(57)【要約】  本発明は、インドール−３−アルキルカルボン酸（ＩＣＡ）を含む光感作剤、及びこれを含む光線力学治療用キットに関するものである。より詳細には、本発明はＩＣＡまたはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物、そして光感作剤としてＩＣＡを使う新規の光線力学治療方法に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む癌治療及び予防用光感作剤：
【化１】
2009542801.tif 000004
前記式（Ｉ）で、ｎは０ないし３の整数である。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、そして薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む薬学的組成物：
【化２】
2009542801.tif 000005
前記式（Ｉ）で、ｎは０ないし３の整数である。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物が、波長２８０ｎｍないし１，０００ｎｍの光に光感作されるものであることを特徴とする請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記式（Ｉ）の化合物が光線力学治療用であり、０．００１ｗｔ％ないし３０ｗｔ％の濃度で含有されるものであることを特徴とする請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物が、波長２８０ｎｍないし１，０００ｎｍの光に光感作されるものであることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記式（Ｉ）の化合物が、波長３５０ｎｍないし４５０ｎｍの光、波長４００ｎｍないし５００ｎｍの光、または波長５００ｎｍないし６００ｎｍの光に光感作されるものであることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記薬学的組成物の剤形が、液体、半固体、固体及びエアロゾルでなる群から選択される形態であることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記薬学的組成物の剤形が、水性または非水性懸濁液、溶液、クリーム、軟膏、ゲル、シロップ、座薬、錠剤、カプセル及び微細−滴スプレーでなす群から選択される形態であることを特徴とする請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記光線力学治療が、皮膚またはこれと係わる器官の疾病、オーラル（oral）及び消化器系疾病、泌尿器またはこれと係わる器官の疾病、呼吸器またはこれと係わる器官の疾病、循環系及びこれと係わる器官の疾病、頭脳とのどに係わる疾病、リンパ細網組織の疾病、そして微生物、ウイルス及び寄生虫を含む感染性疾病の治療または予防に適用されるものであることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記薬学的組成物が、局所塗布、静脈内注射、筋肉内注射、頭蓋内注射、腫瘍内注射、上皮内注射、経皮内注射、食道投与、皮膚投与、動脈注射、関節内注射及び口腔投与でなる群から選択される経路で投与されるものであることを特徴とする請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ｉ）式（Ｉ）の化合物を０．００１ｗｔ％ないし３０ｗｔ％の濃度で含有する薬学的組成物；及び
ii）２８０ｎｍないし１，０００ｎｍ波長の光を照射する光照射装置を含む光線力学治療用キット。
【請求項１２】
前記光照射装置が、３５０ｎｍないし４５０ｎｍ波長の紫外線、４００ｎｍないし５００ｎｍ波長の青色光、または５００ｎｍないし６００ｎｍ波長の緑色光を照射するものであることを特徴とする請求項１１に記載の光線力学治療用キット。
【請求項１３】
前記光照射装置が、発光ダイオード、レーザーダイオード、染料レーザー、ハロゲン化金属ランプ、フラッシュランプ、光線力学治療用のフィルタリングされた蛍光または他の種類のランプ、及びレーザーファイバーを通じて生体内に光を伝達するシステムでなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１１に記載の光線力学治療用キット。
【請求項１４】
前記光照射装置によって照射される光の強さが、１Ｊ／ｃｍ２ないし１００Ｊ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項１１に記載の光線力学治療用キット。
【請求項１５】
光照射装置によって照射される光のパルス持続時間が０．１ｍｓないし５００ｍｓであり、照射回数が１回ないし１００回であることを特徴とする請求項１４に記載の光線力学治療用キット。
【請求項１６】
