(57)【要約】ＧＬＰ−１部分の複合体は１つ以上の水溶性ポリマと共有結合している場合がある。例えば、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、Ｎ末端で水溶性ポリマに解放可能に付着しているＧＬＰ−１部分を含んでいる場合がある。ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、ＧＬＰ−１部分がＮ−メチル置換基を保有する水溶性ポリマと共有結合しているＧＬＰ−１部分を含む場合がある。ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、ＧＬＰ−１部分がポリマ付着部位で、ポリマ付着部位から分離した部位でＧＬＰ−１部分がグリコシル化された水溶性ポリマと共有結合しているＧＬＰ−１部分を含む場合がある。
2009519961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのＮ末端で水溶性ポリマに解放可能に付着するＧＬＰ−１部分を備える、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２】
前記水溶性ポリマは、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリ）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸塩）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびその共重合体ならびに三元重合体から選択される、請求項１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項３】
前記水溶性ポリマはポリエチレングリコールである、請求項２に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項４】
１および２から選択される数の前記ＧＬＰ−１部分上の部位に解放可能に付着する、少なくとも１つの付加的ポリエチレングリコールをさらに備える、請求項３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５】
前記少なくとも１つの付加的ポリエチレングリコールは、Ｌｙｓ２６およびＬｙｓ３４から選択される前記ＧＬＰ−１部分の１つ以上の部位に解放可能に付着する、請求項４に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールは、前記ＧＬＰ−１部分の単一部位に解放可能に付着する、請求項３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７】
前記水溶性ポリマは、カルバメート、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、および炭酸塩から選択される加水分解性結合を備えるリンカーを介して、前記ＧＬＰ−１部分に解放可能に付着する、請求項１〜４のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８】
前記水溶性ポリマは、カルバメート、カルボン酸エステル、および炭酸塩から選択される加水分解性結合を備えるリンカーを介して、前記ＧＬＰ−１部分に解放可能に付着する、請求項７に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項９】
前記水溶性ポリマは、約５００ダルトンから約８０，０００ダルトンに及ぶ分子量を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１０】
前記水溶性ポリマは、約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンに及ぶ分子量を有する、請求項９に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１１】
前記水溶性ポリマは、線状、分岐、叉状、および多腕から選択される構造を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１２】
前記水溶性ポリマは線状または分岐している、請求項１１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１３】
前記ＧＬＰ−１部分はグリコシル化される、請求項１〜６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１４】
前記ＧＬＰ−１部分は、７−Ｈｉｓ、８−Ａｌａ、および９−Ｇｌｕのうちのいずれか１つ以上の位置でＮメチル置換基を保有する、請求項１〜６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１５】
下記の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体であって、
【化００１】
2009519961.tif 000085
ＰＯＬＹは水溶性ポリマであり、ＬＤは加水分解性結合であり、ｋは１、２、および３から選択される整数であり、ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であり、前記［ＰＯＬＹ−ＬＤ−］ポリマセグメントのうちの１つは、前記ＧＬＰ−１部分の前記Ｎ末端に位置する、請求項１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１６】
ＰＯＬＹはポリエチレングリコールを備える、請求項１５に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１７】
ｋは１に等しく、ＬＤは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である、請求項１５に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１８】
ＰＯＬＹは線状ポリマであるか、または２つのポリマ腕を有する分岐ポリマである、請求項１５に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項１９】
下記の構造を有し、
【化００２】
2009519961.tif 000086
式中、ｍＰＥＧはＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−であり、
ｎは、１０から１，８００に及び、
ｐは、１から８に及ぶ整数であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ａｒは、芳香族炭化水素であり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、約１から約１８原子の原子長を有するスペーサ部分であり、
−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、請求項１５に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２０】
ｐは１であり、Ｒ１およびＲ２は両方ともＨである、請求項１９に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２１】
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、少なくとも１つのアミド結合を備える、請求項１９または２０に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２２】
Ｘ１およびＸ２は同一である、請求項２１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２３】
Ｘ１およびＸ２は独立して、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−、および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択され、式中、ｑは２、３、４、および５から選択される、請求項１９に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２４】
Ａｒは、ペンタレン、インデン、ナフタレン、インダセン、アセナフチレン、およびフルオレンから選択される、請求項２１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２５】
【化００３】
2009519961.tif 000087
から選択される構造を有し、式中、−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は、前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、請求項１９に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２６】
下記の構造を有し、
【化００４】
2009519961.tif 000088
式中、ＬＤ１は−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−のいずれかであり、Ａｒ１は、オルト、メタ、およびパラ置換フェニルから選択される芳香族基であり、−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表し、ｋは１、２、および３から選択される整数である、請求項１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２７】
【化００５】
2009519961.tif 000089
から選択される構造を有し、式中、ｎは約１０から約１，８００に及び、−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、請求項１５に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項２８】
少なくとも有効量の請求項１〜６、１５〜２０、および２３〜２７のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体、および薬学的に許容される賦形剤を備える、医薬組成物。
【請求項２９】
基礎インスリンをさらに備える、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＧＬＰ−１をさらに備える、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
乾燥粉末形状であり、少なくとも有効量の請求項１〜６、１５〜２０、および２３〜２７のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える、医薬組成物。
【請求項３２】
少なくとも有効量の請求項１〜６、１５〜２０、および２３〜２７のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える、吸入可能な乾燥粉末組成物。
【請求項３３】
インスリンをさらに備える、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
基礎インスリンをさらに備える、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＧＬＰ−１をさらに備える、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ＧＬＰ−１部分に解放可能に付着する単一の水溶性ポリマを有するＧＬＰ−１モノポリマ複合体の、少なくとも有効量の位置異性体の混合物を備える、医薬組成物であって、前記モノポリマ複合体のうちの１つは、前記ＧＬＰ−１部分の前記Ｎ末端に共有結合する前記水溶性ポリマを保有する、医薬組成物。
【請求項３７】
前記水溶性ポリマはポリエチレングリコールである、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
Ｌｙｓ２６またはＬｙｓ３４のいずれかで前記ＧＬＰ−１部分に解放可能に付着する前記水溶性ポリマを有するＧＬＰ−１モノポリマ複合体を備える、請求項３６または３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
インスリンをさらに備える、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
基礎インスリンをさらに備える、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
ＧＬＰ−１をさらに備える、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
ＧＬＰ−１ポリマ複合体の少なくとも有効量の混合物を備える医薬組成物であって、少なくとも１つのＧＬＰ−１ポリマ複合体は、そのＮ末端でＧＬＰ−１部分に解放可能に付着する水溶性ポリマを保有する、医薬組成物。
【請求項４３】
前記組成物は、イミダゾール窒素におけるＨｉｓ７の側鎖で前記ＧＬＰ−１部分に、解放可能に、または安定的のいずれかで共有結合する前記水溶性ポリマを有するＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える、請求項４２に記載の医薬組成品。
【請求項４４】
ＧＬＰ−１ポリマ複合体を調製するための方法であって、加水分解性結合を形成するために適したアミノ反応性官能基を備える水溶性ポリマ試薬にＧＬＰ−１部分を、前記水溶性ポリマ試薬のアミノ反応性官能基と前記ＧＬＰ−１部分のＮ末端アミノ基の反応を促進するために効果的な接合条件下で、加水分解性結合を形成するのに適したアミノ反応性官能基を備える水溶性ポリマ試薬にＧＬＰ−１部分を接触させるステップを含み、それによって、そのＮ末端で前記水溶性ポリマに解放可能に付着する前記ＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体を形成する、方法。
【請求項４５】
前記接合条件は、約３から約７に及ぶｐＨを有する溶液を備える、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＧＬＰ−１ポリマ複合体を分離するステップをさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＧＬＰ−１ポリマ複合体を精製するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記精製するステップは、クロマトグラフィまたは膜分離を備える、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記アミノ反応性官能基は、反応性炭酸塩またはカルボン酸エステルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記接触させるステップで採用される前記ＧＬＰ−１部分は、保護ε−アミノリジンを備える、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記接触させるステップの後で、前記ＧＬＰ−１ポリマ複合体の前記保護ε−アミノリジンを脱保護するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記グリコシル化ＧＬＰ−１は、前記ＧＬＰ−１部分の１つ以上の部位に共有結合する単、二、または三糖類を保有する、請求項１３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５３】
前記単、二、または三糖類は、前記ＧＬＰ‐１部分の１つ以上の部位に共有結合し、前記１つ以上の部位はそれぞれ、前記Ｎ末端（Ｈｉｓ７）、Ａｌａ８、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｕ２１、Ｇｌｙ２２、Ｇｌｎ２３、Ｌｙｓ２６、およびＬｙｓ３４から選択される１つ以上の部位で自然発生するか、または置換される、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒのうちの１つを備える、請求項１３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５４】
前記糖類は単糖類を備える、請求項５３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５５】
前記ＧＬＰ−１部分のＡｌａ８部位で置換されるＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈのうちの１つと共有結合する単、二、または三糖類を保有する、請求項５３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５６】
前記糖類は、グルコース、マンノース、キシロース、マルトース、メリビオース、およびマルトトリオースから選択される、請求項５３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５７】
Ｇｌｕ２１およびＧｌｎ２３のうちの１つまたは両方の位置で共有結合する単、二、または三糖類をさらに備える、請求項５３から５６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項５８】
請求項１〜６、１５〜２０、２３〜２７、および５３〜５６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える、エアゾール化組成物。
【請求項５９】
ＧＬＰ−１部分を、それを必要とする哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項１〜６、１５〜２０、２３〜２７、および５３〜５６のいずれかに記載の有効量のＧＬＰ−１ポリマ複合体を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項６０】
前記投与するステップは、皮下および吸入から選択される経路による、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記投与するステップは吸入により、前記ＧＬＰ−１ポリマ複合体はエアゾール化形状である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＧＬＰ−１部分を、それを必要とする哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項１〜６、１５〜２０、２３〜２７、および５３〜５６のいずれかに記載の有効量のＧＬＰ−１ポリマ複合体を前記対象に経肺的に投与するステップを含む、方法。
【請求項６３】
ＧＬＰ−１部分を、哺乳類対象に送達するための方法であって、
エアゾール化組成物を形成するように、請求項１〜６、１５〜２０、２３〜２７、および５３〜５６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える医薬品組成物をエアゾール化するステップと、
吸入によって、前記エアゾール化組成物を前記対象の肺に投与するステップとを含む、方法。
【請求項６４】
ＧＬＰ−１による治療に反応する哺乳類対象における症状を治療するための方法であって、水溶性ポリマに解放可能に付着するＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体を、前記対象に投与するステップを含み、前記複合体は、前記投与するステップの前に生物活性が不足しており、それにより、前記投与するステップの結果、前記ＧＬＰ−１部分は前記複合体から解放され、天然ＧＬＰ−１に対して認められるものよりも長い期間にわたって、前記対象の血糖値の低下をもたらすのに効果的である、方法。
【請求項６５】
それを必要とする哺乳類対象の前記血糖値を低下させる方法であって、請求項１〜６、１５〜２０、２３〜２７、および５３〜５６のいずれかに記載の有効量のＧＬＰ−１ポリマ複合体を前記対象に投与するステップを含み、それによって、投与後少なくとも約８時間の長期間にわたって前記対象の血糖値の低下をを生じる、方法。
【請求項６６】
少なくとも８時間の長時間にわたって、それを必要とする哺乳類対象の前記血糖値を下げるための、請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６７】
少なくとも８時間の長時間にわたって、哺乳類対象の前記血糖値を下げるための薬剤の調製のための、請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項６８】
哺乳類対象の肺に送達される薬剤の前記調製のための、請求項１に記載のＧＬＰ−１複合体の使用であって、送達には、糖尿病の治療のために、前記対象の肺に沈着し、そこから吸収するために吸入によって前記薬剤を投与するステップを備える、使用。
【請求項６９】
ＧＬＰ−１部分はＮメチル置換基を保有する、水溶性ポリマに共有結合するＧＬＰ−１部分を備える、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７０】
前記ＧＬＰ−１部分は、７−Ｈｉｓ、８−Ａｌａ、および９−Ｇｌｕのうち１つ以上の位置でＮメチル置換基を保有する、請求項６９に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７１】
ポリマ付着部位で水溶性ポリマと共有結合するＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体であって、前記ＧＬＰ−１部分は、ポリマ付着部位とは別の部位でグリコシル化される、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７２】
前記グリコシル化ＧＬＰ−１は、前記ＧＬＰ−１の１つ以上の部位に共有結合する単、二、または三糖類を保有する、請求項７１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７３】
前記単、二、または三糖類は、前記ＧＬＰ‐１部分の１つ以上の部位に共有結合し、前記１つ以上の部位はそれぞれ、Ｎ末端（Ｈｉｓ７）、Ａｌａ８、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｕ２１、Ｇｌｙ２２、Ｇｌｎ２３、Ｌｙｓ２６、およびＬｙｓ３４から選択される１つ以上の部位で自然発生するか、または置換される、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒのうちの１つを備える、請求項７１に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７４】
前記糖類は単糖類を備える、請求項７３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７５】
前記ＧＬＰ−１部分のＡｌａ８部位で置換される、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈのうちの１つと共有結合する単、二、または三糖類を保有する、請求項７３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７６】
前記糖類は、グルコース、マンノース、キシロース、マルトース、メリビオース、およびマルトトリオースから選択される、請求項７３に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７７】
Ｇｌｕ２１およびＧｌｎ２３のうちの１つまたは両方の位置で共有結合する単、二、または三糖類をさらに備える、請求項７３から７６のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項７８】
段階的な方法で成長ペプチド鎖を保護アミノ酸に接触させるステップを伴う、段階的な固相ペプチド合成によって生成されるグリコシル化およびＰＥＧ化したＧＬＰ−１複合体を備える組成物であって、前記保護アミノ酸のうちの少なくとも１つはグリコシル化され、続いてＰＥＧ化され、前記組成物は、少なくとも約９５％の単一種類のグリコシル化およびＰＥＧ化されたＧＬＰ−１複合体の純度を有する、組成物。
【請求項７９】
段階的な方法で、成長ペプチド鎖を保護アミノ酸に接触させるステップであって、前記保護アミノ酸のうちの少なくとも１つは、グリコシル化ＧＬＰ−１を形成するのに効果的な条件下で、接触させるステップの前にグリコシル化される、ステップと、
前記水溶性ポリマに付着するグリコシル化ＧＬＰ−１部分を備える前記グリコシル化ＧＬＰ−１ポリマ複合体を形成するのに効果的な接合条件下で、前記グリコシル化ＧＬＰ−１を水溶性ポリマ試薬に接触させるステップと、
を含む、グリコシル化ＧＬＰ−１ポリマ複合体を生成する方法。
【請求項８０】
前記成長ペプチド鎖を保護アミノ酸に接触させる前記ステップは、保護端を有する連結アミノ酸を形成するように、前記成長ペプチド鎖を保護アミノ酸に接触させるステップ、前記保護端を脱保護するステップ、および前記接触させるステップおよび脱保護するステップを繰り返すステップを備える、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記保護アミノ酸は、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）のうちの１つによって保護される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
下記の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体であって、
【化００６】
2009519961.tif 000090
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、約１から約１８原子の原子長を有するスペーサ部分であり、
【化００７】
2009519961.tif 000091
は、のイオン化水素原子Ｈαを持つ芳香族含有部分であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は、前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８３】
下記の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体であって、
【化００８】
2009519961.tif 000092
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、約１から約１８原子の原子長を有するスペーサ部分であり、
Ａｒ１は、第１の芳香族部分であり
Ａｒ２は、第２の芳香族部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は、前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８４】
下記の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体であって、
【化００９】
2009519961.tif 000093
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマであり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、約１から約１８原子の原子長を有するスペーサ部分であり、
Ａｒ１は、第１の芳香族部分であり、
Ａｒ２は、第２の芳香族部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は、前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８５】
下記の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体であって、
【化０１０】
2009519961.tif 000094
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマであり、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３はそれぞれ独立して、約１から約１８原子の原子長を有するスペーサ部分であり、
Ａｒ１は、第１の芳香族部分であり、
Ａｒ２は、第２の芳香族部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の前記−ＮＨ−は、前記ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す、ＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８６】
ＰＯＬＹ１およびＰＯＬＹ２のそれぞれは、ポリ（エチレングリコール）である、請求項８２〜８５のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８７】
各ポリ（エチレングリコール）は、約５００ダルトンから約４０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項８６に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８８】
Ｘ１およびＸ２は独立して、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１−３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１−３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、および−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−から選択される、請求項８２〜８５のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項８９】
Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＨである、請求項８２〜８５のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項９０】
Ｙ１はＯであり、Ｙ２はＯである、請求項８２〜８５のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体。
【請求項９１】
有効量の請求項８２〜８５のいずれかに記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体、および薬学的に許容される賦形剤を備える、医薬組成物。
【請求項９２】
請求項８２〜８５のいずれかに記載の複合体を患者に投与するステップを含む、ＧＬＰ−１ポリマ複合体を送達する方法。
【請求項９３】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、投与後約２時間から約３０時間に及ぶ時間で最小値に達する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項９４】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を経肺的に投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、肺投与後約２時間から約１２時間に及ぶ時間で最小値に達する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項９５】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を皮下投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、皮下投与後約２時間から約３０時間に及ぶ時間で最小値に達する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項９６】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、投与前の血糖の約２５％から約６０％に及ぶ最小値に達する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項９７】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者は投与後最大約１６０時間まで低下した血糖を有する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項９８】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を経肺的に投与するステップを含み、前記患者は肺投与後最大約６０時間まで低下した血糖を有する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項９９】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を経肺的に投与するステップを含み、前記患者は投与後、約１２６ｍｇ／ｄｌ未満の血糖値を有する、請求項２８に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１００】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、投与後約２時間から約３０時間に及ぶ時間で最小値に達する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１０１】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を経肺的に投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、肺投与後約２時間から約１２時間に及ぶ時間で最小値に達する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１０２】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を皮下投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、皮下投与後約２時間から約３０時間に及ぶ時間で最小値に達する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１０３】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者の前記血糖は、投与前の血糖の約２５％から約６０％に及ぶ最小値に達する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１０４】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者は投与後最大約１６０時間まで低下した血糖を有する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１０５】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記患者は肺投与後最大約６０時間まで低下した血糖を有する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【請求項１０６】
それを必要とする患者に前記医薬組成物を経肺的に投与するステップを含み、前記患者は投与後、約１２６ｍｇ／ｄｌ未満の血糖値を有する、請求項９１に記載の医薬組成物を送達する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年１２月１６日付申請の米国仮特許出願６０／７５１，１２１および２００５年１２月１６日付申請の米国特許出願第６０／７５１，０８２号の優先権の利益を主張し、その開示は、ここに参照により全体として組み込まれる。本願は、ここに開示全体を参照することで、２００５年６月１６日付申請の米国特許出願第６０／６９１，５１６号を明確に取り込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して医薬に関する。例としては、本発明は１つ以上の水溶性ポリマと共有結合しているＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）部分を備える複合体に関する。特に、本発明は、さらにＧＬＰ−１ポリマ複合体の合成方法、該複合体を備える組成物、およびＧＬＰ−１複合体の投与による患者の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
グルカゴン様ペプチド−１（以下、ＧＬＰ−１という）は、腸のＬ細胞が栄養素摂取を受けて排出するプログルカゴンから生成されるペプチドである（非特許文献１）。ＧＬＰ−１は、内分泌物として腸から吸収された炭水化物とともに、膵臓のベータ細胞からのインスリンの放出を促す役割をする。ＧＬＰ−１は、胃の酵母および食料摂取、およびβ細胞の増殖への刺激の両方の抑制を含む島ホルモンの分泌から独立した作用に働く。
【０００４】
注目に値すべきは、ＧＬＰ−１は、正常および糖尿病患者両方の血糖値を急速に低下する能力を保有することである。（非特許文献２、非特許文献３）６週間の人体を用いた研究で、天然ＧＬＰ−１を２型糖尿病患者（非特許文献４）に継続的に皮下注射したところ、血糖およびＨｂＡｕが著しく低下した。これらの結果に基づき、２型糖尿病などの治療用のＧＬＰ−１ベースの医薬剤開発に対して相当な関心が持たれている。
【０００５】
天然ＧＬＰ−１は、投与後に効果的に血糖を下げるが、治療薬としての実用性は、天然ＧＬＰ−１（アミノ酸１−３７）は活性が不十分であること、および２つの自然発生する不完全型、ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、はインビトロでの半減期が極端に短いという事実により、厳しい状態となっている。ＧＬＰ−１のインビトロ半減期が短い第１の理由は、ＮＨ２−末端開裂および酵素、ジペプチジル・ペプチド、ＤＰＰ−ＩＶ（非特許文献５）による不活性化である。
【０００６】
ＧＬＰ−１のインビトロにおけるＤＰＰ−ＩＶによる急速な開裂を回避する様々な試みが検討されてきた。例えば、開裂を減衰するためにＧＬＰ−１のＤＰＰ−ＩＶに対する親和性を下げることを目的として、１つ以上のアミノ酸置換基を有するＧＬＰ−１アナログが調合された（非特許文献６、非特許文献７）。同様に、自然発生のトカゲのペプチドであるエキセンディン−４は、ＤＰＰ−ＩＶ介在開裂を削減し、ＧＬＰ−１より長い作用持続時間を保有する良く効くＧＬＰ−１Ｒ作用薬が発見された（非特許文献８、非特許文献９）。改変されたＮ末端、リジン−３４でアシル化されたオクタン酸、および位置２６でのアルギニン酸の置換を含むいくつかの改変点を有するＧＬＰ−１アナログが有するように（非特許文献１０）、短い共有化学リンカーを有し、投与後にアルブミンの特定のシステイン残基と相互に作用するよう設計されたＧＬＰ−１誘導体も開発された（非特許文献１１）。さらに、ポリエチレングリコールとＧＬＰ−１の安定した共有結合が説明された（例えば、特許文献１を参照）。
【０００７】
天然ＧＬＰ−１と比較して、改善された治療性を有するＧＬＰ−１組成物を説明するために、その他の様々な取り組みが出現しているが、従来のＧＬＰ−１ベースの治療薬に対して、さらなる治療効果をもたらす改善されたＧＬＰ−１組成物の需要は未だに存在する。従って、さらに効果的なＧＬＰ−１部分ポリマ複合体を提供する技術の必要性が依然として存在する。特に、本発明の１つ以上の実施形態は、複合体および複合体を備える組成物、ここに記載される関連方法を対象としている。
【特許文献１】国際公開第０４／０９３８２３号パンフレット
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１５９−１６９，１９９８
【非特許文献２】Ｇｕｔｎｉａｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２６：１３１６−１３２２，１９９２
【非特許文献３】Ｎａｕｃｋ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１：３０１−３０７，１９９３
【非特許文献４】Ｚａｎｄｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：８２４−８３０，２００２
【非特許文献５】Ｋｉｅｆｆｅｒ  ＴＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３５８５−３５９６，１９９５
【非特許文献６】Ｄｒｕｃｋｅｒ  ＤＪ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ７：１３９９−１４１２，２００１
【非特許文献７】Ｄｒｕｃｋｅｒ  ＤＪ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２２：５３１−５４４，２００２
【非特許文献８】Ｙｏｕｎｇ，ＡＡ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１０２６−１０３４，１９９９
【非特許文献９】Ｅｄｗａｒｄｓ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｉｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２８１：Ｅ１５５−１６１，２００１
【非特許文献１０】Ｃｈｏｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，８６（７），７６８−７７３，２０００
【非特許文献１１】Ｋｉｍ，ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２，７５１，２００３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
従って、本発明は、ＧＬＰ−１複合体を提供する。本発明のその他の特徴および効果は、以下の発明の明細書に説明され、当該明細から明らかになる、または本発明の実施から分かる。本発明は、特にこれに関する明細書および特許請求の範囲で指摘される組成物および方法により実現および達成される。
【０００９】
本発明の１つの側面は、Ｎ末端で水溶性ポリマに解放可能に付着したＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象としている。
【００１０】
本発明の別の側面は、少なくとも、モノポリマ複合体の１つがＧＬＰ−１部分のＮ末端に共有結合している水溶性ポリマを保有しているＧＬＰ−１部分に解放可能に付着した単体水溶性ポリマを有する、ＧＬＰ−１モノポリマ複合体の位置異性体の混合体の有効量を備える医薬組成物を対象としている。
【００１１】
さらに、本発明の別の側面は、少なくとも、少なくとも１つのＧＬＰ−１ポリマ複合体がＮ末端でＧＬＰ−１部分に解放可能に付着している水溶性ポリマを保有している、ＧＬＰ−１ポリマ複合体の混合体の有効量を備える医薬組成物を対象としている。
【００１２】
本発明の別の側面は、ＧＬＰ−１ポリマ複合体の調合方法を対象とし、当該方法は、加水分解可能結合を形成するのに適したアミノ反応性官能基を備える水溶性ポリマ試薬とＧＬＰ−１部分の接触を備え、接続条件下では、ＧＬＰ−１部分のＮ末端アミノ基と水溶性ポリマ試薬のアミノ反応性官能基との反応の促進に効果的であり、その結果、水溶性ポリマにＮ末端で解放可能に付着したＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体が形成される。
【００１３】
本発明の別の側面は、ＧＬＰ−１を用いる治療に奏功する哺乳類患者の状態を取り扱う方法を対象とし、該方法は、患者への投与を備え、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、水溶性ポリマに解放可能に付着したＧＬＰ−１部分を備え、該複合体は、投与前の生物活性が不足しており、それにより、投与の結果、ＧＬＰ−１部分は該複合体から解放され、長期間に渡って患者の血糖値を下げるのに効果的であることが天然ＧＬＰ−１に見られる。
