(57)【要約】  本発明は、皮膚に及ぼす電磁波の作用と闘うための少なくとも１つの表皮分化活性化剤の化粧用使用に関する。本発明は、皮膚に及ぼす電磁波の作用と闘うための少なくとも１つの表皮分化活性化剤を含む化粧品組成物の皮膚又は外皮への適用を包含する美容的処置方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に及ぼす電磁波の作用と闘うための表皮分化の少なくとも１つの活性化剤の化粧用使用。
【請求項２】
前記活性化剤がイワベンケイ（Rhodiola rosea）の抽出物、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の抽出物、セドレロプシス・グレベイ（Cedrelopsisgrevei）の抽出物、アツケシソウ（Salicorniaherbacea）の抽出物、ヘーゼルナッツ又はカプリリルブチラートのペプチド抽出物から選択される植物又は海洋起源の抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記活性化剤がイワベンケイの抽出物、サーマス・サーモフィルスの抽出物及びセドレロプシス・グレベイの抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
イワベンケイの抽出物が植物の根から得られる抽出物であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
イワベンケイの根の抽出物がヒドログリコール性抽出物(hydroglycolic extract)であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記サーマス・サーモフィルスの抽出物がバイオテクノロジーにより得られるサーマス・サーモフィルス細菌の抽出物であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項７】
前記セドレロプシス・グレベイの抽出物が木の樹皮から得られる抽出物であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項８】
前記セドレロプシス・グレベイ樹皮の抽出物がヒドログリコール性又はヒドログリセリン抽出物であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が、以下の：
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のイワベンケイ抽出物；及び／又は
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のサーマス・サーモフィルス抽出物；及び／又は
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のセドレロプシス・グレベイ抽出物
を含有することを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
皮膚に及ぼす電磁波の作用と闘うための美容的処置方法であって、表皮分化の少なくとも１つの活性化剤を含む化粧品組成物の皮膚又は外皮への適用を包含する美容的処置方法。
【請求項１１】
前記活性化剤がイワベンケイの抽出物、サーマス・サーモフィルスの抽出物及びセドレロプシス・グレベイの抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚及び外皮(integument)に及ぼす電磁波の作用と闘うための化粧品組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は約２ｍ２の表面積を有し、身体の最大器官である。皮膚は、相互作用性バリアであり、生命にとって不可欠であり、身体及び環境間の真の界面である。皮膚は、攻撃の表面で適応するか又は反応する大きな能力を有する。皮膚は、環境からの汚染物質の吸収のための好都合な部位でもあり、直接的皮膚毒性作用を有し得る物質の通過を伴う。
【０００３】
汚染物質は、種々の外観をとり得る：十分に実証された粒状及びガス状汚染物質のほかに、電磁波による新規の形態の汚染も付加される。汚染は或る箇所の外側に限定されず、内側にも関する：合成物質及び／又は家庭化学物質の使用は、新規の汚染物質を発生する。主な汚染作用物質は、フリーラジカルを発生する微粒子及びオゾンである。
【０００４】
皮膚は、汚染作用物質と直接接触している。皮膚科専門医は、都市部において、刺激性及び感受性皮膚の急増に、そして或る種の皮膚疾患の悪化に直面している。
【０００５】
多数の研究が、皮膚と接触している場合の汚染作用物質の刺激可能性を示している。汚染作用物質は、皮膚の脂質の組成の改質に及ぼす作用を有し、そのｐＨを酸性化する。これらの種々の改質は、皮膚のバリア機能の崩壊をもたらし、そして表皮の生きている層における酸化的及び炎症的性質と、ストレスタンパク質、前炎症性サイトカイン及びメタロプロテイナーゼの発現との反応を誘導する。
【０００６】
電磁波は、電場及び磁場の振動からなるエネルギーの一形態である。電磁波を見ることも触ることもできないが、しかし電磁波は我々の家庭環境中に漸増的に存在する。
【０００７】
我々の住居において、家庭用電気器具及び設備（電子レンジ、テレビ、ラジオ、携帯電話等）により発生する磁場に我々は曝露される。
【０００８】
相対的に高い閾値から出発して、個々の感受性によって、これらの電磁場は我々の代謝に影響し得る。
