(57)【要約】本発明は、抗不安目的の医薬品を製造するためのエングレイルド転写因子の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗不安医薬品を得るためのエングレイルドタンパク質の使用。
【請求項２】
前記医薬品が注射可能な製剤の形状である、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン代謝を増加させるためのエングレイルド転写因子の使用、特に抗不安薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エングレイルドタンパク質は、ホメオドメインタンパク質クラスの転写因子である。哺乳類は、２つのエングレイルド遺伝子：エングレイルド−１及びエングレイルド−２を有する。類似の活性を有するこれら２種のタンパク質は、以下において、ひとまとめにして包括的な用語、エングレイルド（ＥＮ）という。
【０００３】
新生児及び成人において、ＥＮは、気分の調節及び嗜癖性行動（addictive behavior）の扇動において重要な役割を演じる黒質のドーパミン作用性（ＤＡ）ニューロン（パーキンソン病において退化する）、小脳顆粒細胞及びドーパミン作用性中脳路核において発現される。
【０００４】
発達（development）の間のＥＮの損失に続いてすぐにドーパミン作用性ニューロンの変性がおこること、及びＥＮの転写標的の１つがα−シヌクレインであることが示されている（Ｓｉｍｏｎら Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１（９）：３１２６〜３４，２００１）。α−シヌクレインは、パーキンソン病の特定遺伝形式との遺伝的連関が示され（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７６，２０４５-７, １９９７）、ドーパミン作動性伝達の負のレギュレータを構成すると考えられている（Ａｂｅｌｉｏｖｉｃｈら，Ｎｅｕｒｏｎ，２５，２３９-５２，２０００）。
【０００５】
これらの全ての報告は、ＥＮが神経変性性の病理、特にドーパミン作用性ニューロンに影響を及ぼす病理、例えばパーキンソン病に関与することを強く示唆している。ＥＮの活性を制御しこれらの病理を予防すること又は病理の進行を遅延することが提唱されている。従って、ＰＣＴ出願ＷＯ２００４/１０４０３０には、エングレイルドの活性を調整するペプチドが記載されており、ペプチドを用いて神経変性性の病理を予防又は治療することを提唱している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、ＥＮがニューロンの生存に作用するだけでなく、ドーパミン代謝に直接作用することを見出した。
【０００７】
エングレイルドをマウスに投与すると抗不安作用を誘発し、皮質におけるセロトニンに加えて、線条におけるドーパミン代謝の増加を反映するＤＯＰＡＣ/ＤＡ比の著しい増加を伴うことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、抗不安医薬品を生産するためのエングレイルドタンパク質の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上述のように、「エングレイルドタンパク質」は、本明細書において、脊椎動物のエングレイルド−１又はエングレイルド−２のいずれかのタンパク質を示す。好ましくは、エングレイルドタンパク質は、治療する対象が属する種から選択される。
【００１０】
有利には、該医薬品は注射可能な製剤であり、好ましくは静脈経路により注射される。
【００１１】
本発明は、エングレイルドの抗不安作用及びドーパミン代謝への影響を示す実施例に言及する以下の記載により、よりよく理解されるであろう。
【実施例１】
【００１２】
３又は３００μｇ／ｋｇ用量のＥＮ２の連日注射がマウスの行動に与える影響を以下のように評価した。
【００１３】
対象：
試験は、６ヶ月の雄性スイスマウスを用いて行った。
【００１４】
注射用エングレイルド−２の調製：
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列と翻訳融合するように、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＥＮ２全体をコードする配列を挿入して得られたプラスミドｐＧＥＸＳＥｎ２を用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１ＲＰ−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の組換え型大腸菌内で、ニワトリのＥＮ２タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ登録番号：Ｑ０５９１７）を産生する。
【００１５】
発現したタンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎTMプロテアーゼ（ＧＳＴとヒトライノウイルスのプロテアーゼ３Ｃとの融合による組換えプロテアーゼ；Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の切断部位、及びＥＮ２の完全配列を順に含む融合タンパク質である。
