(57)【要約】  本発明は、ＧＬＩポリペプチド、特にＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現する癌の診断および治療のための組成物、方法、およびキットを提供する。本発明は、ＧＬＩポリペプチドの転写活性化ドメインを模倣する小分子化合物を提供する。本発明の小分子阻害剤は、ＧＬＩポリペプチドのアクチベーター機能を特異的に遮断するが、ＧＬＩ３のリプレッサー機能を遮断しない。
2009519909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2009519909.tif 000028
［式中、
Ｘ１およびＸ２は、各々独立に、ＮまたはＣであり、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＮであり、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＣであり、環のＮは、Ｘ１およびＸ２のうちのいずれかCであるものと二重結合を形成し、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルからなる群から各々独立に選択され、それらは場合によって、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−ＮＲ７Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）およびＳ（Ｏ）ｍＲ７（下付き文字ｍは、０、１または２である）からなる群からそれぞれ独立に選択される０〜３個のＲ６基で置換されていてもよく、
Ｙは、直接結合であるか、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−ＯＲ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−ＮＲ７Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｒ７、およびＳ（Ｏ）ｍＲ７（下付き文字ｍは、０、１または２である）であり、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、場合によって、Ｙと一緒になって５から６員の複素環を形成し、
Ｒ７は、各々独立にＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］
の小分子化合物、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、異性体およびプロドラッグ。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が各々アリールである、請求項１に記載の小分子化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が各々フェニルである、請求項２に記載の小分子化合物。
【請求項４】
Ｒ４がヒドロキシである、請求項２に記載の小分子化合物。
【請求項５】
ＺがＣ１〜Ｃ４アルキルである、請求項４に記載の小分子化合物。
【請求項６】
Ｚがアリールである、請求項４に記載の小分子化合物。
【請求項７】
Ｚがフェニルである、請求項６に記載の小分子化合物。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が各々フェニルであり、
ＹがＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
ＺがＣ１〜Ｃ４アルキルまたはフェニルであり、
Ｒ４がヒドロキシである、
請求項１に記載の小分子化合物。
【請求項９】
Ｘ１がＣであり、Ｘ２がＮである、請求項８に記載の小分子化合物。
【請求項１０】
下記構造：
【化２】
2009519909.tif 000029
を有する、請求項９に記載の小分子化合物。
【請求項１１】
下記構造：
【化３】
2009519909.tif 000030
を有する、請求項９に記載の小分子化合物。
【請求項１２】
Ｘ１がＮであり、Ｘ２がＣである、請求項８に記載の小分子化合物。
【請求項１３】
下記構造：
【化４】
2009519909.tif 000031
を有する、請求項１２に記載の小分子化合物。
【請求項１４】
下記構造：
【化５】
2009519909.tif 000032
を有する、請求項１２に記載の小分子化合物。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１に記載の小分子化合物、および
（ｉｉ）製薬的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項１６】
ＧＬＩタンパク質を発現する腫瘍細胞を誘発することによってアポトーシスを起こすための方法であって、
（ａ）前記腫瘍細胞を、十分な量の請求項１に記載の小分子化合物と接触させる工程を含み、
前記接触させる工程が、前記腫瘍細胞のアポトーシスの誘発をもたらす方法。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞が、大腸癌、黒色腫、中皮腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、肉腫、卵巣癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、および神経膠腫の細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＬＩタンパク質が、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
インビトロで実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
インビボで実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記小分子化合物が、癌治療療法の一部として投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
細胞の不必要な増殖、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つを阻害するための方法であって、
（ａ）前記細胞がＧｌｉ遺伝子を発現するかどうかを判定する工程、および
（ｂ）前記細胞を、有効量の請求項１に記載の小分子化合物と接触させる工程を含み、
工程（ｂ）が、前記細胞の不必要な増殖、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つの阻害をもたらす方法。
【請求項２３】
癌性疾患を患っている対象を治療するための方法であって、
（ａ）前記対象に、治療有効量の請求項１に記載の小分子化合物を投与する工程を含み、
前記癌性疾患が、ＧＬＩタンパク質を発現することによって特徴付けられ、工程（ａ）が、前記対象の治療をもたらす方法。
【請求項２４】
細胞中のＧＬＩタンパク質の活性を阻害するための方法であって、
（ａ）前記細胞を請求項１に記載の小分子化合物と接触させる工程を含み、
前記接触させる工程が、前記細胞中のＧＬＩタンパク質の活性の阻害をもたらす方法。
【請求項２５】
前記ＧＬＩ活性が、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦタンパク質との間のタンパク質間相互作用である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子のプロモーターに作動可能に連結したＧＬＩタンパク質ＤＮＡ結合部位を有する遺伝子の発現を阻害するための方法であって、
（ａ）前記遺伝子を発現する細胞を、請求項１に記載の小分子化合物と接触させる工程を含み、
前記接触させる工程が、前記遺伝子の発現の阻害をもたらす方法。
【請求項２７】
前記遺伝子がＷｎｔ２遺伝子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｗｎｔ２遺伝子がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞の不要な増殖、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つを阻害するための医薬の製造における、請求項１に記載の小分子化合物の使用。
【請求項３０】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の小分子化合物の使用。
【請求項３１】
細胞のアポトーシスを誘発するための医薬の製造における、請求項１に記載の小分子化合物の使用。
【請求項３２】
細胞中のＧＬＩタンパク質シグナル伝達を阻害するための医薬の製造における、請求項１に記載の小分子化合物の使用。
【請求項３３】
ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間のタンパク質間相互作用を阻害することのできる候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）候補化合物を、ＧＬＩタンパク質およびＴＡＦＩＩ３１タンパク質を含む試料と接触させる工程、および
（ｂ）前記ＧＬＩタンパク質の前記ＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合を判定する工程であって、
前記候補化合物の不在下での前記ＧＬＩタンパク質の前記ＴＡＦＩＩ３１への結合と比較して、前記候補化合物の存在下で、前記ＧＬＩタンパク質の前記ＴＡＦＩＩ３１への結合が減少することが、前記候補化合物が、前記ＧＬＩタンパク質と前記ＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間の相互作用を阻害できることを示す工程を含む方法。
【請求項３４】
ＧＬＩタンパク質依存性転写活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）試料を候補化合物と接触させる工程であって、前記試料は、レポーター遺伝子に作動可能に連結した１つまたは複数のＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する発現レポーターコンストラクトを含む工程、および
（ｂ）ある場合には、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性のレベルに対する候補化合物の効果を判定する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記試料が細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれている、２００５年１２月９に出願された米国仮出願第６０／７４８，９６８号、および２００６年１月３０日に出願された米国仮出願第６０／７６３，８２９号、２００６年１２月７日に出願された米国出願第１１／６０８，１９７号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、腫瘍形成、腫瘍成長および腫瘍生存を阻害する組成物および方法に関する。この組成物は、ヘッジホッグシグナル伝達経路およびＧＬＩシグナル伝達経路を阻害する小分子化合物を含む。
【０００３】
発明の背景
ヘッジホッグ（Ｓｈｈ、またはＨｈ）、ＷＮＴ、ＦＧＦおよびＢＭＰシグナル伝達経路は、胚形成、組織再生、および発癌の間に、一緒にネットワーク化する。Ｈｈシグナル伝達経路の異常活性化は、胃癌や膵癌などの様々なヒト腫瘍における病理学的結果を導く。ヘッジホッグは、ＰＡＴＣＨＥＤ１（ｐｔｃｈ１）およびＳＭＯＯＴＨＥＮＥＤ（ｓｍｏ）を含む膜貫通型タンパク質複合体に結合し、ＧＬＩジンクフィンガー転写因子の転写を導くタンパク質キナーゼＡの阻害を含めた、一連の細胞質シグナル伝達事象を誘発することによって、Ｈｈシグナル伝達を開始する分泌糖タンパク質である。次いで、ジンクフィンガー転写因子のＧＬＩファミリーは、細胞外Ｈｈ刺激を、コンテキスト依存的および細胞型特異的様式で、定義された転写プログラムに翻訳する（Ruiz I Altaba et al, 2002, Nat, Rev. Cancer 2:361-72）。
【０００４】
ＧＬＩタンパク質を含めたいくつかのタンパク質は、Ｈｈシグナル伝達を媒介することに関与する（Katoh and Katoh, 2005, Cancer Biol. Ther. 4:1050-4）。脊椎動物は、ＧＬＩ（ＧＬＩ１とも呼ばれる）、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３の、少なくとも３種の異なるＧＬＩタンパク質を有する。これらのタンパク質は、ジンクフィンガー転写因子のＧＬＩファミリーのメンバーであり、ショウジョウバエのキュビタスインターラプタス（Ｃｕｂｉｔｕｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ）（Ｃｉ）およびエレガンス線虫の性決定遺伝子ｔｒａ−１と、高度に保存されたＣ２−Ｈ２ジンクフィンガードメイン（５種のジンクフィンガーＤＮＡ結合モチーフを有する）を共有する（Hui et al., 1994, Dev. Biol. 162:402-13）。ショウジョウバエにおいて、Ｃｉは、ヘッジホッグ標的の活性化に必要であり、ヘッジホッグ発現のリプレッサーとしても機能する。
【０００５】
脊椎動物の胚発生の間、発現が部分的に重複しているすべての遺伝子は、Ｈｈシグナル伝達に応答して転写的に活性化され、経路の活性化に起因するほとんどの効果を媒介することができる。ＧＬＩ１、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３は、それぞれ、脊椎動物発生の間、特定の機能を実行することができる（Kinzler et al., 1984, Nature 332:371-374; Ruppert et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:3104-3113; Walterhouse et al., 1993, Dev. Dyn. 196:91-102; Hui et al., 1994, Dev. Biol. 162:402-413）。例えば、Ｇｌｉ２突然変異マウスは、口蓋裂、歯の欠損、椎体および椎間板の欠如ならびに肢および胸骨の短縮を含めた、重篤な骨格異常を示す（Mo et al., 1997, Development 124:113-23）。
【０００６】
Ｇｌｉ３は、いくつかの身体構造の発生および分化のための重要な制御遺伝子を表す。例えば、遺伝子量の低減は、重篤な混乱、特に肢形態形成を導く（Vortkamp et al., 1995 DNA Cell Biol. 14:629-34）。さらに、ＧＬＩ３における突然変異は、いくつかのヒト形成異常症候群、例えば、肢および頭蓋顔面の発達に影響するＧｒｅｉｇ  ｃｅｐｈａｌｏｐｏｌｙｄａｃｔｙｌｙ症候群（ＧＣＰＳ）ならびに常染色体優性形態のＰａｌｌｉｓｔｅｒ−Ｈａｌｌ症候群などにおいて同定されてきた（Vortkamp et al., 1991, Nature 352:539-40; Bose et al., 2002, Hum. Mol. Genet. 11:1129-35）。マウスにおいて、ＧＬＩ３突然変異は、マウス突然変異体の過剰指に関係付けられた。
【０００７】
ＧＬＩタンパク質は、そのジンクフィンガードメインを介して、標的遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー配列内のＤＮＡ結合部位に結合することによって、転写アクチベーターとして機能する。最近、ＧＬＩタンパク質によって結合されたＤＮＡ結合配列が同定された。例えば、ＧＬＩ３ジンクフィンガーによって結合されたＤＮＡ配列は、１６個のヌクレオチドからなり、ＧＬＩおよびｔｒａ−１タンパク質によって結合された配列と高度の類似性を示す（Vortkamp et al., 1995, DNA Cell. Biol. 14:629-34）。この結合部位は、ＧＬＩタンパク質結合について以前に同定された９塩基対配列の５’−ＧＡＣＣＡＣＣＣＡ−３’を含んでいた（Kinzler and Vogelstein, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:634-42）。ＧＬＩ、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３は、同一または類似のＤＮＡ配列を結合すると考えられる（Yoon et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:3496-3501）。最近、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３タンパク質についての結合部位として、９塩基対共通配列の５’−ＧＡＣＣＡＣＣＣＡ−３’が、Ｈａｌｌｉｋａｓらによって確認された（Hailikas et al., 2006, Cell 124:47-59）。
【０００８】
ＧＬＩ２およびＧＬＩ３タンパク質によるＨｈ／ＧＬＩ標的遺伝子の活性化は、転写コアクチベーターＣｒｅｂ  Ｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）を必要とする場合があり、これは、ＣＢＰ結合ドメインに結合する（図１参照；Dai et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:8143-52; Kasper, Regl, Frischauf and Aberger, 2006, Eur. J. Cancer）。
【０００９】
ＧＬＩ１発現は、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３タンパク質の制御下にあることが報告された（Dai et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:8143-52）。全ＧＬＩ１タンパク質は、転写アクチベーターであるのに対して、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３は、アクチベーターおよびリプレッサーのドメインの両方を含む（図１参照）。ＧＬＩ２およびＧＬＩ３は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の作用を通じて異なる機能のために処理されることができる。全長のＧＬＩ２は、弱い転写アクチベーターとして作用する。Ｃ末端半分における活性化ドメインの切断により、リプレッサー活性を有するタンパク質がもたらされ、Ｎ末端での抑圧ドメインの除去により、ＧＬＩ２は、強いアクチベーターに変換される。Ｎ末端で切断されたＧＬＩ２は、全長タンパク質と異なり、例えば、トランスジェニックマウスの胚における、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）遺伝子、ＨＮＦβを活性化する。これは、ＧＬＩ２の活性化ドメインをアンマスクすることは、Ｓｈｈシグナル伝達経路の重要な機構の１つであることを示す。Ｎ末端領域を伴う同様の調節機構が、ＧＬＩ３についても記載されているが、ＧＬＩについては記載されていない（Sasaki et al., 1999, Development 126:3915-24、その全体が参照により組み込まれている）。
【００１０】
マウスおよびヒトＧＬＩ３ｃＤＮＡの比較により、推定アミノ酸配列同士の間で８５％の全体的な相同性、およびジンクフィンガーを含めたいくつかのドメインにおいて、さらに高い保存（＞９５％）が明らかになった（Thien et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta 1307:267-9）。
【００１１】
最近、ＧＬＩについての転写活性ドメインが、アミノ酸残基１０２０〜１０９１を含むカルボキシ末端で同定された。このドメインは、６個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含有する１８個のアミノ酸のα−ヘリックス（アミノ酸１０３７〜１０５４）を含む（Yoon et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:3496-3501）。このα−ヘリックス領域は、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）転写活性化ドメインと高度に類似しており、ＴＡＦＩＩ３１についての酸性活性化ドメインの一般的な認識要素として記載されている、保存モチーフＦＸＸΦΦ（Ｆ＝フェニルアラニン；Ｘ＝任意の残基；Φ＝任意の疎水性残基）を含む。さらに、ＴＢＰ付随因子（ＴＡＦ）、ＴＡＦＩＩ３１と直接接触すると考えられている、３種のアミノ酸残基（ＶＰ１６における、Ａｓｐ４７２、Ｐｈｅ４７９、およびＬｅｕ４８３、ならびにＧＬＩにおけるＡｓｐ１０４０、Ｐｈｅ１０４８、およびＬｅｕ１０５２）の保存が判明した（Yoon et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:3496-3501; Goodrich et al., 1993, Cell 75:519-530; Klemm et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5788-5792; Uesugi et al., 1997, Science 277:1310-1313）。
【００１２】
類似のドメインが、他のＧＬＩファミリータンパク質において存在する。例えば、推定上のＴＡＦＩＩ３１結合ドメインが記載され、ＮＨ２−ＩＮＫＤＮＬＲＫＤＬＦＴＶＳＩＫＡ−ＣＯＯＨ（ショウジョウバエＣｉ、アミノ酸残基１０４４〜１０６０）、ＮＨ２−ＤＭＡＤＦＥＦＥＱＭＦＴＤＡＬＧＩ−ＣＯＯＨ（ＶＰ１６、アミノ酸残基４６９〜４８５）、ＮＨ２−ＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ、アミノ酸残基１０３７〜１０５４）、ＮＨ２−ＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥ−ＣＯＯＨ（マウスＧＬＩ、アミノ酸残基１０４０〜１０５７）、ＮＨ２−ＤＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ３、アミノ酸残基１４９５〜１５１２）、およびＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＰＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（マウスＧＬＩ２、アミノ酸残基１５０９〜１５２６）を含む（Yoon et al, 1998, J. Biol. Chem. 273:3496-3501）。さらに、ヒトＧＬＩ２の推定上のＴＡＦＩＩ３１相互作用ドメイン、ＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＡＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（アミノ酸残基１５０１〜１５１８）を、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＹ８７１６５から同定することができる。さらに、マウスＧＬＩ３の推定上のＴＡＦＩＩ３１相互作用ドメイン、ＮＨ２−ＥＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤ−ＣＯＯＨ（アミノ酸残基１４９７〜１５１４）を、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ６１６０２から同定することができる。ＴＡＦＩＩ３１を接触させるための保存アミノ酸残基は、太字で示され、下線が引かれている。
【００１３】
ショウジョウバエおよびマウス発生における、Ｈｈシグナル伝達については多くのことが知られているが、ヒト癌において、Ｈｈシグナル伝達およびＧＬＩ活性に応答して活性化される、分子機構および腫瘍化プログラムの理解は、依然として非常に限られている。Ｈｈに関連した癌の共通の性質は、１種または複数種のＧＬＩタンパク質の発現レベルの上昇である。例えば、最近、前立腺癌、膵癌および小細胞肺癌を含めた、いくつかの癌型において、ＧＬＩ１の過剰発現が見出された（Karhadkar et al, 2004, Nature 431:707-12）。さらに、Ｇｌｉは、小児肉腫において増殖され、悪性神経膠腫において５０倍超増殖されることが判明した（Roberts at al., 1989, Cancer Res. 49:5407-13; Kinzler et al., 1987, Science 236:70-3）。ヘッジホッグ（Ｈｈ）およびその受容体Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）においても過剰発現されることが判明したが、この種類の癌において、ＧＬＩ１の発現は見出されなかった。
【００１４】
例えば、ＧＬＩ２の過剰発現は、正常な皮膚と比較して、基底細胞癌（ＢＣＣ）病変部において見出されてきた（Ikram et al., 2004, J. Invest Dermatol. 122:1503-9; Reg1 et al., 2002, Oncogene 21:5529-39; Hutchin et al., 2005, Genes Dev. 19:214-23）。さらに、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３の処理に基づくと、ＧＬＩ２および／またはＧＬＩ３は、肺癌および前立腺癌を含めた、多くの種類の癌に関する腫瘍形成の間のＨｈシグナル伝達の活性化において、より重要である場合がある。
【００１５】
肺癌は、米国おいて、および世界中で、癌による死亡の主要原因であり、米国において毎年１７００００を超える新規に診断される症例、および世界中でほぼ１００万の症例を有する（Minna et al., 2002, Cancer Cell. 1(1):49-52）。過去数十年で、肺癌の治療において積極的なアプローチがなされたにもかかわらず、肺癌についての５年生存率は、１５％未満のままである。肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の２つのグループに分けられる。ＮＳＣＬＣ（すべての癌の７５〜８０％）は、３つの主な種類：腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌からなる（Minna et al., 2002, Cancer Cell. 1(1):49-52）。肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および扁平上皮癌は、すべての肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）の６０〜７０％に相当する。手術、化学療法、および放射線照射が用いられてきているが、進行疾患においては、一般に思わしくない結果を伴っている。肺癌治療の有効性の改善は、重要な公衆衛生上の目標である。
【００１６】
前立腺癌は、男性において最も一般的な固形腫瘍でありうる（Nelson et al., 2003, N. Engl. J. Med. 349:366-381）。例えば、５０歳を超える全男性の５０％、および７０歳を超える実質的に全男性は、何らかの形態の前立腺過形成を患っている。米国において、前立腺癌は、最も頻繁に診断される癌であり、毎年、２５００００超の新規な症例が診断されている。４００００人の男性が、毎年前立腺癌によって死亡する。
【００１７】
したがって、Ｈｈ／ＧＬＩシグナル伝達を伴う、広範囲の、頻繁に起こり、致死的な悪性腫瘍を考慮すると、Ｈｈ／ＧＬＩシグナル伝達経路の特異的ターゲティングは、様々な致死的な腫瘍の治療に対する非常に有効な治療戦略を提供することができる（Pasca di Magliano and Hebrok, 2003, Nat. Rev. Cancer 3:903-911; Sanchez et al., 2005, Cancer Res. 65:2990-2; Kasper, Reg1, Frischauf and Aberger, 2006, Eur. J. Cancer）。異所性のＨｈまたはＧＬＩシグナル伝達経路活性化から生じるヒト疾患に治療には、経路アンタゴニストを用いる必要がある場合がある。現在のところ、異所性の活性の阻害は、異なるレベルで経路を遮断する、シグナル伝達アンタゴニストでの治療によって達成されている。例えば、抗−Ｓｈｈ抗体は、細胞外で作用し、植物性アルカロイドのシクロパミンは、細胞膜中のＳｍｏのレベルで作用する（例えば、米国特許出願第２００５／０１３０９２２Ａ１号； Taipale et al., 2000, Nature 406:1005-9; Sanchez and Ruiz I Altaba, 2005, Mech. Dev. 122(2):223-30; Athar et al., 2004, Cancer Res. 64(20):7545-52を参照されたい）。合成非ペプチジル小分子、Ｈｈ−Ａｇ（Frank-Kamenetsky et al., 2002, J. Biol. 1(2):10）、ＨｈＡｎｔａｇ（Romer et al., 2004, Cancer Cell. 6(3):229-40）、およびＣｕｒ６１４１４（Williams et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(8):4616-21）を含めて、Ｓｍｏにシグナル伝達し、結合するヘッジホッグの小分子モジュレーターが記載された。さらに、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を細胞内で活性化するために、フォルスコリンが用いられたが、これはＧＬＩシグナル伝達経路の細胞質阻害剤(cytoplasmic inhibitor)である。しかし、これらのアプローチは、短所を有する。例えば、治療有効量の抗Ｓｈｈ抗体の投与は、実現することが困難であり、患者における、他の正常な経路依存性細胞に影響する恐れがある。非常に高価なシクロパミンは、Ｓｍｏ以上のレベルでのＨｈシグナル伝達経路の活性化を通じて生じる疾患を治療することにのみ有用となりうる。さらに、ＰＫＡの活性が広範にわたるため、フォルスコリンの投与は、多数の副作用を導く恐れがある。それと対照的に、ＧＬＩシグナル伝達を阻害する小分子化合物の使用は、かなり有望である。
【００１８】
本発明者らは、ＧＬＩタンパク質、特にＧＬＩ３が過剰発現される癌を治療することにおいて、重要で、実現されていない要求に対処する。本発明は、ＧＬＩ３タンパク質が過剰発現される、いくつかの癌の検出および治療に有用な、小分子化合物、薬剤組成物、キットおよび方法を提供する。そのような癌として、肺癌、ＮＳＣＬＣ、乳癌、大腸癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、前立腺癌、卵巣癌、腎癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、神経膠腫などが挙げられる。
【００１９】
発明の概要
本発明において、本発明者らは、ＧＬＩ３タンパク質のアクチベータードメイン（約７０ｋＤａ）は、肺癌、ＮＳＣＬＣ、乳癌、大腸癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、前立腺癌、卵巣癌、腎癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、神経膠腫などを含めた、様々なヒト癌細胞株において過剰発現されることを見出した。ＧＬＩ３の過剰発現は、転移した大腸および肉腫組織試料においても見出された（＞９５％）。
【００２０】
したがって、本発明者らは、正常細胞中ではなく、これらの癌におけるＧＬＩ３タンパク質の活性型の阻害は、著しいアポトーシスを誘発することを提案する。ＧＬＩ３タンパク質シグナル伝達の阻害は、それだけに限らないが、（ｉ）ＧＬＩ３タンパク質の転写活性の直接阻害、（ｉｉ）ＧＬＩ３前駆体タンパク質の処理の阻害、（ｉｉｉ）ＧＬＩ３アクチベータードメインのリン酸化の阻害、または（ｉｖ）活性ＧＬＩ３タンパク質を産生するプロセスに関与する任意の細胞タンパク質の阻害を含めた、様々な手段によって達成することができる。ＧＬＩ３タンパク質シグナル伝達の阻害は、様々な手段、例えば、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって遂行することができる。本発明は、ＧＬＩタンパク質シグナル伝達、特にＧＬＩ３タンパク質シグナル伝達を阻害するための小分子化合物を提供する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、下記式：
【化１】
2009519909.tif 000003
（式中、Ｘ１およびＸ２は、各々独立に、ＮまたはＣであり、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＮであり、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＣであり、環のＮは、Ｘ１およびＸ２のうちのいずれかCであるものと二重結合を形成する）の小分子化合物を提供する。さらに、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルからなる群から独立に選択され、それらは場合によって、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−ＮＲ７Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）およびＳ（Ｏ）ｍＲ７（下付き文字ｍは、０、１または２である）からなる群からそれぞれ独立に選択される０〜３個のＲ６基で置換されていてもよい。Ｙは、直接結合であるか、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択されるメンバーである。Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−ＯＲ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、ＮＲ７Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）およびＳ（Ｏ）ｍＲ７（下付き文字ｍは、０、１または２である）である。Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、場合によって、Ｙと一緒になって５から６員の複素環を形成する。それぞれのＲ７は、独立にＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２２】
さらに、本発明の小分子化合物の塩、水和物、溶媒和物、異性体およびプロドラッグも企図されている。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれがアリールである式の小分子化合物を提供する。さらなる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれはフェニルである。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ４がヒドロキシである式の小分子化合物を提供する。別の実施形態では、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキルである。さらに別の実施形態では、Ｚはアリールである。なおまた別の実施形態では、Ｚはフェニルである。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれがフェニルであり、ＹがＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＺがＣ１〜Ｃ４アルキルまたはフェニルであり、Ｒ４がヒドロキシである式の小分子化合物を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、Ｘ１がＣであり、Ｘ２がＮである式の小分子化合物を提供する。なおまた別の実施形態では、この式の小分子化合物は、以下の構造：
【化２】
2009519909.tif 000004
を有する。さらに別の実施形態では、この式の小分子化合物は、以下の構造：
【化３】
2009519909.tif 000005
を有する。
【００２７】
他の実施形態では、本発明は、Ｘ１がＮであり、Ｘ２がＣである式の小分子化合物を提供する。別の実施形態では、この式の小分子化合物は、以下の構造：
【化４】
2009519909.tif 000006
を有する。さらに別の実施形態では、この式の小分子化合物は、以下の構造：
【化５】
2009519909.tif 000007
を有する。
【００２８】
本発明は、薬剤組成物および薬物も提供する。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明の小分子化合物および薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物を提供する。
【００２９】
本発明は、本発明の小分子化合物を用いるための方法も提供する。本発明の一態様では、ＧＬＩタンパク質を発現する腫瘍細胞を誘発することによってアポトーシスを起こすための方法が提供される。この方法は、腫瘍細胞を、十分な量の本発明の小分子化合物と接触させる工程を含み、この接触させる工程は、腫瘍細胞のアポトーシスの誘発をもたらす。好ましくは、ＧＬＩタンパク質は、ＧＬＩ２またはＧＬＩ３である。
【００３０】
この方法の一実施形態では、小分子化合物は、癌治療療法の一部として投与される。
【００３１】
本発明の別の態様では、細胞の不必要な増殖、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つを阻害するための方法が提供される。この方法は、細胞が、Ｇｌｉ遺伝子、または代わりにＧＬＩタンパク質を発現するかどうかを判定する工程を含む。この方法は、細胞を、有効量の本発明の小分子と接触させる工程をさらに含み、この接触させる工程は、細胞の不必要な増殖、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つの阻害をもたらす。
【００３２】
本発明の方法において有用な細胞または腫瘍細胞は、大腸癌、黒色腫、中皮腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、肉腫、卵巣癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、および神経膠腫の細胞からなる群から選択される。
