(57)【要約】  本発明は、共焦点走査顕微鏡法を用いて、第一に生体組織の細胞核を限局化し、後に、細胞核紫外線吸光度を測定することにより、細胞核ＤＮＡの量をヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法に関する。本発明は、レーザ走査共焦点顕微鏡法により、第一に生体組織の細胞核の限局化を同定し、後に、細胞核紫外線吸光度を測定することによって、ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで癌性の細胞を検出する方法にも関する。さらに、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト又は動物の対象における癌を診断する方法に関し、当該方法は、レーザ走査共焦点顕微鏡法による、生体組織の細胞核における限局化の同定と細胞核紫外線吸光度の測定との組合せに依拠している。
2009545737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物の対象の少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法であって：
（ａ）ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで前記少なくとも１つの細胞の核を限局化するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記核による紫外（ＵＶ）線の吸収作用を測定するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
ヒト又は動物の対象における少なくとも１つの推測上癌性の細胞を検出するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載のステップ（ｂ）で決定された前記核の紫外線吸収作用を、同じく請求項１に記載のステップ（ａ）から（ｂ）を使用して得られた少なくとも１つの非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量が決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量における、２価から少なくとも１０％はずれた偏差が、癌性の細胞を示している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１．８から２．２という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近二倍体の状態を示し、３．６から４．４という倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量が近四倍体の状態を示し、さらに、１．８から２．２及び３．６から４．４という範囲外にある倍数性状態又は細胞核ＤＮＡ含有量がＸ倍体の状態を示している、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの癌性の細胞が、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）における前記核の限局化が、共焦点レーザ走査顕微鏡法、２光子イメージング、走査型光コヒーレンス断層撮影法、高分解能の超音波、又は、ＵＶ内視顕微鏡法を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）における前記核による紫外線吸収作用の測定が、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記紫外線が、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍ、好ましくは２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト又は動物の対象の少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する装置の使用であって、
（ａ）請求項１に記載のステップ（ａ）を行うための、共焦点レーザ走査顕微鏡法、内視顕微鏡法、光コヒーレンス断層撮影法、及び／又は、高プロファイルの超音波の利用；及び
（ｂ）請求項１に記載のステップ（ｂ）を行うための、共焦点レーザ走査顕微鏡法、及び／又は、２光子イメージング；
のための機器を含む装置の使用。
【請求項１１】
共焦点レーザ走査顕微鏡法のための機器を含んだ、ステップ（ａ）もステップ（ｂ）も行うための装置の、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞核を限局化し、該細胞核の紫外線の吸収作用を測定することにより、ヒト又は動物の対象の細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法に関する。
【０００２】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞核を限局化し、該細胞核の紫外線の吸収作用を測定することにより、ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで癌性の細胞を検出する方法にも関する。
【０００３】
同様に、本発明は、ヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関し、当該方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われ、細胞核の限局化、及び、細胞核のＵＶ吸収作用の測定に依拠している。
【背景技術】
【０００４】
癌の早期発見は、癌患者を治療することにおいて鍵となる要点である。生物学的試料内の癌性の細胞を検出する、従って、実在する癌を診断する、又は、少なくとも将来癌が発生するという見込みを推定するといった種々の可能性が存在する。これらの種々の取り組みには、癌組織の理学的検査、癌性の細胞の形態学的特徴づけ、膜及び核等の細胞構造体の免疫組織化学染色並びに特徴づけ、腫瘍特異的因子の発現の測定等が含まれる。
【０００５】
癌性の細胞を検出するという１つの可能性は、核ＤＮＡの量を測定して通常のＤＮＡ含有量との偏差を検出する、いわゆるＤＮＡサイメトリーである。突然変異誘発性の事象の結果としての細胞が、非癌性、すなわち、「健康」又は「正常」タイプの細胞として知られる既知の標準的な細胞よりも少ない又は多いＤＮＡを含んでいる場合、このＤＮＡ含有量における偏差により、重大な染色体再構築、従って進行中の癌発生が示されるということが想定される。
【０００６】
従って、核酸特異的染色による核ＤＮＡの定量化は、癌診断という状況において、研究用途でも臨床用途でもますます慣例になってきている。
【０００７】
フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーによる核ＤＮＡ含有量の測定は、とりわけ（ｉ）ＤＮＡに結合した染料の量は存在するＤＮＡの量に比例する、及び、（ｉｉ）放出、吸収、又は伝導による染料から生じる光学信号は染料の量に比例するという想定に基づいている。
【０００８】
ＤＮＡイメージサイトメトリーにより核ＤＮＡを測定するという目的に対して一般的に使用される１つのＤＮＡ特異的染色法は、フォイルゲン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）とロッセンベック（Ｒｏｓｓｅｎｂｅｃｋ）の名にちなんだ、単にフォイルゲン反応と呼ばれる場合が多い、酸塩基反応である。実際に、フォイルゲン反応は、ＤＮＡが酸により加水分解され、遊離のアルデヒド基を有する、プリン塩基なしのＤＮＡ（すなわち、いわゆるアプリン酸、ＡＰＡ）を生じる発色反応である。次に、遊離のアルデヒド基に共有結合的に結合する染料を含有したシッフ試薬と反応させる。
【０００９】
フォイルゲン反応はＤＮＡに特異的だけれども、種々の欠点を有している。フォイルゲン反応は時間のかかる反応で、むしろ、再現性及び意味のある結果を生じるために、注意深く制御及び確認する必要がある複雑な反応である。プリン塩基の除去において一般的に使用されるＨＣｌがＡＰＡをより小さな断片に加水分解するという事実から１つの問題が生じる。しかし、ＡＰＡ分子の断片化により、これらの断片は細胞核から除去され、従って、染色可能なＤＮＡ物質は失われる。
【００１０】
フォイルゲン染色法に固有のこれらの欠点に加えて、フォイルゲン染色自体が突然変異誘発性であり、従って癌を発生させるため、フォイルゲン法による核ＤＮＡの着色はｉｎ  ｖｉｖｏで可能ではない。
【００１１】