前記光線力学治療が、皮膚またはこれと係わる器官の疾病、オーラル（oral）及び消化器系疾病、泌尿器またはこれと係わる器官の疾病、呼吸器またはこれと係わる器官の疾病、循環系及びこれと係わる器官の疾病、頭脳とのどに係わる疾病、リンパ細網組織の疾病、そして微生物、ウイルス及び寄生虫を含む感染性疾病の治療または予防に適用されるものであることを特徴とする請求項１１に記載の光線力学治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドール−３−アルキルカルボン酸（ＩＣＡ）を含む光感作剤、及びこれを含む光線力学治療用キットに関するものである。より詳細には、本発明はＩＣＡまたはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物、そして光感作剤としてＩＣＡを使う新規の光線力学治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光線力学治療（photodynamic therapy、ＰＤＴ）は最近癌治療において最も嘱望される治療方法の一つである。光線力学治療は、光感作剤、光、そして組織酸素（tissue oxygen）の三つの重要な要素を含む。また、光線力学治療は乾癬及びにきび治療用としても研究されている。光感作剤とは、特定波長の光によって励起することができる化合物である。このような励起に可視光線または近赤外線が使われる。前記光感作剤と酸素分子が会えば、エネルギー伝達が起こって前記光感作剤が弛緩（relaxation）して底一重項状態（singlet state）になり、励起された一重項状態の酸素分子を生成させる。一重項酸素（singlet oxygen）は非常に反応性の大きい化学種であり、その辺りに存在するいかなる生体分子とも早く反応する。結局、このような破壊的な反応による細胞自滅死（apoptosis）または怪死（necrosis）によって細胞を死滅させる。
【０００３】
詳細には、ＩＣＡは紫外線または可視光線によって刺激を受ける。ＩＣＡが光によって刺激を受ければ、ＩＣＡは自由ラジカル（free radical）を放出して癌細胞または不必要な組織または細菌などを破壊する。
【０００４】
ＰＤＴは光に敏感な薬物（光感作剤）と共にレーザー（laser）、または他の光源を使って癌細胞を破壊する。光感作剤は、細胞が光により敏感になるようにする薬物である。前記光感作剤は特定類型の光に露出する前までは活性がない。光を癌が分布する領域に照射すれば、前記薬物が活性化して癌細胞を破壊する。少数の元気な正常細胞らもＰＤＴによって影響を受けるが、このような細胞らは光線力学治療の後にたいてい癒される。ＰＤＴは皮膚癌、または頭脳とのど部分、口腔内膜（lining）、肺内膜、食道内膜、胃内膜、膀胱内膜、胆汁官内膜のような内部器官内膜の癌または、これらの周辺に生ずる癌を治療するのに使われることができる。さらに、ＰＤＴは乾癬または、にきびのような良性疾患（benign disease）の治療に適用することができる。しかし、ＰＤＴには多くの制限がある。したがって、安全で効果的な光線力学治療方法または光線力学治療用キットが開発される必要性が存在する。
【０００５】
悪性腫瘍の治療における光線力学治療の役割を理解するために、このような問題点に対する最新の接近法を考慮する必要がある。すべての治療法は、１）（原発腫瘍を治療する）局所療法、及び２）（播種性癌を治療する）全身療法に分類することができる。
【０００６】
局所療法の主な類型は、外科的治療と放射線治療を含む。局所治療は、一般的に原発腫瘍の破壊と部位リンパ節（regional lymphatic nodes）での転移を阻むことを目標とする。多くの癌患者において、このような治療法だけでも効果的である。全身療法は、たいてい化学療法または免疫療法を意味する。全身療法的な接近は原発性巨大転移及び微細転移を治療するために採択される。これは主に生命延長、そして外科的治療向上を目的とする。この外にも、全身療法は局所的な腫瘍所見（local tumor manifestations）を除去する。光線力学治療は局所療法として、局所的な腫瘍所見を治療することが目的である。しかし、ＰＤＴは表在性効果によってすべての形態の癌治療に適用することはできない。しかし、光感作剤が正常組織に比べて腫瘍細胞に選択的に蓄積されるという報告がある（Gomer and Dogherty, 1979；Jori, 1996；Young et al., 1996；Dougherty et al., 1998）。潜在的に、ＰＤＴ選択性は光感作剤の蓄積と露出領域制限（exposed area confinement）によって達成されることができる。これにより腫瘍細胞には深刻な損傷を与えて、元気な組織には微弱な損傷のみを与えることになる。このような治療的効果の向上によって他の治療法に対するＰＤＴの著しい利点が存在する。
【０００７】
光線力学治療研究は、１９８０年代に始まり、１９９０年代にカナダ、ドイツ及び日本で臨床手術が承認を受けた。アメリカでＦＤＡによって承認を受けた最初のＰＤＴ手術は、閉鎖性食道癌に対する姑息的（palliative）治療である。その後、１９９７年９月にＦＤＡはＰＤＴを使った肺癌治療を最初に承認した。しかし、大きい腫瘍を治療する場合、光が透過することができず、従来の光感作剤であるポルフィリン（porphyrin）が高価で副作用の危険があるため、現在施術されるＰＤＴは制限的である。したがって、腫瘍治療時に一貫性（consistency）が低いため、従来の治療法の効果に対する疑問がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ポルフィリン類（porphyrins）、クロリン類（chlorines）、バクテリオクロリン類（bacteriochlorins）、ポルフィシーン類（porphycenes）などのような次世代光感作剤らがたくさん研究されている（J Org. Chem.