(57)【要約】本発明は、ワクチン処方で有用な種々の高マンノースグリコシル化ポリペプチドを提供する。また、本発明は、そのようなグリコシル化ポリペプチドの製法、およびＨＩＶ−中和抗体を誘導することにおけるその使用も提供する。本発明により、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖を含む単離されたグリコシル化ポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤を含む組成物であって、ここで、該ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものは高−マンノースオリゴ糖であり、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはその組合せであることを特徴とする、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物が、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖を含む単離されたグリコシル化ポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤を含み、ここで、該ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものは高−マンノースオリゴ糖であり、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはその組合せである、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが少なくとも３つのＮ−結合高−マンノースオリゴ糖を含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドがｇｐ１２０のアミノ酸配列、またはその断片を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが真菌糖蛋白質のアミノ酸配列、またはその断片を含む請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、酵母糖蛋白質のアミノ酸配列、またはその断片を含む請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記酵母糖蛋白質が、ＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８、およびＹＪＬ１７１ｃよりなる群から選択される請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記酵母がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項５記載の組成物。
【請求項９】
前記酵母がＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８、またはＹＪＬ１７１ｃに対するホモログである真菌糖蛋白質のアミノ酸配列を含む請求項４記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの少なくとも９０％がＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せである請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの少なくとも９０％がＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記医薬上許容される賦形剤がアジュバントである請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチドであって、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識されるグリコシル化ポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを有する蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物。
【請求項１５】
前記突然変異体真菌が突然変異体酵母である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記突然変異体酵母が破壊されたｐｍｒ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記グリコシル化ポリペプチドがＰＳＴ１のアミノ酸配列、またはその断片を含む請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチドであって、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識されるグリコシル化ポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを有する蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物。
【請求項１９】
前記突然変異体真菌が突然変異体酵母である請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記突然変異体酵母が破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記グリコシル化ポリペプチドが、ＰＳＴ１のアミノ酸配列、またはその断片を含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子、あるいはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１およびｍｎｎ１、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチド、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識され、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを有する蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物。
【請求項２３】
ａ）突然変異体真菌を発酵させる工程であって、ここで、該突然変異体真菌はグリコシル化ポリペプチドを生産するように突然変異されており、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖、および医薬上許容される賦形剤を含み、ここで、該グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものが高−マンノースオリゴ糖である、および該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せである、工程；
ｂ）突然変異体真菌細胞溶解物または上清からグリコシル化ポリペプチドを精製する工程；次いで
ｃ）該グリコシル化ポリペプチドを医薬上許容される賦形剤と共に処方する工程を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物を調製する方法。
【請求項２４】
前記突然変異体真菌が突然変異体酵母である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記突然変異体酵母が破壊されたｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記突然変異体酵母が破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記突然変異体酵母が破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異体酵母が破壊されたｏｃｈ１遺伝子を有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記突然変異体酵母が破壊されたｏｃｈ１遺伝子を有するＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
前記グリコシル化ポリペプチドが酵母糖蛋白質またはその断片である請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
前記酵母糖蛋白質がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８、およびＹＪＬ１７１ｃよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記酵母糖蛋白質がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８、またはＹＪＬ１７１ｃのホモログである請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記突然変異体真菌が、工程ａ）前に、前記グリコシル化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されている請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド配列がｇｐ１２０またはその断片をコードする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ｇｐ１２０をコードするヌクレオチド配列、または少なくとも２つのＮ−グリコシル化部位を含むその断片を含むポリヌクレオチドを含む突然変異体真菌細胞であって、該突然変異体酵母細胞はｇｐ１２０、または抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖を含む断片を生産することができ、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはその組合せである突然変異体真菌細胞。
【請求項３６】
前記突然変異体真菌が破壊されたｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項３５記載の突然変異体真菌細胞。
【請求項３７】
前記突然変異体真菌が、破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項３５記載の突然変異体真菌細胞。
【請求項３８】
前記突然変異体真菌が、破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項３５記載の突然変異体真菌細胞。
【請求項３９】
前記突然変異体真菌が、破壊されたｏｃｈ１を有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項３５記載の突然変異体真菌細胞。
【請求項４０】
有効量の請求項１記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を創製する方法。
【請求項４１】
有効量の請求項１４記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を創製する方法。
【請求項４２】
有効量の請求項１８記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を創製する方法。
【請求項４３】
有効量の請求項２２記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を創製する方法。
【請求項４４】
有効量の請求項１記載の組成物を投与することを含む、対象において、病原体に対する中和抗体を誘導する方法。
【請求項４５】
前記病原体がＨＩＶである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
有効量の請求項１４記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において病原体に対する中和抗体を誘導する方法。
【請求項４７】
前記病原体がＨＩＶである請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
有効量の請求項１８記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において病原体に対する中和抗体を誘導する方法。
【請求項４９】
前記病原体がＨＩＶである請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
有効量の請求項２２記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において病原体に対する中和抗体を誘導する方法。
【請求項５１】
前記病原体がＨＩＶである請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
有効量の請求項１記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法。
【請求項５３】
前記病原体がＨＩＶである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
有効量の請求項１４記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法。
【請求項５５】
前記病原体がＨＩＶである請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
有効量の請求項１８記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法。
【請求項５７】
前記病原体がＨＩＶである請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
有効量の請求項２２記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法。
【請求項５９】
前記病原体がＨＩＶである請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖、および医薬上許容される賦形剤を含むグリコシル化ポリペプチドに対する抗体の結合を検出することを含み、ここで、該グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものは高−マンノースオリゴ糖であり、および、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはその組合せである、Ｎ−結合高マンノースオリゴ糖に特異的に結合する抗体を同定する方法。
【請求項６１】
前記抗体がＨＩＶによって感染される対象の血清中にある請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記グリコシル化ポリペプチドが突然変異体酵母細胞溶解物である請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１およびｍｎｎ４遺伝子、あるいはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１およびｍｎｎ１、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌において生産されたグリコシル化ポリペプチドに対する抗体の結合を検出することを含み、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識される、Ｎ−結合高マンノースオリゴ糖に特異的に結合する抗体を同定する方法。
【請求項６４】
前記抗体がＨＩＶによって感染される対象の血清中にある請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
突然変異体酵母の全細胞、および医薬上許容される賦形剤を含み、ここで、該突然変異体酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、ｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子、あるいはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、ｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／７１９，９５２号（２００５年９月２２日出願）に対する優先権を主張し、その内容は本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、免疫学および薬学の分野に関する。より詳細には、本発明は、有効な免役応答を誘発するために有用なグリコシル化抗原を産生する方法およびそのような抗原を使用するワクチン接種戦略に関する。
【０００３】
（連邦政府の支援を受けた研究および開発に関する宣言）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ助成金番号ＡＩ５１９０３およびＡＩ５８７２４の下で、米国政府支援によって行われた。米国政府は、本発明に対し一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
いくつかの病原体によって発現された複合糖質は宿主免疫応答の回避を容易とし、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｉｎｇｉｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、およびヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）のような生物での感染に続いての破壊的続発症に貢献する。特に、糖蛋白質の炭水化物リッチな領域は免疫原性が貧弱である。免疫原性のこの欠如に貢献する因子は、炭水化物ミクロ不均一性による単一抗原性応答の希釈、および高度に免疫原性の蛋白質エピトープとの立体的干渉を含む。例えば、Ｒｕｄｄら、Ｃｒｉｔ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１−１００（１９９７）；Ｗｏｏｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：４９９−５０１（１９９４）参照。加えて、ウイルスは、細胞グリコシル化マシーナリーを用いて、宿主が既にそれに対して寛容化されている内因性グリカンを発現することによって宿主免疫系をしばしば騙す。
【０００５】
ＨＩＶ病原性における糖蛋白質の役割、特に、ｇｐ１２０のそれは、保護的宿主免疫応答を誘導するにおいて複合糖質の困難性および重要性を例示する。全てのウイルスのように、ＨＩＶは、宿主において首尾よくそれ自体を増殖させるのに、細胞の転写および翻訳マシーナリーを必要とする。ＨＩＶは、特異的細胞受容体との相互作用を介して細胞に進入することによってこれを達成する。特に、ＨＩＶビリオンは、そのウイルスエンベロープ蛋白質（「Ｅｎｖ」）と、初期感染の間における細胞ＣＤ４受容体およびＣＣＲ５細胞共受容体との相互作用を介して、および感染後期のＣＤ４受容体−ＣＸＣＲ４共受容体複合体を介して、細胞、通常、Ｔリンパ球に進入する。例えば、Ｐｏｈｌｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｉｏｌ．７５：４６６４−７２（２００１）；Ｔｅｕｎｉｓら、Ｃｅｌｌ  １００：５８７−９７（２０００）参照。Ｅｎｖ蛋白質はｇｐ１２０として知られた糖蛋白質である。ＨＩＶビリオンの表面では、ｇｐ１２０の３つの分子がもう１つの細胞表面蛋白質ｇｐ４１に非共有結合により連結している。例えば、Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１９９−２１０（２００４）参照。ｇｐ４１は、ウイルスエンベロープにおけるホモトリマー複合体として発見された膜貫通糖蛋白質である。このｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体は、最初に、ＣＤ４／共受容体複合体に結合し、ついで、引き続いて、立体配座変化を受け、その結果、ウイルスの細胞への進入を媒介するウイルス融合ペプチドの暴露をもたらす、ＨＩＶビリオン上でヘテロ−オリゴマースパイクを形成する。
【０００６】
最近の証拠は、ＣＤ４／共受容体相互作用から区別される第二の相互作用も、特に最も初期の段階においてＨＩＶ伝達および感染に対して重要であることを示唆する。樹状細胞（ＤＣ）、高度に特殊化された抗原提示細胞は、感染に際してＨＩＶによって標的とされる最初の細胞である。Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、Ｃｅｌｌ  １００：５８７−９７（２０００）参照。粘膜におけるＤＣは粘膜表面からのＨＩＶを捕獲し、内部化し、ｇｐ１２０、およびＤＣ上の細胞表面分子であるＤＣ−ＳＩＧＮの間の相互作用を介して遠くのリンパ節に輸送する。次いで、ＤＣによる無傷ウイルスの送達の結果、ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球の感染がもたらされる。Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：６７１−７８（２００１）参照。換言すれば、ＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶによるＣＤ４＋細胞の効果的な感染を媒介するようにイン・トランス作用する。Ｐｏｈｌｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４６６４−７２（２００１）参照。より後の研究は、ＤＣ−ＳＩＧＮは、また、イン・シス作用して、効果的なウイルス感染を促進することを示した。例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２０２８−３８（２００１）参照。
【０００７】
感染された細胞を排除するにおける困難性を仮定すれば、免疫応答は、もし誘導された応答がウイルスの細胞への進入を邪魔すれば、最も効果的なようである。現在、そのような保護的応答を誘導する試みは、ｇｐ１２０の貧弱な免疫原性によって妨げられてきた。ｇｐ１２０は、広いグリコシル化、および臨界的なｇｐ１２０エピトープ、すなわち、ウイルスの進入をブロックすることができ、またはウイルスを中和することができる抗体からの受容体／共受容体複合体と相互作用するエピトープに対する物理的遮蔽として作用するより保存された機能的に拘束された領域が散在する高度に可変なループを含有する。例えば、Ｇａｒｂｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４：３９７−４１３（２００４）参照。しかしながら、天然で誘導される中和抗体は同定されており、効果的な中和応答に対する潜在能力を確認する。例えば、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３−３６（２００４）参照。
【０００８】
ＨＩＶ−１一次単離体の広域スペクトルに対する中和抗体を誘導するためのＨＩＶ／ＨＩＤＳワクチンの開発は、依然として、ＡＩＤＳの発見から２５年たっても、かなり挑戦的な努力である。効果的なワクチンを開発するための挑戦は、中和抗体が宿主で誘導されるように免疫学的に提示され得る適当な抗原性エピトープの同定にある。成功したＨＩＶワクチンを開発するにおける挑戦は、一次ＨＩＶ単離体におけるかなりの多様性によってさらに複雑化される。例えば、Ｇａｓｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４−６０（２００２）参照。現在、ワクチン設計に対する伝統的なアプローチでは、中和抗体応答の誘導における成功が示されていない。ＨＩＶワクチンのほぼ３０の臨床試験の中では、中和抗体を広く誘導できるものはない。主な挑戦の内の１つは、抗原の表面に露出され、ＨＩＶ−１の殆どまたは全てのサブタイプにおいて高度に保存された中和エピトープを持つ抗原の適切な設計の欠如である。Ｐａｎｔｏｐｈｌｅｔ  Ｒら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：７３９−６９，２００６。現在までに、広くかつ優れた中和活性を持つ唯４つのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）がＨＩＶ−１感染ヒトから単離された。Ｄｏｕｅｋ  ＤＣら、Ｃｅｌｌ  １２４：６７７−８１（２００６）。それらのいずれも、動物の全てのテストされた種において複製できない。４つのＭＡｂの中で、１つはＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ｇｐ１２０上の立体配座エピトープを標的とし、２つはｇｐ４１を認識し、１つは２Ｇ１２を認識し、ｇｐ１２０上の高マンノース−型炭水化物に結合する。
【０００９】
ＨＩＶ感染についての最も初期の標的細胞は樹状細胞（ＤＣ）であり、従って、最も優れたワクチンは、宿主においてＤＣを標的とするＨＩＶの能力を破壊するものである。ｇｐ１２０の高マンノースオリゴ糖は、ＨＩＶ−ＤＣ相互作用に対して必須のエピトープを提供し、かくして、適当なワクチン標的を提供する。高マンノースオリゴ糖はＤＣ−ＳＩＧＮおよびｇｐ１２０の間の相互作用を媒介する。Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、Ｃｅｌｌ  １００：５８７−９７（２０００）参照。しかしながら、天然に生じるｇｐ１２０は約２０％のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ８）および１０％  Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ９）を発現するに過ぎない。Ｓｃａｌａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７３０６−２１（２００２）参照。シアノビリン−Ｎ（ＣＶ−Ｎ）、シアノバクテリア蛋白質はｇｐ１２０の高マンノースオリゴ糖に結合し、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ９）上のＭａｎα１，２−Ｍａｎ構造、およびＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ８）のＤ１Ｄ３異性体を特異的に認識し、この相互作用を介して、ＨＩＶに対する優れた殺微生物剤として作用する。Ｂｅｗｌｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：３９８２−９０２（２００１）；Ｓａｎｄｓｔｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：１３９２６−３１（２００４）参照。さらに、天然に生じる中和抗体の１つは、ｇｐ１２０のＭａｎα１，２−Ｍａｎ高マンノースオリゴ糖のクラスターを特異的に認識する。Ｓｃａｎｌａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７３０６−２１（２００２）参照。２Ｇ１２抗体として知られたこの抗体は、ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞とのＨＩＶビリオン相互作用を阻害することによって、ＨＩＶ−１一次単離体の広い範囲を潜在的に中和する。例えば、Ｔｒｋｏｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１１００−０８（１９９６）；Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２９３−３０５（２００２）参照。
ＨＩＶ−１ワクチンについての標的としての高マンノース型グルカン
炭水化物−ベースのＨＩＶワクチンの開発は、予防ワクチンのための新規なアプローチの１つであると考えられる。非特許文献１。いくつかの系列の証拠は、Ｍａｎ８ＮＡｃＧｌｃのＤ１およびＤ３アーム上で見出される末端Ｍａｎα１，２−Ｍａｎ構造（α１，２−結合マンノース）はｇｐ１２０糖蛋白質上の新規な標的を提示することを示しており、異なる株およびサブタイプからのＨＩＶ−１に対する優れた中和抗体を誘導する可能性が存在する。
【００１０】
ｇｐ１２０上の高−マンノースグリカンは、広く中和するＭＡｂ  ２Ｇ１２によって認識される。げっ歯類において作られ、ＨＩＶ−１感染ヒトから単離されたｇｐ１２０に対する数百のＭＡｂの中では、２Ｇ１２は、ウイルス炭水化物を認識し、広い範囲のＨＩＶ−１一次単離体を潜在的に中和する唯１つのものである。それは、ＨＩＶ−１とＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞との相互作用を阻害することによってそれを行う。Ｔｒｋｏｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（２）：１１００−０８，１９９６；Ｓｃａｎｌａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６（１４）：７３０６−２１，２００２；Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６（１４）：７２９３−３０５，２００２。２Ｇ１２の結合部位は、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ｇｐ１２０糖蛋白質上の高マンノース−型グリカンとして同定されている。より特異的には、２Ｇ１２  ＭＡｂは、少なくとも３つの高−マンノースグリカンからの末端α１，２−結合マンノース残基のクラスターに結合する（Ｓｃａｎｌａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６（１４）：７３０６−２１，２００２）。それは、異なる末端結合、α１，３−結合またはα１，６−結合マンノースを持つ他の炭水化物またはマンノース残基を認識しない。
【００１１】
高−マンノースグリカン上のＭａｎα１，２−Ｍａｎ構造もまた優れたＨＩＶ−１阻害剤に対する結合部位である。シアノビリン−Ｎ（ＣＶ−Ｎ）と呼ばれるシアノバクテリア蛋白質は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの実験室株および一次単離体の多様なアレイを不活化することができる。Ｂｏｙｄら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１（７）：１５２１−３０，１９９７。該蛋白質は、ＣＤ４および共受容体とのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０相互作用をブロックし、ウイルス−対−細胞融合を妨げ、および細胞の感染を停止させることもできる。Ｅｓｓｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：４３６０−７１，１９９９．Ｄｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４（１０）：４５６２−９  ２０００。ＣＶ−Ｎのこれらの優れた特性は、極端に高い親和性でもって、ｇｐ１２０上の高−マンノースオリゴ糖に結合するその能力に帰される。具体的には、該阻害剤は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ９）上のＭａｎα１，２−Ｍａｎ構造、およびＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ８）のＤ１Ｄ３異性体を認識するが、Ｍａｎ７、Ｍａｎ６、およびＭａｎ５を含めた高マンノースの他の形態を認識しない。Ｂｅｗｌｅｙら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２３（１７）：３８９２−９０２．２００１；Ｓａｎｄｓｔｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３（４４）：１３９２６−１３９３１  ２００４。ＨＩＶ感染を阻害するＣＶ−Ｎのこの能力は、これらの末端グリカン構造に結合することができるそのような分子の潜在能力の証拠を提供する。
【００１２】
樹状細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮと、ｇｐ１２０上の高−マンノースグリカンとの相互作用を介して感染を増強させることが示されている。最近、ＤＣは、身体中のＨＩＶによって標的とされる最初の細胞型であることが判明した。粘膜におけるＤＣは、ＨＩＶを捕獲し、内部化し、遠くのリンパ節へ輸送し、そこで、それは無傷ウイルスをＣＤ４＋Ｔ−リンパ球に送達する。Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、Ｃｅｌｌ．１００：５８７−９７，２０００。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＳＨＩＶの全てのテストされた株はＤＣに結合し、ＤＣ−ＳＩＧＮはこのプロセスにおいて重要な役割を演じることが見出された。Ｐｏｈｌｍａｎｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５（１０）：４６６４−７２，２００１。ＨＩＶおよびＤＣ−ＳＩＧＮの間の相互作用は、ｇｐ１２０上の高−マンノースグリカンによって媒介される。Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、Ｃｅｌｌ．１００：５８７−９７，２０００。事実、合成高マンノースオリゴ糖は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合し、引き続いてのＨＩＶ相互作用を妨げることができる。Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９４（５５４９）：２１６３−６，２００１。
【００１３】
ＨＩＶ−１のｇｐ１２０蛋白質は重くグリコシル化されており、平均して２５のＮ−結合グリコシル化部位を含有する。それらのほぼ半分は、高マンノース型またはハイブリッド型グリカンによって占められ、（Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６５（１８）：１０３７３−８２，１９９０）、高マンノースグリカンは異なる結合部位を介して２Ｇ１２、ＣＶ−Ｎ、およびＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用する。ＭＡｂ  ２Ｇ１２は、少なくとも３つのＭａｎ９またはＭａｎ８残基からのＤ１アームのクラスターに結合し、ＣＶ−Ｎは高い親和性でもって、単一のＭａｎ９およびＭａｎ８残基からのＤ１およびＤ３アームに結合し、ＤＣ−ＳＩＧＮはそのテトラマーを介して数個のマンノース残基に結合する。
【００１４】
一緒にすると、これらの結果は、高マンノースグリカン上で見出されたＭａｎα１，２−Ｍａｎ構造に対する高度に特異的な中和抗体でＨＩＶに感染の初期段階を阻害する強い可能性を示す。主な挑戦は、末端α１，２−結合マンノース構造を持つ厳格に高いマンノースを含有し、ｇｐ１２０に対して交差反応できるこのエピトープに対する免疫原性応答を誘導する抗原を開発することである。
【００１５】
２つのアプローチが、糖ペプチド−ベースのＨＩＶワクチンを確立するための均一ＨＩＶ−１糖ペプチドを構築するためにとられた。非特許文献１。これらのアプローチは、ハイブリッド−型または高マンノース−型Ｎ−グリカンいずれかを運ぶＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖ペプチドの全くの化学的合成、および種々のＨＩＶ−１糖ペプチドを構築するための化学酵素アプローチである。非特許文献２；およびＧｅｎｇら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：２５６２−２５６５，２００４：Ｓｉｎｇｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１３：３２７−３３０，２００３；Ｗａｎｇら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．６：１０６８−１０７４（２００５）；Ｚｅｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：９６９２−９６９３，２００５；Ｌｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７０：９９９０−９９９６，２００５参照。しかしながら、これらの合成糖ペプチドは、動物モデルにおいてその免疫原性についてさらに評価される必要がある。
【非特許文献１】Ｗａｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９（２）：１９４−２０６，２００６
【非特許文献２】Ｍａｎｄａｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：２５５７−２５６１，２００４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
ウイルス単離体の広域スペクトルに対する中和抗体を誘導することができる効果的なＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ流行病を制御するための最良の希望である。あいにく、Ｅｎｖ糖蛋白質の貧弱な免疫原性、ウイルス抗原多様性および免疫回避を含めた、主な障害が、そのようなワクチンの開発を継続的に妨げている。これらの挑戦に対する応答において、本明細書中で提供される組成物は、ＨＩＶの宿主細胞への進入に対して臨界的な多数の複合糖質エピトープを備えた区別される組換え抗原を提供する。増大された数の炭水化物エピトープは、中和抗体を誘導するためのワクチン組成物におけるこれらのエピトープの免疫原性およびその相対的能力を最大化させる。
【００１７】
例えば、本明細書中で提供されるｇｐ１２０は、末端α１−２グリカンを持つ実質的に均一なマンノースオリゴ糖、例えば、マンノース−９−Ｎ−アセチルグルコサミン−２（「Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２」）またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃを発現する。高マンノースｇｐ１２０組成物を作成し、効果的な抗−ＨＩＶ中和抗体応答を誘導するための得られた組成物の使用方法も本明細書中で記載される。
【００１８】
従って、本明細書中において、実質的に均一にグリコシル化された組換え蛋白質が提供され、ここで、末端グリカンは末端α１−２グリカン構造である。該組換え蛋白質は、該蛋白質をコードするヌクレオチド配列でのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ変種の形質転換、形質転換された細胞の発酵、および細胞または培養上清からの蛋白質の単離によって得ることができる。いくつかの実施形態において、該蛋白質はビルレンス因子である。該蛋白質はウイルス蛋白質であり得る。特別な実施形態において、該ウイルス蛋白質は表面蛋白質である。１つの実施形態において、該蛋白質はヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０である。該末端グリカンはマンノースであり得る。いくつかの実施形態において、該グリカンはオリゴマンノースである。いくつかの実施形態において、該末端α１−２構造はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せの上にある。
【００１９】
さらに、本明細書中において、ａ）当該蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを共し；ｂ）蛋白質グリコシル化における欠陥で細胞を形質転換し；ｃ）形質転換された細胞を発酵し；次いで、ｄ）細胞上清から分泌された組換え蛋白質を精製することを含む、不均一にグリコシル化された組換え蛋白質を調製する方法が提供され、ここで、末端グリカンは末端α１−２グリカン構造である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、その天然状態においてはグリコシル化されている蛋白質をコードする。ヌクレオチド配列はビルレンス因子である蛋白質をコードすることができる。特別な実施形態において、ヌクレオチド配列はｇｐ１２０蛋白質をコードする。いくつかの実施形態において、細胞は大いにＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を持つｇｐ１２０蛋白質を発現する。本発明の方法の細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｍｎｓ１ΔまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐｍｒ  １Δのような酵母細胞であり得る。ベクターはＹＥｐＬであり得るが、いくつかの実施形態においては、ＧＡＬ１プロモーターを含むことができる。いくつかの実施形態において、糖蛋白質はＨｉｓタグを用いて精製される。
【００２０】
また、本明細書中において、末端α１−２グリカン構造を含む蛋白質に特異的に結合する抗体を調製する方法が提供され、該方法は、本明細書中に開示された方法または蛋白質によって作製された組換え蛋白質を含む有効量の組成物で動物を免疫化することを含む。該組成物は、さらに、アジュバント、担体または双方をさらに含むことができる。
【００２１】
本明細書中において、本明細書中に開示された方法によって生じた単離された抗体、ならびに単離された抗体を生産するハイブリドーマが提供される。
【００２２】
また、本明細書中において、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖を含む単離されたグリコシル化ポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物が提供され、ここで、グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものは高−マンノースオリゴ糖であり、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せである。
【００２３】
