(57)【要約】  ＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を持って、ＩＧＦ−ＩＩに対して向けられる抗体などの結合タンパク質、およびこうした抗体の使用を記載する。特に、ＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を持って、ＩＧＦ−ＩＩに対して向けられる完全ヒト・モノクローナル抗体を開示する。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、および該分子を含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）に渡る、特にＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の隣接重鎖および軽鎖配列に対応する配列もまた、論じる。
2009519711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に優先的に結合し、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ活性を中和する、完全ヒト単離特異的結合タンパク質。
【請求項２】
ＩＧＦ−Ｉに対するより、少なくとも２．５倍高いアフィニティーでＩＧＦ−ＩＩに結合する、請求項１の特異的結合タンパク質。
【請求項３】
ＩＧＦ−１Ｒを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＩＧＦ−Ｉ依存性ＩＧＦ−Ｉ受容体リン酸化の阻害に関して、１５ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１の特異的結合タンパク質。
【請求項４】
ＩＧＦ−１Ｒを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＩＧＦ−ＩＩ依存性ＩＧＦ−Ｉ受容体リン酸化の阻害に関して、５ｎＭ以下のＥＣ５０を有する、請求項１の特異的結合タンパク質。
【請求項５】
２５ｎＭ以下のＥＣ５０で、組換えｈＩＧＦ−ＩＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のＩＧＦ−ＩＩ依存性増殖の７０％より多くを阻害する、請求項１の特異的結合タンパク質。
【請求項６】
４０ｎＭ以下のＥＣ５０で、組換えｈＩＧＦ−ＩＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のＩＧＦ−Ｉ依存性増殖の７０％より多くを阻害する、請求項１の特異的結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１８からなる群より選択される可変重鎖配列を含むモノクローナル抗体との結合に関して競合する、請求項１の特異的結合タンパク質。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群より選択される可変軽鎖配列を含む、請求項７の特異的結合タンパク質。
【請求項９】
４ｎＭ未満のＫＤで、ＩＧＦ−Ｉに結合する、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１０】
６５０ｐＭ未満のＫＤで、ＩＧＦ−Ｉに結合する、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１１】
３００ｐＭ未満のＫＤで、ＩＧＦ−ＩＩに結合する、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１２】
完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１３】
完全ヒト・モノクローナル抗体の結合断片である、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１４】
前記結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２およびＦｖからなる群より選択される、請求項１３の特異的結合タンパク質。
【請求項１５】
モノクローナル抗体７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）である、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１６】
モノクローナル抗体７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）である、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１７】
モノクローナル抗体７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）である、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号６の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号８の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号１０の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項２１】
配列番号１２の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号１４の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項２３】
配列番号１６の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項２４】
薬学的に許容されうるキャリアーと混合された、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１の特異的結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２６】
請求項２５の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉタンパク質がインスリン増殖因子結合タンパク質に結合している際には、前記抗体がＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉタンパク質に特異的に結合しない、請求項１２のヒト・モノクローナル抗体。
【請求項２９】
患者試料における、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）およびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルを測定する方法であって：
患者試料を提供し；
前記試料と請求項１の結合タンパク質を接触させ；そして
前記試料中のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩレベルを測定する
工程を含む、前記方法。
【請求項３０】
患者試料が血液である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
悪性腫瘍の治療のための薬剤の調製における請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質の使用。
【請求項３２】
前記結合タンパク質が、完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項３１の使用。
【請求項３３】
前記悪性腫瘍が：黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項３１の使用。
【請求項３４】
結合タンパク質が、ｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）またはｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）またはｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）である、請求項３２の使用。
【請求項３５】
前記薬剤が、抗体、化学療法剤、および放射性薬剤からなる群より選択される第二の抗新生物剤と組み合わせた使用のためのものである、請求項３１の使用。
【請求項３６】
前記薬剤が、慣用的な手術、骨髄幹細胞移植または末梢幹細胞移植と組み合わせたかまたはこれらに続く使用のためのものである、請求項３１の使用。
【請求項３７】
増殖因子依存性疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質の使用。
【請求項３８】
前記結合タンパク質が、完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項３７の使用。
【請求項３９】
抗体が、ｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群より選択される、請求項３８の使用。
【請求項４０】
増殖因子依存性疾患が：骨粗鬆症、糖尿病、および心臓血管疾患からなる群より選択される、請求項３７の使用。
【請求項４１】
哺乳動物において、悪性腫瘍を治療する方法であって：
悪性腫瘍の治療が必要な哺乳動物を選択し；そして
請求項１の特異的結合タンパク質の療法的有効用量を前記哺乳動物に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４２】
前記動物がヒトである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記結合タンパク質が、完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項４１の方法。
【請求項４４】
前記悪性腫瘍が：黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項４１の方法。
【請求項４５】
結合タンパク質が、ｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群より選択される、請求項４１の方法。
【請求項４６】
哺乳動物において、増殖因子依存性疾患を治療する方法であって：
増殖因子依存性疾患の治療が必要な哺乳動物を選択し；そして
請求項１の特異的結合タンパク質の療法的有効用量を前記哺乳動物に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記結合タンパク質が、完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項４６の方法。
【請求項４９】
抗体が、ｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項５０】
増殖因子依存性疾患が：骨粗鬆症、糖尿病、および心臓血管疾患からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項５１】
請求項１２の抗体またはその結合断片および療法剤を含む、コンジュゲート。
【請求項５２】
療法剤が毒素である、請求項５１のコンジュゲート。
【請求項５３】
療法剤が放射性同位体である、請求項５１のコンジュゲート。
【請求項５４】
療法剤が薬学的組成物である、請求項５１のコンジュゲート。
【請求項５５】
前記結合タンパク質、またはその結合断片が：
「Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ」（配列番号２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
「Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ」（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
「Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ」（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
「Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ」（配列番号２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
「Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ」（配列番号２５）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
「Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ」（配列番号２６）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項５６】
前記結合タンパク質、またはその結合断片が：
「Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ」（配列番号２７）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
「Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ」（配列番号２８）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
「Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ」（配列番号２９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
「Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ」（配列番号３０）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
「Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ」（配列番号３１）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
「Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ」（配列番号３２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【請求項５７】
前記結合タンパク質、またはその結合断片が：
「Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ」（配列番号３３）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
「Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ」（配列番号３４）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
「Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ」（配列番号３５）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
「Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ」（配列番号３６）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
「Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ」（配列番号３７）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および
「Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ」（配列番号３８）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む、請求項１〜８のいずれか１項の特異的結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
［０００１］本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９のもとに、各々、その全体が本明細書に援用される、米国仮出願第６０／７５０，０８５号、２００５年１２月１３日出願；米国仮出願第６０／７５０，７７２号、２００５年１２月１４日出願；米国仮出願第６０／７７４，７４７号、２００５年２月１７日出願；および米国仮出願第６０／８０８，１８３号、２００６年５月２４日出願に優先権を請求する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
［０００２］本発明は、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する結合タンパク質、およびこうした結合タンパク質の使用に関する。より具体的には、本発明は、ＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を持つ、ＩＧＦ−ＩＩに対して向けられるモノクローナル抗体、およびこれらの抗体の使用に関する。本発明の側面はまた、こうした抗体を発現しているハイブリドーマまたは他の細胞株にも関する。
【０００３】
関連技術の説明
［０００３］インスリン様増殖因子ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、細胞増殖、生存、分化および形質転換を制御する際に関与する小さいポリペプチドである。ＩＧＦは、主に、特異的細胞表面受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）と相互作用し、そして多様な細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって、多様な作用を発揮する。ＩＧＦは、大部分、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜６）に結合して、血清中を循環する。ＩＧＦ−ＩＲとＩＧＦの相互作用は、ＩＧＦＢＰによって制御され、そしてＩＧＦは、ＩＧＦＢＰから遊離（大部分、ＩＧＦＢＰのタンパク質分解による）してからでないと、ＩＧＦ−ＩＲに結合できない。ＩＧＦ−Ｉはまた、ＩＧＦ−ＩＲおよびインスリン受容体（ＩＲ）サブユニットで構成されるハイブリッド受容体にも結合可能である。ＩＧＦ−ＩＩは、インスリン受容体の「Ａ」アイソフォームに結合することが示されている。
【０００４】
［０００４］悪性形質転換には、細胞増殖、分化、アポトーシス、および形質転換などの多様なプロセスの不均衡が関与する。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、広範囲の状態の病態生理に関連付けられてきており、そして受容体、ＩＧＦ−ＩＲによって仲介される分裂促進特性および抗アポトーシス特性のため、腫瘍生成において役割を果たすと考えられる。ＬｅＲｏｉｔｈおよびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １９５：１２７−１３７（２００３）。
【０００５】
［０００５］ＩＧＦ−Ｉは、下垂体成長ホルモンの制御調節下で、肝臓によって産生される増殖因子として発見され、そして元来は、ソマトメジン−Ｃと称された。Ｓａｌｍｏｎら，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  ４９：８２５−８２６（１９５７）。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩはどちらも遍在性に発現され、そしてインスリン受容体（ＩＲ）に構造的にそして機能的に関連する膜貫通チロシンキナーゼであるＩＧＦ−ＩＲとの相互作用を通じて、内分泌、傍分泌、および自己分泌増殖因子として作用する。ＩＧＦ−Ｉは、主に、ＩＧＦ−ＩＲを活性化することによって機能し、一方、ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＲまたはＩＲ−Ａアイソフォームのいずれかを通じて、作用可能である。ＬｅＲｏｉｔｈおよびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １９５：１２７−１３７（２００３）。さらに、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ両方とＩＧＦ結合タンパク質の相互作用は、ＩＧＦの半減期および生物学的利用能、ならびにいくつかの場合は、受容体とこれらの直接相互作用にも影響を及ぼしうる。Ｒａｊａｒａｍら，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １８：８０１−８３１（１９９７）。
【０００６】
［０００６］ＩＧＦ−Ｉは、細胞増殖、分化、およびアポトーシスに長期の影響を有する。培養骨肉腫および乳癌細胞における実験によって、ＩＧＦ−Ｉが強力な分裂促進剤であり、そしてＤＮＡ合成を増加させることによって、そしてＧ１期からＳ期への細胞周期の進行を加速させるサイクリンＤ１の発現を刺激することによって、その分裂促進作用を発揮することが示唆された。Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏら，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ８：５１０−５１７（１９９４）；  Ｄｕｆｏｕｒｎｙら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：３１１６６３−３１１７１（１９９７）。膵臓癌細胞におけるサイクリンＤ１発現の抑制は、ＩＧＦ−Ｉの分裂促進効果を消滅させた。Ｋｏｒｎｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１：３４４−３５２（１９９８）。細胞周期進行を刺激するのに加えて、ＩＧＦ−Ｉはまた、アポトーシスを阻害する。ＩＧＦ−Ｉは、Ｂｃｌタンパク質の発現を刺激し、そしてＢａｘの発現を抑制し、Ｂｃｌ／Ｂａｘヘテロ二量体の相対量の増加を生じて、それによってアポトーシス経路の開始を遮断することが示された。Ｍｉｎｓｈａｌｌら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５９：１２２５−１２３２（１９９７）；  Ｐａｒｒｉｚａｓら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：１３５５−１３５８（１９９７）；  Ｗａｎｇら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：１３５４−１３６０（１９９８）。
【０００７】
［０００７］ＩＧＦ−Ｉ同様、ＩＧＦ−ＩＩもまた、分裂促進作用および抗アポトーシス作用を有し、そして細胞増殖および分化を制御する。ＩＧＦ−Ｉと比較して、高濃度のＩＧＦ−ＩＩが血清中を循環する。高血清ＩＧＦ−ＩＩ濃度は、結腸直腸癌の患者で見られており、進行した疾患ではより高い濃度に向かう傾向があった。Ｒｅｎｅｈａｎら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８３：１３４４−１３５０。さらに、大部分の原発性腫瘍および形質転換細胞株は、ＩＧＦ−ＩＩ  ｍＲＮＡおよびタンパク質を過剰発現する。ＷｅｒｎｅｒおよびＬｅＲｏｉｔｈ  Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：１８３−２２３（１９９６）。結腸癌におけるＩＧＦ−ＩＩの過剰発現は、悪性表現型と関連し、そして結腸直腸発癌において、ＩＧＦ−ＩＩ遺伝子のインプリンティング喪失（アレル特異的発現の喪失）が重要でありうる。Ｍｉｃｈｅｌｌら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７６：６０−６６（１９９７）；  Ｔａｋａｎｏら，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５９：２１０−２１６（２０００）。転移する強い傾向を持つ癌細胞は、転移能が低い細胞よりも、４倍高いＩＧＦ−ＩＩ発現レベルを有する。Ｇｕｅｒｒａら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６５：８１２−８２０（１９９６）。
【０００８】
［０００８］研究および臨床研究は、癌の発展、維持および進行におけるＩＧＦファミリーメンバーの役割を明らかにしてきている。多くの癌細胞が、ＩＧＦ−ＩＲおよび／またはＩＧＦリガンドを過剰発現することが示されてきている。例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、肉腫、白血病、ならびに前立腺、乳房、肺、結腸、胃、食道、肝臓、膵臓、腎臓、甲状腺、脳、卵巣、および子宮の癌を含む、非常に多様な癌細胞株の強い分裂促進剤である。Ｍａｃａｕｌａｙら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６５：３１１−３２０（１９９２）；  Ｏｋｕら，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：１５９１−１５９５（１９９１）；  ＬｅＲｏｉｔｈら，  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  １２２：５４−５９（１９９５）；  Ｙａｇｉｎｕｍａら，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５４：５０２−５０７（１９９７）；  Ｓｉｎｇｈら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：１７６４−１７７４（１９９６）；  Ｆｒｏｓｔａｄら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ６２：１９１−１９８（１９９９）。ＩＧＦ−Ｉを悪性結腸癌細胞に投与すると、これらはサイトカイン誘導性アポトーシスに抵抗性になった。Ｒｅｍａｃｌｅ−Ｂｏｎｎｅｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：２００７−２０１７（２０００）。
【０００９】
［０００９］癌におけるＩＧＦの役割はまた、高レベルの循環ＩＧＦ−Ｉおよび低レベルのＩＧＦＢＰ−３が、いくつかの一般的な癌（前立腺、乳房、結腸直腸および肺）の発展のリスクの増加と関連することを示す、疫学的研究によっても裏付けられる。Ｍａｎｔｚｏｒｏｓら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７６：１１１５−１１１８（１９９７）；  Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：１３９３−１３９６（１９９８）；  Ｍａら，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９１：６２０−６２５（１９９９）；  Ｋａｒａｓｉｋら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ７８：２７１−２７６（１９９４）。これらの結果によって、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが強力な分裂促進シグナルおよび抗アポトーシスシグナルとして作用し、そしてその過剰発現が、いくつかの種類の癌の患者における劣った予後と相関することが示唆される。
【００１０】
［００１０］ノックアウトマウスモデルを用いたいくつかの研究によって、腫瘍増殖におけるＩＧＦの役割がさらに確立されてきた。組織特異的条件的遺伝子欠失のための技術の開発に伴って、肝臓ＩＧＦ−Ｉ不全（ＬＩＤ）のマウスモデルが開発された。ｉｇｆ１遺伝子の肝臓特異的欠失によって、ＩＧＦ−Ｉ  ｍＲＮＡの発現が抑制され、そして循環ＩＧＦ−Ｉレベルの劇的な減少が引き起こされた。Ｙａｋａｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：７３２４−７３２９（１９９９）。乳房腫瘍をＬＩＤマウスで誘導すると、減少した循環ＩＧＦ−１レベルによって、癌発展、増殖、および転移に、有意な減少が生じ、一方、循環ＩＧＦ−１レベルの増加は、腫瘍増殖増進と関連した。Ｗｕら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：４３８４−４３８８（２００３）。
【００１１】
