(57)【要約】  デンプンの生産方法であってアミロペクチンを含んでなる供給デンプンをグルカノトランスフェラーゼで処理して、、鎖延長デンプンを生産し、次いで、鎖延長デンプンを脱分枝酵素で処理して、アミロースフラグメントを含んでなるデンプン製品を生産する方法。このとき、アミロースフラグメントの少なくとも約３８重量％は、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンの生産方法であって、
アミロペクチンを含んでなる供給デンプンを、グルカノトランスフェラーゼで処理して、鎖延長デンプンを生産し；かつ
鎖延長デンプンを脱分枝酵素で処理して、アミロースフラグメントを含んでなるデンプン製品を生産する
ことを含んでなり、
アミロースフラグメントの少なくとも約３８重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、方法。
【請求項２】
アミロースフラグメントを回収することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
供給デンプンが、デントコーン、ワキシーコーン、ポテト、タピオカ、コメ、エンドウ、小麦、ワキシー小麦、またはこれら２種以上の組合せ由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
供給デンプンを、水溶液または懸濁液中、約７０〜１００℃の温度および約５．０〜６．０のｐＨにおいて、グルカノトランスフェラーゼで処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
脱分枝酵素がイソアミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
デンプン製品の多分散度が約２〜４である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
デンプン製品の溶液または分散液を膜濾過して、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有するアミロースフラグメントの濃度を高めることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アミロースフラグメントの少なくとも約４０重量％が、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
膜濾過後に、アミロースフラグメントの少なくとも約５０重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
デンプン製品のピーク融解温度が約１０５℃より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
水溶液または懸濁液中において少なくとも約９０℃の温度で、デンプン製品を加熱することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
デンプン製品を、水溶液または懸濁液中において少なくとも約９８℃の温度で加熱する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
デンプン製品が水中において少なくとも約９０℃までの温度で熱安定性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
デンプン製品が水中において少なくとも約１００℃までの温度で熱安定性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
供給デンプンがワキシーデンプンであり、かつ
供給デンプンを脱分枝酵素で処理した後、供給デンプンをグルカノトランスフェラーゼで処理することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
グルカノトランスフェラーゼを、約１〜１５ｍＬ／１００ｇ供給デンプンの用量で用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
グルカノトランスフェラーゼを、約５〜１２ｍＬ／１００ｇ供給デンプンの用量で用いる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
グルカノトランスフェラーゼが、別々な時間に供給デンプンへ供される、複数回の分割量で用いられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
供給デンプンを、約８時間未満の時間にわたり、グルカノトランスフェラーゼで処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
供給デンプンを、約６時間未満の時間にわたり、グルカノトランスフェラーゼで処理する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脱分枝酵素を、約１〜１０ｍｇ／ｇデンプンの用量で用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
脱分枝酵素を、約１〜５ｍｇ／ｇデンプンの用量で用いる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アミロペクチンを含んでなる供給デンプンを、グルカノトランスフェラーゼで処理して、鎖延長デンプンを生産し；かつ
鎖延長デンプンを脱分枝酵素で処理して、アミロースフラグメントを含んでなるデンプン製品を生産するからなる方法により生産される、デンプン製品であって、
アミロースフラグメントの少なくとも約３８重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、デンプン製品。
【請求項２４】
方法がアミロースフラグメントを回収することをさらに含んでなる、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項２５】
供給デンプンが、デントコーン、ワキシーコーン、ポテト、タピオカ、コメ、エンドウ、小麦、ワキシー小麦、またはこれら２種以上の組合せ由来のものである、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項２６】
供給デンプンを、水溶液または懸濁液中、約７０〜１００℃の温度および約５．０〜６．０のｐＨにおいて、グルカノトランスフェラーゼで処理する、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項２７】
脱分枝酵素がイソアミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項２８】
デンプン製品の多分散度が約２〜４である、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項２９】
方法が、デンプン製品の溶液または分散液を膜濾過して、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有するアミロースフラグメントの濃度を高めることをさらに含んでなる、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項３０】
アミロースフラグメントの少なくとも約４０重量％が、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項３１】
膜濾過後に、アミロースフラグメントの少なくとも約５０重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、請求項２９に記載のデンプン製品。
【請求項３２】
デンプン製品のピーク融解温度が約１０５℃より高い、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項３３】
方法が水溶液または懸濁液中において少なくとも約９０℃の温度で、デンプン製品を加熱することをさらに含んでなる、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項３４】
水溶液または懸濁液中において少なくとも約９８℃の温度で加熱される、請求項３３に記載のデンプン製品。
【請求項３５】
水中において少なくとも約９０℃までの温度で熱安定性である、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項３６】