【００３３】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実行することができる。したがって、本発明の別の態様では、癌性疾患を患っている対象を治療するための方法が提供される。この方法は、治療有効量の小分子化合物を対象に投与する工程を含み、癌性疾患は、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドを発現することによって特徴付けられ、投与する工程は、対象の治療をもたらす。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態では、細胞中のＧＬＩタンパク質の活性を阻害するための方法が提供される。この方法は、細胞を本発明の小分子化合物と接触させる工程を含み、この接触させる工程は、細胞中のＧＬＩタンパク質の活性の阻害をもたらす。阻害される好ましいＧＬＩタンパク質活性は、ＧＬＩタンパク質と細胞タンパク質または核タンパク質との間のタンパク質間相互作用である。好ましい核タンパク質は、ＴＡＦタンパク質、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質随伴因子（ＴＡＴＡ−Ｂｏｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ）、好ましくはＴＡＦＩＩ３１タンパク質である。
【００３５】
さらに、本発明は、遺伝子のプロモーターに作動可能に連結したＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、遺伝子のプロモーターに作動可能に連結したＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する遺伝子を発現する細胞を、本発明の小分子化合物と接触させる工程を含み、この接触させる工程は、この遺伝子の発現の阻害をもたらす。本発明の好ましい実施形態では、この遺伝子は、Ｗｎｔ２遺伝子および好ましくはヒトＷｎｔ２遺伝子である。
【００３６】
さらに、本発明は、細胞の不必要な増殖、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つを阻害するための薬物の製造における、本発明の小分子化合物の使用を提供する。別の態様では、癌治療のための薬物の製造における小分子化合物の使用が提供される。なおまた別の実施形態では、本発明は、細胞のアポトーシスを誘発するための薬物の製造における小分子化合物の使用を提供する。別の態様では、細胞中のＧＬＩタンパク質シグナル伝達を阻害するための医薬の製造における、本発明の小分子化合物の使用が提供される。
【００３７】
なおまた別の態様では、本発明は、スクリーニング法を提供する。本発明の好ましい方法は、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間のタンパク質間相互作用を阻害することのできる候補化合物を同定するための方法である。一実施形態では、この方法は、候補化合物を、ＧＬＩタンパク質およびＴＡＦＩＩ３１タンパク質を含む試料と接触させる工程、およびＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合を判定する工程を含む。候補化合物の不在下でのＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１への結合と比較して、候補化合物の存在下で、ＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１への結合が減少することは、この候補化合物が、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間の相互作用を阻害できることを示す。
【００３８】
本明細書に提供される別の方法は、ＧＬＩタンパク質活性を調節する化合物を同定するための方法である。一実施形態では、ＧＬＩタンパク質活性は、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性であり、方法は、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性を調節する化合物を同定するためのものである。この方法は、試料を候補化合物と接触させる工程であって、この試料は、レポーター遺伝子に作動可能に連結した１つまたは複数のＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する発現レポーターコンストラクトを含む工程、およびある場合には、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性のレベルに対する候補化合物の効果を判定する工程を含む。
【００３９】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いる多くの用語の一般的な定義を有する、１つのスキルを提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いる場合、以下の用語は、他に指定されていない限り、これら本来の意味を有する。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する）、二価および多価の基を含むことができる。飽和炭化水素基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体および異性体、などが挙げられる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、１つまたは複数の二重結合を有する不飽和アルキル基を指す。アルケニル基の例として、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニルおよび３−（１，４−ペンタジエニル）、ならびにより高級な同族体および異性体が挙げられる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、１つまたは複数の三重結合を有する不飽和アルキル基を指す。アルキニルの例として、エチニル（アセチレニル）、１−プロピニル、１−および２−ブチニル、ならびにより高級な同族体および異性体が挙げられる。
【００４３】
用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有することができるが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００４４】
アミノ酸は、本明細書で、一般に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字の記号のいずれによっても参照することができる。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている１文字コードによって参照することができる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「アリール」は、５〜１２個の環員を有し、単環または一緒に縮合しているか、共有結合的に連結している複数環（最大３つの環）であることのできる、多価不飽和芳香族炭化水素置換基を指す。アリール基の限定されない例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、およびベンジルが挙げられる。他のアリール基も、本発明において有用である。
【００４６】
本明細書で用いる「生体試料」は、核酸またはポリペプチドを含有する生物組織または体液の試料である。そのような試料は、典型的にはヒト由来であるが、非ヒト霊長類、またはげっ歯類、例えばマウス、およびラットから分離された組織を含む。生体試料は、生検および剖検試料などの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙、粘液、毛、皮膚なども含むことができる。生体試料には、患者組織に由来する、外植片および初代細胞培養物および／または形質転換細胞培養物も含まれる。「生体試料」は、動物からの細胞または細胞集団、またはある量の組織もしくは体液も指す。ほとんどの場合、生体試料は動物から取り出されてきたが、用語「生体試料」は、インビボで、すなわち動物から取り出すことなく分析される細胞または組織も指すことができる。典型的には、「生体試料」は、動物からの細胞を含有することになるが、この用語は、非細胞生体物質、例えば、血液の非細胞画分、唾液、または尿なども指すことができ、これらは、癌に関係するポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる。それだけに限らないが、組織生検、血液試料、口腔スクレイプ(buccal scrape）、唾液試料、または乳糖分泌物を含めて、多数の種類の生体試料を本発明において用いることができる。本明細書で用いる場合、「組織生検」は、診断分析のために、動物、好ましくはヒトから取り出されるある量の組織を指す。癌を有する患者において、組織は、腫瘍から取り出すことができ、腫瘍内の細胞の分析を可能にする。「組織生検」は、任意の種類の生検、例えば、針生検、細針生検、外科生検などを指すことができる。
【００４７】
「生体試料を提供すること」は、本発明において記載された方法で用いるための生体試料を得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、患者から細胞試料を取り出すことによって行われることになるが、予め分離された細胞を用いることによって（例えば、別の時間に、別の人によって、および／または別の目的のために分離された）、またはインビボで本発明の方法を実施することによっても遂行することができる。治療歴または転帰歴(outcome history)を有する保存組織は、特に有用となろう。
【００４８】
「癌細胞」、「形質転換」細胞または組織培養での「形質転換」は、必ずしも新規な遺伝物質の取り込みを伴うとは限らない、自然発生的な、または誘発された表現型の変化を指す。形質転換は、形質転換ウイルスの感染、および新規なゲノムＤＮＡの取り込み、または外来ＤＮＡの取り込みから生じうるが、自然発生的、または発癌物質への曝露後にも生じることができ、それによって内在性遺伝子を突然変異させる。形質転換は、表現型の変化、例えば、細胞の不死化、異常増殖制御、非形態変化（ｎｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅ）、および／または悪性腫瘍などに関係する（Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)を参照されたい）。
【００４９】
語句「細胞増殖の変化」は、インビトロまたはインビボでの細胞増殖および増殖特性の任意の変化、例えば、病巣の形成、足場非依存性、半固体または軟寒天増殖、増殖の接触阻害および密度制限の変化、増殖因子または血清要求性の低下、細胞形態の変化、不死化の獲得または喪失、腫瘍特異的マーカーの獲得または喪失、適当な動物宿主に注射された場合に腫瘍を形成または抑制する能力、および／または細胞の不死化などを指す。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 (3rd ed. 1994)を参照されたい。
【００５０】
「量を相関させること」は、一試料において決定された物質、分子またはマーカー（ＧｌｉまたはＧＬＩなど）の量を、別の試料において決定された同じ物質、分子またはマーカーの量と比較することを意味する。別の試料において決定された同じ物質、分子またはマーカーの量は、所与の癌に特異的である場合がある。
【００５１】
用語「量を決定すること」の同義語は、本発明の範囲内に企図されており、それだけに限らないが、ＧｌｉまたはＧＬＩなどの分子の存在、不存在、量または濃度を検出すること、測定すること、試験すること、または決定することを含む。
【００５２】
本明細書で用いる場合、用語「シクロアルキル」は、３から１５個の炭素、および縮合しているか、共有結合的に連結していることのできる、１から３個の環を有する、飽和環式炭化水素を指す。本発明において有用なシクロアルキル基として、それだけに限らないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。本発明において有用なビシクロアルキル基として、それだけに限らないが、［３．３．０］ビシクロオクタニル、［２．２．２］ビシクロオクタニル、［４．３．０］ビシクロノナン、［４．４．０］ビシクロデカン（デカリン）、スピロ［３．４］オクタニル、スピロ［２．５］オクタニルなどが挙げられる。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「シクロアルケニル」は、３から１５個の炭化水素、および縮合しているか、共有結合的に連結していることのできる、１から３個の環を有する、不飽和環式炭化水素を指す。本発明において有用なシクロアルケニル基として、それだけに限らないが、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびシクロオクテニルが挙げられる。ビシクロアルケニル基も、本発明において有用である。
【００５４】
「機能的効果を判定すること」によって、ＧＬＩタンパク質の影響下で、間接的または直接的であるパラメーター、例えば、機能的、酵素的、物理的および化学的効果を増大させるか、減少させる化合物をアッセイすることを意味する。そのような機能的効果は、当業者に知られている任意の手段、例えば、タンパク質についての、分光学的特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学的特性（例えば、形状）、クロマトグラフィー特性、または溶解特性の変化、ＧＬＩタンパク質の誘導マーカーまたは転写活性を測定すること、結合活性、例えばＴＡＦタンパク質（例えば、ＴＡＦＩＩ３１）への結合を測定すること、細胞増殖を測定すること、アポトーシスを測定することなどによって測定することができる。癌に対する、化合物、例えば小分子化合物の機能的効果の判定は、インビトロアッセイ、例えば、軟寒天上の細胞増殖；足場依存性；増殖の接触阻害および密度制限；細胞増殖；細胞形質転換；増殖因子または血清依存性；腫瘍特異的マーカーレベル；マトリゲルへの侵襲性；インビボでの腫瘍成長および転移；転移を起こしている細胞中でのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現、および癌細胞の他の特性などの、当業者に知られているアッセイを用いて実施することもできる。機能的効果は、当業者に知られている多くの手段、例えば、形態学的特徴の変化の定量的または定性的測定のための顕微鏡観察、Ｇｌｉ  ＲＮＡまたはタンパク質レベルの変化の測定、ＲＮＡ安定性の測定、例えば、化学発光、蛍光、熱量測定反応、抗体結合、誘導マーカー、およびリガンド結合アッセイによる下流遺伝子またはレポーター遺伝子の発現（ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、ＧＦＰなど）の同定によって評価することができる。「機能的効果」には、インビトロ、インビボおよびエクスビボ活性が含まれる。
【００５５】
用語「決定すること」の同義語は、本発明の範囲内に企図されており、それだけに限らないが、ＧＬＩポリペプチド、標識、本発明の小分子化合物などの分子の存在、不存在、量または濃度を検出すること、測定すること、アッセイすること、試験すること、または決定することを含む。この用語は、定性的および定量的決定の両方を指す。
【００５６】
Ｓｈｈシグナル伝達、ＧＬＩシグナル伝達、またはＷｎｔ２シグナル伝達の脈絡における、用語「下方調節する」または「阻害すること」は、Ｓｈｈシグナル伝達、ＧＬＩシグナル伝達、またはＷｎｔ２シグナル伝達に対する、知られているアッセイによって測定した場合、Ｓｈｈシグナル伝達、ＧＬＩシグナル伝達、またはＷｎｔ２シグナル伝達を部分的または完全に遮断することを指す。例えば、阻害剤は、本発明の小分子化合物である。
【００５７】
治療用の本発明の小分子化合物の「有効量」、「有効用量」、「十分な量」、またはその文法的な相当語句は、症状を寛解させるか、ある様式では、低減する、または病状の進行を停止するか逆転させるのに十分な量である。特定の薬剤組成物の投与による、特定の病状、例えば、癌の症状の寛解は、永久的または一時的、永続的または移行にかかわらず、薬剤組成物の投与に関係することのできる任意の軽減を指す。「有効量」はインビボおよびインビトロで投与することができる。
【００５８】
「発現ベクター」または「発現コンストラクト」は、宿主細胞中で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成で生成された核酸コンストラクトである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部とすることができる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した、転写される核酸を含む。
【００５９】
用語「ＧＬＩ」は、ＧＬＩタンパク質のファミリーを指す。ＧＬＩタンパク質には、ＧＬＩ（ＧＬＩ１とも呼ばれる）、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３が含まれる。好ましいＧＬＩタンパク質は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２またＧＬＩ３である。
【００６０】
用語「Ｇｌｉ」は、ＧＬＩタンパク質をコードする遺伝子を指す。したがって、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、およびＧｌｉ３は、それぞれＧＬＩ１、ＧＬＩ２またＧＬＩ３タンパク質をコードする遺伝子である。
【００６１】
用語「ＧＬＩタンパク質活性」は、ＧＬＩシグナル伝達を指し、例えば、ＧＬＩによる下流遺伝子の転写活性化、ＧＬＩタンパク質の、ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位への結合、およびＧＬＩタンパク質の、他のタンパク質、例えば、ＴＡＦ、またはＣＢＰ（Ｃｒｅｂタンパク質結合タンパク質）などのコアクチベーターへの結合を含む。
【００６２】
用語「ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位」は、ＧＬＩタンパク質が結合し、遺伝子転写を活性化することのできるヌクレオチド配列を指す。ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位は、例えば、Ｖｏｒｔｋａｍｐら（1995, DNA Cell. Biol. 14:629-34）、ＫｉｎｚｌｅｒおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（1990, Mol. Cell. Biol. 10:634-42）ならびにＹｏｏｎら（998, J Biol Chem 273:3496-3501）によって記載された。Ｖｏｒｔｋａｍｐら（1995, DNA Cell. Biol. 14:629-34）によって記載されている、ＧＬＩ３ジンクフィンガーによって結合されたＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位は、例えば、１６個のヌクレオチドからなり、ＧＬＩおよびｔｒａ−１タンパク質によって結合された配列と高度の類似性を示す。この結合部位は、９塩基対配列の５’−ＧＡＣＣＡＣＣＣＡ−３’を含んでいた。ＧＬＩ３  ＤＮＡ結合部位は、Ｖｏｒｔｋａｍｐら（1995, DNA Cell. Biol. 14:629-34）によって同定されたＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位と１００％同一である必要はないことが理解される。例えば、最近、Ｈａｌｌｉｋａｓらは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３のＤＮＡ結合特異性を決定し、また、例えば、５’−ＴＡＣＣＡＡＣＣＣＡ−３’、５’−ＧＣＣＣＡＣＣＣＡ−３’、５’−ＧＧＣＣＡＣＣＣＡ−３’および５’−ＧＡＴＣＡＣＣＣＡ−３’（下線を引いたヌクレオチドは、９塩基対共通配列との差異を示す）へのＧＬＩ結合を見出した（Hallikas et al., 2006, Cell 124(1):47-59；その全体が参照により組み込まれている）。ＧＬＩタンパク質の、ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位への結合を判定するためのアッセイは、当技術分野で知られており、例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ；Fried and Crothers, 1981, Nucleic Acids Res. 9:6505-6525; Hallikas et al., 2006, Cell 124:47-59）、ＳＥＬＥＸ（Roulet et al., 2002 Nat. Biotechnol. 20:831-835）、およびクロマトグラフィー結合アッセイを含む。
【００６３】
「ＧＬＩ」ポリペプチドは、天然型または組換え型の両方を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、ＧＬＩポリペプチドおよびＧＬＩサブドメインポリペプチドは、ヒトＧＬＩ配列に対応する配列を含むことができる。したがって、例示的なＧＬＩが本明細書で提供され、当技術分野で知られている。例えば、いくつかの脊椎動物のＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３タンパク質、例えば、ヒトＧＬＩ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２６９、Ｐ０８１５１）、マウスＧＬＩ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１０２９６、ＡＢ０２５９２２、ＡＡＣ０９１６９、Ｐ４７８０６）、ゼブラフィッシュＧＬＩ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７８２９６）、ヒトＧＬＩ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０３８１；ＮＭ＿０３０３８０；ＮＭ−０３０３７９、ＤＱ０８６８１４）、マウスＧＬＩ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿９２２１０７）、ヒトＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１６８、ＡＪ２５０４０８、Ｍ５７６０９、Ｐ１００７１、ＡＡＹ８７１６５）、チンパンジーＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３４１９０、ＡＹ６６５２７２、Ｑ５ＩＳ５６）、マウスＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９５２５５、ＮＭ＿００８１３０、ＮＰ＿０３２１５６、Ｑ６１６０２）、ラットＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿２２５４１１）、ゼブラフィッシュＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２０５７２８、ＡＹ３７７４２９）が、特徴付けられてきた。
【００６４】
ＧＬＩタンパク質は、全長ＧＬＩタンパク質であってもよく、ＧＬＩタンパク質のサブドメインなどの部分ＧＬＩタンパク質であってもよい。例えば、「ＧＬＩ３」ポリペプチドは、（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１６８、ＡＪ２５０４０８、Ｍ５７６０９、Ｐ１００７１、およびＡＡＹ８７１６５から選択されたヒトＧＬＩ３に対して、好ましくは、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、５００またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約６０％超のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する、（ｉｉ）アミノ酸モチーフＦＸＸΦΦ（Ｆ＝フェニルアラニン；Ｘ＝任意の残基；Φ＝任意の疎水性残基）、好ましくはアミノ酸配列ＦＤＡＩＩを含む、（ｉｉｉ）転写活性化ドメインを含む、（ｉｖ）ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位に結合する、かつ／または（ｖ）ＴＡＦに結合する、ヒトＧＬＩ３のポリペプチドおよび多型変異体、対立遺伝子、突然変異体を指す。
【００６５】
「Ｇｌｉ核酸」または「ｇｌｉポリヌクレオチド」は、ＧＬＩ、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３タンパク質をコードする脊椎動物遺伝子を指す。「Ｇｌｉ核酸」は、天然型または組換え型の両方を含む。ＧｌｉポリペプチドまたはＧＬＩポリペプチドコード配列は、典型的にはヒト由来であるが、他の哺乳動物、それだけに限らないが、非ヒト霊長類、げっ歯類、例えばラット、マウス、もしくはハムスター；雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物由来であってもよい。本発明を実行するのに有用なＧｌｉ核酸、例えば、ヒトＧｌｉ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２６９）、マウスＧｌｉ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１０２９６、ＡＢ０２５９２２）、ゼブラフィッシュＧｌｉ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７８２９６）、ヒトＧｌｉ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０３８１；ＮＭ＿０３０３８０；ＮＭ−０３０３７９、ＤＱ０８６８１４）、マウスＧｌｉ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿９２２１０７）、ヒトＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１６８、ＡＪ２５０４０８、Ｍ５７６０９）、チンパンジーＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３４１９０、ＡＹ６６５２７２）、マウスＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９５２５５、ＮＭ＿００８１３０）、ラットＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿２２５４１１）、ゼブラフィッシュＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２０５７２８、ＡＹ３７７４２９）が、クローン化され、特徴付けられてきた。Ｇｌｉポリヌクレオチドは、全長Ｇｌｉポリヌクレオチド、すなわち、完全なＧＬＩタンパク質をコードするものであってもよく、またはＧＬＩタンパク質のサブドメインをコードする、部分Ｇｌｉポリヌクレオチドであってもよい。
【００６６】
用語「ＧＬＩ経路」、「ＧＬＩシグナル伝達」または「ＧＬＩシグナル伝達経路」は、互換的に用いられ、その受容体（複数も）に結合しているヘッジホッグタンパク質によって開始され、ＧＬＩタンパク質の発現および／または活性を導くシグナル伝達経路を指す。
【００６７】
本明細書で用いる場合、用語「ハロゲン」は、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）およびヨウ素（Ｉ）を含めた元素を指す。
【００６８】
用語「ヘッジホッグ」は、用語「Ｈｈ」と互換的に用いられ、Ｈｈ受容体に結合し、それによって、ＧＬＩタンパク質の発現または活性化を導くＨｈシグナル伝達経路を開始するサイトカインである。哺乳動物において、３種のＨｈファミリー遺伝子、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、およびデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）が存在する。いくつかの脊椎動物ヘッジホッグタンパク質、例えば、ヒトＳＨＨ、マウスＳＨＨ、ラットＳＨＨ、ヒトＩＨＨ、およびマウスＤＨＨが、当技術分野で知られている。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアリール」は、５〜１２個の環員を有し、単環または一緒に縮合しているか、共有結合的に連結している複数環（最大３つの環）であることができ、環中に、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を有する、多価不飽和芳香族炭化水素置換基を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着することができる。ヘテロアリール基の限定されない例として、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。本発明において有用な追加のヘテロアリール基として、ピリジルＮ−オキシド、テトラゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インダゾリル、または置換されている、特に一置換もしくは二置換されている任意の基が挙げられる。
【００７０】
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロシクロアルキル」は、３から１５個の環員および縮合しているか、共有結合的に連結している１から３個の環を有し、環中に、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を有する、飽和環式炭化水素を指す。さらに、ヘテロ原子は、複素環が分子の残部に付着される位置を占めることができる。ヘテロシクロアルキルの例として、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「異性体」は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有する、本発明の化合物を指す。ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は、すべて本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
【００７２】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識として、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、蛍光色素、光電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよび例えば、小分子化合物中に放射標識を組み入れることによって検出可能にすることのできるタンパク質もしくは他の構成要素が挙げられる。標識は、任意の位置で小分子化合物中に組み入れることができる。
【００７３】
生体試料における「Ｇｌｉ  ｍＲＮＡのレベル」または「Ｗｎｔ２  ｍＲＮＡのレベル」という用語は、それぞれ、細胞または生体試料中に存在する、ＧｌｉまたはＷｎｔ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を指す。ｍＲＮＡは、機能的なＧＬＩまたはＷＮＴタンパク質を一般にコードするが、コードされたタンパク質の機能を変化させるか、排除する、突然変異が存在しうる。「Ｇｌｉ  ｍＲＮＡのレベル」または「Ｗｎｔ２  ｍＲＮＡのレベル」は、定量化される必要はないが、単純に検出することができ、例えば、対照試料からのレベルまたは対照試料から予期されるレベルとの比較の有無にかかわらず、ヒトによる主観的な視覚的検出である。
【００７４】
生体試料における「ＧＬＩポリペプチドのレベル」または「Ｗｎｔ２ポリペプチドのレベル」は、それぞれ、細胞または生体試料中に存在する、ＧｌｉまたはＷｎｔ２  ｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量を指す。このポリペプチドは、ＧＬＩまたはＷＮＴ２タンパク質活性を有していても有していなくてもよい。「ＧＬＩポリペプチドのレベル」または「ＷＮＴ２ポリペプチド」は、定量化される必要はないが、単純に検出することができ、例えば、対照試料からのレベルまたは対照試料から予期されるレベルとの比較の有無にかかわらず、ヒトによる主観的な視覚的検出である。
【００７５】
本明細書で用いる場合、ＧＬＩなどのポリペプチドのレベルまたは活性の「モジュレーター」には、そのポリペプチドのアクチベーターおよび／または阻害剤が含まれ、ポリペプチドの発現のレベルまたはポリペプチドの活性を活性化、または阻害する化合物を指すために用いられる。好ましいポリペプチドは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３である。アクチベーターは、例えば、本発明のポリペプチドの発現を誘発するか、活性化する、あるいは本発明のポリペプチドに結合する、本発明のポリペプチドの活性を刺激する、増大させる、開始する、活性化する、促進する、または活性の活性化を増強する、活性を感作する、または上方調節する化合物である。アクチベーターには、天然および合成化合物、小化学分子などが含まれる。アクチベーターのアッセイには、例えば、ＧＬＩポリペプチドを発現する細胞に候補化合物を適用し、次いで機能効果を判定することが含まれる。有望なアクチベーターで処理されるＧＬＩポリペプチドを含む試料またはアッセイは、このアクチベーターを含まない対照試料と比較されることによって、効果の程度が検討される。対照試料（候補化合物で処理されていない）には、１００％の相対活性値が割り当てられる。ポリペプチドの活性化は、対照と比べたポリペプチドの活性値が１１０％、場合によって１３０％、１５０％、場合によって２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００〜３０００％またはそれ以上である場合に達成される。阻害剤は、例えば、本発明のポリペプチドの発現を抑圧するか、不活化する、あるいは本発明のポリペプチドに結合する、本発明のポリペプチドの活性を減少させる、終了させる、不活化する、妨害する、または活性の活性化を低減する、活性を脱感作する、または下方調節する化合物である。阻害剤には、ＧＬＩタンパク質の発現を妨害する、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡなどの核酸、ならびに天然および合成化合物、小化学分子などが含まれる。阻害剤のアッセイは、本明細書に記載されている。有望な阻害剤で処理されるＧＬＩポリペプチドを含む試料またはアッセイは、この阻害剤を含まない対照試料と比較されることによって、効果の程度が検討される。対照試料（候補化合物で処理されていない）には、１００％の相対活性値が割り当てられる。ポリペプチドの阻害は、対照と比べたポリペプチドの活性値が、１０％、場合によって２０％、場合によって３０％、場合によって４０％、場合によって５０％、６０％、７０％、８０％、または９０〜１００％低減される場合に達成される。
【００７６】
用語「薬学的に許容される」は、対象、好ましくはヒト対象に投与された場合、生理的に許容でき、アレルギー性または同様の有害な反応を一般的に生じさせない組成物を指す。好ましくは、本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される」は、動物、さらに特にヒトにおいて用いるために、連邦政府または州政府の監督官庁によって認可されている、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知された薬局方に記載されていることを意味する。
【００７７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に用いられる。この用語は、天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含有するもの、および非天然アミノ酸ポリマーだけでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用する。
【００７８】
本明細書で用いる場合、用語「プロドラッグ」は、生理的条件下で容易に化学変化を起こすことによって、本発明の化合物を提供する化合物を指す。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境において、化学的または生化学的方法によって、本発明の化合物に変換されることができる。例えば、プロドラッグは、適当な酵素または化学的試薬を含む経皮パッチのリザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）に入れられると、本発明の化合物に徐々に変換されることができる。
【００７９】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する、数多くの核酸制御配列として定義される。本明細書で用いる場合、プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなどを含む。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対と同じ程度に位置することのできる、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも場合によって含む。
【００８０】
「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境調節または発達調節下で活性なプロモーターである。用語「作動可能に連結した」は、核酸発現制御配列（プロモーターまたは転写因子結合部位の配列など）と第２の核酸配列との間の機能的な連結を指し、この発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００８１】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる場合、用語「組換えの」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入または未変性の核酸もしくはタンパク質の変質によって修飾されたこと、あるいは細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、未変性（非組換えの）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、あるいは他の方法で異常に発現されている、十分に発現されていない、またはまったく発現されていない未変性遺伝子を発現する。本明細書において、用語「組換え核酸」によって、一般に、通常天然で見出されない形式で、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、核酸を操作することによって、本来インビトロで形成された核酸を意味する。このようにして、異なる配列の作動可能な連結が達成される。したがって、直鎖状形態で単離された核酸、または通常連結されていないＤＮＡ分子を連結することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、本発明の目的に対しては、両方とも組換え型と見なされる。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生体中に再導入されると、この核酸は、非組換えで、すなわち、インビトロ操作ではなく、宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製することになる。しかし、一度組換えで生成されるが、続いて非組換えで複製される核酸は、本発明の目的に対しては、依然として組換え型であると見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、上記に示した組換え核酸の発現を通じて作製されるタンパク質である。