， 63, 1998, 1646-1656）。このような光感作剤のうち、葉緑素から金属イオンが除去されたフェオフィチン類（pheophytins）に対する研究が集中されている。フェオフィチン類は、ポルフィリン類より長波長の光をさらによく吸収するだけでなく、高純度で分離、製造が可能である。しかし、数多くの研究にもかかわらず、まだ実質的な研究結果を得ることができない。結果的に、ＰＤＴに使う効果的な光感作剤の開発が要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従来の光感作剤の欠点を克服するために、本発明者らは新規の光感作剤を開発するために長期間研究した結果、遂に高い癌組織選択性と最小の副作用を示す新規の光線力学治療用光感作剤；光線力学治療に使われる光感作剤用薬学的組成物；前記薬学的組成物の投与方法；そして前記光感作剤を含む光線力学治療用キットを開発した。
【００１０】
本発明の基本的な目的は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む癌治療及び予防用光感作剤を提供することである。
【化１】
2009542801.tif 000002
前記式（Ｉ）で、ｎは０ないし３の整数である。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、そして薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む薬学的組成物を提供することである。前記式（Ｉ）で、ｎは０ないし３の整数である。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、そして薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む薬学的組成物の投与方法を提供することであり、前記投与経路は局所塗布、静脈内注射、筋肉内注射、頭蓋内注射、腫瘍内注射、上皮内注射、経皮内注射、食道投与、皮膚投与、動脈注射、関節内注射、口腔投与からなる群から選択される。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ｉ）前記式（Ｉ）の化合物を０．００１ｗｔ％ないし３０ｗｔ％の濃度で含む薬学的組成物；そしてii）２８０ｎｍないし１，０００ｎｍ波長の光を照射する光照射装置を含む光線力学治療用キットを提供することである。
【００１４】
本発明の基本的な目的は、副作用がほとんどなく非常に敏感で選択的な光線力学治療剤を提供することで達成することができる。本発明は、インドール−３−アルキルカルボン酸（ＩＣＡ）の誘導体及びその光感作剤としての用途に関するものである。より詳細には、ＩＣＡ誘導体は紫外線または可視光線、特に青色光及び緑色光によって光活性化することができる。ＩＣＡに光を照射すれば、光活性化したＩＣＡが癌細胞または疾病組織を破壊することができる。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前述した光とＩＣＡを併用する光線力学的癌治療用キットを提供することである。
【００１６】
インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）はオーキシンという植物ホルモンの一種である。ＩＡＡは一般的に最も重要な天然オーキシン、植物成長調節剤であると考えられている。
【００１７】
インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）は植物成長ホルモンであって、イーストと動物細胞に対して生体活性がある。ＩＡＡを西洋わさび過酸化酵素（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）とともに使えば人間癌細胞を死滅させることができ、新規の抗癌剤として使うことができると報告された（Kim DS et al. Oxidation of indole-3-acetic acid by horseradish peroxidase induces apoptosis in G36１ human melanoma cells. Cell Signal 2004; 16: 81-8； Greco et al. Mechanisms of cytotoxicity induced by horseradish peroxide/indole-3-acetic acid gene therapy. J Cell Biochem 2002; 87: 221-32； Huang et al. Apoptosis of pancreatic cancer BXCP-3 cells induced by indole-3-acetic acid in combination with horseradish peroxide. World J Ganstroenterol 2005; 11: 4519−23）。さらに、ＩＡＡ／ＨＲＰ−誘導細胞自滅死（apoptosis）が抗酸化剤によって遮断されるので、本発明者らはＩＡＡ／ＨＲＰ−誘導自由ラジカルが細胞自滅死を誘導するということを提案した。しかし、前記ＩＡＡ／ＨＲＰ−媒介反応にどのような自由ラジカルが関与して前記自由ラジカルがどのような作用をするかは知られていない。