デンプン製品が水中において少なくとも約１００℃までの温度で熱安定性である、請求項３５に記載のデンプン製品。
【請求項３７】
供給デンプンがワキシーデンプンであり、かつ、
該方法が、供給デンプンを脱分枝酵素で処理した後、供給デンプンをグルカノトランスフェラーゼで処理することをさらに含んでなる、請求項２３に記載のデンプン製品。
【請求項３８】
デンプンを含んでなる食品であって、
該デンプンが、
アミロペクチンを含んでなる供給デンプンを、グルカノトランスフェラーゼで処理して、鎖延長デンプンを生産し；かつ
鎖延長デンプンを、脱分枝酵素で処理して、アミロースフラグメントを含んでなるデンプン製品を生産するからなる方法により生産されるものであって、
アミロースフラグメントの少なくとも約３８重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、食品。
【請求項３９】
方法がアミロースフラグメントを回収することをさらに含んでなる、請求項３８に記載の食品。
【請求項４０】
供給デンプンが、デントコーン、ワキシーコーン、ポテト、タピオカ、コメ、エンドウ、小麦、ワキシー小麦、またはこれら２種以上の組合せ由来のものである、請求項３８に記載の食品。
【請求項４１】
供給デンプンを、水溶液または懸濁液中、約７０〜１００℃の温度および約５．０〜６．０のｐＨにおいて、グルカノトランスフェラーゼで処理する、請求項３８に記載の食品。
【請求項４２】
脱分枝酵素がイソアミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項３８に記載の食品。
【請求項４３】
デンプン製品の多分散度が約２〜４である、請求項３８に記載の食品。
【請求項４４】
該方法が、デンプン製品の溶液または分散液を膜濾過して、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有するアミロースフラグメントの濃度を高めることをさらに含んでなる、請求項３８に記載の食品。
【請求項４５】
アミロースフラグメントの少なくとも約４０重量％が、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、請求項３８に記載の食品。
【請求項４６】
膜濾過後に、アミロースフラグメントの少なくとも約５０重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している、請求項４４に記載の食品。
【請求項４７】
デンプン製品のピーク融解温度が約１０５℃より高い、請求項３８に記載の食品。
【請求項４８】
該方法が水溶液または懸濁液中において少なくとも約９０℃の温度で、デンプン製品を加熱することをさらに含んでなる、請求項３８に記載の食品。
【請求項４９】
デンプン製品を、水溶液または懸濁液中において少なくとも約９８℃の温度で加熱する、請求項４８に記載の食品。
【請求項５０】
デンプン製品が水中において少なくとも約９０℃までの温度で熱安定性である、請求項３８に記載の食品。
【請求項５１】
デンプン製品が水中において少なくとも約１００℃までの温度で熱安定性である、請求項５０に記載の食品。
【請求項５２】
供給デンプンがワキシーデンプンであり、かつ、
該方法が、供給デンプンを脱分枝酵素で処理した後、供給デンプンをグルカノトランスフェラーゼで処理することをさらに含んでなる、請求項３８に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
デンプンは、２種の多糖、アミロースおよびアミロペクチン、を含んでなる。アミロースは、一般的に、アルファ１‐４グリコシド結合で繋がれたグルコース単位を含んでなる、直鎖状のポリマーである。アミロペクチンは、グルコース単位の多くがアルファ１‐４グリコシド結合で繋がれているが、一部がアルファ１‐６グリコシド結合で繋がれた、分枝ポリマーである。
【０００２】
アルファ‐アミラーゼは、人体に存在し、デンプンでアルファ１‐４結合を加水分解し、こうしてデンプンの消化に至る酵素である。ある状況下では、アルファ‐アミラーゼによる加水分解に抵抗するデンプンを生産すること、例えばデンプンのカロリー分を減少させるか、またはその食物繊維分を増加させることが望まれる。しかしながら、過去にこのようなデンプンを生産する試みでは、１以上の問題、例えば高コストを招いていた。
【０００３】
アミラーゼ抵抗性デンプン（amylase-resistant starch）は、通常、多くが高価である、高アミロースデンプンから生産されている。アルファ‐アミラーゼ抵抗性デンプンの生産に適した高アミロース含有率のデンプンを生産するための方法の改善が必要とされる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一つの態様は、デンプンの生産方法である。この方法は、アミロペクチンを含んでなる供給デンプンを、グルカノトランスフェラーゼで処理して、鎖延長デンプン（chain-extended starch）を生産し、次いで、鎖延長デンプンを脱分枝酵素で処理して、アミロースフラグメントを含んでなるデンプン製品を生産する。アミロースフラグメントの少なくとも約３８重量％は、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している。該方法は、必要に応じて、アミロースフラグメントを回収することをさらに含んでなることができる。他のオプションとして、該方法は、デンプン製品の溶液または分散液を膜濾過して、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有するアミロースフラグメントの濃度を高めることをさらに含んでなることができる。
【０００５】
本発明の他の態様は、上記方法により生産されるデンプン製品である。本発明の一部の態様において、アミロースフラグメントの少なくとも約４０重量％は、少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有している。デンプン製品を作るために用いられる方法が膜濾過を含むならば、一部の態様においてアミロースフラグメントの少なくとも約５０重量％が少なくとも約３５の重合度（ＤＰ）を有する。一部の場合において、デンプン製品は約１０５℃より高いピーク融解温度を有する。デンプン中のアミロースは、アルファ‐アミラーゼに対するその抵抗性を高めるために、結晶化させてもよい。
【０００６】
本発明の他の態様は、上記のデンプンを含む食品である。
【０００７】
図面の簡単な説明
図１〜４５は下記頁で説明されている通りである。
【発明の具体的説明】
【０００８】
本発明の一つの態様は、アミロースの比較的高い含有率を有したデンプンを生産する方法である。この方法では、アミロペクチンを含んでなる供給デンプンをグルカノトランスフェラーゼで処理して、デンプン鎖の少なくとも一部を延長し、鎖延長デンプンを脱分枝酵素で処理して、アミロースフラグメントを生産する。これらのアミロースフラグメントは、次いで抵抗性デンプン製品を生産するために結晶化させてもよい。
【０００９】
通常のデントコーンデンプン（dent corn starch）は短鎖アミロースフラグメントを得るために酵素的に脱分枝されるが、該デンプンのアミロペクチン成分は比較的短い分枝鎖から通常構成されているため、該製品は酵素抵抗に必要とされる長い鎖長をほとんど含有していない。グルカノトランスフェラーゼで修飾されなかった脱分枝デントコーンデンプンは典型的には３５％未満のＤＰ３５およびそれ以上の鎖長（即ち、少なくとも約３５の重合度を有するデンプン分子）を有し、したがって抵抗性デンプンに必要な熱安定性を有していない。加えて、脱分枝デントデンプンは、アミロースからの長い鎖長とアミロペクチンからの短い鎖のフラクションを含有している。異種鎖長のこの組合せは、結晶化とアミラーゼ抵抗性にとり最適なものではない。
【００１０】
