(57)【要約】新規な懸濁ハイブリダイゼーション試験を用いてフローサイトメトリによる核酸コピー数を測定した。該試験は、分光学的に異なるポリスチレンマイクロスフェアに接合された長さ１００〜２３０４ｂｐの範囲の低コピー（Ｉｃ）産生物で実証された。本明細書に示される実施例では、これら接合マイクロスフェアは、細胞遺伝子学的細胞ペレットから抽出され、ビオチン−ｄＵＴＰで標識されたゲノムＤＮＡ中の相同配列を検出するためのマルチハイブリダイゼーションプローブとして用いられた。ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンを用いて検出され、フローサイトメトリにより分析された。コピー数の差異は、患者試料のゲノムＤＮＡ中の２倍体参照プローブをもつ試験プローブと、異常細胞株との平均蛍光強度の比較により区別された。この試験は、染色体コンテクストに無関係に、２アレル参照配列由来の試験遺伝子座における単一アレルと３アレルの区別が可能である。この試験は、相同標的の精確なコピー数決定のためにＩｃプローブが充分に特異的でかつ感度が高いため、遺伝子座特異的標的ＤＮＡの事前の増幅が必要な従来の方法の改良である。その高い感度と精度のため、この試験は、核酸コピー数の測定のための、ヒト、疾患の動物モデルおよび溶液中のゲノムコピー数の測定、転写レベルの測定、法医学的ＤＮＡ分析および農業における品質管理などの各種適用のために有用である。【選択図】図１
2009507472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ゲノムの標的核酸配列のコピー数の定量方法：
被検対象から前記標的核酸配列を含有する核酸を抽出する工程、
該標的核酸に標識をつける工程、
前記標的核酸配列を相補するために選択された、微粒子に接合された低コピー核酸プローブを調製する工程、
該プローブを前記標的核酸にハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション反応産生物を生成させる工程、
前記微粒子を検出することで該産生物を同定する工程、
前記産生物上の前記標識を検出することで、前記標的核酸配列のコピー数を定量する工程。
【請求項２】
前記微粒子がナノ結晶粒子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微粒子がナノスフェアを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微粒子がマイクロスフェアを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微粒子が分光的に異なるポリマーマイクロスフェアを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロスフェアがポリスチレンを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロスフェア表面上の生物学的部分に蛍光色素を結合させる工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロスフェアがカルボン酸化されている改変型カルボジイミド反応を介して、前記プローブを前記マイクロスフェアに接合する工程、および求電子的束縛を用いて前記マイクロスフェアを前記プローブに接合する工程からなる群より選ばれる工程をさらに含み、前記束縛がＮ−クロロアセトアミドヘキシルホスホルアミダイトを含む請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記微粒子が、所定の分光特性をもつ、内部染色された蛍光性ポリスチレンビーズを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出された標的核酸がゲノムＤＮＡおよび相補ＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が、インビトロ核酸複製反応の間に直接標識された識別標識を用いるニックトランスレーションを介するラベリング、末端ラベリングおよびランダムプライミングからなる群より選ばれるプロセスにより標識される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、蛍光色素分子、酵素複合体、蛍光色素分子標識したヌクレオチド、抗原担持ヌクレオチドに結合した蛍光標識した抗体、ビオチン−ｄＵＴＰ、ジオキシゲニン−ｄＵＴＰおよびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記低コピーのプローブのコピー数が１０以下である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブの核酸配列が前記被検対象のゲノム中の単一コピー配列に相補的である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１または複数の塩基対の欠失した標的核酸が、前記標的核酸配列の正常相補をもつ参照プローブに対し、約０．１〜約０．７５の応答比を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１または複数の塩基対が挿入または重複された標的核酸が、前記標的核酸配列の正常相補をもつ参照プローブに対し、約１．２５〜約１．６５の応答比を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
１または複数の別々の分光特性をもつ微粒子に接合された別々の核酸配列をもつマルチプローブが、標的核酸にハイブリダイズされる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記微粒子が、前記核酸プローブの３’または５’端  のビオチン部分に結合した、ストレプトアビジン被覆またはカルボン酸化ビーズを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
１μｇの異種ゲノム核酸配列あたりの標的配列の検出量が５０ｐｇ〜５ｎｇの範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
コピー数の差異が最小６０ｂｐのゲノム感度で検出される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記定量工程がフローサイトメトリを用いて前記産生物の分光特性を検出する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブの長さが５０〜２５００塩基の間である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微粒子の直径が５０ｎｍ〜１μｍの間である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、被検対象由来ゲノムまたは相補核酸中の疑われる染色体異常の検出方法：
第１の分光特性をもつ分光学的にコードされた蛍光性マイクロスフェアを準備する工程、
異常の存在が疑われる標的核酸配列の各ヌクレオチドごとの配列の確認により、標的ゲノム核酸プローブ配列を同定する工程、
同定された標的ゲノム核酸プローブ配列にしたがって低コピー標的プローブを合成する工程、
標的プローブを第１の分光特性をもつマイクロスフェアに接合する工程、
既知コピー数の前記標的核酸配列をもつ参照核酸配列にハイブリダイズするために選択された参照プローブを合成する工程、
参照プローブを第２の分光特性をもつマイクロスフェアに接合する工程、
標的プローブを、異常をもつ染色体標的配列と反応させ、それにより標的プローブの標的配列へのハイブリダイズを生起させる工程、
参照プローブを、前記染色体標的配列をもつ染色体参照配列と反応させ、それにより参照プローブの参照配列へのハイブリダイズを生起させる工程、
ハイブリダイズ標的プローブを検出して染色体異常の存在を確認する工程、
ハイブリダイズ参照プローブを検出する工程、および
検出されたハイブリダイズ標的プローブの応答と、検出されたハイブリダイズ参照プローブの応答との比較により、検出されたハイブリダイズ標的プローブを定量する工程。
【請求項２５】
前記異常が、前記ゲノムまたは相補核酸中の配列のコピー数の差異、重複、欠失、逆位、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、６０ｂｐの限界ゲノム感度で異常を検出する請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出工程がフローサイトメトリを用いる請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記低コピーのプローブのコピー数が１０以下である請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
マイクロスフェアに接合された低コピーゲノムまたは相補核酸プローブにハイブリダイズされた標識された標的核酸配列のフローサイトメトリによる検出を介する染色体異常の直接ゲノム定量方法であって、以下の工程を含む方法：
５０ｎｍ〜１μｍの間の直径をもつ、分光学的にコードされた、蛍光性マイクロスフェアを準備する工程、
異常の存在が疑われる標的中の特定の核酸配列にハイブリダイズするために選択された低コピー標的プローブを合成する工程、
標的プローブをマイクロスフェアに接合する工程、
標的プローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズされた標的プローブをフローサイトメトリにより検出する工程、および
前記フローサイトメトリの結果に基づいて前記異常を定量する工程。
【請求項３０】
プローブの核酸配列が、５０〜２５００塩基の間の所定の長さをもつ請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記異常が、前記ゲノムまたは相補核酸内の配列のコピー数の差異、重複、欠失、逆位、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、６０ｂｐの限界ゲノム感度で異常を検出する請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程を含む、染色体異常の検出方法：
分光学的にコードされたポリスチレンマイクロスフェアを、合成ＤＮＡ配列に連結することによりハイブリダイゼーションプローブを準備する工程、
前記プローブを、ゲノムＤＮＡにハイブリダイズする工程、
前記ハイブリダイゼーションの産生物を、フローサイトメトリにより検出する工程。
【請求項３４】
前記異常が、前記ゲノムまたは相補核酸内の配列のコピー数の差異、重複、欠失、逆位、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、６０ｂｐの限界ゲノム感度で異常を検出する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記フローサイトメトリの結果を、前記異常に対応する既知コピー数をもつハイブリダイゼーション産生物のフローサイトメトリの結果と比較する工程をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記プローブが、ゲノムＤＮＡ中の１０以下の位置に相補的である請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡが増幅されていない請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、先に出願され、同時係属中の２００５年８月１６日出願の仮出願番号６０／７０８，７３４を、その引用により本明細書に記載されているものとして、先の出願日の利益を主張する。
【０００２】
配列表
印刷した配列表は、引用により本明細書に取り込まれるものとして、本願に添付し、同一内容が、フロッピイディスク上にコンピュータ読取可能なＡＳＣＩＩファイルの形式で提出されている。
【０００３】
本発明は、低コピー核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて染色体異常を検出するための材料および方法に関する。より具体的に、本発明は、マイクロスフェアに接合された低コピー核酸プローブの標識された標的核酸へのハイブリダイゼーションを介した核酸配列中の染色体異常の定量に関する。より一層具体的には、本発明は、分光学的にコードされたマイクロスフェアを低コピーまたは単一コピーの核酸プローブに接合すること、該プローブを、被検対象由来の核酸から直接的に調製された蛍光色素標識された標的にハイブリダイズすること、該ハイブリダイゼーション反応の産生物を検出すること、および同様にハイブリダイズされた参照プローブにより発生される応答の検出との比較により検出された応答を定量することに関する。
【背景技術】
【０００４】
診断またはヒト疾病素因は、多くの場合、ゲノムまたはトランスクリプトーム中の特定の核酸配列の定量化に基づく。染色体の数および構造異常を検出する現行方法としては、染色体分染法、蛍光インシチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）および他のマイクロアレイ技術、マルチ増幅プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）、マルチライゲーション依存ハイブリダイゼーション（ＭＬＰＡ）、サザン分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が挙げられる。ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の定量は、通常、マイクロアレイ分析法で行なわれる（非特許文献１参照）。
【０００５】
数的異常は、染色体分染法により容易に検出可能であるが、欠失または重複などの構造異常は、染色体分染法による検出を確実にするためには、大きさ（〜３−５Ｍｂ）と、縞模様の正確な分離が求められる。ＦＩＳＨおよびサザン分析は、多量の患者検体を必要とし、実験操作に時間がかかり、かつ達成される検出レベルは〜２０ｋｂ〜６５０ｋｂである。ａＣＧＨの感度は、クローンされるプローブのサイズおよび密度に制限され（配列の増幅について〜４０ｋｂおよび欠失について７０−１３０ｋｂ）（非特許文献２参照）、さまざまな蛍光シグナルが判定の精度に影響を及ぼす傾向がある（非特許文献３参照）。ＭＡＰＨは約５０ｋｂの感度をもち（非特許文献４参照）、ＭＬＰＡは他の技術よりも高感度であるが、時間がかかり、かつ負の誤差となり得るライゲーション部位もしくはその近辺の単一のヌクレオチド多型に高感度である。ｑＰＣＲと同様、汚染防止に注意を払わなくてはならず（非特許文献５参照）、また容易にマルチ化（すなわち、１の反応において多種多様なプローブセットを組み合わせること）できない技術でもある。
【０００６】
合成ＤＮＡ配列に連結される分光学的にコードされたポリスチレンマイクロスフェアの懸濁は、核酸標的配列にハイブリダイズすることができ、特許文献１〜３に記載されるような従来型のフローサイトメトリにより検出することができる。このような試験は、標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションのために、１０−５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブを用いる。マイクロスフェア系試験のフローサイトメトリ分析のための他のマルチ化データ取得および分析基準が開示されている（非特許文献６参照）。標準的核酸ハイブリダイゼーション試験は、当技術分野において周知であり、標識された核酸プローブを用いて標識されてない核酸分子との複合混合物内に含まれる関連している標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を同定することなどが挙げられる。マイクロスフェアハイブリダイゼーションは、環境試料中の微生物由来の増幅されたリボソーム配列の数量の定量に精度および感度の両方を示してきた（非特許文献７参照）。しかしながら、現行の試験法は、プローブとのハイブリダイゼーションに先だって標的ＤＮＡの増幅を必要とし、現行のプローブは、患者のＤＮＡ試料から直接的にゲノムコピー数を高精度に定量するための充分な特異性と感度を供しない。試験に先だつ標的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、検出された各配列あたり５時間以内に完遂することができ、ＦＩＳＨ分析を用いれば、試料毎のプローブあたり、ハイブリダイゼーション、検出および分析手順を２日以内で行なうことできる。また、必須の増幅工程は、該増幅が本質的に対数でかつ制御困難であるため、標的配列の染色体コピー数の概算を複雑化させる傾向にある。しかしながら、増幅されてないゲノムＤＮＡを直接的に分析する先の試みは成功していない（非特許文献８参照）。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７３６，３３０号
【特許文献２】米国特許第５，９８１，１８０号
【特許文献３】米国特許第６，０５７，１０７号
【非特許文献１】ブラウン（Brown）ら，science，２７０：４６７−７０，１９９５
【非特許文献２】シェイファー（Shaffer）およびベジャミ（Bejjani），Hum．Reprod  Update，１０（３）：２２１−６（２００４）
【非特許文献３】エステランダー（Oostlander）ら，Clin．Genet，６６（６）：４４８−９５（２００４）
【非特許文献４】アモー（Armour）ら，Nucleic  Acid  Res．，２８（２）：６０５−０９（２０００）
【非特許文献５】シャウテン（Schouten）ら，Nucleic  Acid  Res．，３０（１２）：ｅ５７（２００２）
【非特許文献６】フルトン（Fulton）ら，Clin．Chem．，４３（９）：１７４９−５６（１９９７）
【非特許文献７】スプロ（Spiro）ら，Applied and Environmental Microbiology，２０００，４２５８−４２６５頁，第６６巻，第１０号
【非特許文献８】ボルッキ（Borucki）ら，J．Clin．Microbiol，４３（７）：３２５５−５９（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以下の従来技術は、以下のすべての方法で、標的試料の予備増幅が必要であり、また全例において、マイクロスフェアに連結されるプローブは、単一または低コピーとしては定義されていないオリゴヌクレオチドであったことから、本発明と別異である。ゲノムまたはトランスクリプトーム中の高度に反復された配列は、信頼性のある検出のための増幅を必ずしも必要としないが、大きく複雑なゲノム中の単一コピーまたは低コピー数配列は、充分な検出感度を得るために、この条件を必要とする。下記は、公開され、特許されたマイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーションを含む実験のリストである。以下に列挙する特許は、核酸標的中の配列のコピー数の直接定量が実施可能ではない点で本発明と異なる。
【０００９】
ａ．分光学的にコードされたマイクロスフェアに接合された検体の分析：米国特許第６，６４９，４１４号、第６，４４９，５６２号、第６，３９５，４７０号
ｂ．オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲおよびＤＮＡの検出：米国特許第６，０５７，１０７号、第６，０６０，２４０号、第５，９８１，１８０号、第５，７３６，３３０号、第６，９１６，６６１号および第５，９８１，１８
ｃ．オリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅されたＤＮＡへのハイブリダイゼーションを含むマイクロスフェア懸濁アレイ・ハイブリダイゼーション技術：米国特許第５，７３６，３３０号および第６，０５７，１０７号およびフルトン（Fulton）ら  Advanced multiplexed analysis  with  The  FlowMetrix  System，Clin  Chem  １９９７年９月；４３（９）：１７４９−５６。
ｄ．米国特許第５，９８１，１８０号は、色分けされたビーズをフローサイトメトリと併用してマルチ化生物学的試験を行なう方法を開示する。
ｅ．標的核酸に結合した光活性化可能な標識を用いてマイクロスフェアに結合したＤＮＡ断片のマルチ化分析方法および核酸の定量方法は、２００１年、ダッタグプタ（Dattagupta）およびナニブフーシャン（Nanibhushan）により特許化されている；米国特許第６，６２０，５８６号。
【００１０】
ｆ．ハイブリダイゼーション試験におけるオリゴヌクレオチドのマイクロスフェアへの付加およびＰＣＲ産生物の検出、多型またはメチル化検出に関する特許を下記する。以下の技術は、本発明とともに用いることができるが、本発明とは異なる。“オリゴヌクレオチドを結合したナノ粒子およびそれの用途”米国特許第６，９０３，２０７号、第６，９０２，８９５号、第６，８７８，８１４号、第６，８６１，２２１号、第６，８２８，４３２号、第６，８１８，７５３号、第６，８１２，３３４号、第６，７７７，１８６号、第６，７７３，８８４号、第６，７６７，７０２号、第６，７５９，１９９号、第６，７５０，０１６号、第６，７４０，４９１号、第６，７３０，２６９号、第６，７２０，４１１号、第６，７２０，１４７号、第６，７０９，８２５号、第６，６８２，８９５号、第６，６７７，１２２号、第６，６７３，５４８号、第６，６４５，７２１号、第６，６１０，４９１号、第６，５０６，５６４号、第６，４９５，３２４号、第６，４１７，３４０号、第６，３６１，９４４号，
【００１１】