【００１８】
ＩＡＡ単独では人間に毒性がなくて耐性が大きいが、ＨＲＰによる酸化性脱カルボキシル反応（oxidative decarboxylation）が起こった後には、ＩＡＡが活性化するので、ＩＡＡはおもしろい物質である。したがって、ＨＲＰを癌細胞に標的化（targeting）する場合のみにＩＡＡが腫瘍において活性化すると提案された。このような研究に基づけば、腫瘍にＨＲＰを標的化させるための三つの概念が提案される：抗体誘導酵素前駆薬物治療法（antibody directed enzyme prodrug therapy、ＡＤＥＰＴ）、高分子誘導酵素前駆薬物治療法（polymer directed enzyme prodrug therapy、ＰＤＥＰＴ）、そして遺伝子誘導酵素前駆薬物治療法（gene directed enzyme prodrug therapy、ＧＤＥＰＴ）（Use of indole-3-acetic acid derivatives in medicine、United States patent 6890948）。しかし、ＡＤＥＰＴは外部タンパク質であるので、免疫学的な問題を起こすことがある。ＧＤＥＰＴでは、酵素が細胞内のみで発現されることができる。したがって、ＩＡＡを活性化させるための十分な量のＨＲＰを腫瘍組織まで伝達することが容易ではない。
【００１９】
したがって、本発明者らは光がインドール−３−アルキルカルボン酸（ＩＣＡ）を活性化させて自由ラジカルを生成することで癌細胞の怪死を誘導することができるかに対して研究した。そして、実際に、ＩＣＡが紫外線と可視光線によって活性化するということを見つけた。
【００２０】
最近、ＩＡＡが自由ラジカルを生成することで光線力学的癌治療の効果を向上させるという報告があった（Folkes, L. K. and Wardman, P. Enhancing the efficacy of photodynamic cancer therapy by radicals from plant auxin (indole-3-acetic acid). Cancer Res, 63: 776-779, 2003； Folkes, L. K. and Wardman, P. Oxidative activation of indole-3-acetic acids to cytotoxic species - a potential new role for plant auxins in cancer therapy. Biochem Pharmacol. 2001 Jan 15; 61(2):129-36）。このような報告書によると、ＩＡＡを酸化させるためにフェノチアジニウム染料（phenothiazinium dye）または、トルイジンブルー染料（toluidine blue dye）が光感作剤として使われた。過酸化酵素（peroxidase）またはフェノチアジニウム染料やリボフラビン（riboflavin）を含む他の光触媒によるＩＡＡの酸化的活性化は癌細胞や微生物に毒性がある（Fukuyama TT and Moyed HS. Inhibition of cell growth by photooxidation products of indole-3-acetic acid. J Biol Chem 1964, 239(7): 2392-2397）。しかし、ＩＡＡは光感作剤として知られていなく、光とともに癌治療に使われたところがない。本発明において、本発明者らはＩＣＡを光感作剤として使って、紫外線と可視光線との両方でＩＣＡの活性化に効果があった。紫外線と比較すると、可視光線は組織深く浸透することができる。したがって、可視光線が腫瘍組織でＩＣＡを活性化するための光の伝達に効果的であった。さらに、ＩＣＡと光の併用は腫瘍細胞のみに毒性を示した。このような結果は、正常なヒト繊維芽細胞（fibroblast）がＩＣＡとＨＲＰまたは光との併用による毒性に抵抗性があるという事実を表す（図２、図３、図４及び図５）。したがって、本発明は副作用がほとんどなく非常に敏感で選択的な光線力学治療方法を提供する。
【００２１】
このような目的を達成するために、式（Ｉ）の化合物の誘導体を含む薬学的光感作剤組成物が提供される。式（Ｉ）で、ｎは０ないし３の整数である。
【化２】
2009542801.tif 000003
【００２２】
また、本発明は光感作剤の品質に効果的な成分らと光線力学治療に効果的な量を含む、前記式（Ｉ）の構造を有するインドール−３−アルキルカルボン酸の組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は前記式（Ｉ）の構造を有する光感作剤ＩＣＡと生体内または生体外の光伝達のための発光装置を含む光線力学治療用キットを提供する。本発明において、ＩＣＡは光によって活性化するためにどのような光触媒も要しない。さらに、どのような波長の光でもＩＣＡを活性化させることができるが、紫外線（＞２８０ｎｍ）がＩＣＡの活性化に最も効果的である。より長い波長の光は組織深く浸透することができる。したがって、２８０ｎｍないし１，０００ｎｍ範囲のどのような波長の光も効果的に使われることができる。しかし、実験結果によれば、青色光及び緑色光（４００ｎｍないし６００ｎｍ）がＩＣＡを活性化させることに最も効果的であった。
