(57)【要約】  この発明は、変異Fc領域を含むタンパク質の製剤であって、部分的にはこうした分子の急速に凝集する傾向を低減させることによる、安定性が改善された製剤を提供する。この発明は、液体および凍結乾燥製剤の両方を提供し、そのいずれかを利用して、被験体への投与に好適な高タンパク質濃度の液体を作製することができる。この発明はさらに、疾病および障害の治療上もしくは予防的処置のための、または診断目的での、この発明の製剤の利用方法を提供する。【選択図】図２２Ａ
2009525986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fc変異タンパク質、濃度1 mM〜100 mMの緩衝剤を含み、さらに以下の(a)〜(d):
(a)  濃度1〜20重量対体積%の炭水化物賦形剤;
(b)  濃度1 mM〜400 mMのカチオン性アミノ酸;
(c)  濃度1mM〜200 mMのアニオン; および
(d)  濃度0.001%〜0.1%のポリソルベート
からなる群から選択される1以上の成分を含み、pHが約5.5〜約8である、液体製剤。
【請求項２】
成分(a)、(b)および場合によって(d)を含む、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項３】
成分(a)、(c)および場合によって(d)を含む、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項４】
Fc変異タンパク質が、10 mMヒスチジン、pH 6.0中で製剤化したときの同一Fc変異体の凝集に比較して、少なくとも10%少ない凝集を有する、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項５】
Fc変異タンパク質が抗体またはFc融合タンパク質である、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項６】
緩衝剤がヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩である、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項７】
炭水化物賦形剤がトレハロース、スクロース、マンニトール、マルトース、またはラフィノースである、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項８】
カチオン性アミノ酸がリシン、アルギニンまたはヒスチジンである、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項９】
アニオンがクエン酸、コハク酸またはリン酸イオンである、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項１０】
pHが6.0〜6.5である、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項１１】
Fc変異タンパク質が、以下：
リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL、ABX-IL8、ABX-MA1、ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide、LkoCide、ProstaCide、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、ChimericKW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321
からなる群から選択される臨床用製品または候補抗体と同一の抗原への結合について競合する、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項１２】
Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化されたADCC活性を持つFc領域を含む、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項１３】
Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下の位置：
234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、252、254、256、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333、および334
からなる群から選択される1以上の位置に、天然に生じないアミノ酸を持つFc領域を含む、請求項12に記載の液体製剤:
【請求項１４】
Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下のアミノ酸：
234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、252Y、254T、256E、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、および332A
からなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を持つFc領域を含む、請求項12に記載の液体製剤。
【請求項１５】
Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239、330および332からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を含む、請求項13に記載の液体製剤。
【請求項１６】
少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸残基が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される、請求項14に記載の液体製剤。
【請求項１７】
Fc変異タンパク質を、請求項1に記載の液体製剤中に配合することを含む、該Fc変異タンパク質の凝集の低減方法。
【請求項１８】
Fc変異タンパク質の凝集を、同一のFc変異体を10 mMヒスチジン、pH 6.0中で製剤化した場合の凝集に比較して、少なくとも10%低減させる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
濃度20 mg/mL〜100 mg/mLのFc変異タンパク質、6%トレハロース、2%アルギニン(〜115 mM)、0.025%ポリソルベート-80および10 mMヒスチジンバッファーを含む凍結乾燥前バルク製剤であって、前記製剤のpHが6.0〜6.5である、製剤。
【請求項２０】
濃度約20 mg/mL〜約100 mg/mLのFc変異タンパク質、約50 mM〜約300 mMクエン酸塩、および約10%〜約20%トレハロース、ならびに場合によって約0.001%〜約0.1%ポリソルベートを含む液体製剤であって、前記製剤のpHが6.0〜6.5である、製剤。
【請求項２１】
Fc変異タンパク質が、10 mMヒスチジン、pH 6.0中で製剤化したときの同一Fc変異体の凝集に比較して、少なくとも10%少ない凝集を有する、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２２】
クエン酸塩の濃度が約100 mM、かつトレハロースの濃度が約15%である、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２３】
クエン酸塩の濃度が約200 mM、かつトレハロースの濃度が約10%である、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２４】
Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化されたADCC活性を持つFc領域を含む、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２５】
Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下の位置：
234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、252、254、256、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333、および334
からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を持つFc領域を含む、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２６】
Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下のアミノ酸：
234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、252Y、254T、256E、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、および332A
からなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を持つFc領域を含む、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２７】
Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239、330および332からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を含む、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２８】
少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸残基が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される、請求項20に記載の液体製剤。
【請求項２９】
Fc変異タンパク質が、以下：
リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL、ABX-IL8、ABX-MA1、ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide、LkoCide、ProstaCide、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、ChimericKW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321
からなる群から選択される臨床用製品または候補抗体と同一の抗原への結合について競合する、請求項20に記載の液体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1．発明の分野
本発明は、タンパク質、特に変異Fc領域を含むタンパク質(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)の安定性を改善する製剤を提供する。特に、本発明は、1〜50 mMの緩衝剤と、以下の少なくとも1つまたはそれ以上、すなわち 約1〜15重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1〜400 mMのカチオン性アミノ酸および約1〜200 mMのアニオンを含む、pH 5.5〜8のFc変異体の製剤を提供する。また、本発明は、約100 mM〜約300 mMのアニオン性バッファーおよび約5〜20重量対体積%の炭水化物賦形剤を含む、pH約5.5〜約8のFc変異体製剤を提供する。本発明の製剤として、安定な液体製剤および凍結乾燥前バルク製剤が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
2．発明の背景
抗体は特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含む大部分の哺乳動物中で、抗体は対になった重鎖および軽鎖ポリペプチドで構築されている。各鎖は可変(Fv)および定常(Fc)領域と称される2つの異なる領域で構成される。軽および重鎖Fv領域はその分子の抗原結合決定因子を含有し、標的抗原との結合を特定化する。Fc領域は抗体のクラス(またはアイソタイプ)(例えばIgG)を確定し、エフェクター機能と称される一連の重要な機能的能力に関与する、多数のFc受容体およびその他のFcリガンドとの結合を特定化する。
【０００３】
IgGクラスについてFc受容体の重要なファミリーは、Fcガンマ受容体(FcγR)である。これらの受容体は抗体と免疫系の細胞アーム間の連絡を仲介する(Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。ヒトでは、このタンパク質ファミリーとしてFcγRI(CID64); FcγRII(CD32);およびFcγRIII(CID16)が含まれる(Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65)。これらの受容体は典型的には、Fcとの結合を仲介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内での何らかのシグナル伝達事象を仲介すると見られる細胞内ドメインを持っている。Fc/FcγR複合体の形成は結合した抗原の部位にエフェクター細胞を誘導し、その結果、典型的には細胞内でのシグナル伝達事象、それに続く、炎症仲介物質の放出、B細胞の活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、および細胞傷害性攻撃などの重要な免疫応答をもたらす。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後その標的細胞の溶解をもたらす、細胞仲介反応は、抗体依存性細胞仲介細胞傷害(ADCC)と称される(Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetieら、2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。また、Fc領域は新生児(仔)Fc受容体(Fc Receptor neonate, FcRn)と相互作用もする。この受容体は抗体リサイクルのためのサルベージ受容体として作用し(Ghetieら、1997, Immunol. Today, 18:592-598)、血清中半減期をモジュレートする。
【０００４】
別の重要なFcリガンドは補体タンパク質C1qである。C1qに結合するFcは補体依存性細胞傷害(CDC)と称されるプロセスを仲介する(Wardら、1995, Ther Immunol 2:77-94に概説されている)。C1qは6つの抗体と結合する能力がある。ただし、その補体カスケードを活性化するには2つのIgGに結合するだけで十分である。C1qはC1rおよびC1sセリンプロテアーゼと複合体を形成して、この補体経路のC1複合体を形成する。
【０００５】
限定するわけではないが、標的に対する特異性、免疫エフェクター機構を仲介する能力、および血清中での長い半減期を含む、抗体のいくつかのキーとなる特徴によって、抗体が強力な治療法となる。現在、がんを含む多様な症状の治療のために膨大な数のモノクローナル抗体が開発中であるか、または治療上使用されている。例えば以下である: エタラシズマブ(Vitaxin(登録商標)、MedImmune)、ヒト化インテグリンαvβ3抗体(例えば、PCT公開WO 2003/075957)、Herceptin(登録商標)(Genentech)、ヒト化抗Her2/neu抗体、乳がん治療のために承認済み(例えば、U.S. 5,677,171)、CNTO 95(Centocor)、ヒトインテグリンαv抗体(PCT公開WO 02/12501)、Rituxan(登録商標)(IDEC/Genentech/Roche)、キメラ抗CD20抗体、非ホジキンリンパ腫治療のために承認済み(例えば、U.S. 5,736,137)およびErbitux(登録商標)(ImClone)、キメラ抗EGFR抗体(例えば、U.S. 4,943,533)。その上、免疫エフェクター機能を仲介し、血清中半減期を安定化する際のFc領域の役割から、これらの領域が抗体様Fc融合タンパク質を作製するための有用な領域となっている(Chamowら、1996, Trends Biotechnol 14:52-60およびAshkenaziら、1997, Curr Opin Immunol 9:195-200)。Fc融合タンパク質は、抗体のFc領域、および、したがってその望ましいエフェクター機能および薬物動態学を、リガンドの標的結合領域、受容体、または標的認識を仲介する何らかのその他のタンパク質ドメインと結びつける。また、Fc融合タンパク質は以下を含む多様な症状の治療のために治療上使用され、かつ/または開発中である: 関節炎(例えば、Enbrel(登録商標)、TNFR-Fc融合体)、多発性硬化症(IFNβ1a-Fc融合体)、貧血(EPO-Fc)および血友病(FVIII-FcおよびFIX-Fc)。
【０００６】
Fc領域のその各種の受容体およびリガンドへの結合性を変更することによって、そのFc領域の下流の活性をモジュレートすることができることが示されている。例えば、Fc領域のFcRnに対する結合親和性を増大させると、この分子の血清中半減期が増加した(Kimら、Eur. J. Immunol., 24:2429-2434, 1994; Popovら、Mol. Immunol., 33:493-502, 1996; Ghetieら、Eur. J. Immunol., 26:690-696, 1996; Junghansら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5512-5516, 1996; Israelら、Immunol., 89:573-578, 1996; およびUS特許公開2003/0190311)。同様に、Fc領域のFcγRIIIAに対する結合親和性を増大させると、この分子のADCC活性が増加した(Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604およびPrestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490)。アミノ酸欠失、置換および付加を含む修飾、そしてFc領域のグリコシル化の変更が、Fc領域のそのリガンドおよび/または受容体との結合性を変更し、それに付随してエフェクター機能の変化をもたらすことが証明された(例えば、Shields、同書、Presta、同書、およびU.S.特許公開2004/0132101参照)。こうして、Fcを改変することによって、Fcを含有する分子の治療上の有効性および/または薬物動態を改善することができる。しかし、下記のように、Fc領域の改変の結果、安定性、溶解性、または構造的完全性の低下などの、望ましくない特徴をもたらすこともある。安定性、溶解性または構造的完全性の低下は、治療または予防用投与のための安定な、高濃度製剤の開発にとって難問を提供することとなる。こうして、被験体への非経口投与に好適な、対象となる改変されたFc領域を持つタンパク質(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)を安定化する製剤への需要が存在する。
【０００７】
本明細書中の参照文献の引用または考察はそれらが本発明の先行技術であることを承認するものと解釈されるべきではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
3．発明の概要
本発明は部分的に、天然に生じないFc領域を含むタンパク質(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)が天然に生ずるFc領域(本明細書中では「野生型Fc領域」とも称する)を含む同一のタンパク質に比較して、より急速な凝集をしやすいという、観察に基づいている。この凝集は例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定される。本発明はまた、天然に生じないFc領域を含むタンパク質の製剤であって、このタンパク質の安定性を増加させ、かつ被験体への非経口投与に好適なものの同定にも、部分的に基づいている。本発明の製剤は天然に生じないFc領域を含むタンパク質を安定化するために特に有用であるが、本出願の製剤を、急速な凝集をしやすい多数のタンパク質の安定性を強化するために使用することができることも意図している。こうした製剤は、精製/充填/最終工程中の温度制限の必要性が低い、輸送/貯蔵条件の厳密度が低いかまたは容易に利用できる、ならびにこうした製剤の治療、予防および診断用途での投薬頻度が低いかまたは投与量が少ないなどの複数の利点を提供する。本発明はさらに、疾病および障害の治療もしくは予防的処置、または診断目的のための、本発明の製剤の利用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
天然に生じないFc領域を含むタンパク質(本明細書で「Fc変異タンパク質(群)」と称する)として、限定するわけではないが、抗体およびFc融合タンパク質が含まれる。天然に生じないFc領域(本明細書で「変異Fc領域」とも称する)として例えば、変更された結合特性および/または変更されたエフェクター機能を持ち得る、天然に生じないアミノ酸残基を含むFc領域が含まれる。天然に生じないFc領域を、多数の分子(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)中に組み込んで、その治療上の有効性および/または薬物動態を改善することができる。
【００１０】
1実施形態において、本発明は、Fc変異タンパク質の製剤であって、その製剤が貯蔵時のタンパク質成分の凝集が低下することによる安定性の増加を提示するものを提供する。特定の実施形態において、本発明の製剤は少なくとも10 mg/mL、あるいは少なくとも15 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mLまたは200 mg/mLのFc変異タンパク質を含む。
【００１１】
1実施形態において、Fc変異タンパク質は変異Fc領域を含む抗体であって、その抗体は対象の抗原に免疫特異的に結合する。特定の1実施形態において、変異Fc領域を含む抗体の製剤は、貯蔵時のこの抗体の凝集が低下することによる安定性の増加を提示する。別の実施形態において、Fc変異タンパク質は変異Fc領域またはそのフラグメントを含むFc融合タンパク質である。別の特定の実施形態において、変異Fc領域を含むFc融合タンパク質の製剤は、貯蔵時のFc融合タンパク質成分の凝集が低下することによる安定性の増加を提示する。こうした製剤は、疾病および障害の診断、治療もしくは予防的処置に使用することができる。
【００１２】
1実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤を含み、pHが約5.5〜約8であり、さらに以下からなる群から選択される1以上の追加の成分: 約1〜約15重量対体積%(% weight to volume)の炭水化物賦形剤; 約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸; および約1 mM〜約200 mMのアニオンを含む。別の実施形態において、本発明の製剤は、約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約100 mM〜約300 mMのアニオン性バッファー、約5〜20重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが約5.5〜約8である。本発明の製剤として、安定な液体製剤および凍結乾燥前バルク製剤が含まれる。場合によって、本発明の製剤はさらに、糖類、ポリオール、ならびに限定するわけではないが、グリシン、メチオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含むその他のアミノ酸などの、一般的な賦形剤および/または添加剤を含んでもよい。その上に、または別成分として、本発明の製剤はさらに、限定するわけではないが、可溶化剤、希釈剤、バインダー、安定剤、塩類、親油性溶媒、界面活性剤、キレート剤、保存剤などの一般的な賦形剤および/または添加剤を含んでもよい。
【００１３】
特定の実施形態において、緩衝剤はヒスチジン、リン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択される。別の実施形態において、炭水化物賦形剤はトレハロース、スクロース（ショ糖）、マンニトール、マルトースおよびラフィノースからなる群から選択される。さらに別の実施形態において、カチオン性アミノ酸はリシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択される。さらに別の実施形態において、アニオンはクエン酸、コハク酸およびリン酸イオンからなる群から選択される。
【００１４】
本発明は、液体製剤と、例えば、限定するわけではないが、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライまたは風乾によって乾燥した製剤(例えば、PCT公開WO 05/123131; WO 04/058156; WO 03/009817; WO 97/04801およびU.S.特許 6,165,463参照)の両方を包含する。本発明の製剤はまた、被験体に疾病および障害の治療または予防的処置のために投与することができる滅菌済み製剤をも包含する。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、凝集についてアッセイするサイズ排除クロマトグラフ(SEC)によって評価して、37℃〜42℃の範囲の温度で少なくとも5日間、20℃〜25℃で少なくとも30日間、そして2℃〜8℃で少なくとも90日間または少なくとも120日間、または少なくとも180日間、または少なくとも1年間、タンパク質重量で10%以下、または5%以下、または2%以下、または1%以下、または0.5%以下の凝集率である。
【００１６】
1実施形態において、Fc変異タンパク質は、野生型Fc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、Fc受容体に対する強化された結合性を持つ。特定の1実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcγRIIIAに対する強化された結合性を持つ。別の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcRnに対する強化された結合性を持つ。
【００１７】
1実施形態において、Fc変異タンパク質は、野生型Fc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化されたADCC活性を持つ。別の実施形態において、Fc変異タンパク質は、野生型Fc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化された血清中半減期を持つ。さらに別の実施形態において、Fc変異タンパク質は、野生型Fc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化されたADCC活性および強化された血清中半減期の両方を持つ。
【００１８】
1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸残基1個を含むものを提供する: 222、224、234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、248、252、254、256、258、262、263、264、265、266、267、268、269、272、274、275、278、279、280、282、290、294、295、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333、334、335、339、359、360、372、377、379、396、398、400、401、430および436。場合によって、Fc領域は、当業者に知られた追加の、および/または代替の位置に、天然に生じないアミノ酸残基を含むことがある(例えば、U.S.特許5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; PCT特許公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217)。
【００１９】
特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下からなる群から選択される天然に生じないアミノ酸残基を少なくとも1つ含むものを提供する: 222N、224L、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241 L、241Y、241E、241R、243W、243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、248M、252Y、254T、256E、258D、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268D、268N、269H、269Y、269F、269R、296E、272Y、274E、274R、274T、275Y、278T、279L、280H、280Q、280Y、282M、290G、290S、290T、290Y、294N、295K、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、300I、300L、312A、313F、318A、318V、320A、320M、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、335A、335T、335N、335R、335Y、339T、359A、360A、372Y、377F、379M、396H、396L、398V、400P、401V、430A。場合によって、Fc領域は、当業者に知られた追加の、および/または代替の、天然に生じない酸残基を含むことがある(例えば、U.S.特許5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; PCT特許公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217参照)。また本発明は、欠失、付加および/または修飾を含むFc領域を包含する。
【００２０】
1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252、254、および256からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸残基を少なくとも1つ含むものを提供する。特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される天然に生じないアミノ酸残基を少なくとも1つ含むものを提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239、330および332からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸残基を少なくとも1つ含むものを提供する。特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される天然に生じないアミノ酸残基を少なくとも1つ含むものを提供する。場合によって、そのFc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252、254、および256からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じない酸残基をさらに含むことがある。特定の1実施形態において、本発明は、Fc変異タンパク質製剤であって、Fc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸と、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される1以上の位置に少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を含むものを提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、Fc変異タンパク質製剤であって、そのタンパク質が1以上の工学操作された糖鎖型、すなわちFc変異タンパク質に共有結合された炭水化物組成を含むものを提供する。工学操作された糖鎖型は限定するわけではないがエフェクター機能の強化または低下を含む、多様な目的のために有用なことがある。工学操作された糖鎖型は当業者に知られた任意の方法で作製することができる(例えば、U.S.特許Nos. 6,602,684; 6,946,292; PCT公開WO 00/61739; WO 01/292246; WO 02/311140; WO 02/30954; WO 02/079255; WO 00/061739; WO 03/035835および欧州特許公開EP 01229125参照)。
【００２３】
本発明は限定するわけではないが、以下を含む、実質的にあらゆる分子由来のFc変異タンパク質を含む製剤を包含する: タンパク質、同様にそのサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープ。限定するわけではない分子の例は以下である: ホルモン、成長因子、抗凝固因子、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー、細胞表面受容体(例えば、ホルモンおよび成長因子受容体)、インテグリンサブユニットおよびそれらの組み合わせ(例えばαV、β3、αVβ3など)、インテグリン受容体、チロシンキナーゼスーパーファミリーのメンバー(例えば、EphA2、EphA4、EphB4、ALKなど)、分化(CD)タンパク質のクラスターのメンバー(例えば、CD19、CD20、CD22など)、免疫グロブリン、がん抗原、微生物タンパク質および抗体ならびに使用のために承認されるか、臨床試験中か開発中の抗体ドメイン融合体タンパク質(例えば、Fc融合体)。1実施形態において、Fc変異タンパク質組成物は、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーに結合する抗体由来のFc変異タンパク質を含む。特定の1実施形態において、その抗体はEphA2、EphA4、EphB4またはALKに結合する。別の実施形態において、Fc変異タンパク質組成物は、インテグリンサブユニットおよび/それらの組み合わせに結合する抗体由来のFc変異タンパク質を含む。特定の1実施形態において、その抗体はαV、β3、αVβ3に結合する。
【００２４】
本発明のFc変異タンパク質製剤は、限定するわけではないが、炎症疾患、自己免疫疾患、骨代謝関連疾患、血管新生関連疾患、感染、およびがんを含む、疾病、疾患、感染の、抗体が関係する診断、予防、管理および治療のために有用である。
【００２５】
（4.  図面の簡単な説明（後記参照））
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
5.  詳細な説明 
本発明は、天然に生じないFc領域(本明細書中では「変異Fc領域」と称する)を含むタンパク質であって、野生型Fc領域を含む同一のタンパク質に比較してより凝集しやすいタンパク質を、特定の製剤が安定化するという観察に、部分的に基づいている。さらに具体的には、本発明者らは、変異Fc領域を含むタンパク質を、多様なバッファー、例えば10 mMヒスチジンバッファー、pH 6などで製剤化するとき、野生型Fc領域を含む同一のタンパク質に比較してより凝集しやすいこと、そして特定の製剤が変異Fc領域を含むタンパク質の凝集を低下させ、それによってこれらを安定化することを発見した。したがって、本発明は、変異Fc領域を含むタンパク質の安定性を、そのタンパク質の凝集を低下させることによって増大させる製剤を提供する。変異Fc領域を含むタンパク質(本明細書中では「Fc変異タンパク質」と称する)として、限定するわけではないが、抗体およびFc融合タンパク質が含まれる。本明細書で使用する「Fc融合タンパク質」および「Fc融合体」とは、1以上のポリペプチドまたは小分子がFc領域またはそのフラグメントに連結されているタンパク質である。Fc融合体は本明細書中で、先行技術で使用されている用語「イムノアドヘシン」、「Ig融合体」、「Igキメラ」、および「受容体グロブリン」と同義であることを意味する(例えば、Chamowら、1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenaziら、1997, Curr Opin Immunol 9:195-200、参照)。変異Fcタンパク質は、タンパク質またはそのフラグメント(例えば、対象の抗原または対象の受容体の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する可変ドメイン)と変異Fc領域を結合させることによる、「デノボ(de novo)」製造するか、または1以上の天然に生じない残基をFc領域に導入して、Fc領域含有タンパク質(例えば、対象の抗原に結合する抗体またはFc融合タンパク質)を改変することによって、製造することができる。
【００２７】
本発明が提供する製剤は、野生型Fc領域を含む同一のタンパク質に比較してより凝集しやすいFc変異タンパク質にとって特に有用である。本明細書で使用する場合、変異Fc領域に代えて野生型(WT)Fc領域を含む以外はFc変異タンパク質と同一のアミノ酸配列を持つタンパク質を「対比分子(comparable molecule)」と称する。
【００２８】
5.1  Fc変異タンパク質製剤
本発明は、Fc変異タンパク質製剤(本明細書中、「本発明の製剤」とも称する)であって、貯蔵時のFc変異タンパク質の成分の凝集の低下による安定性の増大を示す製剤を提供する。本発明の製剤は治療上、予防上または診断上の有用性を持つあらゆるFc変異タンパク質を含む。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は、特に10 mMヒスチジンバッファー、pH 6中で製剤化したときに、対比分子に比較して凝集しやすいものである。
【００２９】
本発明の製剤は、Fc変異タンパク質、緩衝剤を含み、そしてさらに炭水化物賦形剤、カチオン性アミノ酸およびアニオンからなる群から選択される1以上の追加の成分を含む。本発明の製剤として安定な液体製剤および凍結乾燥前バルク製剤が含まれる。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤を含み、pHが約5.5〜約8であり、さらに以下からなる群から選択される1以上の追加成分を含む: 約1〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸、および約1 mM〜約200 mMのアニオン。
【００３１】
別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤を含み、pHが約5.5〜約8であり、さらに以下からなる群から選択される1以上の追加成分を含む: 約1〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸、および約1 mM〜約200 mMのアニオン。
【００３２】
1実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが約5.5〜約8である。特定の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸を含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1 mM〜約200 mMのアニオンを含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３５】
さらに別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸を含み、pHが約5.5〜約8である。特定の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸を含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３６】
別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約200 mMのアニオンを含み、pHが約5.5〜約8である。特定の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約200 mMのアニオンを含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３７】
さらに別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤を含み、さらに約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸、約1 mM〜約200 mMのアニオンを含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸、および約1 mM〜約200 mMのアニオンを含み、pHが約5.5〜約8である。特定の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、約1〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸、および約1 mM〜約200 mMのアニオンを含み、pHが約5.5〜約8である。
【００３９】
場合によって、本発明の製剤はさらに別の一般的な補助成分、限定するわけではないが、好適な賦形剤、可溶化剤、希釈剤、バインダー、安定剤、塩類、親油性溶媒、界面活性剤、キレート剤、保存剤などを含む。
【００４０】
1実施形態において、本発明の製剤は以下の濃度のFc変異タンパク質を含む: 少なくとも約1mg/mL、または少なくとも約10 mg/mL、または少なくとも約15 mg/mL、または少なくとも約25 mg/mL、または少なくとも約50 mg/mL、または少なくとも約75 mg/mL、または少なくとも約100 mg/mL、または少なくとも約150 mg/mL、または少なくとも約200 mg/mL、または少なくとも約250 mg/ml、または少なくとも約300 mg/ml。特定の実施形態において、本発明の製剤は以下の濃度のFc変異タンパク質を含む: 少なくとも1mg/mL、または少なくとも10 mg/mL、または少なくとも15 mg/mL、または少なくとも25 mg/mL、または少なくとも50 mg/mL、または少なくとも75 mg/mL、または少なくとも100 mg/mL、または少なくとも150 mg/mL、または少なくとも200 mg/mL、または少なくとも250 mg/ml、または少なくとも300 mg/ml。本発明の製剤は、少なくとも約25 mg/mLから少なくとも約200 mg/mLの濃度のFc変異タンパク質の、代表的な安定化を提供する。
【００４１】
本発明の製剤には、pH制御の改善を提供するため、緩衝剤またはpH調整剤を含ませる。本発明の製剤のpHは、例えば約pH 5.5〜約pH 8の、広範囲を網羅することができる。1実施形態において、pHは約pH 6〜約pH 8の範囲である。別の実施形態において、pHは約pH 6〜約pH 7の範囲である。さらに別の実施形態において、pHは約pH 6.0〜約pH 6.5の範囲である。さらに別の実施形態において、pHは約pH 6.5〜約7.0の範囲である。特定の1実施形態において、pHは約6.0である。別の特定の実施形態において、pHは約6.5である。さらに別の特定の実施形態において、pHは6.0、または6.1、または6.2、または6.3、または6.4、または6.5、または6.6、または6.7、または6.8、または6.9、または7.0である。
【００４２】
