(57)【要約】  本出願は、核酸中のメチル化部位、すなわち、メチル化シトシンおよび非メチル化シトシンを決定する重亜硫酸反応を行う方法に関する。本方法において、核酸は、重亜硫酸処理され、アルカリ溶液が脱スルホン化および固相からの核酸の溶出のために添加される場合に固相に結合する。核酸はさらなる工程で増幅され得る。固相は、好ましくはガラスまたはシリカを含む物質、より好ましくはガラスフリース、ガラス膜、または磁性ガラス粒子である。さらに重亜硫酸処理のためのアルカリ溶液の数種類の使用、ならびに重亜硫酸試薬、固相およびアルカリ溶液を含むキットが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ１）固相に核酸を結合し、亜硫酸イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化する工程、または
ａ２）亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、固相に核酸を結合する工程、
ｂ）任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
ｃ）アルカリｐＨを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、核酸を溶出する工程
を含む核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法。
【請求項２】
ａ１）固相に核酸を結合し、亜硫酸イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化する工程、または
ａ２）亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、固相に核酸を結合する工程、
ｂ）任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
ｃ）アルカリｐＨを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって
−核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、
−核酸を溶出する工程、
ｄ）溶出核酸を増幅する工程
を含む核酸を増幅する方法。
【請求項３】
溶液がＮａＯＨまたはＫＯＨを含むことを特徴とする請求項１〜２いずれか記載の方法。
【請求項４】
溶液が１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
請求項１または２記載の方法の工程ｃ）における温度が６０〜８０℃であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
固相がシリカまたはガラスを含む物質であることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
固相がガラスフリースまたはガラス膜であることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
固相が磁性ガラス粒子であることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
磁性ガラス粒子が０．５μｍ〜５μｍの平均直径を有することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
磁性ガラス粒子が５〜５００ｎｍの直径を有する磁性物質を含むことを特徴とする請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
磁性ガラス粒子がゾル−ゲル法で製造されることを特徴とする請求項８〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
核酸中のスルホン化および脱アミノ化シトシン塩基の脱スルホン化のための、または固相結合核酸中のスルホン化および脱アミノ化シトシン塩基の脱スルホン化ならびに固相からの固相結合核酸の次の溶出のための、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液の使用。
【請求項１３】
−重亜硫酸塩または重亜硫酸イオンを含む溶液、
−固相、および
−１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液
を含む重亜硫酸反応を行うためのキット。
【請求項１４】
固相がシリカまたはガラスを含む物質である請求項１３記載のキットまたは請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
固相がガラスフリースまたはガラス膜である請求項１３〜１４いずれか記載のキットまたは請求項１２記載の使用。
【請求項１６】
固相が磁性ガラス粒子である請求項１３〜１４いずれか記載のキットまたは請求項１２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、核酸中のメチル化部位、すなわち、メチル化シトシンおよび非メチル化シトシンを決定する重亜硫酸反応を行う方法に関する。本方法において、核酸は、重亜硫酸処理され、アルカリ溶液が脱スルホン化および固相からの核酸の溶出のために添加される場合に固相に結合する。核酸はさらなる工程で増幅され得る。固相は、好ましくはガラスまたはシリカを含む物質、より好ましくはガラスフリース、ガラス膜または磁性ガラス粒子である。さらに重亜硫酸処理のためのアルカリ溶液の数種類の使用、ならびに重亜硫酸試薬、固相およびアルカリ溶液を含むキットが開示される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子は全哺乳動物ゲノムのわずかな部分のみを構成し、非コーディングデオキシリボ核酸（DNA）の圧倒的なバックグラウンドの存在下での発現の正確な制御が調節のための実質的な課題を提示する。イントロン、繰り返しエレメント、および潜在的に活性な転移可能なエレメントを含む非コーディングDNAは長期サイレンシングのための有効な機構を必要とする。哺乳動物は、かかるサイレンシングを補助するDNAタンパク質相互作用を改変するための遺伝機構を提供するシトシンメチル化によって付与される可能性を利用するように思われる。DNAメチル化は哺乳動物の発生に必須である；老化および癌に潜在的な役割を果たす。遺伝子発現の調節におけるおよび刷り込み遺伝子を印づけるエピジェネティック修飾としてのメチル化の関与は十分に確立されている。哺乳動物において、メチル化は、シトシン残基のみ、より具体的にはグアノシン残基に隣接するシトシン残基、すなわち、配列CGのみで生じる。DNAメチル化部位の検出およびマッピングは、所定の配列がメチル化されるかどうかを示す分子シグナルの理解に対する本質的なステップである。
【０００３】
これは、５−メチル−シトシンの検出についてFrommer, M., et al., Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992)1827-31に記載されるいわゆる重亜硫酸法によって現在達成される。５−メチルシトシンをマッピングする重亜硫酸法は、亜硫酸水素ナトリウムが５−メチル−シトシンではなくシトシンとあるいはわずかに５−メチル−シトシンと反応する効果を用いる。シトシンは重亜硫酸と反応し、脱アミノ化されてアルカリ性条件下でウラシルに脱スルホン化され得るスルホン化ウラシルとなる傾向がある、スルホン化シトシン反応中間体を形成する。ウラシルは遊離体シトシンとは異なりチミンと塩基対形成するが、５−メチルシトシンはシトシンと塩基対形成することが一般常識である。これは、例えば重亜硫酸ゲノム配列決定（Grigg, G., and Clark, S., Bioessays16(1994)431-6;Grigg, G. W., DNA Seq 6(1996)189-98）またはUS5,786,146に開示されるメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によってメチル化シトシンまたは非メチル化シトシンの区別を可能にする。
【０００４】
