(57)【要約】本発明は、対象の組織における変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の方法に関係し、該方法は、該組織の細胞におけるＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の活性を増加することを含む。好ましい実施態様において、ＴＬＲ３アゴニストは、スタスミン又は、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ又はＲＢ３のようなスタスミン様タンパク質である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の組織における変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の方法であって、該組織の細胞におけるＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の活性を増加することを含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
−少なくとも１のＴＬＲ３アゴニストの治療的に有効な量
−ＴＬＲ３アゴニストのインビボでの発現を促進する少なくとも１の化合物の治療的に有効な量
−ＴＬＲ３発現を促進する少なくとも１の化合物の治療的に有効な量、及び／又は
−ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を促進する少なくとも１の化合物の治療的に有効な量を、
該対象に適用することを含む前記方法。
【請求項３】
該対象が哺乳類、好ましくはヒトである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該組織が神経組織、好ましくは脳組織及び／又は滑膜組織である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該細胞が、グリア細胞、好ましくは星状細胞、及び／又は滑膜の細胞、好ましくは滑膜細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該変性炎症プロセスが、慢性又は急性神経変性疾患の結果である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該神経変性疾患が、卒中、血液量減少性ショック、外傷性ショック、再灌流傷害、多発性硬化症、ＡＩＤＳ関連認知症、神経毒性、アルツハイマー病（ＡＤ）、頭部外傷、急性脊髄損傷、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び関係するシヌクレイン病、ジストニア、トゥレット症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤｓ）及び関係するタウオパシー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）のようなプリオン疾患及びクロイツフェルトヤコブ病に関係する他の疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三塩基反復病、運動ニューロン病、進行性核上性麻痺、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）並びに癌からなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該処置が該神経組織の細胞における神経保護応答の刺激を伴い且つ／又は該処置が該滑膜組織の細胞における修復機能の刺激を伴う、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該少なくとも１のＴＬＲ３アゴニストが、
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体；
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物、
から成る群から選ばれる、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該アミノ酸配列類似性が、配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αへリックスドメインに関係する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該スタスミン様タンパク質が、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ及び／又はＲＢ３である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αヘリックスドメインの安定化を促進する化合物と一緒の該ＴＬＲ３アゴニストの使用をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
対象の組織における変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の為の医薬組成物であって、該組織の細胞におけるＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の活性を増加することができる少なくとも１の化合物の治療的に有効な量；及びｂ）医薬的に許容可能なキャリアを含む、前記組成物。
【請求項１４】
該少なくとも１の化合物が、
−ＴＬＲ３アゴニスト；
−ＴＬＲ３アゴニストのインビボでの発現を促進する化合物；
−ＴＬＲ３発現を促進する化合物、及び／又は、
−ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を促進する化合物
である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
該対象が哺乳類、好ましくはヒトである、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該組織が神経組織、好ましくは脳組織及び／又は滑膜組織である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
該細胞がグリア細胞、好ましくは星状細胞、及び／又は、滑膜の細胞、好ましくは滑膜細胞である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
該変性炎症プロセスが、慢性又は急性神経変性疾患の結果である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
該神経変性疾患が、卒中、血液量減少性ショック、外傷性ショック、再灌流傷害、多発性硬化症、ＡＩＤＳ関連認知症、神経毒性、アルツハイマー病（ＡＤ）、頭部外傷、急性脊髄損傷、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び関係するシヌクレイン病、ジストニア、トゥレット症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤｓ）及び関係するタウオパシー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）のようなプリオン疾患及びクロイツフェルトヤコブ病に関係する他の疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三塩基反復病、運動ニューロン病、進行性核上性麻痺、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）並びに癌からなる群から選ばれる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
該組成物が該神経組織の細胞における神経保護応答を刺激することができ且つ／又は該組成物が該滑膜組織の細胞における修復機能を刺激することができる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
該少なくとも１のＴＬＲ３アゴニストが、
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体；
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物、
から成る群から選ばれる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
該アミノ酸配列類似性が、配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αへリックスドメインに関係する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
該スタスミン様タンパク質が、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ及び／又はＲＢ３である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αヘリックスドメインの安定化を促進する化合物をさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
医薬としての使用の為の、
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体；
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物、
から成る群から選ばれるＴＬＲ３アゴニスト。
【請求項２６】
対象の組織における変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の為の医薬の調製の為に、
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体；
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物、
から成る群から選ばれるＴＬＲ３アゴニストを使用する方法。
【請求項２７】
何らかの疾患、病気又は障害を欠く対象において、神経変性疾患の発症を阻止し又は遅延させる為の、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
何らかの疾患、病気又は障害を欠く対象において、神経変性疾患の発症を阻止し又は遅延させる為の、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対象中の変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の方法並びにそれに使用する為の医薬的調製物に関係する。好ましい局面における本発明は、神経変性疾患のような変性炎症性疾患を処置する方法及び神経保護プロセスを刺激する方法に関係する。本発明はさらに、対象中、特に該対象の脳又は関節組織中の、急性又は慢性の変性炎症プロセスの予防及び／又は処置の為の医薬の調製の為にＴＬＲ３−アゴニストを使用する方法に関係する。特に好ましい局面において、本発明は、その目的の為にスタスミンを使用する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
卒中、アルツハイマー病及びパーキンソン病のようなヒト神経変性疾患は、高齢化する人口に対して増え続ける脅威をもたらす。関係する分子メカニズムの明確な理解のとおり、処置の有効な方法が無い。神経学的な病気及び損傷を処置する為に現在用いられる薬剤は、せいぜい症状の一時的な緩和を提供するが、根本的な神経変性プロセスを止め又は遅らせない。加速された細胞死又はアポトーシスをもたらす分子カスケードを邪魔することにより該病気を改善すると考えられている薬剤は、なお研究中である。
【０００３】
神経変性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、最終的に組織損傷を結果する過度の局所的炎症応答に関係する。多くの脊椎動物において、Ｔｏｌｌ様レセプター又はＴＬＲは、病原体への先天性免疫応答の調節において重要な役割を果たすことが知られている。ＴＬＲは、細胞外ロイシンリッチ繰返しドメインと、インターロイキン−１受容体の細胞質ドメインと類似する細胞内情報伝達ドメインとを有する膜貫通タンパク質である。今日までに、ヒトゲノムにおいて、１０のＴＬＲファミリーメンバーが同定されている。ＴＬＲ１は、リンパ器官において、単球、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞において発現される。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５は、骨髄単球性成分において広く発現されている。Ｔｏｌｌ様レセプター３（ＴＬＲ３）は、発現のより限定されたパターンを有する。マウスにおける最近の研究は、種々のＴＬＲファミリーメンバーのうちで、ＴＬＲ３が、ＣＮＳにおいて、著しく多いことを示す。
【０００４】
ＴＬＲは、広いさまざまな不変の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識することが示されている。それらは、病原体に対する防御の第一線に関係する一般的に適当な応答である、炎症促進性メディエーターの産生を仲介する。従って、ＴＬＲは、過度の炎症に関係する病気を抑制する為の見込みのある標的として、感染症を防ぐ為のワクチン接種後の免疫応答を刺激する為又は抗腫瘍性免疫を促進する為のアジュバントにとっての標的として、かなりの注目を引いている。
【０００５】
最近のデータは、特に、ＴＬＲ３により仲介される応答が、異なるＴＬＲ３特異的細胞内情報伝達経路の故に、他のＴＬＲファミリーメンバーにより仲介される応答から区別されうることを示す。大抵のＰＡＭＰへの応答において、ＴＬＲ情報伝達は典型的に、ＮＦ−κＢにより仲介される経路を活性化しそしてＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＩＬ−６及び酸化窒素を含む産物の産生をもたらす。従って、ＴＬＲに仲介される応答は一般に、炎症促進性先天性免疫応答及び−最終的には−抗菌性の適応免疫応答を開始するために設計された、典型的な抗菌性宿主防御応答として見られる。
【０００６】
ＴＬＲ３活性化に関して、ヒト肥満細胞におけるＴＬＲ３情報伝達は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β又はＩＬ−５を誘発しないだけでなく、代わりに、これらの細胞の脱顆粒並びにフィブロネクチン及びビトロネクチンのような細胞外マトリックス成分へのそれらの付着を抑制することが報告されている。
【０００７】
ＴＬＲ３及びＴＬＲ４の連結の場合、Ｉ型インターフェロンの産生も刺激され、これは一般に抗ウィルス性応答として理解される。なぜなら、それは主要組織適合性複合体分子の発現及びＭＨＣクラスＩに限られた細胞傷害性Ｔ細胞への細胞性抗原の交差提示を促進するからである。そのような典型的に抗ウィルス性の応答は、ＴＬＲ４と比較して、ＴＬＲ３によってより効率的に仲介されるようにみえる。ＴＬＲ３により仲介される応答のこの特定の特性は、ＴＬＲ３にとっての現在知られている唯一のアゴニストが、二本鎖ＲＮＡ（多くの場合においてウィルス複製の構造中間体）であるという事実を考慮すると道理にかなうようにみえる。しかしながら、ウィルス複製の間に現れる二本鎖ＲＮＡは一般に細胞内にあり且つ、ウィルス複製が完成する前の感染した細胞の溶解後に、細胞外リガンドとしてわずかに利用可能であろうことが注目されるべきである。これは、例外としての場合だけであろう故に、現在の知見は、細胞外の活性化（線維芽細胞及び星状細胞を含むいくつかの細胞タイプ上に豊富に見られるとおりの表面に露出されたＴＬＲ３）についての理論的根拠を完全に与えない。
【０００８】
健康状態及び病気におけるＴＬＲの役割についてのこれらのデータにも関わらず、何らかのＴＬＲの活性を妨害することまたは調節することが、これらの受容体の活性化によりまたは不活性化により、神経変性疾患の処置においてどのように役割を果たしうるかは、これまで知られていないままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、一般的には変性炎症疾患の処置の為の方法及び特には神経変性疾患の処置の為の方法を提供することである。これら疾患に関するメカニズム及び標的の同定を通じて及び続く治療的介入により、局所的炎症反応を制御することが、さらなる目的である。そのような方法において使用するための治療的組成物を提供することもさらに、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要約
本発明者らは今、驚くべきことに、ヒトの星状細胞及び線維芽細胞上のＴＬＲ３の活性化が、再生応答を一緒に支援する、様々な抗炎症性、抗線維性、血管新生促進性、走化性及び神経保護性のメディエーターの高められた産生からなる修復応答を結果することを発見した。
【００１１】
第一の局面において、本発明は、対象の組織における変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の方法に関係し、該方法は該組織の細胞においてＴＬＲ３の活性を増加することを含む。
【００１２】
さらに、本発明者らは今、驚くべきことに、スタスミン及びスタスミン様タンパク質が、ＴＬＲ３についての活性化因子又はアゴニストとして作用できること又はＴＬＲ３に仲介される情報伝達を活性化できることを発見した。本発明者らは、哺乳類ＣＮＳにおいて多い細胞タイプである星状細胞におけるこの活性を発見した。スタスミンにより活性化されるＴＬＲ３により仲介される星状細胞の応答は、対立した炎症促進性宿主防御応答よりもむしろ再生応答を一緒に支援する、様々な神経保護性、抗炎症性、血管新生性及び走化性のメディエーターの産生を含む。非常に類似する応答が、ＴＬＲ３活性化に応答した滑膜細胞（関節線維芽細胞）について発見された。なぜなら、この細胞タイプも、組織修復を促進する広いさまざまな抗炎症性のメディエーター及び分子の高められた産生により応答するからである。とりわけＣＮＳ星状細胞及び滑膜細胞を含む、線維芽細胞様の及び他の細胞についてのスタスミン又はスタスミン様タンパク質による制御されたＴＬＲ３活性化は、それゆえに、変性的及び他の疾患における幅広い治療的能力を有しうる。これは、ヒトの疾患の潜在的に広い範囲における治療上の介入に関係する。特に、ヒトの星状細胞及び線維芽細胞上の並びにマクロファージ様細胞又は樹状細胞におけるＴＬＲ３の活性化が利益を形成するような疾患が、本発明の予防的及び治療的局面において想定される。
【００１３】
それゆえに本発明は、哺乳類の対象における変性炎症状態を処置及び／又は予防する為の医薬の製造におけるＴＬＲ−３アゴニストを使用する方法を提供し、該アンタゴニストはスタスミン又はスタスミン様タンパク質である。
【００１４】
本発明は、哺乳類の対象における変性炎症状態の処置及び／又は予防における使用の為のＴＬＲ−３アゴニストも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の方法の好ましい実施態様において、該方法は、処置又は予防の必要がある該対象に：
−治療的に有効な量の、少なくとも１のＴＬＲ３−アゴニスト；
−治療的に有効な量の、ＴＬＲ３−アゴニストのインビボでの発現を促進する少なくとも１の化合物；
−治療的に有効な量の、ＴＬＲ３発現を促進する少なくとも１の化合物、及び／又は
−治療的に有効な量の、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を促進する少なくとも１の化合物
を投与する段階を含む。
【００１６】
本発明の方法の他の好ましい実施態様において、該組織は神経組織、好ましくは脳の組織及び／又は滑膜の組織である。
【００１７】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施態様において、該細胞はグリア細胞、好ましくは星状細胞、及び／又は滑膜の細胞、好ましくは滑膜細胞である。
【００１８】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施態様において、該変性炎症プロセスは、慢性又は急性の神経変性疾患に関係する。該神経変性疾患は好ましくは、卒中、血液量減少性ショック、外傷性ショック、再灌流傷害、多発性硬化症、ＡＩＤＳに関係する認知症、神経毒性、アルツハイマー病（ＡＤ）、頭部外傷、急性脊髄損傷、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び関係するシヌクレイン病、ジストニア、トゥレット症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤｓ）及び関係するタウオパシー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）のようなプリオン疾患及びクロイツフェルトヤコブ病に関係する他の疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三塩基反復病、運動ニューロン病、進行性核上性麻痺、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）並びに癌から成る群から選ばれる。本発明の方法により処置又は予防されうる、特に好ましい神経変性疾患は、卒中、多発性硬化症、ＡＤ，ＰＤ及び認知症を含む。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法における該処置は、該神経組織の細胞における神経保護性応答の刺激を伴い且つ／又は該処置は該滑膜の組織の細胞における修復機能の刺激を伴う。
【００２０】
本発明の方法において用いられうるＴＬＲ３−アゴニストは好ましくは：
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体；
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するそれらの誘導体及びそれらの前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有する（好ましくはαへリックス形の）ポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物、
からなる群から選ばれる。
【００２１】
一般に、アミノ酸配列類似性は、完全な参照配列へのポリペプチドの類似性に関する。しかしながら、好ましい実施態様において、該アミノ酸配列類似性は、配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αへリックスドメインに関する。
【００２２】
本発明の局面において用いられる該スタスミン様タンパク質は好ましくは、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ及びＲＢ３から選ばれ、ヒトスタスミンが最も好ましく、並びにスタスミンとスタスミン様タンパク質との組合せも意図される。