【０００９】
皮膚に及ぼす電磁波の結果は、あまり知られていない。皮膚レベルに及ぼすそれらの作用を評価するために、本出願人は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成された表皮を所定の周波数の電磁波に曝露することを可能にするオリジナルモデルを開発した。ストレスに応答した熱ショックタンパク質の産生の増大、β−デフェンシンＩＩの合成の低下、フィラグリン及びロリクリンの合成の低下、したがって主に表皮分化の低下を強調することを、本出願人の研究は可能にした。
【００１０】
表皮の最終分化はベクトル化プロセスであり、この間、ケラチノサイト（表皮の胚芽基底層から）は、最終的にそれを角層細胞に転換する進行性代謝的及び構造的再編成を受ける。これらの角層細胞のスタックは、身体の機械的保護を（その大きな強度により）提供し、そして水分損失及び外因性分子の浸透を阻むことにより個体とその環境との間にバリアを形成する皮膚の最外部である角層を構成する。このように形成された強く且つ不透過性である角層は、水の感知できないほどの損失を制限すること、したがってその上の層の良好な水分補給を皮膚に与えて、「正常皮膚」と定性される皮膚の柔軟性及び弾性を皮膚に与えることを可能にする。
【００１１】
表皮分化の低下は、不十分な構造の角質層をもたらす。この構造撹乱の結果は皮膚バリアの凝集力低減（低不透過性になる）であり、外部攻撃から皮膚をあまり有効に保護しない。その後に、皮膚水分補給の低下、皮膚の柔軟性及び弾性の低下が続く。
【００１２】
表皮モデルに及ぼす波動の作用は、フィラグリン及びロリクリンの低下により表わされる。表皮分化の低下の作用をモニタリングするために用いられるマーカーは、ロリクリンである。これは、このタンパク質が主要構成成分（角層細胞の膜の６６％）であるためである（The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 30, p. 17702-17711, 1995）。角質層中のロリクリンの低下の結果はその構造の有意の解体であり、したがって表皮層の不十分な凝集力である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって本発明は、皮膚に及ぼす電磁波の作用と闘うための表皮分化の少なくとも１つの活性化剤の化粧用使用に関する。
【００１４】
「表皮分化の活性化剤」という表現は、実験の項により正確に記載されているサイトケラチン及びフィラグリンを免疫標識する技法に従って対照に比して表皮分化を有意に増大することを可能にする活性作用物質を意味すると理解される。サイトケラチン１０の合成にならびにフィラグリン（表皮分化マーカーを代表する）に及ぼす活性作用物質の作用は、単一層中のヒトケラチノサイトの培養中で分析される。分化の２つのマーカーは、免疫細胞化学作用により明示される。蛍光の強度は、マーカーの存在又は非存在を突き止めることを可能にする。
【００１５】
本発明による表皮分化の活性化剤は、好ましくは植物又は海洋起源である。表皮分化の既知の活性化剤の中で、以下のものが例として挙げられ得る：アツケシソウ（Salicornia herbacea）の抽出物、例えば「サリコルヌ油（huile de Salicorne）」（サムファイア油（samphireoil））の名称でCodifにより販売されているもの、ヘーゼルナッツのペプチド抽出物、例えば「Nuteline C」の名称でSolabiaにより販売されているもの、或いはカプリリルブチラート。好ましくはイワベンケイ（Rhodiola rosea）の抽出物、例えば「イワベンケイ抽出物」の名称でArch Personal Careにより販売されているもの、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の抽出物、例えば「Venuceane（登録商標）」の名称でSederma により販売されているもの、ならびにセドレロプシス・グレベイ（Cedrelopsisgrevei）の抽出物、例えば「セドレロプシス・グレベイの抽出物」の名称でBayer Healthcareにより販売されているもの、が選択される。
【００１６】
イワベンケイは、東シベリアの北極地方の高地に自生する多年生植物である：イワベンケイは、寒冷且つ乾燥した岩場の砂質土壌に生育する。イワベンケイは、化学的、生物学的又は物理的ストレスに耐える大きな能力を有する。この植物は、高い抗酸化力を有するフェノール系化合物に富んでいるだけでなく、フラボノイド、サリドロサイド、ロサビン、ロジン及びロザリンにも富む。
【００１７】
本発明の情況で用いられ得る抽出物は、植物の根から得られ、好ましくはヒドログリコール性抽出物であるのが有利である。乾燥後、イワベンケイの根は、溶媒、水及びペンチレングリコールの混合物中でふやかされて、約５０℃の温度で加熱される。適切な濾過により抽出物を仕上げて、琥珀色で特徴的臭いを有する液体の形態にする。これは以下の分析特性を有する：
−  ｐＨ：４．０〜６．０；そして
−  活性物質のパーセンテージ：０．６％〜１．２％。
【００１８】
本発明の情況で用いられ得る抽出物は、海洋生物：サーマス・サーモフィルスを微小培養することにより得られる抽出物であり得るのも有利である。この微生物は、カリフォルニア湾のグアイマス海盆中に、７５℃で、２００ｂａｒの圧力で、高濃度のイオウ及び重金属での２０００ｍの深さの深海（極端な温度条件及び全くのプロオキシダント環境）に生息する。
