(57)【要約】  本発明は、妊婦における炎症性内皮機能障害に対する診断試験に関する。特に、本発明は、母体の炎症性内皮機能障害にかかるリスクを診断または評価する方法に関し、以下のステップを含んでなる：a）妊婦から採取された血液サンプル中のロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを検出することと；b）前記ステップa）で得られたＰＴＸ３血漿レベルデータを、正常な妊娠群の統計学的に有意なＰＴＸ３血漿レベルデータと比較すること。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体の炎症性内皮機能障害にかかるリスクを診断または評価する方法であって、
a）妊婦から採取される血液サンプル中のロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを検出することと；
b）前記ステップa）により得られたＰＴＸ３血漿レベルデータを、正常な妊娠群の統計学的に有意なＰＴＸ３血漿レベルと比較することとを含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記正常な妊娠群の統計学的に有意なＰＴＸ３血漿レベルデータは約３ng/mlである方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記母体の炎症性内皮機能障害は子癇前症および／または子癇である方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、子癇前症または子癇の診断のため、またはそれらにかかるリスクを評価するための指標となるＰＴＸ３の血漿レベルが約３ng/ml以上である方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、ＰＴＸ３血漿レベルが約１０ng/ml以上である場合に、子癇前症および／または子癇に対する指標またはリスクマーカーであるとみなされる方法。
【請求項６】
請求項３または４に記載の方法であって、７０ng/ml以上、好ましくは８０ng/ml以上のＰＴＸ３血漿レベルが子癇に対するリスクマーカーまたは診断の指標となる方法。
【請求項７】
請求項３または４に記載の方法であって、４０ng/ml以下のＰＴＸ３血漿レベルが軽い子癇前症のリスクマーカーまたは診断の指標となる方法。
【請求項８】
請求項３または４に記載の方法であって、６０ng/ml以下のＰＴＸ３血漿レベルが重篤な子癇前症に対するリスクマーカーまたは診断の指標となる方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の方法であって、前記母体の炎症性内皮機能障害は子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）である方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、６ng/ml以上のＰＴＸ３血漿レベルはＩＵＧＲに対するリスクマーカーまたは診断の指標となる方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記診断方法が行われる体のサンプルは、妊娠の第Iおよび／または第IIの三半期の間に採取される方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記検出ステップa）は以下を含んでなる方法：
i）コーティング緩衝液で希釈されたラットモノクローナル抗ＰＴＸ３抗体（ｍＡｂ）ＭＮＢ４でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることと；
ii）前記プレートを冷蔵温度でインキュベートすることと；
iii）前記プレートを洗浄緩衝液を用いて洗浄することと；
iv）一定量の５％ドライミルク溶液を加えることにより、非特異的な結合部位をブロックすることと；
v）前記体のサンプルを加え、３５〜４０℃で１〜３時間インキュベートすることと；
vi）ビオチン接合ＰＴＸ３親和-精製ウサギＩｇＧを加え、前記ステップv）の条件下でインキュベートすることと；