【００２３】
本発明の方法はさらに、配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αへリックスドメインの安定化を促進する化合物と一緒にＴＬＲ３−アゴニストを使用する方法も含みうる。
【００２４】
本発明の方法は、必ずしも医療的であることはなく、医療的でない実施態様も含みうることが注目されるべきである。例えば、該方法は、何らかの疾患、病気又は損傷のない対象の神経変性疾患の発病を予防し又は遅延する為でありうる。
【００２５】
他の局面において、本発明は、対象の組織における変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の為の医薬組成物に関係し、該組成物は、治療的に有効な量の、該組織の細胞におけるＴＬＲ３の活性を増加することができる少なくとも１の化合物；及びｂ）医薬的に許容可能なキャリアを含む。
【００２６】
本発明の組成物中の該医薬的に活性な化合物は例えば：
−ＴＬＲ３−アゴニスト；
−ＴＬＲ３−アゴニストのインビボでの発現を促進する化合物；
−ＴＬＲ３発現を促進する化合物、及び／又は
−ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を促進する化合物
でありうる。
【００２７】
好ましい実施態様における該活性な化合物は、神経組織の細胞における神経保護的応答を刺激する能力及び／又は滑膜組織の細胞における修復機能を刺激する能力を有する。
【００２８】
非常に好ましい活性な化合物は、ＴＬＲ３−アゴニスト、好ましくは
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体、
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するそれらの誘導体及びそれらの前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物
から成る群から選ばれる１以上である。
【００２９】
さらに、好ましい実施態様において、該アミノ酸配列類似性は、配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αへリックスドメインに関する。
【００３０】
本発明の組成物はさらに、配列ＩＤ  ＮＯ：１の残基４４〜１３８に対応するスタスミン様αヘリックスドメインの安定化を促進する化合物を含みうる。
【００３１】
該医薬組成物は特に、上記に記載されたとおりの本発明の方法における使用の為及び上記に言及された疾患の処置又は予防の為に意味される。加えて、該化合物は、他の薬剤、例えば炎症を引き起こす薬剤などと一緒に、そのような薬剤の炎症効果を改善する為に、使用されうる。
【００３２】
更なる局面において、本発明は、
−スタスミン、ＴＬＲ３を活性化するその誘導体及びその前駆体、
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するそれらの誘導体及びそれらの前駆体、及び
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：３)及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含むタンパク質性化合物、
から成る群から選ばれるＴＬＲ３−アゴニストの、第１及び第２の医学的適用に関する。
【００３３】
そのような第１及び第２の医学的適用は特に、対象の組織中の変性炎症プロセスの処置及び／又は予防の為の、医薬としての使用の為の該化合物及び医薬の調製のために該化合物を使用する方法に夫々関係する。
【００３４】
該組成物が、何らかの疾患、病気又は損傷のない対象中の、上記に記載されたとおりの変性炎症疾患及び神経変性疾患の発病を防ぐ又は遅延させる為であることが、本発明の局面である。
【００３５】
図面の説明
図１は、６の異なるドナーからの、培養されたが処理されていないヒト星状細胞についての、ＴＬＲ４の優先的な発現及びＴＬＲ１〜３のより低い程度の発現、並びにさまざまなサイトカインによるＴＬＲ３の強力且つ優先的な誘導を示す。本データは、炎症促進性サイトカインによるＴＬＲ３の特に強力な誘導を示し、しかし抗炎症性サイトカインによる誘導はないことを示す。パネルＡは、６の異なる対照ドナーからの培養されたが処理されていない星状細胞において、ＴＬＲ４は概して優勢に発現されるが、ＴＬＲ１〜３は、より低い水準で発現されることを示す。ＴＬＲ５〜１０は、全ての培養物におけるＲＴ−ＰＣＲにより検出不能であった。パネルＢは、炎症促進性サイトカインによってＴＬＲ３がヒトの星状細胞において優先的に誘導されるが、抗炎症性サイトカインによってはそうでないことを示す。パネルＢは、単独の代表的な培養物についての、処理されていない対照の星状細胞培養物と比べての、４８時間後のｍＲＮＡ発現水準を描く。個々のサイトカインとは別に、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの混合物（ＭＩＸ）も試験された。
【００３６】
図２は、ＴＬＲ３アゴニスト  ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又はＴＬＲ４アゴニストＬＰＳの影響下で、６の異なるドナーからの培養された成人ヒト星状細胞におけるＴＬＲ３の優先的な誘導を示す。ＴＬＲ３は、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の活性化によりヒト星状細胞培養物において優先的に誘導される（パネルＡ）。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）又はＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）による刺激が、２４時間実施された。パネルＡ中のデータは異なるドナーに由来する６の星状細胞培養物についての個々のデータを表し、同じドナーからの処理されていない対照の星状細胞培養物と比べての、ｍＲＮＡを発現する水準を描く。ＴＬＲ３又はＴＬＲ４を活性化することにより、ＴＬＲ２のいくらかの誘導も観察されるが、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドによりＴＬＲ２は阻害される一方で、ＴＬＲ３はそのような処理により阻害されないので、これは間接的な効果である（パネルＢ；単独の代表的なドナーについてのデータを示す）。
【００３７】
図３は、培養された成人ヒト星状細胞において、ＴＬＲ３並びにＴＬＲ４が、もっぱら細胞表面上で発見されうることを示す。（緑色蛍光により染色された）ＴＬＲ３が、培養されたＧＦＡＰ陽性成人ヒト星状細胞の細胞表面上でもっぱら発見される(パネルＡ）。多発性硬化症の神経炎症プロセスの間のヒトの脳内での（茶色の沈着により染色された）ＴＬＲ３発現（パネルＢ及びＣ）。ＴＬＲ３染色は、２の異なる様式でそれ自身を明白にすることに注目されたい。星状細胞は、細胞培養物中でも発見されるとおり表面発現と一致する様式でもっぱら染色されるが（パネルＢ；白抜き矢印）、追加の小胞染色は、培養されたヒトミクログリアにおけるＴＬＲ３のもっぱら小胞での発現と同様に、ミクログリアにより発現されたＴＬＲ３と関連する（パネルＣ；塗りつぶした矢印）。
【００３８】
図４は、星状細胞（Ａ）又は内皮細胞（Ｂ）の成長についての、ＴＬＲ３活性化に応答して星状細胞により分泌されたメディエーターの効果を示す。星状細胞の成長（グリオーシス）が、ＴＬＲ３により誘発されたメディエーターによって弱められるがＴＬＲ４により誘発されたメディエーターによっては弱められない一方で、内皮細胞の成長は、ＴＬＲ３により誘発されたメディエーターにより刺激されるがＴＬＲ４により誘発されたメディエーターによっては刺激されない。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化培地は星状細胞の増殖を阻害し且つ内皮細胞の成長を促進する。星状細胞（パネルＡ）又は内皮細胞（パネルＢ）が、種々の時点で回収されたｐｏｌｙＩ：Ｃ馴化星状細胞培地又はＬＰＳ馴化星状細胞培地中で３日間培養された。増殖は、培養期間の最後で生存細胞のＷＳＴ−１染色により評価された。バーは、６（パネルＡ）又は２（パネルＢ）の独立した実験（夫々の条件は四重に分析された）からの、こみにしたデータ（pooled  data）±標準偏差を表す。＊＊が付された有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によるｐ＜０．００３を示す。
【００３９】
図５は、ＴＬＲ３活性化に応答した星状細胞により分泌されるがＴＬＲ４活性化に応答した星状細胞により分泌されないメディエーターの、器官型ヒト脳切片培養物におけるニューロンに対する生存促進性効果を示す。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化星状細胞培地は、器官型のヒト脳スライス培養物中のニューロンの生存を促進するが、ＬＰＳ馴化星状細胞培地はそうでない。器官型ヒト皮質脳切片培養物は、４８時間後に回収されたｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化又はＬＰＳ馴化星状細胞培地中で１週間保持された。パネルＡ及びＢにおいて、カルセイン／ＡＭにより染色された脳切片のカラー画像が示されており、対照培地（パネルＡ）と比較して、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化星状細胞培地（パネルＢ）中に保持された切片中の死細胞（赤核により特徴付けられる）の著しく減少した数を示す。パネルＣにおいて、カルセイン／ＡＭによる生／死の染色を用いて、夫々の条件について試験された４つの個々の切片の平均±標準偏差である、生存する又は死んだニューロンの百分率が与えられる。＊が付された有意性は、分散分析（クラスカル−ワリス試験）によるｐ＜０．０３を示す。
【００４０】
ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化星状細胞培地及びｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ単独の両方とも、他の培養条件と比べて、ニューロンの生存を有意に促進し、これは、培養脳切片の一部のときも、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより活性化された星状細胞が、神経保護性メディエーターを産生することができることを示唆する。
【００４１】
図６は、ｃＤＮＡバンク由来の遺伝子産物の、感受性であるが特異的ではないＴＬＲ３関与についてのマーカーである星状細胞中のＣＸＣＬ８分泌を誘導する為の能力についての、スクリーニングの結果を示す。このスクリーニングは、このｃＤＮＡバンクによりコードされた２つの主要なＣＸＣＬ８誘導性産物のうち１つとしてのスタスミン由来配列の同定をもたらした。他方の産物は、星状細胞によるＴＬＲ３仲介情報伝達との関連を有さない。ｃＤＮＡバンクのスクリーニングは、培養物中のヒト星状細胞によるＣＸＣＬ８分泌を誘発する産物についてのヒト脳腫瘍に由来した。ｃＤＮＡは、ヒト脳腫瘍細胞株の混合物からのｍＲＮＡテンプレートを用いて作成され、そして、これらは、哺乳類細胞における産物の発現と分泌とを促進する構築物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中へと、個々にクローン化された。第１の段階において（パネルＡ）、種々のｃＤＮＡを含有する５０〜１００の個々のプラスミドの、７６８の種々のプールが、ＣＯＳ−７細胞中へと形質転換された。それらの形質転換された細胞からの培養上清が４８時間後に集められ、そして、培養物中のヒト星状細胞に供給された。さらなる４８時間後、刺激された星状細胞によるＣＸＣＬ８放出が、酵素連結免疫吸着分析により評価された。パネルＡにおいて、ｃＤＮＡの７６８のプールの第１のスクリーニングについての結果が示されており、１のプール（矢印が付された）が、星状細胞による平均のＣＸＣＬ８放出より著しく高く誘導した。そのプールに含まれる全ての個々のｃＤＮＡの次の試験は、２つのｃＤＮＡ候補アゴニストを明らかにする。候補１は、本発明と関連が無いことが分かったが、候補２はヒトスタスミンの残基４４〜１４９（配列ＩＤ  ＮＯ．１）に対応する配列を含有する。
【００４２】
図７は、ＴＬＲ３関与について感受性だが特異的でないマーカーである、ヒト星状細胞におけるＣＸＣＬ８（インターロイキン−８；ＩＬ−８と言われる）分泌又はマウス星状細胞中のＩＬ−６の分泌を誘導するスタスミンの能力を示し、しかしＴＬＲ３欠損マウスから単離された星状細胞においてそのような誘導をするスタスミンを欠くことを示し、スタスミンへの星状細胞応答がＴＬＲ３により仲介されるという考えを確認する。ＴＬＲ２又はＴＬＲ４を活性化するスタスミンの欠損も示され、スタスミン調製物中の混入物質エンドトキシンによる何らかの混同させる効果を排除する。組み換えヒトスタスミンによる星状細胞の活性化は、ＴＬＲ３依存性である。
【００４３】
パネルＡにおいて、４の個々のヒト成人星状細胞培養物の平均化された応答が、組み換えスタスミンの増加する用量に対して示される；これらの実験におけるｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに応答したＣＸＣＬ８の放出水準は約２００ｎｇ／ｍＬである。おそらく、溶液中のスタスミン分子の一部だけが、ＴＬＲ３結合にとって必要とされる完全なαへリックスのコンフォメーションを採用するという事実故に、スタスミンへの星状細胞応答は１００μｇ／ｍＬでなお最大でない。パネルＢにおいて、ヒトＴＬＲ３について特異的な３つの異なる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の効果が示され、ヒト星状細胞におけるスタスミンにより誘導されたＣＸＣＬ８応答が、これらのｓｉＲＮＡにより強く減じられるか又は完全に除去さえされることを明らかにする。パネルＣ及びＤにおいて、少なくとも５０μｇ／ｍＬの水準で、用いられた組み換えスタスミンの調製物が、ＴＬＲ２経由(パネルＣ）又はＴＬＲ４経由（パネルＤ）のＨＥＫ２９３形質転換体細胞の応答を誘発するエンドトキシン混入物を何も含まないことが示される。パネルＥにおいて、ＴＬＲ３欠損マウスの星状細胞について、スタスミン及びｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導された応答は除去されるが、ＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）への応答はなお損なわれていない。
【００４４】
図８は、正常な（病気にかかっていない）条件下での、種々のヒト組織及び細胞タイプにおけるＴＬＲ３のこれまで実証された発現を集約する。
【００４５】
図９は、ＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ４アゴニストＬＰＳ又は両方の混合物による星状細胞の刺激を受けて、発現水準が少なくとも２倍で再現性良く増加されることが分かった、本実験研究において用いられたマクロアレイ上に提示された全ての遺伝子産物を表にする。数値は、同じ培養条件だが特異的ＴＬＲアゴニストが無い培養条件下で、同じ時間培養された、同じドナーからの刺激されていない星状細胞におけるｍＲＮＡの発現の水準と比較した、刺激された星状細胞集団におけるｍＲＮＡ発現の水準を表す。該数値は、２、６、２４及び４８時間後の発現の水準の分析後に見られた最大の刺激を表す。４８時間の培養期間後の、非処理対照培養物と比較した、アゴニストにより処理された星状細胞培養物において見られた遺伝子発現シグナルの比が与えられる。データは、種々のドナーに由来する４の培養物についての平均の比±標準偏差を表す。３つの実験条件のいずれの下でも少なくとも２倍の誘導（ボールド体で）を示す、それらの遺伝子産物についてのデータだけが与えられる。ＮＤ：確実に検出可能でない；ハウスキーピング遺伝子発現シグナルと比較して１０％閾値より低い平均の遺伝子発現シグナル。星状細胞においてｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導されたメディエーターの約半分が、ヒト滑膜細胞においてｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃによっても誘導される（図１０を参照されたい）。図１０は、培養されたヒト滑膜細胞においてｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導された全ての遺伝子産物を表にする。
【００４６】
図１１は、以下で実験の部において記載されるスクリーニング実験において発見されたｃＤＮＡクローン（クローン  Ｆ５）のヌクレオチド配列及び、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を活性化することができるタンパク質をコードする、その対応するプロテインシークエンスを示す。Ｆ５によりコードされた該プロテインシークエンス（プラスミド配列を除く）は、ヒトスタスミン（配列ＩＤ  ＮＯ．１）の残基４４（Ｄ、アスパラギン酸）〜Ｃ末端残基１４９（Ｄ、アスパラギン酸）と同一であり、その長さは、残基４４〜１３８に置かれる保存されたスタスミン様αへリックスドメインを完全に含む。
【００４７】
図１２は、スタスミン様タンパク質のファミリーの全部で４の現在知られているヒトのメンバーのアミノ酸配列を与える。
【００４８】
図１３は、４のヒトスタスミン様ファミリーメンバーであるスタスミン、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ及びＲＢ３の、保存されたスタスミン様αへリックスのドメインのうちの配列相同性を強調する。配列は、ヒトスタスミン様タンパク質の４のファミリーメンバーの間で類似する。配列の違いの多くは、細胞内輸送及び細胞下の局在を制御するＮ−末端ドメインにあることに注目されたい。残基４４〜１３８に対応する高度に保存されたスタスミン様αへリックスドメインは、四角で囲まれる。スタスミンの配列のこのヘリックス部分と他のファミリーメンバーとの百分率アミノ酸同一性は、７３〜８２である。
【００４９】
図１４は、実施例２において記載されたとおりの野生型マウス又はＴＬＲ３欠損マウスから単離された星状細胞によるＩＬ−６放出を示す。野生型マウスからの星状細胞において、スタスミン、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又はＬＰＳは全て、著しいＩＬ−６放出をもたらす。ＴＬＲ３欠損マウスからの星状細胞において、スタスミン並びにｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃへの応答は完全に無効にされるが、ＬＰＳへの応答はそこなわれていないままである。
【００５０】
図１５は、実施例３において記載されたとおりの、スタスミンにより刺激された又はｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより刺激されたヒト星状細胞の遺伝子応答プロファイルを示す。遺伝子プロファイリングは、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子についての２６８のプローブを含むｃＤＮＡアレイを用いて実施された。パネルＡにおいて、遺伝子プロファイルは、スタスミンにより処理された星状細胞培養物及び非処理の対照培養物の間で比較される。パネルＢにおいて、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより処理された培養物における応答が示される。両方の場合において、様々な遺伝子に対する包括的な刺激性効果が明白である。スタスミンにより誘導されたプロファイルがｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導されたプロファイルと比較された場合（パネルＣ）、全てのハイブリダイゼーションシグナルは、対角線に沿って集まり、いずれの状況における発現プロファイルも実質的に同じであることを示唆する。いずれのデータセットの間のピアソンの相関係数（Ｒ）は＞０．９５である；対応するｐ値＜１０−３５。
【００５１】
図１６は、スタスミンのＴＬＲ３アゴニスト活性が、実施例４において記載されたとおりのそのαへリックスに依存することを示す。図１６Ａのいて、２の調製物における異なるへリックス含有量を産生するためにＴＦＡ又はＴＦＥのいずれかにより予め処理されたスタスミン調製物（ほかは同一である）についてのＣＤスペクトルが与えられる。ＴＦＥにより処理された調製物は３７％のαへリックスを含有し、１２％だけのαへリックスを含有する、ＴＦＡにより処理された調製物よりも３倍高い水準である。図１６Ｂにおいて、ＴＦＥにより予め処理されたスタスミン調製物も、ヒト星状細胞におけるＩＬ−８のＴＬＲ３により仲介される放出を誘発することにおいて、ＴＦＡにより処理された調製物よりも３倍活性であることが示される。参照として、５０％ＴＦＥの存在下におけるＣＤ分光分析法に付されたスタスミン調製物のＣＤスペクトルも示される。そのような条件下で、スタスミンは、実質的にタンパク質鎖の完全長にわたってαへリックスコンフォメーションを採用する（へリックス含有量９８％）。
【００５２】
図１７は、２の健康なドナーからの抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）、樹状前駆細胞（pre-DC）及び成熟形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）の、実施例５において記載されたとおりの種々のＴＬＲアゴニストへの応答を示す。培養倍地中のＣＸＣＬ８蓄積は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４の両方の活性化の尺度として用いられた。ＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（ＰＩＣ）及びスタスミン（ＳＴＭ）の最終濃度は、□ｇ／ｍｌにおいて与えられ、ＴＬＲ４アゴニストＬＰＳのそれらは、ｎｇ／ｍｌにおいて与えられる。
【００５３】
図１８は、実施例６において記載された処理されていない対照細胞と比較した、スタスミンにより処理されたヒト前樹状細胞の培養物中のサイトカイン及びケモカインの４８時間後の蓄積の結果を表にする。
【００５４】
図１９は、実施例７において記載されたとおりのヒトミクログリアの精製された培養物におけるスタスミンによるＣＸＣＬ８誘導を示す。ミクログリアは、３の異なるドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）から単離され、そして、１の場合において、脳の異なる解剖学的領域から単離され、種々のＴＬＲアゴニストにより刺激された。全ての場合において、全てのＴＬＲアゴニストは、対照培養物（Ｃ）と比較して、ＣＸＣＬ８の著しい蓄積を誘発する。
【００５５】
発明の詳細な説明
【００５６】
定義