従来のＤＮＡイメージサイトメトリー法における別の鍵となる要点は、これらの方法には、個々の細胞の測定を可能にするために細胞が例えばガラススライド上に広げられる作動モードが必要とされることである。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡサイトメトリー測定を行うことは、当然ながら、試料を単離することができないのではなく、個々の細胞をその生理学的環境から単離することが可能ではない状況においてＤＮＡ測定を行わなければならないという状況により複雑にされる。正しくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち、ヒト又は動物の対象においてＤＮＡイメージサイトメトリーを行う場合、個々の細胞を物理的にその自然環境から分離することはできず、個々の細胞の量を測定する方法を見つけなければならない。
【００１２】
新規の顕微鏡装置を提供することによって個々の細胞をその自然環境内で可視化させる試みが、当技術分野において行われてきた。
【００１３】
国際公開ＷＯ２００４／１１３９６２  Ａ２号は、厚膜試料内にある細胞の観察を可能にする小型化された共焦点顕微鏡システムを開示している。
【００１４】
しかし、現在まで解決されていない、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡイメージサイトメトリーにおける必要条件のうちの１つは、生体組織内で核ＤＮＡの量を決定することである。
【００１５】
このように、信頼ができて迅速且つ能率的な、ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで核ＤＮＡの量を測定する、並びに、癌性の細胞及び癌を検出する手段を可能にする方法が引き続き必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
細胞の核内にあるＤＮＡ等の二重鎖の細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１７】
癌性の細胞の存在をヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで検出する方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１８】
癌の存在、又は、起こりそうな癌の発生のｉｎ  ｖｉｖｏでの診断を可能にする方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の目的を達成するために、独立請求項１において定義された方法が提供される。
【００２０】
本発明によると、ヒト又は動物の対象の少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで前記少なくとも１つの細胞の核を限局化するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記核による紫外（ＵＶ）線の吸収作用を測定するステップ；
を含む。
【００２１】
本発明の１つの例証的な実施形態において、細胞内の細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する前述の方法を使用して、ヒト又は動物の対象内にある少なくとも１つの癌性の細胞を検出することができる。
【００２２】
前述の方法のさらなる実施形態において、ステップ（ｂ）において得られた細胞核紫外線吸光度を使用して、細胞の倍（異）数性状態を算出することができる。
【００２３】
これは、得られた細胞核紫外線吸光度を、非癌性の種類であると知られ、核ＤＮＡ含有量が既知である細胞に対して実質的に同一の条件のもと得られた細胞核紫外線吸光度に参照することにより行うことができる。好ましい実施形態において、この算出はヒト又は動物の体外で行われる。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態では、２価から少なくとも１０％はずれた異数性状態は、癌性の細胞を示しているとみなされる。健康な状態において増殖する細胞の場合、２及び４価からの少なくとも１０％の異数性の偏差が、進行する癌の発生を示しているとみなされる。
【００２５】
本発明の一実施形態において、上記のように細胞内の核ＤＮＡの量を決定する方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけられる癌性の細胞が少なくとも１つ検出される。
【００２６】
本発明の実施形態のうちの１つにおいて、本発明による方法は、上記の方法のステップ（ａ）における核の限局化のために、共焦点レーザ走査顕微鏡法、２光子イメージング、走査型光コヒーレンス断層撮影法、高分解能の超音波、又は、ＵＶ内視顕微鏡法を使用する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）における細胞核紫外線吸収作用の測定は、紫外線吸収信号を較正し、前記細胞核の体積を決定することにより行われる。
【００２８】
好ましい実施形態において、細胞核紫外線吸収作用の決定は共焦点レーザ走査顕微鏡法により行われる。本発明の特に好ましい実施形態は、この目的のために、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの波長を有する紫外線を使用する。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、ヒト又は動物の対象における癌をｉｎ  ｖｉｖｏで診断及び／又は予測する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで前記少なくとも１つの細胞の核を限局化するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記核による紫外線の吸収作用を測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定した前記核の紫外線吸収作用を、同じくステップ（ａ）から（ｂ）を使用して得られた非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量を決定するステップ；
（ｄ）前記細胞核の核酸の量に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【００３０】
ステップ（ｃ）では、ヒト又は動物の体外で比較を行うことができる。
【００３１】
本発明のこの態様におけるさらに別の実施形態は、前述の特徴を含み、２価から少なくとも１０％はずれた倍数性状態が癌性の細胞、従って、（今後）起こりそうな癌の発生を示す方法を用いてヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する方法に関する。健康な状態において増殖する細胞の場合、２及び４価からの少なくとも１０％の異数性の偏差が、進行する癌の発生を示しているとみなされる。
【００３２】
ヒト又は動物の対象における癌を診断及び／又は予測する前述の特徴の方法に関係する本発明のさらに別の実施形態において、当該方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌が検出される。
【００３３】
本発明の他の実施形態において、診断及び予測の態様に関連して、ステップ（ａ）における核の限局化、及び、ステップ（ｂ）における細胞核紫外線吸収作用の測定は、上記のように行うことができる。
【００３４】
従って、好ましい実施形態において、共焦点レーザ走査顕微鏡法が、好ましくは約２４０ｎｍから約２８０ｎｍの波長の紫外線を用いて、細胞核紫外線吸収作用を測定するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】非癌性の細胞集団の核ＤＮＡ含有量が決定される場合に一般的に得られるヒストグラムを示している。前記細胞は、非増殖性の状態にある。
【図２】癌性の細胞の核ＤＮＡ含有量が決定される場合に一般的に得られるヒストグラムを示している。この場合、一般的に非増殖性である細胞が検査された時、４に対応するピークは癌を示している。
【図３】同じ濃度で溶解されたＤＮＡ及び蛋白質の紫外線の波長範囲における吸光係数を示している。
【図４】細胞の一面内で細胞質から核を通り細胞質の他の部分まで紫外線の光スポット（ｌｉｇｈｔ  ｓｐｏｔ）が移動した場合に、どのように反射光の量、従って吸光度が変化するか概略的に示している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＤＮＡサイトメトリーによる癌性の細胞の同定は、一般的に、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて実行される。
【００３７】
