(57)【要約】  本発明は、式Ａ−Ｂ−Ｃのペプチド誘導体［式中、Ａはポリカチオン性核酸結合コンポーネントであり；Ｂは細胞内で切断を受けうるスペーサーエレメントペプチドであり；そしてＣは細胞表面受容体結合コンポーネントである］を提供する。さらに、本発明は、一般式（Ｉ）：(PEG)q−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)oの脂質誘導体［式中、リンカーは細胞内で切断を受けうる基である；スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；ｑはＰＥＧ鎖の数を表し、ｑ＝１、２または３；ｏは疎水性鎖の数を表し、ｏ＝１、２または３；炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］を提供する。本ペプチド誘導体および本脂質誘導体は非ウイルス遺伝子送達システムにおいて使用される。
2009542582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｂ−Ｃのペプチド誘導体
［式中、
Ａはポリカチオン性核酸結合コンポーネントであり；
Ｂは細胞内で切断を受けうるスペーサーエレメントペプチドであり；そして
Ｃは細胞表面受容体結合コンポーネントである］
【請求項２】
スペーサーエレメントペプチドＢが、
ａ）ジスルフィド結合を含むペプチド鎖；
ｂ）エステル結合を含むペプチド鎖；
ｃ）フューリンによる切断を受けうるアミノ酸配列；および
ｄ）カテプシン酵素による切断を受けうるアミノ酸配列
から選択される基を含む、請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項３】
一般式（ＩＩ）の脂質誘導体：
(PEG)n−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)o
［式中、
・リンカーはエステル基またはアセタール基である；
・スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；
・ｎはＰＥＧ鎖の数を表し、リンカーがエステル基である場合はｎ＝１、リンカーがアセタール基である場合はｎ＝２；
・ｏは疎水性鎖の数を表し、ｏ＝１、２または３；
・炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）の化合物：
【化１】
2009542582.tif 000029
［式中、
・各Ｙは同じであるか異なって、−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択される；
・各Ｒ４は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和Ｃ7-24ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ'（式中、Ｒ'はＣ1-6ヒドロカルビル基である）から選択される１個以上の置換基で置換される）から選択される；
・各Ｒ5は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和Ｃ1-10ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）2、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’（式中、各Ｒ’は同じであるか異なって、Ｃ1-6ヒドロカルビル基である）から選択される１個以上の置換基で置換される）から選択される；
・ＳｐはＣ1-8アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’（式中、Ｒ’はＣ1-6ヒドロカルビル基である）から選択される１個以上の置換基で置換される）である；
・Ｗは−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および式（ＩＶ）の基：
【化２】
2009542582.tif 000030
（ＩＶ）
から選択される；
・ｎはＰＥＧ鎖の数を表し、リンカーＷが−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である場合はｎ＝１、リンカーＷが式（ＩＶ）の基である場合はｎ＝２；
・各Ｂは同じであるか異なって、Ｃ1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ1、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲ1Ｒ2、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ1、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ1および−Ｃ（Ｏ）Ｒ1から選択される１個以上の置換基で置換される）である；
・Ｒ1およびＲ2は同じであるか異なって、Ｃ1-4ヒドロカルビルである；
・ｍは１〜１００の整数である；そして
・Ｑは−Ｎ+（Ｒ3）3、−ＯＨ、および−ＯＲ3（式中、Ｒ3は無置換Ｃ1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択される］
である、請求項３に記載の脂質誘導体。
【請求項５】
一般式（Ｖ）の脂質誘導体：
(PEG)q−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)o
［式中、
・リンカーは細胞内で切断を受けうる基である；
・スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；
・ｑはＰＥＧ鎖の数を表し、ｑ＝１、２または３；
・各ＰＥＧ基は独立して基｛Ｂ−Ｏ｝p−Ｂ−Ｑ
（式中、
・各Ｂは同じであるか異なって、Ｃ1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ1、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲ1Ｒ2、Ｃ（Ｏ）ＯＲ1、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ1および−Ｃ（Ｏ）Ｒ1から選択される１個以上の置換基で置換される）である；
・Ｒ1およびＲ2は同じであるか異なって、Ｃ1-4ヒドロカルビルである；
・ｐは１〜８の整数である；そして
・Ｑは−Ｎ+（Ｒ3）3、−ＯＨ、および−ＯＲ3（式中、Ｒ３は無置換Ｃ1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択される）
である；
・ｏは疎水性鎖の数を表し、ｏ＝１、２または３；そして
・炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］。
【請求項６】
式（ＶＩ）の化合物：
【化３】
2009542582.tif 000031
［式中、
・各Ｙは同じであるか異なって、−Ｏ−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択される；
・各Ｒ4は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和Ｃ7-24ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’（式中、Ｒ’はＣ1-6ヒドロカルビル基である）から選択される１個以上の置換基で置換される）から選択される；
・各Ｒ5は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和Ｃ1-10ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）2、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’（式中、各Ｒ’は同じであるか異なって、Ｃ1-6ヒドロカルビル基である）から選択される１個以上の置換基で置換される）から選択される；
・ＳｐはＣ1-8アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’（Ｒ’はＣ1-6ヒドロカルビル基である）から選択される１個以上の置換基で置換される）である；
・Ｗは細胞内で切断を受けうる基である；
・ｑはＰＥＧ鎖の数を表す；
・各Ｂは同じであるか異なって、Ｃ1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ1、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲ1Ｒ2、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ1、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ1および−Ｃ（Ｏ）Ｒ1から選択される１個以上の置換基で置換される）である；
・Ｒ1およびＲ2は同じであるか異なって、Ｃ1-4ヒドロカルビルである；
・ｐは１〜８の整数である；そして
・Ｑは−Ｎ+（Ｒ3）3、−ＯＨ、および−ＯＲ3（式中、Ｒ3は無置換Ｃ1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択される］
を含む、請求項５に記載の脂質誘導体。
【請求項７】
（ｉ）核酸、および
（ｉｉ）請求項１または請求項２に記載のペプチド誘導体
を含む、非ウイルストランスフェクション複合体。
【請求項８】
脂質コンポーネントをさらに含む、請求項７に記載の非ウイルストランスフェクション複合体。
【請求項９】
（ｉ）核酸、
（ｉｉ）請求項３〜６のいずれか一項に記載の脂質誘導体、
（ｉｉｉ）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント、および
（ｉｖ）細胞表面受容体結合コンポーネント
を含む、非ウイルストランスフェクション複合体。
【請求項１０】
ポリカチオン性核酸結合コンポーネントと細胞表面受容体結合コンポーネントとが一緒になって請求項１または請求項２に記載のペプチド誘導体を形成する、請求項９に記載の非ウイルストランスフェクション複合体。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体を、医薬的に適切な担体と混合して含む、または医薬的に適切な担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項１２】
遺伝子の欠陥および／または欠乏によってヒトまたは非ヒト動物に引き起こされる状態を処置または予防するための方法であって、そのヒトまたは非ヒト動物に請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体を投与することを含む方法。
【請求項１３】
医薬またはワクチンとして使用するための、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項１４】
遺伝子の欠陥および／または欠乏によってヒトまたは非ヒト動物に引き起こされる状態を予防するための医薬、または治療的もしくは予防的免疫処置のための医薬、またはアンチセンス治療もしくはＲＮＡｉ治療のための医薬の製造のための、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体の使用。
【請求項１５】
ヒトまたは非ヒト動物におけるがんを処置する方法であって、そのヒトまたは非ヒト動物に請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体を投与することを含む方法。
【請求項１６】
がん処置用の医薬として使用するための、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項１７】
ヒトまたは非ヒト動物におけるがんを処置するための医薬の製造のための、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞への生物活性物質、例えば核酸、タンパク質または小分子の送達に適した脂質誘導体に関する。また、本発明は、特徴的な切断可能リンカーを有するペプチド誘導体に関する。さらに本発明は、例えば予防、処置およびワクチン接種における、またはインビトロ実験室環境における、上記脂質もしくは上記ペプチドの使用またはそれら二つの併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療目的または他の目的のための遺伝子送達は、特に嚢胞性線維症および一定のがんなどの疾患の処置を目的とするものが、よく知られている。この用語は、何らかの欠乏を補正するために行われる細胞内への遺伝子または遺伝子の一部の送達を指す。本明細書において、この用語は、ターゲット細胞内への核酸物質の任意の導入を指すためにも使用され、遺伝子ワクチン接種およびいわゆる細胞工場における商業的に有用なタンパク質のインビトロ生産を包含する。
【０００３】
細胞送達システムは三種類、すなわち、裸のDNAの直接注入を伴うもの、ウイルスまたは遺伝子改変ウイルスを利用するもの、非ウイルス送達剤を利用するものに大別される。これらはそれぞれに利点と欠点を持っている。送達剤としてのウイルスには高い効率および高い細胞選択性という利点があるものの、毒性、炎症性応答の生成および大きなDNAフラグメントの扱いが困難という欠点を持っている。
【０００４】
非ウイルス遺伝子送達システムは、DNAの負に帯電したリン酸エステル主鎖とカチオン性の脂質、ペプチドまたは他のポリマーとの間の静電相互作用による、ナノメートル粒子への遺伝物質の圧密に基づいている（Erbacher，P.ら，Gene Therapy，1999，6，138-145）。これらの化学種の作用についてはさまざまな機序が示唆されてきた。初期の示唆は、リポソームと細胞膜の間で膜融合が起きるというものだった。最近になって、完全な複合体のエンドサイトーシスが提案された。核酸と脂質の間に形成された複合体は細胞表面に付着した状態になってから、エンドサイトーシスによって細胞に侵入する。次に、それらは、しばらくの間、小胞またはエンドソーム内に局在化した状態を保ち、核酸コンポーネントが細胞質中に放出される。次に、しばらくしてから、核内への核酸の移動が起こりうる。核では、核酸によってコードされた遺伝子が発現されうる。核内での遺伝子発現には、DNAをRNAに転写した後、それをタンパク質に翻訳することが含まれる。
【０００５】
この目的にウイルスではなく脂質を使用すると、毒性を低下させ、コストを低下させ、ほどほどに効率の良いターゲティングを達成し、核酸物質の大きなフラグメントを扱うことが可能になる。残念なことに、トランスフェクション効率は低いことが指摘されている。
【０００６】
既知の遺伝子送達用複合体に「LID複合体」がある。本明細書で使用する用語「LID複合体」は、脂質、インテグリン（または他の受容体）結合ペプチドおよびDNAを含む複合体を表す。LID複合体はインテグリンを介した経路によってトランスフェクションを達成し、必ずしも全体として正荷電を有する必要がないので、望ましくない血清相互作用を減らすことができる。脂質コンポーネントは、DNAと、ある程度はペプチドコンポーネントとを、エンドソーム分解または他の分解から遮蔽する。ペプチドコンポーネントは、細胞タイプ特異的または細胞表面受容体特異的になるように設計することができる。例えば、LID複合体には、インテグリン特異性の度合いにより、ある程度の細胞特異性を付与することができる。特異性は細胞表面受容体（例えばインテグリン受容体）へのターゲティングによってもたらされ、いくつかのアデノウイルスベクターに匹敵するトランスフェクション効率を達成することができる（Hartら，Hum．Gene Ther．9，1037-47，1998；Harbottleら，Hum．Gene．Ther．9，575-85，1998；およびJenkinsら，Gene Therapy 7，393-400，2000）。ヒト気道上皮細胞をターゲットとするペプチドが報告されている（WO02/072616）。樹状細胞をターゲットとするペプチドが報告されている（WO2004/108938）。
【０００７】
LID複合体のコンポーネントは静電的に会合して、脂質/ペプチドベクター複合体、いわゆるリポポリプレックス型のベクターを形成する（Hartら「Lipid-mediated enhancement of transfection by a nonviral integrin-targeting vector」Hum Gene Therapy，1998，9，575-85；Mengら「Efficient transfection of non proliferating human airway epithelial cells with a synthetic vector system」J Gene Med 2004，6，210-21；Parkesら「High efficiency transfection of porcine vascular cells in vitro with a synthetic vector system」J Gene Med 2002，4，292-9）。脂質/ペプチドベクターは、ある範囲の細胞株および初代細胞培養物を、高い効率および低い毒性でトランスフェクトする：上皮細胞（効率40％）、血管平滑筋細胞（効率50％）、内皮細胞（効率30％）および造血細胞（効率10％）。さらにまた、マウスの気管支上皮（Jenkinsら「Formation of LID vector complexes in water alters physicochemical properties and enhances pulmonary gene expression in vivo」Gene Therapy 2003，10，1026-34）、ラット肺（Jenkinsら「An integrin-targeted non-viral vector for pulmonary gene therapy」Gene Therapy 2000，7，393-400）およびブタ肺（Cunninghamら「Evaluation of a procine model for pulmonary gene transfer using a novel synthetic vector」J Gene Med 2002，4，438-46）のインビボトランスフェクションも、アデノウイルスベクターの効率に匹敵する効率で実証されている（前掲のJenkinsら，2000）。
【０００８】
そのようなLID複合体または脂質/ペプチド複合体に使用されるペプチドは、二つの機能性、すなわち細胞表面受容体（例えばインテグリン）認識配列を含有する「頭部」と、DNAを非共有結合的に結合することができる「尾部」とを持たなければならない。これら二つのコンポーネントが個々の機能を妨害しないような形でスペーサーを介して共有結合的に連結されている既知のペプチドには、WO96/15811に記載のペプチド6など、「尾部」がポリカチオン性核酸結合コンポーネントであるペプチドが含まれる。
【０００９】
そのようなペプチドを含むLID複合体が関わる初期の実験では、全身または静脈内送達系路による不十分なトランスフェクション特性が示されている。ありえそうな問題は、他のポリカチオン性ベクターについて述べられているとおり、不十分な溶解度と網内系によるベクターの迅速なクリアランスをもたらす、ベクターと血清タンパク質および赤血球膜との会合である（Dash,P.R.，Read,M.L.，Barrett,L.B.，Wolfert,M.A.，Seymour,L.W.（1999）Gene Therapy 6，643-50）。全身投与によって何らかのトランスフェクション活性を示したベクターは、主として、肝臓および肺などの臓器の初回通過毛細管床において有効だった（Fenske,D.B.，MacLachlan,I.，Cullis,P.R.（2001）Curr Opin Mol Ther 3，153-8）。そのような非特異的トランスフェクション活性もいくつかの治療用途を持ちうるが、特定の応用例における安全な臨床使用には、はるかに高いターゲット特異性を有するベクターが要求される。
【００１０】
LID複合体の脂質コンポーネントについては、そのような用途のためのカチオン性脂質をFelgnerらが1980年代後期に開発し、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84，7413-7417，1987に報告した。参照しうるFelgnerらの特許はUS5264618である。Felgnerは、「リポフェクチン（Lipofectin）」という商標で知られている現在市販のカチオン性リポソームを開発した。これは、比率1：1のサイトフェクチン（cytofectin）DOTMAと中性脂質DOPEとからなる。それ以来、他にもさまざまなカチオン性リポソーム製剤が考案されており、その大部分は、合成カチオン性サイトフェクチンと中性脂質とを組み合わせたものである。サイトフェクチンは、疎水性尾部に何らかのスペーサーを介して取り付けられたカチオン性頭部を有する、正に帯電した分子である。DOTMA類似体の他にも、複合アルキルアミン/アルキルアミド、コレステロール誘導体、およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、グルタメート、イミダゾールおよびホスホネートの合成誘導体を挙げることができる。これらの物質およびそれらの作動機序に関する総説は、Angew．Chem．Int．Ed．37，1768-1785，1998に見出すことができる。しかしカチオン性ベクター系は、血清の存在下でそのトランスフェクション効率が大きく変動し、そのことが、インビボ遺伝子治療へのそれらの潜在的使用に対して強い影響を持つことは明らかである。
【００１１】
WO2005/117985には、一つ以上のポリエチレングリコール（PEG）基を含む脂質（すなわちPEG化脂質）が記載されており、そのようなPEG化脂質はPEG基を持たない脂質（すなわち非PEG化脂質）に対して利点を示すことが示されている。特に、血漿タンパク質への脂質の結合およびベクター凝集が引き起こす網内系による脂質の迅速なクリアランスという問題は、PEGポリマー部分がベクターを遮蔽することによって改善されうる。しかし、PEG化はしばしばトランスフェクション効率の著しい低下につながるので、網内系によって迅速に除去されない脂質であって、しかも満足できるトランスフェクション効率を示す脂質は、依然として必要とされている。
【００１２】
非ウイルス遺伝子治療ベクターが最近の総説の主題になっている：Hart,S.L.（2005）Current Drug Delivery 2，1-6；Kostareloa,K.およびMiller,A.D.（2005）Chem．Soc．Rev.，34，970-994。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、式A-B-Cのペプチド誘導体
［式中、
Aはポリカチオン性核酸結合コンポーネントであり；
Bは細胞内で切断を受けうるスペーサーエレメントペプチドであり；そして
Cは細胞表面受容体結合コンポーネントである］
を提供する。
【００１４】
本発明は、一般式（I）の脂質誘導体：
(PEG)q−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)o
［式中、
・リンカーは細胞内で切断を受けうる基である；
・スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；
・qはPEG鎖の数を表し、q＝1、2または3；
・oは疎水性鎖の数を表し、o＝1、2または3；
・炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］
も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、式A-B-Cのペプチド誘導体
［式中、
Aはポリカチオン性核酸結合コンポーネントであり；
Bは細胞内で切断を受けうるスペーサーエレメントペプチドであり；そして
Cは細胞表面受容体結合コンポーネントである］
を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のペプチドは、細胞内で切断を受けうるスペーサーを持たない先行技術のペプチドよりも効率よく、ターゲット細胞のトランスフェクションを引き起こすことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（a）マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A、（b）マウス胎仔線維芽細胞AJ3.1、（c）マウス内皮細胞bEND.3、および（d）ヒト気管支上皮細胞16HBE14o-で行われた、切断可能ペプチド（ME27、ME28、ME29）または非切断可能ペプチド（ME61）を含有する脂質-ペプチド-DNA（LPD）複合体によるトランスフェクションの結果を示す図である。複合体を2：4：1のリポフェクチン：ペプチド：pCI-Luc重量比で調製した。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。（＊p＜0.05）
【図２】(a）マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A、（b）マウス内皮細胞bEND.3、および（c）ヒト気管支上皮細胞16HBE14o-で行われたトランスフェクションに対する、ペプチド（ME68、FMM8、ME27、ME69およびPCY）における切断配列RVRRの追加効果を示す図である。複合体を、2：4：1のリポフェクチン：非切断可能（黒）または切断可能（グレー）ペプチド：pCI-Luc重量比で調製した。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。（＊非切断可能ペプチドを切断可能ペプチドと比較した場合にp＜0.05）
【図３】（A）マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A、（B）マウス胎仔線維芽細胞AJ3.1、（C）マウス内皮細胞bEND.3、（D）ヒト気管支上皮細胞16HBE14o-、（E）嚢胞性線維症気管上皮細胞（ΣCFTE29o-）および（F）初代ブタ血管平滑筋細胞（PVSMC）で行われた、ペプチドME27のみ（脂質と複合体を形成していないもの）のトランスフェクション効率を示す図である。複合体を2：4：1のリポフェクチンまたはリポフェクチンなし：ペプチド：pEGFP-N1重量比で調製した。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、蛍光細胞のパーセンテージを24時間後にフローサイトメトリーによって決定した。
【図４】3〜7のpH域での37℃におけるPEG-アセタール切断可能脂質JBW389の加水分解に関する研究の結果を示す図である。化合物の酸加水分解をTLCでモニターした後、質量分析によって確認した。使用した対照は、切断されたアセタールの生成物、対応するアルデヒドである。
【図５】（a）ヒト気管支上皮細胞16HBE14o-、（b）マウス内皮細胞bEND.3、（c）初代ブタ血管平滑筋細胞PVSMC、（d）マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A、および（e）嚢胞性線維症気管上皮細胞ΣCFTE29o-で行われた、PEG-アセタール切断可能脂質を含有するLPDまたはLD複合体によるトランスフェクションを示す図である。複合体を、2：4：1の脂質/DOPE：ペプチド6（縦線）またはE（斜線）またはペプチドなし（ドット）：pCI-Luc重量比で調製した。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、ルシフェラーゼ活性を24時間後に測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。
【図６】（a）マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A、および（b）ヒト気管支上皮細胞16HBE14o-で行われた、PEG-エステル切断可能脂質（ME42、ME52、ME53）、PEG-エステル非切断可能脂質（CH300）または非PEG非切断可能脂質（リポフェクチン）を含有するLPD複合体によるトランスフェクションを示す図である。複合体を2：4：1の脂質：ペプチドME27：pCI-Luc重量比で調製した。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、ルシフェラーゼ活性を24時間後に測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。
【図７】ペプチドME27および10μgのpCI-Lucと2：4：1の重量比で複合体を形成させて、合計1mlのPBSに希釈した、リポフェクチン（菱形）、CH3000/DOPE（四角）およびME/DOPE（三角）のサイズ（複合体形成の5分後および60分後に動的光散乱法で決定したもの）を示す図である（＊p＜0.05）。
【図８】（a）マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A、および（b）ヒト気管支上皮細胞16HBE14o-で行われた、PEG化脂質（CH300）またはPEG-エステル切断可能脂質（ME42）を含有するLPD複合体によるトランスフェクションの最適化を示す図である。リポフェクチン（黒）、CH300/DOPE（グレー）またはME42/DOPE（白）複合体を2：4：1の脂質：ペプチドME27：pCI-Luc重量比で調製した。複合体を細胞に加えた後、遠心分離（1500rpm，5分間）を1回行うか、または行わなかった。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、ルシフェラーゼ活性を24時間後に測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。（＊遠心分離後のトランスフェクション効率を遠心分離なしのものと比較した場合にp＜0.05）
【図９】マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A（黒）およびヒト気管支上皮細胞16HBE14o-（グレー）で行われた、PEG-アセタール切断可能脂質（JBW389）と、PEG-エステル切断可能脂質（ME42）による、トランスフェクションの比較を示す図である。複合体を2：4：1の脂質/DOPE：ペプチドME27：pCI-Luc重量比で調製した。複合体を細胞に加えた後、遠心分離（1500rpm，5分間）を1回行った。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、ルシフェラーゼ活性を24時間後に測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。（＊p＜0.05）
【図１０】マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A（黒）、マウス内皮細胞bEND.3（グレー）およびヒト気管支上皮細胞16HBE14o-（白）における、異なる緩衝液中で作製されたPEG切断可能複合体のトランスフェクション効率を示す図である。複合体を、OptiMEM、5％グルコースまたは水中において、2：4：1の脂質ME42/DOPE：ペプチドME27：pCI-Luc重量比で調製した後、それらを各培養ウェルに加える直前にOptiMEMに希釈した。複合体を細胞に加えた後、遠心分離（1500rpm，5分間）を1回行った。トランスフェクションインキュベーションを4時間行い、ルシフェラーゼ活性を24時間後に測定した。10秒間測定した相対発光量（RLU）をタンパク質1mgあたりの平均±s.e.m.として表す。（＊OptiMEM中で作製された複合体のトランスフェクション効率を5％グルコースまたは水中で作製された複合体の一つと比較した場合にp＜0.05）
【図１１】50μgのpCI-Lucを2：4：1の重量比で含有する異なる複合体を5％グルコース中で作製し、それを尾静脈中に注射することによって行った、腫瘍を有する雌A/Jマウスにおけるインビボトランスフェクションを示す図である。注射の24時間後にマウスを屠殺し、腫瘍および臓器を切除し、組織溶解物中のルシフェラーゼ活性を30秒間測定して、タンパク質1mgあたりの形で表した（RLU/mg）。これらのグラフは、（a）プラスミドpCI-Luc単独（ドット）もしくはペプチドM27（斜線）、脂質ME42/DOPE（白）、脂質ME42/DOPE：ペプチドME27（グレー）またはリポフェクチン：ペプチドP1（黒）と複合体を形成させたプラスミドpCI-Lucのi.v.投与（＊ME42/DOPE：ME27：pCI-Lucのトランスフェクション効率を他の複合体の一つと比較した場合にp＜0.05）、（b）ペプチドME27およびpCI-lucと複合体を形成させたリポフェクチン（黒）、CH300/DOPE（グレー）、ME42/DOPE（白）またはペプチドPCYおよびpCI-Lucと複合体を形成させたME42/DOPE（斜線）のi.v.投与、（c）ME42/DOPEおよびpCI-lucと複合体を形成させたペプチドK16（黒）、FMM12（グレー）、ME27（白）のi.v.投与を示す。
【図１２】24時間前にME42/DOPE：ペプチドME27：pAB11複合体の静脈内投与を受けているA/Jマウスの腫瘍切片における、免疫組織化学によるβ-ガラクトシダーゼの局在（黒い矢印）を示す図である。代表的切片を示す。倍率40倍。
【図１３】脂質ME42/DOPEおよびペプチドME27と複合体を形成させた、hIL-2をコードするプラスミド25μgおよびmIL-12 25μgをi.v.投与した、A/Jマウス由来の腫瘍を1mlの培地中24時間培養した後のmIL-12（四角）およびhIL-2（三角）のインビボ発現を示す図である。24時間毎に集めた培養上清をアッセイし、ELISAでサイトカインレベルを決定することにより、サイトカイン産生量を5日間にわたって測定した。
【図１４】治療遺伝子をi.v.注射した後の、定着腫瘍を有するマウスの平均腫瘍体積を示す図である。A/Jマウスに1.5×106個のNeuro2A細胞を移植し、移植後3日目、5日目、7日目および9日目に、何もi.v.注射しないか（菱形）、空のプラスミドを含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI，三角）またはIL-2およびIL-12遺伝子を含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI-IL2/IL12，四角）をi.v.注射した。（＊治療複合体を注射したマウスの平均腫瘍体積を、移植後11日目の対照マウスの平均体積と比較した場合にp＜0.05）
【図１５】移植後3、5、7、9、11、13、15日目に、(a）何もi.v.注射しないか、(b）空のプラスミドを含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI）または（c）IL-2およびIL-12遺伝子を含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI-IL2/IL12）を7回i.v.注射した後の、1本の線で表した、1.5×106個のNeuro-2A細胞を移植した各A/Jマウスの腫瘍成長を示す図である。
【図１６】移植後3、5、7、9、11、13、15日目に、何もi.v.注射しないか（青線）、空のプラスミドを含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI，黄線）またはIL-2およびIL-12遺伝子を含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI-IL2/IL12，緑線）を7回i.v注射した後の、1.5×106個のNeuro-2A細胞を移植されて生き残ったA/Jマウスのパーセンテージを示す図である。
【図１７】移植後3、5、7、9日目に（A，B）何もi.v.注射していないか、（C，D）空のプラスミドを含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI）または（E，F）IL-2およびIL-12遺伝子を含有するLPD複合体（ME42/DOPE-ME27-pCI-IL2/IL12）のi.v.注射を4回受けているA/Jマウスから得られる、移植後12日目の腫瘍組織像を示す図である。パラフィン包埋腫瘍切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。矢印は血管を表し、星印は分裂細胞を表し、黒の三角印は壊死の領域を表す。代表的な切片を示す。倍率40倍。
【図１８】切断緩衝液［酢酸ナトリウム（20mM）、システイン（5mM）およびEDTA（1mM）をミリポア水中で混合し、酢酸（5M）でpH5.0に調節した後、凍結乾燥されたカテプシンB（緩衝液100μlにつき1単位）を溶解することによって調製したもの］（475μl）、ペプチド溶液（5mM，5μl）および酵素溶液（20μl）の混合後、0分、30分、1時間、2時間および4時間における、ME27に関するHPLC結果を示す図である。
【図１９】ME42、ME81、DOPEおよびPEG3のRf値を示している薄層クロマトグラフィープレート（15％メタノール/ジクロロメタン＋酢酸）を示す図である。
【図２０】ME42の分解を示している薄層クロマトグラフィープレート（15％メタノール/ジクロロメタン＋酢酸）を示す図である。
【図２１】製剤化されたME42 LPDの分解を示している薄層クロマトグラフィープレート（15％メタノール/ジクロロメタン＋酢酸）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ポリカチオン性核酸結合コンポーネントAは、DNAまたはRNAに結合する能力を有する任意のポリカチオンである。ポリカチオンはそれ自体がポリカチオン性であってもよいし、DNAまたはRNAへの結合能力が保たれる限り、任意の数のカチオン性モノマーを有することもできる。例えば3〜100個、例えば10〜20個、例えば14〜18個、例えば約16個のカチオン性モノマーが存在しうる。
【００１９】
核酸結合性ポリカチオン分子の例は、1個以上のカチオン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。そのようなオリゴペプチドは、例えばオリゴ-リジン分子、オリゴ-ヒスチジン分子、オリゴ-アルギニン分子、オリゴ-オルニチン分子、オリゴ-ジアミノプロピオン酸分子、またはオリゴ-ジアミノ酪酸分子、またはヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびジアミノ酪酸残基の任意の組合せを含む複合オリゴマーであることができる。上記のオリゴペプチドはいずれも、例えば、全部で3〜35個、例えば5〜25個の残基、好ましくは10〜20個の残基、例えば14〜18個の残基、例えば16個の残基を持ちうる。
【００２０】
オリゴリジン、例えば3〜35個、例えば2〜25個、例えば10〜20個のリジン残基、例えば13〜19個、例えば14〜18個、例えば15〜17個の残基、例えば16個の残基を有するもの、すなわち[K]16（「K」はリジンを表す）は、特に好ましい。
【００２１】
ポリカチオン性コンポーネントのさらなる例にはデンドリマーおよびポリエチレンイミンがある。ポリエチレンイミン（PEI）は遺伝子送達能を有する無毒性の架橋カチオン性ポリマーである（Proc．Natl．Acad．Sci.，1995，92，7297-7301）。ポリエチレンイミンはFluka（800kDa）もしくはSigma（50kDa）から入手することができ、あるいはPolyPlus-transfection（フランス・イルキルシュ）からトランスフェクション用に予め希釈された形で入手することができる。典型的には、DNAに対して9倍過剰（過剰比はPEI窒素：DNAリン酸基として算出される）かつpH5〜8で使用した場合に、PEIは最も効率がよい。そのようなパラメータは、当業者によく知られる方法で最適化することができる。
【００２２】
細胞内で切断を受けうるスペーサーエレメントペプチドBは、細胞内で切断を受けうる任意のペプチドであることができる。そのようなペプチドは、細胞のエンドソーム、リソソーム、および/または細胞質内で切断を受けうるものであることができる。切断を受けうるとは、本明細書においては、そのエレメントが、コンポーネントAおよびCが完全な状態を保っているような時間尺度で、切断を受けうることを意味すると解される。エレメントBは、細胞のペプチド分解経路が効力を生じるよりも速く切断される。
【００２３】
好ましくは、スペーサーエレメントペプチドは、酵素的切断、還元的切断、またはpH依存的切断、例えば加水分解を受けうる。酵素的切断の場合、本発明の一態様において、好ましいペプチドは、NOX（NADH-オキシダーゼ）、GILT（ガンマインターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ）およびPDI（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）から選択される酵素による切断を受けうるものである。本発明のもう一つの態様において、好ましいペプチドは、エンドソーム中に存在する酵素、例えばフューリンまたはカテプシンなどのエンドソームプロテアーゼによる切断を受けうるものである。
【００２４】
好ましくは、スペーサーエレメントペプチドBは、
a）ジスルフィド結合を含むペプチド鎖；
b）エステル結合を含むペプチド鎖；
c）フューリンによる切断を受けうるアミノ酸配列；および
d）カテプシン酵素による切断を受けうるアミノ酸配列
から選択される基を含む。
【００２５】
ジスルフィド結合は、好ましくは、通常の大気および生理的条件下では安定であるが、エンドソーム内では還元的に切断されうるものである。同様に、ペプチド鎖中のエステル結合は、好ましくは、中性pHでは安定であるが、エンドソームの酸性環境中（例えば6.0未満のpH、好ましくは5.5未満のpH、または5.0未満のpH）では切断されるものである。
【００２６】
例えば、フューリンによる切断を受けうるアミノ酸配列には、
i）RX1KR；および
ii）RX2RR；
［式中、X1およびX2は、同じであっても異なってもよく、それぞれ任意のアミノ酸残基を表す］
から選択される配列がある（Zimmerら，J．Biol．Chem.，2001，276，31642-31650；Nakayama，Biochem．J.，1997，327，625-635）。
【００２７】
好ましいアミノ酸残基X1には、Lys（K）およびVal（V）、例えばLys（K）がある。好ましいアミノ酸残基X2には、Lys（K）およびVal（V）、例えばVal（V）がある。
【００２８】
例えばカテプシン酵素は任意の適切なカテプシン酵素であることができる（Pillayら，Biochem．J.，2002，363，417-429参照）。例えばそれはカテプシンBであることができる。例えばカテプシンBによる切断を受けうるアミノ酸配列（Pecharら，Macromol．Chem．Phys.，1997，198，1009-1020参照）には、
iii）X3X4
［式中、X3はチロシン（Tyr，Y）、フェニルアラニン（Phe，F）、ロイシン（Leu，L）、バリン（Val，V）およびイソロイシン（Ile，I）から選択され、X4はグリシン（Gly，G）、アラニン（Ala，A）およびグルタミン酸（Glu，E）から選択される］
から選択される配列がある。
【００２９】
好ましくは、X3はチロシン（Tyr，Y）、フェニルアラニン（Phe，F）およびロイシン（Leu，L）から選択される。
【００３０】
例えば、配列X3X4はGFX3X4として、例えば（Pecharら，Bioconjugate Chem.，2000，11，131-139で使用されているように）GFLGとして、存在することができる。
【００３１】
スペーサーエレメントペプチドBはさらにリンカーを含んでもよく、そのリンカーは、好ましくはペプチドである（すなわちアミノ酸残基を含む）か、ポリエチレングリコール基であるか、またはそれら二つの混合物である。アミノ酸は天然物であっても非天然物であってもよい。それらはL-またはD-立体配置を持ちうる。リンカーは2個以上のアミノ酸を有することができる。例えばリンカーは、3個以上のアミノ酸、例えば4個以上、例えば5個以上、例えば10個までのアミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を含みうる。アミノ酸は同じであっても異なってもよいが、複数のリジン残基（またはベクター複合体のポリカチオン性核酸結合コンポーネントにおける使用に適した他のカチオン性アミノ酸）の使用は、オリゴ-リジン配列がポリカチオン性核酸結合コンポーネントとしての活性を有するので、スペーサーにおいては、一般に避けるべきである。
【００３２】
リンカーは、例えばジペプチド、グリシン-グリシン（GG）またはグリシン-アラニン（GA）であることができる。
【００３３】
リンカーは、ポリエチレングリコール部分であるか、ポリエチレングリコール部分を含むことができる。ポリエチレングリコール部分は、1〜30個のエチレングリコールユニット、好ましくは1〜15個のユニット、より好ましくは1〜8個のユニット、例えば2〜6個のユニット、例えば4個のユニットを含むことができる。
【００３４】
好ましくは、リンカーは、ポリカチオン性核酸結合コンポーネントAに結合されるスペーサーエレメントペプチドBの末端にある。
【００３５】
好ましくは、細胞表面受容体結合コンポーネントＣはペプチドを含む。細胞表面受容体結合コンポーネントＣがペプチドを含む場合、そのペプチドは、長さが20アミノ酸までであってもよいし、それより長くてもよい。ペプチドは一般に少なくとも5個のアミノ酸を有するが、それより少なくてもよい。一般にペプチドは6〜20個（両端を含む）の任意の数のアミノ酸を有する。一般に、ペプチドは、15個以下のアミノ酸、より好ましくは12個以下のアミノ酸、最も好ましくは10個以下のアミノ酸を有することが好ましい。一般に、ペプチドは5個以上のアミノ酸、例えば6個以上のアミノ酸を有することが好ましい。最も好ましくは、ペプチドは7個のアミノ酸を有する。
【００３６】
好ましくは、細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、環状領域を含むペプチドを含む。環状ペプチドは、ペプチド中に少なくとも二つのシステイン残基を設けてジスルフィド結合の形成を可能にすることによって、形成させることができる。したがって好ましい細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、一つ以上のジスルフィド結合を形成する能力を有する2個以上のシステイン残基を有するペプチドからなるか、そのようなペプチドを含む。好ましくはシステイン残基は主要受容体結合部分に隣接する。
