(57)【要約】  本発明は、メタロ‐β‐ラクタマーゼの標的翻訳後修飾に関するものであり、切断とジペプチドの挿入をアミノ鎖末端に行うことで、組み換えＤＮＡ産生系において産生される異型ＤＮＡを減少させる。すなわち、Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ蛋白質を発現させ、宿主プロテアーゼによってＥ‐ΔＢＬ修飾体を得る。適切なヌクレオチド分子、ベクター、宿主についても詳述する。Ｅ‐ΔＢＬは、薬剤成分として利用でき、β‐ラクタム系抗生物質を用いて治療が行われている患者の、腸の有害作用を低減することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質において、式中、
Ｋはリジンであり、
Ｔはスレオニンであり、
Ｅはグルタミン酸であり、
ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項２に記載のヌクレオチド分子において、配列番号２の９４〜７５６のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項２に記載のヌクレオチド分子を有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のヌクレオチド分子によってコードされているメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質を発現可能な宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞において、前記メタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質を分泌する宿主細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の宿主細胞において、前記宿主細胞はBacillus spp、とりわけB. licheniformisあるいはB. subtilisである宿主細胞。
【請求項８】
次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質において、式中、
Ｅはグルタミン酸であり、
ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質。
【請求項９】
請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、Ｂ１従属群に属するメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１０】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記切断されたβ‐ラクタマーゼは、Bacillus spp、とりわけB. licheniformisあるいはB. subtilisにより産生されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１１】
請求項１０に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼにおいて、前記Ｅ‐ΔＢＬは成熟メタロ‐β‐ラクタマーゼのアミノ末端の最初の１１のアミノ酸を欠失させることによって産生されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ。
【請求項１２】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記Ｅ‐ΔＢＬの配列は、配列番号３の６〜２２１のアミノ酸残基の配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１３】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記Ｅ‐ΔＢＬの配列は、配列番号１の配列を有するメタロ‐β‐ラクタマーゼの断形体、またはβ‐ラクタマーゼ活性を有する変異体またはそれらの断片であるメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１４】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記Ｅ‐ΔＢＬは、メタロ‐β‐ラクタマーゼの、アミノ酸ＫＮとアミノ酸Ｅとの間の切断によって産生されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１５】
請求項５に記載の宿主細胞を、次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼを発現可能な条件下で培養する工程（式中、Ｋはリジンであり、Ｔはスレオニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質である）と、
翻訳後修飾により、次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を生じさせる工程（式中、ＥおよびΔＢＬは上記と同様に定義される）と、
任意的に、得られた翻訳修飾後蛋白質を分離および精製する工程と、
を含むメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質の調製方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記メタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質はシグナル配列を含む型で発現され、該シグナル配列により宿主細胞から前記蛋白質を分泌する方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法において、前記蛋白質はBacillus spp、とりわけB. licheniformisあるいはB. subtilisによって産生される方法。
【請求項１８】
請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質を含む医薬成分。
【請求項１９】
請求項８に記載の、薬剤として利用されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体。
【請求項２０】
腸器官内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタムを除去する薬剤の製造用の請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質の使用。
【請求項２１】
請求項２０に記載の使用において、前記β‐ラクタム抗生物質はセファロスポリン、カルバペネム、ペニシリンからなる群より選択されると共に、セリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤の有無に拘らず除去される使用。
【請求項２２】
請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体または請求項１８に記載の医薬成分を、それらを必要とする人へ適量投薬することによって、腸器官内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタム抗生物質を処理する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
細菌感染症には様々な抗生物質が使用されている。しかし、抗生物質は病原体を攻撃するだけでなく、正常な細菌嚢にも影響を及ぼしてしまう。例えば、患者の腸に有害な副作用を引き起こしてしまう。これらの副作用は、腸内に残留している抗生物質を分解可能な酵素を投薬することで低減できる。
【０００２】
本発明は、β‐ラクタム環を有する抗生物質による有害作用の防止および処理に利用できるメタロ‐β‐ ラクタマーゼ修飾体、あるいはその酵素の調製に関するものである。本発明は、β‐ ラクタマーゼ修飾体の調製方法、およびそれらの工程で利用できるヌクレオチド分子、ベクター、宿主細胞を開示する。
【発明の背景】
【０００３】
