(57)【要約】本発明は、ｉ）固定生体サンプルを準備する工程、ｉｉ）前記固定生体サンプルを少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる工程、およびｉｉｉ）前記水溶液に接触した前記生体サンプルを加熱する工程を含む、固定生体サンプルを処置する方法に関する。本発明はまた、本方法によって得ることができる生体サンプル、固定生体サンプルの処置のための求核試薬の使用、固定生体サンプルから生体分子を単離するためのキット、このキットの使用、および疾患の処置方法に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定生体サンプルを処置する方法であって、
ｉ）固定生体サンプルを準備する工程、
ｉｉ）前記固定生体サンプルを好ましくは少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記水溶液に接触した生体サンプルを加熱する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記固定生体サンプルがホルムアルデヒドで固定された生体サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホルムアルデヒドに固定された生体サンプルが、ホルムアルデヒドで固定されてパラフィン中に包埋された生体サンプルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記パラフィンが、前記水溶液との接触前に少なくとも部分的に除去される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記求核試薬が、負電荷であるか、負に分極しているか、少なくとも１つの遊離電子対を含む少なくとも１つの官能基を含む化合物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記求核試薬が、構造Ｉ：
【化１】
2009519027.tif 000004
（式中、
Ｒ１はＣ１〜Ｃ２０炭化水素基、少なくとも１つのヘテロ原子を含むＣ１〜Ｃ２０炭化水素基、または任意選択的にヘテロ原子置換された芳香環系であり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ２０ヒドロキシアルキル基、または水素原子であり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ２０ヒドロキシアルキル基、または水素原子である）の少なくとも１つの第一級、第二級、または第三級アミノ基を含む化合物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｒ２残基およびＲ３残基の少なくとも１つが水素原子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｒ２およびＲ３の両方が水素原子である、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記求核試薬が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミンまたはＣ１〜Ｃ１５アミノアルコール、アミノジオールまたはアミノカルボン酸である、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記求核試薬が、ピロール、ピリジン、ピペリジン、キノリン、インドール、アザシクロペンタン、アザシクロヘキサン、モルホリン、またはこれらの化合物の誘導体からなる群から選択される窒素原子を含む複素環化合物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記求核試薬が、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、アミノ−１，３−プロパン−ジオール、アミノグアニジン、およびトリ（ヒドロキシメチル）−アミノメタンからなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記求核試薬の水への溶解度は、２５℃の温度およびｐＨ７で少なくとも１ｇ／ｌである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記求核試薬が、前記方法の工程ｉｉ）で使用した水溶液中に０．１〜１００００ｍｍｏｌ／ｌの範囲の濃度で存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法の工程ｉｉｉ）で５０〜１００℃の範囲の温度に加熱する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法の工程ｉｉｉ）で６０秒間〜１０時間の範囲で加熱する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法の工程ｉ）〜ｉｉｉ）に加えて、前記方法は、
