(57)【要約】本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染の分野に関する。特に本発明は、ＣＭＶ感染に関連する疾患を治療する上で有用な高度特異的免疫毒素に関する。ＣＭＶは、構成的なインターナリゼーションを受けるケモカイン受容体をコードする。それ故ＣＭＶ感染細胞は、ＣＭＶによってコードされる構成的にインターナライズする受容体に対して高い親和性を有する免疫毒素で特異的に標的され得る。これは、ＣＭＶ感染細胞による免疫毒素の効率的な取込みを確実にし、それによって、望ましくない毒性及び副作用を最小限にとどめつつ感染細胞の死滅を確実にする。さらに、本発明は、構成的にインターナライズする、ＣＭＶによってコードされる受容体を標的することによる、免疫毒素を使用してＣＭＶの複製及び／又は増殖を阻害する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトＣＭＶによってコードされ、ＣＭＶ感染細胞上で発現される、構成的にインターナライズする受容体に結合するリガンド、及び（ｂ）ＣＭＶ感染細胞に対して細胞傷害性である毒素を含む免疫毒素であって、配列番号１ではない免疫毒素。
【請求項２】
受容体が、ヒトＣＭＶによってコードされるタンパク質ＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３及びＵＬ７８又はその何らかの天然に生じる変異体から成る群より選択される、請求項１に記載の免疫毒素。
【請求項３】
受容体がＵＳ２８である、請求項２に記載の免疫毒素。
【請求項４】
リガンドが、ケモカイン又はその変異体又は抗体もしくはそのフラグメントから成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項５】
リガンドがケモカイン又はその変異体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項６】
リガンドが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、家禽、ブタ、ウマ、アカゲザル、オランウータン、ウシ、イヌもしくはウイルスを起源とするケモカイン又はその変異体から成る群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項７】
リガンドが、ＣＣケモカイン、ＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインから成る群より選択されるケモカイン又はその変異体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項８】
リガンドが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７及びＣＣＬ２８から成る群より選択されるＣＣケモカイン又はその変異体である、請求項７に記載の免疫毒素。
【請求項９】
リガンドが、ヒト又はマウスを起源とするＣＣケモカイン又はその変異体である、請求項８に記載の免疫毒素。
【請求項１０】
リガンドが、ＸＣＬ１及びＸＣＬ２から成る群より選択されるＸＣケモカイン又はその変異体である、請求項７に記載の免疫毒素。
【請求項１１】
リガンドが、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５及びＣＸＣＬ１６から成る群より選択されるＣＸＣケモカイン又はその変異体である、請求項７に記載の免疫毒素。
【請求項１２】
リガンドがＣＸ3Ｃケモカイン又はその変異体である、請求項７に記載の免疫毒素。
【請求項１３】
リガンドが、ヒトＣＸ3ＣＬ１（配列番号２）に対して少なくとも６７％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である、請求項１２に記載の免疫毒素。
【請求項１４】
リガンドが、ヒトＣＸ3ＣＬ１のケモカインドメイン（配列番号２の２５〜１００位）に対して少なくとも６７％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である、請求項１２に記載の免疫毒素。
【請求項１５】
リガンドが１０-8Ｍ又はそれ以下のＫｄでＵＳ２８受容体に結合する、請求項１４に記載の免疫毒素。
【請求項１６】
リガンドが１０-6Ｍ又はそれ以下のＫｄでＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する、請求項１４及び１５のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項１７】
リガンドが以下の変異体：配列番号２の３１位で変異した変異体、配列番号２の３８位の変異体、配列番号２の４２位で変異した変異体、配列番号２の６０位で変異した変異体、配列番号２の６１位で変異した変異体、配列番号２の６８位で変異した変異体、配列番号２の７１位で変異した変異体、配列番号２の７２位で変異した変異体、及び配列番号２の７３位で変異した変異体から成る群より選択される、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項１８】
リガンドが以下の変異体：配列番号２の３１位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の３１位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の３８位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の３８位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の４２位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の４２位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の６０位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の６０位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の６１位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の６１位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の６８位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の６８位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の７１位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の７１位がグルタミン酸に変異した変異体、配列番号２の７１位がグルタミンに変異した変異体、配列番号２の７２位がアラニンに変異した変異体、配列番号２の７３位がアラニンに変異した変異体及び配列番号２の７３位がロイシンに変異した変異体から成る群より選択される、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項１９】
リガンドが、配列番号２の３３位、３４位及び３５位の１又はそれ以上のアミノ酸残基が変異している変異体である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項２０】
リガンドが、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によってコードされるＣＣケモカインｖＣＣＬ２（配列番号７）又はその変異体である、請求項１から７のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項２１】
リガンドが２又はそれ以上の異なるケモカインの間のキメラであり、前記ケモカインがＣＣケモカイン、ＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインから成る群より選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項２２】
リガンドが、ＵＳ２８に対する抗体又は前記抗体のフラグメント、ＵＳ２７に対する抗体又は前記抗体のフラグメント、ＵＬ３３に対する抗体又は前記抗体のフラグメント及びＵＬ７８に対する抗体又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される抗体又はそのフラグメントである、請求項４に記載の免疫毒素。
【請求項２３】
リガンドが、ＵＳ２８に対する抗体又は前記抗体のフラグメントである、請求項２３に記載の免疫毒素。
【請求項２４】
毒素が、ゲロニン、ブガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリョジン、ジフテリア、レストリクトシン、ジフテリア毒素、シュードモナス属外毒素Ａ及びそれらの変異体から成る群より選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫毒素。
【請求項２５】
毒素がシュードモナス属外毒素Ａ又はその変異体である、請求項２４に記載の免疫毒素。
【請求項２６】
毒素がＰＥ３８ＫＤＥＬ（配列番号９）である、請求項２５に記載の免疫毒素。
【請求項２７】
請求項１２から１９のいずれか１項に記載のリガンドとＰＥ３８ＫＤＥＬ（配列番号９）を含む、請求項２６に記載の免疫毒素。
【請求項２８】
ケモカインドメインＣＸ3ＣＬ１（配列番号２の２５〜１００位）及びＰＥ３８ＫＤＥＬ（配列番号９）、配列番号１１を有する免疫毒素を含む、請求項２７に記載の免疫毒素。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素の薬剤としての使用。
【請求項３０】
ＣＭＶ感染の治療又は予防のための薬剤を製造するための、請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素の使用。
【請求項３１】
ＣＭＶ感染又はＣＭＶ感染の何らかの症状の確立又は進行を予防するための薬剤の製造のための、請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素の使用。
【請求項３２】
ＨＩＶ感染患者におけるＣＭＶ感染又はＣＭＶ感染の何らかの症状の確立又は進行を予防するための薬剤の製造のための、請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素の使用。
【請求項３３】
ＣＭＶ感染が、網膜、心臓、肝臓、肺、脾臓又は血液細胞から成る群より選択される組織に局在する、請求項２９から３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
ＣＭＶ感染の治療又は予防のための個体が、ＨＩＶ患者、新生児及び免疫抑制患者、骨髄移植患者及び固形器官移植患者から成る群より選択される免疫無防備状態患者である、請求項２９から３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
ＣＭＶ感染の治療又は予防のための個体が、冠動脈疾患に罹患している患者である、請求項２９から３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素又はその何らかの生理的に許容される塩を含有する医薬組成物。
【請求項３７】
医薬的に許容される担体をさらに含有する、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
組成物が、１又はそれ以上の抗ウイルス薬と同時に、別々に又は連続的に投与される、請求項３６及び３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
組成物が、１又はそれ以上の免疫抑制薬と同時に、別々に又は連続的に投与される、請求項３６から３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
（ａ）請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素の有効量及び（ｂ）同時、別々又は連続的な投与のための抗ウイルス薬及び免疫抑制薬の群から選択される治療薬を含む、ＣＭＶ感染の治療又は予防のためのキット。
【請求項４１】
請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素をコードする配列を含む核酸配列。
【請求項４２】
免疫毒素が配列番号１１又はその変異体であり、核酸配列が配列番号２２を有する、請求項４１に記載の核酸配列。
【請求項４３】
適切な宿主において免疫毒素の生産を指令する１又はそれ以上の制御配列に作動可能に連結された請求項４１又は４２に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項４４】
請求項３９において定義される核酸構築物を含む組換え発現ベクター。
【請求項４５】
請求項３９において定義される核酸構築物又は請求項４０において定義される組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４６】
前記宿主細胞が原核生物宿主細胞である、請求項４１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４７】
請求項１から２８のいずれか１項に記載の免疫毒素の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、ＣＭＶ感染の治療又は予防のための方法。
【請求項４８】
個体が、ＨＩＶ患者、新生児及び免疫抑制患者、骨髄移植患者及び固形臓器移植患者から成る群より選択される免疫無防備状態患者である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
個体が冠動脈疾患に罹患している患者である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
ＣＭＶ感染が、網膜、心臓、肝臓、肺、脾臓又は血液細胞から成る群より選択される組織に局在する、請求項４２から４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ＣＭＶ感染に関連する疾患を治療する上で有用な免疫毒素に関する。本発明はまた、薬剤としての免疫毒素の使用、免疫毒素を含有する医薬組成物及び免疫毒素を含むＣＭＶ感染の治療又は予防のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景］
サイトメガロウイルス
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は重要なヒト病原体であり、免疫無防備状態の患者、例えばＡＩＤＳ患者、新生児、及び移植レジメンの一部として免疫抑制薬を投与された個人において疾患を引き起こすように出現する、主要な日和見病原体である。これらの個人では、急性又は再興感染におけるＣＭＶの帰結は深刻であり得、例えば、数ある病変の中でも特に、網膜炎、脳炎及びニューモシスチスを含み得る。さらに、免疫適格性宿主では、ＣＭＶは持続的な生涯にわたる感染を確立し、それを通して様々な炎症状態、例えば心臓移植及びアテレクトミー後の冠動脈閉塞及び血管形成術後の再狭窄に結びついてきた。ＣＭＶは、宿主の急性感染の間並びに生涯にわたる潜伏期の間、白血球と相互作用する。それ自体、白血球はＣＭＶ誘導性疾患において重要な役割を果たし、感染の急性期にはウイルスの伝播のための媒体として及び生涯の潜伏期の間の定住部位として関係づけられてきた。
【０００３】
ＣＭＶ感染は、米国において骨髄又は固形臓器(solid organ)移植を受ける年間推定２９，０００人の患者の約３０〜６０％が罹患し、治療しない場合は移植拒絶反応、重篤な疾病、さらには死亡を引き起こす。高価な抗ウイルス薬治療がこの疾患を制御するために使用されるが、その治療は感染を排除しない。これらの治療は、患者当たり年間３０，０００〜５０，０００米ドルを要する。ＣＭＶ感染は、米国では毎年約３，６００人の小児において深刻な結果を引き起こし、約４００人を死に至らせる。ＣＭＶ感染はまた、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者を侵し、すべてのＡＩＤＳ患者の推定４０％がＣＭＶ感染に対する治療を必要とする。現在のところＣＭＶ感染のための有効な治療はない。ウイルス抑制薬は存在するが、強い副作用があり、感染を制御するためにしか役立たない。
【０００４】
移植患者及びＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者におけるＣＭＶ感染の治療のための最も一般的な薬剤は、最初は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のために開発された一般薬（generic drug）、ガンシクロビル（Ganciclovir）及びアシクロビル（Acyclovir）である。ガンシクロビル及びアシクロビルは、ＣＭＶ並びにＨＳＶにも抑制効果を有する。Ｇｉｌｅａｄからのビスタイド（Vistide）は、より古い一般薬に代わってＲｏｃｈｅのバルサイト（Valcyte）と共に成長し、市場を占有すると予想される、より新しい化合物である。
【０００５】
特許薬又は一般薬のいずれの既存薬剤も、免疫無防備状態又は免疫抑制患者において感染を根絶することはできず、単にＣＭＶ疾患の進行を休止させるだけである。最近の臨床試験では、フォスカビル（Foscavir）とガンシクロビルが、免疫無防備状態患者を治療するそれらの能力に関して比較された。結果は、フォスカビルを使用して３０％のより良好な感染の抑制を示した。しかし、フォスカビル治療下の患者の４０％が、耐容できない吐気のためにその後ガンシクロビルに切り替えられた。これらの結果は、効果と毒性レベルの両方において改善の余地があることを示す。
【０００６】
免疫毒素
免疫毒素は、リガンドについての受容体を発現する細胞を死滅させるために使用できる、毒素と結合したリガンドである。免疫毒素治療はまた、リガンド標的治療としても知られる。それ故、免疫毒素は、送達のための標的部分（リガンド）と細胞傷害のための毒性部分を含む。現在使用されるリガンドは、モノクローナル抗体、サイトカイン／増殖因子及び可溶性受容体である。例えば伝統的な化学療法剤に比べて免疫毒素の利点は、細胞を死滅させるために細胞が分裂している必要がないことである。さらに、免疫毒素が効率よくインターナライズ(internalized)されれば、抗原陰性細胞では副作用が起こらない。
【０００７】
一般に、しかしながら、免疫毒素は印象的なレベルの効果を示さなかった。共通の問題は、それらが疾患細胞に対して十分に特異的ではなく、さらに、しばしば、その細胞傷害作用を及ぼすために効率よく疾患細胞に入り込むことができないことである。免疫毒素はまた、おそらく免疫毒素の非特異的取込みのために、他の治療薬よりも高いレベルの全身毒性を生じさせる。
【０００８】
現在、毒性、免疫原性及び抗原発現の不均一性の問題を克服するために、免疫毒素に対する新しいアプローチが探索されている。これらのアプローチは、毒素の転移及び触媒ドメインをヒト一本鎖抗体に融合するため、及び高親和性の腫瘍選択的リガンドを選択するためにファージディスプレイを使用するための遺伝子操作の使用を含む。二価構築物の使用も親和性と効力を上昇させ得る。他のアプローチは、腫瘍血管内皮を標的するリガンドの選択及び癌遺伝子産物又は分化抗原のターゲティングに集中している。免疫毒素に関する研究が過去２０年間にわたって進められていたにもかかわらず、ウイルス関連疾患に対する免疫毒素はまだ市場で入手可能にはなっていない。
【０００９】
免疫毒素は血液腫瘍においてより有用な傾向があり、血液腫瘍は、固形腫瘍と異なって標的抗原を発現する悪性細胞の割合が高いことを特徴とし、混合細胞集団及びしばしば免疫毒素が容易にアクセスできない細胞を特徴とする。腫瘍細胞を標的する場合、大部分の腫瘍細胞に関して固有の腫瘍関連抗原が同定されていないため、正常細胞も標的するモノクローナル抗体が典型的に使用される。腫瘍細胞がより高いレベルの選択抗原を発現し、腫瘍細胞が選択的に死滅される場合でも、治療はまだ、しばしば重大な副作用に結びつく。もう１つの欠点は、モノクローナル抗体が、ヒトにおいて免疫原性であるマウス起源であることであった。この問題は、主としてヒト抗体の使用によって、及びまたヒトにおいて免疫原性ではない組換えヒト増殖因子を使用することによって解決されてきた。
【００１０】
免疫毒素のインターナリゼーション（internalization）
大部分の免疫毒素は悪性形質転換を受けた細胞に対して開発され、それ故この形質転換の一部として特定の抗原又は特定抗原群を過剰発現する。これらの抗原は形質転換細胞上で過剰発現されるにもかかわらず、まれにしか形質転換細胞に特異的ではなく、しばしば正常細胞でも発現される。従って、ごくわずかな細胞抗原だけが形質転換細胞上で発現される。それ故、標的抗原を発現する正常細胞を死滅させることによる望ましくない毒性を回避するため、薬剤開発者は、ごくわずかな候補疾患抗原を標的することに制限され、それ故伝統的に、もっぱら細胞型分布に基づいて標的抗原だけを選択するように制限されてきた。その結果として、多くの免疫毒素は、それらが高親和性で標的抗原に結合する場合でも、効率よく標的細胞に入り込むことができず、不十分な効力を生じることになる。
【００１１】
