(57)【要約】分子相互作用を検出するための方法および組成物を提供する。本発明の態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーター系の使用を含む。本方法の実施形態を実施するために使用される系およびキットも提供する。一定の実施形態では、親和性が減少した酵素相補性レポーター系は、親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系である。本発明の態様は、第１のタンパク質および第２のタンパク質が相互作用するかどうかを決定する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタンパク質および第２のタンパク質が相互作用するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）以下：
（ｉ）該第１のタンパク質と第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第１の融合タンパク質であって、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第１の融合タンパク質、および
（ｉｉ）該第２のタンパク質と第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第２の融合タンパク質
を含む細胞を提供する工程であって、
ここで、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に対して親和性を有し、該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との間の相互作用の非存在下で公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られ、該活性は該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との間の相互作用の存在下で認められる活性よりも低い、提供する工程、および
（ｂ）該細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について評価して、該第１のタンパク質および第２のタンパク質が相互作用するかどうかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記提供する工程が、前記第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が前記細胞に連続的に導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が前記細胞に同時に導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記評価の前に前記細胞を候補相互作用調整剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記評価が、認められたβ−ガラクトシダーゼ活性を公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルと比較する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い前記第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアミノ酸変異が置換である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアミノ酸変異が欠失である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異が残基３１と残基４１との間で起こる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記相互作用が細胞内部位で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記相互作用が原形質膜部位で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞であって、
（ａ）第１のタンパク質と第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第１の融合タンパク質であって、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第１の融合タンパク質および
（ｂ）第２のタンパク質と第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第２の融合タンパク質
を含み、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に対して低い親和性を有し、該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との間の相互作用の非存在下で公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られ、該活性は該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との間の相互作用の存在下で認められる活性よりも低い、細胞。
【請求項１７】
前記第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質が細胞内タンパク質である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の少なくとも１つが膜結合タンパク質である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
前記第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の両方が膜結合タンパク質である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２０】
キットであって、
（ａ）細胞であって、
（ｉ）第１のタンパク質と第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第１の融合タンパク質であって、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第１の融合タンパク質および
（ｉｉ）第２のタンパク質と第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第２の融合タンパク質
を含み、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に対して低い親和性を有し、該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との間の相互作用の非存在下で公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られ、該活性は該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との間の相互作用の存在下で認められる活性よりも低い、細胞、および
（ｂ）β−ガラクトシダーゼ基質
を含む、キット。
【請求項２１】
キットであって、
（ａ）第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントをコードする第１の核酸、および
（ｂ）第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントをコードする第２の核酸
を含み、
該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドであり、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い該第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する結合親和性を有する、キット。
【請求項２２】
前記第１の核酸および第２の核酸がベクター上に存在する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ベクターが制限部位を含み、該制限部位は、タンパク質コード配列を該制限部位を使用してベクターに挿入する場合に該ベクターが該タンパク質とβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの融合タンパク質をコードするように該ベクター上に配置される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記キットが細胞をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記キットがβ−ガラクトシダーゼ基質をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた連邦政府の補助金番号Ｔ３２  ＧＭ０９４１２；Ｔ３２  ＡＧ０２５９；ＡＦ０５１６７８；ＨＤ０１８１７９；ＡＧ００９５２１；ＡＧ０２４９８７；ＡＧ０２０９６１；ＤＡＭＤ１７−００−１−０４４２の下の政府の支援を受けて成された。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
関連出願への相互参照
米国特許法§１１９（ｅ）に従って、本願は、２００６年３月１３日に出願された、米国仮特許出願第６０／７８２，０５４号（この出願の開示は、本明細書中に参考として援用される）の出願日の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質−タンパク質相互作用などの分子相互作用は、生細胞におけるほとんど全ての細胞過程に関与する。したがって、タンパク質機能の解明は、生物学的経路の基礎をなす機構を理解するための重要なステップである。さらに、人の疾患および障害を治療するための療法の開発は、疾患または障害に関連する生物過程におけるタンパク質機能の理解に依存する。さらに、ヒトゲノム計画の完了に伴い、同定された未知の機能を有するタンパク質の数が劇的に増加した。タンパク質の機能を解明するために、タンパク質の他のタンパク質との相互作用を同定することが有用である。
【０００４】
そのようなものとして、タンパク質−タンパク質相互作用を同定および特徴づける系ならびにそのモジュレーターは、種々の異なる用途で広く適用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
分子相互作用を検出するための方法および組成物を提供する。本発明の態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーター系の使用を含む。一定の実施形態では、親和性が減少した酵素相補性レポーター系は、親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系である。本方法の実施形態を実施するために使用される系およびキットも提供する。
【０００６】
本発明の態様は、第１のタンパク質および第２のタンパク質が相互作用するかどうかを決定する方法を含む。本方法の実施形態は、（ａ）以下：（ｉ）第１のタンパク質と第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第１の融合タンパク質であって、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第１の融合タンパク質、および（ｉｉ）第２のタンパク質と第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第２の融合タンパク質を含む細胞を提供する工程であって、ここで、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に対して親和性を有し、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の非存在下で公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られ、この活性は第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の存在下で認められる活性よりも低い、提供する工程、および（ｂ）細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について評価して、第１のタンパク質および第２のタンパク質が相互作用するかどうかを決定する工程を含む。一定の実施形態では、提供する工程が、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードする核酸を細胞に導入する工程を含み、この核酸を細胞に連続的または同時に導入することができる。一定の実施形態では、本方法は、評価工程の前に細胞を候補相互作用調整剤と接触させる工程をさらに含む。一定の実施形態では、評価工程は、認められたβ−ガラクトシダーゼ活性を公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルと比較する工程を含む。一定の実施形態では、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する結合親和性を有する。一定の実施形態では、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変異は、置換または欠失である。一定の実施形態では、変異は、残基３１と残基４１との間で起こる。一定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一定の実施形態では、相互作用は、細胞内部位（ｌｏｃａｔｉｏｎ）で起こる。一定の実施形態では、相互作用は、原形質膜部位で起こる。
【０００７】
本発明の態様は、（ａ）第１のタンパク質と第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第１の融合タンパク質であって、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第１の融合タンパク質および（ｂ）第２のタンパク質と第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第２の融合タンパク質を含む細胞であって、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に対して低い親和性を有し、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の非存在下で公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られ、この活性は第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の存在下で認められる活性よりも低い、細胞も含む。一定の実施形態では、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質は、細胞内タンパク質である。一定の実施形態では、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の少なくとも１つは、膜結合タンパク質である。一定の実施形態では、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の両方は、膜結合タンパク質である。
【０００８】
（ａ）細胞であって、（ｉ）第１のタンパク質と第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第１の融合タンパク質であって、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第１の融合タンパク質および（ｉｉ）第２のタンパク質と第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第２の融合タンパク質を含み、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に対して低い親和性を有し、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の非存在下で公知のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られ、この活性は第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の存在下で認められる活性よりも低い、細胞、および（ｂ）β−ガラクトシダーゼ基質を含む、キットも提供する。（ａ）第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントをコードする第１の核酸、および（ｂ）第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントをコードする第２の核酸を含むキットであって、該第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドであり、大腸菌野生型β−ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜９２からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントより低い該第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する結合親和性を有する、キットも提供する。一定の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸はベクター上に存在する。一定の実施形態では、ベクターは制限部位を含み、この制限部位は、タンパク質コード配列をこの制限部位を使用してベクターに挿入する場合にベクターがタンパク質とβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの融合タンパク質をコードするようにベクター上に配置される。一定の実施形態では、キットは細胞をさらに含む。一定の実施形態では、キットはβ−ガラクトシダーゼ基質をさらに含む。
【０００９】
定義
本発明によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術を使用することができる。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；”Ｏｌｉｇｏヌクレオチド  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５））；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４））；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照のこと。
【００１０】
用語「ポリマー」は、相互に共有結合した２つまたはそれを超える単量体単位から作製された任意の化合物を意味する。この単量体単位は同一であっても異なっていてもよく、したがって、ポリマーはホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る。代表的なポリマーには、ペプチド、ポリサッカライド、および核酸などが含まれ、ポリマーは、天然に存在するか合成であり得る。
【００１１】
