(57)【要約】  本発明は、ｉ）ｘが１００〜１６０の範囲の整数であるＨＢｃＡｇ１−ｘ、この抗原断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらのうちの２つ、ii）サポニン、またはサポニン誘導体、または少なくともこれらの２つの混合物を含有する、免疫増進剤、を含有し、任意で、iii）ＨＢｓＡｇ、この抗原からの断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらの２つを含有することを特徴とする、組成物に関する。また本発明は、組成物の製造方法、この方法によって得られる組成物、医薬製剤、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用ならびに／もしくは予防用の組成物または医薬製剤の使用、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用ならびに／もしくは予防用の医薬品を製造するための組成物または医薬製剤の使用、のほか、ＨＢＶ感染およびＨＢＶが仲介する疾患の治療ならびに／もしくは予防方法に関する。【選択図】図１
2009507877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
ｉ）ｘが１００〜１６０の範囲の整数であるＨＢｃＡｇ１−ｘ、この抗原断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらのうちの２つ、
ii）サポニン、またはサポニン誘導体、または少なくともこれらの２つの混合物を含有する、免疫増進剤、
および選択的に、
iii）ＨＢｓＡｇ、この抗原からの断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらの２つ、
を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
ｘが、１４０〜１４９の範囲の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｘが１４４〜１４６の範囲の整数であることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組成物であって、
前記免疫増進剤が、サポニン複合体、サポニン誘導体の複合体、または少なくともそれらの２つの混合物であり、
水または塩水溶液とは異なる成分として、
（α１）０〜９５重量％のリン脂質、
（α２）０〜９５重量％のステロイド、
（α３）５〜１００重量％の前記サポニンまたは前記サポニン誘導体、および（α４）０〜２０重量％の別の添加剤、
を含有することを特徴とし、
これらの重量が、それぞれ、前記サポニン複合体または前記サポニン誘導体の複合体の全重量を基準とし、
その水部分またはその塩水溶液部分を除いて、成分（α１）〜（α４）の総量が１００重量％であることを特徴とする、組成物。
【請求項５】
前記免疫増進剤が、ＩＳＣＯマトリックスであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
抗原性成分ｉ）または抗原成分ii）およびiii）と免疫増進剤ii）との相対量比が、１：２０〜２０：１の範囲であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物中の成分ｉ）、ii）および選択的にiii）の総濃度が、０．１〜２，０００μｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４５および
ii）サポニン複合体
を含有することを特徴とする、組成物
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４４＋Ｉおよび
ii）サポニン複合体。
を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４５、
ii）サポニン複合体、および
iii）ＨＢｓＡｇ
を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４４＋Ｉ、
ii）サポニン複合体、および
iii）ＨＢｓＡｇ
を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
生産工程Ｉ）、II）、およびIV）、さらに選択的にIII）を含むことを特徴とする、組成物の調製方法。
Ｉ）ｘが１００〜１６０の範囲の整数であるＨＢｃＡｇ１−ｘ、この抗原断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらのうちの２つの混合物を提供すること、
II）サポニン、サポニン誘導体、または少なくともこれらの２つの混合物を含有する、免疫増進剤を提供すること、
III）ＨＢｓＡｇ、この抗原からの断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらの２つの混合物を提供すること、および
IV）前記ＨＢｃＡｇ１−ｘ、前記免疫増進剤、および選択的に前記ＨＢｓＡｇを接触させること。
【請求項１３】
ｘが、１４０〜１４９の範囲の整数であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｘが、１４４〜１４６の範囲の整数であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物であって、
前記免疫増進剤が、サポニン複合体、サポニン誘導体の複合体、または少なくともこれらの２つの混合物であり、
水または塩水溶液とは異なる成分として、
（α１）０〜９５重量％のリン脂質、
（α２）０〜９５重量％のステロイド、
（α３）２０〜１００重量％の前記サポニンまたは前記サポニン誘導体、および
（α４）０〜２０重量％の別の添加剤、
を含有することを特徴とし、
これらの重量が、それぞれ、前記サポニン複合体または前記サポニン誘導体の複合体の全重量を基準とし、その水部分またはその塩水溶液部分を除いて、（α１）〜（α４）の成分の総量が１００重量％であることを特徴とする、組成物。
【請求項１６】
前記免疫増進剤が、ＩＳＣＯマトリックスであることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法によって得られる、組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１１または１７のいずれかに記載の組成物および好適な添加剤を含有する、医薬製剤。
【請求項１９】
ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用ならびに／または予防用の医薬製剤を製造するための、請求項１〜１１または１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２０】
慢性ＨＢＶ感染症の治療用医薬製剤を調製するための、請求項１〜１１または１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の使用であって、
前記組成物がＨＢｓＡｇを含有し、
前記ＨＢＶ感染症または前記ＨＢＶが仲介する疾患が、本発明に係る組成物が含有するＨＢｓＡｇの遺伝子型または亜型とは異なる遺伝子型または亜型をもつＨＢウイルスによって引き起こされたことを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組成物、組成物の製造方法、この方法により得られる組成物、医薬製剤、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用ならびに／もしくは予防用の組成物または医薬製剤の使用、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用ならびに／もしくは予防用の医薬品を製造するための組成物または医薬製剤の使用、のほか、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療ならびに／もしくは予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機構（ＷＨＯ）の推定によれば、今日の人口の２０億人以上が、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に現在感染しているか、または感染経験をもつ。ＨＢＶは、このようにヒトの健康に多大な影響を与える最も重要なヒト病原体に属する。
【０００３】
ＨＢＶによる感染症は、汚染した血液製剤や性交により、血液を介して起こり、特に感染した母親から新生児に、出産中または出産直後に感染する。ＨＢＶは向肝性ウイルスを代表するものであり、急性感染症も慢性感染症もどちらも引き起こすことができる。出産時または生後１カ月の感染は、９０％の症例において、慢性感染症に至るが、成年の感染の場合、慢性感染は約１０％の症例で観察されるにすぎない。感染した成体の約２％で、劇症肝炎（急性肝不全）が発症することがあり、高率で死亡する。
【０００４】
慢性感染症は、始めは臨床症状を示さないが、継続的に存在するＨＢＶおよび免疫系と感染肝細胞との病理学的相互作用によって、１０〜３０年の潜伏期の後、急性肝疾患（活動性の慢性Ｂ型肝炎）に移行することがある。慢性Ｂ型肝炎を発症する慢性ＨＢＶキャリアの数は約２５％である。慢性Ｂ型肝炎は、最終的に肝硬変および／または原発性肝細胞癌に至る可能性があり、これらはどちらも、高い死亡率を伴う。世界中で、慢性感染ＨＢＶキャリアの数は約３億５０００万人にのぼると推定される。毎年、約１００万人が慢性ＨＢＶ感染症の結果死亡している。
【０００５】
幸い、ＨＢＶ感染症はＢ型肝炎予防ワクチンによって予防することができる。そのようなワクチンは、慢性キャリアの血漿から精製したＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をベースとしており、１９８０年代初頭に初めて入手可能になったが、その後、組換え技術によって製造されるＨＢｓＡｇに取って代わった。しかし、ワクチン接種は現在、必ずしもすべての国で導入されているわけではないため、ＨＢＶは人間の健康を脅かし続けると思われる。ここで、重要な問題は、慢性ＨＢＶキャリアは感染を伝染させウイルスを移すことができるとみなされているということである。
【０００６】
慢性Ｂ型肝炎は、さまざまな発現形態をともなうきわめて動的な疾患である。この慢性感染症の初期段階においては、免疫寛容期があり、この時期は、血清中にウイルスマーカー（ＨＢＶ−ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ）が存在することと、肝障害がみられないことが特徴である。ＨＢＶキャリアの約２５％が慢性肝炎期に移行し、この間に最初の肝炎症状が現われ、治療が必要になる。この慢性肝炎期に、血清中のＨＢＶ−ＤＮＡが一般に減少し血清トランスアミナーゼが断続的に増加する。ＨＢｓＡｇが血清中に存在し続ける間、自然にＨＢｅＡｇ陽性からＨＢｅＡｇ陰性へのセロコンバージョンを起こす患者が、ごくわずか（約１％）存在する。このセロコンバージョンは無症候性キャリア期に入った兆候である。この時期はウイルスの活動性が低いことが特徴である。ごくまれな症例において、ＨＢｓＡｇ陽性から抗ＨＢｓＡｇ陽性へのセロコンバージョンも観察され、これは感染が治癒した兆候と考えられる。活動性慢性Ｂ型肝炎は、肝組織の壊死性炎症および繊維症がみられることが特徴で、これはやがて、硬変および非代償性肝疾患を引き起こす。さらに進んだ合併症として、硬変から原発性肝細胞癌に至ることもある。この場合、硬変の兆候を示さず肝癌を発病する慢性ＨＢＶキャリアもいる。