5−メチル−デオキシシトシンおよびデオキシシトシンの重亜硫酸修飾に対する一般研究（Olek, A., et al., Nucleic Acids Res 24 (1996) 5064-6）が重亜硫酸処理および次のＰＣＲ工程がアガロースビーズ中に包埋される材料で行われる重亜硫酸塩基配列決定の方法を開示する、重亜硫酸反応の特定の局面を記載する様々な文献がある(Benyajati, C., et al., Nucleic Acids Res8 (1980) 5649-67)。Clark, S. J., et al., Nucleic Acids Res22(1994) 2990-7に開示される重亜硫酸法において、試料が脱アミノ化後に脱塩される。
【０００５】
Raizis, A. M., et al., Anal Biochem 226 (1995)161-6は、鋳型分解を最小化する５−メチルシトシンマッピングの重亜硫酸法を開示する。彼らはｐＨ、温度の影響および反応時間を研究している。同様の研究がGrunau, C., et al., Nucleic Acids Res29(2001)E65-5またはWarnecke, P.M., et al., Methods 27 (2002)101-7によって行われている。重亜硫酸混合物中の異なるさらなる成分がWO 01/98528またはPaulin, R., et al., Nucleic Acids Res 26 (1998) 5009-10に開示される。重亜硫酸処理後のさらなる重亜硫酸工程およびPCRがWO02/31186に開示される。Komiyama, M., and Oshima, S., Tetrahedron Letters 35 (1994)8185-8188)は、オリゴデオキシリボヌクレオチド中のシトシンの重亜硫酸誘導脱アミノ化の触媒を研究している。
【０００６】
重亜硫酸処理を行うためのキットは、SerologicalsCorporation, Norcross, GA, USAにより配給されるIntergenから市販されており、例えばCpGenomeTMDNA modification kitまたはCpGenomeTM Fast DNA Modification Kitがある。別の市販キットはZymo Research Inc., Orange, CA, USAから入手可能なEZ DNA Methylation Gold Kitである。これらのキットは精製DNAまたは粗溶解物の変性、DNAの脱アミノ化、固相へのDNAの結合後の脱アミノ化DNAの脱塩（＝DNAが固相に結合することを保証するバッファでの洗浄）、アルカリの添加による結合した脱アミノ化DNAの脱スルホン化、アルカリを除去するDNAの洗浄、および中性バッファを用いたDNAの溶出を含む連続手順を提供する。溶出物またはその一部は次に通常、PCRに使用される。
【０００７】
重亜硫酸ゲノム配列決定法の別のバリエーションはFeil, R., et al., Nucleic Acids Res 22(1994)695-6に開示され、ゲノムDNAが脱アミノ化後にガラスビーズに結合し洗浄される。溶出後に核酸が脱スルホン化される。核酸は、ガラス表面への結合挙動、例えば、シリカゲルまたは珪藻土への吸着、カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子（MGP）または有機シラン粒子への吸着を用いることによって単離され得ることが公知である。固相を用いる抽出は通常、目的の物質の固相への結合を可能にする条件下で、核酸を有する溶液の固相への添加、固相結合核酸からの残渣溶液の除去および固相から溶出液体への核酸の次の放出（時々溶出とよぶ）の工程を含む。かかるプロセスの結果は通常、溶解状態で目的の物質を含む溶液である。
【０００８】
重亜硫酸法のさらに別のバリエーションがUS 2004/0241704またはEP 1 394 173に開示される。そこでは、核酸は重亜硫酸反応の全工程またはいくつかの工程のみで固相に結合する重亜硫酸処理が開示される。
【０００９】
（発明の要約）
本発明によって解決される課題は自動化可能な方法を提供することであった。
【００１０】
上記で議論される課題は、
ａ１）固相に核酸を結合し、亜硫酸イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化する工程、または
ａ２）亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、固相に核酸を結合する工程、
ｂ）任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
ｃ）アルカリｐＨを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって、
−核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、
−核酸を溶出する工程
を含み、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基をウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基に転換し、それによって好ましくは５−メチル−シトシン塩基が有意に転換されない、方法（「重亜硫酸反応」または「重亜硫酸処理」）を提供することによって解決される。
【００１１】
本発明の別の態様において、
ａ１）固相に核酸を結合し、亜硫酸イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化する工程、または
ａ２）亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、固相に核酸を結合する工程、
ｂ）任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
ｃ）アルカリｐＨを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって
−核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、
−核酸を溶出する工程、
ｄ）溶出核酸を増幅する工程
を含む核酸を増幅する方法が提供される。
【００１２】
本発明によって、溶出工程と脱スルホン化を合わせることによるプロセスの自動化が可能となる。結合した脱アミノ化ＤＮＡを脱塩した後に、アルカリの添加、次の洗浄、および終わりの溶出による別々の脱スルホン化工程はないが、アルカリ溶液、好ましくは２０〜６０ｍＭＮａＯＨを用いる溶出がある。溶出物は次に核酸増幅に直接使用され得る。ワークフローを単純化することで、脱アミノ化ＤＮＡを含む溶液が結合、洗浄および溶出工程を含むＤＮＡ精製のための「試料材料」としてみなされる場合、試薬ではなく、古典的ＤＮＡ精製プロセスを有する工程に関して類似になる。従ってプロセスは、マイナーな試薬変更のみと共に、市場に存在するＤＮＡ製品を用いて自動化され得る。
【００１３】
本発明の別の態様において、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液が、核酸中のスルホン化および脱アミノ化シトシン塩基の脱スルホン化のために、または固相結合核酸中のスルホン化および脱アミノ化シトシン塩基の脱スルホン化ならびに固相からの固相結合核酸の次の溶出のために使用される。
【００１４】
本発明の別の態様において、
−重亜硫酸塩または重亜硫酸イオンを含む溶液、
−固相、および
−１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液
を含む重亜硫酸反応を行うためのキットが提供される。
【００１５】
「核酸」は、当業者に公知なように「ヌクレオチド」のポリマー化合物である。これは、分析される試料中の「核酸」、すなわち、試料中のその存在、非存在または量が決定されることを表わすために本明細書で使用される。従って、「核酸」はすなわち標的であり、従って「標的核酸」としても表わされ得る。例えば、血液がヒト免疫不全ウイルスを含むかどうかを決定しなければならない場合、「標的核酸」は、ヒト免疫不全ウイルスの核酸、またはより具体的には核酸配列、すなわち、決定される塩基アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンの順列である。より具体的に本発明の文脈において、「標的核酸」は、ＣｐＧ部位のメチル化シトシン塩基を含み得るゲノムＤＮＡである。「重亜硫酸処理」後に、ゲノムＤＮＡの核酸配列は非メチル化塩基がウラシル塩基に転換されるようなメチル化に依存して変化し、変化した核酸配列が決定される。