免疫毒素を標的細胞に効率よく入り込ませるという問題を解決するための１つの試みがHe D. et al, 2005によって為された。彼らは、免疫毒素、ＰＥ３５／ＣＥＡ（Ｆｖ）／ＫＤＥＬを含むアルギニン（Ａｒｇ９ペプチド）を、標的細胞を発現する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に輸送するための輸送体としてアルギニン含有膜転位シグナル（ＭＴＳ）（例えばＴａｔ及びＶＰ２２）を使用した。著者達は、Ａｒｇ９ペプチド（９量体アルギニンペプチド）の免疫毒素への組込みがＰＥ３５／ＣＥＡ（Ｆｖ）／ＫＤＥＬ免疫毒素の受容体媒介性エンドサイトーシスを促進すると示唆する。残念ながら、免疫毒素へのＭＴＳシグナルの導入は、標的抗原を発現する細胞に対する特異性の喪失を生じさせる。それ故このアプローチは、免疫毒素をいかにして標的細胞に入り込ませるかという問題への解決策ではないと思われる。
【００１２】
サイトカイン／増殖因子と毒素から成る免疫毒素（サイトカインに基づく免疫毒素）は、サイトカインを介した受容体活性化と、それに続く受容体のインターナリゼーション（internalization）後に効率よくインターナライズされ得るという利点を有する。しかし、サイトカインに基づく免疫毒素は２つの大きな問題を抱える。１）サイトカインが誘導する受容体インターナリゼーションは、リガンドがアゴニスト特性を保持することを必要とし、このアゴニスト特性は標的細胞及び受容体を担持する他の細胞に望ましくない刺激作用を及ぼし得る。２）サイトカインに基づく免疫毒素は、正常細胞上のサイトカイン受容体と相互作用し、それにより、疾患標的細胞に加えて正常細胞も死滅させる。従って成功を収めるサイトカインベースの免疫毒素は、１）望ましくない刺激作用を誘導し得るアゴニスト特性を保持せずにインターナリゼーションを刺激できること、及び２）疾患細胞においてのみ相互作用してインターナライズされ、同じサイトカイン受容体を担持する健常細胞とは相互作用せず、インターナライズされないことを必要とする。
【００１３】
抗ウイルス療法のための免疫毒素
ＨＩＶ
免疫毒素はＨＩＶ感染の治療のために評価されてきた。例えば免疫毒素はＣＤ４に対して標的され、ある程度の成功を収めた。また可溶性ＣＤ４も毒素に結合されており、生じた免疫毒素は、インビトロで感染細胞におけるウイルスタンパク質の合成を阻害し、ウイルスの拡大を阻止する。免疫毒素はまた、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０及びその成分であるｇｐ１２０及びｇｐ４１に対しても標的化された。しかしこれらの試みは、一部にはＨＩＶ抗原変異の故に及びまた一部には感染個体の血清中に存在する抗エピトープ抗体の故に、ほとんど作用を及ぼさなかった。
【００１４】
ＣＭＶ
免疫毒素戦略を用いてＣＭＶを治療するためのこれまでの試みは成功していない。
【００１５】
ある学術研究グループが、ＣＭＶ感染細胞を標的する免疫毒素を作製し、試験した（非特許文献１（Barnett et al. 1995）、 非特許文献２（Smee at al. 1995）、 非特許文献３（Barnet et al, 1996）)。非特許文献１（Barnett et al. 1995）は、ヒトＣＭＶに感染した細胞に特異的な免疫毒素及びマウスＣＭＶに感染した細胞に特異的な免疫毒素の作製を述べた。両方の免疫毒素がポリクローナルであった、すなわち抗体は、特異的な十分に定義された標的抗原に対するものではなった。さらに、抗血清（抗ＭＣＭＶ及びＨＣＭＶ）はプロテインＡ親和性によって精製されただけであり、それ故精製ポリクローナル抗血清は、ＣＭＶ抗原（ＭＣＭＶ又はＨＣＭＶ）及び他の定義されない抗原に対する抗体の定義されていないプールを含有する。著者達は、「これらの製剤中に存在するウイルス特異的抗体は総ＩｇＧの数パーセント未満を占めた」と述べている。ポリクローナル抗体プール（抗血清）はゲロニン（gelonin）毒素に結合された。抗ヒトＣＭＶ免疫毒素の作用は、リボソーム活性を阻害する免疫毒素の能力の測定としてタンパク質へのｓ３５メチオニンの取込みを阻害する免疫毒素の能力によって測定された。著者達は、感染細胞におけるヒトＣＭＶの増殖又は複製を阻害する抗ヒトＣＭＶ免疫毒素の能力に関するデータは示していない。さらに著者達は、抗ヒトＣＭＶ免疫毒素が３５Ｓメチオニンの取込みを約１５％しか阻害しないことを示している。逆に、著者達は、抗マウスＣＭＶ免疫毒素がＳ３５メチオニンの取込みを＞９０％阻害し得ることを示す。加えて、著者達は、０．００１のＭＯＩでマウスＣＭＶに感染させたマウス細胞（マウス乳腺癌細胞系、Ｃ１２７Ｉ）への抗マウスＣＭＶ免疫毒素の添加が、感染後７日目のウイルス収量を免疫毒素２０μｇ／ｍｌで約１０2（２ｌｏｇ）（１００倍）抑制したことを述べている。
【００１６】
３つの論文が、マウスサイトメガロウイルスに対するモノクローナル抗体の使用を記述している（非特許文献４（Smee el at. 1995a）、非特許文献５（Smee et al. 1995b）、非特許文献３（Barnet et al, 1996）)。抗体は、マウスＣＭＶに感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスから作製された。モノクローナル抗体Ｄ５．Ｆ１０．Ｂ８（いかなる毒素にも結合していない）によるＭＣＭＶ感染細胞の処置はウイルス力価の１０3-3.5の低下を生じさせたが、試験された様々な濃度（１．２５、２．５、５、１０及び２０μｇ／ｍｌ）の間で用量反応効果は存在しなかった(非特許文献４（Smee el at. 1995a）)。しかし、著者達は、高濃度のガンシクロビル又は高濃度の（Ｓ）−１−［３−ヒドロキシ−（２−ホスホニルメトキシ）−プロピル］シトシン（ＨＰＭＰＣ）のいずれかと高濃度のモノクローナル抗体の組合せを使用してウイルス収量の相乗作用的抑制を示している。インビボでは、モノクローナル抗体単独あるいは２５又は５０ｍｇ／ｋｇ／日のガンシクロビルと併用したモノクローナル抗体による処置は、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＣＭＶ誘導の死亡に全く又はごくわずかしか影響を及ぼさない。
【００１７】
中和モノクローナル抗体Ｄ５．Ｆ１０．Ｂ８又は非中和モノクローナル抗体Ｃ３４．１８．Ｆ６のリシンＡ鎖への結合は、マウスＣＭＶに対する２つの抗体ベースの免疫毒素を生成した。抗体はモノクローナルであるが、抗原は定義されていないことに留意すべきである。モノクローナル免疫毒素によるＭＣＭＶ感染細胞の処置は、ウイルス力価の１０2-3の低下を生じさせた。加えて、著者達は、高濃度のガンシクロビル又は高濃度の（Ｓ）−１−［３−ヒドロキシ−（２−ホスホニルメトキシ）−プロピル］シトシン（ＨＰＭＰＣ）のいずれかと高濃度のモノクローナル抗体の組合せを使用してウイルス収量の相乗作用的抑制を示している。インビボでは、免疫毒素単独による処置はＳＣＩＤマウスにおけるＭＣＭＶ誘導の死亡に影響を及ぼさなかった。５０ｍｇ／ｋｇ／日のガンシクロビルとＤ５．Ｆ１０．Ｂ８又はＣ３４．１８．Ｆ６のいずれかに基づく免疫毒素との併用治療は、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＣＭＶ誘導の死亡を２７．３±２．５日（ガンシクロビル単独）から２９．３±１．１日（ガンシクロビル＋Ｃ３４免疫毒素）及び３０．４±３．１日（ガンシクロビル＋Ｄ５免疫毒素）に遅延させたという点で軽度の相乗作用を示唆すると思われた（非特許文献５（Smee et al. 1995b））。著者達は、免疫毒素の作用不良を、処置した動物における免疫毒素の実際の濃度に関する知識の欠如及び免疫毒素が動物の体内のウイルス複製部位に達したかどうかが不明であることによって説明する。さらに、著者達は、実際の標的抗原、抗原が感染動物において発現されるかどうか、動物における免疫毒素の動態、感染細胞に対する免疫毒素の親和性、又は抗体が感染細胞にインターナライズされるかどうかについてのデータを示していない。また、著者達は、非複合モノクローナル抗体又は毒素結合抗体の間でのウイルス感染への作用の相違を示していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Barnett et al. 1995
【非特許文献２】Smee at al. 1995
【非特許文献３】Barnet et al, 1996
【非特許文献４】Smee el at. 1995a
【非特許文献５】Smee et al. 1995b
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
[発明の要旨]
構成的にインターナライズする、ＣＭＶによってコードされる受容体に対して高い親和性を有する免疫毒素を設計することにより、感染細胞による免疫毒素の効率的な取込み、及びそれによる感染細胞の死が確保される。免疫毒素のインターナリゼーションは免疫毒素媒介性細胞傷害における律速段階とみなされるので、構成的にインターナライズする受容体を標的することは、免疫毒素に基づく薬剤の使用における中心的な問題を解決する。そこで、本発明は、免疫毒素が標的細胞内に輸送され、そこでその機能を発揮し得る、すなわち細胞を死滅させ得ることを確実にする、構成的にインターナライズする受容体を標的する免疫毒素に関する。さらに、本発明の免疫毒素は、ＣＭＶ感染細胞上に存在する受容体だけを標的し、従って本発明の免疫毒素はＣＭＶ感染の治療又は予防において使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
１つの態様では、本発明は、（ａ）ヒトＣＭＶによってコードされ、ＣＭＶ感染細胞上で発現される、構成的にインターナライズする受容体に結合するリガンド及び（ｂ）ＣＭＶ感染細胞に対して細胞傷害性である毒素、を含み、配列番号１ではない免疫毒素に関する。２番目の態様では、本発明は、薬剤としての本発明に従った免疫毒素の使用、及びＣＭＶ感染の治療又は予防のための薬剤を製造するための本発明に従った免疫毒素の使用に関する。本発明はまた、本発明に従った免疫毒素又はその何らかの生理的に許容される塩を含有する医薬組成物に関する。さらに、本発明は、本発明に従った免疫毒素をコードする配列を含む核酸配列及び発現ベクターに関する。さらに、本発明は、（ａ）本発明に従った免疫毒素の有効量及び（ｂ）同時、別個又は連続投与のための抗ウイルス薬及び免疫抑制薬の群から選択される治療薬を含む、ＣＭＶ感染の治療又は予防のためのキットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[発明の詳細な説明]
定義
ここで又は以下の本明細書中の残りの部分で異なる定義が為されない限り、ここで使用するすべての技術用語及び学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２２】
「免疫毒素」は、送達のための標的部分（リガンド）と細胞傷害のための毒性部分（毒素）とを含む二機能性分子である。免疫毒素は、リガンドに対する受容体を発現する細胞を死滅させるために使用され得る。
【００２３】
「リガンド」は、例えばウイルスを起源とする、受容体又は抗原に対して特異的結合親和性を有する何らかのアミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、何らかの抗体もしくはその部分又は何らかの非ペプチド化合物又はナノ粒子と定義される。
【００２４】
「毒素」は、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性であるか、又はアポトーシスもしくは壊死を誘導するか、又は病原体の複製、増殖もしくは伝播を直接阻害するか、又は感染細胞を感染宿主の免疫応答に対して脆弱にする、タンパク質又は非ペプチドである何らかの物質と定義される。
【００２５】
「ケモカイン」は、走化性サイトカインであり、「ＣＣケモカイン」、「ＸＣケモカイン」、「ＣＸＣケモカイン」及び「ＣＸ３Ｃケモカイン」のサブファミリーを含む。一般にケモカインは、細胞移動を調節する低分子量タンパク質である。多くのケモカインはまた、免疫系の細胞の成熟、活性化、増殖及び分化を誘導する能力も備える。
【００２６】
「ＣＸ３ＣＬ１」は、ＣＸ３Ｃケモカインファミリーの成員であるケモカインである。ＣＸ３ＣＬ１は、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列を有し、フラクタルカイン(fractalkine)及びニューロタクチン(neurotactin)とも称される。
【００２７】
「ＣＸ３ＣＬ１のケモカインドメイン」という用語は、配列番号２の２５位から１００位までのアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義される。
【００２８】
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされるか又は部分的にコードされる、１又はそれ以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。本発明の抗体は、ＣＭＶによってコードされる構成的にインターナライズする受容体に対する抗体である。
【００２９】
「受容体」、例えば「ケモカイン受容体」は、ケモカインによって細胞において活性化される、例えばケモカインに結合して細胞内シグナル伝達を開始させる受容体である。
【００３０】
「構成的インターナリゼーション(constitutively internalization)」は、形質膜において発現され、及び事前の刺激なしで細胞形質膜から細胞質又は細胞内画分にインターナライズされる(internalized)何らかの抗原を指す。抗原のインターナリゼーションはリガンドによって調節され得、インターナライズされた抗原は、形質膜に再循環され得るか又はインターナリゼーション後に分解され得る。
【００３１】
「構成的に活性なＧタンパク質共役」という用語は、受容体リガンド（アゴニスト）による活性化なしでシグナルを媒介するＧタンパク質共役受容体と定義される。
【００３２】
「ＵＳ２８」という用語は、ヒトサイトメガロウイルスオープンリーディングフレームＵＳ２８によってコードされるＧタンパク質共役受容体である。ＵＳ２８は構成的にインターナライズする受容体である。それ故ＵＳ２８に結合するケモカイン又は他の化合物は、この受容体を発現する細胞にインターナライズされる。
【００３３】
「ＣＭＶ」は「サイトメガロウイルス」を指す。
【００３４】
「ヒトヘルペスウイルス５型」とも称されるヒトＣＭＶは、ヒトに感染することができるＣＭＶを指す。
【００３５】
「ＣＭＶ疾患」は、疾患個体におけるＣＭＶの存在によって引き起こされるもしくはその存在に関連する又は疾患個体の血清学的検査から明らかな疾患である。
【００３６】
ＣＭＶは急性疾患並びに慢性疾患を生じさせる。急性疾患は、ほとんどの場合高レベルのウイルス複製に結びつき、多臓器を侵すことによって特徴づけられ、単核細胞症様症候群、未熟児における周産期感染、同種異系移植受容者におけるＣＭＶ症候群、及び免疫無防備状態患者（例えば、ＡＩＤＳ患者）における播種性感染である。慢性感染は、ほとんどの場合低レベルのウイルス複製に結びつき、先天性感染、移植患者における血管疾患、正常宿主における血管疾患、及び特に胃腸管における炎症性疾患である。
【００３７】
「親ポリペプチド」は、本発明に従って修飾される（変異される、すなわち欠失、挿入及び／又は置換によって、結合される等）ことになるポリペプチド配列を指示することが意図されている。親ポリペプチド配列は、天然に生じるフラクタルカイン(fraktalkine)（哺乳動物フラクタルカイン、例えば配列番号２としてここで同定されるヒトフラクタルカインなど）の配列であり得るか、又はその変異体であり得る。
【００３８】
「ポリペプチド配列」（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド等）は、文脈に依存して、天然に生じるアミノ酸もしくは人工アミノ酸類似体を含むアミノ酸の重合体、又はアミノ酸重合体を表わす文字列である。遺伝暗号の縮重を考慮して、特定ポリペプチド配列をコードする１又はそれ以上の核酸又はその相補的核酸が、ポリペプチド配列から決定され得る。
【００３９】
「変異体」は、１又はそれ以上のアミノ酸位置において親ポリペプチド配列と（アミノ酸の欠失、アミノ酸の挿入及び／又は異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換によって）異なる配列を含むポリペプチドである。変異体配列は、非天然に生じる配列、すなわち自然界では見いだされない配列である場合がある。好ましくは、「変異体」は親ポリペプチドと同じ機能を保持する。
【００４０】
アミノ酸位置及びアミノ酸置換を同定するために使用される用語は、以下のように例示される。Ｋ３１は、参照アミノ酸配列（例えば、配列番号２）においてリシン（Ｌｙｓ）残基によって占められる位置番号３１を指示する。Ｋ３１Ａは、３１位のリシン残基がアラニン（Ａｌａ）残基で置換されていることを指示する。
【００４１】
物体に適用される「天然に生じる」は、その物体が、人間によって人工的に生産されるものとは異なり自然界で見出すことができるという事実を指す。例えば、生物（ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物又は哺乳動物組織を含む）内に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室において人間によって意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列は、天然に生じる。
【００４２】
物体に適用される「非天然に生じる」は、その物体が天然には生じない、すなわちその物体が人間によって人工的に生産されるものを除いて自然界では見出すことができないことを意味する。
【００４３】
「医薬組成物」という用語は、個体における医薬的使用に適する組成物を意味する。医薬組成物は、一般に有効量の活性因子及び担体（例えば、医薬的に許容される担体が挙げられる）を含有する。
【００４４】
「有効量」という用語は、所望結果を生じさせるために十分な用量又は量を意味する。所望の結果は、その用量又は量のレシピエントにおける客観的改善又は主観的改善を含み得る。
【００４５】
「予防的処置」は、処置が疾患、病変もしくは医学的障害を発現する危険性を軽減する、予防する又は低下させるために与えられるように、疾患、病変もしくは障害の徴候又は症状を示していない固体、あるいは疾患、病変又は障害の初期徴候又は症状だけを示す個体に与えられる処置である。予防的処置は、疾患又は障害に対する防止的な処置として機能する。
【００４６】
「治療的処置」は、処置が病変、疾患もしくは障害の徴候又は症状を軽減又は排除するために個体に与えられる、病変、疾患もしくは障害の症状又は徴候を示す個体に与えられる処置である。
【００４７】
「ヌクレオチド酸配列」（例えば核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等）は、文脈に依存して、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇ又は他の天然に生じるヌクレオチドもしくは人工ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチドの重合体、又は核酸を表わす文字列である。所与の核酸又は相補的核酸は、何らかの特定ポリヌクレオチド配列から決定され得る。異なる指示がない限り、特定核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば縮重コドン置換体）及び相補的配列、並びに明白に指示される配列(sequence explicitly indicated)を暗黙のうちに包含する。特に、縮重コドン置換体は、１又はそれ以上の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基(mixed-base)及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260:2605-2608; Cassol et al. (1992) ; Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91-98）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００４８】
「ある遺伝子に由来する核酸」は、その合成のために遺伝子又はそのサブ配列が最終的に鋳型として働く核酸を指す。従って、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡ等は、すべてその遺伝子に由来し、そのようにして導かれた産物の検出は、試料中のもとの遺伝子及び／又は遺伝子転写産物の存在及び／又は存在率の指標である。
【００４９】
「作動可能に連結される」は、酵素的連結又は別の手段による、配列の正常な機能が達成され得るような相互の立体配置での、２又はそれ以上のヌクレオチド配列の共有結合を指す。例えば、プレ配列又は分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列は、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのヌクレオチド配列に作動可能に連結される；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されているヌクレオチド配列が隣接すること、及び分泌リーダーの場合は、隣接し、読み枠内にあることを意味する。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、標準組換えＤＮＡ法と共に使用される。
【００５０】
「制御配列」という用語は、ここでは、本発明のポリペプチドの発現のために必要である又は好都合であるすべての成分を含むと定義される。各々の制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して特有のものであっても外来のものであってもよい。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳の終結シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域と制御配列のライゲーションを促進する特異的制限部位を導入するためのリンカーを有し得る。