【０００７】
活動性慢性Ｂ型肝炎の治療可能性はきわめて限定されている。現在、治療はインターフェロンα（例えばイントロンＡ（登録商標）もしくはロフェロンＡ（登録商標））または抗ウイルス性物質（ラミブジン、アデフォビル、エンテカビル）により実施可能である。インターフェロンαは好ましくはＨＢｅＡｇ陽性患者に使用される。それにより約３０％が反応してＨＢｅＡｇセロコンバージョンを示すが、それは無症候キャリア状態と関係する。その結果、少数の患者（約３％）が、完全な治癒の兆候としてさらにＨＢｓＡｇセロコンバージョンを示す。しかし、インターフェロンαによる治療は重篤な副作用を伴うため、治療を初期段階で中止しなければならなくなることが多い。ＨＢｅＡｇ陰性患者では、ＨＢｅＡｇ陽性患者と比較して、インターフェロンαへの反応率が低い。この場合、もう１つの方法として、ヌクレオシド／ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤のクラスに属する抗ウイルス性物質を使用することができる。これらの抗ウイルス性物質は、ウイルスの複製を阻害し、その結果、肝疾患の進行を防ぐ。ＨＢｅＡｇ陽性患者のセロコンバージョン率は、インターフェロンα使用の場合と比較して低く、また、自然緩解の場合と比較してもやはり低い。このような理由から、抗ウイルス療法の目標は、ウイルスの活性を減衰させることにより、限りなく長期間にわたって疾患の進行を遅らせることである。しかし、抗ウイルス性物質を長期間服用すると、耐性ウイルス変異体が発生するという問題が起こる。最も頻繁に用いられている物質であるラミブジンの場合は、この４年間で最高６８％にのぼる耐性率が観察された。ごく最近導入されたアデフォビルは、耐性を引き起こしにくいようである。しかし、抗ウイルス性物質類を組み合わせて投与しなければならない場合でも、ウイルス耐性という基本的問題は、長期間治療の本質的な脅威となる。したがって、慢性Ｂ型肝炎の付加的な治療手段が緊急に求められている。特に好ましいのは、副作用が少なく、かつ患者にとって短期治療となる見込みのある免疫調節剤である。
【０００８】
このような選択肢が、治療ワクチンという形態の特異的免疫療法である。治療ワクチンのコンセプトは、ウイルスに対し適切な免疫応答が惹起されるように慢性Ｂ型肝炎患者の免疫系を特異的に刺激し、最終的にウイルスを抑制し肝疾患の進行を阻止できるようにすることである。治療ワクチンが示さなければならない明白な効果の１つが、大量のウイルス抗原の存在下で生じている免疫寛容を克服することである。この治療においては、とりわけ、ＨＢＶの種々の抗原に対する特定の細胞傷害性Tリンパ球のウイルス特異的Ｔ細胞応答を引き起こす必要がある。急性の、自然に治癒する感染症と比較して、慢性Ｂ型肝炎に罹患する患者は、厳密にいえば、このような免疫応答を示すとしてもきわめて小程度か、あるいは、全く示さない。強力なウイルス特異的細胞障害性Tリンパ球応答は、一般に、ウイルス感染が制御されていることを示すと考えられている。したがって、治療ワクチンの開発は、強力な抗ウイルス性細胞障害性Tリンパ球応答を誘導させることを第一のターゲットとしている。
【０００９】
組み換えサブユニット・ワクチンでは、一般に細胞障害性Tリンパ球応答を惹起させることができない。動物（マウス）モデルにおいては、ＤＮＡワクチン、とりわけＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードするプラスミドベクターをベースとしたＤＮＡワクチンによって、顕著な細胞障害性Tリンパ球応答を達成することができる。しかし、ヒトにおいては、現行のワクチンは、これまでのところ、全般的にきわめて弱い免疫応答しか示さず、強力な細胞障害性Tリンパ球応答を刺激しない。このような問題を鑑み、いわゆる「プライムブーストワクチン」が現在開発中である。これは、ＤＮＡワクチン（例えば、ＨＢｓＡｇをコードするもの）と、例えばＨＢｓＡｇを発現する組換えウィルスベクター（例えば、組換え天然痘ウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ由来））により順に免疫を引き起こす治療法である（非特許文献１参照）。
【００１０】
国際公開第０１／９８３３３号（特許文献１）には、ＨＢｃ抗原、とりわけ、ＨＢＶの治療のためのＨＢｃ抗原の使用について記載されている。この抗原は、Ｃ末端の４つのアルギニン反復単位の１つ以上を欠失しているがＣ末端のシステイン残基を保持している。欠失したアルギニン反復単位は、癌に関連する細菌性またはウイルス性病原体、寄生生物、アレルゲンまたは抗原由来のエピトープを表す配列と置換することができる。そのエピトープはヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞または細胞傷害性Tリンパ球によって認識される。
【００１１】
国際公開第２００５／０２３２９７号（特許文献２）には、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用の組成物が開示されている。この組成物は、少なくとも２つのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、それらの断片および／またはこれらをコードする核酸を含有する。従って、この抗原のＳ領域および／またはｐｒｅ−Ｓ１領域におけるＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇが異なり、かつその組成物はＨＢｃＡｇもこれをコードする核酸も含有しないことを特徴とする。
【００１２】
国際公開第２００５／０５６０５１号（特許文献３）には、特に、Ｂ型肝炎感染症の治療または予防のための組換えポリペプチド組成物について記載されている。この組成物は、複数の成分を含有し、好ましくはａ）ＨＢＶコアタンパク質の抗原性領域の配列を含むコア・ポリペプチド要素  ｂ）ＨＢＶ表面抗原タンパク質（Ｓ、ＭまたはＬ領域）の抗原性領域の配列を含む、表面抗原ポリペプチド要素、ｃ）ＨＢＶ  Ｘタンパク質の抗原性領域の配列を含むＸポリペプチド要素、および  ｄ）ＨＢＶポリメラーゼタンパク質の抗原性領域の配列を含むポリメラーゼ・ポリペプチド要素、の以上aからｄのうち少なくとも３つまたは４つのすべてを含有することを特徴としている。ここで、これらの要素の少なくとも１つが、それぞれのＨＢＶタンパク質の少なくとも１００個のアミノ酸を含む。
【００１３】
欧州特許出願公開第１１３６０７７号（特許文献４）には、ＨＢｓＡｇと随意にＨＢｃＡｇとを含有し、とりわけ、治療ワクチンとして使用することができることを特徴とする、鼻用塗布薬のためのワクチン組成物について記載されている。
【特許文献１】国際公開第０１／９８３３３号
【特許文献２】国際公開第２００５／０２３２９７号
【特許文献３】国際公開第２００５／０５６０５１号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１１３６０７７号
【非特許文献１】McConkey S.J., Schneider J., Mendy M., Cavenaugh J.S., Bertoletti A., Whittle H., Hill A. V. S.: “Safety and Immunogenicity of a novel “prime boost” therapeutic immunization strategy against hepatitis B virus”, Meeting abstract: ”The molecular biology of hepatitis B viruses”, Bergamo, Italy, September 7-10, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ヒトにおけるＢ型肝炎感染症の治療用または予防用ワクチン用の先行技術から知られている問題点を克服することを目的とする。
【００１５】
特に、本発明にはヒトの治療に好適な、先行技術から知られている組成物と比較して強力な免疫応答、とりわけ、慢性ＨＢＶ感染症患者において、ＨＢｃＡｇに対する強い細胞傷害性T細胞応答を引き起こす組成物を提供することを目的とした。本組成物は、患者の白血球抗原タイプに関係なく、できるだけ多くの慢性ＨＢＶ感染症患者の免疫寛容を克服することができなれればならない。
【００１６】
本発明に係る組成物は、慢性患者のＨＢＶ遺伝子型に関係なく免疫寛容を克服することができ、その結果ウイルスを抑制下に置くような免疫応答を引き起こすものでなければならない。
【００１７】
さらに本発明は、上記の利点を有する組成物を、できるだけ複雑な調剤工程を経ることなく得られる方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記課題を解決するため、下記の特徴を持った組成物が一助となる。
ｉ）ｘが１００〜１６０の範囲、好ましくは１２０〜１５０の範囲、特に好ましくは１４０〜１４９の範囲、さらに好ましくは１４４〜１４６の範囲、最も好ましくは１４５に等しい整数であるＨＢｃＡｇ１‐ｘ（ＨＢｃＡｇ＝ＨＢＶコア抗原）、この抗原の断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともこれらのうちの２つの混合物、
ii）サポニン、またはサポニン誘導体、または少なくともこれらの２つの混合物を含有する、免疫増進剤、
および選択的に、
iii）ＨＢｓＡｇ、この抗原の断片、この抗原もしくはこの抗原の断片の変異体、または少なくともこれらのうちの２つの混合物。
【００１９】
全くもって意外ではあるが、好都合であることに、原則としてヒトに好適に使用される上記組成物を用いて、動物モデル中で強力なコア特異的細胞傷害性Tリンパ球応答を得ることが可能で、しかもこの細胞傷害性Tリンパ球応答は、同じ動物モデルにおいてＨＢｃＡｇをコードするプラスミドベクター（ＤＮＡ免疫）を使用して得られる細胞傷害性Tリンパ球応答に、ほぼ匹敵するものであることが観察された。
【００２０】
以下に記載される詳細中で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーであり、アミノ酸の特定の最少数に制限されない。したがって、「ポリペプチド」には、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、オリゴマー、粒子などが含まれる。さらに、用語「ポリペプチド」は、リボソームでの翻訳直後に得られるアミノ酸の純粋なポリマーだけでなく、糖鎖形成、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により得られるポリペプチドも含む。
【００２１】