【００１４】
さらに、本発明の別の側面は、水溶性ポリマと共有結合しているＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象とし、該ＧＬＰ−１部分は、Ｎメチル置換基を保有している。
【００１５】
本発明のまた別の側面は、ポリマ付着部位で水溶性ポリマと共有結合しているＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象とし、該ＧＬＰ−１部分は、ポリマ付着部位から離れた部位でグリコシル化されている。
【００１６】
本発明の別の側面は、成長ペプチド鎖と保護アミノ酸を段階的なやり方で接触させることを必要とする段階的な固相ペプチド合成により生成されたグリコシル化されＰＥＧ化されたＧＬＰ−１複合体を備える組成物を対象とし、少なくとも該保護アミノ酸はグリコシル化され、続いてＰＥＧが付加され、該組成物は、少なくとも約９５％の１種類のグリコシル化されＰＥＧ化されたＧＬＰ−１複合体の純度を有する。
【００１７】
さらに、本発明の別の側面は、グリコシル化されたＧＬＰ−１ポリマ複合体の生成方法を対象とする。該方法は、グリコシル化されたＧＬＰ−１を形成するのに効果的な条件下で、成長ペプチド鎖と、少なくとも１つの保護アミノ酸は接触前にグリコシル化されている保護アミノ酸を段階的なやり方で接触させることを含む。前期方法は、水溶性ポリマに付着したグリコシル化されたＧＬＰ−１部分を備える該グリコシル化されたＧＬＰ−１ポリマ複合体を形成するのに効果的な共役条件下で、グリコシル化されたＧＬＰ−１と水溶性ポリマ試薬を接触させることも含む。
【００１８】
本発明のまた別の側面は、以下の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象とする。
【００１９】
【化０１１】
2009519961.tif 000003
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２水溶性ポリマであり、
Ｘ１およびＸ２は、約１から約１８原子の１原子長をそれぞれに独立して有するスペーサ部分であり、
【００２０】
【化０１２】
2009519961.tif 000004
は、１つのイオン化水素原子を持つ芳香族含有部分であり、
Ｈαは、
Ｒ１は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、および
−ＮＨ−ＧＬＰ−１は、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の−ＮＨ−は、ＧＬＰ−１部分のアミノ基を示すＧＬＰ−１部分である。
【００２１】
さらに、本発明の別の側面は、以下の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象とする。
【００２２】
【化０１３】
2009519961.tif 000005
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２水溶性ポリマであり、
Ｘ１およびＸ２は、約１から約１８原子の１原子長をそれぞれに独立して有するスペーサ部分であり、
Ａｒ１は、第１芳香族部分であり、
Ａｒ２は、第１芳香族部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、および
−ＮＨ−ＧＬＰ−１は、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の−ＮＨ−は、ＧＬＰ−１部分のアミノ基を示すＧＬＰ−１部分である。
【００２３】
本発明の別の側面は、以下の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象とする。
【００２４】
【化０１４】
2009519961.tif 000006
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２水溶性ポリマであり、
Ｘ１およびＸ２は、約１から約１８原子の１原子長をそれぞれに独立して有するスペーサ部分であり、
Ａｒ１は、第１芳香族部分であり、
Ａｒ２は、第１芳香族部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、および
−ＮＨ−ＧＬＰ−１は、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の−ＮＨ−は、ＧＬＰ−１部分のアミノ基を示すＧＬＰ−１部分である。
【００２５】
本発明のまた別の側面は、以下の構造を有するＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象とする。
【００２６】
【化０１５】
2009519961.tif 000007
式中、
ＰＯＬＹ１は、第１水溶性ポリマであり、
ＰＯＬＹ２は、第２水溶性ポリマであり、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、約１から約１８原子の１原子長をそれぞれに独立して有するスペーサ部分であり、
Ａｒ１は、第１芳香族部分であり、
Ａｒ２は、第１芳香族部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、および
−ＮＨ−ＧＬＰ−１は、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の−ＮＨ−は、ＧＬＰ−１部分のアミノ基を示すＧＬＰ−１部分である。
【００２７】
従って、１つの側面では、本発明は、ＧＬＰ−１部分を備える拡張送達組成物を提供する。本発明の複合体および組成物は、生インビトロ外において一般的に拡張解放特性を保有する。ここに提示された動物モデルインビトロデータは、本発明のＧＬＰ−１複合体が、血流中で天然ＧＬＰ−１より長い循環半減期を保有可能であることを示唆し、従って、天然ＧＬＰ−１の治療の為の投与に関連するいくつかの障害は、その迅速除去により克服される。
【００２８】
従って、ここに記載される複合体および組成物は、投薬頻度を天然ＧＬＰ−１より減らす手助けをする可能性がある。
【００２９】
例えば、１つ以上の実施形態では、本発明のＧＬＰ−１ポリマ複合体は、解放可能、例えば分解処理による、例えばＧＬＰ−１部分の解放に効果的である。当該解放可能な複合体は、ＧＬＰ−１部分と水溶性ポリマ間に、加水分解可能結合のような、少なくとも１つの分解可能な連結を備えるであろう。
【００３０】
１つ以上の実施形態では、水溶性ポリマは、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリ）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル）、ポリ（糖類）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびコポリマおよびターポリマで構成される基から選択される。
【００３１】
一部の好ましい実施形態では、水溶性ポリマは、ポリエチレングリコールである。
【００３２】
本発明のＧＬＰ−１ポリマ複合体は、１つおよび２つから選択されたＧＬＰ−１部分の多数の部位に解放可能に付着したポリエチレングリコールのような、少なくとも１つの追加水溶性ポリマをさらに備えていてもよい。このようなＧＬＰ−１部分の典型的な部位には、特にＬｙｓ２６およびＬｙｓ３４が含まれる。
【００３３】
１つ以上の実施形態では、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、水溶性ポリマ、例えばＧＬＰ−１部分１部位に解放可能に付着したポリエチレングリコールを保有する。
【００３４】
さらに１つ以上の実施形態では、水溶性ポリマは、ＧＬＰ−１部分に、カルバメート、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエステル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、および炭酸塩から選択された加水分解可能連結を備えるリンカーを介して解放可能に付着している。特に好ましい連結には、カルバメート、カルボン酸エステル、炭酸塩が含まれる。
【００３５】
さらに１つ以上のさらなる実施形態では、本発明のＧＬＰ−１複合体は、例えば、加水分解可能連結を介してＰＥＧのような水溶性ポリマに解放可能に付着したＧＬＰ−１部分を備え、それらは、体外またはインビトロのいずれかで起こる加水分解において、復号していないＧＬＰ−１部分は解放される。当該複合体の加水分解可能な性質により、本発明のＧＬＰ−１複合体は、生物活性であってもなくてもよい。
【００３６】
よって、１つ以上の実施形態では、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、複合体が実質的に生物活性を欠くがなおも効果的である場合で、それを必要とする哺乳類対象にインビボで投与される時に提供され、血糖低下効果を提供する。そのような血糖低下は、投与の後のＧＬＰ−１部分の解放によって達成される。
【００３７】
１つ以上の実施形態では、水溶性ポリマは、約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンなどの、約５００ダルトンから約８０，０００ダルトンに及ぶ分子量を有する。
【００３８】
さらに１つ以上の付加的実施形態では、水溶性ポリマは、線状、分岐、二股、および多腕の構造を有する。
【００３９】
さらに１つ以上のさらなる実施形態では、ＧＬＰ−１部分はグリコシル化している。
【００４０】
好ましい実施形態では、グリコシル化ＧＬＰ−１は、そのアミノ酸部位の１つ以上に共有結合する単、二、または三糖類を保有する。例えば、単、二、または三糖類は、ＧＬＰ‐１部分の１つ以上の部位に共有結合することができ、その場合、１つ以上の部位は、Ｎ末端（Ｈｉｓ７）、Ａｌａ８、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｕ２１、Ｇｌｙ２２、Ｇｌｎ２３、Ｌｙｓ２６、およびＬｙｓ３４から選択される１つ以上の部位で自然発生するか、または置換される、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒのうちの１つを備える。
【００４１】
さらに１つ以上の付加的実施形態では、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、ＧＬＰ−１部分のＡｌａ８部位で置換される、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒのうちの１つと共有結合する単、二、または三糖類を保有する。実例となる糖類は、グルコース、マンノース、キシロース、マルトース、メリビオース、およびマルトトリオースを含む。そのようなＧＬＰ−１ポリマ複合体は、Ｇｌｕ２１およびＧｌｎ２３のうちの１つまたは両方の位置で共有結合する単、二、または三糖類をさらに備えることができる。
【００４２】
さらに１つ以上のさらなる実施形態では、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、ＧＬＰ−１部分の７−Ｈｉｓ、８−Ａｌａ、および９−グルタミン酸のうちいずれか１つ以上の位置でＮメチル置換基を保有する。
【００４３】
１つ以上の実施形態では、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は下記の構造を保有し、
【００４４】
【化０１６】
2009519961.tif 000008
式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマであり、ＬＤは、例えば加水分解性結合などの分解性結合であり、ｋは、ポリマセグメント（ＰＯＬＹ−ＬＤ）が共有結合するＧＬＰ−１上の反応部位の数に対応する。ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分である。ポリマセグメントのそれぞれは独立して選択されるが、典型的に、ＧＬＰ−１部分に共有結合するポリマセグメントのそれぞれは同一である。典型的に、ｋは約１から約４に及び、すなわち、１、２、３、および４から成る群より選択される。しばしば、ｋは１、２、または３である。一部の特定の実施形態では、ｋは１である。さらに１つ以上のさらなる実施形態では、ＬＤは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。
【００４５】
概して、ＬＤは、約１から約２０原子、約２から約１５原子、または約３から約１０原子などの長さを保有する。すなわち、典型的に、ＬＤは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０から成る群より選択される全体的な原子長を有する。
【００４６】
１つ以上の特定の実施形態では、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は下記の構造を保有し、
【００４７】
【化０１７】
2009519961.tif 000009
式中、ｍＰＥＧはＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−であり、
ｎは、１０から１，８００に及び、
ｐは、１から８に及ぶ整数であり、
Ｒ１は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは低アルキル基であり、
Ａｒは、二環式または三環式芳香族などの芳香族炭化水素であり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、約１から約１８原子の原子長を有するスペーサ部分であり、
−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の−ＮＨ−は、ＧＬＰ−１部分のアミノ基を表す。
【００４８】
先行の構造を参照して、１つ以上の具体的実施形態では、ｐは１であり、Ｒ１およびＲ２は両方ともＨである。さらに１つ以上の代替実施形態では、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、少なくとも１つのアミド結合を備える。さらに１つ以上の付加的実施形態では、Ｘ１およびＸ２は同一である。
【００４９】
先行の構造を参照して、Ｘ１およびＸ２は、ある実施形態では、それぞれ独立して、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−、および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択される構造を保有することができ、式中、ｑは２、３、４、および５から選択される。さらに１つ以上のさらなる実施形態ではＡｒは、ペンタレン、インデン、ナフタレン、インダセン、アセナフチレン、およびフルオレンから選択される。
【００５０】
本発明の実例となるＧＬＰ−１ポリマ複合体は、
【００５１】
【化０１８】
2009519961.tif 000010
という解放可能な複合体を含む。
【００５２】
さらに１つ以上の付加的実施形態では、本発明の解放可能なＧＬＰ−１ポリマ複合体は下記の一般化構造を保有し、
【００５３】
【化０１９】
2009519961.tif 000011
式中、ＬＤ１は−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−のいずれかであり、Ａｒ１は芳香族基であり、−ＮＨ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１部分であって、−ＮＨ−ＧＬＰ−１の−ＮＨ−はＧＬＰ−１部分のアミノ基を表し、ｋは１、２、および３から選択される。このましくは、Ａｒ１は、オルト、メタ、およびパラ置換フェニルから選択される。この種類の例示的な複合体は、
【００５４】
【化０２０】
2009519961.tif 000012
を含む。
【００５５】
さらに１つ以上の付加的実施形態では、本発明のＧＬＰ−１ポリマ複合体は下記の構造によって特徴付けられ、
【００５６】
【化０２１】
2009519961.tif 000013
式中、ｎは約１０から約１，８００に及ぶ。
【００５７】
１つ以上の関連実施形態では、ＧＬＰ−１部分は、７−Ｈｉｓ、８−Ａｌａ、および９−Ｇｌｕのうちいずれか１つ以上の位置でＮメチル置換基を保有する。
【００５８】
また本発明の一部を形成するのは、例えば、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた、本明細書で説明されるＧＬＰ−１ポリマ複合体のうちのいずれか１つ以上を備える医薬品組成物である。
【００５９】
１つ以上の実施形態では、医薬組成物は、ＧＬＰ−１複合体に加えて、インスリンおよび／または基礎インスリンを備える。
【００６０】
さらに１つ以上の代替実施形態では、医薬組成物は、ＧＬＰ−１複合体に加えて、ＧＬＰ−１を備える。
【００６１】
好ましい組成物は、非経口または肺投与に適しているものを含む。
【００６２】
１つ以上の実施形態では、本発明の医薬組成品は乾燥粉末形である。
【００６３】
１つ以上の特定の実施形態では、上記の組成物は、イミダゾール窒素におけるＨｉｓ７の側鎖でＧＬＰ−１部分に、解放可能に、または安定的のいずれかで共有結合する水溶性ポリマを有するＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える。
【００６４】
上記のように、ある側面では、本発明は、ＧＬＰ−１ポリマ複合体を調製するための方法を提供する。ある実施形態では、該方法は、ＧＬＰ−１ポリマ複合体を分離するステップをさらに含む。
【００６５】
さらに１つ以上の付加的実施形態では、該方法は、ＧＬＰ−１ポリマ複合体を精製するステップをさらに含む。例えば、精製するステップは、クロマトグラフィまたは膜分離によることが可能である。
【００６６】
該方法の１つ以上の実施形態では、接触させるステップで採用されるＧＬＰ−１部分は、保護ε−アミノリジンを備える。
【００６７】
さらに関連実施形態では、該方法は、接触させるステップの後で、ＧＬＰ−１ポリマ複合体の保護ε−アミノリジンを脱保護するステップをさらに含む。
【００６８】
さらに代替実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＧＬＰ−１ポリマ複合体を備えるエアゾール化組成物である。
【００６９】
上記のように、ある側面では、本発明は、それを必要とする哺乳類対象にＧＬＰ−１ポリマ複合体を送達するための方法を提供する。本発明の本側面の１つ以上の関連実施形態では、投与するステップは、皮下および吸入から選択される経路による。
【００７０】
さらに１つ以上のさらなる実施形態では、投与するステップは吸入により、ＧＬＰ−１ポリマ複合体はエアゾール化形状である。
【００７１】
さらに別の側面では、本発明は、それを必要とする哺乳類対象にＧＬＰ−１部分を送達するための方法を提供し、その場合、該方法は、治療的有効量のＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象に経肺的に投与するステップを含む。
【００７２】
さらに別の側面では、哺乳類対象にＧＬＰ−１部分を送達するための方法を本明細書で提供する。該方法は、エアゾール化組成物を形成するように、ＧＬＰ−１ポリマ複合体を備える医薬品組成物をエアゾール化するステップ、および吸引によって、対象の肺にエアゾール化組成物を投与するステップを含む。
【００７３】
さらに別の側面では、ＧＬＰ−１による治療に反応する哺乳類対象における症状を治療するための方法を提供する。該方法は、水溶性ポリマに解放可能に付着するＧＬＰ−１部分を備えるＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象に投与するステップを含み、複合体は投与するステップの前に生物活性が不足しており、それにより、投与するステップの結果、ＧＬＰ−１部分は複合体から解放され、天然ＧＬＰ−１に対して観察されるよりも長い期間にわたって、対象の血糖値の低下を結果としてもたらすのに効果的である。
【００７４】
さらに別の側面では、本明細書において、治療的有効量のＧＬＰ−１ポリマ複合体を対象に投与するステップを含み、それによって、投与後少なくとも約８時間の長期間にわたって対象の低下した血糖値を生じる、それを必要とする哺乳類対象の血糖値を下げるための方法を提供する。
【００７５】
１つ以上の関連実施形態では、該方法は、そのような対象にＧＬＰ−ポリマ複合体を投与するステップを含み、投与時に、複合体は数日の期間（例えば、２〜７日、２〜６日、３から６日、３〜４日）にわたって加水分解され、それによってＧＬＰ−１を血流内に解放する。例えば加水分解可能な、解放可能な複合体は、ある実施形態では、約４８時間を越える長時間（例えば、約１〜３日くらい、または約１〜２．５日くらい）にわたって血糖値を下げるのに効果的である。
【００７６】
また、本明細書において、哺乳類対象の肺に送達される薬剤の調製のための、ＧＬＰ−１複合体の使用であって、送達は、糖尿病の治療のために、対象の肺に沈着し、かつそこから吸収するために吸入によって薬剤を投与するステップを備える、使用を提供する。
【００７７】
本発明はさらに、哺乳類対象におけるＧＬＰ−１受容体を刺激する方法をさらに包含する。該方法は、治療的有効のＧＬＰ−１複合体を対象に投与するステップを含む。該方法は、非インスリン依存性糖尿病、ストレス誘導性高血糖症、肥満、胃および／または腸運動、または排尿障害から選択される症状を有する対象を治療するために使用することができる。
【００７８】
本明細書で説明される本発明の特徴のそれぞれは、特に指示がない限り、本明細書で説明されるようなそれぞれの、およびあらゆる実施形態に平等に該当するよう意図されている。
【００７９】
本発明の付加的物体、利点、および新規の特徴は、以下の説明で説明され、ある程度、以下を読めば当業者にとって明白となり、または、本発明の実践によって知ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
（発明の説明）
本発明の１つ以上の実施例を詳細に説明する前に、本発明は、変化する場合のあるものとして、特定のポリマ、合成技法、ＧＬＰ−１部分などに限定されないことを理解されたい。
【００８１】
特に明記しない限り、化合物または成分の参照は、それ自体によって、ならびに化合物の混合物など、その他の化合物または成分組み合わせた、化合物または成分を含む。
【００８２】
本明細書および請求項で使用されるように、「１つの」、および「該」という単数形は、文脈が明らかに指示しない限りは、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、「１つのポリマ」の参照は、単一ポリマ、ならびに２つ以上の同一、または異なるポリマを含み、「１つの薬学的に許容される賦形剤」の参照は、単一の薬学的に許容される賦形剤、ならびに２つ以上の同一、または異なる薬学的に許容される賦形剤などを含む。
【００８３】
本発明の記載および主張では、背後の定義に基づく以下の専門用語が使用される。
【００８４】
本明細書に記載される「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」および「ポリ（エチレングリコール）」は、ｉＮｔｅｒに変換可能である。通常、本発明に基づく用途に用いられるＰＥＧは、（ｎ）は２から４０００である「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−」構造を備える。本明細書で使用されるように、ＰＥＧは、末端酸素が置換されたどうかに応じて、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」および「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」も含む。ＰＥＧが、そこに共有結合しているスペーサ部分またはリンカーをさらに含み（以下に、より詳細に記載される）、スペーサ部分またはリンカーを備える原子が、ＰＧＥに共有結合している場合、酸素・酸素結合（例えば、「−Ｏ−Ｏ」または過酸化連結）という形成にはならない。本明細書および特許請求の範囲を通して、「ＰＥＧ」という用語は、様々な末端または「エンドキャッピング」基を有する構造を含むことを念頭においておかなければいけない。用語「ＰＥＧ」は、大部分、すなわち、５０％より多くが−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−繰返しサブユニットからなるポリマも意味する。特定の形態に関しては、ＰＥＧは構造または「分岐」、「線状」、「叉状」、「多官能」等の配置だけでなく様々な分子量を取ることが可能である。
【００８５】
本明細書に記載される用語「エンドキャップト」および「末端キャプト」は、エンドキャッピング部分を有するポリマの末端またはエンドポイントを示すのに同義的に使用される。必ずではないが、一般的に、エンドキャッピング部分は、水酸基またはＣ１−１０アルコキシ基またはＣ１−５アルコキシ基のようなＣ１−２０アルコキシ基を備える。従って、エンドキャッピング部分の例は、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロ等はもちろん、アルコキシ（例えば、メトキシ基、エトキシル基）、ベンジルオキシを含む。エンドキャッピング部分は、ポリマの中に１つ以上の末端単量体の原子を含んでいてもよい（例えば、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−内のエンドキャッピング部分である「メトキシ基」）。併せて、上記のそれぞれの飽和、不飽和、置換および非置換形態が想定される。さらに、エンドキャッピング基は、シランでもよい。エンドキャッピング基は、検出可能なラベルを有利に備えることができる。ポリマが検出可能なラベルを備えるエンドキャッピング基を有するとき、ポリマおよび／またはポリマの結合部分（例えば、活性物質）の量および／または位置は、適切な検出器を使用して確定することができる。ラベルには制限がなく、蛍光剤、化学発光物質、酵素標識に使用される部分、比色部分（例えば、色素）、金属イオン、放射性部分などが含まれる。適切な検出器には、光度計、フィルム、分光計等が含まれる。
【００８６】
本明細書に記載されるポリマに関する「非自然発生」は、全体として自然界で見られないポリマ、例えば、合成のポリマを意味する。非自然発生するポリマは、非自然発生するポリマは、全体のポリマ構造が自然界で見られない限り、１つ以上のモノマーまたは自然発生するモノマーのセグメントを備えている場合もある。
【００８７】
「水溶性ポリマ」にあるような「水溶性」という用語は、室温で水に溶解するすべてのポリマを意味する。水溶性ポリマは、２５℃の水に対して１％（ｗ／ｖ）以上の溶解度を有する。一般的に、水溶性ポリマは、少なくとも約７５％、例としては、少なくとも約９５％のろ過後の同一溶液から伝達された光を伝達する。重量ベースでは、水溶性ポリマは、多くの場合、２５℃で少なくとも約３５％（ｗ／ｖ）水に溶ける、例としては、少なくとも約５０％（ｗ／ｖ）水に溶ける、少なくとも約７０％（ｗ／ｖ）水に溶ける、または少なくとも約８５％（ｗ／ｖ）水に溶ける。一般的に、水溶性ポリマは、少なくとも約９５％（ｗ／ｖ）または完全に水に溶ける。
【００８８】
例えば「親水性ポリマ」関する「親水性」は、水に対する溶解度および融和性を特徴とするポリマを示す。交差結合されていない形態においては、親水性ポリマは水に溶解可能である、または水に溶解される。一般的に、親水性ポリマは、炭素および水素から構成されるポリマ基幹を保有し、通常主ポリマ基幹またはポリマ基幹間で置換されたペンデント基の酸素比率は高く、その結果、「水を好む」性質を持つ。本発明の水溶性ポリマは、一般的に親水性、例えば、非自然発生する親水性のポリマである。
【００８９】
ＰＥＧなどの水溶性ポリマ関連の分子量は、数平均分子量または重量平均分子量のどちらかで表される。指示がない限り、本明細書の分子量は、重量平均分子量を示す。両分子量、数平均および重量平均の測定は、ゲル透過クロマトグラフィックまたはその他の液体クロマトグラフィック技術を使用して測定することができる。数平均分子量の測定に末端基分析または束一性の測定（例えば、凝固点降下、沸点上昇、または浸透圧）、または重量平均分子量の測定に光散乱法、超遠心分離法、または粘度測定など、分子量値を測定するその他の方法も使用可能である。本発明のポリマは、一般的に、多分散系（例えば、ポリマの数平均分子量および重量平均分子量は等しくない）であり、１．２未満、１．１５未満、１．１０未満、１．０５未満、１．０３未満のように多分散性値は低い。本明細書では、基準値は、重量平均分子量または数平均分子量のいずれかを有する単一水溶性ポリマに対して基準が設けられるときもあり、該基準は、単一水溶性ポリマは、規定の分子量を有する水溶性ポリマの構成から取得されたことを意味すると理解される。
【００９０】
特定の官能基と併せて、用語「活性化する」または「活性化した」が使用される場合、他の分子の求電子物質または求核試薬と容易に反する反応性官能基を示す。触媒または反応に非常に非現実的な反応条件（例えば、「反応しない」または「不活性」基）を必要とする基とは対照的である。
【００９１】
本明細書に記載される用語「官能基」またはそのすべての同意語は、非保護形態同様にその保護形態を含むことを意図する。
【００９２】
本明細書で使用されている用語「スペーサ部分」、「連結」または「リンカー」は、原子またはポリマの末端とＧＬＰ‐１部分、またはＧＬＰ−１部分の求電子物質または求核試薬などの相互接続部分の結合に使用される原子の集合体を示す。スペーサ部分は加水分解に安定な場合、または生理学的に加水分解可能または酵素による分解が可能な連結を含んでいる場合もある。
【００９３】
「アルキル」は、炭化水素鎖を示し、一般的に、原子長は１から１５の範囲である。炭化水素鎖は、多くの場合、飽和状態である必要はなく、分岐または直線鎖でもよい。直線鎖は、典型的。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピール、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピール、１−メチルペンチルなどが含まれる。本明細書に記載される「アルキル」には、シクロアルキルおよびシクロアルキレンを含有するアルキルが含まれる。
【００９４】
「低級アルキル」は、１から６個の炭素原子を含有するアルキル基を示し、直線鎖または分岐を示す場合もある。低級アルキルの限定されない例には、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、およびｔ−ブチルが含まれる。
【００９５】
「シクロアルキル」は、３から１２個の炭素原子または３から約８個の炭素原子から構成されているような架橋、溶融、またはスピロ乾式化合物を含む飽和または不飽和の環状炭化水素鎖を示す。「シクロアルキレン」は、環式環系内のどれでも２つの炭素の鎖を結合することでアルキル鎖に挿入されたシクロキアル基を示す。
【００９６】
「アルコキシ」は、ＲはアルキルまたはＣ１−６アルキル（例えば、メトキシ基、エトキシル基、プロピールオキシなど）のような置換アルキルＯ−Ｒ基を示す。
【００９７】
例えば「置換アルキル」のようなここでいう「置換」は、１つ以上の非干渉置換基を有するアリール、例えばアルキル、シクロプロピール、シクロブチルなどのＣ３−８シクロアルキル、フルオロ、クロロ、臭素、およびヨードなどのハロ、シアノ、アルコキシ、低級フェニル、置換フェニルなどだが、限定はされない。「置換アニール」は、１つ以上の非干渉置換基を有するアリールである。フェニル環上の置換に関しては、置換基はいかなる幾何学的配置にもなりえる（オルト、メタ、またはパラ）。
【００９８】
「非干渉置換基」は、分子内に存在するとき、一般的に、分子内に含まれている他の官能基とは非反応性の基である。
【００９９】
「アリール」は、それぞれに５または６個の核を有する炭素原子を１つ以上有する芳香環を意味する。アリールには、ナフチルなどの融解した、またはビニフェルなどの未融解の複数のアリール環が含まれる。アリール環は、１つ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール、または複素環に融解する場合も融解しない場合もある。本明細書に記載される「アリール」は、ヘテロアリールおよびヘテロ環を含む。
【０１００】
「ヘテロアリール」は、硫黄、酸素、または窒素、またはそれらの結合のような１から４個のヘトロアトムを含有するアリール基である。ヘテロアリール環は１つ以上の環状炭化水素、複素環、アリールまたはヘテロアリール環と融合している場合もある。本明細書に記載の「ヘテロアリール」には、置換ヘテロアリールが含まれる。
【０１０１】
「ヘテロ環」または「複素環」は、５から７個の原子のような、飽和または不飽和の、少なくとも１つの炭素ではない環原子を有する、５から１２個の原子の環を意味する。ヘテロアトムは、硫黄、酸素、および窒素を含むが、これだけに限定されない。本明細書に記載される「ヘテロ環」には、置換ヘテロ環が含まれる。本明細書に記載の「ヘテロアリール」には、置換ヘテロアリールが含まれる。
【０１０２】
この「置換ヘテロアリール」は、１つ以上の置換基としての非干渉基を有する。
【０１０３】
「置換ヘテロ環」は、非干渉置換基から形成される１つ以上の側鎖を有するヘテロ環である。
【０１０４】
本明細書に記載される「有機基」は、アルキル、置換アルキル、アリール、および置換アリールを含んでいなければいけない。
【０１０５】
「求電子物質」および「求電子基」は、イオンまたは原子、またはイオンの場合もある原子の集合体を示し、求電子中心、すなわち電子を求める中心を有し、求核試薬と反応する。
【０１０６】
「求核試薬」および「求核群」は、イオンまたは原子、またはイオンの場合もある原子の集合体を示し、求核中心、すなわち求電子中心を求める、または求電子物質と反応する中心を有する。
【０１０７】
「加水分解可能な」または「加水分解型」連結または結合は、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）。例には、ｐＨ８、２５℃で約３０分未満という加水分解性を有する結合が含まれる。結合が水中に加水分解する傾向は、一般的な２つの任意の原子を連結種類だけでなく、２つの任意の原子を接続している連結の種類だけでなく、その任意の原子に付着している置換基にも左右される。加水分解に安定または加水分解が可能な連結には、カルバメート、カルボン酸エステル（本明細書では、単に「エステル」と呼ばれる）、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシロキシアルキルエテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドが含まれるが、これだけに限定されない。加水分解連結には、全体を参照することにより本明細書に盛り込まれているＷＯ  ２００５／０９９７６８で開示されたような活性化基を脱マスキングした後にのみ担体基の開裂が起こる連結を含まない。つまり、加水分解連結には、カスケード開裂メカニズムに基づく連結は含まれない。
【０１０８】
例えば、水溶性ポリマに解放可能に付着したＧＬＰ−１部分に関する「解放可能に付着した」は、上記に定義されたように加水分解連結を含むリンカーを介して共有結合し、加水分解においてＧＬＰ−１部分が解放されるＧＬＰ−１部分を示す。上記の解放されたＧＬＰ−１部分は、一般的に未改変の親または天然、または一般的に水溶性ポリマの不完全な開裂による約８個以下の原子の短い有機標識を保有するわずかに改変されたＧＬＰ−１部分に対応する。未改変の親ＧＬＰ−１部分が解放されることが望ましい。水溶性ポリマがＧＬＰ−１部分を含むまたはアリール基を備えるリンカーを介してＧＬＰ−１部分と共有結合している場合、ＧＬＰ−１部分の解放は、１，４−および１，６−脱離段階を伴わないメカニズムを介して起こる。
【０１０９】
「酵素による分解が可能な結合」は、１つ以上の酵素による分解が起こりやすい連結を意味する。
【０１１０】
「加水分解に安定な」連結または結合は、化学結合、一般的には、水中で大いに安定している、すなわち、生理学的条件下では、いかに長い時間を経ても加水分解が起こらない共有結合を意味する。加水分解に安定な連結の例には、炭素炭素結合（脂肪族鎖など）、エテル、アミド、ウレタンなどが含まれるが、これに限定されない。一般的に、加水分解に安定な連結は、生理学的条件下で、１日当たり１−２％未満の加水分解率を示す。典型的な化学結合の加水分解率は多くの標準化学テキストに見られる。
【０１１１】
「薬学的に許容される賦形剤」は、任意の組成物に含まれている場合があり、患者に投与する際に重大な悪性の毒性効果を与えない賦形剤を示す。
【０１１２】
「医薬組成物」は、医薬目的に役立つ組成物である。
【０１１３】
本明細書では、「有効量」とは治療的有効量および予防に効果的な量の両方を補う量を指す。
【０１１４】
本明細書では、「治療的有効量」とは望ましい治療結果を達成するための効果的な量のことを指す。例えば、糖尿病を治療または改善するための医薬組成物の有効量とは、糖尿病の症状を十分に緩和または解消する量であり、例えば、血糖を下げる結果になる血流の望ましいインスリンレベルをもたらす為に必要な量である。与えられた医薬組成物の薬学的に有効な量は、組成物における動的要素の性質、投与の経路、組成物を受ける動物の大きさおよび種類、および投与の目的などの因子によって異なる。適切な量は、本明細書で記載される文献および情報において当業者がたやすく決定できるものである。
【０１１５】
本明細書では、「予防的有効量」とは望ましい予防的結果を達成するための効果的な量を指す。なぜなら予防線量は、発症年齢に先立って患者に投与されるため、予防的有効量は一般的には治療的有効量未満である。
【０１１６】
「多官能」とは、ポリマが３つ以上の官能基を含有していることを意味し、そこでは官能基は同一のものであってもよく、異なるものであっても良い。多官能ポリマ試薬は一般的にはポリマ骨格の中に、約３〜１００の官能基、または３〜５０の官能基、または３〜２５の官能基、または３〜１５の官能基、または３〜１０の官能基から含有する、または３、４、５、６、７、８、９、または１０の官能基を含有する。
【０１１７】
「ＧＬＰ−１部分」という用語は本明細書では、ＧＬＰ‐１活性を有する部分を指す。ＧＬＰ−１部分は、本明細書に記載される水溶性ポリマとの反応にふさわしい少なくとも１つの求電子基または求核群を有する。さらに、「ＧＬＰ−１部分」という用語は、複合に続くＧＬＰ‐１残留物のみならず、複合より前のＧＬＰ‐１部分の両方を網羅する。以下にこれから詳しく説明するように、当業者が任意の所与の部分がＧＬＰ‐１活性を有するかどうかを判断できるものである。本明細書では、「ＧＬＰ−１部分」という用語は、意図的に改変されたペプチドを含み、例として、部位指定変異導入または偶然の変異を通じる場合をあげられる。「ＧＬＰ−１部分」という用語は、ｉｎｃｌｕｄｅｓ天然ＧＬＰ‐１（ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）、ＧＬＰ‐１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ‐１生物活性のあるフラグメント、拡張ＧＬＰ−１（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる国際特許公開番号ＷＯ  ０３／０５８２０３、特に本書に記載の拡張グルカゴン様ペプチド‐１類似体関連を参照。）、およびエキセンディン‐４類似体および参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ  ２００４／０９３８２３に記載されるようにＧＬＰ‐１中に一つまたは２つのシステイン残留物を備えるエキセンディン‐４誘導体を含む。
【０１１８】
「ＧＬＰ‐１」はＧＬＰ−１活性を有する化合物を指す。本明細書では、「ＧＬＰ−１」は意図的に改変されたペプチドを含み、例として、部位指定変異導入または偶然の変異を通じる場合をあげられる。「ＧＬＰ−１」という用語は、天然ＧＬＰ‐１（ＧＬＰ‐１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）、ＧＬＰ‐１類似体、ＧＬＰ‐１誘導体、ＧＬＰ‐１生物活性のあるフラグメント、拡張ＧＬＰ‐１（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる国際特許公開番号ＷＯ  ０３／０５８２０３、特に本明細書に記載の拡張グルカゴン様ペプチド‐１類似体関連を参照。）、および参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ  ２００４／０９３８２３に記載されるＧＬＰ‐１中の特定位置における１つまたは２つのシステイン残留物を備えるエキセンディン‐４類似体およびエキセンディン‐４誘導体を含む。
【０１１９】
「フラグメント」という用語は、ある程度のＧＬＰ‐１活性を維持するＧＬＰ‐１部分の一部にアミノ酸配列を有するいかなるペプチドを意味する。フラグメントは、ＧＬＰ‐１のタンパク質分解、または本技術において所定の方法による化学合成によって作り出されたペプチドを含む。しばしばＧＬＰ−１フラグメントは、ＧＬＰ‐１部分のＮ−ｔｅｒｍｉｎｕｓおよび／またはＣ−ｔｅｒｍｉｎｕｓから一つまたはそれ以上のアミノ酸を切断の後得られ、ＧＬＰ‐１活性の度合いを保有する。
【０１２０】
「実質的に相同の」という用語は、例えば、変異配列のような特定の対象配列が、参照配列から置換基、欠失、または添加の一つ以上により異なり、その違いの正味の影響は、参照配列と対象配列間の負の機能的相違点の結果にならないことを意味する。本発明の目的としては、生物学的特性と同等の９５％を超える相同を有する配列（潜在的には活性の度合いは異なるが）、および同等の発現特性は実質的に相同と見なす。相同を決定する目的としては、成熟配列の切断を無視しても良い。相同のより少ない度合いを有する配列、同等の生物活性、および同等の発現特性は実質的に同等とみなす。使用のための典型的なＧＬＰ‐１部分は、本明細書では実質的に、例えば天然ＧＬＰ‐１と相同の配列を有するこれらのペプチド含む。
【０１２１】
ＧＬＰ‐１部分の「欠損変異体」は、ＧＬＰ‐１部分の一つまたはそれ以上のアミノ酸残留物が欠失されたペプチドであり、前述および以下の欠失されたアミノ酸残留物はアミノ結合を介して結合される（欠失アミノ酸残留物が、ペプチドまたはタンパク質の末端に位置される場合を除く）。欠損変異体は、２つのアミノ酸が欠失された場合、３つのアミノ酸が欠失された場合、４つのアミノ酸が欠失された場合などと同様に、唯一単独のアミノ酸残留物が欠失された場合を含む。各欠失はＧＬＰ‐１活性のある度合いを残す。
【０１２２】
ＧＬＰ‐１部分の「置換変異体」は、ＧＬＰ‐１部分の１つ以上のアミノ酸残留物が欠失されたペプチドまたはタンパク質であり、異なるアミノ酸残留物が置き換わったものである。置換変異体は、２つのアミノ酸が置換えられた場合、３つのアミノ酸が置換えられた場合、４つのアミノ酸が置換えられた場合などと同様に、唯一単独のアミノ酸残留物が置換えられた場合を含む。各置換変異体はＧＬＰ‐１活性のある度合いを有する。
【０１２３】
ＧＬＰ‐１部分の「付加変異体」は、ＧＬＰ‐１部分の１つ以上のアミノ酸残留物がアミノ酸配列に添加されたペプチドであり、隣り合ったアミノ酸残留物がアミノ結合によって添加されたアミノ酸残留物に付着されたものである。（添加されたアミノ酸残留物が、唯一単独のアミノ結合がアミノ酸残留物に付着するペプチドの末端に位置する場合を除く）。付加変異体は、２つのアミノ酸が添加された場合、３つのアミノ酸が添加された場合、４つのアミノ酸が添加された場合などと同様に、唯一単独のアミノ酸残留物が添加された場合を含む。各付加変異体はＧＬＰ‐１活性のある度合いを有する。
【０１２４】
「向インスリン活性」は、高められた血糖値に反応してインスリン分泌を刺激する能力を意味する。それによって細胞による血糖摂取により、血漿グルコースレベルの低下がもたらされる。向インスリン活性は、ＧＬＰ‐１受容体結合活性または活性化を測定すること、例えば参照することにより本明細書に組み込まれるＥＰ６１９  ３２２および米国特許第５，１２０，７１２号に記載の膵臓の島細胞またはインシュリノーマ細胞を用いた分析などによる本技術において既知の方法でそれぞれ計測することが出来る。向インスリン活性は、一般的にはインスリンまたはＣ‐ペプチドレベルを測定することによって人インビボで測定される。