ｉｖ）前記生体サンプルから溶解した生体分子を分析する工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体分子が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法の工程ｉｉｉ）の加熱中、前記方法の工程ｉｉ）の前、または前記方法の工程ｉｉｉ）の後に、前記生体サンプルを少なくとも１つの酵素と接触させる、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである場合、前記酵素がプロテアーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体分子がタンパク質である場合、前記酵素がヌクレアーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる生体サンプル。
【請求項２２】
固定生体サンプルを処置するための請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の求核試薬の使用。
【請求項２３】
固定生体サンプルから生体分子を単離するためのキットであって、
（α１）求核試薬を含む緩衝液、
（α２）生体分子を吸着するためのマトリックス、
（α３）必要に応じて、溶離緩衝液、
（α４）必要に応じて、酵素、および
（α５）必要に応じて、カオトロピック物質
を含む、前記キット。
【請求項２４】
構成要素（α１）〜（α２）および必要に応じて（α３）〜（α５）に加えて、前記キットは洗浄緩衝液（α６）を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
固定生体サンプルから生体分子を単離するための方法における請求項２３または請求項２４に記載のキットの使用。
【請求項２６】
疾患の処置方法であって、
（β１）生物から生体サンプルを取り出す工程、
（β２）前記生体サンプルをホルムアルデヒドで固定する工程、
（β３）請求項１９に記載の方法によって前記ホルムアルデヒド固定生体サンプル由来の生体分子を分析する工程、
（β４）前記分析の結果に基づいて疾患を診断する工程、および
（β５）前記診断した疾患を治療する工程
を含む、前記方法。
【請求項２７】
サンプル中に存在するタンパク質のその後の分析のためにホルムアルデヒド固定生体サンプルを処置する方法であって、
ｉｖ）固定生体サンプルを準備する工程と、
ｖ）前記固定生体サンプルを少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる工程、および
ｖｉ）前記水溶液と接触させた前記生体サンプルを６５℃〜８５℃の範囲の温度で加熱する工程、
ｉｖ）前記生体サンプルから溶出した生体分子を分析する工程
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記方法の工程ｉｉ）中の水溶液が界面活性剤を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体サンプルを、工程ｉｉｉ）の前に水溶液中で５〜４０分間ボイルする、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体サンプルを、２０分間〜１６時間インキュベートする、請求項２７〜請求項２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定生体サンプルの処置方法、この方法によって得ることができる生体サンプル、固定生体サンプルの処置のための求核試薬の使用、固定生体サンプルから生体分子を単離するためのキット、このキットの使用、および疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料の生きた組織から、例えば、組織断片または単離細胞などを取り出す際、後者は、適切な手段（例えば、培養液中でのインキュベーションなど）を行わない限り、短期間で死滅する。死滅した細胞は、さらに非常に急速に初期自己分解性発酵を受け、その後に細菌分解され、その結果、元の細胞および組織の構造が破壊される。したがって、組織学的試験のために生物から細胞または組織断片を取り出すことを意図する場合、その分解を抑制するために、取り出した生体サンプルを固定する必要がある。この固定の意図は、真の評価が可能であるように生体構造を実質的に生きているように保持することである。調査目的に応じて最も適切な固定剤を見出さなければならない。しかし、固定はまた、試料を書類のように保存することができるという利点を有する。したがって、固定材料にのみ基づいて多数の形態学的調査が可能である。
【０００３】