本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド」は、一方のアミノ酸のα−カルボニル基と他方の基のα−アミノ基との間のアミド形成によって生成された任意のポリマー化合物をいう。
【００１２】
本明細書中で使用する場合、用語「オリゴペプチド」は、約１０〜２０残基（すなわち、アミノ酸単量体単位）未満のペプチドをいう。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、１０〜２０残基を超えるペプチドをいう。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語「タンパク質」は、約５０残基を超える特定の配列のポリペプチドをいう。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸のＬ型、Ｄ型、および非キラル型（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）だけでなく、修飾アミノ酸、アミノ酸アナログ、および従来のオリゴペプチド合成で組み込むことができる他の化合物（例えば、４−ニトロフェニルアラニン、イソグルタミン酸、イソグルタミン、ε−ニコチノイル−リジン、イソニペコチン酸、テトラヒドロイソキノレイン酸（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、α−アミノイソ酪酸、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、および４−アミノ酪酸など）も含まれることが意図される。アミノ酸配列は、一文字表記で示される（Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン、Ｘ：任意の残基）。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ差末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。標準的なポリペプチド命名法を順守して、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（１９６９），３５５２−５９を使用する。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、用語「核酸」は、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）から構成されるポリマーまたは２つの天然に存在する核酸に類似の配列特異的様式（例えば、ワトソン−クリック塩基対合相互作用に関与し得る）で天然に存在する核酸とハイブリッド形成することができる合成によって生成された化合物（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号および引用文献に記載のＰＮＡ）を意味する。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、用語「リボ核酸」および「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。そのようなものとして、「ＤＮＡ」分子は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態をいう。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをいい、任意の特定の三次形態に制限されない。したがって、この用語には、特に、直鎖ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体で見出された二本鎖ＤＮＡが含まれる。
【００１９】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の調節下に置かれた場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写末端配列を、コード配列の３’側に配置することができる。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、約１０〜約１００ヌクレオチド長および２００ヌクレオチド長までの一本鎖ヌクレオチド多量体を示す。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に約１００ヌクレオチド長を超えるヌクレオチド単量体から構成される一本鎖または二本鎖ポリマーをいう。
【００２２】
用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含む部分が含まれることが意図される。かかる修飾物質には、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」には、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分が含まれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドには、糖部分の修飾も含まれる（例えば、１つまたは複数のヒドロキシル基が水素原子または脂肪族基と置換されているか、エーテルまたはアミンなどとして官能化されている）。
【００２３】
「ベクター」は、結合したセグメントが複製されるように別のＤＮＡフラグメントを結合することができるプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、用語「ＤＮＡ調節配列」は、宿主配列中のコード配列を発現し、そして／または発現を制御する転写調節配列および翻訳調節配列（プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびターミネーターなど）である。
【００２５】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、転写開始部位によって３’末端に結合し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内に転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見いだされるであろう。真核生物プロモーターは、しばしば、しかし常にではなく、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。種々のプロモーター（誘導性プロモーターが含まれる）を使用して、本発明の種々のプロモーターを駆動することができる。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれ、特定のヌクレオチド配列またはその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。
【００２７】
かかるＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞は、外因性または異種ＤＮＡによって「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム内に組み込まれていても（共有結合）そうでなくてもよい。例えば、原核生物細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡを、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持することができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように形質転換ＤＮＡが染色体内に組み込まれるようになった細胞である。この安定性を、真核細胞が形質転換ＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンを確立する能力によって証明する。「クローン」は、有糸分裂による単一細胞または共通の祖先由来の細胞集団である。「細胞株」は、多世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定に成長することができる初代細胞のクローンである。
【００２８】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然ではより大きな分子に関連して見いだされないより大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントである。したがって、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、遺伝子は、通常、元の生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接するであろう。別の例では、異種ＤＮＡには、２つの異なる供給源由来の遺伝子の一部が１つになって融合タンパク質産物を産生する構築物中のコード配列が含まれる。対立遺伝子の変動または天然に存在する変異事象では本明細書中で定義のＤＮＡの異種領域は生じない。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、用語「レポーター遺伝子」は、異種プロモーターまたはエンハンサーエレメントに結合したコード配列をいい、構築物が組織または細胞に導入される場合、その産物を容易且つ定量的にアッセイすることができる。
【００３０】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載の環境が起こっても起こらなくてもよいことを意味する。したがって、この説明には、環境が起こる例および環境が起こらない例が含まれる。
【００３１】
「接触」は、１つになるか寄せ集めることを意味する。そういうものとして、例えば、２つの要素が相互に接触することによって２つの要素が１つになるか寄せ集められる場合、第１の要素は第２の要素と接触される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
詳細な説明
分子相互作用を検出するための方法および組成物を提供する。本発明の態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーター系（親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系など）の使用を含む。本方法の実施形態を実施するために使用される系およびキットも提供する。
【００３３】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載の特定の実施形態に制限されず、そのようなものとして変化し得ると理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書中で使用した専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないとも理解すべきである。
【００３４】
一定範囲の値を示す場合、範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在する値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）（他で明確に示さない限り、下限の１／１０まで）および記載の範囲の任意の他で記載した値またはその介在する値が本発明の範囲内に含まれると理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立して、より狭い範囲内に含めることができ、記載の範囲の任意の特に排除された限度を条件として、これらも本発明の範囲内に含まれる。記載の範囲が一方または両方の限度を含む場合、限度を含む範囲のいずれかまたは両方を排除した範囲も本発明に含まれる。
【００３５】
一定の範囲を、本明細書中で、用語「約」を前に付けた数値で示す。用語「約」は、これに先行する厳密な数値の誤植およびこの用語が先行する数値に近いか近似する数値に対応するために本明細書中で使用される。数値が具体的に引用した数値に近いか近似するかどうかを判断する際、示した文脈では、近いか近似する引用していない数値が具体的に引用した数値に実質的に等価な数値であり得る。
【００３６】
他で定義しない限り、本明細書中で使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することもできるが、方法および材料の代表的な例をここに記載する。
【００３７】
本明細書中に引用した全ての刊行物および特許は、それぞれの刊行物または特許が具体的且つ個別に参考として援用されるかのように本明細書中で参考として援用され、刊行物の引用に関連して方法および／または材料を開示および記載するために参考として援用される。任意の刊行物の引用は、出願日以前の開示のためであり、本発明が先行発明によってかかる刊行物に先行する権利が与えられないということを承認すると解釈されるべきではない。さらに、示した刊行日は、実際の刊行日と異なっていても良く、自主的に確認する必要があり得る。
【００３８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、明確に別段に記述しない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意されたい。任意の選択的要素を排除するように特許請求の範囲を作成することができることにも留意されたい。そのようなものとして、本記述は、請求項の要素の引用または「消極的」限定の使用に関連して、「唯一の」および「のみ」などの排他的専門用語の使用の根拠として役立つことが意図される。
【００３９】
本開示を読んだ際に当業者に明らかなように、本明細書中に記載および例示された個別の実施形態は、本発明の範囲または精神を逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離するか組み合わせることができる個別の成分および特徴を有する。任意の引用された方法を、引用した事象の順序または論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。
【００４０】
本発明をさらに説明する場合、方法の態様を最初により詳細に概説し、その後に方法の実施形態を使用する異なる適用を概説し、本発明の一定の実施形態の実施で使用する種々のキットを概説する。
【００４１】
方法
上記でまとめているように、本発明の実施形態は、第１の分子と第２の分子との間の分子相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用など）を検出する方法を提供する。そのようなものとして、本発明の実施形態は、第１の分子および第２の分子が相互に結合する（すなわち、相互作用する）かどうかを決定する方法を提供する。本方法を使用して検出することができる分子相互作用には、種々の異なる分子型が含まれ得、分子は、同一または異なる種類の分子であり得る。そのようなものとして、一定の実施形態では、目的の分子相互作用は、同一の分子型（例えば、第１の分子および第２の分子はポリペプチド（例えば、タンパク質）である）である第１の分子と第２の分子との間の相互作用である。さらに他の実施形態では、第１の分子および第２の分子は、異なる分子型（例えば、第１の分子がポリペプチドであり、第２の分子が核酸である場合）であり得る。一定の実施形態では、第１の分子および第２の分子は、ポリペプチド（例えば、タンパク質）であり、その結果、本方法は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法である。
【００４２】
上記でまとめているように、本発明の実施形態は、第１および第２の結合膜が相互作用するかどうかを決定する方法に関する。本方法は、目的の各結合メンバーを親和性が減少した酵素相補性レポーター系の異なるメンバーで標識する細胞を提供する工程を含む。次いで、細胞を、レポーター酵素の活性を評価し、評価の結果を使用して、第１の結合メンバーと第２の結合メンバーとが相互作用するかどうかを決定する。
【００４３】
本方法の態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーター系の使用を含む。「親和性が減少した」酵素相補性レポーター系は、２つまたはそれを超える酵素のフラグメント（すなわち、レポーターサブユニット）で構成された系を意味し、これらのフラグメントのみではその親酵素で認められるいかなる検出可能な活性も欠く（直接または間接的に検出できない）が、例えば、無作為な相互作用または結合メンバー媒介性相互作用によって十分に近接する場合、検出可能な量の親酵素の活性が生じる。本発明の親和性が減少した酵素相補性レポーター系の態様は、目的の結合部分によって媒介される相互作用が存在しないアッセイ条件下で系の他のサブユニットとの相互作用が可逆的であるように系で使用される少なくとも１つのレポーターサブユニットがその野生型親酵素中の対応するドメインの変異型（ｖａｒｉａｎｔ）であることである。そのようなものとして、本発明の親和性が減少した酵素相補性レポーター系により、目的の相互作用の存在下で認められる第２の検出可能なシグナルより低い目的の相互作用の非存在下での第１の検出可能なシグナルが得られる。例えば、系がβ−ガラクトシダーゼ系である場合（以下により詳細に概説するように）、系により、目的の相互作用の存在下で認められる第２の検出可能なシグナルより低い目的の相互作用の非存在下での第１の検出可能なシグナルが得られる。さらに、本発明の態様は、所与の目的のアッセイ条件組下での第１のシグナルの大きさが公知であり、第２のシグナルが検出された時点または前の検出値を基準として使用する場合にはいくらか以前に決定することができる実施形態を含む。親和性が減少した酵素相補性レポーター系の実施形態を、高い信号雑音比を得ることによって特徴づける。
【００４４】
結合部分媒介性相互作用の非存在下でレポーターサブユニットが相互に可逆的結合を示し、さらに、これらに結合した分子種の結合の際に依然として会合して検出可能なシグナルを生成することができるような十分に低い結合親和性を示すレポーターサブユニットを、多数の異なるアプローチを使用して産生することができる。一定の実施形態では、高親和性サブユニットから構成される第１のレポーター系を研究してサブユニットの高親和性会合を担うサブユニット領域を同定する合理的アプローチを使用する。次いで、同定された領域を、いくつかの方法（例えば、適切な低親和性サブユニットを得、それにより、サブユニットが任意の結合メンバー媒介性会合の非存在下で可逆的に相互作用する親和性が減少したレポーター系を得るための領域への点変異、挿入、または欠失の導入）で変化させる。例えば、以下の実験の部および最初の高親和性β−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系を使用した合理的アプローチなどの概説についての２００５年３月１８日出願の米国特許出願第１１／１３２，７６４号を参照のこと。使用することができるレポーターサブユニットには、会合して検出可能なシグナルを生成することができる任意の結合親和性が減少したサブユニットが含まれる。１つの実施形態では、レポーターサブユニットは、会合することができ、会合した場合に直接または間接的に検出可能な産物を産生する反応を触媒することができるタンパク質である。
【００４５】
本発明の一定の実施形態で使用される親和性が減少した酵素相補性レポーター系は、多数の異なる酵素由来のレポーターサブユニットを使用することができる。レポーターサブユニットが由来し得る目的の酵素には、以下が含まれるが、これらに限定されないβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｃｒｅ−リコンビナーゼ、およびルシフェラーゼ。
【００４６】