【００３７】
本発明のある実施形態では、細胞表面受容体結合コンポーネントＣがインテグリン結合ペプチドを含む。インテグリン結合ペプチドは、細胞の表面上に見出されるインテグリン類に特異的に結合する能力を有する任意のペプチドである。インテグリン結合ペプチドは天然のインテグリン結合リガンド、例えば細胞外マトリックスタンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、細菌タンパク質インベイシン、ヘビ毒ディスインテグリンタンパク質、または任意のそれらタンパク質のインテグリン結合フラグメントであることができる。それらインテグリン結合タンパク質およびそのフラグメントは、自然源から入手するか、組換え技法によって入手することができる。特に、インテグリン結合ペプチドは合成、精製および貯蔵が容易であり、化学修飾が可能であり、生体内での免疫原性がおそらく低いので、インテグリン結合ペプチドを使用することが好ましい。好ましいインテグリン結合ペプチドは、WO96/15811、およびとりわけWO98/54347に記載されているようなものである。例えばインテグリン結合ペプチドはα4β1インテグリンに特異的であることができる。
【００３８】
この実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、好ましくは
a）RGD；
b）RRETAWA；
c）LDV
から選択されるペプチドを含む。
【００３９】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、細胞表面受容体結合コンポーネントＣが、ヒト気道上皮（HAE）細胞に結合する能力を有するペプチドを含む。好ましいHAE細胞結合ペプチドは、WO02/072616に記載されているようなものである。
【００４０】
この実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、好ましくは、
a）X5SM；
b）LX6HK；
c）PSGX7ARA；
d）SX8RSMNF；および
e）LX9HKSMP；
［式中、X5は塩基性アミノ酸残基であり、X6はQまたはPであり、X7はAまたはTであり、X8は酸性アミノ酸残基であり、X9はPまたはQである］
から選択されるペプチドを含む。
【００４１】
好ましくは、細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、
a）X5SM；
b）LX6HK；および
c）PSGAARA
［式中、X5は塩基性アミノ酸残基であり、X6はQまたはPである］。
から選択されるペプチドを含む。
【００４２】
好ましくはX5はKまたはRである。好ましくはX6はPである。好ましくはX7はAである。好ましくはX8はEまたはQである。より好ましくはX8はEである。好ましくはX9はPである。したがって好ましいペプチドは、LQHKSMP、LPHKSMP、VKSMVTH、SERSMNF、VGLPHKF、YGLPHKF、PSGAARA、SQRSMNFおよびPSGTARAから選択される配列を含むものである。
【００４３】
本発明のもう一つの実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、ヒト樹状細胞に結合する能力を有するペプチドを含む。好ましいヒト樹状細胞結合ペプチドは、WO2004/108938に記載されているようなものである。例えば、そのようなペプチドは、
a）PX10X11X12T；
b）PSX13S；
c）QX14X15X16Q；
d）SX17S
［式中、X10、X11およびX12は、同じであっても異なってもよく、それぞれアミノ酸残基を表し；
X13はアミノ酸残基を表し；
X14およびX16は、同じであっても異なってもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、
そしてX15は、アミド側鎖を有するアミノ酸残基、例えばNまたはQを表す。
X17は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、例えばLまたはIを表す］
から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドから選択することができる。
【００４４】
好ましい実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントＣは、
a）CRGDCLG；
b）CRGDCLG；
c）ACDCRGDCFCG；
d）CRGDMFGCA；
e）CRRETAWACG；
f）CRGEMFGCA；
g）CSERSMNFCG；
h）CYGLPHKFCG；および
i）CLPHKSMPCG
から選択されるペプチドを含む。
【００４５】
本発明は、ある実体（この実体は、核酸または他の分子、例えば治療的もしくは医薬的に活性な化合物、または検出可能ラベルを含む分子である）を細胞にターゲティングするための本発明のペプチド誘導体の使用を提供する。
【００４６】
合成ベクターによる遺伝子導入を制限するステップの一つは、核内へのDNAの侵入と核内でのDNAの転写を可能にするであろう複合体の非解離である（概観するにはWiethoffおよびMiddaugh「Barriers to nonviral gene delivery」J Pharm Sci. 2003 Feb;92(2):203-17；およびLechardeurら「Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer」Adv Drug Deliv Rev. 2005 Apr 5;57(5):755-67を参照されたい）。ポリカチオン性核酸結合コンポーネントからのペプチドの切断は、エンドソーム膜不安定化をもたらし（WrobelおよびCollins「Fusion of cationic liposomes with mammalian cells occurs after endocytosis」Biochim Biophys Acta. 1995 May 4;1235(2):296-304）、細胞質中に放出されるプラスミドDNAの量を増加させ（Hafezら「On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids」Gene Ther. 2001 Aug;8(15):1188-96）、したがってトランスフェクション効率を増加させると推測される（ただし本発明者らはこの理論に拘泥するわけではない）。
【００４７】
本発明の切断可能ペプチドは、腫瘍細胞へのベクター複合体のターゲティングを（本発明の切断可能脂質と一緒に使用した場合は特に）改善することが、さらに見出された。したがって本発明のペプチドはがんの処置に利用することができる。したがって本発明は、患者のがんを処置する方法であって、適切な複合体中の本発明のペプチドを、その患者に有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
さらに本発明は、
（i）核酸、および
（ii）本発明のペプチド誘導体
を含む非ウイルストランスフェクション複合体を提供する。
【００４９】
さらに本発明は、
（i）核酸、
（ii）本発明のペプチド誘導体、および
（iii）脂質コンポーネント
を含む非ウイルストランスフェクション複合体を提供する。
【００５０】
核酸コンポーネントは任意の適切な核酸であることができる。これは、DNAもしくはRNAまたは化学修飾された核酸ミメティック、例えばPNA分子であることができる。これは、例えば、ターゲット細胞において有用性を有するタンパク質をコードすることができる。これは、アンチセンス核酸またはRNAi核酸であることができる。
【００５１】
RNAiは、ターゲット遺伝子が産生する細胞性メッセンジャーRNA（mRNA）分子を、そのmRNA分子の短い部分に相補的な配列を含有する二本鎖RNA（dsRNA）分子に曝露することによって達成される。細胞内部では、その二本鎖RNA分子が切断されて、ターゲットmRNA分子に結合することができる短い（21〜23ヌクレオチド長の）一本鎖と二本鎖フラグメントを生成する。そのような結合は、ヌクレアーゼによるターゲットmRNAの切断につながり、その結果、ターゲット遺伝子の発現レベルの低下が起こる。
【００５２】
したがって核酸コンポーネントはそれ自体がRNAi分子（「siRNA」）であってもよいし、あるいは、投与される核酸は、転写された時にRNAi分子（すなわちターゲット遺伝子の発現をRNA干渉によって抑制する能力を有するRNA）を産生する配列を含むDNA分子であってもよい。
【００５３】
本発明は、本発明のトランスフェクション複合体を製造するための方法も提供する。
【００５４】
さらに本発明は、本発明のトランスフェクション複合体を医薬的に適切な担体と混合して含む、または本発明のトランスフェクション複合体を医薬的に適切な担体と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００５５】
さらに本発明は、ある遺伝子の欠陥および/または欠乏によってヒトまたは非ヒト動物に引き起こされる状態を処置または予防するための方法であって、そのヒトまたは非ヒト動物に本発明のトランスフェクション複合体を投与することを含む方法を提供する。
【００５６】
本明細書で使用する「ある遺伝子の欠陥および/または欠乏」という用語は、ある遺伝子のコード領域の欠陥または欠乏を表すだけでなく、その遺伝子の制御エレメント（例えばトランスまたはシスに位置する制御エレメント）の欠陥もしくは欠乏、またはその遺伝子の転写もしくは翻訳に直接的であれ間接的であれ関与する他の任意のエレメントの欠陥もしくは欠乏も表す。
【００５７】
さらに本発明は、ヒトまたは非ヒト動物を治療的または予防的に免疫処置するための方法であって、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスRNA）またはRNAi治療に適した核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体を、そのヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明は、本発明のトランスフェクション複合体をヒトまたは非ヒト動物に投与することを含み、核酸がアンチセンス治療に適した核酸（例えばRNA）またはRNAi治療に適した核酸である、アンチセンス治療の方法も提供する。
【００５９】
さらに本発明は、医薬またはワクチンとして使用するための本発明のトランスフェクション複合体も提供する。
【００６０】
本発明は、ある遺伝子の欠陥および/または欠乏によってヒトまたは非ヒト動物に引き起こされる状態を予防するための医薬、または治療的もしくは予防的免疫処置のための医薬、またはアンチセンス治療もしくはRNAi治療のための医薬の製造を目的とする、本発明のトランスフェクション複合体の使用も提供する。
【００６１】
また、本発明は、
（i）核酸、および
（ii）本発明のペプチド誘導体
を含むキットも提供する。
【００６２】
さらに本発明は
（i）核酸、
（ii）本発明のペプチド誘導体、および
（iii）脂質コンポーネント
を含むキットを提供する。
【００６３】
本発明は、一般式（I）の脂質誘導体
(PEG)q−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)o
［式中、
・リンカーは細胞内で切断を受けうる基である；
・スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；
・qはPEG鎖の数を表し、q＝1、2または3；
・oは疎水性鎖の数を表し、o＝1、2または3；
・炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］
も提供する。
【００６４】
切断を受けうるとは、本明細書においては、そのリンカーが、他のコンポーネントが完全な状態を保っているような時間尺度で、切断を受けうることを意味すると解される。リンカーは、細胞の脂質分解経路が効力を生じるよりも速く切断される。
【００６５】
本発明の一態様（L1）において、本発明の脂質誘導体は、一般式（II）の脂質誘導体：
(PEG)n−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)o
［式中、
・リンカーはエステル基またはアセタール基である；
・スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；
・nはPEG鎖の数を表し、リンカーがエステル基である場合はn＝1、リンカーがアセタール基である場合はn＝2；
・oは疎水性鎖の数を表し、o＝1、2または3；
・炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］
である。
【００６６】
好ましくは、各PEG鎖は、独立して、基-{B-O}m-B-Q
［式中、
・各Bは同じであるか異なって、C1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、-OR1、-C(O)OH、-CN、-NR1R2、-C(O)OR1、-OC(O)R1および-C(O)R1から選択される1個以上の置換基で置換される）である；
・R1およびR2は同じであるか異なって、C1-4ヒドロカルビルである；
・mは1〜100の整数である；そして
・Qは-N+(R3)3、-OH、および-OR3から選択される（式中、R3は無置換C1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）］
である。
【００６７】
好ましくは、mは1〜50、例えば2〜20である。より好ましくはmは1〜10、とりわけ1〜8、例えば1〜6、より好ましくはmは1〜3、例えば1または2である。
【００６８】
リンカーがアセタール基である場合、mは好ましくは1〜8、例えば1〜6、より好ましくは1〜3、例えば1または2、特に1である。
【００６９】
リンカーがエステル基である場合、mは好ましくは1〜8、例えば1〜6、より好ましくはmは1〜3、例えば2である。
【００７０】
リンカーがアセタール基である一般式（II）の脂質誘導体は、さまざまな異なる細胞タイプにおいて、切断可能なリンカー基を欠く対応する非切断可能脂質誘導体よりも高い遺伝子導入効率を有することが見出された。
【００７１】
リンカーがエステル基である一般式（II）の脂質誘導体は、さまざまな異なる細胞タイプにおいて、切断可能なリンカー基を欠く対応する非切断可能脂質誘導体または切断可能なリンカー基とPEG鎖の両方を欠く非切断可能脂質誘導体よりも高い遺伝子導入効率を有することが見出された。
【００７２】
好ましいアセタールまたはエステルリンカー基は、pH3.5以上で、より好ましくはpH4.0以上で、特にpH4.5以上で、例えばpH5.0以上で加水分解を受けうるものである。好ましくは、それらは、pH7.0以上、より好ましくは6.5以上、特にpH6.0以上で安定である。
【００７３】
リンカーがアセタールリンカーである場合は、二つのPEG鎖が存在し、それらは同じであっても異なってもよく、それぞれアセタール基の酸素原子に取り付けられる。
【００７４】
リンカーがエステルリンカーである場合、エステル基はどちら向きに配置されてもよい（カルボニル基がスペーサー側にあっても、酸素原子がスペーサー側にあってもよい）。
【００７５】
スペーサーは1〜8個の炭素原子を含む炭化水素鎖である。
【００７６】
カチオン性頭部は、少なくとも一つの正電荷を有する任意の基であることができる。好ましいカチオン性頭部は、4級アンモニウム基を含むものである。
【００７７】
炭素骨格は、疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基であり、2〜8個の炭素原子、好ましくは2〜6個の炭素原子、とりわけ2〜4個の炭素原子、例えば3個の炭素原子と、疎水性鎖を取り付けるための1個以上、例えば1個、2個または3個の部分、例えば1個以上のエーテル基またはエステル基とを含みうる。
【００７８】
1個、2個または3個の疎水性鎖、好ましくは2個の疎水性鎖が存在しうる。1個より多くの疎水性鎖が存在する場合、それらの鎖は同じであっても異なってもよい。各疎水性鎖は、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C7-24ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）から独立して選択される。
【００７９】
本発明のL1態様の一実施形態において、本発明は、式（III）の化合物：
【化１】
2009542582.tif 000003
［式中、
・各Yは同じであるか異なって、-O-、および-O-C(O)-から選択される；
・各R4は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C7-24ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）から選択される；
・各R5は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C1-10ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2、および-C(O)R'（式中、各R'は同じであるか異なって、C1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）から選択される；
・SpはC1-8アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）である；
・Wは-O-C(O)-、-C(O)O-、および式（IV）の基：
【化２】
2009542582.tif 000004
（IV）
から選択される；
・nはPEG鎖の数を表し、リンカーWが-O-C(O)-または-C(O)O-である場合はn＝1、リンカーWが式（IV）の基である場合はn＝2；
・各Bは同じであるか異なって、C1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、-OR1、-C(O)OH、-CN、-NR1R2、-C(O)OR1、-OC(O)R1および-C(O)R1から選択される1個以上の置換基で置換される）である；
・R1およびR2は同じであるか異なって、C1-4ヒドロカルビルである；
・mは1〜100の整数である；そして
・Qは-N+(R3)3、-OH、および-OR3（式中、R3は無置換C1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択される］
を提供する。
【００８０】
本発明のもう一つの態様（L2）において、本発明の脂質誘導体は、一般式（V）の脂質誘導体：
(PEG)q−リンカー−スペーサー−カチオン性頭部−炭素骨格−(疎水性鎖)o
［式中、
・リンカーは細胞内で切断を受けうる基である；
・スペーサーはリンカーをカチオン性頭部に連結する基である；
・qはPEG鎖の数を表し、q＝1、2または3；
・各PEG基は独立して基{B-O}p-B-Q
（式中、
・各Bは同じであるか異なって、C1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、-OR1、-C(O)OH、-CN、-NR1R2、C(O)OR1、-OC(O)R1および-C(O)R1から選択される1個以上の置換基で置換される）である；
・R1およびR2は同じであるか異なって、C1-4ヒドロカルビルである；
・pは1〜8の整数である；そして
・Qは-N+(R3)3、-OH、および-OR3（式中、R3は無置換C1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択される）
である；
・oは疎水性鎖の数を表し、o＝1、2または3；そして
・炭素骨格は疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基である］
である。
【００８１】
好ましくは、pは1〜6、より好ましくはpは1〜4、例えば1または2である。p＝2である一般式（V）の代表的脂質誘導体は、さまざまな異なる細胞タイプにおいて、p＝5である一般式（V）の対応する脂質誘導体よりも高い遺伝子導入効率を有することが見出された。このことは、短いPEG鎖長を有することによって遺伝子導入効率が改善されることを示唆している。
【００８２】
リンカーは、細胞内で切断を受けうる任意の基であることができる。リンカーは、細胞の任意の部分内で、例えば細胞のエンドソーム、リソソーム、および/または細胞質内で切断を受けうるものであることができる。好ましくは、リンカーは酵素的切断、還元的切断、またはpH依存的切断、例えば加水分解を受けうる。
【００８３】
好ましくは、リンカーはオルトエステル基、ビニルエーテル基、アシルヒドラゾン（acyl hydrozone）基、エステル基、アセタール基、またはジスルフィド基である。
【００８４】
好ましいリンカー基は加水分解を受けうるものである。好ましくは、加水分解を受けうるリンカーは、pH3.5以上、より好ましくはpH4.0以上、特にpH4.5以上、例えばpH5.0以上において加水分解する。好ましくは、そのようなリンカーはpH7.0以上、より好ましくは6.5以上、特にpH6.0以上において安定である。
【００８５】
リンカーがアセタールリンカーである場合は、二つのポリエチレングリコールコンポーネントが存在し、それらは同じであっても異なってもよく、それぞれアセタール基の酸素原子に取り付けられる。
【００８６】
リンカーがエステルリンカーである場合、エステル基はどちら向きに配置されてもよい（カルボニル基がスペーサー側にあっても、酸素原子がスペーサー側にあってもよい）。
【００８７】
スペーサーは1〜8個の炭素原子を含む炭化水素鎖である。
【００８８】
カチオン性頭部は、少なくとも一つの正電荷を有する任意の基であることができる。好ましいカチオン性頭部は、4級アンモニウム基を含むものである。
【００８９】
炭素骨格は、疎水性鎖をカチオン性頭部に連結する基であり、2〜8個の炭素原子、好ましくは2〜6個の炭素原子、とりわけ2〜4個の炭素原子、例えば3個の炭素原子と、疎水性鎖を取り付けるための1個以上、例えば1個、2個または3個の部分、例えば1個以上のエーテル基またはエステル基とを含みうる。
【００９０】
1個、2個または3個の疎水性鎖、好ましくは2個の疎水性鎖が存在しうる。1個より多くの疎水性鎖が存在する場合、それらの鎖は同じであっても異なってもよい。各疎水性鎖は、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C7-24ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）から独立して選択される。
【００９１】
本発明のL2態様の一実施形態において、本発明は、式（VI）の化合物：
【化３】
2009542582.tif 000005
［式中、
・各Yは同じであるか異なって、-O-、および-O-C(O)-から選択される；
・各R4は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C7-24ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）から選択される；