【００１６】
当該分野で公知なように、「ヌクレオシド」は塩基糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基である。かかる複素環塩基の２つの最も一般的な種類は、プリンおよびピリミジン、より詳細にアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）の塩基である。ウラシル塩基はリボ核酸に天然に含まれる。別の天然塩基は、塩基の芳香環の５位がメチル基で置換されるシトシンである、５−メチル−シトシンまたはメチル−シトシンである。
【００１７】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む「ヌクレオシド」である。ペントフラノシル糖を含む「ヌクレオシド」について、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシ部分のいずれかに結合され得る。「ヌクレオチド」は、「オリゴマー化合物」として本明細書でより一般的に表される「オリゴヌクレオチド」、または「ポリマー化合物」としてより一般的に表される「ポリヌクレオチド」の「モノマー単位」である。従って別の一般表記は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００１８】
本発明によって、「オリゴマー化合物」は、「ヌクレオチド」単独、または「非天然化合物」（以下参照）、より具体的には「修飾ヌクレオチド」（もしくは「ヌクレオチドアナログ」）もしくは「非ヌクレオチド化合物」単独もしくはこれらの組み合わせであり得る「モノマー単位」から構成される化合物である。「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、本発明の文脈において「オリゴマー化合物」のサブグループである。
【００１９】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、「モノマー単位」として複数の「ヌクレオチド」から形成される「ポリヌクレオチド」のことをいい、すなわち、「オリゴヌクレオチド」は「モノマー単位」を有するリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の「オリゴマー化合物」または「ポリマー化合物」の特定のサブグループに属する。リン酸基は通常、「オリゴヌクレオチド」のヌクレオシド間骨格を形成するものをいう。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常結合または骨格は３’〜５’ホスホジエステル結合である。
【００２０】
本発明による「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（以下参照）は、当該分野で主に記載され、当業者に公知なように合成され得る。特定配列のオリゴマー化合物を調製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限消化、ならびに直接化学合成を含む。化学合成法は、例えば、Narang, S.A., et al., Methods Enzymol. 68(1979)90-98に記載されるホスホトリエステル法、Brown, E.L., et al., Methods Enzymol. 68(1979) 109-151に開示されるホスホジエステル法、Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tetrahedron Lett. 22(1981) 1859-1862に開示されるホスホルアミダイト法、Garegg, P.J., et al.,Chem. Scr. 25(1985)280-282に開示されるＨ−ホスホネート法およびUS4,458,066に開示される固相支持法を含み得る。
【００２１】
上記のように、「核酸」および「標的核酸」は当業者に公知なように「ヌクレオチド」のポリマー化合物である。これは、分析される試料中の「核酸」、すなわち、試料中のその存在、非存在または量が決定されることを表わすために本明細書で使用される。
【００２２】
当業者に公知なように用語「プライマー」は、本明細書で使用され、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成を「プライム」することができる「オリゴマー化合物」、主に「オリゴヌクレオチド」だけでなく「修飾オリゴヌクレオチド」のことをいい、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’−ＯＨ基を提供し、３’〜５’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによってそこにさらなる「ヌクレオチド」が結合され得、デオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、ピロリン酸が放出される。従って、意図される機能を除いて、本発明による「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」または「プローブ」間に基本的な違いはない。
【００２３】
用語「プローブ」とは、設計または選択によって、所定のストリンジェンシー下で「標的核酸」に特異的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズ可能な特定のヌクレオチド配列を含む、合成または生物学的に生成された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のことをいう。「プローブ」は、標的核酸を「捕捉」することを意味する「捕捉プローブ」として同定され得、これは検出を不明瞭にし得る望ましくない物質から分離され得る。分離が達成されると、捕捉した「標的核酸」の検出が、適切な手順を用いて達成され得る。「捕捉プローブ」はしばしば既に、固相に結合されている。従って特定の例は、多数の「捕捉プローブ」が標識cRNAまたはcDNAを「捕捉」する「固相」に結合されるマイクロアレイ状態である。
【００２４】
本発明によって、用語「重亜硫酸反応」、「重亜硫酸処理」または「重亜硫酸法」は、好ましくは重亜硫酸イオンの存在下で、核酸中のシトシン塩基、特に複数のシトシン塩基をウラシル塩基または複数のウラシル塩基に転換する反応を意味し、そこで好ましくは5−メチル−シトシン塩基は有意に転換されない。メチル化シトシンを検出するこの反応はFrommeret al.,上掲およびGrigg and Clark,上掲で詳細に記載される。重亜硫酸反応は脱アミノ化工程および脱スルホン化工程を含む（図1を参照；Grigg and Clark,上掲）。５−メチル−シトシン塩基が有意に転換されないという記載は、（非メチル化）シトシン塩基を唯一および専ら転換することを意図するが、わずかなパーセントの５−メチル−シトシン塩基もウラシルに転換されるということを除外することができない事実を考慮するだけである（Frommer et al.,上掲）。
【００２５】
用語「メチル−シトシン塩基」、「メチルシトシン塩基」、「メチル化シトシン塩基」および「５−メチル−シトシン塩基」は本出願を通じて互換的に使用され、メチル基がシトシン環のＣ５原子に結合されるシトシン塩基の誘導体を表わす。シトシン塩基を図１の左部分に示す。用語「非メチル化シトシン塩基」は、「メチルシトシン塩基」と対比してメチル基がシトシン環のＣ５原子に結合されない非誘導シトシン塩基を表わす。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
当該技術分野の技術範囲にある分子生物学および核酸化学の従来技術が、文献に説明される。例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Gait, M.J.,編, 1984;Hames, B.D., and Higgins, S.J., Nucleic Acid Hybridisation, a practial approach, IRL Press, Oxford, England(1985);およびMethods in Enzymology, Academic Press, Inc.,のシリーズを参照、全ては参照によって本明細書に援用される。全ての特許、特許出願、および本明細書に記載される刊行物、上掲および下掲の両方は、参照によって本明細書に援用される。
