(57)【要約】  本開示は、カンピロバクター・ジェジュニ（及び他の種由来も）線毛タンパク質のコード配列及びアミノ酸配列を提供する。このタンパク質は、ヒト又は動物に投与された場合、カンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答の発現を誘発し、この生物によるコロニー形成及び／又は感染が減少するという結果を伴う。線毛タンパク質を含む組換えタンパク質又はバイオフィルム物質が、特に粘膜投与のための免疫原性組成物に製剤化される。したがって、本発明は、家禽、卵、食肉及び乳製品を含む食品、並びに間接的に、肥沃化又はかんがい用水のいずれか由来の農業廃棄物と接触する可能性のある植物性食品の、微生物的品質の向上のための方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質をコードする配列を含む、天然に存在しない組換え核酸分子。
【請求項２】
前記線毛タンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
線毛タンパク質をコードする前記配列が配列番号１に示される、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
ベクター配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子が導入されている、組換え細胞。
【請求項６】
細菌細胞である、請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
腸内細菌細胞である、請求項６に記載の細菌細胞。
【請求項８】
非病原性サルモネラ細胞である、請求項７に記載の腸内細菌細胞。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列によって特徴付けられるカンピロバクター線毛タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記カンピロバクター線毛タンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列によって特徴付けられる、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記カンピロバクター線毛タンパク質が、組換えによって生成されたカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
カンピロバクターバイオフィルム物質を含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記カンピロバクターバイオフィルム物質が死滅細胞カンピロバクターバイオフィルム物質である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記カンピロバクターバイオフィルム物質が弱毒化カンピロバクターバイオフィルム物質である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記弱毒化カンピロバクターバイオフィルム物質がｋａｔＡ欠損カンピロバクターバイオフィルム物質又はｆｕｒ欠損カンピロバクターバイオフィルム物質である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
免疫学的アジュバントをさらに含む、請求項９〜１５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記免疫学的アジュバントがコレラ毒素サブユニットＢを含む、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質を発現することができるＤＮＡワクチン分子を含む免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ワクチンＤＮＡ分子が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現することができる、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列によって特徴付けられるカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列によって特徴付けられるカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質に特異的に結合する治療有効量の抗体を、該抗体を必要とするヒト又は動物に投与するステップを含む、カンピロバクター感染を治療するための方法。
【請求項２２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質を含む免疫原性組成物を、該組成物を必要とするヒト又は動物に投与するステップを含む、カンピロバクター・ジェジュニでのヒト又は動物の感染及び／又はコロニー形成を減少させるための方法。
【請求項２３】
前記カンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組成物がヒト又は動物の粘膜表面に投与される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
組成物がヒト又は動物に経口投与される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が免疫学的アジュバントをさらに含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
［請求項２６］請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子が導入されている組換え細胞を、線毛タンパク質が生成される条件下で培養するステップを含む、配列番号２のアミノ酸配列からなる線毛タンパク質を組換えによって生成するための方法。
【請求項２８】
［請求項２７］線毛タンパク質を収集するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
［請求項２８］（ａ）カンピロバクター線毛タンパク質を含む可能性のある試料を提供するステップと、
（ｂ）カンピロバクター線毛タンパク質と抗体との結合を可能にする条件下で、試料を請求項２０に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｃ）線毛タンパク質への抗体の結合を検出するステップと
を含む、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列によって特徴付けられるカンピロバクター線毛タンパク質の存在を検出するための方法。
【請求項３０】
［請求項２９］前記試料が非生物学的試料である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
［請求項３０］前記試料が生物学的試料である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
［請求項３１］前記試料が、盲腸、便、排出腔、家禽、豚肉又は乳試料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
［請求項３２］（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列によって特徴付けられるカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質に特異的に結合する抗体を含む可能性のある試料を提供するステップと、
（ｂ）抗体への線毛タンパク質の結合を可能にする条件下で、試料を線毛タンパク質と接触させるステップと、
（ｃ）抗体への線毛タンパク質の結合を検出するステップと
を含む、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列によって特徴付けられるカンピロバクター・ジェジュニ線毛タンパク質に特異的に結合する抗体を検出する方法。
【請求項３４】
［請求項３３］前記試料がヒト又は動物由来の生物学的試料である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、本開示と不一致のない程度まで、参照により本明細書に援用される２００６年７月１０日に出願した米国特許仮出願第６０／８１９，５８９号明細書の恩恵を主張するものである。
【０００２】
［連邦支援を受けた研究又は開発に関する申告］
本発明は、米国農務省により与えられたＵＳＤＡ／ＣＳＲＥＥＳ認可番号第２００５−５１１１０−０２３３３号の下での米国政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
［付属の配列表、表、又はコンピュータプログラムを載せたコンパクトディスクの参照］
添付して同日付に提出した配列表は、参照により本明細書中に援用される。
【０００４】
［発明の背景］
本発明の分野は、免疫原性組成物、方法、ワクチン、及び細菌毒性決定基をコードする遺伝子、特にカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）又はカンピロバクターの他の種の線毛タンパク質をコードする遺伝子並びにかかる線毛タンパク質を含む免疫原性組成物の分野である。
【０００５】
Ｃ．ジェジュニはグラム陰性で、極性鞭毛を有するらせん状の杆体に湾曲しており、３７℃〜４２℃の範囲の微好気性環境において最もよく増殖する（４、７、１２、２３、２６）。米国において、毎年およそ２１０万〜２４０万件のカンピロバクター症が起こっており、８０億ドルの費用がかかっていると推定されている（１６、１７）。
【０００６】
カンピロバクター症は、無症候性であるか、又は様々な症状を生じるかのいずれかの場合がある。発展途上国において、感染は無症候性である場合があるか、又は比較的軽度の下痢を生じる場合がある。先進国において、カンピロバクター感染は、血液又は粘膜あり又はなしの下痢、嘔吐、筋痙攣及び発熱によって特徴付けられる、自己限定性の胃腸感染症として存在する。症候性感染は、水様下痢、腹痛、発熱、並びに便試料中の血液及び白血球の存在の急性発症からなり、通常自己限定性であり、２〜１１日間続くが、免疫無防備状態の個体においては、感染は３カ月より長く持続する場合がある（４、６、１６）。感染の長期の副次的効果としては、反応性関節炎、ライター症候群、ＨＬＡ  Ｂ２７陽性患者における眼炎、及びギランバレー症候群が挙げられる（１５、１８）。
【０００７】
カンピロバクターは、多数の家畜及び鳥の腸の正常細菌叢と見なされている（１、２、５、８、３１）。これらの鳥がカンピロバクターを流す能力は、水路又は水系の汚染を引き起こし、そのようにして、他の動物又はヒトについての汚染の源として作用する場合がある。カンピロバクター感染は、汚染された水、殺菌されていない乳又はチーズの摂取、家禽等の加熱が不十分な、又は生の食物を消費することを含む、経口経路によって生じる（５、８、３１）。しかしながら、生乳及び加熱が不十分な家禽の消費は、カンピロバクター感染の主な源である。Ｃ．ジェジュニがバイオフィルムを形成することができる能力並びに家畜及びヒトへの接種の継続的な源になることはまた、他の研究の対象であった（８、３１）。Ｃ．ジェジュニは、畜産施設及び動物加工工場の散水供給及び配管システムにおいてバイオフィルムを形成する能力を有し、そのようにして、感染及び汚染の源になる（８、３１）。しかしながら、この可能性は、Ｃ．ジェジュニが非生物表面上でバイオフィルムを形成することができることを示す非常に限られた数の刊行物によって支持されている。
【０００８】
医療費のために、当技術分野において、家禽及び／又はウシの、Ｃ．ジェジュニのコロニー形成を減少させるため並びにＣ．ジェジュニ感染の発生率を減少させるために有効なワクチンの必要性がある。
【０００９】
［発明の概要］
本発明の目的は、カンピロバクター・ジェジュニ由来の線毛タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供することである。特に例示されているように、コードされる線毛タンパク質は、配列番号１に示されるようなコード配列を有する。コードされる線毛タンパク質は、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有する。特に例示されている配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するコード配列及びアミノ酸配列は、本発明の範囲内である。
【００１０】
本発明のＣ．ジェジュニ線毛タンパク質の組換え生成のための天然に存在しない（「組換え」）核酸分子、及びこのタンパク質を組換えによって生成するための方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００１１】
当業者は、例示されている線毛タンパク質のコード配列及びアミノ酸配列を用いて、配列番号２に示されるような同じアミノ酸配列、又はそれに対して７０％、８０％、８５％、９０％、９５％（及び７０〜１００の間の全ての整数パーセンテージ）より同一性が大きく同等な生物活性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする、さらなる例示されていないヌクレオチド配列を同定及び単離することができることを理解する。本発明の線毛タンパク質をコードする配列が発現されることが所望される場合、当業者は、コード配列が発現される宿主細胞によって調節配列が決定されるような選択で、転写及び翻訳制御調節配列をコード配列に動作可能に連結させる。Ｃ．ジェジュニ線毛タンパク質コード配列を保有する組換えＤＮＡ分子に関して、当業者は、宿主細胞中に導入することができ、宿主細胞中で複製することができる、ベクター（例えばプラスミドベクター又はウイルスベクター）を選択することができる。宿主細胞は、細菌、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）若しくは非毒性のサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は、或いは、酵母若しくは哺乳動物細胞であってもよい。
【００１２】
別の実施形態において、例えばタンパク質融合又は欠失を含む、線毛タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド、並びに発現系が提供される。発現系は、適切な宿主細胞に形質転換された場合に本発明の線毛タンパク質又は機能的に同等なタンパク質を発現することができるポリヌクレオチドとして定義される。組換えポリヌクレオチドは、天然のＣ．ジェジュニ線毛タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその断片に、相当類似したヌクレオチド配列を有する。発現は、通常遺伝子と関連するプロモーターの制御下にあってもよく、又は、線毛タンパク質コード配列は、異種プロモーター（天然には線毛タンパク質コード配列と関連しないもの）の調節制御下で発現されてもよい。線毛タンパク質生成のための好ましい腸内細菌宿主株は、大腸菌の株である。
【００１３】
本発明によって、当業者に十分理解されている標準的な条件を用いて、Ｃ．ジェジュニゲノムＤＮＡ、本発明の線毛タンパク質をコードするクローン化ＤＮＡ（又は同族のｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドがさらに提供される。これらの線毛タンパク質特異的配列はまた、線毛タンパク質コード核酸の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のためのプライマーの調製において使用することができる。ハイブリダイゼーション又はＰＣＲのいずれかを、生物学的試料、食物試料、チーズ試料、水試料、便試料若しくは環境試料中のＣ．ジェジュニの検出又はＣ．ジェジュニによって引き起こされる疾患の診断における使用に適応させてもよい。
【００１４】
ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、並びに混合ポリマー、センス及びアンチセンス鎖の両方が挙げられ、化学的若しくは生化学的に修飾されていてもよく、又は非天然若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。ＤＮＡが好ましい。線毛タンパク質の一次配列中の変化によって、防御免疫を誘発することができるエピトープ（複数可）が変化しない限り、１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、置換を含むがこれらに限定されない、又は他のポリヌクレオチド配列への融合による、野生型Ｃ．ジェジュニ線毛タンパク質コード配列の変化のように、他の状態では天然に存在しない配列を含む組換えポリヌクレオチドもまた本発明によって提供される。
【００１５】
本発明はまた、Ｃ．ジェジュニ線毛タンパク質又はその抗原部分を含む融合ポリペプチドを提供する。異種融合は、それらが由来するタンパク質の特性又は活性の組合せを示すよう構築してもよい。可能性のある融合パートナーとしては、限定されないが、免疫グロブリン、ユビキチン、細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母α接合因子（Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：８１２〜８１６ページ）又は種々のタンパク質「タグ」配列（特に当技術分野で公知の鞭毛抗原、ポリ−ヒスチジン、ストレプトアビジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が挙げられる。融合タンパク質は、典型的には組換え方法によって作製されるが、当技術分野で周知のように化学的に合成してもよい。
【００１６】
