(57)【要約】  本発明は、上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結（ＧＥ）配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有し、外来遺伝子配列が、少なくとも３個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、これらのアミノ酸をコードするコドンのヌクレオチド配列が、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しない、組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを産生するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結（ＧＥ）配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを作製する方法であり、外来遺伝子配列は、少なくとも３個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、該一続きはアルギニン（Ａｒｇ）及び／又はリジン（Ｌｙｓ）残基からなり、並びに少なくとも１個のリジンを含有するタンパク質をコードし、外来遺伝子のヌクレオチド配列は、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しないように選択されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
修飾された外来遺伝子配列を作製するために、少なくとも３個の塩基性アミノ酸の前記一続きをコードする野生型外来遺伝子配列の一部が、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る何れの配列も除去するための部位特異的突然変異誘発により修飾されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
野生型外来遺伝子配列に元来存在するｔ／ａＧＡＡＡＡ配列内で、少なくとも１つの突然変異が導入されており、それによりアデニンストレッチ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｔｒｅｔｃｈ）の「Ａ」が別のヌクレオチドにより置換されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
突然変異がサイレントであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのａａａコドンがａａｇコドンにより置換されることを特徴とする、請求項３から４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの点突然変異が行われることを特徴とする、請求項３から５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つのａａａコドンがａａｇコドンにより置換されることを特徴とする、請求項３から６に記載の方法。
【請求項８】
コード配列ａｇａ  ａｇａ  ａａａ  ａａａがコード配列ａｇｇ  ａｇｇ  ａａｇ  ａａｇにより置換されることを特徴とする、請求項３から７に記載の方法。
【請求項９】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ベクターであり、並びに外来遺伝子が病原性Ｈ５鳥インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１から８に記載の方法。
【請求項１０】
上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結（ＧＥ）配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、外来遺伝子が、少なくとも３個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、該一続きはアルギニン（Ａｒｇ）及び／又はリジン（Ｌｙｓ）残基からなり、並びに少なくとも１個のリジンを含有するタンパク質をコードし、外来遺伝子が遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しないことを特徴とする、組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１１】
外来遺伝子が病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードし、塩基性アミノ酸の一続きが少なくとも２個のリジンアミノ酸を連続して含有し、並びにこれらのリジンの少なくとも１個がコドンａａｇによりコードされることを特徴とする、請求項１０に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１２】
塩基性アミノ酸の一続きが、ヌクレオチド配列ａｇｇａａｇａａｇによりコードされるアミノ酸配列Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓを含有することを特徴とする、請求項１０から１１に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項１３】
請求項１０から１２の何れかに記載の組み換えＭＶウイルスベクター及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む病原性微生物に対するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結（ＧＥ）配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターに関する。本発明はさらに、このような組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターの作製のための方法及びこのような組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染宿主中で複製することができる生ウイルスは、その発現された抗原に対して強く長期間持続する免疫反応を誘導する。これらは、液性及び細胞介在性免疫反応の両方ならびに刺激性のサイトカイン及びケモカイン経路を誘導するのに有効である。したがって、弱毒化生ウイルスは、通常は免疫系の液性反応のみを大きく刺激する、不活性化又はサブユニット免疫原の何れかに基づくワクチン組成物を凌ぐ独特の長所を与える。
【０００３】
過去１０年間にわたり、組み換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルス両方のゲノムの遺伝子操作の分野を大きく変革させてきた。特に、現在、宿主動物での新しいベクターウイルスの複製において、宿主動物で生物学的効果を及ぼすことができる外来タンパク質が発現されるように、ウイルスのゲノムに外来遺伝子を導入することが可能である。このように、微生物感染の制御及び予防のためだけでなく、悪性腫瘍などの非微生物疾患に対して、及び遺伝子治療において標的治療を講じるためにも、組み換えベクターウイルスが開発されてきた。
【０００４】
１９９４年（Ｓｃｈｎｅｌｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３、４１９５−４２０３、１９９４）に最初に報告された「逆遺伝学」と呼ばれる技術による、完全にクローン化ｃＤＮＡ由来の非分節ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス（モノネガウイルス目のウイルス）の生成により、ベクターとして、モノネガウイルス目（ＭＶ）のウイルスも使用できるようになった。このときから、その病原体に対するワクチンの開発において、病原性動物由来の外来抗原を発現させるためにウイルスベクターとしてＭＶ目の多くのウイルスを使用することを述べる研究が発表されてきた。
【０００５】
モノネガウイルス目は、４種類の主な科：パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科に分類される。これらの科に属するウイルスは、１本鎖のネガティブ（−）センスＲＮＡ分子により表されるゲノムを有し、即ち、ＲＮＡゲノムの極性は、プラス（＋）センスと呼ばれるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の極性とは反対である。主なヒト及び脊椎動物ＭＶウイルスの分類を下記の表で示す。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
ＭＶ目のウイルスのゲノム構成及び生活環の詳細は、現在よく分かっており、様々な著者による概説がある（Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３、２６３５−２６６２、２００２；Ｗｈｅｌａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３、６３−１１９、２００４；Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３、１−４１、２００４）。モノネガウイルス目ウイルスは、様々な宿主及び個別の形態学的及び生物学的特性を有するが、ゲノム構成及び複製及び遺伝子発現のそれらの典型的様式に必須の因子など、これらは共通の多くの特性を有し、この事実からこれらが共通の祖先由来であることが示される。これらは、細胞の細胞質において複製し、スプライシングされないｍＲＮＡを生成するエンベロープウイルスである。
【０００８】
モノネガウイルス目ウイルスは、２つの主な機能単位、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及びエンベロープからなる。上述の全ての科の属の代表的ウイルスに対して完全なゲノム配列が決定されている。ゲノムは、約９．０００ヌクレオチドから約１９．０００のサイズの範囲であり、これらは、５から１０個の遺伝子を含有する。ＭＶウイルスのゲノムの構造及び構成は非常に類似しており、それらの特定の遺伝子発現形式により支配されている。ＭＶウイルスゲノムは全て、核タンパク質（Ｎ又はＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードする３つのコア遺伝子を含む。ウイルスのエンベロープは、ウイルスの集合／出芽において、ならびにウイルスの細胞付着及び／又は侵入に関与する、マトリックス（Ｍ）タンパク質及び１以上の膜貫通糖タンパク質（例えばＧ、ＨＮ及びＦタンパク質）から構成される。属によって、タンパク質レパートリーは、転写及びウイルス複製においてある種の特異的な制御機能を示す、又はウイルス宿主反応に関与する（例えばＣ、Ｖ及びＮＳタンパク質）、アクセサリータンパク質により拡大される。ＭＶウイルスの遺伝子順序は非常によく保存されており、３’末端もしくはこの付近にコア遺伝子Ｎ及びＰがあり、５’遠位にラージ（ｌａｒｇｅ）（Ｌ）遺伝子がある。表面糖タンパク質遺伝子であるＭならびにその他のアクセサリー遺伝子は、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子間に位置する。
【０００９】
ＲＮＰ複合体において、ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡはＮタンパク質により固くカプシド被覆されており、Ｌ及びＰタンパク質からなるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと会合している。細胞の感染後、ＲＮＰ複合体（裸のＲＮＡゲノムではない。）は、２つの個別のＲＮＡ合成機能（即ち、サブゲノムｍＲＮＡの転写及び全長ゲノムＲＮＡの複製）のための鋳型となる。