【００５７】
本明細書において用いられる「処理及び／又は予防」は、組織悪化又は組織破壊の進行を遅延させ及び／又は逆行させること、並びに、そのような悪化又は破壊を抑制し又は阻止すること、又は変性プロセスを再生プロセスへと逆にすることを含む。もし該悪化又は破壊が神経組織で起こり又は向けられるならば、該処置及び／又は予防は、本明細書において記載されるとおりの神経保護性プロセスを含みうる。本明細書で用いられるとおり、該語は特に、再生応答を一緒に支援する、さまざまな抗炎症性、抗線維性、血管新生促進性、走化性及び神経保護性のメディエーターの増強された産生からなる、ＴＬＲ３により仲介された修復応答と関連して用いられる。語「再生応答」は、組織変性プロセスの反対を指し、すなわちそれは細胞損傷に対する保護の用意を含む、組織再生プロセスを指す。従って、語「ＴＬＲ３により仲介される修復応答」が本明細書において用いられるとき、それは上記効果の全てを指すために意味される。
【００５８】
本明細書において用いられる語「組織変性」、「組織悪化」又は「組織破壊」は、交換可能に用いられ、そして、組織に損傷若しくは障害を引き起こし又は組織損傷の生体組織の減じられた機能を引き起こす内部又は外部の何らかのプロセスを表し、これは組織内における減じられた細胞活性又は細胞死により特徴付けられてよく且つ一般に組織学的変化を含む。この変性は、薬により、ウィルス感染により、外傷により、酸素欠乏により若しくは飢餓により又は、例えば過度の炎症の有害な効果による、組織内若しくは支持組織内の細胞の慢性若しくは急性の変性を結果する何らかの他のプロセス又は疾患により引き起こされうる。
【００５９】
本明細書で用いられるときに、語「神経変性疾患」は、ニューロンの悪化から結果する病気を云い、卒中、血液量減少性ショック、外傷性ショック、再灌流障害、多発性硬化症、ＡＩＤＳに関連した認知症、神経毒性、アルツハイマー病（ＡＤ）、頭部外傷、急性脊髄損傷、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び関連したシヌクレイン病、ジストニア、トゥレット諸侯群、前頭側頭型認知症及び関連したタウオパシー、致死性家族性不眠症及びクロイツフェルトヤコブ病に関連した他の疾患のようなプリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三塩基反復病、運動ニューロン疾患、進行性核上性麻痺、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）並びに癌などの慢性及び急性神経変性疾患を含む。他の神経変性疾患は、アレキサンダー病、アルパー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、バッテン病（スピールマイヤー−フォークト−ショーグレン−バッテン病としても知られる）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、ハンチントン病、ケネディー病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド−ジョセフ病（３型脊髄小脳失調）、多発性硬化症、多系統萎縮症、ペリツェウス−メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、統合失調症、脊髄小脳失調（種々の特徴を有する複数のタイプ）、脊髄性筋萎縮症、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー病、及び脊髄癆を含む。
【００６０】
「神経保護性」効果は、本明細書において、神経組織の細胞、特にはニューロンへの損傷又は障害を引き起こすプロセスの抑制、予防又は一般的には制御として定義される。以下の実施例においてより詳細に記載されるとおり、スタスミンによるＴＬＲ３刺激の神経保護性効果が星状細胞において観察された。
【００６１】
語「神経組織」は、本明細書において、インパルス伝導性ニューロン（神経節細胞）及びそれらの支持性グリア細胞からなる組織の、当分野で認められるそれの意味において用いられる。神経系の該支持性グリア細胞は、例えば、末梢神経節細胞、上衣細胞、神経膠細胞（星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア）及びシュワン細胞の皮膜細胞又は衛星細胞を含む。
【００６２】
本明細書において用いられるときに、語「変性炎症状態」は、組織の変性が関係する何らかの炎症疾患を云う。例は、関節リウマチ、骨関節炎及び慢性閉塞性肺（肺臓）疾患であり、炎症と関係する任意の神経変性疾患を含む。
【００６３】
元来は癌タンパク質１８（又はＯｐ−１８）とも名づけられたスタスミンは、様々な情報伝達経路を統合する細胞内中継分子として元々特徴付けられた、細胞質ゾルのホスホプロテインである。該分子のＮ−末端領域中の４つのセリン残基の組み合わせのホスホリル化は、その機能の少なくとも一部に影響すると考えられている。スタスミンの主要な機能は、微小管集合の調節である。
【００６４】
本明細書において用いられるときに、語「スタスミン様タンパク質」（厳密な意味で）は、スタスミン（スタスミン−１）と共通のアミノ酸配列モチーフを有するタンパク質の特定の群について当分野において認められた語を云い、そして、一般に、スタスミン様タンパク質  ＳＣＧ１０（Ｓｐｅｒｉｏｒ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  １０；スタスミン−２）、ＳＣＬＩＰ（ＳＣＧ１０様タンパク質；スタスミン−３）、及びＲＢ３（スタスミン−４）から成る化合物の群を呼ぶ為に用いられる。語「スタスミン様タンパク質」は本明細書において、スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列(配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：３）及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、及び特に好ましくは少なくとも９７％、９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含有するタンパク質性化合物をいう為にも用いられる。好ましくは、該アミノ酸配列類似性は、少なくと３０の近接するアミノ酸、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも８０及び最も好ましくは少なくとも９０の近接するアミノ酸配列の領域に関係する。最も好ましくは、該アミノ酸配列類似性は、ヒトスタスミンの残基４４〜１３８（配列ＩＤ  ＮＯ：１）に対応するスタスミン様αへリックスドメインに関係し、ＴＬＲ３との相互作用を許すスタスミン様αへリックスのドメインに対応した基本的な構造的特徴が維持されるスタスミン様タンパク質を結果する。
【００６５】
本明細書において用いられる語「アミノ酸配列類似性」は、２つのポリペプチド又はタンパク質の間の類似性の存在を意味する。ポリペプチドは、最大の対応について整列されたときに該２の配列内のアミノ酸の配列がもし同じならば、「類似の」配列を有する。２以上のポリペプチドの間の配列比較は、一般に、配列類似性の局所的領域を同定し且つ比較する為の比較ウィンドウ（comparison window）にわたり２の配列の部分を比較することにより実施される。該比較ウィンドウは、一般に、約１０〜１００の隣接するアミノ酸である。ポリペプチドについての「配列類似性のパーセンテージ」、例えば５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００パーセント配列類似性などは、比較ウィンドウにわたり２つの最適に整列された配列を比較することにより決定されてよく、ここで該比較ウィンドウにおけるポリペプチド配列の部分は、２の配列の最適な整列の為に、（付加や欠失を含まない）参照配列と比較して、単一のアミノ酸又はアミノ酸の群のアミノ酸欠失、アミノ酸改変又はアミノ酸付加を含みうる。該パーセンテージは、（ａ）同一のアミノ酸が両方の配列において現れる位置の数を決定して、マッチする位置の数を得ること；（ｂ）比較のウィンドウ内の位置の全数によりマッチした位置の数を割り算すること；及び（ｃ）該結果に１００を掛け算して、配列類似性のパーセンテージを得ることにより、計算される。比較の為の配列の最適な整列は、既知のアルゴリズムのコンピューター処理された実行により、又は視覚的検討により、実施されうる。配列比較及び複数配列整列アルゴリズムは、インターネット上で、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４を通じて容易に利用可能である。
【００６６】
「誘導体」又は「アナログ」は、（例えば有機化学的または酵素的な）（生物）化学的改変に付される、本明細書において定義されるとおりのスタスミン又はスタスミン様タンパク質として本明細書において定義される。誘導体化は、タンパク質への或る化学基の置換、例えばリン酸化、それにより化合物のＴＬＲ３アゴニストの特徴を維持する、を含みうる。そのような誘導体化は、当技術分野において知られている。該誘導体及びアナログは、或る化学基の置換により、天然のスタスミン又はスタスミン様タンパク質の生物学的活性を維持し且つ、それらがＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の活性を増加させる類似の様式で機能する（すなわちＴＬＲ３アゴニストとして機能する）が、より長い半減期、分解に対する耐性又は増加された活性などの利点を天然の分子に提供しうる。保存的なアミノ酸置換は、例えば脂肪族非極性アミノ酸の群（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、極性非荷電アミノ酸の群（Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、極性荷電アミノ酸の群（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）又は芳香族アミノ酸の群（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）の範囲でなされうる。本発明のスタスミン様タンパク質は、化学的に修飾されてよく、例えば翻訳後に改変されうる。例えば、それらは、グリコシレート化されてよく、又は修飾されたアミノ酸残基を含んでよい。それらは、ヒスチジン残基又エピトープタグの付加により、例えばそれらの精製又は検出を助ける為の当技術分野の当業者によく知られた、いくつかのヒスチジン残基の繰り返し又は他の配列タグにより修飾されてもよい。そのような修飾タンパク質は、語「スタスミン様タンパク質又はそれらの誘導体又は前駆体」の範囲内でもある。語「スタスミン様タンパク質」は、好ましくは、配列ＩＤ  ＮＯ．１において示されたとおりのヒトスタスミンのアミノ酸残基４４〜１３８のαヘリックス構造と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％のアミノ酸相同性を有するαへリックス構造を含むタンパク質として理解されるべきである。スタスミン様タンパク質（ペプチド）の例は、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ及びＲＢ３であり、これらタンパク質の間の相同性及び配列同一性は、実施例１において記載されている。特に、本発明に従うペプチドの誘導体は、（天然又は合成の）合成アミノ酸アナログを包含する。アミノ酸アナログは、類似の分子構造を有する化学物質であり且つ標準的アミノ酸と機能する。例は、脂肪族アミノ酸、単環芳香族アミノ酸、多環式芳香族アミノ酸、単環複素環アミノ酸、多環式異核アミノ酸、側鎖を含有するアミノ及びアルキルアミノ、側鎖を含有するカルボキシル、カルボキサミド及びカルボキシルエステル基、側鎖を含有するグアニジン及びアミジン、側鎖を含有するヒドロキシ及びアルコキシ、側鎖を含有するメルカプト及びアルキルメルカプト、側鎖を含有する他のヘテロ原子、α−イミノ酸、非αアミノ酸（β−アミノ酸等）、脱カルボキシ及び脱アミノ酸を含む。該誘導体は、機能的等価物、例えば修飾されたペプチド、ペプチドアナログ又はペプチド模倣体などを包含する。ペプチド模倣体は、それらの最も広い範囲において、それらの機能的構造においてペプチドと多かれ少なかれ類似であるが、バックボーンに非ペプチド結合又はＤ−アミノ酸も含みうる化合物である。一般に、ペプチド模倣体は、受容体と酵素との相互作用において、天然のペプチドの代用物としての役目をする（Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D.J.A.Crommelin and R.D.Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 138）。ペプチド模倣体の１種類であるシュードペプチドは、アミド結合の代わりにアミド結合アイソスターを含有する化合物である（同書、pp. 137-140）。本発明のペプチドは、ペプチド又は機能的な等価物の塩、例えば医薬的に許容可能な酸−又は塩基付加塩なども包含する。それらは、ペプチド又は機能的等価物の多量体も包含する。天然に発生するアミノ酸の適当なアナログ又は模倣体を選ぶ為の技術は、当技術分野における当業者に良く知られている。例えば、シュードペプチドアプローチは、ペプチドの生物活性を維持しながらペプチドのより高い化学的又は酵素的安定性を達成することをねらう。インビボで速い分解を受けるペプチド結合は、生物学的アイソスター又はアミド結合代理物を形成する為に他の官能基により置換される。生物学的アイソスター基の例は、Ｎ−メチルアミド、チオエステル、チオアミド、ケトメチレン、メチレンアミノ、レトロ−インバースアミド、メチレンチオ及びメチレンオキシ基である（同書、pp. 138-139）。ペプチドの選択性を改善する為のアプローチは、バックボーンに立体構造の制約を導入することであり、これはあり得る受容体又は酵素の相互作用を減じる。該制約は、炭素−炭素二重結合（オレフィンのアナログ）及び環構造の導入により最も頻繁に達成される（同書）。システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）又はバリン（Ｖ）のようなアミノ酸の機能的構造を模倣するアナログを同定する為のさらなる方法は、コンピューターによるモデル化である。好ましい模倣的構造は、該アミノ酸と同様の電荷又は電気陰性度、疎水性及び空間的定位を有する側鎖を有する。
【００６７】
本明細書において用いられる「配列類似性」は、２の（アミノ酸又は核酸）配列の間のパーセント類似性をいう。高度に類似の配列は、多くの同一の又は相同な位置を有しうる。同一の位置は、両方の残基が同一である位置をいい、他方、相同な位置は以下の群のいずれか１つの範囲において１のアミノ酸の他のアミノ酸との交換が生じた位置をいう：１．小さい脂肪族、非極性又はわずかに乏しい残基：アラニン、セリン、スレオニン、グリシン、プロリン；２．極性、負に荷電した残基及びそれらのアミド：アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン；３．極性、正に荷電した残基：ヒスチジン、アルギニン、リジン；４．大きな脂肪族、非極性残基：メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン；５．大きな芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
【００６８】
「前駆体」は本明細書において、類似の活性が少ない又は有さない活性化合物の誘導体であって、そして、例えば体内の消化管又は他の消化系により、活性化合物へと変換されうる上記誘導体として定義される。そのような前駆体は、活性な分子の化学的又は酵素的修飾により入手されうる。
【００６９】
本明細書において用いられる「対象」は、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ又は他の非ヒト哺乳類を含む哺乳類；及び、例えば非哺乳類脊椎動物、例えば鳥（例えばニワトリ又はカモ）又は魚など、及び無脊椎動物を含む、非哺乳類動物を包含するが、これらに限定されない。本発明の局面において好ましい対象は哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００７０】
語「医薬的化合物」、「（医薬的に）活性な化合物」、「（医薬的に）活性な物質」、「治療剤」、「医薬剤」、「医薬」及び「薬剤」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【００７１】
語「医薬的に許容可能なキャリア」は、治療剤の投与の為のキャリアをいう。該語は、該組成物を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自身は誘導しない任意の医薬的キャリアであって、過度の毒性無く投与されうる上記キャリアをいう。医薬的に許容可能なキャリアとして、特定の剤形にとって最も適しており且つスタスミン又はスタスミン様タンパク質と相容性である、任意の溶媒、希釈剤又は他の液体賦形剤、分散助剤又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、封入剤、固体の結合剤又は滑剤が、用いられうる。治療的組成物中における適当な医薬的に許容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体であり得る。リポソームは、医薬的に許容可能なキャリアの定義の範囲内に包含される。適当なキャリアは、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウィルス粒子のような、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子でもありうる。そのような選択的なキャリアは、当技術分野の通常の技術を有する当業者によく知られてもいる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤など、ｐＨを緩衝する物質及びその同様物が、そのような媒介物中に存在しうる。医薬的に許容可能な賦形剤の議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において利用可能である。
【００７２】
本明細書において用いられる語「治療的に有効な量」は、病気又は状態を処置し、改善し若しくは防ぐ為、又は、検出可能な治療的又は予防的効果を示す為の、治療的な剤の量をいう。対象にとって必要とされる正確な有効量は、対象のサイズ及び健康状態、状態の性質及び程度、並びに投与の為に選ばれる治療剤又は治療剤の組み合わせに依存するであろう。従って、前もって正確な有効量を特定することは有用でない。しかしながら、或る状況についての有効量は、慣用の実験により決定されうる。
【００７３】
ＴＬＲ３は、例えば星状細胞及び滑膜細胞のような哺乳類の細胞タイプにおける、組織修復応答の好ましいメディエーターとして本明細書において同定される。ＴＬＲ３により仲介される修復応答は、対立した炎症促進性宿主防御応答よりもむしろ再生応答を一緒に支援する、抗炎症性、抗線維性、血管新生促進性、走化性及び神経保護性の様々なメディエーターの高められた産生からなる。
【００７４】
ＴＬＲ３は、樹状細胞及びＣＮＳミクログリア中の細胞内小胞中に局在化されるが、線維芽細胞及び星状細胞においては、表面に露出された膜タンパク質としてもっぱら発見される。細胞内のとき、ＴＬＲ３は、エンドサイトーシス及びファゴサイトーシスのエンドソーム／リソソーム経路内に関係する多小胞体中に存在する。どの程度まで、局在化におけるそのような違いが種々のＴＬＲ機能に関係するか及びＴＬＲアゴニストへの種々の機能的な応答に関係しうるかは、証明されるべきままである。これが事実かもしれないヒントが、酸性環境によりＴＬＲ情報伝達が増加されることを示し、そしてＴＬＲ３分子の多量体化も要求する最近の研究から現れた。それ故に、或るアゴニストへの、ＴＬＲ３により仲介される応答は、酸性エンドソーム小胞中又は細胞表面での発現におけるその存在により影響されうる。
【００７５】
ＴＬＲ３細胞外ドメインは、一部がグリコシル化された２３のロイシンに富む繰返しから会合した蹄鉄様構造である。細胞外ドメイン二量体構造に一致する、高度に保存されたＴＬＲ３特異的構造が存在する。正に荷電したアミノ酸残基のパッチが、二量体立体配置において互いに向き合うＴＬＲ３細胞外ドメインの表面上に存在し、そしてこれらは負に荷電したリン酸基が並ぶ、延びた棒状の二本鎖ＲＮＡヘリックスにとって適当な接触領域と考えられうる。
【００７６】
本発明者らは、ＴＬＲ３の活性化又はＴＬＲの発現の促進又はＴＬＲ３情報伝達経路の促進が、神経変性プロセスの遅延を結果することを発見した。ＴＬＲ３にとっての治療的に有用なアゴニストを同定する試みにおいて、驚くべきことに、スタスミン及びスタスミン様タンパク質が、非常に適当にそのようなアゴニストを提供することが発見された。
【００７７】
アゴニストの効果を試験することにおいて、本発明者らは、ＴＬＲ３により仲介された応答の活性化が、該修復応答の活性化だけでなく、ＴＬＲ３それ自身の高められた且つ選択的なさらなる発現ももたらすことを発見した。これは、ＴＬＲ３により仲介される応答を自己促進的にする。
【００７８】
十分に興味深いことに、アゴニストとしてのスタスミンの使用は、スタスミンそれ自身も増強し且つ選択的にさらに発現し、この場合もスタスミンにより誘導されたＴＬＲにより仲介される応答を自己促進的にすることを、さらに明らかにした。
【００７９】
本発明はさらに、急性又は慢性の変性炎症プロセスを遅延し又は抑制し且つ／又はそれが必要である哺乳類、好ましくはヒトにおける神経保護性プロセスを刺激する方法に関係し、該方法は、該哺乳類にスタスミン又はスタスミン様タンパク質の治療的に有効な量を投与することを含む。
【００８０】
以下の表において、細胞表面上（星状細胞）又は細胞内（樹状細胞）にＴＬＲ３を発現する、２つの異なるヒトの細胞タイプについてのスタスミンの質的な効果が、集約される。
【００８１】
2009525323.tif 000002
【００８２】
本明細書において開示されるとおり、ＴＬＲ３を活性化する物質又は、スタスミン及び／又はスタスミン様タンパク質及び／又はＴＬＲ３の発現を特異的に促進し且つ／又はスタスミン又はスタスミン様タンパク質とＴＬＲ３との間の機能的相互作用を促進する他の物質が、自己免疫、移植又はグラフト拒絶、炎症、アレルギー応答、他の自己免疫、免疫により仲介される又は外傷に関連する組織変性、組織病及び過度の炎症に対して有効である。従って、本発明は、創傷治癒を可能にし又は促進する為；ニューロンへの損傷又は傷害を含む神経変性疾患を制御する為の使用の方法を開示する。
【００８３】
線維芽細胞様細胞及び他の細胞についての、スタスミン又はスタスミン様タンパク質による制御されたＴＬＲ３活性化は、潜在的に広いさまざまな変性的及び他のヒトの疾患における治療的介入に関係することが、３つの重要な観察から結論付けられうる：