【００８２】
本明細書において「化学療法剤に耐性である」によって、化学療法剤での処置に応答しない、すなわちそのような処置によって死滅しない、または増殖が阻害されない腫瘍を意味する。
【００８３】
本明細書で用いる場合、用語「塩」は、本明細書に記載される化合物上に見出される特定の置換基に応じて、比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を指す。本発明の化合物が、比較的酸性の官能性を含む場合、中性形態のそのような化合物を、直接または適当な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基と接触させることによって、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウムの塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が、比較的塩基性の官能性を含む場合、中性形態のそのような化合物を、直接または適当な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸と接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リン酸、リン酸一水素酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、リン酸二水素酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、硫酸、硫酸一水素酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸のような無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的無毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギネート（ａｒｇｉｎａｔｅ）などのアミノ酸の塩、グルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S.M., et al, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照されたい）。本発明のある特定の化合物は、塩基性官能性および酸性官能性の両方を含み、この化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれにも変換されることを可能にしている。
【００８４】
中性形態の化合物は、塩を、塩基または酸と接触させ、従来の様式で親化合物を単離することによって再生することができる。親形態の化合物は、極性溶媒中の溶解性などのある物理的特性において、様々な塩形態と異なるが、その他の点では、塩は、本発明の目的に対しては、親形態の化合物と等価である。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「溶媒和物」は、溶媒と複合体を形成した本発明の化合物を指す。本発明の化合物と溶媒和物を形成することのできる溶媒として、通常の有機溶媒、例えば、アルコール（メタノール、エタノールなど）、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ハロゲン化溶媒（塩化メチレン、クロロホルムなど）、ヘキサンおよびペンタンなどが挙げられる。さらなる溶媒には、水が含まれる。水が、複合体を形成する溶媒である場合、この複合体は、「水和物」と呼ばれる。
【００８６】
用語「対象」または「患者」は、癌などの病状、障害、または疾患の治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００８７】
用語「ＴＡＦ」は、ＴＢＰ関連因子を指す。好ましくは、ＴＡＦは、ＴＡＦＩＩ、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される真核生物遺伝子の転写活性を媒介することに関与するＴＡＦタンパク質である。ＴＡＦタンパク質は、他の転写アクチベーターまたはリプレッサーと相互作用する（Goodrich and Tjian, Curr Opin Cell Biol 6(3):403-9 (1994); Albright and Tjian, Gene 242(1-2):1-13 （２０００））。ＴＡＦは、好ましくは、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、または酵母由来である。ＧＬＩと相互作用する好ましいＴＡＦタンパク質は、ＴＡＦＩＩ３１タンパク質である。Ｋｌｅｍｍらは、ヒトＴＦＩＩＤサブユニットをクローン化し、ｈＴＡＦＩＩ３２と名付けた（Klemm et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92(13):5788-92）。３２−ｋＤタンパク質は、ＨｅＬａ細胞核抽出物から単離され、部分的に配列決定された。同定されたｃＤＮＡは、２６４残基の推定アミノ酸配列を有し、ショウジョウバエＴＡＦＩＩ４０に関連している。Ｋｌｅｍｍらは、ＴＡＦＩＩ３２は、ＧＴＦ２Ｂおよびウイルス転写トランスアクチベーターＶＰＩ６と相互作用することを示した（Klemm et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92(13):5788-92）。この著者らは、組換えで発現されたＴＡＦＩＩ３２は、部分組換えＴＦＩＩＤ複合体中で機能的であり、この組換え複合体は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質による活性化を媒介することを示した。ＴＡＦＩＩ３２およびＴＡＦＩＩ３１は、同じタンパク質に対する２つの名称であり、これは、現在では、ＴＡＦ９とも呼ばれる。Ｌｕらは、ＴＡＦ９をクローン化し、これをＴＡＦＩＩ３１と呼んだ。ＴＡＦ９は、２６４−アミノ酸タンパク質をコードする。免疫沈降分析および結合分析により、ＴＡＦ９は、ｐ５３活性の主要な細胞の負の調節因子である、ＭＤＭ２によって結合されている部位と同一な部位で、ｐ５３のＮ末端ドメインと相互作用することが示された（Lu et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92(11):5154-8）。ヒトＴＡＦＩＩ３１ヌクレオチドおよびタンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２５１１２、Ｕ２１８５８、およびＮＭ＿０１６２８３において見出すことができる。
【００８８】
本明細書で用いる場合、用語「治療する」、「治療すること」、および「治療」には、（１）癌などの疾患を予防すること、すなわち疾患に罹る恐れがあるが、まだ疾患のあらゆる症状を経験していない対象において、疾患の臨床症状を発生させないこと；（２）疾患を阻害すること、すなわち疾患またはその臨床症状の発生を抑止または低減すること；あるいは（３）疾患を軽減すること、すなわち、疾患またはその臨床症状を退行させることが含まれる。治療は、病状、障害、または疾患の症状または病態が、寛解するか、他の方法で有利に変化する任意の様式を意味する。好ましくは、そのような治療を必要とする対象は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００８９】
「腫瘍細胞」は、腫瘍における前癌細胞、癌細胞、および正常細胞を指す。
【００９０】
用語「Ｗｎｔ」は、哺乳動物遺伝子のファミリーおよびショウジョウバエのセグメントポラリティー遺伝子、無翅に関連するコードされたタンパク質を指す。ヒトにおいて、Ｗｎｔファミリーの遺伝子は、典型的には、疎水性シグナル配列および保存されたアスパラギン連結オリゴ糖共通配列を有する、３８から４３ｋＤａのシステインに富む糖タンパク質をコードする（Shimizu et al., Cell Growth Differ 8(12):1349-58 (1997)）。Ｗｎｔファミリーは、少なくとも１９の哺乳動物メンバーを含む。代表的なＷｎｔタンパク質として、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１２、Ｗｎｔ１３、Ｗｎｔｌ４、Ｗｎｔｌ５、およびＷｎｔｌ６が挙げられる。本発明の好ましいＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ２であり、好ましくはヒトＷｎｔ２タンパク質である。
【００９１】
ＩＩ．小分子化合物
Ａ．ＧＬＩ３標的配列の選択
転写活性化ドメインは、わずかな配列相同性しか共有しておらず、その標的結合タンパク質の不在下で、折り畳み構造を一般に欠いている。本明細書で説明したように、ＧＬＩ、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３は、その転写活性化ドメイン内に見出されるα−へリックスドメインを通じて、ＴＢＰ関連因子であるＴＡＦＩＩ３１と接触すると考えられる（図３を参照されたい）。本発明の一態様では、ＧＬＩ、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３の転写活性化ドメインは、様々な種の中で個々に良好に保存されている一方で、これらのドメインの間でまったく異なっていることが理解される。例えば、トランス活性化ドメインのヒトＧＬＩ１、ＮＨ２−ＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ１、アミノ酸残基１０３７〜１０５４）とマウスＧＬＩ１、ＮＨ２−ＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥ−ＣＯＯＨ（マウスＧＬＩ１、アミノ酸残基１０４０〜１０５７）は同一である。さらに、ヒトＧＬＩ２、ＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＡＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（アミノ酸残基１５０１〜１５１８）とマウスＧＬＩ２、ＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＰＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（マウスＧＬＩ２、アミノ酸残基１５０９〜１５２６）のトランス活性化ドメインは、１つのアミノ酸残基位置でのみ異なる（イタリック体および下線）。ヒトＧＬＩ３、ＮＨ２−ＤＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ３、アミノ酸残基１４９５〜１５１２）とマウスＧＬＩ３、ＮＨ２−ＥＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤ−ＣＯＯＨ（アミノ酸残基１４９７〜１５１４）のトランス活性化ドメインも、１つのアミノ酸残基位置でのみ異なる（イタリック体および下線）。
【００９２】
しかし、ヒトＧＬＩ１、ヒトＧＬＩ２およびヒトＧＬＩ３の間に、はるかに大きな相違が存在する（アステリスクは、ヒトＧＬＩ１、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３の間の同一のアミノ酸残基を示す）。
ＮＨ２−ＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ１、アミノ酸残基１０３７〜１０５４）
ＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＡＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ２、アミノ酸残基１５０１〜１５１８）
ＮＨ２−ＤＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ３、アミノ酸残基１４９５〜１５１２）。
以下は、ヒトＧＬＩ１とヒトＧＬＩ２のＴＡＦＩＩ３１相互作用ドメインの比較である（アステリスクは、アミノ酸残基の同一性を示す）。
ＮＨ２−ＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ１、アミノ酸残基１０３７〜１０５４）
ＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＡＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ２、アミノ酸残基１５０１〜１５１８）。
【００９３】
以下は、ヒトＧＬＩ２とヒトＧＬＩ３のＴＡＦＩＩ３１相互作用ドメインの比較である（アステリスクは、アミノ酸残基の同一性を示す）。
ＮＨ２−ＤＳＱＬＬＥＡＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ２、アミノ酸残基１５０１〜１５１８）
ＮＨ２−ＤＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤ−ＣＯＯＨ（ヒトＧＬＩ３、アミノ酸残基１４９５〜１５１２）
【００９４】
説明したように、哺乳動物の骨格発生の間、ＧＬＩ２およびＧＬＩ３について、特異的ならびに重複性の機能が示されたが、例えば、ＧＬＩ３ではなくＧＬＩ１は、組織培養においてＨＮＦ−３βエンハンサーを活性化することが示された（Mo et al., 1997, Development 124:113-123; Sasaki et al., 1997, Development 124:1313-1322）。ＴＡＦ結合または結合親和性の差異は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３の異なる特性に潜在的に寄与することができるだろう。
【００９５】
Ｙｏｏｎらは、ＧＬＩ１の転写活性化ドメインは、ＦＸＸΦΦモチーフの保存を含めて、α−へリックスドメインを含むＶＰ１６転写活性化ドメインに類似していることを説明した（Yoon et al., 1998, J. Biol. Chem., 273(6):3496-3501）。ＶＰ１６活性化ドメインは、その標的タンパク質であるＴＡＦＩＩ３１に結合すると、ランダムコイルからα−へリックスへの移行の誘発を起こし、ＴＡＦＩＩ３１に直接接触すると考えられる、Ｄ４７２、Ｆ４７９、およびＬ４８３の３つの残基が同定された（Uesugi et al., 1997, Science, 277:1310-1313）。これらの３つのアミノ酸残基は、ＦＸＸΦΦ（ＦＶＡＩＬ）を含むヒトＧＬＩ１の活性化ドメイン内にも見出された（Ｄ１０４０、Ｆ１０４８、およびＬ１０５２）。
【００９６】
ＧＬＩ３におけるＦＸＸΦΦモチーフは、ＦＤＡＩＩである。ＧＬＩ３のこのモチーフは、ＴＡＦ、おそらくＴＡＦＩＩ３１と接触することにおいて直接関与する可能性が非常にある。
【００９７】
ＦＸＸΦΦモチーフは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の活性化ドメイン内およびＮＦ−ｋＢ  ｐ６５においても示された。ｐ５３の細胞アテニュエーターであるＭＤＭ２は、ｐ５３のＦＸＸΦΦモチーフと、ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５およびＶＰ１６のＦＸＸΦΦモチーフを区別し、ｐ５３活性を特異的に阻害する（Uesugi and Verdine, 1999, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(26):14801-14806）。したがって、ＦＸＸΦΦモチーフを含むポリペプチドＩの活性化ドメインは、ＦＸＸΦΦモチーフも含むが、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドＩＩの活性化ドメインから分化しうると仮定することはもっともらしいように思われる。したがって、ポリペプチドＩのＦＸＸΦΦモチーフを模倣する小分子化合物、すなわち、ポリペプチドＩのＦＸＸΦΦモチーフのアミノ酸配列を設計し、用いることによって、ポリペプチドＩ（ＧＬＩ３など）の活性を著しく阻害するが、ポリペプチドＩＩの活性を著しく阻害しないことも可能であるはずである。
【００９８】
したがって、本発明の目的は、ＧＬＩ３シグナル伝達を著しく阻害するが、ＧＬＩ１またはＧＬＩ２シグナル伝達を著しく阻害しない小分子化合物を提供することである。したがって、本発明の一態様では、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３の転写活性化の潜在能力に異なって影響を及ぼす小分子化合物が提供される。
【００９９】
本発明の一実施形態では、小分子化合物は、ＧＬＩ３のＴＡＦ、好ましくはＴＡＦＩＩ３１への結合を阻害または低減する。
【０１００】
本発明の別の実施形態では、ＧＬＩタンパク質、好ましくはヒトまたはマウスＧＬＩタンパク質のＦＸＸΦΦモチーフを模倣する小分子化合物が提供される。好ましい実施形態では、この小分子化合物は、ＧＬＩ３のＦＸＸΦΦモチーフであるＦＤＡＩＩを模倣する（図３を参照されたい）。
【０１０１】
本発明の他の実施形態では、小分子化合物は、ＧＬＩ２のＦＸＸΦΦモチーフであるＦＤＡＩＭを模倣する。本発明のなおまた別の実施形態では、小分子化合物は、ＧＬＩ１のＦＸＸΦΦモチーフであるＦＶＡＩＬを模倣する。
【０１０２】
Ｂ．本発明の小分子化合物
上述したように、本発明の目的は、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドの転写活性化ドメインを模倣する小分子化合物を提供することである。トリアリール／アルキル複素環化合物を含めた、多くのα−ヘリックス模倣体が、従来技術において記載されている。しかし、ピラゾリンに基づく、α−ヘリックスドメインを模倣する化合物は、十分に研究されていない。したがって、本発明の目的は、ピラゾリンに基づき、ＧＬＩ転写活性化ドメインのα−ヘリックスドメイン、好ましくはＧＬＩ３転写活性化ドメインのα−ヘリックスドメインを模倣する小分子化合物を提供することである。ＧＬＩ３のＦＤＡＩＩモチーフを含む提案されたα−へリックスドメインを有する本発明の小分子化合物のＲＭＳオーバーレイ（ＲＭＳ  ｏｖｅｒｌａｙ）（ＦＮ１−５；以下を参照されたい）を図３に示す。
【０１０３】
したがって、本発明の化合物には、下記式：
【化６】
2009519909.tif 000008
（式中、Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に、ＮまたはＣであり、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＮであり、Ｘ１およびＸ２のうちの１つはＣであり、環のＮは、Ｘ１およびＸ２のうちのいずれかＣであるものと二重結合を形成する）の小分子化合物が含まれる。さらに、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルからなる群から独立に選択され、それらは場合によって、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−ＮＲ７Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）およびＳ（Ｏ）ｍＲ７（下付き文字ｍは、０、１または２である）からなる群からそれぞれ独立に選択される０〜３個のＲ６基で置換されていてもよい。Ｙは、直接結合であるか、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択されるメンバーである。Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、−ＯＲ７、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、ＮＲ７Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｎ（Ｒ７）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）、−Ｃ（ＮＲ７）Ｎ（Ｒ７，Ｒ７）およびＳ（Ｏ）ｍＲ７（下付き文字ｍは、０、１または２である）である。Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、場合によって、Ｙと一緒になって５から６員の複素環を形成する。それぞれのＲ７は、独立にＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１０４】
さらに、本発明の小分子化合物の塩、水和物、溶媒和物、異性体およびプロドラッグも企図されている。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれがアリールである式の小分子化合物を提供する。さらなる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれはフェニルである。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ４がヒドロキシである式の小分子化合物を提供する。別の実施形態では、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。さらに別の実施形態では、Ｚは、アリールである。なおまた別の実施形態では、Ｚはフェニルである。
【０１０７】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のそれぞれがフェニルであり、ＹがＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＺがＣ１〜Ｃ４アルキルまたはフェニルであり、Ｒ４がヒドロキシである式の小分子化合物を提供する。
【０１０８】
したがって、本発明の好ましい小分子化合物には、それだけに限らないが、以下のものが含まれる。
【化７】
2009519909.tif 000009
2009519909.tif 000010
【０１０９】
本発明の他の化合物として、以下の小分子化合物が挙げられる。
【化８】
2009519909.tif 000011
当業者は、他の小分子化合物も本発明において有用であることを理解するだろう。
【０１１０】
Ｃ．小分子化合物の調製
本発明の小分子化合物は、ケイ皮酸エチルとベンズアルデヒドフェニルヒドラゾンの縮合、それに続く、エチルエステルのけん化およびアミンとの反応によって調製することができ、所望のアミド最終生成物をもたらす（実施例３を参照されたい）。あるいは、本発明の小分子化合物は、最初にケイ皮酸をアミンと反応させてアミドを調製し、次いでベンズアルデヒドフェニルヒドラゾンと縮合することによって調製することができる。当業者は、本発明の小分子化合物の調製のためのさらなる方法が存在することを認識するだろう。
【０１１１】
本発明の一実施形態では、本発明の小分子化合物は標識を含む。これは、インビボで投与した後に小分子化合物の分布を検出し、検査するのに特に有用である。例えば、３Ｈは、従来の薬物動態学的／薬力学的実験における標識として用いることができる。標識を含む小分子化合物は、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出することができる。
【０１１２】
本発明の小分子化合物は、そのような化合物を構成する１種または複数種の原子において、人為的な比率の原子同位体を含有することもできる。例えば、この化合物は、放射性同位元素、例えば、トリチウム（３Ｈ）または炭素−１４（１４Ｃ）などで放射標識することができる。放射性であるかないかにかかわらず、本発明の化合物のすべての同位体変種は、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
【０１１３】
Ｄ．細胞に基づいたアッセイにおける小分子化合物の試験
本発明の小分子化合物は、インビトロおよびインビボで活性をスクリーニングすることができる。インビトロアッセイについては、本発明は、本明細書に記載されるような、細胞に基づいた細胞毒性アッセイ、およびアポトーシスアッセイを提供する（例えば、実施例１を参照されたい）。インビボアッセイについては、本発明は、本明細書に記載されるような、マウス異種移植アッセイを提供する（例えば、実施例３３〜３５を参照されたい）。
【０１１４】
ＩＩＩ．医薬組成物
一態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの小分子化合物、および場合によって製薬的に許容される担体を含む医薬組成物または医薬を提供する。医薬組成物または医薬は、例えば、癌などの病状の治療のために患者に投与することができる。
【０１１５】
Ａ．処方および投与
本発明の小分子化合物は、経腸的なもしくは非経口的な適用のいずれかに適した賦形剤または担体と組み合わせた、あるいは混合したその有効量を含む薬剤組成物または薬物の製造に有用である。
【０１１６】
本発明において使用するための医薬組成物または医薬は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して標準的技術により処方することができる。適切な薬剤担体は、本明細書およびE. W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。本発明の小分子化合物およびその生理学的に許容される塩類および溶媒和物を、吸入を経て、局所的に、経鼻的に、経口的に、非経口的に、または直腸的にを含むあらゆる適切な経路による投与のために処方することができる。したがって、医薬組成物の投与は、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠内または腫瘍内注射により、注射器またはその他の器具を使用して実行してよい。吸入またはエアロゾル投与と同様に、経皮投与も企図されている。錠剤およびカプセルを経口的に、直腸的に、または経膣的に投与することができる。
【０１１７】
経口投与のためには、医薬組成物および医薬は、例えば、製薬的に許容される賦形剤を使用して従来の手段により調製される錠剤またはカプセルの形をとることができる。（ａ）希釈剤または充填剤、例えば、ラクトース、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース（例えば、エチルセルロース、微結晶性セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリル酸および／またはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム；（ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩、ステアリン酸金属塩、コロイド状二酸化ケイ素、硬化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび／またはポリエチレングリコール；また錠剤には（ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはヒドロキシプロピルメチルセルロース；必要であれば（ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン（例えば、ジャガイモデンプン、またはデンプンナトリウム）、グリコール酸、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物；（ｅ）湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびに／または（ｆ）吸収材、着色材、香料、および甘味料と共に、活性成分、すなわち本発明の小分子化合物を含む錠剤およびゼラチンカプセルが好ましい。
【０１１８】
錠剤は、当技術分野で公知の方法に従って、フィルムコートでも腸溶コートでもよい。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形をとることができるし、または、使用前は水または他の適切な溶媒との構成のために乾燥製品として提示することができる。そのような液体製剤は、製薬的に許容される添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂；乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシア；非水性溶媒、例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油；および、保存剤、例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸を使用して従来の手段により調製することができる。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、香料添加剤、着色剤、および／または甘味添加剤を含有することもできる。必要であれば、経口投与のための製剤は、活性化合物の放出制御を与えるように適切に処方することができる。
【０１１９】
吸入による投与のためには、組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示の形で都合よく送達してもよい。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達する弁を提供することにより決定することができる。例えば、化合物と適切な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの混合粉末を含有し、インヘラーまたは吸入器で使用するためのゼラチン製のカプセルおよび薬包を処方することができる。
【０１２０】
本発明の小分子化合物は、注射による、例えば、ボーラス注入または持続注入による非経口投与のために処方することができる。注射のための処方は、単位投与量の形で、例えば、保存剤を添加したアンプルでまたは多用量容器で提示することができる。注射用組成物は、好ましくは、等張水溶液または懸濁液であり、坐薬は、好ましくは、脂肪乳濁液または懸濁液から調製される。組成物は、無菌化される、かつ／あるいは、保存剤、安定化剤、湿潤剤、もしくは乳化剤などのアジュバント、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩類、および／または緩衝液を含有していてもよい。代わりに、活性成分は、使用前は適切な溶媒、例えば、無菌無発熱物質水との構成のために粉末の形になりうる。さらに、組成物は、他の治療的に価値のある物質も含有していてよい。組成物は、それぞれ従来の混合法、顆粒化法、または被膜法に従って調製され、約０．１から７５％までの、好ましくは、約１から５０％までの活性成分を含有している。
【０１２１】
経皮的適用に適した製剤には、担体と共に本発明の有効量の化合物が含まれる。好ましい担体は、宿主の皮膚の通過を支援する吸収性の薬学的に許容される溶媒を含んでいる。例えば、経皮的器具は、裏打ち材、場合によって担体を伴う化合物を含有するリザーバー、場合によって、長期間にわたり制御された所定の速度で化合物を宿主の皮膚に送達する律速バリアー、および器具を皮膚に固定する手段を含む包帯の形である。マトリックス経皮的製剤も使用してよい。
【０１２２】
局所的、例えば、皮膚および眼への適用に適した製剤は、好ましくは、当技術分野で公知の水溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。そのような製剤は、可溶化剤、安定剤、浸透圧増強剤、緩衝液および保存剤を含有してよい。
【０１２３】
化合物は、直腸組成物、例えば、坐薬または、例えば、従来の坐薬基剤、例えば、ココアバターもしくは他のグリセリドを含有する保持浣腸でも処方することができる。
【０１２４】
さらに、化合物はデポー製剤として処方することができる。そのような長時間作用製剤は、埋め込みにより（例えば、皮下にもしくは筋肉内に）、または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切な高分子もしくは疎水性材料で（例えば、許容される油中の乳剤として）、またはイオン交換樹脂で、またはやや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として処方することができる。
【０１２５】
組成物は、必要であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位投与量形状を含有することができるパックまたはディスペンサー器具で提示することができる。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔、例えば、ブリスター包装を含むことができる。パックまたはディスペンサー器具は、投与説明書を添付することができる。
【０１２６】
本発明の一実施形態では、薬剤組成物または薬物は、上で定義した本発明の有効量の化合物、および化学療法薬などの別の治療薬を含む。化学療法薬の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）があるが、これらに限定されるものではない。一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp.1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N. J.を参照されたい。
【０１２７】
本発明の小分子化合物と一緒に使用する場合、そのような化学療法薬は、個別に（例えば、５−ＦＵと小分子化合物）でも、順次に（例えば、一定時間５−ＦＵと小分子化合物を、続いて、例えば、ＭＴＸと小分子化合物を）、または、１つまたは複数の他のそのような化学療法薬と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、および小分子化合物、もしくは、５−ＦＵ、放射線療法、および小分子化合物）使用してもよい。投与は、同一または異なる投与経路によるものでも、同一薬剤処方で一緒にでもよい。
【０１２８】
本発明の一態様では、本発明の治療的有効量の小分子化合物は、外科手術と併用して、および場合によって別の化学療法薬の投与と併用して投与される。
【０１２９】
Ｂ．治療的有効量および投薬
本発明の一実施形態では、医薬組成物または医薬は、癌を予防する、治療する、または抑制するために、患者に治療有効量を投与される。医薬組成物または医薬は、患者に効果的な治療応答を誘発するに十分な量を投与される。効果的な治療応答とは、疾患の症状または合併症を少なくとも部分的に停止させるまたは遅らせる応答のことである。これを実現するために適した量は「治療的有効量」と定義される。
【０１３０】
投与される活性な小分子化合物の投与量は、温血動物（哺乳動物）の種類、体重、年齢、個体の病状、治療すべき領域の表面積、および投与の種類に依存している。用量のサイズは、特定の対象における特定の小分子化合物の投与に付随するあらゆる有害作用の存在、性質、および程度によっても決定される。約５０から７０ｋｇの哺乳動物への経口投与のための単位投与量は、約５と５００ｍｇ間の活性成分を含有してよい。典型的には、本発明の活性小分子化合物の投与量は、所望の効果を実現するに十分な投与量である。
【０１３１】
最適な投与スケジュールは、対象の身体における小分子化合物蓄積の測定値から計算することができる。一般に、投与量は１ｎｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、毎日、毎週、毎月、または毎年１回または複数回与えてよい。当業者ならば、最適投与量、投与方法、および繰返し率を容易に決定することができる。
【０１３２】
本発明の一実施形態では、本発明の小分子化合物を含む医薬組成物または医薬は、複数日間、約１ｍｇの小分子化合物／ｋｇ対象の体重（１ｍｇ／ｋｇ）〜約１ｇ／ｋｇの範囲の１日量を投与される。別の実施形態では、１日量は約５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量である。さらに別の実施形態では、１日量は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、１日量は約２５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇである。１日量は１日１回投与する、または部分用量に分けて複数用量で、例えば、１日２回、３回、もしくは４回投与することができる。
【０１３３】
所望の治療効果を実現するためには、小分子化合物は、治療的に有効な１日量で複数日間投与しなければならない。したがって、対象の癌を治療するための小分子化合物の治療的に有効な投与は、３日から２週間またはそれ以上にわたる期間持続する定期的な（例えば、毎日）投与が必要である。典型的には、小分子化合物は、少なくとも３日間連続して、多くの場合、少なくとも５日間連続して、さらに多くの場合、少なくとも１０日間、および時には、２０日間、３０日間、４０日間またはそれ以上連続して投与されることになる。連続日量は、治療的有効用量を実現するに好ましい経路であるが、治療的に有益な効果は、投与が対象における小分子化合物の治療的有効濃度を維持するほど頻繁に繰り返される限り、たとえ小分子化合物が毎日投与されなくても実現することができる。例えば、小分子化合物を、１日おきに、２日おきに、または、さらに高用量範囲を用いて対象が許容すれば、一週間に１度投与することができる。投与スケジュールは、例えば、実施例３３〜３５、および図１５〜１７に記載されている。
【０１３４】
最適投与量、毒性、およびそのような小分子化合物の治療効果は、個々の小分子化合物の相対的効力によって異なることがあり、細胞培養物または実験動物における標準的製薬法により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効量）を決定することにより決定することができる。毒性効果と治療効果間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。中毒性副作用を示す化合物を使用することはできるが、そのような化合物を罹患組織の部位に標的して、正常細胞への潜在的損傷を最小限に抑え、それによって副作用を抑える送達系を考案するよう注意を払うべきである。