固定は、通常、タンパク質沈殿化合物またはタンパク質架橋化合物（酸、アルコール、ケトン、または他の有機物質（グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドなど）など）によって行い、ホルムアルデヒド（３５重量％の水溶液の形態（ホルマリンと呼ばれる）で使用する）での固定およびその後の固定材料のパラフィンへの包埋（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料と呼ばれる）は、特に病理学において非常に重要である。他の固定剤（例えば、９６％変性アルコールなど）を超えるホルマリン固定の利点は、特に、細胞および組織の構造が固定状態で比較的良好に保たれるという点である。
【０００４】
しかし、ホルムアルデヒドでの固定の欠点は、特に、架橋効果を有するホルムアルデヒドによる生体分子の架橋度の高さの結果として、例えば、ＦＦＰＥ材料由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの生体分子を単離することが非常に困難であるが、これらの生体分子のかかる単離が多くの調査で非常に重要であるという点である。したがって、例えば、腫瘍組織中のチミジル酸シンターゼ酵素の発現の決定によって、腫瘍が特定の細胞傷害性物質で首尾よく治療することができるかどうかまたは腫瘍が場合によっては既に一定の細胞増殖抑制物質に対して耐性を得ているかどうかについての情報を得ることが可能である。例えば、特許文献１に記載のようにチミジル酸シンターゼをコードするｍＲＮＡをＦＦＰＥ腫瘍組織から単離することができる場合、酵素発現およびそれによる組織中のｍＲＮＡの量から一定の細胞増殖抑制物質に対する腫瘍の挙動を結論づけることができる。しかし、ＦＦＰＥ材料中の生体分子が架橋形態であり、架橋ＲＮＡが生化学アッセイ（特に、逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において適切な基質ではないので、架橋タンパク質は、しばしば、免疫学的検出には非常に不十分な抗原であり、生体分子を分析するために、ＦＦＰＥ材料を適切に処理する必要がある。
【０００５】
したがって、特許文献１は、有効量のグアニジウム化合物を含むカオトロピック溶液と共にＦＦＰＥ材料を７５〜１００℃の範囲の温度で５〜１２０分間加熱することを提案している。しかし、この方法の欠点は、材料が加熱される条件により、しばしば、生体分子、特に、感受性の高い生体分子（例えば、ＲＮＡなど）が少なくとも部分的に破壊されるという点である。さらに、ホルムアルデヒド架橋の十分な切断に必要な処置時間は、しばしば、非常に長い。
【０００６】
特許文献２は、固定生体サンプルを最初に加熱して生体分子の架橋を少なくとも部分的に切断し、その後にこの方法で処置したサンプルをタンパク質分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）と共にインキュベートして組織および組織の細胞構造を分解することを提案している。この方法の欠点は、同様に、特に短いインキュベーション時間で架橋を切断するのに非常に高い温度を必要とし、このプロセスは穏やかな温度で非常にゆっくりしか起こらないことである。
【特許文献１】ＷＯ−Ａ−０１／４６４０２
【特許文献２】ＵＳ−Ａ−２００５／００１４２０３
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、先行技術から生じる欠点を克服することを目的とした。
【０００８】
本発明の目的は、簡潔な様式で生体分子を生体サンプルから単離するか生体サンプル中で検出することが可能であるようにできるだけ穏やかな条件下で、特に、固定生体サンプル、好ましくは、ホルムアルデヒドで固定した生体サンプルを処置することができる方法を示すことであった。
【０００９】
本発明はまた、好ましくは９５℃未満の処置温度で先行技術から公知の方法よりも迅速に固定によって生じた生体サンプルの架橋を切断することができる、好ましくはホルムアルデヒドで固定した生体サンプルの処置方法を示すことを目的とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
最初に言及した目的を達成するために、
ｉ）固定生体サンプルを準備する工程、
ｉｉ）固定生体サンプルを好ましくは少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる工程、および
ｉｉｉ）水溶液に接触した生体サンプルを加熱する工程
を含む、固定生体サンプルを処置する方法が寄与する。
【００１１】
驚いたことに、生体サンプルの固定、特に、生体サンプル内のホルムアルデヒド固定によって得られた架橋を求核試薬の存在下で明らかにより迅速に切断することができることが見出された。
【００１２】