・各R5は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C1-10ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、-OR'、-C(O)OH、-CN、-N(R')2、および-C(O)R'（式中、各R'は同じであるか異なって、C1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）から選択される；
・SpはC1-8アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-6ヒドロカルビル基である）から選択される1個以上の置換基で置換される）である；
・Wは細胞内で切断を受けうる基である；
・qはPEG鎖の数を表す；
・各Bは同じであるか異なって、C1-6アルキレン基（これは無置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、-OR1、-C(O)OH、-CN、-NR1R2、-C(O)OR1、-OC(O)R1および-C(O)R1から選択される1個以上の置換基で置換される）である;
・R1およびR2は同じであるか異なって、C1-4ヒドロカルビルである；
・pは1〜8の整数である；そして
・Qは-N+(R3)3、-OH、および-OR3（式中、R3は無置換C1-4アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択される］
を提供する。
【００９２】
本発明のL2態様の上記実施形態において、Wは、細胞内で切断を受けうる任意の基であることができる。リンカーWは、細胞の任意の部分内で、例えば細胞のエンドソーム、リソソーム、および/または細胞質内で切断を受けうるものであることができる。好ましくは、リンカーWは酵素的切断、還元的切断、またはpH依存的切断、例えば加水分解を受けうる。
【００９３】
好ましくは、Wはオルトエステル基、ビニルエーテル基、アシルヒドロゾン（acyl hydrozone）基、エステル基、アセタール基、またはジスルフィド基である。
【００９４】
好ましいW基は加水分解を受けうるものである。好ましくは、加水分解を受けうるW基は、pH3.5以上、より好ましくはpH4.0以上、特にpH4.5以上、例えばpH5.0以上において加水分解する。好ましくは、そのようなW基はpH7.0以上、より好ましくは6.5以上、特にpH6.0以上において安定である。
【００９５】
Wがアセタールリンカーである場合は、二つのPEG鎖が存在し、それらは同じであっても異なってもよく、それぞれアセタール基の酸素原子に結合する。
【００９６】
Wがエステルリンカーである場合、エステル基はどちら向きに配置されてもよい（カルボニル基がスペーサー側にあっても、酸素原子がスペーサー側にあってもよい）。
【００９７】
本明細書にいうC1-4アルキル基またはアルキル部分は、1〜4個の炭素原子を含有する線状または分岐アルキル基またはアルキル部分、例えばC1-2アルキル基またはアルキル部分である。C1-4アルキル基およびアルキル部分の例には、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチルおよびt-ブチルがある。誤解がないように述べておくと、一つの基に二つのアルキル部分が存在する場合、それらのアルキル部分は同じであっても異なってもよい。
【００９８】
本明細書にいうアルキレン基は二価アルキル基であり、この場合、アルキル基は上に定義したとおりである。例えばC1アルキレン基（すなわちメチレン）は二価C1アルキル基、すなわち-CH2-である。アルキレン基が2個以上の炭素原子を含む場合、その基は分岐してもよく、例えばエチレン基は-CH2CH2-または-CH(CH3)-であることができる。
【００９９】
本明細書にいうヒドロカルビル基は、上に定義したアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を包含する。したがって、例えばC1-4ヒドロカルビル基は、上に定義したC1-4アルキル基、C2-4アルケニル基およびC2-4アルキニル基を包含する。C2-4アルケニル基またはアルケニル部分は、2〜4個の炭素原子を含有する線状または分岐アルケニル基またはアルケニル部分である。アルケニル基は、1個以上の炭素-炭素二重結合、例えば1個または2個の二重結合を含有することができ、それらはそれぞれ、シスまたはトランスであることができる。好ましいアルケニル基は1個の二重結合を含有する。好ましくは、それら1個または複数個の二重結合はシス配置である。同様に、C2-4アルキニル基またはアルキニル部分は、2〜4個の炭素原子を含有する線状または分岐アルキニル基またはアルキニル部分である。アルキニル基は1個以上の炭素-炭素三重結合、例えば1個または2個の三重結合、好ましくは1個の三重結合を含有しうる。誤解がないように述べておくと、一つの基に二つのアルケニル部分または二つのアルキニル部分が存在する場合、それらのアルケニル部分またはアルキニル部分は同じであっても異なってもよい。典型的には、アルケニル基は無置換である。好ましい無置換ヒドロカルビル基は、1個以上、例えば1個または2個の二重結合を含有し、そのそれぞれがシスまたはトランスであることができるアルケニル基である。
【０１００】
PEG基はキャップト（capped）でもアンキャップト（uncapped）でもよい。アンキャップトPEG基は末端ヒドロキシ基を有するものである。好ましいキャップトPEG基には、末端ヒドロキシ基がメトキシ、エトキシ、またはトリフルオロメトキシ基に変換されるものがある。リンカーがアセタールリンカーである場合、ポリエチレングリコールコンポーネントは好ましくはキャップトである。リンカーがエステルリンカーである場合、ポリエチレングリコールコンポーネントは好ましくはアンキャップトである。
【０１０１】
好ましいPEG基は、mが1〜6の整数、より好ましくはmが1〜3の整数、例えば1または2であるものである。リンカーがアセタールリンカーである場合、mは好ましくは1である。リンカーがエステルリンカーである場合、mは好ましくは2である。
【０１０２】
好ましいPEG基は、BがC1-5アルキレン基（これは無置換であるか、上で定義したように1個以上の置換基で置換される）であるものである。より好ましくは、BはC2-4アルキレン基（これは無置換であるか、上で定義したように1個以上の置換基で置換される）である。最も好ましくは、Bはエチレン（これは無置換であるか、上で定義したように1個以上の置換基で置換される）である。
【０１０３】
典型的には、Bは無置換であるか、1個または2個の置換基を有する。Bに関して好ましい置換基はヒドロキシ、ハロゲンおよび-OR1（式中、R1はC1-6アルキル基である）から選択される。より好ましくは、Bは無置換である。
【０１０４】
好ましいPEG基はQが-OH、および-OR3（式中、R3は無置換C1-2アルキル基またはトリフルオロメチル基である）から選択されるものである。リンカーがアセタールリンカーである場合、Qは好ましくは-OHまたは-OMe、特に-OMeである。リンカーがエステルリンカーである場合、Qは好ましくは-OHである。
【０１０５】
上記式（III）および（VI）の化合物において、各Yは典型的には同じである。好ましくは各Yが-O-である。
【０１０６】
好ましくは、各R4は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C10-22ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、上で定義したように置換される）から選択される。より好ましくは、各R4は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C12-20ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、上で定義したように置換される）から選択される。より一層好ましくは、各R4は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C16-18ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、上で定義したように置換される）から選択される。
【０１０７】
典型的には、各R4は直鎖である。典型的には、各R4は無置換であるか、1個、2個または3個の置換基を有する。各R4基に関して好ましい置換基は、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-4アルキル基である）から選択されるものである。好ましくは、各R4は無置換である。
【０１０８】
最も好ましくは、各R4は同じであるか異なって、パルミチン酸残基、ステアリン酸残基、オレイン酸残基、リノール酸残基またはリノレン酸残基を表す。この実施形態の一態様においては、各基-Y-R4は脂肪酸残基から誘導されることが好ましく、例えば各基-Y-R4は-O-(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3または-O-(CH2)10CH=CH(CH2)3CH3を表しうる。したがって各R4は、好ましくは、モノ不飽和C18またはC16基、例えば-(CH2)10CH=CH(CH2)3CH3であることができる。典型的には、両R4基が同じである。
【０１０９】
好ましくは、各R5は同じであるか異なって、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和C1-6ヒドロカルビル基、例えばC1-4ヒドロカルビル基（これは無置換であるか、上で定義したように1個以上の置換基で置換される）から選択される。各R5は典型的には無置換であるか、1個または2個の置換基を有する。好ましいR5置換基は、ヒドロキシおよび-OR'（式中、R'はC1-6アルキル基である）から選択される。より好ましくは、各R5は無置換である。典型的には、両R5基が同じである。好ましくは、両R5基がメチルである。
【０１１０】
好ましくは、SpはC2-8アルキレン基（これは無置換であるか、上で定義したように1個以上の置換基で置換される）である。より好ましくは、SpはC4-8アルキレン基（これは無置換であるか、上で定義したように1個以上の置換基で置換される）である。典型的には、Spは無置換であるか、1個または2個の置換基を有する。好ましい置換基は、ヒドロキシ、ハロゲンおよびOR'（式中、R'はC1-4アルキル基である）から選択される。より好ましくは、Spは無置換である。
【０１１１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、
（iii）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント、および
（iv）細胞表面受容体結合コンポーネント
を含む組成物を提供する。
【０１１２】
さらにもう一つの態様において、本発明は
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、および
（iii）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント
を含む組成物を提供する。
【０１１３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、
（i）核酸、
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、
（iii）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント、および
（iv）細胞表面受容体結合コンポーネント
を含む非ウイルストランスフェクション複合体を提供する。
【０１１４】
また、本発明は、
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、
（iii）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント、および
（iv）細胞表面受容体結合コンポーネント
を含むキットも提供する。
【０１１５】
また、本発明は、
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、および
（iii）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント
を含むキットも提供する。
【０１１６】
さらに本発明は、
（i）核酸、
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、
（iii）ポリカチオン性核酸結合コンポーネント、および
（iv）細胞表面受容体結合コンポーネント
を含むキットを提供する。
【０１１７】
ポリカチオン性核酸結合コンポーネントは、DNAまたはRNAに結合する能力を有する任意のポリカチオンである。ポリカチオンはそれ自体がポリカチオン性であってもよいし、DNAまたはRNAへの結合能力が保たれる限り、任意の数のカチオン性モノマーを有することもできる。例えば3〜100個、例えば10〜20個、例えば14〜18個、例えば約16個のカチオン性モノマーが存在しうる。
【０１１８】
核酸結合性ポリカチオン分子の例は、1個以上のカチオン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。そのようなオリゴペプチドとして、例えばオリゴ-リジン分子、オリゴ-ヒスチジン分子、オリゴ-アルギニン分子、オリゴ-オルニチン分子、オリゴ-ジアミノプロピオン酸分子、もしくはオリゴ-ジアミノ酪酸分子、またはヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびジアミノ酪酸残基の任意の組合せを含む複合オリゴマーを挙げることができる。上記オリゴペプチドはいずれも、例えば、全部で3〜35個、例えば5〜25個の残基、好ましくは10〜20個の残基、例えば14〜18個の残基、例えば16個の残基を持ちうる。
【０１１９】
オリゴリジン、例えば3〜35個、例えば2〜25個、例えば10〜20個のリジン残基、例えば13〜19個、例えば14〜18個、例えば15〜17個の残基、例えば16個の残基を有するもの、すなわち[K]16（「K」はリジンを表す）は、特に好ましい。
【０１２０】
ポリカチオン性コンポーネントのさらなる例にはデンドリマーおよびポリエチレンイミンがある。ポリエチレンイミン（PEI）は遺伝子送達能を有する無毒性の架橋カチオン性ポリマーである（Proc．Natl．Acad．Sci.，1995，92，7297-7301）。ポリエチレンイミンはFluka（800kDa）もしくはSigma（50kDa）から入手することができ、あるいはPolyPlus-transfection（フランス・イルキルシュ）からトランスフェクション用に予め希釈された形で入手することができる。典型的には、DNAに対して9倍過剰（過剰比はPEI窒素：DNAリン酸基として算出される）かつpH5〜8で使用した場合に、PEIは最も効率がよい。そのようなパラメータは、当業者によく知られる方法で最適化することができる。
【０１２１】
好ましくは、細胞表面受容体結合コンポーネントはペプチドを含む。細胞表面受容体結合コンポーネントがペプチドを含む場合、そのペプチドは、長さが20アミノ酸までであってもよいし、それより長くてもよい。ペプチドは一般に少なくとも5個のアミノ酸を有するが、それより少なくてもよい。一般にペプチドは6〜20個（両端を含む）の任意の数のアミノ酸を有する。一般に、ペプチドは、15個以下のアミノ酸、より好ましくは12個以下のアミノ酸、最も好ましくは10個以下のアミノ酸を有することが好ましい。一般に、ペプチドは5個以上のアミノ酸、例えば6個以上のアミノ酸を有することが好ましい。最も好ましくは、ペプチドは7個のアミノ酸を有する。
【０１２２】
好ましくは、細胞表面受容体結合コンポーネントは、環状領域を含むペプチドを含む。環状ペプチドは、ペプチド中に少なくとも二つのシステイン残基を設けてジスルフィド結合の形成を可能にすることによって、形成させることができる。したがって好ましい細胞表面受容体結合コンポーネントは、一つ以上のジスルフィド結合を形成する能力を有する2個以上のシステイン残基を有するペプチドからなるか、そのようなペプチドを含む。好ましくはシステイン残基はプライマリーレセプター結合部分に隣接する。
【０１２３】
本発明のある実施形態では、細胞表面受容体結合コンポーネントがインテグリン結合ペプチドを含む。インテグリン結合ペプチドは、細胞の表面上に見出されるインテグリン類に特異的に結合する能力を有する任意のペプチドである。インテグリン結合ペプチドは天然のインテグリン結合リガンド、例えば細胞外マトリックスタンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、細菌タンパク質インベイシン、ヘビ毒ディスインテグリンタンパク質、または任意のそれらタンパク質のインテグリン結合フラグメントであることができる。それらインテグリン結合タンパク質およびそのフラグメントは、自然源から入手するか、組換え技法によって入手することができる。特に、インテグリン結合ペプチドは合成、精製および貯蔵が容易であり、化学修飾が可能であり、生体内での免疫原性がおそらく低いので、インテグリン結合ペプチドを使用することが好ましい。好ましいインテグリン結合ペプチドは、WO96/15811、および特にWO98/54347に記載されているようなものである。例えばインテグリン結合ペプチドはα4β1インテグリンに特異的であることができる。
【０１２４】
この実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントは、好ましくは
a）RGD；
b）RRETAWA；
c）LDV
から選択されるペプチドを含む。
【０１２５】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、細胞表面受容体結合コンポーネントが、ヒト気道上皮（HAE）細胞に結合する能力を有するペプチドを含む。好ましいHAE細胞結合ペプチドは、WO02/072616に記載されているようなものである。
【０１２６】
この実施例において、細胞表面受容体結合コンポーネントは、好ましくは、
a）X5SM；
b）LX6HK；
c）PSGX7ARA；
d）SX8RSMNF；および
e）LX9HKSMP；
［式中、X5は塩基性アミノ酸残基であり、X6はQまたはPであり、X7はAまたはTであり、X8は酸性アミノ酸残基であり、X9はPまたはQである］
から選択されるペプチドを含む。
【０１２７】
好ましくは、細胞表面受容体結合コンポーネントは、
a）X5SM；
b）LX6HK；および
c）PSGAARA
［式中、X5は塩基性アミノ酸残基であり、X6はQまたはPである］。
から選択されるペプチドを含む。
【０１２８】
好ましくはX5はKまたはRである。好ましくはX6はPである。好ましくはX7はAである。好ましくはX8はEまたはQである。より好ましくはX8はEである。好ましくはX9はPである。したがって好ましいペプチドは、LQHKSMP、LPHKSMP、VKSMVTH、SERSMNF、VGLPHKF、YGLPHKF、PSGAARA、SQRSMNFおよびPSGTARAから選択される配列を含むものである。
【０１２９】
本発明のもう一つの実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントは、ヒト樹状細胞に結合する能力を有するペプチドを含む。好ましいヒト樹状細胞結合ペプチドは、WO2004/108938に記載されているようなものである。例えば、そのようなペプチドは、
a）PX10X11X12T；
b）PSX13S；
c）QX14X15X16Q；
d）SX17S
［式中、X10、X11およびX12は、同じであっても異なってもよく、それぞれアミノ酸残基を表し；
X13はアミノ酸残基を表し；
X14およびX16は、同じであっても異なってもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、
そしてX15は、アミド側鎖を有するアミノ酸残基、例えばNまたはQを表す。
X17は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、例えばLまたはIを表す］
から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドから選択することができる。
【０１３０】
好ましい実施形態において、細胞表面受容体結合コンポーネントは、
a）CRGDCLG；
b）CRGDCLG；
c）ACDCRGDCFCG；
d）CRGDMFGCA；
e）CRRETAWACG；
f）CRGEMFGCA；
g）CSERSMNFCG；
h）CYGLPHKFCG；および
i）CLPHKSMPCG
から選択されるペプチドを含む。
【０１３１】
本発明の好ましい態様において、上記トランスフェクション複合体のコンポーネント（iii）および（iv）は、本発明のペプチド誘導体の形をとる。
【０１３２】
したがって、特に好ましい態様において、本発明は、
（i）核酸、
（ii）上に定義した本発明の脂質誘導体、および
（iii）上に定義した本発明のペプチド誘導体
を含む非ウイルストランスフェクション複合体を提供する。
【０１３３】
核酸コンポーネントは任意の適切な核酸であることができる。これは、DNAもしくはRNAまたは化学修飾された核酸ミメティック、例えばPNA分子であることができる。これは、例えば、ターゲット細胞において有用性を有するタンパク質をコードすることができる。これは、アンチセンス核酸またはRNAi核酸であることができる。
【０１３４】
RNAiは、ターゲット遺伝子が産生する細胞性メッセンジャーRNA（mRNA）分子を、そのmRNA分子の短い部分に相補的な配列を含有する二本鎖RNA（dsRNA）分子に曝露することによって達成される。細胞内部では、その二本鎖RNA分子が切断されて、ターゲットmRNA分子に結合することができる短い（21〜23ヌクレオチド長の）一本鎖および二本鎖フラグメントを生成する。そのような結合は、ヌクレアーゼによるターゲットmRNAの切断につながり、その結果、ターゲット遺伝子の発現レベルの低下が起こる。
【０１３５】
したがって核酸コンポーネントはそれ自体がRNAi分子であってもよいし、あるいは、投与される核酸は、転写された時にRNAi分子（すなわちターゲット遺伝子の発現をRNA干渉によって抑制する能力を有するRNA）を産生する配列を含むDNA分子であってもよい。
【０１３６】
本発明は、本発明のトランスフェクション複合体を製造するための方法も提供する。
【０１３７】
さらに本発明は、本発明のトランスフェクション複合体を医薬的に適切な担体と混合して含む、または本発明のトランスフェクション複合体を医薬的に適切な担体と共に含む、医薬組成物を提供する。
【０１３８】
さらに本発明は、ある遺伝子の欠陥および/または欠乏によってヒトまたは非ヒト動物に引き起こされる状態を処置または予防するための方法であって、そのヒトまたは非ヒト動物に本発明のトランスフェクション複合体を投与することを含む方法を提供する。
【０１３９】
本明細書で使用する「ある遺伝子の欠陥および/または欠乏」という用語は、ある遺伝子のコード領域の欠陥または欠乏を表すだけでなく、その遺伝子の制御エレメント（例えばトランスまたはシスに位置する制御エレメント）の欠陥もしくは欠乏、またはその遺伝子の転写もしくは翻訳に直接的であれ間接的であれ関与する他の任意のエレメントの欠陥もしくは欠乏も表す。