本発明の方法で用いられる供給デンプンは、デントコーン、ワキシーコーン、高アミロースａｅ遺伝子コーン（ａｅはコーンブリーダーによく知られている遺伝子変異の名称であり、“アミロース・エキステンダー”の略記である）、ポテト、タピオカ、コメ、エンドウ、小麦、ワキシー小麦、およびこれらデンプンからの精製アミロース、並びに参考のためここに組み込まれる特許出願ＷＯ００／１４２４９に従い生産されたアルファ‐１，４グルカンを含めた様々な供給源と、これらデンプン源の２種以上の組合せから選ばれる。ヒドロキシプロピルデンプン、アジピン酸デンプン、アセチル化デンプンおよびリン酸化デンプンのような化学的修飾デンプンも、本発明では用いうる。例えば、適切な化学的修飾デンプンとしては、架橋デンプン、アセチル化および有機エステル化デンプン、ヒドロキシエチル化およびヒドロキシプロピル化デンプン、リン酸化および無機エステル化デンプン、カチオン性、アニオン性、ノニオン性および双性イオンデンプンと、デンプンのコハク酸および置換コハク酸誘導体があるが、それらに限定されない。このような修飾は当業界で、例えばModified Starches:Properties and Uses,Ed.Wurzburg,CRC Press,Inc.,Florida(1986)で知られている。他の適切な修飾および方法は米国特許第４，６２６，２８８号明細書、同第２，６１３，２０６号明細書および同第２，６６１，３４９号明細書で開示され、それらは参考のためここに組み込まれる。
【００１１】
供給デンプンがワキシーデンプンであれば、それはグルカノトランスフェラーゼでの処理前に脱分枝酵素での処理により少なくとも部分的に脱分枝してもよい。この目的に適した脱分枝酵素としては、プルラナーゼおよびイソアミラーゼがある。これは、グルカノトランスフェラーゼによりアミロペクチン非還元末端へ移転されて、より長い分枝鎖をもたらす、フラグメント源を供給する。
【００１２】
４‐α‐グルカノトランスフェラーゼ〔２．４．１．２５〕は、グルコースまたは他の１，４‐アルファ‐Ｄ‐グルカンであるアクセプターで、新たな位置への、１，４‐アルファ‐Ｄ‐グルカンのセグメントの移転を触媒する酵素である。グルカノトランスフェラーゼはマルトトリオースアクセプターへのマルトシル部分の移転を触媒して、グルコースを放出する。放出されたグルコースは、酵素活性の尺度として用いられる。
【００１３】
グルカノトランスフェラーゼ活性を測定する上で適したアッセイは次の通りである。このアッセイにおいて、マルトトリオースは基質およびアクセプター双方の分子として用いられる。グルコースがこの反応で放出され、一般的グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイの修正バージョン後に測定される（Werner,W.et al(1970)Z.Analyt.Chem.,252:224）。ＧＯＤ-Perid溶液はWAKOのGlucose Release Kitから得ても、０．４ｇ／Ｌグルコースオキシダーゼ（Sigma Ｇ６１２５またはＧ７７７３）、０．０１３ｇ／Ｌ  ＨＲＰ（Sigma Ｐ８１２５）および０．６５ｇ／Ｌ  ＡＢＴＳ（Calbiochem ＃１９４４３０）を含有したｐＨ７の６５ｍＭリン酸ナトリウムで調製してもよい。０．０４Ｎ  ＮａＯＨ溶液も用いられる。基質溶液は１％マルトトリオース（ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１０ｍＬ中０．１ｇマルトトリオース）である。
【００１４】
標準曲線：
グルコース溶液：０．１８０６ｇグルコースを秤量して５００ｍＬ  ＭＱ  Ｈ２Ｏへ入れる
標準曲線用の希釈：
【表１ａ】
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【００１５】
１２０μＬの基質溶液が選択温度、例えば６０℃で１０分間プレインキュベートされる。２０μＬの酵素溶液が基質溶液へ加えられ、反応混合液が６０℃で１０分間インキュベートされる。反応が２０μＬの０．０４Ｎ  ＮａＯＨの添加により停止される。次いで２０μＬが９６ウェルマイクロタイタープレートへ移され、２３０μＬのＧＯＤ-Perid溶液が加えられる。室温で３０分間後、吸光度が４２０ｎｍで測定される。酵素活性は、０〜０．５μｍｏｌグルコース範囲内におけるグルコースの標準曲線と比較して計算される。１単位（Ｕ）の活性は、１μｍｏｌグルコース／ｍｉｎを遊離する酵素の量として規定される。
【００１６】
グルカノトランスフェラーゼによる供給デンプンの処理は、アミロペクチン分子で鎖の延長をもたらす。この処理は、例えば水溶液または懸濁液中において約７０〜１００℃の温度および約５．０〜６．０のｐＨで行なわれる。結果として、最終製品のＤＰ３５およびそれ以上の含有分は３８％超に、または一部のケースでは４０％超に増加し、鎖長もかなり均一になり、脱分枝デントコーンデンプンでの約８に対し、２〜４の多分散度で示される。本発明の一部の態様において、グルカノトランスフェラーゼの用量は約１〜１５ｍＬ／１００ｇデンプン、好ましくは約５〜１２ｍＬ／１００ｇである。グルカノトランスフェラーゼはデンプンと一度に接触させても、または多数回に分割してもよい。本発明の一つの態様において、全用量は３回に分割され、少なくとも１時間互いに離して、別々に（例えば、各２．５ｍＬ／１００ｇの３分割量で）供される。一部の態様において、反応温度は約７５〜８５℃であり、反応時間は約８時間未満、好ましくは約６時間未満である。
【００１７】
必要に応じて、追加のデンプンベース物質が脱分枝前に鎖延長デンプンへ加えられる。例えば、マルトデキストリンが加えられる。
【００１８】
得られた鎖延長デンプンは、次いで、望ましい長さを有するアミロースフラグメントを生産するために、例えば約３０〜６０℃の温度および約４．０〜５．０のｐＨで、イソアミラーゼまたはプルラナーゼのような脱分枝酵素で処理される。本発明のある態様において、イソアミラーゼの用量は約１〜１０ｍｇ／ｇデンプン、好ましくは約１〜５ｍｇ／ｇである。
【００１９】
ＤＰ３５およびそれ以上の含有分は、高温、例えば約６０〜１２０℃、更に典型的には約６０〜９０℃、更に一層典型的には７０〜８５℃において、精密濾過による分別化で、５０％超に高められる。精密濾過後における脱分枝グルカノトランスフェラーゼ処理デンプン製品は約１０５℃より高いピーク融解温度を有し、水中で約９８℃に加熱後は少なくとも約８０重量％の抵抗性デンプンを含有しうる。
【００２０】
必要に応じて、製品デンプンは水溶液または懸濁液中において少なくとも約９０℃、または一部の態様では少なくとも約９８℃の温度で熱処理される。この熱‐水分処理は、一部の場合において、デンプンの総食物繊維（ＴＤＦ）分を増加させうる。例えば、熱水分処理は、本発明の一部態様において、約１５〜３５％から約７５〜８０％へデンプンのＴＤＦを増加させうる。
【００２１】
本方法の一つの態様では、供給デンプンが水に１５％固形分でスラリー化され、ｐＨが希ＮａＯＨで５．５に調整される。スラリーがオートクレーブに入れられ、１４０℃で３０分間加熱される。８５℃に冷却してｐＨを５．５に調整した後、グルカノトランスフェラーゼが加えられ、２４時間反応させられる。ｐＨを３．０以下へ下げることにより酵素が不活性化される。１４０℃に１時間加熱することによりデンプンが再分散され、次いで４５℃に冷却され、ｐＨが４．５に調整される。イソアミラーゼが加えられ、１８〜２４時間反応させられる。酵素を不活性化するために、混合物が８５℃に１時間加熱される。必要であれば、１４０℃加熱と４５℃およびｐＨ４．５での酵素処理を繰り返すことにより、製品がイソアミラーゼで再処理される。次いで製品は長鎖成分の含有率を増加させるために分別化しうる。これは、例えば、孔径約０．４５ミクロンのセラミック膜を用いて、少なくとも約８０℃の温度で結晶化脱分枝物の精密濾過により行なわれる。脱イオン水の添加により保持物の容積を維持しながら、出発スラリーの容積に対して１．５〜２．５倍容積の透過物を集めた後、保持物を濃縮および噴霧乾燥するかまたは遠心およびオーブン乾燥することにより、製品が単離される。
【００２２】
本方法により生産された製品は、アルファ‐アミラーゼに抵抗性であるデンプンを作るために適した、高割合のアミロースを含有している。抵抗性デンプンは、血糖指数を低下させ、結腸で食物繊維および共生効果を高めるために、多くの食品へ加えることができる。
【００２３】
この方法で生産されたデンプンは、低カロリーベークド品のような食品で、増量剤または小麦粉代用品として用いられる。該デンプンは、食品で食物繊維強化にも有用である。該デンプンが用いうる食品の具体例としては、パン、ケーキ、クッキー、クラッカー、成形スナック、スープ、冷凍デザート、フライド食品、パスタ製品、ポテト製品、コメ製品、コーン製品、小麦製品、乳製品、栄養バー、糖尿病者向け食品および飲料がある。
【００２４】
デンプン製品は、少なくとも一部の態様において、少なくとも約９０℃、または一部のケースでは少なくとも約１００℃の温度で、水中において熱安定性であり、高い温度および水分条件下で加工される食品でそれを使用可能にする。