ｇ．特定のオリゴヌクレオチド配列を検出するための他のマイクロスフェア接合プローブ  アレイ：米国特許第６，８９０，７４１号、第６，８５８，３９４号、第６，９１９，２０６号。
ｈ．標的増幅のためのＰＣＲを用いる突然変異スクリーニング：米国特許第６，５２８，２６１号、第６，３４０，５６６号
ｉ．プライマー伸長法を用いる突然変異スクリーニング：米国特許第６，５３７，７４８号
ｊ．増幅した標的を用い、マイクロスフェアを用いる病原体の検出：米国特許第６，８５８，３８７号、第６，６２０，５８６号、第６，８２１，７５４号、第６，８２１，５１９号、第６，８１８，３９７号
【００１２】
上記のとおり、最少量の試料または患者検体を用いて異数性または異数染色体のドメインの配列を迅速に決定する方法が、当分野で必要とされている。さらには、現行の他法の複雑で時間のかかる工程を必要とせず、より高精度で、そのような配列を決定する方法が求められている。染色体またはゲノム核酸配列の数的異常を、プローブとのハイブリダイゼーションに先だって標的ＤＮＡの増幅を必要とせずに決定する方法がなお一層求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記に概説した問題を解消し、方法ゲノムコピー数の測定に基づいて染色体異常を同定する新規な方法を提供する。該法は、また、溶液のＤＮＡ（またはＲＮＡ）濃度の決定または核酸の複合混合物中の１または複数の転写産物のレベルの決定にも利用することができる。
本発明の方法は、一般的にいって、参照配列または標準曲線に相対的な特定の配列のコピー数を決定するための、低コピーゲノムハイブリダイゼーションプローブを用いるマイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーション試験を含む。
通常、半接合または３以上のアレル（対立遺伝子）由来の常染色体あたり２である正常なコピー数を区別しうる充分な精度が得られる。この試験は、フローサイトメトリを用いて全ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡ）の直接分析を可能し、必要に応じて、ルーチンの細胞遺伝学的分析を、多量の患者試料、付加的な採血、遺伝子座特異的増幅または時間のかかるゲノム精製方法を要求することなく行なうことができる。そのため、単一遺伝子座におけるコピー数の決定を、完全ゲノムからなる配列の複合バックグラウンド内で実施しうることは注目に値する。また、この優れた識別能は、完全トランスクリプトームのバックグラウンドに対して極僅かの転写産物のコピー数の決定に、核酸の不均一溶液中に含まれる極希薄なまたは低濃度の特定の核酸配列の検出に利用することもできる。
【発明の効果】
【００１４】
オリゴヌクレオチドプローブを用いる現行のハイブリダイゼーション試験と異なり、遺伝子座特異的標的ＤＮＡの予備増幅は必要としない。本発明に係る長めの低コピーハイブリダイゼーションプローブは、相同，唯一のゲノム標的配列の直接検出に必要な特異性を強めている。たとえば、本発明を用いて、患者のゲノム試料中のコピー数の利得または欠失を、試料ごとの各反応中のプローブ存在数に関係なく、９０分未満、好ましくは１時間未満、より好ましくは５０分未満、さらに好ましくは４５分未満、なお好ましくは４０分未満、より一層好ましくは３５分未満、さらに好ましくは３０分未満の実験操作時間で検出することができる。また、多重のコピー数変化を別々に測定するために、一のハイブリダイゼーション試験において、それぞれ別々の低コピープローブに接合されたマイクロスフェアのセットを複数組み合わせることができる。マルチ化分析は、ＦＩＳＨに比べて試験に必要な試料量を低減するだけでなく、分析時間および試験試料あたりの全費用も低減する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
好ましい態様において、本発明は、高い特異性をもつ半数体（ハプロイド）ゲノム配列中の唯一の遺伝子座にハイブリダイズするように特別に設計された低コピーまたは単一コピーのハイブリダイゼーションプローブを用いる。プローブの選択および合成方法は、米国特許第６，８２８，０９７号および係属中の米国特許出願第０９／８５４，８６７号（米国特許公開第２００５／００６４４４９号）に開示されており、そこでの教示および記載内容は引用により本願明細書に記載されているものとする。察せられるとおり、これらの初期工程は、標的およびゲノム両方の反復の配列の知識、ヒトゲノムプロジェクトおよび関連のバイオインフォマティック研究によって増加的に入手可能な情報を必要とする。さらに、必須の低コピー配列を誘導するために、入手容易なコンピュータ・ソフトウェアが用いられる。
【００１６】
好ましくは、少なくとも２種のプローブ配列が選択され、合成される。異常が、もしあるとすれば、その中に備わっているであろう特定の核酸配列を認識するための少なくとも１セットのプローブ（試験プローブ）を選択かつ合成し、また参照配列（参照プローブ）を認識するための他のプローブセットを選択かつ合成することが望ましい。低コピープローブは、少なくとも約６０塩基対で、一般に２５００塩基対以下のサイズであることが望ましい。好ましくは、該プローブは、６０ないし１０００塩基対の間、より好ましくは約８０−５００塩基対、さらに好ましくは約９０−１１０塩基対の間であることが望ましい。約１００塩基対の低コピープローブに接合されたマイクロスフェアは、輪郭のはっきりした平均蛍光分分布および安定的に第２蛍光色素平均蛍光強度値を生じ、それ故、一層明確に実際のコピー数を反映するという知見を得た。短めのプローブ接合は、また、より安定で、好ましくは暗中、約４０℃で適切に貯蔵すれば、接合から２月以上ハイブリダイゼーション反応に使用可能である。これは、標識されたマイクロスフェアの貯蔵におけるロット間での変動を少なくし、それにより接合、定量およびプローブに接合されたマイクロスフェアの品質に求められる労力を低減する結果となる。長めに接合されたプローブは、接合から２週間以内で、ハイブリダイゼーション係数の低下を示した。
【００１７】
合成の間、上記プローブは、分光的に異なるマイクロスフェアへの接合のため、個々の接合反応に応じてアミン標識を付けることができる。好ましくは、上記プローブは、マイクロスフェアがカルボン酸化を受ける改変型カルボジイミド反応（実施例１に記載）を介してマイクロスフェアに接合される。核酸をマイクロスフェアに連結する他の方法が開発されており、本発明方法の範囲にあるものとする。ＤＮＡをマイクロスフェアに接合する他の慣用法は、ストレプアチビジン（strepatividin）被覆ビーズを、５’端にビオチン部分をもつ修飾ヌクレオチドを含有するプローブに結合する。
米国特許第６３６１９４４号では、金ナノ粒子がチオール修飾核酸に接合されている。米国特許第６，４６８，５４６号、第６，８３８，２４３号、第６，８３３，２４６号、第６，８２８，１４６号、第６，８２８，１４２号では、タンパク核酸がビーズに接合されている。求電子的束縛，すなわちＮ−クロロアセトアミドヘキシルホスホルアミダイト試薬を介するオリゴヌクレオチドのマイクロスフェアへの接合も行なわれている（グザエフ（Guzaev）ら，Bioorg Med ChemLett．１９９８年１２月，１５；８（２４）：３６７１−６）。ＤＮＡは半導体ナノ結晶粒子にも接合されている（テイラー（Taylor），J.R.，ファン（Fang）, M. M.およびニー（Nie）, S. M.，Probing specific sequences on single DNA melecules with bioconugated fluorescent nanoparticles. Anal. Chem. ７２，１９７９−１９８６，２０００；W. Z.グオ（Guo），J. J.リー（Li），Y. A. ウォン（Wang），X. G. ペン（Peng），Conjugation chemistry および bioapplications of semiconductor box nanocrystals prepared via dendrimer bridging. Chem. Mater.１５，３１２５−３１３３（２００３）および米国特許第６，６３０，３０７号）。
【００１８】
好ましい態様において、マイクロスフェアは、内部的に染色された、さまざまな分光特性をもつ蛍光性ポリスチレンビーズであり、さまざまな組み合わせの低コピープローブに接合されたビーズが得られるように低コピープローブに接合され、そこでは、参照プローブが別の分光特性で示される。別々の分光特性は、フローサイトメータで認識され、別々のマイクロスフェアセットに接続したさまざまな低コピープローブとのマルチ反応を可能にする。
【００１９】
次いで、ハイブリダイゼーションのための標的核酸配列が調製される。本発明では、分析のために、ゲノム（またはトランスクリプトーム）の完全コピーをハイブリダイズできることから、他の方法と違って、該標的配列は、予め選択または増幅がされない。試料源および試料条件に応じて、細胞からＤＮＡ（またはＲＮＡ）を抽出し、必要に応じて、どの従来法を用いてもインビトロで複製することができる。好ましくは、GenomiPhiキット（キアゲン（Qiagen），カリフォルニア州バレンシア）を用いて、１ｎｇ未満の試料核酸を用い、操作時間２０分未満で、核酸をインビトロで複製する。
【００２０】
その後、ＤＮＡは、どれでもよい従来手段、好ましくはインビトロ複製の間の直接ラベリング工程により、または標識およびその標識に親和性のリポーター分子からなる間接ラベリングシステムにより標識される。核酸標的は、たとえば、蛍光色素分子、酵素複合体、またはビオチンおよびアビジン、ストレプアビジンもしくは特定の抗体によって認識される部分からなる群より選ばれる１つなどの識別標識で標識される。数種の非同位体識別標識がある。１つのタイプは、核酸標的に化学的に結合して直接同定手段として機能する標識である。この例は、適当な波長の光の照射により高エネルギー準位に励起され、蛍光を発光する蛍光色素部分である。Ｃｙ３−ｄＵＴＰなどの直接的に標識された蛍光性ヌクレオチドは、従来公知であり、本発明で使用するための標的ＤＮＡのラベリング好適な態様といえる。
【００２１】
ＤＮＡを直接ラベリングする他の方法の例としては、Ulysses法（オランダ，Kreatech）として上市されているアミノアリルラベリングも好適といえるが、そのような例では、プローブ接合マイクロスフェアへの標識された標的付加に先だって、ゲノムＤＮＡを、ハイブリダイゼーションに適したサイズに断片化しなくてはならない（ＤＮアーゼＩ，せん断，または他の酵素消化）。好ましい態様において、核酸標的は、好ましくは、ｄＵＴＰまたはｄＡＴＰなどのヌクレオチドに接合される選択（限定されないが）の識別標識を含む反応物を用いる従来の手段において、修飾または直接標識されたヌクレオチド（リグビー（Rigby）ら，J. MoL Biol.，１１３：２３７−２５１，１９７７）を用いるニックトランスレーションにより標識される。断片は、蛍光色素分子標識したヌクレオチドで直接的に標識されるか、または標識された二本鎖が後述の断片中に取り込まれる修飾ヌクレオチドを認識する蛍光標識した抗体に結合することにより間接的に標識される。
【００２２】
ニックトランスレーション（１００μＬ）は、エンドヌクレアーゼ非依存性のＤＮＡポリメラーゼＩ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals）およびＤＮアーゼＩ（ワーシントン・ケミカル（Worthington Chemical））を用いる。各断片を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（４単位／μｍＤＮＡ）、ＤＮアーゼ（０．０１−３μｍ／１００μＬ反応物）、標識されたヌクレオチド（最終的に０．０５ｍｍ）およびニックトランスレーション緩衝液と合わせた。反応を１５℃で６０分間行い、〜３００ないし１０００ｂｐサイズ幅の各種ヌクレオチドサイズのさまざまな標識されたプローブ断片を産する。別に、ビオチン−ｄＵＴＰまたはジオキシゲニン（ジオキシゲニン）−ｄＵＴＰは、インビトロ複製手順の間に取り込むことができ、得られる標識試料をＤＮアーゼＩで処理するか、または所定の他の方法でせん断して、長さ〜３００ｂｐないし１ｋｂの断片を産することができる。従来用いられている他の核酸ラベリングおよび検出方法を、本発明の方法の低コピーＤＮＡ接合したマイクロスフェアの検出に適用することができる。このようなものとしては、蛍光色素標識およびエネルギー転位基、接合したタンパク、抗体または抗原などの蛍光性組成が挙げられる。
【００２３】
ハイブリダイゼーション反応の条件は、個々のヌクレオチド組成および各低コピープローブの長さに依存し、当業者により容易に決定される。ハイブリダイゼーションのために試料配列を、低コピープローブに接合されたマイクロスフェアを含むハイブリダイゼーション緩衝液中に希釈する。プローブに接合されたマイクロスフェアの使用量は、試験される試料の量に依存する。好ましくは約５ｐｇ〜１μｇの試料、より好ましくは約２５−１００ｎｇの試料、一層好ましくは約３０−７０ｎｇ、なお好ましくは約４０−６０ｎｇの試料、特に好ましくは約５０ｎｇの試料を、ハイブリダイゼーション反応ごとに分析する。したがって、緩衝液は、ハイブリダイズされる各セットあたり、好ましくは約２，０００−１０，０００のプローブ接合マイクロスフェア、より好ましくは２，０００−６，０００のプローブ接合マイクロスフェア、さらに好ましくは約４，５００−５，５００のプローブ接合マイクロスフェア、特に好ましくは約５，０００プローブ接合マイクロスフェアを含有する。一旦希釈されたら、ハイブリダイゼーション反応物は、好ましくは約９５℃で加熱変性した後、プローブヌクレオチド組成および長さに応じた適切なハイブリダイゼーション温度、好ましくは約４５〜５１℃で一晩ハイブリダイズされる。次いで、ハイブリダイズしたマイクロスフェアを洗浄し、遠心分離してハイブリダイズされてない標的配列を除去する。
【００２４】
上清を除去し、低コピープローブ接合マイクロスフェアにハイブリダイズされた標識された試料を検出するため、ある量の修飾リポーター分子または他の適切な標識、好ましくは第２の蛍光色素として働くものでハイブリダイズ試料を染色または標識する。好ましいリポーター分子は、それぞれ、好ましい標的配列標識、ビオチンおよびジオキシゲニンを検出し、結合するフィコエリトリンで標識されたストレプトアビジンまたは抗ジオキシゲニンフルオレセインである。ハイブリダイズされ、かつ標識／染色された試料を、ハイブリダイゼーション反応に用いられる温度と同じ温度で、リポーター分子が標識された標的配列を検出し結合するに充分な時間培養する。その後、試料を洗浄して、剰余の着色付着物を除去した。試料を遠心分離し、上清を除去し、染色されたハイブリダイズ・マイクロスフェアをある量のハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁する。
【００２５】
フローサイトメトリによる分析の前に、ハイブリダイズ試料をフローサイトメータ製造会社の取扱説明にしたがって希釈することができる。好ましくは、各反応ごとに約２，０００−６，０００マイクロスフェアのセットが分析され、より好ましくは、各反応ごとに約４，５００−５，５００マイクロスフェア、特に好ましくは約５，０００マイクロスフェアのセットが分析される。しかしながら、分析される試料の量は、分析に用いられる粒子フローサイトメータによって違っていてよい。当然のことながら、フローサイトメータのための計算および操作の設定は、当業者は、多くの条件のうちから過度の実験をすることなく、特定のハイブリダイゼーション試験を測定するための最適な範囲を決定するために変更することができる。これらパラメータも、分析に用いるソフトウエアによって異なるであろう。
【００２６】
蛍光性ビーズ標準は、広く入手可能であり、フローサイトメータのさまざまな蛍光色素検出チャネルの強度を計算するために用いることができる。該装置も、蛍光性参照標準を用いて、等価の溶解性蛍光色素（ＭＥＳＦ）単位の分子において算出された表面標識されたビーズに基づいて調整することができる。前方散乱、側方散乱、流速およびさまざまな検出チャネルのための光電子倍増管電圧設定および閾値は、好ましくは、正常遺伝子型を有する患者の単一の試料にハイブリダイズされる２種のプローブの蛍光強度間の差異を最小化するように最適化されることが望ましい。
非最適電圧パラメータは容易に分かり、ブロードな蛍光ピークまたは非線形データとなり、対照的に、最適なパラメータは、好ましくは側方散乱プロットを用いて可視化される時にさまざまな分光特性をもつマイクロスフェアの高度なクラスターを作ることになる。
好ましくは、これらの設定は、誘導型蛍光測定の算術平均、幾何平均、中央値およびピークチャネルから決定される。
【００２７】
本発明の低コピープローブのほとんどは、プローブの品質が、主にそれをデザインするために用いられる配列の低コピー性に依存しているため、組成について大幅な最適化を必要としないことが分かった。
米国特許第６，８２８，０９７号に記載の低コピープローブデザインの方法は別にして、参照および試験プローブのペアは、同じ長さ、さらに可能なら、組成（具体的に、ＧおよびＣヌクレオチドのパーセンテージ）の配列に適合させることによって、各プローブのハイブリダイゼーション温度で、またはその近傍で、２次構造形成の緩和に有効となるに等しい熱安定性に最適化される。他のゲノム遺伝子座に対するパラロガスである配列は、既知の遺伝子型について確立された信頼区間を超える蛍光強度比を生じる。本発明は、厳密に他のゲノム分節と相同ではない低コピープローブの使用により、この制限を克服する。
【００２８】
次に、ハイブリダイズ試料は、ハイブリダイズプローブを同定および定量するために、フローサイトメトリ、好ましくはデュアルレーザー検出を用いて、該サイトメータが試料配列に結合したマイクロスフェアと第２蛍光色素の分光特性を同時検出することにより、分析される。コピー数の差異は  試験プローブの平均蛍光強度を二染色体の参照プローブの強度と比較することによって区別しうる。特に、その相補プローブに接合されたマイクロスフェアにハイブリダイズされた各試料配列のシグナルは、試料配列に連結した第２蛍光色素の蛍光強度を定量することによって決定される。たとえば、参照プローブは、固有の参照として働き、それにより、蛍光強度の差異に基づいて、１コピー（欠失）が２（正常）と区別でき、２コピーが、３（重複）と区別できる。適合するマイクロスフェア分光特性は、すべての結合していない第２蛍光色素（リポーター分子）の発光波長との重なりを最小化するように選択される。これは、接合もハイブリダイズもされないことを除けば同じマイクロスフェアから得られる結果との比較により確かめられる。ネガティブのコントロールも、第２蛍光色素検出チャネル中のバックグラウンド蛍光を決定するために、試料核酸を除いては全成分を含む反応管を用いて維持することができる。好ましくは、上記系は、ラン同士の間に、残留マイクロスフェアを完全に除去するため蒸留水でフラッシュ洗浄される。
【００２９】
好ましくは、本発明のハイブリダイゼーション試験におけるコピー数を測定するために幾何平均または中央蛍光値の比が用いられ、これは遺伝子型間で重なりのない全遺伝子型について、最小の信頼区間（９５％）および時差をもたらすためである。欠失を有する配列において、参照プローブ強度に対する試験プローブの幾何平均または中央蛍光値の比について予想される値は約０．５であり、これは２に対する１のゲノムコピー数差を反映する。重複（または挿入）を有する配列において、該比は、約１．５と予想され、これは２に対する３のゲノムコピー数の差を反映する。１．７超の比は、通常、配列の５以下の追加コピーのコピー数増加を示す。正常配列における該比は約１．０であることが予想され、これは、両方の遺伝子型の正常２倍体のコピー数を反映する。
【００３０】
本発明の実施において、これら予想比からの偏差は、好ましくは、該比が約８０％の信頼区間内、より好ましくは約８５％、さらに好ましくは約９０％内となるように、最小化される。好ましい態様において、これら比は、信頼区間９５％未満とはならず、かつ遺伝子型間の重なりもないであろうから、より正確なコピー数を決定することができる。欠失を反映する比は、好ましくは約０．２５−０．７５、より好ましくは約０．４０−０．６０、さらに好ましくは約０．４５−０．５５の間、特に好ましくは約０．４９−０．５１であるのがことが望ましい。挿入または重複を反映する比は、好ましくは約１．２５−１．７５、より好ましくは約１．４０−１．６０、さらに好ましくは、約１．４５−１．５５の間であり、特に好ましくは約１．４９−１．５１の間である。正常遺伝子型を反映する比は、好ましくは約０．７５−１．２５、より好ましくは約０．９０−１．１０、さらに好ましくは約０．９５−１．０５の間であり、特に好ましくは約０．９９−１．０１の間である。
【００３１】
本発明は、安定的に、２倍体参照配列と、染色体欠失（単一アレル），挿入，トリソミーまたは重複（３つのアレル）との間でのコピー数の差、ならびに５つまでの追加コピー（５つのアレル）のコピー増加数を区別することが分かった。本発明の試験は、特殊な試験配列がハプロイドゲノムあたりたった１コピーしか存在しなくても、極めて少ないコピーまたは稀少な配列を検出することができる。核酸転位の範囲は、６２ｂｐ内とすることができ、アレイＣＧＨ、サザン分析よりも著しく精確であり、かつＭＬＰＡの精確さに匹敵する。
本発明のマイクロスフェアビーズハイブリダイゼーション試験は、感度を改善し、シグナル／ノイズ比を改善し、マルチ化に容易に追従して、ハイスループット化に近づかせる。そのプローブマルチ化能力は、入手可能な試料または患者検体を保存し、診断に要する時間を低減する。さらに、異種ゲノム配列の混入は、該試験のハイブリダイゼーション係数に影響しないことが示された。したがって、上記マイクロスフェアハイブリダイゼーションの基本骨格は、いくつかの診断状況では、ＦＩＳＨ、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ），発現またはタイル化マイクロアレイ、サザン分析，マルチ増幅プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ），マルチライゲーションプローブハイブリダイゼーション（ＭＬＰＡ）および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に代わって、より適合性がある。
