(57)【要約】本発明は、エンコーディングオリゴヌクレオチドタグを含む分子のライブラリーをスクリーニングすることにより、興味のある化合物を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定する方法であって：
（Ａ）化合物のライブラリーを合成し（ここで、化合物は：
（ｉ）ｍのイニシエーター化合物を含む溶液を提供し（ここで、ｍは１以上の整数であり、イニシエーター化合物は、ｎのビルディングブロックを含む官能部分（ここで、ｎは１以上の整数である）であって、ｎのビルディングブロックを同定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合するものからなる）；
（ｉｉ）段階（ｉ）の溶液をｒの反応容器中に分割し（ここで、ｒは２以上の整数である）、これにより、溶液のｒのアリコートを作製し；
（ｉｉｉ）各反応容器中のイニシエーター化合物をｒのビルディングブロックの１つと反応させ、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むｒのアリコートを作製し；
（ｉｖ）各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドを、ｒの独立した入力オリゴヌクレオチドの組の一つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドを触媒する酵素の存在下、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ；これにより、ｎ＋１のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のｒのアリコートを作製する
ことにより官能部分の構造を特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する２以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む）；
（Ｂ）生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーが標的と結合するために適した条件下で接触させ；
（Ｃ）標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し；
（Ｄ）標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し；
（Ｅ）生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバー，の官能部分の構造を決定するために、段階（Ｄ）において決定された配列を使用し、これにより生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定することを含む方法。
【請求項２】
標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記増幅段階が：
（ｉ）油中水エマルジョンを形成して、複数の水性ミクロリアクターを作製し（ここで、ミクロリアクターの少なくとも１つは、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバー、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドと結合できる１つのビーズ、および核酸増幅を行うために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含む）；
（ｉｉ）前記エンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーを形成するために、ミクロリアクター中でエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅し；
（ｉｉｉ）ミクロリアクター中のビーズにエンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーを結合させることを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記配列決定段階（Ｄ）が：
（ｉ）有効量のシークエンシングプライマーをエンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーとアニールし、シークエンシングプライマーをポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸で伸長して、配列決定生成物、および所定のヌクレオチド三リン酸が前記シークエンシングプライマーの３’末端上に組み入れられるならば、シークエンシング反応副生成物を得；
（ｉｉ）シークエンシング反応副生成物を同定し、これにより、エンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定する方法であって：
（Ａ）化合物のライブラリーを合成し（ここで、化合物は：
（ｉ）ｍのイニシエーター化合物を含む溶液を提供し（ここで、ｍは１以上の整数であり、イニシエーター化合物は、ｎのビルディングブロックを含む官能部分からなり、ｎは１以上の整数であり、前記化合物は、ｎのビルディングブロックを特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する）；
（ｉｉ）段階（ｉ）の溶液をｒの反応容器中に分割し（ここで、ｒは２以上の整数である）、これにより溶液のｒのアリコートを得；
（ｉｉｉ）各反応容器中のイニシエーター化合物をｒのビルディングブロックのうちの１つと反応させて、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むｒのアリコートを作製し；
（ｉｖ）各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドを、１組のｒの異なる入力オリゴヌクレオチドの１つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの結紮を触媒する酵素の存在下、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ；これにより、ｎ＋１ビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合するｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のｒアリコートを作製する
ことにより官能部分の構造を特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する２以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む）；
（Ｂ）生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーを標的と結合させるために適した条件下で接触させ；
（Ｃ）標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し；
（Ｄ）標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し（ここで、前記配列決定は：
（ｉ）有効量のシークエンシングプライマーを増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドとアニールし、シークエンシングプライマーをポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸で伸長して、シークエンシング産物および、もし所定のヌクレオチド三リン酸が前記シークエンシングプライマーの３’末端上に組み入れられるならば、シークエンシング反応副生成物を得；
（ｉｉ）シークエンシング反応副生成物を同定し、これによりエンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を決定することを含む）；
（Ｅ）段階（Ｄ）において決定されたエンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を用いて、生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバーの官能部分の構造を決定し、これにより生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定することを含む方法。
【請求項６】
標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
エンコーディングオリゴヌクレオチドの前記増幅が：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；転写ベースの増幅、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、連続流増幅、およびローリングサークル増幅からなる群から選択される方法により行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
エンコーディングオリゴヌクレオチドの前記配列決定が、ピロホスフェートベースのシークエンシング反応または合成法による単分子配列決定により行われる、請求項１、４、または５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
シークエンシング反応副生成物がＰＰｉであり、カップリングしたスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応が、検出のための光を発生させるために使用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
エンコーディングオリゴヌクレオチドが結合しないビーズから離れた、増幅したエンコーディングオリゴヌクレオチドと結合するビーズに関して濃縮する段階をさらに含む請求項１または５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記濃縮段階が、親和性精製、および電気泳動法からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
１以上の増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドを回収するために、エマルジョンを破壊することをさらに含む請求項３記載の方法。
【請求項１３】
（Ａ）（ｖ）ｒのアリコートの２以上を組み合わせ、これにより、ｎ＋１のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合するｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる溶液を生成させる段階をさらに含む、請求項１または５記載の方法。
【請求項１４】
ｒのアリコートが組み合わせられる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
（Ａ）（ｉ）から（Ａ）（ｖ）の段階が、１回以上行われ、サイクル１〜ｉが得られ、ここで、ｉは２以上の整数であり、サイクルｓ＋１において、ｓはｉ−１以下の整数であり、段階（ａ）のｍのイニシエーター化合物を含む溶液が、サイクルｓの段階（ｅ）の溶液である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのビルディングブロックがアミノ酸である請求項１または５記載の方法。
【請求項１７】
初期オリゴヌクレオチドが共有結合した二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１または５記載の方法。
【請求項１８】
入力オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
イニシエーター化合物が、ビルディングブロックと結合するために適合させられる第一官能基、オリゴヌクレオチドの５’末端と結合するために適合される第二官能基、およびオリゴヌクレオチドの３’末端と結合するために適合される第三官能基を含むリンカー部分を含む請求項１または５記載の方法。
【請求項２０】
リンカー部分が構造：
しない
【化１】
2009513135.tif 000093
（式中
Ａはビルディングブロックと結合するために適合される官能基であり；  
Ｂはオリゴヌクレオチドの５’末端と結合するために適合される官能基であり；
Ｃはオリゴヌクレオチドの３’末端と結合するために適合された官能基であり；  
Ｓは原子または骨格であり；
ＤはＡをＳと連結する化学構造であり；
ＥはＢをＳと連結する化学構造であり；
ＦはＣをＳと連結するる化学構造である）
を有するものである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
Ａがアミノ基であり；
Ｂがホスフェートであり；
Ｃがホスフェートである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｄ、ＥおよびＦがそれぞれ独立して、アルキレン基またはオリゴ（エチレングリコール）基である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
Ｓが炭素原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子、ホスフェート、環状基または多環式基である請求項２３記載の方法。
【請求項２４】
リンカー部分が構造：
【化２】
2009513135.tif 000094
（式中、ｎ、ｍおよびｐのそれぞれは、独立して、１から約２０の整数である）
を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ｎ、ｍおよびｐのそれぞれが独立して２から８の整数である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ｎ、ｍおよびｐのそれぞれが独立して３から６の整数である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
リンカー部分が構造：
【化３】
2009513135.tif 000095
を有する請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記イニシエーター化合物のそれぞれが反応性基を含み、前記のｒのビルディングブロックが前記反応性基に対して相補性である相補反応性基を含む請求項１または５記載の方法。
【請求項２９】
反応性基および相補反応性基が、アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；ホスホニル基；エポキシド基；アジリジン基；およびイソシアネート基からなる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
反応性基および相補反応性基が、ヒドロキシル基；カルボキシル基；スルホニル基；ホスホニル基；エポキシド基；アジリジン基；およびイソシアネート基からなる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
反応性基および相補反応性基が、アミノ基およびアルデヒドまたはケトン基からなる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
反応性基および相補反応性基間の反応が還元条件下で行われる請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
反応性基および相補反応性基が、リンイリド基およびアルデヒドまたはケトン基からなる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
反応性基および相補反応性基が付加環化により反応して、環状構造を形成する請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
反応性基および相補反応性基が、アルキンおよびアジドからなる群から選択される請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
反応性基および相補性官能基が、ハロゲン化複素環式芳香族基および求核試薬からなる群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３７】
ハロゲン化複素環式芳香族基が、塩素化ピリミジン、塩素化トリアジンおよび塩素化プリンからなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
求核試薬がアミノ基である請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
サイクルｉ後に：
（Ａ）（ｖｉ）１以上の官能部分を環化する段階をさらに含む請求項１３記載の方法。
【請求項４０】
段階（Ａ）（ｖｉ）の官能部分がアジド基およびアルキニル基を含む請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
官能部分が、アジド基およびアルキニル基の付加環化に適した条件下で維持されて、トリアゾール基を形成し、これにより環状官能部分を形成する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
付加環化反応が、銅触媒の存在下で行われる請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
段階（ｆ）の１以上の官能部分の少なくとも１つが、少なくとも２つのスルフヒドリル基を含み、前記官能部分が２つのスルフヒドリル基の反応に適した条件下に維持されて、ジスルフィド基を形成し、これにより前記官能部分が環化される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
初期オリゴヌクレオチドがＰＣＲプライマー配列を含む請求項１または５記載の方法。
【請求項４５】
サイクルｉの入力オリゴヌクレオチドがＰＣＲクロージングプライマーを含む請求項１３記載の方法。
【請求項４６】
サイクルｉ後に、
（ｄ）クロージングＰＣＲプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドをエンコーディングオリゴヌクレオチドに結紮する段階をさらに含む請求項１３記載の方法。
【請求項４７】
クロージングＰＣＲプライマー配列がエンコーディングオリゴヌクレオチドに、前記結紮を触媒する酵素の存在下で結紮されることを含む請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年１０月２８日に提出された米国仮出願番号６０／７３１，４６４の優先権を主張する。本出願は、２００５年６月９日に提出された米国特許出願番号６０／６８９，４６６（係属中）、および２００４年１２月１７日に提出された米国特許出願番号１１／０１５４５８に関連する。本出願はさらに、２００３年１２月１７日に提出された米国仮特許出願番号６０／５３０，８５４；２００４年１月３０日に提出された米国仮特許出願番号６０／５４０，６８１；２００４年３月１５日に提出された米国仮特許出願番号６０／５５３，７１５；および２００４年７月１６日に提出された米国仮特許出願番号６０／５８８，６７２にも関連する。前記出願のそれぞれの全内容は本発明の一部として参照される。
【０００２】
（技術分野）
有用な生物活性を有する化合物を同定するためのより有効な方法の探索は、コンビナトリアルライブラリーと呼ばれる集団において存在する、膨大な数の異なる化合物のスクリーニング法の開発に至っている。このようなライブラリーは１０５以上の異なる化合物を含み得る。コンビナトリアルライブラリーを産生するための様々な方法が存在し、ペプチド、ペプチド模倣物および有機小分子の組み合わせ合成が報告されている。
【０００３】
医薬発見における組み合わせ法の使用における２つの主な課題は、十分な複雑さを有するライブラリーの合成および使用されるスクリーンにおいて活性である分子の同定である。ライブラリーの複雑さの程度が高いほど、すなわち、ライブラリー中に存在する異なる構造の数が多いほど、このライブラリーが興味のある活性を有する可能性が高くなることは一般に認識されている。従って、ライブラリー合成において用いられる化学反応は、妥当な時間枠内で膨大な数の化合物を産生できなければならない。しかしながら、所定の形式的または全体的な濃度について、ライブラリー内の異なるメンバーの数の増大は、任意の特定のライブラリーメンバーの濃度を低下させる。これは、高複雑度のライブラリーからの活性分子の同定を複雑にする。
【特許文献１】米国仮出願番号６０／７３１，４６４
【特許文献２】米国特許出願番号６０／６８９，４６６
【特許文献３】米国特許出願番号１１／０１５４５８
【特許文献４】米国仮特許出願番号６０／５３０，８５４
【特許文献５】米国仮特許出願番号６０／５４０，６８１
【特許文献６】米国仮特許出願番号６０／５５３，７１５
【特許文献７】米国仮特許出願番号６０／５８８，６７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの障害を克服するための一つの方法は、エンコードされたライブラリー、特に、各化合物が増幅可能なタグを含むライブラリーの開発であった。このようなライブラリーは、ＤＮＡエンコード化ライブラリーであって、分子生物学の技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてライブラリーメンバーを同定するＤＮＡタグを増幅することができるものを含む。しかしながら、非常に大きなライブラリーの製造するためのこのような方法の使用はまだ実証されていないが、かかるライブラリーを製造するための改善法が、薬剤開発のこの方法の可能性の実現のために必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
伝統的な薬剤開発法は、多段階選択法であって、しばしば、核酸分子の増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）、および最高１０００以上のトップクローンの配列決定を含む方法に依存する。この多段階選択法および核酸増幅のために、しばしば、多くの偏りが導入される（例えば、Ｈｏｌｔ、Ｌ．Ｊ．ら  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８（１５）：Ｅ７２において考察）。偏りの存在は、典型的には、所望の生物活性が欠損した化合物の選択につながる。
【０００６】
本発明は、従来技術の方法と比較して、前記のかたよりを排除する方法を提供する点で改善された方法を提供する。例えば、本発明は、より少ない選択段階を用いて望ましい生物活性を有する化合物の正確な同定に導く、大規模平行配列決定法を用いて興味のある化合物を同定する方法を提供する。さらに、本明細書において記載されるように、核酸増幅、例えば、ＰＣＲ増幅により導入される偏りを排除する独特の標識システムが開発された。加えて、本明細書において記載される方法は、望ましい生物特性を有する選択された化合物の拡張的で大規模な分析を可能にし、次いで科の構造関係を有する関連化合物が同定される（構造活性関係）。まとめると、本発明の方法を用いて、一段階選択／濃縮サイクルを行うことができ、次に配列決定を単分子レベルで、好ましくは核酸増幅を必要としないで行うことができる。
【０００７】
従って、一つの態様において、本発明は生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定する方法を提供する。この方法は、化合物のライブラリーを合成し（ここで、化合物は、ｍのイニシエーター化合物を含む溶液を提供することにより官能部分の構造を同定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合した２以上のビルディングブロックを含む官能部分を含み、ここで、ｍは１以上の整数であり、イニシエーター化合物は、ｎのビルディングブロックを含む官能部分からなり、ｎは１以上の整数であり、前記ビルディングブロックは、ｎのビルディングブロックを同定する初期オリゴヌクレオチドに操作可能に結合する）、前記溶液をｒの反応容器中に分割し（ここで、ｒは２以上の整数である）、これによりｒの溶液のアリコートを得、各反応容器中のイニシエーター化合物をｒのビルディングブロックのうちの１つと反応させ、これにより、初期オリゴヌクレオチドに操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むｒのアリコートを得、各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドをｒの異なる入力オリゴヌクレオチドの組の１つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの結紮を触媒する酵素の存在下で、入力オリゴヌクレオチドと初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ；これにより、ｎ＋１ビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１ビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のｒのアリコートを作製し；生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーが標的と結合するために適した条件下で接触させ、標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し、生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバーの官能部分の構造を決定するために、前記配列を使用し、これにより、生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定することを含む。
【０００８】
１つの実施形態において、本発明の方法は、配列決定の前に標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅をさらに含む。
【０００９】
１つの実施形態において、増幅法は、油中水エマルジョンを形成して、複数の水性マイクロリアクターを作製し（ここで、マイクロリアクターの少なくとも１つは、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバー、標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドと結合できる単一のビーズ、および核酸増幅を行うために必要な試薬を含む増幅反応溶液を含む）、マイクロリアクター中のエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅して、増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドを形成し、増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドをマイクロリアクター中のビーズと結合させることを含む。
【００１０】
１つの実施形態において、配列決定法は、有効量のシークエンシングプライマーをエンコーディングオリゴヌクレオチドの増幅されたコピーにアニールし、シークエンシングプライマーをポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸で伸長して、シークエンシング生成物および、所定のヌクレオチド三リン酸がシークエンシングプライマーの３’末端に組み入れられるならば、シークエンシング反応副生成物を得、シークエンシング反応副生成物を同定し、これによりエンコーディングオリゴヌクレオチドの配列を決定することを含む。
【００１１】
１つの実施形態において、配列決定は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。もう一つ別の実施形態において、配列決定は、ピロホスフェート配列決定法を使用するか、または合成法による単分子配列決定を用いて行われる。
【００１２】
