(57)【要約】カベオリン−３が、ＨＣＶタンパク質Ｅ１およびＥ２と関連付けられる細胞因子として同定され、細胞制限因子として提唱される。代替的な可能性として、カベオリン−３は、ＣＤ８１と一緒に作用するＨＣＶに対する細胞レセプターとして機能し得る。いずれの場合も、カベオリン−３の発現を増大させた細胞は、ＨＣＶのインビトロ培養により適しており、カベオリン−３タンパク質とＨＣＶタンパク質との相互作用を阻止することに治療可能性がある。
2009513109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み；かつ（ｉｉ）カベオリン−３を発現する、細胞。
【請求項２】
（ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸、ならびに（ｉｉ）カベオリン−３をコードする核酸を含む、細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞であって、前記核酸が、カベオリン−３をコードするｍＲＮＡ転写産物である、細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）カベオリン−３を発現し、かつＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞を提供する工程；ならびに（ｂ）該細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）（ｉ）カベオリン−３をコードする核酸、および（ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程；ならびに（ｂ）該細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）カベオリン−３をコードするベクターで細胞をトランスフェクトする工程であって、該細胞がＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む工程；ならびに（ｂ）該細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
【請求項８】
請求項５〜７に記載のプロセスであって、（ｃ）ＨＣＶビリオンを精製する工程を更に包含する、プロセス。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）カベオリン−３をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程；（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスに該細胞を感染させる工程；ならびに（ｃ）該細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
【請求項１０】
Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ｉ）内因性カベオリン−３遺伝子、および（ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞を、該カベオリン−３遺伝子が発現される条件下で培養する工程を包含する、プロセス。
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）（ｉ）カベオリン−３遺伝子と（ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸とを含む細胞を提供する工程；ならびに（ｂ）血清欠乏の条件下において該細胞を維持する工程を包含する、プロセス。
【請求項１２】
請求項９〜１１に記載のプロセスであって、ＨＣＶビリオンを精製する工程を更に包含する、プロセス。
【請求項１３】
カベオリン−３を発現しない細胞を改変するためのプロセスであって、（ｉ）カベオリン−３をコードするベクターで該細胞をトランスフェクトすること；または（ｉｉ）内因性カベオリン−３遺伝子の発現を開始させるために、該細胞中の該内因性遺伝子の調節成分を改変することから選択される方法により、該細胞におけるカベオリン−３の発現を開始させる工程を包含する、プロセス。
【請求項１４】
本発明の細胞を含む動物。
【請求項１５】
前記動物がマウスである、請求項１５に記載の動物。
【請求項１６】
（ｉ）ＣＤ８１；（ｉｉ）ＨＣＶタンパク質；および（ｉｉｉ）カベオリン−３を含む、タンパク質様複合体。
【請求項１７】
カベオリン−３とＨＣＶタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするためのプロセスであって、該方法は、候補化合物の存在下でカベオリン−３とＨＣＶタンパク質との間の相互作用の阻害を評価する工程を包含する、プロセス。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプロセスであって、（ｉ）カベオリン−３とＨＣＶタンパク質と１種以上の候補化合物とを混合する工程；（ｉｉ）混合物をインキュベートして、カベオリン−３、該ＨＣＶタンパク質および該候補化合物の任意の相互作用を許容させる工程；ならびに（ｉｉｉ）カベオリン−３と該ＨＣＶタンパク質との間の相互作用が阻害されるか否かを評価する工程を包含する、プロセス。
【請求項１９】
前記細胞が、ＨＣＶゲノムをコードする核酸をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の細胞、プロセス、培養物、動物または複合体。
【請求項２０】
前記カベオリン−３が、アミノ酸配列ＧＩ：４５０２５８９を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の細胞、プロセス、培養物、動物または複合体。
【請求項２１】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞、プロセスまたは培養物。
【請求項２２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２１に記載の細胞、プロセスまたは培養物。
【請求項２３】
前記細胞が肝臓由来である、請求項２１または請求項２２に記載の細胞、プロセスまたは培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）培養物およびそのインビトロ培養物の分野に該当する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ＨＣＶについての研究における１つの課題は、効率の良いインビトロ培養系の欠如であった。
【０００４】
ＨＣＶの非構造タンパク質の大部分を含むサブゲノムレプリコンが、肝癌細胞株で複製することが示され（非特許文献１）、更に、トランスフェクション効率を改善させたサブゲノムレプリコンも開示されている（非特許文献２および特許文献１）。これらの系は、ＨＣＶ複製機構に関する詳細な研究を可能にしたが、レプリコンにおける構造遺伝子の欠損は、ビリオン集合が不可能であることを意味している。非特許文献３は、細胞培養における全長ＨＣＶゲノムの永続的な複製および一時的な複製のための方法を記載しており、この方法により、変異体である「選択可能全長（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）」（ｓｆｌ）ゲノムが２１−５細胞（Ｈｕｈ-７細胞株由来）において安定的に複製し、全てのウイルスタンパク質を発現し得たことを記載している。これら２１−５細胞は、ウイルス粒子を生成しないことが見出された。
【０００５】
細胞内での粒子集合の欠如のため、ＨＣＶの成熟および集合を制限する細胞因子が存在することが提唱された。この制限因子が同定され得れば、その細胞内レベルを人工的に増大し得、それにより、インビトロでのビリオン集合が可能となる。更に、その因子がビリオン集合にとって重要であるならば、その因子とＨＣＶタンパク質との相互作用を防止または妨害することに治療可能性がある。
【特許文献１】国際公開第０１／８９３６４号パンフレット
【非特許文献１】Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年、２８５：１１０−１１３
【非特許文献２】Ｂｌｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００年、２９０：１９７２−１９７４
【非特許文献３】Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２年、７６：４００８−２１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
カベオリン−３が、ＨＣＶタンパク質Ｅ１およびＥ２と関連する細胞因子として同定され、細胞制限因子として提唱された。別の可能性として、カベオリン−３は、ＣＤ８１と一緒に作用するＨＣＶの細胞レセプターとして機能し得る。いずれの場合も、カベオリン−３の発現を増大させた細胞は、ＨＣＶのインビトロ培養により適しており、カベオリン−３とＨＣＶタンパク質との相互作用を阻止することに治療可能性がある。更に、増大したカベオリン−３の発現を提供することにより、ＨＣＶ感染の動物モデルが改善され得る。
【０００７】
ＨＣＶは、カベオリン−１およびカベオリン−２と以前から関連付けられている。例えば、参考文献５〜７は、カベオリン−１がＨＣＶに関連する硬変肝臓において過剰発現されたと報告している。更に、ＨＣＶ  ＲＮＡがカベオリン−２と共に分画される（ｃｏ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅ）ことが、以前から見出されている［８］。しかしながら、これまでＨＣＶをカベオリン−３と関連づけた報告は存在しなかった。カベオリン−１およびカベオリン−２は、共に遍在的に発現されるが［９］、カベオリン−３の発現は、筋肉特異的であることが報告されている（星状細胞における発現を示唆する証拠もいくつかある［１０］）。この発現パターンはＨＣＶの組織向性（ｔｒｏｐｈｉｓｍ）と合致せず、したがって、ＨＣＶとカベオリン−３との関係は意外である。
【０００８】
したがって、本発明は、（ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み；かつ（ｉｉ）カベオリン−３を発現する細胞を提供する。
【０００９】
本発明はまた、（ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸、ならびに（ｉｉ）カベオリン−３をコードする核酸を含む細胞を提供する。この核酸は、好ましくは、カベオリン−３をコードするｍＲＮＡ転写産物である（すなわち、この核酸が発現されている）。
【００１０】
本発明はまた、本発明の細胞を含むインビトロ細胞培養物を提供する。
【００１１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）カベオリン−３を発現し、かつＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞を提供する工程；ならびに（ｂ）この細胞を培養する工程を包含するプロセスを提供する。ＨＣＶを産生するためのプロセスは、次いで、（ｃ）ＨＣＶビリオンを精製する工程を包含し得る。
