(57)【要約】ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートするための化合物、組成物及び方法を提供する。組成物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸にターゲティングされたオリゴヌクレオチドを含む。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現のモジュレーションのため、及び、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現に関連する疾患及び状態の診断及び治療のためにこれ等の化合物を使用する方法を提供する。更に提供されるものは、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のモジュレーションのためのスクリーニングの方法、及び、本発明の化合物又は組成物の１つ以上に細胞、組織又は動物を接触させることを含む、そのような細胞、組織又は動物におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートする方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における肝トリグリセリドレベルを低減する方法であって、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する、方法。
【請求項２】
前記化合物が配列番号
【化１】
2009516710.tif 000040
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチド配列を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記動物が脂肪症を有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪症が脂肪肝である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記脂肪症がＮＡＳＨである請求項３記載の方法。
【請求項６】
動物における体脂肪を低減する方法であって、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する、方法。
【請求項７】
前記化合物が配列番号
【化２】
2009516710.tif 000041
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチド配列を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
動物におけるグルコース耐性を改善する方法であって、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する、方法。
【請求項９】
前記化合物が配列番号
【化３】
2009516710.tif 000042
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチド配列を有する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
動物における脂肪生成を低減する方法であって、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する、方法。
【請求項１１】
前記化合物が配列番号
【化４】
2009516710.tif 000043
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチド配列を有する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
動物における脂肪組織中の脂肪生成に関与する遺伝子の発現を低減する方法であって、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する、方法。
【請求項１３】
前記化合物が配列番号
【化５】
2009516710.tif 000044
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチド配列を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪生成に関与する遺伝子がＤＧＡＴ２及びＦＡＳである請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
動物におけるグルコース代謝に関与する遺伝子の肝発現をモジュレートする方法であって、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する、方法。
【請求項１６】
前記化合物が配列番号
【化６】
2009516710.tif 000045
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチド配列を有する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記グルコース代謝に関与する遺伝子がグルコース−６−ホスファターゼ及びグリコーゲンシンターゼである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記動物が代謝性の疾患又は状態を有する請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝性の疾患又は状態が肥満、高脂血症、高血糖症、糖尿病、メタボリックシンドローム又はインスリン抵抗性である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝性の疾患又は状態が２型糖尿病である請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートするための組成物及び方法を提供する。特に本発明は、好ましい実施形態においてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にハイブリダイズするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド化合物に関する。そのような化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートすることが本明細書において示される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
真核生物の遺伝子発現は、細胞が広範な種類の異なる状態に迅速に応答できるように調節されなければならない。ｍＲＮＡ翻訳のプロセスは遺伝子発現が高度に調節される１つの工程である。ホルモン、成長因子、サイトカイン及び泳法に応答して、動物の細胞は、増殖応答のための準備において一般的に翻訳を活性化させる。蛋白合成の速度は典型的には酸化性又は浸透圧性のストレス、ＤＮＡ損傷又は栄養撤退のようなストレス過剰状態では減少する。ｍＲＮＡ翻訳の活性化又は抑制は数分以内に生じ、そしてこのプロセスの制御は蛋白合成の開始相において発揮されると考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
翻訳開始は数種の真核生物開始因子（ｅＩＦ）、即ちその細胞質内の所在及び蛋白合成の開始相を調節する能力により慣例上定義される蛋白の協調的な活性化を必要とする。これ等の因子の１つである真核生物開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）は他の開始因子と相対比較して限定的な量で存在し、そして、スカホールド蛋白ｅＩＦ４Ｇ及びＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａも包含するｅＩＦ４Ｆ開始複合体の１つの成分である。細胞質においては、ｅＩＦ４ＥはｅＩＦ４Ｆ複合体にｍＲＮＡを送達する作用を有するほぼ全ての成熟細胞ｍＲＮＡ上に存在する５’末端７−メチルＧｐｐｐＸキャップ構造に特異的に結合することによりキャップ依存性の蛋白合成の律速段階を触媒する。結合後はｅＩＦ４Ｆ複合体はキャップの５’から３’末端にスキャンし、ｅＩＦ４ＡのＲＮＡヘリカーゼ活性が５’未翻訳領域（ＵＴＲ）に存在する如何なる二次構造も分割できるようにし、これにより、翻訳開始コドンを明示し、そして、ｍＲＮＡ上へのリボソームの負荷を促進することができる（非特許文献２）。
【０００４】
ｅＩＦ４Ｅ複合体への取り込みのためのｅＩＦ４Ｅの利用性はホスホリル化を介して、並びに、抑制性蛋白の結合を介して調節される。ｅＩＦ４Ｅは、有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ相互作用キナーゼＭｎｋ１により、並びに、蛋白キナーゼＣにより、セリン２０９上でホスホリル化されるリン蛋白である（非特許文献３；Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，９３７３−９３７７；Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，１９９７，１６，１９０９−１９２０）。抑制性のｅＩＦ４Ｅ結合蛋白１及び２（ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ１及びｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２）はｅＩＦ４Ｅの背部表面への結合に関してｅＩＦ４Ｇと競合することによりキャップ依存性翻訳の効果的抑制剤として作用する（非特許文献４；Ｐｔｕｓｈｋｉｎａ等、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，１９９９，１８，４０６８−４０７５）。ｂｐ１と複合体化した場合、ｅＩＦ４Ｅは蛋白キナーゼＣ又はＭｎｋ１によるホスホリル化の基質ではなく、ｅＩＦ４Ｅからのｂｐ１の解離はｅＩＦ４Ｅホスホリル化の必要条件であることを示唆している（非特許文献５；Ｗｈａｌｅｎ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１，１１８３１−１１８３７）。ｅＩＦ４Ｅのホスホリル化はｍＲＮＡキャップに対するその親和性を増大させ、これにより翻訳速度を上昇させる（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９９，１９，１８７１−１８８０）。
【０００５】
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２（別名ＰＨＡＳ−ＩＩ；４ＥＢＰ２；４Ｅ−結合蛋白２；ＥＩＦ４ＥＢＰ２）はｃＤＮＡ発現ライブラリをプローブする際にｅＩＦ４Ｅ蛋白を用いることによりクローニングされた（Ｈｕ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９４，９１，３７３０−３７３４；Ｐａｕｓｅ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７１，７６２−７６７）。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２はヒト組織、例えば心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及び脾臓並びに脂肪組織及び骨格筋、主要なインスリン応答性の組織において偏在的に発現される（Ｈｕ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９４，９１，３７３０−３７３４；Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９６，３８，３５３−３６３）。ヒト遺伝子では染色体１０ｑ２１−ｑ２２にマッピングされている（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，１９９６，３８，３５３−３６３）。マウスｂｐ１遺伝子は３エクソンよりなり、約２０ｋｂに及び、そしてマウス染色体１０にマッピングされている（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，１９９６，３８，３５３−３６３）。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現はｂｐ１の系統的破壊を担持しているマウスにおいては改変されていないと考えられる（Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２，３１５１０−３１５１４）。
【０００６】
ｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡキャップへの結合を防止することよりはむしろ、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２はｅＩＦ４ＥのｅＩＦ４Ｇへの結合を禁止することにより、標的ｍＲＮＡ上の４０Ｓリボソームサブユニットの効率的結合及び適切な位置づけのために必要な複合体の形成を防止する。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２がｅＩＦ４Ｅに結合する場合、ｅＩＦ４Ｅは蛋白キナーゼＣによるホスホリル化のための基質としては作用せず、ｅＩＦ４ＥからのｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の解離にはｅＩＦ４Ｅのホスホリル化が必要条件であることを示唆している（Ｗｈａｌｅｎ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１，１１８３１−１１８３７）。ｅＩＦ４Ｅが結合する領域はｅＩＦ４Ｇ及びｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２により共有されている共通のモチーフであり、そしてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のこの領域における点突然変異はｅＩＦ４Ｅへの結合を根絶させる（Ｍａｄｅｒ等、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９５，１５，４９９０−４９９７）。２つの保存されたモチーフ、即ちｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のＮＨ２末端領域に観察されるＲＡＩＰモチーフ及びｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の最後の５アミノ酸により形成されるＴＯＳモチーフがｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２上に存在する（Ｓｃｈａｌｍ  ａｎｄ  Ｂｌｅｎｉｓ，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，２００２，１２，６３２−６３９；Ｔｅｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００２，２２，１６７４−１６８３）。
【０００７】
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ１と同様、インスリンは培養細胞中のｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のホスホリル化を刺激し、これがｅＩＦ４ＥからのｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の放出を増進し、そしてキャップ依存性翻訳を進行可能とする（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００３，２７８，４７４５９−４７４６５）。有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ、ラット脂肪細胞中の主要なインスリン刺激キナーゼはインビトロで組み換えｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をホスホリル化することができる。しかしながら、ラパマイシンを３Ｔ３−Ｌ１ラット脂肪細胞に投与するとｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のホスホリル化に対するインスリンの作用が減衰し、ｍＴＯＲシグナリング経路の要素がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に対するインスリンの作用を媒介していることが示される（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１，３０１９９−３０２０４）。更に又、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のセリン−６５は環状ＡＭＰ依存性蛋白キナーゼによるホスホリル化のための理想的なコンセンサス部位を提示する。インスリン又は表皮成長因子がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のホスホリル化を顕著に増大させているラット３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においては、環状ＡＭＰを増大させる化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に取り込まれる放射標識ホスフェートの量を減少させ、そしてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のホスホリル化を増大させることに対するインスリンの作用を減衰させる。環状ＡＭＰ依存性蛋白キナーゼの触媒性サブユニットと共にｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をインキュベートすると、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の急速なホスホリル化が起こる。総括するとこれ等のデータは環状ＡＭＰを増大させることはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のホスホリル化を選択的に増大させる場合があることを示唆している（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１，３０１９９−３０２０４）。
【０００８】
細胞分化の誘導及び細胞増殖の低減は、ヒト骨髄球様細胞の分化の間のｅＩＦ４Ｅ−ＢＰの示差的調節と関連して観察される通り、翻訳速度の低減と同時に起こる。単球／マクロファージに分化するように誘導される場合、ＨＬ−６０プロ骨髄性白血病細胞又はＵ−９３７単芽球細胞系統に由来する細胞はｂｐ１のホスホリル化の低減を示す。これとは対照的に、ＨＬ−６０細胞が顆粒球に分化するように刺激される場合にはｂｐ１の量は減少するのに対し、ｂｐ１のホスホリル化は影響を受けない。逆にｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のレベルは顕著に増大する。これ等の所見は翻訳機序がヒト骨髄球様細胞の分化の間に示差的に調節されていることを示唆している（Ｇｒｏｌｌｅａｕ等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，１６２，３４９１−３４９７）。
【０００９】
細胞の増殖を増進するシグナリングネットワークの調節不全が癌と関連して観察される場合が多い（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｒａｈａｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，１９９７，２２，３４５−３４９）。ｅＩＦ４Ｅ又はｖ−ｓｒｃで形質転換された細胞における過剰なｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現は形質転換された表現型の顕著な回復をもたらし、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２が細胞成育の抑制剤として機能できることを明らかにしている（Ｒｏｕｓｓｅａｕ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６，１３，２４１５−２４２０）。
【００１０】
特許文献１は蛋白ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に関するコーディング配列を含むｅＩＦ４Ｅに結合する細胞成分をコードする精製されたヒト核酸配列を記載しており、そして、ホルモン障害を治療するために潜在的に有用である非ホルモン剤をスクリーニングするための方法を開示している（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ等、２０００）。
【００１１】
現在、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をターゲティングする治療薬は知られていない。その結果、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２を効果的に抑制することができる薬剤がなお必要とされている。アンチセンス技術は特定の遺伝子産物の発現を低減する有効な手段であり、従って、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現のモジュレーションのための多くの治療、診断及び研究用途において独特の有用性を有している。
【００１２】
本発明はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現を抑制する組成物及び方法を提供する。
【特許文献１】米国特許第６，４１０，７１５号明細書
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８，２５０７−２５１７；Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｎ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００２，７０，１０−２２
【非特許文献２】Ｇｒａｆｆ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２００３，２０，２６５−２７３；Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｎ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００２，７０，１０−２２
【非特許文献３】Ｆｌｙｎｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，２１６８４−２１６８８
【非特許文献４】Ｐａｕｓｅ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７１，７６２−７６７
【非特許文献５】Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，９３７３−９３７７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸をターゲティングし、そして、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートするアンチセンス化合物、特に核酸及び核酸様オリゴマーに関する。本発明の化合物を含む医薬品及び他の組成物も提供される。更に提供されるものは、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のモジュレーションのためのスクリーニングの方法、及び、本発明の化合物又は組成物の１つ以上に細胞、組織又は動物を接触させることを含む、そのような細胞、組織又は動物におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートする方法である。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現に関連する疾患又は状態を有するか、それに罹患しやすいことが疑われる動物、特にヒトを治療する方法を本明細書に記載する。そのような方法は治療を必要とする人間に本発明の化合物又は組成物１つ以上の治療上又は予防上有効な量を投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書において提供されるものはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物であって、ここで該化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする該核酸分子に相補であり、そしてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は１２〜５０核酸塩基長、又は、１５〜３０核酸塩基長である。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド又はＲＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物は２本鎖オリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、アンチセンス化合物はキメラオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該化合物の少なくとも一部分はＲＮＡとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−ＲＮＡデュプレックスを形成する。
【００１５】
本発明のアンチセンス化合物は該ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の相補性を有してよい。同様に本明細書において提供されるものは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結、糖部分又は核酸塩基を有するアンチセンス化合物である。１つの実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分又は少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結又は両方を有する。
【００１６】