限定されないが、天然に発現されたＣ．ジェジュニ線毛又は組換えＣ．ジェジュニ線毛タンパク質及び適した担体を含むワクチンを含む、組成物及び免疫原性調製物が本発明によって提供され、これらの組成物及び調製物は、有利に、少なくとも１つのアジュバントをさらに含んでもよい。発現された線毛タンパク質（例えば、バイオフィルム中）を有する、線毛を発現している弱毒化生カンピロバクター、又は線毛タンパク質を含む死滅細胞バイオフィルム物質を含む免疫原性組成物もまた、本発明によって包含される。かかる組成物は、例えばＣ．ジェジュニによる感染に起因する下痢性疾患に対してヒトを免疫化すること又は家禽若しくはウシにおけるＣ．ジェジュニの発生率を減少させて食品中及び環境中の汚染を減少させることにおいて、有用である。調製物は、免疫原性量の本発明の線毛タンパク質又はその免疫原性断片を含む。かかる免疫原性組成物は、有利に、１つ若しくは複数の他の血清型の線毛タンパク質若しくはその抗原決定基又はＣ．ジェジュニ由来の他の抗原性物質をさらに含んでもよい。「免疫原性量」によって、抗体の産生を誘発することができる、好ましくはＣ．ジェジュニによる免疫原性組成物中と同じ線毛タンパク質又は免疫学的に交差反応性の線毛タンパク質でのコロニー形成又は感染に対する防御免疫を与えることができる量が意味される。免疫原性組成物は、アジュバント、例えば、粘膜投与のために設計された組成物のために、コレラ毒素又はコレラ毒素サブユニットＢをさらに含んでもよい。
【００１７】
本明細書中に教示されているようなＣ．ジェジュニ線毛タンパク質を含む免疫原性組成物を家禽又はウシに投与することによって家禽中又は牛肉中又は乳牛中のＣ．ジェジュニの発生率を減少させるための方法もまた、本発明の範囲内である。投与の経路は、粘膜（特に経鼻又は経口）であってもよく、又は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内若しくは非経口であってもよい。同様に、好ましくは粘膜投与によって、かかる免疫原性組成物を、それを必要とするヒトに投与することによって、カンピロバクター感染及び疾患のヒト発生率を減少させることができる。
【００１８】
本発明は、線毛タンパク質に特異的に結合する抗体、並びにＣ．ジェジュニを、特にバイオフィルム及び／若しくは食品中で検出するため、又はカンピロバクター感染を診断するための方法をさらに提供する。また、線毛タンパク質を、免疫応答をモニタリングするため又はそれに対する抗体を検出するための方法において使用して、例えば、カンピロバクターへの曝露を評価すること又は免疫応答の発生を追跡することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Ｃ．ジェジュニバイオフィルム形成に対する増殖培地の効果を示す図である。ＭＨＢ、ブルセラ及びボルトンブロスを、ＣＶ染色によって測定して、それらがＣ．ジェジュニＭ１２９バイオフィルム形成を促進できるかどうかについて評価した。３つの別々の場合で、３点１組で実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。
【図１Ｂ】クリスタルバイオレット（ＣＶ）染色によって測定した、Ｃ．ジェジュニＭ１２９バイオフィルム形成に対する温度及びＯ２分圧の効果を示す図である。増殖条件は、Ｃ．ジェジュニＭ１２９の増殖に適しており、例えば３７℃及び１０％ＣＯ２等は、よりよいバイオフィルム形成を生じた。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。
【図２Ａ】図２Ａはショ糖又はグルコースの効果を示す図であり、図２Ｂは、ＣＶ染色によって測定して、Ｃ．ジェジュニＭ１２９がバイオフィルムを形成することができるかどうかに対する、ＮａＣｌの効果を示す図である。図２Ａにおいて、白色の棒はショ糖を表し、灰色の棒はグルコースを表す。図２Ｂは、種々の濃度のＮａＣｌでのバイオフィルム形成の程度を示す。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。
【図２Ｂ】図２Ａはショ糖又はグルコースの効果を示す図であり、図２Ｂは、ＣＶ染色によって測定して、Ｃ．ジェジュニＭ１２９がバイオフィルムを形成することができるかどうかに対する、ＮａＣｌの効果を示す図である。図２Ａにおいて、白色の棒はショ糖を表し、灰色の棒はグルコースを表す。図２Ｂは、種々の濃度のＮａＣｌでのバイオフィルム形成の程度を示す。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。
【図３】ＣＶ染色によって測定すると、Ｃ．ジェジュニＭ１２９が非生物表面上にバイオフィルムを形成することを示す図である。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。
【図４】クロラムフェニコールがＣ．ジェジュニＭ１２９及びＦ３８０１１のバイオフィルム形成を阻害することを示す図である。Ｃ．ジェジュニ株を、０．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで１５分間処理してから、抗生物質の非存在下でバイオフィルム形成についてアッセイした。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。
【図５Ａ】Ｃ．ジェジュニＭ１２９鞭毛の存在がバイオフィルム形成に正の影響を及ぼすことを示す図である。図５Ａ：ＣＶ染色の関数としてのバイオフィルム形成。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。図５Ｂ：脱色（ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ）前のＣＶ染色を示す、インキュベーション後２４、４８、及び７２時間で示される代表的なウェル。
【図５Ｂ】Ｃ．ジェジュニＭ１２９鞭毛の存在がバイオフィルム形成に正の影響を及ぼすことを示す図である。図５Ａ：ＣＶ染色の関数としてのバイオフィルム形成。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。図５Ｂ：脱色前のＣＶ染色を示す、インキュベーション後２４、４８、及び７２時間で示される代表的なウェル。
【図５Ｃ】Ｃ．ジェジュニＭ１２９クオラムセンシング能力がバイオフィルム形成に正の影響を及ぼすことを示す図である。図５Ｃ：ＣＶ染色によって測定されたバイオフィルム形成。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの１つの標準偏差を表す。図５Ｄ：脱色前のＣＶ染色を示す、インキュベーション後２４、４８、及び７２時間で示される代表的なウェル。
【図６】グラム陰性及びグラム陽性細菌由来の培養上清液が、Ｃ．ジェジュニＭ１２９バイオフィルムの形成に影響を及ぼす場合があることを示す図である。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種及びＡ．ピオゲネス（Ａ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣＳＦは、Ｃ．ジェジュニバイオフィルム形成を促進する。ＭＨＢ、及びＰ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）９０２７、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＣＶ２０６、Ａ．ピオゲネスＢＢＲ１又はＣ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）株１３由来のＣＳＦの１：１混合物中で、Ｃ．ジェジュニＭ１２９でバイオフィルムアッセイを行った。５％新生仔仔ウシ血清を補充したＴＳＢ（ＴＳＢ５％）並びに０．５％酵母抽出物及び０．０５％システインを補充したＴＳＢ（ＹＳＢＹＣ）を、それぞれＡ．ピオゲネス及びＣ．パーフリンジェンスＣＳＦの対照として使用した。３点１組で３回実験を行い、エラーバーは平均からの標準偏差を表す。
【図７】Ｃ．ジェジュニ分離株が非生物表面上でバイオフィルムを形成することを示す図である。Ｃ．ジェジュニ分離株によるバイオフィルム形成は毒性と相関しない。３点１組で３回実験を行った。エラーバーは平均からの標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｃ．ジェジュニがバイオフィルムを形成することができるかどうかを研究する間に、これらの細菌が、極性鞭毛に加えて、非極性の線毛を生成することが発見された。線毛は、無鞭毛のｆｌａＡＢ二重変異体中、並びに野生型株中で生成された。
【００２１】
環境因子及び培地成分がバイオフィルム形成に影響を及ぼす場合があるので、本発明者らは、種々の槽培地条件を、Ｃ．ジェジュニＭ１２９バイオフィルム形成に対するそれらの効果について試験した。ＭＨＢ、ブルセラ及びボルトンブロスを、それらがバイオフィルム形成を促進することができるかどうかについて評価した。栄養分豊富な方のブルセラ及びボルトンブロスは最適なバイオフィルム形成を支持しなかったが、比較的低栄養のＭＨＢにおいては有意なバイオフィルム形成が起こった（図１Ａ）。
【００２２】
インキュベーション温度及び酸素分圧もまた、バイオフィルム形成に影響を及ぼす場合がある（図１Ｂ）。種々の組合せの温度及び酸素付加でＣ．ジェジュニバイオフィルム形成をアッセイした。好気生活及び温度の影響は、バイオフィルム形成に大きな効果を有した。予想されたように、より有利さの低い増殖条件下で、バイオフィルム形成は減少した。
【００２３】
バイオフィルム形成に影響を及ぼすことができるかどうかに関する、浸透圧調節物質であるグルコース、ショ糖及びＮａＣｌに対するＣ．ジェジュニの応答もまた、調べた。図２Ａ及び２Ｂに示されるように、グルコース、ショ糖又はＮａＣｌの存在は、試験した全ての濃度で、有意に減少したバイオフィルム形成を生じた。したがって、環境条件、並びに培地成分は、Ｃ．ジェジュニがバイオフィルムを形成することができるかどうかに影響を及ぼす。
【００２４】
非生物表面上でのバイオフィルム形成を研究した。Ｃ．ジェジュニＭ１２９細胞は、種々の量で、ガラス及び銅等の種々の親水性物質並びにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＡＢＳ及びＰＶＣを含むプラスチック等の疎水性物質上でバイオフィルムを形成した。Ｃ．ジェジュニＭ１２９がバイオフィルムを形成することができるかどうかをさらに研究するために、ＡＢＳ、ＰＶＣ、銅等の、散水システムにおいて一般に使用される物質、並びに対照物質であるポリスチレンを、それらのバイオフィルム形成の促進について定量的にアッセイした（図３）。物質の物理化学的特性がＣ．ジェジュニによる接着及びバイオフィルム形成に影響を及ぼす可能性があるようであった。Ｃ．ジェジュニ細胞は、種々の程度ではあったが、疎水性表面上でより容易に接着し、バイオフィルムを形成した。特に、Ｃ．ジェジュニは親水性物質である銅上でバイオフィルム形成の減少を示した。
【００２５】
バイオフィルム形成にはタンパク質合成が必要である。遺伝子発現試験から、プランクトン様（浮遊している）対バイオフィルム増殖細胞による、合成されたタンパク質のプロフィールに違いがあることが示され、ある種のタンパク質の新規合成がバイオフィルム形成に必要であるかもしれないことが示唆される（９、１０、１９）。タンパク質合成阻害剤はバイオフィルム形成を顕著に減少させ、接着した細菌の、バイオフィルムからの遊離を引き起こす場合もある。したがって、いかなる特定の理論に拘束されることも望むことなく、本発明者らは、バイオフィルム中で増殖したＣ．ジェジュニが、特定の条件下でこの増殖期に必要なタンパク質を合成するという仮説を立てた。クロラムフェニコール（ＣＭ、０．５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下でＣ．ジェジュニ細胞をインキュベートした場合、ＣＭで処理した細胞の間に、未処理の対照と比較して、バイオフィルム形成の違いが観察された（図４）。これらの結果から、Ｃ．ジェジュニ細胞が、適切なシグナル及び増殖条件に応答して、接着及びバイオフィルム形成に必要なタンパク質を合成することが示される。
【００２６】
鞭毛は、表面に関連する力を克服することによって、バイオフィルム形成に関与し、接着の速度に影響を及ぼすことが示されている（１２、１４、２１、２２）。この研究において、Ｃ．ジェジュニ鞭毛欠損変異体（Ｍ１２９：：ｆｌａＡＢ）を、それがバイオフィルムを形成することができるかどうかについてアッセイした。Ｍ１２９：：ｆｌａＡＢは、２４時間では野生型のものと比較してバイオフィルム形成のわずかな減少を示したが、４８及び７２時間の時点で、バイオフィルム形成は顕著に減少した（図５Ａ〜５Ｄ）。本発明者らはまた、光学顕微鏡法を用いて、ｆｌａＡＢ変異体及び野生型Ｍ１２９がポリスチレン表面に接着することができるかどうかを直接評価した（図５Ｃ〜Ｄ）。図５Ｂは、野生型Ｍ１２９についての、２４、４８及び７２時間にわたる接着細胞の増大を示す。しかしながら、鞭毛ノックアウトにおいて、本発明者らは、野生型と比較して、４８及び７２時間で表面に接着している細胞がほとんどないことを観察した。このデータから、Ｃ．ジェジュニバイオフィルム形成における鞭毛の重要性が示される。
【００２７】
ｌｕｘＳ及びクオラムセンシングシグナルは、バイオフィルム形成に影響を及ぼす場合がある。クオラムセンシングがＣ．ジェジュニバイオフィルムに関与する可能性をアッセイするために、ｌｕｘＳクオラムセンシング遺伝子に変異を導入した結果、変異細胞において自己誘発物質２（ＡＩ２）が生成されなかった（１１）。バイオフィルム発生の間、ＡＩ２は、４８及び７２時間の時点のように、Ｃ．ジェジュニバイオフィルム発生において重要な役割を果たし、ｌｕｘＳ変異体については、野生型Ｃ．ジェジュニと比較して、バイオフィルム形成の減少があった（図５Ａ〜５Ｄ参照）。
【００２８】
バイオフィルム中で細胞がごく接近しているために、バイオフィルムは、クオラムセンシングが起こるのに理想的な環境である（３、３２）。この研究の間、適切な培地中で増殖させた種々のグラム陰性及びグラム陽性細菌由来のＣＳＦを、バイオフィルム発生に有利な条件から収集した。Ｃ．ジェジュニ分離株Ｍ１２９を、これらの培養上清液の存在下で増殖させ、いくつかはクオラムセンシングシグナル又は自己誘発物質を含むと考えられた。シュードモナス種及びアルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＢＢＲ１の存在下で、培養上清液がバイオフィルム発生の増大を引き起こすのが観察されたが、収集された他の培養上清液では、バイオフィルム発生の明白な変化がなかった（図６）。しかしながら、これらの培養上清液の正確な組成は研究において定義されていなかった。理論に拘束されることを望むことなく、環境中で一般に見られるシュードモナス種、並びに家畜及び野生動物に一般に生息しているアルカノバクテリウム・ピオゲネスは、Ｃ．ジェジュニが認識して接着及びバイオフィルム形成に必要な遺伝子（複数可）の転写を活性化する、一般的なシグナルを有すると考えられている。
【００２９】
線毛は、バイオフィルム形成に関与するようである。走査型及び透過型電子顕微鏡法によってＣ．ジェジュニバイオフィルムを研究するよう設計された実験において、本発明者らは、種々のＣ．ジェジュニ分離株において表面と相互作用し、細胞間で相互作用する、周毛性の線毛の存在を観察した。示された糸状構造が線毛であって鞭毛でないかどうかを判定するために、鞭毛欠損変異体（Ｍ１２９：：ｆｌａＡＢ）を構築し、それが線毛を生成することができるかどうかについてアッセイした。鞭毛欠損変異体は、その野生型親のように、周毛性の線毛を生成した。
【００３０】
クオラムセンシングシグナルは、バイオフィルム形成に影響を及ぼす。クオラムセンシングがＣ．ジェジュニバイオフィルムに関与する可能性をアッセイするために、クオラムセンシングシグナル分子ＡＩ２の生成を欠いたｌｕｘＳ変異体を構築した（３３）。ＡＩ２は、４８及び７２時間の時点のように、Ｃ．ジェジュニバイオフィルム発生において重要な役割を果たし、野生型Ｃ．ジェジュニＭ１２９と比較して、ｌｕｘＳ変異体についてはバイオフィルム形成の減少があった（図５Ｂ）。この観察を確かめるために、ｌｕｘＳ変異体を、１：１でＭＨＢと混合した野生型Ｍ１２９由来の培養上清液の存在下で増殖させた。Ｍ１２９は、クオラムセンシング分子を生成するのに有利な条件下で増殖させた。野生型Ｍ１２９ＣＳＦの存在下で、ｌｕｘＳ変異体バイオフィルムの増大が観察された。ｌｕｘＳ変異体は、野生型と比較して、増殖は欠損していなかった。
【００３１】
単一の細菌種を含む環境性のバイオフィルムはほとんどなく、細胞が互いにごく接近しているバイオフィルムの構造は、種間シグナル伝達に適している（１３、３４）。この研究の間、培養上清液を、クオラムセンシング分子の発現に有利な条件下で増殖させた種々のグラム陰性及びグラム陽性細菌から調製した。Ｃ．ジェジュニ分離株Ｍ１２９を、Ｃ．ジェジュニの増殖を支持するのに必要な、ＭＨＢと１：１で混合したこれらのＣＳＦの存在下で増殖させた。シュードモナス種及びアルカノバクテリウム・ピオゲネスＢＢＲ１  ＣＳＦの存在下で、バイオフィルム発生の増大が観察されたが、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のＣＳＦは、バイオフィルム発生に対して明白な効果を有さなかった。
【００３２】
バイオフィルム形成における毒性遺伝子発現の役割を研究した。毒性遺伝子がＣ．ジェジュニバイオフィルムに関与する可能性をアッセイするために、３型分泌系タンパク質の生成並びにＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ｔｌｙＡにおけるコロニー形成及び溶血作用に関連する遺伝子を欠いた、ｃｉａＢ及びｔｌｙＡ変異体を構築した。ｔｌｙＡはＣ．ジェジュニにおける、特徴付けられていない遺伝子であり、したがって、バイオフィルム形成においてそれが果たす正確な役割は未知である。ｃｉａＢは、バイオフィルム形成に関与していないようであるが、ｔｌｙＡはわずかな増大を示した。
【００３３】
複数のＣ．ジェジュニ分離株がバイオフィルムを形成する。臨床分離株及び非病原性Ｃ．ジェジュニ分離株がバイオフィルムを形成することができるかどうかを判定した。バイオフィルム形成は、Ｃ．ジェジュニ分離株の病原性と相関しないようであった。分離株Ｓ２Ｂは、Ｍ１２９及び他のヒト臨床分離株と同様の程度までバイオフィルムを形成することができた。しかしながら、最近のヒト臨床分離株であるＵＭＣ３は、試験されたうちバイオフィルム形成が最も乏しかった。ＮＣＴＣ１１１６８は、ＰＳに接着しないと報告されている。ＮＣＴＣ１１１６８は、実験室の継代の際に運動性を失うことが周知であり、異なる結果は、２つの分離株のかかる差異を反映している可能性がある。
【００３４】
