(57)【要約】本発明は化学構造式Iに関するシノメニン派生物の調和と薬理学の活用を説明した。ここで示されたアプローチは、R を置換することによりD環を修飾することだ。別の環の置換方法も示された。いくつかのシノメニン派生物は母体シノメニンと比べ、著しく高い抗炎活性をもっている。【化１】2009519960.tif 000057
2009519960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学結構式(I)に関する化合物は以下に示される：
【化１】
2009519960.tif 000041
ベンゼン環に存在するR1、R2、R3、R4が各々独立に、H、F、Br、Cl、I、-OH、-NH2、-NO2、-CN、acyl、alkyl、alkoxyl、alkylamino、cycloalkyl、heterocyclyl、heterocyclylalkyl、alkenyl、heteroaryl、heteroarylthioおよび heteroarylaminoに置換される。示された有機性置換基には１〜２０の炭素原子がある。それに、それら自身が独自に1つまたは複数の遊離基に置換されることができる。これらの遊離基はhalogen、N、O、-S、-CN、-N3、-SH、nitro、oxo、acyl、alkyl、alkoxyl、alkylamino、alkenyl、aryl、heterocycloalkylおよび heterocyclylである。示された有機性置換基には１〜２０の炭素原子がある。
Rは、飽和または不飽和なアルキル基にすることができる。このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子が１〜２０個ある。
またRはR5-X-COにすることができる。R5-X-COの中のXは化学結合、 NHまたはO
であり、R5は水素原子、または飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子が１〜２０個ある；またR5は芳香族基にすることができる、非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランだ。そこの各アルキル基、およびアリール基は独自に1つまたは複数の遊離基に置換され、または置換されないことができる。これらの遊離基はhalogen、-S-、-CN、-N3、nitro、oxo、acyl、alkenyl、alkoxyl、alkyl、alkylamino、amino、aryl、cycloalkyl、cycloalkylalkyl、heterocyclyl、heterocyclylalkylおよび hydroxylなどである。
R はR5S(O2)-にすることができる。R5は飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子が１〜２０個ある；またR5は任意に置換された芳香族グループにすることができる。
またはRはR5NS(O2)-にすることができる。R5NS(O2)-の中のR5は飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子が１〜２０個ある；またはR5は任意に置換された芳香族グループにすることができる。芳香族グループにあるアルキル基あるいはアリール基が各任意に一つあるいは複数の遊離基に置換される。これらの遊離基本はhalogen、-S、-CN、-N3、nitro、oxo、acyl、alkenyl、alkoxyl、alkyl、alkylamino、amino、aryl、cycloalkyl、cycloalkylalkyl、heterocyclyl、heterocyclylalkylおよび hydroxylから選ばれる。R5 は R6CO- または  R6SO2-にすることができる。ここのR6は飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状である；またR6は非置換または置換された芳香族グループにすることができる、例えばベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランのようなものだ。
またはR6は製薬と製剤的に許容されるその塩である。
【請求項２】
請求項1の化合物について、Rは炭素原子数１〜２０の飽和または不飽和アルキル基にすることができる。このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、任意に置換されることができる。
【請求項３】
請求項1の化合物について、RはR5COもしくはR5S(O2)の構造を持ち、R5は炭素原子数１〜２０の飽和または不飽和アルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状であり；或いは非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランにすることができる。ここの1つまたは複数のアルキル基およびアリール基は独自に1つまたは複数の遊離基に置換され、または置換されないことができる。これらの遊離基はhalogen、-S、-CN、-N3、nitro、oxo、acyl、alkenyl、alkoxyl、alkyl、alkylamino、amino、aryl、cycloalkyl、cycloalkylalkyl、heterocyclyl、heterocyclylalkyl およびhydroxylから選ばれる。この中、製薬的に許容される塩は無機酸塩だ。
【請求項４】
請求項1の化合物について
【化２】
2009519960.tif 000042
R7は水素原子、もしくは飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子数には１〜２０個があり；あるいはR7は非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランにすることができる。R8は一個の水素原子を、もしくは１〜２０個炭素原子を有する非置換または置換されたアルキル基を、もしくは１〜２０個炭素原子をもつ非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランを含んでいる。あるいは製剤的に許容される無機酸塩だ。
【請求項５】
請求項1の化合物のR基は以下の構造を持つ
【化３】
2009519960.tif 000043
製剤的に許容される無機酸塩について、無機酸は例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、ホスホン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、ピルビン酸、マロン酸やグルタル酸などがある。
【請求項６】
請求項４の化合物について、Rは以下の構造を持つ
【化４】
2009519960.tif 000044
製剤的に許容される無機酸塩について、無機酸は例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、ホスホン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、ピルビン酸、マロン酸やグルタル酸などがある。
【請求項７】
請求項１に含まれている化合物は、以下のグループから選ばれる：
17-propylsinomenine、17-butylsinomenine、17-cyclopropylmethyl- sinomenine、17-allylsinomenine、17-cyclopentanylsinomenine、 17-cylclohexanyl-sinomenine、17-cycloheptanylsinomenine、17-ethoxycarbonyl-sinomenine、17-(2’-oxo-propyl)-sinomenine、17-methanesulfonylsinomenine、17-ethanesulfonyl-sinomenine、17-propanesulfonylsinomenine、17-acetylsinomenine、17-propanoylsinomenine、17-butanoylsinomenine、17-(2’-phenyl)acetylsinomenineや17-cyclopropylcarbonyl-sinomenine。
【請求項８】
請求項１に含まれている化合物も、以下のグループから選ばれる：
17-(4'-acetylamino-benzoyl)sinomenine、17-(4’-hydoxybenzoyl)sinomenine、17-(2’-oxo-3'-phenyl-propyl)-sinomenine、17-(2’-phenyl-ethyl)-sinomenine、17-benzyl- sinomenine、17-(furan-2'-yl-methyl)sinomenie、17-(2’-methyl-2’-phenyl-acetyl)sinoemnine、17-benzoylsinomenine、17-toluenesulfonylsinomenine、17-(4’-acetylamino) benzene- sulfonylsinomenine、17-(2'-methyl-6’-methoxycarbonyl)-benzenesulfonylsinomenine、17-(3’-chlorobenzoyl)sinomenine、17-(4’-fluorobenzoyl)sinomenine、17-(4’-methylbenzoyl)- sinomenine、17-(3’,5’-dimethylbenzoyl)sinomenine、17-(2’-hydroxybenzoyl)sinomenine、17-(3’-hydroxy-2’-methylbenzoyl)sinomenine、17-(pyridine-3’-carbonyl)sinomenine, 17-furoyl-sinomenineや17-(3’,4’-difluorobenzoyl)- sinomenine。
【請求項９】
この特許請求には、ヒトの全血培養システムを作り、ヒトの全血培養液における一つもしくは複数のサイトカインの産生対する抑制作用を測定する。この方法は以下のステップを含み：健康人あるいは患者から採血し、ヒトの全血培養システムを作り；請求項１−８に含まれている化合物を有効な分量でヒトの全血培養システムに加え、一つもしくは複数のサイトカインの産生を抑制する。
【請求項１０】
請求項９に関する化合物のR基は以下のいずれの構造を持ち
【化５】
2009519960.tif 000045
【化６】
2009519960.tif 000046
【化７】
2009519960.tif 000047
もしくは化学構造式Ｉに関する化合物は：
【化８】
2009519960.tif 000048
テストに選ばれたサイトカインはTNF-α、IL-1、IL-6やIL-8だ。
【請求項１１】
請求項９に関する化合物は以下のいずれの化合物
【化９】
2009519960.tif 000049
【化１０】
2009519960.tif 000050
【請求項１２】
請求項９もしくは請求項１０に言及された化合物は、請求項５もしくは６にある化学構造を含んでいる。
【請求項１３】
ヒトの全血培養システムの作りには更にいくつかの実験方法を含み：化合物で処理されたヒトの全血培養液の細胞成分と非細胞成分を分離し；非細胞成分における一つもしくは複数のサイトカインの産生を測定する。ヒトの全血培養システムにおいて、化合物のサイトカインへの抑制作用は、健康人および患者はシノメニン派生物に対する反応程度と治療可能性を示唆する。
【請求項１４】
