(57)【要約】【課題】  本発明は、インターロイキン-6（IL-6）を標的とするアミノ酸配列に関し、ならびに、そのアミノ酸配列の１以上を含むもしくは本質的にのみからなる化合物もしくは構造体、特にタンパク質およびポリペプチドに関する。また、本発明は、そのアミノ酸配列およびポリペプチドをコードし、そのアミノ酸配列およびポリペプチドを製造する方法に対する核酸に関し；そのアミノ酸配列もしくはポリペプチドを発現するもしくは発現できる宿主細胞に関し；そのアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸および／もしくは宿主細胞を含む組成物、特に医薬組成物に関し；および、そのアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞および／もしくは組成物を予防、治療もしくは診断の目的に使用するに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-6を標的とする免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片を含むまたは本質的にのみからなるアミノ酸配列であって、IL-6とIL-6Rの間の相互作用を調節するアミノ酸配列。
【請求項２】
IL-6を標的とする免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片を含むまたは本質的にのみからなるアミノ酸配列であって、IL-6Rと競合してIL-6に結合するアミノ酸配列。
【請求項３】
前記免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片がIL-6の抗原決定基に結合し、その抗原決定基がIL-6のIL-6R相互作用部位に存在するか、それを含むか、またはそれの全部もしくは一部と重なることを特徴とする、請求項１または２に記載のアミノ酸配列。
【請求項４】
IL-6を標的とする免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片を含むまたは本質的にのみからなるアミノ酸配列であって、IL-6／IL-6R複合体とgp130の間の相互作用を調節するアミノ酸配列。
【請求項５】
IL-6を標的とする免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片を含むまたは本質的にのみからなるアミノ酸配列であって、gp130と競合してIL-6のgp130相互作用部位IIに結合するアミノ酸配列。
【請求項６】
IL-6を標的とする免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片を含むまたは本質的にのみからなるアミノ酸配列であって、gp130と競合してIL-6のgp130相互作用部位IIIに結合するアミノ酸配列。
【請求項７】
前記免疫グロブリン可変領域またはこれの抗原結合性断片がIL-6に結合するにあたって、その結合の解離定数（KD)が10-5〜10-12mol／L以下、好ましくは10-7〜10-12mol／L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol／L以下であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項８】
前記免疫グロブリン可変領域が軽鎖可変領域、重鎖可変領域、（単）領域抗体、およびナノボディ（登録商標）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９】
前記免疫グロブリン可変領域がナノボディ（登録商標）であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン可変領域がヒト化ナノボディ（登録商標）であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１１】
前記ナノボディ（登録商標）が４個の枠組み構成領域（それぞれFR1〜FR4）および３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR4)を含む又はのみからなり、ここで
CDR1は、以下：
配列番号：167 PYTMG 
配列番号：168 DYAMS 
配列番号：169 YYAIG 
配列番号：170 INAMG 
配列番号：171 IYTMG 
配列番号：172 RLAMD 
配列番号：173 RLAMD 
配列番号：174 FNIMG 
配列番号：175 FNIMG 
配列番号：176 YYGVG 
配列番号：177 YYGVG 
配列番号：178 YYGVG 
配列番号：179 DSAIG 
配列番号：180 PYTIA 
配列番号：181 PYTIG 
配列番号：182 INVMN 
配列番号：183 SYAMG 
配列番号：184 PYTMG 
配列番号：185 PYTVG 
配列番号：186 PYTMG
配列番号：187 PYTMG 
配列番号：188 PYTMG 
配列番号：189 INPMG 
配列番号：190 INPMG 
配列番号：191 INPMA 
配列番号：192 SYPMG 
配列番号：193 SYPMG 
配列番号：194 SYPMG 
配列番号：195 SYPMG 
配列番号：196 SYPMG 
配列番号：197 SYPMG 
配列番号：198 SFPMG 
配列番号：199 SFPMG 
配列番号：200 SFPMG 
配列番号：201 AFPMG 
配列番号：202 AFPMG 
配列番号：203 AFPMG 
配列番号：204 AFPMG 
配列番号：205 AFPMG 
配列番号：206 TYAMG 
配列番号：207 NYHMV 
配列番号：208 NYAMA 
配列番号：209 IDAMA 
配列番号：210 KHHATG 
配列番号：211 SYVMG 
配列番号：212 SYVMG 
配列番号：213 SSPMG 
配列番号：214 SSPMG 
配列番号：215 SSPMG 
配列番号：216 NGPMA 
配列番号：217 SYPIA 
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで
ｃ）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
ｄ）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで
ｃ）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
ｄ）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり；
および／あるいはここで、
CDR2は、以下：
配列番号：218 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号：219 AITGNGASKYYAESMKG 
配列番号：220 CISSSVGTTYYSDSVKG 
配列番号：221 DIMIPYGSTEYADSVKG 
配列番号：222 AAHWTVFRGNTYYVDSVKG 
配列番号：223 SIAVSGTTMLDDSVKG 
配列番号：224 SISRSGTTMAADSVKG 
配列番号：225 DITNRGTTNYADSVKG 
配列番号：226 DITNGGTTMYADSVKG 
配列番号：227 CISSSDGDTYYADSVKG 
配列番号：228 CISSSDGDTYYADSVKG 
配列番号：229 CTSSSDGDTYYADSVKG 
配列番号：230 CISSSDGDTYYDDSVKG 
配列番号：231 TIIGSDRSTDLDGDTYYADSVRG
配列番号：232 TIIGSDRSTDLDGDTYYADSVRG 
配列番号：233 AITSGGRKNYADSVKG 
配列番号：234 AISSNGGSTRYADSVKG 
配列番号：235 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号：236 RINWSGIRNYADSVKG
配列番号：237 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号：238 RINWSGITNYADSVKG 
配列番号：239 RINWSGITNYADSVKG 
配列番号：240 RlHGSITNYADSVKG 
配列番号：241 RIHGSITNYADSVKG 
配列番号：242 RIFGGGSTNYADSVKG 
配列番号：243 GISQSGVGTAYSDSVKG 
配列番号：244 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：245 GISQSSSSTAYSDSVKG 
配列番号：246 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：247 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：248 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：249 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：250 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：251 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：252 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：253 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：254 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：255 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：256 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：257 AISWSGANTYYADSVKG 
配列番号：258 AASGSTSSTYYADSVKG 
配列番号：259 VISYAGGRTYYADSVKG 
配列番号：260 TMNWSTGATYYADSVKG 
配列番号：261 ALNWSGGNTYYTDSVKG 
配列番号：262 TINWSGSNGYYADSVKG 
配列番号：263 TINWSGSNKYYADSVKG 
配列番号：264 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号：265 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号：266 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号：267 AISWRTGTTYYADSVKG 
配列番号：268 AISWRGGNTYYADSVKG
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで
ｃ）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
ｄ）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで
ｃ）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
ｄ）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり；
および／あるいはここで、
CDR3は、以下：
配列番号：269 ASQSGSGYDS 
配列番号：270 VAKDTGSFYYPAYEHDV 
配列番号：271 SSWFDCGVQGRDLGNEYDY 
配列番号：272 YDPRGDDY 
配列番号：273 TRSTAWNSPQRYDY 
配列番号：274 FDGYTGSDY 
配列番号：275 FDGYSGSDY 
配列番号：276 YYPTTGFDD 
配列番号：277 YYPTTGFDD 
配列番号：278 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号：279 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号：280 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号：281 DLSDYGVCSKWPSPYDY 
配列番号：282 TGKGYVFTPNEYDY 
配列番号：283 TAKGYVFTDNEYDY 
配列番号：284 DAPLASDDDVAPADY 
配列番号：285 DETTGWVQLADFRS 
配列番号：286 ASQSGSGYDS 
配列番号：287 ASQSGSGYDS 
配列番号：288 ASRSGSGYDS 
配列番号：289 ASRSGSGYDS 
配列番号：290 ASQVGSGYDS 
配列番号：291 RRWGYDY 
配列番号：292 RRWGYDY 
配列番号：293 RRWGYDY 
配列番号：294 RDKTLALRDYAYTTDVGYDD 
配列番号：295 RDKTLALRDYAYTTDVGYDD 
配列番号：296 RGRTLALRDYAYTTEVGYDD 
配列番号：297 RGRTLFLRDYAYTTEVGYDD 
配列番号：298 RGRTLFLRGYAYTTEVGYDD 
配列番号：299 RGRTIALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：300 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：301 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：302 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：303 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：304 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：305 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：306 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：307 RGGTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：308 SAIIEGFQDSIVIFSEAGYDY 
配列番号：309 VAGLLLPRVAEGMDY 
配列番号：310 VDSPLIATHPRGYDY 
配列番号：311 ARGLLIATDARGYDY 
配列番号：312 GSYVFYFTVRDQYDY 
配列番号：313 SAGGFLVPRVGQGYDY 
配列番号：314 SAGGFLVPRVGQGYDY 
配列番号：315 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号：316 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号：317 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号：318 ERVGLLLAVVAEGYDY 
配列番号：319 ERAGVLLTKVPEGYDY 
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで
ｃ）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／もしくは
ｄ）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで
ｃ）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
ｄ）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列である、
ことを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１２】
IL-6を標的とし、および／もしくはIL-6に特異的に結合できるナノボディ（登録商標）。
【請求項１３】
本質的に単離された形態にある、請求項１２に記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項１４】
IL-6に特異的に結合するにあたって、その結合の解離定数（KD)が10-5〜10-12mol／L以下、好ましくは10-7〜10-12mol／L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol／L以下であることを特徴とする、請求項１２または１３のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項１５】
IL-6に特異的に結合するにあたって、その結合の会合率（ｋon率)が102Ｍ-1ｓ-1と約１107Ｍ-1ｓ-1の間、好ましくは103Ｍ-1ｓ-1と約107Ｍ-1ｓ-1の間、更に好ましくは104Ｍ-1ｓ-1と約107Ｍ-1ｓ-1の間、例えば105Ｍ-1ｓ-1と約107Ｍ-1ｓ-1の間であることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項１６】
IL-6に特異的に結合するにあたって、その結合の解離率（ｋoff率)が1ｓ-1と10-6ｓ-1の間、好ましくは10-2Ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-1と10-6ｓ-1の間、例えば、10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項１７】
IL-6に特異的に結合するにあたって、その結合の親和牲度が500nM未満、好ましくは200nM未満、更に好ましくは10nM未満、例えば500pM未満であることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項１８】
天然起源のナノボディ（登録商標）（適切な任意の種に由来)、又は合成もしくは半合成のナノボディ（登録商標）である、請求項１２〜１７のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項１９】
VHH配列、部分的にヒト化したVHH配列、完全にヒト化したVHH配列、ラクダ化した重鎖可変領域、または親和性成熟のような方法で取得したナノボディ（登録商標）である、請求項１２〜１８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２０】
i）配列番号３２０〜４４７の少なくとも一つのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性が８０％であり、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するために、CDR配列を形成するアミノ酸残基は無視する、および
ii）好ましくは、カバットの番号付与による１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位、および１０８位のアミノ酸残基の１以上を表A−３のホールマーク残基から選択する、
ことを特徴とする、請求項１２〜１９のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２１】
CDR1が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個であるアミノ酸配列、
からなる群から選択され；および／または、
CDR2が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個であるアミノ酸配列、
からなる群から選択され；および／または、
CDR3が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個であるアミノ酸配列、
からなる群から選択される、
ことを特徴とする、請求項１２〜２０のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２２】
CDR1が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個であるアミノ酸配列、
からなる群から選択され；および、
CDR2が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個であるアミノ酸配列、
からなる群から選択され；および、
CDR3が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個であるアミノ酸配列、
からなる群から選択される、
ことを特徴とする、請求項１２〜２１のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２３】
CDR配列が、配列番号３２０〜４４７のアミノ酸配列の少なくとも一つのCDR配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、更に好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、更に実質的に１００％のアミノ酸同一性を有することを特徴とする、請求項１２〜２２のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２４】
部分的にヒト化したナノボディ（登録商標）である、請求項１２〜２３のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２５】
完全にヒト化したナノボディ（登録商標）である、請求項１２〜２４のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２６】
配列番号３２０〜４４７のみからなる群から、または配列番号３２０〜４４７のアミノ酸配列の少なくとも一つとの配列同一性（本明細書で定義）が８０％を超える、好ましくは９０％を超える、更に好ましくは９５％を超える、例えば９９％以上であるアミノ酸配列のみからなる群から選択される、請求項１２〜２５のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２７】
ヒト化されたナノボディ（登録商標）である、請求項１２〜２６のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２８】
配列番号３２０〜４４７のみからなる群から選択される、請求項１２〜２６のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）。
【請求項２９】
請求項１〜１１のいずれかに記載の１以上のアミノ酸配列および／もしくは請求項１２〜２８のいずれかに記載の１以上のナノボディーズ（登録商標）を含み、または本質的にのみからなり、かつ場合によっては、１以上のリンカーを介して任意に結合した１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位を更に含む化合物もしくは構造体。
【請求項３０】
前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位がアミノ酸配列である、請求項２９に記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３１】
前記１以上のリンカーが、もし存在する場合には、１以上のアミノ酸配列である、請求項２９もしくは３０に記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３２】
前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が免疫グロブリン配列である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３３】
前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が、領域抗体、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単領域抗体、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、「dAb」のどれか、「dAb」として使用するのに好適なアミノ酸配列、またはナノボディーズ（登録商標）のみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２９〜３２のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３４】
本発明の前記１以上のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である、請求項２９〜３３のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３５】
本発明の前記１以上のアミノ酸配列が、領域抗体、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単領域抗体、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、「dAb」のどれか、「dAb」として使用するのに好適なアミノ酸配列、またはナノボディーズ（登録商標）のみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２９〜３４のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３６】
本発明の前記１以上のアミノ酸配列が請求項１２〜２８のいずれかに記載の１以上のナノボディーズ（登録商標）を含み、または本質的にのみからなり、かつ前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位がナノボディーズ（登録商標）である、化合物もしくは構造体。
【請求項３７】
多価構造体である、請求項２９〜３６のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３８】
多重特異性構造体である、請求項２９〜３７のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項３９】
前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が治療に関連する標的に結合することを特徴とする、請求項２９〜３８のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４０】
前記治療に関連する標的がTNF-αであることを特徴とする、請求項３９記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列自体もしくは請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）自体に比較して、半減期が上昇している請求項２９〜４０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列自体もしくは請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）自体に比較して、半減期が上昇している化合物もしくは構造体が前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位によって得られることを特徴とする、請求項４１に記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４３】
半減期が上昇している化合物もしくは構造体が得られる前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が、血清タンパク質もしくはそれの断片、血清タンパク質に結合可能な結合性単位、Fc部分、および血清タンパク質に結合可能な小型のタンパク質もしくはペプチドのみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４１もしくは４２に記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４４】
半減期が上昇している化合物もしくは構造体が得られる前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が、ヒト血清アルブミンもしくはそれの断片のみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４１〜４３のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４５】
半減期が上昇している化合物もしくは構造体が得られ前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）に結合可能な結合性単位もしくは血清免疫グロブリン（例えばIgG）のみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４１〜４４のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４６】
半減期が上昇している化合物もしくは構造体が得られる前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が、領域抗体、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単領域抗体、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、「dAb」のどれか、「dAb」として使用するのに好適なアミノ酸配列、または血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）もしくは血清免疫グロブリン（例えばIgG）に結合可能なナノボディーズ（登録商標）のみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４１〜４５のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４７】
半減期が上昇している化合物もしくは構造体が得られる前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）もしくは血清免疫グロブリン（例えばIgG）に結合可能なナノボディーズ（登録商標）であることを特徴とする、請求項４１〜４６のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４８】
血清中半減期が、請求項１〜１１のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列自体もしくは請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）自体のそれぞれの半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、もしくは２０倍を超えて大きい、請求項４１〜４７のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項４９】
血清中半減期が、請求項１〜１１のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列自体もしくは請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）自体のそれぞれと比較して、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、更に好ましくは６時間を越えて、例えば１２時間を越えて、または２４、４８もしくは７２時間を越えて増大されている、請求項４１〜４８のいずれかに記載の化合物もしくは構造体。
【請求項５０】
ヒトでの血清中半減期が、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも約２４時間、更に好ましくは少なくとも約４８時間、一層更に好ましくは少なくとも約７２時間以上である、請求項４１〜４９のいずれかに記載の化合物もしくは構造体；例えば、本発明化合物もしくは構造体の半減期は、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、更に好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１６日）、または、少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、更に好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日を超え（例えば約１４〜１９日）ることができる。
【請求項５１】
請求項１〜１１のいずれかに記載の１個のアミノ酸配列および／または請求項１２〜２８のいずれかに記載の１個のナノボディ（登録商標）を含むもしくは本質的にのみからなる一価構造体。
【請求項５２】
本発明の前記アミノ差配列が、領域抗体、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単領域抗体、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、「dAb」のどれか、「dAb」として使用するのに好適なアミノ酸配列、またはナノボディーズ（登録商標）のみからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５１に記載の一価構造体。
【請求項５３】
請求項１２〜２８のいずれかに記載の１個のナノボディ（登録商標）を含むもしくは本質的にのみからなる一価構造体。
【請求項５４】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体をコードする核酸配列もしくはヌクレオチド配列。
【請求項５５】
遺伝子構造体の形態にある、請求項５４に記載の核酸配列もしくはヌクレオチド配列。
【請求項５６】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体を発現するかもしくは適切な環境下で発現可能であり、および／または、請求項５４もしくは５５に記載の核酸配列もしくはヌクレオチド配列を含む、宿主もしくは宿主細胞。
【請求項５７】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体の製造方法であって、以下の工程：
ａ）請求項５４もしくは５５に記載の核酸配列もしくはヌクレオチド配列を適切な宿主細胞もしくは宿主生物、または他の適切な発現系において発現する、
任意に続いて、
ｂ）得られた請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体を単離および／もしくは精製する、
を少なくとも含む方法。
【請求項５８】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体の製造方法であって、以下の工程：
ａ）請求子５６に記載の宿主もしくは宿主細胞を、該宿主もしくは宿主細胞が請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体を発現および／もしくは生産する条件の下で培養および／もしくは維持する、
任意に続いて、
ｂ）得られた請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体を単離および／もしくは精製する、
を少なくとも含む方法。
【請求項５９】
請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体、または、請求項５４もしくは５５に記載の核酸配列もしくはヌクレオチド配列、を含む組成物。
【請求項６０】
医薬組成物である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
医薬組成物であって、更に少なくとも一つの医薬的に受容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／もしくは補助剤を含み、かつ任意に１以上の更なる医薬的に活性なポリペプチドおよび／もしくは化合物を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体、および／または、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル経路および／もしくは生物学的な機能および応答に関連する少なくとも一つの疾患および／もしくは疾病を予防および／もしくは治療する方法であって、この予防および／もしくは治療を必要とする患者対象に、請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体、あるいは請求項５９〜６１のいずれかに記載の組成物、の医薬的に活性な量を投与することを含む方法。
【請求項６３】
IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体、および／または、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル経路および／もしくは生物学的な機能もしくは応答に関連する少なくとも一つの疾患および／もしくは疾病が、敗血症、種々の形態の癌、骨吸収、骨粗しょう症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポシ肉腫、AIDS関連リンパ腫、および炎症性疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記種々の形態の癌が、多発性骨髄腫疾患（MM)、腎細胞癌（RCC）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Bリンパ増殖性疾患（BLPD）、および前立腺癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、全身発症性若年性特発関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（SLE)、多発性硬化症、カッスルマン疾患、IgM高ガンマグロブリン血症、心臓性粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真性糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体、および／または、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル経路および／もしくは生物学的な機能、薬理学的活性および応答に関連する少なくとも一つの疾患および／もしくは疾病を予防および／もしくは治療する方法であって、この予防および／もしくは治療を必要とする患者対象に、請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体、あるいは請求項５９〜６１のいずれかに記載の組成物、の医薬的に活性な量を投与することを含む方法。
【請求項６７】
請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体を、予防および／もしくは治療を必要とする患者対象に、投与することによって予防および／もしくは治療が可能な少なくとも一つの疾患および／もしくは疾病を予防および／もしくは治療する方法であって、この予防および／もしくは治療を必要とする患者対象に、請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体、あるいは請求項５９〜６１のいずれかに記載の組成物、の医薬的に活性な量を投与することを含む方法。
【請求項６８】
免疫治療の方法であって、この治療を必要とする患者対象に、請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体、あるいは請求項５９〜６１のいずれかに記載の組成物、の医薬的に活性な量を投与することを含む方法。
【請求項６９】
IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体、および／または、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル経路および／もしくは生物学的な機能、薬理学的活性および応答に関連する少なくとも一つの疾患および／もしくは疾病を予防および／もしくは治療するための、および／または、請求項６２〜６８に記載の１以上の方法において使用するための、医薬組成物を製造するために請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも一つのアミノ酸配列、請求項１２〜２８のいずれかに記載のナノボディ（登録商標）、請求項２９〜５０のいずれかに記載の化合物もしくは構造体、または請求項５１〜５３のいずれかに記載の一価構造体の使用。
【請求項７０】
IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体、および／または、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル経路および／もしくは生物学的な機能、薬理学的活性および応答に関連する少なくとも一つの疾患および／もしくは疾病が、敗血症、種々の形態の癌、多発性骨髄腫疾患（MM)、腎細胞癌（RCC）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Bリンパ増殖性疾患（BLPD）、前立腺癌、骨吸収、骨粗しょう症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポシ肉腫、AIDS関連リンパ腫、炎症性疾患、慢性関節リウマチ、全身発症性若年性特発関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（SLE)、多発性硬化症、カッスルマン疾患、IgM高ガンマグロブリン血症、心臓性粘液腫、喘息、アレルギー性喘息および自己免疫インシュリン依存性真性糖尿病からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン-6（IL-6）を標的と（本明細書で定義）するアミノ酸配列に関し、ならびにそのアミノ酸配列の１以上を含む、もしくは本質的にのみからなる化合物もしくは構造体、特にタンパク質およびポリペプチド（それぞれ、「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」、および「本発明のポリペプチド」とも言う）に関する。
【０００２】
また、本発明は、これらアミノ酸配列およびポリペプチドをコードする核酸（「本発明の核酸」もしくは「本発明のヌクレオチド配列」とも言う）に関し、これらアミノ酸配列およびポリペプチドを製造する方法に関し、これらアミノ酸配列もしくはポリペプチドを発現するもしくは発現することができる宿主細胞に関し、これらアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、および／もしくは宿主細胞を含む組成物、特に医薬組成物に関し、および、これらアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、および／もしくは組成物の、特に予防、治療もしくは診断の目的、例えば本明細書に記載の予防、治療もしくは診断の目的への使用に関する。
【０００３】
本発明のその他の側面、実施態様、利点および適用は、本明細書の更なる記述から明瞭となる。
【背景技術】
【０００４】
IL-6は、最初はB細胞分化因子 (Hirano et al., 1985; EP0257406) として同定されたタンパク質であり、IL-6R(Yamasaki et al., 1988; EP0325474)と相互作用するとIL-6／IL-6R複合体を形成する。この複合体は標的細胞の上の膜タンパク質であるgp130(Taga et al., 1989; EP0411946)に結合するので、このタンパク質によってIL-6の種々の生理学的な活性が伝達される。現在、IL-6はとりわけ免疫応答、造血、急性相の応答、骨代謝、新脈管形成、および炎症の制御に関与することが知られている。自己免疫性および慢性炎症性の増殖疾患におけるいくつかの病理的プロセスにはIL-6産生の調節低下が関係している(Ishihara and Hirano, 2002)。その結果、IL-6によって誘起されるシグナル伝達に対する阻害剤が注目されてきた(Hirano et al., 1990).。IL-6 (Klein et al., 1991; EP0312996)、IL-6R (EP0409607),もしくはgp130 (Saito et al., 1993; EP0572118)に特異的に結合するポリペプチドが、IL-6の機能発揮に効果的な阻害効果を示すことが証明された。
【０００５】
IL-6の過剰産生およびシグナル伝達（特にいわゆるトランスシグナル伝達）は種々の疾患および疾病、例えば、敗血症(Starnes et al., 1999)および種々の形態の癌、例えば多発性骨髄腫（MM)、腎細胞癌（RCC）、形質細胞性白血病(Klein et al., 1991)、リンパ腫、B-リンパ増殖性疾病（BLPD)、および前立腺癌に関与している。IL-6の産生過剰とシグナル伝達が原因の他の疾患および疾病には、骨吸収（骨粗しょう症）(Roodman et al., 1992; Jilka et al., 1992)、悪液質(Strassman et al., 1992)、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポシ肉腫、AIDS関連リンパ腫(Emilie et al., 1994)、炎症性疾患および疾病、例えば慢性関節リウマチ、全身発症性若年性特発関節炎、高ガンマグロブリン血症(Gr au et al., 1990)など、クローン疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症、カッスルマン疾患、IgM高ガンマグロブリン血症、心臓性粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）、および自己免疫インシュリン依存性真性糖尿病(Campbell et al., 1991)が挙げられるが、これらに限定されない。他のIL-6関連質病は当業者には明瞭である。
【０００６】
例えば上記参照資料から判るように、従来技術では、ヒトIL-6を標的とする、ヒトIL-6Rを標的とする、およびヒトgp130タンパク質を標的とする抗体および抗体断片をIL-6関連疾病の予防と治療の目的に記述している。例えば、Tocilizumab (参照 Woo P, et al. Arthritis Res Ther. (2005) 7: 1281-8, Nishimoto N et al. Blood. (2005) 106: 2627-32, Ito H et al. Gastroenterology. (2004) 126: 989-96, Choy EH et al. Arthritis Rheum. (2002) 46: 3143-50.)、 BE8 (参照 Bataille R et al. Blood (1995) 86:685-91, Emilie D et al. Blood (1994) 84:2472-9, Beck JT et al. N Engl J Med. (1994) 330:602-5, Wendling D et al. J Rheumatol. (1993) 20:259-62.)、 および CNTO-328 of Centocor (参照 Journal of Clinical Oncology, (2004) 22/14S: 2560; Journal of Clinical Oncology, (2004) 22/14S: 2608; Int J Cancer (2004) 111:592-5)である。IL-6関連疾病を予防し治療するもう一つの従来技術で公知の活性成分は、可溶性gp130のFc融合体である(参照 Becker C et al. Immunity. (2004) 21: 491-501, Doganci A et al. J Clin Invest. (2005) 115:313-25, Nowell MA et al. J Immunol. (2003) 171: 3202-9., Atreya R et al. Nat Med. (2000) 6:583-8).。
【特許文献１】EP0257406公報
【特許文献２】EP0325474公報
【特許文献３】EP0411946公報
【特許文献４】EP0312996公報
【特許文献５】EP0409607公報
【特許文献６】EP0572118公報
【非特許文献１】Woo P, et al. Arthritis Res Ther. (2005) 7: 1281-8,
【非特許文献２】Nishimoto N et al. Blood. (2005) 106: 2627-32,
【非特許文献３】Ito H et al. Gastroenterology. (2004) 126: 989-96,
【非特許文献４】Choy EH et al. Arthritis Rheum. (2002) 46: 3143-50.)、
【非特許文献５】Bataille R et al. Blood (1995) 86:685-91,
【非特許文献６】Emilie D et al. Blood (1994) 84:2472-9,
【非特許文献７】Beck JT et al. N Engl J Med. (1994) 330:602-5,
【非特許文献８】Wendling D et al. J Rheumatol. (1993) 20:259-62.)、
【非特許文献９】Journal of Clinical Oncology, (2004) 22/14S: 2560;
【非特許文献１０】Journal of Clinical Oncology, (2004) 22/14S: 2608;
【非特許文献１１】Int J Cancer (2004) 111:592-5)
【非特許文献１２】Becker C et al. Immunity. (2004) 21: 491-501,
【非特許文献１３】Doganci A et al. J Clin Invest. (2005) 115:313-25,
【非特許文献１４】Nowell MA et al. J Immunol. (2003) 171: 3202-9.,
【非特許文献１５】Atreya R et al. Nat Med. (2000) 6:583-8).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明のポリペプチドおよび組成物を使用すれば、一般に、IL-6のIL-6Rへの結合を調節でき、特に阻害および／もしくは防止でき、したがってIL-6および／もしくはIL-6Rが介在するシグナル伝達を調節でき、特に阻害および／もしくは防止でき、IL-6および／もしくはIL-6Rが関与する生物学的経路を調節でき、および／または、このシグナル伝達もしくはこれら経路に関連する生物学的メカニズム、応答および効果を調節することができる。
【０００８】
かくのごとく、本発明のポリペプチドおよび組成物は、IL-6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病、例えばインターロイキン-6（「IL-6」）に関連する、および／もしくはIL-6／IL-6R複合体に関連する、および／またはインターロイキン-6（「IL-6」）および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル伝達経路および／もしくは生物学的機能および応答に関連する疾患および疾病の予防および／もしくは治療（本明細書で定義）に使用することができる。一般に、「IL-6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病」とは、予防および／もしくは治療を必要としている（すなわちその疾患および疾病もしくはそれの少なくとも一つの症候を有するおよび／またはその疾患および疾病を誘引もしくは顕現する危険にある）患者対象に、本発明のポリペプチドもしくは組成物（特に、医薬的に活性な量の）および／またはIL-6もしくはIL-6が関与する生物学的な経路もしくはメカニズムに対し活性な公知の活性成分（特に、医薬的に活性な量の）を適切に投与することによって予防および／もしくは治療できる疾患および疾病であると定義することができる。そのようなIL-6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病の例は、本明細書の開示に基けば当業者には明瞭であり、例えば次の疾患および疾病、すなわち敗血症、種々の形態の癌、例えば多発性骨髄腫疾患（MM)、腎細胞癌（RCC）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Bリンパ増殖性疾患（BLPD）、前立腺癌、骨吸収（骨粗しょう症）、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポシ肉腫、AIDS関連リンパ腫、炎症性疾患もしくは疾病、例えば慢性関節リウマチ、全身発症性若年性特発関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（SLE)、多発性硬化症、カッスルマン疾患、IgM高ガンマグロブリン血症、心臓性粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）および自己免疫インシュリン依存性真性糖尿病、が挙げられる。
【０００９】
特に、本発明ポリペプチドおよび組成物を使用すれば、IL-6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病、すなわちIL-6もしくはIL-6が関与する経路が介在する過大で望ましくないシグナル伝達を特徴とする疾患および疾病を予防および治療することができる。そのようなIL-6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病の例は、本明細書の開示に基けば当業者には明瞭である。
【００１０】
特に、本発明ポリペプチドおよび組成物を疾患および疾病に使用すれば、その利益は、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体が関与するシグナル伝達経路および／もしくは生物学的な機能および応答を調節することによって得られる。一般に、これら疾患および疾病の特徴は、IL-6および／もしくはIL-6／IL-6R複合体に関連するシグナル伝達が異常であり、望ましくなく、増大しおよび／もしくは減退していることである。
【００１１】
更に特に、本発明ポリペプチドおよび組成物を疾患および疾病に使用すれば、その利益は、IL-6とIL-6の間の、および／またはIL-6／IL-6R複合体とgp130の間の相互作用を調節することによって得られる。
【００１２】
上記の（本明細書で集合的に「IL-6関連疾病」または「IL-6介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病」、二つの用語は本明細書での記述で互換的に使用される）と言う疾患および疾病の例は、従来技術。例えば本明細書で以下に示す背景技術に基けば当業者に明瞭である。
【００１３】
本発明のポリペプチドおよび製造物を使用すれば、一般に、IL-6のIL-6Rへの結合および／もしくはIL-6／IL-6R複合体のgp130への結合を調節でき、特に阻害および／もしくは防止でき、したがってIL-6介在シグナル伝達もしくはIL-6／IL-6R複合体介在シグナル伝達を調節でき、特に阻害および／もしくは防止でき、および／またはこのようなシグナル伝達に関連する生物学的な応答および効果を調節することができる。かくのごとく、本発明のポリペプチドおよび製造物は、IL-6関連疾病、特に過剰で望ましくないIL-6介在シグナル伝達を特徴とするIL-6関連疾病の予防および治療に使用することができる。
【００１４】
したがって、限定されないが、本発明アミノ酸配列およびポリペプチドを使用すれば、現在IL-6介在シグナル伝達を調節可能な活性成分、例えば上に引用した従来技術での活性成分で予防もしくは治療している疾患および疾病を全て予防もしくは治療することができる。本発明ポリペプチドを使用すれば、前記活性成分による治療が現在開発途上にあり、治療が提案されており、もしくは今後治療が提案もしくは開発される筈の疾患および疾病を全て予防もしくは治療できるとも考えられる。更に、これら公知の活性成分を使用中でありまたは提案もしくは開発予定である疾患および疾病以外の他の疾患および疾病も本発明ポリペプチドを使用すれば、本明細書に記述のその特異な性質のゆえに予防および治療されると考えられる。および／または、本発明ポリペプチドにより本明細書に記載の疾患および疾病を治療する新しい方法およびレジメが提供されると考えられる。
【００１５】
本発明のアミノ酸配列およびポリペプチドの他の適用および用途は本明細書の記載に基けば当業者には明瞭である。
【００１６】
一般に、本発明の目的は、上記を含有し、IL-6関連疾病および本明細書に記載の他の疾患および疾病の診断、予防および／もしくは治療に使用可能な薬理学的に活性な薬剤ならびに組成物の提供であり、および、かような疾患および疾病を診断、予防および／もしくは治療する方法であって、上記薬剤および組成物の使用および／もしくは投与を含む方法の提供である。
【００１７】
特に、本発明の目的は、現在使用しておりおよび／もしくは従来公知の薬剤、組成物、および／もしくは方法と比較してある種の利点が得られる薬理学的に活性な薬剤、組成物、および／もしくは方法の提供である。そのような利点は以下の記述から明瞭となる。
【００１８】
更に特に、本発明の目的は、薬理学的に活性な薬剤として使用可能な治療性タンパク質、ならびにそれを含有する組成物をIL-6関連疾病および本明細書に記載のその他の疾患および疾病を診断、予防および／もしくは治療するために提供すること、およびその疾患および疾病を診断、予防および／もしくは治療する方法であって、上記薬剤および組成物を使用および／もしくは投与することを含む方法の提供である。本発明において、これら治療性タンパク質は、アミノ酸配列、（単）領域抗体、および／もしくは特にナノボディーズ（登録商標）であり、および／またはこれらを基礎とするもしくはそれらを含むポリペプチドもしくはタンパク質であり、以下に記載する。
【００１９】
一般に、本発明においてこれら目的は、本明細書に記載のアミノ酸配列、ナノボディーズおよびポリペプチドを使用することによって達成される。
【００２０】
したがって、本発明の特異な目的は、JL-6を標的とする（本明細書で定義）、特に温血動物由来のIL-6を標的とする、更に特に哺乳動物由来のIL-6を標的とする、および特別にヒトIL-6を標的とするアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズの提供であり、および、このアミノ酸配列および／もしくはナノボディの少なくとも一つを含むもしくは本質的にのみからなるタンパク質およびポリペプチドの提供である。
【００２１】
特に、本発明の特異な目的は、温血動物において、および特に哺乳動物において、更に特にヒトにおいて、予防、治療および／もしくは診断の使用に適したアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびタンパク質および／もしくはポリペプチドの提供である。
【００２２】
更に特に、本発明の目的は、温血動物において、および特に哺乳動物において、更に特にヒトにおいて、IL-6に関連したおよび／もしくはIL-6が介在する１以上の疾患、疾病および条件（例えば本明細書に記載の疾患、疾病および条件）の予防、治療、緩和および／もしくは診断に使用可能なアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびタンパク質および／もしくはポリペプチドの提供である。
【００２３】
また本発明の目的は、温血動物において、および特に哺乳動物において、更に特にヒトにおいて、IL-6に関連したおよび／もしくはIL-6が介在する１以上の疾患、疾病および条件（例えば本明細書に記載の疾患、疾病および条件）の予防および／もしくは治療のための医薬組成物もしくは動物薬組成物の製造に使用可能なアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびタンパク質および／もしくはポリペプチドの提供である。
【００２４】
本発明の特異で非限定的な目的は、IL-6もしくはその断片、例えばFab'断片、F（ab'）２断片、ScFv構造体に対する通常の抗体、「ダイアボディース」および／もしくは他のクラスの（単）領域抗体、例えばWardら（上記）が記述している「dAb's」と比較した場合に、進んだ治療的および／もしくは薬理学的特性および／または他の有利な（例えば製造が易しくなりおよび／もしくは商品コストが下がった）特性を有するIl-6を標的とするアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、タンパク質および／もしくはポリペプチドの提供である。これらの進んだ有利な特性は本明細書の他の記述から明瞭であり、例えば以下の１以上が挙げられるが、それに限定されない。
−  IL-6に対する親和性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において増加；
−  構造化への適性が、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）において向上；
−  構造化への適性が、多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において向上；
−  「ヒト化」の置換（本明細書で定義）への適合性もしくは感受性が改善；
−  免疫原性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または一価フォーマット体における多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において低下；
−  安定性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または一価フォーマット体における多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において増加；
−  Il-6に対する特異性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において増加；
−  異なる種に由来するIL-6との交差反応性が減少、もしくは望ましい場合には増加；
および／または、
−  医薬的用途（例えば予防用途および／もしくは治療用途）および／または診断用途（例えば限定されないが画像化目的の用途）に望ましい他の１以上の特性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または一価フォーマット体における多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において向上。
【００２５】
一般にこれらの目的を達成するには、本明細書に記載のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、タンパク質、ポリペプチドおよび組成物を使用する。これらのアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズも本明細書において「本発明のアミノ酸配列」および／もしくは「本発明のナノボディーズ」と言い、およびこれらのタンパク質およびポリペプチドおよび組成物も本明細書において集合的に「本発明のポリペプチド」および「本発明の組成物」と言う。
【００２６】
一般に本発明は、IL-6を標的とする（本明細書で定義）および／もしくは特異的に結合するアミノ酸配列、ならびにそのようなアミノ酸配列を少なくとも一つ含む化合物もしくは構造体、特にタンパク質およびポリペプチドを提供する。
【００２７】
一般に本発明は、本明細書に定義する親和性（適切に測定した、および／または、(実際のもしくは見かけの)KD値、(実際のもしくは見かけの)KA値、kon率および／もしくはkoff率として、または代わりに本明細書で別に記載するIC50値として表現される）をもってIL-6に結合可能なアミノ酸配列、ならびにそのようなアミノ酸配列を少なくとも一つ含む化合物もしくは構造体、特にタンパク質およびポリペプチドを提供する。
【００２８】
特に、本発明のアミノ酸配列およびポリペプチドがIL-6に結合するにあたって、その解離定数（KD）は10-5〜10-12mol／L以下、好ましくは10-7〜10-12mol／L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol／L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol／L（すなわち会合定数（KA）は105〜1012l／mol以上、好ましくは107〜1012l／mol以上、更に好ましくは108〜1012l／mol）である；
および／または、それらがIL-6に結合するにあたって、そのｋon率は102M-1ｓ-1〜約107M-1ｓ-1、好ましくは103M-1ｓ-1〜107M-1ｓ-1、更に好ましくは104M-1ｓ-1〜107M-1ｓ-1、例えば105M-1ｓ-1〜107M-1ｓ-1である；
および／または、それらがIL-6に結合するにあたって、そのｋoff率は１ｓ-1〜10-6ｓ-1（複数日のｔ1/2にて殆ど不可逆な複合体が得られる）、好ましくは10-2ｓ-1〜10-6ｓ-1、更に好ましくは10-3ｓ-1〜10-6ｓ-1、例えば10-4ｓ-1〜10-6ｓ-1である。
【００２９】
本発明のアミノ酸配列（もしくは本発明のアミノ酸配列を唯１個だけ含むポリペプチド）がIL-6に結合するにあたって、その結合の親和性は５００nm未満、好ましくは２００nm未満、更に好ましくは１０nm未満、例えば５００pMである。
【００３０】
本発明のアミノ酸配列もしくはポリペプチドがIL-6に結合するための好ましいIC５０値は本明細書の詳細説明および実施例から明瞭となる。
【００３１】
IL-6に結合するに当たって、本発明のアミノ酸配列は、通常そのアミノ酸配列中に１以上のアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の１以上の連続(すなわち、各「連続」はアミノ酸配列の１次ないし３次構造において相互に隣接するもしくは相互に接近する２以上のアミノ酸残基を含み)を含有し、それらを介して本発明のアミノ酸配列はIL-6に結合することができるので、それらアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の連続によってIL-6に結合するための「部位」(本明細書において「抗原結合部位」とも言う)が形成される。
【００３２】
本発明が提供するアミノ酸配列は、本質的に単離された形態（本明細書で定義）であるのが好ましく、または本発明タンパク質もしくはポリペプチドの部分（本明細書で定義）を形成し、そのタンパク質もしくはポリペプチドは１以上の本発明アミノ酸配列を含むもしくは本質的にのみからなってよく、場合によっては更に１以上の他のアミノ酸配列（場合によっては全て１以上の適切なリンカーを介して連結する）からなってもよい。例えば、限定されないが、１以上の本発明アミノ酸配列が本発明タンパク質もしくはポリペプチドにおける結合単位として使用され、場合によっては１以上の他のアミノ酸配列が該タンパク質もしくはポリペプチドに含まれてよく、それが（IL-6以外の１以上の他の標的に対する）結合単位として機能し、その結果、本発明の一価、多価もしくは多重特異性ポリペプチドが全てそれぞれ本明細書に記載のごとく得られる。このようなタンパク質もしくはポリペプチドも本質的に単離された形態（本明細書で定義）であってよい。
【００３３】
このような本発明タンパク質もしくはポリペプチドは、シスルフィド架橋を介して他のアミノ酸配列もしくは鎖に連結していない単独のアミノ酸鎖のみからなるのが好ましい（しかし１以上の分子内シスルフィド架橋であれば含んでも含まなくてもよい。例えば、ナノボディーズは本明細書に記載のごとくCDR3とCDR1もしくはCDR2との間にシスルフィド架橋を時折含むことがあるのは知られている）。しかしながら、留意すべきこととして、１以上の本発明アミノ酸配列は相互におよび／もしくは他のアミノ酸配列と（例えばシスルフィド架橋を介して）連結し、それによって本発明においてやはり有用なペプチド構造体が得られてもよい（例えば、Fab'断片、F(ab')2断片、ScFv構造体、「ダイアボディーズ」および他の多重特異性構造体。例えばHolliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9): 1126-36によるレビューを参照）。
【００３４】
一般に、本発明アミノ酸配列（またはそれを含む化合物、構造体もしくはポリペプチド）を被検体に(例えば本明細書に記載の治療および／もしくは診断の目的で）投与しようとするときには、そのアミノ酸配列は該被検体にもともと存在しないアミノ酸配列であるか、もしくは、該被検体にもともと存在する場合には本質的に単離された形態（本明細書に定義）であるのが好ましい。
【００３５】
したがって、第一の態様において、本発明は、IL-6を標的とするアミノ酸配列および／もしくはナノボディ、特に温血動物由来のIL-6に対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディ、更に特に温血動物由来のIL-6に対するナノボディ、および特別にヒトIL-6に対するナノボディに関する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、IL-6を標的とするかようなアミノ酸配列および／もしくはナノボディの少なくとも一つを含む、もしくは本質的にのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドに関する。
【００３７】
当業者には明瞭なことであるが、医薬用途の場合には本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（ならびにそれを含む本発明の化合物、構造体およびポリペプチド）はヒトIL-6を標的とするのが好ましく、動物薬目的の場合には、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドは治療対象の種に由来のIL-6を標的とするが、もしくは治療対象の種に由来のIL-6と少なくとも交差反応するのが好ましい。
【００３８】
更に、本発明のアミノ酸配列は、任意におよびIL-6に結合するための少なくとも一つの結合部位の外に、他の抗原、タンパク質もしくは標的に結合するための1以上の別の結合部位を含んでもよい。
【００３９】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチド、およびそれらを含む組成物の有効性をテストするに当たって、適切なインビトロの測定法、細胞系の測定法、インビボの測定法、および／もしくは自体公知の動物モデル、またはこれらの組合せを、特定の疾患もしくは疾病に応じて使用することができる。適切な測定法および動物モデルは当業者には明瞭であり、例えばIL-6に依存性の細胞株、例えばB6、XG1および7TD1を使用する増殖測定法、コラーゲンで誘導した関節炎モデル、SCIDマウスの関節滑液組織の移植モデル、種々のヒト癌、例えばリンパ腫、黒色腫、前立腺癌および腎細胞腫の異種間移植モデル、IBDモデル、例えばTNBS、DSSおよびIL-10ノックアウトモデル、ならびに、以下の実験の部および本明細書に引用の従来技術で使用される測定法および動物モデルが挙げられる。
【００４０】
本発明が提供するアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、本質的に単離された形態（本明細書で定義）であるのが好ましく、または本発明タンパク質もしくはポリペプチドの部分（本明細書で定義）を形成し、そのタンパク質もしくはポリペプチドは１以上の本発明アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズを含むもしくは本質的にのみからなってよく、場合によっては更に１以上の他のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（全て場合によっては１以上の適切なリンカーを介して連結する）からなってもよい。例えば、限定されないが、１以上の他のナノボディーズであって、それが（IL-6以外の１以上の他の標的に対する）結合単位として機能し、その結果、本発明の一価、多価もしくは多重特異性ポリペプチドが全てそれぞれ本明細書に記載のごとく得られる。このようなタンパク質もしくはポリペプチドも本質的に単離された形態（本明細書で定義）であってよい。
【００４１】
また、本発明によれば、温血動物の第一の種に由来するIL-6を標的とするナノボディーズおよびポリペプチドは、温血動物の１以上の他の種に由来するIL-6には交差反応性を呈しても呈さなくてもよい。例えば、ヒトIL-6を標的とするナノボディーズおよびポリペプチドは、霊長類の１以上の他の種（例えば、限定されないが、マカカ（Macaca）属モンキー(例えば特にカニクイザル（Macaca fascicularis）および／もしくはベンガルザル（Macaca mullatta）およびヒヒ（Papio ursinus）)に由来するIL-6、および／または疾患の動物モデル、特にIL-6に関連する疾患および疾病の動物モデル（本明細書に記載の種および動物モデル）においてしばしば使用される動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、もしくはイヌ）の1以上の種に由来するIL-6、と交差反応性を呈しても呈さなくてもよい。これに関し当業者に明瞭なこととして、このような交差反応性が存在する場合にはそれは医薬品開発の観点からすると有利なことである。何故かと言うと交差反応性が存在すればナノボディーズおよびポリペプチドがそれら疾患モデルにおいてIL-6を標的としてテスト可能になるからである。
【００４２】
更に一般的に、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドは、哺乳動物の多数の種に由来するIL-6と交差反応する場合には、動物薬の用途に使用するには通常は有利である。何故かと言うと、そのナノボディもしくはポリペプチドは多数の種にわたって利用可能であるからである。したがって、一つの動物種に由来するIL-6に対するナノボディーズもしくはポリペプチド（例えばヒトIL-6に対するナノボディーズもしくはポリペプチド）は、別の動物種の治療に使用できるということも本発明の範囲に包含される。ただしそのナノボディーズおよび／もしくはポリペプチドによってその治療対象の種に望ましい効果が得られる限りである。
【００４３】
最も広い意味において、本発明は、本発明のアミノ酸配列、および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドが標的とするIL-6の特定の抗原性決定基、エピトープ、部分、領域、サブユニットもしくは確認箇所（適用可能な場合）に限定もされずあるいは特定もされない。本発明によって提供される範囲のアミノ酸配列、および／もしくはナノボディーズはIL-6の種々異なるエピトープもしくは結合部位を標的としているので、有利である。
【００４４】
したがって、本発明の提供は以下である：
−非阻害性のナノボディーズPMP6D5（配列番号３２０）およびPMP8F2（配列番号３２１）。
−IL-6／IL-6Rの相互作用部位と相互作用する阻害性ナノボディーズ：
PMP6B12 (配列番号: 322 ), 
PMP6B6 (配列番号: 323), 
PMP11C1 (配列番号: 324), 
PMP23H2 (配列番号: 325), 
PMP7G4 (配列番号: 326), 
PMP20D2 (配列番号: 327 ), 
PMP7G5 (配列番号: 328 ), 
PMP7H3 (配列番号: 329 ), 
PMP7G9 (配列番号: 330 ), 
PMP9A9 (配列番号: 331 ), 
PMP22E3 (配列番号: 332 ), 
PMP6E10 (配列番号: 333 ), 
PMP6G10 (配列番号: 334 ); 
−gp130の結合部位IIと相互作用する阻害性ナノボディーズ：
NC3 (配列番号: 335), 
NC6 (配列番号: 336), 
PMP13A1 (配列番号: 337), 
PMP20G9 (配列番号: 338), 
PMP20F4 (配列番号: 339), 
PMP21A7 (配列番号: 340), 
PMP13D8 (配列番号: 341), 
PMP21E12 (配列番号: 342), 
PMP21C12 (配列番号: 343), 
PMP21C2 (配列番号: 344 ), 
PMP14G4 (配列番号: 345 ), 
PMP14E1 (配列番号: 346), 
PMP6E9 (配列番号: 347), 
PMP12H3 (配列番号: 348), 
PMP12C5 (配列番号: 349), 
PMP17G7 (配列番号: 350), 
PMP14G11 (配列番号: 351), 
PMP9F9 (配列番号: 352), 
PMP14A8 (配列番号: 353), 
PMP17B5 (配列番号: 354), 
PMP6B7 (配列番号: 355), 
PMP14E9 (配列番号: 356), 
PMP17D7 (配列番号: 357) 
PMP14G1 (配列番号: 358).
−gp130の結合部位IIIと相互作用する阻害性ナノボディーズ：
PMP10C4 (配列番号: 360), 
PMP17C4 (配列番号: 361), 
PMP21B4 (配列番号: 362), 
PMP21H1 (配列番号: 363), 
PMP10A6 (配列番号: 364), 
PMP13H6 (配列番号: 365), 
PMP13Fl2 (配列番号: 366), 
PMP21A2 (配列番号: 367), 
PMP21F7 (配列番号: 368), 
PMP21H3 (配列番号: 369) 
PMP21E7 (配列番号: 370). 