本発明は、化合物およびコンビナトリアル化合物ライブラリーを産生する方法、本発明の方法により産生された化合物およびライブラリー、ならびに望ましい性質、例えば、望ましい生物活性を有する化合物を同定するためのライブラリーの使用法に関する。本発明はさらに、これらの方法を用いて同定された化合物に関する。
【００１３】
コンビナトリアルライブラリーを製造し、スクリーンするために、様々な方法が行われてきた。例には、例えば１つの化合物が多数の反応容器のそれぞれにおいて合成される場合に、ライブラリーの個々のメンバーが互いに物理的に分離される方法が含まれる。しかしながら、これらのライブラリーは典型的には、１つの化合物を一度に、または最高でも、数個の化合物を一度にスクリーンするので、その結果、最も有効なスクリーニング法は得られない。他の方法において、化合物は固体支持体上で合成される。このような固体支持体は、特定の化合物が特定のチップまたは膜の特定の領域（アドレス可能な位置）を占めるチップを含む。他の方法において、化合物はビーズ上で合成され、各ビーズは異なる化学構造を含有する。
【００１４】
大きなライブラリーのスクリーニングにおいて生じる２つの困難は（１）スクリーンできる異なる化合物の数；および（２）スクリーンにおいて活性である化合物の同定である。１つの方法において、スクリーンにおいて活性である化合物は、当初のライブラリーをさらに小さなフラクションおよびサブフラクションに縮小し、それぞれの場合において、活性化合物を含有するフラクションまたはサブフラクションを選択し、小集団の全てのメンバーが個々に合成でき、所望の活性について評価できるような十分小さい化合物の組を含有する活性なサブフラクションが得られるまでさらに分割することにより同定される。これは、退屈で、時間がかかる作業である。
【００１５】
コンビナトリアルライブラリースクリーンの結果を解析する別の方法は、ライブラリーメンバーが識別標識で標識されているライブラリー、すなわち、ライブラリーにおいて存在する各ラベルがライブラリーにおいて存在する異なる化学構造と関連し、ラベルの同定が標識された分子の構造を見分けるものを利用することである。標識されたライブラリーについての一つの方法は、例えば、米国特許番号５，５７３，９０５；５，７０８，１５３；  ５，７２３，５９８、６，０６０，５９６、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／０６１２１；ＷＯ  ９３／２０２４２；ＷＯ  ９４／１３６２３；ＷＯ  ００／２３４５８；ＷＯ  ０２／０７４９２９およびＷＯ  ０２／１０３００８、ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９、５３８１−５３８３（１９９２）；ＮｉｅｌｓｅｎおよびＪａｎｄａ（Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６、３６１−３７１（１９９４）；およびＮｉｅｌｓｅｎ、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＪａｎｄａ（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５、９８１２−９８１３（１９９３））（それぞれは全体として本発明の一部として参照される）により記載されているように、オリゴヌクレオチド標識を利用する。このような標識は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅することができ、多くの標識を産生することができ、配列決定により標識を同定することができる。標識の配列は次に、純粋な形態において合成でき、試験できる結合分子の構造を識別する。今日まで、Ｌｅｒｎｅｒらにより開示された方法の、大きなライブラリーを調製するための使用は報告されていない。本発明は  ＤＮＡによりエンコードされたライブラリーを産生するための方法における改善、ならびにＤＮＡによりエンコードされた分子の大（１０５メンバー以上）ライブラリーであって、官能部分が溶液相合成法を用いて合成される最初の例を提供する。
【００１６】
本発明は、オリゴヌクレオチドによりエンコードされたコンビナトリアルライブラリーの合成を促進にでき、かかるオリゴヌクレオチド標識を分子の膨大な集団に添加するための有効な高忠実度手段を可能にする方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法は、ビルディングブロックから構成される第一部分（官能部分）、および第一部分に操作可能に結合し、第一部分の構造を識別するオリゴヌクレオチドタグを含む第二部分を含む二官能性分子の合成法を含む。すなわち、オリゴヌクレオチドタグは、どのビルディングブロックが第一部分の構築において使用されたか、ならびにビルディングブロックが結合された順序を示す。一般に、オリゴヌクレオチドタグにより提供される情報は、活性部分を構築するために使用されるビルディングブロックを決定するために十分である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドタグの配列は、官能部分例えばペプチド部分については、アミノ酸配列におけるビルディングブロックの配列を決定するために十分である。
【００１８】
本明細書において用いられる場合、「官能部分」なる用語は、１以上のビルディングブロックを含む化学基を意味する。好ましくは、官能部分におけるビルディングブロックは核酸ではない。官能部分は直鎖または環状ポリマーまたはオリゴマーまたは小有機分子であり得る。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、「ビルディングブロック」なる用語は、他の化学構造単位と結合しているか、またはこのような単位と結合できる化学構造単位である。官能部分がポリマーまたはオリゴマーである場合、ビルディングブロックはこのポリマーまたはオリゴマーのモノマー単位である。ビルディングブロックは、これに１以上のさらなる構造（末梢ビルディングブロック）が結合しているか、または結合できる骨格構造（骨格ビルディングブロック）も含み得る。
【００２０】
「ビルディングブロック」なる用語は、本明細書において用いられる場合、官能部分として存在し、官能部分の合成に用いられる反応性形態でも存在するような化学構造単位を意味すると理解されるべきである。官能部分内で、ビルディングブロックは、官能部分中にビルディングブロックを組み入れた結果として失われるビルディングブロックの部分がない状態で存在するであろう。例えば、結合形成反応が小分子を放出する場合（下記参照）、官能部分において存在するようなビルディングブロックは「ビルディングブロック残基」、すなわち、放出された分子に寄与する原子を失った後に合成において用いられるビルディングブロックの残りである。
【００２１】
ビルディングブロックは、相補的である任意の化合物である。すなわち、ビルディングブロックは互いに反応して、２以上のビルディングブロックを含む構造を形成するはずである。典型的には、使用されるビルディングブロックの全ては少なくとも２つの反応性基を有するが、使用されるビルディングブロックのいくつか（例えば、オリゴマー官能部分における最後のビルディングブロック）はそれぞれ１つのだけの反応性基を有する。２つの異なるビルディングブロック上の反応性基は相補性、すなわち、互いに反応して、共有結合を形成することができ、任意に、同時に小分子、例えば、水、ＨＣｌ、ＨＦなどを失う。
【００２２】
本発明の目的に関して、２つの反応性基は、これらが互いに反応して共有結合を形成できるならば相補性である。好ましい実施形態において、好ましい実施形態において、結合形成反応は周囲条件下で、実質的に副生成物を形成することなく容易に起こる。好ましくは、所定の反応性基は所定の相補反応性基とちょうど１回反応する。１つの実施形態において、２つのビルディングブロックの相補反応性基は、例えば、求核置換により反応して、共有結合を形成する。１つの実施形態において、相補反応性基対の１つのメンバーは求電子基であり、対の他のメンバーは求核基である。
【００２３】
相補性求電子および求核基は、任意の好適な条件下で求核置換により反応して、共有結合を形成する任意の２つの基を包含する。様々な好適な結合形成反応が当該分野において公知である。例えば、Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９２）、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １０  ｔｏ  １６；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｐｌｅｎｕｍ（１９９０）、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １−１１；およびＣｏｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＯｒｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎＭｅｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １３  ｔｏ  ２０；（そのそれぞれは全体として本発明の一部として参照される）参照。好適な求電子基の例としては、反応性カルボニル基、例えば、アシルクロリド基、エステル基、例えば  カルボニルペンタフルオロフェニル  エステルおよびスクシンイミドエステル、ケトン基およびアルデヒド基；反応性スルホニル基、例えば、スルホニルクロリド基、および反応性ホスホニル基が挙げられる。他の求電子基は、末端エポキシド基、イソシアネート基およびアルキルハライド基を包含する。好適な求核基は、第一および第二アミノ基およびヒドロキシル基およびカルボキシル基を包含する。
【００２４】
好適な相補反応性基を以下に記載する。当業者は、本発明の方法において使用できる他の反応基対を容易に決定でき、本明細書において記載される例は制限的であることを意図しない。
【００２５】
第一の実施形態において、相補反応性基は活性化カルボキシル基、反応性スルホニル基または反応性ホスホニル基、あるいはその組み合わせ、ならびに第一および第二アミノ基を包含する。この実施形態において、相補反応性基は、好適な条件下で反応して、アミド、スルホンアミドまたはホスホンアミデートを形成する。
【００２６】
第二の実施形態において、相補反応性基は、エポキシド基および第一または第二アミノ基を包含する。エポキシド含有ビルディングブロックはアミン含有ビルディングブロックと好適な条件下で反応して、炭素−窒素結合を形成し、その結果、β−アミノアルコールが得られる。
【００２７】
もう一つ別の実施形態において、相補反応性基はアジリジン基および第一または第二アミノ基を包含する。炭素−窒素結合を形成するために適した条件下で、アジリジン含有ビルディングブロックはアミン含有ビルディングブロックと反応し、その結果、１，２−ジアミンが得られる。第三の実施形態において、相補反応性基はイソシアネート基および第一または第二アミノ基を包含する。イソシアネート含有ビルディングブロックはアミノ含有ビルディングブロックと炭素−窒素結合を形成するために適した条件下で反応し、その結果、尿素基が得られる。
【００２８】
第四の実施形態において、相補反応性基はイソシアネート基およびヒドロキシル基を包含する。イソシアネート含有ビルディングブロックはヒドロキシル含有ビルディングブロックを炭素−酸素結合を形成するために適した条件下で反応し、その結果、カーバメート基が得られる。
【００２９】
第五の実施形態において、相補反応性基はアミノ基およびカルボニル含有基、例えば、アルデヒドまたはケトン基を包含する。アミンはかかる基と還元的アミノ化により反応して、新規炭素−窒素結合を形成する。
【００３０】
第六の実施形態において、相補反応性基はリンイリド基およびアルデヒドまたはケトン基を包含する。リンイリド含有ビルディングブロックはアルデヒドまたはケトン含有ビルディングブロックと炭素−炭素二重結合を形成するために適した条件下で反応して、その結果、アルケンが得られる。
【００３１】
第七の実施形態において、相補反応性基は付加環化により反応して、環状構造を形成する。かかる相補反応性基の一例は、アルキンおよび有機アジドであって、これらは好適な条件下で反応して、トリアゾール環構造を形成する。２つのビルディングブロックを結合させるためのこの反応の使用の一例を図８に示す。かかる反応に適した条件は、当該分野において公知であり、ＷＯ  ０３／１０１９７２（その全内容は、全体として、本発明の一部として参照される）に開示されているものを包含する。
【００３２】
第八の実施形態において、相補反応性基はアルキルハライドおよび求核試薬、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基である。かかる基は好適な条件下で反応して、炭素−窒素（アルキルハライド＋アミン）または炭素  酸素（アルキルハライド＋ヒドロキシルまたはカルボキシル基）を形成する。
【００３３】
第九の実施形態において、相補性官能基はハロゲン化複素環式芳香族基および求核試薬であり、ビルディングブロックは好適な条件下で芳香族求核置換により結合する。好適なハロゲン化複素環式芳香族基は、塩素化ピリミジン、トリアジンおよびプリンを包含し、これらは求核試薬、例えば、アミンと穏やかな条件下、水溶液中で反応する。オリゴヌクレオチド標識されたトリクロロトリアジンのアミンとの反応の代表例を図９および１０に示す。好適な塩素化複素環式芳香族基の例を図１１に示す。
【００３４】
本発明の分子およびライブラリーの合成においてビルディングブロックを結合させるために使用できるさらなる結合形成反応は以下に示すものを包含する。以下に示される反応は、反応性官能基を強調する。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４と表示されるものはじめとする、様々な置換基が反応物質中に存在し得る。置換され得る可能な位置は、これに限定されないが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４により表示されるものを包含する。これらの置換基は、任意の好適な化学基を包含するが、好ましくは、表示される反応を妨害しないか、または著しく阻害しないものに限定され、特に記載しない限り、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アミノ、置換アミノおよび当該分野において公知の他のものを包含する。これらの基上の好適な置換基は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、メルカプト、カルボキシル、およびカルボキサミドを包含する。特定される場合、好適な電子求引基は、ニトロ、カルボキシル、ハロアルキル、例えば、トリフルオロメチルおよび当該分野において公知である他のものを包含する。好適な電子供与基の例は、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、アセトアミドおよび当該分野において公知である他のものを包含する。
【００３５】
第一アミンのアルケンへの付加：
【化１】
2009513135.tif 000002
求核置換
【化２】
2009513135.tif 000003
アミンの還元的アルキル化：
【化３】
2009513135.tif 000004
【化４】
2009513135.tif 000005
パラジウムにより触媒された炭素−炭素結合形成反応：
【化５】
2009513135.tif 000006
【化６】
2009513135.tif 000007
Ｕｇｉ縮合反応：
【化７】
2009513135.tif 000008
芳香族求核置換反応：
【化８】
2009513135.tif 000009
Ｘは電子供与基である。
イミン／イミニウム／エナミン形成反応：
【化９】
2009513135.tif 000010
【化１０】
2009513135.tif 000011
付加環化反応：
【化１１】
2009513135.tif 000012
Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  付加環化
【化１２】
2009513135.tif 000013
１，３−双極性環状付加、Ｘ−Ｙ−Ｚ＝Ｃ−Ｎ−Ｏ、Ｃ−Ｎ−Ｓ、Ｎ３
芳香族求核置換反応：
【化１３】
2009513135.tif 000014
Ｗは電子求引基である。
【化１４】
2009513135.tif 000015
好適な置換基ＸおよびＹの例は、置換または非置換アミノ、置換または非置換アルコキシ、置換または非置換チオアルコキシ、置換または非置換アリールオキシおよび置換および非置換チオアリールオキシを包含する。
【化１５】
2009513135.tif 000016
Ｈｅｃｋ反応：
【化１６】
2009513135.tif 000017
アセタール形成：
【化１７】
2009513135.tif 000018
好適な置換基ＸおよびＹの例は、置換および非置換アミノ、ヒドロキシルおよびスルフヒドリルを包含し；Ｙは、ＸおよびＹを結合させるリンカーであり、反応の生成物において見出される環構造の形成に適している。
アルドール反応：
【化１８】
2009513135.tif 000019
好適な置換基Ｘの例には、Ｏ、ＳおよびＮＲ３が含まれる。
【００３６】
本発明の分子およびライブラリーを形成するために使用できる骨格ビルディングブロックは、例えば、前述の１以上の結合形成反応を使用して、末梢ビルディングブロック前駆体との結合形成反応に関与できる２以上の官能基を有するものを包含する。骨格部分はまた、例えば、特異的な方法で反応して、末梢官能基が付加される中心分子部分を含む分子を形成できる、ビルディングブロック前駆体を使用して、本発明のライブラリーおよび分子の構築中に合成できる。１つの実施形態において、本発明のライブラリーは、不変の骨格部分を含むが、異なる末梢部分または異なる配列の末梢部分を含む分子を含む。あるライブラリーにおいて、全てのライブラリーメンバーは、不変の骨格部分を含み；他のライブラリーは２以上の異なる骨格部分を有する分子を含み得る。本発明の分子およびライブラリーの構築において使用できる骨格部分形成反応の例は表に記載されている。表における言及は、その全体として本発明の一部として参照される。基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、表示された反応を妨害しないか、または著しく阻害しないという点でのみ制限され、水素、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、置換アミノおよび当該分野において公知である他のものを包含し得る。好適な置換基としては、これに限定されないが、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、ニトロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アリールオキシ、アリール−Ｓ−、ハロゲン、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、シアノ、シアネート、ニトリル、イソシアネート、チオシアネート、カルバミル、および置換カルバミルが挙げられる。
【００３７】
官能部分の合成は、一つの特定の種類のカップリング反応、例えばこれに限定されないが、前記の反応の１つにより、または２以上のカップリング反応の組み合わせにより、例えば、２以上の前記カップリング反応により進行できると理解されるべきである。例えば、１つの実施形態において、ビルディングブロックはアミド結合形成（アミノおよびカルボン酸相補性基）および還元的アミノ化（アミノおよびアルデヒドまたはケトン相補性基）の組み合わせにより合わせられる。任意のカップリング化学反応は、オリゴヌクレオチドの存在と適合性であるならば、用いることができる。二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）オリゴヌクレオチドタグは、本発明のある実施形態において用いられる場合、一本鎖タグよりも化学的に強固であり、従って、広範囲の反応条件を容認し、一本鎖タグでは可能でない結合形成反応の使用を可能にする。
【００３８】
ビルディングブロックは、１以上の官能基を、反応性基または機能成分を形成するために用いられる基に加えて含むことができる。これらの追加の官能基の１以上を保護して、これらの官能基の望ましくない反応を防止することができる。好適な保護基は、様々な官能基に関して当該分野において公知である（ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９１）（本発明の一部として参照される））。特に有用な保護基は、ｔ−ブチルエステルおよびエーテル、アセタール、トリチルエーテルおよびアミン、アセチルエステル、トリメチルシリルエーテル，トリクロロエチルエーテルおよびエステルおよびカーバメートを包含する。
【００３９】
１つの実施形態において、各ビルディングブロックは２つの同じであっても、異なっていてもよい反応性基を含む。例えば、サイクルｓにおいて添加される各ビルディングブロックは、同一であっても、異なっていてもよいが、どちらも段階ｓ−１およびｓ＋１で添加されるビルディングブロックの反応性基に対して相補性である２つの反応性基を含み得る。もう一つ別の実施形態において、各ビルディングブロックは、それ自体相補性である２つの反応性基を含む。例えば、ポリアミド分子を含むライブラリーは、２つの第一アミノ基を含むビルディングブロックおよび２つの活性化カルボキシル基を含むビルディングブロック間の反応により産生することができる。結果として得られる化合物において、別のアミド基は反対の方向性を有するので、ＮまたはＣ末端はない。あるいは、ポリアミドライブラリーは、それぞれがアミノ基および活性化カルボキシル基を含むビルディングブロックを用いて産生することができる。この実施形態において、サイクルの段階ｎにおいて添加されるビルディングブロックは、ｎ−１ビルディングブロック上の利用可能な反応性基と相補性である遊離反応性基を有し、一方、好ましくは、ｎ番目のビルディングブロック上の他の反応性基は保護される。例えば、ライブラリーのメンバーがＣからＮ方向へ合成されるならば、添加されるビルディングブロックは活性化されたカルボキシル基および保護されたアミノ基を含む。
【００４０】
官能部分は、ポリマーまたはオリゴマー部分、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド核酸またはペプトイドであるか、あるいはこれらは小さな非ポリマー分子、例えば、中心骨格および骨格の末梢付近に配列された構造を含む構造を有する分子である。直鎖ポリマーまたはオリゴマーライブラリーは、２つの反応性基を有するビルディングブロックの使用の結果得られ、分岐ポリマーまたはオリゴマーライブラリーは、３以上の反応性基を、任意に２個だけの反応基を有するビルディングブロックとの組み合わせにおいて使用することから得られる。このような分子は、一般式Ｘ１Ｘ２…Ｘｎにより表すことができ、式中、各Ｘは、ｎ個のモノマー単位を含むポリマーのモノマー単位であり、ｎは１より大きな整数である。オリゴマーまたはポリマー化合物の場合において、末端ビルディングブロックは２つの官能基を含む必要はない。例えば、ポリアミドライブラリーの場合において、Ｃ末端ビルディングブロックは、アミノ基を含み得るが、カルボキシル基の存在は任意である。同様に、Ｎ末端でのビルディングブロックはカルボキシル基を含み得るが、アミノ基を含有する必要はない。
【００４１】
少なくとも１つのビルディングブロックが、他のビルディングブロックと反応性である３つの官能基を含むならば、分岐オリゴマーまたはポリマー化合物も合成できる。本発明のライブラリーは直鎖分子、分岐分子またはその組み合わせを含み得る。
【００４２】
ライブラリーはまた、例えば、２以上の反応性基を有する骨格ビルディングブロックを、１つだけの利用可能な反応性基を有する他のビルディングブロックとの組み合わせにおいて使用して構築することができ、ここで、任意の追加の反応性基は保護されるか、または骨格ビルディングブロック中に存在する他の反応性基と反応しないかのいずれかである。１つの実施形態において、例えば、合成される分子は、一般式Ｘ（Ｙ）ｎにより表すことができ、式中、Ｘは骨格ビルディングブロックであり；各ＹはＸと結合したビルディングブロックであり、ｎは少なくとも２の整数であり、好ましくは２〜約６の整数である。一つの好ましい実施形態において、サイクル１の初期ビルディングブロックは骨格ビルディングブロックである。式Ｘ（Ｙ）ｎの分子において、各Ｙは同じであっても、異なっていてもよいが、典型的なライブラリーのほとんどのメンバーにおいて、各Ｙは異なっている。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のライブラリーはポリアミド化合物を含む。ポリアミド化合物は、２０の天然に存在するα−アミノ酸、例えば、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）（ここでは、各アミノ酸についての３文字および１文字コードを示す）をはじめとする任意のアミノ酸から誘導されるビルディングブロックから構成することができる。その天然に存在する形態において、前記アミノ酸のそれぞれは、本発明において特に記載しない限り想定される、Ｌ配置において存在する。しかしながら、本発明の方法において、これらのアミノ酸のＤ配置形態も使用できる。これらのＤ−アミノ酸は、本明細書において、小文字の３または１文字コード、すなわち、ａｌａ（ａ）、ｇｌｙ（ｇ）、ｌｅｕ（ｌ）、ｇｌｎ（ｑ）、ｔｈｒ（ｔ）、ｓｅｒ（ｓ）などにより表示される。ビルディングブロックは、３−アリールアラニン、例えば、ナフチルアラニン、フェニル−置換フェニルアラニン、例えば、４−フルオロ−、４−クロロ、４−ブロモおよび４−メチルフェニルアラニン；３−ヘテロアリールアラニン、例えば、３−ピリジルアラニン、３−チエニルアラニン、３−キノリルアラニン、および３−イミダゾリルアラニン；オルニチン；シトルリン；ホモシトルリン；サルコシン；ホモプロリン；ホモシステイン；置換プロリン、例えば、ヒドロキシプロリンおよびフルオロプロリン；デヒドロプロリン；ノルロイシン；Ｏ−メチルチロシン；Ｏ−メチルセリン；Ｏ−メチルトレオニンおよび３−シクロヘキシルアラニンを包含するが、これに限定されない他のα−アミノ酸から誘導することもできる。前記アミノ酸のそれぞれは、Ｄ−またはＬ−構造のいずれかにおいて用いることができる。
【００４４】
ビルディングブロックは、α−アミノ酸でないアミノ酸、例えば、α−アザアミノ酸；β、γ、δ、ε−アミノ酸、およびＮ−置換アミノ酸、例えば、Ｎ−置換グリシンであってよく、ここで、Ｎ−置換基は、例えば、置換または非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基であり得る。１つの実施形態において、Ｎ−置換基は、天然に存在するか、または天然に存在しないα−アミノ酸からの側鎖である。
【００４５】