【００２７】
本発明の態様において、
ａ１）固相に核酸を結合し、亜硫酸イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化する工程、または
ａ２）亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、固相に核酸を結合する工程、
ｂ）任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
ｃ）アルカリｐＨを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって
−核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、
−核酸を溶出する工程
を含む核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に転換する方法が提供される。
【００２８】
当業者は、例えば、重亜硫酸反応の主なパラメーターを開示するFrommer et al.,上掲、またはGrigg and Clark,上掲を参照することで重亜硫酸反応、特に重亜硫酸反応の脱アミノ化工程、すなわち、本発明による方法の工程ａ１）または工程ａ２）をどのように行うか知っている。Grunau et al.,上掲から、重亜硫酸法の如何なるバリエーションが可能であるかは当業者に公知である。脱アミノ化効率に対するインキュベーション時間および温度の影響ならびにＤＮＡ分解に影響を及ぼすパラメーターが開示される。要約すると、脱アミノ化工程において、重亜硫酸イオンを含むバッファおよび任意にグアニジニウムイオンまたは尿素のようなカオトロピック剤およびアルコールのようなさらなる試薬またはハイドロキノンのような安定化剤が使用され、ｐＨは酸性範囲である。重亜硫酸の濃度は０．１〜８Ｍの重亜硫酸、好ましくは０．１〜６Ｍ、より好ましくは０．１〜５．５Ｍであり、カオトロピック剤の濃度は１〜８Ｍであり、一般的に好ましくはグアニジニウム塩、より好ましくはWO2005/054502に記載される亜硫酸水素グアニジニウムを使用する。ｐＨは酸性範囲、好ましくは４．５〜６．５であり、温度は０℃〜９０℃、好ましくは室温（２５℃）〜９０℃であり、反応時間は３０分〜２４時間または４８時間以上であるが、好ましくは１時間〜２４時間である。
【００２９】
従って、本発明の好ましい態様において、本発明による方法の工程ａ１）または工程ａ２）において、試料における亜硫酸イオンの存在が試料中のメチル化標的核酸中の（非メチル化）シトシン塩基をウラシル塩基に転換する方法が提供される。より好ましくは、方法は工程ａ１）または工程ａ２）において、１）メチル化標的核酸を含む試料を亜硫酸イオンを含む溶液と混合する工程；２）（メチル化標的）核酸および亜硫酸イオンを含む工程１）で得られた溶液をインキュベートし、それによって標的核酸を脱アミノ化する工程、３）任意に脱アミノ化核酸を脱塩する工程を含む。亜硫酸イオンの濃度は好ましくは０．１〜８Ｍ、より好ましくは０．１〜６．２５Ｍ、０．１〜６Ｍ、より好ましくは２〜６Ｍである。工程１）および工程２）の溶液のｐＨは、好ましくは酸性範囲であり、より好ましくは４．５〜６．５である。工程２）および工程３）のインキュベーション温度は好ましくは、０℃〜９０℃であり、好ましくは１８℃〜９０℃である。工程２）のインキュベーション時間は好ましくは３０分〜４８時間、より好ましくは２４時間である。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、WO2004/067545に記載されるインキュベーションパラメーターが使用され得、核酸は７０〜９０℃の温度で１．５〜３．５時間の間、溶液中でインキュベートされ、溶液中の重亜硫酸濃度は３Ｍ〜６．２５Ｍであり、溶液のｐＨ値は５．０〜６．０であり、それによって核酸が脱アミノ化される。
【００３１】
本発明の方法の工程ｃ）において、固相結合核酸がアルカリｐＨを有する溶液中でインキュベートされる。それによって、核酸中のシトシン塩基が脱スルホン化され、ウラシル塩基に転換され、核酸が溶出される。これは、これらの効果が同じ工程でまたは同時に起こることを意味するが、短時間スパンにおいて溶出および次の脱スルホン化が起こるかその逆で起こることを除外しない。これは、これらの効果が同時に起こるかまたは互いに従属して、特に互いに非常に離れた時点で関係したことを例示するのみである。
【００３２】
好ましくは、アルカリｐＨを有する溶液は、低濃度の水溶液であり、すなわち、これは好ましくは２００ｍＭ未満、より好ましくは１００ｍＭ未満の、全ての低濃度の溶解物質を含む。脱スルホン化だけでなく溶出をさらに可能にすることが重要である。より好ましくは、溶液はＮａＯＨを含む。より好ましくは溶液は、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜６０ｍＭ、より好ましくは２５〜５０ｍＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含む。２５〜５０ｍＭのＮａＯＨは、本発明を通じて好ましい。例えば、ＬｉＯＨまたは他のアルカリ性水酸化物等としてＮａＯＨまたはＫＯＨのみ以外の他の物質が使用され得ることが当業者に明白である。アルカリ土類水酸化物、または核酸の溶出を阻害せず、満足して溶液をアルカリ性にする物質も使用可能である。溶液のｐＨは好ましくは、１０より大きく、より好ましくは１２または１４より大きい。核酸溶液の安定化剤としての他の物質は、プロセスに干渉せず、それ自体分解される限り、可能である。
【００３３】
溶出および脱スルホン化はまた、室温（２０℃）〜８５℃で行われ得る。しかし、溶出はしばしば、より高い温度でより効率的であるので、６０〜８０℃の範囲の高い温度が好ましい（例えば、WO99/16781を参照）。従って、本発明のより好ましい態様において、本発明の方法の工程ｃ）における温度は６０〜８０℃である。反応の成功自体が影響を受ける限りにおいて、脱スルホン化は温度によってひどく影響を受けない。脱スルホン化の温度範囲が重亜硫酸処理のための条件の記載の下で本明細書に記載される。
【００３４】
本発明の態様において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、特にゲノムＤＮＡ，すなわち、個体ゲノム中に見出され、生存に必要な情報として子孫に伝えられるＤＮＡまたは核酸である。該句は、プラスミド内に見出される等の、他の種類のＤＮＡを区別するために使用される。核酸の供給源は、原核生物または真核生物であり得、好ましくは脊椎動物、特に哺乳動物、最も好ましくは動物またはヒト由来である。好ましくは、核酸はメチル化核酸またはメチル化標的核酸、すなわち、５−メチル−シトシン塩基を含むかまたは含み得る核酸およびシトシン塩基を含むかまたは含み得る核酸である。
【００３５】
重亜硫酸反応の脱アミノ化および／または脱スルホン化工程中の固相の使用は、取り扱いがより単純および／または容易に自動化しやすいという利点を有する。例えば、ガラスフリースを脱アミノ化および／または脱スルホン化工程に使用する場合、ＤＮＡ沈殿反応の消費時間が必要でない；結合のない分離が遠心分離で容易に達成され得、ガラスフリースの無駄な体積を無視することができ、従って洗浄工程が非常に効率的である。これは、重亜硫酸処理ＤＮＡが潜在的なインヒビターが感度を有意に減少し得るＰＣＲに使用される場合に有利である。本発明による方法はまた、マニュアルで行われ得、従って普通の分析器が利用可能でないより小さな実験室に適切である。試料をよりハイスループットにするより大きな実験室のために、普通の分析器で取り扱われ得る固相の使用、特に磁性ガラス粒子が、有利である。
【００３６】