vii）１：４０００に希釈されたデキストラン骨格に接合されたストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを加え、インキュベートすることと；
viii）ＴＭＢ色素原を加え、自動ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４０５ｎｍにおける吸収値を読むこと。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の診断方法を行うためのキットであって、以下の項目の１以上を含んでなるキット：
−ラットモノクローナル抗ＰＴＸ３抗体（ｍＡｂ）ＭＮＢ４でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート；
−組み換えヒトＰＴＸ３標準；
−ビオチン接合ＰＴＸ３親和-精製ウサギＩｇＧ；
−０．０５％ツイーン２０を含有する洗浄ダルベッコリン酸緩衝液；
−デキストラン骨格に接合したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ；
−ＴＭＢ色素原。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
本発明は、妊婦における炎症性内皮機能障害に対する診断試験に関する。
【０００２】
子癇前症は、母親ならびに周産期の罹患率および死亡率の重要な原因を表す。それに関連する疫学的な影響にも関わらず、この疾患の完全な原因は不明なままであり、多因子性の原因を強調する。子癇前症の典型的な臨床症状には、高血圧、タンパク尿および種々の程度の虚血性末梢臓器障害が含まれ、典型的に、妊娠期間の第３の三半期に生じ、胚着床（embryo implantation）の複合的な課程の晩発の現象である。栄養膜侵入の時点において母体と胎児との間で相互作用が起こる間のらせん動脈の不十分な再構築は、胎盤不全の原因として想定されてきた。これは、全身性の母体循環における炎症性の因子の放出（dismission）を引き起こし得る。内皮機能障害は、妊娠に対する過剰な母体の炎症性の反応の一部であると仮定されている。子癇前症における補体活性化、循環する白血球の活性化、活性酸素種の放出の増加、ならびに種々の炎症性サイトカインのレベルの増加は、全て、前記仮定と一致する。
【０００３】
子癇は、いくつかの子癇前症の場合に遅れて現れ、付加的に痙攣を伴い、子癇前症と同じ症状により特徴付けられる。子癇は、命にかかわる母体の状態である。
【０００４】
従来、これらの病態の早期診断を提供することができる診断試験はなかった。  
それ故、子癇前症および／または子癇を患うリスクを診断または評価する方法を提供する必要性について長く考えられてきた。
【０００５】
ロングペントラキシンＰＴＸ３（以下、単に「ＰＴＸ３」と示す）は、周知のＣ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）と同じファミリーに属する、最近示された炎症性分子である。ＰＴＸ３は、細胞起源、分子誘導物質および産生の動力学の点でＣＲＰとは異なる。炎症性の刺激にさらされる内皮細胞、単球、マクロファージおよび線維芽細胞のような異なる炎症性細胞により発現される。通常、ＰＴＸ３血漿レベルは、内毒素ショック、敗血症または他の炎症性の状態の間に劇的に増大する。
【０００６】
ＰＴＸ３は、血管壁成分により高いレベルで産生され、血管由来の成長因子ＦＧＦ２と結合し、そのインビトロおよびインビボでの作用を調節する。ＰＴＸ３血漿レベルは、心筋梗塞および小血管脈管炎を含む血管性の障害において増大する。
【０００７】
我々は、驚くべきことに、妊婦のＰＴＸ３の血漿レベルが、そのような女性が子癇前症および最終的には子癇にかかるリスクと関係があることを見出した。
【０００８】
それ故、本発明の全体の目的は、母体の炎症性内皮機能障害にかかるリスクを検出または評価するための診断方法を提供することであり、前記方法には、妊婦から採取した血液サンプル中のロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを評価することが含まれる。
【０００９】