［００１１］ＩＧＦ−ＩＲ発現および／またはシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、腫瘍増殖の阻害を導くことを、いくつかの論文が報告した。ＩＧＦシグナル伝達の阻害が、化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加させることもまた示された。腫瘍細胞において、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達経路を阻害するため、多様な戦略（アンチセンス・オリゴヌクレオチド、可溶性受容体、阻害性ペプチド、優性ネガティブ受容体突然変異体、キナーゼ活性を阻害する小分子、および抗ｈＩＧＦ−ＩＲ抗体）が開発されてきている。１つのアプローチは、小分子阻害剤を用いて、ＩＧＦ−ＩＲのキナーゼ活性をターゲティングしてきている。近年、ＩＧＦ−ＩＲを選択的に阻害可能な小分子キナーゼ阻害剤として、２つの化合物が同定された。Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９（２００４）；  Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０（２００４）。ＩＧＦ−ＩＲキナーゼ活性の阻害は、ＩＧＦ−Ｉが仲介する、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の軟寒天における生存およびコロニー形成を抑制した。Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９（２００４）。ＩＧＦ−ＩＲキナーゼ阻害剤を、腫瘍異種移植片を所持するマウスに投与すると、腫瘍異種移植片におけるＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達が阻害され、そしてＩＧＦ−ＩＲが駆動する線維肉種の増殖が有意に減少した。Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９（２００４）。血液学的悪性腫瘍、特に多発性骨髄腫に対して、類似の効果が観察された。多発性骨髄腫細胞において、小分子ＩＧＦ−ＩＲキナーゼ阻害剤は、インスリン受容体に比較した際、ＩＧＦ−１Ｒに対して、＞１６倍、より高い強度を示し、そして細胞増殖および生存を阻害するのに同様に有効であった。Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０（２００４）。同じ化合物をマウスに腹腔内注射し、そしてこの化合物は、多発性骨髄腫細胞増殖を阻害し、そしてマウスの生存を増進した。Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０（２００４）。療法用量以下の他の化学療法剤と組み合わせると、ＩＧＦ−ＩＲキナーゼ活性の阻害は、腫瘍負荷を相乗的に減少させた。Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０（２００４）。
【００１２】
［００１２］ＩＧＦシグナル伝達を阻害する別のアプローチは、受容体ＩＧＦ−ＩＲに対して向けられる中和抗体の開発であった。多様なグループが、受容体のＩＧＦ−Ｉ刺激性自己リン酸化を阻害し、受容体内在化および分解を誘導し、そして多様なヒト癌細胞株の増殖および生存を減少させる、ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体を開発してきた。Ｈａｉｌｅｙら，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １：１３４９−１３５３（２００２）；  Ｍａｌｏｎｅｙら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：５０７３−５０８３（２００３）；  Ｂｅｎｉｎｉら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７：１７９０−１７９７（２００１）；  Ｂｕｒｔｒｕｍら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：８９１２−８９２１（２００３）。さらに、異種移植片腫瘍モデルにおいて、ＩＧＦ−ＩＲ遮断は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、乳房、腎臓および膵臓の腫瘍の有意な増殖阻害を生じた。Ｂｕｒｔｒｕｍら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：８９１２−８９２１（２００３）；  Ｍａｌｏｎｅｙら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：５０７３−５０８３（２００３）。キメラヒト化ＩＧＦ−ＩＲ抗体を利用する実験で、類似の結果が得られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、そして腫瘍異種移植片において、乳癌細胞の増殖が阻害された。Ｓａｃｈｄｅｖら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：６２７−６３５（２００３）。他のヒト化ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ＩＧＦ−Ｉ誘導性チロシンリン酸化を遮断し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでもまた、乳房腫瘍および非小細胞肺腫瘍の増殖を阻害した。Ｃｏｈｅｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：２０６３−２０７３（２００５）；  Ｇｏｅｔｓｃｈら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １１３：３１６−３２８（２００５）。
【００１３】
［００１３］ＩＧＦ−Ｉレベルの増加はまた、末端肥大症および巨人症を含む、いくつかの非癌性病的状態とも関連し（Ｂａｒｋａｎ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ６５：３４３，  ３４７−３４９，  １９９８）、一方、異常なＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体機能が、乾癬（Ｗｒａｉｇｈｔら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：５２１−５２６，  ２０００）、アテローム性動脈硬化症および血管形成術後の血管の平滑筋再狭窄（Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓら，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ８６：  １２５−１３０，  ２０００）に関連付けられてきている。増加したＩＧＦ−Ｉレベルは、糖尿病、または微小血管増殖などの糖尿病に関連する合併症に関連付けられてきている（Ｓｍｉｔｈら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５：１３９０−１３９５，  １９９９）。
【００１４】
［００１４］ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する抗体が、当該技術分野に開示されてきている。例えば、Ｇｏｙａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：６２５２−６２５８（２００４）；  Ｍｉｙａｍｏｔｏら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：３４９４−３５０２（２００５）を参照されたい。さらに、ＷＯ  ０５／１８６７１、ＷＯ  ０５／２８５１５およびＷＯ  ０３／９３３１７を参照されたい。
【００１５】
概要
［００１５］本発明の態様は、インスリン様増殖因子に特異的に結合し、そして腫瘍増殖を減少させる結合タンパク質に関する。１つの態様において、結合タンパク質は、インスリン様増殖因子に特異的に結合し、そして腫瘍増殖を減少させる、完全ヒト・モノクローナル抗体、またはその結合断片である。これを達成可能な機構には、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの有効濃度を減少させる、受容体ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの結合の阻害、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが誘導するＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害、またはＩＧＦ−Ｉ／ＩＩのクリアランスの増加のいずれかが含まれることも可能であり、そしてこれらに限定されない。
【００１６】
［００１６］したがって、いくつかの態様は、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に優先的に結合し、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ活性を中和する、完全ヒト単離特異的結合タンパク質を提供する。特定の側面において、結合タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉに対するより、少なくとも２．５倍高いアフィニティーでＩＧＦ−ＩＩに結合する。他の側面において、結合タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉに対するより、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも１００倍または少なくとも１５０倍高いアフィニティーでＩＧＦ−ＩＩに結合する。
【００１７】
［００１７］いくつかの態様において、特異的結合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＩＧＦ−Ｉ依存性ＩＧＦ−Ｉ受容体リン酸化の阻害に関して、１５ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。いくつかの側面において、特異的結合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＩＧＦ−Ｉ依存性ＩＧＦ−Ｉ受容体リン酸化の阻害に関して、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または８ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。
【００１８】
［００１８］いくつかの態様において、特異的結合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＩＧＦ−ＩＩ依存性ＩＧＦ−Ｉ受容体リン酸化の阻害に関して、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、または３ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。
【００１９】
［００１９］他の態様において、特異的結合タンパク質は、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、組換えｈＩＧＦ−ＩＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のＩＧＦ−ＩＩ依存性増殖の７０％より多くを阻害する。
【００２０】
［００２０］他の態様において、特異的結合タンパク質は、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下のＥＣ５０で、組換えｈＩＧＦ−ＩＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のＩＧＦ−Ｉ依存性増殖の７０％より多くを阻害する。
【００２１】
［００２１］特定の態様において、特異的結合タンパク質は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１８からなる群より選択される可変重鎖配列を含み、そして配列番号４、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６からなる群より選択される可変軽鎖配列を含む、モノクローナル抗体との結合に関して競合する。
【００２２】
［００２２］本発明の１つの態様は、５００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで、ＩＧＦ−Ｉに結合する、完全ヒト抗体である。より好ましくは、抗体は、４５０ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は、４１０ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は、３５０ｐＭ未満のＫｄで結合する。さらにより好ましくは、抗体は、３００ｐＭ未満のＫｄで結合する。アフィニティーおよび／またはアビディティー測定は、本明細書に記載するように、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定可能である。
【００２３】
［００２３］本発明のさらに別の態様は、１７５ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで、ＩＧＦ−ＩＩに結合する、完全ヒト・モノクローナル抗体である。より好ましくは、抗体は、１００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は、５０ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。より好ましくは、抗体は、５ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄで結合する。さらにより好ましくは、抗体は、２ｐＭ未満のＫｄで結合する。
【００２４】
［００２４］特定の態様において、特異的結合タンパク質は、完全ヒト・モノクローナル抗体または完全ヒト・モノクローナル抗体の結合断片である。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２およびＦｖなどの断片が含まれうる。
【００２５】
［００２５］本発明の１つの態様は、以下により詳細に論じるように、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに特異的に結合する、完全ヒト・モノクローナル抗体７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）および７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）を含む。
【００２６】
［００２６］いくつかの態様において、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する、特異的結合タンパク質またはその結合断片には、配列番号６の配列を有する重鎖ポリペプチド、および配列番号８の配列を有する軽鎖ポリペプチドが含まれてもよい。
【００２７】
［００２７］特異的結合タンパク質には、配列番号１０の配列を有する重鎖ポリペプチド、および配列番号１２の配列を有する軽鎖ポリペプチドが含まれてもよい。
［００２８］本発明の特異的結合タンパク質には、配列番号１４の配列を有する重鎖ポリペプチド、および配列番号１６の配列を有する軽鎖ポリペプチドが含まれてもよい。
【００２８】
［００２９］特定の態様において、特異的結合タンパク質を、薬学的に許容されうるキャリアーと混合してもよい。
［００３０］別の態様には、本明細書記載の特異的結合タンパク質のいずれかをコードする単離核酸分子、特異的結合タンパク質をコードする単離核酸分子を有するベクター、またはこうした核酸分子およびベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞が含まれる。
【００２９】
［００３１］特定の態様において、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉタンパク質がインスリン増殖因子結合タンパク質に結合している際には、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する、特異的結合タンパク質またはその結合断片は、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉタンパク質に特異的に結合しない。
【００３０】
［００３２］さらなる態様には、患者試料における、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）およびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルを測定する方法が含まれる。これらの方法には、患者試料を提供し；該試料と、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する、特異的結合タンパク質またはその結合断片を接触させ；そして前記試料中のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩレベルを測定する工程が含まれてもよい。いくつかの側面において、患者試料は血液である。
【００３１】
［００３３］さらなる態様には、哺乳動物において、悪性腫瘍を治療する方法が含まれる。これらの方法には、悪性腫瘍の治療が必要な哺乳動物を選択し；そしてインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する、特異的結合タンパク質またはその結合断片の療法的有効用量を該哺乳動物に投与する工程が含まれてもよい。いくつかの側面において、動物はヒトである。いくつかの側面において、結合タンパク質は、完全ヒト・モノクローナル抗体であり、そしてｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群より選択される。
【００３２】
［００３４］治療可能な疾患には、黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌が含まれうる。
【００３３】
［００３５］さらなる態様には、哺乳動物において、増殖因子依存性疾患を治療する方法が含まれる。これらの方法には、増殖因子依存性疾患の治療が必要な哺乳動物を選択し；そしてインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する、特異的結合タンパク質またはその結合断片の療法的有効用量を前記哺乳動物に投与する工程が含まれる。いくつかの側面において、哺乳動物はヒトであってもよい。いくつかの側面において、結合タンパク質は、完全ヒト・モノクローナル抗体であり、そしてｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）、およびｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群より選択される。
【００３４】
［００３６］治療可能な増殖因子依存性疾患には、骨粗鬆症、糖尿病、および心臓血管疾患が含まれうる。他の治療可能な疾患状態には、末端肥大症および巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症および血管の平滑筋再狭窄、ならびに糖尿病が含まれる。
【００３５】
［００３７］さらなる態様には、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片、および療法剤を含む、コンジュゲートが含まれる。いくつかの側面において、療法剤は、毒素、放射性同位体、または薬学的組成物であってもよい。
【００３６】
［００３８］他の態様において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合し、そして「Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ」（配列番号２１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ」（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ」（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片を提供する。
【００３７】
［００３９］さらなる態様には、「Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ」（配列番号２４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を有する完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。本明細書の抗体はまた、「Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ」（配列番号２５）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ」（配列番号２６）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）も含んでもよい。
【００３８】
［００４０］他の態様において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合し、そして「Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ」（配列番号２７）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ」（配列番号２８）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ」（配列番号２９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片を提供する。
【００３９】
［００４１］さらなる態様には、「Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ」（配列番号３０）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ」（配列番号３１）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ」（配列番号３２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。
【００４０】
［００４２］他の態様において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合し、そして「Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ」（配列番号３３）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ」（配列番号３４）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ」（配列番号３５）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片を提供する。
【００４１】
［００４３］さらなる態様には、「Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ」（配列番号３６）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ」（配列番号３７）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ」（配列番号３８）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。
【００４２】
［００４４］他の態様において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合し、そして「Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ」（配列番号８１）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ」（配列番号８２）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ」（配列番号８３）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片を提供する。
【００４３】
［００４５］さらなる態様には、「Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ」（配列番号８４）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ」（配列番号８５）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ」（配列番号８６）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。
【００４４】
［００４６］他の態様において、本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対する交差反応性を持って、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）に結合し、そして「Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ」（配列番号８７）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ」（配列番号８８）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ」（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片を提供する。
【００４５】
［００４７］さらなる態様には、「Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ」（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；「Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ」（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および「Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ」（配列番号９２）のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する、完全ヒト・モノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。
【００４６】
［００４８］いくつかの態様は、悪性腫瘍の治療のための薬剤の調製における、本明細書記載の特異的結合タンパク質の使用を提供する。いくつかの側面において、特異的結合タンパク質は、完全ヒト・モノクローナル抗体であってもよい。特定の側面において、結合タンパク質は、ｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）またはｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）またはｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）である。いくつかの側面において、薬剤は、抗体、化学療法剤、および放射性薬剤からなる群より選択される第二の抗新生物剤と組み合わせた使用のためのものである。いくつかの側面において、薬剤は、慣用的な手術、骨髄幹細胞移植または末梢幹細胞移植と組み合わせたかまたはこれらに続く使用のためのものである。
【００４７】
［００４９］悪性腫瘍は、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌であってもよい。
【００４８】
［００５０］他の態様は、増殖因子依存性疾患の治療のための薬剤の調製における、本明細書記載の特異的結合タンパク質の使用を提供する。いくつかの側面において、特異的結合タンパク質は、完全ヒト・モノクローナル抗体であり、そしてｍＡｂ  ７．２５１．３（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２２）、ｍＡｂ  ７．３４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２３）およびｍＡｂ  ７．１５９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４２４）からなる群より選択可能である。
【００４９】
［００５１］増殖因子依存性疾患は、例えば、骨粗鬆症、糖尿病、および心臓血管疾患からなる群より選択される。
［００５２］好ましくは、抗体は、表１１に示す配列の１以上を持つ相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列を含む。例えば、抗体は、表１１に示す配列の１以上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３、あるいはその組み合わせを有する重鎖アミノ酸配列を含んでもよい。一般の当業者が、ＣＤＲ決定を容易に達成可能であることが注目される。例えば、Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  メリーランド州ベセスダ（１９９１），  ｖｏｌｓ．  １−３を参照されたい。
【００５０】