【００１９】
本発明の情況で用いられ得る抽出物は、バイオテクノロジーにより得られるのが有利である。サーマス・サーモフィルスは、標準発酵培地上で培養され、このようにして得られた濾液は、接線限外濾過により濃縮され、最後に濾過される。抽出物は、特徴的臭いを有する透明〜わずかに乳白光を帯びた黄褐色液体の形態である。これは、以下の特性を有する：
−  ｐＨ：７．０〜８．０；
−  密度：１．０１０〜１．０３０；
−  屈折率：１．３３５〜１．３５５。
【００２０】
最後に、本発明の情況で用いられ得る抽出物は、有利にはセドレロプシス・グレベイの抽出物であり得る。セドレロプシス・グレベイは、マダガスカルに固有の、そしてプタエロクシラ科からの５ｍ〜２２ｍの樹木である。それは特に、海抜１００ｍ〜８００ｍの密な且つ乾燥した森林に見出される。
【００２１】
本発明に従って用いられるセドレロプシス・グレベイ抽出物は、有利には樹木からの樹皮の抽出物であり、好ましくはヒドログリコール性又はヒドログリセリン抽出物である。乾燥された後、粉砕樹皮は、アルコール及び水の混合物中でふやかされる。アルコールを蒸発し、ブチレングリコールで再調整した後、抽出物は滅菌濾過される。セドレロプシス・グレベイ抽出物は、特徴的臭いを有する琥珀色液体の形態である。
【００２２】
本発明の組成物は、表皮分化の活性化剤である1つ又は複数の植物又は海洋性抽出物を含有し得る。さらに特定的には、本発明の組成物は、アツケシソウの抽出物、ヘーゼルナッツ又はカプリリルブチラートのペプチド抽出物から選択される1つ又は複数の活性化剤を含有し得る。最も好ましくは、本発明の組成物は、イワベンケイの抽出物、サーマス・サーモフィルスの抽出物、ならびにセドレロプシス・グレベイの抽出物から選択される1つ又は複数の抽出物を含有し得る。
【００２３】
本発明による組成物は、以下の：
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のイワベンケイ抽出物；及び／又は
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のサーマス・サーモフィルス抽出物；及び／又は
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のセドレロプシス・グレベイ抽出物
を含有する。
【００２４】
局所適用のための本発明の化粧品組成物は、特に、顔面用の、首用の、手用の、又は身体用の美容的又は皮膚科学的保護、処置又はケアのための組成物、例えば昼用クリーム、夜用クリーム、日焼け用クリーム又はオイル、ボディミルク、毛髪用組成物（例えばヘアローション）、メーキャップ組成物（例えばファンデーション）、或いはセルフタンニング組成物を構成し得る。本発明の化粧品組成物は、好ましい一使用形態では、昼用ケアクリームである。
【００２５】
本発明による化粧品組成物は、当業者に既知である1つ又は複数の他の構成成分、例えば化粧品組成物中に慣用的に用いられることが既知である処方剤又は添加剤を含有し得る。例として、そして非限定的に、このような処方剤及び添加剤は、親水性又は親油性ゲル化剤、柔軟剤、染料、可溶化剤、テクスチャリング剤、フレグランス、充填剤、臭気吸収剤、皮膜形成活性剤、防腐剤、界面活性化剤、乳化剤、油、グリコール、ビタミン、日焼け止め剤等であり得る。化粧品に関する知識に基づいて、本発明の化粧品組成物に付加すべき処方剤はどれか、そして所望の特性によってどれだけの量で付加するかが、当業者には分かるであろう。
【００２６】
さらに、本発明の化粧品組成物は、皮膚に適用するという以外如何なる特定の薬学的制限を伴わずに、化粧品分野の当業者に既知の任意の形態であり得る。したがって本発明の化粧品組成物は、水性又はアルコール性の溶液又は懸濁液の形態、或いは油性懸濁液の形態、或いはローション又は美容液タイプの溶液又は分散液の形態、水性相中の脂肪相の分散（水中油型エマルション：Ｏ／Ｗ）又はその逆（油中水型、Ｗ／Ｏ）により得られるミルク型の液体又は半液体粘稠度を有する乳濁液の形態、或いはＯ／Ｗ又はＷ／Ｏクリーム型の乳濁液形態、或いはゲルの形態、或いはローション又はマスクの形態であり得る。本発明による化粧品処方物は、ムースの形態、或いはそれ以外に加圧噴射剤も含むエアロゾル組成物の形態でも想定され得る。
【００２７】
本発明は、皮膚に及ぼす電磁波の作用と闘うための表皮分化の少なくとも１つの活性化剤を含む化粧品組成物の皮膚又は外皮への適用を包含する美容的処置方法にも関する。上記の活性化剤は、好ましくは、イワベンケイの抽出物、サーマス・サーモフィルスの抽出物、ならびにセドレロプシス・グレベイの抽出物から選択される。
【００２８】
以下の例は、一方で、表皮前分化活性の評価に、他方では、皮膚に及ぼす電磁波の作用の評価に関し、そしてイワベンケイ及びサーマス・サーモフィルスの抽出物の使用により提供される保護の評価にも関する。それらは、本発明の目的である組成物にも関する。
【００２９】
実施例は、以下の図面に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1は、非曝露対照の写真を示し、対照は抗ロリクリンを伴わない。
【図２】図2は、ロリクリン標識化を伴う非曝露対照の写真を示す。
【図３】図3は、波動に曝露され、曝露１８時間後にロリクリン標識された対照の写真を示す。
【図４】図4は、曝露１８時間後の対照を示す。