ＩＣＭと呼ぶこともできるＤＮＡイメージサイトメトリーの場合には、ＤＮＡを可視化するために、ＤＮＡはマーカーで染色される。その後、一般的に異数性と呼ばれるＤＮＡの量における変化を使用して、癌性の細胞の存在を検出する。それは、異数性が、すでに実在している癌性の状態、又は、発生している癌性の状態の特徴であるとみなされるためである。従って、ＤＮＡ異数性の検出は、癌性の細胞を検出することによる早期の且つ敏感な癌の診断を可能にし、その診断は、組織診の形態学的及び組織学的特徴づけより何年も前に進められる場合が多くある。
【００３８】
しかし、上記のように、フォイルゲン染色法等の確立されたＤＮＡ発色反応は、面倒で時間がかかってしまう。さらに、フォイルゲン染色法等のＤＮＡ発色反応はそれ自体が突然変異誘発性であり、従って癌を発生させるため、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用することは可能ではない。
【００３９】
本発明者等は、ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで、自然環境に取り囲まれた細胞の細胞核の核酸の量を、第一にそのような細胞の核を限局化し、第二に前記核による紫外線の吸収作用を測定することによって決定することが可能であることを意外にも発見した。
【００４０】
このように、一実施形態における本発明は、少なくとも１つの細胞における細胞核の核酸の量をヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法を対象としており、当該方法は：
（ａ）ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで前記少なくとも１つの細胞の核を限局化するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記核による紫外（ＵＶ）線の吸収作用を測定するステップ；
を含む。
【００４１】
そのような方法を使用して、特に、個々又は種のゲノムサイズを決定することができる。当然ながら、そのような方法を使用して、例えば生体組織内にある少なくとも１つの癌性の細胞を検出することもできる。
【００４２】
ステップ（ｂ）には、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線を使用することが好ましい。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長の紫外線であり得る。核の限局化が紫外線を用いて行われる場合、同じことがステップ（ａ）にも適用される。このように、１つの好ましい実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）に、上記の波長の紫外線が使用される。
【００４３】
本発明の目的に対して、「癌性の細胞」という用語は、いかなる細胞、細胞組織、又は、細胞からなる器官にも関し、当該細胞の一部又は全てが、染色体の複製、欠失、挿入、転座等の結果として、非癌性の細胞に対して決定された核ＤＮＡの量からはずれた核ＤＮＡの量を含んでいる。
【００４４】
染色体ＤＮＡの挿入、複製、欠失、及び転座が、癌の発生に対する大きな原因であり、従って、癌性の細胞の特徴であるとみなすことができるということは既知である。
【００４５】
本発明による方法によって調査することができる細胞は、骨髄細胞、リンパ節細胞、リンパ球、赤血球、神経細胞、筋細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、粘膜細胞等を含めた群から選択することができる。
【００４６】
同様に、本発明による方法を使用して、ヒト又は動物の体内の種々の組織をｉｎ  ｖｉｖｏで分析することができる。そのような組織は、肝臓、心臓、腎臓等の器官の一部である、及び／又は、前述の細胞型を収容している場合がある。
【００４７】
好ましくは少なくとも１つの癌性の細胞を検出するための、細胞核の核酸の量をヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで決定する上記の方法は、次に、各々のステップ（ａ）及び（ｂ）に関して詳細に記述される。
【００４８】
ステップ（ａ）と上記で呼ばれた第一のステップにおいて、ヒト又は動物の対象内の少なくとも１つの細胞は、その核の位置に関してｉｎ  ｖｉｖｏで分析される。好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの細胞は、癌性又は癌性であると疑われた、すなわち、推測上癌性の細胞であり得る。
【００４９】
一般的に、細胞核の限局化は、その自然環境、すなわち生体組織内で細胞に対して行われる。細胞核の限局化は、例えば、共焦点レーザ走査顕微鏡法、走査型光コヒーレンス断層撮影法、２光子イメージング、高分解能の超音波、又は、ＵＶ内視顕微鏡法を用いて達成することができる。
【００５０】
組織の形態、従って核の位置が既知である場合、ＤＮＡ含有量（ステップ（ｂ））等の各細胞における細胞核の核酸の量の測定を開始することができる。このことは、一実施形態において好ましい場合があるけれども、例えば核ＤＮＡの測定が開始される前に、核の位置、従って限局化は正確に決定される必要はなく、概算で十分な場合がある。細胞境界の知識で十分な場合さえある。この理由のため、核の限局化を決定するために紫外線を使用することは、好ましい実施形態であり得るけれども必要でない場合がある。
【００５１】
共焦点レーザ走査顕微鏡法
ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の核の限局化における好ましい実施形態のうちの１つは、共焦点レーザ走査顕微鏡法の使用に依拠しており、さらに好ましい実施形態においては、紫外線光源を使用することができる。共焦点顕微鏡法は、従来の光学顕微鏡法と比較していくつか利点を提供している。最も重要な利点の１つは、画像をゆがめてしまう焦点がずれた情報の除去、制御可能な被写界深度、及び、サブミクロンの解像度である。共焦点顕微鏡法のさらなる利点は、標本のうち焦点がずれた種々の部分における蛍光を取り除くことができるので、焦点の合った部分又は切片を妨害せず、その結果、古典的な光学顕微鏡法によって得られた類似の画像よりもかなり鮮明でより良い解像度を示す画像を生じることである。
【００５２】
共焦点走査顕微鏡法の基本原理は、対物レンズの焦点が合わされた点に「結合」された顕微鏡レンズシステムの焦点にピンホールを有したスクリーンの使用である。対物レンズの焦点からの光のみがピンホールにて集められ、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）であり得る検出器を通り抜けることができる。試料のうち焦点がずれた切片からの光は、ほぼ完全に取り除かれる。
【００５３】
このように、共焦点顕微鏡は、ｘ及びｙ方向に対して従来の顕微鏡よりも有意に優れた分解能を有している。さらに、共焦点顕微鏡は、ｚ方向においてより浅い被写界深度を有している。このように、試料中焦点を走査することにより、試料の異なる面を見ることが可能であり、従って、試料の３次元画像を再構築することが可能である。さらに、共焦点顕微鏡法は、種々の波長の光と両立し得る。
【００５４】
共焦点レーザ走査顕微鏡が例えば内視鏡装置に統合された場合、アクチュエータを使用して、関心のある組織上で共焦点顕微鏡に走査させることができる。従って、第一の粗い走査を使用して組織の形態を決定することができ、関心のある核をこの選別から同定することができる。核が限局化されたこの段階で、次に、細胞核の紫外線の吸収作用を測定するためにステップ（ｂ）に進むことができる。
【００５５】
核の限局化に対して、共焦点走査顕微鏡は、単色光又は多色光を使用することができる。しかし、２４０ｎｍから２８０ｎｍという波長を有した単色紫外線が好ましい場合がある。特に好ましいのは、２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長の紫外線であり得る。
【００５６】
共焦点レーザ走査顕微鏡として、ＬＥＩＣＡ  ＤＭＬＭ等で、蛍光信号の信号強度を測定するためのＱｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｇｉｔａ  ２０００Ｒ  ＦＡＳＴＣｏｏｌｅｄ  Ｍｏｎｏ  １２−ｂｉｔカメラ装置（ＱＩｍａｇｉｎｇ社、Ｂｕｒｎａｂｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を有した顕微鏡を使用することができる。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ６０００は特に好ましい場合がある。
【００５７】