本明細書において提供されるものは、５’−未翻訳領域（５’ＵＴＲ）、開始領域、コーディング領域、終止領域又は３’−未翻訳領域（３’ＵＴＲ）から選択されるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の領域内で特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸分子である。同様に提供されるものは、５’ＵＴＲ中のヌクレオチド１４６〜１６５、コーディング領域中のヌクレオチド３７２〜３９１、４２０〜５２０又は５４４〜５９３、終止コドン領域中のヌクレオチド５８９〜６０８、３’ＵＴＲ中のヌクレオチド６２３〜７６６、８０３〜９４０、１１０５〜１５９９、１８６８〜１８８７、１９９０〜１９１９、１９６２〜１９８１、２２１８〜２２４２、２３７７〜２４０１、２４４９〜２４９０、２５３６〜２５５５又は２５７８〜２５９７、配列番号４の全て；イントロン１中のヌクレオチド８８９２〜８９１１及び１１５５９〜１１９３７、及びイントロン１：エクソン２接合部中のヌクレオチド１７９４１〜１７９６０、配列番号２５の全て；配列番号２６の３’ＵＴＲ中のヌクレオチド２０８８〜２１０７及び配列番号２７の３’ＵＴＲ中のヌクレオチド６９７〜７１６にターゲティングされたアンチセンス化合物であり、ここで化合物はヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。更に提供されるものは、５’ＵＴＲ中のヌクレオチド９〜１０５；コーディング領域中のヌクレオチド１３２〜４８０；終止コドン領域中のヌクレオチド４７３〜４９２；及び３’ＵＴＲ中のヌクレオチド５００〜１１７５，１２２２〜１６３８、１６６２〜１７８０、配列番号１１の全て；配列番号１０７の３’ＵＴＲ中のヌクレオチド３６５〜３８４；及び配列番号１０８の５’ＵＴＲ中のヌクレオチド３６〜５５にターゲティングされたアンチセンス化合物であり、ここで化合物はマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。更に本明細書において提供されるものは５’ＵＴＲ中のヌクレオチド７〜２６、コーディング領域のヌクレオチド７〜１５１、１６４〜２４７、２７０〜３１３又は３０３〜３８８；終止コドン領域中のヌクレオチド３９０〜４０９及び３’ＵＴＲ中のヌクレオチド４０２〜４９０、配列番号１８の全てにターゲティングされたアンチセンス化合物であり、ここで化合物はラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。
【００１７】
１つの実施形態において、アンチセンス化合物は配列番号
【００１８】
【化７】
2009516710.tif 000002
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含む。別の実施形態においては、アンチセンス化合物は配列番号
【００１９】
【化８】
2009516710.tif 000003
及び２５８よりなる群から選択される配列を有する。別の実施形態においては、アンチセンス化合物は配列番号２９、３１、３２、３３、６０、６１、６５又は７５から選択される配列を有する。
【００２０】
同様に本明細書において提供されるものは、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現が抑制されるように本発明のアンチセンス化合物の治療上又は予防上有効な量をｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に関連する疾患又は状態を有する動物に投与することを含む該動物の治療方法である。一部の実施形態においては、動物はヒト又はげっ歯類である。一部の実施形態においては、疾患又は状態は代謝性疾患又は状態である。他の実施形態においては、疾患又は状態は糖尿病、メタボリックシンドロームＸ、肥満、高脂血症、前糖尿病又は血中トリグリセリド上昇である。１つの実施形態において、疾患又は状態は２型糖尿病である。同様に本明細書において提供されるものは、本明細書のアンチセンス化合物を血中グルコースレベル低下の治療を要する動物に投与することを含む、そのような動物におけるそのような方法である。一部の実施形態においては、血中グルコースレベルは血漿中グルコースレベル又は血清中グルコースレベルである。一部の実施形態においては、動物は糖尿病動物である。
【００２１】
更に提供されるものは、本発明の化合物をインスリン感受性を向上させる治療の必要な動物に投与することを含む該動物におけるそのような方法である。一部の実施形態においては、動物は糖尿病、肥満又は高インスリン血症である。同様に提供されるものは、動物において血中脂質レベルを低下させる方法であり、それは本発明のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含む。一部の実施形態においては、血中脂質レベルは血中トリグリセリドレベルである。一部の実施形態においては、血中脂質レベルは血清中又は血漿中の脂質レベルである。
【００２２】
本発明の別の特徴は、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を肥満、高血糖症、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症又はインスリン抵抗性の対象に投与することを含む、該対象におけるこれ等を治療する方法であり、ここで該化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する。１つの実施形態において、化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードし、そして配列番号
【００２３】
【化９】
2009516710.tif 000004
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含む核酸分子に少なくとも８０％の相補性を有する。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の相補性を有する。
【００２４】
同様に提供されるものは、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にターゲティングされた１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物を動物に投与することを含む該動物における体脂肪減少、肝トリグリセリドレベル低下、グルコース耐性の向上及び脂肪生成の減少の方法であり、ここで該化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する。１つの実施形態において、化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードし、そして配列番号
【００２５】
【化１０】
2009516710.tif 000005
又は２５８の少なくとも８核酸塩基部分を含む核酸分子に少なくとも８０％の相補性を有する。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の相補性を有する。一部の実施形態においては、動物は脂肪症を有する。一部の実施形態においては、脂肪症は脂肪肝又はＮＡＳＨである。本発明の別の特徴は本発明のアンチセンス化合物を動物に投与することを含む該動物の脂肪組織における脂肪生成に関与する遺伝子の発現を低減する方法である。一部の実施形態においては、脂肪生成に関与する遺伝子はＤＧＡＴ２及びＦＡＳである。同様に提供されるものは本発明のアンチセンス化合物を動物に投与することを含む該動物におけるグルコース代謝に関与する遺伝子の肝発現をモジュレートする方法である。１つの実施形態において、グルコース代謝に関与する遺伝子はグルコース−６−ホスファターゼ及びグリコーゲンシンターゼである。一部の実施形態においては、該動物は代謝性の疾患又は状態を有する。一部の実施形態においては、代謝性の疾患又は状態は肥満、高脂血症、高血糖症、糖尿病、メタボリックシンドローム又はインスリン抵抗性である。特定の実施形態においては、代謝性の疾患又は状態は２型糖尿病である・
一部の実施形態においてはアンチセンス化合物は配列番号
【００２６】
【化１１】
2009516710.tif 000006
又は２５８の核酸塩基配列を有する。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物は５個の２’−ＭＯＥヌクレオチドにより自身の５’及び３’末端においてフランキングされた１０デオキシヌクレオチドギャップを特徴とする。一部の実施形態においては、少なくとも１つのシトシンは５−メチルシトシンであるか、又は少なくとも１つヌクレオシド間連結はホスホロチオエート連結である。１つの実施形態においては、アンチセンス化合物中のシトシンの全てが５−メチルシトシンである。別の実施形態においては、ヌクレオシド間連結の全てがホスホロチオエート連結である。
【００２７】
Ａ．本発明の概論
「アンチセンス機序」とはハイブリダイゼーションの結果が所望の作用の達成となるような標的核酸とのアンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物のハイブリダイゼーションを包含する。所望の作用は例えば標的の分解、標的の占有と同時に起こる細胞機序、例えば転写又はスプライシング又は他の表現型作用の一端停止を包含できる。
【００２８】
「アンチセンス抑制」とは標的核酸とのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果としての標的発現の抑制を指す。一部の実施形態においては、アンチセンス抑制は、標的核酸レベル、標的核酸によりコードされる蛋白のレベル、又は、標的核酸の発現に関連する表現型の変化の程度における低下により顕在化される。
【００２９】
本発明はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の機能又は作用をモジュレートする場合において使用するためのアンチセンス化合物、好ましくはオリゴヌクレオチド及び同様の物質種を用いる。これはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子１つ以上に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。本明細書においては、「標的核酸」及び「ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子」という用語はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ又はその部分を包含）及びそのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを包含するために好都合に使用されている。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションは一般的に「アンチセンス」と称される。結果として、本発明の一部の好ましい実施形態の実施に包含されると考えられる好ましい機序は本明細書においては「アンチセンス抑制」と称する。そのようなアンチセンス抑制は典型的にはオリゴヌクレオチドの鎖又はセグメントの水素結合系ハイブリダイゼーションに基づいており、その場合、少なくとも１つの鎖又はセグメントが切断、分解又は別様に作動不可能とされる。この点に関し、そのようなアンチセンス抑制のためには特定の核酸分子及びその機能をターゲティングすることが現時点では好ましい。
【００３０】
干渉されるべきＤＮＡの機能は複製及び転写を包含する。複製及び転写は例えば、内因性の細胞鋳型、ベクター、プラスミドコンストラクト又は他のものから行うことができる。干渉されるべきＲＮＡの機能は、蛋白翻訳の部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡ合成の部位から遠い細胞内の部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからの蛋白の翻訳、ＲＮＡのスプライシングによる１つ以上のＲＮＡ種の生成、及び、ＲＮＡが携わっているかこれにより促進されるＲＮＡの関与する触媒活性又は複合体形成のような機能を包含できる。標的核酸機能のそのような干渉の１つの好ましい結果はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現のモジュレーションである。本発明に関する場合、「モジュレーション」および「発現のモジュレーション」は例えばＤＮＡ又はＲＮＡのような遺伝子をコードする核酸分子の量又はレベルにおける増大（刺激）又は低減（抑制）の何れかを意味する。抑制は頻繁には発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡは頻繁には好ましい標的核酸である。
【００３１】
本発明に関する場合、「ハイブリダイゼーション」とはオリゴマー化合物の相補鎖の付け異性を意味する。本発明においては、対形成の好ましい機序は水素結合を包含し、これはオリゴマー化合物の鎖の相補ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間のワトソンクリック型、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型の水素結合であってよい。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成を介して対形成する相補核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは種々の状況下に起こることができる。
【００３２】
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が標的核酸の正常な機能を干渉して活性の消失をもたらし、そして、特異的結合が望まれる条件下において、即ちインビボ試験又は治療の場合は生理学的条件下において、そしてインビトロ試験の場合は試験が実施される条件下において、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００３３】
本発明においては、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」という表現は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが他の配列には最低限の数となるような条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況では異なり、そして本発明に関する場合、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」はオリゴマー化合物の性質及び組成、及び、それらが検討される試験により決定される。
【００３４】
「相補」とは本明細書においては、オリゴマー化合物の２つの核酸塩基の間の厳密な対形成のための能力を指す。例えば、あるオリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合することができる場合であって該標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は相補位置と見なされる。オリゴヌクレオチド及び別のＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子は、各々の分子中の相補位置の十分な数が相互に水素結合できる核酸塩基により占有されている場合に相互に相補となる。即ち、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補」とは、安定で特異的な結合がオリゴヌクレオチドと標的核酸の間に生じるように、十分な数の核酸塩基に渡って厳密な対形成又は相補性の十分な程度を示すために使用される用語である。
【００３５】
当該分野で知られる通り、アンチセンス化合物の配列は特異的にハイブリダイズすべきその標的核酸のものと１００％相補である必要はない。更に又、オリゴヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないようなセグメント１つ以上に渡ってハイブリダイズしておい（例えばループ構造又はヘアピン構造）。本発明のアンチセンス化合物は標的核酸内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％の配列相補性を含むことが好ましく、より好ましくは、それらはそれらがターゲティングされる標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも９０％の配列相補性を含み、そして更に好ましくは少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうち１８が標的領域に相補であり、従って特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を示す場合がある。この例においては残余の非相補の核酸塩基は集塊化するか、相補核酸塩基が散在したものであってよく、そして相互に、又は相補核酸塩基と隣接する必要はない。即ち、標的核酸と完全相補な２領域によりフランキングされた４非相補核酸塩基を有する１８核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の全体的相補性を有することになり、そして、このため本発明の範囲に包含されることになる。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物のパーセント相補性は日常的には当該分野で知られたＢＬＡＳＴプログラム（ベーシックローカルアライメントサーチツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）。
【００３６】
パーセント相同性、配列同一性又は相補性は例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用するデフォルト設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）により決定できる（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）。一部の好ましい実施形態においては、オリゴマーと標的との間の相同性、配列同一性又は相補性は約５０％〜約６０％である。一部の実施形態においては、相同性、配列同一性又は相補性は約６０％〜約７０％である。好ましい実施形態においては、相同性、配列同一性又は相補性は約７０％〜約８０％である。より好ましい実施形態においては、相同性、配列同一性又は相補性は約８０％〜約９０％である。一部の好ましい実施形態においては、相同性、配列同一性又は相補性は約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％である。
【００３７】
Ｂ．本発明の化合物
本発明によれば、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、オルタナティブスプライシング体、プライマー、プローブ及び標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を包含する。即ち、これ等の化合物は１本鎖、２本鎖、環状又はヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入してよく、そして、内部又は末端のバルジ又はループのような構造エレメントを含有してよい。系内に導入された後、本発明の化合物は１つ以上の酵素又は構造蛋白の作用を発揮して標的核酸を修飾する。
【００３８】
そのような酵素の１つの非限定的な例はＲＨＡｓｅＨ、即ちＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「ＤＮＡ様」である１本鎖アンチセンス化合物はＲＮＡｓｅＨを呈することが当該分野で知られている。従ってＲＨＡｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介抑制の効率が大きく増大する。同様の役割は酵素のＲＮａｓｅＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＬファミリーのもののような他のリボヌクレアーゼについても仮想されている。
【００３９】
アンチセンス化合物の好ましい形態は１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種において２本鎖構造、例えば２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の導入が、遺伝子機能又はその関連の遺伝子産物の強力で特異的なアンチセンス媒介の減少を誘導することがわかっている。この現象は植物及び動物の両方で生じ、そしてウィルス防御及びトランスポゾンサイレンシングへの進化学的関連性を有していると考えられる。
【００４０】
ｄｓＲＮＡが動物において遺伝子サイレンシングをもたらすことの最初の証拠は線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおける研究から１９９５年に得られている（Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｋｅｍｐｈｅｕｓ，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，６１１−６２０）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等はｄｓＲＮＡの主要な干渉作用は転写後であることを示している（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２−１５５０７）。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露から生じるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいて定義された転写後のアンチセンス機序はそれ以来ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と標記されている。この用語は内因性のターゲティングされたｍＲＮＡのレベルの配列特異的低下をもたらすｄｓＲＮＡの導入の関与するアンチセンス媒介遺伝子サイレンシングを意味する（Ｆｉｒｅ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６−８１１）。近年、これは実際はＲＮＡｉの強力な誘導物質であるｄｓＲＮＡのアンチセンス極性の１本鎖ＲＮＡオリゴマーであることがわかった（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４−６９７）。
【００４１】
本発明のアンチセンス化合物は、化合物のヌクレオチド位置１つ以上において異なる塩基が存在する修飾された化合物も包含する。例えば、第１のヌクレオチドがアデノシンである場合は、この位置にチミジン、グアノシン又はシチジンを含有する修飾された化合物を生成してよい。これはアンチセンス化合物の位置の何れかにおいて行ってよい。次にこれ等の化合物を本明細書に記載した方法を用いて試験することにより、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制するそれらの能力を測定する。
【００４２】
本発明に関する場合、「オリゴマー化合物」という用語は単量体の単位複数を含む重合体又はオリゴマーを指す。本発明に関する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語はリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそのミメティック、キメラ、類縁体及び相同体のオリゴマー又は重合体を指す。この用語は天然に存在する核酸塩基、糖及び共有結合のヌクレオシド間（骨格）連結よりなるオリゴヌクレオチド、並びに、同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。そのような修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば増強された細胞取り込み、標的核酸への増強された親和性、及び、ヌクレアーゼ存在下の増強された安定性のために、ネイティブの形態よりも好ましい場合が多い。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは本発明のアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明はアンチセンス化合物の他のファミリー、例えば限定しないが、本明細書に記載したもののようなオリゴヌクレオチドの類縁体及びミメティックも同様に包括する。
【００４４】
本発明によるアンチセンス化合物は好ましくは約８〜約８０核酸塩基を含む（即ち約８〜約８０の連結ヌクレオシド）。当該分野で知られる通り、本発明は
【００４５】
【化１２】
2009516710.tif 000007
又は８０核酸塩基長の化合物を実施形態とする。
【００４６】
１つの好ましい実施形態においては、本発明のアンチセンス化合物は１３〜５０核酸塩基長である。当該分野で知られる通り、本発明は
【００４７】
【化１３】
2009516710.tif 000008
又は５０核酸塩基長の化合物を実施形態とする。
【００４８】
別の好ましい実施形態においては、本発明のアンチセンス化合物は１５〜３０核酸塩基長である。当該分野で知られる通り、本発明は
【００４９】
【化１４】
2009516710.tif 000009
又は３０核酸塩基長の化合物を実施形態とする。
【００５０】
特に好ましい化合物は、約１２〜約５０核酸塩基のオリゴヌクレオチドであり、更に好ましくは約１２〜約３０核酸塩基を含むものである。別の実施形態においては、本発明の化合物は約２０〜約３０核酸塩基長のオリゴヌクレオチドである。別の実施形態においては、本発明の化合物は約１３〜約３０核酸塩基長のオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
例示されるアンチセンス化合物内から選択される少なくとも８個の連続した核酸塩基のストレッチを含む１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物も適当なアンチセンス化合物と見なされる。
【００５２】
例示される好ましいアンチセンス化合物は例示される好ましいアンチセンス化合物の１つの５’末端から少なくとも８連続の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を包含する（残余の核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物の５’末端の直ぐ上流で始まり、そして、オリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで続く同じオリゴヌクレオチドの連続ストレッチである）。同様に、好ましいアンチセンス化合物は例示される好ましいアンチセンス化合物の１つの３’末端から少なくとも８連続の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列により示される（残余の核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物の３’末端の直ぐ下流で始まり、そして、オリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで続く同じオリゴヌクレオチドの連続ストレッチである）。更に又、当然ながら、好ましいアンチセンス化合物は、例示される好ましいアンチセンス化合物の配列の内部の部分から少なくとも８連続核酸塩基を含み、そしてオリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで何れか又は両方の方向に伸長してよいオリゴヌクレオチド配列により表されてよい。