バクテリアにおいて、β‐ラクタマーゼ酵素はβ‐ラクタム抗生物質に対して主要な耐性機構を示す。β‐ラクタム抗生物質とは、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム系などを示す。この酵素は、抗菌剤を無効化するために、β‐ラクタム環のアミド結合を不可逆的に加水分解する触媒として機能する。
【０００４】
分子構造の分類と触媒機構に基づきβ‐ラクタマーゼは、４つの分類、すなわちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに分けることができる。分類Ａ、Ｃ、Ｄは、酵素活性の中心にセリン残基を有し、β‐ラクタマーゼの大部分が属する（Ambler,1980）。上記分類に属する酵素は、全体として、ペニシリンあるいはセファロスポリンを失活させる。また、これら２つの抗生物質に対して、一方に優先性を示すこともある。
【０００５】
分類Ｂに属するβ‐ラクタマーゼは、酵素活性のための補因子として、１、２個程度の亜鉛イオンを必要とするメタロ酵素である。ブッシュ、ジャコビィ、マデイラスの機能分類によると、メタロ‐β‐ラクタマーゼは、３つの群より構成される（Bush,1998）。この分類体系は、主に、基質特性、ＥＤＴＡ感受性、セリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤耐性、に基づいている。亜鉛に配位する領域の構造的類似性に基づいて、メタロ‐β‐ラクタマーゼは３つの従属群、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３に分けられる（Galleniら,2001）。
【０００６】
従属群Ｂ１は、３つのヒスチジンと１つのシステインを活性中心である亜鉛に配位する残基として保持している。結晶構造としては、Bacillus cereusのBcII（Carfiら, 1995,1998a）、Bacteroides fragilisのCcrA（Carfiら,1998b）、Pseudomonas eruginosaのIMP-1（Conchaら,2000）に代表されるように、従属群Ｂ１に属する多数の酵素が解析されている。
【０００７】
Ｂ２ラクタマーゼは、代表的な亜鉛結合モチーフＮＸＨＸＤの第１配座において、ヒスチジン残基の換わりに、アルギニン残基を備えたものである。近年、ガラウら（2005）によって従属群Ｂ２酵素（CphA）の第１配座の結晶構造が解明された。従属群Ｂ３は、多量体の構造（Walshら,2005）を有する酵素から構成される。
【０００８】
メタロ‐β‐ラクタマーゼは、例えばペニシリン、セファロスポリンなど、広範な基質特性を示す。さらに、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタムのような従来の一般的なセリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤の作用に対して耐性を有する。さらに、メタロ‐β‐ラクタマーゼは、ほとんどのセリン‐β‐ラクタマーゼが有していない、メロペネムやイミペネムなどのカルバペネム加水分解能を有している。
【０００９】
メタロ‐β‐ラクタマーゼは、様々なバクテリアにおいて産生される。一般的には、Enterobacteriae属（例えば、Serratia marcescens、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter freudii、Shigella fiexnerfなど）、Pseudomonas aeruginosa、Stenobacterium maltophila、Acinetobacter属、Bacteroides fragilis、Bacillus cereus、Flavobacteruim odoratum、Bacteroides fragilisによって発現される（Walshら,2005）。
【００１０】
β‐ラクタマーゼは、胃腸器官内の非吸収のβ‐ラクタム抗生物質を失活させる医薬蛋白として使用される。これにより、腸内正常細菌嚢の変質、β‐ラクタム耐性菌の過成長といったβ‐ラクタムが引き起こす有害作用を防止できる（国際公開第９３／１３７９５号パンフレット、国際公開第０４／０１６２４８号パンフレット）。なお、小腸器官内で効果的なβ‐ラクタマーゼ処理を行うには、酵素は、胆汁酸存在下で腸内プロテアーゼに耐性を有するとともに、ｐＨ（５.５〜７.５）の広範囲で酵素活性を保持することが求められる。
【００１１】
犬やマウスをモデルとして、非経口的にアンピシリンを投薬する間、Bacillus licheniformisが産生するセリン‐β‐ラクタマーゼを使用することによって、標的酵素処理できることは確認されている（Harmoinenら,2004, Mentulaら,2004, Stiefelら,2003）。しかし、β‐ラクタマーゼ阻害剤の存在下でペニシリン、カルバペネム、セファロスポリンを加水分解する能力は乏しいので、この酵素の薬物としての使用は本質的に限定される。
【００１２】
したがって、様々なβ‐ラクタム抗生物質を用いて静脈内薬物治療を行っている入院患者の間で、β‐ラクタマーゼ処理の利用を広げるためには、β‐ラクタム抗生物質に広範な反応性を示すとともに、β‐ラクタマーゼ酵素に耐性を有する、新しいプロテアーゼが不可欠である。
【００１３】
メタロ‐β‐ラクタマーゼは、様々な種類のβ‐ラクタム抗生物質を失活させ、セリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤に耐性を有する。Bacillus cereus系統は、従属群Ｂ１に属するメタロ‐β‐ラクタマーゼを産生することで知られている。臨床的にBacillus cereus 98ME 1552株から単離され、準精製された遺伝子組み換えメタロ‐β‐ラクタマーゼ試料は、マウスモデルで、潜在的な病原菌の過成長を防止することが示された（Stiefelら,2005）。
【００１４】
しかし、本発明者は、このメタロ‐β‐ラクタマーゼ試料にはβ‐ラクタマーゼ変異体が含まれていて、この変異体が製造工程における医薬蛋白の収量を減少し、製造工程の次の処理単位へ移行するまでの処理工程を複雑化させ、臨床試験で一定の結果を産出することを難しくしていることに着目した。なお、当然ながら、臨床試験で一定の結果が得られないと薬事登録に負の印象を残すことになる。
【００１５】
本発明は、メタロ‐β‐ラクタマーゼの組み換え体製造に伴う、異型アミノ末端を減少させる手段を提供する。さらに、本発明は、実質的に単一の型で生成される医薬成分として製造用に利用可能な、メタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を提供する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、次の一般式で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を提供する。
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  （Ｉ）
式中、Ｋはリジン、Ｔはスレオニン、Ｅはグルタミン酸、ΔＢＬは予測されうる二次構造において、第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端を切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼである。
【００１７】
さらに本発明は、上記メタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質をコードしているヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド分子を提供する。同様に、上記ヌクレオチド分子を含む発現ベクター、および、ヌクレオチド分子によってコードされているメタロ‐β‐ラクタマーゼを発現できる宿主細胞を提供する。
【００１８】
本発明は、次の一般式で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を提供する。
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  （II）