［００５３］本明細書記載の本発明の態様は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに結合し、そしてＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ機能に影響を及ぼす、モノクローナル抗体に関する。他の態様は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する高い結合アフィニティー、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−Ｉ／ＩＩを中和する能力、ならびにＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが誘導する細胞増殖を阻害する能力を含めて、療法的展望から望ましい特性を持つ完全ヒト抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体および抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体調製物に関する。
【００５１】
詳細な説明
［００５７］本明細書記載の本発明の態様は、ＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を持ち、ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合する（本明細書において、「ＩＧＦＩ／ＩＩ」と称する）結合タンパク質に関する。いくつかの態様において、結合タンパク質は、抗体、またはその結合断片であり、そしてＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を持って、ＩＧＦ−ＩＩに結合し、そしてこれらの受容体、ＩＧＦ−ＩＲへのこれらのタンパク質の結合を阻害する。本発明の他の態様には、療法的に有用であり、そして両方のインスリン様増殖因子に結合する、完全ヒト中和抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体および抗体調製物が含まれる。こうした抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体調製物は、好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する強い結合アフィニティー、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＧＦ−Ｉ／ＩＩを中和する能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが誘導する細胞増殖を阻害する能力を含めた、望ましい療法特性を有する。
【００５２】
［００５８］本発明の態様にはまた、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体の単離結合断片も含まれる。好ましくは、結合断片は、完全ヒト抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体から得られる。典型的な断片には、以下により詳細に記載されるような、Ｆｖ、Ｆａｂ’または他の周知の抗体断片が含まれる。本発明の態様にはまた、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する完全ヒト抗体を発現する細胞も含まれる。細胞の例には、ハイブリドーマ、または組換え的に生成された細胞、例えばＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。
【００５３】
［００５９］さらに、本発明の態様には、疾患を治療するためにこれらの抗体を用いる方法が含まれる。抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが仲介するＩＧＦ−Ｉ／ＩＩシグナル伝達を防止し、それによって細胞増殖を阻害するために有用である。この阻害の作用機構には、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩがＩＧＦ−ＩＲに結合する有効な濃度を低下させる、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩのその受容体、ＩＧＦ−ＩＲへの結合の阻害、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが誘導するＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害、またはＩＧＦ−Ｉ／ＩＩのクリアランスの増進のいずれかが含まれることも可能である。この阻害機構を通じて治療可能な疾患には、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、婦人科腫瘍、頭部および頸部の癌、食道癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌および腫瘍が含まれる。
【００５４】
［００６０］本発明の他の態様には、生物学的試料において、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの量を特異的に測定するための診断アッセイが含まれる。アッセイキットには、こうした抗体を検出するのに必要な標識とともに、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体が含まれてもよい。これらの診断アッセイは、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、婦人科腫瘍、頭部および頸部の癌、食道癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌を含む、増殖因子関連疾患に関するスクリーニングに有用である。他の非新生物疾患状態には、末端肥大症および巨人症、乾癬、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、および血管の平滑筋再狭窄、ならびに糖尿病が含まれることも可能である。
【００５５】
［００６１］抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体に関するさらなる態様、特徴等を、以下のさらなる詳細に提供する。
配列表
［００６２］本発明の態様には、以下の表１に列挙する特異的抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体が含まれる。この表は、対応する重鎖および軽鎖遺伝子の配列番号とともに、各抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体の同定番号を報告する。さらに、各重鎖および軽鎖が由来する生殖系列配列もまた、以下の表１に提供する。
【００５６】
［００６３］各抗体には、１つまたは２つの小数点によって分離された２つまたは３つのいずれかの数字を含む、同定番号が与えられている。いくつかの場合、１つの抗体のいくつかのクローンを調製した。クローンは、親配列と同一の核酸およびアミノ酸配列を有するが、第二の小数点の右側の数字によって示されるクローン番号を伴って、別個に列挙されることもありうる。したがって、例えば、抗体７．１５９．２の核酸およびアミノ酸配列は、抗体７．１５９．１の配列と同一である。
【００５７】
［００６４］配列表中の配列を比較することによってわかるように、配列番号３９〜５８には、翻訳されないシグナルペプチド、および配列決定された重鎖または軽鎖各々の定常ドメイン領域が含まれるため、配列番号１〜２０は、配列番号３９〜５８とは異なる。
【００５８】
表Ｉ
【００５９】
【表１−１】
2009519711.tif 000003
【００６０】
【表１−２】
2009519711.tif 000004
【００６１】
定義
［００６５］別に定義しない限り、本明細書に用いる科学的用語および技術的用語は、一般の当業者に通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形は複数形を含み、そして複数形は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションと関連して利用する用語、およびこれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。
【００６２】
［００６６］組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換には、標準的技術を用いる（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）。製造者の指定にしたがい、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、酵素反応および精製技術を行う。当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用し、そして論じる、多様な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されるように、一般的に、前述の技術および方法を行う。例えば、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１））を参照されたい。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して利用する用語、ならびにこれらの実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いる。
【００６３】
［００６７］本開示にしたがって利用した際、以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
［００６８］用語「ＩＧＦ−Ｉ」は、インスリン様増殖因子−Ｉ分子を指し、そして用語「ＩＧＦ−ＩＩ」は、インスリン様増殖因子−ＩＩ分子を指す。用語「ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ」は、両方のインスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ分子を指し、そしてＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を持つ、ＩＧＦ−ＩＩに対する優先的な結合に関する。したがって、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに結合する抗体は、ＩＧＦ−ＩＩに優先的に結合するが、ＩＧＦ−Ｉと交差反応し、ＩＧＦ−Ｉに対するより、高いアフィニティーで、ＩＧＦ−ＩＩに結合するであろう。例えば、抗体は、ＩＧＦ−Ｉに対するより２．５倍高いアフィニティーでＩＧＦ−ＩＩに結合可能である。特定の態様において、抗体は、ＩＧＦ−Ｉに対するより、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１５０倍高いアフィニティーで結合可能である。
【００６４】
［００６９］用語「中和」は、抗体を指す場合、抗体が、ターゲット抗原の活性を排除するか、または有意に減少させる能力に関する。したがって、「中和」抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの活性を排除するかまたは有意に減少させることが可能である。中和ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、例えば、その受容体ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの結合を遮断することによって作用可能である。この結合を遮断することによって、ＩＧＦ−ＩＲが仲介するシグナル伝達は、有意に、または完全に、排除される。理想的には、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する中和抗体は、細胞増殖を阻害する。
【００６５】
［００７０］用語「単離ポリヌクレオチド」は、本明細書において、天然に存在する環境から単離されているポリヌクレオチドを意味するものとする。こうしたポリヌクレオチオドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成であってもよい。単離ポリヌクレオチドは、好ましくは、天然に会合しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合していない。単離ポリヌクレオチドは、天然には連結されていない別のポリヌクレオチドと機能可能であるように連結されていてもよい。さらに、単離ポリヌクレオチドは、好ましくは、より大きな配列の一部として、天然に存在しない。
【００６６】
［００７１］本明細書に称される用語「単離タンパク質」は、天然存在環境から単離されているタンパク質を意味する。こうしたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成起源、あるいはその組み合わせに由来してもよく、その起源のため、または派生供給源のため、「単離タンパク質」は、（１）天然に見られるタンパク質と会合せず、（２）同じ供給源由来の他のタンパク質を含まず、例えばネズミ・タンパク質を含まず、（３）異なる種由来の細胞によって発現され、または（４）天然には存在しない。
【００６７】
［００７２］用語「ポリペプチド」は、本明細書において、ポリペプチド配列の天然タンパク質、断片または類似体を指す、一般的な用語として用いられる。したがって、天然タンパク質、断片、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明にしたがった、好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒト・カッパ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパまたはラムダ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子とともに、重鎖免疫グロブリンを含む組み合わせ、およびその逆によって形成される抗体分子、ならびにその断片および類似体を含む。本発明にしたがった、好ましいポリペプチドはまた、単に、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはその断片も含んでもよい。
【００６８】
［００７３］用語「天然存在」は、本明細書において、対象に適用した際、対象が天然で見られうるという事実を指す。例えば、天然供給源から単離可能であり、そして人間によって、実験室において、または別の方式で、意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然存在である。
【００６９】
［００７４］用語「機能可能であるように連結された」は、本明細書において、その意図される方式で機能することが可能にされた関係にある、そのように記載された構成要素の位置を指す。例えば、コード配列に「機能可能であるように連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成される方式で連結されている。
【００７０】
［００７５］用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡへテロ二重鎖の、少なくとも長さ１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を意味する。この用語には、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖型が含まれる。
【００７１】
［００７６］本明細書で称される用語「オリゴヌクレオチド」には、天然存在、および非天然存在連結によって一緒に連結された、天然存在および修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般的に２００塩基以下の長さを含む、ポリヌクレオチド・サブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜６０塩基、そして最も好ましくは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブ用に、一本鎖であるが；オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子突然変異体の構築で使用するため、二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドのいずれかであってもよい。
【００７２】
［００７７］本明細書で称される用語「天然存在ヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書で称される用語「修飾ヌクレオチド」には、修飾されたまたは置換された糖基等を含むヌクレオチドが含まれる。本明細書で称される用語「オリゴヌクレオチド連結」には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホロアミデート等のオリゴヌクレオチド連結が含まれる。例えば、その開示が本明細書に援用される、ＬａＰｌａｎｃｈｅら  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９０８１（１９８６）；  Ｓｔｅｃら  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０６：６０７７（１９８４）；  Ｓｔｅｉｎら  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９（１９８８）；  Ｚｏｎら  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；  Ｚｏｎら  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｐｐ．  ８７−１０８（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；  Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；  ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。所望の場合、オリゴヌクレオチドには、検出のための標識が含まれてもよい。
【００７３】
［００７８］本明細書で称される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能にそして特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびその断片は、非特異的核酸への検出可能な結合の認識しうる量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を用いて、当該技術分野に知られ、そして本明細書に論じるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成してもよい。一般的に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片および目的の核酸配列の間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であろうし、そしてより典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の増加する相同性を持つ。
【００７４】
［００７９］２つのアミノ酸配列間に部分的なまたは完全な同一性がある場合、これらの配列は「相同」である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列を最大マッチングになるように並列させた場合、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。マッチングを最大にする際、ギャップ（マッチングさせている２つの配列のいずれかにおけるもの）が許可され；５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、突然変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティを伴い、プログラムＡＬＩＧＮを用いて、５（標準偏差単位）よりも高い並列スコアを有するならば、本明細書でこの用語を用いた場合、２つのタンパク質配列（または少なくとも長さ約３０アミノ酸のそれに由来するポリペプチド配列）は相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中，  ｐｐ．  １０１−１１０（第５巻，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の補遺２、ｐｐ．  １−１０を参照されたい。２つの配列またはその部分は、より好ましくは、これらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に並列された際、５０％以上同一であるならば、相同である。２つのオルソロガス配列内に、相同性が異なる領域がありうることを認識しなければならない。例えば、マウスおよびヒトのオルソログの機能部位は、非機能領域より高い度合いの相同性を有しうる。
【００７５】
［００８０］用語「に対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相同である（すなわち、厳密に進化的に関連せずに、同一である）か、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。
【００７６】
［００８１］対照的に、用語「に相補的」は、本明細書において、相補配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００７７】
［００８２］以下の用語を用いて、２以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列関係を記載する：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列比較の基礎として用いる、定義された配列である。参照配列は、例えば、配列表に提供する全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとして、より大きい配列のサブセットであってもよいし、あるいは完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでもよい。一般的に、参照配列は、少なくとも長さ１８ヌクレオチドまたは６アミノ酸、しばしば、少なくとも長さ２４ヌクレオチドまたは８アミノ酸、そしてしばしば、少なくとも長さ４８ヌクレオチドまたは１６アミノ酸である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、各々、（１）２つの分子間で類似の配列（すなわち完全ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含む可能性もあり、そして（２）２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間で多様な配列をさらに含む可能性もあるため、２つ（またはそれより多く）の分子間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、そして比較する、「比較ウインドウ」に渡って、２つの分子の配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を、少なくとも１８の隣接ヌクレオチドまたは６アミノ酸配列の参照配列と比較し、そして２つの配列の最適並列のため、参照配列（付加または欠失を含まない）に比較した際に、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分が、２０パーセント以下の付加、欠失、置換等（すなわちギャップ）を含んでもよい、少なくとも約１８の隣接ヌクレオチド位または約６アミノ酸の概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウを並列させるための配列の最適並列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３（１９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８５：２４４４（１９８８）の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳＴＭまたはＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（登録商標）ソフトウェアパッケージ）によって、または検査によって、行ってもよく、そして多様な方法によって生成された最適な並列（すなわち比較ウィンドウに渡って最高の相同性パーセントを生じるもの）を選択する。
【００７８】
［００８３］用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウィンドウに渡って同一である（すなわちヌクレオチドごとまたは残基ごとに基づいて）ことを意味する。用語「配列同一性パーセント」は、２つの最適に並列された配列を、比較ウィンドウに渡って比較し、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）またはアミノ酸残基が両方の配列に生じる位の数を決定して、マッチした位の数を得て、マッチした位の数を比較ウィンドウ中の位の総数（すなわちウィンドウサイズ）によって割り、そして結果に１００を乗じて、配列同一性パーセントを得ることによって、計算される。用語「実質的同一性」は、本明細書において、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位の比較ウィンドウに渡って、しばしば、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位のウィンドウに渡って、参照配列に比較した際、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、比較ウィンドウに渡って、全部で参照配列の２０パーセント以下の欠失または付加を含んでもよい配列に、参照配列を比較することによって、配列同一性パーセントを計算する、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を意味する。参照配列はより大きい配列のサブセットであってもよい。
【００７９】
［００８４］本明細書において、２０の慣用的なアミノ酸およびその略語は、慣用的な用法にしたがう。本明細書に援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，  Ｅ．Ｓ．  ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ監修，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１））を参照されたい。２０の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非慣用的アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適した構成要素でありうる。非慣用的なアミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で用いるポリペプチド表記法において、標準的な用法および慣例にしたがって、左側はアミノ末端方向であり、そして右側はカルボキシ末端方向である。
【００８０】
［００８５］同様に、別に明記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は５’端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向と称され；ＲＮＡと同じ配列を有し、そしてＲＮＡ転写物の５’端の５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され；ＲＮＡと同じ配列を有し、そしてＲＮＡ転写物の３’端の３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００８１】
［００８６］ポリペプチドに適用した際、用語「実質的同一性」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を用いて、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで、最適に並列された際、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００８２】
