(57)【要約】  本発明は、ナノ繊維ポリマーの繊維が整列しており、分子が直接またはリンカーを介してナノ繊維ポリマーに共有結合している、ナノ繊維ポリマーを含む組成物を提供する。この分子は、細胞外マトリックス成分、成長因子、およびそれらの組合せから選択されるメンバーに、共有結合または非共有結合することができる。本発明はまた、組成物の作製方法、および新しい組織をヒトなどの対象に加えるための組成物の使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管と、
ヒルジンと
を含む組成物であって、
前記第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維が整列しており、
前記ヒルジンが、前記第１の繊維状ポリマー足場に、直接またはリンカーを介して、非共有結合的に会合しているか、または共有結合している組成物。
【請求項２】
前記第１の繊維状ポリマー足場が、約０．０１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約０．０５ｃｍ〜約５ｃｍ、約０．５ｃｍ〜約５ｃｍ、約１ｃｍ〜約５ｃｍ、約２ｃｍ〜約５ｃｍ、約１ｃｍ〜約３ｃｍ、約２ｃｍ〜約１０ｃｍ、および約５ｃｍ〜約１５ｃｍから選択されるメンバーである長さを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の繊維状ポリマー足場が、長手方向および円周方向から選択されるメンバーである方向に本質的に整列している、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の繊維状ポリマー足場がシームを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の繊維状ポリマー足場がシームレスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の繊維状ポリマー足場が一体型として形成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つが、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリジメチルシロキサン、ポリカプロラクトン、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、アルギン酸、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ポリペプチドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーであるポリマーまたはサブユニットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記脂肪族ポリエステルが、乳酸（Ｄ−またはＬ−）、ラクチド、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド）グリコール酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、グリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびそれらの組合せから選択されるメンバーである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つが、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）またはポリＬ−ラクチド（ＰＬＬＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヒルジンが、前記第１の繊維状ポリマー足場にリンカーによって共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリラクチド、ポリグリセリドおよびそれらのコポリマー、ならびにポリアクリル酸から選択されるメンバーを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リンカーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）およびそれらの組合せから選択されるメンバーを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管の外面を取り囲むが、前記第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管の内腔内には位置しないスリーブをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記スリーブが、ポリエチレンテレフタレートおよびポリテトラフルオロエチレンから選択されるメンバーであるポリマーまたはサブユニットを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記スリーブが第２の繊維状ポリマー足場を含み、前記第２の繊維状ポリマー足場が整列しているか、またはランダム配向を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１の繊維状ポリマー足場の第１の端部を取り囲む第１のスリーブと、前記第１の繊維状ポリマー足場の第２の端部を取り囲む第２のスリーブとをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞が、前記第１の繊維状ポリマー足場内に埋め込まれているか、またはその表面上にある、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞が、幹細胞および前駆細胞から選択されるメンバーである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞が、成体血管細胞、血管前駆細胞、および血管幹細胞から選択されるメンバーである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
ポリマーを含むポリマー溶液を回転マンドレルに付着させることによって生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリマー足場が、少なくとも１つの非導電性領域を有する回転マンドレルを含むエレクトロスピニング工程によって生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１の繊維状ポリマー足場が、シームレスで円周方向に整列しており、前記第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つが、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含み、
前記ヒルジンが、前記第１の繊維状ポリマー足場に、ジアミノポリ（エチレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）から選択されるメンバーであるリンカーによって共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
約１ｍｍ〜約５０ｃｍの長さを有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
約０．５ｃｍ〜約１０ｃｍの長さを有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
約３ｍｍ〜約６ｍｍの長さを有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
約０．０１ｍｍ〜６ｍｍの内径を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
約３ｍｍ〜約６ｍｍの内径を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
約４ｃｍ〜約８ｃｍの長さを有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
Ａ／Ｖシャントおよび血液透析アクセス移植片から選択されるメンバーとして使用される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
（ａ）請求項１に記載の組成物；および
（ｂ）薬学的に許容できる賦形剤；
を含む医薬組成物。
【請求項３３】
対象において損傷を治療する方法であって、
（ｉ）請求項１または請求項２４に記載の組成物を、前記損傷を治療するのに十分な、量および条件下で、前記対象の関心部位に付着させるステップを含む方法。
【請求項３４】
前記関心部位が、冠動脈、大腿骨、膝窩、頸動脈、大脳、腹部、膝上、膝下および橈骨から選択されるメンバーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記関心部位が、頸動脈および膝下の脈管組織から選択されるメンバーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記損傷が、切断された血管を伴い、前記第１の繊維状ポリマー足場が、第１の端部および第２の端部を含む導管または充填導管形状を有し、前記切断された血管が第１の血管断端および第２の血管断端を含み、前記付着が、
（ｉｉ）前記組成物の前記第１の端部を前記第１の血管断端に結合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記組成物の前記第２の端部を前記第２の血管断端に結合させるステップと
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
対象において血管の成長を増進する方法であって、
（ｉ）請求項１または請求項２４に記載の組成物を、血管の成長を増進するのに十分な、量および条件下で、前記対象における関心血管部位に付着させるステップを含む方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の組成物の作製方法。
【請求項３９】
（ｉ）１つまたは複数の繊維を、エレクトロスピニング工程にかけ、それによって前記組成物を作製するステップ
を含む、請求項１に記載の組成物の作製方法。
【請求項４０】
前記エレクトロスピニング工程が、少なくとも１つの非導電性領域を有する回転マンドレルを含む、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１月２９日に出願された米国特許出願第１１／６６８，４４８号の一部継続出願であり、この出願、ならびに２００７年６月５日に出願された米国仮特許出願第６０／      号（代理人整理番号０６１８１８−０２−５０５３ＰＲ０１）、２００６年１１月３０日に出願された同第６０／８６１，７８０号、および２００６年６月９日に出願された同第６０／８０４，３５０号の優先権を主張し、全ての目的のためにその内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
政府支援に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可（契約）番号ＨＬ０７８５３４の下で政府支援により行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
当技術分野で、対象において生物学的機能を置換または向上させることができる組成物に対する必要性が存在する。当技術分野で、対象において新しい組織の成長を促進し、または傷害を受けた組織を置換することができる組成物への必要性もまた存在する。これらおよび他の必要性は、本明細書に記載する本発明によって対処される。
【発明の概要】
【０００４】
第１の態様では、本発明は、第１の繊維状ポリマー足場と、生体分子とを含む組成物を提供し、前記生体分子は、前記第１の繊維状ポリマー足場に、直接またはリンカーを介して非共有結合的に会合しているか(associated)、または共有結合している。例示的な実施形態では、生体分子は抗血小板剤である。例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は、約０．０１ｃｍ〜約２０ｃｍ、約０．０５ｃｍ〜約５ｃｍ、約０．５ｃｍ〜約５ｃｍ、約１ｃｍ〜約５ｃｍ、約２ｃｍ〜約５ｃｍ、約１ｃｍ〜約３ｃｍ、約２ｃｍ〜約１０ｃｍ、および約５ｃｍ〜約１５ｃｍから選択されるメンバーである長さを有する。他の例示的な実施形態では、組成物は、シート、導管(conduit)、充填導管およびロッドから選択されるメンバーである形状を有する。他の例示的な実施形態では、組成物は、導管、充填導管およびロッドから選択されるメンバーである形状を有する。他の例示的な実施形態では、組成物は、ロッドの形状を有する。他の例示的な実施形態では、組成物は、導管または充填導管の形状を有する。他の例示的な実施形態では、前記第１の繊維状ポリマー足場は、長手方向および円周方向から選択されるメンバーである方向に本質的に整列している。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシーム(seam)を有する。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として(monolithically)形成されている。
【０００５】
他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つは、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリジメチルシロキサン、ポリカプロラクトン、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、アルギン酸、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ポリペプチドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーであるポリマーまたはサブユニットを含む。他の例示的な実施形態では、脂肪族ポリエステルは、乳酸（Ｄ−またはＬ−）、ラクチド、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド）グリコール酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、グリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む。
【０００６】
例示的な実施形態では、抗血小板剤は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）アンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、アデノシン再取込み阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト、ヘパリン、ヘパリン類似体、直接トロンビン阻害剤、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤、抗凝固酵素、ならびにその薬学的に許容できる塩、異性体、エナンチオマー、非晶形を包含した多形結晶形態、溶媒和物、水和物、共結晶、複合体、活性代謝物、活性誘導体および修飾物、プロドラッグなどから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、直接トロンビン阻害剤である。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート、メラガトラン、キシメラガトラン、そのプロドラッグおよび類似体から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、そのプロドラッグおよび類似体から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は、ロッド、導管および充填導管から選択されるメンバーである。
【０００７】
他の例示的な実施形態では、生体分子または抗血小板剤は、第１の繊維状ポリマーにリンカーなしに共有結合している。他の例示的な実施形態では、本発明は、下記の式から選択されるメンバーである構造を有する組成物を提供する。
【０００８】
【化１】
2009540878.tif 000002
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、Ｘは、共有結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ＊，Ｃ（Ｏ）ＮＲ＊、ＮＨまたはＮＲ＊（式中、Ｒ＊は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヘパリン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【０００９】
例示的な実施形態では、この組成物は、下記の式によるメンバーである構造を有する少なくとも１つの部分を含む。
【００１０】
【化２】
2009540878.tif 000003
【００１１】
【化３】
2009540878.tif 000004
式中、記号
【００１２】
【化４】
2009540878.tif 000005
は、示された部分がポリマーの残りに結合している点を示し、Ａ１は、第１の繊維状ポリマー足場のサブユニットである。例示的な実施形態では、Ａ１は、モノマー／一連のモノマーの重合によって形成されるサブユニットである。例示的な実施形態では、Ａ１は、本明細書に記載する１種または複数のモノマーまたはサブユニットから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、Ａ１は、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、アルギン酸、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ポリペプチドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、Ａ１は、官能化ラクチド部分である。例示的な実施形態では、前記官能化ラクチド部分は、側鎖メチルで官能化されている。他の例示的な実施形態では、Ｘは、第１の繊維状足場上の相補的反応性基と抗血小板剤との反応から生じる。これらの相補的反応性基の説明を本明細書において提供する。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【００１３】
例示的な実施形態では、この組成物は、下記の式から選択されるメンバーである構造を有する少なくとも１つの部分を含む。
【００１４】
【化５】
2009540878.tif 000006
式中、記号
【００１５】
【化６】
2009540878.tif 000007
は、示された部分がポリマーの残りに結合している点を示し、Ｘは、共有結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ＊、Ｃ（Ｏ）ＮＲ＊、ＮＨまたはＮＲ＊（式中、Ｒ＊は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである）から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ｘは、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＣ（Ｏ）ＮＲ＊から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヘパリン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。他の例示的な実施形態では、Ｘは、ヒルジンのＣ末端ドメインに結合している。例示的な実施形態では、Ｘは、ヒルジンのＣ末端でアミノ酸に結合している。例示的な実施形態では、Ｘは、アスパラギン酸またはグルタミン酸部分の側鎖を介してヒルジンに結合している。例示的な実施形態では、Ｘは、アスパラギン酸部分の側鎖を介してヒルジンに結合している。例示的な実施形態では、Ｘは、野生型ペプチド配列のＤ５、Ｅ８、Ｅ１７、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｅ４３、Ｄ５３、Ｄ５５、Ｅ５７、Ｅ５８、Ｅ６１、Ｅ６２およびＱ６５から選択されるメンバーであるヒルジンのアミノ酸部分に結合している。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【００１６】
他の例示的な実施形態では、本発明は、下記の式から選択されるメンバーである構造を有する組成物を提供する。
【００１７】
【化７】
2009540878.tif 000008
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、Ｘは、共有結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ＊、Ｃ（Ｏ）ＮＲ＊、ＮＨまたはＮＲ＊（式中、Ｒ＊は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである）から選択されるメンバーであり、Ｌはリンカーであり、抗血小板剤は、それだけに限らないが、ヘパリン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート（経口製剤）、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグが包含されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管であり、第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。例示的な実施形態では、Ｌには、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、ポリビニルフェノール、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸およびそれらのコポリマーから選択されるメンバーが包含される。他の例示的な実施形態では、Ｌには、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマーなど）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、ポリエチレンイミン、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリセリドおよびそれらのコポリ���ー）、ポリアクリル酸から選択されるメンバーが包含される。例示的な実施形態では、Ｌは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、ＸはＮであり、Ｌは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管である。第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【００１８】
他の例示的な実施形態では、生体分子または抗血小板剤は、第１の繊維状ポリマーにリンカーによって共有結合している。例示的な実施形態では、この組成物は、下記の式による構造を有する少なくとも１つの部分を含む。
【００１９】
【化８】
2009540878.tif 000009
式中、Ａ１は本明細書に記載する通りである。他の例示的な実施形態では、少なくとも１つの部分は、下記の式による構造を有する。
【００２０】
【化９】
2009540878.tif 000010
【００２１】
他の例示的な実施形態では、少なくとも１つの部分は、下記の式による構造を有する。
【００２２】
【化１０】
2009540878.tif 000011
【００２３】
他の例示的な実施形態では、ヒルジンは、野生型ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【００２４】
他の例示的な実施形態では、少なくとも１つの部分は、下記の式による構造を有する。
【００２５】
【化１１】
2009540878.tif 000012
式中、Ｘ１およびＸ２は、共有結合、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ＊（式中、Ｒ＊は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである）から独立に選択されたメンバーであり、Ｌ１は、水溶性および水不溶性ポリマーから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ｌ１には、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、ポリビニルフェノール、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸およびそれらのコポリマーから選択されるメンバーが包含される。他の例示的な実施形態では、Ｌ１には、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマーなど）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、ポリエチレンイミン、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリセリドおよびそれらのコポリマー）、ポリアクリル酸から選択されるメンバーが包含される。例示的な実施形態では、Ｌ１は、ＰＥＧ、ＰＰＧおよびそれらのコポリマーから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ｌ１はＰＥＧであり、前記ＰＥＧは、１〜５０００の整数であるいくつかの単量体サブユニットを含む。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約１０〜約１０００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約１０〜約５００の整数である。例示的な実施形態では、���量体サブユニットの前記数は、約２０〜約４００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約２０〜約２５０の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約５０〜約２００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約５０〜約１２５の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約５０〜約１００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約６０〜約９０の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約６０〜約９０の整数である。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【００２６】
他の例示的な実施形態では、少なくとも１つの部分は、下記の式による構造を有する。
【００２７】
【化１２】
2009540878.tif 000013
式中、Ｘ１、Ｌ１およびＸ２は、本明細書に記載するように定義される。例示的な実施形態では、Ｘ２は、ヒルジンのＣ末端ドメインに結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、ヒルジンのＣ末端でアミノ酸に結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、アスパラギン酸またはグルタミン酸部分の側鎖を介してヒルジンに結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、アスパラギン酸またはグルタミン酸部分の側鎖を介してヒルジンに結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、Ｄ５、Ｅ８、Ｅ１７、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｅ４３、Ｄ５３、Ｄ５５、Ｅ５７、Ｅ５８、Ｅ６１、Ｅ６２およびＱ６５から選択されるメンバーであるヒルジンのアミノ酸部分に結合している。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、第１の繊維状ポリマー足場は一体型として形成されている。
【００２８】
他の例示的な実施形態では、少なくとも１つの部分は、下記の式による構造を有する。
【００２９】
【化１３】
2009540878.tif 000014
式中、Ｘ１、Ｌ１およびＸ２は、本明細書に記載するように定義される。例示的な実施形態では、Ｌ１はＰＥＧである。例示的な実施形態では、ヒルジンは、そのＣ末端ドメインを介して結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、ヒルジンのＣ末端でアミノ酸に結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、アスパラギン酸またはグルタミン酸部分の側鎖を介してヒルジンに結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、アスパラギン酸またはグルタミン酸部分の側鎖を介してヒルジンに結合している。例示的な実施形態では、Ｘ２は、Ｄ５、Ｅ８、Ｅ１７、Ｄ３３、Ｅ３５、Ｅ４３、Ｄ５３、Ｄ５５、Ｅ５７、Ｅ５８、Ｅ６１、Ｅ６２およびＱ６５から選択されるメンバーであるヒルジンのアミノ酸部分に結合している。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、トロンビン結合部位を含む。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＦＰＲＰおよびＬＹＥＥＰＩＥＥＦＤＧＮから選択されるメンバーであるタンパク質配列を含む。
【００３０】
他の例示的な実施形態では、本発明は、式ＩＩＩの下記の構造を含む組成物を提供する。
【００３１】
【化１４】
2009540878.tif 000015
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、Ｘ１は、共有結合、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲから選択される任意選択の第１のメンバーであり、Ｌ１は、任意選択の第１のリンカーであり、Ｘ２は、共有結合、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲから選択される任意選択の第２のメンバーであり、Ｌ２は、任意選択の第２のリンカーであり、抗血小板剤は、それだけに限らないが、ヘパリン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート（経口製剤）、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグが包含されるメンバーである。
【００３２】
例示的な実施形態では、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管であり、第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。他の例示的な実施形態では、Ｌ１およびＬ２の各々は、独立に、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されたメンバーである。他の例示的な実施形態では、各Ｘは、Ｎであり、Ｌ１およびＬ２は各々、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されたメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。
【００３３】
他の例示的な実施形態では、本発明は、式ＩＶの下記の構造を含む組成物を提供する。
【００３４】
【化１５】
2009540878.tif 000016
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、各Ｌは、独立に、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから独立に選択される第１のリンカーであり、ｍは、約０〜約１００、約１〜約５０、約１〜約１０の整数であり、各抗血小板剤は、独立に、ヘパリン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート（経口製剤）、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグから選択され、ｚは、０〜１の整数である。
【００３５】
例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーであり、ここではｚは１である。他の例示的な実施形態では、各Ｌは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管であり、第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。