【０１３５】
例えば、細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータを使用して、ヒトで使用するための投与量範囲を処方することができる。そのような小分子化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性のないＥＤ５０を含む一定範囲の血中濃度内にある。投与量は、用いる剤形および投与経路によってこの範囲内で変化しうる。本発明の方法で使用するいかなる小分子化合物にとっても、治療有効用量は、はじめに細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養で決定されるＩＣ５０（症状の最大半量の抑制を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現する用量は動物モデルで処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をもっと正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することができる。一般に、小分子化合物の投与量当量は、典型的な対象で約１ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでである。
【０１３６】
成功をおさめた治療に従って、治療している病状、例えば、癌の再発を予防するために、対象に維持療法を受けさせるのが望ましいであろう。
【０１３７】
ＩＶ．ＧＬＩタンパク質を発現する細胞の同定
Ａ．ＧＬＩタンパク質の検出
別の実施形態では、癌の検出方法は、患者などの対象由来の生体試料中のＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドのレベルを決定することを含む。好ましい実施形態では、転写活性化ドメインを含むＧＬＩ３タンパク質の活性化フラグメントのレベルが決定される。ＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、もしくはＧＬＩ３ポリペプチドのレベルの増加、または正常なレベルと比べた、ＧＬＩ３タンパク質の活性化フラグメントのレベルの増加を検出すれば、対象における癌の存在が示される。
【０１３８】
例えば、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３発現の上方調節は、種々の癌の存在を示しており、種々の癌との相関関係を認めることができる。したがって、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、もしくはＧＬＩ３ポリペプチド、またはＧｌｉ１、Ｇｌｉ２、もしくはＧｌｉ３ポリヌクレオチドは、癌診断における生物マーカーとして利用することができる。本発明の一好ましい実施形態では、生体試料中のＧＬＩタンパク質、例えば、ＧＬＩ３の量が決定される。典型的には、例えば、正常で健常な、または非癌対象から提供された生体試料中のＧＬＩ３の量は、癌対象からまたは癌を有すると疑われている対象から提供された生体試料中のＧＬＩ３の量と相互に関連付けられる。癌対象由来または癌を有すると疑われている対象由来の生体試料において検出されたＧＬＩ３の量は、所与の癌に特異的である可能性がある。
【０１３９】
例えば、ＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドの検出は、本明細書にさらに記載されている、または当業者に公知の、親和性捕捉、質量分析、ＧＬＩ３に向けられた従来の免疫アッセイ、ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、またはＨＰＬＣを含むが、これらに限定されるものではないあらゆる特異的検出法により実現することができる。
【０１４０】
この目的のために用いることができる検出パラダイムには、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリーおよび電流測定技術）、原子間力顕微鏡法、および高周波法、例えば、多極共鳴スペクトル法がある。共焦点でも非共焦点でも、顕微鏡に加えて、光学的方法を例証するのは、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、格子カプラー導波路法または干渉法）がある。
【０１４１】
Ｂ．Ｇｌｉ  ｍＲＮＡの検出
一実施形態では、癌の検出法は、患者などの対象由来の生体試料におけるＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ３ポリペプチドをコードする転写物のレベルを決定することを含む（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ００７１９１および配列番号１を参照されたい）。正常なレベルと比べた、Ｇｌｉ  ｍＲＮＡ、好ましくは、ＧＬＩ３  ｍＲＮＡのレベルの増加を検出すれば、対象における癌の存在が示される。一実施形態では、Ｇｌｉ  ｍＲＮＡのレベルを決定する工程は、増幅反応を含む。別の実施形態では、癌の存在は、細胞中でＧＬＩポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルを決定することにより評価される。対応する非癌組織中よりもＧｌｉ  ｍＲＮＡレベルが高ければ、癌の存在が示される。特定の遺伝子のＲＮＡ発現を評価する方法は当業者には公知であり、とりわけ、ハイブリダイゼーションおよび増幅ベースアッセイがある。
【０１４２】
１．直接ハイブリダイゼーションベースアッセイ
核酸ハイブリダイゼーション法を使用してＧｌｉ遺伝子転写物（ｍＲＮＡまたはそこから産生されるｃＤＮＡ）のレベルを検出しかつ／または定量化する方法は当業者には公知である。例えば、Ｇｌｉポリヌクレオチド、例えば、Ｇｌｉ３ポリヌクレオチドの存在、非存在、または量を評価するために１つの方法は、ノーザンブロットを伴う。遺伝子発現レベルも、当技術分野で公知の技法、例えば、ドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクション、プロービングＤＮＡマイクロチップアレー、等によって分析することができる。
【０１４３】
２．増幅ベースアッセイ
別の実施形態では、増幅ベースアッセイを使用して、Ｇｌｉ遺伝子、好ましくはＧｌｉ３遺伝子の発現レベルを測定する。そのようなアッセイでは、Ｇｌｉ核酸配列は増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲ）において鋳型の働きをする。量的増幅において、増幅産物の量は元の試料中の鋳型の量に比例するであろう。適切な対照との比較により、試料中のＧｌｉ  ｍＲＮＡのレベルが測定される。量的増幅の方法は当業者に公知である。量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y.に提供されている。Ｇｌｉの既知の核酸配列（例えば、本明細書のＡＴＣＣアクセッション番号を参照されたい）だけで、当業者は遺伝子のいかなる部分でも増幅するプライマーを常に選択することができる。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、例えば、実施例１におよび図２に記載されている。
【０１４４】
一実施形態では、ＴａｑＭａｎベースアッセイを使用して、癌関連ポリヌクレオチドを定量する。ＴａｑＭａｎベースアッセイは、５’蛍光染料および３’消光剤を含有する蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用する。プローブはＰＣＲ産物にハイブリダイズするが、それ自体は３’末端の遮断薬のために伸長することはできない。ＰＣＲ産物がそれに続くサイクルで増幅されると、ポリメラーゼ、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが切断される。この切断により、５’蛍光染料と３’消光剤が分離し、それによって増幅の機能として蛍光が増大する（Perkin-Elmerにより提供される文献、例えば、www2.perkin-elmer.comを参照されたい）。
【０１４５】
他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(Wu and Wallace, Genomics 4:560(1989); Landegren et al., Science 241:1077(1988); およびBarringer et al., Gene 89: 117(1990)を参照されたい)、転写増幅(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173(1989))、自家持続配列複製法(Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874(1990))、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ、等があるが、これらに限定されるものではない。
【０１４６】
Ｖ．方法
本発明の小分子化合物は、種々の形の用途がある。本発明は、本発明の小分子化合物を使用して、例えば、（ｉ）ＧＬＩポリペプチドを発現している細胞にアポトーシスを誘発する、（ｉｉ）ＧＬＩポリペプチドを発現している細胞の望ましくない成長、増殖または生存を阻害する、（ｉｉｉ）癌などの、ＧＬＩポリペプチドを発現している病状を治療する、（ｉｖ）ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する遺伝子の発現を阻害する、および（ｖ）ＧＬＩポリペプチドの活性を阻害するための方法を提供する。
【０１４７】
ＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ３ポリペプチドを発現しているいかなる細胞または腫瘍細胞も、本発明の方法を実行するために使用することができる。ＧＬＩポリペプチドを発現している好ましい細胞または腫瘍細胞は、結腸癌、メラノーマ、中皮腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、肉腫、卵巣癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、およびグリオーマ細胞からなる群から選択される。
【０１４８】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実行することができる。
【０１４９】
Ａ．小分子化合物を使用して細胞にアポトーシスを誘発する
アポトーシスは、多細胞生物の発生にも恒常性にも中心的役割を果たしている。「アポトーシス」とはプログラムされた細胞死のことであり、膜ブロビング、クロマチン凝縮および断片化、アポトーシス小体の形成、ならびに陽性「ＴＵＮＥＬ」（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ＵＴＰニック末端標識）染色パターンなどのある種の細胞の特徴に特徴付けられる。アポトーシス過程の後半工程は、細胞膜の分解であり、アポトーシス細胞は種々の色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）に対して漏れやすくなる。
【０１５０】
アポトーシスは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体／リガンドスーパーファミリーに属するいくつかの死受容体とそのリガンド間の複数の相互作用からなる最終エフェクター機構に収束する複数の独立したシグナル伝達経路により誘発することができる。最もよく特徴がわかっている死受容体は、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）、死受容体３（ＤＲ３またはＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４およびＤＲ５（ａｐｏ２−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）である。アポトーシスの最終エフェクター機構は、カスパーゼと命名された一連のプロテイナーゼの活性化である。これらのカスパーゼの活性化により、一連の生命維持に必要な細胞タンパク質が切断され、細胞死に至る。
【０１５１】
本発明は、ＧＬＩタンパク質を発現している細胞にアポトーシスを誘発するための方法を提供する。一態様では、細胞にアポトーシスを誘発するための方法は、細胞を本発明の小分子化合物を含む組成物に曝露する、または細胞を本発明の小分子化合物を含む組成物と接触させる工程を含む。好ましい実施形態では、組成物は小分子化合物ＦＮ１−５を含む。別の好ましい実施形態では、組成物は、小分子化合物ＦＮ１−８を含む。典型的には、細胞を有効量の組成物に曝露させるまたは接触させ、接触によりアポトーシスを誘発させる。好ましい実施形態では、ＧＬＩタンパク質は、ＧＬＩ２またはＧＬＩ３である。
【０１５２】
本発明の別の好ましい実施形態では、細胞を本発明の小分子を含む組成物に曝露することは、組成物を細胞に導入することを含む。
【０１５３】
本発明の別の態様では、本発明の小分子化合物を投与する工程を含み、腫瘍細胞を誘発してアポトーシスを受けさせる方法が提供される。好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−５である。別の好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−８である。
【０１５４】
好ましい実施形態では、細胞を組成物にエクスビボ（生体外）で曝露させる、またはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる。別の好ましい実施形態では、細胞を組成物にインビボ(生体内）で曝露させる、またはインビボで接触させる。
【０１５５】
Ｂ．小分子化合物を用いた細胞の望ましくない成長、増殖、または生存の阻害
ＧＬＩシグナル伝達経路を通るシグナル伝達を妨げる本発明の小分子化合物を使用した癌治療のための新規の治療戦略を提供することが本発明の目的である。本発明の一態様では、細胞の望ましくない成長、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つを阻害するための方法が提供される。この方法は、細胞がＧｌｉ遺伝子または代わりにＧＬＩポリペプチドを発現しているかどうかを決定する工程を含む。この方法は、細胞を有効量の本発明の小分子と接触させ、接触させる工程により細胞の望ましくない成長、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つが阻害される工程も含む。
【０１５６】
細胞の望ましくない成長、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つが阻害される好ましい細胞または腫瘍細胞は、結腸癌細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞、腎細胞癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肉腫細胞、卵巣癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、肝細胞癌細胞、上咽頭癌細胞、膵癌細胞、およびグリオーマ細胞からなるグループから選択される。
【０１５７】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドを発現する細胞の増殖を阻害する方法が提供される。「増殖」とは、細胞の成長、細胞もしくは病的嚢胞の複製または増殖のことである。この方法は、細胞を、細胞の増殖を阻害するに効果的な量の小分子化合物と接触させる工程を含む。好ましくは、小分子化合物のＦＮ１−５またはＦＮ１−８は、単独でも組み合わせても、細胞、好ましくは癌細胞の増殖を阻害するのに有用である。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態では、この方法はインビトロで実行される。本明細書にさらに記載するように、本発明の方法はインビボでも実行することができる。
【０１５９】
多くの腫瘍が転移を形成する。したがって、本発明の別の態様では、本発明の小分子化合物を使用して、転移の形成を妨げる。この方法は、本発明の小分子化合物を腫瘍細胞に投与し、その投与により転移を妨げる工程を含む。好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−５である。別の好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−８である。
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態では、ＧＬＩタンパク質を発現し、本発明の小分子化合物と接触されている細胞は、結腸癌、メラノーマ、中皮腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、肉腫、卵巣癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、およびグリオーマ細胞からなるグループから選択される癌細胞である。好ましい癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、またはメラノーマ細胞である。
【０１６１】
Ｃ．小分子化合物を用いた癌の治療
本発明の方法はインビトロおよびインビボで実行することができる。したがって、本発明の別の態様では、癌性疾患を患っている対象を治療するための方法が提供される。この方法は、癌性疾患がＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現することにより特徴付けられる対象に治療的有効量の小分子化合物を投与し、投与の工程により対象を治療する工程を含む。
【０１６２】
本明細書で明らかにするように、大半の癌がＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドを発現する（図２、データは示されていない）。したがって、対象の大半の癌性疾患または癌は、本発明の小分子化合物を使用して治療することができる。好ましい癌性疾患または癌は、結腸癌、メラノーマ、中皮腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、肉腫、卵巣癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵癌、およびグリオーマ細胞からなるグループから選択される。
【０１６３】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している結腸癌を患っている対象を治療する。
【０１６４】
本発明の別の好ましい実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している乳癌を患っている対象を治療する。
【０１６５】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している上咽頭癌を患っている対象を治療する。
【０１６６】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している肺癌を患っている対象を治療する。肺癌には、気管支原性肺癌［扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌］、肺胞［細気管支］癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、ＳＣＬＣ、およびＮＳＣＬＣがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１６７】
本発明の別の実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している肉腫を患っている対象を治療する。肉腫には、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、および奇形腫などの癌があるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
本発明のさらに別の実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している消化器癌を患っている対象を治療する。消化器癌には、食道［扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫］、胃［癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫］、膵臓［導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍］、小腸［腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫］、および大腸［腺癌、管状腺腫、静脈腺腫、過誤腫、平滑筋腫］の癌があるが、これらに限定されるものではない。
【０１６９】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している泌尿生殖器系の癌を患っている対象を治療する。泌尿生殖器系の癌には、腎臓［腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病、腎細胞癌］、膀胱および尿道［扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌］、前立腺［腺癌、肉腫］、ならびに精巣［精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、ライディッヒ細胞腫、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫］の癌があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７０】
本発明の別の実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している肝臓癌を患っている対象を治療する。肝臓癌には、肝細胞癌、肝管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、および血管腫があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７１】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している皮膚癌を患っている対象を治療する。皮膚癌には、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、母斑、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、および乾癬があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７２】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している婦人科癌を患っている対象を治療する。婦人科癌には、子宮［子宮内膜癌］、子宮頚部［子宮頚癌、前浸潤子宮頚部異形成］、卵巣［卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜癌、明細胞腺癌、未分類癌腫）、顆粒膜莢膜細胞腫、セルトリライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫および他の胚細胞腫瘍］、外陰部［扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ］、膣［明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）］、ならびにファロピウス管［癌腫］の癌があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７３】
本発明のさらに別の実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している骨癌を患っている対象を治療する。骨癌には、骨原性肉腫［骨肉腫］、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫［細網肉腫］、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫［骨軟骨外骨腫］、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、および巨細胞腫があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７４】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している神経系の癌を患っている対象を治療する。神経系の癌には、頭蓋骨［骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、骨パジェット病］、髄膜［髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症］、脳［星細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、脳室上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍］、および脊髄［神経線維腫、髄膜腫、グリオーマ、肉腫］の癌があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７５】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している血液癌を患っている対象を治療する。血液癌には、血液［骨髄性白血病（急性および慢性）、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群］、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）の癌があるが、これらに限定されるものではない。
【０１７６】
本発明の一実施形態では、小分子化合物を使用して、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している副腎の癌を患っている対象を治療する。副腎の癌には、神経芽細胞腫があるが、これに限定されるものではない。
【０１７７】
本発明は、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドが発現されている癌の治療または予防のための方法を提供する。本発明の一実施形態では、この方法は、患者に薬剤組成物を投与する工程を含む。そのような薬剤組成物は、例えば、本発明の小分子化合物を含む。好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−５である。別の好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−８である。本発明の薬剤組成物は、単独で、または１つまたは複数の追加の治療化合物または治療と組み合わせて投与される。そのような治療組成物または治療の例には、タキソール、シクロホスファミド、タモキシフェン、フルオロウラシルおよびドキソルビシンがあるが、これらに限定されるものではない。さらに、他の化学療法薬が本明細書に記載されている。
【０１７８】
癌の治療法は、場合によって、以下の工程、すなわち、個体から組織または体液の生体試料を得る工程；例えば、生体試料をＧＬＩ１、ＧＬＩ２、もしくはＧＬＩ３に向けられた抗体と接触させることにより、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、もしくはＧＬＩ３ポリペプチドの発現を求めて生体試料をスクリーニングする工程；または、例えば、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、もしくはＧｌｉ３  ｍＲＮＡを検出することにより、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、もしくはＧｌｉ３ポリヌクレオチドの発現を求めて生体試料をスクリーニングする工程のうちの１つまたは複数を含んでいてよい。
【０１７９】
多くの癌は、はじめに本明細書に記載の化学療法薬を使用して治療される。しかし、非常に多くの場合、癌はそのような化学療法薬に対して耐性になり、そのときには化学療法薬はもはや有効ではなくなる。したがって、一実施形態では、癌は多剤耐性癌、または他の点で治療に対して抵抗性の癌である。したがって、本発明の別の態様では、本発明の小分子化合物を使用して、腫瘍細胞における化学療法薬に対する耐性を克服する。この方法は、少なくとも１種類の化学療法薬に耐性の腫瘍細胞に本発明の小分子化合物を投与し、投与によりそれに続いて細胞死をもたらす工程を含む。好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−５である。別の好ましい実施形態では、小分子化合物はＦＮ１−８である。
【０１８０】
Ｄ．ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する遺伝子の発現阻害
ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドは転写活性因子として機能するために、本発明の方法によるＧＬＩ転写活性の阻害は、下流遺伝子、すなわち、発現がＧＬＩにより、好ましくはＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３により調節される遺伝子の発現も阻害するまたは下方調節するはずである。ＧＬＩは、典型的に、下流遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー配列に作動可能に連結した同族のＤＮＡ結合部位に結合することにより、下流遺伝子の発現を調節する。例えば、ＧＬＩ３のＤＮＡ結合部位はすでに記載されている(Vortkamp et al. 1995, DNA Cell, Biol. 14:629-34; Hallikas et al., 2006, Cell 124(1):47-59)。
【０１８１】
本発明の一態様では、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３下流遺伝子が同定される。本発明によれば、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３下流遺伝子の同定は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３によって調節されていると疑われている遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域のＤＮＡ塩基配列決定により実現される。ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３が発現されているまたは過剰発現されている癌では、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３下流遺伝子も発現されているまたは過剰発現されていると予想される。ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有するＧＬＩ下流遺伝子も、ゲノムを断片化し、得られたフラグメントを当技術分野で公知のゲルシフトアッセイにおけるプローブとして使用することにより同定することができる。そのようなアッセイで同定されたいかなるフラグメントも、増幅し、同定し、かつ／または核酸プローブとして使用して、例えば、当技術分野で公知のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、フラグメントが生じた元の遺伝子を求めてスクリーニングし同定することができる。哺乳動物エンハンサーエレメント内のＧＬＩ結合部位、および、したがってＧＬＩ標的遺伝子を同定するための代替法は、エンハンサーエレメントロケーターである（EEL; Hallikas et al., 2006, Cell 124:47-59）。例えば、Ｈａｌｌｉｋａｓらは、マウスからヒトまでの、およびラットからヒトまでのアラインメントに保存されている２つ以上のＧＬＩ結合部位のあるいくつかのエンハンサーエレメントを同定した。これらのエンハンサーエレメントは、外嚢胞複合体成分Ｓｅｃ５（ＳＥＣ５Ｌ１）、ＮＵＬＬ（ＮＭ_０１８２７１；ＮＭ_１４４９６２）、初期増殖応答タンパク質３（ＥＧＲ−３）（ジンクフィンガータンパク質パイロット）（ＥＧＲ３）、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１０（ＰＲＤＭ１０）、Ｔ−ｂｏｘ転写因子ＴＢＸ２（Ｔ−ｂｏｘタンパク質２；ＴＢＸ２）、ＳＯＸ−１３タンパク質（１型糖尿病自己抗原ＩＣＡ１２）（島細胞抗原１２）（ＳＯＸ１３）、パッチドタンパク質ホモログ１（ＰＴＣ１）（ＰＴＣ）（ＰＴＣＨ）、ならびにＤＡＮおよびサーベラスに関連したタンパク質（ＮＭ_０２２４６９）などのＧＬＩ標的遺伝子に関連している。したがって、本発明の小分子化合物を使用して、これらの標的遺伝子のいずれの発現も阻害することができる。
【０１８２】
したがって、本発明の一実施形態では、そのプロモーターおよび／またはエンハンサー配列に作動可能に連結したＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３  ＤＮＡ結合部位を有するＧＬＩ下流遺伝子が阻害される。下流遺伝子の阻害は、ＧＬＩシグナル伝達を阻害するための本発明の方法を使用することにより実現される。具体的には、本発明は、ＧＬＩ３下流遺伝子の発現を阻害するための、ＧＬＩ３下流遺伝子を発現している細胞に本発明の小分子化合物を投与する工程を含み、投与によりＧＬＩ３下流遺伝子の発現が阻害される方法を提供する。場合によって、この方法はＧＬＩ３下流遺伝子の阻害を検証する工程を含む。これは、ＲＴ−ＰＣＲまたはウェスタンブロット分析などの当技術分野の方法を使用して実施することができる。
【０１８３】
Ｈａｌｌｉｋａｓら(Hallikas et al., 2006, Cell, 124:47-59)により同定されたＧＬＩ標的遺伝子に加えて、本発明は、Ｗｎｔ２遺伝子もＧＬＩ標的遺伝子、すなわち、ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有すると同定した（本明細書の実施例を参照されたい）。したがって、本発明の一実施形態では、下流遺伝子はＷｎｔ遺伝子であり、好ましくは、Ｗｎｔ−２遺伝子、およびさらに好ましくは、ヒトＷｎｔ２遺伝子である。この実施形態では、ＧＬＩ３シグナル伝達の阻害により、Ｗｎｔ−２の他にＷｎｔ−２シグナル伝達も阻害される、または下方調節される。Ｗｎｔ−２シグナル伝達の阻害は、例えば、米国特許出願第１０／６７８，６３９号および米国特許出願第１１／１３１，４２５号に記載のＤｖｌおよびβ−カテニンの発現に影響を与える。
【０１８４】
ＧＬＩ３はＧＬＩ１およびＧＬＩ２の上流で機能し、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内のＧＬＩ３  ＤＮＡ結合部位への結合を通じてＧｌｉ１およびＧｌｉ２遺伝子の転写を調節するようにも思われる。したがって、ＧＬＩ３、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２によるシグナル伝達は平行してはおらず、むしろ同一シグナル伝達経路内にある。したがって、本発明の一実施形態では、下流遺伝子はＧｌｉ１遺伝子であり、好ましくは、ヒトＧｌｉ１遺伝子である。この実施形態では、ＧＬＩ３シグナル伝達の阻害により、Ｇｌｉ１発現の他にＧＬＩ１シグナル伝達も阻害される、または下方調節される。
【０１８５】
本発明の別の実施形態では、下流遺伝子はＧｌｉ２遺伝子であり、好ましくはヒトＧｌｉ２遺伝子である。この実施形態では、ＧＬＩ３シグナル伝達の阻害により、Ｇｌｉ２発現の他にＧＬＩ２シグナル伝達も阻害される、または下方調節される。
【０１８６】
Ｅ．ＧＬＩポリペプチドの活性を阻害する
ＧＬＩポリペプチドは本明細書に記載のいくつかの生物活性を有する。本発明の一態様では、ＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドの活性を阻害するための方法が提供される。この方法は、ＧＬＩポリペプチドを本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドの活性を阻害する工程を含む。本発明の別の実施形態では、この方法は、ＧＬＩポリペプチドを発現している細胞を本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドの活性を阻害する工程を含む。
【０１８７】
例えば、ＧＬＩポリペプチドは転写活性化タンパク質であり、典型的には、ＴＡＴＡ結合タンパク質付随因子（ＴＡＦ）への結合または相互作用を通じてその転写活性化潜在力を発揮する。したがって、本発明の一態様では、ＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドの活性を阻害するための方法は、ＧＬＩポリペプチドを本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドのＴＡＦへの結合、またはＧＬＩポリペプチドのＴＡＦとの相互作用を阻害する工程を含む。本発明の別の実施形態では、この方法は、ＧＬＩポリペプチドを発現している細胞を本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドのＴＡＦへの結合、またはＧＬＩポリペプチドのＴＡＦとの相互作用を阻害する工程を含む。
【０１８８】
ＧＬＩポリペプチドは転写活性化タンパク質であり、典型的には、ＣＢＰなどのコアクチベーターへの結合またはコアクチベーターとの相互作用を通じてその転写活性化潜在力の一部を発揮する。したがって、本発明の一態様では、ＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドの活性を阻害するための方法は、ＧＬＩポリペプチドを本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドのコアクチベーターへの結合、またはＧＬＩポリペプチドのコアクチベーターとの相互作用が阻害される工程を含む。本発明の別の実施形態では、この方法は、ＧＬＩポリペプチドを発現している細胞を本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドのコアクチベーターへの結合、またはＧＬＩポリペプチドのコアクチベーターとの相互作用を阻害する工程を含む。
【０１８９】