［００８７］本明細書に論じるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における重要でない変動は、アミノ酸配列中のこうした変動が、本明細書記載の抗体または免疫グロブリン分子に対する、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するならば、本発明に含まれると意図される。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、関連側鎖を有するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般的に、ファミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは：セリンおよびスレオニンは、脂肪族ヒドロキシファミリーであり；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシン、グルタミン酸でのアスパラギン酸、セリンでのスレオニンの単一の置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の置換は、特に、その置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合、生じる分子の結合機能または特性に大きな影響を及ぼさないであろうと予測することは妥当である。アミノ酸変化によって、機能するペプチドが生じるかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって、容易に決定可能である。アッセイは、本明細書に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、一般の当業者によって容易に調製可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近くに存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、公的または私的な配列データベースに、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを比較することによって、同定可能である。好ましくは、コンピュータ化比較法を用いて、既知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定する。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が知られる。Ｂｏｗｉｅら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４  （１９９１）。したがって、前述の例は、当業者が、本明細書記載の抗体に一致して、構造ドメインおよび機能ドメインを定義するのに使用可能な、配列モチーフおよび構造コンホメーションを認識可能であることを示す。
【００８３】
［００８８］好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するため、結合アフィニティーを改変し、（４）結合アフィニティーを改変し、そして（５）他の物理化学特性または機能特性を与えるかあるいはこうした類似体のこうした特性を修正するものである。類似体には、天然存在ペプチド配列以外の配列の多様な突然変異タンパク質が含まれうる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を天然存在配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外のポリペプチドの部分において）行うことも可能である。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特徴を実質的に変化させてはならない（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを破壊するか、または親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ニューヨーク（１９８４））；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．  Ｔｏｏｚｅ監修，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載され、これらは各々、本明細書に援用される。
【００８４】
［００８９］用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残っているアミノ酸配列が、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然存在配列中の対応する位と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも長さ５、６、８、または１０アミノ酸、好ましくは少なくとも長さ１４アミノ酸、より好ましくは少なくとも長さ２０アミノ酸、通常、少なくとも長さ５０アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも長さ７０アミノ酸である。用語「類似体」は、本明細書において、推定されるアミノ酸配列の一部に実質的な同一性を有し、そして以下の特性の少なくとも１つを有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントで構成されるポリペプチドを指す：（１）適切な結合条件下での、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する特異的な結合、（２）適切なＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ結合を遮断する能力、または（３）ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ活性を阻害する能力。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然存在配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも長さ２０アミノ酸、好ましくは少なくとも長さ５０アミノ酸以上であり、そしてしばしば、全長天然存在ポリペプチドと同じくらい長いことも可能である。
【００８５】
［００９０］ペプチド類似体は、一般的に、薬学産業において、テンプレート・ペプチドのものと類似の特性を持つ、非ペプチド薬剤として用いられる。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」（「ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」）と称される。本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５：２９（１９８６）；  ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓら  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９（１９８７）。こうした化合物は、しばしば、コンピュータ化分子モデリングの補助で開発される。療法的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、同等の療法効果または予防効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結により、場合によって置換された１以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を、同じ種類のＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定なペプチドを生成することも可能である。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む、制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドを、当該技術分野に知られる方法（本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：３８７（１９９２））によって生成することも可能であり；これは例えば、ペプチドを環状化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによる。
【００８６】
［００９１］本明細書において、用語「抗体」は、抗原の抗原性決定基の特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を持つ三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される、少なくとも１つの結合ドメインで構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。抗体は、典型的には四量体型を有し、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各々の対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００８７】
［００９２］抗体の「結合断片」は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体の酵素的または化学的切断によって産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体は、同一の各結合部位を有すると理解される。抗体は、過剰な抗体が、少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、そしてより一般的には約８５％（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定した際）を超えて、対抗受容体に結合する受容体の量を減少させる場合、対抗受容体に対する受容体の付着を、実質的に阻害する。
【００８８】
［００９３］本明細書において、「結合タンパク質」または「特異的結合タンパク質」は、ターゲット分子に特異的に結合するタンパク質である。抗体、および抗体の結合断片は、結合タンパク質である。
【００８９】
［００９４］用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合可能ないかなるタンパク質決定基も含まれる。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、そして常にではないが、特定の三次元構造特性とともに、特定の電荷特性を有することも可能である。抗体は、解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、そして最も好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００９０】
［００９５］用語「剤」は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的物質から作製される抽出物を意味する。
［００９６］ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩポリペプチドに関する「活性である」または「活性」は、天然ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するＩＧＦ−Ｉ／ＩＩポリペプチドの部分を指す。「生物学的」は、本明細書で用いた際、天然ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩポリペプチドの活性から生じる生物学的機能を指す。好ましいＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ生物学的活性には、例えば、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ誘導性細胞増殖が含まれる。
【００９１】
［００９７］「哺乳動物」は、本明細書で用いた際、哺乳動物と見なされるいかなる動物も指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
［００９８］酵素、パパインでの抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても知られる、２つの同一の抗原結合断片、および抗原結合活性を持たないが、結晶化する能力を有する「Ｆｃ」断片を生じる。酵素、ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり、そして２つの抗原結合部位を含む、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【００９２】
［００９９］「Ｆｖ」は、本明細書で用いた際、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最少断片を指す。
［０１００］「Ｆａｂ」は、本明細書で用いた際、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体断片を指す。
【００９３】
［０１０１］用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。
［０１０２］「リポソーム」は、本明細書で用いた際、本発明のＩＧＦ−Ｉ／ＩＩポリペプチド、またはこうしたＩＧＦ−Ｉ／ＩＩポリペプチドに対する抗体を含んでもよい薬剤を哺乳動物に送達するのに有用でありうる小胞を指す。
【００９４】
［０１０３］「標識」または「標識された」は、本明細書において、ポリペプチドに対する検出可能部分、例えば放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識基またはビオチニル基の付加を指す。放射性同位体または放射性核種には、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉが含まれてもよく、蛍光標識には、ローダミン、ランタニド、リンまたはＦＩＴＣが含まれてもよく、そして酵素標識には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼが含まれてもよい。
【００９５】
［０１０４］用語「薬学的剤または薬剤」は、本明細書において、患者に適切に投与された際、所望の療法効果を誘導可能な化学的化合物または組成物を指す。本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．監修，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  サンフランシスコ（１９８５）（本明細書に援用される）に例示されるように、当該技術分野における慣用的用法にしたがって用いられる。
【００９６】
［０１０５］本明細書において、「実質的に純粋な」は、対象種が、存在する主な種である（すなわちモル濃度に基づいて、組成物中の他の個々の種いずれよりもより豊富である）ことを意味し、そして好ましくは、実質的に純粋な分画は、対象種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル濃度に基づいて）を構成する組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０％より多くを構成し、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、および９９％より多くを構成するであろう。最も好ましくは、対象種は、本質的に均質に精製され（慣用的検出法によって、組成物中に混入種が検出不能である）、ここで組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。
【００９７】
［０１０６］用語「患者」には、ヒトおよび獣医学的被験体が含まれる。
ヒト抗体および抗体のヒト化
［０１０７］ヒト抗体は、ネズミまたはラットの可変および／または定常領域を所持する抗体に付随する問題のいくつかを回避する。こうしたネズミまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の迅速なクリアランスを導く可能性もあるし、あるいは患者によって抗体に対する免疫応答が生成されるのを導く可能性もある。ネズミまたはラット由来抗体の利用を回避するため、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物または動物内に、機能するヒト抗体遺伝子座を導入することによって、完全ヒト抗体を生成してもよい。
【００９８】
［０１０８］完全ヒト抗体を生成するための１つの方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の、１０００ｋｂまでであるが、１０００ｋｂ未満である大きさの生殖系列設定断片を含有するように操作されている、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の使用を通じる。Ｍｅｎｄｅｚら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、ならびにＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５（１９９８）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統は、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）より入手可能である。
【００９９】
［０１０９］マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の産生は、米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１月１２日出願、第０７／６１０，５１５号、１９９０年１１月８日出願、第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月２４日出願、第０７／９２２，６４９号、１９９２年７月３０日出願、第０８／０３１，８０１号、１９９３年３月１５日出願、第０８／１１２，８４８号、１９９３年８月２７日出願、第０８／２３４，１４５号、１９９４年４月２８日出願、第０８／３７６，２７９号、１９９５年１月２０日出願、第０８／４３０，９３８号、１９９５年４月２７日出願、第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日出願、第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日出願、第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日出願、第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６２，５１３号、１９９５年６月５日出願、第０８／７２４，７５２号、１９９６年１０月２日出願、第０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、米国公報第２００３／００９３８２０号、２００１年１１月３０日出願、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第５，９３９，５９８号、および日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号、第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号、および第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号にさらに論じられ、そして描写される。欧州特許第ＥＰ  ０  ４６３  １５１  Ｂ１号、１９９６年６月１２日付与公表（ｇｒａｎｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）、国際特許出願第ＷＯ  ９４／０２６０２号、１９９４年２月３日公表、国際特許出願第ＷＯ  ９６／３４０９６号、１９９６年１０月３１日公表、第ＷＯ  ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日公表、第ＷＯ  ００／７６３１０号、２０００年１２月２１日公表もまた、参照されたい。上記引用特許、出願、および参考文献各々の開示は、その全体が本明細書に援用される。
【０１００】
［０１１０］別のアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．を含む他のグループは、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用した。ミニ遺伝子座アプローチでは、Ｉｇ遺伝子座由来の片（個々の遺伝子）の包含を通じて、外因性Ｉｇ遺伝子座を模倣する。したがって、１以上のＶＨ遺伝子、１以上のＤＨ遺伝子、１以上のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、および通常は第二の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）を、動物内に挿入するための構築物になるように形成する。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、ならびに各々、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号および第６，０２３，０１０号、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、および第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月２９日出願、第０７／５７５，９６２号、１９９０年８月３１日出願、第０７／８１０，２７９号、１９９１年１２月１７日出願、第０７／８５３，４０８号、１９９２年３月１８日出願、第０７／９０４，０６８号、１９９２年６月２３日出願、第０７／９９０，８６０号、１９９２年１２月１６日出願、第０８／０５３，１３１号、１９９３年４月２６日出願、第０８／０９６，７６２号、１９９３年７月２２日出願、第０８／１５５，３０１号、１９９３年１１月１８日出願、第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月３日出願、第０８／１６５，６９９号、１９９３年１２月１０日出願、第０８／２０９，７４１号、１９９４年３月９日出願に記載され、これらの開示は本明細書に援用される。その開示が全体として本明細書に援用される、欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂ１号、国際特許出願第ＷＯ  ９２／０３９１８号、第ＷＯ  ９２／２２６４５号、第ＷＯ  ９２／２２６４７号、第ＷＯ  ９２／２２６７０号、第ＷＯ  ９３／１２２２７号、第ＷＯ  ９４／００５６９号、第ＷＯ  ９４／２５５８５号、第ＷＯ  ９６／１４４３６号、第ＷＯ  ９７／１３８５２号、および第ＷＯ  ９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号もまた、参照されたい。その開示が全体として本明細書に援用される、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｃｈｅｎら、１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、Ｃｈｏｉら、１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎら（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）もさらに参照されたい。
【０１０１】
［０１１１］キリンもまた、微小細胞（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）融合を通じて、染色体の大きな片、または全染色体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成を立証した。その開示が本明細書に援用される、欧州特許出願第７７３  ２８８号および第８４３  ９６１号を参照されたい。さらに、キリンのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスの交雑育種の結果である、ＫＭＴＭマウスが生成された。これらのマウスは、キリン・マウスのヒトＩｇＨトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのカッパ鎖導入遺伝子を所持する（Ｉｓｈｉｄａら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  （２００２）４：９１−１０２）。
【０１０２】
［０１１２］ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によっても得られうる。適切な例には、限定されるわけではないが、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（以前のＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイ等が含まれる。
【０１０３】
抗体の調製
［０１１３］本明細書記載の抗体は、以下に記載するように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通じて調製された。その結果、こうしたマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生可能であり、そしてネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生は欠損している。これを達成するために利用される技術は、本明細書の背景セクションに開示する特許、出願、および参考文献に開示される。しかし、特に、マウスのトランスジェニック産生および該マウスからの抗体の産生の好ましい態様が、米国特許出願０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、ならびに国際特許出願第ＷＯ  ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日出願、および第ＷＯ  ００／７６３１０号、２０００年１２月２１日出願に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。その開示が本明細書に援用される、Ｍｅｎｄｅｚら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）もまた参照されたい。
【０１０４】
［０１１４］こうした技術の使用を通じて、多様な抗原に対する完全ヒト・モノクローナル抗体を産生した。本質的に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を、目的の抗原（例えばＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ）で免疫し、リンパ系細胞（Ｂ細胞など）を過剰免疫（ｈｙｐｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスから回収し、そして回収したリンパ球を骨髄腫型細胞株と融合させて、不死ハイブリドーマ細胞株を調製する。これらのハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、そして選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。本明細書に提供するのは、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに特異的な抗体を産生する多数のハイブリドーマ細胞株の産生法である。さらに、本明細書に提供するのは、こうした抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、こうした細胞株によって産生される抗体の性質決定である。
【０１０５】
［０１１５］あるいは、骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを産生する代わりに、Ｂ細胞を直接アッセイしてもよい。例えば、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞を過剰免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離し、そして増殖させ、そして抗体分泌形質細胞に分化させてもよい。次いで、細胞上清由来の抗体を、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ免疫原に対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。また、上清を、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの断片に対する免疫反応性に関してスクリーニングして、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ上の機能的に関心が持たれるドメインに対する結合に関して、異なる抗体をさらにマッピングしてもよい。また、他の関連ヒト・ケモカインに対して、そしてＩＧＦ−Ｉ／ＩＩのラット、マウス、およびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）などの非ヒト霊長類のオルソログに対して、抗体をスクリーニングしてもよく、後者は、種交差反応性を決定するためである。個々のウェルまたはプールしたウェルのいずれかからハイブリドーマを作製する融合を含む多様な方法によって、あるいはＥＢＶでの感染または既知の不死化遺伝子によるトランスフェクション、そしてその後の適切な培地中でのプレーティングによって、目的の抗体を含有するウェル由来のＢ細胞を、不死化してもよい。あるいは、次いで、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ特異的溶血プラークアッセイ（Ｂａｂｃｏｏｋら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６））を用いて、望ましい特異性を持つ抗体を分泌する単一の形質細胞を単離する。溶解のターゲットとされる細胞は、好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗原でコーティングされたヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）である。