請求項１−８にある数多くの化合物を含んでいる薬物と薬物劑型は、炎症抑制に使用できる。さらに1つまたは複数の製薬学的適切なキャリアおよび賦形剤を添加できる。
【請求項１５】
請求項14の薬物と薬物劑型は無機酸塩である。無機酸は例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、ホスホン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、ピルビン酸、マロン酸やグルタル酸などがある。
【請求項１６】
請求項１４−１５のいずれに示された薬物と薬物劑型は以下の構造を持つ
【化１１】
2009519960.tif 000051
もしくは化学構造式IにあるRは以下のいずれの構造をもつ：
【化１２】
2009519960.tif 000052
【化１３】
2009519960.tif 000053
【化１４】
2009519960.tif 000054
【請求項１７】
請求項１４−１６のいずれに含まれている薬物と薬物劑型について、化学構造式IにあるRは以下のいずれの構造をもつ：
【化１５】
2009519960.tif 000055
【化１６】
2009519960.tif 000056
【請求項１８】
請求項１−８に含まれている全ての化合物は炎症治療のために、適当な薬物と薬物劑型の調和に使える。
【請求項１９】
請求項１−８に含まれている全ての化合物は関節炎を治療するために、適当な薬物と薬物劑型の調和に使える。
【請求項２０】
請求項１−８に含まれている全ての化合物は慢性関節リウマチもしくは骨関節炎を治療するために、適当な薬物と薬物劑型の調和に使える。
【請求項２１】
請求項１−８に含まれている全ての化合物は慢性関節リウマチを治療するために、適当な薬物と薬物劑型の調和に使える。
【請求項２２】
請求項１−８に含まれている全ての化合物は骨関節炎を治療するために、適当な薬物と薬物劑型の調和に使える。
【請求項２３】
請求項１−８に含まれている化合物は薬物に作製され、以下の病気の治療に使うことだできる：アルツハイマー病、パーキンソン病、神経変性疾患、喘息、不整脈や炎症に関連した痛みなど。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、中国での特許出願のApp'l No. 200610038862.9（2006年3月15日に提出された）、中国での特許出願のApp'l No. 200510123089.1（2005年12月15日に提出された）、中国での特許出願のApp'l No. 200510123090.4（2005年12月15日に提出された）の全体の内容を組み込んで、参考し作成される特許出願である。
この特許出願の中、様々な文献を参考している。ここでは、これらの文献を引用し参考することにより、本発明の科学技術的なレベルを位置つけることができる。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、損傷の後、体を復元しようとする組織の構造と機能を維持するとして、身体の防衛の不可欠な一部である。ほとんどの身体の防衛の因子が血液に位置する。炎症は、体の防御細胞と化学物質が血液を離れ、損傷や感染したサイトの周辺組織に入ることを指していう。炎症は、基本的に有益なプロセスものの、過剰化・過激化および長期化の場合、それは深刻な痛みを招き、生体の自己組織の損傷という危害をもたらす。
【０００３】
シノメニンは、類モルヒネのような化学物質であり、sinomenum acutumから得られる。報告によると、それらは抗炎症、鎮痛、それに血圧低下や不整脈に対する治療効果を持つ。[Wang, Naiqin, et al. Yao Xue Xue Bao 1992, 23(2), 81; Zhou, Jinhuang et al. ＜Zhongyao Yaoli Yanjiu Yu Jinzhan＞, Chinese Science and Technology Publisher, 1993, 66；Liu, Q.; Zhou, L.-l.; Li, R. Chinese Traditional and Herbal Drugs 1997, 28, 247.] 。
【０００４】
中国では、シノメニンとその塩酸塩は臨床的に関節リウマチ（ RA ）の治療に使用されている。しかしながら、これらの薬の薬効は緩慢で、またいくつかの副作用が存在する。例えば、皮疹などだ。最近の研究は主に、シノメニンのC-ring2にあるカルボニル基と水素の二重結合に注目している。このほか、シノメニン-金属キレートを修飾することにも集中され研究を行っている。しかし、これらのシノメニンの生理活性を高める試みは、効果が非常に少ない。
【０００５】
前述の生理活性のほか、動物実験ではシノメニンおよびシノメニンの派生物のいくつかの新しい活性が発見された、例えばmnemocognition  facilitating 。(Qin Guo-Wei, et al. PCT Int. Appl. (2004), WO 2004/048340, Chem. Abstr. 131:179808).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、異なるアプローチを使用してシノメニンを修飾し、シノメニンの新しい派生物を作り出した。具体的には、D-ringにあるメチルグループを置換することにより、新しい派生物が得られた。実験のデーターにより、母体のシノメニンと比べ、派生物らの生物的活性と炎症抑制作用はて強化されたことが確認された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
治療薬の開発に関連している本発明の化合物は、Sinomenum acutumの活性的な成分シノメニンを修飾し得られた派生物らである。派生化合物らの具体的な化学構造式は（I）で表される。
【０００８】
本発明は、17番目の炭素につながっているニトロ基でのR基を様々な基により置換することによって、17-置換化合物を得ることができる。シノメニンの自然化合物について、R1とR2は水素原子、R3はメトキシ、R4は水酸基である。Rはメチル基である。この化学構造式には、本発明で生じたすべての化合物との製薬学的に許容される塩を含んでいる。
【０００９】
【化１】
2009519960.tif 000003
【００１０】
化学構造式Iでは、ベンゼン環にあるR1、R2、R3、R4 の置換物はそれぞれ独自に、下記のH、halogen (F、Cl、Br、I)、-OH、-NH2、-NO2、-CN、acyl、alkyl、alkoxyl、alkylamino、cycloalkyl、heterocyclyl、heterocyclylalkyl、alkenyl、heteroaryl、heteroarylthioおよび heteroarylaminoに選ばれる。選ばれた置換基には１〜２０の炭素原子がある。
【００１１】
各アシル基、アルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、シクロアルキル基、 heterocyclyl 、 heterocyclylalkyl 、アルケニル基、ヘテロアリール基、 heteroarylthioおよびheteroarylaminoは自身が独自に1つまたは複数の遊離基に置換されることができる。これらの遊離基はhalogen、N、O、-S、-CN、-N3、-SH、nitro、oxo、acyl、alkyl、alkoxyl、alkylamino、alkenyl、aryl、heterocycloalkylおよび heterocyclylである。置換基には１〜２０の炭素原子がある。
【００１２】
Rは、飽和または不飽和なアルキル基にすることができる。このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子数には１〜２０個がある。
【００１３】
RはR5-X-COにすることができる。R5-X-COの中のXは化学結合部、NHまたはOであり; R5 は水素原子、或いは飽和或いは不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子数には１〜２０個がある; R5 は芳香族基にすることができる、例えば非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランかもしれない、ここの各アルキル基およびアリール基は、各独自に1つまたは複数の遊離基に置換されもしくは置換されないことができる。これらの遊離基はhalogen、-S-、-CN、-N3、nitro、oxo、acyl、alkenyl、alkoxyl、alkyl、alkylamino、amino、aryl、cycloalkyl、cycloalkylalkyl、 heterocyclyl、heterocyclylalkylおよび hydroxylから選ばれる。
【００１４】
R はR5S(O2)- にすることができる。R5S(O2)-中のR5は飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子数には１〜２０個がある；また、R5は芳香族基グループにすることができる、例えば非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランだ。
【００１５】
R はR5NS(O2)- にすることができる。R5NS(O2)-中のR5の場合は、飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子数には１〜２０個がある；また、R5 は芳香族基グループにすることができる、例えば非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランだ。ここの各アルキル基およびアリール基は独自に1つまたは複数の遊離基に置換され、または置換されないことができる。これらの遊離基はhalogen、-S-、-CN、-N3、nitro、oxo、acyl、alkenyl、alkoxyl、alkyl、alkylamino、amino、aryl、cycloalkyl、cycloalkylalkyl、heterocyclyl、heterocyclylalkylおよび hydroxylから選ばれる。R5 は R6CO- もしくはR6SO2-であり、その中のR6は飽和または不飽和なアルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子数には１〜２０個がある；またR6は芳香族基グループにすることができる、例えば非置換または置換されたベンゼン、ナフタレン、ピリジンやフランだ。
【００１６】
上述の化合物は製薬的に許容されるものを含んでいる。具体的には、化合物は、無機酸と有機酸を添加する塩である。制限性はないが、ただここで示された酸は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、ホスホン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、ピルビン酸、マロン酸やグルタル酸である。
【００１７】
別の具体的な例として、R基には以下の構造をもつ：
【００１８】
【化２】
2009519960.tif 000004
【００１９】
R7は、水素原子、または飽和または不飽和アルキル基にすることができるし、このアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状で、炭素原子には１〜２０個がある；またR7は置換、もしくは非置換されたエーテル、エステル、アミド、アミン、チオエーテルまたはチオエステルにすることができる、炭素原子には１〜２０個がある；そしてR8は、水素原子にすることができるし、置換または非置換された炭素原子数１〜２０個のアルキル基にすることができるし、あるいは置換または非置換の炭素原子数１〜２０個のエーテル、エステル、アミド、アミン、チオエーテルまたはチオエステルにすることができる。