【００５３】
例示されるアンチセンス化合物内から選択される少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む１２〜８０核酸塩基長のアンチセンス化合物も適当なアンチセンス化合物と見なされる。当然ながら、当然ながら、好ましいアンチセンス化合物は、例示される好ましいアンチセンス化合物の配列の内部の部分から少なくとも１２連続核酸塩基を含み、そしてオリゴヌクレオチドが約１２〜約８０核酸塩基を含有するまで何れか又は両方の方向に伸長してよいオリゴヌクレオチド配列により表されてよい。
【００５４】
本明細書に記載した好ましいアンチセンス化合物を保有する当業者は、予定外の実験をすることなく、更に好ましいアンチセンス化合物を識別することができる。
【００５５】
Ｃ．本発明の標的
特定の核酸分子にアンチセンス化合物をターゲティングすることは、本発明に関する場合、多工程のプロセスであることができる。プロセスは通常は機能をモジュレートすべき標的核酸の識別から開始する。標的核酸は、例えば、発現が特定の障害又は疾患の状態に関連している細胞性の遺伝子（又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、又は、感染性物質に由来する核酸分子であることができる。本発明においては標的核酸はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする。
【００５６】
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＲＮＡ転写物」及び「核酸標的」という用語は全て、本明細書に開示した化合物及び方法によりターゲティングされることができる何れかの核酸を指す。例えば、標的核酸は細胞性の遺伝子（又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、又は、感染性の生物に由来する核酸分子であることができる。本明細書に開示する通り、標的核酸分子はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２又はそのフラグメントをコードする。本明細書においては、「ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２標的核酸」及び「ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸」という用語は核酸、例えばＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ（例えばプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ）、及び、そのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを包含する。１つの実施形態において、ヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸は配列番号４として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４０９６．３である。別の実施形態においては、マウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸は配列番号１１として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１０１２４．１である。別の実施形態においては、ラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸は配列番号１８として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿２１５４１４．１である。「ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡ」とはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２蛋白をコードするｍＲＮＡを指す。
【００５７】
「ターゲティング」とは標的核酸分子に特異的にハイブリダイズして所望の作用を誘導する化合物の設計及び選択のプロセスを指す。このプロセスにより設計又は選択された化合物は標的核酸分子に「ターゲティングされた」と称する。ターゲティングは所望の作用が起こるように化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの「標的セグメント」の決定を包含する。一部の実施形態においては、所望の作用とは標的核酸分子の低減、標的核酸によりコードされる蛋白のレベルの低下、又は標的核酸に関連する表現型の変化である。「ｍＲＮＡレベル」とは特定の試料中の特定のｍＲＮＡの相対量を指し、「蛋白レベル」とは特定の試料中の蛋白の相対量を指す。
【００５８】
ターゲティングプロセスは通常は更に、所望の作用、例えば発現のモジュレーションが生じるようにアンチセンス相互作用が起こるための、標的核酸内部の少なくとも１つの標的領域、セグメント又は部位の決定を包含する。本発明に関する場合、「領域」という用語は少なくとも１つの識別可能な構造、機能又は特性を有する標的核酸の一部分として定義される。標的核酸の領域内にセグメントが含まれる。「セグメント」とは標的核酸内の領域のより小さい、又は、サブ部分として定義される。「部位」とは、本明細書においては、標的核酸内の位置として定義される。
【００５９】
「ターゲティング」とは標的核酸分子にハイブリダイズして所望の作用を誘導する化合物の設計及び選択のプロセスを指す。このプロセスにより設計又は選択された化合物は標的核酸分子に「ターゲティングされた」と称する。ターゲティングは所望の作用が起こるように化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの「標的セグメント」の決定を包含する。一部の実施形態においては、所望の作用とは標的核酸分子の低減、標的核酸によりコードされる蛋白のレベルの低下、又は標的核酸に関連する表現型の変化である。「ｍＲＮＡレベル」とは特定の試料中の特定のｍＲＮＡの相対量を指し、「蛋白レベル」とは特定の試料中の蛋白の相対量を指す。
【００６０】
本明細書においては、「標的領域」とは「標的セグメント」１つ以上を含有する特定の化合物がターゲティングされる標的核酸のフラグメントを包含する。「標的セグメント」は特定の化合物がターゲティングされる標的核酸のヌクレオチドの配列を指す。「５’標的部位」とは化合物がターゲティングされる特定の標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」とは化合物がターゲティングされる特定の標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。１つの実施形態において標的領域は核酸の構造的に定義された領域である。例えば、標的領域は３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終止領域、これ等の何れかの組み合わせ、又は、他の定義された核酸領域を包含してよい。別の実施形態においては、標的領域は複数の標的セグメントを包含する標的核酸の領域である。例えば、標的領域は領域内の最初の標的セグメントの５’標的から、領域内の最終標的セグメントの３’標的部位までの領域に及んでいる配列であってよい。或いは、標的領域は他の手段により識別される領域であってよい。標的領域内で多数の標的セグメントが重複していてよい。或いは、それらは非重複であってよい。即ち、多数のアンチセンス化合物が特定の標的領域上の重複した配列にハイブリダイズしてよい。標的セグメントは隣接していてよい。標的領域内の標的セグメントはヌクレオチドにより分離されていてよい。１つの実施形態において、標的領域内の標的セグメントは標的核酸上の約１０ヌクレオチド以下により分離されている。別の実施形態においては、標的領域内の標的セグメントは標的核酸上の約５ヌクレオチド以下により分離されている。適当な標的セグメントは５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロン又はエクソン又はこれ等の何れかの組み合わせの内部に存在してよい。開始コドン又は終止コドンを含有する標的セグメントもまたターゲティングに適している。
【００６１】
アンチセンス化合物を選択するための標的セグメント又は標的領域の決定は標的核酸配列を他の核酸配列と比較することにより「非標的」配列又は「オフターゲット配列」に非特異的な態様においてハイブリダイズする可能性のあるアンチセンス化合物配列の選択を防止することを包含する。本明細書においては、「非標的」又は「オフターゲット」配列はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードするもの以外の配列を包含する。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて種々の異なる核酸の間の同様性の領域を識別してよい。
【００６２】
本明細書においては、「活性な標的領域」とは１つ以上の「活性なアンチセンス化合物」が結合する標的核酸上の何れかの標的領域を指す。「活性な標的セグメント」とは活性なアンチセンス化合物が結合する核酸の特定の配列である。「活性なアンチセンス化合物」とは標的核酸にハイブリダイズして所望の作用を起こすものである。１つの実施形態において、所望の作用とは標的の発現を効果的に低減又は抑制することである。効果的な低減又は抑制はｍＲＮＡ又は蛋白のレベルの低下により、又は、表現型変化により顕在化できる。他の実施形態においては、他の所望の作用を用いて「活性な標的領域」を決定してよい。
【００６３】
当該分野で知られる通り翻訳開始コドンは典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；相当するＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンはまた「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子はＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧがインビボで機能することがわかっている。即ち「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は、各例における開始アミノ酸典型的にはメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）であるとしても、多くのコドン配列を包含できる。更に又、真核生物及び原核生物の遺伝子は２つ以上のオルタナティブな開始コドンを有する場合があり、その何れの一方も特定の細胞型又は組織中において、又は、特定のセットの条件下において、翻訳の開始のために優先的に利用されてよいことも当該分野で知られている。本発明に関する場合、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」とはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためのインビボで使用されるコドンを指し、そのようなコドンの配列には関わらない。更に又、遺伝子の翻訳終止コドン（又は「終止コドン」）は３つの配列、即ち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（相当するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）の１つを有してよいことが当該分野で知られている。
【００６４】
「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は翻訳開始コドンからいずれかの方向（即ち５’又は３’）の約２５〜約５０隣接ヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部分を指す。同様に、「終止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語は翻訳終止コドンからいずれかの方向（即ち５’又は３’）の約２５〜約５０隣接ヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部分を指す。結果として、「開始コドン領域」（又は「翻訳開始コドン領域」）及び「終止コドン領域」（又は「翻訳終止コドン領域」）は全て本発明のアンチセンス化合物により効果的にターゲティングしてよい領域である。
【００６５】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を称するものとして当該分野で知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」もまた効果的にターゲティングしてよい領域である。本発明に関する場合、好ましい領域は遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドンを包含する遺伝子内領域である。
【００６６】
他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該分野で知られており、そしてこのためｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチド（又は遺伝子上の相当するヌクレオチド）を包含する５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）、及び、翻訳開始コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該分野で知られており、そしてこのためｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端の間のヌクレオチド（又は遺伝子上の相当するヌクレオチド）を包含する３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）を包含する。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は５’−５’トリホスフェート連結部を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に接続しているＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は５’キャップ構造自体並びにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含すると考えられる。更に又５’キャップ領域をターゲティングすることも好ましい。
【００６７】
一部の真核生物のｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは翻訳される前に転写物から切り取られる「イントロン」として知られる領域１つ以上を含有する。残余（そして従って翻訳された）領域は「エクソン」として知られており、そして共にスプライシングされて連続するｍＲＮＡ配列を形成する。スプライシング部位、即ちイントロン−エクソン接合部又はエクソン−イントロン接合部をターゲティングすることも又、異常なスプライシングが疾患に関与していることが疑われる、又は、特定のスプライシング産物の過剰生産が疾患に関与していることが疑われる状況において、特に有用である場合がある。再配列又は欠失による異常な融合接合部もまた好ましい標的部位である。異なる遺伝子原料に由来するｍＲＮＡ２つ（又はそれより多く）のスプライシングのプロセスを介して生成したｍＲＮＡ転写物は「融合転写物」として知られている。更に又、例えばＤＮＡ又はプレｍＲＮＡにターゲティングされたアンチセンス化合物を用いながらイントロンを効果的にターゲティングすることができることも知られている。
【００６８】
更に又、ＤＮＡの同じゲノム領域からオルタナティブＲＮＡ転写物を生成できることも知られている。これ等のオルタナティブ転写物は一般的に「変異体」として知られている。より特記すれば、「プレｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムＤＮＡから生成した他の転写物とはその開始又は停止位置において異なり、そして共にイントロン及びエクソンの配列を含有する、同じゲノムＤＮＡから生成した転写物である。
【００６９】
スプライシング中の１つ以上のエクソン又はイントロン領域又はその部分の切り出しにより、プレｍＲＮＡ変異体はより小さい「ｍＲＮＡ変異体」を生成する。結果として、ｍＲＮＡ変異体はプロセシングされたプレｍＲＮＡ変異体であり、各々のユニークなプレｍＲＮＡ変異体はスプライシングの結果としてユニークなｍＲＮＡ変異体を常時生成するはずである。これ等のｍＲＮＡ変異体はまた「オルタナティブスプライシング変異体」として知られている。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起こらない場合は、プレｍＲＮＡ変異体はｍＲＮＡ変異体として識別される。
【００７０】
転写を開始又は終止するためにオルタナティブシグナルを使用することを介して変異体を生成することができ、そして、プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡは１つより多い開始コドン又は終止コドンを保有することができることも、当該分野で知られている。オルタナティブ開始コドンを使用するプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを起源とする変異体はそのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「オルタナティブ開始変異体」として知られている。オルタナティブ終止コドンを使用するこのような転写物はそのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「オルタナティブ終止変異体」として知られている。オルタナティブ終止変異体の１つの特定の型は「ポリＡ変異体」であり、これにおいては生成した多数の転写物が転写機序による「ポリＡ終止シグナル」の１つのオルタナティブ選択から生じており、これによりユニークなポリＡ部位において終止する転写物が生成する。本発明に関する場合、本明細書に記載した変異体の型も又、好ましい標的核酸である。
【００７１】
好ましいアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の場所は、以降、「好ましい標的セグメント」と称する。本明細書においては、「好ましい標的セグメント」という用語は、活性なアンチセンス化合物がターゲティングされる標的領域の少なくとも８核酸塩基部分として定義される。理論に制約されないが、現時点では、これ等の標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのために接触することができる標的核酸の部分を提示していると考えられる。
【００７２】
特定の好ましい標的セグメントの特定の配列を本明細書に記載するが、当業者の知る通り、これ等は例示であり、本発明の範囲内の特定の実施形態を説明している。別の好ましい標的セグメントも当該分野で知られる通り識別してよい。
【００７３】
例示される好ましい標的セグメント内から選択された少なくとも８連続核酸塩基のストレッチを含む８〜８０核酸塩基長の標的セグメントもターゲティングのために適すると考えられる。
【００７４】
標的セグメントは例示される好ましい標的セグメントの１つの５’末端から少なくとも８連続核酸塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列を包含できる（残余の核酸塩基は標的セグメントの５’末端の直ぐ上流で始まり、そしてＤＮＡ又はＲＮＡが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで続く同じＤＮＡ又はＲＮＡの連続ストレッチである）。同様に好ましい標的セグメントは、例示される好ましい標的セグメントの１つの３’末端から少なくとも８連続核酸塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列により提示される（残余の核酸塩基は標的セグメントの３’末端の直ぐ下流で始まり、そしてＤＮＡ又はＲＮＡが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで続く同じＤＮＡ又はＲＮＡの連続ストレッチである）。更に又当然ながら、好ましいアンチセンス標的セグメントは、例示される好ましい標的セグメントの配列の内部の部分から少なくとも８連続核酸塩基を含み、そしてオリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで何れか又は両方の方向に伸長してよいＤＮＡ又はＲＮＡ配列により提示してよい。本明細書に記載した好ましい標的セグメントを保有する当業者は、予定外の実験をすることなく、更に好ましい標的セグメントを識別することができる。
【００７５】
１つ以上の標的領域、セグメント又は部位が識別された後、標的に十分相補である、即ち、十分良好に十分な特異性でハイブリダイズすることにより所望の作用を与えるアンチセンス化合物が選択される。
【００７６】
オリゴマーアンチセンス化合物は核酸塩基
【００７７】
【化１５】
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又はこれ等の何れかの組み合わせを含む標的核酸塩基配列（例えば実施例１３に開示されているもの）の領域にもターゲティングしてよい。
【００７８】
本発明の１つの実施形態において、アンチセンス化合物はヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子、例えば５’ＵＴＲ中のヌクレオチド１４６〜１６５、コーディング領域中のヌクレオチド３７２〜３９１、４２０〜５２０又は５４４〜５９３、終止コドン領域中のヌクレオチド５８９〜６０８、３’ＵＴＲ中のヌクレオチド６２３〜７６６、８０３〜９４０、１１０５〜１５９９、１８６８〜１８８７、１９００〜１９１９、１９６２〜１９８１、２２１８〜２２４２、２３７７〜２４０１、２４４９〜２４９０、２５３６〜２５５５又は２５７８〜２５９７、配列番号４の全て；イントロン１中のヌクレオチド８８９２〜８９１１及び１１５５９〜１１９３７、及びイントロン１：エクソン２接合部中のヌクレオチド１７９４１〜１７９６０、配列番号２５の全て；配列番号２６の３’ＵＴＲ中のヌクレオチド２０８８〜２１０７及び配列番号２７の３’ＵＴＲ中のヌクレオチド６９７〜７１６にターゲティングされ；ここで該化合物はヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。
【００７９】
本発明の別の実施形態においては、アンチセンス化合物はマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子、例えば５’ＵＴＲ中のヌクレオチド９〜１０５；コーディング領域中のヌクレオチド１３２〜４８０；終止コドン領域中のヌクレオチド４７３〜４９２；及び３’ＵＴＲ中のヌクレオチド５００〜１１７５，１２２２〜１６３８、１６６２〜１７８０、配列番号１１の全て；配列番号１０７の３’ＵＴＲ中のヌクレオチド３６５〜３８４；及び配列番号１０８の５’ＵＴＲ中のヌクレオチド３６〜５５にターゲティングされ；ここで該化合物はマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。
【００８０】
本発明の更に別の実施形態においては、アンチセンス化合物はラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子、例えば５’ＵＴＲ中のヌクレオチド７〜２６、コーディング領域のヌクレオチド７〜１５１、１６４〜２４７、２７０〜３１３又は３０３〜３８８；終止コドン領域中のヌクレオチド３９０〜４０９及び３’ＵＴＲ中のヌクレオチド４０２〜４９０、配列番号１８の全てにターゲティングされ；ここで該化合物はラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を抑制する。
【００８１】
Ｄ．スクリーニング及び標的のバリデーション
別の実施形態において、本明細書において識別される「好ましい標的セグメント」はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートする追加的化合物を得るためのスクリーニングにおいて使用してよい。「モジュレーター」とはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の発現を低減又は増大させ、そして好ましい標的セグメントに相補である少なくとも８核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング方法は候補モジュレーター１つ以上にｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを接触させ、そしてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の発現を低減又は増大させる候補モジュレーター１つ以上を選択する皇帝を含む。候補モジュレーターがｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の発現をモジュレート（例えば低減又は増大の何れか）することができることが判明した後、モジュレーターはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の機能を更に調査する試験において、又は、研究、診断又は治療薬としての使用のために、本発明に従って用いてよい。
【００８２】
本発明の好ましい標的セグメントは本発明のそれらの対応する相補アンチセンス化合物と組み合わせることにより、安定した２本鎖（デュプレックス）オリゴヌクレオチドを形成してよい。
【００８３】
そのような２本鎖オリゴヌクレオチド部分はアンチセンス機序を介して標的の発現をモジュレートし、そして翻訳並びにＲＮＡプロセシングを調節することが当該分野で知られている。更に又、２本鎖部分は化学的修飾に付してよい（Ｆｉｒｅ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６−８１１；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９５，８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓ等、Ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３−１１２；Ｔａｂａｒａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０−４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１  ５５０２−１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１，１５，１８８−２００）。例えばそのような２本鎖部分は、標的の酵素的分解をトリガーする標的へのデュプレックスのアンチセンス鎖の伝統的ハイブリダイゼーションにより標的を抑制することがわかっている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４−６９７）。