驚いたことに、本発明の方法の特定の実施形態では、ホルマリン固定組織由来のタンパク質を定量分析することが可能であることを見出すこともさらに可能であった。この処置は、固定サンプルを、求核試薬の存在下にて７０℃と９０℃の間の温度でインキュベートするという点で公知の先行技術と異なる。これにより、十分な量のインタクトなタンパク質が放出され、その後に正確に定量することができる。タンパク質の抽出時に固定生体サンプルに接触させる水溶液は、好ましくは、タンパク質分解活性を有する化合物（例えば、プロテアーゼなど）を含まない。
【００１３】
方法の工程ｉ）で準備された固定生体サンプルは、完全な生物、生物の一部（特に、組織断片または組織切片）、体液、細胞もしくはウイルスであり得、特に好ましい生体サンプルは、細胞、組織断片、特に、組織切片である。同様に、動物、植物、または微生物（細菌、酵母、または真菌など）が生物として適切であり、特に好ましい出発材料は、ヒト生体サンプルであり、最も好ましい生体サンプルはヒト組織切片、ヒトから単離された細胞、または培養ヒト細胞である。
【００１４】
当業者に公知の全ての固定剤（特に、酸、アルコール、ケトン、または他の有機物質（例えば、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドなど））を使用して生体サンプルを固定することができ、ホルムアルデヒド固定生体サンプルが特に好ましく、１〜３５重量％、好ましくは２〜１０重量％のホルムアルデヒドを含むホルムアルデヒド水溶液で固定した生体サンプルが最も好ましい。
【００１５】
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、方法の工程ｉ）で使用した生体サンプルは、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋した生体サンプルである。かかるサンプルを、通常、ＦＦＰＥサンプルという。かかるＦＦＰＥサンプルを、好ましくは、漸増量の一連のアルコール（すなわち、アルコール濃度を漸増させた一連の水／アルコール混合物を添加し、最後に純粋なアルコールを添加する）によって最初にホルマリン固定生体サンプルを脱水することによって調製する。これに関して、Ｃ１〜Ｃ５アルコールが特に好ましく、アルコール、エタノール、メタノール、およびイソプロパノールがさらに好ましく、エタノールが最も好ましい。次いで、脱水サンプルを流動パラフィンに浸漬し、サンプルにパラフィンを十分に浸透させた後、硬化させる。次いで、適切な切断デバイス（例えば、マイクロトーム）によってパラフィンブロックから組織切片を調製することができる。光学顕微鏡下での試験のためのこれらの切片の厚さは、通常、約５〜２０μｍである。さらに、他の方法（例えば、中空針での穿孔またはいわゆるレーザーキャプチャー法）により、パラフィン包埋サンプルのサイズをより小さなサンプル断片に小さくすることもできる。
【００１６】
方法のｉｉ）では、方法の工程ｉ）で準備した固定生体サンプルを、次いで、好ましくは少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる。生体サンプルがパラフィンに包埋した生体サンプルである場合、サンプルを好ましくは水溶液と接触させる前に最初にパラフィンを、少なくとも部分的に、好ましくは完全に生体サンプルから除去することが好ましい。原理上、当業者に公知の全ての生体サンプルの脱パラフィン方法によって生体サンプルからパラフィンを除去することができる。好ましくは、最初にサンプルを疎水性有機溶媒、特に芳香族炭化水素、最も好ましくはキシレンと接触させてパラフィンを溶出させることによって脱パラフィンする。これに関して、生体サンプルと有機溶媒との混合物を撹拌して（例えば、研究用震盪機で震盪する）パラフィンをできるだけ効率的に確実に溶出するとも有利であり得る。次いで、混合物を遠心分離し、有機溶液をペレット（＝生体サンプル）から除去することが有利である。この生体サンプルからのパラフィンの溶出工程を、必要に応じて、１回、２回、３回、または１０回まで繰り返すことができる。適切な有機溶媒でのパラフィンの溶出に加えて、他の方法（例えば、Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８（１９９５），Ｐ７６８〜７７３に記載のパラフィン融解など）も脱パラフィン法として適切である。
【００１７】
パラフィンの除去後、生体サンプルを再水和することが好ましいかもしれない。この再水和を、好ましくは、漸減濃度のアルコール水溶液（＝一連の漸減量のアルコール）での段階的洗浄によって行う。この場合も、Ｃ１〜Ｃ５アルコールアルコールが特に好ましく、エタノール、メタノール、およびイソプロパノールがさらに好ましく、エタノールが最も好ましい。本発明の方法の好ましい実施形態では、１００体積％〜７０体積％の濃度範囲の一連のアルコールを使用する。連続する濃度の２つのアルコール水溶液の濃度差は、好ましくは１０体積％未満、特に好ましくは多くとも５体積％である。本発明に適切な漸減濃度の一連のアルコールには、例えば、１００体積％、９５体積％、９０体積％、８０体積％、および７０体積％が含まれる。