【００５１】
本文中で、「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするセグメントを含み、その転写を与える付加的なセグメントに作動可能に連結されている、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を包含する。
【００５２】
「宿主細胞」という用語は、ここで使用するとき、核酸構築物による形質転換を受け得る、いかなる細胞型も包含する。
【００５３】
例えば細胞、ウイルス、ヌクレオチド、ベクター、タンパク質又はポリペプチドに関して使用するとき「組換え」という用語は、典型的には、その細胞、ウイルス、ヌクレオチド又はベクターが異種（又は外来性）核酸の導入又は天然核酸の変化によって修飾されていること、あるいはそのタンパク質又はポリペプチドが異種アミノ酸の導入によって修飾されていること、あるいはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞では見いだされない核酸配列（例えば遺伝子）を発現するか、又は異常発現される、過少発現される又は全く発現されない天然核酸配列（例えば遺伝子）を発現する。
【００５４】
２又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、「同一」又は「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、最大の一致になるように比較して整列した場合に、同じである２又はそれ以上の配列もしくはサブ配列、あるいは同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定パーセンテージを有する２又はそれ以上の配列もしくはサブ配列を指す。
【００５５】
「配列同一性」又は「同一性パーセント」（「同一性％」）という用語は、２個のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が比較ウインドウにわたって（すなわちそれぞれヌクレオチドごとに又はアミノ酸ごとに）同一であることを意味する。配列同一性パーセントは、比較ウインドウにわたって２個の最適に整列したポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を比較し、両方の配列において同一残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を求め、マッチする位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージ（又は配列類似性のパーセンテージ）を求めることによって計算される。従って、例えば、ポリペプチド配列に関して、配列同一性という用語は、２個のポリペプチド配列が比較ウインドウにわたって（アミノ酸ごとに）同一であることを意味し、アミノ酸残基配列同一性のパーセンテージ（又はアミノ酸残基配列類似性のパーセンテージ）が計算できる。配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用するときは、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて配列座標を指定して、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。その後配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。ここで述べる配列アルゴリズムの１つ（又は当業者に使用可能な他のアルゴリズム）を用いて又は目視検査によって最大の一致を決定することができる。
【００５６】
比較的短いアミノ酸配列（約３０残基未満）のアラインメントと比較は、典型的には直接的である。より長い配列の比較は、２個の配列の最適整列を達成するためにより洗練された方法を必要とし得る。比較ウインドウを整列するための配列の最適アラインメントは、
選択された様々な方法によって作成される最適アラインメント（すなわち比較ウインドウにわたって最も高いパーセンテージの配列類似性を生じさせる）に関して、例えばSmith and Waterman (1981) Adv Appl Math 2:482の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970) J MoI Biol 48:443の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:2444の類似性方法検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は検査によって実施できる。
【００５７】
配列同一性パーセント（同一性パーセント）及び配列類似性を決定するの適したアルゴリズムの好ましい例は、Pearson, W. R. & Lipman, D. J. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:2444に述べられているＦＡＳＴＡアルゴリズムである。また、W. R. Pearson(1996) Methods Enzymology 266:227-258も参照のこと。同一性パーセントを計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡ整列において使用される好ましいパラメータは最適化されており、ＢＬ５０マトリックス１５：−５、ｋ−タプル＝２；連結ペナルティー＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティー＝−１２、ギャップ長ペナルティー＝−２；及び幅＝１６である。
【００５８】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの他の好ましい例は、Altschul et al. (1997) Nuc Acids Res 25:3389-3402 及び Altschul et al. (1990) J MoI Biol 215:403-410にそれぞれ述べられている、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０は、ここで述べるパラメータを用いて、本発明の核酸及びタンパク質についての配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さのワードと整列化したとき、いくつかの正の閾値スコアＴに一致する又はそれを満たす、問い合わせ配列における短いワード長Ｗを同定することにより、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al., 上記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。これらのワードヒットを、累積アラインメントスコアが増加し得る限り各々の配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一対の一致する残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各々の方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したとき；１又はそれ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが０又はそれ以下になったとき；あるいはいずれかの配列の末端に達したとき、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴNプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ２．０．１４；２０００年６月２９日）は、デフォルトとしてワード長３及び期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915参照）は、５０のアラインメント（Ｂ）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。やはり、他の適切なアルゴリズムと同様に、プログラムが、他の類似配列、例えばＧｅｎＢａｎｋ又はＧｅｎｅｓｅｑに認められる類似分子により密接に関連する配列ではなく、ここで配列表に列挙されるもの（すなわち配列番号１〜２２）により密接に関連する配列だけを同定するまで、比較の厳密度を高めることができる。言い換えると、例えばＧｅｎＢａｎｋ又はＧｅｎｅｓｅｑに認められるすべての公知の先行技術分子が除外されるように、アルゴリズムの比較の厳密度を高めることができる。
【００５９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性又は同一性の統計学的分析を実施する（例えばKarlin & Altschul (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873-5787参照）。このアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。
【００６０】
有用なアルゴリズムのもう１つの好ましい例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性と配列同一性パーセント又は配列類似性パーセントを示すために漸進的ペアワイズアライメントを用いて関連配列群から多重配列アラインメントを作製する。ＰＩＬＥＵＰはまた、アライメントを作製するために使用されるクラスター関係を示す系統樹又は樹状図も作製する。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolittle (1987) J. MoI. Evol. 35:351-360の漸進的アラインメント法を簡易化したものを用いる。使用される方法は、Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153によって記述された方法に類似する。このプログラムは、各々が最大長５，０００ヌクレオチド又はアミノ酸である、３００配列までを整列することができる。マルチプルアラインメント手順は、２つの最も類似する配列のペアワイズアラインメントから始まり、２つの整列された配列のクラスターを作製する。次にこのクラスターを、その次に最も関連する配列又は整列配列のクラスターに対して整列する。２つの個別配列のペアワイズアラインメントを単純に伸長させていくことによって、２つの配列クラスターが整列される。最終的なアラインメントは、一連の漸進的ペアワイズアラインメントによって達成される。このプログラムは、配列比較領域について特定配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチド座標を指定することによって、及びプログラムパラメータを指定することによって実施される。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列を他の試験配列と比較し、以下のパラメータを用いて配列同一性パーセント（又は配列類似性パーセント）の関係を決定する。デフォルトギャップ加重値（３．００）、デフォルトギャップ長加重値（０．１０）及び加重エンドギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウエアパッケージ、例えばバージョン７．０（Devereaux et al. (1984) Nuc Acids Res 12:387-395）から入手できる。
【００６１】
ＤＮＡ及びアミノ酸配列アラインメントに適したアルゴリズムのもう１つの好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷである（Thompson, J. D. et al. (1994) Nuc Acids Res 22:4673-4680）。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列の群の間で多重ペアワイズ比較を実施し、相同性に基づいてそれらをマルチプルアラインメントに構築する。デフォルトギャップオープンペナルティー及びギャップ伸長ペナルティーはそれぞれ１０及び０．０５である。アミノ酸のアラインメントについては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスがタンパク質加重マトリックスとして使用できる(Henikoff and Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915-10919)。マルチプルＤＮＡ及びアミノ酸配列アラインメントに適したアルゴリズムのもう１つの例は、製造者の指示及びプログラムに指定されるデフォルト値に従って使用される、ＭｅｇａＬｉｎｅTMＤＮＡＳＴＡＲパッケージ（ＭｅｇａＬｉｎｅTMバージョン４．０３、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．によって製造される）からの、Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法、Hein (1990)である。
【００６２】
検索及びアラインメントアルゴリズムについての上記考察が、ヌクレオチド配列を含む問い合わせ配列への置き換え、及び適宜に、核酸データベースの選択により、ポリヌクレオチド配列の同定及び評価にも適用できることは当業者に了解される。
【００６３】
２つの核酸又はポリペプチドに関して「実質的に同一」又は「実質的同一性」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、最大の一致になるように比較し、整列した場合、それぞれ、少なくとも約６０％、７０％、７５％、好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性パーセントを有する２又はそれ以上の配列又はサブ配列を指す。ある態様では、実質的同一性は、少なくとも約１０残基長、例えば少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７６、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００又は６５０アミノ酸残基のアミノ酸配列の領域にわたって存在する。ある態様では、実質的同一性は、少なくとも約５０残基長、例えば少なくとも約６０、７６、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００又は６５０アミノ酸残基のアミノ酸配列の領域にわたって存在する。ある態様では、実質的同一性は、少なくとも約１５０核酸残基、例えば少なくとも約１８０、２２８、３００、３７５、６００、７５０、９００、１０５０、１２００、１３５０、１５００、１６５０、１８００又は１９５０核酸残基の核酸配列の領域にわたって存在する。一部の態様では、アミノ酸配列又は核酸配列は、ポリペプチド配列又は対応するコード領域の長さ全体にわたって実質的に同一である。
【００６４】
ポリペプチド及びペプチドに適用されるとき、「実質的同一性」という用語は、典型的には、２つのポリペプチド又はペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ加重（以下で詳細に述べる）を用いたＢＬＡＳＴ、ＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって、又は目視検査によって、最適に整列したとき、少なくとも約６０％又は７０％、しばしば少なくとも７５％、例えば少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％又はそれ以上の割合のアミノ酸残基配列同一性又は配列類似性を共有することを意味する。同様に、２つの核酸に関して適用されるとき、実質的同一性又は実質的類似性という用語は、２つの核酸配列が、例えばデフォルトギャップ加重（以下で詳細に述べる）を用いたＢＬＡＳＴ、ＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって、又は目視検査によって、最適に整列されたとき、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列統一性又は配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列同一性又は配列類似性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性又は配列類似性、又はそれ以上（例えば約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９８．５、９９、９９．５又はそれ以上のパーセントのヌクレオチド配列同一性又は配列類似性を含む）を共有することを意味する。
【００６５】
以下の配列番号を本発明の説明の中で言及する。
配列番号１：ランテス（Rantes）及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素
配列番号２：ＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン）
配列番号３：ＵＳ２８受容体
配列番号４：ＵＳ２７受容体
配列番号５：ＵＬ３３受容体
配列番号６：ＵＬ７８受容体
配列番号７：ｖＣＣＬ２ケモカイン
配列番号８：外毒素Ａ
配列番号９：ＰＥ３８ＫＤＥＬ
配列番号１０：配列番号２の２５〜３９７位のフラクタルカイン及び配列番号９のＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素
配列番号１１：配列番号２の２５〜１００位のフラクタルカインのケモカイン部分及び配列番号９のＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素
【００６６】
本発明は、ＣＭＶ疾患を治療する又は予防する上で有用な、ＣＭＶ感染細胞に対して高度に特異的な免疫毒素に関する。本発明の免疫毒素は、ＣＭＶによってコードされ、ＣＭＶ感染細胞の表面上で発現される、構成的にインターナライズする受容体を標的する。構成的にインターナライズする受容体に結合したとき、免疫毒素はＣＭＶ感染細胞にインターナライズされ、その後、その細胞傷害作用を及ぼして細胞の死滅を導く。
【００６７】
ＣＭＶは、ＣＭＶ感染細胞の表面で発現されるいくつかの受容体をコードし、これらの中には、構成的なインターナリゼーションを受けるケモカイン受容体、例えばＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３及びＵＬ７８がある。ＵＳ２８に対する多くの高度親和性リガンドが感染個体の免疫系であるケモカイン系の構成成分である。これらの宿主免疫分子、ケモカインは、本発明の免疫毒素のリガンドとして使用できる。
【００６８】
ケモカインに基づく免疫毒素の使用は、それらが、ケモカインを介した受容体活性化とそれに続く受容体のインターナリゼーション後に効率よくインターナライズされ得るという利点を有する。しかし、ケモカインが誘導する受容体インターナリゼーションは、リガンドがアゴニスト特性を保持することを必要とし、このアゴニスト特性は標的細胞に望ましくない刺激作用を及ぼすことがあり、正常細胞上のケモカイン受容体と相互作用して、それにより、疾患標的細胞に加えて正常細胞を死滅させ得る。ＣＭＶによってコードされる受容体に高い特異性を有し、それ故ＣＭＶ感染細胞上でのみ発現される免疫毒素を設計することにより、対象とする標的細胞に対する特異性が確保される。さらに、ＣＭＶによってコードされる、構成的インターナリゼーションを受ける抗原に結合する免疫毒素を設計することにより、リガンドの性質にかかわらず、ＣＭＶ感染細胞による免疫毒素の効率的な取込みが確保される。通常は、細胞の表面で発現される受容体は、受容体がアゴニストによって活性化されたとき細胞内へのインターナリゼーションを受ける。しかし、構成的にインターナライズする受容体は、アゴニストによる活性化なしに絶えず細胞内へのインターナリゼーションを受ける。従って、ＣＭＶ感染細胞上の構成的にインターナライズする受容体に対して特異的な免疫毒素を設計することにより、細胞内への免疫毒素の効率的な取込みが得られ、それ故感染細胞は、望ましくない毒性及び副作用を伴わずに免疫毒素によって特異的に標的され得る。
【００６９】
そこで、最も広い態様では、本発明は、（ａ）ＣＭＶによってコードされ、ＣＭＶ感染細胞上で発現される、構成的にインターナライズする受容体に結合するリガンド及び（ｂ）ＣＭＶ感染細胞に対して細胞傷害性である毒素を含む免疫毒素であって、配列番号１ではない免疫毒素に関する。
【００７０】
従って、本発明のすべての実施形態において、免疫毒素は配列番号１ではない、すなわち配列番号１は本発明の範囲から除外される。
【００７１】
配列番号１はBruhl et al, 2001によって記述されている。配列番号１は、ケモカイン  ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）とシュードモナス属外毒素Ａのトランケート型の融合タンパク質である。著者らは、ＣＣＲ５受容体を発現する細胞を標的するために配列番号１を使用した。より詳細には、免疫毒素が１０ｎＭの濃度でＣＣＲ５（＋）チャイニーズハムスター卵巣細胞を完全に破壊することを示したが、ＣＣＲ５（−）チャイニーズハムスター卵巣細胞に対する細胞傷害作用は検出不能であった。この融合タンパク質は、ＣＣＲ５に結合して、細胞表面から受容体を下方調節する。ケモカイン  ランテスはＵＳ２８のリガンドでもあるが、著者達はＣＭＶ感染細胞に対して免疫毒素を使用することは提案しなかった。
【００７２】
以下では、本発明の免疫毒素のリガンドを説明する。
【００７３】
本発明のリガンド
本発明のリガンドは、本発明の受容体に結合するポリペプチドである。本発明の受容体は、ＣＭＶ感染細胞の表面で発現される、ＣＭＶによってコードされる構成的にインターナライズする受容体である。本発明の受容体を以下でさらに詳細に説明する。