【００４５】
治療用途には、通常は阻害性ナノボディーズ（を１以上含有するポリペプチド）が好ましく、非阻害性ナノボディーズは例えば診断および／もしくは画像化処理の用途に好ましい。
【００４６】
また、本発明によって提供される範囲の多価および多重特異性ポリペプチドは上記ナノボディーズを基礎としている。好ましいが、非限定的な例は配列番号３７１〜４４７の多価および多重特異性のポリペプチドである。
【００４７】
本発明の特別な実施態様は以下に関する：
−IL-6／IL-6Rの相互作用部位と相互作用する少なくとも一つの結合部位（例えばナノボディのよな結合単位）およびgp130の結合部位IIと相互作用する少なくとも一つの結合部位（例えばナノボディのよな結合単位）を含むポリペプチド；
−IL-6／IL-6Rの相互作用部位と相互作用する少なくとも一つの結合部位（例えばナノボディのよな結合単位）およびgp130の結合部位IIIと相互作用する少なくとも一つの結合部位（例えばナノボディのよな結合単位）を含むポリペプチド；
−gp130結合部位IIと相互作用する少なくとも一つの結合部位（例えばナノボディのよな結合単位）およびgp130の結合部位IIIと相互作用する少なくとも一つの結合部位（例えばナノボディのよな結合単位）を含むポリペプチド；
であって、該ポリペプチド中に任意に１以上の他の結合単位および／もしくはアミノ酸配列が含まれ、かつ該ポリペプチド中に存在するこの結合単位および／もしくはアミノ酸配列が任意に1以上のリンカー配列を介して適切に連結されているポリペプチド。
【００４８】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディが適用可能である場合にはIL-6の抗原性決定基、エピトープ、部分、領域、サブユニットもしくは確認箇所の二以上に結合可能であることも本発明の範囲に包含される。そのような場合には、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよび／もしくはポリペプチドが結合するIL-6の抗原性決定基、エピトープ、部分、領域および／もしくはサブユニットは本質的に同一（例えばIL-6は繰り返しの構造単位を含むかもしくは多量体として存在する場合）であってもよいし、あるいは異なってもよい（後者の場合には本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドはIL-6の別々の抗原性決定基、エピトープ、部分、領域、サブユニットに結合してよく、その結合の親和性および／もしくは特異性は同一であっても異なってもよい。また、例えば、IL-6が活性化された立体配座でおよび不活性な立体配座で存在するときには、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドはこれらの立体配座のいずれか一つと結合してもよいし、または両方の立体配座と結合してもよい（すなわちその結合の親和性および／もしくは特異性は同一であっても異なってもよい）。また、例えば、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドは、IL-6が関連リガンドに結合している立体配座にあるIL-6と結合してもよいし、IL-6が関連リガンドに結合していない立体配座にあるIL-6と結合してもよいし、あるいはそれら両方の立体配座に結合してもよい(前と同様にその結合の親和性および／もしくは特異性は同一であっても異なってもよい）。
【００４９】
また、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドは、IL-6の全ての天然のもしくは合成の類似体、改変体、変異体、アリール、部分および断片、または、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドが結合するIL-6中の（例えば野生型IL-6中の）抗原性決定基（複数）もしくはエピトープ(複数)と本質的に同一の１以上の抗原性決定基（複数）もしくはエピトープ(複数)を少なくとも含有するIL-6の類似体、改変体、変異体、アリール、部分および断片に結合することが期待される。このような場合に、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドがこのような類似体、改変体、変異体、アリール、部分および断片に結合する際の親和性および／もしくは特異性は、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズが（野生型）IL-6に結合する際の親和性および特異性と同一であっても、または異なっても（すなわちより高くてももしくはより低くても）よい。IL-6の類似体、改変体、変異体、アリール、部分および断片の中には本発明のナノボディーズおよびポリペプチドが結合するのもあれば、結合しないのもあるということも本発明の範囲に包含される。
【００５０】
IL-6が単量体の形態でおよび１以上の多量体の形態で存在するときに、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドが単量体の形態のIL-6とのみ、多量体の形態のIL-6とのみ、または単量体および多量体の両方の形態と結合することは本発明の範囲に包含される。このような場合に、本発明のアミノ酸配列およびポリペプチドが単量体の形態に結合する際の親和性および／もしくは特異性は、本発明のアミノ酸配列が多量体の形態に結合する際の親和性および特異性と同一であっても、または異なっても（すなわちより高くてももしくはより低くても）よい。
【００５１】
また、IL-6が他のタンパク質もしくはポリペプチドと（例えば多数のサブユニットと)会合してタンパク質複合体を形成できるときには、本発明アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドが非会合状態のIL-6と、会合状態のIL-6と、または両方と結合することは本発明の範囲に包含される。このような場合に、本発明アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドがこのような多量体もしくは会合したタンパク質複合体と結合する際の親和性および／もしくは特異性は、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドが多量体および非会合状態のIL-6に結合する際の親和性および／もしくは特異性と同一であっても、または異なっても（すなわちより高くてももしくはより低くても）よい。
【００５２】
また、当業者に明瞭なことであるが、IL-6を標的とする２以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはポリペプチドがIL-6に結合する傾向性は対応する単量体アミノ酸配列（複数）より高くてもよい。例えば、限定されないが、IL-6の別のエピトープを標的とする２以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはポリペプチドが結合する傾向性は別の単量体の各々より高くてもよい（通常は高い）。またIL-6を標的とする２以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはポリペプチドがIL-6の多量体に結合する傾向性も同様により高くてもよい（通常は高い）。
【００５３】
一般に、当業者に明瞭なことであるが、本発明アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドが少なくとも結合する形態（例えば単量体形態、多量体形態および会合形態）は、生化学的および／もしくは治療的観点から最も関連の深いものである。
【００５４】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドの部分、断片、類似体、変異体、改変体、アリール、および／もしくは誘導体を使用すること、および／または、これら部分、断片、類似体、変異体、改変体、アリール、および／もしくは誘導体の１以上を含むまたは本質的にのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドを使用することは、これらが本明細書で想定する用途に適切である限り、やはり本発明の範囲内にある。これら部分、断片、類似体、変異体、改変体、アリール、および／もしくは誘導体には、IL-6に結合する、好ましくはIL-6に特異的に結合できる、更に好ましくは本明細書で定義の親和性（本明細書で別に記載されるように、適切に測定され、および／もしくは（実際のもしくは見かけの）KD値、（実際のもしくは見かけの）KA値、ｋon率および／もしくはｋoff率として、あるいはIC50値として表現される）をもってIL-6に結合できるための機能的な抗原結合部位(少なくともその部分）が通常は含有される。これら部分、断片、類似体、変異体、改変体、アリール、誘導体、タンパク質および／もしくはポリペプチドの非限定的ないくつかの例は本明細書の記述から明瞭となる。本発明の更なる断片もしくはポリペプチドを得るためには、本明細書に記載の１以上の（比較的に小さな）部分もしくは断片を適切に組み合わせ（すなわち連結もしくは遺伝子融合させ）ればよい。
【００５５】
本明細書で別に記載するが、本発明の特異な、しかし非限定的な態様において、上記の類似体、変異体、改変体、アリール、誘導体は、これらを誘導した元のアミノ酸配列および／もしくはナノボディに比較して血中半減期（本明細書で別に定義）が増大している。例えば本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディを、半減期を延長する１以上の基もしくは構成部分に(化学的その他で)連結して本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディの誘導体を得ると、その半減期が増大していることがある。
【００５６】
特異な、しかし非限定的な態様において、本発明アミノ酸配列は、免疫グロブリンの折り畳み構造を含むアミノ酸配列であってもよく、または好ましい条件（例えば生理学的条件）下で免疫グロブリン折り畳み構造を（すなわち折り畳みによって）形成できるアミノ酸配列であってもよい。Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71の概説をとりわけ参照。上記のアミノ酸配列は、免疫グロブリン折り畳み構造を形成するように適切に折り曲げられれば、IL-6への特異的結合(本明細書で定義)が可能であり、および更に好ましくは、本明細書で定義する親和性（本明細書で別に記載されるように、適切に測定され、および／もしくは（実際のもしくは見かけの）KD値、（実際のもしくは見かけの）KA値、ｋon率および／もしくはｋoff率として、あるいはIC50値として表現される）をもってIL-6に結合することが可能である。また、上記アミノ酸配列の部分、断片、類似体、変異体、改変体、アリール、および／もしくは誘導体は、好ましくは免疫グロブリン折り畳み構造を含有し、または適切な条件下で免疫グロブリン折り畳み構造を形成することができる。
【００５７】
特に、しかし限定されずに、本発明アミノ酸配列は、４個の枠組み構成領域（それぞれFR1〜FR4）および３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR4）のみから本質的になるアミノ酸配列、または、そのようなアミノ酸配列の適切な断片（CDRのどれか少なくとも一つを形成する少なくとも幾つかのアミノ酸残基を通常は含有する）であってよい。
【００５８】
本発明アミノ酸配列は、特に免疫グロブリン配列もしくはそれの適切な断片であってよく、更に特には、免疫グロブリン可変領域配列もしくはそれの適切な断片、例えば軽鎖可変領域配列（例えばVL配列）もしくはそれの適切な断片または重鎖可変領域配列（例えばVH配列）もしくはそれの適切な断片であってよい。本発明アミノ酸配列は、重鎖可変領域配列である場合には、通常の四鎖抗体から誘導される重鎖可変領域配列（例えば、限定されないが、ヒト抗体から誘導されるVH配列）、または、いわゆる「重鎖抗体」(本明細書で定義)から誘導される、いわゆるVHH配列(本明細書で定義)であってよい。
【００５９】
しかしながら、留意すべきこととして、本発明は、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディの(もしくはそれを発現するのに使用される本発明ヌクレオチドの)起源によって限定されないし、また本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはヌクレオチド配列を作成もしくは取得する（もしくはした）方法によっても限定されない。したがって、本発明アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、天然由来（任意の適切な種由来）のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってもよく、あるいは合成もしくは半合成のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってもよく、例えば、限定されないが、「ヒと化」（本明細書で定義）免疫グロブリン配列（例えば部分的にもしくは完全にヒト化したマウスもしくはウサギの免疫グロブリン配列、特に部分的にもしくは完全にヒト化したVHH配列もしくはナノボディーズ）、「ラクダ化」{本明細書で定義）した免疫グロブリン配列、ならびに、抗体の親和性成熟（affinity maturation)（例えば、合成、適宜選択もしくは天然由来の免疫グロブリン配列を出発原料とする）の技術、種々の免疫グロブリン配列から誘導した断片にCDRを移植、接合、組合せる技術、プライマーを重ねるPCR組立て技術、および免疫グロブリン配列を遺伝子操作する当業者に公知の技術等の技術で取得した免疫グロブリン配列、または上記のいずれかの適切な組合せ、が挙げられる。例えば、標準的なハンドブック、ならびに本明細書に記述の詳細説明および先行技術を参照。
【００６０】
同様に、本発明ヌクレオチド配列は、天然由来ヌクレオチド配列または合成もしくは半合成の配列であってよく、および、例えば適切な天然由来の原型からPCRによって単離した配列（例えば細胞から単離したDNAもしくはRNA）、ライブラリー（特に発現ライブラリー）から単離したヌクレオチド配列、天然由来ヌクレオチド配列に変異を導入（自体公知の適切な技術、例えばミスマッチPCRを使用）して調製したヌクレオチド配列、重ね合わせプライマーを使用してPCRにより調製したヌクレオチド配列、または、自体公知のDNA合成技術を使用して調製したヌクレオチド配列、であってよい。
【００６１】
本発明アミノ酸配列は、特に、領域抗体（もしくは領域抗体として使用するのに適切なアミノ酸配列）、  単領域抗体（もしくは単領域抗体として使用するのに適切なアミノ酸配列）、「dAb」（もしくはdAbとして使用するのに適切なアミノ酸配列）またはナノボディ（登録商標）（本明細書で定義、例えば限定されないが、VHH配列）、他の単可変領域、または、これらのいずれか一つの適切な断片、であってよい。（単）領域抗体の一般的な説明には、上に引用した従来技術ならびにEP0368684を参照。「dAbのどれか」の語については、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6), to Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; ならびに例えば WO 06/030220, WO 06/003388 およびDomantis Ltd  の他の公開特許出願を参照。留意すべきこととして、単領域抗体もしくは単可変領域をサメの或る種から誘導することができる（例えば、いわゆる「IgNAR領域」、例えばWO 05／18629）が、ただしこれらは哺乳動物起源ではないので、本発明においてはあまり好ましくはない。
【００６２】
特に、本発明アミノ酸配列はナノボディ（登録商標）もしくはそれの適切な断片であってよい。（注：ナノボディ（登録商標）、ナノボディーズ（登録商標）、およびナノクローン（登録商標）はAblynx N.V..の登録商標である）。IL-6を標的とするこれらナノボディーズも本明細書において「本発明のナノボディーズ」と言う。
【００６３】
ナノボディーズの一般的な説明には、以下の説明ならびに上に引用した従来技術を参照。しかし、これに関し留意すべきこととして、この説明および従来技術が主に記載したのはいわゆる「VH3クラス」のナノボディーズ（すなわち、VH3クラスのヒト生殖細胞系列（例えば、DP-47,DP-51、もしくはDP-29）の配列と配列相同性が高程度のナノボディーズ）であって、これらのナノボディーズは本発明の好ましい態様を形成するものではある。しかし、留意すべきこととして、本発明はその最も広い意味においてIL-6を標的とする全てのナノボディを一般に包含するものであって、例えばいわゆる「VH4クラス」に属するナノボディーズ（すなわち、VH4クラスのヒト生殖細胞系列（例えば、DP-78）の配列と配列相同性が高程度のナノボディーズ）をも包含し、これは例えばAblynx N.V.の米国仮出願60／792,297、出願日2006年４月14日、名称「DP-78-like Nanobodies」に記載されるごとくである。
【００６４】
一般に、ナノボディーズ（特にVHH配列および部分的にヒト化したナノボディーズ）の特徴化は、１以上の「ホールマーク残基」(本明細書で定義）が１以上の枠組み構造配列(やはり本明細書で別に定義）に存在することで可能である。
【００６５】
したがって、一般に、ナノボディは、下の（一般的）な構造を有するアミノ酸配列と定義することができる。
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
構造中、FRl〜FR4は、それぞれ枠組み領域１〜４を示し、CDRl〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域１〜３を示し、１以上のホールマーク残基は本明細書で別に定義されるごとくである。
【００６６】
特に、ナノボディは、下の（一般的）な構造を有するアミノ酸配列であることが可能であり、
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
構造中、FRl〜FR4は、それぞれ枠組み領域１〜４を示し、CDRl〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域１〜３を示し、１以上のホールマーク残基は本明細書で別に定義されるごとくである。
【００６７】
更に特に、ナノボディは、下の（一般的）な構造を有するアミノ酸配列であることが可能であり、
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
構造中、FRl〜FR4は、それぞれ枠組み領域１〜４を示し、CDRl〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域１〜３を示し、かつ
i）カバットの付番表示による位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８における１以上のアミノ酸残基は好ましくは下の表A−3に記述のホールマーク残基から選択され；かつ
ii）該アミノ酸配列は、配列番号１〜２２の少なくとも一つの配列とのアミノ酸同一性が少なくとも８０％であり、構造中、アミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列（配列番号１〜２２の配列においてXと表示）を形成するアミノ酸残基は無視している。
【００６８】
これらのナノボディーズにおいてCDR配列は一般に本明細書で別に定義するごとくである。
【００６９】
したがって、本発明は、IL-6に結合できる（本明細書で定義)および／もしくは標的とするナノボディーズに関し、それの適切な断片に関し、ならびに１以上のそのようなナノボディーズおよび／もしくは適切な断片を含むまたは本質的にのみからなるポリペプチドに関する。
【００７０】
配列番号３２０〜３７０は、IL-6に対して生じた多数のVHH配列のアミノ酸配列を示す。
【００７１】
したがって、本発明の特に好ましいナノボディーズは、IL-6に結合できる（本明細書で定義)および／もしくは標的とするナノボディーズであって、そのナノボディーズは
i）  配列番号３２０〜３７０の少なくとも一つのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性が８０％であり、ただし、構造中アミノ酸同一性の程度を決定するに当たりCDR配列を形成するアミノ酸残基を無視する。これに関し、表A−１を参照し、この表には、配列番号３２０〜３７０のナノボディーズの枠組み構造１配列（配列番号４４８〜４９８）、枠組み構造２配列（配列番号４９９〜５４９）、枠組み構造３配列（配列番号５５０〜６００）および枠組み構造４配列（配列番号６０１〜６５１）がリストされている（枠組み構造１配列の位置１〜４および２７〜３０におけるアミノ酸残基については下のコメントを参照。したがって、同一性の程度を決定するに当たってこれらの残基は好ましくは無視される。）；
および
ii）カバットの付番表示による位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８における１以上のアミノ酸残基は好ましくは下の表A-3に記述のホールマーク残基から選択される。
【００７２】
これらのナノボディーズにおいてCDR配列は一般に本明細書で別に定義するごとくである。
【００７３】
このようなナノボディーズは適切な方法で適切な起源から誘導してよく、例えば天然由来のVHH配列（すなわちラクダの適切な種由来の）、または合成もしくは半合成のアミノ酸配列であってよく、例えば限定されないが、「ヒト化」（本明細書で定義）ナノボディーズ、「ラクダ化」（本明細書で定義）免疫グロブリン配列（特にラクダ化重鎖可変領域配列）、ならびに、抗体の親和性成熟（affinity maturation)（例えば、合成、適宜選択もしくは天然由来の免疫グロブリン配列を出発原料とする）の技術から得られたナノボディーズ、種々の免疫グロブリン配列から誘導した断片にCDRを移植、接合、組合せる技術、プライマーを重ねるPCR組立て技術、および免疫グロブリン配列を遺伝子操作する当業者に公知の技術等の技術で取得した免疫グロブリン配列、または本明細書で別に記載するように上記のいずれかの適切な組合せ、が挙げられる。また、ナノボディがVHH配列を含む場合には、本明細書で別に記載のごとく、該ナノボディを適切にヒト化することによって１以上の更に（部分的もしくは完全に）ヒト化した本発明ナノボディーズを取得してよい。同様に、ナノボディが合成もしくは半合成の配列（例えば部分的にヒト化した配列）を含む場合には、本明細書でやはり記載のごとく、該ナノボディを任意に更に適切にヒト化することによって１以上の更に（部分的もしくは完全に）ヒト化した本発明ナノボディーズを取得してよい。
【００７４】
特に、ヒト化ナノボディーズは、前の諸段落でナノボディーズについて一般的に定義したごときアミノ酸配列であってよいが、ただしその配列中に存在する少なくとも一つのアミノ酸残基（特に少なくとも一つの枠組み構造残基中の）はヒト化のための置換（本明細書で定義）であるおよび／もしくは置換に対応する。ある好ましい、しかし非限定的なヒト化のための置換(およびそれの適切な組合せ）は、本明細書での開示に基いて当業者には明瞭である。更に、あるいは選択的に、他のヒト化のための置換が潜在的に有用か否かを確認できるためには、天然由来のVHH配列の枠組み領域の配列を１以上の密接に関連するヒトVH配列と比較し、その後かくして潜在的に有用であると決定したヒト化のための置換(もしくはその組合せ）を該VHH配列中に（本明細書で別に記載のごとく、自体公知の任意の方法で）導入し、得られたヒト化したVHH配列を標的に対する親和性、安定性、発現の容易性およびレベル、およびまたは他の望ましい特性についてテストする。他のヒト化のための置換(もしくはその組合せ）が適切か否かは、このように限られた試行錯誤によって本明細書での開示に基づき当業者は決定することができる。また、ナノボディの（枠組み構造領域）を上記に基き部分的にヒト化もしくは完全にヒト化してよい。
【００７５】
本発明の特に好ましいヒト化ナノボディーズは、配列番号３２０〜３７０のナノボディーズのヒト化改変体である。
【００７６】
したがって、本発明の他の好ましいナノボディーズは、IL-6に結合(本明細書で別に定義)できるナノボディーズであって、そのナノボディーズは：
i）配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列中の一つのヒト化改変体であり；
ii）配列番号３２０〜３７０アミノ酸配列の少なくとも一つとのアミノ酸同一性が８０％であり、ただし構造中、アミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列を形成するアミノ酸残基は無視する；
および、そのナノボディーズにおいて、
i）カバットの付番表示による位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８における１以上のアミノ酸残基は好ましくは下の表A−3に記述のホールマーク残基から選択される。
【００７７】
本明細書の上で詳細に述べたごとく、本発明ナノボディーズは、一般に単アミノ酸鎖を含み、この鎖は「枠組み構造配列」すなわち「FR」（一般に本明細書に記載のごとくである）および「相補性決定領域」少なくとも「CDRのどれか」を含むと考えることができる。本発明ナノボディーズに存在する好ましいCDRのどれかは本明細書に記載のごとくである。更に一般的に、かつ本明細書に記載の別の記載を参照すると、本発明ナノボディーズに存在するCDR配列は、以下の工程を含む方法によって取得可能／取得できる：
a）IL-6を標的とする少なくとも一つのVHH領域を得るために、
一般に以下の工程を含む方法を行う：（i）IL-6に対する免疫応答および／もしくは抗体（特に重鎖抗体）を生起させるためにラクダ科に属する哺乳動物をIL-6もしくはそれの一部もしくは断片で免疫する；（ii）このように免疫した哺乳動物から生物学的試料を取得する、該試料にはIL-6を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列が含まれる；および(iii）該生物学的試料からIL-6を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列を取得（例えば単離）する；
および／または、一般に以下の工程を含む方法を行う：（i）重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列を含むライブラリーをスクリーニングしてIL-6を標的とするもしくはその少なくとも一部もしくは断片を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列を求める；および（ii）該ライブラリーからIL-6を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列を取得（例えば単離）する；
b）このようにして取得したIL-6を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列に、任意に親和性成熟、突然変異誘発(例えば、ランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発）および／もしくはその他の技術を賦課することにより、IL-6を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列の親和性および／もしくは特異性を増大する；
c）このようにして取得したIL-6を標的とする重鎖抗体配列および／もしくはVHH配列におけるCDR配列を決定する；および任意に、
d）CDR（すなわちCDR1、CDR2およびCDR3、特に少なくともCDR3）の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ、更に好ましくは三つ全部の配列が工程ｃ）で決定されているナノボディを得る。
【００７８】
通常は、本発明ナノボディに存在するCDR配列は全部が同じ重鎖抗体配列もしくはVHH配列から誘導される。しかしながら、本発明はその最も広い意味においてこれに限定されない。例えば（あまり好ましくはないが）、IL-6を標的とする２個もしくは３個の異なる重鎖抗体配列もしくはVHH配列に由来するCDRを本発明ナノボディにおいて適宜に組み合わせること、およびまたは、重鎖抗体配列もしくはVHH配列に由来する１以上のCDR（特に少なくともCDR3）を異なる起原に由来する１以上のCDR（例えば合成CDRもしくはヒト抗体由来CDRもしくはVH領域）と共に本発明ナノボディにおいて適宜に組み合わせることも可能である。
【００７９】
更に特に、本発明は、本明細書で定義の親和性（本明細書で別に記載されるように、適切に測定され、および／または（実際のもしくは見かけの）KD値、（実際のもしくは見かけの）KA値、ｋon率および／もしくはｋoff率として、あるいはIC50値として表現される）をもってIL-6に結合できるナノボディーズ、ならびに、そのようなナノボディを少なくとも一つ含む化合物および構造物、特にタンパク質およびポリペプチドを提供する。
【００８０】
具体的には、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドは、好ましくは、
例えばそれらが
−IL-6に結合するにあたって、その解離定数（KD）は10-5〜10-12mol／L以下、好ましくは10-7〜10-12mol／L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol／L（すなわち会合定数（KA）は105〜1012L／moｌ以上、好ましくは107〜1012L／moｌ以上、更に好ましくは10８〜1012L／moｌ）である；
および／または、例えばそれらが
−IL-6に結合するにあたって、そのｋon率は102M-1ｓ-1と約107M-1ｓ-1の間、好ましくは103M-1ｓ-1と107M-1ｓ-1の間、更に好ましくは104M-1ｓ-1と107M-1ｓ-1の間、例えば105M-1ｓ-1と107M-1ｓ-1の間である；
および／または、例えばそれらが
−IL-6に結合するにあたって、そのｋoff率は1ｓ-1と10-6ｓ-1（複数日のｔ１／２にてほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-１と10-6ｓ-1の間、例えば10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間である。
【００８１】
本発明の一価のナノボディ（もしくは本発明のナノボディを唯１個だけ含むポリペプチド）は、好ましくは、例えばそれがIL-6に結合するにあたって、その結合の親和性度は５００nm未満、好ましくは２００nm未満、更に好ましくは１０nm未満、例えば５００pMである。
【００８２】
本発明のナノボディーズもしくはポリペプチドがIL-6に結合するための好ましいIC５０値は本明細書の詳細説明および実施例から明瞭となる。
【００８３】
本発明ナノボディのIL-6に対する親和性は、自体公知の方法、例えば本明細書に記載の測定法で決定することができる。
【００８４】
好ましいが非限定的な態様において、本発明は、４個の枠組み構造領域（それぞれFR1〜FR4)および３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなるIL-6に対するナノボディ（本明細書で定義）に関し、ここで、
（a）CDR1は以下：
配列番号: 167 PYTMG
配列番号: 168 DYAMS 
配列番号: 169 YYAIG 
配列番号: 170 INAMG 
配列番号: 171 IYTMG 
配列番号: 172 RLAMD
配列番号: 173 RLAMD 
配列番号: 174 FNIMG 
配列番号: 175 FNIMG 
配列番号: 176 YYGVG 
配列番号: 177 YYGVG
配列番号: 178 YYGVG 
配列番号: 179 DSAIG 
配列番号: 180 PYTIA 
配列番号: 181 PYTIG 
配列番号: 182 INVMN
配列番号: 183 SYAMG
配列番号: 184 PYTMG
配列番号: 185 PYTVG
配列番号: 186 PYTMG
配列番号: 187 PYTMG
配列番号: 188 PYTMG
配列番号: 189 INPMG
配列番号: 190 INPMG
配列番号: 191 INPMA
配列番号: 192 SYPMG
配列番号: 193 SYPMG
配列番号: 194 SYPMG
配列番号: 195 SYPMG
配列番号: 196 SYPMG
配列番号: 197 SYPMG
配列番号: 198 SFPMG
配列番号: 199 SFPMG
配列番号: 200 SFPMG
配列番号: 201 AFPMG
配列番号: 202 AFPMG
配列番号: 203 AFPMG
配列番号: 204 AFPMG
配列番号: 205 AFPMG
配列番号: 206 TYAMG
配列番号: 207 NYHMV
配列番号: 208 NYAMA
配列番号: 209 IDAMA
配列番号: 210 KHHATG
配列番号: 211 SYVMG
配列番号: 212 SYVMG
配列番号: 213 SSPMG
配列番号: 214 SSPMG
配列番号: 215 SSPMG 
配列番号: 216 NGPMA 
配列番号: 217 SYPIA
からなる群から；、
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで、
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／または
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」が２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／または
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり
および／或いは、
（b）CDR1は以下：
配列番号: 218 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号: 219 AITGNGASKYYAESMKG 
配列番号: 220 CISSSVGTTYYSDSVKG 
配列番号: 221 DIMPYGSTEYADSVKG 
配列番号: 222 AAHWTVFRGNTYYVDSVKG
配列番号: 223 SIAVSGTTMLDDSVKG 
配列番号: 224 SISRSGTTMAADSVKG 
配列番号: 225 DITNRGTTNYADSVKG 
配列番号: 226 DITNGGTTMYADSVKG 
配列番号: 227 CISSSDGDTYYADSVKG
配列番号: 228 CISSSDGDTYYADSVKG 
配列番号: 229 CTSSSDGDTYYADSVKG 
配列番号: 230 CISSSDGDTYYDDSVKG 
配列番号: 231 TIIGSDRSTDLDGDTYYADSVRG 
配列番号: 232 TIIGSDRSTDLDGDTYYADSVRG
配列番号: 233 AITSGGRKNYADSVKG
配列番号: 234 AISSNGGSTRYADSVKG
配列番号: 235 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号: 236 RINWSGIRNYADSVKG
配列番号: 237 RINWSGIRNYADSVKG
配列番号: 238 RINWSGITNYADSVKG
配列番号: 239 RINWSGITNYADSVKG
配列番号: 240 RIHGSITNYADSVKG 
配列番号: 241 RIHGSITNYADSVKG
配列番号: 242 RIFGGGSTNYADSVKG
配列番号: 243 GISQSGVGTAYSDSVKG
配列番号: 244 GISQSGGSTAYSDSVKG
配列番号: 245 GISQSSSSTAYSDSVKG 
配列番号: 246 GISQSGGSTAYSDSVKG
配列番号: 247 GISQSGGSTAYSDSVKG
配列番号: 248 GISQSGGSTAYSDSVKG
配列番号: 249 GISQSGGSTHYSDSVKG
配列番号: 250 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号: 251 GISQSGGSTHYSDSVKG
配列番号: 252 GISQSGGSTHYSDSVKG
配列番号: 253 GISQSGGSTHYSDSVKG
配列番号: 254 GISQSGGSTHYSDSVKG
配列番号: 255 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号: 256 GISQSGGSTHYSDSVKG
配列番号: 257 AISWSGANTYYADSVKG
配列番号: 258 AASGSTSSTYYADSVKG
配列番号: 259 VISYAGGRTYYADSVKG
配列番号: 260 TMNWSTGATYYADSVKG 
配列番号: 261 ALNWSGGNTYYTDSVKG
配列番号: 262 TINWSGSNGYYADSVKG
配列番号: 263 TINWSGSNKYYADSVKG
配列番号: 264 AISGRSGNTYYADSVKG
配列番号: 265 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号: 266 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号: 267 AISWRTGTTYYADSVKG 
配列番号: 268 AISWRGGNTYYADSVKG 
からなる群から； 
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで、
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／または
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」が３個、２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで、
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／または
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり、
および／或いは、ここで
（c）CDR3は以下：
配列番号: 269 ASQSGSGYDS 
配列番号: 270 VAKDTGSFYYPAYEHDV 
配列番号: 271 SSWFDCGVQGRDLGNEYDY
配列番号: 272 YDPRGDDY
配列番号: 273 TRSTAWNSPQRYDY 
配列番号: 274 FDGYTGSDY 
配列番号: 275 FDGYSGSDY 
配列番号: 276 YYPTTGFDD 
配列番号: 277 YYPTTGFDD
配列番号: 278 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号: 279 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号: 280 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号: 281 DLSDYGVCSKWPSPYDY 
配列番号: 282 TGKGYVFTPNEYDY
配列番号: 283 TAKGYVFTDNEYDY
配列番号: 284 DAPLASDDDVAPADY
配列番号: 285 DETTGWVQLADFRS 
配列番号: 286 ASQSGSGYDS
配列番号: 287 ASQSGSGYDS
配列番号: 288 ASRSGSGYDS
配列番号: 289 ASRSGSGYDS
配列番号: 290 ASQVGSGYDS 
配列番号: 291 RRWGYDY
配列番号: 292 RRWGYDY
配列番号: 293 RRWGYDY
配列番号: 294 RDKTLALRDYAYTTDVGYDD
配列番号: 295 RDKTLALRDYAYTTDVGYDD 
配列番号: 296 RGRTLALRDYAYTTEVGYDD
配列番号: 297 RGRTLFLRDYAYTTEVGYDD
配列番号: 298 RGRTLFLRGYAYTTEVGYDD
配列番号: 299 RGRTIALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 300 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号: 301 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 302 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 303 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 304 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 305 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号: 306 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 307 RGGTLALRNYAYTTEVGYDD
配列番号: 308 SAIIEGFQDSIVIFSEAGYDY
配列番号: 309 VAGLLLPRVAEGMDY
配列番号: 310 VDSPLIATHPRGYDY 
配列番号: 311 ARGLLIATDARGYDY
配列番号: 312 GSYVFYFTVRDQYDY
配列番号: 313 SAGGFLVPRVGQGYDY
配列番号: 314 SAGGFLVPRVGQGYDY
配列番号: 315 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号: 316 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号: 317 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号: 318 ERVGLLLAVVAEGYDY 
配列番号: 319 ERAGVLLTKVPEGYDY 
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで、
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／または
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」が３個、２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで、
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／または
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列である。
【００８５】
したがって、特に好ましいが非限定的な本発明のナノボディーズに存在するCDR配列およびCDR配列の組合せを下の表Ａ−１にリストしてある。
【００８６】
したがって、本発明ナノボディーズにおいて、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つは、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択されるか、または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択される。
【００８７】
特に、本発明ナノボディーズにおいて、存在する少なくともCDR3配列は、表Ａ−１にリストされているCDR3配列（複数）のみからなる群から選択されるか、または、表Ａ−１にリストされているCDR3配列（複数）の少なくとも一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR3配列（複数）からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にリストされているCDR3配列（複数）の少なくとも一つとのアミノ酸相違（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるCDR3配列（複数）からのみなる群から選択される。
【００８８】
好ましくは、本発明ナノボディーズにおいて、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも二つは、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択されるか、または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択される。
【００８９】
特に、本発明ナノボディーズにおいて、存在する少なくともCDR3配列は、表Ａ−１にリストされているCDR3配列（複数）のみからなる群から選択されるか、または、表Ａ−１にリストされているCDR3配列（複数）の少なくとも一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR3配列（複数）からのみなる群から選択され；かつ、存在するCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つは、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1およびCDR2配列からのみなる群から選択されるか、または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR1およびCDR2配列からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR1およびCDR2配列からのみなる群から選択される。
【００９０】
最も好ましくは、本発明ナノボディーズにおいて、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の三つ全てが、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択されるか、または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択される。
【００９１】
更にいっそう好ましくは、本発明ナノボディーズにおいて、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも一つは、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択される。好ましくはこの実施態様において、他の二つのCDR配列の少なくとも一つもしくは好ましくは両方が、表Ａ−１にそれぞれリストされている対応するCDR配列(複数）の少なくとも一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR配列(複数）からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にそれぞれリストされている対応するCDR配列(複数）の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR配列(複数）からのみなる群から選択される。
【００９２】
特に、本発明ナノボディーズにおいて、存在する少なくともCDR3配列は、表Ａ−１にリストされているCDR3配列のみからなる群から選択される。好ましくは、この実施態様において、存在するCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つおよび好ましくは両方が、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1およびCDR2配列との配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるそれぞれCDR1およびCDR2配列からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるそれぞれCDR1およびCDR2配列からのみなる群から選択される。
【００９３】
更にいっそう好ましくは、本発明ナノボディーズにおいて、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも二つは、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択される。好ましくは、この実施態様において、存在する残りのCDR配列が、表Ａ−１にリストされている対応するCDR配列(複数）の少なくとも一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR配列(複数）からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にリストされている対応するCDR配列(複数）の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR配列(複数）からのみなる群から選択される。
【００９４】
特に、本発明ナノボディーズにおいて、少なくともCDR3配列は表Ａ−１にリストされているCDR3配列(複数）からのみなる群から選択され、CDR1配列もしくはCDR2配列のいずれかは表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1およびCDR2配列からのみなる群から選択される。好ましくは、この実施態様において、存在する残りのCDR配列が、表Ａ−１にリストされている対応するCDR配列(複数）の少なくとも一つとの配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR配列(複数）からのみなる群から選択されるか、および／または、表Ａ−１にリストされている対応するCDR配列(複数）の少なくとも一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR配列(複数）からのみなる群から選択される。
【００９５】
更にいっそう好ましくは、本発明ナノボディーズにおいて、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の三つ全てが、表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列からのみなる群から選択される。
【００９６】
また、表Ａ−１にリストされているCDRのどれかを組合せたもの(表Ａ−１の同じ線上に記載のもの）は好ましい。したがって、一般的に好ましいことであるが、本発明ナノボディにおけるCDRが、表Ａ−１に記載のCDR配列であるか、または表Ａ−１にリストされているCDR配列との配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR配列(複数）からのみなる群から選択されるか、および／または表Ａ−１にリストされているCDR配列とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR配列(複数）からのみなる群から選択される場合に、他のCDRの少なくとも一つおよび好ましくは両方が表Ａ−１の同じ組合せ（すなわち表Ａ−１の同じ線上に記載）に属するCDR配列から選択されるか、またはその同じ組合せに属するCDR配列との配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR配列(複数）のみからなる群から選択されるか、および／またはその同じ組合せに属するCDR配列とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR配列(複数）からのみなる群から選択される。上の段落で示した他の好ましい実施態様はＡ−１に記載のCDRのどれかの組合せも適用される。
【００９７】
したがって、非限定的な実施例により、本発明ナノボディは、例えば表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つとの配列同一性が８０％を超えるCDR1配列、表Ａ−１に記載のCDR2配列の一つ（ただし異なる組合せに属する）とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR2配列、およびCDR3配列を含むことができる。
【００９８】
本発明の好ましいナノボディーズは、例えば以下からなってよい：
（１）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つとの配列同一性が８０％を超えるCDR1配列、表Ａ−１に記載のCDR2配列の一つ（ただし異なる組合せに属する）とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR2配列、および表Ａ−１に記載のCDR3配列の一つ（ただし異なる組合せに属する）との配列同一性が８０％を超えるCDR3配列；または、
（２）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つとの配列同一性が８０％を超えるCDR1配列、CDR2配列、および表Ａ−１に記載のCDR3配列の一つ；または
（３）CDR1配列、表Ａ−１に記載のCDR2配列の一つとの配列同一性が８０％を超えるCDR2配列、および表Ａ−１に記載されCDR2配列と同じ組合せに属するCDR3配列とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR3配列。
【００９９】
本発明の特に好ましいナノボディーズは、例えば以下からなってよい：
（１）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つとの配列同一性が８０％を超えるCDR1配列、表Ａ−１に記載され同じ組合せに属するCDR2配列とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR2配列、および表Ａ−１に記載され同じ組合せに属するCDR3配列との配列同一性が８０％を超えるCDR3配列；または
（２）CDR1配列、表Ａ−１にリストされるCDR2配列、および表Ａ−１にリストされるCDR3配列（ただし、そのCDR2配列とCDR3配列は異なる組合せに属してよい）。
【０１００】
本発明の更にいっそう好ましいナノボディーズは、例えば以下からなってよい：
（１）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つとの配列同一性が８０％を超えるCDR1配列、表Ａ−１にリストされ同じ組合せに属するCDR2配列、および表Ａ−１にリストされ同じ組合せに属するCDR2配列；または、
（２）表Ａ−１に記載のCDR1配列、表Ａ−１に記載され同じ組合せに属するCDR2配列とのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR2配列、および表Ａ−１にリストされ同じ組合せに属するCDR3配列との配列同一性が８０％を超えるCDR3配列。
【０１０１】
特に好ましい本発明ナノボディーズは、例えば表Ａ−１に記載のCDR1配列、表Ａ−１に記載され同じ組合せに属するCDR2との配列同一性が８０％を超えるCDR2配列、および表Ａ−１に記載され同じ組合せに属するCDR3を含んでよい。
【０１０２】
最も好ましい本発明ナノボディーズでは、存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列が表Ａ−１にそれぞれリストされているCDR1、CDR2およびCDR3配列の組合せの一つから選択される。
【０１０３】
好ましくは、CDR配列が表Ａ−１にリストされているCDR配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、いっそう更に好ましくは少なくとも９９％であるCDR配列（複数）の群から選択される場合に、および／またはCDR配列が表Ａ−１にリストされているCDR配列の一つとのアミノ酸相違が３個、２個もしくは１個のみであるCDR配列（複数）のみからなる群から選択される場合に、
i）任意のアミノ酸の置換が好ましくはアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義）であり、および／もしくは
ii）上記アミノ酸配列と比較すると、該アミノ酸配列では好ましくはアミノ酸の置換のみで、アミノ酸の削除もしくは挿入は含まれない。
【０１０４】
更に特に、本発明は、本明細書で定義の親和性（本明細書で別に記載されるように、適切に測定され、および／もしくは（実際のもしくは見かけの）KD値、（実際のもしくは見かけの）KA値、ｋon率および／もしくはｋoff率として、あるいはIC50値として表現される）をもってIL-6に結合できるナノボディーズ、ならびに、そのような少なくとも一つのナノボディを含む化合物および構造物、特にタンパク質およびポリペプチドを提供する。
【０１０５】
具体的には、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドは、好ましくは、  
例えばそれらが
−IL-6に結合するにあたって、その解離定数（KD）は10-5〜10-12mol／L以下、好ましくは10-7〜10-12mol／L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol／L（すなわち会合定数（KA）は105〜1012L／moｌ以上、好ましくは107〜1012L／moｌ以上、更に好ましくは108〜1012L／moｌ）である；
および／または、例えばそれらが
−IL-6に結合するにあたって、そのｋon率は102M-1ｓ-1と約107M-1ｓ-1の間、好ましくは103M-1ｓ-1と107M-1ｓ-1の間、更に好ましくは104M-1ｓ-1と107M-1ｓ-1の間、例えば105M-1ｓ-1と107M-1ｓ-1の間である；
および／または、例えばそれらが
−IL-6に結合するにあたって、そのｋoff率は1ｓ-1と10-6ｓ-1（複数日のｔ１／２にてほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-1と10-6ｓ-1の間、例えば10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間である。
【０１０６】
本発明の一価のナノボディ（もしくは本発明のナノボディを唯１個だけ含むポリペプチド）は、好ましくは、例えばそれがIL-6に結合するにあたって、その結合の親和性度は５００nm未満、好ましくは２００nm未満、更に好ましくは１０nm未満、例えば５００pMである。
【０１０７】
本発明のナノボディーズもしくはポリペプチドがIL-6に結合するための好ましいIC５０値は本明細書の詳細説明および実施例から明瞭となる。
【０１０８】
本発明ナノボディのIL-6に対する親和性は、自体公知の方法、例えば本明細書に記載の測定法で決定することができる。
【０１０９】
本発明の別の好ましい、しかし非限定的な実施態様によれば、（a）CDR1の長さは１〜１２個アミノ酸残基、通常は２〜９個アミノ酸残基、例えば５、６もしくは７個アミノ酸残基であり、および／または（b）CDR2の長さは１３〜２４個アミノ酸残基、通常は１５〜２１個アミノ酸残基、例えば１６および１７個アミノ酸残基であり、および／または（c）CDR3の長さは２〜３５個アミノ酸残基、通常は３〜３０個アミノ酸残基、例えば６〜２３個アミノ酸残基である。
【０１１０】
上記CDR配列を有するナノボディーズは好ましくは本明細書で別に定義するような枠組み構造配列を有する。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、アミノ酸配列が、配列番号３２０〜３７０のみからなる郡から、または配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の１以上との配列同一性（本明細書で定義）が８０％を超え、好ましくは９０％を超え、更に好ましくは９５％を超え、例えば９９％以上であるアミノ酸配列（複数）のみからなる群から選択されるナノボディに関する。
【０１１２】
特異な、しかし非限定的な実施態様によれば、後者のアミノ酸配列は本明細書で別に記載されるように「ヒト化」されている。好ましいヒト化のための置換は下に定義されるごとくである。
【０１１３】
このようなナノボディーズは適切な方法で適切な起源から誘導してよく、例えば天然由来のVHH配列（すなわちラクダの適切な種由来の）、または合成もしくは半合成のナノボディーズであってよく、例えば限定されないが、「ヒト化」（本明細書で定義）ナノボディーズ、「ラクダ化」（本明細書で定義）免疫グロブリン配列（特にラクダ化重鎖可変領域配列）、ならびに、抗体の親和性成熟（affinity maturation)（例えば、合成、適宜選択もしくは天然由来の免疫グロブリン配列を出発原料とする）の技術から得られたナノボディーズ、種々の免疫グロブリン配列から誘導した断片にCDRを移植、接合、組合せる技術、プライマーを重ねるPCR組立て技術、および免疫グロブリン配列を遺伝子操作する当業者に公知の技術等の技術で取得した免疫グロブリン配列、または本明細書で別に記載するように上記のいずれかの適切な組合せ、が挙げられる。また、ナノボディがVHH配列を含む場合には、本明細書で別に記載のごとく、該ナノボディを適切にヒト化することによって１以上の更に（部分的もしくは完全に）ヒト化した本発明ナノボディーズを取得してよい。同様に、ナノボディが合成もしくは半合成の配列（例えば部分的にヒト化した配列）を含む場合には、本明細書でやはり記載のごとく、該ナノボディを任意に更に適切にヒト化することによって１以上の更に（部分的もしくは完全に）ヒト化した本発明ナノボディーズを取得してよい。
【０１１４】
特に、ヒト化ナノボディーズは、前の諸段落でナノボディーズについて一般的に定義したごときナノボディーズであってよいが、ただしその配列中に存在する少なくとも一つのアミノ酸残基（特に少なくとも一つの枠組み構造残基中の）はヒト化のための置換（本明細書で定義）であるおよび／もしくは置換に対応する。ある好ましい、しかし非限定的なヒト化のための置換(およびそれの適切な組合せ）は、本明細書での開示に基いて当業者には明瞭である。更に、あるいは選択的に、他のヒト化のための置換が潜在的に有用か否かを確認できるためには、天然由来のVHH配列の枠組み領域の配列を１以上の密接に関連するヒトVH配列と比較し、その後かくして潜在的に有用であると決定したヒト化のための置換(もしくはその組合せ）を該VHH配列中に（本明細書で別に記載のごとく、自体公知の任意の方法で）導入し、得られたヒト化したVHH配列を標的に対する親和性、安定性、発現の容易性およびレベル、およびまたは他の望ましい特性についてテストする。他のヒト化のための置換(もしくはその組合せ）が適切か否かは、このように限られた試行錯誤によって本明細書での開示に基づき当業者は決定することができる。また、ナノボディの（枠組み構造領域）を上記に基き部分的にヒト化もしくは完全にヒト化してよい。
【０１１５】
前記のいずれかの適切な断片（もしくは断片の組合せ）、例えば１以上のCDR配列を含有する断片であって、１以上の枠組み構造配列が側面におよび／もしくは介在して（その断片を誘導した全長の免疫グロブリン配列においてそれらCDR配列および枠組み構造配列が生起するのと同じ順序で）適切に連結した断片、を使用することもできる。
【０１１６】
特異な態様において、上記のような断片には、本明細書に記載の単CDR配列（特にCDR3配列）が含まれ、そのCDR配列の各側面には、断片を誘導した免疫グロブリン配列において該CDR配列に隣接する枠組み構造配列（の部分）（特に、枠組み構造配列の部分）が接している。例えば、CDR3配列の前にFE3配列（の部分）があり、後ろにFR4配列（の部分）があってもよい。このような断片にはジスルフィド架橋、特に、それぞれ一つはCDRに先行し他はそのCDRに続く二つの枠組み構造領域を連結するジスルフィド架橋が含まれてもよい（このようなジスルフィド架橋を形成するためには、該枠組み構造領域に天然に生起しているシステイン残基が使用されてもよいし、あるいはシステイン残基が該枠組み構造領域に合成的に付加もしくは導入されてもよい）。これら「促進断片」の更なる説明には、WO 03／050531を再度参照する。
【０１１７】
本発明ポリペプチドは、IL-6に対する免疫グロブリン可変領域もしくはそれの抗原結合断片、および／またはナノボディもしくはそれの適切な断片を含む、もしくは本質的にのみからなる少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、もしくは本質的にのみからなる。本発明の好ましい、しかし非限定的なポリペプチドの例は配列番号３７１〜４４７に示されている。
【０１１８】
第一の態様において、本発明は、IL-6に結合することによってIL-6とIL-6Rの間の相互作用を調節することができる免疫グロブリン可変領域もしくはそれの抗原結合断片、および／またはナノボディーズを含む、もしくは本質的にのみからなるアミノ酸配列を提供する。好ましくは、これらアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズはIL-6Rと競合してIL-6に結合する。更に好ましくは、これらアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、IL-6のIL-6Rとの相互作用部位に存するか、を含むか、または完全もしくは部分的に重なるIL-6のエピトープに結合することができる（これについては本明細書に引用の従来技術を参照）。
【０１１９】
第二の態様において、本発明は、IL-6に結合することによってIL-6／IL-6R複合体とgp130の間の相互作用を調節することができる免疫グロブリン可変領域もしくはそれの抗原結合断片、および／またはナノボディーズ（本明細書で定義）を含む、もしくは本質的にのみからなるアミノ酸配列を提供する。本発明の文脈において、「IL-6／IL-6R複合体とgp130の間の相互作用を調節する」とは、例えば次を意味することができる。
−  IL-6(IL-6／IL-6R複合体のIL-6もしくは複合体に存在するIL-6）に結合することによって、IL-6／IL-6R複合体の形成が阻害もしくは影響（例えば完全にもしくは部分的に崩壊）を受け、複合体のgp130への結合−例えばその親和性−が減少（または、逆にgp130の複合体への結合−例えばその親和性−が減少）し、その結果複合体のgp130への結合によって誘起および／もしくは促進されるシグナル伝達が調節（例えば減少）される。
−  IL-6(IL-6／IL-6R複合体のIL-6もしくは複合体に存在するIL-6）に結合することによって、IL-6／IL-6R複合体の形成が本質的に影響を受けないが該複合体のgp130への結合が調節（例えば阻害）され、その結果複合体のgp130への結合によって誘起および／もしくは促進されるシグナル伝達が調節（例えば減少）される。
これらは両方とも、本発明のアミノ酸配列もしくはナノボディが存在しない場合における複合体の形成およびそれのgp130への結合に対応する。
【０１２０】
この態様において、本発明のアミノ酸配列もしくはナノボディーズはgp130と競合してIL-6の（もしくはIL-6／IL-6R複合体の）gp130相互作用部位IIまたはIL-6の（もしくはIL-6／IL-6R複合体の）gp130相互作用部位IIIに結合する。
【０１２１】
第三の態様において、本発明は、免疫グロブリン可変領域もしくはそれの抗原結合断片を含む、もしくは本質的にのみからなるアミノ酸配列であって、該免疫グロブリン可変領域もしくはそれの抗原結合断片がIL-6に結合する際の解離定数（Kｄ）が10-5〜10-12mol／ｌ以下、好ましくは10-7〜10-12mol／ｌ以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol/lである、アミノ酸配列に関する。好ましくは、そのアミノ酸配列が免疫グロブリン可変領域を含み、もしくは本質的にのみからなる場合に、その免疫グロブリン可変領域が軽鎖可変領域、重鎖可変領域、（単)領域抗体、ナノボディ（登録商標）、もしくはヒト化ナノボディである。ナノボディを含み、もしくは本質的にのみからなる本発明のアミノ酸配列は、４個の枠組み構造領域（それぞれFR1〜FR4)および３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3)を含む、もしくはのみからなることができ、ここで、
CDR1は、以下：
配列番号：167 PYTMG 
配列番号：168 DYAMS 
配列番号：169 YYAIG 
配列番号：170 INAMG 
配列番号：171 IYTMG 
配列番号：172 RLAMD 
配列番号：173 RLAMD 
配列番号：174 FNIMG 
配列番号：175 FNIMG 
配列番号：176 YYGVG 
配列番号：177 YYGVG 
配列番号：178 YYGVG 
配列番号：179 DSAIG 
配列番号：180 PYTIA 
配列番号：181 PYTIG 
配列番号：182 INVMN 
配列番号：183 SYAMG 
配列番号：184 PYTMG 
配列番号：185 PYTVG 
配列番号：186 PYTMG
配列番号：187 PYTMG 
配列番号：188 PYTMG 
配列番号：189 INPMG 
配列番号：190 INPMG 
配列番号：191 INPMA 
配列番号：192 SYPMG 
配列番号：193 SYPMG 
配列番号：194 SYPMG 
配列番号：195 SYPMG 
配列番号：196 SYPMG 
配列番号：197 SYPMG 
配列番号：198 SFPMG 
配列番号：199 SFPMG 
配列番号：200 SFPMG 
配列番号：201 AFPMG 
配列番号：202 AFPMG 
配列番号：203 AFPMG 
配列番号：204 AFPMG 
配列番号：205 AFPMG 
配列番号：206 TYAMG 
配列番号：207 NYHMV 
配列番号：208 NYAMA 
配列番号：209 IDAMA 
配列番号：210 KHHATG 
配列番号：211 SYVMG 
配列番号：212 SYVMG 
配列番号：213 SSPMG 
配列番号：214 SSPMG 
配列番号：215 SSPMG 
配列番号：216 NGPMA 
配列番号：217 SYPIA 
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで、
a）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
b）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで
a）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
b）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり、
および／或いはここで
CDR2は、以下：
配列番号：218 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号：219 AITGNGASKYYAESMKG 
配列番号：220 CISSSVGTTYYSDSVKG 
配列番号：221 DIMPYGSTEYADSVKG 
配列番号：222 AAHWTVFRGNTYYVDSVKG 
配列番号：223 SIAVSGTTMLDDSVKG 
配列番号：224 SISRSGTTMAADSVKG 
配列番号：225 DITNRGTTNYADSVKG 
配列番号：226 DITNGGTTMYADSVKG 
配列番号：227 CISSSDGDTYYADSVKG 
配列番号：228 CISSSDGDTYYADSVKG 
配列番号：229 CTSSSDGDTYYADSVKG 
配列番号：230 CISSSDGDTYYDDSVKG 
配列番号：231 TIIGSDRSTDLDGDTYYADSVRG
配列番号：232 TIIGSDRSTDLDGDTYYADSVRG 
配列番号：233 AITSGGRKNYADSVKG 
配列番号：234 AISSNGGSTRYADSVKG 
配列番号：235 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号：236 RINWSGIRNYADSVKG
配列番号：237 RINWSGIRNYADSVKG 
配列番号：238 RINWSGITNYADSVKG 
配列番号：239 RINWSGITNYADSVKG 
配列番号：240 RlHGSITNYADSVKG 
配列番号：241 RIHGSITNYADSVKG 
配列番号：242 RIFGGGSTNYADSVKG 
配列番号：243 GISQSGVGTAYSDSVKG 
配列番号：244 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：245 GISQSSSSTAYSDSVKG 
配列番号：246 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：247 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：248 GISQSGGSTAYSDSVKG 
配列番号：249 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：250 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：251 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：252 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：253 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：254 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：255 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：256 GISQSGGSTHYSDSVKG 
配列番号：257 AISWSGANTYYADSVKG 
配列番号：258 AASGSTSSTYYADSVKG 
配列番号：259 VISYAGGRTYYADSVKG 
配列番号：260 TMNWSTGATYYADSVKG 
配列番号：261 ALNWSGGNTYYTDSVKG 
配列番号：262 TINWSGSNGYYADSVKG 
配列番号：263 TINWSGSNKYYADSVKG 
配列番号：264 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号：265 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号：266 AISGRSGNTYYADSVKG 
配列番号：267 AISWRTGTTYYADSVKG 
配列番号：268 AISWRGGNTYYADSVKG
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで
a）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
b）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、ここで
a）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
b）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり、
および／或いはここで
CDR3は、以下：
配列番号：269 ASQSGSGYDS 
配列番号：270 VAKDTGSFYYPAYEHDV 
配列番号：271 SSWFDCGVQGRDLGNEYDY 
配列番号：272 YDPRGDDY 
配列番号：273 TRSTAWNSPQRYDY 
配列番号：274 FDGYTGSDY 
配列番号：275 FDGYSGSDY 
配列番号：276 YYPTTGFDD 
配列番号：277 YYPTTGFDD 
配列番号：278 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号：279 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号：280 DLSDYGVCSRWPSPYDY 