【００１０】
タンデムに並んだ遺伝子の全てが、「遺伝子ジャンクション」と呼ばれる構造により分けられている。遺伝子ジャンクションは、保存された「遺伝子終結」（ＧＥ）配列、非転写「遺伝子間領域」（ＩＧＲ）及び保存された「遺伝子開始」（ＧＳ）配列を含む。これらの配列は、遺伝子転写に対して必要十分である。最初のＧＳ配列のゲノムＲＮＡの３’末端で転写プロセスを開始させるウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、転写の間、各遺伝子は連続してｍＲＮＡに転写される。各遺伝子ジャンクションにおいて、ＧＥ配列でのＲＮＡポリメラーゼの離脱の結果として転写が中断される。効率は低下するが、続くＧＳ配列で転写が再開する。「終結−開始」プロセスとも呼ばれるこのプロセス中断の結果、続く下流遺伝子よりもＭＶウイルスゲノムの３’近位遺伝子がよく転写され、その結果として各遺伝子ジャンクションで転写の減衰が起こる。各遺伝子が個別のシストロン又は転写単位の一部である、ＭＶウイルス遺伝子の転写のモジュラー型により、これらのウイルスが外来遺伝子の挿入及び発現に非常に適切となる。ＭＶウイルスゲノムにおける各転写単位は、次のエレメント：３’−ＧＳ−オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）−ＧＥ−５’を含む。
【００１１】
３’−及び５’−ゲノム末端で、ＭＶウイルスゲノムは全て、それぞれ「リーダー」（約４０−５０ｎｔ）及び「トレイラー」（約２０−６００ｎｔ）と呼ばれる短い非転写領域を有する。リーダー及びトレイラー配列は、ゲノムＲＮＡの複製、ウイルスのカプシド被覆及びパッケージングを調節する必須の配列である。
【００１２】
逆遺伝学技術及び感染性ＭＶウイルスのレスキューによって、そのｃＤＮＡコピーを通じてそのＲＮＡゲノムを操作できるようになった。ウイルスＲＮＡを合成するために必要とされる最小複製開始複合体は、ＲＮＰ複合体である。（抗）ゲノムＲＮＡ及び（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼ駆動プラスミドからの適切なサポートタンパク質の細胞内同時発現により、感染性ＭＶウイルスをレスキューすることができる。１９９４年のＳｃｈｎｅｌｌら、１９９４（前出）による最初の報告以来、オリジナルのプロトコール（又は僅かな変更のあるその変法）に基づき、多くのＭＶウイルス種が確実に回収された。
【００１３】
ニューキャッスル病及び鳥インフルエンザは、家禽の重大な疾患であり、世界中の養鶏業において重大な経済的損失を生じさせ得る。ニューキャッスル病ウイルスは、ＭＶ目内の非分節ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスである。このゲノムは、長さ約１５ｋｂであり、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質及びＶタンパク質（Ｐ／Ｖ）、マトリックス（Ｍ）タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はラージ（ｌａｒｇｅ）（Ｌ）タンパク質をコードする６個の遺伝子を含有する。ＮＤＶ遺伝子は、３’−ＮＰ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’の順序で連続して並んでおり、様々な長さの遺伝子間領域により分かれている。遺伝子は全て、遺伝子開始（ＧＳ）配列が先行し、続いて非コード領域、ＮＤＶタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、第二の非コード領域及び遺伝子終結（ＧＥ）配列が続く。ＮＤＶゲノムの長さは、外来遺伝子の導入が考慮されなければならないので６の倍数である。
【００１４】
鳥インフルエンザ（ＡＩ）は、軽度の呼吸徴候から高い死亡率の重症疾患を特徴とする家禽の疾患である。病原体は、オルトミクソウイルス科に属する、鳥インフルエンザＡウイルス（ＡＩＶ）である。ＡＩＶは、１０個のタンパク質をコードするネガティブ極性のの８個のゲノムＲＮＡセグメントを含有する。表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）の抗原性に基づき、ＡＩウイルスがサブタイプに分類された。現在まで、１６種類のヘマグルチニン（Ｈ１−Ｈ１６）及び９種類のノイラミニダーゼ（Ｎ１−Ｎ９）サブタイプが知られている。Ｈ及びＮに対する抗体は液性免疫反応において重要であり、感染を阻害するか又は疾患を予防する。
【００１５】
鳥インフルエンザ及びニューキャッスル病ウイルスは、それらの毒性により、２種類の個別の病原型にグループ化することができる。低病原性ＡＩＶ（ＬＰＡＩ）又は弱毒性ＮＤＶにより引き起こされる症状は、関連性が低いと考えられる。一方、高毒性のウイルスにより引き起こされる高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）及びニューキャッスル病（ＮＤＶ：中等毒性及び強毒性株）は法定疾患である。
【００１６】
弱毒性ＮＤＶ株でのＮＤＶに対する通常のワクチン接種が高毒性ＮＤＶ株からニワトリを保護するために行われる一方、ＨＰＡＩは撲滅ストラテジーにより制御されるので、ＨＰＡＩに対するワクチン接種は殆どの国で行われていない。しかし、損失を最小限に抑え、疾患の発生を低下させるためのストラテジーとしてワクチン接種を使用し得る。ワクチンにより誘導される免疫はサブタイプ特異的であり、これは、サブタイプＨ５ワクチンがＨ５  ＡＩＶを防御できるが、その他のＨサブタイプを防御できないことを意味する。通常、インフルエンザウイルス複製は肺に限定されるが、これは、肺に限定されるトリプターゼＣｌａｒａ、セリンプロテアーゼによってのみＬＰＡＩウイルスのヘマグルチニンが切断され得るからである。今までのところ、全てのＨＰＡＩウイルスは、Ｈ５及びＨ７サブタイプのものであった。これらのＨＰＡＩウイルスは、ユビキタスなフリン及びサブチリシン様酵素によりサブユニットＨＡ１及びＨＡ２へと切断され得るように、Ｈ切断部位において複数の塩基性アミノ酸を含有する。したがって、このようなウイルスをその他の生物中で増殖させることができる。
【００１７】
サブタイプＨ５及びＨ７ワクチンは、ＨＰＡＩによる感染後の臨床徴候及び死亡が起こらないようにニワトリ及びシチメンチョウに対して防御効果を与えることができる。従来の不活性油を利用したＡＩＶ全体に加えて、ベクターウイルス、サブユニットタンパク質及びＤＮＡワクチンがＡＩに対する免疫付与に有効であることが実験的に示されてきた。様々なウイルスに対する逆遺伝学の出現以来、ワクチンベクターとしての使用のための組み換えウイルスの生成は、重要な適用となっている。外来タンパク質を発現する様々な組み換えネガティブ鎖ＲＮＡウイルスが構築されてきた。また、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）（Ｌｕｓｃｈｏｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９、４２４９−５９、２００１）、牛疫ウイルス（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、１０１６５−７５、２０００）及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２４７、４７０４−１１、１９９８）のような様々なベクターウイルスにＡＩＶのヘマグルチニンが挿入された。また、ＡＩＶヘマグルチニンの発現のためにＮＤＶが使用された。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３のヘマグルチニン遺伝子をＮＤＶ株ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１のＰ及びＭ遺伝子の間に挿入した。この組み換えにより、マウスの検出可能な体重低下はあったものの、１０日以内に完全に回復し、致死性感染からマウスが保護された。Ｎａｋａｙａら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５、１１８６８−７３、２００１）。外来遺伝子に対して同じ挿入部位を有するさらなる組み換えＮＤＶがＬＰＡＩのＨ７を発現したが、強毒性ＮＤＶ及びＨＰＡＩの両方が防御されたのはワクチン接種されたニワトリのうち４０％のみであった（Ｓｗａｙｎｅら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４７、１０４７−５０、２００３）。
【００１８】
前駆タンパク質（ＨＡ０）としてインフルエンザＨＡタンパク質が合成される。前駆ポリペプチドＨＡ０は、保存されているアルギニン（Ａｒｇ）残基において翻訳後に２個のサブユニット、ＨＡ１及びＨＡ２に切断される。この切断は、ウイルスの感染性に関与する（ＨＡ前駆体が効率的に切断されるほど、ウイルスの毒性が強くなると思われる。）。様々なインフルエンザウイルスのＨＡ１−ＨＡ２ジャンクション領域が分析されてきた。病原性株が、切断部位に隣接する塩基性アミノ酸の一続きを含有することが発見された。（Ｓｅｎｎｅら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、４０：４２５−４３７、１９９６；Ｓｔｅｉｎｈａｕｓｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５８、１−２０、１９９９；Ｋａｗａｏｋａ及びＷｅｂｓｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、１９８８）。
【００１９】
特に、高病原性ウイルスは、インフルエンザワクチンにより与えられるはずである予防に関して重要である。
【００２０】
しかし、それらの配列中でアミノ酸の塩基性の一続きを有する、これらのタイプのタンパク質、即ち病原性Ｈ５インフルエンザのＨＡタンパク質のようなタンパク質をモノネガウイルス目ベクターに挿入した場合、ある種の問題に直面した。
【００２１】
最初に、遺伝子配列は、ある程度、不安定であると思われた。Ｈ５遺伝子が挿入されたＮＤＶベクター（ＮＤＶＨ５）の数回の卵継代後、アミノ酸の塩基性の一続きをコードする遺伝子配列の部分内で自然発生的な突然変異が起こった。
【００２２】
さらに、塩基性アミノ酸の一続きに対するコード配列は、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルスにより認識される配列を含有する可能性がある。モノネガウイルス目に対するＧＥ配列はＷｈｅｌａｎにより総括されている（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８３、６１−１１９、２００４）。モノネガウイルス目に対するＧＥ配列は、共通の保存的配列：ｎＵＵＵＵを特徴とする。
【００２３】
病原性Ｈ５型鳥インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の切断部位に隣接するものなどの、塩基性アミノ酸の一続きに対するコード配列の部分が、ＧＥ配列としてモノネガウイルス目ベクターのポリメラーゼにより認識されるＧＥ配列に類似することが分かった。これにより、このようなベクターに基づくワクチンの効率に影響を与え得る、全長タンパク質のタンパク質発現のレベルが低下し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、既存のＭＶウイルスベクターよりも、ベクターウイルスのゲノムに挿入された外来遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルが高い及び／又は免疫原性が上昇している組み換えＭＶウイルスベクターを提供することである。