臨床分離株及び非病原性Ｃ．ジェジュニ分離株がバイオフィルムを形成することができるかどうかを判定した。バイオフィルム形成は、Ｃ．ジェジュニ分離株の病原性と相関しないようであった。非病原性分離株Ｓ２Ｂは、Ｍ１２９及び他の臨床分離株と同様の程度までバイオフィルムを形成することができた。しかしながら、ＵＭＣ３株は、患者から分離されたものであり、試験されたうち最もバイオフィルム形成が乏しかった。
【００３５】
免疫量の、鳥１匹あたり０．１５ｍｇの線毛タンパク質を７及び１７日齢で皮下投与して、予備実験を行った。２４日齢で、ニワトリに５×１０８個の細胞の野生型Ｃ．ジェジュニ（線毛タンパク質が由来するものと異種である）を負荷した。３５日目に、ヒヨコを屠殺し、平均して、対照鳥は盲腸においていくらか高い平均数の生細胞を有したが、免疫化されたヒヨコは、より少ない数の細胞を有し、１９匹中４匹のヒヨコは、生きているＣ．ジェジュニの少なくとも１００倍の低下を有した。理論に拘束されることを望むことなく、本発明者らは、細菌の負荷量が、強い明白な防御を可能にするのに高すぎたと考えている。
【００３６】
考察
重要なヒト腸内病原体としてのカンピロバクター種の認識は、この２０年の間に起こっただけであり、現在のところこの生物の病因及び毒性因子について、ほとんど知られていない。最も知られていない因子の１つは、Ｃ．ジェジュニが非生物表面及び生体表面上でバイオフィルムを形成することができるかどうかである。Ｃ．ジェジュニバイオフィルムの開始の原因である環境因子の同定は、宿主外でのこの生物の生存能力を研究するために、最も重要である。この病原体によるバイオフィルム形成の阻害は、消費及び交際（ｃｏｍｐａｎｉｏｎｓｈｉｐ）のための種々の家畜のコロニー形成並びにヒト感染の源として機能する我々の水路の汚染を潜在的に予防することができよう。
【００３７】
それらの天然の環境において、細菌はしばしば、栄養飢餓、浸透圧変化、温度変動及び多様な酸素分圧を含む環境ストレスを負荷される（１０、１３、１４、１９、２０、２５、２６）。細菌は、固着の生活様式への遷移があるように、環境変化に応答してバイオフィルムを形成すると考えられている（１４、１９、２２、２４、２８）。バイオフィルム形成に影響を及ぼす他の因子としては、基層特性、水力学、基層の条件付け及び槽培地の特徴が挙げられ（３、１０、１９、２７）、これらは全て細菌の接着及びバイオフィルム形成の速度に関与している。いくつかのバイオフィルムモデルにおいて、イオン強度及び栄養分濃度の変化は、細菌が表面に接着及びバイオフィルムを形成する速度に影響を及ぼした（１０、１３、１４）。環境因子及び培地の内容物がバイオフィルム形成に影響を及ぼす可能性があるので、本発明者らは、種々の槽培地条件を、それらのＣ．ジェジュニバイオフィルムに対する効果について試験した。得られた結果から、より栄養分豊富な培地は、最適なバイオフィルム形成を支持しないことが示され、水系に見られるもの等の栄養分に乏しい環境がＣ．ジェジュニバイオフィルムの発生に有利である可能性があるという結論が導かれた。本発明者らはまた、種々の濃度の、浸透圧調節物質であるグルコース、ショ糖及びＮａＣｌに対するＣ．ジェジュニバイオフィルム形成の応答を調べた。これらの浸透圧調節物質のそれぞれのレベルの増大は、バイオフィルム形成の顕著な減少を引き起こした。減少したバイオフィルム形成は、杆体形状又はらせん状の細胞から球菌様への形態変換の結果である可能性がある。球菌様形態は、浸透圧適応が必要な期間中に細胞膜への損傷及び細胞成分の分解が生じる場合がある、変性細胞形態を表す場合がある。
【００３８】
インキュベーション温度及び酸素分圧もまた、バイオフィルム形成に影響を及ぼす場合がある。しかしながら、Ｃ．ジェジュニ生存及びバイオフィルムに対する好気生活の直接の影響に関して行われた研究はほとんどない。海洋及び他の水域環境において、溶存酸素濃度は、より低い水流速度、上昇した温度、有機物及び減少した乱れによって減少する場合がある（６）。Ｃ．ジェジュニの微好気性及び好熱性の性質に沿って、より低い酸素分圧及びより高い温度がバイオフィルムに有利であったが、高い周囲温度、好熱性温度及び／又は好気状態は、バイオフィルム形成を阻害した。
【００３９】
表面の物理化学的特性は、Ｃ．ジェジュニ接着に影響を及ぼす場合がある。Ｃ．ジェジュニは、種々の程度で疎水性及び親水性表面に接着することができた。したがって、Ｃ．ジェジュニは、疎水性及び親水性表面と関連した斥力を克服する能力を有するようである。これらの斥力を克服するのを助けることができる因子のいくつかとしては、鞭毛の存在及びエキソ多糖類（ＥＰＳ）の生成が挙げられる（１０、１２、１４、２４）。細菌表面の疎水性は、接着において重要な場合がある。細菌は負に帯電している傾向があるが、それらは表面と相互作用することができる鞭毛等の疎水性表面成分を含む（１０、３０）。研究から、タンパク質合成阻害剤での細菌の処理によってバイオフィルム形成を顕著に減少させることができ、接着した細菌の遊離を引き起こすことができることが示されている（３、１０、２１）。ＣＭとのＣ．ジェジュニ細胞のプレインキュベーションによってバイオフィルム形成が阻害され、Ｃ．ジェジュニ細胞が適切なシグナル及び増殖条件に応答して接着及びバイオフィルム形成に必要なタンパク質を合成することが示唆された。
【００４０】
多くの細菌種の鞭毛は、バイオフィルム形成及び表面への接着の速度において重要な役割を有する（１０、２１、２２）。この研究において、Ｃ．ジェジュニ鞭毛欠損変異体（Ｍ１２９：：ｆｌａＡＢ）は、野生型株と比較してバイオフィルム形成が減少した。鞭毛ノックアウトは、２４時間で野生型のものと比較してバイオフィルム形成のわずかな減少を示したが、４８及び７２時間の時点ではバイオフィルムは顕著に減少した。これらの発見から、Ｃ．ジェジュニ鞭毛は表面への接着よりもバイオフィルム発生に必要かもしれないことが示唆されるかもしれない。
【００４１】
クオラムセンシング又は細胞間シグナル伝達は、バイオフィルムへの細胞接着及びバイオフィルムからの分離に関与する（１０、１１、２９）。Ｃ．ジェジュニＭ１２９を、細菌培養上清液の存在下で増殖させ、いくつかはクオラムセンシングシグナル又は自己誘発物質を含むと考えられた。研究の間にバイオフィルム形成の増大が観察されたので、研究された液体のいくつかは、Ｃ．ジェジュニＡＩ−２細胞によって認識される一般的なシグナルを含むと考えられる。Ｃ．ジェジュニバイオフィルムにおけるクオラムセンシングの役割をアッセイするために、ｌｕｘＳ遺伝子に変異を構築したが、これはＡＩ２の生成を可能にしない（１１）。グラム陰性細菌におけるクオラムセンシングは、シグナル分子ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）に依存し、これは生物発光、バイオフィルム形成及び毒性因子を含むいくつかの形質の発現を制御する（１１）。Ｃ．ジェジュニにおいて、シグナル分子ＡＩ２を生成するクオラムセンシングシステムが同定されている。このシステムは、グラム陽性及びグラム陰性細菌の両方で高度に保存されており、種間コミュニケーションのために使用されると考えられている（１１）。ｌｕｘＳ遺伝子は、ＡＩ−２生成のための生合成経路における最終的な酵素をコードする（１１）。ｌｕｘＳ変異体と野生型との間でバイオフィルム形成の減少が観察されたので、本発明者らの研究から、Ｃ．ジェジュニにおけるバイオフィルム発生はＡＩ２を必要とすることが示される。Ｃ．ジェジュニバイオフィルム形成の間の遺伝子調節の正確な性質は理解されていないが、明らかに、ＡＩ−２による細胞間コミュニケーションは、これらの機能に必要な遺伝子の発現の誘導に関与している。
【００４２】
顕微鏡法技術及び定量的染色アッセイを用いて、Ｃ．ジェジュニ分離株によるバイオフィルム形成を研究した。バイオフィルム形成は、分離株の病因と相関しないようであった。しかしながら、分離株のそれぞれは、ポリスチレン表面全体で均一な細胞の分布を形成した。接着細胞の密度に違いがあったが、顕微鏡法の間に細菌の微小コロニーはほとんど観察されなかった。Ｃ．ジェジュニ分離株が非生物表面上でバイオフィルムを形成する能力は、それが正常な宿主外で生存し、動物及びヒトにとってのコロニー形成及び／又は感染汚染の継続的な源として作用する能力を説明するのを助けるかもしれない。
【００４３】
Ｃ．ジェジュニ細胞の環境的制限にもかかわらず、バイオフィルム中での生存は、農業及び食品加工工場における動物及び死体への病原体の伝染に重要な役割を果たし、そのようにしてヒトに影響を及ぼす可能性がある。分離株の間のバイオフィルム可変性は、ヒト感染について特に懸念されるある種の株に寄与する可能性がある。したがって、本発明者らの研究は、これらの施設での配水システムの影響及びバイオフィルムに見られるＣ．ジェジュニ分離株と動物にコロニー形成しヒトでの大流行を引き起こすものとの相関を判定することに拡張されるべきである。したがって、ヒト及び動物、特にＣ．ジェジュニによってコロニー形成され、食物、乳、水及び土壌汚染、ひいてはヒト感染の源として機能するものに投与するための、免疫原性組成物を提供することが重要である。
【００４４】
本明細書中でアミノ酸について使用される略記は、当技術分野で標準的である。本明細書中で使用されるアミノ酸残基についての略記は以下の通りである。Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｗ、Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｋ、Ｌｙｓ、リシン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；及びＨ、Ｈｉｓ、ヒスチジン。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、弱毒化は、細菌株の毒性が、ヒト又は特定の動物において疾患を引き起こす「野生型」臨床株と比較して減少していることを意味し、弱毒化株は、ヒト又は特定の動物において疾患を引き起こさない。弱毒化カンピロバクター株の非限定的な例は、機能的ｆｕｒ及び／又はｋａｔＡ遺伝子産物を発現しないものである。
【００４６】
変異に関して、遺伝子の機能的不活化は、遺伝子産物の活性がほとんど又は全くないことを意味する。例えば、遺伝子が酵素をコードする場合、コードされる産物は、野生型遺伝子由来の産物の１０％未満、望ましくは５％未満若しくは１％未満の酵素活性を有するか、又は１０％未満、５％未満若しくは１％未満の発現産物がある。すなわち、活性が有意に減少するように、コード配列を、挿入されたヌクレオチド若しくは配列で中断するか、部分的若しくは全体的に欠失することができ、又は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させる置換変異があってもよい。或いは、発現が遺伝子転写及び／又はｍＲＮＡの翻訳のレベルで減少又は予防されるように、転写及び／又は翻訳調節配列に挿入、欠失又は変化があってもよい。
【００４７】
本内容において、カンピロバクターバイオフィルム物質は、本発明の線毛タンパク質、すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列によって特徴付けられる線毛タンパク質を含む。バイオフィルム物質は、典型的には、細胞外多糖（複数可）、及び細胞も含む。有利に、カンピロバクターは、Ｃ．ジェジュニ又はＣ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）である。線毛タンパク質は、増殖の遅滞期及び定常期の間並びにバイオフィルム中で発現される。例えばミュラーヒントン培地中の、静的増殖条件は、バイオフィルム形成に有利である。バイオフィルムは容器、特に容器の底に接着する。これは、消費された培地の除去の後に除去することができる。カンピロバクターの株が弱毒化されていない場合、生細胞は、当技術分野で公知のように死滅させることができる。
【００４８】
本発明のＣ．ジェジュニ線毛タンパク質を含む免疫原性組成物及び／又はワクチンは、当技術分野で公知の手段のいずれかによって製剤化される。それらは、典型的には、注射可能物質として、又は鼻腔内若しくは経口投与のため、又は例えば溶液若しくは懸濁液のいずれかとしての飲料水中で、経口経管栄養若しくは不断給餌のための製剤として、調製することができる。注射又は他の投与の前の液体中の、溶液、又は懸濁液に適した固体形態もまた、調製してもよい。調製物はまた、例えば、乳化させるか、又はリポソーム中に封入されたタンパク質（複数可）／ペプチド（複数可）であってもよい。
【００４９】
最も可能性の高いヒト及び動物の感染の経路を考慮して、粘膜免疫が特に有利であり、免疫原性組成物は、有利に、無毒性コレラ毒素Ｂサブユニット等のアジュバントを含む（例えば、米国特許第５，４６２，７３４号明細書参照）。コレラ毒素Ｂサブユニットは、例えば、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販されている。他の適したアジュバントは入手可能であり、それに置換してもよい。エアロゾル免疫原性（又はワクチン）製剤のためのアジュバントは、上皮細胞に結合し、粘膜免疫を刺激することができることが好ましい。
【００５０】
末端に、又はポリマーから粒子若しくはその核の長さに沿って結合している、直鎖状、分枝又は架橋シリコーンを含むオルガノメタロポリマーは、粘膜投与及び粘膜免疫の刺激に適したアジュバントの１つである。かかるポリシロキサンは、分子量が約４００から約１，０００，０００ダルトンまで変化してもよく、好ましい長さの範囲は約７００〜約６０，０００ダルトンである。適した官能化シリコーンとしては、（トリアルコキシシリル）アルキル末端ポリジアルキルシロキサン及びトリアルコキシシリル末端ポリジアルキルシロキサン、例えば、３（トリエチオキシシリル）プロピル末端ポリジメチルシロキサンが挙げられる。参照によって本明細書中に援用される米国特許第５，５７１，５３１号明細書を参照のこと。ホスファゼン高分子電解質もまた、粘膜投与（鼻腔内、膣内、直腸、エアロゾル投与による呼吸器系）のための免疫原性組成物に組み込んでもよい（例えば、米国特許第５，５６２，９０９号明細書参照）。
【００５１】
活性免疫原性成分は、しばしば、薬学的に許容され得、活性成分と適合性のある、賦形剤又は担体と混合される。適した賦形剤としては、限定されないが、水、生理食塩水、右旋性ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合せが挙げられる。注射可能物質、エアロゾル又は経鼻製剤中の免疫原性ポリペプチドの濃度は、通常、０．２〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。同様の投薬量を、他の粘膜表面に投与してもよい。かかるワクチンは、タンパク質を薬学的に許容され得る担体と混合することによって、容易に調製することができる。薬学的に許容され得る担体は、少なくとも有害な効果がワクチン接種されていない動物に見られる効果よりも悪い程度まででなく、ワクチン接種される動物の健康に有害な影響を及ぼさない化合物であると理解されている。薬学的に許容され得る担体は、例えば、滅菌水又は滅菌生理食塩水であってもよい。より複雑なものにおいて、担体は、例えばバッファーであってもよい。
【００５２】
しかしながら、飲料水による経口ワクチン接種が構想される場合、水の漏出のために、恐らくより大量のタンパク質を与えなければならない。
【００５３】
本発明によるワクチンは、アジュバントをさらに含んでもよい。免疫学的アジュバントは、一般に、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質を含む。多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例は、フロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロック重合体並びにデキストラン硫酸、カルボポール及びピラン等のポリアミン、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）若しくは大腸菌等の細菌又は細菌由来物質、オリゴペプチド、乳化パラフィン−Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）（ネブラスカ州ラルストンのＭＶＰ  Ｌａｂｓ）、水酸化アルミニウムを含むＬ８０アジュバント（ニュージャージー州のＲｅｈｅｉｓ）、Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｐｈｏｓ）、又は当業者に公知の他のアジュバントである。Ｓｐａｎ、Ｔｗｅｅｎ、ヘキサデシルアミン、リソレクチン、メトキシヘキサデシルグリセロール及びサポニン等の界面活性物質もまた、非常に適している。さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等のペプチドがしばしば使用される。これらのアジュバントの次に、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、ミネラルオイル、例えばＢａｙｏｌ又はＭａｒｋｏｌ、植物油又はその乳濁液及びＤｉｌｕｖａｃ．Ｆｏｒｔｅを、有利に使用することができる。ワクチンはまた、いわゆる「ビヒクル」を含んでもよい。ビヒクルは、ポリペプチドがそれに共有結合することなく接着する化合物である。しばしば使用されるビヒクル化合物は、例えば、アルミニウムの水酸化物、リン酸塩、硫酸塩若しくは酸化物、シリカ、カオリン又はベントナイトである。抗原が部分的にビヒクルに包埋されている、かかるビヒクルの特別な形態は、いわゆるＩＳＣＯＭである（ＥＰ１０９．９４２、ＥＰ１。ワクチンはまた、アジ化ナトリウム、チマーソル、ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びポリミキシン等の保存薬を含んでもよい。８０．５６４、ＥＰ２４２．３８０）。
【００５４】
しばしば、免疫原性組成物は、例えば分解しやすいポリペプチドが分解されるのを保護するため、ワクチンの貯蔵寿命を増強するため、又は凍結乾燥効率を向上させるために、安定化剤をさらに含む。有用な安定化剤としては、限定されないが、ＳＰＧＡ、スキムミルク、ゼラチン、ウシ又は他の血清アルブミン、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストラン若しくはグルコース、アルブミン若しくはカゼイン等のタンパク質又はそれらの分解産物、及びアルカリ金属リン酸塩等のバッファーが挙げられる。アルブミンが使用される場合、望ましくは、それを含む免疫原性組成物が投与される動物（又はヒト）と同じ種に由来する。凍結乾燥は、保存のための効率的な方法である。凍結乾燥された物質は、何年も安定して保存することができる。凍結乾燥された物質の保存温度は、物質に有害であることなく、０度より高いであろう。凍結乾燥は、全ての周知の標準的な凍結乾燥手順に従って行うことができる。
