(57)【要約】  本発明は、有効成分として絡石藤（Ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｉ ｃａｕｌｉｓ）抽出物を含有する炎症性疾患の予防及び治療用医薬組成物に関する。更に詳しくは、本発明の医薬組成物は、アルクチインが絡石藤抽出物に一定範囲で含まれるように規格化されて製剤され、疼痛、急性炎症、急性浮腫、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αの生成、酵素であるＭＡＰキナーゼ及びＮＦκＢの活性の抑制に優れた効果を有するため、関節炎のような炎症性疾患の予防及び治療に有効である。【選択図】図２
2009542634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絡石藤抽出物を含有する炎症疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記炎症疾患は関節炎及び浮腫の中から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
（ａ）水、アルコール及びアルコール水溶液からなる群から選択された溶媒で絡石藤を抽出し、得られた抽出液を濾過する工程、
（ｂ）前記濾液から水層を分離する工程、及び
（ｃ）前記水層を濃縮して可溶性固形物を得る工程と
を含む絡石藤抽出物の製造方法。
【請求項４】
前記濃縮工程（ｃ）は減圧下で行われる、請求項３に記載の絡石藤抽出物の製造方法。
【請求項５】
（ｄ）前記濃縮物をアルコールで懸濁し、得られた懸濁液を遠心分離法により濾過する工程、
（ｅ）前記濾液を減圧下で再濃縮する工程、及び
（ｆ）前記濃縮物を乾燥、粉砕及び滅菌する工程と
を更に含む、請求項３または４に記載の絡石藤抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として絡石藤（Ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｉ ｃａｕｌｉｓ）抽出物を含有する炎症性疾患の予防及び治療用医薬組成物に関する。更に詳しくは、本発明の医薬組成物は、アルクチインが絡石藤抽出物に一定範囲で含まれるように規格化されて製剤され、疼痛、急性炎症、急性浮腫、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びＴＮＦ−αの生成、ＭＡＰキナーゼ（ｐ−ｐ３８、ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＪＮＫ）及びＮＦκＢの活性の抑制に優れた効果を有するため、関節炎のような炎症性疾患の予防及び治療に有効である。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、細菌感染や外傷により関節内で生じた炎症性変化と係る疾病の総称である。このような関節炎は大きく急性関節炎と慢性関節炎の２つに分類される。
【０００３】
急性関節炎は次のようにさらに分類することができる。（１）漿液性関節炎：通常外傷により生じるが、原因不明なものもあり、一般的に１つの関節だけに起きる。（２）漿液線維素性関節炎：急性関節リウマチ関節炎と同時に起き、関節腔内に混濁した滲出液が溜まる。これは偽膜の生成により炎症が治まっても運動障害を引き起こし得る。（３）化膿性関節炎：関節の開放創、または淋疾、腸チフス、しょう紅熱及び敗血症のような伝染病で多発性関節炎が起きる。生後１〜２ヶ月の乳児は、治療不能の骨の損傷により脱臼に発展し得る。成人はしばしば、化膿部がつぶれて膿が関節に入り骨膜骨髄炎に発展するが、これを２次化膿関節炎と言う。
【０００４】
慢性関節炎は次のようにさらに分類することができる。
（１）特殊型炎症：通常、結核性関節炎または梅毒性関節炎、もしくは中年男性に多く発生する尿酸の代謝障害により起こる通風性関節炎と関連する。
（２）多発性関節炎：慢性関節リウマチが大部分である。これは、急性漿液性関節炎から移行したり、肺炎、梅毒及び淋疾の過程で多発性関節炎として起こったり、または敗血症の１種であることもある。その他に、スティル病もこの範疇に属する。
（３）変形性関節炎：通常退行性の老化過程または外傷により起きる。
（４）血友病性関節炎：血友病患者のうち関節内の出血により発生する。
【０００５】