【００２０】
別の具体的な例として、R基には以下の構造をもつ：
【００２１】
【化３】
2009519960.tif 000005
【００２２】
R基を修飾および置換することにより、治療に効く化合物を提供できる。そのため、ここで明確に発表することがあり得ないけれども、本発明には化学構造式Iに関する大量の具体的な派生物を含んでいる。
【００２３】
前記のシノメニン派生物はおそらく1つまたは複数の適切なキャリアおよび賦形剤を添加することによって、合成薬物を作れる。従って、本発明に表われる実施例は、さまざまな投与経路を通して、1つまたは複数シノメニンの派生物の有効量を体内投与するために適したさまざまな合成薬物を取囲むものである。これらの化合物あるいは合成薬物の投与経路は口/腸、頬吸収、結腸直腸吸収、静脈内、筋肉内、皮下および鼻腔内吸入などである。
【００２４】
したがって、ここに表われるシノメニンの派生物から成り立つ薬剤は丸薬、錠剤、 caplets 、錠剤、液体、シロップ剤、 tonics 、錠剤、チュアブル錠とゴムを、スプレー、噴霧またはnebulized、クリーム、化粧水、軟膏、エマルジョンを含む。エマルジョンはmicroemulsions、nanoemulsions、suppositoriesおよび経皮パッチを含む。
【００２５】
“ヒトの全血”モデルは、生理学的なテストシステムである。ヒトの全血テストシステムにおいて細胞因子の産生を抑える化合物は、体内でも細胞因子の産生を抑制できると考えられる。(Hartman et al., Inflamm Res 1995; 44: 269-274; Hermann et al., Journal of Immunological Methods 2003; 275: 69-79; Zhang Y et al: International Immunopharmacology 2004; 4: 1845-1857; Zhang Y et al., J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2004; 309: 348-355; Lagrelius M et al., Cytokine 2006; 33: 156-165.)したがって、ヒトの全血に同定されたサイトカイン産生に有効的な阻害剤は、おそらくin vivoの実験そして臨床治療に同様な効果をもたらすと考えている。
【００２６】
本発明では、ヒトの全血における1つまたは複数のサイトカインの産生を抑制する方法を用いて、キーの化合物を選別する。この方法は以下のステップを含み：化学構造式Iに関する化合物を全血培養液に加え、全血細胞からの1つまたは複数のサイトカイン産生を抑制する。そして化合物のサイトカイン産生抑制効果は、化合物の抗炎活性を示唆する。
【００２７】
最近の報道では、抗炎化合物の有効性を評価するために、とりあえずヒトの全血におけるサイトカイン産生を誘導し、そしてサイトカイン産生に対する抗炎化合物の阻害効果を測定する。ヒトの全血におけるサイトカイン産生はいくつかの因子により刺激し誘導される：例えば、LPSで白血球を刺激、単球性ザイモサンで単球を刺激 (Hartman DA et al: Inflamm Res 1995; 44: 269-274) 、およびSEBでリンパ球を刺激する(Hermann et al: Journal of Immunological Methods 2003; 275: 69-79)。
【００２８】
本発明は、以上紹介されたシノメニン派生物は炎症治療および症状改善に使えるかどうかを確認する方法も提供する。1つの実施例は、慢性関節リウマチだ。
【００２９】
他の実例は、ほかの炎症性疾患と関節炎に関する疾患だ。制限はないが、ここで挙げられた例は：変形性関節症、全身性エリテマトーデス、痛風、gout and similar degenerative disorders、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経変性疾患、喘息、不整脈や炎症に関連した痛みである。
【００３０】
治療以外、本発明のシノメニン派生物はおそらく予防薬として前記した疾患を予防したり治療したりできるだろう。シノメニン派生物の用量、製剤や投与経路を変えることにより、シノメニン派生物を含んでいる薬物は炎症相関疾患そして再発を抑制できる。
【００３１】
ここでは、本発明のシノメン派生物を例示目的のみとして提供する。実際の種類と数量はこれらとは限らない。本発明の化学構造式（I）に関する実施例には：  17-propylsinomenine、17-butylsinomenine、17-cyclopropylmethylsinomenine、17-benzylsinomenine、17-(furan-2'-yl-methyl)-sinomenine、17-allylsinomenine、17-cyclopentanylsinomenine、17-cylclohexanylsinomenine、17-cycloheptanylsinomenine、 17-(2'-phenyl-ethyl)-sinomenine、17-ethoxycarbonylsinomenine、17-(2'-oxo-propyl)-sinomenine、17-(2'-oxo-3'-phenyl-propyl)-sinomenine、17-methanesulfonylsinomenine、17-ethanesulfonylsinomenine、17-propanesulfonylsinomenine、17-toluenesulfonylsinomenine、 17-(4'-acetylamino)benzenesulfonylsinomenine、17-(2'-methyl-6/-methoxycarbonyl)benzenesulfonylsinomenine、
17-acetylsinomenine、17-propanoylsinomenine、17-butanoylsinomenine、17-(phenyl)-acetylsinomenine、17-cyclopropylcarbonyl-sinomenine、17-(2-Phenylpropanoyl)sinomenine、17-benzoylsinomenine、17-(3'-chlorobenzoyl)sinomenine、17-(4'-methylbenzoyl)sinomenine、17-(3',5'-dimethylbenzoyl)sinomenine、17-(2'-hydroxybenzoyl)sinomenine、17-(3'-hydroxy-2'-methylbenzoyl)sinomenine、17-(pyridine-3'-carbonyl)sinomenine、17-Furoylsinomenine、  17-(3',4'-difluorobenzoyl)-sinomenine、17-(4'-fluorobenzoyl)-sinomenine、17-(4'-hydoxybenzoyl)-sinomenine、や 17-( 4'-acetylamino-benzoyl)-sinomenine。
【００３２】
ここでは、化学構造式（I）に関する17‐置換シノメニンの合成をさらに具体的に説明する。ここのRは前記したものである。 合成スキームの実例は以下に示された通りに、以下の手順で実行される：
【００３３】
ステップ（１）、Mitsunobuの反応条件にて、BnOBnOH (4-benzyloxybenzyl alcohol)とシノメニンを反応させて、中間体IIを産出する。また、4-benzyloxybenzyl alcohol の代りにbenzylbenzoateは、シノメニンと反応すると、同様の結果になる。
【００３４】
ステップ（２） 、1-chloroethyl chloroformateを用いて脱メチル化により中間体IIを脱メチルさせ、中間体IIIを産出する。（Hitotsuyanagi, Y.; Nishimura, K.; Ikuta, H. Takeya, K.; Itokawa, H. J. Org. Chem. ,1995, 60(14), 4549-58)。
【００３５】
ステップ（３）、中間体IIIのアルキル化、アシル化またはスルホニル化によって、中間体IVを合成する。
【００３６】
ステップ（４） 、TFA/DCM溶液(trifluoroacetic acid/dichloromethane)を用いて中間体IVを脱保護させ、 化学構造式（I）に関する化合物が得られる。(Hamper, B. C.; et al. Tetrahedron Letters, 37(21), 3671-3674. Mergler, M.;et al. Tetrahedron Letters 29(32), 4005-8.).
【００３７】
スキーム１はただ例証のためにここで示され、制限性はない。普通の技能をもつ専門家はここで示された方法を使って、各種のシノメ二ン派生物を合成できる。このスキームはただ、選ばれた試薬と反応条件を用いて簡単なアプローチを例証する。
【００３８】
【化４】
2009519960.tif 000006
【実施例】
【００３９】
以下の化合物と方法はただ例証のためにここで示され、限定されている化合物ではない。
専門で普通の技能をもつ人々は、ここで提供された試薬と反応条件を利用し、様々なシノメ二ン派生物を容易に合成できると考える。
【００４０】
実例１  17-DemethylBnOBnOsinomenineの調合
【００４１】
ステップ1 ：BnOBnOsinomenineの調合(Hitotsuyanagi, Y.; Nishimura, K.; Ikuta, H.; Takeya, K.; Itokawa, H. J. Org. Chem., 1995, 60(14), 4549-58.)
【００４２】
【化５】
2009519960.tif 000007
【００４３】
25ミリリットルの磁気スターラが付いた４首丸底フラスコに、シノメニン ( 1.65 g， 5  mmol) ， PPh3( 3.93 g， 15 mmol)、 BnOBnOH( 3.17 g，mmol)、 無水THF(50 ミリリットル)を入れてから、攪拌し混合した。反応混合液は、氷で冷却した後、30分間でアゾジカルボン酸ジエチル（ 2.61g、 15mmol ）を加えた。その後混合液は室温で12時間連続的に攪拌された。THFを除去し、残留物をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル、次メチル・アルコール)により精製し、肉色の固体が得られた。イソプロピルエーテルで再結晶で 2.6 g白色の粉末は得られた。mp 72℃; [α] 25D -69.0° (c=0.28 CHCl3)；1HNMR（300MHz, DCCl3）δ: 7.56(d, 2H, J=8.6Hz.), 7.48-7.34(m, 4H), 7.02(d, 2H, J=8.6Hz.), 6.77(dd, 2H, J=8.4Hz), 5.52(d, 1H, J=1.5Hz.), 5.23(d, 1H, J=10.5Hz.), 5.11(s, 2H), 5.01(d, 1H, J=10.5Hz), 4.20(d, 1H, J=16.1Hz.), 3.83(s, 3H), 3.53(s, 3H), 3.18-3.16(m, 1H), 3.05-2.97(m, 2H), 2.82-2.73(m, 1H), 2.49-2.37(m, 2H), 2.43(s, 3H), 1.97(ddd, 1H, J=11.4, 11.4, 4.3Hz.), 1.87-1.80(m, 2H).