【００５５】
線毛タンパク質、特に組換え発現された線毛タンパク質を含むワクチンは、好ましくは粘膜投与される。これは、ワクチンを飲料水又は食品と混合することによって、経口投与によって行うことができる。特に家禽については、眼内ワクチン接種及び鼻腔内ワクチン接種等のさらなる方法もまた、非常に適した粘膜ワクチン接種の方法である。
【００５６】
また、所望される場合、ワクチンは、ワクチンの有効性を増強する湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はアジュバント等の少量の補助物質を含んでもよい。有効であり得るアジュバントの例としては、限定されないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、並びに２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩが挙げられる。アジュバントの有効性は、問題のアジュバントを含むワクチン中の免疫原の投与に起因する、免疫原に対する抗体（特にＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＧ）の量を測定することによって判定することができる。当技術分野で公知のようなかかるさらなる製剤及び投与の様式もまた、使用してもよい。
【００５７】
目的の線毛タンパク質抗原又は前記タンパク質由来の配列に由来するペプチドを、中性又は塩形態としてワクチンに製剤化する。薬学的に許容され得る塩としては、限定されないが、無機酸、例えば塩酸又はリン酸、及び有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマレイン酸で形成された酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成されている）が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は鉄水酸化物、並びに有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノ−エタノール、ヒスチジン、及びプロカインに由来してもよい。
【００５８】
免疫原性組成物又はワクチンは、当技術分野で公知のものに従って、投薬製剤に適合性のある様式で、並びに予防上及び／又は治療上有効な量及び様式で投与される。投与される量は、一般に１用量あたり約１００〜１，０００μｇのタンパク質の範囲、より一般には１用量あたり約２０〜１０００μｇのタンパク質の範囲であり、治療される被験体、抗体を合成する個体の（又は動物の）免疫系の能力、及び所望される防御の程度による。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、医師又は獣医の判断によってもよく、各個体に特有であってもよいが、かかる判定は、かかる実行者の技術の範囲内である。
【００５９】
免疫原性組成物における組換え線毛タンパク質の使用の代替として、線毛が発現されているバイオフィルム増殖を容器表面から採取することによって静置培養（例えばミュラーヒントンブロスを培地として使用して）由来の死滅したＣ．ジェジュニ全細胞調製物を使用することができる。臨床分離株又は野生型株が使用される場合、望ましくは、バイオフィルムを処理して、その中の細菌細胞を死滅させる。生細胞を死滅させることは当技術分野で公知であり、適切な薬剤の非限定的な例としては、ホルマリン及びＢＥＩが挙げられる。全細胞（バイオフィルム）免疫原性組成物の使用に対する別の手法は、バイオフィルム形成条件におけるような線毛形成を生じる条件下で増殖させた弱毒化Ｃ．ジェジュニ変異体の使用である。病原性株は、カタラーゼ遺伝子（ｋａｔＡ、Ｄａｙら、２０００年参照）若しくはｆｕｒ遺伝子を機能的に不活化することによって弱毒化することができ、又は、これらの機能の一方若しくは両方を欠いた変異体を単離することができる。カンピロバクターの他の種を、本方法におけるＣ．ジェジュニの代わりに使用してもよい。
【００６０】
ワクチンに製剤化する前に、調製物中の細菌細胞を不活化してもよい。細菌細胞は、当業者に公知の標準的な手順に従って、熱（例えば、６０℃で２時間の処理）又は化学物質、典型的には市販のワクチン調製物に一般に使用されるものを用いて、不活化してもよい。本発明の細菌調製物を不活化するのに適した化学物質としては、β−プロピオラクトン（β−Ｐｒｏｎｅ、アイオワ州ラーチウッドのＧｒａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）又は０．１Ｍバイナリーエチレンイニン（ＢＥＩ）が挙げられる。他の方法及び物質は当技術分野で周知である。培養物の不活化は、例えば、複数の試料を適した固体に播種し、最適な増殖条件下でプレートをインキュベートすることによって確認してもよい。
【００６１】
ワクチン又は他の免疫原性組成物は、単回投与、例えば２〜８週間隔てた２回投与計画、若しくは複数回投与計画又は他のワクチンとの組合せで与えてもよい。複数回投与計画は、ワクチン接種の最初の過程が１〜１０以上の別々の用量、それに続く、免疫応答を維持及び／又は強化するのに必要な、後の間隔、例えば２回目の投与に１〜４カ月で投与される他の用量、並びに必要な場合、数ヵ月後の後の投与（複数可）を含んでもよいものである。本発明に従って投与された抗原で免疫化されたヒト（又は他の動物）は、目的の抗原が由来する病原体による感染から防御される。
【００６２】
本発明によるワクチンの調製のための方法は、複雑である必要はない。原則として、標準的な技術に従って、例えば動物において、本明細書中に記載されている線毛タンパク質に対する抗体を産生させ、続いて血液を収集し、抗血清を単離することで十分である。かかる抗体を産生させるのに適した動物は、例えば、ウサギ及びニワトリである。ニワトリが使用される場合、抗体は、代替として、全身免疫されたニワトリの卵黄から得てもよい。原則として、抗体は希釈する必要はない。それらはそのまま、又は必要な場合、濃縮した形態でも与えてもよい。或いは、抗体濃度が非常に高い場合、そのようにして得られた抗血清は、例えば、投与の前に希釈してもよい。
【００６３】
この特異性の所望の抗体、モノクローナル抗体又は単鎖抗体を産生する細胞を得て、これらを発酵槽又は細胞培養装置中で増殖させることもまた、可能である。抗体は後で採取してもよく、必要な場合、薬学的に許容され得る担体と混合してもよい。かかる方法の利点は、抗体の調製に動物を使用する必要がないことである。
【００６４】
本発明の免疫化態様の適用は、屠殺する前にブロイラーニワトリを処理することである。かかるブロイラーは、通常、６週齢で屠殺される。したがって、屠殺の１〜３週間前の、線毛タンパク質を含む免疫原性組成物又は線毛含有全細胞ワクチンでの動物の処理によって、カンピロバクター汚染のレベルの有意な減少が引き起こされる。
【００６５】
本発明の線毛タンパク質に特異的な抗体は、例えばニワトリに粗抗血清を供給することによって、いくぶん粗い調製物として与えてもよい。代替的な投与の経路としては、限定されないが、血清を飲料水又はニワトリの食物と混合することが挙げられる。かかる目的のために、別法は、抗体を凍結乾燥し、そのようにしてそれらの長期安定性を増強し、その後それらを食物又は水と混合することである。また、抗体は、カプセル化してからニワトリの食物に添加してもよい。本発明のカンピロバクター線毛タンパク質に対する特異性を有する抗血清又は抗体調製物は、カンピロバクター感染症を患う患者（特にヒト患者）の治療において使用することができる。
【００６６】
バイオフィルム若しくは便試料中のカンピロバクター、特にＣ．ジェジュニを検出するため、又はカンピロバクター、特にＣ．ジェジュニ感染の診断のために、本発明の線毛タンパク質に特異的な抗体を用いることができる。
【００６７】
本発明の線毛タンパク質の別の使用は、このタンパク質に特異的な抗体の検出において、例えば、カンピロバクター、特にＣ．ジェジュニに対する動物若しくはヒトの曝露をモニタリングすること、又はＣ．ジェジュニ線毛タンパク質に対する免疫応答（体液性）の発生をモニタリングすることである。
【００６８】
ヒト又は動物の免疫化のための別の戦略は、本発明の線毛タンパク質をコードするＤＮＡ分子を投与することであり、ここでコード配列は、それが導入されているヒト又は動物における発現を指示するのに適切な転写及び翻訳配列に、動作可能に連結されている。
【００６９】
さらに別の戦略は、非毒性サルモネラ株を用いて、目的の線毛コード配列を発現させることである（線毛タンパク質を含まない以前の実験については、Ｐａｗｅｌｅｃら（１９９７年）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：１３７〜１４０ページ参照）。Ｐａｗｅｌｅｃらは、ＣｊａＡ、ＣｊａＣ、ＬＰＳ、ＭＯＭＰ、鞭毛又は鞭毛サブユニット等の防御Ｃ．ジェジュニ抗原をコードするＣ．ジェジュニ遺伝子を発現するＳ．チフィムリウム株の構築によって、両方の腸管病原体に対するニワトリワクチンを得る有効な方法を提供することができるかもしれないと示唆した。米国特許出願公開第２００１／００３８８４４Ａ１号明細書は、組換えサルモネラ変異体株における鞭毛抗原又は断片の発現を教示している。ニワトリにおいて粘膜免疫応答を誘発することができるサルモネラの多数の非毒性株が記載されている。例えば、Ｓ．チフィムリウムｄｅｌｔａ−ｃｙａ−ｄｅｌｔａ−ｃｒｐ変異体は、Ｃｕｒｔｉｓｓ及びＫｅｌｌｙによって開発され（Ｃｕｒｔｉｓｓ及びＫｅｌｌｙ、１９８７年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５．３０３５〜３０４４ページ）、Ｇａｌｅｎらによってさらに修飾された（Ｇａｌｅｎら、１９９０年、Ｇｅｎｅ  ９４：２９〜３５ページ）。ｐｈｏＰ遺伝子に変異を有するサルモネラの別の変異体株の開発並びにサルモネラ・チフィムリウムに対するワクチンの成分としてのこれらの非毒性変異体生物の使用を開示している米国特許第５，４２４，０６５号明細書も参照のこと。Ｓ．チフィムリウムＸ３９８５Δ−ｃｙａ−Δ−ｃｒｐは、用量及び株依存的であると示される応答である、ニワトリにおけるサルモネラの毒性株での再負荷に対する有意な防御を誘発した（Ｈａｓｓａｎ及びＣｕｒｔｉｓｓ、１９９０年、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：８３９〜８５０ページ）。しかしながら、Ｃｕｒｔｉｓｓら、米国特許第５，４２４，０６５号明細書によって教示されているように、これらのサルモネラ変異体の成功利用は、宿主、細菌種、及び免疫化の経路による。サルモネラ変異体はまた、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）変異体、Ｓ．ソブリナス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）（Ｄｏｇｇｅｔｔら、１９９３年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：１８５９〜１９６６ページ、Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａら、１９９３年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：１００４〜１０１５ページ、Ｒｅｄｍａｎら、１９９５年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２００４〜２０１１ページ、Ｒｅｄｍａｎら、１９９６年、Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：８６８〜８７８ページ）、Ｓ．エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）、ボルデテラ・アビウム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ａｖｉｕｍ）（Ｇｅｎｔｒｙ−Ｗｅｅｋｓら、１９９２年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７７２９〜７７４２ページ）、Ｂ．パータシス、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｃｕｒｔｉｓｓら、１９９０年、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：７９７〜８０５ページ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｓｃｈｏｄｅｌら、１９９４年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１６６９〜１６７６ページ）、大腸菌熱不安定性毒素−ウイルス���合タンパク質（Ｓｍｅｒｄｏｕら、１９９６年、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４１：１〜９ページ）、及び破傷風毒素断片Ｃ（Ｋａｒｅｍら、１９９５年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：４５５７〜４５６３ページ）由来の外来性抗原を発現するためのベクターとして使用されている。
【００７０】
明細書中で言及される種々のアミノ酸配列中で生じるアミノ酸は、当技術分野で通法により使用されるそれらの通常の３文字及び１文字略記を有する。Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リシン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｗ、Ｔｒｙ、トリプトファン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン。
【００７１】
タンパク質は、それが組換えによって生成される宿主細胞から単離されたタンパク質である場合、単離されたタンパク質と考えられる。それは精製されてもよく、又は単に自然界ではそれと関連している他のタンパク質及び生物学的物質を含まなくてもよい。
【００７２】
単離された核酸は、構造が任意の天然に存在する核酸のもの又は３つより多い別々の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意の断片のものと同一でない核酸である。したがって、用語は、例えば、天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するがそれが天然に存在する生物のゲノムにおいて分子のその部分が隣接するコード又は非コード配列の両方が隣接していないＤＮＡ、得られる分子が任意の天然に存在するベクター又はゲノムＤＮＡと同一でないようにベクター又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片、又は制限酵素断片等の別々の分子、並びにハイブリッド遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子にわたる。ＤＮＡ分子、形質転換又はトランスフェクト細胞、及び細胞クローンの混合物中に存在する核酸は、例えばこれらがｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリー中で生じるように、この定義から特異的に排除される。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、特定の配列によって指示される発現は、関連する下流配列の転写である。関連する配列について適切で所望される場合、用語、発現はまた、転写されたＲＮＡの翻訳（タンパク質合成）も包含する。
【００７４】
本文脈において、プロモーターは、関連する（下流）配列の転写を引き起こすのに十分な配列を含むＤＮＡ領域である。プロモーターは調節してもよく、すなわち、関連する配列の転写を引き起こすよう構成的に作用していない。誘導性である場合、生物が中又は上で培養される培地中に誘導因子分子が存在する場合にのみ関連する配列が転写されるように発現の調節を媒介する、存在する配列がある。本文脈において、転写調節配列はプロモーター配列を含み、当技術分野で周知のように、環境シグナルに応答した、関連する配列の調節された発現のためのシス−活性配列をさらに含んでもよい。
【００７５】
あるＤＮＡ部分又は配列は、それが第２のＤＮＡ部分又は配列の３’に位置する場合、第２のＤＮＡ部分又は配列の下流である。あるＤＮＡ部分又は配列は、第２のＤＮＡ部分又は配列の５’に位置する場合、そのＤＮＡ部分又は配列の上流である。
【００７６】
あるＤＮＡ分子又は配列と別のものとは、２つが同じ天然の本源に由来しない場合に、異種である。配列は、天然の配列であってもよく、又は多重クローニング部位領域の場合のように、少なくとも一方の配列が人によって設計されてもよい。２つの配列は、２つの異なる種に由来してもよく、又は合成された部分のヌクレオチド配列がもう一方の配列と同じ生物に由来しなければ、一方の配列が化学合成によって生成されてもよい。
【００７７】
単離された、又は実質的に純粋な核酸分子又はポリヌクレオチドは、天然の転写調節配列を天然に伴う他のポリヌクレオチド配列から実質的に分離されたポリヌクレオチドである。用語は、その天然に存在する環境から除去されているポリヌクレオチド配列を包含し、組換え又はクローン化ＤＮＡ分離物、化学的に合成された類似体、及び異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。
【００７８】
ポリヌクレオチドは、その天然の状態、又は、当業者に公知の方法によって操作された場合、転写及び／若しくは翻訳されてポリペプチド若しくはその断片を生成することができる場合、ポリペプチドをコードするといわれる。かかるポリヌクレオチドのアンチセンス鎖はまた、配列をコードするといわれる。
【００７９】
ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的関係に配置される場合に、動作可能に連結されている。例えば、プロモーターは、プロモーターがその転写又は発現を生じさせる場合に、コード配列に動作可能に連結されている。一般に、動作可能に連結されている、は、連結されている配列が連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、連続であり、リーディングフレーム中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサー等のある種の遺伝因子は隔たっていても、すなわち連続していなくても、動作可能に連結されていてもよいことは周知である。
【００８０】
用語、組換えポリヌクレオチドは、遺伝子操作技術又は化学合成によって単離されたポリヌクレオチドのセグメントの人工的操作によって達成される、２つの、他の状態では別々の配列のセグメントの組合せによって作製されたポリヌクレオチドをいう。その際、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを連結させて所望の機能の組合せを生じてもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチドプローブは、標識又はレポーター分子に付着した単離されたポリヌクレオチドを含み、他の配列、例えばカンピロバクター・ジェジュニの他の株に由来するものを同定及び単離するのに使用することができる。合成オリゴヌクレオチド又は他のポリヌクレオチドを含むプローブは、天然に存在する、又は組換え一本鎖若しくは二本鎖核酸に由来してもよく、又は化学合成してもよい。ポリヌクレオチドプローブは、当技術分野で公知の方法のいずれか、例えばランダムヘキサマー標識、ニックトランスレーション、又はクレノウフィルイン反応法によって標識してもよい。
【００８２】
適した宿主細胞中の複製によって、大量のポリヌクレオチドを生成することができる。目的のタンパク質をコードする天然又は合成のＤＮＡ断片を、タンパク質発現が所望される、原核又は真核細胞、特に大腸菌での導入及び複製が可能な、組換えポリヌクレオチド構築物、典型的にはＤＮＡ構築物中に組み込む。通常、構築物は、大腸菌、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム又はシュードモナス等の単細胞宿主における複製に適しているが、宿主細胞のゲノム内の組込みあり又はなしで、多細胞真核宿主もまた適当である場合がある。真核宿主細胞としては、酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類及び鳥類が挙げられる。操作の容易さ、発現されたタンパク質を適切にグリコシル化することができるかどうか、タンパク質発現の程度及び制御、発現されるタンパク質の、細胞混入物からの精製の容易さ等の要因又は他の要因は、宿主細胞の選択に影響を及ぼす。
【００８３】
ポリヌクレオチドはまた、化学合成によって、例えばＢｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１年）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２ページによって記載されているホスホラミダイト法又はＭａｔｔｅｕｃｉら（１９８１年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５ページによるトリエステル法によって、生成してもよく、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機で行ってもよい。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングすること、又は適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することのいずれかによって、化学合成の一本鎖生成物から得てもよい。
【００８４】
原核又は真核宿主への導入のために調製されたＤＮＡ構築物は、典型的には、所望のポリペプチドをコードする意図されるＤＮＡ断片を含む、宿主によって認識される複製系（すなわち、ベクター）を含み、好ましくは、ポリペプチドコードセグメントに動作可能に連結された転写及び翻訳開始調節配列も含む。発現系（発現ベクター）は、例えば、複製開始点又は自律複製配列（ＡＲＳ）及び発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、及びｍＲＮＡ安定化配列等の必要なプロセシング情報部位を含んでもよい。シグナルペプチドもまた、適切な場合、同じ又は関連した種の分泌されたポリペプチドから含まれてもよく、これによってタンパク質が細胞膜中で交差する及び／若しくは留まる又は細胞から分泌されることが可能になる。
【００８５】
適切なプロモーター及び他の必要なベクター配列は、宿主中で機能的であるように選択される。細胞系及び発現ベクターの実行可能な組合せの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）下記参照、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９５年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、及びＭｅｔｚｇｅｒら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３４：３１〜３６ページに記載されている。細菌、酵母、菌類、哺乳動物、昆虫、植物又は他の細胞における発現のための多くの有用なベクターは当技術分野で周知であり、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、及び他のもの等の業者から得ることができる。また、構築物は、遺伝子の複数のコピーが生じるように、増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結してもよい。適切なエンハンサー及び他の発現制御配列については、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８３年）も参照のこと。かかる発現ベクターは自律的に複製することができるが、それらは宿主細胞のゲノムに挿入されることによって、あまり好ましく複製しない場合がある。
【００８６】
発現及びクローニングベクターは、有利に、選択可能なマーカー、すなわち、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む。かかるマーカー遺伝子は、宿主細胞に同時に導入された別のポリヌクレオチド配列上に保持されていてもよいが、これはほとんどの場合クローニングベクター上に含まれる。マーカー遺伝子が導入されている宿主細胞のみが、選択的な条件下で生存及び／又は増殖する。典型的な選択遺伝子は、抗生物質又は他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート等に対する耐性を与える、栄養要求性欠損を補完する、又は複合培地から入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。適切な選択可能なマーカーの選択は宿主細胞により、種々の宿主についての適切なマーカーは当技術分野で公知である。
【００８７】
組換え宿主細胞は、本文脈において、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むよう遺伝子組換えされているものである。ＤＮＡは、特定の細胞の型に適切で、限定されないが形質転換、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含む、当技術分野で公知の任意の手段によって導入することができる。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、コロニー形成は、宿主動物又はヒト内でのＣ．ジェジュニの確立をいう。ある種の動物、例えば家禽（ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等）において、コロニー形成は、疾患を生じない。本明細書中で教示されているようなＣ．ジェジュニの線毛タンパク質を含む免疫原性組成物の投与によってコロニー形成が減少又は予防される場合、利点は、より少ない細菌が食品及び環境中に導入されることである。感染は、本文脈において、疾患症状が起こる結果を伴う、ヒト又は動物のコロニー形成をいう。
【００８９】
ＤＮＡ配列は遺伝コードの縮重及びコドン使用頻度によって変化してもよいことが、当業者によって認識される。目的の線毛タンパク質をコードする全ての（同義の）ＤＮＡ配列が、本発明に含まれる。
【００９０】
また、ＤＮＡ配列がコードするペプチドのアミノ酸配列の活性を有意に変化させない対立遺伝子変異体がＤＮＡ配列中で生じてもよいことが、当業者によって認識されるであろう。全てのかかる同等なＤＮＡ配列が本発明の範囲内及び制御されたプロモーター領域の定義に含まれる。当業者は、例示された配列を用いて、示された配列と機能的に同等なさらなる例示されていないヌクレオチド配列を同定及び単離することができることを理解するであろう。
【００９１】
本発明の線毛タンパク質のアミノ酸配列に、わずかな変更があってもよい。アミノ酸配列の変化は、１つ又は複数のアミノ酸の、機能的同等物による置換の結果であってもよい。機能的同等物による置換はしばしば見られる。Ｎｅｕｒａｔｈら（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７９年）、１４ページ、図６）によって記載されている例は、すなわち、アミノ酸アラニンの、セリンによる置換、Ａｌａ／Ｓｅｒ、又はＶａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ等である。上述の機能的同等物アミノ酸による置換を生じる変化に加えて、機能的同等物でない別のアミノ酸によってアミノ酸が置換されている変化が見られてもよい。この種類の変化は、その空間的折り畳みにわずかな変化を有するタンパク質を生じ得る点で機能的同等物での置換と異なるだけである。両方のタイプの変化がタンパク質中でしばしば見られ、それらは生物学的変化として公知である。線毛タンパク質のアミノ酸配列の変化はポリペプチドの免疫原性活性が保持される程度まで可能であること、すなわち変異体タンパク質に対して産生された抗体が特に例示された線毛タンパク質又はＣ．ジェジュニの他の分離株の線毛タンパク質と交差反応することが理解される。
【００９２】
ハイブリダイゼーション手順は、本明細書中で教示されているような有用な対象の調節配列に対して十分な相同性を有するポリヌクレオチドを同定するために有用である。特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術に改良がなされているため、それらは当業者によって容易に適用することができる。
【００９３】
プローブ及び試料はハイブリダイゼーションバッファー溶液中で合わされ、アニーリングが起こるまで適切な温度で維持される。その後、膜は外来性物質なしに洗浄されて、典型的にはオートラジオグラフィー及び／又は液体シンチレーション測定によって検出及び定量される、試料及び結合しているプローブ分子が残る。当技術分野で周知のように、プローブ分子及び核酸試料が、２つの分子の間で強力な非共有結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブ及び試料は本質的に同一であるか、又はアニーリング及び洗浄工程が高ストリンジェンシーの条件下で行われる場合、完全に相補的であると合理的に仮定することができる。プローブの検出可能な標識によって、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを判定するための手段が提供される。
【００９４】
プローブとしての、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用において、特定のプローブは、放射性及び非放射性標識を含む、当業者に公知の任意の適した標識で標識される。典型的な放射性標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ等が挙げられる。非放射性標識としては、例えば、ビオチン若しくはチロキシン等のリガンド、並びにヒドロラーゼ若しくはペルオキシダーゼ等の酵素、又はルシフェリン等の化学発光物質、又はフルオレセインのような蛍光化合物及びその誘導体が挙げられる。或いは、プローブは、国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されているように、本質的に蛍光にしてもよい。
【００９５】
ハイブリダイゼーションの種々の程度のストリンジェンシーを採用してもよい。条件がストリンジェントであるほど、二本鎖形成に必要な相補性は高くなる。ストリンジェンシーは、温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間等によって制御することができる。好ましくは、例えば参照によって本明細書中に援用されるＫｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．、Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ（１９８７年）ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１６９〜１７０ページに記載されているように、当技術分野で公知の技術によって、ハイブリダイゼーションは、中〜高ストリンジェンシー条件下で行われる。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、ハイブリダイゼーションのための中〜高ストリンジェンシー条件は、本発明者らによって採用された条件と同じ又はほぼ同じ程度のハイブリダイゼーションの特異性を達成する条件である。高ストリンジェンシー条件の例は、６８℃、５×ＳＳＣ／５×デンハルト液／０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイズさせ、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、室温で洗浄することである。中ストリンジェンシーの条件の例は、６８℃、５×ＳＳＣ／５×デンハルト液／０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイズさせ、４２℃、３×ＳＳＣ中で洗浄することである。温度及び塩濃度のパラメーターは、プローブと標的核酸との間で所望のレベルの配列同一性を達成するよう変化させてもよい。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指導については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）下記参照又はＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨークを参照のこと。
【００９７】
特に、標準的な方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら）によって、３２Ｐ標識遺伝子特異的プローブでのサザンブロットにおける固定化されたＤＮＡのハイブリダイゼーションを行った。一般に、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄は、例示された配列に対して相同性を有する標的配列の検出を可能にする中〜高ストリンジェンシー条件下で行った。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ  ５×デンハルト液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ中で、ＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）の２０〜２５℃下で一晩行ってもよい。融点は、以下の式によって記載されている（Ｂｅｌｔｚら（１９８３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｗｕ、Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ及びＫ  Ｍｏｌｄａｖｅ（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１００：２６６〜２８５ページ）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（＋Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／二本鎖の塩基対の長さ
【００９８】
洗浄は、典型的には以下のように行われる。１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、室温で２回（低ストリンジェンシー洗浄）、及び０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、ＴＭ−２０℃で１回（中ストリンジェンシー洗浄）。
【００９９】
オリゴヌクレオチドプローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ中で、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）の１０〜２０℃下で一晩行った。オリゴヌクレオチドプローブのＴｍは、以下の式によって判定した：ＴＭ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）（Ｓｕｇｇｓ，Ｓ．Ｖ．ら（１９８１年）ＩＣＢ−ＵＣＬＡ  Ｓｙｍｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、Ｄ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２３：６８３〜６９３ページ）。
【０１００】
洗浄は、典型的には、以下のように行った。１５分間１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで、室温で２回（低ストリンジェンシー洗浄）、及び１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、ハイブリダイゼーション温度で１回（中ストリンジェンシー洗浄）。
【０１０１】