【０１０６】
［０１１６］目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するＢ細胞培養の存在下で、プラークの形成は、目的の形質細胞を取り巻くヒツジ赤血球の、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが仲介する特異的溶解を示す。プラーク中心の単一の抗原特異的形質細胞を単離してもよく、そして抗体の特異性をコードする遺伝的情報を、単一の形質細胞から単離する。逆転写後のＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングしてもよい。次いで、こうしたクローニングされたＤＮＡを、適切な発現ベクター、好ましくは、ｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含有するｐｃＤＮＡベクターに、さらに挿入してもよい。次いで、生成したベクターを、宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションし、そして転写を誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾した、慣用的な栄養培地中で培養してもよい。
【０１０７】
［０１１７］一般的に、融合ハイブリドーマによって産生される抗体は、完全ヒト・カッパまたはラムダ軽鎖を含むヒトＩｇＧ２重鎖であった。本明細書に記載する抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖ならびにＩｇＧ２重鎖を所持する。抗体はまた、ＩｇＧ１を含む他のヒト・アイソタイプのものであってもよい。抗体は、高いアフィニティーを所持し、固相および溶液相技術によって測定した際、典型的には約１０−６〜約１０−１２Ｍまたはそれ未満のＫｄを所持する。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの活性を阻害するには、少なくとも１０−１１ＭのＫＤを所持する抗体が好ましい。
【０１０８】
［０１１８］認識されるであろうように、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体を発現させてもよい。特定の抗体をコードする配列を用いて、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換してもよい。形質転換は、例えばウイルスにおける（またはウイルスベクター内への）ポリヌクレオチドのパッケージング、およびウイルス（またはベクター）での宿主細胞の形質導入を含む、宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入のために知られる任意の方法によっても、または米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（これらの特許は本明細書に援用される）に例示されるように、当該技術分野に知られるトランスフェクション法によってもよい。用いる形質転換法は、形質転換しようとする宿主に応じる。哺乳動物細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数または複数）の被包、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１０９】
［０１１９］発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野に周知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高発現レベルを有し、そして恒常的なＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ結合特性を持つ抗体を産生するかを決定することによって、特に好ましい細胞株を選択することも可能である。
【０１１０】
［０１２０］抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、患者試料におけるＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの検出に有用であり、そしてしたがって、本明細書に記載するような疾患状態の診断として有用である。さらに、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ活性を有意に中和する能力（以下の実施例に立証するようなもの）に基づいて、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ発現から生じる症状および状態を治療する際に療法効果を有する。特定の態様において、本明細書の抗体および方法は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが誘導する細胞増殖から生じる症状の治療に関する。さらなる態様は、本明細書記載の抗体および方法を用いて、新生物疾患、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、婦人科腫瘍、頭部および頸部の癌、食道癌、および膵臓癌を含む疾患を治療することを伴う。他の非新生物疾患状態には、末端肥大症および巨人症、乾癬、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症および血管の平滑筋再狭窄、ならびに糖尿病が含まれてもよい。
【０１１１】
療法的投与および配合
［０１２１］本発明の態様には、疾患に対する治療として有用な抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体の無菌薬学的配合物が含まれる。こうした配合物は、受容体ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの結合を阻害し、それによって、例えば、血清または組織ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩが異常に上昇している病的状態を有効に治療するであろう。抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩを強力に中和する適切なアフィニティーを有し、そして好ましくは、ヒトにおける低頻度の投薬を可能にする、適切な作用期間を有する。作用期間延長は、皮下または筋内注射などの別の非経口投与経路による、より頻繁でなく、そしてより好適な投薬スケジュールを可能にするであろう。
【０１１２】
［０１２２］例えば、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に、無菌ろ過膜を通じたろ過によって、無菌配合物を生成してもよい。抗体は、通常、凍結乾燥型で、または溶液中で、保存されるであろう。療法抗体組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓などの、配合物の回収を可能にするアダプターを有するバイアルに入れられる。
【０１１３】
［０１２３］抗体投与経路は、既知の方法にしたがって、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋内、眼内、動脈内、クモ膜下腔内、吸入または病巣内経路によって注射または注入するか、あるいは以下に示すような持続放出系による。抗体は、好ましくは、注入によって、またはボーラス注射によって、連続投与される。
【０１１４】
［０１２４］療法的に使用しようとする抗体の有効量は、例えば、療法目的、投与経路、および患者の状態に応じるであろう。したがって、最適療法効果を得るために、治療専門家が、必要に応じて、投薬量を用量設定し、そして投与経路を修飾することが好ましい。典型的には、臨床医は、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、抗体を投与するであろう。この療法の進行は、慣用的アッセイによって、または本明細書記載のアッセイによって、容易に監視される。
【０１１５】
［０１２５］本明細書に記載するような抗体は、薬学的に許容されうるキャリアーと混合して調製可能である。この療法組成物を、静脈内投与してもよいし、あるいは好ましくは液体または粉末エアロゾル（凍結乾燥）として、鼻または肺を通じて投与してもよい。組成物はまた、所望に応じて、非経口投与してもまたは皮下投与してもよい。全身投与する場合、療法組成物は、無菌、発熱物質不含であり、そしてｐＨ、等張性、および安定性を十分顧慮して、非経口的に許容されうる溶液中になければならない。これらの条件は、当業者に知られる。簡潔には、所望の度合いの純度を有する化合物を、生理学的に許容されうるキャリアー、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、保存または投与のために、本明細書記載の化合物の投薬配合物を調製する。こうした物質は、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに対して毒性でなく、そしてこうした物質には、ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの酸化防止剤；ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコールなどのナトリウムおよび／または非イオン性界面活性剤などの対イオンが含まれる。
【０１１６】
［０１２６］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載されるように、慣用的薬学的実施にしたがって、注射用の無菌組成物を配合してもよい。例えば、水、あるいはゴマ油、ピーナツ油または綿実油のような天然存在植物油、あるいはオレイン酸エチル等のような合成脂肪性ビヒクルなどのビヒクル中での活性化合物の溶解または懸濁が望ましい可能性もある。許容される薬学的実施にしたがって、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤等を取り込んでもよい。
【０１１７】
［０１２７］持続放出調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、こうしたマトリックスは、成形された物品、フィルムまたはマイクロカプセルの形である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  （１９８１）１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．，  （１９８２）１２：９８−１０５に記載されるようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  （１９８３）２２：５４７−５５６）、分解不能酢酸エチレンビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）、分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー、および酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体）、およびポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）が含まれる。
【０１１８】
［０１２８］酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間に渡って分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。被包されたタンパク質が、体内に長期間残ると、３７℃で湿気に曝露された結果として、変性するかまたは凝集し、生物学的活性の喪失およびもしかすると免疫原性の変化を生じる可能性もある。関与する機構に応じて、タンパク質安定化のための合理的戦略を考案してもよい。例えば、凝集機構が、ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を調節し、適切な添加剤を用い、そして特定のポリマーマトリックス組成を発展させることによって、安定化を達成してもよい。
【０１１９】
［０１２９］持続放出組成物にはまた、結晶を懸濁中に維持することが可能な適切な配合物中に懸濁された抗体の結晶の調製物も含まれる。これらの調製物は、皮下または腹腔内注射されると、持続放出効果を生じうる。他の組成物にはまた、リポソームに捕捉された抗体も含まれる。こうした抗体を含有するリポソームは：それ自体知られる方法によって調製される：米国特許第ＤＥ  ３，２１８，１２１号；  Ｅｐｓｔｅｉｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８５）８２：３６８８−３６９２；  Ｈｗａｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８０）７７：４０３０−４０３４；  ＥＰ  ５２，３２２；  ＥＰ  ３６，６７６；  ＥＰ  ８８，０４６；  ＥＰ  １４３，９４９；  １４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ  １０２，３２４。
【０１２０】
［０１３０］所定の患者に対する抗体配合物の投薬量は、疾患の重症度および種類、体重、性別、食餌、投与時間および経路、他の薬剤および他の関連する臨床要因を含む、薬剤作用を修飾することが知られる多様な要因を考慮して、主治医によって決定されるであろう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法のいずれかによって、療法的有効投薬量を決定してもよい。
【０１２１】
［０１３１］療法的に使用しようとする、本明細書記載の抗体の有効量は、例えば、療法目的、投与経路、および患者の状態に応じるであろう。したがって、治療専門家が、投薬量を用量設定し、そして最適療法効果を得るために、必要に応じて、投与経路を修飾することが好ましい。典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲、またはそれより多くてもよい。典型的には、臨床医は、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、療法抗体を投与するであろう。この療法の進行は、慣用的アッセイによって、または本明細書記載のアッセイによって、容易に監視される。
【０１２２】
［０１３２］本明細書の組成物および方法にしたがった、療法実体の投与は、改善された輸送、送達、耐性等を提供するために、配合物内に取り込まれる、適切なキャリアー、賦形剤、および他の剤とともに投与されるであろうことが認識されるであろう。これらの配合物には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルジョン、エマルジョン・カルボワックス（多様な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックス含有半固体混合物が含まれる。前述の混合物のいずれも、配合物中の活性成分が配合によって不活化されず、そして配合物が投与経路に生理学的に適合し、そして耐性であるならば、本発明にしたがった治療および療法において適切でありうる。薬学的化学者に周知の配合物、賦形剤、およびキャリアーに関連するさらなる情報に関しては、Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ”  Ｒｅｇｕｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２（２）：２１０−８（２０００），  Ｗａｎｇ  Ｗ．  “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２０３（１−２）：１−６０（２０００），  Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ  “Ｌｉｐｉｄｓ，  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ．８９（８）：９６７−７８（２０００），  Ｐｏｗｅｌｌら  “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５２：２３８−３１１（１９９８）、およびこれら文献中の引用文献もまた、参照されたい。
【０１２３】
他の療法剤の設計および生成
［０１３３］本発明にしたがって、そしてＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに関する、本明細書で産生し、そして性質決定する抗体の活性に基づいて、他の療法様式の設計を容易にし、そして当業者に開示する。こうした様式には、限定されるわけではないが、進化した抗体療法剤、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、放射標識療法、および一本鎖抗体Ｖドメイン、Ｖ領域骨格以外に基づく抗体様結合剤、ペプチド療法剤の生成、遺伝子治療、特にイントラボディ、アンチセンス療法、および小分子が含まれる。
【０１２４】
［０１３４］進化した抗体療法剤の生成と関連して、補体結合が望ましい特質である場合、例えば、二重特異性、免疫毒素、または放射標識の使用を通じて、細胞殺傷のための補体に対する依存性を回避することも可能でありうる。
【０１２５】
［０１３５］例えば、（ｉ）一方はＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する特異性を持ち、そして他方は第二の分子に対する特異性を持ち、ともにコンジュゲート化されている、２つの抗体、（ｉｉ）ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対して特異的な１つの鎖、および第二の分子に対して特異的な第二の鎖を有する、単一抗体、または（ｉｉｉ）ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩおよび他の分子の両方に対する特異性を有する一本鎖抗体を含む、二重特異性抗体を生成してもよい。こうした二重特異性抗体は、周知である技術を用いて生成可能であり；例えば（ｉ）および（ｉｉ）に関連して、例えば、Ｆａｎｇｅｒら  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）、ならびにＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ、上記を、そして（ｉｉｉ）に関連して、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）を参照されたい。どちらの場合も、所望に応じて、第二の特異性を作製してもよい。例えば、限定されるわけではないが、ＣＤ１６またはＣＤ６４（例えばＤｅｏら  １８：１２７（１９９７）を参照されたい）、あるいはＣＤ８９（例えばＶａｌｅｒｉｕｓら  Ｂｌｏｏｄ  ９０：４４８５−４４９２（１９９７））を含む、重鎖活性化受容体に対して、第二の特異性を作製してもよい。
【０１２６】
［０１３６］当業者に周知の技術を利用して、免疫毒素として作用するように、抗体を修飾することもまた可能である。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照されたい。また、米国特許第５，１９４，５９４号も参照されたい。放射標識抗体の調製と関連して、当該技術分野に周知の技術を利用して、こうした修飾抗体を容易に調製可能である。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ中  ６５５−６８６（第２版，  ＣｈａｆｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ監修，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照されたい。また、米国特許第４，６８１，５８１号、第４，７３５，２１０号、第５，１０１，８２７号、第５，１０２，９９０号（ＲＥ  ３５，５００）、第５，６４８，４７１号、および第５，６９７，９０２号もまた参照されたい。免疫毒素および放射標識分子は各々、所望のマルチマー酵素サブユニット・オリゴマー化ドメインを発現する細胞を殺す可能性があるであろう。いくつかの態様において、薬学的に許容されうるキャリアーまたは希釈剤と会合した抗体の有効量を含む、薬学的組成物を提供する。
【０１２７】
［０１３７］いくつかの態様において、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体は、剤（例えば放射性同位体、薬学的組成物、または毒素）に連結される。好ましくは、こうした抗体を疾患の治療に用いてもよく、こうした疾患は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩを発現している細胞、またはＩＧＦ−Ｉ／ＩＩを過剰発現している細胞に関連していてもよい。例えば、薬剤が、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、ＣＯＸ−２剤、および抗生物質剤、ならびにその組み合わせの群より選択される薬学的特性を所持することが意図される。ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗剤、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、およびその類似体、ならびにその組み合わせからなる群より薬剤を選択可能である。
【０１２８】
［０１３８］毒素の例には、さらに、ゲロニン、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス属内毒素、ならびにその誘導体、組み合わせおよび修飾が含まれる。
【０１２９】
［０１３９］放射性同位体の例には、位置決定および／または療法に使用可能なガンマ放出体、陽電子放出体、およびＸ線放出体、ならびに療法に使用可能なベータ放出体およびアルファ放出体が含まれる。診断、予後および病期決定に有用と先に示した放射性同位体もまた、療法に有用である。抗癌剤または抗白血病剤の限定されない例には、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）などのアントラサイクリン、ならびにそのモルホリノおよび置換誘導体、組み合わせおよび修飾が含まれる。典型的な薬学的剤には、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロン・アルファ、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにその誘導体、組み合わせおよび修飾が含まれる。好ましくは、抗癌剤または抗白血病剤は、ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、またはモルホリノダウノルビシンである。
【０１３０】
［０１４０］当業者に認識されるであろうように、上記態様において、アフィニティー値が重要でありうるが、抗体の特定の機能に応じて、他の因子が同様にまたはより重要である可能性もある。例えば、免疫毒素（抗体と会合した毒素）に関して、ターゲットへの抗体の結合作用が有用である可能性もある；が、いくつかの態様において、望ましい最終結果は、細胞内への毒素の内在化である。こうしたものとして、高い割合の内在化を伴う抗体が、これらの状況において、望ましい可能性もある。したがって、１つの態様において、内在化の高い効率を持つ抗体が意図される。高い効率の内在化は、内在化抗体パーセントとして測定可能であり、そして低い値から１００％まででありうる。例えば、多様な態様において、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高い効率でありうる。当業者に認識されるであろうように、望ましい効率は、例えば会合する剤、領域に投与可能な抗体の量、抗体−剤複合体の副作用、治療すべき問題の種類（例えば癌の種類）および重症度に応じて、異なる態様で異なりうる。
【０１３１】
［０１４１］他の態様において、本明細書に開示する抗体は、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの発現の変化と関連して、疾患または障害に関してスクリーニングするため、哺乳動物組織または細胞におけるＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ発現の検出のためのアッセイキットを提供する。キットは、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに結合する抗体、および存在する場合、抗原と抗体の反応を示すための手段を含む。
【０１３２】
［０１４２］いくつかの態様において、製品は、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体を含有する組成物、および該組成物がＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ発現によって仲介される疾患を治療するのに使用可能であることを示す添付文書または表示を含む、容器を含んで、提供される。好ましくは、哺乳動物、そしてより好ましくは、ヒトに、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体を投与する。
【０１３３】
併用
［０１４３］本明細書において先に定義する抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体を、単一療法として適用してもよいし、または本発明の化合物に加えて、慣用的な手術または放射療法または化学療法を伴ってもよい。こうした化学療法には、１以上の以下のカテゴリーの抗腫瘍剤が含まれてもよい：
（ｉ）内科的腫瘍学で用いられるような、抗増殖／抗新生物薬剤およびその組み合わせ、例えばアルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、およびニトロソ尿素）；代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジンなどの抗葉酸剤、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトテシン）；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、エストロゲン受容体下方制御剤（例えばフルベストラント）、抗アンドロゲン剤（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）およびエキセメスタン）および５αレダクターゼの阻害剤、例えばフィナステリド；
（ｉｉｉ）癌細胞浸潤を阻害する剤（例えばマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）；
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害剤、例えばこうした阻害剤には、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂｂ２抗体、トラスツズマブ［ハーセプチンＴＭ］および抗ｅｒｂｂ１抗体、セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば上皮増殖因子ファミリーの阻害剤（例えばＥＧＦＲファミリー・チロシンキナーゼ阻害剤、例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ  １０３３）））、例えば血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤および例えば肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤が含まれる；
（ｖ）抗血管形成剤、例えば血管内皮増殖因子の効果を阻害するもの（例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体、ベバシズマブ［アバスチンＴＭ］、国際特許出願ＷＯ  ９７／２２５９６、ＷＯ  ９７／３００３５、ＷＯ  ９７／３２８５６およびＷＯ  ９８／１３３５４に開示するものなどの化合物）および他の機構によって作用する化合物（例えば、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤であるリノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、アンジオスタチン、ならびにアンジオポエチン、例えばアンジオポエチン１およびアンジオポエチン２の作用の阻害剤）；
（ｖｉ）血管損傷剤、例えばコンブレタスタチンＡ４および国際特許出願ＷＯ  ９９／０２１６６、ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ  ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４およびＷＯ０２／０８２１３に開示される化合物；