式中、ＥおよびΔＢＬは上記と同様に定義される。
【００１９】
本発明は、メタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体の調製方法を提供する。この調製方法では、宿主細胞を、次の一般式で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼを発現可能な条件下で培養する。
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  （I）
式中、Ｋはリジン、Ｔはスレオニン、Ｅはグルタミン酸、ΔＢＬは予測されうる二次構造において、第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端を切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼである。
次に、翻訳後修飾により次の一般式で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を生じさせる。
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  （II） 
式中、ＥおよびΔＢＬは上記と同様に定義される。
そして、任意的に、得られた翻訳修飾後蛋白質を分離および精製する。
【００２０】
本発明のさらなる概要としては、式IIで表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を含む医薬成分、式IIで表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体の薬剤としての用途、腸管内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタム抗生物質を除去するために用いられる式IIで表される薬剤の製造用のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体、を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、式IIで表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体、又はその医薬成分を含有するものを、それらを必要とする人へ適量投薬することによって、腸管内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタム抗生物質の処理する方法を提供する。本発明の具体例としては、従属項により開示されている。本発明のさらなる詳細と利点は、以下の図面、発明の詳細な説明、実施例で明らかにする。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
用いられるメタロ‐β‐ラクタマーゼは、メタロ‐β‐酵素の全長をコードしている全長メタロ‐β‐ラクタマーゼの遺伝子コンストラクトを有しているBacillus subtilisの産生システムより生成される。詳細な質量分析によれば、このメタロ酵素は、アミノ鎖末端配列が異型である様々な変異体を含んでいる事が明らかになる。
【００２３】
アミノ末端配列の変異は、宿主細胞のプロテアーゼによって翻訳後修飾された結果であると解されている。メタロ酵素のアミノ酸配列に見られる変異は、Bacillus subtilisの産生システムにおいて生成される酵素の処理工程を複雑化させるとともに、このような影響が規則的に見込まれるため医薬蛋白質としての利用を低減する。
【００２４】
したがって、分子生物学的な手法によりメタロ‐β‐ラクタマーゼ酵素のアミノ鎖末端配列の変異を減少させる研究がなされてきた。
【００２５】
アミノ末端領域は、酵素の触媒特性に非必須の影響を及ぼすと予見されている。加えて、組み換え蛋白質をバクテリアの細胞の外側に分泌するようなBacillus subtilisの産生システムにおいて、アミノ末端領域は、プロテアーゼによる翻訳後修飾を受けるとみられる。
【００２６】
アミノ末端領域における微少な変異を減らすために、予見されている領域をコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲ法によって除去される。しかし、単なる欠失は、アミノ末端の異型を著しく減少させるわけではない。驚くべきことに、欠失は翻訳後修飾を介助するために生成された、ジペプチドの挿入を引き起こし、アミノ末端が一定に修飾されたメタロ‐β‐ラクタマーゼの単一の変異体を導く。
【００２７】
本発明は、全体として、医薬蛋白質として有用であるβ‐ラクタマーゼ修飾体、および組み替えβ‐ラクタマーゼ中間生成物に関する。組み換えβ‐ラクタマーゼ中間生成物は、切断およびアミノ末端にジペプチドの挿入が行われることにより産成する、これより、β‐ラクタマーゼ変異体の数を低減する。
【００２８】
上記の修飾体は、副作用を引き起こすβ‐ラクタム（クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタムのような周知のβ‐ラクタマーゼ阻害剤の存在下又は非存在下における、セファロスポリン、カルバペネム、ペニシリン）を除去するためのβ‐ラクタマーゼ処理において、薬剤基質として利用できる同型の組み換え酵素の産生を促進する。
【００２９】
特に、本発明は、Bacillus subtilisの産生システムにおいて、アミノ末端の異型を低減するために、アミノ末端領域で行われる切断とジペプチドの挿入が行われる、活性メタロ‐β‐ラクタマーゼの所定の位置で生じる、翻訳後修飾に関連する。
【００３０】
以下、メタロ‐β‐ラクタマーゼを、Ｂ群のβ‐ラクタマーゼ、すなわち少なくとも活性するために二価の金属イオン（Zn2+）を必要とするβ‐ラクタマーゼとして説明する。
【００３１】
ブッシュ、ジャコビィ、マデイラスの機能分類によると(Bush, 1998)、メタロ‐β‐ラクタマーゼは、３つの群より構成される。亜鉛に配位する領域の構造類似性に基づいて、メタロ‐β‐ラクタマーゼは、従属群Ｂ1、Ｂ２、Ｂ３に分けることができる(Galleniら, 2001)。
【００３２】
本発明における、メタロ‐β‐ラクタマーゼは、好ましくは従属群Ｂ１に属する。この従属群は、３つのヒスチジン残基と１つのシステイン残基が配意している亜鉛を活性中心として有している。なお、従属群に関する詳細は、本明細書、発明の背景に記載されている。
【００３３】
メタロ‐β‐ラクタマーゼは、αβ／βα構造の４つの類似層を有する広範な蛋白質スーパーファミリーに属する。このポリペプチド鎖は、２つのドメインに分けられ、以下の順番でそれぞれストランドおよびヘリックスを構成している。
β1 β2 β3β4 β5 α1 β6 α2 β7 α3 β8 β9 β10 β11 α4 β12 α5（Carfiら, 1995 1998a, Gallenrら, 2001）。
【００３４】
本発明のメタロ‐β‐ラクタマーゼは、第２のβストランドの直前のアミノ鎖末端を切断される。第１と第２のβストランドの間、特に上記の結晶構造では、第１と第２のβストランドの間のアミノ酸Ｅの手前が切断されると好ましい。
【００３５】
２００４年、ガラウらは、アンブラーがセリンベタラクタマーゼ(Ambler,1980)を対象に行ったβ‐ラクタマーゼの番号振り分け（ＡＢＬ）に相同する形で、分類Ｂに属するβ‐ラクタマーゼを対象に、規格となる番号振り分け表（ＢＢＬ）を発表した。
【００３６】
ＢＢＬの番号振り分け表は、元来のアミノ酸配列において、低次の同一性を有する様々なメタロ‐β‐ラクタマーゼ群内での保存領域を発見するために、Ｘ線構造解析による周知構造のアライメントより派生したものである。
【００３７】
ガラウらの研究により、第１の保存断片は、Bacillus cereus BcIIのメタロ‐β‐ラクタマーゼにおいて、第２のβ‐シートの構造を形成していることが明らかになったBacillus cereus BcIIのメタロ‐β‐ラクタマーゼに関しては、１９９５年および１９９８年ａのカーフィらの論文によって詳述されている。
【００３８】