−第１に、とりわけＴＬＲ３関与それ自身を含む、種々の様式で活性化されたとき、培養された成人ヒト星状細胞は、高められた水準のＴＬＲ３を発現する為に顕著な選択を有することが発見された。炎症促進性サイトカイン、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４のアゴニスト、を供給すること又は酸化ストレスを適用することは一般に、ヒト星状細胞上のＴＬＲ３発現の強力な誘導をもたらし、そして、他のＴＬＲファミリーメンバーでは仮にあったとしてもはるかに少ない。
−第２に、ＴＬＲ３活性化への、培養されたヒト成人星状細胞による応答のｃＤＮＡアレイに基づく分析は、そのような活性化（しかしＴＬＲ４活性化ではない）が、広いさまざまな良く知られた抗炎症性、神経保護性、血管新生性及び走化性のメディエーターを誘導することを明らかにした。機能的アッセイにおいて、一緒に、これらＴＬＲ３により誘発される因子が、脳切片培養物におけるヒトニューロンの生存を促進し、内皮細胞成長を刺激し且つ星状細胞成長（グリオーシス）を抑制することが実証された。従って、星状細胞によるＴＬＲ３により仲介される情報伝達は、炎症促進性宿主防御応答を開始するよりもむしろ修復及び再生を促進することにおいて機能的であるとみえる。類似の応答が、ヒト滑膜細胞においても観察された。
−第３に、ヒト脳腫瘍により産生された遺伝子産物のスクリーニングによる潜在的な内因性ＴＬＲ３アゴニストの探索において、本発明者らは驚くべきことに、ＴＬＲ３アゴニストの候補としてのスタスミンの配列を同定した。星状細胞を活性化するためのこの遺伝子産物の能力は、完全長の組み換えヒトスタスミンにより模倣され、そして、ＴＬＲ３依存性であることが、ＴＬＲ３欠損マウスからの星状細胞を活性化するためのスタスミンの欠乏を示すことにより及び我々のＴＬＲ２又はＴＬＲ４により仲介される効果を支配することにより示された。従って、スタスミン及びスタスミン様タンパク質は、少なくとも星状細胞において、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を活性化し、そして、そうするときに様々な抗炎症性又は組織修復のメディエーターの産生を活性化する。該データは、スタスミンへのＴＬＲ３の応答が、少なくとも或る程度自己増幅的であることも示す。何故なら、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達は、ＴＬＲ３自身のより高い水準を誘導し且つ種々の神経細胞タイプにおけるスタスミン発現を促進するからである。
【００８４】
スタスミンは、２４もの負に荷電したアミノ酸を含有する９４のアミノ酸の保存されたいわゆるスタスミン様αヘリックスドメインを共有する４つのホスホプロテインのファミリーの創始メンバーである。スタスミンは、微小管形成の調節において重要な役割を果たし、そして、ＣＮＳにおいてニューロン及びグリア細胞の両方により、比較的高い水準でそれらは発現される。本発明は、これまで二本鎖ＲＮＡにとっての受容体としてだけ作用すると知られている、ＴＬＲファミリーメンバーであるＴＬＲ３にとって、スタスミンがアゴニストとして作用することを開示する。ヒト線維芽細胞様細胞上で、特にＣＮＳの星状細胞上で活性化されたとき、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達は、神経保護性、抗炎症性、血管新生性及び走化性の機能を有するさまざまなメディエーターの産生をもたらす。類似の応答が、関節リウマチの発症において重要である線維芽細胞様細胞であるヒト滑膜細胞について開示される。ＴＬＲ３が、ヒト肥満細胞において抗アレルギー応答を仲介することも知られている。従って、本発明は、ＴＬＲ３により仲介される該修復様応答を活性化することにより、スタスミン及びスタスミン様タンパク質がＣＮＳ疾患、関節炎、アレルギー及び急性又は慢性の組織変性に関係する他の疾患において広い治療的可能性を有し得ることを明らかにする。
【００８５】
スタスミンは、ホスホプロテインファミリーの一般的な分子であり、脊椎動物のあいだで高度に保存されたタンパク質  ＳＣＧ１０（Superior  Cervical  Ganglion  10タンパク質；スタスミン−２）、ＳＣＬＩＰ（ＳＣＧ１０−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；スタスミン−３）及びＲＢ３（スタスミン−４）を包含する。例えば、１４９アミノ酸のヒトスタスミン配列は、唯一のアミノ酸だけによりラットの配列から異なり、そして２の残基だけによりマウススタスミンから異なる。タンパク質のスタスミンに関連があるファミリーの種々のメンバーは、特に膜との相互作用に関して、細胞内ターゲティングに関係する可変のＮ−末端配列を含有する。スタスミン様タンパク質のファミリーの共通の特徴は、チューブリンと相互作用する著しく長いαヘリックス構造である、保存されたスタスミン様ドメインである。結果として、スタスミンファミリーメンバーは、微小管ダイナミクスを調節することの機能的活性を共有もする。スタスミン及びスタスミン様タンパク質の保存された非常に長いＣ−末端αヘリックスが、この構造ファミリーのメンバーに、ＴＬＲ３の細胞外ドメインと相互作用することを許す重要な構造的特徴であることを推測することは魅力的である。この連続的なヘリックスは、ヒトスタスミン配列において、残基４４から残基１３８へと延びる。従って、それは約９５アミノ酸にわたって延び、長さにおいて約１４０Åのわずかにだけ曲がった棒状構造を形成する。特に、負に荷電したアミノ酸がこのスタスミン様ドメインにおいて豊富であるので−全残基の約２５％を占める−、この構造は興味深いことに、二本鎖ＲＮＡヘリックスの延びた棒状構造を連想させ、そしてＴＬＲ３の結晶構造により提示されたとおりＴＬＲ３の細胞外ドメインにとってのリガンドとして同様に適当であるとみえる。
【００８６】
ヒトにおいて、スタスミンは、中枢神経系、精巣及び胸腺において比較的高い水準で発現され、そして、その発現は、神経新生の間で特に顕著であり且つ損傷に応答して高められる（以下を参照されたい）。さまざまな他の器官においても、スタスミンは発現されるが、上記の器官におけるよりも少なくとも１０倍低い水準で発現される。スタスミンの発現水準は、哺乳類の体内で免疫特権部位として一般的に認められ且つ強力な局所的抗炎症能力を要求するそれらの重要器官において最も高いことが顕著である。胸腺は、自己抗原に対する中心的な免疫学的寛容の為のプログラムにおいて重要であり、そして、この器官におけるスタスミンの高い発現は、それに対する適応免疫の有効な制御を確保する。ヒトにおけるスタスミンの顕著な胸腺での発現の結果として、健全な免疫額的寛容が分子の為に存在することが期待される。ヒトへのスタスミンの投与は、それ故に、細胞性又は体液性（抗体）免疫応答を誘発しそうになく、これはその潜在的な治療的用途を考慮したときに重要な利点である。
【００８７】
神経系におけるスタスミンの優勢は、他の器官におけるよりも約１００倍高い水準でヒト中枢神経系において発現される、関係するスタスミン様タンパク質  ＳＣＧ１０（スタスミン様２）及びＲＢ３（スタスミン様４）についてさらにより明白である。ＳＣＧ１０は特に、ニューロン特異的であるとみえ且つ軸索及び樹状突起の成長円錐の膜に蓄積する傾向にある。いくつかのデータは、中枢神経系におけるスタスミン水準が、年齢の増加に伴い徐々に減少すること及び外傷により誘導された、スタスミンの高められた発現が鈍くなることを示す。げっ歯類においても、スタスミンは胎生期の又は新生時期の脳において広く発現されるが、その発現の水準は、発生の間で次第に減少する。大人のラットの脳において、免疫反応性は、グリア前駆細胞及び神経前駆細胞を産むことにおいて特に重要な役割を有する成体の脳室下帯（ＳＶＺ）のような高度に増殖性の領域においてだけ維持される。脱髄性状態への応答においても、ＳＶＺ内の細胞は、このグリア原性能力を再度獲得する。グリア前駆細胞の発生及び／又は遊走におけるそのあり得る機能と一致して、スタスミンはインビトロでの乏突起膠細胞分化の間に下方制御され且つＭＳ患者の脳内の乏突起膠細胞において再度発現される。これは、脱髄の動物モデルにおけるその高められた発現と同時に起こる。スタスミンは、乏突起膠細胞体の内側にだけでなく、ミエリン膜と密接に付随して蓄積する。脱髄に応答した明白なスタスミンから離れて、スタスミン又はそのファミリーメンバーの増加した発現は、実験的な皮質障害及び舌下神経傷害の適用後のラットにおいても実証されている。ラットの皮質ニューロンの培養物において、スタスミンはシクロヘキシミドにより誘導されたストレス、熱ストレス及びグルタメートアンタゴニストＭＫ８０１への応答において誘導される。培養された乏突起膠細胞において、スタスミン発現は、ＴＮＦ−α及びＴＧＦ−βを含むメディエーターにより誘導される。ラット網膜神経節細胞において、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、軸索切断後に選択的にＲＢ３を誘導する。それゆえ、興味深いことに、スタスミン及びスタスミン様タンパク質の発現は、ＴＬＲ３活性化に応答した星状細胞により産生されるＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＣＮＴＦのようないくつかの因子により少なくとも一部において、これらの種々の神経細胞において誘導される（以下を参照されたい）。これらの観察は、ＣＮＳにおいてスタスミン−ＴＬＲ３相互作用を促進する正のフィードバックメカニズムの存在を示唆する：星状細胞上のＴＬＲ３活性化は、他の神経細胞においてスタスミン発現を促進するいくつかの因子の分泌をもたらしながら、同時に（この場合において最初はＩＦＮ−βを通じて）それはＴＬＲ３発現それ自身も促進する。
【００８８】
蓄積する機能的データに加えて、脊椎動物におけるスタスミン発現のパターンは、従って、スタスミンファミリーのさまざまなメンバーが、特に中枢神経系の損傷又は外傷に応答した、発生、成熟、及び機能的な調節において相補的な役割を果たすことを、強力に示唆する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるスタスミン発現の抑制は、神経成長因子により誘導される、ラットＰＣ１２細胞の交感神経系様ニューロンへの分化を妨げる。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるスタスミンの発現の減少は、新しいニューロンの、吻側の遊走性の流れを経由してのＳＶＺから嗅球への遊走を抑制する。特にＣＮＳにおけるスタスミンの重要な役割と一致して、マウスにおけるスタスミン遺伝子の不活性化は、年をとった（２０月齢）マウスにおいて軸索変性症をもたらす。また、スタスミン欠損マウスが扁桃体の外側核において長期間の増強の不足を示し、恐怖条件付けにおける減少された記憶を結果することが、最近示された。スタスミン欠損マウスはさらに、自然な悪環境において普通に生じる生得的な恐怖における欠如を示した。驚くべきことにそれゆえ、スタスミンは、生得的な及び学習された恐怖を統制する分子メカニズムにおいて重要な役割を果たすとみえる。
【００８９】
これらの効果以外に、マウスにおけるスタスミン発現の除去は、全体の欠如を産生するように見えない。おそらく、（特にＣＮＳにおける）種々のスタスミンファミリーメンバーの存在が、それらが４つのスタスミン様ファミリーメンバーの一つだけの産生を欠くときに、スタスミンの損失を補い、そしてマウスにおける機能的不利を限定する。そのような余剰は、単独のスタスミンに関係する遺伝子だけ（Ｄ−スタスミン遺伝子と呼ばれる）が存在すると知られているショウジョウバエ（Drosophila）において存在しない。Ｄ−スタスミンは、脊椎動物スタスミンと構造的に相同であり、且つ、非常に類似の分子特性及び生物化学的特性を示す。また、ショウジョウバエスタスミン遺伝子のイントロン／エキソン接合は、脊椎動物におけるそれらと同じであり、共通の祖先を示唆し、そして脊椎動物におけるＲＢ３遺伝子についてのように、ショウジョウバエスタスミン遺伝子はいくつかのスプライス変異体をコードする。ショウジョウバエ胚発生の間、Ｄ−スタスミンの発現は主に、遊走する生殖細胞並びに中枢及び抹消神経系のニューロンに限定される。早期ショウジョウバエ胚におけるＤ−スタスミン発現は、マウス又はアフリカツメガエルにおけるスタスミンのそれと類似する。Ｄ−スタスミンは、有糸分裂が非常に活発であり且つ微小管が非常にダイナミックであるときに、高度に且つ均一に、胚発生の非常に初期で細胞膜形成の前に発現される。胚発生の間、胞胚期の終了後、Ｄ−スタスミンは生殖細胞並びに中枢及び末梢神経系の細胞においてだけ発現される。このパターンは、脊椎動物スタスミンについてみられるそれと、非常に類似する。ショウジョウバエにおいて、ｓｉＲＮＡによるスタスミン発現の抑制は、神経系においてだけ、劇的な欠損をもたらす。正常な胚において、腹神経索の軸索の多くは、交連の繰り返しパターンにおいて組織化される。他方、ｓｉＲＮＡにより処理された胚において、交連の形成は生じることがなく又は欠損している。末梢神経系も影響される。従って、Ｄ−スタスミンは、主に神経突起及び軸索の形成に関連する様式において、ドロソフィラ神経系の分化及び成熟のさまざまな段階で、決定的に重要である。
【００９０】
スタスミン発現の転写的及び／又は翻訳的調節は、部分的にだけ書面に書かれている。スタスミン遺伝子の配列分析に基づき、転写因子Ｅ２Ｆ（位置−７０１〜−６９４；−２８〜−２１；−１９〜−１１及び７１５〜７２２）、ｓｐ１（−１２３〜−１１４；−９７〜−８８；７６０〜７６９、７８９〜７９８及び８７１〜８８０）、及びＡＰ−２（−２３１〜−２２３及び−２０７〜−１９８）についての推定上の結合部位が、存在する。Ｅ２Ｆの調節役割は、遺伝毒性ストレスへの応答において、より詳細に書面に書かれた。Ｅ２Ｆは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株においてスタスミン発現の下方制御を仲介する（Polager and Ginsberg, J Biol Chem 278: 1443-1449 [2003]）。ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３−Ｍにおいて、スタスミン遺伝子中のＥ２Ｆ部位は、遺伝子産物の過剰発現にとって必須であるとみられた。それゆえに、特に、種々の細胞タイプにおいてＥ２Ｆにより仲介される調節は明らかに種々の様式において発現水準に影響することができるが、Ｅ２Ｆはスタスミンの水準を制御するために重要であるとみえる。
【００９１】
限定された情報が、ヒトにおける神経変性疾患の間のスタスミン発現について利用可能である。多発性硬化症の典型となる炎症性脱髄性病変におけるスタスミンの著しく高められた水準と対照的に、スタスミンの水準は、正常な脳と比較するとアルツハイマー病に関連する病変においてより低いとみえる。しかしながら、アルツハイマーと正常な脳の間のスタスミン水準の違いは、比較的穏やかである。Okazaki及び同僚達は、アルツハイマーの脳において濃縮体（tangle）にだけ関連するが、斑と関連しない、スタスミン及びＳＣＧ１０の減じられた水準及び変化した細胞内分布を報告した。そのような穏やかな減少は、他のものによっても注目される。筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルにおいても、スタスミン水準は、正常よりも低くみえる。合わせて、これらのデータは、スタスミンの高い水準が、多発性硬化症の間に見られるとおりの炎症により誘導され、そしてスタスミンのより低い水準が、外傷又は損傷へ適切に応答する為の脳の能力が危うくされる状態と関連することを示唆する。
【００９２】
適用の分野
本発明は、スタスミン又はスタスミン様タンパク質が、星状細胞による、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達にとってのアゴニストとして作用できること、及びこの特性が、抗炎症応答及び組織修復応答を、そのようなことが必要とされるときに活性化する為に用いられうることを開示する。ＣＮＳに関して、これは例えば、慢性又は急性神経変性疾患（本明細書に記載されたそれらを含むが、それらに限定されない）の損傷効果が対抗される必要がある場合である。星状細胞におけるＴＬＲ３により仲介される情報伝達経路の活性化は従って、スタスミン又はスタスミン様タンパク質を用いたＴＬＲ３の連結により直接的に又はＴＬＲ３に関係する下流の情報伝達分子の一つと関係する他の活性化段階により間接的に、ＣＮＳ疾患において有益な効果を有することが期待される、さまざまな、星状細胞由来の神経保護性、再生性及び抗炎症性の因子の産生をもたらすであろう。以前の報告と一致して、我々のデータも、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達が、星状細胞に対しＴＬＲ３それ自身のより高い水準の発現の誘導をもたらすであろうことを確認する。同時に、ＴＬＲ３活性化に応答して分泌されるいくつかの因子が、スタスミン及び／又はスタスミン様タンパク質の発現を促進する。これらの観察は、スタスミン／ＴＬＲ３相互作用が自己促進性であるという考えを支持する。
【００９３】
ＴＬＲ３アゴニストの同定
【００９４】
現時点で、二本鎖ＲＮＡの複数のバージョンが、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を活性化するためのそれらの能力について知られる。ＴＬＲ３により仲介される情報伝達経路を活性化することができる追加の化合物を同定するための方法は、天然に又はＴＬＲ３をコードする遺伝子構築物による形質転換後にＴＬＲを発現する細胞において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を観測するスクリーニング分析を含む。そのような方法は、最近、文献において詳細に記載された。好ましい実施態様において、スクリーニング分析についての読み取りは、天然の遺伝子の使用又は代替的にＴＬＲ３情報伝達経路に反応する、形質転換された又は別の方法で人工的に導入されたリポーター遺伝子構築物の使用に基づく。該分析にとって特に有用なリポーター遺伝子及びリポーター遺伝子構築物は、例えばＮＦ−κＢ又はＩＲＦ−３に感受性のプロモーターに動作可能に連結されたリポーター遺伝子を含む。ＴＬＲ３感受性プロモーターに動作可能に連結されたリポーターー遺伝子は、限定なく、酵素（例えばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、バイオルミネセンスマーカー（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）、表面に発現される分子（例えば線維芽細胞成長因子受容体）、及び分泌される分子（例えばＣＸＣＬ８、ＭＩＰ−２α、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦ−α）を含みうる。酵素活性読み取りに依存する分析において、基質は、分析の一部として供給されてよく、そして検出は、化学発光、蛍光、発色、放射性ラベルの取り込み、薬剤耐性、又は酵素活性の他のマーカーを含みうる。分子の表面発現に依存する分析について、検出は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析又は機能的分析を用いて達成されうる。分泌される分子は、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）又はバイオアッセイを用いて分析されうる。これら又は他の適当な読み取り系は、当技術分野で良く知られており、そして市販入手可能である。そのような分析を用いて、ＴＬＲ３により仲介される修復因子産生を活性化する化合物を同定する為に、機能的ＴＬＲ３は、好ましくはインビトロで、試験化合物と接触される。そのような化合物は、レポーター細胞と接触されたときに、ＴＬＲ３により仲介される応答を誘導することができる天然又は合成の化合物である。ＴＬＲ３に選択的に結合し且つＴＬＲ３情報伝達経路を誘導するそのような試験化合物は、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、リポポリサッカライドを含む脂質、オリゴサッカライド及びポリサッカライドを含む炭水化物、及び小分子を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
試験化合物として用いられうる化合物のライブラリーは、様々な商業的供給者から入手可能であり、それらは、コンビナトリアルケミストリー技術を含む当技術分野で良く知られた技術を用いて注文に応じて作成されうる。特にハイスループットスクリーニング方法（そのような方法は特にスクリーニングの自動化されたマルチチャンネル方法を含む）と一緒に、試験化合物の大きなライブラリーが、本発明の方法に従い選抜されうる。大きなライブラリーは、１００、１０００、１００００、１０００００及び１００００００さえの化合物を含みうる。
【００９６】
従って、好ましい実施態様において、試験化合物のスクリーニングの方法は、例えばアレイに基づく分析システム及び少なくとも１の自動化又は準自動化段階を組み込むことにより、ラージスケールで及びハイスループットで実施されうる。例えば、該分析は、マルチウェルプレートの配置に適したマルチウェルデリバリー装置を用いた体系的な様式で、細胞が夫々のウェルに分配され且つ試薬が添加される、複数ウェルプレートを用いて構成されうる。ハイスループットスクリーニング分析における使用に適当な手動及びロボットのマルチウェルデリバリー装置は、当技術分野の当業者によりよく知られている。それぞれのウェル又はアレイエレメントは、特定の試験条件、例えば試験化合物への、１対１の様式でマップされうる。読み取りは、このマルチウェルアレイ中で、好ましくはマルチウェルプレート読み取り装置又は同様物を用いて、実施されてもよい。そのような装置の例は、当技術分野において良く知られており、そして、市販の供給元を通じて入手可能である。サンプル及び試薬操作は、スクリーニング分析のスループット能力をさらに増す為に自動化されてよく、ダース、１００、１０００、又は１００００００さえの並行の分析が１日又は１週間で実施されうる。完全なロボットシステムは、合成化合物のコンビナトリアルライブラリーの産生及び分析のような適用についての当技術分野において知られている。代替的に、ＴＬＲ３ポリペプチドへの試験化合物の結合が直接的に測定されてもよい。例えば、放射性ラベル化試験物質が、ＴＬＲ３ポリペプチドへの試験化合物の結合が観測されうるように、ＴＬＲ３ポリペプチドと一緒にインキュベートされうる。典型的には、放射性ラベル化試験物質は、ポリペプチドを含有する細胞膜と一緒に、平衡が達せられるまでインキュベートされうる。該膜は、次に、結合しなかった試験物質から分離されてよく、そして、放射能含有量がシンチレーション計数により測定されることを許す為に、シンチレーション流体中に溶解されてよい。試験物質の非特異的な結合が、飽和濃度の非放射性リガンドの存在下における実験を繰り返すことにより測定されてもよい。好ましくは、試験物質のさまざまな濃度による実験を繰り返すことにより結合曲線が構築される。
【００９７】
本明細書において用いられるとおり、好ましいＴＬＲ３アゴニストは、
−スタスミン、ＴＬＲを活性化するその誘導体及びその前駆体、