【００８４】
本発明のアンチセンス化合物はまた薬剤発見及び標的バリデーションの分野において適用できる。本発明はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２と疾患状態、表現型又は状態との間に存在する関係を解明するための薬剤発見作業における本明細書において識別される化合物及び好ましい標的セグメントの使用を包括する。これ等の方法は、本発明の化合物に試料、組織、細胞又は生物を接触させること、投与後のある時点においてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の核酸又は蛋白レベル及び／又は関連の表現型又は化学的エンドポイントを計測すること、及び場合により、未投与の試料又は本発明の別の化合物を投与した試料の計測値と比較することを含む、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２を検出又はモジュレートすることを包含する。これ等の方法は又、標的のバリデーションのプロセスに関して未知遺伝子の機能を測定するため、又は特定の疾患、状態又は表現型の治療又は防止のための標的としての特定の遺伝子産物の有効性を測定するために、他の実験と平行して、又は組み合わせて実施することができる。
【００８５】
Ｅ．キット、研究用試薬、診断薬及び治療薬
本発明のアンチセンス化合物は診断薬、治療薬、予防薬用に、そして研究用試薬及びキットとして利用できる。更に又、高度な特異性で遺伝子発現を抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するため、又は、生物学的経路における種々のメンバーの機能の間の区別のために、当業者により頻繁に使用される。
【００８６】
キット及び診断薬における使用のためには、本発明の化合物は、単独又は他の化合物又は治療薬と組み合わせて、示差的及び／又はコンビナトリアルな分析におけるツールとして使用することにより、細胞及び組織内で発現される遺伝子の一部分又は完全な相補物の発現パターンを解明することができる。
【００８７】
１つの非限定的な例として、細胞アンチセンス化合物１つ以上を投与した細胞又は組織内の発現パターンをアンチセンス化合物を投与しない対照細胞又は組織と比較し、そして得られたパターンは、検討している遺伝子の例えば疾患関連性、シグナリング経路、細胞局在化、発現レベル、大きさ、構造又は機能にそれらが関係しているものとして、遺伝子発現の示差的レベルについて分析する。これ等の分析は刺激又は未刺激の細胞に対して、そして発現パターンに影響する他の化合物の存在下又は非存在下で実施することができる。
【００８８】
当該分野で知られている遺伝子発現分析の方法の礼は、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイ（Ｂｒａｚｍａ  ａｎｄ  Ｖｉｌｏ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７−２４；Ｃｅｌｉｓ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現のシリアル分析）（Ｍａｄｄｅｎ等、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化されたｃＤＮＡの制限酵素増幅）（Ｐｒａｓｈａｒ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３，２５８−７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６−８１）、蛋白アレイ及びプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓ等、ＦＥＢ  ＳＬｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔ等、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３−５７）、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１−９８；Ｌａｒｓｏｎ等、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３−２０８）、サブトラクティブクローニング、示差的ディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃ  ａｎｄ  Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６−２１）、コンパラティブゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６−９６）、ＦＩＳＨ（経口インサイチュハイブリダイゼーション）手法（Ｇｏｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５−９０４）及び質量スペクトル分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５−４１）を包含する。
【００８９】
本発明のアンチセンス化合物は、これ等の化合物がｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子にハイブリダイズするため、研究及び診断のために有用である。例えば、効果的なｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤であるとして本明細書に開示した効率及び条件においてハイブリダイズすることがわかっているオリゴヌクレオチドはまた、それぞれ遺伝子の増幅又は検出に好都合な条件下における効果的なプライマー又はプローブとなり得る。これ等のプライマー又はプローブはｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法において、そして検出のための該核酸分子の増幅において、又はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の構造を更に検討する場合の使用のために、有用である。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をコードする核酸との本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にプライマー及びプローブのハイブリダイゼーションは当該分野で知られた手段で検出できる。そのような手段はオリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射標識、又は、何れかの他の適当な検出手段を包含してよい。試料中のｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のレベルを検出するためのそのような検出手段を用いるキットもまた製造してよい。
【００９０】
アンチセンスの特異性及び感受性はまた、治療用途のために当業者により考案される。アンチセンス化合物はヒトを包含する動物の疾患状態の治療において治療薬部分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬、例えばリボザイムはヒトに安全及び効果的に投与されており、そして多くの臨床治験が現在進行中である。即ち、アンチセンス化合物が細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための治療用法において有用であるように構成することができる有用な治療様式となり得ることが確立されている。
【００９１】
治療薬に関しては、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現をモジュレートすることにより治療できる疾患又は障害を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従ってアンチセンス化合物を投与することにより治療する。例えば、１つの非限定的な実施形態において、方法はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤の治療有効量を治療の必要な動物に投与する工程を含む。本発明のｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤は効果的にｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２蛋白の活性を抑制、又はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２蛋白の発現を抑制する。１つの実施形態において、動物におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の活性又は発現は約１０％抑制される。好ましくは、動物におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の活性又は発現は約３０％抑制される。より好ましくは、動物におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の活性又は発現は約５０％抑制される。即ち、オリゴマーアンチセンス化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡの発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％、モジュレートする。
【００９２】
例えばｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現の低減は動物の血清、脂肪組織、肝臓又は何れかの他の体液、組織又は臓器において測定してよい。好ましくは、分析される該液、組織又は臓器に含有される細胞は、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２蛋白をコードする核酸分子及び／又はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２蛋白自身を含有する。
【００９３】
本発明のアンチセンス化合物は適当な製薬上許容しうる希釈剤又は担体に化合物の有効量を添加することにより医薬組成物において使用できる。本発明の化合物及び方法の使用はまた予防的にも有用である場合がある。
【００９４】
本発明の化合物はｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現の抑制剤である。即ち、本発明の化合物は代謝性の疾患及び状態、特に糖尿病、肥満、高脂血症又はメタボリックシンドロームＸを治療するために有用であると考えられる。本発明の化合物は又、代謝性の疾患及び状態、特に糖尿病、肥満、高脂血症又はメタボリックシンドロームＸの発症を防止又は遅延するために有用であると考えられる。メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームＸ又は単にシンドロームＸとは、肥満、血中脂質不全、特に高い血中トリグリセリド、グルコース耐性、高血糖、及び高血圧を包含する危険因子の集団を指す（Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３  Ｊｕｌ  ３；９２（１Ａ）：３５ｉ−４２ｉ）。本発明の化合物は以外にも血中グルコース、例えば血漿中グルコースを低下させるため、及び、血中脂質、例えば血清中脂質、特に血清中コレステロール及び血清中トリグリセリドを低下させるために有効であることがわかっている。従って本発明の化合物は２型糖尿病、高い血中グルコース及び高脂血症の治療、防止及び発症遅延のために特に有用である。
【００９５】
Ｆ．修飾
当該分野で知られる通り、ヌクレオシドは塩基−糖の複合物である。ヌクレオシドの塩基部分は通常は場合により「核酸塩基」又は単に「塩基」と称される複素環塩基である。そのような複素環塩基の２つの最も一般的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスフェート基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドについては、ホスフェート基は糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに連結できる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、ホスフェート基は隣接するヌクレオシドと相互に共有結合することにより線状の重合体化合物を形成する。次に、この線状重合体化合物のそれぞれの末端が更に接続して環状の化合物を形成することができるが、線状化合物が一般的には好ましい。更に又、線状化合物は内部核酸塩基相補性を有する場合があり、従って、完全又は部分的に２本鎖化合物を形成するような態様において折り畳まれる。オリゴヌクレオチド内において、ホスフェート基は一般的にはオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものとされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結部又は骨格は３’から５’へのホスホジエステル連結である。
修飾されたヌクレオシド間連結部（骨格）
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例は修飾された骨格又は非天然のヌクレオシド間連結部を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。本明細書において定義する通り、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは骨格にリン原子を保持しているもの、及び骨格にリン原子を有さないものを包含する。本明細書の目的のため、そして場合により当該分野で参照される通り、自身のヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオチドと見なすことができる。
【００９６】
自身内部にリン原子を含有する好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリアミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホアミデート、例えば３’−アミノホスホアミデート及びアミノアルキルホスホアミデート、チオノホスホアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ノルマル３’−５’−連結部を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、それらの２’−５’連結アナログ及び、ヌクレオチド間連結部１つ以上が３’から３’、５’から５’又は２’から２’の連結部である反転した極性を有するものを包含する。反転した極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは最も３’側のヌクレオチド間連結における単一の３’から３’の連結部、即ち、非塩基性であってよい単一の斑点ヌクレオシドを含む（核酸塩基は消失しているか、その代わりにヒドロキシル基を有する）。種々の塩、混合塩及び遊離の酸の形態も包含される。
【００９７】
上記したリン含有連結部の調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第
【００９８】
【化１６】
2009516710.tif 000011
号及び同第５，６２５，０５０号を包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
自身内部にリン原子を包含しない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド内連結部、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結部、又は、１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間連結部により形成される骨格を有する。これ等には、モルホリノ連結部（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の部分を有する他のものを有するものが包含される。
【０１００】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第
【０１０１】
【化１７】
2009516710.tif 000012
号及び同第５，６７７，４３９号を包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
修飾された糖及びヌクレオシド間連結部のミメティック
他の好ましいアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチドミメティックにおいて、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結部（即ち骨格）の両方は新規な基により置き換えられている。核酸塩基単位は適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持されている。１つのそのような化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することがわかっているオリゴヌクレオチドミメティックはペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置き換えられている。核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡの調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９，２６２号を包含し、これ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡの別の教示はＮｉｅｌｓｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態はホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、及び、ヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、そして特に上記参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここでネイティブのホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］及び上記参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。同様に好ましいものは、上記参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
修飾された糖
修飾されたアンチセンス化合物はまた１つ以上の置換された糖部分を含有してよい。好ましいものは、２’位に以下のもの、即ち：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ただしここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換された、又は未置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであるもの、の１つを含むアンチセンス化合物、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特に好ましいものはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２、ただし式中ｎ及びｍは１〜約１０であるものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは２’位に以下のもの、即ち：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させる基、又は、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基の１つを含む。好ましい修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ等、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ちアルコキシアルコキシ基を包含する。更に好ましい修飾は２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち後述する実施例に記載するようなＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られているもの、および、やはり後述する実施例に記載する２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を包含する。
【０１０３】
他の好ましい修飾は２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。２’−修飾はアラビノ（上）位又はリボ（下）位に会ってよい。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は又、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上、又は２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、又は５’末端ヌクレオチドの５’位において行ってもよい。アンチセンス化合物は又ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖ミメティックを有してもよい。このような修飾された糖の構造の調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第
【０１０４】
【化１８】
2009516710.tif 000013
号及び同第５，７００，９２０号を包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
更に好ましい修飾は２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結することにより２環の糖部分が形成されているロックド核酸（ＬＮＡ）を包含する。連結部は好ましくは２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ここでｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製はＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
天然及び修飾された核酸塩基
アンチセンス化合物はまた核酸塩基（頻繁には当該分野において複素環塩基又は単に「塩基」と称される）の修飾又は置換を包含してよい。本明細書においては、「未修飾」又は「天然」の核酸塩基はプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を包含する。修飾された核酸塩基は他の合成及び天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチル  シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾ  ウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン，２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを包含する。その他の修飾された核酸塩基は３巻のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換されたフェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を包含する。修飾された核酸塩基は又プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリジンで置き換えられているものを包含してよい。別の核酸塩基は米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｐ８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．  Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐ２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものを包含��る。これ等の核酸塩基の特定のものは本発明の化合物の結合親和性を増大させる場合に特に有用である。これ等には５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが包含される。５−メチルシトシン置換が核酸デュプレックスの安定性を０．６〜１．２℃上昇させることがわかっており、そして、現時点では、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に更に好ましい塩基置換となる。
【０１０６】
上記した修飾された核酸塩基並びに他の修飾された核酸塩基の特定のもの調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第３，６８７，８０８号並びに米国特許第
【０１０７】
【化１９】
2009516710.tif 000014
号及び同第５，６８１，９４１号を包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により本明細書に組み込まれ、そして米国特許第５，７５０，６９２号も包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
コンジュゲート