したがって、B. cereusのメタロ‐β‐ラクタマーゼのβ1‐シートは、すべてのメタロ酵素群に含まれているわけではないので、酵素において非必須の機能を発現している。しかし、すべてのメタロ‐β‐ラクタマーゼのアミノ末端領域は、二次構造で第１のαヘリックスの手前に配置される４層のβ‐シートを形成する断片を有している。これより、メタロ‐β‐ラクタマーゼの切断部位は、元来β1が存在しているか否かに拘らず、予見される二次構造で、１つのβストランドが取り除かれ、αヘリックスの前面に４つのβストランドが配置される部位と定義されてもよい。
【００３９】
現在の慣習において、アミノ酸は１つの文字でコードされ、使用される。すなわち、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、Ｖはバリンである。アミノ酸配列は、アミノ末端を左側、カルボキシル末端を右側として表記される。なお、ＮＨ２‐および‐ＣＯＯＨは、記載してもよいし、省略してもよい。
【００４０】
本発明のある具体例によると、宿主細胞は、次の一般式（Ｉ）で表されるβ‐ラクタマーゼを発現可能な発現ベクターを用いて形質転換される。
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  （Ｉ）
式中、Ｋはリジン、Ｔはスレオニン、Ｅはグルタミン酸、ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質である。メタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質は、第２のβストランドの前のアミノ鎖末端を切断され、以下の公式IIで表される蛋白質となる。
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  （II）
上記蛋白は、一般式Ｉの蛋白質において翻訳後修飾が行われた結果形成される。一般式Ｉの蛋白質は、通常、ＥΔＢＬをコードしているＤＮＡ配列に、ＫＴをコードしているＤＮＡ配列を結合することによって産生される。ここでは、ＥΔＢＬは、Bacillus、特に、B. cereusのメタロ‐β‐ラクタマーゼであり、第２のβストランドのグルタミン酸残基Ｅの直前で切断される。特に、このヌクレオチドコンストラクトは、後述する配列番号２の９４−７５６ヌクレオチド配列を構成する。
【００４１】
強固な構造がないアミノ末端領域の長さは、メタロ‐β‐ラクタマーゼ群と各々の従属群内で変動する。
【００４２】
Bacillus sppのメタロ‐β‐ラクタマーゼもまた、第２のβストランドより前のアミノ鎖末端配列に変異を有しているが、ほとんどの酵素は+１２の位置でグルタミン酸が保存されている（表１参照）。結果的に、Ｅに隣接する位置での切断および挿入が、周知のBacillusのメタロ‐β‐ラクタマーゼでは適用される。この場合、当然、最初の１１のアミノ末端のアミノ酸が、生成する成熟メタロ‐β‐ラクタマーゼのＮ末端から削除される。
【００４３】
本発明を適用したある具体例によれば、β‐ラクタマーゼはアミノ酸ＫＴとＥの間、とりわけＶＩＫＮとＥあるいはＶＭＫＮとＥの間で切断される。
【００４４】
【表１】
2009540814.tif 000002
Bacillus spのメタロ‐β‐ラクタマーゼとP2Aの関係においてアミノ鎖配列の比較
【００４５】
本発明を適用したある具体例によれば、Ｅ−ΔＢＬは、配列番号３の６〜２２１のアミノ酸残基の配列と、少なくとも７０、８０、９０、９５、９８あるいは９９％同一性を有する。
【００４６】
配列同一性は、１９９７年アルチュールらによって開発されたＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tools）を使用して特定してもよい。
【００４７】
特に、Ｅ−ΔＢＬは、配列番号１として示されている配列や、β‐ラクタマーゼ活性型変異体や、それらの断片、を有しているメタロ‐β‐ラクタマーゼの断形体である。例えば、B. cereusのメタロ‐β‐ラクタマーゼBcIIの断形体である。なお、Ｅ−ΔＢＬは、配列番号１のアミノ酸残基１２〜１５や、１２〜１９や、１２〜２３と同じ配列を有すると共に、アミノ鎖の+１３の位置はＴ（スレオニン）またはＡ（アラニン）であると好ましい。
【００４８】
特定のアミノ酸配列で“変異”を有するアミノ酸配列とは、特定のアミノ酸配列が同一ではなく、少なくともアミノ酸の所定の変化を含んでいることを指し示す。所定の変化とは、例えば、欠失、置換、反転、挿入などであり、元のアミノ酸配列から生成される蛋白質と比べて、生体内活性に影響を及ぼさないものである。なお、この場合生体内活性とは、β‐ラクタマーゼ活性のことである。変異は、例えば、同一の系統、種、属の対立形質変異、又は突然変異などが生じた結果生成したポリペプチドの可能性もある。
【００４９】
「断片」とは、例えばβ‐ラクタマーゼ活性のような、所望の生体内活性を有するのに十分な長さを有する、あるアミノ酸配列の一部とする。換言すれば、例えば、断片は開示されている、あるβ‐ラクタマーゼの配列の一部である。
【００５０】
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨをコードしているヌクレオチドコンストラクトは、発現ベクターに導入され、宿主細胞を形質転換させてもよい。このとき、宿主細胞は、導入された蛋白質を発現可能な条件下で培養され、この蛋白質に翻訳後修飾を施し、結果ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨを生成する。これにより、実質的に純粋な型、すなわち、少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％の単一の型であるＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨのメタロ‐β‐ラクタマーゼが得られる。発現された蛋白質の翻訳後修飾とは、例えば、宿主細胞のプロテアーゼにより触媒されるジペプチドＫＴの切断である。
【００５１】
宿主としては、バクテリア、酵母、菌類の細胞といった真核生物や原核生物の細胞を使用できる。バクテリアの宿主としては、例えばEscherichia coliが用いられる。なお、Bacillus spp、特にB. licheniformisやB. subtilisを宿主とするとより好ましい。
【００５２】
ある好適な具体例としては、ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨは、シグナルペプチドを有する蛋白質として発現し、それによって、蛋白質は培地内に分泌されるとともに、シングルペプチドは初期に切断される。このとき、切断されるシグナルペプチドはジペプチドである。
【００５３】
少数の他の変化として、脱アミド、酸化、ジスルフィド結合の構造破損、異性化、スクシンイミデーション、非ジスルフィド化、クロスリンキング、メイラード反応、脱グリコシルなどがあり、生成あるいは貯蔵過程で蛋白質内に生じることがある。これらは、生体内活性に影響を及ぼさない限り許容される。
【００５４】
β‐ラクタマーゼ修飾体ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨは、メタロ‐β‐ラクタマーゼを産生することが可能なバクテリアから起こりうる。このバクテリアとしては、例えばEnterobacteriae属（Serratia marcescens、Klebsiella pneumoniae、Cifrobacter freudii、Shigella flexneri）、Pseudomonas aeruginosa、Stenobacterium maltophila、Acinetobacter属、Bacteroides fragilis、Bacillus cereus、Flavobacteruim odoratum、Bacteroides fragilis、が挙げられる。
【００５５】
上記の酵素は、第２のβストランドより前の位置で成熟酵素蛋白質のアミノ鎖末端を切断され、アミノ酸のＮ末端がＥになる。妥当なＥ残基がない場合、バクテリアからΔＢＬの部分だけ得られ、一方、トリペプチドＫＴＥはΔＢＬの前に結合し、ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ蛋白質に帰着する。
【００５６】