【００１８】
単一の試薬（例えば、ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから提供されている市販品のＥＺ−ＤＥＷＡＸ（登録商標））で脱パラフィンおよび再水和を行うことも原理上考えられる。
【００１９】
必要に応じて脱パラフィンおよび再水和した生体サンプルを、方法の工程ｉｉ）で好ましくは求核試薬を含む水溶液と接触させる前に、例えば、大気中に静置するか乾燥オーブン中でインキュベートすることによって事前にサンプルを乾燥させることがさらに有利であり得る。
【００２０】
方法の工程ｉｉ）で好ましくは水溶液と接触させる前に、脱パラフィンおよび再水和した生体サンプルを必要に応じて均質化することが本発明でさらに好ましいかもしれない。均質化は、おそらく、より大きな組織断片で特に有利である。この均質化を、生体サンプルのサイズを小さくするための当業者に公知の任意の装置、特に、高圧細胞破壊、機械的粉砕装置（例えば、ミル、ローターステーターホモジナイザー、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザー、または細針）、または超音波ホモジナイザーによって行うことができる。
【００２１】
本発明の方法の工程ｉｉ）では、固定生体サンプルを、次いで、好ましくは少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる。
【００２２】
これに関して、電子をルイス酸の空の軌道に移動させることができる全てのルイス塩基が、求核試薬として適切である。これらのうちで特に好ましいルイス塩基は、負電荷であるか、負に分極しているか、少なくとも１つの遊離電子対を含む少なくとも１つの官能基を有する試薬である。
【００２３】
負電荷の官能基を含む化合物は、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の酸化物、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のハライド、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のシアニドなどである。
【００２４】
負に分極している少なくとも１つの官能基を有する試薬は、特に、そのアルフレッドとロコーの電気陰性度が少なくとも０．２５、特に好ましくは少なくとも０．５、さらに好ましくは少なくとも１．０異なる２つの原子が共有結合した少なくとも１つの官能基を有する試薬である。
【００２５】
しかし、本発明で特に好ましい求核試薬は、１つまたは２つ、特に好ましくは１つの自由電子対（ｆｒｅｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｐａｉｒ）を有する少なくとも１つの官能基を有する求核試薬である。これらの化合物のうちで最も好ましいものは、構造Ｉ：
【化１】
2009519027.tif 000002
（式中、
Ｒ1はＣ1〜Ｃ20炭化水素基、特に好ましくはＣ2〜Ｃ15炭化水素基、さらに好ましくはＣ2〜Ｃ10炭化水素基であり、少なくとも１つのヘテロ原子を有するＣ1〜Ｃ20炭化水素基、少なくとも１つのヘテロ原子を有するＣ2〜Ｃ15炭化水素基、およびさらに好ましくは少なくとも１つのヘテロ原子を有するＣ2〜Ｃ10炭化水素基であり、または任意選択的にヘテロ原子置換された芳香環系であり、
Ｒ2は、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基、さらに好ましくはＣ1〜Ｃ2アルキル基、特にメチル基またはエチル基、Ｃ1〜Ｃ20ヒドロキシアルキル基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10ヒドロキシアルキル基、さらに好ましくはＣ1〜Ｃ2ヒドロキシアルキル基、または水素原子であり、水素原子が最も好ましく、
Ｒ3は、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基、さらに好ましくはＣ1〜Ｃ2アルキル基、特にメチル基またはエチル基、Ｃ1〜Ｃ20ヒドロキシアルキル基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10ヒドロキシアルキル基、さらに好ましくはＣ1〜Ｃ2ヒドロキシアルキル基、または水素原子であり、水素原子が最も好ましい）の少なくとも１つの第一級、第二級、または第三級アミノ基を有する化合物である。
【００２６】