【００３６】
他の例示的な実施形態では、本発明は、式Ｖの下記の構造を含む組成物を提供する。
【００３７】
【化１６】
2009540878.tif 000017
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、各Ｘは、独立に、共有結合、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲから選択される第１のメンバーであり、ｎは、約０〜約１００、約１〜約５０、約１〜１０の整数であり、各Ｌは、独立に、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから独立に選択される第１のリンカーであり、ｍは、約０〜約１００、約１〜約５０、約１〜約１０の整数であり、各抗血小板剤は、ヘパリン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート（経口製剤）、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグから独立に選択される。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーであり、ここではｚは０〜１の整数である。他の例示的な実施形態では、ＸはＮであり、各Ｌは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管であり、第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。例示的な実施形態では、各抗血小板剤は、独立に、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。
【００３８】
他の例示的な実施形態では、本発明は、式ＶＩの下記の構造を含む組成物を提供する。
【００３９】
【化１７】
2009540878.tif 000018
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲから選択されるメンバーであり、Ｌはリンカーである。例示的な実施形態では、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管である。第１の繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は整列している。例示的な実施形態では、Ｌは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、ＸはＮであり、Ｌは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、Ｃ＝Ｏ部分は、第１の繊維状ポリマー足場中のラクチド部分の一部である。他の例示的な実施形態では、Ｃ＝Ｏ部分は、第１の繊維状ポリマー足場中のグリコリド部分の一部である。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート（経口製剤）、メラガトラン、キシメラガトランおよびそのプロドラッグから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されるメンバーである。
【００４０】
例示的な実施形態では、本発明は、下記の構造を含む組成物を提供する。
【００４１】
【化１８】
2009540878.tif 000019
式中、Ａは、第１の繊維状ポリマー足場であり、Ｘは、ＮＨから選択されるメンバーであり、Ｌは、ポリエチレングリコールであり、抗血小板剤は、ヒルジン、ヒルジン類似体、ビバリルジン、レピルジンおよびデシルジンである。他の例示的な実施形態では、Ｃ＝Ｏ部分は、第１の繊維状ポリマー足場中のラクチド部分の一部である。他の例示的な実施形態では、Ｃ＝Ｏ部分は、第１の繊維状ポリマー足場中のグリコリド部分の一部である。
【００４２】
例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、シームレスである第１の繊維状ポリマー足場を有する。他の例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、一体型として形成されている第１の繊維状ポリマー足場を有する。他の例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、端々吻合または端側吻合として配置されることを意図している。端々吻合については、移植片の各側は、ネイティブな動脈が移植片の直径に適合するように配置される。移植片の２つの端部と動脈とを一緒に保持するために、結節縫合または連続縫合を使用することができる。端側吻合については、移植片は、ある角度（通常約４５度であるが、０〜９０度で変動することができる）で切断され、ネイティブな動脈の側に配置されるであろう。
【００４３】
例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、ＰＴＦＥおよびＤａｃｒｏｎから選択されるメンバーを含む第２のポリマーを含む。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管の外面を取り囲むが、第１の繊維状ポリマー足場の導管または充填導管の内腔内には位置しないスリーブをさらに含む。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する任意の組成物において、前記スリーブは、ポリエチレンテレフタレートおよびポリテトラフルオロエチレンから選択されるメンバーであるポリマーまたはサブユニットを含む。
【００４４】
例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかでは、前記第１の繊維状ポリマー足場は、シームレスで円周方向に整列しており、第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含み、前記ヒルジンは、前記第１の繊維状ポリマー足場にジアミノポリ（エチレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）から選択されるメンバーであるリンカーによって共有結合している。
【００４５】
例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、約１ｍｍ〜約５０ｃｍの長さを有する。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、約０．５ｃｍ〜約１０ｃｍの長さを有する。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、約３ｍｍ〜約６ｍｍの長さを有する。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、約０．０１ｍｍ〜６ｍｍの内径を有する。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、約３ｍｍ〜約６ｍｍの長さを有する。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、約４ｃｍ〜約８ｃｍの長さを有する。例示的な実施形態では、この概要または本明細書に記載する組成物のいずれかは、Ａ／Ｖシャントおよび血液透析アクセス移植片から選択されるメンバーとして使用される。
【００４６】
他の態様では、本発明は、対象において損傷を治療する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）この概要または本明細書に記載する組成物を、前記損傷を治療するのに十分な、量および条件下で、前記対象の関心部位に付着させるステップを含む。例示的な実施形態では、関心部位は、冠動脈、大腿骨、膝窩、頸動脈、大脳、腹部、膝上、膝下および橈骨から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、関心部位は、頸動脈および膝下の脈管組織から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、損傷は、切断された血管を伴い、前記第１の繊維状ポリマー足場は、第１の端部および第２の端部を含む導管または充填導管形状を有し、前記切断された血管は、第１の血管断端(stump)および第２の血管断端を含み、前記付着は、（ｉｉ）前記組成物の前記第１の端部を前記第１の血管断端に結合させるステップと、（ｉｉｉ）前記組成物の前記第２の端部を前記第２の血管断端に結合させるステップとを含む。
【００４７】
他の態様では、本発明は、対象において血管の成長を増進する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）血管の成長を増進するのに十分な、量および条件下で、この概要または本明細書に記載する組成物を、前記対象における関心血管部位に付着させるステップを含む。
【００４８】
他の例示的な実施形態では、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、本発明は、細胞をさらに含む。他の例示的な実施形態では、細胞は、第１の繊維状ポリマー足場内に埋め込まれているか、またはその表面上にある。他の例示的な実施形態では、細胞は、幹細胞および前駆細胞から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞は、成体血管細胞、血管前駆細胞、血管幹細胞、成体筋細胞、筋肉前駆細胞、筋肉幹細胞、成体神経細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞、シュワン細胞、繊維芽細胞、成体皮膚細胞、皮膚前駆細胞、および皮膚幹細胞から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、本発明は、前記第１の繊維状ポリマー足場に直接またはリンカーを介して共有結合している分子をさらに含み、前記分子は、細胞外マトリックス成分、成長因子、分化因子およびそれらの組合せから選択されるメンバーに共有結合または非共有結合することができる。他の例示的な実施形態では、分子はリンカーを介して共有結合しており、前記リンカーは、ジアミノポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、分子は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞外マトリックス成分は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、ポリリシンおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、成長因子は、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング成長因子β、血管内皮増殖因子、上皮増殖因子、ケラチン生成細胞成長因子およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、分化因子は、間質細胞由来因子、ソニックヘッジホッグ、骨形態形成タンパク質、ｎｏｔｃｈリガンド、Ｗｎｔおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、前記第１の繊維状ポリマー足場は、導管、充填導管またはロッドの形状を有し、前記ポリマーはシームレスである。
【００４９】
他の例示的な実施形態では、組成物は、ポリマーを含むポリマー溶液を回転マンドレルに付着させること(applying)によって生成される。他の例示的な実施形態では、前記ポリマー足場は、シート、導管または充填導管の形状を有し、少なくとも１つの非導電性領域を有する回転マンドレルを含むエレクトロスピニング工程によって生成される。他の例示的な実施形態では、前記ポリマー足場は、ロッドの形状を有し、エアギャップを有する回転マンドレルを含むエレクトロスピニング工程によって生成される。
【００５０】
他の例示的な実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載する組成物と、（ｂ）薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。他の例示的な実施形態では、組成物は、ロッドまたは導管であり、第１の繊維状ポリマー足場の繊維の少なくとも１つは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む。他の例示的な実施形態では、組成物は、約０．５ｃｍ〜５０ｃｍの長さを有する。他の例示的な実施形態では、本発明は、第１の繊維状ポリマー足場を取り囲むスリーブをさらに含む。他の例示的な実施形態では、スリーブは、第２の繊維状ポリマー足場を含み、前記第２の繊維状ポリマー足場は、整列しているか、またはランダム配向を配する。他の例示的な実施形態では、本発明は、第１の繊維状ポリマー足場の第１の端部を取り囲む第１のスリーブと、第１の繊維状ポリマー足場の第２の端部を取り囲む第２のスリーブとをさらに含む。
【００５１】
他の態様では、本発明は、対象において損傷を治療する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）本明細書に記載する組成物を、前記損傷を治療するのに十分な、量および条件下で、前記対象の関心部位に付着させるステップを含む。他の例示的な実施形態では、前記損傷は、切断された神経、傷害を受けた神経、切断された筋肉、傷害を受けた筋肉、切断された血管、傷害を受けた血管、皮膚創傷および傷ついた皮膚から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、損傷は切断された神経を伴い、前記第１の繊維状ポリマー足場は、第１の端部および第２の端部を含む導管、充填導管またはロッドの形状を有し、前記切断された神経は、第１の神経断端および第２の神経断端を含み、前記付着は、（ｉｉ）前記組成物の前記第１の端部を前記第１の神経断端に結合させるステップと、（ｉｉｉ）前記組成物の前記第２の端部を前記第２の神経断端に結合させるステップとを含む。
【００５２】
他の例示的な実施形態では、前記損傷は傷害を受けた神経を伴い、前記付着は、（ｉｉ）本明細書に記載する組成物を、前記傷害を受けた神経に巻き付けるステップから選択されるメンバーを含み、前記組成物はシートの形状を有する。他の例示的な実施形態では、損傷は傷害を受けた神経を伴い、前記付着は、（ｉｉ）組成物を、前記傷害を受けた神経に挿入するステップから選択されるメンバーを含み、前記第１の繊維状ポリマー足場はロッド、導管または充填導管の形状を有する。他の例示的な実施形態では、本発明は、対象において神経の成長を増進する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）神経の成長を増進するのに十分な、量および条件下で、本明細書に記載する組成物を前記対象における対象の神経部位に付着させるステップを含む。他の例示的な実施形態では、損傷は、切断された皮膚または傷ついた皮膚を伴い、前記第１の繊維状ポリマー足場はシートの形状を有し、前記付着は、（ｉ）前記組成物を前記切断された皮膚に結合させ、それによって前記損傷を治療することを含む。他の態様では、本発明は、対象において皮膚の成長を増進する方法を提供し、前記第１の繊維状ポリマー足場はシートの形状を有し、前記方法は、（ｉ）皮膚の成長を増進するのに十分な、量および条件下で、本明細書に記載する組成物を前記対象において対象の皮膚部位に付着させるステップを含む。
【００５３】
他の例示的な実施形態では、損傷は切断された血管を伴い、前記第１の繊維状ポリマー足場は、第１の端部および第２の端部を含む導管または充填導管の形状を有し、前記切断された血管は、第１の血管断端および第２の血管断端を含み、前記付着は、（ｉｉ）前記組成物の前記第１の端部を前記第１の血管断端に結合させるステップと、（ｉｉｉ）前記組成物の前記第２の端部を前記第２の血管断端に結合させるステップとを含む。他の態様では、本発明は、対象において血管の成長を増進する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）血管の成長を増進するのに十分な、量および条件下で、本明細書に記載する組成物を前記対象における関心血管部位に付着させるステップを含む。
【００５４】
他の例示的な実施形態では、損傷は切断された筋肉を伴い、前記第１の繊維状ポリマー足場は、第１の端部および第２の端部を含む導管、充填導管またはロッドの形状を有し、前記切断された筋肉は、第１の筋肉断端および第２の筋肉断端を含み、前記付着は、（ｉｉ）前記組成物の前記第１の端部を前記第１の筋肉断端に結合させるステップと、（ｉｉｉ）前記組成物の前記第２の端部を前記第２の筋肉断端に結合させるステップとを含む。他の例示的な実施形態では、損傷は傷害を受けた筋肉を伴い、前記付着は、（ｉｉ）本明細書に記載する組成物を、前記傷害を受けた筋肉に巻きつけるステップから選択されるメンバーを含み、前記組成物は、シートの形状を有する。他の例示的な実施形態では、損傷は傷害を受けた筋肉を伴い、前記付着は、（ｉｉ）前記傷害を受けた筋肉に組成物を挿入するステップから選択されるメンバーを含み、前記第１の繊維状ポリマー足場は、ロッド、導管または充填導管の形状を有する。他の態様では、本発明は、対象において筋肉の成長を増進する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）筋肉の成長を増進するのに十分な、量および条件下で、本明細書に記載する組成物を前記対象において対象の筋肉部位に付着させるステップを含む。他の態様では、本発明は、本明細書に記載する組成物の作製方法を提供する。他の例示的な実施形態では、前記方法は、（ｉ）１つまたは複数の繊維をエレクトロスピニング工程にかけ、それによって前記組成物を作製するステップを含む。他の例示的な実施形態では、前記エレクトロスピニング工程は、エアギャップまたは少なくとも１つの非導電性領域を有する回転マンドレルを含む。
【００５５】
第２の態様では、本発明は、第１の電気伝導領域、第２の電気伝導領域、ならびに第１および第２の電気伝導領域の間に延在する非電気伝導領域を含む、エレクトロスピニング装置のためのマンドレルを提供し、非電気伝導領域は、第１の繊維状ポリマー足場の形成のための繊維状ポリマーを受けるために、特定の寸法に合わせられ、構成される。他の例示的な実施形態では、前記非電気伝導領域は、マンドレルの周りに配置されるスリーブである。他の例示的な実施形態では、前記非電気伝導領域は、テープ、絶縁テープ、Ｔｅｆｌｏｎ、およびプラスチックから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、前記非電気伝導領域は、２つの導電性マンドレル領域を相互連結する。他の例示的な実施形態では、前記非電気伝導領域は、２つの導電性マンドレル領域の間に延在する別個の部分である。他の例示的な実施形態では、前記非電気伝導領域は、Ｔｅｆｌｏｎおよびプラスチックから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、前記非電気伝導領域は、前記電気伝導領域より大きい直径およびより小さい直径から選択されるメンバーである直径を有する。
【００５６】
第３の態様では、本発明は、第１の電気伝導領域および第２の電気伝導領域を含む、エレクトロスピニング装置のためのマンドレルを提供し、第１および第２の電気伝導領域の間に位置するエアギャップは、第１および第２の電気伝導領域の間に非導電性領域を形成する。他の例示的な実施形態では、本発明は、第１の電気導電性部分の少なくとも一部の上に配置された第１の非電気導電性スリーブと、第２の電気導電性部分の少なくとも一部の上に配置された第２の非電気導電性スリーブとをさらに含む。他の例示的な実施形態では、非導電性領域を有するマンドレルを、エレクトロスピニングシステムと組み合わせる。他の例示的な実施形態では、エアギャップを有するマンドレルを、エレクトロスピニングシステムと組み合わせる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】マンドレル５６Ａを有するエレクトロスピニング装置の略図である。
【図２】マンドレル５６Ａを有するエレクトロスピニング装置の斜視図（透視図）である。
【図２Ａ】ポリマー足場９０を形成する、マンドレル５６Ａを有するエレクトロスピニング装置の部分である。
【図２Ｂ】ポリマー足場９０を形成する、マンドレル５６Ａを有するエレクトロスピニング装置の部分である。
【図３】繊維状ポリマー足場を加工するために使用する様々なマンドレルの設計を示す図である。（Ａ）全ての表面が導電性であるマンドレル５６である。（Ｂ）第１の導電性領域５７Ａ、第２の導電性領域５７Ｂ、非導電性領域５５、第１のインターフェース５５Ａ、および第２のインターフェース５５Ｂを有するマンドレル５６Ａである。（Ｃ）非導電性領域５５が２つの導電性マンドレル領域を相互連結するマンドレル５６Ａの断面図である。（Ｄ）非導電性領域５５Ａが導電性部分５７の表面の部分を覆うスリーブであるマンドレル５６Ａの断面図である。（Ｅ）第１の導電性領域５７Ａ、第２の導電性領域５７Ｂ、第１の導電性領域面５７Ｃ、第２の導電性領域面５７Ｄを有するマンドレル５６Ｂである。伝導領域は、エアギャップ５８によって分離されている。
【図４Ａ】長手方向に整列したマイクロ／ナノ繊維から構成される導管のポリマー足場の例示である。
【図４Ｂ】長手方向に整列したマイクロ／ナノ繊維から構成されるロッドのポリマー足場の例示である。注：繊維の寸法は正しい縮尺で描かれていない。
【図５Ａ】図４Ａにおける導管の断面図を示す例示である。
【図５Ｂ】図４Ｂにおけるロッドの断面図を示す例示である。
【図６】マンドレル５６Ｂを有するエレクトロスピニング装置の略図である。
【図７】マンドレル５６Ｂを有するエレクトロスピニング装置の斜視図（透視図）である。
【図７Ａ】ポリマー足場９２を形成するマンドレル５６Ｂを有するエレクトロスピニング装置の部分である。
【図８】長手方向に整列したポリマー足場シート９６の例示である。
【図９】整列したポリマー足場シートからシームを有する繊維状ポリマー導管足場を生成するための巻く工程を示す略図である。ここでは長手方向に整列したポリマー足場シート９６をロッド９７の周りに巻き、後に縫合または接着する。
【図１０】整列したシート９６および１００を含む「十字形交差」シート１０２の例示である。
【図１１】マンドレル５６Ｂを有する複数スピナレット(spinneret)のエレクトロスピニング装置１１０の略図である。ポリマー溶液３８、３８Ａおよび３８Ｂは、溶媒に溶解したポリマーを含有し、各々シリンジアセンブリー３６、３６Ａおよび３６Ｂ内に含有される。シリンジアセンブリーは、シリンジポンプアセンブリー３２の一部であり、そこではコンピュータ３４が、圧力または流量を制御することによってポリマー溶液のシリンジを出る速度を制御する。任意選択で、異なる流量が実現され、選択したスピナレットへと制御することができる。流量は、ポリマー足場の所望の物理的特性、すなわち、膜の厚さ、繊維の直径、孔径、膜密度などによって変化するであろう。  シリンジポンプアセンブリー３２は、ポリマー溶液をプラットフォーム４４上にあるスピナレット４２、４２Ａおよび４２Ｂに供給する。スピナレットは、支障なしにジェット形成および移送を可能にする先端部の形状を有する。約１０〜約３０ｋＶの範囲の電荷を、高圧電源４８によってワイヤー４１Ａを介してスピナレットに加える。  （図３Ｂで述べたように、５７Ａ、５７Ｂおよび５８を包含する）マンドレル５６Ｂを、荷電しているスピナレットとマンドレル５６Ａとの間に電界が生じるように、スピナレット４２、４２Ａおよび４２Ｂの下に配置する。電界によってポリマー溶液のジェットがスピナレットから放出され、マンドレル５６Ｂに噴霧され、ミクロンまたはナノメートル直径のフィラメントまたは繊維４６、４６Ａおよび４６Ｂが形成される。ドリルチャック(drill chuck)は、アース線４１Ｂおよび４１Ｃを使用して接地されている。  マンドレル５６Ｂは、第１のドリルチャック５４（非導電性ベアリング６０に装着されている）および第２のドリルチャック５４Ａ（非導電性ベアリング６０Ａ装着されている）（モーター５２に連結している）に装着されている。モーター５２は、モーターがマンドレル５６Ｂをスピンさせる速度を制御するスピードコントロール５０Ａに連結している。任意選択で、異なるスピン速度を提供することができる。スピン速度は、ポリマー足場の所望の物理的特性、すなわち、膜の厚さ、繊維の直径、孔径、膜密度などによって変化するであろう。
【図１２】整列していない（Ａ）および整列した（Ｂ）ＰＬＬＡナノ繊維のＳＥＭ像である。（Ｃ）ヘパリンによるＰＬＬＡナノ繊維の化学修飾、ならびにｂＦＧＦおよびラミニンの非共有結合を示す例示である。改変したＥＬＩＳＡ技術を使用して、未処理、ジ−ＮＨ２−ＰＥＧ修飾された、およびヘパリン官能化されたＰＬＬＡナノ繊維（Ｄ）上、ならびにポリ（アクリル酸）でコーティングしたポリスチレン表面（Ｅ）上のｂＦＧＦ結合の相対レベルを示した。
【図１３】整列していないナノ繊維上のＤＲＧ組織からの軸索伸張である。ニューロフィラメントの免疫蛍光染色を使用して、６日間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養後の未処理、ＬＡＭおよびＬＡＭ＋ｂＦＧＦの整列していないナノ繊維上のＤＲＧ組織からの軸索伸張を可視化した。スケールバー＝２００μｍ。
【図１４】整列したナノ繊維上のＤＲＧ組織からの軸索伸張である。ニューロフィラメントの免疫蛍光染色を使用して、６日間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養後の未処理、ＬＡＭおよびＬＡＭ＋ｂＦＧＦの整列したナノ繊維上のＤＲＧ組織からの軸索伸張を可視化した。ナノ繊維を、垂直方向に整列させた。スケールバー＝２００μｍ。
【図１５】整列していないおよび整列したＬＡＭ＋ｂＦＧＦのＰＬＬＡナノ繊維上の神経突起の形態の高倍率共焦点顕微鏡観察像である。整列したナノ繊維は、垂直方向であった。
【図１６】ヒト間葉幹細胞を、ＰＬＬＡマイクロ／ナノ繊維膜上で１日、３日、または６日間ペレットとして培養した。整列していないマイクロ／ナノ繊維上の細胞は、時間と共に緩やかな遊走とランダム整列を示す。整列したマイクロ／ナノ繊維上の細胞は、３日および６日目に繊維の方向への遊走の促進と繊維方向の全体的な整列を示す。スケールバーは２００μｍである。
【図１７】様々な細胞型を有するマイクロ／ナノ繊維の足場の創傷治癒モデルである。ＭＳＣ：間葉幹細胞、２日後。ＦＦ：包皮線維芽細胞、５日後。ＥＣ：内皮細胞、１日後。整列していないマイクロ／ナノ繊維の足場上で、創傷の被覆は、最小（ＭＳＣ試料）から中程度（ＥＣ試料）の範囲である。マイクロ／ナノ繊維が創傷の長軸に平行に整列している場合（整列−平行）、創傷への細胞遊走は大幅に損なわれる。マイクロ／ナノ繊維が創傷の長軸と垂直に整列している場合、細胞遊走および創傷の被覆は最も大きい。
【図１８】Ａ）ネーティブなｉｎ  ｖｉｖｏ総頸動脈の平滑筋細胞の配向と、Ｂ）ヒト平滑筋細胞を播種した整列したナノ繊維ポリマーシートとの間の同様の細胞骨格構造を示すアクチン（ファロイジン）および核（ヨウ化プロピジウム）の蛍光染色である。
【図１９】幹細胞が埋め込まれたナノ繊維状の血管移植片の構造である。Ａ）幹細胞を生分解性ナノ繊維の整列したシート上に播種する。Ｂ）シートをロッドの周りに巻くことによって管状構造を生成する。Ｃ）ロッドを除去し、移植片の形状を維持するために縫合を使用する。
【図２０】血管移植片およびラット動脈の断面図のヴァーヘフ(Verhoeff)染色である。コラーゲン（赤）およびエラスチン（黒）繊維の生成は、１〜３週間で有意に改善する。３週間までに、組織設計された血管移植片は、ネイティブなラット動脈に対して強い類似点を有する。
【図２１】３週間の移植後の血管移植片におけるＣＤ３１（内皮細胞マーカー）についての断面図の免疫組織化学染色（茶色）。Ａ）ラット動脈。Ｂ）３週間後の血管移植片。
【図２２】３週間の移植後の血管移植片におけるα−アクチン（平滑筋マーカー）についての断面図の免疫組織化学染色（茶色）。Ａ）ラット動脈。Ｂ）３週間後の血管移植片。
【図２３】筋芽細胞が、整列していない表面またはパターン化していない表面上で成長した場合、筋管はランダムな態様で形成される。筋芽細胞が、整列したナノ繊維または微細パターン化した(micropatterned)表面上で成長した場合、筋管は整列した態様で形成される。
【図２４】整列したＰＬＬＡナノ繊維状足場上の筋芽細胞の整列および筋管アセンブリーである。ＳＥＭ像は、（Ａ）ランダム配向したナノ繊維状足場および（Ｂ）整列したナノ繊維状足場の構造、続いて分化培地中の３日後の（Ｃ）ランダム配向したナノ繊維状足場、および（Ｄ）整列したナノ繊維状足場上の筋芽細胞のＦ−アクチンの免疫蛍光染色を示す。３日目（Ｅ、Ｆ）および７日目（Ｇ、Ｈ）のランダム（Ｅ、Ｇ）および整列した（Ｆ、Ｈ）ナノ繊維状足場上の筋管を示すために、骨格ＭＨＣの蛍光免疫染色を行った。筋管の全体的整列および長さを示す７日後の（Ｉ）ランダム配向した基板および（Ｊ）整列した基板上の骨格ＭＨＣ染色の低倍率の合成像である。矢印はナノ繊維の方向を示す。ＥおよびＦにおける矢じりは、核を示す。スケールバーは、各々５０μｍ（Ａ〜Ｈ）および１００μｍ（Ｉ、Ｊ）である。
【図２５】整列したナノ繊維状基板上の筋管組織および形態の定量化である。（Ａ）ナノ繊維の方向を基準とした筋管整列の角度である。（Ｂ）７日後の筋管の長さである。（Ｃ）７日後の筋管の幅である。＊は統計的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２６】整列したナノ繊維状足場上の筋芽細胞の増殖および筋管横紋の定量化である。（Ａ）細胞増殖のためのＢｒｄＵの取込み（Ｒ、ランダム；Ａ、整列）。（Ｂ）整列したナノ繊維状足場上の横紋のある筋管を示す抗−ＭＨＣの蛍光免疫染色である（スケールバー：２０μｍ）。（Ｃ）７日後の横紋のある細胞の割合の定量化である。＊は統計的有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図２７】微細パターン化したＰＤＭＳ基板上の筋芽細胞の整列および筋管組織である。微細パターン化したＰＤＭＳ基板を、（Ａ）ＳＥＭ（側面図）および（Ｂ）位相差顕微鏡観察によって示す。分化培地中の２日後のＦ−アクチン分布を、（Ｃ）パターン化していない基板および（Ｄ）微細パターン化した基板上に示す。２日後（Ｅ〜Ｆ）および７日（Ｇ〜Ｈ）後のパターン化していない（Ｅ、Ｇ）および微細パターン化した（Ｆ、Ｈ）膜上の細胞融合を示すために、骨格ＭＨＣの免疫蛍光染色を行った。矢印は、微細溝の方向を示す。スケールバーは、各々５μｍ（Ａ）、２０μｍ（Ｂ）および５０μｍ（Ｃ〜Ｈ）である。
【図２８】微細パターン化した膜上の筋管組織および形態の定量化である。（Ａ）パターン化していない（Ｃｏｎ）および微細パターン化した（Ｐａｔ）膜上の微細溝の方向を基準とした筋管整列の角度である。（Ｂ）７日後の筋管の長さである。（Ｃ）７日後の筋管の幅である。＊は統計的有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図２９】微細パターン化したＰＤＭＳ膜上の筋芽細胞の増殖および横紋の定量化である。（Ａ）パターン化していない（Ｃｏｎ）および微細パターン化した（Ｐａｔ）膜上の融合の初期における細胞増殖のためのＢｒｄＵの取込みである。（Ｂ）７日後の横紋のある細胞の割合の定量化である。＊は統計的有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図３０】ナノ繊維状足場上の筋管形成のＳＥＭ像である。（Ａ）ランダム配向したＰＬＬＡナノ繊維状足場、および（Ｂ）整列したＰＬＬＡナノ繊維状足場上の、分化培地中の７日後の筋管整列である（スケールバー：５０μｍ）。
【図３１】微細パターン化した生分解性ＰＬＧＣ基板上の筋芽細胞の整列である。（Ａ）ＰＬＧＣ基板上の組織分布的に微細パターン化した溝のＳＥＭ像である。（Ｂ〜Ｃ）パターン化していない（Ｂ）ＰＬＧＣ基板、および微細パターン化した（Ｃ）ＰＬＧＣ基板上の、分化培地中５日後の筋芽細胞のＦ−アクチン染色である。微細パターン化したＰＬＧＣ基板上の整列し、よく組織されたアクチンストレスファイバーに留意されたい。スケールバーは、各々１０μｍ（Ａ）および５０μｍ（Ｂ〜Ｃ）である。
【図３２】三次元の筋繊維を播種した管状足場を生成するための巻く工程を示す略図である。筋芽細胞を、整列したナノ繊維の膜上の整列した筋管に分化させた。分化の７日目後、シートをロッド軸と共に管状足場に巻き、縫合固着した。
【図３３】低倍率（左）および高倍率（右）の三次元管状ナノ繊維の足場の組織を示したヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色である。
【図３４】横断面（Ａ）および長軸面（Ｂ）における三次元管状ナノ繊維の足場中の筋芽細胞および筋管細胞の形態を示したレーザー共焦点顕微鏡観察である。試料を、Ｆ−アクチン（緑）および核（赤）を免疫蛍光染色した。
【図３５】整列した繊維または整列していない繊維上のｉｎ  ｖｉｔｒｏの創傷治癒モデルの図である。（Ａ）マイクロ／ナノ繊維は、創傷の長縁と平行または垂直に配向することができる整列していない繊維または整列した繊維と共にメッシュとして生成される。（Ｂ）扁平な１８ゲージシリンジ針をナノ繊維メッシュ上に置いて、細胞間接着を遮断する。（Ｃ）細胞をナノ繊維メッシュ上に播種する。（Ｄ）ナノ繊維への細胞接着後、針を除去し、創傷への細胞遊走を可能にする。