【００３２】
この試験は、ハイスループット適用に容易に追従する。たとえば、低コピーマイクロスフェアに接合された懸濁ハイブリダイゼーションプローブのゲノムアレイを用いて、迅速な決定および／またはそのコピー数が各個体間で本質的に不変である１または複数の保存されている参照遺伝子座に対比するコピー数の差異に基づく異常染色体配列の範囲の限定を実現可能にすることが望ましい。染色体領域に架かる稠密セットの低コピープローブのハイブリダイゼーションは、異数染色体のドメインの境界を最初にスクリーンするために用いることができる。それに続くＦＩＳＨ研究は、次にこれら遺伝子的改変について染色体コンテクストを提供する。現行の各ウェル中１０種別々に分光的符号化されたビーズのセットを用いる単一の高密度マイクロタイタープレートにおいてほぼ３８４０種の産生物を試験することができることから、ハイスループット適用を想定することができる。市販のフローサイトメータを用いて、２０ｋｂの最小プローブ感度を仮定するとき、単一のプレートが、２０Ｍｂドメインに対しデータ取得時間９０分以内で高感度のコピー数決定をもたらす。
【００３３】
本発明は、他の当分野関連技術よりも高感度かつ高精度であるため、これまで、高度に反復されたプローブか、または事前の標的増幅の必要なプローブを用いることが求められていた他の診断的応用（本明細書に記載される実施例１および２で示されるものに加え）に用いることができる。
【００３４】
本発明の一態様は、染色体不均衡の検出である。特に顕著な患者の欠失（３アレルの遺伝も同様に可能）検出の暗示は、観察されるアレルの不均衡の結果となる。すなわち、転写されるゲノム配列のハプロ不全または過剰発現が疾患の原因となるが、野生型アレル（または２：１の野生型アレルに対する突然変異体の比）の欠失により現されない一本の突然変異アレルの存在は、いくつかの異常な臨床表現型の決定要因としてまたはより重要な決定要因となるであろう。低コピー区間の賢明な選択は、これら染色体領域の不均衡を検出可能であるだけでなく、これらドメイン内で見られる突然変異またはＳＮＰの検出も可能にするであろう。ハップマップ（ハプロタイプマッピング）コンソーシアムの尽力により、詳細なゲノム位置および何百万もの集団内頻度のＳＮＰは今日入手可能である。本願の発明者のうちの者の研究に基づけば、これらのうちのいくつかはさまざまな先天性異常に明確に関連する。
【００３５】
本マイクロスフェア試験を用いて染色体の不均衡を検出するために用いられるｌｃ（低コピー）プローブは、公表されている多型配列または突然変異の位置についての予備知識に基づいて選択することができる。本試験を用いて染色体異常が検出された後、ハイブリダイズされたマイクロスフェアが回収され、接合された配列から患者由来の配列が溶出され、上記ビーズは遠心沈降された後、溶解したストランドを含む上清が後の工程に使用される。その後、この配列は直接的に分析することができ、すなわち、ハイブリダイズされたアレル（ｓ）の遺伝子型を決定するために、Taqman（Applied Biosystems）などの蛍光ＰＣＲ試験を用いるか、または分子指標試験を用いるか、または直接的に増幅および配列決定することができる。接合されたｌｃプローブにアニールされた患者の試料からなる二本鎖は、ヌクレアーゼ（たとえば、ＳｌまたはエキソヌクレアーゼＩ）を用いて平滑末端に整えることができ、その後、クリアベース（Cleavase）（サードウェーブテクノロジーズ（Third Wave Technologies））を用いて処理し、不一致部位においてＤＮＡを消化することができ、該断片をｄＨＰＬＣ（ウェーブシステム（Wave System），トランスゲノム（Transgenomic）を使用）または電気泳動により分離される。それらの長さがプローブ長さの合計となる２本のより短い断片が期待される（これは、ＳＮＰのために、現行のプローブ合成用テンプレート源であるゲノムＤＮＡの混合物由来よりもむしろ既知のホモ接合体由来のｌｃプローブへのビーズの接合を必要とする）。
【００３６】
他の選択しうる遺伝子型決定手順として、マイクロスフェアハイブリダイゼーションを用いることもでき、そこでは、回収された断片が、その後のマイクロスフェアハイブリダイゼーション試験において標的として用いられる。カルボン酸化マイクロスフェアは、ＳＮＰが配列の中間部に位置する５’アミノ標識されたプローブ（５０−７０ヌクレオチド）に連結される。これらプローブの配列は、そのＳＮＰの位置によって決定されるため、それらの配列は、低または単一のコピーである必要はない。２種のマイクロスフェアが用いられ、１つは野生型配列（参照プローブ）に連結したもの、他は変異ＳＮＰ配列（試験プローブ）を含有するものである。ハイブリダイゼーションは、標的配列の複雑性を低下するためにハイブリダイゼーション時間を１５〜３０分まで短くすることを除き、前述のとおり実施される。塩基不一致を含むプローブは、ハイブリダイゼーション後の激しい洗浄により不安定化し、解離する。正確な配列一致を含むマイクロスフェアは、より一層強い平均蛍光強度を生じるであろう。米国特許第６，３５５，４３１号および関連特許は、マイクロスフェア担持のハイブリダイゼーションを遺伝子型決定の開始に用いうることを開示するが、しかしながら、これら特許は、ハイブリダイゼーションで捕捉されるＤＮＡは、事前に標的増幅で得られたことを見越している。本発明は、ハイブリダイゼーションに先立つ標的増幅の必要性を省く。
【００３７】
少なくとも欠失の場合には、同一標識の核酸内で、ＳＮＰ（フェーズ）にしっかり連結したハプロタイプは、本試験を用いて決定することができる。ここで、突然変異（ｓ）および欠失が、現実に１の試験で検出されることは新規である。
【００３８】
本発明の他の態様は、家畜の試験に利用される。重複または欠失領域は、現在、ウシおよびヒツジのためのＰＣＲおよびｑＰＣＲ試験などの方法により試験される定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）（モンタルド（Montaldo）ら，Use of molecular markers and major genes in the genetic improvement of livestock. Animal Biotechnology Volume 1. No 2. August 15,1998,83-89）と照合することができる。そのハイスループット性により、本発明を用いるＱＴＬ欠失または重複マーカーのための本マイクロスフェア試験は、ｑＰＣＲまたはＰＣＲ試験よりも、大きな群での使用により好適である。ＱＴＬ遺伝子座の系に特異的な試験プローブは、分光学的に異なるマイクロスフェアに接合することができ、これらプローブハイブリダイゼーション効率は、家畜種の場合のＨＯＸＢｌであっても、それぞれＱＴＬ重複または欠失を示す１超または未満の識別比を目標にして、標準参照プローブと対比することができる。分析方法は、上記説明にしたがう。
【００３９】
本発明の他の態様において、本発明を用いて、トランスジェニックコアにおける迅速な配列の挿入／欠失の達成を、トランスジェニックまたはノックアウトマウス（または他の生物）を試験することができる。現行の方法としては、Nature Genes 21 ,249 -251,Modeling cancer in the mouse（１９９９）中に記載されるもののようなＰＣＲまたはｑＰＣＲなどが挙げられる。トランスジェニックまたはノックアウト配列に特異的な試験プローブ（試験プローブ）は、トランスジェニックまたはノックアウト配列（参照プローブ）に隣接するゲノム中の配列と同様に分光学的に異なるマイクロスフェアにも接合することができる。その後、トランスジェニックまたはノックアウト動物由来のゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡは、前述のとおり抽出され、標識される。ハイブリダイゼーションおよび試験の検出および参照プローブも、上記したとおりである。本試験の参照プローブに対するＭＦＩ比が１より大きければ、試験プローブ配列は、トランスジェニック動物中への挿入が達成されている。該ＭＦＩ比が０．５であれば、動物ゲノムから上記試験プローブ配列の１コピーのノックアウトまたは欠失が達成されている。試験プローブがハイブリダイズに失敗していれば、このことは、試験プローブ配列の両方のコピーが、試験されたノックアウト動物から欠失されていることを意味するであろう。
【００４０】
本発明の他の態様は、遺伝子組み換え作物の割合の検出に利用される。ＰＣＲ系の方法は、農作物中の遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）含量の定量の標準的試行の１つとなる（たとえば、チンマーマン（Zimmermann） A., ヘンマー（Hemmer） W.,  リニガー（Liniger） M.,  ルーシー（Luthy） J.,  パウリ（Pauli） U. Lebensmittel-Wissenschaft und- Technologie, ３１（７）：６６４−６６７，１９９８；スツーダー（Studer） E., ライナー（Rhyner） C, ルーシー（Luthy） J., ヒュブナー（Hubner） P. Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und -Forschung Ａ．２０７（３）：２０７−２１３，１９９８；ホルスト・ジェンセン（Holst-Jensen）, シッセル（Sissel） B. レニング（Ronning）,  Astrid Lovseth, クヌート（Knut） G. Berdal. Analytical および Bioanalytical Chemistry第３７５巻，第８号，９８５−９９３，２００３を参照）が、しかしながらこれら方法はいくつかの制限を有する。それらは、特に、感度限界（＜２％）における低レベルの混入物を含む見掛け上正の結果となる影響を受けやすく、それら方法は、見掛け上負の検出などのさまざまな結果をもたらすことがある（アームド（Ahmed） F., Trends in Biotech.２０：２１５−２２３，２００２）。
【００４１】
ＵＳＤＡが採択する現存のｑＰＣＲ試験は、１％検出閾値において特に変動的である。欧州連合がこの値を輸入農産物についての上限値に設定したため、該閾値でのＧＭＯ試験の信頼性における商業的改良は価値があろう。
特定の遺伝子組み換えに特異的な試験プローブは、分光学的に異なるマイクロスフェアに接合することができる。研究されている特定の農作物ゲノムにおいて既知コピー数の参照プローブも、分光学的に異なるマイクロスフェア接合されることが望ましい。すべての実験操作は、前述のとおりとすることができる。参照プローブに対して０．５の試験ＭＦＩ比は、遺伝子的に挿入された生物が、１コピー中に挿入されたことを示し、比１は２コピーを示し、１．５以上の比は、ＧＭＯの３以上のコピーを示すことになる。試験プローブがハイブリダイズに失敗していれば、このことは農作物ゲノム中ＧＭＯの不存在として示されよう。
【００４２】
本発明の方法を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ中の低コピー配列定量で達成される感度は、現在、ＧＭＯ含量の低レベル検出のためのＰＣＲを用いて得られるものよりもはるかによい。さらには、本発明の方法は、標的配列の増幅が不必要であることから、低レベル混入物による見掛け上正の検出となる影響を受けにくい。本発明を用いて示される低レベルコピー数の差を判別する能力に基づき、当業者は、マイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーション試験がＧＭＯ混入物のための優れた試験であると評価するであろう。
【００４３】
本発明の他の態様は、ｃＤＮＡ中またはライブラリー中の転写レベルを、基準の転写等価物または固有のハウスキーピング参照遺伝子との対比で測定する方法を提供する。ｃＤＮＡ中またはライブラリー中の特定の転写産物の存在を検出するための現行方法は、典型的に、ｑＰＣＲ（Physiol Genomics．２００３；１６（ｌ）：９０−８）またはＰＣＲ（Development．１９９２；１１６（３）：５５５−６１）を用いて、またはマイクロスフェアハイブリダイゼーション（米国特許第６，８７５，５６８号）により試験される。ＰＣＲおよびマイクロスフェアハイブリダイゼーションの現行法は、転写レベルを定量せず、単に、転写の存在または不存在を検出するに過ぎない。
本発明は、ｃＤＮＡ中の低コピーまたは稀なｍＲＮＡ配列（ハイブリダイゼーション反応あたり〜５コピー）の検出および定量を実現可能である。（注：５コピーは、異種ゲノム環境中の配列を検出する間、実施例１で実験的に決定された数である）使用した方法論は、上述した方法にしたがう。
【００４４】
本発明の他の態様は、刺激（環境的または化学的摂動）に対する応答または経過時間における転写レベルの変化の測定方法を提供する。
現行の方法は、すなわちＰＣＲ（J. Immunol.２００１年３月１５日：１６６（６）：３６６３−７１，）またはＲＴＰＣＲ（Biomaterials．２００３年７月；２４（１５）：２５６１−７３）に基づく。注目する転写に特異的なプローブは、マイクロスフェア接合することができ、その蛍光強度を、たとえばハウスキーピング遺伝子などの既知の発現レベルの転写と比較した。刺激後、転写レベルが上昇すれば、参照プローブに対するその試験のＭＦＩ比は１より大きいであろう。転写レベルが減少すれば、該比は１より小さくなるであろう。当該ハイブリダイゼーションおよび検出には、標準プロトコルが使用されるであろう。
【００４５】
本発明の他の態様として、試料中の混合細胞数内のキメラ現象またはモザイク現象を検出する方法を提供する。キメラ現象は、２つの遺伝子的に異なる接合子から誘導される細胞からなる個体または組織試料として定義される。モザイク現象は、遺伝子型または１本の接合子から誘導される染色体相補体中の異なる少なくとも２またはそれ以上の細胞株をもつ個体または組織試料として定義される。たとえば、非偽常染色体領域由来のＸまたはＹ染色体に特異的プローブを、異性（たとえば、ＸＸ対ＸＹ）または性別染色体の相補体（すなわち４５，Ｘ対４６，ＸＸ）の２つの分化した細胞株由来の細胞からなるキメラ現象，モザイク現象の検出に用いることができる。これらプローブは、モザイクでもキメラでもない参照細胞株との対比されるコピー数の差異として示されるであろう。
【００４６】
常染色体参照プローブ、たとえば、４５，Ｘ個体を用いれば、〜０．５の平均蛍光比を示し、４６，ＸＸ個体は、〜１．０の比であろう。モザイクまたはキメラ構造をもつ個体は、キメラが異性のものまたはモザイクが性別染色体の相補体からなる場合には、０．５ないし１．０の間の比をもつ。ヒトにおけるキメラ現象の例としては、子宮内二卵生双生児によるの交換；子宮内での２つの接合子が１の個体への融合；および組織または臓器移植などが挙げられる。
キメラ現象は、現在、間期ＦＩＳＨおよびある種の癌における性不一致細胞移植の場合での細胞遺伝学などの方法により（ベルナスコーニ（Bernasconi）P，カビリアーノ（Cavigliano）PM，ジェニーニ（Genini）E，アレッサンドリーノ（Alessおよびrino）EP，コロンボ（Colombo）A，クラーシ（Klersy）C，マルコバチ（Malcovati）L，ビアッジ（Biaggi）G，マルチネッリ（Martinelli）G，カラトリニ（Calatroni）S，カレサーナ（Caresana）M，ボニ（Boni）M，アストリ（Astori）C，ベルナスコーニ（Bernasconi)C，Leukemia．１９９７年１１月；１１（１１）：１９８９−９０；スミス（Smith）A，ロビンソン（Robson） LG，シャルマ（Sharma）P，シャウ（Shaw）PJ．Pathology．１９９９年２月；３１（ｌ）：２５−８；NgIO, チャン（Chan） KL, シェク（Shek） WH, リー（Lee） JM, フォン（Fong） DY, ロー（Lo） CM，ファン（Fan） ST. Hepatology.２００３年１０月；３８（４）：９８９−９８））、または妊娠の結果（オドノウ（O'Donoghue） K，チャン（Chan）J，ドラヒュント（de Ia Fuente）J，ケネア（Kennea）N，サンディソン（Sandison）A，アンダーソン（Anderson） JR，ロバート（Roberts）IA，フィスク（Fisk）NM. Lancet．２００４年７月１０−１６；３６４（９４２９）：１７９−８２) および単一細胞におけるマイクロサテライト検出などのＤＮＡ多型研究により検出される（ユ（Yu）N，クラスコール（Kruskall）MS，ユニ（Yunis）JJ，クノール（Knoll）JH，ウール（UhI）L，アロスコ（Alosco）S，オーハシ（Ohashi）M，クラヴィジョ（Clavijo）O，フセイン（Husain）Z，ユニス（Yunis）EJ，ユニス（Yunis）JJ，ユニス（Yunis）EJ. N Engl J Med. ２００２年５月１６日；３４６（２０）：１５４５−５２)。
【００４７】
モザイク現象は、ＦＩＳＨおよび細胞遺伝学的などの方法により頻繁に検出されるが、この遺伝子型の検出は、他のＤΝＡベースの方法を併用すれば可能である (ロマクス（Lomax）ら，Hum Genet. １９９４３月；９３（３）：２４３−７；クッリシュナモース（Krishnamoorthy）ら，J Perinatol.１９９５年１−２月；１５（ｌ）：４７−５０；チェン（Chen）ら，Prenat Diagn.  ２００４  Ｏｃｔ；２４（１０）：７６７−７３）。
【００４８】
本発明の他の態様において、参照配列との比較による組織または血漿中のウィルスまたはバクテリア負荷の定量が可能である。現行の方法は、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲまたはｑＰＣＲによって、単に、そのようなバクテリア性またはウィルス（vial）性混入物の存在または不存在を検出するだけである（Comp Med ２００１年１０月：５１（５）：４０６−１２. Evaluation of diagnostic methods for Helicobacter bilis infection in laboratory mice.，ホジク（Hodzic）,E ら.，Proc Natl Acad Sci U S A. ２００１年１１月２０日；９８（２４）：１３６８７−９２； J Clin Microbiol. ２００５年２月；４３（２）：７１６−２０； Arch Dermatol Res. ２００５年２月；２９６（８）：３４５−５２． Epub ２００５年１月４日； J Virol Methods.２００５年７月７日）。病原体検出のための１方法は、懸濁アレイを含む（J Microbiol Methods. ２００５年１月２４日および米国特許第６，８２１，７５４号、第６，８２１，５１９号、第６，８１８，３９７号、第６，７９０，６１１号、第６，７０９，８１２号、第６号、第６３２，６０７号、第６，６２７，１９８号）が、しかしながらこれらの各例では、ハイブリダイゼーションに先だって特定の病原体のＰＣＲ増幅を必要とする。懸濁アレイ分析を用いれば、注目するウィルスまたはバクテリアに特異的な試験プローブをマイクロスフェアに接合することがして、ＨＯＸＢｌなどの参照プローブを用いて試験することができる。
【００４９】
本発明のさらなる他の態様は、上述の方法論を用いて、ハイブリダイゼーションによる溶液中のＤＮＡ以外の核酸を含む核酸の濃度の直接的に測定することならびに既知濃度での試料との比較である。いくつかの現行の方法は、固体表面支持体に連結されたビーズへのハイブリダイゼーションに頼るＲＮＡ濃度測定（Genome Research １４：２３４７−２３５６，２００４）、ＰＣＲおよびｑＰＣＲである。結合された核酸を定量するために設計されたマイクロスフェア懸濁アレイ方法は、産生物の予備増幅を含む（米国特許第６，６２０，５８６号、第６，８１２，００５号、第６，３５５，４３１号および第６，８５８，３８７号）。
【００５０】
本発明の他の態様は、法医学的または遺伝子的な素因研究のための類似性を確立するための多型ゲノム遺伝子座におけるコピー数の差異決定を可能にする。分節重複のゲノム配列の不安定性は、ヒトゲノムでみられる。この現象は、これら重複によるフランク配置領域内でのハプロ不全または遺伝子のコピー数増加となる疾患（通常、体質的または生まれつき）の原因となる。本発明のＣＭＴｌＡ実施例は、疾患の原因となる最先の既知の実施例コピー数不安定性の１つであった。
【００５１】
いくつかの不安定な分節重複は、厳密に病原性ではない。個体（ｎ＝１１９）間でのサブセットのコピー数の差分は、ゲノム中の正常変動または多型に関連する（ヒトゲノム中の分節重複およびコピーの数変動：シャープ（Sharp）AJ，ロッケ（Locke）DP，マクグラス（McGrath）SD，チェン（Cheng）Z，ベイリ（Bailey）JA，バレント（Vallente）RU，パーツ（Pertz） LM，クラーク（Clark） RA，シュバルツ（Schwartz） S，セグレーブ（Segraves） R，オセロフ（Oseroff） VV，アルバートソン（Albertson） DG，ピンケル（Pinkel）D，アイヒラー（Eichler） EE.. Am J Hum Genet.２００５年７月；７７（ｌ）：７８−８８．２００５）。これら多型遺伝子座におけるコピー変動は、単一の数に限定されておらず、それらが、多重の始祖に別々に生じていた再発性の遺伝子的事象であるか、またはアフリカからのヒト移住よりも前に存在したことを示唆する。