一定の実施形態では、親和性が減少した酵素相補性レポーター系が基づく酵素は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子によってコードされる野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼである。β−ガラクトシダーゼ活性を、生細胞フローサイトメトリーおよび発色基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）での組織化学的染色を含む一定範囲の方法によって測定することがっできる。例えば、Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：２６０３−２６０７（１９８８）；およびＬｏｊｄａ，Ｚ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，（１９７９）を参照のこと。
【００４７】
例示のみを目的として、本発明を、主に親和性が減少した酵素相補性レポーター系がβ−ガラクトシダーゼ酵素相補性レポーター系である（すなわち、レポーターサブユニットがβ−ガラクトシダーゼフラグメントであり、フラグメントがその対応する野生型β−ガラクトシダーゼ分子中で見いだされるアミノ酸配列または対応する野生型β−ガラクトシダーゼ分子中で見いだされる配列の変異型である配列を有することができる）という実施形態に関してここにさらに記載する。
【００４８】
一定の実施形態では、使用される親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系は、２つまたはそれを超えるβ−ガラクトシダーゼフラグメントまたはその変異型から構成されるものである。例えば、一定の実施形態では、レポーター系は、β−ガラクトシダーゼの第１のフラグメントおよび第２のフラグメント（例えば、αフラグメントおよびωフラグメント）を含む。さらに他の実施形態では、レポーター系は、２つを超えるβ−ガラクトシダーゼフラグメント（第１、第２、および第３のβ−ガラクトシダーゼフラグメント（例えば、α、β、およびωフラグメント）など）を含むことができる。
【００４９】
一定の実施形態では、本方法の実施形態で使用される親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性シグナル生成系は、β−ガラクトシダーゼの第１のフラグメントおよび第２のフラグメント（すなわち、第１および第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメント）から構成される系であり、第１のフラグメントおよび第２のフラグメントは相互に対して親和性を有し、この親和性により、目的のポリペプチド−ポリペプチド相互作用が生じるかどうかに応じて異なるβ−ガラクトシダーゼ活性レベルで得られる。そのようなものとして、第１および第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは相互に対して親和性を有し、この親和性により、目的の相互作用の非存在下での公知の第１のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルおよび目的の相互作用の存在下での第２の異なるβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが得られる。この様式で、シグナル生成系の活性レベルの決定により、目的の相互作用が起こるかどうかを決定することができる。
【００５０】
第１および第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは、相互に対して低親和性を有するフラグメントであり、この低親和性は、上記で概説した異なる相互作用依存活性を得るのに十分である。シグナル生成系のフラグメントが相互に対して低親和性を有する場合、目的のポリペプチド相互作用の非存在下でフラグメントから構成される系から認められる活性レベル（以下の実施例の項で報告したアッセイを使用して決定する）は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７５）７２：１２５４−１２５７で報告されたβ−ガラクトシダーゼ相補性系との目的の相互作用の非存在下で認められる活性レベルより低い。
【００５１】
これらの実施形態の態様は、変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドである第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメント（酵素供与体またはαフラグメントとしても公知）の使用を含む。最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドは、ペプチドが野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端領域中で見いだされるアミノ酸配列（例えば、野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端の１０残基内（Ｎ末端の約５残基内など）から開始される配列）を有することを意味する。本実施例の第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが最小である場合、これらは、一定の実施形態では、約６０アミノ酸長以下（約５５アミノ酸長以下（約５０アミノ酸長以下（例えば、４９アミノ酸長以下、４８アミノ酸長以下など）が含まれる）など）である。
【００５２】
最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼペプチドが変異型である場合、これらは、対応する野生型β−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端ドメイン中の対応する配列と比較して、少なくとも１つの配列の変動を含む。配列の変動は、挿入、欠失、または置換（例えば、点変異の形態）であり得る。変異型は、１つの変動（例えば、挿入、欠失、点変異）または２つまたはそれを超える異なる変動（２つまたはそれを超える点変異など）を有することができる。一定の実施形態では、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは、第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼのアミノ酸残基３〜９２由来の完全配列を有するフラグメントの結合親和性（例えば、Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７５）２５０：２５８７−２５９２に記載）より低い（例えば、結合親和性は第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する野生型フラグメントより低い）第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントに対する結合親和性（以下により詳細に記載）を有する。
【００５３】
一定の実施形態では、系の第２のフラグメントとのβ−ガラクトシダーゼフラグメントの相補性に依存して、第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメント内に「包埋する」位置に存在するβ−ガラクトシダーゼフラグメントの領域内で任意の配列変動が起こる。一定の実施形態では、このドメインは、野生型配列のアミノ酸残基２９〜４１から見いだされた配列を含み、したがって、フラグメントは、この領域（例えば、アミノ酸残基２９〜４１（アミノ酸残基３１〜４１など））に変動を含む。例えば、変動が点変異である場合、変異型は、アミノ酸残基２９〜４１のいずれかに１つまたは複数の点変異を含むことができ、その結果、これらの１３アミノ酸残基の１つまたは複数を置換することができる（これらのアミノ酸残基の２つ以上、３つ以上、４つ以上などを置換することができる）。目的の特定のアミノ酸点変異には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｈ３１（例えば、Ｈ３１Ｒ）、Ｆ３４（例えば、Ｆ３４Ｙ）、Ｅ４１（例えば、Ｅ４１Ｑ）、およびＮ３９（例えば、Ｎ３９Ｑ、Ｎ３９Ｄ）。
【００５４】
例示的αペプチド配列には、以下が含まれる：
配列番号１（Ｈ３１Ｒ）
ＭＧＶＩＴＤＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＲＰＰＦＡＳＷＲＮＳＥＥＡＲＴＤＲＰＳＱＱＬ
配列番号２（Ｆ３４Ｙ）
ＭＧＶＩＴＤＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＣＡＡＨＰＰＹＡＳＷＲＮＳＥＥＡＲＴＤＲＰＳＱＱＬ
配列番号３（Ｅ４１Ｑ）
ＭＧＶＩＴＤＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＷＲＮＳＱＥＡＲＴＤＲＰＳＱＱＬ
配列番号４（Ｎ３９Ｄ）
ＭＧＶＩＴＤＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＷＲＤＳＥＥＡＲＴＤＲＰＳＱＱＬ
配列番号５（短縮）
ＭＧＶＩＴＤＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＷＲＤＳＥＥＡ。
【００５５】
第１のフラグメントが上記で概説した変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼフラグメントである実施形態では、第１のフラグメントを、上記で概説した１つまたは複数のさらなるフラグメントと併せて使用することができる。上記で概説した一定の実施形態では、レポーター系は、第１および第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントから構成される。第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは、第１のβ−ガラクトシダーゼフラグメントと相互作用して検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を得ることができる任意のフラグメントであり得る。第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは、全長β−ガラクトシダーゼ酵素の分子量に基づいて、全長β−ガラクトシダーゼ酵素の約６０％超、約８０超、または約９０％超に対応するβ−ガラクトシダーゼ酵素の主要部分を含むことができる。一定の実施形態では、第２のβ−ガラクトシダーゼフラグメントは、野生型大腸菌β−ガラクトシダーゼタンパク質のアミノ酸１１〜４１を欠く欠失変異体（例えば、Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７５）７２：１２５４−１２５７）であり、このフラグメントは、Ｍ１５受容体またはωフラグメントとして公知である。目的の他の特異的受容体（すなわち、ω−フラグメント）には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｍ１１２二量体（β−ガラクトシダーゼ内のアミノ酸２３〜３１の欠失）（Ｌｉｎ，Ｖｉｌｌａｒｅｊｏ  ａｎｄ  Ｚａｂｉｎ，１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．４０：２４９；Ｃｅｌｅｄａ  ａｎｄ  Ｚａｂｉｎ，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：４０４；Ｗｅｌｐｈｙ，Ｆｏｗｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｂｉｎ，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：６８０４；Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：１２５４）。１つの例示的ωペプチド配列を以下に示す（配列番号６）：
ＭＧＶＩＴＤＳＬＡＶＶＡＲＴＤＲＰＳＱＱＬＲＳＬＮＧＥＷＲＦＡＷＦＰＡＰＥＡＶＰＥＳＷＬＥＣＤＬＰＥＡＤＴＶＶＶＰＳＮＷＱＭＨＧＹＤＡＰＩＹＴＮＶＴＹＰＩＴＶＮＰＰＦＶＰＴＥＮＰＴＧＣＹＳＬＴＦＮＶＤＥＳＷＬＱＥＧＱＴＲＩＩＦＤＧＶＮＳＡＦＨＬＷＣＮＧＲＷＶＧＹＧＱＤＳＲＬＰＳＥＦＤＬＳＡＦＬＲＡＧＥＮＲＬＡＶＭＶＬＲＷＳＤＧＳＹＬＥＤＱＤＭＷＲＭＳＧＩＦＲＤＶＳＬＬＨＫＰＴＴＱＩＳＤＦＨＶＡＴＲＦＮＤＤＦＳＲＡＶＬＥＡＥＶＱＭＣＧＥＬＲＤＹＬＲＶＴＶＳＬＷＱＧＥＴＱＶＡＳＧＴＡＰＦＧＧＥＩＩＤＥＲＧＧＹＡＤＲＶＴＬＲＬＮＶＥＮＰＫＬＷＳＡＥＩＰＮＬＹＲＡＶＶＥＬＨＴＡＤＧＴＬＩＥＡＥＡＣＤＶＧＦＲＥＶＲＩＥＮＧＬＬＬＬＮＧＫＰＬＬＩＲＧＶＮＲＨＥＨＨＰＬＨＧＱＶＭＤＥＱＴＭＶＱＤＩＬＬＭＫＱＮＮＦＮＡＶＲＣＳＨＹＰＮＨＰＬＷＹＴＬＣＤＲＹＧＬＹＶＶＤＥＡＮＩＥＴＨＧＭＶＰＭＮＲＬＴＤＤＰＲＷＬＰＡＭＳＥＲＶＴＲＭＶＱＲＤＲＮＨＰＳＶＩＩＷＳＬＧＮＥＳＧＨＧＡＮＨＤＡＬＹＲＷＩＫＳＶＤＰＳＲＰＶＱＹＥＧＧＧＡＤＴＴＡＴＤＩＩＣＰＭＹＡＲＶＤＥＤＱＰＦＰＡＶＰＫＷＳＩＫＫＷＬＳＬＰＧＥＴＲＰＬＩＬＣＥＹＡＨＡＭＧＮＳＬＧＧＦＡＫＹＷＱＡＦＲＱＹＰＲＬＱＧＧＦＶＷＤＷＶＤＱＳＬＩＫＹＤＥＮＧＮＰＷＳＡＹＧＧＤＦＧＤＴＰＮＤＲＱＦＣＭＮＧＬＶＦＡＤＲＴＰＨＰＡＬＴＥＡＫＨＱＱＱＦＦＱＦＲＬＳＧＱＴＩＥＶＴＳＥＹＬＦＲＨＳＤＮＥＬＬＨＷＭＶＡＬＤＧＫＰＬＡＳＧＥＶＰＬＤＶＡＰＱＧＫＱＬＩＥＬＰＥＬＰＱＰＥＳＡＧＱＬＷＬＴＶＲＶＶＱＰＮＡＴＡＷＳＥＡＧＨＩＳＡＷＱＱＷＲＬＡＥＮＬＳＶＴＬＰＡＡＳＨＡＩＰＨＬＴＴＳＥＭＤＦＣＩＥＬＧＮＫＲＷＱＦＮＲＱＳＧＦＬＳＱＭＷＩＧＤＫＫＱＬＬＴＰＬＲＤＱＦＴＲＡＰＬＤＮＤＩＧＶＳＥＡＴＲＩＤＰＮＡＷＶＥＲＷＫＡＡＧＨＹＱＡＥＡＡＬＬＱＣＴＡＤＴＬＡＤＡＶＬＩＴＴＡＨＡＷＱＨＱＧＫＴＬＦＩＳＲＫＴＹＲＩＤＧＳＧＱＭＡＩＴＶＤＶＥＶＡＳＤＴＰＨＰＡＲＩＧＬＮＣＱＬＡＱＶＡＥＲＶＮＷＬＧＬＧＰＱＥＮＹＰＤＲＬＴＡＡＣＦＤＲＷＤＬＰＬＳＤＭＹＴＰＹＶＦＰＳＥＮＧＬＲＣＧＴＲＥＬＮＹＧＰＨＱＷＲＧＤＦＱＦＮＩＳＲＹＳＱＱＱＬＭＥＴＳＨＲＨＬＬＨＡＥＥＧＴＷＬＮＩＤＧＦＨＭＧＩＧＧＤＤＳＷＳＰＳＶＳＡＥＦＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫ。
【００５６】
本発明の態様は、分子相互作用（すなわち、２つまたはそれを超える分子間の相互作用（これらの分子を、本明細書中で、結合部分または推定結合部分と呼ぶ）の間の相互作用）を検出するための上記の親和性が減少したレポーター系の使用を含む。２つまたはそれを超える結合部分の間の分子相互作用を検出するためのレポーター系の使用では、一定の実施形態では、レポーター系の異なるメンバーと安定に会合した目的の異なる各結合部分を含む細胞を提供する。言い換えれば、目的の各結合部分がレポーター系の異なるサブユニットと安定に会合した細胞を提供する。例えば、系を使用して第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する場合、第１のタンパク質が第１のレポーターサブユニット（例えば、上記の変異最小Ｎ末端β−ガラクトシダーゼフラグメント）と安定に会合する一方で、第２のタンパク質が第２のレポーターサブユニット（例えば、上記のＭ１５ωフラグメント）と安定に会合する細胞を提供する。
【００５７】
「安定に会合された」は、レポーターサブユニットおよび分子的実体が、以下にさらに例示のこれらが使用されるアッセイ条件下で相互に解離しないように共有結合またはその他（例えば、十分に親和性の高い相互作用）によって相互に結合することを意味する。
【００５８】
多数の異なる結合部分を、本発明を使用して、相互の結合親和性についてアッセイすることができ、結合部分には、結合相互作用が可能な任意の分子が含まれる。２つまたはそれを超える結合部分の間の結合相互作用は、直接または１つまたは複数のさらなる結合種（荷電イオンまたは分子、リガンドまたは高分子など）との複合体の形態であり得る。
【００５９】
レポーターサブユニットと安定に会合する（すなわち、結合する）結合部分は、レポーターサブユニットに連結することができる場合、任意の範囲の異なる分子（炭水化物、脂質、タンパク質、および核酸が含まれる）ならびにその一部、ポリマー、およびアナログであり得る。一定の実施形態では、目的の結合部分は細胞内部分であり、その結果、検出される結合相互作用は、例えば、非空間的制限様式で起こる細胞内相互作用である。さらに他の実施形態では、目的の結合部分は原形質膜部分であり、その結果、検出される結合相互作用は、空間的に制限された（例えば、二次元）様式で原形質膜部位で起こる結合相互作用である。
【００６０】
例示的タンパク質には、シグナル伝達カスケードのメンバー、アポトーシスを調節するタンパク質、細胞周期の進行または腫瘍発達を調節するタンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、細胞相互作用に影響を及ぼすタンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、リガンド−受容体対、他のタンパク質の折り畳みに関与するタンパク質、特定の細胞内区画（ゴルジ装置、小胞体、リボゾーム、クロロプラスト、およびミトコンドリアなど）へのターゲティングに関与するタンパク質が含まれる。他の例示的タンパク質には、タンパク質ホルモンおよびサイトカインが含まれる。サイトカインには、シグナル伝達に関与するサイトカイン（インターフェロン、ケモカイン、および造血成長因子など）が含まれる。他の例示的タンパク質には、インターロイキン、リンホトキシン、トランスフォーミング成長因子−αおよびβ、ならびにマクロファージおよび顆粒球コロニー刺激因子が含まれる。他のタンパク質には、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、およびシンターゼなどの細胞内酵素が含まれる。アポトーシスに関与する例示的タンパク質には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆａｓリガンド、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）プロテアーゼ、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が含まれる。細胞周期に関与するタンパク質には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、増殖性細胞核抗原、テロメラーゼ、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、腫瘍抑制因子、およびホスファターゼが含まれる。転写および翻訳に関与するタンパク質には、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ、転写因子、エンハンサー結合タンパク質、リボゾームタンパク質が含まれる。細胞−細胞シグナル伝達などの細胞相互作用に関与するタンパク質には、受容体タンパク質、ペプチドホルモン、またはその増強模倣物または阻害模倣物が含まれる。
【００６１】
分子の結合は、ｐＨ、イオン強度、アッセイの成分濃度、および温度などの溶液における要因に依存するであろう。本明細書中に記載のレポーター系を使用した結合アッセイでは、結合部分の結合親和性は、レポーターサブユニット間に相補性を持たせるのに十分に高くなるべきである。アッセイ溶液（緩衝系または細胞内部など）中の結合部分の解離定数の非限定的な例には、特定のアッセイ系の性質に応じて、約１０−８Ｍ未満（例えば、約１０−９Ｍ未満）または、任意選択的に、約１０−９〜１０−１２Ｍである。