【００４４】
ステップ2 ： 17 - demethylbnobnosinomenine
【００４５】
【化６】
2009519960.tif 000008
【００４６】
氷冷したBnOBnOsinomenine（1.0 g）と重炭酸ナトリウム（1.0 g）の混合物に、無水
1, 2-dichloroethaneおよび1-chloroethyl chlorofomate (0.25 ml)を添加しながら十分な攪拌を行った。この温度で約30分攪拌した後に、混合物を軽微に加熱し、1時間還流されたまで。この混合物を濾過し、濾液を減圧蒸発し、残留物をさらなる浄化せずにアルコールで直接に分解した。
【００４７】
窒素の中で、残留分に無水メタノール(20 ml)を加え、液体を攪拌し、１時間還流させた。 溶媒を蒸発し、固体を得られた。この固体は20 ml CHCl3に溶け、飽和Na2CO3 (5ml)溶液で中和した。有機層を分離、CHCl3 (10 ml)で水層をしたり有機層を減圧蒸発したり、薄黄色の固体を得られた。 
【００４８】
実例２  17-Propanesulfonylsinomenineの調合
【００４９】
ステップ1 
【００５０】
【化７】
2009519960.tif 000009
【００５１】
triethylamineと17-demethylBnOBnOsinomenine (100 mg) が含まれるCH2Cl2 (10 ml)溶剤を攪拌しながら、propanesulfonyl chloride (50 mg)を含んでいるCH2Cl2 (5 ml)を徐々に加えた。5分間攪拌した後、反応混合液は、減圧蒸発により残留物が得られた。この残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ 1:2 V / V  酢酸エチル/石油エーテル）で精製し、17-propanesulfonylBnOBnOsinomenineが得られた。[α] 25D ＋210.5° (c=0.06 CHCl3); 1HNMR (300MHz, DCCl3) δ: 7.56(d, 1H, J=8.7Hz), 7.48-7.34(m, 4H), 7.03(d, 1H, J＝8.7Hz), 6.81(d, 1H, J＝8.7Hz), 6.78(d, 1H, J＝8.7Hz), 5.47(s, 1H), 5.27(d, 1H, J＝10.5Hz), 5.11(s, 1H), 5.01(d, 1H, J=10.5Hz), 4.37(s, 1H), 4.21(d, 1H, J＝15.9Hz), 3.85(s, 3H), 3.53(s, 3H), 3.52-3.44(m, 1H), 3.28-3.20(m, 1H), 2.97-2.85(m, 4H), 2.74-2.55(m, 1H), 2.47(d, 1H, J=15.9Hz), 1.94-1.83(m, 3H), 1.80-1.65(m, 1H), 1.07(t, 3H, J=7.2Hz).
【００５２】
ステップ2
【００５３】
【化８】
2009519960.tif 000010
【００５４】
室温で17-propanesulfonylBnOBnOsinomenine (50 mg)を5％TFA/DCM溶液 (5 ml)に加えた。５分間攪拌した後、5 ml 10％重炭酸ナトリウム溶液を徐々に添加した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥し、そして濾過を行い、この濾液を蒸発し、残渣が得られた。この残留物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白い固体が得られた。mp 110.0-113.0℃; [α] 25D +48.2° (c=0.35 CHCl3);  1HNMR (300MHz, DCCl3) δH: 6.69(d, 1H, J=8.4Hz.), 6.57(d, 1H, J=8.4Hz.), 6.04(s, 1H), 5.44(d, 1H, J=1.8Hz.), 4.40-4.35(m, 2H.), 3.84(s, 3H), 3.56-3.54(m, 1H), 3.51(s, 3H), 3.18-3.16(m, 1H), 3.02-2.95(m, 3H), 2.91-2.85(m, 1H), 2.83-2.76(m, 1H), 2.48(d, 1H, J=16.0Hz.), 2.07-2.01(m, 1H), 1.90-1.82(m, 3H), 1.08(t, 3H, J=7.4Hz.).
【００５５】
実例３  17-Toluenesulfonylsinomenine
ステップ1
【００５６】
【化９】
2009519960.tif 000011
【００５７】
Tolunsulfonyl chloride (30 mg)の含まれるdichloromethane (5 ml)を、17-demethylBnOBnOsinomenine (100 mg)とトリエチルアミン(0.1 ml)を含んでいるジクロロメタン (10 ml)の混合液に、追って垂らして加えた。室温で１０分間攪拌した後、反応混合液は、減圧蒸発し、天然な17-tolunsulfonylBnOBnOsinomenineが得られた。これはさらなる浄化する必要がなく、次のプロセスで直接使われた。
【００５８】
ステップ2
【００５９】
【化１０】
2009519960.tif 000012
【００６０】
実例２のステップ２で示された手順と同様に、この例において、ステップ1で得られた17-tolunsulfonylBnOBnOsinomenine（100 mg）を、10 ml 5% TFA/DCM溶液に加え、そして17-toluenesulfonylsinomenine (50 mg)が得られた。mp 141.0-143.0℃; [α] 10D +92.4° (c=0.49 CHCl3)； 1HNMR(300MHz, DCCl3) δ: 7.74(d, 2H, J=7.6Hz.), 7.33(d, 2H, J=7.6Hz.), 6.62(d, 1H, J=8.3Hz.), 6.38(d, 1H, J=8.3Hz.), 6.00(s, 1H), 5.40(s, 1H), 4.49(s, 1H), 4.32(d, 1H, J=15.70Hz.), 3.80(s, 3H), 3.71-3.67(m, 1H), 3.49(s, 3H), 3.05-2.99(m, 1H), 2.84(s, 1H), 2.74-2.59(m, 2H), 2.46(s, 3H), 2.37(d, 1H, J=15.7Hz.), 1.97-1.93(m, 1H), 1.75-1.70(m, 1H). 13CNMR(75MHz, DCCl3) δ: 193.51, 153.11, 145.57, 145.06, 143.77, 138.03, 130.20, 129.03, 128.87, 127.39, 121.36, 119.07, 115.31, 113.30, 109.81, 56.43, 55.25, 51.14, 48.95, 45.13, 40.82, 39.96, 35.57, 30.99, 21.94.
【００６１】
実例４  17-Cyclopropylmethylsinomenineの調合
ステップ1
【００６２】
【化１１】
2009519960.tif 000013
【００６３】
17-demethylBnOBnOsinoemnine (100 mg)の含まれるメタノール（30 mg）に、cyclopropylmethyl aldehyde (10 ml) とNaBH3CN (50 mg)を加えた。室温で反応混合液を６時間で攪拌した。溶媒を除去し、残留物が得られた。この残留物は、20 ml CHCl3と10 ml 5%NH4Clに溶かされた。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥し、減圧蒸発し、そして天然な17  cyclopropylmethylbnobnosinomenineがえられた。
【００６４】
ステップ2
【００６５】
【化１２】
2009519960.tif 000014
【００６６】
実例２で示された通りに、天然な中間体に5% TFA/DCM (10 ml)を加え、17- cyclopropylmethylsinomenine（白い固体）が得られた。mp:127.0-127.5 ℃ ; [α]25D -5.3°(c=0.52, CHCl3); 1HNMR(300MHz, CDCl3) δ: 6.62(d, 1H, J=8.4Hz), 6.51(d, 1H, J=8.4Hz), 6.09(s, 1H), 5.49(d, 1H, J=2.0Hz), 4.35(d, 1H, J=15.6Hz), 3.79(s, 1H), 3.50(s, 1H), 3.49-3.42(m, 1H), 3.04-3.02(m, 1H), 2.90(d, 1H, J=18.3Hz), 2.80-2.76(m, 1H), 2.73-2.63(m, 1H), 5.53-2.48(m, 1H), 2.46(d, 1H, J=15.6Hz), 2.35-2.30(m, 1H), 2.03-1.91(m, 1H), 1.89-1.80 (m, 1H), 0.90-0.83(m, 1H), 0.52-0.49(m, 2H), 0.15-0.11(m, 2H).13CNMR (75MHz, CDCl3) δ: 194.47, 152.71, 145.27, 145.06, 130.98, 123.21, 118.53, 115.87, 109.29, 60.36, 56.42, 55.15, 55.03, 49.71, 46.20, 46.01, 41.51, 36.36, 25.52, 9.77, 4.47, 4.06. 