【図５】図5は、サーマス・サーモフィルス抽出物及びイワベンケイ抽出物の混合物で処置され、波動に曝露され、曝露１８時間後にロリクリン標識された表皮を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．  表皮前分化活性の評価
当該プロトコールは、単一層中のヒトケラチノサイトの培養中のサイトケラチン１０及びフィラグリン（表皮分化のマーカーを表わす）の合成に及ぼす活性作用物質の作用を分析することを可能にする。
【００３２】
栄養培地中で４日間処理後、分化の２つのマーカーは免疫細胞化学作用により明らかにされた。
【００３３】
Ａ．材料及び方法
１．  使用細胞
−  種類：ヒト表皮ケラチノサイト
−  培養：３７℃、５％ＣＯ２
−  培地：ＤＭＥＭ（ダルベッコの改良必須培地）培地＋１０％ＦＶＳ（ウシ胎仔血清）
【００３４】
２．  プロトコール
細胞をすすぎ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のＦＶＳを含有するＤＭＥＭ培地（試験のために用いられる栄養培地）中で２４時間インキュベートする。細胞をすすぎ、選択された種々の濃度で試験されるべき活性作用物質とともに９６時間インキュベートする。
【００３５】
次に各細胞層をすすぎ、メタノール（−２０℃）中で固定した後、免疫蛍光によりフィラグリン及びサイトカイン１０を明示する。
【００３６】
Ｂ．結果
紫外線で観察する場合、マーカーと結合されたフルオレセインは緑色の蛍光を発し、それらの位置を突き止めることを可能にする。
【００３７】
ＩＩ．  再構築表皮に及ぼす９００ＭＨｚの周波数を有する電磁波の作用の評価
Ａ．材料及び方法
１．  電磁波への曝露
所望の周波数の電磁波以外の如何なる電磁波も有さないために、６時間にわたって、絶縁小室中で９００ＭＨｚの波動に再構築表皮モデルを曝露した。実験のために選択された９００ＭＨｚの波動は、携帯電話からの最も高周波の波動に対応する。
【００３８】
曝露後、曝露により引き起こされる撹乱を評価するために、表皮は３７℃でインキュベートされる。表皮は１８時間インキュベートされる：それは非曝露対照表皮と比較される。
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構築表皮に及ぼす９００ＭＨｚの周波数を有する電磁波の作用を決定するために、ＤＮＡチップ技法を用いた。この最新技法は、遺伝子発現の考え得る活性化又は抑制を測定することを可能にする。選択されるチップは、表皮の６００の主要遺伝子の発現をモニタリングすることを可能にする。次に、ＲＴ−ＰＣＲ又は逆転写ＰＣＲ技法による確証を実行した。
【００４０】
２．  使用試料
ａ）ＤＮＡチップ及びＲＴ−ＰＣＲのための試料
−  Ｔ１（６時間）及びＴ２（６時間）：非曝露対照、６時間後に中断（＝６時間対照）。
−  ＥＸＰ１（６時間）及びＥＸＰ２（６時間）：６時間曝露及び直後に中断（＝６時間曝露）。
−  Ｔ３（６時間＋１８時間）及びＴ４（６時間＋１８時間）：６時間曝露されず、そして１８時間の付加的インキュベーション後に中断された対照（＝６時間＋１８時間対照）。
−  ＥＸＰ３（６時間＋１８時間）及びＥＸＰ４（６時間＋１８時間）：６時間曝露、そして１８時間の付加的インキュベーション後に中断（＝６時間＋１８時間曝露）。
【００４１】
ｂ）免疫組織化学用試料
６時間曝露され、１８時間のインキュベーション後に中断された表皮のバッチ
−  非曝露表皮のバッチ（対照）
−  曝露表皮のバッチ（曝露対照）
−  イワベンケイの抽出物及びサーマス・サーモフィルスの抽出物で処理され、曝露された表皮のバッチ。
【００４２】
３．  遺伝子発現に及ぼす作用  −  ＤＮＡチップ
皮膚生理学におけるそれらの重要性のために選択された「Ｃｕｓｔｏｍ  ＡＴＬＡＳ  ＢＡ６００／１」膜に関して、ＤＮＡチップによる遺伝子発現の分析を実行した。
【００４３】
用いられる方法は、Clontechにより推奨されるものである（Palo Alto, USA, protocol No. PT3140-1, version No. PR0X591-http://www.clontech.com/clontech/techinfo/manuals/PDF/PT3140-1.pdf）。
【００４４】
各試料のＲＮＡの抽出／精製は、適量の総ＲＮＡの単離をもたらした。
【００４５】
可能性のあるＲＮアーゼを阻害するために、ＲＮアーゼＯＵＴ酵素のすべてを含有する総ＲＮＡの溶液を、Ambionにより推奨された手法（Ref. 1906 - manual version 0503 (http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_1906.pdf)）に従ってＤＮアーゼＩで処理して、ＲＮＡに夾雑するあらゆる極微量のＤＮＡを排除した。
【００４６】
次に、質、量、及びＤＮＡの非存在の検証のために、アガロースゲル上で、ＲＮＡの質を検証した。
【００４７】
同一処理を受けた試料から生じるＲＮＡをプールした。
【００４８】
以下の工程は、AtlasPure（Clontech）プロトコールに従った、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）末端とビオチニル化オリゴ（ｄＴ）プライマーとのハイブリダイゼーションによるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のプールの精製、ならびにストレプトアビジン・ビーズ上での選択的捕捉であった。［α３３Ｐ］−ｄＡＴＰの存在下で、チップ上に固定された特定配列プライマーのバッチを用いて、ポリ（ｄＴ）のビーズと結合されたｍＲＮＡの逆転写により、３３Ｐで標識された多重ＤＮＡプローブを産生した。この工程は、Clontechにより推奨された反応体及びプロトコールを用いた。サイズ排除クロマトグラフィーにより標識化プローブを精製し、標識化プローブの質及び等価性を液体シンチレーション計数法により評価した。