【００６２】
上記のように、レポーターサブユニットおよび結合メンバーは、安定に会合する。一定の実施形態では、レポーターサブユニットおよび１つまたは複数の結合部分は、直接またはリンカーを介して共に結合し、この結合は、共有結合であってもそうでなくても良い。例えば、以下により詳細に概説のように、レポーターサブユニットおよび結合部分がタンパク質である場合、これらを、例えば、融合タンパク質として核酸配列から発現したペプチドの結合について当該分野で公知の方法によって結合することができる。
【００６３】
任意の従来のプロトコールを使用して、本発明の方法で使用される所与の細胞を提供することができる。例えば、多数の異なるプロトコール（例えば、微量注入、エレクトロポレーション、または種々の大量負荷技術（ｂｕｌｋ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ））または異なるエレメント（例えば、融合タンパク質の形態）をコードする核酸の細胞への供給を使用して、異なる結合メンバーとレポーターサブユニットとの抱合体を細胞に導入することができる。
【００６４】
一定の実施形態では、レポーターサブユニットおよび結合部分は、レポーターサブユニット（例えば、上記概説の変異最小Ｎ末端βガラクトシダーゼペプチドまたはωペプチド）を含む融合タンパク質を作り上げることができる。したがって、融合タンパク質を、コード核酸から細胞内に発現することができる。この系は、レポーターサブユニットの酵素相補性に基づいて哺乳動物細胞などの細胞中のタンパク質−タンパク質相互作用の検出および定量が可能であるので、一定の実施形態で有利である。例えば、２つの相補レポーターサブユニットの１つおよび目的の「試験」タンパク質を含むキメラ融合タンパク質を細胞内に産生する実施形態では、目的の２つのキメラタンパク質間の相互作用に起因する検出された活性は、レポーターサブユニット（例えば、非酵素）タンパク質成分の相互作用の強度に比例するであろう。したがって、相互作用は、目的の試験タンパク質によって駆動され、相補レポーターサブユニットによって駆動されない。酵素活性は、相互作用の指標として役立つ。本系の別の利点は、結合を検出するのに低レベルの試験タンパク質発現しか必要ないことである。
【００６５】
一定の実施形態では、融合遺伝子構築物を構築し、細胞に形質導入して、第１の（例えば、低い）発現レベルが得られ、ここで、この低発現レベルは、レポーターサブユニットの非結合部分媒介性可逆的会合の結果である。次いで、系により、内因性競合タンパク質パートナーの存在下での所与の細胞中の相互作用をモニタリングすることが可能であり、ここで、融合タンパク質は、結合／会合反応のための「トレーサー」としての機能を果たすであろう。かかる系は、導入タンパク質の過剰発現から人為産物を生じる傾向はない。融合遺伝子構築物の発現を、適切なプロモーター、リボゾーム結合部位、および他の調節エレメントの選択によって減少させることができる。例えば、融合遺伝子構築物を、ベクターに導入することができる。ベクター中の融合遺伝子構築物はその翻訳が脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）によって調節される抗生物質耐性遺伝子の上流に存在し、このベクターは融合遺伝子の翻訳開始を担うＡＴＧ配列の上流のスプライスドナー／アクセプター配列が変異している。この構築物型により、バイシストロン性メッセージ中の第１のコード配列の翻訳効率が低くなるが、第２の（抗生物質耐性）配列の翻訳には影響を及ぼさず、ＩＲＥＳのみに依存する。これらの発現レベルの減少の結果として、濃度に依存するレポーターサブユニットの自発的相互作用の頻度は有意に減少するであろう。
【００６６】
本発明の態様は、本発明の推定結合部分とレポーターサブユニットとの間の融合タンパク質を含む。推定結合部分は、第２の分子に結合する能力が試験される任意のタンパク質または他の分子を含むことができる。レポーターサブユニットは、単量体サブユニットが不活性であるが、２つまたはそれを超える同一または異なる単量体の会合によって活性（例えば、活性によって検出可能なシグナルが得られる）が回復する任意の分子であり得る。
【００６７】
本発明の実施形態の融合タンパク質には、２つまたはそれを超える個別のタンパク質の全配列または部分配列を含むアミノ酸の単一の連続する線状ポリマーが含まれる。２つまたはそれを超えるアミノ酸配列を、例えば、架橋剤の媒介によって化学的結合することができる。一定の実施形態では、融合タンパク質を、細胞中の融合遺伝子構築物の発現によって生成する。融合遺伝子構築物には、同一の非妨害読み取り枠中の２つまたはそれを超える個別のタンパク質の全配列または部分配列をコードするヌクレオチドの単一の連続する線状ポリマーが含まれる。融合遺伝子構築物はまた、真核細胞および／または原核細胞で活性な複製起点ならびに、例えば、薬物耐性をコードする１つまたは複数の選択マーカーを含むことができる。これらはまた、ウイルスパッケージングシグナルならびに転写および／または翻訳調節配列およびＲＮＡプロセシングシグナルを含むことができる。
【００６８】
一定の実施形態では、本発明の融合遺伝子構築物を細胞に導入して、融合遺伝子構築物によってコードされる推定結合部分の間の結合についてアッセイする。融合遺伝子構築物はまた、通常は推定結合部分をコードする遺伝子と会合するプロモーターならびに他の転写および／または翻訳調節配列を含むことができる。融合遺伝子構築物を、当該分野で公知の任意の核酸導入方法（ウイルスベクター、形質転換、供沈、エレクトロポレーション、中性またはカチオン性リポソーム媒介導入、微量注入、または遺伝子銃が含まれるが、これらに限定されない）によって細胞に導入することができる。目的のウイルスベクターには、以下が含まれるが、これらに限定されない：レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス。一定の実施形態では、宿主細胞のゲノムに安定に組み込むことができるレトロウイルスベクターを使用する。例えば、組み込みおよびパッケージングシグナル、薬物耐性マーカー、および１つまたは複数の目的の融合遺伝子をコードするレトロウイルス構築物は、本発明の実施形態の実施に有用である。
【００６９】
固有の融合タンパク質をコードする異なる融合遺伝子構築物は、個別の核酸分子または同一の核酸分子上に存在し得る。一定の実施形態では、細胞による１つの核酸種のみの取り込みが細胞への両推定結合パートナーをコードする配列の導入に十分であるように同一のベクターを使用する。導入順序に関して、コード配列が異なるベクター上存在する実施形態では、ベクターを、細胞に同時または連続的に導入することができる。
【００７０】
本発明の融合遺伝子構築物または融合タンパク質を、培養細胞に導入するか、動物細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するか、動物細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するか、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するのに望ましい任意の他の細胞型に導入することができる。そのようなものとして、本発明での実施に使用される細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれる。例示的な真核細胞には、哺乳動物細胞（例えば、マウス、ネコ、イヌ、ヒトなど）、酵母細胞、寄生虫細胞などが含まれる。一定の実施形態では、細胞は、特定の表現型を有する哺乳動物細胞（初代の正常細胞、新生物細胞、または癌細胞、および株化細胞系（例えば、不死化腫瘍細胞株）が含まれる）である。
【００７１】
それぞれがレポーター系の異なるサブユニットでタグ化（例えば、標識）された目的の異なる結合メンバーを含む細胞を準備したのち、細胞を、レポーター系の活性について評価する。この評価工程の結果により、目的の結合相互作用が起こったかどうかについての情報が得られる。一定の実施形態では、評価は、活性を検出し、次いで、認められた活性を基準値またはコントロール値（例えば、事前に決定されたバックグラウンド活性値（親和性が減少したレポーター系の異なるサブユニットの可逆的相互作用の結果として唯一認められるβ−ガラクトシダーゼ活性レベル（例えば、事前に決定された公知のバックグラウンドレベル）など））と比較することを含む。以下により詳細に明らかにするように、評価は、所与のアッセイプロトコールに必要であり得る場合、所与の観察期間（例えば、細胞と試験因子との接触の前後）に２回またはそれを超えて活性を観察することを含むことができる。以下により詳細に明らかにするように、この評価工程は、系の酵素に適切な基質を提供することおよび系から検出可能な産物の酵素媒介産生を検出することを含むことができる。
【００７２】
本明細書中に開示のレポーター系を使用して、検出可能なシグナルを生成するレポーターサブユニット間の相補性によってレポーターサブユニットに結合した推定結合部分の結合相互作用をアッセイすることができる。推定結合部分間の直接結合相互作用についての試験に加えて、１つまたは複数のさらなる分子またはイオンに依存する相互作用を評価することができる。さらに、生きた動物細胞における多分子相互作用ならびにこれらの相互作用に及ぼす種々の薬物、ペプチド、および医薬品の影響を評価することができる。
【００７３】
１つの実施形態では、１つまたは複数の推定結合部分の結合親和性を、第１のレポーターサブユニットに結合した部分の１つを有する１つの成分および第２のレポーターサブユニットに結合した１つの他の推定結合部分を含む少なくとも１つの他の成分を含むレポーター系を提供することによって測定することができる。結合部分は、異なっていても同一でも良い。この系では、レポーターサブユニットは、これらが相互に近接する場合に限り、例えば、１つまたは複数の推定結合部分の結合によって検出可能なシグナルに結合してこれを生成することができる。このシグナルを、例えば、（例えば、適切なコントロールアッセイで得られた）コントロール値とのシグナルの比較によって直接または間接的に検出および定量することができる。
【００７４】
本発明の１つの態様では、タンパク質−タンパク質相互作用を、検出および定量することができる。相補レポーターサブユニットによって生成されたシグナルは、直接または第３の物質を介して間接的に推定結合部分間の結合の指標として役立ち得る。検出することができるシグナルには、光の放射および吸収が含まれる。例示的シグナルには、発色シグナル、蛍光シグナル、および発光シグナルが含まれる。これらのシグナルを、目視または分光光度計、蛍光光度計、顕微鏡、シンチレーションカウンター、もしくは当該分野で公知の他の装置を使用して検出および定量することができる。
【００７５】
本明細書中に開示のレポーター系成分の結合は、ｐＨ、イオン強度、アッセイの成分濃度、および温度などの溶液における要因に依存するであろう。アッセイ溶液を、特定の系のためにデザインし、構築することができる。本明細書中に開示のレポーター系を使用して、溶液（無細胞緩衝液、細胞内部、細胞溶液、細胞溶解物溶液、細胞画分（核画分、細胞質画分、ミトコンドリア画分、および膜画分など）の溶液など）中でアッセイを行うことができる。当該分野で公知のアッセイ溶液（酵素アッセイ溶液など）、細胞抽出物、および細胞懸濁液の調製方法を使用することができる。例えば、リン酸緩衝化生理食塩水などの生理学的に適合する緩衝液を使用することができる。例えば、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００７６】
１つの実施形態では、レポーターサブユニットは、相補して、基質を直接または間接的に検出可能な産物に変換を触媒することができる酵素活性複合体を形成することができる。１つの実施形態では、レポーター系は、それぞれ融合タンパク質である２つまたはそれを超える成分を含むことができる。この融合タンパク質は、それぞれ、低親和性レポーターサブユニットに融合した推定結合タンパク質を含む。したがって、融合タンパク質をコードする核酸を構築し、細胞に導入し、細胞中で発現することができる。あるいは、結合したレポーター単位または結合した結合部分を、結合した複合体への標識した特異的結合部分（抗体など）の結合の検出によって検出することができる。
【００７７】
１つの実施形態では、上記で概説するように、低親和性レポーターサブユニットは、β−ｇａｌの相補サブユニットであり得る。系は、３つまたはそれを超えるレポーターサブユニット（これらの全てが検出可能なシグナルを生成するために会合することが必要である）を含むことができる。当該分野で開発された活性なβ−ｇａｌの反応生成物の検出方法を使用することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼ活性を、一定範囲の方法（生細胞フローサイトメトリーおよび発色性基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）での組織化学的染色が含まれる）によって測定することができる。Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８５：２６０３−２６０７（１９８８）；およびＬｏｊｄａ，Ｚ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，（１９７９）。β−ｇａｌの組織化学的染色を、細胞の固定およびその後のＸ−ｇａｌへの曝露によって行うことができる。
【００７８】
Ｍｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１２４２３−１２４２７（１９９６）に記載のように、β−ｇａｌ活性についてのアッセイを使用することができる。１つの実施形態では、細胞内分析を、細胞の固定およびインジゴ生成基質Ｘ−ｇａｌでの染色によって行うことができる。固定細胞を、Ｘ−ｇａｌまたは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（５−６−Ｘ−Ｇａｌ）のいずれかと組み合わせたアゾ色素を使用した蛍光組織化学によるβ−ｇａｌ活性についてのアッセイによって分析することもできる。目的の組み合わせは、アゾ色素であるレッドバイオレットＬＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）およびＦｌｕｏｒ−Ｘ−ｇａｌと呼ばれる５−６−Ｘ−Ｇａｌである。この組み合わせのために、ローダミン／テキサスレッドフィルターセットを使用した蛍光顕微鏡によって蛍光顕微鏡写真を得ることができる。これらの基質の使用によって、２つまたはそれを超える他の蛍光シグナルと同時にβ−ｇａｌ依存性蛍光を視覚化することが可能である。
【００７９】
生細胞で使用することができるβ−ｇａｌの重要な基質も本発明に含まれる。例えば、重要な蛍光発生基質であるレゾルフィンβ−ガラクトシドビス−アミノプロピルポリエチレングリコール１９００（ＲＧＰＥＧ）が記載されている。Ｍｉｎｄｅｎ（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（１）：１２２−１２９。この化合物を、微量注入、エレクトロポレーション、または種々の大量負荷技術によって細胞に送達させることができる。一旦細胞内に入ると、基質は、原形質膜またギャップ結合によって脱出することができない。本発明の実施で使用することができる別の重要な基質は、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）であり、これは、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）およびフローサイトメトリーによる分析に特に十分にふさわしい。Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２６０３−２６０７およびＲｏｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５０：１−６。
【００８０】
化学発光活性を使用して、β−ｇａｌを検出することもできる。例えば、β−ｇａｌ融合物を含む細胞を、Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓアッセイキット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｍａｓｓ．）由来のＧａｌａｃｔｏｎ  Ｐｌｕｓ基質を含む緩衝液の混合物中に溶解する。Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，４：９９−１１１（１９８９）。光放放射促進溶液の添加後、照度計またはシンチレーションカウンターで発光を測定する。
【００８１】
分光学的分析または蛍光分析に適切な代表的基質には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；２’−Ｎ−（ヘキサデカノール）−Ｎ−（アミノ−４’−ニトロフェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）−ＡＳ−Ｂ１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；１−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド一水和物；Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ｍ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；およびフェニル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシレドセ（ｇａｌａｃｔｏｐｙｎａｎｏｓｉｒｅｄｓｅ）、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、Ω−ニトロスチリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、およびフルオレセイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。例えば、米国特許第５，４４４，１６１号を参照のこと。
【００８２】
β−ｇａｌ以外のレポーター系も、本発明の実施で使用することができる。例えば、酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をレポーターとして使用することができ、発色性および蛍光発生ＧＵＳ基質が開発されている。ＧＵＳ基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）を、以下に示すように、発色および蛍光発生の両方で使用することができる。１つの発色性染色方法では、固定細胞を、ＰＢＳで洗浄し、２ｍＭ  Ｘ−ｇｌｕｃ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｏｒｅｇ．）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．５ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４で染色する。蛍光発生染色を、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グルクロン酸（５，６  Ｘ−ｇｌｕｃ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）とＦａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）との組み合わせの使用によって行うことができる。固定細胞を、ＰＢＳでリンスし、５０μｇ／ｍｌ  ５，６Ｘ−ｇｌｕｃおよび１００μｇ／ｍｌ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢで染色し、ＰＢＳでリンスした。蛍光を、ローダミン蛍光の検出のために調整した蛍光顕微鏡によって検出する。本発明の１つの実施形態では、レポーターサブユニットは、酵素および酵素のインヒビターを含む。これらの実施形態では、インヒビターは、この酵素に対する親和性が低い。この場合、推定結合部分の間の会合を、酵素活性の阻害によって証明する。例示的酵素には、β−ｇａｌ、ＧＵＳ、β−ラクタマーゼなどが含まれる。