（ｖｉｉ）アンチセンス療法、例えばＩＳＩＳ  ２５０３などの上に列挙するターゲットに対して向けられるもの、抗ｒａｓアンチセンス；
（ｖｉｉｉ）異常なｐ５３、あるいは異常なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常な遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるものなどのＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子治療などの化学療法または放射療法に対する患者耐性を増加させるアプローチを含む、遺伝子治療アプローチ；
（ｉｘ）例えば、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏアプローチ、例えばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインでトランスフェクションした樹状細胞などのトランスフェクションした免疫細胞を用いたアプローチ、サイトカインでトランスフェクションした腫瘍細胞株を用いたアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチを含む、免疫療法アプローチ；
（ｘ）例えばＣＤＫ阻害剤（例えばフラボピリドール）および細胞周期チェックポイントの他の阻害剤（例えばチェックポイントキナーゼ）；オーロラキナーゼ、ならびに有糸分裂および細胞質分裂制御に関与する他のキナーゼ（例えば有糸分裂キネシン）の阻害剤；およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む、細胞周期阻害剤；
（ｘｉ）エンドセリンＡアンタゴニスト、エンドセリンＢアンタゴニスト、ならびにエンドセリンＡおよびＢアンタゴニストを含む、エンドセリンアンタゴニスト；例えばＺＤ４０５４およびＺＤ１６１１（ＷＯ  ９６  ４０６８１）、アトラセンタンおよびＹＭ５９８；ならびに
（ｘｉｉ）生物学的療法剤療法アプローチ、例えば、受容体リガンドを隔離するか、受容体へのリガンド結合を遮断するか、または受容体シグナル伝達を減少させる（例えば受容体分解増進または発現レベル低下のため）かいずれかの、ペプチドまたはタンパク質（例えば抗体または可溶性外部受容体ドメイン構築物）を用いるもの。
【０１３４】
［０１４４］治療の個々の構成要素を同時に、連続してまたは別個に投与することによって、こうした共同の治療を達成してもよい。こうした組み合わせ産物は、本明細書において上述する投薬量範囲内の本発明の化合物、および認可された投薬量範囲内の他の薬学的活性剤を使用する。
【０１３５】
実施例
［０１４５］以下の実施例は、行う実験および達成される結果を含めて、例示目的のみのために提供され、そして本明細書の解説を制限するとは見なされないものとする。
【０１３６】
実施例１
免疫および用量設定
免疫
［０１４６］Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．から得た組換えヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（ミネソタ州ミネアポリス、それぞれ、カタログ番号２９１−Ｇ１および２９２−Ｇ２）を抗原として用いた。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統ＸＭＧ２およびＸＭＧ４（３Ｃ−１系統）、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フレモント）を連続して免疫することによって、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対するモノクローナル抗体を発展させた。すべての注射に関して、足蹠経路を介して、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を免疫した。各注射の総体積は、マウスあたり５０μｌであり、足蹠あたり２５μｌであった。各群で、総数１０匹のマウスを免疫した。表２に詳述するように、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩのみ、あるいはキャリアーとしてのキーホールリンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）抗原にコンジュゲート化したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、各々、マウスあたり１０μｇ注射した。第一の注射は、ダルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中で構成し、そして１：１  ｖ／ｖでＴｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄアジュバント（ＳＩＧＭＡカタログ番号Ｔ２６８４、ロット番号Ｋ１５９９）と混合した。次いで、マウスあたり２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲル、カタログ番号１４５２−２５０、バッチ番号８９３７、ＨＣＩ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）および１０μｇ  ＣｐＧ（１５μｌのＩｍｍｕｎＥａｓｙ  Ｍｏｕｓｅアジュバント、カタログ番号３０３１０１；ロット番号１１５５３０４２；Ｑｉａｇｅｎ）と混合した、総数８〜１１回のさらなる追加免疫を、２７〜３８日間の期間に渡って投与し、その後、アジュバントなしに、発熱物質不含ＤＰＢＳ中の１０μｇの抗原で最終追加免疫した。組み合わせ免疫（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方で動物を免疫する）には、第二の抗原を、最後の２回の追加免疫中に投与した。
【０１３７】
表２．免疫要約
【０１３８】
【表２】
2009519711.tif 000005
【０１３９】
実施例２
リンパ球回収、Ｂ細胞単離、融合およびハイブリドーマの生成
［０１４７］免疫したマウスを頸椎脱臼によって屠殺し、そして流入領域リンパ節を採取し、そして各コホートからプールした。ＤＭＥＭ中ですりつぶすことによって、リンパ系細胞を解離させて、組織から細胞を遊離させ、そして細胞をＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞を計数し、そして１億個のリンパ球あたり０．９ｍｌのＤＭＥＭを細胞ペレットに添加して、細胞を穏やかにしかし完全に再懸濁した。１億個の細胞あたり、１００μｌのＣＤ９０＋磁気ビーズを用いて、磁気ビーズと細胞を４℃で１５分間インキュベーションすることによって、細胞を標識した。最大１０８陽性細胞（または最大２ｘ１０９総細胞）を含有する磁気標識細胞懸濁物をＬＳ＋カラム上に装填し、そしてカラムをＤＭＥＭで洗浄した。総流出物をＣＤ９０陰性分画（これらの細胞の大部分は、Ｂ細胞と期待された）として収集した。
【０１４０】
［０１４８］上記由来の洗浄した濃縮Ｂ細胞およびＡＴＣＣから購入した、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、カタログ番号ＣＲＬ  １５８０（Ｋｅａｒｎｅｙら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３，  １９７９，  １５４８−１５５０）を１：１の比で混合することによって、融合を行った。８００ｘｇの遠心分離によって、細胞混合物を穏やかにペレットにした。上清を完全に除去した後、２〜４ｍｌのプロナーゼ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３７０２；ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ）で２分を超えずに、細胞を処理した。次いで、３〜５ｍｌのＦＢＳを添加して、酵素活性を停止し、そしてエレクトロ細胞融合溶液（ＥＣＦＳ、０．３Ｍスクロース、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ７９０３、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ２５４５、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ４７０５）を用いて、懸濁物を４０ｍｌ総体積に調整した。遠心分離後に上清を除去し、そして４０ｍｌ  ＥＣＦＳ中に細胞を再懸濁した。この洗浄工程を反復し、そして再び、細胞をＥＣＦＳ中に再懸濁して、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度にした。
【０１４１】
［０１４９］融合生成装置（モデルＥＣＭ２００１、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、エレクトロ細胞融合を行った。用いた融合チャンバーサイズは２．０ｍｌであり、以下の装置設定を用いた：
［０１５０］調節条件：電圧：５０Ｖ、時間：５０秒。
【０１４２】
［０１５１］電圧：３０００Ｖ、時間：３０μ秒で膜破壊
［０１５２］融合後保持時間：３秒
［０１５３］ＥＣＦ後、細胞懸濁物を、無菌条件下で、融合チャンバーから注意深く取り除き、そしてＬ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシ・インスリン）（すべてＳｉｇｍａ）およびＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を補充した、同体積のハイブリドーマ培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する無菌試験管に移した。細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベーションし、そして次いで、４００ｘｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。小体積のハイブリドーマ選択培地（０．５ｘＨＡを補充したハイブリドーマ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９６６６））中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして９６ウェルプレートあたり、総数５ｘ１０６  Ｂ細胞およびウェルあたり２００μｌの最終プレーティングに基づいて、さらなるハイブリドーマ選択培地を用いて、体積を適切に調整した。細胞を穏やかに混合し、そして９６ウェルプレート内にピペッティングし、そして増殖を可能にした。第７日または第１０日、培地の半分を取り除き、そして細胞にハイブリドーマ選択培地を再供給した。
【０１４３】
実施例３
ＥＬＩＳＡによる候補抗体の選択
［０１５４］培養１４日後、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ特異的モノクローナル抗体に関して、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２−５６５−１３６）をコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３  ８．４ｇ／ｌ）中のヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（２μｇ／ｍｌ）５０μｇ／ウェルでコーティングし、次いで、４℃で一晩、インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０１％チメロサール）を添加し、そしてプレートを室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清、ならびに陽性および陰性対照を添加し、そしてプレートを室温で２時間インキュベーションした。
【０１４４】
［０１５５］インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの検出抗体ヤギ抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ、カタログ番号Ｈ１０５０７）を添加し、そしてプレートを室温で１時間インキュベーションした。第二のスクリーニングにおいて、第一のスクリーニング中の陽性を２セット中でスクリーニングし、ＩｇＧおよびＩｇカッパ両方に関して完全にヒト組成であることを立証するため、一方はヒトＩｇＧ（重鎖）検出に関して、そして他方はヒトＩｇカッパ軽鎖検出に関して（ヤギ抗ｈＩｇカッパ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２０６０−０５））、スクリーニングした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂ．  カタログ番号ＴＭＳＫ−０１００−０１）を添加し、そしてプレートを約１０分間発色させた（陰性対照ウェルがわずかに呈色し始めるまで）。次いで、５０μｌ／ウェルの停止溶液（ＴＭＢ停止溶液（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂ．  カタログ番号ＳＴＰＲ−０１００−０１））を添加し、そして４５０ｎｍのＥＬＩＳＡプレート読取装置上で、プレートを読み取った。表３に示すように、ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩに対する抗体を含有する総数１，２３３ウェルがあった。
【０１４５】
［０１５６］インスリンと交差反応するものを排除するため、ＥＬＩＳＡによって、インスリンに対する結合に関して、ＥＬＩＳＡアッセイで結合したすべての抗体を対比スクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２−５６５−１３６）をコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３  ８．４ｇ／ｌ）中の組換えインスリン（濃度：１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ２６４３）５０μｌ／ウェルでコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベーションした。表３に詳述するように、元来の１２３３の抗体から、総数１，１２２の抗体が、インスリンと交差反応した。
【０１４６】
表３．スクリーニング要約
【０１４７】
【表３】
2009519711.tif 000006
【０１４８】
［０１５７］最後に、次いで、対比スクリーニングで選択した抗体をＥＬＩＳＡによって試験して、マウスＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩタンパク質に対する結合を確認した。総数６８３ハイブリドーマ系統が、マウスＩＧＦ−Ｉ／ＩＩとの交差反応を有すると同定された。したがって、これらのハイブリドーマ系統は、ヒトＩＧＦ−Ｉ、ヒトＩＧＦ−ＩＩ、マウスＩＧＦ−ＩおよびマウスＩＧＦ−ＩＩに結合するが、ヒト・インスリンに結合しない抗体を発現した。
【０１４９】
実施例４
ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合の阻害
［０１５８］この研究の目的は、ＩＧＦ−ＩＲ受容体に対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合の阻害によって決定されるような、中和活性に関して、ハイブリドーマ上清段階での６８３の抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体をスクリーニングすることであった。したがって、以下に記載するように、ヒトＩＧＦ−ＩＲ受容体を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、受容体／リガンド結合アッセイを行った。
【０１５０】
［０１５９］簡潔には、マルチスクリーンフィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ０．６５μＭ  ９６ウェルＰＶＤＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＤＶ  Ｎ０Ｂ  １０）を、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（０．０２％ＮａＮ３とともに１０％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で、４℃で一晩ブロッキングした。１００μＣｉ／ｍｌおよび５０ｎＭの［１２５Ｉ］標識ＩＧＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号ＩＭ１７２（ＩＧＦ−Ｉ）またはＩＭ２３８（ＩＧＦ−ＩＩ））を、結合緩衝液（０．０２％ＮａＮ３とともに２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で適切な濃度（ＩＧＦ−Ｉに関しては最終７０ｐＭ、そしてＩＧＦ−ＩＩに関しては最終２００ｐＭ）に希釈した。ブロッキング緩衝液でコーティングしたフィルタープレートを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、そして５０μｌの抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ  Ａｂ上清（結合緩衝液中で、２５％最終体積に希釈）を、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレート中、２５μｌの［１２５Ｉ］−ＩＧＦと氷上で３０〜６０分間プレインキュベーションした。ｈＩＧＦ−ＩＲを安定して発現している集密以下（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）のＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａから得た）をトリプシンで採取し、そして冷結合緩衝液中に、６ｘ１０６／ｍｌで再懸濁し、そして２５μｌの細胞をプレートに添加して、氷上で２時間インキュベーションした。２００μｌの冷ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、そして一晩乾燥させた。２５μｌ／ウェルのシンチラント（ＳｕｐｅｒＭｉｘカクテル、Ｗａｌｌａｃ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号１２００−４３９）を添加し、そしてＭｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ読取装置（Ｗａｌｌａｃ）を用いて、プレートを読み取った。
【０１５１】
［０１６０］スクリーニングプレートあたり、以下の対照を用いた：抗体なし（総ＩＧＦ結合）、５０μｇ／ｍｌ（非特異的バックグラウンド）および０．０７５〜０．５μｇ／ｍｌ（中和抗体のおよそのＥＣ５０値）の対照中和抗ＩＧＦ−Ｉ（＃０５−１７２、Ｕｐｓｔａｔｅ）または抗ＩＧＦ−ＩＩ（＃ＭＡＢ２９２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ｍＡｂ、ならびに０．５μｇ／ｍｌの濃度（中和抗体のおよそのＥＣ５０値）のアイソタイプ一致対照ヒトＩｇＧ２（ＰＫ１６．３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ、ロット番号３６０−１５４）またはＩｇＧ４（１０８．２．１、Ａｂｇｅｎｉｘ、ロット番号７１８−５３Ａ）ｍＡｂ。スクリーニングアッセイあたり、１つのプレートに、対照中和抗体およびアイソタイプ一致対照ヒト抗体のさらなる用量設定を添加した（５０μｇ／ｍｌ（３３３．３ｎＭ）からの１／１０連続希釈）。２５％最終体積で、抗ＫＬＨヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４消耗（ｅｘｈａｕｓｔ）上清を補充した、結合緩衝液中で、抗体を含むまたは含まないすべての対照を調製した。
【０１５２】
［０１６１］阻害パーセントを以下のように決定した：
阻害％＝（［（総１２５Ｉ−ＩＧＦ結合の平均ＣＰＭ）−（抗体の存在下での１２５Ｉ−ＩＧＦ結合の平均ＣＰＭ）］／［（総１２５Ｉ−ＩＧＦ結合の平均ＣＰＭ）−（過剰な対照中和抗体の存在下での１２５Ｉ−ＩＧＦ結合の平均ＣＰＭ＊）］）ｘ１００
［０１６２］＊過剰な非放射性ＩＧＦと同等であることが見出された、過剰な対照中和抗ＩＧＦ  Ａｂ（５０μｇ／ｍｌ、３３３．３ｎＭ）を伴う細胞のＣＰＭとして、非特異的バックグラウンドを決定した（総ＣＰＭの１０％以下）。
【０１５３】
［０１６３］放射標識リガンドの入手可能性の問題から、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ上清スクリーニングを、アイソタイプによって分けた。表４に示すように、ＩｇＧ２アイソタイプの抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体由来の上清（総数２９３）を、まず、放射標識ＩＧＦ−Ｉに対してスクリーニングした。このスクリーニングに、まず、４０％阻害のカットオフを適用し（すなわち４０％以上を阻害するハイブリドーマ系統を選択し）、そしてＩＧＦ−ＩＩに対する続くスクリーニングのため、１１１のヒットを選択した。１１１のヒットのうち、総数９１の系統が、５０％カットオフで、受容体に対するＩＧＦ−ＩＩ結合を阻害することが見出された。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ活性両方を５０％中和する上清を取ることによって、総数７１の最終ヒットを選択した。
【０１５４】
［０１６４］ＩｇＧ４アイソタイプを発現するすべての上清（総数３９０）を、まず、放射標識ＩＧＦ−ＩＩに対してスクリーニングし、そして５０％阻害のカットオフでの２３２のヒットを、続いて、ＩＧＦ−Ｉに対してスクリーニングした。総数９０の系統が、５０％カットオフで、受容体に対するＩＧＦ−Ｉ結合を阻害可能であった。ＩｇＧ２（７１）およびＩｇＧ４（９０）に対するヒットを合わせた後、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを５０％以上阻害する、総数１６１の系統が得られた。
【０１５５】
［０１６５］結論として、６８３の元来の上清から、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩいずれかを用いた最初のスクリーニングから、３４３（１１１のＩｇＧ２および２３２のＩｇＧ４、５０．２％）を選択した。５０％阻害の全体のカットオフ基準で、ＩＧＦ−ＩＲに対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合の両方を遮断可能な、総数１６１の最終ヒットが得られた（元来の系統の２３．６％）。
【０１５６】
表４．抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ消耗上清スクリーニング要約（５０％カットオフ）
【０１５７】
【表４】
2009519711.tif 000007
【０１５８】
実施例５
高抗原ＥＬＩＳＡおよび限定抗原ＥＬＩＳＡ
［０１６６］実施例４で選択した１６１のハイブリドーマ系統の間の相対的アフィニティー、ならびに各系統の上清中の抗体濃度を決定するため、高抗原（ＨＡ）および限定抗原（ＬＡ）ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＨＡ定量化アッセイでは、高い抗原濃度および一晩インキュベーションが、抗体アフィニティーの効果を限定し、各試料中に存在する抗原特異的抗体の相対量の定量化を可能にする。ＬＡアッセイにおける低抗原濃度は、抗体濃度の効果を限定し、そして相対アフィニティーに基づいた、抗体のランク付けを生じる。
【０１５９】
高抗原定量化アッセイ
［０１６７］ＥＬＩＳＡプレートを、比較的多量の５００ｎｇ／ｍｌ（６７ｎＭ）のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス、それぞれ、カタログ番号２９１−Ｇ１および２９２−Ｇ２）のいずれかでコーティングした。抗体含有ハイブリドーマ上清を、１：５０〜１：１２２００の希釈範囲に渡って用量設定した。既知のＩＧＦ特異的抗体の対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス、それぞれ、カタログ番号ＭＡＢ２９１およびＭＡＢ２９２）を用いて、アッセイの直線範囲を定義した。次いで、直線範囲内のデータを用いて、各用量設定試料中のＩＧＦ特異的抗体の相対的濃度を得た。
【０１６０】
限定抗原アッセイ
［０１６８］マイクロタイタープレートに低濃度の抗原をコーティングした。５０マイクロリットル（５０μｌ）のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、１％スキムミルク／１ｘＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．５％アジド中、６４、３２、１６、８、４、および２ｎｇ／ｍｌ（８．５ｎＭ〜０．２６ｎＭの範囲に渡る）で、各ウェルに添加した。プレートを３０分間インキュベーションした。
【０１６１】
［０１６９］プレートを水で４回（４Ｘ）洗浄し、そして１％スキムミルク／１ｘＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．５％アジドで１：２５に希釈した試験抗体を含有するハイブリドーマ上清５０μｌをウェルに添加した。プレートをプラスチックラップまたはパラフィンフィルムで固く包み、そして室温で振盪しながら一晩インキュベーションした。
【０１６２】
［０１７０］翌日、すべてのプレートを５回（５Ｘ）洗浄し、そして１％ミルク、１ｘＰＢＳ  ｐＨ７．４中、０．５μｇ／ｍｌの濃度で、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰポリクローナル抗体を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベーションした。
【０１６３】
［０１７１］プレートを少なくとも５回洗浄した（水道水で５ｘ）。５０マイクロリットル（５０μｌ）のＨＰＲ基質ＴＭＢを各ウェルに添加し、そしてプレートを３０分間インキュベーションした。５０μｌの１Ｍリン酸を各ウェルに添加することによって、ＨＲＰ−ＴＭＢ反応を停止した。プレートの各ウェルに関して、４５０ｎｍで、光学密度（吸光度）を測定した。
【０１６４】
データ分析
［０１７２］試験抗体のＯＤ値を平均し、そして範囲を計算した。最高シグナルおよび許容しうる低い標準偏差を持つ抗体を、参照抗体よりも、抗原に対する高いアフィニティーを有する抗体として選択した。
【０１６５】
［０１７３］次いで、分析を行って、中和（実施例４）、強度（ＨＡ  ＥＬＩＳＡおよびリガンド結合の高い阻害によって決定されるような抗体低濃度）、アフィニティー（ＬＡ  ＥＬＩＳＡ）のいずれか、または３つの基準すべてに基づいて、上位の抗体を選択した。この分析から、２５の抗体のリストを生成した。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合の平均阻害％、ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ両方に対するアフィニティーに基づく別個の分析によって、２５の抗体の第二のリストを生成した。１６の抗体が両方のリストに共通しており、４０の抗体の最終リストが生じた。これらの４０の抗体のＬＡおよびＨＡ結果を表５に要約する。これらの４０の系統をクローニングのために選択し、このうち３３のクローニングに成功した。
【０１６６】
表５．上位４０の抗体に関する高抗原および限定抗原ＥＬＩＳＡの結果
【０１６７】
【表５−１】
2009519711.tif 000008
【０１６８】
【表５−２】
2009519711.tif 000009
【０１６９】
実施例６
ＩＧＦＢＰ−３に結合したＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する抗体の結合
［０１７４］ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩは、大部分、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合して、血清中を循環する。１つの目的は、抗ＩＧＦ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇を回避するために、ＩＧＦＢＰとの複合体中にあるＩＧＦを認識しない抗体を同定することであった。ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩがＩＧＦＢＰ−３と複合体形成している際のこれらの増殖因子を認識する抗体の性質決定のため、以下のアッセイ形式を開発した。具体的には、このアッセイは、ＩＧＦ／抗ＩＧＦ抗体複合体中のＩＧＦが、ＩＧＦＢＰ−３に結合する能力を試験した。
【０１７０】
抗体が仲介する、ＩＧＦＢＰ−３によるＩＧＦ捕捉の遮断