さらに、本明細書中において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチド、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識され、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを有する蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物が提供される。
【００２４】
さらに、本明細書中において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチド、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識され、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを有する蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物が提供される。
【００２５】
さらに、本明細書中において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチド、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識され、および医薬上許容される賦形剤を含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを有する蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物が提供される。
【００２６】
さらに、本明細書中において、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物を調製する方法が提供され、該方法はａ）突然変異体真菌を発酵させ、ここで、該突然変異体真菌はグリコシル化ポリペプチドを生産するように突然変異されており、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖、および医薬上許容される賦形剤を含み、ここで、グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものが高−マンノースオリゴ糖であり、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せであり；次いで、ｂ）突然変異体真菌細胞溶解物または上清からグリコシル化ポリペプチドを精製することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、医薬上許容される賦形剤でグリコシル化ポリペプチドを処方する工程を含む。いくつかの実施形態において、突然変異体真菌は破壊されたｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または破壊されたｏｃｈ１遺伝子を有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである。
【００２７】
さらに、本明細書中において、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物を調製する方法であり、該方法は：ａ）突然変異体真菌を発酵し、ここで、該突然変異体真菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有し；次いで、ｂ）突然変異体真菌細胞から、抗体２Ｇ１２によって認識されるグリコシル化ポリペプチドを単離することを含む。該方法は、さらに、医薬上許容される賦形剤で、単離されたグリコシル化ポリペプチドを処方する工程を含むことができる。いくつかの実施形態において、突然変異体真菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓであり、ここで、ｐｍｒ１遺伝子は破壊されている。いくつかの実施形態において、突然変異体真菌は、工程ａ）前にグリコシル化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されている。いくつかの実施形態において、グリコシル化ポリペプチドはＨＩＶ  ｇｐ１２０、またはその断片である。
【００２８】
さらに、本明細書中において、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物を調製する方法が提供され、該方法は：ａ）突然変異体真菌を発酵させ、ここで、該突然変異体真菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有し；次いで、ｂ）突然変異体真菌の細胞から抗体２Ｇ１２によって認識されるグリコシル化ポリペプチドを単離することを含む。該方法は、さらに、医薬上許容される賦形剤で単離されたグリコシル化ポリペプチドを処方する工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、ここで、ｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子は破壊されている。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌は、工程ａ）の前に、グリコシル化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されている。いくつかの実施形態において、グリコシル化ポリペプチドはＨＩＶ  ｇｐ１２０またはその断片である。
【００２９】
さらに、本明細書中において、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を誘導するための組成物を調製する方法が提供され、該方法は：ａ）突然変異体真菌を発酵させ、ここで、該突然変異体真菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有し；次いで、ｂ）突然変異体真菌細胞から抗体２Ｇ１２によって認識されるグリコシル化ポリペプチドを単離することを含む。該方法は、さらに、医薬上許容される賦形剤でグリコシル化ポリペプチドを処方する工程を含んでもよい。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌は破壊されたｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌は、工程ａ）前にグリコシル化されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換されている。いくつかの実施形態において、グリコシル化されたポリペプチドはＨＩＶ  ｇｐ１２０またはその断片である。
【００３０】
さらに、本明細書中において、少なくとも２つのＮ−グリコシル化部位を含むｇｐ１２０をコードするヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドを含む突然変異体真菌細胞が提供され、ここで、該突然変異体酵母細胞は、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖を含むｇｐ１２０または該断片を生産することができ、ここで、該高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せである。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌は、破壊されたｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または破壊されたｏｃｈ１遺伝子を有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌は、破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。いくつかの実施形態において、該突然変異体真菌は、破壊されたｐｍｒ１遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００３１】
さらに、本明細書中において、突然変異体酵母の全細胞、および医薬上許容される賦形剤を含む組成物であり、ここで、該突然変異体酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、ｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、ｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する。
【００３２】
さらに、本明細書中において、有効量の本明細書中に記載された組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象において抗体２Ｇ１２によって認識されるエピトープを含む蛋白質に特異的な抗体を生じさせる方法が提供される。
【００３３】
さらに、本明細書中において、有効量の本明細書中に記載された組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象において（ＨＩＶのような）病原体に対する中和抗体を誘導する方法が提供される。
【００３４】
さらに、本明細書中において、本明細書中において提供された蛋白質、または本明細書中において提供される方法によって調製される蛋白質、および適当な賦形剤を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において病原体に対する中和抗体を誘導する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、アジュバントを投与することを含む。特別な実施形態において、病原体はＨＩＶである。
【００３５】
さらに、本明細書中において、有効量の本明細書中に記載された組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象において病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法が提供される。
【００３６】
さらに、本明細書中において、本明細書中で提供された蛋白質、または本明細書中に提供された方法によって調製された蛋白質、および適当な賦形剤を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、アジュバントを投与することを含む。特別な実施形態において、病原体はＨＩＶである。１つの実施形態において、該蛋白質はｇｐ１２０である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、さらに、異なるＨＩＶ株からの多数のｇｐ１２０蛋白質を含む。
【００３７】
さらに、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖および医薬上許容される賦形剤を含むグリコシル化ポリペプチドへの抗体の結合を検出することを含み、ここで、グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものが高−マンノースオリゴ糖であって、ここで、該高マンノースオリゴ糖がＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せであることを特徴とする、Ｎ−結合高−マンノースオリゴ糖に特異的に結合する抗体を同定する方法が提供される。
【００３８】
さらに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌で生産される糖蛋白質への抗体の結合を検出することを含み、ここに該糖蛋白質は抗体２Ｇ１２によって認識されることを特徴とする、Ｎ−結合高マンノースオリゴ糖に特異的に結合する抗体を同定する方法が提供される。
【００３９】
さらに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌で生産されるグリコシル化ポリペプチドへの抗体への結合を検出することを含み、ここで、該糖蛋白質が抗体２Ｇ１２によって認識されることを特徴とする、Ｎ−結合高マンノースオリゴ糖に特異的に結合する抗体を同定する方法が提供される。
【００４０】
さらに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌で生産されたグリコシル化ポリペプチドへの抗体の結合を検出することを含み、ここで、該糖蛋白質は抗体２Ｇ１２によって認識されることを特徴とする、Ｎ−結合高マンノースオリゴ糖に特異的に結合する抗体を同定する方法が提供される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、該抗体はＨＩＶによって感染される対象の血清中にある。いくつかの実施形態において、グリコシル化ポリペプチドは突然変異体酵母細胞溶解物中にある。
【００４２】
さらに、ａ）第一の細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤＲ５＋を発現する第二の細胞と接触させ、ここで、該第一の細胞は樹状細胞−特異的Ｃ型レクチン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）を発現し、ｂ）該第一および第二の細胞を感染性ウィルス粒子と共に培養し；ｃ）共培養を、請求項２０記載の方法によって調製された候補抗体と接触させ；次いで、ｄ）相対的感染性を決定することを含み、それにより、中和抗体は、感染性ウィルス粒子による第二の細胞の相対的感染性を低下させ、または無くするものであることを特徴とする、ＨＩＶ伝播につき中和モノクローナル抗体を同定する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
（発明を実施するための形態）
ＨＩＶ感染を阻害するＣＶ−Ｎおよび２Ｇ１２の能力は、Ｍａｎ９、Ｍａｎ８、または双方に対する中和抗体応答の誘導は、ＨＩＶ伝播に対する効果的な免疫性を供するであろうことを示唆する。しかしながら、今日、特異的グリコシル化プロフィールを持つｇｐ１２０抗原を供するための再現性がある方法はない。かくして、本明細書中で提供される組換え高マンノースｇｐ１２０組成物は、ＨＩＶ感染に対する保護的免疫性の優れたインデューサーを提供する。
【００４４】
開示の明瞭性のために、限定されるものではないが、本発明の詳細な記載を以下のサブセクションに分ける。
Ａ．定義
特に断りのない限り、本明細書中で用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。全ての特許、公開された特許出願および他の刊行物、ＧｅｎＢａｎｋからの配列、および本明細書中で言及する他のデータベースはここに引用してその全体を援用する。もしこのセクションに記載される定義が、ここに引用して援用する特許、公開された特許出願および他の刊行物、およびＧｅｎＢａｎｋからの配列、および他のデータベースに記載された定義と反対であるか、またはそうでなければ合致しないならば、本セクションに記載された定義が、引用して援用された定義よりも優先する。
【００４５】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な記載から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００４６】
本明細書中で用いる、「ある」は「少なくとも１」または「１以上」を意味する。
【００４７】
本明細書中で用いるように、用語「アジュバント」とは、免疫原性剤に加えられた場合に、混合物への曝露に際して受容者宿主における該剤への免疫応答を非特異的に高め、または増強させる物質をいう。アジュバントは、例えば、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム／リン酸塩）、リポソームおよびミクロ粒子を含むことができる。例示的なアジュバントは、限定されるものではないが、スクワレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ，ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラトキシンＢサブユニット、ポリホスファゼン、および誘導体、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、およびサイトカインを含む。例えば、Ｖｏｇｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ＩＮ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ６９−７９（Ｐｌｏｔｋｉｎら、ｅｄｓ．，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ（２００４））参照。動物用途のため、および動物における抗体の生産のために、フロイントアジュバント（完全および不完全双方）のマイトジェン成分を用いることもできる。
【００４８】
本明細書中で用いるように、「ＡＩＤＳ」とはＨＩＶ感染の兆候的相をいい、後天性免疫不全症候群（通常ＡＩＤＳとして知られている）およびＡＩＤＳ−関連合併症（「ＡＲＣ」）を共に含む。例えば、Ｋｉｌｂｙら、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＩＮ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＡＩＤＳ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ  ４９−５８（Ｍｅｒｒｉｇａｎら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．１９９９）参照。ＡＩＤＳの免疫学的および臨床的発現は当該分野でよく知られており、例えば、免疫不全に由来する日和見感染および癌を含む。
【００４９】
本明細書中で用いるように、用語「抗体」とは、抗原またはエピトープに特異的に結合することができる、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン複数遺伝子、またはその断片に由来する、それをモデル化した、または実質的にそれによってコードされたペプチドまたはポリペプチドのいずれの形態もいう。例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３））；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，最新版）；ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）参照。抗体断片の例は抗原―結合を保持するものであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびＦｖ断片；ダイアボディー；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃＦｖおよびＶＨＨ；ミニボディー；ナノボディー；および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。典型的には、結合断片または誘導体はその結合活性の少なくとも５０％を保持する。好ましくは、結合断片または誘導体はその生物学的活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％を保持する。抗体またはその抗原−結合断片は、その結合および／または生物学的活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を含むことができる。かくして、用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル、多特異的（例えば、二特異的）、ヘテロコンジュゲート、キメラ、ヒト化、ヒト、ネズミ、および合成抗体、ならびに所望の抗原に特異的に結合し、所望の結合および／または生物学的活性を呈する抗体断片をカバーする。
【００５０】
用語「抗原」とは、抗体によって特異的に認識され、結合されるいずれの分子もいう。生物内での特異的抗体の生産によって証明されるように、生物において免疫応答を誘導する抗原を「免疫原」という。抗体によって結合される抗原または免疫原の特異的部分は「結合エピトープ」または「エピトープ」といわれる。抗体は、それが抗原に選択的に結合し、それにより、それを他の抗原から区別する場合、特定の抗原に対して特異的である。好ましくは、抗体は無関係な抗原への有意な結合を欠如する。
【００５１】
本明細書中で用いるように、用語「発現カセット」とは、当該配列に適合する宿主において構造遺伝子（すなわち、本明細書中で提供される抗体のような蛋白質コーディング配列）の発現に影響し得るヌクレオチド配列をいう。発現カセットは、ポリペプチドコーディング配列に；および、所望により、他の配列、例えば、転写終止シグナルと操作可能に連結された少なくともプロモーターを含む。本明細書中で用いるように、用語「プロモーター」は、細胞、例えば、哺乳動物または植物細胞においてコーディング配列の転写を駆動できる全ての配列を含む。かくして、本発明の構築体で用いられるプロモーターは、遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度を調節し、または変調するのに関与するシス−作用転写制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、プロモーターは、転写調節に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、イントロン配列を含めたシス−作用性転写制御エレメントであり得る。プロモーターは構成的または誘導性であり得る。発現を行うのに必要な、またはそれの助けとなるさらなる因子、例えば、エンハンサーも用いることができる。プロモーターは、もしそれが適当な宿主細胞または他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激し、またはそれを変調するならば、本発明の核酸のようなコーディング配列に操作可能に連結されている。一般には、転写された配列に操作可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写された配列に対して物理的に連続しており、すなわち、それらはシス−作用性である。しかしながら、いくつかの転写調節配列、例えば、エンハンサーは物理的に連続していたり、またはその転写をそれらが高めるコーディング配列に近接して位置する必要はない。発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウィルス、組換えの「裸のＤＮＡ」ベクターのいずれかの形態なども含む。
【００５２】
用語「単離された」は、その元の環境、例えば、もしそれが天然に生じるならば天然環境から取り出された物質を含む。例えば、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離されたものである。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではない点で依然として単離されている。
【００５３】
フレーズ「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの断片、本発明の抗体、またはその生物学的に活性な断片の抗体をコードする一本鎖または二本鎖であってよいゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を含む。該用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを含む。該用語は合成骨格を持つ核酸様構造も含む。例えば、Ｍａｔａ，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−９７（１９９７）；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−９８（１９９７）；およびＳａｍｓｔａｇ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ６：１５３−５６（１９９６）参照。
【００５４】
「組換え」ポリペプチドまたは蛋白質は、例えば、所望のポリペプチドまたは蛋白質をコードする外因性ＤＮＡ構築体によって形質転換された細胞から生産された、組換えＤＮＡ技術によって生産されたポリペプチドまたは蛋白質をいう。例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｅｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，最新版）参照。
【００５５】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーをいうのに本明細書中においては相互交換的に用いる。ポリマーは線状または分岐状であってよく、それは修飾されたアミノ酸を含んでもよく、それは非−アミノ酸によって中断されていてもよい。該用語は、天然で、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは標識成分とのコンジュゲーションのようないずれかの他の操作または修飾によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。また、例えば、（例えば、非天然アミノ酸などを含めた）アミノ酸の１以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の修飾も該定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づく故に、該ポリペプチドは一本鎖または会合した鎖として起こり得ると理解される。
【００５６】
用語「ホモログ」は、共通した起源、およびもう１つの種からの遺伝子と同一の機能を有する１つの種からの遺伝子、または遺伝子の産物をいうのに用いられる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子の真菌ホモログ遺伝子とは、共通の起源を有し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子と同一の機能を有する蛋白質をコードする真菌遺伝子をいう。
【００５７】
「ベクター」は、細胞に感染し、それをトランスフェクトし、それを一過的にまたは永久的に形質導入できる核酸を含む。ベクターは裸の核酸、または蛋白質または脂質と複合体化した核酸であり得ることは認識されるであろう。ベクターは、所望により、ウィルスまたは細菌核酸および／または蛋白質および／または膜（例えば、細胞膜、ウィルス脂質エンベロープなど）を含んでもよい。
【００５８】
本明細書中で用いるように、用語「相乗化」とは、第二の剤の抗−病原または中和効果を増大させる１つの剤の能力をいう。相乗効果は、かくして、限定されるものではないが、剤が別々に用いられる場合に観察されない、２つの剤を一緒に用いる増大した生物学的効果（例えば、より優れたまたはより長い継続）、より効果的な生物学的効果、例えば、単一の剤の投与で達成できない多数のタイプの毒性の排除、または単一の剤で観察される生物学的効果を達成するのに投与で必要な剤の量の低下を含む。
【００５９】
用語「病原体」とは、望まない兆候または病気状態を誘導し、または誘発するいずれの生物もいう。病原体は細菌、ウイルス、または真菌であってよい。
【００６０】
本明細書中で使用するように、用語「対象」は、ヒト、ならびに例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、げっ歯類等のような他の動物種を含む。病原体または病気を有する対象は本発明の抗体によって標的とされることは当業者に理解されるであろう。
【００６１】
本明細書中で用いるように、用語「軽減する、治療する、または予防する」は、感染または他の障害に伴う１以上の兆候の遅延、発生するであろう、または発生すると予測されるそのような兆候の重症度の低下、またはそのような兆候の完全な排除を含む。これらの用語は、さらに、現存する病原体−関連兆候の軽減、病気の持続の低下、さらなる兆候の予防、ひどい続発症の軽減または予防、死亡の予防、または逆行、および病原体の伝播の低下または予防を含む。かくして、該用語は、有益な結果が、病原体を持つ、またはそのような病原体への暴露の可能性を持つ対象に付与されてきたことを示す。特に、軽減、治療または予防は、例えば、ＨＩＶに暴露された個体の初期感染の予防；ＨＩＶに感染した個体におけるウイルス負荷の低下；ＨＩＶ感染の無症候相の延長；ＡＩＤＳを持つ個体における総じての健康または生活の質の向上；およびＡＩＤＳを持つ個体の余命の延長を含む。臨床医は、免疫化の効果を、処置に先立って患者の状態と、または未処置患者の予測される状態と比較して、処置がＡＩＤＳを阻害するのに効果的か否かを判断することができる。
【００６２】
本明細書中で用いるように、「有効量」は、病原体の伝播、患者の身体内または上でのビルレンス因子の作用に関連する他の兆候を部分的にまたは全体的に阻害し、または予防するのに、あるいはそのような兆候のさらなる進行を予防し、または低下させるのに十分な量である。有効成分単独を投与された個体に適用される場合、有効な用量とは、その成分単独で必要な用量をいう。活性剤の組合せに適用される場合、有効な用量とは、組み合わせて、系列的に、または同時に投与されたかを問わず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量をいう。用語「治療的に有効な量」および「有効量」は相互交換可能に使用される。
【００６３】
本明細書中で用いるように、用語「生物活性剤」とは、所望の生物学的効果を増強し、または媒介して、特定の生物の感染性または病原性を低下させ、またはそれを無くするいずれの合成または天然に生じる化合物もいう。生物活性剤は、例えば、化学療法薬物、殺生物薬物、抗ウイルス薬物、トキシン、サイトカイン、リガンド、抗体、またはそのいくつかの組合せのような薬剤を含む。
【００６４】
本明細書中で用いるように、「生産的相互作用を予防する」は、抗体またはその生物学的に活性な断片無くして起こるであろう量と比較して、相互作用の量は低下することを意味する。相互作用は、限定されるものではないが、ビルレンス因子上の相互作用領域のマスキングまたは改変、およびビルレンス因子の発現、凝集、立体配座、または会合状態の改変を含めたいずれかの手段によって低下させ、または予防することができる。
【００６５】
本明細書中で用いるように、用語「治療する」とは、病気または障害の回復、治癒、軽減、救済、改変、治療、軽減、改善または影響を目的として、病気または障害、病気または障害の兆候、または病気または障害に向けての素因を有する、対象への治療剤の適用または投与、またはそのような対象からの単離された組織または細胞系への治療剤の適用または投与をいう。
Ｂ．組成物
本明細書中において、均一にグリコシル化された組換え蛋白質が提供され、ここで、末端糖は末端α１−２−マンノース構造である。組換え蛋白質は、蛋白質をコードするヌクレオチド配列でのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ変種の形質転換、形質転換された細胞の発酵、および細胞または培養上清からの蛋白質の単離によって得ることができる。いくつかの実施形態において、該蛋白質はビルレンス因子である。該蛋白質はウイルス蛋白質であり得る。特別な実施形態において、ウイルス蛋白質は表面蛋白質である。１つの実施形態において、該蛋白質はヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０である。いくつかの実施形態において、該グリカンはオリゴマンノースである。１つの実施形態において、末端α１−２−マンノース構造はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２上にある。
【００６６】
いずれの適当なビルレンス因子も本明細書中に開示された組成物で使用することができる。ビルレンス因子は、適当な条件下で宿主において病気を引き起こす微生物の能力を媒介する、またはそれに参画するいずれかの糖蛋白質である。例えば、ビルレンス因子は接着因子、被覆蛋白質、浸入因子、カプセル、エキソトキシン、またはエンドトキシンであり得る。糖蛋白質ビルレンス因子を発現する例示的な生物は、限定されるものではないが、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、エボラウイルス、グラム陰性細菌（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｓ）を含む。
【００６７】
蛋白質ビルレンス因子のグリコシル化はＮ−結合またはＯ−結合することができる。グリカンは、グリコシド結合によって相互に連結された約５を超える単糖残基よりなる多糖である。代表的なグリカンはマンノースを含む。蛋白質ビルレンス因子の実質的に均一なグリコシル化とは、単一のグリコ形態での７０％、８０％、９０％または１００％を超えるグリコシル化をいう。
【００６８】
１つの態様において、本明細書中に提供される組成物は、末端α１−２−Ｍａｎ構造を有する、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはそのいくつかの組合せで実質的に均一にグリコシル化されたｇｐ１２０である。本明細書中で用いるように、用語「実質的に均一に」とは、ｇｐ１２０上のグリカンの７０％を超えるものがＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはそのいくつかの組合せであることをいう。特別な実施形態において、本明細書中で提供されるグリコシル化ｇｐ１２０組成物は、９０％を超えるＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、好ましくは１００％のＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を有する。用語「高マンノース」とは、他の種類の末端糖のない５〜９のマンノース残基のグリカンをいう。例えば、図１参照。哺乳動物細胞表面および血清糖蛋白質は、稀に、末端マンノース残基を含有する。例えば、Ｗｅｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１６３：１９−３４（１９９８）参照。哺乳動物糖蛋白質は、少数のＭａｎ５またはＭａｎ６を持つ最も複雑なタイプのオリゴ糖を含有し、他方、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０蛋白質は非常に多数のＭａｎ７−９を含有し、ＨＩＶ−１ウイルス上の高マンノース、およびヒト糖蛋白質が量および質において有意に異なることを示す。例えば、Ｓｃａｎｌａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７６：７３０６−２１（２００２）；Ｃｕｔａｌｏら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１５：１５４５−５５（２０００）参照。
【００６９】
また、本明細書中において、抗体２Ｇ１２によって認識される少なくとも２つのＮ−結合高マンノースオリゴ糖を含む単離されたグリコシル化ポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤を含む組成物が提供され、ここで、グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合グリカンの５０％を超えるものが高−マンノースオリゴ糖であり、高−マンノースオリゴ糖はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せである。
【００７０】
さらに、本明細書中において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識される。
【００７１】
さらに、本明細書中において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識される。
【００７２】
さらに、本明細書中において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１、ｍｎｎ１、および／またはｍｎｎ４遺伝子の破壊されたいずれかの組合せ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｏｃｈ１、ｍｎｎ１、および／またはｍｎｎ４遺伝子のホモログ遺伝子の破壊されたいずれかの組合せを有する突然変異体真菌から単離されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物が提供され、ここで、該グリコシル化ポリペプチドは抗体２Ｇ１２によって認識される。
【００７３】
グリコシル化ポリペプチドは少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のＮ−結合高−マンノースオリゴ糖を含むことができる。グリコシル化ポリペプチドは（酵母のような）真菌、または非−真菌糖蛋白質またはその断片であってよい。例えば、グリコシル化ポリペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８、またはＹＪＬ１７１ｃ、またはこれらの蛋白質のいずれかのホモログである。グリコシル化ポリペプチドはビルレンス因子であってよい。いくつかの実施形態において、グリコシル化ポリペプチドはウイルス蛋白質またはその断片である。いくつかの実施形態において、グリコシル化ポリペプチドはＨＩＶ  ｇｐ１２０またはその断片である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、グリコペプチド上のＮ−結合グリカンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、またはその組合せである。
【００７５】
本発明の組成物は、Ｗａｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９（２）：１９４−２０６，２００６；Ｍａｎｄａｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：２５５７−２５６１，２００４；Ｇｅｎｇら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：２５６２−２５６５，２００４；Ｓｉｎｇｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１３：３２７−３３０，２００３；Ｗａｎｇら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．６：１０６８−１０７４（２００５）；Ｚｅｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：９６９２−９６９３，２００５；およびＬｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７０：９９９０−９９９６，２００５に記載されたグリコシル化ポリペプチドのいずれも排除する。
【００７６】
さらに、本明細書中において、突然変異体酵母の全細胞、および医薬上許容される賦形剤を含む組成物が提供され、ここで、該突然変異体酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、ｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、ｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、またはｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子の破壊されたホモログ遺伝子を有する。酵母全細胞は生きていてもまたは死んでいてもよい。該組成物は治療または予防ワクチン（例えば、ＨＩＶ用ワクチン）で用いることができる。
【００７７】
本明細書中に記載される組成物は医薬上許容される賦形剤を含む。凍結乾燥された処方または水性溶液の形態の、いずれの医薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ．）も用いることができる。許容される担体、賦形剤または安定化剤は用量および濃度において受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩−形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−蛋白質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非−イオン性界面活性剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬上許容される賦形剤はアジュバントである。アジュバントを含む組成物はワクチンとして用いることができる。
【００７８】
さらに、本明細書中において、ａ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを供し；ｂ）蛋白質グリコシル化における欠点で細胞を形質転換し；ｃ）形質転換された細胞を発酵し；次いで、ｄ）細胞上清から分泌された組換え蛋白質を精製することを含む、均一にグリコシル化された組換え蛋白質を調製する方法が提供され、ここで、末端グリカンは末端α１−２−Ｍａｎ構造である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、その天然状態においてグリコシル化される蛋白質をコードする。該ヌクレオチド配列はビルレンス因子である蛋白質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、突然変異した細胞は、大いにＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を持つ糖蛋白質を発現する。特別な実施形態において、ヌクレオチド配列はｇｐ１２０蛋白質をコードする。いくつかの実施形態において、細胞は大いにＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を持つｇｐ１２０蛋白質を発現する。本発明の方法の細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｍｎｓ１ΔまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐｍｒ１Δのような酵母細胞であり得る。ベクターはＹＥｐＬとすることができ、いくつかの実施形態においては、ＧＡＬ１プロモーターを含むことができる。いくつかの実施形態において、糖蛋白質はＨｉｓタグを用いて精製される。