【００２５】
本発明は、この目的が、本発明による組み換えモノネガウイルス目ウイルスにより満たされることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結（ＧＥ）配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有し、外来遺伝子配列が、少なくとも３個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、該一続きがアルギニン（Ａｒｇ）及び／又はリジン（Ｌｙｓ）残基からなり、少なくとも１個のリジンを含有するタンパク質をコードすることを特徴とし、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しないように外来遺伝子のヌクレオチド配列が選択される、組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを作製するための方法を提供する。
【００２７】
遺伝子終結配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列は、モノネガウイルス目の殆どのＧＥ配列に共通する最小保存配列、即ちａ／ｕＣＵＵＵＵ（モノネガウイルスに対するゲノムのセンスであるネガティブセンスにおいて）を包含する配列である。ポジティブセンスにおいて（ｃＤＮＡレベル）、このモチーフはｔ／ａＧＡＡＡＡ）である。
【００２８】
使用される特定のモノネガウイルス目ベクターについて、当技術分野で公知の特定のＧＥ配列が適合する（Ｗｈｅｌａｎら、前出）。ＮＤＶについて、例えば、Ｗｈｅｌａｎで挙げられるＧＥ配列はａａｕｃＵＵＵＵＵＵｕである。（−センス、これは、モノネガウイルス目に対するゲノムのセンスである。）。従って、＋センス（ｃＤＮＡレベル））において、配列は、アデニン残基：ｇＡＡＡＡＡＡの一続きを特徴とする。
【００２９】
本発明によるベクターにおいて、このようなＧＥ配列は外来タンパク質のコード配列内では生じない。
【００３０】
この目的を達成するために当業者に受け入れられるいくつかのオプションがある。本質的に、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しない外来配列を選択することができる。
【００３１】
例えば、外来遺伝子配列がウイルスタンパク質をコードする場合、このタンパク質をコードする遺伝子（このコード配列は潜在的ＧＥ配列を包含しない。（一方、ウイルスの別の株において同じ遺伝子が包含する。））を本質的に担うウイルスの株から外来遺伝子が得られ得る。
【００３２】
しかし、このような変異体遺伝子配列が野生型ウイルスから得られ得る機会は少ないので、潜在的ＧＥ配列がもはや存在しないような程度に配列を変化させるために部位特異的突然変異誘発によって外来遺伝子の野生型配列を突然変異させることが好ましい。
【００３３】
外来遺伝子がタンパク質をコードしている得られた組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター（タンパク質は、アルギニン（Ａｒｇ）及び／又はリジン（Ｌｙｓ）残基からなり少なくとも１個のリジンを含有する少なくとも３個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、外来遺伝子は、遺伝子終結（ＧＥ）配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しない。）は同様に本発明の一部である。
【００３４】
修飾される必要がある外来遺伝子の部分（特に外来タンパク質が病原性Ｈ５鳥インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質である場合）は、少なくとも３個の塩基性アミノ酸の一続きをコードする野生型外来遺伝子配列の部分であり得る。
【００３５】
塩基性アミノ酸の一続きは、リジン（一文字コード：Ｋ）及びアルギニン（一文字コード：Ｒ）（ここで少なくとも１つのアミノ酸残基がリジンである。）からなる群から選択される少なくとも３個のアミノ酸を包含するものとして定義される。
【００３６】
これには配列ＫＫＫ及び２個のＫと１個のＲの組み合わせ（ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ）及び１個のＫと２個のＲの組み合わせ（ＫＲＲ、ＲＫＲ及びＲＲＫ）が含まれるが、本明細書中で述べられる特定の３個のアミノ酸配列を含む塩基性アミノ酸のより長い一続きも含まれる。Ｓｔｅｉｎｈａｕｓｅｒら（前出）から分かるように、病原性インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質において切断部位に隣接する塩基性アミノ酸の一続きは、より長いものであり得、ＲＲＫＫＲ又はＲＲＲＫＫのような配列が含まれ得る。
【００３７】
リジンをコードするコドンは、ａａａ及びａａｇであり、一方、アルギニンをコードするコドンはａｇａ及びａｇｇを含む。特にＨ５病原性鳥インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対するコード配列において、そのタンパク質の切断部位に隣接するアミノ酸の塩基性の一続きをコードするコード配列は、ＧＥモチーフｔ／ａＧＡＡＡＡを含有し得る。
【００３８】
野生型外来遺伝子内に存在するＧＥ配列を修飾するために、少なくとも１個の突然変異が導入され得、それにより、元来野生型外来遺伝子配列に存在する共通モチーフ（ｔ／ａＧＡＡＡＡ）を有するＧＥ配列内のアデニンストレッチの「Ａ」が別のヌクレオチドにより置換される。
【００３９】
実際に、ＧＥ配列として認識される配列の一部である「ａａａａ」トラクトにおいて突然変異が導入される場合、アデニンヌクレオチドの少なくとも１個は、別のヌクレオチドで置換されなければならない（例えばグアニジン（「ｇ」））。
【００４０】
部位特異的突然変異誘発により配列を変化させる場合、これらの変更は、好ましくはサイレントである（突然変異がアミノ酸レベルで突然変異を導かないことを意味する。）。しかし、アミノ酸レベルで保存的突然変異に導く核酸レベルでの突然変異（１個の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で置換されることを意味し、例えばＬがＲになるか又はＲがＬになるか。）もまた許容可能であり得る。例えば、アミノ酸の塩基性の一続きをコードする野生型遺伝子配列の部分において、少なくとも１個のリジン残基がコドン「ａａａ」によりコードされる場合、本発明のベクターに挿入される修飾外来遺伝子においてこのコドンは「ａａｇ」に突然変異され得る。又は、野生型配列において、アミノ酸の塩基性ストレッチの部分を形成する特定のアルギニン残基が「ａｇａ」によりコードされる場合、このコドンは、本発明によるベクターの部分が形成されるように、遺伝子において「ａｇｇ」へと突然変異され得る。
【００４１】
野生型配列中の少なくとも１個の「ａａａ」コドン（リジンをコードする。）は、本発明のベクターに組み込まれる修飾外来遺伝子配列を生成するために突然変異され得る。このような突然変異には、「ａａｇ」コドンによる「ａａａ」コドンの置換が含まれ得る。例えば、塩基性アミノ酸の一続きが少なくとも２個のリジンアミノ酸を連続して含有する場合、及びこれらのリジンの少なくとも１個がコドン「ａａｇ」によりコードされるベクターが好ましい場合、しかし、２以上の突然変異が行われ得る。例えば、コード配列が２個の「ａａａ」コドンを連続して含有する場合、両者とも「ａａｇ」コドンにより置換され得る。
【００４２】
特に、得られるベクターが所望の安定性を有するために、少なくとも２個の突然変異が外来遺伝子に導入されることが好ましい。外来遺伝子が２個の「ａａａ」コドンを連続して含有する場合、好ましくは両者とも突然変異され、代わりにａａｇコドンにより置換され得る。
【００４３】
塩基性アミノ酸をコードする３又は４個の連続的なコドンのそれぞれにおいてアミノ酸の塩基性ストレッチをコードする外来遺伝子の部分が１個の突然変異を含有するベクターを用いて、よい結果が得られた。塩基性ストレッチが３個のアミノ酸のみを包含する場合、３個の突然変異が行われ得るが、４以上の塩基性アミノ酸がある場合、さらなる突然変異が行われ得る。
【００４４】
例えば、野生型配列がヌクレオチド配列ａｇａ  ａｇａ  ａａａ  ａａａ（＋センス配列、潜在的ＧＥ配列モチーフに下線を付す。）によりコードされるアミノ酸配列  ＲＲＫＫを含有する場合、このコード配列は、ａｇｇ  ａｇｇ  ａａｇ  ａａｇ（これは依然としてＲＲＫＫをコードする。）に突然変異され得る。
【００４５】
モノネガウイルス目ウイルスベクターは好ましくはニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ベクターであり、外来遺伝子は病原性Ｈ５鳥インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質である。
【００４６】
病原性Ｈ５鳥インフルエンザの修飾されたＨＡ遺伝子が組み込まれているＮＤＶベクターを用いて、よい結果が得られた（ＮＤＶＨ５ｍ）。
【００４７】
ＨＡ遺伝子が、ＮＤＶベクターのＮＤＶ融合（Ｆ）とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間の遺伝子間領域に組み込まれた。ＨＡ遺伝子は修飾されたＨ５遺伝子であり、ここで、野生型「ａｇａ  ａｇａ  ａａａ  ａａａ」配列は、本発明の方法による「ａｇｇ  ａｇｇ  ａａｇ  ａａｇ」配列に変更された。
【００４８】
このベクターは、非常により多くの全長ＨＡ転写産物を産生し、非常により高いレベルのＨＡを発現し、また、そのエンベロープにより多くのＨＡタンパク質を組み込んだ。
【００４９】
さらに、ＮＤＶＨ５ｍは、１０回を超える卵継代の間、修飾ＨＡ遺伝子を安定的に発現した。ＮＤＶＨ５ｍを用いたニワトリの免疫付与により、それぞれ、ＮＤＶ−及びＡＩＶ  Ｈ５−特異的抗体が誘導され、強毒性ＮＤＶ又は高病原性ＡＩＶの致死量による曝露処置後のニワトリの臨床疾患を防御した。意外なことに、インフルエンザウイルスの出芽は観察されなかった。さらに、ＮＤＶＨ５ｍでの免疫付与によって、ＡＩＶの核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体に基づき、ワクチン接種された動物及びＡＩＶフィールドウイルスに感染した動物の血清学的識別が可能となった。従って、組み換えＮＤＶＨ５ｍは、ＮＤＶ及びＡＩＶに対する二価ワクチンとして適切であり、鳥インフルエンザ（ＡＩ）の制御のためのマーカーワクチンとして使用され得る。
【００５０】
外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えＭＶウイルスベクターの調製のための方法は当技術分野で周知である。
【００５１】
とりわけ、この方法において、単離核酸分子及びＭＶウイルスのゲノムをそれらのｃＤＮＡ型（＋センス）で使用する。これにより、容易に操作しウイルスゲノムへ所望の核酸分子を挿入できるようになる。
【００５２】
一般に、２個の遺伝子間で、即ち遺伝子間領域（ＩＧＲ）で、遺伝子の３’又は５’非コード領域ならびにゲノムの３’プロモーター−隣接（Ｎ／ＮＰ遺伝子の前）又は５’遠位末端（Ｌ遺伝子の後）で、外来遺伝子の挿入のためにゲノムの様々な部分を使用し得る。