典型的には、緩衝剤は有機もしくは無機酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤として、限定するわけではないが、以下が含まれる: 有機酸塩、例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、またはフタル酸の塩; Tris、トロメトアミン塩酸、またはリン酸塩バッファー。その上、アミノ酸成分がバッファー能力についても機能することができる。本発明の製剤においてで緩衝剤として利用することができる代表的なアミノ酸成分として、限定するわけではないが、グリシンおよびヒスチジンが含まれる。特定の実施形態において、緩衝剤はヒスチジン、リン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択される。特定の1実施形態において、緩衝剤はクエン酸塩である。別の特定の実施形態において、緩衝剤はリン酸塩である。さらに別の特定の実施形態において、緩衝剤はヒスチジンである。緩衝剤の純度は少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%とすべきである。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明の製剤は2つのカチオン性アミノ酸、1つ目は緩衝剤としてのもの、そして2つ目はその製剤のカチオン性アミノ酸成分としてのものを含むことができる。別の実施形態において、本発明の製剤は、緩衝作用のために典型的に使用されるものよりも高濃度(例えば、約5〜50 mMよりも高濃度)のカチオン性アミノ酸を含むことができ、この際カチオン性アミノ酸が緩衝剤とその製剤のカチオン性アミノ酸成分の両方として機能する。カチオン性アミノ酸が緩衝剤とその製剤のカチオン性成分の両方として機能する製剤においては、カチオン性アミノ酸の最終濃度は緩衝剤の濃度とカチオン性アミノ酸の濃度の合計とすることを意図している。したがって、カチオン性アミノ酸が緩衝剤とその製剤のカチオン性成分の両方として機能する実施形態においては、カチオン性アミノ酸は、約50 mM〜約500 mM、または約100 mM〜約300 mM、または約200 mM〜約300 mM、または約300 mM〜約400 mMの濃度で存在する。カチオン性アミノ酸が緩衝剤とその製剤のカチオン性アミノ酸成分の両方として機能する特定の実施形態において、カチオン性アミノ酸は、50 mM、または100 mM、または150 mM、または200 mM、または250 mM、または300 mM、または350 mM、または400 mMの濃度で存在する。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約100 mM〜約500 mMのカチオン性アミノ酸緩衝剤、および約5〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが約5.5〜約8である。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明の製剤は2つのアニオン、1つ目は緩衝剤としてのもの、そして2つ目はその製剤のアニオン成分としてのものを含む。別の実施形態において、本発明の製剤は、緩衝作用のために典型的に使用されるものよりも高濃度(例えば、約5〜50 mMよりも高濃度)のアニオンを含むことができ、この際アニオンが緩衝剤とその製剤のアニオン成分の両方として機能する。アニオンが緩衝剤とその製剤のアニオン成分の両方として機能する製剤においては、アニオンの最終濃度は緩衝剤の濃度とアニオンの濃度の合計とすることを意図している。したがって、アニオンが緩衝剤とその製剤のアニオン成分の両方として機能する実施形態においては、アニオンは、約50 mM〜約300 mM、または約100 mM〜約200 mM、または約200 mM〜約300 mMの濃度で存在する。アニオンが緩衝剤とその製剤のアニオン性成分の両方として機能する特定の特定の実施形態において、アニオンは、50 mM、または100 mM、または150 mM、または200 mM、または250 mM、または300 mMの濃度で存在する。
【００４６】
別の実施形態において、本発明の製剤は約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約100 mM〜約300 mMのアニオン性緩衝剤、および約5〜20重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが約5.5〜約8である。特定の実施形態において、本発明の製剤は約50 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約100 mM〜約200 mMのアニオン性緩衝剤、および約10%〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが約6.0〜約6.5である。別の実施形態において、本発明の製剤は50 mg/mL〜200 mg/mLのFc変異タンパク質、100 mM〜200 mMのアニオン性緩衝剤、および10〜15重量対体積%の炭水化物賦形剤を含み、pHが6.0〜6.5である。
【００４７】
緩衝剤は典型的には1 mM〜200 mM、あるいは所望のイオン強度および必要とされる緩衝能力に応じて、明細書中の任意の範囲または数値の濃度で使用される。非経口製剤で使用される常套的な緩衝剤の通常の濃度は以下から知ることができる: Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications, Volume 1, 2nd Edition, Chapter 5, p. 194, De Luca and Boylan, "Formulation of Small Volume Parenterals", Table 5: Commonly used additives in Parenteral Products。1実施形態において、緩衝剤の濃度は約1 mM、または約5 mM、または約10 mM、または約20 mM、または約30 mM、または約40 mM、または約50 mM、または約60 mM、または約70 mM、または約80 mM、または約90 mM、または約100 mMである。1実施形態において、緩衝剤の濃度は1 mM、または5 mM、または10 mM、または20 mM、または30 mM、または40 mM、または50 mM、または60 mM、または70 mM、または80 mM、または90 mM、または100 mMである。特定の1実施形態において、緩衝剤の濃度は約10 mM〜約50 mMである。別の特定の実施形態において、緩衝剤の濃度は10 mM〜50 mMである。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明の製剤は炭水化物賦形剤を含む。炭水化物賦形剤は、例えば、粘度増強剤、安定剤、バルク剤、可溶化剤などとして作用することができる。炭水化物賦形剤は一般的に約1〜約99重量または体積%で存在する。1実施形態において、炭水化物賦形剤は約1%〜約20%存在する。別の実施形態において、炭水化物賦形剤は約1%〜約15%存在する。特定の1実施形態において、炭水化物賦形剤は約1%〜約20%、または約5%〜約15%、または約8%〜約10%、または約10%〜約15%、または約15%〜約20%存在する。別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤は1%〜20%、または5%〜15%、または8%〜10%、または10%〜15%、または15%〜20%存在する。さらに別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤は約5%〜約10%存在する。さらに別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤は約10%〜約15%存在する。さらに別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤は約15%〜約20%存在する。さらに別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤は1%、または5%、または10%、または15%、または20%存在する。
【００４９】
本発明の製剤での使用に好適な炭水化物賦形剤として、例えば以下が含まれる: 単糖類、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなど; 二糖類、例えばラクトース、スクロース（ショ糖）、トレハロース、セロビオースなど; 多糖類、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、でんぷんなど; およびアルジトール類、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール ソルビトール(グルシトール)など。1実施形態において、本発明で使用するための炭水化物賦形剤は以下からなる群から選択される: ショ糖、トレハロース、ラクトース、マンニトール、およびラフィノース。特定の1実施形態において、炭水化物賦形剤はスクロース（ショ糖）である。別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤はトレハロースである。さらに別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤はマンニトールである。さらに別の特定の実施形態において、炭水化物賦形剤はラフィノースである。炭水化物賦形剤の純度は少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%とすべきである。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明の製剤はカチオン性アミノ酸を含む。1実施形態において、カチオン性アミノ酸は約1 mM〜約400 mMで存在する。特定の1実施形態において、カチオン性アミノ酸は約25 mM〜約200 mM存在する。別の特定の実施形態において、カチオン性アミノ酸は以下の濃度で存在する: 少なくとも10 mM、または少なくとも20 mM、または少なくとも30 mM、または少なくとも40 mM、または少なくとも50 mM、または少なくとも75 mM、または少なくとも100 mM、または少なくとも150 mM、または少なくとも200 mM、または少なくとも250 mM、または少なくとも300 mM、または少なくとも350 mM、または少なくとも400 mM。カチオン性アミノ酸は当業者に知られており、また天然アミノ酸または修飾アミノ酸でもよい。本発明の製剤に利用することができるカチオン性アミノ酸として、限定するわけではないが、以下が含まれる: L-リシン、D-リシン、L-ジメチルリシン、D-ジメチルリシン、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、L-オルニチン、D-オルニチン、L-アルギニン、D-アルギニン、L-ホモアルギニン、D-ホモアルギニン、L-ノルアルギニン、D-ノルアルギニン、2,4-ジアミノ酪酸、ホモリシンおよびp-リシン。1実施形態において、本発明の製剤はカチオン性アミノ酸のリシンを含む。別の実施形態において、本発明の製剤はカチオン性アミノ酸のアルギニンを含む。さらに別の実施形態において、本発明の製剤はカチオン性アミノ酸のヒスチジンを含む。本発明の製剤は2つのカチオン性アミノ酸であって、1つ目は緩衝剤として、そして2つ目はその製剤のカチオン性アミノ酸成分として含むことができることを意図している。前記の場合、カチオン性アミノ酸はより高濃度で存在して、緩衝剤とその製剤のカチオン性アミノ酸成分の両方として機能することができる。カチオン性アミノ酸の純度は少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%とすべきである。
【００５１】
特定の実施形態において、本発明の製剤はアニオンを含む。1実施形態において、アニオンは約1 mM〜約200 mM存在する。別の特定の実施形態において、アニオンは以下の濃度で存在する: 少なくとも10 mM、または少なくとも20 mM、または少なくとも30 mM、または少なくとも40 mM、または少なくとも50 mM、または少なくとも75 mM、または少なくとも100 mM、または少なくとも150 mM、または少なくとも200 mM。アニオンの非限定的例は以下である: 硝酸イオン、亜硝酸イオン、塩化物イオン、シアン化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオンおよびコハク酸イオンである。その上、限定するわけではないが、以下を含む多数の天然アミノ酸および修飾アミノ酸をアニオンとして使用することができる: L-アスパラギン酸イオン、D-アスパラギン酸イオン、L-グルタミン酸イオン、D-グルタミン酸イオン、 γ-カルボキシグルタミン酸イオン。1実施形態において、本発明の製剤はアニオンのクエン酸イオンを含む。別の実施形態において、本発明の製剤はアニオンのコハク酸イオンを含む。さらに別の実施形態において、本発明の製剤はアニオンのリン酸イオンを含む。本発明の製剤は2つのアニオンであって、1つ目は緩衝剤として、そして2つ目はその製剤のアニオン成分として含むことができることを意図している。前記の場合、カチオン性アミノ酸はより高濃度で存在して、緩衝剤とその製剤のアニオン成分の両方として機能することができる。アニオンの純度は少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%とすべきである。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の製剤はアミノ酸を含む。1実施形態において、アミノ酸は約1 mM〜約200 mM存在する。別の特定の実施形態において、アミノ酸は以下の濃度で存在する: 少なくとも10 mM、または少なくとも20 mM、または少なくとも30 mM、または少なくとも40 mM、または少なくとも50 mM、または少なくとも75 mM、または少なくとも100 mM、または少なくとも150 mM、または少なくとも200 mM。限定するわけではないアミノ酸の例として以下が含まれる: アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン。その上、多数の修飾アミノ酸を使用することができる。本発明の製剤は2つのアミノ酸を含むことができ、例えば、1つ目はその製剤のアニオン成分として、2つ目は賦形剤として含むものを意図している。あるいは本発明の製剤は2つのアミノ酸を含むことができ、1つ目がその製剤のカチオン性アミノ酸成分であり、そして2つ目が賦形剤である。単一のアミノ酸が高濃度で存在することができ、賦形剤として、ならびにその製剤のカチオン性アミノ酸および/またはアニオン性成分としての両方で機能できることを意図している。アミノ酸の純度は少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%とすべきである。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明の製剤は賦形剤および/または添加剤としてシステインを含まない。特定の別の実施形態において、本発明の製剤は賦形剤および/または添加剤としてメチオニンを含まない。
【００５４】
場合によって、本発明の製剤は、限定するわけではないが、以下を含む別の一般的な賦形剤および/または添加剤をさらに含む: 希釈剤、バインダー、安定剤、バッファー、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント、界面活性剤など。本発明の製剤での使用にとって、薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤が好ましい。場合によって、凝集を低下させるため、本発明の製剤に以下などの一般的に使用される賦形剤/添加剤を添加することができる: 薬学的に許容される界面活性剤、例えばポリソルベート、Tween 20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)、Tween 40(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート)、Tween 80(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート)、Pluronic F68(ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー)、およびPEG(ポリエチレングリコール)など、あるいは界面活性剤、例えばポリソルベート20もしくは80またはポロキサマー184もしくは188、Pluronic(登録商標)ポリオールなど、その他のブロックコポリマーならびにキレート剤、例えばEDTA、DTPAまたはEGTAなど。これらの添加剤は、その製剤を投与するためにポンプまたはプラスチック容器を使用する場合に、特に有用である。薬学的に許容される界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を緩和する。特定の1実施形態において、本発明の製剤は、以下の範囲の濃度のポリソルベートを含む: 約0.001%〜約1%、または約0.001%〜約0.1%、または約0.01%〜約0.1%。別の特定の実施形態において、本発明の製剤は以下の濃度のポリソルベートを含む: 0.001%、または0.002%、または0.003%、または0.004%、または0.005%、または0.006%、または0.007%、または0.008%、または0.009%、または0.01%、または0.015%、または0.02%。別の特定の実施形態において、ポリソルベートはポリソルベート-80である。
【００５５】
場合によって、本発明の製剤に以下のような保存剤を、約0.001%〜約5%、または任意の範囲もしくはその中の数値などの、任意の好適な濃度で添加することができる: フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル第二水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム(例えば、6水和物)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはそれらの混合物。本発明の製剤で使用する保存剤の濃度は、微生物に対する効果を上げるのに十分な濃度である。こうした濃度は選択する保存剤によって決まり、当業者によって容易に決定されるものである。
【００５６】
本発明の製剤で利用することができるその他の意図される賦形剤/添加剤として、例えば以下が含まれる: 香味剤、抗微生物剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質類、例えばリン脂質または脂肪酸など、ステロイド類、例えばコレステロールなど、タンパク質賦形剤、例えば血清アルブミン(ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA))、ゼラチン、カゼインなど、塩形成性対イオン、例えばナトリウムなど。本発明の製剤での使用に好適な、これらおよびその他の既知の医薬用賦形剤および/または添加剤は当分野で知られており、例えば以下に列挙されている: "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins,(2005)、および"Physician's Desk Reference", 60th ed., Medical Economics, Montvale, N.J.(2005)。当分野で周知のように、または本明細書に記載するように、Fc変異タンパク質の投与方法、溶解性および/または安定性にとって好適な、薬学的に許容される担体を常套的に選択することができる。
【００５７】
当業者は、本発明の製剤がヒト血液と等張性でありうる、すなわち本発明の製剤が基本的にヒト血液と同一の浸透圧であることを理解するであろう。こうした等張性製剤は一般的に約250 mOSm〜約350 mOSmの浸透圧である。等張性は、例えば蒸気圧または氷凍結タイプ浸透圧計を使用して、測定することができる。特定の実施形態において、本発明の製剤は以下の浸透圧である: 約100 mOSm〜約1200 mOSm、または約200 mOSm〜約1000 mOSm、または約200 mOSm〜約800 mOSm、または約200 mOSm〜約600 mOSm、または約250 mOSm〜約500 mOSm、または約250 mOSm〜約400 mOSm、または約250 mOSm〜約350 mOSm。したがって、本発明の製剤の成分の濃度を、最終製剤(例えば、最終液体または再構成製剤)の所望の等張性に応じて調整する。例えば、Fc変異タンパク質に対する炭水化物賦形剤の比率を、当分野で既知の方法(例えば、U.S.特許No. 6,685,940)にしたがって調整する。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質に対する炭水化物賦形剤のモル比は、Fc変異タンパク質約1モルに対して炭水化物賦形剤約100モル〜約1000モル、またはFc変異タンパク質約1モルに対して炭水化物賦形剤約200モル〜約6000モル、またはFc変異タンパク質約1モルに対して炭水化物賦形剤約100モル〜約510モル、またはFc変異タンパク質約1モルに対して炭水化物賦形剤約100モル〜約600モルである。
【００５８】
1実施形態において、本発明の製剤は、内毒素および/または関連する発熱物質を実質的に含まない、発熱物質非含有の製剤である。内毒素として、微生物内に限局していて、その微生物が壊れるか死んだときにのみ放出される毒素が含まれる。発熱物質として、細菌およびその他の微生物の外膜からの熱誘発性、熱安定性物質(糖タンパク質)も含まれる。これらの物質の両方が、ヒトに投与されると、熱、低血圧およびショックの原因となり得る。有害な効果の潜在性のため、静脈内投与する医薬溶液からは、低量の内毒素でも除去しなければならない。Food & Drug Administration(FDA)は、静脈内薬物適用について、1時間に体重kg、1用量当たり、5内毒素単位(EU)の上限を設定している(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。抗体またはFc融合タンパク質の場合のように、治療用タンパク質を体重kg当たり数百または千ミリグラムを投与する場合、微量でも有害で危険な内毒素を除去しなければならない。特定の特定の実施形態において、組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、10 EU/mg未満、または5 EU/mg未満、または1 EU/mg未満、または0.1 EU/mg未満、または0.01 EU/mg未満、または0.001 EU/mg未満である。
【００５９】
in vivo 投与のために使用する場合、本発明の製剤は滅菌すべきである。本発明の製剤は、滅菌ろ過、放射線照射などを含む、各種の滅菌方法によって、滅菌することができる。1実施形態において、Fc変異タンパク質製剤を予備滅菌した0.22ミクロンフィルターでフィルター滅菌する。注射用の滅菌組成物は以下に記載された常套的な医薬実務にしたがって、製剤化することができる: "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins,(2005)。本明細書中に開示したものなどの、Fc変異タンパク質を含む製剤は、普通、凍結乾燥形態または溶液で保存されることとなる。Fc変異タンパク質を含む滅菌組成物を、滅菌取り出し口を持つ容器、例えば、製剤の取り出しが可能なアダプター、皮下注射針によって貫通させることができるストッパーなどを持つ静脈溶液バッグまたはバイアルに入れることを意図している。
【００６０】
本発明は液体製剤と乾燥した製剤の両方を包含する。特定の実施形態において、製剤は液体製剤である。本発明の液体製剤は、1回使用分の1アリコートの液体製剤を含有するバイアルを調製することによって、単位投与剤形を調製することができる。例えば、1バイアルについて単位用剤は、約10 mg/ml〜約200 mg/mlの範囲の各種濃度のFc変異タンパク質を1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml、8 ml、9 ml、10 ml、15 ml、20 mlまたは任意の範囲もしくはその中に入る数値を含み得る。必要ならば、各バイアルに滅菌希釈剤を添加することによって、これらの調製物を所望の濃度に調整することができる。
【００６１】
別の実施形態において、製剤は投与前に再構成する乾燥した製剤である。乾燥製剤の調製のために、本明細書中に開示した1以上の成分を含むFc変異タンパク質を「凍結乾燥前(pre-lyophilization)製剤」として調製し、この際、タンパク質およびその他の製剤成分(例えば、賦形剤および/または添加剤)の量は、所望の投与体積、投与方法などを考慮に入れて決定し、そして生成する製剤を乾燥する。1実施形態において、凍結乾燥前製剤を、再構成時に生成する再構成製剤が以下を含むことになるように、調製する: 約1 mg/mL〜約200 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約100 mMの緩衝剤、pH約5.5〜約8、ならびにさらに以下からなる群から選択される1以上の追加成分、約1〜約15重量対体積%の炭水化物賦形剤、約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸、および約1 mM〜約200 mMのアニオン。別の実施形態において、凍結乾燥前製剤を、再構成時に生成する再構成製剤がさらに約0.001%〜約0.05%の界面活性剤を含むことになるように、調製する。
【００６２】
本発明のいずれの製剤も凍結乾燥前製剤として利用することができることを意図しており、これは本明細書中、「凍結乾燥前バルク製剤」とも称される。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、以下の凍結乾燥前バルク製剤である: 約20 mg/mL〜約100 mg/mLのFc変異タンパク質、約1 mM〜約25 mMの緩衝剤を含み、pH約5.5〜約6.5であり、さらに以下からなる群から選択される1以上の追加成分を含む製剤: 約1〜約10重量対体積%の炭水化物賦形剤、約50 mM〜約200 mMのカチオン性アミノ酸、および約50 mM〜約200 mMのアニオンおよび約0.001%〜約0.05%の界面活性剤。特定の1実施形態において、本発明の製剤は以下の凍結乾燥前バルク製剤である: 20 mg/mL〜100 mg/mLのFc変異タンパク質、1 mM〜25 mMの緩衝剤を含み、pH5.5〜6.5であり、さらに以下からなる群から選択される1以上の追加成分を含む製剤: 1%〜10重量対体積%の炭水化物賦形剤、50 mM〜200 mMのカチオン性アミノ酸、および50 mM〜200 mMのアニオンおよび0.001%〜0.05%の界面活性剤。
【００６４】
液体製剤の乾燥形態を製造するための特定の方法は当分野で十分明らかになっており、例えば、限定するわけではないが、凍結乾燥、フリーズドライ、スプレードライまたは風乾がある(例えば、PCT公開WO 05/123131; WO 04/058156、WO 03/009817; WO 97/04801およびU.S.特許番号6,165,463、参照)。1実施形態において、本発明の製剤の成分を、別々にまたは単位投与剤形中に共に混合して、例えば、活性薬剤の量を指定した、アンプルまたはサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として提供する。組成物を注入によって投与する場合、滅菌医薬等級水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて分配することができる。組成物を注射によって投与する場合は、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを用意して、投与前に成分を混合することができるようにする。
【００６５】
5.2  Fc変異タンパク質製剤の安定性
特定の実施形態において、本発明の製剤は、Fc変異体の凝集を、同一のFc変異体を10 mMヒスチジン、pH 6.0に製剤化した場合の凝集に比較して低下させる。特定の1実施形態において、本発明の製剤は、Fc変異体の凝集を、同一のFc変異体を10 mMヒスチジン、pH 6.0中で製剤化した場合の凝集に比較して、少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも100%、低下させる。別の特定の実施形態において、本発明の製剤は、Fc変異体の凝集を、同一のFc変異体を10 mMヒスチジン、pH 6.0に製剤化した場合の凝集に比較して、少なくとも2倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍、または少なくとも500倍、低下させる。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、貯蔵時、例えば、室温もしくは4℃で長期間(例えば、限定するわけではないが 1週間、1ヶ月、6ヶ月、1年、2年、3年もしくは5年)または38℃〜42℃などの高められた温度で一定の期間(限定するわけではないが1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、または6ヶ月など)、改善された凝集プロフィルを維持する。特定の実施形態において、本製剤は、限定するわけではないが以下の相対湿度: 10%まで、または20%まで、または30%まで、または40%まで、または50%まで、または60%まで、または70%まで、または80%まで、または90%まで、または100%までを含む多様な湿度条件で光に曝露して貯蔵するか暗所で保存したとき、改善された凝集プロフィルを維持する。当分野では、用語「環境」条件とは一般的に、光曝露の下、10%〜60%の相対湿度で約20℃の温度を称するものと理解されたい。同様に、約10%未満の相対湿度で約2℃〜約8℃の温度は「4℃」または「5℃」と総称され、約60%の相対湿度で約23℃〜約27℃の温度は「25℃」と総称され、そして約75%の相対湿度で約38℃〜約42℃の温度は「40℃」と総称される。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、サイズ排除クロマトグラフ(SEC)またはサンプル中の凝集の程度を判定するのに有用な同様のアッセイによって評価して、37℃〜42℃の温度範囲で少なくとも5日、20℃〜25℃で少なくとも30日、そして2℃〜8℃で少なくとも90日、または少なくとも120日、または少なくとも180日、または少なくとも1年間、総タンパク質に対する凝集が20%以下、または10%以下、または5%以下、または2%以下、または1%以下、または0.5%以下、または0.4%以下、または0.2%以下、または0.1%以下、または0.1%未満である。別の特定の実施形態において、本発明の製剤は、サイズ排除クロマトグラフ(SEC)またはサンプル中の凝集の程度を判定するのに有用な同様のアッセイによって評価して、38℃〜42℃の温度範囲で少なくとも5日、23℃〜27℃で少なくとも30日、そして2℃〜8℃で少なくとも90日間、総タンパク質に対する凝集が20%以下、または10%以下、または5%以下、または2%以下、または1%以下、または0.5%以下、または0.4%以下、または0.2%以下、または0.1%以下、または0.1%未満である。
【００６８】
すなわち、本発明の製剤は本明細書中で定義するように、上に規定した期間の貯蔵後、低レベルから検出不能レベルまでの凝集である。1実施形態において、上に規定した期間の貯蔵後、SECまたはサンプル中の凝集の程度を判定するのに有用な同様のアッセイによって測定して、20%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、または0.5%以下、または0.4%以下、または0.2%以下、または0.1%以下(しかし、特定の実施形態において、少なくとも0.1%)のFc変異タンパク質が凝集を形成する。
【００６９】
さらに、本発明の製剤は、上記の条件下で長期間の貯蔵中に、Fc変異タンパク質の生物学的活性の損失をほとんど示さない。本発明の製剤は上記の定義の貯蔵後、貯蔵前の製剤の当初の生物学的活性の80%超、85%超、90%超、95%超、98%超、99%超、または99.5%超を維持している。
【００７０】
貯蔵期間中、製剤が、限定するわけではないが、0〜4℃、2〜8℃、10〜15℃、20〜24℃、23〜27℃、室温、または高められた温度38〜42℃などの温度で、また限定するわけではないが、1週間、2週間、1ヶ月、6ヶ月、1年、3年または5年などの長期間、一定の凝集割合を提示することを意図している。したがって、1実施形態において、Fc変異タンパク質製剤は総タンパク質に対する凝集パーセントの増加が、38〜42℃で1%/月〜10%/月以下、または20〜24℃で0.2%/月〜1.0%/月以下、またはおよそ4℃(すなわち 2〜8℃)で0.2%/月以下となる。
【００７１】
特定の実施形態において、4℃で少なくとも1ヶ月の貯蔵後、本発明の製剤は、粒子マルチサイザーで判定して以下の粒子プロフィルを含む(または凝集画分を構成している): 直径2〜4μm; 約3.4 E +5粒子/ml未満、直径4〜10μm; 約4.0 E +4粒子/ml未満、直径10〜20μm; 約4.2 E +3粒子/ml未満、直径20〜30μm; 約5.0 E +2粒子/ml未満、直径30〜40μm; 約7.5 E +1粒子/ml未満、および直径40〜60μm; 約9.4粒子/ml未満。特定の実施形態において、本発明の製剤は40μmより大きいかまたは30μmより大きい検出可能な粒子を含有しない。
【００７２】
本発明の製剤はFc変異タンパク質を安定化するのに特に有用であるが、本出願の製剤を、急速な凝集傾向がある多種のタンパク質の安定性を強化するためにも使用することができることを意図している。したがって、1実施形態において、本発明の製剤は凝集傾向があるタンパク質の凝集を低下させる。特定の1実施形態において、本発明の製剤は凝集傾向があるタンパク質の凝集を、凝集することが知られている製剤の同一の濃度のタンパク質に比較して、少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも100%低下させる。
【００７３】
さらに、当分野では、多種のタンパク質が高濃度で製剤化するほど凝集しやすいことが知られている。したがって、本発明の製剤は、高濃度で凝集することが知られているタンパク質の高濃度製剤を製剤化するために使用することができる。特定の1実施形態において、本発明の製剤は、高濃度で凝集傾向があるタンパク質の高濃度(例えば、20 mg/mLまたはそれ以上)での凝集を、別のバッファー中でより低濃度(例えば、20 mg/mL未満)で製剤化したタンパク質の凝集まで、低下させる。特定の1実施形態において、本発明の製剤は高濃度で凝集しやすいタンパク質を以下の濃度で製剤化することを可能にする: 少なくとも20 mg/mL、または少なくとも30 mg/mL、または少なくとも40 mg/mL、または少なくとも50 mg/mL、または少なくとも60 mg/mL、または少なくとも70 mg/mL、または少なくとも80 mg/mL、または少なくとも90 mg/mL、または少なくとも100 mg/mL、または少なくとも200 mg/mL、この場合、このタンパク質の20%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、または0.5%以下、または0.4%以下、または0.2%以下、または0.1%以下が凝集を形成する。
【００７４】
タンパク質製剤(例えば、本発明のFc変異タンパク質製剤)中に存在する凝集の程度、ならびに/または凝集のタイプおよび/もしくはサイズを判定するためには、限定するわけではないが、以下を含む多数の有用な方法が当分野で知られている: サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)、静的光散乱(SLS)、フーリェ変換赤外分光法(FTIR)、円偏光二色法(CD)、尿素誘導タンパク質アンフォールディング法、トリプトファン固有蛍光、示差走査熱量法、および1-アニリノ-8-ナフタレンスルホン酸(ANS)タンパク質結合法。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を実施して、適切な樹脂を充填したカラムに分子を通すことによって、そのサイズに基づいて分子を分離することができる。より大きい分子(例えば凝集体)はより小さい分子(例えばモノマー類)の前に溶出することとなる。分子は一般的に280 nmでのUV吸収によって検出し、さらに特性決定するために回収することができる。SEC分析(HP-SEC)のために高圧液体クロマトグラフィーカラムを利用することが多い。特定のSEC方法は、下記の「実施例」の節で詳細を記載する。あるいは、分析用超遠心分離法(AUC)を利用することができる。AUCは、液体サンプル中のマクロ分子の沈降係数を測定する直交法(Svedberg, S、に報告されている)である。SECと同様に、AUCはモノマー群から抗体フラグメント/凝集を分離および検出することができ、またさらに分子量に関する情報を提供することができる。製剤中のタンパク質凝集は、コールター(coulter)カウンターを使用する粒子計数分析または濁度計を使用する濁度測定によっても、特性決定することができる。濁度は溶液中の粒子が光を散乱させる量の尺度であり、これによって、タンパク質凝集の全般的な指標として使用することができる。その上、非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)またはキャピラリーゲル電気泳動(CGE)を使用して、本発明の製剤中のFc変異タンパク質の凝集および/または断片化状態を明らかにすることができる。PAGEおよびCEG法の特定の例を、下記の「実施例」の節で詳述する。
【００７５】
5.3  変異Fc領域
本発明は、変異Fc領域を含むタンパク質の製剤を提供する。これは、天然に生じないFc領域であって、例えば1以上の天然に生じないアミノ酸残基を含むFc領域である。また、本発明の変異Fc領域には、アミノ酸欠失、付加および/または修飾を含むFc領域も包含される。
【００７６】
本明細書で使用するFc領域として第1定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドが含まれるものと理解されたい。したがって、Fcは、IgA、IgD、およびIgGの後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、そしてこれらのドメインのN末端のフレキシブルヒンジ部である。IgAおよびIgMについては、FcはJ鎖を含んでもよい。IgGについては、Fcは免疫グロブリンドメイン、Cガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)ならびにCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)の間のヒンジ部を含む。Fc領域の境界は変更されることがあるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、残基C226またはP230からそのカルボキシル末端までを含むものと定義される。この際、番号は、Kabatら(1991、NIH公開91-3242、National Technical Information Service、Springfield、VA)にあるように、EUインデックスにしたがうものである。「Kabatに示されたEUインデックス」とは、Kabatら、上記、に記載されたヒトIgG1 EU抗体の残基の番号付与である。Fcとは単独でこの領域を称するか、または抗体、抗体フラグメント、もしくはFc融合タンパク質が関連する中でのこの領域を称する。Fc変異タンパク質は抗体、Fc融合体、またはFc領域を含む任意のタンパク質もしくはタンパク質ドメインでありうる。特に好ましいのは、変異Fc領域であって、天然に生じないFcの変異体を含むタンパク質である。注記: 限定するわけではないがKabat 270、272、312、315、356、および358を含む、多数のFc位置に多形が観察されており、したがって提供する配列と先行文献中の配列間にはわずかな差異がある場合がある。
【００７７】
本発明は、対比分子(例えば、野生型Fc領域以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質)に比較して、Fcリガンド(例えば、Fc受容体、C1q)との結合特性が変更されているFc変異タンパク質を包含する。結合特性の例として限定するわけではないが以下が含まれる: 結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離および会合速度(それぞれKoffおよびKon)、結合親和性ならびに/またはアビディティ。一般的に、高KDの結合分子よりも低KDの結合分子(例えば、抗体などのFc変異タンパク質)の方が好ましいものと解釈される。しかし、いくつかの事例では、KD値よりもKonまたはKoff値の方が関連性が高いことがある。当業者は、所定の抗体への適用について、どの動力学パラメーターが最も重要であるかを判断することができる。
【００７８】
Fcドメインのそのリガンドに対する親和性および結合特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわちFcγRへのFc領域の特異的結合性を判定するための当分野で既知の多様なin vitroアッセイ法(生化学的または免疫学的アッセイ)によって決定することができる。これらとして限定するわけではないが以下が含まれる: 平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA); 実施例3参照、またはラジオイムノアッセイ(RIA))、または動力学(例えば、BIACORE(登録商標)分析)、ならびに間接的結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー遷移(FRET)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲルろ過)などのその他の方法。これらおよびその他の方法では、試験する成分の1つ以上の標識を利用し、かつ/または限定するわけではないが以下を含む多様な検出方法を使用することができる: 発色、蛍光、発光、もしくは同位体標識。結合親和性および動力学の詳細な説明は以下から得ることができる: Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia(1999)、これは抗体-免疫原相互作用に焦点を当てている。
【００７９】
1実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較して1以上のFcリガンドへの結合性が強化されている。別の実施形態において、Fc変異タンパク質はFcリガンドとの親和性が対比分子のものよりも、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍大きい。特定の1実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体への結合性が強化されている。別の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcγRIIIAへの結合性が強化されている。さらに別の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcRnへの結合性が強化されている。さらに別の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較してC1qへの結合性が強化されている。
【００８０】
Fc領域を含むタンパク質の血清中半減期は、Fc領域のFcRnに対する結合親和性を増大させることによって、増加させることができる。1実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較して血清中半減期が増強されている。
【００８１】