【００４９】
２シリーズの２つの「Ｃｕｓｔｏｍ  ＡＴＬＡＳ  ＢＡ６００／１」膜を前処理し、次に、各膜上に固定されたｃＤＮＡを対応する標識化プローブとハイブリダイズ（６８℃、一晩）した：次にフィルターを広範に洗浄し（６８℃）、分析のために個々のプラスチック袋中に入れた。
−  シリーズＮｏ．１：膜Ｎｏ．１  −  非曝露対照、６時間後に中断＝６時間対照。
膜Ｎｏ．２  -  ６時間曝露、直後に中断＝６時間曝露。
−  シリーズＮｏ．２：膜Ｎｏ．１  -  ６時間曝露されず、１８時間の付加的インキュベーション後に中断された対照＝６時間＋１８時間対照。
膜Ｎｏ．２  -  ６時間曝露、及び１８時間の付加的インキュベーション後に中断＝６時間＋１８時間曝露。
【００５０】
ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  Ｃｙｃｌｏｎｅ装置（Packard Instruments、３時間、次に７２時間の獲得）及びＢＤ  ＡｔｌａｓＩｍａｇｅ（商標）２．７ソフトウェア（BD Biosciences Clontech）を用いて、スポットの放射能の直接定量により、分析を実行した。
【００５１】
４．  ロリクリンの発現に及ぼす作用  −  ＲＴ−ＰＣＲ
選択マーカーであるロリクリンの発現の確証を、ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲにより評価した。
【００５２】
ａ）逆転写
オリゴ（ｄＴ）プライマー及び酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Gibco）の存在下で、ｍＲＮＡの逆転写反応を実行した。この後に、合成されたｃＤＮＡの（蛍光による）定量、ならびに濃度の調整が続いた。各ｃＤＮＡのさらなる定量を、最終希釈後に、実行した後、ＰＣＲ反応を実施した。
【００５３】
ｂ）定量的ＰＣＲ
「Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ」システム（Roche Molecular Systems Inc.）を用いて、且つ供給元によって推奨された手順に従って、定量的ＰＣＲにより、ＰＣＲ又はＰＣＡ（重合鎖増幅）反応を実行した。
【００５４】
分析のこのシステムは、種々のプライマーの分析条件を予め完全なものにすることにより、迅速且つ高性能ＰＣＲ反応を実行することを可能にさせた。それは、以下の２つの主な構成要素から構成される：
−  サーモサイクラー：ガラス毛管の使用のために、そして極急速熱伝導のために最適化される；及び
−  蛍光計：ＤＮＡ中に組入れられた蛍光の強度を連続的に測定することを可能にする（５２１ｎｍで検出）。
【００５５】
各試料のために毛管中に導入される反応混合物（最終１０μｌ）を以下に示す：
−  １／１０に希釈される２．５μｌのｃＤＮＡ；
−  用いられる種々のマーカーのプライマー；
−  酵素Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、マーカーＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（伸長工程中に二本鎖ＤＮＡに挿入される蛍光物質）及びＭｇＣｌ２を含有する反応混合物（Roche）。
【００５６】
ＰＣＲ条件を以下に示す：
−  活性化：９５℃で１０分；
−  ＰＣＲ反応：［９５℃で１０秒、６４℃で５秒及び７２℃で３５秒］を４０サイクル；ならびに
−  融解：９５℃で５秒、次に６０℃で５秒。
【００５７】
ｃ）Ｑ−ＰＣＲの分析
増幅ＤＮＡ中への蛍光の組入れを、ＰＣＲサイクル中に連続的に測定する。このシステムは、ＰＣＲサイクルの関数としての蛍光測定曲線を得ることを、したがって各マーカーに関する相対的発現値を評価することを可能にする。
【００５８】
ＲＥ（相対的発現）値は、以下の方程式に従って任意の単位で表わされる：
（１／２サイクル数）×１０６
【００５９】
５．  ロリクリンの発現に及ぼす作用  −  免疫組織化学
ミクロトーム（厚さ５μｍ、２スライド／表皮、数切片／スライド）を用いて、表皮の横断切片を採取し、次に、標識化を実行するまで周囲温度で保持した。
【００６０】
氷アセトン中で、−２０℃で１０分間、切片を脱パラフィンして、次に、蒸留水ですすいだ。Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ機（DakoCytomation）及びＬＳＡＢ＋キット（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｋ０６７９１１）を用いて、免疫組織化学的標識化を実行した。要するに、内因性ペルオキシダーゼを遮断するために過酸化水素でブレードを処理し、すすいで、次に、抗ロリクリン一次抗体溶液中で周囲温度で３０分間、インキュベートした。洗浄後、ビオチン結合二次抗体溶液とともに、周囲温度で１５分間、切片をインキュベートして、再びすすぎ、次にストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ溶液とともに１５分間インキュベートした。ＬＳＡＢ＋キットからの基質／色原体の混合物を用いて、酵素による発色を行なった。次にスライドを洗浄し、ヘマトキシリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓ３３０９）の溶液で対比染色し、蒸留水ですすいで、次にグリセルゲル水性培地（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃ０５６３）中に載せた。