β‐ラクタマーゼ修飾体は、好ましくはBacillus、とりわけB. cereusから生じることが好ましい。特にB. cereusのβ‐ラクタマーゼは、非修飾の成熟β‐ラクタマーゼにおいても、最初の１１のＮ末端アミノ酸が欠失されるからである。
【００５７】
本発明のβ‐ラクタマーゼ修飾体は、医薬成分として、医薬的に許容される範囲内で賦形剤や担体と混合されてもよい。腸内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタムを処理するためにβ‐ラクタマーゼ修飾体は、１つ以上β‐ラクタム抗生物質を使用している人へ経口的に適量投薬される。β‐ラクタマーゼ製剤は、抗生物質を用いた治療の前に投薬しても、同時に投薬しても、後に投薬してもよい。これは、セリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤に非感受性であるからであり、いつでも除去できるからである。
【００５８】
本発明は以下の実施例に限定されるものではない。上記の具体例や、以下の実施例は理解を容易にするためのものであり、本発明に属する範囲内で様々な変更や修正が可能である。
【００５９】
（実施例１、物質と方法（バクテリアの系統および増殖条件））
バクテリア系統およびこれらに関連するジェノタイプ、フェノタイプを表２に示す。
【表２】
2009540814.tif 000003
バクテリア系統およびこれらに関連するジェノタイプ、フェノタイプ
【００６０】
バクテリアは、全体として、３７度でフラスコ振とうを行いながら、複合体の培地であるルリア培地にて培養された（１リットルにつき酵母菌抽出液５グラム、トリプトン１０ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ）。ルリア培地には、媒体を選択するために適切な抗生物質が添加された。適切な抗生物質が添加された合成培地は、発酵に用いられた。この改変された合成培地は、Bacillus subtilisコンピテント細胞を産生するために、使用された。これらの培地の詳細な組成は、国際公開第０３／０４０３５２号パンフレットにて詳述されている。
【００６１】
（ＤＮＡ技術）
サンブックやラッセルらによると、レストリクション、アガロースゲル電気泳動、ライゲーションなどに例示されるＤＮＡ技術が実施された。染色体ＤＮＡは、マーマー法によって分離された。プラスミドＤＮＡは、製造者からの説明によればキアゲンプラスミドメディキットによって分離された。（キアゲンプラスミド精製ハンドブック,１９９９）。ただし、ペプチドグリカン層を分解するために、リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）処理がプロトコルに加えられた。リゾチームは、緩衝剤Ｐ１に追加され、細胞は３０分間の間３７度に保温された。ＰＣＲは、全体として、国際公開第０３／０４０３５２号パンフレットにて描写されているプロトコルに基づいて実行された。
【００６２】
（メタロ‐β‐ラクタマーゼのアミノ末端領域における各々の型の評価。）
精製されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ試料は、アミノ酸配列のＮ末端の特定、質量分析による定量のために、逆層クロマトグラフィーにかけられた。これにより、この酵素は、０．１％トリフルオロ酢酸と０．０７５％トリフルオロ酢酸‐アセトニトリルに基づいて、６０分間で０％から１００％の直線的な勾配に分画された。
【００６３】
メタロ‐β‐ラクタマーゼのＮＨ２末端配列型は、アプライドバイオシステムズの４９４Ａ蛋白質配列特定装置を用い、自動操作のエドマン分解によって特定された。
【００６４】
メタロ‐β‐ラクタマーゼ型の質量分析は、四重極/飛行時間（Q-TOF）形装置によって実行された。メタロ‐β‐ラクタマーゼ変異体は、試料の相対的な比率を評価でき、比較可能なイオン化ポテンシャルを提供すると想定する。
【００６５】
β‐ラクタマーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、自動化されたＤＮＡ配列特定装置を用いて、ジデオキシ法によって特定された。
【００６６】
（実施例２：Bacillus cereus 98ME1552のメタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の全長ヌクレオチド配列）
全長メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の特定は、順次、ＰＣＲおよびベクター断片技術を用いて行われた。構造遺伝子の所定の部分は、ＰＣＲによって増幅された。ここでは、Bacillus cereus 569/Hのメタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子のSQKVEKTVIコード領域（順方向プライマー）およびHTLDLLコード領域（逆方向プライマー）でハイブリダイゼーションするようにプライマーを作成し、臨床分離株B. cereus 98ME1552から分離された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲが行われた。また、双方のプライマーは、Hind III制限酵素部位を保有している。増幅されたＤＮＡ断片は（およそ７００ｂｐ）は、Hind IIIによって制限酵素処理され、分泌ベクターpKTH141のHind III部位で結合された。ここでは、Bacillus subtilis 1H6140コンピテント細胞が、核酸連結物質配合物を用いて形質転換された。メタロ‐β‐ラクタマーゼを発現するクローンを宿しているプラスミドは、ＤＮＡシークエンシングにより確認された。このプラスミドをpRSH314と命名した。
【００６７】
国際公開第０３／０４０５２号パンフレットに記載されている通りに調製されたB. subtilis RS303コンピテント細胞を、pRSH314を用いて形質転換し、B. subtilis RS314系統とした。メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の完全長ＤＮＡ配列は次のベクター断片技術を使用することによって得られるＰＣＲ断片から特定された。
Bacillus cereus 98ME1552の染色体ＤＮＡを制限酵素Hind IIIによって制限酵素処理すると共に、Hind IIIによって制限酵素処理したベクター断片と結合させた。得られたベクター断片ライブラリーを、ＰＣＲ反応によってスクリーニングした。このＰＣＲ反応は、pRSH314の７００ｂｐより得られるＤＮＡ配列から作成された開始プライマー、MEBLSQ-F（5'-AGGAAATGTTGCGGATGC）、およびEBLSQ-R（5'-CCTTCGTTAATTTGTTATCCC）を用いた。
【００６８】
MEBLSQ-Fプライマーを用いてベクター断片ライブラリーのＰＣＲスクリーニングを行うと、およそ１０００ｂｐの断片（MEBL1断片）が生成された。また、MEBLSQ-Rプライマーを用いた場合、およそ１１００ｂｐの断片MEBLSQ-R（MEBL２断片）が生成された。MEBL1断片およびMEBL2断片は、電気泳動後のアガロースゲルより精製された。双方の断片のヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンシングによって特定され、その結果、B. cereus 98ME1552の完全長メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子が得られた。B. cereus 98ME1552のメタロラクタマーゼ遺伝子の完全長ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を図１に示す。また、このアミノ酸配列を配列番号１として記載する。このオープンリーディングフレームは２５７のアミノ酸のポリペプチドをコードしていて、ポリペプチドのアミノ末端配列（３０アミノ酸残基）は、バクテリアのシグナルペプチドとしての典型的な特色を示す。シグナルペプチドとは、所定の分泌経路経由で細胞膜を横切り、タンパク質の分泌を促す働きをする。予測されるシグナルペプチド切断部位は、−３０の位置でアラニンの後ろである（図１参照）。