本発明の態様において、核酸は、非修飾固相に結合し、すなわち、核酸は結合を媒介する任意の化合物なしに固相に直接結合する。核酸が固相の非修飾表面に結合し、それによって表面への結合には、固相が孔を含み得、核酸が固相の孔の表面に結合し得ることも考慮する。本発明による態様において、固相は、イオン交換器であり得（例えば、AmershamBiosciences Europe, Freiburg, Germanyから市販）、好ましくは非修飾表面を有する、ヒドロキシルアパタイト（Sigma, Taufkirchen, Germanyから市販）、ガラスもしくはシリカまたはガラスもしくはシリカを含む物質の特定の条件下で、核酸に結合可能であり得る。別の態様において、固相は修飾され得、すなわち、例えば、核酸の表面に結合したオリゴヌクレオチドへの配列特異的な結合またはビオチン標識ＤＮＡに結合するストレプトアビジン（固相の表面に結合する）によって、固相は固相への結合を媒介する化合物と共に間接的に核酸と結合する。従って、適切な粒子がDYNAL, Olso, Norwayから市販されており、例えばWO90/06045に記載される。
【００３７】
用語「非修飾」は、さらなる化学修飾がないこと、すなわち、他の化学基は共有結合または非共有結合されないことを意味する。用語「非修飾表面」、「非修飾シリカ表面」または「非修飾ガラス表面」は、核酸結合のための中間物質として働き、そこで核酸がシリカ表面自体ではなく中間物質と結合する他の化学基が、共有結合または非共有結合されないことを意味する。従って、核酸は好ましくは水素結合および他の原子間力によって「非修飾表面」と直接結合する。修飾表面の例は、配列特異的な様式で核酸分子と結合するオリゴヌクレオチドが結合したシリカ表面である。修飾シリカ表面のための別の例はビオチン化ＤＮＡ分子と結合するストレプトアビジンでコートされたシリカ表面である。
【００３８】
本発明による特に好ましい態様において、固相は、好ましくは非修飾（ガラスまたはシリカ）表面を有する、ガラスまたはシリカを含む物質、例えば、ガラス繊維または珪藻土、ガラスビーズまたは粒子、ガラス膜または磁性ガラス粒子または非修飾表面で覆われた他の物質である。ガラスフリースまたはガラス膜または磁性ガラス粒子が特に好ましい。かかる固相は例えば、EP 0 389 063またはUS 5,234,809に開示される。
【００３９】
DNAまたは核酸のガラス表面またはシリカ表面への結合のための条件は、基本的に当該技術分野の熟練者に公知である。これらの方法は、種々の文書に詳細に記載される。Vogelstein, B., and Gillespie, D., Proc Natl Acad SciUSA 76 (1979) 615-9において、例えば、ヨウ化ナトリウムの存在下で、アガロースゲルからの核酸を研削フリントガラス面に結合させる手順が提唱されている。過塩素酸ナトリウムの存在下のガラスダスト上での細菌からのプラスミドDNAの精製は、Marko, M. A., et al., Anal Biochem 121 (1982) 382-7に記載されている。DE 37 34 442には、酢酸を用いたファージ粒子の沈殿および過塩素酸塩によるファージ粒子の溶解によるガラス繊維フィルター上の一本鎖M13ファージDNAの単離が記載されている。ガラス繊維フィルターに結合した核酸を洗浄して、次いでメタノール含有Tris/EDTAバッファーで溶出する。λファージからDNAを精製する同様の手順は、Jakobi, R., et al., Anal Biochem175 (1988) 196-201に記載されている。該手順は、カオトロピック塩溶液中での核酸のガラス表面への選択的な結合およびアガロース、タンパク質または細胞残渣などの夾雑物からの核酸の分離を必然的に伴う。夾雑物からガラス粒子を分離するために、粒子を遠心分離し得るか、またはガラス繊維フィルターから流体を吸いだす。しかし、これは、該手順が大量の試料を処理するために使用されることを妨げる、制限された工程である。本発明の好ましい態様において、例えばAlderton, R. P., et al., Anal Biochem201 (1992) 166-9およびPCT GB 91/00212に記載されるように、塩およびエタノールを添加して沈殿させた後、磁性ガラス粒子を用いて核酸を結合させる。
【００４０】
本発明の極めて好ましい態様において、固相は、好ましくは、非修飾ガラス表面を有する、磁性ガラス粒子である。磁性ガラス粒子は、ガラス中の小磁性核の固体分散液であり、即ち極めて小さな磁性物質が分散したガラス小滴である。磁性物質と呼ばれるこれらの物質は磁石、即ち、フェリもしくは強磁性物質または例えば超常磁性物質に引き寄せられる。特に、それまでに予備的に磁化されていない場合、フェリまたは強磁性物質が好ましい。好ましい磁性物質は、鉄、または例えば磁鉄鉱（Fe3O4）もしくはFe2O3等の鉄酸化物であり、好ましくはγ-Fe2O3である。原則として、バリウムフェライト、ニッケル、コバルト、Al-Ni-Fe-Co合金または他のフェリもしくは強磁性物質が使用され得る。本発明に従って、WO 96/41811、WO 00/32762およびWO 01/37291に記載される磁性ガラス粒子が特に好ましい。
【００４１】
本発明に使用される磁性ガラス粒子は、本質的にWO 01/37291に記載されるように異なる製剤で提供され得る。粉末または好ましくは懸濁物として、これらを錠剤の形態で提供することが可能である。本発明の好ましい態様において、これらの懸濁物は5〜60mg/mlの磁性ガラス粒子（MGP）を含む。本発明の別の態様において、シリカ含有物質が、2〜8mol/1、好ましくは4〜6mol/1の濃度のカオトロピック剤を任意に含有し得る緩衝化水溶液中に懸濁される。カオトロピック塩はヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネートまたは塩酸グアニジンである。本発明によるカオトロピック剤は、液体水中の整列された構造を乱し、かつこの薬剤がDNAまたはRNA含有溶液中に存在する場合DNAまたはRNAを本発明に従ってMGPに結合させる効果を有する任意の化学物質である。当該技術分野の熟練者に公知の他の化合物も可能である。
【００４２】
本発明による最も好ましいMGPは、MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I（Roche, Mannheim, Germany）にも提供される国際出願WO 01/37291に従って製造される。これらは、直径約23nmの磁性物質または顔料（CERAC製、γ-Fe2O3からなる；CERAC: P.O. Box 1178, Milwaukee, Wisconsin 53201-1178 USA; Article-No. I-2012）を用いて、国際出願WO 01/37291に記載されるようにゾル-ゲル法で製造される。従って、本発明の好ましい態様において、磁性ガラス粒子は0.5μm〜5μmの平均直径を有する。本発明の別の好ましい態様において、磁性ガラス粒子は5〜500nmの直径を有する磁性物質を含む。本発明のさらに別の好ましい態様において、磁性ガラス粒子はゾル−ゲル法で製造される。
【００４３】
核酸を（好ましくは磁性ガラス粒子の）非修飾ガラスまたはシリカ表面に結合させる実験手順は、以下のように詳細に記載され得る。これは、1〜8mol/l、好ましくは2〜6mol/lの濃度を有するカオトロピック塩の存在下で好適に実施される。カオトロピック塩はヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネートまたは塩酸グアニジンであり得る。本発明によるカオトロピック剤は、液体水中の整列された構造を乱し、かつこの薬剤が、DNA（またはRNA）含有溶液中に存在する場合にDNA（またはRNA）が磁性ガラス粒子に結合するという効果を有する任意の化学物質である。当該技術分野の熟練者に公知の他の生物学的物質も存在し得る。さらに他の物質も可能である。核酸および任意に他の生物学的化合物の混合物を結合するために、非修飾ガラス表面を有するガラスビーズが混合物に添加され、結合が生じるのに充分な時間インキュベートされる。熟練者は、通常、インキュベーション工程の時間に精通している。この工程は、異なる時点での表面上の固定核酸の量を決定することで最適化され得る。10秒〜30分のインキュベーション時間が核酸に適切であり得る。次いで、重亜硫酸反応の異なる工程を実施するための試薬が添加される（またはその前に存在させておいてもよい）。インキュベーションまたは洗浄の後、核酸は液体から分離され得る。これは、一般的には重力によりなされ得るか、または磁性ガラス粒子に結合した核酸の都合のよい場合に磁場をかけることにより磁性ガラス粒子に結合した核酸を分離することによってなされ得る。例えば、磁性粒子は、インキュベーションを行なった容器の壁に引き寄せられ得る。磁性粒子に結合しなかった生物学的化合物または反応成分を含有する液体はその後除去され得る。使用される除去手順はインキュベーションを行なった容器の種類に依存する。適切な工程はピペッティングまたはアスピレーションによる液体の除去を含む。結合した核酸を有する物質は、次いで、好ましくは70容量部のエタノールと30容量部の水の混合物（「70％エタノール」）で、またはWO 99/40098に記載されるような酸性洗浄液中で少なくとも1回洗浄され得る。核酸および標的核酸は物質表面から放出されないが、望ましくない夾雑物を可能な限り完全に洗浄する洗浄液が使用される。この洗浄工程は、好ましくは結合核酸をガラスまたはシリカとインキュベートすることで行なう。好ましくは、この工程中に該物質を再懸濁する。好ましくは汚染された洗浄液を上述の結合工程中のように除去する。最後の洗浄工程の後、該物質を真空中で簡単に乾燥させ得るか、または液体を静置して蒸発させ得る。また、アセトンを用いた予備処理工程も行い得る。