前述した様々な関節炎に代表される炎症性疾患の治療に使用するために多くの薬剤が開発されている。
【０００６】
絡石藤は、キョウチクトウ科に属するテイカカズラ、及びツキヌキニンドウとも呼ばれ、５メートルの高さまで育つ。花びらは５つに深く分岐し、５〜６月に風車の形をした白い花が咲き、とても良い香りを持つ。果実は９〜１１月頃に実り、２つの長い果実は漢字の人という字を想像させ、しばしば腕輪のように丸い円形を作る。実際、絡石藤は韓国の南部地方の海岸、山麓、または荒地に育ち、特に、岩石、壁、またはその他の木や植物に巻きつきながら育つ。絡石藤が多い所では、その他の種類の草が育つことができず、四方が絡石藤で覆われている所もある。北朝鮮で発行された「東洋医学辞典」によると、絡石藤はテイカカズラの茎と葉を乾かしたものである。味は苦く、東洋医学の観点からその性質は冷たい。心経絡、肝経絡、及び腎経絡に作用する。病原因子と混ざり合った風湿を排除し、経絡をスムーズに通すようにする。一方、麻痺症候群、四肢痙攣、腰痛、関節痛、扁桃炎、及び発疹を治療するのに有用である。約５〜１０ｇの絡石藤を煎じて経口投与する。更に、病原因子と混ざり合った風湿による四肢麻痺、筋肉麻痺、屈伸がうまくできない症状の治療に、五加皮（Acanthopanax sessiliflorus（Rupr. et Max.）の乾燥根皮、イノコズチ（Achyranthes bidentata Bl.）の乾燥根を加えたものを使用する。血を冷やすことで、水を用いて煎じた後、経口投与を通して咽喉炎、腫れ物の治療に使用される。
【０００７】
絡石藤の果実は医薬目的として使用する。成熟した果実を採集して、筋骨痛の治療のために６〜１２ｇを煎じて経口投与する。葉及び茎が主に使用される。これらは季節に関わらずいつでも採集することができ、日光で乾燥して細かく刻んだ後、使用する。中国の湖南医学誌（Chinese Honam medicine paper）によると、アルコール飲料に絡石藤３７〜７４ｇを浸して作られた絡石藤の経口投与により筋骨痛を治療することが記されている。Kangseo herbal medicineによると、テイカカズラ３７ｇ、五加皮の外皮３７ｇ及びヒソップ１８．５ｇを水に混合した混合液を白酒と共に煎じて作られた液体生薬を経口投与することで関節炎を治療することが記されている。乾燥させた絡石藤８〜１２ｇを２００ｍＬの水に入れて、体積が約３分の２まで減るまで煎じて液体の生薬を製剤することが好ましい。更に、アルコール飲料に浸けたり、粉末形態にした後、服用することができる。外用時、絡石藤を粉末に粉砕した後、患部に塗ったり、貼ったり、絡石藤の生葉を搗いて作ったエキスで患部を洗う。
【０００８】
絡石藤は、キョウチクトウ科の植物であり、腰痛を治療し、筋骨を丈夫にし、関節をスムーズに動かせる作用がある。絡石藤にはトラケロサイド（ｔｒａｃｈｅｌｏｓｉｄｅ）、アクチイン、マテレシノサイド（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｓｉｄｅ）、アクチゲニン、ノトラケロサイド（ｎｏｔｒａｃｈｅｌｏｓｉｄｅ）などが含まれていることが知られている。絡石藤は、東医宝鑑、郷薬集成方、広済秘笈などの薬草書に簡単な処方が記載されている。しかし、このような処方は、外傷形態による識別方法、東方医学的薬効、及び煎じ薬を製剤する方法を簡潔に言及しているだけである。即ち、絡石藤の有効成分に関する教示はなかった。
【０００９】
更に、絡石藤の生体指標の含量は、最終時期及び産地によって大きく異なるため、絡石藤抽出物の規格化が非常に難しい。また、炎症、疼痛、血液循環の改善、関節炎に対して医療活性が優れている活性分画を再現することは難しいため、その商品化が困難である問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、炎症及び疼痛のような炎症症状、ｐ−ｐ３８ ＭＡＰ及びｐ−ＮＦκＢのような酵素の発現、急性炎症、急性浮腫などに対する抑制活性が優れた特定成分及びその含量の調節による絡石藤抽出物の規格化を達成するための努力の結果完成された。
【００１１】