【図３６】整列した繊維対整列していないナノ繊維上にＮＨＤＦを有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒モデルである。４８時間後、整列していないマイクロ／ナノ繊維上のＮＨＤＦ（Ａ）は、中程度の遊走と創傷の被覆、およびランダムな細胞整列を示す。繊維が創傷縁と垂直に整列した場合（Ｂ）、遊走および創傷の被覆は大幅に増進され、細胞は繊維と共に整列する。繊維が創傷の縁と平行に整列した場合（Ｃ）、創傷の被覆は大幅に減少する。染色は、全アクチン(whole actin)（緑）およびＨｏｅｃｈｓｔ核染色（青）である。白い点線は、０時間での当初の創傷縁を示す。スケールバーは３００ｍｍである。
【図３７】化学修飾をしたまたはしていない整列したマイクロ／ナノ繊維上にＮＨＤＦを有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの創傷治癒モデルである。全ての群において、マイクロ／ナノ繊維は、創傷の長縁と垂直に配向された。２４時間後、ＮＨＤＦは、さらなる化学修飾をした繊維上で促進された遊走および創傷の被覆を示した。未処理の繊維上では、細胞は完全に創傷領域を覆わなかった。ラミニンを繊維に加えた場合、細胞はより迅速に遊走した。可溶性形態またはマイクロ／ナノ繊維に固定化したｂＦＧＦの添加によって、遊走がさらに増進された。染色は、全アクチン（緑）および核（青）である。白い点線は、０時間での当初の創傷縁を示す。スケールバーは３００ｍｍである。
【図３８】多層のマイクロ／ナノ繊維組織移植片のアセンブリーである。個々のマイクロ／ナノ繊維シートを互いの上に層状に積み重ね、複雑な構造を有する構築体を生成することができる。この図は、十字形交差の繊維構造を有する移植片のアセンブリーを示す。各々のシートの繊維配向によってさらなる構造体を生成することができる。
【図３９】微細パターン化したポリマー膜の加工である。（Ａ）ネガティブフォトレジストをシリコーンウエハー上にスピンコーティングし、フォトマスクを通して紫外線にさらした。（Ｂ）ＵＶ重合を行わないフォトレジストを現像し、パターン化した表面を残した。（Ｃ）ポリマー溶液をウエハー上に注ぎ、スピンコーティングし、重合させた。（Ｄ）次いでフィルムをケイ素ウエハーから剥がした。
【図４０】多数の細胞型の移植片である(Multiple cell type graft)。Ａ）整列したまたはランダム配向したナノ繊維シートである。Ｂ）シートの異なる領域上に多数の細胞型を播種する。Ｃ）移植片において異なる場所で多数の細胞型を有する管状構築体を生成させる。
【図４１】回転ドラムコレクターを有する本発明のエレクトロスピニング装置を示す。
【図４２】血管移植片およびラット動脈の断面図を示す。移植された血管移植片はＰＬＬＡを含み、ヒルジンなどの共有結合している生体分子を含有しなかった。図４２Ａは、ヴァーヘフ染色を受けた血管移植片およびラット動脈である。図４２Ｂは、ＣＤ３１（内皮細胞マーカー）による免疫組織化学染色（茶色）を受けた血管移植片およびラット動脈である。図４２Ｃは、α−アクチン（平滑筋マーカー）による免疫組織化学染色（茶色）を受けた血管移植片およびラット動脈である。図４２Ｄは、ＣＤ６８による免疫組織化学染色を受けた血管移植片およびラット動脈である。
【図４３】血管移植片およびラット動脈の断面図を示す。移植された血管移植片は、共有結合しているＰＬＬＡを含む。図４３Ａは、ヴァーヘフ染色を受けた血管移植片およびラット動脈である。図４３Ｂは、ＣＤ３１（内皮細胞マーカー）による免疫組織化学染色（茶色）を受けた血管移植片およびラット動脈である。図４３Ｃは、α−アクチン（平滑筋マーカー）による免疫組織化学染色（茶色）を受けた血管移植片およびラット動脈である。図４３Ｄは、ＣＤ６８による免疫組織化学染色を受けた血管移植片およびラット動脈である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
Ｉ  定義および略語
ここに使用されている略語は一般に、化学および生物学の技術分野におけるそれらの従来の意味を有する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別のことを指図しない限り複数の指示物が包含される。
【００６０】
本明細書で使用する場合、および別段の指示がない限り、ある成分が「本質的にない」組成物は、組成物が約１０重量％未満、約５重量％未満、または約３重量％未満などの約２０重量％未満のその成分を含有することを意味する。
【００６１】
「ペプチド」は、そのモノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合しているポリマーを意味し、代わりにポリペプチドとも称される。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた包含される。遺伝子にコードされていないアミノ酸もまた、本発明において使用することができる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療効果部分、生体分子などを包含するように修飾されたアミノ酸もまた、本発明において使用することができる。本発明に使用されるアミノ酸の全ては、Ｄ−異性体またはＬ−異性体であってもよい。さらに、他のペプチド模倣物もまた、本発明に有用である。本明細書で使用する場合、「ペプチド」とは、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドの両方を意味する。また包含されるのは、ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されたペプチドである。一般論については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３）を参照されたい。
【００６２】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ塩基の化学構造、すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を意味する。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ塩基の化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、その機能はある程度天然アミノ酸と同様の化合物を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、またはより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ、およびその任意の化学修飾物を意味する。修飾には、それだけに限らないが、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対して、さらなる電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、結合点および官能性を組み込む化学基を提供するものが包含される。このような修飾には、それだけに限らないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホジエステル基修飾（例えば、ホスホロチオアート、メチルホスホナート）、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−ウラシルの置換または５−ヨード−ウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、異常塩基対の組合せ（例えば、イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなど）が包含される。核酸には、例えば、ニトロインドールなどの非天然塩基もまた包含することができる。修飾にはまた、フルオロフォア（例えば、量子ドット）または他の部分によるキャッピングなどの３’および５’修飾も包含することができる。
【００６４】
「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗原に特異的に結合し認識する、免疫グロブリンまたはそのフラグメントまたは免疫複合体からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを一般に意味する。認識されている免疫グロブリンには、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリンの可変領域遺伝子が包含される。軽鎖は、κまたはλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらがひいては免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを各々規定する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「コポリマー」という用語は、複数のタイプのサブユニットを含有するポリマーを示す。この用語は、２種、３種、４種、５種、または６種のサブユニットを包含するポリマーを包容する。
【００６６】
「単離した」という用語は、材料を生成するのに使用される成分が実質的にまたは本質的にない材料を意味する。組成物の純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【００６７】
「ヒドロゲル」は、液体のその自重の少なくとも３倍、好ましくは少なくとも１０倍を吸収することができる水不溶性および水膨潤性の架橋ポリマーを意味する。「ヒドロゲル」および「熱応答性ポリマー」は、本明細書において互換的に使用される。
【００６８】
「結合した(attached)」という用語は、本明細書で使用する場合、それだけに限らないが、共有結合、イオン結合、化学吸着、物理吸着およびそれらの組合せが包含される相互作用を包容する。
【００６９】
「生体分子」または「生物有機分子」という用語は、典型的には生物によって作られた有機分子を意味する。これには、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、糖類、脂肪酸、ステロイド、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドフラグメント、炭水化物、脂質、およびそれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、リボ核タンパク質、リポタンパク質、または同種のもの）を含む分子が包含される。
【００７０】
「小分子」は、分子量が１ｋＤ未満、好ましくは６００Ｄ未満の種を意味する。
【００７１】
「本発明の組成物」は、本明細書で使用する場合、本明細書において議論されている組成物、それらの組成物の薬学的に許容できる塩およびプロドラッグを意味する。
【００７２】
置換基が、左から右へ記載される従来の化学式によって特定されている場合、それらは、右から左に構造を記載することから生じるであろう化学的に同一の置換基を同様に包容し、例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−もまた列挙することが意図されている。
【００７３】
「有効」量の薬物、製剤、または浸透体とは、所望の局所または全身作用を提供するのに十分な量の活性剤を意味する。「局所的に有効な」、「美容上に有効な」、「医薬的に有効な」または「治療的に有効な」量とは、所望の治療結果をもたらすのに必要とされる薬物の量を意味する。
【００７４】
「薬学的に許容できる塩」という用語は、本明細書に記載する化合物上に見出される特定の置換基に応じた、比較的無毒性の酸または塩基によって調製される本発明の化合物の塩が包含されることを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能性を含有する場合、塩基付加塩は、このような化合物の中性形態を、ニートまたは適切な不活性溶媒中の十分な量の所望の塩基と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容できる塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様の塩が包含される。本発明の化合物が、比較的塩基性の官能性を含有する場合、酸付加塩は、このような化合物の中性形態を、ニートまたは適切な不活性溶媒中の十分な量の所望の酸と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容できる酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機酸由来の塩；ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒性の有機酸由来の塩が包含される。アルギン酸塩などのアミノ酸の塩；およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩もまた包含される（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ６６：１〜１９（１９７７）を参照されたい）。ある特定の本発明の化合物は、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のどちらかに変換されることを可能にする塩基性および酸性両方の官能性を含有する。
【００７５】
化合物の中性形態は好ましくは、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を従来の方法で単離することによって再生される。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度などの特定の物理学的性質において様々な塩の形態と異なる。
【００７６】
塩の形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載する化合物または複合体のプロドラッグは、本発明の化合物を提供する生理条件下で化学変化を容易に受ける。さらにプロドラッグは、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境において化学的または生化学的手法によって本発明の化合物に変換することができる。
【００７７】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する原子の１つまたは複数で自然ではない割合の原子の同位体も含有してもよい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）または炭素１４（１４Ｃ）などの放射性同位体によって放射標識されてもよい。本発明の化合物の全ての同位体の変化は、放射性でもまたはそうでなくても、本発明の範囲内に包容されることが意図されている。
【００７８】
「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できるビヒクル」という用語は、本明細書に記載されているような活性剤有効量の適切な送達を実現し、活性剤の生物活性の有効性を妨げず、宿主または患者に対して十分に無毒性である任意の製剤または担体媒体を意味する。代表的な担体には、水、油（植物および鉱物の両方）、クリーム基剤、ローション基剤、軟膏基剤などが包含される。これらの基剤には、懸濁化剤、増粘剤、透過エンハンサーなどが包含される。それらの製剤は、化粧品および局所薬品の当業者に周知である。担体についてのさらなる情報は、参照により本明細書中に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に見出すことができる。
【００７９】
「薬学的に許容できる局所担体」および同等の用語は、本明細書に前述したような局所適用に適した薬学的に許容できる担体を意味する。活性剤を懸濁させまたは溶解させることができ、皮膚、爪、髪、鉤爪(claw)またはひづめに塗布した場合、無毒性および非炎症性の特性を有する不活性な液体またはクリームビヒクルは、薬学的に許容できる局所担体の例である。この用語は、局所用化粧品においても使用が認められている担体材料も包容することが具体的に意図されている。
【００８０】
「薬学的に許容できる添加剤」という用語は、製剤の分野で知られまたは使用され、活性剤の生物活性の有効性を過度に妨げず、宿主または患者に対して十分に無毒性である保存料、抗酸化剤、香料、乳化剤、色素および賦形剤を意味する。局所製剤のための添加剤は、当技術分野において周知であり、それらが薬学的に許容でき、上皮細胞またはそれらの機能に有害でない限りは、局所組成物に加えてもよい。さらに、それらは組成物の安定性の低下をもたらすべきではない。例えば、不活性な充填剤、抗刺激剤、粘着付与剤、賦形剤、香料、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、安定剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、着色剤、保存料、緩衝剤、他の浸透エンハンサー、および当技術分野において公知であるような局所的または経皮的な送達製剤の他の従来の成分である。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「投与する」とは、対象への、経口投与、坐薬としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋内、病巣内、鼻腔内もしくは皮下投与、または徐放性装置、例えばミニ浸透圧ポンプの移植を意味する。
【００８２】
「賦形剤」という用語は、所望の使用に効果的な薬物組成物の製剤に使用される担体、希釈剤および／またはビヒクルを意味すると慣習的に知られている。
【００８３】
「自己細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、対象自身の細胞、またはそのクローン細胞を意味する。
【００８４】
「同種異系細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、第１の対象自身の細胞またはそのクローンではないが、第２の対象由来の細胞またはそのクローンの細胞を意味し、この第２の対象は、第１の対象と同じ種である。
【００８５】
「異種細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、第１の対象自身の細胞またはそのクローンからではない細胞であるが、第２の対象由来の細胞またはそのクローンの細胞を意味し、この第２の対象は、第１の対象と同じ種ではない。
【００８６】
「幹細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、他の細胞型（特定の特化された機能を有するもの（すなわち、赤血球、マクロファージなどの最終分化細胞）を包含する）へ分化することができる細胞を意味する。幹細胞は、それらの源（成体／体性幹細胞、胚性幹細胞）によって、またはそれらの能力（全能性、多能性、複能性および単能性）によって定義することができる。
【００８７】
「単能性(unipotent)」という用語は、本明細書で使用する場合、ただ１つの細胞型を生じさせることができるが、非幹細胞とは異なるものとして区別される自己複製の特性を有する細胞を意味する。
【００８８】
「複能性(multipotent)」または「前駆体」という用語は、本明細書で使用する場合、いくつかの異なる最終分化細胞型の任意の１つを生じさせることのできる細胞を意味する。これらの異なる細胞型は通常、密接な関係がある（例えば、赤血球、白血球および血小板などの血液細胞）。例えば、（骨髄間質細胞としても知られている）間葉幹細胞は、複能性細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞、およびβ−膵島細胞を形成することができる。他の例は、個々の細胞の多核筋管への融合に関与する分化過程によって骨格筋細胞を優先的に生じさせる骨格筋芽細胞である。
【００８９】
「多能性(pluripotent)」という用語は、本明細書で使用する場合、生物の細胞型のいくつかまたは多く（しかし全てではない）を生じさせる細胞を意味する。多能性幹細胞は、成熟した生物の体において任意の細胞型に分化することができるが、それらは再プログラムなしには、それらが由来した細胞に脱分化することができない。やがてわかるであろうが、「複能性」／前駆細胞（例えば、神経幹細胞）は、多能性幹細胞より狭い分化能力を有する。多能性幹細胞よりさらに原始的な他のクラスの細胞（すなわち、特定の分化の運命に対して中立である）は、いわゆる「全能性」幹細胞である。
【００９０】
「全能性(totipotent)」という用語は、本明細書で使用する場合、受精卵母細胞、ならびに受精卵細胞の最初のいくつかの分裂によって生じた細胞（例えば、発生の２細胞期および４細胞期の胚）を意味する。全能性細胞は、特定の種の任意のタイプの細胞へと分化する能力を有する。例えば、単一の全能性幹細胞は、完全な動物を生じさせ、ならびに特定の種（例えば、ヒト）に見出される無数のどんな細胞型でも生じさせることができる。本明細書で、多能性および全能性の細胞、ならびに完全な器官または組織への分化能力を有する細胞は、「始原」幹細胞と称される。
【００９１】
「脱分化」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞がより特化されていない状態へ戻ることを意味する。脱分化後に、このような細胞は、再プログラムの前に可能であったより多くのまたは異なる細胞型へ分化する能力を有するであろう。逆分化（すなわち、脱分化）のプロセスは、分化より複雑であると思われ、「再プログラム」細胞がより原始的になることを必要とする。脱分化の例は、早期の一次筋芽細胞などの筋前駆細胞の、筋肉幹細胞または衛星細胞への変換である。
【００９２】
「正常な」幹細胞とは、異常な表現型を示さず、または異常な遺伝子型を有さず、したがってこのような幹細胞由来の全ての細胞を生じさせることができる幹細胞（またはその子孫）を意味する。全能性幹細胞との関連において、例えば細胞は、例えば健康である完全で正常な動物を生じさせることができる。対照的に、「異常な」幹細胞とは、例えば１つまたは複数の突然変異または遺伝子組換えまたは病原体によって正常ではない幹細胞を意味する。したがって、異常な幹細胞は、正常な幹細胞とは異なる。
【００９３】
「成長環境」とは、幹細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する環境である。環境の主要なものには、細胞が培養される培地、および存在する場合は支持構造（固体表面上の基板など）が包含される。
【００９４】
「成長因子」とは、細胞の成長を促進するのに効果的で、補足として培地に加えられなければ、基本培地の成分ではない物質を意味する。言い換えれば、成長因子は、（存在する場合は、任意の支持細胞を包含した）培養されている細胞によって分泌されない分子、または培地中の細胞によって分泌されている場合は、成長因子を外因的に加えることによって得られる結果を達成するのに十分な量で分泌されない分子である。成長因子には、それだけに限らないが、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、血小板由来増殖因子−ＡＢ（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、アクチビン−Ａ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン、サイトカイン、ケモカイン、モルフォゲン、中和抗体、他のタンパク質、および小分子が包含される。
【００９５】
「分化因子」という用語は、本明細書で使用する場合、幹細胞または前駆細胞を特定の特化された細胞型に関係付けるように誘導する分子を意味する。
【００９６】
「細胞外マトリックス」または「マトリックス」とは、細胞成長を支持するために、支持細胞によって合成された細胞外マトリックスによって提供されるのと実質的に同じ条件を提供する１種または複数の物質を意味する。マトリックスは、基板上に提供することができる。代わりに、マトリックスを含む成分を、溶液中で提供してもよい。細胞外マトリックスの成分には、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンを包含することができる。
【００９７】
「再生能」という用語は、本明細書で使用する場合、幹細胞の、分裂前駆細胞および分化した組織特異的細胞への変換を意味する。
【００９８】
「自己複製」という用語は、本明細書で使用する場合、系列の特異化なしの増殖を意味する。
【００９９】
「整列した(aligned)」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも５０％の繊維が全体的な方向に配向されており、それらの配向が整列の平均軸を形成する、繊維状ポリマー足場中の繊維の配向を意味する。任意の所与の繊維の配向は、整列の平均軸からずれることが可能であり、その偏差は整列軸と繊維の配向との間に形成される角度として表すことができる。０°の偏差角は完全な整列を示し、９０°（または−９０°）は、整列の平均軸に対する繊維の直交整列を示す。例示的な実施形態では、整列の平均軸からの繊維の標準偏差は、０°〜１°、０°〜３°、０°〜５°、０°〜１０°、０°〜１５°、０°〜２０°、または０°〜３０°から選択される角度でよい。
【０１００】
「ロッド」という用語は、本明細書で使用する場合、本質的に充填された円筒の形状の繊維状ポリマー足場を意味する。ロッドを構成する個々の繊維の間に空間およびチャネルが存在することが可能である。
【０１０１】
「導管(conduit)」という用語は、本明細書で使用する場合、形状が本質的に円筒形の物体を意味する。導管は、内壁および外壁、内部直径、外部直径、ならびに導管の内径およびその長さによって画定される内部空間を有する。導管を構成する個々の繊維の間に空間およびチャネルが存在することが可能である。
【０１０２】
「充填導管」という用語は、本明細書で使用する場合、内部空間の部分が充填材料から構成される導管を意味する。この充填材料は、繊維状ポリマー足場でもよい。充填導管を構成する個々の繊維の間に空間およびチャネルが存在することが可能である。
【０１０３】
「シーム」または「シームのある」という用語は、本明細書で使用する場合、２つの部分を一緒に取り付け、接合、または包むことによって形成される接合部を意味する。これらの２つの部分は、縫合などの機械的手段によって、またはアニーリングまたは接着剤などの化学的手段によって、一緒に保持することができる。例えば、シームは、シートの１つの領域を他の領域と接合することによって形成される。
【０１０４】
「シームレス」という用語は、本明細書で使用する場合、シームが存在しないことを意味する。
【０１０５】
「細胞」という用語は、単一（「細胞」）または複数（「細胞」）の状況を意味する場合がある。
【０１０６】
「細胞外マトリックス成分」という用語は、本明細書で使用する場合、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンから選択されるメンバーである。
【０１０７】
「ステント」という用語は、本明細書で使用する場合、とりわけ金属および有機ポリマーで作製することができる管である。ステントが有機ポリマーで作製されている場合、ポリマーは、本明細書に記載するようにナノ繊維状またはマイクロ繊維状のポリマー足場ではない。すなわち、ステントが繊維状ポリマー足場で作製されている場合、繊維の平均直径は、１００ミクロン〜約５０センチメートルであろう。任意選択で、ステント全体を第１の直径から第２の直径に拡張することができ、第２の直径は第１の直径より大きい。
【０１０８】
「ヒルジン」という用語は、本明細書で使用する場合、６５個のアミノ酸の野生型ペプチドまたはその類似体を意味する。６５個のアミノ酸の野生型ペプチドは、Ｆｏｌｋｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８（６）：２６０１〜２６１７（１９８９）に記載されている配列を有する。ヒルジンの類似体には、１つまたは複数の突然変異、より少ないアミノ酸、より多いアミノ酸、１つまたは複数のアミノ酸残基への化学修飾、およびそれらの組合せを有するペプチドが包含される。ヒルジンの例には、野生型ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、非硫酸化Ｔｙｒ−６３ヒルジン、Ｎ末端修飾（すなわち、アセチル化）したヒルジン、Ｃ末端修飾（すなわち、アセチル化）したヒルジン、Ｎ末端ドメインを欠失したヒルジンフラグメント（おおよそ残基１〜５３）、Ｃ末端ドメインを欠失したヒルジンフラグメント（おおよそ残基５４〜６５）、［Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−６３］−ヒルジンフラグメント５４〜６５、［Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−６３］−ヒルジンフラグメント５５〜６５、アセチル［Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−６３］−ヒルジンフラグメント５４〜６５、アセチル［Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−６３］−ヒルジンフラグメント５５〜６５が包含される。本発明に使用するためのヒルジンは、種々の源から生成することができる。任意選択で、ヒルジンはヒルから単離される。他では、ヒルジンは、細菌、酵母または菌類から組換えによって生成される。また他では、ヒルジンは化学合成される。組換えおよび化学合成は、同種の生成物を生成する傾向がある一方、ヒルから単離されたヒルジンには、複数のヒルジン類似体を包含することができる。ヒルジンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの会社から市販されている。
【０１０９】
記号
【０１１０】
【化１９】
2009540878.tif 000020
は、結合として利用されようと、または結合と垂直に示されようと、示された部分が、分子、例えばポリマーの残りに結合している点を示す。
【０１１１】
ＩＩ  組成物
これらの組成物は、ポリマー足場を含むことができる。これらのポリマー足場は、マイクロ繊維ポリマー足場またはナノ繊維ポリマー足場などの繊維状ポリマー足場でよい。これらのポリマー足場は、また微細パターン化したポリマー足場でもよい。本発明の組成物および／またはポリマー足場は任意選択で整列していなくてもよく、または長手方向もしくは円周方向などに整列することができる。本発明の組成物および／またはポリマー足場は、シート、十字形交差シート、導管、ロッドまたは充填導管などの形状に任意選択で形成することができる。本発明の組成物および／またはポリマー足場は、シームを有していてもよく、またはシームレスでもよい。本発明の組成物またはポリマーはまた、細胞、生体分子、または薬学的に許容できる賦形剤などの材料を任意選択で包含することもできる。これらの整列、形状およびさらなる成分は、生物学的機能の改善または再生または置換に役立つことができる。本発明の組成物には、ステントが包含されない。この組成物は、生物学的機能を改善、再生または置換するために再生医学において使用することができる。
【０１１２】
ＩＩ  ａ）繊維状ポリマー足場
第１の態様では、本発明は、繊維状ポリマー足場を含む組成物を提供する。繊維状ポリマー足場は、ある範囲の直径を有することができる１つまたは複数の繊維を包含する。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約０．１ナノメートル〜約５００００ナノメートルである。他の例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約２５ナノメートル〜約２５，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約５０ナノメートル〜約２０，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約１００ナノメートル〜約５，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約１，０００ナノメートル〜約２０，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約１０ナノメートル〜約１，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約２，０００ナノメートル〜約１０，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約０．５ナノメートル〜約１００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約０．５ナノメートル〜約５０ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約１ナノメートル〜約３５ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約２ナノメートル〜約２５ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約９０ナノメートル〜約１，０００ナノメートルである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の平均直径は、約５００ナノメートル〜約１，０００ナノメートルである。