本発明のアンチセンス化合物の別の修飾では、アンチセンス化合物にオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強する部分又はコンジュゲート１つ以上を化学的に連結する。これ等の部分又はコンジュゲートは第１又は第２ヒドロキシル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基を包含できる。本発明のコンジュゲート基はインターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及び、オリゴマーの薬物動態特性を増強する基を包含する。典型的なコンジュゲート基はコレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び染料を包含する。薬力学的特性を増強する基は、本発明に関する場合、取り込みを向上させ、分解への抵抗性を増強し、及び／又は、標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を包含する。薬物動態特性を増強する基は、本発明に関する場合、本発明の化合物の取り込み、分泌、代謝又は排出を向上させる基を包含する。代表的なコンジュゲート基は参照により全体が本明細書に組み込まれる１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。コンジュゲート部分は限定しないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又は、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、又は、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分を包含する。本発明のアンチセンス化合物はまた、活性な薬品物質、例えばアスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤又は抗生物質にコンジュゲートしてもよい。オリゴヌクレオチド−薬品コンジュゲート及びそれらの製造は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日出願）に記載されている。
【０１０８】
このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示している代表的な米国特許第は限定しないが、米国特許第
【０１０９】
【化２０】
2009516710.tif 000015
号及び同第５，６８８，９４１号を包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ化合物
所定の化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際は、上記した修飾の１つより多くが単一の化合物中に、又、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいてさえも、取り込まれてよい。
【０１１０】
本発明はまたキメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」とは本発明に関する場合、各々が少なくとも１つの単量体単位、即ちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成されている２つ以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。即ちキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の１つの形態である。これ等のオリゴヌクレオチドは典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞取り込み、増大した安定性及び／又は標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに対して付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの追加的領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として作用してよい。例えば、ＲＨＡｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。従ってＲＮａｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介浴しえの効率を大きく増強する。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断は、同様の態様において、細胞及びウィルスのＲＮＡの両方を切断するＲＮＡｓｅＬのようなエンドリボヌクレアーゼの作用を介して達成することができる。ＲＮＡ標的の切断は日常的にはゲル電気泳動、及び必要に応じて、当該分野で知られた関連の核酸ハイブリダイゼーション手法により検出できる。
【０１１１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は上記した通り２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチドミメティックの複合構造として形成してよい。そのような化合物は当該分野ではハイブリッド又はギャップマーとも称される。このようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第
【０１１２】
【化２１】
2009516710.tif 000016
号及び同第５，７００，９２２号を包含し、これ等の特定のものは本出願人により共通して保有されており、そしてこれ等の各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
Ｇ．製剤
本発明の化合物は取り込み、分布及び／又は吸収を支援するために、例えばリポソーム、受容体−ターゲティング分子、経口、直腸、局所又は他の製剤として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と添加混合、カプセル化、コンジュゲート又は別様に会合させてよい。このような取り込み、分布及び／又は吸収を支援する製剤の調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第
【０１１４】
【化２２】
2009516710.tif 000017
号及び同第５，５９５，７５６号を包含し、これ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
本発明のアンチセンス化合物は何れかの製薬上許容しうる塩、エステル又はそのようなエステルの塩、又は、ヒトを包含する動物に投与された場合にその生物学的に活性な代謝産物又は残基を（直接又は間接的に）与えることができる何れかの他の化合物を包含する。
【０１１６】
「製薬上許容しうる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的及び製薬上許容しうる塩、即ち、親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、それに対して望ましくない毒性学的な作用を付与しない塩を指す。オリゴヌクレオチドに関しては、製薬上許容しうる塩及びその使用の好ましい例は更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。オリゴヌクレオチドに関しては、製薬上許容しうる塩の現時点で好ましい例は、限定しないが、（ａ）カチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミン及びスペルミジン等と共に形成した塩；（ｂ）無機の酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と共に形成した塩；（ｃ）有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等と共に形成した塩；及び（ｄ）元素アニオン、例えば塩素、臭素、及びヨウ素と共に形成した塩を包含する。ナトリウム塩が現時点でより好ましいと考えられる。
【０１１７】
本発明は又、本発明のアンチセンス化合物を包含する医薬組成物及び製剤を包含する。本発明の医薬組成物は局所又は全身治療の何れが望まれるかに応じて、又は治療すべき領域に応じて、種々の態様において投与してよい。投与は局所的（例えば眼内又は粘膜、例えば膣内及び直腸送達）、肺内、例えば粉末又はエアロゾルの吸入又は通気によるもの、例えばネブライザーによるもの、髄腔内、鼻内、表皮又は経皮、経口又は非経腸であってよい。非経腸投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内又は脳室内の投与を包含する。少なくとも１つ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドが経口投与のために特に有用であると考えられる。局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末を包含してよい。従来の医薬品用の担体、水性、粉末又は油性の基剤、濃厚化剤等も必要又は望ましい場合がある。コーティングされたサック剤、グローブ剤等も有用である。
【０１１８】
単位剤型において好都合に提示してよい本発明の医薬品製剤は、医薬品産業においてよく知られた従来の手法に従って調製してよい。そのような手法は製薬用担体又は賦形剤に活性成分を会合させる工程を包含する。一般的に、製剤は液体担体又は微細分割固体担体又は両方に活性成分を均一及び緊密に会合させること、そして次に必要に応じてそれを成形して製品とすることにより調製する。
【０１１９】
本発明の組成物は多くの可能な剤型の何れか、例えば限定しないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬及び浣腸に製剤してよい。本発明の組成物は又、水性、非水性又は混合型の媒体中の懸濁液として製剤してもよい。水性懸濁液は更に懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含有してよい。懸濁液は又安定化剤を含有してよい。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は例えば限定しないが、溶液、乳液、フォーム及びリポソーム含有製剤を包含する。本発明の医薬組成物及び製剤は１つ以上の浸透増強剤、担体、賦形剤又は他の活性又は不活性の成分を含んでよい。
【０１２１】
乳液は典型的には通常は直径で０．１μｍを超過する液滴の形態において１つの液が別の液中に分散している不均質な系である。乳液は分散相に加えて他の成分及び水相、油相又はそれ自体別個の相中の溶液として存在してよい活性な薬剤を含有してよい。マイクロエマルジョンは本発明の実施形態として包含される。乳液及びそれらの使用は当該分野で良く知られており、そして更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。
【０１２２】
本発明の製剤はリポソーム製剤を包含する。本発明において使用する場合は、「リポソーム」という用語は球状の二層体内に配置された両親媒性の脂質よりなる小胞を意味する。リポソームは親油性物質から形成された膜及び送達すべき組成物を含有する水性の内部構造を有するユニラメラ又はマルチラメラの小胞である。カチオン性のリポソームは負荷電のＤＮＡと相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている正荷電のリポソームである。ｐＨ感受性又は負荷電であるリポソームはＤＮＡとは複合体を形成するのではなくそれを捕獲すると考えられている。カチオン性及び非カチオン性のリポソームが細胞へのＤＮＡの送達のために使用されている。
【０１２３】
リポソームは又「立体的に安定化された」リポソーム、即ち本明細書においては、リポソーム内に配合されれば特殊化された脂質を欠いているリポソームと相対比較して増強された循環系中の有効期間をもたらすそのような特殊化された脂質１つ以上を含むリポソームを指す用語も包含する。立体的に安定化されたリポソームの例はリポソームの小胞形成脂質部分の一部が１つ以上の糖脂質を含むか、１つ以上の親水性重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されているものである。リポソーム及びその使用は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。
【０１２４】
本発明の医薬品製剤及び組成物は界面活性剤も包含してよい。医薬製品、製剤及び乳液中の界面活性剤の使用は当該分野で良く知られている。界面活性剤及びその使用は更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。
【０１２５】
１つの実施形態において、本発明は核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達を行うために種々の浸透増強剤を使用する。非親油性薬品の細胞膜を通過する拡散の支援となることに加えて、浸透増強剤はまた親油性薬品の透過性も増強する。浸透増強剤は５種の広範な範疇、即ち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート形成剤及び非キレート形成性非界面活性剤の１つに属するものとして分類してよい。浸透増強剤及びその使用は更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。
【０１２６】
製剤は日常的にはその意図される用途、即ち投与経路に従って設計されることは当業者の知る通りである。
【０１２７】
局所投与のための好ましい製剤は本発明のオリゴヌクレオチドが局所送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート形成剤及び界面活性剤との添加混合物中にあるものを包含する。好ましい脂質及びリポソームは中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）負荷電（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及びカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を包含する。
【０１２８】
局所用又は他の投与のためには、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソーム内にカプセル化してよく、又は、それとの、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成してよい。或いはオリゴヌクレオチドは脂質、特にカチオン性脂質と複合体化してよい。好ましい脂肪酸及びエステル、製薬上許容しうるその塩及びそれらの用途は更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。局所用の製剤は参照により全体が本明細書に組み込まれる１９９９年５月２０日出願の米国特許出願０９／３１５，２９８号に詳細に記載されている。
【０１２９】
経口投与用の組成物及び製剤は粉末又は顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水又は非水性媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、ゲル、カプセル、香粉、錠剤又はミニ錠剤を包含する。濃厚化剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤又はバインダーが望ましい場合がある。好ましい経口用製剤は本発明のオリゴヌクレオチドが浸透増強剤、界面活性剤及びキレート形成剤の１つ以上と組み合わせて投与されるものである。好ましい界面活性剤は脂肪酸及び／又はそのエステル又は塩、胆汁酸及び／又はその塩を包含する。好ましい胆汁酸／塩及び脂肪酸及びその使用は更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。同様に好ましいものは浸透増強剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。特に好ましい組み合わせはラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。別の浸透増強剤はポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは噴霧乾燥粒子を包含する顆粒形態において経口送達するか、又は、複合体化してマイクロ又はナノ粒子を形成してよい。オリゴヌクレオチド複合体化剤及びその使用は更に全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号に記載されている。オリゴヌクレオチドに関する経口製剤及びその製造は米国特許出願第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）及び２００２年２月８日出願の同第１０／０７１，８２２号に記載されており、これ等の各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
非経腸、髄腔内又は脳室内投与のための組成物及び製剤は、滅菌水溶液を包含し、これは更に緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤、例えば限定しないが、浸透増強剤、担体化合物及び他の製薬上許容しうる担体又は賦形剤を含有しいてよい。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態はオリゴマー化合物１つ以上及び非アンチセンス機序により機能する他の化学療法剤１つ以上を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例は限定しないが、癌の化学療法剤、例えばダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ビスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、マイトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、窒素マスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシホルミシン、４−ヒドロキシパーオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を包含する。本発明の化合物と共に使用する場合、このような化学療法剤は個別に（例えば５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えば５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチドを一定期間、その後ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド）、又は他のそのような化学療法剤１つ以上と組み合わせて（例えば５−ＦＵ、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド、又は５−ＦＵ、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）使用してよい。抗炎症剤、例えば限定しないが、非ステロイド抗炎症剤及びコルチコステロイド及び抗ウィルス剤、例えば限定しないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルもまた本発明の組成物と組み合わせてよい。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス剤との組み合わせもまた本発明の範囲に包含される。２種以上の組み合わせた化合物は共に、又は逐次的に使用してよい。
【０１３２】
別の関連する実施形態において、本発明の組成物は第１の核酸にターゲティングされたアンチセンス、特にオリゴヌクレオチド１つ以上、及び、第１の核酸標的にターゲティングされた追加的アンチセンス化合物１つ以上を含有してよい。或いは、本発明の組成物は同じ核酸標的の異なる領域にターゲティングされたアンチセンス化合物２つ以上を含有してよい。アンチセンス化合物の多くの例が当該分野で知られている。２種以上の組み合わせた化合物は共に、又は逐次的に使用してよい。
【０１３３】
Ｈ．投薬
治療用組成物の製剤及びその後のそれらの投与（投薬）は当業者の知る通りである。投薬は治療すべき疾患状態の重症度及び応答性に応じたものであり、治療の過程は数日間から数ヶ月、又は治癒するか疾患状態の縮小が達成されるまで継続する。最適な投薬日程は患者の身体における薬品の蓄積の計測から計算できる。当業者であれば最適な用量、投薬方法及び反復速度は容易に決定できる。最適な用量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的力価により変動してよく、そして一般的にはインビトロ及びインビボの動物モデルにおいて有効であることがわかっているＥＣ５０に基づいて推定できる。一般的に、用量は体重ｋｇ当たり０．０１ｕｇ〜１００ｇであり、１回以上を毎日、毎週、毎月又は毎年、又は更には、２〜２０年毎に１回を投与してよい。当業者であれば体液又は組織中の薬品の測定された滞留時間及び濃度に基づいて投薬の反復速度を容易に推定できる。治療が良好に行われた後、患者には維持療法を行うことにより疾患状態の再発を防止することが望ましい場合があり、そのような場合には、オリゴヌクレオチドは体重ｋｇ当たり０．０１ｕｇ〜１００ｇの範囲の維持用量において、１日１回以上〜２０年毎に１回を投与する。
ＮＡＳＨ
「非アルコール性脂肪肝症」（ＮＡＦＬＤ）という用語は肝細胞における単純なトリグリセリドの蓄積（肝脂肪症）から炎症を伴う肝脂肪症の範囲の疾患スペクトルを包含する。肝脂肪症は肝臓の脂質含有量を特に測定することにより試験される。そのような試験は脂質の沈着を可視化するために一般的に使用されているオイルレッドＯ染色で染色され、そして核及び細胞質をそれぞれ可視化するためのヘマトキシリン及びエオシンで逆染色された凍結肝組織切片の組織学的分析を介して行ってよい。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は肝臓におけるトリグリセリドの沈着を超えてＮＡＦＬＤが進行することにより生じる。壊死、炎症及び線維症を誘導することができるセカンドヒットがＮＡＳＨの発症のためには必要である。セカンドヒットの候補は広範な範疇、即ち酸化性ストレスの増大を誘発する要因及びプロ炎症性サイトカインの発現を増進する要因に群分けすることができる。増大した肝トリグリセリドは動物及びヒトの肝細胞中の増大した酸化性ストレスをもたらし、肝トリグリセリド蓄積、酸化性ストレス及び肝脂肪症からＮＡＳＨへの進行の間の潜在的な原因−作用の関係を示していることが示唆されている（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４，１１４，１４７−１５２）。高グリセリド血症及び高脂肪酸血症は末梢組織におけるトリグリセリド蓄積を誘発する場合がある（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，３２２，１０８０−１０８５）。
【０１３４】
本明細書に記載した通り（実施例１６参照）、４Ｅ−ＢＰ２発現の低減は肝脂肪症を改善している。Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統における高脂肪給餌は、低脂肪食餌又は無栄養食塩水群と比較して肝ＴＧ含有量における５倍超の増加を示すことにより、重度の肝脂肪症を誘発していた。対照ＡＳＯ投与は含有量に影響しなかった。しかしながら４Ｅ−ＢＰ２ＡＳＯ投与は食塩水高脂肪給餌群又は対照ＡＳＯ投与高脂肪給餌群の両方と比較して肝ＴＧ含有量を劇的に低下させている（ｐ＜０．０１；図３Ａ）。
メタボリックシンドローム
「メタボリックシンドローム」は代謝起源の脂質及び非脂質の心臓血管の危険因子の集団として定義される。これはインスリン抵抗性として知られている全般性の代謝障害に緊密に関連付けられている。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ（ＡＴＰＩＩＩ）は５つの危険性決定因の３つ以上が存在する場合にメタボリックシンドロームの診断のための基準を確定した。５つの危険性決定因は、男性１０２ｃｍ超又は女性８８ｃｍ超の胴囲として定義される腹部肥満、１５０ｍｇ／ｄＬ異常のトリグリセリドレベル、男性４０ｍｇ／ｄＬ未満及び女性５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロールレベル、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧及び１１０ｍｇ／ｄＬ以上の絶食時グルコースレベルである。これ等の決定因は臨床慣行において容易に計測できる（ＪＡＭＡ，２００１，２８５：２４８６−２４９７）。
【０１３５】
メタボリックシンドロームの世界保健期間の定義は糖尿病、絶食時グルコース障害、グルコース耐性障害又はインスリン抵抗性（クランプ試験により評価）及び以下の基準、即ち胴囲の腰囲に対する比が男性で０．９０超又は女性で０．８５超、血清中トリグリセリド１．７ｍｍｏｌ／ｌ以上又はＨＤＬコレステロールが男性で０．９ｍｍｏｌ未満及び女性で１．０ｍｍｏｌ未満、血圧１４０／９０ｍｍＨｇ以上、尿中アルブミン排出速度２０μｇ／分超、又は、アルブミンのクレアチニンに対する比３０ｍｇ／ｇ以上、のうちの少なくとも２つである（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００５，２８（９）：２２８９−２３０４）。
【０１３６】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓの陳述書は危険因子集合を記載するメタボリックシンドロームの構成に関してコメントしている。伏在する病理生理学的特徴の研究のための参考意見の外に、推奨事項には全ての心臓血管病の危険因子の個別的及び積極的な治療が包含されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００５，２８（９）：２２８９−２３０４）。従って本発明の別の特徴は本発明のアンチセンス化合物を投与することによりメタボリックシンドロームに関連する危険性決定因又は基準の何れかを緩解する方法である。
【０１３７】
本明細書に記載する通り（実施例１６参照）、４Ｅ−ＢＰ２発現の低減は血中グルコースレベルを低下させ、インスリン感受性を向上させた。標準飼料給餌マウスと比較して、高脂肪給餌は高インスリン血症を誘発したのみならず、高血糖症も誘発した。対照ＡＳＯ投与はこれ等の２パラメーターに如何なる変化ももたらさなかった。しかしながら、４Ｅ−ＢＰ２ＡＳＯは血漿中インスリン及びグルコースのレベルを両方とも低下させた。これ等のデータは４Ｅ−ＢＰ２ＡＳＯ投与がインスリン感受性を向上させたことを示している。このことを更に確認するために、グルコース耐性試験を実施した。予測された通り、４Ｅ−ＢＰ２ＡＳＯ投与マウスにおけるグルコースエクスカーション曲線は何れの対照群の場合よりも有意に低値であった。遺伝子発現分析によれば、４Ｅ−ＢＰ２ＡＳＯ投与マウスにおいては肝Ｇ６Ｐａｓｅ（グルコース−６−ホスファターゼ）の発現は６５％超の低値であったのに対して肝ＧＳ（グリコーゲンシンターゼ）の発現は３０％超の高値であり、これ等のマウスにおける低減した肝グルコースアウトプットが示唆された。
【０１３８】
本発明はその好ましい実施形態の特定のものに従って特定的に説明してきたが、以下の実施例は本発明の例示に過ぎず、これを特定する意図はない。本出願において引用する参考文献、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号等は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３９】
実施例１