【００４４】
本発明の態様において、本発明による固相および当該分野の熟練者に公知の方法を用いて、生物学的試料から核酸を得る。生物学的試料は、例えばヒトのような多細胞生物由来の細胞およびリンパ球などの動物細胞、ならびにハプテン、抗原、抗体などの免疫学的に活性な低および高分子化合物および核酸、血漿、脳脊髄液、痰、便、検体標本、骨髄、口内洗浄物、血清、組織、尿またはそれらの混合物を含む。本発明の好ましい態様において、生物学的試料はヒトまたは動物体由来の液体である。好ましくは、生物学的試料は、血液、血漿、血清または尿である。血漿は、好ましくはEDTA、ヘパリンまたはクエン酸処理された血漿である。核酸を含む生物学的試料は溶解されて、核酸およびその他の成分を含む生物学的化合物の混合物を生じる。生物学的試料を溶解する手順は熟練者に公知であり、性質において化学的、酵素的および物理的であり得る。これらの手順の組合せも適用可能である。例えば、溶解は、超音波、高圧、剪断力、アルカリ、界面活性剤もしくはカオトロピック塩溶液、またはプロテアーゼもしくはリパーゼを用いて実施され得る。核酸を得るための溶解手順について、Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版、 Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NYおよびAusubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NYに特定の参照がなされている。次いで、核酸を、本発明による方法および固相を用いて溶解混合物から単離し、その後本発明による方法、即ち本発明による重亜硫酸処理にかけることができる。細胞を溶解し、核酸および他の生物学的物質の混合物を調製するためにカオトロピック剤も使用される（例えば、Sambrook et al. (1989) またはEP 0 389 063参照）。その後、これらの条件下、即ち特定の濃度のカオトロピック剤、より高い濃度の有機溶媒の存在下で、または酸性条件下で、ガラスまたシリカを含む物質を添加して、DNAまたはRNAのガラス表面を有する物質への結合から精製効果が生じる。そのため、本発明はまた、溶解工程および重亜硫酸反応の組合せを考慮し、つまり核酸と他の生物学的物質の混合物から単離された核酸が直接重亜硫酸処理にかけられ、核酸は脱アミノ化および／または脱スルホン化工程の際に固相に結合する。
【００４５】
より詳細に、核酸が、核酸と他の生物学的化合物の混合物から単離され、重亜硫酸反応の脱アミノ化および脱スルホン化工程の際に固相に結合する方法が提供され、つまり、
a)  核酸と他の生物学的化合物の混合物を提供する工程、
b)  固相に核酸を結合し、任意に他の生物学的化合物を除去し、任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
c)  亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、任意に固相結合核酸を洗浄する工程、
d)  アルカリpHを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって
-核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、
-核酸を溶出する工程
を含み、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基をウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基に転換し、好ましくは複数の5−メチル−シトシン塩基が有意に転換されない（「重亜硫酸反応」または「重亜硫酸処理」）方法が提供される。
【００４６】
本発明により、洗浄および結合工程のために、好ましくは分子生物学のプロセス、特に特定の条件下で固相、特にシリカまたはガラス表面、さらに具体的に磁性ガラス粒子へのデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）の結合を利用する精製プロセスに適切な液体が使用される。好ましい液体は、アルコールおよび／またはケトンまたは水を有するそれらの混合物を含む。本発明によって、アルコールとしては、好ましくは一般式R-OH（式中、Rは、n≧0である一般式-(-CH2)n-CH3を表す）の1級、2級または3級アルコールが挙げられる。しかし、分子生物学的目的に適切な場合、例えばグリセロールなどの他のアルコールが使用され得る。特に、アルコール類、イソプロパノール、エタノールまたは水を有するそれらの混合物、好ましくは80容量部のイソプロパノールと20容量部の水の混合物が適切である。本発明の別の態様において、液体は、例えばアセトンなどのケトン類を含む。さらに、適切な緩衝化水溶液が使用される。分子生物学的目的に適切なバッファー系は、例えばSambrook, J., et al., の「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 (1989), J. Sambrook, E. F. FritschおよびT. Maniatis編, Cold Spring HarbourLaboratory Press, Cold Spring Harbour, NYに見出され得る。好ましいバッファー物質はTris-ヒドロキシメチルアミン（TRIS）、リン酸塩、N-(2-ヒドロキシ-エチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)（HEPES）、それらの塩または他の適切な物質である。さらに、例えばNaCl、KClもしくはCaCl2などの溶液のイオン強度を変更する物質、または例えばエチレン-ジアミン-テトラ-酢酸（EDTA）またはその塩などの金属カチオン錯体化剤である物質が存在し得る。
【００４７】
本発明による方法は、結合した核酸を固相から溶出する工程をさらに含む。次いで、溶出された核酸は酵素的処理、例えば増幅され得る。核酸を含む溶液は、溶出後および固相を除去した後に増幅反応に使用されるように調製される。そのため、核酸を、増幅に必要な全ての試薬を含む新しい反応チューブに移す。任意に、増幅に必要な全ての試薬を含む溶液を固相および放出核酸の懸濁物に添加する。別の態様において、溶出工程を行なうことなく、増幅に必要な全ての試薬を含む溶液を固相および結合した核酸の懸濁物に添加して、固相上で核酸の増幅を行なう。従って、本発明の別の態様において、a1)  固相に核酸を結合し、亜硫酸イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化する工程、またはa2)  亜硫酸イオンの存在下で核酸をインキュベートし、核酸中のシトシン塩基を脱アミノ化し、固相に核酸を結合させる工程、b)  任意に固相結合核酸を洗浄する工程、c)  アルカリpHを有する溶液中で固相結合核酸をインキュベートし、それによって核酸中のシトシン塩基を脱スルホン化し、ウラシル塩基に転換し、核酸を溶出する工程、d)  溶出核酸を増幅する工程を含む、核酸を増幅する方法が提供される。
【００４８】