すなわち、本発明の発明者は、炎症の諸症状に対する抑制活性が優れた活性分画を一定含量含む絡石藤抽出物を容易に再現可能に得ることができ、商品化が可能であることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様において、本発明は、炎症疾患の治療及び予防に有効な絡石藤抽出物を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様において、本発明は、炎症疾患の諸症状に対する抑制活性を有する活性分画用生体指標であるアクチインを一定含量含む絡石藤抽出物を提供する。
【００１４】
本発明の実施形態において、活性成分として炎症疾患の予防及び治療に有用な絡石藤抽出物を含有する医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、絡石藤抽出物の生体指標であるアクチインが３．０〜６．０重量％含有し、炎症疾患の予防及び治療に有用な医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の絡石藤抽出物は急性炎症、ＮＯ及びＴＮＦ−αの生成、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ及びＮＦκＢの活性、及び急性浮腫に由来する疼痛において優れた抑制効果を示し、従って、炎症疾患の予防及び治療において効果的な要素及びその含量を調節することで、絡石藤抽出物の規格化を達成することができる。
【００１７】
更に、本発明の絡石藤抽出物は絡石藤から抽出され、アクチインを生体指標とし、生体指標の含量を調節することで、関節炎の治療用薬剤を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施形態により製造された絡石藤抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】マウスの大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞内でのＬＰＳ誘導によるｉＮＯＳ発現、ＮＯ生成に対する絡石藤の効果を示すものである。
【図３】マウスの大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞内でのｐ−３８及びＮＦκＢのリン酸化反応の活性化に対する絡石藤の効果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を更に詳しく説明する。
【００２０】
本発明は、活性成分であるアクチインが適当量含まれるように規格化され、疼痛、ｐ−ｐ３８ ＭＡＰ及びｐ−ＮＦκＢのサイトカインの発現、急性炎症、急性浮腫に対する抑制活性が著しく発現することで、関節炎のような炎症疾患の予防及び治療に有用な医薬組成物を製剤するのに使用される絡石藤抽出物に関する。
【００２１】
本発明の実施形態により製剤した炎症疾患の予防及び治療用医薬組成物は、有効成分として絡石藤抽出物を含有する。好ましくは、絡石藤は、生体指標としてアクチインを３．０〜６．０重量％含む。
【００２２】
一般に、生理学的な活性物質の含量は、産地、採取時期、保管期間及び保管条件によって大きく異なるため、成分の重量比を制限する代りに、生薬組成物の決定において生薬の特定有効成分の含量を制限することが好ましい。従って、本発明では、絡石藤抽出物を得るためにアルクチインを生体指標として選択した。絡石藤抽出物の分子式はＣ27Ｈ34Ｏ11である。
【００２３】
炎症疾患の治療用薬剤として使用される本発明の絡石藤抽出物は、抽出物自体または絡石藤の抽出により得られた特定活性分画であり得る。ここで、混合比は、絡石藤の含量に関わらず、生体指標であるアクチインの含量により決定されることが好ましい。
【００２４】
即ち、本発明による炎症疾患の治療用薬剤の場合、生体指標であるアクチインの含量が３．０〜６．０重量％で含まれる時、意図する治療効果が得られる。例えば、アクチインの含量が３．０重量％未満の場合、関節炎の治療効果が大きく低下する。アクチインの含量に特別な上限はないが、アクチインの含量が前記範囲を超過すると、意図する治療効果が上がらないだけでなく、技術的及び経済的な面でも好ましくない。従って、アクチインの含量は約４．０重量であることが好ましい。
【００２５】
本発明の生体指標であるアクチインは、炎症疾患の治療用薬剤の絶対不可欠な要素であり、一定量を含有するとき、所定の治療薬が相乗効果を表して優れた薬効を示すのを助ける役割をする。更に、前記有効成分だけでなく治療用薬剤の他の成分は、炎症疾患の治療において優れた薬効を発現することと関連し得る。