細胞がその自然な組織の環境において検査されることになる本発明の目的に対して、共焦点レーザ走査顕微鏡は内視鏡内に統合することができる。この目的に対して既知のシステムは、画像が走査される様式において主に異なる。２つのいくぶん進歩した市販のシステムが、例えばＯｐｔｉｓｃａｎ社及びＭａｕｎａ  Ｋｉｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手可能である。Ｍａｕｎａ  Ｋｉｒの機器は、コヒーレント光ファイバー束で画像が内視鏡の下に転送される近位走査システムである。選択された点又はファイバーは、遠心端にて標本にされた組織に画像化される。この共焦点レーザ内視鏡は、内視鏡のワーキングチャンネル介して送達される。共焦点レーザ内視鏡の視野は狭いため、プローブの配置はスタンダードなビデオ内視鏡により導かれる。従って、内視鏡のプラットフォームは、ビデオイメージャも共焦点顕微鏡も含まなければならない。当然ながら、内視鏡ユニットは、得られた画像の処理を可能にするコンピュータ装置及びソフトウェアパッケージも含むことができるか、又は、それらに連結することができる。
【００５８】
検出装置は、例えば、ＢＱ６０００フレームグラバーボードを介してコンピュータに接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７００  ＣＥ  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラであり得る。或いは、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＶ−Ｃ２０  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラを使用することができる。画像分析用ソフトウェアパッケージは、例えば、Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｔｒｕｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ９８  ｖ３．５０．６  画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ社，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）、又は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ３．０画像分析ソフトウェアであり得る。使用することができる別のシステムは、デュアル・モードに基づいたＢｉｏＶｉｅｗ  Ｄｕｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＶｉｅｗ  Ｌｔｄ社，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）、全自動の顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＸＹ電動８スライドステージ（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ社，Ｗｅｔｚｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３ＣＣＤプログレッシブスキャンカラーカメラ（ＤＸＣ９０００，Ｓｏｎｙ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、並びに、システムの制御及びデータの分析用コンピュータである。
【００５９】
Ｏｐｔｉｓｃａｎ社は、遠位走査（ｄｉｓｔａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）を使用する共焦点レーザ内視鏡を開発した。このシステムで、１本のファイバーが光を内視鏡の下に伝達し、遠位ヘッド（ｄｉｓｔａｌ  ｈｅａｄ）のファイバー端は空間的に走査され、オプティクスで組織に画像化される。Ｏｐｔｉｓｃａｎ社は内視鏡をＰｅｎｔａｘ社と共同開発した。その機器には共焦点顕微鏡が統合され、その結果、ワーキングチャンネルがはずされた。このシステムを使用して得られた組織の画像は、細胞核限局化の同定を可能にする解像度によるものである。
【００６０】
他の小型の共焦点光学装置は、本明細書に援用する国際公開ＷＯ２００４／１１３９６２  Ａ２号に記載されている。生体組織の共焦点イメージングのためのシステムも、国際公開ＷＯ０２／０７３２４６  Ａ２号並びに米国特許第２００５／００３６６６７号に記載されており、どちらも同様に本明細書に援用する。
【００６１】
光コヒーレンス断層撮影法
ヒト又は動物の対象の生体組織においてｉｎ  ｖｉｖｏで細胞核を限局化することにおけるさらに別の可能性は、光コヒーレンス断層撮影法（ＯＣＴ）の使用である。
【００６２】
ＯＣＴは、超高解像度（数ミクロン）で数ミリメートルまでの浸透度（一般的に、１．５ｂｉｓ２ｍｍ）を達成し、リアルタイムで３−Ｄの組織画像を生じるイメージングテクノロジーである。ＯＣＴは、任意に機能的及び分子的イメージングを達成するため、並びに、分光学的情報を与えるために３−Ｄ構造の画像（組織層、密度変化）を実現する。ＯＣＴは、−９０ｄＢくらい小さい信号を測定することができる干渉法ベースの技術である。１つのスタンダードなファイバーベースのＯＣＴ機構が、図５に示されている。
【００６３】
カプラーは、光源から生じる光を分割する。１つのアームは干渉計（ｉｎｔｅｒｐｈｅｒｏｍｅｔｅｒ）の参照アームとして役立つけれども、もう一方のアームは光を試料まで伝え、従って、サンプルアームと呼ばれる。走査型オプティクスは左右走査の能力を与えるため、ＯＣＴ機構は各側臥位に対してアキシャルスキャン（Ａ−ｓｃａｎ）を得る。全ての組み合わされたＡ−ｓｃａｎが、３−Ｄ構造の画像を形成する。
【００６４】
各Ａ−ｓｃａｎを得る際に、参照ミラー変位は深度情報を提供する。波長を走査することにより深度情報を得ることも可能である。さらに短い時間でより優れた深度情報を得るために、より進歩した技術がいくつか開発された。分光学的ＯＣＴは、いかなる移動部分もなしで前後走査のデータを提供するＯＣＴの中で最も進歩している。
【００６５】
現在最速のＯＣＴシステムは、１フレームあたり１０００回を超えるＡ−ｓｃａｎで、１秒あたりおよそ３０フレームという速さで画像を生成することができる。方位分解能は、走査型オプティクス及び光フォーカスシステム（ｌｉｇｈｔ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｓｙｔｅｍ）によってのみ制限される。距離分解能は、今度は光源に依存している。およそ７０ｎｍから９３０ｎｍの帯域幅を有する市販のスーパールミネッセントダイオードを用いて現在入手可能である典型的な距離分解能は約５μｍである。およそ１．５μｍという最も優れた実証済みの分解能のうちの１つは、Ｔｉ：サファイア  ｆｓレーザーを用いることによって達成した。
【００６６】
本発明の目的に対して、上記のＯＣＴ装置、及び、特に分光学的ＯＣＴ装置は小型化することができるため、すなわち内視鏡システムにおいて使用することができる。ＯＣＴ技術を小型化するために、例えばＯｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ２９，２２６１（２００４）の刊行物において練られた案を参照することができる。一般的に、内視鏡システムに使用することができる小型化されたＯＣＴ装置は以下のものを提供する：
光源。これは光源の帯域幅に比例する距離分解能を決定する。商業的に入手可能なＳＬＤ（スーパールミネッセントダイオード）は、およそ５μｍの距離分解能を得る。より優れた分解能（１μｍに近い分解能）は、Ｔｉ：サファイア  ｆｓレーザー又はタングステン電球（非常に低電力）が使用された場合に入手可能である。チューナブルレーザーは、フーリエ領域ＯＣＴに必要とされる。
【００６７】
光の送達を提供するためのファイバーオプティクス要素、マイケルソン干渉計を実現するための循環装置、及び／又は、ファイバーカプラー。
【００６８】
検出要素。これはＯＣＴの種類次第である。フォトダイオードが一般的に使用されるが、スペクトルＯＣＴの場合は、スペクトル分解された検出（リニアＣＣＤアレイと組み合わせたスペクトルアナライザ）が必要である。
【００６９】
偏光又は位相（ｐｈａｓｅ）ＯＣＴの場合、エンジン及びプローブ要素は偏光特性を維持することができなくてはならない。
【００７０】
高分解能超音波
前述したように、細胞核の限局化は、高分解能超音波を用いて行うこともできる。
【００７１】
２光子イメージング
当然ながら、細胞核は、２光子イメージングテクノロジーを用いて限局化することもできる。２光子の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリアルタイムの組織の３次元イメージングが可能である。この技術において、組織内の蛍光物質が低エネルギーの２つの光子を吸収することにより励起され、蛍光を放出するということが基本原理である。このことは、より高いエネルギーの１光子が蛍光物質を励起させる従来の（共焦点）顕微鏡法に対立する。
【００７２】