【０１２５】
「対象」、「個人」または「患者」という用語は、本明細書では置換可能なものとして使用されており、脊椎動物、望ましくは哺乳類を指す。哺乳類は、ねずみ科の動物、齧歯動物、類人猿、人、家畜、スポーツ動物およびペットを含むがこれに限らない。
【０１２６】
「任意の」または「任意に」とは、その次に続いて記述される条件が起こる可能性があるまたはないこと意味し、記述はその条件が起こる場合およびその条件が起こらない場合を含む。
【０１２７】
「十分に」（特別に特定の文脈に対してどこかに定義されているかまたは文脈が明らかに指示しない限り）およそ全くまたは完全に以下のうちの１つ以上を意味する。例えばその状態の５０％を超える、５１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上および９５％以上である。
【０１２８】
文脈が明らかに指示がない限り、「約」という用語が数値に先立つ場合、その数値は規定された数値の平均値±１０％と理解される。
【０１２９】
「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基の両方を含むいかなる化合物を指す。カルボキシ官能基に隣接する位置でアミノ基が一般的に発生するが、アミノ基は分子中のいかなる場所にも位置付けてもよい。アミノ酸は、アミノ、チオ、カルボキシル、カルボキサミド、イミダゾールなどの付加的官能基をも含むことがある。アミノ酸は合成物質または自然発生的なものであってもよく、ラセミ化合物または光学的に活性化した（Ｄ‐，またはＬ‐）構造のいずれかに使用されることがある。
【０１３０】
ペプチド内のアミノ酸残留物は以下のように短縮される。フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ、ロイシンはＬｅｕまたはＬ、ＩｓｏロイシンはＩｌｅまたはＩ、メチオニンはＭｅｔまたはＭ、バリンはＶａＩまたはＶ、セリンはＳｅｒまたはＳ、プロリンはＰｒｏまたはＰ、トレオニンはＴｈｒまたはＴ、アラニンはＡｌａまたはＡ、チロシンはＴｙｒまたはＹ、ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ、グルタミンはＧｌｎまたはＱ、アスパラギンはＡｓｎまたはＮ、リジンはＬｙｓまたはＫ、アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ、グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ、システインはＣｙｓまたはＣ、トリプトファンはＴｒｐまたはＷ、アルギニンはＡｒｇまたはＲ、およびグリシンはＧｌｙまたはＧ。
【０１３１】
「持続放出組成物」または「徐放組成物」は、「速放」性組成物よりも活性成分をゆっくりと比較的長い期間にわたり放出する組成物である。一般的に活性成分、例えばＧＬＰ‐１ポリマ複合体は少なくとも約３時間、または少なくとも約４時間、または少なくとも約５時間、または少なくとも約６時間、または少なくとも約８時間に渡って放出される。
【０１３２】
特定の期間に対するタンパク質の「持続的血漿中濃度」とは、特定の期間に対してタンパク質が血漿内で検出されることを意味する。タンパク質は当該タンパク質検出の為のどんな方法、例えば、免疫学的、生物学的または機能上の方法などによって検出することができる。例えば、インスリンは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析法、または血糖値の決定によって検出することが出来る。
【０１３３】
「肺送達に適している」組成物とは、胃小窩に浸透することを可能にするために、エアゾール化された粒子の部分が肺に到達しエアゾール化できて、対象によって吸入される能力がある組成物を指す。このような組成物は「呼吸に適する」または「吸入可能」と見なしてもよい。
【０１３４】
「エアゾール化した」組成物は、ガス（一般には空気）の中に懸濁される液体、または固体粒子であり、一般的にはその結果として、乾燥粉末吸入器、アトマイザー、または噴霧器などの吸入器の駆動（発射）を含む。
【０１３５】
「ジェット噴霧器」とは、圧縮された空気を単一薬剤の溶液を通じて押し出すことによって、細粒なスプレーがフェイスマスクに送られ吸入される器具といったようなシステムである。噴霧器はしばしば定量噴霧または携帯型吸入器を使用する能力がない者に薬物を投与するために使用される。
【０１３６】
「乾燥粉末吸入器」とは、粉末形状の薬物の一単位投薬量が込められた投与器具である。概して、吸入器は呼吸をすることによって作動される。例えば、カプセルまたはブリスターが穴をあけられることで、ＳｐｉｎｈａｌｅｒまたはＲｏｔａｈａｌｅｒなどで吸入されることができる。「Ｔｕｒｂｏｈａｌｅｒｓ」は、粉末形状で薬物の計測された投与量を小型容器に取付けたものである。
【０１３７】
「定量噴霧式吸入器」または「ＭＤＩ」とは、圧力下における推進力によって吸入器から分注される、極めて小さい液体または固体の粒子の懸濁にある計測された投与量を送達する器具である。このような吸入器は、個人が呼吸をするときに薬物を解放するために、口の中に設置され、押圧（作動）される。
【０１３８】
本明細書では、「放出された投与量」または「ＥＤ」とは、作動または粉末単位または容器からの分散事象の後の乾燥粉末形状が吸入器から送達されることの指摘を指す。ＥＤは、名目上の投与量に対して、吸入器によって送られた投与量の率として定義される。（すなわち、発射の前に適切な吸入器に設置された投与量ごとの粉末の質量である）。ＥＤとは、実験的に決められた量であり、患者の服用を模倣した生インビトロの器具設定の使用によって決定されても良い。ＥＤの値を決めるためには、本明細書で使用されているように、全体が参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，２５７，２３３号に記載される、乾燥粉末の肺送達システム（ＰＤＳ）器具（ＮｅｋｔａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に設置する。ＰＤＳ器具は作動され、粉末を分散する。その結果として生じたエアゾールクラウドは、作動から２．５秒後にわたって真空（３０Ｌ／分）によって器具から引き出され、器具のマウスピースに取付けられた風袋グラスファイバーフィルタ（Ｇｅｌｍａｎ，４７ｍｍ直径）によって捕獲される。フィルタに到達する粉末の量は送られた投与量を構成する。例えば、吸入器内に設置された５ｍｇの乾燥粉末を含むブリスターに対して、粉末の散布が上記に記載の風袋フィルタ上に４ｍｇの粉末回収の結果になる場合には、乾燥粉末組成物のためのＥＤは８０％となる（＝４ｍｇ（送られた投与量）／５ｍｇ（名目上の投与量））。
【０１３９】
「乾燥粉末形状」にある組成物とは、一般的に約２０重量％未満、約１０重量％未満、または約５重量％未満の水を含む粉末組成物である。
【０１４０】
本明細書では、「質量中位径」または「ＭＭＤ」とは、複数個の粒子の中位径を指し、一般的には、すなわち粒径の範囲を構成している多分散粒子集団にある。本明細書に報告されるＭＭＤ値は、文脈が指示しない限り、レーザー回折（Ｓｙｍｐａｔｅｃ  Ｈｅｌｏｓ，Ｃｌａｕｓｔｈａｌ−Ｚｅｌｌｅｒｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定される。一般的には、粉末試料が、ＳｙｍｐａｔｅｃＲＯＤＯＳ乾燥粉末散布装置の供給じょうごに直接加えられる。これは、手動またはＶＩＢＲＩ振動性供給要素の端部から機械によって攪拌することによって達成されることができる。試料は、与えられた低気圧に対し最大限にされた真空低気圧（吸気）を伴う、圧力をかけられた空気（２から３バール）の利用を通じて一次粒子に散布される。散布された粒子は、散布された粒子の軌道を直角に交差する６３２．８ｎｍレーザービームで調査される。粒子の集合から散在するレーザー光は、逆フーリエ・レンズ・アセンブリを使用する光電子倍増管検出器要素の同心円状の配列の上に撮像される。散光は５ミリ秒の時間の一片において得られる。粒子のサイズ分配は散光空間／アルゴリズムを使用した強度分布から逆算される。
【０１４１】
「空気力学的質量中位径」または「ＭＭＡＤ」とは、散布された粒子の空気力学的サイズを測るものである。空気力学中位径は、沈降する性質の点からみてエアゾール化された粉末を表現するために使用され、粒子として、空気中で、沈降する速度を有する一単位の密度球の直径である。空気力学中位径は、粒子の形、密度、および粒子の物質的サイズを網羅する。本明細書では、ＭＭＡＤとは、指示が無い限り、全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，２５７，２３３に記載される、肺送達システム（ＰＤＳ）器具（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用する基準条件におけるカスケード固着によって決定されたエアゾール化された粉末の粒径配分の中間点または平均値を指す。
【０１４２】
「微粒子フラクション」とは、５マイクロン未満である空気力学中位径をもつ粒子のフラクションである。明確に述べれば、微粒子フラクションは、３．３マイクロン未満である空気力学的中位径をもつ粒子のフラクションを指すこともある。
【０１４３】
病気または病状を「治療または改善」とは、病気または病状の症状を緩和または取り除くことを意味する。一部の実施形態においては、病気または病状の「治療または改善」とは、病気または病状の原因に処置を施すことに向けられる。病気の治療は病気の治癒の結果にいたることもある。
【０１４４】
「基礎インスリン」とは、基礎的要件を満たすために有効であるインスリンの安定した低いレベルを維持するのに十分である持続効果のあるインスリンのことを指す。概して、基礎インスリンとは、糖尿病の標準モデルにおいて約８時間以上長期にわたる作用時間を示しているものである。商業上入手できる基礎インスリンは、中間型インスリン（ＮＰＨ）、Ｌｅｎｔｅ、およびＵｌｔｒａｌｅｎｔｅ’およびインスリングラルギンなどの類似体を含む。
【０１４５】
生物活性を欠くＧＬＰ−１ポリマ複合体とは、ＧＬＰ‐１見極めのための分析において評価されるとき、天然ＧＬＰ‐１と比べた場合、約２％の生物活性を保有するもののことである。本明細書にさらに詳細が記載されるように、生物活性を見極めるために、ＧＬＰ‐１受容体結合活性または受容体活性化を測定するインビトロまたはインビボ分析を含む様々な分析が使われることがある。受容体信号伝達分析もＧＬＰ‐１活性を見極めるために使用されることがある（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：８４−８８参照）。
【０１４６】
ＧＬＰ‐１のポリマ複合体に関連して、「単量体」または「単一複合体」とは、そこに単独の水溶性ポリマ分子の共有結合を有する一方、ＧＬＰ‐１「二量体」または「ジ複合体」とは、そこに２つの水溶性ポリマ分子の共有結合を有するもの、など、ＧＬＰ‐１部分を指す。
【０１４７】
次に本発明の１つ以上の特徴に目を向けると、複合体があげられるが、この複合体とは一般的に解放可能なように、直接加水分解性連結を通してあるいは加水分解性連結のリンカーのいずれかを通し、水溶性ポリマに付着したＧＬＰ‐１部分を備える。インビボで投与される場合、本発明の複合体は血糖値の大幅な引き下げをもたらすことに効果的であるだけではなく、拡張解放配列を保有することが示されている。つまり、天然ＧＬＰ‐１の急速な撤去または短時間活性とは対照的に、本発明の複合体の血糖低下能力は一般的に数時間、場合によっては、数日に渡って効果がある。したがって、本発明の複合体は、一般的に天然ＧＬＰ‐１を上回る複数の注目すべき利点をもたらす。最後に、ＧＬＰ‐１のＮ末端改変は、薬学的使用に適したＧＬＰ‐１誘導体をもたらすのに効果的でない。例えば、国際公開広報第ＷＯ  ０４／０７８７７７号を参照。本発明は、１つの特徴において、効果的であるだけでなく、天然ＧＬＰ‐１を上回る複数の利点を保有する、Ｎ末端的改変水溶性ポリマ複合体は以下にさらに詳細を述べる。
【０１４８】
ＧＬＰ−１部分
本発明の複合体はＧＬＰ−１部分を備える。上記に記載のとおり、「ＧＬＰ‐１部分」という用語は、１つ以上の水溶性ポリマに対する以下の付着のみならず、複合より前のＧＬＰ‐１を網羅する。しかし、当然のことながら、ＧＬＰ‐１部分が水溶性ポリマに共有結合する場合、ＧＬＰ‐１部分は、ポリマに対する連結（またはポリマに付着するリンカー）と関連する１つ以上の共有結合の存在のため、ＧＬＰ‐１部分の１つ以上の反応基（例えば、アミノ、アルボキシルなど）の反応のため、水溶性ポリマを伴って、わずかに変更される。しばしば、水溶性ポリマなどのような、こうした他の分子に付着したＧＬＰ‐１部分のわずかに変更された形状は、ＧＬＰ‐１部分の「残留物」を指す。
【０１４９】
本発明において使用するためのＧＬＰ−１部分とは、ＧＬＰ‐１活性を有するいかなるＧＬＰ‐１部分である。多数のＧＬＰ‐１類似体、誘導体、および変異体は前に記載されており、「ＧＬＰ‐部分」という用語によって網羅される。本発明において使用するための１つの好ましいＧＬＰ‐部分は、人ＧＬＰ‐１、すなわち３７アミノ酸ペプチドである。その自然発生する形状は、従来式の付番に従うと、Ｎ末端ヒスチジンが残留物７と割り当てられるＧＬＰ‐１（７‐３６）ＮＨ２、ＧＬＰ−１（７‐３７）ＯＨおよびＧＬＰ−１（７‐３７）ＮＨ２を含む。市販に入手可能な形状もＧＬＰ‐１（１‐３６）を含む。
【０１５０】
ＧＬＰ‐１（７‐３６）のアミノ酸配列は以下に相当する。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【０１５１】
Ｈｉｓ７‐Ａｌａ８‐Ｇｌｕ９‐Ｇｌｙｌ０‐Ｔｈｒ１１‐Ｐｈｅｌ２‐Ｔｈｒ
ｌ３‐Ｓｅｒｌ４‐Ａｓｐｌ５‐Ｖａｌｌ６‐Ｓｅｒｌ７‐Ｓｅｒｌ８‐Ｔｙｒ
ｌ９‐Ｌｅｕ２０‐Ｇｌｕ２１‐Ｇｌｙ２２‐Ｇｌｎ２３‐Ａｌａ２４‐Ａｌａ
２５‐Ｌｙｓ２６‐Ｇｌｕ２７‐Ｐｈｅ２８‐Ｉｌｅ２９‐Ａｌａ３０‐Ｔｒｐ
３１‐Ｌｅｕ３２‐Ｖａｌ３３‐Ｌｙｓ３４‐Ｇｌｙ３５‐Ａｒｇ３６
ＧＬＰ‐１（７‐３７）ＨＯのアミノ酸配列は以下に相当する。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【０１５２】
Ｈｉｓ７‐Ａｌａ８−Ｇｌｕ９−Ｇｌｙ‐１０−Ｔｈｒ１１‐Ｐｈｅ‐１２‐Ｔ
ｈｒ１３‐Ｓｅｒ１４‐Ａｓｐ１５‐Ｖａｌ１６‐Ｓｅｒ１７‐Ｓｅｒ１８‐Ｔ
ｙｒ１９‐Ｌｅｕ２０‐Ｇｌｕ２１‐Ｇｌｙ２２‐Ｇｌｎ２３‐Ａｌａ２４‐Ａ
ｌａ２５‐Ｌｙｓ２６‐Ｇｌｕ２７‐Ｐｈｅ２８‐Ｉｌｅ２９‐Ａｌａ３０‐Ｔ
ｒｐ３１‐Ｌｅｕ３２‐Ｖａｌ３３‐Ｌｙｓ３４‐Ｇｌｙ３５‐Ａｒｇ３６‐Ｇ
ｌｙ３７。
【０１５３】
本発明において使用するための追加的なＧＬＰ‐１部分は、とりわけ、ＷＯ  ９１／１１４５７に記載のＧＬＰ‐１ペプチド類似体、ＥＰ  ０  ６９９  ６８６に記載のＮ末端切断フラグメント、および２００４／０９３８２３号に記載のシステイン挿入ＧＬＰ‐１配列を含む。本発明で使用するシステイン挿入ＧＬＰ‐１変異体は、ＧＬＰ‐１のアミノ酸１１、１２、１６、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３４、３５、３６、および３７から選択される位置に付着されるシステインを有するものを含む。こうした変異体は一般的に以下のように指定される。例えば、２２および３５位置にシステイン付着を有するＧＬＰ‐１変異体は一般的に以下のように記載される。［Ｃｙｓ２２Ｃｙｓ３５］ＧＬＰ‐１（７‐３７）。本発明の複合体調製における異性体の使用は、しばしば１または２以上のシステインアミノ酸をＧＬＰ‐１部分ごとに有する。システインの組み入れのための典型的な場所は、ＧＬＰ‐１のアミノ酸２２、２６、３４、３５、３６および３７であるが、これに限らない。このようなＧＬＰ‐１部分は、１つ以上の反応マレイミド基を有する水溶性ポリマといった、特にチオール‐選択的ポリマ試薬に対する結合に有効である。
【０１５４】
本発明において使用するのに適するその他のＧＬＰ‐１部分は、シリアル番号第１０／４８６，３３３に相当する米国公開出願第２００４／０２３５７１０号に記載されるＧＬＰ‐１部分を含む。
【０１５５】
また、本発明における使用は、エキセンディンとして参照されるＧＬＰ‐１類似体である。エキセンディンは、最初にヒーラ・モンスターおよびメキシコ・ビーデッド・リザードの唾液分泌物から分離されたペプチドである。エキセンディンは、ＧＬＰ‐１（７‐３６）ＮＨ２に対し、５３％という最高の相同で（Ｇｏｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１９６５０−５５，１９９３）ＧＬＰ族の複数の部分に類似する度合いを有する。
【０１５６】
本発明に使用される特定のエキセンディンは、エキセンディン‐３およびエキセンディン４（合成エキセンディン‐４はエキセナチドとして知られる）を含む。
【０１５７】
エキセンディン‐３（１‐３９）は以下のアミノ酸配列を有する。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。
【０１５８】
Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  ＧＩｙ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  
Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  
Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  ＧＩｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  
Ａｓｎ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  ＧＩｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  
Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ
エキセンディン‐４（１‐３９）のアミノ酸配列は以下に相当する。（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。
【０１５９】
Ｈｉｓ  ＧＩｙ  ＧＩｕ  ＧＩｙ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  
Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  ＧＩｎ  Ｍｅｔ  ＧＩｕ  ＧＩｕ  ＧＩｕ  Ａｌａ  
ＶａＩ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  ＧＩｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  
Ａｓｎ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｉｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  
Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ
Ｃ末端セリンはアミド化される。
【０１６０】
ＧＬＰ‐１部分は、非組換え法または組換え法のいずれかで得てもよく、本発明はこの点で限られない。さらに、いくつかのＧＬＰ‐１部分は商業的に入手可能であり、とりわけ例えばＰｒｏＳｐｅｃＴａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｇｅｎｅ  ＬＴＤ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から得られるｈＧＬＰ−１、ｒエキセンディン−４、およびｒＨｕＧＬＰ−１および（Ｓｅｒ８）ＧＬＰ−ｌ（７−３６）アミド、ｈＧＬＰ−１アミド、ｈＧＬＰ−ｌ（７−３６）Ｌｙｓ（ビオチン）アミド、（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）である。ＧＬＰ‐１部分調製のための方法は周知のとおりであり、例えば米国特許第５，１１８，６６６号、５，１２０，７１２号、および５，５２３，５４９号に記載される。
【０１６１】
ＧＬＰ‐１部分は、Ｄｕｇａｓ  Ｈ．，Ｐｅｎｎｙ，Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．５４−９２（１９８１）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，８５，２１４９（１９６２）、およびＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｃｓｏ，ｐ．２４−６６（１９６９）などに記載される溶液または固体段階のペプチド合成の標準の方法を用いることで調製されることができる。ペプチド合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能である。固形段階の合成物は、一般的に妨害基を阻止し、ある一定のアミノ酸を保護、連結、分離、および未反応のアミノ酸を被覆するために製造指示書に従って使用される。ＢＯＣ‐アミノ酸およびその他の試薬は商業的にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。限定されない例として、二重連結プロトコルを使用する配列ＢＯＣ化学は、Ｃ末端カルボキサミドの生産のための最初のｐ‐メチルベンジドリルアミン樹脂に適用される。Ｃ末端酸の生産については、相当するＰＡＭ樹脂を使用する。Ａｓｎ、Ｇｉｎ、およびＡｒｇは、予備形成されたヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを使用して連結される。適した側鎖保護基は以下を含む。Ａｒｇ（トシル）、Ａｓｐ（シクロヘキシル）、ＧＩｕ（シクロヘキシル）、Ｓｅｒ（ベンジル）、Ｔｈｒ（ベンジル）、およびＴｙｒ（４‐ブロモカルボベンゾキシ）。ＢＯＣ脱保護は、塩化メチレンにおけるトリフルオロ酢酸をもちいて達成されても良い。以下の合成物、結果として生じるペプチドは、例えば１０％のメタ‐クレゾールを含む無水ＨＦを使用する樹脂から脱保護または開裂されても良い。
【０１６２】
ＧＬＰ‐１部分（人ＧＬＰ‐１またはＧＬＰ‐１活性を有する異なるタンパク質）を調製するために使用される典型的な組換え法は、とりわけ本技術分野に精通するものに明らかであるものとして、以下を含む。一般的に、本明細書に記載のＧＬＰ‐１部分は、望ましいポリペプチドまたはフラグメントに変換する核酸を組み立てること、核酸を発現ベクターに模造し、宿主細胞に変形させること、（例えば、植物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどのバクテリア、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのイースト、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞または幼児ハムスターの腎臓細胞）、および望ましいポリペプチドまたはフラグメントを形成するために核酸を発現することにより調製される。この発現は、外生発現（宿主細胞が自然に望ましい遺伝暗号を含む場合）または内生発現を介して発生することができる。インビトロの組換えポリペプチドの形成および発現のための方法、および原核または真核親主細胞は本技術の通常の技量を有するものに既知のものである。例えば、米国特許第４，８６８，１２２号を参照。
【０１６３】
組換えポリペプチドの同一化および精製を容易にするためには、エピト−プタグまたはその他の親和性結合配列を符号化する核酸配列が、望ましいポリペプチドおよび結合に適したポリペプチドからなる融合タンパク質を形成する、符号配列をインフレームに挿入または添加することができる。融合タンパク質は、結合部分を担う親和性のカラム（例えば抗体）を通じて、カラム内で融合タンパク質が結合する融合タンパク質において、エピト−プタグ、または他の結合配列に対して直接融合タンパク質を含む混合物を最初に流すことによって同一化および精製することができる。従って、融合タンパク質は、結合融合タンパク質を解放するために、適切な溶液（例えば酸）でカラムを洗浄することによって再生することができる。組換えポリペプチドは、宿主細胞の溶解、例えばサイズ排除クロマトグラフィなどによるポリペプチドの分離、およびポリペプチドの回収によっても同一化および精製することができる。組換えポリペプチド同一化および精製のためのこれらおよび他の方法は、本技術の通常の技量を有する者に既知のものである。本発明の１つ以上の実施形態において、ＧＬＰ‐１部分は融合タンパク質の形状ではない。例えば、Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３３：１９０７−１９１０（１９９３）を参照。
【０１６４】
与えられるいかなる部分については、この部分がＧＬＰ‐１活性を保有するか否か判断するのは不可能である。ＧＬＰ‐１受容体結合活性または受容体活性化を測定するインビトロおよびインビボ分析を含む、生物活性を見極めるための様々な分析を使用しても良い。例えば、ＧＬＰ‐１活性の記載についてＥＰ  ６１９  ３２２および米国特許第５，１２０，７１２号を参照。Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，８４−８８，１９９８に記載されるような、受容体信号伝達分析もＧＬＰ‐１活性を見極めるために使用されても良い。
【０１６５】
本技術において通常の技量を有する者に既知の他の方法もまた与えられた部分がＧＬＰ‐１活性を有するか否か判断するために使用されても良い。こうした方法は、相当するポリマ部分複合体の活性のみならず、部分それ自体の両方のＧＬＰ‐１活性（従って「ＧＬＰ‐１部分」として使用される）を判断するのに有効である。例えば、人ＧＬＰ‐１受容体を適切な溶剤に含むｃＡＭＰの部分形成を促進するか否かを見極めることによって、与えられた部分が人ＧＬＰ‐１受容体の作用薬であるか否かを判断することができる。こうした部分の有効性は、用量反応曲線からのＥＣ５０値を計算することによって判断する。例として、人ＧＬＰ‐１受容体を発現しているＢＨＫ細胞（幼児ハムスター腎臓細胞）は、ペニシリン、ストレプトマイシン、仔牛血清、およびジェネティシンを含むＤＭＥＭ媒体において成長することができる。その細胞は、リン酸緩衝生理食塩水内で洗浄され、収穫される。原形質膜が、均一化によって細胞から調製され、その均一化されたものは沈殿物を形成するために遠心分離機にかけられる。その結果として生じる沈殿物は、適した緩衝において均一化されることで懸濁され、遠心分離され、そして洗浄される。ｃＡＭＰ受容体分析が、試験向インスリン部分に対する反応として、環式ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）測定によって達成される。ｃＡＭＰは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM  ｃＡＭＰ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の使用で計ることができる。培養は一般的に、例えばＡＴＰ、ＧＴＰ、ＩＢＭＸ（３‐イソブチル‐１‐メチルキサンチン、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＢＳＡ、アクセプタービーズ、およびビオチニル化‐ｃＡＭＰによって培養されたドナービース）を加えた緩衝におけるマイクロタイタープレートで行われる。計数は、例えばＦｕｓｉｏｎTM器具（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用することで実行しても良い。濃縮反応曲線が、評価の下個々の向インスリン部分に対して描かれ、それらのＥＣ５０値が決定される。
【０１６６】
ＧＬＰ‐１部分の限定されない例はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの以下のいずれかを含む。１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、本明細書での不完全型は合成変異体、およびＧＬＰ‐１活性を有するペプチド模倣である。少なくともＧＬＰ‐１活性のある度合いを維持する前述の生物活性のあるフラグメント、欠損変異体、置換変異体または付加変異体のいずれかは、本発明の複合物におけるＧＬＰ‐１部分としての役目を果たす。
【０１６７】
ＧＬＰ‐１改変
ＧＬＰ‐１部分は以下に記載のとおり、１つ以上の付加的な改変、例えば１つ以上の配糖体、またはメチル基の導入も含む。
【０１６８】
メチル化反応
ＧＬＰ‐１部分は、ＧＬＰ‐１配列の１つ以上の位置に１つ以上のメチルまたは他の低アルキル基を保有するものであってもよい。このような基の例は、メチル、エチル、ポリピル、イソポリピル、ブチル、イソブチル、ペンチルなどを含む。改変の部位は好ましいとされる７および／または９位置の試薬７、８、９および／または１０を含む。１つ以上のメチル基の導入は、改変されたＧＬＰ‐１がＤＰＰ  ＩＶから分解されることから保護するような、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）認識部位を改変することが期待される。理論により拘束されないことを望む一方、７、８、９、および／または１０以外の位置におけるＮ‐メチル反応はＧＬＰ‐１の螺旋構造を崩壊するため、その活動が低下すると考えられる。
【０１６９】
ＧＬＰ‐１に対するＮ末端改変の導入は、全体が参照することにより本明細書に組み込まれるＧａｌｌｗｉｔｚ，Ｂ．，ら、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，８６（１−３），１０３−１１１（２０００）またはＷＯ  ２００４／００７４２７に記載されるように達成される。とりわけ、Ｎ末端における変更を伴う実例となるＧＬＰ‐１類似体は、Ｎ‐メチル反応ＧＬＰ‐１（Ｎ−ｍｅ−ＧＬＰ−１）、アルファ‐メチル反応ＧＬＰ‐１（アルファ‐ｍｅ−ＧＬＰ‐１）、デスアミド化ＧＬＰ‐１（デスアミノ‐ＧＬＰ‐１）、およびイミダゾール乳酸置換ＧＬＰ‐１（イミ‐ＧＬＰ−１）を含み、本発明において使用するのに適する。
【０１７０】
前述のメチル‐誘導体を含む、ＧＬＰ‐１のその他様々な類似体を合成する方法、そのような付加的ＧＬＰ‐１類似体の良い例は、国際公開広報ＷＯ  ００／３４３３２、ＷＯ  ２００４／０７４３１５、およびＷＯ  ２００５／０５８９５５に記載される。
【０１７１】
糖鎖形成
本明細書に記載のＧＬＰ‐１部分は、１つ以上の配糖体を含んでもよい。どんな配糖体でも使用できるが、ＧＬＰ‐１部分は単糖、二糖、または三糖のいずれかの導入によって好ましく改変される。糖類の導入によってＧＬＰ‐１部分のどんな部位をも改変できるが、好ましくは、糖類は、ＤＰＰ  ＩＶタンパク質分解に対してペプチドを保護するために位置７、８、または９のいずれか１つ以上の位置に導入される。さらに、タンパク質分解に付加的な抵抗をもたらすのみならず、例えば、ペプチドの中心部を通じて螺旋構造を増すために位置１１、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２６、または３４のいずれか１つ以上に付加的な配糖体を導入してもよい。糖鎖形成は自然発生するアミノ酸において起こることもある。もうひとつの方法としては、糖類は、Ｎ末端（Ｈｉｓ７）、Ａｌａ８、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒｌｌ、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｕ２１、Ｇｌｙ２２、Ｇｌｎ２３、Ｌｙｓ２６、およびＬｙｓ３４からえらばれる１つ以上の部位において置換られる、１つ以上の各部位がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒのひとつを備えるＧＬＰ‐１部分の１つ以上の部位に共有結合していてもよい。
【０１７２】
グリコシル化ＧＬＰ‐１部分は、望ましい保護された糖アミノ酸がペプチド合成より前に調製され、ペプチド合成の間において、望ましい位置においてペプチド鎖のなかに導入されるような、従来指摘のＦｍｏｃ化学および固体段階のペプチド合成技術、例えば樹脂を使用して調製されてもよい。したがって、ＧＬＰ‐１ポリマ複合体はインビトロで複合化されてもよい。糖鎖形成は脱保護の前に起こってもよい。アミノ酸配糖体の調製は、全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７６７，２５４号、ＷＯ  ２００５／０９７１５８、およびＤｏｏｒｅｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１４０１−１４０３，２００６に記載される。例えば、セリンおよびトレオニン残留物のアルファおよびベータ選択糖鎖形成はＫｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ反応およびシッフ塩基中間体を伴うＬｅｍｉｅｕｘのインシツアノマー化方法論を使用することで達成される。シッフ塩基配糖体の脱保護は、弱酸性状態または水素添加分解を使用することで達成される。保護されたアミノ酸の少なくとも１つが糖化された、段階的な方法における保護されたアミノ酸を伴う成長性のペプチド鎖への接触を伴う段階的な固形合成ペプチドによって作られる糖化およびｐｅｇ化ＧＬＰ‐１複合体を備える化合物は、ｐｅｇ化にに続いて、少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％などといった、糖化されたおよびｐｅｇ化されたＧＬＰ‐１の１種類の少なくとも約９５％の純度を有してもよい。
【０１７３】
ＧＬＰ‐１の１つ以上のアミノ酸残留物の対する導入に使用される単糖類は、ブドウ糖（Ｄ形グルコース）、果糖、ガラクトース、およびリボースを含む。使用に適した付加的な単糖類は、他のもののみならず、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、トレオース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、マンノースを含む。ＧＬＰ‐１を改変するために使用される単一の、２つの、または三糖類といった配糖体は、自然発生するまたは合成物であってよい。
【０１７４】
ＧＬＰ‐１の１つ以上のアミノ酸残留物にたいする導入に使用される二糖類は、とりわけサッカロース、乳糖、麦芽糖、トレハロース、メリビオース、およびセロビオースを含んでもよい。三糖類は、アクラボス、ラフィノース、およびメレチトースを含む。
【０１７５】
水溶性ポリマ
本発明の複合体は、好ましくはしかし解放可能である必要は無く水溶性ポリマに付着したＧＬＰ‐１部分を備える。この水溶性ポリマは一般的に親和性、非ペプチド、非毒性、非自然発生、および生体適合性である。物質は、生体組織に（例えば、患者に対する投与）関連して、その物質単独またはそれ以外の物質（例えばＧＬＰ‐１部分などの活性剤）を伴った使用に関連して、医師などの臨床医学者によって評価されるとき、いかなる悪影響をも上回る有益な効果生体適合性であると見なされる。物質は、インビボにおける物質の意図される使用が好ましくない免疫反応をもたらさない場合、またはその反応が臨床学的に顕著であるまたは臨床医学者によって評価された時に重用であると見なされない免疫反応がもたらされる場合、非免疫性と見なされる。一般的に、水溶性ポリマは親水性、生体適合性、および非免疫性である。
【０１７６】
さらに、水溶性ポリマは一般に、２から約３００の末端を有し、さらに好ましくは約２から５０の末端を有する特徴をもつ。このようなポリマの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体などのポリ（アルキレングリコール）、および同種のもの、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オルフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸）、多糖類）、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ‐アクリロイルモルホリン）、および、共重合体および三元重合体を含む、前述のいずれかの組み合せを含むがこれに限らない。
【０１７７】
水溶性ポリマは特定の構造に限られるものではなく、線構造（例えば、ＰＥＧアルコキシまたは二官能ＰＥＧ）または、分岐、叉状、多腕（例えば、ポリオール核に結合されたＰＥＧ）または樹木状のような非線構造を保有してもよい。さらに、そのポリマサブユニットは異なる形態のかなり多数を組織し、例えば、ホモポリマ、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、相互トリポリマ、ランダムトリポリマ、およびブロックトリポリマから選択することができる。
【０１７８】
本発明に使用する水性ポリマのとりわけ望ましい種類の１つは、ポリアルキレンオキサイド、および特に、ポリエチレングリコール（またはＰＥＧｓ）である。概して、本発明のＧＬＰ‐１ポリマ複合体を調製するために使用されるＰＥＧは「活性化されている」または反応するものである。すなわち、ＧＬＰ‐１複合体を形成するために使用される活性化されたＰＥＧ（および他の活性化水溶性ポリマは本明細書では集合的に「ポリマ試薬」と示される）は、望ましい部位またはＧＬＰ‐１部分上の部位と連結するのに適した活性化された官能基を備える。したがって、ＧＬＰ‐１複合体を調製するのに使用するポリマ試薬はＧＬＰ‐部分と反応するための官能基を含む。
【０１７９】
代表的なポリマ試薬およびこのようなポリマが活性部分に結合する方法は、本技術において既知であり、これらは、例えばＨａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．およびＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｄｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９７、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．，およびＪ．Ｍ  Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄｓ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４（４）、４５３−６０９（２００２）、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）のＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９５）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ１６：．１５７−１８２，およびＲｏｂｅｒｔｓ内，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，４５９−４７６（２００２）に記載される。
【０１８０】
本発明の結合を形成することにおいて使用に適した追加的なＰＥＧ試薬、および結合の方法はＴｈｅ  Ｎｅｋｔａｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｓ，２００５−２００６、２００４、２００３およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  ２００１内、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇｓ，２０００および１９９７−１９９８，およびＰａｓｕｔ内に記載される。Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００４），１４（５）。本発明に使用するのにふさわしいＰＥＧ試薬は、概してＮＯＦ  ｗｅｂｓｉｔｅ（２００６）上のＰｒｏｄｕｃｔｓのページ下に記載されるようにＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるもの、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｉｔｙ  ＰＥＧｓおよびＡｃｔｉｖａｔｅｄ  ＰＥＧも含む。本明細書に記載される製品およぶその化学構造は、参照によって明確に本明細書に組み込まれる。本明細書のＧＬＰ‐１複合体を形成するのに使用される追加的なＰＥＧは、Ｐｏｌｙｐｕｒｅ（Ｎｏｒｗａｙ）およびＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  ＬＴＤ（Ｏｈｉｏ）から入手できるものを含み、入手できるＰＥＧ試薬に関するオンラインカタログ（２００６）の内容は参照によって明確に本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
一般的に、結合における水溶性ポリマの重量平均分子量は約１００ダルトンから約１５０、０００ダルトンである。しかし、典型的な範囲は、約２５０ダルトンから約８０，０００ダルトン、５００ダルトンから約８０，０００ダルトン、約５００ダルトンから約６５，０００ダルトン、約５００ダルトンから約４０，０００ダルトン、約７５０ダルトンから約４０，０００ダルトン、約１０００ダルトンから約３０，０００ダルトンの範囲における重量平均分子量を含む。
【０１８２】
与えられる水溶性ポリマについては、１つ以上の範囲の分子量は一般的である。概して、皮下または静脈投与することを意図する場合、本発明によるＧＬＰ‐１複合体は、約２０，０００ダルトンの重量平均分子量のＰＥＧまたは他のふさわしい水溶性ポリマを備える一方、肺投与するよう意図されるＧＬＰ‐１複合体が、必ずしもそうとは限らないが、概して約２０，０００ダルトンまたはそれ以下の重量平均分子量を有するＰＥＧポリマを備える。例えば、例２５および２６は、約８ｋＤの全体分量を有する実例となる分岐ＰＥＧのためのネズミにおける気管内注入データを提供する。
【０１８３】
水溶性ポリマのための典型的な重量平均分子量は約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、ａｎｄ約７５，０００ダルトンを含む。
【０１８４】
前述の分子量のいずれかを有する合計水溶性ポリマの分岐版（例えば、２つの２０，０００ダルトンポリマまたは同様のものを備えた分岐４０，０００ダルトン水溶性ポリマ）も使用することができる。対象のＧＬＰ‐１複合体の他の特徴次第で、１つ以上の特定の実施形態において、複合体とは、複合体は約６，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有する１つ以上の結合ＰＥＧ部分を有しない複合体である。
【０１８５】
水溶性ポリマがＰＥＧ５である一部の例では、ＰＥＧは一般的に多くの（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマー［またはＰＥＧがどのように定義されるかにより、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）モノマー］を備える。本明細書では、繰り返し単位の数は一般的に、例えば「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」では下付き文字「ｎ」によって定義される。したがって、（ｎ）の値は一般的には以下の範囲の１つ以上以内に当てはまる。２から約３４００、約１００から約２３００、約１００から約２２７０、約１３６から約２０５０、約２２５から約１９３０、約４５０から約１９３０、約１２００から約１９３０、約５６８から約２７２７、約６６０から約２７３０、約７９５から約２７３０、約７９５から約２７３０、約９０９から約２７３０および、約１，２００から約１，９００。ｎの望ましい範囲は、約１０から約７００、および、約１０から約１８００を含む。分子量が分かっている任意の所与のポリマについては、繰り返し単位（すなわち「ｎ」）を決定することが繰り返しモノマーの分子量で合計重量平均分子量を割ることによって可能である。
【０１８６】
本発明の１つ以上の特定の実施形態では、水溶性ポリマの分子量に関しては、ＧＬＰ‐１複合体の他の特徴次第で、複合体は、約２，０００ダルトン以上の分子量を有する水溶性ポリマと共有結合するＧＬＰ‐１部分を備える。