２２７アミノ酸残基の成熟蛋白質において、分子量と等電点の値は、それぞれ、２４８７７．３Ｄａおよび６．０と算出される。98ME1552のメタロ‐β‐ラクタマーゼ配列は、相同蛋白質を探すために、ＢＬＡＳＴ検索において探索鋳型として使用された。ＢＬＡＳＴ探索は、スイス生命情報科学研究所のＳＩＢ ＢＬＡＳＴネットワークサービス（http://www.expasy.org/tools/blast/）を用いて実行される。この検索は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ２.２.１３プログラムを使用するデータベースに基づく（Altschulら, 1997）UniProtKB Knowledgeとは異なる。すなわち、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ２.２.１３プログラムは、ギャップペナルティ１１およびギャップ伸張ペナルティ１が課せられ、BLOSUM62アルゴリズムを用いている。98ME1552のメタロ‐β‐ラクタマーゼをＢＬＡＳＴ検索すると、群Ｂの従属群Ｂ１に属する他のβ‐ラクタマーゼとの間で最も高い類似度スコアが得られた。故に、98ME1552のβ‐ラクタマーゼは、他のB. cereusのβ‐ラクタマーゼに対して高度な相同性（９０％以上）を示すと期待される。様々なS. cereusメタロ‐β‐ラクタマーゼの構造アラインメントによると、S. cereus 98ME 1552ラクタマーゼにおけるアミノ酸置換は、酵素の機能に非必須の領域内に存在すると予測される。
【００６９】
（実施例３、Bacillus subtilis内でのB. cereus 98ME 1552のメタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子のクローニングと発現）
ベクター断片ライブラリーから得られたＤＮＡ配列に基づき、完全長メタロ‐β‐ラクタマーゼをコードしているＤＮＡを挿入するために、新しいプライマーBLC1-F
（5'-CGCGAAGCTTCCGAACAAAAGCTAGAGCAAATAGTAATC）、およびBLC1-R
（5'-GCCGAAGCTTTTATTTTAATAAATCCAATGTATGTAAAAGTAATCCC）を作成した。このプライマーもまた、Hind Ill部位を末端に保有していて、B cereus 98ME1552の精製された染色体ＤＮＡが、鋳型として使われた。およそ０．７ｋｂに増幅されたＰＣＲ断片は、Hind IIIによって制限酵素処理され、pKTH141分泌ベクターのHind III部位と結合された。Bacillus subtilis RS303コンピテント細胞は、核酸連結物質配合物によって形質転換された。１つの陽性クローンはRS315と命名し、宿している発現コンストラクトをpRSH315と命名した。
【００７０】
発現コンストラクトpRSH315を分離し、その挿入範囲をシークエンシングした。メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子クローンのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列と、このベクター断片ライブラリーは一致した。特定されたＤＮＡ配列は、フレーム内の、Hind IIIクローニング部位であるBacillus amyloliquefaciensのアルファアミラーゼの３１アミノ酸長鎖シグナル配列をコードしているヌクレオチド配列と、B. cereus 98ME1552の完全長メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子間を明らかにした（図２参照）。シグナルペプチドは−１の位置のアラニン（Ａ）と+１の位置のグルタミン（Ｑ）のペプチド結合を切断すると予測される。成熟メタロ‐β‐ラクタマーゼはＮＨ２末端は、遺伝子コンストラクトの中のHind IIIクローニング部位より生じるトリペプチドにより伸張し、ＮＨ２‐ＱＡＳとなる。そのため、成熟メタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体に基づいて推定されたアミノ酸配列は２３０のアミノ酸残基となる。
【００７１】
（実施例４：Bacillus subtilisの産生システムから得られるメタロ‐β‐ラクタマーゼ変異体のアミノ末端のアミノ酸配列の特定）
更なる評価のために、組み換えメタロ‐β‐ラクタマーゼを、合成培地においてフラスコ振とうや発酵を用いて培養した。分泌されたメタロ‐β‐ラクタマーゼは、培養液の上澄みから効果的に得られた。その酵素は、濃縮された上澄み培養液をイオンクロマトグラフィーにかけることで精製された。酵素活性は２つの分画で観察された。精製された酵素の分画は、ＮＨ２末端のシークエンシングおよび質量分析がなされた。この解析により、双方の分画を構成している異型酵素の、アミノ末端の違いを明らかにされた。様々な酵素の型とそれらの相対的な比率を表３に記載する。すべての酵素型は、推定されたアミノ酸配列からみると、ＮＨ２末端領域に様々な長さの欠失を有する。全体として、オクタペプチドNH2-QASEQKLEが、すべての酵素で欠失されるように思われる。分画２の短い方の酵素では、上記に加えてペンタペプチドIVIKNを欠失している。ＮＨ２末端領域でみられるわずかな変異は、様々な宿主プロテアーゼが作用する翻訳後修飾によって説明される。
【００７２】
【表３】
2009540814.tif 000004
推定されたアミノ末端配列、解析されたアミノ酸配列、および断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ体の解析された質量
【００７３】
（実施例５、Bacillus subtilisの産生システムにおける、Bacillus cereus 98ME1552のメタロ‐β‐ラクタマーゼの欠失型の構造およびそのアミノ鎖末端変異）
ＮＨ２末端の異型を減らすために、メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の可変領域NH2-EQKLEQIVIKNをコードしているＤＮＡ配列はＰＣＲによって欠失された。ＰＣＲでは、次にストップコドンＴＡＡが続く、ETGTISISQをコードする配列とハイブリダイゼーションする順方向プライマー、およびGLLLHTLDLLKをコードする配列とハイブリダイゼーションする逆方向プライマーが用いられた。また、B. cereus 98ME1552の全長メタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子が、鋳型として使用された。なお、双方のプライマーはHind III部位を保有する。
【００７４】
得られたおよそ０．７ｋｂのＰＣＲ断片は、pKTH141分泌ベクターのHind III部位でクローニングされ、B. subtilis RS303コンピテント系統を用いて核酸連結物質配合物によって形質転換された。ＮＨ２末端の欠失は、陽性クローンから分離される発現コンストラクトの挿入されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ遺伝子をＤＮＡシークエンシングすることで確認された。この形質転換体系統をBacillus subtilis RS317と命名し、その発現コンストラクトをpRSH317と名付けた。
【００７５】
断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ体は生成能を有するBacillus subtilis宿主において産生された。この酵素は培養上澄み液を、単一の酵素を１分画として溶出するイオン交換クロマトグラフィーにかけることで精製された。酵素分画は、ＮＨ２末端のシークエンシングおよび質量分析がなされた。その結果、断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ体は、異型アミノ末端を有する蛋白質として示された（表４。）。主な酵素変異体は、Hind III部位に最初のトリペプチドＱＡＳが含まれている推定されたアミノ配列と同一のアミノ末端配列を有していた。わずかな変異体は、ジペプチドQA‐の欠失を持っていると分かった。アミノ末端が封鎖されている場合は、ある変異体を生じていてもアミノ酸配列を検出できなかった。産生過程においては、ピログルタミル残基が形成されグルタミン残基が環化した結果、アミノ鎖末端の封鎖を生じるおそれがある。結果としては、アミノ末端を欠失させても、基本的にアミノ末端の異型を低減することはない。
