して、細胞コロニーを形成する（データは示されてない）。
【０１０６】
（参考文献）
・  ハインズ  Ｎ、イングルンド  ＭＣＯ、スヨブロム  Ｃ他、ヒトＥＳ細胞の起源、特徴描写、分化。ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ２００４年；  ２２：３６７−７６
・  国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット、多能性ヒト胚盤胞−派生幹細胞線の樹立のための方法、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社
・  ヒトＥＳ細胞プロトコル  ＢｒｅｓａＧｅｎ  Ｉｎｃ  ２００４年、シェーグレン−ヤンソン  Ｅ他。無フィーダ培養系の４つの未分化ＥＳ細胞株の大規模な培養。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２００５年；  ２３３：１３０４−１３１４
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・  アンドリュース  ＰＷ他。胚幹（ＥＳ）細胞及び胎児性癌（ＥＣ）細胞：同じコインの反対側。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ２００５年１２月；  ３３（Ｐｔ  ６）：１５２６−３０  論評
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ｈＦＦｓおよび酵素（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標））を使用して単細胞として培養、継代されたｈＢＳ細胞コロニーの形態を示す。  ａ）第１の酵素解離後の適応ｈＢＳ細胞コロニー  ｂ）早期調整時（新培養系の第１継代）に観察される異種の細胞集団面積  ｃ）クラスタ・サイズ（すなわち酵素継代期の単細胞）  ｄ）ｈＦＦｓ上のｈＢＳ細胞の単細胞懸濁液  ｅ）酵素解離の２日後の本培養系に適合したｈＢＳ細胞  ｆ）適合したｈＢＳ細胞コロニー  ｇ）同種のｈＢＳ細胞コロニー（右上と）  ｈ）ｈＢＳ細胞コロニー有する培養ウェルの全体図、スケール・バー５０μｍ（ｃ）、１００μｍ（ａ，ｂ，ｇ）、２００μｍ（ｄ）、２５０μｍ（ｅ，ｆ）、１．６６ｍｍ（ｈ）
【図２】以下の図において、記号「ＳＡ００１  ＴｒｙｐＬｅ」は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓの細胞株ＳＡ００１からのｈＢＳ細胞を意味し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）を使用して培養され、「ＳＡ００２  ＴＥ」は、同じ細胞株からのｈＢＳ細胞を意味し、代わりにトリプシン  ＥＤＴＡを使用して培養される。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）およびトリプシン  ＥＤＴＡを使用して２０以上の酵素継代した後のＳＡ００１の免疫組織化学染色：Ｏｃｔ−４（ａ）、ＴＲＡ−１−８１（ｃ）、ＳＳＥＡ−４（ｅ）及びアルカリホスファターゼ（ｇ）のために染色されたＳＡ００１  ＴｒｙｐＬｅ。Ｏｃｔ−４（ｂ）、ＴＲＡ−１−８１（ｄ）、ＳＳＥＡ−４（ｆ）およびアルカリホスファターゼ（ｈ）のために染色されたＳＡ００１  ＴＥ。スケール・バー１００μｍ（ａ−ｇ）。スケール・バー２５０μｍ（ｇ）。
【図３】ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）を用いて、２５継代後のＳＡ００１の核型およびＦＩＳＨ（蛍光インシトゥハイブリデーション法）（ａ）ＳＡ００１  ＴｒｙｐＬＥからの染色体は正常２倍体である。本図面は代表的な核型を示す。細胞が染色体Ｘ（青）、Ｙ（金）、１３（赤）、１８（青）および２１（緑）のためのＸＹおよび正常２倍体であることが証明された（ｂ）ＳＡ００１  ＴｒｙｐＬＥ（ｃ）およびＳＡ００１  ＴＥ（ｄ）から選択された染色体のＳＡ００１  ＴＥ、正常２倍体（ｃ，ｄ）  ＦＩＳＨ分析。
【図４】ＳＡ００１の生体内多分化能分析。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）およびトリプシン−ＥＤＴＡを用いて２０以上の継代後の奇形腫。２７継代後のＳＡ００１  ＴｒｙｐＬＥ（商標）（ａ，ｃ，ｅ）および２２継代後のＳＡ００１ＴＥ（ｂ，ｄ，ｆ）からの奇形腫の組織学的分析。（ａ，ｂ）神経外胚葉（外胚葉）、（ｃ，ｄ）軟骨（中胚葉）、（ｅ，ｆ）腺上皮（内胚葉）スケール・バー２５μｍ（ａ，ｃ，ｅ）と５０μｍ（ｂ，ｄ，ｆ）