【００１２】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）（ｉ）カベオリン−３をコードする核酸、および（ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程；ならびに（ｂ）この細胞を培養する工程を包含するプロセスを提供する。ＨＣＶを産生するためのプロセスは、次いで、（ｃ）ＨＣＶビリオンを精製する工程を包含し得る。
【００１３】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）カベオリン−３をコードするベクターで細胞をトランスフェクトする工程であって、この細胞がＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む工程；ならびに（ｂ）この細胞を培養する工程を包含するプロセスを提供する。ＨＣＶを産生するためのプロセスは、次いで、（ｃ）ＨＣＶビリオンを精製する工程を包含し得る。
【００１４】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）カベオリン−３をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程；（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスにこの細胞を感染させる工程；ならびに（ｃ）この細胞を培養する工程を包含するプロセスを提供する。工程（ａ）と（ｂ）とは、いずれの順序でも実施され得る。ＨＣＶを産生するためのプロセスは、次いで、（ｄ）ＨＣＶビリオンを精製する工程を包含し得る。
【００１５】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ｉ）内因性カベオリン−３遺伝子、および（ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞を、このカベオリン−３遺伝子が発現される条件下で培養する工程を包含するプロセスを提供する。ＨＣＶを産生するためのプロセスは、次いで、ＨＣＶビリオンを精製する工程を包含し得る。
【００１６】
本発明はまた、カベオリン−３を発現しない細胞を改変するためのプロセスであって、（ｉ）カベオリン−３をコードするベクターでこの細胞をトランスフェクトすること；または（ｉｉ）内因性カベオリン−３遺伝子の発現を開始させるために、この細胞中の上記内因性遺伝子の調節成分を改変することから選択される方法により、この細胞におけるカベオリン−３の発現を開始させる工程を包含するプロセスを提供する。この改変細胞は、次いで、ＨＣＶ増殖に使用され得る。
【００１７】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのプロセスであって、（ａ）（ｉ）カベオリン−３遺伝子と（ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸とを含む細胞を提供する工程；ならびに（ｂ）血清欠乏の条件下においてこの細胞を維持する工程を包含するプロセスを提供する。ＨＣＶを産生するためのプロセスは、次いで、（ｃ）ＨＣＶビリオンを精製する工程を包含し得る。このカベオリン−３遺伝子は、好ましくは、内因性である。
【００１８】
本発明はまた、本発明の細胞を含む動物を提供する。この細胞は、動物に移植されたものであっても内因性のものであってもよい。
【００１９】
本発明は、（ｉ）ＣＤ８１；（ｉｉ）ＨＣＶタンパク質；および（ｉｉｉ）カベオリン−３を含むタンパク質様複合体を提供する。この複合体は、コレステロールも含み得る。
【００２０】
本発明は、カベオリン−３とＨＣＶタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でカベオリン−３とＨＣＶタンパク質との間の相互作用の阻害を評価する工程を包含する方法を提供する。この相互作用を阻害する候補化合物は、抗ウイルス活性を有し得る。このスクリーニングの方法は、（ｉ）カベオリン−３とＨＣＶタンパク質と１種以上の候補化合物とを混合する工程；（ｉｉ）この混合物をインキュベートして、カベオリン−３、上記ＨＣＶタンパク質および上記候補化合物の任意の相互作用を許容させる工程；ならびに（ｉｉｉ）カベオリン−３と上記ＨＣＶタンパク質との間の相互作用が阻害されるか否かを評価する工程を包含し得る。工程（ｉ）におけるカベオリン−３と、上記ＨＣＶタンパク質と、候補化合物との混合は、いずれの順序でもなされ得る。
【００２１】
本発明はまた、カベオリン−３とＨＣＶタンパク質との相互作用を阻害する化合物であって、本発明のスクリーニング方法により得られたか、または得られ得る化合物を提供する。
【００２２】
本発明はまた、カベオリン−３と特異的に結合し得る抗体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、標的細胞におけるカベオリン−３の発現をダウンレギュレートし得る化合物を提供する。これは、典型的に、カベオリン−３に対して配列特異的な様式で作用し得る核酸（例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、ロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはｓｉＲＮＡ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（Ｃ型肝炎ウイルスゲノム）
本発明の細胞は、ＨＣＶゲノムおよび／またはＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む。したがって、これらの細胞は、＋鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを含み得るか、または転写されて直接的もしくは間接的に＋鎖ＲＮＡゲノムを与え得る核酸を含み得る。例えば、（天然ＨＣＶの生活環はＤＮＡ段階を含まないが）正しい配向のゲノムのＤＮＡコピーの転写は、ＨＣＶゲノムとして作用し得る（すなわち、その後に通常のＨＣＶ生活環において見られるようにプロセシングされるＨＣＶポリタンパク質の発現を指示し得る）ＲＮＡを与える。
【００２５】
ＨＣＶのゲノムＲＮＡは、天然には、５’キャップ（ｍ７Ｇ５’ｐｐｐ５’Ａ）を含み、ポリ−Ａ尾部を含まず、５’非コード領域（ＮＣＲ：ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）および３’非コード領域の両方を有する。これらのエレメントは、本発明に従って使用されるＨＣＶゲノムに典型的に存在するが、このＨＣＶゲノムおよび／またはこのゲノムをコードする核酸は、天然ゲノムにおいては見られない１つ以上のエレメントを含み得る。例えば、通常、インビトロ複製系において使用されるＨＣＶゲノムは、以下の内の１つ以上を含む：ポリタンパク質の上流の（例えば、ゲノムの５’末端近くの）選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性マーカー）をコードする配列；たとえ他の上流コード配列が存在し得ても、ポリタンパク質の翻訳を可能とする、例えば、ポリタンパク質をコードする配列の上流の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、ＥＭＣＶまたはポリオウイルス由来のＩＲＥＳ）。ゲノムの５’末端にて５’Ｔ７プロモーターを有する構築物が記載されているが［１１］、これは好適なものではない。
【００２６】
ＨＣＶゲノムは、いずれかの型（例えば、１、２、３、４、５、６）または亜型（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、１ｌ、１ｍ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｋ、４ａ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、４ｎ、４ｏ、４ｐ、４ｑ、４ｒ、４ｓ、４ｔ、５ａ、６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ、６ｊ、６ｋ、６ｌ、６ｍ、６ｎ）であり得る。この名称は、以前の遺伝子型７〜９を参考文献１３に基づき６型の亜型として再分類したＮＩＡＩＤ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ［１２］に提示される通りの現行の標準である。したがって、この新たな分類は、以前の分類Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、４α、４β、７ａ、７ｂ、７ｃ／ＮＧＩＩ／ＶＩＩ、７ｄ、ＮＧＩ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａ／ＴＤ３および１１ａを含む。本発明による使用に適したＨＣＶ株の１つは、遺伝子型２ａのＪＦＨ１株である［１４］。
【００２７】
ＨＣＶゲノムは、野生型ゲノムに対する１つ以上の変異のハイブリッド（挿入、欠失および／または置換を含む）を含み得、または２種以上の野生型ゲノム（例えば、亜型２ａ株（例えば、Ｊ６）および亜型１ａ株（例えば、Ｈ７７）のキメラ）であり得る。ウイルスＲＮＡレプリカーゼがプルーフリーディング活性を有さないのでゲノムにおける変異は頻繁であり、その結果、変異体ゲノム（すなわち、「準種（ｑｕａｓｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）」）が容易に得られ、分析され得る。一部の変異が、ゲノムの特定の細胞内で複製される能力を改善することが報告された。参考文献４は、細胞適合（ｃｅｌｌ−ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）に関する変異体（Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、Ｋ１８４６ＴおよびＳ２１９７Ｐを含む）を記載している。参考文献３は、トランスフェクション効率および継代培養（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）を生き残る能力を増大する変異（例えば、Ｒ１１６４Ｇ、Ｓ１１７２Ｃ、Ｓ１１７２Ｐ、Ａ１１７４Ｓ、Ｓ１１７９Ｉ）を含むＨＣＶ改変体を記載している。他の公知の変異としては、Ｌ１７５７Ｉ、Ｎ２１０９Ｄ、Ｐ２３２７ＳおよびＫ２３５０Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。特定の変異が、特定の宿主細胞を用いた使用に好適であり得、その逆も言える。ＨＣＶのポリタンパク質は、好ましくは、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの全てを含むが、より大きな欠失および挿入（例えば、成熟コード領域（例えば、非構造タンパク質の成熟コード領域）の欠失、または非ＨＣＶ配列の挿入）も可能である。本発明はまた、サブゲノムＨＣＶ（すなわち、完全なゲノムよりも短いＨＣＶ（典型的には、非構造タンパク質を含むが構造タンパク質を含まない（例えば、完全なＣ、Ｅ１、Ｅ２を有さない）ＨＣＶ）を含む）と共に使用され得るが、本発明の主要な利点は、全長ゲノムの複製を可能とすることである。