２光子処理を生じるために、一般的に共焦点顕微鏡の焦点で得られる比較的高い光子束が必要とされる。結果として、共焦点顕微鏡法の利点は、３次元イメージング及び高分解能（〜０．２ミクロンの方位分解能、及び、〜０．５ミクロンの距離分解能）のように、２光子イメージングにも適用される。
【００７３】
低エネルギーの励起光子のため、組織による１光子吸収は比較的少なく、組織における光子誘起の損害の量は最小限にされる。このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏの利用にとって重要な利点である。さらに、低い吸収率により、光子は組織内により深く浸透し、０．５ｍｍまでのイメージング深度を生じる。
【００７４】
要するに、２光子イメージングは、高分解能の共焦点顕微鏡法という利点と大きなイメージング深度及び少ない量の光子誘起の損害を兼ね備えている。２光子イメージングは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリアルタイムの組織の細胞レベルまでの特徴づけを可能にし、疾患を診断するのに適していると証明した。
【００７５】
上記の方法のうちステップ（ｂ）に話を変えると、ｉｎ  ｖｉｖｏで核による紫外（ＵＶ）線の吸収作用を測定することは、種々の方法によって達成することができる。
【００７６】
共焦点顕微鏡機構を使用することにより、細胞の核内にあるプローブに焦点を合わせることができる。一般的に、共焦点機構のプローブスポットは核よりも小さくさせる。
【００７７】
共焦点機構により測定された核から反射される紫外線の量は、スポットにより探られた領域によって吸収された光の量に逆比例している。吸収作用は核を通してほぼ等しいと仮定すると、唯一残されたことは、測定値を較正し、核のサイズを決定することである。
【００７８】
較正
較正は、共焦点走査の同じ面内にある核及び核外の領域による紫外線の吸収作用を決定することからなる。核内外のどちらの測定に対しても、光は、関心のある細胞に到達する前に組織のほぼ同じ量及び同じ距離だけ伝わり、どちらの測定においても、類似のバックグラウンド信号を生じた。従って、細胞核による吸収対細胞核によらない吸収に対する測定値間の比は、細胞核の吸収に対する絶対測定値として利用することができる。
【００７９】
好ましい実施形態において、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線が使用される。特に好ましい実施形態において、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長を有する紫外線が使用される。波長の状況において「約」という用語は、１．５％、好ましくは１％、最も好ましくは０．５％の偏差に関している。紫外線、特に、２４０ｎｍから２８０ｎｍという波長の紫外線を使用する理由は、細胞の核に存在するＤＮＡが、この波長範囲において、その細胞の蛋白質よりもはるかに高い吸収作用を示すためである（図３を参照されたい）。
【００８０】
従って、蛋白質もＤＮＡも含有している核は、ＤＮＡではなく主に蛋白質を含有する残りの細胞よりも光を吸収するであろう。
【００８１】
共焦点レーザ走査顕微鏡を好んで使用することにより、核内の物質による紫外線の反射を測定し、その値を核外の細胞物質による反射と比較することができる。核により吸収された紫外線対核外の領域により吸収された紫外線の比を算出することによって、共焦点走査で得られた一面内のＤＮＡの密度に対する測定値である信号が得られる。
【００８２】
核容積の決定
核内にある細胞核の核酸の量を決定することにおける第２のステップでは、細胞核の全容積を決定しなければならない。これは、以下のように行うことができる。
【００８３】
核を通して３−Ｄで光スポット（ｌｉｇｈｔ  ｓｐｏｔ）を走査することによって、測定値を較正する際に記述されたように反射光の強度を決定することができる。反射光の強度により、依然として核内にいるのか、核の境界に達したのか、又は、すでに核外にいるのかわかる。このことは、図４に示されている。
【００８４】
反射し得る紫外線の信号は、すでに説明したように、顕微鏡の光スポットが核内で焦点を合わせられた場合と核外で合わせられた場合とで異なる。焦点を合わせた光スポットが核外にある場合、紫外線吸収作用は比較的低く、高強度の反射光が測定される。光スポットの焦点が細胞を通して移動して核の縁を通過した場合、より多くの光が核内に吸収されるため、反射光の強度は徐々に減少する。光スポットが完全に核内にある限り、核のもう一方の縁に再び達するまで、反射光の信号は一定で比較的小さい。次に、信号は、以前の高い値まで連続的に大きくなる。移動方向において信号が比較的低い箇所の距離により、核の局所的な厚さが測定される。
【００８５】
核の一面内での一走査を図４が示しているように、異なる面に対して同じ測定を行うことにより、これら１−Ｄ走査を三次元まで広げて核の全形を得ることができる。異なる座標（ｘｙ）で、核の局所的な厚さがｚ方向において測定される。このように、種々の面の異なる１−Ｄ画像から３−Ｄ画像を再構築することにより、核の外見を再構築して、核の容積を算出することができる。
【００８６】
このように、細胞核紫外線吸光度の測定値は、本発明によると、核内の紫外線吸光度信号を較正すること、及び、核の容積を決定することにより得られる。較正には、細胞核内の領域の紫外線吸光度対細胞核外の領域に対する吸光度の比が一つの面に対して考慮されることになる。
【００８７】
次に、核の容積の決定は、核の各面に対して得られた、較正された紫外線吸光度を加算することにより得られる。
【００８８】
この全ては、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線を用いた共焦点レーザ走査顕微鏡法を使用して行われることが好ましい。特に好ましい実施形態では、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長を有した紫外線が使用される。
【００８９】
このように、核の異なる面に対して共焦点走査顕微鏡を用いて紫外線吸光度を決定することにより、細胞核による紫外線の吸収作用を決定することが可能である。細胞核により吸収された光の量とＤＮＡの量は比例するため、ＤＮＡイメージサイトメトリーに必要とされているように、核におけるＤＮＡの量を決定することができる。
【００９０】
細胞核吸収信号と細胞核内のＤＮＡの量を相関させることは、例えばハーディー（Ｈａｒｄｉｅ）等（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２），５０（６），７３５−７４９、以下も参照）により記載されたスタンダードなＤＮＡイメージサイトロジー手順に従って行うことができる。
【００９１】
細胞核の紫外線の吸収作用が決定及び測定され、この工程がいくつかの細胞に対して繰り返されると、例えば、種々の細胞に含有されるＤＮＡの量に対する統計を算出することができる。これらの統計から、古典的なＤＮＡイメージサイトメトリーにおいて一般的に行われるように、組織の癌性又は非癌性の状態に関する結論を引きだすことができる。
【００９２】
当業者は、当然ながら、紫外線吸光度信号を記録する方法、並びに、これらの信号を使用して、例えば細胞核の画像を算出する方法に精通している。
【００９３】
信号強度、すなわち吸収又は透過された光の量の決定は、これらの目的に対して一般的に使用される機器を用いて行われる。
【００９４】
従って、例えば、前述の光源を用いて励起された場合にその細胞を見るために使用される顕微鏡の口径につながれた電荷結合素子又はデジタルカメラを使用することができる。当然ながら、フィルム等も使用することができる。
【００９５】
発光スペクトルが総合感度のスペクトル範囲内にある場合、蛍光の測定は、いかなる標準的な（バリアフィルター、励起フィルター、及びダイクロイックミラーからなる）フィルターキューブ、又は、特別な用途に対してカスタマイズされたいかなるフィルターキューブを用いても行うことができる。暗視野顕微鏡法及び位相差顕微鏡法等のいかなる標準的な空間フィルタリング方法と共にスペクトルバイオイメージングを使用することもでき、さらには、偏向顕微鏡法と共に使用することさえもできる。
【００９６】