【００７４】
本発明の１つの実施形態では、リガンドは、ケモカイン又はその変異体及び抗体又はそのフラグメントから成る群より選択される。
【００７５】
本発明のもう１つの実施形態では、リガンドはケモカイン又はその変異体である。
【００７６】
ケモカインは、タンパク質の大きくて多様なスーパーファミリーである。このスーパーファミリーは、古典的ケモカインモチーフにおける最初の２個のシステインが隣接しているか（ＣＣケモカインを含むＣ−Ｃ型）又は介在残基によって隔てられているどうか（ＣＸＣケモカインを含むＣ−Ｘ−Ｃ型）に基づいて、又は対応するモチーフ内に最初の２個のシステインのうちの１個を欠く型（ＸＣケモカインを含むＸ−Ｃ型）、又は最後に、最初の２個のシステインが３つの介在残基によって隔てられている型（ＣＸ3Ｃケモカインを含むＣ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ型）の４つの型に細分される。ケモカインは、７回膜貫通型（７ＴＭ）のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるケモカイン受容体との相互作用を通してそれらの機能を及ぼす。白血球の移動を制御することに加えて、ケモカインは免疫系の発現を調節し、白血球のホメオスタシスと炎症を制御し、リンパ系細胞の活性化と分化を制御する。それ故ケモカインは、感染性病原体に対する宿主免疫応答における中心であると思われる。実際に、ウイルス感染において宿主のケモカイン系を制御することの重要性は、例えばＣＭＶが宿主（例えばヒト又はマウス）のケモカイン系に干渉することが公知のいくつかのタンパク質をコードするという事実によって強調される。
【００７７】
本発明の１つの実施形態では、リガンドは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、家禽、ブタ、ウマ、アカゲザル、オランウータン、ウシ、イヌ又はウイルスを起源とするケモカイン又はその変異体又はそのフラグメントから成る群より選択される。
【００７８】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＣケモカイン、ＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインから成る群より選択されるケモカイン又はその変異体である。
【００７９】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインから成る群より選択されるケモカイン又はその変異体である。
【００８０】
さらにもう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７及びＣＣＬ２８から成る群より選択されるＣＣケモカイン又はその変異体である。
【００８１】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１６及びＣＣＬ２２から成る群より選択されるＣＣケモカイン又はその変異体である。
【００８２】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５及びＣＣＬ７から成る群より選択されるＣＣケモカイン又はその変異体である。
【００８３】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及びＣＣＬ７から成る群より選択されるＣＣケモカイン又はその変異体である。
【００８４】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＫＳＨＶによってコードされるＣＣケモカイン  ｖＣＣＬ１又はｖＣＣＬ２又はその変異体である。
【００８５】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＫＳＨＶによってコードされるＣＣケモカイン  ｖＣＣＬ２又はその変異体である。
【００８６】
好ましい実施形態では、リガンドは、ヒト又はマウスを起源とするＣＣケモカインである。
【００８７】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ＣＸ3Ｃケモカイン又はその変異体である。
【００８８】
もう１つの実施形態では、リガンドは、ヒトＣＸ３ＣＬ１（配列番号２）に少なくとも６７％、例えば７０％、又は例えば７５％、又は例えば８０％、又は例えば８５％、又は例えば９０％、又は例えば９５％、又は例えば９６％、又は例えば９７％、又は例えば９８％、又は例えば９９％、例えば７０％、又は例えば７１％、又は例えば７２％、又は例えば７３％、又は例えば７４％、又は例えば７５％、又は例えば７６％、又は例えば７７％、又は例えば７８％、又は例えば７９％、又は例えば８０％、又は例えば８１％、又は例えば８２％、又は例えば８３％、又は例えば８４％、又は例えば８５％、又は例えば８６％、又は例えば８７％、又は例えば８８％、又は例えば８９％、又は例えば９０％、又は例えば９１％、又は例えば９２％、又は例えば９３％、又は例えば９４％、又は例えば９５％、又は例えば９６％、又は例えば９７％、又は例えば９８％、又は例えば９９％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【００８９】
１つの態様では、本発明は、配列番号２に少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上の割合の配列同一性を有するフラクタルカイン変異体又はそのフラグメントを提供する。
【００９０】
本発明はまた、ＣＸ３ＣＬ１（配列番号２）のアミノ酸配列に実質的なアミノ酸配列類似性を有するタンパク質又はペプチドを包含する。
【００９１】
天然変異体は、個体、多型、対立遺伝子、株又は種の変異体を含む。
【００９２】
ＣＸ３ＣＬ１の天然の種変異体は以下を含む。
【化１】
2009540842.tif 000002
【００９３】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、リガンドは、ヒトＣＸ３ＣＬ１のケモカインドメイン（配列番号２の残基２５〜１００）に対して少なくとも６７％、例えば７０％、又は例えば７５％、又は例えば８０％、又は例えば８５％、又は例えば９０％、又は例えば９５％、又は例えば９６％、又は例えば９７％、又は例えば９８％、又は例えば９９％、例えば７０％、又は例えば７１％、又は例えば７２％、又は例えば７３％、又は例えば７４％、又は例えば７５％、又は例えば７６％、又は例えば７７％、又は例えば７８％、又は例えば７９％、又は例えば８０％、又は例えば８１％、又は例えば８２％、又は例えば８３％、又は例えば８４％、又は例えば８５％、又は例えば８６％、又は例えば８７％、又は例えば８８％、又は例えば８９％、又は例えば９０％、又は例えば９１％、又は例えば９２％、又は例えば９３％、又は例えば９４％、又は例えば９５％、又は例えば９６％、又は例えば９７％、又は例えば９８％、又は例えば９９％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【００９４】
好ましくは、免疫毒素のリガンドは、１０-8Ｍ又はそれ以下のＫｄでＵＳ２８受容体に結合する。１０-9Ｍ未満、例えば１０-10Ｍ未満、１０-11Ｍ未満又は１０-12Ｍ未満のＫｄがさらに一層好ましい。
【００９５】
好ましくは、免疫毒素は、親リガンドの内因性受容体に対して低い親和性を有する。従って、好ましい実施形態では、リガンドは、１０-6Ｍ又はそれ以上のＫｄでＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する。より好ましくは、リガンドは、１０-5Ｍ又は１０-4Ｍ超のＫｄでＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する。ＵＳ２８受容体に対する特異性は、親リガンドの適切な変異によって達成され得る。
【００９６】
好ましくは、免疫毒素のリガンドは、以下の変異体から成る群より選択される：配列番号２の３１位で変異した変異体、配列番号２の３８位で変異した変異体、配列番号２の４２位で変異した変異体、配列番号２の６０位で変異した変異体、配列番号２の６１位で変異した変異体、配列番号２の６８位で変異した変異体、配列番号２の７１位で変異した変異体、配列番号２の７２位で変異した変異体、配列番号２の７３位で変異した変異体。
【００９７】
より好ましくは、免疫毒素のリガンド部分は、配列番号２の変異体の以下の群から選択される：３１位がリシンからアラニンに変異した変異体Ｋ３１Ａ、３１位がリシンからグルタミン酸に変異した変異体Ｋ３１Ｅ、３８位がリシンからアラニンに変異した変異体Ｋ３８Ａ、３８位がリシンからグルタミン酸に変異した変異体Ｋ３８Ｅ、４２位がリシンからアラニンに変異した変異体Ｋ４２Ａ、４２位がリシンからグルタミン酸に変異した変異体Ｋ４２Ｅ、６０位がリシンからアラニンに変異した変異体Ｋ６０Ａ、６０位がリシンからグルタミン酸に変異した変異体Ｋ６０Ｅ、６１位がアルギニンからアラニンに変異した変異体Ｒ６１Ａ、６１位がアルギニンからグルタミン酸に変異した変異体Ｒ６１Ｅ、６８位がアルギニンからアラニンに変異した変異体Ｒ６８Ａ、６８位がアルギニンからグルタミン酸に変異した変異体Ｒ６８Ｅ、７１位がアルギニンからアラニンに変異した変異体Ｒ７１Ａ、７１位がアルギニンからグルタミン酸に変異した変異体Ｒ７１Ｅ、７１位がアルギニンからグルタミンに変異した変異体Ｒ７１Ｑ、７２位がロイシンからアラニンに変異した変異体Ｌ７２Ａ、７３位がフェニルアラニンからアラニンに変異した変異体Ｆ７３Ａ、７３位がフェニルアラニンからロイシンに変異した変異体Ｆ７３Ｌ。
【００９８】
もう１つの実施形態では、リガンドは、（配列番号２の）３３位、３４位及び３５位の１又はそれ以上のアミノ酸残基が変異している又は欠失している、ヒトＣＸ３ＣＬ１のケモカインドメイン（配列番号２の残基２５〜１００）を含む。
【００９９】
好ましい実施形態では、配列番号２の３３位は、ａａからａａ１、ａａ２、ａａ３、ａａ４又はａａ５に変異しているか又は欠失している。
【０１００】
好ましい実施形態では、配列番号２の３４位は、ａａからａａ１、ａａ２、ａａ３、ａａ４又はａａ５に変異しているか又は欠失している。
【０１０１】
好ましい実施形態では、配列番号２の３５位は、ａａからａａ１、ａａ２、ａａ３、ａａ４又はａａ５に変異しているか又は欠失している。
【０１０２】
残基３３、３４及び３５の変異は、内因性ケモカイン受容体に結合せずにＣＭＶによってコードされる受容体に結合する、免疫毒素の選択性を与えるために望ましい。
【０１０３】
本発明のリガンドはまた、ウイルスによってコードされるケモカインであり得る。１つのそのような好ましいケモカインは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によってコードされるＣＣケモカインｖＣＣＬ２（配列番号７）又はその変異体である。
【０１０４】
キメラ
本発明はまた、異なるケモカイン、例えばＣＣケモカイン、ＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインからのセグメントを含む組換えポリペプチド又はタンパク質であるリガンドを提供する。従って、本発明は、ＣＣケモカイン、ＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン又はＣＸ３Ｃケモカイン、例えばＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン）又はフラクタルカインのケモカインドメインからの２又はそれ以上のセグメントを含む異種融合タンパク質であるリガンドに関する。特異性、例えば受容体特異性の新しい組合せを示す本発明のキメラポリペプチドは、タンパク質結合特異性と他の機能性ドメインの機能的連結から生じる。
【０１０５】
それ故、本発明のリガンドは、ケモカインがＣＣケモカイン、ＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインから成る群より選択される、２又はそれ以上の異なるケモカインの間のキメラであり得る。
【０１０６】
より詳細には、リガンドは、ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８及びｖＣＣＬ１又はｖＣＣＬ２から成る群より選択されるＣＣケモカイン又はその変異体又はトランケート型である、２又はそれ以上の異なるケモカインの間のキメラであり得る。
【０１０７】
リガンドはまた、１又はそれ以上のＣＣケモカイン又はその変異体と１又はそれ以上のＣＸ３Ｃケモカイン又はその変異体の間のキメラであり得る。この実施形態において、ＣＣケモカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８及びｖＣＣＬ２又はその変異体から成る群より選択され得、及びＣＸ３Ｃケモカインは、ＣＸ３ＣＬ１（配列番号２）又はその変異体及びＣＸ３ＣＬ１のケモカインドメイン（配列番号２の残基２５〜１００）又はその変異体から成る群より選択され得る。
【０１０８】
好ましい実施形態では、リガンドは、ｖＣＣＬ２（配列番号７）とＣＸ３ＣＬ１（配列番号２）の間のキメラである。
より詳細には、リガンドは、ＣＸ３ＣＬ１のＮ末端部分（配列番号２の残基２５〜３１又は２５〜３６）を置換するｖＣＣＬ２のＮ末端部分（配列番号７の残基１〜５又は１〜９又は１〜１２）をコードする一連のアミノ酸、例えば２（ＬＧ）、又は例えば３、又は例えば４、又は例えば５、又は例えば６、又は例えば７、又は例えば８、又は例えば９、又は例えば１０、又は例えば１１、又は例えば１２アミノ酸の間のキメラであり得る。
【０１０９】
本発明の抗体
上記で概説したように、免疫毒素は送達のための標的部分（リガンド）と細胞傷害のための毒性部分を含む。標的部分は、受容体リガンド、例えばサイトカイン又は増殖因子、可溶性受容体及び抗体、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。それゆえ、本発明の１つの実施形態では、本発明の免疫毒素のリガンドは抗体又はその変異体である。本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。本発明の抗体又はそのフラグメントは、ＵＳ２８に対する抗体、ＵＳ２７に対する抗体、ＵＬ３３に対する抗体及びＵＬ７８に対する抗体から成る群より選択され得る。本発明の好ましい実施形態では、リガンドはＵＳ２８に対する抗体である。
【０１１０】
当業者に公知であるように、特異的で高親和性の抗体が、当分野で公知の多くの手法によって作製できる。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて作製し得る。好ましい抗体は、ＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３もしくはＵＬ７８に対するヒト化抗体又はヒト抗体である。
【０１１１】
抗体という用語は、全長抗体及びその結合フラグメントを意味するために使用される。広く認められている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに数え切れないほどの免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκ又はλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεとして分類され、それらが順に、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン（例えば抗体）構造単位は、四量体を含む。各々の四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各々の対は１本の「軽」鎖（約２５ＫＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ＫＤａ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、主として抗原認識の役割を担う約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
【０１１２】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして又は様々なペプチダーゼでの消化によって生成される多くの広く特性決定されたフラグメントとして存在する。従って、例えばペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合している軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下で還元されてヒンジ領域内のジスルフィド結合が壊れ、それによってＦ（ａｂ）’２二量体がＦａｂ’単量体に変換され得る。Ｆａｂ’単量体は、基本的にはヒンジ領域の部分を有するＦａｂである。抗体分子のＦｃ部分は、主として免疫グロブリン重鎖の定常領域に対応し、抗体のエフェクター機能を担う（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993)参照）。様々な抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化の観点から定義されているが、当業者は、そのようなＦａｂ’フラグメントが化学的に又は組換えＤＮＡ法を利用することによって新たに合成され得ることを認識する。従って抗体という用語はまた、ここで使用するとき、全長抗体の修飾によって生成される又は組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成される抗体フラグメントを包含する。
【０１１３】
抗体はまた、１本の腕の複合モノクローナル抗体、可変重鎖と可変軽鎖が一緒に結合して（直接又はペプチドリンカーを通して）連続ポリペプチドを形成する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体を含む、一本鎖抗体、並びにダイアボディ、トリボディ及びテトラボディを含む（Pack et al. (1995) J MoI Biol 246:28; Biotechnol 11: 1271; and Biochemistry 31: 1579）。抗体は、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産されるフラグメント等である。
【０１１４】
親和性
１つの実施形態では、本発明のリガンドは、本発明の受容体、例えばＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３又はＵＬ７８に少なくとも１０-6Ｍ、例えば１０-7Ｍ、又は例えば１０-8Ｍ、又は例えば１０-9Ｍ、又は例えば１０-10Ｍ、又は例えば１０-11Ｍ、又は例えば１０-12Ｍの特異的結合親和性で結合する。
【０１１５】
２つの分子、例えばリガンドと受容体の間の「特異的結合親和性」は、分子の混合物中での１つの分子のもう一方の分子に対する選択的結合を意味する。分子の結合は、典型的には、結合親和性が約１×１０4Ｍ-1から約１×１０9Ｍ-1又はそれ以上（すなわち約１０-4から１０-9Ｍ又はそれ以下のＫD）である場合、特異的とみなされる。リガンドと受容体の結合親和性は、当業者に公知の標準手法によって測定し得る。結合親和性を測定するための周知の手法の非限定的な例は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）テクノロジー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、等温滴定型熱量測定（ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ  ＵＳＡ）、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳを含む。例えばＦＡＣＳ又は他の選別法は、関連結合対成員（受容体、例えば可溶性受容体など）に特異的に結合する分子（例えば細胞表面に提示されるリガンドなど）の集団を選択するために使用し得る。リガンド−受容体複合体は、例えば蛍光によって（例えば複合体を認識する蛍光抗体と複合体を反応させることによって）検出し、選別し得る。関連結合対成員（例えば受容体）に結合する対象分子をプールし、より低濃度の受容体の存在下で再選別する。漸減濃度（例示的な濃度範囲は、リガンド−受容体相互作用の性質に依存して、約１０-6Ｍから１０-9Ｍまで、すなわち１マイクロモル（μＭ）から１ナノモル（ｎＭ）まで、又はそれ以下のオーダーである）の受容体の存在下で多数回の選別を実施することにより、受容体に対して特異的結合親和性を示す対象分子の集団が単離され得る。
【０１１６】
ポリペプチド、核酸又は他の成分は、それが通常結びついている成分（他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質（複合体、例えば天然配列に付随し得るポリメラーゼ及びリボソームを含む）、核酸、細胞、合成試薬、細胞夾雑物、細胞成分等）、例えばそれがもともと由来する細胞において通常結びついている他の成分から、部分的に又は完全に分離されるとき、「単離」される。ポリペプチド、核酸又は他の成分は、それが成分の組成物、混合物又は収集物中に存在する主要な種である（すなわちモルベースで、組成物中のいかなる他の個別種よりも豊富である）ように、その天然環境の他の成分から部分的に又は完全に回収又は分離されるとき、単離される。一部の場合、製剤は、約６０％、７０％又は７５％超、典型的には約８０％超、又は好ましくは約９０％超の単離種から成る。
【０１１７】
本発明の毒素
免疫毒素の毒性部分は、標的細胞の死滅を媒介する。最も一般的には、毒素は細菌（例えばシュードモナス属外毒素（ＰＥ）（配列番号８）又はジフテリア毒素（ＤＴ））又は植物（例えばリシン(recin)又はアブリン）のいずれかに由来する。どちらの種類の毒素も、タンパク質合成を阻害することによって細胞を死滅させる。ＰＥ及びＤＴは伸長因子２（ＥＦ２）を不活性化させ、リシン及びアブリンは２８Ｓリボソームサブユニット上のＥＦ２結合部位を不活性化させる。