「抗体依存性細胞仲介細胞傷害性」または「ADCC」とは、一定の細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcRs)に結合した分泌されたIgが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保有標的細胞に特異的に結合させて、その標的細胞を細胞毒素によって殺傷することを可能にするという、細胞傷害作用の形成を称する。標的細胞の表面に対して特異的高親和性のIgG抗体はその細胞傷害性細胞への「アーム」を持ち、こうした殺傷にはこれが絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は細胞外のことであり、直接の細胞-細胞接触を必要とし、これには補体は関与しない。その上、抗体の外に、抗原産生性標的細胞に特異的に結合する能力を持つFc領域、特にFc融合タンパク質を含むその他のタンパク質が、細胞仲介細胞傷害の作用をすることができることを意図している。単純化のため、Fc融合タンパク質の活性がもたらす細胞仲介細胞傷害性も、本明細書中ではADCC活性と称する。
【００８２】
任意の特定のFc変異タンパク質が標的細胞の溶解をADCCによって仲介する能力を、アッセイすることができる。ADCC活性を評価するために、対象のFc変異タンパク質を免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に添加する。これが抗原抗体複合体によって活性化されて、その結果、標的細胞の細胞溶解をもたらすことができる。細胞溶解は一般的に、溶解された細胞からの標識(例えば放射性基質、蛍光染料または在来の細胞内タンパク質)の放出によって検出する。こうしたアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。in vitro ADCCアッセイの特定の例は以下に記載されている: Wisecarverら、1985 79:277-282; Bruggemannら、1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinsonら、2001、J Immunol Methods 258:183-191; Patelら、1995 J Immunol Methods 184:29-38、および本明細書中(実施例3参照)。別法として、またはこれに加えて、目的のFc変異タンパク質のADCC活性をin vivoで、例えば以下に開示されているような動物モデルで評価することができる: Clynesら、1998, PNAS USA 95:652-656。
【００８３】
1実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較して強化されたADCC活性を持つ。特定の1実施形態において、Fc変異タンパク質のADCC活性は対比分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きい。別の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較してFc受容体 FcγRIIIAに対する結合が強化され、かつ強化されたADCC活性を持つ。別の実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較して強化されたADCC活性と増強された血清中半減期の両方を持つ。
【００８４】
「補体依存性細胞傷害性」および「CDC」とは、補体の存在中での標的細胞の溶解作用を称する。補体活性化経路は補体系(C1q)の第1成分と分子、例えば対応抗原と複合体化した抗体、との結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoroら、1996, J. Immunol. Methods, 202:163、に記載されたCDCアッセイを実施することができる。1実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較して強化されたCDC活性を持つ。特定の1実施形態において、Fc変異タンパク質のCDC活性は対比分子に比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きい。別の実施形態において、Fc変異タンパク質は対比分子に比較して強化されたCDC活性と増強された血清中半減期の両方を持つ。
【００８５】
1実施形態において、本発明はFc領域が以下からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸残基を含む製剤を提供する: Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、222、224、234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、248、252、254、256、258、262、263、264、265、266、267、268、269、272、274、275、278、279、280、282、290、294、295、296、297、298、299、300、312、313、318、320、325、326、327、328、329、330、332、333、334、335、339、359、360、372、377、379、396、398、400、401、430および436。場合によって、Fc領域は当業者に知られた追加の、および/または代替位置に天然に生じないアミノ酸残基を含む(例えば、U.S.特許 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; PCT特許公開 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217、参照)。
【００８６】
特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、Fc領域が以下からなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸残基を含む製剤を提供する: Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、222N、224L、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241 L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、248M、252Y、254T、256E、258D、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268D、268N、269H、269Y、269F、269R、296E、272Y、274E、274R、274T、275Y、278T、279L、280H、280Q、280Y、282M、290G、290S、290T、290Y、294N、295K、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、300I、300L、312A、313F、318A、318V、320A、320M、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、335A、335T、335N、335R、335Y、339T、359A、360A、372Y、377F、379M、396H、396L、398V、400P、401V、430A。場合によって、Fc領域は当業者に知られた追加の、および/または代替の天然に生じないアミノ酸残基を含んでもよい(例えば、U.S.特許 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; PCT特許公開 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217、参照)。
【００８７】
1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、Fc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252、254、および256からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を少なくとも1個を含む製剤を提供する。特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、Fc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を含む製剤を提供する。
【００８８】
別の実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、Fc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239、330および332からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を少なくとも1個を含む製剤を提供する。特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、Fc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を含む製剤を提供する。場合によって、Fc領域は、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252、254、および256からなる群から選択される1以上の位置に、追加の天然に生じないアミノ酸をさらに含む。特定の1実施形態において、本発明はFc変異タンパク質製剤であって、Fc領域がKabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸と、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を含む製剤を提供する。
【００８９】
1実施形態において、本発明のFc変異体を以下に開示されているような別の既知のFc変異体と結合させることができる: Ghetieら、1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncanら、1988, Nature 332:563-564; Lundら、1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lundら、1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegreら、1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchinsら、1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferisら、1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lundら、1995, Faseb J 9:115-119; Jefferisら、1996, Immunol Lett 54:101-104; Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969; Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogieら、2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddyら、2000, J Immunol 164:1925-1933; Xuら、2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogieら、2001, J Immunol 166:2571-2575; Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65; Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); U.S.特許Nos. 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; U.S.特許公開Nos. 2004/0002587およびPCT Publications WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351。欠失、付加および/または修飾を含むFc領域も本発明に包含される。Fcドメインのさらに別の修飾/置換/付加/欠失は当業者に容易に明らかになるはずである。
【００９０】
上記の置換のいずれについても保存アミノ酸置換をさせることができることを、特に意図している。「保存アミノ酸置換」が、機能的に等価なアミノ酸と置換するアミノ酸置換であることは、当分野で周知である。保存アミノ酸の変更は生成するペプチドのアミノ酸配列のサイレント変化をもたらす。例えば、同程度の極性を持つ1以上のアミノ酸は機能的等価物として作用し、その結果、そのペプチドのアミノ酸配列内にサイレント変更をもたらす。また、中性荷電であって、残基をより小さい残基に置き換える置換は、その残基が異なるグループのもの(例えば、フェニルアラニンのより小さなイソロイシンとの置き換え)であっても、「保存置換」とみなされ得る。同類の側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。保存アミノ酸置換の限定するわけではないいくつかのファミリーを表1に示す。
【表１】
2009525986.tif 000003
【００９１】
用語「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸類似体または変異体の使用をも称する。表現型サイレントアミノ酸置換の作製方法に関する指針が以下に提供されている: Bowieら、"Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,"(1990, Science 247:1306-1310)。
【００９２】
天然に生じないFc領域の作製方法は当分野で知られている。例えば、アミノ酸置換および/または欠失は、限定するわけではないが以下を含む突然変異誘発方法によって作製することができる: 部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492(1985))、PCR突然変異誘発(Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183(1990))、およびカセット突然変異誘発(Wellsら、Gene 34:315-323(1985))。好ましくは、オーバーラップ-伸長PCR法によって部位特異的突然変異誘発を実施する。これは実施例で開示している(Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70(1989))。あるいは、オーバーラップ-伸長PCRの技法(Higuchi、同書)を使用して、標的配列(出発DNA)中に任意の所望の突然変異(群)を導入することができる。例えば、オーバーラップ-伸張法におけるPCRの第1ラウンドでは、外部プライマー(プライマー1)と内部突然変異誘発プライマー(プライマー3)、そして別に第2の外部プライマー(プライマー4)と内部プライマー(プライマー2)による、標的配列の増幅を含み、2つのPCRセグメント(セグメントAおよびB)を生成させる。内部突然変異誘発プライマー(プライマー3)は、所望の突然変異(群)を特定する標的配列についてミスマッチを含有するように設計する。PCRの第2ラウンドでは、PCRの第1ラウンドの産物(セグメントAおよびB)を、2つの外部プライマー(プライマー1および4)を使用して、PCRによって増幅させる。生成する全長PCRセグメント(セグメントC)を制限酵素で消化し、生成する制限フラグメントを適切なベクターにクローン化する。突然変異誘発の第1段階として、出発DNA(例えば、Fc融合タンパク質、抗体または単純にFc領域をコードするもの)を突然変異誘発ベクターに機能し得るようにクローン化する。プライマーは所望のアミノ酸置換を反映するように設計する。変異Fc領域の作製に有用なその他の方法は当分野で知られている(例えば以下参照: U.S.特許Nos. 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; U.S.特許公開Nos. 2004/0002587およびPCT公開 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351)。
【００９３】
いくつかの実施形態において、Fc変異タンパク質は工学操作された糖鎖型、すなわちFc領域を含む分子に共有結合で接続された炭水化物組成物を含む。工学操作糖鎖型は、限定するわけではないがエフェクター機能の強化または低下を含む、多様な目的にとって有用でありうる。工学操作糖鎖型は当業者に知られた方法によって作製することができる。例えば、工学操作または変異体を発現する株の使用、1以上の酵素、例えばDI N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTI11)との同時発現、各種生物または各種生物からの細胞系でのFc領域を含む分子の発現、あるいはFc領域を含む分子が発現された後の炭水化物の修飾による。工学操作糖鎖型の作製方法は当分野で知られており、また限定するわけではないが以下に記載されたものが含まれる: Umanaら、1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Daviesら、20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shieldsら、2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawaら、2003, J Biol Chem 278:3466-3473) U.S.特許No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent(商標)技法(Biowa、Inc. Princeton、N.J.); GlycoMAb(商標)グリコシル化工学操作技法(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)。例えば、以下を参照されたい: WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazakiら、2004, JMB, 336: 1239-49。その他の方法が下記の「抗体」の節で説明する。
【００９４】
5.4  Fc変異タンパク質
上記のように、Fc変異タンパク質は変異Fc領域またはそのフラグメントを含むタンパク質であって、限定するわけではないが、抗体およびFc融合タンパク質が含まれる。Fc融合体はFc領域またはそのフラグメントと、融合相手との結合物であり、それは一般的にあらゆるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドが可能であり、限定するわけではないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、またはその他の何らかのタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれる。また、本発明には、小分子に融合したFc領域、またはそのフラグメントを含むFc融合タンパク質も包含される。Fc融合体の非Fc部分の役割は標的の結合を仲介することであり、したがってそれは抗体の可変領域に機能的に類似するものである。したがって、1実施形態において、Fc変異タンパク質は抗体である。別の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc融合タンパク質である。
【００９５】
変異Fcタンパク質は、タンパク質またはそのフラグメント(例えば、対象の抗原に免疫特異的に結合する可変ドメインまたは対象の受容体の細胞外ドメイン)と変異Fc領域またはそのフラグメントを結合させることによる「de novo」製造することができる。あるいは、Fc領域を含有するタンパク質(例えば、対象の抗原に結合する抗体またはFc融合タンパク質)を、そのFc領域中に1以上の天然に生じない残基を導入して、修飾することによって、製造することができる。
【００９６】
5.4.1  抗体
抗体は、可変領域を含み、さらに1以上の定常領域をも含む、特異的抗原に結合する、免疫学的タンパク質である。定常領域は配列の多様性が低く、重要な生化学的事象を誘発する多数の天然タンパク質との結合に関係する。抗体の可変領域はその分子の抗原結合性決定因子を含有し、したがって抗体のその標的抗原に対する特異性を決定付ける。可変領域は、同一のクラス内の別の抗体と配列が最も異なっているので、このように命名されている。配列可変性の大部分はその相補性決定領域(CDR)で発生する。合計6個のCDRがあり、重鎖および軽鎖が3個ずつであって、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3と命名されている。CDRの可変領域の外側はフレームワーク(FR)領域と称される。CDRほど多様性ではないが、各種抗体間でFR領域の配列可変性も発生する。相補性決定領域(CDR)の残基の数は本明細書中ではKabatら(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)のものに相当するものと理解されたい。具体的には、軽鎖可変ドメイン内の残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)および89-97(CDR3)ならびに重鎖可変ドメイン内の31-35(CDR1)、50-65(CDR2)および95-102(CDR3)である。CDRは抗体同士で相当差異があること(また定義から、Kabatコンセンサス配列との相同性は示さないこと)に注意されたい。Fv領域のために使用する、フレームワーク残基の最大アラインメントには番号付与システムで「スペーサー」残基の挿入が必要となる場合が多い。本明細書中で示すCDRはKabatら、上記のものであることが理解されよう。その上、どの所定のKabat部位番号での一定の個々の残基の個体特性も、種間またはアレル多様性によって、抗体鎖同士で差異があり得る。
【００９７】
本明細書で使用する用語「抗体」および「抗体群」とは、認識されている免疫グロブリンの全部または一部に実質的にコードされた1以上のポリペプチドで構成されるタンパク質のことであり、限定するわけではないが以下が含まれる: モノクローナル抗体、多種特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体が含まれる)、ならびにFc領域またはそのフラグメントに融合した上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメント。本発明の方法で使用する抗体として、以下が含まれる: 免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原結合部位を含有する分子。特定の実施形態において、これらのフラグメントはFc領域またはそのフラグメントに融合している。それは変異Fc領域であっても、そうでなくてもよい。本明細書中に概説するように、用語「抗体」および「抗体群」には特定的に以下が含まれる: 本明細書に記載された変異Fc領域を含む抗体、変異Fc領域を含む全長抗体およびFc融合体、あるいは免疫グロブリンの免疫学的に活性なフラグメントまたは本明細書に記載されたその他のタンパク質に融合した、本明細書に記載されたそれらのフラグメント。こうしたFc変異体-融合体として限定するわけではないが、以下が含まれる: scFv-Fc融合体、可変領域(例えば、VLおよびVH)-Fc融合体、scFv-scFv-Fc融合体。本発明の免疫グロブリン分子は任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または免疫グロブリン分子のサブクラスとすることができる。
【００９８】
抗体または抗体フラグメントは以下のようなどの動物起源からのものでもよい: 鳥類および哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)。1実施形態において、抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用する、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を持つ抗体が含まれ、またヒト免疫グロブリンライブラリーまたはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離した抗体が含まれる。
【００９９】
抗体はすべてのポリペプチドと同様に等電点(pI)を持ち、これは一般的にはポリペプチドが総合的に荷電を持たなくなるpHとして定義される。当分野では、溶液のpHがタンパク質の等電点(pI)に等しいときに、そのタンパク質の溶解性は典型的には最低になることが知られている。抗体内のイオン化性残基の数と位置を変更して、pIを調整することによって、溶解性を最適化することが可能である。例えば、あるポリペプチドのpIを、適切なアミノ酸置換をすることによって(例えば、リシンなどの荷電アミノ酸をアラニンなどの非荷電残基と置換することによって)、操作することができる。何らかの特定の理論に束縛されることは望まないが、抗体のpIに変化をもたらすその抗体のアミノ酸置換は、その抗体の溶解性および/または安定性を改善しうる。当業者は、特定の抗体について所望のpIを達成するために、どのアミノ酸置換が最も適切であるかを理解できるはずである。タンパク質のpIは、限定するわけではないが、等電点電気泳動法および各種コンピュータアルゴリズムを含む多様な方法によって測定することができる(例えばBjellqvistら、1993、Electrophoresis 14:1023-1031)。1実施形態において、本発明にしたがって利用する抗体のpIは、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、または約9.0よりも高い。特定の1実施形態において、抗体のpIに変更をもたらす置換が、その抗原に対する結合親和性を顕著に低下させないものとする。別の実施形態において、本発明にしたがって利用する抗体のpIは6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、または9.0よりも高い。1以上のFcリガンド(上記)への結合性の変更をもたらすFc領域の置換がpIの変化をももたらすことを特定的に意図している。別の実施形態において、FcγR結合性の所望の変更とpIの任意の所望の変化の両方に効果を上げるため、Fc領域の置換を具体的に選択する。本明細書で使用する場合、pI値は優勢な荷電形態のpIとして定義される。タンパク質のpIは、限定するわけではないが、等電点電気泳動法および各種コンピュータアルゴリズムを含む多様な方法によって測定することができる(例えばBjellqvistら、1993、Electrophoresis 14:1023-1031)。
【０１００】
抗体のFabドメインのTmは抗体の熱安定性の良好な指標となることができ、さらに貯蔵期間の指標を提供することができる。低いTmの方が高凝集性/低安定性を示し、一方高いTmの方が低凝集性/高安定性を示す。したがって、高い方のTmを持つ抗体が好ましい。1実施形態において、本発明にしたがって利用する抗体のFabドメインは、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃または120℃より高いTm値を持つ。タンパク質ドメイン(例えば、Fabドメイン)の熱溶融温度(Tm)は当分野で既知の標準的方法を使用して、例えば、示差走査熱量計によって、測定することができる(例えば、Vermeerら、2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeerら、2000, Biophys. J. 79: 2150-2154参照)。その上、各種バッファー中に製剤化した抗体のTmを試験して、抗体安定性に対する製剤の影響を判定することができる。
【０１０１】
本発明にしたがって使用する抗体または抗体フラグメントは単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性とすることができる。多重特異性抗体は、所望の標的分子の異種エピトープに免疫特異的に結合するか、または標的分子と同様に異種ポリペプチドまたは固体支持材料などの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合することができる。例えば以下を参照されたい: 国際公開Nos. WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793; Tutt,ら、1991. J. Immunol. 147:60-69; U.S.特許Nos. 4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、および5,601,819; ならびにKostelnyら、1992, J. Immunol. 148:1547-1553。
【０１０２】
多重特異性抗体は少なくとも2つの別の抗原に対する結合特異性を持つ。こうした分子は正常では2つの抗原にのみ結合する(すなわち二重特異性抗体、BsAb)が、三重特異性抗体などの追加の特異性を持つ抗体も本発明に包含される。BsAbの例として、限定するわけではないが、第1抗原に特異的な一本のアームと第2抗原に特異的な別のアームを持つものが含まれる。二重特異性抗体の作製方法は当分野で知られている。全長二重特異性抗体の伝統的な製造方法は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対であって、この際2本の鎖が異なる特異性を持つものの同時発現に基づくものである(Millsteinら、1983, Nature, 305:537-539)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の任意の組み合わせのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は別の抗体分子の潜在的混合物を産生し、その中で1つのみが正しい二重特異性構造を持つ。正しい分子の精製は、通常親和性クロマトグラフィーステップによって行われるが、かなり面倒であり、また生成収率は低い。同様の操作法が以下に開示されている: WO 93/08829、およびTrauneckerら、1991, EMBO J., 10:3655-3659。より特異的な手法はジ-ダイアボディ、4価二重特異性抗体の作製である。ジ-ダイアボディの製造方法は当分野で知られている(例えば、Luら、2003, J Immunol Methods 279:219-32; Marvinら、2005, Acta Pharmacolical Sinica 26:649、参照)。
【０１０３】
別の手法によれば、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を持つ抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は好ましくは、少なくともヒンジ部、CH2およびCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものとする。融合体の少なくとも1つに、軽鎖結合に必要な部位を含有する第1重鎖定常領域(CH1)を存在させているものが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および、所望ならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物体中に同時トランスフェクトする。これによって、構築物で使用する3つのポリペプチド鎖の比率が等しくないものが最適収率を与える実施形態において、3つのポリペプチドフラグメントの相互割合を調整する際に、多大な自由度が提供される。しかし、少なくとも2つのポリペプチド鎖の同一の比率での発現が高収率の結果をもたらすか、または比率が何ら特定の意味を持たない場合は、2つまたは3つ全部のポリペプチド鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０４】
この手法の1実施形態において、二重特異性抗体を、一方のアームに第1の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性を提供する)で構成させる。この非対称構造が、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することがわかった。なぜならば、この二重特異性分子の半分の側にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在すると、容易な分離方法が可能だからである。この手法はWO 94/04690に開示されている。二重特異性抗体の作製のこれ以上の詳細は、例えば、Sureshら、1986, Methods in Enzymology、121:210、を参照されたい。WO96/27011に記載された別の手法によれば、一対の抗体分子を工学操作して、組換え細胞培養物から回収するヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。その好ましい接合部分は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第1抗体分子の接合部分からの1以上の小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)と置き換える。第2抗体分子の接合部分について、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの(例えばアラニンまたはトレオニン)と置き換えることによって、大きい側鎖と同一または同様のサイズの代償的「空洞」が創設される。これによって、ホモ二量体などの望ましくないその他の最終産物よりも、ヘテロ二量体の収率を増加させる機構が提供される。
【０１０５】
二重特異性抗体として交差結合または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体の一方をアビジンと結合させ、他方をビオチンと結合させる。例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的とするため(U.S.特許No. 4,676,980)、またHIV感染の治療のため(WO 91/00360、WO 92/200373、およびEP 03089)、こうした抗体が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な交差結合方法を使用して、作製することができる。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多数の交差結合技術とともに、U.S.特許No. 4,676,980に開示されている。2よりも多い結合価を持つ抗体も意図している。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。例えば、Tuttら、J. Immunol. 147: 60(1991)を参照されたい。
【０１０６】
特に意図する別の抗体は「オリゴクローナル」抗体である。本明細書で使用する用語「オリゴクローナル抗体」とは、別のモノクローナル抗体の既定の混合物である。例えば、PCT公開WO 95/20401; U.S.特許Nos. 5,789,208および6,335,163を参照されたい。1実施形態において、1以上のエピトープに対する抗体の既定の混合物で構成されるオリゴクローナル抗体を、単一の細胞で作製する。別の実施形態において、オリゴクローナル抗体は、天然に生じないアミノ酸を持ち、一般的な軽鎖と対になって多重特異性を持つ抗体を作製することができる、複数の重鎖を含む(例えば、PCT公開WO 04/009618)。オリゴクローナル抗体は、単一の標的分子上の複数のエピトープを標的とすることが望ましい場合に、特に有用である。当業者は、意図する目的および所望の必要性のために、どんなタイプの抗体または抗体混合物が適用可能であるかを知るか、決定できるであろう。
【０１０７】
本発明はラクダ化単一ドメイン抗体を含む単一ドメイン抗体で実行することもできる(例えば以下参照: Muyldermansら、2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttallら、2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999、J. Immunol. Meth. 231:25; 国際公開Nos. WO 94/04678およびWO 94/25591; U.S.特許No. 6,005,079)。
【０１０８】
本発明にしたがって利用することができる抗体には、哺乳動物(例えば、ヒト)の半減期(例えば、血清中半減期)が以下のものが包含される: 5日より長い、10日より長い、15日より長い、20日より長い、25日より長い、30日より長い、35日より長い、40日より長い、45日より長い、2ヶ月より長い、3ヶ月より長い、4ヶ月より長い、または5ヶ月より長い。哺乳動物(例えば、ヒト)での抗体の半減期の増加は、その哺乳動物のその抗体または抗体フラグメントの血清中の高力価をもたらし、したがって、その抗体または抗体フラグメントの投与頻度を減少させ、かつ/あるいは投与する抗体または抗体フラグメントの濃度を低下させる。in vivo半減期が増加した抗体は、当業者に知られた技法によって作製することができる。例えば、上記のように、FcドメインとFcRn受容体間の相互作用に関与することが確定されているアミノ酸残基を修飾(例えば、置換、欠失または付加)することによって、in vivo半減期が増加した抗体を作製することができる(例えば以下参照: 国際公開Nos. WO 97/34631; WO 04/029207; U.S. 6,737056およびU.S.特許公開No. 2003/0190311)。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、本発明にしたがって利用する抗体のグリコシル化を改変する。例えば、脱グリコシル化抗体(すなわち、グリコシル化を欠損している抗体)を作製することができる。グリコシル化を変更して、例えば、抗体の標的抗原に対する親和性を増大させることができる。こうした炭水化物改変は、例えば、抗体配列中の1以上のグリコシル化部位を変更することによって、達成することができる。例えば、1以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらす1以上のアミノ酸置換を実施して、それによってその部位のグリコシル化を排除することができる。こうした脱グリコシル化は抗体の抗原に対する親和性を増大させることができる。こうした手法は以下にさらに詳細に記載されている: U.S.特許Nos. 5,714,350および6,350,861。あるいは、Fc領域内に存在するグリコシル化部位(例えば、IgGのアスパラギン297)の排除をもたらす1以上のアミノ酸置換を実施することができる。さらに、グリコシル化抗体を、必要なグリコシル化機構を欠損している細菌細胞で、産生させることができる。
【０１１０】
その上、または別法として、フコシル残基の数が減少した低フコシル化抗体または2分岐型(bisecting)GlcNAc構造が増加した抗体などの、グリコシル化のタイプが変更された抗体を作製することができる。こうしたグリコシル化が変更されたパターンは抗体のADCC能力を増大させることが証明されている。こうした炭水化物改変は、例えば、変更されたグリコシル化機構を持つ宿主細胞で抗体を発現させることによって、達成することができる。変更されたグリコシル化機構を持つ細胞は当分野で記述されており、これを宿主細胞として使用して、その中で本発明の組換え抗体を発現させ、それによってグリコシル化が変更された抗体を産生させることができる。例えば以下を参照されたい: Shields, R.L.ら(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umanaら(1999) Nat. Biotech. 17:176-1、また、欧州特許No: EP 1,176,195; PCT公開WO 03/035835; WO 99/54342。
【０１１１】
また、「抗体様」および「抗体-ドメイン融合」タンパク質も本発明に包含される。抗体様分子は、所望の結合特性を持つように作製された、どんな分子でもよい。例えば以下を参照されたい: PCT公開Nos. WO 04/044011; WO 04/058821; WO 04/003019およびWO 03/002609。抗体-ドメイン融合タンパク質はFc領域とともに可変ドメインなどの1以上の抗体ドメインを組み込むことができる。例えば、異種ポリペプチドをFabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、VHドメイン、VLドメイン、VH CDR、VL CDR、またはそのフラグメントと融合するかまたはコンジュゲート化することができ、次にそれを変異Fc領域などのFc領域に融合し、そして本発明にしたがって製剤化する。多数の抗体-ドメイン分子が当分野で知られており、限定するわけではないが以下が含まれる: ダイアボディ(二重特異性抗体)(dsFv)2(Beraら、1998, J. Mol. Biol. 281:475-83); ミニボディ(ミニ抗体)(scFv-CH3融合タンパク質のホモ二量体)(Pessiら、1993, Nature 362:367-9)、4価ジ-ダイアボディ(Luら、2003 J. Immunol. Methods 279:219-32)、Bs(scFv)4-IgGと称する4価二重特異性抗体(Zuoら、2000, Protein Eng. 13:361-367)。これらの分子を変異Fc領域に融合するか、または現存するFc領域に、天然に生じないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。ポリペプチドの抗体部分との融合またはコンジュゲート化の方法は当分野で周知である。例えば以下を参照されたい: U.S.特許Nos. 5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、および5,112,946; 欧州特許Nos. EP 307,434およびEP 367,166; PCT公開Nos. WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590-5600; およびVilら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341。特に意図しているその他の分子は、小さな、工学操作タンパク質ドメイン、例えば、免疫ドメインおよび/またはモノマードメインなどである(例えば、U.S.特許公開Nos. 2003082630および2003157561参照)。免疫ドメインは抗体の相補性決定領域(CDR)の少なくとも1つを含み、一方モノマードメインは既知の天然に生ずる非抗体ドメインファミリーを基礎とするもので、特にタンパク質細胞外ドメインであって、保存スキャフォールドおよび可変結合部位を含むもので、その1例はリガンド結合に関与するドメインである、LDL受容体細胞外ドメインである。こうしたタンパク質ドメインは独立して、または例えば、シャペロニンもしくは金属イオンの存在の限定的な補助があって、適正に折りたたまれることができる。この能力によって、そのドメインが新しいタンパク質環境に挿入されたときに、その不正な折りたたみが回避され、それによって特定の標的に対するそのタンパク質ドメインの結合親和性が保存される。このタンパク質ドメインの可変結合部位は、例えば以下などの各種の多様な作製方法を使用して、ランダム化される: ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、また指向的進化方法、例えば、再帰的変異性PCR、再帰的組換えなど。各種の多様な作製方法の詳細については以下を参照されたい: U.S.特許Nos.5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; PCT公開Nos. WO 95/22625; WO 96/33207; WO 97/20078; WO 97/35966; WO 99/41368; WO 99/23107; WO 00/00632; WO 00/42561; およびWO 01/23401。次に突然変異させたタンパク質ドメインを、例えばファージディスプレーなどのディスプレーシステムを使用して、発現させる。これは少なくとも1010の変異体のライブラリーを作製して、その後のパニングおよびスクリーニングによって、意図する標的に対して改善された親和性および能力を持つタンパク質ドメインの単離を容易にすることができる。こうした方法は以下に記載されている: PCT公開Nos. WO 91/17271; WO 91/18980; WO 91/19818; WO 93/08278。その他のディスプレーシステムの例が以下に記載されている: U.S.特許Nos. 6,281,344; 6,194,550; 6,207,446; 6,214,553および6,258,558。これらの方法を利用して、sub-nM結合親和性(Kd)およびブロック機能(IC50)を持つ、非常に多様な工学操作タンパク質ドメインを迅速に作製することができる。同定後、長さが約4〜15アミノ酸の天然タンパク質リンカーを使用して、2〜10種のこうした工学操作タンパク質ドメイン同士を連結して、結合タンパク質を形成させることができる。個々のドメインが単一タイプ、または用途/疾病適応に応じて、いくつかのタンパク質を標的とすることができる。次にこの工学操作タンパク質ドメインを変異Fc領域に連結して、Fc変異タンパク質を作製することができる。