【００１６】
グルタチオンカラム（ＧＳＴｒａｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた親和クロマトグラフィーにより、形質転換細菌の溶菌液からこの融合タンパク質を精製し、ＥＮ２タンパク質を、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎTMプロテアーゼを用いた切断の後にカラムから抽出する。
【００１７】
実施試験
Ｙ−迷路：この試験では、動物をＹ字型迷路に置く。迷路のアームに進入するつど記録し、アームに進入した総数とともに、１つのアームから他のアームへ続けて進入した回数も記録する。アーム間を行き来する割合から作業記憶が評価可能であり、アームへ進入した総数から活動が評価可能であり、この活動の発展から短期及び長期馴化が評価可能である。
【００１８】
ロータロッド：回転しているシリンダー上に動物がとどまることができた時間の長さを測定することで、運動協調性と平衡性が評価可能である。
【００１９】
テイル・ピンチ：この試験により、痛覚閾値の測定が可能である。
【００２０】
オープン・フィールド：明るく照明した囲いに動物を３０分間入れる。移動距離と立ち上がりの回数から自発運動及び探索活動の評価が可能であり、該試験における前半と後半の活動の変動から馴化型記憶の評価が可能である。囲いの中心（不安惹起環境を構成する）における滞在時間及び移動距離を測定することにより、不安水準の測定が可能である。
【００２１】
オープン・フィールドの中心とは、総面積の２５％を占める囲いの中心の正方形と定義する。不安型行動の変数指標とは、中心における滞在時間の割合及び移動距離の割合である。中心が不安を惹起する性質は中心を回避する行動により示され、これら２つの変数が２５％未満の値であることにより示される。治療の抗不安型効果は、中心における滞在時間及び移動距離の割合の増加により明らかになる。
【００２２】
高架式十字迷路：これは、２本の開放アームと側面が閉鎖した２本のアームを有する十字型装置である。動物を５分間迷路に置く。２種類のアームへ進入した総数（不安惹起環境における探索活動）とともに、開放アームへの進入割合（もっとも不安惹起的）及びこれらのアームでの滞在時間を測定する。たいていの場合、マウスは５０％未満の時間を費やし、開放アームに５０％未満の回数で進入する。これにより、後者の不安惹起的性質が証明される。従って、開放アームへの進入時間と回数の割合が低いほど、不安型行動はより顕著であるとされる。治療の抗不安型効果は、開放アームへの進入時間と回数の割合が増加することで明らかになる。
【００２３】
方法：
注射は以下のプロトコルに従い行われた。
【００２４】
２１匹の動物を無作為に４つの群に分け、
ＮａＣｌ  ０．９％：対照群（Ｓａｌ）；ｎ=１０）；
ＥＮ２  ３μｇ/ｋｇ：ＥＮ３群（ｎ=１０）; 
ＥＮ２  ３００μｇ/ｋｇ：ＥＮ３００群（ｎ=１０）
を注射をした。
【００２５】
注射は、尾に静脈注射で行った。
【００２６】
注射及び試験の日程表を、以下に示す。
１日目      ｔ＝０            注射１
ｔ＝１ｈ          Ｙ−迷路−セッション１
２日目      ｔ＝０            注射２
ｔ＝１ｈ          Ｙ−迷路−セッション２
ｔ＝１ｈ４０      ロータロッド−セッション１
３日目      ｔ＝０            注射３
ｔ＝１ｈ          Ｙ−迷路−セッション３
ｔ＝１ｈ４０      ロータロッド−セッション２
４日目      ｔ＝０            注射４
ｔ＝１ｈ          Ｙ−迷路−セッション４
ｔ＝１ｈ４０      ロータロッド−セッション３
ｔ＝１ｈ５５      テイル・ピンチ−セッション１
７日目      ｔ＝０            注射５
ｔ＝１ｈ          オープン・フィールド
ｔ＝１ｈ４０      ロータロッド−セッション４
ｔ＝１ｈ５５      テイル・ピンチ−セッション２
８日目      ｔ＝０            注射６
ｔ＝１ｈ          高架式十字迷路
【００２７】
結果：
自発運動：
迷路、ロータロッド、テイル・ピンチ、オープン・フィールド試験のいずれにおいても、ＥＮ２は３及び３００μｇ／ｋｇで顕著な効果を示さなかった。従って、用いた実験条件では、ＥＮ２が自発運動及び探索活動に影響を与えるとは結論付けられない。
【００２８】
馴化型記憶：
環境への馴化は探索活動により明らかになり 、探索活動は環境がわかるにつれて減少する。馴化指標変数は水平及び垂直方向の活動であり、オープン・フィールドにおけるセッションの後半期に測定され、セッション全体の活動に対する割合で示される。馴化は、これら２つの変数が５０％未満の値のときに示唆される。
【００２９】
３つの群について、セッションの後半期では、中心での移動距離と立ち上がりの割合が５０％未満よりかなり低かった。ＥＮ２はこれら２つの変数を顕著には変えない。よって、実験に用いた条件において、ＥＮ２が馴化型記憶に影響を与えるとは結論付けられない。