ビルディングブロックはまた、ペプチド模倣構造、例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチド模倣物であってもよい。このようなペプチド模倣ビルディングブロックは、好ましくは、アミノアシル化合物から誘導され、従って、これらのビルディングブロックの成長するポリ（アミノアシル）基への添加の化学反応は、他のビルディングブロックについて用いられる化学反応と同じであるか、または類似している。ビルディングブロックは、ペプチド結合に関して等配電子結合を形成でき、ペプチド骨格修飾、例えば、ペプチド模倣官能部分を形成でき、ペプチド骨格修飾、例えば、Ψ［ＣＨ２Ｓ］、Ψ［ＣＨ２ＮＨ］、Ψ［ＣＳＮＨ２］、Ψ［ＮＨＣＯ］、Ψ［ＣＯＣＨ２］、およびΨ［（Ｅ）または（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］を含むペプチド模倣性官能部分を形成できる分子でもある。前記で使用された用語において、Ψはアミド結合が無いことを示す。アミド基を置換する構造をかっこ内に記載する。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明は、エンコーディングオリゴヌクレオチドと操作可能に結合した官能部分を含むか、または前記官能部分からなる化合物を合成する方法を提供する。方法は：（１）ｎのビルディングブロックを含む初期官能部分からなるイニシエーター化合物を提供し（ここで、ｎは１以上の整数であり、初期官能部分は少なくとも１つの反応性基を含み、初期官能部分は、ｎのビルディングブロックをエンコードする初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合している）；（２）イニシエーター化合物を、少なくとも１つの相補反応性基を含むビルディングブロックと反応させ（ここで、少なくとも１つの相補反応性基は、反応性基および相補反応性基を反応させて、共有結合を形成するために適した条件下で、段階（１）の反応性基に対して相補性である）；（３）初期オリゴヌクレオチドを入力オリゴヌクレオチドと、初期オリゴヌクレオチドおよび入力オリゴヌクレオチドの結紮に適した条件下で、初期オリゴヌクレオチドと入力オリゴヌクレオチドの結紮を触媒する酵素の存在下で反応させ、これにより、エンコーディングオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分を含むか、または前記官能部分からなる分子を産生する段階を含む。段階（３）の官能部分が反応性基を含むならば、段階１−３は１回以上繰り返すことができ、これによりサイクル１〜ｉが形成される（ここで、ｉは２以上の整数であり、サイクルｓ−１の段階（３）の生成物（ｓはｉ以下の整数である）はサイクルｓの段階（１）のイニシエーター化合物になる。各サイクルにおいて、１つのビルディングブロックを成長する官能部分に添加し、新規ビルディングブロックをエンコードする１つのオリゴヌクレオチド配列を成長するエンコーディングオリゴヌクレオチドに添加する。
【００４７】
１つの実施形態において、初期イニシエーター化合物は、第一ビルディングブロックを  オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドまたは初期オリゴヌクレオチド）または、オリゴヌクレオチドが結合するリンカーと反応させることにより生成される。図５において記載される実施形態において、リンカーは、第一ビルディングブロックの結合のための反応性基を含み、初期オリゴヌクレオチドに結合している。この実施形態において、ビルディングブロック（または複数のアリコートのそれぞれにおいては、ビルディングブロックの集団の１つ）の、リンカーの反応性基との反応およびビルディングブロックをエンコードするオリゴヌクレオチドの初期オリゴヌクレオチドへの添加は、前記プロセスの１以上の初期イニシエーター化合物を産生する。
【００４８】
好ましい実施形態において、個々のビルディングブロックは異なるオリゴヌクレオチドと結合し、従って所定のサイクルにおいて添加されるオリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドの配列は、同じサイクルにおいて添加されるビルディングブロックを特定する。
【００４９】
ビルディングブロックのカップリングおよびオリゴヌクレオチドの結紮は、一般に、出発物質および試薬と類似した濃度で起こる。例えば、ビルディングブロックに有効なカップリングのためには、マイクロモル濃度からミリモル濃度のオーダーで、約１０ｍＭから約１０ｍＭの反応物質の濃度が好ましい。
【００５０】
ある実施形態において、方法はさらに、段階（２）の後に、任意の未反応初期官能部分を除去する段階を含む。特定のサイクルにおける任意の未反応初期官能部分の除去は、サイクルの初期官能部分が、後のサイクルにおいて添加されるビルディングブロックと反応するのを防止する。このような反応は、１以上のビルディングブロックを失った官能部分の生成につながり、潜在的に、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応する様々な官能部分構造をもたらす。このような除去段階は、任意の残存する初期官能部分を、段階（２）の反応性基と反応する化合物と反応させることにより行うことができる。好ましくは、スカベンジャー化合物は、段階（２）の反応性基と迅速に反応し、後のサイクルにおいて添加されるビルディングブロックと反応できる追加の反応性基を含まない。例えば、段階（２）の反応性基がアミノ基である化合物の合成において、好適なスカベンジャー化合物はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５１】
もう一つ別の実施形態において、本発明は化合物のライブラリーを生成させる方法を提供し、ここで、各化合物は、オリゴヌクレオチドと操作可能に結合した２以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む。好ましい実施形態において、各分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、分子内のビルディングブロックおよび、任意に、ビルディングブロックの添加の順序を特定するために十分な情報を提供する。この実施形態において、本発明の方法は、化合物のライブラリーを合成する方法を含み、ここで、化合物は、官能部分の構造を特定するオリゴヌクレオチドと操作可能に結合した２以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む。方法は、（１）ｎのビルディングブロックを特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したイニシエーター化合物（ここで、ｍは１以上の整数であり、イニシエーター化合物はｎビルディングブロックからなり、ｎは１以上の整数である）を含む溶液を提供し；（２）段階（１）の溶液を少なくともｒのフラクションに分割し（ここで、ｒは２以上の整数である）；（３）各フラクションをｒのビルディングブロックの１つと反応させ、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むｒのフラクションを生成させ；（４）段階（３）のｒフラクションのそれぞれを異なる入力オリゴヌクレオチド組の１つと、入力オリゴヌクレオチドの初期オリゴヌクレオチドとの酵素結紮に適した条件下で反応させ、これにより、ｎ＋１のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドに操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子を含むｒのフラクションを生成させる段階を含む。任意に、方法は、（５）段階（４）において製造されたｒのフラクションを再結合させて、これにより、ｎ＋１のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子を含む溶液を得る。段階（１）から（５）は、１回以上行って、サイクル１からｉを得ることができ、ここで、ｉは２以上の整数である。サイクルｓ＋１において（ここで、ｓはｉ−１またはそれ以下の整数である）、段階（１）のｍのイニシエーター化合物を含む溶液は、サイクルｓの段階（５）の溶液である。同様に、サイクルｓ＋１の段階（１）のイニシエーター化合物はサイクルｓの段階（４）の生成物である。
【００５２】
好ましくは、段階（２）の溶液をライブラリー合成の各サイクルにおいてｒのフラクションに分割する。この実施形態において、各フラクションを独自のビルディングブロックと反応させる。
【００５３】
本発明の方法において、ビルディングブロックおよび入力オリゴヌクレオチドの添加の順序は重要ではなく、分子の合成の段階（２）および（３）、およびライブラリー合成における段階（３）および（４）は逆にすることができる。すなわち、新規ビルディングブロックを添加する前に、入力オリゴヌクレオチドを初期オリゴヌクレオチドと結紮することができる。ある実施形態において、これらの２段階を同時に行うことが可能である。
【００５４】
ある実施形態において、方法は、段階（２）の後に、任意の未反応初期官能部分を除去する段階をさらに含む。特定のサイクルにおいて任意の未反応初期官能部分を除去することは、サイクルの初期官能部分が、後のサイクルで添加されるビルディングブロックと反応することを防止する。このような反応は、１以上のビルディングブロックが欠失した官能部分の生成に至り、潜在的に、特定のオリゴヌクレオチド配列に対応する様々な官能部分構造をもたらす。このような除去は、任意の残存する初期官能部分を、段階（２）の反応性基と反応する化合物と反応させることにより達成できる。好ましくは、スカベンジャー化合物は段階（２）の反応性基と迅速に反応し、後のサイクルにおいて添加されるビルディングブロックと反応できる追加の反応性基を含まない。例えば、段階（２）の反応性基がアミノ基である化合物の合成において、好適なスカベンジャー化合物はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５５】
１つの実施形態において、ライブラリー合成において使用されるビルディングブロックは、候補ビルディングブロックの組から、ライブラリーの合成に使用される条件下で、適切な相補性官能部分と反応する候補ビルディングブロックの能力を評価することにより選択される。かかる条件下で好適に反応性を示すビルディングブロックを次にライブラリー中への組み入れについて選択することができる。所定のサイクルの生成物は、任意に精製することができる。サイクルが中間サイクル、すなわち、最終サイクル前の任意のサイクルである場合、これらの生成物は中間体であり、次のサイクルの開始前に精製することができる。サイクルが最終サイクルであるならば、サイクルの生成物は最終生成物であり、化合物の使用前に精製することができる。この精製段階は、例えば、未反応または過剰な反応物質およびオリゴヌクレオチド結紮に用いられる酵素を除去することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの液体クロマトグラフィーおよびエタノールなどの好適な補助溶媒での沈殿をはじめとする、溶液中に存在する他の種から生成物を分離するために適した任意の方法を使用できる。好適な精製法は、生成物および合成に使用される溶媒系の性質に依存する。
【００５６】
反応は、好ましくは、水溶液、例えば、緩衝水溶液中で行われるが、ビルディングブロック、オリゴヌクレオチド、中間体および最終生成物、ならびにオリゴヌクレオチド結紮を触媒するために使用される酵素の溶解特性と合致する混合水性／有機媒体中で行うこともできる。
【００５７】
前記方法における所定のサイクルにより生成される化合物の理論数は、サイクル中で使用される異なるイニシエータ化合物の数ｍおよびサイクル中に添加される異なるビルディングブロックの数ｒの積であると理解される。サイクルにおいて生成される異なる化合物の実際の数は、ｒおよびｍの積（ｒ×ｍ）であり得るが、あるビルディングブロックの他のビルディングブロックの反応性に差があるならば、さらに低い可能性がある。例えば、特定のビルディングブロックの、特定のイニシエーター化合物への添加の動力学は、合成サイクルの時間スケールで、反応の生成物がほとんどまたは全く生成されないほどである。
【００５８】
ある実施形態において、サイクル１の前、最終サイクル後または任意の２つのサイクルの間で、共通のビルディングブロックが添加される。例えば、官能部分がポリアミドである場合、共通のＮ−末端キャッピングビルディングブロックを、最終サイクル後に添加することができる。例えば、官能基、例えば、アルキンまたはアジド基（例えば、環化により、官能部分を修飾するために利用できる）を、ライブラリー合成後に添加するために、共通のビルディングブロックは、任意の２つのサイクル間に導入することもできる。
【００５９】
「操作可能に結合した」なる用語は、本明細書において用いられる場合、２つの化学構造が、これらが受けることが予想される様々な操作により結合したままであるような方法で、結合されることを意味する。典型的には、官能部分およびエンコーディングオリゴヌクレオチドは、適切な結合基により共有結合する。結合基は、オリゴヌクレオチドの結合部位および官能部分の結合部位を有する二価部分である。例えば、官能部分がポリアミド化合物である場合、このポリアミド化合物は、そのＮ末端、そのＣ末端の結合基に、または側鎖の１つの官能基により結合することができる。結合基は、少なくとも１つの原子、好ましくは１より多い原子、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６個の原子により、ポリアミド化合物およびオリゴヌクレオチドを分離するために十分である。好ましくは、結合基は、オリゴヌクレオチドと独立した方法で、ポリアミド化合物を標的分子と結合させるために十分柔軟性である。
【００６０】
１つの実施形態において、結合基は、ポリアミド化合物のＮ末端およびオリゴヌクレオチドの５’−ホスフェート基に結合する。例えば、結合基は、一端上に活性化カルボキシル基および他端上に活性化エステルを含む結合基前駆体から誘導することができる。結合基前駆体のＮ末端窒素原子との反応は、結合基をポリアミド化合物またはＮ末端ビルディングブロックと連結するアミド結合を形成し、一方、結合基前駆体のオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基との反応の結果、オリゴヌクレオチドがエステル結合により結合基に結合される。結合基は、例えば、ポリメチレン鎖、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−鎖またはポリ（エチレングリコール）鎖、例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖を含むことができ、両方の場合において、ｎは１から約２０の整数である。好ましくは、ｎは２〜約１２、さらに好ましくは約４から約１０である。１つの実施形態において、結合基はヘキサメチレン（−（ＣＨ２）６−）基を含む。
【００６１】
ビルディングブロックがアミノ酸残基である場合、得られる官能部分はポリアミドである。アミド結合の形成に適した任意の化学反応を用いて、アミノ酸をカップリングさせることができる。好ましくは、アミノ酸ビルディングブロックのカップリングは、オリゴヌクレオチドの酵素結紮と適合する条件下、例えば、中性または中性付近のｐＨで、水溶液中で行われる。１つの実施形態において、ポリアミド化合物は、Ｃ末端からＮ末端方向へ合成される。この実施形態において、第一、またはＣ末端ビルディングブロックをそのカルボキシル末端で、オリゴヌクレオチドに、好適な結合基によりカップリングさせる。第一ビルディングブロックを第二ビルディングブロックと反応させ、これは好ましくは、活性化カルボキシル基および保護されたアミノ基を有する。溶液相アミド結合形成に適した任意の基の活性化／保護法を使用できる。例えば、好適な活性化カルボキシル種は、アシルフルオリド（米国特許第５，３６０，９２８号、その全体として本発明の一部として参照される）、対称無水物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを包含する。アシル基は当該分野において公知であるように、好適な活性化化合物との反応により、その場で活性化することもできる。好適な活性化化合物は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノン（ＥＥＤＱ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、ｎ−プロパン−ホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）イミド−ホスホリルクロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏｐ）、ジフェニルホスホリル  アジド（ＤＰＰＡ）、Ｃａｓｔｒｏ試薬（ＢＯＰ、ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム塩（ＨＢＴＵ）、ジエチルホスホリルシアニド（ＤＥＰＣＮ）、２，５−ジフェニル−２，３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシ−チオフェンジオキシド（Ｓｔｅｇｌｉｃｈ試薬；ＨＯＴＤＯ）、１，１’−カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）、および４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）を包含する。カップリング試薬は、単独または添加剤、例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）  Ｎ−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、アザベンゾトリアゾリル−テトラメチルウロニウム塩（ＨＡＴＵ、ＨＡＰｙＵ）または２−ヒドロキシピリジンとの組み合わせにおいて用いることができる。ある実施形態において、ライブラリーの合成は、構造的に多様なビルディングブロックの組の使用を可能にするために、２以上の活性化法の使用を必要とする。各ビルディングブロックについて、当業者は適切な活性化法を決定できる。
【００６２】
Ｎ末端保護基は、プロセスの条件と適合性である任意の保護基、例えば、溶液相合成条件に適した保護基であり得る。好ましい保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。アミノアシルビルディングブロックの側鎖上の任意の潜在的に反応性の官能基も適切に保護する必要がある。好ましくは、側鎖保護基はＮ末端保護基に対して直角である。すなわち、側鎖保護基は、Ｎ末端保護基の除去に必要とされる条件とは異なる条件下で除去される。好適な側鎖保護基は、側鎖カルボキシル基および側鎖アミノ基の両方を保護するために使用できるニトロベラトリル基を包含する。別の好適な側鎖アミン保護基は、Ｎ−ペント−４−エノイル基である。
【００６３】
ビルディングブロックを、官能部分中に組み入れた後に、例えば、１以上のビルディングブロック上の官能基を含む好適な反応により修飾することができる。ビルディングブロック修飾は、最終ビルディングブロックの添加後または官能部分の合成のいずれかの中間時点、例えば、合成プロセスの任意のサイクル後に行うことができる。本発明の二官能性分子のライブラリーが合成される場合、ビルディングブロック修飾は、全ライブラリーまたはライブラリーの一部に関して行うことができ、これにより、ライブラリーの複雑さの程度が増大する。好適なビルディングブロック修飾反応は、官能部分およびエンコーディングオリゴヌクレオチドと適合性の条件下で行うことができる反応を包含する。かかる反応の例は、アミノ基またはヒドロキシル基のアシル化およびスルホン化、アミノ基のアルキル化、カルボキシル基のエステル化またはチオエステル化、カルボキシル基のアミド化、アルケンのエポキシ化、および当該分野において公知の他の反応を包含する。官能部分がアルキンまたはアジド官能基を有するビルディングブロックを含む場合、アジド／アルキン付加環化反応を用いて、ビルディングブロックを誘導体化することができる。例えば、アルキンを含むビルディングブロックを有機アジドと反応させることができるか、または、アジドを含むビルディングブロックをアルキンと反応させることができ、いずれかの場合に、トリアゾールが形成される。ビルディングブロック修飾反応は、最終ビルディングブロックの添加後、または合成プロセスの中間時点で行うことができ、炭水化物、金属結合部分およびある生体分子または組織タイプを標的とする構造を包含する様々な化学構造を官能部分に付加するために使用できる。
【００６４】
もう一つ別の実施形態において、官能部分は線系列のビルディングブロックを含み、この線系列は、好適な反応を用いて環化される。例えば、直線状アレイにおける少なくとも２つのビルディングブロックがスルフヒドリル基を含む場合、このスルフヒドリル基を酸化して、ジスルフィド結合を形成することができ、これにより直線状アレイを環化する。例えば、官能部分は、２以上のＬまたはＤ−システインおよび／またはＬまたはＤ−ホモシステイン部分を含むオリゴペプチドであり得る。ビルディングブロックはまた、一緒に反応して、直線状アレイを環化させることができる他の官能基、例えば、カルボキシル基およびアミノまたはヒドロキシル基も含み得る。
【００６５】
好ましい実施形態において、直線状アレイ中のビルディングブロックの１つはアルキン基を含み、直線状アレイにおける別のビルディングブロックはアジド基を含む。アジドおよびアルキン基は、付加環化により反応させることができ、その結果、大員環状構造が形成される。図９において示される例において、官能部分は、プロパルギルグリシンビルディングブロックをそのＣ末端で、アジドアセチル基をそのＮ末端で含むポリペプチドである。アルキンおよびアジド基の好適な条件下での反応の結果、環状化合物が形成され、これは、その大員環内にトリアゾール構造を含む。ライブラリーの場合、１つの実施形態において、ライブラリーの各メンバーは、アルキン−およびアジド含有ビルディングブロックを含み、このようにして環化することができる。第二の実施形態において、ライブラリーの全てのメンバーは、アルキン−およびアジド−含有ビルディングブロックを含むが、ライブラリーの一部だけが環化される。第三の実施形態において、ある官能部分のみがアルキン−およびアジド−含有ビルディングブロックを含み、これらの分子だけが環化する。前記の第二および第三の実施形態において、ライブラリーは、付加環化反応後に、環状および直線状官能部分の両方を含むであろう。
【００６６】
同じ官能部分、例えば、トリアジンが、特定の合成段階中にライブラリーのフラクションのそれぞれ全部に添加される本発明のいくつかの実施形態において、この官能部分をエンコードするオリゴヌクレオチドタグを添加する必要はない。
【００６７】
オリゴヌクレオチドを化学的または酵素法により結紮することができる。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドを化学的手段により結紮する。ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的結紮は、試薬、例えば、水溶性カルボジイミドおよび臭化シアンを用いて、例えば、Ｓｈａｂａｒｏｖａ、ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９、４２４７−４２５１）、Ｆｅｄｅｒｏｖａ、ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１５、１１３７−１１４７、およびＣａｒｒｉｅｒｏおよびＤａｍｈａ（２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６８、８３２８−８３３８により教唆されるようにして行うことができる。１つの実施形態において、化学的結紮は臭化シアンを用い、５Ｍアセトニトリル中、５’リン酸化オリゴヌクレオチドと１：１０ｖ／ｖの比で、ｉｎ  ａ  ｐＨ  ７．６緩衝液（１ｍＭＥＳ  ＋  ２０ｍＭｍｇＣｌ２）中、０度で１〜５分間行われる。オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、好ましくは、約５から約１４塩基の突出部を有する。オリゴヌクレオチドはまた、一本鎖であってもよく、この場合、約６塩基の重複を有するスプリントであって、オリゴヌクレオチドのそれぞれと結紮されるものを用いて、反応性５’および３’部分を互いに近接した位置にする。
【００６８】
もう一つ別の実施形態において、酵素法を用いてオリゴヌクレオチドを結紮する。１つの実施形態において、初期ビルディングブロックを初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合させる。第二ビルディングブロックを初期ビルディングブロックとカップリングさせる前、またはカプリング後に、第二ビルディングブロックを同定する第二オリゴヌクレオチド配列を初期オリゴヌクレオチドに結紮する。初期オリゴヌクレオチド配列および入力オリゴヌクレオチド配列を結紮する方法は図１および２に記載される。図１において、初期オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、１つのストランドは、第二オリゴヌクレオチドの一端と相補性であり、第二オリゴヌクレオチドを初期オリゴヌクレオチドと接触させる突出部配列を含む。好ましくは、初期オリゴヌクレオチドの突出配列および第二オリゴヌクレオチドの相補性配列はどちらも少なくとも約４塩基；さらに好ましくは、両配列はどちらも同じ長さである。初期オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを、好適な酵素を用いて結紮することができる。初期オリゴヌクレオチドが第一ビルディングブロックとストランド（トップストランド）の５’末端で結合されるならば、トップストランドと相補性であるストランド（ボトムストランド）は、その５’末端で突出配列を含み、第二オリゴヌクレオチドはその５’末端で相補性配列を含む。第二オリゴヌクレオチドの結紮後に、突出部相補性配列に対して３’である第二オリゴヌクレオチドの配列と相補性であり、追加の突出部配列を含むストランドを添加することができる。
【００６９】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは図２において記載されるように伸長される。成長する官能部分に結合したオリゴヌクレオチドおよび入力オリゴヌクレオチドは、初期オリゴヌクレオチドの３’末端に対して相補性である領域および入力オリゴヌクレオチドの５’末端に対して相補性である領域を含む「スプリント」配列の使用により結紮されるために配置される。スプリントは、オリゴヌクレオチドの５’末端を入力オリゴヌクレオチドの３’末端と接近させ、結紮は酵素結紮を用いて行われる。図２において示される例において、初期オリゴヌクレオチドは１６のヌクレオ塩基からなり、スプリントは３’末端で６塩基に対して相補性である。入力オリゴヌクレオチドは１２のヌクレオ塩基からなり、スプリントは５’末端で６塩基に対して相補性である。スプリントの長さおよび相補性領域の長さは重要ではない。しかしながら、相補性領域は、結紮の条件下で安定なダイマー形成を可能にするために十分長くなければならないが、最終分子において過剰に大きなエンコーディングヌクレオチドが得られるほど長くない。相補性領域が約４塩基から約１２塩基、さらに好ましくは約５塩基から約１０塩基、最も好ましくは、約５塩基から約８塩基の長さであるのが好ましい。
【００７０】
本明細書において記載されるライブラリー合成の方法に使用されるスプリット・アンド・プール（ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｐｏｏｌ）法は、各独自の官能部分が、少なくとも１つの独自のオリゴヌクレオチド配列であって、官能部分を同定するものに操作可能に結合することを保証する。２以上の異なるオリゴヌクレオチドタグが、少なくとも１つの合成サイクルにおいて、少なくとも１つのビルディングブロックに使用されるならば、ビルディングブロックを含むそれぞれの異なる官能部分は、複数のオリゴヌクレオチドによりエンコードされる。例えば、２のオリゴヌクレオチドタグが、４サイクルのライブラリーの合成中に各ビルディングブロックについて使用されるならば、各独自の官能部分をエンコードする１６のＤＮＡ配列（２４）が存在する。複数の配列を有するそれぞれの独自の官能部分をエンコードするいくつかの潜在的な利点が存在する。第一に、同じ官能部分をエンコードするタグ配列の異なる組み合わせの選択は、これらの分子が独立して選択されることを保証する。第二に、同じ官能部分をエンコードするタグ配列の異なる組み合わせの選択は、選択がオリゴヌクレオチドの配列に基づく可能性を排除する。第三に、技術的人工物は、特定の官能部分が非常に豊富であるが、多くの可能性のうち、１つの配列組み合わせのみであることを配列分析が示唆するかどうかを認識できる。複数標識付けは、同じビルディングブロックであるが、異なるオリゴヌクレオチドタグとの独立したスプリット反応をすることにより達成できる。別法として、複数標識付けは、個々のビルディングブロックとの単一タグ付け反応において各タグの適切な比を混合することにより達成できる。
【００７１】
１つの実施形態において、初期オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、２つのストランドは共有結合している。２つのストランドを共有結合させる１つの手段を図３に示し、図中、結合部分は２つのストランドおよび官能部分を連結させるために使用される。結合部分は、ビルディングブロックと反応させられる第一官能基、オリゴヌクレオチドの３’末端と反応させられる第二官能基、およびオリゴヌクレオチドの５’末端と反応させられる第三官能基を含む任意の化学構造を有するものであり得る。好ましくは、第二および第三官能基は、２つのオリゴヌクレオチドストランドを、２つのストランドのハイブリダイゼーションを可能にする相対配向に配置されるように配向させる。例えば、結合部分は一般構造（Ｉ）：