【０１１８】
いかなる細胞傷害性毒素も本発明において有用であり得る。しかし、考慮因子、例えば免疫原性、生産の実現可能性、副作用等を配慮し得る。本発明の１つの実施形態では、好ましい毒素は、ゲロニン(gelonin)、ブガニン(bouganin)、サポリン(saporin)、リシン、リシンＡ鎖、ブリョジン(bryodin)、ジフテリア、レストリクトシン(restrictocin)、ジフテリア毒素、シュードモナス属外毒素Ａ及びそれらの変異体から成る群より選択される。
好ましい実施形態では、毒素はシュードモナス属外毒素Ａ又はその変異体である。
【０１１９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の免疫毒素の毒素は、ＰＥ３８ＫＤＥＬ（配列番号９）と呼ばれるＰＥの３８ｋＤａ変異体を含む組換え毒素である。天然では、ＰＥは、３つのドメイン:結合ドメイン、転位ドメイン及びＡＤＰリボシル化ドメイン、から構成される６６ｋＤａタンパク質である。組換え免疫毒素は、ＰＥの細胞結合ドメインを欠失させ、それをもう１つ別の標的部分、本発明者らの場合は本発明のリガンド、例えば構成的にインターナライズするＣＭＶ ＧＰＣＲに対して高親和性を有するケモカイン誘導体で置換することによって作製される。
【０１２０】
それ故、シュードモナス属外毒素ＰＥ３８は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｋ０１３９７に従って、転位ドメイン（ドメインＩＩ、配列番号８の２５３〜３６４位から成るアミノ酸配列）、ドメイン１ｂの一部（配列番号８の３８１〜３９９位から成るアミノ酸配列）及びＡＤＰリボシル化ドメイン（ドメインＩＩＩ、アミノ酸４００〜６１２）から成る。
【０１２１】
シュードモナス属外毒素Ａを含む免疫毒素は、付属の実施例において概説する方法を用いて作製され得る。これらの方法は他の免疫毒素の作製に適合させ得る。これらにおいては、免疫毒素のリガンドと毒性部分の間で翻訳融合物を作製する。
【０１２２】
本発明の好ましい免疫毒素は配列番号１０である。
【０１２３】
配列番号１１を含む免疫毒素も好ましい。
【０１２４】
変異体
本発明はまた、本発明の好ましいポリペプチドの変異体及びフラグメントを包含する。より詳細には、本発明は、本発明の免疫毒素の変異体、本発明の免疫毒素のリガンド部分の変異体、及び本発明の免疫毒素の毒性部分の変異体を包含する。１つの特定実施形態では、変異体は、本発明の好ましいポリペプチドのフラグメントである。
【０１２５】
変異体は、天然に生じるか又は、例えば遺伝子操作によって、人工的に作製され得る。さらに、変異体は機能的変異体であり得、その場合、機能性は本発明の好ましいポリペプチドの機能に関して定義される。従って、リガンドの機能的変異体は、本発明の受容体に結合し得る変異体である。リガンドの特定の好ましい機能的変異体は、ＣＭＶによってコードされる構成的にインターナライズする受容体、例えばヒトＣＭＶによってコードされるケモカイン受容体、例えばＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３又はＵＬ７８受容体に結合し得る変異体である。
【０１２６】
本発明のポリペプチド及びそれらをコードするＤＮＡセグメントの構造に修飾及び変更を加えて、望ましい特徴を備えたタンパク質又はペプチドをコードする機能的変異体をまだ入手し得る。以下は、機能的変異体、又はさらには改善された第二世代分子を作製するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。アミノ酸変化は、遺伝子暗号に従って、ＤＮＡ配列のコドンを変化させることによって達成され得る。
【０１２７】
タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはそのタンパク質の相互作用能力と性質であるので、タンパク質配列内、及び言うまでもなく、その基礎であるＤＮＡコード配列内である種のアミノ酸配列置換を実施することができ、それでもなお同様の性質を有するタンパク質を得ることができる。それ故、本発明のポリペプチド又は前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列内で、それらの生物学的有用性又は活性を評価し得るほどに失わなければ、様々な変更を行い得ることが本発明者らによって考慮される。
【０１２８】
そのような変更を行う場合、アミノ酸の疎水親水指数を考慮し得る。タンパク質に相互作用性生物学的機能を与える上での疎水親水アミノ酸指数の重要性は、当分野において一般的に了解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次に、他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等とタンパク質の相互作用を定義することは広く認識されている。各々のアミノ酸には、それらの疎水性特性及び電荷特性に基づいて疎水親水指数(hydropathic index)が割り当てられており(Kyte and Doolittle, 1982)、これらは以下の通りである。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【０１２９】
特定のアミノ酸を、類似の疎水親水指数又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換し、それでもなお類似の生物活性を有するタンパク質を生じ得ること、すなわち生物学的機能性において等価のタンパク質を入手し得ることは当分野において公知である。そのような変更を行う場合、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがより一層特に好ましい。また、同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効に行われ得ることも当分野において了解されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大局所平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、タンパク質の生物学的性質と相関すると述べている。
【０１３０】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸を、類似の親水性値を有するもう１つ別のアミノ酸によって置換し、それでもなお生物学的に等価の、特に免疫学的に等価のタンパク質を入手し得ることは了解されている。そのような変更を行う場合、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがより一層特に好ましい。
【０１３１】
上記で概説したように、アミノ酸置換は一般に、それ故、アミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。前記特性のいくつかを考慮に入れた例示的な置換は当業者に周知であり、以下を含む。アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリン、ロイシン及びイソロイシン。
【０１３２】
変異体は、所定の配列に対する配列類似性又は配列同一性によって表わされ得る。好ましい実施形態では、所定の配列は、本発明のポリペプチドの配列である。
【０１３３】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の配列同一性パーセントを決定するには、最適比較のために配列を整列する（例えば２番目のアミノ酸又は核酸配列との最適アラインメントのために１番目のアミノ酸又は核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。１番目の配列内の位置が２番目の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、それらの分子はその位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列によって共有される同一位置の数の関数である。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【０１３４】
アミノ酸配列の「配列同一性」の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置の同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の「配列類似性」の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置のアミノ酸、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数の関数である。配列同一性は、上述した配列比較アルゴリズムによって又は目視検査によって決定される。
【０１３５】
好ましくは、本発明の変異体内の残基位置は、本発明の好ましいポリペプチドと比較したとき保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０１３６】
ここで使用する保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸（アミノ酸の所定の群内の）によるもう１つ別のアミノ酸（同じ群内の）の置換に関し、前記の２つのアミノ酸は類似の又は実質的に類似の特徴を示す。
【０１３７】
ここで適用する「保存的アミノ酸置換」という用語の意味の中で、１つのアミノ酸は、ここで以下に示すアミノ酸の群の中のもう１つ別のアミノ酸を置換し得る。
極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＣｙｓ）
非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ及びＭｅｔ）
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ  Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
環状側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
酸性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
アミド側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
中性の弱い疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
親水性の酸性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、及び
疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）
【０１３８】
好ましい保存的アミノ酸置換群は以下の通りである。バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミン。
【０１３９】
本発明の１つの実施形態では、変異体は、非天然アミノ酸、例えば非天然側鎖を有するＤ−アミノ酸、β−アミノ酸又はＬ−アミノ酸を含む。そのような非天然アミノ酸は、変異体のその受容体への結合を最適化する、毒性を高める、副作用を低減する、変異体の薬物動態を最適化する等のために望ましいと考えられる。
【０１４０】
従って、本発明に従った変異体又はそのフラグメントは、当該配列の同じ変異体又はそのフラグメント内に、又は当該配列の異なる変異体又はそのフラグメントの中に、少なくとも１つの置換、例えば互いに独立して導入される複数の置換を含み得る。
【０１４１】
同じ変異体又はそのフラグメントが、ここで上記に定義した保存的アミノ酸の２以上の群からの２以上の保存的アミノ酸置換を含み得ることは上記の概説から明らかである。
【０１４２】
本発明において使用する機能的変異体は、１つの好ましい実施形態によれば、本発明の所定のポリペプチドの対応する機能性を参照することによって確立される。
【０１４３】
本発明の１つの実施形態では、配列番号２（ＣＸ３ＣＬ１）のすべての機能的変異体は、それらが配列番号２に対して示す同一性又は類似性の程度のかかわりなく、本発明の範囲内に含まれる。この理由は、配列番号２の一部の領域が、生じるフラグメントの結合活性にいかなる有意の影響を及ぼすことなく、容易に変異し得る又は完全に欠失され得る可能性が極めて高いためである。
【０１４４】
置換によって得られる機能的変異体は、機能的に類似のアミノ酸側鎖を含む残基が置換される場合、何らかの形態又は程度の活性を十分に示し得、それにもかかわらずより低い配列同一性を有し得る。これに関して機能的に類似するとは、側鎖の支配的な特徴、例えば疎水性、塩基性、中性又は酸性、又は立体的なかさの存在又は不在を指す。従って、本発明の１つの実施形態では、配列同一性の程度は、変異体が本発明に従った好ましいポリペプチドの機能的変異体であることの主要な尺度ではない。
【０１４５】
変異体が機能的変異体であるかどうかはアッセイによって判定できる。例えばリガンドの機能性は、機能的パラメータ、例えば本発明の所定の受容体に結合する能力によって判定され得る。受容体結合は、付属の実施例において概説するような、競合結合アッセイ、飽和結合アッセイ、蛍光偏光アッセイ、ビアコアアッセイ及び表面プラズモン共鳴に基づくアッセイによって測定され得る。
【０１４６】
免疫毒素変異体の機能性は、例えば付属の実施例において概説するようなＣＭＶ感染細胞に対する毒性に基づく、生物学的アッセイにおいて測定され得る。
【０１４７】
機能的変異体の機能は、それ故、状況に依存する。
【０１４８】
受容体
ＣＭＶゲノムは、７回膜貫通型受容体をコードするいくつかの遺伝子（例えばＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３及びＵＬ７８）を含み、少なくともＵＳ２８は機能的ケモカイン受容体である。これらの受容体はＣＭＶ感染細胞の表面で発現され、その環境においてケモカインに応答することができるようになる。ウイルスそれ自体は、本質的に非運動性であるため、及びヒト細胞によってコードされるケモカイン及びそれらの受容体は、身体を通る白血球及び他の細胞の移動を調節することが公知であるため、ＣＭＶによってコードされるケモカイン受容体は、感染の間及び感染後に身体を通るＣＭＶの播種を促進するためにウイルスによってコードされると思われる。
【０１４９】
ＣＭＶによってコードされるケモカイン受容体はＣＭＶ感染細胞上で発現されるので、これらの受容体は、ＣＭＶ感染細胞に対する免疫毒素のための標的として有用である。
【０１５０】
免疫金コロイド電子顕微鏡法により、ＵＳ２８は主として多胞性エンドソームに局在することが認められる。このタンパク質の重要でない割合（多くても２０％）は、細胞表面でも発現される。抗体供給（antibody-feeding）実験は、細胞表面のＵＳ２８が構成的なリガンド非依存性エンドサイトーシスを受けることを指示する。ヨウ素化リガンドを使用したさらなる生化学的分析は、ＵＳ２８が速やかにインターナライズされたことを示す。
【０１５１】
他のＨＣＭＶタンパク質の不在下で発現されるとき、標識ＵＳ２８分子は主として細胞内に位置する。ＵＳ２８の局在は、初期エンドソーム及び後期エンドソーム／リソソームについてのマーカーと有意に重なり、このウイルスタンパク質が、少なくとも部分的には、エンドサイトーシス経路内に位置することを示唆する。超薄凍結切片における免疫金標識ＵＳ２８−ＧＦＰの電子顕微鏡検査により、このタンパク質が、後期エンドソームの特徴を有し、後期エンドソームマーカーＣＤ６３及びリゾビスホスファチジン酸に対する抗体で標識することができる多胞体に関連することが認められる。ＵＳ２８−ＧＦＰの標識は、これらの構造の制限膜及び内部小胞の両方で認められる。加えて、ＵＳ２８−ＧＦＰは、形質膜及び初期エンドソームに相当し得る小管及び小胞にある程度位置する。
【０１５２】
この細胞表面ＵＳ２８は、速やかな構成的エンドサイトーシス及びリサイクリングを受けることが認められる。インターナリゼーションの割合は、１分当たり細胞表面プールの７％であり、６０分後には初期表面プールの９０％までが細胞内にある。これらのインターナリゼーション特性は、活性化ケモカイン受容体のものに類似する。ホルボールエステル及びＳＤＦ−１の両方が細胞ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４のエンドサイトーシスを誘導することが以前に明らかにされている。ＵＳ２８エンドサイトーシスの反応速度は、ＳＤＦ−１が誘導するＣＸＣＲ４のインターナリゼーションに関して見られるものに類似し、ホルボールエステル誘導の取込みよりも有意に速い。ＵＳ２８の迅速なエンドサイトーシスは、リガンド、ランテスによって影響されず、又はＵＳ２８受容体に架橋する潜在能を有する二価トレーサー抗体Ｑ４１２０の結合によって影響を受けない。細胞が細胞表面に一定レベルのＵＳ２８を保持するという事実は、構成的エンドサイトーシスは起こるが、インターナライズされたＵＳ２８がリサイクルされることを示唆する。シクロヘキシミド処理は、細胞表面のＵＳ２８を有意に減少させない。さらに、抗体供給実験においてリサイクリングが直接明らかにされる。興味深いことに、ＣＤ４−ＵＳ２８上でインターナライズされた抗体分子は、抗体処理したＣＤ４−ＵＳ２８細胞の凍結切片を免疫標識することによって多胞性エンドソームにおいて認めることができ、ＵＳ２８の多胞体プールがリサイクリング工程の一部であり得ることを示唆する。これに関して、ＵＳ２８のリサイクリング経路は、同じく多胞体の内膜で認められるが形質膜を通してリサイクルできる、リソソームテトラスパニンＣＤ６３について述べられているものに類似すると考えられる。ＵＳ２８は細胞外ケモカインをインターナライズすることが示され、このウイルスケモカイン受容体がＨＣＭＶ感染細胞の環境からＣＣ及びＣＸ３Ｃケモカインを分離し得ることを示唆した。構成的エンドサイトーシスは、おそらくＵＳ２８に結合するいかなるリガンドについても起こる。ひとたびインターナライズされると、リガンドは初期又は後期エンドソームにおいて受容体から解離され、最終的に分解され得る。
【０１５３】
ＣＭＶは、構成的にインターナライズするＧＰＣＲをコードするいくつかの遺伝子、例えばＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３及びＵＬ７８をそのゲノム内に保持する。それ故本発明の１つの実施形態では、本発明の免疫毒素の標的である受容体は、ヒトＣＭＶタンパク質ＵＳ２８（配列番号３）、ＵＳ２７（配列番号４）、ＵＬ３３（配列番号５）及びＵＬ２８（配列番号６）又は天然に生じるその変異体から成る群より選択される。
【０１５４】
ＵＳ２８は、特定のヒト及びウイルスケモカインについての機能的受容体として働くタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。ＣＭＶによる細胞の感染後、ＵＳ２８が感染細胞の表面で発現され、その環境においてケモカインに応答することができるようになる。ＵＳ２８受容体は、様々なアッセイ形式において多様なヒト、マウス及びウイルスによってコードされるＣＣケモカインに結合することが示された。加えて、ＣＸ３Ｃケモカイン、フラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１とも称される）は、非常に高い親和性（ＫＩ５０ｐＭ）でＵＳ２８に結合する。フラクタルカインは、特定の内皮細胞表面及び樹状細胞（ＤＣ）の集団で発現され、それ故ＣＭＶ感染細胞が循環から組織腔に入る入口を規定し、並びにＤＣ内に定住場所を見出し得る。好ましい実施形態では、受容体はＵＳ２８又は天然に生じるその変異体である。
【０１５５】
ＵＳ２８は構成的にインターナライズする受容体である。従ってＵＳ２８に結合するケモカイン又は他の化合物は、この受容体を発現する細胞にインターナライズされる。同様に、ＵＳ２８に結合する免疫毒素は、毒素がその細胞傷害機能を及ぼすことができる、ＣＭＶ感染細胞内へと輸送される。
【０１５６】
いくつかの試験は、ＵＳ２８がリガンド結合に応答してシグナル伝達し得ることを示した。また別の試験は、ＵＳ２８が構成的に活性であることを示した。本文中で、「構成的に活性なＧタンパク質共役」という用語は、受容体リガンド（アゴニスト）による活性化を伴わずにシグナルを媒介するＧタンパク質共役受容体に関する。活性ＧＰＣＲは少なくとも１つの活性Ｇタンパク質に結合する。Ｇタンパク質は、ＧＴＰに結合しているとき活性である。ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は静止状態のＧタンパク質を再生する。
【０１５７】
ＵＳ２８タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトヘルペスウイルス５型（ＨＨＶ５）（実験室株ＡＤ１６９）、全ゲノムＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１３４７としても知られるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの一般的に注釈によれば、ヒトサイトメガロウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＵＳ２８に局在する。
【０１５８】
ヒトＣＭＶの配列は単離物によって異なり、それ故ＵＳ２８の多数のゲノム変異体が存在する。ＵＳ２７、ＵＬ３３及びＵＬ７８と同様に、ＵＳ２８、ＵＳ２７、ＵＬ３３及びＵＬ７８という用語は、本発明において使用されるとき、ＣＭＶによってコードされるタンパク質のすべての天然に生じる変異体を包含することが了解されるべきである。