【００３０】
抗不安薬活性：
オープン・フィールド
対照マウス（Ｓａｌ;□）、３μｇ／ｋｇのＥＮ２注射を受けたマウス
【化１】
2009529001.tif 000002
及び３００μｇ／ｋｇのＥＮ２注射を受けたマウス（■）について、中心における滞在時間の割合（Ａ）、及び中心における移動距離の割合（Ｂ）を示す図１に、結果を示す。２５％に対する差：＃＃ｐ＜０．０１; ＃＃＃ｐ＜０．００１。
【００３１】
対照群（Ｓａｌ）に対する差：＊ｐ＜０．０５; ＊＊ｐ＜０．０１。
【００３２】
３つの群の動物で、中心における滞在時間及び移動距離の割合が２５％未満であることがわかる。このことから中心を回避していることが分かり、後者の不安惹起的性質が示される。
【００３３】
３μｇ／ｋｇ用量のＥＮ２は、動物の行動に顕著な影響を与えない。一方、３００μｇ／ｋｇ用量のＥＮ２は、中心における滞在時間及び移動距離の割合を非常に有意に増加させることから（ｐ＜０.０１）、抗不安型作用が示される。
【００３４】
高架式十字迷路
対照マウス（Ｓａｌ;□）、３μg／ｋｇのＥＮ２注射を受けたマウス
【化２】
2009529001.tif 000003
及び３００μｇ／ｋｇのＥＮ２注射を受けたマウス（■）について、開放又は閉鎖アームへ進入した総数（Ａ）、開放アームでの時間の割合（Ｂ）、及び開放アームへの進入回数の割合（Ｃ）を示す図２に、結果を示す。５０％に対する差：＃＃ｐ＜０．０１; ＃＃＃ｐ＜０．００１。対照群（Ｓａｌ）に対する差：＊ｐ＜０．０５。
【００３５】
３つの群の動物が、５０％未満の開放アームでの時間及び侵入の割合を示し、このことは、開放アームの不安惹起的性質を示す。
【００３６】
３μｇ／ｋｇ用量のＥＮ２は動物の行動に著しい影響を与えない。
【００３７】
３００μｇ／ｋｇ用量では、ＥＮ２により開放アーム又は閉鎖アームへの進入回数が増加し、このことは、探索活動の増加及び／又は不安の減少を示唆する。また、開放アームでの滞在時間の割合も顕著に増加する。
【００３８】
これらの試験の結果により、ＥＮ２タンパク質を用いた治療により抗不安作用が誘発されることが示された。
【実施例２】
【００３９】
大脳アミンに対するエングレイルド−２の影響
実施例１に述べた試験の翌日に、対照群及びＥＮ３００群のマウスは、７回目の注射として、それぞれＮａＣｌ０．９％及び３００μｇ／ｋｇ用量のＥＮ２を受けた。
【００４０】
注射１時間後、動物を断頭し屠殺した。脳を素早く取り出して冷蔵プレート上に置いた（０〜４℃）。脳構造（皮質、線条、及び海馬）を解剖して計量し、クロマトグラフィーのサンプル調製まで−３０℃のエッペンドルフチューブに入れておいた。
【００４１】
テフロンポッターを用い、０．０５％メタ重亜硫酸ナトリウム含有０．１Ｎ過塩素酸水溶液５００μｌ中で組織を均質化し、試料を遠心した（２５０００×ｇ、３０分、４℃）。上清を回収し、クロマトグラフィーにかけるまで凍結した。
【００４２】
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いて、これらの上清中のドーパミン（ＤＡ）とともに、その代謝物の１つである３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、及びセロトニンを測定した。
【００４３】
グラフトシリカＣ１８カラムを用いた逆相配分クロマトグラフィーにより化合物を分離し、溶出はメタノール／水混液：１５／８５を用いて行った。
【００４４】
検出は、質量分析計ＬＣＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて行った。これは、陽イオン化モードで作動するエレクトロスプレー型のイオン化源を備えたイオントラップを含む。
【００４５】
表Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩに結果を示す。
【００４６】
【表１】
2009529001.tif 000004
【００４７】
【表２】
2009529001.tif 000005
【００４８】
【表３】
2009529001.tif 000006
【００４９】
線条において、ＤＯＰＡＣのわずかな増加、及びＤＯＰＡＣ／ＤＡ比の著しい増加（５０％ ｐ＜０．０５）が見られるとともに、皮質において５ＨＴのわずかな増加が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】
2009529001.tif 000007
【図１Ｂ】
2009529001.tif 000008
【図２Ａ】
2009529001.tif 000009
【図２Ｂ】
2009529001.tif 000010
【図２Ｃ】
2009529001.tif 000011
【国際調査報告】
2009529001.tif 000012
2009529001.tif 000013
2009529001.tif 000014
2009529001.tif 000015
2009529001.tif 000016
2009529001.tif 000017