【００５２】
分節重複化区間からのゲノムプローブの適切な選択により、本発明は、個体間でコピー数遺伝子型がいかに違うかを決定することができる。個体のＤＮＡ指紋鑑定は、充分に大きい数のこのように分光学的に異なるマイクロスフェアに接合されたプローブを用いてコピー数決定を行なうことにより得ることができる。これらプローブについてコピー数多型頻度は、比較的高く、これらゲノムマーカーが遺伝子的同定の法医学的適用に充分有益であろうことを示唆する。
【００５３】
これら同一の分節重複は、いくつかの個体に、減数分裂の際に配偶子転位を経させやすくする染色体構造を示す。これら個体自体は影響を受けないが、染色体立体配置の傾向をもつ領域において分節異数染色体をもつ子孫の危険性がより高くなる。他の染色体転位、たとえば相互の、ロバートソンおよびジャンピング転座、転置、同腕染色体および小マーカー染色体などは、ゲノム構成または構造に関連した転位の影響を受けやすいであろう。分節繰り返し（duplicon）、ＡＴ−リッチ回文配列（ゴッター（Gotter）AL，シャイク（Shaikh）TH，ブーダルフ（Budarf）ML，ロードス（Rhodes）CH，エマニュエル（Emanuel）BS．Hum MoI Genet．２００４年１月ｌ；１３（ｌ）：１０３−１５）および動原体周辺の繰り返しは、そのような転位切断点に配置されている。
転位の連結における組み換え産物の分析は、相同組み換えおよび非相同末端繋合の両方を明らかにする。（ショウ（Shaw）CJ およびラプスキ（Lupski）JR，Hum MoI Genet．２００４年４月１；１３スペック番号１：Ｒ５７−６４）。染色体の分節重複領域内での、またはそれに隣接するプローブの適切な選択により、どの個体が、異常子孫のリスク上昇を伴う配偶子染色体転位の高いリスクであるかどうかの決定を実現することが望ましい。
【００５４】
さらに、記載される方法を用いて、コピー数の喪失または取得を含まないゲノム転位、たとえば転置または転座などを評価することができる。逆転または転座した配列の５’または３’端に特異的なプローブは、マイクロスフェアに接合し、染色体異常を含む標識されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズされる（たとえば、慢性骨髄性白血病を生起するＡＢＬ／ＢＣＲ転座の場合におけるＡＢＬ）。
【００５５】
次に、ハイブリダイズしたマイクロスフェアを回収し、接合した配列から患者由来の配列を溶出し、ビーズを遠心沈降し、溶解したストランドを含む上清をその後の工程で用いる。回収された断片は、それに続く、隣接するが転置または転座には関与しない配列（たとえば、染色体２２上のＢＣＲ）に特異的な試験プローブを用いるマイクロスフェアハイブリダイゼーション試験における標的として用いられる。ハイブリダイゼーションおよび検出は、ハイブリダイゼーション反応が先のハイブリダイゼーション由来の試験プローブ（ＡＢＬ）と同様に、新規な試験プローブ（ＢＣＲ）を含むことを除き、上記にしたがって行なうことができる。もし、２つの試験プローブのＭＦＩ比が、ほぼ１に等しければ、それは転座または転置をうまく同定できたことを示すといえる。もし、第２の試験プローブがハイブリダイズに失敗していれば、異常はなにも検出されない。第２の試験プローブの第１の試験プローブに対するＭＦＩ比は、１より大きな比とはならないはずである。懸濁アレイを用いる従来のゲノム試験は、転座または転置の存在を検出できるものはない。
【００５６】
すなわち、本発明の好ましい一態様は、ゲノム中の標的核酸配列のコピー数の定量方法を提供する。該方法は、通常、被検対象由来の上記標的核酸配列を含む核酸を抽出する工程、該標的核酸に標識を連結する工程、該標的核酸配列を相補するために選択された微粒子接合低コピー核酸プローブを調製する工程、該プローブを上記標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション反応の産生物を形成する工程、上記微粒子の検出を介して上記産生物を同定する工程、および該産生物における上記標識の検出を介して上記標的核酸配列のコピー数を定量する工程を含む。
【００５７】
上記微粒子は、好ましくはナノ結晶粒子を含み、より好ましくは、該微粒子はナノスフェアを含み、さらに好ましくは、該微粒子はマイクロスフェアを含み、特に好ましくは、前記微粒子は、分光的に異なるポリマーマイクロスフェアからなる。
特に好ましい態様において、上記マイクロスフェアはポリスチレンからなり、より具体的には、該微粒子は、所定の固有分光特性をもつ、内部染色された蛍光性ポリスチレンビーズからなる。
ある用法において、本方法は、上記マイクロスフェア表面の生物学的部分に蛍光色素を結合する工程をさらに含む。
【００５８】
他の好ましい用法において、一般方法は、そこではマイクロスフェアがカルボン酸化されている改変型カルボジイミド反応を介して前記プローブを前記マイクロスフェアに接合すること、および束縛がＮ−クロロアセトアミドヘキシルホスホルアミダイトである求電子的束縛を用いて前記マイクロスフェアを前記プローブに接合することからなる群より選ばれる工程も含む。抽出された標的核酸は、ゲノムＤＮＡおよび相補ＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを含む。
【００５９】
ラベリングは、どのような従来の方法によっても行うことができ、たとえば識別標識を用いるニックトランスレーションを介して、インビトロ核酸複製反応、末端ラベリングおよびランダムプライミングの間に直接的に標識される。標識は、どのような従来の標識でもよく、たとえば蛍光色素分子、酵素複合体、蛍光色素分子標識したヌクレオチド、抗原担持ヌクレオチドに結合した蛍光標識した抗体、ビオチン−ｄＵＴＰ、ジオキシゲニン−ｄＵＴＰおよびそれらの組合せが挙げられる。好ましくは、上記プローブの核酸配列は、前記被検対象のゲノム中の低コピーまたは単一コピー配列に対する相補配列である。
１または複数の塩基対の欠失を含む標的核酸配列の、前記標的核酸配列の正常な相補体をもつ参照プローブとの対比における典型的な応答比は、約０．１〜約０．７５である。
１または複数の塩基対の挿入または重複を含む標的核酸配列の、前記標的核酸配列の正常な相補体をもつ参照プローブとの対比における典型的な応答比は、約１．２５〜約１．６５である。
【００６０】
本方法は、別々の核酸配列をもつマルチプローブを、１または複数の別々の分光特性をもつ微粒子に接合し、標的核酸にハイブリダイズすることを可能にすることは有利である。好ましい態様において、上記微粒子は、ビオチンまたは前記核酸プローブの３’または５’端におけるアミノ部分に結合したストレプトアビジン被覆のまたはカルボン酸化のビーズであって、径が５０ｎｍないし１μｍの間のビーズを含む。
さらに、１μｇの異種ゲノム核酸配列あたりの標的配列検出量は、５０ｐｇ〜５ｎｇの範囲内にあり、かつコピー数の差異は、最小ゲノム感度６０ｂｐで検出される。好ましくは、前記定量工程は、フローサイトメトリを用いて前記産生物の分光特性を検出する工程を含む。好ましいプローブの長さは、５０〜２５００塩基の間、より好ましくは７０〜約２５００塩基の間、さらに好ましくは６０〜約１０００塩基の間、一層好ましくは８０〜約８００塩基の間、なお好ましくは９０〜約１１０塩基の間、特に好ましくは約１００塩基である。
【００６１】
他の好ましい態様は、被検対象由来のゲノムまたは相補の核酸中の疑われる染色体異常の検出方法を提供する。
本方法は、通常、第１の分光特性を有する、分光学的にコードされた蛍光性マイクロスフェアを調製する工程、
上記異常の存在が疑われる標的核酸配列のヌクレオチドごとの配列を確認することにより標的ゲノム核酸プローブ配列を同定する工程、
同定された標的ゲノム核酸プローブ配列にしたがい低コピー標的プローブを合成する工程、
上記標的プローブを、第１の分光特性を有するマイクロスフェアに接合する工程、
既知のコピー数前記標的核酸配列をもつ参照核酸配列にハイブリダイズするために選択された参照プローブを合成する工程、
上記参照プローブを、第２の分光特性を有するマイクロスフェアに接合する工程、
上記標的プローブを、上記異常を含む染色体標的配列と反応させ、それにより該標的プローブを該標的配列にハイブリダイズさせる工程、
参照プローブを、前記染色体標的配列を含む染色体参照配列と反応させ、それにより該参照プローブを該参照配列にハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズされた標的プローブを検出し、染色体異常を確認する工程、
ハイブリダイズされた参照プローブを検出する工程、および
検出されたハイブリダイズ標的プローブの応答を、検出されたハイブリダイズ参照プローブの応答と比較することにより、検出されたハイブリダイズ標的プローブを定量する工程を含む。
【００６２】
好ましくは、前記異常は、前記ゲノムまたは相補の核酸内での配列コピー数の差異、重複、欠失、転置、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。好ましい形態において、前記方法は、最小ゲノム感度６０ｂｐでの前記異常の検出を実現する。
好ましい方法は、フローサイトメトリを用いる。好ましくは、前記低コピープローブのコピー数は、用途および標的核酸配列に応じて、１０，９，８，７，６，５，４，３，２，１または０である。
【００６３】
他の好ましい態様において、本発明は、マイクロスフェアに接合された低コピーゲノムまたは相補の核酸プローブにハイブリダイズされた標識された標的核酸配列のフローサイトメトリによる検出を介して、染色体異常の直接ゲノム定量方法を提供する。該方法は、通常、分光学的にコードされた、５０ｎｍ〜５．８μｍの径をもつ蛍光性マイクロスフェアを調製する工程、異常の存在が疑われる標的中の特定の核酸配列にハイブリダイズするために選択された低コピー標的プローブを合成する工程、該標的プローブを上記マイクロスフェアに接合する工程、標的プローブを標的核酸配列にハイブリダイズする工程、ハイブリダイズした標的プローブをフローサイトメトリにより検出する工程、および該フローサイトメトリの結果に基づいて前記異常を定量する工程を含む。
好ましくは、プローブの核酸配列は、上記定義のとおりである。このような方法は、前記ゲノムまたは相補の核酸内での配列コピー数の差異、重複、欠失、転置、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる異常の検出および定量に特に好ましい。
他の好ましい方法として、本方法は、最小ゲノム感度６０ｂｐで異常を検出することができる。
【００６４】
他の好ましい態様において、本発明は染色体異常の検出方法を提供する。該方法は、通常、分光学的にコードされたポリスチレンマイクロスフェアを合成ＤＮＡ配列に連結することによりハイブリダイゼーションプローブを調製する工程、該プローブをゲノムＤＮＡにハイブリダイズする工程、および該ハイブリダイゼーションの産生物をフローサイトメトリにより検出する工程を含む。検出しうる異常および検出感度は、上記のとおりである。この態様の好ましい形態において、上記フローサイトメトリの結果と、前記異常に対応する既知のコピー数をもつハイブリダイゼーション産生物からのフローサイトメトリの結果とを比較する付加的な工程。好ましくは、該プローブは、低コピーまたは単一のコピーある。このおよび他の好ましい態様のためのＤＮＡは、増幅しないでよいことは有利である。
【００６５】
定義
特にことわりのない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者の常識と同じ意味をもつ。すべての特許、出願、公開されている出願および他の刊行物およびジーンバンク（GenBank）からの配列および他のデータベースは、それらの全文を引用することにより本明細書に記載されているものとする。もし、このセクションで説明される定義が、本明細書で引用により記載されているものとされる出願、公開されている出願および他の刊行物およびジーンバンク（GenBank）からの配列および他のデータベース中で説明される定義と逆または相反するならば、このセクションで説明される該定義が、引用により記載されているものとされる定義に勝る。
【００６６】
本明細書において、“ａ”または“ａｎ”は、“少なくとも１”または“１または複数の”を意味する。本明細書において、“核酸（ｓ）”とは、どのような形態であってもよい、とりわけ、単一ストランド（鎖）、二本鎖、三本鎖、線状および環状形態などのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）をいう。
【００６７】
本明細書において、“参照プローブ”の語は、ゲノム中、好ましくは常染色体配列由来の遺伝子座に特異的なプローブを意味し、２以外のどのようなコピー数でも深刻なダメージを与えるか、好ましくは致死を意味する。該参照プローブは、それが患者の試料における正常な染色体相補体をもつ限り、どの低または単一のコピー染色体遺伝子座由来であってもよい。体質性疾患診断のためのゲノムコピー数の決定において、参照プローブは、通常、正常な発達の間、２つのアレルから発現することが求められる遺伝子の１または複数を起源とする常染色体であろう。腫瘍性疾患の診断のためのゲノムコピー数の決定のための参照プローブは、癌遺伝子欠乏の染色体ドメインであり、正常な染色体相補体をもつ。
【００６８】
本明細書において、“標識”とは、検出しうる物理的特性を有するどのような化学基または部分でも、または検出しうる物理的特性を示す化学基または部分を生起しうるどのような化合物、たとえば基質の検出しうる産生物への転換を触媒するすべての酵素などをいう。“標識”の語は、特定の物理的特性の発現を阻害する化合物も包含する。“標識”は、検出しうる物理的特性を有する他のメンバーとのペアの結合メンバーである化合物であってもよい。標識の例としては、巨大基、金属、蛍光性基、発光性基、化学発光性基、光学基、電荷基、極性基、着色剤、ハプテン、タンパク結合性リガンド、ヌクレオチド配列、放射性基、酵素、微粒子および組み合わせが挙げられる。
【００６９】
本明細書において、“試料”とは、分析される標的核酸を含むものであればすべてのものをいう。試料は、生物学的液体または生物学的組織などの生物学的試料であってもよい。生物学的液体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、排泄物、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水または同等物が挙げられる。生物学的組織は、細胞の凝集体であり、通常、ヒト、動物、植物、細菌性、真菌性またはウィルス的構造、たとえば神経線維、上皮、皮膚、筋肉および神経の組織などの構造的材料の１つを形成するそれらの細胞間物質を伴う特定の細胞である。生物学的組織としては、また、たとえば臓器、腫瘍、リンパ節、動脈および個体細胞（ｓ）の集合体たとえば血漿、血液または尿などから単離された個体細胞のまたは固体組織のコラーゲン化処理による個体細胞の集合体が挙げられる。
【００７０】
本明細書において、“増幅”とは、試験感度を改善するために、試料中の標的検体核酸を指数関数的に複製する方法をいう。本明細書に記載されるとおり、当技術分野において、多種の核酸増幅方法が知られている。
【００７１】
本明細書において、“セット”とは、単一のｌｃプローブまたはｌｃプローブの集合体と接合された固有の分光特性を格納しているマイクロスフェアの集積をいう。
【００７２】
本明細書において、“低コピー”または“ｌｃ”とは、ゲノム中の標的核酸または局所における１０以下の配列区間にハイブリダイズしようとする配列をいう。コピー数は、好ましくは１０以下、より好ましくは７以下、さらに好ましくは５以下および特に好ましくは３以下である。
【００７３】
本明細書において、“単一コピー”または“ｓｃ”とは、ゲノム中の標的核酸または局所における３以下の配列区間にハイブリダイズしようとする核酸配列をいう。すなわち、この用語は、２コピー体（duplicon）および３コピー体（triplicon）ならびに厳密に唯一の配列（すなわち、１に対する配列相補および対応ゲノム中の唯一の配列）を包含する。
【００７４】
本明細書において、“高度に反復された”とは、１０コピーを超える存在を意味する。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様の説明である。この実施例は、ヒトゲノム中の半接合、トリソミー、重複および挿入の検出、ならびに溶液中の核酸定量を示す。しかしながら、この実施例は、単なる説明を目的とするものであり、ここでの開示が本発明の範囲を意味するものではない。
【００７６】
（実施例１）
材料および方法
選択、連結およびマイクロスフェアに接合されたプローブのハイブリダイゼーション
プローブ選択。
５つのｌｃプローブが開発され（ローガン（Rogan）ら，２００１；クノール（Knoll）およびローガン（Rogan），２００４）、この研究において、患者の試料中のゲノムコピー数の差異を区別するために用いられた。それらは次を含む：（ｉ／ｉｉ）ＡＢＬｌのイントロンＩｂ内由来で、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者のサブセットに欠失される染色体９ｑ３４プローブ（１６−１および１６−２）、（ｉｉｉ／ｉｖ）ＣＭＴｌＡ重複領域内にあるＴＥＫＴ３およびＰＭＰ２２を認識する染色体１７ｐｌ２プローブ（イノウエ（Inoue）ら，２００１）、および（ｖ）ＨＯＸＢｌを認識する参照染色体７ｐｌ５プローブ（２倍体ゲノムあたり２コピー）。プローブ長、ハイブリダイゼーション温度およびゲノム座標を表１に示す。各プローブは、ゲノム内に確認されるプローブの全長について決定される時のもののコピー数をもっていた；しかしながら、いくつかの相同の低コピー配列は、プローブの小さな（＜２００塩基）分節（セグメント）内に確認された。
【００７７】
低コピー（ｌｃ）プローブ合成。
各ｌｃプローブ特異的ペア（２２−２４ヌクレオチド長）の１本鎖プライマーをマイクロスフェア連結用５’アミノ修飾剤Ｃ−１２（インテグレイテドＤＮＡテクノロジーズ（Integrated DNA Technologies），アイオワ州コーラルビル）を用いて合成した。Ｐｆｘ（インビトロジェン（Invitrogen），カリフォルニア州カールスバッド）を用い、ｌｃプローブ合成のテンプレートとしてコントロールのヒトゲノムＤＮＡ（プロメガ（Promega），ウィスコンシン州マディソン）を用いて各プライマーペア（修飾したものおよび未修飾のもの）とともにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。ＰＣＲ産生物は、低ＥＥＯアガロース（シーケラ（Seakera），ＦＭＣバイオプロダクト（FMC Bioproducts），メイン州ロックランド）中の電気泳動により分離し、マイクロスピンカラム遠心（キアゲン，バレンシア，カリフォルニア州）により抽出した。産生物を、分光光度計を用いて定量分析し、次いで各マイクロスフェアに連結された平均１２０，０００のＤＮＡ分子をもつマイクロスフェアに接合させた。
【００７８】
プローブのマイクロスフェアへの接合。
各別々の分光特性をもつ蛍光性マイクロスフェア（Ｒ１−Ｒ９と表記；モレキュラープローブス（Molecular Probes），オレゴン州ユージーン）であって、ほぼ２００，０００のカルボキシ部位で被覆されているものを、独立に、別々のｌｃプローブに接合した。精製されたアミノ修飾ｌｃプローブを、改変型カルボジイミド連結法（ダンバー（Dunbar）ら，２００３；フルトン（Fulton）ら，１９９７）を介してカルボン酸化マイクロスフェアに連結した。最初に、各プローブを加熱変性し、次いで氷で急冷した。同一の分光特性をもつほぼ３．１２５×１０５のマイクロスフェアを、１．５ｍＬマイクロ遠心管（ＵＳＡサイエンティフィック（USA Scientific），フロリダ州オーカラ）にピペットで取り、１０，０００ｇで２分間遠心し、上清を捨てた。１５０μＬの０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ４．５を各遠心管に加え、マイクロスフェアを軽く撹拌した後、１０，０００ｇで２分間遠心した。上清を除去し、マイクロスフェアを８０μＬの０．１ＭのＭＥＳ中に撹拌して再懸濁した。１本鎖ｌｃプローブ（０．５ｎｍｏｌ）を各遠心管に加え、撹拌混合した。１．２５μＬ容の１０ｍｇ／ｍＬｌ−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）フレッシュ溶液を加え、反応物を軽く撹拌した後、ときどきかき混ぜながら暗中で３０分間培養した。ＥＤＣの混合および培養を、各回ごとに、その都度調製された新鮮ＥＤＣ溶液１．２５μＬを用いて２回繰り返した。５００μＬの０．０２％ツイーン（Tween）２０を添加して反応を停止した後、撹拌および１０，０００ｇで２分間遠心した。上清を除去後、２５０μＬの０．１％ＳＤＳを各遠心管に加え、撹拌し、１０，０００ｇで２分間遠心した。上清を注意深く除去し、２５μＬの０．１ＭのＭＥＳ，ｐＨ４．５を加え、遠心管を撹拌した後、暗中、４０℃で貯蔵した。連結したマイクロスフェア濃度を、１μＬの各マイクロスフェアを１００ｕＬの１×ＰＢＳに添加し、以下の条件のFACSCaliburフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson），カリフォルニア州サンホセ）で分析することにより、定量分析した。
【００７９】
ゲノムＤＮＡテンプレート調製