配列番号：281 DLSDYGVCSKWPSPYDY 
配列番号：282 TGKGYVFTPNEYDY 
配列番号：283 TAKGYVFTDNEYDY 
配列番号：284 DAPLASDDDVAPADY 
配列番号：285 DETTGWVQLADFRS 
配列番号：286 ASQSGSGYDS 
配列番号：287 ASQSGSGYDS 
配列番号：288 ASRSGSGYDS 
配列番号：289 ASRSGSGYDS 
配列番号：290 ASQVGSGYDS 
配列番号：291 RRWGYDY 
配列番号：292 RRWGYDY 
配列番号：293 RRWGYDY 
配列番号：294 RDKTLALRDYAYTTDVGYDD 
配列番号：295 RDKTLALRDYAYTTDVGYDD 
配列番号：296 RGRTLALRDYAYTTEVGYDD 
配列番号：297 RGRTLFLRDYAYTTEVGYDD 
配列番号：298 RGRTLFLRGYAYTTEVGYDD 
配列番号：299 RGRTIALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：300 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：301 RGRTLALRNYAYTTEVG YDD 
配列番号：302 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：303 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：304 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：305 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：306 RGRTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：307 RGGTLALRNYAYTTEVGYDD 
配列番号：308 SAIIEGFQDSIVIFSEAGYDY 
配列番号：309 VAGLLLPRVAEGMDY 
配列番号：310 VDSPLIATHPRGYDY 
配列番号：311 ARGLLIATDARGYDY 
配列番号：312 GSYVFYFTVRDQYDY 
配列番号：313 SAGGFLVPRVGQGYDY 
配列番号：314 SAGGFLVPRVGQGYDY 
配列番号：315 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号：316 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号：317 ERVGLLLTVVAEGYDY 
配列番号：318 ERVGLLLAVVAEGYDY 
配列番号：319 ERAGVLLTKVPEGYDY 
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの配列同一性（本明細書で定義）が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列からなり、ここで
a）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
b）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つとの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）が３個、２個もしくは１個のみであるアミノ酸配列からなり、
a）アミノ酸の任意の置換があった場合にその置換は好ましくは保存的（本明細書で定義）であり、および／または
b）上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列には好ましくは置換のみであって削除もしくは挿入が含まれない、群から；
選択されるアミノ酸配列である。
【０１２２】
本発明の別の特異な態様によれば、本発明は、IL-6に結合するのに特に好適な多数の伸長アミノ酸残基(すなわち小ペプチド）を提供する。これら伸長アミノ酸残基は、本発明のアミノ酸配列に存在しても、および／もしくは編入されてもよく、特にそれによって本発明アミノ酸配列の抗原結合部位（の部分）が形成される。これら伸長アミノ酸残基は、IL-6に対して生起された重鎖抗体のCDR配列もしくはVHH配列として最初は作成された（または本明細書で別に記載されるごとく、CDR配列に基いてもおよび／もしくはCDR配列から誘導してもよい）ので、本明細書で包括的に「CDR配列」（すなわち、それぞれCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列）とも言われる。しかし、留意すべきこととして、本発明は、その最も広い意味において、これら伸長アミノ酸残基が本発明アミノ酸配列のIL-6への結合を可能にする限り、これら伸長アミノ酸残基の本発明アミノ酸配列における特定の構造的役割もしくは機能によって限定されない。したがって、一般的に、最も広い意味において本発明は、IL-6に結合可能で本明細書に記載の１以上のCDR配列、特に２以上のCDR配列であって他の１以上のアミノ酸配列を介して相互に適切に連結した適切な組合せのCDR配列を包含しており、その結果、そのアミノ酸配列の全体によってIL-6に結合可能な結合領域および／もしくは結合単位が形成される。しかしながら、留意すべきこととして、本発明アミノ酸配列中にこのようなCDR配列が唯１個存在するだけでも既に十分であり、それによってIL-6に結合可能な本発明アミノ酸配列は得られる。例えば、ＷＯ03／050531に記載のいわゆる「促進断片」を再度参照する。
【０１２３】
したがって、他の特異な、しかし非限定的な態様において、本発明アミノ酸配列は、本明細書に記載のCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列（もしくはこれらの適切な組合せ）からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であってよい。特に、本発明アミノ酸配列は、少なくとも一つの抗原結合部位を含むアミノ酸配列であってよく、該抗原結合部位には本明細書に記載のCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列（もしくはこれらの適切な組合せ）からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列が含まれる。
【０１２４】
一般に、本発明のこの態様では、本発明アミノ酸配列は、少なくとも一つの伸長アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってよく、該伸長アミノ酸残基は本明細書に記載の少なくとも一つのCDR配列の配列に対応するアミノ酸配列を有する。このようなアミノ酸配列は免疫グロブリンの折畳み構造を含んでも含まなくてもよい。例えば、限定されないが、このようなアミノ酸配列は、少なくとも一つの上記のCDRを含むが、しかし（完全な）免疫グロブリンの折畳み構造を形成するほど大きくはない免疫グロブリンの適切な断片であってよい（例えばＷＯ03／050531に記載のいわゆる「促進断片」を再度参照する）。あるいは、このようなアミノ酸配列は、上記のCDR配列に対応する少なくとも一つの伸長アミノ酸残基を含む適切な「タンパク質骨格」（すなわち抗原結合部位の部分としての）であってよい。アミノ酸配列を提供する適切な骨格は当業者には明瞭であり、例えば限定されないが、免疫グロブリンに基くもしくは免疫グロブリン（すなわち本明細書で既に記載した免疫グロブリン配列以外の）から誘導される結合性の骨格、タンパク質A領域から誘導されるタンパク質骨格（例えばアフィボディーズ（Affibodies）登録商標）、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、CTLA-4、T細胞受容体、設計したアンキリン反復タンパク質、アビマーおよびPDZの諸領域（Binz et al., Nat. Biotech 2005, VoI 23: 1257）、およびDNAもしくはRNA、例えば限定されないがDNAもしくはRNAのアプタマーに基く結合性のタンパク質構成部分（Ulrich et al.^Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8):619-32）を含む。
【０１２５】
再度、これらのCDR配列の１以上を含む本発明の任意のアミノ酸配列は、例えばそれがIL-6に特異的に結合（本明細書で定義）でき、より具体的には例えばそれがIL-6に結合できるにあたって、その結合の親和性［（実際のまたは見かけの）ＫＤ値、（実際のまたは見かけの）ＫＡ値、ｋｏｎ率および／もしくはｋｏｆｆ率、または別法として更に本明細書に記載したようなIC50値として好適に測定され、および／または表現される］が本明細書で定義したとおりであるのが好ましい。
【０１２６】
より具体的には、本発明のこの態様によるアミノ酸配列は、少なくとも一個の抗原結合部位を含む任意のアミノ酸配列であってよく、該抗原結合部位は、本明細書に記載のCDR1配列、本明細書に記載のCDR2配列、および本明細書に記載のCDR3配列のみからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸配列を含み、その際、（ｉ）第１のアミノ酸配列が本明細書に記載のCDR1配列から選択される場合には、第２のアミノ酸配列は、本明細書に記載のCDR2配列もしくは本明細書に記載のCDR3配列から選択され、（ｉｉ）第１のアミノ酸配列が本明細書に記載のCDR2配列から選択される場合には、第２のアミノ酸配列は、本明細書に記載のCDR1配列もしくは本明細書に記載のCDR3配列から選択され、または（ｉｉｉ）第１のアミノ酸配列が本明細書に記載のCDR3配列から選択される場合には、第２のアミノ酸配列は、本明細書に記載のCDR1配列もしくは本明細書に記載のCDR3配列から選択される。
【０１２７】
更により具体的には、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも一個の抗原結合部位を含むアミノ酸配列であってよく、該抗原結合部位は、本明細書に記載のCDR1配列、本明細書に記載のCDR2配列、および本明細書に記載のCDR3配列のみからなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含み、その際、第１のアミノ酸配列は本明細書に記載のCDR1配列から選択され、第２のアミノ酸配列は本明細書に記載のCDR2配列から選択され、そして第３のアミノ酸配列は本明細書に記載のCDR3配列から選択される。CDR1、CDR2、およびCDR3配列の好ましい組合せは、本明細書の更に詳しい記述から明瞭である。当業者には明瞭であるが、そのようなアミノ酸配列は、（本明細書に更に詳しく記載するように）免疫グロブリン配列であることが好ましいが、例えば、前記CDR配列を提示する好適な骨格を含む他の任意のアミノ酸配列であってもよい。
【０１２８】
従って、一つの具体的ではあるが限定しない態様では、本発明は、IL-6を標的とするアミノ酸配列に関し、そのアミノ酸配列には、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
あるいはそれらの任意の好適な組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸残基の１以上の連続、を含む。
【０１２９】
本発明のアミノ酸配列が、ｂ）および／もしくはｃ）に記載の１以上のアミノ酸配列を含む場合、
ｉ）  ｂ）および／もしくはｃ）に記載のそのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換がある場合に、その置換は、ａ）に記載の対応するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であることが好ましく；および／または、
ｉｉ）  ｂ）および／もしくはｃ）に記載のアミノ酸配列は、ａ）に記載の対応するアミノ酸配列と比較して、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず；および／または、
ｉｉｉ）  ｂ）および／もしくはｃ）に記載のアミノ酸配列は、自体公知の１以上の親和性成熟技術を使用する親和性成熟によって、ａ）に記載のアミノ酸配列から誘導させるアミノ酸配列であってよい。
【０１３０】
同様に、本発明のアミノ酸配列が、ｅ）および／もしくはｆ）に記載の１以上のアミノ酸配列を含む場合、
ｉ）  ｅ）および／もしくはｆ）に記載のそのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換がある場合に、その置換は、そしてｄ）に記載の対応するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であることが好ましく；および／または、
ｉｉ）  ｅ）および／もしくはｆ）に記載のアミノ酸配列は、ｄ）に記載の対応するアミノ酸配列と比較して、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず；および／または
ｉｉｉ）  ｅ）および／もしくはｆ）に記載のアミノ酸配列は、自体公知の１以上の親和性成熟技術を使用する親和性成熟によって、ｄ）に記載のアミノ酸配列から誘導させるアミノ酸配列であってよい。
【０１３１】
同様に類似して、本発明のアミノ酸配列が、ｈ）および／もしくはｉ）に記載の１以上のアミノ酸配列を含む場合、
ｉ）  ｈ）および／もしくはｉ）に記載のそのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換がある場合に、その置換は、ｇ）に記載の対応するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であることが好ましく；および／または、
ｉｉ）  ｈ）および／もしくはｉ）に記載のアミノ酸配列は、ｇ）に記載の対応するアミノ酸配列と比較して、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず、および／または
ｉｉｉ）  ｈ）および／もしくはｉ）に記載のアミノ酸配列は、自体公知の１以上の親和性成熟技術を使用する親和性成熟によって、ｇ）に記載のアミノ酸配列から誘導させたアミノ酸配列であってよい。
【０１３２】
理解すべきこととして、最前の段落群は、一般的には、それぞれ、ｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）またはｉ）に記載の１以上のアミノ酸配列を含む、本発明の任意のアミノ酸配列にも当てはまる。
【０１３３】
この具体的態様では、アミノ酸配列は、
ｉ）  配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｉｉ）  配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、および
ｉｉｉ）  配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
または任意の好適なそれらの組合せのみからなる群から選択されたアミノ酸残基の１以上の連続を含むのが好ましい。
【０１３４】
同様に、好ましくは、そのようなアミノ酸配列では、前記のアミノ酸残基の連続の少なくとも一つは、IL-6と結合するための抗原結合部位の部分を形成する。
【０１３５】
より特定的であるが他方限定しない態様では、本発明は、IL-6に対するアミノ酸配列に関し、該アミノ酸配列に、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）  配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択されたアミノ酸残基の２個以上の連続が含まれ、
その結果、（ｉ）アミノ酸残基の第１の連続が、ａ）、ｂ）またはｃ）に記載のアミノ酸配列の一つに対応する場合、アミノ酸残基の第２の連続は、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）またはｉ）に記載のアミノ酸配列の一つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１の連続が、ｄ）、ｅ）またはｆ）に記載のアミノ酸配列の一つに対応する場合、アミノ酸残基の第２の連続は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）またはｉ）に記載のアミノ酸配列の一つに対応し、あるいは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１の連続が、ｇ）、ｈ）またはｉ）に記載のアミノ酸配列の一つに対応する場合、アミノ酸残基の第２の連続は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に記載のアミノ酸配列の一つに対応する。
【０１３６】
この具体的態様では、アミノ酸配列は、
ｉ）  配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｉｉ）  配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、および
ｉｉｉ）  配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列
のみからなる群から選択されたアミノ酸残基の２個以上の連続を含むのが好ましく、
その結果、（ｉ）アミノ酸残基の第１の連続が、配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の一つに対応する場合、アミノ酸残基の第２の連続は、配列番号２１８〜２６８または配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の一つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１の連続が、配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の一つに対応する場合、アミノ酸残基の第２の連続は、配列番号１６７〜２１７または配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の一つに対応し、または（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１の連続が、配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の一つに対応する場合、アミノ酸残基の第２の連続は、配列番号１６７〜２１７または配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の一つに対応する。
【０１３７】
同様に、そのようなアミノ酸配列では、アミノ酸残基の少なくとも２つの連続は、IL-6と結合するための抗原結合部位の部分を形成するのが好ましい。
【０１３８】
更により具体的ではあるが限定しない態様では、本発明は、アミノ酸残基の３個の以上の連続を含む、IL-6に対するアミノ酸配列であって、
アミノ酸残基の第１の連続が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され、アミノ酸残基の第２の連続が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；およびアミノ酸残基の第３の連続が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択されることを特徴とするアミノ酸配列に関する。
【０１３９】
好ましくは、この具体的態様では、アミノ酸残基の第１の連続は、配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列のみからなる群から選択され、アミノ酸残基の第２の連続は、配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列のみからなる群から選択され；およびアミノ酸残基の第３の連続は、配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列のみからなる群から選択される。
【０１４０】
また、好ましくは、そのようなアミノ酸配列では、アミノ酸残基の少なくとも３つの連続は、IL-6と結合するための抗原結合部位の部分を形成する。
【０１４１】
アミノ酸配列のそのような連続の好ましい組合せは、本明細書の更に詳しい開示から明らかになるであろう。
【０１４２】
好ましくは、そのようなアミノ酸配列では、CDR配列は、配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つのCDR配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、更に好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、または更に実質的に１００％のアミノ酸同一性を有する。この程度のアミノ酸同一性は、例えば、前記アミノ酸配列と、配列番号３２０〜３７０の配列の１以上との間のアミノ酸同一性度を（本明細書に記載した方法で）定量することによって決定でき、その際、その枠組み構成領域を形成するアミノ酸残基は無視する。同様に、そのような本発明のアミノ酸配列は、本明細書に更に詳しく記載したようなものであってよい。
【０１４３】
同様に、そのようなアミノ酸配列は、IL-6に特異的に結合（本明細書で定義）できることが好ましく、より具体的にはIL-6に本明細書で定義した親和性［（実際のまたは見かけの）ＫＤ値、（実際のまたは見かけの）ＫＡ値、ｋｏｎ率および／もしくはｋｏｆｆ率、または別法として更に本明細書に記載したようなＩＣ５０値として好適に測定され、かつ／もしくは表現される］で結合できることが好ましい。
【０１４４】
本発明のアミノ酸配列が、本質的に、４個の枠組み構成領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなる場合、本発明のアミノ酸配列は、
CDR1が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および／または
CDR2が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および／または
CDR3が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列
のみからなる群から選択されるような配列が好ましい。
【０１４５】
特に、そのような本発明のアミノ酸配列は、CDR1が、配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列のみからなる群から選択され；および／またはCDR2が、配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列のみからなる群から選択され；および／またはCDR3が、配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列のみからなる群から選択されてよい。
【０１４６】
特に、本発明のアミノ酸配列が、本質的に、４個の枠組み構成領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなる場合、本発明のアミノ酸配列は、
CDR1が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および
CDR2が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および
CDR3が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列
のみからなる群から選択されるような配列、あるいはそのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片が好ましい。
【０１４７】
特に、そのような本発明のアミノ酸配列は、CDR1が、配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列のみからなる群から選択され；およびCDR2が、配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列のみからなる群から選択され；およびCDR3が、配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列のみからなる群から選択されてよい。
【０１４８】
また、CDR配列の好ましい組合せは、本明細書の更に詳しい記述から明らかになるであろう。
【０１４９】
同様に、そのようなアミノ酸配列は、IL-6に特異的に結合（本明細書で定義）できることが好ましく、より具体的にはIL-6に本明細書で定義した親和性［（実際のまたは見かけの）ＫＤ値、（実際のまたは見かけの）ＫＡ値、ｋｏｎ率および／もしくはｋｏｆｆ率、または別法として更に本明細書に記載したようなIC50値として好適に測定され、かつ／もしくは表現される］で結合できることが好ましい。
【０１５０】
一つの好ましいが限定しない態様では、本発明は、本質的に、４個の枠組み構成領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列のCDR配列が、配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つのCDR配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、更に好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、または更に実質的に１００％のアミノ酸同一性を有することを特徴とするアミノ酸配列に関する。アミノ酸同一性の程度は、例えば、前記アミノ酸配列と、配列番号３２０〜３７０の配列の１以上との間のアミノ酸同一性度を（本明細書に記載した方法で）定量することによって決定でき、その際、その枠組み構成領域を形成するアミノ酸残基は無視する。そのような本発明のアミノ酸配列は、本明細書に更に詳しく記載したようなものであってよい。
【０１５１】
そのような本発明のアミノ酸配列では、枠組み配列は任意の好適な枠組み配列であってよく、好適な枠組み配列の例は、例えば、標準的ハンドブック、および更に本明細書に記載した詳しい開示および従来技術に基づき当業者には明白である。
【０１５２】
枠組み配列は、免疫グロブリン枠組み配列、または（例えば、ヒト化またはラクダ化により）免疫グロブリン枠組み配列から誘導した枠組み配列（の好適な組合せ）が好ましい。例えば、枠組み配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ配列など）および／または重鎖可変領域（ＶＨ配列など）に由来する枠組み配列であってよい。一つの特に好ましい態様では、枠組み配列は、ＶＨＨ配列に由来する枠組み配列（前記枠組み配列は、場合によっては、部分的にまたは完全にヒト化されている）、またはラクダ化された従来のＶＨ配列（本明細書で定義）である。
【０１５３】
枠組み配列は、本発明のアミノ酸配列が、領域抗体（または、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）；単領域抗体（または、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）；「dAb」（または、dAbとして使用するのに好適なアミノ酸配列）；またはナノボディ（登録商標）（それだけに限定されるわけではないがＶＨＨ配列を含む）であるようなものが好ましい。また、好適な枠組み配列は、例えば標準的ハンドブック、および更に本明細書に記載した詳しい開示および従来技術に基づき当業者には明白である。
【０１５４】
特に、本発明のアミノ酸配列中に存在する枠組み配列がホールマーク残基（本明細書で定義）の１以上を含み、その結果本発明のアミノ酸配列がナノボディ（登録商標）となってもよい。そのような枠組み配列（の好適な組合せ）のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい開示から明らかである。
【０１５５】
再度、本発明のアミノ酸配列について本明細書に概括的に記載したように、前記のいずれかの好適な断片（または断片の組合せ）、例えば１以上のCDRを含有し、１以上の枠組み配列が適切に（例えば、該断片を誘導した完全サイズの免疫グロブリン配列においてこれらCDRおよび枠組み配列が存在すると同じ順序で）そのCDRの側面に隣接および／またはそのCDRを連結している断片、を使用することも可能である。また、そのような断片は、免疫グロブリンの折り畳みを含みもしくはこれを形成できてもよいし、あるいは反対に免疫グロブリンの折り畳みを含まずもしくはこれを形成できなくてもよい。
【０１５６】
具体的な一態様として、そのような断片では、本明細書に記載したように１個のCDR配列（特にCDR3配列）が含まれ、そのCDR配列の各側面に枠組み配列（の部分）が連接する(特に、該断片を誘導した免疫グロブリン配列において該CDR配列に隣接する枠組み配列の部分。したがって例えば、CDR3配列の前にＦＲ３配列（の部分）が連接し、後ろにＦＲ４配列（の部分）が連接してよい）。そのような断片には、ジスルフィド橋、特に、CDR配列の前後にそれぞれ連接する２個の枠組み構成領域を結合するジスルフィド橋が含有されてよい（そのようなジスルフィド橋を形成するためには、前記枠組み構成領域に元来存在するシステイン残基を使用してもよいし、あるいは別法として合成によってシステイン残基を前記枠組み構成領域に付加もしくは導入してよい）。これらの「促進断片」（Expedite fragments)の更なる説明については、国際公開公報第０３／０５０５３１号、ならびにAblynx N.V.による２００６年１２月５日出願の米国仮出願、表題「Peptides capable of binding to serum proteins」（発明者：Revets, Hilde Adi Pierrette; Kolkman, Joost Alexander;およびHoogenboom, Hendricus Renerus Jacobus Mattheus）を再度参照されたい。
【０１５７】
別の態様では、本発明は、化合物もしくは構造体、特に、本発明の１以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（または好適なそれの断片）を含みまたは本質的にのみからなり、場合によっては、更に、１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位を含む、タンパク質もしくはポリペプチド（本明細書ではそれぞれ「本発明の化合物」もしくは「本発明のポリペプチド」ともいう）に関する。本明細書の更に詳しい開示から当業者に明らかになるように、そのような別の基、残基、構成部分、結合単位もしくはナノボディーズは、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ（および／またはそれが存在する化合物もしくは構造体）に、更なる機能性を付与することも、または付与しないことも考えられ、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディの特性を改変することも、または改変しないこともありうる。
【０１５８】
例えば、そのような別の基、残基、構成部分もしくは結合単位は、化合物もしくは構造体が、（融合）タンパク質または（融合）ポリペプチドとなるように、１以上の追加のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってもよい。好ましいが限定しない態様では、前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位は免疫グロブリン配列である。より更に好ましくは、前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位は、領域抗体、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単領域抗体、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、「dAb」、dAbとして使用するのに好適なアミノ酸配列、またはナノボディーズのみからなる群から選択される。
【０１５９】
あるいは、そのような基、残基、構成部分もしくは結合単位は、例えば、単独で、生物学的におよび／または薬理学的に活性であるかもしれず、または活性でないかもしれない化学基、残基、構成部分であってよい。例えば、それだけに限定されるわけではないが、本明細書に更に詳しく記載するように、本発明のアミノ酸配列もしくはポリペプチドの「誘導体」を得るために、そのような基と本発明の１以上のアミノ酸配列とを結合してよい。
【０１６０】
同様に、本明細書に記載したような１以上の誘導体を含み、または本質的にそれらのみからなり、そして場合によっては、更に任意により１以上のリンカーを介して結合した１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位を含む、化合物もしくは構造体も本発明の範囲内にある。好ましくは、前記１以上の他の基、残基、構成部分もしくは結合単位は、アミノ酸配列である。
【０１６１】
そのような化合物もしくは構造体では、本発明の１以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、および１以上の基、残基、構成部分もしくは結合単位は、互いに、直接および／または１以上の好適なリンカーもしくはスペーサーを介して結合しうる。例えば、１以上の基、残基、構成部分もしくは結合単位がナノボディーズである場合、リンカーが同様にアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであれば、得られる化合物もしくは構造体は融合（タンパク質）もしくは融合（ポリペプチド）となる。
【０１６２】
本発明の化合物もしくはポリペプチドの一般的な製造方法では、本発明の１以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと１以上の別の基、残基、構成部分もしくは結合単位とを、場合によっては１以上の好適なリンカーを介して好適に結合させて本発明の化合物もしくはポリペプチドを得る少なくとも一つのステップが含まれる。本発明のポリペプチドの製造方法でも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を得、次に好適な方法でこの核酸を発現させ、そして発現した本発明のポリペプチドを回収する諸ステップが最低限含まれるのが一般的である。そのような方法は、例えば更に本明細書に記載した方法や技術に基づいて当業者には明白である自体公知の方法で実施することができる。
【０１６３】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディから出発して、本発明の化合物もしくはポリペプチドを設計／選択しかつ／もしくは製造する方法は、本明細書では前記本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディの「フォーマット化」とも言い、本発明の化合物もしくはポリペプチドの部分から作成された本発明のアミノ酸は、「フォーマット化されている」または前記本発明の化合物もしくはポリペプチドの「フォーマット体」であると言う。本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディをフォーマット化することが可能な方法の例、およびそのようなフォーマット体の例は、本明細書の開示に基づき当業者には明白である。そしてそのようなフォーマット化されたアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、本発明の別の態様を形成する。
【０１６４】
本発明の具体的一態様では、本発明の化合物、本発明のナノボディ、もしくは本発明のポリペプチドの半減期は、対応する本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディと比較して上昇してよい。そのような化合物およびポリペプチドのいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい開示に基づき当業者に明らかであり、例えば、その半減期を上昇させるために（例えばＰＥＧ化によって）化学的に改変した、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズもしくはポリペプチド；血清タンパク質（例えば血清アルブミン）と結合するための少なくとも一個の追加の結合部位を含む、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ；あるいは本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディの半減期を上昇させる少なくとも一個の構成部分に結合する（特に、少なくとも一つのアミノ酸配列および／もしくはナノボディ）、少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディを含む本発明のポリペプチドを含む。そのような半減期延長構成部分もしくはアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズを含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書の更に詳しい開示に基づき当業者に明らかであり、例えば、限定されるわけではないが、ポリペプチド［本発明の１以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズが、１以上の血清タンパク質もしくはそれの断片（例えば、血清アルブミンもしくはそれの好適な断片）、または血清タンパク質（例えば、領域抗体、領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、単領域抗体、単領域抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列、「dAb」、dAbとして使用するのに好適なアミノ酸配列、または血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）などの血清タンパク質、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンと結合可能なナノボディーズなどと結合可能な１以上の結合単位と好適に結合したポリペプチド（更に詳しい記述および本明細書に記載した参照文献を参照されたい）］；ポリペプチド［本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディが、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃ）またはそれの好適な部分もしくは断片と結合しているポリペプチド］；またはポリペプチド［本発明の１以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズが、血清タンパク質（例えば、限定されるわけではないが、国際公開公報第９１／０１７４３号、同第０１／４５７４６号、同第０２／０７６４８９号に記載され、そしてAblynx N.V.により２００６年１２月５日に出願された表題「Peptides capable of binding to serum proteins」のAblynx N.V.による米国仮出願に記載されたタンパク質もしくはペプチド）と結合可能な１以上の小さいタンパク質もしくはペプチドと好適に結合したポリペプチド］が挙げられる。
【０１６５】
一般的に、半減期が上昇した本発明の化合物もしくはポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、もしくは２０倍を越えて大きい半減期を有することが好ましい。例えば、半減期が上昇した本発明の化合物もしくはポリペプチドの半減期は、対応する本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ自体と比較して、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、更に好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を越えて、または２４、４８もしくは７２時間さえも超えて上昇していてよい。
【０１６６】
本発明の好ましいが限定しない態様では、そのような本発明の化合物もしくはポリペプチドの血清中半減期は、対応する本発明のアミノ酸配列自体と比較して、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、更に好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を越えて、または２４、４８もしくは７２時間さえも超えて上昇している。
【０１６７】
本発明の別の好ましいが限定しない態様では、そのような本発明の化合物もしくはポリペプチドは、ヒトでの血清中半減期が、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、更に好ましくは少なくとも４８時間、一層更に好ましくは少なくとも７２時間以上を示す。例えば、本発明の化合物もしくはポリペプチドの半減期は、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、更に好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、更に好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日を越え（例えば約１４〜１９日）てよい。
【０１６８】
一般的に、単一のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ（例えば、単一の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ）を含むまたは本質的にのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドは、本明細書では「一価の」タンパク質もしくはポリペプチド、または「一価構造体」をさす。２個以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（例えば、少なくとも２つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、あるいは少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディと、少なくとも一つの他のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ）を含むまたは本質的にのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドは、本明細書では「多価」タンパク質もしくはポリペプチド、または「多価構造体」をさし、これらは、対応する本発明の一価のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと比較して、ある種の利点をもたらしうる。そのような多価構造体のいくつかの限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかである。
【０１６９】
一つの具体的ではあるが限定しない実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも２つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、例えば、２個もしくは３個の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズを含むまたは本質的にのみからなる。本明細書に更に詳しく記載するように、そのような多価構造体からは、単一の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディを含むまたは本質的にのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドと比較して、IL-6に対して非常に改善された親和性および／もしくは特異性など、ある種の利点が得られる。上記したように、そのような本発明の多価ポリペプチドでは、アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、同じエピトープ／結合部位を標的とし、または異なるエピトープ／結合部位を標的としうる。
【０１７０】
別の具体的ではあるが限定しない実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ、および少なくとも一つの他の（すなわち、別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質、またはポリペプチドに対する）アミノ酸配列および／もしくはナノボディを含むまたは本質的にのみからなる。そのようなタンパク質もしくはポリペプチドは、本明細書では、「多重特異性」タンパク質もしくはポリペプチドとも、または「多重特異性構造体」とも言い、これらは、対応する本発明の一価のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと比較して、ある種の利点をもたらしうる。再度、そのような多重特異性構造体のいくつかの限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかである。
【０１７１】
更に別の具体的ではあるが限定しない実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ、場合によっては１以上の更なるアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディおよび／または得られた融合タンパク質に少なくとも一つの所望の特性を付与する少なくとも一つの他のアミノ酸配列（例えば、タンパク質もしくはポリペプチド）とを含みまたは本質的にそれらのみからなる。再度、そのような融合タンパク質は、対応する本発明の一価のナノボディーズと比較して、ある種の利点をもたらしうる。そのようなアミノ酸配列およびそのような融合構造体のいくつかの限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０１７２】
本発明の別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、IL-6に対する少なくとも一個の結合部位（例えば、アミノ酸配列および／もしくはナノボディなどの結合単位）、ＴＮＦ−αに対する少なくとも一個の結合部位（例えば、アミノ酸配列および／もしくはナノボディなどの結合単位）、および場合によっては、半減期を上昇させる少なくとも一個の結合部位（例えば、アミノ酸配列および／もしくはナノボディなどの結合単位）を含み（例えば、ＩｇＧまたは血清アルブミンなどの血清タンパク質に対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディ）、場合によっては１以上の好適なリンカーを介して結合している。この目的のために、例えば、本出願人の国際出願公開公報第０４／０４１８６２号、または本出願人による予め公開されていない米国仮出願第６０／６８２，３３２号（出願日２００５年５月１８日）に記載されているナノボディーズを本発明のポリペプチドに使用してよい。配列番号４１９〜４４７は、そのような二重特異性および三重特異性構造体のいくつかの限定しない例を提供する。
【０１７３】
従って、本発明の別の実施形態は、IL-6に対する少なくとも一つの領域抗体もしくは単領域抗体、ＴＮＦ−αに対する少なくとも一つの領域抗体もしくは単領域抗体、および場合によっては、１以上の更なる結合領域またはアミノ酸配列を含み、場合によっては１以上の好適なリンカーを介して結合しているポリペプチドに関する。
【０１７４】
２つ以上の上記実施形態を組み合わせて、例えば、２つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、一つの他のアミノ酸配列および／もしくはナノボディと、場合によっては１以上の他のアミノ酸配列を含む三価の二重特異性構造体を得ることも可能である。そのような構造体、および本発明の脈絡内で特に好ましいいくつかの構造体の更に限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０１７５】
上記構造体では、１以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよび／または他のアミノ酸配列は、直接結合していても、または１以上のリンカー配列を介して結合していてもよい。そのようなリンカーのいくつかの好適であるが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０１７６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、場合によっては、１個または２個のリンカーを介して結合した、２つまたは３つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズを含むか、あるいは一つまたは２つ、好ましくは２つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、半減期を上昇させる少なくとも一つのアミノ酸配列および／もしくはナノボディ（例えば、血清タンパク質を標的とする、特に、ヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディ）とを含む多重特異性ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズが、再度場合によっては、１以上のリンカーを介して結合している多重特異性ポリペプチドである。
【０１７７】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横切ることができるようにする１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列に（場合によっては、１以上の好適なリンカー配列を介して）結合した、１以上の（例えば２個、または好ましくは１個の）本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズを含む。特に、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横切ることができるようにする前記１以上のアミノ酸配列は、１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、例えば、国際公開公報第０２／０５７４４５号に記載されているアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってよく、その中でＦＣ４４（配列番号１６０）およびＦＣ５（配列番号１６１）が、いくつかの好ましいが限定しない例である。
【０１７８】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、インビボで得られた本発明のポリペプチドの半減期を上昇させる１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列に（場合によっては、１以上の好適なリンカー配列を介して）結合した、１以上の（例えば２個、または好ましくは１個の）本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズを含む。特に、インビボで得られた本発明のポリペプチドの半減期を上昇させる前記アミノ酸配列は、１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、特に、ヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってよく、そのうち、PMＰ６Ａ６（「ＡＬＢ−１」、配列番号１５７）、ＡＬＢ−８（ＡｌＢ−１のヒト化したバージョン、配列番号１５８）およびPMP6A8（「ＡＬＢ−２」、配列番号１５９）が、いくつかの好ましいが限定しない例である。マウスもしくはヒト血清アルブミンに対する好適なアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズの他の例を以下に示す本出願人による出願に記載する。
【０１７９】
更に本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、１以上の（例えば２個、または好ましくは１個の）本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横切ることができるようにする１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列と、インビボで得られた本発明のポリペプチドの半減期を上昇させる（場合によっては、１以上の好適なリンカー配列を介して結合した）１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列とを含む。再度、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横切ることができるようにする前記１以上のアミノ酸配列は、（本明細書に記載したような）１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってよく、かつインビボで得られた本発明のポリペプチドの半減期を上昇させる前記アミノ酸配列は、（同様に本明細書に記載したような）１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズであってよい。
【０１８０】
より具体的には、本発明は、本明細書で定義した親和性［（実際のまたは見かけの）ＫＤ値、（実際のまたは見かけの）ＫＡ値、ｋｏｎ率および／もしくはｋｏｆｆ率、または別法として更に本明細書に記載したようなＩＣ５０値として好適に測定され、かつ／もしくは表現される］でIL-6に結合できるアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、ならびに少なくとも一個のそのようなアミノ酸配列および／もしくはナノボディとを含む化合物もしくは構造体、特にタンパク質もしくはポリペプチドを提供する。
【０１８１】
具体的には、本発明のナノボディーズ、アミノ酸配列および／もしくはポリペプチドは、好ましくは、例えばそれらが
−  IL-6に結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12mol/L以下、好ましくは10-7〜10-12mol/L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol/L（すなわち、会合定数（ＫＡ）が、105〜1012L/mol以上、好ましくは107〜1012L/mol以上、更に好ましくは108〜1012L/mol）であり；
および／または、例えばそれらが
−  IL-6に結合するにあたって、その結合のｋｏｎ率は102M-1s-1と約107M-1s-1の間、好ましくは103M-1s-1と107M-1s-1の間、更に好ましくは104M-1s-1と107M-1s-1の間、例えば105M-1s-1と107M-1s-1の間であり；、
および／または、例えばそれらが
−  IL-6に結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は、1s-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6s-1（複数日（multiple days）のｔ１／２でほぼ不可逆な複合体（near irreversible complex）となる）の間、好ましくは10-2s-1と10-6s-1の間、更に好ましくは10-3s-1と10-6s-1の間、例えば、10-4s-1と10-6s-1の間である。
【０１８２】
好ましくは、本発明の一価のナノボディ（または、唯一個の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディを含むポリペプチド）は、例えばそれがIL-6に結合するにあたって、その結合の親和性度が５００nM未満、好ましくは２００nM未満、更に好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満である。
【０１８３】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズまたはポリペプチドとIL-6との結合のいくつかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書の更に詳しい記述および実施例から明らかになる。
【０１８４】
IL-6に対する本発明のポリペプチドの親和性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、自体公知の方法で定量することができる。
【０１８５】
本発明のポリペプチドのいくつかの好ましいが限定しない例は、配列番号３７１〜４４７のポリペプチドであり、その際、
−  配列番号３７１〜３９０は、本発明の多価（特に二価）のポリペプチドのいくつかの限定しない例であり、
−  配列番号３９１〜４１８は、１個または２個の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、ヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディとを含む本発明の二重特異性ポリペプチドのいくつかの限定しない例であり、
−  配列番号４１９〜４３８は、１個または２個の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、ＴＮＦに対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディとを含む本発明の二重特異性ポリペプチドのいくつかの例であり、かつ
−  配列番号４３９〜４４７は、１個または２個の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズと、ヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディと、ＴＮＦに対するアミノ酸配列および／もしくはナノボディとを含む本発明の三重特異性ポリペプチドのいくつかの例である。
【０１８６】
他の本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号３７１〜４４７の１以上のアミノ酸配列と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、更に好ましくは９５％を超える、例えば９９％以上の「配列同一性」（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列のみからなる群から選択してよく、その際、前記アミノ酸配列中に含まれるアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、本明細書で定義したようなものであることが好ましい。
【０１８７】
別の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディおよび／または本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。そのような核酸は、本明細書では「本発明の核酸」ともいい、例えば、本明細書で定義した遺伝子構造体形であってよい。
【０１８８】
別の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディおよび／または本発明のポリペプチドを発現し、または発現することができる宿主もしくは宿主細胞；および／または本発明の核酸を含む宿主もしくは宿主細胞に関する。そのような宿主もしくは宿主細胞のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０１８９】
本発明は、更に、少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディ、少なくとも一個の本発明のポリペプチドおよび／または少なくとも一個の本発明の核酸、および場合によっては、すなわち組成物の意図した使用に応じて、自体公知のそのような組成物の１以上の別の成分を有し、またはそれらを含む生成物もしくは組成物に関する。そのような生成物もしくは組成物は、例えば（本明細書に記載したような）医薬組成物、動物用組成物、または（同様に本明細書に記載したような）診断に使用するための生成物もしくは組成物であってよい。そのような生成物もしくは組成物のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０１９０】
本発明は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、またはポリペプチドの使用、またはそれを含む組成物の使用であって、インビトロで（例えば、インビトロアッセイもしくは細胞アッセイで）、またはインビボで（例えば、単細胞もしくは多細胞生物、特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば、IL-6媒介シグナル伝達に関連する疾患および／もしくは疾病の危険にさらされているか、またはこれに罹患しているヒトで）IL-6を調節する（方法または組成物ための）使用にも関する。
【０１９１】
本発明はまた、インビトロで（例えばインビトロアッセイもしくは細胞アッセイで）またはインビボで（例えば、単細胞もしくは多細胞生物、特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば、IL-6媒介シグナル伝達に関連する疾患および／もしくは疾病の危険にさらされているか、またはこれに罹患しているヒトで）IL-6を調節する方法であって、少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチドで、IL-6を調節するのに適したな形（方法）および量で、少なくとも、IL-6と少なくとも一つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチド、またはそれを含む組成物とを接触させるステップを含む方法にも関する。
【０１９２】
本発明はまた、インビトロで（例えば、インビトロアッセイもしくは細胞アッセイで）またはインビボで（例えば、単細胞もしくは多細胞生物、特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば、IL-6媒介シグナル伝達に関連する疾患および／もしくは疾病の危険にさらされているか、またはこれに罹患しているヒトで）IL-6を調節する組成物（例えば、それだけに限定されるわけではないが、本明細書に更に詳しく記載したような医薬組成物または製造）の製造における本発明の一個のアミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチドの使用に関する。
【０１９３】
本発明と関連して、「調節（modulating）」または「調節する（modulate）」は、一般的に、好適なインビトロでの細胞アッセイもしくはインビボアッセイ（例えば本明細書に記載したアッセイ）を使用して測定したIL-6の活性を減少もしくは阻害し、または別法としてその活性を上昇させることを意味する。特に、「調節」または「調節する」は、好適なインビトロでの細胞アッセイもしくはインビボアッセイ（例えば本明細書に記載したアッセイ）を使用して測定したIL-6の活性を同じ条件下であるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、またはポリペプチドが存在しない同じアッセイでのIL-6の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、または少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上減少しもしくは阻害し、または別法として上昇させることを意味しうる。
【０１９４】
当業者には明白であるが、「調節」すれば、標的、リガンド、または基質の１以上に対するIL-6の親和性、結合力、特異性、および／または選択性が変化し、；および／または、IL-6が存在する培地または環境での１以上の条件（例えばｐＨ、イオン強度、補助因子の存在など）に対するIL-6の感受性が、同じ条件であるが本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、またはポリペプチドが存在しない条件での感受性に比較して、変化（上昇でも減少でもよい）する。当業者には明白であろうが、これら変化は、任意の好適な方法および／もしくは自体公知の任意の好適なアッセイ、例えば本明細書に記載のアッセイにより、または本明細書に引用した従来技術により定量してよい。
【０１９５】
「調節」はまた、IL-6が関与する（または、その基質、リガンド、または経路、例えば、そのシグナル経路もしくは代謝経路、およびそれらの関連する生物学的もしくは生理学的作用が関与する）、１以上の生物学的もしくは生理学的機序、効果、応答、機能、経路、または活性に関して、変化（すなわち、それぞれアゴニストもしくはアンタゴニストとしての活性）が生じることを意味しうる。再度、当業者には明白であろうが、アゴニストもしくはアンタゴニストとしてのそのような作用は、任意の好適な方法で、および／または自体公知の任意の好適な（インビトロでの、および通常、細胞系またはアッセイでの）アッセイ、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、または本明細書に引用した従来技術で定量しうる。特に、アゴニストもしくはアンタゴニストとしての作用は、意図した生物学的もしくは生理学的活性が、同じ条件下であるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、またはポリペプチドが存在しない同じアッセイでの生物学的もしくは生理学的活性と比較して、それぞれ、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、または少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上増加しまたは減少するようなものでありうる。
【０１９６】
調節には、例えば、IL-6と、その基質もしくはリガンドの一つとの結合の減少または阻害、および／またはIL-6との結合を求めて天然リガンド、基質との競合が関与しうる。調節には、IL-6、またはそれが関与する機序または経路の活性化も関与しうる。調節は、可逆的または不可逆的であってよいが、医薬的および薬理学的目的では、調節は通常可逆的方式をとる。
【０１９７】
本発明は、更に、本明細書に記載したアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、および組成物を製造しまたは生成する方法にも関する。そのような方法のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０１９８】
一般的に、こうした方法は、
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーを得るステップ、および
ｂ）IL-6に結合可能であり、かつ／またはそれに対して親和性を有するアミノ酸配列を求めて、前記アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーをスクリーニングするステップ、
および
ｃ）IL-6に結合可能であり、かつ／またはそれに対して親和性を有するアミノ酸配列を単離するステップ
を含みうる。
【０１９９】
そのような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、任意の好適なアミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、（本明細書に記載したような）免疫グロブリン配列のセット、コレクション、もしくはライブラリー、例えば、免疫グロブリン配列の未処置のセット、コレクション、もしくはライブラリー；免疫グロブリン配列の合成もしくは半合成のセット、コレクション、もしくはライブラリー；および／または親和性成熟を経た免疫グロブリン配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。
【０２００】
同様に、そのような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、重鎖可変領域（例えばＶＨ領域もしくはＶＨＨ領域）もしくは軽鎖可変領域のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、領域抗体もしくは単領域抗体のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよく、または領域抗体もしくは単領域抗体として機能することが可能なアミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。
【０２０１】
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、免疫グロブリン配列の免疫セット、コレクション、もしくはライブラリー、例えば、IL-6によって、またはそれをベースとし、もしくはそれに由来する好適な抗原決定基によって、例えば、その抗原部分、断片、領域、領域、ループまたは他のエピトープによって適切に免疫化した哺乳動物から誘導させてよい。具体的一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、領域、ループまたは他の細胞外エピトープであってよい。
【０２０２】
上記方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、例えば、スクリーニングを促進するために、ファージ、ファージミド、リボソームまたは好適な微生物（例えば酵母）上にディスプレイさせてよい。アミノ酸配列（のセット、コレクション、もしくはライブラリー）をディスプレイし、スクリーニングするための好適な方法、技術、および宿主生物は、例えば本明細書の更に詳しい開示に基づき当業者に明白である。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)中のHoogenboomによる概説も参照されたい。
【０２０３】
別の態様では、アミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）アミノ酸配列を発現する細胞のコレクションまたは試料を得るステップ、
ｂ）IL-6に結合可能であり、かつ／またはそれに対して親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞を求めて、前記細胞のコレクションまたは試料をスクリーニングするステップ、および
ｃ）（ｉ）前記アミノ酸配列を単離するステップ；または（ｉｉ）前記細胞から前記アミノ酸配列をコードする核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現するステップ
を含む。
【０２０４】
例えば、所望のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である場合、細胞のコレクションまたは試料は、例えば、Ｂ細胞のコレクションまたは試料であってよい。同様に、この方法では、細胞試料は、IL-6よって、またはそれをベースとし、もしくはそれに由来する好適な抗原決定基によって、例えば、その抗原部分、断片、領域、領域、ループまたは他のエピトープによって適切に免疫化した哺乳動物から誘導させてよい。具体的一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、領域、ループまたは他の細胞外エピトープであってよい。
【０２０５】
上記方法は、当業者には明白であるが、任意の好適な方法で実施してよい。例えば、欧州特許第０５４２８１０号、国際公開公報第０５／１９８２４号、同第０４／０５１２６８号、および同第０４／１０６３７７号を参照されたい。ステップｂ）のスクリーニングは、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー技術を使用して実施するのが好ましい。これについては、例えば、Liebyら, Blood, Vol. 97, No. 12, 3 820 (2001)  を参照されたい。
【０２０６】
別の態様では、IL-6に対するアミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーを得るステップ、
ｂ）IL-6と結合することができ、かつ／またはこれに親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を求めて、前記核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーをスクリーニングするステップ、
および
ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現するステップ
を含みうる。
【０２０７】
そのような方法では、アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、例えば、免疫グロブリン配列の未処置のセット、コレクション、もしくはライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリー；免疫グロブリン配列の合成もしくは半合成セット、コレクション、もしくはライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリー；および／または親和性成熟を経た免疫グロブリン配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。
【０２０８】
同様に、そのような方法では、核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、重鎖可変領域（例えばＶＨ領域もしくはＶＨＨ領域）もしくは軽鎖可変領域のセット、コレクション、もしくはライブラリーをコードしうる。例えば、核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、領域抗体もしくは単領域抗体のセット、コレクション、もしくはライブラリー、または領域抗体もしくは単領域抗体として機能することが可能なアミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーをコードしうる。
【０２０９】
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、核酸配列の免疫セット、コレクション、もしくはライブラリー、例えば、IL-6によって、またはそれをベースとし、もしくはそれに由来する好適な抗原決定基によって、例えば、その抗原部分、断片、領域、領域、ループまたは他のエピトープによって適切に免疫化した哺乳動物から誘導させてよい。具体的一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、領域、ループまたは他の細胞外エピトープであってよい。
【０２１０】
核酸配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、例えば、重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域の免疫セット、コレクション、もしくはライブラリーをコードしうる。具体的一態様では、ヌクレオチド配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、ＶＨＨ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーをコードしうる。
【０２１１】