本発明に係る「ＨＢｃＡｇ１−ｘ」とは、天然のＨＢｃＡｇの１番目〜ｘ番目のアミノ酸を含む、好ましくは天然のＨＢｃＡｇの１番目〜ｘ番目のアミノ酸からなるポリペプチドであると理解される。ここで、「ＨＢｃＡｇ１−ｘ」という用語は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨという現在既知の８つの標準的遺伝子型のＨＢｃＡｇの１番目〜ｘ番目（第１番目のアミノ酸はポリペプチドのＮ末端である）のアミノ酸を有すると考えられる全てのポリペプチドであると理解されなければならない。これらの８つの標準的な遺伝子型は、塩基配列の約８％が互いに異なり、（Bartholomeusz, Rev. Med. Virol. 13 (2003), 1-14  参照）、この変異が主にＨＢｓＡｇ遺伝子に関連する。好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａは参照核酸配列Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ０２７６３を含む。また、ＨＢＶ遺伝子型ＡａｆｒはＧｅｎｂａｎｋ  ＡＦ２９７６２１参照核酸配列を含む。ＨＢＶ遺伝子型Ｂａは、参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ  Ｄ００３３０であり、遺伝子型Ｂｊは、参照核酸配列ＡＢ０７３８５８である。ＨＢＶ遺伝子型Ｃは、参照核酸配列はＡＹ２０６３８９であり、遺伝子型Ｃａｕｓは、参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ  ＡＢ０４８７０４である。遺伝子型Ｄは、参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ  Ｘ０２４９６であり、遺伝子型Ｅの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ７５６５７であり、遺伝子型Ｆの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ６９７９８であり、遺伝子型Ｇの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ１６０５０１であり、遺伝子型Ｈの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ０９０４５４である。
【００２２】
ＨＢｃＡｇ１‐ｘの「断片」という用語は、少なくとも２５、好ましくは少なくとも５０、特に好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸配列が、ＨＢｃＡｇ１‐ｘと相同性があるポリペプチドであると理解されることが好ましい。
【００２３】
ＨＢｃＡｇ１‐ｘまたはＨＢｃＡｇ１‐ｘ断片の「変異体」とは、ＨＢｃＡｇ１‐ｘのまたはＨＢｃＡｇ１‐ｘの断片の、最多でも１０、好ましくは最多でも５個のアミノ酸、特に好ましくは最多でも２個のアミノ酸、最も好ましくは最多でも１個のアミノ酸が、Ｃおよび／またはＮ末端で、欠失、挿入、置換、もしくは付加されているポリペプチドであると理解されることが好ましい。中でも特に置換が好ましい。「変異体」という用語にはまた、融合ポリペプチド、特にＨＢｓＡｇとの融合ポリペプチドでＨＢｃＡｇ１‐ｘを含有するものが含まれる。
【００２４】
本発明に係る「免疫増進剤」とは、免疫応答の誘導、好ましくは抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球反応の誘導を可能にする化合物であると理解される。
【００２５】
本発明に係る組成物に含有されるＨＢｃＡｇ１‐ｘは、天然のＨＢｃＡｇと比較して切り詰められており、Ｃ末端核酸結合領域の少なくとも一部、好ましくは、Ｃ末端核酸結合領域の全部を欠失している。該ＨＢｃＡｇ１‐ｘ当業者に既知の遺伝子組換え法によって得ることができる。
【００２６】
一つの可能性として、ウイルス分離株から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃｏｒｅまたはｐｒｅ−ｃｏｒｅ領域の翻訳域を増幅することが挙げられる。また、対応するＤＮＡ塩基配列を合成し、次に、ＰＣＲにより増幅することも考えられる。その後、得られたＰＣＲ断片を、プラスミドベクターでクローニングする。さらにその後、さらなるＰＣＲクローニングによって、対応する長さに短縮された断片を、発現ベクター、例えば大腸菌発現ベクターに挿入することができる。この時、ＨＢｃＡｇ１−ｘ、その断片、または、その変異体をコードする遺伝子が活性プロモーターの制御下に置かれるように挿入されることが好ましい。この発現ベクターには、発現率を高めるため、同時に誘導要素を組み込むことができる。この発現ベクターを大腸菌に導入して形質転換した後、個々のクローンが得られ、これが、ＨＢｃＡｇ１‐ｘ、その断片、またはその変異体のそれぞれを発現する。抗原となるポリペプチドを得るためには、個々のクローンを培地に注入し、振盪フラスコ中で３７℃にて一晩培養する。その後、遠心分離により、まず大腸菌を収集する。大腸菌ペレットを緩衝液中で再懸濁し、次に、超音波処理、または高圧ホモジナイゼーションによって大腸菌を破壊する。ホモジェネート中に個々に存在するＨＢｃＡｇまたはＨＢｃＡｇ変異体群を、硫酸アンモニウムによる析出によって濃縮し、その後、ゲル濾過により、大腸菌成分を除去する。粒子を形成するＨＢｃＡｇ変異体群は、さらに沈降速度遠心法によって精製することができる。粒子が欠乏するＨＢｃＡｇ１−ｘは、理想的にはＮ末端  Ｈｉｓ−Ｔａｇアフィニティマーカーにより改変し、Ｎｉ‐ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーおよびそれに続くゲル濾過により精製する。このようにして製造したＨＢｃＡｇ１−ｘは、濾過滅菌され、本発明に係る組成物を調合するために使用される。
【００２７】
基本的に、本発明の組成物に係るＨＢｃＡｇ１−ｘ、その断片、または変異体は、合成によって得ることもできる。
【００２８】
ポリペプチドの組換え調製または合成技術に関するさらなる詳細は、次のような文献に記載されている。
‐Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (1989);
‐”DNA Cloning”, Volumes I and II (D. N. Glover, editor., 1985); 
‐”Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, editor, 1986); 
‐”Nucleic Acid Hybridization” (B. D. Hames & S. J. Higgins, editors, 1984); 
‐”Transcription and Translation” (B. D. Hames & S. J. Higgins, editors, 1984);
‐“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, editors, 1986); 
‐”Immobilised Cells and Enzymes” (IRL Press, 1986); 
‐B. Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”(1984);
‐”The Methods in Enzymology series” (Academic Press, Inc.), 特に Volumes 154 and 155;
‐”Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. H. Miller and M. P. Calos, editors, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
‐Mayer and Walker, editors, (1987), “Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology” (Academic Press, London);
‐Scopes, (1987), “Protein Purification: Principles and Practice”, second edition (Springer-Verlag, N.Y.); および
‐,,Handbook of Experimental Immunology”, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, editors, 1986)
【００２９】
基本的に、本発明に係る組成物に含まれるＨＢｃＡｇ１‐ｘは、粒子形成性を有しても、有さなくてもよいが、粒子形成性を有するＨＢｃＡｇ１‐ｘのほうがより好ましい。粒子成形性を有するＨＢｃＡｇ１‐ｘは、集合し、直径約２７ｎｍのキャプシドを形成することができる。１８０または２４０個の二量体が集合して高分子構造を形成する。したがって、本発明に係る組成物の特に好ましい実施形態によれば、このＨＢｃＡｇ１‐ｘは、前記の粒子状物質の形で存在する。
【００３０】
本発明に係る好ましい抗原は、特に、ＨＢｃＡｇ１−１２４、ＨＢｃＡｇ１−１２７、ＨＢｃＡｇ１−１４４、ＨＢｃＡｇ１−１４６、ＨＢｃＡｇ１−１４７、ＨＢｃＡｇ１−１４８、ＨＢｃＡｇ１−１４９（すなわち、天然ＨＢｃＡｇの最初の１２７、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、または１４９個のアミノ酸を含む、好ましくはこれらからなるポリペプチド）、およびＨＢｃＡｇ８１−１３３（天然ＨＢｃＡｇの８１番目〜１３３番目のアミノ酸を含む、好ましくはこれらからなるＨＢｃＡｇ断片）である。さらに好ましい抗原はＨＢｃＡｇ１−１４４＋ＡＳである。これは、天然のＨＢｃＡｇの最初の１４４個のアミノ酸を含み、かつ、天然ＨＢｃＡｇでは１４５番目のアミノ酸であるグルタミン酸とは異なるアミノ酸ＡＳを１４５番目のアミノ酸として含むポリペプチドで、グルタミン酸とは異なるこのアミノ酸ＡＳは好ましくはイソロイシンである。本発明に係る組成物中に含有させるのに、特に好ましい抗原は、ＨＢｃＡｇ１‐１４５およびＨＢｃＡｇ１‐１４４＋Ｉである。
【００３１】
本発明によれば、ＨＢｃＡｇ１‐ｘは、ＨＢｃＡｇに対し外来性のエピトープ、特にＨＢｓＡｇエピトープは全く含まないことがさらに好ましい。最も好ましくは、ＨＢｃＡｇ１‐ｘがｐｒｅ−Ｓ１エピトープを含まない、特にｐｒｅ−Ｓ１抗原の３番目〜５５番目のアミノ酸を含まない。また、本発明によれば、ｘが４８、６１、１０７のいずれとも等しくない限り、ＨＢｃＡｇ１−ｘはＣ末端ｘ番目でシステイン残基を含まないことが好ましい。
【００３２】
本発明に係る組成物の特定の実施形態によれば、本組成物は少なくとも２つのＨＢｃＡｇ１‐ｘまたはその断片もしくは変異体を含有し、これらのＨＢｃＡｇ１‐ｘはＨＢＶ遺伝子型が異なる。
【００３３】
本発明に係る組成物は、サポニンもしくはサポニン誘導体または少なくともそれら２つの混合物を含有する免疫増進剤を含有する。好ましくは、この免疫増進剤は、サポニン複合体、サポニン誘導体の複合体または少なくともそれら２つの混合物である。特に好ましくは、このサポニン複合体またはこのサポニン誘導体の複合体は、リポソームサポニン複合体またはリポソームサポニン誘導体の複合体である。
【００３４】
ここで、特に好ましくは、このサポニン複合体、このサポニン誘導体の複合体、または少なくともそれら２つの混合物は、水または塩水溶液とは異なる成分として、
α１）０〜９５重量％、特に好ましくは１０〜５０重量％、最も好ましくは１５〜２５重量％のリン脂質、
α２）０〜９５重量％、特に好ましくは１０〜５０重量％、最も好ましくは１５〜２５重量％のステロイド、
α３）５〜１００重量％、特に好ましくは１５〜９０重量％、最も好ましくは３０〜８０重量％のこのサポニンまたはこのサポニン誘導体、および
α４）０〜２０重量％、特に好ましくは１〜１５重量％、最も好ましくは５〜１０重量％の別の添加物（例えば、リン脂質とは異なる別の脂質および水とは異なるステロイド脂質または溶媒）、