【００２６】
炎症疾患の治療に有用な本発明の絡石藤抽出物を製造する方法は、
（ａ）絡石藤の重量に対して５〜８倍の水、アルコールまたはアルコール水溶液で絡石藤を抽出して、冷却及び濾過する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた濾液をアルコール水溶液を使用して層分離した後、６０〜８０℃で減圧濃縮する工程、及び
（ｃ）工程（ｃ）で得られた濃縮物にアルコールを添加し、５００〜１，０００ｒｐｍで遠心分離し、濾液を減圧濃縮した後、真空下で乾燥し、粉砕及び滅菌する工程と、
を含む。
【００２７】
前記方法を下記に更に詳しく説明する。
【００２８】
絡石藤の原生薬を水、アルコールまたはアルコール水溶液に添加し、２〜３時間２〜５回繰り返して抽出を行う。前記抽出物を室温まで徐々に冷却し、遠心分離を通して濾過をして残渣と分離する。前記残渣に、生薬の重量に対して５〜８倍の水、アルコールまたはアルコール水溶液を加えて加熱し、再抽出した後、濾過して以前の濾液と混合した後、濾過する。水、アルコールまたはアルコール水溶液を残渣に加えて再抽出して濾過することにより、抽出効率を高めることができる。ここで、水、アルコールまたはアルコール水溶液の使用量が５倍未満のとき、抽出物の溶解度が低減するため抽出効率が低下する。一方、水、アルコールまたアルコール水溶液の使用量が８倍を超過するとき、アルコールの使用量が増加して減圧濃縮工程が長時間となるため、経済的でなく、取り扱い上の問題が生じる。
【００２９】
本発明のアルコールとしては、脂肪族及び芳香族アルコールが使用され、好ましくは、脂肪族アルコール、更に好ましくは、Ｃ１−Ｃ６の低級アルコールを使用する。
【００３０】
本発明において、１次抽出後、追加して抽出が行われる。これは、効率的な濾過方法を実施しても生薬自体の水分含量が比較的高いため、生薬の大量抽出において発生する抽出物の損失を減少させるためである。更に、抽出効率の分析では、２次抽出にて抽出物全体の約８０〜９０％が得られることを示し、３次以上の多段階抽出は経済的ではないことを示した。
【００３１】
前述した通り、水、アルコールまたはアルコール水溶液で抽出することで得られた抽出物を濾過し、濃縮した後、不純物として濾液に含まれている不必要なタンパク質、多糖及び及び脂肪酸を精製する。本発明において、溶媒として濾液と同一量のアルコール水溶液を使用して２〜５回層分離を行い、溶媒分画を得ることで、不純物を除去した。
【００３２】
前記アルコールはＣ１−Ｃ６アルコールであることが好ましく、３０％エタノールが更に好ましい。低級アルコール溶液の使用量が濾液の使用量より少ない場合、脂肪酸のような不必要な成分により顆粒が形成されるため、層分離が円滑に行われないだけでなく、有効成分の抽出含量が低くなるため経済的ではない。
【００３３】
層分離後に得られた抽出液を６０〜８０℃で減圧濃縮し、残存する溶媒を除去する。その後、得られた濃縮物に減圧濃縮で回収されたアルコールを加え、５００〜１０００ｒｐｍで遠心分離した後に得た濾液を加えて、再び減圧濃縮する。ここで、減圧濃縮温度が６０℃未満の場合、溶媒を完全に除去することができない。一方、温度が８０℃を超えると、濃縮安定性に問題が発生する。濃縮が５００ｒｐｍ未満で行われたとき、濃縮物とアルコールの分離が困難となる。一方、１０００ｒｐｍを超過するとき、濃縮安定性に問題が発生する。
【００３４】
従って、得られた濃縮物を６０〜８０℃の０．０８〜０．３ｐａ下で乾燥し、３０〜８０メッシュのふるいにかけて滅菌した後、粉末状の絡石藤抽出物を最終的に得る。得られた絡石藤抽出物は関節炎などの治療において効果が優れているため、絡石藤抽出物を含有する生薬は関節の保護に有用である。
【００３５】
本発明の絡石藤抽出物は、既存の方法を用いて錠剤、カプセル剤、注射材などに剤形化することができる。錠剤の剤形時に基剤として使用されるラクトース、微細結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウムなどの混合量と絡石藤抽出物を１：１の重量比で使用すると、製造された錠剤は関節炎、浮腫などの炎症疾患の治療に効果的であり、鎮痛効果を有する。
【００３６】