−スタスミン様タンパク質、ＴＬＲ３を活性化するそれらの誘導体及びそれらの前駆体、
−スタスミンのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＣＧ−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：２）、ＳＣＬＩＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：３）及びＲＢ３のアミノ酸配列（配列ＩＤ  ＮＯ：４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド鎖を含有するタンパク質性化合物
から成る群から選ばれる。
【００９８】
上記の化合物は全て、ＴＬＲ３を活性化する能力を示す。ＴＬＲ３の構造は、Choeらにより２００５年に記載された（Science, 2005 Vol. 309 (5734):581-5）。彼らは、２．１オングストロームのヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン構造が、２３のロイシンに富む反復（ＬＲＲ）から組み立てられた大きな馬蹄型ソレノイドを明らかにすることを発見した。２４残基ＬＲＲモチーフにおいて保存されたアスパラギンは、ソレノイド安定化の為の広い水素結合ネットワークに寄与すると発見された。ＴＬＲ３はさらに、炭水化物により大部分が隠されていることが発見されたが、１の面がグリコシル化フリーであり、これはリガンド結合及びオリゴマー化における潜在的な役割を示唆した。高度に保存された表面残基及びＴＬＲ３特異的ＬＲＲ挿入は、結晶中でホモ二量体のインターフェースを形成することが発見され、そして、正に荷電した残器の２つのパッチと第二の挿入が、例えば二本鎖ＲＮＡにとっての適切な結合部位を提供すると考えられた。理論にとらわれることを望まないが、負に荷電した大量のグルタミン残基を含む、スタスミンのαヘリックスは、二本鎖ＲＮＡ及びｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ分子としてこの領域において同等に結合できると考えられる。
【００９９】
それ故に、スタスミン誘導体、スタスミン様タンパク質又はそれらの誘導体、又は実際に何らかの化合物が、ＴＬＲ３を活性化することができるかどうか及びそれ故にＴＬＲ３により仲介される応答を誘発できるかどうかを評価する為に、Choeらにより記載された（上記参照）リガンド結合部位に結合する分子の能力、すなわち、正に荷電した残基の２のパッチが一緒に結合する分子の能力を試験しうる。当業者は、例えば薬剤設計において現在用いられるタンパク質／リガンド相互作用の３Ｄ視覚化又は仮想現実モデルを用いてタンパク質間の相互作用を試験することによる、インシリコでのこの能力を試験する様々な可能性に気づくであろう（Morphy and Rankovic. 2005. J.Med.Chem. 48(21):6523-43;  Raitio et al.2005. Review.Curr.Med.Chem. 12:1217-1237;  Salo et al. 2004. J.Med.Chem. 47:3048-3057; Salo, et al. 2005. J Med Chem. 48:7166-71;  Tervo et al. 2003. J. Comp. Aid. mol. Des. 17:797-810;  Warren et al. 2006. J.Med.Chem. 49(20):5912-31を参照されたい。内容は、引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１００】
ＴＬＲ３アゴニストの使用方法
【０１０１】
スタスミン及び／又はスタスミン様タンパク質そのままのようなＴＬＲ３アゴニストを使用することに加えて、本発明は、スタスミン及び／又はスタスミン様タンパク質のようなＴＬＲ３アゴニストのインビボでの促進も予想する。スタスミン又はスタスミン様タンパク質のようなアゴニスト化合物と、星状細胞上のＴＬＲ３アゴニストとの間の相互作用の有益な結果を促進する為に、様々な戦略が予想されうる。第１に、該アゴニストは、それらが様々な組織へアクセスし且つ、線維芽細胞様細胞（星状細胞、滑膜細胞）、上皮細胞、肥満細胞、マクロファージ又はマクロファージ様細胞及び樹状細胞又は樹状細胞様細胞のような標的細胞によって表面又は細胞内に発現されたＴＬＲ３を活性化することができるような様式で投与されうる。正常な条件下では、末梢部に投与されたタンパク質のＣＮＳへのアクセスは、脳及び脊髄実質への血液感染性物質の通過を厳しく制限する血液脳関門の存在の故に、非常に制限される。しかしながら、炎症性ＣＮＳ疾患において、この関門の活性化及び結果としての部分的な破壊がよく実証されていることが、注目されるべきである。それらの条件下における血液脳関門の活性化され且つ部分的に破壊された状態は、例えばスタスミンタンパク質の分子量をはるかに超える分子量の血液由来タンパク質の、内皮バリアを通ってＣＮＳ組織への「漏出」を許す。従って、特にＣＮＳにおける進行中の炎症の解剖学的領域（ＴＬＲ３発現も増加され且つ治療的介入が向けられるべき領域）において、末梢のタンパク質によるアクセスは、強力に高められる。第２に、とりわけＣＮＳの細胞において、スタスミン又はスタスミン様タンパク質のようなアゴニストの発現のより高い水準を誘導し又は常在細胞によるアゴニストの表面露出又は分泌さえを促進する物質が投与されてよく、従ってＴＬＲ３により仲介される情報伝達の局所的な活性化を促進する。第３に、ＴＬＲ３との相互作用のためのアゴニストの機能的構造エレメントの形成を促進し及び／又は安定化する物質（スタスミンの場合は残基４４〜１３８の間の延びたαヘリックス構造を大抵含む）が投与されうる。第４に、線維芽細胞様細胞（星状細胞、滑膜細胞）、上皮細胞又は肥満細胞のような標的細胞上のＴＬＲ３の発現のより高い水準を誘導する物質が投与されうる。本発明は、これが有益な応答に寄与しうることを開示する。実際に、ＩＦＮ−βはすでに、この効果を有し且つ多発性硬化症の間の臨床的に有益な様式で作用すると知られるそのような物質のひとつの例である。第５に、線維芽細胞様細胞（星状細胞、滑膜細胞）、上皮細胞、肥満細胞又は樹状細胞のような標的細胞において、ＴＬＲ３により仲介される選択的情報伝達経路を活性化する物質が投与されうる。
【０１０２】
本発明の局面において用いられる、スタスミン、スタスミン様タンパク質又は、スタスミン発現、そのヘリックスの安定化、ＴＬＲ３発現又は、ＴＬＲにより仲介される情報伝達を促進する何らかの物質は、複合体化されず、結合形態化されず、すなわち、遊離の形態で、他の（生物学的）分子と共有結合的に連結されないで用いられうるが、例えばＣＮＳのような標的組織への輸送を促進する為に、又は、その生物学的半減期を増す為に設計された複合体化形態で用いられてもよい。本発明の局面において、スタスミンとスタスミン様タンパク質との組み合わせを使用することも可能である。
【０１０３】
原則として、全てのあり得る源のスタスミン及びスタスミン様タンパク質は、本発明の局面及び実施態様における使用に適当である。例えば、適当なスタスミン及びスタスミン様タンパク質は、植物から、動物から又は微生物、例えば酵母などから、入手されうる。それらは、それらの源において天然に代謝産物として産生され、又はそれらにおいて組み換えタンパク質として産生されうる。スタスミン及びスタスミン様タンパク質は、これらの生物から単離されてよく又は純粋でない形態で、すなわち豊富な画分として、又は（組み換え）酵母のような微生物の場合、完全な生物体又はその画分を取ることにより用いられうる。さらに、本発明に従う医薬組成物又は例えば栄養補助組成物（すなわち食品又は補助食品）における使用の為に、スタスミン及びスタスミン様タンパク質は、他の適当な源、例えば乳、卵、大豆、酵母、バクテリア、藻類、植物、肉、脳などから単離されてよく、又は合成的に調製されてよい。
【０１０４】
スタスミン及びスタスミン様タンパク質は、例えば（有機）溶媒による抽出、クロマトグラフィー分離、沈殿、結晶化及び／又は酵素的又は化学的加水分解により、当業者に既知の方法により、上記源から抽出されうる。スタスミン又はスタスミン様タンパク質の単離は、例えば、スタスミン結合性タンパク質を用いることにより起こりうる。
【０１０５】
本発明の組成物中に用いられるスタスミンは、天然の又は組み換えの源から精製されてよく、又は市販で購入されうる。組み換えスタスミンは、例えばCurmi et al.(1994) Biochem. J. 300:331-338により記載されたとおりに産生され且つ精製されうる。代替的に、組み換えスタスミンが、当技術分野でよく知られた方法を用いてＥ．ｃｏｌｉのような生産株において生産されるところの手順を使用しうる。例えば、スタスミンの完全な又は一部のコード配列を含む完全長ｃＤＮＡが合成的に調製されそして適当な発現系に連結されてよく、生産株における発現にとって適当なプロモーターの制御下で、スタスミンの完全な又は一部のコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を算出する。適切なポリヌクレオチド構築物は、例えばSambrook et al., (1989) Molicular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)において記載されたとおりの標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて精製される。該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばバクテリア、酵母、昆虫、両生類及び哺乳類の系を含む任意の発現系において発現される。適当なベクター及び宿主細胞は、米国特許第５，６５４，１７３号明細書において記載される。
【０１０６】
バクテリアにおける発現系は、Chang et al., Nature (1978) 275:615、Goeddel et al., Nature (1979) 281:544、Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8;4057、欧州特許第０，０３６，７７６号明細書、米国特許第４，５５１，４３３号明細書、DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1983) 80:21-25、及びSiebenlist et al., Cell (1980) 20:269において記載されたものを含む。
【０１０７】
バクテリア細胞中で生産が起こったとき、該組み換えスタスミンは、抽出バッファー中でのスタスミンを発現する組み換えバクテリアの超音波処理、該超音波処理された培養物の低速度上清に１００ｍＭ  ＮａＣｌを補うこと、及び該混合物を１００℃で三分間加熱すること、続いて超遠心により、生産株から精製されうる。次に、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２を用いたゲル濾過が、スタスミンの純粋な調製物をもたらし、それは水性バッファー中で濃縮されてよく、そして、冷蔵環境において保存されうる。
【０１０８】
ペプチド又は機能的等価物の塩は、既知の方法により調製され、典型的には、酸付加塩を形成する為に医薬的に許容可能な酸と又は塩基付加塩を形成する為に医薬的に許容可能な塩基と、ペプチド又はペプトイドとの混合を含む。酸又は塩基が医薬的に許容可能かどうかは、該化合物の特定の意図された使用方法を考慮して、当技術分野の当業者により容易に決定されることができる。例えば、インビトロでの診断組成物にとって許容可能である酸及び塩基の全てが、治療的組成物にとって用いられることができるわけではない。意図された使用方法に依存して、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、桂皮酸、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、過塩素酸、リン酸及びチオシアン酸のような有機酸及び無機酸を含み、これはペプチド及び機能的等価物の遊離アミノ基とのアンモニウム塩を形成する。ペプチド及び機能的等価物の遊離カルボキシル基とカルボン酸塩を形成する、医薬的に許容可能な塩基は、エチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン及び他のモノ−、ジ−及びトリアルキルアミン、並びにアリールアミンを含む。さらに、医薬的に許容可能な溶媒も包含される。
【０１０９】
スタスミン、スタスミン様タンパク質又は、スタスミン発現、そのへリックスの安定化、ＴＬＲ発現又は、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を促進する何らかの物質が、標準的な医薬的に許容可能なキャリア及び／又は医薬的分野において慣用の賦形剤と一緒に処方されうる。これらの化合物は、口、口腔、肛門、肺、鼻腔、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、局所的、皮下、舌下、病巣内を介するような腸内又は非経口経路により投与されてよく、又は、組織の間質腔へ又は他の適当な投与経路へ輸送されうる。
【０１１０】
当業者は、タンパク質分解酵素による分解の故の治療的タンパク質／ペプチドの乏しい口内バイオアベイラビリティー、乏しい膜透過性及び大きな分子サイズの結果として、治療的タンパク質／ペプチドは大抵非経口的（注射可能な）調製物として投与されることを知っている。しかしながら、経口経路は、非経口的な投与より好ましいだろう。なぜなら、それは、自己投与にとってより簡便であり、非侵襲であり且つより患者に優しいからである。結果として、経口経路を通じた最適なバイオアベイラビリティを達成する為に、タンパク質及びペプチド薬剤の吸収の程度を最大化するための努力が、過去二十年間にわたり活発化した。適当な経口輸送システムは、該タンパク質／ペプチドが放出される最大吸収の領域にそれが到るまで、薬剤を保持し且つその完全性を維持する。当業者は、投与の様々な経路の効果を評価する為に、様々な薬物動態研究を実施しうる。一般に、製品の薬物動態を評価することに関する治療的タンパク質についての要件は、従来の製品についてと同じであるが、タンパク質の固有の特徴に関する特定の考慮が要求される。薬物動態（吸収、分布及び排出）は好ましくは、適切な母集団における、単回投与及び定常状態の間に特徴付けられる。しかしながら、薬物動態要件は、タンパク質のタイプに依存して異なりうる。
【０１１１】
スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質又はそれらの誘導体若しくは前駆体は、それらを必要とする対象に、予防的又は治療的理由の為に、任意の投与形態で提供されうる。例えば食品製品、食品補助物又は医薬調製物の形態における、ＴＬＲ３により仲介される修復応答を開始することができるそのような投与全てを成し、それにより特にＴＬＲ３活性化の神経保護性効果の行使が考慮される。該医薬調製物は、カプセル、錠剤、トローチ剤、糖衣錠、丸薬、液滴、座薬、粉末、スプレー、ワクチン、軟膏、ペースト、クリーム、吸入、パッチ、エアロゾル、点滴として、輸液として、注射、及び同様物の形態でありうる。典型的には、該治療的組成物は、液体溶液又は懸濁物として注射剤として調製される；注射に先立つ液体媒体中の溶液又は懸濁物に適当な固体の形態も調製されうる。さらに他の代替的な実施態様において、スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質又は本発明の組成物は、対象の体内に挿入された放出制御マトリックス又は徐放性マトリックスから投与されうる。
【０１１２】
スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質、又はそれらの誘導体若しくは前駆体に加えて、本発明の医薬組成物は、適当な医薬的に許容可能なキャリア、及び任意的に追加の医薬的に許容可能な賦形剤を含みうる。
【０１１３】
治療的処理の為に、スタスミン又はスタスミン様タンパク質は、上で記載されたとおりに入手され又は製造されてよく、そして、それらが必要な対象に投与されうる。スタスミン又はスタスミン様タンパク質は、任意の適当な経路により、好ましくはそのような経路に適合される医薬組成物の形態で且つ意図される処置にとって有効な用量で、対象に投与されうる。疾患を処置する為、例えばヒト又は動物の対象の体内の過度の炎症の予防及び／又は処置の為に必要とされる、スタスミン又はスタスミン様タンパク質の治療的に有効な用量は、例えば動物モデルを用いることにより、当業者により容易に決定されうる。
【０１１４】
上記で述べられたとおり、本明細書で用いられる語「治療的に有効な量」は、組織悪化プロセスを軽減する若しくは防ぐ為又はＴＬＲ３により仲介される修復応答を誘導する為、又は、検出可能な治療的又は予防的効果を示す為の治療物、すなわちスタスミン又はスタスミン様タンパク質の量をいう。該効果は、例えば、運動機能又は挙動のような、組織変性から結果する臨床的兆候の測定により、組織学的検査による組織変性の直接評価により、又は生物学的流体又は組織サンプルにおける組織変性に関係するバイオマーカーの水準を観測することにより、又は当業者にそれ自体既知である、炎症の進行又は重症度を評価する任意の他の適当な方法により、検出されうる。対象にとっての正確な有効量は、対象のサイズと健康状態、状態の性質と程度、及び投与の為に選ばれる治療物又は治療物の組み合わせに依存するであろう。従って、予め正確な有効量を特定することは有益でない。しかしながら、或る状況についての有効量は、慣用の実験により決定されることができ、そして臨床医又は実験者の判断の範囲内である。臨床医が最初の用量を確立することを認める方法は、当技術分野で知られている。投与されるべき用量は、安全且つ有効でなければならない。
【０１１５】
本明細書において記載される医薬、医薬組成物、食品又は食品補助物の治療的効果を達成する為の用量は、当業者により容易に決定されうる。投与されるべき化合物の用量は、様々なパラメーターに従い、特には用いられる物質；処置されるべき患者の年齢、体重及び状態；投与の経路；及び要求される投与計画に従い、決定されうる。医師は、或る特定の患者について、要求される投与の経路及び用量を決定することができるであろう。
【０１１６】
適当な用量の投与計画を進展することにおいて、当業者は、動物モデルにおけるｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃの治療的効果についての利用可能な研究により手引きされうる。例えば、Fitzgeraldら（J. Immunol 2006 Vol.177:7505-7509）は最近、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃを用いた、多発性硬化症（実験的な自己免疫の脳脊髄炎又はＥＡＥ）についての標準動物モデルにおける変性炎症病の処置についてのそのような研究を記載した。慢性麻痺疾患ＥＡＥは、自己の脳抗原に対するＴ細胞の反応性により引き起こされ、これはげっ歯類又は霊長類においてそのような脳抗原による免疫により誘発される。通常は、該病気は、免疫後２週間で明白となり、そしてその後、慢性の再発寛解過程をとる。該病気の実験的誘導後５、７及び９日でのＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃによるマウスの処置は、ほとんど完全に続く病気の発展を阻止する。この効果は、ＴＬＲ３活性化により誘導され且つＩＦＮ−βを含む抗炎症性メディエーターにより大部分は仲介される。
【０１１７】
そのような試みは、スタスミン及びスタスミン様タンパク質についての適当な治療的用量の投与計画を調査することにおいても用いられうる。例えば、スタスミン及び／又は１以上のスタスミン様タンパク質が、フォスフェート緩衝生理食塩水中に溶解され、該溶液は、それぞれの注射について、マウス当たり１００マイクログラムの１回分で、腹腔内注射により投与される、。注射は、次に例えば、Fitzgeraldら（上記参照）により記載されたのと同じ様式で、２日毎に、３回実施され、病気を誘導する為の動物の免疫後５日に開始する。Fitzgeraldら（上記参照）により記載された実験において用いられるｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃの１回分は、体重の約５ｍｇ／ｋｇであるとみられた。
【０１１８】
ヒトにおいて、腹腔内注射は許容可能でないが、筋肉内、皮下、口又は静脈内の投与のような、他の体系的な投与経路が、非常に適当な代替方法である。マウスとヒトとの間の表面対体重比を考慮する場合、ヒトにおいて同等だろうｍｇ／ｋｇの１回分は、マウスにおけるよりも１２．６倍少なく、すなわちヒトの対象の約０．４ｍｇ／ｋｇである。これまで得られたインビトロでのデータは、同じ重量用量でのスタスミンは、種々の細胞タイプにおける抗炎症性メディエーターを誘導することにおいて、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃと少なくとも同程度の効果だろう。ヒトにおいて治療的に有効な用量は従って、マウスにおいて実施された比較されうる実験に基づき、０．４ｍｇ／ｋｇ体重のこの水準の前後であろうと見積もられうる。
【０１１９】
本発明の目的に関して、有効な一日の用量は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．５μｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ治療的タンパク質／ｋｇそれが投与される個体の体重。典型的な１日の用量は、化合物の活性、処置されるべき対象の年齢、体重及び状態、病気のタイプ及び重症度、並びに投与の頻度及び経路に従い、体重のｋｇ当たり約０．１〜５０ｍｇである。好ましくは、１日の投与量水準は、５ｍｇ〜２ｇである。
【０１２０】
上記で記載されたとおりの医薬組成物において、スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質、又はそれらの誘導体若しくは前駆体は、該組成物の全重量に基づき、０．０１〜９９．９（乾燥）重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましくは０．０１〜５重量％の量で用いられる。
【０１２１】
本発明はさらに、対象における卒中、血液量減少性ショック、外傷性ショック、再灌流傷害、多発性硬化症、ＡＩＤＳに関係する認知症、神経毒性、アルツハイマー病（ＡＤ）、頭部外傷、急性脊髄損傷、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び関係するシヌクレイン病、ジストニア、トゥレット症候群、前頭側頭型認知症（ＦＴＤｓ）及び関係するタウオパシー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）及びクロイツフェルトヤコブ病に関係する他の疾患のようなプリオン疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三塩基反復病、運動ニューロン病、進行性核上性麻痺、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）並びに癌から成る群から選ばれる神経変性疾患の予防及び／又は処置の為の医薬組成物の調製の方法であって、医薬組成物中に医薬的に許容可能なキャリアと一緒に、活性な物質としてスタスミン若しくはスタスミン様タンパク質、又はそれらの誘導体又は前駆体を処理又は組み込むことを含む上記方法に関係する。