を含有することを特徴とし、
これらの重量による量が、それぞれ、このサポニン複合体またはこのサポニン誘導体の複合体の全重量を基準とし、その水部分またはその塩水溶液部分を除いて、（α１）〜（α４）の成分の総量が１００重量％であることを特徴とする。
【００３５】
このタイプのサポニン複合体は、文献中で、とりわけ、「ＩＳＣＯマトリックス」という名称でも言及されている。該組成物が、成分（α１）〜（α４）に加えて、抗原としてタンパク質類を含む場合、この複合体は「ＩＳＣＯＭ（登録商標）」と呼ばれる。
【００３６】
リン脂質（α１）は、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびジパルミトイルホスファチジルコリンからなる群から選ばれるリン脂質である。
【００３７】
ステロイド（α２）は、好ましくはコレステロール、ラノステロール、ルミステロール、スチグマステロール、およびシトステロールからなる群から選ばれる植物または動物由来のステロイドである。
【００３８】
本発明によれば、サポニンとは、好ましくは、糖とステロイド、ステロイドアルカロイド、もしくはトリテルペンとの化学化合物、またはこれらの化合物の混合物であると理解される。これらは、ステロイドサポニン、ステロイドアルカロイドサポニンおよびトリテルペンサポニンとも呼ぶことができる。そのようなサポニンは界面活性配糖体であり、植物から得ることができる。この場合、免疫増進剤として最も効力のあるサポニンが、南米産の樹木キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）から、好ましくは、この木の樹皮から得られる。キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）からサポニンを単離する工程で、「クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）」として知られている、部分的に精製された状態の抽出物が得られる（この部分精製されたサポニン抽出物とは、規定量のトリテルペンサポニンを含有し、サポニン粗抽出物と比較して毒性が低い）。
【００３９】
また別の好適なサポニンが、R. Tschesche and Wulf, “Chemie and Biologic der Saponine in Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe”published by H. Herz, H. Grisebach, G. W. Kirby, Vol. 30 (1973)に記載されており、特に、極性トリテルペンサポニンなどの高極性サポニン、特に、極性酢酸ビスデスモシド類（ａｃｅｔｉｃ  ｂｉｓｄｅｓｍｏｓｉｄｅｓ）、例えば、キラヤバーク・アラロシドＡ（Ｑｕｉｌｌａｊａｂａｒｋ  Ａｒａｌｏｓｉｄ  Ａ）、キコセツサポニンIV  （Ｃｈｉｋｏｓｅｔｓｕｓａｐｏｎｉｎ  IV）、カレンデュラ・グリコシドＣ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｃ）、キコセツサポニンＶ（Ｃｈｉｋｏｓｅｔｓｕｓａｐｏｎｉｎ  Ｖ）、アキランセス・サポニンＢ（Ａｃｈｙｒｒａｎｔｈｅｓ−Ｓａｐｏｎｉｎ  Ｂ）、カレンデュラ・グリコシドＡ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ａ）、アラロシドＢ（Ａｒａｌｏｓｉｄ  Ｂ）、アラロシドＣ（Ａｒａｌｏｓｉｄ  Ｃ）、ピュトランジ・サポニンIII（Ｐｕｔｒａｎｊｉ−Ｓａｐｏｎｉｎ  III）、バーサマサポニシド（Ｂｅｒｓａｍａｓａｐｏｎｉｓｉｄ）、ピュトラヤ・サポニンIV（Ｐｕｔｒａｊｉａ−Ｓａｐｏｎｉｎ  IV）、トリコシドＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｉｄ  Ａ）、トリコシドＢ（Ｔｒｉｃｈｏｓｉｄ  Ｂ）、  サポナシドＡ（Ｓａｐｏｎａｓｉｄ  ）、トリコシドＣ  （Ｔｒｉｃｈｏｓｉｄ  Ｃ）、ギプソシド（Ｇｙｐｓｏｓｉｄ）、ヌタノシド（Ｎｕｔａｎｏｓｉｄ）、ディアンソシドＣ（Ｄｉａｎｔｈｏｓｉｄ  Ｃ）、サポナシドＤ（Ｄｉａｎｔｈｏｓｉｄ  Ｄ）からのサポニン抽出物が挙げられるが、セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）  由来のエスシン（Ａｅｓｃｉｎ）が好ましい  (T. Patt and W. Winkler: “Das thera-peutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum) “, Arzneimittelforschung 10(4), 273-275 (1960))。
【００４０】
サポニン（α３）は、好ましくは、「クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）」と呼ばれる、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮に由来する部分的に精製されたサポニン抽出物である。これは、国際公開第９６／１１７１１号に記載されているように、少なくとも２２の異なるサポニン画分、この均質なクイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）画分の亜画分（例えばＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、もしくはＱＳ２１など）、またはこの均質なクイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）画分から得られる亜画分のうちの少なくとも２つの混合物、好ましくは亜画分ＡとＣとの混合物からなる。この混合物は、好ましくは５０〜９０重量％の画分Ａおよび１０〜５０重量％の画分Ｃからなる。この画分ＡおよびＣは、国際公開第９６／１１７１１号の実施例１に従って得られる。この種の混合物は、例えば「ＩＳＣＯＰＲＥＰ（（登録商標）７０３」として、市販されている。特定の実施形態によれば、サポニンは、１００重量％の画分Ｃからなることもある。「クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）」由来のサポニンに加えて、例えば、米国特許第６２６２０２９号に記載されているように、サポニン誘導体も該複合体に含有させることができる。本発明に係る好適なサポニン複合体は、特に、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）‐１００、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）‐２００、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）‐３００（イスコノバ社、ウプサラ、スウェーデン）、またはＳｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）ＱＳ−２１（アンチジェニックス社、ウォーバーン、米国）といった市販の製品である。
【００４１】
上記サポニン複合体（ＩＳＣＯマトリックス）の製造は、当業者に既知のそのような複合体の任意の製造方法によって行なうことができる。このようなタイプのサポニン複合体の好ましい製造方法は、例えば、欧州特許出願公開第０２３１０３９号（リポソームサポニン複合体）または国際公開第９０／０３１８４号パンフレット（非リポソームサポニン複合体）に記載されている。ＩＳＣＯマトリックスの製造に関するその開示内容を本明細書に援用し、本発明の開示の一部とする。
【００４２】
本発明に係る組成物が、ＩＳＣＯマトリックスを免疫増進剤として含有する場合、本発明によればさらに、既知のＩＳＣＯＭとは異なり、ＩＳＣＯマトリックスの内部には、一つもしくは複数の抗原が局在しないことが好ましい。
【００４３】
本発明に係る組成物の特定の実施形態によれば、本組成物は、共同免疫増進剤として、サポニン複合体に加えて、サポニン誘導体の複合体、または少なくともこれらの複合体の２つの混合物、サポニンもサポニン誘導体も含有しない別の免疫増進剤を含有することができる。このとき、これらの共同免疫増進剤は、複合体とは別に存在することもできるし、この複合体に抱合されて存在することもできる。共同免疫増進剤としては、ワクチンに一般に使用されている当業者に既知の免疫増進剤であれば、いかなるものも使用することができる。好ましい免疫増進剤は、例えば、サブミクロンの水中油型乳剤などの微粒子状免疫増進剤類（これに属するものの例としては、ＭＦ５９（５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、および０．５％Ｓｐａｎ（登録商標）８５）、ＳＡＦ（１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、５％Ｐｌｕｒｏｎブロックポリマー）、およびスレオニンムラミルジペプチド（ｔｈｒ−ＭＤＰ）が挙げられる）；ミネラル化合物（例えば、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、不完全フロイント免疫増進剤、リポ多糖類、Ｎ−アセチルグルコサミル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル‐ジペプチド（ＧＭＤＰ）もしくはムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＧＡＬセラミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ））；好ましくはリン脂質とコレステロールとを含むリポソーム；ポリ‐ラクチド‐コ−グリコライド（ＰＬＧＡ）などの生分解性高分子の微粒子；オリゴデソキシリボヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを有しても有していなくてもよい）；Ｎ，Ｎ−ジ‐（β‐ステアロイルエチル）‐Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＥＱ１）；糖ペプチド；ミコバクテリアの細胞壁の成分；例えば塩化セチルピリジウムや塩化ベンザルコニウムなどの第四級アミン；３‐（３‐コールアミドプロピル‐ジメチル‐アンモニオ）‐１‐プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）などの両性イオン性アミン；硫酸デキストラン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；Ｐ１２０５もしくはＰｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０１などのブロックコポリマー；ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；３β−ヒドロキシ−５−アンドロスタン−ｌ７−オン（ＤＨＥＡ）；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；  デゾキシコール酸ナトリウム塩；イミキモド；ＤＴＰ−ＧＤＰ；７−アリル−８−オキソグアノシン；モンタナイドＩＳＡ（登録商標）−５１、モンタナイドＩＳＡ（登録商標）‐７２０；ムラメチド；ムラパルミチン；ジセチルホスフェート；ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）；ポリソルベート２０もしくは８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０もしくは８０）をはじめとするＰＥＧソルビタン脂肪酸エステル類、；コレラ毒素または百日咳毒素などの細菌性ＡＤＰリボシル化毒素由来の解毒変異体、または少なくともこれらの免疫増進剤の２つの混合物；を含む群から選ばれる。特に好ましい共同免疫増進剤は、リポ多糖類、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＧＡＬセラミド、ＣｐＧモチーフを有するオリゴデソキシリボヌクレオチド、およ���ＰＥＧソルビタン脂肪酸エステル類である。