本明細書に記載するように、ＧＬＩポリペプチドは転写活性化タンパク質であり、典型的にはＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位への結合を通じてその転写活性化潜在力を発揮する。したがって、本発明の別の態様では、ＧＬＩポリペプチド、好ましくは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドの活性を阻害するための方法は、ＧＬＩポリペプチドを本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドのＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位への結合を阻害する工程を含む。本発明の別の実施形態では、この方法は、ＧＬＩポリペプチドを発現している細胞を本発明の小分子化合物と接触させ、それによりＧＬＩポリペプチドのＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位への結合を阻害する工程を含む。
【０１９０】
ＧＬＩポリペプチドの活性の阻害はインビトロまたはインビボで実行可能である。
【０１９１】
Ｆ．薬剤組成物または薬物の製造における小分子化合物の使用
本発明の別の態様は、病状、例えば、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している癌の治療的なおよび／または予防的な処置のための、薬剤組成物または薬物の製造における本発明の小分子化合物の使用を提供する。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明は、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドを発現する癌細胞にアポトーシスを誘発するための薬剤組成物または薬物の製造における小分子化合物の使用を提供する。
【０１９３】
別の関連する態様では、本発明は、ＧＬＩポリペプチド、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドを発現している癌の治療のために、別の化学療法的抗癌剤と組み合わせて使用するための、薬剤組成物または薬物の製造における小分子化合物の使用を提供する。本発明により提供される薬剤組成物または薬物は本明細書に記載されている。
【０１９４】
Ｇ．ＧＬＩタンパク質活性のモジュレーターのためのスクリーニング
阻害剤および活性化剤は、本明細書ではＧＬＩタンパク質活性のモジュレーターと呼ばれるが、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の方法を使用して同定される。いくつかの異なるスクリーニングプロトコルを使用して、ＧＬＩポリペプチドの活性を調節する本明細書に記載の化合物以外の追加の化合物を同定することができる。用語「調節する」は、適切な対照と比べた場合のＧＬＩポリペプチドの測定された活性の増加または減少を包含する。
【０１９５】
これらのスクリーニングプロトコルは、細胞、特に哺乳動物細胞、具体的にはヒト細胞において、さらに好ましくは、ヒト癌細胞において使用することができる。一般用語では、スクリーニング法は、種々の化合物をスクリーニングして、ＧＬＩポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する。方法は一般に、（ａ）候補化合物をＧＬＩポリペプチド、ＧＬＩポリペプチドを含む試料、またはＧＬＩポリペプチドを発現している哺乳動物細胞と接触させる工程、および（ｂ）候補化合物の存在の下でＧＬＩポリペプチドの活性をアッセイする工程を含む。適切な対照（例えば、候補化合物の不在の下でのＧＬＩポリペプチド、候補化合物の不在の下でのＧＬＩポリペプチドを含む試料、または候補化合物の不在の下でのＧＬＩポリペプチドを発現している哺乳動物細胞）におけるＧＬＩポリペプチドの活性と比べた測定される活性の増加または減少は、候補化合物がＧＬＩポリペプチドの活性を調節することを示すものである。候補化合物または候補薬剤が本発明のスクリーニング法のうちの１つで同定されると、それは候補化合物または候補薬剤ではなく、典型的に化合物または薬剤と呼ばれる。
【０１９６】
ＧＬＩポリペプチド活性を所望の程度にまで増加させるまたは減少させる化合物を、さらに研究するために選択し、細胞有効性、薬物動態学的分析、細胞傷害性、生体適合性、等を評価してもよい。
【０１９７】
好ましい態様では、スクリーニング法は、候補化合物をスクリーニングして、ＧＬＩポリペプチドの活性を阻害するまたは減少させる化合物を同定する。別の態様では、スクリーニング法は、候補化合物をスクリーニングして、ＧＬＩポリペプチドの活性を増加させる化合物を同定する。
【０１９８】
一態様では、本発明は、ＧＬＩタンパク質活性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。本発明の好ましい方法は、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質間のタンパク質間相互作用を調節することができる候補化合物を同定するための方法である。一実施形態では、この方法は、候補化合物を、ＧＬＩタンパク質およびＴＡＦＩＩ３１タンパク質を含む試料と接触させる工程、およびＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合を決定する工程を含む。候補化合物の不在の下でのＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合と比べて、候補化合物の存在の下でのＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合が減少していれば、候補化合物は、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質間の相互作用を阻害できることが示される。候補化合物の不在の下でのＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合と比べて、候補化合物の存在の下でＧＬＩタンパク質のＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合が増加していれば、候補化合物は、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質間の相互作用を増加させることができることが示される。
【０１９９】
一実施形態では、ＧＬＩタンパク質活性は、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性であり、その方法は、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性を調節する化合物を同定することを目的とする。方法は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位を有する発現レポーターコンストラクトを含む試料を候補化合物と接触させる工程、および、ＧＬＩタンパク質依存性転写活性のレベルに対する候補化合物の効果を、もしあれば、決定する工程を含む。
【０２００】
当技術分野で公知の多くのレポーター遺伝子を使用してよい。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ（クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、およびβ−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）があるが、これらに限定されるものではない。
【０２０１】
例えば、免疫沈降アッセイおよび転写アッセイなどの、本明細書に記載の結合アッセイ（例えば、実施例３５を参照されたい）を使用して、候補化合物の不在または存在の下でのＧＬＩポリペプチドのＴＡＦＩＩ３１タンパク質への結合の調節を評価することができる。原則として、本明細書に記載のアッセイは、これらのアッセイで分析される小分子化合物が、試験する候補化合物で置き換えられるスクリーニングプロトコルで用いることができる。
【０２０２】
本明細書に記載するように、ＧＬＩタンパク質活性を阻害すると、癌細胞のアポトーシスをもたらすことができる。したがって、本発明のさらに別の態様では、アポトーシスを誘発するための候補化合物を同定するための方法が提供される。この方法の好ましい実施形態では、方法は、（ａ）ＧＬＩポリペプチドを候補化合物と接触させる工程、および（ｂ）候補化合物がＧＬＩポリペプチドに結合し、ＧＬＩポリペプチドの活性を阻害しているかどうかを決定する工程を含み、そこでは、ＧＬＩポリペプチドに結合している、またはＧＬＩポリペプチドの活性を阻害している候補化合物は、アポトーシスを誘発するに有用な候補化合物である。
【０２０３】
場合によって、本明細書に記載の候補化合物を同定するための方法は、ＧＬＩポリペプチドに結合する、またはＧＬＩポリペプチドの活性を調節する化合物を選択する工程を含む。
【０２０４】
アポトーシスを誘発するに有用であり、本明細書に記載する方法により同定される候補化合物は、本明細書に記載のアポトーシスアッセイおよび当技術分野で公知のアッセイを使用することにより評価することができる。
【０２０５】
候補化合物は、トリパンブルー色素排除、ＭＴＴ（［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド］）アッセイ、等などの公知のアッセイを使用して、候補化合物が正常細胞（例えば、非癌細胞）に対して示す可能性のあるあらゆる細胞傷害活性を評価される。細胞傷害活性を示さない化合物は候補化合物と見なされる。
【０２０６】
ａ）化合物のクリーニング
上記のスクリーニング法および本明細書に記載のアッセイに加えて、本発明のスクリーニング法の別の実施形態では、細胞を利用したツーハイブリッドシステムを使用してよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドシステム」、「哺乳動物ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドアッセイキット」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲワンハイブリッドシステム」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰツーハイブリッドベクターシステム」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；Dalton and Treisman, 1992, Cell 68:597-612; Fields and Sternglanz, 1994, Trends Genet 10:286-92も参照されたい）。
【０２０７】
ツーハイブリッドシステムでは、例えば、ＧＬＩポリペプチドは、ＳＲＦ−結合領域またはＧＡＬ４−結合領域に融合され、酵母細胞で発現される。ＧＬＩポリペプチドに結合するＴＡＦＩＩ３１ポリペプチドは、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合され、酵母細胞で発現もされる。代わりに、ＧＬＩポリペプチドに結合するＴＡＦＩＩ３１ポリペプチドは、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合されてもよく、ＧＬＩポリペプチドがＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合されてもよい。試験化合物が、ＧＬＩポリペプチドとＴＡＦＩＩ３１ポリペプチド間の結合を阻害しない場合、２種類の結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子として、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などは、ＨＩＳ３遺伝子の他に使用することができる。代わりに、試験化合物が、ＧＬＩポリペプチドとＴＡＦＩＩ３１ポリペプチド間の結合を確かに阻害する場合、２種類のポリペプチドの非結合も検出可能である（例えば、ｌａｚＺ遺伝子が発現していなければ白色の酵母コロニーが生じ、ｌａｃＺ遺伝子が発現していると青色のコロニーを生じる）。
【０２０８】
いかなる試験化合物も、例えば、細胞抽出物、細胞培養上澄み、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製または未精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物および天然化合物は、本発明のスクリーニング法において使用することができる。本発明の試験化合物は、（１）生物学的ライブラリー、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相または溶液相ライブラリー、（３）解析を必要とする合成ライブラリー法、（４）「ワンビーズワンコンパウンド」ライブラリー法、および（５）アフィニティークロマトグラフ選別を使用する合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのどれを使用しても入手することができる。アフィニティークロマトグラフ選別を使用する生物ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定され、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145）。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野に見ることができる(DeWitt et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:6909; Erb et al., 1994, Pro. Natl Acad Sci USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J Med Chem 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carell et al., 1994, Angew Chem Int. Ed Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew Chem Int Ed. Engl. 33:2061; Gallop et al., 1994, J Med Chem 37:1233)。化合物のライブラリーは、水溶液(Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412を参照されたい)またはビーズ上で(Lam, 1991, Nature 354:82)、チップ(Fodor, 1993, Nature 364:555)、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４０３，４８４号；および米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド(Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865)、またはファージ(Scott and Smith, 1990, Science 249:386; Devlin, 1990, Science 249:404; Cwirla et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:6378; Felici, 1991, J Mol Biol 222:301; 米国特許出願公開第２００２０１０３３６０号)で提示してよい。本発明のスクリーニング法に従って細胞またはタンパク質に曝露される試験化合物は、単一化合物でもよいし、化合物の組合せでもよい。化合物の組合せが本発明のスクリーニング法において使用される場合、化合物は順次にまたは同時と接触させてよい。
【０２０９】
本発明のスクリーニング法により単離される化合物は、アポトーシスを誘発するための、および癌などの本明細書に記載する病態を治療するまたは予防するための、ＧＬＩポリペプチドの活性を調節する薬剤の候補である。本発明の本スクリーニング法により得られる化合物の構造の一部が、付加、欠失および／または置換により変換される化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる化合物に含まれる。
【０２１０】
天然に存在するＧＬＩポリペプチドも組換えＧＬＩポリペプチドも、本発明の方法を実行するのに使用することができる。
【０２１１】
本明細書に記載する方法により同定される化合物、薬剤、またはアンタゴニストを試験し、アッセイするための方法は、本明細書に提供されており、所与の化合物、薬剤、または小分子化合物が本発明の方法を実行するに有用であるかどうかを決定するための種々の認められた試験を伴う。本発明の方法は、場合によって、ｍＲＮＡ（例えば、核酸ハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲにより）などの核酸、ポリペプチド（例えば、ウェスタンブロット、免疫学的アッセイ、もしくは質量分析により）、酵素活性（例えば、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子産物の酵素活性）、またはアポトーシスの誘発もしくは阻害を検出する工程を含んでよい。これらの検出法は、当技術分野で公知である。
【０２１２】
ＶＩ．キット
上で提案されている診断的、研究的、および治療的適用で使用するために、キットも本発明により提供される。診断的および研究的適用では、そのようなキットは以下の：アッセイ試薬、緩衝液、本発明の小分子化合物、ＧＬＩポリペプチド、Ｇｌｉ核酸、抗ＧＬＩ抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび／もしくはプライマー、Ｇｌｉ発現コンストラクト、等のいずれでもまたはすべてを含んでいてよい。治療薬は、無菌食塩水または別の薬学的に許容される乳濁液および懸濁液ベースを含んでいてよい。
【０２１３】
さらに、キットは、本発明の方法の実行のための使用法（すなわち、プロトコル）を含有する指示資料を含んでいてよい。指示書は種々の形でサブジェクトキットに存在していてよく、そのうちの１つまたは複数の形の指示書がキット内に存在していてよい。指示資料は典型的には、書かれたまたは印刷された資料を含むが、そうしたものに限定されるものではない。そのような指示書を蓄え、それを最終使用者に伝えることができるあらゆる媒体が本発明では企図されている。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）、等があるが、これらに限定されるものではない。そのような媒体は、そのような指示資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでいてよい。
【０２１４】
キットの対象となる使用者および使用者の特定の要求により、広範囲のキットおよび化合物を本発明に従って調製することができる。
【０２１５】
本発明の好ましい実施形態では、キットは薬剤キットであり、（ｉ）小分子化合物、好ましくは、ＦＮ１−５またはＦＮ１−８、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物を含む。薬剤キットは、場合によって、薬剤組成物は、ＧＬＩポリペプチドまたはＧｌｉ核酸、好ましくはＧＬＩ３ポリペプチドまたはＧｌｉ３核酸を発現している癌を治療するために使用できることまたは使用するべきであることを記載する指示書を含む。
【０２１６】
本発明に従ったキットは、質量分析を実行するための試薬をさらに含んでいてよい。そのような試薬は、当業者に公知であり、例えば、プローブまたはチップを含む。
【０２１７】
本発明の追加のキット実施形態は、当業者が本明細書に記載の方法の変法のいずれでも実行することを可能にすると考えられる任意選択の機能的成分を含む。
【０２１８】
先述の発明は、明確さと理解のために図示および実例によってかなり詳細に記載されているが、必ずしも本発明の精神と範囲から逸脱することなく、等価物のある種の変動、変化、修正および置換をそれに加えられることは、本発明の教えに照らして当業者には容易に明らかになるであろう。その結果、本明細書に記載の実施形態は、この文書に付記する特許請求の範囲を参照するだけで決定される本発明の範囲で、種々の修正、変化、等を受ける。当業者は、変化させ、変更し、または修正することができても本質的に類似の結果を生じる重要ではない種々のパラメーターを容易に認識するであろう。
【０２１９】
本発明の要素はそれぞれが複数の実施形態を含有するものとして本明細書に記載されているが、他の方法で指示されなければ、本発明の所与の要素の実施形態はそれぞれが、本発明のその他の要素の実施形態それぞれと共に使用することができ、そのような使用はそれぞれが本発明の異なる実施形態を形成するよう意図されていることを理解すべきである。
【０２２０】
この明細書に引用するすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願それぞれが、参照により組み込まれるように具体的におよび個々に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０２２１】
上記の開示から認識されるように、本発明は広範囲の適用を有する。本発明は、以下の実施例によりさらに例証されるが、実施例は説明的にすぎず、本発明の定義と範囲を決して限定することを意図するものではない。
【０２２２】
ＶＩＩ．実施例
実施例１：一般的方法
Ａ．細胞系
ヒト細胞系の多くは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州、マナサス、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手した。これら細胞系には、以下を含む：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞Ａ５４９、Ｈ１７０３、Ｈ４６０、Ｈ３５８、Ｈ３２２、Ｈ８３８、Ｈ１２９９、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、およびＡ４２７；中皮腫細胞２１１Ｈ、Ｈ５１３、Ｈ２０５２、Ｈ２８、およびＭｅｔ５Ａ；結腸癌細胞ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、Ｌｏｖｏ、およびＣａＣＯ２；乳癌細胞ＭＣＦ７、ＨｕＬ１００、ＳＫＢＲ−３、およびＢＴ４７４；肉腫ＭＧ−６３、ＭＮＮＧ、Ａ−２０４、およびＳＪＳＡ−１；黒色腫細胞ＬＯＸ、ＦＥＭ、ＦＥＭＸ、Ａ３７５、Ｇ３６１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、およびＭａｌｍｅ−３Ｍ、ヒト正常皮膚線維芽細胞、Ｍａｌｍｅ−３；腎細胞癌細胞７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ、７６９−Ｐ、Ａ７０４、およびＯＭＲＣ３；前立腺癌細胞系ＬｎＣＡＰ；神経膠腫細胞系Ｕ８７、肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２およびＳＫ−Ｈｅｐ−１；正常筋肉細胞系；正常腎細胞系ＨＲＥ１５２およびＨＫ−２。他のヒト中皮腫癌細胞系Ｈ２９０およびＭＳ−１は米国立保健研究所（メリーランド州、フレデリック、ＮＩＨ）から入手し、ＬＲＫ１ＡおよびＲＥＮはペンシルベニア大学（ペンシルベニア州、フィラデルフィア）のＳｔｅｖｅｎ  Ａｌｂｅｌｄａ博士研究室のご好意により提供された。正常中皮細胞系ＬＰ−９は、バーバード大学（マサチューセッツ州、ボストン）の細胞培養コア施設から入手した。ヒト膵癌細胞系ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ４．２１、ＣＦＰＡＣ−１、およびＬ３．６ｓｌは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州、サンフランシスコ）のＭａｔｔｈｉａｓ  Ｈｅｂｒｏｋ博士研究室のご好意により提供された。ヒト上咽頭癌細胞系ＨＮＥ−１およびＨＯＮＥ−１は、オハイオ州立大学（オハイオ州、コロンバス）のＲｏｎａｌｄ  Ｇｌａｓｅｒ博士のご好意により提供された。ヒト胃癌細胞系、ＮＵＧＣ３、ＭＮＫ２８、およびＡＧＳは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州、サンフランシスコ）のＸｉｎ  Ｃｈｅｎ博士のご好意により提供された。食道癌細胞系ＳＥＧ−１、ＴＥ−７、ＢＩＣ−１、およびＯＥ２１は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州、サンフランシスコ）のＭｉｃｈａｅｌ  Ｋｏｒｎ博士のご好意により提供された。卵巣癌細胞系ＡＺ２３２４７は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州、サンフランシスコ）のＫａｒｅｎ  Ｓｍｉｔｈ−ＭｃＣｕｎｅ博士のご好意により提供された。
【０２２３】
細胞系の多くは、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０中で常套的に培養したが、例外として、ＬＰ−９は、１５％ＣＳに１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび０．４μｇ／ｍｌのＨＣを含むＭ１９９中で培養した；卵巣癌細胞系ＡＺ２３２４７は、１０％ウシ胎仔血清（ＵＣＳＦ細胞培養施設製）を添加したＭ１５培地中で培養した；正常腎細胞系ＨＲＥ１５２は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を添加したαＭＥＭ中で培養した；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社（メリーランド州、ウォーカースビル）から入手した正常ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）および気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）（初代培養）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製ＳＡＧＭ（商標）Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔにより培養した。５％ＣＯ２による加湿インキュベータ中３７℃で、すべての細胞系を培養した。
【０２２４】
Ｂ．組織試料
摘出直後の癌組織および隣接する正常組織は、初回の治癒的腫瘍切除を受ける患者から、手術時に採取し（ＩＲＢ認証第Ｈ８７１４−１５３１９−０４０号）、ただちに液体窒素により瞬時凍結した。これら組織試料は、その後の使用まで液体窒素により−１７０℃で保管した。初代組織培養液は、以下の手順で調製した：切除を受ける患者からの同意により摘出直後の癌細胞を取得し、小片（直径１〜２ｎｍ）に切り分けた後、製造元のプロトコルに従い、コラゲナーゼＡ（インディアナ州、インディアナポリス、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）により室温で２時間消化する。消化による単細胞を遠沈し、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０を用いて細胞ペレットを２度洗浄した。次いで、同じ培地に細胞を再懸濁させ、その後の処理の準備ができるまで、５％ＣＯ２による加湿インキュベータ中３７℃の６ウェルプレートにより培養した。
【０２２５】
Ｃ．細胞生存率アッセイ（細胞ベースの細胞毒性アッセイ）
典型的な手順として、本発明による小分子化合物を濃度３０ｍＭのＤＭＳＯ中に溶解した。次いで、該小分子化合物を、０ｕＭから、１０、３０、５０、１００ｕＭの範囲の各濃度の細胞培養条件下で調べた。処理後の細胞生存率を測定するため、細胞を６ウェルプレート中の該小分子化合物で約３日間インキュベートした。細胞培養培地の除去後、１ｍｌの０．５％クリスタルバイオレット液（２０％エタノールおよび２０％メタノールで調製）を添加して、５分間細胞を染色した。次いで、清浄な水道水でクリスタルバイオレット溶液をすすいだ。細胞生存率は、クリスタルで染色されたプレートの密度に基づいて推定した。
【０２２６】
増殖または細胞毒性アッセイにおける生存細胞数測定のための別のアッセイは、比色分析法としてのＭＴＳアッセイであった。ＭＴＳアッセイ試薬は、市販品を入手できた（ウィスコンシン州、マジソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）。該試薬は、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム分子内塩：ＭＴＳ］および電子結合試薬（エト硫酸フェナジン：ＰＥＳ）を含有した。ＰＥＳは、化学的安定性を高めることで、ＭＴＳと結合し、安定的な溶液を生成する。ＭＴＳテトラゾリウム化合物（Ｏｗｅｎ試薬）は、細胞が、組織培養培地内で可溶性の有色フォルマザン産物に生体還元した。この変換は、代謝活性細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素が産生するＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨによっても達することができる。４９０ｎｍにおける吸光度により測定したフォルマザン産物の量は、培養液中の生細胞数に直接比例する。ＭＴＳフォルマザン産物は組織培養培地中で可溶性なので、本アッセイは、ＭＴＴなどのテトラゾリウム化合物を用いる手順よりも必要な工程が少ない。ＭＴＴ還元によるフォルマザン産物は、５７０ｎｍでの吸光度測定値を記録する前に、該結晶溶解手順の工程を追加する必要のある結晶沈降物である。
【０２２７】
Ｄ．アポトーシス分析
アポトーシスは、製造元のプロトコルに従い、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（カリフォルニア州、カマリーロ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を用いて分析した。各濃度の各種小分子化合物による約３日間の処理後、細胞をトリプシン化により採取し、染色し、ただちにフローサイトメトリー（ニュージャージー州、フランクリンレイク、Ｄｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＦＡＣＳｃａｎ）により分析した。ホスファチジルセリンを露出させても細胞膜は無傷の早期アポトーシス細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣに結合しても、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）には結合しない。壊死または後期アポトーシス工程の細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣおよびＰＩのいずれによっても標識される。「アポトーシス細胞百分率」または「アポトーシス百分率」は、早期および後期を合わせた細胞を示す。
【０２２８】
Ｅ．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法
Ｑｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシア）を用いて、細胞系または組織試料からの全ＲＮＡを単離した。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２７００（カリフォルニア州、フォスターシティ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）において、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州、カールスバード）製のＯｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ法用のプライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州、アラメダ）から入手した。ヘッジホッグおよびＷｎｔシグナル伝達経路における各種遺伝子増幅用のプライマー配列を、以下の表に一覧する（表１；Ｆ、順行プライマー；Ｒ、逆行プライマー）。プライマーペアごとに、ＰＣＲ産物の推定サイズを示す。内部対照として、ＧＡＰＤＨを用いた。
【０２２９】
表１．半定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列
2009519909.tif 000012
2009519909.tif 000013
【０２３０】
Ｆ．ｃＤＮＡ構造の一過性トランスフェクション
一過性トランスフェクション試験のため、トランスフェクションの２４時間前に、抗生剤なしの成長培地を用いて、細胞（２×１０５個）を６ウェルプレートに接種した。製造元のプロトコルに従い、リポフェクタミン（商標）２０００（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、ｐＣＤＮＡ３ベクター中に２．０μｇのｃＤＮＡ、または対照である空のｐＣＤＮＡ３ベクター２．０μｇを用いるトランスフェクションを媒介した。次いで、トランスフェクションした細胞を、分析の準備ができるまで、５％ＣＯ２による加湿インキュベータ中３７℃で培養した。Ｇｌｉ２  ｃＤＮＡは、ザルツブルク大学（オーストリア、ザルツブルク）のＦｒｉｔｚ  Ａｂｅｒｇｅｒ博士のご好意により提供された。Ｇｌｉ１およびＧｌｉ３  ｃＤＮＡは、ジョンズホプキンス大学シドニーキンメル総合癌センター（メリーランド州、ボルチモア）のＢｅｒｔ  ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ両博士のご好意により提供された。ＴＡＦＩＩ３１  ｃＤＮＡは、ハーバード大学（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）のＧｒｅｇｏｒｙ  Ｌ．Ｖｅｒｄｉｎｅ博士のご好意により提供された。
【０２３１】
Ｇ．プロモーター活性分析
トランスフェクションの前日、細胞（１×１０５個）を、抗生剤なしの成長培地入り１２ウェルプレートに接種した。細胞が８０〜９０％のコンフルエンスに達したところで、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃベクター中の各プロモーター構造０．５μｇ、および、形質転換効率のための内部対照としてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを含む０．０２５μｇのｐＲＬ−ＴＫベクター（ウィスコンシン州、マジソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、細胞を共トランスフェクションした。リポフェクタミン２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、約６時間トランスフェクションを媒介した。次いで、培地を濃度３０μＭの各種小分子化合物を含む新鮮培地で置換し、得られる細胞をさらに１８〜２４時間培養し、ルシフェラーゼアッセイにかける。略述すると、細胞を溶解バッファーで溶解し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）および照度計を用いて、各ウェルの細胞中におけるＦｉｒｅｆｌｙおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定した。測定したルシフェラーゼ活性は、ｐＲＬ−ＴＫベクター活性で規格化し、１と設定する空のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターによるベース活性との対比で求めた。示したデータは、平均値（±標準偏差）を表す。すべての測定はトリプリケートで行い、少なくとも３つの独立した試験で繰り返した。ヒトＷｎｔ−２プロモーター−ルシフェラーゼ構造、ヒトＳＯＣＳ３プロモーター−ルシフェラーゼ構造、およびヒトグレムリンプロモーター−ルシフェラーゼ構造をクローンし、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州、サンフランシスコ）のＪａｂｌｏｎｓ博士研究室で特性解析された（He et al., Biochem Biophy Res Comm, 2003；および非公表データ）。６ＧＬＩ−ＴＫＯ−ルシフェラーゼ構造（コンセンサスＧＬＩ  ＤＮＡ結合配列の６回反復を含む）は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州、サンフランシスコ）のＭａｔｔｈｉａｓ  Ｈｅｂｒｏｋ博士研究室のご好意により提供された。
【０２３２】
Ｈ．ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ
１２ウェルプレートに細胞を接種した。ＴＯＰＦＬＡＳＨまたはＦＯＰＦＬＡＳＨレポータープラスミド（バージニア州、シャルロットビル、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を、前出の手順で、細胞に一過性トランスフェクションした。ｐＴＯＰＦＬＡＳＨ：ｐＦＯＰＦＬＡＳＨルシフェラーゼ活性の比率によりＴcｆ媒介遺伝子転写量を測定し、各測定値を、ｐＲＬ−ＴＫレポーター（共トランスフェクション済み内部対照）のルシフェラーゼ活性で規格化した。すべての試験はトリプリケートで実施し、３回繰り返した。
【０２３３】
Ｉ．ウェスタンブロット