【００２４】
本発明において、前記発光装置は発光ダイオード、レーザーダイオード、染料レーザー、ハロゲン化金属ランプ、フラッシュランプ（flash lamp）、光線力学治療用のフィルタリングされた蛍光または他の種類のランプ、またはレーザーファイバーを通じて生体内に光を伝達するシステムであることができる。
【００２５】
さらに、ＩＣＡは、体内に注入された後に光活性化するか、または体内に注入する前に光活性化することができる。生体外のＩＣＡ活性化で放出される光のエネルギー強さに制限がないために、放出された光の強さが弱い場合には、光に対する露出時間及び／または周波数を増加させて、光の強さが強い場合には、光に対する露出時間及び／または周波数を減らせばよい。
【００２６】
光の強さがあまりにも弱ければ、目標組織まで充分に浸透することができないので、効果的な光活性化ができない。反面、光の強さがあまりにも強ければ、正常組織の怪死が起こるので、効果的な光活性化が起こらない。したがって、光の強さは１Ｊ／ｃｍ２ないし１００Ｊ／ｃｍ２を維持しなければならない。
【００２７】
さらに、パルス持続時間があまりにも短いか、または伝達回数があまりにも低ければ、光活性化効率が低下する反面、パルス持続時間があまりにも長いか、または伝達回数があまりにも高ければ、正常組織の怪死が起こる。したがって、前記パルス持続時間は０．１ｍｓないし５００ｍｓを維持しなければならないし、光の放出回数は１回ないし１００回を維持しなければならない。
【００２８】
光線力学治療（ＰＤＴ）において、ＩＣＡ組成物は、全重量の０．００１％ないし９９％、より望ましくは０．００１％ないし３０％のＩＣＡを含む。ＩＣＡの光感作効果と治療効果を充分に維持するために、ＩＣＡの重さは少なくとも０．００１％でなければならない。前記組成物は、液体、半固体、固体、または水性や非水性懸濁液のようなエアロゾル、溶液、クリーム、軟膏、シロップ、座薬、錠剤、カプセル、微細液滴スプレーなどの剤形であることができる。また、前記のような剤形化に必要な伝達賦形剤（delivery vehicle）が前記組成物に添加されることができる。また、前記組成物は、保存及び投与のために、防腐剤、安定剤、バッファー（buffer）、ｐＨ調節剤、甘味料、香料、色素などを含むことができる。さらに、治療の目的によって他の種類の薬物が前記組成物に添加されることができる。
【００２９】
ＩＣＡは体内に注入後に光活性化するか、または体内注入前に光活性化することができる。体内で光活性化するために、ＩＣＡは体内投入後に光が照射されなければならない。ＩＣＡを含む光感作剤は、局所塗布、静脈内注射、筋肉内注射、頭蓋内注射、腫瘍内注射、上皮内注射、経皮内注射、食道投与、皮膚投与、動脈注射、関節内注射、及び口腔投与を含む多様な投与方法によって投与されることができる。
【００３０】
本発明の薬学的組成物及び光線力学治療用キットは、皮膚またはこれと係わる器官の疾病（光線角化症（actinic keratosis）、いぼ、ボーエン病（Bowen's disease）、にきび、基底細胞癌腫（basal cell carcinoma）、扁平上皮癌（squamous cell carcinoma）、悪性黒色腫（malignant melanoma）、乾癬（psoriasis）、扁平苔癬（lichenplanus）など）、オーラル（oral）及び消化器系疾病（胃癌、十二支膓癌、胃炎など）、泌尿器またはこれと係わる器官の疾病（前立腺癌（prostate cancer）、前立腺炎（prostatitis）、子宮頸部癌（cervix cancer）、子宮内膜炎（endometritis）、子宮癌、骨盤内感染（pelvic inflammatory disease）など）、呼吸器またはこれと係わる器官の疾病（肺癌など）、循環系及びこれと係わる器官の疾病（白血病（leukemia）など）、頭脳とのどに係わる疾病（脳癌（brain cancer）、甲状腺癌（thyroid cancer）、喉頭癌（larynx cancer）、喉頭炎（laryngitis）、鼻癌（nose cancer）、鼻炎（rhinitis）、舌癌（tongue cancer）など）、リンパ細網組織の疾病（リンパ種（lymphoma）など）、そして微生物、ウイルス及び寄生虫を含む感染性疾病（膿痂疹（impetigo）、腫れもの（furuncle）、癰（carbuncle）など）の治療または予防に使われることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１のインドール−３−酢酸とHorseradish Peroxidase（ＨＲＰ）による細胞毒性を測定したグラフである。
【図２】実施例２の多様な種類の細胞株に対するインドール−３−酢酸とＨＲＰの併用による細胞毒性を示したグラフである。
【図３】実施例２の多様な種類の細胞株に対するインドール−３−酢酸とＨＲＰの併用による細胞毒性を示したグラフである。
【図４】実施例２の多様な種類の細胞株に対するインドール−３−酢酸とＨＲＰの併用による細胞毒性を示したグラフである。
【図５】実施例３のインドール−３−酢酸と光線の併用による細胞毒性を示したグラフである。
【図６】実施例４のインドール−３−酢酸の多様な波長による光活性化程度を示したグラフである。