【００６７】
実例５  17-Cyclopropylmethylsinomenine・HClの調合
【００６８】
【化１３】
2009519960.tif 000015
【００６９】
例の4中獲得した17- cyclopropylmethylsinomenine（50 mg）は、DCM（2 ml）で溶解した後、ガラスで無水塩酸を添加した。見出しに示した白色固体の化合物が得られた。
【００７０】
実例６  17-Cyclopentanylsinomenineの調合
【００７１】
【化１４】
2009519960.tif 000016
【００７２】
実例４で言った通りに、cyclopentanoneと17-demethylBnOBnOsinomenineから、タイトルの化合物が得られた。この化合物は白い固体であった。 mp: 180.0-182.0 ℃; [α] 25D -69.5°(c=0.48, CHCl3) ; 1HNMR (300MHz, CDCl3) δ: 6.65 (d, 1H, J=8.3Hz), 6.55 (d, 1H, J=8.3Hz), 5.98 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 4.36 (d, 1H, J=15.6Hz), 3.82 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.45-3.41 (m, 1H), 3.07-3.01 (m, 2H), 2.90-2.69 (m, 3H), 2.46 (d, 1H, J=15.6Hz), 2.05-1.85 (m, 6H), 1.85-1.70 (m, 2H), 1.61 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 2H) . 13CNMR (75MHz, CDCl3) δ: 194.50, 152.65, 145.29, 145.05, 130.91, 123.15, 118.49, 115.85, 109.30, 63.84, 56.43, 55.15, 53.95, 49.60, 46.15, 45.18, 41.18, 36.45, 32.03, 31.42, 25.03, 24.17, 23.98. 
【００７３】
実例７  17-(2/-Oxo-Propyl)-Sinomenineの調合
【００７４】
【化１５】
2009519960.tif 000017
【００７５】
17-demethylBnOBnOsinomenine (100 mg)とpotassium carbonate (30 mg) をアセトン(10 ml)に溶かし、攪拌してから1-Chloroacetone (20 mg)を加えた。この反応混合液を、30分間加熱し還流させた。冷却した後、この混合液を濾過し、ろ液の溶媒を蒸発したことにより残渣がえられた。この残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（1:1酢酸エチル/石油エーテル）で精製し、粘着性固体17-(2/-oxo-propyl)-BnOBnOsinomenineが得られた。[α] 25D +27.5°(0.11 CHCl3); 1HNMR(300MHz, DCCl3) δ: 7.55(d, 1H, J=8.7Hz),  7.48-7.34(m, 5H),  7.02(d, 2H, J＝8.7Hz),  6.78(s, 2H), 5.47(s, 1H), 5.27(d, 1H, J＝10.8Hz), 5.11(s, 2H), 5.01(d, 1H, J=10.8Hz), 4.20(d, 1H, J＝15.9Hz), 3.84(s, 3H), 3.57-3.3.53(m, 2H), 3.52(s, 3H), 3.52-3.35(m, 1H), 3.27(m, 1H), 2.94(s, 2H), 2.76-2.70(m, 1H), 2.50(d, 1H, J=15.9Hz), 2.24(s, 3H), 1.94-1.83(m, 1H), 1.87-1.82(m, 2H). 
【００７６】
実例４の中で表される手順と同様に、17-(2/-oxo-propyl)-BnOBnOsinomenine (60 mg)を5% TFA/DCM (5 ml)に加え、処理し、白色固体の17-(2/-oxo-propyl)-sinomenineがえられた。mp 147.2-148.0℃; [α] 25D +53°(c=0.21 CHCl3); 1HNMR(300MHz, CDCl3) δ: 6.65(d, 1H, J=8.3Hz), 6.54(d, 1H, J=8.3Hz), 5.99(s, 1H), 5.44(d, 1H, J=1.5Hz), 4.36(d, 1H, J=15.6Hz), 3.82(s, 1H), 3.49(s, 1H), 3.44(d, 1H, J=17.1Hz), 3.29(d, 1H, J=17.1Hz), 3.25(m, 1H), 3.12(s, 1H), 2.98-2.70(m, 2H), 2.57-2.53(m, 1H), 2.47(d, 1H, J=15.6Hz), 2.21(s, 3H), 2.18-2.10(m, 1H), 1.96-1.91(m, 2H)
【００７７】
【化１６】
2009519960.tif 000018
【００７８】
実例８  17-cyclopropylcarbonylsinomenineの調合
【００７９】
【化１７】
2009519960.tif 000019
【００８０】
17-demethyl-BnOBnOsinomenine (100 mg)とcyclopropylcarboxylic acid (18 mg)が含まれているDCM (10 ml)混合液に、DCC (45 mg)を加えた。室温で、6時間攪拌した後、反応混合液を濾過し、飽和NaHCO3溶液(2×10 ml)で洗った 。有機層をNa2SO4で乾燥し、それから蒸発することにより粗品固体が得られた。
【００８１】
実例２で述べた通りに、粗品固体を5% TFA/DCM (20 ml)で処理することにより白色固体が得られた。mp >187.0 ℃; +144.2°(c 0.22 CHCl3); 1HNMRδ: 6.69(d, 1H, J=8.1Hz.), 6.54(d,  1H, J=8.1Hz.), 6.05(s, 1H), 5.50(s, 1H), 5.17(s, 0.7H), 4.78(br s, 0.3H), 4.41(d, 1H, J=15.6Hz.), 4.04-4.00(m, 0.7H), 3.84(s, 3H), 3.54, 3.52(each s, 0.9, 2.1H), 3.43(s, 0.3H), 3.25-3.10(m, 1H), 3.02-2.93(m, 1H), 2.83(s, 1H), 2.69(d, 1H, J=17.7), 2.46(d, 1H, J=15.6Hz.), 2.10-2.06(m, 1H), 1.90-1.80(m, 1H), 1.75-1.65(m, 1H), 1.05-1.00(m, 2H), 0.85-0.70(m, 2H). 
【００８２】
実例９  17-(3／, 5／-Dimethyl-Benzoyl)-Sinomenineの調合
【００８３】
【化１８】
2009519960.tif 000020
【００８４】
17-demethyl-BnOBnOsinomenine (100 mg)とtriethylamine (0.05 ml)を含んでいるDCM (10 ml)混合液に3, 5-dimethylbenzoyl chloride (50 mg)が添加された。室温で、５分攪拌した後、約7 mlの溶媒を取り除いて、残渣を得た。実例２で示された通りに、この残渣を5% TFA/DCM (20 ml)で処理し、残留物を得た。この残留物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ 1:1酢酸エチル/石油エーテル）で精製し、タイトル化合物を手に入れた。 mp 147.2-149.6。
【００８５】
実例１０  化学構造式I化合物の具体的に説明
【００８６】
次の表には化学構造式Iに関する化合物のリストを示す。すべての化合物の具体的な特徴は、母体のシノメ二ンのメチル基にあるRグループを置換する異なった数量と構造の置換基によって決定される。この表には69種類の化合物を陳列するが、実際の数量が本発明で含んでいる数量より大幅に超える可能性が高い。
【００８７】
N-置換シノメ二ン 化合物
【００８８】
TABLE A
【００８９】
【表１】
2009519960.tif 000021
【００９０】
【表２】
2009519960.tif 000022
【００９１】
【表３】
2009519960.tif 000023
TABLE B
【００９２】
【表４】
2009519960.tif 000024
【００９３】
【表５】
2009519960.tif 000025
【００９４】
TABLE C
【００９５】
【化１９】
2009519960.tif 000026
【００９６】
【化２０】
2009519960.tif 000027
【００９７】
【化２１】
2009519960.tif 000028
【００９８】
【化２２】
2009519960.tif 000029
【００９９】
実例１１  シノメ二ン派生物ライブラリの組み立て
本発明で含まれているライブラリにある化合物は以下の構造をもっている： 
【０１００】
【化２３】
2009519960.tif 000030
【０１０１】
, or more specifically
【０１０２】
【化２４】
2009519960.tif 000031
【０１０３】
and/or
【０１０４】
【化２５】
2009519960.tif 000032
【０１０５】
伝統的な化学合成は1つのステップもしくは1つの反応プロセスです。この概念は、一つの化学反応で一つの化合物を生成することである。例えば、下の図に示すように、適切な条件の下R1COOHとR2NH2の間の反応で1つの新しい化合物が生成されます。しかし、この伝統的なアプローチのコストが高いが効率性は低い。
【０１０６】
コンビナトリアル  ケミストリーの概念は、R1COOHとR2NH2との間で、多数の反応を起こし、そして多数の化合物が得られる。図1に示された通りに、50種のR1COOHと50種のR2NH2との反応で、2500種のアミドが得られた。このアプローチを使用して、効率は伝統的な化学合成よりはるかに高い。