より具体的には、本発明の目的は、妊婦において子癇前症および子癇にかかるリスクを診断または評価する方法を提供することであり、前記方法には、妊婦から採取した血液サンプルにおけるロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを評価することが含まれる。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、妊婦において子癇前症および子癇を早期に診断し、またはそれらにかかるリスクを評価するための方法を提供することであり、前記方法には、妊娠の第Iおよび／または第IIの三半期において妊婦から摂取された血液におけるロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを評価することが含まれる。
【００１１】
本発明のさらなる目的によると、ＰＴＸ３の血漿レベルは、疾患の重篤度と関連し、本発明の方法は、内皮機能障害の軽い形態または重篤な形態にかかるリスクを診断または評価するための方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、妊婦において、ＩＵＧＲ（子宮内胎児発育遅延）にかかるリスクを診断または評価するための方法を提供することであり、前記方法には、前記妊婦の血液サンプルにおけるロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを評価することが含まれる。
【００１３】
実験
患者は、以下の基準に従って、妊婦の中から募集した：44の正常な妊娠；33の子癇前症を合併した予め診断された妊娠；24のＩＵＧＲを合併した妊娠。在胎齢は、最後の月経期の開始および妊娠20週前に行われる超音波検査により決定された。
【００１４】
生理的な妊娠および正常な子宮内の胎児の成長を有する女性は、正常な妊娠として登録された。この群の除外基準は、以前または現在母体の疾患に罹患しており、妊娠の結果または胎児の成長に影響を与え得る薬理学的な治療を行っていることである。胎児の成長は、子宮における超音波により実証され、出生時体重および在胎齢に対するイタリアの基準に従って、第10と第90の百分位数の間の出生における胎児の体重により確認された。全ての正常な妊娠は、第37週〜第42週の期間に出産した。
【００１５】
母親の血液サンプルを、妊娠の第I、第IIおよび第IIIの三半期において、彼女たちが定期的に産科を訪れる際に病院で採取した。子癇前症またはＩＵＧＲを併発した妊娠をしている患者の血液サンプルも、妊娠性の疾患の診断時に採取した。母親の血液は、上腕の静脈から空腹の状態で採取し、遠心分離した。その後、血漿を−80℃で分析まで保存した。
【００１６】
血液サンプル中のＰＴＸ３の血漿レベルの評価
ＰＴＸ３に対するサンドイッチＥＬＩＳＡが行われた。ＥＬＩＳＡプレート（96ウェル；Nunc Immuno Plate, MaxiSorp, Nunc）をコーティング緩衝液（15 mM 炭酸塩, Na2CO3 + NaHCO3, 緩衝液 pH 9.6）で希釈した100ng/ウェルのラットモノクローナル抗-ＰＴＸ３抗体（ｍＡｂ）ＭＮＢ４でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。前記プレートを洗浄緩衝液（0.05％のツイーン２０を含有するダルベッコリン酸緩衝）で洗浄し、300μLの5％ドライミルクを加えて非特異的な結合部位をブロックした。50μlの組み換えヒトＰＴＸ３標準（100 pg/ml〜2 ng/ml)および未知のサンプルを二重に加え、37℃で2時間インキュベートした。これらを前記洗浄緩衝液で洗浄した後、25 ng/ウェルのビオチン接合ＰＴＸ３親和-精製ウサギＩｇＧを37℃で１時間加えた。ウェルを広範に洗浄し、1：4000に希釈されたデキストラン骨格（AmDex, Copenhagen, Denmark）と接合した100μlのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼと共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを4回洗浄し、100μlのＴＭＢ色素原（BD, Pharmingen）を加えた。吸収値は、自動ＥＬＩＳＡリーダーにおいて405nmで読んだ。
【００１７】
免疫組織化学
ＰＴＸ３の発現のパターンおよび部位は、帝王切開のときに採取した正常な妊娠および子癇前症の妊娠の胎盤サンプルにおいて、免疫組織化学により研究した。病理学者は、サンプルがどの群に由来するかに関して知らなかった。