【００６１】
ニコンＤｉａｐｈｏｔ  ３００倒立顕微鏡（４０×レンズ）を用いて、切片を観察した。Ｌｕｃｉａ  ７．０ソフトウェアにより制御されるＣＯＨＵカメラを用いて、像を獲得した。
【００６２】
Ｂ．結果
１．  ロリクリン遺伝子の発現  −  ＤＮＡチップ
結果は、相対的発現（ＲＥ）単位で表わされる。これらのレベルは、各膜中に存在する平均バックグラウンドノイズに関して、そして用いられる種々のプローブの標識化強度の差に関して、補正される（この補正は、参照遺伝子の標識化強度の差に基づいて実行される）。
【００６３】
この実験において、波動への表皮の曝露は、ロリクリンの発現レベルを、曝露後２時間で３８％、曝露後１８時間で２８％低減した。低強度のこれらの変動は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより立証される必要があった。
【００６４】
２．  ロリクリン遺伝子の発現  −  ＲＴ−ＰＣＲ
ロリクリンに対応するｍＲＮＡの程度の定量的分析を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより実行した。波動への表皮の曝露は、ロリクリンの発現レベルを、曝露後２時間で２０％低減させ、曝露後１８時間で２０％増大させた。
【００６５】
３．  ロリクリン遺伝子の発現  −  免疫組織化学
ａ）二次抗体対照単独（図１）
予測どおり、二次抗体単独（抗ロリクリン一次抗体を伴わずに）の存在下で標識化を実行した場合、表皮内にシグナルは観察されなかった。
【００６６】
ｂ）波動への曝露の作用（図２及び３）
抗ロリクリン標識化は、主に顆粒層中に局在した。標識化は、電話波（telephone wave）に曝露された表皮においてはあまり強くなく、そして断続的であった。
【００６７】
ｃ）イワベンケイ抽出物及びサーマス・サーモフィルス抽出物の作用（図４及び５）
これらの実験条件下で、生成物「活性作用物質Ａ＋Ｂ」を用いて波動に暴露された表皮の処理は、曝露対照に比して標識化強度を増大した。標識化は、非曝露対照の標識化より大きかった。
【００６８】
Ｃ．結論
ＤＮＡチップ技法は、単一試験において多数の遺伝子の発現レベルに及ぼす処置の作用を検出するために強力であり、したがってそれは、一次スクリーニングを実行するのを可能にした。それは、他方で、あまり定量的でないという、そして大きな発現変動振幅に関して信頼性が高いだけであるという欠点を有する。逆に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ技法は、正確に所定遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定する、という利点を有する。実行された試験において、ＤＮＡチップによる分析は、波動への表皮の曝露後のロリクリンの発現における低減を示したが、一方、ＲＴ−ＰＣＲは、曝露後２時間のロリクリンの発現レベルにおける２０％の低減、ならびに曝露後１８時間の２０％の増大を示した。表皮の切片の免疫標識による分析は、曝露後１８時間のロリクリンの低減を確認した。この見かけ上の矛盾は、２時間後のｍＲＮＡの低減がずっと後のタンパク質レベルで表わされるに過ぎない、という事実により説明され得た。
【００６９】
イワベンケイの抽出物及びサーマス・サーモフィルスの抽出物は、ロリクリンの発現に、したがって表皮分化に及ぼす波動のこの阻害作用に対して有意の保護を示した。
【００７０】
ＩＩＩ．例
Ａ．アンチウェーブクリームゲル
％
脱イオン水                                    １００にするのに十分な量
ＰＥＭＵＬＥＮ  ＴＲ１                                    ０．５
グリセロール                                              ５．０
ＳＥＰＩＧＥＬ  ３０５                                    １．０
イワベンケイ抽出物                                        ２．０
サーマス・サーモフィルス抽出物                            ２．０
イソノナン酸イソノニル                                    ７．０
Ｃ１２〜Ｃ１５  安息香酸アルキル                          ３．０
シリコーン油                                              ２．０
水酸化ナトリウム                                          ０．２
香料                                                      ０．３
１％の着色剤                                              ０．１２