検出装置は、例えば、ＢＱ６０００フレームグラバーボードを介してコンピュータに接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７００  ＣＥ  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラであり得る。或いは、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＶ−Ｃ２０  ｔｈｒｅｅ−ｃｈｉｐ  ＣＣＤカメラを使用することができる。画像分析用ソフトウェアパッケージは、例えば、Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｔｒｕｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ９８  ｖ３．５０．６  画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ社，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）、又は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ３．０画像分析ソフトウェアであり得る。使用することができる別のシステムは、デュアル・モードに基づいたＢｉｏＶｉｅｗ  Ｄｕｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＶｉｅｗ  Ｌｔｄ社，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）、全自動の顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＸＹ電動８スライドステージ（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ社，Ｗｅｔｚｌｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３ＣＣＤプログレッシブスキャンカラーカメラ（ＤＸＣ９０００，Ｓｏｎｙ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、並びに、システムの制御及びデータの分析用コンピュータである。
【００９７】
ＤＮＡ含有量の算出、及び、細胞の癌性又は非癌性の状態に対するＤＮＡ含有量の相関がより詳細に記述される前に、本発明のさらなる実施形態が記述される。これらの実施形態は種々の例を与えており、その技術及び方法を使用して、生体組織の細胞における核を限局化し、そのような核による紫外線の吸収作用を測定することができる。
【００９８】
一実施形態において、細胞核の限局化並びに細胞核紫外線吸収作用の測定は、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて行うことができる。
【００９９】
この実施形態では、共焦点顕微鏡は例えば内視鏡装置内に統合される。この装置は、さらに、光記録装置との類似点を有している。アクチュエータを使用して、関心のある組織上で共焦点顕微鏡を走査させる。第一の粗い走査を使用して形態を決定する。この選別から関心のある核は同定される。後に、核における細胞核紫外線吸収作用の測定、従って、ＤＮＡサイトメトリー測定が上記のように行われる。
【０１００】
このように、一実施形態において本発明は、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するための、共焦点レーザ走査顕微鏡法光学装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するための、共焦点レーザ走査顕微鏡法光学装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。前記装置は、例えば国際公開ＷＯ０２／０７３２４６号、米国特許第２００５／００３６６６７号、及び、国際公開ＷＯ２００４／１１３９６２  Ａ２号に記載されたもの等の内視鏡装置に組み込まれる小型の共焦点レーザ走査顕微鏡法装置であり得る。
【０１０１】
別の実施形態では、組織の形態は、内視鏡の先端で統合されている顕微鏡である共焦点レーザ内視鏡により決定することができる。好ましい実施形態において共焦点レーザ内視鏡は、紫外線で作動させることができる。国際公開ＷＯ０２／０７３２４６号に記載されたもの等の共焦点レーザ内視鏡が、細胞核を限局化するために使用されるであろう。次に、走査型共焦点顕微鏡法を用いてＤＮＡサイトメトリー測定を行うことができる。共焦点レーザ内視鏡を追加することにおける利点は、共焦点顕微鏡法に対して走査が必要ではなく、細胞の形態の画像をリアルタイムで得ることができるということである。
【０１０２】
一実施形態において本発明は、従って、国際公開ＷＯ０２／０７３２４６号に記載されたもの等、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するための紫外線及び共焦点レーザ走査顕微鏡法で作動させることができる共焦点レーザ内視鏡のための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
【０１０３】
このリアルタイムイメージングの結果として、細胞核紫外線吸収作用を決定するための共焦点顕微鏡を用いた核走査は非常に正確に行うことができる。当然ながら、使用される、核紫外線吸収作用の測定のための共焦点顕微鏡は、同じ核が測定されるのを確実にするために共焦点レーザ内視鏡と一列に並べなければならないであろう。
【０１０４】
第三の実施形態において、核の形態、従って限局化は、光コヒーレンス断層撮影法により決定され、走査型共焦点顕微鏡法が核探索、従って細胞核紫外線吸収作用の測定を行う。これら２つの異なる方法が核の限局化及び細胞核吸光度の決定に使用される場合、ＤＮＡサイトメトリーの精度は上がる。
【０１０５】
一実施形態において本発明は、従って、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するために光コヒーレンス断層撮影法及び共焦点レーザ走査顕微鏡法のための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
【０１０６】
第四の実施形態では、１００ＭＨｚを超えるトランスデューサーが、高分解能超音波を使用して組織内の核の限局化を決定する。これらの条件のもと、組織内の細胞を分解することができる分解能を得ることが可能になる。核走査及び細胞核紫外線吸収作用の測定は、ここでも共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて行うことができる。
【０１０７】
一実施形態において本発明は、従って、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するために高分解能超音波の利用及び共焦点レーザ走査顕微鏡法のための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
【０１０８】
第五の実施形態において、細胞核の形態、従って限局化は、上記の方法により、従って、例えばレーザ走査顕微鏡法により、共焦点レーザ内視鏡により、光コヒーレンス断層撮影法により、及び高分解能超音波により達成することができる。しかし、細胞核の紫外線の吸収作用を測定することは、共焦点走査顕微鏡法を用いて行われず、２光子イメージング処理において行われる。
【０１０９】
一実施形態において本発明は、従って、ヒト又は動物の対象における細胞核の核酸の量をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するために、共焦点レーザ走査顕微鏡法、共焦点レーザ内視鏡、光コヒーレンス断層撮影法、及び／又は高分解能超音波、並びに、２光子イメージングのための機器を組み込んだ装置の使用にも関する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における癌性の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで同定するそのような装置の使用に関する。細胞核の核酸の量は、細胞核を限局化して細胞核紫外線吸光度を測定することにより、上記のように決定することができる。
【０１１０】
２光子イメージング処理の場合、レーザービームが関心のある細胞に焦点を合わせられる。検出モジュールは、２光子吸収により誘起された蛍光を検出する。そのような場合、ＤＮＡの自己蛍光に依拠しなければならない。２光子イメージングテクノロジーを使用する場合、原則共焦点レーザ走査顕微鏡法に対して記述されたのと同じ機構を実行することができる。しかし、この時点では２光子吸収により生じた蛍光を探しているため、検出器の前にフィルターが配置されて、２光子蛍光とは異なる波長を有したいかなる光も取り除かれる。この方法を使用して、ＤＮＡサイトメトリーの精度を上げることができる。
【０１１１】
上記の実施形態の大多数において、調査される組織の形態を同定する、従って前記組織の細胞内の核を限局化するという第一のステップは、細胞核紫外線吸収作用を測定するために、共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて、いくぶん粗い走査を行い、続いて精密な走査を行うことにより達成された。しかし、共焦点レーザ走査顕微鏡法を使用して、細胞核を限局化し、細胞核の吸収作用を測定する高分解能走査をたった１回行うことも可能である。