【００７９】
さらに、本明細書中において、突然変異体真菌を発酵させ、ここで、該突然変異体真菌はグリコシル化ポリペプチドを生産するように突然変異されており；該グリコシル化ポリペプチドを単離または精製し；次いで、該ポリペプチドを医薬上許容される賦形剤と組み合わせて、組成物を形成することによって、本明細書中に記載された組成物のいずれかを調製する方法が提供される。全酵母細胞を含む組成物は、突然変異体酵母を発酵させ；医薬上許容される賦形剤と共に全酵母細胞を調製して、組成物を形成することによって調製することができる。
【００８０】
いずれの適当な細胞も使用することができる。好ましくは、細胞は、グリカンを切形またはそうでなければグリカンの典型的な細胞内プロセッシングを変調する欠陥を有する。いくつかの実施形態において、細胞は真菌細胞（例えば、酵母または黴細胞）である。特別な実施形態において、該細胞は酵母細胞である。例えば、米国特許第５，９１９，６５１号、第５，７０５，６１６号参照。分泌された酵母蛋白質の外側鎖グリコシル化は高（または長）マンノース型オリゴ糖鎖である。かくして、酵母生産は、時々「高グリコシル化」と示される、高マンノース型のこの酵母−特異的外側鎖グリコシル化を持つ異種蛋白質を提供する。簡単に述べれば、酵母蛋白質のＯ−グリコシド炭水化物構造は、１〜５のマンノース残基の未分岐マンノース鎖よりなる。Ｏ−グリコシル化はＥＲ（第一のマンノース残基の移動）で始まり、ゴルジ装置で完了する。Ｎ−グリコシル化はＮ−アセチルグルコサミンのコアユニットで始まり、マンノースおよびグルコースは、引き続いて、小胞体において蛋白質のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に移動される脂質担体中間体で形成される。次いで、蛋白質−結合コアユニットは特異的グルコースおよびマンノース残基で切断され、続いて、ゴルジ装置において多糖が延長され、その結果、「外側鎖」グリコシル化をもたらす。
【００８１】
多数の酵母株を使用して、本明細書中で提供される組成物を生産することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞が典型的には用いられるが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのそれもまた異種蛋白質の生産のために商業的に入手可能である。例えば、Ｔｕｉｔｅら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  ６１−１００（Ｈｉｇｇｉｎｓら、ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４２１−４４０（１９９０）；Ｂａｒｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ５：９０−１０１（１９８７）；Ｌｉｕら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５９２−９４（１９９８）参照。Ｍｎｓ１ｐまたはＰｍｒ１ｐにおいて欠陥を持つ酵母株が有用である。Ｍｓｎ１ｐはＥＲに局所化されるａ１，２マンノシダーゼであり、ＥＲにおいて、それは、α１，２−結合マンノースの中央アームを除去することによってＭａｎ９をＭａｎ８の単一異性体にトリミングする。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｍｎｓ１ｐ突然変異体株Ｍｎｓ１ΔはＭａｎ９のみでグリコシル化された蛋白質を生産する。蛋白質Ｐｍｒ１ｐは、Ｃａ＋＋のＥＲからゴルジへの輸送について重要であるカルシウム−依存性ＡＴＰａｓｅである。Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４２６：２７５−８５（１９９９）；Ｃａｍｉｒａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５１２０−２７（１９９１）参照。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐｍｒ１ｐ突然変異体株ｐｍｒ１Δは、ＥＲにおいてマンノシダーゼＩによってＭａｎ９からトリミングされたＭａｎ８のみからなる糖蛋白質を分泌する。例えば、Ｈａｒｍｓｅｎら、Ｇｅｎｅ  １２５：１１５−２３（１９９３）参照。しかしながら、Ｎ−グリコシル化における適当な欠陥を持ついずれの酵母株を使用して本明細書中に提供される組成物を生産することができる。例えば、米国特許第５，７０５，６１６号、第５，７９８，２２６号参照。
【００８２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの破壊されたｐｍｒ１遺伝子、破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１遺伝子、破壊されたｏｃｈ１遺伝子、ｍｎｎ１、ｍｎｓ１、およびｍｎｎ４遺伝子の１以上と組み合わせた破壊されたｏｃｈ１遺伝子、破壊されたｏｃｈ１およびｍｎｎ１遺伝子、または破壊されたｏｃｈ１、ｍｎｎ１、およびｍｎｎ４遺伝子を持つ酵母株、または破壊されたホモログ遺伝子を持つ他の酵母株を用いて、グリコシル化ポリペプチド、全酵母細胞組成物を生産することができる。
【００８３】
突然変異体真菌細胞を生じさせる方法は当該分野で知られている。本発明の実施例は、数個の突然変異体酵母細胞の生成の詳細を提供する。例えば、Ｃｈｉｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−２６３０４，１９９８；Ｒｕｄｏｌｐｈら、Ｃｅｌｌ  ５８：１３３−１４５，１９８９；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６３３８−２６３４５，１９９３参照。
【００８４】
いずれの適当なベクターを使用しても、突然変異体細胞をトランスフェクトして、組換えグリコシル化ポリペプチドを生産することもできる。酵母細胞は、典型的には、プラスミド−ベースのベクターを使用する。ベクターは自立マルチコピープラスミド（例えば、ＹＥｐまたはＹＲｐ）、自立単一コピープラスミド（例えば、ＹＣｐ）、または組込み（通常、単一コピー）プラスミド（例えば、ＹＩｐ）であり得る。例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｕｎｉｔ  １３．４）ＩＮ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｅｂｅｌら、ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，最新版）参照。１つの実施形態において、ベクターはＹＥｐＬまたはｐＹＥＳ２−ＣＴである。形質転換細胞における異種蛋白質生産をもたらす当該分野で公知のいずれのプロモーターも使用することができる。酵母細胞では、天然および作製されたプロモーターが入手可能である。そのようなプロモーターは、限定されるものではないが、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＥＦ１、ＧＡＬ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＴＲＰ１、ＰＡＬ、ＧＡＰ／ＧＡＬ、ＧＡＰ／ＡＤＨ２、ＣＹＣ１／ＧＲＥ、およびＰＧＫ／ＡＲＥを含む。１つの実施形態において、プロモーターはＧＡＬ１である。例えば、米国特許第５，１３９，９３６号参照。ベクターは、複製起点および異種ビルレンス因子、例えば、ｇｐ１２０の精製で有用な種々のタグ配列のようなさらなる配列を含むこともできる。
【００８５】
細胞をビルレンス因子−コーディングベクターで形質転換し、当該分野においてよく知られた方法を用いて発酵する。酵母では、細胞は、酢酸リチウム、スフェロプラスト形質転換、またはエレクトロポレーションを用いて形質転換し、続いて、標準的な発酵を行うことができる。例えば、Ｙｅａｓｔ（Ｕｎｉｔ１３）ＩＮ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｅｂｅｌら、ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，最新版）参照。
【００８６】
例示的なビルレンス因子は、限定されるものではないが、ｇｐ１２０、エボラウイルスエンベロープ蛋白質、または他のグリコシル化ウイルスエンベロープ蛋白質またはウイルス蛋白質を含む。例えば、米国特許第６，６３０，１４４号、第６，７１３，０６９号参照。
【００８７】
１つの態様において、いずれかの適当なｇｐ１２０ヌクレオチド配列を本明細書中で提供された組成物で使用することができる。ｇｐ１２０分子はＮ−結合グリコシル化によってかなり修飾され、それにより、その見掛けの分子量を１２０ｋＤを増大させる６０ｋＤのポリペプチドコアよりなる。例えば、Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１９９−２０９（２００４）参照。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５つの超可変ドメインが散在する５つの比較的保存されたドメインを含有する。ｇｐ１２０一次配列における１８のシステイン残基の位置、およびｇｐ１２０配列中のほぼ２４のＮ−結合グリコシル化部位の１３の位置は全てのｇｐ１２０配列に共通している。Ｍｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５７０−７８（１９８７）参照。超可変ドメインは、かなりのアミノ酸置換、挿入および欠失を含有する。これらのドメインにおける配列変種の結果、種々のウイルス単離体からのｇｐ１２０分子の間での３０％の総じての配列変位をもたらす。例えば、Ｇａｓｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４−６０（２０００）参照。それにもかかわらず、ｇｐ１２０配列は、ウイルス受容体ＣＤ４およびＤＣ−ＳＩＧＮに結合するウイルスの能力を維持する。例示的な配列は、限定されるものではないが、Ｒａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：２２７（１９８５）；Ｍｕｅｓｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４５０−５８（１９８５）；ＭｃＣｕｔｃｈａｎら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８：１８８７−９５（１９９２）；Ｇｕｒｇｏら、Ｖｉｒｏｌ．１６４：５３１−３６（１９８８）；およびｔｈｅ  ＨＩＶ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ  １９８７−ＰＲＥＳＥＮＴ（Ｍｙｅｒｓら、ｅｄｓ．，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ）に開示されたものを含む。新しく単離された株からの配列を用いることもできる。例えば、Ｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１１６５−７１（１９９２）；Ｚｈａｎｇら、ＡＩＤＳ  ５：６７５−８１（１９９１）；およびＷｏｌｉｎｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：１１３４−３７（１９９２）参照。
【００８８】
いずれの適当な精製およびグリコシル化分析方法も、本明細書中で提供された（均一にグリコシル化されたような）グリコシル化ポリペプチドで使用することができる。例えば、組換えｇｐ１２０からの蛍光標識Ｎ−グリカンのＮＰ−ＨＰＬＣはＨＰＬＣでのエキソグリコシダーゼ消化を使用して、グリカンの種々の形態を同定する。例えば、Ｓｃａｌａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７３０６−２１（２００２）参照。別法として、発現レベルは、例えば、２Ｇ１２抗体のようなグリカン特異的抗体を用いるフローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロット分析を用いて決定することができる。他の例示的な方法はレクチン−ベースのアッセイ、ロケット親和性電気泳動、二次元電気泳動、フルオロフォア−援助炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）、毛細管電気泳動、核磁気共鳴、質量分析、質量分析と連結したガス−液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ／ＭＳ）、速原子衝撃（ＦＡＢ）、およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む。例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ＆ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＬＹＣＯＢＩＯＬＯＧＹ（ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ  ２００２）参照。
【００８９】
本明細書中で提供された（均一にグリコシル化された蛋白質のような）グリコシル化ポリペプチドは、病原体、例えば、ＨＩＶに対する中和抗体の存在を検出するためのアッセイで用いることもできる。そのようなアッセイにおいて、蛋白質は、通常、アッセイで用途を見出す種々の標識の１つで標識する。これらの標識は特許および技術文献でかなり報告されており、放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、粒子、小分子等を含む。
【００９０】
ビルレンス因子の野生型蛋白質血清型は使用する必要がない。というのは、関連結合特性、グリコシル化部位、および他の関連免疫学的特性が保持される限り、１以上のアミノ酸を付加し、欠失し、または置換することができるからである。かくして、アミノ酸の少なくとも９０％、通常少なくとも９５％、より通常には少なくとも９９％は正しいアミノ酸であり、正しい配列中にある。通常、いずれの変化も、０〜５のアミノ酸が異なってもよいＮ−末端にある。
【００９１】
１つの実施形態において、本明細書中で提供される均一にグリコシル化されたｇｐ１２０は、一次ＨＩＶ−１単離体を中和することができる高度に中和性の抗体を誘導する立体配座エピトープを提示する。いくつかの実施形態において、好ましい蛋白質は、２以上の異なるクレード（例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの２以上）における一次単離体を中和する抗体を誘導することができる。中和は本明細書中に開示されたように決定される。
【００９２】
本発明は、本明細書中に記載された組成物のいずれか、例えば、均一にグリコシル化された蛋白質を含むキットを提供する。該キットは、本明細書中に記載されたように、本発明の方法および産業的使用を教示する指示材料を含有することもできる。
【００９３】
具体的には、本明細書中には、１以上の容器、ここで、第一の容器は本発明の方法によって作成された１以上の抗体を含み、および以下の：洗浄試薬、組成物の投与で必要な、または組成物に特異的な抗体の存在を検出することができる試薬の１以上を含む１以上の他の容器を含む区画キットが提供される。該容器はガラス、プラスチックまたはプラスチックまたは紙のストリップであり得る。検出試薬のタイプは標識された二次抗体、他の標識された二次結合剤、あるいは別法として、もし一次抗体が標識されているならば、標識された抗体と反応できる酵素または抗体結合試薬を含む。そのような方法を実行するのを助けるための、またはそれを可能とする補助的材料を本明細書中に提供されたキット内に含めることができる。
Ｃ．グリコシル化ポリペプチドまたは全突然変異体酵母細胞を用いるワクチン
本明細書中において、有効量の本明細書中に記載された組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象において（ＨＩＶのような）病原体に対する抗体の中和を誘導する方法が提供される。
【００９４】
本明細書中において、ａ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを供し；ｂ）蛋白質グリコシル化における欠陥で細胞を形質転換し；ｃ）形質転換された細胞を発酵し；次いで、ｄ）本明細書中に開示された細胞上清から分泌された組換え蛋白質を精製することを含む、均一にグリコシル化された組換え蛋白質、ここで、末端グリカンは、末端α１−２グリカン構造、または均一にグリコシル化された組換え蛋白質を調製する方法によって調製された蛋白質であり、ここで、該グリカンは末端α１−２グリカン構造を持つオリゴマンノースであり、および適当な賦形剤を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において病原体に対する抗体の中和を誘導する方法が提供される。該方法は、さらに、アジュバントを投与することを含むことができる。１つの実施形態において、該病原体はＨＩＶである。特別な実施形態において、該均一にグリコシル化された組換え蛋白質はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２ｇｐ１２０またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ｇｐ１２０である。
【００９５】
また、本明細書中において、有効量の本明細書中に記載された組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象において（ＨＩＶ−誘導のような）病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法が提供される。
【００９６】
また、本明細書中において、ａ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを供し；ｂ）蛋白質グリコシル化における欠陥で細胞を形質転換し；ｃ）形質転換された細胞を発酵し；次いで、ｄ）本明細書中に開示された細胞上清から分泌された組換え蛋白質を精製することを含む、均一にグリコシル化された組換え蛋白質、ここで、末端グリカンは末端α１−２グリカン構造、または均一にグリコシル化された組換え蛋白質を調製する方法によって調製された蛋白質であり、ここで、該グリカンは末端α１−２グリカン構造を持つオリゴマンノースであり、および適当な賦形剤を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法が提供される。該方法は、さらに、アジュバントを投与することを含むことができる。１つの実施形態において、該病原体はＨＩＶである。特別な実施形態において、均一にグリコシル化された組換え蛋白質はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２ｇｐ１２０またはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ｇｐ１２０である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供された医薬組成物は、さらに、異なるＨＩＶ株からの多数のｇｐ１２０蛋白質を含む。
【００９８】
本発明のワクチン組成物は、限定されるものではないが、鼻腔内、経口、目、胃腸、直腸、膣、尿生殖器経路を含めた、粘膜の表面への適用によるような、臨床的に示されたいずれかの経路によって投与することができる。別法として、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内のような非経口投与形態を用いることもできる。いくつかの実施形態において、蛋白質は経皮または経粘膜投与される。
【００９９】
典型的には、ＨＩＶ感染に対するワクチン保護は、粘膜免疫応答、全身免疫応答、または双方を誘導する。投与のための有用な経路は、限定されるものではないが、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、経口、粘膜または鼻腔内投与を含めた非経口または非−非経口経路を含むことができる。
【０１００】
本発明によるワクチンは、当該分野で公知のいずれかの適当な方法に従って処方することができ、いずれかの適当なかつ適合する希釈剤、担体、保存剤、医薬賦形剤または他の成分を含有することができる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｇｅｎｎａｒｏ  ら（ｅｄｓ．），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０００参照。静脈内、腹腔内、筋肉内、経粘膜（例えば、鼻腔内、直腸、膣、口腔）、経皮、皮下投与あるいはいずれかの他の投与経路のための適当な医薬担体は当該分野で良く知られており、本発明で用いることが考えられる。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（ｅｄｓ．），ＶＡＣＣＩＮＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００３）；Ｐｏｗｅｌｌら（ｅｄｓ．），ＶＡＣＣＩＮＥ  ＤＥＳＩＧＮ：ＴＨＥ  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＡＮＤ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｐｌｏｔｋｉｎら（ｅｄｓ．）ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ２００４）；米国特許第４，２３５，８７７号；第４，３７２，９４５号；および第４，４７４，７５７号参照。アジュバントを含むことができる適当な処方は経験的に決定することができる。
【０１０１】
投与されるワクチンの量は、当業者によって判断されるように、使用される特別なワクチン抗原およびいずれかのアジュバント、投与の態様および頻度、受容者の年齢および体重、および所望の効果（例えば、予防および／または治療）に依存する。ワクチン用量中の蛋白質の量は、典型的なワクチンにおける有意な有害副作用なくして免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、いずれ特定の免疫原が用いられるかに依存して変化するであろう。一般には、各用量は１μｇおよび１００ｍｇの間の蛋白質、時々は、２〜２００μｇの間、および他の場合には４〜４０μｇの間を含むであろうと期待される。特定のワクチンのための最適な量は、抗体力価および対象における他の応答の観察を含む標準的な実験によって確認することができる。
【０１０２】
投与は、当業者によって必要であると判断されるように反復することができる。多くの場合、通常、６ワクチン接種を超えない、より通常には、４ワクチン接種を超えない、好ましくは１以上、通常約３ワクチン接種の複数投与を有するのが望ましいであろう。ワクチン接種は、通常、２〜１２週間の間隔、より通常には３〜５週間の間隔であり、１〜５年の間隔における任意の周期的ブースターを伴う。免疫化のコースに続いて、病原体に対する抗体、例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗体についてのアッセイを行うことができる。
【０１０３】
本発明の活性なワクチンが単独で、あるいは限定されるものではないが、関連するビルレンス因子、ウイルスの減弱化または殺した形態、またはアジュバントを含めた生物活性剤と組み合わせて用いることができる。そのようなさらなる剤は、同一または直接的投与経路を介して同時または順次に投与することができる。いくつかの実施形態において、投与される蛋白質は、同一または関連する病原体の異なる血清型に由来する。１つの実施形態において、生物活性剤は、本明細書中に提供されるグリコシル化蛋白質と相乗作用して、病原体に対する効果的な免疫応答を刺激する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される（均一にグリコシル化された組換え蛋白質のような）グリコシル化蛋白質はアジュバントと共に投与される。本発明で用いるワクチンの処方において、アジュバント組成物は体液性応答またはＴｈ２応答を誘導するのが好ましい。そのようなアジュバントは、ＩＬ−４、ＩＬ−６、および／またはＩＬ−１０生産を誘導するもの、ならびにＴ−独立性抗原の免疫原性を増強させる他の手段を含むことができる。例えば、Ｍｏｎｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：６５５−９２（１９９５）；Ｌｅｓｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４７：１３５−４９（２００１）参照。しかしながら、細胞応答を含めた他の応答は、特に、もし他のビルレンス因子がワクチン養生法で共投与されるならば、排除されないことは理解されるであろう。従って、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、破傷風トキソイド、サポニン、リポペプチド、およびＩＬ−１２のようなよく知られたアジュバントも考えられる。特別な実施形態において、本明細書中で提供されるグリコシル化蛋白質は、破傷風トキシンの刺激性エピトープにコンジュゲートされる。例えば、Ｋｕｍａｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１４９９−５０５（１９９２）参照。
【０１０５】
本明細書中で提供される蛋白質は、同時にまたは順次に、アジュバントと共に、またはアジュバントとは別々に処方にて送達することができる。適当なアジュバントは水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩を含むが、カルシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、あるいはアシル化されたチロシン、またはアシル化された糖、カチオン的にまたはアニオン的に誘導体化された多糖、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（ｅｄｓ．），ＶＡＣＣＩＮＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００３）；Ｐｏｗｅｌｌら（ｅｄｓ．），ＶＡＣＣＩＮＥ  ＤＥＳＩＧＮ：ＴＨＥＳＵＢＵＮＩＴ  ＡＮＤ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｐｌｏｔｋｉｎら（ｅｄｓ．）ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ２００４）；米国特許第６，７９７，２７６号；第６，５９６，２７８号；第６，４９１，９１９号；第４，８９４，２２９号；第５，８１４，３２１号；第５，６７９，３５５号；および第４，８０３，０７０号参照。いくつかの実施形態において、アジュバントはフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）またはミョウバンである。使用されるアジュバントの量は、アジュバントの性質に依存して広く変化することができ、一般には免疫原の重量の０．１〜１００倍、より通常には約１〜１０倍の範囲である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された全突然変異体酵母細胞（例えば、生きたものまたは殺したもの）は、予防的または治療的ワクチンで用いることができる。例えば、全突然変異体酵母細胞は、経口、膣、または直腸投与のためのカプセル、丸剤、ゲル、またはクリームに処方される。
【０１０７】
誘導された抗体の中和能力は、ルーチン的方法を用いて評価することができる。かくして、ＨＩＶを中和する抗体は以下の：ウイルス付着、共受容体従事、膜融合、またはいくつかの生産的相互作用のうちの１以上を阻害することができると考えられる。例えば、米国特許第６，３９１，５６７号；Ｌｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７７：１３３７（２００３）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２０２８（２００１）；Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、Ｃｅｌｌ  １００：５８７（２０００）；Ｂｒｅｗｌｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：３８９２−３９０２（２００１）；米国特許出願第２００３００９６２２１号；第２００５００６４３９０号；第２００４０２５９７８５号；第２００４０２２８８６９号および第２００４００９６８２３号。細胞融合は、ＨＩＶ−１のような哺乳動物細胞またはウイルスで見出される脂質二層膜の接合または一体化を含む。このプロセスは、ＨＩＶ−１の標的細胞への付着から区別できる。１つの実施形態において、付着は、ＨＩＶ−１外部糖蛋白質のヒトＣＤ４受容体への結合によって媒介される。相互反応は、限定されるものではないが、ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４，ＣＣＲ２，ＣＣＲ３，ＣＣＲ８，ＳＴＲＬ３３，ＧＰＲ−１５，ＣＸ３ＣＲ１およびＡＰＪを含めた共受容体も含むことができる。例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．１６：１２０１−１０（２００４）；Ｐｈｉｌｐｏｔｔら、Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ  Ｒｅｓ．１：２１７−２７（２００３）参照。特別な実施形態において、中和抗体は、グリコシル化ｇｐ１２０のＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を予防し、または阻害するものである。例えば、米国特許第６，３９１，５６７号；Ｌｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７：１３３７−４６（２００３）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：３１：２８９３９−４５（２００１）参照。
【０１０８】
中和抗体はいずれかのイソタイプであり得る。いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧ抗体である。より特別には、抗体はＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体であり得る。
Ｄ．実質的に均一にグリコシル化された組成物に特異的な抗体を作成し、同定する方法。
【０１０９】
また、本明細書中において、末端α１−２グリカン構造を含む蛋白質に特異的に結合する抗体を調製する方法であり、該方法は、有効量の本明細書中に記載された組成物（例えば、該方法によって作成された組換え蛋白質、または本明細書中に開示された蛋白質を含む組成物）で動物を免疫化することを含む。該組成物は、さらに、アジュバント、担体、または双方を含むことができる。本明細書中において、本明細書中に開示された方法によって生成した単離された抗体、ならびに該単離された抗体を生産するハイブリドーマが提供される。１つの実施形態において、該抗体はＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２ｇｐ１２０およびＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ｇｐ１２０に特異的であり、好ましくは、ヒト糖蛋白質との実質的交差反応を有しない。
【０１１０】
本明細書中で提供されたグリコシル化蛋白質に特異的な抗体を生じさせるいずれかの適当な方法を使用することができる。抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）を免疫化し、生産し、および単離する方法は当業者に公知であり、科学および特許文献に記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ２００５）；Ｓｔｉｔｅｓ（ｅｄｓ．），ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（９ｔｈ  ｅｄ．）（Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９８）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（３ＲＤ  ＥＤ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）；Ｈａｒｌｏｗ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９９８）参照。
【０１１１】
本明細書中で提供される抗体は、天然源から単離されたもの、合成のもの、または当該分野で公知の方法を用いて組換え的に生じさせたポリペプチドであり得る。抗体はイン・ビトロまたはイン・ビボで組換えにより発現させることができる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｍ（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２；Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ，ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＡＮＤ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（１９９５）Ｔｅｃｈｏｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ参照。例えば、抗体合成は種々の固相技術を用いて行うことができ（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３−１３参照）、自動合成は、例えば、製造業者によって供される指示書に従って、ＡＢＩ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成することができる。抗体の創製および生産の組換え手段の例示的記載は、Ｄｅｌｖｅｓ，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ最新版）を含む。また、抗体は、例えば、限定されるものではないが、遺伝子工学作成動物を含めた動物を用いる伝統的なイン・ビボ方法に加えて、ファージディスプレイライブラリーを発現する組換え抗体結合部位を用いてイン・ビトロで生じさせることもできる。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）；Ｋａｔｚ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７−４５（１９９７）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：８４５（１９９６）；Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６（１９９７）；米国特許第６，６３２，９７６号参照。
【０１１２】
一旦生成されたならば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｕｐｒａに記載されているように、標準的方法によるウエスタンブロットまたは免疫沈澱分析によってグリコシル化蛋白質の特異的認識につきテストされる。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化することができる。米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１；およびＷＯ９０／０７８６１。
【０１１３】
実質的に均一なグリコシル化を持つ抗原は、本明細書中に提供される方法を用いて生産される。誘導性抗原は単一エピトープ、多数エピトープ、または全蛋白質単独、あるいは当該分野で公知の１以上の免疫原性増強剤と組み合わせたものであってよい。該誘導性抗原は、単離された全長蛋白質、（例えば、抗原の少なくとも一部でトランスフェクトされた細胞で免疫化する）細胞表面蛋白質、または（例えば、蛋白質の細胞外ドメイン部分のみで免疫化する）可溶性蛋白質であってよい。
【０１１４】
特許請求される発明の抗体は、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，またはＩｇＡ抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧ抗体である。より特別には抗体はＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，およびＩｇＧ４抗体であり得る。いずれかの適当な源も抗体で用いることができる。例えば、抗体はヒト、ネズミ、ラット、ウサギ、ウシ、ラクダ、リャマ、ヒトコブラクダ、またはサル抗体であり得る。一旦、適当な抗原結合領域が同定されたならば、例えば、イン・ビトロ、イン・ビボまたは双方にて中和する抗体からのＣＤＲが同定されるならば、該抗体はいずれかの適当な方法で修飾して、その治療効果を増強させることができる。特許請求される発明の抗体における修飾は、抗体のアミノ酸配列における少なくとも１つの突然変異を含む。例えば、１以上の突然変異は、抗体の１以上の特性を改変するための抗体をコードする核酸に対する修飾、付加または欠失によって導入することができる。本発明の抗体は、いずれかの適当な方法で修飾して、所望のエフェクター機能または物理的特徴を付与し、または増強することができる。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；およびＵＳ２００４／０１３２１０１参照。かくして、本発明の方法によって修飾された抗体をコードする核酸は、いずれかの適当な手段によって改変することができる。
【０１１５】
従って、抗体はヒト化抗体、キメラ抗体、二特異的抗体、融合蛋白質、またはその生物学的に活性な断片であり得る。いくつかの実施形態において、抗体（またはその生物学的に活性な断片）は融合蛋白質である。融合蛋白質は、精製または生産を単純化するさらなるペプチド配列を含むことができる。融合蛋白質は、抗体の活性を補充する方法で生物学的に活性なドメインおよび／または全ポリペプチドを含むことができる。例えば、抗体をサイトカイン、リガンド、接着分子、ペプチド、受容体、酵素、治療蛋白質、色素、小有機分子、またはいずれかのその生物学的に活性な部分に融合させることができる。
【０１１６】
いずれかの適当な手段を用いて、本発明の抗体の結合親和性を決定することができる。１つの例において、親和性は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって決定される。本発明の抗体をさらに修飾して、当該分野で公知の方法を用いて結合親和性を増大させることもできる。例えば、米国特許第６，３５０，８６１号参照。
【０１１７】
本明細書中で提供される抗体は、免疫アッセイで適当なものであり得る。特定のアッセイはＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロットを含む。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）参照。これらのモノクローナル抗体は、通常はＥＬＩＳＡによって測定して、通常、少なくとも、約１μＭ、より通常には少なくとも約３００ｎＭ、典型的には少なくとも約３０ｎＭ、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも約３ｎＭまたはそれよりも良好なＫｄにて結合するであろう。
【０１１８】
いずれの適当な方法を使用して、ビルレンス因子の存在下で抗体の生物学的活性を決定することもできる。１つの実施形態において、もし抗体が、少なくとも、２０％、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％だけ、生物の病原性および／またはビルレンス因子の毒性を低下させるならば、抗体は抗−ビルレンス因子活性を有する。もう１つの実施形態において、もし抗体が、１以上の他の抗−ビルレンス因子の存在において、少なくとも、２０％、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％だけ、生物の病原性および／またはビルレンス因子の毒性を低下させるならば、本発明の方法の抗体は抗−ビルレンス活性を有する。
【０１１９】
本発明の抗体は、いずれかの適当なグリコシル化ビルレンス因子に特異的に結合することができる。ビルレンス因子は、接着因子、被覆蛋白質、侵入因子、カプセル、エキソトキシン、またはエンドトキシンであり得る。抗体の抗−病原性効果は、ビルレンス因子に結合する抗体、該因子のクリアランス、該因子の不活性化などに由来することができる。
【０１２０】
もう１つの態様において、本発明は、ここに開示された抗体をコードする配列を含む単離されたまたは組換え核酸、コーディング核酸を含むベクター、および該コーディング核酸、または該コーディング核酸を含むベクターを含む細胞を提供する。典型的には、ベクターは、指名された宿主細胞における発現に適したプロモーターに操作可能に連結された抗体−コーディング核酸を含む。本発明の核酸、発現カセットおよびベクターを発現させるための宿主細胞は細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞および哺乳細胞を含む。かくして、本発明は、コドン−改変核酸によって作成されたこれらの細胞、コドン−改変核酸およびポリペプチドの全てにおけるコドン用法を最適化するための方法を提供する。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのようなグラム陰性細菌；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉｖｅｒｓａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなグラム陽性菌を含む。例示的な宿主細胞は真核生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓを含めたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．のような種々の酵母、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、および哺乳動物細胞および細胞系、および昆虫細胞および細胞系も含む。かくして、本発明は、これらの生物および種における発現について最適化された抗体およびそれらをコードする核酸も含む。例えば、米国特許第５，７９５，７３７号；Ｂａｃａ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３０：１１３−１１８；Ｈａｌｅ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：１８５−１８８；Ｎａｒｕｍ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７２５０−７２５３；Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２４：１８−２４；Ｆｅｎｇ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１５３９９−１５４０９；ａｎｄ  Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０：２５２−２６４参照。