【０１４０】
さらに本発明は、ヒトまたは非ヒト動物を治療的または予防的に免疫処置するための方法であって、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスRNA）またはRNAi治療に適した核酸を含む本発明のトランスフェクション複合体を、そのヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む方法を提供する。
【０１４１】
本発明は、本発明のトランスフェクション複合体をヒトまたは非ヒト動物に投与することを含み、核酸がアンチセンス治療に適した核酸（例えばRNA）またはRNAi治療に適した核酸である、アンチセンス治療の方法も提供する。
【０１４２】
さらに本発明は、医薬またはワクチンとして使用するための本発明のトランスフェクション複合体も提供する。
【０１４３】
本発明は、ある遺伝子の欠陥および/または欠乏によってヒトまたは非ヒト動物に引き起こされる状態を予防するための医薬、または治療的もしくは予防的免疫処置のための医薬、またはアンチセンス治療もしくはRNAi治療のための医薬の製造を目的とする、本発明のトランスフェクション複合体の使用も提供する。
【０１４４】
合成ベクターによる遺伝子導入を制限するステップの一つは、核内へのDNAの侵入と核内でのDNAの転写を可能にするであろう複合体の非解離である（概観するにはWiethoffおよびMiddaugh「Barriers to nonviral gene delivery」J Pharm Sci. 2003 Feb;92(2):203-17；およびLechardeurら「Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer」Adv Drug Deliv Rev. 2005 Apr 5;57(5):755-67を参照されたい）。PEGコンポーネントからの脂質の切断は、エンドソーム膜不安定化をもたらし（WrobelおよびCollins「Fusion of cationic liposomes with mammalian cells occurs after endocytosis」Biochim Biophys Acta. 1995 May 4;1235(2):296-304）、細胞質中に放出されるプラスミドDNAの量を増加させ（Hafezら「On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids」Gene Ther. 2001 Aug;8(15):1188-96）、したがってトランスフェクション効率を増加させると推測される（ただし本発明者らはこの理論に拘泥するわけではない）。
【実施例】
【０１４５】
I−ペプチド合成
記載のペプチド（Table IA）を標準的な装置および技法を使って合成した。
【０１４６】
ME27、ME28、ME29、ME61、ME68、FMM8、FMM7、ME69、FMM12は、SYRO自動ペプチド合成装置で合成した。
【０１４７】
直鎖ペプチド配列：ペプチドは、テフロンフリット付きの2mlシリンジと500μlのカップリング体積を使って、20μmolスケールで合成した。これらの配列にはFmoc-GlyプレロードNovaSyn TGTレジンまたはFmoc-Gly-2-Cl-Trt-レジンを使用した。既報の手法に従って合成したFmoc-Peg4-COOH（ME28およびME29に使用）を除けば（WO2005/117985の82頁にあるFmoc-Haa4-COOHの合成を参照されたい−Fmoc-Haa4-COOHはその明細書においてFmoc-Peg4-COOHに与えられた名称である）、標準的なFmoc保護アミノ酸を使用した（Novobiochem）。TGTレジンはまず最初に10分間膨潤させたが、2-Cl-TrtレジンはDMF中で長時間にわたる初期膨潤時間（数時間）を必要とした。通常のカップリングを、HBTU（DMF中）およびDIPEA（NMP中）により、4倍過剰量の試薬を使って行った。Fmocを、DMF中の40％ピペリジン溶液で3分間および20％溶液で10分間切断した。合成サイクルは、40分のカップリング時間、40％ピペリジンによるFmoc脱保護に3分、20％ピペリジンによるFmoc脱保護にさらに10分、および洗浄ステップからなった。合成およびDMFによる最後の洗浄サイクル後に、Syroの「マニュアル（munual）」/「エンプティ（empty）」機能を使って、ペプチドをDCM、メタノールおよびジメチルエーテルで洗浄した（各3回）。エーテルの蒸発を助長するために、さらにしばらくの間、吸引をかけた。
【０１４８】
オン−レジン ジスルフィド結合形成：レジン上でジスルフィド橋を形成させるために、レジンをPEフリット付きのシリンジに入れ、DMF中で膨潤させた。過剰のDMFを除去した後、新しく調製した最少量のDMF中のヨウ素の溶液（例えば2mlシリンジの場合、500μl、レジン負荷量に対して10等量のヨウ素）を加え、シリンジを4時間の間、4分毎に、20秒間ボルテックスした。試薬溶液を除去し、レジンをDMFで10〜20回、DCM、メタノールおよびエーテルでそれぞれ3回洗浄した。
【０１４９】
切断および脱保護：
切断のためにシリンジを換気フードに移した。切断は95％TFA、2.5％TISおよび2.5％H2Oのカクテルで行った。最少量の新しく調製したカクテルを加えてレジンを覆った（例えば2mlシリンジに＜500μl）。4時間後にプランジャーを使って切断溶液をPPチューブに通し、レジンを新たな最少量の切断カクテルで洗浄した（例えば2mlシリンジに200μl）。次にペプチドをエーテルで沈殿させた(例えば2mlシリンジの合わせたフラクションに4mlのジエチルエーテルを加えた）。PPチューブを少なくとも15分間はフリーザーに入れてから、3000rpmで3分間遠心分離し、溶液をペプチドペレットからデカントした。遠心分離とデカンテーションを約2mlのエーテルを使って2回繰り返した。最後にペプチドを水またはtBuOH/水（4：1）に溶解し、凍結乾燥した。いくつかのペプチド配列は、極めて低い溶解性を示し、綿毛状のペプチドを得るには、異なる溶媒混合物（水、tBuOHまたはアセトニトリル）を使った数回の凍結乾燥/溶解プロセスが必要な場合もあった。ペプチドを逆相HPLCで分析し、必要な場合は逆相HPLCで純度＞90％まで精製した。質量スペクトルはMicromass Quattro ES-MS（ソフトウェア：Masslynx）を使って記録した。それらの質量をTable IBに記録する。
【０１５０】
FMM5もSYRO自動ペプチド合成装置で合成した。
【０１５１】
直鎖ペプチド配列：
ペプチドは、テフロンフリット付きの2mlシリンジと500μlのカップリング体積を使って、20μmolスケールで合成した。全てのアミノ酸に標準的側鎖保護基を使用した；Cys24およびCys32にはAcmを使用し；Cys26およびCys30にはTrtを使用した。Fmoc-GlyプレロードNovaSyn TGTレジンを使用した。TGTレジンをまず最初に10分間膨潤させた。通常のカップリングを、HBTU（DMF中）およびDIPEA（NMP中）により、4倍過剰量の試薬を使って行った。Fmoc基を、DMF中の40％ピペリジン溶液で3分間および20％溶液で10分間切断した。合成サイクルは、40分のカップリング時間、40％ピペリジンによるFmoc脱保護に3分、20％ピペリジンによるFmoc脱保護にさらに10分、および洗浄ステップからなった。合成およびDMFによる最後の洗浄サイクル後に、Syroの「マニュアル（munual）」/「エンプティ（empty）」機能を使って、ペプチドをDCM、メタノールおよびジメチルエーテルで洗浄した（各3回）。エーテルの蒸発を助長するために、さらにしばらくの間、吸引をかけた。
【０１５２】
空気酸化：
ペプチドを脱気水に溶解して最終濃度を約0.25mg/mlにした。溶液を室温で撹拌放置して、1週間、大気に曝露した。1週間後に反応を減圧下で濃縮し、残った残渣を脱気水に再溶解し、凍結乾燥した。これにより、Cys26とCys30の間にジスルフィド結合が形成された。
【０１５３】
第2のジスルフィド橋の形成：
ペプチドおよびジフェニルスルホキシドを、0℃、Ar下で、TFAおよびアニソールに溶解した。次にトリクロロメチルシランを加え、反応をArでパージして、室温まで温まらせながら3時間撹拌した。次にペプチドを遠心管に移し、エーテルで沈殿させた。PPチューブを少なくとも15分間はフリーザーに入れてから、3000rpmで3分間遠心分離し、溶液をペプチドペレットからデカントした。遠心分離およびデカンテーションを約2mlのエーテルで2回繰り返した。最後にペプチドを水またはtBuOH/水（4：1）に溶解し、凍結乾燥した。ペプチドをRP HPLCで精製した。質量スペクトルはMicromass Quattro ES-MS（ソフトウェア：Masslynx）を使って記録した。それらの質量をTable IBに記録する。
【０１５４】
PCY、ペプチドYはAlta Biosciences（www.Altabioscience.bham.ac.uk）から購入したものであり、標準的な自動ペプチド合成技法を使って合成された。ペプチドを逆相HPLCで分析し、必要な場合は逆相HPLCで純度96％（PCY）および95％（ペプチドY）まで精製した。相対分子質量をTable 1Bに示す。
【０１５５】
K16、ペプチド1、ペプチド6、ペプチド11、ペプチドEは、既に述べたように購入した（ペプチド1についてはHartら「Integrin-mediated transfection with peptides containing arginine-glycine-aspartic acid domains」Gene Ther．1997 Nov;4(11):1225-30；ペプチド6およびK16についてはHartら「Lipid-mediated enhancement of transfection by a nonviral integrin-targeting vector」Hum Gene Ther.，1998，9，575-585；ペプチド11についてはUduehiら「Enhancement of integrin-mediated transfection of haematopoietic cells with a synethetic vector system」Biotechnol．Appl．Biochem.，2003，38，201-209；ペプチドEについてはWriterら「Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display」J．Drug Target.，2004，12，185-193）。相対分子質量をTable IBに示す。
【０１５６】
これらの凍結乾燥ペプチドは全て、水に10mg/mlの濃度で希釈し、数ヶ月間、-20℃で保存した。いったん融解したら、小分けしたペプチドを、数週間、4℃に保った。凍結融解サイクルの反復は、ペプチド分解につながるので避けるべきである。
【表１】
2009542582.tif 000006
【０１５７】
II−PEG-エステル脂質合成
A−ME42
【化４】
2009542582.tif 000007
5-ブロモペンタン酸8-ヒドロキシ-3,6-ジオキソオクチルエステル3
トリエチレングリコール1（2.25ml，15mmol）をジクロロメタン（10ml）中、室温で10分間撹拌した。5-ブロモペンタノイルクロリド2（670μl，5mmol）を滴下し、撹拌を18時間続けた。その混合物を減圧下で濃縮した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の生成物3を帯黄色油状物として得た（900mg，58％）。
δH（300MHz；CDCl3）1.68（2H，m，COCH2CH2）、1.80（2H，m，CH2CH2Br）、2.28（2H，t，J 7.2Hz，COCH2）、3.31（2H，t，J 6.5Hz，CH2Br）、3.47-3.62（10H，m）、4.14（2H，t，J 4.7Hz，CH2OCO）；
δC（75MHz；CDCl3）23.35（COCH2CH2）、31.86（CH2CH2Br）、33.03（CH2Br）、33.07（COCH2）、61.51（HOCH2）、63.32（CH2OCO）、69.01（CH2CH2OCO）、70.20（HOCH2CH2OCH2）、70.44（CH2OCH2CH2OCO）、72.50（HOCH2CH2）、173.05（C=O）；
m/z（ES+）335.04651（[M+Na]+）。
【０１５８】
(2,3-ビス-オクタデカ-9-エニルオキシプロピル)-(8-ヒドロキシ-3,6-ジオキソオクチルオキシカルボニルブチル)-ジメチルアンモニウムブロミド（ME42）
アセトン（5ml）中の(2,3-ビス-オクタデカ-9-エニルオキシプロピル)-ジメチルアミン4（378mg，0.61mmol）(Hurleyら，J．Org．Chem.，2004，69，980-984によって既に記述されているようにオクタデカ-9-エニル=メシレートおよび3-ジメチルアミノ-1,2-プロパンジオールから合成したもの）と3（335mg，1.07mmol）との混合物を、封管中、80℃で48時間撹拌した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；5％→10％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、ME42を橙色油状物として得た（140mg，27％）。
δH（300MHz；CDCl3）0.89（6H，t，J 6.7Hz，2×CH2CH3）、1.25（44H，m）、1.53（4H，m，2×OCH2CH2CH2）、1.72（2H，m，COCH2CH2）、1.85（2H，m，CH2CH2N+）、1.99（8H，m，2×CH2CH=CHCH2）、2.45（2H，t，J 6.8Hz，COCH2）、3.36-3.43（11H，m，2×CH3N+，CHOCH2，CHCH2OCH2，N+CH2CHの1H）、3.54-3.72（14H，m，8×CH2CH2O，HOCH2，CH2NCH2CH，CHCH2OCH2）、3.88（1H，d，J 13.2 N+CH2CH）、4.06（1H，m，CH）、4.23（2H，t，J 4.6Hz，CH2OCO）、5.32（4H，m，2×CH=CH）；
δC（75MHz；CDCl3）14.10（2×CH2CH3，オーバーラップ）、21.52（COCH2CH2）、22.06（CH2CH2N+）、22.66、26.03、26.22、27.20、29.14-30.17（シグナルオーバーラップ）、32.59、33.20（COCH2）、52.25（2×CH3N+，オーバーラップ）、61.39（HOCH2）、63.44（CH2OCO）、65.14（N+CH2CH）65.73（CH2CH2N+）、68.44（CHCH2O）、68.96（CH2CH2OCO）、69.28（CHOCH2）、70.16（HOCH2CH2OCH2）、70.49（CH2OCH2CH2OCO）、71.99（CHCH2OCH2）、72.50（HOCH2CH2）、73.31（CH）、129.72（2×CH=CH，オーバーラップ）、129.95（2×CH=CH，オーバーラップ）172.74（C=O）；
m/z（ES+）852.76483（M+）。
【０１５９】
B−ME53
【化５】
2009542582.tif 000008
5-ブロモペンタン酸3,6,9-トリオキソデシルエステル6
トリエチレングリコールモノメチルエーテル5（880μl，5.5mmol）をジクロロメタン（10ml）中、室温で10分間撹拌した。5-ブロモペンタノイルクロリド2（670μl，5mmol）を滴下し、撹拌を18時間続けた。その混合物を減圧下で濃縮した。生成物をシリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；2％→7％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の生成物6を帯黄色油状物として得た（805mg，51％）。
δH（300MHz；CDCl3）1.70（2H，m，COCH2CH2）、1.81（2H，m，CH2CH2Br）、2.30（2H，t，J 7.2Hz，COCH2）、3.30（3H，s，CH3O）、3.33（2H，t，J 6.5Hz，CH2Br）、3.45-3.64（10H，m）、4.15（2H，t，J 4.7Hz，CH2OCO）；
δC（75MHz；CDCl3）23.38（COCH2CH2）、31.87（CH2CH2Br）、33.04（CH2Br）、33.06（COCH2）、58.97（CH3O）、63.47（CH2OCO）、69.05（CH2CH2OCO）、70.49（シグナルオーバーラップ）、70.54、71.86（CH3OCH2）、172.98（C=O）；
m/z（ES+）349.06202（[M+Na]+）。
【０１６０】
(2,3-ビス-オクタデカ-9-エニルオキシプロピル)-(3,6,9-トリオキソデシルオキシカルボニルブチル)-ジメチル-アンモニウムブロミド（ME53)
アセトン（5ml）中の4（430mg，0.69mmol）と6（252mg，0.8mmol）との混合物を、封管中、室温で24時間、次に80℃でさらに24時間撹拌した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（10％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、ME53を橙色油状物として得た（264mg，44％）。
δH（300MHz；CDCl3）0.85（6H，t，J 6.7Hz，2×CH2CH3）、1.24（44H，m）、1.53（4H，m，2×OCH2CH2CH2）、1.69（2H，m，COCH2CH2）、1.84（2H，m，CH2CH2N+）、1.99（8H，m，2×CH2CH=CHCH2）、2.44（2H，t，J 6.8Hz，COCH2）、3.34-3.45（14H，m，2×CH3N+，CH3O，CHOCH2，CHCH2OCH2，N+CH2CHの1H）、3.54-3.72（14H，m，8×CH2CH2O，CH3OCH2，CH2NCH2CH，CHCH2OCH2）、3.88（1H，d，J 13.6 N+CH2CH）、4.05（1H，m，CH）、4.21（2H，t，J 4.7Hz，CH2OCO）、5.32（4H，m，2×CH=CH）；
δC（75MHz；CDCl3）14.07（2×CH2CH3，オーバーラップ）、21.46（COCH2CH2）、22.11（CH2CH2N+）、22.62、25.99、26.18、27.16、29.13-29.98（シグナルオーバーラップ）、31.84、32.55、33.11（COCH2）、52.17（CH3N+）52.31（CH3N+）、58.95（CH3O）、63.57（CH2OCO）、64.98（N+CH2CH）、65.62（CH2CH2N+）、68.44（CHCH2O）、68.96（CH2CH2OCO）、69.23（CHOCH2）、70.46（シグナルオーバーラップ）、70.52、71.86（CH3OCH2）、71.92（CHCH2OCH2）、73.27（CH）、129.69（2×CH=CH，オーバーラップ）、129.90（2×CH=CH，オーバーラップ）172.61（C=O）；
m/z（ES+）866.78074（M+）。
【０１６１】
C−ME52
【化６】
2009542582.tif 000009
5-ブロモペンタン酸17-ヒドロキシ-3,6,9,12,15-ペンタオキソヘプタデシルエステル8
ヘキサエチレングリコール7（3.75ml，15mmol）をジクロロメタン（10ml）中、室温で10分間撹拌した。5-ブロモペンタノイルクロリド2（670μl，5mmol）を滴下し、撹拌を18時間続けた。その混合物を減圧下で濃縮した。生成物をシリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；5％→10％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の生成物8を帯黄色油状物として得た（1.429g，64％）。
δH（300MHz；CDCl3）1.44（2H，m，COCH2CH2）、1.55（2H，m，CH2CH2Br）、2.04（2H，t，J 7.2Hz，COCH2）、3.11（2H，t，J 6.5Hz，CH2Br）、3.22-3.38（22H，m）、3.88（2H，t，J 4.8Hz，CH2OCO）；
δC（75MHz；CDCl3）23.18（COCH2CH2）、31.64（CH2CH2Br）、32.77（CH2Br）、33.03（COCH2）、61.14（HOCH2）、63.21（CH2OCO）、68.76（CH2CH2OCO）、70.03-70.27（シグナルオーバーラップ）、72.38（HOCH2CH2）、172.60（C=O）；
m/z（ES+）467.12615（[M+Na]+）。
【０１６２】
(2,3-ビス-オクタデカ-9-エニルオキシプロピル)-(17-ヒドロキシ-3,6,9,12,15-ペンタオキソヘプタデシル-オキシカルボニル-ブチル)-ジメチルアンモニウムブロミド（ME52)
アセトン（5ml）中の4（395mg，0.64mmol）と8（330mg，0.74mmol）との混合物を、封管中、室温で24時間撹拌し、次に80℃でさらに24時間撹拌した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；5％→10％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、ME52を橙色油状物として得た（300mg，47％）。
δH（300MHz；CDCl3）0.85（6H，t，J 6.7Hz，2×CH2CH3）、1.24（44H，m）、1.52（4H，m，2×OCH2CH2CH2）、1.69（2H，m，COCH2CH2）、1.84（2H，m，CH2CH2N+）、1.98（8H，m，2×CH2CH=CHCH2）、2.44（2H，t，J 6.9Hz，COCH2）、3.37-3.43（11H，m，2×CH3N+，CHOCH2，CHCH2OCH2，N+CH2CHの1H）、3.54-3.70（26H，m，20×CH2CH2O，HOCH2，CH2NCH2CH，CHCH2OCH2）、3.92（1H，d，J 13.4 N+CH2CH）、4.06（1H，m，CH）、4.22（2H，t，J 4.7Hz，CH2OCO）、5.31（4H，m，2×CH=CH）；
δC（75MHz；CDCl3）14.05（2×CH2CH3，オーバーラップ）、21.47（COCH2CH2）、22.09（CH2CH2N+）、22.59、25.97、26.15、27.13、29.10-29.70（シグナルオーバーラップ）、29.97、31.82、32.53、33.19（COCH2）、52.19（2×CH3N+，オーバーラップ）、61.08（HOCH2）、63.45（CH2OCO）、64.99（N+CH2CH）、65.61（CH2CH2N+）、68.50（CHCH2O）、69.05（CH2CH2OCO）、69.21（CHOCH2）、69.89、70.18-70.27（シグナルオーバーラップ）、71.89（CHCH2OCH2）、72.31（HOCH2CH2）、73.25（CH）、129.69（2×CH=CH，オーバーラップ）、129.87（2×CH=CH，オーバーラップ）172.79（C=O）；
m/z（ES+）984.84335（M+）。
【０１６３】
III-PEG-アセタール脂質合成