上記方法では、ヌクレオチド配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、例えば、スクリーニングを促進するために、ファージ、ファージミド、リボソームまたは好適な微生物（例えば酵母）上にディスプレイさせてよい。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクション、もしくはライブラリー）をディスプレイしスクリーニングするのに好適な方法、技術、および宿主生物は、例えば本明細書の更に詳しい開示に基づき当業者に明白である。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)中のHoogenboomによる概説も参照されたい。
【０２１２】
本発明はまた、上記方法、あるいは別法として上記方法の一つ、および更に少なくとも前記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を定量するステップ；および自体公知の方法で、例えば、好適な宿主細胞もしくは宿主生物で発現させることによって、もしくは化学合成によって前記アミノ酸配列を発現しまたは合成するステップを含む方法によって得られるアミノ酸配列にも関する。
【０２１３】
同様に、上記ステップに続いて、本発明の１以上のアミノ酸配列は、適切にヒト化（または別法としてラクダ化）し；かつ／または本発明のポリペプチドを得るために、このようにして得られたアミノ酸配列を（場合によっては、１以上の好適なリンカーを介して）互いに、または１以上の他の好適なアミノ酸配列と結合させてよい。
【０２１４】
同様に、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、適切にヒト化（または別法としてラクダ化）し、適切に発現させ；かつ／または本発明のポリペプチドを得るために、本発明のアミノ酸配列をコードする１以上の核酸配列を（場合によっては、１以上の好適なリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して）互いに、または他の好適なアミノ酸配列をコードする１以上の核酸配列と結合し、その後、このようにして得られたヌクレオチド配列を適切に発現させることができる。
【０２１５】
本発明は、更に、本明細書に記載したアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、および組成物の適用および使用、ならびにIL-6が関与する疾患および疾病を予防および／もしくは治療する方法に関する。いくつかの好ましいが限定しない適用および使用は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０２１６】
本発明のナノボディーズおよびそれを含む本発明のポリペプチドに関して、本発明を詳しく記載し考察する本明細書の更に詳しい記述から、本発明の好ましい態様のいくつかを形成する本発明の他の態様、実施形態、利点、および適用も明白になる。
【０２１７】
本明細書の更に詳しい記述から明らかになるように、一般的に、「ｄＡｂ」または同様の（単）領域抗体または免疫グロブリン配列と比較して、ナノボディーズによって（本明細書に概略を述べる）ある種の利点が得られるが、それらの利点は本発明のナノボディーズによっても得られる。しかし、以下の教示により、一般的な態様を本発明の他のアミノ酸配列に（直接もしくは類似させて）施用できることは当業者には明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２１８】
本説明、実施例、特許請求の範囲において、
【０２１９】
ａ）  別段明示しまたは定義しない限り、使用する全ての用語は、それらの当技術分野で通常の意味を有し、それは当業者には明白である。例えば、標準的ハンドブック、Sambrookら, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (第２版),第１〜３巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；F. Ausubelら編, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)；Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,(1985)；Oldら, "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 第２版, University of California Press, Berkeley, CA (1981)；Roittら, "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)；Roittら, Roitt's Essential Immunology,第１０版,Blackwell Publishing, UK (2001)；およびJanewayら, "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)など、ならびに本明細書に引用した概括的な背景技術を参照されたい。
【０２２０】
ｂ）  別段の指示がない限り、「免疫グロブリン配列」という用語は、たとえそれが本明細書で重鎖抗体または従来の４鎖抗体をさすために使用されようとも、完全サイズ抗体、その個々の鎖、ならびにそれの全ての部分、領域、または断片（それだけに限定されるわけではないが、それぞれ、ＶＨＨ領域またはＶＨ／ＶＬ領域など、抗原結合領域または断片を含む）を含む総称として使用される。更に、本明細書で使用する「配列」という用語（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変領域配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語）は、文脈から、より限定した解釈が必要とされるのでなければ、関連するアミノ酸配列、ならびにそれをコードする核酸配列もしくはヌクレオチド配列を含むと一般的に理解されるものとする。
【０２２１】
ｃ）  当業者には明白であるが、別段の指示がない限り、具体的に詳述しない全ての方法、ステップ、技術、および操作は、自体公知の方法で実施することができ、かつ実施されている。例えば、標準的ハンドブック、および本明細書に記載した概括的な背景技術、およびその中で引用されたそれ以上の参照文献；ならびに、例えば、以下の概説Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56；Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57；lrvingら, J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45；Schmitzら, Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12、Gonzalesら, Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43を再度参照されたい。これらは、タンパク質工学の技術、例えば、親和性成熟、および免疫グロブリンなど、タンパク質の特異性および他の所望の特性を改善する他の技術について説明している。
【０２２２】
ｄ）  アミノ酸残基は、表Ａ−２に記載したように、標準的な３文字または１文字のアミノコードに従って示す。
【０２２３】
表Ａ−２：１文字および３文字アミノ酸コード
【表１】
2009529339.tif 000002
注）
（１）  極性非荷電アミノ酸と考えられることもある。
（２）  非極性非荷電アミノ酸と考えられることもある。
（３）  当業者には明白であるが、ｐＨ６．０〜７．０で荷電もしくは非荷電であるアミノ酸残基をこの表に記載したからと言って、決して、前記アミノ酸残基が６．０より低いｐＨおよび／もしくは７．０より高いｐＨで有しうる電荷を反映するものではなく、当業者には明白であるが、表に記載したアミノ酸残基は、そのような高いまたは低いｐＨでも荷電および／または非荷電でありうる。
（４）  当技術分野で公知なように、Ｈｉｓ残基の電荷は、ほんのわずかなｐＨの移動にも著しく左右されるが、Ｈｉｓ残基（residu）は、一般的にｐＨ約６．５で本質的に非荷電と考えることができる。
【０２２４】
ｅ）  ２個以上のヌクレオチド配列を比較するための、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の「配列同一性」の％割合は、［第１のヌクレオチド配列において、第２のヌクレオチド配列の対応する位置のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列の総ヌクレオチド数］で割り、［１００％］を掛けることによって計算してよい。その際、第１のヌクレオチド配列と比較した、第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドのそれぞれの削除、挿入、置換、または添加は、一ヌクレオチド（位置）での相異としてみなされる。
【０２２５】
あるいは、２個以上のヌクレオチド配列間の配列同一性度は、配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズム、例えば、NCBI Blast v2.0を使用し、標準的設定を用いて計算されてよい。
【０２２６】
配列同一性度を定量するためのいくつかの他の技術、コンピューターアルゴリズム、および設定については、例えば、国際公開公報第０４／０３７９９９号、欧州特許第０９６７２８４号、欧州特許第１０８５０８９号、国際公開公報第００／５５３１８号、同第００／７８９７２号、同第９８／４９１８５号および英国特許第２３５７７６８号Ａに記載されている。
【０２２７】
通常、上記に概略を述べた計算方法に従って、２個のヌクレオチド配列間の「配列同一性」の％割合を定量するためには、最大数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列ととらえ、その他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列ととらえる。
【０２２８】
ｆ）  ２個以上のアミノ酸配列を比較するためには、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間の「配列同一性」（本明細書では「アミノ酸配列同一性」ともいう）の％割合は、［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基が、第２のアミノ酸配列の対応する位置のアミノ酸残基と同一である数］を［第１のアミノ酸配列の総アミノ酸残基数］で割り、［１００％］を掛けることによって計算される。その際、第１のアミノ酸配列と比較した、第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基のそれぞれの削除、挿入、置換、または添加は、１アミノ酸残基（位置）での相異、すなわち本明細書で定義した「アミノ酸相違」とみなされる。
【０２２９】
あるいは、２個のアミノ酸配列間の配列同一性度は、公知のコンピューターアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列の配列同一性度を定量するための上記のものを使用し、再度標準的設定を用いて計算してよい。
【０２３０】
通常、上記に概略を述べた計算方法に従って、２個のアミノ酸配列間の「配列同一性」の％割合を定量するためには、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列ととらえ、その他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列ととらえる。
【０２３１】
同様に、２個のアミノ酸配列間の配列同一性度の定量では、当業者は、いわゆる、一般的にアミノ酸置換として記載することができ、そのポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんど、または本質的に全く影響を与えない「保存的」アミノ酸置換（その際、一アミノ酸残基は、同様の化学構造の別のアミノ酸残基によって置換されている）を考慮に入れてよい。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野で公知であり、例えば、国際公開公報第０４／０３７９９９号、英国特許第２３５７７６８号Ａ、国際公開公報第９８／４９１８５号、同第００／４６３８３号および同第０１／０９３００号から公知であり、そしてそのような置換の（好ましい）種類および／または組合せは、国際公開公報第０４／０３７９９９号および国際公開公報第９８／４９１８５号の関連する教示に基づき、そしてその中で引用されたそれ以上の参照文献から選択してよい。
【０２３２】
好ましくは、そのような保存的置換は、以下の（ａ）〜（ｅ）群内の一アミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基によって置換されている置換である：（ａ）小さい脂肪族の非極性もしくはわずかに極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負荷電残基およびそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正電荷残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
【０２３３】
特に好ましい保存的置換は、以下のものである：ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒまたはＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換。
【０２３４】
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulzら, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変動の頻度分析、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974およびAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978によって開発された電位を形成する構造の分析、およびEisenbergら, Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984；Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、およびGoldmanら, Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質の疎水性パターン分析にも基づいてよく、全て、参照によりそれら全体を本明細書に組み込む。ナノボディーズの一次、二次、および三次構造についての情報は、本明細書の記述および上記に引用した概括的な背景技術に示す。同様に、この目的のために、ラマのＶＨＨ領域の結晶構造は、例えば、Desmyterら, Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996)；Spinelliら, Natural Structural Biology (1996): 3, 752-757；およびDecanniereら, Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)に示される。従来のＶＨ領域ではＶＨ／ＶＬ界面を形成するアミノ酸残基のいくつか、およびこれらの位置での潜在的なラクダ化置換についての詳しい情報は、上記に引用した従来技術に見出すことができる。
【０２３５】
ｇ）  アミノ酸配列および核酸配列は、その全体長にわたって１００％の配列同一性（本明細書で定義）を有するとき「正確に同じ」であると言う。
【０２３６】
ｈ）  ２個のアミノ酸配列を比較した場合、「アミノ酸相違」という用語は、第２の配列と比較して、第１の配列の位置にある一個のアミノ酸残基の挿入、削除もしくは置換をさし、したがって、その場合における２つのアミノ酸配列にはそのようなアミノ酸相違が１個、２個以上含まれることが理解される。
【０２３７】
ｉ）  ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「を含む」、または「本質的に」別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「のみからなる」と言う場合、これは、後者のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が、それぞれ最初に記載したヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列中に組み込まれていることを意味しうるが、より一般的には、これは一般的に、どのようにして最初に記載した配列が実際に発生し、または得られたかに関わりなく（例えば、本明細書に記載の任意の好適な方法によってよい）、最初に記載したヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が、その配列中に、後者の配列と、それぞれ同じヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を含む、ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の連続をそれぞれ含むことを意味する。限定しない例によって、本発明のナノボディが、CDR配列を含むと言う場合、これは、前記CDR配列が本発明のナノボディ中に組み込まれていることを意味しうるが、より一般的には、これは一般的に、前記本発明のナノボディがどのようにして発生し、または得られたかに関わりなく、本発明のナノボディが、その配列中に、前記CDR配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の連続を含むことを意味する。後者のアミノ酸配列が、特定の生物学的または構造的機能を有する場合、それは、最初に記載したアミノ酸配列中に、本質的に同じ、類似または同等の生物学的または構造的機能を有することが好ましい（すなわち、最初に記載したアミノ酸配列は、後者の配列が、本質的に同じ、類似または同等の生物学的または構造的機能を実施できるというものであることが好ましい）ことにも留意すべきである。例えば、本発明のナノボディが、それぞれ、CDR配列または枠組み配列を含むと言う場合、そのCDR配列および枠組みは、前記ナノボディ中で、それぞれCDR配列または枠組み配列として機能できることが好ましい。同様に、ヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むと言う場合、最初に記載したヌクレオチド配列が、発現産生物（例えばポリペプチド）中で発現した場合、後者のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列が、前記発現産生物の部分を形成するようなものが好ましい（すなわち、後者のヌクレオチド配列が、第１に記載した大きい方のヌクレオチド配列と同じ読み枠中にある）。
【０２３８】
ｊ）  核酸配列もしくはアミノ酸配列は、−例えばその天然生物供給源および／もしくはそれが得られた反応培地または培養培地と比較して−前記供給源または培地に通常付随する少なくとも一つの他の成分、例えば、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、または少なくとも一種の混入物質、不純物、または副成分から分離した場合、「本質的に単離されている（形態）」と考えられる。特に、核酸配列もしくはアミノ酸配列は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも１００倍、および１０００倍までまたはそれ以上に精製されている場合、「本質的に単離されている」と考えられる。「本質的に単離された形態」である核酸配列もしくはアミノ酸配列は、好適な技術、例えば、好適なクロマトグラフ技術、例えばポリアクリルアミド−ゲル電気泳動を使用して定量するように、本質的に均質であることが好ましい。
【０２３９】
ｋ）  一般的には、本明細書で使用する「領域」という用語は、抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、または本質的にそのような球状領域のみからなるポリペプチドをさす。通常、そのような領域は、例えばシートとして、またはジスルフィド結合によって安定化したペプチドループ（例えば、３個または４個のペプチドループ）を含む。「結合領域」という用語は、抗原決定基（本明細書で定義）を標的とするそのような領域をさす。
【０２４０】
ｌ）  「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（例えば、本発明のナノボディもしくはポリペプチド）、より具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される抗原のエピトープをさす。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語は、本明細書では互換的に使用しうる。
【０２４１】
ｍ）  特定の抗原決定基、エピトープ、抗原、もしくはタンパク質（または、その少なくとも一部分、断片、もしくはエピトープ）に結合可能な、それらに親和性を有する、かつ／もしくは特異性を有するアミノ酸配列（例えば、本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、または一般的に抗原結合タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらの断片）は、前記抗原決定基、エピトープ、抗原、もしくはタンパク質「に対する」または「を標的とする」と言う。
【０２４２】
ｎ）  「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子もしくは抗原結合タンパク質（例えば、本発明のナノボディもしくはポリペプチド）分子が結合できる、様々な種類の抗原もしくは抗原決定基数をさす。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／もしくは結合力に基づいて定量することができる。抗原と抗原結合タンパク質の解離平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度を示す尺度であり、ＫＤ値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度は強くなる（あるいは、親和性は、１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）として表すこともできる）。（例えば本明細書の更に詳しい開示に基づき）当業者には明白であるが、親和性は、当該の特定抗原に応じて自体公知の方法で定量することができる。結合力は、抗原結合分子（例えば、本発明のナノボディもしくはポリペプチド）と関連する抗原間の結合強度の尺度である。結合力は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数に関連する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディーズ、および／もしくはポリペプチド）は、解離定数（ＫＤ）が10-5〜10-12mol/L以下、好ましくは10-7〜10-12mol/L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol/L（すなわち、会合定数（ＫＡ）が、105〜10-12L/mol以上、好ましくは107〜10-12L/mol以上、更に好ましくは108〜10-12L/mol）でそれらの抗原に結合する。一般的に、104mol/Lを越える任意のＫＤ値（または、104M-1L/molより低い任意のＫＡ値）は、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価免疫グロブリン配列は、親和性が５００nM未満、好ましくは２００nM未満、更に好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満で、所望の血清タンパク質に結合する。抗原結合タンパク質と、抗原もしくは抗原決定基との特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析および／または競合的結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイを含む自体公知の任意の好適な方法で、かつ当技術分野で自体公知の異なるその変化形、ならびに本明細書に記載した他の技術によって定量することができる。
【０２４３】
当業者には明白であるが、解離定数は、実際のまたは見かけの解離定数であってよい。解離定数を定量する方法は、当業者には明白である。そして、例えば本明細書に記載した技術が含まれる。この点で、また、10-4mol/Lまたは10-3mol/L（10-2mol/Lなど）を越える解離定数が測定できるとは思われないことも明らかである。場合によっては、当業者には明らかであるが、その関係［ＫＤ＝１／ＫＡ］によって、（実際のまたは見かけの）解離定数は、（実際のまたは見かけの）会合定数（ＫＡ）を基準として計算しうる。
【０２４４】
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を示す。一般的には、親和性は、単位がmol/L（またはＭ）であるＫＤ、すなわち解離定数によって示される。親和性は、１／ＫＤに等しく、単位が（mol/L）-1（またはM-1）である会合定数ＫＡで表現することもできる。本明細書では、２分子間（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチドと、その意図した標的と）の相互作用の安定性は、主として、その相互作用のＫＤ値の点から表現し、ＫＡ＝１／ＫＤという関係を考慮して、分子相互作用の強度をそのＫＤ値によって特定することが、対応するＫＡ値の計算に使用できることは当業者には明らかである。ＫＤ値は、熱力学的認識でも分子相互作用の強度を特徴づけるが、それは、公知の関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（ＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ）に相当）［式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度であり、ｌｎは自然対数を示す］による結合の自由エネルギー（ＤＧ）に関するからである。
【０２４５】
意義ある（例えば特異的）と考えられる生物学的相互作用のＫＤは、典型的には10-10（０．１nM）〜10-5M（１００００nM）の範囲である。相互作用が強いほど、そのＫＤは低い。
【０２４６】
ＫＤは、［ｋｏｆｆと示す複合体の解離速度定数］／［ｋｏｎと示すその会合率］の比として表現することもできる（したがって、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフ率ｋｏｆｆは、単位s-1（式中、ｓは第２ＳＩ単位記号）を有する。オン率ｋｏｎは、単位M-1s-1を有する。オン率は、102M-1s-1〜約107M-1s-1で変化すると思われ、二分子相互作用の拡散制限会合率定数に近づく。オフ率は、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆにより、所与の分子相互作用の半減期に関する。オフ率は、10-6s-1（ほぼ不可逆な複合体のｔ１／２は複数日）〜１s-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）で変化しうる。
【０２４７】
２分子間の分子相互作用の親和性は、自体公知の様々な技術、例えば、公知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術によって測定でき（例えば、Oberら, Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照）、その際、一分子をバイオセンサーチップ上に固定し、流動条件下で固定した分子の上に他方の分子を流すと、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定が行われ、それによってＫＤ（またはＫＡ）値が得られる。これは、例えば、公知のBIACOREの装置を使用して実施することができる。
【０２４８】
同様に、測定方法によって、例えばバイオセンサー上に一個の分子をコーティングすることにより生ずる関連物質の影響を、目的分子の固有の結合親和性が多少なりとも受ける場合には、測定したＫＤが見かけのＫＤに対応する可能性は当業者には明らかである。同様に、一分子中に、他の分子を認識する部位が２以上を含まれる場合には、見かけのＫＤが測定される可能性がある。そのような状況では、測定した親和性は、２個の分子の相互作用の結合力に左右される可能性がある。
【０２４９】
親和性を評価するために使用しうる別の手法は、Friguetら (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985)の２段階ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）手順である。この方法によれば、溶液相結合平衡測定が確立され、またプラスチックなどの担体上に一個の分子を吸着させことにより生ずる可能性のある関連物質が回避される。
【０２５０】
しかし、ＫＤの正確な測定は、甚だ労働集約的であり、その結果、しばしば見かけのＫＤ値が、２個の分子の結合強度を評価するために測定される。全ての測定を一貫した方法で（例えば、アッセイ条件を変えないままで）行う限り、見かけのＫＤ測定は、真のＫＤの近似値として使用できることは注目すべきであり、従って本明細書では、ＫＤおよび見かけのＫＤは、同等の重要性または関連性を持って扱うべきである。
【０２５１】
最後に留意すべきこととして、熟練科学者は、結合親和性をある参照分子との対比によって測定するのが便宜であると判断する場合が多い。
【０２５２】
例えば、分子ＡとＢ間の結合強度を評価するためには、例えば、Ｂに結合することが知られ、かつフルオロフォアまたは発色団基または他の化学的構成部分、例えばビオチン、で適切に標識した参照分子Ｃを使用すれば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別法）または他のフォーマット（蛍光検出にはフルオロフォア、光吸収検出には発色団、ストレプトアビジン介在ＥＬＩＳＡ検出にはビオチン）での検出が容易になる。典型的には、参照分子Ｃの濃度を固定し、Ｂの濃度を所与のＢの濃度または量になるように変化させる。その結果、Ａの不在在下でＣについて測定したシグナルが半分になるＡの濃度に対応してＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆおよび参照分子の総濃度ｃｒｅｆが判明している場合、Ａ−Ｂ間の相互作用の見かけのＫＤは、次式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（ｌ＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）から得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆである場合には、ＫＤ＝ＩＣ５０ということに留意されたい。比較するバインダーについて条件を固定（例えばｃｒｅｆを固定）してＩＣ５０の測定を実施した場合には、分子相互作用の強度または安定性は、ＩＣ５０により評価することができ、本書類全体を通して、この測定値は、ＫＤまたは見かけのＫＤに等しいと判定される。
【０２５３】
ｏ）  一般的に、本発明のアミノ酸配列、化合物もしくはポリペプチドの半減期とは、例えば、自然の機序によって配列もしくは化合物が分解されおよび／または配列もしくは化合物が消失もしくは排除され、その結果アミノ酸配列、化合物もしくはポリペプチドの血清濃度がインビボで５０％減少するのに要する時間であると定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物もしくはポリペプチドのインビボ半減期は、自体公知の任意の方法によって、例えば薬物動態分析によって定量することができる。好適な技術は、当業者に明白であり、例えば、一般的に、温血動物［すなわち、ヒトまたは別の好適な哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌまたは霊長類、例えばマカク（Macaca）属のサル｛例えば、特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）および／またはアカゲザル（Macaca mulatta）｝およびヒヒ（Papio ursinus）］に好適な用量の本発明のアミノ酸配列、化合物もしくはポリペプチドを適切に投与するステップ、前記動物から血液試料もしくは他の試料を採取するステップ、前記血液試料中の、この態様のアミノ酸配列、化合物もしくはポリペプチドのレベルもしくは濃度を定量するステップ；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列、化合物もしくはポリペプチドのレベルもしくは濃度が、投薬初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算するステップが含まれてよい。例えば、以下の実験の部、および標準的ハンドブック、例えば、Kenneth, Aら: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Petersら, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996）を参照されたい。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)も参照されたい。
【０２５４】
当業者には明らかであるが（例えば、国際公開公報第０４／００３０１９号の６、７頁、およびその中で引用されたそれ以上の参照文献を参照）、半減期は、パラメーター、例えば、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用し表現することができる。本明細書では、「半減期の上昇」は、これらのパラメーターのどれか一つ、例えば、これらのパラメーターの任意の２つ、または実質的にこれらのパラメーター３つ全てにおける上昇をさす。本明細書で使用する「半減期の上昇」もしくは特に「上昇した半減期」は、ｔ１／２−βの上昇を言い、ｔ１／２−αおよび／もしくはＡＵＣ、またはその両方における上昇には関係しない。
【０２５５】
ｐ）  更に本明細書に詳述したように、ナノボディの総アミノ酸残基数は、１１０〜１２０の範囲であってよく、１１２〜１１５の範囲が好ましく、１１３が最も好ましい。しかし、ナノボディの（本明細書に更に詳しく記載したような）部分、断片、類似体、または誘導体は、特に、その長さおよび／またはサイズによって限定されることはないが、ただし、そのような部分、断片、類似体、または誘導体が、本明細書に概略する更なる要件に適合し、さらに本明細書に記載の目的に好ましく好適であることを条件とすることは留意すべきである。
【０２５６】
ｑ）  本明細書に記載（例えば前記文献の図２を参照）した、RiechmannおよびMuyldermansの論文ではラクダ科のＶＨＨ領域に適用されたように、Kabatら［"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91］によって示されたＶＨ領域に対する一般的番号付与に従って、ナノボディのアミノ酸残基に番号を付す。
【０２５７】
この番号付与に従って、ナノボディのＦＲ１は位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR1は位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ナノボディのCDR2は位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR3は位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、そしてナノボディのＦＲ４は位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。［この点で、ＶＨ領域およびＶＨＨ領域について当技術分野で公知なように、CDRのそれぞれの総アミノ酸残基数は様々であってよく、カバットの番号付与によって示唆された総アミノ酸残基数に対応しなくてもよいことに留意されたい（すなわち、カバットの番号付与による１以上の位置は、実際の配列で占有されていなくてもよく、すなわち実際の配列は、カバットの番号付与により可能な数も多くのアミノ酸残基を含みうる）。これは、一般的に、カバットによる番号付与が、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付与に対応しても、またはしなくてもよいことを意味する。一般的に、しかし、カバットの番号付与に従い、かつCDR中のアミノ酸残基数に関わりなく、カバットの番号付与による１位は、ＦＲ１の開始に対応し逆も同様であり、カバットの番号付与による３６位は、ＦＲ２の開始に対応し逆も同様であり、カバットの番号付与による６６位は、ＦＲ３の開始に対応し逆も同様であり、カバットの番号付与による１０３位は、ＦＲ４の開始に対応し逆も同様であるということができる。］。
【０２５８】
ＶＨ領域のアミノ酸残基に番号付与する別の方法は、ラクダ科ＶＨＨ領域およびナノボディーズにも同様に施用でき、Chothiaら（Nature 342, 877-883 (1989)）が記載した方法であり、いわゆる「ＡｂＭ定義（AbM definition）」であり、いわゆる「接触定義（contact definition）」である。
【０２５９】
しかし、本発明の記述、請求項、および図では、別段指摘しない限り、RiechmannおよびMuyldermansがＶＨＨ領域への適用したようなカバットによる番号付与が行われる。
【０２６０】
ｒ）  本明細書で別段明記しない限り、図、配列表、および実験の部／実施例は、本発明を更に説明するためにのみ提供され、決して本発明の範囲および／もしくは添付の特許請求の範囲を制限するものと解釈したり、または看做したりすべきではない。
【０２６１】
重鎖抗体およびその可変領域の一般的説明については、とりわけ、本明細書に引用した従来技術、Muyldermans in Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277-302による論評記事、ならびに概括的な背景技術として記載された以下の特許出願を参照されたい：Vrije Universiteit Brusselによる国際公開公報第９４／０４６７８号、同第９５／０４０７９号および同第９６／３４１０３号；Unileverの国際公開公報第９４／２５５９１号、同第９９／３７６８１号、同第００／４０９６８号；同第００／４３５０７号、同第００／６５０５７号、同第０１／４０３１０号、同第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号および国際公開公報第０２／４８１９３号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）による国際公開公報第９７／４９８０５号、同第０１／２１８１７号、同第０３／０３５６９４号、同第０３／０５４０１６号および同第０３／０５５５２７号；Algonomics N. V.およびAblynx N.V.国際公開公報第０３／０５０５３１号；カナダの国立研究評議会による国際公開公報第０１／９０１９０号；Institute of Antibodiesによる国際公開公報第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号）；ならびにAblynx N.V.による国際公開公報第０４／０４１８６７号、同第０４／０４１８６２号、同第０４／０４１８６５号、同第０４／０４１８６３号、同第０４／０６２５５１号、同第０５／０４４８５８号、同第０６／４０１５３号、同第０６／０７９３７２号、同第０６／１２２７８６号、同第０６／１２２７８７号および同第０６／１２２８２５号、およびAblynx N.V.によりそれ以上に公開された特許出願。これらの出願に記載されたそれ以上の従来技術、特に、国際出願公開公報第０６／０４０１５３号の４１〜４３頁に記載された参照文献のリストも参照されたい。それらのリストおよび参照文献を参照により本明細書に組み込む。
【０２６２】
上記参照文献に使用された用語によれば、天然重鎖抗体中に存在する可変領域は、従来の４鎖抗体（以下本明細書で「ＶＨ領域」と呼ぶ）に存在する重鎖可変領域、および従来の４鎖抗体（以下本明細書で「ＶＬ領域」と呼ぶ）に存在する軽鎖可変領域と区別するために「ＶＨＨ領域」ともいう。
【０２６３】
前記従来技術に記載したように、ＶＨＨ領域は、数種の特有の構造特性および機能特性を有し、それによって単離したＶＨＨ領域（ならびにそれに基づくナノボディーズであって、そのナノボディーズは、天然ＶＨＨ領域と、これらの構造特性および機能特性を共有する）が作成され、そしてそれを含むタンパク質は、機能性抗原結合領域もしくはタンパク質として使用するのに極めて有利である。特に、かつそれらに限定されることなく、（軽鎖可変領域の存在も、それとのいかなる相互作用もなしに、抗原に機能的に結合するように、自然に「設計された」）ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、単一の比較的小さな機能性抗原結合構造単位、領域、またはタンパク質として機能することができる。これは、ＶＨＨ領域と、従来の４鎖抗体のＶＨおよびＶＬ領域とを区別するが、この従来の４鎖抗体は、一般的に、単独では、単一の抗原結合タンパク質もしくは領域として実際的な適用に好適ではなく、ある形または別の形で組み合わせて、機能性抗原結合単位（例えば、Ｆａｂ断片などの従来の抗体断片；ＶＬ領域と共有結合したＶＨ領域のみからなるＳｃＦｖ'ｓ断片）を得る必要がある。
【０２６４】
これらの特有の特性のために、単一の抗原結合タンパク質として、または抗原結合領域（すなわち、大型のタンパク質もしくはポリペプチドの一部）として、ＶＨＨ領域およびナノボディーズを使用することによって、従来のＶＨおよびＶＬ領域、ｓｃＦｖ'ｓ、または従来の抗体断片（例えばＦａｂ断片またはＦ（ａｂ'）２断片）の使用に優る以下のいくつかの顕著な利点がもたらされる。
−  高親和性および高選択性で抗原と結合するのに一領域だけでよく、その結果、２個の別個の領域を存在させる必要がないばかりか、確実にこれらの２個の領域が（すなわち、ｓｃＦｖ'ｓのように、特別に設計したリンカーを用いて）正しい空間的立体配座および配置で存在するようにする必要もない。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後に折畳みまたは改変する必要がない。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、容易に、（本明細書に詳しく記載した）多価および多重特異性フォーマット体に設計することができる。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、高度に可溶性であり、（Wardら, Nature, Vol. 341, 1989, p. 544が記載したマウス由来抗原結合領域のような）凝集する傾向はない。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、熱、ｐＨ、プロテアーゼおよび他の変性させる薬剤もしくは条件（例えば上記Ewertらを参照）に高度に安定性である。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、生成に必要な規模においてすら、製造が容易で比較的安価である。例えば、ＶＨＨ領域、ナノボディーズ、およびそれを含むタンパク質／ポリペプチドは、生成することができる（例えば、以下にさらに記載したような）微生物発酵を使用し、例えば従来の抗体断片のように哺乳動物発現系を使用する必要がない。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、従来の４鎖抗体およびそれの抗原結合断片と比較して比較的小さく（約１５kDa、すなわち従来のＩｇＧの１／１０）、従ってそのような従来の４鎖抗体およびそれの抗原結合断片よりも高い組織（それだけに限定されるわけではないが、固形腫瘍および他の高密度組織を含む）浸透性を示す。
−  ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、いわゆる空洞結合（cavity-binding）特性（とりわけ、従来のＶＨ領域と比較して、それらの伸展したCDR3ループによる）を示すことができ、従って従来の４鎖抗体およびそれの抗原結合断片が到達できなかった標的およびエピトープにも到達することができる。例えば、ＶＨＨ領域およびナノボディーズは、酵素を阻害できることが示されている（例えば、上記国際公開公報第９７／４９８０５号；Transueら,(1998)上掲; Lauwereysら,(1998)を参照）。
【０２６５】
特定の好ましい態様では、本発明は、IL-6に対するナノボディーズ、特に温血動物のIL-6に対するナノボディーズ、より具体的には哺乳動物のIL-6に対するナノボディーズ、特にヒトIL-6に対するナノボディーズ、同様に少なくとも一個のそのようなナノボディを含むタンパク質および／またはポリペプチドを提供する。
【０２６６】
特に、本発明は、IL-6に対する従来の抗体またはそれの断片、そのような従来の抗体もしくは抗体断片をベースにするであろう構造体［例えばＦａｂ'断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、ＳｃＦｖ構造体、「二重特異性抗体」、および他の多重特異性構造体｛例えばHolliger and Hudson, Nat Biotechnol、2005 Sep; 23(9):1126-36による概説を参照されたい｝］、同様にいわゆる「ｄＡｂ」または従来の抗体の可変領域から誘導させうる同様の（単）領域抗体と比較して、治療特性および／または薬理学的特性が改善され、かつ／または他の有利な特性（例えば、製造の容易さが改善され、かつ／または物品コストが減少するなど）を有する、IL-6に対するナノボディーズ、およびそれを含むタンパク質および／またはポリペプチドを提供する。これらの改善された有利な特性は本明細書の他の記述から明瞭であり、例えば以下の１以上が挙げられるが、これらに限定されない。
−  IL-6に対する親和性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において増加；
−  フォーマット化への適合性が、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）において向上；
−  フォーマット化への適合性が、多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において向上；
−  「ヒト化」の置換（本明細書で定義）への適合性もしくは感受性が改善；
−  免疫原性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または一価フォーマット体における多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において低下；
−  安定性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または一価フォーマット体における多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において増加；
−  Il-6に対する特異性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において増加；
−  異なる種に由来するIL-6との交差反応性が減少、もしくは望ましい場合には増加；
および／または、
−  医薬的用途（例えば予防用途および／もしくは治療用途）および／または診断用途（例えば限定されないが画像化目的の用途）にとって望ましい他の１以上の特性が、一価フォーマット体、多価フォーマット体（例えば二価フォーマット体）および／または一価フォーマット体における多重特異性フォーマット体（例えば以下に記載の多重特異性フォーマット体の一つ）において向上。
【０２６７】
本発明のアミノ酸配列について本明細書に概括的に記載したように、本発明のナノボディーズは、本質的に単離された形態（本明細書で定義）、または本発明のタンパク質もしくはポリペプチドの形態部分（本明細書で定義）であることが好ましく、それらは、本発明の１以上のナノボディーズを含み、または本質的にそれらのみからなる可能性があり、かつ場合によっては更に（任意により、全て、１以上の好適なリンカーを介して結合した）１以上の更なるアミノ酸配列を含みうる。例えば、それだけに限定されるわけではないが、本発明の１以上のアミノ酸配列は、１以上の更なるアミノ酸配列を含みうる、タンパク質もしくはポリペプチドにおいて、結合単位として使用してもよく、そのようなタンパク質もしくはポリペプチドは、場合によっては、全て本明細書に記載した、それぞれ、本発明の一価、多価、もしくは多重特異性ポリペプチドを得るために、（すなわち、IL-6以外の１以上の他の標的に対する）結合単位として利用することができる。特に、本明細書に更に詳しく記載したような、それぞれ一価、多価、もしくは多重特異性ナノボディ構造体を得るために、そのようなタンパク質もしくはポリペプチドは、本発明の１以上のナノボディーズ、および場合によっては（すなわち、IL-6以外の他の標的に対する）１以上の（他の）ナノボディーズを含み、または本質的にそれらのみからなってよく、これらは全て、場合によっては１以上の好適なリンカーを介して結合している。そのようなタンパク質もしくはポリペプチドは、本質的に単離された形態（本明細書で定義）であってもよい。
【０２６８】
本発明のナノボディでは、IL-6と結合する結合部位は、CDR配列によって形成されていることが好ましい。場合によっては、本発明のナノボディは、IL-6と結合するための少なくとも一個の結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質、もしくは標的と結合するための１以上の更なる結合部位も含みうる。そのような第２の結合部位を導入するための方法および位置については、例えば、Keck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011；欧州特許第０６４０１３０号；国際公開公報第０６／０７２６０号およびAblynx N.V.により２００６年１１月２７日に出願された表題「Immunoglobulin domains with multiple binding sites」の米国仮出願を参照されたい。
【０２６９】
本発明のアミノ酸配列について本明細書に概括的に記載したように、本発明のナノボディ（またはそれを含む本発明のポリペプチド）を（例えば、本明細書に記載したように治療および／または診断を目的として）対象に投与することを意図している場合、ヒトIL-6を標的とすることが好ましいが、動物用薬の目的では、治療する種のIL-6を標的とするのが好ましい。同様に、本発明のアミノ酸配列と同様に、本発明のナノボディは、（すなわち２種以上の哺乳動物種のIL-6、例えば、ヒトIL-6に、本明細書に記載した哺乳動物種の少なくとも一つのIL-6を標的として）交差反応性であるかもしれず、またはそうでないかもしれない。
【０２７０】
同様に、再度本発明のアミノ酸配列について本明細書に概括的に記載したように、本発明のナノボディーズは、一般的に、IL-6の任意のエピトープ、抗原決定基、部分、領域、サブユニット、または（適用可能なであれば）コンフォメーション（confirmation）を標的としうる。
【０２７１】
既に本明細書に記載したように、ナノボディのアミノ酸配列および構造は、−それらに限定されるわけではないが−当技術分野および本明細書では、それぞれ、「枠組み構成領域１」または「ＦＲ１」；「枠組み構成領域２」または「ＦＲ２」；「枠組み構成領域３」または「ＦＲ３」；および「枠組み構成領域４」または「ＦＲ４」と呼ぶ４個の枠組み構成領域または「ＦＲ」（または「ＦＷ」と言う場合もある）から構成され、それらの枠組み構成領域が、当技術分野で、それぞれ、「相補性決定領域１」または「CDR1」；「相補性決定領域２」または「CDR2」；および「相補性決定領域３」または「CDR3」と呼ぶ３個の相補性決定領域または「CDR」によって中断されていると考えることができる。本発明のナノボディーズ中に存在する、いくつかの好ましい枠組み配列とCDR（およびそれらの組合せ）は、本明細書に記載したようなものである。他の好適なCDR配列は、本明細書に記載の方法によって得ることができる。
【０２７２】
本発明の限定しないが好ましい態様によれば、本発明のナノボディーズ（中に存在するCDR配列）は、例えば
−  そのナノボディーズがIL-6に結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12mol/L以下、好ましくは10-7〜10-12mol/L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol/L（すなわち、会合定数（ＫＡ）が、105〜1012L/mol以上、好ましくは107〜1012L/mol以上、更に好ましくは108〜1012L/mo）が可能あり；、
および／または、例えば
−  そのナノボディーズがIL-6に結合するにあたって、その結合のｋｏｎ率は102M-1s-1と約107M-1s-1の間、好ましくは108M-1s-1と107M-1s-1の間、更に好ましくは104M-1s-1と107M-1s-1の間、例えば、105M-1s-1と107M-1s-1の間が可能あり；
および／または
−  そのナノボディーズがIL-6に結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は１s-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6s-1（複数日のｔ１／２でほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2s-1と10-6s-1の間、更に好ましくは10-3s-1と10-6s-1の間、例えば10-4s-1と10-6s-1の間が可能ある。
【０２７３】
好ましくは、本発明のナノボディーズ（中に存在するCDR配列）は、例えば本発明の一価のナノボディ（または、本発明のナノボディのみを含むポリペプチド）は、好ましくは、例えばそれがIL-6に結合するにあたって、その結合の親和性度は５００nM未満、好ましくは２００nM未満、更に好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満である。
【０２７４】
本発明のIL-6に対するナノボディの親和性は、自体公知の方法、例えば、本明細書に記載したＫＤ、ＫＡ、ｋｏｆｆまたはｋｏｎを測定するための一般的な技術、ならびに本明細書に記載の特定の測定法のいくつかを使用し定量することができる。
【０２７５】
いくつかの好ましい、IL-6と本発明のナノボディーズ（およびそれを含むポリペプチドの）との結合のＩＣ５０値は、本明細書の更に詳しい記述および実施例から明らかになる。
【０２７６】
好ましいが限定しない態様では、本発明は、４個の枠組み構成領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなるIL-6に対するナノボディ（本明細書で定義）であって、
CDR1が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および／または
CDR2が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および／または
CDR3が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択されることを特徴とするナノボディ、あるいはそのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片に関する。
【０２７７】
特に、この好ましいが限定しない態様によれば、本発明は、４個の枠組み構成領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなるIL-6に対するナノボディ（本明細書で定義）であって、
CDR1が、
ａ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１６７〜２１７のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および
CDR2が、
ｄ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２１８〜２６８のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択され；および
CDR3が、
ｇ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号２６９〜３１９のアミノ酸配列の少なくとも一つと３個、２個または１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
のみからなる群から選択されることを特徴とするナノボディ、あるいはそのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片に関する。
【０２７８】
本発明のアミノ酸配列について本明細書に概略的に記載したように、本発明のナノボディが、ｂ）および／またはｃ）に記載の１以上のCDR1配列を含む場合、
ｉ）  ｂ）および／またはｃ）に記載のそのようなCDR中の任意のアミノ酸置換は、好ましくは、そしてａ）に記載の対応するCDRと比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であり；および／または
ｉｉ）  ａ）に記載の対応するCDRと比較して、ｂ）および／またはｃ）に記載のCDRは、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず、かつ／または
ｉｉｉ）  ｂ）および／またはｃ）に記載のCDRは、自体公知の１以上の親和性成熟技術を使用する親和性成熟によって、ａ）に記載のCDRから誘導させたCDRであってよい。
【０２７９】
同様に、本発明のナノボディが、ｅ）および／またはｆ）に記載の１以上のCDR2配列を含む場合、
ｉ）  ｅ）および／またはｆ）に記載のそのようなCDR中の任意のアミノ酸置換は、好ましくは、そしてｄ）に記載の対応するCDRと比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であり；および／または
ｉｉ）  ｄ）に記載の対応するCDRと比較して、ｅ）および／またはｆ）に記載のCDRは、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず、かつ／または
ｉｉｉ）  ｅ）および／またはｆ）に記載のCDRは、自体公知の１以上の親和性成熟技術を使用する親和性成熟によって、ｄ）に記載のCDRから誘導させたCDRであってよい。
【０２８０】
同様に類似して、本発明のナノボディが、ｈ）および／またはｉ）に記載の１以上のCDR3配列を含む場合、
ｉ）  ｈ）および／またはｉ）に記載のそのようなCDR中の任意のアミノ酸置換は、好ましくは、そしてｇ）に記載の対応するCDRと比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であり；および／または
ｉｉ）  ｇ）に記載の対応するCDRと比較して、ｈ）および／またはｉ）に記載のCDRは、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず、かつ／または
ｉｉｉ）  ｈ）および／またはｉ）に記載のCDRは、自体公知の１以上の親和性成熟技術を使用する親和性成熟によって、ｇ）に記載のCDRから誘導させたCDRであってよい。
【０２８１】
最後の３段落は、一般的に、それぞれｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）、またはｉ）による、１以上のCDR1配列、CDR2配列および／またはCDR3配列を含む任意の本発明のナノボディに当てはまると理解すべきである。
【０２８２】
本発明のナノボディーズのうち、先に明示したCDRの１以上を含むナノボディーズが特に好ましく、先に明示したCDRの２個以上を含むナノボディーズがさらに特に好ましく、先に明示したCDRの３個を含むナノボディーズが最も特に好ましい。
【０２８３】
いくつかの特に好ましいが限定しないCDR配列の組合せ、ならびにCDR配列と枠組み配列の好ましい組合せを下表Ａ−１に記載するが、下表Ａ−１には、本発明のいくつかの好ましい（が限定しない）ナノボディーズ中に存在するCDR配列と枠組み配列を列挙する。当業者には明白であるが、通常、同じクローンで生じるCDR1、CDR2、およびCDR3配列の組合せ（すなわち、表Ａ−１の同じ列に記載されたCDR1、CDR2、およびCDR3配列）が好ましい（ただし、その最も広い意味において本発明は、それらだけには限定されず、更に表Ａ−１に記載のCDR配列の他の好適な組合せを含む）。同様に、通常、同じクローンで生じるCDR配列と枠組み配列の組合せ（すなわち、表Ａ−１の同じ列に記載されたCDR配列と枠組み配列）が好ましい（ただし、その最も広い意味において本発明は、それらだけには限定されず、更に表Ａ−１に記載のCDR配列と枠組み配列の他の好適な組合せ、ならびに例えば、本明細書に更に詳しく記載したような、そのようなCDR配列と他の好適な枠組み配列の組合せを含む）。
【０２８４】
同様に、表Ａ−１に記載のCDRの組合せを含む本発明のナノボディーズでは、各CDRは、記載したCDRと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列のみからなる群から選択したCDRと置き換えることができ、その際
ｉ）  そのようなCDR中の任意のアミノ酸置換は、好ましくは、そして表Ａ−１に記載の対応するCDR配列と比較して保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であり、
および／もしくは
ｉｉ）  表Ａ−１に記載の対応するCDR配列と比較して、任意のそのようなCDR配列は、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除または挿入を含まず、
および／もしくは
ｉｉｉ）  任意のそのようなCDR配列は、自体公知の親和性成熟技術によって、特に配列表Ａ−１に記載の対応するCDRから出発して誘導させたCDRである。
【０２８５】
しかし、当業者には明白であるが、表Ａ−１に記載のCDR配列（の組合せ）、ならびにCDR配列と枠組み配列配列（の組合せ）が一般的には好ましい。
【０２８６】
表Ａ−１：CDR配列の好ましい組合せ、枠組み配列の好ましい組合せ、および枠組み配列とCDR配列の好ましい組合せ。
（添付の配列表で「ＩＤ」は配列番号をさす）
【表２−１】
2009529339.tif 000003
【表２−２】
2009529339.tif 000004
【表２−３】
2009529339.tif 000005
【表２−４】
2009529339.tif 000006
【表２−５】
2009529339.tif 000007
【表２−６】
2009529339.tif 000008
【０２８７】
従って、本発明のナノボディーズでは、存在するCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも１個は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群；またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の「配列同一性」（本明細書で定義）を有する、それぞれCDR1、CDR2、およびCDR3配列の群；および／またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）を有する、それぞれCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２８８】
この意味において、「適切に選択した」は、適用可能であれば、それぞれ、CDR1配列は、好適なCDR1配列（すなわち、本明細書で定義したもの）から選択し、CDR2配列は、好適なCDR2配列（すなわち、本明細書で定義したもの）から選択し、CDR3配列は、好適なCDR3配列（すなわち、本明細書で定義したもの）から選択することを意味する。より具体的には、CDR配列は、本発明のナノボディーズが、IL-6に本明細書で定義した親和性［（実際のまたは見かけの）ＫＤ値、（実際のまたは見かけの）ＫＡ値、ｋｏｎ率および／もしくはｋｏｆｆ率、または別法として更に本明細書に記載したようなＩＣ５０値として好適に測定され、かつ／もしくは表現される］で結合できるように選択するのが好ましい。
【０２８９】
特に、本発明のナノボディーズでは、存在する少なくともCDR3配列は、表Ａ−１に列挙したCDR3配列のみからなる群；または表Ａ−１に列挙したCDR3配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR3配列の群；および／または表Ａ−１に列挙したCDR3配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有するCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９０】
好ましくは、本発明のナノボディーズでは、存在するCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも２個は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群；またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それぞれCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群；および／またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」を有するそれぞれCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９１】
特に、本発明のナノボディーズでは、存在する少なくともCDR3配列は、表Ａ−１に列挙したCDR3配列のみからなる群；またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR3配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR3配列の群；およびCDR1の少なくとも一つから適切に選択される。ならびに、存在するCDR2配列は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1およびCDR2配列のみからなる群；またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれぞれCDR1およびCDR2配列群；および／またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有する、それぞれCDR1およびCDR2配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９２】
最も好ましくは、本発明のナノボディーズでは、存在する全３個のCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群；またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それぞれCDR1、CDR2、およびCDR3配列の群；および／またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有する、それぞれCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９３】
より更に好ましくは、本発明のナノボディーズでは、存在するCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも一つは、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在する他の２個のCDR配列の少なくとも一個または好ましくは両方は、それぞれ表Ａ−１に列挙した対応するCDR配列の少なくとも一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR配列；および／またはそれぞれ表Ａ−１に列挙した対応する配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有するCDR配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９４】
特に、本発明のナノボディーズでは、少なくとも存在するCDR3配列は、表Ａ−１に列挙したCDR3のみからなる群から適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在するCDR1もしくはCDR2配列の少なくとも一個および好ましくは両方は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1およびCDR2配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それぞれCDR1およびCDR2配列群；および／またはそれぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1およびCDR2配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有する、それぞれCDR1およびCDR2配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９５】
より更に好ましくは、本発明のナノボディーズでは、存在するCDR1、CDR2、およびCDR3配列の少なくとも２個は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在する残りのCDR配列は、表Ａ−１に列挙した対応するCDR配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR配列の群；および／または表Ａ−１に列挙した対応する配列の少なくとも一つと、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有するCDR配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９６】
特に、本発明のナノボディーズでは、少なくともCDR3配列は、表Ａ−１に列挙したCDR3配列のみからなる群から適切に選択され、かつCDR1配列またはCDR2配列は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1およびCDR2配列のみからなる群から適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在する残りのCDR配列は、表Ａ−１に列挙した対応するCDR配列の少なくとも一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR配列の群；および／または表Ａ−１に列挙した対応するCDR配列と、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有するCDR配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９７】
より更に好ましくは、本発明のナノボディーズでは、存在する全３個のCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列のみからなる群から適切に選択される。
【０２９８】
同様に、一般的に、表Ａ−１に列挙したCDRの組合せ（すなわち、表Ａ−１の同じ列に記載されているもの）が好ましい。従って、一般的に、本発明のナノボディ中のCDRが、表Ａ−１に記載のCDR配列であるか、または表Ａ−１に列挙したCDR配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR配列の群；および／または表Ａ−１に列挙したCDR配列と、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有するCDR配列のみからなる群から適切に選択された場合、他のCDRの少なくとも一個および好ましくは両方は、表Ａ−１の同じ組合せ（すなわち、表Ａ−１の同じ列に記載されている）に属するCDR配列から適切に選択されるか、または同じ組合せに属しているCDR配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するCDR配列の群；および／または同じ組合せに属しているCDR配列と、３個、２個もしくは１個のみのアミノ酸相違を有するCDR配列のみからなる群から適切に選択されるのが好ましい。上記段落に示した他の好ましい例は、表Ａ−１に記載のCDRの組合せにも当てはまる。
【０２９９】
従って、限定しない例によって、本発明のナノボディは、例えば、表Ａ−１に記載のCDR1配列に８０％を超える配列同一性を有するCDR1配列、表Ａ−１に記載の（しかし異なる組合せに属している）CDR2配列の一つと、３個、２個もしくは１個のアミノ酸相違を有するCDR2配列、およびCDR3配列を含みうる。
【０３００】
本発明のいくつかの好ましいナノボディーズは、例えば、（１）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つと８０％を超える配列同一性を有するCDR1配列；表Ａ−１に記載の（しかし異なる組合せに属している）CDR2配列の一つと、３個、２個もしくは１個のアミノ酸相違を有するCDR2配列；および表Ａ−１に記載の（しかし異なる組合せに属している）CDR3配列の一つと８０％を超える配列同一性を有するCDR3配列；あるいは（２）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つと８０％を超える配列同一性を有するCDR1配列；CDR2配列、および表Ａ−１に列挙したCDR3配列の一つ；あるいは（３）CDR1配列；表Ａ−１に列挙したCDR2配列の一つと８０％を超える配列同一性を有するCDR2配列；およびCDR2配列と同じ組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR3配列と、３個、２個もしくは１個のアミノ酸相違を有するCDR3配列を含みうる。
【０３０１】
本発明のいくつかの特に好ましいナノボディーズは、例えば、（１）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つと８０％を超える配列同一性を有するCDR1配列；同じ組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR2配列と、３個、２個もしくは１個のアミノ酸相違を有するCDR2配列；および同じ組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR3配列と、８０％を超える配列同一性を有するCDR3配列；（２）CDR1配列；表Ａ−１に列挙したCDR2、および表Ａ−１に列挙したCDR3配列（その際、CDR2配列およびCDR3配列は異なる組合せに属してよい）を含みうる。
【０３０２】
本発明のいくつかのより更に好ましいナノボディーズは、例えば、（１）表Ａ−１に記載のCDR1配列の一つと８０％を超える配列同一性を有するCDR1配列；同じ組合せに属する表Ａ−１に列挙したCDR2配列；および異なる組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR3配列；または（２）表Ａ−１に記載のCDR1配列；同じ組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR2配列と、３個、２個もしくは１個のアミノ酸相違を有するCDR2配列；および同じもしくは異なる組合せに属する表Ａ−１に列挙したCDR3配列と８０％を超える配列同一性を有するCDR3配列を含みうる。