【０１１２】
例えばｉｎ  ｖｉｖｏでのリアルタイムの癌検出を可能にするために、上記の方法をヒト又は動物の対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡサイトメトリー測定に使用することができる。前記の方法は、従って、例えば皮膚癌、口腔、肺、喉頭、甲状腺、及び子宮頸部等の粘膜表面の癌の検出に適用することができる。内視鏡法等の最小限の侵襲的手法が適用された場合、前記方法を使用して内部の癌を検出することもできる。
【０１１３】
本発明による方法はリアルタイムでの癌性の細胞の検出を可能にするため、ＤＮＡイメージサイトメトリーは、単離された細胞集団に対するＤＮＡイメージサイトメトリーに主に依拠する既知の方法と比較して有意に早められる。
【０１１４】
以下において説明されるように、ただ細胞核の吸光度、すなわち細胞核により吸収された紫外線を考慮することにより、本発明による方法は、迅速で正確な細胞核内にある細胞核の核酸の量の決定を可能にする。
【０１１５】
大抵の哺乳動物細胞が各２対の染色体を含んでいることは常識である。従って、染色体の数は、ｎを染色体の数として２ｎで算出することができる。しかし、細胞は複製する時、娘細胞への染色体の分離が起こる前に染色体の数を２倍にする。
【０１１６】
従って、ＤＮＡ複製中及び細胞分裂の前に、哺乳動物細胞は、ここでもｎを染色体の数として４ｎで算出することができる多数の染色体を含む。
【０１１７】
哺乳動物細胞のＤＮＡ量が染色体の数に参照された場合、「健康な」又は「正常な」細胞と呼ぶこともできる非癌性の細胞のＤＮＡ含有量には、従って、細胞の複製状態に応じて２又は４の価を割り当てることができる。
【０１１８】
本発明の状況において「倍数性」という用語は、正常で非癌性の細胞のＤＮＡ含有量を意味し、説明されたように、２及び４の価を有することができる。
【０１１９】
例えば前述されたフォイルゲン染色法を使用することによる非癌性の細胞の倍数性状態の決め方も当技術分野では常識である。この状況においては、ハーディー（Ｈａｒｄｉｅ）等の刊行物（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２），５０（６），７３５−７４９）を、ＤＮＡ染色法を用いた細胞のＤＮＡ含有量の決定を記載している限り援用する。
【０１２０】
ハーディー等による参考文献の７３８頁にある“Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ”という項において、例えばフォイルゲン染色法又は蛍光マーカーにより得られた信号強度をどのようにして濃度測定値に変換することができるかが説明されている。同じことが、本発明による方法によって測定された吸収信号に適用されるはずである。上記において説明されたように、健康で非癌性の細胞は、ｎを染色体の数として、２ｎ又は４ｎの染色体を含む。従って、本発明において使用されたフォイルゲン染色法又は吸収信号から得られた信号強度の濃度測定分析は、２つのピーク領域を有した濃度プロファイルを生じる。
【０１２１】
これら２つのピーク領域には、２又は４の価がそれぞれ割り当てられる。そのような濃度プロファイルの例が図１に提供されている。特定の場合において、非増殖の細胞を分析し、なぜ４に対応するピークがないのかを説明した。
【０１２２】
手短に言えば、画像分析デンシトメトリーに対して、細胞を目視するため及び吸収信号を測定するために使用される顕微鏡視野は、コンピュータに接続された、顕微鏡に取り付けられたＣＣＤ（電荷結合素子）検出装置又はデジタルカメラにより捕らえられる。デジタル化された画像の写真は、一連のピクセルとして記録され、各ピクセルには特有の色及び彩度が割り当てられる。次に、前記彩度は、一般的にコンピュータベースのアルゴリズムによって吸光度に変換され、次に、前述のデンシトグラムとして画像分析ソフトウェアにより表示される。
【０１２３】
当然ながら、正常で非癌性の細胞における、意義があり信頼できるデンシトグラムは、好ましくは数多くの細胞からなる集団から算出するべきであり、２５〜１００という多数の細胞が一般的には十分であるということに当業者は気づいている。従って、本発明の好ましい実施形態において細胞核ＤＮＡの量は、上記のように少なくとも約３０、４０、５０、又は６０個の細胞の細胞核紫外線吸光度を測定することにより決定される。
【０１２４】
本発明による上記の方法を用いて推測上癌性の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態を決定することにより、癌性の細胞の存在における決定を達成することができる。決定された倍数性状態は、次に、同一の方法により得られた細胞核の吸収強度から決定された非癌性の細胞の倍数性状態と比較される。本発明の一実施形態において、これら全ての計算はヒト又は動物の体外で行うことができる。
【０１２５】
従って、推測上癌性の細胞が実際に癌になりやすい細胞かどうかを決定するために、上記のようにデンシトグラムが決定される。非癌性の細胞に対して観察されたデンシトグラムは、「標準」又は「参照」デンシトグラムと呼ばれる。
【０１２６】
好ましくは、そのような参照デンシトグラムは癌性の細胞を検出するのと同じ方法を用いて測定されるが、非癌性の細胞のみが使用されることが確実にされる。これは、同じ個体の細胞だが、癌性であると思われる組織部位ではない他の組織部位由来の細胞を使用することにより達成することができる。或いは、又は、さらに、同じ組織から、形態が非癌性の状態を示す同一若しくは類似の細胞型を使用することができる。好ましくは類似の細胞型を、非癌性であると保証されている限り使用するべきである。標準デンシトグラムを得るために調査されることになる細胞の数及び細胞型は、当業者の知識内のもので十分であり、２５から１００個の細胞までさまざまで、好ましくは、約３０、４０、５０、又は６０個の細胞である。
【０１２７】
従って、本発明の目的に対して「類似の細胞型」という用語は、疑われた癌性の細胞と類似の由来で類似の細胞特徴を有した細胞型に関している。例えば、粘膜の細胞が癌発生に対して検査される場合、標準対照細胞も粘膜由来のものであるべきである。一方、リンパ系細胞が癌発生に対して検査される場合、標準対照細胞も、類似の細胞型であるためにリンパ由来のものであるべきである。
【０１２８】
非癌性であると知られ、推測上癌性の細胞に対して得られた細胞核紫外線吸光度の標準対照として使用される類似の細胞型の細胞核紫外線吸光度は、同一の条件下ではない場合、可能であれば、非常に類似の条件下で測定されるべきである。
【０１２９】
推測上癌性の組織において十分な数の細胞核が分析された場合、２及び４に対応するピークの「広がり」、並びに、追加のピークの発生は、すでに癌の発生を示している場合がある。
【０１３０】
特定の細胞に対して、前述された２又は４の価からはずれた倍数性状態が決定された場合、これは、実質的な複製、挿入、欠失、又は、染色体再構築を示し、従って、癌性の細胞を示している。この場合のように、そのような細胞の倍数性状態は２及び４の価からはずれており、異数性状態も表している。このことは、当然ながら、正常な状態においてでさえも一般的に増殖性である細胞型が考慮されていると仮定している。
【０１３１】
このように、非増殖性であると通常知られる細胞を検査する場合、４という倍数性の価は、癌発生を示している場合がある。
【０１３２】
正常な状態において増殖性であると知られる細胞が検査された場合、４の価は癌発生を示しているとはみなされない。この場合、２及び／又は４の価からの偏差のみが癌発生を示すことになる。
【０１３３】
本発明の状況における「異数性状態」という用語は、従って、細胞内の細胞核ＤＮＡの異常量に関している。
【０１３４】
当然ながら、細胞核紫外線吸光度、従って、推測上癌性の細胞のデンシトグラムは細胞の集団からも算出され、一般的に約１００から７００個、好ましくは約１００から３００個の細胞が測定される。
【０１３５】
例えば、肝組織由来の癌性の細胞が検査される場合、２及び／又は４の価が割り当てられた２つの主なピークを有したデンシトグラムを得ることができる。しかし、非癌性の細胞の場合以外では、前記２つの主なピークのデンシトグラムはそれほど鋭く細くないが、いくぶん広い。さらに、２未満、２を越える、４未満、及び４を越えるデンシトグラムにおけるピーク及び信号が観察される。例が図２に提供されている。
【０１３６】
いかなる試料においても過半数の細胞が２というＤＮＡ含有量を有するはずであるため、その過半数からの偏差も異常又は不審であるとみなすことができる。正常な細胞が少数である癌性試料の事象においても、試料を不審であるとラベルするために使用することができるＤＮＡ含有量における大きな変動が依然として存在する。
【０１３７】