［０１７５］前述の実施例由来のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ特異的抗体の間で複合体があらかじめ形成されているアッセイを開発した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、これらの複合体が、ＩＧＦＢＰ−３に結合する能力を試験した。３８４ウェルプレートにおいて、１０μｌの１：２０希釈したハイブリドーマ上清を、１０μｌの３ｎＭビオチン化ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと混合して、そして室温で２時間インキュベーションした。ストレプトアビジンでコーティングしたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズおよびＩＧＦＢＰ−３にカップリングしたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズ（ハイブリドーマ上清の１／６０最終希釈に対して、混合物１０μｌ）を添加し、そしてインキュベーションをさらに１時間続けた。次いで、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｕｓｉｏｎプレート読取装置中で、試料を読み取った。
【０１７１】
［０１７６］商業的に入手可能な抗ＩＧＦモノクローナル抗体Ｍ２３（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０５−１７２（Ｕｐｓｔａｔｅ）およびＭＡＢ２９１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、低ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値で、ＩＧＦＢＰに対するＩＧＦの結合を阻害する、異なる能力を示した。ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−Ｉ結合の阻害は、最大１０μｇ／ｍｌの無関係なマウスＩｇＧおよびヒトＩｇＧではまったく観察されず、抗ＩＧＦ−Ｉ効果が特異的であることが示唆された。商業的に入手可能なモノクローナル抗体０５−１６６（Ｕｐｓｔａｔｅ）およびＭＡＢ２９２（Ｒ＆Ｄ）は、ＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦＢＰ−３相互作用の阻害に関して、アフィニティーの有意な相違を示した。これらの実験は、抗ＩＧＦ  ｍＡｂが、ＩＧＦＢＰ−３へのＩＧＦの結合を遮断可能であることを示し、ハイブリドーマ系統由来の精製抗体をスクリーニングするために使用可能なアッセイを提供した。次の工程は、アッセイシグナルに対する、消耗したハイブリドーマ培地の影響を評価することであった。
【０１７２】
［０１７７］ハイブリドーマ培地および抗ＫＬＨハイブリドーマ消耗上清の連続希釈をアッセイ系で試験した。ＩＧＦＩ／ＩＩとのプレインキュベーションのための調製中、ハイブリドーマ上清を１：１０に希釈した際（アッセイ中の最終希釈は１：６０であった）、アッセイ結果には、培地の影響はほぼなかった。これらのデータに基づいて、ＩＧＦとのプレインキュベーションのため、ハイブリドーマ上清を希釈し、アッセイにおける好ましい１／６０希釈の最終希釈を提供した。
【０１７３】
［０１７８］ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ結合に関して陽性である６８３の消耗上清を、ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦの結合を阻害する能力に関して調べた。ＩＧＦ−Ｉに対する５０％を超える阻害およびＩＧＦ−ＩＩに対する６０％を超える阻害をカットオフ基準として用いた。これらのカットオフを用いたスクリーニングの要約結果を表６に示す。
【０１７４】
表６．スクリーニングにおいて同定された陽性ヒットの数
【０１７５】
【表６】
2009519711.tif 000010
【０１７６】
［０１７９］ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いたＩＧＦＢＰ競合アッセイによって、６８３の試験した上清の中で、ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−Ｉ結合を阻害する８７の試料、およびＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−ＩＩ結合を阻害する１２９の試料が同定された。５１の試料がＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの二重競合を示した。しかし、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰ複合体が、大部分、あらかじめ形成されているであろう、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の機能または振る舞いをより注意深く再現するため、実施例８に記載するようなさらなるアッセイを行った。
【０１７７】
実施例７
ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いた抗ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ抗体アフィニティーの決定（低解像度スクリーニング）
３４の精製モノクローナル抗体の低解像度スクリーニング
［０１８０］標識不含表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、またはＢｉａｃｏｒｅを利用して、抗原に対する抗体アフィニティーを測定した。この目的のため、ルーチンのアミン・カップリングを用いて、ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ上の高密度ヤギ抗ヒト抗体表面を調製した。１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液中、すべてのｍＡｂをおよそ２０μｇ／ｍｌに希釈した。ｍＡｂベースラインを安定化させるため、３０秒間の接触時間を用いて、１０μｌ／分で、各ｍＡｂを別個の表面上に捕捉した。
【０１７８】
［０１８１］ＩＧＦ−Ｉを２３℃で１２０秒間、すべての表面上に３３５．３ｎＭで注入し、その後、流速１００μｌ／分を用いて、５分間解離させた。上述のＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液中で、試料を調製した。すべての捕捉／注入周期後、１４６ｍＭリン酸（ｐＨ１．５）の１回１５秒間のパルスで、表面を再生した。１１４．７ｎＭ  ＩＧＦ−ＩＩを用いて、各抗体に関して、同じ捕捉／注入周期を反復した。対照フローセル由来のシグナルを減じ、そして各抗原注入直前に注入した緩衝液のベースライン・ドリフトを減じることによって、３４のｍＡｂに関するドリフト補正した結合データを用意した。ＣＬＡＭＰを用いて、１：１相互作用モデルにデータを広範囲で適合させて、結合動力学を決定した（Ｄａｖｉｄ  Ｇ．  ＭｙｓｚｋａおよびＴｈｏｍａｓ  Ｍｏｒｔｏｎ（１９９８）“ＣＬＡＭＰ（ｃ）：  ａ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ，”  ＴＩＢＳ  ２３，  １４９−１５０）。データを適合させる際に、物質移動係数を用いた。２５℃でのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合の動力学分析結果を以下の表７に列挙する。最高から最低のアフィニティーに、ｍＡｂをランク付けした。
【０１７９】
表７．３４のモノクローナル抗体のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ低解像度ＢＩＡＣＯＲＥスクリーニング
【０１８０】
【表７−１】
2009519711.tif 000011
【０１８１】
【表７−２】
2009519711.tif 000012
【０１８２】
ＩＧＦ−Ｉ結合データ
［０１８２］大部分のｍＡｂは、１：１モデルに適度によく適合する。ｍＡｂ  ４．９０．２および４．１４１．１は、非常に複雑なデータによって、特徴付けられた。１：１モデル適合からは、意味がある動力学定数が概算不能であったため、表７中、これらのｍＡｂにアスタリスクをつけて列挙した。後者の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）相は、これらのｍＡｂの両方に関して非常に遅いようであり（少なくとも１ｘ１０−５秒−１）、このことから、これらの２つのｍＡｂは、療法化合物として有用となりうる。
【０１８３】
ＩＧＦ−ＩＩ結合データ
［０１８３］大部分のｍＡｂは、１：１モデルに適度によく適合する。ｋｄを適切に概算するのに十分な崩壊データがないため、ｍＡｂ７．１５９．２に関する解離速度を、１ｘ１０−５秒−１で一定に保持した。
【０１８４】
［０１８４］本実施例において、低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ研究を半定量的ランク付けアプローチとして設計する。個々のｍＡｂの特徴的な速度定数およびアフィニティーに関して、より正確な情報を得るため、実施例８に記載するように、高解像度Ｂｉａｃｏｒｅ研究を行った。
【０１８５】
実施例８
ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いた、抗ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ抗体アフィニティーの決定（高解像度スクリーニング）
［０１８５］高解像度Ｂｉａｃｏｒｅ分析を行って、抗原に対する抗体アフィニティーをさらに測定した。ｍＡｂ  ７．１５９．２、７．２３４．２、７．３４．１、７．２５１．３、および７．１６０．２を各々捕捉し、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ抗原を各々、ある濃度範囲に渡って注入した。生じた結合定数を、表８に列挙する。
【０１８６】
表８．低および高解像度ＢＩＡＣＯＲＥ分析によって決定した抗ＩＧＦ抗体アフィニティー
【０１８７】
【表８】
2009519711.tif 000013
【０１８８】
［０１８６］したがって、本発明の態様には、ＩＧＦ−ＩＩに優先的に結合するが、ＩＧＦ−Ｉと交差反応し、ＩＧＦ−ＩＩに対する結合が、ＩＧＦ−Ｉに対するより高いアフィニティーである抗体が含まれうる。例えば、抗体は、ＩＧＦ−Ｉに対するより、２．５倍高いアフィニティーでＩＧＦ−ＩＩに結合可能である。特定の態様において、抗体は、ＩＧＦ−Ｉに対するより、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１５０倍、高いアフィニティーでＩＧＦ−ＩＩに結合可能である。
【０１８９】
あらかじめ形成されたＩＧＦ−Ｉ／ＧＦＢＰ−３複合体のスクリーニング
［０１８７］実施例６に記載するＩＧＦＢＰ競合アッセイによって、６８３の試験した上清の中で、ＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−Ｉ結合を阻害する８７の試料、およびＩＧＦＢＰ−３に対するＩＧＦ−ＩＩ結合を阻害する１２９の試料が同定された。５１の試料が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの二重競合を示した。しかし、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰ複合体が、大部分、あらかじめ形成されているであろう、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の機能または振る舞いをより注意深く再現するため、選択した抗体に対して、以下のＢｉａｃｏｒｅアッセイを行った。
【０１９０】
［０１８８］６つの選択した抗体をスクリーニングして、これらがＩＧＦＢＰとの複合体中のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに結合するかどうかを決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００装置で、ルーチンのアミン・カップリングを用い、２つのＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ上で、高い表面容量（５，４００〜１２，８００ＲＵ）まで、６つの選択したｍＡｂすべて（７．１５９．２、７．１４６．３、７．３４．１、７．２５１．３、７．５８．３、および無関係の対照抗体ＡＢＸ−ＭＡ１）を共有固定した。各ＣＭ５チップ上の１つのフローセルを活性化し、そして対照表面として使用するため、ブロッキングした（ｍＡｂをまったく固定しなかった）。
【０１９１】
［０１８９］次に、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．４、０．００５％Ｐ−２０、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ＨＢＳ−Ｐ）中でともに混合して、それぞれ、１９３ｎＭおよび４５４ｎＭの最終溶液を作製した。ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦＢＰ−３をともに混合して、それぞれ、１９２ｎＭおよび４５５ｎＭの最終溶液を作製した。これらの条件下で、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦＢＰ−３と９９．９７％、複合体形成した。これらの条件下で、数分以内に平衡に到達した。複合体形成したＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦＢＰ−３の溶液を、４０μｌ／分および２３℃で、多様なｍＡｂ表面上に１８０秒間流し、そして１２０秒間、解離を追跡した。次いで、複合体形成していないＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを、それぞれ、１９３ｎＭおよび１９２ｎＭで、各表面上に流し、そしてＩＧＦＢＰ−３を４５４ｎＭで各表面上に流した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０の２０秒間のパルスで、表面を再生した。
【０１９２】
［０１９０］固定したｍＡｂを含む表面由来の結合シグナルから、バルクの屈折率変化およびブランク表面に対する分析物のいかなる非特異的結合シグナルも減じることによって、プログラムＳｃｒｕｂｂｅｒを用いて、センサーグラムをプロセシングした。ブランク補正減算後、特定のフローセル上の緩衝液注入に関して、平均センサーグラムを減じることによって、センサーグラムの２回目の参照処理を行った。この「二重参照」は、特定のフローセル上に存在するいかなるシステムエラーに関しても、ｍＡｂ結合センサーグラムを補正した。
【０１９３】
［０１９１］複合体形成したおよび複合体形成していないＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦＢＰ−３は、結合した抗体にかなり弱く結合し、非特異的結合相互作用の大まかな概算は、陰性対照ＡＢＸ−ＭＡ１を含めた、６つのｍＡｂすべてに関して、ＫＤ＞１μＭであった（表９を参照されたい）。しかし、ＡＢＸ−ＭＡ１を用いると、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ結合は弱く、そしてこれらの３つの分析物すべてで、非特異的結合相互作用が起こっていることが示された。一見したところ、ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体は、ＩＧＦＢＰ−３単独よりも、これらのｍＡｂすべてにわずかにより強く結合するようである。しかし、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＢＰ−３はどちらも、両方が一緒に結合した際、これらのｍＡｂ自体に非特異的に結合するようであるため、これが、さらに「より粘着性の」非特異的結合タンパク質複合体を生じ、このことは、複合体に関する、より高い結合シグナルを説明する。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ／ＩＧＦＢＰ−３複合体およびＩＧＦＢＰ−３は、対照表面に有意に結合し、このこともまた、これらの２つのタンパク質の非特異性を示す。しかし、以下のセンサーグラムでは、上述のように、データプロセシング中、最初の参照中に、このバックグラウンド結合を減じる。
【０１９４】
［０１９２］この実験は、試料のうち５１が、ＩＧＦＢＰ３に対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＩの結合を阻害することが先に示された（実施例６）が、抗体がまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ複合体に結合可能であることを示唆する。
【０１９５】
表９．６つのｍＡｂに対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−ＩＩ／ＩＧＦＢＰ−３結合に関する結合要約
【０１９６】
【表９】
2009519711.tif 000014
【０１９７】
＋、ｍＡｂに対するＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに比較してわずかな結合
＋＋、ｍＡｂに対するＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに比較して中程度の結合
＋＋＋、ｍＡｂに対するＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ結合に比較して強い結合
＊これらの評価は、これらの相互作用に関するＫＤを示さない。
【０１９８】
実施例９
ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いた抗インスリン抗体アフィニティーの決定（低解像度スクリーニング）
［０１９３］ヒト・インスリンに対するｍＡｂのアフィニティーを測定することによって、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する抗体の交差反応性をさらに調べた。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体をＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定し、そして結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および解離速度を決定するため、溶液中のインスリンを注入した。この実験中、７．２３４．２、７．３４．１、７．１５９．２、７．１６０．２、および７．２５１．３を含む、５つのｍＡｂを試験した。泳動緩衝液中、５０２ｎＭに希釈したインスリンを、すべての捕捉表面上に注入した。
【０１９９】
［０１９４］５０２ｎＭインスリンで、ｍＡｂのいずれに対しても、インスリン結合はまったく観察されなかった。これらの結果は、インスリンとＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ  ｍＡｂの見かけの交差反応性がまったくないことを示唆した。
【０２００】
実施例１０
抗体のビニング
［０１９５］エピトープ・ビニングを行って、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体のいずれが、互いに交差競合するか、そしてしたがってＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ上の同じエピトープに結合する可能性があるかを決定した。ビニング法は、米国特許出願２００３０１７５７６０に記載され、Ｊｉａら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  （２００４）  ２８８：９１−９８にも記載され、どちらもその全体が本明細書に援用される。簡潔には、Ｌｕｍｉｎｅｘウェブサイト上に提供されるタンパク質カップリングプロトコルにしたがって、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズをマウス抗ｈｕＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５５７８４）とカップリングした。ビーズを光から保護しながら、以下の方法を用いて、未知の一次抗体にカップリングするために、あらかじめカップリングしたビーズを調製した。未知の上清各々に関して、個々の試験管を用いた。以下の式を用いて、必要な上清の体積を計算した：（ｎＸ２＋１０）ｘ５０μｌ（式中、ｎ＝試料総数）。このアッセイ中、０．１μｇ／ｍｌの濃度を用いた。ビーズストックを穏やかにボルテックスし、そして上清中で希釈して、ウェルあたり５０μｌ中、２５００の各ビーズまたは０．５Ｘ１０５ビーズ／ｍｌの濃度にした。
【０２０１】
［０１９６］暗所中、室温で一晩、振盪装置上で、試料をインキュベーションした。
［０１９７］ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝液を添加し、次いで、この緩衝液を吸引することによって、フィルタープレートをあらかじめ湿らせた。５０μｌの各ビーズをフィルタープレートの各ウェルに添加した。１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を添加して、そして吸引することによって、試料を一度洗浄した。抗原および対照を５０μｌ／ウェルでフィルタープレートに添加した。プレートを覆い、振盪装置上で、暗所で１時間インキュベーションし、そして次いで、試料を３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルで、未知の二次抗体を添加した。一次抗体に関しては、０．１μｇ／ｍｌの濃度を用いた。次いで、プレートを暗所中、室温で２時間、振盪装置上でインキュベーションし、そして次いで、試料を３回洗浄した。５０μｌ／ウェルの１：５００希釈したビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５５７８５）を添加し、そして試料を室温で振盪しながら、暗所中、１時間インキュベーションした。
【０２０２】
［０１９８］試料を３回洗浄した。１：１０００希釈の５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＰＥを添加し、そして室温で振盪しながら、暗所中、１５分間インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００上で、２回の洗浄周期を実行した後、試料を３回洗浄した。各ウェル中の内容物を８０μｌのブロッキング緩衝液中に再懸濁した。試料を数回ピペッティングして注意深く混合し、ビーズを再懸濁した。次いで、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００上で試料を分析した。結果を以下の表１０に示す。
【０２０３】
表１０．機能アッセイにおいて陽性である上位３４のＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体に関するビン
【０２０４】
【表１０】
2009519711.tif 000015
【０２０５】
実施例１１
抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体の構造分析
［０１９９］いくつかの抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列決定して、ＤＮＡ配列を決定した。各ガンマ鎖およびカッパ鎖の組み合わせに関して、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列とともに、配列リスト中に、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体に関する完全配列情報を提供する。可変重鎖配列を分析して、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列およびＪ領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳して、一次アミノ酸配列を決定し、そして生殖系列ＶＨ、ＤおよびＪ領域配列に比較して、体細胞超変異を評価した。
【０２０６】
［０２００］生殖系列遺伝子に対するこれらの抗体の配列の並列を以下の表に示す。表１１は、抗体重鎖領域を、その同族（ｃｏｇｎａｔｅ）生殖系列重鎖領域に比較した表である。表１２は、抗体カッパ軽鎖領域を、その同族生殖系列軽鎖領域に比較した表である。生殖系列からの突然変異を、新規アミノ酸として示す。
【０２０７】
［０２０１］免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、多数の生殖系列ＤＮＡセグメントによってコードされ、これは、Ｂ細胞発生中、連結されて、機能する可変領域になる（ＶＨＤＪＨまたはＶＫＪＫ）。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに対する抗体応答の分子および遺伝子多様性を詳細に研究した。これらのアッセイは、抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体に特異的ないくつかの点を明らかにした。
【０２０８】
［０２０２］ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩに特異的な５つの個々の抗体の分析の結果、抗体が３つの異なる生殖系列ＶＨ遺伝子に由来し、このうち４つがＶＨ４ファミリーに由来し、２つの抗体がＶＨ４−３９遺伝子セグメントに由来すると決定された。表１１および１２は、この分析の結果を示す。
【０２０９】
［０２０３］各ハイブリドーマから収集したシスタークローンの間で、アミノ酸配列が同一であることを認識すべきである。例えば、ｍＡｂ７．１５９．２の重鎖および軽鎖配列は、ｍＡｂ７．１５９．１に関して表１１および１２に示す配列と同一である。
【０２１０】
［０２０４］本発明の抗体の重鎖ＣＤＲ１は、表１１に開示するような配列を有する。表１１に開示するＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔの定義のものである。あるいは、ＦＲ１配列の最後の５残基を含むように、別の定義を用いて、ＣＤＲ１を定義してもよい。例えば、抗体７．１５９．１に関しては、ＦＲ１配列は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号９３）であり、そしてＣＤＲ１配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮ（配列番号９４）であり；抗体７．１５８．１に関しては、ＦＲ１配列は、ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（配列番号９５）であり、そしてＣＤＲ１配列は、ＧＧＳＩＲＳＳＳＹＹＷＧ（配列番号９６）であり；抗体７．２３４．１に関しては、ＦＲ１配列は、ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（配列番号９７）であり、そしてＣＤＲ１配列は、ＧＧＳＩＮＳＳＳＮＹＷＧ（配列番号９８）であり；抗体７．３４．１に関しては、ＦＲ１配列は、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（配列番号９９）であり、そしてＣＤＲ１配列は、ＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳ（配列番号１００）であり；そして抗体７．２５１．３に関しては、ＦＲ１配列は、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（配列番号１０１）であり、そしてＣＤＲ１配列は、ＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳ（配列番号１０２）である。
【０２１１】
［０２０５］特定の抗体が、アミノ酸レベルで、それぞれの生殖系列配列と異なる場合、抗体配列を突然変異させて生殖系列配列に戻してもよいこともまた、認識すべきである。こうした修正突然変異は、標準的分子生物学的技術を用いて、１つ、２つ、３つまたはそれより多い位で、あるいは突然変異した位のいかなる組み合わせで起こることも可能である。限定されない例として、表１２は、ｍＡｂ  ７．３４．１の軽鎖配列（配列番号１２）が、ＦＲ１領域中のＰｒｏからＡｌａの突然変異（突然変異１）を通じて、そしてＦＲ２領域中のＰｈｅからＬｅｕの突然変異（突然変異２）を通じて、対応する生殖系列配列（配列番号８０）と異なることを示す。したがって、ｍＡｂ  ７．３４．１の軽鎖をコードするアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異１を変化させて、突然変異１の部位で、生殖系列配列を生じてもよい。さらに、ｍＡｂ  ７．３４．１の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異２を変化させて、突然変異２の部位で、生殖系列配列を生じてもよい。さらになお、ｍＡｂ  ７．３４．１の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異１および突然変異２の両方を変化させて、突然変異１および突然変異２の両方の部位で、生殖系列配列を生じてもよい。
【０２１２】
表１１．重鎖分析
【０２１３】
【表１１】
2009519711.tif 000016
【０２１４】