ゲノムＤＮＡテンプレートを、臨床細胞遺伝学的分析後に残存する患者の試料またはＮＩＧＭＳ−コリエル・セル・デポジトリ（NIGMS-Coriell 細胞  Repository（ニュージャージー州カムデン）から得られる細胞株から誘導されるメタノール−酢酸で固定した細胞ペレットを用いて調製した。固定細胞は、１×ＰＢＳで２回洗浄し、その濃度を血球計を用いて決定した。ゲノムＤＮＡテンプレートを試料ごとに〜６００固定細胞から抽出した。このＤＮＡを、GenomiPhiキット（キアゲン，カリフォルニア州バレンシア）を用いてインビトロで複製し、その後、ビオチン−１６ｄＵＴＰを用いて１５０℃で６０分間ニックトランスレーションし（１μｇ）、標識された産生物３００ｂｐ〜１ｋｂの長を得た（クノール（Knoll）およびリヒター（Lichter），１９９４）。５０ｎｇのニックトランスレーションした患者の試料を各ハイブリダイゼーション試験において分析した。
【００８０】
方法を評価するために用いた試料は、ルーチンの細胞遺伝学的分析および／または蛍光インシチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に基づいて、染色体９ｑ３４および染色体１７ｐｌ２のコピー数に差異があることが分かった。これら試験試料についての細胞遺伝学的結果を表２に示す。
【００８１】
上記試料は、ＣＭＬ患者由来の５つを含み、そのうちの２つは固有染色体９；２２転座への付加に関連した染色体９ｑ３４ＡＢＬｌ欠失（１０％の患者中にみられる；シンクレア（Sinclair）ら，２０００）をもち（試料３３，８１と表記）があり、他の３つは、欠失なしの単なる染色体９；２２転座をもつものであり（試料３８，４７および８６と表記）；さらに、完全トリソミー９をもつ細胞株由来の２つ（ＧＭ０９２８６およびＧＭＬ０１８６）；染色体９ｑ３４重複をもつ細胞株由来の１つ（ＧＭ０６０７４）；そしてシャルコー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）病タイプＩＡ患者由来の５つおよび染色体１７ｐｌ２重複（４経由のＣＭＴｌＡ−Ｉ、およびＧＭ１２２１４と表記）を含む。残余の固定細胞の使用は、施設内治験審査委員会の承認をとった。
【００８２】
ハイブリダイゼーション反応。
ハイブリダイゼーション，５０ｎｇの各試料を、５，０００のｌｃプローブ連結マイクロスフェアを含有するＴＭＡＣハイブリダイゼーション緩衝液（３−ｍｏｌ／Ｌのテトラメチルアンモニウムクロライド，５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，０，ｌｇ／ＬのＮ-ドデシルサルコシン酸ナトリウム（sarkosyl））４０μＬ中に希釈した。ハイブリダイゼーション反応物は、９５℃で３分間加熱変性した後、プローブヌクレオチドの組成および長さに応じて４５℃〜５１℃で一晩ハイブリダイズした（リューイン（Lewin），１９８０）（表１）。その後、ハイブリダイズしたマイクロスフェアを２５０ｕＬの１．５×ＴＭＡＣで洗浄し（ダンバー（Dunbar）ら，２００３）、次いで、１０，０００ｇで２分間で遠心分離した。上清を除去し、ビオチン含有ゲノム標的を検出するため、１．５×ＴＭＡＣ中にリポーター分子、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＰＥ；モレキュラープローブ（Molecular Probes））を含む１：５０希釈液１２μＬを添加した。反応物をそのハイブリダイゼーション温度で１２分間培養した。ラベリング後、各反応物に２５０μＬの１．５×ＴＭＡＣを添加し、混合し、１０，０００ｇで２分間で遠心分離した。上清を除去し、ハイブリダイズしたマイクロスフェアを７０μＬの１．５×ＴＭＡＣ中に再懸濁した。
【００８３】
ハイブリダイズしたマイクロスフェア連結低コピープローブのフローサイトメトリ検出
FACSCaliburフローサイトメータでの分析に先だって、ハイブリダイゼーション反応物を３００μＬの１×ＰＢＳ中に希釈した。各反応ごとにほぼ５，０００マイクロスフェアのセットを分析した。マイクロスフェアに連結されたその相補プローブにハイブリダイズされた各標的のシグナルは、ＳＰＥ蛍光強度から決定した。フィコエリトリン（ＰＥ）の発光波長との重複を最小限にするように選択された適合するマイクロスフェア分光特性が、接合およびハイブリダイズされた同一のマイクロスフェアがないものとして得られる結果との比較により確かめられた。各反応物について、標的ＤＮＡを除く全成分を含む反応管を、ＦＬ２（ＰＥ）検出チャネル中のバックグラウンド蛍光を決定するための負のコントロールとして用いた。
【００８４】
蛍光性ビーズ標準（リニアフロー（LinearFlow）フローサイトメトリ強度計算キット；Molecular Probes）を用いてフローサイトメータの別々の蛍光色素検出チャネルの強度計算をした。機器についても、蛍光参照標準（クオンタム（Quantum）Ｒ−ＰＥ  ＭＥＳＦ培地レベルキット；バングスラボラトリー（Bangs Laboratories），インデアナ州フィッシャー）を用い、等価溶解性蛍光色素（ＭＥＳＦ）単位の分子における表面標識されたビーズに基づいて計算した。
【００８５】
正常遺伝子型の単一患者ＤＮＡ試料にハイブリダイズした２つの別々のプローブの蛍光強度間の差異が最少になる光電子倍増管電圧管設定法を選択することにより最適な光電子倍増管電圧設定法を決定した。これらの設定法は、算術平均、幾何平均、中央値およびピークチャネルの機器誘導型蛍光測定（セルクエスト（細胞Quest）；Becton Dickinson）から決定した。FACSCalibur装置のための典型的な光電子倍増管電圧設定は、ＦＳＣ（前方散乱）＝Ｅ００（シグナル増幅なし）、ＳＳＣ（側方散乱）＝３４４Ｖ，ＦＬｌ＝７２７Ｖ，ＦＬ２＝６４０Ｖ，ＦＬ３＝３００ＶおよびＦＬ４＝５００Ｖである。ＦＳＣ，ＦＬ１，ＦＬ２およびＦＬ３の閾値は、デフォルト５２Ｖで設定された。ＦＳＣ閾値は、初期パラメータとして選択され、５２Ｖの値であり、第２パラメータは、１２５Ｖの値をもつＳＳＣで設定された。流速は遅く設定され、使用したシース流体はFACsFlow（Becton Dickinson）であった。ランとランの間、系を２−５ｍＬの蒸留水でフラッシュ洗浄し、残留するマイクロスフェアをすべて除去した。細胞Questを用いてデータ集積および分析した。WinMDI２．８フローサイトメトリパッケージ（WinMDI；J．トロッター（Trotter），SaIk Institute，カリフォルニア州ラホーラ）を用いてデータ分析も行った。
【００８６】
試験したプローブのほとんどが、プローブ品質が主としてそれをデザインするために用いられた配列の低コピー性に依存するため、組成の大幅な最適化を必要としなかった。蛍光強度比は、確立された信頼区間またはパラロガスないし他の遺伝子座である配列について既知遺伝子型（データは示さず）から外れた。これは、他のゲノム部分とまったく相同ではないｌｃプローブを用いて回避された。最適化電圧設定は、側方散乱（ＳＳＣ）プロットを用いて細胞Questで視認される高度にクラスター化された別々の分光特性をもつマイクロスフェアをもたらした。非最適化電圧パラメータは、ブロードなＦＬ２ピークまたは非線形データの結果となった（バグウェル（Bagwell）ら，１９８９；ブラウン（Brown）ら，１９９４）。
【００８７】
我々は、最初に、全てのプローブがハイブリダイゼーション反応において対応のＰＣＲ産生物を得ることができ、それによってプローブ接合およびマイクロスフェアへのハイブリダイゼーションが実効となったことを確立することを示した。精製したＡＢＬｌ（１６−１，１６−２），ＴＥＫＴ３，ＰＭＰ２２およびＨＯＸＢｌ産生物を、単一の５’ビオチン化プライマーを用いて、正常ゲノムＤＮＡ（Promega）から増幅した。ビオチン化ＰＣＲ産生物を相補のマイクロスフェアに接合されたプローブにハイブリダイズし、ＳＰＥで検出した。ハイブリダイズされたクロスフェアのカウントおよび平均蛍光強度を、CellQuestソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて測定した。マイクロスフェアのセットについて、ハイブリダイズしたビーズの数（取得したビーズシグナルカウントおよび平均蛍光強度値）に対する単一のビーズの量（取得した側方散乱ビーズカウントから）の比較により、ハイブリダイズされたｌｃ産生物の密度を算出して、カルボジイミド連結手順の接合係数を決定した。
その標的配列に対するマイクロスフェア接合ｌｃプローブの特異性は、同種の独立したハイブリダイゼーション試験のフローサイトメトリ繰り返しラン数の平均蛍光強度を異種プローブに対して比較することによって決定された。各プローブのハイブリダイゼーションは、アニーリング温度（４５℃〜６０℃）の範囲にわたり最適化された。
【００８８】
プローブ特異性および感度の検証
ゲノム再構築実験。
複合ゲノム環境中のｌｃプローブの特異性試験のため、ｌｃプローブ連結マイクロスフェアを、それに対応する精製ＰＣＲ産生物に、過剰せん断した仔ウシ胸腺ＤＮＡ（アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences），ニュージャージー州ピスカタウェイ）の存在下でハイブリダイズした。１６−１ａ，１６−２ａおよびＨＯＸＢ１ａについて別々のハイブリダイゼーション反応を実施し、各プローブについて１０，０００マイクロスフェア、５ｎｇの対応ＰＣＲ産生物および５０ｎｇのニックトランスレーションした仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡを用いて行なった。ハイブリダイズ産生物の検出下限値を見積もるため、ＰＣＲ産生物（ハイブリダイゼーション反応あたり５−１５０ゲノム等価）の希釈系列を、１０ｎｇのせん断した仔ウシ胸腺ＤＮＡに、ＰＣＲ産生物：仔ウシ胸腺ＤＮＡのモル比〜１：３００ないし１：１０の範囲で加えた。
【００８９】
１６−１ａ，１６−２ａおよびＨＯＸＢｌａについてｌｃプローブ接合したマイクロスフェアと、５ｎｇの各対応するＰＣＲ産生物とを用いて、１０ｎｇのせん断した仔ウシ胸腺ゲノムＤＮＡの存在または不存在下で、マルチハイブリダイゼーションも実施した。付加的に、マイクロスフェア交換実験を実施した。そこでは、ｌｃプローブ１６−ｌａを別々の分光特性（Ｒ２およびＲ９）をもつ２つのマイクロスフェアセットに接合し、マルチ反応において、対応するＰＣＲ産生物にハイブリダイズし、平均蛍光強度レベルを、各マイクロスフェアセットのものと比較した。
【００９０】
ＭＡＴＬＡＢ（マスワークス（Mathworks），マサチューセッツ州ナティック）を用いて統計解析を行なった。試験プローブおよび参照プローブ間の平均蛍光比は、テキスト（コーダー（Coder）ら，１９９４）中の算術平均を用いて報告される。残りは、平均蛍光比およびピークチャネル値を、公知の遺伝子型に基づいて、期待値に対してフィッティングすることにより計算した。
【００９１】
結果
本ハイブリダイゼーション試験の特異性
マイクロスフェアに連結されたｌｃプローブに相同するＰＣＲ産生物は、ハイブリダイゼーション反応における標的ＤＮＡとして用い、カルボジイミド連結手順のラベリング係数を試験した。
バックグラウンド蛍光（＞１０1）より大きいＳＰＥ平均シグナル（ＦＬ２チャネル中）と、反応中に存在するＰＣＲ産生物にハイブリダイズしたマイクロスフェアの数に基づけば、９８％（＋／−０．４％）の該マイクロスフェアが標的ＰＣＲ産生物にハイブリダイズしていた（データは示さず）。
【００９２】
ゲノム再構築実験は、ｌｃプローブ１６−１，１６−２ａおよびＴＥＫＴ３が、仔ウシ（Bos taurus）ゲノム中のどの配列とも相同（＞７５％）ではないことを確認した。配列分析に基づけば、Bos taurusゲノムは、プローブ１６−１，１６−２，ＴＥＫＴ３およびＰＭＰ２２に密接に関連する配列を含むはずである。バックグラウンドよりも低いレベルの平均蛍光強度がこれらＳＰＥシグナルについて安定的に観察される。これに対して、ＨＯＸＢｌａは、１つのハイブリダイゼーション試験において、１２．８１の平均蛍光強度を示したが、このプローブは、Bos taurusゲノム中のＨＯＸＢｌ配列と９０％相同であることからこれは期待されたものであった。
【００９３】
相同配列の検出された接合ｌｃプローブ１６−１ａおよび１６−２ａは、異種ゲノムバックグラウンド中に播種された。検出の感度は、産生物濃度に伴うＳＰＥ平均蛍光強度の上昇に基づいて、プローブ存在量に線状的に相関していた（データは示さず）。マイクロスフェア交換実験は、これら結果がマイクロスフェアの分光特性と無関係であったことを示した。同じプローブに接合した各種マイクロスフェア強度についての平均ハイブリダイゼーション・シグナル強度は、極めて近似したシグナル強度値をもたらした。たとえば、試料４７について、マイクロスフェアＲ２に接合したプローブ１６−１ａのマルチハイブリダイゼーションは、３２．８の平均蛍光強度を生じ、マイクロスフェアＲ９は、平均蛍光シグナル３２．０２で、〜２％の差であった。試料３３では、これと同じプローブの平均蛍光は、別々の分光特性をもつマイクロスフェアについて、〜１３％（４１．８８対３６．１６）で変動した。
【００９４】
プローブ長さの最適化
各種長さのプローブを、マイクロスフェアに接合し、ハイブリダイゼーションシグナルにおけるプローブ長さの効果を試験した。プローブ１６−２のサブセットであるＬｃプローブ１６−２ａ（１３８１塩基）および１６−２ｂ（１０１塩基）を、分光学的に異なるマイクロスフェアの表面に連結し、試料４７（１６−２遺伝子座に正常遺伝子型をもつ）に対する単一のハイブリダイゼーション反応においてマルチ化した。驚いたことに、短い方の１６−２ｂプローブのＨＯＸＢｌｃに対する平均蛍光シグナル比は、対応する１６−２ａ比のほぼ倍であった。染色体９欠失患者（試料３３）由来のＤＮＡを用いるマルチ実験は、１６−２ａおよび１６−２ｂプローブが、ＨＯＸＢｌｃ参照よりもそれぞれ低めのシグナル−５２％および６６％をもつことを示した。欠失患者は、ＨＯＸＢｌｃに比べて１６−２のコピー数は半分であることから、短い方の１６−２ｂプローブを用いて得られたシグナルがこれら個体中の実際のコピー数をより正解に反映することを示す。
【００９５】
マイクロスフェアに接合したプローブ１６−１（１６−ｌａ［２３０４ｂｐ］および１６−ｌｂ［１００ｂｐ］）のサブセットを用いて、対応するＰＣＲ産生物およびコントロールのゲノムＤＮＡに独立にハイブリダイズしたとき、同様の結果を得た。両プローブはＰＣＲ産生物およびコントロールのゲノムＤＮＡの両方へのハイブリダイズに成功したが、しかしながら１６−１ａ反応についてのＳＰＥ蛍光分布は、１６−ｌｂについてのものよりかなり広かった。我々は、短めのプローブ（〜１００塩基）に接合されたマイクロスフェアが、輪郭のはっきりした平均蛍光分布および安定的に高めのＰＥ値を生じることを見出した。これら接合は、調製の２週間以内にハイブリダイゼーション係数の低下を示す長めの接合プローブと異なり、接合から２月間、４０℃で暗中貯蔵した場合、ハイブリダイゼーション反応に用いることもできる。
【００９６】
短めのオリゴヌクレオチドプローブ（ＨＯＸＢｌｅおよび１６−ｌｃ）は、既知試料遺伝子型を解析するために充分であることを証明した。このようなプローブは、参照プローブＭＦＩ比に対し、コピー数を区別できる試験を創作する。たとえば、トリソミー９細胞株，ＧＭ０９２８６由来のＤＮＡは、試験プローブ１６−ｌｃ（６２塩基）および参照プローブＨＯＸＢｌｅ（６２塩基）とハイブリダイズすれば、１．２８のＭＦＩ比を得る。このＭＦＩ比は、１６−ｌｃ配列の３コピーの存在に一致する。
【００９７】
９ｑ３４欠失をもつ試料における低減されたゲノムコピー数の検出
染色体９ｑ３４欠失の遺伝子型と、正常なコントロール試料とは、蛍光強度の比較に基づいて区別可能であった。盲検では、１６−２ｂおよびＨＯＸＢｌｃに接合されたマイクロスフェアは、別々の反応において、試料３３および試料４７ゲノムＤＮＡにハイブリダイズした（図３）。図３に示すヒストグラム中、蛍光強度シグナル（ＦＬ２フィコエリトリン，ｘ軸）対マイクロスフェアのカウント（ｙ軸）を、各試料の試験プローブおよび参照プローブについてプロットした。１６−２ｂプローブのＨＯＸＢｌｃ参照プローブに対する平均蛍光の比（表２）は、試料３３（比＝０．６７）中の１６−２ｂについて、この遺伝子座の１コピー欠失に一致する低めのコピー数を示し、これは先にプローブ１６−２ａを用いるｓｃＦＩＳＨで示された。同様のシグナル強度は、試料４７（比＝０．９６）中の両方のプローブについて、正常遺伝子型に一致することが分かった。試料３３および８１中のプローブ１６−１ｂのＨＯＸＢｌｃに対する平均蛍光比もまた、両方の患者における１６−１ａの１コピー欠失を示すＦＩＳＨ結果に一致する。
【００９８】
次に、試料３３および３８は、別々のマルチ反応において、プローブ１６−ｌｂ，１６−２ｂおよびＨＯＸＢｌｃとハイブリダイズされる。ＨＯＸＢｌｃプローブに関連して、試料３３は、１６−ｌｂについて６１％および１６−２ｂについて５１％の平均蛍光を示した。試料３８ハイブリダイゼーションは、同様のＨＯＸＢｌｃおよび１６−ｌｂ（８７％）および１６−２ｂ（８９％）平均蛍光レベルを示した。これら結果は、試料３３がＡＢＬｌについて半接合欠失であり、試料３８はそうでないことを示すＦＩＳＨデータに一致する。
【００９９】
５’ＡＢＬｌ欠失をもつ試料および欠失のない試料について、１６−１のＨＯＸＢｌに対するシグナル強度および１６−２のＨＯＸＢｌに対するシグナル強度の比を図２にグラフで示す。図２中、試料は、試験プローブにより群分けされている（ｙ軸）。各異なる遺伝子型群（左＝染色体欠失，中央＝正常，右＝染色体重複）を枠（破線）で囲む。縦軸は、各遺伝子型（欠失，正常および重複化試料のそれぞれについて、０．５，１．０および１．５）の理論ＭＦＩ比を示す。図に示されるとおり、各遺伝子型における全試料のＭＦＩ比は、他の遺伝子型と重ならない。一般に、二染色体の相補体を用いて試験したすべての試料は、プローブ由来の１６−１または１６−２のＨＯＸＢｌ平均蛍光強度に対する比が１に近い比をもち、また５’ＡＢＬｌ欠失をもつそれらの試料は、０．５に近い比をもつ（表５）。幾何平均および中央値は、これら数的指標が研究されたすべての遺伝子型について期待される比に対する回帰における最小の時差分散（０．１０）をもつことから、本ハイブリダイゼーション試験におけるシグナルについて、蛍光強度のもっとも精確な測定値をもたらす。
【０１００】
三染色体性９細胞株における染色体９ｑ３４の増加コピー数の検出
３アレルのコピー数を２アレルのコピー数と区別することができるかを決定するため、プローブ１６−ｌｂを、９ｑ３４について三染色体性の細胞株由来のＤＮＡにハイブリダイズし、この領域について二染色体である試料４７と比較した（表２）。ＨＯＸＢｌｃおよび１６−ｌｂの両方とも、単一のハイブリダイゼーション反応においてマルチ化させた。細胞株ＧＭ０９２８６（比＝１．３４），ＧＭ１０１８６（比＝１．４０）およびＧＭ０６０７４（比＝１．２６）は、各、１６−ｌｂについてＨＯＸＢｌｃに対し、著しく高い平均蛍光を示す一方、試料４７について、両方のプローブは同等の平均蛍光シグナル（比＝０．９６）を示した。期待値の比１．５からの偏差は、ｌｃプローブ１６−ｌｂの安定性すなわち低グアニン−シトシン（ＧＣ）含量によるか、または試験したゲノム領域のほとんどマイクロスフェア結合していない標的に帰結する２次構造によるであろうと、我々は考える。本試験は、すべての３細胞株における染色体９ｑ３４配列の追加コピーおよび試料４７における配列の正常コピー数を示す先の細胞遺伝学的およびＦＩＳＨの結果を確認する（表５）。
【０１０１】
ＣＭＴｌＡ患者における染色体１７ｐｌ２領域の増加コピー数の検出
ＦＩＳＨ確認した染色体１７ｐｌ２重複をもつ５人のＣＭＴｌＡ患者およびこの染色体領域における正常な核型をもつ試料８６由来のゲノムＤＮＡを、マイクロスフェアに接合されたＴＥＫＴ３またはＰＭＰ２２およびＨＯＸＢｌｃのｌｃプローブとハイブリダイズした。すべてのＣＭＴｌＡ患者の試料は、ＴＥＫＴ３へのハイブリダイゼーションについて、平均蛍光強度シグナルにおいて同様な高さを表し（ＨＯＸＢｌｃよりも２８−４０％高い範囲）、この遺伝子座の３コピーの存在を反映している（図３）。試料８６は、２つのプローブについて、平均蛍光シグナル強度において僅かに２％の差を示した（表２）。ＰＭＰ２２およびＨＯＸＢｌで試験された同じＣＭＴｌＡ試料のマルチ分析について、同様の結果が観察された（ＨＯＸＢｌｃを上回る２８．５〜５４％の範囲；表２参照）。ＣＭＴｌＡ−１およびＣＭＴｌＡ−２にハイブリダイズしたマイクロスフェア連結のＴＥＫＴ３およびＨＯＸＢｌを用いた独立のマルチハイブリダイゼーションは、これら結果が再現可能で、ＣＭＴｌＡ−２について２％未満、ＣＭＴｌＡ−１について１６％の平均蛍光強度比の変動を生じることを示した（表２）。これら比は、１７ｐｌ２重複含有試料について、期待値１．５の周辺を示す（１．２６−１．８５）（図２）（表５）。
【０１０２】
幾何平均のまたは中央の蛍光比は、遺伝子型間で重複のないすべての遺伝子型について最小の信頼区間および時差をもたらすためであるため、ハイブリダイゼーション試験として最善の測定であることが分かった（図２）。全遺伝子型にわたる期待比に対する各比カテゴリーについてのデータのマルチ直線回帰は、算術平均で０．８６、幾何平均および中央値で０．８９，およびピークチャネル比で０．４２の相関係数をもたらす。参照試料強度に対する試験の幾何平均蛍光比に対する９５％信頼区間は、正常２倍体遺伝子型をもつ被検体について０．９７〜１．０３であり、半接合欠失は０．５〜０．６４であり、重複は１．４４〜１．５６であった。算術平均は、僅かに大きい信頼区間（時差分散＝０．１３）、ピークチャネル蛍光は、いくつかのハイブリダイゼーション反応が、コピー数の次善の測定法であることがわかった。これら遺伝子型についてかなり大きめの時差を生じたためである。
【０１０３】
盲検において、２２コードのゲノム試料（２０の正常な患者および先に確認した重複をもつ２人のＣＭＴｌＡ患者の試料）からなる３組の反応は、ＴＥＫＴ３およびＨＯＸＢｌｃプローブｓにハイブリダイズされた。これら試料の各の３組のランについての再現性は優れており、ＭＦＩ比の分散は、６．５×１０−６〜１×１０−３の範囲であった。ＣＭＴｌＡ重複をもつ患者の試料は、これら群について、それぞれのＴＥＫＴ３：ＨＯＸＢｌｃハイブリダイゼーションＭＦＩ比に基づいて、正常なコントロールと容易に区別できた（表５中に要約）。これらは、我々の非盲検分析（図２）におけるこれら遺伝子型間に重複のないことを示す我々の先の結果に一致する。