【００２８】
これらおよび他の変異が本発明に従って使用されるＨＣＶゲノム中に存在し得るが、一般的に、これらの変異体は、このゲノムのＨＣＶポリタンパク質の発現を誘導する能力を除去せず、このＨＣＶポリタンパク質は、発現された後、このＨＣＶポリタンパク質を発現したＨＣＶゲノムを複製し得る。
【００２９】
ＨＣＶ  ＲＮＡまたはこのＨＣＶ  ＲＮＡをコードする核酸は、本発明のプロセスの一部として細胞に導入され得るか、または、既に細胞の一部であり得る（例えば、２１−５細胞株［４］は、既にＨＣＶに感染している）。
【００３０】
この細胞がＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む場合、この核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとり得、染色体性または染色体外性（例えば、エピソーム性）のいずれかであり得る。ＨＣＶゲノムをコードするＤＮＡプラスミドが、好都合に使用され得る。
【００３１】
ＨＣＶゲノムおよびカベオリン−３タンパク質の両方をコードするＤＮＡが使用され得る。このＤＮＡは、通常、以下の２つの異なる転写物を有する：（ｉ）ＨＣＶゲノム（または、おそらくアンチゲノム）および（ｉｉ）カベオリン−３をコードするｍＲＮＡ。しかしながら、このＤＮＡは、（ｉ）ＨＣＶゲノム（またはアンチゲノム）およびカベオリン−３のコード配列を、下流配列の翻訳を制御するためのＩＲＥＳと共に含む単一の転写物を有することも可能である。
【００３２】
ＨＣＶゲノムは、典型的に、レプリコンの形態（すなわち、それ自体のコピーの生成を誘導し得る核酸）で含まれる。ゲノムレプリコン系またはサブゲノムレプリコン系を使用する細胞ベースのＨＣＶ複製系が周知である。レプリコンは、ウイルスＲＮＡのセンス鎖に基づくが、本発明は、センス鎖へと転換されてレプリコンを提供し得る相補配列も、利用し得る。レプリコンは、非ＨＣＶ遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）も含み得る。
【００３３】
（カベオリン−３）
カベオリンは、カベオラの規定タンパク質成分である［９］。カベオラは、古典的に、約５０ｎｍ〜１００ｎｍの特有の直径を有する原形質膜陥入部と定義されるが、このような形態学的な記述が不適切であることが、現在では知られている。カベオラは、原形質膜面内または分離小胞面内に平たく陥入され得る。加えて、カベオラは、融合して、大きさが１００ｎｍよりも顕著に大きなブドウ様構造物および細管を形成し得る。形態学的には、これらは内皮、筋肉細胞型、脂肪細胞および肺上皮細胞に豊富に存在する。カベオラ様構造物は、神経系内にも存在する。
【００３４】
カベオラは、特有の液体組成を有する。カベオラは、主に、コレステロールおよびスフィンゴ脂質からなる。一方、原形質膜の非カベオラ領域（ｎｏｎｃａｖｅｏｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ）は、主に、リン脂質からなる。カベオリンは、多様な細胞機能に関係付けられた２１ｋＤａ〜２５ｋＤａの内在性膜タンパク質のファミリーである。少なくとも３つのカベオリン遺伝子が存在することが知られている。これらのカベオリン遺伝子は、そのコレステロールとの相互作用により、陥入カベオラの形成を促進すると考えられる。カベオリンは、中央部にある３３アミノ酸の疎水性ドメインを通じて膜と会合し、Ｎ−末端ドメインおよびＣ−末端ドメインが共に、完全に細胞質ゾルのままであることを可能にしていると考えられる。カベオリンは、直接、コレステロールと結合する。
【００３５】
カベオリンについて、３つの関連する重要な機能的役割が記載された：（ｉ）カベオラ膜の主要な構造タンパク質成分；（ｉｉ）ＥＲから原形質膜までのコレステロールの生合成の輸送におけるシャトルタンパク質；および（ｉｉｉ）カベオラ膜の細胞質表面に集中するシグナル伝達分子を統合し、不活性化させる足場タンパク質（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【００３６】
カベオリンは、広範なシグナル伝達プロセスと機能上で関係付けられている。一般に、カベオリン−１およびカベオリン−３は、広範なシグナル伝達分子の酵素活性を抑制するが、カベオリン−２は、ほとんどまたは全く効果を有さない。１つの顕著な例外は、インシュリンレセプターチロシンキナーゼである；カベオリン−１およびカベオリン−３は、インシュリンレセプターがその主要な基質の１つであるＩＲＳ−１をリン酸化する能力を増大させる。
【００３７】
カベオリン−３は、筋細胞膜（筋肉細胞原形質膜）に局在し、別の筋肉特異的原形質膜マーカータンパク質であるジストロフィンの分布と一致する。カベオリン−３は、細胞質のシグナル伝達分子（Ｇタンパク質およびＳｒｃ様キナーゼ）およびジストロフィン複合体（ジストロフィン、α−サルコグリカンおよびβ−ジストログリカン）の膜と共に分画される。
【００３８】
カベオリン−３がジストロフィンと物理的複合体を形成することも示され、このことは、筋肉生物学におけるカベオリン−３の重要な役割を示唆している。カベオリン−３タンパク質の発現は、培養中のＣ２Ｃ１２骨格筋芽細胞の分化の間に劇的に誘発される。更に、カベオリン−３は、筋発生の間、Ｔ細管と一時的に会合し、Ｔ細管系の初期発生に関与し得る。
【００３９】
カベオリン−３はまた、筋肉中のホスホフルクトキナーゼ−Ｍと相互作用する。この相互作用は、（ｉ）グルコースの細胞外濃度により高度に調節されており、かつ（ｉｉ）多数の関連する細胞内代謝産物（例えば、ホスホフルクトキナーゼ−Ｍの公知のアロステリック活性化因子である、フルクトース１，６−ビスホスフェートおよびフルクトース２，６−ビスホスフェート）により安定化され得る。カベオリン−３による活性化ホスホフルクトキナーゼ−Ｍのグルコース依存性原形質膜への動員は、骨格筋線維におけるエネルギー代謝を調節することにおける重要な役割を果たし得る。
【００４０】
遺伝子的証拠は、筋機能におけるカベオリン−３の重要性を強調する。筋線維におけるカベオリン−３の深刻な欠乏と関係づけられる常染色体優性肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）の形態が報告された。ヒトカベオリン−３の遺伝子は、染色体３ｐ２５上にマッピングされ、遺伝子内の２つの変異（膜貫通領域中のミスセンス変異（Ｐ→Ｌ）、および足場ドメイン中の微小欠失（ΔＴＦＴ））が同定された。これらの変異は、カベオリン−３のオリゴマー化を妨げ得、また、筋肉細胞原形質膜におけるカベオラ形成を妨害する可能性もある。しかしながら、これら２つの変異が筋ジストロフィーの原因となる分子機構はまだ知られていない。
【００４１】
これらのカベオリン−３の変異の表現型の挙動が、異種発現を使用することにより調査された。野生型カベオリン−３またはカベオリン−３の変異体が、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞内で一時的に発現された。ＬＧＭＤ−１Ｃ変異はカベオリン−３の不安定な高分子量凝集物の形成をもたらし、これは、ゴルジ複合体内に保持され、原形質膜には導かれない。遺伝的伝達の常染色体優性形態と一致して、カベオリン−３のＬＧＭＤ−１Ｃ変異体は、優性阻害様式で挙動し、ゴルジ複合体のレベルでの野生型のカベオリン−３の保持をもたらす。これらのデータは、なぜＬＧＭＤ−１Ｃを有する患者においてカベオリン−３のレベルがダウンレギュレートされるのかについての分子的説明を提供する。
【００４２】
カベオリン−３は、シャペロニンであることが報告された［１６］。
【００４３】
目下、カベオリン−３の発現が、筋肉内だけに見られるものではないことが見出された。驚くことに、これはＨＣＶレプリコンを有するＨｕｈ−７細胞株中に検出され［１５］、更に、粒状のＨＣＶタンパク質構造物と共に細胞内に局在することが見出された。発現は、ＨＣＶ感染によって誘発されないと思われるが、低い内因性レベルで存在するものと思われる。
【００４４】
カベオリン−３のＧｅｎｅＣａｒｄの登録は、コードＣＡＶ３を使用して見つけられ得る。ＧｅｎＣａｒｄは、このタンパク質がＬＧＭＤ１Ｃ、Ｍ−カベオリンおよびＶＩＰ−２１とも呼ばれていたことを明らかにする。１０種のＳＮＰがこれまでのところ記載されている。参照ヒトＣＡＶ３配列は、１５１マーであり、ＧＩ番号ＧＩ：４５０２５８９およびアクセッション番号ＮＰ＿００１２２５（配列番号１）を有する。
【００４５】
【化１】
2009513109.tif 000003
疾病関連単一アミノ酸変異は、残基２７（Ｒ／Ｑ）、２９（Ｄ／Ｅ）、３３（Ｎ／Ｋ）、４４（Ｖ／Ｅ）、４６（Ａ／ＴおよびＡ／Ｖ）、５６（Ｇ／Ｓ）、６４（Ｔ／Ｐ）、７２（Ｃ／Ｗ）、８７（Ｌ／Ｐ）、９３（Ａ／Ｔ）、および１０５（Ｐ／Ｌ）におけるものが開示された。残基６４〜６６の欠失も報告された。切断型のカベオリン−３もまた、報告された（例えば、参考文献１６のｃａｖＤＧＶ切断）。
【００４６】
データベース中のさらなるヒトＣＡＶ３配列としては、ＡＦ０４３１０１、ＡＡＣ１４９３１．１、Ｙ１４７４７、ＣＡＡ７５０４２．１、ＡＦ０３６３６７、ＡＡＣ３９７５８．１、ＡＦ０３６３６６、ＡＡＣ３９７５８．１、ＡＦ０３６３６５、ＡＡＣ３９７５６．１、ＢＣ０６９３６８、ＡＡＨ６９３６８．１などの登録が挙げられる。ヒトカベオリン−３は、マウスおよびラットのカベオリン−３タンパク質配列と９５％同一である。ヒトカベオリン−３は、ヒトカベオリン−１に対して８２％の類似性を示し、ヒトカベオリン−２に対して５８％の類似性を示す。
【００４７】
このような機能上の特徴付けおよび配列情報を背景にして、当業者は、所与の配列がカベオリン−３の配列であるか否かを容易に同定し得る。本発明の好ましいカベオリン−３タンパク質は、配列番号１に対し、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を有する。他の好ましいカベオリン−３タンパク質は、配列番号１の少なくともｎ連続するアミノ酸のフラグメントを含み、このｎは、７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。このフラグメントは、シグナルペプチドなどを除外し得る。このフラグメントは、Ｃ末端および／またはＮ末端におけるカベオリン−３の切断によるものであり得る。好ましいフラグメントとしては、膜貫通ドメインであるアミノ酸８４〜１０４の中央領域が挙げられる。別の好ましいフラグメントとしては、カベオリン−３のカベオリン−足場ドメイン（すなわち、少なくともアミノ酸５５〜７３）が挙げられる。
【００４８】