【０３０３】
本発明の特に好ましいナノボディーズは、例えば、表Ａ−１に記載のCDR1配列、同じ組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR2配列と８０％を超える配列同一性を有するCDR2配列；および同じ組合せに属する表Ａ−１に記載のCDR3配列を含みうる。
【０３０４】
本発明の最も好ましいナノボディーズでは、存在するCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、それぞれ表Ａ−１に列挙したCDR1、CDR2、およびCDR3配列の組合せの一つから適切に選択される。
【０３０５】
本発明の別の好ましいが限定しない態様によれば、（ａ）CDR1の長さは１〜１２アミノ酸残基、通常２〜９アミノ酸残基、例えば、５、６または７アミノ酸残基であり；および／または（ｂ）CDR2の長さは１３〜２４アミノ酸残基、通常１５〜２１アミノ酸残基、例えば、１６〜１７アミノ酸残基であり；および／または（ｃ）CDR3の長さは２〜３５アミノ酸残基、通常３〜３０アミノ酸残基、例えば、６〜２３アミノ酸残基である。
【０３０６】
別の好ましいが限定しない態様では、本発明は、CDR配列（本明細書で定義）が、配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つのCDR配列と、８０％を超える、好ましくは９０％を超える、更に好ましくは９５％を超える、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で定義）を有するナノボディに関する。
【０３０７】
一般的に、上記CDR配列を有するナノボディーズは、本明細書に更に詳しく記載しうるようなものであり、好ましくは本明細書にも更に詳しく記載したような枠組み配列を有する。従って、例えば、および本明細書に記載するように、そのようなナノボディーズは、（任意の好適な種から得た）天然ナノボディーズ、（すなわち、好適なラクダ科の種から得た）天然ＶＨＨ配列、または合成もしくは半合成アミノ酸配列またはナノボディーズであってよく、それだけに限定されるわけではないが、部分的にヒト化したナノボディーズまたはＶＨＨ配列、完全にヒト化したナノボディーズまたはＶＨＨ配列、ラクダ化した重鎖可変領域配列、および本明細書に記載した技術によって得られたナノボディーズが含まれる。
【０３０８】
従って、一つの具体的ではあるが限定しない態様では、本発明は、４個の枠組み構成領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）のみからなるヒト化したナノボディであって、CDR1〜CDR3は本明細書で定義した通りであり、そして前記ヒト化したナノボディが、少なくとも一個のヒト化置換（本明細書で定義）を含み、特に、その枠組み配列（本明細書で定義）の少なくとも一個中に少なくとも一個のヒト化置換を含むナノボディに関する。
【０３０９】
別の好ましいが限定しない態様では、本発明は、CDR配列が、配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つのCDR配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、更に好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、または更に実質的に１００％のアミノ酸同一性を有するナノボディに関する。このアミノ酸同一性の程度は、例えば、前記ナノボディと、配列番号３２０〜３７０の配列の１以上との間のアミノ酸同一性度を（本明細書に記載した方法で）定量することによって決定でき、その際、その枠組み構成領域を形成するアミノ酸残基は無視する。そのようなナノボディーズは、本明細書に更に詳しく記載したようなものであってよい。
【０３１０】
別の好ましいが限定しない態様では、本発明は、配列番号３２０〜３７０のみからなる群、または配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つと、８０％を超える、好ましくは９０％を超える、更に好ましくは９５％を超える、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列のみからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するナノボディに関する。
【０３１１】
本発明の別の好ましいが限定しない態様は、配列番号３２０〜３７０のナノボディーズのヒト化した変異体であって、対応する天然ＶＨＨ配列と比較して、少なくとも一個のヒト化置換（本明細書で定義）、特に、その枠組み配列（本明細書で定義）の少なくとも一個中に少なくとも一個のヒト化置換を含む変異体に関する。
【０３１２】
本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも一個のナノボディを含むまたは本質的にのみからなる。本発明のポリペプチドのいくつかの好ましいが限定しない例を配列番号３７１〜４４７に示す。
【０３１３】
「好ましい」（または「より好ましい」、「より更に好ましい」など）として本明細書に記載したナノボディーズは、本明細書に記載のポリペプチドの使用にも好ましい（または、より好ましい、またはより更に好ましいなど）ことは当業者には明らかである。従って、本発明の１以上の「好ましい」ナノボディーズを含むまたは本質的にのみからなるポリペプチドが、一般的には好ましく、本発明の１以上の「より好ましい」ナノボディーズを含むまたは本質的にのみからなるポリペプチドが、一般的にはより好ましく、以下同様。
【０３１４】
本明細書では、一般的に、１個のナノボディ（例えば、本発明の一個のナノボディ）を含むまたは本質的にのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドは、「一価の」タンパク質もしくはポリペプチドまたは「一価構造体」をさす。本明細書では、２個以上のナノボディーズ（例えば本発明の少なくとも２個のナノボディーズ、または本発明の少なくとも一個のナノボディと少なくとも一つの他のナノボディ）を含むまたは本質的にのみからなるタンパク質およびポリペプチドは、「多価の」タンパク質もしくはポリペプチド、または「多価構造体」をさし、これらは、対応する本発明の一価のナノボディーズと比較して、ある種の利点をもたらしうる。そのような多価構造体のいくつかの限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３１５】
一つの具体的ではあるが限定しない態様によれば、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも２個のナノボディーズ、例えば、２個または３個の本発明のナノボディーズを含むまたは本質的にのみからなる。本明細書に更に詳しく記載するように、そのような多価構造体からは、単一の本発明のナノボディを含む、または本質的にそれらのみからなるタンパク質もしくはポリペプチドと比較して、IL-6に対する非常に改善された結合力など、ある種の利点を得ることができる。そのような多価構造体は、本明細書の開示に基づき当業者には明白である。そのような多価ナノボディ構造体のいくつかの好ましいが限定しない例は、配列番号３７１〜４４７の構造体である。
【０３１６】
別の具体的ではあるが限定しない態様によれば、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１個のナノボディ、および同様にナノボディであることが好ましい少なくとも一つの他の（すなわち別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質もしくはポリペプチドに対する）結合単位を含むまたは本質的にのみからなる。本明細書では、そのようなタンパク質もしくはポリペプチドは、「多重特異性」タンパク質もしくはポリペプチド、または「多重特異性構造体」とも言い、これらは、対応する本発明の一価のナノボディーズと比較して、（本明細書でいくつかの好ましいが、限定しない多重特異性構造体をさらに考察することから明らかになるが）ある種の利点をもたらしうる。そのような多重特異性構造体は、本明細書の開示に基づき当業者には明白である。そのような多重特異性ナノボディ構造体のいくつかの好ましいが限定しない例が配列番号３７１〜４４７の構造体である。
【０３１７】
更に別の具体的ではあるが限定しない態様によれば、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも一個のナノボディ、場合によっては１個以上の更なるナノボディーズ、ならびに本発明のナノボディおよび／もしくは得られた融合タンパク質に少なくとも一つの所望の特性をもたらす少なくとも一つの他のアミノ酸配列（例えば、タンパク質もしくはポリペプチド）を含むまたは本質的にのみからなる。再度、そのような融合タンパク質は、対応する本発明の一価のナノボディーズと比較して、ある種の利点をもたらしうる。そのようなアミノ酸配列およびそのような融合構造体のいくつかの限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３１８】
２個以上の上記態様を組み合わせて、例えば、本発明の２個のナノボディーズおよび１個の他のナノボディ、および場合によっては１以上の他のアミノ酸配列を含む三価の二重特異性構造体を得ることも可能である。そのような構造体、および本発明の脈絡内で特に好ましいいくつかの構造体のそれ以上の限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３１９】
上記構造体では、１以上のナノボディーズおよび／または他のアミノ酸配列は、互いに直接結合していても、かつ／または１以上のリンカー配列を介して互いに適切に結合していてもよい。そのようなリンカーのいくつかの好適であるが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３２０】
本発明の具体的一態様では、本発明のナノボディ、または本発明の少なくとも一個のナノボディを含む本発明の化合物、構造体、もしくはポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列と比較して半減期が上昇している。そのようなナノボディーズ、化合物およびポリペプチドのいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい開示に基づき当業者に明らかになる。そして、例えば、それらの例には、その半減期を上昇させるために（例えばＰＥＧ化によって）化学的に改変した本発明のナノボディーズ配列もしくはポリペプチド；血清タンパク質（例えば血清アルブミン。例えば、Ablynx N.V.により２００６年１１月２７日に出願された表題「Immunoglobulin domains with multiple binding sites」という米国仮出願を参照）と結合するための少なくとも一個の追加の結合部位を含む本発明のアミノ酸配列；または本発明のナノボディの半減期を上昇させる少なくとも一個の構成部分（特に少なくとも一つのアミノ酸配列）に結合する本発明の少なくとも一個のナノボディを含む本発明のポリペプチドが含まれる。そのような半減期伸張構成部分またはアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書の更に詳しい開示に基づき当業者に明らかであり、例えば、限定されるわけではないが、本発明の１以上のナノボディーズが、１以上の血清タンパク質もしくはそれの断片（例えば血清アルブミンまたはそれの好適な断片）に適切に結合しているか、または血清タンパク質（例えば、血清アルブミンなどの血清タンパク質、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンと結合可能なナノボディーズもしくは（単）領域抗体）と結合可能な１以上の結合単位に適切に結合しているポリペプチド；本発明のナノボディがＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）またはそれの好適な部分もしくは断片に結合しているポリペプチド；または本発明の１以上のナノボディーズが、血清タンパク質と結合可能な１以上の小さいタンパク質もしくはペプチド（例えば、それだけに限定されるわけではないが、国際公開公報第９１／０１７４３号、同第０１／４５７４６号、同第０２／０７６４８９号、およびAblynx N.V.により２００６年１２月５日に出願された表題「Peptides capable of binding to serum proteins」というAblynx N.V.の米国仮出願に記載されているタンパク質もしくはペプチド）に適切に結合しているポリペプチドが挙げられる。
【０３２１】
再度、当業者には明白であるが、そのようなナノボディーズ、化合物、構造体またはポリペプチドは、三重もしくは多重特異性（tri- of multispecific）ナノボディ構造体を得るために、１以上の付加基、残基、構成部分、もしくは結合単位、例えば、１以上の更なるアミノ酸配列、特に１以上の追加の（すなわちIL-6を標的としない）ナノボディーズを含みうる。
【０３２２】
一般的に、半減期が上昇している本発明のナノボディーズ（またはそれを含む化合物、構造体、もしくはポリペプチド）は、対応する本発明のアミノ酸配列それ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、もしくは２０倍を越えて大きい半減期を有することが好ましい。例えば、半減期が上昇している本発明のナノボディーズ、化合物、構造体、もしくはポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体と比較して、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、更に好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を越えて、または２４、４８もしくは７２時間さえも超えて上昇した半減期を有してよい。
【０３２３】
本発明の好ましいが限定しない態様では、そのような本発明のナノボディーズ、化合物、構造体もしくはポリペプチドは、ヒトでの血清中半減期が、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、更に好ましくは少なくとも４８時間、一層更に好ましくは少なくとも７２時間以上を示す。例えば、本発明の化合物もしくはポリペプチドの半減期は、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、更に好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、更に好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日を越え（例えば約１４〜１９日）てよい。
【０３２４】
本発明の別の一態様では、本発明のポリペプチドは、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横切ることができるようにする１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）アミノ酸配列に（場合によっては、１以上の好適なリンカー配列を介して）結合した、本発明の１以上の（例えば２個、または好ましくは１個の）ナノボディーズを含む。特に、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横切ることができるようにする前記１以上のアミノ酸配列は、１以上の（例えば２個、好ましくは１個の）ナノボディーズ、例えば、国際公開公報第０２／０５７４４５号に記載されているナノボディーズであってよく、そのうち、ＦＣ４４（国際公開公報第０６／０４０１５３号の配列番号１８９）およびＦＣ５（国際公開公報第０６／０４０１５４号の配列番号１９０）が好ましい例である。
【０３２５】
具体的には、本発明の１以上のナノボディーズを含むポリペプチドは、好ましくは例えばそれらが
−  IL-6に結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12mol/L以下、好ましくは10-7〜10-12mol/L以下、更に好ましくは10-8〜10-12mol/L（すなわち、会合定数（ＫＡ）が、105〜1012L/mol以上、好ましくは107〜1012L/mol以上、更に好ましくは108〜1012L/mol）であり；
および／または、例えばそれらが
−  IL-6に結合するにあたって、その結合のｋｏｎ率は102M-1s-1と約107M-1s-1の間、好ましくは108M-1s-1と107M-1s-1の間、更に好ましくは104M-1s-1と107M-1s-1の間、例えば105M-1s-1と107M-1s-1の間であり；
および／または、例えばそれらが
−  IL-6に結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は1s-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6s-1（複数日のｔ１／２でほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2s-1と10-6s-1の間、更に好ましくは10-3s-1と10-6s-1の間、例えば、10-4s-1と10-6s-1の間である。
【０３２６】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列のみを含むポリペプチドは、好ましくは例えばそれがIL-6に結合するにあたって、その親和性度は５００nM未満、好ましくは２００nM未満、更に好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満である。この点で、２個以上の本発明のナノボディーズを含むポリペプチドがIL-6に結合する強度は、本発明のアミノ酸配列のみを含むポリペプチドと比較して増加することは当業者には明らかである。
【０３２７】
IL-6と本発明のアミノ酸配列もしくはポリペプチドとの結合のいくつかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書の更に詳しい記述および実施例から明らかになる。
【０３２８】
本発明のこの好ましい態様による他のポリペプチドは、例えば、配列番号３７１〜４４７のアミノ酸配列の１以上と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、更に好ましくは９５％を超える、例えば９９％以上の「配列同一性」（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列のみからなる群から選択することができ、その際、前記アミノ酸配列中に含まれるナノボディーズは、本明細書でさらに定義したものであることが好ましい。
【０３２９】
本発明の別の態様は、本発明のナノボディまたはそれを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。再度、本発明の核酸について本明細書に概括的に記載したように、そのような核酸は、本明細書で定義した遺伝子構造体の形をしていてよい。
【０３３０】
別の態様では、本発明は、本発明のナノボディおよび／またはそれを含む本発明のポリペプチドを発現し、または発現することができる宿主もしくは宿主細胞；および／または本発明の核酸を含む宿主もしくは宿主細胞に関する。そのような宿主もしくは宿主細胞のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３３１】
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも一個のナノボディ、少なくとも一個の本発明のポリペプチドおよび／または少なくとも一個の本発明の核酸、および場合によっては、すなわち組成物の意図した使用に応じて、自体公知のそのような組成物の１以上の別の成分を含む、またはそれらを含む生成物もしくは組成物に関する。そのような生成物もしくは組成物は、例えば（本明細書に記載したような）医薬組成物、動物薬用組成物、または（同様に本明細書に記載したような）診断に使用するための生成物もしくは組成物であってよい。そのような生成物もしくは組成物のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。本発明は、更に、本明細書に記載したナノボディーズ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、および組成物を製造しまたは生成する方法に関する。そのような方法のいくつかの好ましいが限定しない例は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３３２】
本発明は、更に、本明細書に記載したナノボディーズ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、および組成物の適用および使用、ならびにIL-6が関与する疾患および疾病を予防および／もしくは治療する方法に関する。いくつかの好ましいが限定しない適用および使用は、本明細書の更に詳しい記述から明らかになる。
【０３３３】
以下の本明細書の更に詳しい記述から本発明の他の態様、実施形態、利点、および適用も明白になる。
【０３３４】
一般的に、本明細書で使用するナノボディという用語は、その最も広い意味では、特定の生物学的供給源または特定の製造方法だけに限定されないことに留意されたい。例えば、以下により詳細に記載するように、本発明のナノボディーズは、一般的に、（１）天然重鎖抗体のＶＨＨ領域を単離し；（２）天然ＶＨＨ領域をコードするヌクレオチド配列を発現させ；（３）天然ＶＨＨ領域を（本明細書に記載したように）「ヒト化」し、またはそのようなヒト化したＶＨＨ領域をコードする核酸を発現させ；（４）任意の動物種、特に哺乳動物種、例えばヒトから得た天然ＶＨ領域を（本明細書に記載したように）「ラクダ化」し、またはそのようにラクダ化したＶＨ領域をコードする核酸を発現させ；（５）Wardら（上記）が記載したように「領域抗体」または「Ｄａｂ」を「ラクダ化」し、またはそのようにラクダ化したＶＨ領域をコードする核酸を発現させ；（６）自体公知のタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を製造する合成もしくは半合成技術を使用し；（７）自体公知の核酸合成技術を使用してナノボディをコードする核酸を製造し、続いてこのようにして得られた核酸を発現させ；かつ／または（８）前記核酸の１以上を任意に組み合せることによって得ることができる。前記手順を実施する好適な方法や技術は、本明細書の開示に基づき当業者には明白であり、例えば、本明細書により詳細に記載した方法や技術が含まれる。
【０３３５】
ナノボディーズの好ましい一クラスは、IL-6に対する天然重鎖抗体のＶＨＨ領域に相当する。本明細書に更に詳しく記載するように、そのようなＶＨＨ配列を発生させ取得できるためには、一般的に、ラクダ科種をIL-6で適切に免疫化し（すなわち、IL-6に対して免疫応答および／または重鎖抗体を発生させる）、前記ラクダ科から好適な生物試料（例えば、血液試料、血清試料もしくはＢ細胞試料）を取得し、そして自体公知の任意の好適な技術を使用し前記試料から出発してIL-6に対するＶＨＨ配列を発生させる。そのような技術は、当業者には明白であり、かつ／または更に本明細書に記載する。
【０３３６】
あるいは、IL-6に対するそのような天然ＶＨＨ領域は、未処置のラクダ科ＶＨＨ配列ライブラリーから、例えば、自体公知の１以上のスクリーニング技術を利用し、IL-6、またはその少なくとも一部分、断片、抗原決定基、またはエピトープを使用し、そのようなライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。そのようなライブラリーおよび技術は、例えば、国際公開公報第９９／３７６８１号、同第０１／９０１９０号、同第０３／０２５０２０号、および同第０３／０３５６９４号に記載されている。あるいは、未処置のＶＨＨライブラリーから誘導した合成もしくは半合成の改善されたライブラリー、例えば、例えば国際公開公報第００／４３５０７号に記載されているような、ランダム変異誘発および／またはCDRシャッフリングなどの技術によって、未処置のＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーを使用してもよい。
【０３３７】
従って、別の態様では、本発明は、IL-6を対象とするナノボディーズを生成する方法に関する。一態様では、前記方法は、
ａ）ナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーを得るステップ、および
ｂ）IL-6に結合可能であり、かつ／またはそれに対して親和性を有するナノボディ配列を求めて、前記ナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーをスクリーニングするステップ
および
ｃ）IL-6に結合可能であり、かつ／またはそれに対して親和性を有するアミノ酸配列を単離するステップ
を少なくとも含む。
【０３３８】
そのような方法では、ナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、未処置のナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリー；合成もしくは半合成ナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリー；および／または親和性成熟を経たナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。
【０３３９】
この方法の好ましい態様では、ナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーは、免疫ナノボディ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリー、特に、IL-6によって、またはそれをベースとし、もしくはそれに由来する好適な抗原決定基によって、例えば、その抗原部分、断片、領域、領域、ループまたは他のエピトープによって適切に免疫化したラクダ科種に由来する免疫ＶＨＨ配列のセット、コレクション、もしくはライブラリーであってよい。具体的一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、領域、ループまたは他の細胞外エピトープであってよい。
【０３４０】
上記の方法では、例えばスクリーニングを円滑にするために、ナノボディまたはVHH配列のセット、コレクション、またはライブラリーをファージ、ファージミド、リボソーム、または適当な微生物（酵母など）上にディスプレイできる。ナノボディ配列（のセット、コレクション、またはライブラリー）をディスプレイおよびスクリーニングするための適当な方法、技術、および宿主生物は、当業者には明らかであり、例えば、本明細書のさらなる開示に基づく。国際公開広報第03/054016号およびHoogenboomによるNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)のレビューも参照される。
【０３４１】
別の態様では、ナノボディ配列の作成方法には少なくとも、
a)免疫グロブリン配列を発現するラクダ種から得られた細胞のコレクションまたはサンプルを提供すること；
b)（i）IL-6に結合できる、および／または親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞；ならびに（ii）重鎖抗体を発現する細胞について前記細胞のコレクションまたはサンプルをスクリーニングする段階を少なくとも含み、ここでIL-6に結合できる、および／または親和性を有する重鎖抗体を発現する少なくとも1つの細胞を提供するために、サブステップ（i）および（ii）を本質的に1回のスクリーニング段階または別々の2つのスクリーニング段階として適当な順番で実施できる；および
c)（i）前記重鎖抗体に存在するVHH配列を前記細胞から単離すること；または（ii）前記重鎖抗体に存在するVHH配列をコード化する核酸配列を前記細胞から単離すること、続いて前記VHHドメインを発現させることの段階が含まれる。
【０３４２】
この態様の方法では、細胞のコレクションまたはサンプルは、例えば、B細胞のコレクションまたはサンプルでよい。また、この方法では、細胞のサンプルは、IL-6、もしくは抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ、または他のエピトープなどのIL-6に基づく、またはIL-6に由来する抗原決定基で適切に免疫されたラクダから得ることができる。特定の一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ、または他の細胞外エピトープでよい。
【０３４３】
上記の方法は、当業者には明らかな任意の適当な方法で実施できる。例えば、欧州特許第0542 810号、国際公開広報第05/19824号、国際公開広報第04/051268号、および国際公開広報第04/106377号を参照すること。段階b）のスクリーニングは、好ましくはFACSなどのフローサイトメトリー技術を利用して実施される。これについては、Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820を参照すること。Ablynx N.Vによる国際出願国際公開広報第06/079372号に記載の「Nanoclone (商標)」技術を特に参照する。
【０３４４】
別の態様では、IL-6を標的とするアミノ酸配列の作成方法には、少なくとも次の段階を含むことができる：
a)重鎖抗体またはナノボディ配列をコード化する核酸配列のセット、コレクション、またはライブラリーを提供すること；
b)IL-6に結合できる、および／または親和性を有する重鎖抗体またはナノボディ配列をコード化する核酸配列の前記セット、コレクション、またはライブラリーをスクリーニングすること；および
c)前記核酸配列を単離した後、前記重鎖抗体に存在するVHH配列を発現させること、または前記ナノボディ配列を発現させることによる。
【０３４５】
このような方法では、重鎖抗体またはナノボディ配列をコード化する核酸配列のセット、コレクション、またはライブラリーは、例えば、重鎖抗体またはVHH配列の野生型のセット、コレクション、またはライブラリーをコード化する核酸配列のセット、コレクション、またはライブラリーでよい；
ナノボディ配列の合成または半合成セット、コレクション、またはライブラリーをコード化する核酸配列のセット、コレクション、またはライブラリー；
および／または、親和性成熟を受けたナノボディ配列のセット、コレクション、またはライブラリーをコード化する核酸配列のセット、コレクション、またはライブラリー。
【０３４６】
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション、またはライブラリーは、IL-6、またはIL-6の抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ、または他のエピトープなどのIL-6に基づく、またはIL-6に由来する抗原決定基で適切に免疫されたラクダに由来する重鎖抗体またはVHH配列をコード化する核酸配列の免疫セット、コレクション、またはライブラリーでよい。特定の一態様では、前記抗原決定基は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ、または他の細胞外エピトープでよい。
【０３４７】
上記の方法では、スクリーニングを円滑にするために、ヌクレオチド配列のセット、コレクション、またはライブラリーをファージ、ファージミド、リボソーム、または適当な微生物（酵母など）上にディスプレイできる。アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列（のセット、コレクション、またはライブラリー）をディスプレイおよびスクリーニングするための適当な方法、技術、および宿主生物は、例えば、本明細書のさらなる開示に基づき、同業者には明らかである。国際公開広報第03/054016号およびHoogenboomによるNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)のレビューも参照できる。
【０３４８】
当業者には明らかなように、本明細書に記載の方法のスクリーニング段階は、選択段階としても実施できる。したがって、この記述で使用する「スクリーニング」という用語には、選択、スクリーニング、または選択および／もしくはスクリーニング技術の任意の適当な組み合わせを含むことができる。また、配列のセット、コレクション、またはライブラリーを使用する場合、1、2、3、または約5、10、50、100、500、1000、5000、104、105、106、107、108以上の配列などの任意の適当な数の配列を含むことができる。
【０３４９】
また、上記のアミノ酸配列のセット、コレクション、またはライブラリーの配列の1以上または全ては、コンピュータモデリング技術または生物静力学またはデータマイニング技術などの理論的または半経験的なアプローチによって入手または定義できる。
【０３５０】
さらに、このようなセット、コレクション、またはライブラリーは、相互の変異体である1または2以上の配列（例えば、設計された点突然変異またはランダム化位置）を含む多様なセットの天然多様化配列（例えば、免疫ライブラリー）に由来する複数の配列を含み、または多様な配列の任意の他の原料を含む（例えば、Hoogenboom et al, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005 and Binz et al, Nat Biotechnol 2005, 23: 1247に記載）。 配列のこれらのセット、コレクション、またはライブラリーは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞の表面にディスプレイでき、そしてこれらのキャリア内でアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列に連結できる。これによって、これらのセット、コレクション、またはライブラリーは、本発明の所望のアミノ酸配列を単離するための選択方法に適するようになる。より一般的には、配列を適当な宿主または宿主細胞にディスプレイした場合、最初に前記宿主または宿主細胞から所望の配列をコード化するヌクレオチド配列を単離して、そして次に適当な宿主生物で前記ヌクレオチド配列を適切に発現させることによって、所望の配列を得ることも可能である（そして通例である）。ここでも、当業者に明らかなように、それ自体公知の適当な方法でこれを実施できる。
【０３５１】
IL-6に対するVHH配列を得るための別の技術には、重鎖抗体を発現できるトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫する（つまり、IL-6に対する免疫反応および／もしくは重鎖抗体を作成するために）、重鎖抗体を発現できる前記トランスジェニック哺乳動物からの適当な生物学的サンプルを得ること（つまり、IL-6に対する免疫反応および／もしくは重鎖抗体を作成するように）、前記VHH配列またはナノボディ配列（をコード化する核酸配列）を含む前記トランスジェニック哺乳動物からの適当な生物学的サンプルを得ること（血液サンプル、血清サンプル、またはB細胞のサンプル）、そして次に、前記サンプルから始めて、それ自体が既知の任意の適当な技術を利用して、IL-6に対するVHH配列を作成することが含まれる。例えば、この目的のために、重鎖抗体発現マウス、ならびに国際公開広報第02/085945号、国際公開広報第04/049794号および国際公開広報第06/008548号、およびJanssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA.2006 Oct 10; 103(41): 15130-5に記載のさらなる方法や技術を利用できる。例えば、このような重鎖抗体を発現するマウスは、例えば、合成または半合成の（単一）可変領域の他、天然原料からの（単一）可変領域（例えば、ヒト（単一）可変領域、ラクダ（単一）可変領域、またはシャーク（単一）可変領域）などの任意の適当な（単一）可変領域を伴う重鎖抗体を発現できる。
【０３５２】
本発明は、上記の方法によって、または代わりに上記の方法の1つ、および加えて、少なくとも前記VHH配列またはナノボディ配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定する段階；およびそれ自体公知の方法、例えば、適当な宿主細胞または宿主生物での発現による、または化学合成などにより前記VHH配列またはナノボディ配列を発現させる、または合成する段階を含む方法により入手されるVHH配列またはナノボディ配列に関する。
【０３５３】
本明細書で言及されるように、本発明の特に好ましいナノボディーズのクラスには、天然VHHドメインのアミノ酸配列と一致するが、しかし「ヒト化」されている、つまり、前記天然VHH配列（および特に枠組み構造配列内）のアミノ酸配列内の1以上のアミノ酸残基を、ヒトの通常の4鎖抗体のVHドメイン（例えば、上記）内の対応する位置に現れる1以上のアミノ酸残基と置換することによるアミノ酸配列を伴うナノボディーズが含まれる。当業者には明らかな、それ自体公知の方法、例えば、本明細書のさらなる記述および本明細書で参照されるヒト化に関する先行技術に基づいて、これは実施できる。ここでも、本発明のこのようなヒト化ナノボディーズは、それ自体公知の任意の適当な方法（つまり、上記のポイント（1）〜（8）に示している）で得ることができるため、天然VHHドメインを出発材料として含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意するのが望ましい。
【０３５４】
特に好ましい本発明の別のクラスのナノボディーズは、天然VHドメインのアミノ酸配列と一致するが、しかし、「ラクダ化（camelized）」された、つまり、通常の4鎖抗体の天然VHドメインのアミノ酸配列内の1以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のVHHドメイン内の対応する位置に現れる1以上のアミノ酸残基と置換することによるアミノ酸配列を伴うナノボディーズを含む。これはそれ自体公知の方法で実施でき、これは当業者には明らかであり、例えば、本明細書のさらなる記述に基づく。このような「ラクダ化する」置換は、好ましくは、VH-VL接合部分を形成する、ならびに／もしくはVH-VL接合部分、および／または本明細書で定義するラクダホールマーク残基に存在するアミノ酸位置に挿入される（例えば、国際公開公報第94/04678号および上記のDavies and Riechmann (1994 and 1996)を参照）。好ましくは、ラクダ化ナノボディを作成する、または設計するための出発物質または出発点として使用されるVH配列は、好ましくは哺乳動物のVH配列、より好ましくはVH3配列などのヒトVH配列である。しかし、本発明のこのようなラクダ化ナノボディーズは、それ自体公知の任意の適当な方法（つまり、上記のポイント（1）〜（8）に示している）で得ることができるため、天然VHドメインを出発材料として含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意するのが望ましい。
【０３５５】
例えば、ここでも、本明細書にさらに記述されているとおり、「ヒト化」と「ラクダ化」のいずれも、天然VHHドメインまたはVHドメインをそれぞれコード化するヌクレオチド配列を提供すること、そして次にそれ自体公知の方法で、新しいヌクレオチド配列が本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」ナノボディをコード化するように前記ヌクレオチド配列の1以上のコドンを変化させることによって実施できる。本発明の所望のナノボディを提供するように、次にこの核酸をそれ自体公知の方法で発現させることができる。または、天然VHHドメインまたはVHドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づき、本発明の所望のヒト化またはラクダ化されたナノボディのアミノ酸配列をそれぞれ設計することができ、そして次にそれ自体公知のペプチド合成技術を利用して新たに合成できる。また、天然VHHドメインまたはVHドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列にそれぞれ基づき、本発明の所望のヒト化またはラクダ化されたナノボディをコード化するヌクレオチド配列をそれぞれ設計することができ、そして次にそれ自体公知のペプチド合成技術を利用して新たに合成でき、その後、本発明の所望のナノボディを提供するために、このようにして入手した核酸をそれ自体公知の方法によって発現させることができる。
【０３５６】
天然VH配列または好ましくはVHH配列から始めて、本発明のナノボディーズおよび／または同をコード化する核酸を得るための他の適当な方法および技術は、当業者には明らかであり、そして、例えば、本発明のナノボディまたはそれをコード化するヌクレオチド配列または核酸を提供するために（これは次に適切に発現させることができる）、1以上の天然VH配列の1以上の部分（例えば、1以上のFR配列および／もしくはCDR配列など）、1以上の天然VHH配列の1以上の部分（例えば、1以上のFR配列もしくはCDR配列など）、および／または1以上の合成配列または半合成配列を適当な方法で組み合わせることが含まれる。VHH配列またはナノボディーズの枠組み構造配列をコード化するヌクレオチド配列は、本明細書の開示および／またはさらなる先行技術に基づき、当業者には明らかであり（および／または本明細書に記載の方法を利用して得られるヌクレオチド配列から始めたPCRによって代わりに得ることができる）、そして、本発明のナノボディをコード化する核酸を提供するために、所望のCDR配列をコード化するヌクレオチド配列と適切に組み合わせることができる（例えば、オーバーラッピングプライマーを使用したPCRアセンブリーにより）。
【０３５７】
任意に、本発明のナノボディは、IL-6に対する少なくとも1つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質、または標的に対して結合するための1以上のさらなる結合部位を含むことができる。このような第2の結合部位を導入するための方法および位置については、Keck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011、欧州特許第0 640 130号、国際公開公報第06/07260号、およびAblynx N. V.による2006年11月27日出願の米国特許仮出願で表題"Immunoglobulin domains with multiple binding sites"を参照すること。
【０３５８】
本明細書に記載の通り、ナノボディーズは特に1以上の枠組み構造配列内の1以上の"ホールマーク残基"（本明細書に記載）の存在によって特徴付けることができる。
【０３５９】
本発明の限定はされないが、好ましい一態様によると、ナノボディはその最も広義において一般的に：
(a)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQである3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列；ならびに／もしくは：
(b)カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基が荷電アミノ酸（本明細書で定義）またはシステイン残基であり、そして44位が好ましくはEである、3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列；ならびに／または：
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され、そして特にRおよびSからなる群より選択される、3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義できる。
【０３６０】
従って、限定はされないが、好ましい第1の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで
(a)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQであり；そして／または、ここで：
(b)カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基が荷電アミノ酸またはシステイン残基であり、そして44位のアミノ酸残基が好ましくはEである；そして／または、ここで：
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され、そして特にRおよびSからなる群より選択される；ならびに、ここで：
(d) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６１】
特に、広義のナノボディは、一般的に：
(a)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQである、3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列；ならびに／もしくは：
(b)カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がEであり、そして45位のアミノ酸残基がRである、3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列；ならびに／もしくは：
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され、そして特にRおよびSからなる群より選択される、3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義できる。
【０３６２】
従って、限定はされないが、好ましい態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで
(e)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQであり；そして／または、ここで：
(f)カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がEであり、そして45位のアミノ酸残基がRである；そして／または、ここで：
(g)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され、そして特にRおよびSからなる群より選択される；ならびに、ここで：
(h) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６３】
特に、本発明のIL-6に対するナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで
(a)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQであり；そして／または、ここで：
(b)カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がEであり、そして45位のアミノ酸残基がRである；そして／または、ここで：
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され、そして特にRおよびSからなる群より選択される；ならびに、ここで：
(d) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６４】
特に、限定はされないが、好ましい本発明の一態様では、一般的に、ナノボディは3つの相補性決定領域／配列が割り込んだ4つの枠組み構造領域／配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義でき、ここで；
（a-1）カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がA、G、E、D、G、Q、R、S、Lからなる群より選択され、そして好ましくはG、E、またはQからなる群より選択される；ならびに、
（a-2）カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基がL、R、またはCからなる群より選択され、そして好ましくはLまたはRからなる群より選択される；ならびに、
（a-3）カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がW、R、またはSからなる群より選択され；そして好ましくはWまたはRからなる群より選択される；そして最も好ましくはWであり；
（a-4）カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQであり；または、ここで：
（b-1）カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がEおよびQからなる群より選択され；ならびに、
（b-2）カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基がRであり；ならびに、
（b-3）カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がW、R、またはSからなる群より選択され；そして好ましくはWまたはRからなる群より選択される；そして最も好ましくはWであり；
（b-4）カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQおよびLからなる群より選択され；そして好ましくはQであり；または、ここで；
（c-1）カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がA、G、E、D、Q、R、S、およびLからなる群より選択され；そして好ましくはG、E、およびQからなる群より選択され；ならびに
（c-2）カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基がL、R、およびCからなる群より選択され；そして好ましくはLおよびRからなる群より選択され；ならびに
（c-3）カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され；そして特にRおよびSからなる群より選択され；ならびに
（c-4）カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQおよびLからなる群より選択され；そして好ましくはQであり；ならびに、ここで
(d) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６５】
従って、限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで
(a)カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がA、G、E、D、G、Q、R、S、Lからなる群より選択され、そして好ましくはG、E、またはQからなる群より選択される；ならびに、
(b)カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基がL、R、またはCからなる群より選択され；そして好ましくはLまたはRからなる群より選択され；ならびに
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がW、R、またはSからなる群より選択され；そして好ましくはWまたはRであり；そして最も好ましくはWであり；ならびに、ここで
(d)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQであり；ならびに、ここで
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６６】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで
(a)カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がEおよびQからなる群より選択され；ならびに、ここで
(b)カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基がRであり；ならびに、ここで
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がW、R、およびSからなる群より選択され；そして好ましくはWであり；ならびに、ここで
(d)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQおよびLからなる群より選択され；そして好ましくはQであり；ならびに、ここで
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６７】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで
(a)カバットの番号付与による44位のアミノ酸残基がA、G、E、D、Q、R、S、およびLからなる群より選択され；そして好ましくはG、E、およびQからなる群より選択され；ならびに、ここで
(b)カバットの番号付与による45位のアミノ酸残基がL、R、およびCからなる群より選択され；そして好ましくはLおよびRからなる群より選択され；ならびに、ここで
(c)カバットの番号付与による103位のアミノ酸残基がP、R、およびSからなる群より選択され；そして特にRおよびSからなる群より選択され；ならびに、ここで
(d)カバットの番号付与による108位のアミノ酸残基がQおよびLからなる群より選択され；そして好ましくはQであり；ならびに、ここで
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３６８】
限定はされないが、特に好ましい本発明の2つのナノボディーズ群は、上記の(a)のナノボディーズ群；上記の(a-1)から(a-4)のナノボディーズ群；上記の(b)のナノボディーズ群；上記の(b-1)から(b-4)のナノボディーズ群；上記の(c)のナノボディーズ群；ならびに／もしくは上記の(c-1)から(c-4)のナノボディーズ群であり、ここで
a)カバットの番号付与による44〜47位のアミノ酸残基がGLEW配列（もしくは本明細書で定義するGLEW様配列）を形成して、そして108位のアミノ酸残基がQである；または、ここで：
b)カバットの番号付与による43〜46位のアミノ酸残基がKERE配列またはKQRE配列（もしくは本明細書で定義するKERE様配列）を形成して、そして108位のアミノ酸残基がQまたはL、そして好ましくはQである。
【０３６９】
従って、限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで：
(a)カバットの番号付与による44〜47位のアミノ酸残基がGLEW配列（もしくは本明細書で定義するGLEW様配列）を形成して、そして108位のアミノ酸残基がQである：および、ここで
(b) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３７０】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ここで：
(a)カバットの番号付与による43〜46位のアミノ酸残基がKERE配列またはKQRE配列（もしくは本明細書で定義するKERE様配列）を形成して、そして108位のアミノ酸残基がQまたはL、そして好ましくはQである；ならびに、ここで：
(b) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３７１】
カバットの番号付与による43〜46位のアミノ酸残基がKERE配列またはKQRE配列を形成する本発明のナノボディーズでは、37位のアミノ酸残基は最も好ましくはFである。カバットの番号付与による44〜47位のアミノ酸残基がGLEW配列を形成する本発明のナノボディーズでは、37位のアミノ酸残基がY、H、I、L、V、またはFからなる群より選択され、そして最も好ましくはVである。
【０３７２】
従って、本明細書に限定されることは決してないが、上記の位置に存在するアミノ酸残基に基づいて、本発明のナノボディーズは一般的に以下の3群に基づいて分類できる：
a)「GLEW群」：カバットの番号付与による44〜47位のアミノ酸残基にGLEWアミノ酸配列およびカバットの番号付与による108位にQを伴うナノボディーズ。本明細書においてさらに記載されている通り、この群のナノボディーズは通常、37位にV、103位にW、P、R、またはS、そして好ましくは103位にWを持つ。GLEW群は、以下の表A-3に記載の配列などのいくつかのGLEW様も含む。
b)「KERE群」：カバットの番号付与による43〜46位のアミノ酸残基にKEREアミノ酸配列またはKQREアミノ酸配列（または、別のKERE様配列）およびカバットの番号付与による108位にQまたはLを伴うナノボディーズ。本明細書においてさらに記載されている通り、この群のナノボディーズは通常、37位にF、47位にLまたはFであり；そして103位にW、P、R、またはSを持ち、そして好ましくは103位にWを持つ；
c)「103P、R、S群」：103位にP、R、またはSを持つナノボディーズ。これらのナノボディーズは、カバットの番号付与による44〜47位にGLEWアミノ酸配列、もしくはカバットの番号付与による43〜46位にKEREアミノ酸配列またはKQREアミノ酸配列のいずれかを持ち、また後者は最も好ましくは37位にFおよび47位にLまたはFを持ち（KERE群で定義）、そしてカバットの番号付与による108位にQまたはL、そして好ましくはQを持つことができる。
【０３７３】
また、適切な場合、ナノボディーズはこれらのクラスの2以上に属することができる（つまり、特徴とする）。例えば、特に好ましいナノボディーズ群は44〜47位にGLEW配列またはGLEW様配列；103位にP、R、またはS（および特にR）；そして108位にQ（これはLにヒト化できる）を持つ。
【０３７４】
より一般的には、上記で参照した定義は、野生型（つまり、非ヒト化）VHH配列の形のナノボディーズについて記述し、およびこれに適用され、そしてこれらのナノボディーズのヒト化変異体が上記のアミノ酸残基以外の他のアミノ酸残基を含むことができる（つまり、本明細書で定義する1以上のヒト化置換）ことに留意するのが望ましい。例えば、限定はされないが、GLEW群または103P、R、S群の一部のヒト化ナノボディーズでは、108位のQを108Lにヒト化できる。本明細書で既述の通り、他のヒト化置換（およびその適当な組み合わせ）が、本明細書の開示に基づき、当業者には明らかである。加えて、もしくは、または、他の潜在的に有用なヒト化置換は、天然VHH配列の枠組み構造領域の配列を、1以上の密接に関連するヒトVH配列の対応する枠組み構造配列と比較することで確認でき、その後、このようにして決定した1以上の潜在的に有用なヒト化置換（またはその組み合わせ）を前記VHH配列に（本明細書でさらに記述されている、それ自体公知の任意の方法で）導入でき、そして結果として得られるVHH配列の標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ、およびレベル、ならびに／もしくは他の所望の特性を試験できる。この方法では、限られた程度の試行錯誤によって、本明細書の開示に基づいて、他の適当なヒト化置換（またはその適当な組み合わせ）を当業者によって決定できる。または、上記に基づいて、ナノボディ（の枠組み構造領域）を部分的にヒト化できる、または完全にヒト化できる。
【０３７５】
従って、限定はされないが、好ましい他の態様では、本発明のナノボディは、GLEW群（本明細書で定義）に属するナノボディでよく、ここで、CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３７６】
限定はされないが、好ましい他の態様では、本発明のナノボディは、KERE群（本明細書で定義）に属するナノボディでよく、ここで、CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３７７】
従って、限定はされないが、好ましい他の態様では、本発明のナノボディは、103P、R、S群（本明細書で定義）に属するナノボディでよく、ここで、CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３７８】
また、より一般的に、上記の108Q、43E/44R、および103P,R,Sの残基に加えて、本発明のナノボディーズは、通常のVHドメイン内において、VH/VL接続部分（の一部）を形成する1以上の位置に、対応する天然VH配列内の同じ位置に天然で現れるアミノ酸残基よりも高度に荷電している1以上のアミノ酸残基、および特に1以上の荷電アミノ酸残基（表A-2に記載）を含むことができる。このような置換としては、限定はされないが、例えば、108位のQと44〜47位のKLEWを組み合わせたナノボディを得るために、いわゆる「マイクロボディ（microbody）」に関する国際出願国際公開公報第00/29004号に記載の置換の他、以下の表A-3に記載のGLEW配列が挙げられる。これらの位置の可能な他の置換は、本明細書の開示に基づき、当業者に明らかである。
【０３７９】
本発明のナノボディーズの一態様では、83位のアミノ酸残基は、L、M、S、V、およびWからなる群より選択され；そして好ましくはLである。
【０３８０】
また、本発明のナノボディーズの一態様では、83位のアミノ酸残基は、R、K、N、E、G、I、T、およびQからなる群より選択され；そして最も好ましくはKまたはEのいずれか（天然VHHドメインに対応するナノボディーズ）またはR（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディーズ）である。一態様では、84位のアミノ酸残基は、P、A、R、S、D、T、およびVからなる群より選択され；そして最も好ましくはP（天然VHHドメインに対応するナノボディーズ）またはR（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディーズ）である。
【０３８１】
さらに、本発明のナノボディーズの一態様では、104位のアミノ酸残基はGおよびDからなる群より選択され；そして最も好ましくはGである。
【０３８２】
まとめると、ナノボディーズにおいて上記の11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位、および108位のアミノ酸残基を「ホールマーク残基」として本明細書において参照することもできる。ホールマーク残基および最も密接に関連するヒトVHドメインであるVH3の対応する位置のアミノ酸残基を表A-3にまとめている。
【０３８３】
限定はされないが、天然VHHドメイン内に現れるこれらのホールマーク残基のいくつかの特に好ましい組み合わせを表A-4で述べている。比較のために、DP-47と呼ばれるヒトVH3の対応するアミノ酸残基をイタリックで示している。
【０３８４】
表A-3：ナノボディーズ内のホールマーク残基
【表３】
2009529339.tif 000009
注：
（1）特に、限定はされないが、43〜46位のKEREまたはKQREとの組み合わせ
（2）通常、44〜47位のGLEW
（3）通常、43〜46位のKEREまたはKQRE、例えば、43〜47位のKEREL、KEREF、KQREL、KQREFまたはKEREG。または、TERE（例えば、TEREL）、KECE（例えば、KECELまたはKECER）、RERE（例えば、REREG）、QERE（例えば、QEREG）、KGRE（例えば、KGREG）、KDRE（例えば、KDREV）などの配列も可能である。いくつかの可能な、しかし、好ましくない配列としては、例えば、DECKLおよびNVCELが挙げられる。
（4）44〜47位のGLEWおよび43〜46位のKEREまたはKQREのいずれも伴う。
（5）多くの場合、天然VHHドメインの83〜84位のKPまたはEP
（6）特に、限定はされないが、44〜47位のGLEWとの組み合わせ
（7）44〜47位がGLEWであるとの条件で、108位は常に103位にWも含むQ（非ヒト化）VHH配列である。
（8）GLEW群は44〜47位にGLEW様配列、例えば、GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLERおよびELEWなども含む。
【０３８５】
表A-4：限定はされない、天然ナノボディーズ内のいくつかの好ましいホールマーク残基の組み合わせ
これらの組み合わせのヒト化については、本明細書において参照されている。
【表４】
2009529339.tif 000010
【０３８６】
ナノボディーズにおいては、ホールマーク残基以外の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然VHHドメインの対応する位置（カバットの番号付与による）に天然で現れる任意のアミノ酸残基でよい。
【０３８７】
このようなアミノ酸残基は当業者には明らかである。表A-5〜A-8には、天然VHHドメインのFR1、FR2、FR3、およびFR4の各位置（カバットの番号付与による）に存在しうるいくつかの残基について述べているが、これらに限定はされない。各位置について、天然VHHドメインの各位置に最も頻繁に現れるアミノ酸残基（そしてナノボディの前記位置において最も好ましいアミノ酸残基）を太字で示しており；そして、各位置の好ましい他のアミノ酸残基に下線を引いている（注意：天然VHHドメインの26〜30位に見出されるアミノ酸残基の数は、これらの位置の残基がCDR1の一部を既に形成するとのChothiaの番号付与（上記）の基礎となる仮説を裏付けている）。
【０３８８】
表A-5〜A-8には、ヒトVH3ドメインの各位置に存在しうる残基のいくつかについても述べているが、これらに限定されない。ここでも、天然ヒトVH3ドメインの各位置に最も頻繁に現れるアミノ酸残基を太字で示しており；そして、各位置の好ましい他のアミノ酸残基に下線を引いている。
【０３８９】
参照のためのみに、表A-5には、1118VHH配列（Utrecht UniversityのDavid Lutje HulsingおよびProf. Theo Verripsより供与）の見本サンプルでの各アミノ酸位置のVHHエントロピー（「VHH Ent.」）およびVHH可変性（「VHH Var.」）に関するデータも含まれる。VHHエントロピーとVHH可変性の値は、分析した1118VHH配列間でのアミノ酸残基の可変性の測定値および保存度を与える：低い値（つまり<1、例えば<0.5など）は、アミノ酸残基がVHH配列間で高度に保存されている（つまり、可変性がほとんどない）ことを示す。例えば、8位のGおよび9位のGのVHHエントロピー値はそれぞれ0.1および0であり、これらの残基が高度に保存されており、そして可変性がほとんどないことを示しているが（そして、分析した全1118配列の9位がGの場合）、CDR配列の一部を形成する残基では、一般的に1.5以上の値が認められる（データ未提示）。（1）表A-5の第2列に記載されているアミノ酸残基は、最後の2列において参照されるVHHエントロピーおよびVHH可変性を決定するために分析された1118VHH配列よりも大きなサンプルに基づいており；ならびに（2）以下に示すデータは、27〜30位のアミノ酸残基および恐らくは93位および94位のアミノ酸残基でさえCDR配列の一部を既に形成するとの仮説を裏付けている（もっとも、本発明は、任意の特定の仮説または説明に限定されず、そして上記の通り、本明細書ではカバットの番号付与が使用される）ことに注意すること。配列エントロピー、配列可変性およびそれらの測定方法に関する一般的な説明については、Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52: 544-552 (2003)を参照すること。
【０３９０】
表A-5：限定はされない、FR1内のアミノ酸残基の例（脚注については表A-3の脚注を参照すること）
【表５−１】
2009529339.tif 000011
【表５−２】
2009529339.tif 000012
【０３９１】
表A-6：限定はされない、FR2内のアミノ酸残基の例（脚注については表A-3の脚注を参照すること）
【表６】
2009529339.tif 000013
【０３９２】
表A-7：限定はされない、FR3内のアミノ酸残基の例（脚注については表A-3の脚注を参照すること）
【表７−１】
2009529339.tif 000014
【表７−２】
2009529339.tif 000015
【０３９３】
表A-8：限定はされない、FR4内のアミノ酸残基の例（脚注については表A-3の脚注を参照すること）
【表８】
2009529339.tif 000016
【０３９４】
従って、限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで：
(a)ホールマーク残基は本明細書において定義している通りであり；ならびに、ここで：
(b) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３９５】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで：
(a) FR1は、アミノ酸配列：
［1］QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG［26］［配列番号：126］
からなる群から：
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-5で定義するアミノ酸置換のいずれかであり；および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
ならびに／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-5で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(b) FR2は、アミノ酸配列：
［36］WXRQAPGKXXEXVA［49］［配列番号：127］
からなる群から；、
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-6で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、ならびに／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸の違い（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで：
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-6で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
から選択され、
ならびに、ここで：
(c) FR3は、アミノ酸配列：
［66］RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA［94］［配列番号：128］
からなる群から；
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-7で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸の違い（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで：
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-7で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
から選択され、
ならびに、ここで：
(d) FR4は、アミノ酸配列：
［103］XXQGTXVTVSS［113］［配列番号：129］
からなる群から；
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-8で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸の違い（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで：
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-8で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
選択され
ならびに、ここで：
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される；ここでホールマーク残基は「X」によって示され、そして上で定義した通りであり、そしてカッコ間の数はカバットの番号付与によるアミノ酸位置を指す。
【０３９６】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで：
(a) FR1は、アミノ酸配列：
［1］QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG［26］［配列番号：130］
からなる群から；
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-5で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）位置のホールマーク残基が上記の配列において示されている、群から；
および／あるいは上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-5で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）位置のホールマーク残基が上記の配列において示されている、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(b) FR2は、アミノ酸配列：
［36］WFRQAPGKERELVA［49］［配列番号：131］
［36］WFRQAPGKEREFVA［49］［配列番号：132］
［36］WFRQAPGKEREGA［49］［配列番号：133］
［36］WFRQAPGKQRELVA［49］［配列番号：134］
［36］WFRQAPGKQREFVA［49］［配列番号：135］
［36］WYRQAPGKGLEWA［49］［配列番号：136］
からなる群から；
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-6で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに：
iii）37位、44位、45位、および47位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、郡から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-6で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）37位、44位、45位、および47位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで、
(c) FR3は、アミノ酸配列：
［66］RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA［94］［配列番号：137］
からなる群から；
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-7で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）83位および84位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-7で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに：