【図５】ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）を用いて、２０酵素単細胞継代後のＳＡ１２１の特性分析。（ａ）Ｏｃｔ−４免疫組織化学的染色、（ｂ）ＴＲＡ−１−６０、（ｃ）ＳＳＥＡ−３、（ｄ）ＳＳＥＡ−４、（ｅ）アルカリ性のリン酸塩、（ｆ）２０単細胞酵素継代後のＳＡ１２１  ＴｒｙｐＬＥの正常２倍体核型、（ｇ−ｉ）：２３継代後のＳＡ１２１から由来の奇形腫（ｇ）、神経外胚葉（外胚葉）（ｈ）、軟骨（中胚葉）、（ｉ）、腺上皮（内胚葉）、スケール・バー：ａ−ｅ：１００μｍ；ｇ−ｉ：５０μｍ。
【図６】ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）伴う単細胞酵素継代はクロ−ン生存を増強させる。細胞がＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）処理後のｈＦＦｓに転移されるとき、細胞群体の数量がトリプシン−ＥＤＴＡ奇形腫（ｐ＝００．１）と比較して３倍に増加する。もし、解離されたｈＢＳ細胞がｈＦＦｓの上に被覆される場合は、ｍＥＦｓ上に被覆される場合と比べてより取得する良い細胞群体数が著しく増大された（ｐ＝０．２）。この統計デ−タは平均値の標準誤差（ｎ＝３）として存在する。
【図７】一週間後の培養液中のｈＦＦ細胞。（Ａ）は磁石上に付着されたｈＦＦｓ細胞群体を示す、（Ｂ）は浮遊液に残っている少量残留ｈＦＦ細胞を示す。
【図８】人体胎児線芽細胞上で実施されたＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）を有する単細胞酵素継代。（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），  ＣＣＬ−１１０  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）。
【図１】
2009529859.tif 000003
【図２】
2009529859.tif 000004
【図３】
2009529859.tif 000005
【図４】
2009529859.tif 000006
【図５】
2009529859.tif 000007
【図６】
2009529859.tif 000008
【図７】
2009529859.tif 000009
【図８】
2009529859.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月25日(2008.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養系が、
ｉ）  密度が５０，０００細胞／ｃｍ２以上のヒト支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
ｉｉｉ）  有効な培養基、を含む、ヒト胚盤胞からの幹（ｈＢＳ）細胞を培養する培養系。
【請求項２】
ヒト支持細胞の密度が約５０，０００乃至約５００，０００細胞／ｃｍ２までの範囲、例えば、約５０，０００乃至約４００，０００細胞／ｃｍ２、約５０，０００乃至約３００，０００細胞／ｃｍ２、約５０，０００乃至約２００，０００細胞／ｃｍ２、６０，０００乃至約２００，０００細胞／ｃｍ２、７０，０００乃至約２００，０００細胞／ｃｍ２である、請求項１に記載の培養系。
【請求項３】
ヒト支持細胞がヒト組織に由来する、請求項１または２のいずれかに記載の培養系。
【請求項４】
ヒト組織が胚、胎児、新生児、少年又は成体組織から由来する、請求項３に記載の培養系。
【請求項５】
ヒト組織が包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは乳房を含む皮膚に由来する、請求項３または４のいずれかに記載の培養系。
【請求項６】
ヒト支持細胞が例えば、ｈＢＳ細胞またはｈＢＳ細胞由来の細胞から試験管に誘導される、請求項１−５のいずれかに記載の培養系。
【請求項７】
ヒト支持細胞がヒト線維芽細胞株維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型に由来する、請求項１−６のいずれかに記載の培養系。
【請求項８】
ヒト支持細胞が線維芽細胞である、請求項１−７のいずれかに記載の培養系。
【請求項９】
支持細胞がヒトの新生児包皮線維芽細胞に由来する、請求項８に記載の培養系。
【請求項１０】
ｈＢＳ細胞に由来する細胞が線維芽細胞であるかまたは間葉表現型を有する、請求項６に記載の培養系。
【請求項１１】
支持細胞が、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および／または胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤内皮細胞、出産後のヒト包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後のヒト包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞及び／または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成ヒト質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮細胞または成体ケラチン生成細胞に由来する、請求項１−１０のいずれかに記載の培養系。