【００８３】
本明細書中に開示の方法は、細胞溶解物およびインタクトな細胞における結合事象を検出および定量することができる。したがって、完全に折り畳まれたタンパク質の間の相互作用を検出可能であり、結合部分の同時翻訳発現は、結合の検出に必要ない。
【００８４】
本発明の実施では、反応生成物を、例えば、免疫学的技術（免疫蛍光標識など）によって間接的に検出することができる。
【００８５】
タンパク質−タンパク質相互作用を、１つまたは複数の融合タンパク質を含むレポーター系で測定することができる。融合タンパク質は、それぞれ、低親和性レポーターサブユニットにカップリングした推定結合タンパク質を含む。融合タンパク質の細胞内発現のために、融合タンパク質をコードする配列を含む１つまたは複数の融合遺伝子構築物を調製する。融合遺伝子構築物を、当該分野で利用可能な方法（ウイルスベクター、形質転換、供沈、エレクトロポレーション、中性またはカチオン性リポソーム媒介導入、微量注入、または遺伝子銃が含まれるが、これらに限定されない）によって細胞に導入することができる。
【００８６】
融合遺伝子構築物を含む細胞を使用して、種々の細胞ベースのアッセイを行うことができる。細胞中で発現した融合タンパク質上の推定結合部分の結合を、結合メンバーによって媒介された相補性を受けたレポーターサブユニットによって生成されたシグナルの検出によって確認することができる。したがって、例えば、レポーターサブユニットが相補β−ｇａｌサブユニットである場合、β−ｇａｌ活性を示す細胞は、これらの細胞内の推定結合部分間の結合を示す。
【００８７】
融合遺伝子構築物はまた、通常は推定結合部分をコードする遺伝子と会合するプロモーターおよび他の転写および／または翻訳調節配列を含むことができる。これにより、試験タンパク質が過剰発現する系と対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏで推定結合タンパク質の生理学的に関連するレベルを研究することが可能である。さらに、これにより、長期間にわたって結合活性レベルの天然に存在する変化を研究することが可能であり、結合相互作用に及ぼす内因性または外因性物質の影響を明らかにすることができる。
【００８８】
例えば、スクリーニングアッセイ（高処理スクリーニングアッセイが含まれる）において、本発明の方法および組成物を使用して、２つの推定結合パートナー間の相互作用に影響を及ぼす他の分子を研究することもできる。タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、イオン、小分子、合成化合物、または他の物質（細胞に対して内因性であるか、外因的に添加）は、結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる。例えば、特定の試験タンパク質対に相当する２つまたはそれを超える融合物を含む細胞によって生成されたβ−ｇａｌ活性に及ぼすかかる分子の影響の測定により、かかる分子のアゴニストまたはアンタゴニストの活性を決定することができる。本発明の方法および組成物の使用により、高処理アッセイを実施して、特定の結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストについて試験を行うことができる。かかる高処理アッセイは、医学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用に影響を及ぼす薬物のスクリーニングで有益であろう。
【００８９】
本明細書中で使用される推定結合パートナー（すなわち、推定結合部分）は、通常は相互作用しないが、それぞれ第３の分子と相互作用し、その結果、第３の分子の存在下で推定結合パートナーが１つになる分子を含むことができる。したがって、推定結合パートナー間の相互作用に影響を及ぼす物質には、推定結合パートナー間の弱い相互作用を刺激する物質および通常は相互作用しない分子間の相互作用を媒介する１つまたは複数の分子が含まれる。さらに、推定結合パートナー間の相互作用に影響を及ぼす物質には、上流領域に直接または間接的に影響を及ぼし、それにより、推定結合パートナー間で会合する物質が含まれ得る。例えば、推定結合パートナーのリン酸化によって別の推定結合パートナーと会合する能力が付与される場合、推定結合パートナーの相互作用に影響を及ぼす物質には、キナーゼ活性に直接または間接的に影響を及ぼす物質が含まれる。
【００９０】
本明細書中に開示のように、薬物（解熱薬および抗炎症薬、鎮痛薬、抗関節炎薬、鎮痙薬、抗鬱薬、抗精神病薬、精神安定薬、抗不安薬、麻酔性アンタゴニスト、抗パーキンソン病薬、コリン作動性アンタゴニスト、化学療法薬、免疫抑制薬、抗ウイルス薬、寄生虫駆除薬、食欲減衰薬、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗片頭痛薬、冠拡張薬、脳血管拡張薬、末梢血管拡張薬、ホルモン剤、避妊薬、抗血栓薬、利尿薬、血圧降下薬、心臓脈管薬、オピオイド、およびビタミンなど）を含む種々の組成物の分子内相互作用に及ぼす影響を試験するためのアッセイを開発することができる。
【００９１】
第３の分子によって媒介されたタンパク質−タンパク質相互作用を、検出および定量することができる。結合反応速度も研究することができる。例えば、結合反応速度を、第１および第２の結合メンバーと第１および第２のレポーターサブユニットとの融合物を発現する細胞の培養物への結合メディエーターの添加後の異なる時間でのβ−ｇａｌ活性の測定によって決定することができる。用量−応答曲線も得ることができ、この曲線は、β−ｇａｌ活性によって測定される結合範囲を結合メディエーター濃度の関数として決定する。このアッセイを、タンパク質成分がその融合パートナーに影響を及ぼす可能性を制御するように適応し、それにより、定量的様式でタンパク質−タンパク質相互作用を研究することができる。例えば、レポーターサブユニット、結合タンパク質、および目的のタンパク質を含む三成分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）融合構築物が得られる。目的の試験タンパク質を含む融合物および異なる潜在的相互作用パートナーを含む融合物の簡潔な同時発現によって得られたβ−ｇａｌ活性の絶対値を決定する。類似のサンプルでは、一定量の試験タンパク質での相補性の誘導の際にβ−ｇａｌ活性を測定する。試験タンパク質の非存在下および存在下で得られたβ−ｇａｌ活性の比は、異なるタンパク質対が相互作用する相対的能力を示す。三成分融合系のさらなる利点は、第１および第２の結合メンバー成分の存在によってβ−ｇａｌ変異体と試験タンパク質との間に可動性ヒンジドメインが得られることである。これにより、β−ｇａｌ成分と試験タンパク質との間が妨害される可能性が減少する。さらに、これにより、より有効なウイルスベクターに再クローニングする必要のない様式で、β−ｇａｌ成分の機能的完全性を直接試験することが可能である。
【００９２】
β−ｇａｌ融合タンパク質の発現レベルを定量できるコントロールを使用して、レポーター系をデザインすることもできる。これにより、２つの（またはそれを超える）融合タンパク質の潜在的な差分配列を制御することができるようになるであろう。例えば、十分に特徴づけられたモノクローナル抗体が利用可能なペプチドタグは、各β−ｇａｌ変異体のＣ末端でインフレームに融合することができる。異なるタグ（ｆｌａｇ、ＨＡ、およびｍｙｃなど）を異なるサブユニットのために使用して、同一細胞で同時発現した場合に２つの変異体を差分検出することができる。これらの細胞の溶解物中のβ−ｇａｌ活性の決定と並行して、ＥＬＩＳＡアッセイは、サンプル溶解物中の正確な各β−ｇａｌ融合タンパク質量を決定することができる。第１に、ポリクローナル抗β−ｇａｌ抗血清を使用して、抗原を固定することができる。次いで、モノクローナル抗体を適切なタグに指向させ、その後、酵素結合抗マウス二次抗体を使用して、目的のβ−ｇａｌ融合タンパク質量を定量することができる。十分に特徴づけられた技術を使用するかかるアプローチにより、各融合タンパク質の発現レベルを決定することができるはずである。結合したタグがタンパク質の結合またはレポーターサブユニットが相補する能力を損なうことがない場合、この修飾は有用であろう。
【００９３】
有用性
本発明の実施形態を、生細胞中で定量的または定性的に行うべき多タンパク質および他の多分子相互作用型の広範な研究で使用することができる。以下では、本発明の方法の異なる適用の非限定的な例を示す。
【００９４】
本発明の方法を使用して、所与の標的タンパク質の新規の結合パートナーをスクリーニングすることができる。この実施形態では、第１のレポーターサブユニットに結合した標的タンパク質は、十分に特徴づけられた細胞株中で安定に発現する。第２のレポーターサブユニットに融合したｃＤＮＡを含む発現ライブラリーを、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９１４６−９１５０（１９９５））または当該分野で公知の任意の他の遺伝子導入手段を使用して、これらの細胞に導入する。標的タンパク質と相互作用する遺伝子産物を発現するベクターを、ポジティブクローン（すなわち、第１および第２のレポーターサブユニットの相補性に起因する活性を有するクローン）の同定によって単離する。この系の利点は、内因性（および潜在的に競合する）タンパク質の細胞の環境と無関係に、任意の細胞型中でスクリーニングを行うことができる点である。一定の実施形態では、特定の位置に制限された相互作用に関与するタンパク質を同定する目的で、標的タンパク質を特定の細胞区画に局在させる。蛍光標示式細胞分取技術の使用は、本発明のこの実施形態に特に十分に適合する。例えば、標的タンパク質と相互作用する遺伝子産物を発現するｃＤＮＡを含むβ−ｇａｌ陽性細胞は、かかる細胞を細胞分取技術によって精製することが可能なシグナルを生成するであろう。かかるｃＤＮＡを、例えば、感染効率の高い複雑性の高いｃＤＮＡライブラリーを導入可能なレトロウイルスベクターを使用して送達させることができる。
【００９５】
本発明のアッセイおよび方法を、細胞外シグナル伝達分子、成長因子もしくは異なる因子、ペプチド、または薬物もしくは合成アナログなどの存在下で行うこともできる。その存在または影響により、特定の細胞型中の２つまたはそれを超える所与のタンパク質間で相互作用する可能性を変化させることができる。
【００９６】
本発明の方法および組成物を使用した分子相互作用の検出は、核内で生じる分子相互作用に制限されず、細胞内相互作用にも制限されない。例えば、表面受容体に関与する相互作用を、本発明の実施で検出することができる。１つの実施形態では、本発明は、生細胞中の表面受容体のリガンド誘導二量体化を検出するための新規の技術を提供する。細胞表面受容体の二量体化または高次オリゴマー化は、しばしば、受容体活性化および次のシグナル伝達の必須条件である。本発明の実施は、２つの異なる分子間の相互作用の検出に制限されない。本発明の方法および組成物を使用して、分子の多量体化も検出することができる。
【００９７】
一定の実施形態では、本発明の方法をレトロウイルス中で高力価で高複雑性のｃＤＮＡライブラリーと共に使用して、哺乳動物細胞中の特定の試験タンパク質の相互作用パートナーを同定する（例えば、タンパク質レベルで機能的ゲノミクスを行う）。この適用のために、例えば、第１のレトロウイルスベクター中に存在する場合にｃＤＮＡコード配列が第１のレポーターサブユニットをコードする配列に融合するｃＤＮＡライブラリーのレトロウイルスベクター中での構築を使用するであろう。第２の一連のレトロウイルスベクターでは、第２のレポーターサブユニットを、目的のタンパク質に結合する能力について試験される種々の異なるタンパク質に融合するであろう。第１のレトロウイルスベクターおよび一連の第２のレトロウイルスベクターの１つとの細胞の同時感染によって試験を行うであろう。目的のタンパク質に結合することができる試験タンパク質により、目的のタンパク質と同時発現する細胞中のレポーターシグナルを検出可能であろう。この適用は、医学的に関連するタンパク質相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングにも有用である。
【００９８】
本発明の１つの実施形態では、一連の第２のベクターの１つによってコードされるタンパク質が第１のベクターによってコードされる目的の結合タンパク質と相互作用することができる細胞を検出し、フローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって検出および単離する。フローサイトメトリー法およびＦＡＣＳ法は、当該分野で周知である。例えば、Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２６０３−２６０７；Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７４：２５２−２６５（１９８８）；およびＰａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（ｅｄｓ．Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．＆  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．２９．１−２９．２１。このような方法で、結合が起こる細胞のクローンを、さらなる研究のため単離および増殖することができる。この態様は、発達機構の研究に特に適切であり、特定の発達に関連する相互作用が起こった細胞集団を選択し、この細胞集団のさらなる発達を研究することが可能であると同時に、比較のために相互作用が起こらなかった細胞をさらに研究することが可能である。類似の様式では、本発明の実施により、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、ＤＮＡ複製タンパク質、ｍＲＮＡスプライシングタンパク質、シグナル伝達に関与するタンパク質、細胞−細胞接着および細胞−基質接着（例えば、細胞移動、軸索ガイダンス、および血管形成）に関与するタンパク質、癌遺伝子産物、腫瘍抑制因子、細胞周期の制御に関与するタンパク質、ウイルスタンパク質（ウイルス複製の調節、ウイルス−宿主相互作用、およびウイルスアセンブリの調節に関与するウイルスタンパク質など）、サブユニット、架橋剤、修飾剤、または細胞骨格内の分子モーターであるタンパク質などのタンパク質に関与する相互作用を示す細胞の単離および／またはさらなる開発のための研究を可能にする。
【００９９】
その遺伝子がレポーターサブユニットに融合することができる所与の標的タンパク質のために、本発明の組成物および方法使用によって、相互作用する公知およびこれまで未知であったタンパク質または他の内因性もしくは外因性物質を同定することが可能である。同様の様式で、核酸配列データベースから得ることができる配列などの未知の機能のタンパク質をコードする配列（またはｃＤＮＡライブラリーなどの複数の配列）について、本発明の実施により、コードされたタンパク質が相互作用する分子を同定することが可能である。相互作用分子の同定により、未知のタンパク質の構造および／または機能に関連する情報が得られる。そのようなものとして、本発明の実施形態は、新規に発見されたタンパク質およびタンパク質コード核酸配列の同定および特徴づけに役立つ。
【０１００】
本発明の別の態様では、第１のレポーターサブユニットに融合した一方のｃＤＮＡライブラリーのコード産物を発現する第１の構築物組および第２のレポーターサブユニットに融合した第２の（同一の）ｃＤＮＡライブラリーのコード産物を発現する第２の構築物組の生成によってタンパク質−タンパク質相互作用を同定するためのショットガンアプローチを行うことができる。２つの構築物組の同時発現および相補が起こる細胞の選択により、クローンの単離および相互作用パートナーをコードするｃＤＮＡの同定が可能である。相互作用パートナーの一方または両方が公知であり得る。あるいは、相互作用パートナーの両方がこれまで同定されていなかったタンパク質を示すことができる。両パートナーが公知である場合、その結合特異性に関する新規の情報を得ることができる。一方のパートナーが公知である場合、未知の結合パートナーの機能に関する情報を得ることができる。いずれも知られていない場合、これらが相互作用する所見により、相互作用対の一方または両方の最終的な同定を補助することができる。
【０１０１】
本発明を、特定の分子のホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化または多量体化のいずれかを調節する機構の研究（かかる二量体化／多量体化に影響を及ぼし得る合成または天然に存在する化合物を同定するための高効率スクリーニングが含まれる）に適用することができる。
【０１０２】
本発明を、中枢神経系疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病など）で見いだされる異常または病原性のタンパク質凝集体の研究に適用することができる。これらの研究を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系で行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、多数の細胞型（培養神経細胞（例えば、哺乳動物、昆虫、線虫など）から目的のタンパク質凝集体を発現するように操作された非神経細胞までの範囲）を使用することができる。
【０１０３】
例えば、最近の研究では、神経変性疾患（パーキンソン病が含まれる）に関連するα−シヌクレインの誤折り畳みおよび凝集を研究するために酵母細胞を使用している（例えば、本明細書中で参考として援用されるＣｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：３２４−８を参照のこと）。上記の本発明の説明に関して、α−シヌクレインの２つの融合タンパク質（それぞれ対応するレポーターサブユニットを有する）を誘導発現する酵母作用を産生する。α−シヌクレイン凝集がこれらの細胞中で起こる場合（すなわち、両融合タンパク質が発現する場合）、レポーターサブユニットが相補して検出可能な活性を有する機能的酵素を生成するであろう。スクリーニングアッセイの実施では、両α−シヌクレイン融合タンパク質の発現を、１つまたは複数の候補薬剤の存在下または非存在下にて酵母細胞中で誘導する（薬剤を、α−シヌクレイン発現の誘導前、間、または後に添加することができる）。細胞中でα−シヌクレイン凝集を阻害、防止、および／または逆転する薬剤は、コントロール細胞と比較してレポーター遺伝子活性を減少させるであろう。この所望の活性を有する薬剤を、α−シヌクレイン凝集に起因する病態の治療薬としての安定性についてさらに評価する。
【０１０４】
上記のように、細胞中に病原性凝集体を形成する他のタンパク質（またはタンパク質の組み合わせ）は、上記スクリーニングアッセイの主題であり得る。これらのアッセイは、迅速であり、且つ高処理スクリーニング（ＨＴＳ）（例えば、高処理フローサイトメトリースクリーニング）に適用することができるので、治療薬のスクリーニングで非常に有用である。
【０１０５】