【０１１３】
例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場は、ナノ繊維ポリマー足場およびマイクロ繊維ポリマー足場から選択されるメンバーである。マイクロ繊維ポリマー足場は、ミクロンスケールの特徴（繊維の平均直径は、約１，０００ナノメートル〜約５０，０００ナノメートル、特に約１，０００ナノメートル〜約２０，０００ナノメートルである）を有する一方、ナノ繊維ポリマー足場は、サブミクロンスケールの特徴（繊維の平均直径は、約１０ナノメートルおよび約１，０００ナノメートル、特に約５０ナノメートル〜約１，０００ナノメートルである）を有する。これらのポリマー足場の各々は、治療の領域で、天然コラーゲン微小繊維または他の細胞外マトリックスなどの身体構造に類似することが可能である。
【０１１４】
合成源および／または自然源からの種々のポリマーを、これらの繊維状ポリマー足場を構成するために使用することができる。繊維は、１種のモノマーまたはサブユニットから作製することができる。例えば、乳酸またはポリ乳酸またはグリコール酸またはポリグリコール酸を利用して、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）もしくはポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）ナノ繊維、またはポリ（グリコリド）（ＰＧＡ）ナノ繊維を形成することができる。繊維もまた、複数のモノマーまたはサブユニットから作製され、したがってコポリマー、ターポリマーなどを形成することができる。例えば、乳酸またはポリ乳酸は、グリコール酸またはポリグリコール酸と結合し、コポリマーのポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を形成する。本発明において使用される他のコポリマーには、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニル）アルコール）が包含される。例示的な実施形態では、繊維は、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、アルギン酸、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ポリペプチドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーであるポリマーまたはサブユニットを含む。他の例示的な実施形態では、繊維は、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、アルギン酸、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ポリペプチドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである、２種の異なるポリマーまたはサブユニットを含む。他の例示的な実施形態では、繊維は、脂肪族ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリリシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、アルギン酸、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ポリペプチドおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである、３種の異なるポリマーまたはサブユニットを含む。例示的な実施形態では、脂肪族ポリエステルは直鎖状または分枝状である。他の例示的な実施形態では、直鎖状脂肪族ポリエステルは、乳酸（Ｄ−またはＬ−）、ラクチド、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド）グリコール酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、グリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトンおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、脂肪族ポリエステルは、分枝状であり、リンカーまたは生体分子に共役している乳酸（Ｄ−またはＬ−）、ラクチド、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド）グリコール酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、グリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトンおよびそれらの組合せから選択される少なくとも１つのメンバーを含む。例示的な実施形態では、前記ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコールおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、繊維状ポリマー足場は、単一の連続した繊維で構成される。他の実施形態では、繊維状ポリマー足場は、少なくとも２種、３種、４種、または５種の繊維で構成される。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の数は、２〜１００，０００から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の数は、２〜５０，０００から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の数は、５０，０００〜１００，０００から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の数は、１０〜２０，０００から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場中の繊維の数は、１５〜１，０００から選択されるメンバーである。
【０１１６】
繊維状ポリマー足場は、少なくとも１つの組成物の繊維を含むことができる。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場は、いくつかの異なるタイプの繊維を含み、この数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択されるメンバーである。
【０１１７】
他の例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場の１つまたは複数の繊維は、生分解性である。他の例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場の繊維は、生分解性ポリマーを含む。他の例示的な実施形態では、生分解性ポリマーは、乳酸およびグリコール酸から選択されるメンバーであるモノマーを含む。他の例示的な実施形態では、生分解性ポリマーは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）またはそれらのコポリマーである。好ましい生分解性ポリマーは、ポリ（乳酸）およびポリ（グリコール酸）などの、臨床用途のためにＦＤＡにより承認されたものである。他の例示的な実施形態では、本発明の生分解性ポリマー足場は、設計された組織の形態形成を導き、組織のアセンブリーの後に徐々に分解されるために使用することができる。ポリマーの分解速度は、組織生成速度に適合するように当業者によって調整されることができる。例えば、急速に生物分解されるポリマーが所望である場合、約５０：５０のＰＬＧＡの組合せを選択することができる。ポリマー足場の生分解性を高めるさらなる方法は、より親水性のコポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を選択すること、ポリマーの分子量を減少させること（より高い分子量はより遅い分解速度を意味することが多いため）、および孔隙率(porosity)または繊維密度を変化させること（より高い孔隙率およびより低い繊維密度はより多い水分吸収およびより速い分解をもたらすことが多いため）を伴う場合がある。他の例示的な実施形態では、組織は、筋組織、脈管組織、神経組織、脊髄組織および皮膚組織から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、生分解性の繊維状足場は、設計された筋肉組織の形態形成を導き、筋芽細胞、筋管および骨格筋組織のアセンブリーの後で徐々に分解するために使用することができる。
【０１１８】
繊維状ポリマー足場の作製方法
本発明のポリマー足場は、種々の方法で生成することができる。例示的な実施形態では、ポリマー足場は、エレクトロスピニングによって生成することができる。エレクトロスピニングとは、静電場と導電性流体との間の相互作用を利用する、導電性流体の噴霧工程である。導電性流体（例えば、半希釈ポリマー溶液または溶融ポリマー）に外部静電場を印加した場合、懸濁した円錐状の小滴が形成され、それによって小滴の表面張力は電界と平衡状態となる。静電場が液体の表面張力に打ち勝つほど強い場合は静電噴霧が起こる。次いで小液滴は不安定となり、極小のジェットが小滴の表面から放出される。接地した標的に到達すると、材料は、比較的微細すなわち小径の繊維を含有する相互連結されたウェブとして収集されることができる。これらの小径繊維からこのように得られたフィルム（または膜）は、非常に高い表面積対容積比および小さな孔径を有する。エレクトロスピニング装置の詳細な説明は、Ｚｏｎｇら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、４３（１６）：４４０３〜４４１２（２００２）；Ｒｏｓｅｎら、Ａｎｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ．、２５：３７５〜８７（１９９０）；Ｋｉｍ，Ｋ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００３、２４、（２７）、４９７７〜８５；Ｚｏｎｇ，Ｘ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００５、２６、（２６）、５３３０〜８において提供されている。ポリマーをさらに仕上げるために、エレクトロスピニング後に、押出および成形を用いることができる。繊維組織を整列した繊維状ポリマー足場へと調整するための、パターン化した電極、ワイヤードラムコレクター、または一軸延伸などの後処理方法の使用は成功してきた。Ｚｏｎｇ，Ｘ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００５、２６、（２６）、５３３０〜８；Ｋａｔｔａ，Ｐ．、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ、２００４、４、（１１）、２２１５〜２２１８；Ｌｉ，Ｄ．、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ、２００５、５、（５）、９１３〜６。
【０１１９】
ポリマー溶液は、いくつかの方法の１つで生成することができる。１つの方法は、モノマーを重合し、その結果生じたポリマーを適切な溶媒に溶解することを伴う。この工程は、シリンジアセンブリー中で行うことができ、またはその後にシリンジアセンブリーに充填することができる。他の方法は、市販のポリマー溶液または市販のポリマーを購入し、それらを溶解してポリマー溶液を生じさせることを伴う。例えば、ＰＬＬＡは、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）から購入することができ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）は、Ｅｔｈｉｃｏｎ（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）から購入することができる。他の製造者には、Ｌａｃｔｅｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ）が包含される。細胞および生体分子などの、本発明のさらなるポリマー足場成分はまた、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）などの供給業者から市販されている。
【０１２０】
ポリマー足場を形成するために使用されるポリマーを、最初に溶媒に溶解させる。溶媒は、ポリマーモノマーおよび／またはサブユニット溶解することができ、伝導しエレクトロスピニングされることができるポリマー溶液を提供することができる任意の溶媒でよい。典型的な溶媒には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、塩化メチレン、ジオキサン、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、クロロホルム、水およびそれらの組合せから選択される溶媒が包含される。
【０１２１】
ポリマー溶液は、エレクトロスピニング工程を促進するための過剰な荷電効果を生じさせる塩を任意選択で含有することができる。適切な塩の例には、ＮａＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＩＯ３、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３、ＣａＣｌ２またはこれらの塩の混合物が包含される。
【０１２２】
導電性流体を形成するポリマー溶液は、約１〜約８０重量％、さらに好ましくは約８〜約６０重量％の範囲のポリマー濃度を有することが好ましいであろう。導電性流体は、約５０〜約２０００ｍＰａ Ｘ s、さらに好ましくは約２００〜約７００ｍＰａ Ｘ sの範囲の粘度を有することが好ましいであろう。
【０１２３】
エレクトロスピニング工程において生じた電界は、約５〜約１００キロボルト（ｋＶ）、さらに好ましくは約１０〜約５０ｋＶの範囲であることが好ましいであろう。スピナレット（または電極）への導電性流体の供給速度は、約０．１〜約１０００マイクロリットル／分、さらに好ましくは約１〜約２５０マイクロリットル／分の範囲であることが好ましいであろう。
【０１２４】
単一または多数のスピナレットは、プラットフォームと接地したコレクター基板との間の距離を変化させて調節することができるプラットフォーム上に乗っている。距離は、ポリマーが接地したコレクター基板に接触する前に溶媒が本質的に完全に蒸発できるような任意の距離でよい。例示的な実施形態では、この距離は、１ｃｍ〜２５ｃｍで変動することができる。接地したコレクター基板とプラットフォームとの間の距離を増加させることは、一般により細い繊維を生じさせる。
【０１２５】
回転マンドレルが必要とされるエレクトロスピニングの場合、マンドレルは、多くの場合ドリルチャックを介してモーターに機械的に装着される。例示的な実施形態では、モーターは、約１毎分回転数（ｒｐｍ）〜約５００ｒｐｍのスピードでマンドレルを回転させる。例示的な実施形態では、約２００ｒｐｍ〜約５００ｒｐｍのモーター回転速度である。他の例示的な実施形態では、約１ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍのモーター回転速度である。
【０１２６】
エレクトロスピニング工程および装置のさらなる実施形態または修正形態を、本明細書に記載する。
【０１２７】
導電性流体の電気的／機械的性質の変動
エレクトロスピニングによって生成されるこのように得られた膜の特性は、導電性流体の電気的および機械的性質によって影響を受けるであろう。ポリマー溶液の導電性は、イオン性無機／有機化合物を加えることによって大幅に変化させることができる。ポリマー溶液の電磁流体特性は、物理的および機械的性質（例えば、流体の表面張力、粘性および粘弾性挙動）、ならびに電気的性質（例えば、流体の電荷密度および分極率）の組合せに依存する場合がある。例えば、界面活性剤をポリマー溶液に加えることによって、流体の表面張力を減少させることができ、その結果静電場がより広範囲の条件に亘ってジェット形状およびジェット流に影響を与えることができる。定圧または一定流速で流量を制御できるシリンジポンプを連結することによって、導電性流体の粘度の影響を軽減することができる。
【０１２８】
電極の設計
本発明による膜を生成するための他の実施形態では、エレクトロスピニングの間のジェット形成工程は、繊維サイズをより制御するためにさらに改良される。上記のように荷電しているスピナレットおよび接地板を単に提供する代わりに、正に帯電しているスピナレットは、ポリマー溶液小滴の形成にさらに関与し、中心に小さい排出孔を有するプレート電極はジェット気流の形成に関与する。この排出孔は、ジェット気流がプレート電極を通過させる手段を提供するであろう。したがって、正に帯電しているスピナレット上のポリマー小滴が２〜３ｍｍの典型的な大きさを有し、プレート電極がスピナレットから約１０ｍｍの距離に配置されている場合、適度な静電電位を生じさせることができる。２つの電極間の短い距離は、静電電位がかなり低い可能性があることを意味する。しかし、その結果得られる電界強度は、エレクトロスピニング工程のために十分に強い場合がある。スピナレットの電位を変化させることによって、ジェット形成を制御し調節することができる。このような電極配置は、スピナレット上に必要とされる印加電位を代表値で約１５キロボルト（ｋＶ）から代表値で約１．５〜２ｋＶに大幅に減少させるはずである（接地板の電位に関連して）。安定したジェット形成に必要とされる正確なスピナレットの電位は、特定の導電性流体の電気的／機械的性質に依存するであろう。
【０１２９】
ジェット加速および移送の制御
本発明のポリマー足場を生成するための他の好ましい実施形態では、ジェット気流の飛行(flight)もまた正確に制御される。プレート電極の排出孔を通過するジェット気流は正に帯電している。この気流は、飛行の間にまっすぐになる傾向があるが、外部電界の閉じ込めなしでは、ジェットはその軌道中に不安定となるであろう。すなわち、帯電気流の焦点がぼけ、流体の微視的性質および巨視的性質の制御不能をもたらす。この不安定性は、プレート電極および一連の（均等）間隔のプレート電極の直後に、注意深く設計されたプローブ電極を使用することによって取り除くことができる。電極アセンブリー（または複合電極）、すなわちプローブ電極およびプレート電極は、（直線状の）飛行経路に沿った静電電位の均一な分布を生じさせることができる。加速度電位は、スピナレットのベース電位を（グラウンド電位で）標的より約＋２０〜＋３０ｋＶ高くすることによって形成されるが、一方プローブ電極の静電電位は、プレート電極のベース電位をやや下回って調節することができる。複合電極は、ジェット気流を所望の標的領域に供給することができる。複合電極もまた、ジェット気流を操作するために用いることができる。静電電位を変化させることによって、ジェット気流加速を変化させ、形成されるポリマー繊維の直径の変化がもたらされる。この静電電位の変動はジェット気流の安定性を変化させ、したがって、複合電極の対応する変化を使用して新しいジェット気流を安定化することができる。このような手順は、エレクトロスピニング工程の間に微調整し、繊維の直径を変化させるために使用することができる。
【０１３０】
ジェットの操作
また別の実施形態では、ジェット気流は、高エネルギー物理学の加速器技術において広範に使用されている「交番勾配」（ＡＧ）技術を使用することによって集束させることができる。基本的な考え方は、２対の静電四重極レンズを使用することである。第２のレンズは、逆（交番）電場勾配(reversed (alternate) electric gradient)を伴い第１のレンズと同じ幾何学的配置を有する。正に帯電しているジェット気流は、例えば第１のレンズの後でｘｚ面に集束し、次いで第２のレンズの後でｙｚ面に再集束するであろう。ｚ方向は当初の飛行経路の方向を表すことに留意されたい。四重極の対の１つの電位にさらなる三角形状の波形を印加することによって、ジェットは標的領域に亘って掃引されることができ、ジェット気流の方向の制御が可能となる。さらに「掃引(sweep)」電位の変動する波形によって、標的上に所望のパターンを形成することができる。
【０１３１】
独特のマンドレルを有するエレクトロスピニング装置
エレクトロスピニングされたポリマー繊維を、静止または回転している基板上に付着することができる。従来（過去には）、静止した金属コレクターが、エレクトロスピニングされた繊維のランダムな付着のために使用されてきた。回転している金属マンドレルが、エレクトロスピニングの間に使用されてきた。回転している金属マンドレルは、マンドレルの表面上のランダムな繊維の付着をもたらし、マンドレルを取り除くと導管を生成することができる。円周方向の繊維の整列を有する導管もまた、この方法を修正し、マンドレルを高速（＞１００ｒｐｍ）で回転させることによって生成することができる。大きな直径および／または長さを有する回転ドラムをコレクター基板として使用する場合、整列していないおよび整列した繊維状ポリマー足場のシートは、付着した繊維状ポリマー足場を切断しドラムから取り除くことによって生成することができる。静止した金属コレクター内にエアギャップ（穴）を生成することによって、ギャップに亘って付着されたエレクトロスピニングされた繊維の整列を誘導することが従前示されてきた（Ｌｉ，Ｄ．、Ｗａｎｇ  Ｙ．Ｌ．、Ｘｉａ，Ｙ．Ｎ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  ａｓ  Ｕｎｉａｘｉａｌｌｙ  Ａｌｉｇｎｅｄ  Ａｒｒａｙｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００３、３（８）：１１６７〜７１頁）。しかし、Ｌｉにおいて、または他のどこでも、整列した三次元の導管もしくはロッドを加工すること、または長手方向に整列した繊維から構成される導管もしくはロッドを直接エレクトロスピニングすることについての記載はない。
【０１３２】
他の態様では、本発明には、回転マンドレル上で整列した繊維状ポリマー足場をエレクトロスピニングする方法が包含される。これらの繊維状ポリマー足場は、使用者が望む任意の配向で整列させることができる。例示的な実施形態では、足場は、本質的に長手方向または本質的に円周方向に整列している。この方法によって生成された繊維状ポリマー足場は、シームを有することができるか、またはシームレスであることも可能である。例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場はシームレスである。他の例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場は、ポリマー足場の長手方向軸に対して本質的に平行な軸に沿ってシームレスである。
【０１３３】
他の態様では、本発明には、シームレスな導管、シームレスな充填導管およびシームレスなロッドのエレクトロスピニングを可能とする独特のマンドレルが包含される。他の例示的な実施形態では、シームレスな導管、シームレスな充填導管およびシームレスなロッドは、整列していない繊維配向を有する。他の例示的な実施形態では、シームレスな導管、シームレスな充填導管およびシームレスなロッドの繊維は整列している。他の例示的な実施形態では、シームレスな導管、シームレスな充填導管およびシームレスなロッドは、本質的に長手方向に整列した繊維を有する。
【０１３４】
他の態様では、本発明には、一体型として形成されている導管、充填導管およびロッドのエレクトロスピニングを可能とする独特のマンドレルが包含される。他の例示的な実施形態では、一体型として形成されている導管、充填導管およびロッドは、整列していない繊維配向を有する。他の例示的な実施形態では、一体型として形成されている導管、充填導管およびロッドの繊維は整列している。他の例示的な実施形態では、一体型として形成されている導管、充填導管およびロッドは、本質的に長手方向に整列した繊維を有する。
【０１３５】
例示的な実施形態では、マンドレルは、その長手方向軸を中心にマンドレルを回転させることができるモーターアセンブリーに装着される。エレクトロスピニング装置において、回転マンドレルを接地し、スピナレットの下に配置する。ポリマー溶液をスピナレットの先端部に供給し、電源によって荷電させる。スピナレットとマンドレルとの間に生じた電界は、スピナレットの先端部における荷電しているポリマー溶液のジェット形成を誘導する。ジェットは、マンドレルに向けて噴霧される。ポリマーは、マンドレルの１つの導電性領域に接触し、次いでマンドレルの第２の導電性領域に接触し、マンドレルの非導電性領域またはエアギャップに亘って繊維を付着させる。これによって、非導電性領域上またはエアギャップ中に付着した整列した繊維の形成がもたらされる。マンドレルを回転させることによって、結果は整列した繊維が均一に施された層となる。付着した線維層は、マンドレルまたはマンドレルの間のエアギャップの形状に従い、したがって場合によってはシート、場合によっては導管、または他の場合ではロッドを形成する。シート、導管またはロッドを構成する繊維は、導管またはロッドの長さに沿って整列し、したがって長手方向に整列した繊維を有するシート、導管またはロッドを形成するであろう。例示的な実施形態では、導管またはロッドはシームレスであろう。例示的な実施形態では、導管またはロッドは、導管またはロッドの長軸に対して本質的に平行な軸に沿ってシームレスであろう。
【０１３６】
一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの導電性領域および少なくとも１つの非導電性領域を有するマンドレルを提供する。このようなマンドレルは、多くの方法で設計することができる。マンドレルの例示的な描写を図３Ｂに提供し、本発明のシートおよび／または導管を生成するための装置の一部としてのマンドレルの例示的な描写を、図１、図２、図２Ａ、および図２Ｂに記載する。例示的な実施形態では、電気導電性材料は金属である。他の例示的な実施形態では、金属は、鋼およびアルミニウムから選択されるメンバーである。ある場合においては、導電性マンドレルの領域は、非電気導電性材料で覆われてもよい。このマンドレルの例示的な断面図を、図３Ｄに提供する。例示的な実施形態では、非電気導電性材料は、テープ、絶縁テープ、Ｔｅｆｌｏｎおよびプラスチックから選択されるメンバーである。他の例では、少なくとも３つの部分、すなわち２つの導電性マンドレル領域を相互連結する非電気伝導領域を有するマンドレルを生成することができる。他の例では、非電気伝導領域は、２つの導電性マンドレル領域の間に延在する別個の部分である。このマンドレルの例示的な断面図を図３Ｃに提供する。非導電性領域をマンドレルの導電性領域上に配置することによって、またはマンドレルの２つの導電性領域の間の非導電性領域を相互連結することによって、さらなる非導電性領域をマンドレルに加えることができる。これらのさらなる非導電性領域は、さらなるスピナレットと関連して使用される場合、同じマンドレル上で同時に複数の導管を生成することを促進することができる。一実施形態では、本発明は、少なくとも３つの導電性領域および少なくとも２つの非導電性領域を有するマンドレルを提供する。一実施形態では、本発明は、少なくとも４つの導電性領域および少なくとも３つの非導電性領域を有するマンドレルを提供する。一実施形態では、本発明は、少なくとも５つの導電性領域および少なくとも４つの非導電性領域を有するマンドレルを提供する。
【０１３７】
一実施形態では、本発明は、第１の導電性領域、第２の導電性領域、および第１の導電性領域と第２の導電性領域との間のエアギャップを有するマンドレルを提供する。このようなマンドレルは、多くの方法で設計することができる。マンドレルの例示的な描写を、図３Ｅに提供し、本発明のロッドを生成するための装置の部分としてのマンドレルの例示的な描写を、図６、図７、および図７Ａに記載する。多数のスピナレットを有する実施形態を、図１１に記載する。例示的な実施形態では、電気導電性材料は金属である。他の例示的な実施形態では、金属は、鋼およびアルミニウムから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、マンドレルの各導電性領域は、他と整列している。例示的な実施形態では、マンドレルの各導電性領域は、同じ速度で回転することができるアセンブリーに装着される。これは、モーターアセンブリーをマンドレルの各導電性領域に装着し、各モーターが同じ速度で作動することを確実にすることによって達成することができる。これはまた、マンドレルの各導電性領域を同じモーターに連結することを確実にすることによって達成することができる。
【０１３８】
エレクトロスピニングが完了した後、本発明のポリマー足場を、マンドレルから取り出す。シート状ポリマー足場では、シートをマンドレルから剥がすことができる。導管のポリマー足場では、マンドレルをモーターアセンブリーから取り出すことができ、次いで導管を取り出すことができる。いくつかの実施形態では、取り出しはまた、マンドレルを中央で連結を断つことによって、または導管を切断することによっても達成することができる。ロッドのポリマー足場では、ロッドは、導電性領域の金属端部から剥がすことができる。任意選択で、付着した繊維の長さは等しくなく、ポリマー足場の１つまたは複数の端部でギザギザの縁をもたらすであろう。任意選択で、ポリマー足場の端部は、本質的に同じサイズの長さを有するポリマー足場を生成するために切断することができる。ポリマー足場がマンドレル上にあるとき、またはマンドレルから取り出された後に、この切断をすることができる。
【０１３９】
本明細書に記載するポリマー足場の特徴は、様々なパラメーターを変更することによって変化させることができる。例えば、単独または組み合わせて、繊維状ポリマー足場において繊維の平均直径を減少させることができるいくつかの方法がある。１つの方法は、ポリマー溶液に、より多くの塩を加えることである。スピナレットとマンドレルとの間の距離を増加させるのと同様に、ポリマー溶液中に、より極性の高い溶媒を使用することによってもまた、繊維の平均直径を減少させる傾向がある。足場の直径を減少させるさらなる方法には、装置電圧を増加させること、およびポリマー濃度を増加させることが包含される。
【０１４０】
多層のポリマー足場は、いくつかのマンドレル回転を完了することによって本明細書に記載の方法によって形成することができる。例えば、いくつかのマンドレル回転を完了することによって多層の導管を形成することができる。複数のタイプの層を有するさらなるポリマー足場もまた、生成することができる。例示的な実施形態では、繊維の円周方向の整列はまた、マンドレルが回転する速度を変化させることによって調節または変更することができる。したがって、内側の長手方向に整列した層および外側の円周方向に整列した層を有するポリマー足場を生成することができる。各層が特定の整列を有する多層の中空の導管足場を加工するために、様々なマンドレルおよび回転速度を使用することができる。例示的な実施形態では、中空の導管形状の繊維状足場が、長手方向に整列した繊維から構成される内腔層、および円周方向に整列した繊維を有する外側の層と共に生成される。このような足場を生成する１つの方法は、前記の非導電性領域を有するマンドレルを使用することを伴う。マンドレルを低速で回転させることによって、長手方向に整列した繊維から構成される導管の形状の繊維状足場の形成を可能にする。次いでマンドレルの回転速度を増加させ、それによってエレクトロスピニングされた繊維を長手方向に整列した繊維状導管の周りの円周方向に整列させる。他の例示的な実施形態では、内層は長手方向に整列しており、一方外層はランダムに整列した繊維から構成される。これは、外層を形成する場合、マンドレルを、繊維の長手方向および円周方向の整列の両方を妨げる中速で回転させることを除いて、前記と同じ設定を使用して達成することができる。
【０１４１】
ＩＩ  ｂ）微細パターン化したポリマー足場
第２の態様では、本発明は、微細パターン化したポリマー足場を含む組成物を提供する。微細パターニングでは、ソフトリソグラフィーは、ポリマーの空間的および幾何学的構成を組織分布的または化学的に変化させ、基板表面上にミクロンスケールの特徴を生成するために使用される。Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｍ．、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００５、２、（８）、５９９〜６０５；Ｄｏｗ，Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  Ｓｕｐｐｌ、１９８７、８、５５〜７９；Ｋａｎｅ，Ｒ．Ｓ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９９、２０、（２３〜２４）、２３６３〜７６。この技術によって生成されたポリマー足場を、細胞の大きさ、形状、空間的構成、増殖および生存を包含する細胞挙動の多くの側面を制御するために使用することができる。Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、２７６、（５３１７）、１４２８〜８；Ｂｈａｔｉａ，Ｓ．Ｎ．、Ｆａｓｅｂ  Ｊ、１９９９、１３、（１４）、１８８３〜９００；Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｊ．、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、２０００、５３、（３）、２６７〜７６；Ｆｏｌｃｈ，Ａ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ、２０００、２、２２７〜５６；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ、２００１、３、３３５〜７３。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）は、高い再現性を伴う微細パターン化をすることができ、細胞接着のための柔軟な基板を提供するエラストマーである。Ｗａｎｇ，Ｎ．、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、２００２、５２、（２）、９７〜１０６。