＊ハッチ（ｈａｔｃｈ）記号（＃）は、生殖系列中のスペースを示し、そして表に示す抗体配列との適切な並列を示すために用いられる。
＊＊上記表に示す生殖系列配列は、並列目的のためであり、そして各個々の抗体領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫グロブリン生殖系列ＤＮＡセグメントの可変領域内のそれ自身の位置に存在することを認識すべきである。
【０２１５】
表１２．軽鎖分析
【０２１６】
【表１２】
2009519711.tif 000017
【０２１７】
＊ハッチ記号（＃）は、生殖系列中のスペースを示し、そして表に示す抗体配列との適切な並列を示すために用いられる。
＊＊上記表に示す生殖系列配列は、並列目的のためであり、そして各個々の抗体領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫グロブリン生殖系列ＤＮＡセグメントの可変領域内のそれ自身の位置に存在することを認識すべきである。
【０２１８】
実施例１２
ＮＩＨ３Ｔ３細胞で異所性に発現されたｈＩＧＦ−ＩＲの、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ誘導性リン酸化の阻害
［０２０６］ＩＧＦリガンドは、ＩＧＦ−ＩＲ受容体中の受容体チロシンキナーゼ活性を活性化することによって増殖および抗アポトーシス機能を発揮する。抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体が、ＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦ誘導性リン酸化を阻害する能力に関して評価するため、異所性にｈＩＧＦ−ＩＲを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を以下のアッセイで用いた。
【０２１９】
［０２０７］ヒトＩＧＦ−ＩＲを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の密度で９６ウェルプレート中に植え付け、そして飢餓培地（炭でストリップ処理（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）した１％ＦＢＳ）中で一晩インキュベーションした。翌日、増殖培地を廃棄し、ウェルをＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、そして１００μｌの血清不含培地（０％ＦＢＳ）を添加して細胞を飢餓させた。多様な抗体濃度と３７℃で６０分間プレインキュベーションした、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）またはＩＧＦ−ＩＩ（１０ｎＭ）のいずれかを含有し、０．０５％ＢＳＡを含む、１００μｌの血清不含培地を、１〜２時間後に、３つ組で細胞に添加した。３７℃で１０分間、刺激を起こすのを可能にし、刺激後、培地を取り除き、そして１００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡ中の３．７％ホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、そして室温で２０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで２Ｘ洗浄し、そして１００μｌの透過化緩衝液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を各ウェルに添加した。これを室温で１０分間インキュベーションするのを可能にし、廃棄し、そして１００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡ中の０．６％過酸化水素を添加して、いかなる内因性ペルオキシダーゼ活性も不活性化した。２０分間の室温インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３Ｘ洗浄し、そして１００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０％ＦＢＳを室温で１時間添加することによって、ブロッキングした。次いで、ブロッキング緩衝液を取り除き、そして１μｇ／ｍｌの５０μｌ抗ホスホＩＧＦＩＲ抗体（カタログ番号４４−８０４、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ−Ｔ中の各ウェルに添加した。２時間の室温インキュベーション後、細胞を、各洗浄の間、５分間浸して、ＰＢＳＴで３Ｘ洗浄した。洗浄後、ブロッキング緩衝液中で１：２５０に希釈した５０μｌ／ウェルのヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ二次抗体を各ウェルに添加した。１時間の室温インキュベーション後、前のように、細胞をＰＢＳＴで５分間、３Ｘ洗浄し、そして軽く叩いて乾燥させた。次いで、５０μｌのＥＣＬ試薬（ＤｕｏＬｕｘ）を添加し、そしてＲＬＵを直ちに読み取った。
【０２２０】
［０２０８］３２の抗体系統をスクリーニングし、そして各抗原に関して、２つの独立のアッセイを行った。上位１０の抗体に関する結果を以下の表１３に要約する。
表１３．ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＩＧＦ依存性ＩＧＦ−ＩＲリン酸化の阻害の要約
【０２２１】
【表１３】
2009519711.tif 000018
【０２２２】
＊これらのアッセイは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに関するｍＡｂ  ＫＤが与えられれば、抗原限定条件下で行うことも可能であった。
実施例１３
ｈＩＧＦ−ＩＲでトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ誘導性増殖の阻害
［０２０９］上に論じるように、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体を中和するための基準の１つは、ＩＧＦ誘導性増殖を阻害する能力である。ＩＧＦ誘導性増殖を阻害する能力に関して抗体を評価するため、ｈＩＧＦ−ＩＲを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を以下のアッセイに用いた。
【０２２３】
［０２１０］ｈＩＧＦ−ＩＲを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ウェルあたり５０００細胞の密度で、９６ウェルプレート中に植え付け、そして飢餓培地（炭でストリップ処理した１％ＦＢＳ）中で一晩培養した。翌日、増殖培地を廃棄し、ウェルを血清不含培地で穏やかに２回洗浄し、そして１００μｌの血清不含培地を添加して細胞を飢餓させた。多様な抗体濃度と３７℃で３０分間プレインキュベーションした、１５ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦＩまたは５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦＩＩを含有する１００μｌの飢餓培地を、２つ組または３つ組で細胞に添加した。２０時間インキュベーションした後、細胞をＢｒｄＵで２時間パルス処理し、そしてＲｏｃｈｅの細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１  ６４７  ２２９）を用いて、取り込み（増殖）の度合いを定量化した。
【０２２４】
［０２１１］総数３２の抗体系統をスクリーニングし、そして各抗原に関して、２つまたは３つの独立のアッセイを行った。上位１０の抗体に関する結果を以下の表１４に要約する。
【０２２５】
表１４．ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＩＧＦ−ＩＲ細胞のＩＧＦ依存性増殖の阻害の要約
【０２２６】
【表１４】
2009519711.tif 000019
【０２２７】
＊これらのアッセイは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに関するｍＡｂ  ＫＤが与えられれば、抗原限定条件下で行うことも可能であった。
実施例１４
ＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞で発現されるｈＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ誘導性リン酸化の阻害
［０２１２］ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＲ受容体において、受容体チロシンキナーゼ活性を活性化することによって、増殖および抗アポトーシス機能を発揮する。抗体がＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦ誘導性リン酸化を阻害する能力を評価するため、内因性ｈＩＧＦ−ＩＲを発現するＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞を以下のアッセイに用いた。
【０２２８】
［０２１３］ＢｘＰＣ３細胞をウェルあたり５５，０００細胞の密度で９６ウェルプレート中に植え付け、そして通常の増殖培地中で一晩インキュベーションした。翌日、増殖培地を廃棄し、ウェルを血清不含培地で穏やかに２回洗浄し、そして１００μｌの血清不含培地を添加して細胞を飢餓させた。２４時間後、培地を廃棄し、そして細胞を血清不含培地で穏やかに１回洗浄した。ＩＧＦ−Ｉ（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＧＦ−ＩＩ（７５ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを含有し、０．０５％ＢＳＡを含む血清不含培地を、多様な抗体濃度と３７℃で３０分間プレインキュベーションして、そして次いで、１００μｌを３つ組で細胞に添加した。プレートを３７℃で１５分間インキュベーションし、そして続いて冷ＰＢＳでリンスした。１００μｌの溶解緩衝液をウェルに添加し、そしてプレートを４℃で３０分間インキュベーションした。溶解物を２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間回転して落とし、そして上清を収集した。Ｄｕｏｓｅｔヒト・リンＩＧＦ−ＩＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹＣ１７７０）を用いて、ＩＧＦ−ＩＲリン酸化を定量化した。
【０２２９】
［０２１４］１０の抗体系統をスクリーニングし、そして各抗原に関して、２つの独立のアッセイを行った。結果を以下の表１５に要約する。
表１５．ＩＧＦ依存性ＩＧＦ−ＩＲリン酸化の阻害の要約
【０２３０】
【表１５】
2009519711.tif 000020
【０２３１】
＊最後の３つの抗体に関しては３３３ｎＭ。
Ｎ．Ｄ．：未決定
実施例１５
ＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ誘導性増殖の阻害
［０２１５］上に論じるように、中和ＩＧＦ抗体の基準の１つは、ＩＧＦ誘導性増殖を阻害する能力である。ＩＧＦ誘導性増殖を阻害する能力に関して、抗体を評価するため、内因性ｈＩＧＦ−ＩＲを発現するＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞を以下のアッセイに用いた。
【０２３２】
［０２１６］ＢｘＰＣ３細胞をウェルあたり２０００細胞の密度で９６ウェルプレート中に植え付け、そして通常の増殖培地中で一晩培養した。翌日、増殖培地を廃棄し、ウェルを血清不含培地で穏やかに２回洗浄し、そして１０μｇ／ｍｌトランスフェリンおよび０．１％ＢＳＡを含む１００μｌの血清不含培地（アッセイ培地）を添加して細胞を飢餓させた。２４時間後、培地を廃棄し、細胞を血清不含培地で穏やかに１回洗浄し、そして多様な抗体濃度と３７℃で３０分間プレインキュベーションした、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦを含有する１００μｌのアッセイ培地を、２つ組または３つ組で細胞に添加した。プレートを３日間インキュベーションし、そしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増殖を定量化した。
【０２３３】
［０１２７］１０の抗体系統をスクリーニングし、そして各抗原に関して、２つまたは３つの独立アッセイを行った。結果を以下の表１６に要約する。以下の機能データおよび実施例１４からのデータに基づいて、４つの最適抗体を選択した。高いアッセイ変動性が観察されたため、ＩＧＦ−Ｉ誘導性増殖アッセイデータを選択基準から排除した。
【０２３４】
表１６．ＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞のＩＧＦ依存性増殖の阻害の要約
【０２３５】
【表１６】
2009519711.tif 000021
【０２３６】
＊最後の３つの抗体に関しては３３３ｎＭ。
Ｎ．Ｄ．：未決定
実施例１６
マウスＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびインスリンとの交差反応性の決定
［０２１８］１つの目的は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的であるが、インスリンとの交差反応性をまったく持たない抗体を開発することであった。動物において、後の実験を行うため、抗体はまた、ネズミＩＧＦ−Ｉ／ＩＩと交差反応しなくてはならないが、ネズミ・インスリンとは交差反応してはならない。したがって、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、選択した抗体が、ネズミＩＧＦまたはインスリンと交差反応可能であるかどうかを決定した。
【０２３７】
［０２１９］表１７に示すように、ＥＬＩＳＡによって、マウスまたはラット・インスリンとの交差反応性に関して、上位１０の抗体のうち５つを試験した。これらの抗体は、陰性対照抗体ＰＫ１６．３．１に匹敵して、そして陽性対照抗ラット・インスリン抗体と対照的に、マウスまたはラット・インスリンとの交差反応性をまったく持たないことが、ＥＬＩＳＡによって示された。
【０２３８】
表１７．マウス・インスリンとの交差反応性
【０２３９】
【表１７】
2009519711.tif 000022
【０２４０】
実施例１７
ＮＩＨ３Ｔ３細胞で異所性に発現されたヒトＩＧＦ−ＩＲのマウスＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ誘導性リン酸化の阻害
［０２２０］マウスＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと交差反応性を持つモノクローナル抗体が、ＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦ誘導性リン酸化を阻害する度合いを決定するため、これらの抗体を、さらに試験した。ｈＩＧＦ−ＩＲ受容体を異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、先に記載したように、このアッセイを実行した。このアッセイの結果を表１８に要約する。
【０２４１】
［０２２１］ヒトＩＧＦ−ＩＲを異所性に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の密度で９６ウェルプレート中に植え付け、そして飢餓培地（炭でストリップ処理した１％ＦＢＳ）中で一晩インキュベーションした。翌日、増殖培地を廃棄し、ウェルをＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、そして１００μｌの血清不含培地（０％ＦＢＳ）を添加して細胞を飢餓させた。多様な抗体濃度と３７℃で６０分間プレインキュベーションした、マウスＩＧＦ−１（１０ｎＭ）またはＩＧＦ−ＩＩ（１０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓｍ，  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス、それぞれ、カタログ番号７９１−ＭＧおよび７９２−ＭＧ）のいずれかを含有し、０．０５％ＢＳＡを含む、１００μｌの血清不含培地を、１〜２時間後に、３つ組で細胞に添加した。３７℃で１０分間、刺激を起こすのを可能にし、刺激後、培地を取り除き、そして１００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡ中の３．７％ホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、そして室温で２０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで２Ｘ洗浄し、そして１００μｌの透過化緩衝液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を各ウェルに添加した。これを室温で１０分間インキュベーションするのを可能にし、廃棄し、そして１００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡ中の０．６％過酸化水素を添加して、いかなる内因性ペルオキシダーゼ活性も不活性化した。２０分間の室温インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３Ｘ洗浄し、そして１００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０％ＦＢＳを室温で１時間添加することによって、ブロッキングした。次いで、ブロッキング緩衝液を取り除き、そして１μｇ／ｍｌの５０μｌ抗ホスホＩＧＦＩＲ抗体（カタログ番号４４−８０４、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ−Ｔ中の各ウェルに添加した。２時間の室温インキュベーション後、細胞を、各洗浄の間、５分間浸して、ＰＢＳＴで３Ｘ洗浄した。洗浄後、ブロッキング緩衝液中で１：２５０に希釈した５０μｌ／ウェルのヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃ−ＨＲＰ二次抗体を各ウェルに添加した。１時間の室温インキュベーション後、前のように、細胞をＰＢＳＴで５分間、３Ｘ洗浄し、そして軽く叩いて乾燥させた。次いで、５０μｌのＥＣＬ試薬（ＤｕｏＬｕｘ）を添加し、そしてＲＬＵを直ちに読み取った。
【０２４２】
表１８．ｈＩＧＦ−ＩＲのマウスＩＧＦ誘導性リン酸化の阻害
【０２４３】
【表１８】
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【０２４４】
実施例１８
ヌードマウスにおける、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの増殖阻害
［０２２２］ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−ＩＩ誘導性増殖を阻害する能力に関して抗体を評価するため、以下の実験を行った。
【０２４５】
［０２２３］６〜８週齢の雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国マサチューセッツ州ウィルミントンによって供給）に、５ｘ１０６のＣｌｏｎｅ  ３２細胞（ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびヒトＩＧＦ−１Ｒを異所性に過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞）を皮下移植した。総接種体積３３０μｌ中、ＰＢＳ中に細胞を懸濁した。モノクローナル抗体７．１５９．２、７．３４．１および７．２５１．３での処置前に、腫瘍を１００〜２００ｍｍ３に増殖させた。ＰＢＳ中に懸濁した５または５０ｍｇ／ｋｇの抗体またはＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体を、第２２日から、９または１２匹のマウスのランダム化した群に、４週間に渡って、毎週、腹腔内投与した。第２２日から、１１匹のマウスのさらなる群に、ビヒクル対照としてＰＢＳを、４週間に渡って、毎週、腹腔内投与した。腫瘍サイズおよび体重を週２〜３回測定した。結果を図１および２に要約する。
【０２４６】
［０２２４］有意な腫瘍増殖阻害が観察され（図１を参照されたい）、いかなる群にも有意な体重喪失は起きなかった（図２を参照されたい）。抗体７．１５９．２、７．３４．１および７．２５１．３は、５および５０ｍｇ／ｋｇ／週で、Ｃｌｏｎｅ  ３２腫瘍の増殖を有意に阻害した（図１を参照されたい）。
【０２４７】
実施例１９
ヌードマウスにおける、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−１Ｒを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの増殖阻害
［０２２５］先の実施例では、抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−ＩＩ誘導性増殖を阻害することが示された。ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−Ｉ誘導性増殖を阻害する能力に関して抗体を評価するため、以下の実験を行った。
【０２４８】
［０２２６］雌ヌードマウス（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａより供給される、Ｓｗｉｓｓ  ｎｕ／ｎｕマウス系統に由来するＡｌｄｅｒｌｅｙ  Ｐａｒｋ系統）の左わき腹に、５ｘ１０６生存Ｐ１２細胞［ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−１Ｒを異所性に過剰発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら，  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ３，  １９９−２０５，  １９９２）］を皮下移植した。総接種体積０．１ｍｌ中、ＰＢＳ中に細胞を懸濁した。同じスケジュールで、マウスあたり１．０ｍｇのｍＡｂ  ７．１５９．２、または等体積のＰＢＳビヒクル（０．３ｍｌ）のいずれかを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を移植した日から、週２回、動物２群（各々、ｎ＝１０）に投与した。すべての用量を、ｉ．ｐ．経路を介して、腹腔内投与した。動物の体重を毎日測定し、そして腫瘍がひとたび確立されたら、ノギスを用いて、毎週２回、腫瘍測定を行った。卵形と仮定して、ノギス測定値から、すべての測定可能な腫瘍の体積を計算した。結果を図３に要約する。
【０２４９】
［０２２７］図３に示すように、１．０ｍｇ抗体／マウスの週２回のｉ．ｐ．投与後、ｍＡｂ  ７．１５９．２で、有意な腫瘍増殖阻害が観察された。動物群のいずれでも、有意な体重喪失は観察されなかった。
【０２５０】
実施例２０
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
［０２２８］膵臓癌と診断されたヒト癌患者群をランダム化して治療群にする。各患者群を、本明細書記載のｍＡｂ  ７．１５９．２、７．３４．１または７．２５１．３の毎週の静脈内注射で治療する。各患者に、５０ｍｇ／ｋｇ〜２，２５０ｍｇ／ｋｇの範囲の抗体有効量を、４〜８週間投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを投与する。
【０２５１】
［０２２９］治療措置中および措置後、定期的に、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。ｍＡｂ  ７．１５９．２、７．３４．１または７．２５１．３での毎週の抗体治療を受けた患者は、抗体治療を受けていない患者に比較して、腫瘍サイズの有意な減少を示すことが見出される。何人かの治療患者では、腫瘍はもはや検出不能である。対照的に、対照群では腫瘍サイズは増加するか、または実質的に不変のままである。
【０２５２】
実施例２１
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
［０２３０］ヒト患者が悪性腫瘍と診断されている。この患者を、ｍＡｂ  ７．１５９．２の毎週の静脈内注射で８週間治療する。治療措置中および措置後、定期的に、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。腫瘍サイズの有意な減少が見られる。
【０２５３】
実施例２２
ヒト患者における末端肥大症の治療
［０２３１］成人男性が末端肥大症と診断されている。この患者を、ｍＡｂ  ７．３４．１の週２回の（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）の静脈内注射で、２年間に渡って治療する。その結果、患者は、末端肥大症の症状の有意な減少を経験する。
【０２５４】
実施例２３
ヒト患者における乾癬の治療
［０２３２］成人女性が重度の乾癬と診断されている。この患者を、ｍＡｂ  ７．２５１．３の週２回の静脈内注射で、３年間に渡って治療する。その結果、患者は、乾癬の症状の有意な減少を経験する。
【０２５５】
実施例２４
ヒト患者における骨粗鬆症の治療
［０２３３］成人女性が骨粗鬆症と診断されている。この患者を、ｍＡｂ  ７．１５９．２の週２回の静脈内注射で、１年間に渡って治療する。その結果、骨密度喪失の有意な減少がある。
【０２５６】
実施例２５
ヒト患者におけるアテローム性動脈硬化症の治療
［０２３４］成人男性がアテローム性動脈硬化症と診断されている。この患者を、ｍＡｂ  ７．３４．１の週２回の静脈内注射で、１年間に渡って治療する。その結果、患者は、狭心症などの、アテローム性動脈硬化症の症状の減少を経験する。
【０２５７】
実施例２６
ヒト患者における再狭窄の治療
［０２３５］遮断された動脈を緩和するため、成人男性が血管形成術を受ける。血管形成術後、この患者を、ｍＡｂ  ７．２５１．３の週２回の静脈内注射で、１年間に渡って治療する。その結果、患者は、治療した動脈の再狭窄を経験しない。
【０２５８】
実施例２７
ヒト患者における糖尿病の治療
［０２３６］成人女性が糖尿病と診断されている。この患者を、ｍＡｂ  ７．１５９．２の週２回の静脈内注射で、１年間に渡って治療する。その結果、糖尿病の症状が減少する。
【０２５９】
配列
［０２３７］サブクローニングされたハイブリドーマの配列を決定して、可変重鎖および可変軽鎖遺伝子両方に関して、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベル両方で、一次構造を決定した。表１に列挙するような、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対するモノクローナル抗体の可変領域のヌクレオチドおよびポリペプチド配列を、配列表に提供する。
【０２６０】
参照による援用
［０２３８］特許、特許出願、論文、教科書等を含む、本明細書に引用するすべての参考文献、および該文献に引用される参考文献は、すでにそうでない度合いまで、その全体が本明細書に援用される。
【０２６１】
同等物
［０２３９］前述の記載した明細書は、当業者が本発明を実施可能となるのに十分であると見なされる。前述の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳述し、そして発明者らが意図する最適の様式を記載する。しかし、前述の記述がテキスト中でいかに詳細であるかに関わらず、本発明を多くの方式で実施してもよく、そして本発明は付随する請求項およびその任意の同等物にしたがって解釈されるべきであることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１】［００５４］図１は、ＩｇＧ２およびＰＢＳ対照に比較した、ｍＡｂ  ７．１５９．２、７．３４．１、７．２５１．３を用いた、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＲを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｃｌｏｎｅ  ３２細胞）のヌードマウスにおける異種移植片腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。平均腫瘍体積をｙ軸上に示し、そして移植後の時間をｘ軸上に示す。
【図２】［００５５］図２は、ＩｇＧ２およびＰＢＳ対照に比較した、ｍＡｂ  ７．１５９．２、７．３４．１、７．２５１．３で処置した、Ｃｌｏｎｅ  ３２異種移植片マウスにおける体重を示すグラフである。平均体重をｙ軸上に示し、そして移植後の時間をｘ軸上に示す。
【図３】［００５６］図３は、ＰＢＳ対照に比較した、ｍＡｂ  ７．１５９．２を用いた、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｐ１２細胞）のヌードマウスにおける異種移植片腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。平均腫瘍体積をｙ軸上に示し、そして移植後の時間（日付で示す）をｘ軸上に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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