【０１１２】
5.4.2  Fc融合タンパク質
上記のように、本発明の製剤はFc融合タンパク質の製剤を包含する。Fc融合タンパク質は免疫グロブリンのFc領域またはそのフラグメントと融合相手が結びついたもので、これは一般的にはタンパク質であって、限定するわけではないが、以下が含まれる: 抗体の抗原結合部分、リガンド、酵素、受容体のリガンド部分、接着タンパク質、またはその他の何らかのタンパク質もしくはドメイン。例えば以下を参照されたい: Chamowら、1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenaziら、1997, Curr Opin Immunol 9:195-200; Heidaranら、1995, FASEB J. 9:140-5。ポリペプチドのFc領域への融合またはコンジュゲート化の方法は当分野で周知である。例えば以下を参照されたい: U.S.特許Nos. 5,336,603; 5,349,053; 5,447,851; 5,783,181; 欧州特許No. EP 367,166; 国際公開Nos. WO 91/06570; Ashkenaziら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zhengら、1995, J. Immunol. 154:5590-5600; およびVieら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341。変異Fc領域を含むFc融合タンパク質を本発明にしたがって製剤化して、安定性を改善しうる(例えば、凝集を低下させる)ことを意図している。変異Fc領域を含むFc融合タンパク質は、例えば、異種ポリペプチドを1以上の天然に生じないアミノ酸残基を含むFc領域またはそのフラグメント(すなわち、変異Fc領域)に融合またはコンジュゲート化させることによって、作製することができる。あるいは、Fc融合タンパク質のFc領域を、そのFc領域に1以上の天然に生じない残基を導入することによって修飾して、変異Fc領域を作製することができる。
【０１１３】
1実施形態において、1分子(すなわち、標的)に結合するFc融合タンパク質は、限定するわけではないが、本明細書中に開示したものを含む、変異Fc領域に融合した融合相手を含む。これらの実施形態では、その融合相手が1分子(すなわち、標的)に結合する。変異Fc領域と融合することができる融合相手として、限定するわけではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、小分子、模倣剤、合成薬剤、無機分子、および有機分子が含まれる。1実施形態において、融合相手は少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも100の連続アミノ酸残基を含むポリペプチドであって、変異Fc領域のアミノ酸配列とは異種性である。
【０１１４】
5.4.3  抗原、融合相手および抗体
Fc変異タンパク質は実質的にどんな分子でも標的とし、かつ/または組み込むことができ(例えば、抗体、Fc融合タンパク質)、これらとして限定するわけではないが、以下に列挙するタンパク質、また以下に列挙するタンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープが含まれる: レニン; 成長ホルモン、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなど; 成長ホルモン放出因子; 副甲状腺ホルモン; 甲状腺刺激ホルモン; リポタンパク質; アルファ-1-抗トリプシン; インスリンA鎖; インスリンB鎖; プロインスリン; 卵胞刺激ホルモン; カルシトニン; 黄体形成ホルモン; グルカゴン; 凝固因子、因子VII、因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)、およびフォンヴィルブラント（von Willebrands）因子など; 抗凝固因子、タンパク質Cなど; 心房性ナトリウム利尿因子; 肺表面活性物質; プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織-タイププラスミノーゲンアクチベーター(t-PA); ボンベシン; トロンビン; 造血成長因子; 腫瘍壊死因子(TNF)タンパク質、TNF-アルファ、TNF-ベータ、TNFベータ2、TNFc、TNFアルファベータ、4-1BBLなど、またTNFスーパーファミリーメンバーのメンバー、TNF様アポトーシス弱インデューサー(TWEAK)およびLIGHT、Bリンパ球スティミュレーター(BlyS)など; TNF受容体スーパーファミリーのメンバー、例えばTNF-RI、TNF-RII、TRAIL受容体-1、CD137、膜貫通アクチベーターおよびCAMLインタラクター(TACI)ならびにOX40Lなど; Fasリガンド(FasL); エンケファリナーゼ; RANTES(活性化、正常T細胞発現および分泌時の調節); ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP-1-アルファ); 血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなど; Muellerian阻害性物質; レラキシンA鎖; レラキシンB鎖; プロレラキシン; マウスゴナドトロピン関連ペプチド; 微生物タンパク質、ベータ-ラクタマーゼなど; DNAアーゼ; IgE; 細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA)、CTLA-4など; インヒビン; アクチビン; 血管内皮成長因子(VEGF); ホルモンまたは成長因子の受容体、例えば、EGFR(ErbB-1)、VGFR、CTGF(結合性組織成長因子)など; インターフェロン、アルファインターフェロン(α-IFN)、ベータインターフェロン(β-IFN)およびガンマインターフェロン(γ-IFN)など; インターフェロンアルファ受容体(IFNAR)サブユニット1および/または2ならびにその他の受容体、A1、アデノシン受容体、リンホトキシンベータ受容体、BAFF-R、エンドセリン受容体など; タンパク質AまたはD; リウマチ因子; 神経栄養因子、骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5、もしくは-6(NT-3、NT-4、NT-5、またはNT-6)など、または神経成長因子; 血小板由来成長因子(PDGF); 繊維芽細胞成長因子、αFGFおよびβFGFなど; 表皮成長因子(EGF); トランスフォーミング成長因子(TGF)、TGF-アルファおよびTGF-ベータなど、TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4、またはTGF-5を含む; インスリン様成長因子-Iおよび-II(IGF-IおよびIGF-II); des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様成長因子結合性タンパク質、ケラチノサイト成長因子; 成長因子受容体、FGFR-3、IGFR、PDGFRαなど; CDタンパク質、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD 8、CD11、CD11a、CD14、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67タンパク質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD52、CD54、CD55、CD56、CD63、CD64、CD80など; CD137およびCD147; IL-2R/IL-15Rベータサブユニット(CD122); エリスロポエチン; 骨誘導因子; イムノトキシン; 骨形成タンパク質(BMP); インターフェロン、インターフェロン-アルファ、-ベータ、および-ガンマなど; コロニー刺激因子(CSF)、M-CSF、GM-CSF、およびG-CSFなど; インターロイキン(ILs)、例えば、IL-1〜IL-13およびIL-15、IL-18、IL-23; EPO; スーパーオキシドジスムターゼ; T細胞受容体アルファ/ベータ; 表面膜タンパク質; 崩壊促進因子; ウイルス抗原、例えば、AIDSエンベロープの部分、例えば、gp120; 輸送タンパク質; ホーミング受容体; アドレシン; 調節タンパク質; ケモカインファミリーメンバー、エオタキシン、MIP、MCP-1、RANTESなど; 細胞接着分子、例えばセレクチン(L-セレクチン、P-セレクチン、E-セレクチン)、LFA-1、LFA-3、Mac1、p150.95、VLA-1、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3、EpCAMおよびVCAM、a4/p7インテグリン、およびXv/p3インテグリン、インテグリンアルファサブユニット、例えばCD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、アルファ7、アルファ8、アルファ9、アルファD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、アルファIIb、アルファIELbなど; インテグリンベータサブユニット、CD29、CD 18、CD61、CD104、ベータ5、ベータ6、ベータ7およびベータ8など; インテグリンサブユニットの組み合わせ、例えば限定するわけではないが、αVβ3、αVβ5およびα4β7など; 細胞リガンド、TNF関連アポトーシス誘発性リガンド(TRAIL)、増殖誘発性リガンド(APRIL)、B細胞活性化因子(BAFF)、アポトーシス経路のメンバーなど; IgE; 血液型抗原; flk2/flt3受容体; 肥満(OB)受容体; mpl受容体; CTLA-4; タンパク質C; Eph受容体、EphA2、EphA4、EphB2、その他など; 免疫系マーカー、受容体およびリガンド、例えばCTLA-4、T細胞受容体、B7-1、B7-2、IgE、ヒト白血球抗原(HLA)、HLA-DR、CBLなど; 補体タンパク質、例えば補体受容体CR1、C1Rqおよびその他の補体因子、C3、およびC5など; 血液因子、例えば組織因子、因子VII; 糖タンパク質受容体、GpIbα、GPIIb/IIIaおよびCD200など; ならびに上掲のいずれかのポリペプチドのフラグメント。
【０１１５】
限定するわけではないが以下を含むがん関連タンパク質をも意図している: ALK受容体(プレイオトロフィン受容体)、プレイオトロフィン; KS 1/4汎-がん抗原; 卵巣がん抗原(CA125); 前立腺酸性ホスファターゼ; 前立腺特異的抗原(PSA); 前立腺特異的膜抗原(PSMA); メラノーマ関連抗原p97; メラノーマ抗原gp75; 高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA); 前立腺特異的膜抗原; がん胎児性抗原(CEA); がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM1); サイトケラチン腫瘍関連抗原; ヒト乳脂肪球(HMFG)抗原; CanAg抗原; Lewis Y関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原; 結直腸腫瘍関連抗原、CEA、腫瘍関連糖タンパク質-72(TAG-72)、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1およびLEAなど; Burkittリンパ腫抗原-38.13; CD19; ヒトBリンパ腫抗原-CD20; CD22; CD33; メラノーマ特異的抗原、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2およびガングリオシドGM3など; 腫瘍特異的移植型細胞-表面抗原(TSTA); ウイルス誘発腫瘍抗原、例えばT抗原、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原; 腫瘍胎児抗原-アルファ-フェトプロテイン、結腸のCEA、5T4 腫瘍胎児トロホブラスト糖タンパク質および膀胱腫瘍胎児抗原など; 分化抗原、ヒト肺がん抗原L6およびL20など; 線維肉腫の抗原; ヒト白血病T細胞抗原-Gp37; ネオ糖タンパク質; スフィンゴリピド; 乳がん抗原、EGFR(表皮成長因子受容体)など; NY-BR-16; NY-BR-16およびHER2抗原(p185HER2); Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、多形上皮ムチン(PEM)抗原; 上皮膜抗原(EMA); メラノーマ関連抗原 MUC18; MUC1; 悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1; 分化抗原、胎児赤血球に見られるI抗原など; 成体赤血球に見られる初期内胚葉I抗原; 着床前胚; 胃腺がんに見られるI(Ma); 乳房上皮に見られるM18、M39; 骨髄細胞に見られるSSEA-1; VEP8; VEP9; Myl; VIM-D5; 結直腸がんに見られるD156-22; TRA-1-85(血液型H); 精巣および卵巣に見られるSCP-1; 結腸腺がんに見られるC14; 肺腺がんに見られるF3; 胃がんに見られるAH6; Yハプテン; 胚性がん細胞に見られるLey; 結直腸腫瘍に見られる結腸細胞分化抗原、細胞がんに見られる炭酸脱水酵素IX、多数の腫瘍タイプの周囲の間質のFAPα、卵巣腫瘍に見られる葉酸結合性タンパク質、PD1; 死受容体タンパク質、DR5; TL5(血液型A); A431細胞に見られるEGF受容体; 膵がんに見られるE1シリーズ(血液型B); 胚性がん細胞に見られるFC10.2; 胃腺がん抗原; 腺がんに見られるCO-514(血液型Lea); 腺がんに見られるNS-10; CO-43(血液型Leb); A431細胞のEGF受容体に見られるG49; 結腸腺がんに見られるMH2(血液型ALeb/Ley); 結腸がんに見られる19.9; 胃がんムチン; 骨髄細胞に見られるT5A7; メラノーマに見られるR24; 胚性がん細胞に見られる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8ならびに4〜8細胞分裂期の胚に見られるSSEA-3およびSSEA-4; 皮膚T細胞リンパ腫抗原; MART-1抗原; シアリルTn(STn)抗原; 大細胞リンパ腫に見られる未分化リンパ腫キナーゼ(ALK); 結腸がん抗原NY-CO-45; 肺がん抗原NY-LU-12変異体A; 腺がん抗原ART1; 腫瘍随伴脳-精巣-がん抗原(がん性ニューロン抗原MA2; 腫瘍随伴ニューロン抗原); 神経がん性腹部抗原2(NOVA2); 肝細胞がん抗原遺伝子520; 腫瘍関連抗原CO-029; 腫瘍関連抗原MAGE-C1(がん/精巣抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4bおよびMAGE-X2; がん-精巣抗原(NY-EOS-1); 胎盤アルカリホスファターゼ(PLAP)および精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、トランスフェリン受容体; ヘパラナーゼI; 多種のがんに��連するEphA2; 多くの腫瘍タイプの壊死核に見られるDNA/ヒストンH1複合体; アミノリン脂質、ホスファチジルセリンなど; 胎盤アルカリホスファターゼ(PALP); 多種の腫瘍タイプに関連する細胞表面糖タンパク質、CS1、gp-3、gp4およびgp9など、そして上記のいずれかのポリペプチドのフラグメント。
【０１１６】
標的とし、かつ/またはFc変異タンパク質に組み込むことができるその他の代表的なタンパク質として、限定するわけではないが、以下に列挙するタンパク質、そして以下に列挙する微生物タンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフ、およびエピトープが含まれる: B. anthracisタンパク質またはトキシン; ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)タンパク質、エンベロープ糖タンパク質、gB、このウイルスの内部マトリックスタンパク質、pp65およびpp150、前初期(IE)タンパク質など; ヒト免疫不全ウイルス(HIV)タンパク質、Gag、Pol、VifおよびNef(Vogtら、1995, Vaccine 13: 202-208)など; HIV抗原gp120およびgp160(Achourら、1995, Cell. Mol. Biol. 41: 395-400; Honeら、1994, Dev. Biol. Stand. 82: 159-162)など; ヒト免疫不全ウイルスのgp41エピトープ(Eckhartら、1996, J. Gen. Virol. 77: 2001-2008); C型肝炎ウイルス(HCV)タンパク質、分泌もしくは非分泌型ヌクレオカプシドタンパク質、核タンパク質(pC)など; E1(pE1)、E2(pE2)(Saitoら、1997, Gastroenterology 112: 1321-1330)、NS3、NS4a、NS4bおよびNS5(Chenら、1992, Virology 188:102-113); 重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルスタンパク質、限定するわけではないが、S(スパイク)糖タンパク質、小エンベロープタンパク質E(Eタンパク質)、膜糖タンパク質M(Mタンパク質)、ヘマグルチニンエステラーゼタンパク質(HEタンパク質)、およびヌクレオカプシドタンパク質(Nタンパク質)など、(例えば以下参照: Marraら、"The Genome Sequence of the SARS-Associated Corona Virus," Science Express, May 2003); Mycobacterium tuberculosisタンパク質、正常では細胞表面のリポ糖タンパク質30-35 kDa(a.k.a.抗原 85、アルファ-抗原)、65-kDa熱ショックタンパク質、および36-kDa富プロリン抗原(Tasconら、(1996) Nat. Med. 2: 888-92)、Ag85A、Ag85b(Huygenら、1996, Nat. Med. 2: 893-898)、65-kDa熱ショックタンパク質、hsp65(Tasconら、1996, Nat. Med. 2: 888-892)、MPB/MPT51(Mikiら、2004, Infect. Immun. 72:2014-21)、MTSP11、MTSP17(Limら、2004, FEMS Microbiol. Lett. 232:51-9および上記)など; 単純ヘルペスウイルス(HSV)タンパク質、gD糖タンパク質、gB糖タンパク質など; リーシュマニアなどの細胞内寄生虫からのタンパク質、LPG、gp63(Xu and Liew, 1994, Vaccine 12: 1534- 1536; Xu and Liew, 1995, Immunology 84: 173-176)、P-2(Nylenら、2004, Scand. J. Immunol. 59:294-304)、P-4(Karら、2000, J Biol. Chem. 275:37789-97)、LACK(Kellyら、2003, J Exp. Med. 198:1689-98)など; 微生物トキシンタンパク質、Clostridium perfringensトキシンなど; C. difficileトキシンAおよびB; さらに、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)の代表的な抗原ペプチド、ヒトメタ肺炎ウイルス(HMPV)およびパラインフルエンザウイルス(PIV)がYoungら、特許公開 WO04010935A2に詳細に記載されている。
【０１１７】
当業者は、前記のタンパク質のリストが、特定のタンパク質および生体分子のみでなく、その生化学的経路またはそれを含む経路にも言及していることが理解できるはずである。例えば、標的抗原および/または融合相手としてのCTLA-4の言及は、T細胞同時刺激経路を構成するリガンドおよび受容体、例えばCTLA-4、B7-1、B7-2、CD28など、ならびにこれらのタンパク質に結合するその他のどんな未発見のリガンドまたは受容体もまた、標的抗原および/または融合相手として有用であることの意味を含んでいる。こうして、本発明は、特定の生体分子のみでなく、生体分子と相互作用する一群のタンパク質、ならびにその生体分子が属する生化学的経路のメンバーをも包含する。当業者は、あるタンパク質に結合する抗体および/またはその抗原結合性フラグメント、それらに結合するリガンドまたは受容体、あるいはそれらに対応する生化学的経路の別のメンバーを、以下に記載するものなどの、当分野で周知の方法によって誘導しうること、そしてこうした抗体および/または抗原結合フラグメントを工学操作して、限定するわけではないが、本明細書に記載されたものなどの、変異Fc領域またはそのフラグメントを含むようにしうること、ができることを理解するはずである。当業者はさらに、Fc融合体を作製するために、前記タンパク質、これに結合するリガンドまたは受容体、あるいはそれらに対応する生化学的経路の別のメンバーのいずれをも、限定するわけではないが、本明細書に記載されたものなどの、変異Fc領域またはそのフラグメントに機能し得るように連結することができることを理解するはずである。こうして、例えば、EGFRを標的とするFc融合体は、EGF、TGFα、またはEGFRに結合する、発見済みまたは未発見のその他の任意のリガンドに、変異Fc領域を機能し得るように連結することによって、構築することができる。したがって、EGF、TGFα、またはEGFRに結合する、発見済みまたは未発見のその他の任意のリガンドと結合するFc融合体を作製するためには、変異Fc領域をEGFRに機能し得るように連結すればよい。こうして、リガンド、受容体、または別の何らかのタンパク質またはタンパク質ドメイン、例えば限定するわけではないが前記標的およびそれらに対応する生化学的経路を構成するタンパク質など、の実質的にいずれのポリペプチドでも、Fc変異タンパク質を作製するための融合相手として利用することができる。上に列挙した1以上の分子を標的とし、かつ/または組み込む、生成するFc変異タンパク質(例えば、抗体、Fc融合体)を、本発明にしたがって製剤化することを意図するものである。
【０１１８】
使用を承認されるか、臨床試験中または開発中の多数の特定のマルチドメインタンパク質、すなわち抗体および抗体ドメイン融合タンパク質(例えば、Fc融合体)を、当分野で既知の方法を使用して改変して、変異Fc領域を含むようにし、それによってFc変異タンパク質を作製することができる。したがって、こうしたFc変異タンパク質は本発明の製剤によって便益が得られるはずである。これらの抗体および抗体ドメイン融合タンパク質(例えば、Fc融合体)を、本明細書中で「臨床用製品および候補物質」と称する。こうして、1実施形態において、本発明の製剤は変異Fc領域を含むように改変された一連の臨床用製品および候補物質を含む。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明の製剤は、本明細書に記載された臨床用製品および/または候補物質からた誘導したFc変異タンパク質を含むことができる。例えば、本発明の製剤は、臨床用製品および/または候補物質からの少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または6つのCDRを含むFc変異タンパク質を含むことができる。当業者は、臨床用製品および/または候補物質を、例えばCDR最適化によって最適化して、特性が改善された分子を作製することができることを理解できるはずである。したがって、別の実施形態において、本発明の製剤は、ある臨床用製品および/または候補物質からの1以上のCDRのアミノ酸配列と少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約92%、または少なくとも約94%、または少なくとも約96%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性がある、1以上のCDRのアミノ酸配列を含むFc変異タンパク質を含むことができる。2つのアミノ酸配列の同一性パーセントの測定は、当業者に知られ、また本明細書に記載されたいずれの方法によっても実施することができ、BLASTタンパク質検索などが含まれる。
【０１２０】
さらに別の実施形態において、本発明のFc変異タンパク質製剤は、臨床用製品および/または候補物質と同一の抗原に結合するFc変異タンパク質を含む。さらに別の実施形態において、本発明のFc変異タンパク質製剤は、臨床用製品および/または候補物質と同一の抗原との結合について競合するFc変異タンパク質を含む。特定の1実施形態において、本発明の製剤中に存在するFc変異タンパク質は、臨床用製品および/または候補物質と実質的に同様の結合および機能上の特性を持ち、そのFc領域内に、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される天然に生じないアミノ酸の少なくとも1つを含む。
【０１２１】
例えば、本発明の製剤は、限定するわけではないが以下を含む、臨床用製品および/または候補物質と実質的に同様の結合および機能上の特性を持つ変異Fc領域を含む、抗体またはFc融合タンパク質の安定化(例えば、凝集の低下)のための用途があり得る: リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、IDEC/Genentech/Roche)(例えばU.S.特許No. 5,736,137参照)、キメラ抗CD20 IgG1抗体、非ホジキンリンパ腫の治療用に承認; ザノリムバム(HuMax-CD20、Genmab)、抗CD20(例えばPCT WO 04/035607参照); 抗CD20抗体、U.S.特許No. 5,500,362に記載; AME-I33(Applied Molecular Evolution)、ヒト化および最適化抗CD20 Mab; hA20(Immunomedics、Inc.)、ヒト化抗CD20 Mab; HumaLYM(商標)(Intracel)、完全ヒト抗CD20 Mab; 抗CD19抗体、U.S.特許公開Nos. 2006-0233791、2006-0263357および2006-0280738に記載; 抗CD20抗体、PCT特許公開Nos. WO 05/000901に記載; 抗CD22抗体、U.S.特許No. 5,484,892およびU.S.特許公開No. 2003-0202975に記載; トラスツズマブ(Herceptin(登録商標)、Genentech)、ヒト化抗Her2/neu抗体、乳がん治療用に承認(例えばU.S.特許No. 5,677,171参照); ペルツズマブ(rhuMab-2C4、Omnitarg(商標)、Genentech); 抗Her2抗体、U.S.特許No. 4,753,894に記載; セツキシマブ(Erbitux(登録商標)、Imclone)(U.S.特許No. 4,943,533; PCT WO 96/40210)、キメラ抗EGFR抗体、多様ながんについて臨床試験中; IMC-3G3(Imclone)、完全ヒト抗PDGFRα抗体; パニツムマブ(Vectibx(商標))、ABX-EGF、Abgenix/Immunex/Amgen)、完全ヒト抗EGFR抗体、U.S.特許No. 6,235,883に記載; ザルツムマブ(HuMax-EGFr、Genmab)、U.S.特許出願No. 10/172,317に記載; EMD55900、EMD62000、およびマツズマブ(EMD72000、ヒト化EMD55900)(Merck KGaA)(U.S.特許No. 5,558,864)、抗EFGR抗体; ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045); ニモツズマブ(TheraCIMhR3、YM Biosciences、Canada and Centro de Immunologia Molecular、Cuba)(U.S.特許Nos. 5,891,996; 6,506,883); ch806(ヒト化mAb-806、Ludwig Institute for Cancer Research、Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluthら、2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44)、抗EGFR抗体; KSB-102(KS Biomedix); MR1-1(IVAX、National Cancer Institute)(PCT WO 01/62931)、親和性最適化抗EGFR Fvs; およびSC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)、脱免疫抗EGFR抗体; SC101(Scancell)、抗Lewisy/b抗体; SC103(Scancell)、抗PALP抗体; アレムツズマブ(Campath(登録商標)、G酵素)、ヒト化モノクローナル抗CD52 IgG1抗体、現在多様なB細胞慢性リンパ性白血病用に承認; ムロモナブ-CD3(OrthoClone OKT3(登録商標)、Ortho Biotech/Johnson & Johnson)、抗CD3抗体; OrthoClone OKT4A(Ortho Biotech)、ヒト化抗CD4 IgG抗体; イブリツモマブチウキセタン(Zevalin(登録商標)、IDEC/Schering AG)、放射性標識抗CD20抗体; ゲムツズマブオゾガマイシン(Mylotarg(登録商標)、(以前のAVE9633、huMy9-6-DM4)、Celltech/Wyeth)、抗CD33(p67タンパク質)抗体; アレファセプト(Amevive(登録商標)、Biogen)、抗LFA-3 Fc融合体; アブシキシマブ(ReoPro(登録商標)、Centocor/Lilly)、血栓形成の予防のための血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体; バシリキシマブ(Simulect(登録商標)、Novartis)、抗CD25抗体; パリビズマブ(Synagis(登録商標)、MedImmune)、ヒト化中和抗RSV抗体; モタビズマブ(Numax(商標)、MedImmune)、ヒト化中和抗RSV抗体; インフリキシマブ(Remicade(登録商標)、Centocor)、抗TNFアルファ抗体; アダリムマブ(Humira(登録商標)、Abbott)、抗TNFアルファ抗体; Humicade(商標)(CDP-571, CellTech)、抗TNFアルファ抗体; エタネルセプト(Enbrel(登録商標), Immunex/Amgen)、抗TNFアルファFc融合体; ABX-CBL(Abgenix)、抗CD147抗体; ABX-IL8(Abgenix)、抗lL8抗体; ABX-MA1(Abgenix)、抗MUC18抗体; ペムツモマブ(R1549、90Y-muHMFG1、Antisoma)、抗MUC1抗体; Therex(R1550、Antisoma)、抗MUC1抗体; AngioMab(AS1405、HuBC-1、Antisoma)、抗胎児がんフィブロネクチン抗体およびAntisomaが開発した Thioplatin(AS1407); ナタリズマブ(Antegren(登録商標)、Biogen)、抗アルファ-4-ベータ-1(VLA-4)およびアルファ-4-ベータ-7抗体; ANTOVA(商標)(IDEC-131、Biogen)、ヒト化抗CD40L IgG抗体; VLA-1 mAb(Biogen)、抗VLA-1インテグリン抗体; LTBR mAb(Biogen)、抗リンホトキシンベータ受容体(LTBR)抗体; CAT-152(Cambridge Antibody Technology)、抗TGFβ2抗体; J695(Cambridge Antibody Technology/Abbott)、抗IL-12抗体; CAT-192(Cambridge Antibody Technology/Genzyme)、抗TGFβ1抗体; CAT-213(Cambridge Antibody Technology)、抗Eotaxin1抗体; BR3-Fc(BiogenIdec)、可溶性BAFFアンタゴニスト; Lymphostat-B(商標)、抗Blys抗体およびTRAIL-R1mAb、抗TRAIL-R1抗体、いずれもCambridge Antibody TechnologyおよびHuman Genome Sciences, Inc. が開発; ベバシズマブ(Avastin(商標)、rhuMAb-VEGF、Genentech) 抗VEGF抗体; ラニビズマブ(Lucentis(登録商標)、Genentech)、抗VEGF抗体フラグメント; 抗HER受容体ファミリー抗体(Genentech); 抗組織因子抗体(Genentech); オマリズマブ(Xolair(商標)、Genentech) 抗IgE抗体; エファリズマブ(Raptiva(商標)、Genentech/Xoma)、抗CD11a抗体; MLN-02抗体(以前のLDP-02、Genentech /Millenium Pharmaceyticals)、ヒト化抗α4β7抗体; ザノリムマブ(HuMax CD4、Genmab)、抗CD4抗体being; HuMax-IL 15(GenmabおよびAmgen)、抗IL15抗体; HuMax-Inflam(Genmab/Medarex); HuMax-Cancer(Genmab/Medarex/Oxford GcoSciences)、抗Heparanase I抗体; HuMax-Lymphoma(Genmab/Amgen); HuMax-TAC(Genmab);; クレノリキシマブ(IDEC-151、IDEC Pharmaceuticals)、抗CD4抗体;; ルミリキシマブ(IDEC-152、IDEC Pharmaceuticals)、抗CD23; 抗マクロファージ遊走因子(MIF)抗体、IDEC Pharmaceuticalsが開発; BEC2(Imclone、U.S.特許No. 5792455参照)、GD3を模倣する抗イディオタイプ抗体; IMC-1C11(Imclone)、抗KDR抗体; DC101(Imclone)、抗flk-1抗体; 抗VEカドヘリン抗体、Imcloneが開発; ラベツズマブ(CEA-Cide(商標)、Immunomedics)、抗がん胎児性抗原(CEA)抗体; アルシツモマブ(CEAScan(登録商標)、Immunomedics)、抗がん胎児性抗原(CEA)抗体); エプラツズマブ(Lymphocide(商標)、Immunomedics)、抗CD22抗体; タカツズマブ(AFP-Cide、Immunomedics)、ヒト化抗アルファ-フェトタンパク質抗体; MyelomaCide(Immunomedics); LkoCide(Immunomedics); ProstaCide(Immunomedics); イピリムマブ(MDX-010、Medarex)、抗CTLA4抗体; MDX-060(Medarex)、抗CD30抗体; MDX-070(Medarex); MDX-018(Medarex); Valortim(商標)(MDX-1303、Medarex)、抗B. anthracis抗体; MDX-1103(MEDI-545、Medarex/MedImmune)、抗IFNa抗体; MDX-1333(MEDI-546、Medarex/MedImmune)、抗IFNAR抗体; MDX-1106(ONO-4538、Medarex/Ono Pharmaceutical)、抗PD1抗体; MDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab)、ヒト抗CD4 IgG抗体; MDX-1388(MBL/Medarex)、ヒト抗C. difficile Toxin B抗体; MDX-066(CDA1、MBL/Medarex)、抗C. difficile Toxin A抗体; MDX-1307(Medarex/Celldex)、抗Mannose Rector(hCGβ)抗体; MDX-214(Medarex)、抗EGFR(CD89)抗体; MDX-1100(Medarex)、抗IP10抗体; FG-3019(Medarex/Fibrogen)、抗CTGF抗体; HGS-TR2J(Medarex/Kirin)、抗TRAIL-R2; BMS-66513(Medarex/Bristol-Myers Squibb)、抗CD137抗体; SGN-30(Seattle Genetics)、キメラ抗CD30抗体; SGN-40(Seattle Genetics)、ヒト化抗CD40抗体; トシリズマブ(Actemra(商標)、Roche)、ヒト化抗IL-6抗体; CS-1008(Daiichi Sankyo)、ヒト化抗DR5抗体; Osidem(商標)(IDM-1、Medarex/Immuno-Designed Molecules)、抗Her2抗体; ; ゴリムマブ,(CNTO 148、Medarex/Centocor/J&J)、抗TNFα抗体; CNTO 1275(Centocor/J&J)、抗サイトカイン抗体; CNTO 95(Centocor/J&J)、ヒトインテグリンαv抗体(PCT公開WO 02/12501); CNTO 328(Centocor/J&J) 抗IL-6抗体; メポリズマブ(GlaxoSmithKline)、ヒト化抗IL-5抗体; CNTO 528(Centocor/J&J)、造血模倣抗体融合タンパク質; MOR101およびMOR102(MorphoSys)、抗細胞内接着分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体; MOR201(MorphoSys)、抗繊維芽細胞成長因子受容体3(FGFR-3)抗体; ビシリズマブ(Nuvion(登録商標)、Protein Design Labs)、抗CD3抗体; HuZAF(商標)(Protein Design Labs)、抗ガンマインターフェロン抗体; ボロシキシマブ(volocixmab)(M200、Protein Design Labs)、キメラ抗α5β1インテグリン抗体; 抗IL-12(Protein Design Labs); HuLuc63(Protein Design Labs)ヒト化抗CS1糖タンパク質抗体; ING-1(Xoma)、抗Ep-CAM抗体; MLN2201(MLN01、Xoma)、抗ベータ2インテグリン抗体; HCD122(CHIR-12.12、Xoma/Chiron)、完全ヒト抗CD40抗体; ダクリズマブ(ZENAPAX(登録商標)、Roche Pharmaceuticals)、急性腎移植片拒絶の予防用の免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体; CDP860(Celltech、UK)、ヒト化、PEGyl化抗CD18 F(ab')2; PRO542(Progenics/Genzyme Transgenics)、CD4と融合した抗HIV gp120抗体; C14(ICOS Pharm)、抗CD14抗体; オレゴボマブ(OVAREX(商標)、Altarex)、マウス抗CA 125抗体; エドレコロマブ(PANOREX(商標)、Glaxo Wellcome/Centocor)、マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体; エタラシズマブ(VITAXIN(商標)、MedImmune、PCT公開No. WO 2003/075957)、ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体; シプリズマブ(MEDI-507、MedImmune)、ヒト型のマウスモノクローナル抗CD2抗体、BTI-322; リンツズマブ、(Zamyl(商標)、Smart M195、Protein Design Lab/Kanebo)、ヒト化抗CD33 IgG抗体; Remitogen(商標)(Hu1D10、Protein Design Lab/Kanebo)、ヒト化抗HLA抗体; ONCOLYM(商標)(Lym-1、Techniclone)、放射性標識マウス抗HLA DR抗体; エファリズマブ(Genetech/Xoma)、ヒト化モノクローナル抗CD11a抗体; ICM3(ICOS Pharm)、ヒト化抗ICAM3抗体; ガリキシマブ(IDEC-114、IDEC Pharm/Mitsubishi)、霊長類化抗CD80抗体; エクリズマブ(5G1.1、Alexion Pharm)、ヒト化抗補体因子5(C5)抗体; ペキセリズマブ(5G1.1-SC、Alexion Pharm)、完全ヒト化単鎖モノクローナル抗体; LDP-01(Millennium/Xoma)、ヒト化抗β2-インテグリンIgG抗体; huA33、完全ヒト化抗結腸細胞分化抗原抗体; Rencarex(登録商標)(WX-G250、Wilex AG)、マウス−ヒトキメラ抗炭酸脱水素酵素IX抗体; シブロツズマブ(BIBH 1)、ヒト化抗FAPα抗体; キメラKW-2871、抗GD3抗体; hu3S193、ヒト化抗LewisY血液型抗原抗体; huLK26、ヒト化抗葉酸結合タンパク質抗体; ビバツズマブ(Boehringer/Immunogen)、抗CD44v6抗体; ch14.18、キメラ抗GD2抗体; 3F8、マウス抗GD2抗体; BC8マウス抗CD45抗体; huHMFG1ヒト化抗ヒト乳脂肪球抗体; MORAb-003(Morphotek)、ヒト化抗GP-3モノクローナル抗体; MORAb-004(Morphotek)、ヒト化抗GP-4モノクローナル抗体; MORAb-009(Morphotek)、ヒト化抗GP-9モノクローナル抗体; デノスマブ(AMG 162、Amgen)、完全ヒト抗RANKリガンド抗体; PRO-140(Progenics)、抗CCR5抗体; 1D09C3(GPC Biotech/Morphosys)、完全ヒト抗HLA-DR IgG4抗体; huMikベータ-1ヒト化抗IL-2R/IL-15Rベータサブユニット(CD122)抗体; NI-0401(NovImmune)抗CD3抗体; NI-501(NovImmune)、抗IFN-ガンマ抗体; カンツズマブメルタンジン(HuC242、ImmunoGen Inc)、抗CanAg抗原抗体; HuN901(ImmunoGen Inc)、抗CD56抗体; 8H9抗体、U.S.特許公開2003/0103963に記載; chTNT-1/B(Peregrine)、キメラ抗DNA/ヒストンH1複合体抗体; バビツキシマブ(Peregrine)、キメラ抗ホスファチジルセリン抗体; huJ591、脱免疫化抗PSMA抗体; HeFi-1、マウス抗CD30抗体; Pentacea(商標)(IBC Pharmaceuticals)、抗CEA x 抗DTPA-インジウム二重特異性抗体; アバゴボマブ(MEL-1およびMEL-2、MELIMMUNE(登録商標))、CA125に対するマウス抗イディオタイプ抗体の組み合わせ; 105AD7(Onyvac-P、CRC Technology/Oncovac)、CD55を模倣するイディオタイプ抗体(Gp72); トシツモマブ(BEXXAR(商標)、Corixa/GSK); GMA161(Macrogenics)、抗FcγRIIIA(CD16A)抗体およびGMA321(Macrogenics)、抗FcγRIIB(CD32B)抗体; 抗CD16A/CD32BダイアボディFc融合分子（U.