PEGアセタール脂質は以下に概略を示す一般構造を有するものだった。二つの異なる長さを有する短いPEG鎖を組み込んだ。アセタールのPEG鎖とカチオン性頭部の間のスペーサーは、さまざまな長さ（4〜8個の炭素）を有するものだった。製造した大半の化合物でR＝Hを使用したが、表示するとおり、いくつかの化合物にはR＝Meも組み込んだ。二つの代表的鎖長の脂質（多くの脂質に使用される/存在するC-9位のC18:1を大部分に、C-11位のC16:1を残りのものに）を組み込んだ。
【化７】
2009542582.tif 000010
【０１６４】
スキーム1に概略を示すように、まず最初に、ペンダントブロミド基を有するスペーサーを含有するPEGアセタールを製造してから、それを3級アミンにカップリングした。
【化８】
2009542582.tif 000011
スキーム1
【０１６５】
A−PEGブロモアセタール形成の一般手法
ブロモアルコール（11.1mmol，1.0等量）、N-メチルモルホリン-N-オキシド（NMO，12.2mmol，1.1等量）および活性化したモレキュラーシーブ（4Å，粉末；300mg/mmol）の無水ジクロロメタン（45mL）溶液に、過ルテニウム酸テトラ-n-プロピルアンモニウム（TPAP，1.11mmol，0.1等量）を加えた。室温で10分間撹拌した後、その懸濁液を小さなシリカゲルプラグ越しに濾過し、残渣をジクロロメタン（20mL×3）で洗浄した。合わせた有機濾液を減圧下で濃縮することによって得た対応するアルデヒドを、それ以上精製することなく、次の工程に使用した。
【０１６６】
粗アルデヒド（11.1mmol，1.0等量）、PEG-アルコール（44.4mmol，4等量）、p-トルエンスルホン酸一水和物（monohydride）（3.35mmol，0.3等量）および活性化した粉末モレキュラーシーブ（4Å，400mg/mmol）の無水ジクロロメタン（50ml）溶液を、室温で48時間撹拌した。その懸濁液を小さなシリカゲルプラグ越しに濾過し、残渣をジクロロメタン（20mL×3）で洗浄した。合わせた有機濾液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（30mL）、水（30mL）およびブライン（30mL）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。
【０１６７】
a）7-(3-ブロモプロピル)-3,6,8,11-テトラオキサトリデカン-1,13-ジオール（JBW381）
【化９】
2009542582.tif 000012
以下の量を使って上記の手法を実行した：1-ブロモブタン-4-オール（1.70g，11.1mmol）、NMO（1.47g，12.1mmol）、モレキュラーシーブ（3.30g）、ジクロロメタン（45mL）、TPAP（0.39g，1.11mmol）；ジエチレングリコール（3.99ml，44.4mmol）、p-トルエンスルホン酸一水和物（0.64g，3.35mmol）、モレキュラーシーブ（4.40g）およびジクロロメタン（50mL）。中性アルミナでのクロマトグラフィー（勾配；ジクロロメタン→2％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（0.68g，40％）。
Rf 0.35（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3358br s、1128m、1063br m；δH（300MHz；CDCl3）1.73（2H，m，CHCH2）、1.87（2H，m，CH2CH2Br）、3.37（2H，t，J 6.5Hz，CH2Br）、3.43（2H，m，OH）、3.50-3.81（16H，m，PEG-OCH2CH2）、4.58（2H，t，J 5.6Hz，OCHO）；δC（75.4MHz；CDCl3）28.0（CH2）、31.7（CH2）、33.5（CH2）、61.8（CH2OH）、64.6（CHOCH2）、70.6（CHOCH2CH2）、72.8（CH2CH2OH）、102.2（OCHO）；m/z（+ES）369（[M(81Br)+Na]+，97％）、367（[M(79Br)+Na]+，100％）；m/z（+HRES）367.0723（[M(79Br)+Na]+，C12H25BrO6Naには367.0727が必要）。
【０１６８】
b）7-(5-ブロモペンチル)-3,6,8,11-テトラオキサトリデカン-1,13-ジオール（JBW407）
【化１０】
2009542582.tif 000013
以下の量を使って上記の手法を実行した：1-ブロモヘキサン-6-オール（1.76g，10.3mmol）、NMO（1.33g，11.3mmol）、モレキュラーシーブ（3.0g）、ジクロロメタン（40mL）、TPAP（0.37g，1.03mmol）；ジエチレングリコール（4.63ml，51.5mmol）、p-トルエンスルホン酸一水和物（0.59g，3.90mmol）、モレキュラーシーブ（4.0g）およびジクロロメタン（50mL）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；ジクロロメタン→5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（0.45g，12％）。
Rf 0.38（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3362br s、1124m、1074br m；δH（300MHz；CDCl3）1.35（4H，m，CHCH2CH2CH2）、1.59（2H，dt，J 5.7，8.2Hz，CHCH2CH2）、1.79（2H，tt，J 6.7，7.1Hz，CH2CH2Br）、3.27（2H，t，J 5.7Hz，OH）、3.36（2H，t，J 6.7Hz，CH2Br）、3.51-3.82（16H，m，PEG-OCH2CH2）、4.54（2H，t，J 5.7Hz，OCHO）；δC（75.4MHz；CDCl3）23.8（CH2）、27.8（CH2）、32.6（CH2）、32.8および33.8（2×CH2）、61.6（CH2OH）、64.3（CHOCH2）、70.5（CHOCH2CH2）、72.7（CH2CH2OH）、102.8（OCHO）；m/z（+ES）398（[M(81Br)+Na]+，95％）、396（[M(79Br)+Na]+，100％）；m/z（+HRES）395.1039（[M(79Br)+Na]+，C14H29BrO6Naには395.1040が必要）。
【０１６９】
c）13-(5-ブロモペンチル)-3,6,9,12,14,17,20,23-オクタオキサペンタコサン-1,25-ジオール（JBW408）
【化１１】
2009542582.tif 000014
以下の量を使って上記の手法を実行した：1-ブロモヘキサン-6-オール（1.76g，10.3mmol）、NMO（1.33g，11.3mmol）、モレキュラーシーブ（3.0g）、ジクロロメタン（40mL）、TPAP（0.37g，1.03mmol）；テトラエチレングリコール（8.88ml，51.5mmol）、p-トルエンスルホン酸一水和物（0.59g，3.90mmol）、モレキュラーシーブ（2.7g）およびジクロロメタン（50mL）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；ジクロロメタン→5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（0.49g，9％）。
Rf 0.33（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3418br m、1185m、1107m、1072br m；
δH（300MHz；CDCl3）1.33（4H，m，CHCH2CH2CH2）、1.55（2H，dt，J 5.7，8.0Hz，CHCH2CH2）、1.79（2H，tt，J 6.8，7.3Hz，CH2CH2Br）、3.00（2H，t，J 6.3Hz，OH）、3.33（2H，t，J 6.2Hz，OH）、3.36（2H，t，J 6.7Hz，CH2Br）、3.50-3.75（32H，m，PEG-OCH2CH2）、4.51（2H，t，J 5.7Hz，OCHO）；δC（75.4MHz；CDCl3）23.8（CH2）、27.9（CH2）、32.6（CH2）、32.9および33.8（2×CH2）、61.6（CH2OH）、64.4（CHOCH2）、70.3-70.6（OCH2CH2O，シグナルオーバーラップ）、72.5（CH2CH2OH）、103.0（OCHO）；m/z（+ES）574（[M(81Br)+Na]+，96％）、572（[M(79Br)+Na]+，100％）；m/z（+HRES）571.2081（[M(79Br)+Na]+，C22H45BrO10Naには571.2088が必要）。
【０１７０】
d）7-(7-ブロモヘプチル)-3,6,8,11-テトラオキサトリデカン-1,13-ジオール（JBW396）
【化１２】
2009542582.tif 000015
以下の量を使って上記の手法を実行した：1-ブロモオクタン-8-オール（2g，9.57mmol）、NMO（1.12g，9.57mmol）、モレキュラーシーブ（3.0g）、ジクロロメタン（40mL）、TPAP（0.34g，0.96mmol）；ジエチレングリコール（5.18ml，57.6mmol）、p-トルエンスルホン酸一水和物（0.55g，2.91mmol）、モレキュラーシーブ（4.0g）およびジクロロメタン（40mL）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；ジクロロメタン→3％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を無色の油状物として得た（1.50g，39％）。
Rf 0.35（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3434br s、1128br m、1071br m；δH（300MHz；CDCl3）1.22-1.47（8H，m，4×CH2）、1.60（2H，m，CH2）、1.82（2H，tt，J 6.8，7.1Hz，CH2CH2Br）、3.22（2H，t，J 6.2Hz，OH）、3.37（2H，t，J 6.8Hz，CH2Br）、3.56-3.76（16H，m，PEG-OCH2CH2）、4.56（2H，t，J 6.0Hz，OCHO）；δC（75.4MHz；CDCl3）24.6（CH2）、28.0、28.6および29.2（3×CH2）、32.7（CH2）、33.0（CH2）、34.0（CH2）、61.7（CH2OH）、64.3（CHOCH2）、70.6（CHOCH2CH2）、72.7（CH2CH2OH）、102.9（OCHO）；m/z（+ES）425（[M(81Br)+Na]+，100％）、423（[M(79Br)+Na]+，83％）；m/z（+HRES）423.1361（[M(79Br)+Na]+，C16H33BrO6Naには423.1353が必要）。
【０１７１】
e）9-(5-ブロモペンチル)-2,5,8,10,13,16-ヘキサオキサヘプタデカン（JBW409）
【化１３】
2009542582.tif 000016
以下の量を使って上記の手法を実行した：1-ブロモ-ヘキサン-6-オール（1.76g，10.3mmol）、NMO（1.33g，11.3mmol）、モレキュラーシーブ（3.0g）、ジクロロメタン（40mL）、TPAP（0.37g，1.03mmol）；ジエチレングリコールメチルエーテル（3.63ml，30.9mmol）、p-トルエンスルホン酸一水和物（0.59g，3.90mmol）、モレキュラーシーブ（4.0g）およびジクロロメタン（50mL）。中性アルミナでのクロマトグラフィー（勾配；ジクロロメタン→2％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（1.45g，35％）。
Rf 0.43（2％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 1113br s、1078br s、1028m、1001m；δH（300MHz；CDCl3）1.38（4H，dt，J 6.2Hz，CH2CH2）、1.59（2H，dt，J 5.7，8.3Hz，CHCH2）、1.81（2H，tt，J 6.8，7.0Hz，CH2CH2Br）、3.35（6H，s，CH3）、3.24-3.49（2H，m，CH2Br）、3.51-3.82（16H，m，PEG-OCH2CH2）、4.56（2H，t，J 5.7Hz，OCHO）；δC（75.4MHz；CDCl3）23.8（CH2）、27.9（CH2）、32.7（CH2Br）、33.0（CH2）、33.7（CH2）、59.0（CH3）、64.4（CHOCH2）、70.5および70.6（CH2OCH2）、72.0（CH3OCH2）、103.1（OCHO）；m/z（+ES）424（[M(81Br)+Na]+，94％）、423（[M(79Br)+Na]+，100％）；m/z（+HRES）423.1351（[M(79Br)+Na]+，C13H33BrO6Naには423.1353が必要）。
【０１７２】
B−アセタール脂質形成の一般手法
ブロモアセタール（0.43mmol，1等量）および3級アミン（0.57mmol，1.3等量）を封管中、40℃で48時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム/メタノールの1：1混合物に溶解し、クロロホルム/メタノール（1：1）を溶離液とするアンバーライト（Amberlite（登録商標））IRA-400（Cl）イオン交換カラムに通した後、減圧下で濃縮した。3級アミンAおよびBは既報のように製造した（Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1987，84，7413-7417；Hurleyら，J．Org．Chem.，2004，69，980-984）。
【化１４】
2009542582.tif 000017
【０１７３】
a）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-4,4-ビス(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)-N,N-ジメチルブタン-1-アミニウムクロリド（JBW389）
【化１５】
2009542582.tif 000018
以下の量を使って上記の手法を実行した：C18:1鎖を有する3級アミンA（0.15g，0.43mmol）およびJBW381（0.35g，0.57mmol）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（81mg，21％）。
Rf 0.32（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3383br s、1634w、1123br m、1080m；δH（300MHz；CDCl3）0.83（6H，t，J 6.6Hz，2×CH2CH3）、1.13-1.39（44H，m）、1.50（4H，m，2×CH2）、1.74（2H，m，CH2CH2CH2N+）、1.83-2.05（10H，m，2×CH2CH=CH，CH2CH2N+）、3.28（3H，s，N+CH3）、3.31（3H，s，N+CH3）、3.39（4H，t，J 6.9Hz，2×CH2CH2O）、3.48-3.94（22H，m）、4.00（1H，m，CHOCH2）、4.79（1H，m，CHアセタール）、5.33（4H，m，2×CH=CH）；δC（75.4MHz；CDCl3）14.1（2×CH2CH3）、17.9、22.7、26.0、26.2、27.2、29.2-30.2（シグナルオーバーラップ）、31.9、32.6、51.9（N+CH3）、52.2（N+CH3）、61.2（CH2OH）、65.1、65.9、66.0、68.8、69.3、70.6、72.0、72.7、73.3、103.0（CHアセタール）、129.8および129.9（C=C）；m/z（+ES）885（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRES）885.7988（[M-Cl]+，C53H107NO6には885.7991が必要）。
【０１７４】
b）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-6,6-ビス(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)-N,N-ジメチルヘキサン-1-アミニウムクロリド（JBW411）
【化１６】
2009542582.tif 000019
以下の量を使って上記の手法を実行した：C18:1鎖を有する3級アミンA（0.30g，0.48mmol）およびJBW407（0.16g，0.44mmol）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を黄色油状物として得た（0.12g，29％）。
Rf 0.34（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3357br m、1622m、1124m、1078br m；δH（300MHz；CDCl3）0.86（6H，t，J 6.7Hz，2×CH2CH3）、1.15-1.38（46H，m）、1.44（2H，m，CH2）、1.53（4H，m，2×CH2）、1.65（2H，dt，J 6.0，6.2Hz，CH2CHOアセタール）、1.79（2H，m，CH2CH2N+）、1.90-2.06（8H，m，2×CH2CH=CH）、2.46（2H，s，br，OH）、3.29（3H，s，N+CH3）、3.33（3H，s，N+CH3）、3.32-3.50（8H，m，2×CH2CH2O，2×CH2N+）、3.52-3.91（18H，m，OCHCH2OCH2，16PEG CH2）、3.97（1H，m，CHOCH2）、4.65（1H，t，J 5.6Hz，CHアセタール）、5.34（4H，m，2×CH=CH）；δC（75.4MHz；CDCl3）14.1（2×CH2CH3）、22.6、22.7、23.9、25.7、26.0、26.2、27.2、29.3-30.2（シグナルオーバーラップ）、31.9、32.6、32.8、51.9（N+CH3）、52.3（N+CH3）、61.5（CH2OH）、64.9、65.2、68.5、69.4、70.5、72.0、72.7、73.3、103.0（CHアセタール）、129.8および130.0（C=C）；m/z（+ES）914（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRES）912.8235（[M-Cl]+，C55H110NO8には912.8236が必要）。
【０１７５】
c）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-6,6-ビス(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)-N,N-ジメチルヘキサン-1-アミニウムクロリド（JBW412）
【化１７】
2009542582.tif 000020
以下の量を使って上記の手法を実行した： C18:1鎖を有する3級アミンA（0.30g，0.48mmol）およびJBW408（0.24g，0.44mmol）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（0.18mg，33％）。
Rf 0.31（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3362br s、1643w、1124br m、1082br m；
δH（300MHz；CDCl3）0.85（6H，t，J 6.5Hz，2×CH2CH3）、1.15-1.41（48H，m）、1.52（4H，m，2×CH2）、1.62（2H，m，CH2CHOアセタール）、1.74（2H，m，CH2CH2N+）、1.97（8H，m，2×CH2CH=CH）、2.78（2H，s，br，OH）、3.31（3H，s，N+CH3）、3.34（3H，s，N+CH3）、3.35-3.50（8H，m，2×CH2CH2O，2×CH2N+）、3.51-3.93（34H，m，OCHCH2OCH2，32PEG CH2）、4.03（1H，m，CHOCH2）、4.58（1H，t，J 5.4Hz，CHアセタール）、5.34（4H，m，CH=CH）；δC（75.4MHz；CDCl3）14.1（2×CH2CH3）、22.5、22.7、23.9、25.8、26.0、26.2、27.2、29.3-30.0（シグナルオーバーラップ）、31.9、32.5、32.6、52.0（2×N+CH3）、61.4（CH2OH）、64.1、65.1、68.5、69.3、70.1、70.4、70.5-70.6（シグナルオーバーラップ）、72.0、72.8、73.4、103.0（CHアセタール）、129.8および130.0（C=C）；m/z（+ES）1090（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRES）1088.9280（[M-Cl]+，C63H126NO12には1088.9275が必要）。
【０１７６】
d）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-6,6-ビス(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)-N,N-ジメチルヘキサン-1-アミニウムクロリド（JBW413）
【化１８】
2009542582.tif 000021
以下の量を使って上記の手法を実行した：C18:1鎖を有する3級アミンA（0.30g，0.48mmol）およびJBW409（0.18g，0.44mmol）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（2％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（0.21g，44％）。
Rf 0.41（2％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 1633m、1123br s、1086m、1030w；δH（300MHz；CDCl3）0.80（6H，t，J 6.6Hz，2×CH2CH3）、1.15-1.41（48H，m）、1.47（4H，m，2×CH2）、1.55（2H，m，CH2CHOアセタール）、1.67（2H，m，CH2CH2N+）、1.83-2.10（8H，m，2×CH2CH=CH）、3.30（6H，s，2×N+CH3）、3.30-3.43（14H，m，2×CH2CH2O，2×CH2N+，2×OMe）、3.46-3.91（18H，m，OCHCH2OCH2，16PEG CH2）、3.99（1H，m，CHOCH2）、4.50（1H，t，J 5.6Hz，CHアセタール）、5.28（4H，m，CH=CH）；δC（125.8MHz；CDCl3）14.5（2×CH2CH3）、23.0、23.1、24.6、26.4、26.6、27.6、29.6-30.4（シグナルオーバーラップ）、32.7、33.2、52.3および52.6（2×N+CH3）、59.4（2×OMe）、65.0、65.3、66.6、68.9、69.7、70.8、71.0、72.3、73.8、103.1（CHアセタール）、130.1および130.4（C=C）；m/z（+FAB）941（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRFAB）941.8602（[M-Cl]+，C57H114NO8には941.8622が必要）。