【０１５９】
以下のリストは、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能な９４個のＵＳ２８アミノ酸配列へのアクセッション番号を示す。
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【０１６０】
薬剤としての免疫毒素
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、免疫無防備状態の患者、例えばＡＩＤＳ患者、新生児、及び移植レジメンの一部として免疫抑制薬を投与された個人において疾患を引き起こすように出現する、重要なヒト病原体である。これらの個人では、急性又は再興感染におけるＣＭＶの帰結は深刻であり得、例えば、数ある病変の中でも特に、網膜炎、脳炎及びニューモシスチスを含み得る。さらに、免疫無防備状態宿主では、ＣＭＶは持続的な生涯にわたる感染を確立し、それを通して様々な炎症状態、例えば心臓移植及びアテレクトミー後の冠動脈閉塞及び血管形成術後の再狭窄に結びついてきた。ＣＭＶは、宿主の急性感染の間並びに生涯にわたる潜伏期の間、白血球と相互作用する。それ自体、白血球はＣＭＶ誘導性疾患において重要な役割を果たし、感染の急性期にはウイルスの伝播のための媒体として及び生涯の潜伏期の間の定住部位として関係づけられてきた。
【０１６１】
本発明の免疫毒素は、ＣＭＶ感染細胞を標的し、死滅させる、すなわちＣＭＶ感染個体、例えばＡＩＤＳ患者、新生児、及び移植レジメンの一部として免疫抑制薬を投与された個人及び免疫応答性宿主を治療するために使用できるので、薬剤として有用である。
【０１６２】
１つの実施形態では、本発明は、本発明の免疫毒素の薬剤としての使用に関する。それ故、本発明の免疫毒素は、ＣＭＶ感染の治療又は予防のための薬剤を製造するための使用に関する。
【０１６３】
本発明の免疫毒素は、ＣＭＶ感染、もしくはＣＭＶ感染の何らかの症状の確立又は進行のためにも使用され得る。
【０１６４】
本発明の免疫毒素はまた、ＨＩＶ感染患者が特にＣＭＶ感染を起こしやすいことは周知であるので、ＨＩＶ感染患者におけるＣＭＶ感染又はＣＭＶ感染の何らかの症状の確立又は進行を予防するために使用し得る。
【０１６５】
さらに、本発明のＣＭＶ感染は、網膜、心臓、肝臓、肺、脾臓又は血液細胞から成る群より選択される組織に局在し得る。
【０１６６】
免疫毒素の好ましい使用は、ＣＭＶ感染の治療又は予防のための個体が、ＨＩＶ患者、新生児及び免疫抑制患者、骨髄移植患者及び臓器移植患者から成る群より選択される免疫無防備状態患者である治療をさらに含む。
【０１６７】
免疫毒素のさらなる好ましい使用は、ＣＭＶ感染の治療又は予防のための個体が、冠動脈疾患に罹患している患者である治療を含む。
【０１６８】
免疫毒素のさらなる好ましい使用は、ＣＭＶ感染の治療又は予防のための個体が胎児／新生児である治療を含む。
【０１６９】
本発明の医薬組成物
本発明の免疫毒素は、動物、特に哺乳動物における、予防的治療を含む、疾患及び障害及び／又は病的状態の治療及び診断のために使用できるが、最も好ましくはヒトにおけるこれらの目的のために使用される。さらに、本発明の免疫毒素は、健常個人及び健常動物においてその生理的状態を変化させるためにも使用できる。
【０１７０】
そのような治療又は診断では、本発明の免疫毒素は、医薬的に許容される担体、及び場合により、打錠剤（tabletting agents）、湿潤剤、結合剤及び充填剤、防腐剤、例えば抗酸化剤及び抗菌剤、緩衝剤及び塩をさらに含む医薬組成物の形態で投与される。好ましい担体は、注射用媒質、特に水を含む。組成物は、経口、経腸、直腸及び非経口経路を含む何らかの従来の経路によって投与される。非経口経路は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔注射を含む。本発明の免疫毒素はまた、吸入によって、鼻スプレーとして、及び皮膚に局所的に投与され得る。それらはまた、硬膜外、髄腔内及び脳室内に投与され得る。
【０１７１】
特に、本発明の免疫毒素の薬理的に有効な量を含有する医薬組成物は、生理的状態の変化、ＣＭＶ関連疾患の診断、予防又は治療処置のために、動物、特にヒトに投与される。そのような状態の例は、数ある病変の中でも特に、下痢、網膜炎、脳炎及びニューモシスチスを引き起こし得る急性又は再興性のＣＭＶ感染を含む。
【０１７２】
そこで、１つの実施形態では本発明は、本発明に従った免疫毒素及びその何らかの生理的に許容される塩を含有する医薬組成物に関する。もう１つの実施形態では、本発明は、医薬的に許容される担体をさらに含有する医薬組成物に関する。
【０１７３】
本発明に従った使用のための組成物における医薬的に許容される賦形剤の選択及びその最適濃度は一般には予測できず、その実験測定に基づいて決定されねばならない。また医薬的に許容される賦形剤が医薬組成物における使用に適するかどうかは、一般にどのような種類の投与形態が選択されるかに依存する。しかし、医薬製剤の当業者は、例えば「Remington: The science and practice of pharmacy」20th ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3に指針を見出すことができる。
【０１７４】
医薬的に許容される賦形剤は、組成物が投与される個体に対して実質的に無害な物質である。そのような賦形剤は通常、国の医薬品局によって与えられる必要条件を満たす。公式薬局方、例えばイギリス薬局方、米国薬局方及び欧州薬局方は、周知の医薬的に許容される賦形剤についての基準を定めている。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、非経口、静脈内、経口、局所、経粘膜又は経皮組成物であり得る。
【０１７６】
以下において、本発明に従った使用のための関連医薬組成物についての総説を述べる。総説は特定投与経路に基づく。しかし、医薬的に許容される賦形剤が異なる投与形態又は組成物において使用され得る場合、特定の医薬的に許容される賦形剤の適用は、特定投与形態又は賦形剤の特定機能に限定されない。
【０１７７】
非経口組成物：
全身適用に関しては、本発明に従った組成物は、ミクロスフェア及びリポソームを含む、従来の非毒性の医薬的に許容される担体及び賦形剤を含有し得る。
【０１７８】
本発明に従った使用のための組成物は、すべての種類の固体、半固体及び液体組成物を含む。特に関係する組成物は、例えば溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、移植用錠剤及びインプラントである。
【０１７９】
医薬的に許容される賦形剤は、溶媒、緩衝剤、防腐剤、保湿剤、キレート化剤、抗酸化剤、安定剤、乳化剤、懸濁化剤、ゲル形成剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤及び湿潤剤を含み得る。種々の作用物質の例については以下参照。
【０１８０】
局所、経粘膜及び経皮組成物
粘膜又は皮膚への適用に関しては、本発明に従った使用のための組成物は、ミクロスフェア及びリポソームを含む、従来の非毒性の医薬的に許容される担体及び賦形剤を含有し得る。
【０１８１】
本発明に従った使用のための組成物は、すべての種類の固体、半固体及び液体組成物を含む。特に関係する組成物は、例えばペースト、軟膏、親水軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、溶液、乳剤、懸濁液、ローション、リニメント、レゾリブレット（resoriblets）、坐薬、浣腸剤、ペッサリー、成形ペッサリー、膣カプセル、膣錠剤、シャンプー、ゼリー、石けん、スティック、スプレー、粉末、フィルム、泡、パッド、スポンジ（例えばコラーゲンスポンジ）、パッド、包帯（例えば吸収性創傷包帯など）、飲薬、絆創膏、硬膏及び経皮送達システムである。
【０１８２】
医薬的に許容される賦形剤は、溶媒、緩衝剤、防腐剤、保湿剤、キレート化剤、抗酸化剤、安定剤、乳化剤、懸濁化剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、坐薬基剤、浸透促進剤、香料、皮膚保護剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤及び湿潤剤を含み得る。種々の作用物質の例については以下参照。
【０１８３】
経口組成物：
粘膜又は皮膚への適用に関しては、本発明に従った使用のための組成物は、ミクロスフェア及びリポソームを含む、従来の非毒性の医薬的に許容される担体及び賦形剤を含有し得る。
【０１８４】
本発明に従った使用のための組成物は、すべての種類の固体、半固体及び液体組成物を含む。特に関係する組成物は、例えば溶液、懸濁液、乳剤、非被覆錠剤、放出制御錠剤、胃抵抗性錠剤、口腔内崩壊錠剤、発泡性錠剤、チュアブル錠剤、軟カプセル、硬カプセル、放出制御カプセル、胃抵抗性カプセル、非被覆顆粒、発泡性顆粒、経口使用のための液体の調製用顆粒、被覆顆粒、胃抵抗性顆粒、放出制御顆粒、経口投与用粉末及び経口使用のための液体の調製用粉末である。
【０１８５】
医薬的に許容される賦形剤は、溶媒、緩衝剤、防腐剤、保湿剤、キレート化剤、抗酸化剤、安定剤、乳化剤、懸濁化剤、ゲル形成剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、被覆剤及び湿潤剤を含み得る。種々の作用物質の例については以下参照。
【０１８６】
様々な作用物質の例：
溶媒の例は、水、アルコール、植物油又は魚油（例えばアーモンド油、ヒマシ油、カカオバター、ココナツ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、オリーブ油、ヤシ油、落花生油、ケシ油、ナタネ油、ゴマ油、ダイズ油、ヒマワリ油及び茶油のような食用油）、鉱物油、脂肪油、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、液体ポリアルキルシロキサン、及びそれらの混合物であるが、これらに限定されない。
【０１８７】
緩衝剤の例は、クエン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、リン酸水素（hydrogenphosphoric acid
）、ジエチルアミン等であるが、これらに限定されない。
【０１８８】
本組成物における使用のための防腐剤の例は、パラベン、例えばメチル、エチル、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベン、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸、安息香酸メチル、フェノキシエタノール、ブロノポール、ブロニドックス、ＭＤＭヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカルバメート、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム及びベンジルアルコール、又は防腐剤の混合物であるが、これらに限定されない。
【０１８９】
保湿剤の例は、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、乳酸、尿素、及びそれらの混合物であるが、これらに限定されない。
【０１９０】
キレート化剤の例は、ＥＤＴＡナトリウム及びクエン酸であるが、これらに限定されない。
【０１９１】
抗酸化剤の例は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、システイン、及びそれらの混合物であるが、これらに限定されない。
【０１９２】
乳化剤の例は、天然に生じるゴム、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム；天然に生じるホスファチド、例えばダイズレシチン；モノオレイン酸ソルビタン誘導体；羊毛脂；羊毛アルコール；ソルビタンエステル；モノグリセリド；脂肪アルコール；脂肪酸エステル（例えば脂肪酸のトリグリセリド）；及びそれらの混合物であるが、これらに限定されない。
【０１９３】
懸濁化剤の例は、セルロース及びセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カラギーナン、アカシアゴム、アラビアゴム、トラガカント、及びそれらの混合物であるが、これらに限定されない。
【０１９４】
ゲル基剤及び増粘剤の例は、流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、コロイド状シリカ又はアルミニウム、亜鉛石けん、グリセロール、プロピレングリコール、トラガカント、カルボキシビニルポリマー、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、親水性ポリマー、例えばデンプン又はセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及び他のセルロース誘導体、水膨潤性親水コロイド、カラギーナン、ヒアルロン酸塩（例えば、場合により塩化ナトリウムを含むヒアルロン酸ゲル）、及びアルギン酸プロピレングリコールを含むアルギン酸塩であるが、これらに限定されない。
【０１９５】
軟膏基剤の例は、密ろう、パラフィン、セタノール、パルミチン酸セチル、植物油、脂肪酸のソルビタンエステル（スパン（Span））、ポリエチレングリコール、及び脂肪酸のソルビタンエステルとエチレンオキシドの間の縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン（Tween））であるが、これらに限定されない。
【０１９６】
疎水性軟膏基剤の例は、パラフィン、植物油、獣脂、合成グリセリド、ろう、ラノリン及び液体ポリアルキルシロキサンであるが、これらに限定されない。
【０１９７】
親水性軟膏基剤の例は、固体マクロゴール（ポリエチレングリコール）であるが、これらに限定されない。
【０１９８】
粉末成分の例は、アルギン酸塩、コラーゲン、ラクトース、創傷に適用したときゲルを形成する（液体／創傷滲出物を吸収する）ことができる粉末であるが、これらに限定されない。
【０１９９】
希釈剤及び崩壊剤の例は、ラクトース、ショ糖、エムデックス、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、デンプン及び微結晶セルロースであるが、これらに限定されない。
【０２００】
結合剤の例は、ショ糖、ソルビトール、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールであるが、これらに限定されない。
【０２０１】
湿潤剤の例は、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリソルベート８０であるが、これらに限定されない。
【０２０２】
潤滑剤の例は、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、酸化ケイ素、プレシロール及びポリエチレングリコールであるが、これらに限定されない。
【０２０３】
被覆剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース及びポリメチルアクリレートであるが、これらに限定されない。
【０２０４】
坐薬基剤の例は、カカオ脂、固相脂（adeps solidus）及びポリエチレングリコールであるが、これらに限定されない。
【０２０５】
医薬組成物は、好ましくは本発明の免疫毒素の有効用量を含有する。医薬組成物は、１０μｇ〜３００００μｇ／日の用量の免疫毒素を含有し得る。
【０２０６】
本発明の免疫毒素は、薬剤の０．００１〜９９重量％、典型的には０．０１〜７５重量％、より典型的には０．１〜２０重量％、特に１〜１０重量％の量で薬剤中に存在する。
【０２０７】
本発明の医薬組成物は、単回投与として、定期的又は連続投与として投与され得る。
【０２０８】
現在のところ、移植患者及びＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者におけるＣＭＶ感染の治療のための最も一般的な薬剤は、最初は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のために開発された一般薬、ガンシクロビル及びアシクロビルである。ガンシクロビル及びアシクロビルは、ＣＭＶ並びにＨＳＶに対する抑制作用を有する。Ｇｉｌｅａｄからのビスタイドは、より古い一般薬に代わってＲｏｃｈｅのバルサイトと共に成長し、市場を占有すると予想されるより新しい化合物である。
【０２０９】
本発明の医薬組成物は、１又はそれ以上の抗ウイルス治療薬、例えばガンシクロビル及びアシクロビル、ビスタイド、バルサイトなどと共に同時に、別々に又は連続的に投与し得る。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、抗ＨＩＶ治療薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び／又はヌクレオシド類似体又はＨＡＡＲＴなどと共に併用投与し得る。
【０２１１】
特許薬又は一般薬のいずれの既存薬剤も、免疫無防備状態又は免疫抑制患者において感染を根絶することはできず、単にＣＭＶ疾患の進行を休止させるだけである。最近の臨床試験では、フォスカビルとガンシクロビルが、免疫無防備状態患者を治療するそれらの能力に関して比較された。結果は、フォスカビルを使用して３０％のより良好な感染の抑制を示した。しかし、フォスカビル治療下の患者の４０％が、耐容できない吐気のためにその後ガンシクロビルに切り替えられた。これらの結果は、効果と毒性レベルの両方において改善の余地があることを示す。
【０２１２】
本発明の医薬組成物は、１又はそれ以上の免疫抑制治療薬、例えばシクロスポリンＡ、アザチオプリン、シクロホスファミド、コルチコステロイド（例えばプレドニゾン）、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムス、シロリムス及びバシリキシマブ（Basiliximab）（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、キメラ（ヒト／マウス）モノクローナル抗体、インターロイキン２受容体拮抗物質及び抗汎Ｔ細胞ポリクローナル及びモノクローナル抗体などと共に同時に、別々に又は連続的に投与し得る。
【０２１３】
さらに、（ａ）本発明の免疫毒素の有効量及び（ｂ）同時、別個又は連続投与のための抗ウイルス薬、免疫抑制薬の群から選択される治療薬又は治療薬の組合せ、を含む、ＣＭＶ感染の治療又は予防のためのキットが本発明に含まれる。
【０２１４】
本発明の核酸
さらに、本発明の免疫毒素をコードする核酸配列を含む核酸配列は本発明に含まれる。好ましい実施形態では、核酸配列は、配列番号１０及び配列番号１１から成る群より選択される免疫毒素をコードする核酸配列を含む。
【０２１５】
さらに、本発明の免疫毒素をコードする配列を含む発現ベクターが本発明に含まれる。
【０２１６】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、配列番号１０又は配列番号１１をコードする核酸配列を含む。
【０２１７】
また、上記発現ベクターでトランスフェクトした宿主も本発明の一部である。
【０２１８】
本発明の免疫毒素を生産する方法
ここで述べる免疫毒素は、当分野で公知の何らかの適切な方法によって生産され得る。そのような方法は、免疫毒素をコードする核酸配列を構築し、適切な形質転換又はトランスフェクトした宿主においてその配列を発現させることを含む。
【０２１９】
ここで述べる免疫毒素をコードする核酸配列は、所望免疫毒素又はその部分又は変異体をコードする核酸配列を単離する又は合成することによって構築され得る。核酸配列は、化学合成によって、例えば所望免疫毒素のアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドが設計される、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用すること、及び好ましくは、免疫毒素が生産される宿主細胞において優先されるコドンを選択することによって作製され得る。例えば所望免疫毒素の部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ、連結又は連結連鎖反応（ＬＣＲ）によって合成し、構築し得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的構築のための５’又は３’突出末端を含む。
【０２２０】
ひとたび構築されれば、所望免疫毒素をコードする核酸配列を組換えベクターに挿入し、所望形質転換宿主細胞における免疫毒素の発現のために必要な制御配列に作動可能に連結する。
【０２２１】
すべてのベクター及び発現制御配列が、ここで述べる免疫毒素をコードする核酸配列を発現するために等しく良好に機能するとは限らないことは言うまでもなく了解されるべきである。同様に、すべての宿主が同じ発現系に関して等しく良好に機能するとは限らない。しかし、当業者は、過度の実験を必要とせずにこれらのベクター、発現制御配列及び宿主の中から選択し得る。例えばベクターを選択する場合、ベクターは宿主内で複製しなければならない又は染色体に組み込まれることができなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、及びベクターによってコードされる何らかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮すべきである。発現制御配列を選択する場合も、やはり様々な因子を考慮すべきである。これらは、例えば配列の相対的な強さ、その制御能、及び免疫毒素をコードする核酸配列との適合性、特に潜在的二次構造に関する適合性を含む。宿主は、選択されるベクターとのそれらの適合性、核酸配列によってコードされる産物についての宿主の感受性及び耐容性、それらの分泌特徴、免疫毒素を正しく折りたたむ能力、及びそれらの発酵又は培養必要条件を考慮して選択されるべきである。