S.特許公開2007/0004909に記載）。
【０１２２】
1実施形態において、本発明のFc変異タンパク質製剤は、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーまたはそのリガンドに結合する抗体またはその他のタンパク質(例えば、Fc融合タンパク質)から誘導した、Fc変異タンパク質を含む。受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーとして限定するわけではないが、受容体のEphファミリーのメンバー(例えば、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5、EphB6)、ALKが含まれる。受容体チロシンキナーゼファミリーのリガンドとして、限定するわけではないが、エフリンリガンドのメンバー(例えば、エフリンA1、エフリンA2、エフリンA4、エフリンA5、エフリンB1、エフリンB2、エフリンB3およびプレオトロピン)が含まれる。特定の実施形態において、抗体またはその他のタンパク質は、EphA2、EphA4、EphB4またはALKと結合する。別の実施形態において、抗体またはその他のタンパク質はEphA2、EphA4、EphB4またはALKのリガンドと結合する。EphA2、EphA4、EphB4、ALKまたはそのリガンドと結合する代表的な抗体およびその他のタンパク質は以下に開示されている: U.S.特許出願No. 11/203,251、PCT特許出願No. PCT/US2006/044637ならびに特許公開No. WO 06/034456およびWO 06/034455。特定の1実施形態において、本発明のFc変異タンパク質製剤はEphA2と結合するFc変異タンパク質を含み、この際そのFc変異タンパク質は少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも6個のMedi3可変ドメインのCDRを含む(図1A-1B参照)。別の特定の実施形態において、EphA2と結合するFc変異タンパク質はそのFc領域に、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される、天然に生じないアミノ酸を少なくとも1つ含む。
【０１２３】
1実施形態において、本発明のFc変異タンパク質製剤は、インテグリンサブユニットおよび/またはその組み合わせに結合する抗体またはその他のタンパク質(例えば、Fc融合タンパク質)から誘導されたFc変異タンパク質を含む。インテグリンサブユニットのメンバーとして、限定するわけではないが、以下が含まれる: インテグリンアルファサブユニット、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、アルファ7、アルファ8、アルファ9、アルファD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、アルファIIb、アルファIELbなど; インテグリンベータサブユニット、CD29、CD 18、CD61、CD104、ベータ5、ベータ6、ベータ7およびベータ8など。代表的なインテグリンサブユニットの組み合わせとして、限定するわけではないが、以下が含まれる: αVβ3、αVβ5およびα4β7。特定の1実施形態において、抗体またはその他のタンパク質はαV、β3および/またはαVβ3に結合する。αV、β3および/またはαVβ3と結合する代表的な抗体およびその他のタンパク質は、U.S.特許出願No. 11/203,253に開示されている。特定の1実施形態において、本発明のFc変異タンパク質製剤は、インテグリンαVβ3に結合するFc変異タンパク質であって、この際、そのFc変異タンパク質が少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも6個のMedi2可変ドメインのCDRを含むもの、を含む(図1C-1D参照)。別の特定の実施形態において、インテグリンαVβ3と結合するFc変異タンパク質はそのFc領域に、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される、天然に生じないアミノ酸を少なくとも1つ含む。
【０１２４】
2つのアミノ酸配列(または2つの核酸配列)の同一性パーセントは、例えば、最適比較の目的で配列を一列に並べることによって、決定することができる(例えば、第1配列の配列中にギャップを導入することができる)。次に対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドを比較するが、2つの配列間の同一性パーセントはこれらの配列が共有する同一の位置の数の関数となる(すなわち、同一性% = 同一位置の数/位置の総数 x 100)。2つの配列の実際の比較は、周知の方法、例えば、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。こうした数学的アルゴリズムの特定の、限定するわけではない1例が、Karlinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877(1993)、に記載されている。こうしたアルゴリズムを、Schafferら、Nucleic Acids Res., 29:2994-3005(2001)に記載されたBLASTNおよびBLASTXプログラム(version 2.2)に組み入れる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTN)のデフォルトパラメーターを使用することができる。2002年4月10日時点で利用可能な、http://www.ncbi.nlm.nih.gov、を参照されたい。1実施形態において、検索したデータベースは非冗長(NR)データベースであり、配列比較のパラメーターは以下のように設定することができる: フィルター無し; Expect value 10; Word size 3; Matrix BLOSUM62; そしてGap Costs, Existence 11およびExtension 1。
【０１２５】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の、限定するわけではない例は、Myers and Miller、CABIOS(1989)、のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムをALIGNプログラム(version 2.0)に組み入れる。これは、GCG(Accelrys)配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列の比較のためにこのALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウェイト、残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用することができる。配列解析のためのその他のアルゴリズムは当分野で知られており、これらとして以下が含まれる: ADVANCEおよびADAM、Torellis and Robotti, Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5(1994)に記載; ならびにFASTA、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA、85: 2444-8(1988)に記載。
【０１２６】
別の実施形態において、以下を使用して2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを取得することができる: GCGソフトウェアパッケージでのGAPプログラム(2001年8月31日現在入手可能な、http://www.accelrys.com、から利用可能)、Blossom 63マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、ならびにギャップウェイト12、10、8、6、もしくは4およびレングスウェイト2、3、もしくは4を使用。さらに別の実施形態において、以下を使用して2つの核酸配列間の同一性パーセントを取得することができる: GCGソフトウェアパッケージでのGAPプログラム(http://www.cgc.com、から利用可能)、ギャップウェイト50およびレングスウェイト3を使用。
【０１２７】
5.4.4  Fc変異タンパク質コンジュゲートおよび誘導体
本発明の製剤として、限定するわけではないが以下を含む、あらゆるタイプの分子の接続によって改変されたFc変異タンパク質である、Fc変異タンパク質誘導体も包含される: ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣体、合成薬物、無機分子、および有機分子。例えば、限定するわけではないが、Fc変異タンパク質誘導体として、例えば以下によって改変されたFc変異タンパク質が含まれる: グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質への連結など。限定するわけではないが以下を含む、既知の技法によって、多数の化学的修飾を実施することができる: 特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成など。その上、この誘導体に1以上の非古典的アミノ酸を含ませることができる。
【０１２８】
in vivo半減期が増加したFc変異タンパク質を、その抗体または抗体フラグメントに、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマー分子を接続することによって、作製することができる。PEGは、多機能リンカーを使用するか使用しないで、その抗体または抗体フラグメントのNもしくはC末端への、またはリシン残基上に存在するイプシロンアミノ基を介したPEGの部位特異的コンジュゲート化によって、その抗体または抗体フラグメントに接続することができる。生物学的活性の最少の損失をもたらすように、線状または分枝ポリマー誘導体化を使用するものとする。コンジュゲート化の程度をSDS-PAGEおよび質量分析によって厳密にモニターして、PEG分子の抗体への適正なコンジュゲート化を確実なものにする。未反応のPEGは、例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。
【０１２９】
1実施形態において、本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド(あるいはそのフラグメント、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも100アミノ酸のポリペプチド)と組換え融合または(共有結合および非共有結合コンジュゲート化の両方を含む)化学的コンジュゲート化したFc変異タンパク質を含む製剤を包含する。例えば、Fc変異タンパク質を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲート化させることによって、そのFc変異タンパク質を使用して、in vitroまたはin vivoで特定の細胞タイプに対して異種性のポリペプチドを標的とさせることができる。異種ポリペプチドと融合またはコンジュゲート化したFc変異タンパク質は、当分野で既知の方法を使用する、in vitroイムノアッセイおよび精製方法でも使用することができる。例えば以下を参照されたい: 国際公開No. WO 93/21232; 欧州特許No. EP 439,095; Naramuraら、1994, Immunol. Lett. 39:91-99; U.S.特許No. 5,474,981; Gilliesら、1992, PNAS 89:1428-1432; およびFellら、1991, J. Immunol. 146:2446-2452。
【０１３０】
その上、Fc変異タンパク質をin vivoでより安定にするか、またはより長期のin vivo半減期を持つようにするため、Fc変異タンパク質をアルブミンとコンジュゲート化させることができる。この技法は当分野で周知であり、例えば以下を参照されたい: 国際公開Nos. WO 93/15199、WO 93/15200、およびWO 01/77137; および欧州特許No. EP 413、622。
【０１３１】
さらに、精製を促進するため、Fc変異タンパク質をペプチドなどのマーカー配列と融合させることができる。特定の実施形態において、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、中でもpQEベクター(QIAGEN、Inc., 9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)中に配備されたタグなどであり、これらの多くが市販されている。Gentzら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用なその他のペプチドタグとして、限定するわけではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来の1エピトープに相当するヘマグルチニン「HA」タグ(Wilsonら、1984, Cell 37:767)、および「フラッグ」タグが含まれる。
【０１３２】
別の実施形態において、Fc変異タンパク質またはその類似体もしくは誘導体を診断用または検出用薬剤とコンジュゲート化させる。こうしたFc変異タンパク質は、特定の治療法の有効性を判定するなどの臨床試験の操作法の一部として、疾病の発症または進行をモニターまたは予知するために有用である。こうした診断および検出は、Fc変異タンパク質を、限定するわけではないが以下を含む検出用物質に連結させることによって、達成することができる: 各種酵素、限定するわけではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなど; 補欠分子族、限定するわけではないがストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなど; 蛍光物質、限定するわけではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなど; 発光物質、限定するわけではないが、ルミノールなど; 生物発光物質、限定するわけではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなど; 放射性物質、限定するわけではないが以下など: ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142 Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tin; 各種陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属イオン、非放射性常磁性金属イオン、および特定の放射性同位体で放射性標識するか、これとコンジュゲート化した分子。
【０１３３】
本発明はさらに、治療薬とコンジュゲート化したFc変異タンパク質を包含する。Fc変異タンパク質を、細胞毒性剤などの治療薬の部分、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射性金属イオン、例えば、アルファ波放出剤とコンジュゲート化させることができる。細胞毒素または細胞傷害性剤として細胞にとって傷害性のあらゆる薬剤が含まれる。その例として以下が含まれる: パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミドならびにその類似体または相同体。治療薬として、限定するわけではないが、以下が含まれる: 代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シトラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミンプラチナ(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前のダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)。治療薬の部分のそれ以外のリストは、PCT公開WO 03/075957に見られる。
【０１３４】
さらに、Fc変異タンパク質を、所定の生物学的応答を改変する治療薬または薬物の部分とコンジュゲート化させることができる。治療薬または薬物の部分は、古典的な化学的治療薬に限定されるものと解釈すべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドとすることができる。こうしたタンパク質として、例えば以下が含まれる: 毒素、アブリン、リシンA、Onconase(もしくはその他の細胞傷害性RNAアーゼ)、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素など; タンパク質、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際公開No. WO 97/33899参照)、AIM II(国際公開No. WO 97/34911参照)、Fasリガンド(Takahashiら、1994, J. Immunol., 6:1567)、およびVEGI(国際公開No. WO 99/23105参照)、血栓剤または抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチンなど; あるいは、生物学的応答改変剤、例えば、リンホカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))、または成長因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))。
【０１３５】
その上、Fc変異タンパク質を、放射性物質または放射性金属イオン(上記の放射性物質の例参照)とのコンジュゲート化に有用な大環状キレート剤などの、治療薬部分とコンジュゲート化させることができる。特定の実施形態において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してFc変異に接続することができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"-テトラ酢酸(DOTA)である。こうしたリンカー分子は一般的に当分野で知られており、また以下に記載されている: Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Petersonら、1999, Bioconjug. Chem. 10:553; およびZimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943。
【０１３６】
治療薬部分分子の抗体とのコンジュゲート化のための技法は周知である。限定するわけではないが以下を含む当分野で既知の任意の方法によって、部分分子を、抗体(例えば、Fc変異タンパク質)とコンジュゲート化させることができる: アルデヒド/Schiff結合、スルフヒドリル結合、酸不安定性結合、シス-アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合(一般的にはGarnett、2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171参照)。抗体とポリペプチド部分分子との融合またはコンジュゲート化のための方法は当分野で知られている。例えば以下を参照されたい: U.S. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851、および5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT公開WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら、1991, PNAS USA 88:10535; Zhengら、1995, J 1mmunol 154:5590; およびVilら、1992, PNAS USA 89:11337。抗体の部分分子への融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介したものでもよい。こうしたリンカー分子は一般的に当分野で知られており、また以下に記載されている: Denardoら、1998, Clin Cancer Res 4:2483; Petersonら、1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmermanら、1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett、2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171。これらの方法を、治療薬部分分子のFc融合タンパク質へのコンジュゲート化のためにも利用することができる。
【０１３７】
5.5  Fc変異タンパク質の作製方法
5.5.1  抗体の作製
本発明の製剤は、当分野で既知のあらゆる方法によって製造する抗体について、特に、化学的合成または組換え発現技術による、抗体の合成のために有用である。特定の実施形態において、本発明の製剤は、抗体であって、その抗体が変異Fc領域を含むものを含む。
【０１３８】
特定の抗原を認識するポリクローナル抗体を、当分野で周知の各種の操作法によって、製造することができる。例えば、抗原またはその免疫原性フラグメントを、限定するわけではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む各種の宿主動物に投与して、ある抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発することができる。宿主の種類に応じて、免疫学的応答を増加させるため、各種のアジュバントを使用することができるが、これとして限定するわけではないが、以下が含まれる: Freund(完全および不完全)、ミネラルゲル、水酸化アルミニウムなど、表面活性物質、リゾレシチンなど、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化物、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、BCG(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumなど。こうしたアジュバントも当分野で周知である。
【０１３９】
ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレー技術、またはそれらの組み合わせを含む、当分野で既知の多様な技法を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当分野で既知であって、また例えば以下に教示されているものを含む、ハイブリドーマ技法を使用して、モノクローナル抗体を製造することができる: Harlowら、Antibody: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerlingら、: Monoclonal Antibody and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier, N.Y., 1981)。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって製造する抗体に限定されるものではない。用語「モノクローナル抗体」とは、あらゆる真核、原核、またはファージクローンを含む、単一クローンから誘導される抗体を称するものであって、それを製造する方法のことではない。
【０１４０】
ハイブリドーマ技術を使用する特定の抗体の製造およびスクリーニング方法は、常套的であり、当分野で周知である。簡単に述べると、マウスを抗原またはその免疫原性フラグメントで免疫し、免疫応答が検出された後、例えば、マウス血清中に投与された抗原に特異的な抗体を検出した後、そのマウスの脾臓を収穫し、脾細胞を単離する。次に、周知の技法によって、脾細胞を任意の好適な骨髄腫細胞、例えばATCCから入手可能な細胞系SP20からの細胞に、融合させる。その上、RIMMS(反復免疫、複数部位)技法を使用して、動物を免疫することができる(Kilpatrickら、1997, Hybridoma 16:381 9)。限界希釈によってハイブリドーマを選択およびクローン化する。次に、当分野で既知の方法によって、本発明のポリペプチドとの結合能力がある抗体を分泌する細胞について、ハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫することによって、一般的に高レベルの抗体を含有する、腹水を作製することができる。
【０１４１】
したがって、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって、モノクローナル抗体を作製することができるが、この際そのハイブリドーマは、抗原またはその免疫原性フラグメントで免疫したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって作製し、その後融合で生成したハイブリドーマを、投与した抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、スクリーニングすることができる。
【０１４２】
本発明の製剤は、変異Fc領域またはそのフラグメントを含む抗体を安定化するために有用である。変異Fc領域を含む抗体は、当業者に十分知られた多数の方法によって作製することができる。限定するわけではない例として、(例えば、ハイブリドーマから)抗体をコードする領域を単離し、単離した抗体コード領域のFc領域に1以上の修飾を導入するものが含まれる。あるいは、限定するわけではないが、本明細書に記載された物を含む、変異Fc領域またはそのフラグメントをコードするベクター中に、可変領域をサブクローン化することができる。その他の方法および詳細を以下に提供する。
【０１４３】
特定の抗原を認識する抗体フラグメントは、当業者に知られたあらゆる技法によって、作製することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2フラグメントは、パパイン(Fabフラグメントを製造するため)またはペプシン(F(ab')2フラグメントを製造するため)などの酵素を使用する、免疫グロブリン分子のタンパク質切断によって、製造することができる。F(ab')2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体を、当分野で既知の各種のファージディスプレー方法を使用して、作製することもできる。
【０１４４】
ファージディスプレー法では、機能的抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチドを保有するファージ粒子の表面に表示させる。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー(例えば、ヒトまたはマウスリンパ組織のcDNAライブラリー)から増幅させる。VHおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRによってscFvリンカーとともに組み換えて、ファージミドベクター(例えば、pCANTAB 6またはpComb 3 HSS)中にクローン化する。そのベクターをE. coliにエレクトロポレートし、そのE. coliをヘルパーファージに感染させる。これらの方法で使用するファージは典型的にはfdおよびM13を含む線状ファージであり、VHおよびVLドメインは通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに組換え融合されている。目的の抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、例えば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、抗原によって選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレー法の例として、以下に開示されたものが含まれる: Brinkmanら、1995,J. Immunol. Methods 182:41-50; Amesら、1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleboroughら、1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persicら、1997、Gene 187:9-18; Burtonら、1994,Advances in Immunology 57:191-280; PCT公開No. WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびWO97/13844; ならびにU.S.特許No. 5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743および5,969,108。
【０１４５】
上記の参照文献に記載されているように、ファージ選択後、そのファージから抗体コード領域を単離し、ヒト抗体などの完全抗体、または任意のその他の所望の抗原結合性フラグメントを作製するために使用し、例えば、下記のようにして、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む、任意の所望の宿主中で発現させることができる。Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントの組換え産生のための技法を、以下に開示されたものなどの、当分野で既知の方法によって利用することができる: 国際公開No. WO 92/22324; Mullinaxら、1992, Biotechniques 12(6): 864-869; Sawaiら、1995, AJRI 34:26-34; およびBetterら、1988, Science 240:1041-1043。
【０１４６】
完全抗体を作製するためには、VHもしくはVLヌクレオチド配列、制限部位、およびその制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを使用して、そのVHもしくはVL配列をscFvクローン中で増幅させることができる。当業者に知られたクローニング技法を利用して、PCR増幅したVHドメインを、VH定常領域、例えば、ヒトガンマ定常領域を発現するベクターにクローン化でき、またPCR増幅したVLドメインは、VL定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローン化することができる。限定するわけではないが、重鎖定常領域は、本明細書中に開示したものなどの、変異Fc領域を含むか、あるいはそれで構成されるものであることを意図している。特定の実施形態において、VHもしくはVLドメインを発現させるためのベクターは、プロモーター、分泌シグナル、可変および定常ドメインの両方のためのクローニング部位、そしてネオマイシンなどの選択マーカーを含んでいる。VHおよびVLドメインを、所望の定常領域を発現する1ベクター中にクローン化してもよい。その後、当業者に知られた技法を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系中に同時トランスフェクトして、全長抗体、例えば、IgGを発現する安定なまたは一時的な細胞系を作製する。
【０１４７】
またファージディスプレー技術を利用して、抗原に結合する抗体の保有についてスクリーニングしたヒトリンパ球の、PCR増幅したv-遺伝子のレパートリーまたはナイーブライブラリーのいずれかから、抗原に対する結合活性を持つ抗体遺伝子を選択することもできる(McCaffertyら、Nature 348:552-554, 1990; およびMarksら、Biotechnology 10:779-783, 1992)。鎖シャッフルによって、これらの抗体の親和性を改善することもできる(Clacksonら、Nature 352: 624-628, 1991)。抗体の最適化について、関連する技法の記載がある(例えば、Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233; Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212; およびKunkelら、1987, Methods Enzymol. 154, 367-382参照)。
【０１４８】
キメラ抗体とは、抗体の別々の部分が別の免疫グロブリン分子に由来している分子である。キメラ抗体の製造方法は当分野で知られている。例えば以下を参照されたい: Morrison, 1985, Science 229:1202; Oiら, 1986, Biotechniques 4:214; Gilliesら、1989, J. Immunol. Methods 125:191 202; ならびにU.S.特許Nos. 5,807,715、4,816,567、4,8 16397、および6,311,415。
【０１４９】
抗体のヒト中でのin vivo使用およびin vitro検出アッセイなどの、いくつかの用途では、ヒトまたはキメラ抗体を使用するのが好ましい。ヒト被験体の医療処置にとっては、完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する、上記のファージディスプレー法などの、当分野で既知の多様な方法によって、作製することができる。以下も参照されたい: U.S.特許Nos. 4,444,887および4,716,111; ならびにPCT公開Nos. WO 05/042743; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO98/16654; WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741。
【０１５０】
抗体をin vivo適用で治療用に使用する場合、好ましくは、個体中での免疫原性を低くするように、その抗体を改変する。例えば、その個体がヒトである場合、その抗体を好ましくは「ヒト化」する。これはその抗体の相補性決定領域をヒト抗体の1つに移植することである(例えば、以下に記載されている: Jonesら、Nature 321:522-525, 1986; およびTempestら、Biotechnology 9:266-273, 1991)。
【０１５１】
ヒト化抗体は、既定の抗原に結合する能力があり、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に持つフレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に持つCDRとを含んでいる、抗体もしくはその変異体またはそれらのフラグメントである。ヒト化抗体は、少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)の実質的に全部を含み、その中で、CDR領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のものに対応し、そしてフレームワーク領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものとなっている。特定の1実施形態において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をも含んでいる。普通は、抗体に少なくとも軽鎖と、重鎖の可変ドメインの両方を含ませる。抗体は重鎖のCH1、ヒンジ部、CH2、CH3、およびCH4領域を含んでいてもよい。ヒト化抗体は以下を含む任意のクラスの免疫グロブリンから選択することができる: IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgE、ならびに以下などの任意のアイソタイプ; IgG1、IgG2、IgG3およびlgG4。通常、ヒト化抗体が細胞傷害活性を提示することが望ましい場合、定常ドメインは補体固定性定常ドメインであって、そのクラスは典型的にはIgG.sub.1である。こうした細胞傷害活性が望まれない場合は、定常ドメインはIgG.sub.2クラスでもよい。ヒト化抗体は1つ以上のクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでもよい。さらに、本明細書に記載したように、所望のエフェクター機能を最適化するために、変異Fc領域を含む特定の定常ドメインを選択することは、当分野で普通の技術範囲内のことである。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は元の配列に厳密に対応する必要は無く、例えば、ドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークを、少なくとも1残基の置換、挿入または欠失によって突然変異させて、その部位のCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたは移入抗体のいずれかに対応しないようにすることができる。しかし、こうした突然変異は広範囲のものにはならない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75%を元のフレームワーク領域(FR)およびCDR配列のものに対応させ、多くの場合90%、または95%を超えるものとする。ヒト化抗体は、限定するわけではないが以下を含む、当分野で既知の多様な技法を使用して、製造することができる: CDRグラフト(欧州特許No. EP 239,400; 国際公開No. WO 91/09967; およびU.S.特許Nos. 5,225,539、5,530,101、および5,585,089)、ベニヤリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)(欧州特許Nos. EP 592,106およびEP 519,596; Padlan, 1991, Mollecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnickaら、1994, Protein Engineering 7(6): 805 814; およびRoguskaら、1994, PNAS 91:969 973)、鎖シャッフル(U.S.特許No. 5,565,332)、フレームワークシャッフル(国際公開No. WO 05/042743)ならびに例えば以下に開示された技法: U.S.特許No. 6,407,213、U.S.特許No. 5,766,886、WO 9317105、Tanら、J. Immunol. 169:1119-25(2002)、Caldasら、Protein Eng. 13(5): 353-60(2000), Moreaら、Methods 20(3): 267-79(2000)、Bacaら、J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84(1997), Roguskaら、Protein Eng. 9(10): 895-904(1996), Coutoら、Cancer Res. 55(23 Supp): 5973s-5977s(1995), Coutoら、Cancer Res. 55(8): 1717-22(1995)、Sandhu JS, Gene 150(2): 409-10(1994)、およびPedersenら、J. Mol. Biol. 235(3): 959-73(1994)。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基をCDRドナー抗体からの対応する残基と置換して、抗原結合性を変更、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法によって同定する。例えば、CDRおよびフレームワーク残基の相互作用をモデル化し、抗原結合に関する重要なフレームワーク残基を同定する、また配列比較によって特定の位置での通常にはないフレームワーク残基を同定するものがある(例えば、Queenら、U.S.特許No. 5,585,089;およびRiechmannら、1988, Nature 332:323参照)。
【０１５２】
ヒト抗体は、機能的内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現することができる、トランスジェニックマウスを使用して、製造することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウス胚性幹細胞中に、ランダムまたは相同組換え導入する。あるいは、マウス胚性幹細胞中に、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子の外に、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別に、または同時に、非機能性にすることができる。特に、JH領域のホモ接合体欠損は内在性抗体の産生を防止する。改変した胚性幹細胞を増数して、胚盤胞中にマイクロインジェクトして、キメラマウスを産生させる。その後このキメラマウスを妊娠させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生させる。このトランスジェニックマウスを、選択した抗原またはその免疫原性フラグメントで正常の様式で免疫する。この免疫したトランスジェニックマウスから、常套的なハイブリドーマ技術を使用して、その抗原に特異的なモノクローナル抗体を取得することができる。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリントランス遺伝子はB細胞分化中に再配置されて、その後クラススイッチと体細胞変異をもたらす。このように、こうした技法を使用して、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を製造することが可能である。ヒト抗体製造のためのこの技術についての総説は、LonbergおよびHuszar(1995、Int. Rev. Immunol. 13:65 93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体の産生のためのこの技術ならびにこれらの抗体の製造プロトコルについての詳細な考察は、例えば以下を参照されたい: 国際公開Nos. WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735; ならびにU.S.特許Nos. 5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、および5,939,598。その上、Abgenix、Inc.(Freemont, CA)、Genpharm(San Jose, CA)およびMedarex(Princeton, NJ)などの企業が、上記のものと同様の技術を使用した、選択された抗原に特異的なヒト抗体の提供業務を行っている。
【０１５３】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を、「誘導選択(guided selection)」と称される技法を使用して、作製することができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導させるものである(Jespersら、Bio/technology 12:899-903(1988))。
【０１５４】
さらに、逆に本発明の抗体を利用し、当業者に周知の技法を使用して、1ポリペプチドを「模倣」するイディオタイプ抗体を作製することができる(例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5): 437-444; およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8): 2429-2438参照)。例えば、ポリペプチドに結合して、その結合相手(例えば、リガンドまたは受容体)との結合を競合的に阻害する(当分野で周知であり、また下記に開示されたアッセイによって判定)、本発明の抗体を使用して、そのポリペプチドを「模倣」し、その結果、結合相手(例えば、受容体および/またはそのリガンド)を中和する、抗イディオタイプを作製することができる。こうした中和抗イディオタイプまたはこの抗イディオタイプのFabフラグメントを治療処方で使用して、1ポリペプチドの結合相手を中和することができる。
【０１５５】
1実施形態において、抗原に特異的に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を取得して、本発明のFc変異タンパク質を作製する。ヌクレオチド配列はシークエンシングハイブリドーマクローンDNAから取得することができる。特定の抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントをコードする核酸を含有するクローンを入手できないけれども、抗体分子またはそのエピトープ結合性フラグメントの配列が知られている場合、その免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成するか、あるいは、好適な起源(例えば、抗体cDNAライブラリー、あるいは抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、その抗体を発現する組織もしくは細胞から作製したcDNAライブラリー、またはこれらから単離した核酸、好ましくはポリA+RNA)から、その配列の3'および5'末端にハイブリダイズする合成プライマーを使用するPCR増幅によるか、あるいは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングし、例えば、その抗体をコードするcDNAライブラリーから1cDNAクローンを同定することによって、取得することができる。次に、PCRによって増幅させて作製した核酸を、当分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクター中にクローン化することができる。
【０１５６】
抗体のヌクレオチド配列が決定された後、ヌクレオチド配列の操作のための当分野で周知の方法、例えば、組換えDNA技法、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを使用して、その抗体のヌクレオチド配列を操作して(例えば以下に記載された技法を参照: Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら、ed., John Wiley & Sons(Chichester, England, 1998); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, J. Sambrookら、ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY, 2001);Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY, 1988); およびUsing Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane、ed., Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor, NY, 1999))、例えば、その抗体の所望の領域に欠失および/または挿入を導入することによって、別のアミノ酸を持つ抗体を作製することができる。
【０１５７】
1実施形態において、1抗原に特異的に結合することができる1抗体のFc領域内に1以上の修飾(例えば上記)を作製する。その修飾が少なくとも1つのFcリガンド(例えば、FcγRsおよび/またはC1q)との結合性を変更し、かつ/またはADCCおよび/もしくはCDC機能を変更することを特に意図している。
【０１５８】
特定の1実施形態において、慣用の組換えDNA技法を使用して、フレームワーク領域内に1以上のCDRを挿入する。そのフレームワーク領域は天然に生ずるものでもコンセンサスフレームワーク領域でもよく、限定するわけではないが、ヒトフレームワーク領域が含まれる(ヒトフレームワーク領域の一覧について、例えば、Chothiaら、1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照)。フレームワーク領域およびCDRの組み合わせによって、作製したポリヌクレオチドが抗原に特異的に結合する抗体をコードすることを意図している。1実施形態において、上記考察のように、1以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に作製し、そして特定の実施形態において、そのアミノ酸置換はその抗原へのその抗体の結合を改善する。抗体のヒト化および最適化のための技法は当分野で知られている(例えば以下参照: Wu & An, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 213-233; Wu, 2003, Methods Mol. Biol., 207, 197-212; Dall'Acquaら、2005, Methods, 36: 43-60およびU.S.特許公開No. 2006/0228350)。その上、こうした方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に携わっている1以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製して、1以上の鎖内ジスルフィド結合を欠失している抗体分子を作製することができる。ポリヌクレオチドのその他の変更は本発明に包含され、またそれは当分野の技術範囲内のものである。
【０１５９】
限定するわけではないが、本明細書に記載されたものを含むスクリーニング方法から同定された、抗体のFc領域を、上記のように修飾して、変異Fc領域を組み込んだ抗体を作製することができる。新たに同定された抗体のFc変異タンパク質は、限定するわけではないが以下を含む、疾病、障害、感染の予防、管理および治療にとって有用であるものと意図している: 炎症疾患、自己免疫疾患、骨代謝関連疾患、血管新生関連疾患、感染症、およびがん。こうした抗体は本発明の製剤によって安定化される(例えば、凝集が低下する)。
【０１６０】
5.5.2  Fc融合タンパク質の作製
Fc融合タンパク質は免疫グロブリンのFc領域またはそのフラグメントと融合相手を結合させているが、これは一般的にはあらゆるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または小分子とすることができる。Fc融合タンパク質の非Fc部分、すなわち融合相手の役割は、常にではないが標的の結合を仲介することが多く、このことから抗体の可変領域に機能的に類似している。代表的な融合相手は上に詳述した(「抗原、融合相手および抗体」の表題の節参照)。本明細書で定義および記載した多様なリンカーを使用して、Fc領域を融合相手に共有結合で連結して、Fc融合タンパク質を作製することができる。あるいは、Fc融合タンパク質を、標準的組換えDNA技法またはタンパク質合成技法(例えば、ペプチドシンセサイザーの使用による)によって製造することができる。例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子を、自動DNAシンセサイザーを含む常套的技法によって合成することができる。場合によって、2つの隣接する遺伝子フラグメントの間に相補的なオーバーハングを発生させるアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのPCR増幅を実施し、続いてアニールおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を作製することができる(例えば以下参照: Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら、ed., John Wiley & Sons(Chichester, England, 1998); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, J. Sambrookら、ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY、2001))。その上、融合相手をコードする核酸を、Fc領域またはそのフラグメントを含有する発現ベクター中にクローン化して、融合相手が定常ドメインまたはそのフラグメント(例えば、Fc領域)のフレーム内に連結されるようにすることができる。