【００５３】
Ｎ／ＮＰ遺伝子の前、ＮＰ−Ｐ、Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｇ／Ｆ、Ｇ／Ｆ−ＨＮ、ＨＮ−Ｌの間及びＬ遺伝子の後に、外来遺伝子を有利に挿入し得る。
【００５４】
最も単純な方法は、酵素で切断し適切な転写カセットを導入することによって、これらの部位の１つにおいて既存の制限酵素（ＲＥ）認識配列を使用することである。天然に存在する制限酵素認識配列は必ずしも所望の位置にあるわけではないので、従来どおり部位特異的又はＰＣＲ突然変異誘発により、ゲノムにＲＥ認識部位を導入し得る。
【００５５】
挿入すべき転写カセットの組成は、挿入の部位に依存する。例えば、転写カセットがＩＧＲに挿入される場合、カセットは次のエレメント：３’ＲＥ認識部位−ＧＳ−非コード領域−（外来遺伝子の）ＯＲＦ−非コード領域−ＧＥ−ＲＥ認識部位５’を含み得る。
【００５６】
あるいは、転写カセットが天然のＭＶウイルス遺伝子の５’非コード領域に導入される場合、カセットは、３’ＲＥ認識部位−ＧＥ−ＩＧＲ−ＧＳ−非コード領域−（外来遺伝子の）ＯＲＦ−非コード領域−ＲＥ認識部位５’から構成され得る。
【００５７】
同様に、転写カセットが天然のＭＶウイルス遺伝子の３’非コード領域に導入されるべき場合、カセットは、３’ＲＥ認識部位−非コード領域−（外来遺伝子の）ＯＲＦ−非コード領域−ＧＥ−ＩＧＲ−ＧＳ−ＲＥ認識部位５’から構成され得る。
【００５８】
このような転写カセットの調製及びＭＶウイルスゲノムへのこの挿入は、列挙した参考文献及び本発明の実施例で例示されるものなどの通常の分子生物学的技術しか含まない。特に、この目的に対して、部位特異的及びＰＣＲ突然変異誘発などの技術を使用することができる（Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９、前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編：Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら、Ｗｉｌｅｙ  Ｎ．Ｙ．、１９９５編集、８．５．１．−８．５．９頁；及びＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５４、３７６−３８２、１９８７）。
【００５９】
とりわけ、ＭＶ目の非分節ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの遺伝子修飾を可能にするよく確立された「逆遺伝学」法により、本発明による組み換えＭＶウイルスベクターを調製することができる（例えばＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３、１−４１、２００４；及びＷａｌｐｉｔａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４４、９−１８、２００５により概説される。）。
【００６０】
この方法において、ＭＶ（抗）ゲノム及びサポートタンパク質の転写及び同時発現及び組み換えＭＶベクターの作製を可能にするのに十分な条件下で、全長ゲノム又は、好ましくはＭＶウイルスのアンチゲノム（ポジティブセンス）をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子を含むベクター及び、必要とされるサポートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子を含む１以上のベクターにより、適切な細胞の同時遺伝子移入を行う。この方法において、全長ＭＶウイルス（抗）ゲノムをコードする前記核酸分子は、上記で定義されるようなさらなる転写単位を含む。
【００６１】
ベクターは、このベクターにより遺伝子移入が行われた細胞において連結されるＤＮＡセグメントの複製及びその転写及び／又は発現を起こすような、別のＤＮＡセグメントが連結される、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンを意味する。
【００６２】
好ましくは、全長ゲノムの転写のためのベクターは、その５’末端でＴ７ポリメラーゼプロモーター及びその３’末端で（デルタ肝炎）リボザイム配列に隣接する、ＭＶウイルスの（抗）ゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドであるが、Ｔ３又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用することもできる。
【００６３】
適切なサポートタンパク質の細胞内発現に対して、適切な発現調節配列（例えばＴ７ポリメラーゼプロモーター）の調節下で、好ましくは、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを使用する。
【００６４】
本発明による組み換えＭＶウイルスベクターの調製のための特に好ましい方法において、ＭＶウイルスのＮ（又はＮＰ）、Ｐ及びＬタンパク質をコードする発現プラスミドを使用する。
【００６５】
この逆遺伝学技術で使用される遺伝子移入されたサポートプラスミドの量又は割合は、幅広い範囲にわたる。サポートプラスミド、Ｎ：Ｐ：Ｌに対する割合は約２０：１０：１から１：１：２の範囲であり得、各ウイルスに対する効率的な遺伝子移入プロトコールは当技術分野で公知である。
【００６６】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びリボザイム配列の複合作用により、遺伝子移入が行われた細胞中でゲノムＲＮＡの正確なコピーが生成され、続いて、このＲＮＡが、同時遺伝子移入された発現プラスミドにより与えられるウイルスサポートタンパク質によりパッケージ化され複製される。
【００６７】
遺伝子移入された細胞に感染する組み換えワクシニアウイルスにより、特にワクシニアウイルス  ｖＴＦ７−３、またその他の組み換えポックスベクター（鶏痘ウイルスなど、例えばｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ）により、Ｔ７ポリメラーゼ酵素が与えられることが好ましいか又はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現のために他のウイルスベクターを使用し得る。
【００６８】
ろ過など単純な物理的技術により、ワクシニアウイルスからレスキューされたウイルスの分離を容易に行うことができる。センダイウイルス又はＮＤＶのレスキューのために、孵化卵での遺伝子移入細胞の上清の接種によって、レスキューを行うことができる。
【００６９】
さらにより好ましい実施形態において、（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は必要なサポートタンパク質の１以上を構成的に発現する転写及び発現ベクターの遺伝子移入に対して、細胞株を使用する。
【００７０】
例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及び麻疹ウイルスサポートタンパク質、Ｎ及びＰの両方を発現するヒト胚腎臓細胞株、２９３−３−４６において、麻疹ウイルスのレスキューを行うことができる（Ｒａｄｅｃｋｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４、５７７３−５７８４、１９９５）。本発明において有利に使用できる別の非常に有用な細胞株は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＳＲ細胞、即ち細胞株ＢＳＲ−Ｔ７／５に基づく（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２５１−２５９、１９９９）。
【００７１】
さらに、本発明によるＭＶウイルスの調製のために本明細書中で使用されるべき逆遺伝学技術に関するより詳細な情報はＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．（前出）による概説及び実施例１において開示される。
【００７２】
組み換えＭＶウイルスベクターが外来遺伝子を安定に発現する能力の結果、予防的及び治療的適用の両方に対してベクターが開発されてきた。
【００７３】
本発明による組み換えＭＶウイルスベクターにおいて、特異的ＭＶウイルスベクター種及びベクターウイルスの適用に依存して、外来遺伝子は様々であり得る。
【００７４】
外来遺伝子は、（その他の）微生物病原体（例えば、ウイルス、寄生生物の細菌）抗原をコードし得、特に外来遺伝子は、防御的免疫反応を誘導することができる病原体の抗原をコードする。
【００７５】
例えば、本発明のウイルスベクターに挿入することができる非相同遺伝子配列には、以下に限定されないが、インフルエンザウイルス糖タンパク質遺伝子、特に鳥インフルエンザウイルスのＨ５及びＨ７ヘマグルチニン遺伝子、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、特に（ＩＢＤＶ）のＶＰ２由来の遺伝子、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、狂犬病ウイルス、エールリヒア生物、特にエールリヒア犬、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス及び麻疹ウイルス由来の遺伝子が含まれる。
【００７６】
あるいは、外来遺伝子は、例えばインターロイキンなどのサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α又はＧＭ−ＣＳＦ）を同時発現させることにより、ウイルス感染に対する免疫反応を促進又は調節することができるポリペプチド免疫調節因子をコードし得る。
【００７７】
ＭＶ目には、ヒト及び動物において又は両方において複製することができるウイルスの両方が含まれる（例えば狂犬病ウイルス及びニューキャッスル病ウイルス）。従って、ヒト及び脊椎動物微生物病原体の幅広い範囲から外来遺伝子を選択することができる。
【００７８】
本発明においてベクターウイルスとして全てのＭＶウイルスを使用することができるが、本発明の好ましい実施形態において、組み換えＭＶウイルスベクターはラブドウイルス科のウイルス、好ましくはリッサウイルス属又はノヴィラブドウイルス、より好ましくはそれぞれ狂犬病ウイルス又はＩＨＮＶ種のウイルスである。
【００７９】
また好ましい実施形態において、組み換えＭＶウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスであり、好ましくはレスポウイルス属、特にｈＰＩＶ３又はｂＰＩＶ３種；麻疹ウイルス、特にＣＤＶ種；肺炎ウイルス、特にＲＳＶ種；及びアブラウイルス、特にＮＤＶ種である。
【００８０】
本発明の特に好ましい実施形態において、ウイルスがニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である組み換えＭＶウイルスベクターが提供される。ＮＤＶはヒト及び動物の両方、特に家禽、とりわけニワトリ、で複製可能なので、本発明による組み換えＮＤＶベクターは、病原体の、特に呼吸器病原体の抗原又はヒトもしくはこれらの動物の何れにおいても適切な免疫反応を誘導し得る免疫調節因子をコードする外来遺伝子を含み得る。
【００８１】
Ｐｅｅｔｅｒｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３、５００１−５００９、１９９９）、Ｒｏｅｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｅｒら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０、２９８７−２９９５、１９９９）により、及びＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．（前出）による概説において、ＮＤＶの遺伝子操作のための逆遺伝学的方法が具体的にＮＤＶについて開示されている。さらに、外来遺伝子の発現のために、例えば、ＮＤＶベクターによって感染した動物での免疫反応の誘発のために、ベクターとしてＮＤＶを使用することができることも知られている。（Ｎａｋａｙａら、２００１、前出）及び（Ｓｗａｙｎｅら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４７、１０４７−５０、２００３）。
【００８２】
上述のＭＶウイルスについて全般的に概説するように、ＮＤＶゲノムの様々な位置に外来遺伝子を有利に導入することができる。特に、本発明による組み換えＮＤＶベクターにおいて、外来遺伝子（適切な転写単位の一部として）を次のＮＤＶ遺伝子の間（ＮＰ−Ｐ、Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｆ、Ｆ−ＨＮ、ＨＮ−Ｌ）及び３’隣接及び５’遠位遺伝子座に（Ｚｈａｏら、２００３、前出；Ｎａｋａｙａら、２００１、前出）、好ましくは３’隣接、Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｆ及びＦ−ＨＮ領域に挿入することができ、Ｆ−ＨＮ領域が最も好ましい。
【００８３】
本発明の特定の実施形態において、さらなる転写単位がＦ−ＨＮ遺伝子の間に位置する組み換えＮＤＶベクターが提供される。
【００８４】
その他の病原体に対して家禽、特にニワトリにおいて免疫反応を誘導するために、本発明による組み換えＮＤＶベクターを有利に使用することができる。従って、組み換えＮＤＶベクターは、好ましくは、鳥類病原体、特にインフルエンザウイルス、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、Ｅ．コリ、アイメリア種、クリプトスポリジア、マイコプラズマ、例えばＭ．ガリナルム（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｍ．シノビエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）及びＭ．メレグリディス（Ｍ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）など、サルモネラ、カンピロバクター、オルニトバクテリウム（ＯＲＴ）又はパスツレラ種、の防御抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【００８５】
より好ましくは、組み換えＮＤＶベクターは、ＡＩＶ、ＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＶ、ＴＲＴＶ、Ｅ．コリ、ＯＲＴ又はマイコプラズマの抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【００８６】
特に、組み換えＮＤＶベクター突然変異体は、インフルエンザウイルス、好ましくは鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、より好ましくは高病原性ＡＩＶ、特にＨ５又はＨ７ＡＩＶの、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を含む。
【００８７】
原則として、本発明において、全ての（鳥類）インフルエンザ株のＨＡ遺伝子を使用することができる。当技術分野で多くのＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、ＧｅｎＢａｎｋ又はＮＣＢＩデータベースなどの核酸配列データベースから関連するＨＡ遺伝子を回収することができる。
【００８８】
上記で概説されるように、本発明において、最近単離された高病原性Ｈ５Ｎ２サブタイプＡＶＩＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／８／９８のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を外来遺伝子として有利に使用することができる。この遺伝子を逆転写し、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングし、配列決定を行う（Ｌｕｓｃｈｏｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１９、４２４９−４２５９頁、２００１年及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ３０５３０６）。得られた発現プラスミドｐＣＤ−ＨＡ５から、ＮＤＶゲノム配列におけるＨＡ遺伝子の挿入を可能にする人為的ＲＥ認識部位を生成する特異的プライマーを用いた増幅によって、ＨＡ遺伝子を得ることができる。
【００８９】
さらなる実施形態において、上記で概説されるように、本発明において、高病原性Ｈ７Ｎ１サブタイプＡＩＶＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９９のＨＡ遺伝子を外来遺伝子として使用することができる。このＨＡ遺伝子を逆転写しＰＣＲにより増幅する。ＳｍａＩで消化したベクターｐＵＣ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において１７１１ｂｐ産物をクローニングし、配列決定を行う（Ｖｅｉｔｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４．３３４３−３３５２、２００３；及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５８０３５３）。
【００９０】
本発明による特に有利な組み換えＭＶウイルスベクターにおいて、ＭＶベクターウイルスは弱毒化されている、つまり、このベクターウイルスは標的動物にとって病原性ではないか、又は野生型ウイルスと比較して毒性が顕著に低下している。ウイルスベクターとして本明細書中で使用される多くのＭＶウイルスは、麻疹ウイルス及びＮＤＶなどの弱毒化生ワクチンとして長らく安全であった記録があり、一方、ＳｅＶ及びＶＳＶなどのその他のウイルスはヒトに対して非病原性であると考えられる。さらに、限定的な複製又は感染能を示す弱毒化ウイルスを得てそれに対してスクリーニングを行うために、従来の技術が存在する。このような技術には、異種培養基におけるウイルスの連続的（コールド）継代及び化学的突然変異誘発が含まれる。
【００９１】
本発明による組み換えＮＤＶベクターは、何らかの従来のＮＤワクチン株由来であり得る。市販のＮＤワクチンにおいて存在するこのような適切なＮＤＶ株の例は：Ｃｌｏｎｅ−３０（登録商標）、Ｌａ  Ｓｏｔａ、Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  ＢＩ、ＮＤＷ、Ｃ２及びＡＶ４であり；Ｃｌｏｎｅ−３０（登録商標）は好ましい株である。
【００９２】
本発明による組み換えＭＶウイルスベクターが動物において防御的免疫反応を誘導できることもまた本発明により見出された。
【００９３】
従って、本発明の別の実施形態において、生又は不活性化型の上記で定義されるような組み換えＭＶウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含む微生物病原体に対するワクチンが提供される。
【００９４】
市販の生及び不活性化ＭＶウイルスワクチンに対して一般に使用されるものなどの従来の方法により、本発明によるワクチンを調製することができる。
【００９５】
簡潔に述べると、組み換えＭＶウイルスベクターを用いて感受性物質を接種し、所望のタイターにウイルスが複製するまで増殖させ、その後、物質を含有するウイルスを回収する。続いて、免疫付与特性を有する医薬製剤へと回収した物質を処方する。
【００９６】
本発明において、組み換えＭＶウイルスベクターの複製を支えることができる全ての培養基を使用することができる。培養基として、ＭＶウイルスに依存して、原核及び真核源の両方からの宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞は脊椎動物、例えば霊長類細胞であり得る。適切な例は；ヒト細胞株ＨＥＫ、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５又はＨ−２３９、サル細胞株Ｖｅｒｏ、げっ歯類細胞株ＣＨＯ、ＢＨＫ、イヌ細胞株ＭＤＣＫ又は鳥類ＣＥＦ又はＣＥＫ細胞である。
【００９７】
本発明による組み換えＮＤＶベクターを増殖させることができる特に適切な培養基はＳＰＦ孵化卵である。例えば卵あたり少なくとも１０２．０ＥＩＤ５０を含む尿膜腔液を含有する０．２ｍＬ  ＮＤＶを孵化卵に接種することができる。好ましくは、９から１１日胚の孵化卵に約１０５．０ＥＩＤ５０を接種し、続いて３７℃で２−４日間温置する。２−４日後、好ましくは尿膜腔液を回収することによって、ＮＤウイルス産物を回収することができる。その後、２５００ｇで１０分間、この液体を遠心し、続いてフィルター（１００μｍ）に通して上清を濾過することができる。
【００９８】
本発明によるワクチンは、このような組成物に対して慣習的に使用される医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とともに、組み換えＭＶウイルスベクターを含む。
【００９９】
生ウイルスを含有するワクチンを懸濁液又は乾燥凍結形態で調製し、販売することができる。担体には、安定化剤、保存料及び緩衝剤が含まれる。希釈剤には、水、水性緩衝液及びポリオールが含まれる。
【０１００】
本発明の別の態様において、不活性形態の組み換えＭＶウイルスベクターを含むワクチンが提供される。不活性化ワクチンの主要な長所は、その安全性及び長期にわたり高レベルの防御抗体を誘導できることである。
【０１０１】
増殖段階後に回収されたウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの複製を排除することである。一般に、周知の化学又は物理的手段によってこれを達成することができる。
【０１０２】
必要に応じて、本発明によるワクチンは、アジュバントを含有し得る。この目的のためのアジュバント活性のある適切な化合物及び組成物の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えば鉱物油（Ｂａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標）など）又は植物油（ビタミンＥアセタートなど）に基づく水中油又は油中水乳液及びサポニンである。
【０１０３】
本発明によるワクチンの投与は、周知の有効な形態の何れかによるものであり得、ＭＶウイルスベクターのタイプに基づき得る。投与の適切な形式には、非経口、鼻腔内、経口及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【０１０４】
本発明によるＮＤＶベクターワクチンは、好ましくは、ＮＤＶワクチン接種に対して一般に使用される安価な大量適用技術により投与される。ＮＤＶワクチン接種の場合、これらの技術には、飲用水及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【０１０５】