【０１２１】
１つの態様において、本発明は、本発明の抗体、および治療剤として投与される適当な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、本発明の作成された抗体、および適当な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、前記した少なくとも１つのモノクローナル抗体、および適当な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物で有用な処方および賦形剤は、当該分野で良く知られたものである。（限定されるものではないが、組換え源からを含めた、いずれの源に由来するものでも）本発明の方法で有用な抗体は、それ自体で、あるいはそれが適当な担体または賦形剤と混合された医薬組成物にて、種々の障害を治療または軽減するための用量で必要とする対象に投与することができる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（最新版）参照。そのような組成物は（蛋白質または担体以外に）希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および当該分野で良く知られた他の物質を含有することもできる。用語「医薬上許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性と干渉しない非−毒性物質を含む。担体の特徴は、投与の経路に依存する。本発明の医薬組成物は、望ましいそのようなサイトカインまたは抗微生物剤のような他の抗−病原体を含有することもできる。
【０１２２】
本発明の抗体を１以上の生物学的に活性な剤と共に投与する場合、本明細書中で提供される抗体は生物学的に活性な剤と同時に、または順次に投与することができる。順次に投与するのであれば、主治医は、生物学的に活性な剤と組み合わせた、本発明の蛋白質を投与する適当な配列について決定するであろう。
【０１２３】
そのような抗体の毒性および治療効果は、ルーチン的な方法を用いて決定することができる。正確な処方、投与の経路、および用量は患者の状態に鑑みて個々の医師が選択することができる。例えば、Ｆｉｎｇｌら、ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  １（最新版）参照。
【０１２４】
さらに、本明細書中において、本明細書中に提供された蛋白質を含む医薬組成物、または本明細書中で提供された方法によって調製された蛋白質の有効量を投与することを含む、それを必要とする対象において病原体に対する抗体の中和を誘導する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法はさらにアジュバントを投与することを含む。特別な実施形態において、病原体はＨＩＶである。
【０１２５】
なおさらに、本明細書中において、本明細書中で提供される蛋白質、または本明細書中で提供される方法によって調製された蛋白質、および適当な賦形剤を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、それを必要とする対象において病原体によって誘導される疾患を予防または治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法はさらにアジュバントを投与することを含む。特別な実施形態において、病原体はＨＩＶである。１つの実施形態において、蛋白質はｇｐ１２０である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、さらに、異なるＨＩＶ株からの多数のｇｐ１２０蛋白質を含む。
【０１２６】
さらに、ａ）第一の細胞を、ＣＤ４＋およびＣＣＲ５＋を発現する第二の細胞と接触させ、ここで、該第一の細胞は樹状細胞−特異的Ｃ−タイプレクチン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）を発現し、ｂ）該第一および第二の細胞を感染性ウイルス粒子と共培養し；ｃ）請求項２０記載の方法によって調製された候補抗体と共培養とを接触させ；次いで、ｄ）相対的感染性を決定することを含み、それにより、中和抗体は、感染性ウイルス粒子による第二の細胞の相対的感染性を低下させ、または排除するものであることを特徴とする、ＨＩＶ伝播につき中和モノクローナル抗体を同定する方法が提供される。例えば、米国特許第６，３９１，５６７号；Ｂａｓｈｉｒｏｖａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：６７１（２００１）Ｌｅｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：１２０２８（２００１）参照。
【０１２７】
さて、本発明を一般的に記載してきたが、それは説明のために掲げ、かつ特記しない限り本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
発現系の選択。Ｐｍｒ１ｐ蛋白質、ＥＲからゴルジへのＣａ＋＋の輸送で重要なカルシウム−依存性ＡＴＰａｓｅを欠乏するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株を選択した（５５，５６）。ｐｍｒ１Δ株は異種蛋白質のいわゆるスーパーセクレーターであり、ほとんど１００％の異種蛋白質を分泌する（５７〜５８）。この株は、いくつかの蛋白質について報告されているように、ＥＲにおけるマンノシダーゼＩによってＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からトリミングされたＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のみを持つ糖蛋白質を分泌する（５８〜６０）。
【０１２９】
分泌された糖蛋白質を発現するためのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０遺伝子のクローニング。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α接合因子（ＭＦα）のシグナル配列を発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ＭＦαについてのコーティング配列は、ＰＣＲによって全酵母ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲプライマーはＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を含有した。２５０ｂｐ断片を増幅し、精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。形質転換およびミニプレプ同定の後に、陽性クローンを同定した。ｐＧＥＭ−Ｔ−ＭＦαおよびｐＹＥＳ２／ＣＴプラスミドを、次いで、同時にＢａｍＨＩおよびＫｐｎ１で消化した。ＭＦαバンドおよびｐＹＥＳ２バンドの精製の後に、プラスミドを連結し、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ−アンピシリンプレートに播種した。ＭＦαを含有する陽性クローンを同定し、それを用いてｇｐ１２０をクローン化した。
【０１３０】
ＪＲ−ＦＬ、ＪＲ−ＣＳＦおよびＹＵ２の株からのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０蛋白質をコードする配列を、鋳型としてそれらの対応するプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ＡＲＲＲＰ）を用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅ｇｐ１２０  ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を含有するｐＹＥＳ２／ＣＴ−ＭＦαプラスミドにクローン化した。次いで、３つのｐＹＥＳ２／ＣＴ−ＭＦα−ｇｐ１２０プラスミドをＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞に形質転換し、陽性クローンをミニプレプの消化分析によって同定した。これらのプラスミドを、迅速酢酸リチウム形質転換プロトコルを用いるジプロイド酵母株ｐｍｒ１Δ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への形質転換で用いた。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターは、誘導性ＧＡＬ１プロモーターを含有し、ガラクトースでの誘導に続いての組換え蛋白質の高発現レベルを可能とした。ｇｐ１２０を生産し、それを培養基に分泌させるために、形質転換された酵母細胞を−Ｕｒａ／ラフィノース培地中にて３０℃で一晩成長させた。遠心分離の後に、細胞を、ｇｐ１２０発現の誘導のために−Ｕｒａ／ガラクトース培地で再懸濁させた。
【０１３１】
均一にグリコシル化されたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ蛋白質の発現、精製、および分析。ｐｍｒ１Δ株は温度感受性であり、許容される温度にてゆっくりと成長する。従って、ｇｐ１２０発現を異なる温度および時点で調べて、これらの酵母細胞が最高レベルの蛋白質を発現でき、それらを最も効果的に培養基に分泌できる条件を決定した。ｐｍｒ１Δ酵母細胞は２５℃にて７〜１４日間、最大量のｇｐ１２０蛋白質を分泌した（図２Ａ）。ｇｐ１２０蛋白質は１日の培養後に検出され、培養基中で少なくとも１４日間継続して蓄積され、これは、酵母細胞が異種蛋白質の生産および分泌を継続したことを示す。また、グリコシル化ｇｐ１２０蛋白質が室温で安定であることも示された。もしｐｍｒ１Δ株で生産されたｇｐ１２０糖蛋白質がＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖のみを含有したならば、該蛋白質は、各々、ＪＲ−ＣＳＦ、ＪＲ−ＦＬ、およびＹＵ２について９９６０３Ｄａ、９６３８５Ｄａ、および９９６２１Ｄａの予測される分子量を有した。ウエスタンブロットは、蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてこれらの予測されるサイズで移動したことを示した。ブロットを、ｐｍｒ１Δ株で生産されたｇｐ１２０蛋白質を容易に検出したＭＡｂ  ２Ｇ１２でプローブした（図２Ａ）。
【０１３２】
精製手法は単純であった。なぜならば、培養基は蛋白質が貧弱だったからである。マンノース結合レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過の組合せは、９５％を超える純度を得るのに十分であった。簡単に述べれば、１４日における培養上清を濃縮し、透析緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）に対して４℃にて１６時間透析した。４℃にて３０分間における４０，０００ｇにおける遠心分離の後、興味のない蛋白質を含有する沈殿を除去した。次いで、アガロース−Ｃｏｎ−Ａカラム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）を用いて、これらのｇｐ１２０蛋白質を精製した。ｇｐ１２０蛋白質を含有する上清を、予め平衡化させたＣｏｎ−Ａ−アガロースカラムに負荷し４℃にて１６時間インキュベートした。次いで、カラムを透析緩衝液で洗浄し、結合した蛋白質を溶出緩衝液（５００ｍＭ  α−メチルマンノシド、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリスＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１Ｍｎ  ＭｎＣｌ２，ｐＨ６）で溶出させた。精製した物質は、主として１００ｋＤａおよび１６０ｋＤａ蛋白質を含有した。次いで、ゲル濾過を用いて、１６０ｋＤａ蛋白質を除去した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲの予めパッキングされたカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を洗浄緩衝液（５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で洗浄した。結合した蛋白質を溶出緩衝液（５００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で溶出し、１ｍｌ画分を集めた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、クーマシーブルー染色によって分析した（図２Ｂ）。
【０１３３】
精製に続き、ＰＧＮａｓｅ  Ｆ消化および質量分析を用いて炭水化物のタイプを分析した。典型的には、Ｍａｎの９０％を超えたものはＭａｎ８またはｍａｎ９であろう。
【０１３４】
ｇｐ１２０および汚染物の量を見積もるために、精製された蛋白質を、高マンノースおよびハイブリッドタイプの炭水化物を切断することが知られている酵素エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）で消化した。図３からの結果は、圧倒的なバンドは５５〜６０ｋＤａ蛋白質であることを示し、ｇｐ１２０ポリペプチドのサイズと相関する。図３からのデータに基づき、見積もられたｇｐ１２０純度は９０％よりも大であった。より後の実験において、このバンドはさらにほとんどが酵母蛋白質であるＰＳＴ１であると同定された。図１５参照。
【０１３５】
グリコシル化ｇｐ１２０蛋白質に特異的な抗体。マンノース−特異的に抗体が誘導でき、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ蛋白質と反応するか否かをテストするために、ウサギを、β−グリカンおよびα−マンナンを含有する、酵母細胞壁抽出物であるザイモサンＡで免疫化した。これらのマンノース−リッチの構造は、ｇｐ１２０で通常見出されるような、少数のα１，２構造と共に、ほとんどが末端α１，３およびα１，６結合を含有した。２つのウサギを、０週においてＣＦＡを含有する２００μｇのザイモサンＡで免疫化し、２および４週および、そのうち、４週毎に、ＩＦＡを含有する１００μｇの抗原をブースター注射した。免疫血清を各ブースター後５週および１週に集めた。抗原は、ザイモサンＡまたはプレートに捕獲されたマンナンいずれかを用い、ＥＬＩＳＡ分析によって測定して良好な抗体応答を誘導した（図４Ａ）。注目すべきは、免疫血清は、テストされたｇｐ１２０糖蛋白質のいくらかをやはり認識した（図４Ｂ）。抗−マンナン血清は、比較的低いレベルであるが広いクラーデＥ（ＣｈｅｎＭａｉおよび９３ＴＨ９７５）、Ｃ（ＣＮ５４および９６ＺＭ６５１）、およびクラーデＢの１つ（ＬＡＶ）に対する反応性を示した。対照的に、２Ｇ１２  ＭＡｂはクラーデＢ（ＡＤＡ、ＪＲ−ＦＬ、ＢＡＬ、ＬＡＶ）株と主として反応したが、クラーデＣ（ＣＮ５４および９６ＺＭ６５１）に対して応答を有さず、テストされたクラーデＥ株（９３ＴＨ９７５およびＣｈｅｎＭａｉ）に対してほとんど応答を有しなかった。クラーデＥ  Ｃｈｅｎ株に対する抗体の高い力価は、さらに、ウエスタンブロットおよび反復されたＥＬＩＳＡによって確認された。これらの結果は、マンノースに対する抗体が動物において誘導でき、およびＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する反応性を得ることができることを示唆する。これらの知見は、我々の新規なマンノース−リッチなｇｐ１２０免疫原に対して順方向に移動する強力な合理性を提供する。
【０１３６】
ｐｍｒ１Δ酵母細胞で発現された株ＹＵ２、ＪＲ−ＦＬおよびＪＲ−ＣＳＦからのｇｐ１２０蛋白質は２２〜２４のＭａｎ８構造を含み、他方、同一ＨＩＶ株からの哺乳動物細胞で発現されたものは、約半分のＭａｎ５−９および半分の複合糖質構造を含有した。酵母で発現されたｇｐ１２０蛋白質がマンナンならびに２Ｇ１２に対する抗体によってより効果的に認識されるかを判断するために、我々は、酵母からのＹＵ２株からの精製されたｇｐ１２０蛋白質を用いて、哺乳動物細胞で発現されたＹＵ２と比較した。このＥＬＩＳＡ分析からの結果（図４Ｃ）は、酵母からのｇｐ１２０蛋白質は、哺乳動物細胞からのそれよりも抗−マンナン抗体に対してかなりより高い抗原性を有することを示す。またこの図面は、抗−マンナン抗体がＭａｎ９−ＢＳＡコンジュゲートを認識したが、ＢＳＡ単独を認識しなかったことを示した。
【０１３７】
Ｍａｎ９の単離、およびＭａｎ９のＢＳＡへのコンジュゲーション。抗−α１，２−Ｍａｎ構造抗体に対するスクリーニングツールとしてＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を用いるために、Ｍａｎ９を植物蛋白質から単離し、ＢＳＡにコンジュゲートした。具体的には、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ大学（ＵＣＳＤ）の糖生物学中枢施設によって大豆アグルチニン（ＳＢＡ，ＥＹ  ｌａｂｓ）からＭａｎ９グリカンを単離した。簡単に述べれば、精製されたＳＢＡ上のＮ−グリカンをＰＮＧａｓｅＦを用いて放出させ、ＴＣＡ沈殿を用いて精製して、蛋白質を除去した。上清をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジを通して、残存する洗剤を除去し、グリカンを多孔性黒鉛化炭素カートリッジで精製した。単糖分析は、収率が２５ｍｇの蛋白質から０．２ｍｇであることを示した。グリカンはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析し、低下したＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２標準および低下したＲＮＡｓｅ  Ｂグリカンと比較した。グリカンの見積もられた９０％は、事実、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２あり、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対するＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の比率は９：１であった。アリコートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に付した。より少量のグリカンも低量で観察されたが、主な種はＨｅｘ９ＨｅｘＮＡｃ２であった。
【０１３８】
次いで、スルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）方法を用いてＢＳＡにＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２をコンジュゲートさせた。簡単に述べれば、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を２−アミノエタンチオール−ＨＣｌと８５℃にて３０分間反応させた。反応混合物を水に対して透析して、反応試薬および塩を除去し、次いで、真空乾燥した。次いで、Ｍａｎ９誘導体を１００μｌのＳＭＣＣ反応緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解させた。ＢＳＡを、反応緩衝液中のスルホ−ＳＭＣＣで２時間活性化させた。過剰のＳＭＣＣを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｇ２５カラムを通じて反応混合物を通すことによって除去した。ＢＳＡ−ＳＭＣＣを含有する画分を合わせ、濃縮した。１００μｇのＢＳＡ−ＳＭＣＣを５０μｇの誘導されたＭａｎ９と３０分間反応させた。反応を０．５Ｍシステインの添加によって停止させ、リン酸緩衝生理食塩水に対して透析した。溶液を真空乾燥し、ＢＳＡ−Ｍａｎ９コンジュゲートを０．１ｍｌの水で溶解させて、１ｍｇ／ｍｌにおいてＢＳＡの濃度を有するようにした。図５は、ＢＳＡ−ＳＭＣＣおよび非−コンジュゲーテッドＢＳＡに比較したＢＳＡ−Ｍａｎ９のコンジュゲートの移動シフトを示す。
【０１３９】
ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体および組換え蛋白質の調製。ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体を用いて、組換えＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質の発現をモニターした。２つの抗体を合成ペプチドを用いてウサギにおいて生産させた。免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、免疫血清を精製した。ペプチド抗体の双方は、ヒト粘膜組織からの溶解物における４４ｋＤａバンドを認識した。このバンドは抗原性ペプチドによってブロックされ、これは、これらの２つの抗体が特異的であることを示す。
【０１４０】
ＤＣ−ＳＩＧＮのクローニングおよび発現。ｇｐ１２０−ＤＣ−ＳＩＧＮ結合アッセイを行い、誘導された抗体の中和活性をテストするために、ＤＣ−ＳＩＧＮの細胞外ドメインをクローン化し、発現させた。ＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅によって調製し、ｐＥＴ１００ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結させた。ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を用いて、０．５Ｍ  ＩＰＴＧの存在下で組換え蛋白質を発現させた。細菌細胞を４時間のＩＰＴＧ誘導後に収穫した。細菌溶解物を可溶性および不溶性画分に分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。組換えＥＣＤ蛋白質は不溶性画分に見出され、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製した（図６Ａ）。
【０１４１】
細菌封入体からのＤＣ−ＳＩＧＮの再折り畳みおよび精製。封入体中の不溶性蛋白質は正しくなく折り畳まれた。変性した蛋白質を再度折り畳んで、生物学的に機能的な蛋白質が得られ、再度折り畳まれた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡおよびＤ−マンノースアフィニティークロマトグラフィーで精製した。簡単に述べれば、細菌細胞を、１ｍｇ／ｍｌリゾチウムおよび５μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉを含有する溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃ１、１５０ｍＭ  ＮａＣ１、５ｍＭ  ２ＭＥ、ｐＨ７．４５）で溶解させて、封入体および可溶性蛋白質を放出させた。封入体を遠心分離によって沈殿させ、徹底的に洗浄して、可溶性蛋白質を除去した。封入体を、８Ｍ尿素を含有する再折り畳み緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ２ＭＥ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  グリシン、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．１ｍＭ  ＧＳＳＧ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．５）中で溶解させた。尿素の濃度を再折り畳み緩衝液で希釈し、溶液を１Ｎ  ＨＣｌで順次ｐＨ９．０、８．８、８．５および８．０に調製した。再折り畳み溶液を４０，０００ｇで３０分間遠心分離して、不溶性物質を除去した。次いで、再折り畳み蛋白質をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムで精製し、５００ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液で溶出させた。精製されたＥＣＤ蛋白質の量および純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、クーマシーブルー染色で分析した。図６Ａは、再度折り畳まれた蛋白質がＮｉ−ＮＴＡ精製後に９０％を超える純度を有したことを示す。ＥＣＤ蛋白質を含有するＮｉ−ＮＴＡカラムからの溶出物を、さらに、負荷緩衝液で予め平衡化させたＤ−マンノース−アガロースカラムを用いて精製して、蛋白質成分を選択して、リガンドに結合させた。カラムを負荷緩衝液で洗浄し、結合した蛋白質を５０ｍＭ  α−Ｄ−マンノースで溶出させた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、クーマシーブルー染色によって分析した。図６Ｂにおける結合アッセイは、この組換え蛋白質はポリクローナル抗体に対する同様な親和性でもってｇｐ１２０に結合するので、それは機能的であることを示す。
【０１４２】
ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０相互作用の結合アッセイ。ＤＣ−ＳＩＧＮ活性をテストするために、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０の結合アッセイを行う。対照としての異なる濃度の２Ｇ１２  ＭＡｂでの免疫血清の異なる希釈を２００ｎｇのｇｐ１２０蛋白質でインキュベートして、ＩＣ５０値を決定する。哺乳動物細胞および酵母細胞において生産されたＹＵ２およびＪＲ−ＦＬ株からのｇｐ１２０蛋白質を平行して用いて、比較する。次いで、ウェルを抗−ｇｐ１２０ポリクローナル抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と共に、続いて、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートした。各条件は二連である。ＤＣ−ＳＩＧＮに結合したｇｐ１２０の量は、ｇｐ１２０濃度およびＯＤ値に基づいて作成された標準曲線を用いて決定される。与えられた抗体濃度におけるパーセント阻害は、［（抗体の不存在下におけるｇｐ１２０の量−与えられた抗体濃度の存在下におけるｇｐ１２０の量）／抗体の不存在下におけるｇｐ１２０の量］×１００として表される。阻害能力、すなわち、５０％（ＩＣ５０および９０％ＩＣ９０阻害用量が決定される。各抗体の広く中和する反応性をテストするために、クレードＡ、ＢおよびＣからの組換えｇｐ１２０糖蛋白質を用いる。
【０１４３】
５００ｎｇ／ウェルの精製されたＥＣＤ蛋白質を用いて、マイクロウェルプレートを１６時間被覆する。ウェルを、０．１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでブロックした。哺乳動物細胞において生産されたＹＵ２株からのｇｐ１２０蛋白質を用いて、固定化された蛋白質に対して結合させる。次いで、ウェルを抗−ｇｐ１２０−ＭＮポリクローナル抗体、続いて、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。基質での発色の後に、光学密度（ＯＤ４５０）をマイクロウェルリーダーで読む。各条件は二連で設定する。
【０１４４】
２つのポリクローナル抗体以外に、精製されたＥＣＤ蛋白質に対するＭＡｂも開発されている。ＥＬＩＳＡを用いる培養上清の最初のスクリーニング、および陽性クローンの拡大培養後に、ウエスタンブロットを用いてハイブリドーマをさらにスクリーニングした（図７）。これらのＭＡｂは高い特異性を示した。というのは、フィルムのより長い暴露（３０分）は、他の検出可能なバンドを示さなかった。
【０１４５】
組換えｇｐ１２０蛋白質および中和アッセイ。異なるクレードからのｇｐ１２０蛋白質を用いて、免疫血清およびハイブリドーマ上清の一次スクリーニングを行う。蛋白質は理想的には哺乳動物細胞で発現されて、十分にグリコシル化される。これらの蛋白質の多くは商業的源から入手可能である。１ｍｇ未満の各蛋白質がスクリーニングで必要であろう。ＨＩＶ中和アッセイは、典型的には、Ｂｉｎｌｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１３２３２−５２（２００４，Ｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０１０８−２５（２００５）；Ｍａｓｃｏｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０１０３−７（２００５）に記載されているように行われる。簡単に述べると、レトロウイルスプラスミドｐＨＩＶ−ｇｐｔおよびｇｐ１６０  ｅｎｖ  ｐＨＸＢ２はＣｏｓ−７細胞の共−トランスフェクション後に高力価シュードウイルスを生産する。このシュードウイルスは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）および最近購入されたＶｅｒｉｔａｓルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてルシフェラーゼ活性によって測定して、インジケーター細胞系ＬｕＳＩＶを非常によく感染させる。この系を用いて、我々の研究室で最近生成された抗−ＨＩＶ−１ポリクローナル抗体をテストした（図８）。２つのポリクローナル抗体は、用量依存性中和活性を用いた。Ｔｒｉｍ５αポリクローナル抗体を陰性対照として用い、ヒトＭＡｂ（２Ｆ５、４Ｅ１０、および２Ｇ１２）を陽性対照として用いた。
【０１４６】
免疫刺激体にコンジュゲートされたｇｐ１２０の調製。均一にグリコシル化されたｇｐ１２０の免疫原性を増強するために、破傷風トキシンからのユニバーサルＴ細胞エピトープを含有する多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）を合成し、異なるカップリング手法を用いて、ｇｐ１２０−破傷風トキソイドおよびｇｐ１２０−ＭＡＰのコンジュゲートを調製し、カップリング効率および抗原性について分析する。簡単に述べると、ｐ２配列（ｐ２４）の４分岐を持つ多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）は、よく確立されたペプチド会社（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．）によって合成される。ＭＡＰペプチドはＨＰＬＣによると９０％を超える純度で精製され、質量分析によって分析される。コアマトリックスに添加されたシステイン残基を用いることによって、ＭＡＰペプチドはｇｐ１２０蛋白質に共有結合によりカップリングされるであろう。システインスルフヒドリル基は架橋されて、ＳＭＣＣ方法を用いてｇｐ１２０蛋白質上のアミノ基を遊離させて、かくして、我々がそれに対して抗体を開発することを希望する炭水化物構造を修飾すべきではない。簡単に述べると、１０ｍｇ／ｍｌのｇｐ１２０蛋白質は、カップリング緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中で１０ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液と２時間反応させる。反応溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを通して、過剰のＳＭＣＣを除去する。蛋白質を含有する画分を集める。合成ＭＡＰペプチドを１０ｍｇ／ｍｌにてカップリング緩衝液に溶解させ、３０：１モル比率で活性化された抗原と混合し、それは、ｇｐ１２０蛋白質上の遊離アミン基のほとんどをカップリングさせる。架橋反応は２時間進行する。全ての反応は室温で行われる。
【０１４７】
ｇｐ１２０−破傷風トキソイドコンジュゲートは同様なアプローチを用いて調製される。それらの遊離アミノ基を通じての架橋によって、破傷風トキソイド蛋白質（ＴＴ，Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をｇｐ１２０にカップリングさせる。簡単に述べると、１００倍モラー過剰の新鮮なグルタルアルデヒドは、自己−コンジュゲートを妨げるために、５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０中のＴＴと反応する。遊離グルタルアルデヒドは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを通すことによって除去される。次いで、ＴＴ−グルタルアルデヒドをｇｐ１２０にカップリングさせる。遊離アルデヒド基は１Ｍグリシンの添加によってブロックされる。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを再度通過させる。ＴＴ−ｇｐ１２０コンジュゲートを含有させる画分を集め、ＰＢＳに対して透析する。
【０１４８】
カップリング効率は、ゲルシフトアッセイを用いて分析する。簡単に述べると、コンジュゲートは、４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、クーマシーブルー染色、およびｇｐ１２０に対する抗体を用いるウエスタンブロットで分析される。コンジュゲートは、非コンジュゲート蛋白質よりも遅く移動する。コンジュゲートのサイズ変化は、ｇｐ１２０蛋白質にカップリングされたＭＡＰペプチドおよび蛋白質分子の数に依存する。コンジュゲートの抗原性は、マンナンおよび２Ｇ１２  ＭＡｂに対するポリクローナル抗体でのＥＬＩＳＡを用いて、非−コンジュゲートｇｐ１２０蛋白質に対する比較によってテストされる。
【０１４９】
イン・ビボにおけるｇｐ１２０蛋白質およびそれらのコンジュゲートの免疫原性のスクリーニング。５〜６週齢の６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの６つの群を免疫化する（表１）。抗原を示した用量で皮下注射する。一次免疫化から１４日後、およびその後３週間毎にマウスを同一用量の抗原でブースター注射する。各ブースター注射から１週間後にそれらから採血する。かくして、マウスを週０、２、５、８および１１において免疫化し、免疫血清を週０、３、６、９および１２で集める。ＹＵ２およびＪＲ−ＦＬの双方を使用して、Ｍａｎα１，２−ｍａｎエピトープを有するようにし、より多くの数の広く中和するＭＡｂを開発することができる。
【０１５０】
（表１）
（免疫化の群）
【０１５１】
【表１】
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ｇｐ１２０抗原被覆マイクロウェルプレートでのＥＬＩＳＡを用い、抗体力価をテストする。ＥＬＩＳＡ手法を簡単に記載する。Ｃｏｓｔａｒマイクロウェルプレートを、１００μｌの５０ｍＭ炭酸塩（ｐＨ９．５）中の３００ｎｇの抗原／ウェルで２４時間コーティングする。ウェルを２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０２％チメロザール）で２時間ブロックする。洗浄の後、１００μｌの系列希釈免疫血清を、抗原−被覆ウェルと共に２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの５回の洗浄の後に、ウェルを、ブロッキング緩衝液中の１：５０００の１００μｌのヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間インキュベートする。洗浄の後、ウェルを１００μｌのＨＲＰ基質ＴＭＢ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に１０分間インキュベートし、１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌの添加によって反応を停止させる。光学密度をマイクロウェルリーダーによってＡ４５０で読む。全ての反応を室温で行う。
【０１５２】
異なるクレードからのｇｐ１２０蛋白質に対する交差反応性抗体についての免疫血清のスクリーニング。１２クレードまでのＨＩＶ−１単離体が世界中で報告されており、クレードＡ（２７％）、Ｂ（１２％）およびＣ（４２％）は全てのＨＩＶ−１感染の８０％を超えるものを含む。高マンノースオリゴ糖のＭａｎ９およびＭａｎ８形態が、全てのＨＩＶ−１株および単離体で高度に保存されている。かくして、Ｍａｎα１，２−Ｍａｎ構造に対する抗体は、単一Ｍａｎ８またはＭａｎ９からのエピトープ、またはこれらのグリカンの２または３によって形成された立体配座エピトープを認識できるであろう。従って、Ｍａｎα１，２−Ｍａｎエピトープに対する抗体はほとんどのＨＩＶ−１株および単離体を認識できよう。
【０１５３】
広く中和する活性を持つＭＡｂを開発するために、我々は、クレードＡ（例えば、Ｑ２３１７、Ｂ２５３９およびＱ１７６９）、Ｂ（例えば、ＡＤＡ、ＹＵ２、ＪＲ−ＦＬ、８９．６、ＢａＬ、ＳＦ１６２）、およびＣ（例えば、ＤＵ１２３、ＤＵ４２２、ＤＵ１７９および９８ＩＮ０１２）の株からのｇｐ１２０糖蛋白質で免疫化されたマウスおよびハイブリドーマ上清をスクリーニングする。加えて、高マンノースＭａｎ８構造に対する抗体をテストすることができる。Ｍａｎ８は酵母で生産されたｇｐ１２０蛋白質から単離され、本明細書中で開示されたスルホ−ＳＭＣＣ方法を用いてＢＳＡにコンジュゲートされる。ＢＳＡ−Ｍａｎ８を用いて、マイクロウェルプレートを被覆し、Ｍａｎα１，２−Ｍａｎエピトープに対する抗体について免疫血清をスクリーニングする。
【０１５４】
免疫原に対して≦１：１０，０００および異なるクレードおよびＢＳＡ−Ｍａｎ８からのｇｐ１２０蛋白質１２０蛋白質に対して≧１：１，０００の血清力価を持つマウスを、ハイブリドーマの作成で選択する。簡単に述べれば、マウスを融合から３日前に同一用量の抗原でブースター注射し、その後、それらを犠牲にし、脾臓を無菌的に収穫する。細胞懸濁液を、２０ｍｌの滅菌完全無血清ＤＭＥＭ（ＣＳＦＤ）の脾臓への注射によって調製する。同時に、ミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ）の培養を収穫する。脾臓細胞およびミエローマ細胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、１０ｍｌのＣＳＦＤ中に別々に再度懸濁させる。細胞生存性を評価した後、それらを１：１比率で混合し、３０ｍｌのＤＭＥＭを補足し、遠心分離によってペレット化する。１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００，Ｒｏｃｈｅ）を各滴下後に攪拌しつつゆっくりと加えることによって、細胞ペレットを再懸濁させる。滅菌ＣＳＦＤを、攪拌しつつ、滴下によって混合物に加えて、最終容量を１０ｍｌとする。融合された細胞を遠心分離し、完全ＤＭＥＭ−２０／ＨＥＰＥＳ／ピルベート／ＨＡＴで再度懸濁させる。細胞懸濁液を２．５ｘ１０６合計細胞／ｍｌに調製する。融合細胞を９６−ウェルプレートに蒔き、湿潤化された３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で７日間インキュベートする。次いで、培地を完全ＤＭＥＭ−２０／ＨＥＰＥＳ／ピルベート／ＨＴで交換する。１２〜１５日に、目に見えるハイブリドーマコロニーによって証明されるように、ハイブリドーマはスクリーニングの準備ができている。典型的には、脾臓当たりほぼ１ｘ１０８胞を１０の９６−ウェルプレートに蒔き、融合において≧８０％効率を得る。
【０１５５】
目に見えるコロニーを含むウェル中の上清を、免疫原と共にＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングする。手法は、抗原−被覆ウェルを１００μｌの非−希釈ハイブリドーマ上清でプローブする以外は、スクリーニング免疫血清と同一である。陽性ウェル中の候補ハイブリドーマ細胞は、ＤＭＥＭ−２０／ＨＥＰＥＳ／ピルベートおよびクローニング／拡大培養培地にて２４ウェルに移し、３〜５日間拡大培養する。前記したように、上清を異なるクレードおよびＢＳＡ−Ｍａｎ８からのｇｐ１２０で再度スクリーニングする。全てのまたはほとんどのテストされたｇｐ１２０蛋白質、およびＢＳＡ−Ｍａｎ８に対して陽性を示すウェルにおける細胞を、ウェル当たり１および３細胞を平板培養することによってクローニングに付す。細胞を７〜１０日間培養し、前記したのと同一の抗原のパネルを用いて候補クローンを再度スクリーニングする。サブクローニングおよびスクリーニングを、注目する安定なハイブリドーマ細胞系が確立されるまで反復する。
【０１５６】
非常に多数のＨＩＶ−１株および一次単離体に対するこれらのＭＡｂの中和活性をテストするために、ＭＡｂをマウスにおいて生産し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【０１５７】
広い範囲のＨＩＶ−１株および一次単離体を潜在的に中和することができるＭＡｂの同定。培養上清およびＭＡｂのＨＩＶ中和アッセイは、相同ＨＩＶ株を中和する能力についてテストされる。かくして、酵母で生産されたＹＵ２またはＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０で免疫化された動物からのハイブリドーマ培養上清を、ＹＵ２またはＪＲ−ＦＬ  Ｅｎｖ蛋白質を担うＨＩＶシュードタイプ、ならびにルシフェラーゼレポーター遺伝子を中和する能力についてテストする。上清およびＭＡｂを、ＣＤ４およびＣＣＲ５（またはＸ４ウイルス株を用いる場合はＣＸＣＲ４）を担うＵ８７細胞上のｐ２４−正規化ウイルスストックの感染を中和する能力についてテストする。ウイルスシュードタイプを、まず、感染に１時間先立って、非−希釈上清またはＭＡｂの系列希釈と共にインキュベートする。感染された細胞で生産されたルシフェラーゼの量は４８〜７２時間後に測定する。中和活性は、抗体−陰性対照と比較した、各抗体希釈におけるウイルス複製（ルシフェラーゼ活性）のパーセント阻害として示される：％阻害｛１［ルシフェラーゼＡｂルシフェラーゼＡｂ］｝１００。力価は、５０％阻害（ＩＣ５０）を付与するＭＡｂ希釈の逆数として計算される。次いで、上清、および相同ウイルスを中和するＭＡｂを、種々の一次ＨＩＶ−１株を中和する能力についてテストする。