【０１４２】
ＩＩ  ｃ）ポリマー足場の整列
本発明のポリマー足場は、整列した配向またはランダム配向を有することができる。整列した配向では、ポリマー足場を構成する繊維の少なくとも５０％は、整列の平均軸に沿って配向されている。
【０１４３】
例示的な実施形態では、組成物は、本質的に長手方向、本質的に円周方向、および「十字形交差」から選択されるメンバーである整列を有する。繊維が、導管、充填導管またはロッドの形状のポリマー足場の長軸の方向に整列している場合、長手方向の整列が存在する。繊維が、ポリマー足場の短軸に沿って整列している場合、円周方向の整列が存在する。第１のポリマー足場の平均の整列軸が、第１のポリマー足場に隣接した第２のポリマー足場の平均の整列軸に対してある角度をなしているような態様で、組成物中の１つのポリマー足場の繊維が整列している場合は、十字形交差の整列が存在する。長手方向に整列または円周方向に整列したポリマー足場は、繊維の複数の層を有することができる。十字形交差の整列したポリマー足場は、繊維の複数の層を必要とする。
【０１４４】
他の例示的な実施形態では、ポリマー繊維は、繊維束の中心軸からの標準偏差を有することができる。例示的な実施形態では、繊維の標準偏差は、約０°〜約１°、約０°〜約３°、約０°〜約５°、約０°〜約１０°、約０°〜約１５°、約０°〜約２０°、および約０°〜約３０°から選択されるメンバーである。
【０１４５】
整列したポリマー足場は、細胞骨格の整列、細胞遊走および細胞機能に計り知れない影響を有する。整列したポリマー足場は、細胞遊走を誘発、誘導し、したがって組織の再生を促進することができる。このような足場は、筋肉、皮膚、脈管組織、神経および脊髄の再生などの種々の組織の再生のための前途有望な解決策である。例えば、長手方向に整列した繊維状ポリマー足場は、損傷ギャップに亘って神経、皮膚、筋肉および／または脈管組織の成長を促進し、特異的に誘導することができる。
【０１４６】
整列したポリマー足場が置かれている方向は、整列したポリマー足場が置換または改善する生物学的機能に影響を及ぼし得る。例えば、整列したポリマー足場が創傷中に置かれているときに、整列したポリマー足場が創傷の長軸に対して平行であるよりはむしろ垂直の場合、創傷治癒がより迅速である。例示的な実施形態では、整列したポリマー足場の束の中心の長軸は、整列したポリマー足場が改善または置換する材料の方向と垂直に置かれている。他の例示的な実施形態では、整列したポリマー足場の束の中心の長軸は、整列したポリマー足場が改善または置換する材料の方向と平行に置かれている。
【０１４７】
他の例示的な実施形態では、（ポリマー足場などの）本発明の整列した組成物は、生分解性ポリマーを含むことができる。これらの組成物は、他のタイプの異方性の構造を有する組織（例えば、神経、皮膚、血管、骨格筋、心筋、腱および靭帯）の形態形成を誘導するために使用することができる。本発明のこれらの整列した生分解性の組成物もまた、三次元の組織の発生において使用することができる。エレクトロスピニングされた生分解性の繊維状ポリマー足場を使用して、神経組織、脊髄組織、皮膚組織、脈管組織および筋組織の三次元の構築体を生成することができる。
【０１４８】
例示的な実施形態では、本明細書に記載する組成物は、複数のポリマー足場を含むことができる。それらのポリマー足場の各々は、組成物中の他のポリマー足場もしくは複数の足場と同一または異なる整列を有することができる。
【０１４９】
例示的な実施形態では、この組成物は２つのポリマー足場を有する。第１のポリマー足場は、導管の形状を有し、長手方向に整列している。第２のポリマー足場は、第１のポリマー足場の外側を取り囲み、ランダム、円周方向、十字形交差、および長手方向から選択されるメンバーである配向を有する。例示的な実施形態では、第２のポリマー足場の配向は、ランダムおよび円周方向から選択されるメンバーである。
【０１５０】
ＩＩ  ｄ）ポリマー足場の形状／ポリマー足場の作製方法
本発明のポリマー足場は、解決するべき問題の性格に応じて種々の形状に形成することができる。
【０１５１】
本発明の組成物および／またはポリマー足場は、種々の大きさを有することができる。例示的な実施形態では、ポリマー足場は、０．１ｍｍ〜５０ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、０．１ｍｍ〜１ｍｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、１ｍｍ〜１ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、１ｃｍ〜１０ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、１０ｃｍ〜５０ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、１ｃｍ〜５ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、２．５ｃｍ〜１５ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、５ｍｍ〜６ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、８ｍｍ〜３ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、１０ｃｍ〜２５ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、０．５ｃｍ〜２ｃｍの長さである。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、０．１ｃｍ〜２ｃｍの長さである。
【０１５２】
本発明の組成物および／またはポリマー足場は、種々の線維層で構成されることができる。例示的な実施形態では、組成物は、約１〜約２，０００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１〜約１，０００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１〜約５００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１〜約２０の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１〜約１０の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約５〜約２５の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約５００〜約１，５００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１０〜約２０の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約３５〜約８０の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１０〜約１００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約５〜約６００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１０〜約８０の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約２〜約１２の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約６０〜約４００の線維層を有する。例示的な実施形態では、組成物は、約１，２００〜約１，７５０の線維層を有する。
【０１５３】
例示的な実施形態では、ポリマー足場は、シートまたは膜の形状を有する。ポリマー足場膜は、エレクトロスピニングによって作製することができる。膜内の個々の繊維は、コレクターとして回転ドラムを使用したエレクトロスピニングの間に、または機械的な一軸延伸によってエレクトロスピニングの後に整列させることができる。
【０１５４】
他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、「十字形交差」シートの形状を有する。十字形交差シートを形成するために、整列したポリマーシートまたは膜の層は、互いに対して、２０度超で１６０度未満、３０度超で１５０度未満、４０度超で１４０度未満、５０度超で１３０度未満、６０度超で１２０度未満、７０度超で１１０度未満、および８０度超で１００度未満から選択されるメンバーである角度で配列することができる。
【０１５５】
「十字形交差」シートを作製する種々の方法がある。例示的な一実施形態では、非導電性領域を含有しない回転金属ドラムコレクターを使用する。繊維の整列した層をドラム上で生成し、次いでそれをドラムから剥がす。整列した層を９０度回転させ、次いでドラム上にもどす。次にドラムが高速で回転している間に、エレクトロスピニングされた繊維のさらなる層を加える。これらのステップを繰り返すことによって、さらなる十字形交差層を加えることができる。他の例示的な実施形態では、非導電性領域を有するドラムを使用する。ここで、繊維が非導電性部分上に長手方向に付着および整列するように、第１の期間ドラムをゆっくりと回転させる。次いで繊維が円周方向に整列させるようにドラムを速くスピンさせる。さらなる十字形交差層を、これらのステップを繰り返すことによって加えることができる。
【０１５６】
導管
他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、導管の形状を有する。導管の例示的な描写を図４Ａに提供し、導管の横断面図の例示的な描写を図５Ａに提供する。導管は、その長さ、ならびにその内径および外径によって種々のサイズを有することができる。例示的な実施形態では、導管の内部空間は、繊維状ポリマー足場が本質的にない。これらのパラメーターは、例えば、様々な組織の大きさおよび用途に適応するように変化させることができる。例示的な実施形態では、導管壁は整列した繊維から構成される。他の例示的な実施形態では、繊維は長手方向に整列または円周方向に整列している。他の例示的な実施形態では、導管はシームを有する。他の例示的な実施形態では、導管のシームは、導管の長手方向軸に対して本質的に平行である。他の例示的な実施形態では、導管はシームレスである。他の例示的な実施形態では、導管は、導管の長手方向軸に平行して本質的にシームレスである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁は長手方向に整列した繊維の層で構成され、一方導管の外壁は整列していない繊維から構成される。他の例示的な実施形態では、導管は、導管の長手方向軸に平行してシームレスであり、および導管の内壁は、長手方向に整列した繊維の層から構成され、一方導管の外壁は整列していない繊維から構成される。この場合定義する導管は、外側の鞘としてランダム配向した繊維があることによってより大きな構造的結合性を示すように設計される。他の例示的な実施形態では、導管の内壁は、整列していないランダム配向した繊維から構成され、一方導管の外壁は長手方向に整列した繊維の層から構成される。他の例示的な実施形態では、この導管は、導管の長手方向軸に平行してシームレスである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁は、長手方向に整列した繊維から構成され、一方導管の外壁は、円周方向に整列した繊維から構成される。他の例示的な実施形態では、この導管は、導管の長手方向軸に対して本質的に平行な軸に沿ってシームレスである。
【０１５７】
例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１ｎｍ〜５０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１ｎｍ〜１０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１ｎｍ〜５００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１ｎｍ〜５０ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１ｎｍ〜５ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１０ｎｍ〜５００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約１００ｎｍ〜１，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約５，０００ｎｍ〜１５，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約２０，０００ｎｍ〜５０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約７５ｎｍ〜６００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内壁と外壁との間の距離は、約２，０００ｎｍ〜７，０００ｎｍである。
【０１５８】
例示的な実施形態では、導管の内径は、約１ｎｍ〜５０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１ｎｍ〜１０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１ｎｍ〜５００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１ｎｍ〜５０ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１ｎｍ〜５ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１０ｎｍ〜５００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約１００ｎｍ〜１，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約５，０００ｎｍ〜１５，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約２０，０００ｎｍ〜５０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約７５ｎｍ〜６００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、導管の内径は、約２，０００ｎｍ〜７，０００ｎｍである。
【０１５９】
本明細書に記載する導管は、多くの方法で得ることができる。例示的な実施形態では、導管は、エレクトロスピニングされていない。他の例示的な実施形態では、導管は、ランダムな無配向の繊維またはランダムな無配向のポリマー足場から構成される。
【０１６０】
例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場シートを巻いて、シームを有する導管が加工される。最初に、繊維状ポリマー足場シートを、エレクトロスピニングする。エレクトロスピニングの間に、シートを構成する繊維を整列させることができる。エレクトロスピニングされた整列した繊維を生成させるいくつかの方法には、接地したコレクター基板としての回転ドラムの使用、または本明細書に記載するマンドレルの使用が包含される。例示的な実施形態では、マンドレルは、マンドレル５６Ａである。シートを構成する繊維をまた、機械的な一軸延伸によるエレクトロスピニング後に整列させることもできる。次いで整列した繊維状ポリマー足場シートを、マンドレルの周りに巻いて導管を形成する。マンドレルは、導管を留める前または後に取り除くことができる。例示的な実施形態では、次いでポリマー足場の長手方向軸に平行なシートの２つの端を、一緒に留めて長手方向に整列したシームのある導管を生成させる。例示的な実施形態では、シートを２回以上マンドレルの周りに巻いて、シートの一端を導管の一部に留めて、長手方向に整列したシームのある導管を生じさせる。留め付けはアニーリング（熱）、接着によってまたは縫合によって行うことができる。接着の例は、フィブリンシーラントおよびコラーゲンゲルなどの溶媒または生物学的接着を伴う。
【０１６１】
ここでいくつかの本発明の実施形態を詳細に言及するが、それらの例を添付図面において例示する。この後の実施形態と関連して本発明を説明するが、本発明はそれらの実施形態に限定されることを意図してしないことは理解されよう。対して、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨および範囲内に包含することができる代替形態、修正形態および均等物をカバーすることを意図している。
【０１６２】
他の例示的な実施形態では、本発明は、シームレスな導管を提供する。図１は、このような構造を生じさせるためのエレクトロスピニング装置３０を意味する。溶媒に溶解したポリマーを含有するポリマー溶液３８は、シリンジアセンブリー３６中に含有されている。シリンジアセンブリー３６は、シリンジポンプアセンブリー３２の一部であり、そこではコンピュータ３４が、圧力または流量を制御することによってポリマー溶液がシリンジを出る速度を制御する。任意選択で、異なる流量を、選択したスピナレットに提供し、制御することができる。流量は、ポリマー足場の所望の物理的特性、すなわち、膜の厚さ、繊維の直径、孔径、膜密度などによって変化するであろう。
【０１６３】
シリンジポンプアセンブリー３２は、ポリマー溶液をプラットフォーム４４上にあるスピナレット４２に供給する。スピナレットは、支障なしにジェット形成および移送を可能にする先端部の形状を有する。約１０〜約３０ｋＶの範囲の電荷を、高圧電源４８によってワイヤー４１Ａを介してスピナレットに加える。
【０１６４】
荷電しているスピナレットとマンドレル５６Ａとの間に電界が生じるように、（図３Ｂにおいて述べたように、５５、５７Ａ、および５７Ｂを包含する）マンドレル５６Ａをスピナレット４２の下に配置する。電界によってポリマー溶液のジェットがスピナレットから放出され、マンドレル５６Ａに噴霧され、ミクロンまたはナノメートル直径のフィラメントまたは繊維４６が形成される。ドリルチャックは、アース線４１Ｂおよび４１Ｃを使用して接地されている。
【０１６５】
マンドレル５６Ａは、モーター５２に連結している（非導電性ベアリング６０に装着された）第１のドリルチャック５４および（非導電性ベアリング６０Ａに装着された）第２のドリルチャック５４Ａに装着される。モーター５２は、モーターがマンドレル５６Ａをスピンさせる速度を制御するスピードコントロール５０に連結している。任意選択で、異なるスピン速度を提供することができる。スピン速度は、ポリマー足場の所望の物理的特性、すなわち、膜の厚さ、繊維の直径、孔径、膜密度などによって変化するであろう。
【０１６６】
他の例示的な実施形態では、本発明は、図２のエレクトロスピニング装置によって生成されるシームレスな導管を提供する。この装置は、図１の装置と同様であるが、プラットフォーム４４を保持するタワー４０もまた含む。
【０１６７】
多層のポリマー足場を有する導管を、種々の方法で生成することができる。例示的な実施形態では、さらなるポリマー足場シートは、本明細書に記載する導管の外側または内側の周りに巻くことができる。例示的な実施形態では、長手方向に整列した繊維状ポリマー足場の導管は、シームレスまたはシームを有して生成される。次いで整列していないマイクロ／ナノ繊維の繊維状ポリマー足場シートを、長手方向に整列した導管の周りに配置し、内側の長手方向に整列した線維層および外側の整列していない線維層を有する２層導管を形成させる。さらなる層（３層、４層、５層、６層など）を有する導管は、これらの方法の可能性のある延長である。縫合または接着剤を、この構造を維持するためにポリマーに任意選択で加えることができる。
【０１６８】
他の例示的な実施形態では、長手方向に整列した繊維状ポリマー足場の導管は、シームレスまたはシームを有して生成される。次いで円周方向に整列した繊維状ポリマー足場シートを、長手方向に整列した導管の周りに配置し、内側の長手方向に整列した線維層および外側の円周方向に整列した線維層を有する２層導管を形成させる。縫合または接着剤を、この構造を維持するためにシームのあるポリマー足場に任意選択で加えることができる。
【０１６９】
他の例示的な実施形態では、シームレスな繊維状ポリマー足場の導管は、長手方向に整列した繊維から構成される内壁および円周方向に整列した繊維から構成される外壁と共に生成される。非導電性領域に隣接する２つの導電性領域を有する本明細書に記載するマンドレルは、エレクトロスピニングの間に使用される。マンドレルを低速で回転させ、長手方向に整列した繊維の均一な付着を可能とする。次いでマンドレルを高速で回転させ、円周方向に整列した繊維の均一な付着を可能とする。結果は、内側の長手方向に整列した線維層および外側の円周方向に整列した線維層を有するシームレスな繊維状ポリマー足場の導管となる。
【０１７０】
他の例示的な実施形態では、シームレスな繊維状ポリマー足場の導管は、長手方向に整列した繊維から構成される内壁および整列していない繊維から構成される外壁と共に生成される。非導電性領域に隣接する２つの導電性領域を有する上記の専用のマンドレルは、エレクトロスピニングの間に使用される。マンドレル低速で回転させ、長手方向に整列した繊維の均一な付着を可能とする。次いでマンドレルを、付着した繊維の長手方向および円周方向両方の整列を妨げる中速で回転させる。結果は、内側の長手方向に整列した線維層および外側のランダムに整列した線維層を有するシームレスな繊維状ポリマー足場の導管となる。
【０１７１】
ロッド
他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、ロッドの形状を有する。ロッドの例示的な描写を図４Ｂに提供し、ロッドの横断面図の例示的な描写を図５Ｂに提供する。ロッドは、その長さ、ならびにその直径によって種々のサイズを有することができる。ロッド中の繊維の数もまた、変化させることができ、これはロッドの密度に影響を与えるであろう。これらのパラメーターは、例えば、様々な組織のサイズおよび用途に適応するように変化させることができる。例示的な実施形態では、ロッドは整列した繊維から構成される。他の例示的な実施形態では、繊維は長手方向に整列または円周方向に整列している。他の例示的な実施形態では、ロッドはシームを有する。他の例示的な実施形態では、ロッドのシームは、ロッドの長手方向軸に対して本質的に平行である。他の例示的な実施形態では、ロッドはシームレスである。他の例示的な実施形態では、ロッドは、導管の長手方向軸に平行して本質的にシームレスである。他の例示的な実施形態では、ロッドは、整列していない繊維から構成される導管によって覆われている長手方向に整列した繊維の層を包含する。他の例示的な実施形態では、ロッドは、その長手方向軸に平行してシームレスであり、整列していない繊維から構成される導管によって覆われているロッドは長手方向に整列した繊維の層を包含する。この場合定義する材料は、外側の鞘としてランダム配向した繊維があることによってより大きな構造的結合性を示すように設計される。他の例示的な実施形態では、ロッドは整列していないランダム配向した繊維から構成され、一方導管は長手方向に整列した繊維の層から構成される。他の例示的な実施形態では、ロッドは、その長手方向軸に平行してシームレスである。他の例示的な実施形態では、ロッドは、円周方向に整列した繊維から構成される導管によって覆われている長手方向に整列した繊維から構成される。他の例示的な実施形態では、このロッドは、その長手方向軸に平行してシームレスである。
【０１７２】
例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１ｎｍ〜５０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１ｎｍ〜１０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１ｎｍ〜５００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１ｎｍ〜５０ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１ｎｍ〜５ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１０ｎｍ〜５００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約１００ｎｍ〜１，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約５，０００ｎｍ〜１５，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約２０，０００ｎｍ〜５０，０００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約７５ｎｍ〜６００ｎｍである。他の例示的な実施形態では、ロッドの直径は、約２，０００ｎｍ〜７，０００ｎｍである。
【０１７３】
本明細書に記載するロッドは、多くの方法で生成することができる。例示的な実施形態では、ロッドは、エレクトロスピニングされていない。他の例示的な実施形態では、ロッドは、ランダムな無配向の繊維またはランダムな無配向のポリマー足場で構成される。
【０１７４】
例示的な実施形態では、繊維状ポリマー足場シートを巻いてシームを有するロッドを加工する。最初に、繊維状ポリマー足場シートを、エレクトロスピニングする。シートを構成する繊維を、エレクトロスピニングの間に整列させることができる。エレクトロスピニングされた整列した繊維を生成するいくつかの方法には、接地したコレクター基板として回転ドラムの使用、または本明細書に記載するマンドレルを使用が包含される。例示的な実施形態では、マンドレルはマンドレル５６Ｂである。シートを構成する繊維をまた、エレクトロスピニング後に機械的な一軸延伸によって整列させることができる。次いで、整列した繊維状ポリマー足場シートを、それ自体の上に巻いてロッドを形成させる。次いで、ポリマー足場シートの端部を、ロッドの一部に留めて、長手方向に整列したシームのあるロッドを生成させる。シートを、アニーリング（熱）、接着または縫合によって一緒に留めることができる。接着の例は、フィブリンシーラントおよびコラーゲンゲルなどの溶媒または生物学的接着を伴う。
【０１７５】
ここでいくつかの本発明の実施形態を詳細に言及するが、それらの例を添付図面において例示する。この後の実施形態と関連して本発明を説明するが、本発明はそれらの実施形態に限定されることを意図してしないことは理解されよう。対して、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨および範囲内に包含することができる代替形態、修正形態および均等物をカバーすることを意図している。
【０１７６】
他の例示的な実施形態では、本発明は、シームレスなロッドを提供する。図６は、このような構造を生じさせるためのエレクトロスピニング装置８０を意味する。溶媒に溶解したポリマーを含有するポリマー溶液３８は、シリンジアセンブリー３６中に含有されている。シリンジアセンブリー３６は、シリンジポンプアセンブリー３２の一部であり、そこではコンピュータ３４が、圧力または流量を制御することによってポリマー溶液のシリンジを出る速度を制御する。任意選択で、異なる流量を、選択したスピナレットに提供し、制御することができる。流量は、ポリマー足場の所望の物理的特性、すなわち、膜の厚さ、繊維の直径、孔径、膜密度などによって変化するであろう。
【０１７７】
シリンジポンプアセンブリー３２は、ポリマー溶液をプラットフォーム４４上にあるスピナレット４２に供給する。スピナレットは、支障なしにジェット形成および移送を可能にする先端部の形状を有する。約１０〜約３０ｋＶの範囲の電荷を、高圧電源４８によってワイヤー４１Ａを介してスピナレットに加える。
【０１７８】
（図３Ｃにおいて述べたように、５７Ａ、５７Ｂおよび５８を包含する）マンドレル５６Ｂを、スピナレット４２の下に配置する。荷電しているスピナレットとマンドレル５６Ｂとの間に電界が生じるように、マンドレル５６Ｂは、第１の電気伝導領域５７Ａおよび第１の電気導電面５７Ｃ、第２の電気伝導領域５７Ｂおよび第２の電気導電面５７Ｄを有する。電界によってポリマー溶液のジェットがスピナレットから放出され、マンドレル５６Ｂに噴霧され、ミクロンまたはナノメートル直径のフィラメントまたは繊維が５８内に形成される。ドリルチャックは、アース線４１Ｂおよび４１Ｃを使用して接地されている。
【０１７９】
第１の電気伝導領域５７Ａは、（非導電性ベアリング６０に装着された）第１のドリルチャック５４に装着され、第２の電気伝導領域５７Ｂは、モーター５２Ａに連結されている（非導電性ベアリング６０Ａに装着された）第２のドリルチャック５４Ａに装着される。モーター５２および５２Ａは、モーターがマンドレル５６Ｂをスピンさせる速度を制御するスピードコントロール５０Ａに連結している。任意選択で、異なるスピン速度を提供することができる。スピン速度は、ポリマー足場の所望の物理的特性、すなわち、膜の厚さ、繊維の直径、孔径、膜密度などによって変化するであろう。
【０１８０】
他の例示的な実施形態では、本発明は、図７のエレクトロスピニング装置によって生成されるシームレスなロッドを提供する。この装置は、図６の装置と同様であるが、プラットフォーム４４を保持するタワー４０もまた含む。
【０１８１】
多層のポリマー足場を有するロッドを、種々の方法で生成することができる。例示的な実施形態では、さらなるポリマー足場シートは、本明細書に記載するロッドの外側の周りに巻くことができる。例示的な実施形態では、長手方向に整列した繊維状ポリマー足場のロッドは、シームレスまたはシームを有して生成される。次いで整列していないマイクロ／ナノ繊維の繊維状ポリマー足場シートを、長手方向に整列したロッドの周りに配置し、内側の長手方向に整列した線維層および外側の整列していない線維層を有する２層ポリマー足場を形成させる。さらなる層（３層、４層、５層、６層など）を有するロッドは、これらの方法の可能性のある延長である。縫合または接着剤を、この構造を維持するためにポリマーに任意選択で加えることができる。これらの多層のロッドの実施形態のいくつかは、「充填導管」とも称される場合がある。
【０１８２】
他の例示的な実施形態では、長手方向に整列した繊維状ポリマー足場のロッドは、シームレスまたはシームを有して生成される。次いで円周方向に整列した繊維状ポリマー足場シートを、長手方向に整列したロッドの周りに配置し、内側の長手方向に整列した線維層および外側の円周方向に整列した線維層を有する２層のロッドを形成させる。縫合または接着剤を、この構造を維持するためにシームのあるポリマー足場に任意選択で加えることができる。
【０１８３】
他の例示的な実施形態では、シームレスな繊維状ポリマー足場は、長手方向に整列した繊維から構成される内側のロッドと、円周方向にまたはランダムに整列した繊維から構成される外側の導管またはスリーブとを有する。シームレスな長手方向に整列した繊維状ポリマーロッドの足場は、本明細書に記載するように加工される。円周方向に整列した繊維の外側の導管またはスリーブを形成するために、マンドレルの回転を高速に増加させ、長手方向に整列した繊維状ポリマーロッドの周りの円周方向に整列した繊維の均一な付着を可能にする。代わりに、ランダムに整列した繊維の外側の導管またはスリーブを形成するために、マンドレルの回転を中速に増加させ、これによって長手方向に整列した繊維状ポリマーロッド上に付着した繊維の長手方向および円周方向両方の整列を妨げる。足場ロッドをマンドレルから取り除くと、結果は、長手方向に整列した繊維から構成される内側のロッドと、円周方向に整列した繊維または整列していない繊維から構成される外側の導管またはスリーブとを有するシームレスな繊維状ポリマー足場となる。
【０１８４】
充填導管
例示的な実施形態では、ポリマー足場は、充填導管の形状を有する。充填導管は、下記のように生成することができる。（１）導管を本明細書に記載するように形成し、（２）充填導管のための充填材料は、長手方向に整列した繊維から構成される。この充填材料は、緩く高度に多孔質の材料であってもよい。例示的な実施形態では、充填材料は、整列した繊維の薄膜としてエレクトロスピニングされている。次いで、材料を、導管の長軸に平行な整列した繊維の配向を有する本明細書に記載する導管内に直接挿入する。他の例では、長手方向に整列した繊維のロッドを、本明細書に記載するように生成する。次いで、このロッドを、（１）完全に形成した導管に直接挿入するか、または（２）マンドレルとして使用し、周りに繊維状シートを巻き、次いで縫合または接着剤で閉じ充填導管を形成する。