一般に、塩及び／又は温度を変化させてストリンジェンシーを変化させることができる。長さが７０塩基を超えるくらいの、標識されたＤＮＡ断片で、以下の条件を使用することができる。低、１又は２×ＳＳＰＥ、室温；低、１又は２×ＳＳＰＥ、４２℃；中、０．２×又は１×ＳＳＰＥ、６５℃；及び高、０．１×ＳＳＰＥ、６５℃。
【０１０２】
二本鎖形成及び安定性は、ハイブリッドの２つの鎖の間の実質的な相補性により、上述のように、ある程度のミスマッチは許容され得る。したがって、本発明のプローブ配列は、記載されている配列の変異（単一及び多重の両方）、欠失、挿入、及びそれらの組合せを含み、ここで前記変異、挿入及び欠失は、目的の標的ポリヌクレオチドとの安定したハイブリッドの形成を可能にする。変異、挿入、及び欠失は、多くの方法で所与のポリヌクレオチド配列において生じることができ、それらの方法は当業者に公知である。他の方法が将来知られるようになるかもしれない。
【０１０３】
このようにして、開示されたヌクレオチド配列の、変異、挿入、及び欠失の変異体は、当業者に周知の方法によって容易に調製することができる。これらの変異体は、変異体が元々の配列と相当な配列相同性を有する限りは、例示されたプライマー配列と同じ様式で使用することができる。本明細書中で使用される場合、相当な配列相同性は、変異体ポリヌクレオチドが、プローブが由来するポリヌクレオチドと同じ能力で機能することができるようにするのに十分な相同性をいう。好ましくは、この相同性は７０％又は８０％よりも高く、より好ましくは、この相同性は８５％よりも高く、さらにより好ましくは、この相同性は９０％よりも高く、最も好ましくは、この相同性は９５％よりも高い。７０〜１００％の間の全ての整数もまた、本発明の範囲内である。変異体がその意図される能力で機能するのに必要な相同性又は同一性の程度は、配列の意図された使用による。機能が同等であるか又は配列の機能を改良するよう設計されているか或いは方法論的利点を提供する、変異、挿入、及び欠失の変異体を作製することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列の、反復的で、酵素による、刺激された（ｐｒｉｍｅｄ）合成である。この手順は当業者によって周知であり、一般に使用されている（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、第４，６８３，２０２号明細書、及び第４，８００，１５９号明細書、Ｓａｉｋｉら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０〜１３５４ページ参照）。試薬、装置及び説明書は市販されている。好熱菌サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＴａｑポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、増幅プロセスを完全に自動化することができる。使用することができる他の酵素は当業者に公知である。
【０１０５】
元々の全長配列の、得られた断片及び／又は変異体のいくらかが全長配列の所望の特徴を保持できるように、本発明のポリヌクレオチド配列を切断及び変異させることができることは、当技術分野で周知である。より大きな核酸分子から断片を生じるのに適している多種多様な制限酵素が周知である。また、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼをＤＮＡの時間制御された限定消化に簡便に使用することができることは周知である。例えば、参照によって本明細書中に援用されるＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１３５〜１３９ページを参照のこと。Ｗｅｉら（１９８３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１３００６〜１３５１２ページも参照のこと。Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼ（一般に「塩基を消す」手順と呼ばれる）の使用によって、当業者は、対象核酸のいずれか又は両方の末端からヌクレオチドを除去して、対象ヌクレオチド配列と機能的に同等な、広範な断片を生じることができる。当業者は、この様式で、元々の分子の全ての位置から、制御された様々な長さの、何百もの断片を生じることができる。当業者は、生じた断片を、それらの特徴について通法によって試験又はスクリーニングし、本明細書中に教示されているような断片の有用性を判定することができる。全長配列の変異配列、又はその断片を部位特異的変異誘発で容易に生成することができることもまた、周知である。例えば、ともに参照によって本明細書中に援用される、Ｌａｒｉｏｎｏｖ，Ｏ．Ａ．及びＮｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｖ．Ｇ．（１９８２年）Ｇｅｎｅｔｉｋａ  １８（３）：３４９〜５９ページ、Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ、ＤｉＭａｉｏ，Ｄ．及びＮａｔｈａｎｓ，Ｄ．（１９８１年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２６５〜９４ページを参照のこと。当業者は通法によって、欠失、挿入、又は置換型の変異を生じさせること、並びに全長野生型配列又はその断片の所望の特徴を含む変異体を生じるもの、すなわち、投与されるヒト若しくは動物においてそれに対するコロニー形成及び／若しくは感染を阻害する抗体が産生される本発明の線毛タンパク質若しくはその断片を発現するものを同定することができる。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸のパーセント配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７ページのように改変されたＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８ページのアルゴリズムを用いて判定される。かかるアルゴリズムを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０２〜４１０ページのＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、単語長＝１２で行って、所望のパーセント配列同一性を有するヌクレオチド配列を得る。比較目的のためのギャップトアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２ページに記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用する。例えば、インターネット上のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを参照のこと。
【０１０７】
Ｃ．ジェジュニ線毛タンパク質に特異的に結合する、モノクローナル又はポリクローナル抗体、単鎖抗体、ヒト若しくはヒト化単鎖抗体又はヒト若しくはヒト化抗体の抗原結合断片は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｇｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照のこと。
【０１０８】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製のため、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を伴う酵素反応のための標準的な技術、並びに種々の分離技術は、当業者によって公知で一般に採用されているものである。多数の標準的な技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州プレーンビュー、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州プレーンビュー、Ｗｕ（編）（１９９３年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８、第Ｉ部、Ｗｕ（編）（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８、Ｗｕら（編）（１９８３年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００及び１０１、Ｇｒｏｓｓｍａｎ及びＭｏｌｄａｖｅ（編）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５、Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｏｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ、バークレー、Ｓｃｈｌｅｉｆ及びＷｅｎｓｉｎｋ（１９８２年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５年）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第Ｉ巻及び第ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、英国オックスフォード、Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、英国オックスフォード、並びにＳｅｔｌｏｗ及びＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９年）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１巻〜第４巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークに記載されている。略語及び命名法は、採用されている場合、当該分野で標準的で本明細書中に引用されるもの等の専門雑誌中で一般に使用されていると見なされる。
【０１０９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに理解することができる。これらの実施例は例示目的のために提供され、本明細書中で請求されているような発明の範囲を限定するよう意図されない。当業者の思い当たる、例示された項目のいかなる変化も、本発明の範囲内に含まれるよう意図される。
【０１１０】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、本開示と不一致がない程度まで、参照によって本明細書中に援用される。引用される参考文献は、関連する技術における技術のレベルを反映する。
【実施例】
【０１１１】
実施例１  細菌株及び培地
全てのＣ．ジェジュニ分離株（表１）は、５％ウシ血液を補充したミュラーヒントンアガー（Ｄｉｆｃｏ）上で、３７℃、１０％ＣＯ２インキュベータ中で、維持した。
【０１１２】
実施例２  バイオフィルム形成アッセイ
バイオフィルム形成についてアッセイするＣ．ジェジュニ分離株を、ミュラーヒントンブロス（ＭＨＢ）中、３７℃及び１０％ＣＯ２で、振とうしながら０．２５のＯＤ６００まで一晩増殖させた。１ｍｌのＭＨＢ、ブルセラＡ（Ｄｉｆｃｏ）又はボルトン（Ｄｉｆｃｏ）ブロスを含む２４ウェルポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに、Ｃ．ジェジュニ分離株の一晩培養物をＯＤ６００＝０．０２５（約２．５×１０７個の細菌）まで接種した。次いで、プレートを周囲空気１０％ＣＯ２雰囲気中、２５又は３７℃で２４、４８又は７２時間インキュベートした。インキュベーションの後、培地を除去し、ウェルを５５℃で３０分間乾燥させ、１ｍｌの０．１％クリスタルバイオレット（ＣＶ）を室温で５分間添加した。非結合ＣＶを除去し、ウェルをＨ２Ｏで２回洗浄した。ウェルを５５℃で１５分間乾燥させ、結合したＣＶを８０％エタノール：２０％アセトンで脱色した。この溶液の１００μｌの分割量をウェルから除去し、９６ウェルプレートに入れ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を用いてＯＤ５７０を判定して、バイオフィルム形成を判定した。
【０１１３】
バイオフィルム形成に対する浸透圧調節物質の効果を判定するために、バイオフィルムアッセイの前にＭＨＢに化合物を添加した。分析の前に、プレートを１０％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１１４】
実施例３  非生物表面上でのＣ．ジェジュニバイオフィルム形成
アクリロニトリルブタジエンスチレンプラスチック（ＡＢＳ）、ポリ塩化ビニルプラスチック（ＰＶＣ）、ポリスチレン又は銅の、無菌の約１×４ｃｍの切り取り試片を、切り取り試片が完全に沈むように、５ｍｌのＭＨＢとともに１５ｍｌのポリプロピレンチューブに入れた。チューブにＣ．ジェジュニをＯＤ６００＝０．０２５まで接種し、１０％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした。切り取り試片を無菌で除去し、２ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３（ＰＢＳ）及び２０個の無菌の４ｍｍガラスビーズとともに無菌の１５ｍｌチューブに入れ、全速力で１分間チューブをボルテックスして細菌細胞を除去した。５％血液を補充したミュラーヒントンアガー上に希釈平板することによって生菌を数えた。
【０１１５】
実施例４  タンパク質合成の阻害
ＭＨＢ中のＣ．ジェジュニの一晩培養物を０．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＭ）で、室温で１５分間処理してから、抗生物質の非存在下でバイオフィルム形成についてアッセイした。この濃度のＣＭではタンパク質合成は阻害されたが、Ｃ．ジェジュニ細胞の生存率は損なわれなかった。ＣＭ処理したＣ．ジェジュニのバイオフィルム形成を、上述のようにアッセイした。
【０１１６】
実施例５  バイオフィルム形成に対する培養上清液の効果
グラム陰性グラム陽性細菌培養上清液を、適切な培地中での２４時間の増殖の後に収集した（表２）。５０００ｇでの遠心分離によって細胞を除去し、上清培養液を０．２２μｍフィルターによってろ過した。上清又は接種されていない培地をＭＨＢと１：１で混合した。Ｃ．ジェジュニをこれらの培地に接種し、上述のようにバイオフィルム形成をアッセイした。
【０１１７】
実施例６  Ｃ．ジェジュニｆｌａＡＢ及びｌｕｘＳ変異体の構築
鞭毛又はクオラムセンシング分子自己誘発物質２（ＡＩ２）をコードする遺伝子のＣ．ジェジュニ変異体を構築して、バイオフィルム形成におけるこれらの因子の役割を評価した。Ｃ．ジェジュニＭ１２９ｆｌａＡ及びｆｌａＢ二重変異体を以下のように構築した。ＰＣＲを用いて、プライマー５’ＣＴＴＴＧＧＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣ  ３’（配列番号３）及び５’ＡＡＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡ  ３’（配列番号４）でＣ．ジェジュニＭ１２９ゲノムＤＮＡ由来のｆｌａＡの５’末端を含む０．９ｋｂの断片を増幅し、プライマー５’ＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＧＴＴＣＧＧＴＧ  ３’（配列番号５）及び５’ＴＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧＧ  ３’（配列番号６）でｆｌａＢの３’末端を含む０．９ｋｂの断片を増幅した。得られた生成物を、それぞれＸｈｏＩ  ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ  ＢａｍＨＩで消化した（プライマー配列中で制限酵素部位に下線を引く）。断片が耐性遺伝子を挟み、同じ方向に配向するように、ｐＢＣ  ＫＳのＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングされたカンピロバクター・コリａｐｈＡ３カナマイシン耐性遺伝子を含むベクターｐＳＪＢ２１中に２つの断片を連続的にクローニングした。この対立遺伝子交換プラスミドをエレクトロポレーションによってＣ．ジェジュニ株Ｍ１２９に導入し、５％血液及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したミュラーヒントンアガー上で推定上の変異体を選択した。対立遺伝子置換をＰＣＲ及びサザンブロットによって確認した。ｆｌａＡ及びｆｌａＢはＣ．ジェジュニ中で隣接しているので、得られたｆｌａＡＢ変異体は、両方の遺伝子を破壊して、ｆｌａＡの５’末端及びｆｌａＢの３’末端のみを含んでいた。
【０１１８】
プライマー５’ＣＴＴＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＴＣＧＴＡＴＣ  ３’（配列番号７）及び５’ＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣ  ３’（配列番号８）で増幅された、Ｃ．ジェジュニＭ１２９ｌｕｘＳ遺伝子の５’末端、並びにプライマー５’ＧＡＡＣＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＣ  ３’（配列番号９）及び５’ＡＴＣＴＴＴＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＣＣＴＴＧＡＧ  ３’（配列番号１０）で増幅された、ｌｕｘＳの３’末端に由来するＰＣＲ産物を、ｐＳＪＢ２１にクローニングすることによって、同様にＣ．ジェジュニｌｕｘＳ変異体を構築した。次いで、得られたプラスミドを、上述のように対立遺伝子交換に用いた。
【０１１９】
実施例７  走査型及び透過型電子顕微鏡法