本発明で特に好ましく、上記の構造Ｉの官能基を有する求核試薬は、特に、Ｒ2およびＲ3ラジカルの少なくとも１つ、最も好ましくはＲ2およびＲ3ラジカルの両方が水素原子である構造Ｉの少なくとも１つの官能基を有する求核試薬である。さらに特に好ましい求核試薬は、窒素原子がｓｐ3混成したＲ1、Ｒ2、およびＲ3ラジカル中の原子のみに共有結合する少なくとも１つの構造Ｉの官能基を有する求核試薬である。特に、Ｒ1、Ｒ2、またはＲ3ラジカルは、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3ラジカルを超えた窒素原子上の自由電子対を非局在化できないはずである。したがって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3ラジカルは、例えば、構造ＩＩ：
【化２】
2009519027.tif 000003
を持たないことが特に好ましい。本発明の特に好ましく、構造Ｉの少なくとも１つの官能基を有する求核試薬は、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、イソブチル−アミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ−エタノールアミン、ヘキサメチレンテトラアミン、２−エチルヘキシルアミン、２−アミノ−１，３−プロパンジオール、ヘキシルアミン、シクロヘキシルアミン、１，２−ジメトキシプロパンアミン、１−アミノ−ペンタン、２−メチルオキシプロピルアミン、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アミノカルボン酸（特に、グリシンまたはヒスチジン）、またはアミノグアニジンからなる群から選択され、これらのうち、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、アミノ−１，３−プロパンジオール、アミノグアニジン、およびトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタンが最も好ましい。少なくとも１つの構造Ｉの官能基を有するさらに好ましい求核試薬は、アニリン、トルイジン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、キシリデン、キシレン−ジアミン、ナフタレンジアミン、トルエンジアミン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジフェニルジアミン、フェニレンジアミン、２，４’−メチレンジアニリン、４，４’−メチレンジアニリン、スルホニルジアニリン、およびジメチルベンジルアミンからなる群から選択される芳香族アミンである。
【００２７】
求核試薬が少なくとも１つの構造Ｉの第一級アミノ基を有する本発明の方法の特定の実施形態では、求核試薬は、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルアミン、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルジアミン、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルトリアミン、Ｃ1〜Ｃ15アミノアルコール、Ｃ1〜Ｃ15アミノジオール、またはＣ1〜Ｃ15アミノカルボン酸である。
【００２８】
本発明の方法の別の特定の実施形態では、求核試薬は、ピロール、ピリジン、キノリン、インドール、アザシクロペンタン、アザシクロヘキサン、モルホリン、ピペリジン、イミダゾール、またはこれらの化合物の誘導体からなる群から選択される窒素原子を含む複素環化合物であり、これらの化合物の誘導体は、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3−アルキル基、特に好ましくはメチル基またはエチル基が水素原子の代わりに上記化合物中の１つまたは複数の炭素原子または窒素原子に結合した誘導体を意味する。
【００２９】
上記のうちで特に好ましい求核試薬は、特に、水溶性の求核試薬、特に、２５℃の温度およびｐＨ７で少なくとも１ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌの水への溶解度を示す求核試薬である。
【００３０】
上記求核試薬を含む好ましくは水溶液は、純水、好ましくは脱イオン水または他の水系、特に水と有機溶媒（アルコールなど）との混合物、特に水とエタノールまたはメタノールとの混合物（水の量は、好ましくは少なくとも５０重量％、特に好ましくは少なくとも７５重量％、最も好ましくは少なくとも９０重量％（それぞれ、水および有機溶媒、生理食塩水、緩衝液、特に、０．１〜１０００ｍｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは１〜５００ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは１０〜２００ｍｍｏｌ／ｌの範囲の量で当業者に公知の緩衝液成分（例えば、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、またはＭＯＰＳなど）を含む緩衝液の総重量に基づく））に基づき得る。必要に応じて、かかる緩衝液成分はまた、その構造に応じて、求核試薬と同時に供給することが可能である。水系として栄養培地（例えば、ＭＥＭ培地およびＤＭＥＭ培地など）を使用することもさらに可能である。求核試薬を含む水溶液を、水または適切な水系と求核試薬との混合によって簡潔に調製することが好ましい。