配列番号１と比較すると、これらのポリペプチドは、１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の保存的なアミノ酸の置換（すなわち、関連側鎖を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換）を含む。遺伝子的にコードされたアミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分けられる：（１）酸性（すなわち、アスパルテート、グルタメート）；（２）塩基性（すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および；（４）非荷電極性（すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることもある。一般に、これらのファミリー中の単一アミノ酸の置換は、生物活性に対して大きな影響を有さない。これらのポリペプチドは、配列番号１と比較して、１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一アミノ酸欠失を有し得る。これらのポリペプチドはまた、配列番号１と比較して、１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、それぞれ１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、または５アミノ酸）を含み得る。
【００４９】
（細胞型）
本発明の細胞は、以下の２つの必須の特徴を有する：（１）これらは、ＨＣＶ生活環およびその複製を支持するためにＨＣＶゲノムを発現し得る；（２）これらは、カベオリン−３を発現し得る。これらの細胞は、これら両方の特徴を既に有し得るか、またはこれらの特徴のうちの一方もしくは両方が導入され得る。したがって、例えば、細胞はＨＣＶまたはＨＣＶをコードする核酸で感染され得、かつ（ＨＣＶの導入前、導入後または導入と同時のいずれかに）カベオリン−３をコードするベクターでトランスフェクトされ得る。
【００５０】
全ての野生型のヒト細胞がカベオリン−３をコードする遺伝子を含むので、上記細胞（例えば、筋肉細胞）は、既にこのタンパク質を既に発現し得る。細胞が天然には内因性遺伝子由来のカベオリン−３を発現しない場合、このタンパク質を発現する能力は、内因性遺伝子の発現を活性化することにより（例えば、プロモーターの置換により）および／または発現されるさらなるコピーを提供することにより達成され得る。このさらなるコピーは、エピソーム性であっても染色体性であってもよい。
【００５１】
内因性カベオリン−３の発現はまた、その内因性遺伝子を発現する細胞を刺激することによっても達成され得る。カベオリン−３の発現を刺激する１つの公知の方法は、血清欠乏を用いる。この処理は、典型的に、「高マイトジェン」増殖培地（例えば、１０％のウシ胎仔血清を含む）の代わりに、低量の血清を含むか血清を含まない「低マイトジェン」増殖培地（例えば、２％のウマ血清を含む）を使用することを含む。「低マイトジェン」増殖培地は、筋肉細胞を分化する際の使用について、参考文献１７に記載されている。
【００５２】
ＨＣＶゲノムを含むことに加え、細胞は、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を含み得る。参考文献１８に開示されるように、ＨＣＶ生活環の間に生成されるＥ１およびＥ２タンパク質とは別にＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質を発現する能力が、ビリオン集合を促進する。Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡベクターが好ましい。上記核酸は、染色体性または染色体外性（例えば、エピソーム性）のいずれかであり得る。Ｅ１およびＥ２を細胞に導入するのに好ましい核酸ベクターは、レトロウイルスベクターであり、このレトロウイルスベクターは、組込み型ベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）であり得る。したがって、Ｅ１配列およびＥ２配列は、レトロウイルスのＲＮＡゲノムに挿入物として導入され得る。逆転写（および、適用可能な場合は、組込み）後、Ｅ１配列およびＥ２配列は、上記細胞内でＤＮＡ形態である。他の適切なベクターとしては、ＤＮＡプラスミドが挙げられる。Ｅ１およびＥ２を発現することに加え、上記核酸は、ｐ７を発現し得る。
【００５３】
ＨＣＶは天然には真核細胞に感染するので、本発明は、一般的に、真核細胞を使用する。哺乳動物細胞（例えば、霊長類細胞（ヒト細胞を含む））を使用することが好ましい。その細胞がＨＣＶ研究に使用され得る他の動物としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス；ラット；ウッドチャック；トガリネズミ（例えば、ツバイ）；チンパンジー；テナガザル；タマリン；およびマーモセット。
【００５４】
あらゆる適切なカベオリン−３発現細胞（筋細胞を含む）が代わりに使用され得るが、ＨＣＶは天然には肝臓細胞に感染するので、肝臓由来の細胞（例えば、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ））を使用することが好都合である。カベオリン−３の発現が血清欠乏の簡単な工程によりアップレギュレートされ得るので、筋肉細胞（筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）を含む）は好都合な細胞型である。しかしながら、本発明は、筋肉細胞ではない細胞（特に、カベオリン−３を発現する非筋肉細胞）を使用し得る。
【００５５】
典型的に、本発明で使用される細胞は、細胞株（好ましくは、パッケージング細胞株（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ））である。本発明での使用に好ましい細胞株は、肝細胞癌腫（すなわち、「Ｈｕｈ７」として知られるヒトヘパトーマ細胞株［１５］）に由来する。特に好ましい細胞株は、「２１−５」として知られるＨｕｈ７由来の細胞株であり、この細胞株は、全長ＨＣＶレプリコンを支持する。他の好ましい細胞株は、Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７．８であり、これらは、細胞培養において完全なＨＣＶ複製を支持し得るＨｕｈ−７の亜株［１９、２０］であり、Ｈｕｈ−７．５が好ましい。Ｈｕｈ７細胞（およびそれらの派生物）の継代培養により得られる細胞もまた、α−インターフェロンおよび／またはγ−インターフェロンでＨｕｈ７細胞を処理することにより得られる細胞と同様に使用され得る。参考文献２０で開示されるように、ＨＣＶを許容する細胞株は、以下の工程を包含するプロセスにより調製され得る：（ａ）ＨＣＶに感染した細胞を培養する工程；（ｂ）ＨＣＶの細胞を治療する工程；および（ｃ）ＨＣＶ複製を許容する治療された細胞の亜株を同定する工程。
【００５６】
他の確立されたヒトヘパトーム細胞株および肝芽腫細胞株としては、ＨｕＨ−６  ｃｌ−５、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ｈｕＨ−１およびｈｕＨ−４が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞は、完全ＤＭＥＭ（例えば、２ｍＭのＬ−グルタミン（非必須アミノ酸）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％のウシ胎仔血清を補ったダルベッコ変法最小基礎培地）のような培地で単層として増殖され得る。
【００５７】
特定の細胞型が特定のウイルス株での使用に対して好ましくあり得、その逆も言える。
【００５８】
本発明の細胞は、ＨＣＶゲノム由来のポリタンパク質を発現する。結果として、これらの細胞は、ＨＣＶ粒子（ビリオンおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む）を発現するためのタンパク質構成要素を含む。したがって、ビリオンおよびＶＬＰは、本発明の細胞から調製され得る。これらは、ＲＮＡゲノムを含むこともあるし、含まないこともある。これらの細胞はまた、Ｅ１とＥ２との複合体も発現し得る。これらの細胞はまた、Ｅ１とＥ２とＮＳ３とＮＳ５ａとの複合体も発現し得る。
【００５９】
上記により詳細に記載されるように、本発明の細胞は、ＨＣＶゲノムおよび／またはＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む。ＨＣＶゲノムは、ウイルス感染により細胞に導入され得、あるいは、ウイルス感染（現実の感染または人工的感染）後またはゲノムのＤＮＡコピーからの転写後のいずれかに、インサイチュで生成され得る。ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶゲノムをコードするＤＮＡを細胞に導入するための方法は、当該技術分野において慣例的である。インビトロで転写されたＨＣＶゲノムは、参考文献４で開示されるように、電気穿孔法を用いてＨｕｈ７細胞に導入され得る（４×１０６個のＨｕｈ−７細胞に１μｇの精製インビトロ転写産物を電気穿孔法により導入、または２．４×１０７個のＨｕｈ−７細胞に６０μｇのＨＣＶ  ＲＮＡを電気穿孔法により導入）。
【００６０】
本発明の細胞は、インビトロ培養で増殖し得る。ＨＣＶ複製が起こる条件でこれらの細胞を培養することについての詳細は、当該技術分野において公知である。ウイルス増殖後のＨＣＶビリオンを精製するための方法もまた、当該技術分野において公知である。
【００６１】
ＨＣＶゲノムを本発明に従って発現させる場合、免疫蛍光染色法が用いられる場合にドット様（ｄｏｔ−ｌｉｋｅ）の粒子が見られ得る。望ましい場合は、細胞からのこれらの粒子の遊離が、（例えば、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）などの遊離を引き起こすために）適切な遊離因子で細胞を処理することにより促進され得る。そのような因子としては、アルコール、ストレス条件などが挙げられる。非共有結合性のＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーが、小胞体中で検出されており、この細胞コンパートメントから回収され得る。
【００６２】
（動物モデル）
ＨＣＶ感染用の多種の動物モデルが記載されている（例えば、参考文献２１〜２９）。
【００６３】
ＨＣＶ感染の効率が所望されるよりも低い場合、動物中のカベオリン−３の発現をアップレギュレートすることによりその効率を上昇させ得る。これは種々の方法で達成され得る。例えば、本発明の細胞は、宿主動物に移植または注射され得、そこで、外来の細胞がカベオリン−３を発現し、ＨＣＶ増殖を促進し得る。別の方法として、遺伝子変化が（例えば、遺伝子治療技術を用いて）動物の内在性の細胞に導入され得る。更に別の方法として、動物が生成される細胞に（例えば、胚細胞、幹細胞、胚幹細胞、核移植ドナー細胞などに）そのような遺伝子変化を導入し、それにより、その動物全体に同種性を与え得る。更に別の方法として、この動物は、その内因性カベオリン−３遺伝子の発現を刺激する処置に供され得る。
【００６４】