ミュラーヒントンブロス（ＭＨＢ、Ｄｉｆｃｏ）中、３７℃及び１０％ＣＯ２で、振とうしながら０．２５の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）まで、Ｃ．ジェジュニ分離株を一晩増殖させた。無菌のポリカーボネート膜及び３ｍｌのＭＨＢを含む３５ｍｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、ＯＤ６００＝０．０２５（約２．５×１０７ＣＦＵ）までＣ．ジェジュニ分離株の一晩培養物を接種した。プレートを１０％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｃ．ジェジュニバイオフィルムを含むポリカーボネート膜を無菌で除去し、固定のために、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒド１％グルタルアルデヒドに入れた。固定後の膜を、脱イオンＨ２Ｏ中の１％四酸化オスミウムを含む溶液に入れた。次いで、膜を、ＥｔＯＨ勾配１×８０％５分間、２×９５％５分間、２×１００％５分間によって処理し、臨界点乾燥し、金でスパッタコートし、マウントし、走査型電子顕微鏡法によって観察した。バイオフィルムはまた、透過型電子顕微鏡法によっても観察した。培養物を上述のように増殖させた。２４ウェルプレートを１０％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、１０μｌのＣ．ジェジュニバイオフィルムを、Ｆｏｒｍｖａｒコートされた４００メッシュ銅格子上に１分間ピペッティングした。Ｗｈａｔｍａｎろ紙を用いて液体を吸収し、２回すすいだ。すすいだ後、格子を、１％リンタングステン酸を用いてネガティブ染色した。種々の有益な倍率で画像を作成して、糸状構造の詳細を解明した。
【０１２０】
実施例８  線毛採取
ＮＣＴＣ株１１１６８を、バイオフィルム形成条件下で７２時間、２２５ｃｍ細胞培養フラスコ中で増殖させる。成熟したバイオフィルムを採取し、貯蔵し、遠心分離（３０，０００ｘｇ３０分間）によって培地を除去する。ペレット化したバイオフィルムをエタノールアミン（０．４Ｍ、ｐＨ９．０）中に再懸濁し、機械的せん断によって細胞から線毛を除去する。次いで試料を遠心分離（２，５００Ｘｇ、６０分間）し、可溶化した線毛を含む上清を収集する。硫酸アンモニウムを４５％飽和まで上清に添加し、溶液を４℃で一晩インキュベートして線毛を沈殿させる。遠心分離（３０，０００Ｘｇ、３０分間）によって線毛を収集し、再蒸留Ｈ２Ｏ中に再懸濁させる。次いで、ＴＥＭを用いて粗試料を観察して、粗調製物中の繊維の存在を保証する。
【０１２１】
実施例９  バイオフィルム生成
１ｍｌのミュラー−ヒントンブロスに．０５のＯＤ６００までＣ．ジェジュニの一晩ブロス培養物を接種する。培養物は、バイオフィルム形成条件下（３７℃、５％ＣＯ２）でインキュベートされたＴＰＩＧＤＰＶＬ  ｎである。２４、４８及び７２時間の時点で、吸引によってブロスを除去し、無菌ＰＢＳでバイオフィルムを２回すすいで、非接着性細胞及び破片を除去する。次いで、得られたバイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色し、４０５ｎｍ波長でプレートリーダーを用いて、生成されたバイオフィルムの量を測定する。
【０１２２】
実施例１０  組換え線毛タンパク質発現及び生成
シグナル３Ｐソフトウエアを用いてｃｊ１５３４ｃ遺伝子の検索を行って、遺伝子中の任意のシグナル配列の存在を判定したが、同定されたものはなかった。理論に拘束されることを望むことなく、本発明者らは、本発明の線毛タンパク質遺伝子がＩＩＩ型分泌タンパク質であると考えている。
【０１２３】
大腸菌において標準的な技術を用いて、遺伝子ＣＪ１５３４ｃのコード領域全体を発現ベクターｐＴＲＣ−ＨＩＳ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）中にクローニングした。Ｃ．ジェジュニ線毛タンパク質遺伝子のＰＣＲ増幅のために、特異的プライマーを設計した。フォワードプライマー、ｃｊ１５３４Ｆ１、ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＴＣＡＧＴＴＡＣ（配列番号１１）及びリバースプライマー、ｃｊ１５３４Ｒ２、ＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号１２）。この戦略によって、コード配列の上流のＢａｍＨ１部位及びコード配列の下流のＥｃｏＲ１認識部位を導入した。制限切断部位は、ＰＣＲ産物が発現プラスミドｐＴＲＣ−ＨＩＳ  Ｂ中の適切なリーディングフレーム中にクローニングされるよう配置した。カスタムプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を配列決定して、正しい遺伝子が増幅されていることを保証した。次いで、ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１を用いて、ＰＣＲ産物及び精製されたｐＴＲＣ−ＨＩＳ  Ｂベクターを消化した。得られた消化を浄化及び脱塩し、次いで合わせてライゲートした。一旦ライゲートすると、ｃｊ１５３４ｃを含むベクターを脱塩し、大腸菌ＤＨ５α中にエレクトロポレーションした。プラスミドを含むコロニーを選択し、配列決定を行って、適切なプラスミド構築を保証した。
【０１２４】
次いで、得られたプラスミド構築物を配列決定して、遺伝子の適切な挿入を保証した。適切な構築物の確認の際に、１ＬのＬＢブロスに、．０５のＯＤ６００まで、発現プラスミドを含む大腸菌を接種し、．８のＯＤに達するまでインキュベート（３７℃、１５０ＲＰＭ）した。２５０ｎＭの終濃度までＩＰＴＧを添加し、さらに３時間インキュベーションを継続した。次いで、遠心分離によって細胞を収集し、製造業者の使用説明書の通りにＴＡＬＯＮ（登録商標）アフィニティー精製（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）を用いて、組換えタンパク質を収集した。次いで、タンパク質濃縮装置（Ａｍｉｎｃｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ダンバース）を用いて、収集されたタンパク質を濃縮し、試料を配列決定して、適切なタンパク質生成を保証する。ＢＣＡアッセイを用いて全タンパク質生成を判定し、収集された試料全てを、無菌ＰＢＳ又は再蒸留Ｈ２Ｏで１ｍｇ／ｍｌの終濃度まで調節する。
【０１２５】
実施例１１  ワクチンプロトコール
市販のブロイラーヒヨコを商業用の孵化場から購入する。到着の際に、クロシールスワブを行って、鳥がＣ．ジェジュニを含まないことを保証し、鳥を実験のために必要な群に分ける。食物及び水は随意に入手可能である。孵化の１４日後に、ヒヨコに１回目のワクチンを施し、有害な副作用についてモニタリングする。最初のワクチン接種の１０日後に、鳥にブースターワクチン接種を施し、再び副作用について観察する。ブースターワクチン接種の１０日後に、ヒヨコにおよそ５×１０４ＣＦＵのＣ．ジェジュニを経口経管栄養によって負荷する。負荷の５日後に、陽性対照をスワブして、Ｃ．ジェジュニが流されていることを保証し、生細胞数を判定した。負荷の１０日後に、鳥を人道的に屠殺し、盲腸を収集し、盲腸の内容物を除去し、段階希釈し、播種して、コロニー形成のレベルを数える。また、盲腸及び腸を全体的に調べて、非特異的病変形成が生じていないことを保証する。
【０１２６】
実施例１２  リポソーム生成
市販のリポソーム調製物を購入し（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、製造業者の仕様書に従って使用する。リポソーム生成のために、５ｍｇ／ｍｌの濃度で組換えタンパク質を使用する。リポソーム形成の完了の際に、体積を鳥１羽あたり１ｍｌまで増大させ、経口経管栄養によって投与する。線毛タンパク質の用量は、約０．０１０〜約０．５００ｍｇ、望ましくは約０．２５０ｍｇ／鳥である。
【０１２７】
実施例１３  ＣＴアジュバント
市販のコレラ毒素アジュバントを購入し（Ｓｉｇｍａ）、．０３３μｇ毒素／鳥の最終量まで、組換えタンパク質で希釈する。次いで、これを１ｍｌの終体積まで希釈し、経口経管栄養によって投与する。
【０１２８】
実施例１４  ニワトリのコロニー形成は、非線毛化株によるよりも線毛化Ｃ．ジェジュニによる方がより大きい。
Ｃ．ジェジュニ株ＮＣＴＣ１１１６８の線毛タンパク質ノックアウト変異体を作製した。この変異体は、電子顕微鏡法によって判定すると、Ｃ．ジェジュニ細胞表面上での線毛の発現の欠乏を生じる。本発明の線毛タンパク質遺伝子は線毛タンパク質の発現に必要であり、これは１８ｋＤである。配列番号２及び表４中にアミノ酸配列を提供する。
【０１２９】
非線毛化変異体株を２週齢のヒヨコに導入し、並行した実験において、野生型ＮＣＴＣ１１１６８を他の２週齢のヒヨコに導入した。非線毛化変異体株を施されたヒヨコにおいて、全体的減少（少なくとも１０００倍）が観察された。野生型株が導入された全てのヒヨコはコロニー形成された（１４／１４）。非線毛化変異体を負荷されたヒヨコについては、５／１４のみがコロニー形成された。このことから、Ｃｊ１５３４遺伝子（コード配列、配列番号１）の変異によって、変異体がヒヨコにコロニー形成する能力が減少することが示される。このタンパク質を含む免疫原性組成物は、Ｃ．ジェジュニによるヒト及び動物のコロニー形成及び／又は感染を減少させるのに有効である。農業用の動物の減少したコロニー形成は、食品の微生物的品質を向上させ、Ｃ．ジェジュニでの環境汚染を減少させるであろう。かかる免疫原性組成物が投与されたヒトは、Ｃ．ジェジュニによって引き起こされた疾患の、減少した発生率及び／又は重症度を有するであろう。
【０１３０】
実施例１５  抗体判定のためのＥｌｉｓａ
９６ウェルマイクロタイタープレートを、適切な抗原（組換え又は天然のタンパク質のいずれか）で一晩コートする。非接着性の抗原をプレートから洗い流し、ワクチン接種された動物由来の一次抗体を１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で段階希釈（２倍）し、マイクロタイタープレートに添加する。一晩インキュベートした後、非接着性の一次抗体をプレートから洗い流し、１％ＦＢＳで１：４００に希釈した二次抗体を添加する。二次抗体は市販されており（ＫＰＬ）、種々の動物種（ニワトリを含む）から産生された抗体を認識し、酵素と結合している。４時間のインキュベーションの後、プレートを洗い流し、発色基質を各ウェルに添加する。目的の抗体がウェル中で抗原コーティングに結合している場合、二次抗体に連結された酵素は基質を切断し、発色を生じ、これは存在する抗体のレベルに比例し、目的の結合している抗体の定量を可能にするか、又は、このシステムは定量アッセイにおいて機能することができる。
【０１３１】
組換え線毛タンパク質に応答して生じる抗血清は、組換え線毛タンパク質並びに天然のＣ．ジェジュニ線毛を認識した。組換え線毛タンパク質を皮下でワクチン接種されたヒヨコから調製された血清を分析すると、組換え及びバイオフィルム線毛タンパク質抗原の両方と反応することが見出された。組換え線毛タンパク質を含むリポソームをワクチン接種されたヒヨコ由来の便物質由来の抗体（ＩｇＡ）は、組換え線毛と反応した（ワクチン接種されていないヒヨコの反応より３倍増大）。
【０１３２】
実施例１６  差次的遺伝子発現
プレート上で発現されたＣ．ジェジュニ遺伝子のものに対してヒヨコモデル及び２４時間のバイオフィルムにおいて異なった形で発現されるＣ．ジェジュニ遺伝子を同定し、上方制御された遺伝子について比較を行った。２羽の１５日齢ブロイラーニワトリに１０７個のＣ．ジェジュニを経口接種によって感染させ、Ｃ．ジェジュニＲＮＡの抽出のために、感染の１０日後に盲腸内容物を収集した。ミュラーヒントンブロスに、Ｃ．ジェジュニを接種し、２４時間のバイオフィルムからＲＮＡを抽出した。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られたＲＮＡ及びプレート増殖させた細胞から抽出されたＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成及び標識化に供した。Ｃｏｍｂｉｍａｔｒｉｘ  ＤＮＡマイクロアレイスライドでハイブリダイゼーション実験を行った。データ抽出のためにＣｏｍｂｉｍａｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｉｍａｇｅｒを利用し、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウエアを用いて、識別的発現についてデータを分析した。
【０１３３】
各動物モデルについてのハイブリダイゼーションのために、２枚のスライドを用い、各スライドは１アレイあたり６，０００個の独自のプローブ（２つ組）〜合計１２，０００個のプローブからなった。主なデータ又は対照データのいずれかを表す色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５）をスライド間で切り替えた。中央値データ（対平均データ）を利用して、異常値に対する感度を最小限にした。データの正規化の後に、ｃｊ１５３４遺伝子に特異的な、スライド１枚あたり４つの独自のプローブ（合計８つのプローブについて）が、ヒヨコモデルにおいて平均７．０倍（２．１〜１６．４の範囲）及び２４時間のバイオフィルムにおいて平均１．８倍（１．３〜２．２の範囲）過剰発現した。このデータは、ｃｊ１５３４遺伝子がトリ宿主のコロニー形成に関与していることを支持する。
【０１３４】
実施例１７  抗体判定のためのＥｌｉｓａ
９６ウェルマイクロタイタープレートを、適切な抗原（組換え又は天然のタンパク質のいずれか）で一晩コートする。非接着性の抗原をプレートから洗い流し、ワクチン接種された動物由来の一次抗体を１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で段階希釈（２倍）し、マイクロタイタープレートに添加する。一晩インキュベートした後、非接着性の一次抗体をプレートから洗い流し、１％ＦＢＳで１：４００に希釈した二次抗体を添加する。二次抗体は市販されており（ＫＰＬ）、種々の動物種（ニワトリを含む）から産生された抗体を認識し、酵素と結合している。４時間のインキュベーションの後、プレートを洗い流し、発色基質を各ウェルに添加する。目的の抗体がウェル中で抗原コーティングに結合している場合、二次抗体に連結された酵素は基質を切断し、発色を生じ、これは存在する抗体のレベルに比例し、目的の結合している抗体の定量を可能にするか、又は、このシステムは定性的なアッセイにおいて機能することができる。
【０１３５】
組換え線毛タンパク質に応答して生じる抗血清は、組換え線毛タンパク質並びに天然のＣ．ジェジュニ線毛を認識した。組換え線毛タンパク質を皮下でワクチン接種されたヒヨコから調製された血清を分析すると、組換え及びバイオフィルム線毛タンパク質抗原の両方と反応することが見出された。高用量のＣ．ジェジュニ（約１０５個）を負荷された、ワクチン接種されたヒヨコは、対照ヒヨコよりも平均２５％少ない、コロニー形成した細菌を有した。特に、ワクチン接種されたヒヨコのサブセットは、１〜４桁まで少ない、コロニー形成したＣ．ジェジュニを有したが、ワクチン接種されたヒヨコの何羽かは、対照のものと同様の数を有した。理論に拘束されることを望むことなく、負荷用量が、天然の感染の結果を適切に予測するのには高すぎたと考えられる。
【０１３６】
組換え線毛タンパク質を含むリポソームをワクチン接種されたヒヨコ由来の便物質由来の抗体（ＩｇＡ）は、組換え線毛と反応した（ワクチン接種されていないヒヨコの反応より３倍増大）。
【０１３７】
本明細書中の記載はある特定の情報及び実施例を含むが、これらは本発明の範囲を限定するものとしてではなく、単に本発明の現在好ましい実施形態のいくつかの例示を提供するものとして解釈されるべきである。例えば、したがって、本発明の範囲は、示された実施例によってではなく、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物によって決定されるべきである。
【０１３８】
【表１】
2009542257.tif 000002
【０１３９】
【表２】
2009542257.tif 000003
【０１４０】
【表３】
2009542257.tif 000004
【０１４１】
【表４】
2009542257.tif 000005
【０１４２】
【表５】
2009542257.tif 000006
【０１４３】
【表６】
2009542257.tif 000007
【０１４４】
文献目録
１．  Ａｙｄｉｎ，  Ｆ．，  Ｈ．  Ｉ．  Ａｔａｂａｙ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ａｋａｎ．  ２００１．  Ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｊｅｊｕｎｉ  ｆｒｏｍ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｇｅｅｓｅ  （Ａｎｓｅｒ  ａｎｓｅｒ）．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９０：６３７−６４２．
２．  Ｂａｋｅｒ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｄ．  Ｂａｒｔｏｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｌａｎｓｅｒ．  １９９９．  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｔｓ  ａｎｄ  ｄｏｇｓ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ．  Ａｕｓｔ．  Ｖｅｔ．  Ｊ．  ７７：６６２−６６６．
３．  Ｂｅｎｄｉｎｇｅｒ，  Ｂ．，  Ｈ．  Ｈ．  Ｒｉｊｎａａｒｔｓ，  Ｋ．  Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｚｅｈｎｄｅｒ．  １９９３．  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈａｉｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５９：３９７３−３９７７．
４．  Ｂｌａｓｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｉ．  Ｄ．  Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，  Ｆ．  Ｍ．  ＬａＦｏｒｃｅ．  Ｊ．  Ｃｒａｖｅｎｓ，  Ｌ．  Ｂ．  Ｒｅｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｌ．  Ｗａｎｇ．  １９７９．  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  ９１：１７９−８５．