【００１８】
胎盤サンプルは、中性に緩衝されたホルマリン中に固定され、パラフィン中に包埋され；ヘマトキシリン-エオシン染色された切片が組織学的な評価のために試験された。免疫組織化学的な分析のために、3μmのパラフィンに包埋された切片がカットされ、スーパーフロスト（Superfrost）スライド（Bio-Optica, Milan, Italy）に固定され；キシレン中での脱ろうおよびエタノール中での再水和の後、前記切片はマイクロ波オーブン中で前処理され（780 Wにおいて、各5分間、2サイクル、0.01 M クエン酸緩衝液中）、ヒトＰＴＸ３に対するポリクローナル抗体と共に2時間インキュベートされた。前記反応は、色素原として3,3’-ジアミノベンジジン遊離塩基を用いた非ビオチンペルオキシダーゼ検出システムにより明らかにされた。陰性対照は、一次抗体の脱落により得られた。
【００１９】
結果
データは、平均±ＳＤとして表されている。正常な妊娠と子癇前症またはＩＵＧＲを合併した妊娠との間のデータは、独立スチューデント検定により比較された。違いは、p＜0.05で統計学的に有意であるとみなされた。
【００２０】
正常な妊娠および子癇前症の妊娠は、第I、第IIおよび第IIIの三半期においてモニターされた。サンプリング時の平均在胎齢は、それぞれ、10.1±1.5週、20.6±3.0週および32.6±3.1週であった。母親の年齢および基礎的な肥満度指数（ＢＭＩ）は、前記３つの三半期の女性の間で同様であった。
【００２１】
26の正常な第III三半期の妊娠のうち9は、胎位または以前の帝王切開が原因で、帝王切開により出産した。子癇前症の妊娠は、正常な妊娠よりも有意に早く（39.2±1.0週の妊娠期間に対して32.1±3.6週、p＜0.001）、胎児の危険または母体の症候により常に帝王切開により出産した。子癇前症の群における胎児および胎盤の重量は、正常な妊娠と比較して有意に低かった。
【００２２】
正常な妊娠において、ＰＴＸ３のレベルは、第I（3.09±1.92 ng/ml）、第II（1.88±0.45 ng/ml）および第III（3.01±2.49 ng/ml）の三半期の間で有意には変化しない。
【００２３】
子癇前症の患者は、同じ妊娠週のサンプリングの正常な妊娠より、ＰＴＸ３のレベルが有意に高いことを示す（第III三半期において、3.01±2.49 ng/mlに対して子癇前症の患者において23.3±27.2 ng/ml）。最も高いＰＴＸ３レベル（106.55 ng/ml）を有する患者は、子癇にも発展した。
【００２４】
胎盤組織において行われる免疫組織化学は、正常な妊娠と子癇前症の妊娠との間でＰＴＸ３分布の違いを示さなかった。対照および試験の両方の場合において、ＰＴＸ３に対する免疫染色は、幹絨毛（stem villi）の間質性組織および付着絨毛に主に局在していた。より低い免疫染色は、いくつかの末端絨毛のマトリックスにおいて見られた。
【００２５】
臨床的な研究は、ＰＴＸ３の血漿レベルが子癇前症の重篤度と関連することも証明した。軽い形態の子癇前症に冒された患者のＰＴＸ３レベルは17.7±22.5 ng/ml（p＜0.001）である一方、重篤な子癇前症に罹患した患者におけるＰＴＸ３血漿レベルは、24.1±32.2 ng/ml（p＜0.001）まで上昇することが見出された。
【００２６】
他の臨床的な研究において、ＰＴＸ３のレベルは、ＩＵＧＲ（子宮内胎児発育遅延）に冒された妊婦において評価された。上述した研究と同じ実験基準が使用された。そのようなＩＵＧＲ患者におけるＰＴＸ３レベルは、7.7±12.4 ng/ml（p＜0.05）であると決定された。
【００２７】
上述した結果は、子癇前症が、妊娠に対する過剰な母体の炎症性の反応の一部として内皮機能障害の臨床的な症状を示すという示唆と合致する。いずれかの理論と結合させることなく、妊娠の第III三半期における子癇前症の臨床症状は、胚着床の複雑な過程における遅発性の現象であってよい。この内皮機能障害は、全身性の母体の循環において、サイトカインおよび成長因子（ＴＮＦ-α、ＩＬ-１）のような炎症性因子の活性化および放出を引き起こし得る。
【００２８】