iii）83位および84位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(d) FR4は、アミノ酸配列：
［103］WGQGTQVTVSS［113］［配列番号：138］
［103］WGQGTLVTVSS［113］［配列番号：139］
からなる群から；
あるいは、上記のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-8で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）103位、104位、および108位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
および／あるいは上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-8で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）103位、104位、および108位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３９７】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで：
(a) FR1は、アミノ酸配列：
［1］QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG［26］［配列番号：130］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで：
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-5で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに
iii）位置のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(b) FR2は、アミノ酸配列：
［36］WFRQAPGKERELVA［49］［配列番号：131］
［36］WFRQAPGKEREFVA［49］［配列番号：132］
［36］WFRQAPGKEREGA［49］［配列番号：133］
［36］WFRQAPGKQRELVA［49］［配列番号：134］
［36］WFRQAPGKQREFVA［49］［配列番号：135］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと2個もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-6で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに：
iii）37位、44位、45位、および47位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(c) FR3は、アミノ酸配列：
［66］RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA［94］［配列番号：137］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-7で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）83位および84位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、ならびにここで、
(d) FR4は、アミノ酸配列：
［103］WGQGTQVTVSS［113］［配列番号：138］
［103］WGQGTLVTVSS［113］［配列番号：139］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで：
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-8で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）103位、104位、および108位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３９８】
限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の構造を取ることができる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで：
(a) FR1は、アミノ酸配列：
［1］QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG［26］［配列番号：130］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-5で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）位置のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで：
(b) FR2は、アミノ酸配列：
［36］WYRQAPGKGLEWA［49］［配列番号：136］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと2個もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-6で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）37位、44位、45位、および47位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、
ならびに、ここで、
(c) FR3は、アミノ酸配列：
［66］RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA［94］［配列番号：137］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-7で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、そしてアミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）83位および84位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、ならびに、ここで：
(d) FR4は、アミノ酸配列：
［103］WGQGTQVTVSS［113］［配列番号：138］
からなる群から；
および／あるいは、上記のアミノ酸配列の1つと3個、2個、もしくは1個のみのアミノ酸相違（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
i)ホールマーク位置以外の任意の位置の任意のアミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）および／もしくは表A-8で定義するアミノ酸置換のいずれかであり、および／または、
ii）上記のアミノ酸配列と比較して、前記アミノ酸が好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、ならびに、
iii）103位、104位、および108位のホールマーク残基が上記の配列において示されている通りである、群から；
選択され、ならびに、ここで：
(e) CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０３９９】
本発明のナノボディーズに存在しうるいくつかの他の枠組み構造配列は、上記の欧州特許第656 946号において見ることができる（例えば、対応する許可済み米国特許第5,759,808号も参照すること）。
【０４００】
従って、限定はされないが、好ましい別の態様では、本発明のナノボディは以下の（一般的な）構造を伴うアミノ酸配列と定義できる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで：
i)カバットの番号付与による11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位、および108位のアミノ酸残基の1以上は、表A-3に記載のホールマーク残基から選択できる；ならびに、ここで：
ii）CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０４０１】
上記のナノボディーズは、例えば、VHH配列でよく、またはヒト化ナノボディーズでよい。上記のナノボディ配列がVHH配列である場合、本明細書でさらに記載されている通りに、これらを適切にヒト化できる。ナノボディーズが部分的にヒト化されたナノボディーズである場合、ここでも、本明細書でさらに記載されている通りに、これらを任意に適切にヒト化できる。
【０４０２】
特に、本発明のナノボディは以下の（一般的な）構造を伴うアミノ酸配列と定義できる：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、FR1からFR4はそれぞれ枠組み構造領域1から4を指し、そしてCDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3を指し、ならびに、ここで、
i)（好ましくは）カバットの番号付与による11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位、および108位のアミノ酸残基の1以上が表A-3に記載のホールマーク残基より選択され（VHH配列が1以上のホールマーク残基を含み；そして部分的にヒト化されたナノボディーズが通常、そして好ましくは、［依然として］1以上のホールマーク残基を含み［もっとも、本発明に従って適当な場合、他のアミノ酸残基の1以上ではなく、全てのホールマーク残基がヒト化された部分的なヒト化ナノボディーズを提供することも本発明の範囲内である］；本発明に従って適当な場合、完全にヒト化されたナノボディーズにおいては、ホールマーク残基の位置の全てのアミノ酸残基はヒトVH3配列中に現れるアミノ酸残基であると理解されている。本明細書の開示に基づいて、当業者に明らかな通り、このようなVHH配列、少なくとも1個のホールマーク残基を伴うこのような部分的にヒト化されたナノボディーズ、ホールマーク残基を伴わないこのような部分的にヒト化されたナノボディーズ、およびこのような完全にヒト化されたナノボディーズは全て本発明の態様を形成する）；ここで：
ii）前記アミノ酸配列が配列番号：1〜22の少なくとも1つのアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を持ち、ここでアミノ酸の同一性の程度を決定する目的で、CDR配列（配列番号：1〜22 の配列内においてXで示している）を形成するアミノ酸残基を無視する；ならびに、ここで：
iii）CDR1、CDR2、およびCDR3は本明細書で定義されている通りであり、そして好ましくは本明細書の好ましい態様の1つにより定義され、そしてより好ましくは本明細書のより好ましい態様の1つにより定義される。
【０４０３】
上記のナノボディーズは、例えば、VHH配列でよく、またはヒト化ナノボディーズでよい。上記のナノボディ配列がVHH配列である場合、本明細書でさらに記載されている通りに、これらを適切にヒト化できる。ナノボディーズが部分的にヒト化されたナノボディーズである場合、ここでも、本明細書でさらに記載されている通りに、これらを任意に適切にヒト化できる。
【０４０４】
表Ａ−９：KERE、GLEWおよびP,R,S103グループのナノボディーズの代表的なアミノ酸配列
CDRをXXXXで示している。
【表９−１】
2009529339.tif 000017
【表９−２】
2009529339.tif 000018
【０４０５】
特に、ＫＥＲＥグループの本発明のナノボディは、
ＦＲ１−CDR1−ＦＲ２−CDR2−ＦＲ３−CDR3−ＦＲ４
の（一般）構造を持つアミノ酸配列であって、
ここで、
ｉ）  カバットの付番付与による４５位のアミノ酸残基が、電荷アミノ酸（本明細書で定義）もしくはシステイン残基であり、第４４位がＥであることが好ましく、更に
ｉｉ）  ＦＲ１は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４０６】
表Ａ−１０：ＫＥＲＥグループのナノボディーズの代表的なＦＷ１配列
【表１０】
2009529339.tif 000019
【０４０７】
更に、
ｉｉｉ）  ＦＲ２は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４０８】
表Ａ−１１：ＫＥＲＥグループのナノボディーズの代表的なＦＷ２配列
【表１１】
2009529339.tif 000020
【０４０９】
更に、
ｉｖ）  ＦＲ３は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４１０】
表Ａ−１２：ＫＥＲＥグループのナノボディーズの代表的なＦＷ３配列
【表１２】
2009529339.tif 000021
【０４１１】
更に、
ｖ）  ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４１２】
表Ａ−１３：ＫＥＲＥグループのナノボディーズの代表的なＦＷ４配列
【表１３】
2009529339.tif 000022
【０４１３】
更に、
ｖｉ）  CDR1、CDR2、およびCDR3は、本明細書に定義されているとおりであり、好ましくは本明細書に記載の好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、より好ましくは本明細書に記載の更に好ましい態様の一つに従って定義されているとおりである。
【０４１４】
上記ナノボディーズでは、一以上のさらなるホールマーク残基が、本明細書に記載されているとおりであることが好ましい（例えば、これらが、ＶＨＨ配列もしくは部分的にヒト化されたナノボディーズの場合）。
【０４１５】
更に、上記ナノボディーズは、例えば、ＶＨＨ配列であってもよいし、ヒト化ナノボディーズであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列の場合には、本明細書に更に詳しく記載するように、好適にヒト化されていてよい。ナノボディーズが、部分的にヒト化されたナノボディーズである場合には、先と同様に本明細書に記載されているように、状況に応じて、更に好適にヒト化されてもよい。
【０４１６】
枠組み構成１に関して、上に略述したアミノ酸配列がヌクレオチド配列の発現によって生成される場合には、最初の４つのアミノ酸配列（すなわち、カバットの付番付与によるアミノ酸残基１−４）は、多くの場合、前記核酸を生成するのに使用したプライマー（複数もあり）によって決定される可能性がある。したがって、アミノ酸配列同一性度を決定する場合には、最初の４つのアミノ酸残基を無視することが好ましい。
【０４１７】
更に、枠組み構成１に関して、アミノ酸の２７位と３０位とは、カバットの付番付与によれば、枠組み構成領域の一部とみなされる（のでありCDRの一部とはみなされない）にもかかわらず、２７〜３０位の変動性（ＶＨＨエントロピーおよびＶＨＨ変動性で表現される、表Ａ−５〜Ａ−８参照）は、１〜２６位上の変動性よりはるかに大きいことが、１０００個を超えるＶＨＨ配列からなるデータベースの解析によって明らかにされている。こうした理由から、アミノ酸配列同一性度を決定する場合には、２７〜３０位のアミノ酸残基も無視することが好ましい。
【０４１８】
したがって、ＫＥＲＥクラスのナノボディは、３つの相補性決定領域／配列によって分断される４つの枠組み領域／配列からなるアミノ酸配列であってよく、
ここで、
ｉ）  カバットの付番付与による４５位のアミノ酸残基は、電荷アミノ酸（本明細書で定義）もしくはシステイン残基であり、４４位は、好ましくはＥであり、更に
ここで、
ｉｉ）  ＦＲ１は、カバットの付番付与による５〜２６位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
【０４１９】
表Ａ−１４：ＫＥＲＥグループのナノボディーズの代表的なＦＷ１配列（５〜２６位アミノ酸残基）
【表１４】
2009529339.tif 000023
【０４２０】
更に、
ｉｉｉ）  ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、ＫＥＲＥクラスのナノボディーズのＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に関して本明細書に記載されるとおりであり、
更に
ｉｖ）  CDR1、CDR2およびCDR3は、本明細書に定義されているとおりであり、好ましくは本明細書に記載の好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、更に好ましくは本明細書に記載のより好ましい態様の一つに従って定義されているとおりである。
【０４２１】
上記ナノボディーズは、例えば、ＶＨＨ配列であってもよいし、ヒト化されたナノボディーズであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合には、本明細書に更に記載されているように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディーズが部分的にヒト化されたナノボディーズである場合には、先と同様に本明細書に記載されているように、状況に応じて、更に好適にヒト化されていてもよい。
【０４２２】
ＧＬＥＷクラスのナノボディは、３つの相補性決定領域／配列によって分断される４つの枠組み領域／配列からなるアミノ酸配列であってよく、
ここで、
ｉ）  好ましくは、ＧＬＥＷクラスのナノボディが、非ヒト化ナノボディであるときには、１０８位のアミノ酸残基がＱであり；
ｉｉ）  ＦＲＩは、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４２３】
表Ａ−１５：GLEWグループのナノボディーズの代表的なＦＷ１配列
【表１５】
2009529339.tif 000024
更にここで、
【０４２４】
ｉｉｉ）  ＦＲ２は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４２５】
表Ａ−１６：GLEWグループのナノボディーズの代表的ＦＷ２配列
【表１６】
2009529339.tif 000025
【０４２６】
更にここで、
ｉｖ）  ＦＲ３は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４２７】
表Ａ−１７：GLEWグループのナノボディーズの代表的なFW3配列
【表１７】
2009529339.tif 000026
【０４２８】
更にここで、
ｖ）  ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４２９】
表Ａ−１８：GLEWグループのナノボディーズの代表的なFW4配列
【表１８】
2009529339.tif 000027
【０４３０】
更にここで、
ｖｉ）  CDR1、CDR2およびCDR3は、本明細書に定義されているとおりであり、好ましくは本明細書に記載の好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、更に好ましくは、本明細書に記載の更に好ましい態様の一つに従って定義されているとおりである。
【０４３１】
上記のナノボディーズでは、一以上の更なるホールマーク残基が、本明細書に記載されているとおりであることが好ましい（例えば、これらがＶＨＨ配列もしくは部分的にヒト化されたナノボディーズである場合）。
【０４３２】
枠組み１に関しては、先と同様に、アミノ酸配列同一性の程度を決定するにあたり、１〜４位および２７〜３０位のアミノ酸残基は無視するのが好ましいことは、当業者にとっては明瞭である。
【０４３３】
したがって、ＧＬＥＷクラスのナノボディは、３つの相補性決定領域／配列によって分断される４つの枠組み領域／配列からなるアミノ酸配列であってよく、
ここで、
ｉ）  ＧＬＥＷクラスのナノボディが非ヒト化ナノボディである場合には、１０８位のアミノ酸残基は好ましくはＱであり；
更にここで、
ｉｉ）  ＦＲ１は、カバットの付番付与の５〜２６位に、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４３４】
表Ａ−１９：ＫＥＲＥグループのナノボディーズの代表的なＦＷ１配列（アミノ酸残基５〜２６）
【表１９】
2009529339.tif 000028
【０４３５】
更にここで、
ｉｉｉ）  ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が、ＧＬＥＷクラスのナノボディーズのＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に関して本明細書に記載されているとおりであり；
更にここで、
ｉｖ）  CDR1、CDR2およびCDR3が本明細書に定義されているとおりであり、好ましくは本明細書に好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、より好ましくは本明細書により好ましい態様の一つに従って記載されているとおりである。
【０４３６】
上記ナノボディーズは、例えばＶＨＨ配列もしくはヒト化ナノボディーズであってよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合には、本明細書に更に詳細に記載されているように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディーズが部分的にヒト化されたナノボディーズである場合には、先と同様に本明細書に記載されているとおり、状況に応じて更に好適にヒト化されていてよい。上記ナノボディーズでは、一以上のさらなるホールマーク残基が、本明細書に記載されているとおりであることが好ましい（例えば、これらが、ＶＨＨ配列もしくは部分的にヒト化されたナノボディーズである場合）。
【０４３７】
Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３クラスのナノボディは、３つの相補性決定領域／配列によって分断される４つの枠組み領域／配列からなるアミノ酸配列であってよく、
ここで、
ｉ）  カバットの付番付与による１０３位のアミノ酸残基が、Ｗとは異なっており、
更にここで、
ｉｉ）  カバットの付番付与による１０３位のアミノ酸残基がＰ、ＲもしくはＳであることが好ましく、Ｒであることが更に好ましく；
更にここで、
ｉｉｉ）  ＦＲ１が、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４３８】
表Ａ−２０：Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３グループのナノボディーズの代表的なＦＷ１配列
【表２０】
2009529339.tif 000029
【０４３９】
更にここで、
ｉｖ）  ＦＲ２が、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４４０】
表Ａ−２１：Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３グループのナノボディーズの代表的なＦＷ２配列
【表２１】
2009529339.tif 000030
【０４４１】
更にここで、
ｖ）  ＦＲ３が、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４４２】
表Ａ−２２：Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３グループのナノボディーズの代表的なＦＷ３配列
【表２２】
2009529339.tif 000031
【０４４３】
更にここで、
ｖｉ）  ＦＲ４が、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４４４】
表Ａ−２３：Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３グループのナノボディーズの代表的なＦＷ４配列
【表２３】
2009529339.tif 000032
【０４４５】
更にここで、
ｖｉｉ）  CDR1、CDR2およびCDR3は、本明細書に定義されているとおりであり、好ましくは、本明細書に記載の好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、更に好ましくは、本明細書に記載の更に好ましい態様の一つに従って定義されているとおりである。
【０４４６】
上記のナノボディーズでは、一以上の更なるホールマーク残基が、本明細書に記載されているとおりであることが好ましい（例えば、これらがＶＨＨ配列もしくは部分的にヒト化されたナノボディーズである場合）。
【０４４７】
枠組み１に関しては、先と同様に、アミノ酸配列同一性の決定では、１〜４位のアミノ酸残基は無視するのが好ましいことは、当業者にとっては明白でる。
【０４４８】
したがって、Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３クラスのナノボディは、３つの相補性決定領域／配列によって分断される４つの枠組み領域／配列からなるアミノ酸配列であってよく、
ここで、
ｉ）  カバットの付番付与による１０３位のアミノ酸残基が、Ｗとは異なっており、
更にここで、
ｉｉ）  カバットの付番付与による１０３位のアミノ酸残基がＰ、ＲもしくはＳであることが好ましく、Ｒであることが更に好ましく；
更にここで、
ｉｉｉ）  ＦＲ１が、以下のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり：
【０４４９】
表Ａ−２４：Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３グループのナノボディーズの代表的なＦＷ１配列（アミノ酸残基５〜２６）
【表２４】
2009529339.tif 000033
【０４５０】
更にここで、
ｉｖ）  ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が、Ｐ、Ｒ、Ｓ１０３クラスのナノボディーズのＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に関して本明細書に記載されているとおりであり；
更にここで、
ｖ）  CDR1、CDR2およびCDR3が、本明細書に定義されているとおりであり、好ましくは本明細書に好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、より好ましくは本明細書により好ましい態様の一つに従って定義されているとおりである。
【０４５１】
上記ナノボディーズは、例えばＶＨＨ配列もしくはヒト化ナノボディーズであってよい。上記ナノボディ配列が、ＶＨＨ配列である場合には、本明細書に更に詳細に記載されているように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディーズが、部分的にヒト化されたナノボディーズである場合には、先と同様に本明細書に記載されているとおり、状況に応じて更に好適にヒト化されていてよい。
【０４５２】
上記ナノボディーズでは、一以上の更なるホールマーク残基が、本明細書に記載されているとおりであることが好ましい（例えば、これらが、ＶＨＨ配列もしくは部分的にヒト化されたナノボディーズである場合）。
【０４５３】
別の好ましいが限定されない態様では、本発明のナノボディは、以下の構造を有することができ、
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ枠組み領域１〜４を表し、更にここで、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域１〜３を表しており、
更にここで、
（ａ）ＦＲ１は、配列番号：３２０〜３７０のナノボディーズに存在するＦＲ１からなる群から；あるいは
前記ＦＲ１配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−５に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ１配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  ホールマーク残基は、前記ＦＲ１配列内に表されているとおりである、群から；
および／あるいは、前記ＦＲ１配列の一つと３個、２個、もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−５に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ１配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  ホールマーク残基は、前記ＦＲ１配列内に表されているとおりである、群から；
選択され、さらに
（ｂ）ＦＲ２は、配列番号：３２０〜３７０のナノボディーズに存在するＦＲ２からなる群から；あるいは、
前記ＦＲ２配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−６に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ２配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  ３７位、４４位、４５位および４７位のホールマーク残基は、前記ＦＲ２配列内に表されているとおりである、群から；
および／あるいは、前記ＦＲ２配列の一つと３個、２個、もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−６に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ２配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  ３７位、４４位、４５位および４７位のホールマーク残基は、前記ＦＲ１配列内に表されているとおりである、群から； 
選択され、さらに
（ｃ）ＦＲ３は、配列番号：３２０〜３７０のナノボディーズ（登録商標）内に存在するＦＲ３からなる群から；あるいは、
前記ＦＲ３配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−７に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ３配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  ８３位および８４位のホールマーク残基は、前記ＦＲ３配列内に表されているとおりである、群から；
および／あるいは、前記ＦＲ３配列の一つと３個、２個、もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−７に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ３配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  ８３位および８４位のホールマーク残基は、前記ＦＲ３配列内に表されているとおりである、群から；
選択され、さらにここで、
（ｄ）ＦＲ４は、配列番号：３２０〜３７０のナノボディーズ（登録商標）内に存在するＦＲ４からなる群から；あるいは、
前記ＦＲ４配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置      換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−８に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ４配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  １０３位、１０４位および１０８位のホールマーク残基は、前記ＦＲ３配列に表されているとおりである、群から；
および／あるいは、前記ＦＲ４配列の一つと３個、２個、もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書で定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
ｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−８に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉ）  前記ＦＲ４配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まず、および
ｉｉｉ）  １０３、１０４および１０８のホールマーク残基は、前記ＦＲ４配列内に表されているとおりである、群から；
選択され、
（ｅ）CDR1、CDR2およびCDR3は、本明細書に定義のとおりであり、好ましくは本明細書に記載の好ましい態様の一つに従って定義されているとおりであり、更に好ましくは本明細書に記載の更に好ましい態様の一つに従って定義されているとおりである。
【０４５４】
本発明の一部の特に好ましいナノボディーズは、配列番号：３２０〜３７０のアミノ酸配列からなる群から；あるいは、前記アミノ酸配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで
ｉ）  ホールマーク残基が、上記表Ａ−３に示されているとおりであり、
ｉｉ）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）、および／もしくは表Ａ−５〜Ａ−８に定義されているアミノ酸置換であることが好ましく、および／または
ｉｉｉ）  上記アミノ酸配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ  酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；選択される。
【０４５５】
本発明の一部の更に特に好ましいナノボディーズは、配列番号：３２０〜３７０のアミノ酸配列からなる群から；あるいは、前記アミノ酸配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで
（１）  ホールマーク残基が、配列番号３２０〜３７０から選択された関連配列に表されているとおりであり
（２）  ホールマーク位置以外の位置にアミノ酸置換があった場合には、その置換が好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書で定義）であり、および／もしくは、好ましくは表Ａ−５〜Ａ−８に定義されているアミノ酸置換であり、および／または
（３）  配列番号３２０〜３７０から選択された関連配列と比較すると、前記アミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；選択される。
【０４５６】
本発明の一部のより更に特に好ましいIL-6に対するナノボディーズは、配列番号：３２０〜３７０のアミノ酸配列からなる群から選択することができる。
【０４５７】
好ましくは、本発明のナノボディーズのCDR配列とＦＲ配列とは、本発明のナノボディが本明細書に定義の親和性（本明細書に更に詳しく記載のとおり、ＫＤ値（実際のもしくは見かけの）、ＫＡ値（実際のもしくは見かけの）、ｋｏｎ率および／またはｋｏｆｆ率、あるいは別にＩＣ５０値として適切に測定されおよび／もしくは表現される）をもってIL-6に結合するもの、ならびにこのようなアミノ酸配列の少なくとも一つを含む化合物と構造物、および特にタンパク質とポリペプチドである。
【０４５８】
もう一つの好ましいが限定されない態様では、本発明は、CDR配列が、配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つのCDR配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、更に好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、例えば９５％以上のアミノ酸配列同一性または実質的に１００％のアミノ酸配列同一性を有する、上記ナノボディに関する。このアミノ酸同一性の程度を決定するには、例えば、該ナノボディと配列番号３２０〜３７０の一以上の配列との間のアミノ酸配列の同一性の程度を（本明細書に記載の方法で)測定し、ただし枠組み領域を形成するアミノ酸残基を無視すれば可能である。このようなナノボディーズについては、本明細書に更に詳しく記載されている。
【０４５９】
本明細書にすでに記載のとおり、本発明のもう一つの好ましいが限定されない態様は、配列番号３２０〜３７０からなる群から、または、配列番号３２０〜３７０のアミノ酸配列の少なくとも一つと８０％を超える、好ましくは９０％を超える、更に好ましくは９５％を超える、例えば９９％以上のアミノ酸配列同一性（本明細書に定義）を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するナノボディに関する。
【０４６０】
さらに、上記ナノボディーズでは、
ｉ）  アミノ酸置換（本明細書に定義のヒト化置換ではない場合）は、配列番号３２０〜３７０の対応するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸置換である（本明細書に定義）のが好ましく；、および／または
ｉｉ）  そのアミノ酸配列が、配列番号３２０〜３７０の対応するアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列置換のみを含むか、もしくはそれ以外の場合には、好ましくは５個未満、３個未満、更に好ましくは１個もしくは２個のみの削除もしくは挿入を含むのが好ましく、および／または
ｉｉｉ）  CDRは、親和性成熟によって、例えば、配列番号３２０〜３７０のCDRから開始して対応するアミノ酸配列に誘導されるCDRであってよい。
【０４６１】
好ましくは、本発明のナノボディーズのCDR配列とＦＲ配列は、例えば本発明のナノボディーズ（および該ナノボディーズを含む本発明のポリペプチド）が、
−IL-6に結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは10-7〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは10-8〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下（すなわち、会合定数（ＫＡ）は105〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは107〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、更に好ましくは108〜1012Ｌ／ｍｏｌ）であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｎ率は102Ｍ-1ｓ-1と約107Ｍ-1ｓ-1の間、好ましくは108Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間、更に好ましくは104Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間、例えば105Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は１ｓ-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6ｓ-1（複数日のｔ１／２にてほぼ可逆的な複合体となる）の間、好ましくは10-2ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-1と10-6ｓ-1の間、例えば10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間である。
【０４６２】
好ましくは、本発明のナノボディーズに存在するCDR配列とＦＲ配列は、例えば本発明のナノボディーズがIL-6と結合に結合するにあたって、その結合の親和性度は５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、更に好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満である。
【０４６３】
本発明のナノボディのIL-6に対する親和性は、例えば本明細書記載の測定法を用いて、自体公知の方法で決定することができる。
【０４６４】
本発明の一つの限定されない態様によれば、ナノボディは本明細書に定義のとおりであってよいが、ただしそれは、天然由来ヒトＶＨドメインの対応する枠組み領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応する枠組み領域と比較して、少なくとも一つの枠組み領域において少なくとも「１個のアミノ酸相違」（本明細書に定義）を有する。さらに詳細には、本発明の一つの限定されない態様によれば、ナノボディは本明細書に定義のとおりであってよいが、ただしそれは、天然由来ヒトＶＨドメインの対応する枠組み領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応する枠組み領域と比較して、少なくとも一個のホールマーク残基（１０８位、１０３位および／もしくは４５位のホールマーク残基を含む）において少なくとも「１個のアミノ酸相違」（本明細書に定義）を有する。通常、ナノボディは、ＦＲ２および／もしくはＦＲ４の少なくとも一つ、さらに詳しくはＦＲ２および／もしくはＦＲ４におけるホールマーク残基（先と同様に（１０８位、１０３位および／または４５位のホールマーク残基を含む））の少なくとも一つにおいて、天然由来ＶＨドメインと少なくとも１個のアミノ酸相違を有する。
【０４６５】
さらに、本発明のヒト化ナノボディは、本明細書に定義のとおりであってよいが、ただし天然由来ＶＨドメインの対応する枠組み領域と比較して、枠組み領域の少なくとも一つにおいて少なくとも「１個のアミノ酸相違」（本明細書に定義）を有する。さらに詳細には、本発明の一つの限定されない態様によれば、ナノボディは、本明細書に定義のとおりであってよいが、ただし天然由来ヒトＶＨドメインの対応する枠組み領域と比較して、ホールマーク残基（１０８位、１０３位および／または４５位のホールマーク残基）の少なくとも一つにおいて少なくとも「１個のアミノ酸相違」（本明細書に定義）を有する。通常、ナノボディは、ＦＲ２および／またはＦＲ４の少なくとも一つ、さらに詳しくはＦＲ２および／またはＦＲ４におけるホールマーク残基の少なくとも一つ（先と同様に（１０８位、１０３位および／または４５位のホールマーク残基を含む））において、天然由来ＶＨドメインと少なくとも１個のアミノ酸相違を有する。
【０４６６】
本明細書の開示からも明らかなように、本明細書に定義されているとおり、本発明のナノボディーズの天然もしくは合成の類似体、突然変異体、変異体、アリール、相同体、および正統体（本明細書では集合的に「類似体」と言う）、特に配列番号３２０〜３７０のナノボディーズの類似体を使用することは、本発明の範囲内にある。したがって、本発明の一つの実施形態によれば、広い意味での「本発明のナノボディ」という用語は、このような類似体も包含する。
【０４６７】
一般に、このような類似体では、本明細書に定義のナノボディーズと比較して、一以上のアミノ酸残基が置換、削除および／もしくは付加されていてもよい。このような置換、挿入もしくは削除は、枠組み領域の1以上で、および／またはCDRの1以上で行われてよい。このような置換、挿入もしくは削除が、枠組み領域の1以上で行われる場合には、これらはホールマーク残基の1以上で、および／または枠組み残基の他の位置の1以上でおこなわれてよいが、ホールマーク残基における置換、挿入もしくは削除は、一般にあまり好ましくない（本明細書に定義のとおり、これらが好適なヒト化置換ではないかぎり）。
【０４６８】
限定されない例をあげると、置換は、例えば、保存的置換（本明細書に定義）であってよく、および／またはあるアミノ酸残基が、他のＶＨＨドメインの同じ位置に天然に発生する別のアミノ酸残基によって置換されてもよい（このような置換の限定されない例については、表Ａ−５〜Ａ−８を参照）が、本発明は一般にそのことに限定されない。したがって、本発明のナノボディの特性を改善するか、あるいは少なくとも本発明のナノボディの所望の特性もしくは所望の特性の均衡状態または組み合わせを大きく損なう（すなわち、ナノボディが目的の用途にもはや適さなくなるまで）ことのない1以上の置換、削除もしくは挿入、あるいはそれらの任意の組み合わせは本発明の範囲内に含まれる。当業者が好適な置換、削除もしくは挿入またはそれらの好適な組合せを測定し選択するためには、本明細書の開示に基づけば、および場合によっては日常的な程度の実験をすれば可能であり、例えば限られた数の可能な置換を導入し、得られたナノボディーズの特性にその置換がどのような影響を及ぼしたかを測定すればよい。
【０４６９】
例えば、本発明のナノボディもしくはポリペプチドを発現させるのに用いる宿主生物に応じて、このような削除および／もしくは置換をデザインするために、翻訳後の修飾用に1以上の部位（例えば1以上のグリコシル化部位）を除去すればよく、これは当業者の能力の範囲内である。あるいは反対に、置換もしくは挿入をデザインして1以上の官能基を付加（本明細書に記載）するための部位を導入し、それによって例えば部位特異的なPEG化（先と同様に、本明細書に記載）を可能にしてもよい。
【０４７０】
上記表Ａ−５〜Ａ−８に提示されているＶＨＨエントロピーとＶＨＨ変動性に関するデータから分かるように、枠組み領域内の一部のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基より保存度が高い。一般に、広い意味での本発明は、そのことに限定されないが、任意の置換、削除もしくは挿入が、保存度の低い位置で行われることが好ましい。さらに、一般に、アミノ酸置換は、アミノ酸の削除もしくは挿入より好ましい。
【０４７１】
類似体は、本発明のナノボディーズに関して本明細書で定義の親和性（本明細書に更に詳しく記載のとおり、ＫＤ値（実値もしくは見掛け値）、ＫＡ値（実値もしくは見掛け値）、ｋｏｎ率および／またはｋｏｆｆ率、あるいはＩＣ５０値として好適に測定されおよび／もしくは表現される）をもってIL-6に結合できるのが好ましい。
【０４７２】
具体的には、本発明のアミノ酸配列およびポリペプチドは、好ましくは例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは10-7〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは10-8〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下（すなわち、会合定数（ＫＡ）が105〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは107〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、更に好ましくは108〜1012Ｌ／ｍｏｌ）であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｎ率は102Ｍ-1ｓ-1と約107Ｍ-1ｓ-1の間、好ましくは108Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間、更に好ましくは104Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間、例えば105Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は１ｓ-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6ｓ-1（複数日のｔ１／２にてほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-1と10-6ｓ-1の間、例えば10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間である。
【０４７３】
好ましくは、本発明の一価アミノ酸配列（もしくは本発明のアミノ酸配列を１個のみ含むポリペプチド）は、好ましくは例えばそれがIL-6と結合するにあたって、その結合の親和性度が５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、更に好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満である。
【０４７４】
IL-6に対する類似体の親和性は、例えば本明細書に記載の測定法を用いて、自体公知の方法で測定できる。
【０４７５】
類似体は、本明細書に記載のナノボディーズの好ましい特性を保持していることが好ましい。
【０４７６】
さらに、一つの好ましい実施形態によれば、類似体は、配列番号３２０〜３７０のナノボディーズの一つと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、例えば９５％もしくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、および／または多くとも２０個、好ましくは多くとも１０個、更に好ましくは多くとも５個、例えば４個、３個、２個、１個のみのアミノ酸相違（本明細書に定義）を有することが好ましい。
【０４７７】
さらに、類似体の枠組み配列とCDRとは、本明細書に定義の好ましい実施形態に従っていることが好ましい。本明細書に定義されているように、更に一般には、類似体は、（ａ）１０８位にＱ；および／または（ｂ）４５位に電荷アミノ酸もしくはシステイン残基および好ましくは４５位にＥ、および更に好ましくは４４位にＥ、４５位にＲ；および／または（ｃ）１０３位にＰ、ＲもしくはＳを有する。
【０４７８】
本発明のナノボディーズの類似体の一つの好ましいクラスは、（すなわち、本発明の天然に発生するナノボディの配列と比べて）ヒト化されたナノボディーズを含む。本明細書に前述の背景技術で記載したように、このようなヒト化は、一般に、天然由来のＶＨＨ配列における1以上のアミノ酸残基を、ヒトＶＨ領域、例えばヒトＶＨ３ドメインの同じ位置に発生するアミノ酸残基で置換することを伴う。可能なヒト化置換もしくはヒト化置換の組み合わせの例は、例えば本明細書に掲載の表、本明細書で引用の背景技術で記載した可能なヒト化置換、および／またはナノボディの配列と天然由来のヒトＶＨドメインの配列との間の比較から、当業者にとって明らかである。
【０４７９】
ヒト化置換を選択した場合には、得られるヒト化ナノボディーズは、本明細書に定義のナノボディーズの好ましい特性を依然として保持し、さらに好ましくは、先行段落で類似体に関して記載したとおりであるのが望ましい。当業者が好適なヒト化置換もしくはヒト化置換の好適な組合せを測定し選択するためには、本明細書の開示に基づけば、および場合によっては日常的な程度の実験をすれば可能であり、例えば限られた数の可能なヒト化置換を導入し、得られたナノボディーズの特性にその置換がどのような影響を及ぼしたかを測定すればよい。
【０４８０】
一般に、ヒト化するとその結果として、本発明のナノボディーズは、いっそう「ヒト様」になるが、本明細書に記載の本発明のナノボディーズの好ましい特性は依然として保持される。したがって、このようなヒト化ナノボディーズは、対応する天然由来ＶＨＨドメインと比較して、いくつかの利点、例えば免疫原性の減弱、を有する可能性がある。先と同様に、本明細書の開示に基づけば、および場合によっては日常的な程度の実験をすれば、当業者は、一方でヒト化置換によって提供される好ましい特性と、他方で天然由来ＶＨＨの好ましい特性との間の望ましいもしくは好適な均衡状態を最適化もしくは実現するヒト化置換もしくは好適なヒト化置換の組み合わせを選択することができる。
【０４８１】
本発明のナノボディーズは、任意の枠組み残基、例えば1以上のホールマーク残基（本明細書に定義）もしくは１以上の他の枠組み残基（すなわち、非ホールマーク残基）あるいはそれらの任意の好適な組み合わせにおいて好適にヒト化されてよい。「Ｐ、Ｒ、Ｓ−１０３群」もしくは「ＫＥＲＥ群」のナノボディーズに対する好ましい一つのヒト化置換は、Ｑ１０８をＬ１０８に置換である。「ＧＬＥＷクラス」のナノボディーズも、Ｑ１０８をＬ１０８に置換することによってヒト化してよいが、ただし条件として他のホールマーク残基の少なくとも一つは、ラクダ（ラクダ化）置換（本明細書に定義）を含む。例えば、上記のように、ヒト化ナノボディーズの一つの特に好ましいクラスは、４４〜４７位にＧＬＥＷもしくはＧＬＥＷ様の配列；１０３位にＰ、ＲもしくはＳ（および特にＲ）および１０８位にＬ；を有しており、ヒト化ナノボディーズのもう一つの特に好ましいクラスは、４３〜４６位にＫＥＲＥ、ＫＱＲＥもしくはもう一つのＫＥＲＥ様配列および１０８位にＱ（および状況に応じて、本明細書に定義されているＫＥＲＥ群に関するほかのホールマーク残基の1以上）を有している。
【０４８２】
ヒト化ナノボディーズのもう一つのクラスは、１０３位にＰ、ＲもしくはＳ（および特にＲ）および１０８位にＱ（および状況に応じて、本明細書に記載されているＰ、Ｒ，Ｓ１０３群に関するほかのホールマーク残基の1以上）を有している。
【０４８３】
ヒト化した他の類似体、およびそれをコードする核酸配列は、自体公知の任意の方法で得られる。例えば、類似体を取得するためには、天然由来ＶＨＨドメインをコードする核酸を得、置換すべき１以上のアミノ酸残基のコドンを対応する所望のアミノ酸残基のコドンに変更し（例えば部位特異的変異導入によりもしくは好適なミスマッチプライマーを用いたＰＣＲにより）、かくして得られた核酸／ヌクレオチド配列を好適なホストもしくは発現系にて発現し；かくして得られた類似体を単離および／もしくは精製して該類似体を実質的に単離された形態で得る（例えば、本明細書に更に詳しく記載）。これを実施するためには、自体公知の方法および技術を用い、これは例えば本明細書に前述の便覧および参考文献、本明細書に前述の背景技術および／もしくは本明細書の更なる記述から、当業者にとって明らかとなる。あるいは反対に、所望の類似体をコードする核酸を自体公知の方法で合成し（例えば自動装置を用いて既定のアミノ酸配列で核酸配列を合成し）、次に、本明細書に記載のとおり発現させることができる。更に別の技術により、所望の類似体の各部分をコードする1以上の天然由来および／もしくは合成の核酸配列を組合せ、次に本明細書に記載のように組み合わせた核酸配列を発現させてもよい。さらに、類似体をその関連するアミノ酸配列の化学合成によって得るために、自体公知のペプチド合成技術、例えば本明細書に記載の技術を利用することができる。
【０４８４】
これに関し当業者には明瞭なことであるが、ヒトＶＨ配列（すなわち、アミノ酸配列もしくは対応するヌクレオチド配列）から、例えばヒトＶＨ３配列、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１もしくはＤＰ−２９から、本発明のナノボディーズ（それらの類似体を含む）を設計および／または調製するために、1以上のラクダ化置換を導入して（すなわち、前記ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸残基をＶＨＨドメインの対応する位置に発生するアミノ酸残基に変更して）、本発明のナノボディの配列を得、および／またはかくして得られた配列にナノボディの好ましい特性を付与する。先と同様に、これを前段落で述べた各種の方法および技術を用いて実施するために、ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列を開始点として用いることができる。
【０４８５】
好ましいが限定されないあるラクダ化置換は、表Ａ−５〜Ａ−８から導出できる。1以上のホールマーク残基をラクダ化置換すれば、所望の特性に及ぼすその影響は1以上の他のアミノ酸位置での置換よりも一般に大きいのは明瞭である。しかし両方およびその任意の好適な組み合わせは本発明の範囲内に包含される。例えば、１以上のカメリド化置換を導入することにより最低限ある所望の特性を付与し、次に更なるラクダ化置換を導入することにより前記特性を更に改良するか、および／または更なる好ましい特性を追加することは可能である。先と同様に、当業者が好適なカメリド化置換もしくは好適なカメリド化置換の組み合わせを測定および選択するには、本明細書の開示に基づき、更に場合によっては日常的程度の実験、例えば限定された数の可能なカメリド化置換を導入してナノボディーズの好ましい特性が取得もしくは改良されているか（すなわち、元のＶＨドメインと比較して）否かを決定すれば可能である。
【０４８６】
ただし、一般に、このようなラクダ化置換では、得られるアミノ酸配列中に、少なくとも、（ａ）１０８位に９；および／または（ｂ）４５位に電荷アミノ酸もしくはシステイン残基および好ましくは４４位にさらにＥ、さらに好ましくは４４位にＥおよび４５位にＲ；および／または（ｃ）１０３位にＰ、ＲもしくはＳ；および状況に応じて、1以上の更なるラクダ化置換が含まれることが好ましい。更に好ましくは、ラクダ化置換により、本発明のナノボディおよび／またはそれの類似体（本明細書に定義）、例えばヒト化類似体および／または好ましくは先行段落に定義した類似体が生成する。
【０４８７】
本明細書の開示からも明らかなように、本明細書に定義されている本発明のナノボディーズの部分もしくは断片、あるいは二以上の部分もしくは断片の組み合わせ、特に、配列番号３２０〜３７０のナノボディーズの部分もしくは断片の使用も本発明の範囲内である。したがって、本発明の一つの実施形態によれば、もっとも広い意味での「本発明のナノボディ」という用語は、このような部分もしくは断片も包含している。
【０４８８】
一般に、本発明のナノボディーズ（それらの類似体を含む）のこのような部分もしくは断片のアミノ酸配列は、本発明の対応する全長ナノボディ（もしくはそれらの類似体）のアミノ酸配列と比較すると、1以上のＮ末端アミノ酸残基、1以上のＣ末端アミノ酸残基、1以上の隣接する内側のアミノ酸残基、もしくはそれらの任意の組み合わせが削除および／もしくは除去されている。
【０４８９】
更に特に、本発明は、本明細書に定義されている親和性（本明細書に更に詳しく記載のとおり、ＫＤ値（実際のもしくは見かけの）、ＫＡ値（実際のもしくは見かけの）、ｋｏｎ率および／またはｋｏｆｆ率、あるいはＩＣ５０値として適切に測定されおよび／もしくは表現される）をもってIL-6に結合する本発明ナノボディーズの部分もしくは断片（それらの類似体を含む）、ならびにそのようなナノボディの少なくとも一つを含む化合物と構造物、および特にタンパク質とポリペプチドを提供する。
【０４９０】
具体的には、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドの部分もしくは断片（それらの類似体を含む）は、好ましくは例えばそれらが、
−IL-6と結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは10-7〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは10-8〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下（すなわち、会合定数（ＫＡ）が105〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは107〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、更に好ましくは108〜1012Ｌ／ｍｏｌ）であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｎ率は102Ｍ-1ｓ-1と約107Ｍ-1ｓ-1の間、好ましくは108Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間、更に好ましくは104Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間、例えば105Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1の間であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は１ｓ-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6ｓ-1（複数日のｔ１／２にてほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-1と10-6ｓ-1の間、例えば10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間である。
【０４９１】
好ましくは、本発明の一価ナノボディ（もしくは本発明のナノボディを１個のみ含むポリペプチド）の部分もしくは断片（それらの類似体を含む）は、好ましくは、好ましくは例えばそれらがIL-6と結合するにあたって、その結合の親和性度は５００ｎＭ、好ましくは２００ｎＭ未満、更に好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭである。
【０４９２】
本発明のナノボディーズもしくはポリペプチドの部分もしくは断片（それらの類似体を含む）がIL-6に結合するるための好ましいＩＣ５０値は、本明細書の更なる記述および例から明らかになる。
【０４９３】
任意の部分もしくは断片は、本発明の対応する全長ナノボディのアミノ酸配列の、少なくとも１０個の隣接アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個の隣接アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも３０個の隣接アミノ酸残基、例えば少なくとも４０個の隣接アミノ酸残基を含むことが好ましい。
【０４９４】
更に、任意の部分もしくは断片は、CDR1、CDR2および／またはCDR3の少なくとも一つ、もしくはそれらの少なくとも一部（および、詳細には、少なくともCDR3もしくは少なくともその一部）を含むことが好ましい。更に好ましくは、任意の部分もしくは断片は、好適な枠組み配列もしくは少なくともその一部によって接続されていることが好ましい、CDRの少なくとも一つ（好ましくは、少なくともCDR3もしくはその一部）および少なくとも一つの他のCDR（すなわち、CDR1もしくはCDR2）もしくは少なくともそれらの一部を含んでいる。更に好ましくは、任意の部分もしくは断片が先と同様に、好適な枠組み配列もしくは少なくともその一部によって接続されていることが好ましい、CDRの少なくとも一つ（好ましくは、少なくともCDR3もしくはその一部）および二つの残りのCDRの少なくとも一部を含む。
【０４９５】
もう一つの特に好ましいが限定されない実施形態によれば、このような部分もしくは断片は、例えば国際出願ＷＯ０３／０５０５３１（Ｌａｓｔｅｒｓら）に記載されているように、本発明の対応する全長ナノボディの、ＦＲ３、CDR3およびＦＲ４などの、少なくともCDR3を含んでいる。
【０４９６】
すでに上述したように、二以上のこのような部分もしくは断片（本発明の同じもしくは異なるナノボディーズから）を結合すること、すなわち類似体（本明細書に定義）および／または本発明のナノボディの更なる部分もしくは断片（本明細書に定義）を提供することも可能である。例えば、本発明のナノボディの1以上の部分または断片を、ヒトＶＨドメインの1以上の部分または断片と組み合わせることも可能である。
【０４９７】
一つの好ましい実施形態によれば、部分もしくは断片は、配列番号３２０〜３７０のナノボディーズの一つと、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、更に好ましくは７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、９５％もしくは９９％以上の配列同一性度を有している。
【０４９８】
部分および断片、ならびにこれら部分および断片をコードする核酸配列は、自体公知の任意の方法で提供され、場合によって結合させることができる。例えば、このような部分もしくは断片は、本発明の全サイズのナノボディをコードする核酸の中に停止コドンを挿入し、次に取得られた核酸を（本明細書に記載の）自体公知の方法で発現させることによって取得できる。あるいは、このような部分もしくは断片をコードする核酸は、本発明の全サイズナノボディをコードする核酸を好適に制限するか、または自体公知の方法でこのような核酸を合成することによって取得できる。部分もしくは断片は、自体公知のペプチド合成技術を用いても提供されうる。
【０４９９】
もっとも広い意味での本発明は、本発明のナノボディーズの誘導体も含んでいる。このような誘導体は、一般に、本発明のナノボディーズおよび／もしくは本発明のナノボディーズを形成しているアミノ酸残基の1以上を修飾、更に詳細には、化学および／または生物学的（例えば、酵素による）に修飾することによって取得できる。
【０５００】
このような修飾の実施例ならびに、このような方法で（タンパク質骨格上、好ましくは側鎖上に）修飾できるナノボディ配列内のアミノ酸残基、このような修飾を導入するのに使用できる方法および技術、ならびにこのような修飾の潜在的使用および利点の実施例は、当業者にとって明らかであ。
【０５０１】
例えば、このような修飾には、1以上の官能基、残基もしくは部分、特に、本発明のナノボディに1以上の所望の特性または機能を付与する1以上の官能基、残基または部分を本発明のナノボディの中にもしくは上に導入（共有結合もしくは任意のその他の好適な方法による）することが含んまれてもよい。このような官能基の実施例は、当業者にとって明らかであろう。
【０５０２】
例えば、このような修飾には、1以上の官能基の導入（例えば共有結合もしくは任意の他の好適な方法での）が含まれてよく、この官能基によって、本発明のナノボディの半減期、可溶性および／または吸収が増大され、本発明のナノボディの免疫原性および／または毒性が低減され、本発明のナノボディの望ましくない副作用が排除もしくは減弱され、および／または、本発明のナノボディーズおよび／もしくはポリペプチドまたはこれら二つ以上の任意の組み合わせに対し、他の有利な特性が付与され、および／または望ましくない特性が低減される。このような官能基およびこれら官能基を導入するための技術の実施例は、当業者にとって明らかであり、一般に、本明細書で前述の一般的背景で述べたすべての官能基および技術ならびに薬剤タンパク質の修飾、詳細には抗体もしくは抗体の断片（ＳｃＦｖの抗体およびシングルドメイン抗体を含む）の修飾のための自体公知の官能基および技術を挙げることができ、例えば、これらに関しては、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)が参照される。このような官能基は、例えば、本発明のナノボディに直接に（例えば共有結合により）結合させてもよいし、あるいは場合によっては適切なリンカーもしくはスペーサーを介して結合させてもよく、これは当業者にとって明らかである。
【０５０３】
半減期の増大および／または薬剤タンパク質の免疫原性の低下のためのもっとも広く使用されている技術の一つには、適切な薬理学的に受容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）もしくはその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）もしくはｍＰＥＧ）の付着が含まれる。一般に、PEG化の適切な形態を使用することができ、例えば抗体および抗体断片（（シングル）ドメイン抗体およびＳｃＦｖの抗体を含むが限定されない）のためのPEG化が、当技術分野で使用されている；例えば、Chapman, Nat. Biotechnol., 54,531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54,453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) and WO 04/060965を参照。タンパク質のPEG化のための各種作用物質は、例えばＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （ＵＳＡ）などから購入することもできる。
【０５０４】
好ましくは、部位特異的PEG化を、具体的にはシステイン残基を介して使用する（例えば、Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770(2003))。したがって、例えば、本発明のナノボディで天然に発生させたシステイン残基にＰＥＧを付着させてもよいし、本発明のナノボディを修飾して1以上のシステイン残基を適切に導入し、ＰＥＧを付着させるようにもよいし、またはＰＥＧを付着させるための1以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を本発明のナノボディのNおよび／もしくはC末端に融合させてもよく、すべての場合に当業者に自体公知のタンパク質組み換え技術を使用する。
【０５０５】
好ましくは、本発明のナノボディーズおよびタンパク質のために使用するPEGの分子量は５０００を超え、例えば１０，０００を超えて２０，０００未満、例え１００，０００未満であり、例えば２０，０００〜８０，０００の範囲である。
【０５０６】
もう一つの、通常はあまり好ましくない修飾に、Ｎ結合もしくはＯ結合のグリコシル化があり、通常は共翻訳および／もしくは翻訳後の修飾の一部としてのグリコシル化であるが、これは本発明のナノボディもしくはポリペプチドを発現させるのに使用する宿主細胞によって変わる。
【０５０７】
さらにもう一つの修飾は、1以上の検出可能な標識または他の信号生成の基または部分の導入があり得るが、この導入は標識を付したナノボディの使用目的次第で、ある。これらを付着、使用および検出のための好適な標識および技術は、当業者には明らかであり、例えば、限定されないが（蛍光色素、イソチオシアン酸塩、ローダミン、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレサミンならびに（１５２Ｅｕもしくはランタニド系列のほかの金属など）蛍光金属、燐光標識、（ルミナール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンもしくはＧＦＰおよびその類似体などの）化学蛍光標識もしくは生物標識、（３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６ＣＩ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅおよび７５Ｓｅなどの）放射性同位体、（例えば、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａおよび６８Ｇａなどの）金属、金属キレートもしくは金属カチオンもしくは（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ）など、インビボ、インビトロ、インジッツ診断および画像処理での使用に特に好適な他の金属もしくは金属カチオン、ならびに（リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、イースト菌アルコール分解酵素、アルファ−グリセロリン酸塩、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸塩、ブドウ糖酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウリアーゼ、カタラーゼ、ブドウ糖−ＶＩ−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどの）発色団および酵素などがあげられる。他の好適な標識は当業者に明らかであり、例えば、ＮＭＲもしくはＥＳＲスペクトロスコピーを用いて検出可能な部分があげられる。
【０５０８】
本発明のこのような標識化ナノボディーズおよびポリペプチドは、例えば、インビボ、インビトロもしくはインジッツ検定（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチ検定」など、自体公知の免疫学的検定を含む）、ならびにインビボ診断および画像処理の目的で使用してよいが、これらはどのような特異的標識を選択するかによって変わる。
【０５０９】
当業者にとって明らかであるが、もう一つの修飾は、例えば上記に引用した金属もしくは金属カチオンの一つをキレート化するためのキレート化基の導入を伴うものであってよい。例えば、好適なキレート基には、制限されないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）もしくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）があげられる。
【０５１０】
さらにもう一つの修飾には、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの、特異的結合対の一方である官能基の導入が含まれてよい。このような官能基は、本発明のナノボディを、結合対のもう一方に結合している別のタンパク質、ポリペプチドもしくは化学的化合物を、結合対の形成を介して、結合させるのに使用してよい。例えば、本発明のナノボディをビオチンに結合し、次にアビジンもしくはストレプトアビジンに結合している別のタンパク質、ポリペプチド、化合物もしくは単体に結合させる。例えば、このように結合したナノボディは、例えば診断系におけるレポーターとして使用してよく、この系では検出可能な信号を生成する薬剤がアビジンもしくはストレプトアビジンに結合している。このような結合対を使用すれば、本発明のナノボディを担体、例えば製剤目的に好適な担体に結合させることができる。一つの限定されない例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257(2000)に記載のリポソーム剤形である。このような結合対を使用すれば、治療的に活性な薬剤を本発明のナノボディに結合させることができる。
【０５１１】
ある用途のために、特に、本発明のナノボディーズが標的とする標的を発現する細胞を殺滅する（ガン治療などで）、あるいはそのような細胞の成長および／もしくは増殖を減少もしくは低下させることを意図する用途のために、本発明のナノボディーズを毒素または毒性の残基もしくは部分に結合してもよい。例えば細胞毒性化合物を提供するために本発明のナノボディに結合できる毒性の部分、化合物もしくは残基の例は、当業者には明らかであり、例えば前述の先行技術および／または本明細書の更なる記述に見ることができる。一つの例が、いわゆるＡＤＥＰＴＴＭ技術ＷＯ  ０３／０５５５２７である。
【０５１２】
他の有力な化学的および酵素的修飾は、当業者にとって明らかである。そのような修飾を研究目的（例えば機能−活性の関連を研究する）に導入してもよい。例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151(1997)を参照。
【０５１３】
更に詳細には、本発明は、IL-6に結合可能なナノボディーズおよびポリペプチドの誘導体を提供しており、その結合の親和性（本明細書に更に詳しく記載のとおり、ＫＤ値（実際のもしくは見かけの）、ＫＡ値（実際のもしくは見かけの）、ｋｏｎ率および／もしくはｋｏｆｆ率として、あるいは別にＩＣ５０値として好適に測定され表現される）は本発明のナノボディーズのために本明細書で定義されているとおりである。
【０５１４】
具体的には、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドの誘導体は、好ましくは例えばそれらが、
−IL-6と結合するにあたって、その結合の解離定数（ＫＤ）は10-5〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは10-7〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは10-8〜10-12ｍｏｌ／Ｌ以下（すなわち、会合定数（ＫＡ）が105〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは107〜1012Ｌ／ｍｏｌ以上、更に好ましくは108〜1012Ｌ／ｍｏｌ）であり；
および／または、例えばそれらが