５．  Ｂｌａｓｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｅ．  Ｓａｚｉｅ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｐ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｊｒ．  １９８７．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｒａｗ  ｍｉｌｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  ＪＡＭＡ  ２５７：４３−４６．
６．  Ｂｏｋｋｅｎｈｅｕｓｅｒ，  Ｖ．  Ｄ．，  Ｎ．  Ｊ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｂｒｙｎｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｒｏｕｘ，  Ａ．  Ｂ．  Ｓｃｈｕｔｔｅ，  Ｈ．  Ｊ．  Ｋｏｏｒｎｈｏｆ，  Ｉ．  Ｆｒｅｉｍａｎ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｈａｒｔｍａｎ．  １９７９．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９：２２７−２３２．
７．  Ｂｏｕｃｈｅｒ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｅ．  Ｒ．  Ｓｌａｔｅｒ，  Ａ．  Ｈ．  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｒ．  Ａｄａｍｓ．  １９９４．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｃｃｏｉｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ７７：３０３−３０７．
８．  Ｂｕｓｗｅｌｌ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｙ．  Ｍ．  Ｈｅｒｌｉｈｙ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｊ．  Ｔ．  ＭｃＧｕｉｇｇａｎ，  Ｐ．  Ｄ．  Ｍａｒｓｈ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｋｅｅｖｉｌ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ａ．  Ｌｅａｃｈ．  １９９８．  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．  ｉｎ  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ａｑｕａｔｉｃ  ｂｌｏｆｉｌｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  −ｒＲＮＡ  ｓｔａｉｎｉｎｇ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４：７３３−７４１．
９．  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｚ．  Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｋｏｒｂｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｍ．  Ｌａｐｐｉｎ−Ｓｃｏｔｔ．  １９９５．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４９  ：７１１−７４５．
１０．  Ｄｏｎｌａｎ，  Ｒ．  Ｍ．  ２００２．  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｆｅ  ｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ８：８８１−９０．
１１．  Ｅｌｖｅｒｓ，  Ｋ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｆ．  Ｐａｒｋ．  ２００２．  Ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｕｘＳ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：１４７５−１４８１．
１２．  Ｆｅｒｒｅｒｏ，  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｌｅｅ．  １９８８．  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｉｎ  ａ  ｖｉｓｃｏｕｓ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｒｏｄ−ｓｈａｐｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３４：５３−５９．
１３．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｍ．  １９８８．  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｔｏ  ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７０：２０２７−２０３０．
１４．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇ．  Ｉ．  Ｌｏｅｂ．  １９７９．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：６７−７２．
１５．  Ｌｅｕｎｇ，  Ｆ．  Ｙ．，  Ｇ．  Ｏ．  Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒ．  １９８０．  Ｒｅｉｔｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２３：９４８−５０．
１６．  Ｍａｎｎｉｎｅｎ，  Ｋ．  Ｉ．，  Ｊ．  Ｆ．  Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，  ａｎｄ  Ｉ．  Ｒ．  Ｄｏｈｏｏ．  １９８２．  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３８：４６−５２．
１７．  Ｍｅａｄ，  Ｐ．  Ｓ．，  Ｌ．  Ｓｌｕｔｓｋｅｒ，  Ｖ．  Ｄｉｅｔｚ，  Ｌ．  Ｆ．  ＭｃＣａｉｇ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｂｒｅｓｅｅ，  Ｃ．  Ｓｈａｐｉｒｏ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖ．  Ｔａｕｘｅ．  １９９９．  Ｆｏｏｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｌｉｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ５：６０７−６２５．
１８．  Ｎａｃｈａｍｋｉｎ，  Ｉ．，  Ｂ．  Ｍ．  Ａｌｌｏｓ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｈｏ．  １９９８．  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  １１：５５５−５６７．
１９．  Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，  Ｇ．，  Ｈ．  Ｂ．  Ｋａｐｌａｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｋｏｌｔｅｒ．  ２０００．  Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４：４９−７９．
２０．  Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，  Ｇ．  Ａ．，  Ｋ  Ａ．  Ｇｉｂｂｓ，  Ｐ．  Ｗ．  Ｈａｇｅｒ，  Ｐ．  Ｖ．  Ｐｈｉｂｂｓ  Ｊｒ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｋｏｌｔｅｒ．  ２０００．  Ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｃｒｃ  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｂｌｏｆｉｌｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２：４２５−４３１．
２１．  Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，  Ｇ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｋｏｌｔｅｒ．  １９９８．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＷＣＳ３６５  ｐｒｏｃｅｅｄｓ  ｖｉａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ，  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ：  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２８：４４９−４６１．
２２．  Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，  Ｇ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｋｏｌｔｅｒ．  １９９８．  Ｆｉａｇｅｌｌａｒ  ａｎｄ  ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：２９５−３０４．
２３．  Ｐｅａｄ，  Ｐ．  Ｊ．  １９７９．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２：３８３−３８５．
２４．  Ｐｒｉｎｇｌｅ，  Ｊ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ．  １９８３．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  Ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｏ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４５：８１１−８１７．
２５．  Ｐｒｉｎｇｌｅ，  Ｊ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ．  １９８６．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５１：１３２１−１３２５．
２６．  Ｒｅｅｚａｌ，  Ａ．，  Ｂ．  ＭｃＮｅｉｌ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ．  １９９８．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｅｄｉａ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：４６４３−４６４９．
２７．  Ｒｉｊｎａａｒｔｓ，  Ｈ．  Ｈ．，  Ｗ．  Ｎｏｒｄｅ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｂｏｕｗｅｒ，  Ｊ．  Ｌｙｋｌｅｍａ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｚｅｈｎｄｅｒ．  １９９３．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  Ｓｔａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９：３２５５−３２６５．
２８．  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｅ．  Ａ  Ｂａｙｅｒ，  Ｊ．  Ｄｅｌａｒｅａ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ．  １９８２．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｈｉｎ  Ｆｉｍｂｒｉａｅ  ｉｎ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＲＡＧ−１  ｏｎ  Ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４４：９２９−９３７．
２９．  Ｘｉｅ，  Ｈ．，  Ｇ．  Ｓ．  Ｃｏｏｋ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，  Ｇ．  Ｂｒｕｃｅ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｒｏｓｅ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｌａｍｏｎｔ  ２０００．  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｐｌａｑｕｅ  ｂｉｏｆｌｉｍｓ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２：７０６７−７０６９．
３０．  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｈ．  Ｋ．  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ．  ２００２．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  Ｇｅｎｅｓ  Ａｒｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ６８：６２８３−６２９１．
３１．  Ｚｉｍｍｅｒ，  Ｍ．，  Ｈ．  Ｂａｒｎｈａｒｔ，  Ｕ．  Ｉｄｒｉｓ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｄ．  Ｌｅｅ．  ２００３．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｗａｔｅｒ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｈｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ．  Ａｖｉａｎ．  Ｄｉｓ．  ４７：１０１−１０７．
３２．  Ｆｌｅｍｍｉｎｇ，  Ｈ．Ｃ．，  Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｇｒｉｅｇｂｅ，  Ｃ．，  Ｍａｙｅｒ．  Ｐｈｙｓｉｃｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ．  Ｉｎ：  Ｅｖａｎｓ  ＬＶ，  ｅｄｉｔｏｒ．  Ｂｌｏｆｉｌｍｓ：  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；  ２０００；ｐ．１９−３４．
３３．  Ｂｕｌｌｉｔｔ，  Ｒ．，  Ｌ，  Ｍａｋｏｗｓｋｉ．  １９９５．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７３：  １６４−１６７．
３４．  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｐ．  Ｌ．  １９９３．  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７：  １５２  １５５．
３５．  Ｄａｙ．  Ｗ．Ａ．，  Ｊｒ．，  Ｊ．Ｌ  Ｓａｊｅｃｋｉ，  Ｔ．Ｍ．  Ｐｉｔｔｓ，  ＬＡ．  Ｊｏｅｎｓ．  ２０００．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃａｔａｌａｓｅ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６８：  ６３３７−６３４５．
【図１Ａ】
2009542257.tif 000008
【図１Ｂ】
2009542257.tif 000009
【図２Ａ】
2009542257.tif 000010
【図２Ｂ】
2009542257.tif 000011
【図３】
2009542257.tif 000012
【図４】
2009542257.tif 000013
【図５Ａ】
2009542257.tif 000014
【図５Ｂ】
2009542257.tif 000015
【図５Ｃ】
2009542257.tif 000016
【図６】
2009542257.tif 000017
【図７】
2009542257.tif 000018
【配列表】
2009542257000001.app
【国際調査報告】
2009542257.tif 000019
2009542257.tif 000020