保存料                                                    １．０
【００７１】
Ｂ．アンチウェーブクリーム
％
脱イオン水                                    １００にするのに十分な量
セテアリルグルコシド                                      ５．０
Ｃ８〜Ｃ１０  トリグリセリド                            １０
シリコーン油                                              ２．０
揮発性シリコーン                                          ５．０
カルボマー                                                ０．２
グリセロール                                              ５．０
イワベンケイ抽出物                                        ２．０
サーマス・サーモフィルス抽出物                            ２．０
香料                                                      ０．３
保存料                                                    １．０
【００７２】
Ｃ．アンチウェーブスキンローション
％
脱イオン水                                    １００にするのに十分な量
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム                        ０．２
塩化ナトリウム                                            １．０
イワベンケイ抽出物                                        ２．０
サーマス・サーモフィルス抽出物                            ２．０
セドレロプシス・グレベイ抽出物                            ２．０
ローズマリー水                                            ４．０
グリコール                                                １．０
保存料                                                    １．０
【００７３】
Ｄ．アンチウェーブヘアローション
％
ジメチコーン                                              ８．００
着色剤溶液                                                ０．６０
精油                                                      ０．４０
９６．２度の非変性アルコール                            ２５．００
セドレロプシス・グレベイ抽出物                            ２．００
イワベンケイ抽出物                                        ２．００
サーマス・サーモフィルス抽出物                            ２．００
香料                                                      １．００
脱イオン水                                      １００にするのに十分な量
【００７４】
Ｅ．アンチウェーブファンデーション
％
セドレロプシス・グレベイ抽出物                            ２．００
イワベンケイ抽出物                                        ２．００
サーマス・サーモフィルス抽出物                            ２．００
シリコーン乳化剤                                          ５．００
共乳化剤                                                  ０．５０
ソルビン酸                                                ０．０５
メトキシ桂皮酸オクチル                                    ５．００
シリコーンワックス                                        ３．００
揮発性シリコーン                                        １０．５０
ＢＥＮＴＯＮＥ  ＧＥＬ                                    ２．００
酸化鉄                                                  １３．４０
シリコーンエラストマー                                    ２．００
シリコーン粉末                                            ０．９０