実施例２〜４で用いる材料および方法
二重および三重酵母突然変異体の創製：
酵母株および培地。本実験で用いる４つの酵母欠失株はＯｐｅｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓから獲得した：ＭＡＴα，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｌｙｓ２Δ０，ｕｒａ３Δ０，ｍｎｎｌ：ｋａｎＭＸ４（１０３２２）；ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０、ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０，ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４（７０３４）；ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０，ｏｃｈｌ：ｋａｎＭＸ４（４４０６）；および  ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０  ｐｍｒｌ：ｋａｎＭＸ４（１４５３４）。２つの親酵母株は、接合型ＭＡＴａ、ｔｒｐ１Δ６３（指名：ＢＹ４７１０）およびＭＡＴα、ｔｒｐ１Δ６３（指名：ＢＹ４７１１）の証明およびスクリーニングのためにＡＴＣＣから獲得した。野生型ジプロイド酵母株ＩＮＶＳｃ１はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。示された遺伝子のノックアウトは、ＭＮＮ１、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４、およびＰＭＲ１遺伝子（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｙｅａｓｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｒｏｊｅｃｔにおけるＹｅａｓｔ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔにおける配列参照）に対して、およびＫａｎＭＸ４カセット（ＫａｎＢ、５’−ＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＣＧＴＡＡＴ−３’（配列番号：８）およびＫａｎＣ、５’−ＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴ−３’（配列番号：９））に特異的な合成されたプライマーを用いてＰＣＲによって証明した。ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用い、コロニーＰＣＲを記載されたように行った（Ｇｉａｅｖｅｒ，２００２）。全ての酵母培養は、示されたように、２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した、ＹＰＤ（１％Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物、２％Ｂａｃｔｏ−ペプトン、２％グルコース）またはＹＰＤ＋０．３Ｍ  ＫＣｌ中で成長させた。ジプロイドおよびハプロイドの選択は、２０μｇ／ｍｌ  Ｌ−メチオニン（ＣＭＳ−ｌｙｓ）または５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−リシン−ＨＣｌ（ＣＳＭ−ｍｅｔ）を補足した、ＣＳＭ−ｍｅｔ−ｌｙｓプレート（アミノ酸無しの．６７％酵母窒素塩基、０．０７％ＣＳＭ−ｍｅｔ−ｌｙｓドロップアウトミックス、２％グルコース、２％Ｂａｃｔｏ−寒天）を用いて行った。ＣＳＭ−ｍｅｔ−ｌｙｓドロップアウトミックスは、ＱＢｉｏＧｅｎｅから得た。酵母接合型テストでは、株をＳＤプレート（アミノ酸無しの０．６７％酵母窒素塩基、２％グルコース、２％Ｂａｃｔｏ−寒天）上で選択した。
【０１５８】
酵母接合。酵母株１０３２２（Δｍｎｎ１）を株７０３４（Δｍｎｎ４）、４４０６（Δｏｃｈｌ）、および１４５３４（Δｐｍｒ１）と接合させて、ジプロイド株ＤＩＰ−ｍｎｎ１ｍｎｎ４（ＭＡＴａ／α；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０：ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４／ＭＮＮ４；ＭＮＮ１／Ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４）、ＤＩＰ−ｍｎｎ１ｏｃｈ１（ＭＡＴａ／α；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０；ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４／ＯＣＨＩ；ＭＮＮ１／ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４）およびＤＩＰ−ｍｎｎ１ｐｍｒ１（ＭＡＴａ／α；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０；ｐｍｒ１：ｋａｎＭＸ４／ＰＭＲ１；ＭＮＮ１／ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４）を形成させた。ジプロイドは、ＣＳＭ−ｍｅｔ−ｌｙｓ上で選択し、記載されたように胞子形成した（Ｇｉａｅｖｅｒ，２００２）。胞子形成ジプロイドの子嚢をザイモリアーゼ１００Ｔ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で消化し、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されたようにランダム胞子分析を行った。ＤＩＰ−ｍｎｎ１ｍｎｎ４およびＤＩＰ−ｍｎｎ１ｐｍｒ１からの胞子をＹＰＤ上で平板培養し、他方、ＤＩＰ−ｍｎｎ１ｏｃｈ１からの胞子をＹＰＤ＋０．３Ｍ  ＫＣｌ上で平板培養した。得られたハプロイド胞子を、ＳＤ上の親株（ＢＹ４７１０およびＢＹ４７１１）と交差させることによって接合−タイプにつき、ＣＳＭ−ｍｅｔおよびＣＳＭ−ｌｙｓへのレプリカ平板培養によって栄養要求要件について選択した。Δｏｃｈ１突然変異を、３７℃にてＹＰＤ上でゆっくりとした成長によってスクリーニングし、他方、全てのＯＲＦノックアウトをスクリーニングし、コロニーＰＣＲを用いて確認した。最終二重突然変異体はΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４−９（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３Δ１、ｌｕｅ２Δ０、ｍｅｔ１５Δ０、ｕｒａ３Δ０、ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４、ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４）Δｍｎｎ１Δｏｃｈ１−３（Ｍａｔα、ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０、ｌｙｓ２Δ０、ｕｒａ３Δ０、ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４、ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４）およびΔｍｎｎ１Δｐｍｒ１−５（ＭＡＴα、ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０、ｌｙｓ２Δ０、ｕｒａ３Δ０、ｍｎｎ１：ｋａｎＭＡＸ４、ｐｍｒ１：ｋａｎＭＸ４）であった。
【０１５９】
ハプロイド二重突然変異体、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４−９およびΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１−３を接合させて、ジプロイド株ＤＩＰ−ｍｎｎ１ｍｎｎ４ｏｃｈ１（ＭＡＴａ／α；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０；，ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４／ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４；ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４／ＭＮＮ４；ＯＣＨ１／ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４）を形成し、続いて、前記したように、胞子形成、消化、ランダム胞子分析、および選択を行った。最後の三重突然変異体ハプロイドは：Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−１−２、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−１−３、およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０、ｍｅｔ１５Δ０、ｕｒａ３Δ０、ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４、ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４、ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４）；Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４ｏｃｈ１−２−４およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−６（ＭＡＴα、ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０、ｌｙｓ２Δ０、ｕｒａ３Δ０、ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４、ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４、ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４）；およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−２（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０、ｌｙｓ２Δ０、ｕｒａ３Δ０、ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４、ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４、ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４）であった。全てのクローンは、３’および５’末端において、ＰＣＲによって各ＯＲＦのＫａｎＭＸノックアウトについて確証した（Ｇｉａｅｖｅｔ，２００２）。
【０１６０】
２つのハプロイド三重突然変異体Δｍｍｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−４およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５を接合させて、ジプロイド三重突然変異体、Δｍｍｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ（ＭＡＴａ／α；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ／ＭＥＴ１５；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０；ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４／ｍｎｎ１：ｋａｎＭＸ４；ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４／ｍｎｎ４：ｋａｎＭＸ４；ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４／ｏｃｈ１：ｋａｎＭＸ４）を形成した。
免疫血清の調製：
酵母ザイモサンに対する抗体。野生型酵母のβ−グルカンおよびα−マンナンから構成される、酵母細胞壁抽出物であるザイモサンＡを用いてウサギを免疫化した。二匹のウサギを、週０において、ＣＦＡを含有する２００μｇのザイモサンＡで免疫化し、週２および４において、その後、４週間毎に、ＩＦＡを含有する１００μｇの抗原でブースター注射した。免疫血清を５週、および各ブースターから１週間後に集めた。得られた血清をプールし、プロテインＡ−アガロースで精製した。
【０１６１】
酵母糖蛋白質に対する抗体。合成ペプチドを用いて、注目する酵母蛋白質に対するウサギにおいて免疫血清を生じさせた。加速された免疫化スケジュールを用い、開始時における２００μｇの初期免疫化、および週２、４、６および１０における１００μｇ免疫化で、週５、７、８および１１においてテスト採血を行った。用いたペプチドの配列をリストする：ＰＳＴ１についての
【０１６２】
【数１】
2009509970.tif 000003
（配列番号：１０）、ＥＣＭ３３についての
【０１６３】
【数２】
2009509970.tif 000004
（配列番号：１１）、Ｇｐ３８についての
【０１６４】
【数３】
2009509970.tif 000005
（配列番号：１２）、Ｇａｓ１についての
【０１６５】
【数４】
2009509970.tif 000006
（配列番号：１３）、および
【０１６６】
【数５】
2009509970.tif 000007
（配列番号：１４）、Ｇａｓ５についての
【０１６７】
【数６】
2009509970.tif 000008
（配列番号：１５）、および
【０１６８】
【数７】
2009509970.tif 000009
（配列番号：１６）、およびＹＪＬ１７１ｃについての
【０１６９】
【数８】
2009509970.tif 000010
（配列番号：１７）および
【０１７０】
【数９】
2009509970.tif 000011
（配列番号：１８）。抗原性ペプチドカップルドＳｕｌｆｏＬｉｎｋゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、抗原特異的抗体を精製した。
【０１７１】
α１，３−結合マンノースに特異的な抗体。α１，３−結合マンノース残基に特異的な免疫血清は、わずかに変形して、従前に記載されているように調製した（Ｒａｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８（１３）：４６６０−６，１９７３およびＢａｌｌｏｕ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４５−１１９７−１２０３，１９７０）。簡単に述べれば、３．０ｘ１０７細胞／ｍｌで０．９％ＮａＣｌに懸濁させたｌｏｇ相ＩＮＶＳｃ１細胞を７０℃にて９０分間加熱−殺傷した。ウサギに、各々、週１、週２、週３および週４につき、０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、０．７５ｍｌおよび１．０ｍｌにて一週間につき３回、耳縁静脈にこの懸濁液を注射した。最後の注射から３日後に、ウサギから採血した。次いで、得られた血清をΔｍｎｎ１酵母細胞に吸着させた。各５ｍｌの血清を、５０ｍｌの０．９％ＮａＣｌ中の５ｇ（湿潤重量）の加熱−殺傷Δｍｎｎ１酵母と共にインキュベートした。アジ化ナトリウムを０．２％まで加え、回転混合しつつ、懸濁液を室温にて一晩インキュベートした。細胞を６，０００ｇにおいて２０分間遠心分離することによって除去し、吸着を反復した。最終血清を０．９％ＮａＣｌに対して透析し、０．２ミクロンフィルターで滅菌した。
【０１７２】
酵母全細胞についての炭水化物型の決定
材料。２Ｇ１２モノクローナル抗体は、Ｐｏｌｙｍｕｍ  Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ  Ｉｎｃ（Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ）から購入した。プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢコンジュゲートはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ヤギ抗−ウサギＩｇＧ  ＨＲＰはＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｓｒｃｈ（Ｗｅｓｅ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。
【０１７３】
免疫蛍光。ＹＰＤ＋０．３Ｍ  ＫＣＬ中で３０℃にて成長させたｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰおよびＩＮＶＳｃＩ細胞を１ｍｌの新鮮な４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、遠心分離によってペレット化した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ポリリシン−被覆スライドに移した。風乾の後、細胞を室温（ＲＴ）にて０．５％ＳＤＳと共に１５分間インキュベートした。単一染色では、ウサギ抗−ザイモサン抗体を１０μｇ／ｍｌまで希釈し、α１，３−結合マンノース抗−血清を１：５００希釈で用いた。これらの抗体を細胞と共に室温にて１時間インキュベートした。スライドを洗浄し、二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−コンジュゲーテッドヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡ）と共に室温にて１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、スライド上に設置した。共−局所化染色では、抗−ザイモサンおよび２Ｇ１２抗体を、各々、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞と共に１時間インキュベートした。スライドを洗浄し、プローブし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−コンジュゲーテッドヤギ抗−ヒトＩｇＧおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲーテッドヤギ抗−ウサギＩｇＧを二次抗体として用いて前記したようにスライド上に設置した。イメージは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐｅ蛍光顕微鏡（ＭｃＢａｉｎ，ＵＳＡ）を用いて得た。
【０１７４】
全−細胞ＥＬＩＳＡ。酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を加熱−殺傷全酵母細胞で行った。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰおよびＩＮＶＳｃＩ細胞を、０．９％ＮａＣｌ中で７０℃にて１時間加熱−殺傷し、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするためにＰＢＳ中に５．０ｘ１０７細胞／ｍｌまで希釈した。ＳＦ１６２株（ＡＲＲＲＰ）からのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０、および野生型酵母マンナン（Ｓｉｇｍａ）を５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５中に５μｇ／ｍｌまで希釈した。１００マイクロリットルの抗原を各ウェル中で室温にて一晩インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％チメロザール）でブロックし、湿潤チャンバー中で室温にて２時間インキュベートした。２回のｄＨ２Ｏすすぎの後、２Ｇ１２および抗−α１，３−マンノース抗体を、ブロッキング緩衝液中での３倍系列希釈にて１０μｇ／ｍｌで加え、室温にて一晩インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％チメロザール）で洗浄し、各々、２Ｇ１２または抗−α１，３−マンノースについて、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰまたはヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：１０，０００希釈と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ウェルを前記したように洗浄し、発色のためにＴＭＢと共にインキュベートし、ＨＣｌで停止させた。ＥＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、ＨＲＰ活性を４５０ｎｍにおける吸光度によって読んだ。
【０１７５】
グリカンプロファイリング。３０℃にて成長させたｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞を、０．９％ＮａＣｌ中で〜３．０ｘ１０７で細胞／ｍｌまで希釈した。細胞を７０℃にて１時間加熱−殺傷した。細胞からのＮ−結合グリカンをＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化によって放出した。放出されたＮ−結合グリカンをペルメチル化し、ＵＣＳＤにおけるＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  ＲｅｓｏｕｒｃｅによるＭａｌｄｉ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）によって分析した。
【０１７６】
２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質の同定および確認
ウエスタンブロット。ＩＮＶＳｃ１、Δｍｎｎ１、Δｍｎｎ４、Δｏｃｈ１、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４、Δｍｎｎ１ｏｃｈ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１の株からの酵母細胞を、ＹＰＤ＋０．３Ｍ  ＫＣｌ中で３０℃にて３．０のＯＤ６００まで成長させた。酵母細胞を１４，０００ｇにおいて２分間遠心分離した。２−容量の氷冷アセトンと共に−８０℃にて３０分間インキュベートすることによって、培養上清をアセトン沈殿に付した。試料を１４，０００ｇにおいて１５分間遠心分離し、上清を除去した。１５分間の風乾の後、ペレットを、元の試料容量の１／１０の２×  Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−試料緩衝液で５分間煮沸した。
【０１７７】
ＲＩＰＡ緩衝液に溶解させることによって、酵母細胞溶解物を調製した。簡単に述べれば、各１ｍｌの細胞ペレットを、１００μｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣ１、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、および１μｇ／ｍｌロイペプチン）に再懸濁させ、酸−洗浄ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）で１０分間ボルテックスすることによって細胞壁を破壊した。得られた溶解物を１３，０００ｇにおいて３０分間遠心分離して、いずれのデブリスも除去し、各々の蛋白質濃度を希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および０．１％ＳＤＳ）中で０．３ｍｇ／ｍｌまで希釈した。Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−緩衝液を１回加え、０．２４ｍｇ／ｍｌ蛋白質を含有する試料を５分間煮沸した。
【０１７８】
上清および細胞溶解物画分を４〜２０％グラジエントゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離に付し、２５０ｍＡのニトロセルロース膜に２時間で移した。示された希釈の、ＭＡｂ  ２Ｇ１２、および前記したようにウサギで生起させたポリクローナル抗体を含めた一次抗体、続いて、二次抗体、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用い、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＣＬ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ケミルミネセント検出を使用した。
【０１７９】
２Ｇ１２交差反応性蛋白質の部分的精製。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されたように、分別遠心分離を用い、内因性酵母蛋白質の細胞下位置を見積もった。ＩＮＶＳｃ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ株からのｌｏｇ−相細胞を前記したように３．０のＯＤ６００まで成長させた。各１ｍｌの細胞ペレットを、１００μｌのスクロース溶解緩衝液（０．４Ｍスクロース、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、および１μｇ／ｍｌロイペプチン）に再懸濁させた。等容量の酸−洗浄ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）を加え、１５分間の高速ボルテックスおよび氷浴インキュベーションを交互に行って細胞壁を破壊した。溶解物を５００ｇにて５分間遠心分離して、未溶解細胞および大きな凝集物をペレット化し、上清を２２，０００ｇにて３０分間遠心分離した。細胞質、ゴルジ複合体およびエンドソーム蛋白質を含有する得られた上清を分析用に貯蔵した。大部分の空胞、核、ＥＲおよび原形質膜蛋白質を含有するペレットを同様な容量のＰＢＳ＋１．０％Ｔｒｉｔｏｎに再懸濁させて、膜蛋白質を可溶化させた。画分を前記したように遠心分離して、可溶性および不溶性膜画分を分離した。
【０１８０】
レクチンアフィニティークロマトグラフィー。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）レクチンアフィニティークロマトグラフィーのために、９．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ−可溶性膜画分を、５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の１ｍｌのＣｏｎＡ−アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と共に４℃にて一晩インキュベートした。カラムをＴｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液で徹底的に洗浄した。ＣｏｎＡ−結合蛋白質を溶出するために、０．５Ｍメチルマンノ−ピラノシドを含む５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液をカラムに加え、続いて、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１．０％ＳＤＳを含む５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液を加えた。
【０１８１】
培養上清からの精製のために、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む３００ｍｌのΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５酵母上清を５ｍｌのＣｏｎＡ−アガロースカラム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）に負荷し、ＣｏｎＡ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣ１、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）、続いて、０．５Ｍメチルマンノ−ピラノシドを含むＣｏｎＡ洗浄緩衝液で十分に洗浄した。ＣｏｎＡ−結合蛋白質を溶出させるために、５ｍｌの２×ＳＤＳ負荷緩衝液をカラムに加えて５分間煮沸した。
【０１８２】
２次元ゲル電気泳動および質量分析。ＣｏｎＡ−アガロース精製蛋白質画分をＴＣＡで沈殿させ、２００μｌの尿素／チオ尿素再水和溶液（７Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、６０ｍＭ  ＤＴＴ；１％  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ  ｐＨ３−１０；０．０１％  ブロモフェノールブルー）中で再可溶化させた。ＩＰＧ  ＺＯＯＭ  ４−７  ＩＰＧストリップ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をシプロルビーゲルでは、１２０μｌの試料および２０μｌの再水和緩衝液（７Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、２％  ＣＨＡＰＳ。６０ｍＭ  ＤＴＴ、１％  Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ  ｐＨ３−１０、０．０１％  ブロモフェノールブルー）、およびウエスタンブロットでは、８０μｌの試料および６０μｌの再水和緩衝液で一晩再水和させた。ストリップをＺＯＯＭ  ＩＰＧ  Ｒｕｎｎｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷し、以下のようにフォーカスした：３０分間の２００Ｖ、２５分間の４５０Ｖ、２５分間の７５０Ｖ、および６０分間の２０００Ｖ。
【０１８３】
第二の次元では、軌道シェーカーにて、ＤＴＴを含有するＬＤＳ−平衡緩衝液中でＩＰＧストリップを１５分間で２回還元した。次いで、ストリップを、ヨードアセトアミドを含有するＬＤＳ−平衡緩衝液中で１５分間アルキル化し、ＭＥＳ泳動緩衝液にて、４〜１２％グラジエントアクリルアミドゲルを用いるＩＰＧ  ＺＯＯＭシステムで電気泳動に付した。ゲルは、色素前方部がゲルの底からほぼ０．３ｃｍまで移動するまで電気泳動に付した。
【０１８４】
シプロルビー染色では、ゲルを４０％メタノール、１０％酢酸中で１時間固定し、シプロルビー蛍光染色にて一晩染色した。脱色溶液を１回交換してゲルを１０％メタノール、６％酢酸中で１２０分間脱色し、以下のパラメーターで：５３２ｎｍの励起波長、６０５ｎｍの発光波長、および１００μｍの分解能にて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＰｈａｒｏｘＦＸレーザーイメージャーで解像した。
【０１８５】
ウエスタンブロットでは、第二の次元の泳動直後に、ゲルを移動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浸漬した。蛋白質をニトロセルロースに移し、１μｇ／ｍｌにおいて２Ｇ１２でプローブした。
【０１８６】
２Ｇ１２によって検出された２Ｄブロット上の蛋白質は、シプロルビーで染色されたスポットに合致した。合致するスポットをスライスし、トリプソンでのゲル中で消化に付した。消化されたペプチドをＮａｎｏ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって分析した。前記実験は、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄによって行った。
【０１８７】
免疫沈澱。培養上清および細胞溶解物は、前記したように、ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５から調製した。これらの試料は、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂコンジュゲートとの室温での２時間のインキュベーションによって予め清澄化した。抗原−抗体複合体の形成では、１０μｇの２Ｇ１２を細胞溶解物または培地試料いずれかに加え、シェーカーにて室温にて１時間インキュベートした。インキュベーションの後、２０μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂコンジュゲートを抗原−抗体複合体に加え、シェーカーにて室温にて１時間再度インキュベートした。試料を１０，０００ｇで５分間回転させ、上清を吸引した。ビーズを８００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、４０μｌの１×ＳＤＳ試料緩衝液と共に沸騰させることによって、結合した蛋白質を溶出させた。全ての試料を４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、ＥＣＭ３３、ＰＳＴ１、ＧＰ３８、ＹＪＬ１７１Ｃ、Ｇａｓ１およびＧａｓ５を含めた同定された酵母糖蛋白質に対する抗体を用いてウエスタン分析用にブロットした。
【０１８８】
Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の生物情報分析
Ｎ−結合グリコシル化部位の分析。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムにおける、および実験で同定された糖蛋白質上のＮ−結合グリコシル化部位を、我々が最近開発したソフトウェアを用いて分析した。
【０１８９】
Ｏ−結合グリコシル化部位の分析。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃで利用可能な、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋの生物学配列分析センター（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ３．１を用い、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムにおけるいくつかの蛋白質上の、および実験で同定された糖蛋白質上のＯ−結合グリコシル化部位を分析した。
【０１９０】
酵母三重突然変異体で生産されたｇｐ１２０のクローニング、発現、特徴付け
試薬。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、ｐＪＲ−ＦＬｓｙｎｇｐ１２０およびｐＹＵ−２プラスミドはＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＡＲＲＲＰ）から入手した。アミノ酸無しの酵母窒素塩基および−ＵｒａＤｒｏｐｏｕｔミックスは、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手した。ＨＩＶ−１ＩＩＩＢからのｇｐ１２０に対するウサギポリクローナル抗体（抗−ｇｐ１２０−ＩＩＩＢ）はＶｉｒｏｓｔａｔ  Ｉｎｃ．から入手した。ＨＩＶ−１ＹＵ−２に対するもう一つのウサギポリクローナル抗体（抗−ｇｐ１２０−ＹＵ２）は合成されたペプチド、ＣＥＱＭＨＥＤＩＩＳＬＷＤＱＳＬＫ（配列番号：１９）を用いてイン・ハウス製造し、Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）にカップリングされたペプチドを用いてアフィニフィー精製した。
【０１９１】
α−接合因子およびｇｐ１２０のＰＣＲクローニング。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−接合因子（ＭＦα）のシグナル配列を、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の上流に付加した。ＭＦαは、各々、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を付加させた、プライマーＭＦα１−Ｋｐｎ−５（
【０１９２】
【数１０】
2009509970.tif 000012
（配列番号：２０））、およびＭＦα１−Ｂａｍ−３（
【０１９３】
【数１１】
2009509970.tif 000013
（配列番号：２１））を用いるＰＣＲによって、（ＩＮＶＳｃ１から抽出された）全酵母ＤＮＡからクローン化した。この断片は、ｇｐ１２０からシグナル配列を除去するためのＫｅｘ２切断部位を含有する。ＰＣＲは、製造業者のプロトコルに従い、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。標準的な分子生物学技術を用い、ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に消化されたｐＹＥＳ２／ＣＴプラスミドに連結した。得られたプラスミドはｐＹＥＳ２／ＣＴ−αであった。
【０１９４】
ＪＲ−ＦＬについてのコーディング配列は、各々、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を付加した、プライマーＪＲＦＬ−Ｅｃｏ−５（
【０１９５】
【数１２】
2009509970.tif 000014
（配列番号：２２））およびＪＲＦＬ−Ｘｂａ−３（
【０１９６】
【数１３】
2009509970.tif 000015
（配列番号：２３））を用いるＰＣＲによってｐＪＲ−ＦＬｓｙｎｇｐ１２０から増幅した。ＹＵ−２についてのコーディング配列は、各々、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を付加した、プライマーＹＵ２−Ｅｃｏ５（
【０１９７】
【数１４】
2009509970.tif 000016
（配列番号：２４））およびＹＵ２−Ｘｂａ３（
【０１９８】
【数１５】
2009509970.tif 000017
（配列番号：２５））を用いてｐＹＵ−２から増幅した。ｇｐ１２０  ＰＣＲ産物を、前記したように、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの消化にて、ｐＹＥＳ２／ＣＴ−αにクローン化した。最終プラスミドはｐＹＥＳ２／ＣＴ−α−ＪＲＦＬ（ｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０）およびｐＹＥＳ２／ＣＴ−α−ＹＵ２（ｐＹＵ２−ｇｐ１２０）であった。
【０１９９】
Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５酵母の酢酸リチウム形質転換。プラスミドｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０およびｐＹＵ２−ｇｐ１２０を用いて、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５酵母細胞を形質転換した。簡単に述べれば、ＹＰＤ＋０．３Ｍ  ＫＣｌ中で成長させた酵母の一晩培養物１．５ｍｌをペレット化した。〜５０μｌを除いた全ての上清を除去し、細胞を再懸濁させた。次いで、２μｌの１０ｍｇ／ｍｌ単一標準サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、続いて、１μｇのｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０またはｐＹＵ２−ｇｐ１２０を加えた。ボルテックス後、５００μｌのＰＬＡＴＥ混合物（４０％  ＰＥＧ−４０００、１００ｍＭ  ＬｉＡｃ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、および２０μｌの１Ｍ  ＤＴＴを加え、混合物を室温にて４時間インキュベートした。細胞に４２℃で１０分間熱ショックを与え、細胞をペレット化し、１００μｌの滅菌ｄＨ２Ｏに再懸濁させた。細胞をｕｒａ／グルコース（２％グルコース、アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、０．２％−Ｕｒａ  Ｄｒｏｐｏｕｔミックス、２％Ｂａｃｔｏ−寒天）上で平板培養した。コロニーが出現するまでプレートを３０℃にてインキュベートした。ＰＣＲをコロニーに対して直接用いて、ｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０形質転換体についてはプライマーＭＦα１−Ｋｐｎ−５およびＪＲＦＬ−Ｘｂａ−３、およびｐＹＵ２−ｇｐ１２０についてはＭＦα１−Ｋｐｎ−５およびＹＵ２−Ｘｂａ−３を用いて各プラスミドの存在を確認した。
【０２００】
Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母におけるｇｐ１２０蛋白質の発現。ｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０およびｐＹＵ２−ｇｐ１２０で形質転換された三重突然変異体酵母細胞を、ｕｒａ／グルコース培地（２％グルコース、アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、０．２％−Ｕｒａ  Ｄｒｏｐｏｕｔミックス）中でｌｏｇ相まで成長させた。細胞を遠心分離し、ｕｒａ／ガラクトース培地（２％ガラクトース、アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素塩基、０．２％−Ｕｒａ  Ｄｒｏｐｏｕｔミックス）で２回洗浄し、ＯＤ６００＝０．４において−ｕｒａ／ガラクトースに再懸濁させた。細胞を３０℃で成長させ、培地の試料を異なる時点で採取して、蛋白質誘導についてテストした。
【０２０１】