【化１９】
2009513135.tif 000020
（Ｉ）
を有し得、式中、Ａは、ビルディングブロックと共有結合を形成できる官能基であり、Ｂはオリゴヌクレオチドの５’末端と結合を形成できる官能基であり、Ｃはオリゴヌクレオチドの３’末端と結合を形成できる官能基である。Ｄ、ＦおよびＥは官能基Ａ、ＣおよびＢを、コア原子または骨格であるＳと連結する化学基である。好ましくは、Ｄ、ＥおよびＦ  はそれぞれ独立して、原子の鎖、例えば、アルキレン鎖またはオリゴ（エチレングリコール）鎖であり、およびＤ、ＥおよびＦは同一または異なり、好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび官能部分の合成を可能にするために有効である。１つの実施形態において、三価リンカーは構造
【化２０】
2009513135.tif 000021
を有する。この実施形態において、ＮＨ基はビルディングブロックとの結合に利用可能であり、一方、末端ホスフェート基はオリゴヌクレオチドとの結合に利用可能である。
【００７２】
初期オリゴヌクレオチドが二本鎖である実施形態において、入力オリゴヌクレオチドも二本鎖である。図３に示すように、初期オリゴヌクレオチドは、他よりも長い１つのストランドを有し、突出部配列を提供する。この実施形態において、入力オリゴヌクレオチドは、初期オリゴヌクレオチドの突出部と相補性である突出配列を含む。２つの相補性突出配列のハイブリダイゼーションは、入力オリゴヌクレオチドを初期オリゴヌクレオチドとの結紮のための位置にする。この結紮は、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いて酵素により行うことができる。入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの突出部配列は好ましくは同じ長さであり、２以上のヌクレオチド、好ましくは２〜約１０のヌクレオチド、さらに好ましくは２から約６ヌクレオチドからなる。一つの好ましい実施形態において、入力オリゴヌクレオチドは、各末端に突出部配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドである。一端での突出部配列は初期オリゴヌクレオチドの突出部配列に対して相補性であり、一方、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの結紮後、他の末端での突出部配列は次のサイクルの初期オリゴヌクレオチドの突出部配列になる。１つの実施形態において、３つの突出部配列はすべて長さが２から６ヌクレオチドであり、入力オリゴヌクレオチドのエンコーディング配列は長さが３から１０ヌクレオチドであり、好ましくは、３から６ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態において、突出部配列は全て長さが２ヌクレオチドであり、エンコーディング配列は長さが５ヌクレオチドである。
【００７３】
図４において示される実施形態において、入力ストランドは初期オリゴヌクレオチドの３’末端と相補性である領域をその３’末端に有し、両ストランドの５’末端で突出部が残される。５’末端は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ベントポリメラーゼを用いてうめることができ、その結果、二本鎖の伸長されたオリゴヌクレオチドが得られる。このオリゴヌクレオチドのボトムストランドを除去することができ、追加の配列を同じ方法を用いてトップストランドの３’末端に添加できる。
【００７４】
エンコーディングオリゴヌクレオチドタグは、それぞれの連続したビルディングブロックを同定するオリゴヌクレオチドの連続した添加の結果として形成される。本発明の方法の１つの実施形態において、連続オリゴヌクレオチドタグを酵素結紮によりカップリングさせることができ、エンコーディングオリゴヌクレオチドを得る。
【００７５】
酵素により触媒されたオリゴヌクレオチドの結紮は、核酸フラグメントを結紮する能力を有する任意の酵素を用いて行うことができる。酵素の例は、リガーゼ、ポリメラーゼ、およびトポイソメラーゼを包含する。本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ  ６．５．１．１）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．７）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．６）またはトポイソメラーゼ（ＥＣ  ５．９９．１．２）は、オリゴヌクレオチドを結紮するために使用される。各ＥＣクラスに含まれる酵素は、例えば、Ｂａｉｒｏｃｈ（２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：３０４−５において記載されているようにして、見出すことができる。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド結紮を触媒するために使用される酵素は、ＤＮＡリガーゼである。結紮がリガーゼの存在下で起こるために、すなわち、ホスホジエステル結合が２つのオリゴヌクレオチド間で形成されるために、１つのオリゴヌクレオチドは遊離５’ホスフェート基を有さなければならず、他のオリゴヌクレオチドは遊離３’ヒドロキシル基を有さなければならない。本発明の方法において用いることができるＤＮＡリガーゼの例は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ（イー・コリ）（全て、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡから入手可能である）を包含する。
【００７７】
当業者は、結紮に使用される各酵素は、温度、緩衝液濃度、ｐＨおよび時間などの特定の条件下で最適の活性を有することを理解するであろう。これらの条件のそれぞれは、オリゴヌクレオチドタグの最適結紮を得るために、例えば、製造業者の指示に従って調節することができる。
【００７８】
入力オリゴヌクレオチドは任意の望ましい長さのものであり得るが、好ましくは少なくとも３ヌクレオ塩基の長さである。さらに好ましくは、入力オリゴヌクレオチドは４以上のヌクレオ塩基の長さである。１つの実施形態において、入力オリゴヌクレオチドは３から約１２ヌクレオ塩基の長さである。本発明のライブラリーにおける分子のオリゴヌクレオチドが、当該分野において公知のように、ＰＣＲのプライマーとして機能できる共通末端配列を有することが好ましい。このような共通末端配列を、ライブラリー合成の最終サイクルにおいて添加される入力オリゴヌクレオチドの末端として組み入れることができるか、または、例えば、本明細書において開示される酵素結紮法を用いて、ライブラリー合成後に添加することができる。
【００７９】
本発明の方法の好ましい実施形態を図５に記載する。プロセスは、その５’末端で、アミノ基を末端とするリンカーに結合された合成ＤＮＡ配列で始まる。段階１において、この出発ＤＮＡ配列を入力ＤＮＡ配列とスプリントＤＮＡストランド、ＤＮＡリガーゼおよびジチオトレイトールの存在下、トリス緩衝液中で結紮する。これにより、標識されたＤＮＡ配列を得、これをその後次の段階において直接用いることができるか、または次の段階に進む前に、例えば、ＨＰＬＣまたはエタノール沈殿を用いて精製することができる。段階２において、標識されたＤＮＡを保護された活性化アミノ酸（この例においては、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸フルオリド）と反応させて、保護アミノ酸−ＤＮＡ接合体を得る。段階３において、保護されたアミノ酸−ＤＮＡ接合体を、例えば、ピペリジンの存在下で脱保護し、得られた脱保護接合体を、任意に、例えば、ＨＰＬＣまたはエタノール沈殿により精製する。脱保護接合体は、第一合成サイクルの生成物であり、第二サイクルの出発物質になり、これは第二アミノ酸残基を脱保護接合体の遊離アミノ基に添加する。
【００８０】
選択された分子のエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅および／または配列決定するためにＰＣＲが使用される実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー配列および／またはシークエンシングプライマー（例えば、プライマー、例えば、３’−ＧＡＣＴＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧ−５’および３’−ＧＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧ−５’）を含む。ＰＣＲプライマー配列は、たとえば、合成の第一サイクル前に初期オリゴヌクレオチド中に含めることができる、および／または第一入力オリゴヌクレオチドとともに含めることができる、および／またはライブラリー合成の最終サイクル後にエンコーディングオリゴヌクレオチドに結紮することができる、および／または最終サイクルの入力オリゴヌクレオチド中に含めることができる。ライブラリー合成の最終サイクル後に添加される、および／または最終サイクルの入力オリゴヌクレオチド中のＰＣＲプライマー配列は、本明細書において、「キャッピング配列」と称する。
【００８１】
１つの実施形態において、ＰＣＲプライマー配列は、エンコーディングオリゴヌクレオチドタグ中に設計される。例えば、ＰＣＲプライマー配列を初期オリゴヌクレオチドタグ中に組み入れることができる、および／または最終オリゴヌクレオチドタグ中に組み入れることができる。１つの実施形態において、同じＰＣＲプライマー配列が初期および最終オリゴヌクレオチドタグ中に組み入れられる。もう一つ別の実施形態において、第一ＰＣＲ配列が初期オリゴヌクレオチドタグ中に組み入れられ、第二ＰＣＲプライマー配列が最終オリゴヌクレオチドタグ中に組み入れられる。別法として、第二ＰＣＲプライマー配列を本明細書において記載されるキャッピング配列中に組み入れることができる。好ましい実施形態において、ＰＣＲプライマー配列は少なくとも約５、７、１０、１３、１５、１７、２０、２２、または２５ヌクレオチドの長さである。
【００８２】
本発明のライブラリーにおける使用に適したＰＣＲプライマー配列は当該分野において公知であり；好適なプライマーおよび方法は、例えば、Ｉｎｎｉｓ、ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）（その内容は全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。本明細書において記載されるライブラリーの構築において使用される他の好適なプライマーは、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００４／０６９８４９およびＷＯ  ２００５／００３３７５（その内容は、本発明の一部として参照される）において記載されているプライマーである。
【００８３】
本明細書において、プライマー伸長法により合成されるプライマー、プローブおよび核酸フラグメントまたはセグメントに関して用いられる「ポリヌクレオチド」なる用語は、２以上、好ましくは３より多いデオキシリボヌクレオチドからなる分子として定義される。
【００８４】
本明細書において用いられる「プライマー」なる用語は、核酸制限消化から精製されるか、または合成により生成されるかにかかわらず、核酸ストランドに対して相補性であるプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下に置かれた場合、すなわち、ヌクレオチドおよび重合用薬剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの存在下、好適な温度およびｐＨで、核酸合成の開始点として作用できるポリヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは、最大効率を得るためには一本鎖であるが、別法として、二本鎖形態であってもよい。二本鎖であるならば、伸長生成物を調製するために使用される前に、相補ストランドから分離するためにプライマーをまず処理する。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合用薬剤の存在下で伸長生成物の合成を準備するために十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマー源をはじめとする多くの因子に依存する。
【００８５】
本発明において使用されるプライマーは、増幅されるそれぞれの特異的配列の異なるストランドに対して「実質的」に相補性であるように選択される。これは、そのそれぞれのテンプレートストランドと非ランダムにハイブリダイズするために、プライマーが実質的に素十分相補性でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映しても、しなくてもよい。
【００８６】
ポリヌクレオチドプライマーは、任意の好適な方法、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０；米国特許第４，３５６，２７０号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，４１６，９８８号、米国特許第４，２９３，６５２号；およびＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９において記載されているホスホトリエステルまたはホスホジエステル法を用いて調製することができる。前記文献の全ての内容は、本発明の一部として参照される。
【００８７】
ＰＣＲプライマー配列が入力オリゴヌクレオチド中に含まれる場合において、これらの入力オリゴヌクレオチドは、好ましくは、他のサイクルにおいて添加される入力オリゴヌクレオチドよりも著しく長い。これは、これらがエンコーディング配列およびＰＣＲプライマー配列の両方を含むからである。
【００８８】
１つの実施形態において、最終ビルディングブロックおよび最終入力オリゴヌクレオチドの添加後、キャッピング配列を添加し、前述のライブラリーの合成は、キャッピング配列をエンコーディングオリゴヌクレオチドと結紮して、実質的に全てのライブラリーメンバーのオリゴヌクレオチド部分がＰＣＲプライマー配列を含む配列で終わるようにする段階を含む。好ましくは、キャッピング配列を、最終合成サイクルの生成物であるプールされたフラクションに結紮することにより添加する。ライブラリーの構築において使用される酵素プロセスを用いて、キャッピング配列を添加することができる。
【００８９】
１つの実施形態において、同じキャッピング配列をライブラリーの全てのメンバーと結紮する。もう一つ別の実施形態において、複数のキャッピング配列が使用される。この実施形態において、様々な塩基を含有するオリゴヌクレオチドキャッピング配列を、例えば、ライブラリーメンバー上に、最終合成サイクル後に結紮する。１つの実施形態において、最終合成サイクル後、フラクションをプールし、次に再度フラクションに分割する（各フラクションは異なるキャッピング配列が添加されている）。別法として、最終合成サイクル後に、複数のキャッピング配列をプールされたライブラリーに添加することができる。両方の実施形態において、最終ライブラリーメンバーは、２以上の異なるキャッピング配列を含む同定オリゴヌクレオチドと結合した特異的官能部分を含む分子を含む。
【００９０】
１つの実施形態において、キャッピングプライマーは、様々な、すなわち、縮重ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド配列を含む。キャッピングプライマー内のこのような縮重塩基により、ビルディングブロックの組み合わせがＰＣＲ複製（同じ配列）の結果であるか、または分子の独立した存在（異なる配列）の結果であるかを決定することにより、興味のあるライブラリー分子の同定が可能になる。例えば、このような縮重塩基は、エンコードされたライブラリーの生物学的スクリーニングの間に同定される誤検出の見込数を減少させる。
【００９１】
１つの実施形態において、縮重キャッピングプライマーは次の配列を含むかまたは有する：
【化２１】
2009513135.tif 000022
ここで、Ｎは４塩基のいずれかであり、１０２４の異なる配列（４５）が可能である。プライマーはライブラリー上へのその結紮およびプライマー伸長後に次の配列を有する：
５’−ＣＡＧＣＧＴＴＣＧＡ  Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’ＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣ−３’
３’−ＡＡ  ＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  Ｎ  ＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＧ−５’
【００９２】
もう一つ別の実施形態において、キャッピングプライマーは次の配列を含むかまたは有する：
３’−ＡＡ    ＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧ  ＡＢＢＢＡＢＢＢＡＢＢＢＡ  ＧＡＣＴＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧ
【化２２】
2009513135.tif 000023
ここで、ＢはＣ、ＧまたはＴのいずれかであり、１９，６８３の異なる配列（３９）が可能である。縮重Ｂ塩基の側面に位置し、中断するＡ塩基は、３塩基より大きなホモポリマーストレッチを防止し、配列アライメントを促進するので、このプライマーにおける縮重領域のデザインは、ＤＮＡ配列分析を向上させる。  
【００９３】
１つの実施形態において、縮重キャッピングオリゴヌクレオチドをライブラリーのメンバーと、好適な酵素を用いて結紮し、縮重キャッピングオリゴヌクレオチドの上部ストランドを次に好適な酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを用いて重合する。
【００９４】
もう１つ別の実施形態において、ＰＣＲプライミング配列は「ユニバーサルアダプター」または「ユニバーサルプライマー」である。本明細書において用いられる場合、「ユニバーサルアダプター」または「ユニバーサルプライマー」は、独自のＰＣＲプライミング領域、すなわち、例えば、約５、７、１０、１３、１５、１７、２０、２２、または２５ヌクレオチドの長さの領域を含有するオリゴヌクレオチドであって、独自の配列決定プライミング領域、すなわち、例えば、約５、７、１０、１３、１５、１７、２０、２２、または２５ヌクレオチドの長さの領域に隣接した位置にあり、任意に、４つのデオキシリボヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）のそれぞれの少なくとも１つからなる独自の特異なキー配列（またはサンプル識別子配列）が後に続くものである。
【００９５】
本明細書において用いられる場合、「特異なキー配列」または「サンプル識別子配列」なる用語は、サンプルからの分子の集団を独自に標識するために使用できる配列をさす。複数のサンプルであって、それぞれが独自のサンプル識別子配列を含有するものを混合し、配列決定し、個々のサンプルの分析のためのＤＮＡ配列決定後に配列決定および再分類することができる。同じ特異な配列を全ライブラリーについて用いることができるか、あるいは異なる特異なキー配列を用いて、異なるライブラリーを追跡することができる。１つの実施形態において、特異なキー配列は、５’ＰＣＲプライマー、３’ＰＣＲプライマー、または両プライマー上のいずれかである。両ＰＣＲプライマーがサンプル識別子配列を含有するならば、独自のサンプル識別子配列とともにプールできる異なるサンプルの数は各プライマー上のサンプル識別子配列の数の積である。したがって、１０の異なる５’サンプル識別子配列プライマーを１０の異なる３’サンプル識別子配列と組み合わせて、１００の異なるサンプル識別子配列組み合わせを得ることができる。
【００９６】
特異なキー配列を含有する５’および３’独自ＰＣＲプライマーの非制限的例は、次のものを包含する：
【化２３】
2009513135.tif 000024
【化２４】
2009513135.tif 000025
【化２５】
2009513135.tif 000026
【００９７】
１つの実施形態において、特異なキー配列は約４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの長さである。もう１つ別の実施形態において、特異なキー配列は約１−４ヌクレオチドの組み合わせである。さらに別の実施形態において、各ユニバーサルアダプターは約４４ヌクレオチドの長さである。１つの実施形態において、ユニバーサルアダプターは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、エンコーディングオリゴヌクレオチドの末端上に結紮される。異なるユニバーサルアダプターを、各ライブラリー調製について特異的に設計することができ、従って、各ライブラリーの独自の識別子を提供する。ユニバーサルアダプターのサイズおよび配列は当業者により必要であるとして修飾され得る。
【００９８】
１つの実施形態において、キャッピング配列として添加されるユニバーサルアダプターを支持体結合部分に連結させる。例えば、５’−ビオチンをユニバーサルアダプターに添加して、例えば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの単離、ならびにユニバーサルアダプターの、ビオチン結合タンパク質（すなわち、ストレプトアビジン、ニュートロアビジンまたはアビジン）で飽和された固体支持体表面への非共有カップリングを可能にする。他の結合は当該分野において周知であり、ビオチン−ストレプトアビジン（例えば抗体／抗原−エピトープ、レセプター／リガンドおよびオリゴヌクレオチド対合または相補性）の代わりに使用できる。
【００９９】
もう一つ別の実施形態において、キャッピング配列はアンカープライマー配列を含有し、したがって、ライブラリーのメンバーは固体支持体に結合できる。１つの実施形態において、承認された技術を用いてアンカープライマー配列をキャッピング配列にアニールする（例えば、Ｈａｔｃｈ、ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  １５：３５−４０；米国特許第５，７１４，３２０号、および米国特許第５，８５４，０３３号参照）。一般に、アンカープライマーをキャッピング配列にアニールするための任意の手順は、結果として、特異的な、すなわち、アンカープライマー配列中のアダプター領域とキャッピング配列中に存在する配列間に完全またはほぼ完全な相補性が形成される限り、好適である。エンコーディングオリゴヌクレオチドの固体表面に対する固定は可逆的または不可逆的であり、例えば、固体表面に対するアンカーは開裂可能であるか、または非開裂可能である。
【０１００】
１つの実施形態において、ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルアダプター末端のＰＣＲプライミング領域に対して相補性であるオリゴヌクレオチド捕捉プライマーを含有する固体支持体にアニールされる。
【０１０１】
１つの実施形態において、固体支持体はビーズ、例えばセファロースビーズである。ビーズは、任意の都合のよいサイズであり、任意の数の公知材料から加工することができる。かかる材料の例は：無機物質、天然ポリマー、および合成ポリマーを包含する。これらの材料の具体例は：セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス；シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンなどと架橋したポリスチレン（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：１３８５−１３９０参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然スポンジ、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ）およびアガロースゲル（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ）および当業者に公知の固相支持体を包含する。
【０１０２】
エンコーディングオリゴヌクレオチドは、固体支持体捕捉ビーズ（ＤＮＡ捕捉ビーズ）  に、当該分野において公知の任意の方法で結合させることができる。当該分野において公知の任意の好適なカップリング剤、例えば、水溶性カルボジイミドを用いて、ＤＮＡ上の５’−ホスフェートをアミンでコートされた捕捉ビーズに、ホスホアミデート結合により結合させることができ、類似の化学反応を用い、ＤＮＡをビーズ上のリンカーと結合させるＤＮＡリガーゼを用いて特異的オリゴヌクレオチドリンカーをビーズにカップリングさせ、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）およびその誘導体を用いてオリゴヌクレオチドをビーズに結合させて、オリゴヌクレオチドの一端が、固体支持体と共有結合を形成する反応性基（例えば、アミド基）を含有し、一方、リンカーの他の末端は、固定化されるオリゴヌクレオチドと結合できる第二反応性基を含有する。
【０１０３】
もう一つ別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは非共有結合、例えば、キレート化によりＤＮＡ捕捉ビーズと結合するか、または抗原−抗体複合体を用いて、オリゴヌクレオチドをビーズと結合させることができる。ＤＮＡフラグメントの末端、例えば、制限酵素部位からの重複する末端またはバクテリオファージラムダベースのクローニングベクターの「付着末端」で独自の配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドリンカーを用いることができるが、平滑末端結紮も有利に使用できる。これらの方法は、米国特許第５，６７４，７４３号において詳細に記載されている。ビーズを固定化するために使用される任意の方法は、固定化されたオリゴヌクレオチドを本発明の方法における段階全体にわたって結合し続けることが好ましい。
【０１０４】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドを、例えば、ガラス、プラスチック、ナイロン膜、ゲルマトリックス、セラミックス、シリカ、シリコン、または米国特許第６，７８７，３０８号（本発明の一部として参照される）において記載されているような、任意の他の非反応性物質から製造さえる固体支持体に付着させる。支持体表面は、一般的に、平らな、すなわち、平面的な表面、または少なくとも分析される分子が同じ平面にある配置を含む。オリゴヌクレオチドを特異的共有または非共有結合性相互作用により付着させることができる。本発明の１つの実施形態において、支持体の表面はストレプトアビジンまたはアビジンでコートされる。本発明のもう一つ別の実施形態において、固体支持体はエポキシドでコートされ、分子はアミン結合によりカップリングされる。さらに別の実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドを固体支持体に、固体支持体にあらかじめ付着させた相補性核酸分子とのハイブリダイゼーションにより付着させることができる。
【０１０５】
１つの実施形態において、固体支持体を前処理して、オリゴヌクレオ付着および次の配列分析を容易にする界面化学を形成する。１つの実施形態において、固体支持体を高分子電解質多層（ＰＥＭ）でコートする。もう一つ別の実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドを微細加工チャンネルの表面または微細加工フローチャンネルに沿って配置された反応チャンバーの表面に付着させる。これらの付着法のそれぞれの方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００５／０８０６０５（その全内容は本発明の一部として参照される）において記載されている。