【０１８７】
本発明に使用するポリマはエンドキャップされていても良く、すなわち、低アルコキシ基（すなわちＣ１−６アルコキシ基）、またはヒドロキシ基などの比較的不活性基ですくなくとも１つの末端のキャップトを有するポリマである。しばしばエンドキャップされるポリマの１つは、メトキシ‐ＰＥＧ（一般にｍＰＥＧと示される）であり、ポリマの１末端がメトキシ（‐ＯＣＨ３）基である。前述で使用される‐ＰＥＧ‐記号は、概して以下の構成単位を表す。−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−、ここで（ｎ）概して０から約４，０００の範囲である。
【０１８８】
米国特許第５，９３２，４６２に記載されるような、多腕または分岐ＰＥＧ分子も本発明に使用するのに適している。例えば、ＰＥＧは、構造に従い概して以下のように記載される場合がある。
【０１８９】
【化０２２】
2009519961.tif 000014
ポリ（エチレングリコール）などのポリａおよびポリｂ（同一または異種のいずれか）が基幹であり、Ｒ”は、Ｈ、メチルまたはＰＥＧ基幹などの非反応部分であり、ＰおよびＱは非反応連結である。１つの実施形態において、分岐ＰＥＧ分子とは、ＧＬＰ‐複合体の形成の使用に適した以下の反応性ＰＥＧなどのリジン残留物を含むものである。例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇ，２００１，６ページを参照。以下の分岐ＰＥＧは反応性スクシンイミジル基を伴って示されるが、これはＧＬＰ‐１部分に達するのにふさわしい無数の反応性官能基のたった１つを代表するものである。
【０１９０】
【化０２３】
2009519961.tif 000015
一部の例では、ポリマ試薬（ポリマ試薬から調製される対応複合体のみならず）は、ポリマ部分が「‐ＯＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯ‐」基を介してアミノ基に連結される、リジン残留物を欠く場合がある。さらに他の例では、ポリマ試薬（ポリマ試薬から調製される対応複合体のみならず）は、リジン残留物（リジン残留物が分岐を有効にするために使用される）をふくんだ分岐水溶性ポリマを欠く場合がある。
【０１９１】
本発明のＧＬＰ‐１複合体を形成するのに使用する付加的な分岐ＰＥＧｓは、共同所有の米国特許広報第２００５／０００９９８８号を含む。本明細書に記載される代表的な分岐ポリマは、以下の一般化構造を有するものを含む。
【０１９２】
【化０２４】
2009519961.tif 000016
ＰＯＬＹ１は水溶性ポリマであり、ＰＯＬＹ２は水溶性ポリマであり、（ａ）は０、１、２または３、（ｂ）は０、１、２または３、（ｅ）は０、１、２または３、（ｆ’）は０、１、２または３、（ｇ’）は０、１、２または３、（ｈ）は０、１、２、または３であり、（ｊ）は０から２０であり、各Ｒ１は、独立してＨ、またはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリールおよび置換アリールから選択された有機基であり、存在する場合、Ｘ１はスペーサ部分であり、存在する場合、Ｘ２はスペーサ部分であり、存在する場合、Ｘ５はスペーサ部分であり、存在する場合Ｘ６はスペーサ部分であり、存在する場合Ｘ７はスペーサ部分であり、存在する場合Ｘ８はスペーサ部分であり、Ｒ５は分岐部分であり、Ｚは、ＧＬＰ‐１部分の連結のための反応基であり、任意に介在スペーサを介す。前述の分岐ポリマにおけるＰＯＬＹ１およびＰＯＬＹ２構造は異なるかまたは同一であってもよい。すなわち、それらは同一のポリマ種（構造）および分子量である。
【０１９３】
本発明に使用するのに適した好ましい上記の分類に当てはまるポリマは以下のとおりである。
【０１９４】
【化０２５】
2009519961.tif 000017
（ｒｎ）は２から４０００であり、（ｆ）は０から６であり、（ｎ）は０から２０ある。
【０１９５】
本発明の複合体を調製するのにふさわしい分岐ポリマは、さらに一般にＲ（ＰＯＬＹ）ｙ式によって代表されるものをを含み、Ｒは、ＰＥＧなどの２以上のＰＯＬＹ腕を拡張する中心または核分子である。変数ｙは、ＰＯＬＹの腕の数を表し、各ポリマの腕は独立してエンドキャップされるか、あるいはその末端に反応性官能基を保有する。本発明のこの実施形態によるさらに明白は構造はＲ（ＰＯＬＹ−Ｚ）ｙ構造を保有し、各Ｚは独立してエンドキャッピング群または、例えばＧＬＰ‐１部分との反応にふさわしい反応基である。さらに代替実施形態では、ＧＬＰ‐１部分の反応により、Ｚは反応基であり、その結果として生じる連結は、加水分解に安定した、またあるいは、分解可能な、すなわち加水分解可能であってもよい。一般的に、少なくとも１ポリマ腕は、例えばＧＬＰ‐１部分との反応にふさわしい末端官能基を保有する。前述のＲ（ＰＥＧ）ｙの式によって一般的に代表されるような分岐ＰＥＧは、２ポリマ腕から約３００ポリマ腕（すなわち、２から約３００のｎ範囲）を保有する。好ましくは、このような分岐ＰＥＧは、一般的に、２から約２０ポリマ腕、２から約１５ポリマ腕、または３から約１５ポリマ腕などの、２から約２５ポリマ腕を保有する。多腕ポリマは、３，４，５，６，７または８腕を有するものを含む。
【０１９６】
上記に記載の分岐ＰＥＧ内の核分子は、さらに官能化されたポリオールを含む。そのようなポリオールは、１から１０の炭素原子、および、エチレングリコール、アルカンジオール、アルキルグリコース、アルキリデンアルキルジオール、アルキルシクロアルカンジオール、１，５‐デカリンジオール、４，８‐ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキリデンジオール、ジヒドロキシアルカン、トリヒドロキシアルカン、および同種のものを含む１から１０のヒドロキシ基を有する脂肪族ポリオールを含む。脂環式のポリオールは、直鎖、または、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、クェブラキトール、トレイトール、アラビトール、エリトリトール、アドニトール、ドゥシトール、ファコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、果糖、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タジトース、ピラノシド、サッカロース、乳糖、麦芽糖、および同種のものなどの、閉鎖の糖および糖アルコールを用いてもよい。追加的な脂肪族ポリオールは、グリセルアルデヒド、グルコース、リボース、マンノース、ガラクトース、および関連した立体異性体の誘導体を含む。他の使用してもよいコアポリオールは、クラウンエテル、シクロデキストリン、デキストリン、および他のスターチおよびアミロースなどの炭水化物を含む。一般的なポリオールは、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、およびトリメチロールプロパンを含む。
【０１９７】
以下のリンカー項でさらに詳しく記載するように、ＧＬＰ‐部分に共有結合に使用される連結の数のいずれも、特定の例において、連結は分解可能であり、本明細書ではＬＤと指定される。すなわち、例えば、エステル、加水分解可能なカルバメート、炭酸塩、または他の当該基などの、生理学的条件下において加水分解する少なくとも１つの結合または部分を含む。
【０１９８】
３腕、４腕、および８腕を有する向インスリン多腕ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２００５−２００６，ｐａｇｅ  ２６に記載のものに相当する。本発明の方法に使用される多腕活性ポリマは、ＧＬＰ‐１部分における反応基と反応するのにふさわしいＥが反応基を代表する、以下の構造に相当するものを含む。１つ以上の実施形態において、Ｅは‐ＯＨ（ＧＬＰ‐１カルボキシ基またはそれと同等のものとの反応のための）、カルボン酸またはそれと同等のもの（活性エステルなどの）、炭酸（ＧＬＰ‐１‐ＯＨ基との反応のための）、またはアミノ基である。
【０１９９】
【化０２６】
2009519961.tif 000018
上記の構造において、ＰＥＧは、‐（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２‐、およびｍは３、４、５、６、７、および８より選択される。特定の実施形態においては、一般的な連結は、複合体のポリマ部分がＧＬＰ‐１部分を原型を保ったポリマ複合体から解放するためにインビボで加水分解されるような、エステル、カルボキシル、および加水分解可能なカルバメートである。このような例において、リンカーＬはＬＤ‐として指定される。
【０２００】
別の方法としては、ポリマは、米国特許第６，３６２，２５４号に記載されるように全体的に叉状構造を保有してもよい。この種類のポリマセグメントは、２つのＧＬＰ‐１部分が正確なまたは所定の間隔を離れて位置する、２つのＧＬＰ‐１部分と反応するのに有効である。
【０２０１】
本明細書に規定された代表的な構造のいずれかにおいて、１つ以上の分解可能な連結は、初期に投与された複合体中よりもより小さいＰＥＧ鎖を有する複合体のインビボでの生成を可能にするために、さらにポリマセグメント、ＰＯＬＹに含まれてもよい。生理学的に適切な開裂性（すなわち解放可能）連結は、エステル、カルボネートエステール、カルバメート、硫酸塩、リン酸塩、アシロキシアルキルエスタール、アセタール、およびケタールを含むがこれに限らない。得られたポリマセグメントに含まれるとき、このような連結は、しばしば保存および初期投与において安定している。
【０２０２】
ＧＬＰ‐１ポリマ複合体を調製するために使用されるＰＥＧポリマは、ＰＥＧ鎖の端部においてというよりは、ＲＥＧの長さに従って共有結合する、カルボキシルまたはアミノといった、反応基を有するペンダントＰＥＧ分子を備えてもよい。ペンダント反応基は、ＰＥＧに直接またはアルキレン基などのようなスペーサ部分を通じて付着することができる。
【０２０３】
本発明の複合体を形成するのに使用するための線状または分岐のいずれかを有する付加的な代表的ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）から購入してもよい。実例となるインスリンＰＥＧ試薬は、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」と表題をつけられたＮｅｋｔａｒ’ｓ  ２００５−２００６  ｃａｔａｌｏｇｕｅに記載されており、その内容は参照によって明確に本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
解放可能な連結
好ましくは、本発明の１つの側面によるＧＬＰ‐１ポリマ複合体は、ＧＬＰ‐１部分が水溶性ポリマに、好ましくはそのＮ末端において、解放可能に有するものである。ポリマ基幹中における分解可能な連結として有効であるだけではなく、本発明の特定の好ましい実施形態の場合において、ＧＬＰ‐１部分に共有結合するために有効である加水分解連結は、以下を含む。炭酸塩、たとえばアミノおよびアルデヒドの反応によって生じるイミン（例えば、Ｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３８（ｌ）：５８２−３を参照）、例えば、アルコールとリン酸基の反応によって形成されるリン酸エステル、例えばヒドラジンとアルデヒドの反応によって形成されるヒドラゾン、アルデヒドとアルコールの反応によって形成されるアセタール、例えばギ酸塩とアルコール間の反応によって形成されるオルトエステル、およびエステル、および特定のウレタン（カルバメート）連結である。
【０２０５】
本発明による解放可能なＧＬＰ‐１複合体の調整に使用するための向インスリンＰＥＧ試薬は、米国特許第６，３４８，５５８号、第５，６１２，４６０号、第５，８４０，９００号、第５，８８０，１３１号、および第６，３７６，４７０号に記載される。
【０２０６】
本発明に使用するための付加的なＰＥＧ試薬は、２００６年６月１６日付申請の米国仮特許出願１１／４５４，９７１に記載される加水分解可能、または解放可能なＰＥＧを含む。結果として生じた複合体において、ＧＬＰ‐１部分およびポリマは、例えば、ＦｍｏｃまたはＦＭＳ、構造、および生理学的条件下において解放可能である、ｓｃａｆｆｏｌｄ芳香族のそれぞれ異なる位置に共有結合する。本明細書に記載のポリマに相当する一般化構造は以下に記載される。
【０２０７】
例えば、そのようなポリマ試薬の１つは、以下の構造を備える。
【０２０８】
【化０２７】
2009519961.tif 000019
ＰＯＬＹ１は第１の水溶性ポリマであり、ＰＯＬＹ２は第２の水溶性ポリマであり、Ｘ１は第１のスペーサ部分であり、Ｘ２は第２のスペーサ部分である。
【０２０９】
【化０２８】
2009519961.tif 000020
はイオン化水素原子ＨＯを持つ芳香族含有部分であり、Ｒ１はＨまたは有機基であり、Ｒ２はＨまたは有機基であり、（ＦＧ）は、カルバメート連結（Ｎ‐サクシニミジロキシ、１‐ベンゾトリアゾリルオキシ、オキシカルボニルイミダゾール、‐Ｏ‐Ｃ（Ｏ）‐Ｃｌ、Ｏ‐Ｃ（Ｏ）‐Ｂｒ、非置換芳香族炭酸塩基および置換芳香族炭酸塩基）のような分解可能連結を形成するための活性剤のアミノ基を反応する能力のある官能基である。ポリマ試薬は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の芳香族含有部分に付着した電子改変基を含むことができる。
【０２１０】
好ましい芳香群含有部分はニ環式および三環式の芳香族炭化水素である。融合ニ環式および三環式芳香族は、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ‐インダセン、ｓ‐インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、アントラセン、およびフルオランテンを含む。
【０２１１】
好ましいポリマ試薬は以下の構造を保有する。
【０２１２】
【化０２９】
2009519961.tif 000021
ｍＰＥＧは、ＣＨ３Ｏ‐（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２‐に相当し、Ｘ１およびＸ１はそれぞれ独立して、約１から１８の原子長を有するスペーサ部分であり、ｎは約１０から１、８００に及び、ｐは、１から８に及ぶ整数であり、Ｒ１はＨまたは低アルキル基であり、Ｒ２はＨまたは低アルキル基であり、Ａｒは芳香族炭化水素、好ましくは二環式または三環式の芳香族炭化水素である。ＦＧは上記に定義されるとおりである。好ましくは、ＦＧは、ＧＬＰ‐１上のアミノ基との反応にふさわしい活性炭酸塩エステルに相当する。好ましいスペーサ部分であるＸ１およびＸ２は、‐ＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐ＣＨ２‐Ｏ‐、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（ＯＭＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−、および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を含み、ｑは２、３、４、および５から選択される。必ずではないが、好ましくは、スペーサにおける窒素は元素部分よりもＰＥＧに最も近い。
【０２１３】
他のこのような２つの電子改変基からなる分岐（２腕）ポリマ試薬は、以下の構造を備える。
【０２１４】
【化０３０】
2009519961.tif 000022
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、
【０２１５】
【化０３１】
2009519961.tif 000023
のそれぞれ、および（ＦＧ）はすぐ上に記載のとおりであり、Ｒｅ１は第１の電子改変基であり、Ｒｅ２は第２の電子改変基である。電子改変基は、電子ども与（従って「電子ども与基」という）、または電子求引性（従って「電子吸引基」という）のいずれかの基である。イオン化水素原子を持つ芳香族含有部分に付着する場合、電子ども与基は、電子それ自体から離れて、および芳香族含有部分にさらに近づいて、またはその中で電子を位置付ける能力を有する基である。イオン化水素原子を持つ芳香族含有部分に付着する場合、電子吸引基は、電子にそれ自体にたいして、および芳香族含有部分から離れて電子を位置付ける能力を有する基である。水素は、得られた基が電子を離れた場所にまたはそれ自体に向かって配置するかどうかの決定における比較のための基準として使用される。好ましい電子改変基は、ＲはＨまたは有機基であるＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２Ｃ６Ｆ５、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）アリール、−Ｓ（Ｏ２）Ｒ、−Ｓ（Ｏ２）アリール、−Ｓ（Ｏ２）ＯＲ、−Ｓ（Ｏ２）Ｏアリール、−Ｓ（Ｏ２）ＮＨＲ、−Ｓ（Ｏ２）ＮＨアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、および同様のものを含むが、これに限らない。
【０２１６】
本発明に使用するのにふさわしい付加的な分岐ポリマ試薬は以下の構造を備える。
【０２１７】
【化０３２】
2009519961.tif 000024
ＰＯＬＹ１は第１水溶性ポリマであり、ＰＯＬＹ２は第２水溶性ポリマであり、Ｘ１は第１スペーサ部分であり、Ｘ２は第２スペーサ部分であり、Ａｒ１は第１芳香族部分であり、Ａｒ２は第２芳香族部分であり、Ｈαはイオン化水素原子であり、Ｒ１はＨまたは有機基であり、Ｒ２はＨまたは有機基であり、（ＦＧ）はカルバメート連結などのような、分解可能連結を形成するためのＧＬＰ‐１のアミノ基と反応する能力のある官能基である。
【０２１８】
他の典型的なポリマ試薬は以下の構造を備える。
【０２１９】
【化０３３】
2009519961.tif 000025
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｈα、Ｒ１、Ｒ２、および（ＦＧ）のそれぞれおよび、上記に記載のとおりであり、Ｒｅｌは第１電子改変基である。本明細書に記載されるいかなる構造においても立体化学は明確に示されていないが、記載される構造は、同量（すなわち、ラセミ混合物）および非同量における各光学異性体の混合物を備える化合物のみならず光学異性体もまた意図するものである。
【０２２０】
ＧＬＰ‐１複合体の調整において使用するためのさらに付加的なポリマ試薬は、以下の構造を保有する。
【０２２１】
【化０３４】
2009519961.tif 000026
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｈα、Ｒ１、Ｒ２のそれぞれ、および（ＦＧ）は、上記に記載のとおりであり、Ｒｅ１は第１電子改変基であり、Ｒｅ２は第２電子改変基である。
【０２２２】
好ましいポリマ試薬は以下の構造を備える。
【０２２３】
【化０３５】
2009519961.tif 000027
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈαのそれぞれおよび（ＦＧ）は、上記に記載のとおりであり、上記の構造に見られるように、芳香族部分はフルオレンである。フルオレン上に置換されたＰＯＬＹ腕は、個々のフェニル環のそれぞれ任意の位置であってよい。すなわちＰＯＬＹ１−Ｘ１−は炭素１、２、３、および４のいずれか１つに配置することができ、ＰＯＬＹ２−Ｘ２−は５、６、７、および８のいずれか１つに配置することができる。
【０２２４】
さらに別の好ましいフルオレンベースのポリマ試薬は以下の構造を備える。
【０２２５】
【化０３６】
2009519961.tif 000028
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈαのそれぞれおよび（ＦＧ）は、上記に記載のとおりであり、上記に記載のとおり、Ｒｅ１は第１電子改変基であり、Ｒｅ２は第２電子改変基である。
【０２２６】
ＧＬＰ‐１部分と結合するために、さらに別の典型的なポリマ試薬は、以下のフルオレンベースの構造を備える。
【０２２７】
【化０３７】
2009519961.tif 000029
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈαのそれぞれおよび（ＦＧ）は、上記に記載のとおりであり、Ｒｅ１は第１電子改変基であり、Ｒｅ２は第２電子改変基である。
【０２２８】
本発明による解放可能なＧＬＰ‐１ポリマ複合体を形成するための特定のフルオレンベースのポリマ試薬は以下を含む。
【０２２９】
【化０３８】
2009519961.tif 000030
さらに別の典型的なポリマ試薬は以下の構造を備える。
【０２３０】
【化０３９】
2009519961.tif 000031
ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈαのそれぞれおよび（ＦＧ）は、上記に記載のとおりであり、Ｒｅ１は第１電子改変基であり、Ｒｅ２は第２電子改変基である。ＧＬＰ‐１への共有結合のみならず、フルオレンスカフォールドを保有する好ましい分岐した解放可能ポリマ試薬の合成課程および化学構造は、実施例１、２、３、４、５、６、および２４に記載される。このような解放可能なＧＬＰ‐１複合体の調整に適した分岐した試薬は、Ｎ‐｛ジ（ｍＰＥＧ（２０，０００）オキシメチルカルボニルアミノ）フルオレン‐９‐イルトキシカルボニルオキシ｝スクシンイミド、Ｎ‐[２，７ジ（４ｍＰＥＧ（１０，０００）アミノアルボニルブチルイルアミノ）フルオレン‐９イルメトキシカルボニルオキシ]‐スクシンイミド（「Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ‐ＮＨＳ」）、およびＰＥＧ２‐ＣＡＣ‐Ｆｍｏｃ４ｋ‐ＢＴＣ（実施例２４）を含む。言うまでもなく、本明細書において以下に記載されるＰＥＧの分子量はいずれも上記の構造に使用されてもく、上記に記載の特定の活性化基はいずれの点においても限定されることを意味せず、ＧＬＰ‐１部分上に与えられる活性基との反応にふさわしい活性基化のいずれかに置換されてもよい。
【０２３１】
当業者は、ＧＬＰ‐１複合体を形成するのに使用する水溶性ポリマについて記載する前述の論考が、決して包括的で、単に実例的で、前述の品質を有するすべてのポリマ物質が予測されるものではないことを理解するであろう。本明細書では、「ポリマ試薬」という用語は概して、付加的なスペーサおよび官能基のみならず、水溶性ポリマセグメントを備えることのできる分子全体を指す。
【０２３２】
ＧＬＰ−１複合体
上記に記載されるように、本発明の複合体は、ＧＬＰ‐１部分に共有結合する（直接またはスペーサまたはリンカー部分を通じてのいずれかによって）水溶性ポリマを備える。一般的に、得られる複合体のいずれもに対して、ＧＬＰ‐１部分に共有結合する１つから４つの水溶性ポリマがある（水溶性ポリマに対して、水溶性ポリマは直接ＧＬＰ‐１部分に、またはスペーサまたはリンカー部分を通じてのいずれかによって付着する）。
【０２３３】
すなわち、本発明のＧＬＰ‐１複合体は一般的に１つ、２つ、３つ、または４つの水溶性ポリマが個別にＧＬＰ‐１部分に付着する。すなわち、特定の実施形態において、本発明の複合体は最大４つの水溶性ポリマがＧＬＰ‐１部分に個別に付着したものを保有し、または最大３つの水溶性ポリマＧＬＰ‐１部分に個別に付着したものを保有し、または最大２つの水溶性ポリマがＧＬＰ‐１部分に個別に付着したものを保有し、または最大１つの水溶性ポリマがＧＬＰ‐１部分に個別に付着したものを保有する。好ましくは、ＧＬＰ‐１部分に付着した水溶性ポリマのそれぞれの構造は同一である。本発明によるとりわけ好ましいＧＬＰ‐１複合体は、ＧＬＰ‐１のＮ末端に解放可能に水溶性ポリマを有するものである。付加的な水溶性ポリマは、たとえば１つまたは２つの付加的部位などのＧＬＰ‐１部分上の他の部位に解放可能に付着してもよい。たとえば、Ｎ末端に水溶性ポリマを解放可能に付着するＧＬＰ‐１複合体は、付加的に、Ｌｙｓ２６、および／またはＬｙｓ３４に解放可能に付着する水溶性ポリマを保有してもよい。本発明の別の特定の好ましい複合体はアミノ‐ＧＬＰポリマ複合体、すなわちそこに１つの水溶性ポリマを共有結合するＧＬＰ‐１部分を有するものである。その上さらに好ましくは、水溶性ポリマがＮ末端においてＧＬＰ‐１部分に解放可能に付着するものである。
【０２３４】
好ましくは、本発明のＧＬＰ‐１ポリマ複合体は金属イオン不在である、すなわちＧＬＰ‐１部分が金属インにキレートしないものである。
【０２３５】
本明細書に記載されるＧＬＰ‐１ポリマ複合体に対しては、ＧＬＰ‐１部分は、例えば、７‐Ｈｉｓ、８‐Ａｌａ、および９‐グルタミン酸位置の１つ以上のいずれかの、任意に１つ以上のＮ‐メチル置換基を保有する。もうひとつの方法としては、本明細書に記載のＧＬＰ‐１ポリマ複合体に対しては、ＧＬＰ‐１部分は、例えば１つ以上の部位に共有結合が指定されている単糖類、または二糖類を有するグリコシル化されていてもよい。とりわけ好ましいグリコシル化部位はＮ末端、Ａｌａ８、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｕ２１、Ｇｌｙ２２、Ｇｌｎ２３、Ｌｙｓ２６、およびＬｙｓ３４を含む。
【０２３６】
本明細書に記載のとおり、本発明の化合物は、本技術における技量を有する者によって周知であり、利用することのできるさまざまな方法および技法のいずれによって生成されてもよい。
【０２３７】
連結
ＧＬＰ‐１部分と水溶性ポリマ（または水溶性ポリマに付着したスペーサ部分）との間の特定の連結は要因数によって決まる。そのような要因は、例えば、特定の連結化学の採用、特定のＧＬＰ‐１部分、ＧＬＰ‐１部分内における利用できる官能基（ポリマに対する付着あるいはふさわしい付着部位に対する変換のいずれか）、メチル化および／またはグリコシル化によるＧＬＰ‐１部分内における付加的官能基の可能な存在、および同様のものを含む。
【０２３８】
本発明の１つ以上の実施形態において、ＧＬＰ‐１部分と水溶性ポリマ間における連結は解放可能な連結である。すなわち、水溶性ポリマは（加水分解、酵素処理、またはその他のいずれかを通じて）開裂され、結果として天然または複合していないＧＬＰ‐１部分を生じる。好ましくは、解放可能な連結は加水分解可能な連結であり、加水分解によって、天然ＧＬＰ‐１部分または若干の改変版が解放される。解放可能な連結は、ＧＬＰ‐１部分に付着した水溶性ポリマ（および／またはスペーサまたはリンカー部分）の任意のフラグメントを残さずに、インビボ（およびインビボ）でＧＬＰ‐１部分から分離する水溶性ポリマ（および任意のスペーサ部分）の結果になってもよい。典型的な連結は、炭酸塩、カルボン酸エステル、リン酸エステル、チオールエステル、無水物、アセタール、ケタール、アシロキシアルキルエテル、イミン、カルバメート、およびオルトエステルを含む。このような連結はＧＬＰ‐１部分および／または本技術において通常採用される連結方法を用いたポリマ試薬の反応によって容易に形成される。加水分解性結合は、適切に活性化されたポリマとＧＬＰ‐１部分内に含まれる非改変官能基との反応によってしばしば容易に形成される。水溶性ポリマの共有結合のための好ましい位置は、内部リジンのみならず、Ｎ末端、Ｃ末端を含む。好ましい解放可能な連結は、カルバメートおよびエステルを含む。
【０２３９】
一般的に言えば、本発明の好ましい複合体は以下の一般化構造を保有する。
【０２４０】
【化０４０】
2009519961.tif 000032
ＰＯＬＹは、表に記載される実例となるポリマ試薬のいずれかのような水溶性ポリマであり、ＬＤは加水分解性結合であり、ｋは１、２、および３から選択された整数である。上記の一般化構造において、ＬＤはそれ自体、加水分解性結合（たとえば、カルバメートまたはエステル連結）を示す一方、「ＰＯＬＹ」は、付加的なリンカー、またはポリマ繰り返し単位と加水分解性結合間に介入するスペーサ原子のみならず、例えばＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎなどのポリマ繰り返し単位を含むこと意味する。本発明の好ましい実施形態において、水溶性ポリマ分子の少なくとも１つが、ＧＬＰ‐１のＮ末端に共有結合する。本発明の１つの実施形態において、ｋは１と同等であり、ＬＤは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり、アミノ基を代表する−ＮＨ−はＧＬＰ‐１残留物の一部である。
【０２４１】
解放可能な連結が望ましいが、ＧＬＰ‐１部分と水溶性ポリマ（ポリマに付着するまたはリンカー部分）間における連結は、アミド、ウレタン（カルバメートとしても知られる）、アミン、チオエテル（硫化物としても知られる）、または尿素（カルバミドとしても知られる）などの加水分解に安定な連であってもよい。本発明のこのような実施形態の１つは、ＰＥＧがＧＬＰ‐１のＮ末端に共有結合するような水溶性ポリマを有するＧＬＰ‐１を備える。このような例において、Ｎ末端残留物のアルキル化はＮ末端窒素上での電化の保持を可能にする。
【０２４２】
連結に関しては、本発明の１つ以上の実施形態において、直接または１つ以上の原子から成るリンカーを通じて水溶性ポリマに、アミノ酸残留物において共有結合するＧＬＰ‐部分を備える複合体がもたらされる。
【０２４３】
複合体（複合していないＧＬＰ‐１部分に反して）はＧＬＰ‐１活性の測定可能な度合いを保有してもよく、または保有しなくてもよい。すなわち、本発明による複合体は、一般に、約０％から約１００％またはそれ以上の非改変された親ＧＬＰ‐１部分の生物活性を保有する。一般的に、わずかな、または少しのＧＬＰ‐１活性も保有しない化合物はＧＬＰ‐１部分にポリマが連結している解放可能な連結を含んでいるため、複合体の活性の欠如に関わらず、活性親分子（またはＧＬＰ‐１活性を有する誘導体）は連結の分解（例えば、連結の水性誘発開裂における加水分解）によって解放される。この様な活性は、ＧＬＰ‐１活性採用を有する特定の部分の既知の活性次第でふさわしいインビトロまたはインビボモデル使用によって決定されてもよい。
【０２４４】
任意に、連結の分解は、水分性開裂および／または、ウレタン、アミド、特定のカルバメート、炭酸塩またはエステル含有連結などの酵素的分解連結の使用を通じて促進される。この方法において、個々の水溶性ポリマの開裂を介した複合体の除去は、ポリマ分子サイズ、および望ましい除去特性をもたらすための官能基の種類を選択することによって調節することができる。ある特定の例において、ポリマ複合体の混合物は、ＧＬＰ‐１部分の解放（加水分解率）を変更するのに有効な構造的または他の違いを保有する場合、採用され、望ましい持続的な送達を得ることができる。
【０２４５】
本技術における通常の技量を有する者は、投与方法を含むいくつかの要因次第で、開裂性官能基のみならず、ポリマの適切な分子サイズを決定することができる。例えば、所定の実験を使用した、本技術における通常の技術のひとつは、異なる重量平均分子量、分解可能な官能基、および化学構造をもつ様々なポリマ（ＧＬＰ‐１）を最初に調製し、複合体を患者に投与し、定期的な血液および／または尿サンプルを得ることによる各複合体の除去特徴を得ることで、適切なな分子サイズおよび開裂性官能基を決定できる。各試験された複合体のための除去特徴の一組が一度得られると、望ましい除去特性を有する複合体または複合体の混合物が決定できる。
【０２４６】
ＧＬＰ‐１部分が水溶性ポリマに連結する加水分解に安定な連結を保有することについては、複合体は一般にＧＬＰ‐１活性の測定可能な度合を保有する。例えば、そのような複合体は、一般に、複合していないＧＬＰ‐１部分に相対して生物学的に十分な１つ以上の以下の割合を有することが特徴付けられる。少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約１００％、および１０５％以上（本明細書に記載されるようなおよび／または本技術に既知の適切な方法で測定された場合）。しばしば、加水分解に安定な連結を有する複合体（例えばアミノ連結）は、非改変された親ＧＬＰ‐１部分の生物活性の少なくともある度合いを保有する。それらの拡張された半減期のため、
本発明による典型的な複合体は、ここに記載される。
【０２４７】
ＧＬＰ‐１部分は、（少なくとも部分的に）人ＧＬＰ‐１と類似または関連するアミノ酸配列を共有すると期待される。したがって、前述に示されるように、ＧＬＰ‐１内の特定の位置または原子に対して参照が成される場合に、このような参照は都合上のみであり、本技術における通常の技量を有する者が、ＧＬＰ‐１活性を有する他の部分における、相当する位置または原子をたやすく決定できるものである。とりわけ、人ＧＬＰ‐１のために本明細書で提供される記述もまた、しばしば人ＧＬＰ‐１に対して適切であるだけではなく、前述のフラグメント、欠損変異体、サブステーション変異体および付加変異体いずれかに対して適切である。
【０２４８】
ＧＬＰ‐１部分上のアミノ基はＧＬＰ‐１部分と水溶性ポリマ間における付着位置を提供する。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ．各１および２は２つのリジン残留物を備え、各リジン残留物は、１つのアミノ末端のみならず、複合に利用可能であるようなε−アミノ基を含有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２参照。したがって、典型的な付着位置は、２６および３４のいずれかまたは両方におけるアミノ酸（リジン残留物のアミノ含有側鎖を通じ）を含む。ＧＬＰ‐１の一般的な付着位置は、２６、３４、およびＮ末端位置のいずれか１つにおける付着を含む。１つ以上の実施形態において、付着は、２６、３４、またはＮ末端位置（Ｈｉｓ  ７）のいずれか１つにおける単独付着である。
【０２４９】
ＧＬＰ‐１部分の利用できるアミンを伴う共有結合形成に利用可能な適切な水溶性ポリマ残留物の例がたくさんある。対応複合体と並んで、ある特定の例は以下の表１に提供される。表中、変数（ｎ）は、繰り返し単量単位の数を表し、「（ＧＬＰ−１）」は、水性ポリマに結合に続くＧＬＰ‐１部分を表す。
さらに各ポリマ特長は、表１に表される末端［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は「ＣＨ３」基において停止し、他の基（Ｈおよびベンジルなど）は置き換えられる。
【０２５０】
当業者に明白に理解されるように、ＧＬＰ‐１アミノ基を伴う反応から結果として生じる以下に定義するような複合体について、ＧＬＰ‐１指定「〜ＮＨ−ＧＬＰ−１」から伸びているアミノ基分は、〜ＮＨ‐がＧＬＰ‐１部分のアミノ基である、ＧＬＰ‐１部分それ自体の試薬をあらわす。以下に示すポリマ試薬のための付着の好ましい部位の１つは、Ｎ末端である。さらに、本明細書の表における複合体は、ＧＬＰ‐１部分に単独の水溶性ポリマが共有結合することを説明するが、右側の複合体構造は、例えば、２、３、または４つの水溶性ポリマ分子などの、ＧＬＰ‐１に共有結合する１つ以上の水溶性ポリマを有する複合体も含有するということを意味することを理解するべきである。
【０２５１】
【表００１−０１】
2009519961.tif 000033
【０２５２】
【表００１−０２】
2009519961.tif 000034
【０２５３】
【表００１−０３】
2009519961.tif 000035
【０２５４】
【表００１−０４】
2009519961.tif 000036
【０２５５】
【表００１−０５】
2009519961.tif 000037
【０２５６】
【表００１−０６】
2009519961.tif 000038
【０２５７】
【表００１−０７】
2009519961.tif 000039
【０２５８】
【表００１−０８】
2009519961.tif 000040
【０２５９】
【表００１−０９】
2009519961.tif 000041
ＧＬＰ‐１部分のアミン基にたいするポリマ試薬の共役は様々な技術によって達成することができる。ひとつの方法においては、ＧＬＰ‐１部分は、スクシンイミジル誘導体（例えば、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジエステル）などの活性エステルをにより官能基化されたポリマ試薬に共役する。この方法において、反応セステールを持つポリマ試薬は、例えば、ｐＨ範囲が約３から約８、約３から約１、または約４から約６．５の、適切なｐＨ条件下における水媒体においてＧＬＰ‐１部分と反応する。大部分のポリマ活性エステルは、例えば、７．０の生理学的ｐＨにおいてＧＬＰ‐１などの対象タンパク質と結合する。しかしながら、より少ない反応誘導体は、さらに高いｐＨを必要とすることがある。一般に、活性化されたＰＥＧは、内部リジンとの共有結合のために、約７．０から約１０．０のｐＨで、ＧＬＰ‐１のようなタンパク質に付着することができる。一般に、例えば、４から約５．７５のさらに低いｐＨはＮ末端に共有結合するために使用される。したがって、異なる反応条件（例えば、異なるｐＨまたは異なる温度）はＧＬＰ‐１部分上（例えば、内部リジンに対するＮ末端）への、ＰＥＧなどの水溶性ポリマの異なる位置への付着の結果になることがある。さらに低い温度がとりわけ不安定なＧＬＰ‐１部分に対して必要とされることがあるが、結合反応はしばしば室温で実行することができる。反応時間は一般的に、約数分、例えば３０分、３０分から１時間、例えば約１時間から３６時間）であり、ｐＨおよび反応の温度左右される。例えばアルデヒド基を持つＰＥＧ試薬をもちいたＮ末端ＰＥＧ化は、一般に、ｐＨが約５〜１０、約６から３６時間の、穏やかな条件下で行われる。ＧＬＰ‐１部分に対するポリマ試薬のさまざまな比率は、例えば、等モル比率が、ポリマ試薬の過剰１０倍モルまでから採用されてもよい。一般に、ポリマ試薬の過剰５倍モルまでが十分である。
【０２６０】
ある例において、部位特定共有結合が、当技術分野において既知の、一般的に採用される保護／脱保護手段を使用することが望ましい場合、あるアミノ酸を、特定のポリマ試薬との反応から保護することが望ましいこともある。ＧＬＰ‐１のＮ末端において選択的に共役するモノ‐ＧＬＰ‐１複合体は、保護／または脱保護方法の採用を必要とすることなく、本明細書の実施例に詳しく述べるように調製された。
【０２６１】
直接結合反応への別の手段において、ＰＥＧ試薬は、ペプチド合成の間、ＧＬＰ‐１部分の望ましい位置において組み込まれてもよい。この様にして、１つ以上のＰＥＧの部位選択的導入は達成することができる。例えば、共役ペプチドの部位選択的合成を記載する国際公開広報第ＷＯ  ９５／００１６２号を参照。
【０２６２】
例えば、ＧＬＰ‐１のアミノ基と結合するための反応エステルを含むポリマ試薬を使用して調製される典型的な複合体は、以下のアルファ分岐構造を備える。
【０２６３】
【化０４１】
2009519961.tif 000042
ＰＯＬＹは水溶性ポリマであり、（ａ）はゼロまたは１のいずれかであり、存在する場合、Ｘ１は１つ以上の原子からなるスペーサ部分であり、Ｒ１は水素原子有機ラジカルであり、「〜ＮＨ−ＧＬＰ−１」はＧＬＰ‐１部分の残留物を表し、下線のアミノ基はＧＬＰ‐１部分のアミノ基を表す。
【０２６４】
前項において示されたものに相当する構造に関しては、本明細書で提供される水溶性ポリマのいずれもがＰＯＬＹとして定義することができ、本明細書で提供されるスペーサ部分のいずれもがＸ１（存在する場合）として定義することができ、本明細書で提供される有機ラジアルのいずれもがＲ１（例において、Ｒは水素ではない）として定義することができ、本明細書で提供されるＧＬＰ‐１部分はＧＬＰ‐１として定義することができる。前項において示される構造に相当する１つ以上の実施形態においてＰＯＬＹは、Ｈ３ＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−などの、ポリ（エチレングリコール）であり、（ｎ）は、３から４０００、さらに好ましくは１０から約１８００の値を有する整数であり、（ａ）は１であり、Ｘ１は、メチレン（例えば、−ＣＨ２−）、エチレン（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）およびプロピレン（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）から選択されたＣ１−６アルキレンであり、Ｒ１はＨまたはメチルまたはエチルなどの低アルキル基であり、ＧＬＰ−１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に相当する。
【０２６５】
ポリマ試薬にたいしてＧＬＰ‐１部分を共役するための一般的な別の方法は、還元的アミノ化である。一般的に、還元的アミノ化は、ポリマ試薬がケトン、アルデヒドを用いるか、またはその水和されたもの（例えば、ケトン水和物およびアルデヒド水和物）によって官能基化されたものを有したＧＬＰ‐１部分の初期アミノを共役するために採用される。この方法において、ＧＬＰ‐１部分からの初期アミノ（例えば、Ｎ末端）はアルデヒドまたはケトンのカルボニル基と反応し（または、水酸化アルデヒド、またはケトンの相当するヒドロキシ含有基）、それによってシッフベースを形成する。言い換えると、シッフベースは、水素化ホウ素ナトリウムまたは他のふさわしい還元剤などの還元剤の使用を通じて安定した複合体にｒｅｄｕｃｔｉｖｅｌｙ転向される。選択的反応（例えば、Ｎ末端において可能）、とりわけケトンおよびアルファメチル分岐アルデヒドとのポリマ官能基化および／または特定の反応条件下（例えば、減少されたｐＨ）において可能である。
【０２６６】
例えば、アルデヒド（またはアルデヒド水和物）またはケトンまたは（ケトン水和物）を含むポリマ試薬を使用して調整することができる典型的な複合体は、以下の構造を保有する。
【０２６７】
【化０４２】
2009519961.tif 000043
ＰＯＬＹは水溶性ポリマであり、（ｄ）はゼロまたは１のいずれかであり、存在するならば、Ｘ２は１つ以上の原子から成るスペーサ部分であり、（ｂ）は１から１０の値を有する整数であり、（ｃ）は１から１０の値を有する整数であり、Ｒは、各存在において、単独でＨまたは有機ラジカルであり、Ｒ３は、各存在において、独立でＨまたは有機ラジカルであり、「〜ＮＨ−ＧＬＰ−１」はＧＬＰ‐１部分の残留物を示し、下線のアミノ基はＧＬＰ‐１部分のアミノ基を示す。
【０２６８】
本発明のさらに他の具体的複合体は以下の構造を保有する。
【０２６９】
【化０４３】
2009519961.tif 000044
ｋは１から３の範囲であり、ｎは１０から約１８００の範囲である。
【０２７０】
前項において示されたものに相当する構造に関しては、本明細書で提供される水溶性ポリマのいずれもがＰＯＬＹとして定義することができ、本明細書で提供されるスペーサ部分のいずれもがＸ２（存在する場合）として定義することができ、本明細書で提供される有機ラジアルのいずれもがＲ２およびＲ３（例において、Ｒ２およびＲ３は独立してで水素ではない）として定義することができ、本明細書で提供されるＧＬＰ‐１部分はＧＬＰ‐１として定義することができる。前項において示される構造に相当する１つ以上の実施形態においてＰＯＬＹは、Ｈ３ＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−などの、ポリ（エチレングリコール）であり、（ｎ）は、３から４０００、さらに好ましくは１０から約１８００の値を有する整数であり、（ｄ）は１であり、Ｘ１は、アミド［例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−］、（ｂ）は、４などの２から６であり、（ｃ）は、４などの２から６であり、各Ｒ２およびＲ３は、低アルキル基の時、たとえばメチルなどの独立してＨまたは低アルキル基であり、ＧＬＰ−１は人ＧＬＰ−１である。
【０２７１】
本発明によるＧＬＰ‐１複合体の別の例は、以下の構造を有する。
【０２７２】
【化０４４】
2009519961.tif 000045
各（ｎ）は、３から４０００、好ましくは１０から１８００の値を有する整数であり、Ｘ２は上記に記載のとおりであり、（ｂ）は２から６であり、（ｃ）は２から６であり、Ｒ２は、各存在において、独立してＨまたは低アルキル基であり、「〜ＮＨ−ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ‐１部分の残留物を表し、下線のアミノ基はＧＬＰ‐１部分のアミノ基を表す。
【０２７３】
水溶性ポリマとＧＬＰ‐１のアミノ基との反応の結果生じる付加的なＧＬＰ‐１ポリマ複合体は以下に提供される。以下の複合体構造は解放可能である。このような構造の１つは以下と相当する。