本発明は、母体の炎症性内皮機能障害にかかるリスクを診断または評価する方法であって、妊婦から採取した血液サンプルにおいてロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルを検出する第１のステップを含んでなる方法を提供する。
【００２９】
特に、前記母体の炎症性内皮機能障害は、子癇前症および／または子癇である。  
もう１つの実施形態において、前記炎症性内皮機能障害はＩＵＧＲ（子宮内胎児発育遅延）である。
【００３０】
体のサンプルは、全妊娠期間の間に採取することができる。しかしながら、早期の診断を提供するため、または前記疾患にかかるリスクを評価するために、本発明の診断方法を有益に行うことができる体のサンプルは、妊娠の第Iおよび／または第IIの三半期に採取したものである。
【００３１】
ＰＴＸ３の血漿レベルは、上述したＥＬＩＳＡ試験により検出することができる。しかしながら、他の既知の臨床検査が使用されてよい。
【００３２】
前記ＥＬＩＳＡ試験は、以下を含んでなる：
i）コーティング緩衝液（好ましくはpH9.6の緩衝液）で希釈されたラットモノクローナル抗ＰＴＸ３抗体（ｍＡｂ）ＭＮＢ４（好ましくは100 ng/ウェルの量）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることと；
ii）前記プレートを冷蔵温度（好ましくは約4℃）でインキュベートすることと；
iii）前記プレートを洗浄緩衝液（好ましくは、0.05％ツイーン２０を含むダルベッコリン酸緩衝）を用いて洗浄することと；
iv）一定量の5％ドライミルク溶液を加えることにより、非特異的な結合部位をブロックすることと；
v）前記体のサンプルを加え、35〜40℃で1〜3時間インキュベートすることと；
vi）ビオチン接合ＰＴＸ３親和-精製ウサギＩｇＧを加え、前記ステップv）の条件下でインキュベートすることと；
vii）1：4000に希釈されたデキストラン骨格に接合されたストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを加え、インキュベートすることと；
viii）ＴＭＢ色素原を加え、自動ＥＬＩＳＡリーダーにおいて405nmにおける吸収値を読むこと。
【００３３】
本発明の方法は、前記第１の検出ステップにより得られたＰＴＸ３血漿レベルデータを、正常な妊娠群の統計学的に有意なＰＴＸ３血漿レベルデータと比較する第２のステップをさらに含んでなる。一般的に、正常な妊娠群について、約3 ng/mlの血漿レベルが統計学的に有意であることが見出されている。
【００３４】
子癇前症、子癇またはＩＵＧＲを診断またはそれらにかかるリスクを評価するための指標であるＰＴＸ３の血漿レベルは、一般的に、約3 ng/ml以上である。
【００３５】
好ましくは、約10 ng/ml以上のＰＴＸ３血漿レベルは、子癇前症および／または子癇に対する指標またはリスクマーカーとして考慮に入れられるが、約6 ng/ml以上のＰＴＸ３血漿レベルは、ＩＵＧＲに対する指標またはリスクマーカーとして考慮に入れられる。
【００３６】
より具体的には、40 ng/ml以下のＰＴＸ３血漿レベルは、軽い子癇前症のリスクマーカーまたは診断の指標となり、60 ng/ml以下のＰＴＸ３血漿レベルは、重篤な子癇前症のリスクマーカーまたは診断の指標となり、70 ng/ml以上、好ましくは80 ng/ml以上のＰＴＸ３血漿レベルは、子癇に対するリスクマーカーまたは診断の指標となる。
【００３７】
本発明は、体のサンプルにおけるロングペントラキシンＰＴＸ３の血漿レベルの評価のためのキットにも関する。
【００３８】
本発明によるキットは、ラットモノクローナル抗ＰＴＸ３抗体（ｍＡｂ）ＭＮＢ４でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを含んでよい。本発明のキットは、組み換えヒトＰＴＸ３標準（100 pg/ml〜2 ng/ml）およびビオチン接合ＰＴＸ３親和-精製ウサギＩｇＧをさらに含んでよい。加えて、0.05％のツイーン２０を含有するダルベッコリン酸緩衝液も含まれてよい。デキストラン骨格に接合したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼおよびＴＢＭ色素原は、最後に、本発明のキットに含まれてよい。
【国際調査報告】
2009525463.tif 000002
2009525463.tif 000003