生薬抽出物自体は治療剤として使用されるが、一般的に担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、粉末、顆粒、カプセルまたは注射剤に剤形される。本発明の絡石藤は食用及び薬用として使用されてきた。投与用量に特別な制限はないが、体内吸収度、体重、年齢、性別、健康状態、患者の食餌、投与時間、投与方法、排泄率，疾患の重傷度などにより異なり得る。一般に、体重１ｋｇ当り絡石藤抽出物を約０．１〜１０００ｍｇを投与することが好ましい。
【００３７】
従って、本発明の有効成分を含む組成物はその有効範囲を考慮して製造しなければならず、このように剤形化された単位投与製剤の投与は、必要に応じて監視される。更に、特別な投与は専門家の判断と患者の要求に応じて使用されるか、一定間隔で数回投与され得る。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの実施形態により限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：絡石藤抽出物の製造
絡石藤を水で洗浄して乾燥させ、３０％エタノールを添加した後、攪拌して２時間単位で２回熱湯抽出をした。前記抽出物を室温まで冷却し、遠心濾過を行って不純物を除去した。濾液を混合して６０〜８０℃で減圧濃縮した。濃縮物をエタノール分画から回収されたエタノールと懸濁し、１０００ｒｐｍで遠心濾過を行い、６０℃で減圧濃縮し、０．０８ｐａの圧力下で乾燥させた後、８０メッシュのふるいでふるいをかけて滅菌した。得られた絡石藤にはアクチイン４．０重量％が含まれていた。更に、下記条件で絡石藤抽出物のＨＰＬＣ分析を行った。
１）溶離液：Ａ：５０％エタノール
２）カラム：Ｃ−１８ ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＰＡＣＫＥＤ、１０μｍ、４．６×２５０ｍｍ
３）流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
４）カラム温度：２０℃
５）検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
【００４０】
実験例１：ＴＰＡ誘導によるマウスの耳浮腫試験
実施例１で得られた絡石藤抽出物に対するＴＰＡ誘導によるマウスの耳浮腫への効果を調べた。その結果を下記表１に示す。
【００４１】
［実験方法１］
２４時間絶食させた生後７週のＩＣＲマウスを各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。経口投与１時間後、ＴＰＡ（２．５μｇ／２０μＬ）をアセトンに溶解した後、各マウスに浮腫を誘発させた。実験の間、観察者は実験体を後方から完全に固定し、２次観察者がマイクロピペットを用いて浮腫誘導物質で各マウスの耳を刺激した。４時間後、耳浮腫が各実験群から観察された。頚椎脱臼を通してマウスを犠牲にし、正確な観察を行った。
【００４２】
【表１】
2009542634.tif 000003
【００４３】
前記表１に示すように、本発明の絡石藤抽出物はＴＰＡ誘導による耳浮腫に対して優れた抑制効果を示した。特に、使用した絡石藤抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに浮腫抑制率が最高であった。
【００４４】
実験例２：アラキドン酸誘導によるマウスの耳浮腫試験
実施例１で得られた絡石藤抽出物に対するアラキドン酸誘導によるマウスの耳浮腫への効果を調べた。その結果を下記表２に示す。
【００４５】
［実験方法２］
２４時間絶食させた生後７週のＩＣＲマウスを各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。経口投与１時間後、アラキドン酸（２ｍｇ／２０μＬ）をアセトンに溶解した後、各マウスに浮腫を誘発させた。実験の間、観察者は実験体を後方から完全に固定し、２次観察者がマイクロピペットを用いて浮腫誘導物質で各マウスの耳を刺激した。１時間後、耳浮腫は各実験群から観察された。頚椎脱臼を通してマウスを犠牲にし、正確な観察を行った。
【００４６】
【表２】
2009542634.tif 000004
【００４７】
前記表２に示すように、本発明の絡石藤抽出物はアラキドン酸誘導による耳浮腫に対して優れた抑制効果を示した。特に、使用した絡石藤抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに浮腫抑制率が最高であった。