−IL-6と結合し、結合のｋｏｎ率は102Ｍ-1ｓ-1〜約107Ｍ-1ｓ-1の間、好ましくは108Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1との間、更に好ましくは104Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1との間、例えば105Ｍ-1ｓ-1と107Ｍ-1ｓ-1との間であり、および／または、それらが
−IL-6と結合するにあたって、その結合のｋｏｆｆ率は１ｓ-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と10-6ｓ-1（複数日のｔ１／２にてほぼ不可逆な複合体となる）の間、好ましくは10-2ｓ-1と10-6ｓ-1の間、更に好ましくは10-3ｓ-1と10-6ｓ-1の間、例えば10-4ｓ-1と10-6ｓ-1の間である。
【０５１５】
好ましくは、本発明の一価ナノボディ（もしくは本発明のナノボディを１個のみ含むポリペプチド）の誘導体は、好ましくは例えばそれらがIL-6と結合するにあたって、その結合の親和性度は５００ｎＭ、好ましくは２００ｎＭ未満、更に好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭである。
【０５１６】
本発明のナノボディーズもしくはポリペプチドの誘導体がIL-6に結合するための好ましいＩＣ５０値は、本明細書の更なる記述と実施例から明らかとなる。
【０５１７】
上記のように、本発明は、本質的に本発明の少なくとも一つのナノボディから本質的になるもしくはこれを含むタンパク質もしくはポリペプチドに関する。「本質的に……からなる」という用語は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が本発明のナノボディのアミノ酸配列とまったく同じであるか、または本発明のナノボディのアミノ酸配列に一致しているが、ただしそのナノボディのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に限定された数のアミノ酸残基、例えば１から２０個のアミノ酸残基、例えば１〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜６個のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５もしくは６個のアミノ酸残基が付加されていることを意味する。
【０５１８】
前記アミノ酸残基は、ナノボディの特性を変更、改変もしくは前記特性に影響を与えてもよいし、そうでなくてもよく、ナノボディに別の機能を付加してもよいし、そうでなくてもよい。例えば、このようなアミノ酸残基は：
ａ）  例えば、異種の宿主細胞もしくは宿主生命体で発現させた結果として、Ｎ末端Ｍｅｔ残基を含むことができ、
ｂ）  信号配列もしくはレーダー配列を合成時に形成してよく、それによって宿主細胞からのナノボディの分泌が指示される。好適な分泌リーダーは、当業者に明らかであり、本明細書にさらに詳細に記載されているとおりであってよい。通常は、このようなリーダー配列は、ナノボディのＮ末端に結合されるが、もっとも広い意味での本発明は、そのことに限定されない。
ｃ）  ある配列もしくは信号を形成してもよく、それによってナノボディは、特定の器官、組織、細胞、または細胞の部分もしくは区画に指向され、および／または、ナノボディに、生物学的障壁、例えば細胞膜。細胞層、例えば上皮細胞層、腫瘍、例えば充実性腫瘍、または血液脳関門を浸透もしくは横断させる。このようなアミノ酸配列の例は、当業者には明らかでなる。一部の限定されない実施例として、WO 03/026700およびTemsamaniet al., Expert Opin. Biol. Ther., 1,773(2001);Tesamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012(004)およびRousselle, J.Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131(2001)に記載されている微小ペプチドベクター、およびZhao et al., Apoptosis, 8, 631-637(2003)によって記載されている膜転座配列があげられる。抗体断片の細胞内ターゲッティングのためのＣ末端およびＮ末端アミノ酸配列は、例えばCardinale et al., Methods, 34,171(2004)によって記載されている。細胞内ターゲッティングに関する他の好適な技術は、以下に述べる本発明のナノボディを含むいわゆる「細胞内発現抗体」（intrabodies）の発現および／または使用を伴う；
ｄ）  「タグ」、となるアミノ酸の配列もしくは残基を形成してよく、それによって例えば該配列もしくは残基を標的とする親和性技術を用いてナノボディの精製が可能もしくは容易になる。その後で、（例えば化学的もしくは酵素的に開裂して）該配列もしくは残基を除去してナノボディ配列を得る（この目的のために、タグは、任意に開裂可能なリンカー配列を介してナノボディ配列に結合させてもよいし、開裂可能なモチーフを含んでもよい）。このような残基の好ましいが限定されない例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基およびｍｙｃタグ、例えばＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ［配列番号：１５６］である。
ｅ）  官能基化された、および／もしくは官能基の付着のための部位として役立つ1以上のアミノ酸残基であってよい。好適なアミノ酸残基および官能基は、当業者に明らかであり、限定されないが、本発明のナノボディーズの誘導体に関して本明細書に記載のアミノ酸残基および官能基があげられる。
【０５１９】
もう一つの態様によれば、本発明のポリペプチドに本発明のナノボディが含まれ、そのナノボディが、そのアミノ酸末端、そのカルボキシ末端、またはそのアミノ酸末端とそのカルボキシ末端の両方で、1以上の別のアミノ酸配列に融合されれば、該本発明のナノボディとその1以上の別のアミノ酸配列を含む融合タンパク質が得られる。このような融合体は、本明細書では「ナノボディ融合体」と言う。
【０５２０】
1以上の別のアミノ酸配列は、任意の好適なおよび／もしくは所望のアミノ酸配列であってよい。別のアミノ酸配列は、ナノボディの（生物学的）特性を変更、改変、または左右してもよいし、しなくてもよく、および、本発明のナノボディもしくはポリペプチドに別の機能を付加してもよいし、しなくてもよい。好ましくは、別のアミノ酸配列は、本発明のナノボディもしくはポリペプチドに1以上の所望の特性または機能を付与する。
【０５２１】
例えば、別のアミノ酸配列は、第二の結合部位を提供してもよく、この結合部位は、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定因子もしくはエピトープ（例えば、限定されないが、本発明のナノボディが標的とする同じタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定因子もしくはエピトープ、または、異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定因子もしくはエピトープが挙げられる）を標的にしてもよい。
【０５２２】
このようなアミノ酸配列の例は、当業者にとって明らかであり、一般に、従来の抗体およびそれらの断片（例えば、限定されないが、ＳｃＦｖの抗体および単領域抗体が挙げられる）に基づくペプチド融合で使用されるすべてのアミノ酸配列が含まれる。例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology, 23,9,1126-1136 (2005)による概説を参照。
【０５２３】
例えば、このようなアミノ酸配列は、本発明のナノボディ自体と比較して、半減期、可溶性もしくは吸収性を増大させ、免疫原性もしくは毒性を軽減させ、望ましくない副作用を排除もしくは減弱させ、および／または本発明のポリペプチドに他の有利な特性を付与し、および／または本発明のポリペプチドの望ましくない特性を軽減させるアミノ酸配列であってよい。このようなアミノ酸配列の限定されない例は、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質（例えばＷＯ  ００／２７４３５を参照）もしくはハプテン分子（例えば循環抗体によって認識されるハプテン、例えばＷＯ  ９８／２２１４１を参照）である。
【０５２４】
別のアミノ酸配列は、第二の結合部位を提供してもよく、この結合部位は、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定因子もしくはエピトープ（例えば、限定されないが、本発明のナノボディが標的とする同じタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定因子もしくはエピトープ、または、異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定因子もしくはエピトープが挙げられる）を標的にしてもよい。例えば、別のアミノ酸配列は、血清中の半減期を増大できるように、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンやＩｇＧなどの別の血清タンパク質）を標的にする第二の結合部位を提供してもよい。例えば、ＥＰ０３６８６８４、ＷＯ  ９１／０１７４３、ＷＯ  ０１／４５７４６およびＷＯ  ０４／００３０１９（ここでは、各種血清タンパク質が記載されている）アルツハイマー病などの変性神経疾患の治療のため同じものを含むアミロイドベーターおよびポリペプチドに対するナノボディーズ（登録商標）と題する、出願者による国際出願（ここでは、他の各種タンパク質が記載されている）ならびに、Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42を参照。
【０５２５】
本発明の一つの特定の態様では、本発明のナノボディ、または本発明の少なくとも一つのナノボディを含む本発明の化合物、構造体もしくはポリペプチドは、本発明の対応するナノボディと比較して、半減期が長くなっていることがある。このようなナノボディーズ、化合物およびポリペプチドの一部の好ましいが限定されない例は、本明細書の更なる開示に基づいて当業者には明らかであり、その例には以下、半減期を（例えばPEG化によって）増大するよう化学修飾されている本発明のナノボディーズ配列もしくはポリペプチド；血清タンパク質（例えば血清アルブミン。例えばAblynx N. V. による "Immunoglobulin domains with multiple binding sites"と題する、２００６年１１月２７日出願の米国仮出願を参照）に結合のための少なくとも一つの追加の結合部位を含む本発明のナノボディーズ；  あるいは、本発明のナノボディの半減期を増大させる、少なくとも一つの構成部分（特に、少なくとも一つのナノボディ）に結合する本発明の少なくとも一つのナノボディを含む本発明のポリペプチドが挙げられる。このような半減期を延長する構成部分もしくはナノボディーズを含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書の更なる開示に基づいて、当業者には明らかであり；その例には以下、制限されないが、本発明の1以上のナノボディーズが1以上の血清タンパク質もしくは断片（例えば、血清アルブミンもしくはその好適な断片）に、あるいは血清タンパク質に結合可能な1以上の結合ユニット（例えば、血清タンパク質、例えば血清アルブミン、血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、もしくはトランスフェリンに結合可能なナノボディーズもしくは（単）領域抗体）に好適に結合しているポリペプチド；本発明のナノボディがFc部分（例えばヒトFc部分）もしくはそれの適切な部分もしくは断片に結合しているポリペプチド；あるいは、本発明の1以上のナノボディーズが血清タンパク質と結合可能な1以上の微小タンパク質もしくはペプチド（例えば制限されないが、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、ＷＯ０２／０７６４８９に記載のタンパク質およびペプチド）に好適に結合しているポリペプチドが挙げられる。
【０５２６】
一般に、半減期が増大している本発明のナノボディーズ（あるいはこれらを含む化合物、構造体もしくはポリペプチド）の半減期は好ましくは、対応する本発明のナノボディ自体の半減期より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、更に好ましくは、少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍もしくは２０倍を超えて大きい。例えば、半減期が増大している本発明のナノボディーズ、化合物、構造体もしくはポリペプチドの半減期は、本発明の対応するナノボディ自体と比べて、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、更に好ましくは６時間を越えて、例えば１２時間を越えて、更に２４、４８もしくは７２時間を越えて増大してもよい。
【０５２７】
本発明の好ましいが限定されない態様では、本発明のこのようなナノボディーズ、化合物、構造体もしくはポリペプチドが呈するヒトでの血清中半減期は、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、更に好ましくは少なくとも４８時間、更により好ましくは少なくとも７２時間以上である。例えば、本発明の化合物もしくはポリペプチドの半減期は、少なくとも５日間（約５〜１０日間など）、好ましくは少なくとも９日間（約９〜１４日間など）、さらに好ましくは少なくとも１０日間（約１０〜１５日間など）もしくは少なくとも約１１日間（約１１〜１６日間など）、更に好ましくは少なくとも約１２日間（約１２〜１８日間など）もしくは１４日間より長くて（約１４〜１９日間など）よい。
【０５２８】
本発明のもう一つの態様では、本発明のポリペプチドには、含まれている1以上（例えば二つ、好ましくは一つ）のナノボディーズが1以上（例えば二つ、好ましくは一つ）の本発明のナノボディーズに（場合によって、1以上の好適なリンカー配列を介して）結合しており、その結果得られた本発明のポリペプチドは血液脳関門を通過することができる。詳細には、得られた本発明のポリペプチドの血液脳関門通過を可能にする前記1以上のナノボディーズは、1以上（例えば二つ、好ましくは一つ）のナノボディーズ、例えばＷＯ０２／０５７４４５に記載のナノボディーズであって、その中のＦＣ４４（配列番号：ＷＯ０６／０４０１５３の１８９）およびＦＣ５（配列番号：ＷＯ０１／０７７１３７）が好ましい例である。
【０５２９】
詳細には、血清アルブミンもしくはその断片に結合している免疫グロブリンの断片（例えばＶＨドメイン）を使用すると半減期を増大することができると当技術分野では記載されている（ＷＯ００／２７４３５およびＷＯ０１／０７７１３７を参照）。本発明によれば、本発明のナノボディは、血清アルブに（もしくは好適なその断片に）直接または好適なリンカーを介して、特に本発明のポリペプチドが遺伝子融合体（タンパク質）として発現可能なように結合された適切なペプチドを介して結合していることが好ましい。一つの特定の態様によれば、本発明のナノボディは、血清アルブミンの少なくともドメインＩＩＩもしくはその一部を有する血清アルブミン断片に結合していてよい。例えば、"Albumin derived Nanobody, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic proteins and entities, and constructs comprising the sameと題する、２００６年３月３１日出願の、Ablynx N. V. による、ＵＳ仮出願６０／７８８，２５６を参照。
【０５３０】
あるいは、別のナノボディは、血清中の半減期の増大を可能にするよう、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンもしくは別の血清タンパク質、例えばＩｇＧ）を標的とする第二の結合部位もしくは結合ユニットを提供してもよい。このようなナノボディーズとして、以下に記載のナノボディーズ、ならびに、ＷＯ  ９１／０１７４３、ＷＯ  ０１／４５７４６およびＷＯ  ０２／０７６４８９に記載の微小ぺプチドおよび結合タンパク質、ならびにＷＯ  ０３／００２６０９およびＷＯ  ０４／００３０１９に記載のｄＡｂがあげられる。Harman et al., Vaccine, 23(41); 4926-42, 2005、ならびにＥＰ０３６８６８４、ならびに本明細書に記載のＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．による以下のＵＳ仮出願６０／８４３，３４９、６０／８５０，７７４，６０／８５０，７７５、および"Peptides capable of binding to serum proteins"と題する、２００６年１２月５日出願のAblynx N. V.によるＵＳ仮出願（本明細書にも記載）も参照。
【０５３１】
このようなアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズは、詳細には、血清アルブミン（更に詳細には、ヒト血清アルブミン）および／もしくはＩｇＧ（更に詳細には、ヒトＩｇＧ）を標的にしてよい。例えば、このようなアミノ酸配列および／もしくは ナノボディーズは、（ヒト）血清アルブミンを標的とするアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、および血清アルブミンがＦｃＲｎに結合することに関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合できるアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（例えば、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照）、および／または血清アルブミンの領域ＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合可能なアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（例えば、先と同様に、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照）；半減期が増大しているか増大させるアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（例えば、"Serum albumin binding proteins with long half-lives"と題する、２００６年９月８日に出願の、Ablynx N. V. によるＵＳ仮出願６０／８４３，３４９を参照）；少なくとも一種の哺乳動物由来の血清アルブミン、特に少なくとも一種類の霊長類（例えば、制限されないが、キツネザル属のサル(例えばキツネザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／もしくはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））およびヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ）の血清アルブミンと交差反応するヒト血清アルブミンを標的とするするアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ；ｐＨに依存せずに血清アルブミンに結合可能なアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（"Nanobodies that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof"と題する、２００６年１０月１１日出願の、Ablynx N. V. によるＵＳ仮出願６０／８５０，７７４を参照）、および／または条件付きのバインダーであるアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ"Nanobodies that bind to a desired molecule in a conditional manner"と題する、２００６年１０月１１日出願申請の、Ablynx N. V. によるＵＳ仮申請６０／８５０，７７５を参照）であってよい。
【０５３２】
もう一つの態様によれば、1以上の更なるアミノ酸配列は、通常の４鎖抗体（特に、ヒト抗体）および／もしくは重鎖抗体の1以上の部分、断片もしくは領域を含んでよい。例えば、通常はあまり好ましくはなくても、本発明のナノボディは、通常の（好ましくはヒト）ＶＨもしくはＶＬドメインに、またはＶＨもしくはＶＬドメインの天然もしくは合成の類似体に結合していてよく、先と同様に場合によってこの結合はリンカー配列（例えば限定されないが、他の（単）領域抗体、例えばＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されているｄＡｂ）を介する。
【０５３３】
少なくとも一つのナノボディは、1以上の（好ましくは、ヒト）ＣＨ１、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域に結合してもよく、場合によってこの結合はリンカー配列を介する。例えば、好適なＣＨ１領域に結合しているナノボディを、例えば、好適な軽鎖とともに使用すれば、通常のＦａｂ断片もしくはＦ（ａｂ'）２断片に類似の抗体断片／構造体を生成することができるが、ただし、通常のＶＨドメインの一つもしくは（Ｆ（ａｂ'）２断片の場合には）一つもしくは両方を本発明のナノボディによって置換しておく。さらに、二つのナノボディーズをＣＨ３領域に結合すれば（場合によって、リンカーを介して）、インビボでの半減期が増大した構造体が得られる。
【０５３４】
本発明のポリペプチドの一つの特異な態様によれば、本発明の1以上のナノボディーズは、本発明のポリペプチドに1以上のエフェクター機能を付与しおよび／もしくは1以上のＦｃ受容体に結合する能力を付与してもよい1以上の抗体部分、断片もしくは領域に結合していてよい。例えば、限定されないが、この目的のために、1以上の別のアミノ酸配列が、重鎖抗体（本明細書に記載）更に好ましくは通常のヒト４鎖抗体などから得た、抗体の1以上のＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域を有していてよく；および／または例えばＩｇＧ、ＩｇＥもしくは別のヒトＩｇから得たＦｃ領域およびその一部を形成してもよい。例えば、ＷＯ９４／０４６７８には、ラクダＶＨＨ領域もしくはそのヒト化誘導体（すなわち、ナノボディ）を有する重鎖抗体についての記載があるが、この抗体では、ラクダＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域をヒトＣＨ２およびＣＨ３領域に予め置換してナノボディならびにヒトＣＨ２およびＣＨ３領域を含む（ＣＨ１領域は含まない）二つの重鎖からなる免疫グロブリンが得られており、この免疫グロブリンにはそのＣＨ２およびＣＨ３領域により与えられるエフェクター機能があり、かつこの免疫グロブリンは軽鎖が存在しなくても機能することができる。本発明ナノボディーズに適切に結合することによってエフェクター機能を得ることができる他のアミノ酸配列は当業者にとって明らかであり、それらは所望のエフェクター機能に基づいて選択すればよい。例えば、ＷＯ０４／０５８８２０、ＷＯ９９／４２０７７およびＷＯ０５／０１７１４８、ならびにHollingerとHudsonらによる概説を参照。本発明のナノボディがFc部に結合すれば、本発明の対応するナノボディに比較して、半減期が増大する可能性がある。ある用途では、生物学的に有意なエフェクター機能が存在しなくても半減期を増加せしめるFc部分および／もしくは定常領域(すなわちＣＨ２およびＣＨ３領域)が使用されることが、好適もしくは更に好ましい。1以上のナノボディーズおよび1以上の定常領域を含みインビボの半減期が増大した他の好適な構造体は、当業者には明らかであり、例えば、ＣＨ３領域に場合によってリンカー配列を介して結合した二つのナノボディーズが挙げられる。一般に、半減期が増大した融合タンパク質もしくは誘導体の分子量は、腎吸収率のカットオフ値である５０ｋＤを超えることが好ましい。
【０５３５】
更なるアミノ酸配列には、本発明のナノボディもしくはポリペプチドが宿主細胞から分泌されるのを指示する信号配列もしくはリーダー配列が合成時に形成されてもよい（例えば、本発明のポリペプチドの形成は、本発明のポリペプチドを発現させるのに使用する宿主細胞に応じて前、後もしくは前後になる）。
【０５３６】
更なるアミノ酸配列には、本発明のナノボディもしくはポリペプチドを特定の器官、組織、細胞あるいは細胞の部分もしくは区画に指向させおよび／または浸透もしくは侵入させる、および／または本発明のナノボディもしくはポリペプチドに生物学的障壁、例えば細胞膜、細胞層、例えば上皮細胞層、腫瘍、例えば充実性腫瘍、もしくは血液脳関門を浸透もしくは横切らせる配列もしくは信号が形成されてもよい。このようなアミノ酸配列の好適な例は、当業者にとって明らかであり、例えば、限定されないが、上記の「ペプトランス（Peptrans）」ベクター、Cardinateらによって記載の配列、および、いわゆる「イントラボディーズ」として、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを発現もしくは産生させるのに使用できる自体公知のアミノ酸配列および抗体断片であって、例えばＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９５／２２６１８、ＵＳ−Ａ−６００４９４０、ＷＯ０３／０１４９６０、WO９９／０７４１４；ＷＯ０５／０１６９０；ＥＰ１５１２６９６；およびCattaneo, A.&.Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications, Lanes and Springer-Verlag; およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ３４，（２００４），１６３−１７０および本明細書に記載の更なる参考文献に記載のものがあげられる。
【０５３７】
ある用途、具体的には、本発明のナノボディーズが標的とするターゲットを発現する細胞を（例えばガンの治療で）殺滅すること、またはこのような細胞の成長および／もしくは増殖を低下もしくは減速させること、を意図する用途には、本発明のナノボディーズを（細胞）毒性のタンパク質もしくはポリペプチドに結合させてもよい。例えば、本発明のナノボディに結合させることによって本発明の細胞毒性ポリペプチドが得られるこのような毒性のタンパク質およびポリペプチドは、当業者にとって明らかであり、例えば、前述の先行技術におよび／または本明細の更なる記述に見ることができる。一つの例が、いわゆるＡＤＥＰＴ(登録商標）技術ＷＯ０３／０５５５２７である。
【０５３８】
一つの好ましいが限定されない実施形態によれば、前記1以上の更なるアミノ酸配列には、少なくとも一つの別のナノボディが含まれ、その結果少なくとも２個、例えば３個、４個、５個以上のナノボディーズが含まれる本発明のポリオペプチドが得られる。このポリペプチドにおいて、前記ナノボディーズは場合により1以上のリンカー配列を介して結合してよい（本明細書に定義）。二つ以上のナノボディーズを含み、その中の少なくとも一つは本発明のナノボディである本発明のポリペプチドは、本明細書において本発明の「多価」ポリペプチドと言い、このようなポリペプチドの形態で存在するナノボディーズを、本明細書では「多価フォーマット」と言う。例えば、本発明の「二価」ポリペプチドでは、二つのナノボディーズが含まれ場合によってリンカー配列を介して結合しており、本発明の「三価」ポリペプチドでは、三つのナノボディーズが含まれ場合によって２個のリンカー配列を介して結合しており、ここでポリペプチドに存在するナノボディーズの少なくとも一つ、およびポリペプチドに存在するナノボディーズのすべては、本発明のナノボディである。
【０５３９】
本発明の多価ペプチドでは、二つ以上のナノボディーズが同一であっても、異なっていてもよく、同一の抗原もしくは抗原決定基を標的としてよく（例えば、同一の部分もしくはエピトープあるいは異なる部分もしくはエピトープ対して）；あるいは異なる抗原もしくは抗原決定基、またはそれらの適切な任意の組合せを標的にしてよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドには、(a)二つの同一ナノボディーズ；（ｂ）タンパク質もしくは抗原の第一の抗原決定基を標的とする第一のナノボディおよび該タンパク質もしくは抗原の同じ抗原決定基を標的とするが第一のナノボディとは異なる第二のナノボディ；（ｃ）タンパク質もしくは抗原の第一の抗原決定基を標的とする第一のナノボディおよび該タンパク質もしくは抗原の別の抗原決定基を標的とする第二のナノボディ；あるいは（ｄ）第一のタンパク質もしくは抗原を標的とする第一のナノボディおよび第二のタンパク質および抗原を標的とする第二のナノボディ、が含まれる。同様に、本発明の三価ポリペプチドには、例えば、限定されないが、（ａ）三つの同一ナノボディーズ；（ｂ）抗原の第一の抗原決定基に対する二つの同一ナノボディ、および、同じ抗原の異なる抗原決定基を標的とする第三のナノボディ；（ｃ）抗原の第一の抗原決定基に対する二つの同一ナノボディ、および該第一の抗原とは異なる第二の抗原を標的とする台三のナノボディ；（ｄ）第一の抗原の第一の抗原決定基を標的とする第一のナノボディ、該第一の抗原の第二の抗原決定基を標的とする第二のナノボディ、該第一の抗原とは異なる第二の抗原を標的とする第三のナノボディ；あるいは（ｅ）第一の抗原を標的とする第一のナノボディ、該第一の抗原とは異なる第二の抗原を標的とする第二のナノボディ、および、該第一および第二の抗原とは異なる第三の抗原を標的とする第三のナノボディ、が含まれる。
【０５４０】
少なくとも二つのナノボディーズを含み、その中の少なくとも一つのナノボディは第一の抗原（すなわちIL-6）を標的とし、少なくとも一つのナノボディは第二の抗原（IL-6とは異なる）を標的とする本発明のポリペプチドは、本発明の「多特異性」ポリペプチドチと言い、このようなポリペプチド状態で存在するナノボディーズを、本明細書では、「多価フォーマット体」にあると言う。したがって、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第一の抗原（すなわちIL-6）を標的とする少なくとも一つのナノボディと、（IL-6とは異なる）第二の抗原を標的とする少なくとも一つの別のナノボディを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第一の抗原（すなわち、IL-6）を標的とする少なくとも一つのナノボディと（IL-6とは異なる）第二の抗原を標的とする少なくとも一つの別のナノボディと、（IL-6と第二の抗原の両方と異なる）第三の抗原を標的とする少なくとも一つの別のナノボディを含むポリペプチドである。
【０５４１】
したがって、最も単純な形態において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、IL-6を標的とする第一のナノボディと第二の抗原を標的とする第二のナノボディとを含む本発明の二価ポリペプチドであり(本明細書に定義)、ここで、該第一および第二のナノボディは場合によってはリンカー配列(本明細書に定義)を介して結合されてよく、他方、本発明の三重特異性ポリペプチドは、最も単純な形態において、IL-6を標的とする第一のナノボディと第二の抗原を標的とする第二のナノボディと第三の抗原を標的とする第三のナノボディを含む本発明の三価ポリペプチドであり(本明細書に定義)、ここで、該第一、第二および第三のナノボディは場合によっては１以上、特に２個のリンカー配列を介して結合されてよい。
【０５４２】
しかし、上記記述から明らかなように、本発明の多重特異性ポリペプチドにはIL-6に対する少なくとも一つのナノボディとIL-6とは異なる1以上の抗原を標的とする任意の数のナノボディーズとが含まれてもよいという意味で、本発明は上記記述には限定されない。
【０５４３】
更に、本発明のポリペプチドにおける各種ナノボディーズの特定の順序もしくは配列が本発明の最終ポリペプチドの特性（例えば、限定されないが、IL-6もしくは1以上の他の抗原に対する親和性、特異性もしくは結合力）に多少影響する可能性があるということは本発明の範囲内に包含されているが、この順序もしくは配置は通常はさほど重要ではなく、当業者は本明細書の開示に基づき限られた日常的実験を行って適宜に選択すればよい。したがって、本発明の多価もしくは多重特異性ポリペプチドを参照する際には、特に明示的に記載されていない限り、その参照が関連するナノボディーズの任意の順序もしくは配置を包含しているかに留意するのが望ましい。
【０５４４】
最後に、本発明のポリペプチドが２以上のナノボディーズと1以上の別のアミノ酸配列とを含むということも本発明の範囲内である(本明細書に記載)。
【０５４５】
1以上のＶＨＨドメイン含む多価および多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製に関しては、Contrath et al., J. Biol, Chem., Vol.276, 10, 7346-7350, 2001、ならびに例えば、ＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１が参照される。本発明のある特定の多重特異的および／または多価のポリペプチドの他の例は、本明細書に引用した、ABLYNX N.V.による出願書類に見られる。
【０５４６】
本発明の多重特異性ポリペプチドの一つの好ましいが限定されない例は、本発明の少なくとも一つのナノボディと半減期を増大させる少なくとも一つのナノボディを含む。このようなナノボディーズの好ましいが限定されない例には、血清蛋白質、例えばヒト血清アルブミン、チロキシン結合性タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、例えばIgG、IgEもしくはIgM、またはＷＯ０４／００３０１９に列挙されている他の血清タンパク質の一つ、を標的とするナノボディーズがあげられる。それらナノボディーズの中で、血清アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）にもしくはIgG(特に、ヒトIgG、例えば、Muyldermansらによる概説に記載されているナノボディVH-1を参照)に結合可能なナノボディーズが特に好ましい（ただし、例えば、マウスもしくは霊長類での実験用には、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）もしくは前記霊長類由来の血清アルブミンに対するもしくは交差反応するナノボディーズが使用できる。しかし、医薬用途には、ヒト血清アルブミンもしくはヒトIgGに対するナノボディーズが通常は好ましい）。半減期を増大させ、かつ本発明のポリペプチドにおいて使用可能なナノボディーズには、例えばＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０６／１２２７８７に、および上記のAblynx N. V.による別の特許出願書類に記載されている血清アルブミンを標的とするナノボディーズが挙げられる。
【０５４７】
例えば、マウスの実験では、マウス血清アルブミンに対するナノボディーズが使用可能であるが、医薬用途では、ヒト血清アルブミンに対するナノボディーズが使用できる。
【０５４８】
例えば、半減期を増大させることが可能で本発明で使用するのに好ましいナノボディーズには、例えば、（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基であって血清アルブミンがFcRnに結合することに関与しないアミノ酸残基に結合可能なナノボディーズ（例えば、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照）；血清アルブミン上のアミノ酸残基であって、血清アルブミンの領域ＩＩＩの一部を形成しないアミノ酸残基に結合可能なナノボディーズ（例えば、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照）；半減期が増大しているか増大可能なナノボディーズ（例えば、本明細書に記載の、Ablynx N.V.によるＵＳ仮出願６０／８４３，３４９を参照）；少なくとも一種の哺乳動物、特に少なくとも一種の霊長類(例えば、限定されないが、キツネザル属のサル（例えば、特にキツネザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／もしくはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）およびヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ）に由来する血清アルブミンと交差反応するヒト血清アルブミンに対するナノボディーズ（例えば、Ablynx N.V.によるＵＳ仮出願６０／８４３，３４９を参照）；ｐＨに依存せずに血清アルブミンに結合可能なナノボディーズ（例えば、本明細書に記載の、Ablynx N.V.によるＵＳ仮出願６０／８５０，７７４を参照）；および／または条件付きのバインダーであるナノボディーズ（例えば、Ablynx N.V.によるＵＳ仮出願６０／８５０，７７５を参照）が挙げられる。
【０５４９】
半減期の増大を可能にし、本発明のポリペプチドで使用可能な特に好ましいナノボディーズには、例えば、ＷＯ０６／１２２７８７（表ＩＩおよびＩＩＩを参照）に開示されているナノボディーズＡＬＢ−１〜ＡＬＢ−１０が挙げられ、それらの中でALB-8（ＷＯ０６／１２２７８７での配列番号：６２）が特に好ましい。
【０５５０】
本発明のもう一つの実施形態は、上記のポリペプチド構造体であり、その構造体において前記少なくとも一つの（ヒト）血清タンパク質は、（ヒト）血清アルブミン、（ヒト）血清免疫グロブリン、（ヒト）チロキシン結合性タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、（ヒト）フィブリノーゲンなどのいずれか一つである。
【０５５１】
本発明の特定の限定されない態様によれば、本発明のポリペプチドには、本発明の1以上のナノボディーズに加えて、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも一つのナノボディが含まれる。ヒト血清アルブミンに対するこのようなナノボディーズは、上に引用した出願者が出願書類に一般的に記載した（例えば、ＷＯ０４／０６２５５１を参照）とおりでよいが、特に好ましいが限定されない実施形態によれば、ヒト血清アルブミンに対する前記ナノボディは、４個の枠組み領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（CDR1〜CDR3）とからなっており、ここで、
ｉ）  CDR1は、以下、
SFGMS [配列番号: 140]
LNLMG [配列番号: 141]
INLLG [配列番号: 142]
NYWMY; [配列番号: 143] 
からなる群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つと２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」を有するアミノ酸配列からなり（本明細書に記載）、ここで、
（１）  アミノ酸置換があった場合には、保存的アミノ酸置換であることが好ましく（本明細書に定義）、および／または
（２）  前記アミノ酸配列が、好ましくは上記アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
選択されるアミノ酸配列であり、
ここで、
ｉｉ）  CDR2は、以下、
SISGSGSDTLYADSVKG [配列番号: 144]
TITVGDSTNYADSVKG [配列番号: 145]
TITVGDSTSYADSVKG [配列番号: 146] 
SINGRGDDTRYADSVKG [配列番号: 147]
AISADSSTKNYADSVKG [配列番号: 148]
AISADSSDKRYADSVKG [配列番号: 149]
RISTGGGYSYYADSVKG [配列番号: 150]
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
（１）  アミノ酸置換があった場合には、保存的アミノ酸置換であることが好ましく（本明細書に定義）、および／または
（２）  前記アミノ酸配列は、好ましくは上記アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つと２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」を有するアミノ酸配列からなり（本明細書に記載）、ここで、
（１）  アミノ酸置換があった場合には、保存的アミノ酸置換であることが好ましく（本明細書に定義）、および／または
（２）  前記アミノ酸配列は、好ましくは上記アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から、
選択されるアミノ酸配列であり、ここで、
ｉｉｉ）  CDR3は、以下、
DREAQVDTLDFDY [配列番号: 151] 
からなる群から；
あるいは、上記アミノ酸配列の一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは９５％、更により好ましくは９９％の配列同一性を有しているアミノ酸配列からなり、ここで、
（１）アミノ酸置換があった場合には、保存的アミノ酸置換であることが好ましく（本明細書に定義）、および／または
（２）前記アミノ酸配列は、好ましくは上記アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つと２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」を有するアミノ酸配列からなり（本明細書に記載）、ここで、
（１）アミノ酸置換があった場合には、保存的アミノ酸置換であることが好ましく（本明細書に定義）、および／または
（２）前記アミノ酸配列は、好ましくは上記アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換のみを含んみ、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
あるいは、以下：
GGSLSR [配列番号: 152]
RRTWHSEL [配列番号: 153]
GRSVSRS [配列番号: 154]
GRGSP [配列番号: 155] 
からなる群から；
および／あるいは、上記アミノ酸配列の一つと3個、２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書に記載）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
（１）アミノ酸置換があった場合には、保存的アミノ酸置換であることが好ましく（本明細書に定義）、および／または
（２）前記アミノ酸配列が、好ましくは上記アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；
選択されるアミノ酸配列である。
【０５５２】
別の態様において、本発明は、４個の枠組み構成領域（それぞれFR1〜FR4）と３個の相補性決定領域（それぞれCDR1〜CDR3）からなる、ヒト血清アルブミンに対するナノボディであって、それぞれ以下のCDR1、CDR2及びCDR3の組合せの１つを有するナノボディーズからなる群より選択されるナノボディに関する：
・CDR1：SFGMS；CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG；CDR3：GGSLSR；
・CDR1：LNLMG；CDR2：TITVGDSTNYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
・CDR1：INLLG；CDR2：TITVGDSTSYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；
・CDR1：SFGMS；CDR2：SINGRGDDTRYADSVKG；CDR3：GRSVSRS；
・CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
・CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；
・CDR1：NYWMY；CDR2：RISTGGGYSYYADSVKG；CDR3：DREAQVDTLDFDY。
【０５５３】
上記CDRの組合せを含む本発明のナノボディーズにおいて、各CDRは、以下のCDR：すなわち、
上記CDRと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも ９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書に定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
（１）任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書に定義）であり、および／または
（２）前記アミノ酸配列は、上記アミノ酸配列と比較して好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；選択され、
および／あるいは、上記CDRの上記アミノ酸配列の一つと（前の段落で示したように）３個、２個もしくは１個のみの「アミノ酸相違」（本明細書に定義）を有するアミノ酸配列からなり、ここで、
（１）任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書に定義）であり；および／または
（２）前記アミノ酸配列は、上記アミノ酸配列と比較して好ましくはアミノ酸置換のみを含み、アミノ酸の削除もしくは挿入を含まない、群から；選択されるCDR、によって置き換えることができる。
【０５５４】
しかしながら、上記CDRの組合せを含む本発明のナノボディーズでは、１以上の上記CDRを含むナノボディーズが特に好ましく；２以上の上記CDRを含むナノボディーズが更に好ましく；かつ３個の上記CDRを含むナノボディーズが最も好ましい。
【０５５５】
ヒト血清アルブミンに対するこれらナノボディーズにおいて、枠組み構成領域FR1〜FR4は、好ましくは本発明のナノボディーズについて上で定義したとおりである。
【０５５６】
ヒト血清アルブミンを標的とする、本発明のポリペプチドで使用可能ないくつかの非限定的な好ましいナノボディーズの例を下の表Ａ−９に記載する。ALB-8は、ヒト化バージョンのALB-Iである。
【０５５７】
表Ａ−９：アルブミン結合性ナノボディーズの好ましい非限定的な例
【表２５】
2009529339.tif 000034
【０５５８】
一般的に、半減期が増大した本発明の誘導体および／またはポリペプチドはいずれも（例えば、本発明のPEG化ナノボディーズまたはポリペプチド、IL-6と（ヒト）血清アルブミンを標的とする多重特異性のナノボディーズ、またはFcタンパク質に融合したナノボディーズ、すべて本明細書で述べたとおり）、本発明の対応するナノボディ自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍長い半減期を有する。例えば、半減期が増加したそのような誘導体又はポリペプチドの半減期は、対応する本発明のナノボディ自体と比較して、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、更に好ましくは６時間を越えて、例えば１２時間を越えて、または２４、４８もしくは７２時間を越えて増加してもよい。
【０５５９】
非限定的な好ましい本発明の態様において、そのような誘導体またはポリペプチドは、 少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも約２４時間、更に好ましくは少なくとも約４８時間、より一層好ましくは少なくとも約７２時間以上のヒトでの血清中半減期を示してもよい。例えば、本発明のそのような誘導体またはポリペプチドの半減期は、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、更に好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、または、少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、更に好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日を超え（例えば約１４〜１９日）てよい。
【０５６０】
本発明の１つの態様によれば、該ポリペプチドは、生体内においてポリペプチドの半減期を増加可能な１以上の分子に結合することができる。
【０５６１】
本発明のポリペプチドは生体内で安定であり、分解および／または切断または分離に耐える分子に結合することによって、その半減期が増す。典型的に、このような分子は天然に存在するタンパク質であり、それ自体長い生体内半減期を有する。
【０５６２】
半減期は、一般的にポリペプチドの血清濃度が、例えば、自然のメカニズムによるリガンドの分解および／またはリガンドの切断もしくは分離によって、生体内で５０％まで減少するのにかかる時間として定義することができる。半減期の薬物動態学的解析方法および決定方法は、当業者に知られている。詳細はKenneth, Aら、Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacist；およびPetersら、Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)で見つけ得る。Marcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition (1982)により出版された"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perronも参照されたい。
【０５６３】
本発明の１つの態様によれば、該ポリペプチドは、生体内においてポリペプチドの半減期を増加可能な１以上の分子に結合することができる。
【０５６４】
本発明のポリペプチドは生体内で安定であり、分解および／または切断または分離に耐える分子に結合することによって、その半減期が増す。典型的に、このような分子は天然に存在するタンパク質であり、それ自体長い生体内半減期を有する。
【０５６５】
本発明の多重特異性ポリペプチドの別の非限定的な好ましい例は、少なくとも一つの本発明のナノボディと、本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、または細胞の一部もしくは区画に方向づけ、および／あるいは本発明のポリペプチドが特定の器官、組織、細胞、または細胞の部分もしくは区画に浸透または侵入を可能とし、および／あるいはナノボディが細胞膜等の生物学的障害、上皮細胞層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、または血液脳関門を浸透または通過することを可能にする、少なくとも一つのナノボディを含む。このようなナノボディーズの例としては、所望の器官、組織もしくは細胞の特定の細胞表面タンパク質、マーカーまたはエピトープ（例えば腫瘍細胞関連細胞表面マーカー）に対するナノボディーズ、および国際公開第０２／０５７４４号パンフレット記載の脳の単一領域を標的とする抗体断片が挙げられ、この中でFC44（配列番号１６０）とFC5（配列番号１６１）が好ましい例である。
【０５６６】
表Ａ−１０：FC44およびFC5の配列表
【表２６】
2009529339.tif 000035
【０５６７】
本発明のポリペプチドでは、１以上のナノボディーズおよび１以上のポリペプチドが互いに直接連結してよく（例えば、国際公開第９９／２３２２１号パンフレットに記載）、および／あるいは１以上の適切なスペーサーもしくはリンカー、またはこれらいずれかの組合せを介して互いに連結し得る。
【０５６８】
多価および多重特異ポリペプチドで用いる適切なスペーサーもしくはリンカーは当業者に明らかであり、一般的に、当技術分野でアミノ酸配列を連結するために用いられるどのリンカーもしくはスペーサーでもよい。好ましくは、前記リンカーもしくはスペーサーは、医薬用途を目的したタンパク質またはポリペプチドの構築における使用に適する。
【０５６９】
特に好ましいスペーサーとしては、抗体断片または抗体領域を連結するために当技術分野で用いられるスペーサーもしくはリンカーが挙げられる。これには、上述の一般的な背景技術で言及したリンカーに加えて、例えば二重特異性抗体またはScFv断片を構築するために当技術分野で用いられるリンカーが挙げられる（しかし、この点に関して、二重特異性抗体およびScFv断片では、使用するリンカーが、隣接するVHおよびVL領域が一緒になって完全な抗原結合部位を形成できるような長さ、柔軟度および他の特性を持たなければならないが、本発明のポリペプチドで使用するリンカーの長さまたは柔軟性には、各ナノボディが単独で完全な抗原結合部位を形成するので、何ら特定の制限がないことに注意すべきである）。
【０５７０】
例えば、リンカーは適切なアミノ酸配列、特に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、例えば１〜１０アミノ酸残基のアミノ酸配列でよい。このようなアミノ酸配列のいくつかの好ましい例として、gly-serリンカー、例えば(glyxsery)z型、例えば国際公開第９９／４２０７７号パンフレットに記載されているような(gly4ser)3または(gly3ser2)3、ヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または同様の配列（例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットに記載されている当該配列）が挙げられる。
【０５７１】
他の特に好ましいリンカーとしては、ポリアラニン（例えばAAA）、加えて、表Ａ−１１で言及するリンカーが挙げられ、AAA、GS-7およびGS9が特に好ましい。
【０５７２】
表Ａ−１１：リンカーの配列表
【表２７】
2009529339.tif 000036
【０５７３】
他の適切なリンカーとしては、一般的に有機化合物またはポリマー、特に医薬用途のタンパク質での使用に適したものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分を用いて抗体領域を連結している。例えば、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレットを参照されたい。
【０５７４】
使用するリンカーの長さ、柔軟度および／または他の特性（ScFv断片で用いるリンカーでは通常重要ではあるが、ここでは重要ではない）が、本発明の最終ポリペプチドの特性、例えば、IL-6または１以上の他の抗原に対する親和性、特異性もしくは結合力に何らかの影響を及ぼし得ることは本発明の範囲に包含されるが、限定するものではない。当業者は、本明細書の開示に基づき、場合により限られた日常的実験をして、本発明特有のポリペプチドで用いる最適なリンカーを決定することができる。
【０５７５】
例えば、多量体抗原（例えば多量体の受容体または他のタンパク質）を標的とするナノボディーズを含む本発明の多価ポリペプチドでは、リンカーの長さと柔軟性は、好ましくは該ポリペプチド中に存在する本発明の各ナノボディが該多量体の各サブユニット上の抗原決定基に結合できるようにするようなものである。同様に、同じ抗原上の２以上の異なる抗原決定基に対する（例えば抗原の異なるエピトープに対する、および／または多量体受容体、チャネルもしくはタンパク質の異なるサブユニットに対する）ナノボディーズを含む本発明の多重特異性ポリペプチドでは、該リンカーの長さと柔軟性は、好ましくは各ナノボディが意図した抗原決定基に結合できるようにするものである。この場合も、当業者は、本明細書の開示に基づき、場合により有限の日常的実験をして、本発明特有のポリペプチドで用いる最適なリンカーを決定することができる。
【０５７６】
使用するリンカーが、本発明のポリペプチドに１以上の他の有利な特性または機能性を与え、ならびに／または誘導体形成用および／もしくは官能基付着用の１以上の部位を提供する（例えば、本発明のナノボディーズの誘導体について本明細書で述べたとおり）ことも、本発明の範囲内である。例えば、１以上の荷電アミノ酸残基（上記の表Ａ−２を参照）を含むリンカーは、親水特性を改良することができ、一方、小さいエピトープまたはタグを形成するまたは含むリンカーは、検出、同定および／または精製の目的で使用できる。この場合も、当業者は、本明細書の開示に基づき、場合により有限の日常的実験をして、本発明特有のポリペプチドで用いる最適なリンカーを決定することができる。
【０５７７】
最後に、本発明のポリペプチドで２以上のリンカーを用いる場合、これらのリンカーは同一でも異なっていてもよい。この場合も、当業者は、本明細書の開示に基づき、場合により有限のルーチン実験後に、本発明特有のポリペプチドで用いる最適なリンカーを決定することができる。
【０５７８】
通常、発現および生産を容易にするため、本発明のポリペプチドは直線状ポリペプチドである。しかし、そのもっとも広い意味において、本発明はこれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３以上のナノボディーズを含む場合、３以上の「腕」を持つリンカーを用いてそれらを連結することが可能で、ここでは各「腕」をナノボディに連結して「星形」構築体を提供することができる。通常あまり好ましくないが、環状構築体を使うこともできる。
【０５７９】
本発明は、本発明のナノボディーズの誘導体と本質的に類似し得る、すなわち本明細書で述べるような、本発明のポリペプチドの誘導体をも含む。
【０５８０】
本発明は、本発明のポリペプチドから「本質的にからなる」タンパク質またはポリペプチドをも含む（ここで、「本質的に〜からなる」という表現は、上述した意味と本質的に同じ意味を有する）。
【０５８１】
本発明の１つの実施態様によると、本発明のポリペプチドは、本明細書に定義のごとく、本質的に単離された形態である。
【０５８２】
本明細書の更なる説明から当業者には明であるように、それ自体既知の方法で、本発明のアミノ酸配列および／またはナノボディーズ、ポリペプチドならびに核酸を調製することができる。例えば、抗体の調製、特に抗体断片（限定するものではないが、（単一）領域抗体およびScFv断片を含む））の調製のためのそれ自体既知のいずれの方法で、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドを調製することができる。アミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ、ポリペプチドおよび核酸のいくつかの非限定的な好ましい調製方法としては、本明細書記載の方法と技術が挙げられる。
【０５８３】
当業者には明であるように、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディおよび／もしくはポリペプチドの調製に特に有用な方法の１つは、一般的に以下の工程を含む：・本発明の前記アミノ酸配列および／もしくはナノボディまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも称する）を、適切な宿主細胞または宿主生物（本明細書では「本発明の宿主」とも称する）内、または別の適切な発現系内での発現する工程、場合により、その後：
・このようにして得られた本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチドを単離および／もしくは精製する工程。
【０５８４】
特に、このような方法は、以下の工程を含み得る：
・本発明の宿主が、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディおよび／もしくはペプチドの少なくとも一つを発現および／もしくは産生するような条件下で、前記宿主を培養および／もしくは維持する工程；場合により、その後
・このようにして得られた本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチドを単離および／もしくは精製する工程。
【０５８５】
本発明の核酸は、一本鎖のもしくは二本鎖DNAまたはRNAの形態が可能で、好ましくは二本鎖DNAの形態であり得る。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA（例えば、意図した宿主細胞または宿主生物内で発現するように特に適応させたコドン使用を有するDNA）でよい。
【０５８６】
本発明の１つの実施態様によると、本発明の核酸は、本明細書に定義のように、本質的に単離された形態である。
【０５８７】
本発明の核酸は、本明細書においては、例えばプラスミド、コスミド、またはYACのようなベクターの形態、ベクターに存在する、またはベクターの一部でもよく、これらは、本質的に単離された形態であり得る。
【０５８８】
本発明の核酸は、本明細書で提供される本発明のポリペプチドのアミノ酸配列についての情報に基づき、それ自体既知の方法で調製するまたは得ることができ、および／または適切な天然源から単離することができる。類似体を提供するため、例えば、天然に存在するVHH領域をコードするヌクレオチド配列を部位特異的変異誘発に供して、前記類似体をコードする本発明の核酸を提供することができる。また、当業者には明らかなように、本発明の核酸を調製するため、いくつかのヌクレオチド配列、例えばナノボディをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列と例えば１以上のリンカーをコードする核酸を適切な方法で一緒に連結することができる。
【０５８９】
本発明の核酸の作成技術は当業者には明らかであるし、限定するものではないが、例えば、DNA自動合成；部位特異的変異誘発；２以上の天然に存在する配列および／または合成配列（またはその２以上の部分）の組合せ；切り詰められた（truncated）発現産物の発現をもたらす変異の導入；１以上の制限部位の導入（例えば、適切な制限酵素を用いて容易に消化および／または連結されるカセットおよび／または領域を作成するため）、および／または１以上の「ミスマッチ」プライマーを用いる、例えば鋳型として天然に存在するGPCRの配列を用いる、PCR反応を利用した変異の導入が挙げられる。これらの技術および他の技術は当業者には明白であるし、この場合もやはり、標準的なハンドブック、例えば上述したSambrookらおよびAusubelら、加えて以下の実施例を参照されたい。
【０５９０】
当業者には明らかなように、本発明の核酸は、遺伝子構築物の形態でもよいし、遺伝子構築物内に存在してもよいおよび／もしくは遺伝的構築物の一部として存在してもよい。このような遺伝子構築物は、一般的に、場合により例えば１以上の適切な調節エレメント（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）等のそれ自体既知の遺伝子構築物の１以上のエレメントに連結される、少なくとも一つの本発明の核酸と、本明細書で言及する遺伝子構築物の更なるエレメントを含む。本明細書では、このような少なくとも一つの本発明の核酸を含む遺伝子構築物を「本発明の遺伝子構築物」とも称する。
【０５９１】
本発明の遺伝子構築物はDNAまたはRNAでよく、好ましくは二本鎖DNAである。本発明の遺伝子構築物は、意図した宿主細胞または宿主生物の形質転換に適した形態、意図した宿主細胞のゲノムDNA中への組込みに適した形態あるいは意図した宿主生物における非依存的な複製、維持および／または遺伝に適した形態でもよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクターまたはトランスポゾンの形態でよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち生体外および／もしくは生体内発現（例えば適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系内で）を与え得るベクターでよい。
【０５９２】
非限定的な好ましい実施態様では、本発明の遺伝子構築物は以下：
ａ）操作可能となるように連結されている、少なくとも一つの本発明の核酸；
ｂ）１以上の調節エレメント、例えばプロモーターおよび場合により適切なターミネーター；を含み、場合により、
ｃ）それ自体既知の、遺伝子構築物の１以上の更なるエレメント；
を含んでもよく、ここで、用語「調節エレメント」、「プロモーター」「ターミネーター」および「操作可能となるように連結している」は、それらの当技術分野で通常の意味を有し（更に本明細書で述べるとおり）；ならびに遺伝子構築物に存在し得る前記「更なるエレメント」は、例えば３'もしくは５'非翻訳領域配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、および／または形質転換もしくは組込み（の効率）を促進または高めうるエレメントでよい。このような遺伝子構築物に好適なこれらのエレメントおよび他のエレメントは、当業者には明らかであるし、例えば、使用する構築物のタイプ、意図した宿主細胞もしくは宿主生物；問題の本発明のヌクレオチド配列を発現させる様式（例えば、構成的発現、一過性発現または誘導発現を通じて）；および／または使用する形質転換技術による。例えば、抗体および抗体断片（限定するものではないが、（単一）領域抗体およびScFv断片を含む）の発現および産生用のそれ自体既知の調節配列、プロモーターおよびターミネーターは、本質的に類似の方法で使用し得る。
【０５９３】
好ましくは、本発明の遺伝的構築物では、前記少なくとも一つの本発明の核酸および前記調節エレメント、および場合によって前記１以上の更に別のエレメントは、互いに「操作可能となるように連結」されており、この用語は、一般的にそれら核酸およびエレメントが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写および／または発現を開始あるいは制御／調節することができるならば、前記プロモーターはコード配列と「操作可能となるように連結されている」と考えられる（この場合、前記コード配列は前記プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）。一般的には、２個のヌクレオチド配列が操作可能となるように連結されている場合、それらは同じ向きであり、通常は同じ読み枠内にもある。それらは、通常は本質的に隣接しているが、このことが必要でないこともある。
【０５９４】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節的な別の要素は、意図した宿主細胞または宿主生物内でそれらが意図する生物学的機能を与えうるようなものである。
【０５９５】
例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、意図した宿主細胞または宿主生物内で「操作可能」でなければならない。これは、（例えば）前記プロモーターが、操作可能となるように連結されている（本明細書に定義）ヌクレオチド配列（例えばコード配列）の転写および／もしくは発現を開始さもなければ制御／調節できなければならない。
【０５９６】
いくつかの特に好ましいプロモーターとして、本明細書で述べる宿主細胞内の発現用としてそれ自体既知のプロモーター；並びに特に細菌細胞、例えば本明細書で述べる細菌細胞および／もしくは実施例で使用する細菌細胞内での発現用ベクターが挙げられるが、限定するものではない。
【０５９７】
選択マーカーは、本発明のヌクレオチド配列で（うまく）形質転換された宿主細胞および／または宿主生物を、（うまく）形質転換されなかった宿主細胞／生物と区別できる、すなわち適切な選択条件下で区別できるようなものでなければならない。このようなマーカーのいくつかの非限定的な好ましい例としては、抗生物質（例えばカナマイシンまたはアンピシリン）に対する耐性を与える遺伝子、温度耐性を与える遺伝子、あるいは、非形質転換の細胞または生物の生存に必須である培地中の特定の因子、化合物および／または（食物）成分の非存在下で、宿主細胞または宿主生物を維持できるようにする遺伝子が挙げられる。
【０５９８】
リーダー配列は、意図した宿主細胞または宿主生物内で、所望の翻訳後修飾を可能にし、および／または転写されたmRNAを細胞の所望の部分もしくは器官に方向づけるようなものでなければならない。リーダー配列は、前記細胞からの発現産物の分泌をも可能にもし得る。それ自体では、リーダー配列は、宿主細胞または宿主生物内で操作可能ないずれのプロ配列、プレ配列、もしくはプレプロ配列でもよい。リーダー配列は、細菌細胞内での発現には必要でないこともある。例えば、抗体および抗体断片（単一領域抗体およびScFv断片を含むが、限定されるものではない）の発現および産生用のそれ自体既知のリーダー配列は、本質的に類似した方法で使用し得る。
【０５９９】
発現マーカーまたはレポーター遺伝子は、宿主細胞または宿主生物内で、該遺伝子構築物（存在する遺伝子またはヌクレオチド配列）の発現の検出ができるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合により、例えば細胞の特定の部分もしくは器官および／または多細胞生物の特定の細胞、組織、器官もしくは部分への発現産物の局所化を可能にしてもよい。このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列との融合タンパク質として発現されることもある。いくつかの非限定的な好ましい例としてGFPのような蛍光タンパク質が挙げられる。
【０６００】
適切なプロモーター、ターミネーターおよび更なるエレメントのいくつかの非限定的な好ましい例としては、本明細書で述べる宿主細胞内での発現に使用できるもの；特に細菌細胞、例えば本明細書で述べる発現細菌細胞および／もしくは後述する実施例で使用する発現細菌細胞に好適なものが挙げられる。プロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカーおよび本発明の遺伝子構築物で存在／使用し得る更なるエレメント、例えばターミネーター、転写および／もしくは翻訳のエンハンサーならびに／もしくは組込み因子のいくつかの（更なる）非限定的な好ましい例については、上述したSambrookらおよびAusubelらのような一般的なハンドブック、加えて国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９６／２３８１０号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９５／２１１９１号パンフレット、国際公開第９７／１１０９４号パンフレット、国際公開第９７／４２３２０号パンフレット、国際公開第９８／０６７３７号パンフレット、国際公開第９８／２１３５５号パンフレット、米国特許第６２０７４１０（Ａ）号明細書、米国特許第５６９３４９２（Ａ）号明細書および欧州特許第１０８５０８９号明細書にある例を参照されたいが、限定されるものではない。他の例は当業者には明白である。上述の一般的な背景技術および本明細書で引用した更なる参考文献も参照されたい
【０６０１】
本発明の遺伝子構築物は、一般的に、本発明のヌクレオチド配列を上述した１以上の更なるエレメントに、例えば上述したSambrookらおよびAusubelらのような一般的なハンドブックに記載されている技術を用いて、適切に連結することによって提供される。
【０６０２】
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、それ自体既知の適切な（発現）ベクター内に本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって得られる。適切な発現ベクターのいくつかの非限定的な好ましい例は、後述する実施例で使用するもの、加えて本明細書で言及するものである。
【０６０３】
本発明の核酸および／もしくは本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞もしくは宿主生物の形質転換に使用し得る。すなわち、本発明のナノボディもしくはポリペプチドの発現および／もしくは生産のために使用し得る。適切な宿主もしくは宿主細胞は当業者には明らかだろうし、例えば、いずれの適切な真菌細胞、原核細胞もしくは真核細胞または細胞系でもよく、あるいはいずれの適切な真菌生物、原核生物もしくは真核生物でもよい。例えば：・細菌株、限定するものではないが、グラム陰性菌株、例えば大腸菌、プロテウス属、例えばプロテウス・ミラビリス（mirabilis）；シュードモナス属、例えば蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）の株；およびグラム陽性菌株、例えばバシラス属、例えば枯草菌もしくはブレビス菌の株；ストレプトマイセス属、例えばストレプトマイセス・リビダンス（lividans）の株；スタフィロコッカス属、例えばスタフィロコッカス・カルノーサス（carnosus）の株；およびラクトコッカス属、例えばラクトコッカス・ラクチスの株が挙げられる；
・真菌細胞、限定するものではないが、トリコデルマ属、例えばトリコデルマ・レエセイ（reesei）；パンカビ属、例えばアカパンカビ（Neurospora crassa）；ソルダリア属、例えばソルダリア・マクロスポラ（macrospora）；アスペルギルス属、例えばアスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルスソーヤ；または他の糸状菌の種由来の細胞が挙げられる；
・酵母菌細胞、限定するものではないが、サッカロマイセス属、例えばサッカロマイセス・セレビシエ；スキゾサッカロミセス属、例えばスキゾサッカロミセス・ポンベ；ピキア属、例えばピキア・パストリスまたはピキア・メタノリカ（methanolica）；ハンセヌラ属（Hansenula）、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（polymorpha）；クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、例えばクルイベロミセス・ラクチス；アルクスラ属（Arxula）、例えばアルクスラ・アデニニボランス（adeninivorans）；ヤロウイア属（Yarrowia）、例えばヤロウイア・リポリチカ（lipolytica）の種由来の細胞が挙げられる；
・両生類の細胞または細胞系、例えばアフリカツメガエル卵母細胞；
・昆虫由来の細胞または細胞系、例えば鱗翅目由来の細胞／細胞系、限定するものではないが、スポドプテラSF9およびSf21細胞またはショウジョウバエ由来の細胞／細胞系、例えばシュナイダーおよびKc細胞が挙げられる；
・植物または植物細胞、例えばタバコの細胞；ならびに／あるいは
・哺乳類の細胞または細胞系、例えばヒト由来、哺乳類由来の細胞または細胞系、限定するものではないが、CHO細胞、BHK細胞（例えばBHK-21細胞）およびヒトの細胞または細胞系、例えばHeLa、COS（例えばCOS-7）およびPER.C6細胞；
加えて、当業者には明らかなように、抗体および抗体断片（限定するものではないが、（単一）領域抗体およびScFv断片が挙げられる）の発現および生産用としてそれ自体既知の他のすべての宿主または宿主細胞が挙げられるが。上で引用した一般的な背景技術、並びに、例えば国際公報第９４／２９４５７号パンフレット；国際公報第９６／３４１０３号パンフレット；国際公報第９９／４２０７７号パンフレット；Frenkenら、（１９９８）（前出）；RiechmannおよびMuyldermans、（１９９９）（前出）；van der Linden、（２０００）（前出）；Thomassenら、（２００２）（前出）；Joostenら、（２００３）（前出）；Joostenら、（２００５）（前出）；および本明細書で引用する更なる参考文献も参照されたい。
【０６０４】