【０１０７】
【化２６】
2009519960.tif 000033
【０１０８】
基本的には、２種類の化学合成方法がある：固相合成と液相合成: 
固相合成：
簡単に言うと、小さな分子が化学結合で高分子材料に結合できる。例えばポリスチレンなど。高分子材料は有機溶剤に拡張できるため、化学物質は高分子材料の中まで入られ、化学反応を起こす。化学反応の後、不純物や他の不要な化合物は濾過あるいは洗いにより除去できる。新しい分子または化合物について、適切な化学のアプローチをを使用して回収できる。固相合成の利点は、従来の方法（例えばカラムもしくは蒸留での精製）を避ける。 
【０１０９】
このタイプの合成には、最も有名な方法はいわゆる“ミックスと分割”アプローチだ。このアプローチを使用して、多くの化学反応の手順を省くことができる。たとえば、化合物ライブラリを組立てるため、化学修飾サイトが3つある（ 50x50x50ライブラリ）。125000化合物のライブラリを組立てるため、150の反応が必要だ。しかしながら、もし伝統的な化学合成またはパラレル合成にすれば、125000化合物のライブラリを組立てるため、125000の反応が必要だ。
【０１１０】
液相合成：パラレル合成はこのカテゴリに主要な方法である。液相合成の概念は、伝統的な化学反応に基づいて複数の化学反応はを起こす。例えば、 2500ライブラリを入手するために、50種酸と50種アミンを材料としての2500化学反応が必要だ。このアプローチの利点は、実験を最適化するためかかる時間は長くない。化合物の生産量が大きく、簡単実施できる。欠点は効率は低いだ。
【０１１１】
コンビナトリアル  ケミストリーのアプローチは、新しい化合物を探すため広範に使用されている。しかし、コンビナトリアル  ケミストリーはまだ伝統的な漢方薬の主要構造の修飾に使われていない。以下スキームのとおり（スキーム1）、私たちは、特殊のコンビナトリアル  ケミストリー合成アプローチをデザインし、シノメニン派生物のライブラリを造った：
【０１１２】
【化２７】
2009519960.tif 000034
【０１１３】
適切な化学的条件で、シノメニンは高分子材料（例えばpolyvinyl benzene）と反応し、共有結合により中間物（1）が得られる。
【０１１４】
中間物（1）のN-メチル基を取り除くすることによって、中間物（２）が得られた。
【０１１５】
中間物（２）を異なった50個の反応容器に入れ、50種類のaldehyde（R1CHO,ここでR1は異なった基）と反応させ、中間物（３）が得られた。
【０１１６】
適切な条件で、重合体を切り裂くことにより５０種類のシノメ二ン派生物ライブラリが得られた。もし500種類のアルデヒドを使用すると、500種類のシノメ二ン派生物ライブラリが得られた。
【０１１７】
新たな化合物ライブラリをつくるため、中間物（３）を別の化学反応に使れる。以下のスキーム２示すように、中間物（３）のカルボニル基を還元反応により、中間物（５）が得られた。次、“ミックスと分割”アプローチをを使用し、中間物（５）は５０種類のR2Xと反応し、シノメ二ン派生物を産生する。最後、重合体を切り裂くすることにより2500種類のシノメ二ン派生物ライブラリができる。
【０１１８】
【化２８】
2009519960.tif 000035
【０１１９】
実例12  生物活性
【０１２０】
シノメニン派生物の活性は、ヒトの全血の培養液において、LPSに誘導されたサイトカイン産生を抑制する能力によって評価されている。ヒトの全血において、サイトカインの産生は以下のルートで刺激できる：LPSを用いて白血球を刺激し、 “staphylococcal enterotoxin B”（SEB）を用いて単球（Hartman DA et al: Inflamm Res 1995; 44: 269-274）もしくはリンパ球を刺激する。（Hermann et al: Journal of Immunological Methods 2003; 275: 69-79）
【０１２１】
今度、慢性関節リウマチに関する四つのサイトカイン(TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8)をはかることにより、シノメニン派生物の活性を評価する。TNF-αは慢性関節リウマチの病理に関する最も重要な反応メディエーターであり、テストした化合物によるTNF-αへの抑制程度は、キー化合物の同定に使われる。この考えと方法は、更にほかの研究に結び付けられ、例えばIL-1、IL-6やIL-8などのサイトカインへの抑制作用とIC50の定量。
【０１２２】
ヒトの全血におけるサイトカインの産生を抑制する化合物は、in vivoにも同様な抑制の役割を果たす可能性が高いと考えられている。(Hartman et al., Inflamm Res 1995; 44: 269-274; Hermann et al., Journal of Immunological Methods 2003; 275: 69-79; Zhang Y et al: International Immunopharmacology 2004; 4: 1845-1857; Zhang Y et al., J. of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2004; 309: 348-355; Lagrelius M et al., Cytokine 2006; 33: 156-165.) したがって、ヒトの全血におけるサイトカインの阻害剤の同定は、臨床的に効き目の治療薬の開発につながっている可能性が高い。
【０１２３】
長年にわたって、ヒトの全血のサイトカインのモデルは、様々な患者のグループの特性を同定することに使われている。例として、多発性硬化症(Beck et al., 1988 Acta Neurol. Scand. 78, 318323.; Chofflon et al., 1991, Schweiz. Arch. Neurol. Psychiatr. 142, 107112; 1992, Eur. Cytokine Netw. 3, 523531.), リーシュマニア症(Frankenburg and Klaus, 1991)、関節リウマチ(Zangerle et al., 1992, Cytokine 4, 568575)、敗血症(Volk et al., 1991, Behring Inst., 2082 15.; Ertel et al., 1993, Surgery 114, 243250 (discussion 2501); Ertel et al., 1994, Arch. Surg. 129, 9097 (discussion 978)1994);がん(Elsasser-Beile et al., 1993a,b)、 HIV感染症(Hartung et al., 1998, J. Infect. Dis. 178, 686692.)、borreliosis (Diterich et al., 2001)がある。
【０１２４】
この方法も、in vivoで炎症と免疫調節治療の効果を評価することに重要な役割をはたす。例えば、健康なボランティアにgranulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) を投与し(Hartung et al., 1995, 1999; von Aulock et al., 2000)  もしくはIL-10を投与し (Chernoff et al., 1995, J. Immunol. 154, 54925499)、もしくは患者にgranulocyte-macrophage colony-stimulating factorを投与する場合 (Hartung et al., 2000)。
【０１２５】
１．In vivoの方法
【０１２６】
簡単な説明
テストにより、シノメニン派生物は活性を有する安定な医薬合成物だということがすでに確認された。口服のため様々な活性を持たないデンプン, ゼラチンなどの材料と混合し錠剤および/またはカプセルを製剤できる。われわれの実験では、in vivoでのシノメニン派生物の生物活性を検討した。ラット実験では、経口投与のため、シノメニン派生物は、2% Tween 80と0.5% Methylcellulose vehicleと調製し、終濃度は30 mg/mlにした。また、シノメニン派生物は、水或いはbuffer-based solvents、さらに現在臨床的に使われている多くの溶剤に溶けることができる。たとえば、D5W（ 5％ブドウ糖水）、生理食塩水、ブドウ糖、リン酸バッファなど。これらのバッファを用いて、シノメニン派生物は、静脈注射、点滴、皮下注入、筋肉注射などのできる形になれる。
【０１２７】
動物実験のプロトコル
特許請求で説明したシノメニン派生物の抗炎症作用は、in vivoで動物関節炎モデルを用いて評価された。たとえば、adjuvant-誘導されたラットの関節炎モデルと、コラーゲン-誘導されたマウスの関節炎モデルである。
【０１２８】
adjuvant-誘導されたラットの関節炎モデル
【０１２９】
関節炎は、Lewis系雄性ラットの尾の末端から0.1 ml Freund's Adjuvant-Complete (Signa-Aldrich, Saint Louis, MO)を皮内注射することにより誘導される。八日後関節炎モデルができ、関節炎の損傷は発表した方法の通りに見られる。(Zhang, et al: International Immunopharmacology 2004; 4: 1845-1857).
【０１３０】
次、動物を2つのグループにランダムに分け、各グループには、少なくとも6匹ラットがいる：グループ1：2% Tween 80と0.5% Methylcellulose vehicleで調製した終濃度30 mg / mLのシノメニン派生物を投与（経口投与、毎日2回で1mg/kg）；グループ2：コントロール  グループ（2% Tween 80と0.5% Methylcellulose vehicleのみ投与）。治療の21日間のなか、後肢の腫れや紅斑を観察することによって治療の効果を評価する。(Zhang et al: International Immunopharmacology 2004; 4: 1845-1857). 