【００４８】
実験例３：酢酸誘導によるマウスのライジング反応
実施例１で得られた絡石藤抽出物に対する酢酸誘導によるマウスのライジング反応への効果を調べた。その結果を下記表３に示す。
【００４９】
［実験方法３］
２４時間絶食させた生後７週のＩＣＲマウスをジークムント法に基づき各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。経口投与１時間後、０．１ｍＬ／１０ｇの濃度で酢酸（０．７％）を腹腔投与することで、各マウスに腸浮腫を誘発させた。腹腔投与１０分後に、各マウスのストレッチングを観察し、その結果を痛覚指標として使用した。
【００５０】
【表３】
2009542634.tif 000005
【００５１】
前記表３に示すように、本発明の絡石藤抽出物は酢酸誘導によるストレッチングに対して優れた抑制効果を示した。特に、使用した絡石藤抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに酢酸誘導による鎮痛効果に対する抑制効果が優れていた。
【００５２】
実験例４：ＳＤラットの急性関節炎に対する絡石藤抽出物の効果試験
実施例１で得られた絡石藤抽出物の急性関節炎に対する効果を調べた。その結果を下記表４に示す。
【００５３】
［実験方法４］
２４時間絶食させた体重約２００ｇのＳＤラットを各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した後、１％カラギーナン生理食塩水１００μＬを左足底に注射することで、急性足浮腫を誘発させた。３時間後、誘発された浮腫をＰＬＥＴＨＹＳＭＯＭＥＴＥＲ ＬＥ ７５００を利用して測定して分析した。
【００５４】
【表４】
2009542634.tif 000006
【００５５】
前記表４に示すように、本発明の絡石藤抽出物は急性関節炎に対して優れた治療効果を示した。特に、使用した絡石藤抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに治療効果が優れていた。
【００５６】
実験例５：ＮＯ、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αの生成に及ぼす絡石藤抽出物の効果試験
実施例１で得られた絡石藤抽出物の炎症関連因子の治療効果を調べた。その結果を図２に示す。
【００５７】
［実験方法］
マウス由来の大食細胞であるＲａｗ２６４．７細胞株をＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で処理した。２４時間後、培養液を回収し、酸化窒素分析に対するグリース試薬を用いて分析した。４時間後、細胞を溶解し、体内の炎症誘発因子である細胞を誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びＴＮＦ−αの発現に対する絡石藤抽出物の効果をｉＮＯＳまたはＴＮＦ−α抗体を利用してウエスタンブロット法により測定した。
【００５８】
酸化窒素として、２４時間培養液１００μＬをグリース試薬１００μＬと混合し、その吸光度をＯＤ５４０ｎｍで測定した。
【００５９】
ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αとして、Ｒａｗ２６４．７細胞株をＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で処理した。４時間後、細胞を溶解し、全細胞溶解液タンパク質を回収した。タンパク質を電気泳動法により分離した後、ウエスタンブロット法でナイロン膜に転換し、タンパク質の量をｉＮＯＳ及びＴＮＦ−α抗体を利用して分析した。
【００６０】
図２に示すように、絡石藤抽出物はｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αの発現に対する抑制効果を示すだけでなく、ＬＰＳによるＮＯ生成に対する抗炎症効果も優れていることを確認した。
【００６１】
実験例６：大食細胞内のＭＡＰキナーゼ及びＮＦκＢの活性に対する絡石藤抽出物の効果
実施例１で得られた絡石藤抽出物のＭＡＰキナーゼの活性及びＮＦκＢに対する炎症関連因子の抑制効果を調べた。その結果を図３に示す。
【００６２】
［実験方法］ウエスタンブロット分析