酵母発現糖蛋白質の精製
硫酸アンモニウム沈殿。Δｍｎｎ１Δｐｍｒ１からの酵母培養上清中のＰＳＴ１蛋白質、および形質転換されたΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１で発現されたｇｐ１２０を集め、３０００ｇにて４℃において１０分間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＡｌｌｅｇｒａＴＭ  ６４Ｒ，ローターＦ０６５０）して、いずれの不溶性粒子も除去した。上清をきれいなビーカーに移し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを加え、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を用いてｐＨをｐＨ７．４に調整した。４℃にて５５％飽和の最終濃度に到達するまで攪拌しつつ、硫酸アンモニウムをゆっくり加えた。溶液をさらに３０分間攪拌し、１５，０００×ｇにおいて４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、１５，０００×ｇにおける４℃での１時間の遠心分離によって不溶性物質を除去した。この物質をＡＳ５５沈殿と命名した。４℃における９０％飽和の最終濃度に到達するまで攪拌しつつ、硫酸アンモニウムを５５％ＡＳ４上清にゆっくり加えた。ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、１５，０００×ｇにおける４℃での１時間の遠心分離によって不溶性物質を除去した。この物質をＡＳ９０沈殿と命名した。５ｍｌのＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＡＳ５５およびＡＳ９０沈殿を５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に脱塩し、蛋白質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０２０２】
酵母発現ｇｐ１２０の免疫アフィニティー精製。１ｍｌゲル当たり５ｍｇ抗体にて、製造業者のプロトコルに従い、抗−ｇｐ１２０−ＩＩＩＢを臭化シアン−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲートした。ＰＢＳでカラムを充分に洗浄した後、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞からのＡＳ５５試料を免疫アフィニティーカラムにて室温で２時間インキュベートした。フルースローを集め、カラムをＰＢＳで再度洗浄した。結合した蛋白質を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で、５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５を含有する１ｍｌ画分に溶出させた。２Ｇ１２および抗−ｇｐ１２０−ＹＵ２を用いるウエスタンブロットによって、これらの画分をｇｐ１２０についてテストした。ｇｐ１２０含有画分をプールし、ＡＳ５５−ＡＰと命名した。
【０２０３】
カチオン−交換クロマトグラフィー。別々のクロマトグラフィーを異なる試料について、ｇｐ１２０精製で用いるＡＳ５５−ＡＰにて、およびＰＳＴ１精製で用いるＡＳ９０にて行った。５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化した。試料を１ｍｌ／分でカラムに負荷し、１５ｍｌの５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄した。１ｍｌ／分の流速にて、蛋白質を、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５中の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの８０−ｍｌグラジエントで溶出させた。２ｍｌの画分を徹底的に集め、ドットブロットアッセイを使用して、３μｌの試料を所望の糖蛋白質の存在についてテストした。有意な量の蛋白質を呈する画分をプールし、ＧＰ−ＩＥＣ−５５およびＧＰ−ＩＥＣ−９０と命名した。これらの画分を、前記したように、糖蛋白質のＣｏｎＡ精製を用いてさらに精製した。蛋白質を、６０分間のインキュベーションにて、１Ｍメチルマンノピラノシドに溶出させた。
【０２０４】
糖蛋白質のゲル濾過クロマトグラフィー。最終工程として、２つのＧＰ−ＩＥＣ−５５およびＧＰ−ＩＥＣ−９０画分を負荷緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣ１、５ｍＭ  ２−ｂＭＥ、ｐＨ７．５）に脱塩し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって〜１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮した。１５０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−ＨＲ−２００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を同一緩衝液で平衡化させ、ＧＰ−ＩＥＣプールをカラムに負荷した。蛋白質を０．３ｍｌ／分の流速にて負荷緩衝液で溶出させ、２ｍｌの画分を集め、ドットプロットアッセイを使用して、各画分の３μｌ試料を糖蛋白質の存在についてテストした。有意な量の糖蛋白質を呈する画分をプールし、集合的に  ＧＰ−ＳＨＲ２００−５５およびＧＰ−ＳＨＲ２００−９０と命名した。以下の標準を用い、濾過カラムから共溶出させた：ＩｇＧ（ＭＷ１５０ｋＤ）、ＡＰ（ＭＷ１４０ｋＤ）、卵白アビジン（ＭＷ６８）およびストレプトアビジン（ＭＷ５３）。
【０２０５】
グリカンプロファイリング。各々、精製されたｇｐ１２０  ＰＳＴ１を含有するＧＰ−ＳＨＲ２００−５５およびＧＰ−ＳＨＲ２００−９０画分をＰＮＧａｓｅ  Ｆで消化して、すべてのＮ−結合グリカンを放出させた。これらのグリカンをペルメチル化し、ＵＣＳＤにおけるＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＦａｃｉｌｉｔｙによるＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）によって分析した。
【０２０６】
免疫化、およびα１，２−結合末端マンノースに特異的な抗体の調製
酵母全細胞を用いるα１，２−結合マンノースに対する抗体の生起。三重突然変異体（Ｒａｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８（１３）：４６６０−６，１９７３；およびＢａｌｌｏｕ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４５：１１９７−１２０３，１９７０）を用い、α１，２−結合マンノース残基に特異的な免疫血清を調製した。簡単に述べれば、０．９％ＮａＣｌ中に３．０×１０７細胞／ｍｌで懸濁させたｌｏｇ相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ−ＤＩＰを７０℃にて９０分間加熱殺傷した。ウサギに、この懸濁液を、各々、週１、週２、週３および週４において、０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、０．７５ｍｌおよび１．０ｍｌにて一週間に３回耳縁静脈に注射した。週２、３および４についての最後の注射から３日後にウサギから採血した。残りの４週間後、ウサギに、週９、週１０、および週１１にて０．５ｍｌ、０．７５ｍｌおよび１．０ｍｌで一週間に３回耳縁静脈に同一懸濁液を注射した。４回目の最後の採血は、最後の注射から３日後に集めた。得られた血清を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってｇｐ１２０についてテストした。
【０２０７】
酵母細胞抽出物を用いるα１，２−結合マンノースに対する抗体の生起。三重突然変異体の膜画分を用いてα１，２−結合マンノース残基に特異的な免疫血清を調製した。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ株からのｌｏｇ−相細胞を酸−洗浄ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）を用い、スクロース溶解緩衝液（０．４Ｍ  スクロース、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２３ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌロイペプチン）中に溶解させた。溶解物を５００ｇにて５分間遠心分離して、未溶解細胞および大きな凝集体をペレット化し、上清を２２，０００ｇで３０分間遠心分離した。ほとんどの空胞、核、ＥＲおよび原形質膜蛋白質を含有する得られたペレットを同様な容量のＰＢＳ＋１．０％Ｔｒｉｔｏｎに再懸濁させて、膜蛋白質を可溶化させた。画分を前記したように遠心分離して、Ｔｒｉｔｏｎ−可溶性および−不溶性膜画分を分離した。２匹のウサギの４つの群をこれらの画分で免疫化し、一つの群は野生型（ＩＮＶＳｃ１）のＴｒｉｒｏｎ−可溶性画分で、２つの群は三重突然変異体のＴｒｉｔｏｎ−可溶性画分で、および一つの群は三重突然変異体のＴｒｉｔｏｎ−不溶性画分で免疫化した。加速された免疫化スケジュールを用い、開始時には、２００μｇの初期免疫化、および週２、４、６および１０においては１００μｇ免疫化であり、週５、７、８および１１においてはテスト採血を行った。得られた血清をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってｇｐ１２０結合についてテストした。
【０２０８】
加熱−殺傷全細胞酵母に対する抗血清の吸着。α１，２結合マンノース残基に特異的な抗体を豊富とするために、次いで、ｇｐ１２０結合を示したいずれの血清もΔｏｃｈ１およびＩＮＶＳｃ１（ＷＴ）酵母細胞に吸着させた。各１ｍｌの血清を、５ｍｌの０．９％ＮａＣｌ中で、１．０〜２．０ｇ（湿潤重量）の加熱−殺傷Δｏｃｈ１および／またはＷＴ酵母と共にインキュベートした。アジ化ナトリウムを０．２％まで加え、懸濁液を回転混合しつつ、室温にて一晩インキュベートした。細胞を２０分間の６，０００ｇでの遠心分離によって取り出し、吸着を反復した。最終血清を０．９％ＮａＣｌに対して透析し、０．２ミクロンフィルターで滅菌した。次いで、抗体をプロテインＡ−アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製し、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってｇｐ１２０結合について再度テストした。
【０２０９】
α１，２−結合マンノース残基に対する抗体のアフィニティー精製。α１，２−結合マンノース残基に特異的な抗体をさらに精製するために、ＥＬＩＳＡによってｇｐ１２０結合を示したいずれかの吸着された抗体からの血清を、三重突然変異体からのＣｏｎＡ−溶出蛋白質を用いて精製した。簡単に述べると、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５細胞からの培養上清、および細胞溶解物を、前記したように、ＣｏｎＡレクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。各画分（上清および溶解物）からの蛋白質を、１ｍｇゲル当たり１０ｍｇ合計蛋白質にて、製造業者のプロトコルに従い、臭化シアン−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ）に別々にコンジュゲートさせた。ＰＢＳでのカラムの十分な洗浄の後に、選択された血清の１０〜２０ｍｌを濾過滅菌し、５ｍｌ当たり２時間、室温にて培地と共にインキュベートした。フロースルーを集め、カラムをＰＢＳで再び洗浄した。５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５を含有する１ｍｌ画分へ、結合した抗体を１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。ＰＢＳに対する透析の後、これらの抗体をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってｇｐ１２０結合についてテストした。
【０２１０】
ｇｐ１２０反応性およびシュードウイルス中和についての免疫血清の分析
ｇｐ１２０に対するＥＬＩＳＡ。酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を行って、抗−α１，２−結合マンノース血清のｇｐ１２０特異性についてテストした。（Ｄｒ．Ｄｏｍｓの研究所、ＡＲＲＲＰおよび商業的会社を含めた種々の源からの）異なるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０蛋白質を、５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５中で３〜５μｇ／ｍｌまで希釈した。１００マイクロリットルの抗原を各ウェル中で室温にて一晩インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％チメロザール）でブロックし、湿潤チャンバー中で室温にて２時間インキュベートした。２回のｄＨ２Ｏすすぎの後、２Ｇ１２、およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰに対する抗−血清をブロッキング緩衝液中で種々の希釈で加え、室温にて一晩インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％チメロザール）で洗浄し、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰまたはヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：１０，０００希釈と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ウェルを前記したように洗浄し、発色のためにＴＭＢと共にインキュベートし、ＨＣｌで停止させた。Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、ＨＲＰ活性を４５０ｎｍにおける吸光度によって読んだ。ＣＨＯ細胞で発現されたＳＦ１６２ｇｐ１２０は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＡＲＲＲＰ）を通じて入手した。２９３Ｔ細胞で発現されたＡＤＡ、ＪＲ−ＦＬ、およびＹＵ２  ｇ１２０はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａのＤｒ．Ｄｏｍｓから入手した。
【０２１１】
前記で用いたのと同様な方法で、哺乳動物細胞で発現されたｇｐ１２０蛋白質の結合アフィニティーを、定量的ＥＬＩＳＡによって発現された三重突然変異体酵母と比較した。異なる株からの、（Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１で発現された）ｇｐ１２０−酵母、および（２９３Ｔ細胞で発現された）ｇｐ１２０−２９３の同等量を用いて、マイクロウェルプレートを被覆する。次いで、２Ｇ１２、抗−ｇｐ１２０−ＩＩＩＢ、および抗−ｇｐ１２０−ＹＵ２を用いてプローブする。同等量の蛋白質を捕獲し、および結合抗体を連続的に希釈することによって、各ｇｐ１２０に対する結合アフィニティー２Ｇ１２を計算し、比較する。
【０２１２】
中和アッセイ。２９３Ｔ／１７細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。プラスミドｐＮＬ４−３．ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−はＤｒ．Ｌａｎｄａｕの研究所から購入した。シュードウイルスを生産するのに用いた種々のＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ｇｐ１６０プラスミドは、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｆｅｒｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＩＨ，ＡＲＲＲＰ）から入手した。シュードウイルス感染性で用いるＣＣＲ５およびＣＤ４を発現するＵ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５およびＵ８７．ＣＤ４．ＣＸＣＲ４細胞系は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａのＤｒ．Ｄｏｍｓの贈物であった。
【０２１３】
シュードウイルスについては、製造業者の指示に従い（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リン酸カルシウム方法を用い、７０〜８０％密集２９３Ｔ／１７細胞の１０ｃｍ皿を、ｇｐ１６０  ｅｎｖ−発現プラスミドおよび補充ウイルスゲノム―レポーター遺伝子ベクター、ｐＮＬ４−３．Ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−で共トランスフェクトした。Ｅｎｖ蛋白質でシュードタイプ分けした組換えウイルスを含有する培養上清をトランスフェクションから４８時間後に収穫し、遠心分離し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、−８０℃で凍結した。シュードウイルス感染性を測定するために、収穫された上清のアリコートを用いて、ＣＣＲ５（Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５）またはＣＸＣＲ４（Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＸＣＲ４）発現細胞系の９６ウェルプレート当たり１０，０００細胞を感染させた。単一ラウンドの感染した細胞からのルシフェラーゼ活性を、製造業者の指示に従って、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＶｅｒｉｔａｓマルチプレートルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）機器を用いて細胞培養の７２時間後に測定した。三連ウェルについての平均相対的光単位（ＲＬＵ）を決定し、シュードウイルスストック≧２ｘ１０５ｒｌｕ／ｍｌを引き続いての中和アッセイで用いた。
【０２１４】
中和アッセイでは、単一ラウンドのシュードタイプ・レポーター・アッセイを用い、動物血清または精製された抗体を、ＨＩＶ−１ウイルスに対する中和抗体（ＮＡｂ）活性についてアッセイした。簡単に述べると、ＣＣＲ５（Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５）またはＣＸＣＲ４（Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＸＣＲ４）を発現する細胞系を９６平坦底プレートで１０，０００細胞／ウェルにおいて平板培養し、一晩培養した。血清でのテストでは、使用前に、試料を５６℃にて４５分間加熱−不活化した。翌日、分離された９６ウェル平坦底プレートにて、２５μｌの適切に希釈されたシュードウイルス懸濁液を、三連にて、２５μｌの系列希釈抗体試料と混合し（これは、最終抗体濃度を精製された抗体では２００ｕｇ／ｍｌまたは５０ｕｇ／ｍｌ、または血漿試料では１：５希釈とする）、３７℃にて１時間インキュベートする。抗体／ウイルス混合物のインキュベーションの後に、培地を予めインキュベートされたプレート細胞から取り出し；抗体混合物を細胞に加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーションの後、次いで、混合物を細胞から取り出し、新鮮な培地で交換した。等容量（通常、５０〜１００ｕｌ）のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を培養細胞に加えることによって、細胞を感染から７２時間後に収穫し、製造業者によって記載されているように、Ｖｅｒｉｔａｓマイクロプレートルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることによって（ＲＬＵで表す）、ルシフェラーゼ活性を測定した。阻害のパーセンテージは、以下の式：［（ウイルス対照ウェル−テスト試料ウェル）／（ウイルス対照ウェル−細胞対照）×１００］を用いて、テストされた試料ウェル（細胞／抗体／ウイルス）、ウイルス対照、（細胞／ウイルス）、および細胞対照（細胞のみ）ウェルでルシフェラーゼ活性測定を平均することによって各試料について決定した。
【０２１５】
実施例２  酵母糖蛋白質ＰＳＴ１は、破壊されたｐｍｒ１遺伝子、あるいは破壊されたｐｍｒ１およびｍｎｎ１の双方の遺伝子を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異体株と交差反応する。
【０２１６】
酵母突然変異体株における２Ｇ１２交差反応性蛋白質のスクリーニング。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリコシル化経路は広く研究されている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムにおけるほとんど全てのＯＲＦの欠失（Ｗｉｎｚｅｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：９０１−９０６，１９９９；Ｇｉａｅｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８７−３９１，２００２）、および各突然変異体株の入手可能性は、酵母におけるグリカンプロフィールの変化を調べる優れた機会を提供した。異なる突然変異体を、まず、２Ｇ１２を用い、突然変異体のいずれかにおける可能な交差反応性糖蛋白質についてスクリーニングした。図１０に示すように、Ｍｎｓ１，Ｏｃｈ１，Ｍｎｎ９，またはＰｍｒ１を含めた、ＥＲおよびゴルジでの炭水化物のプロセスに関与する酵素の欠失を持つ５つの単一突然変異体からの細胞溶解物および培養基をテストした。結果は、シグナルは、陽性対照として用いたＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖蛋白質（２９３Ｔ−発現）からのそれよりも弱かったが、ほぼ１００および１２０ｋＤａにおける２つの弱いバンドがΔｐｍｒ１突然変異体の細胞溶解物で検出された。
【０２１７】
ＰＭＲ１遺伝子は、Ｃａ２＋およびＭｎ２＋のゴルジへの輸送に必要であって、およびＣａ２＋依存性蛋白質ソーティングおよびプロセッシングに関与する高親和性Ｃａ２＋／Ｍｎ２＋Ｐ−型ＡＴＰａｓｅをコードする（Ｒｕｄｏｌｐｈら、Ｃｅｌｌ．５８：１３３−１４５，１９８９）。ＰＭＲ１遺伝子の欠失は、ＥＲからの直接的ないくらかの糖蛋白質野分泌を引き起こし、それにより、ゴルジ装置およびその中での全てのグリカンプロセッシングを迂回すると考えられる（Ｒｕｄｏｌｐｈら、Ｃｅｌｌ．５８：１３３−１４５，１９８９）。この結果、ポリマンノース外側鎖およびＮ−結合グリカン上の末端α―１，３−結合キャップの欠如をもたらすであろう（Ｖｅｒｏｓｔｅｋら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（７）：６７１−８１，１９９５）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ―接合因子シグナル配列を含有する、ＹＵ−２株からのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０遺伝子を用いて、Δｐｍｒ１酵母を形質転換した。図１１Ａに示すように、２４時間の培養後の培地中のほぼ１００ｋＤａ蛋白質がウエスタンブロットにおいて２Ｇ１２によって認識された（本明細書中においては、ＹＰ１００と呼ぶ）。平行成長条件において、２Ｇ１２反応性ＹＰ１００は形質転換された細胞からの培地中に示されたが、３〜９日の培養後の非−形質転換ｐｍｒ１突然変異体細胞からの培地中では検出できなかった（図１１Ｂ）。９０〜１６０ｋＤａの範囲のいくつかのバンドはこの実験においては非―形質転換および形質転換細胞で示されたが、他の実験では示されなかった。これらの結果は、ｇｐ１２０プラスミドの形質転換が、この蛋白質の発現または分泌の増加を引き起こすことを示唆する。
【０２１８】
ｇｐ１２０形質転換ｐｍｒ１突然変異体における２Ｇ１２反応性蛋白質（ＹＰ１００）は、最初、以下の証拠のためｇｐ１２０糖蛋白質であると考えられた：２Ｇ１２検出可能なバンドはｇｐ１２０プラスミドの形質転換によって誘導され（図２Ａ、１１Ａ）、該バンドはｇｐ１２０形質転換酵母細胞で検出されたが、非―形質転換細胞では検出されず（図１１Ｂ）、それは糖蛋白質の９６〜１００ｋＤａの予測されたサイズを示し、（図２Ａおよび１１）、それはグリコシル化無しのｇｐ１２０と同様な分子量である〜６０ｋＤａの予測されたＥｎｄｏ  Ｈ消化蛋白質サイズを示した（図３）。さらなる実験は、誘導されたＹＰ１００蛋白質が事実ｇｐ１２０であるという疑いを提示した。というのは、ｇｐ１２０に対する抗体を用いて矛盾する結果が観察されたからである（データは示さず）。図１０に示すように、Δｐｍｒ１酵母細胞溶解物における〜１００ｋＤａおよび１２０ｋＤａにおける２つの弱いバンドが２Ｇ１２によって認識された。これらの結果は、２Ｇ１２反応性１００ｋＤａバンドは、発現された外因性ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０または未知の内因性酵母蛋白質いずれかである可能性を有することを示す。
【０２１９】
Ｐｍｒ１突然変異体における２Ｇ１２交差反応性蛋白質の同定。２Ｇ１２によって認識される蛋白質がｇｐ１２０または酵母糖蛋白質であるかを決定するために、レクチンアフィニティークロマトグラフイー（図２Ｂおよび１２）およびゲル濾過を用いて、Ｙｐ１００を部分的に精製した。精製された物質中の蛋白質はＮａｎｏ−ＬＣ−ＭＳ−ＭＳを用いて同定した。６つのペプチドは未知の酵母蛋白質、ＰＳＴ１に属すると同定された（図１３）が、いくつかの他のペプチドはｇｐ１２０および酵母蛋白質に合致した。ＰＳＴ１蛋白質はそのカルボキシ末端においてシグナリングペプチドおよびＧＰＩアンカーを含有し、これは、それが細胞壁または膜蛋白質であり、分泌できることを示す。成熟蛋白質の４００アミノ酸において１５の潜在的Ｎ−結合糖蛋白質部位があり、これは、３．８％密度を占め、ＰＳＴ１がかなりグリコシル化されていることを示す。
【０２２０】
Ｙｐ１００が事実ＰＳＴ１であることを確認するために、ポリクローナル抗体を合成ペプチドに対してウサギで生起させ、抗原免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。部分的に精製されたＹｐ１００蛋白質を２Ｄ、続いてクーマシーブルー染色およびウエスタンブロット分析によって分離した。図１４Ａは、１００ｋＤａの分子量、および９〜１０の等電点（ＰＩ）の圧倒的なスポットを示す。同一スポットは２Ｇ１２（図１４Ｂ）および抗―ＰＳＴ１ポリクローナル抗体（図１４Ｃ）によって同一に認識された。ＰＳＴ１蛋白質は９．２５の計算されたＰＩを有する。これらの全ての結果は合致し、２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質は酵母糖蛋白質ＰＳＴ１と非常に似ていることを示唆する。これらの結果は、ＨＩＶ−特異的中和抗体、２Ｇ１２に対する結合親和性を示す内因性酵母蛋白質の最初の証拠を示す。
【０２２１】
ＰＳＴ１の２Ｇ１２特異性をさらに確認するために、高マンノース型のグリカンを特異的に切断する酵素、エンド−Ｌ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）でＹＰ１００を消化した。クーマシーブルーおよび抗−ＰＳＴ１抗体染色によって図１５に示されるように、消化の後、ＰＳＴ１蛋白質の移動は〜１００ｋＤａから〜６０ｋＤａに変化した（レーン２および４をレーン３および５と比較）。ＰＳＴ１蛋白質はＥｎｄｏ  Ｈ消化の後に抗―ＰＳＴ１によって依然として認識されたが、それはもはや２Ｇ１２によって認識されず（レーン７）、これは、ＰＳＴ１蛋白質上のＮ−グリカンが、ＨＩＶ−１中和ＭＡｂ  ２Ｇ１２によって認識されるエピトープであることを示唆する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＥｎｄｏ  Ｈ消化の後におけるＰＳＴ１の分子量（〜６０ｋＤａ）は、成熟蛋白質からのアミノ酸の計算された分子量（４１ｋＤａ）よりも高い。これはＯ−結合グリコシル化のためであり得る。というのは、ＰＳＴは潜在的なＯ−結合グリコシル化部位を含有するからである（図３３）。これらの結果は、さらに、図２および１１に示された２Ｇ１２−反応性蛋白質が、現実に、未知の機能を持つ酵母糖蛋白質ＰＳＴ１であることを確認した。この蛋白質は、外因性遺伝子、少なくともＨＩＶ−１  ｇｐ１２０  Ｅｎｖの形質転換によって誘導される。
【０２２２】
二重突然変異体の創製、および二重突然変異体におけるＰＳＴ１の特徴付け。ｇｐ１２０上の２Ｇ１２の結合部位は、少なくとも３つのＮ−結合グリカンのクラスターで見出される末端α１，２−結合マンノース残基の立体配座として同定された。酵母におけるΔｐｍｒ１突然変位はゴルジを迂回すると考えられ、かくして、酵母蛋白質上にはＭａｎ８グリカンのみが残る。しかしながら、他の証拠は、この突然変異が初期ゴルジ区画を迂回できるに過ぎず、あるいはＣａ＋＋の得られた変化はゴルジに見出される酵素の効率に影響することを示唆する。これを踏まえると、ゴルジにおける２Ｇ１２結合のための最も弱いグリコシル化酵素の１つはＭｎｎ１ｐであり、これは、α１．２残基の全ての末端α１，３−結合マンノースキャッピングを担う（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７２：３９１２−３９１６，１９７５）。ＰＳＴ１のこのキャッピングを妨げるために、酵母二重突然変異体株Δｍｍｎ１Δｐｍｒ１を作成した。ＭＮＮ１およびＰＭＲ１遺伝子におけるＯＲＦノックアウトを持つ酵母欠失株を接合させ、胞子を形成させて、Δｍｍｎ１Δｐｍｒ１ハプロイドを生じさせた。Δｍｍｎ１およびΔｐｍｒ１表現型の選択および確認のために、コロニーＰＣＲを行った。（データは示さず）。遺伝子欠失当たり４つのユニークなプライマーは、各ＯＲＦが完全に欠失しており、ＫａｎＭＸ４モジュールで置き換えられていることを確認した。
【０２２３】
５つの二重突然変異体株（Δｍｍｎ１Δｐｍｒ１）を、２Ｇ１２でのウエスタンブロットを用いてスクリーニングした。予測されるように、従前の実験で見られた〜１００ｋＤａバンド（図１０参照）は、全ての５つの突然変異体株において２Ｇ１２によって検出された（図１６）。事実、シグナルの増強があるように見え、これは、末端α１，３−Ｍａｎキャップの喪失およびその蛋白質上のより多くのα１，２−Ｍａｎの露出によるものらしい。この仮説は、図１７および１８に示される以下の実験的研究によって確認された。
【０２２４】
グリコシル化経路に関与する遺伝子の欠失の効果を分析するために、他の酵母単一突然変異体と共に、この二重突然変異体におけるＰＳＴ１蛋白質でのサイズ変化を調べた。異なる株からの細胞溶解物（図１７Ａ、上部）および培養基（図１７Ｂ、上部）を抗―ＰＳＴ１ポリクローナル抗体でのウエスタンブロットを用いて分析した。ＰＳＴ１は、Δｍｍｎ１Δｐｍｒ１二重突然変異体の細胞溶解物でのみ検出された。培養基は、野生型株における≧２００ｋＤａでの超グリコシル化ＰＳＴ１の存在を示す。Ｏｃｈ１突然変異体におけるＰＳＴ１は、ほぼ１０５ｋＤａへの有意な移動シフトを示し、これは、ｐｍｒ１単一突然変異体におけるそれと同様なサイズで移動した。これらの結果は、ｐｍｒ１突然変異体におけるＰＳＴ１上の高マンノースの外側鎖は、ｏｃｈ１突然変異体におけるように付加されていなかったことを示唆する。二重突然変異体におけるＰＳＴ１は、それがｐｍｒ１またはｏｃｈ１において移動したよりも速くさえ移動し、これは、二重突然変異体におけるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コア上での末端α１，３−Ｍａｎの喪失を示唆する。
【０２２５】
ＰＳＴ１とは対照的に、もう１つの糖蛋白質ＧＰ３８は、全てのテストした株からの細胞溶解物に存在した（図１７Ａ、下部）。この蛋白質のサイズは、株が突然変異するにつれて、劇的に変化した。野生型およびΔｍｎｎ１は、２００ｋＤａを超える大きな超グリコシル化サイズを示した。〜９０ｋＤａにおけるバンドはΔｏｃｈ１で示され、他方、〜１１０ｋＤａにおけるバンドはΔｐｍｒ１で示され、これは、各々、これらの２つの突然変異体における超グリコシル化の完全な喪失および切形を示唆する。ｐｍｒ１ｍｎｎ１二重突然変異体におけるＧＰ３８は、ｐｍｒ１単一突然変異体におけるそれよりもわずかに小さなサイズを示し、これは、これらの２つの突然変異体で見られるＰＳＴ１と合致するα１，３−結合マンノースキャップの喪失を示す。加えて、ＧＰ３８は、野生型からの、またはｍｎｎ１突然変異体からのいずれの培地においても検出できなかった（図１７Ｂ、下部）。興味深いことには、それは、ｐｍｒ１またはｏｃｈ１の突然変異によって強く誘導された。これは、さらに、Ｐｍｒ１ｐが、Ｏｃｈ１ｐと同様に、少なくともいくつかの蛋白質においてグリコシル化で重要な役割を演じることを示す。しかしながら、Δｏｃｈ１突然変異は、外側鎖開始を担う遺伝子の欠失による、超グリコシル化の喪失をほとんど保証し、他方、Δｐｍｒ１はそのような鎖の延長の効果に影響するように見える。これは、ＰＳＴ１のような、超グリコシル化の完全な喪失を有するいくつかの蛋白質、およびＧｐ３８のような、低下した超グリコシル化を有する他の蛋白質をもたらす。ｐｍｒ１単一突然変異体およびｐｍｒ１ｍｎｎ１二重突然変異体におけるＧＰ３８のサイズの変化は、これらの２つの突然変異体におけるＰＳＴ１と同一パターンを示し、これは、ゴルジに加えられたα１，３−Ｍａｎの欠失を示す。
【０２２６】
ｍｎｎ１ｐ機能の喪失を確認するために、末端α１，３−Ｍａｎおよびα１，２−Ｍａｎの存在を、各構造に特異的な抗体でのウエスタンブロットによって分析した。図１８の下方パネルは、ｐｍｒ１単一突然変異体およびｐｍｒ１ｍｎｎ二重突然変異体におけるＰＳＴ１発現のレベルが同様であることを示す。しかしながら、バンドは、ｐｍｒ１単一突然変異体において抗―α１，３−Ｍａｎ特異的ポリクローナル抗体によって検出され、他方、この活性は二重突然変異体において完全に喪失していた（図１８、上部パネル）。対照的に、抗―α１，２−Ｍａｎ  ＭＡｂ  ２Ｇ１２は、反対の結果を示した。二重突然変異体における２Ｇ１２シグナルは、単一突然変異体におけるそれよりもかなり強かった（図１８、中央パネル）。ｏｃｈ１突然変異体においては、抗―α１，２−Ｍａｎ（２Ｇ１２）はそうではないが、抗―α１，３−Ｍａｎ抗体は、７０〜１５０ｋＤａを超える範囲の強力なスミアを検出し、これは、α１，３−Ｍａｎ構造を持つ多数の糖蛋白質が抗―α１，３−Ｍａｎ抗体によって検出されることを示す。部分的に精製されたＹｐ１００はＰＳＴ１抗体および２Ｇ１２に対して反応性を示したが、抗―α１，３−Ｍａｎ抗体に対しては示さなかった。
【０２２７】
２Ｇ１２  ＭＡｂは天然および変性したＰＳＴ１糖蛋白質双方と交差反応する。２Ｇ１２がＰＳＴ１の天然形態上のグリカンを認識するか否かをテストするために、イムノブロットを行った。二重突然変異体からの培養基中の蛋白質を２Ｇ１２で沈殿させ、続いて、抗―ヒトＩｇＧ−アガロースと共にインキュベートした。免疫複合体をＳＤＳ−試料緩衝液を用いて溶出させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ついで、ブロットを抗―ＰＳＴ１ポリクローナル抗体でプローブした。図１９に示されるように、強力なシグナルは出発物質において抗―ＰＳＴ１によって検出され（レーン１）、プレクリアビートを通る流れで検出され（レーン２）、および流出で検出され（レーン６）、しかしながら、上清および洗浄液においては検出されないか、または弱く検出された（レーン３〜５）。これらの結果は、２Ｇ１２が天然ＰＳＴ１蛋白質を認識し、炭水化物エピトープに対して高い親和性を有することを示す。というのは、ほとんどのＭＡｂは蛋白質を沈殿させないからである。
【０２２８】
ＰＳＴ１遺伝子および蛋白質の背景情報
Ｐｓｔ１ｐ（プロトプラスト分泌蛋白質１）はＳＰＳ２ファミリーに属する。それは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって膜に付着され、かつ再生するプロトプラストによって分泌される蛋白質である。Ｐｓｔ１ｐは、Ｒｌｍ１ｐによって媒介される細胞一体性経路の活性化に際してのそのアップレギュレーション、およびＦｋｓ１ｐによって媒介される細胞壁損傷によるそのアップレギュレーションのため、細胞壁一体性で重要であると考えられる。
【０２２９】
遺伝子およびファミリー：その前駆体は、１９アミノ酸の予測されたシグナリングペプチド、およびＧＰＩアンカー結合のための２５アミノ酸のＣ−末端ドメインを持つ４４４アミノ酸を有する。前駆体の分子量および等電点は、各々、４５，７７６Ｄａおよび９．９１を有する。それは非常に多数のＮ−結合グリコシル化部位を有し、セリンおよびスレオニンが豊富であり、これはかなりＯ−グリコシル化されているようである。その成熟蛋白質は、４１，２６０Ｄａの予測される分子量、および９．２５の等電点を持つ４００アミノ酸を有する。ＰＳＴ１は１５の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を含有し、これは、該４００アミノ酸の３．８％を占める。合計１１８のセリンおよびスレオニン残基があり、これは該４００残基の２９．５％を占める。これらのセリンおよびスレオニンのうちのいくつかは、Ｏ−結合グリコシル化部位である（図３３）。
【０２３０】
ＰＳＴ１はＥｃｍ３３に非常に似ており、全蛋白質にわたって５８％同一性および７９％同様性を示す。ＰＳＴ１およびＥｃｍ３３のホモログが酵母および真菌の異なる種で見出されたが、哺乳動物、植物、昆虫、虫および鳥類を含めたいずれかの他の種では見出されていない（図２０）。それらは同様なまたは重複する活性を有するが、それらは機能的には冗長ではない（Ｐａｒｄｏ  Ｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：４１５７−４１７０，２００４）
機能：ＰＳＴ１の分子機能は未知である。それは細胞壁の組織化および生物発生に関与する。ＰＳＴ１およびＥｃｍ３３は共にＧＰＩ−アンカード細胞壁蛋白質であり、細胞表面に局所化される。
【０２３１】
発現、誘導、および分泌：ＰＳＴ１（ＹＤＲ０５５Ｗ）は、最初に、グルスラーゼ処理での再生条件でインキュベートして、プロトプラストが得られたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養基で見出された（Ｐａｄｒｏら、Ｙｅａｓｔ，１５：４５９−４７２，１９９９）グルカンシンターゼのサブユニットの１つであるＦＫＳ１の破壊は、ＹＤＲ０５５Ｗ  ＲＮＡおよび蛋白質の発現レベルをアップレギュレートした（Ｔｅｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２６４−６４−７４，２０００）。そのｍＲＮＡの発現レベルは、ＭＡＰキナーゼ、Ｍｐｋ１／Ｓｌｔ２の活性化、または酵母細胞壁の一体性に挑戦する環境ストレスを引き起こす上昇した温度によってアップレギュレートされることが見出された（Ｊｕｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４（５）：１０４９−５７，１９９９）。
【０２３２】
考え併わせると、酵母糖蛋白質は、高マンノース型のグリカン上のＭａｎα１，２−Ｍａｎから構成されるエピトープに結合するＨＩＶ−１の広く中和するＭＡｂ  ２Ｇ１２と交差反応することが見出された。このかなりグリコシル化された蛋白質は、ＧＰＩアンカーを通じて結合された細胞壁または膜蛋白質であるＰＳＴ１であると同定された。それは分泌蛋白質であって、グリコシル化経路に関与する遺伝子の形質転換または欠失後にアップレギュレートされる。
【０２３３】
実施例３  三重突然変異体の構築、Ｏｃｈ１／Ｍｎｎ１／Ｍｎｎ４三重突然変異体における２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質の同定
Ｉ．酵母三重突然変異体の構築および特徴付け：
酵母接合、およびΔｍｎｎ１Δｍｍｎ４Δｏｃｈ１三重突然変異体の確証
ｇｐ１２０で見出されたものと同様な糖蛋白質を生産するために酵母を用いる可能性を探索するためには、グリコシル化経路を突然変異させなければならなかった。３つの蛋白質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特異的なＮ−結合グリカンを作り出すのに重要であり；ＯＣＨ１ｐは超マンノシル化に必要な最初のα１，６マンノース残基を開始させ（Ｌｅｈｌｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７０（１−２：４１−５，１９９５）、ＭＮＮ１ｐはα１．２残基の全ての末端α１，３−結合マンノースのキャッピングを担い（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７２：３９１２−３９１６，１９７５）、およびＭＮＮ４ｐはマンノシルリン酸化の陽性レギュレーターである（Ｊｉｇａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１４２６（２）：３３５−４５，１９９９）。これらの遺伝子のＯＲＦノックアウトを持つ酵母欠失株を接合させ、胞子を形成させて、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４およびΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１ハプロイドを得た。Δｏｃｈ１表現型（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９７（２２）：１２６７９−８４，１９９９）によって呈される温度感受性のため、これらのクローンの選択は、３７℃におけるＹＰＤでのゆっくりとした成長によって決定した。Δｍｎｎ１およびΔｍｎｎ４表現型の選択および確証のためにコロニーＰＣＲを行った（データは示さず）。
【０２３４】