【図７】実施例５のIntense Pulsed Light（ＩＰＬ）単独照射によって癌細胞らが影響を受けないことを表す写真である。
【図８】実施例６のＩＡＡとＩＰＬの併用による癌の治療効果を示す写真である。
【図９】実施例７でＩＡＡとＩＰＬの併用による癌の予防効果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を下記の実施例に基づいてより詳細に説明する。下記実施例らは本発明を例示するためのものであるだけで、本発明がこれら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：インドール−３−酢酸とＨＲＰによる細胞毒性効果
本実験を通じてＩＡＡの細胞毒性効果は、ＨＲＰとともに使うときに現れ、ＩＡＡ単独では全然毒性を表さないという事実を確認した。
【００３４】
（細胞培養）
悪性黒色腫細胞株であるＧ３６１（ＡＴＣＣ、Rockville、ＭＤ）細胞を５％のＣＯ２、３７℃の条件下で１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのペニシリンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地（WelGene、大邱、韓国）で培養した。
【００３５】
（Ｇ３６１細胞での毒性実験）
前記ＲＰＭＩ培養液で育てた細胞を２４個のウェルを有する培養容器に分株して（４×１０４個／ウェル）、牛胎児血清が含まれていない培地で２４時間の間培養した。細胞毒性効果は、ＭＴＴ［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide］分析法を利用して測定した（Kim, D. S.， Jeon, S.E.， Park, K. C. Cell Signal, 16, 81-8, 2004）。
【００３６】
ＨＲＰ（１．２ｍｇ／ｍＬ、 Sigma、 St. Louis、 MO）で処理した群（図１に‘○'で表示される）とＨＲＰを処理しない群（図１に‘■'で表示される）に分けて、前記培地に溶解されているＩＡＡの最終濃度が１ないし５００ｍＭになるように処理して２０時間培養した後、ＭＴＴ溶液０．５ｍｇ／ｍＬを入れて培地で４時間さらに培養した。その後、１ｍＬ ジメチルスルフォキサイド溶液をウェルに入れて溶解させ、ＥＬＩＳＡ判読機（ＴＥＣＡＮ、Salzburg、Austria）を使って５４０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度は計算式１で計算して細胞生存率を換算し、その結果は図１に示した。図１において、ＩＡＡを含まない対照群の生存率を１００％にした。
【００３７】
（計算）
細胞生存率（％）＝（実験群の吸光度／対照群の吸光度）×１００
図１から分かるように、ＩＡＡを単独で処理した群（■）では、何らの細胞毒性も見えない反面、ＩＡＡとＨＲＰをともに処理した群（○）では、１００ｍＭ以上の濃度で確実な細胞毒性の効果が観察された。本実験の結果、ＩＡＡは単独では細胞毒性効果を示すことができず、ＨＲＰなどの活性化剤の使用が必須的であることが分かる。
【００３８】
実施例２：多種類の細胞株に対するＩＡＡ／ＨＲＰの細胞毒性効果
多様な種類の腫瘍細胞株及び繊維芽細胞などを培養した後、ＩＡＡとＨＲＰを処理した。実験結果、ＩＡＡ／ＨＲＰの併用は癌細胞株には細胞毒性効果が良い反面、正常細胞である繊維芽細胞には毒性効果がないことを確認することができた。
【００３９】
胃癌細胞株（ＳＮＵ１、ＳＮＵ１６、ＳＮＵ６０１、ＳＮＵ７１９、韓国細胞株銀行、ソウル、韓国）、肝癌細胞株（ＰＬＣ／ＰＲＦ５、韓国細胞株銀行、ソウル、韓国）、及び肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１５７、ＮＣＩ−Ｈ１２６４、韓国細胞株銀行、ソウル、韓国）を５％のＣＯ２、３７℃の条件下で１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのペニシリンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、肝癌細胞株（ＳＫ−ＨＥＰ−１、韓国細胞株銀行、ソウル、韓国）は同じ条件のＤＭＥＭ培地（WelGene、大邱、韓国）で培養した。繊維芽細胞（fibroblasts）は、子供の包茎手術によって得られた包皮で分離して使った。皮膚生検は、Rheinward and Greenの方法に従って遂行し、（Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975; 6: 331-43.）、前記分離された繊維芽細胞は、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。
【００４０】
（多様な細胞での毒性実験）
培養液で育てた細胞を２４個のウェルを有する培養容器に分株して（４×１０４個／ウェル）、牛胎児血清が含まれていない培地で２４時間の間培養した。細胞毒性効果は、ＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide）分析法を利用して測定した。ＨＲＰ（１．２ｍｇ／ｍＬ）で処理した群と処理しない群に分けて、前記培地に溶解されているＩＡＡの最終濃度が５０ないし１０００ｍＭになるように処理して２０時間培養した後、ＭＴＴ溶液０．５ｍｇ／ｍＬを入れて培地で４時間さらに培養した。その後、１ｍＬ ジメチルスルフォキサイド溶液をウェルに入れて溶解させ、ＥＬＩＳＡ判読機を使って５４０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度は計算式１で計算して細胞生存率を換算し、その結果は図２ないし図４に示した。図２ないし図４でＩＡＡを含まない対照群の生存率を１００％にした。