【０１８５】
ＩＩ  ｆ）さらなる組成物またはポリマー足場成分
ＩＩ  ｆ１）細胞
例示的な実施形態では、本明細書に記載する組成物および／またはポリマー足場は、細胞をさらに含む。細胞は、組成物および／もしくはポリマー足場の表面上にある、または埋め込まれる、またはからませることができる。例示的な実施形態では、細胞は、本発明の組成物および／またはポリマー足場と共有結合しているか、または非共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、細胞は新しい組織の成長を促進するために利用される。例示的な実施形態では、細胞は、自系（ドナーおよびレシピエントは、同じ個体である）、同種異系（ドナーおよびレシピエントは、同じ個体ではないが、同じ種からである）および異種（ドナーおよびレシピエントは、異なる種からである）から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、細胞は幹細胞ではない。例示的な実施形態では、細胞は幹細胞である。例示的な実施形態では、細胞は、成体幹細胞および胚性幹細胞から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、成体幹細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）（骨髄由来）または脂肪由来成体幹細胞（ＡＤＡＳ）でもよい。他の例示的な実施形態では、幹細胞は、単能性、複能性、多能性および全能性から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、細胞は前駆細胞である。他の例示的な実施形態では、前駆細胞は、線維芽細胞、筋芽細胞、神経前駆細胞、造血前駆細胞、および内皮前駆細胞でもよい。他の例示的な実施形態では、細胞は、筋芽細胞および筋肉前駆細胞から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞は、成体筋細胞、筋肉前駆細胞、筋肉幹細胞またはそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞は、成体血管細胞、血管前駆細胞、血管幹細胞またはそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞は、成体神経細胞、グリア細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経幹細胞、神経上皮細胞またはそれらの組合せから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞は、シュワン細胞、線維芽細胞および血管細胞から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、細胞は、成体皮膚細胞、皮膚前駆細胞、および皮膚幹細胞から選択されるメンバーである。最近、細胞の成長、機能および組織の誘導のためのナノ繊維基板の実現可能性が、線維芽細胞、血管細胞、および間葉幹細胞について示されてきている。Ｚｏｎｇ，Ｘ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｕｃｌｅｓ、２００３、４、（２）、４１６〜２３；Ｌｉ，Ｄ．、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ、２００４、１６、（４）、１１５１〜１１７０；Ｂｏｌａｎｄ，Ｅ．Ｄ．、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、２００４、９、１４２２〜３２；Ｂｈａｔｔａｒａｉ，Ｓ．Ｒ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４、２５、（１３）、２５９２〜６０２；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００３、２４、（１２）、２０７７〜８２。
【０１８６】
他の実施形態では、本明細書に記載する細胞が埋め込まれた組成物および／またはポリマー足場を、三次元の組織の発生において使用することができる。他の例示的な実施形態では、筋芽細胞が埋め込まれたポリマー足場を、筋組織を発生させるために使用することができ、神経細胞が埋め込まれたポリマー足場を、神経組織を発生させるために使用することができ、血管細胞が埋め込まれたポリマー足場を、脈管組織を発生させるために使用することができ、脊髄細胞が埋め込まれたポリマー足場を、脊髄組織を発生させるために使用することができ、皮膚細胞が埋め込まれたポリマー足場を、皮膚組織を発生させるために使用することができる。
【０１８７】
エレクトロスピニング後または加工後に、組成物および／またはポリマー足場内に、細胞を組み込むことができる。
【０１８８】
ＩＩ  ｆ２）生体分子
（調合薬、核酸、アミノ酸、糖または脂質などの）生体分子は、本明細書に記載する組成物および／またはポリマー足場と共有結合しているか、または非共有結合的に会合することができる。例示的な実施形態では、生体分子は、調合薬、受容体分子、細胞外マトリックス成分または生化学的因子から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、生化学的因子は、成長因子および分化因子から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、生体分子は、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、生体分子は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびそれらの組合せから選択されるメンバーである。
【０１８９】
他の例示的な実施形態では、第１の分子（生体分子でも、または生体分子でなくてもよい）は、本発明の組成物および／またはポリマー足場に共有結合している。この第１の分子を、第２の生体分子と相互作用させるために使用することができる。例示的な実施形態では、第１の分子はリンカーであり、第２の生体分子は、受容体分子、生化学的因子、成長因子および分化因子から選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、第１の分子は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、第２の生体分子は、受容体分子、生化学的因子、成長因子および分化因子から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、第１の分子は、リンカーを介して共有結合している。例示的な実施形態では、リンカーには、水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマーから選択されるメンバーが包含される。他の例示的な実施形態では、リンカーには、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、ポリビニルフェノール、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸およびそれらのコポリマーから選択されるメンバーが包含される。例示的な実施形態では、リンカーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはこれらの混合物から選択されるメンバーが包含される。他の例示的な実施形態では、ＰＥＧまたはＰＰＧは、１〜５０００の整数のいくつかの単量体サブユニットを含む。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約１０〜約１０００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約１０〜約５００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約２０〜約４００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約２０〜約２５０の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約５０〜約２００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約５０〜約１２５の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約５０〜約１００の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約６０〜約９０の整数である。例示的な実施形態では、単量体サブユニットの前記数は、約６０〜約９０の整数である。例示的な実施形態では、前記リンカーは、ジアミノポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。ヘパリンに結合しない生体分子では、ポリマー足場への直接の共役またはリンカー（ＰＥＧ、アミノ−ＰＥＧおよびジアミノ−ＰＥＧなど）を介した共役もまた可能性がある。
【０１９０】
Ｉ  ａ）抗血小板剤
例示的な実施形態では、生体分子は抗血小板剤である。本発明の組成物において使用することができる抗血小板剤の非限定的例には、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）アンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、アデノシン再取込み阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト、ヘパリン、ヘパリン類似体、直接トロンビン阻害剤、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤、アスピリン、非アスピリン系ＮＳＡＩＤｓ、抗凝固酵素、ならびにその薬学的に許容できる塩、異性体、エナンチオマー、非晶形を包含した多形結晶形態、溶媒和物、水和物、共結晶、複合体、活性代謝物、活性誘導体および修飾物、プロドラッグなどが包含される。
【０１９１】
ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、血小板の細胞膜上のＡＤＰ受容体を遮断する。このＰ２Ｙ１２受容体は、血小板凝集すなわちフィブリンによる血小板の架橋において重要である。この受容体の遮断は、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ経路の活性化を遮断することによって、血小板凝集を阻害する。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストである。他の例示的な実施形態では、抗血小板剤は、チエノピリジンである。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、チエノピリジンである。
【０１９２】
他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、スルフィンピラゾン、チクロピジン、クロピドグレル、プラスグレル、Ｒ−９９２２４（プラスグレルの活性代謝物、三共により供給）、Ｒ−１３８１７２７、Ｒ−１２５６９０（Ｌｉｌｌｙ）、Ｃ−１３３０−７、Ｃ−５０５４７（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ−４８８２１、ＩＮＳ−４８８２４、ＩＮＳ−４４６０５６、ＩＮＳ−４６０６０、ＩＮＳ−４９１６２、ＩＮＳ−４９２６６、ＩＮＳ−５０５８９（Ｉｎｓｐｉｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＳｃｈ−５７２４２３（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、塩酸チクロピジン（ＴＩＣＬＩＤ（商標））である。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、スルフィンピラゾン、チクロピジン、ＡＺＤ６１４０、クロピドグレル、プラスグレルおよびこれらの混合物から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、クロピドグレルである。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、重硫酸クロピドグレル（ＰＬＡＶＩＸ（商標））、硫酸水素クロピドグレル、臭化水素酸クロピドグレル、クロピドグレルメシラート、カングレロール四ナトリウム（ＡＲ−０９９３１ＭＸ）、ＡＲＬ６７０８５、ＡＲ−Ｃ６６０９６ＡＲ−Ｃ１２６５３２、およびＡＺＤ−６１４０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、プラスグレルである。他の例示的な実施形態では、ＡＤＰアンタゴニストまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニストは、クロピドグレル、チクロピジン、スルフィンピラゾン、ＡＺＤ６１４０、プラスグレルおよびこれらの混合物から選択されるメンバーである。
【０１９３】
ＰＤＥ阻害剤は、酵素ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の５つのサブタイプの１つまたは複数を遮断する薬物であり、各々のＰＤＥサブタイプによって、細胞内セカンドメッセンジャー、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の不活性化を妨げる。例示的な実施形態では、抗血小板剤はＰＤＥ阻害剤である。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、選択的ｃＡＭＰ  ＰＤＥ阻害剤である。例示的な実施形態では、ＰＤＥ阻害剤はシロスタゾール（Ｐｌｅｔａｌ（商標））である。
【０１９４】
アデノシン再取込み阻害剤は、アデノシンの血小板、赤血球および内皮細胞への細胞再取込みを妨げ、アデノシンの細胞外濃度の増加をもたらす。これらの化合物は、血小板凝集を阻害し、血管拡張をもたらす。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、アデノシン再取込み阻害剤である。例示的な実施形態では、アデノシン再取込み阻害剤は、ジピリダモール（Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ（商標））である。
【０１９５】
ビタミンＫ阻害剤は、血栓症（血管内の不適切な血液凝固）を停止させるために人々に与えられる。これは、素因がある人々において深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞および脳卒中の第１次予防および第２次予防に有用である。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ビタミンＫ阻害剤である。例示的な実施形態では、ビタミンＫ阻害剤は、アセノクマロール、クロリンジオン、ジクマロール（ジクマロール）、ジフェナジオン、ビスクマセタートエチル、フェンプロクモン、フェニンジオン、チオクロマロールおよびワルファリンから選択されるメンバーである。
【０１９６】
ヘパリンは、ブタ腸から作製される場合がある生物学的物質である。それは、トロンビンが血液を凝固させるのを遮断するアンチトロンビンＩＩＩを活性化することによって作用する。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヘパリンまたはヘパリンのプロドラッグである。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ヘパリン類似体またはヘパリン類似体のプロドラッグである。例示的な実施形態では、ヘパリン類似体は、アンチトロンビンＩＩＩ、ベミパリン、ダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、フォンダパリヌクス（皮下）、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、スロデキシド、およびチンザパリンから選択されるメンバーである。
【０１９７】
直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）は、酵素トロンビンを直接阻害することによって（血液凝固を遅延させる）抗凝血剤として作用する医薬品の１種である。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、ＤＴＩである。他の例示的な実施形態では、ＤＴＩは一価である。他の例示的な実施形態では、ＤＴＩは二価である。例示的な実施形態では、ＤＴＩは、ヒルジン、ビバリルジン（ＩＶ）、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン（ＩＶ）、ダビガトラン、ダビガトランエテキシレート（経口製剤）、メラガトラン、キシメラガトラン（経口製剤、しかし肝臓の合併症）およびそのプロドラッグから選択されるメンバーである。
【０１９８】
糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤は、血小板の表面上のＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を阻害し、したがって血小板凝集および血栓形成を防止することによって作用する。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤である。例示的な実施形態では、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤は、アブシキマブ、エプチフィバチド、チロフィバンおよびそのプロドラッグから選択されるメンバーである。これらの薬物は静脈内にのみ投与されるので、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤のプロドラッグは、経口投与に有用である。
【０１９９】
抗凝固酵素もまた、本発明に使用することができる。例示的な実施形態では、抗血小板剤は、経口投与に適切な形態である抗凝固酵素である。他の例示的な実施形態では、抗凝固酵素は、アルテプラーゼ、アンクロド、アニストレプラーゼ、ブリナーゼ、ドロトレコギンα、フィブリノリジン、タンパク質Ｃ、レテプラーゼ、サルプラーゼ、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼから選択されるメンバーである。
【０２００】
例示的な実施形態では、抗血小板剤は、アロキシプリン、ベラプロスト、カルバサラートカルシウム、クロリクロメン、デフィブロチド、ジタゾール、エポプロステノール、インドブフェン、イロプロスト、ピコタミド、リバロキサバン（経口ＦＸａ阻害剤）トレプロスチニル、トリフルサール、またはそのプロドラッグから選択されるメンバーである。
【０２０１】
生体分子および／または細胞を生体模倣足場に結合させる方法
生体分子および／または細胞は、生体模倣足場に種々の方法で結合することができる。一実施形態では、生体分子は、本明細書に記載する第１の繊維状ポリマー足場に非共有結合的に埋め込まれ、または吸収される。
【０２０２】
他の例示的な実施形態では、生体分子は、直接またはリンカーを介して第１の繊維状ポリマー足場に共有結合している。この共有結合は、第１の繊維状足場上の相補的反応性基および生体分子もしくは細胞、または第１の繊維状足場上のリンカーと生体分子もしくは細胞との間、または第１の繊維状足場と生体分子もしくは細胞上のリンカーとの間の反応から生じる。
【０２０３】
本発明を実施する上で有用な相補的反応性官能基および数種の反応は一般に、生体共役化学の技術分野で周知である。本発明の反応性官能基と共に使用できる反応で現在好まれている種類は、比較的穏やかな条件下で進行する反応である。これらには、それだけに限らないが、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合に対する付加（例えば、マイケル反応、ディールズアルダー付加）が包含される。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９８２において議論されている。
【０２０４】
有用な反応性官能基には、例えば
（ａ）それだけに限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルが包含されるカルボキシル基および様々なその誘導体、
（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができるヒドロキシル基、
（ｃ）ハロアルキル基（ハロゲン化物を、例えば、アミン、カルボン酸陰イオン、チオール陰イオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基と後で置換することができ、それによってハロゲン原子の部位で新しい基の共有結合をもたらす）、
（ｄ）ディールズアルダー反応に参加することができるジエノフィル基、例えばマレイミド基、
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などの機序を介してそれに続く誘導体化が可能であるような、アルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）例えば、アミンと引き続き反応してスルホンアミドを形成するためのハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）ジスルフィドへ変換することができ、またはハロゲン化アシルと反応することができるチオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化または酸化することのできるアミンまたはスルフヒドリル基、
（Ｉ）例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加などを受けることのできるアルケン、
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド、
（ｋ）核酸合成に有用なホスホラミダイトおよび他の標準的官能基
が包含される。
【０２０５】
例示的な実施形態では、反応性官能基は、
【０２０６】
【化２０】
2009540878.tif 000021
（式中、Ｒ３１およびＲ３２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから独立に選択されるメンバーである。）から選択されるメンバーである。
【０２０７】
反応性官能基、ならびにそれらが反応する対応する官能基のさらなる例を、下記の表に提供する。
【０２０８】
【表１】
2009540878.tif 000022
【０２０９】
例えば、本発明の化合物をセリンアミノ酸上のヒドロキシル部分に結合させるために、例示的な反応性官能基には、スクシンイミジルエステル、無水物、イソチオシアナート、チオシアナート、塩化スルホニル、スルホニルフルオリド、酸ハロゲン化物、ハロアセトアミド、マレイミドおよびホスホラミダイトが包含される。
【０２１０】
本発明の化合物を構築するのに必要な反応に参加しない、または干渉しないように、反応性官能基を選択することができる。一方、反応性官能基は、保護基の存在によって、反応に参加することから保護されることが可能である。当業者であれば、特定の官能基が反応条件の選択したセットを妨げないようにそれをどのように保護するかを理解している。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい。
【０２１１】
例示的な実施形態では、カルボン酸部分がアミン部分に結合している。最初に、カルボン酸部分がカルボジイミドと反応し、Ｏ−アシルイソ尿素が生じ、これがアミン部分と反応して、アミドを生成することができ、それは次いで２つの部分に結合する。
【０２１２】
例示的な実施形態では、生体分子の本明細書に記載する繊維状ポリマー足場への結合は、いくつかの方法のいずれかによって達成することができる。例えば、（抗血小板剤などの）生体分子は、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ（すなわち、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド）で処理することによって、連結基を任意選択で含有する本明細書に記載するポリマー足場に結合することができ、それにより、例えば繊維状ポリマーのアミノ末端の、生体分子のカルボキシル基への、または繊維状ポリマーに結合しているアミン含有リンカーへの結合が促進されるであろう。結合は、反対の種の上であってもよいことを留意されたい（カルボキシル基が繊維状ポリマー上にあってもよく、アミン基が生体分子上にあってもよい）。当業者であれば容易に理解するであろうが、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳは、それだけに限らないが、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド；ｐ−アジドフェナシルブロミド；ｐ−アジドフェニルグリオキサール；ｎ−４−（アジドフェニルチオ）フタルイミド；ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート；ビスマレイミドヘキサン；ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン；４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン；ジメチルアジプイミデート−２  ＨＣｌ；ジメチルピメルイミデート−２  ＨＣｌ；ジメチルスベルイミデート−２  ＨＣｌ；ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）；ジスクシンイミジルスベレート；ジスクシンイミジルタータレート；ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート−２−ＨＣｌ；４，４’−ジオチオビスフェニルアジド；３，３−ジチオビス（スルホスクシンイミジル−プロピオネート）；エチル−４−アジドフェニル１，４−ジチオ−ブチルイミデート；エチレングリコールビス（スクシンイミジル−スクシネート）；１−アジド−４−フルオロ−３−ニトベンゼン；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート；メチル−４−アジドベンゾイミデート；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸；ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロ−プロピオネート；Ｎ−スクシンイミジル（４−アキシドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート；スルホスクシンイミジル２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロ−ベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート；Ｎ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロ−フェニル−アミノ）ヘキサノエート；スルホスクシンイミジル２−（ｐ−アジドサリチル−アミド）エチル−１，３’−ジチオ−プロピオネート；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ−ベンゾエート；スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート；ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシ−カルボニル−オキシ）エチル］スルホン；ジスルホスクシンイミジルタータレート；エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジル−スクシネート；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル；スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニルジチオ）−プロピオネート；スルホスクシンイミジル６−（４’アジド−２’−ニトロ−フェニルアミノ）ヘキサノエート−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ−ベンゾエート；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート；および２−イミノチオラン−ＨＣｌを包含する任意の適切な基によって置換することができる。
【０２１３】
ＩＩ  ｆ３）薬学的に許容できる賦形剤／製剤
薬学的に許容できる賦形剤はまた、本発明のポリマー足場を有する組成物中に包含されることもできる。例示的な実施形態では、本発明は、ａ）本発明のポリマー足場、およびｂ）薬学的に許容できる賦形剤を含む、製剤である組成物を提供する。例示的な実施形態では、この製剤は、薬学的に許容できる賦形剤が存在するポリマー足場である。例示的な実施形態では、薬学的に許容できる賦形剤は、不活性希釈剤、造粒剤および崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ならびに遅延材料から選択されるメンバーである。
【０２１４】
本発明の製剤は、選択された投与経路に適合された種々の形態をとることができる。当業者であれば本明細書に記載する化合物を組み込んだ無毒性製剤を調製するために用いることができる様々な合成法を理解するであろう。当業者であれば、水、エタノール、プロピレングリコール、鉱油、植物油およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの本発明の化合物の溶媒和物を調製するために使用することができる多種多様の無毒性の薬学的に許容できる溶媒を理解するであろう。
【０２１５】
本発明の組成物は、従来の無毒性の薬学的に許容できる担体、補助剤およびビヒクルを含有する投与単位製剤中で局所的または非経口的に、外科的切開によって投与することができる。
【０２１６】
他の例示的な実施形態では、本明細書に記載する組成物および／またはポリマー足場は、キットの一部である。このキットは、本発明の方法を教示し、および／またはキットの成分の使用法を説明する取扱説明書を含むことができる。
【０２１７】
ＩＩＩ  組成物の使用
他の態様では、本発明の組成物（ポリマー足場など）は、生物学的機能を置換、再生または改善するために、対象において使用することができる。例示的な実施形態では、組成物は、対象において神経機能または筋肉機能または皮膚機能または血管機能を置換、再生、または改善する。他の態様では、本発明は、対象において損傷を治療する方法を提供し、前記方法は、（ａ）前記対象を、損傷を治療するのに十分な治療有効量の本発明の組成物と接触させるステップを含む。例示的な実施形態では、組成物は、損傷部位で対象に接触する。他の例示的な実施形態では、損傷は、切断された神経、傷害を受けた神経、切断された筋肉、傷害を受けた筋肉、切断された血管、傷害を受けた血管、皮膚創傷および傷ついた皮膚から選択されるメンバーである。他の態様では、本発明は、対象において組織を成長させる方法を提供し、前記方法は、（ａ）前記対象を、前記組織の成長を促進するのに十分な本発明の組成物の治療有効量と接触させるステップを含む。例示的な実施形態では、組織は、筋組織、血管組織、神経組織および皮膚組織から選択されるメンバーである。組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、それらの有効性を試験することができる。他の例示的な実施形態では、対象は動物である。他の例示的な実施形態では、動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ラットおよびマウスから選択されるメンバーである。
【０２１８】
下記は、本発明の組成物の使用の例である。
【０２１９】
ＩＩＩ  ａ）神経を伴う使用
例示的な実施形態では、本明細書に記載する組成物は、切断されたまたは傷害を受けた神経を置換するために使用される。１つの使用法は、傷害を受けた末梢神経の再生である。末梢神経の傷害は、外傷、自己免疫疾患、糖尿病などによってもたらされる場合がある。末梢神経は、脊髄から様々な最終標的に向かい身体全体に走る神経線維から構成される。末梢神経の損傷は、神経の最終標的における運動機能および感覚機能の少なくとも部分的損失をもたらす。損傷の最も重症型では、神経が完全に切断され、大きな損傷ギャップが近位神経断端および遠位神経断端の間に形成される。近位端の神経線維は再生することができるが、数ミリメートルより長いギャップに亘ってはそれほど効率的に再生することができない。したがって、近位神経セグメントから遠位神経セグメントへと効率的に神経線維の再生を誘導する材料によって損傷ギャップを架橋することが絶対必要である。
【０２２０】