標準的プロトコル（イリノイ州、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用い、小分子化合物（３０μＭで２〜３日間）による処理または非処理を区別して、細胞培養液から全タンパク質を調製した。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を用いて、タンパク質濃度を測定した。全細胞ライセートタンパク質（５〜２０ｕｇ）を５分間煮沸し、１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（カリフォルニア州、ベニシア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（マサチューセッツ州、ベッドフォード、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に、タンパク質を転写した。トリスバッファー中の５％無脂肪ミルクパウダーおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０により、４℃オーバーナイトで膜をブロックした後、一次抗原により室温で１時間インキュベートした。トリスバッファー中の５％無脂肪ミルクパウダーおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０により、１０分間で３回、膜を洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギまたはロバ抗マウス抗体を、二次抗体として用いた。ケミルミネッセンス法のルミノール試薬（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ−ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）により、タンパク質を可視化した。抗Ｄｖｌ−３、および抗スルビビンの各抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ−ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州、サンタクルス）から入手した。抗カスパーゼ３抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から入手した。抗β−アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州、セントルイス）から入手した。抗β−カテニン抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ケンタッキー州、レキシントン）から入手した。抗チトクロームｃ抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。β−カテニンの変化の検出には、出願者らの研究室からの既報が述べる手順で細胞質抽出物を調製し、精査した。
【０２３４】
Ｊ．インビボ抗腫瘍原性試験
ヒト癌細胞を擁するマウス異種移植モデルにおいて、小分子化合物ＦＮ１−８をインビボで調べた。略述すると、雌無胸腺ヌードマウス株ＮＣＲＮＵ−Ｍ（５〜１０週齢、体重２０〜２５グラム；ニューヨーク州、ジャーマンタウン、Ｔａｃｏｎｉｃ社製）を、無病原菌状態に維持した。３種類のヒト癌細胞系：ＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０、黒色腫ＬＯＸ（いずれもＧｌｉ３活性化を示す）、および結腸癌ＨＴ２９（陰性対照として、Ｇｌｉ３活性化なし）を用いた。各群１０例ずつのマウスを用い、３×１０６個の癌細胞を１００μｌ容で背部に皮下注射した。接種後、マウス中でヒト癌細胞を７日間にわたり成長させ、目に見える腫瘍小結節とした。次いで、マウスに小分子化合物ＦＮ１−８を、体重比用量５０ｍｇ／ｋｇ（１日あたり１ｍｇ／匹）で注射した。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた。該化合物および対照を、マウス腹部における腹腔内注射用の４０μｌ容に調整した。該化合物の注射後（６回の注射後）１時間以内にマウス１例を安楽死させ、血液を採取した。次いで、質量分析法を用いて、血液試料中の該化合物濃度を分析し、該化合物のマウス血流中への吸収を確認した。１４日間にわたり毎日同じ時間帯に注射を行った。該化合物投与の完了後、さらに１〜２週間にわたり、腫瘍を成長させた。３日ごとに腫瘍サイズを測定し、幅（ｘ）および長さ（ｙ）（ｘ２ｙ／２、ただしｘ＜ｙ）を用いて、腫瘍体積を計算した。データは、平均値（±標準偏差）として示した。
【０２３５】
Ｋ．腫瘍異種移植におけるアポトーシスのＴＵＮＥＬ染色分析
インビボ試験終了時に、安楽死後、各投与群マウスから腫瘍を切除した。切除した腫瘍は、ただちに凍結切片化した後、各試料の腫瘍塊を測定した。製造元のプロトコルに従い、ＡｐｏｐＴａｇペルオキシダーゼＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎアポトーシス検出キット（カリフォルニア州、テメクラ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）により、腫瘍標本のＴＵＮＥＬ染色を行った。
【０２３６】
Ｌ．毒性評価のための組織学的検査
インビボ試験の完了後、マウスから各器官を切除した。これら器官には、肝臓、肺、心臓、腎臓、小腸、卵巣、脳、脾臓、皮膚、および筋肉を含めた。４％緩衝ホルムアルデヒド中に標本を固定し、パラフィン中に包埋し、切片化し、ヘマトキシンおよびエオシン（ＨＥ）染色法により組織学的分析を施した。すべての器官からの毒性の証拠について、マウス病理学者がＨＥ染色済みスライドを、ＤＭＳＯ対照と比較検討した。
【０２３７】
Ｍ．統計学的解析
示したデータは、平均値（±標準偏差）を表す。Ｅｘｃｅｌ中の対応なしＴ検定を用いて、各投与および細胞系を比較した。
【０２３８】
実施例２：Ｇｌｉ３転写活性化ドメインのペプチドＦＤＡＩＩの模倣
小分子によりＧＬＩ３転写活性化ドメインのＦＤＡＩＩモチーフを模倣させるため、ＦＤＡＩＩの３Ｄ構造をモデル化した。Yoon et al.（1998, J Biol Chem 273:3496-3501）が示唆する通り、ＧＬＩ１ポリペプチド内のＦＶＡＩＬモチーフは、α−らせん構造を生じた。ＧＬＩ３ポリペプチドのＦＤＡＩＩモチーフについても、α−らせん構造をモデル化することが妥当であった。こうして、ＧＬＩ３ポリペプチドＦＤＡＩＩモチーフのα−らせん構造を生成し、妥当な化学的設計法を用いて、このモチーフの該構造を模倣する小分子化合物を設計した。ピラゾリン構造を含む小分子化合物を設計した。図３は、小分子化合物ＦＮ１−５（本実施例で記述）と、α−らせん構造としてモデル化されるＧＬＩ３ポリペプチドのＦＤＡＩＩモチーフとの間の、ＲＭＳオーバーレイを示す。
【０２３９】
実施例３：小分子化合物の調製
ａ）エチル１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシレート（ＦＮ１−１）の調製
【化９】
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ケイ皮酸エチル（７、２．５５ｇ）、ベンズアルデヒドフェニルヒドラゾン（２、４．２１ｇ）、クロラミン−Ｔ三水和物（６．４５ｇ）、およびメタノール（４５ｍＬ）の混合物を、還流下で２２時間加熱した。反応混合物を、ｎ−ヘキサン中５０％の酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈し、濾過し、蒸発させた。残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ、溶出剤：ヘキサン中、０から１０％の酢酸エチル勾配）によって精製し、蒸発させることによって、無色結晶としてＦＮ１−１（８、１．２５ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００  ＭＨｚ）δ７．６６−７．６４（ｍ，ＩＨ），７．４６−７．２２（ｍ，１３Ｈ），６．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＩＨ），４．８１（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，ＩＨ），４．７０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，ＩＨ），４．０７（ｑｕａｒｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），０．９７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：３７１．９  （Ｍ＋Ｈ），３２５．５，２９７．５。
【０２４０】
ｂ）１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボン酸（ＦＮ１−２）の調製
ＦＮ１−１（５３ｍｇ）、メタノール（０．５ｍＬ）、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）、および水（０．１ｍＬ）中１０％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウムの混合物を、室温で１時間保持した。反応混合物を水（３０ｍＬ）で希釈し、ｎ−ヘキサン中３０％の酢酸エチルで洗浄した。水相を２Ｎ塩酸で酸性化し、酢酸エチルで抽出した。抽出物を、水で２回（それぞれ５ｍＬ）、続いてブライン（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させることによって、ＦＮ１−２（３８ｍｇ）を得た。ＭＳ：２９７．９（Ｍ−ＣＯ２Ｈ）。
【０２４１】
ｃ）Ｎ−ブチル−１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシアミド（ＦＮ１−３）の調製
【化１０】
2009519909.tif 000015
ＦＮ１−３は、４−（ヒドロキシフェニル）エチルアミンの代わりに、ｎ−ブチルアミンを用いることにより、ＦＮ１−５の様式と同様の様式によって調製した。ＭＳ：４２０．９（Ｍ＋Ｎａ）、３９８．９（Ｍ＋Ｈ）、３２５．５、２９７．５。
【０２４２】
ｄ）Ｎ−（５−ヒドロキシペンチル）−１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシアミド（ＦＮ１−５）の調製
【化１１】
2009519909.tif 000016
ＦＮ１−１（２２ｍｇ）、５−アミノペンタノール（１００μＬ）およびＮ−Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００μＬ）の混合物を、９５℃で２０時間加熱した。反応混合物を、酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、水で２回（それぞれ５ｍＬ）、続いてブライン（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｍＬ、溶出剤：ヘキサン中、０から７０％の酢酸エチル勾配）によって精製し、蒸発させることによって、淡黄色非結晶としてＦＮ１−５（１２ｍｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ７．６９−７．６７（ｍ，ＩＨ）５７．３４−７．１４（ｍ，１３Ｈ），６．９４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＩＨ），６．３７（ｂｒｏａｄ  ｔ，ＩＨ），４．８２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，ＩＨ），４．４８（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，ＩＨ），３．５３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．４０−３．３３（ｍ，ＩＨ），３．２２−３．１４（ｍ，ＩＨ），１．５６−１．４１（ｍ，６Ｈ）。ＭＳ：４５０．６（Ｍ＋Ｎａ），４２８．６（Ｍ＋Ｈ），３２５．５，２９７．５。ＵＶ吸収の最大  ３４８ｎｍ（０．０５％  ＴＦＡ−ＭｅＯＨ−水  ８：２）。
【０２４３】
ｅ）Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシアミド（ＦＮ１−７）の調製
【化１２】
2009519909.tif 000017
ＦＮ１−７は、４−（ヒドロキシフェニル）エチルアミンの代わりに、３−アミノプロパノールを用いることにより、ＦＮ１−５と同様の様式によって調製した。ＭＳ：４２２．９（Ｍ＋Ｎａ）、４００．９（Ｍ＋Ｈ）、３２５．５、２９７．５。
【０２４４】
ｆ）Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシアミド（ＦＮ１−８）の調製
【化１３】
2009519909.tif 000018
ＦＮ１−１（１１ｍｇ）、４−（ヒドロキシフェニル）エチルアミン（１３２ｍｇ）およびＮ−Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００μＬ）の混合物を、９５℃で２０時間加熱した。反応混合物を、酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、水で２回（それぞれ５ｍＬ）、続いてブライン（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｍＬ、溶出剤：ヘキサン中、０から５０％の酢酸エチル勾配）によって精製し、蒸発させることによって、淡黄色非結晶としてＦＮ１−８（９．５ｍｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ７．６６−７．６３（ｍ，ＩＨ），７．３４−７．１６（ｍ，１４Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＩＨ），６．９４（ｔ，Ｊ＝６．８  Ｈｚ，ＩＨ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＩＨ），６．５２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＩＨ），６．３５（ｂｒｏａｄ  ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，ＩＨ），４．６６（ｓ，ＩＨ），４．６５（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，ＩＨ），４．４１（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，ＩＨ），３．５６−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．３３（ｍ，ＩＨ），２．７６−２．５７（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ：４８４．５（Ｍ＋Ｎａ），４６２．５（Ｍ＋Ｈ），３２５．５，２９７．５。ＵＶ吸収の最大  ３５１ｎｍ（０．０５％  ＴＦＡ−ＭｅＯＨ−水  ８：２）。
【０２４５】
小分子化合物ＦＮ１−８の調製物を、液体クロマトグラフィー質量分析によって分析し、９０〜９５％純粋であることが判明した（データは示していない）。
【０２４６】
ｇ）５−（１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボニル）アミノペンタン酸（ＦＮ１−９Ｕ）および５−（１，３，４−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−５−カルボニル）アミノペンタン酸（ＦＮＩ−９Ｓ）の調製
【化１４】
2009519909.tif 000019
塩化アセチル（５ｍＬ）をメタノール（１５０ｍＬ）中に加えることによって、メタノール溶液中の塩化水素を調製し、５−アミノペンタン酸（１ｇ）を加えた。この混合物を室温で一晩保持し、蒸発させることによって、メチル５−アミノペンタノアート塩酸塩を単離した。メチル５−アミノペンタノアート塩酸塩（２５１ｍｇ）、シナモイック酸（ｃｉｎｎａｍｏｉｃ  ａｃｉｄ）（７４ｍｇ）、ＨＢＴＵ（１６８ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ）、およびジメヒルホルムアミド（ｄｉｍｅｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（２ｍＬ）の混合物を、室温で１時間保持した。反応混合物を、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、水で２回（それぞれ１０ｍＬ）、続いてブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させることによって、（４−メトキシカルボニル）ブチルシンナムアミド（１、１００ｍｇ）を単離した。（４−メトキシカルボニル）ブチルシンナムアミド（１、１００ｍｇ）、ベンズアルデヒドフェニルヒドラゾン（２、１１３ｍｇ）、クロラミン−Ｔ三水和物（１６０ｍｇ）、およびメタノール（２ｍＬ）の混合物を、還流下で２２時間加熱した。反応混合物を、ｎ−ヘキサン中５０％の酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、濾過し、蒸発させた。残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ、溶出剤：ヘキサン中、０から１０％の酢酸エチル勾配）によって精製することによって、メチル５−（１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボニル）アミノペンタノアート（３、１３ｍｇ）およびメチル５−（１，３，４−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−５−カルボニル）アミノペンタノアート（４、１０３ｍｇ）を単離した。それぞれの異性体の位置化学は、アミドカルボニルに隣接するＣＨの１Ｈ−および１３−Ｃ  ＮＭＲ化学シフトによって同定した。５−（１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボニル）アミノペンタン酸（５、ＦＮ１−９Ｕ）は、ＦＮ１−２の調製において示したように、標準的なエステル加水分解条件によって３から得た。ＭＳ：４６４．９（Ｍ＋Ｎａ）、４４２．９（Ｍ＋Ｈ）、３２５．８、２９７．９。５−（１，３，４−トリフェニル−４，５−ジヒドロピラゾール−５−カルボニル）アミノペンタン酸（６、ＦＮ１−９Ｓ）は、ＦＮ１−２の調製と同様の様式によって、４から得た。ＭＳ：４６４．９（Ｍ＋Ｎａ）、４４２．９（Ｍ＋Ｈ）、３２５．８、２９７．９。
【０２４７】
５および６の位置化学の割当ては、そのＥＳＩ−ＭＳフラグメンテーションとよく一致する。すなわち、５は、そのβ−ケトイミノ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏｉｍｉｎｏ）構造が、脱カルボニルを促進するため、６よりも大きな脱カルボニルピーク（ｍ／ｚ＝２９７）を与える。
【化１５】
2009519909.tif 000020
【０２４８】
ＦＮ１−９Ｕ（右上のパネル）およびＦＮ１−９Ｓ（左上のパネル）のＥＳＩ−ＭＳ。ＦＮ１−９Ｕは、脱カルボニルフラグメントの形成（下のパネル）のために、ＦＮ１−９Ｓのｍ／ｚ＝２９７でのピークよりも大きなｍ／ｚ＝２９７でのピークを示す。
【０２４９】
ｈ）エチル１，３−ビフェニル−５−イソブチル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシレート（ＦＮ２−１）の調製
【化１６】
2009519909.tif 000021
鉱油分散系中の６０％の水素化ナトリウム（０．２４ｇ）を、ｎ−ヘキサンで短時間すすいで油を除去し、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に懸濁させた。この懸濁液を、氷水浴中で冷却し、ホスホノ酢酸トリエチル（１．０ｍＬ）を加えた。この混合物を０．５時間攪拌した後、３−メチルブタナール（０．６５ｍＬ）を氷浴温度で加えた。この混合物を室温で一晩攪拌し、水（１０ｍＬ）で処理し、ｎ−ヘキサン中５０％の酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出し、水で２回（それぞれ２０ｍＬ）、続いてブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｍＬ、溶出剤：ヘキサン中、０から５％の酢酸エチル勾配）によって精製し、蒸発させることによって、無色油状物としてエチル５−メチルヘキサ−２−エノアートを得た。ＦＮ２−１は、実施例２におけるケイ皮酸エチルの代わりにエチル５−メチルヘキサ−２−エノアートを用いることにより、ＦＮ１−１と同様の様式によって調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ７．３５−７．２９（ｍ，３Ｈ），７．２５（ｄｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｄｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，６．４Ｈｚ，２Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｑｕａｒｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１４（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０５（ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），１．９５（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，６．０Ｈｚ，ＩＨ），１．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ：３５１．９（Ｍ＋Ｈ），２７７．９，１９４．７．
【０２５０】
ｉ）Ｎ−（５−ヒドロキシペンチル）−１，３−ジフェニル−５−イソブチル−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシアミド（ＦＮ２−５）の調製
【化１７】
2009519909.tif 000022
ＦＮ２−５は、ＦＮ１−１の代わりにＦＮ２−１を用いることにより、ＦＮ１−５と同様の様式によって調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ７．３１−７．２５（ｍ，５Ｈ），７．０９−７．０３（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｂｒｏａｄ  ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｄｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２８（ｄｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０５（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，１Ｈ），１．９３（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．５３（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．３２（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：４３１．０（Ｍ＋Ｎａ），４０９．０（Ｍ＋Ｈ），３０５．９，２７７．９。
【０２５１】
ｊ）Ｎ−（５−ヒドロキシペンチル）−１−フェニル−３，５−ビス（イソブチル）−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシアミド（ＦＮ３−５）の調製
【化１８】
2009519909.tif 000023
エチル１−フェニル−３，５−ビス（イソブチル）−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシレートは、それぞれ実施例２における、ケイ皮酸エチルの代わりにエチル５−メチル−２−ヘキサノアート、ベンズアルデヒドフェニルヒドラゾンの代わりに３−メチルブタナールフェニルヒドラゾンを用いることにより、実施例２と同様の様式によって調製した。ＦＮ３−５は、実施例４におけるＦＮ１−１の代わりにエチル１−フェニル−３，５−ビス（イソブチル）−４，５−ジヒドロピラゾール−４−カルボキシレートを用いることにより、実施例４と同様の様式によって調製した。ＭＳ：４１１．０（Ｍ＋Ｎａ）、３８９．１（Ｍ＋Ｈ）、２８５．９、２５７．９。
【０２５２】
実施例４：大半の癌細胞系はＧｌｉ３を発現する
複数の癌細胞系および初代組織試料を、半定量ＲＴ−ＰＣＲ法により分析し、Ｇｌｉ３の発現を精査した。Ｇｌｉ３発現を検出するＲＴ−ＰＣＲ法の範例的分析を図２に示す。分析により検出可能な濃度のＧｌｉ３  ｍＲＮＡを発現することがわかる細胞系には以下を含んだ：正常肝臓（図２、中パネル、レーン１）、ＮＳＣＬＣ：Ｈ１７０３、Ｈ４６０、およびＡ５４９（図２、中パネル、レーン２、３、４）、乳癌：ＨｕＬ１００、ＢＴ４７４、およびＭＣＦ−７（図２、中パネル、レーン５、６、７）、中皮腫：Ｍｅｔ５Ａ、Ｈ２９０、ＲＥＮ、Ｈ５１３、Ｈ２８、および２１１Ｈ（図２、中パネル、レーン８〜１３）、結腸癌：ＳＷ４８０（図２、中パネル、レーン１５）、初代ＮＳＣＬＣ組織試料（図２、中パネル、レーン１６および１７は、それぞれ正常および癌組織）。ＬＡＲＫ１Ａは、検出可能な濃度のＧｌｉ３  ｍＲＮＡ発現を示さなかった（図２、中パネル、レーン１４）。
【０２５３】
別の一連の同様なＲＴ−ＰＣＲ法試験では、以下におけるＧｌｉ３発現を分析し、検出した：結腸癌細胞ＳＷ４８０、ＬｏｖｏおよびＣａＣｏ２（図２、下パネル、レーン１、４、５）；正常結腸（図２、下パネル、レーン６）；正常腎細胞系：ＨＲＥ−１５２およびＨＫ−２（図２、下パネル、レーン７および８）；腎細胞癌：７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ、７６９−Ｐ、Ａ７０４、およびＯＭＲＣ３（図２、下パネル、レーン９〜１３）；正常肺（図２、下パネル、レーン１４）；中皮腫：ＲＥＮ、Ｈ２９０、２１１Ｈ、Ｈ５１３、Ｈ２０５２、Ｈ２８、およびＭＳ−１（図２、下パネル、レーン１５〜２１）；ＮＳＣＬＣ：Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ８３８、Ｈ１７０３、Ｈ１２９９、Ｈ１６５０、およびＨ１９７５（図２、下パネル、レーン２２〜２８）。こうして、大半の癌細胞系は、Ｇｌｉ３を発現する。細胞系ＨＣＴ１１６（図２、下パネル、レーン２）、ＨＴ２９（図２、下パネル、レーン３）、およびＡ４２７（図２、下パネル、レーン２９）においては、Ｇｌｉ３発現が見られないかまたは低度であった。
【０２５４】
実施例５：ＧＬＩ３シグナル伝達に対する小分子阻害剤のスクリーニング
本実施例で述べる細胞ベースのアッセイを用いて、本発明の小分子化合物の初期スクリーニングを行った。図４は、このような分析の結果を示す。２つのＮＳＣＬＣ細胞系であるＨ１２９９およびＡ５４９、ならびに２つの結腸癌細胞系であるＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６を、濃度１００μＭの小分子化合物ＦＮ１−１、ＦＮ１−２、ＦＮ１−３、ＦＮ１−５、およびＦＮ２−１でインキュベートした。ＤＭＳＯを対照として用いた。すべての被験癌細胞系において、ＦＮ１−５の劇的な殺細胞効果が観察された（０．５％クリスタルバイオレットにより生細胞を染色した）。本アッセイは、ＧＬＩ転写活性ドメイン（ＴＡＦ結合ドメイン、ＴＡＦｂｄ）を阻害する小分子化合物ＦＮ１−５を、活性ヒット化合物として同定した。
【０２５５】
図６は、３つのＮＳＣＬＣ細胞系（Ｈ１２９９、Ａ５４９、およびＨ４６０）ならびに１つの結腸癌細胞系（ＳＷ４８０）に対する小分子化合物ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、およびＦＮ３−５の効果を調べる細胞毒性アッセイの結果を示す。上述の通り、６ウェルプレートに癌細胞系を接種し、５０および１００μＭの各化合物（ストックを３０ｍＭのＤＭＳＯに溶解した）で３日間インキュベートした。小分子化合物ＦＮ１−５の改良バージョンであるＦＮ１−８について調べたすべての被験癌細胞系において、劇的な細胞殺滅が観察された。フローサイトメトリーを用いてアポトーシス分析も行ったところ、結果は整合的であった（データは示さない）。したがって、本実施例で述べた妥当な設計−スクリーニング法を用い、ＧＬ１３転写活性ドメイン（ＴＡＦ結合ドメイン）を阻害するさらなる小分子化合物ＦＮ１−８を同定した。
【０２５６】
実施例６：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は結腸癌細胞系ＣａＣＯ２およびＳＷ４８０においてアポトーシスを誘発する
フローサイトメトリーを用いて、本発明の小分子化合物による細胞処理後の結腸癌細胞におけるアポトーシスを検証した。図５に示す典型例では、１００μＭ  ＦＮ１−５による３日間の処理後に、結腸癌細胞系ＳＷ４８０において有意なアポトーシス（５８．６％）が観察された（表２）。この結果は、染色結果と符合した。
【０２５７】
細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて、本発明の小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８を用いたところ、ヒト結腸癌細胞系ＬｏＶｏおよびＣａＣＯ２において、劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。細胞殺滅において、ＦＮ１−８は、ＦＮ１−５よりもより強力であると思われた。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれの小分子化合物とも、ＣａＣＯ２におけるアポトーシスを誘発した（表２および３）。
【０２５８】
２つの結腸癌細胞系であるＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６は、１０、３０、５０、および１００μＭの化合物ＦＮ１−９ＵおよびＦＮ１−９Ｓでもインキュベートした。劇的な殺細胞効果またはアポトーシスは観察されなかった（データは示さない）。
【０２５９】
実施例７：結腸癌細胞系ＨＴ２９においては小分子化合物ＦＮ１−８ではなくＦＮ１−５が細胞殺滅を誘発する
細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて小分子化合物ＦＮ１−５を用いたところ、ヒト結腸癌細胞系ＨＴ２９において劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。一方、より高用量（５０μＭ；データは示さず）でも、小分子化合物ＦＮ１−８による処理後には、殺細胞が観察されなかった。
【０２６０】
フローサイトメトリーを用いて、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８による細胞処理後の結腸癌細胞系ＨＴ２９におけるアポトーシスを検証した。ＦＮ１−５がＨＴ２９細胞におけるアポトーシスを誘発した（５０μＭで３５％のアポトーシス細胞が観察された；表２）のに対し、ＦＮ１−８による処理後にはアポトーシスが観察されなかった（表３）。以上の結果は、前出の染色結果と符合した。こうして、小分子化合物ＦＮ１−８が、ＨＴ２９細胞において細胞生存率に影響を及ぼさずアポトーシスを誘発しないという事実も、他の被験細胞系においてＦＮ１−８の媒介する効果が、ＦＮ１−８の一般的毒性によらないことを確認する。
【０２６１】
この点で、ＨＴ２９細胞がＧｌｉ１およびＧｌｉ２を発現する（データは示さない；Zhu et al., 2004, Cancer Lett. 207 (20:205-214)）のに対し、ＨＴ２９細胞においてＧｌｉ３の発現が観察されなかったことは、注目に値する（図２、下パネル、レーン３）。
【０２６２】
実施例８：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８はＮＳＣＬＣ細胞においてアポトーシスを誘発する
フローサイトメトリーを用いて、本発明の小分子化合物による処理後の複数のＮＳＣＬＣ細胞系におけるアポトーシスをも検証した。例えば、１００μＭ  ＦＮ１−５による３日間の処理後には、ＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ１２９９（５５．９％アポトーシス）、Ａ５４９（３０．０％アポトーシス）において有意なアポトーシスが観察された（さらなるデータについては、表２を参照のこと）。以上の結果は、染色結果と符合する。
【０２６３】
３０μＭおよび５０μＭ  ＦＮ１−８による３日間の処理後において、ＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ４６０においてもアポトーシスが観察された（５０μＭで８２．３％、表３）。以上の結果は、染色結果と符合する。ＦＮ１−５も、Ｈ４６０およびＨ３８３細胞におけるアポトーシスを誘発した（表２）。一貫して、同用量におけるアポトーシスの誘発では、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であることが観察された（表２および３）。
【０２６４】
本発明の小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８を細胞ベースの細胞毒性アッセイに用いたところ、ＮＳＣＬＣ細胞系であるＨ４６０、Ｈ８３８、Ｈ１９７５、Ｈ１６５０、およびＨ１７０３において劇的な細胞殺滅が観察された。同濃度を比較したところ、これら細胞系では、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であると思われた（データは示さない）。
【０２６５】
ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９、Ｈ３５８、およびＨ３２２を用いて、小分子化合物ＦＮ１−８の用量滴定試験を行った。６ウェルプレートにＡ５４９、Ｈ３５８、およびＨ３２２細胞を接種し、ＤＭＳＯ（対照）または、それぞれ、７．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、および３０μＭのＦＮ１−８で３日間インキュベートした。１５μＭ以上でＦＮ１−８を添加すると、これら細胞系における用量依存的で劇的な細胞殺滅が観察された。ＦＮ１−８は、Ｈ３２２細胞よりもＡ５４９およびＨ３６８における方が、より低濃度で細胞殺滅を誘発した（データは示さない）。３日後、２０μＭ  ＦＮ１−８でインキュベートすると、約２８％のＡ５４９細胞および５８％のＨ３５８がアポトーシスを生じた（表３）。
【０２６６】
小分子化合物ＦＮ１−８の投与後のＮＳＣＬＣ細胞Ａ５４９、Ｈ３５８、およびＨ３２２における細胞生存率の時系列変化を分析した。Ａ５４９細胞は１０μＭおよび２０μＭ  ＦＮ１−８で、Ｈ３５８およびＨ３２２細胞は１５μＭおよび３０μＭ  ＦＮ１−８でそれぞれインキュベートした。次いで、フローサイトメトリーを用いて、異なる時点における生細胞および死滅細胞の百分率を検証した。Ａ５４９細胞において、ＦＮ１−８は、３日後に用量依存的な殺細胞効果を示した。Ｈ３５８細胞において、ＦＮ１−８の殺細胞効果は、１日目までですでに明らかであり、Ｈ３２２においても２日目までに明らかであった（データは示さない）。
【０２６７】
小分子化合物ＦＮ１−８は、Ａ５４９、Ｈ３５８、およびＨ３２２細胞を含むＮＳＣＬＣ細胞における細胞増殖をも有意に阻害した。このことは、７．５μＭまたは１５μＭいずれかのＦＮ１−８でインキュベートした後、製造元のプロトコルに従い、該化合物添加後の様々な時点においてＭＴＳアッセイを実施することにより示した。ＦＮ１−８がこれら細胞における細胞増殖を、すでに１日後から用量依存的に阻害することがわかった（データは示さない）。
【０２６８】
小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８により得られたスクリーニング結果に基づき、本実施例で述べる細胞毒性およびアポトーシスアッセイを用い、Ｈ１２９９およびＡ５４９細胞において、さらなる小分子化合物を調べた。１０、３０、５０、および１００μＭのＦＮ１−９ＵおよびＦＮ１−９Ｓを用いたところ、検知可能な殺細胞効果またはアポトーシスは観察されなかった（データは示さない）。
【０２６９】
実施例９：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は初代培養ＮＳＣＬＣにおいて細胞殺滅およびアポトーシスを誘発する
フローサイトメトリーを用い、本発明の分子化合物が誘発するアポトーシスを、組織試料から単離直後の初代培養ＮＳＣＬＣ細胞において検証した。例えば、１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−８または３０および５０μＭ  ＦＮ１−５による３日間の処理後、初代培養ＮＳＣＬＣ細胞において、有意なアポトーシスが観察された（データは示さない）。例えば、５０μＭ  ＦＮ１−８においては、約６０％のアポトーシス細胞が観察された。以上の結果は、初代培養ＮＳＣＬＣ細胞（データは示さない）ならびに化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８を用いる細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて得られる結果と符合する。また同濃度では、ＦＮ１−５よりもＦＮ１−８の方が強力であることがわかった。
【０２７０】
実施例１０：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は黒色腫細胞においてアポトーシスを誘発する
細胞毒性アッセイおよび黒色腫細胞系ＬＯＸを用いて、小分子化合物ＦＮ１−５、ＦＮ１−８、ＦＮ１−７、ＦＮ１−９Ｕ、およびＦＮ１−９Ｓの効果を調べた。６ウェルプレートにＬＯＸ細胞を接種し、本実施例で述べる手順により、１００μＭの各化合物（ストックを３０ｍＭのＤＭＳＯに溶解した）でインキュベートした。一貫して、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれについても、劇的な殺細胞効果が観察された（図７）。ＬＯＸ細胞を小分子化合物ＦＮ１−７およびＦＮ１−９Ｕでインキュベートしても、一定の殺滅が観察された。０．５％クリスタルバイオレットにより、生細胞を染色した。
【０２７１】
ヒト黒色腫細胞系ＬＯＸおよび各用量の小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８をも用いて、細胞殺滅を調べた。本実施例で述べる手順により、６ウェルプレートにＬＯＸ細胞を接種し、１０、３０、および５０μＭの各化合物により３日間インキュベートした。いずれの化合物とも、５０μＭで劇的な殺細胞効果が観察された。３０μＭ  ＦＮ１−５と比べ、３０μＭ  ＦＮ１−８での方がより高度な細胞殺滅が観察されるので、ＦＮ１−５よりもＦＮ１−８の方が、ＬＯＸ細胞殺滅においてより強力であると考えられた（データは示さない）。
【０２７２】
小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８処理によるＬＯＸ細胞に対する細胞殺滅を、各濃度によるこれら２つの化合物およびフローサイトメトリーを用いて、より詳細に分析した。処理３日後に、いずれの化合物も、すべての被験濃度でのＬＯＸ細胞系において、以下の有意なアポトーシスを誘発した：１０μＭの小分子化合物ＦＮ１−５、１４．０％のアポトーシス、３０μＭで１６．６％のアポトーシス、および５０μＭでは５８．１％のアポトーシス；対照ＤＭＳＯ、１０．９％（表２）；（ｂ）１０μＭの小分子化合物ＦＮ１−８、１６．７％のアポトーシス、３０μＭで１９．０％のアポトーシス、および５０μＭでは７８．９％のアポトーシス（対照ＤＭＳＯ：１０．９％のアポトーシス）（表３）。また、同等用量においては、小分子化合物ＦＮ１−８の方が、ＦＮ１−５よりもアポトーシス誘発においてやや強力であると考えられた。