本発明の好ましい態様において、核酸はポリメラーゼ連鎖反応（PCR；EP 0 201 184、EP 0 200 362、US 4,683,202）により増幅される。増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（LCR, Wu, D. Y., and Wallace, R. B., Genomics 4 (1989) 560-9およびBarany, F., Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 189-93；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Barany, F., PCR Methods Appl 1 (1991) 5-16); Gap-LCR （PCT特許公開公報第WO 90/01069号）；修復連鎖反応（欧州特許公開公報第EP 439 182 号A2）、3SR（Kwoh, D. Y., et al., Proc Natl AcadSci USA 86 (1989) 1173-7；Guatelli, J. C., et al., Proc Natl AcadSci USA 87 (1990) 1874-8；PCT特許公開公報第WO 92/08808号）、ならびにNASBA（米国特許第US 5,130,238号）であってもよい。さらに、鎖置換増幅（SDA）、転写仲介増幅（TMA）、およびQβ-増幅（総説について例えば、Whelen, A. C., and Persing, D. H., Annu Rev Microbiol 50 (1996) 349-73；Abramson, R. D., and Myers, T. W., CurrOpin Biotechnol 4 (1993) 41-7を参照）がある。本発明による特に好ましい増幅方法は、US 5,786,146に開示された、重亜硫酸処理および対立遺伝子特異的PCRを組み合わせたメチル化特異的PCR法（MSP）（例えば、US 5,137,806、US 5,595,890、US 5,639,611参照）である。
【００４９】
好ましい態様において、該方法は、増幅した核酸の検出工程をさらに含み得る。増幅した核酸を、当業者に公知で、例えばSambrook, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press (1989), Lottspeich and Zorbas, の「Bioanalytik」(1998), L. a. Zorbas編, Spektrum AkademischerVerlag, Heidelberg, Berlin, Germany, またはAusubel, F., et al., の「Current protocols in molecular biology」(1994), F. Ausubel, R. Brent and K. R.E.編, Wiley & Sons Verlag, New Yorkに記載される標準的な解析方法により測定または検出し得る。標的核酸を検出する前にさらなる精製工程、例えば沈殿工程が存在し得る。検出方法としては、限定されないが、二本鎖DNA中に挿入されその後蛍光を変化するエチジウムブロマイドなどの特異的な色素の結合または挿入が挙げられ得る。精製された核酸は、任意に制限酵素消化してその後視覚化された後、電気泳動法により分離され得る。特異的な配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびその後のハイブリッドの検出を利用するプローブベースアッセイも存在する。当該技術分野の熟練者に公知のさらなる工程の後、標的核酸の配列を決定することも可能である。他の方法は、特異的なプローブが結合して、相補的な配列が結合した際にシグナルを生じるシリコンチップに対する多様な核酸配列を適用する。
【００５０】
本発明の特に好ましい態様において、核酸は、増幅の際の蛍光強度の測定により検出される。この方法は、リアルタイムでの蛍光のモニタリングを必然的に伴う。蛍光の強度の測定による同時の増幅と検出を利用する特に好ましい方法は、WO 92/02638および対応する米国特許第US 5,210,015号、US 5,804,375号、US 5,487,972号に開示されるTaqMan（登録商標）法である。この方法は、シグナルを生成するポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性を利用する。詳細に、試料を、標的核酸の領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドおよび第1のオリゴヌクレオチドにより規定される核酸配列を含まないが同一の標的核酸鎖の第2の領域に相補的な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドと接触させ、ハイブリダイゼーション条件で二本鎖の混合物を生成する工程であって、ここで該二本鎖は、第1のオリゴヌクレオチドの3'末端が標識されたオリゴヌクレオチドの5'末端に隣接するように、第一のオリゴヌクレオチドおよび標識されたオリゴヌクレオチドにアニーリングする標的核酸を含む、工程を含む方法により核酸は検出される。次いでこの混合物は、ポリメラーゼの5'〜3'ヌクレアーゼ活性によりアニーリングされ標識されたオリゴヌクレオチドを切断し、標識されたフラグメントを放出するのに充分な条件下で5'〜3'ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的な核酸ポリメラーゼで処理される。標識オリゴヌクレオチドの加水分解により生成されたシグナルを検出および／または測定する。TaqMan（登録商標）計測器に使用される形式は、固相結合反応複合体を形成し検出可能にする必要性を排除する。より一般的な条件においては、本発明による方法の増幅および／または検出反応は、均一な溶液相アッセイである。さらに好ましい方法は、LightCycler（登録商標）計測器（例えば、US 6,174,670参照）に使用される形式である。US 6,331,393に記載される重亜硫酸処理、メチル化特異的プローブの存在下でのメチル化特異的プライマーを有するかまたは有さない増幅、およびリアルタイム蛍光検出の使用が特に好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、該方法は自動化される、つまり該方法は、例えばWO 99/16781に記載されるような自動化方法を実行する。自動化方法とは、該方法の工程が、外部制御または人の手による影響をほとんどまたは全く有することなく操作可能な装置または機械によって実行されるのに適切であることを意味する。自動化された方法とは、自動化可能な方法の工程が、外部制御または人の手による影響をほとんどまたは全く有することなく操作可能な装置または機械によって実行されることを意味する。該方法の調製工程、例えば、保存容器は充填されて設置される必要があり、試料の選択は人によってなされなければならず、当該技術分野の熟練者に公知のさらなる工程、例えばコンピューター制御の操作のみが手動によって行なわれなければならない。該装置または機械は、例えば自動的に液体を添加し得るか、試料を混合し得るか、または特定の温度でのインキュベーション工程を行い得る。典型的に、かかる機械または装置は、単一工程およびコマンドが指定されたプログラムを実行するコンピューターによってロボット制御される。本発明の好ましい態様において、該方法はハイスループット形式であり、即ち自動化された方法は、該方法および使用される機械または装置が短時間で、試料のハイスループットについて最適化されることを意味するハイスループット形式で実行される。
【００５２】
好ましくは、本発明による方法は、特定のメチル化パターンの存在について、診断的解析または生物解析のため、またはヒトもしくはさらに動物体由来の組織もしくは液体のスクリーニングのための診断に使用される。さらに、本発明による方法は、核酸中のメチル化部位の検出の速度、精度または感度を高めるために使用される。
【００５３】
本発明の態様において、核酸中のスルホン化および脱アミノ化シトシン塩基の脱スルホン化または固相結合核酸中のスルホン化および脱アミノ化シトシン塩基の脱スルホン化ならびに固相からの固相結合核酸の次の溶出のために、10〜100mM、好ましくは20〜60mMのNaOHまたはKOHを含む溶液が使用される。好ましくは、固相はシリカまたはガラスを含む物質である。好ましくは、固相はガラスフリースまたはガラス膜である。より好ましくは、固相は磁性ガラス粒子である。