本発明は、細胞中の一過性または非安定性タンパク質／タンパク質相互作用の存在を決定するアッセイでも使用される。本発明はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中のタンパク質／タンパク質会合を読み出すことができるので、これらを使用して、標準的な細胞分画アッセイでは不可能である（すなわち、検出前のサンプルの処理中のタンパク質／タンパク質相互作用の破壊に起因する）不安定または一過性のタンパク質／タンパク質相互作用を検出することができる。
【０１０６】
例えば、本発明を使用して、種々の細胞型（酵母、昆虫、哺乳動物、植物などが含まれる）中の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、例えば、ＨＳＰ−９０）シャペロン複合体形成を研究することができる（例えば、Ｑｕｅｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：６１８；Ｃｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，２００５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：２１８５；およびＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ  １９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：３３６（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これらのアッセイでは、ＨＳＰ／レポーターサブユニット融合タンパク質および対応する標的タンパク質／レポーターサブユニット融合タンパク質を構築し、細胞中で発現する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは生物（例えば、トランスジェニック動物）中の細胞を、１つまたは複数の目的の条件（例えば、薬物／抗生物質処理、温度ストレス、酸化ストレス、栄養ストレス、サイトカイン／ホルモン／成長因子での処理など）に供し、ＨＳＰ融合タンパク質と標的融合タンパク質とのタンパク質／タンパク質相互作用をモニタリングする（すなわち、複合体の形成および溶解をモニタリングする）。レポーター融合ライブラリー（例えば、核酸ライブラリー）を特定の条件下でＨＳＰ関連メンバーの存在について試験するスクリーニングを設定することもできる。例えば、ＨＳＰ融合タンパク質およびライブラリー融合タンパク質を発現する（例えば、ライブラリー由来の核酸によってコードされるタンパク質を発現する）細胞を、薬物および／または特定の条件で処理し、ＨＳＰのライブラリータンパク質との会合／解離をアッセイすることができる。かかるアッセイは、どのようにしてタンパク質（野生型および変異形態の両方）の活性が個別の条件下で調節されるのかを決定する場合に使用する。
【０１０７】
本発明を、インタクトな細胞またはインタクトな動物内での特定の複合体の局在化に関する調査のために使用することができる。使用することができる細胞型は、初代細胞または株化細胞系および他の胚細胞型、新生児細胞型、もしくは成体細胞型、または形質転換細胞（例えば、自発的またはウイルス形質転換細胞）である。これらには、線維芽細胞、マクロファージ、筋芽細胞、破骨細胞、破骨細胞、造血細胞、ニューロン、グリア細胞、初代Ｂ−細胞およびＴ細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞株、軟骨細胞、角化細胞、脂肪細胞、および肝細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の実施により、相補変異体の会合の調節による酵素活性の調節についての系を考案することも可能である。本発明のこの態様は、プロドラッグのその活性形態への酵素駆動変換を調節する方法としてヒト療法に適用される可能性がある。
【０１０９】
本発明の実施で研究することができる分子相互作用、特にタンパク質−タンパク質相互作用に関与する過程には、転写、翻訳、複製、有糸分裂、成長制御、細胞周期の進行および調節、アポトーシス、細胞−細胞相互作用、細胞−基層相互作用、および細胞−リガンド相互作用、細胞内シグナル伝達カスケード、発癌、細胞系譜、および胚発生が含まれるが、これらに限定されない。細胞リガンドの例には、レプチンおよび成長因子（上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびインスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、トランスフォーミング成長因子αおよびβ（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）など）、エンドルフィンおよびエンドルフィン受容体、プロスタグランジンおよびその受容体、サイトカインおよびその受容体、神経伝達物質およびその受容体、アドレナリン受容体、コリン作動性受容体が含まれる。リガンドと相互作用することができる受容体には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＰＤＧＦ受容体およびレプチン受容体。
【０１１０】
本発明の実施によって研究することができるさらなる相互作用には、細胞代謝および細胞構造に関与する相互作用が含まれる。これらには、エネルギー代謝に関与するか細胞の膜構造、細胞質、細胞骨格、オルガネラ、核、核基質、または染色体を確立するか修飾する相互作用が含まれるが、これらに限定されない。細胞外基質の構成要素または細胞外基質の構成要素と細胞の間の相互作用を、本発明の方法および組成物を使用して研究することもできる。
【０１１１】
主題の親和性が減少した酵素相補性レポーター系のさらなる有用性には、米国特許出願公開２００３０２１９８４８号ならびに米国特許第４，３７８，４２８号；同第４，７０８，９２９号；同第５，０３７，７３５号；同第５，１０６，９５０号；同第５，３６２，６２５号；同第５，４６４，７４７号；同第５，６０４，０９１号；同第５，６４３，７３４号；およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／１９７３２号；ＷＯ９８／０６６４８号；ＷＯ９２／０３５５９号；ＷＯ０１／０２１４号；ＷＯ０１／６０８４０号、およびＷＯ  ００／０３９３４８号（その開示が本明細書中で参考として援用される）に記載の有用性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
キット
１つまたは複数の上記適用を実施するために使用されるキットも本発明によって提供される。一定の実施形態では、上記で概説するように、キットは、少なくとも、結合メンバーおよびレポーターサブユニットを含む１つまたは複数の融合タンパク質を構成性または誘導性に発現する細胞を含む。一定の実施形態では、上記で概説するように、キットは、かかる細胞を作製するためのエレメント（例えば、同一または異なるベクター上に存在する第１および第２の融合タンパク質をコードする第１および第２の核酸ならびに／または標準的な分子生物学技術を使用して目的のタンパク質を融合することができるレポーターサブユニットをコードする核酸）を含む。キットは、さらに、本発明の実施形態の実施に使用する１つまたは複数のさらなる成分（酵素基質、細胞成長培地などが含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【０１１３】
上記成分に加えて、主題のキットは、さらに、主題の方法の実施のための説明書を含むことができる。これらの説明書は、種々の形態で主題のキット中に存在することができ、その１つまたは複数がキット中に存在することができる。これらの説明書が存在することができる１つの形態は、適切な媒体または被印刷物上の印刷された情報である（例えば、情報が印刷された紙、キットの包装中、添付文書など）。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体（例えば、ディスケット、ＣＤなど）であろう。存在することができるさらに別の手段は、インターネットによって離れたサイトに情報をアクセスするために使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の都合のよい手段で、キット中に存在することができる。
【０１１４】
以下の実施例を、例示のために提供し、これらは本発明を決して制限しない。
【実施例】
【０１１５】
Ｉ．親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ系
本発明者らは、最近、β−ｇａｌを使用してタンパク質翻訳をモニタリングするための近接ベースの低親和性酵素相補系を説明している。低親和性酵素相補性系を達成するために、Ｊａｃｏｂ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｄ（１９６１）によって最初に記載された古典的αペプチドを、結晶構造に基づいて特定の残基を短縮して変異させ、オメガ（ω）フラグメントに弱く相補するαペプチド（α＊）を駆動した。タンパク質の移動をアッセイするために、１つの酵素フラグメント（ω）を、特定の細胞内領域に局在させ、小さな相補α＊ペプチドを目的のタンパク質に融合した。ωのすぐ周辺のα＊の濃度は、用量および時間依存様式で得た酵素活性量と相関し、局在タンパク質濃度についての遺伝学的にコードされたバイオセンサーとして役立った（Ｔ．Ｓ．Ｗｅｈｒｍａｎ，Ｃ．Ｌ．Ｃａｓｉｐｉｔ，Ｎ．Ｍ．Ｇｅｗｅｒｔｚ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，５２１（Ｊｕｌｙ，２００５））。その低親和性のために、α＊とωβ−ｇａｌフラグメントとの間の相互作用は、相補した酵素を維持するのに十分に強くない。結果として、任意の所与の時間に得たβ−ｇａｌ活性は、２つのフラグメントの動的相互作用の基準であり、その局所濃度を反映する。この親和性が減少した系は、２００５年５月１８日出願の米国特許出願公開１１／１３２，７６４号（この出願の実験の部に記載の系およびその生成方法の開示は、本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
【０１１６】
この系を使用して、２タンパク質の相互作用を、受容体タンパク質に融合したβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）酵素の低親和性変異サブユニットの相補性の関数として測定する（図１Ａ）。誘導性および可逆性の相互作用をアッセイすることができ（信号雑音比が高い）、巨大なポリクローナル細胞集団の原形質膜中の受容体のホモ二量体およびヘテロ二量体を定量様式で比較することができる。
【０１１７】
この特徴の組み合わせは、エネルギー移動に基づいた他のタンパク質相互作用検出系（Ｙ．Ｘｕ，Ｄ．Ｗ．Ｐｉｓｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，１５１（Ｊａｎ．５，１９９９）；Ｂ．Ａ．Ｐｏｌｌｏｋ，Ｒ．Ｈｅｉｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９，５７（Ｆｅｂｒｕａｒｙ，１９９９））または開裂酵素（ｓｐｌｉｔ  ｅｎｚｙｍｅ）（ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｆ．Ｘ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｖａｌｏｉｓ，Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１２１４１（Ｏｃｔ．１３，１９９８））、β−ラクタマーゼ（Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ｍ．Ｐｒｉｍｅａｕ，Ｌ．Ｅ．Ｔｒｕｄｅａｕ，Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０，６１９（Ｊｕｎｅ，２００２）；Ｔ．Ｗｅｈｒｍａｎ，Ｂ．Ｋｌｅａｖｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｈ．Ｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．Ｂａｌｉｎｔ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，３４６９（Ｍａｒ．１９，２００２））、ルシフェラーゼ（Ｒ．Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｓ．Ｓ．Ｇａｍｂｈｉｒ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５，１５８４（Ａｐｒ．１，２００３））、および前述のβ−ガラクトシダーゼ（Ｆ．Ｒｏｓｓｉ，Ｃ．Ａ．Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，８４０５（Ａｕｇ．５，１９９７）；Ｆ．Ｒｏｓｓｉ，Ｃ．Ａ．Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，８４０５（Ａｕｇ．５，１９９７））が含まれる）で見いだされない。すぐ下に概説するように、この新規の親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ系により、乳癌に関連するＥｒｂＢファミリーメンバーの組み合わせ相互作用の比較分析が可能である。
【０１１８】
ＩＩ．ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３がホモ二量体化またはヘテロ二量体化する能力を調査するための親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ系の使用
ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／Ｎｅｕ）（受容体値ロイシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバー）は、３０％の乳癌で過剰発現し、特に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と同時発現した場合に、悪性表現型および不良な予後に最も明確に関連する（Ｄ．Ｊ．Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１７７（Ｊａｎ．９，１９８７）；Ｄ．Ｇｓｃｈｗａｎｔｌｅｒ−Ｋａｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  １４，３０５（Ａｕｇｕｓｔ，２００５）：Ｍ．Ｐ．ＤｉＧｉｏｖａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３，１１５２（Ｆｅｂ．２０，２００５））。その腫瘍がＥｒｂＢ２を過剰発現する乳癌患者について、モノクローナル抗体であるハーセプチンは、前例のない様式での延命および再発率の減少によって治療を激変させた（Ｍ．Ｊ．Ｐｉｃｃａｒｔ−Ｇｅｂｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３，１６５９（Ｏｃｔ．２０，２００５）；Ｍ．Ａ．Ｃｏｂｌｅｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７，２６３９（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９９）；Ｅ．Ｈ．Ｒｏｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３，１６７３（Ｏｃｔ．２０，２００５））。しかし、ハーセプチンは、使用される症例の一部しか有効でなく、今日まで、どのＥｒｂＢ２陽性腫瘍が治療に応答するかを予想するための根拠として認められていない。これは、ハーセプチンが作用する機構の理解が不十分であることに一部起因する。ハーセプチンが免疫系による破壊のために腫瘍細胞を標的にするといういくつかの証拠が存在するにもかかわらず（Ｒ．Ａ．Ｃｌｙｎｅｓ，Ｔ．Ｌ．Ｔｏｗｅｒｓ，Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ，Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，４４３（Ａｐｒｉｌ，２０００））、免疫応答と無関係にｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞成長のインヒビターとして抗体を最初に選択した（Ｒ．Ｍ．Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９，１１６５（Ｍａｒｃｈ，１９８９））。ハーセプチンは、ＥｒｂＢ２のヘテロ二量体形成を遮断することは知られていないが、細胞増殖に及ぼすその阻害効果により、ハーセプチンがチロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーによるシグナル伝達を妨害すると示唆される。ハーセプチンの作用機構の理解が困難であり続けている１つの理由は、利用可能な生化学的方法（精製または同時免疫沈降した受容体が含まれる）を使用した定量的様式でのＥｒｂＢ受容体の相互作用のモニタリングの難しさにある（Ｋ．Ｍ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｈａｎ，Ｔ．Ｌ．Ｍａｃａｔｅｅ，Ｍ．Ａ．Ｌｅｍｍｏｎ，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９，４６３２（Ｓｅｐ．１，２０００）；Ｔ．Ｈｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，２４６０４（Ｏｃｔ．１３，１９９５）；Ｄ．Ｋａｒｕｎａｇａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １５，２５４（Ｊａｎ．１５，１９９６）。
【０１１９】