【実施例】
【００２５】
本発明のある態様が下記実施例で記載されている。
【００２６】
実施例１
１７０ｇの普通コーンスターチ（Minstar 2030）を３０００ｍＬガラスビーカー中において８３０ｍＬ水道水でスラリー化した。ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣｌで５．５に調整し、濃厚ゲルを形成させるために懸濁物を一定攪拌下で６５〜７０℃へ慎重に加熱した。蓋をガラスビーカーに付し、次いでこれをオートクラーブへ移した。スチーム圧力が４０ｐｓｉ（１４０℃）に達したとき、その条件を３０分間維持し、次いでオートクラーブを冷却させた。
【００２７】
調理されたデンプンを攪拌ガラス反応器へ移し、条件を８５℃、ｐＨ５．５に調整した。１０μｇ酵素タンパク質／ｇＤＳに相当する１．０７ｍＬ  T.thermophilusグルカノトランスフェラーゼを加え、反応を２４時間続けた。
ｐＨを３．０以下へ低下させることにより反応を停止させた。
【００２８】
実施例２
グルカノトランスフェラーゼに適したドナー分子を作製するために、下記実験を行なった。１７５ｇのワキシーコーンスターチ（Cerestar 04201）を３０００ｍＬガラスビーカー中において８３０ｍＬ水道水でスラリー化した。ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣｌで５．５に調整し、濃厚ゲルを形成させるために懸濁物を一定攪拌下で６５〜７０℃へ慎重に加熱した。蓋をガラスビーカーに付し、次いでこれをオートクラーブへ移した。スチーム圧力が４０ｐｓｉ（１４０℃）に達したとき、その条件を３０分間維持し、次いでオートクラーブを冷却させた。
【００２９】
調理されたデンプンを攪拌ガラス反応器へ移した後で、それを部分的に脱分枝した。温度を５５℃、ｐＨ４．３に調整し、２００イソアミラーゼ単位／ｇＤＳに相当する０．０８７２ｇPseudomonas amyloderamosaイソアミラーゼ（３５０，０００ＩＡ単位／ｇ，Hayashibara）を加えた。次いで反応を３時間続けた。
部分的脱分枝後、温度を８５℃へ上げ、ｐＨをＮａＯＨで５．５に調整した。１０μｇ酵素タンパク質／ｇＤＳに相当する１．１０ｍＬ  T.thermophilusグルカノトランスフェラーゼを加え、反応を２４時間続けた。
ｐＨを３．０以下へ低下させることにより反応を停止させた。
【００３０】
実施例３
グルカノトランスフェラーゼによるデンプンの修飾の程度が重要な役割を果たすかどうかを試験するために、１７０ｇの普通コーンスターチ（Minstar 2030）を３０００ｍＬガラスビーカー中において８３０ｍＬ水道水でスラリー化した。ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣｌで５．５に調整し、濃厚ゲルを形成させるために懸濁物を一定攪拌下で６５〜７０℃へ慎重に加熱した。蓋をガラスビーカーに付し、次いでこれをオートクラーブへ移した。スチーム圧力が４０ｐｓｉ（１４０℃）に達したとき、その条件を３０分間維持し、次いでオートクラーブを冷却させた。
【００３１】
調理されたデンプンを攪拌ガラス反応器へ移し、条件を８５℃、ｐＨ５．５に調整した。１０μｇ酵素タンパク質／ｇＤＳに相当する１．１０ｍＬ  T.thermophilusグルカノトランスフェラーゼを加えた。
２時間後、１．１０ｍＬ  T.thermophilusグルカノトランスフェラーゼの更なる添加を行い、反応を２７時間続けた。
１．１０ｍＬ  T.thermophilusグルカノトランスフェラーゼの更なる添加を次いで行い、反応を一夜続けた。
ｐＨを３．０以下へ低下させることにより反応を停止させた。
【００３２】
実施例４
実施例１からのグルカノトランスフェラーゼ処理デントデンプンのサンプルを凍結スラリーとして受け取った。解凍スラリーの５０ｇサンプルを貯蔵した後、残りのスラリー（４９５．３ｇ）を２００ｇの脱イオン水で希釈し、ｐＨを５％ＮａＯＨで６．５に調整した。スラリーを攪拌高圧反応器へ入れた。窒素でパージした後、反応器を１４０℃に１時間加熱し、次いで１０５℃に冷却した。ディップ‐チューブ（dip-tube）へ接続されたバルブから３首丸底フラスコ中へパージすることにより、製品を反応器から取り出した。フラスコを４５℃水浴へ入れ、希ＨＣｌを加えることによりｐＨを４．５に調整した。溶液の温度が４５℃に達したとき、１８ｍｇ（３００単位／ｇデンプン）のHayashibaraイソアミラーゼを加えた。溶液を一夜攪拌させた。８５℃に１時間加熱することにより、酵素を不活性化させた。
【００３３】
実施例５
実施例２からのグルカノトランスフェラーゼ処理、部分的脱分枝ワキシーデンプンのサンプルを凍結スラリーとして受け取った。解凍スラリーの５０ｇサンプルを貯蔵した後、残りのスラリー（４６９．０ｇ）を２００ｇの脱イオン水で希釈し、ｐＨを５％ＮａＯＨで６．５に調整した。スラリーを攪拌高圧反応器へ入れた。窒素でパージした後、反応器を１５０℃に１時間加熱し、次いで１０５℃に冷却した。ディップ‐チューブへ接続されたバルブから３首丸底フラスコ中へパージすることにより、製品を反応器から取り出した。フラスコを４５℃水浴へ入れ、希ＨＣｌを加えることによりｐＨを４．５に調整した。溶液の温度が４７．７℃に達したとき、１８ｍｇのHayashibaraイソアミラーゼを加えた。溶液を４５℃で一夜攪拌させた。ｐＨを５％ＮａＯＨで６．３へ上げ、８５℃に１時間加熱することにより、酵素を不活性化させた。
【００３４】
実施例６
実施例３からのグルカノトランスフェラーゼ処理デントデンプンのサンプルを凍結スラリーとして受け取った。解凍スラリーの５０ｇサンプルを貯蔵した後、残りのスラリー（４７３．０ｇ）を５００ｇの脱イオン水で希釈し、ｐＨを５％ＮａＯＨで６．５に調整した。スラリーを攪拌高圧反応器へ入れた。窒素でパージした後、反応器を１４０℃に１時間加熱し、次いで９５℃に冷却した。ディップ‐チューブへ接続されたバルブから３首丸底フラスコ中へパージすることにより、製品を反応器から取り出した。フラスコを４５℃水浴へ入れ、２滴の酢酸および数滴の５％ＮａＯＨを加えることによりｐＨを４．５に調整した。溶液の温度が４５℃に達したとき、４０ｍｇ（３００単位／ｇデンプン）のHayashibaraイソアミラーゼを加えた。溶液を一夜攪拌させた。ｐＨを６．０に調整した後、サンプルを水浴中で９５℃に加熱し、１時間攪拌した。次いでフラスコを４５℃水浴へ入れ、ｐＨを希ＨＣｌで４．５に調整し、溶液の温度が４５℃に達したとき、３０ｍｇのHayashibaraイソアミラーゼを加えた。一夜攪拌した後、ｐＨを６．０に調整し、８５℃に１時間加熱した。
【００３５】
分子分布データは、有意量の＞１６，０００ドルトン物質の存在で指摘されるように、このサンプルが完全には脱分枝されていないことを示した。サンプルを５％ＮａＯＨで６．５にｐＨ調整し、上記のように高圧攪拌反応器で１４０℃に１時間加熱した。サンプルを反応器から取出し、５５℃水浴中のフラスコへ入れ、ｐＨを４．５に調整した。溶液が５５℃に達した後、７９ｍｇのHayashibaraイソアミラーゼを加えた。５５℃で一夜攪拌した後、この懸濁物の分析では、脱分枝が完了したことを示した。
【００３６】
実施例７
脱分枝デンプンのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析の結果が表１で示されている。
【表１ｂ】
2009507495.tif 000004
“ＤＰ”は重合度を意味する。“Ｍｗ”は重量平均分子量を意味する。“Ｍｎ”は数平均分子量を意味する。
【００３７】
実施例８
再循環ポンプへ接続された加熱ジャケット含有のリザーバーとMillipore０．４５ミクロンセラミック膜を含有したハウジングを含んでなるシステムで精密濾過を行なった。ジャケットを循環油浴で加熱し、膜ハウジングを電気加熱テープで加熱した。膜で脱分枝物質の結晶化を防ぐために、膜ハウジングをリザーバー温度より通常１０〜１５℃高く維持した。
【００３８】
実施例６からの脱分枝グルカノトランスフェラーゼ処理デントデンプン懸濁物（約５％固形分で１０５６．９ｇ）を２９７ｇの脱イオン水で希釈し、再循環付の精密濾過リザーバーで８０℃に加熱し、１時間保持した後、膜ハウジングから透過物を抜き取り始めた。透過物が集められたら、等容積の脱イオン水をリザーバーへ加えた。３３６０ｇの透過物を集めた後、保持物（１２３６ｇ）をリザーバーから取出し、冷蔵庫に入れられたビーカーで冷却させた。保持物は３４．１ｇの乾燥固形物を含有し、透過物は９．０ｇの乾燥固形物を含有していた。保持物は３Ａエタノールでスラリーの希釈、濾過および乾燥により単離した。