絡石藤抽出物で処理したＬＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄した後、溶解緩衝器で３０分間溶解した。溶解液を４℃で１２，０００ｒｐｍの速度で１５分間遠心分離した。上層液をラエムリ緩衝器で２回溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離した後、ニトロセルロース膜に転換した。
【００６３】
１次抗体として、抗ｉＮＯＳ、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦκＢまたはその他の抗体を使用した。
【００６４】
２次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に示される抗体を使用した。
【００６５】
図３に示すように、絡石藤抽出物はｐ３８ ＭＡＰキナーゼ及びＮＦκＢの活性を抑制することが分かった。
【００６６】
実験例７：急性毒性試験
実施例１で得られた絡石藤抽出物１ｇを使用して、絡石藤抽出物１ｇの反復投与により毒性の存在を確認した。１６時間絶食させた生後４〜５週のＩＣＲマウス（１群当り７匹）を実験動物として選定した。
【００６７】
０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に溶解された絡石藤抽出物１ｇを５日間反復して経口投与した結果、斃死したマウス及び臓器が損傷したマウスは見られなかった。
【００６８】
製造例１：錠剤の製造
下記の組成にて絡石藤抽出物を含む経口投与用錠剤を湿式顆粒法及び乾式顆粒法を通して製剤した。
[組成]
絡石藤抽出物                    ２００ｍｇ
軽質無水ケイ酸                    １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム            ２ｍｇ
微細結晶セルロース                ５０ｍｇ
デンプングリコール酸ナトリウム    ２５ｍｇ
ポビドン                          １２ｍｇ
無水エタノール                        適量
【００６９】
製造例２：軟膏剤の製造
下記の組成にて絡石藤抽出物を含む軟膏剤を製剤した。
[組成]
絡石藤抽出物                        ５ｇ
パルミチン酸セチル                ２０ｇ
セタノール                        ４０ｇ
ステアリル・アルコール            ４０ｇ
ミリスチン酸イソプロピル          ８０ｇ
モノステアリン酸ソルビタン        ２０ｇ
ポリソルベート                    ６０ｇ
パラオキシ安息香酸プロピル          １ｇ
パラオキシ安息香酸メチル            １ｇ
リン酸及び精製水                    適量
【００７０】
製造例３：注射剤の製造
下記の組成にて絡石藤抽出物を含む注射剤を製剤した。
[組成]
絡石藤抽出物                    １００ｍｇ
マンニトール                    １８０ｍｇ
第二リン酸ナトリウム              ２５ｍｇ
注射剤用精製水                ２９７４ｍｇ
【００７１】
製造例４：経皮剤の製造
下記の組成にて絡石藤抽出物を含む経皮剤を製剤した。
[組成]
絡石藤抽出物                    １００ｍｇ
ポリアクリル酸ナトリウム          １．３ｇ
グリセリン                        ３．６ｇ
水酸化アルミニウム                ０．００４ｇ
メチルパラベン                    ０．２ｇ
アクリル接着溶液                  １４ｍＬ
【図１】
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【図２】
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【図３】
2009542634.tif 000009
【国際調査報告】
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