ここに、本発明者らは、上記の実施例１に記載のように、インタクトな細胞の膜内で受容体相互作用をモニタリングすることが可能な新規のタンパク質相互作用検出系を使用して、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３がホモ二量体化およびヘテロ二量体化する能力を調査した。この系を使用して、２タンパク質の相互作用を、受容体タンパク質に融合したβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）酵素の低親和性変異サブユニットの相補性の関数として測定する（図１Ａ）。誘導性および可逆性の相互作用をアッセイすることができ（信号雑音比が高い）、巨大なポリクローナル細胞集団の原形質膜中の受容体のホモ二量体およびヘテロ二量体を定量様式で比較することができる。この特徴の組み合わせは、エネルギー移動に基づいた他のタンパク質相互作用（Ｙ．Ｘｕ，Ｄ．Ｗ．Ｐｉｓｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，１５１（Ｊａｎ．５，１９９９）；Ｂ．Ａ．Ｐｏｌｌｏｋ，Ｒ．Ｈｅｉｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９，５７（Ｆｅｂｒｕａｒｙ，１９９９））または開裂酵素（ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｊ．Ｎ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｆ．Ｘ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｖａｌｏｉｓ，Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１２１４１（Ｏｃｔ．１３，１９９８））、β−ラクタマーゼ（Ａ．Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ｍ．Ｐｒｉｍｅａｕ，Ｌ．Ｅ．Ｔｒｕｄｅａｕ，Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０，６１９（Ｊｕｎｅ，２００２）；Ｔ．Ｗｅｈｒｍａｎ，Ｂ．Ｋｌｅａｖｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｈ．Ｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．Ｂａｌｉｎｔ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，３４６９（Ｍａｒ．１９，２００２））、ルシフェラーゼ（Ｒ．Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｓ．Ｓ．Ｇａｍｂｈｉｒ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５，１５８４（Ａｐｒ．１，２００３））、および前述のβ−ガラクトシダーゼ（Ｆ．Ｒｏｓｓｉ，Ｃ．Ａ．Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，８４０５（Ａｕｇ．５，１９９７）；Ｆ．Ｒｏｓｓｉ，Ｃ．Ａ．Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，８４０５（Ａｕｇ．５，１９９７））が含まれる）で見いだされない。本発明者らは、タンパク質転位置のアッセイのために構築した新規のβ−ガラクトシダーゼ系（Ｔ．Ｓ．Ｗｅｈｒｍａｎ，Ｃ．Ｌ．Ｃａｓｉｐｉｔ，Ｎ．Ｍ．Ｇｅｗｅｒｔｚ，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，５２１（Ｊｕｌｙ，２００５））が、乳癌に関連するＥｒｂＢファミリーメンバーの組み合わせ相互作用の比較分析を行うことができると主張した。
【０１２０】
提案した受容体のＥｒｂＢファミリーの相互作用研究のために、特定の誘導性タンパク質−タンパク質相互作用の分析のための近接性ベースの低親和性β−ｇａｌ相補性系の見込みを最初に立証した。第１に、ＦＫＢＰ１２とＦＲＢ（高親和性で会合する細胞質タンパク質）との間のラパマイシン誘導性相互作用（Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｆ．Ｚｈｅｎｇ，Ｅ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２，４９４７（Ｍａｙ  ２３，１９９５））を、化学発光によってアッセイした。ＦＫＢＰ１２ωおよびＦＲＢα＊を発現する細胞のラパマイシンでの２時間の処理により、β−ｇａｌ活性が１０倍増加した（図１Ｂ）。β−ｇａｌ系を使用してより低い親和性の相互作用をモニタリングすることもできるかどうかを決定するために、可逆的相互作用であるＧタンパク質共役受容体であるβ２アドレナリン作動性（ａｄｅｎｅｒｇｉｃ）受容体（Ｂ２ＡＲ）のβ−アレスチン２との会合を評価した。刺激の際、Ｂ２ＡＲがリン酸化されるようになり、β−アレスチン２に結合する。Ｂ２ＡＲ−ωおよびβ−アレスチン２α＊融合タンパク質を発現する細胞のアゴニスト（イソプロテレノール）での処理により、酵素活性が５倍に増加し、アンタゴニスト（プロプラノロール）での前処理によって活性が防止された（図１Ｃ〜Ｅ）。β−ｇａｌ活性の関数として得た用量−応答およびＥＣ５０は、公開された値と良好に一致し（Ｒ．Ｈ．Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １，２１（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００２））、低親和性近接性ベースのα−相補性をその天然の状況（インタクトな細胞の膜）におけるタンパク質−タンパク質相互作用の定量的基準として使用することができる。
【０１２１】
ＥｒｂＢ２は、一般に、各リガンド結合ＥｒｂＢ受容体（ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ３）の好ましいヘテロ二量体化パートナーと見なされているが（Ｄ．Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｒ．Ｒ．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｊ．Ｍ．Ｄａｌｙ，Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，１６４７（Ａｐｒ．１，１９９７））、従来の方法を使用したＥｒｂＢ２相互作用の特徴づけに問題があった。例えば、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインは、溶液中でヘテロ二量体を形成することが示されておらず（Ｋ．Ｍ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｈａｎ，Ｔ．Ｌ．Ｍａｃａｔｅｅ，Ｍ．Ａ．Ｌｅｍｍｏｎ，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９，４６３２（Ｓｅｐ．１，２０００））、受容体相互作用の代替マーカーとしてのリン酸化の使用では矛盾した結果が導かれた（Ｄ．Ｊ．Ｒｉｅｓｅ，２ｎｄ，Ｔ．Ｍ．ｖａｎ  Ｒａａｉｊ，Ｇ．Ｄ．Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｃ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｆ．Ｓｔｅｒｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５，５７７０（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９５）；Ｄ．Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｒ．Ｒ．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｊ．Ｍ．Ｄａｌｙ，Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，１６４７（Ａｐｒ．１，１９９７））。本発明者らは、原形質膜中のＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３の研究のために低親和性β−ｇａｌ系を適用した。受容体のクラスター化および内在化を防止するために、受容体の細胞内ドメインを、受容体−α＊キメラまたは受容体−ωキメラ中に含めなかった（図１Ｆ）。ＥＧＦへの曝露により、時間依存性に酵素活性が増加し、これらの受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、ヘテロ二量体形成の媒介に十分であることが証明された（図１Ｇ）。β−ｇａｌアッセイがこの相互作用の動的性質をモニタリングすることができることを検証するために、誘導物質（ＥＧＦおよびＴＧＦ−α）を最初に添加し、その後に分析前に培地から取り出す実験を行った。β−ｇａｌ活性は経時的に減少し、シグナルはＥＧＦ曝露後よりもＴＧＦ−α後に急速に減衰し、β−ｇａｌ活性の喪失速度がリガンド特異性を示すことを示した（図１Ｈ）。これらの結果は、β−ｇａｌアッセイが可逆的相互作用をモニタリングすることができ、これは、今まで記載されている他の酵素相補性系と異なる。
【０１２２】
β−ｇａｌ融合タンパク質の量がβ−ｇａｌ酵素活性に影響を及ぼすので、異なる受容体対の定量的比較を行うために、細胞中の受容体発現レベルを制御した（図２）。このために、ＥｒｂＢファミリーメンバーを非常に低いレベルで発現するＣ２Ｃ１２細胞を使用して２つの類似の細胞株を構築した（Ｓ．Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２６８，３６（Ａｕｇ．１，２００１））。これらの細胞を、ＥｒｂＢ２−ωまたはＥＧＦＲ−ω融合タンパク質のいずれかを発現するように操作した。次いで、各ω発現親細胞株を分割し、異なるα−融合タンパク質（ＥＧＦＲ−α＊、ＥｒｂＢ２−α＊、ＥｒｂＢ３−α＊）をコードする３つの各構築物で形質導入した。細胞を同一の親株から生成したので、細胞は、等量のωを発現した。α＊キメラタンパク質発現レベルを測定するために、ＹＦＰを各構築物中のＥｒｂＢ受容体とα＊との間に含めた。α＊−融合タンパク質レベルが類似であるように類似のＹＦＰレベルを発現する細胞をＦＡＣＳによって単離した。ＹＦＰを共焦点顕微鏡方によって画像化し、確実に受容体融合タンパク質がその機能に不可欠な原形質膜に適切に局在させた（図３）。
【０１２３】
リガンド刺激酵素活性を、受容体対を発現する６つの各細胞株について評価した。細胞を、ＥＧＦＲに結合するリガンドＥＧＦまたはＥｒｂＢ３受容体に結合するリガンドヘレグリン（ＨＲＧβ１）のいずれかに曝露した（Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ，Ｈ．Ａ．Ｌａｎｅ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，３４１（Ｍａｙ，２００５））。全ての予想される相互作用が認められた（図４Ａ）。ＥＧＦはＥＧＦＲをホモ二量体化させ、ＥＧＦＲをＥｒｂＢ２とヘテロ二量体化させたのに対して、ＨＲＧβ１はこれらの受容体の相互作用を誘導できなかった。ＥＧＦＲω−ＥｒｂＢ２α＊またはＥｒｂＢ２ω−ＥＧＦＲα＊を発現した細胞を比較した場合、応答は類似していた。受容体がα＊またはωに融合するかどうかと無関係に類似の相互作用が起こることを示したので、この所見は重要である。ＥＧＦＲによるＥｒｂＢ３のリン酸化が他の者によって示されているにもかかわらず（Ｄ．Ｊ．Ｒｉｅｓｅ，２ｎｄ，Ｔ．Ｍ．ｖａｎ  Ｒａａｉｊ，Ｇ．Ｄ．Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｃ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｆ．Ｓｔｅｒｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５，５７７０（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９５）；Ｋ．Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，３８８４（Ｆｅｂ．１６，１９９６））、本発明者らはこれら２つのタンパク質間で有意な相互作用を検出せず、ＥＧＦＲによるＥｒｂＢ３の活性化がその細胞外ドメインの二量体化によって媒介される可能性が低いことを示した。ＥｒｂＢ２ωおよびＥｒｂＢ３α＊を発現する細胞は、ＨＲＧβ１とのみ反応してヘテロ二量体を生成したが、ＥＧＦとは反応しなかった。ＥｒｂＢ２ωおよびＥｒｂＢ２α＊を発現する細胞はＥＧＦまたはＨＲＧβ１処理のいずれとも反応せず、ＥｒｂＢ２がいかなる公知のリガンドとも結合できないことと一致していた。
【０１２４】
ＥｒｂＢ２の結晶構造によってＥｒｂＢ２が構成性に活性な高次構造であることが明らかとなり、ＥｒｂＢ２は自発的にホモ二量体化し、シグナルを生じることができることが示唆される（Ｈ．Ｓ．Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１，７５６（Ｆｅｂ．１３，２００３）；Ｔ．Ｐ．Ｇａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１，４９５（Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００３））。しかし、この見解は、ＥｒｂＢ２のみではＥｒｂＢ２の完全な活性化が起こらないが、細胞中の他のＥｒｂＢ受容体の存在が必要であるという所見によって支持されない（Ｙ．Ｙａｒｄｅｎ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１  Ｓｕｐｐｌ  ２，１（２００１））。さらに、生化学的研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｒｂＢ２ホモ二量体を検出することができなかった。本発明者らの研究は、誘導物質の非存在下で酵素活性が全ての細胞株で類似しているので、ＥｒｂＢ２が試験した他の受容体対よりも容易に自発的ホモ二量体を形成しないことが確認された（図４Ｂ）。
【０１２５】
ＥｒｂＢ２に対する３つのモノクローナル抗体を、ＥｒｂＢ受容体二量体レベルに及ぼすその影響について試験した（図５Ａ）。抗体Ｌ８７は、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに結合するが、受容体活性化に影響を及ぼさない（Ｌ．Ｎ．Ｋｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，２０９９（Ｍａｙ  １，１９９７））。β−ｇａｌ相補性によってアッセイした場合、Ｌ８７はＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ３のいずれかとのＥｒｂＢ２の相互作用に影響を及ぼさなかった。抗体２Ｃ４は、ＥｒｂＢ３またはＥＧＦＲのいずれかとのＥｒｂＢ２の二量体化を防止することが見いだされ、これは、リン酸化の関数として活性をアッセイした以前の報告と良好に一致した（Ｄ．Ｂ．Ａｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２，１２７（Ａｕｇｕｓｔ，２００２））。明白に、ハーセプチンは、ＥＧＦＲωのＥｒｂＢ２α＊との相互作用を顕著に阻害した。２Ｃ４と対照的に、ハーセプチンは、ＥｒｂＢ２ω−ＥｒｂＢ３α＊二量体化を比較的小さく阻害した。ハーセプチンのこれらの影響は用量依存性であり、ＥＧＦＲω−ＥｒｂＢ２α＊相互作用の阻害は２Ｃ４と同様の用量で起こった（図５Ｂ、Ｃ）。結果が受容体が融合したβ−ｇａｌフラグメントに影響を受けないことを確認するために、ＥＧＦＲα＊およびＥｒｂＢ２ωを使用して同一の実験を行い、類似の結果が得られた（図６）。本発明者らは、２Ｃ４による二量体形成のより高い阻害は、ハーセプチンがＥｒｂＢ２の膜近傍ドメインに結合するのに対して、２Ｃ４がＥｒｂＢ２の二量体化アームに結合するという事実に起因すると主張する。
【０１２６】
上記の二量体化研究は、ハーセプチンが主にＥｒｂＢ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体の形成を阻害することを示す。ハーセプチンは、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体よりも強力にＥｒｂＢ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体の形成を阻害することが可能であるにもかかわらず、配列レベルおよび構造レベルの両方でＥｒｂＢ受容体の細胞外ドメインの相同性が高いので、これは可能性が低いようである。本発明者らは、ＥＧＦＲが容易にホモ二量体化するのに対して、ＥｒｂＢ３はそうでないので（Ｍ．Ｂ．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｍｅｎｄｒｏｌａ，Ｍ．Ａ．Ｌｅｍｍｏｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５６９，３３２（Ｊｕｌ．２，２００４））、ＥＧＦＲ単量体がホモ二量体を形成する傾向は、ＥｒｂＢ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体の形成と競合すると主張する。対照的に、ＥｒｂＢ３はホモ二量体化することができず、ハーセプチンの存在下でさえもＥｒｂＢ３単量体が遊離し、これがＥｒｂＢ２とのヘテロ二量体化に利用可能である。結果として、ＥｒｂＢ３と異なり、ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ−ＥＧＦＲ複合体中に徐々に捕捉され、漸増的にヘテロ二量体化に利用できなくなるであろう。
【０１２７】
ＥｒｂＢ受容体の公知の性質を加えた本発明のデータにより、ハーセプチンがＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２の両方を発現する細胞中でのＥＧＦＲホモ二量体化に影響を及ぼすかどうかを試験する必要に迫られた。図４Ａに示すように、ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体およびＥＧＦＲホモ二量体は、同等の効率で形成される。結果として、ハーセプチン処理によるヘテロ二量体形成の阻害によってホモ二量体の比率がより高くなるはずである（Ｂ．Ｓ．Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，Ｈ．Ｓ．Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８５，２７３２（Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００３））。この仮説の試験として、β−ｇａｌフラグメントを欠く野生型ＥｒｂＢ２が、ＥＧＦＲα＊−ＥＧＦＲω細胞株中で過剰発現した。予想通り、ＥＧＦへの曝露ではβ−ｇａｌ活性を刺激することができず、ヘテロ二量体を形成する強い傾向が得られた（図７Ａ）。しかし、細胞をハーセプチン抗体とプレインキュベートした場合、ハーセプチンに結合したＥｒｂＢ２はＥＧＦＲとヘテロ二量体化する能力が減少したので、ＥＧＦはβ−ｇａｌ活性を増加させた。この破壊により、ＥＧＦＲα＊とＥＧＦＲωとが相互作用し、ホモ二量体化した。２Ｃ４の添加により、より広い範囲の細胞株のβ−ｇａｌ活性のＥＧＦ誘導性増加が修復され、予想されるように、ハーセプチンと比較してＥｒｂＢ２ヘテロ二量体がより強く阻害された。
【０１２８】
本発明者らは、ハーセプチンの存在下でのＥＧＦＲホモ二量体形成の増加により、ＥＧＦＲが急速に内在化してホモ二量体として分解するが、ＥｒｂＢ２とのヘテロ二量体としては分解されないので、細胞表面上のＥＧＦＲが減少するであろうと推論した（Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｔ．Ｋ．Ｙｅｕｎｇ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０，１６２１（Ｍａｙ，１９９９））。この仮説を試験するために、野生型ＥＧＦＲおよび野生型ＥｒｂＢ２を細胞中に同時発現させ、細胞表面上のＥＧＦＲを、フローサイトメトリーによって定量した（図７Ｂ）。ハーセプチンおよび２Ｃ４の両方により、コントロールとの比較によってＥＧＦ処理の際に細胞表面からＥＧＦＲが急速に喪失した。ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２の両方を過剰発現することが公知のＳＫＢＲ３乳癌細胞株を使用して類似の実験を行い、ハーセプチンおよび２Ｃ４の存在下でＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲ内在化が同様に増加した（図７Ｃ）。これらの実験は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２のハーセプチンとのヘテロ二量体化の阻止がＥｒｂＢ２活性を減少させるだけでなく、ＥＧＦＲホモ二量体形成が増加し、その後に活性化受容体がより有効に下方制御されることを示す。まとめると、これらの所見により、ハーセプチンのＥｒｂＢ２発現癌細胞の成長を阻害する能力が説明される。