【０１０６】
１つの実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドを固体表面に高密度で、単一分子解像度で付着させる。１つの実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドを個別にアドレス可能な位置で固体表面に付着させる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００５／０８０６０５参照）。
【０１０７】
エンコーディングオリゴヌクレオチドの任意の好適な固体表面への付着は、増幅および／または配列決定のためのプライマーのハイブリダイゼーション前に起こり得るか、あるいは  エンコーディングオリゴヌクレオチドは、増幅および／または配列決定のためのプライマーのハイブリダイゼーション後に任意の好適な固体表面に付着させることができる。
【０１０８】
もう一つ別の実施形態において、オリゴヌクレオチドを、粒子、例えば、マイクロスフェアであって、それ自体が固体支持体に付着しているものに付着させる。マイクロスフェアは、任意の好適なサイズ、典型的には、直径１０ｎｍから１００ｎｍの範囲であってよい。
【０１０９】
１つの実施形態において、ユニバーサルアダプターは５’−リン酸化されていない。したがって、当該分野において承認された技術に従ってニック付ＤＮＡフラグメントに結合し、ストランド置換し、伸長することができるＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用することにより、「ギャップ」または「ニック」を埋めることができる。３’−＞  ５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているが、５’  −＞  ３’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼは、結果として非ニック付二本鎖ＤＮＡの修復を形成する方法で、ニックを認識し、ニック付ストランドを置換し、ストランドを伸長する能力を有する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ｅｔ  ａｌ．（２００１）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：３７０）
【０１１０】
いくつかの修飾酵素（ポリメラーゼ、リガーゼおよびキナーゼを包含するが、これに限定されない）はニック修復段階に利用される。この用途に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、例えば、イー・コリＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ  ｐｏｌ  Ｉ、およびバクテリオファージｐｈｉ  ２９を包含する。１つの実施形態において、ストランド置換酵素Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｏｌ  Ｉ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ）がニック付ｄｓＤＮＡを修復するために使用され、その結果、非ニック付ｄｓＤＮＡが得られる。もう一つ別の実施形態において、リガーゼはＴ４であり、キナーゼはポリヌクレオチドキナーゼである。
【０１１１】
本発明はさらに、本発明の方法を用いて産生できる化合物、およびかかる化合物（単離種または化学構造のライブラリーを形成するためにプールされる）の集合にも関する。本発明の化合物は、式
【化２６】
2009513135.tif 000027
の化合物を包含し、式中、Ｘは、１以上のビルディングブロックを含む官能部分であり、Ｚはその３’末端でＢに付着したオリゴヌクレオチドであり、ＹはＣにその５’末端で付着するオリゴヌクレオチドである。Ａは、Ｘと共有結合を形成する官能基であり、Ｂは、Ｚの３’末端と結合を形成する官能基であり、Ｃは、Ｙの５’末端と結合を形成する官能基である。Ｄ、ＦおよびＥは、官能基Ａ、ＣおよびＢを、中心原子または骨格であるＳと連結する化学基である、好ましくは、Ｄ、ＥおよびＦはそれぞれ独立して、原子の鎖、例えば、アルキレン鎖またはオリゴ（エチレングリコール）鎖であり、Ｄ、ＥおよびＦは同一または異なり得て、好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび官能部分の合成を行うのに有効である。
【０１１２】
好ましくは、ＹおよびＺは実質的に相補性であり、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合および二本鎖形成を好適な条件下で可能にするために化合物において配向している。ＹおよびＺは同じ長さであるか、または異なる長さである。好ましくは、ＹおよびＺは同じ長さであるか、またはＹおよびＺの一方は他方よりも１から１０塩基長い。好ましい実施形態において、ＹおよびＺはそれぞれ１０塩基以上の長さであり、１０塩基対以上の相補性領域を有する。さらに好ましくは、ＹおよびＺはその長さ全体にわたって実質的に相補性である。すなわち、これらは１０塩基対ごとに１以下のミスマッチを有する。最も好ましくは、ＹおよびＺはその長さ全体にわたって、相補性である。すなわち、ＹまたはＺ上の突出部を除いて、ストランドはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合により、その全長にわたってミスマッチなしにハイブリダイズする。
【０１１３】
Ｓは１つの原子または分子骨格であり得る。例えば、Ｓは炭素原子、ホウ素原子、窒素原子またはリン原子、あるいは多原子骨格、例えば、ホスフェート基または環状基、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリール基であり得る。１つの実施形態において、リンカーは構造
【化２７】
2009513135.tif 000028
の基であり、式中、ｎ、ｍおよびｐのそれぞれは、独立して、１から約２０、好ましくは２から８、さらに好ましくは、３から６の整数である。一つの好ましい実施形態において、リンカーは以下に示す構造を有する
【化２８】
2009513135.tif 000029
【０１１４】
１つの実施形態において、本発明のライブラリーは、ビルディングブロックから構成される官能部分からなる分子を含み、ここで、各官能部分は、エンコーディングオリゴヌクレオチドと操作可能に結合している。エンコーディングオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、官能部分において存在するビルディングブロックを示し、いくつかの実施形態においては、ビルディングブロックの結合性および配列を示す。本発明は、官能部分を構築するために使用される方法およびオリゴヌクレオチドタグを構築するために使用される方法は、同じ反応媒体、好ましくは、水性媒体中で行うことができ、従って、従来技術における方法と比較して、ライブラリーを調製する方法が簡素化されるという利点を提供する。オリゴヌクレオチド結紮段階およびビルディングブロック添加段階がどちらも水性媒体中で行うことができる、ある実施形態において、各反応は異なるｐＨ最適値を有する。これらの実施形態において、ビルディングブロック添加反応は、好適な水性緩衝液中、好適なｐＨおよび温度で行うことができる。緩衝液を次に、オリゴヌクレオチド結紮に適したｐＨを提供する水性緩衝液に交換することができる。
【０１１５】
もう一つ別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの化合物、およびかかる化合物を含むライブラリーを提供する
【化２９】
2009513135.tif 000030
（ＩＩ）
式中、Ｘは分子骨格であり、各Ｙは独立して、末梢部分であり、ｎは１から６の整数である。各Ａは独立してビルディングブロックであり、ｎは０から約５の整数である。Ｌは結合部分であり、Ｚは一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであって、構造−Ａｔ−Ｘ（Ｙ）ｎを特定するものである。構造Ｘ（Ｙ）ｎは、例えば、表８（下記参照）に記載される骨格構造の一つである。１つの実施形態において、本発明は式ＩＩＩの化合物、およびかかる化合物を含むライブラリーを提供する
【化３０】
2009513135.tif 000031
（ＩＩＩ）
式中、ｔは０から約５、好ましくは、０から３の整数であり、各Ａは独立してビルディングブロックである。Ｌは結合部分であり、Ｚは一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであって、各ＡおよびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４を特定するものである。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、置換基水素、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換アリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、および置換アミノから選択される置換基である。１つの実施形態において、各Ａはアミノ酸残基である。
【０１１６】
式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を含むライブラリーは、少なくともａｂｏｕｔ  １００；１０００；１０，０００；１００，０００；１，０００，０００  または１０，０００，０００の式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を含むことができる。１つの実施形態において、ライブラリーは、少なくとも約１００；１０００；１０，０００；１００，０００；１，０００，０００または１０，０００，０００の式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を含むライブラリーを作製するために設計される方法により調製される。
【０１１７】
【表１−１】
2009513135.tif 000032
【表１−２】
2009513135.tif 000033
【表１−３】
2009513135.tif 000034
【表１−４】
2009513135.tif 000035
【表１−５】
2009513135.tif 000036
【表１−６】
2009513135.tif 000037
【表１−７】
2009513135.tif 000038
【０１１８】
本発明の方法の一つの利点は、膨大な数の化合物を含むライブラリーを調製するために使用できることである。公知方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてエンコーディングオリゴヌクレオチド配列を増幅できることは、比較的少ないコピーが回収される場合でも、選択された分子を同定できることを意味する。これにより、その高い複雑さのために、比較的少ない所定のライブラリーメンバーを含むか、または非常に大きな体積を使用することを必要とする、非常に大きなライブラリーの実用化が可能になる。例えば、１０８の独自の構造からなるライブラリーであって、それぞれの構造が１  ｘ  １０１２コピー（約１ピコモル）を有し、１μＭの有効濃度の約１００Ｌの溶液を必要とするもの。同じライブラリーに関して、各メンバーが１，０００，０００コピーにより表されるならば、必要な体積は、１μＭの有効濃度で１００μＬである。
【０１１９】
好ましい実施形態において、ライブラリーは約１０３から約１０１５の各ライブラリーメンバーを含む。ライブラリーメンバー間で合成の有効性に差があるならば、異なるライブラリーメンバーは所定のライブラリーにおいて異なる数のコピーを有することが可能である。従って、ライブラリー中に理論的に存在する各メンバーの数は同じであるが、任意の所定のライブラリーメンバーの実際の数は、他のメンバーの数と関係ない。本発明の化合物ライブラリーは、少なくとも約１０５、１０６または１０７の各ライブラリーメンバー、あるいは実質的に全てのライブラリーメンバーを含む。「実質的に全て」のライブラリーメンバーとは、少なくとも約８５％のライブラリーのメンバー好ましくは、少なくとも約９０％、さらに好ましくは、少なくとも約９５％のライブラリーのメンバーを意味する。
【０１２０】
好ましくは、ライブラリーは、複数回（すなわち２以上）の生物学的標的に対する選択を、行うことができ、残存する分子のオリゴヌクレオチドタグの増幅を可能にする選択の最終回後に十分な量の結合分子が残存し、従って、結合分子の官能部分の同定が可能になる、十分な数の各メンバーを含む。  かかる選択プロセスの概略図を図６に示し、図中、１および２はライブラリーメンバーを表し、Ｂは標的分子であり、ＸはＢと操作可能に結合した部分であって、選択培地からのＢの除去を可能にするものである。この例において、化合物１はＢと結合し、一方、化合物２はＢと結合しない。ラウンド１において図示される選択プロセスは、（Ｉ）化合物１および２を含むライブラリーをＢ−Ｘと、化合物１のＢに対する結合に適した条件下で接触させ；（ＩＩ）未結合化合物２を除去し、（ＩＩＩ）化合物１をＢから解離させ、ＢＸを反応媒体から除去することを含む。ラウンド１の結果は、化合物２に対して化合物１が豊富である分子の集団である。段階Ｉ−ＩＩＩを採用する次のラウンドの結果、化合物２に対して化合物１がさらに濃縮される。3ラウンドの選択を図６において示すが、非結合分子に対して望ましい濃度の結合分子を得るために、実際、任意の数のラウンド、例えば、１ラウンドから１０ラウンドを用いることができる。
【０１２１】
図６において示される実施形態において、選択のラウンドのいずれかの後に残存する化合物の増幅（より多くのコピーの合成）がない。このような増幅は、選択後に残存する化合物の相対量と一致しない化合物の混合物をもたらす。この不一致は、ある化合物が他の化合物よりも容易に合成され得るので、選択後のその存在に比例しない方法で増幅され得るという事実のためである。例えば、化合物２が化合物１よりも容易に合成され得るならば、ラウンド２後に残存する分子の増幅の結果、化合物１に対して化合物２の不均衡な増幅になり、結果として得られる化合物の混合物は、化合物２に対して化合物の濃度がずっと低い（もしあれば）。
【０１２２】
１つの実施形態において、標的は固体支持体上に、任意の公知固定化技術により固定化される。固体支持体は、例えば、クロマトグラフィーカラムまたは膜内に含まれる水不溶性マトリックスであり得る。エンコードされたライブラリーを、クロマトグラフィーカラム内に含まれる水不溶性マトリックスに適用することができる。カラムを次に洗浄して、非特異性バインダーを除去する。標的結合化合物を次に、ｐＨ、塩濃度、有機溶媒濃度を変えることによるか、または他の方、例えば、標的に対する公知リガンドに対する競合法により解離させることができる。
【０１２３】
もう一つ別の実施形態において、標的は溶液中フリーで、エンコードされたライブラリーとともにインキュベートされる。標的と結合する化合物（本明細書においては、「リガンド」とも称する）はサイズ分離段階、例えば、ゲル濾過または限外濾過により選択的に単離される。１つの実施形態において、エンコードされた化合物の混合物および標的生体分子を、任意のリガンド−標的複合体を未結合化合物から分離する、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ゲル濾過）に通す。リガンド−標的複合体を、リガンドを標的から解離させる、逆相クロマトグラフィーカラムに移す。解離したリガンドを次にエンコーディングオリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅および配列分析により分析する。この方法は、標的の固定化の結果、活性が失われる状況において特に有利である。
【０１２４】
従って、本発明の一つの態様において、本明細書において記載されるようにして産生され、生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定し、次に生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバーの官能部分の構造を決定する方法が提供される。
【０１２５】
例えば、１つの実施形態において、生物学的標的と結合する１以上の化合物は：
（Ａ）化合物のライブラリーを合成し（ここで、化合物は：
（ｉ）ｍのイニシエーター化合物を含む溶液を提供し（ここで、ｍは１以上の整数であり、イニシエーター化合物は、ｎのビルディングブロックを含む官能部分（ここで、ｎは１以上の整数である）であって、ｎのビルディングブロックを同定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合するものからなり；
（ｉｉ）段階（ｉ）の溶液をｒの反応容器中に分割し（ここで、ｒは２以上の整数である）、これにより、溶液のｒのアリコートを作製し；
（ｉｉｉ）各反応容器中のイニシエーター化合物をｒのビルディングブロックの１つと反応させ、これにより、初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる化合物を含むｒのアリコートを作製し；
（ｉｖ）各アリコート中の初期オリゴヌクレオチドを、ｒの独立した入力オリゴヌクレオチドの組の一つと、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドを触媒する酵素の存在下、入力オリゴヌクレオチドおよび初期オリゴヌクレオチドの酵素結紮に適した条件下で反応させ；これにより、ｎ＋１のビルディングブロックをエンコードする伸長されたオリゴヌクレオチドと操作可能に結合したｎ＋１のビルディングブロックを含む官能部分からなる分子のｒのアリコートを作製する
ことにより、官能部分の構造を特定する初期オリゴヌクレオチドと操作可能に結合する２以上のビルディングブロックを含む官能部分を含む）；
（Ｂ）生物学的標的を化合物のライブラリー、またはその一部と、化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーが標的と結合するために適した条件下で接触させ；
（Ｃ）標的と結合しないライブラリーメンバーを除去し；
（Ｄ）標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを配列決定し；
（Ｅ）生物学的標的と結合する化合物のライブラリーのメンバー，の官能部分の構造を決定するために、段階（Ｄ）において決定された配列を使用し、これにより生物学的標的と結合する１以上の化合物を同定することを含む方法により同定することができる。
【０１２６】
１つの実施形態において、方法は縮重キャッピングオリゴヌクレオチドを化合物のライブラリーのメンバーと、結紮を触媒する酵素の存在下で結紮し、縮重キャッピングオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡの重合を触媒する酵素と重合させることをさらに含む。
【０１２７】
１つの実施形態において、方法は、配列決定前に標的と結合する化合物のライブラリーの少なくとも１つのメンバーのエンコーディングオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含み得る。
【０１２８】
本発明の１つの実施形態において、ライブラリーの選択および濃縮は、オリゴヌクレオチドアレイを用いてモニターされる。例えば、化合物のライブラリーは、固体表面、例えば、オリゴヌクレオチドを含むチップ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドチップとハイブリダイズさせることができ、これを次に蛍光発光させて、表面に結合したオリゴヌクレオチドタグを検出する。所望の生物活性を有する化合物を同定するために、このハイブリダイゼーションをスクリーニングプロセスの各連続した段階で繰り返すことができる。
【０１２９】
１つの実施形態において、前記のようにビーズを捕捉するために任意に結合していてもよいエンコーディングオリゴヌクレオチドを含む化合物のライブラリーを、熱安定油中みずエマルジョンとして乳化させて、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００４／０６９８４９、ＷＯ  ２００５／００３３７５、およびＷＯ  ２００５／０７３４１０において記載されている方法に従って、マイクロカプセルを形成する。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグ（付着したビーズの有無を問わない）を増幅溶液中に懸濁して、例えば、「マイクロリアクター」を形成することにより、エマルジョンを生成させることができる。本明細書において用いられる場合、「増幅溶液」なる用語は、テンプレートＤＮＡの増幅を行うために必要な試薬の十分な混合物を意味する。増幅溶液の一例は、ＰＣＲ増幅溶液であって、当業者が容易に調製できるものである。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドを含む化合物のライブラリーを増幅させて、配列決定前に、エンコーディングオリゴヌクレオチド分子の数を増加させる。エンコーディングオリゴヌクレオチドを任意の好適なＤＮＡ増幅法、例えば、例えば、温度サイクル−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｓａｉｋｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４；Ｇｉｎｇｅｒａｓ、ｅｔ  ａｌ．  ＷＯ  ８８／１０３１５；Ｄａｖｅｙら、欧州特許出願公開番号３２９，８２２；Ｍｉｌｌｅｒら、ＷＯ  ８９／０６７００）、リガーゼ連鎖ｌｉ反応（例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９：１１７−１２２参照）、転写ベースの増幅（例えば、Ｋｗｏｈ、ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７参照）等温増幅システム−自立配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）；Ｑｐレプリカーゼシステム（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２参照）；ストランド置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０（７）：１６９１−６；Ｗａｌｋｅｒらにより記載されている方法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９２）  ｌ：８９（ｌ）：３９２−６；Ｋｉｅｖｉｔｓら（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９１）  ３５（３）：２７３−８６；「ｒａｃｅ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＭｅｔｈｏｄｓおよびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０））により記載されている方法；「片側ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６．５６７３−５６７７参照）；「ジ−オリゴヌクレオチド」増幅、等温増幅（Ｗａｌｋｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：３９２−３９６）、およびローリングサークル増幅（米国特許第５，７１４，３２０号において総説）により増幅することができる。
【０１３１】
１つの実施形態において、選択されたライブラリーミックス中に存在するＤＮＡ分子の集団分布における任意の潜在的なひずみを最小限に抑えるために、エンコーディングオリゴヌクレオチドを含む化合物のライブラリーは、配列分析の前に増幅される。例えば、少量のライブラリーのみが選択段階後に回収され、典型的には、配列分析前にＰＣＲを用いて増幅される。ＰＣＲは、選択されたライブラリーミックス中に存在するＤＮＡ分子の集団分布におけるひずみをもたらす可能性を有する。インプット分子の数が少なく、インプット分子が不十分なＰＣＲテンプレートである場合に、これは特に問題である。早期サイクルで産生されるＰＣＲ産物は、共有二本鎖ライブラリーよりも有効なテンプレートであり、従って、最終増幅集団におけるこれらの分子の頻度は、当初のインプットテンプレートよりもはるかに高い。
【０１３２】
したがって、ＰＣＲひずみのこのような可能性を最小限に抑えるために、本発明の１つの実施形態において、個々のライブラリーメンバーに対応する一本鎖オリゴヌクレオチドの集団は、例えば、反応において１つのプライマーを使用し、続いて２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより産生される。このようにすることにより、ＰＣＲを用いたっすうてき増幅の前に、一本鎖プライマー伸長産物の直線的蓄積が存在し、蓄積したプライマー伸長産物における分子の多様性および分布は、当初のインプットテンプレート中に存在する分子の多様性および分布をより正確に反映するが、これは、増幅の対数期は、存在する当初の分子多様性の多くがプライマー伸長反応中に産生される分子の集団において表された後にのみ、指数増幅期が起こるためである。
【０１３３】
好ましくは、ＤＮＡ増幅はＰＣＲにより行われる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、および第４，９６５，１８８号において記載され、少なくともＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．  Ｅｒｌｉｃｈ、ｅｄ．、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＭｅｔｈｏｄｓおよびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において記載される。前記文献の全ての内容は、出典明示により本発明の一部として参照される。本発明の１つの実施形態において、テンプレートのＰＣＲ増幅は、ビーズに結合し、ＰＣＲ反応に必要な試薬の全てを含むＰＣＲ溶液で封入されたオリゴヌクレオチドタグに関して行われ、本発明のもう一つ別の実施形態において、テンプレートのＰＣＲ増幅は、可溶性オリゴヌクレオチドタグ（すなわち、ビーズに結合していない）であって、ＰＣＲ反応に必要な試薬の全てを含むＰＣＲ溶液で封入されたものに関して行われる。ＰＣＲはその後、エマルジョンを、当該分野において公知の任意の好適な熱サイクル法に付すことにより行われる。１つの実施形態において、３０から５０の間のサイクル、好ましくは、約４０サイクルの増幅が行われる。増幅処置後に、１以上のハイブリダイゼーションおよび増幅のサイクル後に伸長サイクルがあるのが望ましいが、必要ではない。別の実施形態において、１０から３０サイクルの間、または約２５サイクルのハイブリダイゼーションおよび伸長が行われる。１つの実施形態において、テンプレートＤＮＡは、１つのビーズにつき、約２百万から５千万または約１千万から３千万のテンプレートＤＮＡが固定化されるまで増幅される。
【０１３４】
エンコーディングオリゴヌクレオチドタグ増幅後、エマルジョンを「破壊」（当該分野において「抗乳化」とも称する）される。エマルジョンを破壊する周知の方法が数多くあり（例えば、米国特許第５，９８９，８９２および本明細書において記載される文献）、当業者は適切な方法を選択することができる。  例えば、エマルジョンは、追加の油を添加することにより破壊することができ、エマルジョンを２相に分ける。油相を次に除去し、好適な有機溶媒（例えば、ヘキサン）を添加する。混合後、油／有機溶媒相を除去する。この段階を数回繰り返すことができる。最後に水性層を除去する。エンコーディングオリゴヌクレオチドがビーズに付着するならば、ビーズを次に有機溶媒／アニーリング緩衝液混合物で洗浄し、次にアニーリング緩衝液中で再度洗浄する。好適な有機溶媒は、アルコール、例えば、メタノール、エタノール等を含む。
【０１３５】