【００４１】
（計算）
細胞生存率（％）＝（実験群の吸光度／対照群の吸光度）×１００
図２ないし図４から分かるように、ＩＡＡだけ単独処理した場合には、癌細胞株と正常細胞のいずれでも細胞毒性効果が現れず、ＩＡＡとＨＲＰをともに処理した場合には癌細胞株のみで特異的に細胞毒性効果が現れ、正常繊維芽細胞には細胞毒性効果が現れなかった。
【００４２】
実施例３：多種類の細胞株に対するＩＡＡ／ＵＶＢの細胞毒性
多様な種類の腫瘍細胞株及び繊維芽細胞などを培養した後、紫外線を照射したＩＡＡを処理した。実験結果、ＩＡＡ／ＵＶＢの併用は癌細胞株には細胞毒性効果がよい反面、正常細胞である繊維芽細胞には毒性効果がないことを確認した。
【００４３】
（細胞培養）
悪性黒色腫細胞株であるＧ３６１（ＡＴＣＣ、Rockville、ＭＤ）を５％のＣＯ２、３７℃下で１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのペニシリンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、ネズミの悪性黒色腫細胞株であるＢ１６（韓国細胞株銀行、ソウル、韓国）と肝癌細胞株（ＳＫ−ＨＥＰ−１、韓国細胞株銀行、ソウル、韓国）は同じ条件のＤＭＥＭ培地で培養した。繊維芽細胞（fibroblasts）は子供の包茎手術によって得られた包皮から分離した。皮膚生検はRheinward and Greenの方法によって遂行し、分離した繊維芽細胞は１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μｇ／ｍＬのペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。
【００４４】
（多様な細胞での毒性実験）
培養液で育てた細胞を２４個のウェルを有する培養容器に分株して（４×１０４個／ウェル）、牛胎児血清が含まれていない培地で２４時間の間培養した。細胞毒性効果はＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide）分析法を利用して測定した。ＵＶＢ（１００ｍＪ／ｃｍ２）を照射したＩＡＡを処理した群とＵＶＢ照射なしにＩＡＡのみ処理した群に分けて、前記培地に溶解されているＩＡＡの最終濃度が０．５ないし１ｍＭになるように処理して２０時間培養した後、ＭＴＴ溶液０．５ｍｇ／ｍＬを入れて培地で４時間さらに培養した。その後、１ｍＬ ジメチルスルフォキサイド溶液をウェルに入れて溶解させ、ＥＬＩＳＡ判読機を使って５４０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度は計算式１で計算して細胞生存率を換算し、その結果は図５に示した。図５において、ＩＡＡを含まない対照群の生存率を１００％にした。
【００４５】
（計算）
細胞生存率（％）＝（実験群の吸光度／対照群の吸光度）×１００
図５から分かるように、ＩＡＡのみ単独処理した場合には、癌細胞株と正常細胞のいずれでも細胞毒性効果が現れず、ＵＶＢを照射したＩＡＡをともに処理した場合には癌細胞株のみで特異的に細胞毒性効果が現れ、正常繊維芽細胞には細胞毒性効果が現れなかった。
【００４６】
実施例４：ＩＡＡの多様な波長による光感作効果
ＩＡＡの光感作に及ぶ多様な波長の影響を調査するために、ＨＬ−２０００−ＨＰ光源（Ocean Optics、Dunedin、FL、アメリカ）照射器を使った。自由ラジカルの生成は2,7-dichlorofluorescin diacetate（ＤＣＦＨ−ＤＡ）が自由ラジカルによって蛍光を示すdichlorofluorescein（ＤＣＦ）を生成するという原理を利用して測定した。ＤＣＦＨＤＡを活性化させるために、ＤＣＦＨ−ＤＡを１００％エタノールに１ｍＭの濃度で溶解させた後、前記溶液を３５０μl取って、０．０１Ｎ ＮａＯＨ１．７５ｍＬと混合して、５分、１０分及び２０分間反応させた。これに２５ｍＭのナトリウム−リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）１７．９ｍＬを添加して活性化したＤＣＦＨ−ＤＡ溶液を準備した。活性化したＤＣＦＨ−ＤＡ溶液にＩＡＡ１ｍＭを処理し、ＨＬ−２０００−ＨＰ光源と共に多様な波長に該当するフィルター（３８０、４００、４８０、５２０、５９０、６４０ｎｍ）（Thorlabs、Inc.，Long Beach、CA、アメリカ）を使って各波長でＩＡＡが光感作されるか否かを調査し、その結果を図６に示した。吸光度はＥＬＩＳＡ判読機を使って４９０ｎｍで測定した。図６に示すように、５分ないし２０分照射した結果、４８０ｎｍ（青色光）と５２０ｎｍ（緑色光）の波長が他の波長に比べて優秀なＩＡＡ光感作効果を表した。
【００４７】
実施例５：ＩＰＬ単独照射による癌の治療効果