【０１６１】
ポリペプチドを抗体の定常ドメインと融合またはコンジュゲート化させる方法は当分野で知られている。例えば以下を参照されたい: U.S.特許No. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,723,125; 5,783、181; 5,908、626; 5,844,095;および5,112,946; 欧州特許公開 EP 0 307 434; EP 0 367 166; EP 0 394 827; PCT公開 WO 91/06570; WO 96/04388; WO 96/22024、WO 97/34631; およびWO 99/04813; Ashkenaziら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539(1991); Trauneckerら、Nature 331:84-86(1988); Zhengら、J. Immunol. 154:5590-5600(1995); およびVilら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341(1992)。
【０１６２】
融合相手として使用することができるタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られた入手可能などんな情報元からでも取得することができ(例えば、Genbank、文献、または常用のクローニング)、またFc領域またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を、Genbankまたは文献から取得することができる。Fc領域またはそのフラグメントは天然に生ずるドメインでもよく、または限定するわけではないが、本明細書に記載されたものを含む、変異Fc領域でもよい。天然に生ずるFc領域を利用する場合においては、限定するわけではないが本明細書中に開示したものなどの、当分野で既知の方法を使用して、変異体を作製することができる。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入するタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター中に、挿入することができる。タンパク質をコードする配列を発現させるためには、本発明では多様な宿主-ベクターシステムを利用することができる。これらとして限定するわけではないが以下が含まれる: ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感染させた哺乳動物細胞システム; ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞システム; 微生物、酵母ベクターを含有する酵母など; またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換した細菌。ベクターの発現エレメントはその強度および特異性が異なる。利用する宿主-ベクターシステムに応じて、多数の好適な転写および翻訳エレメントのどの1つでも使用することができる。
【０１６３】
5.5.3  Fc変異タンパク質の組換え発現
Fc変異タンパク質、誘導体、類似体またはそのフラグメント(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)の組換え発現には、Fc変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。Fc変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得した後、当分野で周知の技法を使用する組換えDNA技術によって、Fc変異タンパク質の製造のためのベクターを製造することができる。こうした、変異Fc領域をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによる、タンパク質の調製方法は、本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を使用して、Fc変異タンパク質をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法として、例えば、in vitro組換えDNA技法、合成技法、およびin vivo遺伝子組換えが含まれる。こうして、本発明は、Fc変異タンパク質をコードし、プロモーターに機能し得るように連結された、ヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。こうしたベクターには以下をコードするヌクレオチド配列を含ませることができる: 抗体分子の定常領域(例えば以下参照、国際公開No. WO 86/05807; 国際公開No. WO 89/01036; およびU.S.特許No. 5,122,464)およびその抗体の可変ドメイン、あるいは、全長抗体鎖(例えば重鎖または軽鎖)の発現のためのベクター中にクローン化することができる、Fc融合タンパク質を作製するためのポリペプチド、または非抗体由来のポリペプチドと変異Fc領域の融合体を含む完全Fc融合タンパク質。
【０１６４】
発現ベクターを常套的技法によって宿主細胞に転移させ、次にトランスフェクトした細胞を常套的技法によって培養して、Fc変異タンパク質を産生させる。こうして、本発明には、Fc変異タンパク質をコードし、異種プロモーターに機能し得るように連結されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が含まれる。以下に詳細を記載するように、二本鎖抗体を含むFc変異タンパク質の発現のための特定の実施形態において、完全免疫グロブリン分子の発現のため、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞中で同時発現させることができる。
【０１６５】
Fc変異タンパク質(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)を発現させるために、多様な宿主-発現ベクターシステムを利用することができる(例えば、U.S.特許No. 5,807,715参照)。こうした宿主-発現システムは、目的のコード配列を製造し、その後精製するためのベヒクルの役目を持つが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトしたとき、Fc変異タンパク質をin situ発現することができる細胞でもある。これらとして、限定するわけではないが、以下が含まれる: 微生物、例えばFc変異タンパク質をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌(例えば、E. coliおよびB. subtilis); Fc変異タンパク質をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、Saccharomyces Pichia); Fc変異タンパク質をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞システム; Fc変異タンパク質をコードする配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV; タバコモザイクウイルス、TMV)で感染させるか、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞システム; あるいは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のもの(例えば、アデノウイルス後期プロモーター; ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を内蔵する、哺乳動物細胞システム(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0、および3T3細胞)。特定の実施形態において、組換え抗体またはFc融合タンパク質であるFc変異タンパク質の発現のためには、細菌細胞、Escherichia coliなど、または真核細胞を使用する。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの腫瘍中間体早期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと連携させた、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの、哺乳動物細胞が、抗体にとって効果的な発現システムである(Foeckingら、1986, Gene 45:101;およびCockettら、1990, Bio/Technology 8:2)。特定の1実施形態において、Fc変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を、構成性プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって、調節する。
【０１６６】
細菌システムでは、発現させるFc変異タンパク質(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)について意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有利になるように選択することができる。例えば、医薬用のFc変異タンパク質製剤の作製のために、こうしたタンパク質を大量に製造する場合、容易に精製できる、高レベルの融合タンパク質産物の発現をもたらすベクターが望ましい。こうしたベクターとして限定するわけではないが、以下が含まれる: E. coli発現ベクターpUR278(Rutherら、1983, EMBO 12:1791)、ここではFc変異タンパク質をコードする配列をlacZコード領域とともに、lacZ融合タンパク質が産生されるように、個別にこのベクター中フレーム内に連結させることができる; pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); など。pGEXベクターを使用して、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般的に、こうした融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在中で溶出させることによって、容易に精製することができる。pGEXベクターを、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計して、クローン化した標的遺伝子産物をGST部分分子から放出させるようにすることができる。
【０１６７】
昆虫システムでは、Autographa californica核ポリヘドロシスウイルス(AcNPV)をベクターとして使用して、外来遺伝子を発現させる。このウイルスをSpodoptera frugiperda細胞中で増殖させる。Fc変異タンパク質をコードする配列を、このウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)に個別にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
【０１６８】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現システムを利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的のFc変異タンパク質をコードする配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3部構成の(tripartite)リーダー配列に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域ElまたはE3)への挿入の結果、生存可能で、感染した宿主でFc変異タンパク質を発現する能力がある組換えウイルスをもたらすことになる(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359参照)。挿入された抗体をコードする配列の有効な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要とされる。これらのシグナルとしてATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは所望のコード配列の読み取りフレームと合っていて、挿入物全体の翻訳を確実にするものでなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然および合成の多様な起源のものとすることができる。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含ませることによって、発現の有効性を強化することができる(例えば、Bittnerら、1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照)。
【０１６９】
Fc変異タンパク質の発現は、当分野で既知の任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントによって制御することができる。Fc変異タンパク質をコードする遺伝子発現を制御するために使用することができるプロモーターとして、限定するわけではないが、以下が含まれる: SV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、Rous sarcomaウイルスの3'長末端反復中に含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982, Nature 296:39-42)、テトラサイクリン(Tet)プロモーター(Gossenら、1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547 5551); 原核生物発現ベクター、β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)、またはtacプロモーター(DeBoerら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25; "Useful protein from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94も参照); ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター(Herrera-Estrellaら、Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸塩カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら、1984, Nature 310:115-120); 酵母またはその他の菌類からのプロモーターエレメント、例えばGal 4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示してトランスジェニック動物に利用されてきた、以下の動物転写制御領域: 膵臓腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら、1984, Cell 38:639-646; Ornitzら、1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 膵臓ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658; Adamesら、1985, Nature 318:533-538; Alexanderら、1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域(Lederら、1986, Cell 45:485-495)、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら、1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓中で活性なアルファ-フェトタンパク質遺伝子制御領域(Krumlaufら、1985, Mol.Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら、1987, Science 235:53-58); 肝臓中で活性なアルファ1-抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら、1987, Genes and Devel. 1:161-171)、骨髄細胞中で活性なベータ-グロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985, Nature 315:338-340; Kolliasら、1986, Cell 46:89-94); 脳内のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987, Cell 48:703-712); 骨格筋中で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286); ニューロン細胞中で活性なニューロン特異的エノラーゼ(NSE)(Morelliら、1999, Gen. Virol. 80:571 83); ニューロン細胞中で活性な脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子制御領域(Tabuchiら、1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823); 星状膠細胞で活性なグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター(Gomesら、1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619 631; Morelliら、1999, Gen. Virol. 80:571 83)および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、1986, Science 234:1372-1378)。
【０１７０】
Fc変異タンパク質をコードする遺伝子の挿入物を含有している発現ベクターは、3つの一般的な手法によって、同定することができる:(a) 核酸ハイブリダイゼーション、(b) 「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、および(c) 挿入した配列の発現。第1の手法では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクター中の存在を、挿入したペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれと相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって、検出することができる。第2の手法では、その組換えベクター/宿主システムを、抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列のそのベクターへの挿入の結果である、一定の「マーカー」遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス内の封入体の形成など)の存在または不存在に基づいて同定かつ選択することができる。例えば、Fc変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入する場合は、挿入された抗体または融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換え体を、そのマーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。第3の手法では、組換え発現ベクターを、その組換え体によって発現される遺伝子産物(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)についてアッセイすることによって、同定することができる。こうしたアッセイシステムは、in vitroアッセイでのその融合タンパク質の物理的または機能的特性、例えば、抗生体活性分子抗体との結合性に基づくものである。
【０１７１】
その上、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または遺伝子産物を特定の所望の様相で改変もしくはプロセシングする宿主細胞株を選定することができる。一定のプロモーターからの発現を、一定のインデューサーの存在中で上昇させることができる。こうして、遺伝子工学操作した融合タンパク質の発現を制御することができる。さらに、別の宿主細胞は、翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変(例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化)について特徴的かつ特異的な機構を持っている。適切な細胞系または宿主システムを選定して、発現させる外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実なものにすることができる。例えば、細菌システム中での発現では、非グリコシル化産物が産生され、酵母中での発現では、グリコシル化産物が産生される。遺伝子産物の一次転写物の適正なプロセシング(例えば、グリコシル化、およびリン酸化)のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。こうした哺乳動物宿主細胞として、限定するわけではないが、以下が含まれる: CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38、NS0、そして特に、ニューロン細胞系、例えば、SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZヒト神経芽細胞腫(Sugimotoら、1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57)、SK-N-SHヒト神経芽細胞腫(Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460)、Daoyヒト小脳髄芽腫(Heら、1992, Cancer Res. 52: 1144-1148)、DBTRG-05MGグリア芽腫細胞(Kruseら、1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614)、IMR-32 ヒト神経芽細胞腫(Cancer Res., 1970、30: 2110-2118)、1321N1ヒト星状細胞腫(Proc. Natl Acad. Sci. USA、1977, 74: 4816)、MOG-G-CCMヒト星状細胞腫(Br. J. Cancer、1984、49: 269)、U87MGヒトグリア芽腫-星状細胞腫(Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486)、A172ヒトグリア芽腫(Olopadeら、1992, Cancer Res. 52: 2523-2529)、C6ラットグリオーマ細胞(Bendaら、1968, Science 161: 370-371)、Neuro-2aマウス神経芽細胞腫(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129-136)、NB41A3マウス神経芽細胞腫(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184-1190)、SCPヒツジ脈絡叢(Bolinら、1994, J. Virol. Methods 48: 211-221)、G355-5、PG-4ネコ正常星状細胞(Haapalaら、1985, J. Virol. 53: 827-833)、Mpfフェレット脳(Trowbridgeら、1982, In Vitro 18: 952-960)など、ならびに正常細胞系、例えば、CTX TNA2ラット正常大脳皮質(Radanyら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471)、例えば、CRL7030およびHs578Bstなど。その上、別のベクター/宿主発現システムはプロセシング反応について程度の異なる効果を及ぼすものである。
【０１７２】
組換えタンパク質の長期間の高収率での製造のためには、安定な発現が好ましいことが多い。例えば、Fc変異タンパク質を一定して発現する細胞系を工学操作することができる。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択マーカーで制御されたDNAで形質転換するほうがよい。外来DNAの導入後、工学操作した細胞を富化培地で1〜2日間増殖させ、その後選択用培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーによって選択に対する耐性が与えられて、細胞がその染色体内にそのプラスミドを安定的に組み込んで、増殖巣を形成するまで増殖し、次にこれがクローン化されて細胞系内に展開されるようになる。この方法は、抗原に特異的に結合するFc変異タンパク質を発現する細胞系を工学操作するために、有利に使用される。こうした工学操作細胞系は、抗原に特異的に結合するFcタンパク質の活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用である。
【０１７３】
限定するわけではないが以下を含む、多数の選択システムを使用することができる: 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980, Cell 22:817)遺伝子を、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞中で使用することができる。また、以下の遺伝子についての選択の基礎として、抗代謝物質耐性を使用することができる: dhfr、メトトレキサートに対する耐性を付与(Wiglerら、1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt、マイコフェノール酸に対する耐性を付与(Mulligan & Berg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与(Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150:1); およびhygro、ハイグロマイシンに対する耐性を付与(Santerreら、1984、遺伝子 30:147)。
【０１７４】
Fc変異タンパク質の発現レベルを、ベクター増幅によって増加させることができる(概説について、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、Vol.3.(Academic Press、New York、1987)参照)。例えば、抗体またはFc融合タンパク質を発現するベクターシステム中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養液中に存在させるインヒビターのレベルの増加によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅した領域は抗体遺伝子に関係するものなので、抗体または融合タンパク質の産生も増加することになる(Crouseら、1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【０１７５】
宿主細胞に、本発明の2つの発現ベクターを同時トランスフェクトしてもよい。例えば、重鎖由来のポリペプチドをコードする第1ベクターと、軽鎖由来のポリペプチドをコードする第2ベクターである。2つのベクターに同一の選択マーカーを含ませてもよい。この場合、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同量の発現が可能になる。あるいは、融合タンパク質または重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、そして発現させる能力がある、単一のベクターを使用してもよい。融合タンパク質または重鎖および軽鎖のためのコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０１７６】
5.5.4  Fc変異タンパク質の精製
Fcタンパク質を組換え発現によって製造した後、タンパク質の精製のための当分野で既知の任意の方法によって精製することができる。例えば以下による: クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、特にProtein Aの後、特異的抗原に対する親和性によるもの、およびサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、分別溶解性、またはタンパク質の精製のための任意のその他の標準的技法。
【０１７７】
「単離」または「精製」したFc変異タンパク質は、細胞物質またはそのタンパク質が由来する細胞もしくは組織起源からのその他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは、化学的合成の場合、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」には、Fc変異タンパク質を、それを単離しまたは組換え産生させた細胞の細胞成分から分離する、Fc変異タンパク質の調製物が含まれる。こうして、細胞物質を実質的に含まないFc変異タンパク質には、異種タンパク質(本明細書中では「混入タンパク質」とも称される)が(乾燥重量として)約30%、20%、10%、または5%未満である、Fc変異タンパク質の調製物が含まれる。Fc変異タンパク質を組換え製造する場合、実質的に培地を含まない、すなわち、培地の存在量がタンパク質調製物の体積の約20%、10%、または5%未満であることも好ましい。Fc変異タンパク質を化学的合成によって製造する場合は、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体またはその他の化学物質から分離するのが好ましい。したがって、こうしたFc変異タンパク質の調製物は、化学的前駆体または目的の抗体以外の化合物が(乾燥重量として)約30%、20%、10%、5%未満である。特定の実施形態において、本発明にしたがって製剤化する前、またはそれと併行して、Fc変異タンパク質を単離または精製する。
【０１７８】
一般的に、Fc変異タンパク質の発現は、例えば、SDS-PAGE還元もしくは非還元タンパク質ゲル分析を使用するゲル電気泳動などの任意の当分野で既知の技法によって、まず確認する。Fc変異タンパク質の発現およびそのFc変異タンパク質の存在量の両方を検出するため、ELISAを使用することもできる。本明細書に記載した改変Fc融合タンパク質は細胞内のペリプラズム空間に産生させるか、または直接培地中に分泌させることができる。1実施形態において、Fc変異タンパク質を培養培地中に分泌させる。Fc変異タンパク質を産生する宿主細胞培養の培地を回収して、遠心分離によって細胞破片を沈殿させる。上清を回収してタンパク質精製方法を実施する。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の調製および精製方法は当分野で知られており、例えば以下に記載されている: Harlow and Lane, Antibody: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)。精製したFc変異タンパク質を濃縮するのが望ましい。タンパク質の濃縮方法は当分野で周知であり、適切な分子量(MW)カットオフ値(例えば、全体抗体分子について30 kDのカットオフ値)を持つ半透膜を使用するものが含まれる。多数の方法を利用して、精製したFc変異タンパク質を本発明の製剤に製剤化することができる。例えば、バッファー交換のために二重ろ過(difiltration)を利用することができる。この方法は濃縮とバッファー交換の両方のために使用することができる。当業者は、本発明の製剤の成分の全部ではなく、いくつかを含む塩基性バッファー中に、例えば二重ろ過によって、Fc変異タンパク質を最初に製剤化し、その後製剤の残りの成分を添加して所望の成分の全部を好ましい濃度で含む最終製剤を作製することができることを、理解できるはずである。一般的に、医薬用製剤での使用のためのFc変異タンパク質の最低許容純度は、90%、好ましくは95%、より好ましくは98%、そして最も好ましくは99%またはそれ以上である。
【０１７９】
5.6  使用方法
本発明は、疾病、疾患、または感染に関係する1以上の症候を予防、治療、または緩和するために、1以上のFc変異タンパク質(例えば、変異Fc領域を含む抗体)を含む本発明の製剤を、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトに投与することを包含する。Fc変異タンパク質は、エフェクター細胞機能(例えば、ADCC、CDC)の効力の変更が望まれる疾病または障害の治療または予防のために、特に有用である。Fc変異タンパク質を含む本発明の製剤は、原発もしくは転移性腫瘍性疾患(すなわち、がん)、および感染性疾患の治療または予防のために、特に有用である。薬学的に許容される成分を含む本発明の製剤は、本明細書に記載したようにして、作製することができる。下記に詳述するように、本発明の製剤を、がん(特に受動免疫療法)、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患の治療または予防において使用することができる。
【０１８０】
本発明の製剤は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患の治療または予防のための当分野で既知のその他の薬剤と併用しても、有利に利用することができる。特定の1実施形態において、本発明の製剤を以下と併用して使用することができる: モノクローナルまたはキメラ抗体、リンホカイン、または造血成長因子(例えば、IL-2、IL-3およびIL-7など)。これらは、例えば、その分子と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大させ、かつ免疫応答を増加させる作用をする。本発明の製剤は、例えば抗がん剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤などの、疾病、障害、または感染を治療するための1以上の薬物と併用して、有利に利用することもできる。
【０１８１】
本発明はさらに、限定するわけではないが以下を含む、がんの治療または予防のための、当業者に知られたその他の療法と組み合わせて、本発明の製剤を投与することを包含する: 現行の標準的および試験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、または外科手術。いくつかの実施形態において、本発明の製剤を、治療または予防のために効果的な量の1以上の抗がん剤、治療用抗体またはがんの治療および/もしくは予防のための当業者に知られたその他の薬剤と併用して投与することができる。本発明の製剤と組み合わせて使用することができる投薬処方および療法の例は当分野で周知であり、また各所に詳述されている(例えば、PCT公開WO 02/070007およびWO 03/075957参照)。
【０１８２】
本発明の方法および組成物によって治療または予防することができるがんおよび関連する疾患として、限定するわけではないが、以下が含まれる: 白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨および結合組織肉腫、脳腫瘍、乳がん、副腎がん、甲状腺がん、膵臓がん、下垂体がん、眼がん、膣がん、外陰部がん、子宮頚がん、子宮がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、肺がん、精巣がん、立腺がん、ペナル(penal)がん; 口腔がん、唾液腺がん、咽頭がん、皮膚がん、腎臓がん、膀胱がん(こうした疾患の概説については、以下参照: Fishmanら、1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia、およびMurphyら、1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America)。
【０１８３】
特定の1実施形態において、本発明の製剤単独、またはその他の抗がん剤もしくは療法との組み合わせは、原発腫瘍の成長またはがん性細胞の転移を、この本発明の製剤の不存在中での原発腫瘍の成長または転移に比較して、少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%、抑制または低下させる。
【０１８４】
本発明は、被験体中の炎症性疾患に関係する1以上の症候を予防、治療または管理するための、本発明の1以上の製剤の使用を包含する。
【０１８５】
本発明はさらに、本発明の製剤を、治療または予防のために効果的な量の1以上の抗炎症剤と併用して投与することを包含する。本発明はまた、自己免疫疾患に関係する1以上の症候を予防、治療または管理するための方法であって、その被験体に、本発明の製剤を治療または予防のために効果的な量の1以上の免疫調節剤と併用して投与することを含む方法を、提供する。本発明の製剤の投与によって治療することができる自己免疫疾患の例として、限定するわけではないが以下が含まれる: 円形脱毛症、強直性脊柱炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および精巣炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、Churg-Strauss症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集疾患、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病(ITP)、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエル病、混合型結合組織病、多発性硬化症、I型もしくは免疫介在糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群、リューマチ性多発筋痛、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リューマチ様関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、皮膚疱疹性血管炎、白斑およびヴェーゲナー肉芽腫など。炎症性疾患の例として、限定するわけではないが、以下が含まれる: 喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー性疾患、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスもしくは細菌感染の結果としての慢性炎症。いくつかの自己免疫疾患は炎症性症状と関係している。このように、自己免疫疾患および炎症性疾患と考えられるものはオーバーラップしている。したがって、いくつかの自己免疫疾患を炎症性疾患とみなすこともできる。本発明の方法にしたがって予防、治療または管理することができる炎症性疾患の例として、限定するわけではないが、以下が含まれる: 喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー性疾患、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスもしくは細菌感染の結果としての慢性炎症。
【０１８６】
本発明の製剤を、炎症性疾患の動物、特に哺乳動物が体験する炎症を軽減させるために使用することができる。特定の1実施形態において、別の抗炎症剤または治療法と一緒に、あるいはこれを組み込んだ本発明の製剤は、本発明の製剤を投与しない動物中の炎症に比較して、その動物の炎症を少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、または少なくとも10%、軽減する。
【０１８７】
本発明はまた、治療上または予防上効果的な量の本発明の製剤を投与することを含む、被験体中の感染性疾患の治療または予防方法をも包含する。本発明の製剤によって治療または予防することができる感染性疾患として、限定するわけではないがウイルス、細菌、菌類、原生動物、およびウイルスを含む、感染性病原体に起因するものである。
【０１８８】
本発明の製剤を本発明の方法と連携して使用することによって治療または予防することができるウイルス疾患として、限定するわけではないが、以下に起因するものが含まれる: A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、I型単純ヘルペス(HSV-I)、II型単純ヘルペス(HSV-II)、牛痘、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、フンタウイルス、コサッキーウイルス、ムンプウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタインバールウイルス、I型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-I)、II型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-II)、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘などの、ウイルス疾患の病原体。
【０１８９】
本発明の製剤を本発明の方法と連携して使用することによって治療または予防することができる細菌疾患として、限定するわけではないが、以下に起因するものが含まれる: マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、S. pneumonia、Borrelia burgdorferi(ライム病)、Bacillus antracis(炭疽病)、破傷風、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリウム、破傷風、百日咳(pertissus)、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、S. aureusおよびレジオネラ。本発明の分子を本発明の方法と連携して使用することによって治療または予防することができる原虫症として、限定するわけではないが、以下に起因するものが含まれる: リーシュマニア、kokzidioa、トリパノゾーマまたはマラリア。本発明の製剤を本発明の方法と連携して使用することによって治療または予防することができる寄生虫症として、限定するわけではないが、以下に起因するものが含まれる: クラミジアおよびリケッチア。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、感染性疾病の治療および/または予防のために、本発明の製剤を、治療または予防のために効果的な量の、当業者に知られた1以上のその他の治療薬と併用して投与することができる。本発明は、限定するわけではないが、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤を含む、感染性疾病の治療または予防のために、当業者に知られた1以上のその他の分子と併用した、本発明の分子の使用を、意図している。
【０１９１】
したがって、本発明は、被験体に、効果的な量の本発明の製剤を投与することによる、疾病、疾患、または感染に関係する1以上の症候を予防、治療、または緩和するための方法を提供する。1態様において、その製剤は、実質的に精製された(すなわち、その効果を制限するか、または望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない)Fc変異タンパク質を含む。特定の1実施形態において、被験体は哺乳動物などの動物、例えば非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットその他)および霊長類(例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト)である。特定の1実施形態において、被験体はヒトである。さらに別の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は被験体と同一の種由来のものである。
【０１９２】
本発明は、疾病、疾患、または感染に関係する1以上の症候を予防、治療、または緩和するための方法を提供するが、その方法は以下を含む:(a) これらを必要とする被験体に、予防上または治療上効果的な量の本発明の製剤の1用量を投与し、そして(b) その製剤を1回以上追加投与して、Fc変異タンパク質の血漿濃度を、抗原または標的分子に継続して結合する、所望のレベル(例えば、約0.1〜約100μg/ml)に維持するようにする。特定の1実施形態において、Fc変異タンパク質の血漿濃度を、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/mlまたは50μg/mlに維持する。特定の1実施形態において、投与すべきFc変異タンパク質の、その効果的な量は、1用量について少なくとも1 mg/kgと8 mg/kgの間である。別の特定の実施形態において、投与すべきFc変異タンパク質の、その効果的な量は、1用量について少なくとも4 mg/kgと8 mg/kgの間である。さらに別の特定の実施形態において、投与すべきFc変異タンパク質の、その効果的な量は、1用量について少なくとも50 mgと250 mgの間である。さらに別の特定の実施形態において、投与すべきFc変異タンパク質の、その効果的な量は、1用量について少なくとも100 mgと200 mgの間である。
【０１９３】
本発明は、本発明の製剤以外の治療法(例えば、予防用または治療用薬剤)と併用して本発明の製剤を使用する、疾病、疾患、または感染に関係する1以上の症候を予防、治療、または緩和するためのプロトコルをも包含する。本発明は、部分的に、本発明の製剤の成分、具体的にはFc変異タンパク質が、現行の標準的および試験的治療法を含む、他の治療法を増強および相乗効果を示す、有効性を強化する、耐性を改善する、かつ/またはそれがもたらす副作用を低下させることの認識に基づいている。本発明の併用療法は、追加の効力、追加の治療効果または相乗効果がある。本発明の併用療法は、疾病、疾患、または感染に関係する1以上の症候を予防、治療、または緩和するための本発明の製剤と連携して利用する治療法(例えば、予防または治療剤)を低用量化し、かつ/または疾病もしくは疾患を持つ被験体へのこうした予防もしくは治療剤の投与頻度を小さくして、その被験体の「生活の質」を改善し、かつ/または予防もしくは治療上の効果をあげることを可能にする。さらに、本明細書に記載した併用療法は、現行の単剤療法および/または現状の併用療法の投与に関係する望ましくないかまたは逆行性の副作用を低減または回避することができ、それによって治療プロトコルにともなう患者のコンプライアンスを改善する。本発明の製剤と併用して使用することができる多数の分子が当分野で周知である。例えば、PCT公開WO 02/070007; WO 03/075957およびU.S.特許公開2005/ 064514を参照されたい。
【０１９４】
組成物の投与経路は治療すべき症状次第である。例えば、リンパ腺がんまたは転移した腫瘍などの全身性疾患の治療のためには、静脈注射が好ましい。投与する組成物の用量は標準的用量−応答研究と連携し、過度な実験をすることなく、当業者が決定することができるものである。これらの決定をする際に考慮すべき、関連する状況として、治療する症状および症状群、投与する組成物の選定、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症候の重篤度が含まれる。症状に応じて、組成物を経口、非経口、経鼻、経膣、経直腸、経舌、舌下、経頬、頬内および/または経皮で、患者に投与する。
【０１９５】
したがって、経口、経舌、経頬および頬内投与用に設計した本発明の製剤を、当分野で周知の手段、例えば、不活性希釈剤または可食性担体とともに、過度な実験をすることなく、作製することができる。本発明の製剤をゼラチンカプセルに内封するか、圧縮して錠剤にしてもよい。経口治療薬投与の目的のためには、本発明の製剤を賦形剤と併用して、以下の形態で使用することができる: 錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース、チューインガムなど。
【０１９６】
錠剤、ピル、カプセル、トローチなどに、以下を含ませることもできる: バインダー、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、および/または香味剤。バインダーのいくつかの例として、微結晶セルロース、トラガカントガムおよびゼラチンが含まれる。賦形剤の例としてでんぷんおよびラクトースが含まれる。崩壊剤のいくつかの例として、アルギン酸、コーンスターチなどが含まれる。潤滑剤の例として、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸カリウムが含まれる。流動促進剤の例として、コロイド状二酸化ケイ素が含まれる。甘味剤のいくつかの例として、ショ糖、サッカリンなどが含まれる。香味剤の例として、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバーなどが含まれる。これらの各種組成物の調製に使用する物質は医薬用純度のもので、使用する量で毒性であってはならない。
【０１９７】
本発明の製剤を、例えば、静脈内、筋内、髄腔内および/または皮下注射などの、非経口で投与することができる。非経口投与は、本発明の製剤を溶液または懸濁液中に組み込むことによって、達成することができる。こうした溶液または懸濁液には、以下などの滅菌希釈剤を含ませてもよい: 注射用の水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールおよび/またその他の合成溶媒。非経口製剤には以下も含ませることができる: 抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールおよび/またはメチルパラベンなど、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸および/または亜硫酸水素ナトリウムなど、ならびにキレート剤、EDTAなど。バッファー、例えば酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩など、ならびに等張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムおよびデキストロースなども添加してもよい。非経口調製物を、アンプル、使い捨てシリンジおよび/またはガラスもしくはプラスチック製の多数回用量バイアルに内封することができる。直腸投与には、組成物の直腸および/または大腸内への投与が含まれる。これは坐剤および/または浣腸剤を使用することによって達成することができる。坐剤は当分野で既知の方法によって作製することができる。経皮投与には、皮膚を通して組成物を経皮吸収させることが含まれる。経皮製剤として、パッチ、軟膏、クリーム、ジェル、膏薬などが含まれる。本発明の製剤を鼻から患者に投与することができる。本明細書で使用する、鼻から投与する、または経鼻投与には、患者の鼻道および/または鼻腔の粘膜への組成物の投与が含まれる。
【０１９８】
6.  具体的な実施形態
1.  Fc変異タンパク質、濃度約1 mM〜約100 mMの緩衝剤を含み、さらに以下からなる群から選択される1以上の成分:
(a)  濃度約1〜約20重量対体積%の炭水化物賦形剤;
(b)  濃度約1 mM〜約400 mMのカチオン性アミノ酸;
(c)  濃度約1mM〜約200 mMのアニオン; および
(d)  濃度約0.001%〜約0.1%のポリソルベートを含み、pHが約5.5〜約8.0である、前記製剤。
【０１９９】
2.  成分(a)を含むが、(b)、(c)または(d)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２００】
3.  成分(a)および(b)を含むが、(c)または(d)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０１】