【０２７４】
【化０４５】
2009519961.tif 000046
ｍＰＥＧはＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎは１０から１８００の範囲であり、ｐは１から８の範囲の整数であり、Ｒ１はＨまたは低アルキル基であり、Ｒ２はＨまたは低アルキル基であり、Ａｒは、縮合二環系または三環系芳香族炭化水素などの芳香族炭化水素であり、Ｘ１およびＸ２は、１から約１８原子の原子長を有する各独立してスペーサ部分であり、〜ＮＨ−ＧＬＰ−１は、上記に記載のとおりであり、ｋは１、２、および３から選択される整数である。Ｋの値は、ＧＬＰ‐１部分上の異なる部位に吹かされた水溶性ポリマ分子の数を示す。好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は共にＨである。スペーサ部分であるＸ１およびＸ２は好ましくは各自１つのアミド結合を含む。好ましい実施形態において、Ｘ１およびＸ２は同一である。好ましいスペーサ、すなわちＸ１およびＸ２は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−、および−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を含み、ｑは２、３、４、および５から選択される。スペーサはいずれかの方向にあることができるが、好ましくは窒素は、芳香族部分よりはＰＥＧに最も近接する。具体的な芳香族部分は、ペンタレン、インデン、ナフタレン、インダセン、アセナフチレン、およびフルオレンを含む。
【０２７５】
この種類の特に好ましい複合体は以下に提供される。
【０２７６】
【化０４６】
2009519961.tif 000047
【０２７７】
【化０４７】
2009519961.tif 000048
解放可能なＧＬＰ‐１のアミノ基との共有結合の結果として発生する付加的なＧＬＰ‐１複合体は以下を含む。
【０２７８】
【化０４８】
2009519961.tif 000049
ＬＤ１は−Ｏ−または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−のいずれかであり、Ａｒは、オルト、メタ、または、パラ置換フェニルなどの芳香族基であり、ｋは１、２、および３から選択された整数である。この種類の特定の複合体は以下を含む。
【０２７９】
【化０４９】
2009519961.tif 000050
ｎは約１０から約１８００の範囲である。
【０２８０】
本発明による付加的な解放可能な複合体は、米国特許第６，２１４，９６６号に記載される水溶性ポリマ試薬を使用して調整される。このような水溶性ポリマは分解可能であり、活性剤に対する共有結合に近接して、少なくとも１つの加水分解可能なエステル連結を保有する。ポリマは、概して以下のＰＥＧ−Ｗ−ＣＯ２−ＮＨＳまたは同等の活性化エステルの構造を保有する。
Ｗ＝    −Ｏ２Ｃ−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−                      ｂ＝ｌ−５
−Ｏ−（ＣＨ２）ｂＣＯ２−（ＣＨ２）ｃ−            ｂ＝１−５，ｃ＝２−５
−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２−（ＣＨ２）ｃ−Ｏ−      ｂ＝１−５、ｃ＝２−５
ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルである。加水分解において、結果によって生じた解放された活性剤、例えばＧＬＰ‐１は、ポリマ試薬のエステル官能基の加水分解の結果によって生じた短いタグを保有する。この種類の具体的な解放可能な複合体は以下を含む。ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＧＬＰ−ｌ、およびｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＧＬＰ−１、ＧＬＰ‐１に付着された水溶性ポリマの数は１から４であるか、またはさらに好ましくは１から３である。
【０２８１】
カルボニル結合結果によって生ずる複合体
カルボニル基は、ＧＬＰ‐１部分との付着位置としての役目を果たすことができる別の官能基を表す。構造的に、複合体は以下を備える。
【０２８２】
（ＧＬＰ−１）−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＰＯＬＹ
ＧＬＰ−１−Ｃ（Ｏ）〜はＧＬＰ‐１部分の残留物に相当し、カルボニルはＧＬＰ‐１部分のカルボニル（カルボキシ基から生成される）であり、Ｘは、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、およびＳから選択されるヘテロ原子などのスペーサ部分であり、ＰＯＬＹは、エンドキャッピング部分において任意に停止しているＰＥＧなどの水溶性ポリマである。
【０２８３】
Ｃ（Ｏ）−Ｘ連結は、末端官能基を持つポリマ誘導体とカルボキシル含有ＧＬＰ‐１部分間における反応の結果生じる。上記に記載されるように、特定の連結は使用される官能基の種類に左右される。ポリマが末端官能基化される、または水酸基で「活性化」される場合、その結果として生じる連結はカルボン酸エステルであり、ＸはＯである。ポリマ基幹がチオール基で官能基化される場合、その結果として生じる連結はチオエステルであり、ＸはＳである。特定の多腕、分岐または叉状ポリマが採用される場合、Ｃ（Ｏ）Ｘ部分、およびとりわけＸ部分は、比較的複雑であり、さらに長い連結構造を含むことがある。
【０２８４】
ヒドラジド部分を含むポリマ試薬は、カルボニルにおける共役に適している。ＧＬＰ‐１部分がカルボニル部分を含まない限り、カルボニル部分は任意のカルボン酸官能基（例えばＣ末端カルボン酸）を減少させることによって導入することができる。ヒドラジド部分を備えるポリマ試薬の具体的な例は、対応複合体とともに、以下の表２に提供される。加えて、活性化エステル（例えば、スクシンイミジル基）を備えるポリマ試薬は、ポリマ活性化エステルとヒドラジン（ＮＨ２−ＮＨ２）またはｔｅｒｔ−ブチルカルバジン酸［ＮＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３］との反応によって含有ヒドラジド部分に転向される。表中、変数（ｎ）は、繰り返し単量単位の数を表し、「＝Ｃ−（ＧＬＰ−１）」は、直後のポリマ試薬との共役ＧＬＰ‐１部分の残留物を表し、下線を付されたＣは、ＧＬＰ−１部分の一部である。任意に、ヒドラゾン連結は、適切な還元剤の使用により減少することができる。表２に示される各ポリマ部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は「ＣＨ３」基内で停止する一方、他の基（Ｈおよびベンジルなど）は置き換えられる。
【０２８５】
【表００２−０１】
2009519961.tif 000051
【０２８６】
【表００２−０２】
2009519961.tif 000052
【０２８７】
【表００２−０３】
2009519961.tif 000053
チオール結合結果によって生ずる複合体
ＧＬＰ‐１部分内に含まれるチオール基は水溶性ポリマにたいする付着の効果的な部位としての役目を果たす。ＧＬＰ‐部分のシステイン残留物に含まれるチオール基は、例えば、米国特許第５，７３９，２０８、ＷＯ  ０１／６２８２７、および以下の表３に記載されるように、例えば、Ｎマレイミジルポリマまたは他の誘導体などの、チオール基との反応に特定の活性化ＰＥＧと反応することができる。本発明の実施形態に使用するＧＬＰ−１部分はＷＯ  ２００４／０９３８２３に記載されるものを含む。
【０２８８】
対応複合体と共に、試薬の特定の例は、以下の表３に提供される。表中、変数（ｎ）は繰り返しモノマー単位の数を表し、「−Ｓ−（ＧＬＰ−１）」は、水溶性ポリマとの共役直後のＧＬＰ‐１部分の残留物を表し、Ｓは、ＧＬＰ‐１チオール基の残留物を表す。表３に示される各ポリマ部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は「ＣＨ３」基内で停止する一方、他のエンドキャッピング群（Ｈおよびベンジルなど）または反応基が使用され場合がある。
【０２８９】
【表００３−０１】
2009519961.tif 000054
【０２９０】
【表００３−０２】
2009519961.tif 000055
【０２９１】
【表００３−０３】
2009519961.tif 000056
【０２９２】
【表００３−０４】
2009519961.tif 000057
１つ以上のマレイミド官能基（マレイミドがＧＬＰ‐１部分のアミンまたはチオール基と反応するとしないとにかかわらず）を持つ水溶性ポリマから形成される複合体については、相当する水溶性ポリマのマレアミン酸形成もまたＧＬＰ‐１部分と反応することができる。特定の条件下において、（例えば、約７〜９のｐＨおよび水の存在において）、マレイミド環は、相当のマレアミン酸を形成するために「開く」。言い換えると、マレアミン酸は、ＧＬＰ‐１部分のアミンまたはチオール基と反応することができる。典型的なマレアミン酸ベースの反応は、概略的に以下に示す。ＰＯＬＹは水溶性ポリマを表し、−Ｓ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ‐１部分の残留物を表し、ＳはＧＬＰ‐１のチオール基から生成される。
【０２９３】
【化０５０】
2009519961.tif 000058
チオールＰＥＧ化は、ＧＬＰ‐１部分上の３つのチオールに特有である。一般的に、ポリママレイミドは、メルカプト基含有ＧＬＰ‐にｐＨ範囲約６〜９（例えば６、６．５、７、７．５、８、８．５、または９）で、さらに好ましくはｐＨ範囲約７から９で、さらにもっと好ましくは約７から８ｐＨで共役する。概して、ポリママレイミドの、例えば１．５から１５倍モル過剰、好ましくは２倍から１０倍のわずかなモル過剰が採用される。反応時間は概して、室温で、約１５分から例えば８時間以上の数時間の範囲である。立体的に込み合ったメルカプト基については、必要とされる反応時間は著しく長い場合がある。チオール選択共役は、好ましくはｐＨ７前後で行われる。共役反応の温度は一般的に、必ずしもそうではないが、約０°Ｃから約４０°Ｃであり、共役はしばしば室温またはそれ以下の温度で達成される。共役はしばしばリン酸塩、またはアセテート緩衝または同様のシステムなどの緩衝内で達成される。
【０２９４】
試薬濃縮については、ポリマ試薬の過剰は一般にＧＬＰ‐１部分と混合される。共役反応は、実質上それ以上共役が起こらなくなるまで続けることができ、反応を長期にわたって観察することによって決定することができる。
【０２９５】
反応の進行は、さまざまな時間点における反応混合物からのアリコートを抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、または他のふさわしい分析方によって反応混合物を分Ｓ刑することによって観察することができる。複合形成の量、または複合していないポリマ残存量に関して平坦域に達した場合、反応は完了したと想定される。一般的に、共役反応は数分から数時間を要する（例えば、５分から２４時間またはそれ以上）。反応の結果によって生じた生成混合物は、過剰試薬、複合していない反応剤（例えば、ＧＬＰ‐１）、望ましくない多複合種、およびフリーポリマまたは非反応ポリマを析出するために、好ましくは精製されるがそうとは限らない。反応の結果によって生じた複合体は、ＭＡＬＤＩ、キャピラリ電気泳動、ゲル電気泳動、および／またはクロマトグラフィなどの分析方法を使用してさらに特徴付けることができる。
【０２９６】
１つ以上のＧＬＰ‐１チオール基との反応によって形成される具体的なＧＬＰ‐１複合体は、以下の構造を保有する場合がある。
【０２９７】
ＰＯＬＹ−Ｌ０，１−Ｃ（Ｏ）Ｚ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−（ＧＬＰ−１）
ＰＯＬＹは水溶性ポリマであり、Ｌは任意のリンカーであり、ＺはＯからなる群から選択されたヘテロ原子であり、ＮＨ、およびＳ、およびＹはＣ２−１０アルキル、Ｃ２−１０置換アルキル、アリール、および置換アリールからなる群から選択され、−Ｓ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ‐１部分の残留物であり、ＳはＧＬＰ‐１チオール基の残留物を表す。ＧＬＰ‐１部分と結果によって生じたこの複合体の種類との反応にふさわしいこのようなポリマ試薬は、参照することによって組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００１４９０３号に記載される。
【０２９８】
ＧＬＰ‐１チオール基との反応にふさわしいポリマ試薬については、本明細書に記載されるものおよび商業的供給元（例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ  ＡＬ）から得られるものである。加えて、ポリマ試薬調製の方法は本文献に記載される。
【０２９９】
付加的な複合体および特性
本発明の任意のＧＬＰ‐１複合体の件として、ＧＬＰ‐１部分と水溶性ポリマ間の付着は、ＧＬＰ‐１部分とポリマ間に位置する原子の妨げがない場合、直接であり、ＧＬＰ‐１部分とポリマ間に位置する１つ以上の原子がある場合、非直接であることがある。非直接付着に関しては「スペーサまたはリンカー部分」はＧＬＰ‐１部分と水溶性ポリマ間の連結としての役目を果たす。スペーサ部分を作り上げる１つ以上の原子は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、およびこれらの組み合せを含んでもよい。スペーサ部分はアミド、第２級アミン、アルバメート、チオエテル、および／または二硫化基を備えてもよい。特定のスペーサ部分（「Ｘ」、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３を含む）の限定されない例は、以下から成る基から選択されるものを含む。−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，
−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−[ＣＨ２]ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、二価シクロアルキル基、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ酸、−Ｎ（Ｒ６）−、および前述のいずれかの２つ以上の組み合せであり、そこではＲ６はＨまたはアルキルから成る基から選択される有機ラジカル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、置換アルキニル、アリールおよび置換アリールであり、（ｈ）は０から６であり、（ｊ）は０から２０である。他の特定スペーサ部分は以下の構造を有する。−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１−６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、構造に含まれる各メチレンに続く下付きの値、例えば（ＣＨ２）１−６は、構造が１、２、３、４、５または６メチレンを含むことがあることを意味する。さらに、上記のスペーサ部分のいずれかは、さらに、１つから２０のエチレンオキシドモノマー単位、［すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２０］を備える、エチレンオキシドオリゴマー鎖を含む。すなわち、エチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサ部分の前後において、任意に、２つ以上の原子を含むスペーサ部分の任意の２つの原子間に発生することがある。また、オリゴマー鎖は、オリゴマーがポリマセグメントに隣接し、ポリマセグメントの伸長を示すに過ぎない場合、スペーサ部分の一部とは見なされない。
【０３００】
上記に示すように、ある例においては、水溶性ポリマ（ＧＬＰ‐１）複合体は非線形水溶性ポリマを含む場合がある。このような非線形水溶性ポリマは、分岐水溶性ポリマ（他の非線形水溶性ポリマも考慮するが）を網羅する。したがって、本発明の１つ以上の実施形態において、複合体は、直接的に、または１つ以上の原子より成るスペーサ部分を介したいずれかによって、共有結合する内部アミン、またはＮ末端アミンを有するＧＬＰ‐１部分を有する。本明細書で使用されるように、内部アミンは、Ｎ末端アミノ酸（Ｎ末端アミンだけではなく、Ｎ末端アミノ酸の側鎖上のどんなアミンもという意味）の部分ではないアミンである。
【０３０１】
このような複合体は、ＧＬＰ‐１部分の内部アミノ酸においてＧＬＰ‐１部分に付着する分岐水溶性ポリマを含むが、付加的な分岐水溶性ポリマも、他の位置において同一のＧＬＰ‐１部分に付着することができる。したがって、例えば、ＧＬＰ‐１部分の内部アミノ酸において、ＧＬＰ‐１部分に付着する（直接またはスペーサ部分を通じたいずれかで）分岐水溶性ポリマを含む複合体は、さらに、直接または１つ以上の原子からなるスペーサ部分を通じたいずれかで、例えばＮ末端アミンにおいて、Ｎ末端アミノ酸残留物に共有結合する付加的な分岐水溶性ポリマを含む。
【０３０２】
上記に記載されるように、一部の例においては、分岐水溶性ポリマは、「−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯ−」基を介してリジンのアミン基に結合するポリマの一部が、リジン残留物を欠く場合がある。さらに他の例において、分岐水溶性ポリマはリジン残留物を欠く（リジン残留物は分岐を生じるために使用される）。
【０３０３】
好ましい分岐水溶性ポリマの１つは、以下の構造を備える。
【０３０４】
【化０５１】
2009519961.tif 000059
各（ｎ）は独立して３から４０００の値、またはさらに好ましくは約１０から１８００の値を有する整数である。
【０３０５】
また、本発明の形成部は、ＧＬＰ‐１部分の共有結合の能力に各自ふさわしい３つ以上のポリマ腕を有する、ポリマスカフォールドを備える多腕ポリマ複合体である。
【０３０６】
本発明の実施形態による典型的な複合体は、概して以下の構造を備える。
【０３０７】
Ｒ−（−ＰＯＬＹ−ＬＤ−ＧＬＰ−１）ｙ
Ｒは上記に記載のとおり核分子であり、ＰＯＬＹは水溶性ポリマであり、ＬＤは、例えば、加水分解性結合のように分解可能であり、ｙは約２から１５の範囲である。
【０３０８】
さらにとりわけ、このようは複合体は以下の構造を備えてもよい。
【０３０９】
【化０５２】
2009519961.tif 000060
ｍは３、４、５、６、７、および８から選択される。
【０３１０】
さらに関連する実施形態において、ＧＬＰ‐１複合体は以下の構造に相当してもよい。
【０３１１】
【化０５３】
2009519961.tif 000061
Ｒは上記に記載のとおり核分子であり、Ｐはスペーサであり、Ｚは−Ｏ−であり、−ＮＨ−、または−ＣＨ２−、−Ｏ−ＧＬＰ−１はＧＬＰ‐１部分の水酸基残留物であり、ｙは３から１５である。好ましくは、−ＮＨ−Ｐ−Ｚ−Ｃ（Ｏ）−は、自然発生または非自然発生のアミノ酸である。
【０３１２】
本発明によるさらに典型的な複合体は、本明細書実施例、４〜２６に提供される。
【０３１３】
精製
本明細書に記載のＧＬＰ−１ポリマ複合体は、異なる複合体種を得る／分離するために精製することができる。とりわけ、生成混合物は、ＧＬＰ‐１部分ごとに、平均１つ、２つ、または３つまたはそれ以上のＰＥＧから得るために精製することができる。本発明の実施形態の１つにおいて、好ましいＧＬＰ−１複合体は単一複合体である。最終複合反応混合物の精製の方法は、例えば、採用されたポリマ試薬分子量、ＧＬＰ‐１部分、および生成物の望ましい性質、例えば単量体、二量体、、特定位置異性体などを含む、多数の要因に左右される。
【０３１４】
望ましくは、異なる分子量を有する複合体は、ゲルろ過クロマトグラフィおよび／またはイオン交換クロマトグラフィを使用して分離することができる。ゲルろ過クロマトグラフィは、異なる分子量（違いとは、本質的に水溶性ポリマの平均分子量に相当する）に基づいて、異なるＧＬＰ‐１複合体（例えば、２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒ、など、「１−ｍｅｒ」はＧＬＰ‐１ごとの１ポリマ分子を示し、「２−ｍｅｒ」はＧＬＰ‐１に付着する２ポリマを示す、など）を断片化するために使用されてもよい。この方法が、ＰＥＧおよび異なる分子量を有する他のＧＬＰ‐１ポリマ複合を分離するために使用することができる一方、この方法は概して、ＧＬＰ‐１部分内に異なるポリマ付着部位を有する位置異性体の分離に効果がない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィは、各回復ＰＥＧ‐ｍｅｒ組成物は、異なる活性アミノ基（たとえば、リジン残留物）または他のＧＬＰ‐１部分の官能基に付着するＰＥＧを含むかもしれないが、ＰＥＧ１−ｍｅｒｓ、２−ｍｅｒｓ、３−ｍｅｒｓ、などの各その他の混合物を分離するために使用することができる。
【０３１５】
この種の分離の実行にふさわしいゲルろ過カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘTMおよびＳｅｐｈａｄｅｘTMカラムを含む。特定カラムの選択は望ましい分別範囲を希望することにより左右される。溶離は概して、リン酸、アセテート、またはそれと同様のものなどの適切な緩衝を使用することで達成される。収集された分留は、ヨウ化バリウムで染色することに続き、例えば、（ｉ）タンパク量にたいして２８０ｎｍ光学密度（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ量にたいするヨウ素試験（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０７：６０−６３）、および（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）などの多くの異なる方法によって分析されてもよい。
【０３１６】
位置異性体の分離は、一般的に逆層高速液体クロマトグラフィ（ＰＲ‐ＨＰＬＣ）Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＶｙｄａｃ）、または、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能であるＳｅｐｈａｒｏｓｅTMイオン交換カラムなどのイオン交換カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィによって実行される。いずれかの方法が、同一の分子量（位置異性体）を有するポリマＧＬＰ‐１異性体を分離するために使用することができる。
【０３１７】
結果により発生した精製組成物は、好ましくは非共役ＧＬＰ‐１部分の実質上のフリーである。さらに、組成物は、好ましくはすべての他の共有結合水溶性ポリマの実質上のフリーである。
【０３１８】
組成物
複合体異性体の組成物
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるＧＬＰ‐１ポリマ複合体の１つ以上のいずれかを備える組成物である。ある例において、組成物は、複数個のＧＬＰ‐１ポリマ複合体を有する。例えば、そのような化合物は、１つ、２つ、３つおよび／または４つの水溶性ポリマ分子がＧＬＰ‐１部分上の部位の共有結合を有するＧＬＰ‐１ポリマ複合体の混合物を備えることがある。すなわち、本発明の組成物は単量体、二量体および可能であればさらに三量体または４−ｍｅｒの混合物を備えることがある。もう一つの方法として、組成物は単一複合体のみ、またはジ複合体のみなどを保有することもある。単一複合体ＧＬＰ−１組成物は、概して、例えば、好ましくは解放可能に付着した単一ポリマの共有結合を有するＧＬＰ‐１部分を備える。単一複合体組成物は、１つの位置異性体を備えることがある、またはＧＬＰ‐１部分内の異なる部位に共有結合するポリマを有する、異なる位置異性体の混合物を備えることがある。例えば、単一複合体ＧＬＰ‐１組成物は、リジン２６またはリジン３４のいずれかに付着した水溶性ポリマを有する単一複合体ＧＬＰ‐１種の混合物を含むことがある。もう一つの方法として、単一複合体組成物は、リジン２６にのみ、またはリジン３４にのみ、またはＮ末端にのみ付着する水溶性ポリマを保有することがある。
【０３１９】
さらに他の実施形態において，ＧＬＰ‐１複合体は、３つ以上のポリマ腕を有する１つの多腕ポリマと共有結合する複数のＧＬＰ‐１部分を保有することがある。一般的に、ＧＬＰ‐１部分は、例えばＮ末端などの同一のＧＬＰ‐１アミノ酸部位において各自付着する。
【０３２０】
組成物における複合体については、、組成物は一般に以下の特徴の１つ以上を満たす。組成物内の複合体の少なくとも約８５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから４つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約８５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから３つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約８５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから２つのポリマを有し、または、組成物内の複合体の少なくとも約８５％はＧＬＰ‐１に付着する１つのポリマを有し（すなわち、モノＰＥＧ付加化）、組成物内の複合体の少なくとも約９５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから４つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから３つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから２つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９５％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９９％はＧＬＰ‐１に付着する１から４のポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９９％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから３つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９９％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つから２つのポリマを有し、組成物内の複合体の少なくとも約９９％はＧＬＰ‐１部分に付着する１つのポリマを有する（すなわち、モノＰＥＧ付加化）。
【０３２１】
１つ以上の実施形態において、複合体含有組成物はフリーまたは実質上アルブミンのフリーである。
【０３２２】
本発明の１つ以上の実施形態において、医薬組成物は、例えば、解放可能に、水溶性ポリマが約２、０００ダルトンより大きい重量平均分子量を有する水溶性ポリマに共有結合するＧＬＰ‐１部分〜成る複合体からなるものを提供し、薬学的に許容される賦形剤である。
【０３２３】
ＧＬＰ‐１に共有結合するポリマの望ましい数の調整は、適切なポリマ試薬選択、ＧＬＰ‐１部分に対するポリマ試薬の比率、温度、ｐＨ条件、および他の共役反応の側面によって達成される。加えて、望ましくない複合体（例えば、４つ以上の付着ポリマを有する複合体）の削減または削除は前述の精製方法によって達成することができる。
【０３２４】
例えば、水溶性ポリマ（ＧＬＰ−ｌ）部分複合体は、異なる複合体種を得る／分離するために精製することができる。とりわけ、生成混合物は、一般的にはＧＬＰ‐１部分ごとに、１つ、２つ、または３つのＰＥＧの、ＧＬＰ‐１ごとに平均１つ、２つ、３つ、または４つのＰＥＧを得るために精製することができる。１つ以上の実施形態において、生成混合物はＰＬＧ‐１ごとに１つのＰＥＧを含み、ＰＥＧは、そこでは、例えば分岐または直鎖ＰＥＧポリマのように、開放可能に（加水分解を介して）ＰＥＧポリマに付着する。
【０３２５】
医薬組成物
任意に、本発明のＧＬＰ−１複合体組成物は、ＧＬＰ‐１複合体に加えて、薬学的に許容される賦形剤を備える。さらに具体的に言えば、投与および投薬形態の方法により、組成物はさらに賦形剤、溶媒、安定剤、膜透過エンハンサーなどを備える。
【０３２６】
本発明の医薬組成物はすべての種類の製剤、例えば、粉末またはさらに液体再構成の凍結乾燥物などの、吸入のみならず、とりわけ注射にふさわしいものを網羅しする。注射に先立つ再構成液体組成物のためのふさわしい賦形剤の例は、注射のための静菌性水、水中Ｄ形グルコース５％、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン化水、およびそれらの組み合せを含む。液剤組成物については、溶液および懸濁液が想定される。肺からの投与にふさわしい組成物は以下にさらに詳しく記載する。
【０３２７】
典型的な薬学的に許容できる賦形剤は、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、酸化防止剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびこれらの組み合せを含む。
【０３２８】
本発明の組成物に使用する代表的な炭水化物は、糖、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および糖ポリマなどの誘導体化糖を含む。本発明の使用にふさわしい典型的な炭水化物賦形剤は、例えば、果糖、麦芽糖、ガラクトース、グルコース、Ｄマンノース、ソルボース、および同様もの、などの単糖類、乳糖、サッカロース、トレハロース、セロビオース、および同様のものなどの二糖類、ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチ、および同様のものなどの多糖類、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールおよび同様のものなどのアルジトールを含む。吸入を意図した製剤にとりわけ好ましいものは、非還元糖、本発明の組成物と結合した時に実質上乾燥無定形相またはガラス質相を形成する糖類、比較的高いガラス移転温度を保有している糖類、またはＴｇ（例えば、４０°Ｃを超える、または５０°Ｃを超える、または６０°Ｃを超える、または７０°Ｃを超えるＴｇ、または８０°Ｃ以上を有するＴｇ）である。そのような賦形剤はガラス形成賦形剤と見なしてもよい。
【０３２９】
付加的な賦形剤はアミノ酸、ペプチドを含み、とりわけ２−９アミノ酸、または２−５ｍｅｒｓを備えるオリゴマー、およびポリペプチドであり、そのすべては同一種またはヘテロ種ペプチドであってもよい。代表的なアミノ酸は、グリシン（ｇｌｙ）、アラニン（ａｌａ）、バリン（ｖａｌ）、ロイシン（ｌｅｕ）、イソロイシン（ｉｌｅ）、メチオニン（ｍｅｔ）、プロリン（ｐｒｏ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）、トリプトファン（ｔｉｐ）、ｓセリン（ｓｅｒ）、トレオニン（ｔｈｒ）、システイン（ｃｙｓ）、チロシン（ｔｙｒ）、アスパラギン（ａｓｐ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、リジン（ｌｙｓ）、アルギニン酸（ａｒｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、ノルロイシン（ｎｏｒ）、およびこれらの改変形を含む。
【０３３０】
さらに、例えば吸入可能な組成物において、有効な賦形剤は、参照することで全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの国際特許出願ＷＯ  ０１／３２１４４に記載されるように、２つ以上のロイシル残基を含むジペプチドおよびトリペプチドである。
【０３３１】
さらに好ましくは、ガラス移転温度が約４０°Ｃ以上、または５０°Ｃ以上、または６０°Ｃ以上、または７０°Ｃ以上を有するジペプチドおよびトリペプチドである。
【０３３２】
水中での限られた溶解度のためそれほど好ましくないが、肺からの投与の組成物において使用するための付加的な安定性およびエアゾール機能増加ペプチドは、上記に記載されるように、アミノ酸のいずれの組み合せを含む４−ｍｅｒｓおよび５−ｍｅｒｓを含む。４−ｍｅｒまたは５−ｍｅｒは、２つ以上のロイシン残留物を備えることがある。ロイシン残留物は、ペプチド内の任意の位置を占めてもよい一方、残存（例えば非ロイシル）アミノ酸位置は、上記に記載されるように、いかなるアミノ酸によって占められ、ただし、結果として発生する４−ｍｅｒまたは５−ｍｅｒは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水中での溶解性を有する。一部の実施形態において、４−ｍｅｒまたは５−ｍｅｒにある非ロイシルアミノ酸は、リジンなどのような親水性アミノ酸であり、従って水中のペプチドの溶解度を高めるものである。
【０３３３】
典型的なタンパク質賦形剤は、人血清アルブミン（ＨＳＡ）、遺伝子組換人アルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン、ヘモグロビン、および同様のものなどを含む。組成物はまた緩衝剤またはｐＨ調整剤、一般的に有機酸または有機基から調製された塩を含むが必ずしもそうとは限らない。代表的な緩衝剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、琥珀酸、酢酸、またはフタル酸の有機酸を含む。他の適切な緩衝剤は、トリス、トロメタミン、塩酸塩、ホウ酸塩、グリセリンリン酸、およびリン酸を含む。グリシンなどのアミノ酸も適している。
【０３３４】
本発明の組成物は、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシメチルセルロースなどの誘導化セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピリメチルセルロース、Ｆｉｃｏｌｌｓ（ポリマ糖）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、デキストレート（例えば、２‐ヒドロキシプロピールβ‐シクロデキストリン、および、サルフォブチルエテルβ‐シクロデキストリンなどのような、シクロデキストリン）、ポリエチレングリコース、およびペクチンなどの、１つ以上の付加的なポリマ賦形剤／添加剤も含む。
【０３３５】
組成剤はさらに、香料添加剤、嬌味剤、無機塩類（例えば、塩化ナトリウム）、抗菌剤、（例えば、塩化ベンザルコニウム）、甘味料、酸化防止剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」および「ＴＷＥＥＮ８０」、およびＢＡＳＦから入手可能なＦ６８およびＦ８８などのプルロニックなどのポリソルベート）、ソルビタンエステル、脂質（例えば、好ましくはリポソーム形ではないが、レシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、などのリン脂肪）、脂肪酸および脂肪酸エステル、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート剤（例えば、亜鉛および他の当該のふさわしいキレート）を含む。せん孔した微細構造（例えば、空洞、多孔性ミクロスフィア）を生成するための特定の二基置換ホスファチジルコリンの使用も採用されることがある。
【０３３６】
本発明による組成物における使用にふさわしい他の薬学的賦形剤および／または添加剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００５）、および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」６０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（２００６）中に記載される。
【０３３７】
組成物におけるＧＬＰ‐１複合体の量（すなわち、活性剤とポリマ試薬間で形成する）は、多くの要因に左右されるが、好ましくは、組成物が投与容器（例えば、水薬瓶）に保存された場合、治療に効果的な量である。さらに、薬学的調製は、水溶液形態にある場合、シリンジ内に保管される。治療に効果的な量は、どの量が臨床的に望ましい終点を形成するかを決定することにおいて、複合体の増加量の連続投与によって実験的に決定することができる。
【０３３８】
組成物の個々の賦形剤のいずれの量は、賦形剤の作用および組成物の特定の必要性によって様々である。一般的に、個々の賦形剤の好ましい量は、定期的な試験、すなわち賦形剤の様々な量を含む組成物の調製（低から高範囲）、安定性および他のパラメータの調査、そして、重大な悪影響を伴うことなく好ましい性能を達成する範囲の決定を通じて決定される。
【０３３９】
しかしながら概して、賦形剤または賦形剤類は、重量で約１％から約９９％、重量で約５％から約９８％の量、賦形剤の重量で約１５から約９５％、または濃縮を伴い、重量で３０％以下である。概して、ＧＬＰ‐１部分の高濃縮は、最終的な薬学的製剤において望ましい。
【０３４０】
活性剤の組合せ
本発明の組成物は、水溶性ポリマ（ＧＬＰ‐１）部分複合体および共役ＧＬＰ‐１の混合物も備えることがあり、これによって即効性および持続効果のあるＧＬＰ‐１の混合物を提供する。もう一つの方法としては、組成物は、ＧＬＰ‐１水溶性ポリマ複合体に加えて、アシル化基礎インスリンまたはｐｌ転換基礎インスリンのような、例えば基礎インスリンなどのインスリンも備えることがある。概して、基礎インスリンは、糖尿病の標準モデルにおいて、約８時間以上長期にわたる作用時間を示しているものである。典型的な基礎インスリンはＮＰＨ、ＮＰＬ、ＰＺＩ、Ｕｌｔｒａｌｅｎｔｅおよびインスリングラルギンを含む。
【０３４１】
本発明による付加的な薬学的組成物は、本明細書に記載の拡張作用ＧＬＰ‐１水溶性ポリマ複合体に加えて、水溶性ポリマが、イミダゾール窒素において末端ヒスチジン（Ｈｉｓ７）の側鎖に解放可能に付着する即効性ＧＬＰ−１ポリマ複合体を備えるものを含む。
【０３４２】
肺投与のための組成物
ＧＬＰ‐１ポリマ複合体を備える組成物は、肺投与にふさわしいものを含む。このような吸入可能な組成物の調製および特徴を記載する。
【０３４３】
本発明の１つの実施形態は、肺送達にふさわしい乾燥粉末組成物を提供する。本発明の乾燥粉末組成物は、噴霧乾燥を含む多くの乾燥技術のいずれかによって調製されてもよい。組成物の噴霧乾燥は、例えば、”Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，”５ｔｈ  ｅｄ．，Ｋ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）、およびＰｌａｔｚ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，国際公開広報第ＷＯ  ９７／４１８３３（１９９７）内およびＷＯ  ９６／３２１４９（１９９６）に記載されるように達成される。
【０３４４】
本発明のＧＬＰ‐１複合体を備える懸濁または溶液は、ＮｉｒｏＡ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｂｕｃｈｉ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および同様などの商業的供給者などから入手可能な、従来型の噴霧乾燥機における噴霧乾燥であってよく、分散可能な乾燥粉末を結果として生じる。噴霧乾燥のための望ましい条件は、組成物の成分によって様々であり、概して試験で決定される。物質の噴霧乾燥に使用される気体は、窒素、またはアルゴンなどの不活性気体も適しているが、一般的に空気である。さらに、噴霧化物質を乾燥するために使用される気体の両注入または放出の温度は、噴霧化物質における薬学的タンパク質の分解を引き起こさないようなものである。そのような温度は、概して注入温度は約５０°Ｃから約２００°Ｃの範囲である一方、放出温度は約３０°Ｃから約１５０°Ｃの範囲であるが、一般的に試験で決定される。パラメータは、約２０〜１５０ｐｓｉ、または約３０〜１００ｐｓｉの範囲の噴霧器圧力を含んでもよい。一般的に噴霧化圧力は、以下の（ｐｓｉ）の１つを採用する。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０以上。
【０３４５】
本明細書に記載の特徴を有する本発明の吸入可能な組成物は、特定の組成物の成分を乾燥することによって生成されてもよく、ＷＯ  ９９／１６４１９に記載される多孔性微細構造粉末の形成を結果として生じる。多孔性微細構造粉末は、一般的に、大きい内部空洞を特徴付ける比較的薄い多孔性壁を有する噴霧乾燥、空洞ミクロスフィアを備える。多孔性微細構造粉末は乾燥に先立って、安定した分散を提供するための選択された懸濁媒体（非水性および／またはふっ素化発泡剤）において分離されることがある。比較的低い濃度のせん孔（または多孔性）微細構造または微粒子の使用は、著しく微粒子間の引力を減少し、従って剪断力を低くし、その結果によって生じる粉末の流動性および分散性を増加し、その安定化された散布の綿状沈殿、沈殿またはクリーム状化によって分解が減少される。
【０３４６】
別の方法としては、粉末は凍結乾燥、真空乾燥、噴霧凍結乾燥、臨界超過液体処理（例えば、Ｈａｎｎａ，ｅｔａｌ．，米国特許第６，０６３，１３８号に記載されるような）、空気乾燥、または蒸発乾燥の他の形状によって調製されてもよい。
【０３４７】
乾燥粉末は、組成物成分を混合、細砕、篩がけ、またはジェット製粉によって乾燥粉末に調製してもよい。
【０３４８】
一度形成されると、乾燥粉末組成物は、好ましくは製造、処理、および保管の間、乾燥した（すなわち、比較的低湿度）条件下で保持される。採用される乾燥処理にかかわりなく、処理は、本発明のＧＬＰ‐１複合体を備える微粒子が、好ましくは吸引可能であり、高分散性の結果になる。
【０３４９】
１つ以上の実施形態において、本発明の粉末はいくつかの特性を特徴とする。最も顕著なのは、（ｉ）一貫した高分散性であり、保管においても持続され、（ｉｉ）小さい空気力学的粒径（ＭＭＡＤ）、（ｉｉｉ）改善された微粒子用量値、すなわち粒径１０ミクロン以下を有する粉末であり、これらすべてが体循環への送達のための低呼吸路（すなわち、肺胞）の細胞組織に浸透する粉末の能力を改善することに貢献する。本発明の吸入可能な粉末のこれらの物質的特長は、以下にさらに詳しく述べるが、深肺への当該粉末のエアゾール化された送達の効率を最大限にする役割を担う。
【０３５０】
本発明の微粒子は該して、約２０μｍ以下、または約１０μｍ以下、または約７．５μｍ以下、または約４μｍ以下、または約３．３μｍ以下の質量中位径（ＭＭＤ）、または体積メジアン幾何学的直径（ＶＭＧＤ）、または質量メジアンエンベロープ直径（ＭＭＥＤ）または質量メジアン幾何学的直径（ＭＭＧＤ）を有し、通常はこれら直径の０．１μｍから５μｍの範囲にある。好ましい粉末は、約１から５μｍのＭＭＤ、ＶＭＧＤ、ＭＭＥＤ、またはＭＭＧＤを有する微粒子によって構成される。一部の例では、粉末は、乳糖などの非吸入可能な担体微粒子もまた含み、非吸入可能な微粒子は一般的に約４０ミクロンのサイズより大きい。
【０３５１】
本発明の粉末は、エアゾール微粒径配分、-空気力学的質量中位径（ＭＭＡＤ）-を特徴とすることもあり、一般に、５μｍ以下、４．０μｍ以下、３．３μｍ以下、または３μｍ以下などの、約１０μｍ以下のＭＭＡＤ有する。粉末の空気力学的質量中位径は、一般に約０．１〜５．０μｍ、または約０．２〜５．０μｍＭＭＡＤ、または約１．０〜４．０μｍＭＭＡＤ、または約１．５から３．０μｍの範囲である。小さい空気動力学的直径は、最適化された噴霧乾燥条件および選択、および賦形剤の濃度の組み合わせによって達成されてもよい。
【０３５２】