したがって、内因性カベオリン−３遺伝子の発現は、アップレギュレートされ得、かつ／または外因性カベオリン−３遺伝子が導入され得る。外因性カベオリン−３遺伝子が導入される場合は、この遺伝子は、上記動物と同じ生物体に由来し得るか（例えば、マウスにマウスカベオリン−３遺伝子を導入する）、または異なる生物体に由来し得る（例えば、マウスにヒトカベオリン−３遺伝子を導入する）。
【００６５】
本発明の動物は、好ましくは、細胞がこのようにして改変された肝臓を有する。より好ましくは、全てのその肝臓細胞が、このようにして改変される。
【００６６】
本発明の動物は、ＨＣＶに感染してなくてもよく、その場合は、この動物は、後で研究のためにＨＣＶ感染に曝露され得る；あるいは、ＨＣＶに感染していてもよく、その場合は、この動物は、ＨＣＶのウイルス学的研究（例えば、細胞への侵入、感染進行、複製、ウイルス集合、抗ウイルス化合物の効力など）に有用である。
【００６７】
この動物は、免疫欠損（例えば、ＳＣＩＤ動物または放射線照射動物）であり得る。放射線照射ＳＣＩＤマウスが特に有用である。
【００６８】
任意の適切な動物が使用され得るが、典型的なモデルは、マウス；ラット；ウッドチャック；トガリネズミ（例えば、ツバイ（Ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ））；チンパンジー；テナガザル；タマリン；およびマーモセットからなる群より選択される哺乳動物に基づく。
【００６９】
一生物体の細胞が、動物モデルの生成のために異なる生物体に導入され得る。例えば、ヒト肝細胞をマウス宿主の肝臓に移植することが知られている［３０、３１］。
【００７０】
（スクリーニング方法）
上記したように、本発明は、カベオリン−３とＨＣＶタンパク質との相互作用を阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。このＨＣＶタンパク質は、典型的には、Ｅ１、Ｅ２、またはＥ１および／もしくはＥ２を含むオリゴマーであるか、あるいは、コアタンパク質または非構造タンパク質であり得る。これらのスクリーニング方法は、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３との相互作用を評価する工程を包含し、試験化合物のこの相互作用を破壊する能力は、ＨＣＶの成熟を妨げる潜在的な治療活性を示している。
【００７１】
（直接スクリーニング）
候補化合物の存在下におけるＨＣＶ／カベオリン−３相互作用の阻害が、直接的に評価され得る。タンパク質／タンパク質相互作用の直接検出のための種々の方法が利用可能である。
【００７２】
例えば、ＨＣＶ／カベオリン−３複合体が形成または破壊される場合に生じる固有の蛍光変化によりＨＣＶとカベオリン−３との相互作用が検出され得るように、ＨＣＶおよびカベオリン−３の一方または両方が、蛍光ラベルで標識され得る。例えば、ＨＣＶとカベオリン−３とが相互作用する場合、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーの刺激がＦＲＥＴアクセプターを励起し、それにより光子が放射され得るように、ＨＣＶタンパク質がＦＲＥＴドナーと結合され、カベオリン−３がＦＲＥＴアクセプターと結合され得る（またはその逆）。ＨＣＶタンパク質およびカベオリン−３が複合体を形成する際に蛍光が消光されるように、相互作用もまた、ＨＣＶタンパク質および／またはカベオリン−３の蛍光標識により検出され得る。
【００７３】
ＨＣＶとカベオリン−３タンパク質との相互作用を評価するための別の方法は、共免疫沈降反応（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）である。例えば、抗ＨＣＶ抗体が、混合物から関連するＨＣＶタンパク質を免疫沈降させるために使用され得、この沈降させた物質が、カベオリン−３の存在について（例えば、ウェスタンブロットによりまたは標的タンパク質中のタグの存在を検出することにより）試験され得る。この逆もまた用いられ得る（すなわち、抗カベオリン−３抗体を用いて免疫沈降させ、共沈降したＨＣＶタンパク質について調査する）。
【００７４】
ＨＣＶとカベオリン−３との相互作用を評価するための他の方法は、候補化合物が存在する場合にＮＭＲを用いて複合体が存在するか否かを決定する工程を包含し得る。
【００７５】
ＨＣＶ／カベオリン−３複合体の存在はまた、ゲル上で実施される場合に、特定の位置においてバンドとして検出され得る。候補化合物の添加による複合体の破壊は、ゲル上の異なる位置におけるバンドの存在により検出され得る。
【００７６】
ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用もまた、それらが複合体を形成する場合に遮蔽されるＨＣＶタンパク質および／またはカベオリン−３タンパク質上のペプチド配列（例えば、エピトープ）の利用可能性を検出することにより評価され得る。
【００７７】
（２−ハイブリッド系（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いる、インヒビターの間接スクリーニング）
ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が候補化合物の存在下において阻害されるか否かは、間接的にも評価され得る。候補化合物の存在下におけるＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用の阻害についてのスクリーニングの１つの間接的方法は、２−ハイブリッド系を用いることを包含する。ＨＣＶタンパク質が転写因子の活性化ドメインに融合され、カベオリン−３が転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合されて（またはその逆）、これらの相互作用が細胞内のレポーター遺伝子の転写を促進する。
【００７８】
したがって、本発明は、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）レポーター遺伝子と操作可能に連結されるプロモーターを含む核酸分子を含む細胞を（ａ）転写因子の活性ドメインに融合したＨＣＶタンパク質およびカベオリン−３のうちの一方を含む第一融合タンパク質、（ｂ）転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合したＨＣＶタンパク質およびカベオリン−３のうちの他方を含む第二融合タンパク質；および（ｉｉｉ）候補化合物と接触させる工程；ならびに（ｉｉ）レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程を包含する方法を提供する。この方法において、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が、上記プロモーターを活性化することによりレポーター遺伝子の転写を促進する。
【００７９】
この方法は、あらゆる真核細胞におけるＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を評価するために使用され得る。好ましくは、この方法は、酵母細胞または哺乳動物細胞におけるＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を評価するために使用される。候補化合物が有機化合物であり、酵母２−ハイブリッド系が使用されている場合、好ましくは、酵母細胞壁の透過性が（例えば、化学物質（例えば、ポリミキシンＢ）を使用することにより）高められる。
【００８０】
２−ハイブリッド系におけるレポーター遺伝子の発現レベルは、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用のレベルを示している。この相互作用を阻害する候補化合物は、レポーター遺伝子の発現レベルを低下させるかまたは発現を停止させる。
【００８１】
好ましくは、上記レポーター遺伝子は、容易にアッセイされる。例えば、上記レポーター遺伝子は、検出可能なシグナル（例えば、可視シグナル）を与え得る。上記レポーター遺伝子は、可視シグナルそのものを与えるタンパク質、または可視変化を与える反応を触媒するタンパク質（例えば、蛍光タンパク質または酵素）をコードし得る。上記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼまたはペルオキシダーゼといった酵素をコードし得、これらの酵素はいずれも、一般的には、有色基質および／または有色生成物と共に使用される。上記レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその蛍光誘導体（例えば、ＹＦＰまたはＣＦＰ）をコードし得る［３２］。上記レポーター遺伝子は、発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をコードし得る。上記レポーター遺伝子は、細胞内のＤＮＡ複製を推進し得るか［３３］、または薬物耐性マーカーをコードし得る［３４］。
【００８２】
上記レポーター遺伝子は、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が阻害される細胞の正の選択を可能とするタンパク質をコードし得る。例えば、上記レポーター遺伝子は、毒性または細胞増殖抑制性のタンパク質をコードし得、その結果、このタンパク質を発現しない細胞のみが残存または増殖し得る（「逆２−ハイブリッド」または「ＭＡＰＰＩＴ」アッセイ［３５〜３７］）。結果として、残存する細胞のみが、候補化合物によってＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が阻害される細胞であり、その結果、上記レポーター遺伝子が発現されない。酵母において使用され得るこの種のレポーター遺伝子の例としては、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２およびＣＹＨ２が挙げられる［３８］。レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質はまた、細胞培地において、特定のアミノ酸もしくは他の成分の不在下または存在下で細胞増殖を妨げ得る。例えば、上記レポーター遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質であるＴｎ１０テトラサイクリンをコードし得、このタンパク質が、ＴｅｔＲｏｐ−ＨＩＳ３遺伝子の転写を抑制し、その結果、上記レポーター遺伝子が発現される酵母細胞はヒスチジンの不在下で増殖しない［３９］。対照的に、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が破壊された酵母細胞はＴＮ１０テトラサイクリンを発現せず、したがって、ヒスチジンの不在下で増殖し得る。
【００８３】
上記レポーター遺伝子によりコードされるこれらのタンパク質は、融合タンパク質の形態であり得る。融合タンパク質の生成のための方法は、当該技術分野における標準であり、当業者に公知である。
【００８４】