【０１７７】
e）N-(2,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-11-エニルオキシ)プロピル)-6,6-ビス(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)-N,N-ジメチルヘキサン-1-アミニウムクロリド（JBW418）
【化１９】
2009542582.tif 000022
以下の量を使って上記の手法を実行した：C16:1鎖を有する3級アミンB（0.27g，0.48mmol）およびJBW407（0.16g，0.44mmol）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（0.13g，34％）。
Rf 0.33（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3358br m、1661m、1124br m、1076br m；δH（300MHz；CDCl3）0.86（6H，t，J 6.9Hz，2×CH2CH3）、1.15-1.35（38H，m）、1.40（2H，m，CH2）、1.50（4H，m，2×CH2）、1.61（2H，m，CH2CHOアセタール）、1.79（2H，m，CH2CH2N+）、1.92（8H，m，2×CH2CH=CH）、2.64（2H，s，br，OH）、3.30-3.46（14H，m，2×CH2CH2O，2×CH2N+，2×N+CH3）、3.50-3.86（18H，m，OCHCH2OCH2，16PEG CH2）、4.00（1H，m，CHOCH2）、4.62（1H，t，J 5.5Hz，CHアセタール）、5.35（4H，m，CH=CH）；δC（75.4MHz；CDCl3）13.9（2×CH2CH3）、22.2、22.7、24.1、25.8、26.0、26.2、29.2-30.0（シグナルオーバーラップ）、31.8、32.2、32.6、32.9、52.1（2×N+CH3）、61.5（CH2OH）、64.9、66.0 68.5、69.3、70.6、72.0、72.7、73.4、103.0（CHアセタール）、130.3（C=C）；m/z（+ES）857（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRES）857.7660（[M-Cl]+，C51H102NO8には857.7683が必要）。
【０１７８】
f）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-8,8-ビス(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)-N,N-ジメチルオクタン-1-アミニウムクロリド（JBW400）
【化２０】
2009542582.tif 000023
以下の量を使って上記の手法を実行した：C18:1鎖を有する3級アミンA（0.27g，0.44mmol）およびJBW396（0.16g，0.4mmol）。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を淡黄色油状物として得た（81mg，21％）。
Rf 0.32（5％メタノール/ジクロロメタン）；νmax（ニート）/cm-1 3331br m、1661m、1126br m 1069m；δH（300MHz；CDCl3）0.85（6H，t，J 6.7Hz，2×CH2CH3）、1.15-1.45（52H，m）、1.52（4H，m，2×CH2）、1.62（2H，m，CH2CHOアセタール）、1.73（2H，m，CH2CH2N+）、1.88-2.05（8H，m，2×CH2CH=CH）、3.36（3H，s，N+CH3）、3.38（3H，s，N+CH3）、3.31-3.50（8H，m，2×CH2CH2O，2×CH2N+）、3.50-3.80（18H，m，OCHCH2OCH2，16PEG CH2）、4.01（1H，m，CHOCH2）、4.60（1H，t，J 5.8Hz，CHアセタール）、5.34（4H，m，CH=CH）；δC（75.4MHz；CDCl3）14.1（2×CH2CH3）、22.7、22.8、24.3、26.0、26.2、27.2、28.9-29.8（シグナルオーバーラップ）、31.9、33.0、52.1（2×N+CH3）、61.6（CH2OH）、64.6、64.9、68.4、69.3、70.6、72.0、72.7、73.4、103.0（CHアセタール）、129.8および130.0（C=C）；m/z（+ES）941（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRES）941.8659（[M-Cl]+，C57H115NO8には941.8617が必要）。
【０１７９】
g）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-8-ヒドロキシ-N,N-ジメチルオクタン-1-アミニウムクロリド（JBW438）
【化２１】
2009542582.tif 000024
8-ブロモオクタン-1-オール（0.l5g，0.71mmol）およびC18:1鎖を有する3級アミンA（0.71mmol）を封管中、40℃で48時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム/メタノールの1：1混合物に溶解し、クロロホルム/メタノール（1：1）を溶離液とするアンバーライト（Amberlite（登録商標））IRA-400（Cl）イオン交換カラムに通した。有機溶媒を減圧下で蒸発させた。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（5％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を無色の油状物として得た（0.24g，47％）。
Rf 0.28（5％メタノール/ジクロロメタン）；δH（300MHz；CDCl3）0.85（6H，t，J 6.4Hz，2×CH2CH3）、1.16-1.45（50H，m）、1.52（8H，m）、1.75（2H，m，CH2CH2N+）、1.90-2.08（8H，m，2×CH2CH=CH）、3.33-3.50（10H，m，2×CH2CH2O，2×N+CH3）、3.52-4.06（7H，m，2×CH2N+，CHアセタール、OCHCH2OCH2）、5.34（4H，m，CH=CH）；δC（75.4MHz；CDCl3）14.1（2×CH2CH3）、22.7、25.4、26.1、26.3、27.2、28.8、29.3-30.0（シグナルオーバーラップ）、31.9、32.4、32.6、52.2および52.4（2×N+CH3）、62.5（CH2OH）、64.9、66.3、68.4、69.3および72.0、73.4、129.8および130.0（C=C）；m/z（+FAB）749（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRFAB）749.7592（[M-Cl]+，C49H99NO3には749.7624が必要）。
【０１８０】
h）N-(2,3-ビス((Z)-オクタデカ-9-エニルオキシ)プロピル)-N,N-ジメチル-8-オキソオクタン-1-アミニウムクロリド（JBW456）（非切断可能脂質）
【化２２】
2009542582.tif 000025
JBW438（0.23g，0.29mmol）、N-メチルモルホリン-N-オキシド（41mg，0.35mmol）および活性化されたモレキュラーシーブ（4Å、粉末；100mg）の無水ジクロロメタン（5mL）溶液に過ルテニウム酸テトラ-n-プロピルアンモニウム（10mg，0.03mmol）を加えた。室温で10分間撹拌した後、その懸濁液を小さなシリカゲルプラグ越しに濾過し、残渣をジクロロメタン（10mL×3）で洗浄した。合わせた有機濾液を減圧下で濃縮した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（3％メタノール/ジクロロメタン）で精製することにより、標題の化合物を黄色油状物として得た（0.12g，57％）。
Rf 0.30（3％メタノール/ジクロロメタン）；ｖmax（ニート）/cm-1 1722m、1634w、1121br m、1088m；δH（300MHz；CDCl3）0.87（6H，t，J 6.6Hz，2×CH2CH3）、1.17-1.43（50H，m）、1.54（6H，m）、1.75（2H，m，CH2CH2N+）、1.90-2.07（8H，m，2×CH2CH=CH）、2.44（2H，dt，J 1.4Hz，7.2，CH2CHO）、3.32-3.50（10H，m，2×CH2CH2O，2×N+CH3）、3.52-4.06（7H，m，2×CH2N+，CHアセタール、OCHCH2OCH2）、5.35（4H，m，CH=CH）、9.76（1H，t，J 1.5Hz，CHO）；δC（125.8MHz；CDCl3）14.5（2×CH2CH3）、22.1、23.1、26.5、27.6、29.2、29.7-30.4（シグナルオーバーラップ）、32.3、44.1（CH2CHO）、52.5および52.8（2×N+CH3）、68.8、69.7、72.4（シグナルオーバーラップ）、73.8、130.1（C=C）、202.9（CHO）；m/z（+FAB）747（[M-Cl]+，100％）；m/z（+HRFAB）747.7592（[M-Cl]+，C49H97NO3には747.7486が必要）。
【０１８１】
脂質（1または2mg/ml）は全て4℃で数ヶ月間保存され、すぐに使用することができた。
【０１８２】
遺伝子導入手法
I−細胞
D.C.Gruenert（ベルモント大学、米国バーモント州バーリントン）の厚意で提供されたヒト気管支上皮（16HBE14o-）および嚢胞性線維症気管上皮（ΣCFTE29o-）細胞株は、10％ウシ胎仔血清（FBS）（Sigma、英国プール）、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（全て英国ペイズリーのInVitrogenから入手）を補足したイーグル最小必須培地（MEM）HEPES改変（Sigma、英国プール）で維持した。ATCC（米国バージニア州マナッサス）から入手したマウス神経芽細胞腫（Neuro2A）および内皮（bEND.3）細胞株は、10％FBS、1％非必須アミノ酸、1％ピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（全て英国ペイズリーのInVitrogenから入手）を補足したGlutamax-1含有ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（InVitrogen、英国ペイズリー）で維持した。AJ3.1は交尾後13.5日のA/J胎仔から以下のようにして得られたマウス胎仔線維芽細胞株である：頭骨および赤色臓器を取り除き、残りの組織を円刃刀で切り刻み、トリプシンで消化してから、セルストレーナーに通した。得られた懸濁液を、10％FCSならびに100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（全て英国ペイズリーのInVitrogenから入手）を含有するGlutamax-1含有DMEMに播種し、各胎児を個別の培養物として維持した。培養物が老化するまで、まばらなコロニーが維持されるように細胞を数日毎に継代したところ、7〜10日後に、成長する細胞コロニーが観察された。以後の全ての作業用に、ある培養物を選択した。以下、これをAJ3.1と呼ぶ。初代ブタ血管平滑筋細胞（PVSMC）は、以前記載された外植法（Ross，J．Cell．Biol.，1971，50，172-186）を使って調製し、20％FBSならびに100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（全て英国ペイズリーのInVitrogenから入手）を補足したGlutamax-1含有DMEMで維持した。細胞は全て付着性であり、Falcon 75cm2プラスチック組織培養フラスコで成長させ、95％空気および5％CO2の湿潤雰囲気下に37℃で維持した。
【０１８３】
II−プラスミドDNA
プラスミドpCI-Luc（5.7kb）は、サイトメガロウイルス（CMV）即時/初期プロモーター-エンハンサーによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するpCI（Promega、英国サウサンプトン）からなる。緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子を含有するプラスミドpEGFP-N1（4.7kb）は、Clontech（英国ハンプシャー）から入手した。核局在β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子lacZを保持するプラスミドpAB11（7.7kb）は、J．Samulski（ノースカロライナ大学、ノースカロライナ州チャペルヒル）から贈与された。ヒトインターロイキン-2遺伝子はpCI-hIL-2（Siapatiら，2003；Br J Cancer 88:1641-1648）から発現させた。マウスインターロイキン-12は、フレキシブルなリンカーによって分離されたマウスIL-12のp35サブユニットおよびp40サブユニットの単鎖融合タンパク質をコードする遺伝子をプラスミドpcDNA3.1scIL12（Lodeら，1998；Proc Natl Acad Sci USA 95:2475-2480）からpCI（Promega、英国サウサンプトン）へとサブクローニングすることによって作製したプラスミドpCI-mIL-12から発現させた。プラスミドは大腸菌DH5α中で増殖させ、細菌のアルカリ溶解後に、樹脂カラム（Qiagen Ltd.、英国クローリー）で精製した。イソプロパノール沈殿したDNAペレットを70％エタノールで洗浄した後、1mg/mlの濃度で水に溶解した。
【０１８４】
III−インビトロトランスフェクション
細胞を、bEND.3細胞については1ウェルあたり2.5×103細胞、他の細胞については全て1ウェルあたり2×104細胞の密度で、96ウェルプレートに播種した後、完全成長培地中、37℃で終夜インキュベートした。翌日、リポポリプレックス（LPD）製剤を、基本的に既述のように（Hartら，1998）、コンポーネントを以下の順序で混合することによって調製した：それぞれ2：4：1の重量比に相当するOptiMEM中80μg/mlの脂質（L）50μl、OptiMEM中110μg/mlのペプチド（P）70μlおよびOptiMEM中40μg/mlのプラスミドpCI-Luc（D）50μl。複合体は全て、手短にピペッティングすることによって混合し、室温に1時間保った後、最終体積が1.57mlになるようにOptiMEMに希釈した。完全成長培地を除去した後、0.25μgのプラスミドDNAに相当する200μlの複合体を、各培養ウェルに加えた。トランスフェクションは全てそれぞれ6ウェルで行った。複合体の沈降および細胞接触を促進するために遠心分離（1500rpm，5分間）を行ってもよい。細胞を複合体と共に37℃で4時間インキュベートしてから、新鮮培地に交換して24時間インキュベートし、その後、レポーター遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイ（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）で解析した。bEND.3細胞の場合は、至適発現レベルが達成されるように、5mM酪酸ナトリウムをトランスフェクション培地および新鮮培地に加えた。GFP発現を調べるために、bEND.3細胞は1ウェルあたり1×104細胞の密度で、他の細胞は全て1ウェルあたり1×105細胞の密度で、12ウェルプレートに播種した。トランスフェクションのために、1μgのpEGFP-N1プラスミドを含有する1mlの複合体を各培養ウェルに加えた。
【０１８５】
IV−遺伝子発現測定
ルシフェラーゼおよびタンパク質アッセイ
細胞をPBSで1回洗浄してから、20μlの1×レポーター溶解緩衝液（Reporter Lysis Buffer）（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を4℃で20分間、細胞に加え、次に-80℃で少なくとも30分間凍結してから、室温で融解した。次に、ルシフェラーゼアッセイシステム（Lucifierase Assay System）（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）およびLucy-1照度計（Anthos Ltd.、オーストリア・ザルツブルク）を使って、ルシフェラーゼ活性を10秒間測定した。Bio-Rad（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）タンパク質アッセイ試薬を使用し、製造者の説明書に従って、ルシフェラーゼ試験液20μlを5分の1に希釈した試薬180μlに加え、室温で10分間インキュベートしてから、そのOD590を一連のBSA標準と比較することにより、各トランスフェクション溶解物中に存在するタンパク質の量を決定した。インビトロルシフェラーゼ活性をタンパク質1ミリグラムあたりの相対発光量（RLU）として表した。
【０１８６】
緑色蛍光タンパク質発現
GFPトランスフェクションをフローサイトメトリーによって解析した。細胞を488nmレーザーで励起し、525nm帯域フィルタでGFP+イベントを捕捉した。トランスフェクト細胞および非トランスフェクト陰性対照をウェルから取り出し、PBSで洗浄してから、PBS中の1％PFA 300μlで固定した。合計10,000イベントをカウントし、生細胞だけが含まれるようにゲートをかけた。12ウェルプレートに播種した細胞をオリンパスIX70落射蛍光顕微鏡（Olympus America、米国ニュージャージー州メルビル）でも観察した。
【０１８７】
V−インビボトランスフェクション
全ての動物実験は英国内務省によって承認および認可され、英国癌研究調整委員会（UKCCCR）が要求する基準に合わせて行われた（Workmanら，British Journal of Cancer，1998，77，1-10）。8〜12週齢の雌A/Jマウス（Harlan Laboratories、英国）の右後側腹部に1.5×106個のNeuro2A細胞を皮下注射した。10±2日後、腫瘍が約8〜12mmのサイズに到達した時に、5％グルコース中で作製したLPD複合体（50μgのpCI-LucまたはpAB11を含有するもの）100μlを尾静脈に注射した。実験は少なくとも6回行った。注射の24時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍および臓器を切除し、-80℃で保存した。組織を氷中で解凍し、レポーター遺伝子アッセイ溶解緩衝液（Roche、ドイツ）に沈め、IKAホモジナイザー（IKA、ドイツ・シュタウフェン）でホモジナイズし、4℃、4600rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、4℃、13000rpmで10分間遠心分離した。FLUOstar Optima（BMG Labtech、英国）を使って組織溶解物中のルシフェラーゼ活性を30秒間測定し、タンパク質1ミリグラムあたりのRLU（RLU/mg）として表した。200万RLU/30秒はルシフェラーゼ1ngに相当する。
【０１８８】
VI−免疫組織化学によるβ-ガラクトシダーゼ局在の評価
pAZB11プラスミドを使って作製したLPD複合体を静脈内投与した24時間後に、動物を屠殺し、腫瘍を切除し、4％パラホルムアルデヒド/PBS中、室温で終夜固定し、パラフィンろうに包埋し、7μm切片をポリリジン被覆スライドにマウントした。免疫染色のために、組織切片をHistoclear（Raymond A Lamb、英国イーストボーン）で脱パラフィンし、逐次的に再水和し、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために室温において0.3％H2O2/メタノール（v/v）で30分間覆い、PBSで洗浄し、非特異的結合部位をブロックするために室温において3％正常ヤギ血清（Vector Laboratories、英国ピーターバラ）/PBSで30分間覆った。次に過剰のブロックを除去し、1％BSAおよび0.1％NaN3を含有するPBS中の非コンジュゲートウサギ抗β-ガラクトシダーゼ（AbD serotec、英国オックスフォード）の1：500希釈液を適用した。切片を4℃の湿潤箱で終夜インキュベートした。対照スライドは、1％BSAおよび0.1％NaN3だけを含有するPBSと共にインキュベートした。切片をPBSで洗浄した後、1％BSAを含有するPBS中の1：100希釈ヤギ抗ウサギビオチン化抗体（Vector Laboratories、英国ピーターバラ）を加え、室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSで洗浄した後、ストレプトアビジン-ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と共に室温で1時間インキュベートした（ABC Reagent、Vector Laboratories、英国ピーターバラ）。陽性に染色された細胞を3,3'-ジアミノベンジジン（Sigma FAST DAB、Sigma Chemical Co.、英国ドーセット）を使って同定した。切片をdH2O中で洗浄し、段階的アルコール液によって脱水し、Histoclearで透徹し、DPX（BDH Labs、英国プール）で封入した。次に、デジタルカメラ（ProgRes3012、Kontron Electronic、英国チチェスター）を装着した光学顕微鏡（AxioPhot2顕微鏡、Zeiss、英国ウェリンガーデンシティ）でスライドを解析し、Adobe Photoshop（Adobe Systems、米国カリフォルニア州）を使って画像を解析した。
【０１８９】
VII−腫瘍外植片におけるサイトカイン発現の測定
5％グルコースにおいて脂質ME42/DOPEおよびペプチドME27を使って作製したLPD複合体（hIL-2をコードするプラスミド25μgおよびmIL-12 25μgを含有するもの）を静脈内投与した24時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を収集し、細かく切り刻み、6ウェルプレートにおいて、10％FBS、1％非必須アミノ酸、1％ピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（全て英国ペイズリーのInVitrogenから入手）を補足したGlutamax-1含有DMEM（InVitrogen、英国ペーズリー）1ml中で培養した。5日間にわたって24時間毎に培地を抽出し、DuoSet ELISA Development System（R&D Systems、英国アビンドン）により、製造者の説明書に従って、サイトカイン発現レベルを決定した。
【０１９０】
VIII−動物ワクチン接種