【００３９】
脱分枝グルカノトランスフェラーゼ処理デンプンと精密濾過からの保持物および透過物フラクションの分子量をＧＰＣにより分析した。保持物を抵抗性デンプン（％ＲＳ）について試験した。Englyst（Eur.J.Clinical Nut.(1992),46(Suppl.2),S33-S50）により規定されるような抵抗性デンプンが、２時間処理後に３７℃でブタパンクレアチンアルファ‐アミラーゼによる加水分解に抵抗性であるデンプンの量の基準である。結果が初期乾燥デンプン重量のパーセントとして示されている。
【００４０】
【表２】
2009507495.tif 000005
表２において、“２．５／Ｌ”は、サンプルが洗浄されて、２．５リットルの透過物が出発サンプルのリットル当たりで集められたことを示している。
【００４１】
実施例９
デントデンプンのＧＴ酵素処理：
Dent Starch Pearl-C（１５％）をジェット調理し（２８５〜２９０°Ｆ）、ｐＨを５．７に調整し、４‐α‐グルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）〔２．４．１．２５〕を加え（１０ｍＬ／１００ｇデンプン）、８０℃で４時間反応させた。デンプンスラリーを１４０℃に１時間加熱し、スラリーを５５℃、ｐＨ４．５でインキュベートし、イソアミラーゼを加え（１ｍｇ／ｇデンプン）、スラリーを２４時間インキュベートした。デンプンスラリーを室温に冷却させ、次いで４℃で貯蔵した。
【００４２】
ＤＭＳＯ溶液中でＧＴ処理デンプンの脱分枝：
STAR-DRIＲ１０マルトデキストリン（Tate and Lyle,Decatur,Illinois）が加えられた実験において、ＧＴ処理デンプンの脱分枝をＤＭＳＯ溶液で行なった。乾燥デンプン（３５ｍｇ）を１ｍＬ水性ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ：水＝９：１ｖ／ｖ）に溶解するか、または湿潤サンプル（２６９ｍｇ，ＧＴ処理サンプル中１３％ＤＳ）を０．９ｍＬ純粋ＤＭＳＯに溶解した。デンプン溶液を沸騰水浴中で攪拌しながら３時間加熱した。次いでデンプン溶液を３９℃に冷却し、３．５ｍＬ温酢酸ナトリウム緩衝液（３９℃，５０ｍＭ）を加えた。１００μＬイソアミラーゼ〔ｐＨ４．５の０．１Ｎ  ＮａＯＡｃ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬイソアミラーゼ（１，２８０，０００Ｕ／ｇ固形分）〕をデンプン溶液に加えた。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を水浴中３９℃で２時間インキュベートした。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を沸騰水中で２０分間加熱し、次いで３９℃に冷却した。１００μＬイソアミラーゼを加え、混合物を１６時間インキュベートした。脱分枝後、デンプン溶液を沸騰水浴中で２０分間加熱し、次いで暖温まで冷却した。２ｍＬ分の混合物を２ｍＬの純粋ＤＭＳＯで希釈した。ＤＭＳＯ混合物（約５ｍｇデンプン／ｍＬ）を沸騰水浴中で２０分間加熱し、次いで暖温まで冷却した。Dowex ＭＲ‐３樹脂（０．５ｇ）をデンプン溶液へ加え、ＮａＯＡｃを除去するために１分間振盪した。デンプン溶液を３ｍＬシリンジに装着された０．４５μｍ孔径Milliporeフィルターで濾過した。濾過されたサンプルをＳＥＣまたはＧＰＣカラム装備のＨＰＬＣ中へ注入した。
【００４３】
図１はＧＴ変換デントデンプンの異なる部分の総食物繊維分（ＴＤＦ）を示している。精密濾過を用いなかったならば、濾紙を用いて沈殿変換デンプンを濾過し、オーブン（５０℃）で乾燥させた。ＴＤＦは熱‐水分処理前に１６．８％、熱‐水分処理後に８０％であった。精密濾過を用いた場合、保持物は熱‐水分処理前に３３．８４％、熱‐水分処理後に７７．６％のＴＤＦを有していた。透過物は４℃で固体物をほとんど沈殿させず、そのためＴＤＦは分析しなかった。オーブン（１００℃）で乾燥ボウルを用いて保持物および透過物中のすべてを乾燥させると、概算固形分は保持物で７１．４％および透過物で２８．６％であった。
【００４４】
図２は、２４時間にわたり反応器中で１ｍｇイソアミラーゼ／ｇデンプンを用いて脱分枝され、更に分析用脱分枝で脱分枝された、ＧＴ処理抵抗性デンプンのクロマトグラムを示している。精密濾過保持物は約３５のピークＤＰを有していたが、精密濾過透過物は約１４のピークＤＰを有していた。濾紙保持物は約３０のピークＤＰを有していた。
【００４５】
図３は、本方法で２４時間にわたり１ｍｇイソアミラーゼ／ｇデンプンを用いて脱分枝されたＧＴ処理抵抗性デンプン、および更に分析用脱分枝で脱分枝されたＧＴ処理抵抗性デンプンのクロマトグラムを示している。図３は、ＧＴ変換デンプンが２４時間にわたり１ｍｇイソアミラーゼ／ｇデンプンを用いて反応器中でほぼ完全に脱分枝されたことを示している。
【００４６】
図４および５は、ＧＴ変換デンプンで３部分の異なるＤＰ範囲のパーセンテージを示している。精密濾過保持物は約３８％ＤＰ３７‐１００、５９％ＤＰ２５‐１００、１０％ＤＰ１‐１２および３４％ＤＰ１‐２４を有していた。精密濾過透過物は約１２％ＤＰ３７‐１００、２６％ＤＰ２５‐１００、４０％ＤＰ１‐１２および７４％ＤＰ１‐２４を有していた。濾紙保持物は約３３％ＤＰ３７‐１００、５２％ＤＰ２５‐１００、１４％ＤＰ１‐１２および３９％ＤＰ１‐２４を有していた。
【００４７】
【表３】
2009507495.tif 000006
【００４８】
濾紙を用いて沈殿変換デンプンを濾過し、保持物をオーブン（５０℃）で乾燥させた場合。示差走査熱量法（ＤＳＣ）データは、熱‐水分処理前に１１６．０３℃（１３．７４Ｊ／ｇ）および１３８．７９℃（０．３８７９Ｊ／ｇ）の２つの融解ピーク（図６）、並びに熱‐水分処理後に２１．２３Ｊ／ｇの全エンタルピーで１１７．４５℃および約１４０℃の２つの融解ピーク（図７）を示した。熱‐水分処理は２５％水分で１．５時間にわたり２５０°Ｆで行なった。
【００４９】
保持物が精密濾過を用いて集められたとき、ＤＳＣデータは、熱‐水分処理前に１９．８３Ｊ／ｇの全エンタルピーで１１４．９℃および１３８．７９℃の２つの融解ピーク（図８）、並びに熱‐水分処理後に２１．５０Ｊ／ｇの全エンタルピーで１１７．０７℃および約１４０℃の２つの融解ピーク（図９）を示した。
【００５０】
実施例１０
デントデンプンのＧＴ酵素処理：
Dent Starch Pearl-C（ＤＳ８９．５６％）を秤量し（５０２．５ｇ）、２４９７．５ｇ脱イオン（Ｄ．Ｉ．）水および１３５ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏをデンプンに加えた（１５％デンプンスラリー）。２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いてデンプンスラリーのｐＨを５．５に調整した。デンプンスラリーをジェット調理（２８５〜２９０°Ｆ，１４０〜１４３℃）したところ、通常乾燥固形分は１５％から１３．１９％に減少した。ｐＨが異なっていれば、それを５．７に調整した。５５０ｇのデンプンスラリーを秤量して数個の１０００ｍＬ反応器の各々へ入れた。反応器の各々で乾燥固形分の量に応じて、以下で更に説明されているように、ＧＴ酵素を加えた。デンプンおよびＧＴ酵素混合物を水浴中８０℃で２４時間までインキュベートした。分枝鎖長を分析するために、サンプル（約５ｍＬ）を取り出した。
【００５１】
ＧＴ変換デンプンの脱分枝：