例えば、公知技術に従ってシークエンシング反応において使用するために、増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチドを次に水溶液中に再懸濁させることができる。（例えばＳａｎｇｅｒ、Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７５：５４６３−５４６７；Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４：５６０−５６４；Ｒｏｎａｇｈｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３、３６５；Ｌｙｓｏｖ、ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ３０３：１５０８−１５１１；Ｂａｉｎｓ  ＆  Ｓｍｉｔｈ  （１９８８）  Ｊ  ＴｈｅｏｒＢｉｏｌ  １３５：３０３−３０７；Ｄｒｎａｎａｃ、Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：１１４−１２８；Ｋｈｒａｐｋｏ、ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５６：１１８−１２２  ；Ｐｅｖｚｎｅｒ（１９８９）  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  ７：６３−７３；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：１００８−１０１７参照）。
【０１３６】
ビーズに付着したエンコーディングオリゴヌクレオチドが、ピロホスフェートベースのシークエンシング反応（例えば、米国特許第６，２７４，３２０、６２５８，５６８号および第６，２１０，８９１号において記載、本発明の一部として参照される）において使用されるならば、ＰＣＲ産物の第二ストランドを除去し、シークエンシングプライマーをビーズに結合した１つの標準的テンプレートにアニールする必要がある。
【０１３７】
簡単に説明すると、任意の数の一般的に公知の方法、例えば、ＮａＯＨ低イオン（例えば、塩）強度、または熱処理を用いて第二ストランドを溶融させる。溶融段階後、ビーズをペレット化し、上清を捨てる。ビーズをアニーリング緩衝液中に再懸濁させ、シークエンシングプライマーを添加し、標準的アニーリングサイクルを用いて、ビーズに付着した一本鎖テンプレートにアニールする。
【０１３８】
増幅されたエンコーディングオリゴヌクレオチド（任意にビーズ上）を、直接または異なる反応容器中で配列決定させることができる。本発明の１つの実施形態において、エンコーディングオリゴヌクレオチドは、ビーズを反応容器に移し、シークエンシング反応（例えば、ピロホスフェートまたはＳａｎｇｅｒシークエンシング）に付すことにより、ビーズ上で直接配列決定させる、別法として、ビーズを単離することができ、エンコーディングオリゴヌクレオチドを各ビーズから除去し、配列決定することができる。それでも、シークエンシング段階を個々のビーズについて行うことができる、および／または核酸テンプレートを含有しないビーズを、たとえば、ビオチン−ストレプトアビジン磁気ビーズにより、反応容器に分配する前に除去することができる。ビーズを分離するための他の好適な方法は、例えば、Ｂａｕｅｒ、Ｊ．（１９９９）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７２２：５５−６９およびｉｎ  Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔ．  ７４：１４４−１４６において記載されている。
【０１３９】
エンコーディングオリゴヌクレオチドタグが増幅されたら、タグの配列、最終的には選択された分子の組成を、核酸配列分析、ヌクレオチド配列の配列を決定するための周知の手順を用いて決定することができる。核酸配列分析は、（ａ）プローブストランド＋その相補性標的のハイブリダイゼーションまたは変性に基づく生理化学的技術、および（ｂ）ポリメラーゼを用いた酵素反応の組み合わせにより取り組むことができる。
【０１４０】
前記のように官能部分を構成するビルディングブロックを同定するポリヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列は、当業者に公知のシークエンシング法の使用により決定することができる。好適な方法は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７５：５４６３−５４６７；Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４：５６０−５６４；Ｒｏｎａｇｈｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３、３６５；Ｌｙｓｏｖ、ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ３０３：１５０８−１５１１；Ｂａｉｎｓ  ＆  Ｓｍｉｔｈ  （１９８８）  Ｊ  ＴｈｅｏｒＢｉｏｌ  １３５：３０３−３０７；Ｄｒｎａｎａｃ、Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：１１４−１２８；Ｋｈｒａｐｋｏ、ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５６：１１８−１２２  ；Ｐｅｖｚｎｅｒ（１９８９）  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  ７：６３−７３；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：１００８−１０１７）において記載されている。
【０１４１】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドタグは、ＰＣＴ  公開ＷＯ  ２００４／０６９８４９、ＷＯ  ２００５／００３３７５、ＷＯ  ２００５／０７３４１０、およびＷＯ  ２００５／０５４４３１（それぞれの内容は、本発明の一部として参照される）において記載される装置および方法を用いて配列決定される。
【０１４２】
１つの実施形態において、シークエンシングプライマーをテンプレート核酸の領域にアニールし、次にシークエンシングプライマーをＤＮＡポリメラーゼおよび公知ヌクレオチド三リン酸、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはこれらのヌクレオチドの類似体、例えば、例えば、−チオ−ｄＡＴＰと接触させることにより、配列産物の領域が決定される。配列は、配列反応当該分野において公知の方法を用いて、配列反応副生成物を検出することにより決定できる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、ハプテンのジスルフィド−誘導体、例えば、ビオチンを含有するように修飾される。アンカー基質にアニールされた新生プライマーへの修飾されたヌクレオチドの添加を、好適な重合後法により分析する。このような方法は、ヌクレオチドを所定の目標位置において同定し、電気泳動法および潜在的に危険な放射性標識の使用を回避しつつ、ＤＮＡが簡単かつ迅速に配列されることを可能にする。
【０１４４】
好適なハプテンの例は、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素分子ｃｙ３およびｃｙ５、およびフルオレセインを包含する。ハプテンの付着は、糖、塩基、および／またはヌクレオチド上のホスフェート部分による結合により起こり得る。エンコーディングオリゴヌクレオチドの重合および伸長後のシグナル増幅の手段の例は、蛍光手段、電気化学的手段および酵素手段を包含する。酵素増幅を使用する１つの実施形態において、酵素はその発光基質が公知であるもの、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、または  ルシフェラーゼであり、これらの発光（化学発光）基質を検出するための手段はＣＣＤカメラを含み得る。
【０１４５】
シークエンシングプライマーは、ある領域の核酸テンプレート（すなわち、オリゴヌクレオチドタグ）と特異的にアニールできる限り、任意の長さまたは塩基組成であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、通常の技術により、例えば、商業的なオリゴヌクレオチド合成器を使用して、および／またはこのようにして合成されたサブフラグメントをあわせて結紮することにより、合成できる。シークエンシングプライマーは、テンプレート核酸上の領域を特異的にプライムできる限り、特別な構造は必要とされない。シークエンシングプライマーはＤＮＡポリメラーゼで伸長されて、配列生成物を形成する。伸長は、１種以上のヌクレオチド三リン酸、および必要に応じて、補助結合タンパク質の存在下で行われる。ｄＮＴＰの組み入れは、例えば、シークエンシング副生成物の存在について分析することにより決定される。
【０１４６】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグの核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用により決定される。簡単に説明すると、オリゴヌクレオチドタグ（任意にビーズに付着していてもよい）を次のようにしてＰＣＲ反応に付す。適切なサンプルをＰＣＲプライマー対（この対の各メンバーはあらかじめ選択されたヌクレオチド配列を有する）と接触させる。ＰＣＲプライマー対は、エンコーディングオリゴヌクレオチドタグ上のＰＣＲプライマー結合部位とハイブリダイズすることにより、プライマー伸長反応を開始させることができる。
【０１４７】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対、好ましくは、その所定量をＰＣＲ緩衝液中でエンコーディングオリゴヌクレオチドタグの核酸と混合して、ＰＣＲ反応混合物を形成することにより行われる。混合は、あらかじめ決められた、ＰＣＲ反応生成物の形成に十分な多数サイクルで熱サイクルされる。生成物の十分な量とは、ＤＮＡ配列決定を可能にするために十分な量で単離することができるようなものである。
【０１４８】
ＰＣＲは典型的には、熱サイクリングにより、すなわち、ＰＣＲ反応混合物の温度を、下限が約３０℃から上限が約９０℃〜約１００℃である範囲内で繰り返し上下させることにより行われる。上昇および下降は連続的に行うことができるが、好ましくは、好ましいポリヌクレオチド合成、変性およびハイブリダイゼーションのそれぞれの相対的温度安定性の期間をともなう一過性のものである。
【０１４９】
ＰＣＲ反応は、好適な方法を用いて行われる。一般に、ＰＣＲ反応は、緩衝水溶液、すなわち、ＰＣＲ緩衝液中、好ましくはｐＨ７〜９で起こる。好ましくは、モル過剰のプライマーが存在する。プロセスの効率を改善するためには、大モル過剰が好ましい。
【０１５０】
ＰＣＲ緩衝液は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ポリヌクレオチド合成基質）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰおよびポリメラーゼ（典型的には熱安定性で、すべてプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応に適切な量）も含有する。結果として得られる溶液（ＰＣＲ混合物）を約９０℃〜１００℃に約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。この加熱期間の後、溶液をプライマーのハイブリダイゼーションに好ましい５４℃に冷却させる。合成反応は、室温からポリメラーゼ（薬剤を含む）がもはや有効に機能しない温度までの範囲の温度で起こり得る。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ  が使用されるならば、温度は一般に約４０℃以下である。望ましい量のＰＣＲ産物が産生されるまで、熱サイクルを繰り返す。ＰＣＲ緩衝液の一例は、次の試薬を含む：５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ．ｓｕｂ．２；０．００１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチン、２００ｍＭ  ｄＡＴＰ；２００ｍＭ  ｄＴＴＰ；２００ｍＭ  ｄＣＴＰ；２００ｍＭ  ｄＧＴＰ；および２．５単位のＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（１００マクロリットルの緩衝液あたり）。
【０１５１】
プライマー配列を伸長するために適した酵素は例えば、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ  ＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および他の酵素、例えば熱安定性酵素（ヌクレオチドの組み合わせを適切な方法で促進して、各核酸ストランドに対して相補性であるプライマー伸長産物を形成する）を包含する。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、５’方向にテンプレートストランドに沿って合成が終結するまで進行して、異なる長さの分子を産生する。新たに合成されたＤＮＡストランドおよびその相補性ストランドは、分析プロセスの次の段階において使用できる二本鎖分子を形成する。
【０１５２】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列は、ｄＮＭＰが伸長された配列プライマー中に組み入れられる際にヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から放出される無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）を測定することにより決定される。このシークエンシング法（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）技術（ＰｙｒｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と称する）は、溶液（液相）中または固相技術として行うことができる。ＰＰｉベースのシークエンシング法は、例えば、米国特許第６，２７４，３２０号、第６２５８，５６８号および第６，２１０，８９１号、ＷＯ９８１３５２３Ａ１、Ｒｏｎａｇｈｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２：８４−８９、Ｒｏｎａｇｈｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５、およびＵＳＳＮ  ２００１／００２４７９０において記載されている。これらのＰＰｉシークエンシングの開示は、その全体として本発明の一部として参照される。例えば、米国特許第６，２１０，８９１号および第６，２５８，５６８号（それぞれ、出典明示により完全に本発明の一部として参照される）も参照のこと。
【０１５３】
ピロホスフェートは、多くの異なる方法により検出することができ、様々な酵素法がすでに記載されている（例えば、Ｒｅｅｖｅｓ、ｅｔ  ａｌ．（１９６９）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２８：２８２−２８７；Ｇｕｉｌｌｏｒｙ、ｅｔ  ａｌ．（１９７１）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３９：１７０−１８０；Ｊｏｈｎｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９６８）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５：２７３；Ｃｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．  １９７８．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９１：５５７−５６５；およびＤｒａｋｅ、ｅｔ  ａｌ．（１９７９）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９４：１１７−１２０参照）。
【０１５４】
１つの実施形態において、ＰＰｉは、酵素により（例えば、光の発生により）検出される。このような方法は、ヌクレオチドが所定の標的位置において同定され、電気泳動法および潜在的に危険な放射標識の使用を回避しつつ、簡単かつ迅速にＤＮＡが配列決定されるのを可能にする。
【０１５５】
１つの実施形態において、ＰＰｉおよびカップリングされたルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を使用して、検出のために光を発生させる。もう一つ別の実施形態において、ＰＰｉおよびカップリングされたスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応を使用して、米国特許第６，９０２，９２１号（その内容は本発明の一部として参照される）において記載されるように光を発生させる。１つの実施形態において、スルフリラーゼは熱安定性である。いくつかの実施形態において、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれか、または両方を各反応部位に配置された１以上の固体支持体上に固定化する。
【０１５６】
もう一つ別の実施形態において、オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／２３６１０（その内容は本発明の一部として参照される）において記載されている方法に従って決定される。簡単にいうと、標的ヌクレオチド配列は、好適なプライマーを伸長するためにポリメラーゼ反応を使用して、その補体を生成させ、相補配列を生成させる塩基の連続的組み入れを特徴づけることにより決定できる。標的配列は、典型的には、固体支持体上に固定される。異なる塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣのそれぞれを次に、連続添加により、標的と接触させ、任意の組み入れ事象が好適な塩基への付着により検出される。
【０１５７】
ポリメラーゼ、例えば、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ）の使用により、標識された塩基を相補性配列中に組み入れる。組み入れられた標識された塩基の検出後、ポリメラーゼは末端で標識された塩基を対応する未標識塩基と置換し、かくしてシークエンシングが起こる。
【０１５８】
さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００５／０８０６０５（その全内容は明確に本発明の一部として参照される）において記載される合成法による単一分子シークエンシングの使用により決定される。この技術を使用する利点は、シークエンシングの前にＤＮＡ増幅の必要がなく、増幅エラーおよび偏りの導入をなくすことである。簡単に言うと、エンコーディングオリゴヌクレオチドを固体表面上に固定化されたユニバーサルプライマーにハイブリダイズする。例えば、表面をレーザーで照らし、顕微鏡に接続されたデジタルＴＶカメラで画像化することにより視覚化し、表面上の全ての二本鎖の位置を記録する。ＤＮＡポリメラーゼおよび１種の蛍光標識されたヌクレオチド、例えばＡを表面に添加し、適切なプライマー中に組み入れる。続いて、ポリメラーゼおよび組み入れられていないヌクレオチドを表面から洗い流し、組み入れられたヌクレオチドを、例えば表面をレーザーで照らし、カメラで画像化することにより視覚化した後、組み入れられたヌクレオチドの位置を記録する。蛍光標識をそれぞれの組み入れられたヌクレオチドから除去し、次のヌクレオチド、例えば、Ｇに関して、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔから、所望のリード長が達成されるまでプロセスを繰り返す。
【０１５９】
このシークエンシング法に適した蛍光色素の１つの基は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素、例えば、ドナーおよびアクセプターエネルギー蛍光色素およびリンカー、例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５である。ＦＲＥＴは、例えば、Ｓｅｌｖｉｎ（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．  ２４６：３００において記載されている現象である。ＦＲＥＴは、複数のヌクレオチドの単一オリゴヌクレオチド分子中への組み入れを検出することができ、従っておよび本発明のエンコーディングオリゴヌクレオチドのシークエンシングに有用である。ＦＲＥＴを用いたシークエンシング法は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００５／０８０６０５（その全内容は明確に本発明の一部として参照される）において記載されている。あるいは、量子ドットを使用して、シークエンシング反応において使用される異なる種類のヌクレオチド上の標識部分として使用できる。
【０１６０】
１つのリガンドが前記方法により同定されると、様々なレベルの分析を適用して、構造活性な関連情報を得、リガンドの親和性。特異性および生物活性のさらなる最適化をガイドする。同じ骨格から誘導されるリガンドについて、三次元分子モデルを用いて、リガンドに共通した顕著な構造特性を特定することができ、これにより、おそらくは標的生体分子上の共通の部位で結合する小分子リガンドのファミリーを生成させる。
【０１６１】
様々なスクリーニング法を用いて、１つの標的に対して高い親和性を有するが、別の密接に関連した標的については著しく弱い親和性を有するリガンドを得ることができる。１つのスクリーニング法は、平行実験における両生体分子についてのリガンドを同定し、相互参照比較により共通のリガンドを実質的に削除することである。この方法において、各生体分子生体分子のリガンドを前記のように別々に同定することができる。この方法は、固定化された標的分子および溶液中で遊離した標的生体分子の両方と適合性である。
【０１６２】
免疫化標的生体分子について、非標的生体分子と結合する全てのリガンドをライブラリーから排除する別の方法を事前選択の段階に付加する。例えば、前記のように第一生体分子をエンコードされたライブラリーと接触させることができる。第一生体分子と結合しない化合物を次に形成される任意の第一生体分子−リガンド複合体から分離する。第二生体分子を次に、第一生体分子と結合しない化合物を接触させる。第二生体分子と結合しない化合物を前記のように特定することができ、この化合物は第二生体分子について第一生体分子よりも著しく高い親和性を有する。
【０１６３】
前記開示の方法により特定される既知機能を有する生体分子のリガンドは、生体分子の生物学的機能を決定するためにも使用できる。新規遺伝子が継続して同定されるが、これらの配列によりエンコードされるタンパク質の機能およびこれらのタンパク質の新規薬剤発見および開発の標的としての有効性は測定することが困難であり、おそらくは疾患の治療のゲノム情報を適用するための最も顕著な障害であるので、これは有利である。本発明において記載されるプロセスにより得られる標的特異性リガンドは、標的タンパク質の機能および治療的介入のための標的タンパク質の有効性の両方の理解のための全細胞生物学的検定法または適切な動物モデルにおいて有効に用いることができる。この方法はまた、標的が小分子薬剤開発を特に受けやすいことを裏付けることができる。
【０１６４】
１つの実施形態において、本発明のライブラリー内の１以上の化合物は特定の生体分子のリガンドとして同定される。これらの化合物を次に、インビトロアッセイにおいて、生体分子と結合するその能力について評価することができる。好ましくは、結合化合物の官能部分は、オリゴヌクレオチドタグまたはリンカー部分無しに合成され、これらの官能部分は生体分子と結合するその能力について評価される。
【０１６５】
官能部分の生体分子との結合の、生体分子の機能に対する影響はまた、インビトロ無細胞検定または細胞ベースの検定を用いて評価することができる。既知の機能を有する生体分子について、検定は、リガンドの存在下および不在下での生体分子の活性を、例えば、酵素活性などの活性の直接測定、または、例えば生体分子により影響を受ける細胞機能の間接的測定により比較する。生体分子が未知の機能を有するものであるならば、生体分子を発現する細胞をリガンドと接触させることができ、細胞の有効性、機能、表現型、および／または遺伝子発現に対するリガンドの効果を評価する。インビトロ分析は、例えば、細胞死検定、細胞増殖検定またはウイルス複製検定であり得る。例えば、生体分子がウイルスにより発現されるタンパク質であるならば、ウイルスに感染した細胞をタンパク質のリガンドと接触させることができる。ウイルス有効性に対するリガンドのタンパク質との結合の影響を次にホウ化することができる。
【０１６６】
本発明の方法により同定されるリガンドは、インビボモデルまたはヒトモデルにおいて評価することもできる。例えば、リガンドは、生体分子を産生する動物または生命体において評価することができる。結果としての動物または生命体の健康状態における変化（例えば、疾患の進行）を判定することができる。
【０１６７】
未知の機能を有する生体分子、例えば、タンパク質または核酸分子について、生体分子を産生する細胞または生命体に対する生体分子と結合するリガンドは、生体分子の生物学的機能に関する情報を提供する。例えば、特定の細胞プロセスがリガンドの存在下で阻害されるという観察は、このプロセスが、少なくとも一部で生体分子の機能に依存することを示す。
【０１６８】
本発明の方法を用いて同定されるリガンドはまた、これらが結合する生体分子の親和性試薬として用いることもできる。１つの実施形態において、このようなリガンドは、例えば、１以上のかかるリガンドが付着される固相を使用して、生体分子を含む溶液のクロマトグラフィーにより、生体分子の親和性精製に影響を及ぼすために使用される。
【０１６９】
本明細書において記載されるようなエンコードされたライブラリーのスクリーニングに加えて、他の伝統的な医薬開発法、例えば、ファージディスプレー、差次的発現（ｍＲＮＡ  ディスプレー）、およびａｐｔａｍｅｒ／ＳＥＬＥＸは、増幅エラーおよび偏りの導入を排除する本発明の方法から恩恵を受け得る。例えば、ファージディスプレー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１８９８０、Ｗ０９１／１９８１８、およびＷ０９２／１８６１９、および米国特許第５２２３４０９号（それぞれの全内容は本発明の一部として参照される）において記載）を用いた複数ラウンドの選択は、宿主毒性の原因となり、結果として、所望のライブラリーメンバーの損失または少ない発現量の原因となる（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ、Ｐ．Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２（７）：６１３−６２１およびＨｏｌｔ、Ｌ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｎｕｃｌｅｉ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２８（１５）：Ｅ７２参照）。さらに、方法は、例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的発生（ＳＥＬＥＸとも呼ばれ、米国特許第５６５４１５１号、第５５０３９７８号、第５５６７５８８号および第５２７０１６３号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９６／３８５７９およびＷＯ９９２７１３３Ａ１に記載され、それぞれの全内容は本発明の一部として参照される）は、複数ラウンドの選択、すなわち、未結合核酸を、標的分子と特異的に結合した核酸から分離すること、ならびに逆転写およびＰＣＲにより標的と結合した核酸の複数回の増幅を必要とするために偏りを導入する。同様に、差次的発現（例えば、米国特許第５５８０７２６号および第５７００６４４号（それぞれの全内容は本発明の一部として参照される）において記載されている）などの選択法は、複数ラウンドのＰＣＲ増幅に依存し、これはさらに、ライブラリーにおけるクローンの同等でない発現量につながる。従って、前記多段選択プロセスは、大規模並列シークエンシング法を用いる本発明において記載される方法（例えば、ピロホスフェート−ベースのシークエンシング法または合成法による単一分子シークエンシング  ）から恩恵を受け、これは、核酸増幅を必要とせずに、所望の生物活性を有する化合物の正確な同定につながる。