【００４４】
共同免疫増進剤として好適な化合物については、Cox, J.C. and Coulter, A.R. “Adjuvants - a classification and review of their modes of action” in Vaccine 15:248-256 (Feb. 1997)に概説されている。ワクチン組成物中に含有させることが可能な免疫増強剤に関するこの文献中の開示内容を、本明細書に援用し、本発明の開示の一部とする。
【００４５】
本発明に係る組成物の、また別の好ましい実施形態によれば、本組成物は、抗原ＨＢｃＡｇ１‐ｘおよび少なくとも一つのＨＢｓＡｇ免疫増進剤に加えて、さらに、この抗原からの断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともそれらの２つの混合物を含有することを特徴とする。ここで、ＨＢｃＡｇ１‐ｘだけでなくＨＢｓＡｇも、本発明に係る組成物中に微粒子の形態で存在することが特に好ましい。
【００４６】
ＨＢｓＡｇは、２２６個のアミノ酸のタンパク質（ｐ２４／ｇｐ２７またはＳタンパク質）で、２０〜３０ｎｍのリポタンパク質粒子に自己集合しており、複合の分子間および分子内ジスルフィド結合によって約１００〜１５０のサブユニットが相互に回路網を成している。本発明に係る組成物に選択的に含有されるＨＢｓＡｇは、ＨＢｃＡｇ１‐ｘと同じように、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨという現在既知の８つの標準的なＨＢＶ遺伝子型に由来する。用語「ＨＢｓＡｇ」には、２２６個のアミノ酸のタンパク質に加えて、Ｍタンパク質およびＬタンパク質の両方もさらに含まれる。これらのM−、L−蛋白質は、ＨＢｓＡｇに加えて、５５アミノ酸長のｐｒｅ‐Ｓ２ペプチド（Ｍタンパク質）または５５アミノ酸長のｐｒｅ‐Ｓ２ペプチドおよび１２０アミノ酸長のｐｒｅ‐Ｓ１ペプチド（Ｌ‐タンパク質）を含む。
【００４７】
ＨＢsＡｇの「断片」という用語は、少なくとも５０、好ましくは少なくとも１５０、特に好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸の配列が、ＨＢcＡｇと相同性があるポリペプチドであると理解されることが好ましい。  
【００４８】
ＨＢsＡｇまたはＨＢsＡｇの断片の「変異体」とは、ＨＢｓＡｇのまたはＨＢｓＡｇの断片の、最多でも５、好ましくは最多でも２個のアミノ酸、特に好ましくは最多でも１個のアミノ酸がＣおよび／またはＮ末端で欠失、挿入、置換、もしくは付加されている（置換が好ましい）ポリペプチドであると理解されることが好ましい。
【００４９】
本発明に係る組成物の好ましい実施形態によれば、本組成物は、少なくとも１つのＨＢｓＡｇを含有するが、このＨＢｓＡｇのみでなく、国際公開第２００５／０２３９７号に記載されているように、少なくとも２つのＨＢｓＡｇまたはそれらの断片もしくは変異体を含有する。ここで、これらのＨＢｓＡｇは、Ｓ領域および／またはｐｒｅ−Ｓ１領域のＨＢＶ遺伝子型が異なる。ここで、国際公開第２００５／０２３９７号に同じように記載されているように、ＨＢＶ遺伝子型が異なる２つのＨＢｓＡｇが均一の粒子の形態で存在することが特に好ましい。「均一のＨＢｓＡｇ粒子」とは、同じＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇのみからなる粒子であると理解される。
【００５０】
これらのＨＢｓＡｇは、当業者に既知の方法により、慢性Ｂ型肝炎患者の血清から合成的に、または組換えポリペプチドとして得ることができる。ここで、ＨＢｃＡｇ１−ｘの作製についての上記方法が参照される。
【００５１】
本発明に係る組成物には、特に医薬製剤として存在する場合、別の添加物iv）薬学的担体または添加物ｉ）、ii）および選択的にiii）を含有させることができる。
【００５２】
好ましい薬学的担体は、特に、水、緩衝水、好ましくはリン酸緩衝リン酸緩衝生理食塩水のような等浸透圧の塩水溶液、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセロール、ヒアルロン酸、エタノール、ポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール類、トリグリセリドなどである。使用する薬学的担体のタイプは、該組成物が、経口、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内のいずれの投与経路用に調製されるかにより決定される。添加剤としては、張性調節剤、湿潤剤、乳化剤、または緩衝物質を、本発明に係る組成物に含有させることができる。
【００５３】
抗原性成分ｉ）または抗原成分ｉ）とiii）、および免疫増進剤ii）との相対重量比は、好ましくは１：２０〜２０：１の範囲、特に好ましくは１：１０〜１０：１の範囲、さらに好ましくは１：５〜５：１の範囲、最も好ましくは：１：２〜２：１の範囲である。個々の適用の場合に最適な免疫増進剤と抗原との重量比は、当業者が、単純な実験により決定することができ、その実験の中で、例えば、細胞傷害性Tリンパ球の応答の強さがこの重量比によって決定される。
【００５４】
本発明に係る組成物がＨＢｃＡｇ１‐ｘに加えてＨＢｓＡｇも含有する場合、そのＨＢｃＡｇ１‐ｘとそのＨＢｓＡｇとの重量比は、好ましくは１：２０〜２０：１の範囲、特に好ましくは１：１０〜１０：１の範囲、さらに好ましくは１：５〜５：１の範囲、最も好ましくは：１：２〜２：１の範囲である。この場合の最適な重量比もやはり、当業者が単純な実験によって決定することができる。
【００５５】
本発明に係る組成物中のｉ）、ii）および、随意のiii）の成分の総濃度（すなわち本発明に係る組成物の容量を基準とする成分ｉ）、ii）およびiii）の総量）は、本発明に係る組成物が凍結乾燥物として存在するのでない限り、好ましくは０．１〜２，０００μｇ／ｍｌの範囲、特に好ましくは０．５〜１，５００μｇ／ｍｌの範囲、さらに好ましくはに１〜１，０００μｇ／ｍｌの範囲、最も好ましくは１０〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００５６】
本発明に係る組成物の１つの実施形態によれば、本組成物は、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４５と、
ii）免疫増進剤としてのサポニン複合体、好ましくはリポソームサポニン複合体と、を含有することを特徴とする。
【００５７】
本発明に係る組成物の別の実施形態によれば、本組成物は、
ｉ）  ＨＢｃＡｇ１−１４４＋Iと、
ii）免疫増進剤としてのサポニン複合体、好ましくはリポソームサポニン複合体と、を含有することを特徴とする。
【００５８】
本発明に係る組成物のまた別の実施形態によれば、本組成物は、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４５と、
ii）免疫増進剤としてのサポニン複合体、好ましくはリポソームサポニン複合体と、
iii）ＨＢｓＡｇと、を含有することを特徴とする。
【００５９】
本発明に係る組成物のさらに別の実施形態によれば、本組成物は、
ｉ）ＨＢｃＡｇ１−１４４＋Iと、
ii）免疫増進剤としてのサポニン複合体、好ましくはリポソーム複合体と、
iii）ＨＢｓＡｇと、を含有することを特徴とする。
【００６０】
本発明に係る組成物はさらに、本明細書中に記載された免疫方法およびＭＧＬＫＦＲＱＬ（配列番号１）（ＨＢｃＡｇの合成断片）による後の再刺激によって、免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞１０５個あたり、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞が、少なくとも３０個、特に好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも７５個、なおいっそう好ましくは少なくとも１００個、最も好ましくは少なくとも３００個のＨＢｃＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を有することを特徴とすることが好ましい。
【００６１】
また、本発明に係る組成物は、さらに、ＨＢｓＡｇを含有する場合、本明細書中に記載された免疫方法による免疫により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＨＢｓＡｇに対する強力な抗体反応を誘導することを特徴とすることが好ましい。総抗ＨＢｓ抗体価は、本明細書中に記載されているＡＵＳＡＢ（登録商標）によるアッセイによって決定し、平均値として、少なくとも１００ｍＩＵ／ｍＬ、好ましくは少なくとも５００ｍＩＵ／ｍＬ、特に好ましくは少なくとも１，０００ｍＩＵ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１，５００ｍＩＵ／ｍＬまでである。抗ＨＢｓ特異的ＩｇＧアイソタイプのクラスの決定は、ＩｇＧ１抗体価およびＩｇＧ２ｂ抗体価がいずれも増加していることを示すが、それはＴｈ１およびＴｈ２の両者の免疫応答が形成されたことを示す。
【００６２】
前述の目的を達成するために、生産工程I）、II）およびIV）、および随意にIII）を含むことを特徴とする、組成物を製造する方法が、さらなる一助となる。これらの工程を以下に示す。
I）ｘが１００〜１６０の範囲、好ましくは１２０〜１５０の範囲、特に好ましくは１４０〜１４９の範囲、さらに好ましくは１４４〜１４６の範囲、最も好ましくは１４５に等しい整数であるＨＢｃＡｇ１‐ｘ、この抗原の断片、この抗原もしくはこの抗原の断片の変異体、または少なくともこれらのうちの２つの混合物を提供すること、
II）サポニン、サポニン誘導体、または少なくともそのうちの２つの混合物を含有する、免疫増進剤を提供すること、
III）ＨＢｓＡｇ、この抗原の断片、この抗原もしくはこの抗原断片の変異体、または少なくともそれらの２つの混合物を提供すること、および
IV）前記ＨＢｃＡｇ１‐ｘ、前記免疫増進剤、および選択的に前記ＨＢｓＡｇを接触させること。
【００６３】
ＨＢｃＡｇ１‐ｘ、またはその断片もしくは変異体として、サポニン、サポニン誘導体、または少なくともそのうちの２つの混合物を含有する免疫増進剤として、さらに、ＨＢｓＡｇ、またはその断片ともしくは変異体として、本発明に係る組成物に関連する好ましい成分ｉ）、ii）およびiii）として、既に言及した化合物が好ましい。
【００６４】