湿潤ＧＴ変換サンプル（約１３％乾燥固形分）を、それが流体になるまで、密栓を付して電子レンジ中フルパワーで加熱した。サンプル（１９２±２５ｍｇ）を１０ｍＬチューブ中で秤量し、２．５ｍＬ精製（ＨＰＬＣ用）水を加えた。乾燥サンプルの場合、２５ｍｇ乾燥デンプンを秤量して２．５ｍＬ精製ＨＰＬＣ用水に溶解させた。デンプンを電子レンジで溶液（約１％固形分）に溶解させた。熱デンプン溶液を熱水道水（約５０℃）で冷却し、５０μＬイソアミラーゼ〔ｐＨ４．５の０．１Ｎ  ＮａＯＡｃ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬイソアミラーゼ（１，２８０，０００Ｕ／ｇ固形分）〕をデンプン溶液に加えた。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物をオーブン中５５℃で２時間インキュベートした。イソアミラーゼを不活性化するために、デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を１００℃以上に加熱した。熱水道水（約５０℃）を用いてデンプン溶液を冷却し、０．１ｇ  Dowex ＭＲ‐３樹脂をデンプン溶液へ加え、ＮａＯＡｃを除去するために１分間振盪した。デンプン溶液を３ｍＬシリンジに装着された０．４５μｍ孔径Milliporeフィルターで濾過した。濾過されたサンプルをＳＥＣまたはＧＰＣカラム装備のＨＰＬＣ中へ注入した。
【００５２】
２４時間反応（８０℃，ｐＨ５．７）における異なるグルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）用量でのデントデンプンの鎖のＤＰの最適化：
ＧＴの４つの異なる用量を試みた：１．２５、２．５、５および１０ｍＬ／１００ｇデンプン。意外にも、ＤＰ値の変化のほとんどが初めの４時間で生じ、最終ＤＰ値は異なる用量のときに異なる。
【００５３】
図１０は、４つの用量で２４時間にわたるＤＰ３７‐１００変化率を示している。ＤＰ３７‐１００成分が抵抗性デンプンに望ましく、反応の初めの４時間で顕著に増加した。高用量（１０ｍＬ／１００ｇデンプン）のとき、６時間の反応後にＤＰ３７‐１００の減少があった。５ｍＬ／１００ｇデンプンの用量のとき、２２時間の反応後にＤＰ３７‐１００の減少があった。
【００５４】
図１１は、４つの用量で２４時間にわたるＤＰ２５‐１００変化率を示している。変化のパターンはＤＰ３７‐１００の場合とまさしく同一である。ＤＰ２５‐３７成分はさほど熱安定性でない抵抗性デンプンに望ましく、反応の初めの４時間で顕著に増加した。高用量（１０ｍＬ／１００ｇデンプン）のとき、６時間の反応後にＤＰ２５‐１００の減少があった。５ｍＬ／１００ｇデンプンの用量のとき、２２時間の反応後にＤＰ３７‐６０の減少があった。
【００５５】
図１２および１３は、４つの用量で２４時間にわたるＤＰ１‐２４およびＤＰ１‐１２変化率を示している。ＤＰ１‐２４成分、特にＤＰ１‐１２は抵抗性デンプンに望ましくなく、反応の初めの４時間で顕著に減少した。高用量（１０ｍＬ／１００ｇデンプン）のとき、６時間の反応後にＤＰ１‐２４の増加があった。
【００５６】
図１４は、４つの用量で２４時間にわたるＤＰ１００＋変化率を示している。ＤＰ１００＋成分は抵抗性デンプンに望ましくなく、反応の初めの４時間で顕著に減少した。
【００５７】
図１５は、５つの異なるＧＴ酵素用量で２４時間反応による最高ＤＰピークを示している。２４時間にわたる最高ＤＰピークはＧＴ酵素用量と直接関連していた。低濃度のＧＴ酵素のときにおける反応時間の増加は、高濃度のＧＴ酵素のときほど高いピークＤＰを呈しなかった。
【００５８】
分枝鎖のＤＰに及ぼす高用量のグルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）の効果：
先の研究において、酵素用量の増加（１．２５〜１０ｍＬ／１００ｇデンプン）で最終製品のＤＰが増加したことがわかった。この実験において、我々は、どの酵素用量のとき最終製品のＤＰがＧＴの増量でも増加せず、またはＤＰとＧＴ濃度とのプロットでプラトーに達するかを調べようと試みた。１５％デンプン溶液に１０、１２．５および１５ｍＬ  ＧＴ／１００ｇデンプンを加え、反応を８０℃、ｐＨ７．５で行なった。サンプルを２、４、６および２２時間目に取り出した。結果が図１６〜２１で示されている。
【００５９】
１０〜１５ｍＬ／１００ｇデンプンでＧＴ用量の増加は少し効果を呈したが、ＤＰ３７‐１００のパーセンテージの増加とＤＰ１‐２４および１００＋の減少は、酵素用量が１．２５〜１０ｍＬ／１００ｇデンプンで増加したときに観察された場合と比較してかなり少なかった。
【００６０】
実施例１１
デントデンプンのＧＴ酵素処理：
Dent Starch Pearl-C（ＤＳ８９．５６％）を秤量し（５０２．５ｇ）、２４９７．５ｇＤ．Ｉ．水および１３５ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏをデンプンに加えた（１５％デンプンスラリー）。２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いてデンプンスラリーのｐＨを５．５に調整した。デンプンスラリーをジェット調理（２８５〜２９０°Ｆ，１４０〜１４３℃）したところ、通常乾燥固形分は１５％から１３．１９％に減少した。ｐＨが異なっていれば、それを５．７に調整した。５５０ｇのデンプンスラリーを秤量して数個の１０００ｍＬ反応器の各々へ入れた。数個の反応器の各々で乾燥固形分の量に応じてＧＴ酵素を加えた。デンプンおよびＧＴ酵素混合物を水浴中８０℃で２４時間までインキュベートした。分枝鎖長を分析するために、サンプル（約５ｍＬ）を取り出した。
【００６１】
ＧＴ変換デンプンの脱分枝：
湿潤ＧＴ変換サンプル（約１３％固形分）を、それが流体になるまで、密栓を付して電子レンジ中フルパワーで加熱した。サンプル（１９２±２５ｍｇ）を１０ｍＬチューブ中で秤量し、２．５ｍＬ精製（ＨＰＬＣ用）水を加えた。乾燥サンプルの場合、２５ｍｇ乾燥デンプンを秤量して２．５ｍＬ精製ＨＰＬＣ用水に溶解させた。デンプンを電子レンジで溶液（約１％固形分）に溶解させた。熱デンプン溶液を熱水道水（約５０℃）で冷却し、５０μＬイソアミラーゼ〔ｐＨ４．５の０．１Ｎ  ＮａＯＡｃ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬイソアミラーゼ（１，２８０，０００Ｕ／ｇ固形分）〕をデンプン溶液に加えた。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物をオーブン中５５℃で２時間インキュベートした。イソアミラーゼを不活性化するために、デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を１００℃以上に加熱した。熱水道水（約５０℃）を用いてデンプン溶液を冷却し、０．１ｇ  Dowex ＭＲ‐３樹脂をデンプン溶液へ加え、ＮａＯＡｃを除去するために１分間振盪した。デンプン溶液を３ｍＬシリンジに装着された０．４５μｍ孔径Milliporeフィルターで濾過した。濾過されたサンプルをＳＥＣまたはＧＰＣカラム装備のＨＰＬＣ中へ注入した。
【００６２】
ＤＭＳＯ溶液中でＧＴ変換デンプンの脱分枝：
STAR-DRI 10 マルトデキストリンが加えられた実験において、ＧＴ変換デンプンの脱分枝をＤＭＳＯ溶液で行なった。乾燥デンプン（３５ｍｇ）を１ｍＬ水性ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ：水＝９：１ｖ／ｖ）に溶解するか、または湿潤サンプル（２６９ｍｇ，ＧＴ変換サンプル中１３％ＤＳ）を０．９ｍＬ純粋ＤＭＳＯに溶解した。デンプン溶液を沸騰水浴中で攪拌しながら３時間加熱した。次いでデンプン溶液を３９℃に冷却し、３．５ｍＬ温酢酸ナトリウム緩衝液（３９℃，５０ｍＭ）を加えた。１００μＬイソアミラーゼ〔ｐＨ４．５の０．１Ｎ  ＮａＯＡｃ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬイソアミラーゼ（１，２８０，０００Ｕ／ｇ固形分）〕をデンプン溶液に加えた。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を水浴中３９℃で２時間インキュベートした。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を沸騰水中で２０分間加熱し、次いで３９℃に冷却した。１００μＬイソアミラーゼを加え、混合物を１６時間インキュベートした。脱分枝後、デンプン溶液を沸騰水浴中で２０分間加熱し、暖温まで冷却した。２ｍＬ分の混合物を２ｍＬの純粋ＤＭＳＯで希釈した。ＤＭＳＯ混合物（約５ｍｇデンプン／ｍＬ）を沸騰水浴中で２０分間加熱し、暖温まで冷却した。Dowex ＭＲ‐３樹脂（０．５ｇ）をデンプン溶液へ加え、ＮａＯＡｃを除去するために１分間振盪した。デンプン溶液を３ｍＬシリンジに装着された０．４５μｍ孔径Milliporeフィルターで濾過した。濾過されたサンプルをＳＥＣまたはＧＰＣカラム装備のＨＰＬＣ中へ注入した。
【００６３】