香料                                                      ０．５０
純塩化ナトリウム                                          ２．００
ＥＤＴＡ                                                  ０．１０
保存料                                                    １．００
セリサイト                                                ０．２０
雲母／チタン                                              ０．２０
プロピレングリコール                                      ４．１０
脱イオン水                                      １００にするのに十分な量
【図１】
2009542606.tif 000002
【図２】
2009542606.tif 000003
【図３】
2009542606.tif 000004
【図４】
2009542606.tif 000005
【図５】
2009542606.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月21日(2007.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
家庭用電気器具及び設備により発生する電磁波の皮膚に及ぼす作用と闘うための表皮分化の少なくとも１つの活性化剤の化粧品組成物中の使用。
【請求項２】
前記活性化剤がイワベンケイ（Rhodiola rosea）の抽出物、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の抽出物、セドレロプシス・グレベイ（Cedrelopsisgrevei）の抽出物、アツケシソウ（Salicorniaherbacea）の抽出物、ヘーゼルナッツ又はカプリリルブチラートのペプチド抽出物から選択される植物又は海洋起源の抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記活性化剤がイワベンケイの抽出物、サーマス・サーモフィルスの抽出物及びセドレロプシス・グレベイの抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記イワベンケイの抽出物が植物の根から得られる抽出物であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
前記イワベンケイの根からの抽出物がヒドログリコール性抽出物であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記サーマス・サーモフィルスの抽出物がバイオテクノロジーにより得られるサーマス・サーモフィルス細菌の抽出物であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項７】
前記セドレロプシス・グレベイの抽出物が木の樹皮から得られる抽出物であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項８】
前記セドレロプシス・グレベイ樹皮の抽出物がヒドログリコール性又はヒドログリセリン抽出物であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
組成物が、以下の：
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のイワベンケイ抽出物；及び／又は
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のサーマス・サーモフィルス抽出物；及び／又は
−  約０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％のセドレロプシス・グレベイ抽出物
を含有することを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
携帯電話により発生する電磁波の作用と闘うための請求項１ないし９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
９００ＭＨｚの周波数を有する波動の作用と闘うための請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
家庭用電気器具及び設備により発生する電磁波の皮膚に及ぼす作用と闘うための美容的処置方法であって、表皮分化の少なくとも１つの活性化剤を含む化粧品組成物の皮膚又は外皮への適用を包含する美容的処置方法。
【請求項１３】
前記活性化剤がイワベンケイの抽出物、サーマス・サーモフィルスの抽出物及びセドレロプシス・グレベイの抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
2009542606.tif 000007
2009542606.tif 000008
2009542606.tif 000009
2009542606.tif 000010
2009542606.tif 000011
2009542606.tif 000012