【請求項１２】
ヒト支持細胞が成長不活性化された請求項１−１１のいずれかに記載の培養系。
【請求項１３】
ヒト支持細胞がマイトマイシン処理によって成長不活性化された請求項１２に記載の培養系。
【請求項１４】
ヒト支持細胞が放射によって成長不活性化された請求項１２に記載の培養系。
【請求項１５】
ｈＢＳ細胞の接種から、１日乃至１０日、例えば１日乃至５日、２日乃至４日の前に支持細胞が接種される請求項１−１４のいずれかに記載の培養系。
【請求項１６】
ｈＢＳ細胞の接種前に、培養基が１回以上、例えば２回以上、３回以上、４回以上または５回以上変わる請求項１５に記載の培養系。
【請求項１７】
一つ以上の解離薬品が酵素である請求項１−１６のいずれかに記載の培養系。
【請求項１８】
前記酵素がタンパク質分解酵素である請求項１７に記載の培養系。
【請求項１９】
前記酵素がコラーゲン分解酵素である請求項１７または１８のいずれかに記載の培養系。
【請求項２０】
酵素がトリプシン、トリプシン様、ディスパーゼ、ディスパーゼ様、プロナーゼ、プロナーゼ様、コラゲナーゼ、コラゲナーゼ様およびマトリックス・メタロプロテイナーゼからなる群から選択される請求項１７−１９のいずれかに記載の培養系。
【請求項２１】
酵素が組み換え酵素である請求項１７−２０のいずれかに記載の培養系。
【請求項２２】
一つ以上の解離薬品がキレート剤である請求項１−２１のいずれかに記載の培養系。
【請求項２３】
キレート剤が二価陽イオンのキレート化剤である請求項２２に記載の培養系。
【請求項２４】
キレート剤がＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸）およびＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸）からなる群から選択される請求項２２または２３のいずれかに記載の培養系。
【請求項２５】
前記解離薬品が二つ以上、例えば三つ以上、四つ以上、五つ以上の解離薬品の組合せである請求項１−２４のいずれかに記載の培養系。
【請求項２６】
前記解離薬品の組合せが一つ以上の酵素および一つ以上のキレート剤を含む請求項２５に記載の培養系。
【請求項２７】
前記解離薬品の組合せが異種動物由来成分不含である請求項２５または２６のいずれかに記載の培養系。
【請求項２８】
解離薬品の組合せがＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）から成る市販の組合せの群から選択される請求項２５−２７のいずれかに記載の培養系。
【請求項２９】
有効な培養基がＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）およびＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）からなる群から選択される前記請求項１−２８のいずれかに記載の培養系。
【請求項３０】
有効な培養基が、約０．５乃至約１０００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、例えば約１乃至約５００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ、約２乃至約２００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦ又は約４乃至約１００ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦに補充される請求項１−２９のいずれかに記載の培養系。
【請求項３１】
前記培養基が約１乃至約４０％の血清、例えば約５乃至約２０％の血清、約１０％の血清に補充される請求項１−３０のいずれかに記載の培養系。
【請求項３２】
前記血清がＦＢＳまたはヒト血清である請求項３１に記載の培養系。
【請求項３３】
培養系は、
ｉ）  密度が少なくとも７０，０００細胞／ｃｍ２のヒト新生児包皮支持細胞、
ｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するためのＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、
ｉｉｉ）  少なくとも４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦの有効な培養基で補充されるＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、を含み、
ｈＢＳ細胞の重要特徴を保全しながら長期間の各連続的な継代において、単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離することによってｈＢＳ細胞を培養することを可能にする請求項１−３２のいずれかに記載の培養系。