上記レポーター遺伝子の発現レベルはまた、このレポーター遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルまたはその転写後に翻訳されるタンパク質のレベルを測定することにより評価され得る。
【００８５】
（スクリーニング方法を実施するための系）
本発明のスクリーニング方法は、無細胞系において、または細胞もしくは組織において実施され得る。特に、上記の間接スクリーニング方法は、無細胞系において、細胞において、または組織において実施され得る。この無細胞系は、発現レベルがｍＲＮＡレベルを測定することにより検出されるレポーター遺伝子の転写に必要な全ての成分を含んでいなければならず、発現レベルがタンパク質レベルを測定することにより評価されるレポーター遺伝子の転写および翻訳に必要な全ての成分を含んでいなければならない。
【００８６】
本発明のスクリーニングの方法は、候補化合物の高スループットスクリーニングが促進されることから無細胞系で行われることが好ましい。
【００８７】
本発明の間接スクリーニング方法は、好ましくは、真核細胞（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞または酵母細胞）において実施される。これらはまた、哺乳動物（例えば、ヒト）組織において実施され得る。典型的な細胞は、肝臓細胞である。
【００８８】
（参照基準）
参照基準（例えば、コントロール）は、典型的には、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が阻害されるか否かを検出するために必要とされる。候補化合物がＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を阻害するか否かを検出するために、候補化合物の存在下におけるＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用が、候補化合物の不在下におけるＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用と比較され得る。
【００８９】
上記基準は、本発明の方法を実施する前に決定されることも、この方法が実施されている間に（例えば、並行して）決定されることも、またはこの方法が実施された後に決定されることもあり得る。上記基準は、以前の研究から導かれた絶対基準であり得る。
【００９０】
（候補化合物）
本発明のスクリーニング方法の全てにおける使用のための典型的な候補化合物としては、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、小有機分子、ＲＮＡアプタマー、抗生物質および他の公知の製剤、ポリアミン、抗体または抗体誘導体（例えば、抗原結合フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖを含む）など）、およびそれらの組み合わせまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。小有機分子は、約５０ダルトンより大きく約２，５００ダルトンより小さい分子量、最も好ましくは、約３００ダルトン〜約８００ダルトンの分子量を有する。候補化合物は、合成化合物または天然化合物の大規模なライブラリーから導かれ得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、ＭａｙＢｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｅｖｉｌｌｅｔ  Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）により市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが使用され得る。更に、候補化合物は、個々の化合物としてまたは混合物として、コンビナトリアルケミストリーを用いて合成され得る。
【００９１】
場合により、本発明の方法において使用される候補化合物の数を減少させる予備的スクリーニング工程を行うことが望ましくあり得る。ＨＣＶタンパク質およびカベオリン−３タンパク質の各々と結合する化合物は、本質的に、それらと結合しない化合物よりも、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を阻害するようである。
【００９２】
したがって、本発明は、ＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、更に、ＨＣＶタンパク質およびカベオリン−３タンパク質のいずれかと結合する化合物を同定することにより候補化合物をスクリーニングする予備的な工程を包含する方法を提供する。
【００９３】
（インビボにおける同定された化合物の機能の確認）
ある化合物がＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用のインヒビターとして同定されると、この化合物のインビボでの抗ウイルス機能を確認するために、更なる実験を実施することが望ましくあり得る。
【００９４】
したがって、本発明は、上記の方法のいずれかにより得られたか、または得られ得る化合物のインビボでの抗ウイルス効果を評価する方法であって、試験動物にこの化合物を投与する工程およびＨＣＶ生活環に対する効果を評価する工程を包含する方法を提供する。非ヒトにおける試験が使用され得る。
【００９５】
（スクリーニング方法により同定される化合物）
本発明は、上記方法のいずれかにより得られたか、または得られ得るＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を阻害する化合物を提供する。好ましくは、本発明のこれらの化合物は、有機化合物である。
【００９６】
上記方法のいずれかにより得られたか、または得られ得るＨＣＶタンパク質とカベオリン−３タンパク質との相互作用を阻害する化合物を含む組成物も提供される。
【００９７】
ＨＣＶ活性を阻害することが見出される化合物は、それら単独で有用な抗ウイルス薬であり得るか、または新たな避妊薬の開発のための化合物を導き得る。これらの化合物はまた、抗ウイルス調査においても有用である。
【００９８】
（同定された化合物の薬学的用途）
本発明の方法のうちの１つを用いて化合物が同定されると、その薬学的特性についての更なる研究を行う必要があり得る。例えば、化合物を改変して薬物動態学的特性または生物学的利用能を改善する必要があり得る。本発明は、本発明の方法により同定され、薬物動態学的特性を改善するために改変されたあらゆる化合物、およびそれらの化合物を含む組成物に及ぶ。
【００９９】
本発明は、更に、本発明の方法を用いて得られた、または得られ得る化合物、および抗ウイルス薬として使用するための、それらの化合物を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明の方法を用いて得られた、もしくは得られ得る化合物、またはそれらの化合物を含む組成物の、抗ウイルス薬剤の製造における使用を提供する。本発明の方法のうちのいずれか１つにより得られた、もしくは得られ得る化合物、またはそのような化合物を含む組成物を、哺乳動物（好ましくは、ヒト）に投与する工程を包含する抗ウイルス方法も提供される。
【０１００】
（治療抗体）
上述のように、本発明は、カベオリン−３に特異的に結合し得る抗体を提供する。参考文献４０は、カベオリン−３のＮ末端領域を認識するマウスモノクローナル抗体について記載しているが、カベオリンファミリーの他のメンバーについては記載していない。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．より、カタログ番号ＲＤＩ−ＣＡＶＥＯ３ａｂｍおよびＲＤＩ−ＣＡＶＥＯＬ３ａｂｒＸのマウス抗−カベオリン−３抗体およびウサギ抗−カベオリン−３抗体が、インビトロでの研究用途のために利用可能である。ＡｂＣａｍのウサギポリクローナル抗体ａｂ２９１２も利用可能である。以前に、ナトリウムチャネルの調査のために、抗カベオリン−３抗体がピペットを介して細胞の細胞質に注射された［４１］。
【０１０１】
本発明の抗体は、好ましくは、カベオリン−３に位置するエピトープと結合し、この結合により、カベオリン−３のＨＣＶタンパク質との相互作用が妨げられる。したがって、これらの抗体は、ＨＣＶの成熟を妨げる治療方法において使用され得る。結合するコレステロールが枯渇しない限り、一部のカベオリン−３のエピトープが遮蔽され得ることが報告された［４２、４３］。したがって、一部の抗体は原形質膜中のカベオリン−３を認識し、一部の抗体はゴルジ体中のカベオリン−３を認識し、一部の抗体はその両方を認識する。適切な反応性の抗体は、慣例的な試験により選択され得る。
【０１０２】
本発明の抗体は、多クローン性または単クローン性であり得、任意の適切な手段により（例えば、組み換え発現）により生成され得る。ヒト免疫系との適合性を増大するために、これらの抗体は、キメラであるかもしくはヒト化され得るか（例えば、［参考文献４４および４５］）、または、完全なヒト抗体が使用され得る。本発明の抗体は、好ましくは、天然のマウス抗体でもウサギ抗体でもない。
【０１０３】
細胞内環境に結合活性を保持する可溶性抗体が好ましい。
【０１０４】
本発明の抗体は、好ましくは、精製された形態または実質的に精製された形態で提供される。典型的には、この抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物（例えば、この組成物のうち９０（重量）％未満、通常は６０（重量）％未満、より通常には５０（重量）％未満の組成が他のポリペプチドから構成される）に存在する。
【０１０５】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわち、α重鎖、γ重鎖またはμ重鎖）であり得るが、一般的に、ＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプのうち、抗体は、ＩｇＧ１サブクラス、ＩｇＧ２サブクラス、ＩｇＧ３サブクラスまたはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κ軽鎖またはλ軽鎖を有し得る。
【０１０６】
本発明の抗体は、種々の形態（完全な抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメント）、Ｆｖフラグメント（非共有結合性ヘテロダイマー）、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ））、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、オリゴボディ（ｏｌｉｇｏｂｏｄｙ）などを含む）をとり得る。用語「抗体」は任意の特定の起源を示唆しておらず、非慣例的なプロセス（例えば、ファージディスプレイ）により得られた抗体を含む。
【０１０７】
（治療用核酸）
翻訳後に（例えば、抗体を用いることにより）カベオリン−３活性を阻止する代替法として、タンパク質の発現がより早期の段階で、転写を妨げるかまたは転写されたｍＲＮＡの翻訳を妨げることにより阻止され得る。この効果を達成するための技術としては、アンチセンス、リボザイム、および遺伝子サイレンシングが挙げられる。