【０２７３】
黒色腫細胞系Ａ３７５、Ｇ３６１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８を用いて、小分子化合物ＦＮ１−８の用量滴定試験を行った。６ウェルプレートにＡ３７５細胞を接種し、それぞれＤＭＳＯ（対照）または２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、および４０μＭのＦＮ１−８で３日間インキュベートした。１０μＭ以上でＦＮ１−８を添加すると、本細胞系において劇的で用量依存的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。黒色腫細胞系Ｇ３６１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８でも、同様の殺細胞効果が観察された（データは示さない）。２０μＭ  ＦＮ１−８による４日間のインキュベーション後、約２０％のＭａｌｍｅ−３Ｍ細胞、２８％のＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞、３６％のＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞、４１％のＡ３７５細胞、および１７％のＧ３６１細胞がアポトーシスを示したのに対し、同じ条件下における正常皮膚線維芽細胞の３％未満がアポトーシスを示した（表３）。
【０２７４】
小分子化合物ＦＮ１−８は、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、Ａ３７５、Ｇ３６１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞系を含む黒色腫細胞においても、細胞増殖を有意に阻害した。このことを、細胞を５μＭまたは１０μＭいずれかのＦＮ１−８でインキュベートした後、該化合物添加後の各時点において、製造元のプロトコルに従いＭＴＳアッセイを実施することにより示した。ＦＮ１−８は、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、Ｇ３６１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、およびＳＫ−Ｍｅｗｌ−２８では１０μＭで１〜２日後に、Ａ３７５およびＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞では１日後にすでに該細胞の増殖を阻害した（データは示さない）。
【０２７５】
小分子化合物ＦＮ１−８投与後の黒色腫細胞系（Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、Ａ３７５、Ｇ３６１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８）における細胞生存率の時系列変化を分析した。これら黒色腫細胞を、１０μＭまたは２０μＭ  ＦＮ１−８でインキュベートした。次いで、フローサイトメトリーを用いて、異なる時点における生細胞および死滅細胞の百分率を検証した。すべての被験黒色腫細胞において、２０μＭのＦＮ１−８は、２日後に明らかとなる殺細胞効果を示した（図１８Ａ、Ｂ、およびＣ、ならびに不表示データ）。
【０２７６】
本発明の小分子化合物、例えば、ＦＮ１−８が、癌細胞を特異的に殺滅するかどうかを探索するため、ヒト正常皮膚線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ−３）を用いる、１０μＭおよび２０μＭのＦＮ１−８投与後における細胞生存率の時系列試験も実施した。これら細胞を、１０μＭまたは２０μＭいずれかのＦＮ１−８でインキュベートすると、６日後でも細胞殺滅は観察されなかった（図１８Ｄ）。こうして、正常皮膚線維芽細胞へのＦＮ１−８の投与は、これら正常皮膚細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。この結果は、ＦＮ１−８の殺細胞効果が癌細胞に特異的であることを示す。
【０２７７】
実施例１１：小分子ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は中皮腫細胞系２１１ＨおよびＨ２９０ならびに初代培養中皮腫細胞においてアポトーシスを誘発する
中皮腫細胞系Ｈ２９０、２１１Ｈ、ＭＳ１およびＲＥＮ、ならびに各用量の小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８をも用いて、細胞殺滅を調べた。本実施例に述べる手順で、６ウェルプレートに細胞を接種し、１、１０、および３０μＭの各化合物で３日間インキュベートした。３０μＭのいずれの化合物についても、Ｈ２９０および２１１Ｈ細胞の劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。一方、被験濃度では、いずれの化合物も、ＭＳ−１およびＲＥＮ細胞には検知可能な効果を及ぼさなかった（データは示さない）。
【０２７８】
フローサイトメトリーを用いて、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８による細胞処理後の中皮腫細胞系２１１Ｈにおいて、アポトーシスを検証した。３０μＭ  ＦＮ１−５（３７．５％、表２）または３０μＭ  ＦＮ１−８（３０．７％、表３）のいずれかによる３日間の処理後に、中皮腫細胞系２１１Ｈにおける有意なアポトーシスが観察された。
【０２７９】
次に、組織試料から作製直後の初代培養ヒト中皮腫細胞に対する各種小分子化合物の効果を検証した。本実施例で述べる手順で、６ウェルプレートに初代培養液を接種し、５０および１００μＭの各化合物（ＦＮ１−５、ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、およびＦＮ３−５；ストックを３０ｍＭのＤＭＳＯに溶解した）で３日間インキュベートした。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれについても、劇的な殺細胞効果が観察された。また、同用量では、小分子化合物ＦＮ１−５よりもＦＮ１−８の方が、該初代培養物の殺滅ではより強力であった。化合物ＦＮ１−７およびＦＮ３−５については、有意な細胞殺滅が見られなかった（図８）。
【０２８０】
次に、フローサイトメトリーを用いて、組織試料から作製直後の初代培養ヒト中皮腫細胞における各用量（１０μＭ、３０μＭ、および５０μＭ）の小分子化合物ＦＮ１−５投与後におけるアポトーシスを検証した。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８（それぞれ、表２および３）の中用量（３０および５０μＭ）で、アポトーシスの増大が観察された。同用量では、ＦＮ１−５よりもＦＮ１−８の方が、アポトーシス誘発でより強力であり、図８に示す染色結果と符合した（表２および３）。
【０２８１】
中皮腫細胞系ＭＳ−１は、１０、３０、５０、および１００μＭの化合物ＦＮ１−９ＵおよびＦＮ１−９Ｓでもインキュベートした。１００μＭ  ＦＮ１−９Ｕを用いると一定の細胞殺滅が観察されたが、ＦＮ１−９Ｓを用いても殺細胞効果またはアポトーシスは観察されなかった（データは示さない）。
【０２８２】
実施例１２：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト前立腺癌細胞系ＬｎＣＡＰに対する効果
本実施例で述べる細胞ベースの細胞毒性アッセイを用いて、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の、ヒト前立腺癌細胞系ＬｎＣＡＰに対する効果を解明した。３０および５０μＭ  ＦＮ１−５投与後、ならびに１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−８投与後において、ＬｎＣＡＰ細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８において、劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。ＦＮ１−５の細胞殺滅効果ははるかに低度であることが観察された（データは示さない）。
【０２８３】
フローサイトメトリーを用いて、分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８がＬｎＣＡＰ細胞において誘発するアポトーシスを検証した。１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−８、ならびに５０μＭ  ＦＮ１−５による３日間の処理後に、ＬｎＣＡＰ細胞において有意なアポトーシスが観察された（表２および３）。例えば、５０μＭ  ＦＮ１−８では、約４２％のアポトーシス細胞が観察された。以上の結果は、前述した細胞ベースの細胞毒性アッセイで得られる結果と符合した。また、同じ濃度では、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であることがわかった。
【０２８４】
実施例１３：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト膵癌細胞系に対する効果
本実施例で述べる細胞ベースの細胞毒性アッセイを用いて、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の、ヒト膵癌細胞系Ｌ３．６ｓ１、Ｐａｎｃ４．２１、ＢｘＰＣ３、およびＣＦＰＡＣ−１に対する効果を解明した。１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後に、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８で、分析対象のヒト膵癌細胞系において劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。一方、ＦＮ１−５がＰａｎｃ４．２１において媒介する細胞殺滅は、他の３つの膵癌細胞系に対する該効果と比べ、低度であった。
【０２８５】
フローサイトメトリーを用いて、分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８が、ヒト膵癌細胞系Ｌ３．６ｓｌ、Ｐａｎｃ４．２１、ＢｘＰＣ３、およびＣＦＰＡＣ−１細胞において誘発するアポトーシスをも検証した。１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−８、または３０および５０μＭ  ＦＮ１−５による３日間の処理後、ＦＮ１−５がアポトーシスを誘発しないと考えられるＰａｎｃ４．２１を例外として、分析対象であるすべてのヒト膵癌細胞系において、有意なアポトーシスが観察された（表２および３）。例えば、５０μＭ  ＦＮ１−５および５０μＭ  ＦＮ１−８では、約４５％のアポトーシス細胞が観察された。以上の結果は、前述した細胞ベースの細胞毒性アッセイと符合した。Ｌ３．６ｓｌにおいてはＦＮ１−５およびＦＮ１−８共に同程度のアポトーシスを誘発するのに対し、ＣＦＰＡＣ−１細胞では、同濃度において、ＦＮ１−５の方がやや強力であり、Ｐａｎｃ４．２１およびＢｘＰＣ３細胞では、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力なアポトーシス反応を誘発した（表２および３）。
【０２８６】
実施例１４：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト乳癌細胞系ＭＣＲ−７に対する効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。３０および５０μＭ  ＦＮ１−５による処理後、ならびに１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−８による処理後において、ＭＣＦ−７細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。本アッセイでは、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であった。
【０２８７】
実施例１５：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト卵巣癌細胞系ＡＺ２３２４７に対する効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト卵巣癌細胞系ＡＺ２３２４７における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、ＡＺ２３２４７細胞の生存率を分析した。３０μＭおよび５０μＭのいずれの化合物でも、劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。
【０２８８】
実施例１６：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト腎細胞癌細胞系に対する効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト腎細胞癌細胞系７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ、およびＯＭＲＣ３における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、分析対象であるすべてのヒト腎細胞癌細胞系における劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。本アッセイでは、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であった。
【０２８９】
実施例１７：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト食道癌細胞系に対する効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト食道癌細胞系ＳＥＧ−１、ＴＥ−７、およびＢＩＣ−１およびＯＥ２１における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、分析対象であるすべてのヒト食道癌細胞系における劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。本アッセイでは、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であった。
【０２９０】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ヒト食道癌細胞系ＳＥＧ−１、ＴＥ−７、およびＢＩＣ−１およびＯＥ２１におけるＨｈシグナル伝達の活性化を検証した。これら細胞系において、Ｐｔｃｈ  １、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、およびＧｌｉ３の発現を含むＨｈ経路の活性化が見られた（データは示さない）。
【０２９１】
実施例１８：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト胃癌細胞系における効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト胃癌細胞系ＮＵＧＣ３、ＭＮＫ２８、およびＡＧＳにおける小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、分析対象であるすべてのヒト胃癌細胞系における劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。本アッセイでは、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であった。
【０２９２】
実施例１９：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト肉腫細胞系における効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト肉腫細胞系ＭＧ６３およびＭＮＮＧにおける小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、分析対象であるすべてのヒト胃癌細胞系における劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。これら肉腫細胞系では、ＦＮ１−５による有意な細胞殺滅が観察されなかった（データは示さない）。
【０２９３】
実施例２０：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト肝細胞癌細胞系における効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト肝細胞癌細胞系ＨＥＰＧ２およびＳＫ−Ｈｅｐ−１における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、分析対象であるすべてのヒト胃細胞における劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。本アッセイでは、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であった。
【０２９４】
実施例２１：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト上咽頭癌細胞系における効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト上咽頭癌細胞系ＨＮＥ１およびＨＯＮＥ１における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による処理後において、これら細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８および５０μＭ  ＦＮ１−５で、分析対象であるすべてのヒト上咽頭癌細胞における劇的な細胞殺滅が観察された（データは示さない）。本アッセイでは、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力であった。
【０２９５】
実施例２２：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヒト神経膠腫細胞系Ｕ８７における効果
本実施例で述べた細胞ベースの細胞毒性試験を用いて、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ８７における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の効果を解明した。３０および５０μＭ  ＦＮ１−５または１０、３０および５０μＭ  ＦＮ１−８による処理後において、Ｕ８７細胞の生存率を分析した。５０μＭ  ＦＮ１−８で劇的な細胞殺滅が観察され、５０μＭ  ＦＮ１−５ではより低度の細胞殺滅であった（データは示さない）。
【０２９６】
実施例２３：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の正常ヒト筋肉細胞に対する効果
各用量の小分子化合物ＦＮ１−８、ＦＮ１−７、およびＦＮ１−５の殺細胞効果を、正常ヒト筋肉細胞において検証した。他の２つの化合物と同様の構造を有するが被験癌細胞系においてさほどの細胞毒性を有さないＦＮ１−７を、陰性対照として含めた。他の同様の試験について本実施例で述べたのと同じ手順で、６ウェルプレートに正常筋肉細胞を接種し、１、１０、３０、および５０μＭの各化合物で３日間インキュベートした。すべての用量におけるすべての化合物について検知可能な殺細胞効果が観察されなかったことは、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の両方が正常筋肉細胞に対して毒性でないことを示唆する。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８共に、癌細胞の殺滅に特異的であると考えられる。
【０２９７】
さらに、正常ヒト筋肉細胞における各用量のＦＮ１−５またはＦＮ１−８投与後におけるアポトーシスの誘発を、フローサイトメトリーにより検証した。前述の通り、６ウェルプレートに正常筋肉細胞を接種し、１、１０、３０、および５０μＭの各化合物で３日間インキュベートした。すべての用量におけるいずれの化合物についても、ＤＭＳＯ対照と比べアポトーシス細胞数に検知可能な差が観察されなかったことは、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の両方が正常筋肉細胞に対して毒性でないことをさらに示唆する（表２および３）。この結果も、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８共に、癌細胞におけるアポトーシス誘発に特異的であることを示唆する。
【０２９８】
実施例２４：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の正常ヒト腎細胞に対する効果
各用量の小分子化合物ＦＮ１−５、およびＦＮ１−８の殺細胞効果を、正常ヒト腎細胞において検証した。他の同様の試験について本実施例で述べたのと同じ手順で、６ウェルプレートに正常腎細胞を接種し、３０および５０μＭの化合物ＦＮ１−５、ならびに１０、３０、および５０μＭ  ＦＮ１−８化合物で３日間インキュベートした。すべての用量におけるすべての化合物について検知可能な殺細胞効果が観察されなかったことは、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の両方が正常腎細胞に対して毒性でないことを示唆する（データは示さない）。
【０２９９】
さらに、正常ヒト腎細胞における各用量のＦＮ１−５（３０および５０μＭ）またはＦＮ１−８（１０、３０、および５０μＭ）投与後におけるアポトーシスの誘発を、フローサイトメトリーにより検証した。すべての用量におけるいずれの化合物についても、ＤＭＳＯ対照と比べアポトーシス細胞数に検知可能な差が観察されなかったことは、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の両方が正常腎細胞に対して毒性でないことをさらに示唆する（表２および３）。
【０３００】
実施例２５：小分子ＦＮ１−５によるアポトーシス誘発効果の概要
以下の表に、表示濃度での小分子化合物ＦＮ１−５による処理後に観察されるアポトーシス細胞百分率をまとめる。アッセイは、本実施例に述べる手順で実施した。Ｎ．ｄ．は、「実施なし」を示す。
表２：小分子化合物ＦＮ１−５を用いた細胞におけるアポトーシスの誘発
2009519909.tif 000024
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【０３０１】
実施例２６：小分子ＦＮ１−８によるアポトーシス誘発効果の概要
以下の表に、表示濃度での小分子化合物ＦＮ１−８による処理後に観察されるアポトーシス細胞百分率をまとめる。アッセイは、本実施例に述べる手順で実施した。Ｎ．ｄ．は、「実施なし」を示す。
表３：小分子化合物ＦＮ１−８を用いた細胞におけるアポトーシスの誘発
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【０３０２】
実施例２７：ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９における小分子によるＷｎｔ２プロモーター活性の調節
本発明の小分子化合物の特異性を検証するため、該化合物を、Ｇｌｉ下流の標的遺伝子発現の調節について調べた。Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｇｌｉ活性化の下流で活性化することが示されており、Ｈｈ／Ｇｌｉシグナル伝達は、Ｗｎｔ遺伝子の発現を調節することが示されている。ヒトＷｎｔ２プロモーターをクローンしたところ、該プロモーター領域内に推定Ｇｌｉ−ＤＮＡ結合部位を含有することがわかった（データは示さない）。こうして、ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９（Ｗｎｔ２を発現する）を、本発明による複数の小分子化合物で処理した後に、Ｗｎｔ２プロモーター−ルシフェラーゼレポーター活性を分析した。３０μＭで１８〜２４時間の処理後、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８共に、Ｗｎｔ２プロモーター活性を劇的に下方調節することがわかった（図９）。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８ほど強力な殺細胞効果を持たない小分子化合物は、Ｗｎｔ２プロモーター活性の下方調節に対して、はるかに低度の効果しか及ぼさないか、またはまったく効果を及ぼさないかのいずれかであった（図９）。この結果は、細胞毒性およびアポトーシス分析と符合し、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、Ｗｎｔ２発現のＧｌｉ転写に対する阻害を介してアポトーシスを誘発することを強く示唆する。
【０３０３】
実施例２８：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は癌細胞におけるヘッジホッグ経路を調整する
本発明による小分子化合物の作用機序をさらに検証するため、化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路に対する効果を、ＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ４６０およびＡ５４９において検証した。Ｈ４６０およびＡ５４９細胞を、３０μＭの各化合物（ＦＮ１−５またはＦＮ１−８）で２日間インキュベートした後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に用いる全ＲＮＡを単離した。Ｈｈ経路の主な要素および直接の標的遺伝子（例えば、Ｐｔｃｈ１およびＧｌｉ１）が、下方調節されることがわかった（データは示さない）。ＧＡＰＤＨを対照として用いた。
【０３０４】
前出で示したのと同様、Ｗｎｔ２プロモーター−ルシフェラーゼレポーター活性アッセイにより、Ｗｎｔ２発現も、ＦＮ１−８処理後に下方調節されることがわかった（データは示さない）。以上の結果は、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８が、ＨｈおよびＷｎｔ経路の双方に対する二重の阻害剤となりうることを示唆する。さらに、ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりもいずれの経路に対してもより高度の阻害効果を有すると考えられ、これら細胞系におけるアポトーシス分析と符合する（データは示さない）。
【０３０５】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲが示す通り、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は、黒色腫細胞系ＬＯＸ、結腸癌細胞系ＳＷ４８０、および組織から作製直後の初代培養ヒト中皮腫細胞におけるヘッジホッグ経路をも調整することができた（データは示さない）。興味深いことに、ＨＴ２９細胞においては、検知可能な変化が観察されなかった（データは示さない）。
【０３０６】
実施例２９：小分子化合物ＦＮ１−８は黒色腫細胞におけるＧＬＩ１誘発転写を下方調節する
特に小分子化合物ＦＮ１−８の特異性をさらに検証するため、小分子化合物ＦＮ１−８の存在および非存在下におけるＧＬＩ依存性転写について調べることで、ＦＮ１−８のＨｈ／Ｇｌｉシグナル伝達経路調節効果を検証した。とりわけ、６回反復ＧＬＩ結合部位（６×ＧＬＩ  ＢＳ；Sasaki et al., Development 124(7):1313-22(1997)）を、ＧＬＩ依存性転写の代理指標としてのルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結したプラスミド発現構造を用い、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ（図１５Ａ）、Ａ３７５（図１５Ｂ）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２（図１５Ｃ）、およびＳＫ−Ｍｅｌ−５（図１５Ｄ）を含む複数の黒色腫細胞系において、ＦＮ１−８投与後の６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を測定した。４つの被験黒色腫細胞系すべてにおいて、ＧＬＩ１の共発現（本実施例で述べたＧｌｉ１発現プラスミドの黒色腫細胞へのトランスフェクションによる）が、６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を有意に上昇させた（図１５Ａ〜Ｄ、「Ｇｌｉ＋ＤＭＳＯ」表示欄）。このことは、過剰発現（すなわち、外因性添加）したＧＬＩ１が、ＧＬＩ結合部位へ特異的に結合し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの転写を機能的に誘発することを確認した。ＧＬＩ１を発現せず、しかもこれら黒色腫細胞にトランスフェクトした対照ベクターは、高度のルシフェラーゼ活性を示すには至らなかった（図１５Ａ〜Ｄ、「対照ベクター＋ＤＭＳＯ」表示欄）。２０μＭ  ＦＮ１−８による１６〜２０時間の処理後、ルシフェラーゼ活性の低下が観察された（図１５Ａ〜Ｄ、「Ｇｌｉ＋２０ｕＭ  ＦＮ１−８」表示欄）。こうして、小分子化合物ＦＮ１−８は、これら黒色腫細胞におけるＧＬＩ１誘発転写を有意に低下させた。この結果は、ＦＮ１−８が、ＧＬＩ依存性転写の阻害剤であることを示した。この結果は、細胞におけるＧＬＩ依存性転写の阻害法をも提示する。
【０３０７】
実施例３０：小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は膵癌細胞におけるＧＬＩ１およびＧＬＩ２誘発転写を下方調節する
Ｈｈ／Ｇｌｉシグナル伝達経路を阻害する上での小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の特異性をさらに検証するため、膵癌細胞におけるこれら化合物の存在および非存在下でのＧＬＩ依存性転写をも解明した。特に、実施例２９で述べた（６×Ｇｌｉ  ＢＳ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子構造を用いて、ＧＬＩ１単剤（本実施例で述べたＧｌｉ１発現プラスミドのＰａｎｃ４．２１細胞へのトランスフェクションによる）またはＧＬＩ２単剤（本実施例で述べたＧｌｉ２発現プラスミドのＰａｎｃ４．２１細胞へのトランスフェクションによる）の６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ過剰発現が、６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を有意に上昇させることを解明した（データは示さない）。このことは、過剰発現（すなわち、外因性添加）したＧＬＩ１またはＧＬＩ２ポリペプチドが、ＧＬＩ結合部位に特異的に結合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を機能的に誘発することを確認した。Ｇｌｉ１またはＧｌｉ２を発現しない対照ベクター、あるいはＧｌｉ３発現ベクターは、これら膵癌細胞にトランスフェクトしたとき、高度のルシフェラーゼ活性を示すには至らなかった（データは示さない）。Ｇｌｉ３発現がルシフェラーゼ活性の上昇をもたらさなかった事実は、ＧＬＩ３においては、アクチベーターおよびリプレッサーのいずれもが存在するためであると考えられる。
【０３０８】
２０μＭ  ＦＮ１−５またはＦＮ１−８による１６〜２０時間の処理後、ルシフェラーゼ活性値の有意な低下が観察された（データは示さない）。こうして、小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は、これら膵癌細胞におけるＧＬＩ１およびＧＬＩ２誘発転写を有意に低下させた。以上の結果は、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８が、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２依存性転写の阻害剤として作用することを示した。この結果は、細胞におけるＧＬＩ１およびＧＬＩ２依存性転写の阻害法をも提示する。
【０３０９】
別の試験では、ＴＡＦＩＩ３１発現プラスミドの、ＧＬＩ１またはＧＬＩ２発現プラスミドのいずれかとの共トランスフェクションも、６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を有意に上昇させることがわかった（データは示さない）。ＦＮ１−５またはＦＮ１−８のいずれかを添加（２０μＭで１６〜２０時間）すると、６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性が、有意に低下した（データは示さない）。ＴＡＦＩＩ３１発現プラスミドは、ＰＣＲ法で産生し、ｃ−Ｍｙｃタグ付き哺乳類発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１（−）Ｂ）のＥｃｏＲＩ（５’）およびＢａｍＨＩ（３’）部位にクローンする、全長ＴＡＦＩＩ３１ｃＤＮＡを含有した。ＴＡＦＩＩ３１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセションＮｏ．Ｕ２５１１２に対応する。
【０３１０】
実施例３１：結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０における小分子化合物によるＴＯＰ／ＦＯＰ活性の調節
本発明の小分子化合物に対する別の特異性試験として、小分子化合物ＦＮ１−５、ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、ＦＮ１−９Ｕ、ＦＮ１−９Ｓ、ＦＮ２−１、およびＦＮ３−５が標準的Ｗｎｔシグナル伝達の転写活性を調節できるかどうかを、ＴＯＰ／ＦＯＰ法を用いて調べた。これらの試験では、ＴＯＰ／ＦＯＰ法で測定される高度なＴＣＦ転写活性を有することが示されている結腸癌細胞系を用いた。図１０は、ＨＣＴ１１６細胞における結果を示す。３０μＭでの１８〜２４時間の処理後、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、ＴＯＰ／ＦＯＰ活性を劇的に下方調節することがわかった。本アッセイで、有意な細胞殺滅を誘発しない化合物をも用いたところ、有意な下方調節は観察されなかった。この結果も、細胞毒性、アポトーシス、およびＷｎｔ２プロモーター活性分析と符合し、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、Ｗｎｔ２発現のＧｌｉ転写を阻害し、これがＷｎｔシグナル伝達依存性転写を阻害することによりアポトーシスを誘発することを示す。
【０３１１】
結腸癌細胞系ＳＷ４８０において、前出と同じ化合物によるＴＯＰ／ＦＯＰ活性の調節をも分析した。化合物ＦＮ１−５が本細胞系においてより低度の効果を示すのに対し、小分子化合物ＦＮ１−８は、ＳＷ４８０細胞においても、ＴＯＰ／ＦＯＰ活性を、ＨＣＴ１１６細胞における約３６％の低下（図１０参照）と同等に約３２％低下させた（データは示さない）。
【０３１２】
実施例３２：小分子化合物によるＳＯＳＣ−３およびＧｒｅｍｌｉｎプロモーター活性の調節
本発明の小分子化合物に関する３つ目の特異性試験として、これら化合物による、Ｇｌｉ活性化の下流標的でない遺伝子の発現に対する調節能を分析した。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤であり下流標的遺伝子であるＳＯＳＣ３を、本試験のために選定した。ＳＯＳＣ３の発現は、Ｇｌｉおよび／またはＷｎｔ活性化の調節下にはない。さらに、Ｊａｂｌｏｎｓ博士（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）の研究室がクローンしたヒトＳＯＳＣ３プロモーターには、ＧＬＩおよびＴＣＦ結合部位が見出されなかった（データは示さない）。こうして、小分子化合物ＦＮ１−５、ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、およびＦＮ１−９ＵによるＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９の処理後において、ＳＯＳＣ３プロモーター−ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。３０μＭでの１８〜２４時間の処理後、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、ＳＯＳＣ３プロモーター活性の調節に不活性であることがわかり、細胞殺滅を示さなかった他の化合物（例えば、ＦＮ１−７およびＦＮ１−９Ｕ、図１１）と同様であった。この結果は、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、ＧＬＩ転写活性の阻害に特異的な小分子阻害剤であることを示す。
【０３１３】
本発明の小分子化合物に関する４つ目の特異性試験として、化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８による、Ｇｌｉ活性化の下流標的ではない別の遺伝子の発現に対する調節能を調べた。ＢＭＰおよびＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤であるＧｒｅｍｌｉｎを、本実験用に選定した。Ｇｒｅｍｌｉｎ発現は、Ｇｌｉおよび／またはＷｎｔ活性化の調節下にはない。こうして、化合物ＦＮ１−５、ＦＮ１−８、またはＤＭＳＯ（対照）、あるいは空ベクター（対照）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の処理後において、ヒトＧｒｅｍｌｉｎプロモーター−ルシフェラーゼレポーターの活性を検証した。３０μＭでの１８〜２４時間の処理後、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、Ｇｒｅｍｌｉｎプロモーター活性の調節に不活性であることがわかった（データは示さない）。この結果も、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、ＧＬＩ転写活性の阻害に特異的な小分子阻害剤であることを示す。ヒトＧｒｅｍｌｉｎは、Ｊａｂｌｏｎｓ博士（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）の研究室がクローンした（データは示さない）。