本発明の粉末は、その密度を特徴とする。粉末は、概して約０．１から１０ｇ／立方センチメートル、または約０．１〜２ｇ／立方センチメートル、または約０．１５〜１．５ｇ／立方センチメートル嵩密度を保有する。本発明の１つの実施形態において、粉末は、約０．４ｇ／立方センチメートル以下の密度で、ＭＭＤが５ミクロンと３０ミクロンの間の大きな綿毛状の粒子を有する。直径、密度および空気動力学的直径の関係は以下の式（Ｇｏｎｄａ，”Ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９９１，Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋ．Ｋ．Ｍｉｄｈａ，Ｅｄｓ．，Ｍｅｄｐｈａｒｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ｐｐ．９５−１１７，１９９２）によって決定できることは注目に値する。９５−１１７，１９９２）。
【０３５３】
粉末は、重量で約２０％以下、通常、重量で約１０％以下、または重量で約５％以下の湿度を有することがある。このような低湿度含有固体は、梱包および保管において、非常に高い安定性を示す傾向がある。
【０３５４】
さらに、本明細書に記載の噴霧乾燥法および安定剤は、概して非常に分散性のある組成物を提供することに効果的である。概して、これら粉末の放出された投与量（ＥＤ）は、３０％以上であり、通常４０％以上である。一部の実施形態において、本発明の粉末のＥＤは５０％、６０％、７０％以上、またはそれ以上である。
【０３５５】
通常改善された分散性および取り扱い特徴に関連する特定の特徴は、製品皺度である。皺度は、小穴のない球形粒子を想定した、特定の領域（例えば、ＢＥＴ、分子表面吸着作用、または他の従来型の技術によって測定される）、粒径配分（例えば、遠心沈降粒径分析器、Ｈｏｒｉｂａ  Ｃａｐａ  ７００によって測定される）から計算された表面領域、および粒子密度（例えば、ピクノメトリーによって測定される）の比率である。皺度は、空気透過法によって測定してもよい。粒子が、噴霧乾燥の事例において、その形状において概して結節性であることが分かっている場合、皺度は、表面の畳み込み、または折り重ねの度合いを測定する。これは、本発明によって作られた粉末をＳＥＭ分析によって検証してもよい。皺度１は、粒子表面が球状であり、小穴がないことを示す。１以上の皺度値は、より大きい数が非均一のより高い度合いを示すことで、粒子表面が非均一であり、少なくともある程度畳み込まれていることを示す。本発明の粉末は、一般的に、少なくとも約３、少なくとも約４、または少なくとも約５などの少なくとも約２の皺度を有し、４から８、または４から６などの２から１０の範囲である。
【０３５６】
本発明の一部の実施形態において、窒素吸着作用によって測定される、粉末表面領域は、一般に、約７ｍ２／ｇから約１０ｍ２／ｇなどの、約６ｍ２／ｇから約１３ｍ２／ｇである。粒子は、しばしば、滑らかな球状表面よりはむしろ畳み込まれた「干しブドウ」構造を有する。
【０３５７】
本発明のとりわけ好ましい実施形態は、外側表面を含む、粉末粒子の少なくとも最外部領域が無定形ガラス質状態にあるものである。粒子が高いＴｇ物質をその表面に有する場合、粉末は、Ｔｇを不安定な位置（約１０°Ｃ以下のＴｇ-Ｔｓ）まで下げる前の湿度かなりの量を吸収することができると考えられる。
【０３５８】
本明細書に記載される組成物は、一般的に、化学的安定性および物質的安定性、すなわち、長期にわたるエアゾール機能について良好な安定性を保有する。概して、化学的安定性に関して、組成物内に含まれるＧＬＰ‐１複合物は、噴霧乾燥においてわずか約１０％で分解される。すなわち、粉末は、原型を保った薬学的タンパク質の概して少なくとも約９０％、または約９５％、または少なくとも約９７％またはそれ以上を保有する。
【０３５９】
エアゾール機能については、本発明の組成物は、概して、３ヶ月の期間周囲条件のもとに保管された場合、わずか約２０％、またはわずか約１５％、またはわずか約１０％の少量の放出された投薬量を特徴付ける。
【０３６０】
別の方法としては、本発明のＧＬＰ−１ポリマ複合体は、せん孔下微細構造に製剤される。そのような微細構造、およびその生産方法は、米国特許第６，５６５，８８５号に記載される。
【０３６１】
簡潔には、そのようなせん孔微細構造は、概して、空間率、微細孔、欠陥、空洞、空間、間質腔、開口、せん孔、または穴を示し、定義する構造的マトリクスを備える。せん孔微細構造の完全な形状（形態学に相反して）は、概して重大ではなく、望ましい特徴を提供する全体のどんな構造も、本発明の範囲において意図される。従って、一部の実施形態はだいたい微小球形状を備える。
【０３６２】
投与
本発明のＧＬＰ−１複合体は、口、直腸、鼻、局所（経皮的、エアゾール、経口および舌下線を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈および皮内をふくむ）、気管および肺投与のいずれの手段によっても投与することができるが、これに限らない。投与の好ましい形状は非経口および肺投与を含む。非経口投与の適切な製剤は、とりわけ、注射用溶液、使用に先立った溶媒のための乾燥粉末、注射用の懸濁液、使用に先立った賦形剤との組み合せのための不溶性組成物、および、投与に先立った希釈のためのエマルジョンおよび原液を含む。
【０３６３】
実施例８に提供されるインビボデータは、注射によって投与された場合、すなわち４８時間以上のすくなくとも長期間にわたって効果を提供する能力のみならず、本発明の典型的な解放可能ＧＬＰ‐１複合体の血糖値低下効果を明示する。一方、天然ＧＬＰ−１は、急速な機能の撤去を示す。例えば、ＦＩＧ  １３および１４を参照。
【０３６４】
本発明の一部の好ましい実施形態において、ＧＬＰ−１ポリマ複合体は、経肺的、好ましくは吸引によって投与される。本発明のこの側面を指示するインビボデータは、実施例２５および２６に提供され、そこでは特定の典型的な解放可能ＧＬＰ−１複合体は、気管内投与された。両データは、開放化のＧＬＰ‐１ポリマ複合体の肺投与は、複合していないＧＬＰ‐１に対して認められるよりも、実質的少なくともに長期にわたって血糖値の抑制の結果に効果的であることを示す。
【０３６５】
本明細書に記載の乾燥粉末組成物は、ふさわしい乾燥粉末吸引器（ＤＰＩ）、すなわち、乾燥粉末剤を肺に転送する手段として、患者が吸入吸息を使用する、吸入器のいずれかを用いることで、経肺によって送達されてもよい。Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４５８，１３５号，Ｏｃｔ．１７，１９９５、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７４０，７９４号，Ａｐｒ．２１，１９９８、およびＳｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７８５，０４９号，Ｊｕｌ．２８，１９９８に記載される、参照することで本明細書に組み込まれる、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの乾燥粉末吸入器を含む。この種類の器具を使用して投薬される場合、粉末薬剤は、好ましくはブリスター包装またはカートリッジなど、容器が単回投与単位または数回投与単位を含む、穴を開けることができるふた、または他の方法による表面を有する容器に含まれる。計測された乾燥粉末薬剤で多数の空洞（すなわち、単位投与包装）を充てんする便利な方法は、例えば、参照することで本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｋｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，国際公開広報第ＷＯ  ９７／４１０３１号，Ｎｏｖ．６，１９９７に記載される。
【０３６６】
乾燥粉末の肺投与のための他の乾燥粉末散布器具は、例えば、参照することで本明細書に組み込まれる、Ｎｅｗｅｌｌ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，欧州特許第ＥＰ  １２９９８５号，Ｓｅｐ．７，１９８８、Ｈｏｄｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第ＥＰ４７２５９８号，Ｊｕｌ．３，１９９６、Ｃｏｃｏｚｚａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第ＥＰ  ４６７１７２，Ａｐｒ．６，１９９４、およびＬｌｏｙｄ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５２２，３８５号，Ｊｕｎ．４，１９９６に記載される。本発明の乾燥粉末の送達にふさわしいのは、Ａｓｔｒａ−Ｄｒａｃｏ「ＴＵＲＢＵＨＡＬＥＲ」のような吸引器である。この種類の器具は、そのすべてが参照することで本明細書に組み込まれる、Ｖｉｒｔａｎｅｎ，Ｒ．，米国特許第４，６６８，２１８号，Ｍａｙ  ２６，１９８７、Ｗｅｔｔｅｒｌｉｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６６７，６６８号，Ｍａｙ  ２６，１９８７、およびＷｅｔｔｅｒｌｉｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８０５，８１１号  Ｆｅｂ．２１，１９８９内に詳しく載される。他のふさわしい器具は、ＲｏｔａｈａｌｅｒTM（Ｇｌａｘｏ）、ＤｉｓｃｕｓTM（Ｇｌａｘｏ）、ＳｐｉｒｏｓTM吸入器（Ｄｕｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＳｐｉｎｈａｌｅｒTM（Ｆｉｓｏｎｓ）などの乾燥粉末吸入器を含む。さらにふさわしいのは、参照することで本明細書に組み込まれる、Ｍｕｌｈａｕｓｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ，米国特許第５，３８８，５７２号，Ｓｅｐ．３０，１９９７に記載されるような、粉末化薬剤を取り込むこと、スクリーンを通じて空気を通過させることによって担体スクリーンから薬剤を浮上すること、または器具のマウスピースを通じることによって生じる患者はの粉末の採用を伴い、混合チャンバ内で空気と粉末薬剤を混合することのために、空気を提供するため、ピストンを採用する器具である。
【０３６７】
本発明の組成物は、Ｌａｕｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３２０，０９４号、およびＲｕｂｓａｍｅｎ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，米国特許第５，６７２，５８１号に記載されるような、クロロフルオロカーボンまたは過フッ化炭化水素などのような、薬学的に不活性溶液の推進力における、薬剤の溶媒または懸濁を含む、例えば、ＶｅｎｔｏｌｉｎTM定量噴霧式吸入器などの、加圧型、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）を使用することで送達されてもよい。
【０３６８】
別の方法としては、本明細書に記載の組成物は、例えば、水、生理食塩水の溶媒中で、溶解または懸濁され、霧状によって投与されてもよい。エアゾール化された溶媒の送達のための噴霧器は、ＡＥＲｘTM（Ａｒａｄｉｇｍ）、ＵｌｔｒａｖｅｎｔTM（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）、Ｐａｒｉ  ＬＣ  ＰｌｕｓTMまたはＰａｒｉ  ＬＣ  ＳｔａｒTM（Ｐａｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  Ｐｕｌｍｏ−Ａｉｄｅ、およびＡｃｏｒｎ  ＩＩTM（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含む。
【０３６９】
本発明の１つ以上の実施形態において、患者への複合体の送達を備える方法、本明細書に記載のＧＬＰ‐１ポリマ複合体を備える薬学的組成物を患者に投与する方法を備える方法、などが提供される。投与は、本明細書に記載されるいずれの手段によっても効果がある。方法は、薬学的組成物の治療的に有効量の投与によって、ＧＬＰ‐１での治療に反応する状態にさいなまれている患者の治療に使用してもよい。
【０３７０】
上記に記載のとおり、本明細書に提供されるＧＬＰ‐１ポリマ複合体送達の方法は、ＧＬＰ‐１の投与によって改善または防止できる状態を有する患者の治療に使用されてもよい。本発明のＧＬＰ‐１またはＧＬＰ‐１複合体での治療の必要がある対象は、非インスリン依存糖尿病、インスリン依存糖尿病、脳卒中、心筋梗塞、肥満、術後異化変化、機能性消化不良、および過敏性腸症候群を伴うものを含む。さらに、予防的治療を必要とする対象、例えば非インスリン依存糖尿病発現の危険にある対象を含む。付加的な対象は、耐糖能障害または空腹時血糖障害をもつ者を含む。
【０３７１】
本発明の、例えば解放可能な複合体などの特定の複合体は、例えば、ふさわしいインビトロモデルにおいて評価される場合、数時間から数日にわたって（例えば、２〜７日、２〜６日、３〜６日、３〜４日）、加水分解などによって、ＧＬＰ‐１部分を解放するのに効果的なものを含む。本発明の解放可能な複合体は、血糖値を、例えば少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、約１〜３日程度、または約１〜２．５日にわたり、すくなくとも長期間にわたって下げることに効果のあるものを含む。
【０３７２】
上記の観点において、患者の血糖は、投与の後、約４時間から約２４時間、６時間から約１８時間、または約８時間から約１２時間など、約２時間から約３０時間の範囲で最低値に達することがある。肺投与の場合、患者の血糖は約４時間から約１０時間、または約６時間から約８時間など、約２時間から約１２時間の範囲で最低値に達することがある。皮下投与の場合、患者の血糖は約４時間から約２４時間、６時間から約１８時間、または約８時間から約１２時間など、約２時間から約３０時間の範囲で最低値に達することがある。
【０３７３】
患者の血糖は、例えば、皮下または肺投与によって、投与前の血糖の約３０％から約５５％、３５％から約５０％、または約４０％から約４５％など、約２５％から約６０％の範囲で最低値に達することがある。１つの例として、例えば、皮下または肺投与などの投与後、患者は約１２０ｍｇ／ｄｌ以下、約１１０ｍｇ／ｄｌ以下、または１００ｍｇ／ｄｌ以下など、約１２６ｍｇ／ｄｌ以下の血糖値を有することがある。
【０３７４】
投与後、患者は、最大約１４０時間、最大約１２０時間、最大約１００時間、最大約８０時間、最大約６０時間、最大約４０時間、最大約２４時間、または最大約１２時間など、約１６０時間、減少された血糖を有することがある。肺投与の場合、患者は最大約６０時間、最大約５０時間、最大約４０時間、最大約３０時間、最大約２４時間、または最大約１２時間減少された血糖を有することがある。
【０３７５】
投与すべきＧＬＰ‐１複合体の実際の投与量は、治療する状態の重症度、医療専門家の判断、および投与する複合体のみならず、年齢、体重、および対象の一般的な状態によって様々である。治療的有効量は、当業者に既知であるおよび／または付属参照および文献に記載される。概して、本発明の複合体はＧＬＰ‐１部分のプラズマレベルが約５ピコモル／リットルから約２００ピコモル／リットルの範囲内で送達される。
【０３７６】
重量基準において、本明細書に記載のＧＬＰ‐１複合体の薬学的に効果的な投薬量は、成人にたいして、１日あたり約０．０１ｍｇから１日あたり約１０００ｍｇの範囲であってもよい。例えば、投薬量は、１日あたり約０．１ｍｇから１日あたり約１００ｍｇ、または１日あたり約１．０ｍｇから約１０ｍｇ／日の範囲であってもよい。活性基準において、活性の国際単位に従った相当する投薬量は、当業者が計算することができる。
【０３７７】
得られた複合体（ここでも、学的組成物の一部として提供されるような）の単位投薬量は、臨床医学者の判断、患者のニーズなどにより様々な投薬計画において投与することができる。特定の投薬計画は、当業者によって既知であるか、あるいは実験的に所定の方法を使用することによって決定することができる。典型的な投薬計画は、１日に５回、１日に４回、１日に３回、毎日２回、毎日１回、週に３回、週２回、週１回、月２回、月１回投与、およびこれらのいずれかの組み合せを含むが、これに限らない。一度臨床学的な終点が達成されると、組成物の投薬を停止する。
【０３７８】
本発明は、本発明の好ましい特定の実施形態をもつ複合体において記載される一方、以下の例のみならず前述の記述は、説明を意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。他の側面として、本発明の範囲内の利点および改変は、本発明に関連する当業者に明らかである。
【０３７９】
本明細書において参照されるすべての項目、書籍、特許、および他の出版物は、ここに参照することにより全体として取り込まれる。
【０３８０】
実験
本発明の実施は、指示がない限り、本技術内における有機合成およびそれと同様の従来技術を採用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。試薬および物質は、特別に別に言及がない限り、商業的に入手可能である。例えば、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２），ｓｕｐｒａを参照。
【０３８１】
以下の例において、使用する数（例えば、量、温度など）についての正確さを確実にする努力がなされたが、一部の実験的な誤りおよび偏差をみなすべきである。指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海抜における大気圧または大気圧付近である。
【０３８２】
当業者に既知である他の略語が参照され、当業者に既知の他の試薬および物質が使用されるであろうが、以下の一覧および方法の説明は利便性の目的のために提供するものである。
【０３８３】
略語：
ｍＰＥＧ−ＳＰＡ        ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート
ｍＰＥＧ−ＳＢＡ        ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタン酸
ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ      ｍＰＥＧ−オルトピリジル‐ジスルフィド
ｍＰＥＧ−ＭＡＬ        ｍＰＥＧ−マレイミド，ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＭＡＬ
ｍＰＥＧ−ＳＭＢ        ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−酪酸メチル、
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−スクシンイミド
ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ      Ｈ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈ
ｍＰＥＧ−ＰＩＰ        ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ピペリジン−４−ｏｎｅ
ｍＰＥＧ−ＣＭ     ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ）
ａｎｈ．                        無水
ＣＶ                            カラム体積
Ｆｍｏｃ                        ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＮａＣＮＢＨ３                  シアノ水素化ほう素ナトリウム
ＨＣｌ                          塩化水素酸
ＨＥＰＥＳ                      ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸
ＮＭＲ                          核磁気共鳴
ＤＣＣ                          １，３−ジクロロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＦ                          ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ                        ジメチルスルホキシド
ＤＩ                            脱イオン化
ＭＷ                            分子量
ＫまたはｋＤａ                  キロダルトン
ＳＥＣ                          サイズ排除クロマトグラフィ
ＨＰＬＣ                        高性能液体クロマトグラフィ
ＦＰＬＣ                        高速蛋白質液体クロマトグラフィ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ                ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ              マトリックス支援レーザー脱離イオン化
飛行時間型
ＴＬＣ                          薄層クロマトグラフィ
ＴＨＦ                          テトラヒドロフラン
物質：添付例において参照されるすべてのＰＥＧ試薬は、特別に指示がない限り商業的に入手可能である。実施例で使用されるグルカゴン様ペプチド‐１（ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）、「ＧＬＰ−１」）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。
【実施例】
【０３８４】
（実施例１．  ＧＬＰ−１の可逆性ＰＥＧ付加試薬用のＮ−｛ジ（ｍＰＥＧ（２０，０００）オキシメチルカルボニルアミノ）フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ｝スクシンイミドの調製）
【０３８５】
【化０５４】
2009519961.tif 000062
【０３８６】
【化０５５】
2009519961.tif 000063
Ａ．        ２、７−ジ（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの調整
アルゴン雰囲気下で、２、７−ジアミノフルオレン（２．４５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）は、１、４−ジオキサン中（２８ｍＬ）に溶解された。脱イオン化水（１４ｍＬ）、ＮａＯＨ２Ｍ（２．２ｅｑ、２７．５ｍｍｏｌ、１３．８ｍＬ）およびジ−タート−ブチルジカルボン塩（ＢＯＣ２Ｏ）（２．５ｅｑ、３１．３ｍｍｏｌ、６．８２ｇ）が連続的に添加された。反応物を室温で２０時間激しく撹拌した。生成物は、茶色の固体で沈殿した。反応物は、加水およびＫＨＳＯ４１ＭでｐＨ３まで酸性化で急冷された。生成物を、クロロホルム（３×４００ｍＬ）で抽出し、混合した有機層を、１／２の飽和塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発した。生成物は、クロロホルム内の１％のメタノールで溶離されたシリカゲル６０Ａのフラッシュクロマトグラフィで精製された。精製された黄色固体（５．１ｇ、約９９％）ＴＬＣ（ニンヒドリン染色液）で純粋であった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）７．７（ｂｓ、２Ｈ、ＮＨウレタン）、７．６（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、６．５（ｓ、２Ｈ、Ａｒ）、３．８（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、１．５（ｓ、１８Ｈ、Ｂｏｃ）。
【０３８７】
Ｂ．          ９−ホルミル−２、７−ジ（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの調製
精製された２、７−ジ（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）（上記のステップＡで調製）は、弱い加熱で、ギ酸エチル（５０ｍＬ）および無水ＴＨＦ（６０ｍＬ）中に溶解された。（注記：ギ酸エチルは、ギ酸を除去するためにＫ２ＣＯ３で保存された。）溶液は、氷浴で冷却され、鉱油中の６０％の水素化ナトリウムが部分的に添加された（５．５ｅｑ、６９ｍｍｏｌ、２．７５ｇ）。反応物は、室温までゆっくりと暖められ、次いで、還流冷却器に適合した後、５０℃まで熱せられた。２時間後、反応物は、氷浴で冷却され、脱イオン化水（５０ｍＬ）をゆっくりと添加して急冷された。水層は、氷酢酸でｐＨ５に調節され、酢酸エチル（２×４００ｍＬ）で抽出された。混合有機層は、減圧下で、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発された。粗組成物（暗褐色の固体）は、クロロホルム内のシリカゲル６０Ａ段階的勾配溶離１〜５メタノールのフラッシュクロマトグラフィで精製された。黄色から茶色の固体の収率（４．８ｇ、約９０％）は、純度による。１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ（ｐｐｍ）１１．０（ｓ、０．９Ｈ、エノール）、９．３（２ｓ、１．９Ｈ、ＮＨウレタン）、７．２〜８．３（ｍ、Ａｒ、Ｃ１０Ｈエノール）、６．５（２ｓ、０．１Ｈ、ＮＨウレタン）、４．１（ｍ、０．３Ｈ、ＣＨ）、１．５（ｓ、１８Ｈ、Ｂｏｃ）。
【０３８８】
Ｃ．          ９−ヒドロキシメチル−２−７−ジ（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレンの調製
９−ホルミル−２、７−ジ（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（０．４７ｇ、１．１ｍｍｏｌ）は、アルゴン環境下で、無水メタノール（ＭｅＯＨ）（５ｍＬ）中に溶解された。ＮａＢＨ４（１．２ｅｑ、１．３ｍｍｏｌ、０．０５ｇ）が添加され、反応物は、５時間室温で撹拌された。反応物は、脱イオン化水で希釈され、氷酢酸でｐＨ５に酸性化された。反応物は、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出され、有機層は、飽和ＮａＨＣＯ３（４×２０ｍＬ）および塩水（３×２０ｍＬ）で洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ４で乾燥され、ろ過され、蒸発された。オレンジ色の固体である粗組成物は、クロロホルム内のシリカゲル６０Ａ勾配溶離１〜５％のメタノール（ジクロロメタン内の１５〜２０％の酢酸エチルの代替的勾配溶離）のフラッシュクロマトグラフィで精製された。生成物は黄色の固体であった（０．３９、８３％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）７．９（ｓ、０．５Ｈ、ＮＨウレタン）、７．７（ｓ、２Ｈ、Ａｒ），７．６（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、７．４（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、４．０（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、３．９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）、１．６（ｓ、１８Ｈ、Ｂｏｃ）。
【０３８９】
Ｄ．          ９−ヒドロキシメチル−２、７−ジアミノフルオレン二塩酸塩の調製
９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（０．３９ｇ、０．９ｍｍｏｌ）は、１、４−ジオキサン中に溶解された。０℃で、濃縮ＨＣｌ（２．５ｍＬ）が添加され、反応物は、０℃で２時間、室温で１時間撹拌された。反応溶媒は、減圧で（４５℃）除去された。生成物は、メタノール中に溶解され、蒸発された（２回）。生成物はメタノール（８ｍＬ）中に溶解され、ジエチルエテルおよび冷却剤をゆっくりと添加して沈殿された（繰り返す）。生成物は、橙赤色の固体（０．２５ｇ、９１％）であり、ＴＬＣ（８５：１５：３のクロロホルム／メタノール／酢酸、ニンヒドリン染色液）で単一スポットを呈した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）８．１（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、７．８（ｓ、２Ｈ、Ａｒ）、７．５（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、４．３（ｔ、ＩＨ、ＣＨ）、４．０（ｄ、２Ｈ、ＣＨ２）。
【０３９０】
Ｅ．          ９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（ｍＰＥＧ（２０，０００）オキシメチルカルボニルアミノ）フルオレンの調製．
無水トルエン（８０ｍＬ）中のｍＰＥＧ−ＣＭ（２０、０００）（ＭＷ＝１９、４５８を有するｍＰＥＧ−ＣＭ、２０ｇ、１．０３ｍｍｏｌ、３．５ｅｑ）は、６０℃の減圧下で、回転蒸発器で共沸的に蒸留された。固体は、アルゴン環境下で無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）中に溶解され、次いで、無水Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）（３．５ｅｑ、１．０３ｍｍｏｌ、１３９ｍｇ）および１、３−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（３．７ｅｑ、１．０９ｍｍｏｌ、２２４ｍｇ）が添加された。別のフラスコで、９−ヒドロキシメチル−２、７−ジアミノフルオレンニ塩酸塩（１ｅｑ、０．２９４ｍｍｏｌ、８８ｍｇ）および４−ジメチルアミノピリジン（２．２ｅｑ、０．６５ｍｍｏｌ、７９ｍｇ）が、無水ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に溶解された。ＤＣＣ反応物を数分間（５〜１５分）撹拌した後、９−ヒドロキシメチル−２、７−ジアミノフルオレンのＤＭＦ溶液は、ＤＣＣ反応物に定量的に移された。反応物は、溶媒が減圧で蒸発する前に、室温で２７時間撹拌された。濃いシロップ剤は、弱い加熱で、ドライのイソプロピールアルコール（４００ｍＬ、ゆっくりと添加）中に溶解された。ＰＥＧ生成物は、室温で放置すると沈殿する。付加的イソプロピールアルコール（１００ｍＬ）が、０℃で３０分間撹拌されている間に添加された。沈殿物は、ろ過され、冷たい７：３のイソプロピールアルコール／ジエチルエテル（８０ｍＬ）およびジエチルエテルで洗浄された。粗組成物（淡黄色の粉末、９−（ｍＰＥＧ（２０，０００）メチルエステル）−メチル−２、７−ジ（ｍＰＥＧ（２０，０００）−メチルアミド）フルオレン）は、高真空下（収率１８．３ｇ）で乾燥された。
【０３９１】
アルゴン環境下で、粗組成物（１８．３ｇ）は、脱イオン化水中に溶解され、ＮａＯＨ１ＭでｐＨ１２±０．１に調整された。加水分解反応混合物は、室温で３時間撹拌された。ｐＨは、１０％のリン酸で３．０に調整された。（水溶液は、セリット層を介してろ過され、水ですすがれた。）ＮａＣｌ（６０ｇ）は、水性液中に溶解され、次いでジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）で抽出された。混合有機層は、ＭｇＳＯ４上で乾燥され、ろ過され、減圧で蒸発された。粗組成物は、脱イオン化水中に溶解され、イオン交換樹脂で脱塩化された。ＰＥＧ溶液のイオン交換クロマトグラフィは、水で溶離するＤＥＡＥセファロース（０．９Ｌ）で行われた。ＰＥＧを含む留分が収集された。精製生成物（単黄色の粉末）は、ｍＰＥＧ−ＣＭ（２０，０００）（ＨＰＬＣ分析）で見られなかった。収率７．３ｇ、６４％（回収したＰＥＧ材料の総量を示す）、置換７５％以上（所望の官能性を有する、回復した量のＰＥＧのパーセンテージを示す）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：δ（ｐｐｍ）８．９（ｓ、２Ｈ、ＮＨアミド）、７．９（ｓ、２Ｈ、Ａｒ）、７．７（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、４．１（ｍ、５Ｈ、ＣＨ２Ｃ＝Ｏ、ＣＨ）、４．０（ｄ、２Ｈ、ＣＨ２）、３．６（ｓ、ＰＥＧ骨格）、３．３（ｓ、３Ｈ、−ＯＣＨ３）。
【０３９２】
Ｆ．          Ｎ−｛ジ（ｍＰＥＧ（２０、０００）オキシメチルカルボニルアミノ）フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ｝スクシンイミド
無水アセトニトリル（１０ｍＬ）中の９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（ｍＰＥＧ（２０、０００）−メチルアミド）フルオレン（０．５ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）は、５０℃の減圧下で、回転蒸発器で、共沸的に蒸留された。固体物は、無水ジクロロメタン（２ｍＬ、「ＣＨ２Ｃｌ２」）中に溶解され、次いで、トリホスゲンが添加された。（ベーストラップのある反応物から過剰なホスゲンガスを捕捉するためにケアを使用した。）（１．４ｅｑ、０．０１８ｍｍｏｌ、５ｍｌ）。数分後、無水ピリジン（２ｅｑ、０．０２６ｍｍｏｌ、ジクロメタン中の２μＬのピリジン（２μＬピリジン／５０μＬジクロロメタン））が添加された。一時間半で、殆どの反応溶媒および過剰ホスゲン（ベントにベーストラップを使用）が、弱い加熱（４０℃）で蒸発した。シロップ剤は無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中に溶解し、次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（５．３ｅｑ、０．０６８ｍｍｏｌ、８ｍｇ、「ＮＦＳ」）および無水ピリジン（３．２ｅｑ、０．０４１ｍｍｏｌ、ジクロロメタン中の８３μＬの上記（２：５０）溶媒）が添加された。４時間後、溶媒は、アルゴンストリーム下で蒸発した。シロップ剤は無水イソプロピールアルコール中に溶解し、室温で沈殿した。沈殿物は、ろ過され、冷たいイソプロピールアルコールおよびジエチルエテルで洗浄された。残留溶媒は、非常に淡黄色の粉末を得るために、真空で蒸発された。収率０．４ｇ、８０％、ＨＰＬＣによる置換７３％ＮＨＳ炭酸塩。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：δ（ｐｐｍ）８．９（ｓ、２Ｈ、ＮＨアミド）、７．９（ｓ、２Ｈ、Ａｒ）、７．７（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、４．７（ｄ、２Ｈ、Ｃｈ２）、４．３（ｔ、１Ｈ、ＣＨ）、４．１（ｓ、４Ｈ３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、２．８（ｓ、４Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＳ）。
【０３９３】
この同一の手順を用いて、他の分子量を有するポリマ試薬は、２０、０００ダルトン以外の分子量を有するｍＰＥＧ−ＣＭポリマ試薬を置換して調製することができる。
【０３９４】
（実施例２．  Ｎ−[２、７ジ（４ｍＰＥＧ（１０、０００）アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ]スクシンイミド（「Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳ」）の調製）
ｍＰＥＧ（１０、０００）アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ]スクシンイミドの合成は、以下のスキーム２に図式的に示される。
【０３９５】
【化０５６】
2009519961.tif 000064
Ａ．          ９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（４−カルボキシブチリルアミノ）フルオレン
アルゴン環境下、９−ヒドロキシメチル−２、７−ジアミノフルオレンニ塩酸塩（実施例１のステップＡからＤに記載の調製）は、脱イオン化水中に溶解され、飽和ＮａＨＣＯ３でｐＨ８に調整された。混合物は、塩水で半分に希釈され、沈殿物は、酢酸エチルで抽出された。酢酸エチル層は、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥され、ろ過され、９−ヒドロキシメチル、２、７−ジアミノフルオレン（茶色の粉末、８４％単離収率）に蒸発された。
【０３９６】
９−ヒドロキシメチル−２、７−ジアミノフルオレン（０．３８ｇ、１．７ｍｍｏｌ）は、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍＬ）中に溶解され、グル炭酸無水物（９７％、２．２ｅｑ、３．７ｍｍｏｌ、０．４３５ｇ）が添加された。反応物は、４．５時間撹拌され、アミノがみられないことがＴＬＣにより確認された（ニンヒドリン染色液、９０：１０：３の酢酸エチル／メタノール／酢酸）。反応混合物は、ヘキサン（１０ｍＬ）で希釈され、ろ過され、１：１のＴＨＦ／ヘキサンで洗浄後、ヘキサンで洗浄された。粗組成物は、必要最低限量のメタノール（１ｍＬ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解され、ヘキサンの添加で沈殿された（１０ｍＬ）。混合物は、冷却され（４℃）、ろ過され、１：１のＴＨＦ／ヘキサンで洗浄後、ヘキサンで洗浄された。収率は、０．５９ｇ（７７％）の橙黄色の粉末であった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）７．９（ｓ、２Ｈ、Ａｒ）、７．７（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、７．５（ｄｄ、２Ｈ、Ａｒ）、４．０（ｔ、１Ｈ、ＣＨ）、３．９（ｄ、２Ｈ、ＣＨ２）、２．５（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２）、２．４（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２）、２．０（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２）。
【０３９７】
Ｂ．          ９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（４ｍＰＥＧ（１０，０００）−アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン
無水トルエン中のｍＰＥＧ−ＮＨ２（１０、０００）（Ｍｎ＝１０、２００、クロマトグラフ的に精製、１２．７５ｇ、１．２５ｍｍｏ）は、５０℃の減圧下で、回転蒸発器で共沸的に蒸留された。固体物は、アルゴン環境下で、無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）中に溶解された。無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（アミドグルタル酸）フルオレン（１ｅｑ、０．５ｍｍｏｌ、０．２２５ｇ）および無水（２．２ｅｑ、１．１ｍｍｏｌ、１４９ｍｇ）Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）の溶媒は、ＰＥＧ溶媒（洗浄用に２．５ｍＬＤＭＦ）に定量的に添加された。次いで、１、３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．４ｅｑ、１．２ｍｍｏｌ、２４８ｍｇ）は、反応溶媒に添加された。反応物は、溶媒が減圧で蒸発する前に、室温で２４時間撹拌された。濃いシロップ剤は、弱い加熱で、ドライなイソプロピールアルコール（５００ｍＬ、ゆっくりと添加）中に溶解された。ＰＥＧ生成物は、室温で放置すると沈殿した。沈殿物は、１０℃で１０分間冷却され、ろ過され、冷たいイソプロピールアルコール（２００ｍＬ）で洗浄後、ジエチルエテル（２００ｍＬ）で洗浄された。粗組成物（オフホワイトの粉末）は、高真空で乾燥され、次いで、脱イオン化水中に溶解された。ＰＥＧ溶媒のイオン交換クロマトグラフィは、水で希釈されたＰＯＲＯＳメディア（０．１Ｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）で予備成形された。中性ＰＥＧを含んだ留分が収集された。精製生成物は、ｍＰＥＧ−ＮＨ２（１０，０００）（ＨＰＬＣ分析）を含有していなかった。収率５．５ｇ、５３％、置換８５％以上。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃ１２）：δ（ｐｐｍ）８．６（ｓ、２Ｈ、ＡｒＮＨアミド）、７．９（ｓ、２Ｈ、Ａｒ）、７．６（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、６．４（ｂｓ、２Ｈ、ＮＨアミド）、４．１（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、４．０（ｄ、２Ｈ５ＣＨ２）、３．６（ｓ、ＰＥＧ骨格）、３．３（ｓ、３Ｈ、−ＯＣＨ３）、２．４（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２）、２．３（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２）、２．０（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２）。
【０３９８】
Ｃ．          Ｎ−［２、７  ジ（４ｍＰＥＧ（１０，０００）アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン−９−イルメトキシカルボニルオキシ］スクシンイミド
無水アセトニトリル（１００ｍＬ）中の９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（４ｍＰＥＧ（１０，０００）−アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン（５．３ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）は、５０℃の減圧下で、回転蒸発器で共沸的に蒸留された。固体物は、無水ジクロロメタン（２７ｍＬ）中に溶解され、次いで、トリホスゲン（１．４ｅｑ、０．３６ｍｍｏｌ、１０６ｍｇ）が添加された。（ベーストラップのある反応物から過剰なホスゲンガスを捕捉するためにケアを使用した）。数分後、無水ピリジン（２ｅｑ、０．５１ｍｍｏｌ、４１μＬ）が添加された。一時間半後、殆どの反応溶媒および過剰ホスゲン（ベントにベーストラップ使用）は、弱い加熱（４０℃）で蒸発された。シロップ剤は、無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）中に溶解され、次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５．３ｅｑ、１．３５ｍｍｏｌ、１５５ｍｇ、「ＮＨＳ」）が添加された。１５分後、無水ピリジン（３．２ｅｑ、０．８１ｍｍｏｌ、６６μＬ）が添加された。反応物は、２時間拡散され、溶媒は、減圧下で蒸発された。シロップ剤は、無水イソプロピールアルコ−ル（２００ｍＬ）中に溶解され、室温で沈殿された。沈殿物は、ろ過され、冷たいイソプロピールアルコールおよびジエチルエテル（１０ｍｇＢＨＴを含有する１５０ｍＬ）で洗浄された。残留溶媒は、オフホワイト色の粉末を得るために、真空で蒸発された。収率５．１ｇ、９５％、ＨＰＬＣによる置換約７０％のＮＨＳ炭酸塩。
【０３９９】