【０１０４】
特徴的なコピー数遺伝子型
ＭＦＩ比は、その遺伝子座が分析されたかどうかにかかわらず、ゲノムコピー数を決定するための強い測定基準である。参照プローブＭＦＩ比に対する標準試験は、本研究におけるすべての正常な個体において、１．０±０．０６（ｎ＝２１）であった（表２）。該比は、半接合欠失をもつすべての試料では０．５７±０．０８（ｎ＝８）であり、３アレルの試料では１．５０±０．１５（ｎ＝２６）であった。いくつかのプローブは、多少はずれるＭＦＩ比を示したが、異常はすべてのｌｃプローブについて９５％信頼レベルで正常遺伝子型と明確に区別でき、正常は、欠失された遺伝子型に対して９８％信頼レベルで明確に区別できた。
【０１０５】
検討
合成ＤＮＡ配列に連結された、分光学的にコードされたポリスチレンマイクロスフェアの懸濁は、ゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、従来型のフローサイトメトリ装置で検出することができる。この試みは、単一のヌクレオチド多型のハイスループット遺伝子型決定を容易にしている（ビニャリ（Vignali），２０００）。しかしながら、従来技術の方法論は、該標的ＤＮＡを、マイクロスフェアに連結される１０−５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするに先立って、標的ＤＮＡの増幅を必要とする（ハド（Hadd）ら，２００４；Rockenbauerら，２００５）。オリゴヌクレオチドプローブは、感度および特異性が不充分であるため、患者のＤＮＡ試料に直接的に由来するゲノムコピー数を正確に定量できない（アーリー（Earley）ら，２００２；セカー（Sekar）ら，２００５；ビニャリ（Vignali），２０００）。標的配列のコピー数概算も、必須の増幅工程が、本質的に指数関数的であるため、制御困難であるという事実により複雑である。ゲノムコピー数は、直接的に標識されたゲノムＤＮＡを予備増幅なしでハイブリダイズすれば、明確に決定することができる（サザン（southern），１９７５；ホワイト（White）ら，２００４）。
【０１０６】
我々は、患者由来のＤＮＡをマイクロスフェアに連結した長めのプローブに直接ハイブリダイゼーションすることが、コピー数の定量的測定可能かの可能性を試験した（図１）。この図の工程１）において、各ｌｃプローブを、アミノ修飾フォーワードプライマーを用いるＰＣＲにより合成し、分光学的に異なるカルボン酸化マイクロスフェアに接合した。工程２）において、試料ＤＮＡを固定された細胞遺伝学的細胞ペレットから抽出し、ニックトランスレーションしてビオチンｄＵＴＰを組み込む。工程３）は、ｌｃプローブ連結したマイクロスフェアを、上記調製されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＰＥ）で染色し、洗浄して残留ＳＰＥを除去する。工程４）において、別々の分光特性をもつマイクロスフェアを検出し、工程５）における各マイクロスフェアに連結したプローブにより結合した標的の定量のため、試料をフローサイトメータ（デュアルレーザー検出）にかける。
【０１０７】
先に、我々は、多種の染色体領域について、蛍光インシチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による多種多様な染色体異常を検出するため、コンピュータで導出した低コピー（ｌｃ）プローブの正当性を立証した（クノール（Knoll）およびローガン（Rogan），２００３；ローガン（Rogan）ら，２００１）。この研究において、我々は、異数染色体の状態に付随する３種の染色体領域由来のｌｃプローブを用いるマイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーションを開発し、アーカイブの、メタノール−酢酸固定された細胞遺伝学的被検体におけるコピー数取得または喪失を検出するためのこの方法の使用を示した。
【０１０８】
本発明を用いて、低コピー（ｌｃ）ゲノムプローブを利用する、ゲノムコピー数の差異を検出するためのマイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーション試験が開発された。ｌｃプローブが、高度に特異性をもつハプロイドゲノム配列中の唯一の遺伝子座にハイブリダイズするために設計されているため、遺伝子座特異的標的ＤＮＡの予備増幅は要求されなかった。低コピー配列の喪失または取得は、患者ゲノムＤＮＡ中で直接的に検出することができる。この試験は、多量の患者の試料、追加の採血、遺伝子座特異的ゲノム増幅または時間を消耗するゲノムＤＮＡ精製方法を必要とすることなく、ルーチンの細胞遺伝学的分析に準ずることができる。
これら研究は、細胞遺伝学的分析後に残存する固定化細胞調製物を用いて実施された。
【０１０９】
ハイブリダイゼーション実験は、ゲノム配列の２対３コピーと同様に、１対２コピーの存在を認めるに足りる充分な感度を示した。別々の分光特性をもつマイクロスフェアに接合された別々のマルチｌｃプローブの使用は、同一のハイブリダイゼーション試験において、コピー数変化を別々に測定することができる。染色体欠失は、２人のＣＭＬ患者において、ＡＢＬ１遺伝子中に確認され、染色体９ｑ３４のトリソミーが３つの培養細胞株中で確認され、染色体１７ｐｌ２の重複が、１の細胞株を含む５人のＣＭＴｌＡ患者の細胞中で確認された。
半接合（hemizyogous）染色体９ｑ３４欠失を検出するために使用された同一のプローブは、この遺伝子座でトリソミーをもつ細胞株において、３アレルも検出した。プローブ平均または中央蛍光強度の比は、同一の遺伝子型をもつ患者のものと一致し、試験プローブの染色体起源と無関係に期待値の周辺値であった。
【０１１０】
いくつかのパラメータが試験開発中に最適化された：（ｉ）マイクロスフェアに接合されたｌｃプローブは、異種複合ゲノム環境で試験した時、相同配列に特異性を示し、すなわち１ｕｇの異種ゲノム配列中の５ｎｇ程度の標的配列の存在が現実的に検出された。；（ｉｉ）別々の分光特性をもつマイクロスフェアセットに接合されたｌｃプローブの示す平均蛍光強度は、マイクロスフェアがプローブに接合されたことに関係なく無視しうる差異であった。；（ｉｉｉ）マイクロスフェア表面に連結されたｌｃプローブの長さは、長めのプローブ（１〜２ｋｂ）より大きな平均蛍光強度を示す短めのプローブ（〜１００ｂｐ）を用いるハイブリダイゼーション係数に影響を及ぼした。短めのプローブは、より安定であり（より長い寿命）、結果として、標識されたマイクロスフェアの貯蔵におけるロットごとの変動が少ないとともに（ｉｖ）これは、換言すれば、接合、定量およびＤＮＡ結合マイクロスフェアの品質の要件を低減する。
【０１１１】
（実施例２）
この実施例は、染色体１５ｑ１１−１３上のプラダーウィリ（Prader−Willi）症候群（ＰＷＳ）およびアンジェルマン（Angelman）症候群（ＡＳ）領域を試験するための定量的マイクロスフェアハイブリダイゼーションの臨床適用を記述する。
ＰＷＳ／ＡＳ領域の〜３．２Ｍｂをスパニングする１７の低コピーおよび単一コピー試験プローブ（各８０ヌクレオチド）および二染色体の参照プローブ（ＨＱＸＢｌ，染色体１７ｑ２１）を、各、１０レベルの分光学的に異なるポリスチレンマイクロスフェアの１つに接合した。すべてのプローブを、マルチＱＭＨ反応において、ビオチン標識されたゲノム患者ＤＮＡにハイブリダイズし、フィコエリトリン−標識されたストレプトアビジンを用いてハイブリダイゼーションを検出し、デュアルレーザー・フローサイトメトリを用いて分析した。コピー数の差は、試験プローブの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を参照プローブに対比することで区別された。正常遺伝子座についてのＭＦＩ比が０．９８±０．０７５（ｎ＝１８６）であったのに対し、欠失された遺伝子座についての該ＭＦＩ比は、０．５８±０．０７２（ｎ＝８０）であった。
【０１１２】
染色体１５ｑ１１−１３のゲノム転位は、プラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）およびアンジェルマン症候群（ＡＳ）などのさまざまな表現型を引き起こす。この染色体領域は、ゲノム刷り込みに依存し、低コピー反復要素（ｒｅｆ）の複合組み合わせにより特徴づけられる。ＰＷＳおよびＡＳは、典型的に、父方または母方の染色体１５ｑ１１−１３領域中の〜４Ｍｂ欠失に起因し（ニコール（Nichols），１９９８）、それぞれ、欠失患者（クラスＩおよびＩＩ）の分類を可能にする２つの近接部位（ＢＰｌおよびＢＰ２）および１つの遠位部位（ＢＰ３）のどちらかにおけるクラスター化された切断点（ＢＰ）をもつ（クノール（Knoll）ら, １９９０）。クラスＩの欠失患者は、ＢＰｌをｂｐ３にスパニングする領域について欠失され、クラスＩＩの欠失患者は、ＢＰ２をｂｐ３にスパニングする領域について欠失されている（クノール（Knoll），１９９０）。付加的に、この領域における二分刷り込み中央（ＩＣ）内の突然変異は、どちらかの疾患を引き起こし得る。このＩＣの１つの領域は、父方または母方の刷り込みを確立し、維持するのに必要とされ、研究は、ＰＷＳ−ＩＣ（ＰＷＳ−ＳＲＯ）およびＡＳ−ＩＣ（ＡＳ−ＳＲＯ）を定義する、重なりの最短領域（ＳＲＯ）を確認している（メイペンダノ（Mapendano）ら，２００６）。さらに、ＰＷＳおよびＡＳの両方とも、ＰＷＳ患者における母方の起源（母方のダイソミー）またはＡＳ患者における父方の起源（父方のダイソミー）である染色体１５の片方の親ダイソミー（ＵＰＤ）から生じる。
【０１１３】
材料および方法
プローブ選択、合成およびマイクロスフェア接合。
染色体１５ｑ１１−１３に特異的な１７種一連の試験ｌｃプローブとともに、染色体１７ｑ２１上のＨＯＸＢｌ由来の二染色体の参照プローブを設計した。プローブの各は、表３に示すとおり８０塩基長さであった。各プローブの全長８０塩基にマッチするゲノムは唯一であった；しかし、プローブの小分節は、他のゲノム領域とマッチしてもよい。
【０１１４】
プローブは、それらの低コピー配列組成、ＧＣ含量（４８−５５％）、ＭＦｏＩｄソフトウエア（レンセリア総合技術研究所（Rensselaer  Polytechnic  Institute），ニューヨーク州トロイ，レンセリアとウォズワースのバイオインフォマティックセンター（The Bioinformatics Center）を介して入手可能、）により予測されるようなポテンシャルの安定な二次配列立体配座の欠乏およびその長さ（８０ヌクレオチド）に基づいて選択した。各プローブを、カルボン酸化マイクロスフェアに連結するための５’−Ｃ６−アミノ標識されたフォーワードプライマー（Integrated DNA Thechnologies，アイオワ州コーラルビル）と、テンプレートとして正常なヒトゲノムコントロールＤＮＡ（Promega）を用いるＰＣＲ（Promega RedTaq Ready Mix，ウィスコンシン州マディソン）による未修飾リバースプライマーとを用いて合成した。ＰＣＲ産生物をゲル電気泳動（Seakem；ＦＭＣ Bioproducts，メイン州ロックランド）で分離し、マイクロスピンカラム遠心分離（QiaQuik；キアゲン，カリフォルニア州バレンシア）で抽出した。プローブを、カルボジイミド連結反応（Dunbarら２００３；Fultonら１９９７）を介して、分光学的に異なる１０種のマイクロスフェア（CytoPlex；Duke Scientific，カリフォルニア州パロアルト）の１つに接合した。
【０１１５】
各プローブを、まず加熱変性した後、氷で急冷した。ほぼ３．１２５×１０5の同一の分光特性をもつマイクロスフェアを、１．５ｍＬマイクロ遠心管（USA  Scientific，フロリダ州オーカラ）にピペットで移し、１０，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を排除した。０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）１５０μＬ（ｐＨ４．５）を各遠心管に加え、マイクロスフェアを軽くかき混ぜた後、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、マイクロスフェアを０．１ＭのＭＥＳ８０μＬ中にかき混ぜながら再懸濁した。単一のｌｃプローブ（０．５ｎｍｏｌ）を各遠心管に加え、かき混ぜて混合した。１．２５μＬ容量の１０ｍｇ／ｍＬのｌ−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）フレッシュ溶液を添加し、反応液を軽くかき混ぜ、暗中、３０分間ときどき混合しながら培養した。毎回１．２５μＬの調製したてのＥＤＣ溶液を用いて、ＥＤＣの混合および培養を２回繰り返した。５００μＬの０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加して反応を停止した後、撹拌し、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。上清を除去した後，２５０μＬの０．１％ＳＤＳを各遠心管に添加し、撹拌した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、２５μＬの０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ４．５）を添加し、試験管をかき混ぜ、暗中、４℃で貯蔵した。
１μＬの各マイクロスフェアを１×ＰＢＳ１００μＬ中に加え、FACSCaliburフローサイトメータ（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson），カリフォルニア州サンホセ）を用いて以下の条件で分析することにより連結したマイクロスフェア濃度を定量分析した。
【０１１６】
各マイクロスフェアに接合されたプローブの品質管理手順を、マイクロスフェアへのプローブの適切な連結を確かめるために実施した。まず、すべてのプローブは、ハイブリダイゼーション反応における対応するＰＣＲ産生物を検出することができ、プローブのマイクロスフェアへの接合およびハイブリダイゼーションが有効であったことを確立することが決定された。この研究で利用されたＱＭＨプローブの各に特異的な精製したＰＣＲ産生物（表３）を、正常なゲノムＤＮＡ（Promega）から、単一の５’ビオチン化プライマーを用いて増幅した。ビオチン化ＰＣＲ産生物を、相補のマイクロスフェア接合プローブにハイブリダイズし、ＳＰＥで検出した。ハイブリダイズしたマイクロスフェアのカウントおよび平均蛍光強度を、CellQuestソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて測定した。マイクロスフェア１セットあたりのハイブリダイズしたｌｃ産生物の密度を、単一ビーズ（ゲート側方散乱ビーズカウントから）の量を、ハイブリダイズしたビーズ（ゲートのビーズシグナルカウントおよび平均蛍光強度レベル）の数に対する比較により概算した。それはカルボジイミド連結方法の接合係数を決定した。
マイクロスフェアに接合されたｌｃプローブのその標的配列への特異性を、別々のハイブリダイゼーション試験のフローサイトメトリの反復数の平均蛍光強度を、相同対異種プローブで比較することにより決定した。各プローブのハイブリダイゼーションは、アニーリング温度（４５℃〜６０℃）の範囲にわたり最適化された。
【０１１７】
さらに、ＭＦＩ値が接合に用いられるマイクロスフェアのレベルと無関係であることを実証するため、マイクロスフェア交換実験を行なった。その詳細は既報（ニューカーク（Newkirk）ら，２００６）のとおり。このような実験は、別々の分光特性（Ｌ２およびＬ９）をもつ２つのマイクロスフェアセットに接合したｌｃプローブＤ１５Ｓ６３を用いて行なわれた。両方のマイクロスフェアセットを、マルチ反応中の対応するＰＣＲ産生物にハイブリダイズし、各マイクロスフェアセットについて平均蛍光強度レベルを比較した。両方の反応とも、同じプローブについて同様のＭＦＩ値を示した。この実験は、ｌｃプローブＩＣ（表３）について繰り返しても同様の結果であった。
【０１１８】
患者の試料およびゲノム標的の調製。
アーカイブの患者のＤＮＡ試料（ｎ＝２１）を用いるか、またはメタノール−酢酸で固定した、骨髄試料を含む細胞遺伝学的調製物由来の細胞ペレット（ｎ＝１０）を用いてゲノムＤＮＡテンプレートを調製した。固定化した患者由来の細胞ペレットを、メタノールおよび酢酸中で２年〜８年貯蔵した。いくつかの試料について遺伝子型は、従来の細胞遺伝学的、マイクロサテライトおよび／またはサザンハイブリダイゼーション研究により既知であったが、いくつかは未知であった（表４−７）。固定細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、血球計でその濃度を決定した。ゲノムＤＮＡテンプレートを、試料ごとに〜６００固定細胞から抽出した。
【０１１９】
アーカイブのＤＮＡ試料について、増幅前に何の処理も必要としなかった。完全ゲノムＤＮＡを、GenomiPhiキット（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare），ニュージャージ州ピスケタウェイ）の改変プロトコルを用いてインビトロ複製し、テンプレートＤＮＡ中へのビオチンの直接取り込みをさせた。最初に、１ｕＬの各ＤＮＡ試料を９ｕＬの試料緩衝液（GE Healthcare）と混合し、９５℃で３分間加熱変性した。試料を氷で２分間急冷した後４ｕＬの５０ｎｍｏｌビオチン−１６−ｄＵＴＰ（ロッシュ（Roche），インデアナ州インデアナポリス）、９ｕＬの反応緩衝液（GE Healthcare）および１ｕＬの酵素混合物（GE Healthcare）を添加した。
【０１２０】
反応を３００℃で２４−３６時間培養した。患者ＤＮＡの充分な複製は、ＨＯＸＢｌおよびＰＷＳ−ＳＲＯプローブのＰＣＲ増幅により実証された（表３）。この初期品質制御工程ではＰＣＲ産生物を生じない試料はどれもＱＭＨには用いられない。ＰＣＲ産生物を充分に増幅しない試料は、精確なＱＭＨ結果（データは示さず）をもたらさないことが観察された。固定細胞ペレットの年代は、改変GenomiPhi法に続くＰＣＲ増幅欠落の有望な分配因子である。ＰＣＲおよびゲル電気泳動によるこれら試料の分析は、抽出したＤＮＡが高度に劣化およびせん断されたことを示し、ＱＭＨ中で順々に無傷のプローブを生じ欠失されるように見えた。ＰＣＲ品質管理を通過したゲノムＤＮＡは、古い細胞ペレット（＞６年）に対してより最近貯蔵した固定細胞ペレット（〜２−５年）から得られたことが観察された。品質管理ＰＣＲ試験を通過したＤＮＡ試料は、超音波処理（Ｂ−３００，Bransonic，コネチカット州ダンバリー）により、〜３００−８００ｂｐまでせん断し、ゲル電気泳動（Seakem）で観察した。２５ｎｇの各標識および断片化したゲノムＤＮＡ試料をＱＭＨ反応ごとに用いた。
【０１２１】
ハイブリダイゼーション反応およびフローサイトメトリ。
調製されたゲノムＤＮＡを、〜７，５００の各プローブ連結したマイクロスフェアを含む１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション緩衝液（３−ｍｏｌ／ｌのテトラメチルアンモニウムクロライド，５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｇ／ｌのSarkosyl）４０ｕＬ中に希釈した。ＱＭＨのためのプローブに接合した２〜１０種レベルのマイクロスフェアのマルチ分析は、CytoPlexマイクロスフェア（Duke Scientific；カリフォルニア州パロアルト）を用いる１の反応で可能であった。ハイブリダイゼーション反応に含まれるプローブは、各、予め特徴づけられた患者またはファミリーにおいて入手可能な遺伝子型証拠に基づいて選択され、未知試料は、ｃｈｒｌ５Ｃｅｎ，ＧＣＰ５，Ｄ１５Ｓ１１，Ｄ１５Ｓ６３，ＰＷＳ−ＳＲＯ，および最初にクラスＩ，クラスＩＩおよびＩＣ欠失に分類が図られるＯＣＡ２とハイブリダイズされる（表３）。その後のハイブリダイゼーション反応で用いられるＱＭＨプローブは、欠失区間を正確に特徴づけるための最初のＱＭＨ反応において検出されたどれでもよい欠失領域に隣接して、または領域内で選択された（図４）。反応物は、９５℃で５分間加熱変性し、５００℃で一晩ハイブリダイズさせた。反応物を１０，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去し、１．５×ＴＭＡＣ中にリポーター分子、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＰＥ；Molecular Probes，オレゴン州ユージーン）を含む１：５０希釈液１２μＬを、ビオチン含有検出ゲノム標的に添加した。反応物を、それらのハイブリダイゼーション温度で１２分間培養した。ラベリングした後、２５０μＬの１．５×ＴＭＡＣを各反応に添加し、混合し、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ハイブリダイズしたマイクロスフェアを、１．５×ＴＭＡＣ７０μＬ中に再懸濁した。
【０１２２】
試料を、FACSCalibur（Becton  Dickenson，カリフォルニア州サンホセ）を用いてフローサイトメトリ分析により評価し、反応ごとにほぼ２０，０００事象を分析した。FACSCalibur装置で設定する典型的なＰＭＴ電圧は、ＦＳＣ（前方散乱）＝ログモードでＥ００（シグナル増幅なし），ＳＳＣ（側方散乱）＝線形モードで３４４Ｖ，ＦＬｌ＝指数関数モードで６２８Ｖ，ＦＬ２＝指数関数モードで６２０Ｖ，ＦＬ３＝指数関数モードで７１０ＶおよびＦＬ４＝指数関数モードで５００Ｖであった。ＦＬｌ，ＦＬ２およびＦＬ３についての閾値は、５２Ｖデフォルトで設定した。ＦＳＣ閾値は、５０Ｖ値の初期パラメータであり、その２次パラメータはＳＳＣであり、１３０Ｖに設定した。流速は、低く設定した。色補償は次のとおり設定した：ＦＬ１＝１．９％ＦＬ２，ＦＬ２＝２１％ＦＬｌ，ＦＬ２＝０％ＦＬ３，ＦＬ３＝１０％ＦＬ２，ＦＬ３＝４．７％ＦＬ４およびＦＬ４＝３．６％ＦＬ３。色補償値は、フローサイトメータの別々のチャネルで測定されたＭＦＩ値のスペクトル的重なりを最小化する。