異なる反応温度（７５、８０および８５℃）におけるグルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）活性：
この実験では、５ｍＬ  ＧＴ／１００ｇデンプン含有の１５％デンプン溶液を７５、８０および８５℃で反応させ、ＧＴの添加後１、２、４、６、８、１０および２２時間目にサンプルを取り出した。結果が図２２〜２３で示されている。
【００６４】
短い反応時間（６時間以下）の場合、ＧＴ変換デンプンは高い反応温度（８５℃）のとき高割合のＤＰ３７‐１００を有していた。しかしながら、長い反応時間（８時間以上）の場合、ＧＴ変換デンプンは低い温度（７５および８０℃）のとき高割合のＤＰ３７‐１００を有していた。
【００６５】
図２４〜２６で示されているように、短い反応時間（６時間以下）の場合、ＧＴ変換デンプンは高い反応温度（８５℃）のとき低割合のＤＰ１‐２４または１‐１２を有していた。しかしながら、長い反応時間（８時間以上）の場合、ＧＴ変換デンプンは低い温度（７５および８０℃）のとき低割合のＤＰ１‐２４または１‐１２を有していた。
【００６６】
図６で示されているように、短い反応時間（６時間以下）の場合、トレンドはＤＰ１００＋フラクションで明確でなかった。長い反応時間（８時間以上）の場合、ＧＴ変換デンプンは高い温度（８０および８５℃）のとき低割合のＤＰ１００＋を有していた。高い温度のときほど、デンプン老化（retrogradation）が少なく生じ、ＧＴ酵素がＤＰ１００＋フラクションでより効率的に作用できたようである。
【００６７】
高温時のグルカノトランスフェラーゼ（ＧＴ）活性：
先の反応温度研究（７５、８０および８５℃）において、ＤＰ３７‐１００の最高パーセンテージは３つの異なる温度で類似（２９％に近い）していたが、ＤＰ３７‐１００の最高パーセンテージは８５℃のとき早く、８０および７５℃のとき遅かった。反応が最高時（最高ピークＤＰまたは最高ＤＰ“３７‐１００”）より長く続くと、有害効果（ＤＰの減少）があった。実験は、１）高い温度で早期段階（０．５時間）にＤＰ３７‐１００およびピークＤＰを試験する、および２）ＧＴ酵素を８５℃で４時間予熱することによりＧＴ熱安定性を試験するために行なわれた。
【００６８】
この実験では、ＧＴ１０ｍＬ／１００ｇデンプンを全４処理で用いた。デンプンとのＧＴ反応を８０℃、８５℃、予熱変換ＧＴ（８５℃で４時間）と８５℃、および９０℃で行なった。図２８が結果を示している。初めの１．５時間において、ＤＰ３７‐１００のパーセンテージは９５℃のとき高かった。しかしながら、８５℃の予熱ＧＴは８５℃のＧＴ反応より高いＤＰ３７‐１００を呈した。ＤＰ２５‐１００フラクション（図２９）も類似トレンドをたどった。
【００６９】
短ＤＰ鎖（ＤＰ１‐１２または１‐２４）に関する結果はデータの変動のせいで確定的でなかったが、有意な有害効果は高温でみられなかった（図３０および３１）。ピークＤＰ（図３０）は、９０℃の反応が１．５時間以内のとき８０℃の反応より高いピークＤＰを呈し、８５℃で４時間にわたるＧＴの予熱がＧＴ予熱なしで８５℃の反応より高いピークＤＰを呈したことを示した。
【００７０】
図３２はＤＰ１００＋が９０℃で低かったことを示している。
【００７１】
図３３は、ピークＤＰが初めの１．５時間において９０℃で高かったが、トレンドがさほど明確でなかったことを示している。
【００７２】
それより長い時間（２時間〜８時間）における反応のピークＤＰが図３４で示されている。２時間の反応を超えると、低温反応ほどピークＤＰについて高温反応より良いようである。
【００７３】
ＧＴ変換デンプンに及ぼすSTAR-DRI １０の添加の効果：
Dent Starch Pearl-C（１５％）をジェット調理し（２８５〜２９０°Ｆ）、ｐＨを５．７に調整した。STAR-DRI １０マルトデキストリンを１：２比率でＤＩ水に溶解し、８０℃で可溶化させ、ｐＨ５．７に調整した。デンプンスラリーを８０℃でインキュベートし、４回の試験を行なった：１．デンプンスラリー＋１０ｍＬ  ＧＴ／１００ｇデンプン；２．デンプンスラリー＋１０ｍＬ  ＧＴ／１００ｇデンプン＋乾燥デンプンベースで２５％STAR-DRI １０；３．デンプンスラリー＋１０ｍＬ  ＧＴ／１００ｇデンプンおよび２時間の反応、次いで２５％STAR-DRI １０；４．デンプンスラリー＋１２．５ｍＬ  ＧＴ／１００ｇデンプン＋２５％STAR-DRI １０。サンプルを２、４および６時間目に取り出した。サンプルを脱分枝した。結果が図３５〜３８で示されている。
【００７４】
STAR-DRI １０の添加はＧＴ変換デントデンプンでＤＰを減少させた。STAR-DRI １０が反応の初めまたは２時間後に加えられても、それは全般的にＤＰを減少させた。溶液中でデンプン固形分の増加を補うために相当量のＧＴ酵素が加えられても、それは全体ＤＰを減少させた。
【００７５】
実施例１２
デントデンプンのＧＴ酵素処理：
Dent Starch Pearl-C（ＤＳ８９．５６％）を秤量し（５０２．５ｇ）、２４９７．５ｇＤ．Ｉ．水および１３５ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏをデンプンに加えた（１５％デンプンスラリー）。２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いてデンプンスラリーのｐＨを５．５に調整した。デンプンスラリーをジェット調理（２８５〜２９０°Ｆ，１４０〜１４３℃）したところ、通常乾燥固形分は１５％から１３．１９％に減少した。ｐＨが異なっていれば、それを５．７に調整した。５５０ｇのデンプンスラリーを秤量して数個の１０００ｍＬ反応器の各々へ入れた。反応器の各々で乾燥固形分の量に応じてＧＴ酵素を加えた。デンプンおよびＧＴ酵素混合物を水浴中８０℃で２４時間までインキュベートした。分枝鎖長を分析するために、サンプル（約５ｍＬ）を取り出した。
【００７６】
ＧＴ変換デンプンの脱分枝：
湿潤ＧＴ変換サンプル（約１３％固形分）を、それが流体になるまで、密栓を付した試験管中において電子レンジ中フルパワーで加熱した。サンプル（１９２±２５ｍｇ）を１０ｍＬチューブ中で秤量し、２．５ｍＬ精製（ＨＰＬＣ用）水を加えた。乾燥サンプルの場合、２５ｍｇ乾燥デンプンを秤量して２．５ｍＬ精製ＨＰＬＣ用水に溶解させた。デンプンを電子レンジで溶液（約１％固形分）に溶解させた。熱デンプン溶液を熱水道水（約５０℃）で冷却し、５０μＬイソアミラーゼ〔ｐＨ４．５の０．１Ｎ  ＮａＯＡｃ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬイソアミラーゼ（１，２８０，０００Ｕ／ｇ固形分）〕をデンプン溶液に加えた。デンプンおよびイソアミラーゼ混合物をオーブン中５５℃で２時間インキュベートした。イソアミラーゼを不活性化するために、デンプンおよびイソアミラーゼ混合物を１００℃以上に加熱した。熱水道水（約５０℃）を用いてデンプン溶液を冷却し、０．１ｇ  Dowex ＭＲ‐３樹脂をデンプン溶液へ加え、ＮａＯＡｃを除去するために１分間振盪した。デンプン溶液を３ｍＬシリンジに装着された０．４５μｍ孔径Milliporeフィルターで濾過した。濾過されたサンプルをＳＥＣまたはＧＰＣカラム装備のＨＰＬＣ中へ注入した。
【００７７】
先の実験から、２４時間にわたる最高ＤＰピークはＧＴ酵素用量と直接関連していた。低濃度のＧＴ酵素で反応時間の増加は、高濃度のＧＴ酵素の場合ほど高いピークＤＰを呈しなかった。ＧＴ酵素が初めの４時間の反応後に不活性化されたか、またはデンプンが老化されて、ＧＴがデンプンで効果的に作用していない、と推定される。
【００７８】
いかなる要因が反応を遅延させているのか調べるために、３回の実験を行なった：１．ジェット調理直後（０時間目）にＧＴを全用量（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）で加えた；２．ジェット調理直後に全用量の１／３（０時間目に２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）、２．５時間反応後に２回目の１／３用量（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）、および４時間反応後に３回目の１／３用量（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）でＧＴを加えた；３．デンプンがジェット調理後に８０℃で５．５時間インキュベートされた後でＧＴを加えた。