【０１７０】
本発明を次の実施例（制限的であると理解すべきではない）によりさらに説明する。本出願、ならびに図面および配列表全体にわたって記載される全ての文献、特許、公開された特許出願は本発明の一部として参照される。
実施例
【実施例１】
【０１７１】
１０５メンバーのオーダーのライブラリーの合成および特性化  
１０５のオーダーで異なるメンバーを含むライブラリーの合成を、次の試薬を用いて行った：
【化３１】
2009513135.tif 000039
デオキシリボヌクレオチドについての１文字コード：
Ａ＝アデノシン
Ｃ＝シチジン
Ｇ＝グアノシン
Ｔ＝チミジン
【０１７２】
ビルディングブロック前駆体：
【化３２】
2009513135.tif 000040
ＢＢ１                  ＢＢ２                    ＢＢ３
【化３３】
2009513135.tif 000041
ＢＢ４                ＢＢ５                  ＢＢ６
【化３４】
2009513135.tif 000042
ＢＢ７                ＢＢ８              ＢＢ９
【化３５】
2009513135.tif 000043
ＢＢ１０            ＢＢ１１                ＢＢ１２
【０１７３】
オリゴヌクレオチドタグ：
配列                                                          タグ番号
５’−ＰＯ３−ＧＣＡＡＣＧＡＡＧ（配列番号１）                １．１
ＡＣＣＧＴＴＧＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号２）
５’−ＰＯ３−ＧＣＧＴＡＣＡＡＧ（配列番号３）                １．２
ＡＣＣＧＣＡＴＧＴ−ＰＯ３−５’（配列番号４）
５’−ＰＯ３−ＧＣＴＣＴＧＴＡＧ（配列番号５）                １．３
ＡＣＣＧＡＧＡＣＡ−ＰＯ３−５’（配列番号６）
５’−ＰＯ３−ＧＴＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号７）                １．４
ＡＣＣＡＣＧＧＴＡ−ＰＯ３−５’（配列番号８）
５’−ＰＯ３−ＧＴＴＧＡＣＣＡＧ（配列番号９）                １．５
ＡＣＣＡＡＣＴＧＧ−ＰＯ３−５’（配列番号１０）
５’−ＰＯ３−ＣＧＡＣＴＴＧＡＣ（配列番号１１）                １．６
ＣＡＡＧＴＣＧＣＡ−ＰＯ３−５’（配列番号１２）
５’−ＰＯ３−ＣＧＴＡＧＴＣＡＧ（配列番号１３）                １．７
ＡＣＧＣＡＴＣＡＧ−ＰＯ３−５’（配列番号１４）
５’−ＰＯ３−ＣＣＡＧＣＡＴＡＧ（配列番号１５）                １．８
ＡＣＧＧＴＣＧＴＡ−ＰＯ３−５’（配列番号１６）
５’−ＰＯ３−ＣＣＴＡＣＡＧＡＧ（配列番号１７）                １．９
ＡＣＧＧＡＴＧＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号１８）
５’−ＰＯ３−ＣＴＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号１９）                １．１０
ＣＧＴＴＣＡＧＣＡ−ＰＯ３−５’（配列番号２０）
５’−ＰＯ３−ＣＴＣＣＡＧＴＡＧ（配列番号２１）                １．１１
ＡＣＧＡＧＧＴＣＡ−ＰＯ３−５’（配列番号２２）
５’−ＰＯ３−ＴＡＧＧＴＣＣＡＧ（配列番号２３）                １．１２
ＡＣＡＴＣＣＡＧＧ−ＰＯ３−５’（配列番号２４）
５’−ＰＯ３−ＧＣＧＴＧＴＴＧＴ（配列番号２５）                ２．１
ＴＣＣＧＣＡＣＡＡ−ＰＯ３−５’（配列番号２６）
５’−ＰＯ３−ＧＣＴＴＧＧＡＧＴ（配列番号２７）                ２．２
ＴＣＣＧＡＡＣＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号２８）
５’−ＰＯ３−ＧＴＣＡＡＧＣＧＴ（配列番号２９）                ２．３
ＴＣＣＡＧＴＴＣＧ−ＰＯ３−５’（配列番号３０）
５’−ＰＯ３−ＣＡＡＧＡＧＣＧＴ（配列番号３１）                ２．４
ＴＣＧＴＴＣＴＣＧ−ＰＯ３−５’（配列番号３２）
５’−ＰＯ３−ＣＡＧＴＴＣＧＧＴ（配列番号３３）                ２．５
ＴＣＧＴＣＡＡＧＣ−ＰＯ３−５’（配列番号３４）
５’−ＰＯ３−ＣＧＡＡＧＧＡＧＴ（配列番号３５）                ２．６
ＴＣＧＣＴＴＣＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号３６）
５’−ＰＯ３−ＣＧＧＴＧＴＴＧＴ（配列番号３７）                ２．７
ＴＣＧＣＣＡＣＡＡ−ＰＯ３−５’（配列番号３８）
５’−ＰＯ３−ＣＧＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号３９）                ２．８
ＴＣＧＣＡＡＣＧＡ−ＰＯ３−５’（配列番号４０）
５’−ＰＯ３−ＣＣＧＡＴＣＴＧＴ（配列番号４１）                ２．９
ＴＣＧＧＣＴＡＧＡ−ＰＯ３−５’（配列番号４２）
５’−ＰＯ３−ＣＣＴＴＣＴＣＧＴ（配列番号４３）                ２．１０
ＴＣＧＧＡＡＧＡＧ−ＰＯ３−５’（配列番号４４）
５’−ＰＯ３−ＴＧＡＧＴＣＣＧＴ（配列番号４５）                ２．１１
ＴＣＡＣＴＣＡＧＧ−ＰＯ３−５’（配列番号４６）
５’−ＰＯ３−ＴＧＣＴＡＣＧＧＴ（配列番号４７）                ２．１２
ＴＣＡＧＡＴＴＧＣ−ＰＯ３−５’（配列番号４８）
５’−ＰＯ３−ＧＴＧＣＧＴＴＧＡ（配列番号４９）                ３．１
ＣＡＣＡＣＧＣＡＡ−ＰＯ３−５’（配列番号５０）
５’−ＰＯ３−ＧＴＴＧＧＣＡＧＡ（配列番号５１）                ３．２
ＣＡＣＡＡＣＣＧＴ−ＰＯ３−５’（配列番号５２）
５’−ＰＯ３−ＣＣＴＧＴＡＧＧＡ（配列番号５３）                ３．３
ＣＡＧＧＡＣＡＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号５４）
５’−ＰＯ３−ＣＴＧＣＧＴＡＧＡ（配列番号５５）                ３．４
ＣＡＧＡＣＧＣＡＴ−ＰＯ３−５’（配列番号５６）
５’−ＰＯ３−ＣＴＴＡＣＧＣＧＡ（配列番号５７）                ３．５
ＣＡＧＡＡＴＧＣＧ−ＰＯ３−５’（配列番号５８）
５’−ＰＯ３−ＴＧＧＴＣＡＣＧＡ（配列番号５９）                ３．６
ＣＡＡＣＣＡＧＴＧ−ＰＯ３−５’（配列番号６０）
５’−ＰＯ３−ＴＣＡＧＡＧＣＧＡ（配列番号６１）                ３．７
ＣＡＡＧＴＣＴＣＧ−ＰＯ３−５’（配列番号６２）
５’−ＰＯ３−ＴＴＧＣＴＣＧＧＡ（配列番号６３）                ３．８
ＣＡＡＡＣＧＡＧＣ−ＰＯ３−５’（配列番号６４）
５’−ＰＯ３−ＧＣＡＧＴＴＧＧＡ（配列番号６５）                ３．９
ＣＡＣＧＴＣＡＡＣ−ＰＯ３−５’（配列番号６６）
５’−ＰＯ３−ＧＣＣＴＧＡＡＧＡ（配列番号６７）                ３．１０
ＣＡＣＧＧＡＣＴＴ−ＰＯ３−５’（配列番号６８）
５’−ＰＯ３−ＧＴＡＧＣＣＡＧＡ（配列番号６９）                ３．１１
ＣＡＣＡＴＣＧＧＴ−ＰＯ３−５’（配列番号７０）
５’−ＰＯ３−ＧＴＣＧＣＴＴＧＡ（配列番号７１）                ３．１２
ＣＡＣＡＧＣＧＡＡ−ＰＯ３−５’（配列番号７２）
５’−ＰＯ３−ＧＣＣＴＡＡＧＴＴ（配列番号７３）                ４．１
ＣＴＣＧＧＡＴＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号７４）
５’−ＰＯ３−ＧＴＡＧＴＧＣＴＴ（配列番号７５）                ４．２
ＣＴＣＡＴＣＡＣＧ−ＰＯ３−５’（配列番号７６）
５’−ＰＯ３−ＧＴＣＧＡＡＧＴＴ（配列番号７７）                ４．３
ＣＴＣＡＧＣＴＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号７８）
５’−ＰＯ３−ＧＴＴＴＣＧＧＴＴ（配列番号７９）                ４．４
ＣＴＣＡＡＡＧＣＣ−ＰＯ３−５’（配列番号８０）
５’−ＰＯ３−ＣＡＧＣＧＴＴＴＴ（配列番号８１）                ４．５
ＣＴＧＴＣＧＣＡＡ−ＰＯ３−５’（配列番号８２）
５’−ＰＯ３−ＣＡＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号８３）                ４．６
ＣＴＧＴＡＴＧＣＧ−ＰＯ３−５’（配列番号８４）
５’−ＰＯ３−ＣＧＡＴＣＴＧＴＴ（配列番号８５）                ４．７
ＣＴＧＣＴＡＧＡＣ−ＰＯ３−５’（配列番号８６）
５’−ＰＯ３−ＣＧＣＴＴＴＧＴＴ（配列番号８７）                ４．８
ＣＴＧＣＧＡＡＡＣ−ＰＯ３−５’（配列番号８８）
５’−ＰＯ３−ＣＣＡＣＡＧＴＴＴ（配列番号８９）                ４．９
ＣＴＧＧＴＧＴＣＡ−ＰＯ３−５’（配列番号９０）
５’−ＰＯ３−ＣＣＴＧＡＡＧＴＴ（配列番号９１）                ４．１０
ＣＴＧＧＡＣＴＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号９２）
５’−ＰＯ３−ＣＴＧＡＣＧＡＴＴ（配列番号９３）                ４．１１
ＣＴＧＡＣＴＧＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号９４）
５’−ＰＯ３−ＣＴＣＣＡＣＴＴＴ（配列番号９５）                ４．１２
ＣＴＧＡＧＧＴＧＡ−ＰＯ３−５’（配列番号９６）
５’−ＰＯ３−ＡＣＣＡＧＡＧＣＣ（配列番号９７）                ５．１
ＡＡＴＧＧＴＣＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号９８）
５’−ＰＯ３−ＡＴＣＣＧＣＡＣＣ（配列番号９９）                ５．２
ＡＡＴＡＧＧＣＧＴ−ＰＯ３−５’（配列番号１００）
５’−ＰＯ３−ＧＡＣＧＡＣＡＣＣ（配列番号１０１）                ５．３
ＡＡＣＴＧＣＴＧＴ−ＰＯ３−５’（配列番号１０２）
５’−ＰＯ３−ＧＧＡＴＧＧＡＣＣ（配列番号１０３）                ５．４
ＡＡＣＣＴＡＣＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号１０４）
５’−ＰＯ３−ＧＣＡＧＡＡＧＣＣ（配列番号１０５）                ５．５
ＡＡＣＧＴＣＴＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号１０６）
５’−ＰＯ３−ＧＣＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号１０７）                ５．６
ＡＡＣＧＧＴＡＣＡ−ＰＯ３−５’（配列番号１０８）
５’−ＰＯ３−ＧＴＣＴＧＣＴＣＣ（配列番号１０９）                ５．７
ＡＡＣＡＧＡＣＧＡ−ＰＯ３−５’（配列番号１１０）
５’−ＰＯ３−ＣＧＡＣＡＧＡＣＣ（配列番号１１１）                ５．８
ＡＡＧＣＴＧＴＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号１１２）
５’−ＰＯ３−ＣＧＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号１１３）                ５．９
ＡＡＧＣＧＡＴＧＡ−ＰＯ３−５’（配列番号１１４）
５’−ＰＯ３−ＣＣＡＣＡＧＡＣＣ（配列番号１１５）                ５．１０
ＡＡＧＧＴＧＴＣＴ−ＰＯ３−５’（配列番号１１６）
５’−ＰＯ３−ＣＣＴＣＴＣＴＣＣ（配列番号１１７）                ５．１１
ＡＡＧＧＡＧＡＧＡ−ＰＯ３−５’（配列番号１１８）
５’−ＰＯ３−ＣＴＣＧＴＡＧＣＣ（配列番号１１９）                ５．１２
ＡＡＧＡＧＣＡＴＣ−ＰＯ３−５’（配列番号１２０）
１Ｘリガーゼ緩衝液：５０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．５；１０ｍＭ  ジチオトレイトール；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２．５ｍＭ  ＡＴＰ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ。
１０Ｘリガーゼ緩衝液：５００ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．５；１００ｍＭ  ジチオトレイトール；１００ｍＭｍｇＣｌ２；２５ｍＭ  ＡＴＰ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１７４】
サイクル１
１２のＰＣＲ試験管のそれぞれに、化合物１の水中１ｍＭ溶液５０μＬ；タグ１．１−１．１２のうちの１つの０．８ｍＭ溶液７５μＬ；１０Ｘリガーゼ緩衝液１５μＬおよび脱イオン水１０μＬを添加した。試験管を９５℃に１分間加熱し、次いで１６℃に１０分間かけて冷却した。各試験管に、５０μｌ  １Ｘリガーゼ緩衝液中５，０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２，０００，０００単位／ｍＬ溶液２．５μＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．Ｍ０２０２））を添加し、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベートした。
【０１７５】
結紮後、サンプルを１．５μｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に移し、２０μＬ  ５μ水性ＮａＣｌおよび５００μＬ冷（−２０℃）エタノールで処理し、−２０℃で１時間保持した。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを７０％水性エタノールで−２０℃で洗浄した。ペレットのそれぞれを次に１５０μＬの１５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．４）中に溶解させた。
【０１７６】
ビルディングブロック前駆体ＢＢ１からＢＢ１２、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエタノールアミンおよびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（それぞれ０．２５Ｍの濃度）のそれぞれ１つを含むストック溶液をＤＭＦ中で調製し、室温で２０分間撹拌した。ビルディングブロック前駆体溶液を前記ペレット溶液のそれぞれに添加して、リンカーに対して１０倍過剰のビルディングブロック前駆体を得た。得られた溶液を撹拌した。追加の１０当量のビルディングブロック前駆体を２０分後に反応混合物に添加し、さらに１０当量を４０分後に添加した。反応混合物中のＤＭＦの最終濃度は２２％であった。反応溶液を次に一夜４℃で撹拌した。  反応の進行は、５０ｍＭ水性テトラエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ＝７．５）およびアセトニトリルおよび２−４６％アセトニトリルの勾配を用いて１４分にわたってＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。出発物質（リンカー）の〜９５％がアシル化されたら、反応を停止した。アシル化後、反応混合物をプールし、凍結乾固させた。凍結乾燥さえた物質を次にＨＰＬＣにより精製し、ライブラリー（アシル化生成物）に対応するフラクションをプールし、凍結乾燥した。
【０１７７】
ライブラリーを２．５μｌの０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）中に溶解させ、０．１ｍｌのピペリジン（４％  ｖ／ｖ）をこれに添加した。ピペリジンを添加すると濁り、これは混合しても溶解しない。反応混合物を室温で５０分間撹拌し、次に濁った溶液を遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ）、２００μｌピペットを用いて上清を除去し、およびペレットを０．１μｌの水中に再懸濁させた。水性洗浄液を上清と合わせ、ペレットを捨てた。過剰の氷冷エタノールの添加により脱保護ライブラリーを溶液から沈殿させ、反応中エタノールの最終濃度を７０％  ｖ／ｖにした。水性エタノール混合物の遠心分離により、ライブラリーを含む白色ペレットを得た。ペレットを１回冷７０％水性エタノールで洗浄した。溶媒の除去後、ペレットを空気中で乾燥し（〜分）  、微量のエタノールを除去し、次にサイクル２において使用した。タグおよびラウンド１において使用された対応するビルディングブロック前駆体を以下の表１に記載する。
【０１７８】
【表２】
2009513135.tif 000044
【０１７９】
サイクル２〜５
これらのサイクルのそれぞれについて、前のサイクルから得られる合した溶液をそれぞれ５０ｕｌの１２の等しいアリコートに分割し、ＰＣＲ管中に入れた。それぞれの試験管に、異なるタグを含む溶液を添加し、結紮、精製およびアシル化をサイクル１について記載されたようにして行った。ただし、サイクル３−５について、サイクル１について記載されたＨＰＬＣ精製段階は省略した。サイクル２−５についてのタグおよびビルディングブロック前駆体間の対応を表２に示す。
【０１８０】
サイクル５の生成物を以下に示すクロージングプライマーと、タグの結紮について前述の方法を用いて結紮した。
５’−ＰＯ３−ＧＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＡ
ＧＴＧＴＡＡＣＴＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＴ−ＰＯ３−５’
【０１８１】
【表３】
2009513135.tif 000045
【０１８２】
結果：
前記の合成手順は、１２５（約２４９，０００）の異なる構造を含むライブラリーを産生できる。ライブラリーの合成は、各サイクルの生成物のゲル電気泳動法によりモニターした。５サイクルのそれぞれの結果およびクロージングプライマーの結紮後の最終ライブラリーを図７に示す。化合物標識「ヘッドピース」は化合物１である。図は、各サイクルの結果、予想されるように分子量が増加し、各サイクルの生成物は分子量に関して実質的に均一であることを示す。
【実施例２】
【０１８３】
１０８メンバーのオーダーのライブラリーの合成および特性化
１０８のオーダーの異なるメンバーを含むライブラリーの合成は、次の試薬を用いて行った：
化合物２：
【化３６】
2009513135.tif 000046
デオキシリボヌクレオチドの１文字コード：
Ａ＝アデノシン
Ｃ＝シチジン
Ｇ＝グアノシン
Ｔ＝チミジン
【０１８４】
ビルディングブロック前駆体：
【化３７】
2009513135.tif 000047
【化３８】
2009513135.tif 000048
【化３９】
2009513135.tif 000049
【化４０】
2009513135.tif 000050
【化４１】
2009513135.tif 000051
【化４２】
2009513135.tif 000052
【０１８５】
【表４−１】
2009513135.tif 000053
【表４−２】
2009513135.tif 000054
【表４−３】
2009513135.tif 000055
【表４−４】
2009513135.tif 000056
【表４−５】
2009513135.tif 000057
【表４−６】
2009513135.tif 000058
【表４−７】
2009513135.tif 000059
【表４−８】
2009513135.tif 000060
【０１８６】
【表５−１】
2009513135.tif 000061
【表５−２】
2009513135.tif 000062
【表５−３】
2009513135.tif 000063
【表５−４】
2009513135.tif 000064
【表５−５】
2009513135.tif 000065
【表５−６】
2009513135.tif 000066
【表５−７】
2009513135.tif 000067
【表５−８】
2009513135.tif 000068
【０１８７】
【表６−１】
2009513135.tif 000069
【表６−２】
2009513135.tif 000070
【表６−３】
2009513135.tif 000071
【表６−４】
2009513135.tif 000072
【表６−５】
2009513135.tif 000073
【表６−６】
2009513135.tif 000074
【表６−７】
2009513135.tif 000075
【０１８８】
【表７−１】
2009513135.tif 000076
【表７−２】
2009513135.tif 000077
【表７−３】
2009513135.tif 000078
【表７−４】
2009513135.tif 000079
【表７−５】
2009513135.tif 000080
【表７−６】
2009513135.tif 000081
【表７−７】
2009513135.tif 000082
【表７−８】
2009513135.tif 000083
【０１８９】
【表８−１】
2009513135.tif 000084
【表８−２】
2009513135.tif 000085
【表８−３】
2009513135.tif 000086
【表８−４】
2009513135.tif 000087
【０１９０】
１Ｘリガーゼ緩衝液：５０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．５；１０ｍＭジチオトレイトール；１０ｍＭｍｇＣｌ２；２ｍＭ  ＡＴＰ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０Ｘリガーゼ緩衝液：５００ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．５；１００ｍＭジチオトレイトール；１００ｍＭｍｇＣｌ２；２０ｍＭ  ＡＴＰ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１９１】
水溶性スペーサーの化合物２への付着
化合物２（６０ｍＬ、１ｍＭ）のホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中溶液（４℃に冷却）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１６ｍＬ、０．１５Ｍ）中４０当量のＮ−Ｆｍｏｃ−１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサオクタデカン酸（Ｓ−Ａｄｏ）を添加し、続いて、水（９．６ｍＬ、０．２５Ｍ）中４０当量の４−（４，６−ジメトキシ［１．３．５］トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド水和物（ＤＭＴＭＭ）を添加した。混合物を２時間４℃で穏やかに振盪した後、追加の４０当量のＳ−ＡｄｏおよびＤＭＴＭＭを添加し、４℃でさらに１６時間振盪した。
【０１９２】
アシル化後、０．１Ｘ体積の５Ｍ水性ＮａＣｌおよび２．５Ｘ体積の冷（−２０℃）エタノールを添加し、混合物を２０℃で少なくとも１時間静置した。混合物を次に１５分間１４，０００ｒｐｍで４℃の遠心分離機中で遠心分離して、白色ペレットを得、これを冷ＥｔＯＨで洗浄し、次に凍結乾燥機中、室温で３０分間乾燥させた。固体を４０ｍＬの水中に溶解させ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。５０ｍＭ水性トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．５）および９９％アセトニトリル／１％水溶液を用いて生成物を溶出させるために、二成分移動相勾配特性を使用した。精製された物質を凍結乾燥により濃縮し、得られた残留物を５ｍＬの水中に溶解させた。０．１Ｘ体積のピペリジンを溶液に添加し、混合物を穏やかに４５分間室温で振盪した。生成物を次に前記のようにしてエタノール沈殿により精製した。得られたペレットを２回冷ＥｔＯＨで洗浄し、凍結乾燥により乾燥させて、精製された化合物３を得た。
【０１９３】
サイクル１
９６ウェルプレート中の各ウェルに、１２．５μＬの化合物３の水中４ｍＭ溶液；１００μＬの表３（化合物３のタグに対するモル比は１：２であった）に示すオリゴヌクレオチドタグ１．１から１．９６のうちの１つの１ｍＭ溶液を添加した。プレートを９６℃に１分間加熱し、次に１０分にわたって１６℃に冷却した。各ウェルに、１０μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液、３０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１μＬの３０単位／μＬ溶液（ＦｅｒｍｅｎｔａｓＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＥＬ００１３））、７６．５μｌの水を添加し、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベートした。
【０１９４】
結紮反応後、２０μＬの５Ｍ水性ＮａＣｌを各ウェルに直接添加し、続いて５００μＬの冷（−２０℃）エタノールを添加し、−２０℃で１時間保持した。プレートを１時間３２００ｇでＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離機中、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓを用いて遠心分離した。プレートを反転させることにより、上清を慎重に除去し、ペレットを、７０％水性冷エタノールを用いて−２０℃で洗浄した。ペレットのそれぞれを次にホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中に１ｍＭの濃度になるように溶解させ、４℃に冷却した。
【０１９５】
各溶液に、ＤＭＦ中４０当量の９６ビルディングブロック前駆体のうちの１つ（１３μＬ、０．１５Ｍ）を添加し、続いて水中４０当量のＤＭＴ−ＭＭ（８μＬ、０．２５Ｍ）を添加し、溶液を穏やかに４℃で振盪した。２時間後、追加の４０当量のビルディングブロック前駆体おｎそれぞれのうちの１つおよびＤＭＴＭＭを添加し、溶液をおだやかに１６時間４℃で振盪した。アシル化後、ＤＭＦ中１０当量の酢酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（２μＬ、０．２５Ｍ）を各溶液に添加し、１０分間穏やかに振盪した。
【０１９６】
アシル化後、９６の反応混合物をプールし、０．１体積の５Ｍ水性ＮａＣｌおよび２．５体積の冷無水エタノールを添加し、溶液を−２０℃で少なくとも１時間静置した。混合物を次に遠心分離した。遠心分離後、マイクロピペットを用いて、できるだけ多くの上清を除去し、ペレットを冷エタノールで洗浄し、再度遠心分離した。上清を２００μＬピペットで除去した。冷７０％エタノールを試験管に添加し、得られた混合物を５分間４℃で遠心分離した。