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をターゲティングするデュプレックスアンチセンス化合物の設計及びスクリーニング
本発明によれば、本発明の化合物を含むｄｓＲＮＡ及びそのミメティックを包含する一連のデュプレックス及びその相補物をｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をターゲティングするように設計することができる。デュプレックスのアンチセンス鎖の核酸塩基配列は本明細書に記載したｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２にターゲティングされたアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を含む。鎖の末端は１つ以上の天然又は修飾された核酸塩基の付加により修飾し、オーバーハングを形成してよい。次にｄｓＲＮＡのセンス鎖をアンチセンス鎖の相補物として設計して合成し、そして同様に何れかの末端に修飾又は付加を含有してよい。デュプレックスのアンチセンス及びセンス鎖は、約１７−２５ヌクレオチド、又は約１９−２３ヌクレオチドを含む。デュプレックスのアンチセンス及びセンス鎖は２０、２１又は２２ヌクレオチドを含む。
【０１４０】
例えば、１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡデュプレックスの両方の鎖は中央の核酸塩基に渡って相補であり、各々が一方又は両方の末端にオーバーハングを有する。
【０１４１】
例えば配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号２６１）を有し、そしてデオキシチミジン（ｄＴ）の２核酸塩基オーバーハングを有するアンチセンス鎖を含むデュプレックスは以下の構造：
【０１４２】
【化２３】
2009516710.tif 000018
を有することになる。
【０１４３】
オーバーハングは２〜６核酸塩基の範囲であることができ、これ等の核酸塩基は標的核酸に対して相補であってもなくてもよい。別の実施形態においては、デュプレックスは一方の端部にのみオーバーハングを有することができる。
【０１４４】
別の実施形態においては、同じ配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号２６１）を有するアンチセンス鎖を含むデュプレックスは下記：
【０１４５】
【化２４−１】
2009516710.tif 000019
に示す通り平滑末端を有する（１本鎖オーバーハングを有さない）ように調製してよい。ＲＮＡデュプレックスは単一分子又は２分子であることができ、即ち、２鎖は単一の分子の部分であることができ、又は、別個の分子であってもよい。
【０１４６】
デュプレックスのＲＮＡ鎖は当業者の日常的方法により合成するか、又は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入することができる。合成後、相補鎖をアニーリングする。１本鎖を小分けにし、５０□Ｍの濃度まで希釈する。希釈後、各鎖３０μｌをアニーリング緩衝液の５Ｘ溶液１５μＬと混合する。該緩衝液の終濃度は１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４及び２ｍＭ酢酸マグネシウムとする。採集容量は７５μＬである。この溶液を９０℃で１分間インキュベートし、次に１５秒間遠心分離する。管を３７℃で１時間静置させ、この時点でｄｓＲＮＡデュプレックスを実験に使用する。ｄｓＲＮＡデュプレックスの終濃度は２０μＭとする。
【０１４７】
調製後、デュプレックス化合物を、標的ｍＲＮＡレベルをモジュレートするその能力について評定する。細胞が８０％コンフルエントに達した時点で、それらを本発明のデュプレックス化合物で処理する。９６穴プレート中に生育している細胞については、ウェルを１回２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１減血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄し、次に５μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及び所望の終濃度のデュプレックスアンチセンス化合物を含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１で処理する。約４時間処理後、培地を新鮮培地に交換する。細胞は処理後１６時間に採取し、その時点でＲＮＡを単離し、標的の減少を本明細書に記載した定量的リアルタイムＰＣＲで計測する。
【０１４８】
実施例２
オリゴヌクレオチド単離
コントロールされた多孔性ガラス固体支持体から分離し、１２〜１６時間５５℃で濃水酸化アンモニウム中で脱ブロッキングした後、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドを＞３容量のエタノールを用いて１ＭのＮＨ４ＯＡｃ析出により回収する。合成されたオリゴヌクレオチドは電子スプレースペクトル分析器（分子量測定）により、そしてキャピラリーゲル電気泳動により分析し、少なくとも７０％完全長の物質であると判断した。合成で得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル連結の相対量を−１６ａｍｕ産物（＋／−３２＋／−４８）と相対比較した場合の正しい分子量の比により求めた。一部の試験では、オリゴヌクレオチドはＣｈｉａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２２６，１８１６２−１８１７１に記載の通りＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ精製物質を用いて得られた結果は非ＨＰＬＣ精製物質で得られたものと同様であった。
【０１４９】
実施例３
オリゴヌクレオチド合成−９６穴プレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは９６穴フォーマットにおいて同時に９６配列を組み立てることができる自動合成器上で固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学により合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間連結は水性ヨウ素による酸化により行った。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結は無水アセトニトリル中３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１時オキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いたイオウ化により形成した。標準塩基保護ベータシアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは市販品を購入した（例えばＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ又はＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。非鎖ヌクレオシドは標準的又は特許付与された方法により合成する。それらは塩基保護ベータシアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして使用する。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、１２〜１６時間高温（５５〜６０℃）において濃ＮＨ４ＯＨで脱保護し、次に遊離した生成物を真空下に乾燥した。次に乾燥した生成物を滅菌水に再懸濁してマスタープレートとし、これから全分析用及び試験用のプレート試料をロボットピペッターを用いて希釈した。
【０１５１】
実施例４
オリゴヌクレオチド分析−９６穴プレートフォーマット
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度は試料の希釈及びＵＶ吸収スペクトル分析により評価した。個々の精子得物の完全長の一貫性は９６プレートフォーマット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭＭＤＱ）において、又は、個々に調製した試料については市販のＣＥ装置（例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭ５０００、ＡＢＩ２７０）上のいずれかでキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により評定した。塩基及び骨格の組成は電子スプレー質量スペクトル分析器を用いて化合物の質量の分析により確認した。全試験の試験プレートはシングル及びマルチチャンネルのロボットピペッターを用いてマスタープレートから希釈した。プレート上の化合物の少なくとも８５％が少なくとも８５％完全長である場合にプレートを許容可能と判断した。
【０１５２】
実施例５
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の作用は、測定可能なレベルにおいて標的核酸が存在する限り種々の細胞型の何れにおいても試験できる。これは例えばＰＣＲ又はノーザンブロット分析を用いて日常的に測定できる。以下の細胞型を説明目的のために提示するが、他の細胞型も選択された細胞型で標的が発現される限り日常的に使用できる。これは当該分野で日常的な方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護試験又はＲＴ−ＰＣＲにより容易に測定できる。
Ｔ−２４細胞：
ヒト一過性細胞膀胱癌細胞系統Ｔ−２４はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｔ−２４細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ペニシリン１００単位／ｍＬ及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した完全ＭｃＣｏｙ５Ａ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして９０％コンフルエントに達した時点で希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析において使用するために７０００個／ウェルの細胞密度において９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２）に細胞を播種した。
【０１５３】
ノーザンブロッティング又は他の分析のためには、細胞を１００ｍｍ又は他の標準的な組織培養プレートに播種し、培地及びオリゴヌクレオチドの適量を用いて同様に処理してよい。
【０１５４】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞系統Ａ５４９はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ペニシリン１００単位／ｍＬ及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加したＤＭＥＭ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして９０％コンフルエントに達した時点で希釈した。
【０１５５】
ＮＨＤＦ細胞
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｋｊｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手した。ＮＨＤＦは供給元の推奨する通り添加物を加えた腺維芽細胞生育培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｋｊｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で日常的に維持した。細胞は供給元の推奨する通り１０継代まで維持した。
【０１５６】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｋｊｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手した。ＨＥＫは供給元の推奨する通り添加物を加えたケラチノサイト生育培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｋｊｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で日常的に維持した。細胞は供給元の推奨する通り１０継代まで日常的に維持した。
【０１５７】
ｂ．ＥＮＤ細胞：
マウス脳内皮細胞系統ｂ．ＥＮＤはＭａｘ  Ｐｌａｎｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤｒ．Ｗｅｒｎｅｒ  Ｒｉｓａｕより入手した。ｂ．ＥＮＤ細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして９０％コンフルエントに達した時点で希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析において使用するために３０００個／ウェルの細胞密度において９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に細胞を播種した。
【０１５８】
ノーザンブロッティング又は他の分析のためには、細胞を１００ｍｍ又は他の標準的な組織培養プレートに播種し、培地及びオリゴヌクレオチドの適量を用いて同様に処理してよい。
【０１５９】
Ａ１０細胞：
ラット大動脈平滑筋細胞系統Ａ１０はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ１０細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして８０％コンフルエントに達した時点で希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析において使用するために２５００個／ウェルの細胞密度において９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に細胞を播種した。
【０１６０】
ノーザンブロッティング又は他の分析のためには、細胞を１００ｍｍ又は他の標準的な組織培養プレートに播種し、培地及びオリゴヌクレオチドの適量を用いて同様に処理してよい。
【０１６１】
ＥＭＴ−６細胞：
マウス乳房上皮癌細胞系統ＥＭＴ−６はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。これ等は３７℃において９０％空気−１０％ＣＯ２の湿潤雰囲気下に１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１００ｕｇ／ｍｌペニシリン及び１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で連続単層培養において生育させた。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして８５〜９０％コンフルエントに達した時点で希釈した。細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにおいて使用するために１０００個／ウェルの細胞密度において９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２）に播種した。
【０１６２】
アンチセンス化合物による処理：
細胞が６５〜７５％コンフルエントに達した時点で、それらをオリゴヌクレオチドで処理した。９６穴プレート中に生育している細胞については、ウェルを１回１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１減血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄し、次に３．７５μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＩＮＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及び所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１で処理した。細胞は３連で処理してデータを得た。３７℃で４〜７時間処理後、培地を新鮮培地に交換した。細胞はオリゴヌクレオチド処理後１６〜２４時間に採取した。
【０１６３】
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は細胞系統毎に異なる。特定の細胞系統に対する最適なオリゴヌクレオチド濃度を求めるためには、細胞をある範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドはヒトＨ−ｒａｓをターゲティングするＩＳＩＳ  １３９２０（
【０１６４】
【化２４−２】
2009516710.tif 000020
又はヒトＪｕｎ−Ｎ−末端キナーゼ−２（ＪＮＫ２）をターゲティングするＩＳＩＳ  １８０７８
【０１６５】
【化２４−３】
2009516710.tif 000021
のいずれかから選択される。両方の対照ともホスホロチオエート骨格を有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字）である。マウス又はラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドはマウス及びラットｃ−ｒａｆの両方をターゲティングするＩＳＩＳ  １５７７０、
【０１６６】
【化２４−４】
2009516710.tif 000022
、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字）である。次にｃ−Ｈ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ  １３９２０の場合）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ  １８０７８の場合）又はｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ  １５７７０の場合）のｍＲＮＡの８０％抑制をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度をその細胞系統における後の実験における新しいオリゴヌクレオチドに関するスクリーニング濃度として用いる。８０％抑制が達成されなかった場合は、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ＪＮＫ２又はｃ−ｒａｆのｍＲＮＡの６０％抑制をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度をその細胞系統における後の実験におけるオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として用いる。６０％抑制が達成されなかった場合は、その特定の細胞系統はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験には適さないと見なす。本明細書において使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は５０ｎＭ〜３００ｎＭである。
【０１６７】
実施例６
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現のオリゴヌクレオチド抑制の分析
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現のアンチセンスモジュレーションは当該分野で知られた種々の態様において試験できる。例えば、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により定量できる。リアルタイム定量的ＰＣＲが現時点で好ましい。ＲＮＡ分析は全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して実施できる。本発明のＲＮＡ分析の好ましい方法は本明細書の別の実施例において記載する通り全細胞ＲＮＡの使用である。ＲＮＡ単離方法は当該分野で良く知られている。ノーザンブロット分析も当該分野で日常的に行われている。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能であり、製造元の説明書に従って使用される市販のＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ７６００、７７００又は７９００配列検出システムを用いて好都合に達成できる。
【０１６８】
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の蛋白レベルは当該分野で良く知られている種々の態様、例えば免疫沈降、ウエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）又は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）において定量できる。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に指向された抗体を識別して種々の入手元、例えばＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）より入手するか、又は当該分野で良く知られている従来のモノクローナル又はポリクローナル抗体の形成方法により製造できる。
【０１６９】
実施例７
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤の使用のための表現型試験の設計
表現型試験
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤を本明細書に開示する方法で識別した後、特定の疾患の状況又は状態の治療において薬効を予測させる測定可能なエンドポイントを各々が有する表現型試験１つ以上において更に化合物を検討する。
【０１７０】
表現型試験、キット及びその使用のための試薬は当該分野で良く知られており、そしてここで使用することにより健康及び疾患におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の役割及び／又は関連性を検討する。代表的な表現型試験は数種の市販元のいずれかより購入できるものであり、細胞の生存性、細胞毒性、増殖又は細胞の生存を測定するためのもの（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、蛋白系試験、例えば酵素試験（Ｐａｎｖｅｒａ，ＬＬＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセス及びアポトーシス（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、トリグリセリド蓄積（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、血管形成試験、管形成試験、サイトカイン及びホルモン試験及び代謝試験（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を包含する。
【０１７１】
１つの非限定的な例においては、特定の表現型試験のために適切であると判断された細胞（即ち乳癌試験のために選択されたＭＣＦ−７細胞；肥満試験のための脂肪細胞）を、上記した方法により決定される最適濃度においてインビトロ試験で識別されたｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤並びに対照化合物で処理する。処理時間の終了時に、処理及び未処理の細胞を、表現型の結果及びエンドポイントを測定する試験に特定される方法１つ以上により分析する。
【０１７２】
表現型のエンドポイントには時間又は処理用量に渡る細胞の形態の変化並びに蛋白、脂質、核酸、ホルモン、糖又は金属のような細胞成分のレベルの変化を包含する。ｐＨ、細胞周期の段階、細胞による生物学的インジケーターの取り込み又は排出を包含する細胞の状態の尺度も目的のエンドポイントである。
【０１７３】
処理後の細胞の遺伝子型の分析（細胞の遺伝子の１つ以上の発現の測定）もまたｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２抑制剤の薬効又は力価のインジケーターとして使用される。目印となる遺伝子、又は、特定の疾患の状況、状態又は表現型に関連することが疑われる遺伝子を処理及び未処理細胞の両方において計測する。
【０１７４】
実施例８
ＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡはＭｉｕｒａ等（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，４２，１７５８−１７６４）に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のための他の方法も当該分野で日常的に行われている。慨すれば、９６穴プレート上で生育している細胞については、生育培地を細胞から分離し、各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジルリボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、次に５分間室温でインキュベートした。溶解物５５μＬをＯｌｉｇｏｄ（Ｔ）コーティング９６穴プレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）に移した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、洗浄緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）２００μＬで３回洗浄した。最終洗浄の後、プレートをペーパータオル上で吸水させて過剰な洗浄緩衝液を除去し、次に５分間風乾した。予め７０℃に加熱しておいた溶離緩衝液（５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）６０μＬを各ウェルに添加し、プレートを５分間９０℃のホットプレート上でインキュベートし、次に溶出駅を新しい９６穴プレートに移した。
【０１７５】
１００ｍｍ又は他の標準的なプレート上に生育させた細胞を適量の全溶液を用いて同様に処理してよい。
【０１７６】
全ＲＮＡ単離
全ＲＮＡをＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭキット及びＱｕｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入した緩衝液を用いながら、製造元の推奨する操作法に従って単離した。慨すれば、９６穴プレート上で生育している細胞については、生育培地を細胞から分離し、各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。１５０μＬの緩衝液ＲＬＴを各ウェルに添加し、プレートを２０秒間激しく攪拌した。次に１５０μＬの７０％エタノールを各ウェルに添加し、内容物をピペットで３回吸入吐出を繰り返すことにより混合した。次に試料を廃棄物収集トレーを装着し、真空源に連結したＱＩＡＶＣＴＭマニホールドに連結したＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭウェルプレートに移した。真空を１分間適用した。５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、１５分間インキュベートし、そして再度１分間真空を適用した。更に５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、２分間真空を適用した。次に１ｍｌの緩衝液ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、９０秒間真空を適用した。次に緩衝液ＲＰＥ洗浄を反復し、更に３分間真空を適用した。次にプレートをＱＩＡＶＣＴＭマニホールドから取り外し、そしてペーパータオル上で吸水乾燥させた。次にプレートを１．２ｍｌの収集管の入った収集管ラックを装着したＱＩＡＶＣＴＭマニホールドに再度連結した。次に各ウェル内にＲＮＡｓｅ非含有水１４０μＬをピペッティングすることによりＲＮＡを溶出させ、１分間インキュベートし、次に３分間真空を適用した。
【０１７７】
反復ピペッティング及び溶出の工程はＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を用いて自動化してよい。本質的には、培養プレート上の細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移してそこでピペッティング、ＤＮａｓｅ処理及び溶出の工程を実施する。
【０１７８】
実施例９
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡレベルの定量はＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ７６００、７７００又は７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いながら製造元の説明書に従ってリアルタイム定量的ＰＣＲにより行った。これは閉鎖管の非ゲル系の蛍光検出システムであり、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の高スループットの定量を可能にする。増幅産物をＰＣＲ終了後に定量する標準的なＰＣＲとは異なり、リアルタイム定量的ＰＣＲの産物はそれらが蓄積するに従って定量される。これはフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの間で特異的にアニーリングし、そして２つの蛍光染料を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に包含させることにより達成される。レポーター染料（例えばＦＡＭ又はＪＯＥ、入手元はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡの何れか）をプローブの５’末端に連結し、そしてクエンチャー染料（例えばＴＡＭＲＡ、入手元はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡの何れか）をプローブの３’末端に連結する。プローブと染料が未損傷の場合は、レポーター染料の発光は３’クエンチャー染料の接近によりクエンチングされる。増幅の間、標的配列へのプローブのアニーリングによりＴａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断されることができる基質が形成される。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長期の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断により残余のプローブから（従ってクエンチャー部分から）のレポーター染料の放出が起こり、そして配列特異的な蛍光シグナルが発生する。各サイクルに付き、追加的なレポーター染料分子がそれらの対応するプローブから切断され、そして蛍光強度はＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ配列検出システムに搭載されたレーザー光学により一定間隔でモニタリングされる。各試験において、未投与対照試料由来のｍＲＮＡの連続希釈物を含有する一連の平行反応が標準曲線を与え、これを用いて被験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のパーセント抑制を定量する。
【０１７９】
定量的ＰＣＲ反応の前に、測定すべき標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブのセットを、ＧＡＰＤＨ増幅反応により「マルチプレックス化」されるそれらの能力に関して評価する。マルチプレックス化においては、標的遺伝子及び内標準遺伝子ＧＡＰＤＨの両方が単一の試料中で同時に増幅される。この分析においては、未処理細胞から単離したｍＲＮＡを連続希釈する。各希釈物をＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「シングルプレックス化」）又は両方（マルチプレックス）に対して特異的なプライマー−プローブのセットの存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅の後、希釈度の関数としてのＧＡＰＤＨ及び標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線をシングルプレックス及びマルチプレックス化試料の両方から作成する。マルチプレックス化試料から作成されたＧＡＰＤＨ及び標的シグナルの傾き及び相関係数の両方がシングルプレックス化試料から作成されたその相当する値の１０％以内に入れば、その標的に対して特異的なプライマー−プローブのセットがマルチプレックス化可能と見なされる。ＰＣＲの他の方法も当業者の知る通りである。
【０１８０】
ＰＣＲ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は３０μＬの全ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含有する９６穴プレートに２０μＬのＰＣＲカクテル（２．５ｘＰＣＲ緩衝液マイナスＭｇＣｌ２、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３７５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの各々、３７５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマーの各々、１２５ｎＭのプローブ、４単位のＲＮＡｓｅ抑制剤、１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素、及び、２．５ｘＲＯＸ染料）を添加することにより実施した。ＲＴ反応は４８℃で３０分間インキュベートすることにより実施した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化するための９５℃における１０分間インキュベーションの後、２工程ＰＣＲプロトコル、即ち１５秒間９５℃で実施（変性）の後１．５分間６０℃（アニーリング／伸長）を４０サイクル実施した。
【０１８１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで得られた遺伝子標的の量は、発現が一定であるＧＡＰＤＨの発現レベルを用いるか、又は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて総ＲＮＡを定量することにより、規格化する。ＧＡＰＤＨの発現は標的と同時にマルチプレックス化により、又は別個に試行することにより、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量する。全ＲＮＡはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて定量する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭによるＲＮＡ定量の方法はＪｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）により教示されている。
【０１８２】
この試験においてはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭワーキング試薬（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中に１：３５０希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）１７０μＬを３０μＬの精製細胞ＲＮＡを含有する９６穴プレート内にピペッティングする。プレートは励起４８５ｎｍ及び発光５３０ｎｍでＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取る。
【０１８３】
ヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に対するプローブ及びプライマーは公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４０９６．３、配列番号４として本明細書に取り込まれる）を用いてヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２については、ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＣＣＴＣＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＡＴＧＴ（配列番号５）、リバースプライマー：ＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＧ（配列番号６）とし、ＰＣＲプローブはＦＡＭ−ＴＧＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＡＡＡＡＣＴＧＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号７）とし、ここでＦＡＭは蛍光染料であり、そしてＴＡＭＲＡはクエンチャー染料である。ヒトＧＡＰＤＨについてはＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号８）、リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号９）とし、ＰＣＲプローブは５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１０）とし、ここでＪＯＥは蛍光レポーター染料であり、そしてＴＡＭＲＡはクエンチャー染料である。
【０１８４】
マウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に対するプローブ及びプライマーは公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１０１２４．１、配列番号１１として本明細書に取り込まれる）を用いてマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２配列にハイブリダイズするように設計した。マウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２については、ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号１２）、リバースプライマー：ＣＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＧＡＴＧＡＧ（配列番号１３）とし、ＰＣＲプローブはＦＡＭ−ＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＧＣＣＣＴ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１４）とし、ここでＦＡＭは蛍光レポーター染料であり、そしてＴＡＭＲＡはクエンチャー染料である。マウスＧＡＰＤＨについてはＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号１５）、リバースプライマー：ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴ（配列番号１６）とし、ＰＣＲプローブは５’ＪＯＥ−ＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号１７）とし、ここでＪＯＥは蛍光レポーター染料であり、そしてＴＡＭＲＡはクエンチャー染料である。
【０１８５】
ラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に対するプローブ及びプライマーは公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿２１５４１４．１、配列番号１８として本明細書に取り込まれる）を用いてラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２配列にハイブリダイズするように設計した。ラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２については、ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡ（配列番号１９）、リバースプライマー：ＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＣ（配列番号２０）とし、ＰＣＲプローブはＦＡＭ−ＴＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＴＴＧＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２１）とし、ここでＦＡＭは蛍光レポーター染料であり、そしてＴＡＭＲＡはクエンチャー染料である。ラットＧＡＰＤＨについてはＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴ（配列番号２２）、リバースプライマー：ＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＴ（配列番号２３）とし、ＰＣＲプローブは５’ＪＯＥ−ＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号２４）とし、ここでＪＯＥは蛍光レポーター染料であり、そしてＴＡＭＲＡはクエンチャー染料である。
【０１８６】
実施例１０
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理後１８時間に、細胞の単層を２回冷ＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのＲＮＡＺＯＬＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ”Ｂ”Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）中で溶解した。全ＲＮＡは製造元の推奨するプロトコルに従って調製した。２０マイクログラムの全ＲＮＡをＭＯＰＳ緩衝液系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を用いて１．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲルを通した電気泳動により分画した。ノーザン／サザン転移緩衝液系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ”Ｂ”Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いた一夜キャピラリー転移によりＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にゲルからＲＮＡを転移させた。ＲＮＡ転移はＵＶ可視化により確認した。膜はＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭＵＶ交差結合剤２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてＵＶ交差結合により固定し、そして次にＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いながらストリンジェントな条件に関する製造元の推奨事項を用いてプローブした。
【０１８７】
ヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２を検出するためには、ヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２特異的なプローブをフォワードプライマー：ＣＣＴＣＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＡＴＧＴ（配列番号５）及びリバースプライマー：ＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＧ（配列番号６）を用いながらＰＣＲにより調製した。負荷及び転移の効率の変動を最小限にするために、膜をストリッピングし、そしてヒトグルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に対してプローブした。
【０１８８】
マウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２を検出するためには、マウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２特異的なプローブをフォワードプライマー：ＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＣＡＧＴ（配列番号１２）及びリバースプライマー：ＣＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＧＡＴＧＡＧ（配列番号１３）を用いながらＰＣＲにより調製した。負荷及び転移の効率の変動を最小限にするために、膜をストリッピングし、そしてマウスグルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に対してプローブした。
【０１８９】
ラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２を検出するためには、ラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２特異的なプローブをフォワードプライマー：ＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡ（配列番号１９）及びリバースプライマー：ＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＣ（配列番号２０）を用いながらＰＣＲにより調製した。負荷及び転移の効率の変動を最小限にするために、膜をストリッピングし、そしてラットグルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に対してプローブした。
【０１９０】
ハイブリダイズした膜を可視化し、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ及びＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭソフトウエアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｘｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。データは未処理対照のＧＡＰＤＨレベルに対して規格化した。
【０１９１】
実施例１１
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現のアンチセンス抑制
本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列情報（配列番号４として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４０９６．３、配列番号２５として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＴ＿００８５８３．１６の配列のヌクレオチド２０７１４６７７〜２０７４００００、配列番号２６として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０５７６４３．１、配列番号２７として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ００１９３６．１、及び配列番号２８として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＦ６８６４０１．１、）を用いてヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ＲＮＡの異なる領域をターゲティングするために設計した。化合物を表１に示す。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的配列上の第１（最も５’側）のヌクレオチド番号を示す。表１に示す全化合物は５ヌクレオチドの「ウイング」により両側（５’及び３’方向）においてフランキングされた２’−デオキシヌクレオチド１０個よりなる中央の「ギャップ」領域を有する２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドを有する。ヌクレオシド間（骨格）連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムＰＣＲによりヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡに対するそれらの作用について分析した。データは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド７５ｎＭでＡ５４９細胞を処理した２つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「Ｎ．Ｄ．」とある場合は「データ無し」を示す。
【０１９２】
表１  ２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２レベルの抑制
【０１９３】
【表１−１】
2009516710.tif 000023
【０１９４】
【表１−２】
2009516710.tif 000024
表１に示す通り、配列番号
【０１９５】
【化２５】
2009516710.tif 000025
及び１０５は本試験におけるヒトｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現の少なくとも２５％抑制を明らかにしており、従って好ましいものである。これ等の好ましいアンチセンスが相補である標的領域は本明細書においては「好ましい標的セグメント」と称し、従って本発明の化合物によるターゲティングのために好ましいものである。このような好ましい標的セグメントを表５に示す。これ等の配列はチミジン（Ｔ）を含有するように示されているが、当該分野で知られる通り、チミジン（Ｔ）は一般的にＲＮＡ配列ではウラシル（Ｕ）で置き換えられている。配列は本明細書に開示した好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を示している。「標的部位」はオリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第１（最も５’側）のヌクレオチド番号を示す。表５には又、好ましい標的セグメントの各々が観察される種を記載する。
【０１９６】
配列番号２９、３０、３１及び３２はマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２核酸標的に対しても相補である交差種オリゴヌクレオチドである。配列番号２９及び３３はラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に対しても相補である交差種オリゴヌクレオチドである。
実施例１２
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現のアンチセンス抑制
本発明により、第２の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列情報（配列番号１１として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１０１２４．１、配列番号１０７として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＩ６９６１２７．１及び配列番号１０８として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＥ３３２４０９．１）を用いてマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ＲＮＡの異なる領域をターゲティングするために設計した。化合物を表２に示す。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的核酸上の第１（最も５’側）のヌクレオチド番号を示す。表２に示す全化合物は５ヌクレオチドの「ウイング」により両側（５’及び３’方向）においてフランキングされた２’−デオキシヌクレオチド１０個よりなる中央の「ギャップ」領域を有する２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドを有する。ヌクレオシド間（骨格）連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムＰＣＲによりマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡに対するそれらの作用について分析した。表２に示すデータは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド１５０ｎＭでｂ．ＥＮＤ細胞を処理した２つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「Ｎ．Ｄ．」とある場合は「データ無し」を示す。