4.  成分(a)および(c)を含むが、(b)または(d)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０２】
5.  成分(a)および(d)を含むが、(b)または(c)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０３】
6.  成分(b)および(c)を含むが、(a)または(d)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０４】
7.  成分(b)および(d)を含むが、(a)または(c)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０５】
8.  成分(c)および(d)を含むが、(a)または(b)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０６】
9.  成分(b)および(c)および(d)を含むが、(a)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０７】
10.  成分(a)および(c)および(d)を含むが、(b)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０８】
11.  成分(a)および(b)および(d)を含むが、(c)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２０９】
12.  成分(a)および(b)および(c)を含むが、(d)は含まない、実施形態1の製剤。
【０２１０】
13.  成分(a)および(b)および(c)および(d)を含む、実施形態1の製剤。
【０２１１】
14.  バッファーがアニオンである、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１２】
15.  Fc変異タンパク質の凝集が、10 mMヒスチジン、pH 6.0に製剤化した同一のFc変異タンパク質の凝集に比較して、少なくとも10%少ない、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１３】
16.  Fc変異タンパク質の凝集が、サイズ排除クロマトグラフ(SEC)で評価して、温度範囲2℃〜8℃で少なくとも90日間、Fc変異タンパク質の総量に対して約2%以下である、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１４】
17.  製剤が賦形剤および/または添加剤としてシステインを含まない、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１５】
18.  Fc変異タンパク質濃度が約10 mg/mL〜約200 mg/mLである、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１６】
19.  Fc変異タンパク質が抗体である、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１７】
20.  Fc変異タンパク質がFc融合タンパク質である、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２１８】
21.  Fc変異タンパク質が以下からなる群から選択される臨床用製品または候補物質と同一の抗原に結合する、実施形態19または20の製剤: リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM(商標)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL 、ABX-IL8、ABX-MA1ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B(商標)、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide(商標)、LkoCide(商標)、ProstaCide(商標)、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF(商標)、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、Chimeric KW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea(商標)、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321。
【０２１９】
22.  Fc変異タンパク質が以下からなる群から選択される臨床用製品または候補物質と同一の抗原への結合について競合する、実施形態19の製剤: リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM(商標)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL 、ABX-IL8、ABX-MA1、ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B(商標)、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide(商標)、LkoCide(商標)、ProstaCide(商標)、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF(商標)、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、Chimeric KW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea(商標)、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321。
【０２２０】
23.  Fc変異タンパク質が以下からなる群から選択される臨床用製品または候補物質からの少なくとも1つのCDRを含む、実施形態19の製剤: リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM(商標)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL 、ABX-IL8、ABX-MA1ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B(商標)、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide(商標)、LkoCide(商標)、ProstaCide(商標)、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF(商標)、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、Chimeric KW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea(商標)、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321。
【０２２１】
24.  Fc変異タンパク質が配列番号2、4、6および8-20からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む、前記実施形態のいずれかの製剤。
【０２２２】
25.  緩衝剤の濃度が約10 mM〜約50 mMである、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２２３】
26.  緩衝剤の濃度が約50 mM〜約100 mMである、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２２４】
27.  緩衝剤がヒスチジン、リン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択される、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２２５】
28.  緩衝剤がヒスチジンである、実施形態27の製剤。
【０２２６】
29.  緩衝剤がリン酸塩である、実施形態27の製剤。
【０２２７】
30.  緩衝剤がクエン酸塩である、実施形態27の製剤。
【０２２８】
31.  炭水化物賦形剤の濃度が約5〜約20重量対体積%である、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２２９】
32.  炭水化物賦形剤がトレハロース、スクロース（ショ糖）、マンニトール、マルトース、およびラフィノースからなる群から選択される、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２３０】
33.  炭水化物賦形剤がトレハロースである、実施形態32の製剤。
【０２３１】
34.  炭水化物賦形剤がスクロース（ショ糖）である、実施形態32の製剤。
【０２３２】
35.  カチオン性アミノ酸の濃度が約35 mM〜約200 mMである、実施形態1、3、6、7、9、11、12または13のいずれかの製剤。
【０２３３】
36.   カチオン性アミノ酸がリシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択される、実施形態1、3、6、7、9、11、12または13のいずれかの製剤。
【０２３４】
37.  カチオン性アミノ酸がリシンである、実施形態36の製剤。
【０２３５】
38.  カチオン性アミノ酸がアルギニンである、実施形態36の製剤。
【０２３６】
39.  カチオン性アミノ酸がヒスチジンである、実施形態36の製剤。
【０２３７】
40.  アニオンの濃度が約10 mM〜約50 mMである、実施形態1、3、6、7、9、11、12または13のいずれかの製剤。
【０２３８】
41.  アニオンの濃度が約50 mM〜約100 mMである、実施形態1、3、6、7、9、11、12または13のいずれかの製剤。
【０２３９】
42.  アニオンの濃度が約100 mM〜約200 mMである、実施形態1、3、6、7、9、11、12または13のいずれかの製剤。
【０２４０】
43.  アニオンがクエン酸、コハク酸およびリン酸イオンからなる群から選択される、実施形態1、3、6、7、9、11、12または13のいずれかの製剤。
【０２４１】
44.  アニオンがクエン酸イオンである、実施形態43の製剤。
【０２４２】
45.  アニオンがコハク酸イオンである、実施形態43の製剤。
【０２４３】
46.  アニオンがリン酸イオンである、実施形態43の製剤。
【０２４４】
47.  アニオンがクエン酸イオン、バッファーがクエン酸塩であって、クエン酸塩の合計濃度が約100 mM〜300 mMである、実施形態43の製剤。
【０２４５】
48.  クエン酸塩の合計濃度が約100 mMである、実施形態47の製剤。
【０２４６】
49.  クエン酸塩の合計濃度が約200 mMである、実施形態47の製剤。
【０２４７】
50.  ポリソルベートの濃度が約0.01%〜約0.05%である、実施形態1、5、7、8、9、10、11または13のいずれかの製剤。
【０２４８】
51.  ポリソルベートがポリソルベート-20、ポリソルベート-60、およびポリソルベート-80からなる群から選択される、実施形態1、5、7、8、9、10、11または13のいずれかの製剤。
【０２４９】
52.  pHが約5.5〜約7.0である、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２５０】
53.  pHが約6.0〜約7.0である、実施形態52の製剤。
【０２５１】
54.  Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、Fc受容体への結合性が強化されたFc領域を含む、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２５２】
55.  Fc受容体がFcγRIIIAである、実施形態54の製剤。
【０２５３】
56.  Fc受容体がFcRnである、実施形態54の製剤。
【０２５４】
57.  Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化されたADCC活性を持つFc領域を含む、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２５５】
58.  Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化された血清中半減期を持つFc領域を含む、実施形態1〜13のいずれかの製剤。
【０２５６】
59.  Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を持つFc領域を含む、実施形態1〜13のいずれかの製剤: 222、224、234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、248、252、254、256、258、262、263、264、265、266、267、268、269、272、274、275、278、279、280、282、290、294、295、296、297、298、299、300、312、313、318、320、325、326、327、328、329、330、332、333、334、335、339、359、360、372、377、379、396、398、400、401、430および436。
【０２５７】
60.  Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下からなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸を持つFc領域を含む、実施形態1〜13のいずれかの製剤: 222N、224L、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241 L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、248M、252Y、254T、256E、258D、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268D、268N、269H、269Y、269F、269R、296E、272Y、274E、274R、274T、275Y、278T、279L、280H、280Q、280Y、282M、290G、290S、290T、290Y、294N、295K、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、300I、300L、312A、313F、318A、318V、320A、320M、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、335A、335T、335N、335R、335Y、339T、359A、360A、372Y、377F、379M、396H、396L、398V、400P、401V、430A。
【０２５８】
61.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239、330および332からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を含む、実施形態59の製剤。
【０２５９】
62.  少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される、実施形態60の製剤。
【０２６０】
63.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、天然に生じないアミノ酸239D、330Lおよび332Eを含む、実施形態60の製剤。
【０２６１】
64.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、天然に生じないアミノ酸239D、330Yおよび332Eを含む、実施形態60の製剤。
【０２６２】
65.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、天然に生じないアミノ酸332Eを含む、実施形態60の製剤。
【０２６３】
66.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252、254、および256からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸をさらに含む、実施形態59の製剤。
【０２６４】
67.  1以上の位置の天然に生じないアミノ酸が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される、実施形態60の製剤。
【０２６５】
68.  Fc変異タンパク質を実施形態1〜14、17〜20、または25〜53のいずれかの製剤に製剤化することを含む、Fc変異タンパク質の凝集の低減方法。
【０２６６】
69.  Fc変異タンパク質の凝集を、同一のFc変異体を10 mMヒスチジン、pH 6.0中で製剤化した場合の凝集に比較して、少なくとも10%低減させる、実施形態68の方法。
【０２６７】
70.   濃度約20 mg/mL〜約100 mg/mLのFc変異タンパク質、約6%トレハロース、約2%アルギニン(〜115 mM)、約0.025%ポリソルベート-80および約10 mMヒスチジンバッファーを含む凍結乾燥前バルク製剤であって、前記製剤のpHが約6.0である、製剤。
【０２６８】
71.  Fc変異タンパク質が配列番号2、4、6および8-20からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む、実施形態70の凍結乾燥前バルク製剤。
【０２６９】
72.   濃度約40 mg/mL〜約100 mg/mLのFc変異タンパク質、約2%〜約12%トレハロース、約1%〜約4%もしくは約58 mM〜230 mMアルギニン、および約5 mM〜約20 mMヒスチジンバッファーを含む再構成製剤であって、前記再構成製剤のpHが約6.0である、製剤。
【０２７０】
73.   濃度約40 mg/mL〜約100 mg/mLのFc変異タンパク質、約12%トレハロース、約4%もしくは約230 mMアルギニン、および約20 mMヒスチジンバッファーを含む、実施形態72の再構成製剤であって、前記再構成製剤のpHが約6である、製剤。
【０２７１】
74.   濃度約40 mg/mLのFc変異タンパク質、約4.5%トレハロース、約1.5%もしくは約58 mMアルギニン、および約7.5 mMヒスチジンバッファーを含む、実施形態72の再構成製剤であって、前記再構成製剤のpHが約6である、製剤。
【０２７２】
75.  Fc変異タンパク質が配列番号: 2、4、6および8-20からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む、実施形態72、73または74の再構成製剤。
【０２７３】
76.  再構成製剤がさらに約0.01%〜約0.05%ポリソルベート80を含む、実施形態72、73または74の再構成製剤。
【０２７４】
77.  約20 mg/mL〜約100 mg/mLの濃度のFc変異タンパク質、約50 mM〜約300 mMクエン酸塩、および約10%〜約20%トレハロースを含む液体製剤であって、前記製剤のpHが約6.0〜約7.0である、製剤。
【０２７５】
78.  クエン酸塩の濃度が約50 mM、かつトレハロースの濃度が約10%である、実施形態77の液体製剤であって、前記製剤のpHが約6.0〜約6.5である、製剤。
【０２７６】
79.  クエン酸塩の濃度が約200 mM、かつトレハロースの濃度が約10%である、実施形態77の液体製剤。
【０２７７】
80.  クエン酸塩の濃度が約100 mM、かつトレハロースの濃度が約15%である、実施形態77の液体製剤。
【０２７８】
81.  pHが約6.0である、実施形態77、79または80の液体製剤。
【０２７９】
82.  pHが約6.5である、実施形態77、79または80の液体製剤。
【０２８０】
83.  pHが約7.0である、実施形態77、79または80の液体製剤。
【０２８１】
84.   濃度約0.001%〜約0.1%のポリソルベートをさらに含む、実施形態77、79または80の液体製剤。
【０２８２】
85.   濃度約20 mg/mL〜約100 mg/mLのFc変異タンパク質、約25 mMクエン酸塩、約200 mMアルギニン、約8%トレハロースを含む液体製剤であって、前記製剤のpHが約6.0〜約6.5である、製剤。
【０２８３】
86.   濃度約0.001%〜約0.1%のポリソルベートをさらに含む、実施形態85の液体製剤。
【０２８４】
87.  Fc変異タンパク質の凝集が、10 mMヒスチジン、pH 6.0に製剤化した同一のFc変異タンパク質の凝集に比較して、少なくとも10%少ない、前記実施形態77〜85のいずれかの液体製剤。
【０２８５】
88.  Fc変異タンパク質の凝集が、サイズ排除クロマトグラフ(SEC)で評価して、温度範囲2℃〜8℃で少なくとも90日間、Fc変異タンパク質の総量に対して約2%以下である、実施形態77〜85のいずれかの液体製剤。
【０２８６】
89.  Fc変異タンパク質が抗体である、実施形態77〜87のいずれかの液体製剤。
【０２８７】
90.  Fc変異タンパク質がFc融合タンパク質である、実施形態77〜87のいずれかの液体製剤。
【０２８８】
91.  Fc変異タンパク質がヒトEphA2またはヒトαVβ3インテグリンに結合する、実施形態89または90の液体製剤。
【０２８９】
92.  Fc変異タンパク質が配列番号: 2、4、6および8-20からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含む、実施形態91の液体製剤。
【０２９０】
93.  Fc変異タンパク質が以下からなる群から選択される臨床用製品または候補抗体と同一の抗原に結合する、実施形態89または90の液体製剤: リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM(商標)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL 、ABX-IL8、ABX-MA1ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B(商標)、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide(商標)、LkoCide(商標)、ProstaCide(商標)、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF(商標)、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、ChimericKW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea(商標)、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321。
【０２９１】
94.  Fc変異タンパク質が以下からなる群から選択される臨床用製品または候補物質と同一の抗原への結合について競合する、実施形態89または90の液体製剤: リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM(商標)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、エタネルセプト、ABX-CBL、ABX-IL8、ABX-MA1、ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B(商標)、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide(商標)、LkoCide(商標)、ProstaCide(商標)、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF(商標)、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、ChimericKW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea(商標)、アバゴボマブ、GMA161およびGMA321。
【０２９２】
95.  Fc変異タンパク質が以下からなる群から選択される抗体からの少なくとも1つのCDRを含む、実施形態89または90の液体製剤: リツキシマブ、ザノリムマブ、hA20、AME-I33、HumaLYM(商標)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、IMC-3G3、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch806、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、アレムツズマブ、ムロモナブ-CD3、OKT4A、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-571、ABX-CBL 、ABX-IL8、ABX-MA1、ペムツモマブ、Therex、AS1405、ナタリズマブ、HuBC-1、ナタリズマブ、IDEC-131、VLA-1; CAT-152; J695、CAT-192、CAT-213、LymphoStat-B(商標)、TRAIL-R1mAb 、ベバシズマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、MLN-02、ザノリムマブ、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、BEC2、IMC-1C11、DC101、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、MyelomaCide(商標)、LkoCide(商標)、ProstaCide(商標)、イピリムマブ、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、トシリズマブ、CS-1008、IDM-1、ゴリムマブ、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、メポリズマブ、MOR101、MOR102、MOR201、ビシリズマブ、HuZAF(商標)、ボロシキシマブ、ING-1、MLN2201、ダクリズマブ、HCD122、CDP860、PRO542、C14、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、シプリズマブ、リンツズマブ、Hu1D10、Lym-1、エファリズマブ、ICM3、ガリキシマブ、エクリズマブ、ペキセリズマブ、LDP-01、huA33、WX-G250、シブロツズマブ、ChimericKW-2871、hu3S193、huLK26; ビバツズマブ、ch14.18、3F8、BC8、huHMFG1、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、デノスマブ、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、カンツズマブ、HuN901、8H9、chTNT-1/B、バビツキシマブ、huJ591、HeFi-1、Pentacea(商標)、アバゴボマブ、トシツモマブ、105AD7、GMA161およびGMA321。
【０２９３】
96.  Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、Fc受容体への結合性が強化されたFc領域を含む、実施形態77〜86のいずれかの液体製剤。
【０２９４】
97.  Fc受容体がFcγRIIIAである、実施形態96の液体製剤。
【０２９５】
98.  Fc受容体がFcRnである、実施形態96の液体製剤。
【０２９６】
99.  Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化されたADCC活性を持つFc領域を含む、実施形態77〜86のいずれかの液体製剤。
【０２９７】
100.  Fc変異タンパク質が、天然に生ずるFc領域を持つ以外は同一のアミノ酸配列を持つタンパク質に比較して、強化された血清中半減期を持つFc領域を含む、実施形態77〜86のいずれかの液体製剤。
【０２９８】
101.  Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸残基を持つFc領域を含む、実施形態77〜86のいずれかの液体製剤: 222、224、234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、248、252、254、256、258、262、263、264、265、266、267、268、269、272、274、275、278、279、280、282、290、294、295、296、297、298、299、300、312、313、318、320、325、326、327、328、329、330、332、333、334、335、339、359、360、372、377、379、396、398、400、401、430および436。
【０２９９】
102.  Fc変異タンパク質が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、以下からなる群から選択される少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸残基を持つFc領域を含む、実施形態77〜86のいずれかの液体製剤: 222N、224L、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、248M、252Y、254T、256E、258D、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268D、268N、269H、269Y、269F、269R、296E、272Y、274E、274R、274T、275Y、278T、279L、280H、280Q、280Y、282M、290G、290S、290T、290Y、294N、295K、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、300I、300L、312A、313F、318A、318V、320A、320M、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、335A、335T、335N、335R、335Y、339T、359A、360A、372Y、377F、379M、396H、396L、398V、400P、401V、430A。
【０３００】
103.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239、330および332からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸を含む、実施形態101の液体製剤。
【０３０１】
104.  少なくとも1つの天然に生じないアミノ酸が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、239D、330L、330Yおよび332Eからなる群から選択される、実施形態102の液体製剤。
【０３０２】
105.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、天然に生じないアミノ酸239D、330Lおよび332Eを含む、実施形態102の液体製剤。
【０３０３】
106.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、天然に生じないアミノ酸239D、330Yおよび332Eを含む、実施形態102の液体製剤。
【０３０４】
107.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、天然に生じないアミノ酸332Eを含む、実施形態102の液体製剤。
【０３０５】
108.  Fc領域が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252、254、および256からなる群から選択される1以上の位置に天然に生じないアミノ酸をさらに含む、実施形態101の液体製剤。
【０３０６】
109.  1以上の位置の天然に生じないアミノ酸が、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、252Y、254Tおよび256Eからなる群から選択される、実施形態102の液体製剤。
【０３０７】
本発明を、これから以下の実施例を参照しながら説明する。これらの実施例は、説明のみの目的で提供するものであって、本発明がこれらの実施例に限定されるものとは決して解釈すべきではなく、むしろ、本明細書中に提供する教示の結果として、明確になるあらゆる、かつすべての変化形を包含するものと解釈すべきである。
【実施例】
【０３０８】
7.1  実施例１
Fc変異体の安定性の分析
抗EphA2抗体(「Medi3」と命名、可変領域について図1A-B参照、配列番号について表2参照)の2つのFc変異体を作製した。変異体1(「Medi3-V1」と命名)は、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、残基332にグルタミン酸を持ち、FcγRIIIAに対してMedi3よりも8.8倍高い結合親和性を持つ。変異体2(「Medi3-V3」と命名)は、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、残基239にアスパラギン酸、残基330にロイシン、および残基332にグルタミン酸を持ち、FcγRIIIAに対してMedi3よりも100倍近く高い結合親和性を持つ(データ非掲載)。Medi3-V1およびMedi3-V3は野生型Medi3に比較してADCC活性も高く、相対的ADCC活性はMedi3-3V>Medi3-1V>Medi3(データ非掲載)であった。野生型Medi3抗体およびFc変異体、そして異質の可変領域を持つ第2の野生型抗インテグリンαvβ3抗体(「Medi2」と命名、可変領域について図1C-D参照、配列番号について表2参照)を、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中で100 mg/mLで製剤化し、40℃で保存したとき、3ヶ月にわたって、UV検出でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、サンプルを分析した。あるいは、これらの抗体製剤を、下記のものなどのキャピラリーゲル電気泳動法によって、抗体凝集および/またはフラグメントの存在について分析してもよい。その上、作製した物質を、下記のものなどのポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して、分析して、純度、凝集の性質-共有結合か非共有結合か、そしてまた何らかのフラグメントの存在/不存在についてモニターすることができる。経時的にプロットした製剤中に存在するモノマーのパーセントを図2Aに示す。存在するモノマーの量の低下は、製剤中の抗体の凝集に相関し、安定性の低下の指標となる。両方の野生型抗体製剤、およびMedi3-V1製剤中に存在するモノマーの量は同程度で、3ヶ月間で15%未満の低下を示した。対照的に、Medi3-V3製剤のモノマーのパーセントは、わずか15日で約40%低下した。Medi3-V3抗体は、WTバージョン(Medi3)および無関係な抗体のWTバージョン(Medi2)に比較して、製剤として不安定であることを示している。
【０３０９】
ほとんどまたは全く凝集がないMedi3-V3の溶液を、非還元条件下のSDS-PAGEによって試験して、単一のモノマーバンドとして泳動することがわかった(図2B、レーン4)。同様に、約30%凝集(SECによって測定、データ非掲載)がある溶液も、これらの条件下で大部分がモノマーバンドとして泳動し(図2B、レーン5)、凝集の性質が共有結合ではないことを示しており、また凝集が可逆的であるらしいことを示している。SEC分析を使用して、濃縮した抗体の40℃でのインキュベーションによって形成された凝集の可逆性を試験した。4℃で16時間のインキュベーション中に、80 mg/ml溶液中に40℃で形成された凝集%に約2%の低下が見られた(図2C、三角参照)。溶液を最初に10 mg/mlに希釈し、その後4℃でインキュベートしたとき、同様の低下が見られた(図2C、四角)。しかし、凝集%は、非希釈抗体溶液に比較して、最初の試験時点(4時間)で、すでに低下した(三角と四角の比較)。凝集した抗体溶液を、20 mMクエン酸塩を含むバッファーで10 mg/mlに希釈した場合、4℃で6時間後に、さらに大きい凝集%(約3%)の初期減少が見られ、その凝集%は、4℃でのさらに長期のインキュベーション中、減少を続けた(図2C、ひし形)。これらのデータを総合すると、Medi3-V3の凝集は非共有結合であり、一定のインキュベーション条件下では、多少の可逆性があることを示している。
【０３１０】
Medi3-V3の安定性の低下に際しての変異Fc領域の役割をさらに調査するため、Kabatに示されたEUインデックスによる番号付けで、残基239にアスパラギン酸、残基330にロイシン、および残基332にグルタミン酸を持つ、Medi2抗体の「V3」Fc変異体をも作製した(「Medi2-V3」と命名)。Medi2-V3と同様に、Medi2-V3はFcγRIIIAに対してはるかに高い、Medi2よりも78倍高い、結合親和性と、さらに高いADCC活性を持つ(データ非掲載)。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に80 mg/mLで製剤化し、40℃で保存したMedi2-V3の安定性について、24時間にわたって、UV検出でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。経時的にプロットした製剤中に存在するモノマーのパーセントを図2Dに示す。溶液中に存在するモノマーのパーセントはわずか4日で20.7%低下したが、一方Medi2(WT)モノマーの濃度は2.5ヶ月で、約9.0%低下しただけだった。
【０３１１】
抗体安定性を低下させる変異Fc領域の役割を特性決定するため、示差走査熱量法(DSC)を使用して、Medi3およびその2つのFc変異体の溶融曲線を試験した(図3)。以前の研究から、可変ドメインの溶融によって、これらの曲線に最大のピークがもたらされることが証明されており、したがってMedi3および両変異体の可変ドメインはすべて溶融温度(Tm)が約72℃である。示していない研究において、野生型Fc領域、特にCH2ドメインのTmが約69℃であると判定されたので、可変領域の溶融によってもたらされた曲線とオーバーラップするため、Medi3のFc領域についての別個のピークは見ることができない。しかし、両Fc変異体についてのピークは見ることができる。Fc領域のTmはMedi3-V1について約59℃まで低下し、Medi3-V3についてはさらにわずか約49℃までの低下が見られる。これらの結果はともに、変異Fc領域、特にCH2ドメインが、部分的には変異Fc領域についてのTmの低下によって、Medi3-V3およびMedi2-V3 Fc変異体の凝集の増加に大きく関係することを証明している。
【表２】
2009525986.tif 000004
【０３１２】
7.1.1  方法
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC): 抗体凝集およびフラグメントの存在について抗体製剤を分析するため、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。試験サンプルをサイズ排除G3000 SWXLカラム(5 μm、300Å、7.8 x 300 mm、TosoHaas)に注入した。移動相は0.1 Mリン酸二ナトリウム、0.1 M硫酸ナトリウムおよび0.05 %アジ化ナトリウム(pH 6.8)、1.0 mL/minの流速で定組成で実施した。溶出タンパク質を280 nmでのUV吸収によって検出し、さらに特性決定するために回収した。検出したタンパク質の各種類について、相対的量を、当初含まれていた体積ピークを除いた、すべてのその他の検出ピークの合計面積に比較した、その産物のピークの面積パーセントとして報告した。抗体モノマーピークよりも早く溶出するピークを凝集パーセント分として記録する一方、抗体モノマーピークよりは遅いが、バッファーピークよりも早く溶出するピークをフラグメントパーセント分として記録した。
【０３１３】
ドデシル硫酸ナトリウムを使用するキャピラリーゲル電気泳動(CGE-SDS): 50μm i.d.および総長38.5 cmの延長光路細管(Agilent Technologies)で、CGE-SDSを実施する。Hewlett Packard 3D-キャピラリー電気泳動ユニットを使用して、分析を実施する。220 nmでUV検出を実行する。試薬: SDSサンプルバッファー、SDS分離用バッファー、および2-メルカプトエタノールは市販品を購入することができる。サンプル調製: サンプルを水に2.5 mg/mLに希釈する。還元サンプルについては、希釈抗体80μLをCE-SDSサンプルバッファー100μLおよび2-メルカプトエタノール原液20μLに混合する。非還元サンプルについては、水に代えて2-メルカプトエタノール20μLとする。還元サンプルを沸騰水浴中で10分間インキュベートする。非還元サンプルは加熱しない。CE分析: 注入の前に、細管を、0.1 M NaOH、0.1 M HCl、およびSDS分離用バッファーでそれぞれ3、3、および8分間洗浄する。サンプルを電気泳動用に-10 kVで40秒間注入する。CE分析を陰極性モード(-15 kV)で実施する。得られた典型的な電流は〜20μAである。キャピラリー温度を50℃に維持し、サンプルは環境温度とする。
【０３１４】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動: 4-12 % Bis-Trisを含有するNuPAGEゲル(Invitrogen)を使用する。分析には、還元(70℃で10分間加熱)および非還元条件(非加熱)の両方での泳動サンプルの実行を含む。NRサンプル用 - 5mg/mlのサンプル5 ul、逆浸透脱イオン(RODI)水60 ul、サンプルバッファー25 ul(合計体積=90ul)。その後RODI水10ulを添加して、サンプルを合計体積100 ulにする。Rサンプル用 - 5mg/mlのサンプル5 ul、RODI水60 ul、サンプルバッファー25 ul(合計体積=90 ul)。その後還元剤10 ulを添加して、サンプルを合計体積100 ulにする。これらのサンプルをその後70℃で10分間加熱する。1ウェルについてサンプル15 ulを添加する。ゲルに1X MES分離用バッファーを、200 Vで35分、添加する。還元されたゲルの内部チャンバーに抗酸化剤500 ulを添加する。電気泳動マーカー(例えば、カラーバースト(color burst)、Sigma)を使用して、広範囲、すなわち220 kDa〜8 kDaを網羅するようにする。ゲルを、例えばSimply Blue Safe Stainで染色し、例えばGel-Dry溶液で保存する。
【０３１５】
示差走査熱量法(DSC): 走査速度1.0℃/分および 温度範囲10〜110℃または25〜120℃を使用する、VP-DSC(Microcal、LLC)で、熱溶融温度(Tm)を測定した。5分間の走査前熱安定化とともに8秒間のフィルター期間を使用した。サンプルを透析によって10 mMヒスチジン-HCl、pH 6中に、または透析(例えば、Pierce透析カップ(3.5 kD)を使用)によって、製剤に調製した。平均mAb濃度はA280によって判定して50 μg/mLであった。溶融温度はこのシステムとともに供給されるOriginソフトウェアを使用し、製造者の操作法にしたがって測定した。簡単に述べると、サンプルおよび参照セルの両方の中にバッファーとともに複数ベースライン(baseline)を添加し、熱平衡を確立させる。サンプルサーモグラムからベースラインを差し引いた後、データを濃度について正規化し、デコンボリューション機能を使用して、近似化した。Tmは、取得したサーモグラムの熱容量の吸熱最大ピーク時点として報告している。
【０３１６】
7.2  実施例２
Fc変異体の安定性に対する濃度および温度の効果
40℃で保存したときの、数種の濃度(10、50および100 mg/mL)で10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中で製剤化したMedi3-V3の安定性を、37日間、UV検出でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(上記の通り)によって分析し、製剤中に存在するモノマーのパーセントを経時的にプロットしている(図4)。10 mg/mL溶液中に存在するモノマーパーセントは37日で約4.4%しか減少しなかったが、50 mg/mLおよび100 mg/mL溶液はわずか14日後にそれぞれ約14%および37.5%の減少を示し、高濃度溶液の方で凝集が増加することを示した。
【０３１７】
各種温度(4、25および40℃)で保存したときの、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に100 mg/mLで製剤化したMedi3-V3の安定性を、30日間、UV検出でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、製剤中に存在するモノマーのパーセントを経時的にプロットしている(図5)。4℃および25℃で保存した溶液中に存在するモノマーパーセントはそれぞれ0.3%および1.0%減少したが、40℃で保存した溶液中のモノマーパーセントはわずか15日後に約37%減少した。
【０３１８】
これらのデータは、「V3」変異体は低濃度および/または低温側でより安定であるが、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0のV3抗体の全体としての安定性は高濃度抗体製剤の製造および最終製品化(fill finish)には適していないことを示している。
【０３１９】
7.3  実施例３
バッファー製剤のファストスクリーンアッセイ
V3変異体の安定性を改善するものについて、大量の別のバッファー製剤を迅速にスクリーニングするために、「ファストスクリーン」アッセイ法を開発した。簡単に述べると、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0のMedi3-V3の100 mg/mL溶液をモノクローナル抗体(mAb)原液として使用した。この方法では濃縮した賦形剤溶液を利用し、これを20体積%でmAb原液のアリコートに添加する。賦形剤の添加後、タンパク質濃度は80 mg/mLであった。これらの賦形剤含有mAb溶液を40℃で4〜24時間インキュベートし、凝集含有量をSEC(上記の通り)によって測定した。「純度の損失パーセント(%)」(実質的に凝集パーセントの増加と同一)を、賦形剤によって与えられる安定化を比較するための指標として使用した。このアッセイを下記のように使用して、一連の賦形剤をスクリーニングした。
【０３２０】
7.3.1  糖類およびアルギニン
10%ショ糖、10%トレハロース、および200 mM L-アルギニンはそれぞれ、7時間のインキュベーションでの純度損失パーセントを、対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)中での約9%から、2%未満まで低下させる、有意な安定化を提供する(図6)。ショ糖およびトレハロースの効果を多様な濃度で比較した。24時間のインキュベーション中の純度の損失パーセントは対照では約19%であったが、それぞれ1%、5%および10%の糖を含有するサンプルでは、約16%、9%および3%であった(図7A)。いずれかの糖の濃度の増加は増大した安定化をもたらし、また両方の糖がほぼ同程度の安定化効果を持ち、これらは互換性があるらしいことを示している。
【０３２１】
同様に、50 mg/ml抗体溶液(20 mMヒスチジンバッファー、pH 6)に対するトレハロースおよびマンニトールの安定化効果を、多様な濃度(5%〜20%)で比較した。サンプルを40℃で1日インキュベートし、純度の損失パーセントをSECによって測定した(上記の通り)。24時間のインキュベーション中の純度の損失パーセントは対照では約8.4%であったが、それぞれ5%、10%および20%の糖を含有するサンプルでは、約4%、2%および0.6%であった(図7B)。前にも見られたように、いずれかの糖の濃度の増加は増大した安定化をもたらし、また5〜10％ではすべての3つの糖がほぼ同程度の安定化効果を持ち、これら3つの糖は互換性があるらしいことを示している。トレハロースのみを20%より上の濃度で試験したが、試験したいずれの糖についても同様の安定性の改善が期待される。
【０３２２】
7.3.2  アミノ酸、アニオン性物質およびキレート剤
L-アルギニンおよびその他のいくつかのアミノ酸を、アニオン性物質、クエン酸塩とともに、濃度50 mM、200 mMおよび400 mMで試験した。その上、キレート剤DTPAを50 mMで試験した。図8Aに示すように、アルギニン、リシン、およびクエン酸塩はそれぞれ濃度200 mM〜400 mMで、24時間のインキュベーションでの純度損失パーセントを、対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)での約19%から、4%またはそれ未満まで低下させる、有意な安定化を提供した。グリシンはいくらか効果が低く、濃度200 mM〜400 mMで、純度の損失パーセントを約9%またはそれ未満まで低下させた。相対的順位はクエン酸塩>リシン>アルギニン>グリシンであることがわかった。ここで「>」は「より大きな安定化効果」を意味するために使用する。DTPAは何ら効果が見られなかったが、システインは凝集の大きな増加をもたらした(下記実施例7参照)。
【０３２３】
7.3.3  ショ糖とL-アルギニンの併用効果
5%ショ糖単独では24時間のインキュベーションでの純度損失パーセントを、対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)での約19%から、約9%まで低下させ、一方200 mM L-アルギニンは純度の損失パーセントを約3.5%まで低下させた(図9)。しかし、5%ショ糖および200 mM L-アルギニンの併用は各成分それぞれよりもより効果的であって、純度の損失パーセントをわずか1.5%まで低下させた(図9)。
【０３２４】
7.3.4  いくつかのクラスの分子のその他のメンバー
上記の試験した賦形剤を拡張するため、各クラスの分子のいくつかのその他のメンバーを試験した。その上、いくつかのその他のクラスの分子を試験した。サンプルを40℃で19時間インキュベートし、純度の損失パーセントをSECによって測定した(上記の通り)。トレハロースを再び10%で試験し、19時間のインキュベーションで、純度の損失パーセントを対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)での約22%から約5.4%まで低下させることがわかった(図10)。
【０３２５】
アニオン性分子、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、および硫酸塩は中から強程度の効果を持つことがわかり、純度の損失パーセントをそれぞれ約2%、10%、6%、9%、11%、<1%および10%まで低下させた(図10)。相対的順位はリン酸塩>クエン酸塩>コハク酸塩>その他のアニオン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酢酸塩、および 硫酸塩などであることがわかった。ここで「>」は「より大きな安定化効果」を意味するために使用する。
【０３２６】
カチオン性アミノ酸、リシン、アルギニンおよびヒスチジンは50 mMでそれぞれ弱い安定化効果を持ち、純度の損失パーセントを約16%まで低下させた(図10)。親水性アミノ酸のセリンならびに疎水性アミノ酸のフェニルアラニンおよびアラニンは50 mMで、安定性に対して弱いかまたは不利な効果さえ持っていた。セリンおよびアラニンは純度の損失パーセントをそれぞれ約17%および18%にやや低下させることがわかり、一方フェニルアラニンは純度の損失パーセントを26%に増加させた(図10A)。
【０３２７】