【０３１４】
実施例３３：ＧＬＩシグナル伝達の小分子化合物阻害剤は結腸癌細胞、ＮＳＣＬＣ細胞、および黒色腫細胞における標準的Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する
本発明の小分子化合物が、ＧＬＩ３活性化ドメインの小分子阻害剤として作用し、標準的なＷｎｔシグナル伝達を抑制するかどうかを調べるため、３０μＭの小分子化合物ＦＮ−１５およびＦＮ１−８ならびにＤＭＳＯ（対照）による２日間の処理後の結腸癌細胞ＳＷ４８０、ＨＴ２９、およびＣａＣＯ２において、標準的なＷｎｔシグナル伝達の主要要素（Ｄｖｌ−３および細胞質β−カテニン）に対するウェスタンブロット分析を行った。アポトーシス誘発の結果と符合して、該化合物による処理後のこれら細胞において、Ｄｖｌ−３および細胞質β−カテニンの劇的な下方調節が観察された（図１２）。アポトーシス阻害剤でＷｎｔ下流標的遺伝子の１つであるスルビビン（Kim et al., 2003）も、下方調節された（図１２）。ＨＴ２９細胞において、ＦＮ１−８処理後にＤｖｌ−３および細胞質β−カテニンの下方調節が観察されず、ＦＮ１−８化合物がＨＴ２９細胞の生存率に影響を及ぼさなかった結果と符合することは注目に値する。
【０３１５】
本発明の小分子化合物が、ＧＬＩ３活性化ドメインの小分子阻害剤として作用し、標準的なＷｎｔシグナル伝達を抑制するかどうかを調べるため、３０μＭの小分子化合物ＦＮ−１５およびＦＮ１−８ならびにＤＭＳＯ（対照）による２日間の処理後のＮＳＣＬＣ細胞Ｈ４６０、Ａ５４９、およびＨ８３８において、標準的なＷｎｔシグナル伝達の主要要素（Ｄｖｌ−３および細胞質β−カテニン）に対するウェスタンブロット分析を行った。β−アクチンは、添加対照とした。アポトーシス誘発の結果と符合して、該化合物による処理後のこれら細胞において、Ｄｖｌ−３および細胞質β−カテニンの劇的な下方調節が観察された（図１３）。アポトーシス阻害剤でありＷｎｔ下流標的遺伝子（Kim et al., 2003）であるスルビビンも、下方調節された（図１３）。
【０３１６】
別の試験で、出願人らはウェスタンブロット分析を用いて、小分子化合物ＦＮ１−８が、標準的なＷｎｔ経路の阻害により、黒色腫細胞成長（前出参照）を抑制するかどうかを調べた。ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ、または２０μＭ  ＦＮ１−８による処理後に、２つの黒色腫細胞系Ａ３７５およびＳＫ−Ｍｅｌ−５、およびヒト正常皮膚線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ−３）から細胞質タンパク質を単離した。β−アクチンを、対照として用いた。以上の試験は、いずれの黒色腫細胞においても、標準的なＷｎｔ活性化経路の主要な指標の１つである細胞質β−カテニン濃度が、ＦＮ１−８による処理後に下方調節される（データは示さない）ことを示した。一方、ヒト正常皮膚線維芽細胞においては、細胞質β−カテニン濃度の検知可能な変化が観察されなかった（データは示さない）。以上の結果は、本発明の小分子化合物が、本実施例においてＦＮ１−８が示す通り、標準的なＷｎｔ経路の阻害により、黒色腫細胞成長を特異的に抑制し、これら癌細胞におけるアポトーシスを誘発することを示す。本実施例においてすでに示した通り、以上の結果は、ＦＮ１−８が、ＨｈおよびＷｎｔシグナル伝達経路の二重の阻害剤であることをさらに支持する。
【０３１７】
実施例３４：ＧＬＩ２の過剰発現は小分子化合物阻害剤ＦＮ１−５およびＦＮ１−８で処理した結腸癌細胞系ＳＷ４８０を救済する
本実施例で述べる通り、ＧＬＩ３は、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２遺伝子の転写を活性化すると考えられる。こうして、本発明の小分子化合物によるＧＬＩ３活性の阻害も、ＧＬＩ１および／またはＧＬＩ２によるシグナル伝達を阻害すると考えられる。そのように仮定すると、本発明の小分子化合物により処理した細胞にＧＬＩ１および／またはＧＬＩ２発現構造をトランスフェクトすれば、該小分子化合物によるアポトーシス効果の少なくとも部分的な抑制が生じると考えられる。こうして、小分子化合物ＦＮ１−５の特異性のほか、その阻害機序をもさらに検証するため、過剰発現するＧＬＩ２タンパク質が、ＦＮ１−５の殺細胞効果を緩和しうるかどうかを調べた。この試験では、結腸癌細胞系ＳＷ４８０に、空のｐＣＤＮＡ３ベクターまたはＧｌｉ２  ｃＤＮＡ発現構造のいずれかをトランスフェクトした。選別後、同数のトランスフェクト済み細胞を６ウェルプレートに再接種した後、最終濃度５０μＭでＦＮ１−５を培地に添加した。５日後、ＦＮ１−５は、空ベクターをトランスフェクトした細胞よりも少数のＧｌｉ２トランスフェクト済み細胞を殺滅することがわかった（データは示さない）。この結果は、ＦＮ１−５が、ＧＬＩ３転写アクチベーター機能を阻害することで、癌細胞を殺滅することを示した。
【０３１８】
小分子化合物ＦＮ１−８の特異性のほか、その阻害機序をもさらに検証するため、過剰発現するＧＬＩ２タンパク質が、ＦＮ１−８の殺細胞効果を緩和しうるかどうかを調べた。トランスフェクション試験は、上述の手順で実施した。５日後、フローサイトメトリーを用いるアポトーシス分析を実施して、該試験を定量化した。Ｇｌｉ２発現構造をトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞（２７．７％）におけるよりも、空ベクターをトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞（４８．１％）において、有意に多数のアポトーシス細胞が見られた。この結果も、ＦＮ１−８が、ＧＬＩ３転写アクチベーター機能を阻害することで、癌細胞にアポトーシスを誘発することを示した。
【０３１９】
結腸癌細胞ＳＷ４８０において、ＧＬＩ２過剰発現が、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８によるアポトーシス誘発を緩和するという結果を確認するため、ウェスタンブロット分析を実施して、標準的なＷｎｔシグナル伝達の主要要素（細胞質β−カテニン）、その下流標的（スルビビン）、および該アポトーシス経路における主要作用物質の一部（アポトーシスの正のレギュレーターとしてのチトクロームｃおよび活性ＰＡＲＰ（開裂形態）、アポトーシス阻害剤としてのスルビビン）の発現を調べた。β−アクチンをローディング対照として用いた。得られた結果は、上述に報告したアポトーシスのフローサイトメトリー分析と符合した（データは示さない）。以上のデータは、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、ＧＬＩ３転写アクチベーター機能の阻害により、癌細胞の一部においてアポトーシスを誘発しうるという他のデータをさらに支持した。
【０３２０】
結腸癌細胞において、Ｇｌｉ２過剰発現が、Ｈｈシグナル伝達経路の再活性化により、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８によるアポトーシス誘発を緩和するという結果を確認するため、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、Ｈｈシグナル伝達の主要要素およびその下流標的（Ｓｈｈ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ３）を分析した。ＧＡＰＤＨを対照として用いた。結果は、上述に報告したアポトーシスのフローサイトメトリー分析と符合することがわかった（データは示さない）。
【０３２１】
実施例３５：小分子化合物はＧＬＩポリペプチドとＴＡＦタンパク質との間のタンパク質間相互作用を阻害し、ＧＬＩ−ＴＡＦ誘発転写活性の阻害を生じる
さらに、本発明による化合物のＧＬＩ活性阻害における特異性、および、これら化合物が上述したＧｌＬＩとＴＡＦＩＩ３１との間の相互作用を遮断するかどうかを検証した。本分析ではとりわけ、６回反復ＧＬＩ結合部位（６×ＧＬＩ  ＢＳ）を、ＧＬＩ依存性転写の代理指標としてのルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結する発現構造を用いて、ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞の化合物ＦＮ１−８による処理後における６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を検証した。本試験の結果は、ＧＬＩ１またはＧＬＩ２単剤の過剰発現が、６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を有意に上昇させることを示した（図１６）。ＴＡＦＩＩ３１とＧＬＩ１またはＧＬＩ２のいずれかとの共発現は、６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を、ＧＬＩ１またはＧＬＩ２単剤によるよりもさらに高度に上昇させるのに対し、ＴＡＦＩＩ３１単剤の過剰発現は、何らの影響も及ぼさなかった（図１６）。この結果は、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２のいずれもが、ＧＬＩ結合部位に特異的に結合し、転写において機能的に活性であることを再度確認した。この結果は、さらに、ＴＡＦＩＩ３１が、コアクチベーターとしてのＧＬＩタンパク質と相互作用しうることを示した。Ａ５４９細胞の２０μＭ  ＦＮ１−８による１６〜２０時間の処理後、ＧＬＩ単剤およびＧＬＩ／ＴＡＦＩＩ３１のいずれが誘発する６×ＧＬＩ  ＢＳ−ルシフェラーゼ転写も低下した。興味深いことに、ＧＬＩ単剤による転写活性が約３０％低下したのに対し、ＴＡＦＩＩ３１を共トランスフェクトしたＡ５４９細胞における転写活性は、ＧＬＩ２で約５０％、およびＧＬＩ１で約７０％低下した。この結果は、ＦＮ１−８が、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１との間の相互作用に特異的な阻害剤でありうることを示す。
【０３２２】
共免疫沈降試験は、小分子化合物ＦＮ１−８が、ＧＬＩタンパク質のＴＡＦ結合ドメインとＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間のタンパク質間相互作用を遮断することを示した（図２３）。本試験のために、ＧＬＩタンパク質ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、およびＧＬＩ３のビオチニル化ＴＡＦ結合ドメイン（下記参照）を、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で特注合成した。ＧＬＩ−ＴＡＦ結合ドメイン（ＧＬＩ−ＴＡＦｂｄ）ペプチド配列は、以下の通りであった：
ＧＬＩ１−ＴＡＦｂｄ：（ＮＨ２）−ＬＤＳＬＤＬＤＮＴＱＬＤＦＶＡＩＬＤＥＰＱＧ−（ＣＯＯＨ）、
ＧＬＩ２−ＴＡＦｂｄ：（ＮＨ２）−ＶＤＳＱＬＬＥＡＰＱＩＤＦＤＡＩＭＤＤＧＤＨ−（ＣＯＯＨ）、及び
ＧｌＬＩ−ＴＡＦｂｄ：（ＮＨ２）−ＬＤＳＨＤＬＥＧＶＱＩＤＦＤＡＩＩＤＤＧＤＨ−（ＣＯＯＨ）。
【０３２３】
ＴＡＦＩＩ３１タンパク質は、製造元のプロトコルに従い、ＴＮＴ  ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて調製した。（ｃ−ｍｙｃタグ付き）ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターにクローンした全長ＴＡＦＩＩ３１  ｃＤＮＡ挿入物を、本インビトロ翻訳システムにおけるテンプレートとして用いた。空の（ｃ−ｍｙｃタグ付き）ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターを、対照として用いた。ビオチニル化ＧＬＩペプチド（すなわち、３つの異なるＧＬＩタンパク質のＴＡＦ結合ドメイン）を、小分子化合物ＦＮ１−８（濃度２０μＭおよび５０μＭ）の存在下または非存在下で、ＴＡＦＩＩ３１タンパク質によりインキュベートした。次いで、ビオチニル化ＧＬＩペプチド−ＴＡＦＩＩ３１複合体をストレプトアビジンアガロースで沈殿させた後、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ａ−１４；Cao et al., 2001, Science 293;115-120）でイムノブロッティングした。本アッセイでは、５０μＭ  ＦＮ１−８の添加が、ＧＬＩペプチド−ＴＡＦＩＩ３１複合体の形成を低減することがわかった（図２３）。特に、ＦＮ１−８は、ＴＡＦＩＩ３１とＧＬＩ３およびＧＬＩ１のＴＡＦ結合ドメインとの間のタンパク質間相互作用の遮断における方が、ＧＬＩ２のＴＡＦ結合ドメインとの相互作用の遮断におけるよりも強力であると考えられた。対照として、空の（ｃ−ｍｙｃタグ付き）ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターをインビトロ翻訳システムに用いると、３つすべてのＧＬＩペプチドによるＴＡＦＩＩ３１のプルダウンは生じなかった（図２３）。
【０３２４】
まとめると、以上のデータは、小分子化合物ＦＮ１−８が、ＧＬＩタンパク質（より適切にはＧＬＩ１およびＧＬＩ３）のＴＡＦ結合ドメインとＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間のタンパク質間相互作用を遮断することを示し、上述のＧＬＩ／ＴＡＦＩＩ３１依存性転写レポーターアッセイと符合した。このＧＬＩペプチド／ＴＡＦＩＩ３１タンパク質間相互作用アッセイは、ＧＬＩタンパク質（または上述のＧＬＩペプチド）間のタンパク質間相互作用を阻害する作用物質のスクリーニングのための方法においても、用いることができる。この方法では、バリデーションまたはスクリーニング対象となる作用物質を、ＧＬＩタンパク質（またはＧＬＩペプチド）およびＴＡＦＩＩ３１タンパク質によりインキュベートする。
【０３２５】
実施例３６：小分子化合物ＦＮ１−８はインビボ（マウス異種移植モデル：ＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０）における腫瘍成長を抑制する
マウス異種移植モデル（ＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０）を用いて、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボ有効性試験を行った。マウスの背部に、１００μｌ容中３×１０６個の細胞を皮下注射した（図１７、矢印）。接種の７日後、マウスに体重比５０ｍｇ／ｋｇで毎日２回×６日間のＦＮ１−８投与を開始した（ｎ＝６）。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた（ｎ＝７）。マウス腹部への４０μｌ容の腹腔内注射用に、ＦＮ１−８およびＤＭＳＯを調整した。図１８Ａにおける矢印は、各注射時点を示す。３日ごとに、カリパーにより腫瘍サイズ（腫瘍の形状に従う長さおよび幅）を測定した。式ｘ２ｙ（ただしｘ＜ｙ）を用いて、腫瘍体積を計算した。図１７および１８に見られる通り、小分子化合物ＦＮ１−８の投与後、腫瘍成長は有意に抑制された。
【０３２６】
上述した初回腫瘍接種および投与の３週間後に、各群マウスから腫瘍を切除し、秤を用いて重量を測定した。ＦＮ１−８化合物の投与後は、腫瘍重量が劇的に減少した（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
【０３２７】
実施例３７：小分子化合物ＦＮ１−８はインビボ（マウス異種移植モデル：黒色腫ＬＯＸ）における腫瘍成長を抑制する
マウス異種移植モデル（黒色腫ＬＯＸ）を用いて、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボ有効性試験を行った。マウスの背部に、１００μｌ容中３×１０６個の細胞を皮下注射した（図１７、矢印先）。接種の７日後、マウスに体重比５０ｍｇ／ｋｇで毎日２回×６日間のＦＮ１−８投与を開始した（ｎ＝９）。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた（ｎ＝１０）。マウス腹部への４０μｌ容の腹腔内注射用に、ＦＮ１−８およびＤＭＳＯを調整した。図１９Ａにおける矢印は、各注射時点を示す。上述の手順で、腫瘍サイズおよび腫瘍体積を計算した。図１７および１９に見られる通り、小分子化合物ＦＮ１−８の投与後、腫瘍成長は劇的に抑制された。
【０３２８】
上述した初回腫瘍接種および投与の３週間後に、各群マウスから腫瘍を切除し、秤を用いて重量を測定した。ＦＮ１−８化合物の投与後は、腫瘍重量が劇的に減少した（図１９Ｂおよび１９Ｃ）。
【０３２９】
マウス異種移植モデル（ＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０）における小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のインビボ有効性試験を、低用量の該化合物を用いて繰り返した。マウスへの注射は、上述の手順で行った。接種の９日後、マウスに体重比１５ｍｇ／ｋｇの低用量で毎日２回×６日間の該化合物投与を開始した（ｎ＝７）。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた（ｎ＝７）。マウス腹部への５０μｌ容の腹腔内注射用に、ＦＮ１−８およびＤＭＳＯを調整した。初回腫瘍接種の２４日後に、各群マウスから腫瘍を切除し、秤を用いて重量を測定した。小分子化合物ＦＮ１−８の投与後は、腫瘍重量が減少した（データは示さない）。一方、低用量の化合物ＦＮ１−５を投与したマウスの腫瘍重量は、ＤＭＳＯ対照群と同様であった。このインビトロにおける低用量の結果は、本実施例に示すインビボデータと符合する。
【０３３０】
実施例３８：小分子化合物ＦＮ１−８はインビボ（マウス異種移植モデル：結腸癌ＨＴ２９）における腫瘍成長に影響を及ぼさない
陰性のマウス異種移植モデル（結腸癌ＨＴ２９）を用いて、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボ有効性試験を行った。マウスの背部に、１００μｌ容中３×１０６個の細胞を皮下注射した。接種の７日後、マウスに体重比５０ｍｇ／ｋｇで毎日２回×６日間のＦＮ１−８投与を開始した（ｎ＝２）。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた（ｎ＝４）。マウス腹部への４０μｌ容の腹腔内注射用に、ＦＮ１−８およびＤＭＳＯを調整した。図２０Ａにおける矢印は、各注射時点を示す。３日ごとに、カリパーにより腫瘍サイズを測定した。式ｘ２ｙ（ただしｘ＜ｙ）を用いて、腫瘍体積を計算した。図１６Ａに見られる通り、小分子化合物ＦＮ１−８の投与後、腫瘍成長には影響が及ばなかった。この結果は、ＦＮ１−８の、ＨＴ２９細胞においてＧＬＩ３活性化に対する効果、およびＧｌｉ３  ＲＴ−ＰＣＲ産物を示さないインビトロデータと符合する（例えば、図１２および不表示データを参照）。ＦＮ１−８投与後の腫瘍重量は、ＤＭＳＯ対照群と同等である（図２０Ｂ）。結果は、平均±標準偏差（誤差バー）で示す。
【０３３１】
接種７日後の別の試験において、マウスに体重比１５ｍｇ／ｋｇの低用量で毎日２回×６日間のＦＮ１−８またはＦＮ１−５投与を開始（ｎ＝７）した後、体重比３０ｍｇ／ｋｇで毎日１回×６日間の別の投与ラウンドを実施した。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた（ｎ＝７）。マウス腹部への５０μｌ容の腹腔内注射用に、該化合物およびＤＭＳＯを調整した。初回腫瘍接種の４３日後に、各群マウスから腫瘍を切除し、秤を用いて重量を測定した。ＦＮ１−８投与後のＨＴ２９腫瘍重量は、ＤＭＳＯ対照群と同等であることがわかった（データは示さない）。さらに、ＦＮ１−５投与は腫瘍重量をわずかに減少させることもわかった（データは示さない）。以上の結果は、結腸癌細胞系ＨＴ２９においては、ＦＮ１−５が細胞殺滅およびアポトーシスを誘発するのに対し、ＦＮ１−８は誘発しなかったことを示す、ＨＴ２９細胞によるインビトロデータと符合する。
【０３３２】
実施例３９：小分子化合物ＦＮ１−８はインビボ（マウス異種移植モデル：ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９）における腫瘍成長を抑制した
マウス異種移植モデル（ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９）におけるＦＮ１−８のインビボ有効性試験も検証した。マウスの背部に、１００μｌ容中３×１０６個の細胞を皮下注射した。接種の１０日後、マウスに体重比１５ｍｇ／ｋｇの低用量で毎日２回×６日間の小分子化合物ＦＮ１−８投与を開始した（ｎ＝５）後、体重比３０ｍｇ／ｋｇで毎日１回×６日間の別の投与ラウンドを実施した。ＤＭＳＯ単剤を対照として用いた（ｎ＝５）。マウス腹部への５０μｌ容の腹腔内注射用に、ＦＮ１−８およびＤＭＳＯを調整した。初回腫瘍接種の４３日後に、各群マウスから腫瘍を切除し、秤を用いて重量を測定した。ＦＮ１−８化合物投与後の腫瘍重量は、ＤＭＳＯ対照群と比べて減少した（データは示さない）。このインビボにおける低用量の結果は、本実施例に示すインビトロデータと符合する。
【０３３３】
実施例４０：小分子化合物ＦＮ１−８のインビボの腫瘍におけるヘッジホッグ経路に対する効果
最重要化合物ＦＮ１−８が、インビボにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害を介して腫瘍成長を抑制したのかどうかを検証するため、Ｈｈ経路の主要要素および直接の標的遺伝子（例えば、Ｓｈｈ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、Ｄｖｌ−３）の発現を、異種移植腫瘍から単離した全ＲＮＡを用いる半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＧＡＰＤＨを対照として用いた。このＲＴ−ＰＣＲ分析は、各群から適度なサイズの腫瘍を示すマウス２例ずつを無作為選別する腫瘍「プール」を用いて行った。ＮＳＣＬＣ腫瘍（Ｈ４６０）において、ＦＮ１−８がＨｈシグナル伝達を阻害することがわかった（データは示さない）。一方、インビボにおけるＦＮ１−８投与後の陰性対照ＨＴ２９腫瘍においては、Ｈｈシグナル伝達に検知可能な変化が観察されなかった。以上の結果は、インビトロの結果（例えば、Ｈ４６０およびＨＴ２９細胞におけるアポトーシスの誘発については、表２および３を参照のこと）と符合し、小分子化合物ＦＮ１−８が、Ｈｈ経路の阻害を介して、インビボにおける腫瘍成長を特異的に抑制しうることを示唆する。
【０３３４】
実施例４１：小分子化合物ＦＮ１−８のインビボの腫瘍におけるＷｎｔ経路に対する効果
最重要化合物ＦＮ１−８が、インビボにおけるＷｎｔシグナル伝達経路の阻害を介して腫瘍成長を抑制したのかどうかを検証するため、Ｈ４６０およびＨＴ２９異種移植腫瘍から単離した細胞質タンパク質のウェスタンブロット分析を実施した。ＧＡＰＤＨを対照として用いた。このウェスタンブロット分析は、各群から適度なサイズの腫瘍を示すマウス２例ずつを無作為選別する腫瘍「プール」を用いて行った。標準的なＷｎｔ活性化の主要な指標であるＤｖｌ−３および細胞質β−カテニンの発現が、ＦＮ１−８で処理したＨ４６０腫瘍においては、ＤＭＳＯ処理と比べ下方調節されることがわかった（データは示さない）。一方、インビボにおけるＦＮ１−８投与後の陰性対照ＨＴ２９腫瘍においては、Ｄｖｌ−３および細胞質β−カテニンの検知可能な変化が観察されなかった（データは示さない）。
【０３３５】
実施例４２：小分子化合物ＦＮ１−８のインビボ投与後マウスの体重に対する効果
インビボにおけるＦＮ１−８の準備的毒性試験の１つとして、ＦＮ１−８投与後のマウスにおいて、体重の減少が見られるかどうかを検討した。前出の実施例で述べた手順による初回腫瘍接種および該投与の３週間後に、ＤＭＳＯ対照群（ｎ＝１１）およびＦＮ１−８投与群（ｎ＝８）の体重を、秤を用いて測定した。ＦＮ１−８投与後の検知可能な体重減少は観察されなかった（データは示さない）。
【０３３６】
実施例４３：マウスにおける小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８の薬物動態学的分析
体重比３０ｍｇ／ｋｇの小分子化合物ＦＮ１−５を、マウス３例の腹部に腹腔内注射した。次いで、各マウスの尾静脈から、ＦＮ１−５注射の１０分、２時間、６時間および２４時間後に、血漿を採取した。質量分析により各血漿試料中のＦＮ１−５濃度を測定し、図２１Ａに示す。この分析は、ＦＮ１−５の、注射１０分以内における血漿への迅速な取り込みを示す。次いで、血清中におけるＦＮ１−５濃度が２４時間以内に低下することは、ＦＮ１−５がインビボで吸収されうることを示唆する。
【０３３７】
同様に、小分子化合物ＦＮ１−８の薬物動態学的特性を分析した（図２１Ｂ）。ＦＮ１−８の取り込みをＦＮ１−５と比較すると、腹腔内注射後のＦＮ１−５の取り込みの方が、約２倍良好であると考えられる。
【０３３８】
別の薬物動態学的試験においては、体重比３０ｍｇ／ｋｇの小分子化合物ＦＮ１−５を、マウス３例に経口投与した。次いで、上述の手順で、各マウスの尾静脈から血漿を採取し、各血漿試料中のＦＮ１−５濃度を質量分析により測定した。結果を図２２Ａに示す。本分析の結果は、ＦＮ１−５が血漿中に迅速に取り込まれ（該化合物の投与１０分以内）、２４時間以内に減少することを示す。また、この結果は、ＦＮ１−５が、癌治療用に経口でも使用可能となりうることを示唆する。
【０３３９】
同様に、経口投与した小分子化合物ＦＮ１−８の薬物動態学的特性を分析した（図２２Ｂ）。ＦＮ１−８の取り込みをＦＮ１−５と比較すると、経口投与後のＦＮ１−５の取り込みの方が、約７倍良好であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】ＧＬＩ３の転写活性化ドメインの位置を示す図である。ＧＬＩ３転写活性化ドメインは、Ｃ末端の近くにあり、保存されたＶＰ１６様の活性化領域（ＴＡＦＩＩ３１結合ドメイン）を含み、ＧＬＩ３のアクチベーター機能に必要であるが、ＧＬＩ３のリプレッサー機能には必要でない。このＦＸＸΦΦモチーフが、ＴＡＦＩＩ３１に直接的と接触すると考えられる。ＧＬＩ３におけるこのドメインは、アミノ酸配列ＦＤＡＩＩを有する。
【図２】ヒト細胞系におけるＧｌｉ３発現の検出を裏付けるための、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。本図の上パネルは、抑制ドメイン（アミノ酸残基１〜３９７）、ジンクフィンガードメイン（アミノ酸残基４８２〜６３７）、およびＣＢＰ結合ドメイン（アミノ酸残基８２７〜１１３２）を示すＧＬＩ３の図式表示を表す。ＰＣＲプライマーＦ２およびＲ２のおおよその位置を示す（詳細については表１を参照）。本図の中パネル（レーン１〜１７）は、ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した以下の細胞系を示す：正常肝（レーン１）；ＮＳＣＬＣ：Ｈ１７０３、Ｈ４６０およびＡ５４９（レーン２〜４）；乳癌：ＨｕＬ１００、ＢＴ４７４、およびＭＣＦ−７（レーン５〜７）；中皮腫：Ｍｅｔ５Ａ、Ｈ２９０、ＲＥＮ、Ｈ５１３、Ｈ２８、２１１Ｈ、およびＬＡＲＫ１Ａ（レーン８〜１４）；結腸癌：ＳＷ４８０（レーン１５）；一対の初代ＮＳＣＬＣ組織試料（レーン１６および１７が、それぞれ、正常および癌組織）。本図の下パネル（レーン１〜２９）は、ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した以下の細胞系を示す：結腸癌：ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＬｏｖｏおよびＣａＣＯ２（レーン１〜５）；正常結腸（レーン６）；正常腎細胞系：ＨＲＥ−１５２およびＨＫ−２（レーン７および８）；腎細胞癌：７８６−Ｏｍ  Ｃａｋｉ、７６９−Ｐ、Ａ７０４、およびＯＭＲＣ３（レーン９〜１３）；正常肺（レーン１４）；中皮腫：ＲＥＮ、Ｈ２９０、２１１Ｈ、Ｈ５１３、Ｈ２０５２、Ｈ２８、およびＭＳ−１（レーン１５〜２１）；ＮＳＣＬＣ：Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ８３８、Ｈ１７０３、Ｈ１２２９、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、およびＡ４２７（レーン２２〜２９）。大半の癌細胞系および初代組織試料は、Ｇｌｉ３を発現する。結腸癌細胞系ＨＴ２９ではＧｌｉ３発現を検出しないことが、注目に値する（下パネル、レーン２）。詳細を実施例４に述べる。
【図３】小分子化合物ＦＮ１−５とＧＬＩ３のＦＸＸΦΦモチーフ（アミノ酸配列：ＦＤＡＩＩ）との間で、手計算により求めたＲＭＳオーバーレイを示す図である。ＦＤＡＩＩは、α−螺旋として示す。詳細は、例えば、実施例２に述べる。
【図４】小分子化合物ＦＮ１−１、ＦＮ１−２、ＦＮ１−３、ＦＮ１−５、およびＦＮ２−１の初期スクリーニングを示す図である。該小分子化合物は、ＧＬＩ３転写活性化（ＴＡＦ結合ドメイン）を阻害する目的で設計した。小分子化合物ＦＮ１−５により、すべての被験癌細胞の劇的な殺滅が観察された。ＤＭＳＯは、対照として用いた。詳細は、実施例５に述べる。
【図５】小分子化合物ＦＮ１−５が、結腸癌細胞系ＳＷ４８０においてアポトーシスを誘発することを裏付ける、フローサイトメトリーを示す図である。１００μＭ  ＦＮ１−５で有意なアポトーシス（５８．６％）が観察されたことは、染色結果と符合する。詳細は、実施例５および６に述べる。
【図６】細胞毒性アッセイおよび本説明に述べたＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ１２９９、Ａ５４９、およびＨ４６０を用いる、小分子化合物ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、およびＦＮ３−５のスクリーニングを示す図である。小分子化合物ＦＮ１−８で処理したすべての癌細胞において、劇的な細胞殺滅が観察された。詳細は、実施例５に述べる。
【図７】小分子化合物ＦＮ１−５、ＦＮ１−８、ＦＮ１−７、ＦＮ１−９Ｕ、およびＦＮ１−９ＳによるＬＯＸ細胞（黒色腫）処理後における細胞毒性アッセイの結果を示す図である。一貫して、ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれについても、劇的な殺細胞効果が観察された。ＬＯＸ細胞を小分子化合物ＦＮ１−７およびＦＮ１−９Ｕでインキュベートしても一定の殺滅が観察された。０．５％クリスタルバイオレットにより、生細胞を染色した。ＤＭＳＯは、対照として用いた。詳細は、実施例１０に述べる。
【図８】各種小分子化合物の、組織試料から作製直後の初代培養ヒト中皮腫細胞に対する効果を示す図である。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれについても、劇的な殺細胞効果が観察された。同用量では、小分子化合物ＦＮ１−８の方がＦＮ１−５よりも強力に、この初代培養物を殺滅した。ＤＭＳＯは、対照として用いた。詳細は、実施例１１に述べる。
【図９】小分子化合物ＦＮ１−１、ＦＮ１−２、ＦＮ１−３、ＦＮ１−５、ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、ＦＮ２−１、ＦＮ２−５、およびＦＮ３−５による、ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９におけるＷｎｔ２プロモーター活性の調節を示す図である。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、Ｗｎｔ２プロモーター活性を劇的に下方調節する。ＤＭＳＯおよび「空ベクター」を対照とする。詳細は、実施例２７に述べる。
【図１０】小分子化合物ＦＮ１−５、ＦＮ１−７、ＦＮ１−８、ＦＮ１−９Ｕ、ＦＮ１−９Ｓ、ＦＮ２−１、およびＦＮ３−５による、結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６におけるＴＯＰ／ＦＯＰ活性の調節を示す図である。ＦＮ１−５およびＦＮ１−８のいずれもが、ＴＯＰ／ＦＯＰ活性を劇的に下方調節することがわかった。ＤＭＳＯを対照として用いた。詳細は、実施例３１に述べる。
【図１１】小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８が、ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞におけるＳＯＣＳ３プロモーター活性を調節しないことを示す図である。空ベクターおよびＤＭＳＯを対照として用いた。詳細は、実施例３２に述べる。
【図１２】ＦＮ１−５およびＦＮ１−８による処理後の結腸癌細胞における、Ｄｖｌ−３、細胞質β−カテニン、スルビビンおよびアクチン（対照）のウェスタンブロット分析を示す図である。小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は、結腸癌細胞における標準的なＷｎｔシグナル伝達を抑制する。詳細は、実施例３３に述べる。
【図１３】ＦＮ１−５およびＦＮ１−８による処理後のＮＳＣＬＣ細胞における、Ｄｖｌ−３、細胞質β−カテニン、スルビビンおよびアクチン（対照）のウェスタンブロット分析を示す図である。小分子化合物ＦＮ１−５およびＦＮ１−８は、ＮＳＣＬＣ細胞における標準的なＷｎｔシグナル伝達を抑制する。詳細は、実施例３３に述べる。
【図１４】ＦＮ１−８が、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ細胞（Ａ）、Ａ３７５細胞（Ｂ）、およびＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞（Ｃ）において有意なアポトーシスを誘発するが、ヒト正常皮膚線維芽細胞（Ｄ）においては誘発しないことを裏付ける時系列試験の結果を示す図である。詳細は実施例１０に述べる。
【図１５】小分子化合物ＦＮ１−８が、黒色腫細胞系Ｍａｌｍｅ−３Ｍ（Ａ）、Ａ３７５（Ｂ）、およびＳＫ−Ｍｅｌ−２（Ｃ）、およびＳＫ−Ｍｅｌ−５（Ｄ）においてＧＬＩ１誘発転写活性を下方調節することを示す図である。詳細は実施例２９に述べる。
【図１６】小分子化合物ＦＮ１−８が、ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９におけるＧＬＩタンパク質−ＴＡＦ誘発転写活性化を抑制することを示す図である。詳細は、実施例３５に述べる。
【図１７】マウス異種移植モデルＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０（矢印）および黒色腫ＬＯＸ（矢印先）における、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボでの有効性を示す図である。腫瘍成長は、ＦＮ１−８による処理後に有意に抑制される。詳細は、実施例３６および３７に述べる。
【図１８−１】マウス異種移植モデル（ＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０）を用いる、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボでの有効性試験を示す図である。Ａ．腫瘍成長は、ＦＮ１−８処理後に有意に抑制された。矢印は、小分子化合物ＦＮ１−８または対照であるＤＭＳＯの毎日の注射（６日間連続で２回ずつ）を示す。
【図１８−２】マウス異種移植モデル（ＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０）を用いる、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボでの有効性試験を示す図である。Ｂ．各群マウスから切除した腫瘍を示す。ＤＭＳＯ：ＤＭＳＯ処理、ＦＮ１−８：本実施例で述べる小分子化合物ＦＮ１−８による処理。Ｃ．ＦＮ１−８処理後に腫瘍重量は劇的に減少した。結果は、平均±標準偏差（誤差バー）で示す。詳細は、実施例３６に述べる。
【図１９−１】マウス異種移植モデル（黒色腫ＬＯＸ）を用いる、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボでの有効性試験を示す図である。Ａ．腫瘍成長は、ＦＮ１−８処理後に劇的に抑制された。矢印は、小分子化合物ＦＮ１−８または対照であるＤＭＳＯの毎日の注射（６日間連続で２回ずつ）を示す。
【図１９−２】マウス異種移植モデル（黒色腫ＬＯＸ）を用いる、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボでの有効性試験を示す図である。Ｂ．各群マウスから切除した腫瘍を示す。ＤＭＳＯ：ＤＭＳＯ処理、ＦＮ１−８：本実施例で述べる小分子化合物ＦＮ１−８による処理。Ｃ．ＦＮ１−８処理後に腫瘍重量は劇的に減少した。結果は、平均±標準偏差（誤差バー）で示す。詳細は、実施例３７に述べる。
【図２０】マウス異種移植モデル（結腸癌ＨＴ２９）を用いる、小分子化合物ＦＮ１−８のインビボでの有効性試験を示す図である。詳細については、実施例３５を参照のこと。Ａ．腫瘍成長は、ＦＮ１−８処理後の影響を受けなかった。矢印は、小分子化合物ＦＮ１−８または対照であるＤＭＳＯの毎日の注射（６日間連続で２回ずつ）を示す。Ｂ．ＦＮ１−８処理後の腫瘍重量は、ＤＭＳＯ対照群と同等である。結果は、平均±標準偏差（誤差バー）で示す。詳細は、実施例３８に述べる。
【図２１】マウス（腹腔内注射）における小分子化合物ＦＮ１−５（Ａ）およびＦＮ１−８（Ｂ）の薬物動態学的分析を示す図である。結果は、マウス３例から得られたデータの平均値に標準偏差（誤差バー）を加えて示す。詳細は、実施例４３に述べる。
【図２２】マウス（経口投与）における小分子化合物ＦＮ１−５（Ａ）およびＦＮ１−８（Ｂ）の薬物動態学的分析を示す図である。結果は、マウス３例から得られたデータの平均値に標準偏差（誤差バー）を加えて示す。詳細は、実施例４３に述べる。
【図２３】小分子化合物ＦＮ１−８が、ＧＬＩタンパク質とＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間のタンパク質間相互作用を遮断することを裏付ける、共免疫沈降分析の定量化を示す図である。共免疫沈降法試験各バンドの任意の単位による強度を測定することにより、ＧＬＩ−ＴＡＦ結合ドメインペプチド（ＧＬＩ−ＴＡＦｂｄ）とＴＡＦＩＩ３１タンパク質との間の結合を定量化した。各ＧＬＩ−ＴＡＦｂｄペプチドにつき、ＤＭＳＯ処理後の結合を１００％と設定した。ＦＮ１−８が、結合を用量依存的に阻害した：２０μＭおよび５０μＭ  ＦＮ１−８による処理後のＧＬＩ１−ＴＡＦｂｄの結合はそれぞれ７３．６％および３３．５％、ＧＬＩ２−ＴＡＦｂｄの結合はそれぞれ７３．８％および６０％、ＧＬＩ３−ＴＡＦｂｄの結合はそれぞれ７１．６％および２８．６％であった。詳細は、実施例３５に述べる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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