本発明によるワクチンは、活性成分として組み換えＭＶウイルスベクターの有効量、即ちワクチン接種された鳥類において毒性微生物による曝露処置に対して免疫を誘導する免疫付与ＭＶウイルス物質の量、を含む。免疫は、本明明細書中で、ワクチン接種していない群と比較した、ワクチン接種後の死亡及び臨床症状に対する、ヒト又は動物集団における顕著に高い防御レベルの誘導として定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種されたヒト又は動物の大部分において、疾患の臨床症状の発生及び死亡を防ぐ。
【０１０６】
通常、１０２．０−１０８．０組織培養／胚感染用量（ＴＣ／ＥＩＤ５０）の用量で、好ましくは、１０４．０−１０７．０ＴＣ／ＥＩＤ５０の範囲の用量で、生ワクチンを投与することができる。不活性化ワクチンは、１０４．０−１０９．０の抗原当量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を含有し得る。
【０１０７】
本発明はまた、本発明による組み換えＭＶウイルスベクターに加えてさらなる病原体に対する防御を誘導することができるワクチン株を含む、混合ワクチンも含む。
【０１０８】
実施例
【実施例１】
【０１０９】
非修飾（野生型）Ｈ５遺伝子及び修飾Ｈ５遺伝子を含むＮＤＶベクターの構築及びタンパク質の発現
サブタイプＨ５の鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）ヘマグルチニン（ＨＡ）を発現するニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を逆遺伝学によって構築した。ＮＤＶ融合（Ｆ）とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子との間の遺伝子間領域において高病原性（ＨＰ）ＡＩＶ単離株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／８／９８（Ｈ５Ｎ２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ３０５３０６）のＨＡをコードするオープンリーディングフレームを挿入するために、弱毒性ＮＤＶ株Ｃｌｏｎｅ３０のゲノムのクローニングされた全長コピーを使用した。
【０１１０】
３回の卵継代後、ＮＤＶＨ５組み換え体のタイターは親ウイルスＣｌｏｎｅ３０（１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と同様であり、挿入されたＨ５遺伝子の存在をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。外来遺伝子の正しい転写を確認するために、ノーザンブロット分析を行った（図２）。組み換えＮＤＶ及びＡＩＶ（Ｈ５Ｎ２）におけるＨ５  ＯＲＦが同一であるにもかかわらず、ＮＤＶにクローニングされたＨ５  ＯＲＦは、ＨＮ遺伝子の非コード配列由来のおよそ２７０ヌクレオチドに隣接する。従って、ＮＤＶＨ５とＡＩＶ  ｍＲＮＡとの間のサイズの相違はそれぞれ〜２ｋｂ及び１．７ｋｂ  ｍＲＮＡの予想サイズとよく一致する（図２、中央）。しかし、ＮＤＶＨ５において約１ｋｂの第二の転写産物が現れた（図２、中央、レーン３）。
【０１１１】
ノーザンブロット分析により分かるように、組み換えＮＤＶＨ５ｍは、２ｋｂ  Ｈ５転写産物（図２、中央、レーン４）の予想サイズのみを生成し、このことから、ＮＤＶＨ５における短い転写産物がＨＡ切断部位で終結し、おそらくＨＡ１領域のみを示すことが確認される。
【０１１２】
修飾の結果として、ＮＤＶＨ５ｍは、ＮＤＶＨ５よりも１．８倍多い全長ＨＡ（ＨＡ０）を生成する。ＡＩＶに感染した細胞における全長ＨＡ転写産物は、ＮＤＶＨ５ｍ及びＮＤＶＨ５よりもそれぞれ３．４倍及び６倍多かった。ＮＤＶＨ５のＨ５切断部位配列とは異なり（これは、５回の継代以内で変更されている。）、この領域のＮＤＶＨ５配列は、試験した１０回の継代を通じて依然として安定していた（表１）。ＮＤＶ  Ｆ及びＨＮプローブを用いたハイブリッド形成から、親ＮＤＶ  クローン３０のＦ及びＨＮ  ｍＲＮＡとサイズが異ならなかったので、隣接ＮＤＶ遺伝子の正しい転写が確認された（図２）。さらに、ＨＡ  ＯＲＦの挿入の結果として、ＨＮ遺伝子の転写効率の僅かな低下のみが観察された（図２、右）。
【０１１３】
ＮＤＶ組み換え体によるＡＩＶ  Ｈ５の特異的発現を確認するために、感染したＣＥＦ細胞を間接的ＩＦ試験に供した。ＮＤＶ特異的抗血清との温置から、ＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＨ５及びＮＤＶＨ５ｍに感染した細胞では顕著な蛍光が見られたが、ＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２に感染した細胞では見られなかった。対して、ＡＩＶサブタイプＨ５−特異的抗血清は、ＡＩＶ、ＮＤＶＨ５及びＮＤＶＨ５ｍに感染した細胞においてＨ５の特異的発現を示し、一方、親ＮＤＶに感染した細胞は陰性であった。ＡＩＶ感染細胞によるＨ５発現の強度は両組み換え体の強度よりもかなり高かったが、ＮＤＶ組み換え体によるＨ５発現のレベルが顕著であることが分かった。
【０１１４】
これと一致して、３倍だけ多いＮＤＶＨ又はＮＤＶＨ５  ＲＮＡ量をＲＮＡ−ゲルに供し、同程度のハイブリッド形成シグナルが得られ（図２（中央）で示される。）、このことから、ＡＩＶがおよそ３倍多い転写産物を生成し、おそらくずっと多いタンパク質を生成することが示される。興味深いことに、ＮＤＶＨ５ｍ感染細胞によるＨ５発現は、ＮＤＶＨ５に感染した細胞での発現よりも効率が高いと思われるが、これは、Ｈ５の早過ぎる転写終結を無効にするサイレント突然変異に起因し得る。
【実施例２】
【０１１５】
ＡＩＶ  Ｈ５タンパク質をＮＤＶ粒子のエンベロープに組み込む。
【０１１６】
以前の実験から、非関連ウイルスのエンベロープへの外来タンパク質の組み込みが特異的組み込みシグナルの非存在下で受動的に起こり得ることが示された（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ、Ｅ．ら、１９９７、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７１、５９８２−５９８９頁）。このような受動的組み込みの効率はタンパク質の発現レベルに主に依存するので、発明者らは、組み換えウイルスにより発現されるＨＡタンパク質が正しく切断され、またＮＤＶ組み換え体のエンベロープに組み込まれたか否かも調べた（図３）。両組み換え体により感染した細胞において、ＡＩＶサブタイプＨ５−特異的抗血清により、未切断ＨＡ０及び切断ＨＡ１及びＨＡ２タンパク質をおそらく示すと思われるおよそ７０、５０及び２５ｋＤａの３種類のタンパク質が検出された（図３Ａ）。このことから、組み換え体により発現されるＨＡがタンパク質分解酵素に接近可能であることが分かった。ＮＤＶＨ５ウイルスに感染した細胞において産生されるトータルＨＡタンパク質は、ＮＤＶＨ５ｍよりも顕著に少なく、ＮＤＶＨ５感染細胞におけるＨＡ２タンパク質は辛うじて見ることができる。予想されるように、ＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０感染細胞では反応は検出できず、一方、ＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２感染細胞では全ての対応するＨＡタンパク質種が検出された。ＡＩ特異的血清がウイルス全体に対して生成されたが、ＮＰ／ＮＡ及びＭにおそらく対応すると思われるその他のタンパク質種もＡＩＶ感染細胞において検出された（図３）。興味深いことに、精製ビリオンのウエスタンブロット分析から、両組み換え体のエンベロープにＨＡタンパク質が効率的に組み込まれたことが示された（図３Ｂ）。より多くのＮＤＶＨ５ウイルスタンパク質をウエスタンブロット分析に供したが、ＮＤＶＨ５に組み込まれたＨＡ２タンパク質の量は依然としてＮＤＶＨ５ｍビリオンのＨＡ２よりもかなり低かった。このことから、ＮＤＶＨ５が産生し組み込むＨＡ２タンパク質は非常に少ないことが示されるが、これはおそらく、切断部位での早過ぎる終結の結果として利用可能なタンパク質がより少ないことによると思われる。
【実施例３】
【０１１７】
ＡＩＶ  ＨＡタンパク質を担う組み換えＮＤＶはニワトリにおいて安全である。
【０１１８】
あるＮＤＶ単離株の病原性の程度を測定する高感度である方法の１つは、脳内接種後１日齢ニワトリに対するウイルスの病原性を評価することによる（ＣＥＣ（１９９２）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｌ  ２６０、１−２０）。最も毒性の高いウイルスは、２．０の最大スコアに達する指数を与え、一方、弱毒株は、０．０に近い値を与える。ＡＩＶのヘマグルチニンは重要な毒性決定因子なので、ＨＰＡＩウイルスのＨ５の発現がＮＤＶ毒性を変化させるか否かを評価するために、ＮＤＶＨ５及びＮＤＶＨ５ｍに対する脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）を決定した。両組み換え体に対して、ＩＣＰＩ値は、２の可能な最大スコアのうち０．０であったが、このことから、それ自身のタンパク質に加えて、ＡＩＶ  Ｈ５の発現はＮＤＶ毒性への著しい影響はなかった。ちなみに、可能な生ウイルスワクチンの使用のためには弱毒株ＮＤＶワクチン株のＩＣＰＩは０．５以下でなければならない。
【実施例４】
【０１１９】
ＡＩＶ  ＨＡタンパク質を発現する組み換えＮＤＶは、ＮＤＶ及びＡＩＶ曝露処置からニワトリを保護する。
【０１２０】
ＮＤＶＨ５ｍによりＨ５タンパク質をより多く発現させるために、動物実験においてこの組み換え体のみを試験した。従って、動物あたり１０６ＥＩＤ５０の用量で眼鼻経路により２５羽の３週齢ニワトリに組み換えＮＤＶＨ５を投与した。観察期間の間、全動物は何ら有害反応又は疾患の臨床徴候なく健康なままであった。ＨＩ試験により決定されるように、ＡＩＶ  Ｈ５−特異的抗体は、血清の２８％で第１４日に最初に検出可能であり、ワクチン接種後、２１日で９２％に上昇した（図４Ａ）。しかし、間接的ＩＦ試験を用い、免疫付与後７日で、血清の９６％において、ＡＩに対してより早く免疫が出現することが検出された。
【０１２１】
単回ワクチン接種の防御効果を調べるために、対照動物の適切な数とともに５及び１０羽のワクチン接種動物の群をそれぞれＮＤＶ及びＡＩＶに対する致死性曝露処置の最初の試験に供した。予想に違わず、ワクチン接種動物の１００％が致死性の強毒性ＮＤＶ曝露感染から保護され、一方、典型的なＮＤの徴候を示した全対象動物が４日以内に死亡した（図４Ｂ）。高病原性ＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２曝露感染により、非免疫付与ニワトリにおいて重症疾患が引き起こされ、死亡率は１００％であった。一方、ＮＤＶＨ５ｍ免疫付与群の動物は全て高病原性ＡＩＶの致死用量で生存した。１０羽のニワトリのうち７羽は完全に健康なままであり、一方、３羽の動物が非常に軽度の呼吸器症状を呈した。しかし、０．０５という得られた臨床スコアは、対照群に対する２．６１の臨床スコアと比較して無視できるものであった（図４Ｃ）。ＡＩからのニワトリの保護における追加免疫ワクチン接種の効果を調べるために、最初のワクチン接種から４２日後に、残る１０羽のニワトリに２回目の免疫付与を行い、それから２週間後、曝露処置を行った。同種ＨＰＡＩウイルスの致死用量後、全動物において臨床疾患が完全に防御され、一方、全対照動物で重症疾患が発現し、４日以内に死亡し、その結果、臨床スコアは２．６６となった（図４Ｄ）。
【実施例５】
【０１２２】
ＮＤＶ−ＡＩワクチンによりＡＩＶ出芽が減少する。
【０１２３】