ダイオード光源では十分な臨床的効果を期待しにくいという点を考慮して、本動物実験では比較的強いエネルギーの光を照射するＩＰＬ（Intense Pulsed Light）を動物実験時に光源として使った。まず、ＩＰＬの単独効果を調べるために、腫瘍細胞注射１日後ＩＰＬを照射した。ＩＰＬ照射４日後、組織学的所見を確認して図７に示し、真皮内腫瘍結節の組織所見内何らの怪死の所見を表さなくてＩＰＬ単独では何らの細胞毒性がないことを確認することができた。
【００４８】
（癌細胞株の移植）
人体肺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１２６４細胞株を０．１Ｍ ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）で洗浄した後、１×１０６、１×１０５、そして５×１０４と細胞数を違うようにして３０Ｇシリンジを利用してそれぞれヌードマウス（Charles River Lab. Wilmington、MA、雄、６週齢、体重２２〜２５ｇ）に皮内注射し、４日後に組織所見を観察した結果、腫瘍が形成されることを確認した。癌細胞株移植が完了した後、実験動物は無菌動物飼育室で一定期間腫瘍結節が形成されるまで飼育した。
【００４９】
（ＩＰＬの照射）
可視光線の照射器機としてEclipse社のintense pulsed light（ＩＰＬ）器機を使った。実験に使ったＩＰＬ器機は５１５ｎｍないし１２００ｎｍ間の光線を照射することができる器機であって、２０Ｊ／ｃｍ２のエネルギー量で光線を照射した。腫瘍形成部位にTransmission gel（PROGEL DA−YO Medical、ソウル、韓国）を塗った後、ＩＰＬを各部位ごとに２回ずつ照射した。光線力学治療が終わった投与群は動物飼育室で次の実験の時まで飼育した。
【００５０】
実施例６：ＩＡＡとＩＰＬの併用による癌治療効果
人体肺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１２６４細胞株１×１０６個をヌードマウス（Charles River Lab. Wilmington、MA、雄、６週齢、体重２２−２５ｇ）に皮内注射した後、一群は４日目、他の一群は７日目にＩＡＡを５０ｍｇ／ｋｇの量で静脈内注射し、３０分の後、前記実施例５のように、ＩＰＬ（２０Ｊ／ｃｍ２）を照射した。１２日後、前記実施例５の方法とＴＵＮＥＬ試験法によって組織検査を施行した結果、腫瘍内怪死の現象を確認することができた。したがって、ＩＡＡはＩＰＬのように使った時、細胞怪死を誘導する能力があり、癌などの疾患の治療に効果があることを確認した。
【００５１】
（ＩＡＡの投与）
実験に使うＩＡＡ（１０ｍｇ／ｍＬ in ５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３／２％ｖ／ｖエタノール／水、ｐＨ７）を準備する。腫瘍結節が形成された実験動物は、対照群と投与群に分離し、投与群は二つの群に分けて、一群は腫瘍注入後４日目に、他の一群は腫瘍注入後７日目にＩＡＡ（ｐＨ７、５０mg／kg）を、静脈内注射を通じて注入した。ＩＡＡ注入後３０分後、前記実施例５のように、ＩＰＬ（２０Ｊ／ｃｍ２）を照射した。
【００５２】
（ＴＵＮＥＬ試験法）
ＴＵＮＥＬ（Chemicon、Temecula、ＣＡ）検出キットを使って使用説明書にしたがって試験を進行した。略述すれば、前記ＩＡＡ注入及びＩＰＬ照射後１２日後に、ヌードマウスから組織を引き離して１０％ホルマリンで２４時間固定した後、０．１％ Triton X−１００を使って細胞透過性を増大させた。ＤＮＡ断片は末端デオキシヌクレオチド転移酵素（terminal deoxynucleotidyl transferase）と抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼコンジュゲート（anti−digoxigenin peroxidase conjugate）の培養によって標識した。色の形成はペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジン（diaminobenzidine）を使って観察した。
【００５３】
前記観察結果を図８に示した。図８から分かるように、ヘマトキシリン・エオシン染色とＴＵＮＥＬ試験法との両方でＩＡＡとＩＰＬの並行処理によって腫瘍怪死が誘導されたことを確認することができた。
【００５４】
実施例７：ＩＡＡとＩＰＬの併用による癌の予防効果
ＩＡＡとＩＰＬの併用によって癌細胞の怪死を起こすことができるという事実は確認した。しかし、癌の治療において、癌の組織学的転移または他の器官への遠隔転移などに対する予防がより重要である。このような予防効果を確認するために、癌細胞を注射して腫瘍結節が発生する前に周期的にＩＡＡとＩＰＬ治療を並行した後、結果を比較してみた。ＮＣＩ−Ｈ１２６４細胞株を移植した後、１日目、３日目、５日目にＩＡＡ及びＩＰＬを処理した。
【００５５】
癌細胞注入１０日後、組織検査を施行した。この結果は図９に表す。予想したように、対照群では腫瘍細胞の成長が観察された反面、ＩＡＡとＩＰＬを併用した群では腫瘍細胞を見つけることができなかった。したがって、本発明のＩＡＡとＩＰＬ併用方法が遠隔転移の予防に有用であると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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