生産工程I）およびIII）に関しては、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇを提供する際、慢性Ｂ型肝炎（ＨＢｓＡｇの場合のみ）の患者の血漿から得られた抗原または抗原断片が、合成法、または組換え発現によって、好適な薬学的担体中で提示されるようにすることが好ましい。この薬学的担体は、好ましくは液体、特に好ましくは水性の液体、さらに特に好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水などの塩水溶液である。このように得られた水性の抗原溶液は、生産工程IVで、他の成分と接触させる前に、当業者に既知の方法によって濾過滅菌することもできる。
【００６５】
本発明に係る方法の好ましい実施形態によれば、生産工程I）およびIII）において、ＨＢｃＡｇおよび選択的にＨＢｓＡｇを提供する際、これらの抗原が、薬学的キャリア中で、好ましくは塩水溶液中で最初に提示され、その濃度が、本発明に係る最終目標組成物中のＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇの濃度の少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも３倍、さらに好ましくは少なくとも４倍、最も好ましくは６倍となることが望ましい（したがって、本発明に係る組成物中のＨＢｃＡｇの濃度が１０μｇ／ｍｌに達する場合は、該組成物を製造する際、最初に塩水溶液中で、ＨＢｃＡｇを少なくとも２０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは少なくとも３０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも４０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは６０μｇ／ｍｌの濃度で提供することが好ましい）。ＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇの両方を本発明に係る組成物に含有させる場合は、前述の濃度（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも６倍に過剰濃縮）で、同じ塩水溶液中でこれらＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇがともに提示されることがより好ましい。本発明によれば、これらの過剰濃縮した抗原溶液は、生産工程IV）で免疫増進剤と接触させる前に、１０分〜４時間、特に好ましくは２０分〜２時間、さらに好ましくは３０分〜１時間の時間、３０〜６０℃の範囲、特に好ましくは３５〜５５℃の範囲、さらに好ましくは３７〜５０℃の範囲の温度でインキュベートすることが、さらに好ましい。抗原を免疫増進剤に接触させた後、このように得られた組成物を、１５分〜５時間、特に好ましくは３０分〜３時間、さらに好ましくは４５分から２時間の時間で、１０〜４０℃、特に好ましくは１５〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２５℃の温度、最も好ましくは室温で、インキュベートすることがさらに好ましい。
【００６６】
生産工程II）では、免疫増進剤を提供する。ここでも、使用する免疫増進剤は、滅菌状態で既に市販されているものでない限り、成分I）またはIII）と接触させる前に、例えば濾過滅菌法によって、最初に滅菌することが好ましい。
【００６７】
特に、サポニンまたはサポニン誘導体、ステロイド類および／またはリン脂質類の複合体を免疫増進剤として用いる場合（ＩＳＣＯマトリックス）、本発明によれば、その複合体は最初に殺菌するかまたは適切な業者から市販されている滅菌状態のものを入手し、このサポニン複合体またはサポニン誘導体の複合体を、滅菌ＨＢｃＡｇ水溶液および選択的に滅菌ＨＢｓＡｇ水溶液またはこれらの２つの混合物と接触させることが好ましい。この方法では、抗原がＩＳＣＯマトリックスの内部に組みこまれている古典的なＩＳＣＯＭ複合体（いわゆるＩＳＣＯＭ）の形成は起こらない。
【００６８】
このようにして得られた組成物は、次に、該組成物が、経口、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内のいずれの投与経路で投与されるかにより、例えば、別の薬学的担体および添加剤などの別の添加剤と組み合わせることができる。薬学的担体および添加剤としては、本発明に係る組成物に関する、好ましい薬学的担体および好ましい添加剤として既に言及した化合物が、やはり好ましい。
【００６９】
水溶液が得られる場合、それらは水性の滅菌状態でパッケージするか凍結乾燥することができる。それによって凍結乾燥された組成物は、投与の前に滅菌溶剤と混合する。
【００７０】
前記の目的を達成するため、上記方法によって得られる組成物が、さらなる一助となる。ここで、これらの組成物は、本発明に係る上記組成物と同じ特性を有することが好ましい。
【００７１】
前記の目的を達成するため、本発明に係る組成物および前述の添加剤iv）の少なくとも１つを含有する医薬製剤もまた、一助となる。
【００７２】
前述の目的を達成するため、さらに、本発明に係る組成物の使用、または、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用ならびに／もしくは予防用の、本発明に係る医薬製剤も一助となる。本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤は、哺乳動物への投与、特にヒトへの投与に用いられることが好ましい。本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤の好ましい使用によれば、本組成物または本医薬製剤は、特に、急性および／または慢性の、好ましくは慢性ＨＢＶ感染症の、治療および／または予防、好ましくは治療に役立つ。
【００７３】
ヒトにおけるＨＢＶ感染症の場合の「予防」という用語は、好ましくは次のことを含む。
−  ＨＢＶと接触経験のないヒトのＨＢＶ感染を防ぐ目的での、治療。
−  ＨＢＶとの接触経験があり、免疫寛容期にあるヒトが、慢性肝炎期に入るのを防ぐ目的での、このヒトの治療、のほか、
−  ＨＢＶとの接触経験があり、無症候性キャリア期にあるヒトが、新たに慢性肝炎期に入ることを防ぐ目的での、ヒトの治療。
【００７４】
ヒトにおけるＨＢＶ感染症に関する「治療」という用語は、好ましくは次のことを含む。
‐  ＨＢＶとの接触経験があり、感染の急性期にあるヒトの治療、
−  ＨＢＶとの接触経験があり、慢性肝炎期にあるヒトの治療。
【００７５】
本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤は、ＨＢＶに既に感染している患者に投与することが、特に好ましい。
【００７６】
急性の感染期、免疫寛容期、慢性肝炎期、または無症候性キャリア期にある患者を、本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤により、単独でまたは必要に応じ他の療法と併用して治療することができる。治療的用途では、本組成物または医薬製剤をそれぞれ、ＨＢＶ抗原に対する有効な細胞傷害性T細胞の応答を引き起こすために十分であり、ＨＢＶによる症状および／もしくは合併症を治療するか、または少なくとも部分的に阻止する用量で、患者に投与する。本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤をそれぞれ、慢性Ｂ型肝炎の治療に用いる場合（それが特に好ましい）、治療の目標は、ウイルス感染細胞低減または、理想的には、除去である。感染の急性期には細胞傷害性T細胞の応答は不適切または不十分であることから、慢性Ｂ型肝炎を発病することがある。そのため、本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤のそれぞれの中に、免疫関連ウイルス抗原（ＨＢｃＡｇ１−ｘおよび選択的にＨＢｓＡｇ）を、効果的に細胞傷害性T細胞の応答を刺激するために十分な量を提供することが重要である。これらの目的が達成される量は「治療上有効量」として定義される。個々の適用症例に対する治療上有効な投与量は、例えば、本発明に係る組成物、または本発明に係る医薬製剤のそれぞれの正確な組成、投与方法、治療対象疾患の病期および重症度、患者の体重および全身の健康状態、のほか処方医師の判断、により決定される。しかし一般に、体重７０ｋｇの患者に対して、好ましくは０．１〜２，０００μｇの範囲（免疫増進剤の総量、ＨＢｃＡｇ１−ｘ、および選択的にＨＢｓＡｇ）、特に好ましくは０．５〜１，５００μｇの範囲、さらに好ましくは、１〜１，０００μｇの範囲、最も好ましくは１０〜５００μｇの範囲である。その後、患者の細胞傷害性T細胞の応答により、投与量を０．１〜２，０００μｇの範囲に変更して数週間から数カ月間続行する。細胞傷害性T細胞応答は、その患者の末梢血リンパ球のＨＢＶ特異的細胞傷害性T細胞活性を測定することにより決定される。
【００７７】
慢性Ｂ型肝炎の治療では、ＨＢＶ感染症が除去されたか少なくとも免疫系の制御下に置かれたことが少なくとも臨床症状または研究指標によって確認されるまでは、投与は一定期間（選択的には、長期にわたり）継続する必要がある。
【００７８】
本発明に係る組成物または本発明に係る医薬製剤は、原則として、経口、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内投与することができる。
【００７９】
また、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用および／もしくは予防用医薬製剤を製造するための本発明に係る組成物の使用が、前述の目的を達成するための、さらなる一助となる。
【００８０】
ここで、前記目的を達成するために、次に列挙するものを含有することを特徴とする本発明に係る組成物の使用が一助となる。ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用医薬製剤を製造するための、好ましくはＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療用の
ｉ）前記のＨＢｃＡｇ１−ｘ、
ii）サポニン、サポニン誘導体、または少なくともそのうちの２つの混合物を含有する、上記の免疫増進剤
および、
iii）前記のＨＢｓＡｇ。
ここで、前記ＨＢＶ感染症または前記ＨＢＶが仲介する疾患は、本発明に係る組成物が含有するＨＢｓＡｇの遺伝子型または亜型（好ましくは遺伝子型）とは異なる遺伝子型または亜型（好ましくは遺伝子型）をもつＨＢウイルスによって引き起こされている。例えば、ＨＢＶ感染症またはＨＢＶが仲介する疾患が、遺伝子型ＡのＨＢウイルスによって引き起こされる場合、その疾患のその感染を治療するためには、成分ｉ）およびii）に加えて、遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧのＨＢｓＡｇまたはこれらの遺伝子型のＨＢｓＡｇの混合物を使用し、遺伝子型ＡのＨＢｓＡｇも含有される、本発明に係る組成物を使用することが好ましい。
【００８１】
そのうえさらに上記目的を達成するための一助となるのが、ＨＢＶ感染症およびＨＢＶが仲介する疾患の治療および／または予防のための方法である。これは、ＨＢＶとの接触経験のないヒトまたはＨＢＶとの接触経験のあるヒト、好ましくは慢性Ｂ型肝炎を罹患している患者に、治療上有効量の本発明に係る組成物または本発明に係る医薬製剤を、好ましくは前記技術と方法により投与することを特徴とする方法である。