ＡＩワクチンが成功するためには、ワクチンは、安全であり疾患を予防するのに有効である他に、ウイルス出芽の阻止に効果的であるべきである。ウイルス出芽の量を調べるために、曝露処置後様々な時間において、気管及び排泄スワブを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。曝露処置から２日後、両対照群の免疫付与されていないが曝露処置が行われたニワトリ全てにおいて、ウイルスＲＮＡが検出された。最初及び２回目のＡＩＶ曝露処置の対照ニワトリのスワブの閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ、Ｃｔ）値は、それぞれ３２．２から３８．１及び２９．２から３５．５の範囲であった。曝露処置から４日以内に全対照動物が死亡したので、この群においてさらなる試験を行うことができなかった。一方、免疫付与動物の殆どにおいてｖＲＮＡは検出されなかった（６０検体のスワブ中４９検体）。
【実施例６】
【０１２４】
ＮＰ−ＥＬＩＳＡにより循環ＡＩＶが検出される：
家禽の通常のワクチン接種での最大の懸念の１つは、ワクチン接種によって鳥間でウイルスが検出されずに循環することができるようになり得ることである。組み換えＮＤＶワクチンは、ＨＡ遺伝子のみを含有するので、曝露処置前及び曝露処置後の様々な時間にワクチン接種動物から回収された血清を分析するために、非常に免疫原性の高い核タンパク質遺伝子に基づくＥＬＩＳＡを使用した。曝露感染前に全動物の血清中でＡＩＶ  ＮＰに対する抗体がなかった一方、ＮＰセロコンバーションがＡＩＶ曝露処置から７日及び２１日後にそれぞれニワトリの９０％及び１００％で検出することができた（図５）。このことから、ＮＰに基づくＥＬＩＳＡ試験によって、ワクチン接種動物と感染動物との区別が可能になるだけでなく、ワクチン接種したトリ間の何らかの循環ウイルスの検出も容易になり得ることが分かる。
【実施例７】
【０１２５】
実施例１から６に対する材料及び方法
ウイルス及び細胞：
Ｃｌｏｎｅ−３０のワクチン株に基づく組み換えＮＤＶが既に記載されている（Ｒｏｅｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｅｒ、Ａ．、Ｍｕｎｄｔ、Ｅ．、Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ、Ｔ．、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ、Ｕ．Ｊ．  ＆  Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、Ｔ．Ｃ．（１９９９）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０（Ｐｔ１１）、２９８７−２９９５）。インフルエンザウイルス単離株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／８／９８（Ｈ５Ｎ２）は、Ｉ．Ｃａｐｕａの好意により提供された。強毒性ＮＤＶ株Ｈｅｒｔｓ３３／５６及びＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０ワクチン（Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標））は、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔ．ＢＶ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得た。特定病原体不含（ＳＰＦ）の１０日胚齢孵化ニワトリ卵でウイルスを増殖させた。ｃＤＮＡから感染性ＮＤＶを回収するために、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを安定的に発現するＢＳＲ−Ｔ７／５細胞（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ、Ｕ．Ｊ．、Ｆｉｎｋｅ、Ｓ．  ＆  Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｋ．Ｋ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２５１−２５９）を使用した。タンパク質発現及びウイルス複製を調べるために、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、初代ニワトリ胚腎臓（ＣＥＫ）細胞又はウズラ筋肉細胞（ＱＭ９−Ｒ）を使用した。
【０１２６】
ＡＩＶ  Ｈ５遺伝子を発現する組み換えウイルスの構築：
ＡＩＶ  Ｈ５遺伝子を導入するために、Ｃｌｏｎｅ３０の全長アンチゲノムＲＮＡを発現するプラスミドｐｆｌＮＤＶ−１（Ｒｏｅｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｅｒ、Ａ．、Ｍｕｎｄｔ、Ｅ．、Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ、Ｔ．、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ、Ｕ．Ｊ．  ＆  Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、Ｔ．Ｃ．（１９９９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０（Ｐｔ１１）、２９８７−２９９５）を使用した。最初に、Ｃｌｏｎｅ３０ゲノムのＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ断片（ｎｔ４９５３−８８５２）をｐＵＣ１８プラスミドにクローニングした（段階Ａ、図１）。次に、プライマーＭＰ１（５’−ｇａｃａａｃａｇｔｃｃｔｃａａｃｃａｔｇｇａｃｃｇｃｇｃｃｇ−３’、配列番号１）及びＭＰ２（５’−ｃｔｇｇｃｔａｇｔｔｇａｇｔｃａａｔｔｃｔｔａａｇｇａｇｔｔｇｇａａａｇａｔｇｇｃ−３’、配列番号２）を用いて、新しく生成したＮｃｏＩ及びＡｆＩＩＩ部位を導入した（段階Ｂ）。ＮｃｏＩ又はＡｆＩＩＩで消化後、Ｃｌｏｎｅ３０のＨＮ  ＯＲＦを置換するために、人為的ＮｃｏＩ又はＡｆＩＩＩ制限部位を含有する特異的プライマー（ＰＨ５Ｆ２：５’−ｃｃｔｔｃｃａｔｇｇａｇａａａａｔａｇｔｇｃｔｔｃ−３’、配列番号３及びＰＨ５Ｒ２：５’−ｃｃｔｃｃｔｔａａｇｔａｔａａｔｔｇａｃｔｃａａｔｔａａａｔｇｃａａａｔｔｃｔｇｃａｃｔｇｃａａｔｇａｔｃｃ−３’、配列番号４）によりプラスミドｐＣＤ−ＨＡ５から増幅されたＡＩＶ  Ｈ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Ｌｕｓｃｈｏｗ、Ｄ．、Ｗｅｒｎｅｒ、Ｏ．、Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、Ｔ．Ｃ．  ＆  Ｆｕｃｈｓ、Ｗ．（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９、４２４９−４２５９）を使用した（段階Ｃ）。さらに、プライマーＭＰ３（５’−ｃａａａａｃａｇｃｔｃａｔｇｇｔａｃｇｔａａｔａｃｇｇｇｔａｇｇａｃａｔｇｇ−３’、配列番号５）及びＭＰ４（５’−ｇａａａａａａｃｔａｃｃｇｇｃｇａｔｃｇｃｔｇａｃｃａａａｇｇａｃｇａｔａｔａｃｇｇｇ−３’、配列番号６）を用いて、Ｌ遺伝子の前の遺伝子間領域に新しいＳｇｆＩ−及びＳｎａＢＩ−部位を導入した（段階Ｃ）。Ｈ５ＯＲＦの後にＨＮ遺伝子をクローニングするために、プライマーＭＰ３及びＭＰ５（５’−ｇａａａａａａｃｔａｃｃｇｇｃｇａｔｃｇｃｔｇａｃｃａａａｇｇａｃｇａｔａｔａｃｇｇｇ−３’、配列番号７）を用いて、ＨＮ遺伝子（段階Ｄ）に隣接する同様の部位を生成させた（段階Ｅ）。図１の段階Ｆで示されるように、プライマーＭＰＨ５Ｆ２（５’−ｇｇａａｔｇｔｃｃｃｔｃａａａｇａａｇｇａｇｇａａｇａａｇａｇａｇｇａｃｔａｔｔｔｇｇｇｇｃ−３’、配列番号８）を用いて、サイレント突然変異によって、ＮＤＶの転写終結配列に類似しているＨ５切断配列を修飾した。最後に、全長クローンＮＤＶＨ又はＮＤＶＨｍそれぞれを生成させるために段階Ｅ又はＦから得られた同様の断片によって、ｐｆｌＮＤＶ−１のＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換した（図１）。得られたクローンの長さ（１７１９６ヌクレオチド）は６で割ることができ、これにより「６の法則（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」が満たされる。Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて本明細書中に記載���全ての突然変異誘発反応を行った。
【０１２７】
遺伝子移入及びウイルス回収：
ＡＩのＨ５を発現する組み換えＮＤＶを回収するために、１：１．５のＤＮＡ：リポフェクタミン２０００の比率でリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＮＰ、Ｐ及びＬタンパク質を発現するプラスミドとともに全長クローンをＢＳＲ−Ｔ７細胞に遺伝子移入した。ウイルス増殖及び感染性ウイルスの回収の確認は、基本的に既に記載されているように行った（Ｒｏｅｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｅｒ、１９９９、前出；Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ、Ｉ．、Ｗｅｒｎｅｒ、Ｏ．、Ｔｅｉｆｋｅ、Ｊ．Ｐ．、Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ、Ｔ．、Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、Ｔ．Ｃ．  ＆  Ｒｏｅｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｅｒ、Ａ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０８、１９−２８）。
【０１２８】
ノーザンブロット分析：
細胞あたり１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＨ５、ＮＤＶＨ５ｍ又はＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２でＣＥＫ細胞を感染させ、３７℃で８時間温置した。感染及び非感染細胞のトータルＲＮＡを調製し（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．  ＆  Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２、１５６−１５９）、変性アガロースゲルで分離し、他で記載されるように、放射性標識ｃＲＮＡとハイブリッド形成させた（Ｆｕｃｈｓ、Ｗ．  ＆  Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、Ｔ．Ｃ．（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７（Ｐｔ９）、２２２１−２２２９）。３２Ｐ−標識ｃＲＮＡ（ＳＰ６／Ｔ７転写キット、Ｒｏｃｈｅ）のインビトロ転写のために、ＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２ヘマグルチニン、ＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０Ｆ及びＨＮのオープンリーディングフレームを含有するプラスミドを使用した。