【００７６】
【表４】
2009540814.tif 000005
特定されたアミノ酸配列、および断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ体の質量
【００７７】
（実施例６、ＫＴをコードする配列が挿入されたBacillus cereus 98ME1552の断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ体の構造）
翻訳後修飾を避けるために、メタロ‐β‐ラクタマーゼ分子の切断が、
NH2-EQKLEQIVIKN領域のＤＮＡ配列の欠失と共に、3'-Hind IIIクローニング部位の下流に設置されているＫＴジペプチドをコードしている配列の挿入を引き起こすように形成した。
【００７８】
メタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体の遺伝子は、ＫＴをコードしているＤＮＡ配列を含んでいる順方向プライマーを除いた、上記実施例５の方法において作成された。そのＰＣＲ断片を、Hind IIIで切断し、pKTH141分泌ベクターのHind III部位で結合させると共に、核酸連結物質配合物を用いて、B. subtilis RS303コンピテント細胞を形質転換させた。発現コンストラクトにおいて、メタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体の遺伝子の正確なヌクレオチド配列が、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。ある陽性のクローンをBacillus subtilis RS318と命名し、その発現コンストラクトをpRSH318と名付けた。pRSH318由来のB. cereus 98ME1552のβ‐ラクタマーゼのヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸配列を図３に示し、この配列のそれぞれを配列番号２と配列番号３とする。
【００７９】
上記足早に説明したように、断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ体は、産生され、精製され、解析される。このメタロ酵素の活性は、カラムより単一のシグナルピークで検出される。この単一の分画は、同一のアミノ鎖末端であるグルタミン酸残基を有するメタロ‐β‐ラクタマーゼを含んでいる（ＮＨ２‐Ｅ、表５参照）。したがって、ＫＴジペプチドの挿入が、翻訳後修飾を制御し、結果として均一なアミノ末端アミノ酸配列を生じる。このメタロ‐β‐ラクタマーゼ切断体をP2A蛋白質と命名した。
【００８０】
【表５】
2009540814.tif 000006
推定されたアミノ鎖末端配列、特定されたアミノ酸配列、および切断型メタロ‐β‐ラクタマーゼ分子の質量
【００８１】
（実施例７、P2Aメタロ‐β‐ラクタマーゼの酵素反応パラメーター）
P2A酵素の触媒作用の性質の多様性は、セリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤の存在下もしくは非存在下で、ペニシリン系統、第２世代、第３世代セファロスポリン、カルバネム（メロペネム）などの様々なタイプのβ‐ラクタムで研究された。この酵素の反応パラメーターＫcatおよびＫｍは、ハーネスウルフプロットによって初速度から特定された。この反応は、ｐＨ７．０、温度３０℃の１０ｍＭリン酸塩緩衝剤内において実行され、この反応のキュベット（１ｍｌ）は、おおよそ５ピコモルの酵素をすべての反応において含んでいた。（メロペネム測定における１．７ピコモルを除く。）様々なβ‐ラクタム基質の加水分解は、分光光度的に各々の基質に特異な波長ごとに記録された。
【００８２】
３回の独立した測定より得られた平均値を示している、酵素反応パラメーター（Ｋcat、Ｋｍ、Ｋcat/Ｋｍ）を、表６に記録する。
【００８３】
【表６】
2009540814.tif 000007
P2Aメタロ‐β‐ラクタマーゼの酵素反応パラメーターの値
【００８４】
（実施例８、人回腸粥状液に対するP2Aたんぱく質の安定性）
小腸内標的β‐ラクタマーゼ処理において、腸管内プロテアーゼ耐性は、薬剤基質としてのP2A蛋白質の適用可能性に影響を与える最も重要な因子の１つである。小腸内プロテアーゼ作用に対するメタロ‐β‐ラクタマーゼの感受性は、人回腸粥状液を含む管に、様々な量の活性酵素を加えることで試された。メタロ‐β‐ラクタマーゼの加水分解は、様々な時間点で回腸試料のβ‐ラクタマーゼ活性を測定することで計測された。メロペネムが、活性測定において基質として利用された。
【００８５】
４回の独立した実験から得られた結果とその平均値を、表７に示す。P2A酵素は、人回腸粥状液内でも分解しにくい、半減期５５分（平均値）の蛋白質であることが明らかになった。実験系の間で、半減期は高変位で観察された。しかし、人小腸粥状液内でのP2Aの半減期は、腸器官内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタム残基を除去するために、P2A酵素処理に利用するのに適している。
【００８６】
【表７】
2009540814.tif 000008
ヒト回腸粥状液内でのP2Aメタロ‐β‐ラクタマーゼ半減期（試験管内）
【参考文献】
【００８７】
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【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】B. cereus 98ME1552における‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の完全長ヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図。
【図２】B. cereus 98ME1552における発現コンストラクトpRSH315由来の‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の完全長ヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図。Bacillus amyloliquefaciensにおける３１アミノ酸残基長鎖シグナル配列切断部位は、−１の位置のアラニンと＋１の位置のグルタミン酸の間であると予測される。Hind IIIクローニングサイトより生じるトリペプチドＮＨ２‐ＱＡＳによるＮＨ２末端の伸張は、太字で示してある。
【図３】B. cereus 98ME1552における発現コンストラクトpRSH318由来の‐β‐ラクタマーゼ遺伝子の完全長ヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図。Bacillus amyloliquefaciensにおける３１アミノ酸残基長鎖シグナル配列切断部位は、−１の位置のアラニンと＋１の位置のグルタミン酸の間であると予測される。Hind IIIクローニングサイトより生じるトリペプチドＮＨ２‐ＱＡＳによるＮＨ２末端の伸張およびＫＴの挿入は、太字で示してある。
【図１】
2009540814.tif 000009
【図２】
2009540814.tif 000010
【図３】
2009540814.tif 000011
【配列表】
2009540814000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月24日(2008.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質において、式中、
Ｋはリジンであり、
Ｔはスレオニンであり、
Ｅはグルタミン酸であり、
ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項２に記載のヌクレオチド分子において、配列番号２の９４〜７５６のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項２に記載のヌクレオチド分子を有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のヌクレオチド分子によってコードされているメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質を発現可能な宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞において、前記メタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質を分泌する宿主細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の宿主細胞において、前記宿主細胞はBacillus spp、とりわけB. licheniformisあるいはB. subtilisである宿主細胞。
【請求項８】
次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質において、式中、
Ｅはグルタミン酸であり、
ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質。
【請求項９】
請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、Ｂ１従属群に属するメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１０】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記切断されたβ‐ラクタマーゼは、Bacillus spp、とりわけB. licheniformisあるいはB. subtilisにより産生されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１１】
請求項１０に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼにおいて、前記Ｅ‐ΔＢＬは成熟メタロ‐β‐ラクタマーゼのアミノ末端の最初の１１のアミノ酸を欠失させることによって産生されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ。
【請求項１２】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記Ｅ‐ΔＢＬの配列は、配列番号３の６〜２２１のアミノ酸残基の配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１３】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記Ｅ‐ΔＢＬの配列は、配列番号１の配列を有するメタロ‐β‐ラクタマーゼの断形体、またはβ‐ラクタマーゼ活性を有する変異体またはそれらの断片であるメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１４】
請求項９に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質において、前記Ｅ‐ΔＢＬは、メタロ‐β‐ラクタマーゼの、アミノ酸ＫＮとアミノ酸Ｅとの間の切断によって産生されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質。
【請求項１５】
請求項５に記載の宿主細胞を、次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼを発現可能な条件下で培養する工程（式中、Ｋはリジンであり、Ｔはスレオニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質である）と、
翻訳後修飾により、次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ  
で表されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体を生じさせる工程（式中、ＥおよびΔＢＬは上記と同様に定義される）と、
任意的に、得られた翻訳修飾後蛋白質を分離および精製する工程と、
を含むメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質の調製方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記メタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質はシグナル配列を含む型で発現され、該シグナル配列により宿主細胞から前記蛋白質を分泌する方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法において、前記蛋白質はBacillus spp、とりわけB. licheniformisあるいはB. subtilisによって産生される方法。
【請求項１８】
請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質を含む医薬成分。
【請求項１９】
請求項８に記載の、薬剤として利用されるメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体。
【請求項２０】
腸器官内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタムを除去する薬剤の製造用の請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体蛋白質の使用。
【請求項２１】
請求項２０に記載の使用において、前記β‐ラクタム抗生物質はセファロスポリン、カルバペネム、ペニシリンからなる群より選択されると共に、セリン‐β‐ラクタマーゼ阻害剤の有無に拘らず除去される使用。
【請求項２２】
請求項８に記載のメタロ‐β‐ラクタマーゼ修飾体または請求項１８に記載の医薬成分を、それらを必要とする人へ適量投薬することによって、腸器官内で有害作用を引き起こすβ‐ラクタム抗生物質を処理する方法。
【請求項２３】
同型メタロ‐β‐ラクタマーゼ酵素製剤の製造方法であって、
ａ）次の一般式、すなわち
ＮＨ２‐Ｋ‐Ｔ‐Ｅ‐ΔＢＬ‐ＣＯＯＨ
で表される蛋白質を発現する発現コンストラクトを調製する工程（式中、Ｋはリジンであり、Ｔはスレオニンであり、Ｅはグルタミン酸であり、ΔＢＬはメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質であって、該蛋白質の予測されうる二次構造の第１のαヘリックスの前に４つのβストランドを配置するようにアミノ鎖末端が切断されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ蛋白質である）と、
ｂ）前記発現コンストラクトにてバクテリア宿主細胞を形質転換する工程と、
ｃ）培養された前記バクテリア宿主細胞によって製造されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ酵素製剤を分離する工程（ここで、培養された前記バクテリア宿主細胞によって製造されたメタロ‐β‐ラクタマーゼ酵素製剤とは、メタロ‐β‐ラクタマーゼ非修飾体を遺伝子にコードしている発現コンストラクトにて形質転換された宿主細胞から、同様の条件下で製造された非断形メタロ‐β‐ラクタマーゼ製剤より多くの同型を有するものである。）と、
を含むことを特徴とする同型メタロ‐β‐ラクタマーゼ酵素製剤の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
したがって、様々なβ‐ラクタム抗生物質を用いて静脈内薬物治療を行っている入院患者の間で、β‐ラクタマーゼ処理の利用を広げるためには、β‐ラクタム抗生物質に広範な反応性を示すとともに、β‐ラクタマーゼ阻害剤に耐性を有する、新しいプロテアーゼが不可欠である。
【国際調査報告】
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