末梢神経が傷害を受け、もはやひと続きでない臨床的症状において、本明細書に記載する長手方向に整列した繊維状ポリマー足場の少なくとも１つを使用してもよい。ポリマー足場は、導管、充填導管またはロッドの形状でよい。神経断絶をもたらす損傷は通常四肢でおこる。整列した繊維状足場を、これらの領域に移植し、損傷ギャップに亘る神経の再生を増進し、四肢への運動機能および感覚機能の回復を可能とすることができる。神経断端間のギャップが直接の再結合をさまたげるのに十分大きい場合、不連続な傷害を受けた神経を伴う全ての状況において足場を使用することができる。いずれの場合にも、足場は、神経の２つの端部を架橋し、神経セグメントに縫合され、近位神経セグメントから遠位神経セグメントへの神経線維の再生を増進し、導くであろう。足場を構成する長手方向に整列した繊維は、神経線維と本質的に同じ配向に整列しているであろう。したがって、整列した足場の繊維は、損傷ギャップに亘って神経線維の再生を効率的に導く特異的誘導キューを提供することができる。長手方向に整列した導管のポリマー足場は、近位断端の周辺部に沿って位置する神経線維の導かれた成長を最初に促進することによって機能することができる。ロッドの形状および充填導管の形状の長手方向に整列したポリマー足場は、全ての神経線維を近位神経セグメントから遠位神経セグメントへと連続的に誘導することができる。ポリマー足場はまた、細胞外マトリックスタンパク質、ポリペプチド、成長因子および／または分化因子などの生体分子で充填されており、神経線維の再生をさらに増進し、誘導することができる。ポリマー足場に加えることができる細胞外マトリックスタンパク質には、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンが包含される。ポリマー足場に加えることができる成長因子には、塩基性繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子および血管内皮増殖因子が包含される。ポリマー足場に加えることができるポリペプチドには、ポリリシン、ＲＧＤをベースとするポリペプチドおよびラミニン模倣ポリペプチドが包含される。ポリマー足場に加えることができる他の生体分子には、ヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンが包含される。これらの生体分子はまた、ラミニン、ＶＥＧＦおよびＢＦＧＦを繊維状ポリマー足場上に非共有結合的に捕捉するために使用することができる。
【０２２１】
足場は、患者の神経損傷の特定の必要性に適合するように成形され、所定の大きさに作ることができる。例えば、導管、充填導管の内径、およびロッドの形状のポリマー足場の全体的な直径は、約１ｍｍ〜約２０ｍｍでよい。他の例示的な実施形態では、直径は、約２ｍｍ〜約８ｍｍでよい。他の例示的な実施形態では、直径は、約５ｍｍ〜約１０ｍｍでよい。他の例示的な実施形態では、直径は、約２ｍｍ〜約１５ｍｍでよい。他の例示的な実施形態では、直径は、約１２ｍｍ〜約１８ｍｍでよい。他の例示的な実施形態では、損傷した神経と適合する特定のサイズのために、直径は、約１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、５ｍｍ、５．５ｍｍ、６ｍｍ、６．５ｍｍ、７ｍｍ、７．５ｍｍ、８ｍｍ、８．５ｍｍ、９ｍｍ、９．５ｍｍ、１０ｍｍ、１０．５ｍｍ、１１ｍｍ、１１．５ｍｍ、１２ｍｍ、１２．５ｍｍ、１３ｍｍ、１３．５ｍｍ、１４ｍｍ、１４．５ｍｍ、１５ｍｍ、１５．５ｍｍ、１６ｍｍ、１６．５ｍｍ、１７ｍｍ、１７．５ｍｍ、１８ｍｍ、１８．５ｍｍ、１９ｍｍ、１９．５ｍｍ、２０ｍｍ、２１ｍｍでよい。足場の長さは、広範囲の損傷ギャップを適応させるために、１ｃｍ〜約５０ｃｍで変動することができる。他の例示的な実施形態では、足場の長さは、約４ｃｍ〜約１５ｃｍでよい。他の例示的な実施形態では、足場の長さは、約１４ｃｍ〜約３０ｃｍでよい。他の例示的な実施形態では、足場の長さは、約１ｃｍ〜約５ｃｍでよい。他の例示的な実施形態では、足場の長さは、約２ｃｍ〜約８ｃｍでよい。他の例示的な実施形態では、足場の長さは、約１ｃｍ、１．５ｃｍ、２ｃｍ、２．５ｃｍ、３ｃｍ、３．５ｃｍ、４ｃｍ、４．５ｃｍ、５ｃｍ、５．５ｃｍ、６ｃｍ、６．５ｃｍ、７ｃｍ、７．５ｃｍ、８ｃｍ、８．５ｃｍ、９ｃｍ、９．５ｃｍ、１０ｃｍ、１０．５ｃｍ、１１ｃｍ、１１．５ｃｍ、１２ｃｍ、１２．５ｃｍ、１３ｃｍ、１３．５ｃｍ、１４ｃｍ、１４．５ｃｍ、１５ｃｍ、１５．５ｃｍ、１６ｃｍ、１６．５ｃｍ、１７ｃｍ、１７．５ｃｍ、１８ｃｍ、１８．５ｃｍ、１９ｃｍ、１９．５ｃｍ、２０ｃｍ、２０．５ｃｍでよい。長手方向に整列した繊維状足場の全ての形態は、現在最も広範に使用されるが、神経損傷のための治療の完全な形態から程遠い神経自家移植片の代わりとしての機能を果たすことができる。足場はまた、現在の合成の神経誘導生成物によって覆われる範囲を超えた長い損傷ギャップを架橋するために使用することができる。例えば、架橋される損傷ギャップは、３ｃｍを超えることができる。例示的な実施形態では、対象は長い損傷ギャップを有し、ロッドの形状のポリマー足場または充填導管のポリマー足場が、長い損傷ギャップに亘る神経の再生のために最も好ましい足場形状であり得る。
【０２２２】
末梢神経が傷害を受けているが、切断されていない臨床的症状において、本発明に記載されている長手方向に整列した繊維状足場は、シートとして形成され、神経の周りを覆うものとして使用することができ、および／またはロッドもしくは充填導管もしくは導管として形成され、傷害を受けた領域に直接挿入することができる。長手方向に整列した繊維状足場はまた、本明細書に記載するような同様の生体分子で充填することができる。
【０２２３】
本発明に記載されている足場の他の使用は、傷害を受けた脊髄の再生である。整列した繊維状ポリマー足場を、傷害を受けた領域に挿入し、脊髄組織を架橋することができる。整列した繊維状ポリマー足場は、脊髄神経繊維の再生を増進し、導くことができる。足場はまた、生体分子および／または細胞で充填することができる。生体分子は、上記で列挙したような細胞外マトリックスタンパク質、ポリペプチド、成長因子および／または分化因子を包含することができ、脊髄神経の再生を開始させ、増進することができ得る。細胞には、神経幹細胞、グリア細胞、および／または神経前駆細胞が包含することができ得る。細胞は、失われたニューロンおよびグリア細胞を置換することができ、および／または脊髄神経の成長を支持し、増進することができ得る。
【０２２４】
他の例示的な実施形態では、長手方向に整列したポリマー導管足場は、損傷ギャップに亘る神経の再生を促進するための神経誘導導管として使用される。
【０２２５】
ＩＩＩ  ｂ）皮膚を伴う使用
本発明に記載されているポリマー足場は、臨床的および個人的な創傷のケアならびに軟部組織の再生に有用である場合がある。本発明の一態様では、ポリマー足場シートは、外部の皮膚創傷のための創傷被覆材または移植片として使用される。臨床現場において、これらのシートは、外傷、火傷、潰瘍、擦過傷、裂傷、手術、または他の傷害からもたらされる創傷を治療するために使用することができる。外科医は、これらの移植片を使用して、創傷領域を覆いおよび保護し、失われたまたは傷害を受けた皮膚組織を一時的に置換し、傷害を受けた領域への新しい組織の生成および創傷治癒を誘導することができる。臨床現場において、マイクロ／ナノ繊維シートは、縫合、接着剤、または表面を覆う包帯を使用して創傷領域に固定することができる。これらのマイクロ／ナノ繊維の創傷被覆材は、創傷の大きさに適合するように切断してもよく、または創傷の縁と重なってもよい。
【０２２６】
本発明の他の態様では、シートを粘着性の裏地と組み合わせてポリマー足場の包帯を生成することによって、ポリマー足場シートを、個人医療／在宅医療のために調整することができる。粘着性部分は、創傷領域上で所定の位置にポリマー足場シートを保持し、繊維が分解または組織と融合した場合に除去することができる。ポリマー足場シートはまた、液状接着剤またはゲル接着剤で固定することができる。
【０２２７】
本発明の他の態様では、大きなポリマー足場シートは、体液を吸収し、大きな創傷を保護するためにガーゼとして使用することができる。このポリマー足場のガーゼは、創傷領域に巻き付け、またはテープで固定することができる。
【０２２８】
本発明の他の態様では、ポリマー足場シートは、羊膜腔内の創傷などの内部の軟部組織の創傷、消化管または粘膜の潰瘍、歯肉の傷害または退縮、内部の外科的切開または生検などの治療に使用することができる。さらにまた、ポリマー足場移植片は、所定の位置に縫合または接着し、傷害を受けた組織領域を充填または覆うことができる。
【０２２９】
ポリマー足場は、創傷治癒のために有用な多くの特徴を有する。第１に、ナノ繊維を包含する本明細書に記載するポリマー足場は、ナノ多孔性および通気性の両方である。それらは、微生物および感染性粒子が通過するのを妨げることができるが、自然の創傷治癒には重大な意味を持つ空気の流れおよび水分浸透は通過させる。
【０２３０】
第２に、本発明における繊維は生分解性であり、これは一時的な創傷の被覆と、その後の最終的な新しい組織の内部成長を可能にする。ポリマー足場による創傷被覆材のための材料の選択は、機械的強度および分解／組織の再生の速度を包含した天然組織の特徴に適合するように決定することができる。
【０２３１】
第３に、ポリマー足場は、分解によって放出することができる様々な因子に埋め込まれ、または共役することができる。これらの因子には、それだけに限らないが、創傷治癒に有益であることが示されてきた上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）が包含されてもよい（Ｆｕ，Ｘ．ら、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ、１３（２）：１２２〜３０（２００５））。抗生物質、殺菌剤、殺真菌剤、銀含有剤、鎮痛剤、および一酸化窒素放出化合物などのさらなる創傷治癒因子もまた、ポリマー足場の創傷被覆材または移植片に組み込むことができる。
【０２３２】
第４に、創傷治癒のためのポリマー足場移植片は、より速い組織の再生およびより天然の組織構造のために細胞と共に播種してもよい。これらの細胞には、それだけに限らないが、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉幹細胞、および／または胚性幹細胞が包含されてもよい。
【０２３３】
第５に、ナノ繊維状ポリマー足場のナノスケールの構造体は、多くの共通の軟部組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のそれを厳密に模倣する。例えば、ナノスケールの繊維は、皮膚および他の組織に見出されるコラーゲン微小繊維と構造的に似ている。この構造体は、細胞が創傷に遊走する組織化された足場を提供することによって瘢痕形成を妨げることができる。本発明のこの態様では、（ランダム配向した繊維とは対照的に）ポリマー足場の整列は、瘢痕組織の形成におけるようにランダムに配置するより、細胞が整列して組織化されるのを保つために重要である。整列したポリマー足場は、より速い組織の内部成長および創傷の被覆を可能にするために、創傷の所与の軸に対して配向することができる。
【０２３４】
ポリマー足場の整列はまた、天然組織のＥＣＭの構造体に厳密に適合するように使用することができる。これには、単一の方向の繊維の整列、直交方向の十字形交差の整列、またはより複雑な繊維構造体を包含することができる。本発明のこの場合には、ポリマー足場には、各層において特定の繊維配向を有する繊維の多層が包含される。同様に、各々のポリマー足場層はまた、前に列挙したものなどの特定の因子または細胞型も含有することができる。これによって、天然組織構造体および組成物に厳密に適合することができるポリマー足場の生成が可能となる。例えば、単純なポリマー足場の創傷被覆材または移植片は、整列した繊維の単層を包含してもよい。他方、より複雑なポリマー足場の皮膚移植片は、一番下のシートに線維芽細胞および一番上のシートにケラチン生成細胞を有し、ならびに一番下のシートにｂＦＧＦおよび一番上のシートに抗菌剤を有する、十字形交差パターンに層状となった多数の整列した繊維シートを包含することができる。患者の特定の必要性に応じて、他のこのような組合せが可能である。
【０２３５】
ＩＩＩ  ｃ）血管系を伴う使用
本明細書に記載するポリマー足場を、種々の傷害を受け、切断されまたは変質した血管を置換またはバイパスするために使用することができる。例示的な実施形態では、導管または充填導管のポリマー足場は、冠動脈バイパス手術に使用される。さらにこれらの移植片は、血管のポリマー足場による完全な置換によって、または鞘のようなケースを生成することによって、血管動脈瘤を支持および安定化するために使用することができる（すなわち、腹部大動脈瘤は、ｅＰＴＦＥまたはＤａｃｒｏｎなどの合成ポリマー置換移植片を典型的に必要とする）。他の補強技術は、ポリマー足場シートを動脈瘤部位の周りに巻き付けることを伴う。それらの使用は、下半身の血管置換に限定されず、内頸動脈、後交通動脈、後大脳動脈などを包含する局所動脈のいずれかを伴う動脈瘤の他の好発部位（例えばウィリス輪）を包含することができる。
【０２３６】
例示的な実施形態では、スリーブによって取り囲まれているポリマー足場は、血管を置換または再生するために使用される。スリーブは、ポリマー足場を取り囲み、その機械的強度、剛性、伸展性または任意の他の物理的または化学的性質を改善するように作製することができる。例えば、下にあるナノ繊維が特定の方向の整列を有し、スリーブが同じまたは異なる方向の整列を有し得るように、このスリーブをナノ繊維状ポリマー足場の導管の周りに配置することができる。整列していないまたはランダムに整列したマイクロまたはナノ繊維はまた、スリーブ材料または下にあるナノ繊維構築体としての機能を果たすことができる。多数のスリーブを、異なる物理的または化学的性質を有する多層の構築体を生成するために使用することができる。
【０２３７】
多数の細胞型の移植片
管状構築体は、ポリマー足場の異なる領域に異なる細胞型を播種することによって作製することができる。例えば、図４０は、細胞型１が内腔の内側を覆い、細胞型２が移植片の中間の部分にあり、細胞型３を移植片の他の領域上に播種することによって移植片を入れるために使用する移植片を示す。
【０２３８】
ナノ繊維の管状構築体の修飾
例示的な実施形態では、本発明は、移植の前に生化学修飾または細胞修飾を有さない血管系において使用するためのポリマー足場を提供する。他の例示的な実施形態では、本発明は、血小板がナノ繊維に接着することを妨げる、汚染性でなく血栓形成性でないブラシ層を生成するためのポリ（エチレングリコール）または同様の生化学修飾をさらに含む。このブラシ層は、血栓症を減少させるためにナノ繊維状ポリマー足場に共有結合的に移植することができる。他の例示的な実施形態では、ポリマー足場は、ヘパリン、ヒルジンまたはそれらの組合せをさらに含む。ヘパリンは、血流中の第Ｘａ因子およびトロンビンを遮断することができる抗トロンビンＩＩＩに結合することができる。ヒルジンは、トロンビンの阻害剤である。ヘパリンおよびヒルジンは、ジアミノポリ（エチレングリコール）リンカーを使用することによって、ポリマー足場に共有結合的に移植することができる。例示的な実施形態では、ポリマー足場は、ＰＬＬＡ繊維を含有する。対象の血管系と関連して使用される本発明のポリマー足場は、血栓症を減少させ、移植片の開存性を増加させる。
【０２３９】
他の例示的な実施形態では、血管系と関連して使用されるポリマー足場は、ヒト骨髄由来間葉幹細胞をさらに含む。例示的な実施形態では、間葉幹細胞は、移植の少なくとも２４時間前に播種されるであろう。他の例示的な実施形態では、細胞は、移植の２日前に移植片に播種されるであろう。
【０２４０】
脱細胞(decellularization)−ヒト骨髄由来間葉幹細胞または任意の細胞型を、上記のように播種する。移植の数時間前に、細胞を殺し、一方細胞の構造および細胞表面はそのままに保つ。
【０２４１】
他の例示的な実施形態では、血管系と関連して使用されるポリマー足場は、内皮前駆細胞をさらに含む。例示的な実施形態では、内皮前駆細胞は、移植の２日前に移植片に２日間播種される。これらの内皮細胞は、細胞自体によって分泌されるヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびいくつかの因子が関与する高度に活性な細胞膜表面を介して、血小板接着／活性化、血栓症およびフィブリン形成を妨げることができる。
【０２４２】
他の例示的な実施形態では、血管系と関連して使用されるポリマー足場は、ヒト胚性幹細胞由来の血管前駆細胞をさらに含む。これらの胚性幹細胞は、コラーゲンＩＶ・インテグリンシグナル伝達によって血管前駆系統に分化することができ、成長因子の刺激によって内皮および平滑筋細胞に完全に分化することができる。
【０２４３】
ＩＩＩ  ｄ）筋肉を伴う使用
本発明のポリマー足場を伴う筋肉移植片は、急性損傷後の大幅な筋肉損失に起因する筋肉再生を増進するために、治療的に筋肉内に移植することができる。成長因子および他の生体分子を筋肉移植片に組み込んで、筋肉細胞の増殖および分化ならびに血管新生（それら全てが筋肉の回復を促進するであろう）を刺激することができる。成長因子には、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を包含することができる。成長因子を、共有結合または生理学的コーティングによって移植片に組み込むことができる。関連するアプローチは、このようなタンパク質のため遺伝子を過剰発現させるために細胞を遺伝子組換えすることを伴う。
【０２４４】
移植片の他の治療への応用は、特定の遺伝子の遺伝子突然変異によって特徴付けられる筋ジストロフィーなどの筋肉疾患を有する動物またはヒトの遺伝子組換えのためである。このタイプの遺伝子治療への応用のために、正常遺伝子を有する筋芽細胞を、移植片内で筋肉に供給することができる。代わりに、遺伝子をプラスミドＤＮＡの形態で、足場に直接共役させることができる。体内での足場の移植は、正常な筋機能の組織発達の側面を助長するための遺伝子組換えに至る場合がある。遺伝子治療の目的で、ポリマー足場は、移植された細胞の生存および成長のためのマトリックスを提供し、ならびに／またはプラスミドＤＮＡの放出およびそれに続く取込みのための送達ビヒクルとしての役割を果たす。
【０２４５】
移植片は、パッチまたは導管の形状でよい。いずれの場合も、繊維の方向は筋肉の方向と平行である。げっ歯類では、足場の物理的寸法は、０．５〜５．０×０．５〜５．０×０．１〜０．５ｃｍの範囲である。ヒト移植片では、足場のサイズは、１．０〜５０．０×１．０〜５０．０×０．１〜５．０ｃｍの範囲である。
【０２４６】
このタイプの治療上の処置の最も適した筋肉は、整列した形状を有し、移植片に栄養を与えるため脈管構造に近い。このような筋肉には、二頭筋、四頭筋、前脛骨筋、および腓腹筋が包含される。
【０２４７】
例示的な実施形態では、筋芽細胞が埋め込まれた導管は、骨格筋を成長させるために使用することができる。他の例示的な実施形態では、間葉幹細胞が埋め込まれた導管は、血管移植片として使用することができる。他の例示的な実施形態では、神経幹細胞が埋め込まれた導管は、神経移植片として使用することができる。他の例示的な実施形態では、本発明は、（ｉ）ポリマーに細胞を播種するステップと、（ｉｉ）生成物をマンドレルの周りに巻いて、したがってポリマーのために管状の形状を形成させるステップと、（ｉｉｉ）マンドレルを除去するステップとを含む、組成物の作製方法を提供する。他の例示的な実施形態では、本発明は、（ｉｖ）ポリマーの第１の部分をポリマーの第２の部分に結合させるステップを提供する。この結合は、アニーリング（熱）、接着（生物学的接着など）または縫合を使用することによって達成することができる。
【０２４８】
ＩＩＩ  ｅ）微細パターン化したポリマー足場を有する筋肉移植片
微細パターン化したポリマー足場を有する筋肉移植片の用途は、微細パターン化したポリマー足場はシートの形状であることを除いて、上記のようなナノ繊維状足場のそれと同様である。
【０２４９】
本発明を下記の実施例によってさらに例示する。実施例は、本発明の範囲を定義または限定することを意図していない。
【実施例１】
【０２５０】
筋芽細胞の調製
マウスのＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用して、細胞組織および細胞集合体を研究した。筋芽細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンから構成される増殖培地中で培養した。筋芽細胞の分化および融合を開始させるために、試料がコンフルエントとなった２４時間後に、増殖培地を、ＤＭＥＭ、５％ウマ血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンから構成される分化培地と置換した。全ての実験において、時点を分化培地中のインキュベーション時間によって示した。
【実施例２】
【０２５１】
ＰＬＬＡナノ繊維の足場の調製
生分解性のポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）（Ｌａｃｔｅｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ、１．０９ｄＬ／ｇインヘレント粘度）を使用して、ナノ繊維の足場をエレクトロスピニングにより加工した。（Ｚｏｎｇ、Ｘ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、４（２）：４１６〜２３（２００３））。手短に言えば、ＰＬＬＡ溶液（クロロホルム中１０％ｗ／ｖ）を、プログラム可能なポンプによって電極の排出孔に２５μＬ／分の流量で供給した。高電圧源（Ｇｌａｓｓｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｎｃ．、Ｈｉｇｈ  Ｂｒｉｄｇｅ、ＮＪ）を使用して、２０ｋＶの電圧を印加した。回収プレートは、接地されステッピングモーターによって制御された回転ドラム上にあった。ナノ繊維を整列させるため、エレクトロスピニングされた足場を、２００％工学ひずみまで６０℃で一軸延伸した。ナノ繊維状足場は、厚さが約１５０μｍであった。ナノ繊維状足場の表面を、細胞播種の前に２％ゼラチンまたはフィブロネクチン（５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした。ゼラチンとフィブロネクチンコーティングとの間に細胞間接着および形態の有意な差異は認められなかった。ランダム配向した足場を対照として使用した。
【０２５２】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、一軸延伸後にナノ繊維の整列を可視化した。ＳＥＭ像は、一軸延伸によって整列したナノ繊維が生じたことを示す（図２４Ａ〜Ｂ）。足場におけるナノ繊維の平均直径は、約５００ｎｍであり、ギャップの平均サイズは約４μｍであった。
【実施例３】
【０２５３】
分化培地でのナノ繊維の足場上の筋芽細胞の成長／性質決定
コンフルエントな筋芽細胞を、分化培地中、ナノ繊維状足場上で７日まで成長させた。ランダム配向および整列したナノ繊維状足場上の細胞組織および細胞骨格構造を決定するために、Ｆ−アクチン、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）および細胞核の蛍光染色を行った（補足情報）。フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用してＦ−アクチンを染色した。マウス抗骨格速筋型ＭＨＣ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でＭＨＣを免疫染色した。ＴｏＰｒｏ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞核を染色した。Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００顕微鏡およびＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＬ共焦点顕微鏡を使用することによって蛍光顕微鏡検査法を行った。
【実施例４】
【０２５４】
微細パターン化した基板の微細加工
Ｔｈａｋａｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、３０７（４）：８８３〜９０（２００３）から改変した方法によって、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリ−Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−ε−カプロラクトン（ＰＬＧＣ）ポリマーから構成される微細パターン化したフィルムを、ケイ素ウエハー逆テンプレートから加工した。微細パターン化したテンプレートを生成するために、ウエハーをアセトン、次いで硫酸と過酸化水素との４：１洗浄液（ピラニア酸）で洗浄した。ウエハーを乾燥させ、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）で５分間コーティングし、基板へのフォトレジスト接着を改善した。パターン化された感光乳剤ストリップを有するマスクを最初に生成した。平行なストリップは幅１０μｍ、１０μｍの間隔、長さ４ｃｍであった。パターンをケイ素ウエハーに転写するために、Ｉ−ライン（ＯＣＧ  ＯｉＲ８９７−１０ｉ、Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）フォトレジストをウエハー上に８２０ｒｐｍで１分間スピンし、約２．８μｍの厚さの層のフォトレジストを生成した。次いで、ＫＳ  Ａｌｉｇｎｅｒ（Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ、ＭＪＢ３、ドイツ）でフォトレジストを紫外線に露光する前に、ウエハーを９０℃で６０秒間ベークし、フォトレジストを硬化させた。露光後ベークを１２０°Ｃで６０秒間行い、フォトレジストの固化を促進し、光産物の拡散を促進した。フォトレジスト現像溶液ＯＰＤ４２６２を使用して、露光したフォトレジストを６０秒間現像した。露光されていないフォトレジストを有するウエハーを、プライマーオーブン中に１２０°Ｃで１５分間置いて、残りのフォトレジストを固化させた。この時点で、ウエハーはＰＤＭＳフィルムの調製のためにすぐに使用することができた。ＰＬＣＧフィルムの加工のためのテンプレートは、約２μｍの深さの微細溝を生成するために、２〜３分間のＳＴＳ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈｅｒによるエッチングのさらなるステップを必要とした。
【０２５５】
製造者（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＩ）の指示通りに、微細パターン化したおよびパターン化していないＰＤＭＳフィルムを調製した。真空下での脱ガス処理の後、１５ｇのＰＤＭＳをウエハー上に注いだ。ＰＤＭＳを有するウエハーを、フォトレジストスピナー上に置き、１００ｒｐｍで３０秒間、次いで２００ｒｐｍで２分間スピンし、それによって約３５０μｍの均一な厚さを有するＰＤＭＳフィルムが形成された。スピンコーティングしたＰＤＭＳを有するウエハーを、１０分間室温に保ち、次いでオーブン内に８０℃で１５分間置き、ＰＤＭＳを重合させた。ベーク後に、ＰＤＭＳを室温に冷却し、次いでウエハーから取り除いた。加工工程後に、ＰＤＭＳ膜を超音波処理によって水で洗浄した。細胞播種前に、滅菌し細胞間接着を促進するために、膜を酸素プラズマで処理し、２％ゼラチンで３０分間コーティングした。
【０２５６】
生分解性の微細パターン化したフィルムのために、７０：１０：２０の成分比（Ｍｎ〜１００，０００）のトリブロックコポリマーＰＬＧＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用した。ＰＬＧＣ溶液を、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のクロロホルム中で調製し、撹拌プレート上で溶解するまで撹拌した。次いで、溶液をシリコン型上に注ぎ、溶媒を蒸発させ、ポリマー薄膜を形成させた。加工後に、ＰＬＧＣフィルムを７０％エタノール中で２時間滅菌し、ＰＢＳ中ですすいだ。細胞播種前に、フィルムを２％ゼラチンで３０分間コーティングし、細胞接着を増進した。
【実施例５】
【０２５７】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による組成物の性質決定
細胞を含有する組成物または試料を、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２％グルタルアルデヒド中で固定することによって、ＳＥＭのために加工した。エタノール脱水シリーズ後に、試料を乾燥させ、イリジウムまたは金：パラジウム（４０：６０）粒子で１０〜１５ｎｍの厚さまでスパッタコーティングした。試料を環境制御型走査電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ−３０）下で可視化した。
【実施例６】
【０２５８】
免疫蛍光染色
試料を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間前処理した。Ｆ−アクチンアセンブリーを、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役ファロイジン（５Ｕ／ｍＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）インキュベーションで１時間染色した。ミオシン重鎖染色のために、試料を、マウス抗骨格速筋型ミオシン重鎖（８７μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、次いでＦＩＴＣ共役ロバ抗マウス（６．２５μｇ／ｍＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）抗体と共にインキュベートした。Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００顕微鏡またはＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＬ共焦点顕微鏡で可視化する前に、細胞核をＴｏＰｒｏ（１μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。共焦点像は、三次元の積層した像の二次元映像を表す。
【実施例７】
【０２５９】
ＢｒｄＵの取込み
細胞周期分析のために、試料を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄する前に、増殖培地中でブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１：１０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で２時間パルス標識した。試料を５０％メタノールで３０分間前処理し、次いで０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で１０分間透過処理し、次いで２ＮのＨＣｌで３０分間処理した。その後、試料をマウス抗ＢｒｄＵ（２．５μｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）と共に、次いでＦＩＴＣ共役ロバ抗マウス（６．２５μｇ／ｍＬ）抗体と共にインキュベートした。細胞核をヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。
【実施例８】
【０２６０】
細胞融合および増殖の分析
抗骨格ミオシン染色の免疫蛍光像を、少なくとも５つの代表的な高倍率視野（４０×）および低倍率視野（１０×）で撮像した。ＳＰＯＴ４．０．５ソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）を使用して、各々高倍率および低倍率を使用して、整列したナノ繊維の軸または微細溝を基準とした筋管の幅、長さ、および整列を定量化した。０度という最小の筋管整列の値は、ナノ繊維の軸に対して平行の整列を表し、最大の９０度は、垂直な整列を表した。ランダム配向したナノ繊維状足場およびパターン化していないＰＤＭＳ基板の整列を分析するために、整列の任意軸を使用した。さらに、融合した核、ＢｒｄＵ−陽性細胞、および横紋のある筋管の割合を、高倍率で定量化し平均化した。平均幅を定量化し平均化した。低倍率の連続像を併せて、筋管の長さを定量化した。全てのデータを平均±標準偏差（ｎ≧３）として表現した。２群についてはスチューデントのｔ−検定、または多重比較についてはＨｏｌｍ補正を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計的有意性を計算した。
【実施例９】
【０２６１】
導管
整列したナノ繊維の長方形のシート上で筋芽細胞を７日間分化させた。三次元構造を生成するために、ナノ繊維シートを１〜２ｍｍ直径の鋼ロッド（図２７）の周りに巻いた。管状構造を、管状構築体の両方の端部で７−０Ｔｉｃｒｏｎ縫合糸によって固定した。次いで、試料を組織分析のために凍結切断した。凍結切断した試料を、常法のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって、ならびにＦ−アクチンの免疫蛍光染色によって分析した。
【０２６２】