【０２２２】
組換えベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されたとき、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものである。
【０２２３】
ベクターは、好ましくは、所望免疫毒素をコードする核酸配列の転写のために必要な付加的なセグメントに作動可能に連結されている、発現ベクターである。ベクターは、典型的にはプラスミド又はウイルスＤＮＡに由来する。ここで言及する宿主細胞における発現のための多くの適切な発現ベクターが、市販されているか又は文献において記述されている。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えばＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターを含む。具体的なベクターは、例えばｐＣＤＮＡ３．１（＋）｜Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）である。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、公知の細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａ及びｐＥＴ１２ａ（いずれもＮｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡより）を含む大腸菌（E. coli）からのプラスミド、より広い宿主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばλファージの数多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、及び他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージを含む。酵母細胞のための有用な発現ベクターは、２μプラスミド及びその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号）、(Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996)に述べられているｐＪＳＯ３７ベクター及びｐＰＩＣＺ  Ａ、Ｂ又はＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。昆虫細胞のための有用なベクターは、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１ (Cate et al., 「Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells」, Cell, 45, pp. 685-98 (1986))、ｐＢｌｕｅｂａｃ  ４．５及びｐＭｅｌｂａｃ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能）を含む。
【０２２４】
本発明における使用のための他のベクターは、ここで述べる免疫毒素をコードする核酸配列がコピー数増幅することを許容するものを含む。そのような増幅可能ベクターは当分野において周知である。それらは、例えばＤＨＦＲ増幅（例えばKaufman, 米国特許第４，４７０，４６１号, Kaufman and Sharp, 「Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression」, Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)参照）及びグルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州特許第３３８  ８４１号参照）によって増幅され得るベクターを含む。
【０２２５】
組換えベクターは、ベクターが当該宿主細胞において複製することを可能にするＤＮＡ配列をさらに含み得る。そのような配列の一例（宿主細胞が哺乳動物細胞であるとき）は、ＳＶ４０複製起点である。宿主細胞が酵母細胞であるとき、ベクターが複製することを可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点である。
【０２２６】
ベクターはまた、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はスキゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＴＰＩ遺伝子（P. R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130によって記述されている)、又は薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を付与するものを含み得る。糸状菌に関しては、選択マーカーは、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ、ｓＣを含む。
【０２２７】
多種多様な発現制御配列が本発明において使用され得る。そのような有用な発現制御配列は、前記発現ベクターの構造遺伝子に関連する発現制御配列並びに原核又は真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の何らかの配列、及びそれらの様々な組合せを含む。
【０２２８】
哺乳動物細胞において転写を指令するための適切な制御配列の例は、ＳＶ４０及びアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、例えばアデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ショウジョウバエ（Drosophila）最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルスＥｌｂ領域ポリアデニル化シグナル及びコザックコンセンサス配列 (Kozak, M. J MoI Biol 1987 Aug 20; 196(4) :947-50)を含む。
【０２２９】
哺乳動物細胞における発現を改善するため、免疫毒素をコードするヌクレオチド配列の５’非翻訳領域内に合成イントロンを挿入し得る。合成イントロンの一例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡより入手可能）からの合成イントロンである。
【０２３０】
昆虫細胞において転写を指令するための適切な制御配列の例は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）多角体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター及びバキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター、及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。
【０２３１】
酵母宿主細胞における使用のための適切な制御配列の例は、酵母α交配系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖系遺伝子又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター及び誘導的ＧＡＬプロモーターを含む。
【０２３２】
糸状菌宿主細胞における使用のための適切な制御配列の例は、ＡＤＨ３プロモーター及びターミネーター、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼ又はアルカリプロテアーゼ、黒色アスペルギルス（A. niger）α−アミラーゼ、Ａ．ニガー又はＡ．ニジュランス（A. nidulans）グルコアミラーゼ、Ａ．ニジュランスアセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ又はリパーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びＡＤＨ３ターミネーターを含む。
細菌宿主細胞における使用のための適切な制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系及びλファージの主要プロモーター領域のプロモーターを含む。
【０２３３】
細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、又は他の適切な動物細胞又は細胞系、並びにトランスジェニック動物又は植物を含む、いかなる適切な宿主も、ここで述べる免疫毒素又はその部分を発現するために使用され得る。１つの実施形態では、宿主細胞は真核宿主細胞、例えばグリコシル化することができる哺乳動物宿主細胞である。
【０２３４】
細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルス属（Bacillus）、例えばＢ．ブレビス（B. brevis）又は枯草菌（B. subtilis）、シュードモナス属（Pseudomonas）又はストレプトミセス属（Streptomyces）の菌株、又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌の菌株を含む。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換によって（例えばChang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115参照）、コンピテント細胞（たとえばYoung and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81 : 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221参照）、電気穿孔法（例えばShigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751参照）、又はコンジュゲーション（例えばKoehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278参照）を使用して実施され得る。
【０２３５】
適切な糸状菌宿主細胞の例は、アスペルギルス属、例えばＡ．オリゼ、黒色アスペルギルス又はＡ．ニジュランス、フザリウム属（Fusarium）又はトリコデルマ属（Trichoderma）の菌株を含む。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体が公知の方法での細胞壁の再生を含む工程によって形質転換し得る。アスペルギルス属宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、欧州特許第２３８  ０２３号及び米国特許第５，６７９，５４３号に述べられている。フザリウム属種を形質転換するための適切な方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 及び国際公開広報第ＷＯ９６／００７８７号によって述べられている。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920によって述べられている手順を用いて形質転換し得る。
【０２３６】
適切な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス属（Saccharomyces）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スキゾサッカロミセス、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、例えばＰ．パストリス（P. pastoris）又はＰ．メタノリカ（P. methanolica）、ハンセヌラ属（Hansenula）、例えばＨ．ポリモルファ（H. Polymorpha）又はヤロウィア属（Yarrowia）の菌株を含む。酵母細胞を異種ＤＮＡで形質転換し、そこから異種ポリペプチドを生産するための方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡによって（ＹｅａｓｔｍａｋｅｒTMＹｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔのための製品プロトコールにおいて）、及びReeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415 and Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164によって開示されている。
【０２３７】
適切な昆虫宿主細胞の例は、鱗翅目（Lepidoptora）細胞系、例えばヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９またはＳｆ２１）又はイラクサギンウワバ（Trichoplusioa ni）細胞（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）（米国特許第５，０７７，２１４号）を含む。昆虫細胞の形質転換及び昆虫細胞における異種ポリペプチドの生産は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって述べられているように実施し得る。
【０２３８】
適切な哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えばＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞系（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ  １（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ  ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞（例えばＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞系（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２又はＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、及びヒト細胞（例えばＨＥＫ  ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））、並びに組織培養下の植物細胞を含む。さらなる適切な細胞系は当分野において公知であり、公的預託機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である。また、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞は、受容体の改善されたグリコシル化を与えるために、例えば米国特許第５，０４７，３３５号に述べられているように、シアリルトランスフェラーゼ、例えば１，６−シアリルトランスフェラーゼを発現するように修飾し得る。
【０２３９】
本発明はまた、本発明の免疫毒素の配列の１コピー又は数コピーを含む融合タンパク質を包含する。そのような融合タンパク質は、典型的には、上述した原理に従って、適切なＤＮＡを利用することによる発現系の使用によって、及び当分野で周知の手順の適用によって製造される。
【０２４０】
本発明はまた、本発明の免疫毒素の１コピー又は数コピーのアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。本発明によれば、ＤＮＡを、化学的に変化した非天然ＤＮＡに交換することができ、前記非天然ＤＮＡは、ペプチド又はタンパク質合成に関して基本的に天然ＤＮＡと同じ機能を与えることができる。さらに、本発明に従ったＤＮＡはまた、ＲＮＡに交換することができる。非天然ＤＮＡ又はＲＮＡを動物、特にヒトに投与するとき、ＲＮＡ又は非天然ＲＮＡを使用することは特に好都合であり、その理由は、ＲＮＡ又は非天然ＤＮＡが動物又はヒトの内因性ＤＮＡと組み換わるのが回避され、それ故長期的な副作用の危険度を低下させるためである。
【０２４１】
また、免疫毒素を翻訳融合物として作製しないことも考慮される。その代りに、リガンドと毒素部分を別々に合成し、その後化学的手段又はタンパク質連結によって融合し得る。
【０２４２】
さらに、リガンド及び／又は毒素が、例えば化学合成によってインビトロで生産されるポリペプチドであり得ることも考慮される。
【０２４３】
さらに、リガンド及び／又は毒素がポリペプチドではなく、その代りに、例えば合成分子であり得ることも考慮される。
【０２４４】
ＡＩＤＳ／死亡への進行についてのマーカーとしてのＣＭＶ
高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）が使用可能になる以前は、サイトメガロウイルスはＨＩＶ感染患者における日和見感染の主要原因であり、ＡＩＤＳ及び死亡への加速的進行に結びついてきた。試験は、サイトメガロウイルス血症がＨＡＡＲＴの時代においてもまだＨＩＶ疾患及び死亡の進行にとっての重要な危険因子であるかどうかを検討した。
【０２４５】
方法。過去にＣＤ４細胞数が１００／μＬ以下であった３７４名の患者を前向き試験に登録した。連続的な血液試料をＰＣＲによってサイトメガロウイルスに関して検査した。新たなサイトメガロウイルス疾患、新たなＡＩＤＳを定義づける障害、及び死亡の割合を、基線値に従った層化後３７ヶ月間の平均フォローアップ期間にわたって算定し、フォローアップ期間中のいずれかの時点で最も新しいサイトメガロウイルスＰＣＲ状態を算定した。
【０２４６】
２９６９のＰＣＲアッセイの所見。３７５名（１２．６％）がサイトメガロウイルスＤＮＡに関して陽性であった。２５９名（６９．３％）の患者は、ＰＣＲによりサイトメガロウイルスに関して持続的に陰性であり；１５名は持続的に陽性であり；及び１００名は間欠的に陽性及び陰性であった。多変量モデルにおいて、時間依存性共変量（time-updated covariate）としてのサイトメガロウイルスＰＣＲ陽性状態は、新たなＡＩＤＳを定義づける障害への進行（２．２２［９５％  ＣＩ  １．２７〜３．８８］ｐ＝０．００５）及び死亡（４．１４［１．９７〜８．７０］ｐ＝０．０００２）の高い相対的比率と有意に関連した。
【０２４７】
解釈。ＰＣＲによる血液中のサイトメガロウイルスの検出は、ＨＡＡＲＴの時代においてさえも予後不良の患者を同定し続ける。このウイルスがＨＩＶ疾患進行のマーカー又は決定因子であるかどうかを検討するための、サイトメガロウイルスに対して活性な薬剤の無作為化対照臨床試験が必要である。
【０２４８】
治療又は予防の方法
本発明はまた、本発明の免疫毒素の有効量を、それを必要とする個人に投与することを含む、ＣＭＶ感染の治療又は予防の方法に関する。個人は、ＣＭＶ感染を有する任意の個人又はＣＭＶに感染する危険性のある任意の個人である。１つの実施形態では、個人は、ＨＩＶ患者、新生児及び免疫抑制患者、骨髄移植患者及び臓器移植患者から成る群より選択される免疫無防備状態患者である。もう１つの実施形態では、個人は、冠動脈疾患に罹患している患者である。
【０２４９】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、本発明の免疫毒素の有効量を、それを必要とする個人に投与することを含み、ＣＭＶ感染が、個人の網膜、心臓、肝臓、肺、脾臓及び血液細胞から成る群より選択される組織に局在する、ＣＭＶ感染の治療又は予防の方法に関する。
【０２５０】
さらなる実施形態では、本発明は、ＣＭＶ感染又はＣＭＶ感染の何らかの症状の確立又は進行を予防するための方法に関する。
【０２５１】
本発明の様々な態様及びこれらの態様の特定実施形態の上記説明に関して、本発明の１つの態様及び／又は態様の１つの実施形態に関して上記で説明される又は言及される何らかの特徴及び特性はまた、類推により、記述される本発明の何らかの又はすべての他の態様及び／又は実施形態にも適用されることが了解されるべきである。
【実施例】
【０２５２】
[実施例１]
大腸菌における組換え免疫毒素、ＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬの構築
フラクタルカインｃＤＮＡを、ＣＸ３ＣＬ１発現プラスミドｐＬＳＭ１０３（Ｔｒａｃｙ  Ｈａｎｄｅｌの好意により提供された）及びｐＲＢ１３９９（Ｉｒａ  Ｐａｓｔａｎの好意により提供された）からの外毒素ＰＥ３８ＫＤＥＬから増幅した。標準ＰＣＲ手法により、ＮｃｏＩ部位、ｈｉｓ６タグ及び第Ｘａ因子切断部位をＣＸ３ＣＬ１のＮ末端に付加し、ＰＥ３８配列とのオーバーラップをＣ末端に付加した。
【０２５３】
ＣＸ３ＣＬ１をプライマーＣＸ３ＣＬ１（６ｈｉｓ、Ｘａ）Ｓ（ｔａｇ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ａｔｇ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ａｔｃ  ｇａａ  ｇｇｔ  ｃｇｔ  ｃａｇ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｇｇｔ  ｇｔｇ  ａｃｇ）及びＣＸ３ＣＬ１（ＰＥ３８）ＡＳ（ｃｔｇ  ｃｃｇ  ｃｃｃ  ｔｃｇ  ｃｃａ  ｔｔｔ  ｃｇａ  ｇｔｔ  ａｇｇ  ｇｃａ  ｇ）で増幅した。
ＰＣＲ反応混合物は以下の通りであった：
各プライマー０．４μＭ
１０×ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）緩衝液５μｌ
ｄＮＴＰ ０．２μＭ
ＤＭＳＯ ５μｌ