【請求項３４】
請求項１−３３のいずれかに定義される培養系においてｈＢＳ細胞を培養する方法は、細胞の重要特徴を保全しながらｈＢＳ細胞を培養するために、
ｉ）  万能細胞株から得られたｈＢＳ細胞を培養系に適合させるために任意に調整手順を実行し、
ｉｉ）  一つ以上の解離薬品を利用して単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を解離し、
ｉｉｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：４の単細胞懸濁液を分配し、
ｉｖ）  通常培養基変化において約３日乃至２５日間ｈＢＳ細胞を培養させ、
ｖ）ステップｉｉ）からｎ回を繰り返し、ｎは１以上の整数である、前記ステップを含むｈＢＳ細胞を培養する方法。
【請求項３５】
培養方法が、さらに
ｖｉ）  ｈＢＳ細胞の重要特徴が保全されるかどうか確認するためにステップｉｖ）において得られる細胞を分析し、
ｖｉｉ）  ｈＢＳ細胞の重要な特徴が保全される場合、ステップｉｉ）から繰り返し実行する請求項３４に記載の培養方法。
【請求項３６】
ｎが例えば少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のように、少なくとも５である請求項３４または３５のいずれかに記載の培養方法。
【請求項３７】
ステップｉｉ）の単一細胞懸濁液へのｈＢＳ細胞コロニーの解離は、ｈＢＳ細胞コロニーを一つ以上の解離薬品で処理することによって実行される請求項３４−３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
一つ以上の解離薬品の効力がステップｉｉｉ）の前に軽減される請求項３４−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
一つ以上の解離薬品の物理的な除去、一つ以上の解離薬品の薄弱化、一つ以上の解離薬品の一つ以上の抑制剤の追加、過度の一つ以上の解離薬品に一つ以上の培養基の追加または一つ以上解離薬品の固有の自動抑制によって、一つ以上の解離薬品の効果を減弱させる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
分割比が約１：４乃至約１：５０００の間、例えば約１：２０の乃至約１：１０００、約１：５０の乃至約１：５００の範囲内である請求項３４−３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
分割比が１：２０である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップｉｉｉ）において得られたｈＢＳ細胞が約３日乃至約２５日間、例えば約４日乃至２０日間、６日乃至１２日間培養される請求項３４−４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
ステップｉｖ）の培養基の変化が一周間に約１回乃至約１４回、例えば約２回乃至約６回、約２回乃至約４回、約３回行われる請求項３４−４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記調整手順が、
ａ）  一つ以上の解離薬品を用いて単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離し、
ｂ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：３の単細胞懸濁液を分配し、
ｃ）  通常時間間隔の培養基変化において約５日乃至３０日間ｈＢＳ細胞を培養させ、
ｄ）  均一な未分化のｈＢＳ細胞コロニーを得るために、任意に、多くとも５回ステップａ）から繰り返す、ステップを含む請求項３４−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ステップｃ）において得られたｈＢＳ細胞が約５日から約３０日間、たとえば約７日から約１６日間、約７日から約１０日間培養される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップｄ）が含まれる請求項４４または４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ステップａ）からの繰り返しを多くて５回、例えば多くて４回、多くて３回、多くて２回実行される請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ステップｃ）の培養基の変更が一週間に約１回から１４回、例えば一週間に約２回から６回、一週間に約２回から４回、週約３回実行される請求項４４−４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
細胞の重要特徴を保全しながらｈＢＳ細胞を培養するために、前記方法が、