他のポリマ試薬は、約２０、０００の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＮＨ２（クロマトグラフ的に精製）を除くこの同一の方法を用いて調製され、ｍＰＥＧ−ＮＨ２（１０、０００）に置換された。派生ポリマ試薬は、約４０、０００ダルトンの総分子量を有した。そのように調製されたポリマ試薬の名称は、９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（４ｍＰＥＧ（２０、０００）−アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン（または「Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−ＮＨＳ」）である。
【０４００】
他のポリマ試薬は、約３０、０００の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＮＨ２（従来の方法を用いて高純度で調製）を除くこの同一の方法を用いて調製され、ｍＰＥＧ−ＮＨ２（１０、０００）に置換された。派生ポリマ試薬は、約６０、０００ダルトンの総分子量を有した。そのように調製されたポリマ試薬の名称は、９−ヒドロキシメチル−２、７−ジ（４ｍＰＥＧ（３０、０００）−アミノカルボニルブチリルアミノ）フルオレン（または「Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ６０ｋ−ＮＨＳ」）である。
【０４０１】
（実施例３．  ＧＬＰ−１に結合した放出可能ＰＥＧ部分を有する例示的ＧＬＰ−１−ポリマ複合体の調製：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の調製）
具体的ポリマ試薬であるＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−ＮＨＳは、ＰＥＧ部分が放出可能に結合されたタンパク質のプロドラッグ形を提供するために、ＧＬＰ−１のＮ−末端に共有結合された。ポリマ試薬の二腕の性質は、投与後に、ＧＬＰ−１部分により一層の安定性を提供し、それにより、ＧＬＰ−１が天然または未修飾ＧＬＰ−１先駆物質を提供するために、加水分解を介して複合体から放出される、放出製剤を提供する。Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の化学構造を以下に提供する（化学構造の「ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１の残渣を示す）。
【０４０２】
【化０５７】
2009519961.tif 000065
ポリマ試薬であるＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳは、上記の実施例２に記載される通りに調製された。
【０４０３】
ｐＨ５．５０での２５ｍＬの２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液内の５０ｍｇのＧＬＰ−１（名目上１．２２７６×１０−５モル）（ＧＬＰ−１の実純度は９８．５％（ＨＰＬＣにより）であり、ペプチド含有量は８２．２％であった）の溶液が調製され、次いで、拡散しながら、８７６．８ｍｇのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳ（３．０６９２×１０−５モル）が添加された。溶媒は、室温で１６時間拡散することができ、従って、ＰＥＧ付加のＧＬＰ−１複合体であるＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１の形成が可能になる。次いで、反応混合物は、２０ｍＭＨＡｃによりｐＨ４．３０に酸性化された。反応物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で監視された（図１）。
【０４０４】
Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、ｐＨ４．３０での２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ａ）およびｐＨ４．３０での１ＭのＮａＣｌを有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ｂ）の移動相を使用するＡ°ＫＴＡベーシックシステム（図２）の陽イオン交換クロマトグラフィにより、モノＰＥＧ付加の複合体を得るために精製された。カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が販売するＳｐセファロース高性能イオン交換媒体を備えるＶａｎｔａｇｅ  Ｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｕｍｍ  ＶＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）である。流速は、１４ｍＬ／分であった。精製される溶媒は、まずカラム上に保持された。次いで、保持された生成物は、勾配を使用する移動相により溶離された。以下の勾配が使用された：０ｍＬから５５０ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有した０％の移動相、５５０ｍＬから１０４１ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有した０％の移動相、１０４１ｍＬから１０９３ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有した１０％の移動相、１０９３ｍＬから１１３３８ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有した１００％の移動相、１３３８ｍＬから１４８６ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有した１００％の移動相、１４８６ｍＬ以上の保持容量では、溶液Ｂを含有した０％の移動相。溶離剤のＵＶ吸収度は、２１５ｎｍで監視された。６８９．３ｍＬの保持容量でピークに達したＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加形）に対応する留分は、収集され（図２）、凍結乾燥された。凍結乾燥された粉末は、２５ｍＬのｐＨ４．３での２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解され、精製工程は、同一の陽イオン交換クロマトグラフの条件下で、再び繰り返された。収率：１７９．４ｍｇ。
【０４０５】
精製されたＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３、レーン２）および逆相ＨＰＬＣ（図４Ａ）で分析された。水性媒体［５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）溶液、ｐＨ１０、５０℃で一晩]中のＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体の開裂可能な特性も、両ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３、レーン３）および逆相ＨＰＬＣ（図４Ｂ）により研究され、複合体からのＧＬＰ−１の完全放出が見られた。カラムは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ社が販売する、５μｍ粒子の１００ｍｍ×２．１ｍｍのＩＤ  Ｂｅｔａｓｉｌ  Ｃ１８カラムであった。逆相ＨＰＬＣは、３７℃で行われた０．１％の脱イオン化水（溶液Ｃ）内の移動相およびアセトニトリル（溶液Ｄ）内の０．１％ＴＦＡを使用した。逆相ＴＰＬＣに使用した勾配は以下の通りであった：０．００から１０．００分の時間では、溶液Ｄを含有した３５％の移動相、２０．００から２１．００分の時間では、溶液Ｄを含有した５５％の移動相、２１．００から２３．００分では、溶液Ｄを含有した８０％の移動相、２３．００から２４．００の時間では、溶液Ｄを含有した８０％の移動相、２４．００から２５．００の時間では、溶液Ｄを含有した３５％の移動相、２５．００以上の時間では、溶液Ｄを含有した３５％の移動相。
【０４０６】
Ｓｔｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８からのエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃを使用した複合体のプロテアーゼ消化後のＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体（モノＰＥＧ付加種）のＮ−末端ＰＥＧ付加部位（Ｈｉｓ７）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により確認された。
【０４０７】
（実施例４．  ＧＬＰ−１に結合した放出可能ＰＥＧ部分を有する例示的ＧＬＰ−１−ポリマ複合体の調製：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の調製）
【０４０８】
【化０５８】
2009519961.tif 000066
ポリマ試薬であるＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、上記の実施例２に記載の通りに調製された。
【０４０９】
ｐＨ５．５０での２５ｍＬの２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液内の５０ｍｇＧＬＰ−１（名目上１．２２７６×１０−５モル）（ＧＬＰ−１の実純度は９８．５％であり（ＨＰＬＣにより）、ペプチド含有率は８２．２％であった）の溶液は調製され、次いで、拡散しながら、１．４９７１ｇｍのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−ＮＨＳ（３．０６９２×１０−５モル）が添加された。溶液は、室温で１５時間撹拌することが可能であり、それにより、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のＰＥＧ付加のＧＬＰ−１複合体の形成が可能になる。反応混合物は、２ＮＨＡｃでｐＨ４．００に酸性化され、次いで、ｐＨ３．００での２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で５０ｍＬに希釈された。
【０４１０】
Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１のモノＰＥＧ付加複合体を得るために、Ａ°ＫＴＡベーシックシステムの陽イオン交換クロマトグラフィにより精製された（図５）。カラムは、ＳＰセファロース高性能イオン交換媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えるＶａｎｇａｔｅ  Ｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＶＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。カラム内の流速は、１４ｍＬ／分であった。精製に使用した移動相は、ｐＨ４．００での２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ａ）およびｐＨ４．００で１ＭＮａＣｌを有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ｂ）から成った。精製される溶液は、まずカラム上に保持された。次いで、保持された生成物は、勾配を使用する移動相により溶離された。以下の勾配が使用された：０ｍＬから５５０ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、５５０ｍＬから１０４１ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、１０４１ｍＬから１０９３ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１０％の移動相、１０９３ｍＬから１３３８ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、１３３８ｍＬから１４８６ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、１４８６ｍＬ以上の保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相。溶離剤のＵＶ吸収率は２１５ｎｍで監視された。６６８．４ｍＬの保持容量でピークに達したモノＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１に対応する留分は、収集され（図５）、凍結乾燥された。凍結乾燥された粉末は、２５ｍＬのｐＨ４．０での２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解され、精製工程は、同一の陽イオン交換クロマトグラフの条件下で、再び繰り返された。６６８ｍＬで収集した留分は凍結乾燥された。
【０４１１】
精製Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６、レーン２）で分析された。水性媒体［５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）溶液、ｐＨ１０、５０℃で一晩］中のＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋＮｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体の開裂可能な特性も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図６、レーン３）により研究され、複合体からのＧＬＰ−１の完全放出が見られた。
【０４１２】
（実施例５．  ＧＬＰ−１に結合した放出可能ＰＥＧ部分を有する例示的ＧＬＰ−１−ポリマ複合体の調製：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の調製）
例示的放出可能なポリマ試薬である、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳは、ＧＬＰ−１のリジン位置に共有的および放出可能的に結合され、本明細書でＧＬＰ−１の「内部」のＰＥＧ付加という。
【０４１３】
ｐＨ１０．０での２４．５ｍＬの２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液内の３０ｍｇのＧＬＰ−１（名目上１．２２７６ラ１０−５モル）（ＧＬＰ−１の実純度は９８．５％（ＨＰＬＣにより）であり、ペプチド含有量は８２．２％であった）の溶液が調製され、次いで、拡散しながら、２７６．３ｍｇのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳ（１．１０４９×１０−５モル、上記の実施例２に記載の通り調整）が添加された。溶媒は、室温で１０分間撹拌することが可能であった。次いで、反応混合物は、２ＮＨＡｃによりｐＨ４．３０に酸性化された。
【０４１４】
モノＰＥＧ付加形内のＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１を得るために、反応混合物は５つのアリコートに分割され、Ａ°ＫＴＡベーシックシステムの各アリコートは、陽イオン交換クロマトグラフィにより単独に精製された。カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが販売する、５ｍＬの濃縮樹脂ＨｉＴｒａｐTMＳＰ  ＨＰであり、カラム内の流速は、５ｍＬ／分であった。精製に使用した移動相は、ｐＨ４．３０での２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ａ）およびｐＨ４．３０で１ＭＮａＣｌを有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ｂ）であった。移動相は、勾配を使用して移動した。以下の勾配が使用された：０ｍＬから１１８．６ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、１１８．６ｍＬから２１９．１ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、２１９．１ｍＬから２２９．２ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１０％の移動相、２２９．２ｍＬから２６９．４ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、２６９．４ｍＬから２７９．４ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、２７９．４ｍＬ以上の保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相。溶離液のＵＶ吸収率は、２１５ｎｍで監視された。１５０．４ｍＬの保持容量でピークに達するＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１に対応するモノＰＥＧ付加ＧＬＰ−１留分は、各精製中に収集された（図７）。次いで、各精製作動からの精製Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加ＧＬＰ−１形内の）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（図８）。収集された留分は混合され、凍結乾燥された。収率：４１ｍｇ。
【０４１５】
（実施例６．  ＧＬＰ−１に結合した放出可能なＰＥＧ部分を有する例示的ＧＬＰ−１−ポリマ複合体の調製：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の調製）
例示的放出可能なポリマ試薬である、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳは、ＧＬＰ−１のリジン位置に共有的および放出可能的に結合され、本明細書でＧＬＰ−１の「内部」のＰＥＧ付加という。
【０４１６】
ｐＨ１０．０での４５ｍＬの２０ｍＭの酢酸ナトリウム重炭酸塩緩衝液内の５０ｍｇのＧＬＰ−１（名目上１．２２７６×１０−５モル）（ＧＬＰ−１の実純度は９８．５％（ＨＰＬＣにより）であり、ペプチド含有量は８２．２％であった）の溶液が調製され、次いで、拡散しながら、８９８．０ｍｇのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−ＮＨＳ（１．８４１４×１０−５モル、上記の実施例２に記載の通り調整）が添加された。溶媒は、室温で１０分間撹拌することが可能であった。次いで、反応混合物は、２ＮＨＡｃによりｐＨ４．００に酸性化された。
【０４１７】
モノＰＥＧ付加形内のＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１を得るために、酸性化された反応混合物（５０ｍＬ）は１０のアリコートに分割され、各５ｍＬのアリコートは、Ａ°ＫＴＡベーシックシステムの陽イオン交換クロマトグラフィにより精製された。カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが販売する、５ｍＬの濃縮樹脂ＨｉＴｒａｐTMＳＰ  ＨＰであり、カラム内の流速は、５ｍＬ／分であった。精製に使用した移動相は、ｐＨ４．００での２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（Ａ）およびｐＨ４．００で１ＭＮａＣｌを有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（Ｂ）であった。移動相は、勾配を使用して移動した。以下の勾配が使用された：０ｍＬから１１８．６ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、１１８．６ｍＬから２１９．１ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、２１９．１ｍＬから２２９．２ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１０％の移動相、２２９．２ｍＬから２６９．４ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、２６９．４ｍＬから２７９．４ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、２７９．４ｍＬ以上の保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相。溶離液のＵＶ吸収率は、２１５ｎｍで監視された。１５８．３ｍＬの保持容量でピークに達するＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１に対応するモノＰＥＧ付加ＧＬＰ−１留分は、各精製中に収集された（図９）。各精製中に精製されたＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加ＧＬＰ−１形内の）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（図１０）。収集された留分は混合され、限外ろ過で凝縮され、凍結乾燥された。収率：１８７．５ｍｇ。
【０４１８】
（実施例７．  ＧＬＰ−１に安定的に結合したＰＥＧを有する例示的のＧＬＰ−１−ポリマ複合体の調製：ＰＥＧ２Ｋ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の調製）
ＧＬＰ−１を放出する生理的条件下で開裂可能である、実施例３から６に記載するモノＰＥＧ付加ＧＬＰ−１複合体とは異なり、本実施形態に記載するモノＰＥＧ付加ｍＰＥＧ２ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１は、安定アミドが１つのＧＬＯ−１のリジン残基に安定結合することで形成されたｍＰＥＧ−ＧＬＰ−１複合体である。調製方法を以下に記載する。
【０４１９】
ｐＨ１０．０での９０ｍＬの２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液内の１００ｍｇのＧＬＰ−１（名目上２．４５５３×１０−５モル）（ＧＬＰ−１の実純度は９８．５％（ＨＰＬＣにより）であり、ペプチド含有量は８２．２％であった）の溶液が調製され、次いで、拡散しながら、９０．７ｍｇのｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ２Ｋ（３．６８２９×１０−５モル）が添加された。溶媒は、室温で１０分間撹拌することが可能であった。次いで、反応混合物は、最終量の１００ｍＬまで、２  Ｎ  ＨＡｃによりｐＨ４．３０に酸性化された。溶液は、脱イオン化水を添加して、２００ｍＬに希釈され、希釈液はｐＨ４．３０であった。
【０４２０】
「ｍＰＥＧ２ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１」で示される、そのように形成されたＧＬＰ−１のこのモノＰＥＧ付加形は、Ａ°ＫＴＡベーシックシステムの陽イオン交換クロマトグラフィにより精製された。カラムは、ＳＰセファロース高性能イオン交換媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えるＶａｎｇａｔｅ  Ｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＶＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。流速は、１４ｍＬ／分であった。精製に使用した移動相は、ｐＨ４．３０での２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ａ）およびｐＨ４．３０で１ＭＮａＣｌを有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ｂ）であった。精製される溶液は、まずカラム上に保持された。次いで、保持された生成物は、勾配移動相を使用して溶離された。以下の勾配が使用された：０ｍＬから５５０ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、５５０ｍＬから１０４１ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相、１０４１ｍＬから１０９３ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１０％の移動相、１０９３ｍＬから１３３８ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、１３３８ｍＬから１４８６ｍＬの保持容量では、溶液Ｂを含有する１００％の移動相、１４８６ｍＬ以上の保持容量では、溶液Ｂを含有する０％の移動相。溶離剤のＵＶ吸収率は２１５ｎｍで監視された。１０９８．２ｍＬの保持容量でピークに達するモノＰＥＧ付加ｍＰＥＧ２ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１に対応する留分は、収集され（図１１）、脱イオン化水に緩衝液交換され、凍結乾燥された。収率：２３ｍｇ。
【０４２１】
精製モノＰＥＧ付加ｍＰＥＧ２ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２、レーン１）で分析された。その分子量は、５４９９ＤａであるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより決定された。
【０４２２】
Ｎ−末端（Ｈｉｓ７）ではなく、レジン残基（Ｌｙｓ２６またはＬｙｓ３４）で結合するモノＰＥＧ付加ｍＰＥＧ２ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１のＰＥＧ付加部位は、エンドプロテナーゼＬＹＳ−Ｃを使用した複合体のプロテアーゼ消化後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により確認された。
【０４２３】
（実施例８．  具体的ＧＬＰ−１ポリマ重合体の血糖値低下作用を分析するためのマウスにおけるインビトロ研究）
オスの糖尿病のマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０１ａＨｓｄ）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（イスラエル、エルサレム）から購入した。生後８〜９週の動物（３０〜４０ｇｍ）は、マウスケージ（ケージ当たり２匹）に入れられ、研究開始前に、少なくとも４８時間、環境順応させる。
【０４２４】
Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（実施例３）、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（実施例４）、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（実施例５）およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（実施例６）の調製は前述の実施例に記載される。各化合物は、容量に対応する濃度（ＧＯＰ−１当量を基準）および１００μＬの注入量を調製するために、ガラス製バイアルに正確に重量化され、生理食塩水中に溶解された。
【０４２５】
研究は、実現可能段階および評価段階の第２段階に分割された。
【０４２６】
実現可能段階では、ＧＬＰ−１の効果を検査するために糖尿病のｄｂ／ｄｂマウス使用の実現可能性がまず評価される。実現可能段階を実行する上で、幾つかのグループのマウスが使用され、各グループには４匹のマウスが使用される。ベースライン血糖値のデータは、薬剤投与の２〜３日前に各マウスから収集された。これは動物グループのいかなる異常値を特定するために実施された。治療日（０日目）に、各動物の体重が量られた。時間０日目の血液試料（５〜１０μＬ）が尾静脈から採取された。血糖値（ｍｇ／ｄＬ）は、グルコースアナライザを使用して測定された。次いで、各動物は、背中の皮膚下に皮下投与（ＳＣ）された。投与された被検物質量および投与量（６０と１２０μｇ／マウス）は、動物の平均体重に基づくものであり、投与量の全量は１０ｍＬ／ｋｇを超えなかった。その後、動物は、ケージに戻された。５から１０μＬの血液試料（３５ｇのマウスの２ｍＬ血液量の０．５％以下）は、以下の時点で針／毛細管を介して除去された。−３、−２、−１、０、０．０４、０．１６、０．３３、１．０、１．１６日。摂取された各血液試料は、その血糖値が検査された。研究の最後に、動物は二酸化炭素窒息により人道的に安楽死させられた。
【０４２７】
評価段階では、３〜５日の効果用に、ＧＬＰ−１の持続的送達を実現するために必要とされる適切な投与量を選択するために、フィージビリティ段階からの結果が使用された。評価段階を行う上で、各グループに８匹のマウスが使用された。ベースライン血糖値のデータは、薬剤投与の３日前に各マウスから収集された。治療日（０日目）に、各動物の体重が量られた。時間０日目の血液試料（５〜１０μＬ）が尾静脈から採取された。血糖値（ｍｇ／ｄＬ）は、グルコースアナライザを使用して測定された。次いで、各動物は、背中の皮膚下に皮下投与（ＳＣ）された。投与された被検物質量は、動物の平均体重に基づくものであり、投与量の全量は１０ｍＬ／ｋｇを超えなかった。その後、動物は、ケージに戻された。５から１０μＬの血液試料（３５ｇのマウスでは２ｍＬ血液量の０．５％以下）は、以下の時点で針／毛細管を介して除去された。−３、−２、−１、０、０．０４、０．１６、０．３３、０．５、１、２、３、６日。採取された各血液試料は、その血糖値が検査された。投薬後最初の４時間は、動物は餌を与えられなかった。研究の最後に、動物は二酸化炭素窒息により人道的に安楽死させられた。
【０４２８】
以下の表４は、試験化合物および各グループの動物への投与量を示す。
【０４２９】
【表００４】
2009519961.tif 000067
研究からのデータが収集され分析された。動物は、単回皮下投与に耐用性があったことに留意されたい。図１３に示すとおり、ＧＬＰ−１およびそれぞれのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（図中、「ＰＥＧ２０−Ｌｙｓ−ＧＬＰ１」と表す）ならびに、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１（図中「ＰＥＧ４０−Ｌｙｓ−ＧＬＰ１」と表す）複合体の血糖値低下効果が確認された。薬力学的（ＰＤ）測定で見られ、ＧＬＰ−１はマウスから迅速に除去されるが、ＧＬＰ−１複合体は、３〜４日にわたりペプチドを放出する。つまり、本発明の例示的ＧＬＰ−１分解可能の複合体は、インビトロ加水分解により無傷ＧＬＰ−１を、時間をかけて放出して、分子ポンプにやや似た働きをする。共有結合した親水性ポリマ（すなわち、ＰＥＧ）は、ＧＬＰ−１インビトロ（すなわち、酵素分解からタンパク質を保護する）を安定化するだけでなく、３〜４日の延長期間にわたり血流内にタンパク質を徐々に放出して、その循環する半減期を延長する働きをする。４０キロダルトンのＰＥＧ複合体は、２０キロダルトンのＰＥＧ複合体を比較すると、小さいが広範なＰＤ効果を有することも観測された。
【０４３０】
図１３からのデータは以下を示唆する。（ａ）ＧＬＰ−１は、ＰＥＧ付加複合体からの拡散または加水分解によって、注入部位からマウスの血液に放出される。（ｂ）ＰＥＧ−ＧＬＰ１に共役したレジンの血糖値を低下させる活性は、無傷複合体の活性と、対象複合体からのペプチドの明らかなインビトロ放出を組み合わせることが原因である場合がある。
【０４３１】
図１４は、ＧＬＰ−１およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の血糖値低下効果を示す。ＧＬＰ−１は、マウスから迅速に除去されるが、ＰＥＧ  ＧＬＰ−１複合体は、３〜４日にわたりペプチドを放出する、薬力学的（ＰＤ）測定で明らかである。４０キロダルトンのＰＥＧ複合体は、２０キロダルトンのＰＥＧ複合体を比較すると、小さいが広範なＰＤ効果を有することも観測された。
【０４３２】
この一連のデータ（図１４）は、以下を示唆する。（ａ）ＧＬＰ−１は、ＰＥＧ付加複合体の拡散および加水分解によって、注入部位からマウスの血管内に放出される。（ｂ）ヒスチジン共役ＰＥＧ−ＧＬＰ１は活性ではなく、見られた血糖値を低下する活性は複合体からのペプチドの放出が原因である。
【０４３３】
この研究は、本明細書に記載のするＰＥＧ付加ＧＬＰ−１の一回の注入は、４８時間以上の長期間にわたって糖尿病を制御するために用いることができることを明示する。本研究は、ＧＬＰ−１と共役する際、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ試薬の持続放出特性も明示する。本研究は、ＧＬＰ−１は、非経口投与に適した生成物を提供するために、Ｎ−末端でＰＥＧ付加されることができることも示した。
【０４３４】
（実施例９．  ４０ｋＤａの分岐ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
【０４３５】
【化０５９】
2009519961.tif 000068
分岐ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａ、（「ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ」）
アルゴン下で−２０℃で保存されたｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、４０ｋＤａは、常温まで暖められる。暖められたｍＰＥＧ２−ＮＨＳの５倍の過剰（ＧＬＰ−１の原液の測定したアリコート内のＧＬＰ−１の量に関連）は、１０％の試薬液を生成するために、２ｍＭ  ＨＣｌ中に溶解される。１０％の試薬液は、ＧＬＰ−１原液のアリコート（リン酸ナトリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加され、よく混ぜられた。ＰＥＧ試薬を添加した後、反応混合物のｐＨは、７．０に決定され、調整された。アミド結合を介して、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳがＧＬＰ−１へ結合することを可能にするために、反応液は、室温で共役を促進するために、一晩、Ｓｌｏｗ  Ｓｐｅｅｄ  Ｌａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒに置かれる。反応は、トリス緩衝液で急冷される。共役溶液は、共役混合物のコンポーネントを決定するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより特徴付けられる。イオン交換クロマトグラフィは、共役物を精製するために使用される。
【０４３６】
異なる分子量のＧＩｐ−１共役は、異なる分子量のｍＰＥＧ２−ＮＨＳ試薬を使用して、同様に調製される。１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａなど。
【０４３７】
（実施例１０．  ３０ｋＤａの線状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα―酪酸メチルを有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
【０４３８】
【化０６０】
2009519961.tif 000069
線状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−酪酸メチル誘導体、３０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ−ＳＭＢ」）
アルゴン下で−２０℃で保存されたｍＰＥＧ−ＳＭＢ、３０ｋＤａは、常温まで暖められる。暖められたｍＰＥＧ−ＳＭＢの１０倍過剰（ＧＬＰ−１の原液の測定したアリコート内のＧＬＰ−１の量に関連）は、１０％の試薬液を生成するために、２ｍＭ  ＨＣｌ中に溶解される。１０％の試薬液は、ＧＬＰ−１原液のアリコート（リン酸ナトリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加され、よく混ぜられた。ｍＰＥＧ―ＳＭＢを添加した後、反応混合物のｐＨは、７．０に決定され、調整された。アミド結合を介して、ｍＰＥＧ−ＳＭＢがＧＬＰ−１へ結合することを可能にするために、反応液は、室温で共役を促進するために、一晩、Ｓｌｏｗ  Ｓｐｅｅｄ  Ｌａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒに置かれる。反応は、トリス緩衝液で急冷される。
【０４３９】
共役溶液は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより特徴付けられる。イオン交換クロマトグラフィは、共役物を精製するために使用される。
【０４４０】
この同一の方法を用いて、他の共役物を、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、４０ｋＤなど、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ０ＳＭＢを使用して調製する。
【０４４１】
（実施例１１．  ２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ピペリドンを有するＧＬＰ‐１のＰＥＧ付加）
２０，０００ダルトンの分子量を有するｍＰＥＧ−ピペリドン（ｍＰＥＧ−ＰＩＰ）を、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）より入手する。ポリマ試薬の基本構造は以下に提供する。
【０４４２】
【化０６１】
2009519961.tif 000070
アルゴン下にて−２０℃で保存された２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＰＩＰを、常温まで暖める。５０から１００倍過度（ＧＬＰ−１の原液の測定したアリコート内のＧＬＰ−１の量に対して）の暖められたｍＰＥＧ−ＰＩＰは、１０ｍＭリン酸ナトリウム中（ｐＨ７．０）中で溶解し、１０％の試薬液を生成する。１０％の試薬液は、ＧＬＰ−１原液のアリコート（リン酸ナトリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加してよく混合する。ｍＰＥＧ−ＰＩＰを添加した後、反応混合物のｐＨは、７．０に決定および調整し、続いて３０分間の混合を行う。そして還元剤であるシアノホウ化水素ナトリウムを添加し、１３ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を作る。反応溶液は、一晩Ｓｌｏｗ  Ｓｐｅｅｄ  Ｌａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒに置き、室温で共役を促進する。反応物は、トリス緩衝液で急冷する。
【０４４３】
共役溶液は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって特徴付けられる。イオン交換クロマトグラフィは、共役物を精製するために使用する。
【０４４４】
この同一の方法を用いて、他の共役物を、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤなど、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＰＩＰを使用して調製することが可能である。
【０４４５】
（実施例１２．  ２０ｋＤａの線状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体を有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ線状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ」）
アルゴン下で−２０℃で保存された２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤを、常温まで暖める。３０倍過度（ＧＬＰ−１の原液の測定したアリコート内のＧＬＰ−１の量に対して）の暖められたｍＰＥＧ−ＢｕｔｒｙＡＬＤは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、１０％の試薬液を生成する。１０％の試薬液は、ＧＬＰ−１原液のアリコート（リン酸ナトリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加してよく混合する。ｍＰＥＧ−ＢｕｔｒｙＡＬＤを添加した後、反応混合物のｐＨは、６．０に決定および調整し、続いて３０分間の混合を行う。そして還元剤であるシアノホウ化水素ナトリウムを添加し、９ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を作る。反応溶液は、一晩Ｓｌｏｗ  Ｓｐｅｅｄ  Ｌａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒに置き、室温で共役を促進する。反応物は、トリス緩衝液で急冷する。共役溶液は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび陰イオン交換クロマトグラフィによって特徴付けられる。
【０４４６】
この同一の方法を用いて、他の共役物を、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤなど、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤを使用して調製することが可能である。
【０４４７】
（実施例１３．  ４０ｋＤａの分岐ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体を有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
【０４４８】
【化０６２】
2009519961.tif 000071
アルゴン下で−２０℃で保存された４０ｋＤａのｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤを、常温まで暖める。３０倍過度（ＧＬＰ−１の原液の測定したアリコート内のＧＬＰ−１の量に対して）の暖められたｍＰＥＧ２−ＢｕｔｒｙＡＬＤは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、１０％の試薬液を生成する。１０％の試薬液は、ＧＬＰ−１原液のアリコート（リン酸ナトリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加してよく混合する。ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｒｙＡＬＤを添加した後、反応混合物のｐＨは、従来技術を使用して６．０に決定および調整し、続いて３０分間の混合を行う。そして還元剤であるシアノホウ化水素ナトリウムを添加し、９ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を作る。反応溶液は、一晩Ｓｌｏｗ  Ｓｐｅｅｄ  Ｌａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒに置き、室温で共役を促進する。反応物は、トリス緩衝液で急冷する。
【０４４９】
共役溶液は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびイオン交換クロマトグラフィ法によって特徴付けられる。
【０４５０】
この同一の方法を用いて、他の共役物を、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、５０ｋＤ、６０ｋＤなど、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤを使用して調製することが可能である。