【０１３１】
サイトカイン
血漿におけるTNF-α, IL-1, IL-6およびIL-8の産生レベルを測定するために、5日目、１０日目そして２１日目に血液サンプルは末梢血管から採取される。21日間の治療後、動物を二酸化炭素で犠死させる。剖検を行い、足根関節結合部と足根関節結合部の滑膜組織を回収し、組織学的検査に用いられる。
【０１３２】
コラーゲンに誘導されたマウスの関節炎モデル
ウシタイプIIコラーゲンは以下の割合で混合され：0.01 M acetic acid: Freund's complete adjuvant (Signa-Aldrich, Saint Louis, MO) : POLYTRON (KINEMATICA, Switzerland)= 2:1:3, 終濃度1 mg/ml type II collagen emulsionになる。DBA1/Jマウスの尾の末端から0.1 ml emulsion を皮内注射する。２１日後、100 μg of bovine type II collagenを添加した Incomplete Freund's Adjunvantを用いてチャレンジする。マウスの関節炎ができたかどうかの判断基準は、最近発表された四つの等級に従う(Wada et al: European Journal of Pharmacology 2005; 506: 285-295)。
【０１３３】
後足のいずれかの変化は３番目の等級を超える時点は、実験のday 0として指定される。そこから、マウスに２１日間にわたって100 mg/kgのシノメニン派生物（2% Tween 80と0.5% Methylcellulose vehicleと混合する）を経口投与する。二つグループのマウスは（各グループに１２匹）研究に使われ：実験グループと、コントロールグループ（2% Tween 80と0.5% Methylcellulose vehicleのみ）。21日間の治療中、関節炎の重さを同じ評価システムで毎日観察する。21日間の治療後、すべての動物を二酸化炭素で犠死させ、4つの足を回収し、組織学的検査に用いられる。
【０１３４】
２．サイトカインのアッセイのため、ヒトの全血培養液を調製ヒトの血液サンプル（~20 ml）は健康なボランティア（男性、20-50歳、たばこを吸わない人）の末梢静脈から（10 ml）採取され、滅菌したendotoxin-free ethylenediaminetetra-acetic (EDTA) tubeにすみやかにいれる。血液サンプルは3つの異なった実験グループに分けて：コントロールグループ、LPS単独刺激グループとLPSプラステスト化合物グループ。各グループには、5つの異なる個体からの血液サンプルが含まれる。
【０１３５】
コントロールグループにおいて、 100μlの全血サンプルは900 μLのRPMI 1640に希釈され、24ウェルプレートに入れた。LPS単独刺激グループとLPSプラステスト化合物グループにおいて、100μlの全血サンプルは，1 μlテスト化合物あるいは1 μl のDMSOを添加した889 ul RPMI 1640 (RPMI 1640 was consisted of 25 mM Hepes supplemented with 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 4 mM l-glutamine, and 10% fetal calf serum)  に希釈された。すべてのサンプルは１５分間で37℃ 5% CO2インキュベートしてから、10 μl LPS (1 μg/ml)を加え（コントロールグループを除き）、37℃ 5% CO2 にて６時間インキュベートした。サンプルは３分間で氷冷されてから、4 ℃ 1500gで10分遠心を行った。上清は回収し、TNF-α、IL-1、IL-6および IL-8を定量するため、-80℃で保存された。各グループの全血培養液に加えたものは以下のテーブルに示され：
【０１３６】
【表６】
2009519960.tif 000036
３．ヒトの全血培養液においてTNF-αの産生阻害アッセイを用いて、キーのシノメニン派生物を同定
【０１３７】
今回、前述の２２種テスト化合物により阻害されるTNF-αの産生を測定しました。R&D Systems会社 (MN, USA)のhuman TNF-αEnzyme Immunometric Assay Kit キット(Lot.235123)を用いて、TNF-αの産生をはかった。具体的な方法はキットの説明書に掲載されている。ヒトの全血培養液においてLPSに誘導されるTNF-αの濃度は884.2±329.8 pg/ml。抑制活性により、２２種テストされる化合物を三つのグループに分け：
【０１３８】
グループI ：LPS刺激培養によるTNF-αの産生を４０％以上抑制する化合物を“キー化合物”として定義され、更なる研究に使われた。7つのテスト化合物は、LPSにより誘導されたTNF-αの産生を884.2±329.8 pg/mlから530 pg/ml以下まで抑えた。抑制率は40.2%から 64.1%までであった。これらの化合物の番号は、＃20、＃33、＃37、＃39、＃44、＃48と＃54だった。図1Aと1Bは、これらの化合物によりTNF-αの産生への抑制絶対値と抑制パーセンテージを示した。（バーグラフが生物活性によって配置された）。
【０１３９】
グループII ：ヒトの全血においてLPS単独刺激培養によるTNF-αの産生レベルと比べ、５つ化合物の抑制率は30％-40％で、LPS刺激培養によるTNF-αの産生を884.2±329.8 pg/mlから530 pg/ml-650 pg/mlまで阻害した。抑制率は３１%から３８．３%までだった。これらの化合物の番号は、#18、#42、#43、#46、#49だった。図2Aと2Bは、これらの化合物によりTNF-αの産生への抑制絶対値と抑制パーセンテージを示した。（バーグラフが生物活性によって配置された）。
【０１４０】
グループIII ：10種化合物がLPS刺激培養によるTNF-αの産生に対する抑制率は３０％以下だった。これらの化合物の抑制率は29.5%から-5.2%までだった。化合物の番号は#1、#2、#5、#9、#10、#14、#15、#28、#36、#47だった。図３Aと３Bは、これらの化合物によりTNF-αの産生への抑制絶対値と抑制パーセンテージを示した。（バーグラフが生物活性によって配置された）。
【０１４１】
TNF-αは慢性関節リウマチと炎症相関病気において大きな役割を果たす。だから、LPS刺激培養によるTNF-αの産生を40%以上阻害できた化合物は次の研究に用いられ：LPS刺激培養によるTNF-αやIL-1やIL-6やIL-8などの産生に対する抑制IC50を測定した。#54と#44は混合した化学isomersであったため、IC50実験には使われなかった。これらの化合物(#20、#33、#37、#39、#48)は以下の濃度でテストされ：10-9、10-8、10-7、10-6、10-5と10-4 Molar/L。母体シノメニンはコントロールとして使われた。Calcdemoプログラムを用いてIC50を計算した。
【０１４２】
４．LPS刺激培養によるTNF-αの産生に対する5種キーの化合物のIC50
図4は、ヒトの全血培養液において、五つのキーの化合物がLPS刺激培養によるTNF-αの産生を阻害する容量−作用曲線を示した(濃度: 10-9-10-5  mol/L)。血液サンプルはLPS (濃度: 10 ng/ml)ととともに６時間でインキュベートした。シノメニンはコントロールとして使用された。シノメニンを含むすべてのテスト化合物は10-9 mol/L以上の濃度では、LPS刺激培養によるTNF-αの産生に対する抑制効果が認められなかったので、LPS刺激培養によるTNF-αの産生を10-9 mol/Lテスト化合物で影響されたレベルは、LPS単独刺激培養によるTNF-αの産生レベルと一致にした。図a (a1-a6)のデータ-はTNF-αの絶対値を示し、図b (b1-b6)のデーターはLPS刺激培養によるTNF-αの産生をテスト化合物により抑制百分比を示した。全てのデーターはMean ± SD (n=6)の形であった。
【０１４３】
五つのキーの化合物がLPS刺激培養によるTNF-αの産生を抑制するIC50は以下のテープルにまとめて示された：
【０１４４】
【表７】
2009519960.tif 000037
５．LPS刺激培養によるIL-１の産生に対する5種キーの化合物のIC50
Cayman Chemical社(MI, USA)のhuman IL-1β Enzyme Immunometric Assay Kit (Lot number 145020)キットを用いて、LPS刺激培養によるIL-1の産生に対するテスト化合物の抑制作用を検討した。キットの提供した説明書は実験方法を詳しく説明していた。キットは全ての試薬と試剤を提供した：
【０１４５】
1 ）試薬と試剤は説明書の示す通りに準備され、生物化学的活性を測定するため実験に使用された。
【０１４６】
2 ）標準品はキットより提供され、前記した方法の通りにテスト化合物で処理された血液サンプルとLPSで処理された血液サンプルを調製した。各ウェルに50ulの試剤あるいは血液サンプルを加えた。その後、10μL DTT, 5μL マウス血清と100μL Fab'も各ウェルに入れた。ウェルはテープでカバーされてから、4℃一晩でインキュベートした。標準品とサンプルのアッセイのため、プレートのレイアウトを設計した。
【０１４７】
3 ）自動洗浄機を用いて600μL filling wash bufferで各ウェルを洗浄した。洗いを合わせて５回繰り返し行った。各ステップではウェルに残る液体を完全に取り除く。
【０１４８】
4 ） 200μl Ellman's reagentを各ウェルに追加してから、黒い紙でプレーを覆い、室温で4時間穏やかに揺れしながらインキュベートした。
【０１４９】
5 ）マイクロプレートリーダーで各ウェルの412 nmでの吸光度を測定した。
【０１５０】
図５は、ヒトの全血培養液において、五つのキーの化合物がLPS刺激培養によるIL-1の産生を抑制する容量−作用曲線を示した(濃度: 10-9-10-5 mol/L)。血液サンプルはLPS (濃度: 10 ng/ml)とともに６時間でインキュベートした。シノメニンの活性もはかった。シノメニンを含むすべてのテスト化合物は10-9 mol/L以上の濃度では、LPS刺激培養によるIL-1の産生に対する抑制効果が認められなかったため、LPS刺激培養によるIL-1の産生を10-9 mol/Lテスト化合物で影響されたレベルは、LPS単独刺激培養によるIL-1の産生レベルと一致にした。図a (a1-a6)のデータ-はIL-1の絶対値を示し、図b (b1-b6)のデーターはLPS刺激培養によるIL-1の産生をテスト化合物により抑制百分比を示した。全てのデーターはMean ± SD (n=6)の形で表示された。
【０１５１】