【０１２２】
医薬組成物の調製物は、フィラー、結合剤、滑剤及び任意的に他の賦形剤のような別の成分全てを、スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質又はそれらの誘導体若しくは前駆体と一緒に混合すること、及び得られた該混合物を医薬調製物へ処理することにより、非常に適当に生じうる。
【０１２３】
本発明に従う医薬組成物は、１以上のスタスミン又はスタスミン様タンパク質を含むことに加えて、１以上の他の医薬的に活性な化合物を含みうる。非常に適当な追加の医薬的に活性な化合物は例えば、追加の抗炎症性化合物、抗ウィルス剤、感染性プリオンに対する抗体及び、変性炎症疾患、特には神経変性及び／又は神経炎症性疾患の処置の為に一般的に用いられる他の治療的化合物である。追加の医薬的に活性な化合物を含む好ましい医薬組成物は、一緒にされた調製物の形態をとる。
【０１２４】
本発明は特に、スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質、又はそれらの誘導体若しくは前駆体と、神経毒性であり又は神経組織を害するとして認められる医薬とが一緒にされた調製物に関係する。そのような一緒にされた調製物の利点は、該医薬により（すなわち医薬的化合物により又は該化合物を含む医薬的調製物中に含まれる賦形剤により）加えられるような神経組織への害が、該調製物中のスタスミン又はスタスミン様タンパク質の存在の結果として相当に減少されることである。一緒にされた調製物は、少なくとも２の別の調製物の形を有しうる、スタスミン又はスタスミン様タンパク質を含む少なくとも１の調製物及び神経を害する医薬を含む少なくとも他の調製物、これら２の別の調製物は、一緒にまとめられそして、同時の、別の又は逐次の使用について意図される。しかしながら、好ましくは、本発明に従う一緒にされた調製物は、スタスミン又はスタスミン様タンパク質と神経を害する医薬とを一緒に、一つの調製物の形中に含む。
【０１２５】
従って、本発明は、一般的な言葉でいうと薬剤又は薬剤賦形剤により誘導される神経毒性又は神経組織損傷の予防又は抑制、好ましくは薬剤の急性又は慢性の使用に関係する過度の炎症から生じる神経毒性又は神経組織損傷の予防又は抑制を意図する。神経毒性に関係する薬剤及び賦形剤の例は、鎮痛剤（例えばオピオイド）、抗うつ剤、痛み、精神障害又は人格障害に対処する薬剤、睡眠疾患に対処する薬剤、癌の対処において用いられる細胞増殖抑制剤である。これらの例は、しばしば或る水準の炎症と関連して神経毒性効果を引き起こしうる医薬である。
【０１２６】
他の局面において、本発明は、治療における同時の、別の又は逐次の使用のための一緒にされた調製物の製造の為の、スタスミン若しくはスタスミン様タンパク質又はそれらの誘導体若しくは前駆体と、炎症を引き起こす又は炎症を増大すると認められる医薬との使用に関係する。
【０１２７】
一般的な言葉でいうと、スタスミン誘導性のＴＬＲ３仲介の応答は、「創傷治癒」として定義されてよく、これは、細胞増殖、遊走、分化及び細胞外マトリックス成分の産生の統合された段階に関する複雑な過程である。（上記で詳述されたとおり）星状細胞及び滑膜細胞におけるＴＬＲ３活性化により誘導されるメディエーターの生物学的機能の本理解に基づき、これらのメディエーターは、創傷治癒の過程にとって支持的である。ＴＬＲ３により活性化された星状細胞及び滑膜細胞により産生される因子のいくつかは、ＣＮＳ又は関節以外の種々の器官及び組織において良く知られた修復機能を有する。それ故に、ＴＬＲ３により仲介される応答を選択的に活性化する化合物の投与は、これら器官の外側での創傷治癒誘導性についても予想されうる。本明細書において用いられる語「誘導性」は、本明細書において記載されたとおりの、組織又はその一部の形成にとって必要な細胞のメカニズム又はプロセスの活性化、刺激、増強、開始及び／又は維持、修復プロセス又は組織展開をいう。これは、対象において、創傷に有効量のスタスミン又はスタスミン様タンパク質又は、ＴＬＲ３により仲介される応答を活性化することができる他の物質を接触させることにより達成されうる。対象は、何らかの哺乳類、好ましくはヒトでありうる。該接触は、局所的又は全身的でありうる。局所的な投与の例は例えば、創傷と、スタスミン、スタスミン様タンパク質又は他のＴＬＲ３アゴニストを含むローション、膏薬、ゲル、クリーム、ペースト、スプレー、懸濁物、分散物、ヒドロゲル、軟膏、又はオイルとを接触させることを包含する。全身的な投与は例えば、スタスミン、スタスミン様タンパク質又は他のＴＬＲ３アゴニストを含む組成物の静脈内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内の注射を包含する。ＴＬＲ３を活性化するそのような化合物の投与は、外傷性損傷に続き又は関節炎、骨粗しょう症及び他の筋骨格疾患、熱傷、潰瘍及び他の皮膚損傷、末梢神経病及び、虚血及びアテローム性動脈硬化症を含む循環器疾患を含む状態において、有益な効果を産しうる。本発明の方法及び組成物により処置されうる他の可能性の或る組織は、表皮、目、尿−生殖器、胃腸、心臓血管、筋肉及び結合組織を包含する。
【０１２８】
本発明は、抗炎症性、抗線維性又は再生応答が有益であるところの広いさまざまな他の疾患において適用されてもよい。これらの疾患は、さまざまな器官の線維性疾患、アレルギー、及び、関節、胃腸管、膵臓、皮膚、粘膜組織及び肺を含むさまざまな器官の炎症性変性疾患を含みうるが、これらに限定されない。
【０１２９】
実施例
【０１３０】
実施例１．ＴＬＲ３活性化が、器官型脳切片培養において星状細胞の成長を抑制し、内皮細胞の成長を刺激し且つニューロンの生存を促進する。
【０１３１】
げっ歯類とヒトとの間のいくつかの異なるＴＬＲファミリーメンバーの発現及び機能の両方において現れる違いを前提とすると、ＣＮＳ疾患についてのげっ歯類モデルからのデータは、追加の支持的な証拠なしで、ヒトの状況に直接に当てはめられることはできない。この問題を回避する為に、我々は、ドナーの死後すぐに死後脳サンプルから得られた、培養されたヒトの星状細胞におけるＴＬＲ機能を研究することを選択した。そのような星状細胞は、インビボでのヒト星状細胞から区別できない（特に炎症経路の調節における）多くの形態学的及び機能的特性を示す。これらの培養されたヒト成人星状細胞の細胞生物学的特徴は、従って、構築するための有用な概念的枠組みを提供するために、成人ヒト脳におけるインビボでのそれらの挙動を十分に代表すると考えられる。
【０１３２】
用いられた材料と方法
【０１３３】
ヒト脳サンプル
【０１３４】
ヒト脳材料が、臨床学的によく記述され且つ神経病理学的に確認された患者及び対照から死後標本を供給するＮｅｔｈｅｒｌａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋの迅速な剖検システムを通じて得られた。剖検は、書面のインフォームドコンセントがドナー又は直系の最近親者から得られたドナーについて実施された。サンプルは、年齢、性別、季節的変化、概日変動、死亡時刻及び投薬について管理された。死後因子は、剖検の遅延、保管時間及び側性を含む。サンプルは、ｐＨによる死戦状態の観測により品質についても管理された。、パーキンソン病の症例から得られた図５Ａ及び５Ｂの実験を除き、すべての実験について、対照からの脳材料が用いられた。
【０１３５】
ヒト成人星状細胞及び内皮細胞の単離及び培養
【０１３６】
死後の皮質下白質サンプルからの成人ヒト星状細胞が単離され、そして以前に記載されたとおりに培養された（Bsibsi et al., J Neuropath Exp Neurol 61:1013-1021 [2002]）。星状細胞にとっての細胞マーカー（グリア細胞線維性酸性タンパク質；ＧＦＡＰ）及びミクログリアにとっての細胞マーカー（ＣＤ６８)の特異的な染色により決定されたとおり、星状細胞培養物は実質的に均一であった；原則として、全ての細胞はＧＦＡＰを発現し、そして、それらのいずれもがＣＤ６８を発現しなかった。必要とされたときは、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を活性化するために夫々、５０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）又は２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム州、ドイツ連邦共和国）により星状細胞は刺激された。これらの用量は、星状細胞における最大の効果に基づき選ばれた。市販のＬＰＳ調製物中の混入物がもしかすると、用いられたＬＰＳ調製物によりＴＬＲ４に加えていくらかのＴＬＲ２活性化をもたらしうるが、ＴＬＲ３の活性化はもたらさないだろうことが注目されるべきである。サイトカインにより刺激されたとき、星状細胞は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β（夫々５００Ｕ／ｍＬで）、ＩＬ−４（２５０Ｕ／ｍＬで）、ＩＬ−６（２００Ｕ／ｍＬで）、ＩＬ−１２（５０ｎｇ／ｍＬで）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍＬで)及びＴＧＦ−β（１２．５ｎｇ／ｍＬで）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州）を補われた。対照ｃＤＮＡアレイプロファイリング実験は、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ処理の前３０分間及びｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ処理の間の、５０μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド又は２００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−β（Ａｖｏｎｅｘ）による処理を含んだ。内皮細胞（ＵＶＥＣ）は、臍帯から単離されそして２０ｎＭのＨＥＰＥＳ、１０％ヒト血清、１０％加熱不活性化ＮＢＣＳ、１５０ｍｇ／ｍＬのＥＣＧＦ、５Ｕ／ｍＬのヘパリン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補われたＭ１９９中でゼラチンコート化の皿上で培養された。
【０１３７】
ヒト星状細胞及びヒト内皮細胞の増殖が、３時間の生存細胞によるＷＳＴ−１の転化（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により測定され、そして４９０ｎｍでの光学密度を測定することにより定量された。
【０１３８】
リアルタイムＰＣＲ
【０１３９】
全細胞内ＲＮＡが、前に記載されたとおり（Bsibsi et al., [2002] 上記参照）、ＲＮＡ−Ｂｅｅ（商標）を用いて単離された。続いて、ＲＮＡは、ｃＤＮＡへと逆転写され、そしてＴＬＲ１〜１０の水準及び参照としてのβ−アクチンの水準が、定量的リアルタイムＰＣＲにより決定された。以下の蛍光発生的分子ビーコン及びプライマー（Ｂｉｏｌｅｇｉｏ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が用いられた：
2009525323.tif 000003
βアクチンビーコンは、５’フルオレセインＶＩＣ及び３’消光剤Ｄａｂｃｙｌとを含有した。ＴＬＲ１〜４ビーコンは５’フルオレセインＦＡＭと３’消光剤Ｄａｂｃｙｌとを含有した。温度のサイクルは、５分間の９５℃と、３０秒間の９５℃、２０秒間の５６℃、２０秒間の５６℃及び３０秒間の７２℃の４０サイクルとから成る。ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施された。データは、配列ディテクターバージョン１．７ソフトウェアを用いて分析された。
【０１４０】
器官型脳切片培養物
【０１４１】
器官型ヒト脳切片培養物は、以前に記載されたとおりに（Verwer et al., FASEB J.16:54-60[2002]）用意されそして分析された。手短に言うと、組織塊が、種々の死後の皮質サンプルから集められ、そして、２００μｍ切片が作られた。これらの切片が、５０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又は２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳのいずれかの存在下において星状細胞を培養する際に得られたｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化又はＬＰＳ馴化星状細胞培地中で、１週間培養された。対照として、同じドナー由来の非処理星状細胞馴化培地が用いられた。全ての星状細胞馴化培地は、４８時間後に回収されそして−２０℃で保存された。切片培養物中のニューロンの生存能が、カルセイン−ＡＭ及びエチジウムブロマイドホモダイマー−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて評価された。Ｚｅｉｓｓ  ４１０  Ｉｎｖｅｒｔ  共焦点レーザー走査型顕微鏡が、切片を視察する為及び染色を定量する為に用いられた。
【０１４２】
ｃＤＮＡアレイプロファイリング
【０１４３】
星状細胞のｍＲＮＡプロファイルの分析が、以前に記載されたとおり（Meeuwsen et al., Glia 43:243-253[2003]）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ／ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ａｔｌａｓ（商標）アレイについての３２Ｐ−ラベル化ｃＤＮＡのハイブリッド選抜により実施された。２６８のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子（受容体）遺伝子の夫々についてのハイブリダイゼーションシグナルは、繰返しの測定の平均として計算され、製造者により提供されたソフトウェアを用いて背景強度について補正され且つ定量された。相対的な発現は、これらのハイブリダイゼーションシグナルを、全部で９つのハウスキーピング参照遺伝子について対応するアレイ上の平均シグナルにより割り算ることによって計算された。
【０１４４】
発現シグナルは、これらの発現の相対的水準の、非処理対照培養物において見られたそれらに対する比±平均の標準誤差として表される。遺伝子プロファイリングは、４つの異なる対照ドナーからの星状細胞を用いて実施された。
【０１４５】
ｃＤＮＡバンクスクリーニング
【０１４６】
Ｃｏｓ−７細胞（９６ウェルプレート中のウェル当たり２５，０００細胞）が、リポフェクタミンを用いて、ヒト脳腫瘍（髄膜腫、乏突起細胞腫、ＩＩ型及びＩＶ型星状細胞腫、並びに髄芽細胞腫を含む５のプールされた腫瘍；ＮＣＩ  ＣＧＡＰ  Ｂｒｎ３５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のｃＤＮＡの７６８のプールにより５時間形質転換され、その後細胞は完全に洗浄された。緑色蛍光タンパク質をコードするｃＤＮＡによる形質転換が、形質転換効率ついての内部標準として用いられた。形質転換された細胞の４８時間の継続した培養後、夫々の培養物上清の７５μＬが回収され、そして、７５μＬで、ウェル当たり１０００細胞で播種された、培養されたヒト星状細胞に添加された。４８時間の培養後、上清が回収され、そしてＥＬＩＳＡを用いてＣＸＣＬ８放出について評価された。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃによる星状細胞の刺激は、全ての場合についてＣＸＣＬ８放出について陽性対照として役目を果たし、非処理Ｃｏｓ  ７培養物上清は陰性対照として役目を果たした。
【０１４７】
マウス星状細胞又は形質転換されたＨＥＫ２９３細胞を用いた追加の対照実験が、前に記載されたとおり、いくつかの他の研究グループによりに実質的に実施された。
【０１４８】
統計的方法
【０１４９】
図２における全てのデータは、平均±標準偏差として表される。集団は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較され、そしてｐ値が事後多重比較検定により計算された。器官型脳切片培養物中のニューロンの生存能の統計学的有意性を評価する為に、ノンパラメトリック  クラスカル−ワリス検定が、夫々の顕微鏡視野中の生存する又は死んだニューロンの絶対計数に適用された。ｐ値＜０．０５が、統計学的に有意と考えられた。
【０１５０】
結果
【０１５１】
サイトカイン又はＴＬＲアゴニストに応答したヒト星状細胞における優先的なＴＬＲ３誘発
【０１５２】
６の異なるドナーに由来する培養された成人ヒト星状細胞のＴＬＲ発現プロファイルが、ＲＴ−ＰＣＲにより試験された。いくらかのドナーとドナーとの差異を考慮すると、コンフルエント後の星状細胞は主に、ＴＬＲ２及びＴＬＲ３のより低い水準を伴い、ＴＬＲ４を発現する（図１Ａ）。ＴＬＲ１の発現水準は該して非常に低いが、分析された６の培養物すべてにおいて、ＴＬＲ５〜１０の発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって実質的に検出不能であった。ＴＬＲ発現水準は、次に、さまざまなサイトカインにより活性化された同じドナーからの細胞の発現水準と比較された（図１Ｂ）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４又はＩＬ−６による刺激の後に、最大で３６０倍の、ＴＬＲ３の著しく選択的な誘導が観察された。他のＴＬＲは誘導されず、そしていくつかの場合では抑制さえされ、これは特にＴＬＲ２について明白であった。ＴＬＲ３の誘導は、抗炎症性サイトカインＴＧＦ−β及びＩＬ−１０による星状細胞の処理後に見られなかった。ＴＬＲ３発現の高められた水準の誘導は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を活性化するための、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（二本鎖ＲＮＡの合成的模倣体）による又はＬＰＳによる星状細胞の刺激後にも観察された。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又はＬＰＳによる刺激の後、ＴＬＲ３の最大で４００倍の誘導及び、いくつかの場合はＴＬＲ２の誘導も、観察されたが、概して、他のＴＬＲの発現は変化しなかった。ＴＬＲ２の誘導は、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又はＬＰＳによるＴＬＲ活性化の間接的な効果である。何故なら、それはシクロヘキシミド（タンパク質合成阻害剤）により抑制されうるのに対し、ＴＬＲ３の誘導はこの処理に非感受性であったからである（図２B）。酸化的なストレスを誘導する為のＨ２Ｏ２への曝露の後も、ＴＬＲ３の選択的な誘導が観察された（データは示されていない）。
【０１５３】
これらのデータは、成人ヒト星状細胞の限られたＴＬＲプロファイルについての、以前に発行されたデータを拡張し、そして炎症促進性サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト又は酸化的ストレスによる活性化の際の、培養された細胞上のＴＬＲ４の著しい発現及びＴＬＲ３の著しく強力且つ選択的な誘導を明らかにする。これは、後期の多発性硬化症障害の炎症性環境内で、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４が、神経膠症の星状細胞上に顕著に存在するのに対し、それらは健康な脳において免疫組織化学的検査によって検出できないという、我々の以前の観察と完全に一致する。興味深いことに、星状細胞は、それらの細胞表面にだけＴＬＲ３及びＴＬＲ４を発現し、これは、樹状細胞又はミクログリアのような他の細胞タイプにおけるこれらのＴＬＲのもっぱら細胞内局在と対照をなす。図３A及び３Bにおいて集約されたとおり、これらのデータは、胎児のヒト及びマウスの星状細胞上のTLR３発現を確認する他のグループによる最近の報告と大部分は一致する。
【０１５４】
ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ及びＬＰＳにより刺激されたヒト成人星状細胞の遺伝子プロファイリング
【０１５５】
活性化された星状細胞上のＴＬＲ３及びＴＬＲ４の優勢な発現は、遺伝子プロファイリングにより、これら２のＴＬＲファミリーメンバーにより仲介される機能的な応答を試験することを、我々に促した。発現シグナルは、星状細胞機能の変化に重要である、２６８のサイトカイン、ケモカイン、成長因子及びそれらの受容体についてのｃＤＮＡアレイ分析により評価された。星状細胞応答の試験におけるこれらｃＤＮＡアレイの検証は、我々により以前に実証された。星状細胞は、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＬＰＳ又は両方のアゴニスト一緒の存在下において培養され、そして４８時間後、遺伝子発現プロファイルが、非処理の同時実行されている培養物におけるそれらと比較された。図９は、４つの別の実験からの平均化されたデータを集約し、夫々の場合で異なるドナーに由来する細胞を用いた。結果は、いくつかのケモカイン、抗炎症性サイトカイン及びサイトカイン受容体と一緒に、成長、分化及び神経保護のさまざまなメディエーターを、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃは誘導したがＬＰＳは誘導しなかったことを明らかにする。以前の報告（Doyle et al., Immunity 17:251-263[2002]、Doyle et al., J.Immunol. 170:3565-3571[2003]）と一致して、Ｉ型インターフェロン産生のメディエーターも誘導された。３つの他の遺伝子型だけが、少なくとも２の因子により下方制御されることが発見された。これらは、ＶＥＧＦ受容体２（発現の比  ０．２２）、ＥＲＢＢ４受容体タンパク質チロシンキナーゼ（０．４３）及びＳｍｏ（０．４８）を含んだ。強力な炎症促進性メディエーターＩＬ−１２及びＩＬ２３のｐ４０サブユニットは、大抵２のファクターにより下方制御された。
【０１５６】
ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導された遺伝子産物のいくつかは、良く知られた神経保護のメディエーターである。脳に由来する神経栄養性因子は例えば、皮質のニューロンにおける樹状突起形成を調節し、そして、感染性の損傷及びアポトーシスからニューロンを保護する。ニューロトロフィン−４は、神経の生存、分化及び成熟を促進する（Poo, Nat Rev Neurosci 2: 24-32[2002]）を促進する。同様に、グリア成長因子１及び２並びにプレイオトロフィンは、グリア細胞及びニューロンの生存及び分化を支持し、そして、エフリンＢ型受容体１は、遊走を導き、そして新たなニューロンの結合性を促進する。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘発される他のメディエーターは、マウスにおけるウィルス誘導性脱髄を減少し、細胞死からニューロンを保護し、そして星状細胞の増殖を抑制するＴＧＦ−β２である。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導される神経保護性メディエーター、繊毛神経栄養性因子及び白血病抑制因子も、再ミエリン化を促進するそれらの能力について良く知られている。この特定の機能は、Ｊａｇ１の１．９６の因子と付随するｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより仲介される下方制御により支援されそうである。これらの神経保護性及び修復性メディエーターと一緒に、いくつかの成長及び分化因子も誘導され、ＧＭ−ＣＳＦ、胚性成長／分化因子１及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）−Ｃを含む。後者は、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃによっても誘導されるＣＸＣＬ８のような強力な血管新生性分子である。
【０１５７】
これまでほとんどの注目は、種々のＴＬＲの、炎症促進性サイトカインを誘発する能力に与えられてきたが、星状細胞のｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ活性化は、主に強力な抗炎症性サイトカインを誘発することがわかる。星状細胞における（並びに滑膜細胞における）ＴＬＲ３活性化への最も顕著な応答の一つは、急性及び慢性の組織損傷、特に関節炎のいくつかのモデルにおいて評価されたとおり強力な抗炎症性産物である、腫瘍壊死因子により刺激される遺伝子６（ＴＳＧ−６）の１０倍を超える誘導である。ＴＬＲ３により仲介される応答の抗炎症性特徴はさらに、ＩＬ−９の７．５倍の誘導、ＩＬ−１０の２．３倍の誘導及びＩＬ−１１の３．２倍の誘導により支持され、これら３つ全ては、よく知られた抗炎症性サイトカインである。これら３つのサイトカインのいずれも、ＬＰＳにより誘導されない。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ及びＬＰＳの両方とも、ＴＮＦ−αを誘導した。このメディエーターはしばしば、典型的な炎症促進性メディエーターとしてみなされるが、特にヒトのＣＮＳにおいて、その機能的な役割は変化し、しかも抗炎症性となりうる。これらのメディエーターの誘導に付随して、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃは、星状細胞のＴＬＲ３により仲介された応答の全体の抗炎症性特徴をさらに強調するＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのほぼ２倍の下方制御をもたらす。実験の時間の範囲内で、Ｉ型インターフェロンは、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより顕著には誘導されなかったが、インターフェロンコンセンサス配列結合性タンパク質及びインターフェロン調節因子−１のようなＩＦＮＩ型合成の上流レギュレーターの誘導が見られた。これは、ＴＬＲ３に応答した星状細胞によるＩ型ＩＦＮ産生が起こりそうだが、応答の比較的遅くに起こりそうであることを示唆する。ＴＬＲ３機能におけるＩＦＮ−βの一般的な中心的な役割に注目することも興味深い。ＩＦＮ−βだけでなく、いくつかの実験的細胞系におけるＴＬＲ情報伝達の際に放出される主な産物も、ＴＬＲ３それ自身の高められた発現を誘導する。同時に、ＩＦＮ−βは、神経変性疾患多発性硬化症において証明された有益な効果を有する治療剤である。これはそれ自身において、星状細胞が最も豊富な細胞でありかつ優先的にＴＬＲ３を発現する（ＴＬＲ３発現の間の自己増幅性ループ）ＣＮＳにおいて、ＴＬＲ３活性化及びＩＦＮβ産生が有益なメカニズムの一部を形成するという考えを支持するとみえる。
【０１５８】
遺伝子産物のなかで、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ２及びＣＣＬ３を含むいくつかのケモカインが、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ並びにＬＰＳにより強力に誘導される。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃは、より低い程度であるが、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ６、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２の誘導ももたらすが、ＬＰＳはもたらさない。一般的に、ケモカインの主な機能的関連性は、炎症と白血球の補充についてである。しかしながら、ＴＬＲ３により誘発される上記のケモカイン全てについて、星状細胞及びニューロンの両方とも機能的な受容体を発現することが注目されるべきである。これは、ＣＮＳ内の、神経の細胞の遊走の調節及び組織再形成を調節するためのこれらのケモカインのより特定の関連性を強調する。この考えを支持するために、ＣＸＣＬ８及びＣＸＣＬ２も、ＩＦＮ−βによって星状細胞においてで強力に誘導される。シクロヘキシミド処理と一緒に、ＩＦＮ−βの影響が、ＴＬＲ３により誘発されるメディエーターによる星状細胞についてのあり得る間接的効果を排除するために対照としてｃＤＮＡアレイにより試験された（データは示されていない）。驚くべきことに、ＩＦＮ−βも、多発性硬化症における治療的剤である。この状態に対するその有益な効果は、炎症促進性シグナルとして主に働く、ＩＦＮ−βにより誘導されるＣＸＣＬ８及びＣＸＣＬ２と調和させるのは困難だろう。この理由のためから、上記のＴＬＲ３により誘導されるケモカインは、炎症を促進するよりも、ＣＮＳそれ自身内での神経の細胞の遊走を主に調節しそうであるという考えを我々は好む。
【０１５９】
図９から明らかなとおり、ＬＰＳは、星状細胞においてはるかにより限定された応答を誘導し、そして、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導される多くの神経保護性メディエーター及び抗炎症性ケモカインを活性化する能力を欠く。ＬＰＳ及びｐｏｌｙ  Ｉ：ｃの組み合わせも、非常に限定された程度でだけ、星状細胞のｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより仲介される刺激を模倣する。
【０１６０】
ＴＬＲ３により誘発されるメディエーターは、星状細胞の成長を抑制し、内皮細胞の成長を刺激し且つニューロンの生存を促進するが、ＴＬＲ４に誘発されたメディエーターはそうでない
【０１６１】
ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の活性化への複数の側面を持った応答を前提とすると、誘導されたメディエーターの機能的関連性を額面どおりだけで評価することは困難である。それ故に、機能的な分析が、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又はＬＰＳによる刺激に続き、種々の時間で回収された星状細胞培養培地により実施された。そのようなｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化培地及びＬＰＳ馴化培地が、精製された星状細胞及び内皮細胞の成長に対するそれらの効果について試験された。加えて、器官型ヒト脳切片培養物中でのニューロンの生存能に対するそれらの効果が試験された。
【０１６２】
ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化星状細胞培地は、３日の培養期間にわたり約３５％だけ星状細胞増殖を抑制したが、ＬＰＳ馴化培地は抑制しなかった（ｐ＜０．００３：図４Ａ）。そのような抑制は、培養培地が僅か２時間後に回収されたときには観察されなかったので、この効果は、馴化星状細胞培地中の残余のｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより得ないが、細胞により分泌されたメディエーターの組み合わせられた作用を反映する。もしかすると、ＴＧＦ−β２及びインスリン成長因子結合性タンパク質６（図９参照）は、種々の細胞タイプの増殖を抑制する以前に記述されたそれらの能力を前提とすると、抗増殖性効果において役割を果たす。星状細胞の成長は、損害を与える損傷から健康な組織を素早く封鎖するためのメカニズムとしてみなされうるＣＮＳにおける傷害への共通の応答である、グリオーシスの主要な特徴である。しかしながら、それは機能不全の瘢痕組織を結果し、そして、弱まるグリオーシスは、ＣＮＳ外傷の動物モデルにおける改善された機能的な回復を許すと知られている。これは、線維症（傷害に応答して瘢痕形成をする為の線維芽細胞様細胞の素早く且つ豊富な成長）が、皮膚、肝臓及び肺を含む、同様の他の組織への外傷又は損傷後の正常に機能しない回復と関係するので、ＣＮＳに独特であるとみえないことが注目されるべきである。非常にしばしば、瘢痕形成の程度の減少は有益と考えられ、そして改善された機能的回復を許しうる。従って、抗線維症薬剤又は剤は、広いさまざまなヒトの疾患において治療的物質として重要な可能性を保持する。ＴＬＲ３活性化への星状細胞及び滑膜細胞の応答の間の類似性を前提とすると、該応答の抗線維性効果は、他の細胞タイプ及び組織へと同様に広がり、スタスミン又はスタスミン様タンパク質が、広いさまざまな適用にとって抗線維性物質として役目を果たしうることを示唆する。
【０１６３】
良く知られた血管新生性メディエーターＶＥＧＦ−Ｃ及びＣＸＣＬ８のｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化培地における存在と一致して（図９参照）、これらの培地は３日間にわたりヒト内皮細胞の成長を有意に促進した（ｐ＜０．００３；図４Ｂ）。これらの成長促進性効果は、陽性対照として用いられた組換え線維芽細胞成長因子−２の効果と同様であった。明らかに、ＣＮＳにおける血管新生は、傷害への有益な応答と考えられる。ＣＮＳにおいて特に、栄養及び酸素の十分な流入を確保する為の最適な血液供給が、決定的に重要である。
【０１６４】
最後に、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化培地及びＬＰＳ馴化培地が、器官型ヒト脳切片培養物中のニューロンの生存に対するそれらの効果について試験された。そのような培養物は、１週間維持され、そして、ニューロンの生存がカルセイン−ＡＭ及びエチジウムブロマイドホモダイマー−１により評価された。これは、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ馴化培地を補われた切片培養物中のニューロンの生存が有意に改善されたが、ＬＰＳ馴化培地ではそうでないことを明らかにした（ｐ＜０．０３；図５）。新たに添加されたｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃを有する対照培地における器官型ヒト脳切片の培養は、ニューロンの生存を同等に良く促進した（図５Ｃ）。これは、そのような切片との関連においても、局所的な星状細胞が、培養の間にｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより活性化されて、神経保護性メディエーターを産生すること、及び他の神経細胞タイプについてのいずれのＴＬＲ３活性化もこの保護に干渉しないことを示唆する。
【０１６５】
上記のデータからの主な結論は、アストログリアのＴＬＲ３は、ＴＬＲ４と異なる応答を仲介し且つさまざまな神経保護因子、血管新生因子、ケモカイン及び抗炎症性サイトカインの産生に関係することである。これらのＴＬＲ３により仲介される産物の良く知られた特性と一致して、ＴＬＲ３活性化の際に培養物中の星状細胞により産生されるメディエーターの一緒のコレクションは、星状細胞の成長を抑制し、内皮細胞成長を刺激し、そして重要なことには、器官型能切片培養物におけるニューロンの生存を促進する。これらの効果のいずれもが、星状細胞培養物上清からの、ＴＬＲ４により誘発されるメディエーターのコレクションを用いて、観察されなかった。星状細胞中において、ＴＬＲ３により仲介される応答のそのような有益な且つ広い神経保護的特質は、ＭＳ病変におけるアストログリアのＴＬＲ３発現が、後期病変において特に顕著でありそして活性な病変において存在すると知られる炎症促進性メディエーターによって少なくとも培養された星状細胞中に誘導されるという観察と一致するとみえる。従って、星状細胞（ミクログリアでない）上のＴＬＲ３が、進行中の炎症反応を強めるよりもむしろ炎症に対する応答としての修復を促進することにおいて役割を果たすようによりみえる。ＭＳにおけるその有益な効果について知られるＩＦＮ−βは特に、他のＴＬＲによるよりも、ＴＬＲ３による情報伝達においてはるかにより重要な役割を果たす。ＩＦＮ−β放出及び続く、ＩＦＮ−βにより誘導されるＴＬＲ３発現は、多くの細胞タイプにおけるＴＬＲ３により仲介される応答の、重要な自己増幅性要素を表す。星状細胞において、ＴＬＲ３活性化に応答したＩＦＮ−βの産生は、本研究において観測された４８時間の培養期間の間で有意な水準に達さなかったので、おそらくゆっくりとした応答である。しかしながら、我々は、最終的にＩ型インターフェロン産生を誘導すると期待されうる因子の誘導を観察した。
【０１６６】
スタスミンは、新規のＴＬＲ３アゴニストとして作用する
【０１６７】
従って、上記のデータは、豊富なＴＬＲ３発現が、炎症性メディエーターへの応答としてヒト星状細胞上に誘導されること、及びＴＬＲ３により仲介される情報伝達は、強力な抗炎症性応答を活性化すること、並びに神経保護、修復及び再生プロセスを促進するものを示唆する。活性化された星状細胞の表面上のＴＬＲ３の選択的且つ強力な誘導とは際立って対照的に、唯一の既知のＴＬＲ３にとってのアゴニスト、すなわち二本鎖ＲＮＡは、ＣＮＳにおける細胞外物質として著しく乏しい。他の理由の故に唯一のＴＬＲ３アゴニストとしての二本鎖ＲＮＡの役割は、本文脈において、合理的に説明されることが困難であるので、我々は、追加のＴＬＲ３アゴニスト分子が、ヒトのＣＮＳそれ自身に存在しうる可能性を試験することを決定した。そのようなアゴニストの存在は、組織損傷又は外傷の炎症性エピソード又は他の形態に続いて活性化されうる、ＴＬＲ３により仲介された内因性修復メカニズムの可能性と一致するだろう。
【０１６８】
髄膜腫、乏突起細胞腫、ＩＩ型及びＩＶ型星状細胞腫、並びに髄芽細胞腫を含む５のプールされた腫瘍に由来するｃＤＮＡバンクが、ＴＬＲ３にとっての内因性タンパク質アゴニストをコードするかもしれない配列の源として用いられた。ｃＤＮＡは、哺乳類細胞による、ｃＤＮＡによりコードされた産物の発現及び分泌を促進するプラスミドベクター中にクローン化され、そしてこれらのプラスミドは、ＣＯＳ−７細胞中に形質転換され、そして２段階のアプローチにおいて評価された。第１に、ｃＤＮＡを含有する５０〜１００のプラスミドのプールが一緒に形質転換され、そしてそのようなプール（合計で７６８）が、ＴＬＲ３活性化と一致してヒト星状細胞における応答を誘発するタンパク質を産生そして分泌するＣＯＳ−７細胞を構築するそれらの能力について選抜された。この第１の段階においてそのような星状細胞応答を観測する為に、ＣＸＣＬ８の分泌が評価された。何故なら、これは、これら及び他の細胞におけるＴＬＲ３活性化についての感受性マーカーであるからである（図９及び１０参照）。マウス星状細胞において、マウスのＣＸＣＬ８オルソログはないので、ＩＬ−６はＴＬＲにより仲介される応答についてのマーカーとして用いられる。しかしながら、ＣＸＣＬ８又はＩＬ−６放出は、ＴＬＲ３活性化にとって特異的でないことが留意されるべきである：他のさまざまな刺激及び情報伝達経路も、星状細胞によるＣＸＣＬ８又はＩＬ−６分泌を仲介できる。ＣＯＳ−７細胞により産生された産物に応答したヒト星状細胞によるＣＸＣＬ８分泌が観察されたとき、そのプールに含有される個々のプラスミドが個々に、ＣＸＣＬ８分泌を誘導する産物をコードするそれらの能力について試験された。このようにして、ＣＯＳ−７細胞により転写されたときに、星状細胞において顕著なＣＸＣＬ８分泌を誘発したタンパク質産生をもたらした２つの候補配列が同定された（図６）。２の候補ｃＤＮＡの１つ（クローンＣ１１）は、引き続いての実験においてＴＬＲ２を通じて作用すると分かったので、本発明と関係ない産物として同定された。他のＣＸＣＬ８誘導性産物(クローンＦ５）は、ヒトスタスミンの残基４４〜１４９と同一のアミノ酸配列として同定された（図１１及び配列ＩＤ  ＮＯ．１）。
【０１６９】
選抜されたｃＤＮＡによりコードされる部分的スタスミン配列が実際に、対応するＣＯＳ−７形質転換細胞に由来するＣＸＣＬ８誘導性因子であることを検証する為に、市販の供給元からの、精製された組み換えヒトスタスミンのＣＸＣＬ８誘導性効果が評価された。この実験（図７Ａ）は、５〜１００μｇ／ｍＬの用量で、組み換えヒトスタスミンも、試験された４のドナーの全てからの培養されたヒト星状細胞による顕著なＣＸＣＬ８放出を誘導することができたことを確認した。星状細胞中のＴＬＲ３の発現を阻止する為の、ＴＬＲ３に向けられた低分子干渉ＲＮＡを用いた対照実験は、ヒト星状細胞における該スタスミンにより誘導された応答が主に−１の場合では完全に−ＴＬＲ３発現のそのような選択的干渉により阻害されたことを明らかにした（図７Ｂ）。ＴＬＲをコードする個々のプラスミドにより安定的に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞を用いた追加の対照実験（図７Ｃ及び７Ｄ）は、これらの実験の為に用いられた組み換えスタスミンが、これらの条件下においてＴＬＲ２又はＴＬＲ４の活性化を許すエンドトキシンの水準を含有しなかったことを確認した。決定的な実験において、ＴＬＲ３欠損マウスからの星状細胞は、それらがｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃへ応答することを欠いたように、組み換えスタスミンへ応答することを欠く一方で、非常に穏やかな応答だけを誘発するザイモサンによるＴＬＲ２又はＬＰＳによるＴＬＲ４を介した活性化に応答するそれらの能力が維持されたことが観察された（図７Ｅ）。これらの観察は、スタスミンにより誘導された応答が完全にＴＬＲ３依存性であることの決定的な証拠を提供する。
【０１７０】
保存されたスタスミン様ドメインの延びたリン酸化されていないαヘリックスは、ＴＬＲ３細胞外ドメインへ結合する構造的エレメントであるようである。
【０１７１】
上記の新規データと以前に報告された情報とを合わせることは、ＴＬＲへの連結にとって必須であるスタスミンの構造部分が、残基４４〜１３８の間の９５アミノ酸長αヘリックス構造であることを強く示唆する。重要なことに、ｃＤＮＡバンクスクリーンにおいて同定されたクローンＦ５によりコードされたＴＬＲ３を活性化するタンパク質産物は、ヘリックス形成性残基４４〜１４９を含有するが、スタスミンのＮ末端部分１〜４３を含有しない。このヘリックスに含有される残基の２５％以上が負に荷電したアミノ酸、主にグルタミン酸残基である。これらは、二本鎖ＲＮＡのホスフェートが並んだヘリックス構造を構造的に暗示する（保存された）スタスミン様ヘリックスドメインを与える。ＴＬＲ３の細胞外ドメインの最近のモデル化は、豊富な負電荷を含有する延びた棒状構造は、情報伝達にとって必須であるＴＬＲ３連結及び二量体化にとって重大な構造的要件であるという考えと一致する。
【０１７２】
スタスミンのＮ−末端部分は、チューブリンとのその相互作用を調節すると知られるリン酸化の標的である。位置１６、２５、３８及び６３での４つのセリン残基が、種々のキナーゼによりリン酸化されると知られている。残基６３だけが、機能的Ｆ５配列４４〜１４９に含有されるが、追加のデータは、この残りの部位だけでのリン酸化がＴＬＲ３アゴニスト活性にとって要件であるとは全くありそうにないことを示唆する。残基４０〜１４０を含有する切り取られた種々のタンパク質の構造的並びに機能的分析により、位置６３でのセリンのリン酸化が、スタスミンのαヘリックス構造をほとんど完全に破壊することが以前に示されている。上記で説明されたとおり、このヘリックス構造が、ＴＬＲ３連結にとって必須でありそうであり、スタスミンの機能的な形態は、Ｓｅｒ−６３のリン酸化された形態よりもむしろリン酸化されていないＳｅｒ−６３を含むだろうことを暗示する。Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚとその同僚らによる研究は、精製された組み換えタンパク質として、ヘリックス形成性ドメインを含有するスタスミン又はスタスミンの切り出された形態が、培養培地と類似のバッファーにおいて試験された場合に、約４０〜６０％だけについてそのようなαヘリックス中に要求されることを明らかにした。これは、我々により用いられた実験の条件下で、最大で約半分のタンパク質分子だけが、ＴＬＲ３細胞外ドメインに結合することにおいて機能的であると期待されうることをありそうにする。これは、スタスミンとＴＬＲ３活性化の間の明白な用量応答関係に負に影響する。図１３において示されたとおり、スタスミン様タンパク質  スタスミン、ＳＣＧ−１０、ＳＣＬＩＰ及びＲＢ３は全て、負に荷電したアミノ酸の多数を含む、保存されたスタスミン様ドメインにおけるαヘリックスを定義する領域におけるマークされた配列相同性を共有する。これは、全ての４つのファミリーメンバーが、ＴＬＲ３アゴニストとして作用するそれらの能力を非常に共有しそうであるという考えと一致する。スタスミン、ＳＣＧ−１０、ＳＣＬＩＰ及びＲＢ３０の間の配列比較は以下に与えられる。以下の整列化において見られるとおり、１３４の重なるアミノ酸のウィンドウにおいて、スタスミン（ＳＴＭ−１）及びスタスミン−２（ＳＣＧ１０又はＳＴＭ−２）は、７４．６％の配列同一性を示し（ダブルポイントは、同一のアミノ酸残基を示す）、９３％の相同性に対応する（シングルポイントは、相同なアミノ酸残基を示す）。
【０１７３】
2009525323.tif 000004
【０１７４】
さらに、１３９の重なるアミノ酸のウィンドウにおいて、スタスミン（ＳＴＭ−１）及びスタスミン−３（ＳＣＬＩＰ又はＳＴＭ−３）は、６７．６％の配列同一性を示し、９２％の相同性に対応する。
【０１７５】
2009525323.tif 000005
【０１７６】
また、１４０の重なるアミノ酸のウィンドウにおいて、スタスミン（ＳＴＭ−１）及びスタスミン−４（ＲＢ３又はＳＴＭ−４）は、７２．１％の配列同一性を示し、９５％の相同性に対応する。
【０１７７】
2009525323.tif 000006
【０１７８】