【００５４】
別の態様において、本発明は、重亜硫酸塩または重亜硫酸イオンを含む溶液、固相および10〜100mM、好ましくは20〜60mM、より好ましくは25〜50mMのNaOHまたはKOHを含む溶液を含む、重亜硫酸反応を行うためのキットに関する。好ましくは、固相はシリカまたはガラスを含む物質である。好ましくは、固相はガラスフリースまたはガラス膜である。より好ましくは、固相は磁性ガラス粒子である。本発明の別の好ましい態様において、本発明による磁性ガラス粒子またはその懸濁物を含有する保存容器を含むキットの一部が提供される。当該技術分野に公知のかかるキットは、例えば96もしくは384ウェル形式のマイクロタイタープレートまたはEppendorf, Hamburg, Germany製の反応チューブ等の重亜硫酸手順の際に使用され得るプラスチック製品をさらに含む。キットは、固相、特にガラスフリースもしくはガラス膜または磁性ガラス粒子の洗浄工程に適した洗浄溶液をさらに含み得る。しばしば、洗浄溶液は、使用前に希釈されることを必要とするストック溶液として提供される。さらに、本発明の使用に適したバッファーを含むさらなる試薬が存在してもよい。好ましくは、本発明によるキットは、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基が、重亜硫酸イオンの存在下でウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基に転換され、それにより好ましくは5-メチル-シトシン塩基が有意に転換されない反応に使用される。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲が付随の特許請求の範囲に記載される。本発明の範囲を逸脱することなく、以下に記載の手順において変更がなされ得ることが理解されよう。
【００５６】
（実施例）
実施例1-簡易BISプロセスと当該技術分野手順の様式の比較
実施例1-バックグラウンド
重亜硫酸反応が作用し、非メチル化シトシンをウラシルに転換するという事実は、核酸配列の領域に特異的なプライマーが使用されるポリメラーゼ連鎖反応によって説明され得、非メチル化シトシンがウラシルに転換される、即ちプライマー中の塩基アデニンが、非メチル化シトシンに由来する重亜硫酸反応産物であるウラシルに対向する。転換が不完全な場合には、プライマー中のアデニン塩基と適合しないシトシンがあるために、プライマーはこの領域にはハイブリダイズすることができない。これによってPCR産物が得られないという影響がある。
【００５７】
迅速ポリメラーゼ連鎖反応を実施する改善された方法は、例えばUS 6,174,670に開示され、LightCycler（登録商標）計測器（Roche, Mannheim, Germany）に使用される。この方法において、2つの標識されたプローブが増幅物依存的な様式で近位に接近でき、2つの標識は蛍光エネルギー転移（FRET）を行い得る。それによって増幅物の量は、特定の波長の放射光の強度に相関する。この特定PCR法は、従って、適切なプローブおよびプライマーを使用して非メチル化シトシンの完全な転換が得られたかどうかを解析するために使用され得る。しかしながら、当業者は、この評価に対して他の方法も使用され得ることを知っている。蛍光測定値は、反応のサイクル初期に得られた開始の蛍光測定値、即ちバックグラウンド蛍光で割ることによって標準化されるが、一方でサイクル間の蛍光測定値は相対的に一定であるように見える。開始の蛍光測定値について選択されるサイクル数は、比較される全ての反応について同じであるので、全ての測定値は、同じ反応サイクルに対して増加を示す。ポリメラーゼ連鎖反応増幅の初期のサイクルにおいて、標的分子の数は、幾何学的方程式（geometric equation）Ni=NOx(1+E)i、（式中NO=反応開始時の標的分子の数、Ni=i回目のサイクルの完了時の標的分子の数、E=増幅効率（0≦E≦1））で示され得る。増幅の幾何学的増殖期の間に、特定の閾値に達するのに必要なサイクル数（CTもしくはCP値または交点）は（1+E）の対数に反比例する。従って、CTまたはCP値は、反応間の比較を可能にする反応効率の基準を示す。反応がより少ないサイクル数で閾値に達したことを意味するCTまたはCP値の減少は、反応効率の増加を示す。反応蛍光の増加を測定することにより増幅産物の増加がモニターされるので、CTまたはCPは、本明細書中では、蛍光が任意蛍光レベル（AFL）を超えるまで実行される増幅サイクルの数として規定される。基準値蛍光レベルに近いが測定された蛍光におけるランダム変動の範囲を超えるAFLが選択され、反応速度が増幅の幾何学的増殖期の間に測定された。後期のサイクルにおける増幅産物の蓄積により、反応が阻害され、全体的に反応がプラトーになる。全ての反応について1.5のAFLが選択された。PCR増幅は個別のサイクルからなり、1サイクルごとに1度の蛍光測定がなされるので、典型的に、測定された蛍光は1サイクル中でAFL以下からAFLを超えて増加する。測定の精度を改善するために、本明細書ではCTもしくはCP値または交点という、AFL閾値に到達する「正確な」サイクル数が、サイクル間に蛍光測定値を挿入することで計算された。
【００５８】
実施例1-実験
重亜硫酸処理されたDNA（例えば、標準的方法に従ったパラフィン包埋組織（PET組織）から抽出された））の脱アミノ化後、脱アミノ化されたDNAを有する溶液を固相（例えば、磁性ガラス粒子）に結合させて、洗浄して重亜硫酸を除去した。次いで、重亜硫酸処理DNAを、異なる濃度のNaOHを種々の温度で使用して直接溶出して以降の増幅に使用する（簡易重亜硫酸プロセス）か、または結合した重亜硫酸処理DNAをまず脱スルホン化して、その後、再度洗浄してTEバッファーで溶出する（欧州特許出願第EP 1 394 173号に記載）。マスターミックスの組成および増幅条件はEP 1 394 173と同じにしたが、簡易ワークフローに使用したマスターミックスは、PCR反応混合物自体と同一のpHとなる参照プロセスについてpH 7.8対8.2であった。試料は3重で処理して、結果も3重で示す。PCRとしては、重亜硫酸転換DNAに特異的なプライマー／プローブを使用する任意のPCR、またはEP 1 394 173に記載される物質および方法が使用され得る。
【００５９】
以下の表は、広範囲のNaOH濃度において、および異なる溶出温度において簡易ワークフローが良好に働き、参照プロセスよりもかなり高い感度であることを示す。
【００６０】
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【００６１】
実施例2：COBAS（登録商標）AmpliPrep全核酸単離（TNAI）キット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を使用した、COBAS（登録商標）AmpliPrep装置による簡易BISプロセスの自動化
2つのPET試料由来の脱アミノ化DNAを手動的に（上述のように）、または自動的に水を1000μlまで添加してチューブをCOBAS（登録商標）AmpliPrep装置（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）にセットして、プロテイナーゼKおよび内部コントロールピペッティング工程を省略するプログラムを適用することによってのいずれかで処理した。TANIキットの結合バッファー、磁性ガラス粒子（MGP）および洗浄バッファーを使用したが、溶出試薬はPCR水中25mM NaOHとした。溶出容量は75μlであった。自動化方法について、4回の測定を行い、手動方法については8回の測定を行った。
【００６２】
その後の増幅について、手動または自動プロセスで得られた50μlの溶出物を増幅した。
【００６３】
以下の表は結果を示す：おそらくCOBAS（登録商標）AmpliPrep装置によるより効率的な洗浄プロセスのために、自動化プロセスは非常に有効に働き、Ct値は手動プロセスよりもかなり良好であった。
【００６４】
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【国際調査報告】
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