【００８２】
ここで、特に有利となり得るのは、ＨＢＶとの接触経験のあるヒト、好ましくは慢性Ｂ型肝炎を罹患している患者に、ＨＢｃＡｇ１−ｘおよび免疫増進剤に加えて、治療対象患者のＨＢＶ感染症またＨＢＶが仲介する疾患の原因であるＨＢＶウイルスの遺伝子型または亜型（好ましくは遺伝子型）とは異なるＨＢＶ遺伝子型またはＨＢＶ亜型由来のＨＢｓＡｇもまた含有する組成物を投与することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
本発明を、以下実施例および図面によりさらに詳細に説明するが、これらの実施例と図面は限定的なものではない。
【００８４】
〈方法〉
＝＝Ｃ５７ＢＬ／６マウスの免疫＝＝
Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、表１および２に示された量のリン酸緩衝生理食塩水、ＨＢｃＡｇ含有１００μｌリン酸緩衝生理食塩水、ＨＢｓＡｇ含有１００μｌリン酸緩衝生理食塩水、および免疫増進剤含有１００μｌリン酸緩衝生理食塩水で免疫した。ここで、表中にそれぞれ示された量を２１日の間隔を置いて２回皮下注射した。ＤＮＡ免疫については、プラスミドｐＣＩ／ＨＢＶａｙｗのコア２ｘ５０μｇを含有する５０μｌリン酸緩衝生理食塩水を、マウスの前脛骨筋に注射した。
【００８５】
＝＝脾臓における抗原特異性のＣＤ８＋Ｔ細胞頻度の測定＝＝
２回目の免疫の２週間後に、動物個体から脾臓を除去し、脾臓細胞から細胞懸濁液を作成した。脾臓細胞懸濁液の作成については、Schirmbeck R., Bohm W., Fissolo N., Mel-ber K., and Reimann J.: “Different imunogenicity of H-2 Kβ-restricted epitopes in natural variants of the hepatitis B surface antigen”, Europ. J. Immunol. 2003, 33: 2429-38. に記載されている。脾臓細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、０．２５μＭ  ＨＢｃＡｇ特異的ペプチド（ＭＧＬＫＦＲＱＬ；Ｊｅｒｉｎｉバイオツールズ社、ベルリン、ドイツ）および５μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）（カタログ番号１５８７０、シグマ社）とともに、３７℃でインキュベートすることにより、再刺激した。再刺激した細胞を回収し、抗ＣＤ８マウス抗体（抗マウスＣＤ８ａ−ＰＥ結合体；  カタログ番号５５３０３；  ＢＤバイオサイエンシーズ社、ハイデンベルグ、ドイツ）を用いて表面を発色させ、固定し、浸透化処理し、さらに細胞質性ＩＦＮγ（抗マウスＩＦＮγ‐ＦＩＴＣ結合体；  カタログ番号５５４４１１；  ＢＤバイオサイエンシーズ社、ハイデンベルグ、ドイツ）の発色を行った。コア特異的ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞障害性Tリンパ球の頻度をＦＡＣＳ解析によって決定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞１０５個あたりのＣＤ８＋ＩＮＦγ＋Ｔ細胞の平均値を示す。
【００８６】
＝＝抗体アイソタイプの測定＝＝
９６ウエルマイクロタイタープレート（ヌンク社、ヴィースバーデン、ドイツ）を、免疫に用いたＨＢｓＡｇ（２μｇ／ｍＬを炭酸バッファーに加えたもの）により、４℃にて一晩コーティングした（１００ｍＬ／ウエル）。
【００８７】
ＥＬＩＳＡ法の開始時、コーティングしたプレートを、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBST）で３回洗浄した。それらのウエルを３７℃で１時間、０．２％ゼラチンによりブロッキングした。アイソタイプを決定するためのマウス血漿／血清を、リン酸緩衝生理食塩水で二段階希釈し（１：２５０〜１：３２，０００の範囲で）、それぞれの希釈液１００ｍＬを適切なウエルに加え（２連）、３７℃で１時間インキュベートした。免疫しなかったマウスから得た血清をコントロールとして使用した。次に、マイクロタイタープレートを、PBSTで５回洗浄し、アイソタイプ特異的二次抗体（ペルオキシダーゼ結合体）とともにインキュベートした。ＩｇＧ１の検査のため、ｇａｍＩｇ１（カタログ番号ＧＡＭ／ＩｇＧ１／ＰＯ）を使用した。また、ＩｇＧ２ｂの検査のため、ｇａｍＩｇ２ｂ（カタログ番号ＩｇＧ２ｂ／ＰＯ；ノルディックイミュノロジカルラボラトリーズ社、チルブルグ、オランダ）を使用した。次に、Ｏ‐フェニレンジアミン（ｏＰＤ）（カタログ番号Ｐ２９０３、シグマ社）を基質（１μＬ／ｍＬ３０％Ｈ２Ｏ２を含む１ｍｇ／ｍｌｏＰＤ）（１００μＬ／ウエル）として、発色反応を行った。発色反応は、10〜15分後に１規定Ｈ２ＳＯ４（５０μＬ／ウエル）により停止し、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｐｌｕｓ；モレキュラー・ディバイシーズ社、イスマニング、ドイツ）を用いて、４９２ｎｍにおける光学密度を測定した。
【００８８】
＝＝全抗ＨＢｓ抗体価の決定＝＝
免疫したマウスの血清中の抗ＨＢｓ抗体の抗体価は、ＩＭＸ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アボットダイアグノースティックス社、ヴィースバーデン、ドイツ）により、ＩＭＸ  ＡＵＳＡＢ（登録商標）試験キット（商品番号２２２６−２１、アボット社、ヴィースバーデン、ドイツ）を用いて決定した。アッセイは、メーカーの説明に従って実施した。
【００８９】
＝＝抗原の調製＝＝
ａ）ＨＢｃＡｇ１−１４４＋Ｉ
ＢａｍＨＩ酵素処理により、完全ＨＢＶゲノムを含むプラスミドｐＨＢ３２０（７，５４３塩基対）を、ベクターｐＢＲ３２２(Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W.: “Construction and Characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose Cloning System,” Gene. 1977; 2(2): 95-113)と環状化Ｂ型肝炎ウィルスゲノム(ＨＢＶ３２０、３，１８２塩基対; Bichko V, Pushko P, Dreilina D, Pumpens P, Gren E (1985), “Subtype ayw variant of hepatitis B virus”, FEBS 185: 208-212)から構築した 。
【００９０】
突出している個々の鎖配列をＨｈａＩ酵素処理およびＳＩヌクレアーゼ分解後、ｐｒｅ−ｃｏｒｅ／ｃｏｒｅ遺伝子（ｃｏｒｅ遺伝子の翻訳域）の遺伝子配列を含む、１つの１，０００塩基対長断片を、平滑末端ライゲーションによって、ベクターｐＢＲ３２２  Ｐｔｒｐにクローニングした(Ikehara M, Ohtsuka E, Tokunaga T. et al. (1984): Synthesis of a gene for human growth hormone and its expression in E. coli.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5956-5960)。このベクターはあらかじめ、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩにより切断し、また突出末端をＤＮＡポリメラーゼで平滑にしておいたものである。得られたプラスミドｐＧＣ７４（６，０４６塩基対）はトリプトファンプロモーターとＨＢｃ遺伝子を逆方向に含んでいる。この方向に配置しておくと、ＨＢｃＡｇ発現カセットを最適化するために、単一の制限部位を再構成することにより、その後のクローニングステップが容易になる。
【００９１】
ＨＢｃ断片の方向を変えるため、ｐＧＣ７４をＢａｍＨＩにより酵素処理し、突出末端はＤＮＡポリメラーゼで平滑にしてＳａｌＩにより後処理した。この断片をベクターｐＢＲ３２２  Ｐｔｒｐにライゲーションした。このベクターはあらかじめ、ＡｖａＩにより線状化し、末端をＤＮＡポリメラーゼで平滑にしてＳａｌＩにより後処理しておいたものである。このように構築したプラスミドｐＧＣ２（５，５５２塩基対）は、トリプトファンプロモーターとＨＢｃ遺伝子を同方向に含んでいる。
【００９２】
このプラスミドをＳａｌＩにより酵素処理し、突出末端はヌクレアーゼＢａｌ３１により除去してＥｃｏＲＩにより後処理した。こうして得られた突出末端をＤＮＡポリメラーゼにより平滑にし、再度ライゲーションした。トリプトファン・プロモーターとＨＢｃ遺伝子との間に短い配列を含むプラスミドｐＨＢｃ１０（４，８２５塩基対）が生成し、最適なＰｔｒｐ−シャイン・ダルガーノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）−ＨＢｃ構造、またはこれらの最適距離を得た。  
【００９３】
この遺伝子発現を最適化するため、１，０４４塩基対のＨｈａｌ−ＨＢｃ断片を、ＨｈａｌＩおよびＳ１ヌクレアーゼによる酵素処理の後、ｐＨＢｃ１０から切断し、ベクターｐＢＲ３２２−ｔｒｐ−Ｉ（ＢＲ３２２プラスミドを改変したもの）にクローニングした。このように構築した結果、トリプトファンプロモーターの制御下で、ＨＢｃ遺伝子の最適化された発現配列を含むｐＨＢｃ３（７，１０８塩基対）が得られた。
【００９４】
プラスミドｐＨＢｃ３をＫｐｎ２ｌで酵素処理し、合成ポリリンカーＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ−ＰｖｕＩ（５’ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＣＣＧＧＡ−３’）（配列番号２）をＨＢｃ遺伝子の１４４番目のアミノ酸の切断部位に組み込んだ。その結果、プラスミドｐＨＢｃ１６１５（７，１２９塩基対）が生成した。ＰＨＢｃ１６１５はＣ１ａＩによって線状化した。１４４番目のアミノ酸の後に終止コドン、およびアミノ酸１４５番目に付加的なイソロイシンのコドンを持つ合成ポリリンカーを組み込み、プラスミドｐＨＢｃ２−７が得られた。
【００９５】
大腸菌コンピテント細胞（ＢＬ２１株由来：  遺伝子型ＢＦ−ｄｃｍ  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ（ｒΒ−ｍΒ−）ｇａ１）を、プラスミドｐＨＢｃ２−７で形質転換し３７℃で一晩、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に撒菌することにより作製した。０．２％グルコースを含有する３００ｍｌＭ９最少培地（１％カザミノ酸添加、カタログ番号２２３０５０、ベクトン・ディキンソン・Ｄｉｆｃｏ社、ハイデルベルク、ドイツ）にコロニーを１個ずつ接種した。これを、１Lのエルレンマイヤーフラスコに入れ、回転振盪機上にて３７℃で一晩培養した。培養物は、総じて、２〜５の光学密度（ＯＤ５４０ｎｍ）に達した。
【００９６】