【０１０８】
したがって、本発明は、細胞中でカベオリン−３の発現を阻害し得る核酸を提供し、この核酸は、アンチセンス核酸；リボザイム、ロックト核酸；および遺伝子サイレンシング核酸より選択される。これらの核酸は、特に、治療目的に有用である。これらは直接的に投与され得るか、またはこの細胞において発現からインサイチュで生成され得る。したがって、本発明はまた、細胞中で転写されて活性分子を提供し得る核酸を提供する。
【０１０９】
アンチセンス技術は、一般的に、遺伝子の転写された（センス）ｍＲＮＡ配列に相補的な核酸配列の使用を伴う。アンチセンス分子は、標的の制御領域、５’領域、または調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサーおよびイントロン）に標的化され得る。阻害はまた、ポリメラーゼ、転写因子、または制御分子の結合に対して十分に開くための二重らせんの能力を阻害し得る「三重らせん」法を用いて達成され得る。阻害はまた、ハイブリダイズしたｍＲＮＡとアンチセンス分子とのハイブリダイゼーションにより、転写産物がリボソームなどと結合することを妨げることによって達成され得る。
【０１１０】
リボザイム（酵素ＲＮＡ分子）もまた、ＲＮＡの特定の切断を触媒するために使用され得る。これらのリボザイムは、天然であっても合成であってもよい。合成リボザイムは、選択された位置でｍＲＮＡを特異的に切断し、それによりｍＲＮＡの機能性ポリペプチドへの翻訳を妨げるように設計され得る。リボザイム作用の機序は、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ的（endonucleolytic）切断を伴う。使用され得るものの例としては、標的配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効率的に触媒し得る、操作されたハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子が挙げられる。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位が、リボザイム切断部位（例えば、ＧＵＡトリヌクレオチド、ＧＵＵトリヌクレオチド、またはＧＵＣトリヌクレオチドを含むリボザイム切断部位）について標的分子を走査することにより最初に同定される。同定されると、オリゴヌクレオチドを操作不可能（ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ）にし得る二次構造の特徴について、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５リボヌクレオチド〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が評価され得る。候補標的の適正は、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性をリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて試験することによっても評価され得る。
【０１１１】
ロックト核酸（ＬＮＡ）は、参考文献４６に、より詳細に記載されている。これらのロックト核酸は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡに対し、高い結合親和性を有する。改変ＬＮＡオリゴヌクレオチドおよびキメラＬＮＡオリゴヌクレオチドが適用された。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは市販されており、標準的な技術を用いてトランスフェクトされ得、非毒性であり、標的の利用可能性を増大させ、ＲＮａｓｅ  Ｈを活性化するように設計され得、立体阻害アプローチ（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋ  ａｐｐｒｏａｃｈ）において機能する。ＬＮＡアンチセンス（ＬＮＡのギャップに隣接する中央のＤＮＡまたはホスホロチオエート−ＤＮＡセグメントを含むギャップマーＬＮＡを含む）が特に有用である。
【０１１２】
種々の遺伝子サイレンシング技術が利用可能である。最も一般的に使用される技術として、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を介するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられる。標的転写産物と相同的である適切な大きさのｄｓＲＮＡ分子（例えば、１鎖あたり２１〜２３個のヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡ、すなわち低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が、ＲＩＳＣによるその転写産物の急速な分解を引き起こし、その結果、遺伝子サイレンシングが生じる。ｓｉＲＮＡに加えて、ｓｔＲＮＡを使用して、翻訳を抑制することにより遺伝子を分割し得、μＲＮＡもまた、遺伝子サイレンシングを起こし得る。ｓｉＲＮＡについての好ましい標的部位は、開始コドンの下流のＡＡジヌクレオチド配列から始まり、次の１９個の３’ヌクレオチドの間続く。ｓｉＲＮＡの設計および送達のためのキットおよびアルゴリズムは、容易に入手し得る（例えば、参考文献４７、４８などを参照）。
【０１１３】
ＲＮＡ分子はインビボで分解され得るので、技術がそれを許容する場合は、天然のＲＮＡヌクレオチドを人工のヌクレオチドと置き換えることが可能である。例えば、ＲＮＡ分子は、分子の主鎖内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用により、または非従来的な塩基（例えば、イノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）およびワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、ならびにアセチルアデニン、アセチルシチジン、アセチルグアニン、アセチルチミンおよびアセチルウリジン、メチルアデニン、メチルシチジン、メチルグアニン、メチルチミンおよびメチルウリジン、チオアデニン、チオシチジン、チオグアニン、チオチミンおよびチオウリジン、同様に修飾された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジン）の包含により改変され得る。ヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））もまた使用され得る。
【０１１４】
（薬学的組成物）
本発明の抗体および核酸は、薬学的に受容可能なキャリアを更に含む薬学的組成物として提供され得る。そのような組成物は、活性成分と薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程を包含するプロセスを用いて調製され得る。
【０１１５】
典型的な「薬学的に受容可能なキャリア」としては、組成物を受容する個体に対して有害な抗体の生成をそれ自体は誘発しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的に、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム））である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。ワクチンもまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含み得る。更に、補助剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、スクロースなど）が存在し得る。無菌の発熱物質を含まない（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）リン酸緩衝生理食塩水が、典型的なキャリア（例えば、注射用溶液に基づく）である。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な検討が、参考文献４９で利用可能である。
【０１１６】
本発明の組成物は、典型的には、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）ではなく水性形態（例えば、溶液または懸濁液）である。水性組成物は、他の物質を凍結乾燥形態から再構成するのにも適している。本発明の組成物がそのような即時再構成に使用される場合に、本発明はまた、２つのバイアルを含み得るキット、または、１つの充填済み注射器（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）および１つのバイアルを含み、シリンジの水性内容物が注射前にバイアルの乾燥内容物を再活性化させるために使用され得るキットを提供する。
【０１１７】
本発明の組成物は、バイアルで提供され得るか、または充填済み注射器で提供され得る。上記注射器は、針の付いているものまたは針のついていないものが提供され得る。組成物は、単位用量形態または複数用量形態で包装され得る。一般的に、注射器は単一用量の組成物を含み、バイアルは単一用量または複数用量を含み得る。したがって、複数用量形態には、事前に充填された注射器よりもバイアルが好ましい。
【０１１８】
有効な投薬容積は、慣例的に設定され得るが、上記組成物の典型的なヒト用量（例えば、筋肉内注射用）は、約０．５ｍｌの容積を有する。
【０１１９】
上記組成物のｐＨは、好ましくは、６〜８であり、より好ましくは、６．５〜７．５（例えば、約７）である。適切なｐＨは、緩衝剤（例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液）の使用により維持され得る。本発明の組成物は、一般的には、緩衝剤を含む。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合は、ヒスチジン緩衝液を（例えば、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭで）使用することが好ましい［５０］。上記組成物は、無菌かつ／または発熱物質非含有であり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【０１２０】
組成物は、注射可能物質として（溶液または懸濁液のいずれかとして）調製され得る。上記組成物は、経肺投与用に（例えば、微細な粉末またはスプレーを用いた吸入器として）調製され得る。上記組成物は、坐剤または膣坐剤として調製され得る。上記組成物は、経鼻投与用、経耳投与用または経眼投与用に（例えば、スプレー、ドロップ、ゲルまたは粉末として）調製され得る［例えば、参考文献５１および５２］。筋肉内投与用の注射可能物質が、典型的である。
【０１２１】