得られた二重突然変異体ハプロイドを接合させ、胞子形成させて、ハプロイド、三重突然変異体、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１を得た。Δｍｎｎ４およびΔｏｃｈ１表現型のスクリーニングは、前記したように、Δｏｃｈ１については３７℃におけるＹＰＤでのゆっくりとした成長、およびΔｍｎｎ４およびΔｏｃｈ１についてはＰＣＲを用いて行った。図２３Ａは、４つのクローンについてのコロニーＰＣＲスクリーニングのサンプルを示し、３つのクローンはΔｍｎｎ４およびΔｏｃｈ１表現型双方の存在を示す。
【０２３５】
６つの推定三重突然変異体をＰＣＲによってテストして、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１遺伝子型を確認した。図２１Ｂは、これらのクローンのうち２つ、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−６についての結果を示す。遺伝子欠失当たり４つのユニークなＯＲＦ−特異的プライマーにより、各遺伝子が完全に欠失されたことが確認された。内部ＯＲＦ−特異的プライマー（ＭＮＮ１Ｂ、ＭＮＮ４Ｂ、ＯＣＨ１Ｂ、ＭＮＮ１Ｃ、ＭＮＮ４ＣおよびＯＣＨ１Ｃ）、および上流または下流プライマー（ＭＮＮ１Ａ、ＭＮＮ４Ａ、ＯＣＨ１Ａ、ＭＮＮ１Ｄ、ＭＮＮ４ＤおよびＯＣＨ１Ｄ）の組合せの結果、もしＯＲＦが存在すればＰＣＲ産物が得られる（すなわち、ＭＮＮ１Ａ＋ＭＮＮ１Ｂ、ＭＮＮ１Ｃ＋ＭＮＮ１Ｄなど）。図面で見られるように、双方のクローンは、ＭＮＮ１、ＭＮＮ４、およびＯＣＨ１に対する双方のプライマー対についてＰＣＲ産物を示さず、欠失遺伝子型が確認された。各ＯＲＦ特異的プライマー対もまた、陽性対照としてのＷＴに対してテストした（結果は示さず）。
【０２３６】
対照的に、上流または下流プライマーおよび内部ＫａｎＭＸ特異的プライマー（ＫａｎＢおよびＫａｎＣ）の組合せの結果、もしＯＲＦがＫａｎＭＸモジュールで置き換えられていれば、ＰＣＲ産物がもたらされる。図２３Ｂに見られるように、遺伝子欠失当たり双方のプライマー対でテストした場合、これらのクローンの双方は予測されたサイズにおいてＰＣＲ産物を示す。
【０２３７】
ハプロイド三重突然変異体のうち２つ、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−６およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５を接合させて、ジプロイド三重突然変異体、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰを形成した。この株は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光および免疫化を含めた、野生型ジプロイド株、ＩＮＶＳｃ１に対するいずれかの将来の比較研究のために用いられるであろう。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡによる、三重突然変異体における、α１，３−マンノースの喪失および２Ｇ１２交差反応性の増加
Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１突然変異体酵母株は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２グリカンの大部分を持つ糖蛋白質を生じることが予測される。これらのオリゴ糖の存在を間接的に確認するために、三重突然変異体を、２つのマンノース―特異的抗体、２Ｇ１２および抗−α１，３−結合マンノース（抗―α１，３）に対する交差反応性についてテストした。α１，３―結合マンノース残基に特異的な免疫血清は、ＩＮＶＳｃ１全細胞でウサギを免疫化し、血清をΔｍｎｎ１細胞に吸着させることによって調製した。（Ｒａｓｃｈｋｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４８（１３）：４６６０−６，１９７３；ａｎｄ  Ｂａｌｌｏｕ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２４５：１１９７−１２０３，１９７０）得られた血清は、Ｍｎｎ１ｐによってα１，２−結合残基をキャップするのに用いられる末端α１，３―結合マンノース残基に特異的な抗体が豊富であることが予測される。対照的に、２Ｇ１２は、そのような残基のクラスターに拘わらず、コアＮ−結合グリカンで見出される末端α１，２−結合マンノース残基に対して特異的であることが知られている（Ｓｃａｎｌａｎら、Ｊ  Ｂｉｒｏｌ，７６：７３０６−２１，２００２）
ＷＴについての無傷全酵母細胞（ＩＮＶＳｃ１）およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞を用いて、ＥＬＩＳＡプレートを被覆し、２Ｇ１２およびα１，３特異的Ａｂを用いてプローブした。図２２Ａに見られるように、抗―α１，３抗体は野生型細胞に対して高い親和性を示し、三重突然変異体は低い親和性を示す。ＳＦ１６２および野生型酵母マンナンは、各々、陰性および陽性対照として含めた。これらの結果は、三重突然変異体における末端α１，３―結合マンノース残基の喪失を示す。三重突然変異体に対する抗―α１，３のいずれかの残存親和性は、吸着プロセスが完全には効果的でない事実に帰すことができ；依然として存在する他の酵母―特異的抗体は、三重突然変異体上に暴露されたエピトープに結合することができる（すなわち、細胞壁蛋白質およびβ―グリカン）。
【０２３９】
図２２Ｂは、２Ｇ１２が、野生型への結合において交差反応無くして、三重突然変異体全細胞に結合することができたことを示す。この親和性は、１０μｇ／ｍｌ〜〜１μｇ／ｍｌの間で見られた。ＳＦ１６２および野生型酵母マンナンは、各々、陽性および陰性対照として含めた。これらの結果は、三重突然変位体における末端α１，３−結合マンノース残基の喪失を確認するのみならず、コアＭａｎ８グリカンで見出されるα１，２−結合マンノースの結果としての露出も示す。より重要なことには、２Ｇ１２に結合するΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母能力は、酵母細胞壁で見出される１以上の蛋白質上の２Ｇ１２−様エピトープの存在を示唆する。
【０２４０】
免疫蛍光による三重突然変異体でのα１，３―マンノースの喪失、および２Ｇ１２交差反応性の増加
酵母における末端α１，３マンノース残基はα１，２−結合マンノース残基をキャップするのみならず、高度に免疫原性であり、それらを、ＨＩＶ  ｇｐ１２０上で見出されるグリカンから発散したものとする。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１株におけるα１，３―結合マンノース残基の喪失をさらに確認するために、我々は、無傷全細胞での抗―α１，３―Ｍａｎを用いて免疫蛍光を行った。図２３（パネルＡおよびＣ）に示されるように、野生型細胞壁はα１，３―結合マンノース残基に特異的な抗血清に対して強い反応を示し、他方、ジプロイド三重突然変異体は同一希釈においてシグナルを示さない。対照として、酵母細胞壁の共通の成分、α―マンナンおよびβ―グルカンを含有する酵母ザイモサンに特異的な抗体は、免疫蛍光によると、ＩＮＶＳｃ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１全細胞双方に対して同様なシグナルを与えることが判明した（図２３、パネルＢおよびＤ）。これらの結果は、ＭＮＮ１蛋白質に特異的なα１，３−マンノシルトランスフェラーゼ活性の喪失を示す。それらの喪失は、三重突然変異体の細胞壁で見出される全ての糖蛋白質上にα１，２―結合末端マンノース残基をかなり厳格に残すであろう。
【０２４１】
三重突然変異体でのα１，２−マンノース残基のこの露出を確認するために、次いで、２Ｇ１２を、免疫蛍光によって抗―ザイモサンとの共―局所化についてテストした。図２４（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）は、２Ｇ１２がΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞に強く結合し、細胞壁上の抗−ザイモサンと共―局所化されることを示す。野生型酵母は抗―ザイモサンへの結合を示すに過ぎず、２Ｇ１２についてシグナルが見られない（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）。これらのデータは、全細胞ＥＬＩＳＡ結果と同様に、三重突然変異体で見出される糖蛋白質が、天然条件下で２Ｇ１２に結合する能力を持つ露出されたα１，２−結合マンノース構造を含有することを示す。三重突然変異体酵母細胞のサイズは野生型細胞のそれよりも顕著に大きいことに注意するのは興味深い。
【０２４２】
ウエスタンブロットによる三重突然変異体における、α１，３−マンノースの喪失、および糖蛋白質上のα１，２−マンノースの露出
これらの２Ｇ１２−反応性蛋白質は、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母の細胞壁に出現するが、野生型では存在しない。しかしながら、これは、２Ｇ１２に対する親和性についての第一の理由として露出されたα１，２―結合マンノース残基を直接的に示唆するものではない。ウエスタンブロットを用い、酵母グリコシル化突然変異体のパネルの中での２Ｇ１２−反応性蛋白質の存在をテストした。図２５左側パネルに見られるように、二重突然変異体Δｍｎｎ１Δｏｃｈ１および三重突然変異体Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１からの溶解物のみが、２Ｇ１２によって検出される特異的蛋白質バンドを示した。事実、これらのグリコシル化突然変異体の双方は、２Ｇ１２に対して反応性である同一数の蛋白質（〜４〜５）を有するように見える。これは、他の酵母突然変異体の中のシグナルの欠如と共に、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１およびΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１突然変異体におけるコアＭａｎ８の存在が、これらの蛋白質に対する２Ｇ１２の特異性において重要な役割を演じることを示唆する。加えて、多数の露出したα１，２―結合マンノース残基を持つ超グリコシル化Ｎ−結合グリカンを有するはずであるΔｍｎｎ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４突然変異体で見られるシグナルの欠如は、さらに、２Ｇ１２結合におけるＭａｎ８グリカンの唯一の役割を示唆する。
【０２４３】
酵母グリコシル化突然変異体のこのパネルを、抗−α１，３でやはりプローブして、α１，３−結合マンノースキャップの存在または喪失を確認した。図２５右側パネルは、抗−α１，３−Ｍａｎ血清がΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１および三重突然変異体を含めた、Δｍｎｎ１表現型を持ついずれの突然変異体上の蛋白質も検出しないことを示す。これは、さらに、２Ｇ１２が認識しない、Δｍｎｎ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４株と共に、三重突然変異体およびΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１上のα１，２エピトープの露出を示唆する。第二の同一のウエスタンブロットを（一次抗体なくして）モックインキュベートし、株のいずれにおいても有意なシグナルを示さず、それにより、ヤギ抗−ヒト二次抗体との相互作用を排除した（結果は示さず）。
【０２４４】
２Ｇ１２に対する三重突然変異体蛋白質の反応性が酵母株の遺伝子型によるものであることを確認し、補充的な機能を持つ他の蛋白質は発現されないことを確認するために、異なる三重突然変異体クローンを分析した。合計して６つのΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母株は、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４×Δｍｎｎ１Δｏｃｈ１雑種から得た。各々はＹＰＤ＋ＫＣｌプレートで成長する別々のハプロイドコロニーから拾い、３つの欠失を含むことを確認した（クローン２−５および２−６については図２１参照）。図２６においては、全ての６つのクローンは、ウエスタンブロットによる同一蛋白質に対する２Ｇ１２反応性を示す。これは、２Ｇ１２に対するこれらの蛋白質の反応性が、突然変異したグルカンをもたらす三重突然変異体の遺伝子型に最もよるものであろうことを示す。
【０２４５】
三重突然変異体でのグリカンの確認
Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１糖蛋白質に存在するオリゴ糖の最終確認として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＮＰ−ＨＰＬＣプロファイリングを、全酵母細胞抽出物から抽出されたＮ−結合グリカンで行った。図２６において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２が三重突然変異体抽出物において圧倒的なグリカンであり、非常に少量のＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５ＧｌｕＮＡｃ２が存在することを示す。Ｍａｎ８グリカンのレベルはＭａｎ９またはＭａｎ５いずれかのそれよりも２０倍高く、従って、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２は三重突然変異体における合計グリカンの９０％を超えて表す。ＮＰ−ＨＰＬＣ結果はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦと合致するように見え、従って、Ｍａｎ８はΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞抽出物に存在する圧倒的なＮ−結合グリカンである。
【０２４６】
一緒にすると、これらの結果は、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞に存在するグリカンの型は、コアＮ−結合グリカンで見出されるものと同様に、圧倒的にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であることを確証する。これは、高度に免疫原性の末端α１，３−結合マンノース残基の喪失のみならず、超マンノシル化外側鎖の喪失も示す。末端α１，２−結合マンノース残基の得られた露出は、この突然変異体で見出された特異的細胞壁蛋白質に対する２Ｇ１２の親和性の背後にある理由のもっともなものである。
【０２４７】
ＩＩ．酵母三重突然変位体における２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質の同定および確証
酵母細胞からの２Ｇ１２−反応性蛋白質の２Ｄ分離
ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光およびウエスタンブロットによって２Ｇ１２に対する結合を示すΔｍｎｎ１Δｍｎｎ２Δｏｃｈ１酵母におけるこれらの蛋白質は、２Ｇ１２−様抗体の生産のための有望な抗原である。これは、Ｎ−結合グリカンのクラスターに見出されるα１，２−結合マンノース残基の立体配座よりなる２Ｇ１２エピトープを模倣する能力を持つ酵母で生産された最初のそのような抗原を表すであろう。かくして、この研究は、これらの蛋白質の部分的精製および同定で続けた。細胞壁および原形質膜における糖蛋白質の圧倒性のため、異なる遠心分離を用いて、細胞質蛋白質から膜−結合蛋白質をかなり分離した。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞を溶解させ、遠心分離に付して、細胞質、ゴルジ複合体およびエンドソーム蛋白質を取り出した。ほとんどの空胞、核、ＥＲおよび原形質膜蛋白質を含有するペレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再度可溶化させて、高度に不溶性の蛋白質を分離した。図２８Ａに見られるように、２Ｇ１２−結合蛋白質は主として膜画分に見出され、これらの蛋白質の小さな割合はＴｒｉｔｏｎに可溶性であることが判明した。これらの結果は、これらの蛋白質が主として細胞壁−または原形質膜−結合のように見える点で、全細胞ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光と合致する。
【０２４８】
膜―結合に加えて、従前の結果は、これらの２Ｇ１２−反応性蛋白質が高度にグリコシル化されていることも示唆した。従って、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）レクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いてＴｒｉｔｏｎ−可溶性画分に見出される２Ｇ１２―反応性蛋白質を精製した。図２８Ｂは、これらの蛋白質がＣｏｎＡに対して高い親和性を有し、かつ溶出させるのにより過酷な条件（１％ＳＤＳ）を必要とする、（０，５Ｍメチルマンノ−ピラノシド）を用いる競合結合によって十分に溶出させることができないことを示す。
【０２４９】
ＣｏｎＡ溶出物からの得られた蛋白質は、２Ｇ１２に結合するものを含めた、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞に見出される高度にグリコシル化された膜蛋白質を表す。同定のためにこれらの蛋白質を効果的に分離するのに、２−Ｄゲル電気泳動をこの画分で用いた。２つの別々のアリコートをｐＨ４．０〜７．０のＩＰＧストリップ上で泳動させ、続いて、４〜１２％グラジエントゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離した。１つのゲルをシプロルビーによって染色し、他のゲルを２Ｇ１２を用いるウエスタンブロット用のニトロセルロースに移した。図２８Ｃは、２つの大きなスポットはウエスタンブロットによって同定されることを示し、これは、シプロルビー染色ゲルでの可視化された２つのスポットに対応した（示さず）。これらのスポットを、トリプシン消化およびナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ同定のために切り出した。（〜１１０ｋＤａにおける）より高い２Ｄスポットは、３つの酵母糖蛋白質、Ｇａｓ５（５ペプチド）ＥＣＭ３３（４ペプチド）およびＧａｓ１（２ペプチド）からのペプチドを同定した。（〜９５ｋＤａにおける）より低い２Ｄスポットは、単一の酵母糖蛋白質ＹＪＬ１７１ｃからの７ペプチドを同定した。これらの蛋白質は、２Ｇ１２−反応性を持つより高い分子量の蛋白質の全てまたはほとんどを表す。同定されなかったこのサイズ範囲においてより多くのそのような蛋白質があり得るが、このスクリーニングで同定されなかった〜３５ｋＤａ蛋白質が明らかに存在する（図２５および２８参照）。この蛋白質の同一性は知られていないが、現在調査中である。
【０２５０】
培養上清からの２Ｇ１２−反応性蛋白質の１−Ｄ分離
細胞溶解物に加えて、酵母三重突然変異体の培養上清は、２Ｇ１２−反応性を持つ糖蛋白質を含有することが判明した。ＩＮＶＳｃ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞からの培養基を、ウエスタンブロットによって２Ｇ１２−反応性についてテストした。図２９Ａは、三重突然変異体の培養基における２Ｇ１２  ＭＡｂに対する強い反応性を持つ少なくとも４つのバンドの発現を示し、他方、野生型酵母上清はシグナルを示さない。
【０２５１】
培地中のこれらの２Ｇ１２−反応性蛋白質は、天然による、あるいは三重突然変異体の細胞壁構造の変化により、分泌された糖蛋白質、または培地に放出された細胞壁蛋白質を表すことができる。事実、これらの４つの蛋白質のサイズは、細胞溶解物で見出された２Ｇ１２−反応性蛋白質と同様に見え（図２５Ａおよび２８Ａ参照）、シグナルの圧倒性は９０〜１１５ｋＤａで見られ、１つのバンドは〜３７ｋＤａで見られる。これは、これらが細胞溶解物で見出された同一蛋白質であり得ることを示唆する。それにも拘わらず、これらの蛋白質は、２Ｇ１２エピトープを模倣する他の抗原を表し得るという事実は、それらの同定を保証する。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母からの上清を、糖蛋白質の部分的精製のために、ＣｏｎＡから直接適用した。培養上清中の蛋白質は、ＣｏｎＡに対して非常に高い親和性を示し、メチルマンノ―ピラノシドを用いる競合結合を介して溶出させることができなかった。従って、２Ｇ１２−反応性蛋白質は、ＣｏｎＡビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液で煮沸することによって溶出させた（図２９Ｂ）。このＳＤＳ溶出物は、大規模な（１０ｃｍ×１６ｃｍ）１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。ゲルのクーマシーブルー染色は５つの別々の蛋白質バンドを示し、その各々をゲルから切り出した（データは示さず）。これらのバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに再度負荷し、ウエスタンブロットによって２Ｇ１２でプローブすることによって２Ｇ１２反応性についてテストした。（１１０ｋＤａおよび９５ｋＤａにおける）２つの蛋白質バンドは、２Ｇ１２に結合することが判明し（結果は示さず）、切り出した。これらの蛋白質はトリプシンで消化し、ペプチド同定のために、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ２でのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。１１０ｋＤａバンドはゲルスライス中で唯一つの蛋白質を同定し、４ペプチドはＥＣＭ３３にマッチし、同一の蛋白質は膜画分において１１０ｋＤａで２Ｄによって同定された。９５ｋＤａバンドはゲルスライスにおいて唯一つの蛋白質を同定し、４ペプチドは酵母糖蛋白質Ｇｐ３８にマッチする。
【０２５２】
これらの２つの蛋白質は、おそらくは、培養基における２Ｇ１２−反応性蛋白質の半分を表すに過ぎず（図２９Ａ参照）；事実、培養上清に２Ｇ１２−反応性であるように見える４つのバンドがある。これらの２つの同定されていない蛋白質は、細胞溶解物で見出されたものと同一であるらしく、あるいはＧｐ３８のように、２Ｇ１２に結合する能力を持つ未知の蛋白質を表し得る。これらの同定されていない蛋白質は依然として調査中である。
【０２５３】
免疫沈澱による２Ｇ１２−反応性蛋白質の確証
２Ｇ１２−反応性酵母糖蛋白質としてのＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８およびＹＪＬ１７１ｃの同定は間接的に行った；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、ウエスタンブロッティングによって、２Ｇ１２に結合したゲル電気泳動におけるバンドを同定した。２Ｇ１２に対するこれらの蛋白質の親和性を確認するために、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞の細胞溶解物および培養基を２Ｇ１２で免疫沈澱させ、これらの蛋白質に対する抗体で得られたウエスタンブロットをプローブした。図３０Ａは、２Ｇ１２によって培養上清から沈殿した４つの蛋白質Ｇａｓ１、ＥＣＭ３３、ＹＪＬ１７１ｃ、およびＧＰ３８の同定を示す。Ｇａｓ１、ＥＣＭ３３およびＹＪＬ１７１ｃは２Ｄ分離によって三重突然変異体の細胞溶解物によって同定され、双方の実験において同様なサイズ、各々、〜１１５ｋＤａ、〜１１０ｋＤａ、および〜９５ｋＤａを示す。ＧＢ３８は、元来、三重突然変異体の培養上清によって同定されたが、ここでは、２Ｇ１２によって細胞溶解物から沈殿させることもできることを示す。Ｇａｓ５は比較的低い親和性でもって２Ｇ１２でもやはり沈殿し（データは示さず）、これは、他の同定された蛋白質よりもＮ−結合グリカンのより少ない数およびより低い密度によるものであろう（図３８）。
【０２５４】
図３０Ｂは、イムノブロットでの３つの蛋白質、ＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、およびＧＰ３８の同定を示す。これらの蛋白質は、２Ｇ１２によって培養上清から沈殿した。ＥＣＭ３３およびＧＰ３８もまた、１Ｄ分離によって三重突然変異体の培養基で同定され、双方の実験において同様なサイズ、各々、〜１１０ｋＤａおよび〜９５ｋＤａを示す。興味深いことには、ＰＳＴ１は、元来、Δｐｍｒ１酵母の培養上清において２Ｇ１２−結合蛋白質として同定された（実施例２）。ここで、ＥＣＭ３３およびＧＰ３８と比較すると、ＰＳＴ１の発現レベルは三重突然変異体の上清において非常に低いことが理解でき（図３０Ｂ、レーン１）、これは、この蛋白質がなぜ元来はこの突然変異体で同定されなかったかを説明することができる。
【０２５５】
これらの結果は、この免疫沈澱実験の天然条件下で２Ｇ１２に結合するＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８、ＰＳＴ１およびＹＪＬ１７１の能力を確認する。我々の従前の実験で分析すると、これらの酵母糖蛋白質は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖蛋白質で見出された２Ｇ１２エピトープを模倣する能力を有し、それにより、ウエスタンブロッティング、免疫沈澱、免疫蛍光およびＥＬＩＳＡによる、この抗体への結合を引き起こすように見える。
【０２５６】
２つの２Ｇ１２−反応性酵母蛋白質についての糖蛋白質サイズシフト
２Ｇ１２エピトープを模倣する潜在能力を持つ６つの酵母糖蛋白質の発見および同定はこれらの蛋白質についてのグリカン構造に関するさらなる調査を保証する。これらの蛋白質の２つ、ＥＣＭ３３およびＧＰ３８は、ウエスタンブロットによって酵母グリコシル化突然変異体のパネルに対して分析した。ＥＳＭ３３は、細胞壁安定性で重要なグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカード蛋白質であり（Ｐａｒｄｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：４１５７−７０，２００４）、およびｇｐ３８は細胞壁−関連分泌蛋白質である（Ｄｅｓｔｒｕｅｌｌｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４（４）：２７４０−５４，１９９４）。図３１（左側パネル）は結果を示す。細胞溶解物においてこれらの蛋白質の双方は、異なるレベルにおけるにも拘わらず、全ての株に存在する。加えて、これらの蛋白質はΔｏｃｈ１遺伝子型を含まないいずれの株においても超マンノシル化されている。事実、Δｏｃｈ１遺伝子型は双方の蛋白質についての８０ｋＤａよりも大きなサイズの劇的なシフトを引き起こし、ＧＰ３８はより有意な変化を示す。これらの株の綿密な分析は、双方の蛋白質において、Δｏｃｈ１およびΔｏｃｈ１Δｍｎｎ１株の間で顕著なサイズのシフトがあることを示し、これは、末端α１，３−結合マンノース残基の喪失を示す。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１突然変異体における最終蛋白質サイズは、２Ｇ１２によって沈殿された蛋白質と同一のサイズのように見える；ＥＣＭ３３については〜１１０ｋＤａおよびＧＰ３８については〜９５ｋＤａ（図３１参照）。Δｍｎｎ４突然変異体におけるホスホマンノースの喪失によって引き起こされたいずれのサイズのシフトもＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで見られず、これは、該変化が余りにもわずかであることを示唆する。
【０２５７】
培養上清において（図３１、右側パネル）、ＯＣＨ１遺伝子を持ついずれの株からの存在するＧＰ３８またはＥＣＭ３３はほとんどまたは全くない。Δｏｃｈ１含有酵母突然変異体の弱い細胞壁の結果、これらの蛋白質の培地への放出がもたらされるようである。しかしながら、Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４突然変異体で見出された〜２００ｋＤａ、およびΔｏｃｈ１含有突然変異体で見出される１１０〜１１５ｋＤａバンドを比較することによって、同様なサイズのシフトがＥＣＭ３３で見ることができる。再度、これは外側鎖超マンノシル化の欠如を示す。また、Δｍｎｎ１突然変異からの同様なサイズシフトは、Δｏｃｈ１およびΔｏｃｈ１Δｍｎｎ１突然変異体または三重突然変異体の間で見ることができる。
【０２５８】
一緒にすると、これらの結果は、我々が、酵母株が突然変異されるにつれて、超マンノシル化およびα１，３−結合マンノースキャップの喪失を可視化するのを助ける。これらの結果を図２５と比較することによって、グリカン構造におけるこれらの変化の双方が存在するのでなければ、２Ｇ１２反応性は存在しない。かくして、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＹＪＬ１７１ｃ、およびＰＳＴ１と共に、２Ｇ１２に結合するＥＣＭ３３およびＧＰ３８の能力は、酵母三重突然変異体およびΔｏｃｈ１Δｍｎｎ１二重突然変異体において保存されたコアＭａｎ８オリゴ糖の存在に依存する。
【０２５９】
ＥＬＩＳＡによると、ｇｐ１２０と交差反応するウサギにおけるα１，２−マンノース特異的抗−血清の生産
我々は、ＨＩＶ  ＭＡｂ  ２Ｇ１２に対する交差反応性を示すΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞から、少なくとも６つの酵母糖蛋白質、ＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、Ｇａｓ５、ＧＰ３８およびＹＪＬ１７１ｃを同定した。加えて、酵母三重突然変異体の細胞壁は、全細胞ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光によると２Ｇ１２と交差反応することができた。従って、それらがα１，２−結合末端マンノース糖に対して特異的なように、２Ｇ１２と同様な抗体を誘導することを試みるために、全細胞、加熱−殺傷三重突然変異体細胞を用いて、ウサギを免疫化した。０、４、５および１２週からの血清試料を、ＨＩＶ  Ｅｎｖ−特異的全ＩｇＧ抗体についてテストした。図３２に示されるように、ｇｐ１２０に対して特異的な抗体のレベルは、週０〜週５の有意な増加、および週１２における引き続いての減少を示す。週０と比較した場合、週５からの血清におけるｇｐ１２０結合の有意な増加（Ｐ＜０．００１）があり、他方、週１２における結合は、力価はより低いが、優位な増加をやはり示した（Ｐ＜０．０５）。
【０２６０】
比較のために、ウサギを全細胞、加熱−殺傷ＷＴ細胞で平行して免疫化した。これらの血清は、週０〜週１２におけるｇｐ１２０特異的抗体のレベルの有意な増加はないことを示した（図３２参照）。ＷＴおよび三重突然変異体免疫化ウサギからの平行採血を比較することによって我々は、ＷＴと比較した場合、特に週５において三重突然変異体でのｇｐ１２０−特異的ＩｇＧの有意な増加を見る（Ｐ＜０．００１）。これらのＰ値の全てはスチューデントの両側ｔ検定によって計算した。一緒にすると、これらの結果は、ｇｐ１２０上のα１，２−結合末端マンノース残基と交差反応できる動物における抗体の生産の最初の例を示すことができる。
【０２６１】
ＩＩＩ．酵母三重突然変異体における、２Ｇ１２によって認識される糖蛋白質でのＮ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の生物情報分析
図３３〜３８は、ＰＳＴ１、ＥＣＭ３３、ＧＰ３８、ＹＪＬ１７１ｃ、Ｇａｓ１、およびＧａｓ５の潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。以下の表２は、酵母突然変異体における同定された２Ｇ１２−反応性糖蛋白質のまとめを示す。同定された２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質のいくつかの顕著な特徴がある。全てはＮ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化部位の大きな数および高い密度を有する。中でも、ＰＳＴ１およびＥＣＭ３３は同一ファミリーに置けるメンバーであって、Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位双方の大きな数および高い密度を有する。ＧＰ３８およびＹＪＬ１７１ｃは、Ｎ−結合グリコシル化部位の大きな数および高い密度のみを有し、同一ファミリーにおけるＧａｓ１およびＧａｓ５はＯ−結合グリコシル化部位の大きな数および高い密度、およびグリカンからの分子量のより低いパーセンテージ（他の４つのほぼ５０％ｖｓ６０％）を有する。
【０２６２】
（表２  酵母突然変異体における同定された２Ｇ１２−反応性糖蛋白質のまとめ）
【０２６３】
【表２】
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以下の表３は、１８ゲノム内での２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質のホモログを示す。６つの２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質の蛋白質配列を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベース（リリース５０．１）からの相同遺伝子をサーチした。ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅは、いくつかの完全に配列決定された真核生物ゲノムの注記された遺伝子の中でのホモログの自動検出用のシステムである。現在、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースは、１８の種からの１６５、８２０のＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ群を含有する。注目するＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅは、ＮＣＢＩホームページに蛋白質参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号をエンターすることによって得られる。ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅの多数整列は、ｃｌｕｓｔａｌｗプログラムによって行った。各遺伝子のホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースサーチングから得られ、表にリストされる。６つの遺伝子のＣａｎｄｉｃａ  ｇｌａｂｒａｔａにおけるホモログはＮＣＢＩデータベースで見出されたが、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのゲノムはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースに含まれていない。
【０２６４】
（表３  １８ゲノム内での２Ｇ１２交差反応性糖蛋白質のホモログ）
【０２６５】
【表３】
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実施例４  Ｏｃｈ１／Ｍｎｎ１／Ｍｎｎ４三重突然変異体における相同Ｍａｎ８型グリカンを持つＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖蛋白質の生産および特徴付け
哺乳動物発現系におけるのとは異なり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで生産される糖蛋白質上の炭水化物はコアＧｌｃＮＡｃ２糖に形成されたマンノース残基のみを含有する。全長ｇｐ１２０蛋白質はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて首尾よく発現されてきたが、それらは超グリコシル化されているように見える。厳密にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を持つ酵母中のｇｐ１２０蛋白質の創製には、グリコシル化経路を突然変異しなければならなかった。三つの蛋白質はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特異的なＮ−結合グリカンを作成することを担い：ＯＣＨ１ｐは超マンノシル化に必要な最初のα１，６−マンノース残基を開始し（Ｌｅｈｌｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７０（１−２）：４１−５，１９９５）、ＭＮＮ１ｐはα１，２−残基の全ての末端α１，３−結合マンノースキャッピングを担い（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，３９１２−３９１６，１９７５）、およびＭＮＮ４ｐはマンノシルリン酸化の陽性レギュレーターである（Ｊｉｇａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１４２６（２）：３３５−４５，１９９９）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてこれらの３つの遺伝子を欠失することによって、厳密にＭａｎ８オリゴ糖を持つｇｐ１２０の生産用の株を創製した。
【０２６６】
ｇｐ１２０がＥＲにおいて効果的にグリコシル化され、培養基に分泌されるようにするために、我々は、まず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−接合因子（ＭＦα）のシグナル配列を、ガラクトース誘導に続いての組換え蛋白質の高レベル発現のためのＧＡＬ１プロモーターを含有するｐＹＥＳ２／ＣＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。次いで、ＪＲ−ＦＬおよびＹＵ２（ＡＲＲＲＰ）の株からのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０遺伝子をｐＹＥＳ２／ＣＴ−αプラスミドにＰＣＲクローン化した。迅速酢酸リチウム形質転換プロトコルを用いて、得られたｇｐ１２０発現プラスミドをハプロイド酵母株Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１に形質転換した。図４０のパネルＡに見られるように、ｐＹＵ２−ｇｐ１２０またはｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０で形質転換されたΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−２−５の４つの別々のクローンが、コロニーＰＣＲによってそれらの各プラスミドを含有することを確認した。ＪＲＦＬ−ｇｐ１２０形質転換体は、７２４ｋＢの予測されたＰＣＲ産物のサイズを示し、他方、ＹＵ２−ｇｐ１２０形質転換体は１６９７ｋＢにおける産物を示す。
【０２６７】
ｐＹＵ２−ｇｐ１２０およびｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０を含有するこれらの酵母形質転換体を、細胞をガラクトース含有培地に移すことによって、蛋白質発現について誘導した。抗−ｇｐ１２０−ＩＩＩＢ（Ｖｉｒｏｓｔａｔ  Ｉｎｃ．）および抗−ｇｐ１２０−ＹＵ２を用いるウエスタンブロッティングを用いて培地中でのｇｐ１２０糖蛋白質の誘導および分泌を検出した。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母形質転換体は、３０℃における６〜９日間の成長によって最大量のｇｐ１２０を分泌することが判明した（図３９、パネルＢおよびＣ）。ウエスタンブロットで見られるように、これらのｇｐ１２０蛋白質がおもにＭａｎ８オリゴ糖を含有すると仮定するならば、それらは、各々、ＪＲ−ＦＬおよびＹＵ−２ｇｐ１２０について９６．４および９９．６ｋＤａのそれらの予測される分子量まで移動する。
【０２６８】
抗−ｇｐ１２０抗体に対して反応性であることに加えて、これらの発現されたｇｐ１２０蛋白質は２Ｇ１２に対する反応性を示す（図４０）。（ｐＹＵ２−ｇｐ１２０およびｐＪＲ−ＦＬ−ｇｐ１２０を持つ）２つのΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１形質転換体、および非−形質転換株を、非−形質転換体の培地ではウラシルを加えて平行して成長させた。そのうち１つは〜１１０ｋＤａの分子量を有するΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞の培養上清における他の２Ｇ１２−反応性蛋白質の存在のため、２Ｇ１２でテストした場合に、ｇｐ１２０の誘導が間接的に見ることができるに過ぎない。非−形質転換酵母は３〜９日の間に定常的な基礎発現レベルを示し、これは、〜１１０ｋＤａにおける基礎レベル蛋白質（ＥＣＭ３３）がこの期間に増加しないことを強く示唆する。対照的にｇｐ１２０形質転換酵母の双方は、３〜９日において、１１０ｋＤａ蛋白質の発現の顕著な増加を示し、これは、２Ｇ１２抗体によって認識されるｇｐ１２０糖蛋白質の誘導を示唆する。
【０２６９】
（引用した文献）
【０２７０】
【化１】
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【０２７１】
【化２】
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【０２７２】
【化３】
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【０２７３】
【化４】
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【０２７４】
【化５】
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【０２７５】
【化６】
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【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】図１は、哺乳動物細胞における高マンノースの構造およびプロセッシングを示す。左側ボックスは、ＥＲにおける前駆体からＭａｎ８へのグリカンのプロセスを示す。次いで、主としてＭａｎ８を持つ蛋白質はさらなるプロセッシングのためにゴルジに輸送される（頂部−右側ボックス、哺乳動物細胞における例）。酵母におけるＰｍｒ１遺伝子によるなどの、ＥＲからゴルジへの蛋白質輸送がブロックされた場合、これらのグリカンはさらにプロセッシングされず、その結果、グリカンのＭａｎ８およびＭａｎ９形態のみを含有する糖蛋白質がもたらされる（右下）。