ｐｆｕ ０．５μｌ
ｐＬＳＭ１０３ １００ｎｇ
５０μｌにするためのＨ2Ｏ
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
９５℃、３分間
以下の３５サイクル、
９５℃、３０秒間
６０℃、４０秒間
７２℃、１分間
７２℃、１０分間
予想フラグメント長は２９１ｂｐであった。
【０２５４】
ＣＸ３ＣＬ１とのオーバーラップをＰＥ３８のＮ末端に付加し、そのフラグメントをプライマーＰＥ３８（ＣＸ３ＣＬ１）Ｓ（ｃｔａ  ａｃｔ  ｃｇａ  ａａｔ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ａｇｃ  ｃｔｇ  ｇｃ）及びＰＥ３８  ＫＤＥＬ  ＡＳ（ｔａｇ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｔａ  ｇａｇ  ｃｔｃ  ｇｔｃ  ｔｔｔ  ｃｇｇ  ｃｇ）で増幅した。ＰＣＲ反応混合物及びＰＣＲ条件は上述した通りであった。フラグメントを、ｐｒｏｍｅｇａ  ｗｉｚａｒｄキットを使用して１％アガロースゲルから精製し、ＣＸ３ＣＬ１（６ｈｉｓ、Ｘａ）Ｓ及びＰＥ３８  ＫＤＥＬ  ＡＳプライマーと共にＰＣＲ反応物に連結して、ＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８融合タンパク質免疫毒素（ＩＭＴ）ｃＤＮＡを作製した。
濃度及び条件は上記の通りであるが、ＰＥ３８フラグメント１．２５μｌ及びＣＸ３ＣＬ１フラグメント０．２５μｌを鋳型ＤＮＡとした。
ＩＭＴフラグメントを上記のようにアガロースゲルから精製し、水４０μｌ中に溶出した。（フラグメント長  １３０６ｂｐ）。
【０２５５】
ＩＭＴ及び細菌発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素消化による粘着末端連結のために作製した。
ＩＭＴ ４０μｌ又はｐＥＴ２４ｄベクター２μｇ＋ＥｃｏＲＩ緩衝液１０μｌ、ＮｃｏＩ １μｌ、ＥｃｏＲＩ １μｌ、及び１００μｌにするための水を混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。
両方のフラグメントを１ｖｏｌのフェノールと１ｖｏｌのクロロホルム中で連続的に精製し、２．５ｖｏｌの９６％エタノール／０．１ｖｏｌの３Ｍ ＮａＡｃ  ｐＨ４．６で沈殿させた。フラグメントを、ｐＥＴ２４ｄについては水３０μｌ中に、ＩＭＴについては水１０μｌ中に再懸濁し、粘着末端連結のために使用した。
【０２５６】
ｐＥＴ２４ｄ及びＩＭＴの粘着末端連結
ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＥＴ２４ｄ １μｌ及びＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化したＩＭＴ ５μｌを、１０μｌにするための水、２×クイックリガーゼ緩衝液１０μｌ及びクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌと混合し、室温で５分間インキュベートした。
【０２５７】
ＩＭＴ構築物のクローニング
コンピテントＦ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３０μｌを氷上で解凍し、ＩＭＴ ２μｌを添加して、氷上で１５分間インキュベートした。
細菌に、水浴中４２℃で６０秒間熱ショックを与え、その後氷上で２分間インキュベートした。
ＳＯＣ培地４５０μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
細菌懸濁液１２５μｌを、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃でＯ／Ｎインキュベートした。
【０２５８】
細菌コロニーを採取し、ＬＢ＋カナマイシン培地５ｍｌ中３７℃でＯ／Ｎインキュベートした。Ｆ’細胞中のＩＭＴの存在を確認するため、Ｑｉａｇｅｎのプラスミドミニプレップ精製キットを用いてプラスミドＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで切断した。制限消化混合物は以下の通りであった：
プラスミド  ５μｌ
ＥｃｏＲＩ緩衝液  ２μｌ
ＥｃｏＲＩ   ０．２５μｌ
ＮｃｏＩ   ０．２５μｌ
水  １２．５μｌ
反応物を３７℃で９０分間放置し、１０μｌをアガロースゲルで分析して、予想サイズ（１３０６ｂｐ）を有するフラグメントの存在を検出した。
【０２５９】
Ｆ’ＩＭＴの一晩培養物２ｍｌを使用してＬＢ培地１００ｍｌに接種し、プラスミドＤＮＡマキシプレップを作製した。Ｑｉａｇｅｎのプラスミド「マキシプレップ」精製キットを用いてプラスミドを一晩培養物１００ｍｌから精製し、沈殿したＤＮＡを水２５０μｌに溶解した。ＩＭＴの存在を確認するため、プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩの両方で消化して１３０６ｂｐのフラグメントを得、ＸｈｏIで消化して３００ｂｐのフラグメントを得る。プラスミドＤＮＡ濃度は０．２２μｇ／μｌと測定された。制限消化混合物は以下の通りであった。
プラスミド  １１．５μｌ
ＥｃｏＲＩ   １．５μｌ
ＮｃｏＩ   １．５μｌ
ＥｃｏＲＩ緩衝液  １０μｌ
水  ７５．５μｌ
又は
プラスミド  １１．５μｌ
ＢＳＡ   １μｌ
ＸｈｏＩ   １．５μｌ
ＮＥＢ２   １０μｌ
水  ７７μｌ
【０２６０】
両方の反応物を３７℃で９０分間インキュベートし、アガロースゲルで分析した。ＩＭＴ配列を確認するため、プラスミドはベクター特異的プライマー、Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いて配列決定して、ＩＭＴの正しい配列が確認された。
【０２６１】
ＩＭＴ構築物のＯｒｉｇａｍｉ  ２細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）への形質転換
化学的コンピテントｏｒｉｇａｍｉ  ２細胞５０μｌを氷上で解凍した。
ＩＭＴ構築物７５ｎｇを添加し、反応物を氷上で５分間インキュベートした。
混合物を水浴中４２℃で３０秒間加熱し、氷上で１５分間冷却した。
ＳＯＣ １５０μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ＩＭＴで形質転換したｏｒｉｇａｍｉ  ２細胞７５μｌを、テトラサイクリン及びカナマイシンを含む寒天プレートに添加し、３７℃でＯ／Ｎインキュベートした。
１つのコロニーをクローニングし、増殖させた。
【０２６２】
大腸菌における組換え免疫毒素、ＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬの発現
Ｏｒｉｇａｍｉ  ２細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるＩＭＴ発現
ＬＢ培地３０ｍｌ＋３０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを、ＩＭＴで形質転換したｏｒｉｇａｍｉ  ２細胞と共に３７℃でＯ／Ｎインキュベートした。
ＬＢ培地１．５Ｌ（３×５００ｍｌ）にＯ／Ｎ培地を接種し、ＯＤ600＝０．６まで３７℃でインキュベートした。
ＩＭＴ発現を０．５ｍＭ イソプロピルｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２時間半誘導し、遠心分離（あらかじめ計量したチューブにおいて１００００ｇ、４℃で１５分間）によって細胞を収集した。
【０２６３】
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いた大腸菌の溶解
ペレットを、湿ペレットグラム当たりＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌに再懸濁し、１０〜２０分間又は抽出物がもはや粘性でなくなるまでインキュベートした。
不溶性細胞デブリを、１６０００ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。
可溶性ＩＭＴタンパク質を含む上清を清浄なチューブに移した。
【０２６４】
ＮｉアフィニティーカラムにおけるＨｉｓ標識ＩＭＴの精製
イミダゾールを最終濃度２０ｍＭまで添加し、ｐＨを７．５に調整して、試料を０．２２μｍフィルターでろ過した。
カラムを洗浄緩衝液で洗い、試料を添加した。
タンパク質が結合したカラムを５×カラム容積の洗浄緩衝液で洗った。
Ｈｉｓ標識ＩＭＴを、２５０ｍＭ イミダゾールを含む溶出緩衝液中で溶出した。
【０２６５】
Ｐｉｅｒｃｅからの２０ＫＤａのカットオフ値を有するｉｃｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いた緩衝液交換及び濃縮
ＩＭＴタンパク質をｉｃｏｎチューブに負荷し、所望濃度／容積が得られるまで３５００×ｇで遠心分離した。
第Ｘａ因子切断緩衝液をもとの容積に添加し、所望濃度が得られるまで遠心分離した。この工程を３回反復する。
【０２６６】
第Ｘａ因子を用いたＩＭＴプロテアーゼ消化物
第Ｘａ因子を、第Ｘａ因子１単位対タンパク質１０μｇの割合でタンパク質溶液に添加し、室温で５時間インキュベートする。
第Ｘａ因子捕捉キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて第Ｘａ因子を除去する。
第Ｘａ因子の除去後、ＩＭＴを−２０℃で保存する。
緩衝液
洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．５
溶出緩衝液：ＰＢＳ＋１００ｍＭ、２５０ｍＭ又は５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．５
第Ｘａ因子切断緩衝液：５ｍＭ ＣａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０。
インビトロ薬理学及び細胞生物学
【０２６７】
[実施例２]
ＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬの分析−ＵＳ２８結合親和性
ＣＯＳ−７細胞を、トランスフェクションの１日後に２４穴培養プレートに移す。各穴当たりに接種した細胞数は、添加した放射性リガンドの５−１０％の特異的結合が得られる数である。トランスフェクションの２日後に、１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルミンを添加した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４ ０．５ｍｌ中で、１２ｐＭの125Ｉ−ＭＩＰ−１α、125Ｉ−ＭＩＰ−１β、125Ｉ−ランテス、125Ｉ−ＭＣＰ−１、125Ｉ−ＣＸ3Ｃ又はもう１つ別の高親和性ＵＳ２８リガンドのいずれかプラス可変量の試験する非標識リガンドを使用して、全細胞に関して４℃で３時間、競合結合を実施する。インキュベーション後、非特異的結合及びリガンドの二量体化によって引き起こされる干渉を低減するため、０．５Ｍ ＮａＣｌを添加した４℃の結合緩衝液中で細胞を迅速に４回洗浄する。非特異的結合は、０．１μＭ 非標識ケモカインの存在下での結合として測定される。
【０２６８】
非線形回帰によってＩＣ50値を決定し、ＫD及びＢmax値を、Ｉｎｐｌｏｔ  ４．０ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、方程式ＫD＝ＩＣ50−Ｌ及びＢmax＝Ｂ0（１＋（ＫD／Ｌ））を用いて競合結合実験から算定する。
【０２６９】
［実施例３]
ＵＳ２８を介したＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬのインターナリゼーションの分析
リガンド／免疫毒素供給実験
リガンド／免疫毒素供給実験のため、ＵＳ２８発現細胞をカバーガラス上で４８時間増殖させる。細胞を室温で結合培地（ＢＭ：重炭酸塩を含まず、０．２％ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、ｐＨ７．４に調整した、ＲＰＭＩ−１６４０）中にて洗浄する。その後、細胞を、リガンド、修飾ケモカイン又は全長免疫毒素のいずれかを含むＢＭ中でインキュベートする。１時間後、カバーガラスを氷上に置き、低温ＢＭで洗浄する。細胞表面結合リガンドを除去するため、細胞をｐＨ３．０に調整したＢＭ中で２回洗浄し、次に同じ培地中で３分間のインキュベーションを２回実施して、ＢＭ、ｐＨ７．４に戻す。その後、３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定し、０．０５％サポニンで透過化処理を行うか又は行わずに、リガンドに対する抗体で染色して、共焦点顕微鏡によって検査する。
【０２７０】
エンドサイトーシスアッセイ
接着細胞に関するエンドサイトーシスアッセイを、基本的に記述されているように実施する（Pelchen-Matthews et al., 1991*)。簡単に述べると、細胞を２４穴プレートの１６ｍｍの穴に接種し、〜２．５×１０5細胞／穴の最終密度まで２日間増殖させる。細胞を氷上で冷却し、４％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで洗浄して、ＤＭＥＭ中の125Ｉ−リガンド又は125Ｉ−免疫毒素のいずれか２５０μｌと共に４℃で２時間インキュベートする。その後、細胞をＤＭＥＭ中で洗浄して遊離リガンドを除去し、次に３７℃のＤＭＥＭ １ｍｌを添加して温める。選択された時点で細胞を４℃に戻し、低温ＤＭＥＭで洗浄する。穴の半数について、細胞を０．２Ｍ ＮａＯＨ ４００μｌ中で直接収集し、計数（全細胞関連活性）のためにチューブに移す。細胞内活性を測定するため、残りの穴を酸で洗って細胞表面リガンドを除去する（酸抵抗性活性）。細胞を上記のようにＮａＯＨ中で収集する。各時点についてのインターナライズされた活性の割合を、酸抵抗性活性を全細胞関連活性で除することによって決定する。
【０２７１】
［実施例４]
ＦＡＣＳ分析によって測定したＵＳ２８陽性細胞の除去
免疫毒素を有する細胞の除去
ＵＳ２８陽性細胞及び免疫毒素に結合しない内因性ケモカイン受容体を発現する対照細胞を種々の濃度の精製免疫毒素及び対照としての培地と共に２４時間インキュベートする。生存細胞をＦＡＣＳで分析し、計数する。
【０２７２】
ＵＳ２８又はＣＸＣＲ４を発現する細胞を２４穴培養プレートで準集密状態に増殖させ、種々の濃度の精製免疫毒素又は対照としての培地と共にインキュベートする。４０時間後、接着細胞と非接着細胞を回収し、死細胞のパーセンテージを測定するためにＦＡＣＳで分析した。我々は以前に、死（ヨウ化プロピジウム陽性）ＣＨＯ細胞がそれらの光散乱特性によって同定できることを確認した。
インビトロウイルス学
【０２７３】
［実施例６]
ＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬはヒト線維芽細胞におけるヒトＣＭＶ複製の阻害を媒介する。野生型ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９株）に作用を及ぼし、対照としてのＵＳ２８ノックアウトＨＣＭＶ（ＡＤ１６９株）には作用を及ぼさない。
【０２７４】
［実施例７]
マウス線維芽細胞におけるＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬを介したマウスＣＭＶ複製の阻害。ＵＳ２８を過剰発現する組換えＭＣＭＶ（ｓｍｉｔｈ株）には作用を及ぼし、対照としての野生型ＭＣＭＶ（ｓｍｉｔｈ株）には作用を及ぼさない。
インビボウイルス学
【０２７５】
［実施例８]
免疫適格性モデル：Ｂａｌｂ／Ｃ及びＣ５７／Ｂ６バックグラウンドでのＣＸ３ＣＲ１ノックアウトマウスにおけるウイルス複製及び播種へのＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬの作用。Ｂａｌｂ／ＣとＢ６マウスは、異なるウイルス感受性及び疾患進行を示す。ＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬ処置の作用を、ガンシクロビル（ＧＣＶ）又はシドフォビル（cidofovir）（ＨＰＭＰＣ）のいずれかと比較する。すべての薬剤を腹腔内に投与する。感染後３日目、５日目及び７日目に末梢リンパ節、脾臓及び肝臓において及び感染後１４日目に唾液腺において、重量減少及びウイルス力価を測定し、処置の作用を評価するために採点する。さらに、ウイルス複製及び播種を、感染器官のＭＣＭＶ  ＩＥ１に対する免疫組織化学によって検討する。
【０２７６】
［実施例９]
免疫不全モデル：ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスにおけるウイルス複製及び疾患の進行へのＣＸ３ＣＬ１−ＰＥ３８ＫＤＥＬの作用を検討する。ＳＣＩＤマウスは用量依存的にＣＭＶ感染に屈し、それ故抗ＣＭＶ薬の効果を測定するための最も感受性の高いモデルである。
【０２７７】
［実施例１１]
親和性部分を試験するための方法
競合結合実験は、様々な濃度の非標識競合物質と単一濃度の放射性リガンドの平衡結合を測定する。競合物質に対する受容体の親和性を調べるためにこれらのデータを分析する。アッセイは、受容体結合物質との反応における標識リガンドと非標識リガンドの間の競合に基づく。
【０２７８】
受容体は、哺乳動物細胞内での発現によってリガンドに対して使用可能となる。発現は安定であるか又は一過性であり得る。一過性発現は、受容体をコードする発現構築物による関連細胞系のトランスフェクションによって実施し得る。
【０２７９】
トランスフェクションの１日後、細胞を関連細胞培養プレート（たとえば２４穴プレートであるが、必要な細胞数に依存する）に移す。各穴当たりに接種する細胞数は、添加する放射性リガンドの５〜１０％の特異的結合が得られるように決定される。トランスフェクションの２日後、結合緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルミンを添加した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４   ０．５ｍｌ）中で、約１２ｐＭの放射性標識リガンド（例えば125Ｉ−ＭＩＰ−１α、125Ｉ−ＭＩＰ−１β、125Ｉ−ランテス、125Ｉ−ＭＣＰ−１、125Ｉ−ＣＸ3Ｃ）プラス可変量の非標識競合リガンドを使用して、全細胞に関して４℃で３時間、競合結合を実施する。インキュベーション後、非特異的結合及びリガンドの二量体化によって引き起こされる干渉を低減するため、０．５Ｍ ＮａＣｌを添加した４℃の結合緩衝液中で細胞を迅速に４回洗浄する。非特異的結合は、０．１μＭ 非標識リガンド（ケモカイン）の存在下での結合として測定される。
【０２８０】
飽和結合実験
飽和結合実験は、様々な濃度の放射性リガンドの平衡結合を測定する。部位の数、Ｂｍａｘ、及びリガンド親和性、Ｋｄを決定するために結合とリガンド濃度の間の関係を分析する。
【０２８１】
飽和放射性リガンド結合実験は、様々な濃度の放射性リガンドの平衡時の特異的な放射性リガンド結合を測定する。受容体の数及び親和性を決定するためにこれらのデータを分析する。この種の実験はスカッチャードプロット（より正確にはＲｏｓｅｎｔｈａｌによる）で分析するために使用されるので、時として「スカッチャード実験」とも呼ばれる。
【０２８２】
分析は、インキュベーションを平衡に至るまで進行させたという仮定に依存する。これは、リガンド、受容体、温度及び他の実験条件に依存して、数分間から何時間もの間のどこかで起こり得る。最も低濃度の放射性リガンドが、平衡に至るまでに最も長い時間を要する。平衡時間を調べるときには、それ故、低濃度の放射性リガンド（おそらくＫｄの１０〜２０％）を使用する。
［参考文献］
【化１４】
2009540842.tif 000015
［配列表］
配列番号１：ランテス及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素のタンパク質配列
配列番号２：ＣＸ3ＣＬ１（フラクタルカイン）のタンパク質配列
配列番号３：ＵＳ２８受容体のタンパク質配列
配列番号４：ＵＳ２７受容体のタンパク質配列
配列番号５：ＵＬ３３受容体のタンパク質配列
配列番号６：ＵＬ７８受容体のタンパク質配列
配列番号７：ｖＣＣＬ２ケモカインのタンパク質配列
配列番号８：外毒素Ａのタンパク質配列
配列番号９：ＰＥ３８ＫＤＥＬのタンパク質配列
配列番号１０：フラクタルカイン及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素のタンパク質配列
配列番号１１：配列番号２のフラクタルカインのケモカイン部分２５〜１００位及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素のタンパク質配列
配列番号１２：ランテス及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素のＤＮＡ配列
配列番号１３：ＣＸ3ＣＬ１（フラクタルカイン）のＤＮＡ配列
配列番号１４：ＵＳ２８受容体のＤＮＡ配列
配列番号１５：ＵＳ２７受容体のＤＮＡ配列
配列番号１６：ＵＬ３３受容体のＤＮＡ配列
配列番号１７：ＵＬ７８受容体のＤＮＡ配列
配列番号１８：ｖＣＣＬ２ケモカインのＤＮＡ配列
配列番号１９：外毒素ＡのＤＮＡ配列
配列番号２０：ＰＥ３８ＫＤＥＬのＤＮＡ配列
配列番号２１：フラクタルカイン及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素のＤＮＡ配列
配列番号２２：配列番号２のフラクタルカインのケモカイン部分２５〜１００位及びＰＥ３８ＫＤＥＬを含む免疫毒素のＤＮＡ配列
【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【国際調査報告】
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