【０４５１】
（実施例１４．  ｍＰＥＧ−ＳＢＡを有するＧＬＰ‐１のＰＥＧ付加）
２０，０００ダルトンの分子量を有するｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエートを、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）より入手する。ポリマ試薬の基本構造は以下に提供する。
【０４５２】
【化０６３】
2009519961.tif 000072
ＧＬＰ−１は、水溶液（１ｍｇ／ｍＬ中リン酸緩衝液）中に溶解する。そしてこの溶液に、１．５から１０倍モル過度のｍＰＥＧ−ＳＢＡを添加する。ｍＰＥＧ−ＳＭＢを添加した後、反応混合物のｐＨは、７．０から７．５に決定および調整する。結果として生じる混合物は、室温で数時間撹拌する。
【０４５３】
反応混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質のＰＥＧ付加の程度を決定する。
【０４５４】
（実施例１５．  ２０ＫのｍＰＥＧ−ＭＡＬを有するシステイン挿入ＧＬＰ−１の共役）
【０４５５】
【化０６４】
2009519961.tif 000073
【０４５６】
【化０６５】
2009519961.tif 000074
ＧＬＰ−１は、米国特許出願第６０／３４６，４７４号および第６０／４０５，０９７号に記載される通りに、１つ以上のシステイン残留物が挿入される。実例となるシステイン修飾ＧＬＰ−１化合物は、ＷＯ  ２００４／０９３８２３に記載される。
【０４５７】
アルゴン下で−２０℃で保存された２０ＫのｍＰＥＧ−ＭＡＬを、常温まで暖める。５から２０倍過度の暖められた２０ＫのｍＰＥＧ−ＭＡＬは、脱イオン水中に溶解し、１０％のｍＰＥＧ  ＭＡＬ溶液を生成する。ｍＰＥＧ  ＭＡＬ溶液は、システイン修飾ＧＬＰ−１原液のアリコート（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加してよく混合する。室温での１時間の反応後、反応バイアルは冷温室へ移し、Ｒｏｔｏｍｉｘ（低速、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）上で４℃で一晩、反応を進行させる。
【０４５８】
共役混合物は、ゲルろ過クロマトグラフィを使用して精製する。サイズ排除クロマトグラフィ法を、反応混合物および最終生成物を分析するために開発する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析も、試料の特徴付けのために使用する。
【０４５９】
（実施例１６．  ３０ＫのｍＰＥＧ−ＭＡＬを有するＧＬＰ−１の共役）
【０４６０】
【化０６６】
2009519961.tif 000075
システイン修飾ＧＬＰ−１は、上記の実施例１６に記載の通りに得られる。
【０４６１】
アルゴン下で−２０℃で保存された３０ＫのｍＰＥＧ−ＭＡＬを、常温まで暖める。５から２０倍過度の暖められた３０ＫのｍＰＥＧ−ＭＡＬは、脱イオン水中に溶解し、１０％のｍＰＥＧ  ＭＡＬ溶液を生成する。ｍＰＥＧ  ＭＡＬ溶液は、システイン挿入ＧＬＰ−１原液のアリコート（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）に迅速に添加してよく混合する。室温での１時間の反応後、反応バイアルは冷温室へ移し、Ｒｏｔｏｍｉｘ（低速、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）上で４℃で一晩、反応を進行させる。
【０４６２】
共役混合物は、ゲルろ過クロマトグラフィを使用して精製する。サイズ排除クロマトグラフィ法を、反応混合物および最終生成物を分析するために開発する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析も、試料の特徴付けのために使用する。
【０４６３】
（実施例１７．  水性反応における、２０ＫＤＡのＭＰＥＧ−スクシンイミジルベンズアミド炭酸塩を有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
【０４６４】
【化０６７】
2009519961.tif 000076
アルゴン下で−２０℃で保存された、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）より入手可能な２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＢＣを、常温まで暖める。反応は室温で行う。計算された量の暖められた２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＢＣ（絶対ＧＬＰ−１含有量に基づく、８倍モル過度の２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＢＣを得るため、４１４ｍｇ）の重量を、５ｍＬガラス製バイアル内で量る。１．１ｍＬのＤＭＳＯをＰＥＧに添加し、ＰＥＧが溶解するまで４０℃の水槽中で加熱する。そして室温まで再び平衡化させる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で調製されるＧＬＰ−１の４．５ｍｇ／ｍＬ溶液の２．０ｍＬアリコートを、１０ｍＬガラス製バイアルに添加し、容量をさらなるＰＢＳにより４．５ｍＬにする。タンパク質は、中程度の速度で磁気攪拌器を使用して攪拌する。ＰＥＧは、約１ｍＬ／ｍｉｎの速度で、シリンジ注入を介してタンパク質に添加する。反応は１０分間進行させる。そして、１ＭのＨＣｌでｐＨを５．５まで下げることによって急冷する。
【０４６５】
共役溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。
【０４６６】
（実施例１８．  水性反応における、３０ＫＤＡのＭＰＥＧ−スクシンイミジルベンズアミド炭酸塩を有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
採用されるＰＥＧ試薬が３０ｋＤａの分子量を保有することを除いて、ＧＬＰ−１は上記の例１８に記載の通りにＰＥＧ付加される。
【０４６７】
（実施例１９．  水性反応における、２０ＫＤＡのＭＰＥＧ−スクシンイミジルフェニル炭酸塩を有するＧＬＰ−１のＰＥＧ付加）
【０４６８】
【化０６８】
2009519961.tif 000077
アルゴン下で−２０℃で保存された、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）より入手可能な２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＰＣを、常温まで暖める。反応は室温で行う。絶対ペプチド含有量に基づき、絶対８倍モル過度のｍＰＥＧ−ＳＰＣ試薬を使用する。ＰＥＧ試薬の重量を、磁気攪拌器を含む５ｍＬのガラス製バイアル内で量る。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で調製されるＧＬＰ−１の４．５ｍｇ／ｍＬ溶液の２．０ｍＬアリコートを添加し、容量をさらなるＰＢＳにより４．５ｍＬにする。混合物は、ＰＥＧが完全に溶解するまで、磁気攪拌器を使用して最大速度で攪拌する。攪拌速度は５０％に下げ、反応は共役生成物の形成へ進行させる。反応の終わりの共役溶液のｐＨはを測定し、必要に応じて０．１ＭのＨＣｌの添加によってさらに酸性化して、最終溶液のｐＨを約５．５にする。
【０４６９】
そして共役溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）によって分析し、反応の程度（つまり、反応が完了したかどうか）を決定する。
【０４７０】
上記に記載の通りに行われる付加的な反応は、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａより入手可能な、（ｉ）３０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＰＣ、および（ｉｉ）４０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＰＣで行われる。
【０４７１】
（実施例２０．  ＰＥＧ−Ｇｌｐ−１複合体のインビトロ活性分析）
実施例３〜７および９〜２０に記載の複合体の生物活性は、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：８４−８８に記載の通りのインビトロ活性分析を使用して検査する。
【０４７２】
ＰａｎＶｅｒａ  ＬＬＣ  ＣＲＥ−ＢＬＡＭシステムを使用する、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＨＥＫ−２９３は、ポリ−ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェルプレート内に、１０％ＦＢＳを伴う２０，０００から４０，０００セル／ウェル／１００μｌのＤＭＥＭ培地で播種する。播種の後日、培地を振り払い、８０μｌの血漿遊離型ＤＭＥＭ培地を添加する。播種後の３日目、異なる濃度のＰＥＧ−ＧＬＰ−１複合体を含む０．５％ＢＳＡを伴う２０μｌの血漿遊離型ＤＭＥＭ培地を、各ウェルに添加し、用量反応曲線を生成する。概して、それからＥＣ５０値を決定することが可能である用量反応曲線を生成するために、３ナノモルから３０ナノモルのＰＥＧ−ＧＬＰ−１複合体を含む１４の希釈物を使用する。５時間のインキュベーション後、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１複合体とともに、２０μｌのβ−ラクタマーゼ基質（ＣＣＦ２／ＡＭ、Ｐａｎ  Ｖｅｒａ  ＬＬＣ）を添加し、インキュベーションを、蛍光性が蛍光光度計上で決定される時間である１時間にわたって続ける。
【０４７３】
（実施例２１．  Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のインビトロ解放プロファイル）
Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のインビトロ解放プロファイルを決定した。
【０４７４】
Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加形ＧＬＰ−１の形状で）を実施例３に記載の通りに調製し、加水分解条件下でＧＬＰ−１の解放を評価するために使用した。
【０４７５】
Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のインビトロ解放プロファイルを決定するために使用される条件は、リン酸緩衝食塩水中の２ｍｇ／ｍＬのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加ＧＬＰ−１形）、ｐＨ７．４、３７℃、様々な時点で採取されて「遊離型」または複合していないＧＬＰ−１の存在について検査される試料を含んだ。ＧＬＰ−１の解放は、２１５ｎｍで逆相ＨＰＬＣによって監視した。
【０４７６】
図１５は、グラフ形の実験結果を説明し、Ｙ＝Ａｔ／Ａｍａｘである（Ａｔは、ｔ（ｈｒ）の時間で解放されたＧＬＰ−１のＨＰＬＣピーク面積であり、Ａｍａｘはその最大解放に達したＧＬＰ−１のＨＰＬＣピーク面積である）。反応速度論が曲線図の直線性により一次反応を表すため、式中、ｋは勾配である、１ｎｌ／（１−Ｙ）＝ｋｔ、ｔ１／２＝１ｎ２／ｋと結論付けることが可能である。データの外挿に基づき、複合体は５６．８時間の加水分解半減期を保有すると決定した。
【０４７７】
（実施例２２．  ｍＰＥＧ２ｋ−Ｏ（ＣＨ２）４−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の合成および精製）
【０４７８】
【化０６９】
2009519961.tif 000078
ＧＬＰ−１（４３．２ｍｇ、１３．０μｍｏｌ）を、酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＬ、ｐＨ＝５．０２）およびＣＨ３ＣＮ（１０００μＬ）中で溶解した。ｍＰＥＧ２ｋ−ｂｕｔｙｒＡＬＤ（２５９．２ｍｇ、１３０μｍｏｌ）を攪拌とともに添加し、反応を２０分間室温で維持した。そして固体ＮａＣＮＢＨ３（５〜８ｍｇ、７〜１０ｅｑ）を添加し、還元反応を分析ＨＰＬＣによって監視した。一晩（１６時間）反応させた後、生成物は、Ａ°ＫＴＡTM  Ｂａｓｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および０．７６ＣＶ（カラム体積）中の０．１％  ＴＦＡ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ中の３６．３−５６％  ＣＨ３ＣＮの勾配を使用して、ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）によって精製した。モノｍＰＥＧ２ｋ−Ｏ（ＣＨ２）４−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１に対応する留分を収集した。生成物は凍結乾燥し、白色粉末として得た。収率：６４．５ｍｇ。
【０４７９】
（実施例２３．  ｍＰＥＧ５Ｋ−ＯＣ６Ｈ４−ＯＣＯ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の合成、精製および加水分解（ｍＰＥＧ５ｋ−ＳＰＣ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１））
【０４８０】
【化０７０】
2009519961.tif 000079
ＧＬＰ−１（４３．６ｍｇ、１３．２μｍｏｌ）を、室温の酢酸ナトリウム緩衝液（２８ｍＬ、ｐＨ＝５．９５）中で溶解した。反応の進行を分析ＨＰＬＣによって監視している間に、ｍＰＥＧ５ｋ−ＳＰＣ（５５６ｍｇ、１１１μｍｏｌ）をいくつかの異なる部分に添加した。生成物の最大ピーク面積に達した後、生成物の混合物は、５ＣＶ中の０．１％  ＴＦＡ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ中の３７．８〜６０％  ＣＨ３ＣＮの勾配を伴うＡ°ＫＴＡTM  Ｂａｓｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、即時に精製した。モノｍＰＥＧ５ｋ−ＳＰＣ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１に対応する留分を収集し（１４ｍＬ／留分）、生成物は凍結乾燥して白色粉末として得た。収率：７５ｍｇ。
【０４８１】
加水分解：
ｍＰＥＧ５ｋ−ＳＰＣ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−ｌはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）中で溶解し、３７℃まで暖めた。加水分解は分析ＨＰＬＣによって分析した。半減期は、ＭＳ検出器に従って約８時間と決定した。ＰＥＧ付加ＧＬＰ−１は３日後に完全に加水分解され、６％の未知の生成物を残した。天然ＧＬＰ−１が加水分解時に解放されたものの、主要加水分解生成物は遊離型ＧＬＰ−１ではなくむしろ、下記に示されるＨｉｓ−カルバメート化合物であった。この結果は、ＬＣ−ＭＳによってさらに確認された。
【０４８２】
同様の現象は、ｍＰＥＧ−ＳＢＣ試薬との反応によって調製された対応Ｎ末端ＧＬＰ−１複合体に対して観察された。利用される条件下で複合体をさらに精製しようとする場合、複合体は極度に不安定であることが分かった。複合体は急速に、天然ＧＬＰ−１および、ＧＬＰ−１のＮ末端ヒスチジンのイミダゾリル窒素による、カルバメートカルボニルにおける反応による分子内閉環反応に起因するＧＬＰ−１誘導体に加水分解した。それによって解放される修飾ＧＬＰ−１を下記に示す。さらなる精製は追求されなかった。
【０４８３】
【化０７１】
2009519961.tif 000080
（実施例２４．  ＧＬＰ−１に付着する解放可能ＰＥＧ部分を有する例示的ＧＬＰ−１ポリマ複合体の調製：ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の調製）
【０４８４】
【化０７２】
2009519961.tif 000081
実例となるポリマ試薬であるＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−ＢＴＣ（構造を下記に提供する）は、ＧＬＰ−１のＮ末端に共有結合され、ＰＥＧ部分が解放可能に付着しているタンパク質のプロドラッグ形を提供した。ポリマ試薬の二腕性質は、投与後に、ＧＬＰ−１部分に安定性の増加を提供することによって、持続的放出製剤を提供し、それによってＧＬＰ−１は、加水分解を介して複合体から解放され、天然または未修飾ＧＬＰ−１先駆物質を提供する。ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の構造は上記に提供される（構造中、「ＧＬＰ−１」はアミノ酸８〜３６に対応するＧＬＰ−１の残基であり、ＧＬＰ−１のＮ末端ヒスチジンは、イミダゾール環よりもむしろアルファアミンにおける共役を明確に解説するように示される）。
【０４８５】
【化０７３】
2009519961.tif 000082
ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−ＢＴＣ（ＢＴＣ＝炭酸ベンゾトリアゾール）は、即時出願が優先権を請求し、その内容は参照することにより本明細書に組み込まれている、２００６年６月１６日に出願された、米国特許出願第１１／４５４，９７１号に記載される方法に従って調製した。
【０４８６】
ｐＨ５．５０の１００ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の４００ｇのＧＬＰ−１（１．１１４６×１０−４ｍｏｌ）の溶液を調製し、続いて５分間にわたって１．７３７ｇのＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−ＢＴＣ（３．９０１３×１０−４ｍｏｌ）を攪拌してゆっくりと添加し、１７ｍＬの２ｍＭ  ＨＣｌ中で新たに溶解した。溶液は、室温で１３時間撹拌し、それにより、ＰＥＧ付加ＧＬＰ−１複合体である、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の形成を可能にした。反応混合物は、１ｍＬの１Ｍグリシンの添加によって急冷した。溶液のｐＨは、０．５Ｎ  ＮａＯＨによって７．０に調整した。反応混合物は、室温でさらに２時間撹拌した。そして急冷された反応混合物は、２０ｍＭ  ＨＡｃの添加によってｐＨ４．０に酸性化した。反応物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘより入手可能な、１３０Ａ°のメソ細孔および２μｍのメソ細孔を伴う、１００ｍｍ×４．６ｍｍのＩＤ  ＯｎｙｘモノリシックＣ８カラムを使用して、逆相ＨＰＬＣによって監視した。２５℃の脱イオン水中の０．１％ＴＦＡ（溶液Ｃ）およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶液Ｄ）の移動相を、４分間にわたる３５％Ｂから５５％Ｂへの線状勾配を使用して採用した。
【０４８７】
モノＰＥＧ付加形のＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１を得るために、酸性反応混合物（１２５ｍＬ）を３アリコートに分け、各アリコートは個別に、ｐＨ４．３０の２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ａ）、およびｐＨ４．３０の１ＭのＮａＣｌを伴う２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（溶液Ｂ）の移動相を使用するＡ°ＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ上の陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。利用したカラムは、流速３０ｍＬ／ｍｉｎであるＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の１６０ｍＬカラム体積を備えるＶａｎｇａｔｅ  Ｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＶＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。粗溶液はまず、ｐＨ４．３０の酢酸ナトリウム緩衝液の添加によって希釈し、そしてカラムに搭載した。溶離液のＵＶ吸収率は２１５ｎｍで監視した。ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加形）ピークに対応する留分を収集した。残りの粗組成物の精製を行い、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（モノＰＥＧ付加形）ピークに対応する留分を組み合わせ、逆相ＨＰＬＣによって分析し、限外ろ過によって濃縮した。濃縮した溶液は、ｐＨ４．３の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液に交換された緩衝液であった。そして溶液は凍結乾燥された。収率：１６３．２ｍｇ。
【０４８８】
精製したＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。その分子量は、７８３１．６Ｄａとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって決定した。水性媒体［２００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）溶液を伴う、ｐＨ４．３０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液の１：２ｖ／ｖ混合物、３７℃で１６時間インキュベート］のＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体の開裂可能性も、逆相ＨＰＬＣによって検討し、それより複合体からのＧＬＰ−１の完全解放を観察した。
【０４８９】
（実施例２５．  糖尿病マウスモデルにおける、修飾ＧＬＰ−１作用薬であるＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の薬力学的評価）
本研究の目的は、マウスの気管内に投与される（ＩＴ）、実例となるＧＬＰ−１複合体であるＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の薬理活性を実証することであった。
【０４９０】
オスの糖尿病マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０１  ａＨｓｄ）を本研究で使用した。試験システムは、約８〜９週齢の２１匹のオスの糖尿病マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０１  ａＨｓｄ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ）を含んだ。表５を参照。マウスは麻酔をかけ、そしてその上顎切歯によって垂直につるした。背側の位置よりつるされた動物に接近し、栄養補給針を取り付けた１ｍＬシリンジをマウスに経口挿入し、竜骨の真上で気管内に下降させた。該用量を肺に注入し、そして栄養補給針を即時に取り除いた。エキセナチドを、２０Ｇの１インチ１ｍＬツベルクリンシリンジを使用して、皮下（ＳＣ）注射によって投与した。約０．０７ｍＬの血液試料を各時点において尾静脈から収集した。これらの試料は、グルコースの濃度について検査した。グルコース測定は、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）グルコースモニタで２度繰り返して行った。これらのグルコメータの定量化（ＵＬＯＱ）の上限は６００ｍｇ／ｄｌである。この値（６００ｍｇ／ｄｌ）は、ＯＬＯＱを上回った時に記述統計の計算に使用した。ベースラインの％として表される、血糖濃度の群中央値を図１６に示す。これらの値は、ベースラインとしてその２４時間の投与前血糖測定値を使用して、各個別動物に対して計算した。統計的評価は、０．０５のＰ値で両側ｔ検定により行い、対応する時点における治療および媒体群の群中央値を比較した。１時間のエキセナチド測定に対する対応する媒体時点がない場合は、４時間の媒体測定を統計的比較に使用した。ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１およびエキセナチド治療群の選択された時点も、それらのそれぞれのＴ＝０値と比較した。
【０４９１】
【表００５】
2009519961.tif 000083
本研究の目的、つまり、マウスの気管内に投与される（ＩＴ）場合の、実例となる解放可能ＧＬＰ−１複合体の薬理活性を実証することを達成した。
【０４９２】
マウスは、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１または媒体を気管内に投与し、投与後の様々な時点における血糖濃度について検査した。ＳＣ投与されるエキセナチドは、陽性対照として使用した。
【０４９３】
血糖の有意な低下が、エキセナチドを投与された群において１時間の時点で観察された。血糖は、次の時点（８時間）までにベースラインに戻っていた。
【０４９４】
ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、投与後４および８時間で血糖の大幅な低下を引き起こした。グルコース抑制の規模は、エキセナチドの投与後に観察されるよりも大きかった。Ｔ＝０時間投与前測定、および対応する時点における媒体群の値の両方と比べると、この低下は統計的有意であった。
【０４９５】
原型のＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１には、薬理活性がないと考えられる。これは恐らく、Ｎ末端ＰＥＧが、その受容体に対するＧＬＰ−１リガンドの相互作用に干渉するためである。インビボの薬理活性の観察、および投与後最大８時間の活性の発生は、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のインビボの開裂および活性ＧＬＰ−１の解放と一致する。
【０４９６】
３つの他の時点（３１、５２、および５５時間）において、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１群と媒体群との間で統計的有意差が観察された。該差の規模は、４および８時間で観察されたよりも大幅に小さかった。４および８時間で観察された低下と対照的に、これら３時点におけるグルコース値は、Ｔ＝０における値と有意差がなかった。この観察の生物学的意義はさらに評価する必要があるが、肺中の残留４Ｋ−ＦＭＯＣ  ＧＬＰ−１の開裂の遅延は理論的には、グルコース抑制の遅延を結果としてもたらす。
【０４９７】
化合物が原因である副作用は、これらの研究では観察されなかった。１匹のマウスの死（動物１−８）は、投与過程が原因であった。
【０４９８】
つまり、この実験の結果は、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の気管内投与は、オスの糖尿病マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０ｌａＨｓｄ）モデルにおける、統計的有意な、重度かつ長期の血糖の抑制を結果としてもたらしたことを示唆する。
【０４９９】
（実施例２６．  糖尿病マウスモデルにおける、修飾ＧＬＰ−１作用薬であるｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の薬力学的評価）
本研究の目的は、マウスの気管内に投与される（ＩＴ）場合の、例示的なＧＬＰ−１複合体であるｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の薬理活性を実証することであった。
【０５００】
オスの糖尿病マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０１  ａＨｓｄ）を本研究で使用した。投与された複合体であるｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は開裂可能であり、インビボで活性ＧＬＰ−１を解放することが予期された。解放されたＧＬＰ−１部分には、Ｎ末端における残留カルボニル残基により、約２００倍の活性低下があることが予期された。
【０５０１】
試験システムは、約８〜９週齢の１８匹のオスの糖尿病マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０１  ａＨｓｄ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ）を含んだ。マウスは麻酔をかけ、そしてその上顎切歯によって垂直につるした。背側の位置よりつるされた動物に接近し、栄養補給針を取り付けた１ｍＬシリンジをマウスに経口挿入し、竜骨の真上で気管内に下降させた。該用量を肺に注入し、そして栄養補給針を即時に取り除いた。エキセナチドを、２０Ｇの１インチ１ｍＬツベルクリンシリンジを使用して、皮下（ＳＣ）注射によって投与した。約０．０７ｍＬの血液試料を各時点において尾静脈から収集した。これらの試料は、グルコースの濃度について検査した。グルコース測定は、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）グルコースモニタで２度繰り返して行った。これらのグルコメータの定量化（ＵＬＯＱ）の上限は６００ｍｇ／ｄｌである。この値（６００ｍｇ／ｄｌ）は、ＯＬＯＱを上回った時に記述統計の計算に使用した。血糖濃度の群中央値（ｍｇ／ｄｌ）を図１７に示す。統計的評価は、０．０５のＰ値で両側ｔ検定により行い、選択された時点を、その治療群のＴ＝０値と比較した。
【０５０２】
【表００６】
2009519961.tif 000084
本研究の目的である、マウスの気管内に投与される（ＩＴ）場合の、ＰＥＧ付加および解放可能ＧＬＰ−１複合体の薬理活性を実証することを達成した。
【０５０３】
マウスは、ｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１または媒体を気管内に投与し、投与後の様々な時点における血糖および血漿インスリン濃度について検査した。ＳＣ投与されるエキセナチドは、陽性対照として使用した。
【０５０４】
血糖の有意な低下が、エキセナチドを投与された群において１および３時間の時点で観察された。血糖は、次の時点（２４時間）までにベースラインに戻っていた。
【０５０５】
ｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１は、媒体と比較すると、２時間時点から３１時間時点（最後）までの血糖プロファイルの全体的な低下を引き起こした。個々の時点における群中央値を投与前の値と比較すると、２および４時間でのグルコース抑制は、統計的有意性に達した。これは、比較に−２４または０時間の投与前の値を使用したかにかかわらず正しかった。これらの時点におけるグルコース低下は、対応する時点における媒体群の値と比較すると、有意性に達しなかった。非投与前時点につきマウスが３匹しかなかったこと、および個々のマウスの値の間に大幅な変動があることに注目すべきである。
【０５０６】
原型のｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１には、薬理活性がないと想定される。これは、Ｎ末端ＰＥＧが、その受容体に対するＧＬＰ−１リガンドの相互作用に干渉するためであると推定される。Ｎ末端における残留駆るカルボニル部分（受容体・リガンド結合にも干渉する可能性がある）により、解放されたＧＬＰ−１部分には、天然ＧＬＰ−１と比較すると、低いレベルの薬理活性があることが予期される。開裂生成物のこのより低い固有活性は、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のものと比べてあまり顕著でないｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の薬理効果の一因となったかもしれない。インビボの薬理活性の観察、および投与後最大４時間の活性の発生は、ｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のインビボの開裂およびある形の活性ＧＬＰ−１の解放と一致する。
【０５０７】
個々の時点において統計的有意性に達しないものの、ｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のＩＴ投与は、媒体群と比べて、４時間時点後にグルコース抑制の明白な持続を結果としてもたらす。
【０５０８】
化合物が原因である副作用は、これらの研究では観察されなかった。
【０５０９】
つまり、この実験の結果は、開裂可能なＧＬＰ−１複合体である、ｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の気管内投与は、オスの糖尿病マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ  ｄｂ／０ｌａＨｓｄ）モデルにおける、血糖の統計的有意な抑制を結果としてもたらしたことを示唆する。
【０５１０】
先行の実施形態および利点は例示的なものに過ぎず、本発明を限定するものとして解釈されない。本発明の説明は、請求項の範囲を制限するのではなく、実例となることを目的としている。多くの変更、改良、および変形は、当業者にとって明白であろう。
【０５１１】
このように本発明を完全に解説すると、本発明の方法は、本発明の範囲、またはそのいかなる実施形態も逸脱せずに、広範かつ同等の条件、形成、およびその他のパラメータにより実行することが可能であることが、当業者にとって理解されるであろう。
【０５１２】
本明細書で引用されるあらゆる特許および出版物は、参照することにより、完全にその全体を本明細書に組み込まれる。任意の出版物の引用は、出願日より前のその開示のためであり、そのような出版物が従来技術である、または本発明には、先行発明のために、そのような出版物を先行する資格がないという承認として解釈されるべきではない。
【産業上の利用可能性】
【０５１３】
本発明は、記載された複数の限定されない図面を参照して、下記の本発明の説明においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０５１４】
【図１】図１は、実施例３で説明されるようなＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−ＧＬＰ−１反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に対応する。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２非染色標準。レーン２：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１反応混合物。
【図２】図２は、実施例３で説明されるような陽イオン交換クロマトグラフィによる、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−ＧＬＰ−１の精製の結果を明示する。
【図３】図３は、ＧＬＰ−１の解放の前後のモノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−ＧＬＰ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に対応する（実施例３）。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２非染色標準。レーン２：イオン交換クロマトグラフィによる精製後の、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２−Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体。レーン３：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体からのＧＬＰ−１の次の完全解放。
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂは、実施例３で説明されるような、イオン交換クロマトグラフィによる精製の後（図４Ａ）、およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体からの解放の後（図４Ｂ）の、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体の逆相ＨＰＬＣ分析を明示する。
【図４Ｂ】図４Ａ、４Ｂは、実施例３で説明されるような、イオン交換クロマトグラフィによる精製の後（図４Ａ）、およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体からの解放の後（図４Ｂ）の、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体の逆相ＨＰＬＣ分析を明示する。
【図５】図５は、実施例４で説明されるような陽イオン交換クロマトグラフィによる、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１の精製の結果を図示する。
【図６】図６は、ＧＬＰ−１の解放の前後のモノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す（実施例４）。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２非染色標準。レーン２：イオン交換クロマトグラフィによる精製後の、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２−Ｆｍｏｃ４０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体。レーン３：Ｇ２ＰＥＧ２−Ｆｍｏｃ４０Ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体からのＧＬＰ−１の次の解放。
【図７】図７は、陽イオン交換クロマトグラフィによる、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の精製を明示する（実施例５）。
【図８】図８は、陽イオン交換クロマトグラフィによって精製されるモノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に対応する（実施例５）。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２非染色標準。レーン２乃至６：イオン交換クロマトグラフィによる５つの個別精製後の、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２−Ｆｍｏｃ２０Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１複合体を含む分画。
【図９】図９は、陽イオン交換クロマトグラフィによる、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の精製の結果を図示する（実施例６）。
【図１０】図１０は、実施例６で説明されるような、１つの陽イオン交換クロマトグラフィ精製からのＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１反応混合物および分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２非染色標準。レーン２：Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の反応混合物。レーン３〜５：９．３７ｍＬの保持容量におけるピークからの分画。レーン６〜１０：１５８．３ｍＬの保持容量におけるピークから回収されたモノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の分画。
【図１１】図１１は、実施例７で説明されるような陽イオン交換クロマトグラフィによる、モノＰＥＧ化Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１の精製の結果を明示する。
【図１２】図１２は、精製されたｍＰＥＧ２Ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に対応する（実施例７）。レーン１：クロマトグラフィ精製後のモノＰＥＧ化ｍＰＥＧ２ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１。レーン２：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２非染色標準。
【図１３】図１３は、実施例８に説明されるような、ｄｂ／ｄｂマウスに皮下投与した時の、ＧＬＰ−１、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−ｌ複合体、およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｌｙｓ−ＧＬＰ−１複合体の、経時的な比較血糖低下効果を明示する曲線図である。
【図１４】図１４は、実施例８に説明されるように、ｄｂ／ｄｂマウスに皮下投与した時の、ＧＬＰ−１、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体、およびＧ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ４０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１複合体の、経時的な比較血糖低下効果を明示する曲線図である。
【図１５】図１５は、実施例２１に示されるような、Ｇ２ＰＥＧ２Ｆｍｏｃ２０ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１のインビトロ解放プロファイルを示す曲線図である。
【図１６】図１６は、エキセナチド（皮下）、ＰＥＧ２−ＣＡＣ−Ｆｍｏｃ４ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（気管内）、または媒体（気管内）を投与されたマウスの群平均血糖濃度の曲線図である。血糖濃度は、実施例２５に説明されるように、２４時間投与前で測定された値の％として表される。
【図１７】図１７は、実施例２６に説明されるように、エキセナチド（皮下）、ｍＰＥＧＳＰＣ５ｋ−Ｎｔｅｒ−ＧＬＰ−１（気管内）、または媒体（気管内）を投与されたマウスの群平均血糖濃度の曲線図である。
【図１】
2009519961.tif 000095
【図２】
2009519961.tif 000096
【図３】
2009519961.tif 000097
【図４Ａ】
2009519961.tif 000098
【図４Ｂ】
2009519961.tif 000099
【図５】
2009519961.tif 000100
【図６】
2009519961.tif 000101
【図７】
2009519961.tif 000102
【図８】
2009519961.tif 000103
【図９】
2009519961.tif 000104
【図１０】
2009519961.tif 000105
【図１１】
2009519961.tif 000106
【図１２】
2009519961.tif 000107
【図１３】
2009519961.tif 000108
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
2009519961.tif 000113
2009519961.tif 000114
2009519961.tif 000115
2009519961.tif 000116
2009519961.tif 000117