【０１９７】
表２  ２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるｂ．ＥＮＤ細胞におけるマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２レベルの抑制
【０１９８】
【表２−１】
2009516710.tif 000026
【０１９９】
【表２−２】
2009516710.tif 000027
表２に示す通り、配列番号
【０２００】
【化２６】
2009516710.tif 000028
及び１８２は本実験におけるマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現の少なくとも４４％抑制を明らかにしており、従って好ましいものである。これ等の好ましいアンチセンスが相補である標的領域は本明細書においては「好ましい標的セグメント」と称し、従って本発明の化合物によるターゲティングのために好ましいものである。このような好ましい標的セグメントを表４に示す。これ等の配列はチミジン（Ｔ）を含有するように示されているが、当該分野で知られる通り、チミジン（Ｔ）は一般的にＲＮＡ配列ではウラシル（Ｕ）で置き換えられている。配列は本明細書に開示した好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を示している。「標的部位」はオリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第１（最も５’側）のヌクレオチド番号を示す。表５には又、好ましい標的セグメントの各々が観察される種を記載する。
【０２０１】
別の実施形態において、マウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドをＥＭＴ−６細胞において試験した。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムＰＣＲによりマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡに対するそれらの作用について分析した。表３に示すデータは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド１５０ｎＭでＥＭＴ−６細胞を処理した２つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「Ｎ．Ｄ．」とある場合は「データ無し」を示す。
【０２０２】
表３  ２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるＥＭＴ−６細胞におけるマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２レベルの抑制
【０２０３】
【表３−１】
2009516710.tif 000029
【０２０４】
【表３−２】
2009516710.tif 000030
表３に示す通り、配列番号
【０２０５】
【化２７】
2009516710.tif 000031
及び１８２は本実験におけるマウスｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現の少なくとも６７％抑制を明らかにしており、従って好ましいものである。
【０２０６】
実施例１３
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現のアンチセンス抑制
本発明により、第３の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列情報（配列番号１８として本明細書に取り込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿２１５４１４．１）を用いてラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ＲＮＡの異なる領域をターゲティングするために設計した。化合物を表４に示す。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的核酸上の第１（最も５’側）のヌクレオチド番号を示す。表４に示す全化合物は５ヌクレオチドの「ウイング」により両側（５’及び３’方向）においてフランキングされた２’−デオキシヌクレオチド１０個よりなる中央の「ギャップ」領域を有する２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドを有する。ヌクレオシド間（骨格）連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムＰＣＲによりラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡに対するそれらの作用について分析した。表４に示すデータは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド５０ｎＭでＡ１０細胞を処理した２つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「Ｎ．Ｄ．」とある場合は「データ無し」を示す。
【０２０７】
表４  ２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２レベルの抑制
【０２０８】
【表４−１】
2009516710.tif 000032
【０２０９】
【表４−２】
2009516710.tif 000033
表４に示す通り、配列番号
【０２１０】
【化２８】
2009516710.tif 000034
及び２５８は本実験におけるラットｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２発現の少なくとも４８％抑制を明らかにしており、従って好ましいものである。これ等の好ましいアンチセンスが相補である標的領域は本明細書においては「好ましい標的セグメント」と称し、従って本発明の化合物によるターゲティングのために好ましいものである。このような好ましい標的セグメントを表５に示す。これ等の配列はチミジン（Ｔ）を含有するように示されているが、当該分野で知られる通り、チミジン（Ｔ）は一般的にＲＮＡ配列ではウラシル（Ｕ）で置き換えられている。配列は上記表に示した好ましいアンチセンス化合物の逆相補物を示している。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的核酸上の第１（最も５’側）のヌクレオチド番号を示す。
【０２１１】
１／２２／２００４出願の米国特許出願６０／５３８，７５２の表５に記載される「好ましい標的セグメント」は実験により本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションのために開放されており、そして接触可能であることが判明しており、これ等の好ましい標的セグメントに特異的にハイブリダイズし、そしてその結果ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の発現を抑制する他の化合物を包含する本発明の別の実施形態を、当業者であれば日常的な実験を超えルことなく、認知又は確認することができるはずである。
【０２１２】
本発明によれば、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、オルタナティブスプライサー、プライマー、プローブ及び標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他の短鎖オリゴマー化合物を包含する。
【０２１３】
実施例１４
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２蛋白レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準的な方法を用いて実施される。細胞をオリゴヌクレオチド処理後１６〜２０時間に採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００ｕＬ／ウェル）に懸濁し、５分間煮沸し、そして１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードする。ゲルを１５０Ｖで１．５時間泳動し、ウエスタンブロット用の膜に転移させる。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に指向された適切な一次抗体を一次抗体種に対して指向された放射標識又は蛍光標識された二次抗体と共に使用する。バンドはＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｘｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて可視化する。
【０２１４】
実施例１５
ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のアンチセンス抑制によるｏｂ／ｏｂマウスにおける血中グルコースレベルの低下
ｏｂ／ｏｂマウスは肥満及び高血糖症をもたらすレプチン遺伝子における突然変異を有している。即ち、これ等のマウスは肥満及び糖尿病の研究及びこれ等の状態を治療するために設計された治療のための有用なモデルである。本発明に従って、肥満及び糖尿病のｏｂ／ｏｂモデルにおいてｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２にターゲティングされた化合物を試験する。
【０２１５】
７週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ−Ｌｅｐｒ  ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に脂肪含有量１０〜１５％の飼料を給餌し、そして４週間の期間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でオリゴヌクレオチドを皮下注射する。食塩水注射動物、レプチン野生型同腹仔（即ち、無栄養同腹仔）及び標準的なげっ歯類用飼料を給餌したｏｂ／ｏｂマウスを対照として使用する。投与期間の後、マウスを屠殺し、標的レベルを肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評定する。ＲＮＡの単離及び標的ｍＲＮＡの発現レベルの定量は本明細書の別の実施例に記載する通り実施する。
【０２１６】
標的ｍＲＮＡのアンチセンス抑制に起因する生理学的作用を評価するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与を受けたｏｂ／ｏｂマウスを典型的には更に投与期間の終了時において、血清中脂質、血清中遊離脂肪酸、血清中コレステロール、肝トリグリセリド、脂肪組織トリグリセリド及び肝酵素レベルについて評定する。肝脂肪症又は肝臓中の脂質の蓄積は肝トリグリセリド含有量を計測することにより評価する。即ち、肝脂肪症は脂質の沈着を可視化するために一般的に使用されているオイルレッドＯ染色で染色され、そして核及び細胞質をそれぞれ可視化するためのヘマトキシリン及びエオシンで逆染色された凍結肝組織切片の日常的な組織学的分析により動物モデルにおいて評価する。
【０２１７】
グルコース及びインスクリーニングの代謝に対する標的抑制の作用はアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいて評定する。血漿中グルコースはアンチセンスオリゴヌクレオチド投与の開始時、及び、投与２及び４週間の後に測定する。給餌時及び絶食時の両方の血漿中グルコースレベルを測定した。試験開始時において、マウスの投与群は約３５０ｍｇ／ｄＬの平均給餌時血漿中グルコースレベルを有するように選択する。血漿中のインスリンもまた投与の開始時、及び、投与２及び４週間の後に測定する。グルコース及びインスリン耐性試験もまた給餌及び絶食マウスにおいて行う。マウスにはグルコース又はインスリンの何れかを腹腔内注射し、そして血中のグルコース及びインスリンのレベルをグルコース又はインスリン負荷の前、及び、１５、２０又は３０分の間隔で３時間まで測定する。
【０２１８】
ＩＳＩＳ ２３２８２８（配列番号３２）、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のアンチセンス抑制剤を投与したマウスにおいて、給餌時血漿中グルコースレベルは０週で３５５ｍｇ／ｄＬ、２週で０．２９５ｍｇ／ｄＬ、そして４週で２１０ｍｇ／ｄＬであった。これとは対照的に、食塩水のみを投与したマウスの給餌時血漿中グルコースレベルは０週で３６５ｍｇ／ｄＬ、２週で０．４２５ｍｇ／ｄＬ、そして４週で４１０ｍｇ／ｄＬであった。ＰＴＥＮにターゲティングされた陽性対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １１６８４７（ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡ；配列番号４４７）を投与したマウスの給餌時血漿中グルコースレベルは０週で３６０ｍｇ／ｄＬ、２週で０．２１５ｍｇ／ｄＬ、そして４週で１８０ｍｇ／ｄＬであった。
【０２１９】
絶食時の血漿中グルコースはアンチセンス投与３週で測定した。血漿中グルコースは概ね食塩投与マウスで３３０ｍｇ／ｄＬ、ＩＳＩＳ  ２３２８２８（ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２の抑制剤）を投与したマウスで２４５ｍｇ／ｄＬ、そして、陽性対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１６８４７を投与したマウスで１９５ｍｇ／ｄＬであった。
【０２２０】
４週間の試験の終了時において、平均の肝臓重量は概ね、食塩水投与マウスで３．６グラム、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与マウスで３．２グラム、そして陽性対照（ＩＳＩＳ  １１６８４７）投与マウスで４．１グラムであった。白色脂肪組織重量は概ね、食塩水投与マウスで３．９グラム、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与マウスで３．８グラム、そして陽性対照（ＩＳＩＳ  １１６８４７）投与マウスで３．７グラムであった。
【０２２１】
試験終了時において、肝トランスアミナーゼは食塩水又は陽性対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ  １１６８４７）を投与したマウスよりもｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２に対するアンチセンス（ＩＳＩＳ  ２３２８２８）を投与したマウスにおいて低値であることがわかった。ＡＳＴレベルは概ね、食塩水投与マウスで３３０ＩＵ／Ｌ、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与マウスで１１０ＩＵ／Ｌ、そしてＩＳＩＳ  １１６８４７投与マウスで４３０ＩＵ／Ｌであった。ＡＬＴレベルは概ね、食塩水投与マウスで４３５ＩＵ／Ｌ、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与マウスで１４０ＩＵ／Ｌ、そしてＩＳＩＳ  １１６８４７投与マウスで７１０ＩＵ／Ｌであった。
【０２２２】
血清中脂質も試験終了時に測定した。コレステロールレベルは概ね、食塩水投与マウスで２３０ｍｇ／ｄＬ、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与マウスで２１０ｍｇ／ｄＬ、そしてＩＳＩＳ１１６８４７投与マウスで２６０ｍｇ／ｄＬであった。トリグリセリドレベルは概ね、食塩水投与マウスで１３５ｍｇ／ｄＬ、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与マウスで８０ｍｇ／ｄＬ、そしてＩＳＩＳ  １１６８４７投与マウスで１１０ｍｇ／ｄＬであった。
【０２２３】
肝臓中のｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡレベルは、試験終了時にＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭＲＮＡ定量用試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて計測した。ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２ｍＲＮＡレベルは食塩水投与と比較してＩＳＩＳ２３２８２８投与マウスにおいて約９０％低下していた。ＩＳＩＳ １１６８４７投与マウスにおける標的低下は約３０％であった。
【０２２４】
実施例１６
高脂肪食餌誘導肥満マウスにおけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２のアンチセンス抑制の作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統は高脂血症誘導アテローム性動脈硬化プラーク形成に罹患しやすいことが報告されている。結果として、これ等のマウスに高脂肪食餌を給餌すれば、それらは給餌誘導の肥満を発症する。従ってこれ等のマウスは肥満の研究及びこの状態を治療するために設計された治療のための有用なモデルである。本発明の別の実施形態においては、本発明のオリゴマー化合物を食餌誘導肥満のモデルにおいて試験した。
【０２２５】
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４週齢）に３ヶ月間６０％脂肪食餌を給餌し、その後マウスにＩＳＩＳ２３２８２８（配列番号３２）を６週間の期間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。食塩水注射及び対照化合物注射動物にも高脂肪食餌を上記した通り対照として給餌した。対照化合物はＩＳＩＳ  １４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、配列番号２６０として本明細書に組み込まれる）とした。ＩＳＩＳ  １４１９２３は２’−ＭＯＥヌクレオチド５個で自身の５’及び３’末端をフランキングされた２’−デオキシヌクレオチド１０個よりなる中央ギャップ領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。ヌクレオシド間連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエートであり、そして全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。別の対照として、通常の飼料を給餌した動物に食塩水を注射した。各投与群は動物７匹とし、そして本明細書に記載したこの試験のデータは一般的に投与群当たり６又は７匹の平均とする。
【０２２６】
投与期間の後、マウスをとさつし、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２標的レベルを肝臓及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評定する。ＲＮＡ単離及び標的ｍＲＮＡ発現レベルの定量は本明細書の他の実施例に記載の通り実施する。各投与群に関する平均の結果を食塩水投与高脂肪給餌対照と比較した場合の標的発現のパーセント抑制として表５に示す。
【０２２７】
表５  肝及びＷＡＴにおけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２標的の低減
【０２２８】
【表５】
2009516710.tif 000035
表５に示される通り、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与は肝及び脂肪組織におけるｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２レベルを低下させている。
【０２２９】
グルコース及びインスリンの代謝に対する標的浴しえの作用もまた本発明のオリゴマー化合物を投与した給餌誘導肥満マウスにおいて評定される。血漿中グルコースは投与開始前（０週）、投与約３．５週の後（３．５週）及び投与期間終了時（６週）において当該分野で知られる日常的な方法を介して測定した（例えばＹＳＩグルコース分析装置、ＹＳＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＯＨ）。結果は各投与群の平均の血漿中グルコースレベルとして表６に示す。
【０２３０】
表６  血漿中グルコースレベルに対するｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用
【０２３１】
【表６】
2009516710.tif 000036
表６に示される通り、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与動物は食塩水投与高脂肪給餌対照動物で観察された血漿中グルコースレベルの増大を示さなかった。
【０２３２】
インスリンレベルは記載した時点において当該分野で知られた方法（例えばＡｌｐｃｏインスリン特異的ＥＬＩＳＡキット、Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を用いて計測した。結果は各投与群の平均のインスリンレベルとして表７に示す。
【０２３３】
表７  血漿中インスリンレベルに対するｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ２をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用
【０２３４】
【表７】
2009516710.tif 000037
表７に示される通り、ＩＳＩＳ ２３２８２８投与は６週までインスリンレベルを低下させた。
【０２３５】
グルコース及びインスリン耐性試験も行った。マウスにはグルコース（１ｍｇ／ｋｇ）又はインスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）の何れかを腹腔内注射し、そして血中グルコースレベルをインスリン又はグルコース負荷の前、及び３０分の間隔で２時間まで測定した。インスリン耐性試験は投与約４．５週後に実施した。グルコース耐性試験は投与約５．５週後に実施した。各時点における平均の結果を書く投与群に関して表８（グルコース耐性試験）及び９（インスリン耐性試験）に示す。
【０２３６】
表８  高脂肪給餌マウスにおけるグルコース耐性試験
【０２３７】
【表８】
2009516710.tif 000038
表９  高脂肪給餌マウスにおけるインスリン耐性試験
【０２３８】
【表９】
2009516710.tif 000039
経時的に表８に示す血中グルコースレベルのプロットはＩＳＩＳ  ２３２８４８投与が高脂肪給餌マウスにおけるグルコース耐性を改善したことを明らかにしている。
【０２３９】
体脂肪含有量は試験開始時（０週）及び投与後（６週）にＭＲＩを用いて評価した。０週における投与群の平均は約３３〜３４％体脂肪であった。第６週において、食塩水単独又はＩＳＩＳ  １４１９２３を投与した高脂肪給餌動物は約３５％の体脂肪を有しており、そしてＩＳＩＳ  ２３２８４８を投与した動物は約２９％の体脂肪を有していた。即ち、ＩＳＩＳ  ２３２８４８投与は体脂肪含有量を低下させた。非脂肪質量及び体重は有意に変動しなかった。
【０２４０】
肝トリグリセリドレベルは市販のキットを用いて試験終了時に計測した（例えばトリグリセリドＧＰＯ試験、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。平均して、肝トリグリセリド含有量は食塩水投与高脂肪給餌対照動物で約６６ｍｇ／ｋｇ、ＩＳＩＳ  １４１９２３投与高脂肪給餌動物で約５６ｍｇ／ｋｇ、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与高脂肪給餌動物で約２６ｍｇ／ｋｇ、そして食塩水投与通常飼料動物で約１２ｍｇ／ｋｇであった。即ち、ＩＳＩＳ  ２３２８２８投与は肝トリグリセリド含有量を低下させている。
【０２４１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた定量的遺伝子発現分析を本試験の動物由来の肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及びＷＡＴにおいて実施した。低分子量ホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ）、グルコース−６−ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ、グリコーゲンホスホリラーゼ、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素、ステアリルＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）、ピルベートデヒドロゲナーゼアルファ、グリコーゲンシンターゼ、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）及びジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）の発現を肝組織において検査した。ペリリピン、ＦＡＳ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、ＤＧＡＴ２、リポ蛋白リパーゼ、リポトランシン、１１−ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１、アドロナル受容体ベータ３、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０（アジポネクチンとしても知られている）、グリセロールキナーゼ及び脂肪細胞脂肪酸結合蛋白（ＦＡＢＰ）ａＰ２の発現はＷＡＴにおいて検査した。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＦＡＳ、パーオキシソーム増殖活性化受容体ガンマ共活性化物質１、ＵＣＰ１及びＵＣＰ２の発現はＢＡＴにおいて検査した。
【０２４２】
これ等の分析を介して、ＩＳＩＳ ２３２８２８投与は二次的に脂肪中のＤＧＡＴ２及びＦＡＳの発現を低下させたことがわかり、脂肪生成における低下を示唆していた。投与は又、肝グルコース−６−ホスファターゼの発現の低下及び肝グリコーゲンシンターゼ発現の増加ももたらしていた。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月24日(2008.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009516710000001.app
【国際調査報告】
2009516710.tif 000106
2009516710.tif 000107
2009516710.tif 000108
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