ｉ）  ａ）一つ以上の解離薬品を用いて単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離し、ｂ）密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：３の単細胞懸濁液を分配し、ｃ）通常時間間隔の培養基変化において約５日乃至３０日間、例えば約７日乃至１６日または約７日乃至１０日ｈＢＳ細胞を培養させ、ｄ）均一な未分化のｈＢＳ細胞コロニーを得るために、任意に、多くとも５回ステップａ）から繰り返す、ステップを含む適応手順を実行し、
ｉｉ）  一つ以上の解離薬品、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔの使用によって単一細胞懸濁液へｈＢＳ細胞を解離し、
ｉｉｉ）  密度が少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも１：４の単細胞懸濁液を分配し、
ｉｖ）  通常培養基変更において約３日乃至２５日間ｈＢＳ細胞を培養させ、
ｖ）  ステップｉｉ）から少なくとも２０回を繰り返す、ステップを含む請求項３４−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
請求項３４−４９のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、１０％未満の細胞、例えば５％未満の細胞、２％未満の細胞、１％未満の細胞が細胞群として現れ、２０継代以上、例えば２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上、４０継代以上において細胞の重要特徴を存続及び保全するｈＢＳ細胞の単細胞懸濁液。
【請求項５１】
請求項３４−４９のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、１０％未満の細胞、例えば５％未満の細胞、２％未満の細胞、１％未満の細胞が細胞群として現れ、２０継代以上、例えば２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上、４０継代以上において細胞の重要特徴を存続及び保全するｈＢＳ細胞の異種動物由来成分不含単細胞懸濁液。
【請求項５２】
請求項３４−４９のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、２０継代以上、例えば２５継代以上、３０継代以上、３５継代以上、４０継代以上においてｈＢＳ細胞の重要特徴を存続及び保全することができるｈＢＳ細胞からの改良細胞株。
【請求項５３】
ｈＢＳ細胞の大規模生産のための、請求項１−３３のいずれかにおいて定義した培養系の応用。
【請求項５４】
一つ以上の解離薬品がＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）の少なくとも一つを含む請求項５３に記載の培養系の使用。
【請求項５５】
ｈＢＳ細胞の大規模な生産のための、請求項３４−４９のいずれかの応用。
【請求項５６】
一つ以上の解離薬品がＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）の少なくとも一つを含む請求項５５に基づく応用。
【請求項５７】
ｈＢＳ細胞の大規模な生産のための、ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）のようなタンパク質分解酵素の使用。
【請求項５８】
構成要素である、
ｉ）  請求項３４−４９のいずれかに記載の方法によって入手できる単一ｈＢＳ細胞集団、
ｉｉ）  ｈＢＳ細胞の培養方法を記載しているユーザー・マニュアルを少なくとも一つ、例えば少なくとも二つを含むキット。
【請求項５９】
ｈＢＳ細胞の培養方法が請求項３４−４９のいずれかにおいて定義されたとおりである請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
第１の構成要素として、
ｉ）  請求項３４−４９のいずれかに記載の方法によって入手できる単一ｈＢＳ細胞集団および、二つ以上または三つ以上の下記の構成要素、
ｉｉ）  ヒト支持細胞、
ｉｉｉ）  単細胞懸濁液へｈＢＳ細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、及び、
ｉｖ）  有効な培養基、
ｉｉ）−ｉｖ）  請求項２−３３のいずれかにおいて定義したとおりである、構成要素を含むキット。
【請求項６１】
単細胞集団が異種動物由来成分不含のｈＢＳ細胞株に由来し、その他の構成要素ｉｉ）−ｉｖ）の何れの一つ以上が異種動物由来成分不含である請求項５８−６０のいずれかに記載のキット。
【国際調査報告】
2009529859.tif 000011
2009529859.tif 000012
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