上記の結果に基づいて、クエン酸塩、アルギニンおよびリン酸塩の効果を、濃度100 mM、200 mMおよび300 mMで試験した。これらの実験中、最終抗体濃度を25 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0単独またはプラス指示した濃度のクエン酸塩、アルギニンまたはリン酸塩中50 mg/mLとして、サンプルを40℃で1日インキュベートし、純度の損失パーセントをSECによって測定した(上記の通り)。100 mMでは、クエン酸塩およびリン酸塩は純度の損失パーセントを約8.4%からそれぞれ約1.4%および約1.8%まで低下させ、一方アルギニンは純度の損失パーセントを約6.0%まで低下させただけだった。200 mMおよび300 mMでは、クエン酸塩およびリン酸塩は純度の損失パーセントを約8.4%からそれぞれ約0.8%および約1.0 %まで低下させたが、アルギニンは純度の損失パーセントを約4.8%まで低下させただけだった(図10B)。
【０３２８】
キレート剤、EDTAおよびDTPAは純度の損失パーセントに対してほとんどまたは全く効果を持たなかった。EDTAまたはDTPAを含有するサンプルは純度の損失パーセントが、対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)での約22%に比較して、それぞれ約20%および24%であった(図10A)。
【０３２９】
7.3.5  トレハロースとカチオン性アミノ酸またはクエン酸塩との併用効果
50 mMアルギニン、リシンまたはクエン酸塩を単独でまたは5%トレハロースと併用した効果を試験した。サンプルを40℃で19時間インキュベートし、SECによって純度の損失パーセントを測定した(上記の通り)。賦形剤単独では、すでにわかっているように、対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)に比較して、純度の損失パーセントの同様の低下を示した(図10Aと図11Aの棒グラフの比較)。5%トレハロースと50 mMのリシンまたはアルギニンのいずれかとの併用は、トレハロース単独よりも顕著な併用効果があり、19時間のインキュベーションで、純度の損失パーセントを対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)の約22%から約7%に低下させた(図11A)。リシンおよびアルギニンの両方が高濃度ほど安定化したので(図8参照)、トレハロースと併用する場合、高濃度の方が安定性の顕著な改善をもたらすものと見られる。5%トレハロースと50 mMクエン酸塩の併用は、強力な併用効果があり、純度の損失パーセントがトレハロース単独で約7%またはクエン酸塩単独で約2%に比較して、わずか約1%に低下した。
【０３３０】
トレハロースまたはマンニトールと併用したリン酸塩またはクエン酸塩の効果を、高濃度範囲について試験した(図11B)。これらの実験のため、安定な野生型Medi2抗体(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中に50 mg/mL、賦形剤無し)を対照として使用し、一方Medi3-V3は、5、10もしくは20%トレハロースまたはマンニトール、pH 6.0と併用して、100、200もしくは300 mMリン酸塩またはクエン酸塩を含む25 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中で、最終濃度50 mg/mLで製剤化した。サンプルを40℃で1週間インキュベートし、上記のようにHPLC-SECによって、純度の損失パーセントを測定した。各製剤の純度の損失パーセントを図11Bにプロットし、また下記の表3に要約する。安定な対照についての純度の損失は0.6%であった。100 mMクエン酸塩、20%トレハロース; 100 mMクエン酸塩、20%マンニトールおよび300 mMクエン酸塩、20%トレハロース製剤は、1%またはそれ未満の純度の損失を示し、安定な抗体について見られるものと同程度であった。いくつかのその他の製剤(例えば、100 mMリン酸塩、20%トレハロース; 200 mMリン酸塩、10%トレハロース; 200 mMリン酸塩、10%マンニトール; 300 mMリン酸塩、20%トレハロース; 300 mMリン酸塩、20%マンニトール; 100 mMクエン酸塩、20%マンニトール; 200 mMクエン酸塩、10%トレハロース; 300 mMクエン酸塩、5%トレハロースおよび300 mMクエン酸塩、10%マンニトール)は、1%より大きいが2%未満の純度の損失を示した。試験した残りの製剤はすべて、2%またはそれ以上の純度の損失を示した。
【表３】
2009525986.tif 000005
【０３３１】
7.3.6  バッファーまたは賦形剤としてのクエン酸塩およびヒスチジン
賦形剤としてのクエン酸塩およびバッファーとしてのヒスチジンの安定化効果を以下のようにして試験した。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0のmAb原溶液に、賦形剤としてのクエン酸塩を濃度を増加させながら(50、100および200 mM)添加した。クエン酸塩は、19時間のインキュベーションで、純度の損失パーセントを、対照(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)での約23%から、それぞれ50 mM、100 mMおよび200 mMで約2.2%、約1.3%および<1%に、低下させることがわかった。賦形剤としてのヒスチジンおよびバッファーとしてのクエン酸塩を試験するため、mAb溶液を最初に10 mMクエン酸塩バッファー、pH 6.0中に透析し、ヒスチジンを最終濃度25、50または100 mMで添加した。賦形剤としてのヒスチジンの安定化効果は比較的弱く、純度の損失パーセントを対照での約23%から、それぞれ25 mM、50mMおよび100 mMで約22%、約20%および約16%に低下させた(図12)。緩衝剤としていずれかを使用することができるが、クエン酸塩は賦形剤としてヒスチジンよりも強い安定化作用を持つ。各種濃度および各種pH値でのクエン酸塩のバッファーとしての効果も試験した。以下を参照されたい。
【０３３２】
7.3.7  pHの効果
3〜8のpH範囲でのバッファーとしてのクエン酸塩の安定化効果を、pH 3〜8で0.5単位ずつ増加させた50 mMクエン酸塩バッファー中にmAb原溶液を透析することによって、試験した。pH 5.5未満のクエン酸塩バッファー化製剤は、4時間のインキュベーションでの純度の損失パーセントがpH 3での高い約90%からpH 5での約21%までの低下を示した(図13)。pH 5.5およびそれ以上のクエン酸塩バッファー化製剤は、同一の時間に純度の損失パーセントがpH 5.5で約6%からpH 6.5での約1%への低下を示した(図13)。これらのデータは、pH 5.5未満のクエン酸塩バッファー化製剤は低安定化性であるが、pH 5.5またはそれ以上の製剤では安定化することを示している。
【０３３３】
7.3.8  クエン酸塩バッファーの濃度
pH 5、6および7でのクエン酸塩濃度の効果を、pH 5、6および7でのそれぞれ10 mM、20 mM、30 mMまたは50 mMクエン酸塩バッファーにmAb原溶液を透析することによって試験した。図14にプロットした結果は、pH 5では、クエン酸塩濃度が増加するにつれて、4時間のインキュベーションで、約15%から22%の純度の損失パーセントを示し、高濃度のクエン酸塩は低安定化性であることを示している。しかし、pH 6および7では、通常のバッファー範囲でクエン酸塩はすべての濃度でより安定化性であって、10 mM、pH 6で約6%の純度の損失、そして50 mM、pH 7ではわずか約1%の純度の損失を示した。上に見られるように、pH 5.5より上のクエン酸塩バッファー化製剤は安定化性である。その上、通常のバッファー濃度範囲(10〜50 mM)では、クエン酸塩濃度の増加が、凝集の減少について有利である。
【０３３４】
7.3.9  クエン酸塩と選択した賦形剤の併用効果
トレハロース、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、コハク酸塩、またはリン酸塩と併用する、賦形剤としてのクエン酸塩の効果を試験した。これらの研究のため、上記のmAb原溶液(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)に、最終濃度20 mMのクエン酸塩および/または最終濃度35 mMのその他の賦形剤を添加した。各サンプルについて、4時間のインキュベーションでの純度の損失パーセントを図15にプロットする。クエン酸塩単独では約3.3%の損失を示したが、一方それぞれトレハロース、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、コハク酸塩およびリン酸塩について、3.5%、4.4%、8.5%、4.6%、4.5%、4.0%、3.4%および0.6%の純度の損失が見られた。これらの濃度でのクエン酸塩とヒスチジンの組み合わせは幾分拮抗性であって、クエン酸塩単独よりも純度の損失パーセントの軽度の増加の結果となった(約3.3%対約4.3%)が、その他の組み合わせはクエン酸塩単独よりも純度の損失の減少結果となり、製剤として考慮されよう。相対的順位はリン酸塩(約0.5%)>トレハロース(約1.3%)>アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩およびコハク酸塩(それぞれ約1.75%から約1.85%)であることがわかった。ここで「>」は「より高い安定化効果」を意味している。
【０３３５】
7.4  実施例４
ファストスクリーンアッセイによって分析したDOE
クエン酸塩、アルギニンおよびトレハロースの併用効果の全数予測検定(exhaustive predictive testing)を実施するため、当初の研究に基づいて、Design-Expert(Stat-Ease, Inc., Minneapolis、MN)ソフトウェアを使用して、一連の実験を計画した。Design-Expertによって教示されているようにして、20溶液を調製し、40℃で4時間インキュベートし、そして上記のようにSECによって分析した(実施例1参照)。結果(凝集%)をDesign-Expertにインプットし、二次方程式に適合させた。この方程式を使用して作製した理論上の応答曲線を図16-17に示す。
【０３３６】
図16Aおよび16Bは、クエン酸塩およびアルギニンの各種濃度の効果についての応答曲線のプロットである。クエン酸塩の効果は、アルギニンが存在しないときに最も劇的で、アルギニンが高濃度で存在するときに、最小である。曲線の大きな曲率は、クエン酸塩濃度を10から50 mMに増加させたときの凝集に対する強い効果と、クエン酸塩を50-60 mM以上の濃度に添加したときの凝集に対する効果の減少を示している。クエン酸塩濃度が低いとき(<50 mM)、アルギニン濃度の増加が非常に有益であるが、クエン酸塩濃度が高いとき(50 mMより上)は、最小の効果しかない。クエン酸塩およびトレハロースの各種濃度の効果についての応答曲線は、すべてのクエン酸塩濃度で、トレハロースが強力な安定化効果を持つことを示している(図17)。
【０３３７】
7.5  実施例５
Medi3-V3についての製剤安定性アッセイ
上記のパイロット研究に基づく2つの特定の製剤中に、Medi3-V3を濃度10、25、50または100 mg/mLで製剤化して、上記のようにSEC分析によって、4℃、25℃および40℃での経時的安定性をモニターした。製剤1(50 mMクエン酸塩、10%トレハロース、pH 6.5)の各濃度のMedi3-V3について、存在するモノマーの経時的パーセントを図18A、BおよびC(それぞれ4℃、25℃および40℃)に、製剤2(25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、8%トレハロース、pH 6.5)については図19A、BおよびC(それぞれ4℃、25℃および40℃)に、プロットする。4℃および25℃の両方で7日後に、製剤1および2の各濃度の抗体について、モノマーパーセントは1%未満の低下であった(図18A-Bおよび19A-Bの比較)。40℃では、モノマーパーセントは、製剤1で最高の抗体濃度で3%近く、また製剤2で最高の抗体濃度では14%以上低下したが、これらの製剤は、同一の期間にモノマーパーセントが32%近くの低下を示した対照バッファー(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)よりも、Medi3-V3の安定性を大きく強化した(図2A参照)。4℃で保存したとき、90日近くで、製剤1および2の両方の各抗体濃度について、モノマーパーセントは1%またはそれ以下の低下であり、25℃で保存したときは、各抗体濃度について4%またはそれ以下の低下であって、最高の抗体濃度では、製剤1が製剤2よりも25℃でわずかに良好な安定性を示した。40℃でほぼ90日後、いずれの製剤でも各濃度で、モノマーパーセントが約30〜60%低下した。しかし、上記のように、同様のインキュベーション時間で、両製剤が対照バッファーよりも有意な安定化を提供した(18C、19Cおよび図2A、7および15日目の比較)。図21は、Medi3−V3およびMedi2-V3について、40℃で0日および3日後に、各製剤中に存在する凝集パーセントのプロットである(詳細について下記参照)。これらのデータは、同様の変異Fc領域を持ついずれの抗体についても、特定の製剤が凝集を低下させるのに有用であることの知見を支持している。
【０３３８】
7.6  実施例６
Medi2-V3についての製剤安定性アッセイ
Medi2-V3を、対照バッファー(10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0)、製剤1'(50 mMクエン酸塩、10%トレハロース、pH 6.0)または製剤2'(25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、8%トレハロース、pH 6.0)中に80 mg/mLで製剤化し、上記のようにSEC分析によって、40℃で72時間の経時的安定性をモニターした。対照バッファーのモノマー%は72時間で約23.6%の低下が見られたが、それぞれ製剤1'および2'では低下はわずかに5%および7.4%であった(図20)。これらのデータは上記のものと一致しており、製剤1'および2'の両方が、高濃度(80〜100 mg/mL)および高温度(25〜40℃)でも、Medi2-V3の安定性を対照バッファーよりも大きく強化したことを示している。図21は、Medi2−V3およびMedi3-V3について、40℃で0日および3日後に、各製剤中に存在する凝集パーセントのプロットである(詳細について下記参照)。これらのデータは、同様の変異Fc領域を持ついずれの抗体についても、特定の製剤が凝集を低下させるのに有用であることの知見を支持している。
【０３３９】
7.7  実施例７
Medi3-V3の製剤安定性アッセイ
バッファーとしてアニオン、クエン酸塩を使用する研究を拡張するため、100〜200 mMクエン酸塩と10〜15%トレハロースの組み合わせ、pH 6.0または6.5を含有する製剤も試験した。100 mMクエン酸塩、pH 6.0の100 mg/mlのMedi3-V3を、表4に示す製剤(製剤A-Dに相当)に透析し、体積を調整して、最終抗体濃度50 mg/mLまたは100 mg/mLとなるようにした。ホウケイ酸塩ガラスバイアル中で2〜8℃、23〜27℃および38〜42℃での長期安定性をモニターするため、製剤安定性プロトコルを開始した。10 mMヒスチジン、pH 6.0中で約50 mg/mLで製剤化した野生型Medi2抗体をこれらの研究のための対照製剤とした。0、7、15、21、28および63日目に、凝集パーセント、モノマーおよびフラグメントをSECによって測定した(上記の通り)。その上、0および28日目にIECによって、荷電変異の変化(ピーク前の%)を測定した。
【０３４０】
38〜42℃で28日まで維持したサンプルについての代表的なデータを図22A-Dに示す。サンプルについての経時的凝集パーセントのプロット(図22A)は、製剤BおよびDは安定な野生型抗体について見られるものと非常に近い凝集プロフィルを持ち、28日目、最終凝集%が、対照製剤について見られる1.8%に比較して、それぞれわずかに2.48%および2.87%であることを示している(表5)。同様に、製剤BおよびDは、モノマー損失%が対照についての4.6%に比較して、それぞれわずかに3.61%および4.58%である(図22Bおよび表5)。その上、バッファーpHを6.0から6.5に上昇させることによって、改善されたプロフィルが観察された(製剤AおよびDの比較、表5)。この改善は、抗体の濃度を考慮に入れるとさらに強調される。なぜならば、MedI3-V3の濃度は安定性が低い製剤A(pH 6.0)で50 mg/ml、そしてより安定な製剤D(pH 6.5)で100 mg/mlであり、以前の研究から、MedI3-V3の凝集は抗体濃度とともに増加することが示されているからである(例えば、図4参照)。50 mg/mLの濃度では、製剤Bの性能は製剤Aよりもよかったが、100 mg/mLでは製剤Dの性能が最良であった。これらの傾向は、63日目のサンプルでも観察された(表5および、非掲載データ)。製剤A-D(図22C)間でフラグメントレベルの差異は見られなかった。
【０３４１】
興味深いことに、23〜27℃および2〜8℃の両方で、すべての製剤が対照よりも安定性がよく(表5および非掲載データ)、これらの製剤がより効果的に野生型抗体を安定化しうることを示唆している。これらの温度で、製剤A、Bのプロフィルはほぼ同一であり、凝集速度は2〜8℃で0.01未満および23〜27℃で0.1未満である。38〜42℃で観察されたものとは反対に、製剤Cの性能が製剤Dよりも良好であった。
【０３４２】
高pH側ではアミド分解が加速されるものとみられるので、IECを使用して、40℃で製剤A-D中の抗体の荷電の何らかの変化をモニターした。ピーク前レベルは、アミド分解などの過程による荷電変異の変化を示するものである。図22Dに示すように、製剤A-D中、40℃でのインキュベーションによって生成した荷電変異のレベルには差異がなく、pHの6.0から6.5への上昇がそれ以上の荷電変異の産生を誘発しないことを示している。
【０３４３】
これらのデータは、V3様抗体が、広範囲の温度(2〜42℃)で、製剤A(100 mMクエン酸塩、15%トレハロース、pH 6.0)中で効果的に安定化されることを示すものである。高温側(38〜42℃)では、製剤AおよびDが同等であり、一方低温側(2〜27℃)では製剤AおよびBが同等であった。これらのデータは、高濃度のトレハロース(>10%)を含み、かつ高pH(>6.0)側の製剤が、高温側で、MedI3-V3、および同様の変異Fc領域を持つ抗体の安定性プロフィルを改善することも示している。この研究は図14に示したデータとともに、高温側では少なくとも6.5〜7.0またはさらに高いpHが凝集プロフィル、したがって、V3様抗体の全体としての安定性を改善することができたことを示している。一方、低温側では、クエン酸塩および低pH(約6.0)が改善された安定性を提供する。
【表４】
2009525986.tif 000006
【表５】
2009525986.tif 000007
【０３４４】
7.7.1  方法
イオン交換クロマトグラフィー: カラムはProPac WCX-10 4x250 mm分析用カラム、Dionex Cat# 54993。バッファーは以下とした: A - 20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0およびB - 20 mMリン酸ナトリウム、100 mM塩化ナトリウム、pH 7.0。サンプルをバッファーAに3μg/μLに希釈することによって調製し、各サンプル25μLを注入して、75μgの注入サンプルとした。溶出勾配は以下とした:
時間       % バッファーB
0分             20%
5分             30%
45分            60%
45.1分          90%
50分            20%
ピークは典型的には10〜40分に溶出した。タンパク質の溶出は220 nmでの吸収によってモニターした。
【０３４５】
7.8  実施例８
各種バッファーでの溶融温度分析
上で証明したように(実施例1)、V3様抗体中のCH2ドメインの溶融温度は低い方である。製剤がV3様抗体のTmにどのような影響を与えるかを調べるため、10 mMヒスチジン、pH 6または100 mMクエン酸塩、15%トレハロース(製剤B)中で製剤化したMedi3-V3(0.5 mg/mL)のTmを、上記のようにDSCによって測定した。図23Aに示すように、Medi3-V3を製剤B中で試験したとき、CH2ドメインのTmは約48℃から約55℃に増加した。同様に、製剤B中のMedi3-V3について、蛍光によるとやはりCH2ドメインの溶融に約10℃の増加が観察され(図23B)、また二次導関数UV-Vis.でのモニターによると、溶融に7℃の増加が観測された(図23C)。これらのデータは、製剤B、およびおそらくその他の安定化する製剤が、少なくとも部分的にはCH2ドメインのTmを増加させるように作用していることを示している。こうして、これらの製剤は、低溶融温度の変異Fc領域を持つ抗体を安定化する、広範な適用性を持つものと見られる。その上、これらの研究は、製剤の抗体全般、特にV3様抗体を安定化する能力を調べるために、DSCが有用な手段であることを示している。
【０３４６】
7.8.1  方法
サンプルの調製: Medi3-V3をWFI中に再構成して、約40mg/mLの濃度とした。続いて3,500 MWCO Pierce透析カセットを利用して、製剤を10mM His、pH 6に透析した。>8時間継続した1-L交換後、サンプルをpHおよび浸透圧について試験して、完全なバッファー交換を確認した。次に、その後の生物物理的研究(DSC、蛍光、およびUV分光法)のため、サンプルを10mM His、pH 6または100mMクエン酸塩、15% Tre、pH 6のいずれかで約0.5mg/mLに希釈した。
【０３４７】
蛍光でモニターした溶融: QuantaMaster(商標)蛍光測定装置(Photon Technologies Incorporated Monmouth, NJ, 75W キセノンアークランプ、Model 810 pmt Detector、およびFeliX32 v. 1.0操作ソフトウェア)によって、蛍光放出スペクトルを採取した。トリプトファン放出スペクトルを295nmの励起で305-450nmから採取した。放出スペクトルは、10〜85℃の温度範囲で、0.5mg/mL MEDI-531サンプルを各温度に5分維持した後、採取した。相対的放出強度は、試験温度で329nmで採取した強度を同一の波長および10℃で採取した値で割ることによって、算出した。
【０３４８】
二次導関数UV-Vis.でモニターした溶融: UV吸収研究のために、Agilent 8453ダイオードアレイUV-Visible分光光度計(Palo Alto、CA)を使用した。温度を10から85℃に増加させながら、1-cm光路セル中、各温度で5分、0.5mg/mL MEDI-531溶液をインキュベートした後、25-二次吸光スペクトルを採取した。スペクトルを、温度を増加させながら、芳香族アミノ酸の二次導関数ピーク位置のシフトについて、分析した。二次導関数スペクトルは、第5級(fifth degree)Savitzky-Golay polynomial、9-データポイントフィルター長ウィンドウに基づき、三次関数に適合させた算出によって取得した。最後に、各1ナノメーターのデータポイント間の99の内挿ポイントを使用するスプラインによって、0.01 nm分解した二次導関数スペクトルを取得した。生成した二次導関数スペクトルはおよそ0.01 nmの理論上のピーク分解能を持っていた。温度上昇にともなう三次構造の変化の指標として、250と300nmの間で芳香族残基の陰性ピーク位置をモニターした。
【０３４９】
7.9  実施例９
凝集を増加させ得る賦形剤
上記のように、システインは凝集を増加させることが見られた。この効果をさらに明らかにするため、Medi3-V3およびMedi2(野生型Fc領域を持つ)を、50 mMシステインの存在または不存在中、37℃で16時間インキュベートし、加熱をしない非還元SDS-PAGEおよびSECによって、分析した。37℃でインキュベートしなかった対照サンプルも分析した。システインとともにインキュベートした両抗体サンプルは、SDS-PAGEにかけると、分離された重鎖および軽鎖に分解される(図24A、レーン 1および4)。その上、各抗体+システインサンプル中には少量のフラグメント化物が存在し、またMedi3-V3+システインには、少量の共有結合凝集が存在することがわかる(図24A、星印)。同一のサンプルをSECによっても分析した(図24B-C)。Medi3-V3対照サンプルおよび-システインサンプルはほとんど凝集を示さない(図22B、上段および中段)が、+システインサンプルにはほとんどモノマーが存在せず、ほぼ完全に凝集として流出した(図24B、下段)。対照的に、Medi2サンプルは、一定の低量の定常凝集(約1から1.4%)を示し、それは+システインサンプル中でも増加しなかった(図24C、3つのプロフィル全部の比較)。両抗体は、システインとのインキュベーション後、フラグメントの軽度の増加を示し、Medi3-V3では0.4%から1.6%に増加し、そしてMedi2では0.4%から0.8%に増加した。これらのデータを合わせて、システインは非共有結合性凝集を増加させ、またV3Fc領域を持つ抗体のフラグメント化を増大させるが、野生型Fc領域を持つもののフラグメント化は増大させないことが示される。
【０３５０】
7.10  実施例１０
Medi3-V3の凍結乾燥製剤の安定性
Medi3-V3を、表6に示す製剤の1つに製剤化した。これらの実験のため、凍結乾燥前バルクを製剤化して、以下の1つに再構成できるようにした:
i)  WFI 1 mLに充填量の1/2までのバルク。バルク液体薬物中の全成分の最終濃度が当初の濃度のほぼ200%になるようにする。
ii)   WFI 3 mLにバルク液体薬物中の全成分の最終濃度が当初の濃度のほぼ75%になるようにする。
【表６】
2009525986.tif 000008
【０３５１】
以下に記載する条件でサンプルを凍結乾燥した。凍結乾燥サンプルを2〜8℃、23〜27℃、および38〜42℃で保存し、ICHガイドラインに対応する時間毎に試験した。凍結乾燥後の再構成時の純度の損失は最少であるか、または全くなかった(表7参照)。38〜42℃(40℃と称する)のインキュベーション後、純度の損失は液体製剤に比較して最少であり(表7)、予備凍結乾燥製剤も固体状態で安定化されることを示している。
【表７】
2009525986.tif 000009
【０３５２】
凍結乾燥: バイオセーフティキャビネット内で、製剤化したMedi3-V3を5ccバイアルに2.3〜2.4 mLで充填し、部分的に栓をした。このバイアルをトレー上、六角最密配置にして、Virtis Genesis凍結乾燥機の棚に置いた。凍結乾燥サイクルは以下のステップで構成した:
1)  大気圧下、5〜20℃のバイアルで開始、
2)  「凍結ステップ」、0.5℃/分で-40℃までの温度傾斜、
3)  40℃で120分維持、この間真空度を125 mTorrまで低下、かつコンデンサー温度を-60℃に低下、
4)  -10℃〜-20℃までの傾斜温度、初期乾燥期間(44時間)中、この温度に維持、そして
5)  25℃で10〜18時間の二次乾燥。
【０３５３】
その後凍結乾燥機に乾燥窒素ガスを600〜700 Torrの圧力まで再充填し、凍結乾燥機の油圧系統を使用してバイアルを密栓した。次にチャンバーを通気して、バイアルを取り出した。
【０３５４】
本発明の特定の実施形態を説明の目的で上に記載してきたが、当業者は、添付する特許請求の範囲に記載された発明から離れることなく、詳細について多数の変更をすることができることを理解できるはずである。
【０３５５】
本明細書中に示したすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願が特定的かつ個別に参照として本明細書中に組み込まれることを指示するのと同程度に、参照として本明細書中に組み入れるものである。その上、以下の米国特許仮出願: 60/764,750(2006年2月3日受理)および60/825,231(2006年9月11日受理)の全部をすべての目的のために、本明細書中の参照として、本明細書に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３５６】
【図１Ａ】抗EphA2抗体Medi3の重鎖(VH)の可変領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列。下線部: CDR(Kabat定義)。Medi3 VH(配列番号: 1-2) ;配列番号はそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【図１Ｂ】抗EphA2抗体Medi3の軽鎖(VL)の可変領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列。下線部: CDR(Kabat定義)。Medi3 VL(配列番号: 3-4) ;配列番号はそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【図１Ｃ】抗インテグリンαvβ3抗体Medi2の重鎖の可変領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列。下線部: CDR(Kabat定義)。Medi2 VH(配列番号: 5-6) ;配列番号はそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【図１Ｄ】抗インテグリンαvβ3抗体Medi2の軽鎖(VL)の可変領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列。下線部: CDR(Kabat定義)。Medi2 VL(配列番号: 7-8);配列番号はそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【図２Ａ】「V3」Fc変異体は非共有結合凝集を増加させる。パネルAは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中で製剤化し、40℃で保存した場合の、時間経過についての、抗EphA2抗体Medi3、Medi3-V1、Medi3-V3および抗インテグリンαVβ3抗体Medi2の100 mg/mL溶液に存在する%モノマーのプロットである。Medi3-V3溶液のモノマーのパーセントは、野生型Fc領域を持つ別の抗体のモノマーのパーセントが貯蔵の3ヶ月後に約15%しか低下しないのに比較して、14日後に40%近く減少する。
【図２Ｂ】パネルBは、凝集がないもの(レーン4)または30%凝集があるもの(レーン5)の2つのMedi3-V3のサンプルのクマシー染色した非還元PAGE分析である。いずれのサンプルも共有結合凝集を何ら示さない。
【図２Ｃ】パネルCは、最初に40℃でインキュベートし、以下のいずれかの処置: すなわち、4℃で4および20時間のインキュベーション(三角); 10 mg/mlに希釈し、4℃で4および20時間のインキュベーション(四角); 20 mMクエン酸塩バッファーに10 mg/mlに希釈し、4℃で4および20時間のインキュベーション(黒三角)、をした後の、10 mMヒスチジン中のMedi3-V3の80 mg/ml溶液の凝集の低下%を示すSEC分析である。
【図２Ｄ】パネルDは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中で製剤化し、40℃で保存した場合の、抗インテグリンαVβ3抗体Medi2およびMedi2−V3の100 mg/mL溶液に存在するモノマーの経時的パーセントである。モノマーのパーセントは40℃で2ヶ月半後の低下が10%未満であるが、一方Medi2-V3は40℃で1週間未満で約22%の減少を示す。
【図３Ａ】Fc変異領域は低下したTm値を持つ。パネルA) 野生型Medi3ならびに2つのFc変異体、Medi3-V1およびMedi3-V3のDSCスキャンを示す。矢印は、それぞれ約59℃および49℃でのMedi3-V1およびMedi3-V3のFc領域のCH2ドメインについて、溶融温度ピークが低いことを示している。約72℃で、野生型Medi3抗体の溶融温度は可変領域について見られる大きなピークとオーバーラップしている。
【図３Ｂ】パネルB) 野生型Medi2およびMedi2-V3のDSCスキャンを示す。矢印はMedi2-V3のFc領域のCH2ドメインについてのTmピークを示している。Medi3-V3についてのTmは約47℃であり、これはMedi3-V3について見られる約49℃のTmに非常に近い。
【図４】Medi3-V3の凝集は濃度依存性である。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に、40℃で保存したMedi3-V3の10、50および100 mg/mL溶液についての経時的モノマーパーセントのプロット。10 mg/mL溶液について37日目に5%の減少、ならびに50 mg/mLおよび100 mg/mL溶液についてそれぞれ、丁度15日後に15%および37%の減少を示している。
【図５】Medi3-V3の凝集は温度依存性である。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に、4、25および40℃で保存したMedi3-V3の100 mg/mL溶液についての経時的モノマーパーセントのプロット。40℃でインキュベートした溶液について15日間で約37%の減少、ならびに4℃および25℃でインキュベートした溶液について30日間で5%未満の減少を示している。
【図６】スクロース（ショ糖）、トレハロースおよびアルギニンはMedi3-V3を安定化する。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0プラス以下: 10%スクロース（ショ糖）、10%トレハロースまたは200 mMアルギニンの賦形剤の1つの中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で7時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。各賦形剤は、対照(賦形剤無し)での約9%から2%未満の損失まで低下させたことを示している。
【図７Ａ】高濃度の糖の方がより効果的に安定化する。パネルAは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0プラス賦形剤として0、1、5または10%の糖(スクロース（ショ糖）またはトレハロース)中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で24時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。それぞれ19%、16%、9%および3%のの損失パーセントを示している。2種の糖の効果は同程度であった。
【図７Ｂ】パネルBは、25 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0プラス賦形剤として0、5、10または20%の糖(トレハロースまたはマンニトール)中で製剤化したMedi3-V3の50 mg/mL溶液の、40℃で24時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。それぞれ8.4%、4%、2%および0.6%の損失パーセントを示している。2種の糖の効果は同程度であった。
【図８】カチオン性アミノ酸およびアニオン性物質は安定化性である。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0プラス最終濃度0、50、200 および/または400 mMの、アルギニン、リシン、グリシン、システイン、クエン酸塩またはDTPAの賦形剤の1つの中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で24時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。試験した濃度では、システインまたはDTPAのいずれも損失パーセントの低下に効果的ではなかったが、その他の賦形剤はクエン酸塩>リシン>アルギニン>グリシンの相対的順番で、損失パーセントを低下させた。
【図９】5%のスクロース（ショ糖）およびアルギニンの併用がより効果的である。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に賦形剤を含まないか、5% スクロース（ショ糖）、200 mMアルギニンまたは5%スクロース（ショ糖）と200 mMアルギニンの両方を含むもので製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で24時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。それぞれ19%、9%、3.5%および1.5%の純度の損失パーセントを示している。
【図１０Ａ】カチオン性アミノ酸およびアニオン性物質は安定化性である。パネルAは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に賦形剤を含まないか、トレハロース(最終10%)、リシン、アルギニン、ヒスチジン、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硫酸塩、セリン、フェニルアラニン、アラニン、EDTAまたはDTPA(それぞれ最終50 mM)を含むもので製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で19時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロットである。それぞれ約22%、5.5%、15.5%、16%、16%、15%、2%、10%、6%、9%、11%、<1%、10%、17%、26%、18%、20%および24%の純度の損失パーセントを示している。
【図１０Ｂ】パネルBは、25 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中に賦形剤を含まないか、100 mM、200 mMまたは300 mMのクエン酸塩、アスパラギン酸塩、アルギニンまたはリン酸塩を含むもので製剤化したMedi3-V3の50 mg/mL溶液の、40℃で24時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロットである。クエン酸塩は、対照中の約8.4%から、100 mMで約1.4%に、ならびに200 mMおよび300 mMの両方で約0.8%に純度の損失パーセントを低下させた。リン酸塩100 mMで約1.8%に、ならびに200 mMおよび300 mMの両方で約1.0%に純度の損失パーセントを低下させたが、一方アルギニンは100 mMで約6.0%、ならびに200 mMおよび300 mMの両方で約4.8%に純度の損失パーセントを低下させたのみであった。
【図１１Ａ】低濃度のトレハロースおよびクエン酸塩の方が安定化する。パネルAは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中に賦形剤を含まないか、トレハロース(最終10%)、アルギニン、リシン、クエン酸塩(それぞれ最終50 mM)またはトレハロースとアルギニン、リシンもしくはクエン酸塩との組み合わせを含むもので製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で19時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロットである。試験した濃度では、クエン酸塩とトレハロースの組み合わせのみが併用効果を示し、トレハロースのみについて約7%またはクエン酸塩のみについて約2%に低下させたことに比較して、純度の損失パーセントをわずかに約1%に低下させた。
【図１１Ｂ】パネルBは、100、200または300 mMリン酸塩またはクエン酸塩と5、10または20%トレハロースまたはマンニトールとの組み合わせを含むものでpH 6.0で製剤化したMedi3-V3の50 mg/mL溶液の、40℃で1週間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロットである(詳細については表3参照)。100 mMクエン酸塩、20%トレハロース; 100 mMクエン酸塩、20%マンニトール；および300 mMクエン酸塩、20%トレハロース製剤が1%またはそれ以下の純度の損失を示し、安定な抗体(0.6%)で見られるものに匹敵した。残りの製剤は1%より大きい純度の損失を示した。
【図１２】クエン酸塩はヒスチジンよりも強力な安定剤である。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0に25、50、100および200 mMのクエン酸塩を含むもの、または10 mMクエン酸塩バッファー、pH 6.0に0、25、50および100 mMのヒスチジンを含むもので製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で19時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。試験した各濃度のクエン酸塩がヒスチジンよりも強力な安定化効果を持つことを示している。
【図１３】pH 5.5およびそれ以上が安定化性である。50 mMクエン酸塩バッファー、pH 3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7および8中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で4時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。損失パーセントは5.5未満のpH値で劇的に増加し(21%から90%に)、5.5またはそれ以上のpH値で (6%から1%に) 減少することを示している。
【図１４】標準的バッファー濃度のクエン酸塩は凝集を低下させる。10、20、30または50 mMクエン酸塩、pH 約5、6または7中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で4時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。pH 6および7では試験したすべての濃度について、純度損失%は約6%未満であり、pH 5では、クエン酸塩が安定化しなかったことを示している。
【図１５】クエン酸塩と特定のアミノ酸またはアニオン性物質の併用が安定化する。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中、20 mMクエン酸塩、35 mMトレハロース、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、コハク酸塩またはリン酸塩単独および20 mMクエン酸塩との併用で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で4時間のインキュベーションについて、純度の損失パーセントのプロット。クエン酸塩単独について3.3%の純度損失、およびヒスチジン以外との各種併用についてより少ない純度損失パーセント(約0.5%〜約1.85%)を示している。
【図１６Ａ】コンビナトリアル配合効果のマッピング。パネルAは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0、10%トレハロース、濃度0、50、100、150および200 mMのアルギニン(Arg)ナカデ製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で4時間のインキュベーションについて、理論上の凝集パーセント曲線をプロットしている。
【図１６Ｂ】コンビナトリアル配合効果のマッピング。パネルBは、10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0、10%トレハロース、濃度10、25、50、75および100 mMのクエン酸塩(cit)中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で4時間のインキュベーションについて、理論上の凝集パーセント曲線をプロットしている。
【図１７】トレハロースはすべてのクエン酸塩濃度で強力な安定化効果を持つ。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0、100 mMアルギニン、濃度が10、25、50、75のクエン酸塩(cit)ならびに0〜10%の濃度のトレハロース中で製剤化したMedi3-V3の80 mg/mL溶液の、40℃で4時間のインキュベーションについて、理論上の凝集パーセント曲線をプロットしている。
【図１８Ａ】製剤1はMedi3-V3の安定性を顕著に改善する。50 mMクエン酸塩、10%トレハロース、pH 6.5中で製剤化し、4℃(パネルA)で約90日間インキュベートした、Medi3-V3の10、25、50または100 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中の製剤に比較して、モノマーパーセントの減少が少ないことを示している(図2A参照)。
【図１８Ｂ】製剤1はMedi3-V3の安定性を顕著に改善する。50 mMクエン酸塩、10%トレハロース、pH 6.5中で製剤化し、25℃(パネルB)で約90日間インキュベートした、Medi3-V3の10、25、50または100 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中の製剤に比較して、モノマーパーセントの減少が少ないことを示している(図2A参照)。
【図１８Ｃ】製剤1はMedi3-V3の安定性を顕著に改善する。50 mMクエン酸塩、10%トレハロース、pH 6.5中で製剤化し、40℃(パネルC)で約90日間インキュベートした、Medi3-V3の10、25、50または100 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中の製剤に比較して、モノマーパーセントの減少が少ないことを示している(図2A参照)。
【図１９Ａ】製剤2はMedi3-V3の安定性を顕著に改善する。25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、8%トレハロース、pH 6.5中で製剤化し、4℃(パネルA)、25℃(パネルB)または40℃(パネルC)で約90日間インキュベートした、Medi3-V3の10、25、50または100 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中の製剤に比較して、モノマーパーセントの減少が少ないことを示している(図2A参照)。
【図１９Ｂ】製剤2はMedi3-V3の安定性を顕著に改善する。25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、8%トレハロース、pH 6.5中で製剤化し、25℃(パネルB)で約90日間インキュベートした、Medi3-V3の10、25、50または100 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中の製剤に比較して、モノマーパーセントの減少が少ないことを示している(図2A参照)。
【図１９Ｃ】製剤2はMedi3-V3の安定性を顕著に改善する。25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、8%トレハロース、pH 6.5中で製剤化し、40℃(パネルC)で約90日間インキュベートした、Medi3-V3の10、25、50または100 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0中の製剤に比較して、モノマーパーセントの減少が少ないことを示している(図2A参照)。
【図２０】2種の製剤はMedi2-V3の安定性を顕著に改善する。10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0(対照バッファー)、50 mMクエン酸塩、10%トレハロース、pH 6.0(製剤1')または25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、8%トレハロース、pH 6.0(製剤2')中で製剤化し、40℃で72時間インキュベートした、Medi2-V3の80 mg/mL溶液についての、経時的モノマーパーセントのプロット。両方の製剤1'および2'が劇的に安定性を改善することを示している。
【図２１】同一の変異Fc領域を持つ異なるエピトープを認識する抗体は同一の製剤によって安定化される。40℃で0時点および3日後の、Medi2-V3およびMedi3-V3の異なる製剤に存在する凝集パーセントのプロット。両抗体は10 mM His、pH6中で製剤化した(His)とき、3日後に約23%の凝集がある。10%トレハロース、50 mMクエン酸塩、pH 6(Tre/Cit)、または、8%トレハロース、25 mMクエン酸塩、200 mMアルギニン、pH6中で製剤化した(Tre/Cit/Arg)とき、両抗体は2種の製剤について、凝集パーセントがそれぞれ約4%および約8%に大きく低下する。
【図２２Ａ】ヒスチジンを含まない特定のクエン酸塩/トレハロース製剤はMedi3-V3を安定化する。4種のクエン酸塩/トレハロース製剤(表4参照)に製剤化したMedi3-V3の凝集パーセント、モノマー損失パーセント、断片化パーセントおよび荷電変化を、40℃で1ヶ月(28日)にわたるインキュベーションで判定した。これらの研究で、10 mMヒスチジン、pH 6.0中で製剤化したMedi2を対照として使用した。パネルAは、凝集パーセントのプロットであり、28日後、対照は1.8%凝集であったが、一方製剤A、B、CおよびDのMedi3-V3はそれぞれ4.18、2.48、6.14および2.87%凝集であった。
【図２２Ｂ】パネルBはモノマー損失パーセントのプロットであり、28日後、対照はモノマー損失が4.6%であったが、製剤A、B、CおよびDのMedi3-V3はモノマー損失がそれぞれ5.9、3.61、8.37、4.58%であった。
【図２２Ｃ】パネルCはフラグメントパーセントのプロットであり、製剤A-D間ではほとんど差異が見られなかった。
【図２２Ｄ】パネルDは荷電変化(ピーク前の%)のプロットであり、製剤A-D間に何ら差異が見られなかった。
【図２３Ａ】製剤BはMedi3-V3のCH2ドメインのTmを上昇させる。Medi3-V3を10 mM His、pH 6.0(実線)または製剤B(点線)のいずれかで0.5 mg/mLに製剤化し、CH2ドメインのTmを測定した。パネルAはDSCスキャンであり、10 mM His、pH 6中のCH2ドメインについて、溶融ピーク温度は約48℃であったが、バッファーBでは約55℃に移動した。
【図２３Ｂ】パネルBは温度に対する329 nmでの蛍光発光強度のプロットであり、矢印はCH2ドメインの溶融と一致する遷移を示している。製剤BのMedi3-V3のCH2ドメインの溶融温度は約10℃上昇している。
【図２３Ｃ】パネルCは2階微分UV-Visでモニターした溶融のプロットであり、矢印はCH2ドメインの溶融と一致する遷移を示している。製剤B のMedi3-V3のCH2ドメインの溶融温度は約7℃上昇している。
【図２４Ａ】システインはMedi3-V3の凝集を高める。パネルAは、Medi3-V3(レーン1-3)およびMedi2(レーン4-6)のクマシー染色非還元PAGEゲルであって、50 mMシステイン(レーン1および4)の存在下、システインの不在下(レーン2および5)、37℃で16時間インキュベートしたもの、および、37℃でインキュベートしなかった対照サンプル(レーン3および6)である。レーン7は分子量マーカーであり、サイズが示されている。
【図２４Ｂ】パネルBはMedi3-V3のSEC分析であり、50 mMシステインの存在下、37℃で16時間インキュベートしたものはほとんどすべての抗体が凝集し(下段); システインの不在下(中段)および37℃でインキュベートしなかった対照サンプル(上段)では、両者ともほとんどまたは全く凝集しないことを示している。
【図２４Ｃ】パネルCはMedi2のSEC分析であり、50 mMシステインの存在下 (下段)、 システインの不在下(中段) 、37℃で16時間インキュベートしたもの、および、37℃でインキュベートしなかった対照サンプル(上段)で、それぞれわずかに約1〜1.4%の凝集を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【配列表】
2009525986000001.app
【国際調査報告】
2009525986.tif 000056