実施例２．野生型マウス又はＴＬＲ３欠損マウスから単離された星状細胞による、スタスミンにより誘発された応答の間の比較。
【０１７９】
方法
【０１８０】
星状細胞が、ＴＬＲ３を発現する新生仔野生型（Ｂｉｏｚｚｉ  ＡＢＨ）マウス又はＴＬＲ３を発現しない新生仔ＴＬＲ３欠損マウスから単離された（Alexopoulou et al. (2001) Nature 413:732-8）。星状細胞は、ポリＬ−リジンにより被覆された９６ウェル−フラット−ボトムプレート中に、１０％ＦＣＳ及び抗生物質補充を含有する１００μｌのＤＭＥＭ／ＨＡＭ−Ｆ１０培地中でウェル当たり１×１０４細胞で、２４時間培養されて、コンフルエント後培養物を得た。組み換えヒトスタスミンは、次に星状細胞に添加され、そして同時に行われた対照の刺激が、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（確立したＴＬＲ３アゴニスト）または超高純度リポポリサッカライド（確立したＴＬＲ４アゴニスト）により実施された。これらの刺激物の添加後、星状細胞はさらなる４８時間インキュベートされた。星状細胞培養物上清が次に集められ、そして市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、マウス星状細胞のＴＬＲにより仲介される活性化についてのマーカーとしてＩＬ−６の水準が測定された。
【０１８１】
結果
【０１８２】
図１４に示されたとおり、スタスミンによる容量依存性ＩＬ−６誘導が、野生型星状細胞の培養物において見られるが、ＴＬＲ３欠損動物から単離された星状細胞の培養物からは完全に不在である。この応答プロファイルは、以前に確立したＴＬＲ３アゴニストであるｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに対するそれと同一である。星状細胞培養物において、ＴＬＲ４アゴニストである超高純度ＬＰＳへの強力なＩＬ−６応答は、非常に類似であり、そして両方の培養物において標準の生存能及びＴＬＲ４依存性応答を示す。これらの結果は、スタスミンへの星状細胞応答は、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃへの応答と同様に、ＴＬＲ３発現に決定的に依存性であるという決定的な証拠を提供する。それは、星状細胞を活性化する為の組み換えヒトスタスミンの能力が、ヒト星状細胞に限定されず、少なくともマウス星状細胞にも広がることも示す。
【０１８３】
実施例３．スタスミン又はｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃへの、ヒト星状細胞のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子の応答のｃＤＮＡアレイプロファイリング。
【０１８４】
方法
【０１８５】
星状細胞が、死後のヒト脳組織サンプルから単離され、そして、本出願の他所に記載されたとおりの条件下で培養された。培養物の一部が、５０μｇ／ｍｌスタスミンにより刺激され、第２が、５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより刺激され、そして第３が、参照対照として役目を果たす為に非処理のままであった。さらなる４８時間に続き、ＲＮＡが、夫々の培養物から単離され、そして、３２Ｐラベル化ｃＤＮＡが逆転写により調製された。これらの３２Ｐラベル化ｃＤＮＡサンプルの続くハイブリッド選抜が２６８のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子、並びにこれらメディエーターのさまざまな受容体についての選抜プローブを含有するＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｔｌａｓ（商標）上で実施された。全てのハイブリダイゼーションシグナルは、繰返し測定の平均として計算され、背景強度について補正され、そして、製造者により提供されたソフトウェアを用いて定量された。相対的なシグナル強度は次に、これらの平均化されたハイブリダイゼーションシグナルを、参照として夫々のアレイ上にも存在する９つのハウスキーピング参照遺伝子の全てについての平均シグナルにより割り算することにより計算された。従って、ＴＬＲアゴニストが全ての遺伝子についての発現シグナルに影響する程度が、星状細胞のＴＬＲ３アゴニスト処理された培養物において見られる相対的なハイブリダイゼーションシグナルの、非処理の対照培養物において見られるそれらに対する比として表されうる。
【０１８６】
結果
【０１８７】
図１５Ａ及び１５Ｂに記載されたとおり、スタスミン及びｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃの両方が、種々の免疫メディエーター及び成長因子をコードする遺伝子の発現における包括的且つ顕著な変化をもたらした。相対的な変化の実質的に全ては、図９においてすでに集約されたとおり、遺伝子発現の増強に関係し、そして抑制に関係しない。これは、対角線から有意にそれる、パネルＡ及びＢの上の左半分における多数の遺伝子マーカーの位置から明らかであるが、パネルＡの下の右半分において明らかであるそのようなマーカーはない。スタスミン又はｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより刺激された星状細胞における遺伝子発現シグナルの間の比較は明白に、これらシグナルの実質的に全てが実際に非常に類似するものであることを明らかにする。２６８の発現シグナルの２つのデータセットの間の類似性の程度を表す、ピアソンの相関係数（ｒ）の計算は、０．９５１の値を産し、これは非常に強い類似性を示唆する。この一致することの確率は、ごくわずかである（ｐ＜１０−３５）。この結果からの結論は、いずれのアゴニストによる刺激への遺伝子応答は同一であることである。これはいずれかの刺激へ応答して活性化される情報伝達経路における同等の類似性を示唆するので、これは、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃのように、スタスミンがＴＬＲ３アゴニストであるという考えについての追加の強力な証拠を提供する。
【０１８８】
実施例４．スタスミンのＴＬＲ３アゴニスト機能とってのαヘリックスの要件
【０１８９】
方法
【０１９０】
精製された組み換えスタスミンが、タンパク質鎖内のヘリックス形成の程度に異なって影響する２つの異なる条件にさらされた。タンパク質調製物の一部は、αヘリックスを破壊する傾向にある強力な酸性条件である、水中の５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に、３７℃で１時間さらされた。並行して、他の部分が、ホスフェートにより緩衝された生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％のヘリックス促進性溶媒トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）に、３７℃で１時間さらされた。これらの異なる条件への曝露後、両方のタンパク質サンプルが、ＰＢＳの数回の交換に対して４８時間、大規模に透析された。次に、該サンプルは、円偏光の吸収における楕円率に基づくヘリックス含有量の計算を許す近紫外円偏光二色性分光法により分析された。両方の場合において、透析されたサンプルの他の部分が、本出願の他所において記載されたとおり、ヒト星状細胞におけるＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）の、ＴＬＲ３により仲介される放出の誘導について同時に試験された。
【０１９１】
結果
【０１９２】
ＣＤ分光法に際して、ＴＦＡにより処理されたサンプルは、１２％のαヘリックス含有量を示すスペクトルを生じ、他方ＴＦＥにより処理されたサンプルは、３７％のαヘリックスを含有することがわかった（図１６Ａ）。参照対照サンプルとして、スタスミンも、ＰＢＳ中の５０％ＴＦＥの溶液中に溶解され、直後に透析無しでＣＤ分光法により観測された。これらの条件下において、スタスミンタンパク質鎖は、実質的に完全なヘリックスコンフォメーションをとる（ヘリックス含有量＝９８％；図１６Ａを参照されたい）。２の予め調製され且つ透析されたスタスミンのサンプルを、星状細胞を活性化するそれらの能力について試験するに際して、顕著な違いが、ＴＦＡ又はＴＦＥにより処理されたサンプルの間で観察され、後者は約３倍より活性であった。タンパク質の純度又は濃度においてこれらのサンプルの間に違いは存在しないので、大規模の透析に続くそれらの最終の緩衝液組成においてでなく、我々はＴＦＥにより処理されたサンプルのより高い活性を、そのサンプル中のスタスミンの顕著により高いヘリックス含有量に帰するとする。ＴＦＡにより処理されたサンプルと比較してＴＦＥにより処理されたサンプルの重量に基づき３倍高い活性は、その３倍高いアルファヘリックス含有量とよく対応する。それ故に、我々は、スタスミンのαヘリックスコンフォメーションが、ＴＬＲ３にとってアゴニストとして役目を果たす為のその能力に決定的であると結論付ける。この考えは、２４％の負に荷電したアミノ酸が並んだ（図１２及び１３参照）、αヘリックスコンフォメーションを仮定することにより、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃも特徴付け且つＴＬＲ３とのその相互作用についての重要な特徴であることが示された、負に荷電した二本鎖の構造的模倣体をスタスミンが有効に産生するという考えと完全に一致する。
【０１９３】
実施例５．ヒト末梢血細胞のスタスミンによる活性化。
【０１９４】
方法
【０１９５】
末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）が、２の健康な血液ドナーから単離され、そして、細胞の一部から、ＣＤ１４＋単球が、抗ＣＤ１４抗原により覆われた磁性ビーズを用いたポジティブ選抜により単離された。精製されたＣＤ１４＋単球は次に、ＩＬ−４及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で５日間培養された。これらの成長因子は、この時間枠内で単球の樹状前駆細胞（ｐｒｅ−ＤＣ）への分化を誘導する。この段階で、ｐｒｅ−ＤＣ培養物の一部が、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの混合物により、培養物中でさらに２日間刺激され、従って該細胞の形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）への最終的な成熟を刺激した。
【０１９６】
この分化方法を用いて、ＰＢＭＣ、ｐｒｅ−ＤＣ及びＤＣの別々の集団が産生され、そして以前に用いられた刺激物を全て除去する為の細胞の洗浄後、細胞は次に新しい培地において再び培養され、そしてｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、スタスミン又はＬＰＳへのそれらの応答について試験された。２４時間にわたる培養培地中のＣＸＣＬ８の蓄積が、細胞の活性化の尺度として用いられた。
【０１９７】
結果
【０１９８】
図１７において示されたとおり、ＰＢＭＣ、ｐｒｅ−ＤＣ又はＤＣへのさまざまな用量でのスタスミンの添加は、３つの場合全てについて、及び両方のドナーから単離された細胞について、培養培地中におけるＣＸＣＬ８蓄積の実質的な増加をもたらした。スタスミンにより誘導されたＣＸＣＬ８水準の水準は、ＬＰＳにより誘導されたそれらと一貫して同様であり、この効果の相対的強度を示す。それ故に、これらのデータは、スタスミンが、末梢血由来ヒト細胞及び未成熟及び成熟ＤＣにおけるＣＸＣＬ８産生を活性化することができることを示す。
【０１９９】
実施例６．スタスミン、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ及びＬＰＳへの、未成熟ヒト樹状細胞の応答プロファイル。
【０２００】
方法
【０２０１】
未成熟ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐｒｅ−ＤＣ）の成熟及びサイトカイン産生に対するスタスミンの効果を試験する為に、そのようなｐｒｅ−ＤＣが、末梢血単球細胞のサンプルから、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いた、精製されたＣＤ１４＋単球の成熟により産生された。該細胞は次に、５０μｇ／ｍｌスタスミンにさらされ、そして４８時間後、培養物上清が集められ、そして４０の種々のサイトカイン及びケモカインの蓄積が、市販入手可能な抗体アレイを用いた抗体アレイプロファイリングにより評価された。
【０２０２】
結果
【０２０３】
図１８において集約されるとおり、スタスミンは、（図１７Ｂ及び１７Ｅにおいて既に示されたとおり）ｐｒｅ−ＤＣにおける顕著なＣＸＣＬ８放出を誘発するが、わずかにいくつかの追加のサイトカイン放出を誘発する。抗体に基づくアレイにより分析された４０の種々のサイトカイン及びケモカインメディエーターの４つだけが、スタスミンにより顕著な水準（誘導比＞１．５）で誘導されることが分かった。これらは、ＣＸＣＬ８に加えて、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０及び、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを含んだ。他のサイトカイン及びケモカインのほとんど全てが、スタスミンにより処理された培養物中において対照培養物におけるよりも低い水準で蓄積する傾向であった。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の両方の安定且つ多量の存在は、これらの成長因子が分析に先立ちｐｒｅ−ＤＣの成長のために培養培地に添加されるので、驚くにはあたらない。これら２のサイトカインは、従って、用いられた分析方法にとって適当な内部標準として役目を果たす。
【０２０４】
スタスミンによるｐｒｅ−ＤＣにおいて誘導された２だけの顕著なサイトカイン応答は両方とも強力に、スタスミンの総合的な効果が抗炎症性であるという考えを支持する。アレイ上の全てのサイトカインの、ＩＬ−１０及び、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットだけが、スタスミンにより誘導される一方で、他のサイトカイン全てが抑制される傾向にある。いずれのメディエーターも、強力な抗炎症性メディエーターを代表する。ＩＬ−１０は、炎症を制御すること及び組織修復を促進することにおいて中心的な役割を果たす抗炎症性サイトカインとして良く知られる。ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットは、強力な炎症促進性サイトカインＩＬ−１２及びＩＬ−２３の一部でありうるが、これらのサイトカインを形成する為のそのカウンターパート（ＩＬ−１２についてｐ７０及びＩＬ−２３についてｐ１９）の不在において、ｐ４０はそのままで、実際はＩＬ−１２及びＩＬ−２３の両方にとっての強力なインヒビターを表す。ｐ４０分泌を増強することと対照的に、スタスミンは、ＩＬ−１２のｐ７０サブユニットの水準を２倍減少する。この組み合わせは、ＩＬ−１２を形成する為のそのカウンターパート無しでの抗炎症性ｐ４０サブユニットの蓄積を結果するであろう。従って、樹状前駆細胞におけるこの効果は、炎症プロセスを抑制する為の、スタスミンにより誘導される他のメカニズムを表す。
【０２０５】
図１８において集約されるとおりの結果の他の局面として、明白に得られたデータセットは、スタスミンのＴＬＲ３により仲介される活性化効果が、細胞表面のＴＬＲ３を発現するヒト線維芽細胞様細胞に限られないことを示す。細胞内エンドソーム小胞の内側にだけＴＬＲ３を発現するヒトｐｒｅ−ＤＣは、スタスミンにも明白に応答し、そしてやはりこれは強力な抗炎症性メディエーターの放出をもたらす。
【０２０６】
実施例７．ヒトミクログリア細胞のスタスミンによる活性化
【０２０７】
方法
【０２０８】
死後９時間以内に集められた死後の成人ヒト脳の灰白質サンプル又は白質サンプルを用いて、ミクログリアのいくつかの培養物が前に記載されたとおりに製造された。ミクログリアは次に、種々のＴＬＲアゴニストにより刺激され、そして２４時間後、培養培地中のＣＸＣＬ８の蓄積が、ＴＬＲにより仲介された活性化の尺度として、市販のＥＬＩＳＡ分析を用いて定量された。
【０２０９】
結果
【０２１０】
図１９において記載されたとおり、種々のドナーから及び、ヒト脳の種々の解剖学的領域からのミクログリアは、培養培地中の増強されたＣＸＣＬ８蓄積により証明されるとおり、スタスミンを含む３つ全てのＴＬＲアゴニストへの応答を一貫して示す。やはり、これは、ミクログリア中のＴＬＲ３の唯一の形態である細胞内ＴＬＲ３も、スタスミンにより活性化されうることを強調する。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】６の異なるドナーからの、培養されたが処理されていないヒト星状細胞についての、ＴＬＲ４の優先的な発現及びＴＬＲ１〜３のより低い程度の発現、並びにさまざまなサイトカインによるＴＬＲ３の強力且つ優先的な誘導を示すグラフである。
【図２】ＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ又はＴＬＲ４アゴニストＬＰＳの影響下で、６の異なるドナーからの培養された成人ヒト星状細胞におけるＴＬＲ３の優先的な誘導を示すグラフである。
【図３】培養された成人ヒト星状細胞において、ＴＬＲ３並びにＴＬＲ４が、もっぱら細胞表面上で発見されうることを示す図である。
【図４】星状細胞（Ａ）又は内皮細胞（Ｂ）の成長についての、ＴＬＲ３活性化に応答して星状細胞により分泌されたメディエーターの効果を示すグラフである。
【図５】ＴＬＲ３活性化に応答した星状細胞により分泌されるがＴＬＲ４活性化に応答した星状細胞により分泌されないメディエーターの、器官型ヒト脳切片培養物におけるニューロンに対する生存促進性効果を示す図及びグラフである。
【図６】ｃＤＮＡバンク由来の遺伝子産物の、感受性であるが特異的ではないＴＬＲ３関与についてのマーカーである星状細胞中のＣＸＣＬ８分泌を誘導する為の能力についてのスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図７】ＴＬＲ３関与について感受性だが特異的でないマーカーである、ヒト星状細胞におけるＣＸＣＬ８（インターロイキン−８；ＩＬ−８と言われる）分泌又はマウス星状細胞中のＩＬ−６の分泌を誘導するスタスミンの能力を示し、しかしＴＬＲ３欠損マウスから単離された星状細胞においてそのような誘導をするスタスミンを欠くことを示し、スタスミンへの星状細胞応答がＴＬＲ３により仲介されるという考えを確認するグラフである。
【図８】正常な（病気にかかっていない）条件下での、種々のヒト組織及び細胞タイプにおけるＴＬＲ３のこれまで実証された発現を集約する表である。
【図９】ＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ４アゴニストＬＰＳ又は両方の混合物による星状細胞の刺激を受けて、発現水準が少なくとも２倍で再現性良く増加されることが分かった、本実験研究において用いられたマクロアレイ上に提示された全ての遺伝子産物の表である。
【図１０】培養されたヒト滑膜細胞においてｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより誘導された全ての遺伝子産物の表である。
【図１１】実験の部において記載されるスクリーニング実験において発見されたｃＤＮＡクローン（クローン  Ｆ５）のヌクレオチド配列及び、ＴＬＲ３により仲介される情報伝達を活性化することができるタンパク質をコードする、その対応するプロテインシークエンスである。
【図１２】スタスミン様タンパク質のファミリーの全部で４の現在知られているヒトのメンバーのアミノ酸配列である。
【図１３】４のヒトスタスミン様ファミリーメンバーであるスタスミン、ＳＣＧ１０、ＳＣＬＩＰ及びＲＢ３の、保存されたスタスミン様αへリックスのドメインの配列相同性を示す表である。
【図１４】実施例２において記載されたとおりの野生型マウス又はＴＬＲ３欠損マウスから単離された星状細胞によるＩＬ−６放出を示すグラフである。
【図１５】実施例３において記載されたとおりの、スタスミンにより刺激された又はｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃにより刺激されたヒト星状細胞の遺伝子応答プロファイルを示すグラフである。
【図１６】ＴＦＡ又はＴＦＥのいずれかにより予め処理されたスタスミン調製物（ほかは同一である）についてのＣＤスペクトル、並びに、ＴＦＥにより予め処理されたスタスミン調製物又はＴＦＡにより処理された調製物による、ヒト星状細胞におけるＩＬ−８のＴＬＲ３により仲介される放出を示すグラフである。
【図１７】２の健康なドナーからの抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）、樹状前駆細胞（pre-DC）及び成熟形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）の、実施例５において記載されたとおりの種々のＴＬＲアゴニストへの応答を示すグラフである。
【図１８】実施例６において記載された、処理されていない対照細胞と比較した、スタスミンにより処理されたヒト樹状前駆細胞の培養物中のサイトカイン及びケモカインの４８時間後の蓄積結果の表である。
【図１９】実施例７において記載されたとおりのヒトミクログリアの精製された培養物におけるスタスミンによるＣＸＣＬ８誘導を示すグラフである。
【図１】
2009525323.tif 000007
【図２】
2009525323.tif 000008
【図３】
2009525323.tif 000009
【図４】
2009525323.tif 000010
【図５】
2009525323.tif 000011
【図６】
2009525323.tif 000012
【図７】
2009525323.tif 000013
【図８】
2009525323.tif 000014
【図９】
2009525323.tif 000015
【図９−２】
2009525323.tif 000016
【図１０】
2009525323.tif 000017
【図１１】
2009525323.tif 000018
【図１２】
2009525323.tif 000019
【図１３】
2009525323.tif 000020
【図１４】
2009525323.tif 000021
【図１５】
2009525323.tif 000022
【図１６】
2009525323.tif 000023
【図１７】
2009525323.tif 000024
【図１８】
2009525323.tif 000025
【図１９】
2009525323.tif 000026
【国際調査報告】
2009525323.tif 000027
2009525323.tif 000028
2009525323.tif 000029
2009525323.tif 000030