【０１２９】
インタクトな膜内での動的受容体相互作用をモニタリングする方法の構築は、ＥｒｂＢファミリーメンバーの組み合わせ相互作用の研究に極めて重要であった。このアッセイは、融合されるβ−ｇａｌ酵素フラグメントの近傍を誘導した際に得られる酵素活性の関数としてのタンパク質の相互作用を測定する。各フラグメントの発現レベルの制御により、受容体ヘテロ二量体およびホモ二量体の全プロフィールを、異なる受容体組み合わせを発現する細胞株間で比較することができる。アッセイは、感度が高く、定量的で、誘導性があり、可逆的である。本研究でＥｒｂＢファミリーの相互作用に適用したが、本明細書中に記載のタンパク質相互作用検出系は、目的の他のタンパク質相互作用に容易に適合することができる。
【０１３０】
１０年以上にわたってハーセプチンが臨床的に使用されているにもかかわらず、ＥｒｂＢファミリーの二量体化に及ぼすその影響については明確に特徴づけられていない。本発明者らは、ハーセプチンがＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３ではなくて主にＥｒｂＢ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体レベルに影響を及ぼすことをここに示す。結果として、ハーセプチン曝露は、以下の２つの相関する機構によってシグナル伝達を阻害する：（１）ＥｒｂＢ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体の破壊および（２）細胞表面上の総ＥＧＦＲ発現の減少。ハーセプチンは最初に直接遮断してＥＧＦＲホモ二量体化を増加させ、その後に急速に内在化し、最終的にＥＧＦＲレベルを減少させる。まとめると、本研究における所見により、ハーセプチンがＥｒｂＢ受容体シグナル伝達を阻害し、それによって腫瘍細胞成長を阻害する機構（ＥｒｂＢ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体のターゲティング）が示唆される。
【０１３１】
重要には、本明細書中に報告したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの所見は、ハーセプチンに対する応答者および非応答者由来の腫瘍サンプルの最近報告されたＥｒｂＢ２受容体発現プロフィールと十分に相関する。腫瘍がＥｒｂＢ２を過剰発現する患者では、ハーセプチン治療に対する応答は、ＥＧＦＲおよびそのリガンドの同時発現と相関し、ＥｒｂＢ３と対照的であった（Ｇ．Ｈｕｄｅｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｅｐ．１３，２００５）；Ｂ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９１，１１９０（Ｓｅｐ．１３，２００４））。したがって、本研究におけるデータは、応答の予想およびハーセプチン療法から恩恵を受ける可能性のある患者の選択のための機構的基本を提供する。
【０１３２】
ＩＩＩ．材料と方法
Ａ．β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生成
ＥＧＦＲの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン（ａａ１〜６７９）、ＥｒｂＢ２（ａａ１〜６８６）、およびＥｒｂＢ３（ａａ１〜６９３）、ならびに全長Ｂ２ＡＲ（全ヒト）を、５’Ｍｆｅｌおよび３’ＸｈｏＩ部位を使用してｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ＷＺＬレトロウイルス構築物およびＹＦＰＨ３１Ｒα（α＊）レトロウイルス構築物中のωフラグメントのアミノ末端に融合した。ヒトβ−アレスチン２の全コード配列を、ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位を含むプライマーを使用して、ωおよびα＊ベクターのＭｆｅＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入した。ＦＫＢＰ１２の完全なコード配列およびヒトＦＲＡＰのａａ２０２５〜２１１４をＰＣＲ増幅し、Ｍｆｅｌ−ＸｈｏＩフラグメントしてωおよびα＊ベクターに挿入した。全長ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲもｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し、Ｍｆｅｌ−ＸｈｏＩ制限酵素を使用して、ＭＦＧレトロウイルスベクターに挿入した。
【０１３３】
Ｂ．ウイルスの産生および細胞培養
製造者の説明書にしたがって、６ウェル皿中で、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）を使用して、φｎｘ−パッケージング細胞株（Ｐ．Ｌ．Ａｃｈａｃｏｓｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｎｏｌａｎ）にレトロウイルスベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、Ｃ２Ｃ１２細胞上の０．４５μｍのシリンジフィルターによってウイルスの上清を濾過した。最終濃度４μｇ／ｍｌでポリブレンを添加し、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機において１９００ＲＰＭで３０分間プレートをスピンした。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに１２時間戻し、培地を新鮮な培地と交換した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、ｐｅｎ／ｓｔｅｐを含む２０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で成長させた。適切な細胞を、１μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して選択するか、ＦＬ１チャネルを使用したＦＡＣＳＴＡＲフローサイトメーターによってＹＦＰ発現について分取した。ＡＴＣＣからＳＫＢＲ３細胞株を入手した。ＳＫＢＲ３細胞を、１０％ＦＢＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、およびグルタミンを補足したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地中で培養した。
【０１３４】
Ｃ．細胞の処理およびアッセイ
ハーセプチンおよび２Ｃ４は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，ＭＸ）から厚意的に贈与された。全ての他の抗体は、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）から入手した。組換えヒトｈＥＧＦ、ｈＨＲＧβ１、およびｈＴＧＦ−αをＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手し、水に再懸濁し、その直後に等分して凍結した。イソプロテレノール、プロプラノロール、およびラパマイシンは、Ｓｉｇｍａから入手した。イソプロテレノールを、各実験前に水に再懸濁した。β−ガラクトシダーゼ活性の測定のために、細胞を、９６ウェル皿に２０，０００細胞／ウェルで一晩播種した。適切な処理後、細胞から培地を除去し、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（Ｇａｌ−ｓｃｒｅｅｎ  ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の２０倍希釈物と混合した５０μｌ緩衝液Ｂを添加した。細胞を、室温で４５分間インキュベートし、その後、１秒間の積分時間を使用してＴｒｏｐｉｘ  ＴＲ７１７照度計で発光を測定した。内在化アッセイのために、アッセイの少なくとも２４時間前に細胞を１２ウェル皿に播種した。細胞は、血清を含まない適切な培地中で４時間血清を枯渇させ、次いで、１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦで処理した。ウェルをトリプシン処理し、氷上に置いてさらなるエンドサイトーシスを防止した。細胞を氷冷培地中でリンスし、Ａｌｅｘａ６４７（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）に抱合した抗ＥＧＦＲ  Ａｂ−１１（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）を使用して、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中で２０分間染色し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再度洗浄した。製造者の説明書にしたがって抗体抱合を行い、最適な用量設定で使用した。
【０１３５】
そのようなものとして、本発明は、当該分野に有意に寄与する。
【０１３６】
前述の発明は、理解を明確にするための説明および例によっていくらか詳細に記載しているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、一定の変更形態および修正形態を得ることができることが当業者に明らかである。
【０１３７】
したがって、前述は、本発明の原理を説明しているにすぎない。当業者は、本明細書中に明確に記載も示しもしていないが、本発明の原理を具体化して種々の配置を考案することができ、これが本発明の精神および範囲内に含まれると認識されるであろう。さらに、本明細書中に引用された全ての実施例および条件付きの用語は、主に本発明の原理および本発明者らによって技術の促進に寄与した概念についての読者の理解を補助することを目的とし、かかる具体的に引用した実施例および条件に制限されないと解釈すべきである。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにその特定の例を引用した本明細書中の全ての記述は、その構造的等価物および機能的等価物の両方を含むことが意図される。さらに、かかる等価物には、現在公知の等価物および将来的に開発される等価物（すなわち、構造と無関係に同一の機能を果たす開発された任意の要素）が含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書中に表示および記載した例示的実施形態に制限されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】β−ガラクトシダーゼの親和性が減少したα−相補性によってモニタリングされた誘導性タンパク質相互作用。Ａ）低親和性α相補性系の略図。２つのキメラタンパク質の物理的会合により、変異β−ｇａｌフラグメント、Ｍ１５（ω）、およびＨ３１Ｒα（α＊）を近接させてβ−ガラクトシダーゼ活性が得られる。Ｂ）低親和性α−相補性は、強いタンパク質相互作用をモニタリングする。ＦＲＢα＊およびＦＫＢＰ１２ωを発現する細胞は、ラパマイシン（Ｒａｐ）への曝露後にβ−ガラクトシダーゼ活性が増加した。Ｃ）低親和性α−相補性は、膜結合β２−アドレナリン受容体（Ｂ２ＡＲ）の誘導性相互作用などのタンパク質相互作用を定量的にモニタリングし、Ｂ２ＡＲωおよびβ−アレスチン２α＊キメラを発現する細胞中の細胞質β−アレスチン２をモニタリングした。α＊は、目的のタンパク質である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）−Ｈ３１Ｒα融合物からなるキメラタンパク質を示す。Ｄ）β−ｇａｌ活性としてアッセイしたアゴニストであるイソプロテロノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｏｎｏｌ）への曝露４５分後のＢ２ＡＲωおよびβ−アレスチン２α＊キメラの用量応答。Ｅ）Ｂ２ＡＲωとβ−アレスチン２α＊との相互作用は、アンタゴニストであるプロパノロールによって用量依存性様式で防止された。１０μＭイソプロテレノール添加の１０分前に漸増用量のプロパノロールを細胞に添加し、４５分後にβ−ｇａｌ活性を測定した。Ｆ〜Ｇ）低親和性α−相補性は、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ２との間のヘテロ二量体形態をモニタリングする。ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを使用して、２つのキメラＥＧＦＲωおよびＥｒｂＢ２α＊を作製した。Ｇ）ＥＧＦＲωおよびＥｒｂＢ２α＊の両方を発現する細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦで刺激し、酵素活性を測定し、長期にわたるヘテロ二量体形成の増加が証明された。Ｈ）低親和性α−相補性は、劇的且つ可逆的様式でＥＧＦＲとＥｒｂＢ２との相互作用をモニタリングする。ＥＧＦまたはＴＧＦ−αのいずれかでの刺激後、過剰なリガンドを除去し（洗い流し）、二量体の解離を、酵素活性の関数として測定した。リガンドの存在下での細胞中の定常状態でのβ−ｇａｌ活性を、１００％に規準化し、リガンドの非存在下での細胞中のβ−ｇａｌ活性を、０と指定した。
【図２】基礎β−ｇａｌ活性は、αおよびωキメラの発現レベルに依存する。Ａ）Ｂ２ＡＲω−β−アレスチン２α＊およびＥＧＦＲω−ＥｒｂＢ２α＊細胞株を、α＊ペプチドレベルの指標として役立つＹＦＰ蛍光レベルに基づいたフローサイトメトリーによって区別した。Ｂ）分取後、各細胞株由来の同数の細胞を、９６ウェル皿にプレートし、インデューサーの非存在下でβ−ｇａｌ活性を測定した。酵素活性を、蛍光強度と比較し、最も低い発現物質（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ）を蛍光およびβ−ｇａｌ活性について１にスケーリングした（ｓｃａｌｅｄ）。α＊ペプチドの発現レベルが増加するにつれて、バックグラウンドβ−ｇａｌ活性は増加する。
【図３】ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３受容体対の基礎相互作用および誘導相互作用のプロファイリングのための比較可能なα＊およびωを有する細胞株の作製。Ａ）全キメラが同様に発現し、原形質膜に局在することを確実にするために、α＊融合構築物を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、共焦点顕微鏡法によってＹＦＰ蛍光について画像化した。Ｂ）２つの親細胞株を、ＥＧＦＲωまたはＥｒｂＢ２ωのいずれかを発現するＣ２Ｃ１２細胞から作製した。親株を、α＊キメラで形質導入し、類似のＹＦＰ発現レベルについて分取した。Ｃ）各細胞株についての平均蛍光の定量により、６つ全ての株の変動は１５％未満である。
【図４】ＥＧＦＲと、ＥｒｂＢ２と、ＥｒｂＢ３との間の基礎相互作用および誘導相互作用の比較分析。Ａ）ＥｒｂＢ受容体キメラタンパク質の異なる組み合わせを発現する６つの各細胞株のアリコートを、２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル皿にプレートした。細胞を、標示のリガンドで４５分間刺激し、β−ｇａｌ活性を測定した。ＥＧＦへの曝露の際、ＥＧＦＲホモ二量体およびＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体が形成されたのに対して、ヘレグリン処理により、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体のみが形成された。Ｂ）各細胞株について、リガンドの非存在下で測定したβ−ｇａｌ活性は、基礎二量体化レベルを示す。ＥｒｂＢ２がＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ３と比較してホモ二量体を形成する傾向が高くないことに留意のこと。
【図５】ＥｒｂＢ２二量体化に対するモノクローナル抗体の明確な効果。Ａ）ＥｒｂＢ２ω−ＥｒｂＢ３α＊細胞株およびＥＧＦＲω−ＥｒｂＢ２α＊細胞株を、適切なリガンドで刺激した１ｕｇ／ｍｌの表示の抗体に３０分間曝露し、β−ｇａｌ活性についてアッセイした。コントロールＩｇＧおよびＬ８７抗体は、ＥｒｂＢ２相互作用に影響を及ぼさなかった。２Ｃ４抗体は、全てのＥｒｂＢ２相互作用を完全に阻害し、ハーセプチンはＥＧＦＲとＥｒｂＢ２との間の相互作用を強く阻害するが、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３との間の相互作用に最小の影響しか及ぼさなかった。Ｂ）ハーセプチンおよび２Ｃ４によるＥｒｂＢ２相互作用の阻害が、類似の抗体濃度で起こる。細胞株を異なる用量の表示のモノクローナル抗体で予め処理し、その後に１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはヘレグリン（ＨＲＧβ１）のいずれかを添加した。ＡおよびＢの両方では、データを、図１Ｈに記載のように規準化した。
【図６】β−ｇａｌ活性によって測定したＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２二量体化のハーセプチン媒介阻害は、キメラタンパク質を作製するために使用したβ−ｇａｌフラグメント（ωまたはα＊）と無関係である。図３は、ＥＧＦの存在下でのＥＧＦＲωとＥｒｂＢ２α＊とのヘテロ二量体化の阻害を示す。これがβ−ｇａｌ相補性系の結果ではなかったことを確実にするために、ＥＧＦＲα＊ＥｒｂＢ２ω細胞株も試験した。細胞を、ＥＧＦ処理前に種々の用量のハーセプチンで３０分間処理した。
【図７】ハーセプチンおよび２Ｃ４によるＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体化阻害により、ＥＧＦＲホモ二量体形成および内在化が増加する。Ａ）ＥＧＦＲω、ＥＧＦＲα＊、および過剰発現野生型ＥｒｂＢ２（β−ｇａｌフラグメントなし）を発現するＣ２Ｃ１２細胞を、漸増濃度のＥＧＦで処理した。過剰なＥｒｂＢ２の存在下では、ヘテロ二量体形成が好まれ、抗体の非存在下（Ａｂなし）では、酵素活性はＥＧＦに応答して増加しない。ハーセプチンおよび２Ｃ４は、ＥｒｂＢ２のＥＧＦＲとの会合を阻害する。ＥＧＦ処理前の１ｕｇ／ｍｌの各抗体とのインキュベーションにより、ＥＧＦＲがホモ二量体を形成する能力が開腹する。（Ｂ〜Ｃ）抗体処理に応答したＥＧＦＲ内在化のアッセイ。野生型ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２の両方を過剰発現するＣ２Ｃ１２細胞（Ｂ）または乳癌細胞株、これらの受容体の両方を発現するＳＫＢＲ３（Ｃ）を、異なる時点でＥＧＦで刺激し、抗ＥＧＦＲ抗体（Ａｂ−１１）とインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。ハーセプチンおよび２Ｃ４曲線のために、各時点のＥＧＦ添加の１０分前に５ｕｇ／ｍｌの各抗体を添加した。各抗体により、両細胞株において、コントロール（Ａｂなし）と比較して、細胞表面上のＥＧＦＲの存在が急速に減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月28日(2008.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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