従って、上記のように本発明により得られる細胞核紫外線吸光度を基準として算出されるデンシトグラムが２価（及び、正常状態において増殖性である細胞の場合は４価）に対応するピーク外でピーク信号を示す場合、細胞は癌性と評価される。
【０１３８】
しかし、２（及び４）の価に対応するピークがいくぶん広い曲度を示す場合、そのピーク自体が細胞の癌の可能性を示すことができる。２（及び４）価に対応するピークの形状を考慮してデンシトグラムが実際に癌の発生を示しているかどうかを決めるために、推測上癌性の細胞試料のデンシトグラムが上記の標準又は参照デンシトグラムと重ねられる。
【０１３９】
標準デンシトグラムの２価及び４価を示しているデンシトグラムのピークにおける曲線下の面積（ＡＵＣ）は非癌性の細胞を示していると解され、推測上癌性の細胞のデンシトグラムの対応するピークのＡＵＣにおける少なくとも１０％のいかなる偏差も癌性の細胞又は状態を示しているとみなされる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。
【０１４０】
細胞が正常又は癌性であるとみなされる場合について詳細に説明されている、ハロスク（Ｈａｒｏｓｋｅ）等の刊行物“１９９７  ＥＳＡＣＰ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＤＮＡ  ｉｍａｇｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７（１９９８）１８９−２００に明記された基準も適用することができる。
【０１４１】
このように、類似の非癌性の細胞型に対して得られた細胞核紫外線吸光度と比較した不審な癌性の細胞の細胞核紫外線吸光度の有意な偏差は、進行中の癌発生又は今後起こりそうな癌発生を示している。
【０１４２】
本発明の目的に対して、不審な癌性の細胞の倍数性状態が、２（又は４）という倍数性の価から少なくとも１０％はずれている場合、ＤＮＡ含有量における有意な異常は、癌発生を示しているとみなされる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。デンシトグラムにおけるピークには、該ピークのうち、参照デンシトグラムにおいて対応するピークと同一の部分に対して２価又は４価が割り当てられる。
【０１４３】
慣習によると、参照デンシトグラムの２価のピークに対応するピークが１．８から２．２に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近二倍体（ｐｅｒｉｄｉｐｌｏｉｄ）と呼ぶことができる。
【０１４４】
参照デンシトグラムの４価のピークに対応するピークが３．６から４．４に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近四倍体（ｐｅｒｉｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ）であるとみなされる。
【０１４５】
これらの範囲外にある価はどれも、Ｘ倍体（Ｘ−ｐｌｏｉｄ）とみなされる。
【０１４６】
近二倍体、近四倍体、及びＸ倍体の価を有した細胞及び組織は、本発明の目的に対して癌性の細胞とみなされる。
【０１４７】
このように、本発明の方法に従い得られた推測上癌性の細胞に対する細胞核紫外線吸光度を、同じ方法を用いた、非癌性であると知られる類似の細胞型に対する細胞核紫外線吸光度と参照させることによって推測上癌性の細胞の倍数性（異数性）状態を算出するために、上記の方法を使用することができる。
【０１４８】
本発明の目的に対して、「非癌性の」という用語は、癌発生の徴候を示していないとして知られる細胞を意味している。
【０１４９】
本発明の一実施形態において、癌性の細胞は、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌に関連づけることができる。
【０１５０】
本発明の別の実施形態では、ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで癌を診断及び／又は予測する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）ヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで前記少なくとも１つの細胞の核を限局化するステップ；
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記核による紫外線の吸収作用を測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定した前記核の紫外線吸収作用を、同じくステップ（ａ）から（ｂ）を使用して得られた非癌性の細胞の核の紫外線吸収作用と比較することにより細胞核の核酸の量を決定するステップ；
（ｄ）前記細胞核の核酸の量に応じて、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生を決定するステップ；
を含む。
【０１５１】
ステップ（ｃ）では、ヒト又は動物の体外で比較を行うことができる。
【０１５２】
ステップ（ａ）から（ｃ）は、上記の細胞核の核酸の量をヒト又は動物の対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで決定する方法のように行うことができる。
【０１５３】
従って、ステップ（ｂ）には、約２４０ｎｍから約２８０ｎｍという波長の紫外線を使用することが好ましい。特に好ましいのは、約２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、又は２６０ｎｍという波長の紫外線であり得る。核の限局化が紫外線を用いて行われる場合、同じことがステップ（ａ）に適用される。このように、１つの好ましい実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）に、上記の波長の紫外線が使用される。
【０１５４】
当然ながら、推測上癌性の細胞に対するデンシトグラム、及び、参照又は標準デンシトグラムの決定に関する上記の説明、「癌性の細胞」、「非癌性の細胞」、「倍数性」、「異数性」、「近二倍体」、「近四倍体」、「Ｘ倍体」、「ＡＵＣ」等の用語の意味は、本発明によるｉｎ  ｖｉｖｏでの癌を診断及び／又は予防する方法の状況において等しく適用される。
【０１５５】
上記でステップ（ｄ）と呼ばれた最後のステップでは、癌の存在又は今後起こりそうな癌の発生が、検査中の細胞の細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性状態に応じて決定される。
【０１５６】
推測上癌性の細胞に対して決定された細胞核ＤＮＡ含有量又は倍数性の価が、非癌性であると知られる、非常に類似の条件下若しくは同一の条件下で細胞核紫外線吸光度が測定された類似の細胞型の細胞核ＤＮＡ含有量又は２（及び４）という倍数性の価から少なくとも１０％はずれている場合、癌の診断は陽性であると考えることができる。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。
【０１５７】
標準デンシトグラムの２（及び４）価を示しているピークの曲線下の面積（ＡＵＣ）は非癌性の細胞を示していると解され、推測上癌性の細胞のデンシトグラムの対応するピークのＡＵＣにおける少なくとも１０％のいかなる偏差も癌性の細胞を示しているとみなされ、従って、陽性の診断をもたらす。好ましい実施形態において、偏差は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は、少なくとも５０％である。
【０１５８】
慣習によると、参照デンシトグラムの２価のピークに対応するピークが１．８から２．２に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近二倍体と呼ばれる。
【０１５９】
参照デンシトグラムの４価のピークに対応するピークが３．６から４．４に及ぶ場合、細胞のＤＮＡ含有量は近四倍体であるとみなされる。
【０１６０】
これらの範囲外にある価はどれも、Ｘ倍体とみなされる。
【０１６１】
近二倍体、近四倍体、又はＸ倍体と評価されたいかなる細胞又は組織も癌性の細胞とみなされ、陽性の診断が下される。
【０１６２】
癌を診断及び／又は予測する方法を使用して、白血病、リンパ腫、脳癌、脳脊髄の癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔咽頭癌、食道癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及びメラノーマを含めた群から選択される癌を診断及び／又は予測することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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