【０１２９】
ウエスタンブロット分析：
５のＭＯＩで、ＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＨ５、ＮＤＶＨ５ｍ又はＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２でＣＥＫ細胞を感染させ、３７℃で３０時間温置した。感染細胞又は連続スクロース勾配（３０−６０％）で精製したビリオンの溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  ｃｅｌｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。ＮＤＶに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプＨ５のＡＩＶに対するポリクローナルニワトリ抗血清とともにブロットを温置した（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔ．ＢＶ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、ＮＬ）。Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上でＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた化学発光により、ペルオキシダーゼ結合の種特異的二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）の結合を検出した。
【０１３０】
動物実験：
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（ＣＥＣ（１９９２）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｌ  ２６０、１−２０）に記載のように、１日齢ニワトリにおいて脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）を決定することにより、ＮＤＶ組み換え体の安全性を評価した。ＮＤＶＨ５ｍの１０６ＥＩＤ５０を２５羽の３週齢ＳＰＦニワトリに眼鼻投与することによって、ワクチン接種実験を行った。単回ワクチン接種後の組み換え体の防御能を評価するために、５羽のさらなる対照とともにワクチン接種動物５羽に対して、ＮＤＶ株Ｈｅｒｔｓ３３／５６の１０５．３ＥＬＤ５０でワクチン接種から３週間後に筋肉内投与により曝露処置を行った。同様に、９羽のさらなる対照動物とともに１０羽のワクチン接種動物に対して、高病原性ＡＩＶ−Ｈ５Ｎ２の１０７．７ＥＩＤ５０で眼鼻投与により曝露処置を行った。最初のワクチン接種から６週間後、残った１０羽のニワトリに２回目の免疫付与を行い、それから２週間後、５羽のさらなる対照動物とともに同様のＡＩ曝露処置に供した。免疫付与及び曝露感染後、臨床徴候に関して、１０日間、全ての鳥を毎日観察した。
【０１３１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるウイルス出芽分析：
曝露処置から２、４、８及び１４日後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＡＩＶ出芽を分析するために、気管及び排泄スワブを回収した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いたＴｅｃａｎ−Ａｕｔｏｍａｔ又はウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた手動での方法の何れかによって、気管又は排泄スワブからＲＮＡを調製した。曝露感染後のＡＩＶ出芽の検出のために、Ｍ遺伝子の増幅に基づくインフルエンザＡウイルスリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を使用した（１８）。ＲＴ−ＰＣＲ中のＲＮＡ抽出物及び阻害因子を異種内部調節系により調べた（１９）。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットの１つ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐＴＭＩＩＩ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム）を用い、ＭＸ３０００ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）サイクラーで二重アッセイを行った。温度プロファイルは５０℃で３０分、９４℃で２分、次いで９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、６８℃で３０秒を４２サイクルであった。
【０１３２】
ＨＩ及びＮＰ−ＥＬＩＳＡ
ＮＤＶ及びＡＩＶ  Ｈ５抗体の有無を調べるために、第０、７、１４及び２１日に血液試料を回収し、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（ＣＥＣ（１９９２）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｌ  ２６０、１−２０；ＣＥＣ（１９９２）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｌ  １６７、１−１６２０、２１）に記載のように、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）試験に供した。免疫付与後のＡＩＶ−Ｈ５抗体の有無を評価するために、ＡＩＶ感染ＣＥＦとともに血清の１：１００希釈液を温置することによって、間接的免疫蛍光（ＩＦ）に対して血清をさらに使用した。核タンパク質（ＮＰ−ＥＬＩＳＡ）に基づく間接的酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、ＡＩＶ核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体を調べた。この目的のために、ＡＩＶ  ＮＰ遺伝子の完全なコード領域を包含する精製組み換えバキュロウイルス由来グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＮＰ融合タンパク質を抗原として使用した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で１：３００希釈した血清を２回測定して調べた。ｏ−フェニレンジアミンを用いて呈色反応により二次ＰＯＤ−結合ヤギ−α−ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＲＯＣＫＬＡＮＤ）抗体の結合を検出し、吸収を４９２ｎｍで測定した。
【実施例８】
【０１３３】
修飾されたＨ７遺伝子を含むＮＤＶベクターの構築：
上述のものと基本的に同様の実験において、修飾されたＨ７遺伝子を担うＮＤＶベクターコンストラクトを構築した。挿入物は、ＨＰ  Ｈ７Ｎ１ＡＩＶ単離株：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９９（その配列は、受託番号ＡＪ５８０３５３のもと、ＧｅｎＢａｎｋで公開されている：Ｖｅｉｔｓ、Ｊ．ら、２００３（Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．８４、３３４３頁）も参照のこと。）由来であった。ＮＤＶベクターのＦとＨＮ遺伝子との間にＨ７遺伝子を挿入し、Ｈ７遺伝子をＨＮ遺伝子からの非コード配列に隣接させた。
【０１３４】
潜在的遺伝子末端配列は、Ｈ７  ＨＡ遺伝子の切断部位領域の後に存在する。アミノ酸ＩＥＫＴをコードするヌクレオチド１９５−１２０６のオリジナル配列：ａｔａ  ｇａａ  ａａａ  ａｃｔをａｔａ  ｇａｇ  ａａｇ  ａｃｔ（依然としてＩＥＫＴをコードする。）に突然変異させた。
【０１３５】
この結果、非修飾Ｈ７遺伝子の発現と比較して、ＮＤＶベクターを介した、修飾されたＨ７配列の安定した発現及び提示が向上した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＡＩＶ  Ｈ５を発現する組み換えＮＤＶの構築。転写調節シグナルの転写開始配列に対して灰色の三角を付し、転写終結配列に対して灰色の長方形を付す。ＡＩＶのＨ５  ＯＲＦでＮＤＶのＨＮ  ＯＲＦを置換し、続いて材料及び方法に記載のようにＨＮ遺伝子を挿入した（段階Ａ−Ｃ）。組み換えＮＤＶＨ５（段階Ｄ）は、真のＨＡ配列を含有し、一方、組み換えＮＤＶＨ５ｍは、切断部位配列がサイレント突然変異によって変更されたＨＡを有する（段階Ｅ−Ｆ）。
【図２】ＮＤＶ組み換え体により産生される転写産物のノーザンブロット分析。感染から８時間後に、ＮＤＶクローン３０（ＮＤＶ）、ＮＤＶＨ５、ＮＤＶＨ５ｍ又はＡＩＶＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／８／９８（Ｈ５Ｎ２）に感染しているＣＥＫ細胞及び非感染細胞（ＨＩ）のトータルＲＮＡを調製した。変性アガロースゲルにおいてＲＮＡを分離し、ナイロン膜に転写し、ＮＤＶ−Ｆ（左）、ＡＩＶ−Ｈ５（中央）及びＮＤＶ−ＨＮ（右）の、３２Ｐ−標識遺伝子特異的抗血清ｃＲＮＡとハイブリッド形成させた。中央のブロットのＡＩＶレーンを除き、それぞれのＲＮＡ６μｇをノーザンハイブリッド形成に供し、過剰なＡＩＶシグナルを避けるために中央のブロットのＡＩＶレーンには２μｇのみを添加した。ＲＮＡマーカーのサイズはキロベース（ｋｂ）で左に示す。
【図３】感染細胞で産生された、又はＡＩＶのＨＡを発現するＮＤＶ組み換え体に組み込まれたタンパク質のウェスタンブロット分析。ＮＤＶ  Ｃｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＨ５、ＮＤＶＨ５ｍ又はＡＩＶ（Ｈ５Ｎ２）の、感染細胞（Ａ）又は精製ビリオン（Ｂ）の溶解液をＡＩＶサブタイプＨ５−特異的抗血清（α−ＡＩＶ；上のパネル）又はＮＤＶ−特異的抗血清（α−ＮＤＶ；下のパネル）の何れかとともに温置した。ペルオキシダーゼ結合二次抗体との温置後、化学発光により結合を可視化した。マーカータンパク質の位置を左に示し、ＡＩＶヘマグルチニンの非切断（ＨＡ０）及びプロセシング型（ＨＡ１、ＨＡ２）を右に示す。ＡＩＶ感染細胞又はビリオンにおいて、ＮＰ／ＮＡ及びＭに対応するさらなるウイルスタンパク質も検出可能である。
【図４】ＨＩ試験（Ａ、灰色のバー）又はＩＦ試験（Ａ、白色のバー）により測定されるＨＡ特異的抗体。強毒性ＮＤＶ  Ｈｅｒｔｓ（Ｂ）又は高病原性Ｈ５Ｎ２  ＡＩＶ（Ｃ、Ｄ）により曝露処置を行った後の、ＮＤＶＨ５ｍ（Ｈ５ｍ）で１回（Ｂ、Ｃ）又は２回（Ｄ）免疫付与されたニワトリ及び対照動物（Ｃ）の死亡率及び臨床的指標。臨床徴候について１０日間、動物を毎日観察し、健康（０）、病気（１）、重度の病気（２）又は死亡（３）に分類した。この期間中の群あたりの全ニワトリの平均値を表す臨床指標を計算した。
【図５】ＮＰ−ＥＬＩＳＡによる血清学的試験。１：５００の希釈で間接的ＮＰ−ＥＬＩＳＡによりニワトリの血清を調べた。免疫付与から２１日後（ｐ．ｉ．）及び続くＡＩＶ曝露処置（ｐ．ｃ．）から２１日後に回収した、ｒＮＤＶ／ＡＩＶ  Ｈ５−ＢＭＵＴで免疫付与したニワトリの血清に対して、Ｐ／Ｎ−比の上昇を曲線で表した。２．０のカットオフ値を点線で記す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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