五つのキーの化合物化合物がLPS刺激培養によるIL-1の産生を抑制するIC50は以下のテープルにまとめて示された：
【０１５２】
【表８】
2009519960.tif 000038
６．LPS刺激培養によるIL-６の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【０１５３】
Biosource社(Carlsbad, CA, USA)のhuman IL-6 Elisa Kit (Lot number 054204D)キットを用いて、LPS刺激培養によるIL-６の産生におけるテスト化合物の抑制作用を検討した。キットの提供した説明書は以下の実験方法を詳しく説明している。キットは全ての試薬と試剤を提供した：
【０１５４】
1 ）試薬と試剤は説明書の示す通りに準備され、生物化学的活性を測定するため実験に使用された。
【０１５５】
2 ）50ulの標準品溶剤はキットより提供され、テスト化合物で処理された血液サンプルとLPS単独でで処理された血液は各ウェルに入れた。次に50μL Biotin Conjugateを各ウェルに加えた。ウェルはテープで覆われてから、２時間室温でインキュベートした。
【０１５６】
3 ）自動洗浄機を用いて600μL filling wash bufferで各ウェルを洗浄した。洗いを合わせて４回繰り返して行った。各ステップではウェルに残る液体を完全に取り除く。
【０１５７】
4 ）100μL Streptavidin-HRP working solutionを各ウェルに入れてから、新たなテープでプレーを覆い、室温で３０分間インキュベートした。
【０１５８】
5 ）ステップ３のように洗浄を繰り返した。
【０１５９】
6 ）100μL Stabilized Chromogenを各ウェルに加えてから、室温で３０分間インキュベートした。遮光で行った。
【０１６０】
7 ）100μL Stabilized Chromogenを各ウェルに入れた。
【０１６１】
8 ）Stabilized Chromogenを入れてから３０分間以内、マイクロプレートリーダーで各
ウェルの450nmでの吸光度を測定した。
【０１６２】
図6は、ヒトの全血培養液において、五つのキーの化合物がLPS刺激培養によるIL-6の産生を抑制する容量−作用曲線を示した(濃度: 10-9-10-5mol/L)。血液サンプルはLPS (濃度: 10 ng/ml)とともに６時間でインキュベートした。シノメニンを含むすべてのテスト化合物は10-9 mol/L以上の濃度では、LPS刺激培養によるIL-6の産生に対する抑制効果が認められないため、LPS刺激培養によるIL-6の産生を10-9 mol/Lテスト化合物で影響されたレベルは、LPS単独刺激培養によるIL-6の産生レベルと一致にした。図a (a1-a6)のデーターはIL-6の絶対値を示し、図b (b1-b6)のデーターはLPS刺激培養によるIL-6の産生をテスト化合物により抑制百分比を示した。全てのデーターはMean ± SD (n=6)の形で表示された。
【０１６３】
五つのキーの化合物がLPS刺激培養によるIL-6の産生を抑制するIC50は以下のテープルにまとめて示された：
【０１６４】
【表９】
2009519960.tif 000039
LPS刺激培養によるIL-8の産生に対する5種キーの化合物のIC50
Biosource社(Carlsbad, CA, USA)のhuman IL-8 Elisa Kit (Lot number 061302B)キットを用いて、LPS刺激培養によるIL-8の産生におけるテスト化合物の抑制作用を検討した。キット提供した説明書は以下の実験方法を詳しく説明している。キットは全ての試薬と試剤を提供した：
【０１６５】
1 ）試薬と試剤は説明書示す通りに準備され、生物化学的活性を測定するため実験に使用された。
【０１６６】
2 ）標準品はキットより提供され、テスト化合物で処理された血液サンプルとLPS単独で処理された血液サンプルを各ウェルに50 ulずつ加えた。その後、50μL Biotin Conjugateも各ウェルに入れた。ウェルはテープでカバーされてから、1時間半室温でインキュベートした。
【０１６７】
3 ）自動洗浄機を用いて600μL filling wash bufferで各ウェルを洗浄した。洗いを合わせて４回繰り返して行った。各ステップではウェルに残る液体を完全に取り除く。
【０１６８】
4 ）100μL Streptavidin-HRP working solutionを各ウェルに入れてから、新たなテープでプレーを覆い、室温で３０分間インキュベートした。
【０１６９】
5 ）ステップ３のように洗浄を繰り返した。
【０１７０】
6 ）100μL Stabilized Chromogenを各ウェルに加えてから、室温で３０分間インキュベートした。遮光で行った。
【０１７１】
7 ）100μL Stop Solutionを各ウェルに入れた。
【０１７２】
8 ）Stop Solutionを入れてから３０分間以内、マイクロプレートリーダーで各ウェルの450nmでの吸光度を測定した。
【０１７３】
図7は、ヒトの全血培養液において、五つのキーの化合物化合物がLPS刺激培養によるIL-8の産生を抑制する容量−作用曲線を示した(濃度: 10-9-10-5 mol/L)。血液サンプルはLPS (濃度: 10 ng/ml)とともに６時間でインキュベートした。シノメニンの活性もはかった。シノメニンを含むすべてのテスト化合物は10-9 mol/L以上の濃度では、LPS刺激培養によるIL-8の産生に対する抑制効果が認められないため、LPS刺激培養によるIL-8の産生を10-9 mol/Lテスト化合物で影響されたレベルは、LPS単独刺激培養によるIL-8の産生レベルと一致にした。 図a (a1-a6)のデーターはIL-8の絶対値を示し、図b (b1-b6)のデーターはLPS刺激培養によるIL-8の産生をテスト化合物により抑制百分比を示した。全てのデーターはMean ± SD (n=6)の形で表示された。
【０１７４】
五つのキーの化合物がLPS刺激培養によるIL-8の産生を抑制するIC50は以下のテープルにまとめて示された：
【０１７５】
【表１０】
2009519960.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】ヒトの全血培養液において、lipopolysaccharide （LPS）（濃度: 10 ng/ml）により誘導されたTNF-αに対するグループIの7種テスト化合物（濃度:10-5 mol/L)の抑制作用。テスト化合物はそれぞれ６時間でLPSとともにインキュベートした。C: コントロール グループ(LPSなし)、L: LPS単独グループ。 データは絶対値として表示された。 Mean ±SD. n=2. グループI、 TNF-αレベル<530 pg/ml：#33、#54、#20、#39、#44、#37、#48。
【図１Ｂ】グループIの7種テスト化合物はLPS-誘導されたTNF-αに対する抑制パーセンテージだった。この抑制パーセンテージはLPS単独グループと比べて得たデーターだった。
【図２Ａ】ヒトの全血培養液において、LPS（濃度: 10 ng/ml）により誘導されたTNF-αに対するグループIIの5種テスト化合物（濃度:10-5 mol/L)の抑制効果。テスト化合物はそれぞれ６時間でLPSとともにインキュベートした。C：コントロール グループ(LPSなし), L：LPS単独グループ。 データは絶対値として提示された。 Mean ±SD. n=2. グループI、 TNF-αレベル: 530 ±610 pg/ml：#18、#42、#43、#46、 #49。
【図２Ｂ】グループIIの5種テスト化合物はLPS-誘導されたTNF-αに対する抑制パーセンテージだった。この抑制パーセンテージはLPS単独グループと比べて得たデーターだった。
【図３Ａ】ヒトの全血培養液において、TNF-αに対するグループIIIの10種テスト化合物（濃度:10-5 mol/L)の抑制作用。テスト化合物はそれぞれ６時間でLPS（濃度: 10 ng/ml )とともにインキュベートした。C: コントロール グループ(LPSなし)、L: LPS単独グループ。 データは絶対値として提示された。 Mean ±SD. n=2.グループIII, TNF-αレベル>610 pg/ml: #1、#2、#5、#9、#10、#14、#15、#28、#36、#47。
【図３Ｂ】グループIIIの10種テスト化合物はLPS-誘導されたTNF-αに対する抑制パーセンテージだった。この抑制パーセンテージはLPS単独グループと比べて得たデーターだった。
【図４Ａ】LPSにより誘導されたTNF-αの産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図４Ｂ】LPSにより誘導されたTNF-αの産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図５Ａ】LPSにより誘導されたIL-1の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図５Ｂ】LPSにより誘導されたIL-1の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図６Ａ】LPSにより誘導されたIL-６の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図６Ｂ】LPSにより誘導されたIL-６の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図７Ａ】LPSにより誘導されたIL-８の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図７Ｂ】LPSにより誘導されたIL-８の産生に対する5種キーの化合物のIC50
【図１Ａ】
2009519960.tif 000058
【図１Ｂ】
2009519960.tif 000059
【図２Ａ】
2009519960.tif 000060
【図２Ｂ】
2009519960.tif 000061
【図３Ａ】
2009519960.tif 000062
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2009519960.tif 000064
【図４Ｂ】
2009519960.tif 000065
【図５Ａ】
2009519960.tif 000066
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2009519960.tif 000068
【図６Ｂ】
2009519960.tif 000069
【図７Ａ】
2009519960.tif 000070
【図７Ｂ】
2009519960.tif 000071
【国際調査報告】
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