8〜10週齢の雌A/Jマウス（Harlan Laboratories、英国）の右後側腹部の皮下（s.c.）に1.5×106個のNeuro2A細胞を移植した。腫瘍細胞の注射後3日目、腫瘍が約2×2mmに到達した時に、5％グルコースにおいて脂質ME42/DOPEおよびME27を使って作製したLPD複合体（ヒトインターロイキン2遺伝子（IL-2）をコードするプラスミド25μgおよびマウスインターロイキン12遺伝子（IL-12）25μgを含有するもの）を尾静脈に静脈内（i.v.）注射することによって、動物にワクチン接種を施した。対照動物には何も投与しないか、5％グルコースを投与するか、空のプラスミドpCI 50μgを含有するLPD複合体を投与した。どのマウス群にも、2日おきに、それぞれのワクチンを7回投与した。ノギスを使って2〜3日ごとに二つの垂直軸を測定することによって、腫瘍進行をモニターした。腫瘍が直径12mmに到達したら、マウスを直ちに選別した。最初の注射の3ヶ月後に無腫瘍のままだったマウスには、最初の注射とは反対側の側腹部に1.5×106個の生Neuro2A細胞を再チャレンジして、腫瘍進行をモニターした。
【０１９１】
IX−腫瘍の組織学的解析および白血球浸潤解析
直径約12mmの腫瘍を有するA/Jマウスを選別し、腫瘍を切除した。組織学的解析のために、腫瘍を4％PFAで固定し、パラフィンろうに包埋し、7μm切片をポリリジン被覆スライドにマウントした。切片を段階的に再水和し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した後、エタノールで段階的に脱水し、ガラス製カバースリップで封入した。次に、デジタルカメラ（ProgRes3012、Kontron Electronic、英国チチェスター）を装着した光学顕微鏡（AxioPhot2顕微鏡、Zeiss、英国ウェリンガーデンシティ）でスライドを解析し、Adobe Photoshop（Adobe Systems、米国カリフォルニア州）を使って画像を解析した。白血球浸潤解析のために、DMEM培地を使ってセルストレーナーで細胞を洗浄することにより、単一細胞懸濁液を得た。細胞を遠心分離（240×g）によってペレット化し、0.83％塩化アンモニウムを使って氷上で5分間溶解することによって赤血球を除去した。残りの細胞を1×106/mlの密度でPBSに再懸濁し、PreCP-抗マウスCD45（Pharmingen、米国カリフォルニア州サンディエゴ）の1：15希釈液を4℃で30分間適用した。細胞をPBSで2回洗浄し、1％PFAで固定した。次に白血球浸潤をフローサイトメトリーによって解析した。
【０１９２】
X−カテプシンB
凍結乾燥カテプシンBを配達後直ちに、それぞれが約1単位のカテプシンBを含有するように小分けして、-20℃で保存した。ミリポア水中に酢酸ナトリウム（20mM）、システイン（5mM）およびEDTA（1mM）を含有する緩衝剤溶液を、酢酸（5M）でpH5.0に調節した。凍結乾燥カテプシンB（1単位）をこの緩衝液100μlに溶解した。まず最初に、切断緩衝液（475μl）、ペプチド溶液（5mM、5μl）および酵素溶液（20μl）を混合し、37℃でインキュベートした。対照実験の場合、酵素溶液を等量の緩衝液で置き換えた。30分、1時間、2時間および4時間後に、100μlの混合物を、酢酸（5M、20μl）が入っているHPLCバイアルに移して、酵素を失活させた。その混合物を、標準的ペプチド勾配を使ってHPLCで分析した。一例として図18にME27を示す。
【表２】
2009542582.tif 000026
【０１９３】
XI−インビトロエステラーゼ切断実験
脂質薄膜の調製
カチオン性脂質を単独で、またはDOPE（重量比1：1）と共に製剤化した。クロロホルム中の脂質（10mg/mL；100L［脂質1mg］）を滅菌ガラスバイアルに入れた。溶媒を減圧下で除去し、さらに微量のクロロホルムを高真空下で24時間除去した。
【０１９４】
リポソームの調製
滅菌水（1mL）を脂質薄膜に加えて、水中に1mg/mL（全脂質）の脂質懸濁液を生成させた。その懸濁液を4℃で24時間水和させた。40℃に温めた後、その混合物を約5分間、超音波処理（浴槽式超音波処理）して、透明な溶液を生成させた。得られたリポソーム製剤は6ヶ月まで安定だった。
【０１９５】
ME42のエステラーゼ切断
リン酸二水素カリウムの水溶液（0.1M，50mL）を水酸化ナトリウムの水溶液（0.1M、41mL）と混合することによって、リン酸緩衝液の原液（0.1M，pH7.5）を調製した。ME42の原液は、補助脂質（DOPE）を省き、バクスター（Baxter）水を使って、上述の方法で調製した。ブタ肝エステラーゼ（28mg，672単位，28μmolの酪酸エチルを加水分解する能力を有する）をリン酸緩衝液（875μL）に溶解することにより、ブタ肝エステラーゼの溶液を調製した。リポソーム（125μL，250μg，0.294μmol）に緩衝酵素溶液（875μL）を加え、得られた混合物を37℃で24時間インキュベートした。T＝1、2、4、6、24時間で一部（200μl）を採取し、直ちに凍結乾燥した。その凍結乾燥物をジクロロメタン（50μL）に溶解し、薄層クロマトグラフィー（15％メタノール/ジクロロメタン＋酢酸）により、リンモリブデン酸染色で分析した。
【０１９６】
ME42 LPDのエステラーゼ切断
ME27およびpCI-ルシフェラーゼの原液はバクスター水を使って調製した（それぞれ50mg/mLおよび5mg/mL）。ME42/DOPE原液（2mg/mL）の製剤は、上記の説明に従って調製した。次に、リン酸緩衝液（それぞれ125μL、250μLおよび250μL）にリポソーム（125μL）、ペプチドME27（10μL）およびpCI-ルシフェラーゼ（12.5μL）の二次溶液を調製した。得られたペプチド溶液を緩衝リポソームに加えた。得られた混合物にpCI-ルシフェラーゼ溶液を加え、その混合物を室温で1時間平衡化した。次に、そのLPD混合物にブタ肝エステラーゼ（28mg，672単位，28μmolの酪酸エチルを加水分解する能力を有する）のリン酸緩衝液（223μL）溶液を加えた後、37℃で24時間インキュベートした。T＝1、2、4、6、24時間で一部（200μl）を採取し、直ちに凍結乾燥した。その凍結乾燥物をジクロロメタン（50μL）に溶解し、薄層クロマトグラフィー（15％メタノール/ジクロロメタン＋酢酸）により、リンモリブデン酸染色で分析した。
【０１９７】
XII−統計解析
異なる実験群間の統計的有意性を評価するためにスチューデントのt検定を行い、0.05未満の確率（p＜0.05）を有意とみなした。
【０１９８】
結果と考察
I−切断可能なペプチドのトランスフェクション効率
エンドソーム酵素切断可能ペプチドME27、ME28およびME29（切断可能配列RVRRを含むもの）の遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドを使って異なる細胞タイプで調べ、非切断可能ペプチドME61と比較した。細胞株Neuro2A（図1a）、AJ3.1（図1b）、bEND.3（図1c）、16HBE14o-（図1d）、ΣCFTE29o-（データ未掲載）および初代PVSMC（データ未掲載）のそれぞれにおいて、ME27は、インビトロトランスフェクションにとって有意に最善の切断可能ペプチドだった（p＜0.05）。ME27はNeuro2A細胞では非切断可能対照ME61と同じ程度の効率であり、他の細胞株ではME61よりも有意に効率がよかった（p＜0.05）。
【０１９９】
エンドソームプロテアーゼによって認識される切断可能なRVRR配列を有するペプチドの遺伝子導入の効率を、非切断可能ペプチドのトランスフェクション効率と比較した（図2）。Neuro2A細胞（図2a）、bEND.3細胞（図2b）および16HBE14o-細胞（図2c）において、大半の切断可能ペプチドME68、FMM8、ME27、ME69およびPCYは、それぞれ対応する非切断可能ペプチド対照P1、P6、FMM12、PEおよびPYと同程度か、それ以上の効率だった。
【０２００】
このように、RVRR切断可能配列の存在はトランスフェクション効率を増加させることが実証される。
【０２０１】
さらにまた、Neuro2A（図3A）、AJ3.1（図3B）およびbEND.3（図3C）のような一部の細胞株では、脂質と複合体化させる必要なく、切断可能ペプチド単独でも、効率の良い遺伝子導入が可能である。
【０２０２】
II−PEG-アセタール切断可能脂質の加水分解研究
PEG-アセタール脂質の加水分解を3〜7のpH範囲にわたって37℃で調べた。化合物の酸加水分解をTLCでモニターした後、質量分析によって切断を確認した。化合物JBW389に使用したTLC分析方法の一例を対照（切断されたアセタールの生成物、対応するアルデヒド）と共に図4に示し、加水分解が観察されたpHを、製造した化合物の全てについて、Table IIに記載する。
【表３】
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【０２０３】
III−PEG-アセタール切断可能脂質のトランスフェクション効率
pH感受性脂質であるPEG-アセタール脂質の遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドを使って、異なるタイプ細胞タイプで調べた。細胞株16HBE14o-（図5a）、Neuro2A（図5d）、bEND.3（図5b）、ΣCFTE29o-（図5e）、および初代PVSMC（図5c）に関して、結果を図5に示す。これらの脂質を非切断可能対照JBW456と比較した。どの脂質もトランスフェクションを達成するにはペプチドと複合体化する必要があり（図5a）、脂質へのDOPEの添加が必要だった。
【０２０４】
どの細胞においても、pH感受性脂質をペプチド6またはE（図5）と複合体化した場合、最も良いトランスフェクション用の脂質は、それぞれpH5.5、5.0および4.0で加水分解されるJBW389、JBW413およびJBW400だった。それぞれpH3.5、3.0および3.0で加水分解されるJBW411、JBW418およびJBW412は、効率が低かった。さらにまた、Neuro2Aを除く全ての細胞において、最も良いトランスフェクション効率を許すpH感受性脂質は、非切断可能脂質JBW456よりも効率が良かった。事実、16HBE14o-細胞（図5a）およびΣCFTE29o-細胞（図5e）において、JBW389は、ペプチドEと複合体化した場合に、JBW456よりもそれぞれ6倍および2倍良かった（p＜0.05）。bEND.3細胞（図5b）およびPVSMC細胞（図5c）において、JBW400は、ペプチドEと複合体化した場合に、JBW456よりもそれぞれ2倍および4倍良かった（p＜0.05）。Neuro2A細胞において、JBW413は、ペプチドEと複合体化した場合に、JBW456と同程度の効率だった（p＞0.05；図5d）。
【０２０５】
トランスフェクション効率と、脂質の切断を可能にする酸性pHに対する脂質の感受性との間、したがってエンドサイトーシスによって取り込まれた後のリポポリプレックスの迅速な解離との間には、強い相関関係があった。
【０２０６】
IV−PEG-エステル切断可能脂質のインビトロトランスフェクション効率
遠心分離なしのインビトロトランスフェクション効率
切断可能ペプチドME27と複合体化したPEG-エステル切断可能脂質の遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドを使って、異なる細胞タイプで調べた。トランスフェクションを達成するには脂質をペプチドと複合体化する必要があり、DOPE添加が必要だった（データ未掲載）。細胞株Neuro2A（図6a）、16HBE14o-細胞（図6b）および試験した他の細胞（データ未掲載）において、ME42/DOPEは最も良いPEG-エステル切断可能脂質であり（p＜0.05）、PEG非切断可能脂質CH300/DOPEと同程度またはそれ以上の効率だったが、リポフェクチンよりは効率が低かった（p＜0.05）。脂質をペプチドEのような非切断可能ペプチドと複合体化した場合も、類似する結果が示された（データ未掲載）。
【０２０７】
PEG-エステル切断可能脂質を使って作製した複合体のサイズ
サイズはトランスフェクション効率に影響を持ちうるので、リポポリプレックスのサイズを調べた（図7）。リポフェクチン、CH300/DOPEまたはME42/DOPEを使って作製したLPD複合体（ペプチドME27と複合体化し、PBSで希釈したものであり、10μgのpCI-Lucを含有する）のサイズを、Malvern Zetasizer 3000HS（Malvern Instruments、英国ウスターシャー）を使ってレーザー光散乱法で測定した（図7）。リポフェクチン、CH300/DOPEおよびME42/DOPEを使って作製した複合体のサイズは、その形成の5分後に、それぞれ457±46nm、412±43nmおよび335±11nmだった。したがってこれらの脂質間には相違が観察されなかった。しかし1時間後には、リポフェクチンを使って作製した複合体のサイズが1388±198nmであったのに対して、CH300/DOPEおよびME42/DOPEを使って作製した複合体のサイズは安定なままで、それぞれ417±60および395±14nmだった（p＜0.05）。したがってPEG化脂質を使って作製した複合体は、非PEG化脂質リポフェクチンから作製された複合体よりも小さく安定であることが示された。
【０２０８】
遠心分離後のインビトロトランスフェクション効率
PEG-エステル切断可能脂質（ME42）、PEG化脂質（CH300）およびリポフェクチンの遺伝子導入効率を、Neuro2A細胞（図8a）、16HBE14o-細胞（図8b）および他の細胞タイプ（データ未掲載）において、PEG化された小さな複合体の細胞への沈降を助長するために行われた追加の遠心分離（1500rpm，5分間）後に調べた。遠心分離なしでは、ME42/DOPEはリポフェクチンより効率が低かったが（p＜0.05）、リポポリプレックスを添加した直後に細胞の遠心分離を行った場合、ME42/DOPEは、Neuro2A細胞および16HBE14o-細胞において、リポフェクチンよりも、それぞれ1.8倍および5倍、効率が良かった（p＜0.05）。したがって遠心分離は複合体の沈降、細胞接触を促進し、したがってトランスフェクションを促進する。ME42/DOPEは、大半の細胞株において、CH300/DOPEよりも効率が良かった（図8）。
【０２０９】
PEG化切断可能脂質間のインビトロトランスフェクション効率の比較
本発明者らは、いくつかの細胞タイプにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子（図9）またはGFP遺伝子（データ未掲載）をコードするプラスミドを使用して、遠心分離後に、ペプチドME27と複合体化した最も良いPEG-アセタール切断可能脂質の一つ（JBW389）と最も良いPEG-エステル切断可能脂質（ME42）との間で、インビトロトランスフェクション効率を比較した。Neuro2A細胞、16HBE14o-細胞（図9）および他の細胞タイプ（データ未掲載）において、ME42/DOPEとJBW389/DOPEはどちらも有効であり、効率の良い遺伝子導入が可能だった。16HBE14o-細胞では、JBW389/DOPEおよびME42/DOPEにより、それぞれ細胞の27.5％および38.5％に、効率の良い遺伝子導入が可能になった（データ未掲載）。しかし、調査した細胞では、PEG-エステル切断可能脂質ME42/DOPEの方が、PEG-エステル切断可能脂質JBW389/DOPEよりも、インビトロ遺伝子導入成績が良かった（p＜0.05）。
【０２１０】
異なる緩衝液中で作製したPEG化切断可能複合体のトランスフェクション効率
OptiMEM、5％グルコースまたは水中で作製した脂質ME42/DOPE：ペプチドME27：pCI-Luc複合体の導入効率を、異なる細胞株で調べた（図10）。Neuro2A細胞およびbEND.3細胞において、OptiMEM中で作製した複合体は、5％グルコースまたは水中で作製した複合体と同程度の効率だった（p＞0.05）（図10）。16HBE14o-細胞では、5％グルコースまたは水中で作製した複合体の方が、OptiMEM中で作製した複合体よりも有意に効率が良かった（p＜0.05）。複合体の作製に5％グルコースまたは水が通常使用されるインビボトランスフェクションにとって、これらの結果は重要である。
【０２１１】
V−インビボトランスフェクション効率
腫瘍における特異的ルシフェラーゼ導入遺伝子発現
5％グルコース中で作製した異なる複合体（50μgのpCI-Lucを含有するもの）を、腫瘍を有する雌A/Jマウスの尾静脈に注射し、24時間後にルシフェラーゼ発現を測定した（図11）。プラスミドpCI-Lucのみの静脈内投与またはペプチドME27もしくは脂質ME42/DOPEとだけ複合体化したプラスミドpCI-Lucの静脈内投与は、全ての臓器で極めて低レベルのルシフェラーゼ発現（6500RLU/mg未満）を示したが、脂質ME42/DOPEおよびペプチドME27と複合体化したものは、ルシフェラーゼ発現のレベルが有意に高かった（腫瘍中で約105000RLU/mg，p＜0.05）（図11a）。切断可能PEG化複合体（ME42/DOPE：ME27：pCI-Luc）では、非PEG化非切断可能複合体（リポフェクチン：P1：pCI-Luc，40000RLU/mg）よりも効率のよい、腫瘍におけるトランスフェクションも可能なようである；p＞0.05（図11a）。ペプチドME27またはPCYおよびpCI-Lucと複合体化した異なる脂質の静脈内投与を、非切断可能非PEG化脂質（リポフェクチン）、非切断可能PEG化脂質（CH300/DOPE）および切断可能PEG化脂質（ME42/DOPE）を使って行った（図11b）。全ての脂質で腫瘍の方が他の臓器よりも効率よくトランスフェクトされたが（p＜0.05）、PEG化脂質による腫瘍特異性は非PEG化脂質によるものより高かった（88％対50％）；p＜0.05（図11b）。
【０２１２】
脂質ME42/DOPEおよびpCI-Lucと複合体化した異なるペプチドの静脈内投与を、非ターゲティング非切断可能ペプチド（K16）、RGDターゲティング非切断可能ペプチド（FMM12）およびRGDターゲティング切断可能ペプチド（ME27）を使って行った（図11c）。RGDターゲティング切断可能ペプチドでは、他のペプチドよりも効率のよい腫瘍におけるトランスフェクションが可能なようだった（105000RLU/mg対70000RLU/mg）（p＞0.05）（図11c）。このように、切断可能ペプチドおよびPEG化脂質の使用は、改善された腫瘍のターゲティングをもたらすことが実証された。
【０２１３】
腫瘍細胞における特異的β-ガラクトシダーゼ導入遺伝子発現
脂質ME42/DOPE：ペプチドME27：pAB11を使って作製したPEG化切断可能複合体により、特異的な核局在のβ-ガラクトシダーゼ活性が腫瘍細胞では認められたが、内皮細胞やマクロファージでは認められず（図12）、腫瘍細胞はその形態（ほとんどの場合、核）によって容易に認識可能である。対照切片はβ-ガラクトシダーゼ活性の証拠を示さなかった。
【０２１４】
腫瘍によるサイトカイン発現
脂質ME42/DOPE：ペプチドME27：pCI-IL2/IL12を使って作製したPEG化切断可能複合体では、腫瘍培養48時間後に、それぞれ27pg/mlおよび28pg/mlのmIL-12およびhIL-2サイトカイン発現ピークが認められた（図13）。
【０２１５】
VI−免疫療法による神経芽細胞腫処置への応用
雌A/Jマウスの右後側腹部に1.5×106個のNeuro2A細胞を移植した。移植後3、5、7、9、11、13および15日目に、脂質ME42/DOPE、ペプチドME27ならびにpCI-IL2およびpCI-IL12プラスミドを含むLPD複合体を、定着した腫瘍を有するマウスにi.v.注射した。対照動物には何も投与しないか、5％グルコースを投与するか（データ未掲載）、空のプラスミドpCIを含有するLPD複合体を投与した。
【０２１６】
治療複合体を投与されたマウスの平均腫瘍体積は、移植後11日目までに、平均腫瘍体積が、それぞれ461±242mm3および213±212mm3だった何も投与されていない対照マウスまたは空の複合体を投与された対照マウスと比較して、62±84mm3まで有意に減少した（p＜0.05）（図14）。
【０２１７】
12日目に、治療複合体を投与されたマウスの100％が、腫瘍を発達させていないか、直径12mm未満の腫瘍を有していたのに対して、空の複合体を投与されたマウスまたは何も投与されていないマウスのそれぞれ33.5％および100％は腫瘍を発達させ、処分された。20日目に、治療複合体を投与されたマウスの50％が腫瘍を発達させていないか、直径12mm未満の腫瘍を有していたのに対して、空の複合体を投与されたマウスの88％が腫瘍を発達させ、処分された。1ヶ月後には、治療複合体または空の複合体を投与されたマウスのそれぞれ16.5％および11％が無腫瘍だった（図15および16）。
【０２１８】
対照マウスから得られる腫瘍には血管新生および分裂細胞が多数みとめられたのに対して（図17A、B、CおよびD）、治療複合体を投与されたマウスから得られる腫瘍は壊死の領域を示した（図17EおよびF）。抗CD45染色により、治療複合体を投与されたマウスから得られる腫瘍は対照マウスの腫瘍よりも白血球浸潤が2倍多く、リンパ球量は5倍多いことが示された（Table IV）。
【表４】
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【０２１９】
セルストレーナーで洗浄し赤血球を除去した腫瘍の細胞100万個中の白血球浸潤（各群につきn＝2）を、PreCP-抗マウスCD45（Pharmingen、米国カリフォルニア州サンディエゴ）と共に4℃で30分間インキュベートし、1％PFAで固定した後、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２２０】
治療複合体を使ってワクチン接種されたマウスにおいて腫瘍細胞に対する全身性免疫記憶応答が樹立されているかどうかを確認するため、最初のワクチンの3ヶ月後に、無腫瘍マウス（n＝4）の最初の注射とは反対の側腹部に、1.5×106個の野生型Neuro2A細胞を再チャレンジし、さらなるワクチン接種は行わなかった。75％のマウスが少なくとも3ヶ月間は無腫瘍のままだった（データ未掲載）。
【０２２１】
結論として、脂質ME42/DOPEおよびペプチドME27を使って作製された治療複合体のi.v.投与は、何も投与されていないマウスまたは空の複合体を投与されたマウスと比較して有意な腫瘍成長遅延をもたらし、数匹のマウスでは免疫記憶応答による腫瘍根絶をもたらした。
【０２２２】
VII−インビトロエステラーゼ切断実験
ME42、そのPEG切断生成物（ME81）、DOPEおよびトリエチレングリコール（PEG3）の標品用の薄層クロマトグラフィー系を、まず最初に作製した（図19）。その生分解性を証明し、エンドソームにおける状態を模倣するために、脂質ME42（これはエステル結合を含有する）ならびにME42、ペプチドME27およびpCI-ルシフェラーゼを含有する製剤化されたLPDを、pH7.5に緩衝化した酵素（ブタ肝エステラーゼ）で処理した。トリエチレングリコールと類似するRf値を有するME81に対応するスポットが薄層クロマトグラフィープレート上に現われることにより、1時間以内に分解生成物を観察できることが証明された（図20）。前述のスポットの強度は、24時間の最大期間まで、反応が進行するに連れて着実に増加した。製剤化されたME24 LPDでの反応についても、類似する観察結果が得られた（図21）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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