加工された管状構築体は、直径約２〜３ｍｍおよび長手方向の長さ１０ｍｍであった。これらの構築体断面の全体形態についてのＨ＆Ｅ染色によって、構築体の管状構造が首尾よく加工されたことが示された（図２８）。特徴的な紫色の核を足場の層全体に亘って見出すことができたが、より多くの細胞が各層の表面で見出された。免疫蛍光染色したＦ−アクチンの共焦点顕微鏡観察は、構築体の多層内での細胞浸透を示した（図２９）。細胞は、細長い形態を採り、ナノ繊維の方向に従って整列していた。これらの結果は、ナノ繊維ポリマーを使用した整列した三次元の骨格筋を設計する実現可能性を示す。
【実施例１０】
【０２６３】
ナノ繊維ポリマーの生成
生分解性のポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）（Ｌａｃｔｅｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ、１．０９ｄＬ／ｇインヘレント粘度）を使用して、Ｒｏｓｅｎら、Ａｎｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ．、２５：３７５〜８７（１９９０）によって従前説明されたようにエレクトロスピニングによってナノ繊維状足場を加工した。ＰＬＬＡ溶液（クロロホルム中１０％ｗ／ｖ）を、プログラム可能なポンプによって、高電界中の接地した回収プレートに供給し、ランダムなナノ繊維がもたらされた。ナノ繊維を整列させるために、エレクトロスピニングされた足場を、２００％歪みまで６０℃で一軸延伸した。ナノ繊維状足場は、厚さが約１５０μｍであった。一軸延伸後に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用してナノ繊維の整列を可視化した。ＳＥＭ像は、一軸延伸によって高度に整列したナノ繊維（図１２Ａ〜Ｂ）がもたらされたことを示す。ナノ繊維の平均直径は約５００ｎｍであった。
【０２６４】
ナノ繊維を化学的に修飾するために、１種のＥＣＭタンパク質（ラミニン）および１種の神経栄養因子（塩基性線維芽細胞因子またはｂＦＧＦ）を、代表例として選択した。ラミニンおよびｂＦＧＦの両方は、軸索伸張をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進することが見出されてきた。Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９７：１８８２〜９０（１９８３）；Ｒｙｄｅｌら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、７：３６３９〜５３（１９８７）。さらに、両方のタンパク質は、それらのヘパリン結合ドメインを介してヘパリンと会合する。ヘパリンはまた、ｂＦＧＦが分解されることから保護し、ｂＦＧＦ細胞シグナル伝達経路において重要な役割を果たすことが示されてきた。Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２８：４７５〜８４（１９８６）；Ｓａｋｓｅｌａら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０７：７４３〜５１（１９８８）；Ｙａｙｏｎら、Ｃｅｌｌ、６４：８４１〜８（１９９４）。
【０２６５】
ジアミノ−ポリ（エチレングリコール）（ジ−ＮＨ２−ＰＥＧ）をリンカー分子として使用することによって、ヘパリン官能化されたナノ繊維を生成した（図１２Ｃ）。最初に、足場を０．０１ＮのＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処理することによって、ＰＬＬＡナノ繊維上の反応性カルボキシル基の濃度を増加させた。次いで、ジ−ＮＨ２−ＰＥＧ（ＭＷ３４００、Ｓｉｇｍａ）分子を、ゼロ長架橋剤１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、ＰＬＬＡナノ繊維上のカルボキシル基と共有結合させた。次いで、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）分子を、ジ−ＮＨ２−ＰＥＧ分子上でＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを介して遊離アミンに共有結合させた。試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中の１０％ｗ／ｖグリシン中でインキュベートすることによって、ナノ繊維状足場上の任意の残りの反応部位をブロックした。次いで、ＰＢＳ溶液中のｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｃｍ２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ））およびラミニン（１０μｇ／ｃｍ２、Ｓｉｇｍａ）を、ナノ繊維状足場と共に順次にインキュベートし、それらのヘパリンへの結合およびナノ繊維の表面上での固定化を可能とした。
【０２６６】
ｂＦＧＦ分子のヘパリン官能化されたＰＬＬＡナノ繊維への結合を、改変したＥＬＩＳＡ技術を使用することによって確認した。ｂＦＧＦを固定化する異なる方法の効率を比較するために、同じサイズの未処理、ジ−ＮＨ２−ＰＥＧ修飾された、およびヘパリン官能化されたナノ繊維膜を有する３種のナノ繊維状足場を、ＰＢＳ中のｂＦＧＦと共にインキュベートした。次いで、全ての膜を、ＰＢＳ溶液中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートし、抗体の受動的吸着を最小限にした。引き続いて、試料を、ＨＲＰ共役抗ｂＦＧＦマウスモノクローナルＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と共にインキュベートした。膜を完全に洗浄し、エッペンドルフ管に移動し、ＨＲＰ基質溶液（過酸化水素およびクロマゲン、テトラメチルベンジジン）と共にインキュベートした。次いで、２Ｎの硫酸を使用して反応を停止させた。次いで、分光光度計（４５０ｎｍの波長）を使用して溶液の吸光度を読み取った。ｂＦＧＦ抗体の非特異的吸着を負の対照試料で試験し、無視できる（データは示されない）ことを見出した。結果（図１２Ｄ）は、ｂＦＧＦコーティングがヘパリンで官能化されたナノ繊維上において有意により効率的であることを示す。これらの結果を、ＰＬＬＡナノ繊維上で使用されたものと同じ方法で、ポリ（アクリル酸）でコーティングされジ−ＮＨ２−ＰＥＧおよびヘパリンと共役している組織培養ポリスチレン基板上でさらに検証した（図１２Ｅ）。
【０２６７】
Ｐ４−Ｐ５ラットから収集したＤＲＧ組織を使用して、ナノ繊維の足場上の軸索伸張を研究した。ＤＲＧ組織を、Ｂ２７および０．５ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で、下記の整列したＰＬＬＡナノ繊維および整列していないＰＬＬＡナノ繊維の足場上で６日間培養した。未処理、ラミニン（ＬＡＭ）で官能化されたヘパリン、ならびにラミニンおよびｂＦＧＦ（ＬＡＭ＋ｂＦＧＦ）で官能化されたヘパリン。６日間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養の後、免疫蛍光染色を使用して軸索伸張を分析した。全ての試料を、最初に４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで細胞膜をＰＢＳ溶液中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理した。試料を、ヤギポリクローナル抗ニューロフィラメント−Ｍ（ＮＦＭ）ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、次いでＦＩＴＣ共役ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共にインキュベートした。試料をスライドガラス上に乗せ、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡およびＬｅｉｃａ共焦点蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
【０２６８】
整列していない未処理のナノ繊維の足場上ではＤＲＧ組織からの軸索伸張は観察されなかった（図１３、未処理）。整列していないＬＡＭナノ繊維上で組織培養したＤＲＧからの軸索伸張は最小であった（図１３、ＬＡＭ）。様々な神経突起が、整列していないＬＡＭ＋ｂＦＧＦナノ繊維上で組織培養したＤＲＧから伸長していることが観察された（図１３、ＬＡＭ＋ｂＦＧＦ）。神経突起は、ＤＲＧ組織から外側に放射状に伸長し、整列に均一性を欠いていた。ＤＲＧ組織からの神経突起の成長は約１ｍｍであった。
【０２６９】
未処理の整列していないナノ繊維と対照的に、未処理の整列したナノ繊維上で軸索伸張が観察された。神経突起はＤＲＧ組織の２つの別々の領域から伸長し、ナノ繊維の方向に整列していた。図１４は、神経突起の組織の２つの領域の１つからの伸長を示す。未処理のナノ繊維上の神経突起の成長は、約０．７ｍｍであった。これらの結果は、整列したナノ繊維は、ＤＲＧ組織中の感覚ニューロンからの軸索伸張を誘発するための誘導を実現することを示す。同様に整列しているがより長い神経突起が整列したＬＡＭナノ繊維上で観察され（図１４、ＬＡＭ）、これは、ＥＣＭタンパク質が整列したナノ繊維の誘導をさらに増進することができることを示す。ＬＡＭナノ繊維上の神経突起の成長は、約１．３ｍｍであった。最も長く最も高密度な軸索伸張が、整列したＬＡＭ＋ｂＦＧＦナノ繊維上で観察された（図１４、ＬＡＭ＋ｂＦＧＦ）。ＬＡＭ＋ｂＦＧＦ成長上の神経突起の成長は、約４．８ｍｍであった。これらの結果は、ラミニンおよびｂＦＧＦからの化学的キュー、ならびに整列したナノ繊維基板からの物理的キューが、個々にまたは組み合わさって、感覚ニューロンからの軸索伸張を大幅に増進し導くことを明らかに示す。限界共焦点顕微鏡観察によって、伸長する神経突起は、生理活性ナノ繊維の誘導に従い、ランダムなナノ繊維および整列したナノ繊維上で独特なパターンを形成したことが示された（図１５）。
【実施例１１】
【０２７０】
長手方向に整列したポリマー足場の導管
生分解性のポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（Ｌａｃｔｅｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ、０．８２ｄＬ／ｇインヘレント粘度）を使用して、エレクトロスピニングによってナノ繊維の足場を加工した。ＰＬＧＡ溶液（ＨＦＩＰ中２０％ｗ／ｖ）を、プログラム可能なシリンジポンプによって電極の排出孔に１ｍＬ／時間の流量で供給した。高電圧源を使用して、１１ｋＶの電圧を印加した。コレクター基板は、その長軸の周りにマンドレルを回転することができるモーターに結合している接地した鋼マンドレルであった。Ｔｅｆｌｏｎテープをマンドレルの部分に巻き付け、非導電性領域を生成した。ＰＬＧＡ繊維がエレクトロスピニングされている間、マンドレルを低速で（＜１５ｒｐｍ）回転させた。ジェットは、非導電性Ｔｅｆｌｏｎテープ領域によって分離されたマンドレルの２つの部分の間を交番し、マンドレルの長軸に平行に整列したＰＬＧＡ繊維の付着をもたらした。マンドレルの回転によって、マンドレルの周りのＰＬＧＡ繊維の均一な被覆を確実にした。エレクトロスピニングの完了後、エレクトロスピニングされたＰＬＧＡ繊維状導管の縁を、メスで平滑末端化し、次いで導管をＴｅｆｌｏｎテープおよびマンドレルから取り出した。
【０２７１】
繊維の整列を確認するために、管をその長軸に沿って切開し、繊維の形態を光学顕微鏡で可視化した。繊維の大部分は長手方向に整列していた（すなわち、導管の長軸に沿って）。
【実施例１２】
【０２７２】
長手方向に整列したポリマー足場ロッド
生分解性のポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（Ｌａｃｔｅｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ、０．８２ｄＬ／ｇインヘレント粘度）を使用して、エレクトロスピニングによってナノ繊維の足場を加工することができる。ＰＬＧＡ溶液（ＨＦＩＰ中２０％ｗ／ｖ）を、プログラム可能なシリンジポンプによって、電極の排出孔に１ｍＬ／時間の流量で供給することができる。高電圧源を使用して、１１ｋＶの電圧を印加することができる。エレクトロスピニング工程によってロッドの形状の長手方向に整列した繊維を形成するために、専用のコレクター基板を使用することができる。コレクター基板は、中央に（すなわち、２ｃｍ）エアギャップを有して縦に並べて配置した２つの接地した金属マンドレルから構成することができ、電極の排出孔の下（すなわち、１５ｃｍ）に配置することができる。各マンドレルを、マンドレルをその長軸の周りに同調方式で回転させることができる電子的に制御されたモーターに装着することができる。エレクトロスピニング工程の間に、マンドレルを低速で（＜１０ｒｐｍ）回転させ、エレクトロスピニングされたポリマー繊維の均一の付着を確実にすることができる。エレクトロスピニング工程の間に、ポリマー溶液は、回収基板に向かうジェットを形成するであろう。この場合、ジェットは、２つのマンドレルの端部の間のエアギャップを横切り、ギャップの長さに沿って整列した（およびマンドレルの長軸と同じ配向を有する）繊維を形成するであろう。エレクトロスピニングが完了すると、エレクトロスピニングされたポリマー材料を、メスを使用し、マンドレルの縁に沿って切断することによって、２つの金属マンドレルの端部から分離することができる。結果は、繊維がその長軸に沿って整列したロッドの形状のエレクトロスピニングされた繊維状ポリマー足場となる。
【実施例１３】
【０２７３】
長手方向に整列した充填導管の繊維状ポリマー足場
長手方向に整列した繊維から構成され、長手方向に整列したポリマー繊維で充填導管を形成するために、下記の方法を使用することができる。最初に、長手方向に整列した繊維を有する中空の導管をエレクトロスピニングする。０．５ｃｍの内径を有する２ｃｍの長さの長手方向に整列した充填導管を生成するために、下記の条件を使用することができる。最初に、長手方向に整列した中空の導管を、少なくとも２ｃｍの長さおよび０．５ｃｍの直径の非導電性領域を有するマンドレルを使用して、本明細書に記載するようにエレクトロスピニングすることができる。次いで、長手方向に整列した中空の導管を、マンドレルから取り除いて、一定のサイズに切断することができる。充填材料は、本明細書に記載するような整列したポリマー繊維の高度に多孔質のシートとしてエレクトロスピニングされる。整列したナノ繊維のシートは、中空の導管の内腔の適切な寸法に成形することができる。次いで、整列した繊維のシートを導管に挿入して、その長軸に沿って整列したポリマー繊維で充填導管足場を生成する。
【０２７４】
充填材料は、整列した繊維から構成される巻かれたシートまたは長手方向に整列した繊維から構成されるロッドとして生成することができる。整列した繊維から構成される巻かれたシートを使用した充填材料を生成するために、本明細書に記載する方法を使用することができる。５０ミクロンの厚さを有する整列した繊維状のポリマー膜をエレクトロスピニングすることができ、２ｃｍ×２ｃｍ平方の部分を切断することができる。次いで、整列した繊維が巻かれたシートの長さに沿って走るように、シートをそれ自体の上に巻くことができる。形成されたロッドの直径が０．５ｃｍとなるまでシートを巻くことができる。次いで余分な材料を切断することができる。次いで巻かれたロッドの形状の充填材料を、鉗子で長手方向に整列した中空の導管中に挿入し、長手方向に整列した充填導管を形成することができる。充填材料を生成するために、本明細書に記載する方法による長手方向に整列した繊維から構成されるロッドの形状の繊維状ポリマー足場を使用することができる。適切な大きさに作ったロッドを生成するために、２つのコレクターマンドレルは、０．５ｃｍの直径であり、少なくとも２ｃｍ離れており、少なくとも２ｃｍのエアギャップを生成することができる。実施例１２におけるようにロッドをエレクトロスピニングした後、メスを使用し、マンドレルの縁に沿って切断して、それを取り出すことができる。次いでロッド形状の足場を、鉗子を使用して中空の導管内に挿入することができる。
【実施例１４】
【０２７５】
ＰＬＧＡナノ繊維の足場の調製
生分解性のポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（Ｌａｃｔｅｌ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ、１．０９ｄＬ／ｇインヘレント粘度）を使用して、エレクトロスピニングによってナノ繊維の足場膜を加工した。ＰＬＧＡ溶液（ＨＦＩＰ中２０％ｗ／ｖ）を、プログラム可能なシリンジポンプによって電極の排出孔に１ｍＬ／時間の流量で供給した。高電圧源を使用して、１１ｋＶの電圧を印加した。アルミ箔で覆われている接地されステッピングモーターによって制御されている回転する鋼ドラム（直径：１０ｃｍ、長さ：１０ｃｍ）上に繊維を付着させた（図４１を参照）。整列したナノ繊維では、コレクタードラムは４００ｒｐｍで回転した。整列していない繊維では、回収ドラムは＜３０ｒｐｍで回転した。繊維状足場が５００ｎｍ直径の繊維から構成される約１３０μｍの厚さとなるまでエレクトロスピニングを行った。繊維状ポリマーシートをドラムから取り除くために、ポリマー層および箔をドラムの長さに沿って切断し、ドラムから取り去った。次いで、繊維状ポリマー層をアルミ箔からはがし、長さ約３０ｃｍおよび幅１０ｃｍの繊維状ポリマーシートを生成した。
【０２７６】
位相差顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して繊維の整列を調べ、所与の用途に適するように繊維状ポリマーシートを所望の寸法に切断した。創傷治癒のために、ナノ繊維の足場片は、創傷の寸法に適合するように、または創傷縁を越えて拡張するように切断することができる。繊維の配向は、創傷の所与の軸に対して特定の角度で整列するように選択することができる。
【実施例１５】
【０２７７】
十字形交差ナノ繊維の足場の調製
繊維の十字形交差パターンを有する繊維状ポリマー足場を、いくつかの方法によって形成することができる。１つの例では、エレクトロスピニングを使用して、本特許で前述したように回転ドラム上で繊維を回収することによって、または整列していない繊維を伸ばすことによって、整列した繊維状ポリマーシートを生成することができる。次いで、これらの整列したポリマーシートをコレクタードラムから取り除き、各シート内の繊維が上および下のシート中の繊維と直交して整列するように互いの上に層状にすることができる（図３８）。さらに、機械的強度および安定性のために、シートを一緒に縫合することができる。
【０２７８】
第２の例において、ドラムに沿った長手方向の繊維のエレクトロスピニングのために中心に非導電性部分を有する導電性ドラムを利用することによって、十字形交差パターンを形成することができる。直径１０ｃｍおよび長さ１０ｃｍの鋼ドラムをモーターに固定することができる。Ｔｅｆｌｏｎテープを、ドラムの周りに巻き、その４ｃｍ幅を覆うことができる。十字形交差パターンを生成するために、ドラムを最初に低速（＜３０ｒｐｍ）でスピンし、非導電性Ｔｅｆｌｏｎテープ領域に亘って長手方向軸に沿って整列した繊維を生成させる。その後にドラムを高速（＞１００ｒｐｍ）で回転させ、第１の層に直交に整列した繊維を生成する。ドラムの低速回転および高速回転を切り替えることによって、Ｔｅｆｌｏｎテープ領域上に付着した一連の整列した線維層が生成され、これが十字形交差パターンを生じさせるであろう。代わりに、非導電性領域が本発明において前述したマンドレルの設計と同様の２つの導電性金属領域の間に挟まれているドラムを構築することができる。
【０２７９】
第３の例では、十字形交差で整列した繊維を有する繊維状ポリマー足場シートは、回転ドラムをコレクター基板として使用してエレクトロスピニングすることができる。エレクトロスピニング設定は、エレクトロスピニングされた整列した繊維状ポリマーシートのために本明細書に記載するように構築することができる。整列した繊維の層を回転ドラム上に付着することができる。次いで、繊維の層をドラムからはがし、９０°回転させ、ドラムコレクター上に戻すことができる。ドラムを再び高速で（＜１００ｒｐｍ）回転させ、整列した繊維を付着させることができる。この工程を何度も繰り返して、繊維の任意の所与の層がそれに隣接している線維層に対して直交に整列している十字形交差の整列した繊維状ポリマー足場シートを生成することができる。
【実施例１６】
【０２８０】
マイクロ／ナノ繊維による創傷治癒
ＰＬＬＡマイクロ／ナノ繊維シートを、整列した繊維または整列していない繊維で実施例１０に記載したように生成した。人工の創傷またはギャップの欠陥を、下記のようにこれらの繊維シート上に正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の単層中に生成した。最初に、手万力を使用して１８ゲージシリンジ針を扁平にした。第２に、ナノ繊維状ＰＬＬＡメッシュを１×１ｃｍの寸法に切断した。扁平にした針およびメッシュを、７０％イソプロピルアルコールおよび紫外線で３０分間滅菌した、繊維の整列に対して所望の配向のナノ繊維に亘って、針を固定して配置した。繊維は、創傷の軸に対して平行、垂直であるか、または整列していなかった（図３５）。ＮＨＤＦを、全領域に亘って集密的に播種したが、針によって細胞が下で結合することを防いだ（図３５）。細胞が接着した後、針を除去し、「創傷」をその場所に残した。培養物を、加湿したインキュベーター中３７℃で５％ＣＯ２と共に１〜２日間保持し、細胞遊走および創傷の被覆の時間をとった。播種する前に、ＮＨＤＦをＤｉＩ細胞追跡剤（１：２０００希釈度、１０分）で短時間染色し、当初の創傷サイズを観察し、創傷への細胞浸潤の進行をモニターした。
【０２８１】
マイクロ／ナノ繊維上のＮＨＤＦを、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、１％ＢＳＡでブロックした。細胞骨格染色のために、試料を、抗全アクチン一次抗体と共に６０分間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ共役抗ヤギＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に６０分間インキュベートした。細胞骨格の特徴を使用して、細胞の配向および形態、ならびにＮＨＤＦ単層の全体的組織および創傷の被覆を決定した。ＮＨＤＦ核を、細胞計数を可能とするためにＨｏｅｃｈｓｔで５分間染色した。整列していない繊維上で、細胞遊走および創傷の被覆は、２４時間後にほんの中程度であったが、繊維を創傷の長縁に対して垂直に配向した場合、大幅に増進された（図３６）。また、ＮＨＤＦは、整列していない繊維上ではランダム配向のままであるが、整列した繊維上では繊維の方向に配向していた。
【実施例１７】
【０２８２】
創傷治癒
ＰＬＬＡ繊維状ポリマー足場シートを、整列した繊維のみを使用して実施例１６に記載したように創傷治癒のために生成した。細胞播種前に、繊維状ポリマー足場シートを、実施例１０に記載したようにラミニンおよび／またはｂＦＧＦで官能化した。ｂＦＧＦは、前述のようにポリマー足場シートに固定化されるか、または培地中に可溶性形態で存在した。さらにまた、人口の創傷またはギャップの欠陥を、実施例１６に記載したように、これらの繊維シート上の正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の単層中で生成した。全ての試料についての繊維の整列は、創傷の長軸に対して垂直であった。細胞遊走および創傷の被覆を、実施例１６に記載するように免疫染色および顕微鏡観察によって分析した。未処理の繊維上のＮＨＤＦは、２４時間後に創傷領域を完全に覆わず、一方処理済の繊維（ラミニンまたはｂＦＧＦ）上のＮＨＤＦは、創傷により早く遊走し、創傷の被覆が増進されたことを示した（図３７）。
【実施例１８】
【０２８３】
動物におけるナノ繊維による創傷治癒
整列した生分解性のポリマーナノ繊維シートは、実施例１４に記載するように回転ドラムコレクターを使用して生成されるであろう。これらのシートは、動物の皮膚組織修復を助けるために創傷被覆材として使用されるであろう。外科医は、ラットの背中上の全層ギャップの欠陥を切断するであろう。マイクロ／ナノ繊維シートは、創傷の寸法に切断され、皮膚層に縫合され、線維芽細胞のギャップへの遊走が助長されるであろう。創傷治癒および組織の再生を、デジタル写真、組織診断、および免疫組織化学を使用してモニターするであろう。
【実施例１９】
【０２８４】
ヒルジン生体模倣足場の作製方法
本発明のヒルジン生体模倣足場を、下記の手順を使用して生成することができる。
１．１５〜２５重量／容量パーセントのポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（グリコール酸）、両方の組合せ、または任意の他の生分解性／生体吸収性ポリマーもしくはブレンドを、溶媒（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）に溶解する。
２．０．１〜５重量／重量パーセントの塩（塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）をポリマー溶液に加えて、溶液の導電性を増加させ、繊維の直径を減少させることができる。
３．本明細書に記載するエレクトロスピニング技術を使用して、ポリマー溶液を基板に付着させる（マンドレルの直径０．１〜１０ｃｍ、平らなコレクタープレート）。
４．エレクトロスピニングされた導管中の溶媒を数時間蒸発させる。
５．導管を７０％エタノール中で滅菌し、ＵＶ殺菌剤下に最低３０分間配置する。
６．試料を再蒸留水で完全に洗浄する。
７．０．０１〜１規定ＮａＯＨを使用して、導管を最低１０分間処理し、ポリマー上のカルボキシル基の数を増加させる。
８．試料を再蒸留水で完全に洗浄する。
９．１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣまたはＥＤＡＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を使用して、官能性アミン基をポリマー上の露出したカルボキシル基に結合する。ビス（アミン）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はアミン基をもたらし、緩衝液はｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または０．５モルの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸である。この溶液を、エレクトロスピニングされた導管と共に室温で１時間インキュベートする。
１０．試料を再蒸留水で完全に洗浄する。
１１．ＥＤＣ、スルホ−ＮＨＳおよび緩衝液を使用して、ビス（アミン）ＰＥＧ上のアミン基をヒルジンのカルボキシル基に最終的に結合する。この溶液を、エレクトロスピニングされた導管と共に室温で２時間インキュベートする。
１２．試料をＰＢＳで完全に洗浄する。
１３．試料を真空下で乾燥または空気乾燥し、滅菌様式で保存する。
１４．外科的移植の前に、移植片を滅菌生理食塩水中に１０分間置く。
【実施例２０】
【０２８５】
生体模倣足場を伴う動物研究
全ての手順は、カリフォルニア大学（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）の治験審査委員会および動物実験委員会によって承認された。胸腺欠損ラット（６〜８週齢、約１８０ｇ）を、国立癌研究所の動物施設から得た。ラットを、２．０％イソフルランで麻酔し、仰臥位で置いた。小さく切開し、左総頸動脈（ＣＣＡ）を露出および単離した。それをクランプ、結紮し、移植片を端々で配置し、１０−０結節縫合で縫合した。移植手順の前または間のどの時点でもヘパリンまたは任意の他の抗凝血剤を使用しなかった。移植片の取り出しは、移植のための同じ最初のステップを伴った。４９ユニットのヘパリンを外頸静脈に注射し、移植片の取り出しの間の血液凝固を防いだ。移植片は、縫合場所に直接隣接したネイティブなＣＣＡの結紮によって取り出した。組織分析のために、試料をＯＣＴ内に置き、−２０℃で凍結保存した。凍結切片は１０μｍの厚さで採取した。免疫組織化学染色を使用して、下記の一次抗体によって部分を分析した。ＣＤ３１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミオシン重鎖（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＣＤ６８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。負の対照として一次抗体の代わりにマウスＩｇＧアイソタイプ（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を使用した。免疫組織化学像をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ＭＯＴ顕微鏡で取り込んだ。
【０２８６】
共有結合している生体分子（すなわち、ヒルジン）を含有していないＰＬＬＡ移植片を生成し、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約１８０グラム）の総頸動脈に３０日間移植した。移植の前、間または後のいかなる時点でも全身性抗血小板剤、抗凝血剤またはヘパリンは使用しなかった。図４２Ａにおけるヴァーヘフ弾性染色は、移植片が有意な内側の組織修復、血栓形成および内膜過形成を有することを示す。ＰＬＬＡ移植片（暗紫色に染色）と内膜組織（移植片から離れて内腔に向かって成長する）との比較から、血栓が明らかである。図４２Ｂにおいて、血栓組織に接着し、ＰＬＬＡ移植片から離れる内皮細胞（ＣＤ３１）のコンフルエントな単層がある。図４２Ｃにおける平滑筋細胞特異的染色（ミオシン重鎖）は、内膜過形成および内側の組織修復の明確な徴候を示す。図４２Ｄにおいて単球およびマクロファージ（ＣＤ６８）の数は、ヒルジン移植片と比べて僅かに多く、移植片の壁内に存在する。
【０２８７】
２種のヒルジン共役移植片を生成し、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約１８０グラム）の総頸動脈に２８日間移植した。移植の前、間または後のいかなる時点でも全身性抗血小板剤、抗凝血剤またはヘパリンを使用しなかった。図４３Ａにおけるヘマトキシリン染色は、１００％開存性で(patent)、血栓がない内腔を示す。図４３Ｂにおいて、ＰＬＬＡナノ繊維の内腔側に直接接着した内皮細胞（ＣＤ３１）のコンフルエントな単層があり、移植片が血栓を有さないことはあきらかである。図４３Ｂにおいて、平滑筋細胞特異的染色（ミオシン重鎖）は、内膜過形成の兆候を示さない。図４２Ｄにおいて、単球およびマクロファージ（ＣＤ６８）の数は少なく、ＰＬＬＡ移植片の周辺部に限定されている。
【０２８８】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｓｔｅｒ＊Ｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のヴァーヘフ弾性染色キットは、弾性繊維および膠原線維を示す。ＯＣＴが埋め込まれた冷凍された試料を７μｍで凍結切断した。画像では、弾性繊維を黒で、膠原線維を赤で示す。ヴァーヘフ処理用染色は、ヘマトキシリン、塩化第二鉄およびヨウ素溶液の混合物であり、各試料をこれに１５分間さらす。次いで、２％塩化第二鉄分別溶液を３分間使用し、次いで試料をワンギーソン染色中に３０秒間置く。一連の段階的なアルコール脱水を通してスライドを配置し、ＳａｆｅｃｌｅａｒＩＩで洗浄し、ｐｅｒｍｏｕｎｔでマウントする。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色：Ｈａｒｒｉｓ法
材料：全てを赤い可燃性のキャビネット中に保管する。
【０２８９】
【表２】
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【０２９０】
プロトコル
１．スライドを蒸留水ですすぐ。
２．Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン中に３分間漬ける。
３．清澄となるまで１０秒間３回水道水で洗浄する。
４．青溶液で１分間青く染色する。
５．清澄となるまで１０秒間水道水で洗浄する。
６．エオシンで３０秒間対比染色する。
７．段階的なエタノール（９５％、１００％、１００％を各々１分間）で脱水する。
８．キシレン（またはＳａｆｅｃｌｅａｒＩＩ）で各々５分間脱水する。
９．樹脂性封入剤（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）でマウントする。
化学廃棄物で処分：Ｈ、Ｅ、アルコール
可視化（Ｈ：紫＝核；Ｅ：ピンク＝マトリックス、サイトゾル）
【０２９１】
本明細書に記載する実施例および実施形態は例示のためにすぎず、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらは本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されることが理解される。本明細書において引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【国際調査報告】
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