【００７９】
本実験は、８０℃におけるＧＴ酵素の安定性および酵素活性に及ぼすデンプンの老化の効果を解明するためであった。デンプン老化が酵素活性に効果を有さず、酵素が安定であれば、最終製品（脱分枝デンプンＧＰＣプロフィール）は長時間酵素反応後も同様であろう。しかも、各ＧＴ酵素添加（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン，３回）に際して、脱分枝デンプンＧＰＣプロフィールは、それらが一度で全用量（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）と同様のプロフィールに達するまで、変化するであろう。結果が図３９〜４０で示されている。
【００８０】
図３９は、ジェット調理直後（０時間目）にまたはデンプンが８０℃で５．５時間インキュベートされた後でＧＴが加えられたかどうかにかかわらず、ＤＰ３７-１００のパーセンテージが４時間反応後に同ＧＴ用量（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）のとき同様であったことを示している。同様のトレンドがＤＰ２５-１００にも当てはまった。含有されるＤＰ２５-３７は抵抗性デンプンにとり望ましいが、熱安定性が少ない。
【００８１】
ＧＴの全用量の１／３がジェット調理直後に加えられたとき（０時間目に２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）、ＤＰ３７-１００は初めの１．５時間で増加し、次いで１．５時間〜２．５時間で減少した。２回目のＧＴ添加（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）で、ＤＰ３７-１００は急速に増加した。３回目用量のＧＴ（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）が加えられたとき、変化は２回目用量の添加時ほど大きくなかった。２回目用量ＧＴの添加による反応後に少し老化が生じたか、または２回目ＧＴ用量による反応後に反応が平衡に近づいた、と推定される。ＧＴが一度に加えられたときより、ＧＴが１回に１／３用量ずつ加えられたときに、ＤＰ３７-１００物質が多く得られた。
【００８２】
図４１および４２は、デンプンが８０℃で５．５時間インキュベートされた後より、ＧＴがジェット調理直後（０時間目）に加えられたときに、ＤＰ１-２４および１-１２のパーゼンテージがやや高かったことを示している。しかしながら、差は％未満であった。
【００８３】
ＧＴが１／３の用量でジェット調理直後に加えられたとき（０時間目に２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）、ＤＰ１-２４は０〜１時間で減少したが、１〜３時間で増加し、２回目のＧＴ用量の添加で急に減少し、次いで３回目のＧＴ用量で減少し続けた。一度に全用量の代わりに、ＧＴが１回に１／３用量ずつ加えられたときに、ＤＰ１-２４が少なかった。
【００８４】
図４３は、ＤＰ１００＋が急速に低下し、初めの２時間酵素反応後に最終値に近づいたことを示している。低用量のＧＴ（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）で加えられても、ＤＰ１００＋が２時間反応後に高用量（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）の場合と類似した最終値へ低下したことは、意外である。２回目のＧＴ（２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）添加でＤＰ１００＋が約０．５％から４％へ増加したことも予想されなかった。
【００８５】
図４３は、ジェット調理後に８０℃で５．５時間にわたるデンプンスラリーのインキュベートがＤＰ１００＋の高い最終値を呈したことも示している。少しアミロースが８０℃で５．５時間経て老化し、ＧＴがこれらの老化アミロースで作用していない、と結論づけることが論理的である。
【００８６】
ＧＴが１回に１／３用量ずつ加えられたときの反応から、更なるデータ（０．５時間毎）が得られた。８時間反応における詳細なＤＰ変化が図４４で示されている。
【００８７】
ジェット調理直後（０時間目）にまたはデンプンが８０℃で５．５時間インキュベートされた後でＧＴが加えられたかどうかにかかわらず、ＧＴ酵素（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）変換デンプンの最高ピークＤＰは、６時間反応後に同ＧＴ用量（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）のとき同様であった（図４５参照）。
【００８８】
ＧＴが１回に全用量の１／３ずつで加えられたとき（各々０、２．５および４時間目に２．５ｍＬ／１００ｇデンプン）、最高ピークＤＰは次第に増加した。全用量（７．５ｍＬ／１００ｇデンプン）が加えられた後における最終最高ピークＤＰは、一度に全用量の添加より良かった。
【００８９】
実施例１３
本発明に従い製造された抵抗性デンプンが、クッキー焼き試験（American Association of Cereal Chemists（ＡＡＣＣ）試験５３-１０）で小麦粉の５１．７％に代えて用いられた。抵抗性デンプンをＵＳメッシュ４０シーブに通し、ＵＳメッシュ２００シーブで集めたが、細粉は２００メッシュシーブを通り抜けた。粒径平均は２０２．５μｍ、モードは１８５．４μｍであった。
【００９０】
試験ＡＡＣＣ５６-１１で分析すると、デンプンサンプルは保水能でペースト小麦粉より高いことがわかったが、しかしながらベーキングに際してクッキーの加熱サイクル中に諸成分で何が生じたかをこの測定が解明するわけではない。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
ドゥ（dough）の堅さおよび粘着性を調べるためにInstronテスターを用いた（Instron Corp.,Canton,ＭＡ；１／２インチボールプローブ；トリガー力＝１０ｇ；試験前速度＝５ｍｍ／ｓ；試験速度＝２ｍｍ／ｓ；試験後速度＝１０ｍｍ／ｓ；挿入の距離＝１５ｍｍ）。１５０ｇのドゥを秤量して、８．４ｃｍの高さ、３．２ｃｍの幅および１０．２ｃｍの長さを有するパンへ入れた。のし棒の１叩きでパン中へドゥを詰め込んだ。少なくとも３回のInstron押込みの平均値を記録した。
【００９３】
抵抗性デンプンが過剰の水を吸収すると、ドゥは堅くなる。この実験で用いられたデンプンサンプルは、ペースト小麦粉ほど堅くない（低い最大荷重）ドゥを生じ、押込み後にプローブを抜き取る力により測定すると低粘着性であることがわかった（最小力）。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
ＡＯＡＣ（association of Official Analytical Chemists）法９９１．４３によると、７１．９４％線維がベーキング前に抵抗性デンプン成分で存在し、その物質の８８．３％がクッキーベーキング後も線維として計算された。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
【表７】
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【００９８】
コントロールペースト小麦粉クッキーのクッキー高さは、抵抗性デンプンを含有したクッキーの高さより大きかった。加えて、クッキースプレッド（幅）はコントロールで狭く、抵抗性デンプン含有クッキーで広かった。広いスプレッドおよび低い高さは抵抗性デンプンの低い保水性のせいであり、抵抗性デンプンが水和せずまたはベーキングプロセスに際して部分的にゼラチン化したが、比較的未変化のままであったことを示している。
【００９９】
【表８】
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【０１００】
本発明の具体的態様に関する先の記載は、本発明の全可能態様のリストとなるつもりではない。当業者であれば、他の態様も下記請求項の範囲内に属すると認めるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【国際調査報告】
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