例えば、予防および／もしくは治療の目的（例えば遺伝子療として）のために、１以上の多細胞生物、組織または器官内に本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドを導入し、発現することもできる。この目的のため、本発明のヌクレオチド配列を、いずれの適切な手段によって、例えば、それ自体（例えばリポソームを用いて）またはそれらを適切な遺伝子療法用ベクター（例えばアデノウイルスのようなレトロウイルス由来、またはアデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス由来）中に挿入後、細胞または組織中に導入し得る。やはり当業者には明らかなように、このような遺伝子療法は、本発明の核酸または本発明の核酸をコードする適切な遺伝子療法用ベクターを患者あるいは患者の特異的な細胞または特異的な組織もしくは器官に投与することによって、患者の体内でインビボおよび／もしくはインジッツで行われ；あるいは適切な細胞（多くの場合、治療すべき患者の体から採取、例えば体外に移植した（explanted）リンパ球、骨髄穿刺液または組織バイオプシー）を本発明のヌクレオチド配列により生体外で処理してから、適宜患者の体内に（再）導入することができる。これはすべて当業者に周知の遺伝子療法用のベクター、技術およびデリバリーシステム、例えばCulver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y). Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539；Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919；Anderson, Science 256 (1992), 808-813；Verma, Nature 389 (1994), 239；Isner, Lancet 348 (1996), 370-374；Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086；Onodera, Blood 91; (1998), 30-36；Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699；Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 (1997), 289-292；Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51；Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；国際公開第９４／２９４６９号パンフレット；国際公開第９７／００９５７号パンフレット；米国特許第５５８０８５９号明細書；米国特許第５５８９５４６６号明細書；またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640を用いて行うことが可能である。例えば、ScFv 断片 (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) およびダイアボディーズ (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003))のインジッツの発現は当技術分野で記述されている。
【０６０５】
ナノボディーズを細胞で発現させるために、いわゆるまたはいわゆる「細胞内抗体」として発現してもよく、例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット、国際公開第９５／２２６１８号パンフレット および米国特許第６００４９４０（Ａ）号明細書；国際公開第０３／０１４９６０号パンフレット；Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag；およびKontermann, Methods 34, (2004), 163-170に記載されている。
【０６０６】
生産のため、例えば、トランスジェニック哺乳類のミルク中、例えばウサギ、ウシ、ヤギまたはヒツジのミルク中（導入遺伝子を哺乳類に導入するための一般的な技術については、例えば米国特許第５７４１９５７（Ａ）号明細書、米国特許第５３０４４８９（Ａ）号明細書および米国特許第５８４９９９２（Ａ）号明細書参照）、植物または限定するものではないが、葉、花、果実、種子、根または塊茎（turbers）（例えば、タバコ、トウモロコシ、ダイズまたはアルファルファ）を含む植物の一部、あるいは例えばカイコのボムビックス・モリ（Bombix mori）の蛹中で、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドを生産することもできる。
【０６０７】
更に、無細胞発現系で本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズもしくはポリペプチドを発現および／もしくは産生させることもでき、このような系の適切な例は当業者には明らかだろう。いくつかの非限定的な好ましい例として、コムギ胚芽系、ウサギ網状赤血球溶血液；または大腸菌ズベイ（Zubay）系における発現が挙げられる。
【０６０８】
上述したように、ナノボディーズを使用することの１つの利点は、ナノボディーズに基づくポリペプチドを、適切な細菌発現系での発現により調製可能なことであり、適切な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節エレメント等は、例えば上で引用した参考文献から当業者にとって明白なことである。しかしながら、最も広い意味の本発明は細菌系内での発現に限定されないことに留意すべきである。
【０６０９】
好ましくは、本発明では、医薬用途に適切な形態で本発明のポリペプチドを与える細菌発現系のような（生体内または生体外）発現系が用いられ、この場合もやはり、このような発現系は当業者に明白だろう。当業者には明らかなように、医薬用途に適切な本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の技術を用いて調製可能である。
【０６１０】
工業規模の生産では、ナノボディーズまたはナノボディ含有タンパク質治療薬（工業）生産用の好ましい異種宿主として、大規模な発現／生産／発酵、特に大規模な医薬用発現／生産／発酵に適切な大腸菌、ピキア・パストリス、出芽酵母の菌株が挙げられる。このような菌株の適切な例は当業者に明白である。このような菌株および生産／発現系はBiovitrum（Uppsala, Sweden）のような会社によっても提供されている。
【０６１１】
あるいは、哺乳類細胞系、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、大規模発現／生産／発酵、特に大規模な医薬用発現／生産／発酵に使用可能である。この場合もやはり、このような発現／生産系は、上述したいくつかの会社によっても提供されている。
【０６１２】
特有の発現系の選択は、一部、特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の必要性によって決まるだろう。グリコシル化が望ましいかまたは必要とされるナノボディ含有組換えタンパク質の生産は、発現されたタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類発現宿主の使用を必要とするだろう。この点に関して、得られるグリコシル化パターン（すなわち、付着した残基の種類、数および位置）は、発現用に使用される細胞または細胞系によって決まることは、当業者には明白である。好ましくは、ヒトの細胞または細胞系を使用するか（すなわち、本質的にヒトグリコシル化パターンを有するタンパク質をもたらす）、あるいは本質的および／もしくは機能的にヒトグリコシル化と同一のまたは少なくともヒトグリコシル化を模擬するグリコシル化パターンを与えることのできる別の哺乳類細胞系を使用する。一般的に、大腸菌のような原核生物宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を持たず、酵母のような下等真核生物を使用すると、通常、ヒトグリコシル化と異なるグリコシル化パターンをもたらす。それにもかかわらず、得るべき所望のナノボディもしくはタンパク質にもよるが、本発明では、上述したすべての宿主細胞および発現系を使用できることに留意すべきである。
【０６１３】
従って、本発明の１つの非限定的な実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドはグリコシル化される。本発明の別の非限定的な実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、グリコシル化されない。
【０６１４】
本発明の非限定的な好ましい実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、細菌細胞、具体的には、大規模の医薬用生産に適切な細菌細胞、例えば上述した菌株の細胞内で産生される。
【０６１５】
別の本発明の非限定的な好ましい実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、酵母細胞、具体的には、大規模の医薬用生産に適切な酵母細胞、例えば上述した種の細胞内で産生される。
【０６１６】
更に別の本発明の非限定的な好ましい実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、哺乳類細胞、具体的には、ヒト細胞内またはヒト細胞系の細胞、より具体的には、大規模の医薬用生産に好適なヒト細胞内またはヒト細胞系の細胞、例えば上述した細胞系で産生される。
【０６１７】
宿主細胞内の発現を用いて本発明のナノボディーズおよびタンパク質を生産する場合、本発明のナノボディーズおよびタンパク質を細胞内（例えば、細胞質ゾル内、周辺質内または封入体内）で生産してから、宿主細胞から単離し、場合により更に精製するか、あるいは細胞外（例えば、宿主細胞を培養する培地中）で生産してから培養培地から単離し、場合により更に精製することができる。真核生物の宿主細胞を使用する場合、通常細胞外生産が好ましい。 これは、得られるナノボディーズおよびタンパク質の更なる単離および下流プロセスをかなり容易にするからである。上述した大腸菌株のような細菌細胞は、通常、トキシンおよびヘモリシンのような数種のタンパク質を除き、細胞外にタンパク質を分泌せず、大腸菌における分泌生産とは、タンパク質が細胞の内膜を横断して細胞膜周辺腔に移行することに言及する。周辺質の生産は、細胞質ゾル生産を越えるいくつかの利点を与える。例えば、分泌産物のＮ末端アミノ酸配列は、特異的なシグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後、天然の遺伝子産物と同一であり得る。また、周辺質内のプロテアーゼ活性は細胞質ゾル内のプロテアーゼ活性よりずっと低いようである。加えて、周辺質内には混入しているタンパク質が少ないので、タンパク質精製が容易である。別の利点は、周辺質内は細胞質ゾルより酸化環境を提供するので、正確なジスルフィド結合を形成し得ることである。大腸菌で過剰発現されるタンパク質は、不溶性凝集体、いわゆる封入体内で見られることが多い。これらの封入体は細胞質ゾルまたは周辺質内にもあり得；これら封入体から生物学的に活性なタンパク質を回収するためには、変性／再フォールディングプロセスが必要である。治療用タンパク質を含む多くの組換えタンパク質は、封入体から回収される。あるいは、当業者には明白なように、所望のタンパク質、特に本発明のナノボディまたはポリペプチドを分泌するように遺伝的に修飾された、細菌の組換え菌株を使用することができる。
【０６１８】
従って、本発明の１つの非限定的な実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、細胞内で生産され、かつ宿主細胞から、特に細菌細胞もしくは細菌細胞内の封入体から単離された、ナノボディまたはポリペプチドである。本発明の別の非限定的な実施態様によると、本発明のナノボディまたはポリペプチドは、細胞外で生産され、かつ宿主細胞を培養している培地から単離された、ナノボディまたはポリペプチドである。
【０６１９】
これら宿主細胞と共に使うためのいくつかの非限定的な好ましいプロモーターとして以下のものが挙げられる。
・大腸菌における発現用：lacプロモーター（およびその誘導体、例えばlacUV5プロモーター）；アラビノースプロモーター；ファージλの左方（PL）および右方（PR）プロモーター；trpオペロンのプロモーター；lac/trpハイブリッドプロモーター（tacおよびtrc）；T7プロモーター（より具体的には、T7ファージ遺伝子10のT7プロモーター）および他のTファージプロモーター；Tn10テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター；外来性の調節オペレーター配列の１以上のコピーを含む、上記プロモーターの操作された変異体；
・出芽酵母における発現用：構成的：ADH1（アルコールデヒドロゲナーゼ１）、ENO（エノラーゼ）、CYC1（チトクロムｃイソ−１）、GAPDH（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）；PGK1（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、PYK1（ピルビン酸キナーゼ）；制御的：GAL1,10,7（ガラクトース代謝酵素）、ADH2（アルコールデヒドロゲナーゼ２）、PHO5（酸性ホスファターゼ）、CUP1（銅メタロチオネイン）；異種：CaMV（カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター）；
・ピキア・パストリスにおける発現用：AOX1プロモーター（アルコールオキシダーゼＩ）
・哺乳類細胞における発現用：ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）最初期エンハンサー／プロモーター；該プロモーターがTetリプレッサーによって調節可能なような２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含むヒトサイトメガロウイルス（hCMV）最初期プロモーター変異体；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（Rous Sarcoma Virus long terminal repeat）（RSV LTR）エンハンサー／プロモーター；ヒト、チンパンジー、マウスまたはラット由来の伸長因子１α（hEF-1α）プロモーター；SV40初期プロモーター；HIV-1末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーター；
【０６２０】
これら宿主細胞と使ういくつかの非限定的な好ましいベクターとして以下のものが挙げられる：
・哺乳類細胞における発現用ベクター：pMAMneo（Clontech）、pcDNA3（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO-pSV2-neo（ATCC 37593）、pBPV-1（8-2）（ATCC 37110）、pdBPV-MMTneo（342-12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC37199）、pRSVneo（ATCC37198）、pSV2-dhfr（ATCC 37146）、pUCTag（ATCC 37460）および1ZD35（ATCC 37565）、加えてウイルスに基づく発現系、例えば、アデノウイルスに基づくもの；
・細菌細胞における発現用ベクター：pETベクター（Novagen）およびpQEベクター（Qiagen）；
・酵母または他の真菌細胞における発現用ベクター：pYES2（Invitrogen）およびピキア発現ベクター（Invitrogen）；
・昆虫細胞における発現用ベクター：pBlueBacII（Invitrogen）および他のバキュロウイルスベクター；
・植物または植物細胞における発現用ベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルスもしくはタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウム属の適切な菌株に基づくベクター、またはTiプラスミドに基づくベクター。
【０６２１】
これら宿主細胞と使うためのいくつかの非限定的な好ましい分泌配列として以下のものが挙げられる：
・細菌細胞、例えば大腸菌で使用するため：PelB、Bla、OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、StII、PhoA、PhoE、MalE、Lpp、LamB等；TATシグナルペプチド、ヘモリシンC末端分泌シグナル；
・酵母菌で使用するため：α接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（phol）、インベルターゼ（Suc）等；
・哺乳類細胞で使用するため：標的タンパク質が真核生物起源の場合の内在性シグナル；マウスIgκ鎖V-J2-Cシグナルペプチド等。
【０６２２】
本発明の宿主または宿主細胞の形質転換に適切な技術は、当業者に明白であるし、意図した宿主細胞／宿主生物および用いる遺伝子構築物に依存し得る。この場合もやはり、上述したハンドブックおよび特許出願を参照されたい。
【０６２３】
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物でうまく形質転換された当該宿主細胞または宿主生物を検出および選択する工程が行われてもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子構築物中に存在する選択可能マーカーに基づいた選択工程、または例えば特異抗体を用いて、本発明のアミノ酸配列を検出することを含む工程でよい。
【０６２４】
形質転換した宿主細胞（安定な細胞系の形態または細胞系でよい）または宿主生物（安定な変異系統または株の形態でよい）が、本発明の更なる態様を形成する。
【０６２５】
好ましくは、これら宿主細胞または宿主生物は、本発明のアミノ酸配列を発現する、あるいは（少なくとも）発現できる（例えば、適切な条件下で）ものである（並びに、宿主生物の場合：少なくとも一つの細胞、部分、組織または器官内で）。本発明は、例えば、細胞分裂または有性生殖もしくは無性生殖によって得られる、本発明の宿主細胞または宿主生物の更なる世代、後代（progeny）および／もしくは子孫（offspring）をも包含する。
【０６２６】
本発明のアミノ酸配列の発現を生じさせ／得るため、一般的に、形質転換した宿主細胞または形質転換した宿主生物を、本発明の（所望の）アミノ酸配列が発現／生成されるような条件下で、保持し、維持し、および／または培養し得る。適切な条件は、当業者には明白であるし、通常、使用する宿主細胞／宿主生物により、加えて本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントにより決まる。この場合もやはり、本発明の遺伝子構築物に関する段落で上述したハンドブックおよび特許出願を参照されたい。
【０６２７】
一般的に、適切な条件は、適切な培地の使用、適切な食物源および／または適切な栄養源の存在、適切な温度の使用を含んでもよく、場合により適切な誘導因子または化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）を含むことがあり；これらすべてを当業者は選択し得る。この場合もやはり、このような条件下で、構成的様式で、一過的な様式で、または適切に誘導されたときだけ、本発明のアミノ酸配列が発現し得る。
【０６２８】
当業者には、本発明のアミノ酸配列は（まず）未熟型（上述したように）で産生され、使用する宿主細胞／宿主生物にもよるが、次いで翻訳後修飾を受けうるということも明白である。また、この場合もやはり使用する宿主細胞／宿主生物にもよるが、本発明のアミノ酸配列は、グリコシル化されうる。
【０６２９】
次に、本発明のアミノ酸配列は、宿主細胞／宿主生物からおよび／または前記宿主細胞もしくは宿主生物を培養した培地から、タンパク質の単離および／もしくは精製のそれ自体既知の技術、例えば、（分取）クロマトグラフィーおよび／もしくは電気泳動技術、差別沈降技術、親和性技術（例えば、本発明のアミノ酸配列と融合される特異的な切断可能なアミノ酸配列を用いて）および／または調整用免疫学的調製技術（すなわち、単離すべきアミノ酸配列に対する抗体を用いて）単離される。
【０６３０】
一般的に、医薬用途では、少なくとも一つの本発明のポリペプチドと、少なくとも一つの医薬的に許容し得る担体、希釈剤もしくは賦形剤および／もしくは補助剤とを含み、場合により、１以上の更なる医薬的に活性なポリペプチドおよび／もしくは化合物を含む医薬製剤として、本発明のポリペプチドを製剤化し得る。非限定的な例により、このような剤形は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射または静脈内注入によって）、局所投与、または吸入、皮膚パッチ、インプラント、もしくは坐剤による投与等の適切な形態でよい。このような適切な投与形態‐投与様式によって、固体、半固体または液体でよい‐加えてその調製で使う方法および担体は当業者には明らかであるし、本明細書で更に述べる。
【０６３１】
従って、更なる態様では、本発明は、少なくとも一つの本発明のナノボディもしくは少なくとも一つの本発明のポリペプチドと、少なくとも一つの担体、希釈剤もしくは賦形剤（すなわち、医薬用途に適した）とを含み、場合により、１以上の更なる活性物質を含む医薬組成物に関する。
【０６３２】
一般的に、例えば上記一般的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレットおよび国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット）加えて標準的なハンドブック、例えばRemingtonのPharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)またはRemington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)を参照して、それ自体既知のいずれの適切な方法で本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを製剤化かつ投与することができる。
【０６３３】
例えば、通常の抗体および抗体断片（ScFvおよび二重特異性抗体が挙げられる）並びに他の医薬的に活性なタンパク質についてそれ自体既知のいずれの方法で本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを製剤化および投与し得る。このような剤形および該製剤の調製方法は当業者には明らかであるし、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内またはクモ膜下腔内投与）または局所（すなわち経皮または皮内）投与に好適な製剤が挙げられる。
【０６３４】
非経口投与用製剤は、注入または注射に適切な、例えば無菌溶液、懸濁液、分散系または乳濁液でよい。このような製剤用の適切な担体または希釈剤として、無菌の水並びに水溶性緩衝液および溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液；水油；グリセロール；エタノール；グリコール、例えばプロピレングリコール、並びに鉱油、動物油および植物油、例えばピーナツ油、大豆油、加えて適切なこれらの混合物が挙げられるが、限定するものではない。通常は、水溶性の溶液または懸濁液が好ましい。
【０６３５】
本発明のナノボディーズおよびポリペプチドは、送達の遺伝子治療法を用いても投与可能である。例えば、米国特許第５３９９３４６号明細書（参照することにより全体が本明細書に取り込まれる）を参照されたい。送達の遺伝子治療法を用いて、本発明のナノボディまたはポリペプチドの遺伝子で形質移入した初代細胞を、更に特異的な器官、組織、移植片、腫瘍、または細胞を標的にするための組織特異的プロモーターで形質移入することができ、更に細胞内局在発現用のシグナル配列および安定化配列で形質移入することができる。
【０６３６】
従って、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを、医薬的に許容し得る媒体、例えば不活性な希釈剤または吸収可能な食用担体と共に全身投与、例えば経口投与してもよい。それらを殻の固いまたは軟らかいゼラチンカプセルに封入し、圧縮して錠剤とし、あるいは患者の食事の食物に直接組み入れてよい。経口治療用途では、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを１以上の賦形剤と併用して、経口摂取し得る錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェーハ等の形態で使用し得る。このような組成物および製剤は少なくとも０．１％の本発明のナノボディまたはポリペプチドを含むのが望ましい。当然、組成物および製剤の割合は、もちろん可変であり、好都合には約２〜約６０％の所定の単位用量形態でよい。このような治療的に有用な組成物中の本発明のナノボディおよびポリペプチドは、有効な投与量が得られるような量である。
【０６３７】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、以下の成分を含んでもよく：結合剤、例えばトラガカント・ゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、例えば第二リン酸カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等；潤沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；ならびに甘味料、例えばスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームまたは香味料、例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香料を添加してよい。単位用量形態がカプセル剤の場合、上記タイプの物質に加え、液状担体、例えば植物油またはポリエチレングリコールを含有し得る。コーティング剤として、または該固体単位用量形態の物理的形態を別なやり方で改善するために、各種他の物質が存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤をゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖などでコーティングしてよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、本発明のナノボディーズおよびポリペプチド、甘味料としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、着色剤および香味料、例えばチェリーもしくはオレンジフレーバーを含むことができる。更に、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを徐放性製剤および徐放性装置中に組み込んでもよい。
【０６３８】
経口投与用の製剤および剤形は、本発明の構築物が胃の環境に耐えかつ腸に運ばれることを可能にする腸溶コーティングと共に供給されてもよい。より一般的には、経口投与用の製剤および剤形は、あらゆる所望の胃腸管の部分に送達されるために、適宜製剤化され得る。更に、適切な坐剤を消化管への送達に使用してよい。
【０６３９】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディーズおよびポリペプチドを注入または注射によって静脈内または腹腔内投与してもよい。本発明のナノボディーズおよびポリペプチドまたはその塩の溶液を水中で調製し、場合により、無毒の界面活性剤と混合することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物中および油中で分散系を調製することもできる。保存および使用の通常の条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。
【０６４０】
注射または注入に適した医薬品の剤形は、無菌の注射もしくは注入用溶液または分散系の即時調製に適合され、場合によりリポソームに被包された有効成分を含む無菌の水溶液もしくは分散系または無菌散剤を含むことが可能である。いかなる場合でも、最終的な剤形、製造および貯蔵の条件下で無菌であり、流動性があり、かつ安定でなければならない。液状の担体または媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、液体ポリエチレングリコール類等）、植物油、無毒のグリセリル・エステル、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または液状分散媒であり得る。例えば、リポソームの形成によって、分散系の場合は必要な粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。各種抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって、微生物作用が阻止され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物を使用することにより、注射用組成物の吸収を長引かせることができる。
【０６４１】
無菌の注射剤は、必要量の本発明のナノボディーズ及びポリペプチドを、上で列挙した各種他の成分と共に適切な溶媒に加え、必要な場合は、その後フィルター滅菌することによって調製される。無菌注射液の調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥法および凍結乾燥法であり、この方法は、有効成分と、予め無菌ろ過溶液中に存在する、あらゆる更なる所望成分との散剤をもたらす。
【０６４２】
局所投与では、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドが液体の場合、それだけで適用してよい。しかし、一般的に、固体でも液体でもよい、皮膚科学的に許容し得る担体と共に、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを組成物または製剤として皮膚に投与することが望ましい。
【０６４３】
有用な固形担体としては、微粉固体、例えばタルク、粘土、結晶セルロース、シリカ、アルミナ等が挙げられる。有用な液状担体としては、水、ヒドロキシアルキルもしくはグリコールまたは水・アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、この中に、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドが、場合により無毒の界面活性剤の助けを借りて、有効なレベルで溶解または分散し得る。芳香および追加の抗菌剤のような補助剤を添加して、所定用途用に特性を最適化することができる。得られた液体組成物を吸収パッドから適用する、あるいは包帯および他の包帯材に浸透させる、あるいはポンプ型またはエアロゾル噴霧器を用いて患部に噴霧することができる。
【０６４４】
使用者の皮膚に直接適用するためには、液状担体と共に増粘剤、例えば合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性無機物質を利用して、塗り広げられるペースト、ゲル、軟膏、セッケン等を形成することもできる。
【０６４５】
本発明のナノボディーズおよびポリペプチドを皮膚に送達するために使用できる有用な皮膚科学的組成物の例は当該技術では周知であり；例えばJacquetら（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Geria（米国特許第４９９２４７８号明細書）、Smithら（米国特許第４５５９１５７号明細書）およびWortzman（米国特許第４８２０５０８号明細書）を参照されたい。
【０６４６】
本発明のナノボディーズおよびポリペプチドの有用な投与量は、その生体外活性と動物モデルでの生体内活性を比較することによって決定される。マウス、および他の動物における有効な投与量をヒトに外挿する方法は当該技術では周知であり；例えば、米国特許第４９３８９４９号明細書を参照されたい。
【０６４７】
一般的に、ローションのような液体組成物中の本発明のナノボディーズおよびポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５wt％、好ましくは約０．５〜１０wt％であろう。ゲルまたは散剤のような半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５wt％、好ましくは約０．５〜２．５wt％である。
【０６４８】
治療で使うために必要な本発明のナノボディーズおよびポリペプチドの量は、選択した特定塩によってのみならず、投与経路、処置すべき症状の症度、および患者の年齢と状態によって異なるであろうが、最終的にはかかりつけの医師または臨床医の指示によるであろう。また、本発明のナノボディーズおよびポリペプチドの投与量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片、または器官によっても異なる。
【０６４９】
所望の用量は、便利には、単一用量で、または適宜な間隔で投与される分割用量、例えば、１日２回、３回、４回以上のサブ用量として提示される。サブ用量自体を更に分割して、例えば、別々のおおまかに間隔をあけた投与にしてもよく；例えば、吸入器から複数回吸入または眼中に複数の液滴を投与してもよい。
【０６５０】
投与計画は、長期、毎日の治療を含むことができる。「長期」とは少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の期間を意味する。本明細書の教示を考慮すれば、当業者は、日常的実験だけでこの用量範囲の必要な変更を決定し得る。RemingtonのPharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。また、何らかの余病が併発した場合には、個々の医師が投与量を調製してもよい。
【０６５１】
別の態様では、本発明は、IL-6 に関連する少なくとも一つの疾病の予防および／または治療方法に関し、前記方法は、予防および／または治療が必要な対象に、医薬的に活性な量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／または同じものを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０６５２】
本発明の文脈では、用語「予防および／または治療」は、該疾患を予防および／または治療することのみならず、通常、該疾患の発生を阻止し、疾患の進行を遅らせもしくは退行させ、該疾患に関連する１以上の症状の発生を阻止もしくは遅らせ、該疾患に関連する１以上の症状を低減もしくは緩和し、該疾患および／もしくは該疾患に関連するあらゆる症状の重症度および／もしくは持続期間も減らし、ならびに／または該疾患および／もしくは該疾患に関連するあらゆる症状の更なる増加を阻止し、該疾患によって引き起こされるあらゆる生理的損傷を阻止し、低減し、または退行させること、ならびに治療を受けている患者にとって有益なあらゆる薬理作用をも含む。
【０６５３】
治療対象は、いずれの温血動物でもよいが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者には明らかなように、治療対象は、具体的には本明細書で言及した疾患および疾病を患っている、またはその危険がある人である。
【０６５４】
本発明は、IL-6、その生物学的もしくは薬理学的活性、IL-6に関連する、および／または生物学的経路もしくはシグナルに関連する少なくとも一つの疾患または疾病の予防および／もしくは治療方法に関し、前記方法は、予防および／もしくは治療が必要な対象に、医薬的に活性な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／もしくはそれらを含む医薬組成物を投与することを含む。具体的には、本発明は、IL-6、その生物学的もしくは薬理学的活性、および／またはIL-6が関与する生物学的経路もしくはシグナルを調節することで治療することが可能な少なくとも一つの疾患または疾病の予防および／もしくは治療方法に関し、前記方法は、予防および／もしくは治療が必要な対象に、医薬的に活性な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／もしくはそれらを含む医薬組成物を投与することを含む。具体的には、前記医薬的に活性な量は、IL-6、その生物学的もしくは薬理学的活性、および／またはIL-6が関与する生物学的経路もしくはシグナルを調節するのに十分な量；ならびに／またはIL-6、その生物学的もしくは薬理学的活性、および／またはIL-6が関与する生物学的経路もしくはシグナルを調節するのに十分な、循環血液中の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチドのレベルを提供する量でよい。
【０６５５】
本発明は、患者に本発明のアミノ酸配列、ナノボディもしくはポリペプチドを投与することによって予防および／もしくは治療できる少なくとも一つの疾患または疾病の予防および／もしくは治療の方法に関し、前記方法は、予防および／もしくは治療が必要な対象に、医薬的に活性な量のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／もしくはそれらを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０６５６】
より具体的には、本発明は、本明細書で列挙される疾患および疾病からなる群より選択される少なくとも一つの疾患または疾病の予防および／もしくは治療の方法に関し、前記方法は、予防および／もしくは治療が必要な対象に、医薬的に活性な量のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／またはそれらを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０６５７】
別の態様では、本発明は、免疫療法、具体的には受動免疫療法に関し、この方法は、本明細書で言及した疾患および疾病を患っている、またはその危険のある対象に、医薬的に活性な量のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、および／またはそれらを含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０６５８】
上記方法では、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズならびに／または本発明のポリペプチドならびに／またはそれらを含む医薬組成物は、使用する特有の医薬製剤または医薬組成物により、あらゆる適切な様式で投与することができる。従って、この場合もやはり使用する特有の医薬製剤または医薬組成物により、経口、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または胃腸管を回避するいずれかの他の投与経路により）、鼻腔内、経皮、局所、坐薬を用いて、吸入によって、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／またはそれらを含む医薬組成物を投与することができる。臨床医は、予防または治療すべき疾患もしくは疾病および臨床医に周知の他の因子によって、このような投与で使用すべき適切な投与経路および適切な医薬製剤もしくは医薬組成物を選択できる。
【０６５９】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／またはそれらを含む医薬組成物は、予防または治療すべき疾患または疾病を予防および／または治療するのに適した治療法に従って投与される。臨床医は、一般的に、予防もしくは治療すべき疾患または疾病、治療すべき疾患の重症度および／またはその症状の重症度のような要因により、使用すべき本発明の特有のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチド、使用すべき投与経路ならびに医薬製剤もしくは医薬組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身症状、かつ臨床医に周知の同様の要素によって、適切な治療法を決定することができるで。
【０６６０】
一般的に、治療法は、１以上の医薬的に有効な量または用量の、本発明の１以上の本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよび／もしくはポリペプチド、あるいはそれらを含む１以上の組成物の投与を含む。臨床医は、この場合もやはり、上述した要因に基づいて、投与すべき具体的な量または用量を決定することができる。
【０６６１】
一般的には、治療すべき特有の疾患もしくは疾病、使用すべき本発明の特有のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチドの効力、使用する特有の投与経路および特有の医薬製剤または医薬組成物によるが、本明細書で言及した疾患および疾病の予防および／もしくは治療のために、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよびポリペプチドは、１日に体重１kg当たり１g〜０．０１μg、好ましくは１日に体重１kg当たり０．１g〜０．１μg、例えば１日に体重１kg当たり約１、１０、１００または１０００μgの量を通常連続的に（例えば注入によって）、１日１回、あるいは一日中で複数回に分けて投与される。臨床医は、一般的に、上述した要因によって、適切な一日量を決定できる。特別な場合、臨床医が、例えば上述した要因および自身の専門的判断に基づき、これらの量から外れて選択しうることも明白である。一般的に、基本的に同じ経路から投与される、同じ標的に対する比較できる従来の抗体または抗体断片の普通に投与される量から、投与すべき量に関する何らかの手引きが得られるが、親和性／結合力、効力、生体内分布、半減期および当業者に周知の同様の要因の相違を考慮する。
【０６６２】
通常、上述の方法では、本発明の単一のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチドが使用される。しかし、本発明の２以上のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズおよび／もしくはポリペプチドを併用することも本発明の範囲内である。
【０６６３】
本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズもしくはポリペプチドを１以上の更なる医薬的に活性な化合物もしくは成分と併用して、すなわち、併用治療法としてもよい。 これは相乗効果をもたらすこともあり、そうでないこともある。この場合もやはり、臨床医は、上述した因子および自身の専門的判断に基づいてこのような更なる化合物もしくは成分、並びに適切な併用治療法を選択できる。例えば、TNF-αに対する１以上の活性成分、例えば、既知のTNFに対する抗体または抗体断片、例えば、限定するものではないが、ヒューメラ（HUMERA）（登録商標）およびレミケード（登録商標）または出願人の国際公開第０４／０４１８６２号パンフレットもしくは出願人による非公開の米国仮出願第６０／６８２，３３２号（出願日２００５年５月１８日）に記載の抗TNFポリペプチドとの併用治療または投与計画に、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズもしくはポリペプチドを使用してもよい。他のTNF-α（エンブレル（ENBREL）（登録商標）のような）に対する活性物質は当業者には明白である。
【０６６４】
特に、本明細書で言及した疾患および疾病の予防および／もしくは治療のために使用されるまたは使用できる他の医薬的に活性な化合物もしくは成分と、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズもしくはポリペプチドを併用してもよく、この結果として相乗効果が得られるかも得られないかもしれない。このような化合物および成分、加えてそれらを投与するための方法および医薬製剤または医薬組成物の例は、臨床医には明らかである。
【０６６５】
併用治療法の一部として２以上の物質または成分を使用する場合、同じ投与経路からまたは異なる経路から、本質的に同時または異なる時にそれらを投与することができる（例えば本質的に同時、継続的、または交互法で）。物質または成分を同じ投与経路から同時に投与する場合、当業者には明らかなように、異なる医薬製剤もしくは医薬組成物として、または混合医薬製剤もしくは医薬組成物の一部として投与してもよい。
【０６６６】
また、２以上の活性な物質もしくは成分を併用治療法の一部として使用する場合、該化合物もしくは成分を単独で使用するときに用いられるのと同じ量および同じ治療方法で各物質または成分を投与してよく、このような併用は相乗効果をもたらすこともあるし、またはもたらさないこともある。しかし、２以上の活性な物質もしくは成分の併用が相乗効果をもたらす場合、投与すべき物質もしくは成分の１つ、１以上またはすべての量を減らしても、なお所望の治療作用を達成することもできる。このことは、例えば、１つの物質または成分を通常の量で使用した場合のそれらの使用に関連するあらゆる望ましくない副作用を回避、制限または低減してもなお所望の医薬効果または治療効果を得るのに役立つ。
【０６６７】
臨床医には明らかなように、関与する疾患または疾病についてそれ自体既知のいずれの方法によっても、本発明により使用される治療法の効率を決定および／もしくは理解し得る。臨床医は、妥当な場合および／もしくは個々の症例毎に、特定の治療法を変更もしくは修正して所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限もしくは低減し、および／または一方で所望の治療効果を達成し、他方で望ましくない副作用を回避、制限もしくは低減することの妥当なバランスを達成することもできる。
【０６６８】
一般的に、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持されている限り、治療法は続けられる。この場合もやはり、臨床医はこれを決定することができる。
【０６６９】
別の態様では、本発明は、IL-6が関連する少なくとも１つの疾病を予防および／もしくは治療するための医薬組成物の製剤化における、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチドの使用に関する。
【０６７０】
治療対象は、いずれの温血動物でもよいが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者には明らかなように、治療対象は、具体的には本明細書で言及した疾患および疾病を患っている、またはその危険がある人である。
【０６７１】
本発明は、患者に本発明のアミノ酸配列および／またはナノボディまたはポリペプチドを投与することによって予防および／または治療できる、少なくとも一つの疾病を予防および／または治療するための医薬組成物の製剤化における、本発明のアミノ酸配列および／またはナノボディまたはポリペプチドの使用に関する。
【０６７２】
より具体的には、本発明は、少なくとも一つの神経変性疾患もしくは疾病を予防および／もしくは治療するための、特に本明細書で列挙した１以上の疾患および疾病を予防および治療するための医薬組成物の調製における、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディもしくはポリペプチドの使用に関する。
【０６７３】
この場合もやはり、このような医薬組成物において、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズもしくはポリペプチドは、１以上の本明細書に記載のような他の活性成分と適宜併用してもよい。
【０６７４】
最後に、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズ（本明細書に定義）の使用ならびに本発明のポリペプチドおよび本発明のポリペプチドの使用は非常に好ましいが、本明細書の記載に基づいて、当業者は、同様の方法で、IL-6に対する他の（単一）領域抗体、加えてこのような（単一）領域抗体を含むポリペプチドを設計および／もしくは産生することもできるのは明白である。（ここで、「領域抗体」および「単一領域抗体」との用語は、当技術分野での通常の意味を有する）。
【０６７５】
従って、本発明の１つの更なる態様は、IL-6に対する領域抗体もしくは単一領域抗体、ならびに少なくともそのような１個の（単一）領域抗体を含むポリペプチドおよび／もしくは本質的にそのような（単一）領域抗体からなるポリペプチドに関する。
【０６７６】
具体的には、IL-6 に対するこのような（単一）領域抗体は３個のCDRを含んでもよく、ここで前記CDRは、本発明のナノボディーズについて上で定義したとおりである。例えば、（単一）領域抗体は、例えばWardら（前出）に記載されているような「dAb」として知られている単一領域抗体でよいが、これは本発明のナノボディーズについて上で定義したようなCDRを有する。しかし、上述したように、このような「dAb」の使用は、通常、対応する本発明のナノボディーズの使用と比較していくつかの欠点があるだろう。従って、本発明のこの態様によるIL-6に対するいずれの（単一）領域抗体も、好ましくはIL-6に対するこれら（単一）領域抗体を本発明のナノボディーズと実質的に等価にする特性を有するこれら（単一）領域抗体に与える枠組み構成領域を有する。
【０６７７】
本発明のこの態様は、このような（単一）領域抗体および／もしくはポリペプチドをコードする核酸、このような（単一）の領域抗体、ポリペプチドもしくは核酸を含む組成物、このような（単一）領域の抗体もしくはポリペプチドを発現する（発現可能な）宿主細胞、並びにこのような（単一）領域の抗体、ポリペプチドもしくは核酸の調製方法および使用方法をも包含し、これらは、本発明のナノボディーズについて上述したポリペプチド、核酸、組成物、宿主細胞、方法および使用と本質的に類似である。
【０６７８】
更に、本発明のナノボディーズについて上述した１以上のCDRを、他の「骨格（schaffold）」（ヒト骨格または非免疫グロブリン骨格が挙げられるが、限定するものではない）上に「移植」できることも当業者には明らかである。このようなCDR移植に適切な骨格および技術は当業者には明らかであるし、当技術分野で周知であり、例えば米国特許第６１８０３７０（Ａ１）号明細書、国際公開第０１／２７１６０号パンフレット、欧州特許第０６０５５２２号明細書、欧州特許第０４６０１６７号明細書、米国特許第６０５４２９７（Ａ）号明細書、Nicaiseら、Protein Science (2004), 13:1882-1891；Ewertら、Methods, 2004 Oct; 34(2):184-199；Kettleboroughら、Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783；O'BrienおよびJones, Methods MoL Biol. 2003:207: 81-100；およびSkerra, J. MoI. Recognit. 2000:13: 167-187、およびSaerensら、J. MoI. Biol. 2005 Sep 23;352(3):597-607、並びにこれら文献で引用している更なる参考文献を参照されたい。例えば、ヒト枠組み構成および骨格上にマウスもしくはラットのCDRを移植するためにそれ自体既知の技術を同様の方法で用いて、本発明のナノボディーズの１以上のCDRと、１以上のヒト枠組み構成の領域または配列を含むキメラタンパク質を提供することができる。
【０６７９】
従って、別の実施態様では、本発明は、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列からなる群より選択される少なくとも一つのCDR配列を含むキメラポリペプチドを含む。好ましくは、このようなキメラポリペプチドは、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたCDR3配列からなる群より選択される少なくとも一つのCDR配列を含み、場合により、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたCDR1配列およびCDR2配列からなる群より選択される少なくとも一つのCDR配列を含んでもよい。例えば、このようなキメラポリペプチドは、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたCDR3配列からなる群より選択される１個のCDR配列と、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたCDR1配列からなる群より選択される１個のCDR配列と、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたCDR1配列およびCDR2配列からなる群より選択される少なくとも一つのCDR配列とを含み得る。本発明のナノボディーズについて好ましいとして本明細書で述べたCDRの組合せは、通常、これらキメラポリペプチドについても好ましい。
【０６８０】
前記キメラポリペプチドでは、CDRを更なるアミノ酸配列に連結し、および／またはアミノ酸配列を介して相互に連結してよい。 ここで、前記アミノ酸配列は、好ましくは枠組み構成配列または枠組み構成配列として作用するアミノ酸配列である、あるいはCDRを提示するための骨格を一緒に形成する。この場合もやはり、この前の段落で述べた先行技術を参照されたい。１つの好ましい実施態様によれば、該アミノ酸配列はヒト枠組み構成配列、例えばVH3枠組み構成配列である。しかし、非ヒト、合成、半合成または非免疫のグロブリン枠組み構成配列も使用し得る。好ましくは、使用する枠組み構成配列は、（１）キメラポリペプチドがIL-6と結合できる、すなわち対応する本発明のナノボディの親和性の少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、更に好ましくは少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％および５０％または９０％以上までの親和性をもって結合でき；（２）キメラポリペプチドが医薬用途に適し；かつ（３）キメラポリペプチドが、好ましくは、この医薬用途（すなわち、指標、投与法、致死量および治療法）のために意図した条件下（本発明のナノボディーズの使用について本明細書で述べた条件と本質的に同様でよい）で本質的に非免疫原性である。
【０６８１】
１つの非限定的な実施態様によれば、キメラポリペプチドは、少なくとも一つの枠組み構成配列を介して連結された少なくとも２個のCDR配列（上述したとおり）を含む。 ここで、好ましくは前記２個のCDR配列の少なくとも一つはCDR3配列であり、他方のCDR配列はCDR1またはCDR2配列である。非限定的な好ましい実施態様によれば、キメラポリペプチドは、少なくとも２個の枠組み構成配列によって連結された少なくとも二つのCDR配列（上述したとおり）を含む。 ここで、好ましくは、該３個のCDR配列の少なくとも一つはCDR3配列であり、他の２個のCDR配列はCDR1またはCDR2配列、好ましくは１個のCDR1配列と１個のCDR2配列である。１つの非限定的な特に好ましい実施態様によれば、キメラポリペプチドはFR1'-CDR1-FR2-CDR2-FR3'-CDR3-FR4'構造を有する。 ここで、CDR1、CDR2およびCDR3は本発明のナノボディーズのCDRについて本明細書で定義したとおりであり、かつFR1'、FR2'、FR3'およびFR4'は枠組み構成配列である。FR1'、FR2'、FR3'およびFR4'は、具体的には、それぞれヒト抗体枠組み構成１、枠組み構成２、枠組み構成３および枠組み構成４配列（例えばVH3配列）ならびに／もしくはこのような枠組み構成配列の部分もしくは断片でよい。FR1'-CDR1-FR2'-CDR2-FR3'-CDR3-FR4構造を有するキメラポリペプチドの部分もしくは断片を使用することもできる。好ましくは、このような部分もしくは断片は、それらが、先行する段落で述べた基準を満たす。
【０６８２】
本発明は、このようなキメラポリペプチドを含み、および／または本質的に該キメラポリペプチドからなるタンパク質およびポリペプチド、このようなタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸；このようなタンパク質もしくはポリペプチドの調製方法；このようなタンパク質もしくはポリペプチドを発現しているかまたは発現できる宿主細胞；このようなタンパク質もしくはポリペプチド、核酸または宿主細胞を含む組成物、特に医薬組成物；並びにこのようなタンパク質もしくはポリペプチド、このような核酸、このような宿主細胞および／またはこのような組成物の使用、特に予防、治療もしくは診断の目的、例えば本明細書で言及した予防、治療もしくは診断の目的のための使用にも関する。例えば、このようなタンパク質、ポリペプチド、核酸、方法、宿主細胞、組成物および使用は、本発明のナノボディーズについて本明細書で述べたタンパク質、ポリペプチド、核酸、方法、宿主細胞、組成物および使用と類似していてよい。
【０６８３】
また、本発明のアミノ酸配列および／もしくはナノボディーズが、上述した好ましいCDR配列以外の１以上の他のCDR配列を含む場合、これらCDR配列は、それ自体既知のいずれの方法でも、例えば、ナノボディーズ（好ましい）、通常の抗体（特にヒト抗体）由来のVH領域、重鎖抗体、通常の４鎖抗体（例えば従来のヒト４鎖抗体）またはIL-6を標的とする他の免疫グロブリン配列から得られることに留意すべきである。このようなIL-6を標的とする免疫グロブリン配列は、当業者には明らかなように、それ自体既知のいずれのやり方でも、すなわち、IL-6による免疫化、または免疫グロブリン配列の適切なライブラリーのIL-6によるスクリーニング、またはそのいずれか適切な組合せによっても産生することが可能である。場合により、この後に、ランダムなもしくは部位特異的変異導入および／またはそれ自体既知の親和性成熟のための他の技術のような技術を行ってよい。このような免疫グロブリン配列を産生する適切な技術は当業者には明らかであるし、例えば、Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)で概説されているスクリーニング技術が挙げられる。特定の標的に対する免疫グロブリンを生成する他の技術として、例えば、ナノクローン技術（例えば公開米国特許出願第２００６−０２１１０８８号に記載されているような）、いわゆるSLAM技術（例えば、欧州特許出願第０５４２８１０号に記載されているような）、ヒト免疫グロブリンを発現しているトランスジェニックマウスまたは周知のハイブリドーマ技術の使用（例えばLarrickら、Biotechnology, Vol.7, 1989, p. 934参照）が挙げられる。IL-6に対する免疫グロブリンを産生するため、これらすべての技術を使用でき、上述の概要のように、このような免疫グロブリンのCDRを本発明のナノボディーズに使用することができる。例えば、すべて本明細書で述べたような既知の技術を用いて、このようなCDRの配列を決定し、合成し、および／または単離して、本発明のナノボディの配列中に挿入することができ（例えば、対応する天然のCDRと置き換えるように）、あるいは、この場合もやはり本明細書で述べた技術を用いて、このようなCDR（または該CDRをコードする核酸）を含有する本発明のナノボディーズを新規合成することができる。
【０６８４】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディーズ、ポリペプチド、核酸、遺伝子構築物、ならびに宿主および宿主細胞の更なる使用は、本明細書の記載に基づき、当業者には明白である。例えば、組成物および製剤からIL-6を生成するそれ自体既知の方法で使用できる媒体を提供できるように、制限なく、本発明のアミノ酸配列は適切な単体または固体支持体に結合できる。適切な検出可能な標識を含む本発明のアミノ酸配列の誘導体は、組成物もしくは製剤中のIL-6の存在を同定する（定性的にまたは定量的に）マーカーとして、または細胞もしくは組織の表面上IL-6の存在を選択的に検出する（例えば、適切な細胞分類技術と併用して）マーカーとしても使用可能である。
【実施例１】
【０６８５】
免疫化
獣医学部倫理評価委員会（ゲント大学、ベルギー）の承認を得て、最新の動物保護規制にすべて従い、組換えヒトIL-6により３匹のラマを免疫した。免疫用に、適当な動物にやさしい補助剤との乳剤として抗原を製剤化した（Specoll, CEDI Diagnostics B. V.）。抗体は、首の筋肉内にダブルスポット注射で投与した。各動物に、１００μgのIL-6を含む乳剤を２本注射し、続いて５０μgの抗体を含む注射を１週間間隔でした。免疫化の間の異なった時点で動物から１０mlの血液試料を回収し、血清を調製した。抗原特異的体液免疫反応の誘導は、固定化したIL-6を用いたELISAに基づく実験で血清サンプルを用いて確認した。最後の免疫から５日後、１５０mlの血液試料を採取した。末梢血リンパ球（PBL）を、ラマ重鎖免疫グロブリン（HcAbs）の遺伝源として、血液試料１５０mlからFicoll-Paque勾配（Amersham Biosciences）を用いて単離し、5×108個のPBLを得た。抗体の最大多様性は、サンプリングしたＢリンパ球の数、すなわちPBLの数の約１０％に等しいことが予想される（5×107個）。ラマにおける重鎖抗体の割合は、Ｂリンパ球の数の２０％までである。従って、血液試料１５０ml中のHcAbの最大多様性は、107個の異なる分子として計算する。
【実施例２】
【０６８６】
ヒトIL6で免疫したラマ由来のナノボディーズ（登録商標）のクローニング
ヒトIL6で免疫したラマ由来のナノボディーズ（登録商標）のクローニングは、後述の２つの方法のうち１つを用いて行った。
ａ）ファージディスプレイと組み合わせたレパートリークローニング
「レパートリークローニング」および「ファージディスプレイ」技術は、免疫グロブリン配列のクローニングに使用可能で、例えば、欧州特許第０５８９８７７号明細書、米国特許第６２４８５１６号明細書および Reiterら、(1999)に記載してある。一般的には、免疫グロブリン配列（以下「バインダー」とも言及する）の選択およびクローニングは、以下の工程を含むこれらの技法による。
ａ） ChomczynskiおよびSacchi（1987）記載の方法を用いて、細胞から「全」mRNAを提供する工程。ここで、前記細胞は、動物（例えばＢ細胞）からの全免疫レパートリーを発現可能であり、前記mRNAは前記動物の全免疫レパートリーを含む。
ｂ）オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを用いてMMLV逆転写酵素（Superscript III, Invitrogen）により、前記mRNAからcDNAを合成する工程。
ｃ）免疫レパートリーをコードするヌクレオチド配列を、特異的プライマー（欧州特許第０３６８６８４号明細書；国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット）を用いて選択的に増幅する工程。１回目のPCRでは、従来の抗体遺伝子セグメント（１．６kb）と重鎖抗体遺伝子セグメント（１．３kb）抗体遺伝子両方のレパートリーは、リーダー特異的プライマーおよびオリゴd(T)プライマーを用いて増幅させる。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離する。増幅した重鎖抗体セグメントをコードする１．３kb断片をアガロースゲルから精製し、Sfil制限酵素部位を含むFR1特異プライマーおよびオリゴd(T)プライマーを用いたネステッドPCRの鋳型として用いる。次に、SfiIおよびBstEII（FR４に天然に存在する）でPCR産物を消化する。
ｄ）前記増幅配列がコードするバインダーを表面に発現するファージ粒子を調製する工程。適当な微生物、例えば大腸菌を用い、ゲル電気泳動の後、約４００塩基対のDNA断片をゲルから精製し、増幅したVHHレパートリー３３０ngを、ファージミドベクターの１つの微生物の対応する制限酵素部位に連結して、大腸菌TGlをエレクトロポレーション後ライブラリーを得る。ファージミドベクターにより、遺伝子III産物との融合タンパク質として個々のVHHを発現するファージ粒子の生成が可能となる。
ｅ）IL-6と結合可能なバインダー配列を発現するファージ粒子を選択する工程。０から１nMの異なる濃度のビオチン化IL-6を、０．１％カゼインおよび０．１％Tween-20を含むPBS中でファージ１０μlと培養した。室温で一時間培養後、試料を、ストレプトアビジン５μg/mlで被膜し、引き続き１％カゼインを含むPBSにより室温で３時間ブロックしたマイクロタイタープレートウェルに移す。５分間培養後、ウェルをPBS-Tweenで１０回洗浄し、PBSで１０回洗浄した。１mg/mlトリプシンを添加してファージを溶出し、次に３７℃で３０分間培養するか、または抗IL6抗体CLB8（Sanquin、Amsterdam）およびBE-8（Diaclone）の混合物１００μgを添加して次に４℃で一晩培養する。溶出したファージを、指数関数的に増殖しているTGl細胞に感染させ、次に１００μg/mlアンピシリンおよび２％グルコースを含むLB寒天プレートに蒔く。
【実施例３】
【０６８７】
周辺質抽出物のクローニング、発現および調製
抗IL-6ナノボディーズをコードするDNA断片を、SfilおよびBsteIIで消化し、pAX051の対応する制限酵素部位に連結した。次に、連結混合物をTGlエレクトロコンピテント細胞に形質転換した。カルベニシリン耐性クローンを挿入の存在について解析し、陽性クローンをグリセロールストックとして−８０℃で保存した。
【０６８８】
タンパク質を発現させるために、ナノボディを発現しているクローンを、カルベニシリン（１００μg/ml）および２％グルコースを含むLB培地に播種し、３７℃で一晩培養する。このスターター培養物を用いて、１／１００希釈で生産培地に播種する（TB培地＋カルベニシリン（１００μg/ml）プラス０．１％グルコース）。３７℃で３時間培養した後、IPTG（最終濃度１mM）を添加してナノボディの発現を誘導する。タンパク質を４時間発現させ続け、遠心分離により細胞を回収し、湿潤細胞ペーストとして−２０℃で保存する。
【０６８９】
−２０℃で保存した湿潤細胞ペーストの周辺質抽出物は、ペレットをPBSに懸濁し、遠心分離して細胞をペレット状にして調製する。周辺質画分を示す上清を取り除き、更なる実験に用いた。
【実施例４】
【０６９０】
阻害性抗IL6ナノボディーズの同定
IL6およびIL6Rの間の相互作用を阻害可能なナノボディーズは、Alphascreenにより同定した。この分析において、抗IL6ナノボディを発現している大腸菌細胞から調製した周辺質抽出物（２５倍希釈）を、３８４ウェルプレートで１５分間、３nMのビオチン化ヒトIL6と共にインキュベートした。次に、IL6R（１nM）と抗IL6 RMAb BN-12（Diaclone）で被膜したアクセプタービーズ（２０μg/ml）の混合物を添加し、３０分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンで被膜したドナービーズ（２０μg/ml）を添加した。１時間インキュベートした後、Envision Alphascreen reader（PerkinElmer）でプレートを読み取った。
【０６９１】
IL6のgpl30結合部位に対するナノボディーズは、MAbs BE4（Diaclone）およびCLB 16（Sanquin, Amsterdam）を利用した間接的なAlphascreen分析により同定した。これら２個の抗IL6抗体がgp130結合部位IIおよびIIIをそれぞれ認識する。この分析において、周辺質抽出物を１nMのビオチン化IL6で１５分間インキュベートした。BE-4またはCLB16いずれかで被膜したアクセプタービーズ（２０μg/ml）を加え、３０分後にストレプトアビジンで被膜したドナービーズ（２０μg/ml）を加えた。反応混合物を１時間インキュベートし、次にEnvison Alphascreen reader（PerkinElmer）で読み取った。
【実施例５】
【０６９２】
ビアコア上での抗IL6ナノボディーズのオフ率分析
ナノボディーズとIL6の結合のオフ率分析は、 ビアコア３０００機器による表面プラスモン共鳴法で行った。組換えヒトIL6は、〜５００RUの密度でアミン結合を介してCM5センサーチップ に共有結合させた。残りの反応基は、不活性化した。抗IL6ナノボディーズを発現している大腸菌細胞から調製した周辺質抽出物を１０または１５倍に希釈し、４分間注入してチップに固定化したIL6と結合させた。ナノボディを含まない緩衝液を３０分間チップに送り、結合したナノボディを自然解離させた。解離相を用いて各ナノボディのkoff値を計算した（表Ｂ−１）。
【０６９３】
表Ｂ−１：一価抗IL6ナノボディーズのオフ率
【表２８】
2009529339.tif 000037
【実施例６】
【０６９４】
ナノボディーズの精製
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）により、周辺質抽出物からHis６タグナノボディーズを精製する。TALON樹脂（Clontech）は、メーカーの使用説明書に従い処理する。実施例３記載のように調製した周辺質抽出物は、該樹脂と３０分間室温にてローター上でインキュベートする。該樹脂をPBSで洗浄し、カラムに移す。充填した樹脂を１５mMイミダゾールで洗浄する。１５０mMイミダゾールを用いて、ナノボディーズをカラムから溶出する。溶出した画分をHybond Membraneにスポットし、Ponceauで可視化して解析する。タンパク質を含む画分を貯め、PBSで透析する。透析したタンパク質を回収し、ろ過滅菌し、濃度を測定し−２０℃で保存する。
【実施例７】
【０６９５】
SDS-PAGE分析
純度を決定するために、タンパク質試料を１５％SDS-PAGEゲルで解析した。Laemmli試料緩衝液１０μlを精製タンパク質１０μl（１μg）に加え、該試料を９５℃で１０分間加熱し、冷却して１５％ SDS-PAGEゲルに添加した。ゲルは、一般的な方法に従い処理し、クーマシーブリリアントブルー（CBB）で染色した。図１に、一価および二価抗IL6ナノボディーズのSDS-PAGEを示す。
【実施例８】
【０６９６】
発現レベル
表Ｂ−２に、各種一価および多価ナノボディーズに対して計算した発現レベルを記載する。
【０６９７】
表Ｂ−２：培地１L当りのタンパク質mgで示す各種ナノボディーズの発現レベル
【表２９】
2009529339.tif 000038
【実施例９】
【０６９８】
AlphacreenにおけるIL6R結合部位を標的とする一価ナノボディーズの評価
Alphascreenにおいて、精製したナノボディーズ試料であるPMP6B6、PMP7G5、PMP7G9およびPMP7G4の、IL6およびIL6Rの間の相互作用を阻害する能力を解析した。この解析では、３８４ウェルプレートで、１μM〜１０pMに渡る各種濃度の抗IL6ナノボディーズを３nMのビオチン化ヒトIL6と共に１５分間インキュベートした。次に、IL6R（１nM）と抗IL-6R MAb BN-12（Diaclone）で被膜したアクセプタービーズ（２０μg/ml）との混合物を加えて３０分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンで被膜したドナービーズ（２０μg/ml）を加えた。１時間インキュベートした後、Envision AlphaScreen reader（PerkinElmer）でプレートを読み取った。実験はすべて重複して行った。図２に阻害曲線およびIC50値を示す。
【実施例１０】
【０６９９】
B9分析による一価抗IL6ナノボディーズの解析
B9分析により、精製したナノボディーズ試料であるPMP10A6、PMP21B4、PMP17B11、PMP10C4、PMP17C4、PMP21E7、PMP13F12、PMP21H1、PMP6E10、PMP6B12、PMP6B6、PMP7G5、PMP7G9およびPMP7G4を試験した。この増殖分析にはマウス融合細胞株細胞B9を用い、本質的にAardenら（Eur J Immunol. 17 (1987):1411-1416）の記載のように行った。図３および４に阻害曲線およびIC50値を示す。
【実施例１１】
【０７００】
多価ナノボディーズの構築.
阻害性抗IL6ナノボディーズのサブセットを用いて多価ナノボディーズを構築した。構成要素間のスペーサーとして、９アミノ酸Gly／Serリンカー（配列番号１６４）または対応する２５アミノ酸Gly／Serリンカーのいずれかを使用した。図Ｂ−３に作成した構築物を示す（配列番号３７１〜４４７）。
【実施例１２】
【０７０１】
ヒト化
PCRオーバーラップ伸長法（Stemmerら、1995）により、ヒト化バージョンのナノボディーズ（登録商標）をコードするDNA断片をオリゴヌクレオチドから構築する。
【０７０２】
ｉ）Alphascreenでの拮抗作用
ヒト化クローンは、Alphascreenで、IL6／IL6R相互作用および／またはIL-6／IL-6R複合体／gpl30相互作用の阻害を試験する。精製タンパク質の系列希釈（濃度範囲：５００nM〜１０pM）をIL-6（０．３nM）に加えて１５分間インキュベートする。次に、３nM bio-IL6Rまたはbio-gpl30およびBN12被膜アクセプタービーズを加えて、この混合物を１時間インキュベートする。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを加え、インキュベート１時間後にEnvision microplate readerでプレートを読み取る。
【０７０３】
ｉｉ）温度安定性試験 
ヒト化クローンに対する温度安定性試験を行う。試料を２００μg/mlに希釈し、６０μlを含む５×２の定量に分ける。別々のバイアルをそれぞれ３７℃〜９０℃の所定の温度（３７℃、５０℃、７０℃および９０℃）で１時間インキュベートする（蓋の温度：１０５℃）（対照は４℃で保存）。その後、試料を２５℃で２時間保持し（ランプ速度：０，０５）、４℃で一晩保存する。１４．０００rpmで３０分間遠心分離して沈殿物を除去する。上清を慎重に取り除き、更に解析する。２８０nmのODで測定し、吸光係数に基づき濃度を計算する。
【０７０４】
表Ｂ−3：配列表
【表３０−１】
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【表３０−２】
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【表３０−３】
2009529339.tif 000041
【表３０−４】
2009529339.tif 000042
【表３０−５】
2009529339.tif 000043
【表３０−６】
2009529339.tif 000044
【表３０−７】
2009529339.tif 000045
【表３０−８】
2009529339.tif 000046
【表３０−９】
2009529339.tif 000047
【表３０−１０】
2009529339.tif 000048
【表３０−１１】
2009529339.tif 000049
【表３０−１２】
2009529339.tif 000050
【表３０−１３】
2009529339.tif 000051
【表３０−１４】
2009529339.tif 000052
【表３０−１５】
2009529339.tif 000053
【表３０−１６】
2009529339.tif 000054
【表３０−１７】
2009529339.tif 000055
【表３０−１８】
2009529339.tif 000056
【表３０−１９】
2009529339.tif 000057
【表３０−２０】
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【表３０−２１】
2009529339.tif 000059
【表３０−２２】
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【図面の簡単な説明】
【０７０５】
本発明を、更に以下の非限定的な実施例および図面により説明する。以下に図面を示す。
【図１】抗IL6ナノボディーズのSDS-PAGE分析
【図２】AlphascreenにおけるIL6結合部位に対するナノボディーズの評価
【図３】B9分析によるgpl30結合部位に対するナノボディーズの評価
【図４】B9分析によるIL6R結合部位に対するナノボディーズの評価
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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