本発明の組成物は、特に、複数用量様式で包装される場合、抗菌物質を含み得る。抗菌物質（例えば、チオメルサールおよび２−フェノキシエタノール）が、ワクチンにおいて一般的に見受けられるが、水銀非含有保存剤が使用されるか、または保存剤を全く使用しないことが望ましい。
【０１２２】
本発明の組成物は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０））を含み得る。界面活性剤は、一般的には、低レベル（例えば、＜０．０１％）で存在する。
【０１２３】
本発明の組成物は、張性を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌの濃度が典型的である。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、約９ｍｇ／ｍｌである。
【０１２４】
（処置の方法）
本発明はまた、哺乳動物を処置するための方法であって、本発明の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する方法を提供する。哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。
【０１２５】
本発明はまた、薬剤としての用途に本発明の抗体および核酸を提供する。本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を生じさせるための薬剤の製造における本発明の抗体または核酸の用途を提供する。
【０１２６】
これらの用途および方法は、好ましくは、ＨＣＶにより引き起こされる疾患（例えば、肝炎）の予防および／または処置に関する。肝炎の治療的処置の効力を調査するための方法は、当該技術分野において公知である。
【０１２７】
本発明の組成物は、一般的に、患者に直接的に投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、または組織の間質腔への注射）によってか、または直腸投与、経口投与、膣内投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、経眼投与、経耳投与、経肺投与もしくは他の経粘膜投与により達成され得る。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下注射針）を介し得るが、無針注射が、代替的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。
【０１２８】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のみならず「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」をも包含する（例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、全くＸのみから成り得るか、または何か追加的なものを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１２９】
数値ｘに対する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１３０】
単語「実質的に」は、「完全に」を除外しない（例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないこともあり得る）。必要な場合は、単語「実質的に」は、本発明の定義から除外され得る。
【０１３１】
ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくは、パラメーターｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１を用いるアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるように、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。
【０１３２】
Ｃ型肝炎ウイルスについての詳細な情報（生活環、複製、培養条件、ゲノム、ポリタンパク質、タンパク質分解性のプロセシングなどを含む）は、参考文献５３の第３２章〜第３４章に見出され得る。
【０１３３】
（発明を実施するための態様）
参考文献１８は、ＨＣＶゲノムの翻訳から生じるＥ１およびＥ２に加え、ＨＣＶレプリコン発現のための改良された方法を記載しており、この方法において、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、別個に発現されている。レンチウイルスベクターにより、Ｅ１およびＥ２がｐ７タンパク質と一緒（Ｅ１Ｅ２ｐ７タンパク質）に２１−５細胞に提供され［４］、このレンチウイルスベクターは、染色体に組み込まれて２１−５＿Ｒ８０９細胞を与える。共焦点顕微鏡検査は、コアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ５ａタンパク質が、これらの細胞内でＨＣＶゲノムと共局在して、ドット様構造を形成することを示している。
【０１３４】
共局在する物質に関する更なる研究は、現今実施されており、驚くことに、カベオリン−３が存在することも見出された。カベオリン−３が肝臓細胞で発現されることは、先行技術においては何ら示唆されていない。
【０１３５】
共焦点顕微鏡検査は、Ｈｕｈ−７細胞および２１−５細胞に関して実施され、抗カベオリン−３抗体は、定まったパターンのない、おぼろげな標識のみを示した。しかしながら、ウェスタンブロットにより、上記タンパク質がナイーブＨｕｈ−７細胞中、ＨＣＶレプリコンでトランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞中、ならびにレプリコンおよびレンチウイルスベクターの両方でトランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞中に見出すことができた。これらの結果は、カベオリン−３がＨｕｈ−７細胞中に低レベルで発現されること、そして、ＨＣＶ感染により誘発されるのではなく、Ｅ１／Ｅ２を含有するドット内に蓄積されることを示唆している。
【０１３６】
図１は、２１−５細胞および２１−５＿Ｒ８０９細胞の免疫蛍光顕微鏡検査を示している。ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２タンパク質は、ナイーブ２１−５細胞中に見受けられないが（図１Ｃ）、Ｒ８０９レンチウイルスベクターが導入された後に見受けられる（図１Ｆ）。カベオリン−３は、ナイーブ２１−５細胞において散漫に検出されるが（図１Ｂ）、明るい点が、Ｒ８０９に感染した細胞中に見出すことができる（図１Ｅ）。図１Ｅおよび図１Ｆの重ね合わせ（図１Ｂ）は、Ｅ１／Ｅ２およびカベオリン−３が共局在することを示している。ＮＳ３、ＮＳ５ａおよびウイルスＲＮＡもまた、これらの点中に見受けられる。
【０１３７】
筋肉細胞におけるカベオリン−３の誘発のための通常の刺激は、血清欠乏である。したがって、この技術は、２１−５細胞および２１−５＿Ｒ８０９細胞に対して使用され、これらの両方が、全長のＨＣＶレプリコンを有する。この技術はまた、レンチウイルスベクターによるトランスフェクションと共にこれらの細胞に対して使用された。
【０１３８】
図２は、血清欠乏の７２時間後の、Ｒ８０９に感染した２１−５細胞の免疫蛍光、およびＲ８０９に感染していない２１−５細胞の免疫蛍光を示している。図１と比較して、Ｅ１／Ｅ２の発現が見出され得、カベオリン−３は斑点での発現を示している。Ｅ１／Ｅ２およびカベオリン−３は、共局在している。
【０１３９】
図３は、抗カベオリン−３血清で染色された、種々のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００細胞抽出物のウェスタンブロットである。マウスの筋肉細胞（レーン１〜レーン４）は、カベオリン−３の発現を示している。結果として得られた細胞（レーン１およびレーン２）は発現を示しており、血清欠乏の４８時間後（レーン３）または９６時間後（レーン４）に発現が増大している。ウマ血清（２％）を含まないＨｕｈ−７細胞（レーン５）またはウマ血清（２％）を含むＨｕｈ−７細胞（レーン６）は、検出可能なカベオリン−３の発現を示していない。Ｒ８０９に感染後のＨｕｈ−７は、同様な結果を示している（レーン７およびレーン８）。Ｒ８０９に感染した２１−５細胞（レーン９およびレーン１０）またはＲ８０９に感染していない２１−５細胞（レーン１１およびレーン１２）も、検出可能なカベオリン−３を示していない。
【０１４０】
参考文献１８に記載されるように、Ｅ１およびＥ２の発現は、天然の２１−５細胞中に見られない。しかしながら、免疫蛍光により、血清欠乏後にＥ１およびＥ２の発現が見出され得、カベオリン−３と関連づけられるドット様構造も示した。ウェスタンブロット分析は、２１−５細胞におけるカベオリン−３の全体的な発現レベルが、（筋肉細胞において見受けられる効果とは異なり）血清欠乏の間に増大しなかったことを示しており、したがって、その代わりに拡散したタンパク質が特定の構造へと集中し、そのため、それが免疫蛍光により視覚化し得るものと思われる。
【０１４１】
全体として、これらの結果は、カベオリン−３がＨＣＶの成熟において役割を果たすと思われることを示唆している。
【０１４２】
本発明を例示の目的でのみ記載しており、本発明の範囲および精神の範囲内において改変を成し得ることが理解される。
【０１４３】
【化２−１】
2009513109.tif 000004
【０１４４】
【化２−２】
2009513109.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、ナイーブ２１−５細胞（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ）およびＲ８０９に感染した２１−５細胞（図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ）を用いた免疫蛍光の結果を示している。この染色抗体は、抗Ｅ１／Ｅ２（図１Ｃ、図１Ｆ）または抗カベオリン−３（図１Ｂ、図１Ｅ）のいずれかである。図１Ａは、図１Ｂおよび図１Ｃの重ね合わせである。図１Ｄは、図１Ｅおよび図１Ｆの重ね合わせである。
【図２】図２は、図１と同様であるが、７２時間の血清欠乏後の細胞を示している。
【図３】図３は、細胞抽出物のウェスタンブロットである。レーン１３のマーカーは、１９３ｋＤａ、１０２．９ｋＤａ、５９．９ｋＤａ、４１．２ｋＤａ、２７．６ｋＤａ、２０．７ｋＤａおよび１５．４ｋＤａである。
【図１Ａ】
2009513109.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月9日(2008.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009513109000001.app
【国際調査報告】
2009513109.tif 000020
2009513109.tif 000021
2009513109.tif 000022
2009513109.tif 000023