【０１２３】
これら設定は、ビーズシグナルプロット対ＳＳＣ中の１０種レベルの標識されてないマイクロスフェア各の異なる集団に基づいて最適となるように決定された。蛍光性ビーズ標準（LinearFlow フローサイトメトリ強度計算キット；Molecular Probes）を、フローサイトメータのそれぞれの蛍光色素検出チャネルの強度計算に使用した。装置は、また、蛍光性参照標準（Quantum  Ｒ−ＰＥ  ＭＥＳＦ培地レベルキット；Bangs  Laboratories，インデアナ州フィッシャーズ）を用いて、等価の溶解性蛍光色素（ＭＥＳＦ）単位をもつ分子で計算された表面標識されたビーズに基づいて計算された。フローサイトメトリによる各試料の分析後、試験プローブの参照プローブに対する幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）比を計算し、ＭＳエクセルを用いて表４−１ないし４−９中に示すとおりの統計値（たとえば、平均、９５％信頼区間および標準偏差）を算出した（まとめて表４として参照）。
【０１２４】
表４−１ないし４−９各は、最左欄中にプローブ識別子、次いでカラムと対で、平均蛍光強度および平均蛍光強度比を含む試料結果を含む。欠失を示すデータは、太枠で囲まれている。幾何ＭＦＩ値は、データがフローサイトメータにおける指数関数モードで集積されることから、ＱＭＨ試験からの評価データとしてもっとも精確なものとしてすでに示されている（カークウッド（Kirkwood），１９７９；コーダー（Coder）ら，１９９４；ニューカーク（Newkirk）ら，２００６）。
【０１２５】
結果
ＰＷＳ／ＡＳ患者における大きな欠失の検出
マイクロスフェアに接合された、染色体１５ｑ１１−ｑｌ３をスパニングする一連のｌｃプローブを、ＰＷＳ／ＡＳ領域中に大きな欠失をもつ患者由来の、標識されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズした。いくつかの例では、従来の分析（方法参照）により欠失を決定し（ｎ＝８；ＷＪＫ１８，３５，２９，３６，４８，Ｃ９３−４９−ＰＷＳ，Ｒ９２−１６１−ＰＷＳ，Ｒ９２−１４４−ＰＷＳ）、他の患者では、遺伝子型が未知ではあったが、しかしながらＰＷＳまたはＡＳの臨床診断が実施された（ｎ＝３；未知１，２および３）。
【０１２６】
プローブをもつＰＷＳ領域のマップを図４に示す。この図中、他のマイクロサテライトおよび遺伝子と同様に、マイクロスフェアに接合されたｌｃプローブ（強調表示）についての染色体座標が示される。ＡＳ−ＳＲＯおよびＰＷＳ−ＳＲＯは、大きな星印で確認できる。マイクロスフェアに接合されたプローブは、接合に用いられたマイクロスフェアのレベルを示す環に接続された垂直な点線で示される（１−１０）。クラスＩおよびクラスＩＩの欠失区間ならびにその切断点区間（ＢＰ）が図示される。小さい星は、プローブに接合されたマイクロスフェが、クラスＩをクラスＩＩ欠失患者と区別するための初期ＱＭＨ試験に用いられることを示す。ＱＭＨ結果は、本研究において試験された患者で見出された欠失された領域を示す。欠失区間上に置かれた三角は、以前の研究における欠失区間を定義するための各群で試験されたマイクロサテライトマーカーを印す（ｒｅｆ）。各タイプの欠失区間をもつことがわかった患者の数を（  ）内に示し、これら個体が関連性ありなら黒色“＊”を示す。
【０１２７】
大きな欠失をもつすべての患者（ｎ＝１１）におけるクラスＩとクラスＩＩの欠失を区別するための初期マルチハイブリダイゼーション反応は、Ｃｈｒｌ５Ｃｅｎ、ＧＣＰ５、Ｄ１５Ｓ１１、ＰＷＳ−ＳＲＯおよびＯＣＡ２に特異的な試験プローブおよびＨＯＸＢｌ参照プローブを含有した。すべてのプローブについてのコピー数は、各患者におけるＭＦＩ比に基づいて容易に区別できた（表４−４，４−５および４−６）。ＭＦＩ比は、この群の患者における欠失された領域について、０．４４−０．６７の範囲であり、無傷のゲノム断片について、０．８３−１．０６の範囲であった（表４−４，４−５および４−６）。この初期ＱＭＨ反応の結果を用いて、その後のプローブは、各欠失区間がより狭くなるように選択された。患者での実施例について、ＷＪＫ−２９，ＷＪＫ−３６およびＲ９２−１４４−ＰＷＳ，Ｃｈｒｌ５Ｃｅｎは無傷であったが、ＧＣＰ５，Ｄ１５Ｓ１１，ＰＷＳ−ＳＲＯおよびＯＣＡ２は欠失されることがわかった（表４−５およびＡ−６）。
【０１２８】
これら欠失区間をより一層線引きするため、Ｃｈｒｌ５ＣｅｎとＧＣＰ５との間のＤ１５Ｓ５４１に特異的なＱＭＨプローブを第２の反応中で用いた。このハイブリダイゼーション反応の結果は、ＷＪＫ−２９，ＷＪＫ−３６およびＲ９２−１４４−ＰＷＳでも、Ｄ１５Ｓ５４１が欠失され、〜５．６６Ｍｂ欠失区間からなり、これら２人の患者をクラスＩに分類することが明された（アモ−ランドグラフ（Amos-Landgraf）ら，１９９９）。患者におけるＷＪＫ−１８，３５，４８およびＲ９２−１６１−ＰＷＳ，初期ＱＭＨ結果は、Ｃｈｒｌ５ｃｅｎおよびＧＣＰ５が無傷であるが、Ｄ１５Ｓ１１，ＰＷＳ−ＳＲＯおよびＯＣＡ２は欠失されることを示した（表４−４および４−６）。第２のＱＭＨ反応後、組合わせた結果は、クラスＩＩの欠失と考えられるＡＣ００６５９６−９４５０１からＯＣＡ２（〜４．６Ｍｂ）までの欠失を示した（クノール（Knoll）ら，１９９０）。
【０１２９】
１人の患者のＱＭＨ結果は、クラスＩおよびクラスＩＩ患者に典型的に欠失される断片との対比として非分類の欠失を明らかにした（表４）。Ｃ９３−４９−ＰＷＳ患者において、Ｄ１５Ｓ６３，ＩＣ，Ｕ４１３８４，ＡＣ００４６００および０ＣＡ２のためのプローブは、各１で存在したが、Ｃｈｒｌ５Ｃｅｎ，ＧＣＰ５，ＡＣ００６５９６−９４５０１，ＡＣ００６５９６−７６６１０，Ｄ１５Ｓ１１およびＡＣ００４７３７−１３７４０は、二染色体であった（表４−４）。欠失区間は、〜３．３６Ｍｂの長さであり、クラスＩＩ欠失のサブクラスといえる。
【０１３０】
ＰＷＳ患者におけるＩＣ欠失の検出
以前に、マイクロサテライト分析によりＩＣ欠失をもつことが分かっている全部で６人のＰＷＳ患者をＱＭＨに用いた（Ｒ９３−００１−ＭＯＤ，Ｒ９３−００２−ＭＯＤ，Ｒ９３−０１３−ＭＯＤ，Ｒ９０−０３５−ＰＷＳ，Ｒ９２−１６６−ＰＷＳおよびＲ９２−１６７−ＰＷＳ）（表４−１，４−２および４−３）。最初のファミリーについて、ＡＣ００６５９６−７５６５８，ＡＣ００４７３７−１３７４０，Ｄ１５Ｓ６３，ｃｈｒ１５：２２７３６８０５，ＰＷＳ−ＳＲＯ，Ｕ４１３８４およびＡＣ００４６００に特異的な試験プローブ、ならびに参照プローブ，ＨＯＸＢｌを、標識された各ファミリーのメンバー由来のゲノムＤＮＡにハイブリダイズした（表３）。Ｒ９２−１６６−ＰＷＳおよびＲ９２−１６７−ＰＷＳにおいて、Ｄ１５Ｓ６３からＰＷＳ−ＳＲＯまでの欠失が同定された（〜９３ｋｂ）。先のマイクロサテライト結果は、Ｄ１５Ｓ６３およびＤ１５Ｓ１２８での欠失を示し、このようにＱＭＨ結果は、〜７０ｋｂまでのマイクロサテライト遺伝子型決定で見出された欠失を拡張した。病気にかからないファミリーのメンバー（Ｒ９２−１６８−ＰＷＳ）は、すべての試験した遺伝子座について正常と分かった（表４−１）。
【０１３１】
サザンハイブリダイゼーションおよびマイクロサテライト分析により以前に同定された既知のＰＷＳ  ＩＣ突然変異をもつ他のファミリーを、ＱＭＨで分析した（Ｒ９３−００１−ＭＯＤ，Ｒ９３−００２−ＭＯＤ，Ｒ９３−０１３−ＭＯＤおよびＲ９３−０１４−ＭＯＤ）（表４−２  および  ４−３）（オータ（Ohta）ら，１９９９；ローガン（Rogan）およびクノール（Knoll），２００３）。初期ハイブリダイゼーション反応は、ＨＯＸＢｌ参照プローブに加えて、ＡＣ００６５９６−９４５０１，ＩＣ，ＰＷＳ−ＳＲＯおよびＡＣ００４６００試験プローブを含んだ。結果は、分析したすべての試料がＡＣ００６５９６−９４５０１およびＡＣ００４６００について無傷であるが、ＩＣおよびＰＷＳ−ＳＲＯは、Ｒ９３−００１−ＭＯＤ，Ｒ９３−００２−ＭＯＤおよびＲ９３−０１３−ＭＯＤ中で欠失されることを示した。その後の、この欠失区間に外接する試験プローブを用いるＱＭＨ反応は、ＡＳ−ＳＲＯからＰＷＳ−ＳＲＯまでのＩＣ欠失の限界を改良し（〜５０ｋｂ）、〜４５ｋｂまでの以前の結果（Buitingら，１９９５；Ohtaら，１９９９）を拡張した。
【０１３２】
ＱＭＨを用いて、データ（〜４．３ｋｂ），Ｒ９０−０３５−ＰＷＳが報告された最小のＰＷＳ−ＳＲＯ欠失区間を分析した（表４−３）（オータ（Ohta）ら，１９９９）。初期ハイブリダイゼーションは、参照ＨＯＸＢｌプローブに加えて、Ｄ１５Ｓ６３，ＡＳ−ＳＲＯ，ＩＣ，ＰＷＳ−ＳＲＯ，ｃｈｒ１５：２２７３６８０５およびＵ４１３８４に特異的なプローブを含んだ（表３）。ＭＦＩ比は、すべての試験プローブが無傷であることを示しし、このため、ＡＳ−ＳＲＯおよびＰＷＳ−ＳＲＯ，ＰＷＳ−ＳＲ０２を分離する領域の他のプローブをデザインし、この患者に対しハイブリダイズした。ＰＷＳ−ＳＲＯ２プローブは、ＡＳ−ＳＲＯプローブの１４．５ｋｂ３’（テロメア）かつオリジナルＰＷＳ−ＳＲＯ  ＱＭＨプローブの１１．７ｋｂ５’（セントロメア）に配置される。ＭＦＩ比０．６８は、この遺伝子座が１コピーで存在することを明らかにする（表４−３）。ＰＷＳ−ＳＲＯ２プローブも、現行の研究における他のＩＣ欠失患者にハイブリダイズされ（Ｒ９２−１６６−ＰＷＳ，Ｒ９３−０１３−ＭＯＤ，Ｒ９３−００２−ＭＯＤおよびＲ９３−００１−ＭＯＤ）、ＭＦＩ比の範囲が０．５１から０．６７までであることから期待されるものとして欠失がわかった（表４−１および４−２）。
【０１３３】
臨床的に診察されたＡＳ患者、未知１は、ＦＩＳＨ分析により正常、かつＵＰＤについて正常として試験されたが、異常ＳＮＲＰＮメチル化試験が見出された（表４−７）。未知１の母および父由来の試料は、それぞれ未知２および未知３として同定された（表４−７）。試験結果のこの組み合わせは、この患者を本発明の新規な試験にとって理想の候補にした。ＱＭＨを用いて、この未知の患者（未知１）および該患者の両親（未知２および未知３）を、最初に、Ｃｈｒ１５Ｃｅｎ，ＧＣＰ５，Ｄ１５Ｓ１１，ＰＷＳ−ＳＲＯおよびＯＣＡ２ならびにＨＯＸＢｌ参照プローブを用いてスクリーングした。結果は、ＰＷＳ−ＳＲＯを除いて、すべてのプローブが無傷であることを示した（表４）。
【０１３４】
第２のＱＭＨ分析は、ＡＳ−ＳＲＯをもつＩＣ領域およびＩＣプローブに焦点を合わせた。ＭＦＩ比は、患者およびその母親において、これらプローブが欠失されたことを示したが、これはＡＳ−ＳＲＯ領域周辺の〜１９ｋｂ欠失を形成する（表４）。この結果は、ＩＣおよびＰＷＳ−ＳＲＯプローブに外接されるＰＷＳ−ＳＲＯ２プローブを用いる第３のＱＭＨハイブリダイゼーションで確認され、ＡＳ−ＳＲＯプローブを用いるｓｃＦＩＳＨ分析と同様に、患者およびその母親の両方で欠失されることがわかった（表４）。
【０１３５】
近接欠失染色体１５ｑの検出
患者Ｂ２００２−００９０５，既知の近接染色体１５ｑ欠失をもつ，Ｂ２００２−００９０５は、最初にルーチン細胞遺伝学的分析で特徴づけられ、それに続いてＱＭＨを用いて分析した。マルチＱＭＨ試験は、参照プローブに加え、Ｃｈｒｌ５Ｃｅｎ，Ｄ１５Ｓ５４１，ＧＣＰ５，Ｄ１５Ｓ１１，Ｄ１５Ｓ６３，ＡＣ００４６００およびＯＣＡ２に特異的な試験プローブを含む。結果は、すべての欠失された試験プローブを示し、＞６．６Ｍｂをスパニングする欠失とみなされたが、しかしながら、プローブＣｈｒ１５Ｃｅｎの低コピープローブ配列５’（セントロメア）は、この領域中に反復をもつヘテロクロマチン配列密度のため、なにも同定することができず、したがって、この転置中、セントロメア切断は純化されなかった。
【０１３６】
母方のダイソミーＰＷＳ患者ファミリーにおけるタイミングに非同期複製の評価
染色体１５ｑ１１−１３にタイミングするアレル特異的複製（ＡＳＲ）を試験する以前の研究（クノール（Knoll）ら，１９９０）は、Ｄ１５Ｓ１１およびＤ１５Ｓ６３での父方の早期／母方の後期複製タイミングパターンを明らかにした。これら２つの遺伝子座に特異的なＱＭＨプローブを用いて、染色体１５母方ダイソミー（Ｒ８９−００７−ＰＷＳ，Ｒ８９−００８−ＰＷＳ，Ｒ９０−０１９−ＰＷＳ，Ｒ９０−０４１−ＰＷＳ）をもつ４人のＰＷＳ患者および彼らのファミリーメンバーを試験して、影響を受けた個体において、ＡＳＲがＱＭＨ比に影響を及ぼしたかどうかを判別した（ｎ＝１０）（表４−８および４−９）。ＨＯＸＢｌ参照プローブをＦＩＳＨハイブリダイゼーション研究に用い、同期複製タイミングを実証した。母方二染色体の個体についてのＱＭＨ結果は、正常両親との対比のＭＦＩ比における識別できる差異は何もなかったことを示す。たとえば、Ｒ９０−０４１−ＰＷＳ中のＤ１５Ｓ１１およびＤ１５Ｓ６３についてのＭＦＩ比は、それぞれ０．９５および１．０１（表４−９）であったが、実際には、父親Ｒ９０−０５９−ＰＷＳ（０．９３および０．９４）に比べれば高く、しかし母親Ｒ９０−０６０−ＰＷＳ（０．９７および１．０８）に比べれば僅かに低い（表４−８）。他の２つのファミリー（Ｒ９０−０５９−ＰＷＳ，Ｒ９０−０４１−ＰＷＳ，Ｒ８９−００８−ＰＷＳ，Ｒ８９−０１０−ＰＷＳ，Ｒ８９−００９−ＰＷＳ）について研究されたＱＭＨ結果は、このファミリーについての結果と同義であった。
【０１３７】
正常なおよび欠失した遺伝子座についてのＱＭＨ結果の統計解析
図５中、ＭＦＩ比をｙ軸にプロットし、ＱＭＨハイブリダイゼーション数をｘ軸に沿ってプロットする。正常および欠失プローブのＭＦＩ比における重なりはなかったため、各遺伝子座におけるコピー数を容易に区別できた。正常および欠失遺伝子座についての平均、標準および９５％信頼区間を図５に示す。
【０１３８】
ＱＭＨ（ｎ＝１９１）により試験されたすべての正常遺伝子座分析についてのＭＦＩ値は、０．０１１の９５％信頼レベルで平均０．９８±０．０７５（図５）を示した。また、すべての欠失される遺伝子座（ｎ＝８０）についてのＭＦＩ値は、０．０１６の９５％信頼レベルで平均０．５８±００７２である（図５）。正常および欠失遺伝子座の間でＭＦＩ値の重なりは観察されなかった（ｎ＝２７１）、また遺伝子型は、初期ＰＣＲ品質管理工程を通過したすべての患者について容易に区別できた（図５）。ＤＮＡ抽出に先立ってメタノール：酢酸中で短期間（〜２−５年）貯蔵された観察された患者の試料についてのＱＭＨ試験は、正常および欠失遺伝子座について、長期間（＞５年）貯蔵されたものに比べ、それぞれ安定的にほぼ１．０および０．５のＭＦＩ比を生じた。これは、過度に長期間貯蔵された固定細胞ペレットから得られるＤＮＡの品質低下によると思われる（すなわち、劣化およびせん断条件）。＞６年間貯蔵された患者の試料は、初期ＰＣＲ品質管理工程を通過せず、このためＱＭＨ分析に使用することができなかった。
【０１３９】
検討
この研究は、染色体１５ｑ１１−１３上のＰＷＳ／ＡＳ領域におけるコピー数変化を検出するために、以前に開発された定量的マイクロスフェアハイブリダイゼーション（ＱＭＨ）試験に適用する。ＱＭＨを用いれば、クラスＩおよびクラスＩＩの欠失を、単一の試験において容易に区別でき、第２のＱＭＨ試験でより精確度を上げられた。〜１９ｋｂをスパニングするＡＳ−ＳＲＯ内に含まれる小さい欠失が、ＰＷＳ−ＳＲＯ領域内に含まれる４．３ｋｂと同等に小さい欠失と同様に定義された。一人の患者は、Ｄ１５Ｓ６３からＯＣＡ２までの独特の欠失区間（〜３．３６Ｍｂ）を示し、これは、欠失の新クラスまたはサブクラスということができる。
【０１４０】
ハイブリダイゼーション実験は、大および小の欠失領域について、ゲノム配列の１対２コピーを区別するための充分な感度を示した。しかしながら、ＱＭＨは、母方のダイソミーから生ずるＰＷＳ患者における非同期複製（ＡＳＲ）タイミングパターンの差異を認識することはできなかった。さらなる研究としては、ＱＭＨのこの潜在的適用をさらに試験するための標的ＤＮＡ抽出に先立つ細胞同期化などが挙げられる。別々の分光学的にコードされたマイクロスフェアの使用は、１つの試験管中で９つまでの試験プローブと１つの参照プローブの精確な分析を可能にした。
【０１４１】
このＰＷＳ／ＡＳ領域の研究は、ＱＭＨ試験の最初の臨床適用であり、他のコピー数決定方法に代替しうるコンテクスト依存性の配列同定を要求しない適切な診察であることを実証する。同領域内のコピー数を評価する他の技術としては、ＦＩＳＨ、サザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、ａＣＧＨ、ＭＬＰＡおよびＭＡＰＨが挙げられる。ＱＭＨは、ＦＩＳＨ、サザンハイブリダイゼーション、およびａＣＧＨ（クローンプローブのサイズと密度で制限される）で達成される感度を超え、プローブ密度でのＭＡＰＨおよびＭＬＰＡと同様のゲノム感度≧８０ｂｐで、確実にコピー数の差異を検出した。ｌｃプローブを用いるＱＭＨは、反復的配列抑制のための標的ＤＮＡ増幅または競合相手のＤＮＡ（すなわち、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ）の追加のいずれも要求しない。競合相手のＤＮＡの付加は、ゲノムハイブリダイゼーション試験の精度および再現性を低下させることが示されており（Newkirkら，２００５）、臨床診断試験としては都合が悪いといえる。
【０１４２】
ＱＭＨは、反復的配列を高密度で包囲し、かつプローブ設計に利用可能な低コピー領域数が制限されるにもかかわらず、容易にＰＷＳ／ＡＳ領域に適合できた。試験最適化は、最小限で（方法参照）、結果は、小さい遺伝子型を用いる試料間で、ＭＦＩ比間の無視し得る差異（図５；無傷の遺伝子座について０．９８±０．０７５；欠失遺伝子座について０．５８±０．０７２）で、安定的に再現可能であった。劣化したゲノム標的ＤＮＡの除去で、本研究で分析した試料について、見掛け上の正または見掛け上の負の結果は得られなかった。これは、精確な結果を確実にするため、ＱＭＨによる分析に先だつ品質管理実験の必要性を示す。本発明のＱＭＨ試験は、ＰＷＳおよびＡＳをもつ患者のハイ・スループットスクリーニングのための理想の初期診断試験である。この試験は、それに続くＱＭＨ試験を用いて、ＰＷＳ／ＡＳ欠失区間の精密化を可能にし、ＦＩＳＨは、ＱＭＨにより検出された欠失をもつ染色体コンテクストの確認に使用することができる。
【０１４３】
マイクロスフェアハイブリダイゼーションの基本骨格は、いくつかの診察状況において、ＦＩＳＨ、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、サザン分析，マルチ増幅プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）、マルチライゲーションプローブハイブリダイゼーション（ＭＬＰＡ）および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に代わるより好適なものといえる。本発明のマイクロスフェア試験は、感度を改善し、シグナル／ノイズ比を上昇させ、多重（マルチ）化に容易に適応でき、ハイスループットを試みさせる。マルチ化プローブは、入手しうる患者検体を節約し、診察所要時間を短くさせる能力がある。さらに、異種ゲノム配列の混入物は、本試験におけるハイブリダイゼーション係数に影響を及ぼさないことが示された。
【０１４４】
ＱＭＨ試験では、ハイブリダイゼーション反応ごとに、５ゲノム等価未満のレベルで検出限界１００ｂｐのゲノム感度でコピー数の差異が検出される。従来型のＦＩＳＨおよびサザンハイブリダイゼーションを用いて達成される感度レベルは、〜２０ｋｂないし６５０ｋｂである。ａＣＧＨを用いると、感度はクローンプローブのサイズおよび密度で制限され、蛍光シグナルレベルの変動性は、解釈の精度に影響を及ぼす可能性がある。ＭＡＰＨの感度は、ほぼ５０ｋｂであり、ＭＬＰＡは他の技術よりも高感度であるが、見掛け上負の結果と読取る可能性のあるライゲーション部位においてまたはその近傍における単一のヌクレオチド多型に敏感である。同様にｑＰＣＲは、混入物の防止に注意を払う必要があり、技術も容易にマルチ化されない。
【０１４５】
ｌｃマイクロスフェア接合懸濁ハイブリダイズプローブのゲノムアレイを用いれば、正常コピー数を変える染色体異常の範囲を迅速に描写することが実現可能といえる。染色体領域の長さを測る稠密セットのｌｃプローブのハイブリダイゼーションは、異数染色体のドメインの境界スクリーンに最初に用いることができる。それに続く、ＦＩＳＨ研究は、次に、これら遺伝子的改変についての染色体コンテクストをもたらす。本発明は、それ自体ハイスループット適用を示して以降、理論的に、単一の高密度マイクロタイタープレートにおいて、各ウェル中で分光学的に異なるコード化された１０種の我々の現ビーズセットを用いて、３８４０種の産生物を試験することができた。現装置を用いれば、最小プローブ感度２０ｋｂを想定して、単一のプレートで２０Ｍｂドメインについて９０分以内に高感度コピー数を得ることができる。提示された感度および方法の精度に基いて、マイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーションを、他の応用、たとえばｃＤＮＡにおける低コピーまたは稀少のｍＲＮＡ配列（ハイブリダイゼーション反応ごとに〜５ゲノム等価）の検出および定量に、当然に拡張適用することが望ましい。
【０１４６】
実施例１における参照文献：
以下に示す参照文献の記載内容は引用により本明細書中に記載されているものとする。
【０１４７】
Armour JAL, Sismani C, Patsalis PC, Cross G. 2000. Measurement of locus copy number by hybridisation with amplifiable probes. Nucleic Acids Res. 28(2):605-609.