【図２】図２は酵母におけるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖蛋白質の発現を示す。Ａ．Δｐｍｒ１における３つのＨＩＶ−１株からのｇｐ１２０蛋白質の発現は、示された日の間にガラクトースによって誘導された。培養上清中の蛋白質は２Ｇ１２で検出された。Ｂ．ＨＩＶＹＵ２ｇｐ１２０の精製。レーン１は濃縮された酵母培養基を示し、レーン２は透析および遠心分離後であり、レーン３および４は、各々、２００および４００ｎｇでのＧＮＬおよびゲル濾過後であり、およびレーン５および６は２００および４００ｎｇでの２９３Ｔ細胞で生産されたＨＩＶＹＵ２ｇｐ１２０である。
【図３】図３は酵母で生産されたｇｐ１２０蛋白質のＥｎｄｏＨ消化アッセイを示す。ＭＳ／ＭＳ分析で用いた精製ｇｐ１２０蛋白質の同一ロットを、ＥｎｄｏＨで消化した。次いで、非−消化および消化蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてのクーマシーブルー染色によって分離した。レーン２は２００ｎｇにおける非−消化であり、レーン３は４００ｎｇにおける消化であり、レーン４は酵母で発現されたＨＩＶＳＦ２からの非−グリコシル化ｇｐ１２０である。
【図４】図４は、マンノースに対する抗体を示す。（Ａ）２匹のウサギを週０においてＣＦＡを含有する２００μｇのザイモサンＡで免疫化し、週２および４において、およびその後４週間毎に、フロイントの不完全アジュバント（「ＩＦＡ」）を含有する１００μｇの抗原をブースター注射した。週５および各ブースターから１週後に、免疫血清を収集した。ザイモサンおよび酵母マンナンを被覆したマイクロウェルプレート中でのＥＬＩＳＡを用い、抗体を二連でテストした。２匹のウサギからの平均抗体力価を示した。（Ｂ）マンノースに対する抗体はテストしたｇｐ１２０糖蛋白質のいくつかに対して反応性である。マイクロウェルプレートを５μｇ／ｍｌのｇｐ１２０蛋白質で被覆した。（Ｃ）このバネルは、抗−マンナン抗体によってテストされた哺乳動物細胞における、および酵母細胞におけるＹＵ２株からのｇｐ１２０蛋白質の抗原性の比較を示す。
【図５】図５は、ＢＳＡ−Ｍａｎ９コンジュゲートの分析を示す。ＢＳＡ−Ｍａｎ９コンジュゲートを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてクーマシーブルー染色で分析した。レーン１は非−コンジュゲーテッドＢＳＡであり、レーン２はＢＳＡ−ＳＭＣＣであり、レーン３はＢＳＡ−ＳＭＣＣ−Ｍａｎ９である。
【図６】図６ＡはＤＣ−ＳＩＧＮのＥＣＤ組換え蛋白質の発現および精製を示す。ＤＣ−ＳＩＧＮ  ＥＣＤ組換え蛋白質の発現および精製。ＥＣＤ蛋白質をＩＰＴＧの不存在下（レーン２）および存在下（レーン３）で２５℃にて４時間、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。封入体を単離し（レーン４）、不溶性画分からの再度折り畳まれた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製した（レーン５）。蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシーブルーで染色した。６Ｂは、ＤＣ−ＳＩＧＮ、および抗−ｇｐ１２０ポリクローナル抗体被覆マイクロウェルプレートを用いるＥＬＩＳＡを示す。ＹＵ２株のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０を用いて、コーティング蛋白質に結合させた。
【図７】図７は、ＤＣ−ＳＩＧＮ  ＭＡｂの開発を示す。精製されたＤＣ−ＳＩＧＮ  ＥＣＤ蛋白質を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。良好な抗体応答を持つマウスからの脾細胞を細胞融合で用いた。培養上清のＥＬＩＳＡスクリーニングの後、陽性ウェルからの細胞を拡大培養し、サブクローン化した。ウェスタンブロットを用いて、単一クローンでのウェルからの上清をスクリーニングした。各別々のレーンは、個々のクローンを示す。
【図８】図８は中和アッセイを示す。ｐＨＸＢ２  ｇｐ１２０を担持するシュードウイルスによって感染されたＬｕＳＩＶ細胞系を用いて、２つのポノクローナル（Ｐ）抗体の中和活性をテストした。３つのよく知られた中和ＭＡｂ（Ｍ）を陽性対照として用いた。各抗体の４つの用量（５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍｌ）を調べた。
【図９】図９は、Ｎ−結合オリゴ糖の構造およびプロセッシングを示す。図９Ａは、ＥＲにおける、ＭＮＳ１によるＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２へのグリカンのプロセスを示す。主として高マンノースコアのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２形態を持つ蛋白質はさらなるプロラッシングのためにゴルジに輸送される。図９Ｂの下部ボックスは、主要（太い矢印）経路である超グリコシルル化を示す。図９Ｂ上部ボックスは、主要経路（細い矢印）である、コアへのα１，３−Ｍａｎの付加を示す。Ｏｃｈ１、Ｍｎｎ１およびＭｎｎ４の遺伝子を全て欠失すると、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２へ糖は付加できず、その結果、グリカンのほとんど均一なＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２タイプがもたらされる（図９Ｃ）。
【図１０】図１０は、ウェスタンブロットを用いる、酵母突然変異体株における２Ｇ１２交差反応性蛋白質のスクリーニングを示す。Ａ．種々の突然変異体株からの酵母培養基をＨＩＶ−１  ＭＡｂ  ２Ｇ１２（Ｐｏｌｙｍｕｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ）でスクリーニングした。培養基中の分泌蛋白質をエテトンで沈殿させ、４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。ブロットを２Ｇ１２でプローブし、続いてホースラディッシュペルオキシダ―ゼ（ＨＲＰ）標識抗−ヒトＩｇＧと共にインキュベートした。シグナルをＥＣＬで発生させ、Ｘ線フィルムに暴露した。Ｂ．細胞溶解物を、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０糖蛋白質の対照と共に、酵母突然変異体株の同一組からスクリーニングした。
【図１１】図１１は、Δｐｍｒ１酵母細胞における２Ｇ１２交差反応性蛋白質の誘導を示す。Ａ．ｇｐ１２０形質転換Δｐｍｒ１酵母細胞を示した時点に培養した。培養基中の分泌蛋白質をエテトンで沈殿させ、４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。ブロットを２Ｇ１２でプローブし、続いて、ＨＲＰ−抗−ヒトＩｇＧでインキュベートした。シグナルをＥＣＬで発生させ、Ｘ線フィルムに暴露した。Ｂ．非−形質転換（レーン１〜３）およびｇｐ１２０形質転換（レーン４〜６）Δｐｍｒ１細胞からの培養基中の蛋白質を、Ａに記載したように、２Ｇ１２で検出した。
【図１２】図１２は、２Ｇ１２反応性糖蛋白質の精製および同定を示す。ＧＮＬレクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ほぼ１００ｋＤａの蛋白質（Ｙｐ１００と命名）を部分的に精製した。培養基をアガロース結合ＧＮＬと共に１６時間インキュベートした。出発物質（レーン１）、フロースルー（レーン２）、洗浄液（レーン３〜６）、および溶出物（レーン７〜１１）の試料を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付加した。移動された膜上の蛋白質をＭＡｂ  ２Ｇ１２でプローブした。
【図１３】図１３は、２Ｇ１２反応性糖蛋白質の同定を示す。１００ｋＤａバンドにおける蛋白質をイン−ゲル消化に付した。消化されたペプチドを抽出し、ナノ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。分析は、ナノエレクトロスプレイ源でのＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｄｏｆハイブリッド四極／時間飛行マススペクトルメーターで行った。生ファイルをＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）で処理し、ＭＡＳＣＯＴサーチに付した。全部で６つのペプチドは、アクセションＮＰ＿０１０３４０および４５，７４９Ｄａの質量にて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける酵母蛋白質ＰＳＴ１（配列番号：１）で同定される。Ｎ−末端における太文字はシグナリングペプチドと同定される。Ｃ−末端における太文字はＧＰＩアンカーシグナルと同定される。単一下線は、質量分析による同定されたペプチドを示す。強調された文字は潜在的なＮ−結合グリコシル化部位である。
【図１４】図１４は、２Ｄゲルによる２Ｇ１２交差反応性蛋白質の確認を示す。Ａ．部分的に精製されたＹｐ１００蛋白質を２Ｄゲルによって分離し、クーマシーブルー染色（Ａ）、２Ｇ１２  ＭＡｂでのウェスタンブロット（Ｂ）に付し、抗−ＰＳＴ１ポリクローナル抗体がウサギにおいて合成ペプチドに対して生起された。部分的に精製されたＹｐ１００蛋白質は酵母からの他の糖蛋白質による汚染を有するが、そのいずれもＰＳＴ１がそうであるように同様なＰＩを有しない。
【図１５】図１５は、２Ｇ１２交差反応性蛋白質ＰＳＴ１のグリカン分析を示す。Ａ．部分的に精製されたＹｐ１００蛋白質をＥｎｄｏ  Ｈで消化し、非−消化（レーン２、４および６）および消化（レーン３、５および７）蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、クーマシーブルー染色（レーン１〜３）、抗−ＰＳＴ１ポリクローナル抗体での（レーン４および５）、およびＭＡｂ  ２Ｇ１２（レーン６および７）でのウェスタンブロットに付した。これに続いて、ＨＰＲ標識二次抗体、ＥＣＬと共にインキュベートし、Ｘ線フィルムに曝露した。
【図１６】図１６は、ｐｍｒ１およびｍｎｎ１二重突然変異体におけるＰＳＴ１の２Ｇ１２に対する交差反応性を示す。５つの異なる二重突然変異体株からの細胞溶解物を調製し、４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ブロットをＭＡｂ  ２Ｇ１２でプローブし、続いて、ＨＰＲ標識二次抗体、ＥＣＬと共にインキュベートし、Ｘ−線フィルムに曝露した。
【図１７】図１７は、二重突然変異体におけるＰＳＴ１のアップレギュレーションおよび移動シフトを示す。Ａ．酵母細胞溶解物中のＰＳＴ１。異なる株からの細胞溶解物を４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。野生型および突然変異体におけるＰＳＴ１発現のレベルを抗−ＰＳＴ１ポリクローナル抗体でのウェスタンブロットを用いて分析した。レーン１野生型；レーン２、Δｍｎｎ１；レーン３、Δｏｃｈ１；レーン４、Δｐｍｒ１；レーン５、Δｐｍｒ１およびΔｍｎｎ１二重突然変異体。上部パネルは、ＰＳＴ１がｐｍｒ１およびｍｎｎ１二重突然変異体の溶解物において検出されたに過ぎなかったことを示す。下部パネルは、全ての５株で検出可能なもう１つのグリコシル化蛋白質ＧＰ３８を示す。Ｂ．酵母細胞培養基中のＰＳＴ１。異なる株からの酵母細胞を豊富な培地中で２４時間培養し、培地中の蛋白質をアセトンで沈殿させた。蛋白質分泌のレベルを抗−ＰＳＴ１抗体（上部パネル）および抗−ＧＰ３８（下部パネル）でのウェスタンブロットを用いて検出した。
【図１８】図１８は、二重突然変異体におけるＰＳＴ１上のα１，３−Ｍａｎおよびα１，２−Ｍａｎの分析を示す。ｐｍｒ１単一突然変異体（レーン１）およびｐｍｒ１＋ｍｎｎ１二重突然変異体（レーン２）からの酵母細胞培養基を、抗−α１，３−結合マンノースポリクローナル抗体および２Ｇ１２を用いるウェスタンブロットによって末端α１，３−Ｍａｎおよびα１，２−Ｍａｎについて検出した。Ｏｃｈ１単一突然変異体および精製されたＰＳＴ１を対照として用いた。培地中の蛋白質をアセトンで沈殿させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルに負荷した。ニトロセルロースへのブロッティングの後に、膜を、示された、２Ｇ１２  ＭＡｂおよびウサギ抗−α１，３Ｍａｎ抗体または抗−ＰＳＴ１抗体、続いて、各々、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰでプローブした。
【図１９】図１９は、イムノブロットによる二重突然変異体における２Ｇ１２交差反応性蛋白質の確認を示す。二重突然変異体からの培養上清を遠心分離し、沈殿を捨てた。上清（レーン１）をアガロース（レーン２）で予め清浄した。次いで、試料をＭＡｂ  ２Ｇ１２と共に４℃にて１６時間インキュベートした。免疫複合体をプロテインＡ−アガロースと共に室温にて１時間インキュベートした。試料を軽く遠心分離し、上清をフロースルーとして用いた（レーン３）。プロテインＡ−アガロース結合免疫複合体を２回洗浄した（レーン４および５）。結合した蛋白質をＳＤＳ試料緩衝液で溶出させた（レーン６）。試料を４〜２０％グラジエントゲルで分離し、抗−ＰＳＴ１ポリクローナル抗体でプローブした。
【図２０】図２０は、１８種の中のＰＳＴ１ホモログ遺伝子を示す。ＰＳＴ１（ＮＰ＿０１０３４０）およびＥＣＭ３３（ＮＰ＿００９６３４）の蛋白質配列を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベース（リリース５０．１）からホモログ遺伝子をサーチした。ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅは、いくつかの完全に配列決定された真核生物ゲノムの注記された遺伝子の中のホモログの自動検出のためのシステムである。現在、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースは１８の種からの１６５，８２０のＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ群を含有する。注目するＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅは、ＮＣＢＩホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において蛋白質参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号をエンターすることによって得られる。ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅの多数の整列は、ｃｌｕｓｔａｌｗプログラムによって行った。ＰＳＴ１および３つのホモログ遺伝子（Ｓ．ｐｏｍｂｅおよびＥ．ｇｏｓｓｙｐｉｉの蛋白質はＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースサーチングから得られた。Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａからの蛋白質は、ＮＣＢＩ  ｎｒ配列データベースに対するｂｌａｓｔｐサーチングを用いて得られた）。
【図２１】図２１は、ＰＣＲを用いる二重および三重突然変異体の分析を示す。三重突然変異体ハプロイドについての遺伝子型スクリーニングおよび確証。パネルＡは、ＭＮＮ４ＡおよびＫａｎＢプライマー（予測されるサイズは６０９ｂｐであった）を用いるΔｍｎｎ４遺伝子型（頂部パネル）、およびＯＣＨ１ＡおよびＫａｎＢプライマー（６９７ｂｐ）を用いるΔｏｃｈ１遺伝子型（底部パネル）についての推定三重突然変異体のＰＣＲスクリーニングでの１．５％アガロースゲルを示す。レーン１は、ハプロイドクローン２−２を含有する。レーン２はハプロイドクローン２−３を含有する。レーン３はハプロイドクローン２−４を含有する。レーン４はハプロイドクローン２−５を含有する。パネルＢは、三重突然変異体ハプロイドクローン２−５および２−６（各々、頂部および底部パネル）についてのΔｍｎｎ１、Δｍｎｎ４およびΔｏｃｈ１遺伝子型のＰＣＲ確証での１．５％アガロースゲルを示す。各レーンは、示したようにＰＣＲプライマーの異なる対を含有する。内部ＯＲＦ−特異的プライマー（ＭＮＮ１Ｂ、ＭＮＮ４Ｂ、ＯＣＨ１Ｂ、ＭＮＮ１Ｃ、ＭＮＮ４ＣおよびＯＣＨ１Ｃ）および上流または下流プライマー（ＭＮＮ１Ａ、ＭＮＮ４Ａ、ＯＣＨ１Ａ、ＭＮＮ１Ｄ、ＭＮＮ４ＤおよびＯＣＨ１Ｄ）の組合せの結果、もしＯＲＦが欠失されているならば、ＰＣＲ産物はもたらされない。レーン１はＭＮＮ１Ａ＋ＭＮＮ１Ｂである。レーン２はＭＮＮ４Ａ＋ＭＮＮ４Ｂである。レーン３はＯＣＨ１Ａ＋ＯＣＨ１Ｂである。レーン４はＭＮＮ１Ｃ＋ＭＮＮ１Ｄである。レーン５はＭＮＮ４Ｃ＋ＭＮＮ４Ｄである。レーン６はＯＣＨ１Ｃ＋ＯＣＨ１Ｄである。対照的に、上流または下流プライマーおよび内部ＫａｎＭＸ特異的プライマー（ＫａｎＢおよびＫａｎＣ）の組合せの結果、もし欠失が存在すれば、ＰＣＲ産物がもたらされる。レーン７はＭＮＮ１Ａ＋ＫａｎＢ（５９１ｂｐの予測されるサイズ）である。レーン８はＭＮＮ１Ｄ＋ＫａｎＣ（９４４ｂｐ）である。レーン９はＭＮＮ４Ｄ＋ＫａｎＣ（９３１ｂｐ）である。レーン１０はＯＣＨ１Ｄ＋ＫａｎＣ（８５４ｂｐ）である。
【図２２】図２２は、全細胞ＥＬＩＳＡを示す。ＥＬＩＳＡを用いて、全細胞酵母に対する２Ｇ１２、およびα１，３−結合マンノース抗体の特異性をテストした。ＩＮＶＳｃ１（ジプロイド）およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ酵母をＰＢＳ中で５．０×１０７細胞／ｍｌまで希釈し、これを用いて、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。ＳＦ１６２  ｇｐ１２０および野生型酵母マンナンを５０ｍＭ炭酸緩衝液中で５μｇ／ｍｌまで希釈した。２Ｇ１２および抗−α１，３−マンノースを、ブロッキング緩衝液中の３倍系列希釈での捕獲のために１０μｇ／ｍｌで用いた。パネルＡは、抗−α１，３抗体が野生型細胞およびマンナンに対して高い親和性を有することを示し、三重突然変異体は低い親和性を示し、ＳＦ１６２は結合を示さない。対照的にパネルＢは、三重突然変異体細胞およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０は、各々、末端α１，２−結合マンノース残基に対して特異的である、２Ｇ１２抗体に対して中程度および高い親和性を有することを示す。野生型細胞およびマンナンの双方は、２Ｇ１２に対して結合を示さない。この実験は二連で行い、前記ＯＤ４５０の読みは平均を示す。
【図２３】図２３は、三重突然変異体細胞におけるα１，３−Ｍａｎ反応性の喪失を示す。抗−α１，３−結合マンノース免疫血清および抗−ザイモサン抗体を用いる三重突然変異体および野生型酵母の免疫蛍光。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞（パネルＡ、Ｃ）およびＩＮＶＳｃＩ細胞（パネルＢ、Ｄ）を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ポリリシン−被覆スライドに移した。細胞を０．５％ＳＤＳと共にインキュベートし、１：５００希釈のα１，３−結合マンノース抗血清（パネルＡ、Ｂ）、および１０μｇ／ｍｌの精製抗−ザイモサン（パネルＣ、Ｄ）、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−コンジュゲーテッドヤギ抗−ウサギＩｇＧで染色した。
【図２４】図２４は、三重突然変異体細胞における末端α１，２−Ｍａｎの曝露を示す。２Ｇ１２および抗−ザイモサンを用いる三重突然変異体および野生型酵母の免疫蛍光。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞（パネルＡ、ＢおよびＣ）およびＩＮＶＳｃＩ細胞（パネルＤ、ＥおよびＦ）を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ポリリシン−被覆スライドに移した。細胞を０．５％ＳＤＳと共にインキュベートし、各々、１００μｇ／ｍｌの２Ｇ１２（パネルＡ、Ｄ）、および１０μｇ／ｍｌのウサギ抗−ザイモサン（パネルＢ、Ｅ）、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−コンジュゲーテッドヤギ抗−ヒトＩｇＧおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲーテッドヤギ抗−ウサギＩｇＧで染色した。パネルＣおよびＦは、抗体の共−局所化を示す。
【図２５】図２５は、酵母突然変異体の糖蛋白質上のα１，２−Ｍａｎおよびα１，３−Ｍａｎの分析を示す。全ての酵母グリコシル化突然変異体での２Ｇ１２およびα１，３−結合マンノース抗血清を用いるウェスタンブロット。ｌｏｇ相酵母細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、２．４μｇ／レーンで４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルに負荷した。ニトロセルロースへのブロッティングの後に膜を、各々、２Ｇ１２  ＭＡｂまたはα１，３Ｍａｎ抗血清、続いて、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰでプローブした。レーン１はＩＮＶＳｃ１野生型溶解物を含有する。レーン２はΔｍｎｎ１溶解物を含有する。レーン３はΔｏｃｈ１溶解物である。レーン４はΔｍｎｎ４溶解物を含有する。レーン５はΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４溶解物を含有する。レーン６はΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１溶解物を含有する。レーン７はΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１溶解物を含有する。Δｍｎｎ１Δｏｃｈ１およびΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１Δｍｎｎ４の細胞溶解物中で見出される２Ｇ１２に強く結合する少なくとも４つの蛋白質がある（左側パネル）。対照的に、野生型酵母、およびΔｍｎｎ１遺伝子型なしの突然変異体のみが、α１，３−結合マンノースに特異的な抗血清への結合を示す（右側パネル）。
【図２６】図２６は、全ての単離された三重突然変異体における２Ｇ１２反応性を示す。６つの酵母三重突然変異体クローン上の２Ｇ１２を用いるウェスタンブロット。ｌｏｇ相酵母三重突然変異体クローンをＳＤＳ負荷緩衝液にそのまま溶解させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルに負荷した。ニトロセルロースへのブロッティングの後に、膜を、１μｇ／ｍｌの２Ｇ１２、続いて、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰでプローブした。レーン１はハプロイドクローン１−２を含有する。レーン２はハプロイドクローン１−３を含有する。レーン３はハプロイドクローン２−２を含有する。レーン４はハプロイドクローン２−４を含有する。レーン５はハプロイドクローン２−５を含有する。レーン６はハプロイドクローン２−６を含有する。各三重突然変異体ハプロイドクローンの粗製細胞溶解物に見出される２Ｇ１２に強く結合する少なくとも４つの蛋白質がある。
【図２７】図２７は、酵母三重突然変異体細胞における高マンノースのＭａｎ８形態のホモログを示す。三重突然変異体酵母溶解物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１−ＤＩＰ細胞を脂質抽出で均質化し、得られた溶解物をＰＮＧａｓｅ  Ｆで消化した。ペルメチル化後に、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析によって、Ｎ−グリカンプロファイリングを行った。全グリカンの９０％を超えて表す主なピークはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であり、他方、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を代表する２つの主なピークがある。
【図２８】図２８は、三重突然変異体酵母の細胞溶解物からの２Ｇ１２−反応性蛋白質の部分的精製および分離を示す。パネルＡにおいて、２Ｇ１２−反応性蛋白質の細胞下局所化を、分別遠心を用いて見積もった。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞を、ガラスビーズを用いてスクロース溶解で溶解させた。未溶解細胞および大きな凝集体の除去の後に、蛋白質を２つの画分、２２，０００ｇ上清（レーン１）および２２，０００ｇペレット（レーン２）に分離した。この画分から、ペレットを１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再度可溶化させ、２つのさらなる画分、Ｔｒｉｔｏｎ−可溶性ペレット（レーン３）、およびＴｒｉｔｏｎ−不溶性ペレット（レーン４）に分離した。すべてのレーンは１μｇ／ｍｌの２Ｇ１２を用いるウェスタンブロットを表す。パネルＢにおいて、ＣｏｎＡ−アガロースを用いて、２Ｇ１２−反応性蛋白質を部分的に精製した。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞からのＴｒｉｔｏｎ−可溶性画分（レーン１）をＣｏｎＡ−アガロースビーズと共にインキュベートし、フロースルーを集めた（レーン２）。結合緩衝液での洗浄（レーン３）の後に、蛋白質を０．５Ｍメチルマンノ−ピラノシド（レーン４、５）または２ｍＭ  ＥＤＴＡ＋１．０％ＳＤＳ（レーン６）いずれかで溶出させた。全てのレーンは、１μｇ／ｍｌの２Ｇ１２を用いるウェスタンブロットを表す。パネルＣにおいて、２Ｄ電気泳動を用いて、２Ｇ１２−反応性蛋白質を分離した。ＣｏｎＡ精製からの溶出物画分（パネルＢ、レーン４〜６）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＰＧ  ＺＯＯＭ  ４−７  ＩＰＧストリップ上泳動させ、続いて、４〜１２％を用いてＩＰＧ  ＺＯＯＭシステムでサイズ分離した。１μｇ／ｍｌの２Ｇ１２を用いて、１つのゲルをウェスタンブロッティングによって染色した。ウェスタンブロットによって陽性シグナルを示した２つの大きなスポットをシプロルビーゲルから切り出し、トリプシンで消化し、ペプチド同定のために、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ２にてナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。上方スポットにおける３つの糖蛋白質（ＥＣＭ３３、Ｇａｓ１、およびＧａｓ５）、および下方スポットにおける単一糖蛋白質（ＹＪＬ１７１ｃ）は、ＭＳ／ＭＳを用いて同定した。
【図２９】図２９は、三重突然変異体酵母の培養基における２Ｇ１２−反応性糖蛋白質の発現および部分的精製を示す。パネルＡにおいて、ｌｏｇ相ＩＮＶＳｃ１およびΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１酵母からの１００μｌの培養上清を、２倍の容量の氷冷アセトンと共に−８０℃で３０分間インキュベートすることによってアセトン沈殿に付した。得られたペレットを１０μｌのＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルに負荷した。ニトロセルロースへの移動の後に、蛋白質を、２μｇ／ｍｌの２Ｇ１２でプローブした。三重突然変異体酵母は、２Ｇ１２  ＭＡｂに対する強い反応性を持つ少なくとも４つの蛋白質を有し（レーン２）、他方、野生型酵母上清はシグナルを示さない（レーン１）。パネルＢにおいて、ＣｏｎＡ−アガロースを用い、２Ｇ１２−反応性蛋白質を部分的に精製した。ｌｏｇ−相Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞からの培養上清（レーン１）をＣｏｎＡ−アガロースビーズと共に直接的にインキュベートした。フロースルー（レーン２）を集め、ビーズを結合緩衝液で洗浄した（レーン３）。結合した２Ｇ１２−反応性蛋白質（レーン４）は、ＣｏｎＡビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液と共に煮沸することによって溶出させた。蛋白質は、１μｇ／ｍｌの２Ｇ１２を用いるウェスタンブロットによって検出した。レーン４に示した２Ｇ１２沈殿のアリコートからのＭＳ／ＭＳを用い、２つの糖蛋白質（ＥＣＭ３３およびＧＰ３８）を同定した。
【図３０】図３０は、２Ｇ１２−反応性蛋白質の免疫沈澱を示す。三重突然変異体細胞の細胞溶解物および培養基を２Ｇ１２で免疫沈澱させ、同定された２Ｇ１２−反応性蛋白質に対する抗体でブロットした。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１細胞（レーン１）からの細胞溶解物（パネルＡ）および培養基（パネルＢ）を、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと共にインキュベートすることによって予め清浄化した。２Ｇ１２を試料に加え、１時間インキュベートし、続いて、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを行った。未結合蛋白質を上清として除去し（レーン２）、ＰＢＳで洗浄した（レーン３）。４０μｌの１×ＳＤＳ試料緩衝液と共に煮沸することによって、結合蛋白質を溶出させた（レーン４）。すべての試料を４〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、抗−ＥＣＭ３３、抗−ｇｐ３８、抗−ＹＪＬ１７１Ｃ、抗−Ｇａｓ１、および抗−ＰＳＴ１を用いるウェスタン分析のためにブロットした。
【図３１】図３１は、異なる遺伝子の突然変異体における糖蛋白質の移動シフトを示す。酵母細胞をｌｏｇ相まで成長させ、細胞および培養基を収集した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、２．４μｇ／レーンにて、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルに負荷した。培養基をアセトンで沈殿させ、蛋白質を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルに負荷した。レーン１は野生型である。レーン２はΔｍｎｎ１である。レーン３はΔｏｃｈ１である。レーン４はΔｍｎｎ４である。レーン５はΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４である。レーン６はΔｍｎｎ１Δｏｃｈ１である。レーン７はΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１である。ニトロセルロースへのブロッティングの後に、膜を抗−ＥＣＭ３３（上方パネル）または抗−ＧＰ３８（下方パネル）、続いて、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰでプローブした。
【図３２】図３２は、三重突然変異体酵母細胞で免疫化したウサギにおいて生起したα１，２−結合マンノースに対する抗体の分析を示す。ウサギを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型（ＷＴ）および三重突然変異体（ＴＭ）からの全細胞で免疫化した。マイクロウェルプレートを、２９３Ｔ細胞において生じたＪＲＦＬ株からの５μｇ／ｍｌのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０で被覆した。免疫血清を１：５００に希釈し、α１，２−Ｍａｎに対する抗体を２Ｇ１２で検出した。
【図３３】図３３は、ＰＳＴ１の潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。パネルＡは前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号：２）Ｎ−末端の太文字はシグナリングペプチドと同定される。Ｃ−末端の太文字はＧＰＩアンカーシグナルと同定される。単一の下線は質量分析による同定されたペプチドを示し、他方、二重下線は、ペプチドが同一または異なる質量分析で２回同定されたことを示す。強調された文字は潜在的なＮ−結合グリコシル化部位である。パネルＢは、公のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃ．Ｊｕｌｅｎｉｕｓ  Ｋ．，Ａ．Ｍｏｌｇａａｒｄ，Ｒ．Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５：１５３−１６４，２００５におけるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋにおけるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１を用いるＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。
【図３４】図３４は、ＥＣＭ３３の潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。パネルＡは、前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号：３）。Ｎ−末端の太文字はシグナリングペプチドと同定される。Ｃ−末端の太文字は、ＧＰＩアンカーシグナルと同定される。単一の下線は質量分析による同定されたペプチドを示し、他方、二重下線は、ペプチドが同一または異なる質量分析で２回同定されたことを示す。強調された文字は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位である。パネルＢは、公のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃにおける、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１を用いるＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。
【図３５】図３５は、ＧＰ３８の潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。パネルＡは前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号：４）。Ｎ−末端の太文字は、シグナリングペプチドと同定される。単一下線は質量分析による同定されたペプチドを示し、他方、二重下線は、ペプチドが同一または異なる質量分析において２回同定されたことを示す。強調された文字は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位である。パネルＢは、公のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃにおける、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１を用いるＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。
【図３６】図３６は、ＹＪＬ１７１Ｃの潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。パネルＡは、前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号：５）。Ｎ−末端の太文字はシグナリングペプチドと同定される。Ｃ−末端の太文字は、ＧＰＩアンカーシグナルと同定される。単一の下線は質量分析による同定されたペプチドを示し、他方、二重下線は、ペプチドが同一または異なる質量分析で２回同定されたことを示す。強調された文字は、潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位である。パネルＢは、公のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃにおける、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１を用いるＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。
【図３７】図３７は、Ｇａｓ１の潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。パネルＡは、前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号：６）。Ｎ−末端の太文字は、シグナリングペプチドと同定される。Ｃ−末端の太文字は、ＧＰＩアンカーシグナルと同定される。単一の下線は質量分析による同定されたペプチドを示し、他方、二重下線は、ペプチドが同一または異なる質量分析で２回同定されたことを示す。強調された文字は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位である。パネルＢは、公のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃにおける、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１を用いるＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。
【図３８】図３８は、Ｇａｓ５の潜在的Ｎ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。パネルＡは、前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号：７）。Ｎ−末端の太文字は、シグナリングペプチドと同定される。Ｃ−末端の太文字は、ＧＰＩアンカーシグナルと同定される。単一の下線は質量分析による同定されたペプチドを示し、他方、二重下線はペプチドが同一または異なる質量分析で２回同定されたことを示す。強調された文字は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位である。パネルＢは、公のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙｃにおけるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）によって開発されたソフトウェアＮｅｔＯＧｌｙｃ  ３．１を用いるＯ−結合グリコシル化部位の分析を示す。
【図３９】図３９は、三重突然変異体酵母におけるｇｐ１２０糖蛋白質のクローニングおよび発現を示す。パネルＡは、１．０％アガロースゲル上で泳動させた酵母形質変換体についてのコロニーＰＣＲ結果を示す。Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１の４つの別々の酵母クローンを、ＹＵ２−ｇｐ１２０またはＪＲＦＬ−ｇｐ１２０で形質変換し、−ｕｒａ／グルコースプレートから拾い、ＰＣＲマスターミックスと共にインキュベートした。ＰＣＲ混合物は、ｐＪＲＦＬ−ｇｐ１２０確証のためのプライマーＭＦα１−Ｋｐｎ−５およびＪＲＦＬ−Ｘｂａ−３、およびｐＹＵ−２−ｇｐ１２０のためのＭＦα１−Ｋｐｎ−５およびＹＵ２−Ｘｂａ−３を含有した。予測されるＰＣＲ産物のサイズは各々、ＪＲＦＬおよびＹＵ２で形質変換体については１７２４ｋＢおよび１６９７ｋＢであった。パネルＢは、抗−ｇｐ１２０−ＩＩＩＢ（Ｖｉｒｏｓｔａｔ  Ｉｎｃ．）を用いるｇｐ１２０の検出を示す。−ｕｒａ／ガラクトース培地における成長によって、各プラスミドの１つのΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１形質転換体をｇｐ１２０発現のために誘導した。培養基の試料を４つの異なる時点：０、３、６、および９日に収集した。蛋白質をアセトンで沈殿させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、抗−ｇｐ１２０−ＩＩＩＢを用いて検出した。パネルＣは、抗−ｇｐ１２０−ＹＵ２を用いるｇｐ１２０の検出を示す。同一Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１形質転換体を示した日の間に誘導した。蛋白質をアセトンで沈殿させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させ、抗−ｇｐ１２０−ＹＵ２を用いて検出した。双方の抗−ｇｐ１２０によって検出された得られた蛋白質は、６日〜９日において最適発現にて〜１１０ｋＤａにおいて明瞭なバンドを示す。
【図４０】図４０は、２Ｇ１２での発現されたｇｐ１２０の検出を示す。各プラスミドの１つのΔｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１形質転換体（ＪＲＦＬ−ｇｐ１２０およびＹＵ２−ｇｐ１２０）を、−ｕｒａ／ガラクトース培地での成長によってｇｐ１２０発現につき誘導し、非−形質転換Δｍｎｎ１Δｍｎｎ４Δｏｃｈ１の１つのクローンをＳＣ／ガラクトース中で成長させた。培養基の試料を、示したように、３、６および９日に収集した。蛋白質をアセトンで沈殿させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、２Ｇ１２を用いて検出した。これらのｇｐ１２０糖蛋白質は、各々、ＪＲＦＬ−ｇｐ１２０およびＹＵ２−ｇｐ１２０について９６．４および９９．６ｋＤａの予測された分子量を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月11日(2008.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009509970000001.app
【国際調査報告】
2009509970.tif 000066
2009509970.tif 000067