【０１９７】
上清を除去し、室温で１０分間凍結乾燥ルウことにより、残存するエタノールを除去した。ペレットを２ｍＬの水中に溶解させ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。５０ｍＭ水性トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．５）および９９％アセトニトリル／１％水溶液を使用して、ライブラリーを溶出させるために、二成分移動相勾配特性を使用した。ライブラリーを含有するフラクションを集め、プールし、凍結乾燥した。得られた残基を２．５ｍＬの水中に溶解させ、２５０μＬのピペリジンを添加した。溶液を穏やかに４５分間振盪し、次に前述のようにエタノールで沈殿させた。得られたペレットを凍結乾燥により乾燥させ、次にホウ酸ナトリウム緩衝液（４．８ｍＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ  ９．４）中に１ｍＭの濃度になるように溶解させた。
【０１９８】
溶液を４℃に冷却し、それぞれ４０当量のＤＭＦ中Ｎ−Ｆｍｏｃ−プロパルギルグリシン（１．２ｍＬ、０．１５Ｍ）および水中ＤＭＴ−ＭＭ（７．７ｍＬ、０．２５Ｍ）を添加した。混合物を穏やかに２時間４℃で振等した後、４０当量のＮ−Ｆｍｏｃ−プロパルギルグリシンおよびＤＭＴ−ＭＭを添加し、溶液をさらに１６時間振盪した。混合物を後に前述のようなＥｔＯＨ沈殿および逆相ＨＰＬＣにより精製し、前述のようにピペリジンでの処理によりＮ−Ｆｍｏｃ基を除去した。ＥｔＯＨ沈殿による最終精製後、得られたペレットを凍結乾燥により乾燥し、合成の次のサイクルに移した。
【０１９９】
サイクル２〜４
これらのサイクルのそれぞれについて、先のサイクルから得られた乾燥ペレットを水中に溶解させ、ライブラリーの濃度をライブラリーのＤＮＡ成分の消散係数に基づいた吸光分光分析により決定し、ここで、化合物２の当初の消散係数は１３１，５００  Ｌ／（モル．ｃｍ）であった。ライブラリーの濃度を水で調節して、その後の結紮反応における最終濃度っが０．２５ｍＭになるようにした。ライブラリーを次に９６ウェルプレート中９６の等しいアリコートに分割した。各ウェルに、異なるタグ（ライブラリーのタグに対するモル比は１：２であった）を含む溶液を添加し、サイクル１について記載されたようにして結紮を行った。サイクル２、３および４において使用したオリゴヌクレオチドタグをそれぞれ表４、５および６に記載する。サイクル１から４のそれぞれについてのタグとビルディングブロック前駆体間の対応を表７に示す。サイクル１について前述のようにライブラリーをエタノールの添加により沈殿させ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ  ９．４）中に１ｍＭの濃度まで溶解させた。続いてアシル化および精製をサイクル１について記載されたようにして行った。ただし、ＨＰＬＣ精製をサイクル３において省略した。
【０２００】
サイクル４の生成物を以下に示すクロージングプライマーと、タグの結紮について前述された方法を用いて結紮した。
５’−ＰＯ３−ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  Ｃ    （配列番号８８９）
５’−ＰＯ３−ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＡＡ    （配列番号８９０）
【０２０１】
結果：
前記の合成手順は、９６４（約１０８）の異なる構造を含むライブラリーを産生できる。  ライブラリーの合成は、各サイクルの生成物のゲル電気泳動法およびＬＣ／ＭＳによりモニターした。完了時に、いくつかの技術を用いてライブラリーを分析した。図１３ａはサイクル４後であるが、クロージングプライマーの結紮前のライブラリーのクロマトグラムであり；図１３ｂは、同じ合成段階でのライブラリーの質量スペクトルである。平均分子量は負イオンＬＣ／ＭＳ分析により決定した。ＰｒｏＭａｓｓソフトウェアを用いて、イオンシグナルを脱回旋させた。この結果はライブラリーの予想される質量と一致する。
【０２０２】
ライブラリーのＤＮＡ成分をアガロースゲル電気泳動法により分析し、これにより、ライブラリー材料のほとんどは正しいサイズの結紮生成物に対応することが示された。ライブラリーのサンプリング由来のＰＣＲ産物の分子クローンのＤＮＡ配列により、ＤＮＡ結紮が高い忠実性で、ほぼ完了近くまで起こることがわかる。
【０２０３】
ライブラリー環化
サイクル４の完了時に、通常のアシル化条件下でアジド酢酸を用いて、ライブラリーの一部をＮ末端でキャップした。生成物を、ＥｔＯＨ沈殿による精製後、リン酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ８）中に１ｍＭの濃度まで溶解させ、それぞれ４当量の、水中ＣｕＳＯ４  （２００ｍＭ）、水中アスコルビン酸（２００ｍＭ）、および以下に示す化合物のＤＭＦ中溶液ＤＭＦ（２００ｍＭ）を添加した。反応混合物を次に穏やかに２時間室温で振盪した。
【化４３】
2009513135.tif 000088
【０２０４】
環化の程度を分析するために、ライブラリー環化反応から５μＬアリコートを取り出し、実施例３において記載されたようにして調製された、蛍光標識されたアジドまたはアルキン（１００ｍＭ  ＤＭＦストック１μＬ）で処理した。１６時間後、５００ｎｍでのＨＰＬＣ分析によると、アルキンまたはアジド標識はどちらもライブラリー中に組み入れられなかった。この結果は、ライブラリーがもはや付加環化可能なアジドまたはアルキン基を含有せず、ライブラリーは従ってそれ自体と、環化反応または分子間反応により反応したことを示す。環化したライブラリーをすでに記載されたようにして、逆相ＨＰＬＣにより精製した。未環化ライブラリーを用いた対照実験は、前記の蛍光タグの完全な取り込みを示した。
【実施例３】
【０２０５】
環化検定のための蛍光タグの調製
別の試験管中で、プロパルギルグリシンまたは２−アミノ−３−フェニルプロピルアジド（それぞれ８マイクロモル）をＦＡＭ−ＯＳｕ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）（１．２当量）とｐＨ９．４ホウ酸塩緩衝液（２５０μＬ）中で組み合わせた。反応を室温で３時間進行させ、次に一夜凍結乾燥した。ＨＰＬＣによる精製により、定量的収率で所望の蛍光アルキンおよびアジドを得た。
【化４４】
2009513135.tif 000089
【実施例４】
【０２０６】
アジド／アルキン付加環化反応を用いた個々の化合物の環化
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−ＮＨ２の調製：
０．３ミリモルのＲｉｎｋ−アミド樹脂を用いて、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸およびＨＡＴＵを活性化剤として用いた標準的固相合成技術を用いて、表示された配列を合成した（Ｐｒａ＝Ｃ−プロパルギルグリシン）。アジド酢酸を用いて、テトラペプチドにキャップをして。２０％  ＴＦＡ／ＤＣＭを４時間用いて樹脂からペプチドを開裂させた。ＲＰ  ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として生成物を得た（７５ｍｇ、５１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：８．４−７．８（ｍ、３Ｈ）、７．４−７．１（ｍ、７  Ｈ）、４．６−４．４（ｍ、１Ｈ）、４．４−４．２（ｍ、２Ｈ）、４．０−３．９（ｍ、２Ｈ）、３．７４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６  Ｈｚ、１７  Ｈｚ）、３．５−３．３（ｍ、２Ｈ）、３．０７（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ＝５  Ｈｚ、１４  Ｈｚ）、２．９２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５  Ｈｚ、１６  Ｈｚ）、２．８６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝２  Ｈｚ）、２．８５−２．７５（ｍ、１Ｈ）、２．６−２．４（ｍ、２Ｈ）、２．２−１．６（ｍ、４Ｈ）。ＩＲ（ｍｕｌｌ）  ２９００、２１００、１４５０、１３００  ｃｍ−１．  ＥＳＩＭＳ  ４９７．４（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、９９３．４（［２Ｍ＋Ｈ］、５０％）。イオン源フラグメンテーションを伴うＥＳＩＭＳ：５１９．３（［Ｍ＋Ｎａ］、１００％）、４９１．３（１００％）、４８０．１（［Ｍ−ＮＨ２］、９０％）、４５２．２（［Ｍ−ＮＨ２−ＣＯ］、２０％）、４２４．２（２０％）、３８５．１（［Ｍ−Ｐｒａ］、５０％）、３５７．１（［Ｍ−Ｐｒａ−ＣＯ］、４０％）、２３８．０（［Ｍ−Ｐｒａ−Ｐｈｅ］、１００％）。
【０２０７】
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−ＮＨ２の環化：
【化４５】
2009513135.tif 000090
アジドアセチルペプチド（３１ｍｇ、０．６２ミリモル）をＭｅＣＮ（３０ｍＬ）中に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１ｍＬ）およびＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（１ｍｇ）を添加した。１．５時間撹拌後、溶液を蒸発させ、結果として得られた残留物を２０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中に溶解させた。遠心分離して不溶性塩を除去した後、溶液を分取逆相ＨＰＬＣに付した。所望の環状ペプチドが白色固体として単離された（１０ｍｇ、３２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：８．２８（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５  Ｈｚ）、７．７７（ｓ、１Ｈ）、７．２−６．９（ｍ、９Ｈ）、４．９８（ｍ、２Ｈ）、４．４８（ｍ、１Ｈ）、４．２８（ｍ、１Ｈ）、４．１−３．９（ｍ、２Ｈ）、３．６３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５  Ｈｚ、１６  Ｈｚ）、３．３３（ｍ、２Ｈ）、３．０（ｍ、３Ｈ）、２．４８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１  Ｈｚ、１４  Ｈｚ）、１．７５（ｍ、１Ｈ０、１．５５（ｍ、１Ｈ）、１．３２（ｍ、１Ｈ）、１．０５（ｍ、１Ｈ）。ＩＲ（ｍｕｌｌ）  ２９００、１４７５、１４００  ｃｍ−１．  ＥＳＩＭＳ  ４９７．２（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、９９３．２（［２Ｍ＋Ｈ］、３０％）、１０１５．２（［２Ｍ＋Ｎａ］、１５％）。イオン源フラグメンテーションを伴うＥＳＩＭＳ：５３５．２（７０％）、５１９．３（［Ｍ＋Ｎａ］、１００％）、４９７．２（［Ｍ＋Ｈ］、８０％）、４８０．１（［Ｍ−ＮＨ２］、３０％）、４５２．２（［Ｍ−ＮＨ２−ＣＯ］、４０％）、２０８．１（６０％）。
【０２０８】
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−Ｇｌｙ−ＯＨの調製：
０．３ミリモルのグリシン−Ｗａｎｇ樹脂を使用して、表示された配列を、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸およびＨＡＴＵを活性化剤として使用して合成した。アジド酢酸を最後のカップリング段階において使用して、ペンタペプチドをキャップした。ペプチドの開裂は、５０％ＴＦＡ／ＤＣＭを用いて２時間行った。ＲＰ  ＨＰＬＣによる精製により、ペプチドを白色固体として得た（８３ｍｇ；５０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：８．４−７．９（ｍ、４Ｈ）、７．２（ｍ、５Ｈ）、４．７−４．２（ｍ、３Ｈ）、４．０−３．７（ｍ、４Ｈ）、３．５−３．３（ｍ、２Ｈ）、３．１（ｍ、１Ｈ）、２．９１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４  Ｈｚ、１６  Ｈｚ）、２．８４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝２．５  Ｈｚ）、２．７８（ｍ、１Ｈ）、２．６−２．４（ｍ、２Ｈ）、２．２−１．６（ｍ、４Ｈ）。ＩＲ（ｍｕｌｌ）  ２９００、２１００、１４５０、１３５０  ｃｍ−１．  ＥＳＩＭＳ  ５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）。イオン源フラグメンテーションを伴うＥＳＩＭＳ：５７７．１（［Ｍ＋Ｎａ］、９０％）、５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］、８０％）、４８０．１（［Ｍ−Ｇｌｙ］、１００％）、３８５．１（［Ｍ−Ｇｌｙ−Ｐｒａ］、７０％）、３５７．１（［Ｍ−Ｇｌｙ−Ｐｒａ−ＣＯ］、４０％）、２３８．０（［Ｍ−Ｇｌｙ−Ｐｒａ−Ｐｈｅ］、８０％）。
【０２０９】
アジドアセチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒａ−Ｇｌｙ−ＯＨの環化：
ペプチド（３２ｍｇ、０．０５８ミリモル）をＭｅＣＮ（６０ｍＬ）中に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）およびＣｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６（１ｍｇ）を添加し、溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をＲＰ  ＨＰＬＣに付して、ダイマーおよびトリマーを除去した。環状モノマーが無色ガラス状物質（６ｍｇ、２０％）として単離された。ＥＳＩＭＳ  ５５５．６（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、１１０９．３（［２Ｍ＋Ｈ］、２０％）、１１３１．２（［２Ｍ＋Ｎａ］、１５％）。
イオン源フラグメンテーションを伴うＥＳＩＭＳ：５５５．３（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、４８０．４（［Ｍ−Ｇｌｙ］、３０％）、４５２．２（［Ｍ−Ｇｌｙ−ＣＯ］、２５％）、４２４．５（［Ｍ−Ｇｌｙ−２ＣＯ］、１０％、ｏｎｌｙ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｎ  ａ  環状構造）。
【０２１０】
直鎖ペプチドのＤＮＡへの接合：
化合物２（４５ｎｍｏｌ）を４５μＬ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．４；１５０ｍＭ）中に溶解させた。４℃で、直鎖ペプチド（１００ｍＭのＤＭＦ中ストックを１８μＬ；１８０ｎｍｏｌ；４０当量）を添加し、続いて、ＤＭＴ−ＭＭ（５００ｍＭの水中ストックを３．６μＬ；１８０  ｎｍｏｌ；４０当量）を添加した。２時間撹拌後、ＬＣＭＳ  は完全な反応を示し、生成物は、エタノール沈殿により単離された。ＥＳＩＭＳ  １８２３．０（［Ｍ−３Ｈ］／３、２０％）、１３６７．２（［Ｍ−４Ｈ］／４、２０％）、１０９３．７（［Ｍ−５Ｈ］／５、４０％）、９１１．４（［Ｍ−６Ｈ］／６、１００％）。
【０２１１】
環状ペプチドのＤＮＡへの接合：
化合物２（２０ｎｍｏｌ）を２０μＬホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４、１５０ｍＭ）中に溶解させた。４℃で、直鎖ペプチド（１００ｍＭのＤＭＦ中ストックを８μＬ；８０ｎｍｏｌ；４０当量）を添加し、続いて、ＤＭＴ−ＭＭ（５００ｍＭの水中ストック１．６μＬ；８０ｎｍｏｌ；４０当量）を添加した。２時間撹拌後、ＬＣＭＳは完全な反応を示し、生成物は、エタノール沈殿により単離された。ＥＳＩＭＳ  １８２３．０（［Ｍ−３Ｈ］／３、２０％）、１３６７．２（［Ｍ−４Ｈ］／４、２０％）、１０９３．７（［Ｍ−５Ｈ］／５、４０％）、９１１．４（［Ｍ−６Ｈ］／６、１００％）。
【０２１２】
ＤＮＡ−結合ペプチドの環化：
直鎖ペプチド−ＤＮＡ接合体（１０ｎｍｏｌ）をｐＨ８リン酸ナトリウム緩衝液（１０μＬ、１５０ｍｍ）中に溶解させた。室温で、それぞれ４当量のＣｕＳＯ４、アスコルビン酸、およびＳｈａｒｐｌｅｓｓリガンドを全て添加した（２００ｍＭ  ストック０．２μＬ）。反応を一夜進行させた。ＲＰ  ＨＰＬＣは、直線状ペプチド−ＤＮＡが存在しないこと、および生成物が真正環状ペプチド−ＤＮＡとともに同時溶出されたことを示す。微量のダイマーまたは他のオリゴマーは観察されなかった。
【化４６】
2009513135.tif 000091
【実施例５】
【０２１３】
官能部分合成への芳香族求核置換反応の適用
塩化シアヌルを用いた化合物３のアリール化の基本手順：
化合物２をｐＨ９．４ホウ酸ナトリウム緩衝液中に１ｍＭの濃度で溶解させる。溶液を４℃に冷却し、２０当量の塩化シアヌルを次いでＭｅＣＮ中５００ｍＭ溶液として添加する。２時間後、完全な反応をＬＣＭＳにより確認し、結果として得られたジクロロトリアジン−ＤＮＡ接合体をエタノール沈殿により単離する。
【０２１４】
ジクロロトリアジン−ＤＮＡのアミン置換の手順：
ジクロロトリアジン−ＤＮＡ接合体をｐＨ９．５ホウ酸塩緩衝液中に１ｍＭの濃度で溶解させる。室温で、４０当量の脂肪族アミンをＤＭＦ溶液として添加する。反応に続いてＬＣＭＳを行い、通常２時間後に完了する。結果として得られるアルキルアミノ−モノクロロトリアジン−ＤＮＡ接合体をエタノール沈殿により単離する。
【０２１５】
モノクロロトリアジン−ＤＮＡのアミン置換の手順：
アルキルアミノ−モノクロロトリアジン−ＤＮＡ接合体をｐＨ９．５ホウ酸塩緩衝液中に１ｍＭの濃度で溶解させる。４２℃で、４０当量の第二脂肪族アミンをＤＭＦ溶液として添加する。反応に続いてＬＣＭＳを行い、通常２時間後に完了する。結果として得られるジアミノトリアジン−ＤＮＡ接合体をエタノール沈殿により単離する。
【実施例６】
【０２１６】
官能部分合成への還元的アミノ化反応の適用
アルデヒドビルディングブロックを有する第二アミンを癌有するＤＮＡ−リンカーの還元的アミノ化の基本手順：
化合物２Ｎ末端プロリン残基にカップリングさせた。結果として得られた化合物をリン酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ５．５）中に１ｍＭの濃度で溶解させた。この溶液に、それぞれ４０当量の、ＤＭＦ（８μＬ、０．２５Ｍ）中アルデヒドビルディングブロックおよびＤＭＦ（８μＬ、０．２５Ｍ）中ナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、溶液を８０℃で２時間加熱した。アルキル化後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
【０２１７】
アミンビルディングブロックを有するアルデヒドを含有するＤＮＡ−リンカーの還元的アミノ化の基本手順：
アルデヒド基を含むビルディングブロックとカップリングした化合物２を、リン酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、２５０ｍＭ、ｐＨ  ５．５）中に１ｍＭの濃度で溶解させた。この溶液に、それぞれ４０当量のＤＭＦ（８μＬ、０．２５Ｍ）中アミンビルディングブロックおよびＤＭＦ（８μＬ、０．２５Ｍ）中ナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、溶液を８０℃で２時間加熱した。アルキル化後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
【実施例７】
【０２１８】
官能部分合成へのペプトイドビルディング反応の適用
ＤＮＡリンカー上でのペプトイド合成の基本手順：
【化４７】
2009513135.tif 000092
化合物２をホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中に１ｍＭの濃度で溶解させ、４℃に冷却した。この溶液に、ＤＭＦ（１３μＬ、０．１５Ｍ）中４０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートを添加し、溶液を４℃で２時間優しく振盪した。アシル化後、ＤＮＡリンカーをエタノール沈殿により精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ  ９．４）中に１ｍＭの濃度で再溶解させ、４℃に冷却した。この溶液に、ＤＭＦ（１３μＬ、０．１５Ｍ）中４０当量のアミンビルディングブロックを添加し、溶液を４℃で１６時間優しく振盪した。ＤＮＡリンカーをエタノール沈殿により精製し、ホウ酸ナトリウム緩衝液（５０μＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ  ９．４）中に１ｍＭの濃度で再溶解させ、４℃に冷却した。ペプトイド合成に続いてＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートを滴下し、続いてアミンビルディングブロックを添加する。
【実施例８】
【０２１９】
アジド−アルキン付加環化反応の官能部分合成への適用
基本手順
アルキン含有ＤＮＡ接合体をｐＨ８．０リン酸塩緩衝液中に約１ｍＭの濃度で溶解させる。この混合物に、１０当量の有機アジドおよびそれぞれ５当量の硫酸銅（ＩＩ）、アスコルビン酸、およびリガンド（トリス−（（１−ベンジルトリアゾール−４−イル）メチル）アミンを全て室温で添加する。反応に続いてＬＣＭＳを行い、通常、１〜２時間後に完了する。結果として得られるトリアゾール−ＤＮＡ接合体をエタノール沈殿により単離できる。
【実施例９】
【０２２０】
エンコードされたライブラリー内のＡｂ１キナーゼに対するリガンドの同定
ＤＮＡでエンコードされたライブラリーにおける興味のある分子を望ましくないライブラリーメンバーよりも濃縮する能力は、興味のある治療標的に対して所定の特性を有する１つの化合物を同定するために重要である。この濃縮能力を示すために、ｒｈＡｂｌキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０７５６３）に対して公知の結合分子（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５、３９９−４０１（２００４）（本発明の一部として参照される）により記載）を合成した。標準的方法を用いてこの化合物を前記実施例において記載されるリンカーにより二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに付着させ、実施例１および２において記載される方法により産生されるものと類似した分子（オリゴヌクレオチドに結合した官能部分）を産生した。実施例２において記載されたように一般的に生成されたライブラリーおよびＤＮＡ結合Ａｂｌキナーゼバインダーは、両種のｑＰＣＲ分析を可能にする独自のＤＮＡ配列を有するように設計された。ＤＮＡ結合Ａｂｌキナーゼバインダーをライブラリーと１：１０００の比で混合した。この混合物をｒｈＡｂｌｅキナーゼと平衡化し、酵素を固相上に捕捉し、洗浄して、非結合ライブラリーメンバーを除去し、結合分子を溶出させた。溶離液中のライブラリー分子のＤＮＡ結合Ａｂｌキナーゼ阻害物質に対する比は１：１であり、このことは、ライブラリー分子の１０００倍過剰でＤＮＡ結合Ａｂｌ−キナーゼの５００倍以上の濃縮を示す。
【０２２１】
評価
当業者らは、単に慣用の実験を用いて、本明細書において記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を承認または確認することができる。このような等価物は、以下の請求の範囲に含まれることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】二本鎖オリゴヌクレオチドの結紮の概略図であり、図中、初期オリゴヌクレオチドは、入力オリゴヌクレオチドの突出部と相補性である突出部を有する。初期ストランドは、遊離しているか、アミノヘキシルリンカーと共役しているか、またはフェニルアラニン残基とアミノヘキシルリンカーにより共役しているかのいずれかとして表される。
【図２】スプリントストランドを使用したオリゴヌクレオチド結紮の概略図である。この実施形態において、スプリントは、一本鎖初期オリゴヌクレオチドおよび一本鎖入力オリゴヌクレオチドと相補性の配列を有する１２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドである。
【図３】初期オリゴヌクレオチドが共有結合したストランドを有する二本鎖であり、入力オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合の、初期オリゴヌクレオチドおよび入力オリゴヌクレオチドの結紮の概略図である。
【図４】ポリメラーゼを用いたオリゴヌクレオチド伸長の概略図である。初期ストランドは遊離しているか、アミノヘキシルリンカーと共役しているか、またはアミノヘキシルリンカーによりフェニルアラニン残基と共役しているかのいずれかとして表される。
【図５】本発明の一つの実施態様の合成サイクルの概略図である。
【図６】本発明のライブラリーを使用した複数ラウンドの選択プロセスの概略図である。
【図７】実施例１において記載されるサイクル１〜５のそれぞれ、およびその後のクロージングプライマーの結紮の産物の電気泳動から得られるゲルである。分子量標準はレーン１に示され、ＤＮＡ定量化についてハイパーラダーの表示された量はレーン９〜１２に示される。
【図８】アジド−アルキン付加環化を用いたビルディングブロックのカップリングの概略図である。
【図９】塩素化トリアジン上の芳香族求核置換によるビルディングブロックのカップリングを表す図である。
【図１０】塩素化トリアジン上の芳香族求核置換によるビルディングブロックのカップリングを表す図である。
【図１１】官能部分の合成法における使用に適した代表的な塩素化複素環式芳香族構造を示す図である。
【図１２】アジド／アルキン付加環化反応を用いた直鎖ペプチドの環化を表す図である。
【図１３ａ】実施例２において記載されるようにしてサイクル４後に産生されるライブラリーのクロマトグラムである。
【図１３ｂ】実施例２において記載されるようにしてサイクル４後に産生されるライブラリーのマススペクトルである。
【符号の説明】
【０２２３】
１および２はライブラリーメンバーを表す。
Ｂは標的分子であり、ＸはＢと操作可能に結合した部分であって、選択培地からのＢの除去を可能にするものである。
【図１】
2009513135.tif 000096
【図２】
2009513135.tif 000097
【図３】
2009513135.tif 000098
【図４】
2009513135.tif 000099
【図５】
2009513135.tif 000100
【図６】
2009513135.tif 000101
【図７】
2009513135.tif 000102
【図８】
2009513135.tif 000103
【図９】
2009513135.tif 000104
【図１０】
2009513135.tif 000105
【図１１】
2009513135.tif 000106
【図１２】
2009513135.tif 000107
【図１３】
2009513135.tif 000108
【配列表】
2009513135000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月30日(2008.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009513135000001.app
【国際調査報告】
2009513135.tif 000259
2009513135.tif 000260
2009513135.tif 000261
2009513135.tif 000262