Bagwell CB, Baker D, Whetstone S, Munson M, Hitchcox S, AuIt KA, Lovett EJ. 1989. A simple and rapid method for determining the linearity of a flow cytometer amplification system. Cytometry 10(6):689-94. Brown RD, Zarbo RJ, Linden MD, Torres FX, Nakleh RE, Schultz D, Mackowiak PG. 1994. Two-color multiparametric method for flow cytometric DNA analysis. Standardization of spectral compensation. American Journal of Clinical Pathology 101(5):630-637.
Coder DM, Redelman D, Vogt RF. 1994. Computing the central location of immunofluorescence distributions: logarithmic data transformations are not always appropriate. Cytometry 18(2):75-8.
Dunbar S, Godbout R, Newkirk H, Hetzel J.2003. Microsphere suspension array technology for SNP detection in cattle. IEEE Eng Med Biol Mag 22(4): 158-62.
Earley M, Vogt RJ, Shapiro H, Mandy F, Kellar K, Bellisario R, Pass K, Marti G, Stewart C, Hannon W. 2002. Report from a workshop on multianalyte microsphere. Cytometry 50(5):239- 42. Fulton RJ, McDade RL, Smith PL, Kienker LJ, Kettman JR, Jr. 1997. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clin Chem 43(9): 1749-56.
Hadd AG, Laosinchai- Wolf W, Novak CR, Badgett MR, Isgur LA, Goldrick M, Walkerpeach CR. 2004. Microsphere bead arrays and sequence validation of 5/7/9T genotypes for multiplex screening of cystic fibrosis polymorphisms. J MoI Diagn 6(4):348-55.
Inoue K, Dewar K, Katsanis N, Reiter LT, Lander ES, Devon KL, Wyman DW, Lupski JR, Birren B. 2001. The 1.4-Mb CMTlA Duplicatlon/HNPP Deletion Genomic Region Reveals Unique Genome Architectural Features and Provides Insights into the Recent Evolution of New Genes. Genome Research ll(6):1018-1033.
Knoll JH, Lichter P. 1994. In situ hybridization to metaphase chromosomes and interphase nuclei. In Dracopoli NC, Haines JL, Korf BR, Moir DT, Morton CC, Seidman CE, Seidman JG, Smith DR (eds): "Current protocols in Human Genetics Volume 1 " Unit 4.3, Green- Wiley, New York. (Revised 2005, in press).
Knoll JH, Rogan PK. 2003. Sequence-based, in situ detection of chromosomal abnormalities at high resolution. American Journal of Medical Genetics 121(3):245-257. Knoll JHM, Rogan PK. 2004. Single Copy Genomic Hybridization Probes and Method of Generating Same. US Patent No. 6,828,097. 
Lewin B. 1980. DNA sequence organization: nonrepetitive and repetitive DNA. In "Gene Expression 2 - Eucaryotic Chromosomes", Chapter 18, pp 503-530, 2nd edition, Wiley- Interscience Publication.
Lupski JR, Oca-Luna RMd, Slaugenhaupt S, Pentao L, Guzzetta V, Trask BJ, Saucedo-Cardenas O, Barker DF, Killian JM, Garcia CA et al. 1991. DNA duplication associated with Charcot- Marie-Tooth disease type IA. Cell 66(2):219-32. Oostlander AE, Meijer GA, Ylstra B. 2004. Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics. Clin Genet 66(6):488-95.
Rockenbauer E, Petersen K, Vogel U, Bolund L, Kolvraa S, Nielsen KV, Nexo BA. 2005. SNP genotyping using microsphere-linked PNA and flow cytometric detection. Cytometry A 64(2):80-6.
Rogan PK, Cazcarro PM, Knoll JH. 2001. Sequence-based design of single-copy genomic DNA probes for fluorescence in situ hybridization. Genome Res 11(6): 1086-94. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. 2002. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 30(12):e57.
Sekar M, Bloch W, John PS. 2005. Comparative study of sequence-dependent hybridization kinetics in solution and on microspheres. Nucleic Acids Res. 33(l):366-75.
Shaffer, LG, Bejjani, BA. 2004. A cytogeneticist's perspective on genomic microarrays. Hum Reprod Update. 10(3):221-26. Sinclair P, Nacheva E, Leversha M, Telford N, Chang J, Reid A, Bench A, Champion K, Huntly B, Green A. 2000. Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood 95(3):738-43.
Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J MoI Biol 98:503-518.
Vignali D. 2000. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods.243(1- 2):243-55. White SJ, Breuning MH, den Dunnen JT. 2004. Detecting copy number changes in genomic DNA: MAPH and MLPA. Methods Cell Biol. 75:751-768.
【０１４８】
実施例２における参照文献：
以下に示す参照文献の記載内容は引用により本明細書中に記載されているものとする。
【０１４９】
Amos-Landgraf JM, Ji Y, Gottlieb W, Depinet T, Wandstrat AE, Cassidy SB, Driscoll DJ, Rogan PK, Schwartz S, Nicholls RD (1999) Chromosome breakage in the Prader-Willi and Angelman syndromes involves recombination between large, transcribed repeats at proximal and distal breakpoints. Am J Hum Genet 65:370-386.
Bejjani BA, Shaffer LG (2004) A cytogeneticist's perspective on genomic microarrays. Hum Reprod Update 10:221-226
Bittel DC, Butler MG (2005) Prader-Willi syndrome: clinical genetics, cytogenetics and molecular biology. Expert Reviews in Molecular Medicine 7:1-20. Bittel DC, KibiryevaN, Talebizadeh Z, Butler MG (2003) Microarray analysis of gene/transcript expression in Prader-Willi syndrome: deletion versus UPD. J Med Genet 40:568-574.
Bittel DC, KibiryevaN, Talebizadeh Z, Driscoll DJ, Butler MG (2005) Microarray analysis of gene/transcript expression in Angelman syndrome: deletion versus UPD. Genomics 85:85-91.
Buiting K, Saitoh S, Gross S, Dittrich B, Schwartz S, Nicholls RD, Horsthemke B (1995) Inherited microdeletions in the Angelman and Prader-Willi syndromes define an imprinting centre on human chromosome 15. Nature Genetics 9:395-400 Knoll J, Rogan P (2004) Single Copy Genomic Hybridization Probes and Method of Generating Same.US 6,828,097
Knoll JH, Rogan PK (2003) Sequence-based, in situ detection of chromosomal abnormalities at high resolution. American Journal of Medical Genetics 121:245-257 Knoll JHM, Nicholls RD, Magenis RE, Glatt K, J.M. Graham J, Kaplan L, Lalande M (1990) Angelman syndrome: three molecular classes identified with chromosome 15ql Iql3-specific DNA markers. Am J Hum Genet 47: 149-155
Mapendano CK, Kishino T, Miyazaki K, Kondo S, Yoshiura K-I, Hishikawa Y, Koji T, Niikawa N, Ohta T (2006) Expression of the Snurf-Snrpn IC transcript in the oocyte and its putative role in the imprinting establishment of the mouse 7C imprinting domain. J Hum Genet 51:236-243
Newkirk H, Knoll JHM1 Rogan P (2005) Distortion of quantitative genomic and expression hybridization by Cot-1 DNA: mitigation of this effect. Nucleic Acids Research 33:el91
Newkirk H, Miralles M, Rogan P, Knoll JHM (2006) Determination of genomic copy number with quantitative microsphere hybridization. Human Mutation 27:376-386
Nygren AOH, AmezianeN, Duarte HMB, VijzelaarRNCP, Waisfisz Q, Hess CJ, Schouten JP, Errami A (2005) Methylation-specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research 33:el28
Ohta T, Gray TA, Rogan PK, Buiting K, Gabriel JM, Saitoh S, Muralidhar B, Bilienska B, Krajewska-Walasek M, Driscoll DJ, Horsthemke B, Butler MG, Nicholls RD (1999) Imprinting- mutation mechanisms in Prader-Willi syndrome. Am J Hum Genet 64:397-413
5 Sahoo T, Shaw CA, Young AS, Whitehouse NL, Schroer RJ, Stevenson RE, Beaudet AL (2005) Array-based comparative genomic hybridization analysis of recurrent chromosome 15q rearrangements, Am J Med Genet 139A: 106-113
Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002) Relative o quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification, Nucleic Acids Res 30:e575
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】表１
【図２】表２
【図３】表２つづき
【図４】図１は、低コピープローブ連結マイクロスフェアハイブリダイゼーション試験のスキームである。
【図５】図２は、低コピー試験プローブのペア（１６−１ｂ，１６−２ｂ，ＰＭＰ２２，ＴＥＫＴ３）の参照プローブ（ＨＯＸＢｌｃ）に対する、１７０の反応物から求められたゲノム平均の比（ｘ軸）の比較である。
【図６】図３は、Ａ）無傷の１６−２ｂ（試料４７，１６−２ｂ：ＨＯＸＢｌの比＝０．８６，表２），Ｂ）ＴＥＫＴ３の重複された（ＣＭＴｌＡ−Ｉ，ＴＥＫＴ３：ＨＯＸＢｌの比＝１．４０，表２）およびＣ）１６−ｌｂの欠失された（試料３３，１６−ｌｂ：ＨＯＸＢｌの比＝０．４９）ならびにＨＯＸＢｌを、各試料に対する固有のゲノム参照プローブとして用いて、試料にハイブリダイズされたマルチ化低コピープローブ−マイクロスフェアの蛍光検出ヒストグラムを示す。
【図７】表３
【図８】表４−１
【図９】表４−２
【図１０】表４−３
【図１１】表４−４
【図１２】表４−５
【図１３】表４−６
【図１４】表４−７
【図１５】表４−８
【図１６】表４−９
【図１７】図４は、染色体１５ｑ１１−１３上のＰＷＳ／ＡＳ領域のマップである。
【図１８】図５は、実施例２で得られた全ＱＭＨ  ＭＦＩの比の要約である。
【図１９】表５
【図１】
2009507472.tif 000003
【図２】
2009507472.tif 000004
【図３】
2009507472.tif 000005
【図４】
2009507472.tif 000006
【図５】
2009507472.tif 000007
【図６】
2009507472.tif 000008
【図７】
2009507472.tif 000009
【図８】
2009507472.tif 000010
【図９】
2009507472.tif 000011
【図１０】
2009507472.tif 000012
【図１１】
2009507472.tif 000013
【図１２】
2009507472.tif 000014
【図１３】
2009507472.tif 000015
【図１４】
2009507472.tif 000016
【図１５】
2009507472.tif 000017
【図１６】
2009507472.tif 000018
【図１７】
2009507472.tif 000019
【図１８】
2009507472.tif 000020
【図１９】
2009507472.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月16日(2007.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ゲノム中の標的核酸配列のコピー数の定量方法：
被検対象から前記標的核酸配列を含有する核酸を抽出する工程、
該標的核酸に標識をつける工程、
前記標的核酸配列を相補するために選択された既知配列からなる、微粒子に接合された低コピー核酸プローブを調製する工程、
該プローブを前記標的核酸にハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション反応産生物を生成させる工程、
前記微粒子を検出することで該産生物を同定する工程、
前記産生物上の前記標識を検出することで、前記標的核酸配列のコピー数を定量する工程。
【請求項２】
前記微粒子がナノ結晶粒子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微粒子がナノスフェアを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微粒子がマイクロスフェアを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微粒子が分光的に異なるポリマーマイクロスフェアを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロスフェアがポリスチレンを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロスフェア表面上の生物学的部分に蛍光色素を結合させる工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロスフェアがカルボン酸化されている改変型カルボジイミド反応を介して、前記プローブを前記マイクロスフェアに接合する工程、および求電子的束縛を用いて前記マイクロスフェアを前記プローブに接合する工程からなる群より選ばれる工程をさらに含み、前記束縛がＮ−クロロアセトアミドヘキシルホスホルアミダイトを含む請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記微粒子が、所定の分光特性をもつ、内部染色された蛍光性ポリスチレンビーズを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出された標的核酸がゲノムＤＮＡおよび相補ＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が、インビトロ核酸複製反応の間に直接標識された識別標識を用いるニックトランスレーションを介するラベリング、末端ラベリングおよびランダムプライミングからなる群より選ばれるプロセスにより標識される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、蛍光色素分子、酵素複合体、蛍光色素分子標識したヌクレオチド、抗原担持ヌクレオチドに結合した蛍光標識した抗体、ビオチン−ｄＵＴＰ、ジオキシゲニン−ｄＵＴＰおよびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記低コピーのプローブのコピー数が１０以下である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブの核酸配列が前記被検対象のゲノム中の単一コピー配列に相補的である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１または複数の塩基対の欠失した標的核酸が、前記標的核酸配列の正常相補をもつ参照プローブに対し、約０．１〜約０．７５の応答比を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１または複数の塩基対が挿入または重複された標的核酸が、前記標的核酸配列の正常相補をもつ参照プローブに対し、約１．２５〜約１．６５の応答比を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
１または複数の別々の分光特性をもつ微粒子に接合された別々の核酸配列をもつマルチプローブが、標的核酸にハイブリダイズされる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記微粒子が、前記核酸プローブの３’または５’端のビオチン部分に結合した、ストレプトアビジン被覆またはカルボン酸化ビーズを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
１μｇの異種ゲノム核酸配列あたりの標的配列の検出量が５０ｐｇ〜５ｎｇの範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
コピー数の差異が最小６０ｂｐのゲノム感度で検出される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記定量工程がフローサイトメトリを用いて前記産生物の分光特性を検出する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブの長さが５０〜２５００塩基の間である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微粒子の直径が５０ｎｍ〜１μｍの間である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、被検対象由来ゲノムまたは相補核酸中の疑われる染色体異常の検出方法：
第１の分光特性をもつ分光学的にコードされた蛍光性マイクロスフェアを準備する工程、
異常の存在が疑われる標的核酸配列の各ヌクレオチドごとの配列の確認により、標的ゲノム核酸プローブ配列を同定する工程、
同定された標的ゲノム核酸プローブ配列にしたがって、既知配列をもつ低コピー標的プローブを合成する工程、
標的プローブを第１の分光特性をもつマイクロスフェアに接合する工程、
既知コピー数の前記標的核酸配列をもつ参照核酸配列にハイブリダイズするために選択された参照プローブを合成する工程、
参照プローブを第２の分光特性をもつマイクロスフェアに接合する工程、
標的プローブを、異常をもつ染色体標的配列と反応させ、それにより標的プローブの標的配列へのハイブリダイズを生起させる工程、
既知配列の参照プローブを、前記染色体標的配列をもつ染色体参照配列と反応させ、それにより参照プローブの参照配列へのハイブリダイズを生起させる工程、
ハイブリダイズ標的プローブを検出して染色体異常の存在を確認する工程、
ハイブリダイズ参照プローブを検出する工程、および
検出されたハイブリダイズ標的プローブの応答と、検出されたハイブリダイズ参照プローブの応答との比較により、検出されたハイブリダイズ標的プローブを定量する工程。
【請求項２５】
前記異常が、前記ゲノムまたは相補核酸中の配列のコピー数の差異、重複、欠失、逆位、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、６０ｂｐの限界ゲノム感度で異常を検出する請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出工程がフローサイトメトリを用いる請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記低コピーのプローブのコピー数が１０以下である請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
マイクロスフェアに接合された既知配列の低コピーゲノムまたは相補核酸プローブにハイブリダイズされた標識された標的核酸配列のフローサイトメトリによる検出を介する染色体異常の直接ゲノム定量方法であって、以下の工程を含む方法：
５０ｎｍ〜１μｍの間の直径をもつ、分光学的にコードされた、蛍光性マイクロスフェアを準備する工程
異常の存在が疑われる標的中の特定の核酸配列にハイブリダイズするために選択された低コピー標的プローブを合成する工程、
標的プローブをマイクロスフェアに接合する工程、
標的プローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズされた標的プローブをフローサイトメトリにより検出する工程、および
前記フローサイトメトリの結果に基づいて前記異常を定量する工程。
【請求項３０】
プローブの核酸配列が、５０〜２５００塩基の間の所定の長さをもつ請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記異常が、前記ゲノムまたは相補核酸内の配列のコピー数の差異、重複、欠失、逆位、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、６０ｂｐの限界ゲノム感度で異常を検出する請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程を含む、染色体異常の検出方法：
分光学的にコードされたポリスチレンマイクロスフェアを、合成ＤＮＡ配列に連結することにより既知配列のハイブリダイゼーションプローブを準備する工程、
前記プローブを、ゲノムＤＮＡにハイブリダイズする工程、
前記ハイブリダイゼーションの産生物を、フローサイトメトリにより検出する工程。
【請求項３４】
前記異常が、前記ゲノムまたは相補核酸内の配列のコピー数の差異、重複、欠失、逆位、転位、転座およびそれらの組合せからなる群より選ばれる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、６０ｂｐの限界ゲノム感度で異常を検出する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記フローサイトメトリの結果を、前記異常に対応する既知コピー数をもつハイブリダイゼーション産生物のフローサイトメトリの結果と比較する工程をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記プローブが、ゲノムＤＮＡ中の１０以下の位置に相補的である請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡが増幅されていない請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブがハイブリダイゼーション前の既知配列をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
ハイブリダイゼーションが起きる前記条件が、プローブの特定配列にあわせて調整される請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブの融点がハイブリダイゼーション前に既知である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ゲノムがヒトゲノムである請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブのＧ−Ｃ含量がハイブリダイゼーション前に既知である請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的核酸配列に特異的ハイブリダイゼーションがある請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的核酸配列がハイブリダイゼーション前に既知である請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
三次元懸濁アレイをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記プローブのハイブリダイゼーションがハイブリダイゼーション反応の結果である請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2009507472.tif 000022
2009507472.tif 000023
2009507472.tif 000024