細胞を遠心し、ペレットを溶解バッファー（５０  ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０；  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ，  ０．０８  ％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中で再懸濁した。その後、馴化した細胞を氷上で超音波処理（２２ｋＨｚで、３×１５秒）し溶解した。細胞残渣を遠心除去した後、４℃で４〜２０時間、硫酸アンモニウム（３３％飽和度）により上清からタンパク質を沈殿させた。ペレットを  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水で再懸濁した。次に、得られた溶液はそれぞれ、５〜１０ｍｌセファロースＣＬ４Ｂクロマトグラフィーカラム（２．５ｘ８５ｃｍ）を通過させた。溶出は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含まないリン酸緩衝生理食塩水で行った。個々の画分中のＨＢｃＡｇポリペプチドの存在を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法／クマシー染色により調べた。陽性画分を４℃で２０時間硫酸アンモニウム析出（３３％飽和度）により精製、濃縮した。タンパク質ペレットを３〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、次に１，０００倍量の同バッファーに対して一晩透析した。ＨＢｃＡｇ１‐１４４＋Ｉをリン酸緩衝生理食塩水で濾過滅菌し、−２０℃で保存した。
【００９７】
ｂ）ＨＢｓＡｇ
ＨＢｓＡｇは、以下の記載にしたがって調製した。Brocke P, Schaefer S., Melber K., Jenzelewski V., Miller F., Dahlems U., Bartelsen 0., Park K.N., Janowicz Z.A., Gellissen G.: Recombinant hepatitis B vaccines: disease characteri-zation and vaccine production” (2005) in Gellissen G (Editor):, ,,Production of recombinant proteins - novel microbial and eucaryontic expression sys-tems”, pages 319-360, Wiley-VCH, Weinheim)  。また、ライン・バイオテック社（デュッセルドルフ、ドイツ）から入手することもできる。
【００９８】
ｃ）ＨＢｃＡｇ１−１８３
ＨＢｃＡＧ１−１８３はディアソリンＳ．ｒ．ｌ社（サルッジャ、イタリア）から入手した。
【実施例】
【００９９】
〈実施例１〉
最初の一連の実験では、免疫増進剤として、製品名ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００（イスコノバ社、ウプサラ、スウェーデン）として市販されているサポニン複合体を使用した。ポジティブコントロールとして、コアプラスミドＤＮＡを用い、ネガティブコントロールとして、純粋なリン酸緩衝生理食塩水、純粋な免疫増進剤を含有させたリン酸緩衝生理食塩水、純粋なＨＢｃ１−１４４＋Iを含有させたリン酸緩衝生理食塩水、およびＨＢｃ１‐１８３を含有させたリン酸緩衝生理食塩水を用いた。本発明に係るこの組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＢｃ１−１４４＋I、およびＡｂＩＳＣＯ（登録商標）‐１００を含有させたものである。個々の成分の分量を表１に示した。
【０１００】
プラスミドｐＣＩ／ＨＢＶａｙｗコアを、Kuhrober Pudollek H.P., Reifenberg K., Chisari F.V., Schlicht H.J., Reimann J., Schirmbeck R. (1996): ,,DNA Immunization induces antibody and cytotoxic T cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice”, J. Immunol. R. (1996): , ”DNA Immunization induces antibody and cytotoxic T cell responses to hepatitis B core antigen in H-2b mice”, J. Immunol. 156: 3687-95, 156: 3687-95の記載に従い調製し（該構成物は、この文献中ではｐＣＭＶ−１／ｃと呼ばれている）、メーカーの説明に従ってＱＩＡＧＥＮ‐ｔｉｐ  ５００（カタログ番号１２１６２番；  キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）を用い、単離した。
【０１０１】
本発明に係る組成物を調合するため、ＨＢｃ１−１４４＋Ｉを、まず最終生産物の４倍の濃度までリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、３７℃で３０分間振盪しながらインキュベートした。次に、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００（製造元から届いた時点で水性分散液）を添加した。表１に示した抗原の最終濃度となるようリン酸緩衝生理食塩水で調整した。表１の免疫増進剤と抗原の濃度は、その結果として得られたものである。このように調製した組成物を、室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートし、次に２〜８℃で一晩（１２〜１８時間）保存した後、その翌日、免疫に使用した。
【０１０２】
表１
2009507877.tif 000003
【０１０３】
上記組成物によって達成される細胞傷害性Tリンパ球の応答を、図１示す。この図からわかるように、本発明に係る組成物（試験群Ｅ）は、強力なコア特異的細胞障害性Tリンパ球応答を達成することができる。この応答は、コアプラスミドＤＮＡ（試験群Ａ）により達成することができる細胞障害性Tリンパ球応答よりさら強い。
【０１０４】
〈実施例２〉
別の一連の実験では、免疫増進剤として、製品名ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）‐２００（イスコノバ社、ウプサラ、スウェーデン）として市販されているサポニン複合体を使用した。ポジティブコントロールとして、コアプラスミドＤＮＡを用い、ネガティブコントロールとして、純粋なリン酸緩衝生理食塩水、純粋な免疫増進剤を含有させたリン酸緩衝生理食塩水、純粋なＨＢｃ１−１４４＋Iを含有させたリン酸緩衝生理食塩水、およびＨＢｃ１‐１８３を含有させたリン酸緩衝生理食塩水を用いた。  本発明に係る組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＢｃ１−１４４＋I、およびＡｂＩＳＣＯ（登録商標）‐２００、のほか選択的に、ＨＢｓＡｇを含有させたものである。個々の成分量を表２に示した。
【０１０５】
本発明に係る組成物を調合するため、ＨＢｃ１−１４４＋Ｉおよび選択的にＨＢｓＡｇを、まず最終生産物の４倍の濃度までリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、３７℃で３０分間振盪しながらインキュベートした。最初にＨＢsＡｇを使う時、ＨＢｓＡｇとＨＢｃ１−１４４＋Ｉを無菌環境下で混合し、最終生産物の４倍までさらにリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。次に、製造元から届いた時点で水性分散液の形状であったＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−２００を添加した。この時、表２に示した抗原の最終濃度となるようリン酸緩衝生理食塩水で調整した。表２の免疫増進剤と抗原の濃度は、その結果として得られたものである。このように調製した組成物を、室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートし、次に２〜８℃で一晩（１２〜１８時間）保存した後、その翌日、免疫に使用した。
【０１０６】
表２
2009507877.tif 000004
【０１０７】
前記組成物によって達成された細胞障害性Tリンパ球応答を、図２から解釈することができる。この図２からわかるように、本発明に係る組成物（試験群ＬおよびＭ）は、コアプラスミドＤＮＡ（試験群Ｆ）により達成することができる細胞障害性Tリンパ球応答に匹敵する、コア特異的細胞障害性Tリンパ球応答を達成することができる。
【０１０８】
図３は、本発明に係る組成物が、ＨＢｓＡｇも含有する限り、さらにＨＢｓＡｇに対する強力な抗体反応をも引き起こすことを示す。図４は、本発明に係るそのような組成物により、ＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２ｂ抗体価との両方が上がり、それはＴｈ１免疫応答およびＴｈ２免疫応答の両方の形成を示唆するということを示す。
【０１０９】
本発明を、図面と実施例によりさらに詳細に説明するが、これらの図面と実施例は限定的なものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、本発明に係る組成物を、免疫増進剤としてのＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００と共に使用する場合の、細胞障害性Tリンパ球応答を示したものである。
【図２】図２は、本発明に係る組成物を、免疫増進剤としてのＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−２００と共に使用する場合の、細胞障害性Tリンパ球応答を示したものである。
【図３】図３は、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇを含有した本発明に係る組成物を、免疫増進剤としてのＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−２００と共に使用する場合の、Ｂ細胞応答を、ＡＵＳＡＢ抗ＨＢｓＡｇ抗体価で表したものである。
【図４】図４は、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇを含有した本発明に係る組成物を、免疫増進剤としてのＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−２００と共に使用する場合の、Ｂ細胞応答の免疫プロファイルを、抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧ１および抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗体価で表したものである。本発明に係る組成物は、Ｔｈ１免疫応答およびＴｈ２免疫応答の両方を誘導する。
【図１】
2009507877.tif 000005
【図２】
2009507877.tif 000006
【図３】
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【図４】
2009507877.tif 000008
【配列表】
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【国際調査報告】
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