【００３１】
水溶液中の求核試薬の濃度は、好ましくは０．１〜１００００ｍｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは１〜５０００ｍｍｏｌ／ｌ、なおさらにより好ましくは５〜２５００ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは２０〜１０００ｍｍｏｌ／ｌの範囲である。本発明の方法の特に有利な実施形態では、水溶液中の求核試薬の濃度は、２０ｍｍｏｌ／ｌ超、特に好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ超、最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ超である。
【００３２】
水溶液のｐＨは、それぞれ室温で測定して、好ましくはｐＨ２〜１２、特に好ましくはｐＨ４〜９、最も好ましくはｐＨ５〜８の範囲である。
【００３３】
簡潔な様式で十分な量の水溶液中に生体サンプルを浸漬することによって、水溶液を生体サンプルと接触させることが好ましい。生体サンプルが、例えば、組織切片の形態および基質上の接着細胞の形態である場合、基質を水溶液と簡潔に接触させることによって、生体サンプルを水溶液と接触させることが好ましい。
【００３４】
本発明の方法の工程ｉｉｉ）では、水溶液と接触させた生体サンプルをここで加熱し、好ましくは、５０〜１００℃、特に好ましくは５５℃〜９５℃、さらに好ましくは６０〜９０℃、最も好ましくは６５〜８５℃の範囲の温度に加熱する。特に、水溶液と接触させた生体サンプルを、９５℃未満、特に好ましくは９０℃未満、最も好ましくは８０℃未満の温度に加熱することが本発明で有利であり得る。
【００３５】
固定サンプル由来のタンパク質を分析するために使用することができる本発明の方法の特定の実施形態では、方法の工程ｉｉｉ）の水溶液と接触させた生体サンプルを、６５〜８５℃、特に好ましくは７５〜８５℃の範囲の温度に加熱する。
【００３６】
固定サンプル由来のタンパク質を分析するために使用することができる本発明の方法の特定の実施形態では、生体サンプルを、好ましくは、方法の工程ｉｉｉ）の前に５〜４０分間ボイルする（すなわち、約１００℃に加熱する）。
【００３７】
方法の工程ｉｉｉ）における加熱の持続時間は、本質的に、温度および求核試薬の反応性に依存する。当業者は、所与の処置条件下で生体サンプルの架橋が適切に破壊される場合、簡潔な日常的試験によって持続時間を確立することができるであろう。しかし、加熱の持続時間は、通常、６０秒間〜１０時間の範囲、特に好ましくは２分間〜５時間、最も好ましくは１０分間〜２時間の範囲である。
【００３８】
固定サンプル由来のタンパク質を分析するために使用することができる本発明の方法の特定の実施形態では、加熱の持続時間は１６時間までであり得る。
【００３９】
方法の工程ｉ）で使用される生体サンプルの性質および組成に依存して、方法の工程ｉｉｉ）における加熱後に（特に、求核試薬での処置前にサンプルのサイズを小さくしていなかった場合）、生体サンプルのサイズを小さくすることも有利であり得る。当業者に公知の生体サンプルのサイズを小さくするための任意のデバイスを使用することも可能である。特に、高圧細胞破壊、機械的粉砕デバイス（例えば、ローターステーターホモジナイザー、ミル、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザー、または細針）、または超音波ホモジナイザーによってサイズを小さくすることができる。
【００４０】
本発明の方法の特定の実施形態では、方法の工程ｉｉｉ）の加熱中、方法の工程ｉｉ）の前、または方法の工程ｉｉｉ）の後に、生体サンプルを、生体組織の破壊および／または細胞の溶解を促進する化合物と接触させ、好ましくはインキュベートする。この化合物は、好ましくは、酵素、界面活性剤、カオトロピック物質、またはこれらの成分の少なくとも２つの混合物である。
【００４１】
これらに関して好ましい酵素は、特に、プロテアーゼであり、これらのうち、トリプシン、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、およびエンドプロテイナーゼｌｙｓＣが特に好ましく、プロテイナーゼＫが最も好ましい。しかし、本発明の方法の特定の実施形態では、例えば、例えば、ＷＯ  Ａ  ９１／１９７９２号（サーモコッカス・セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ）、サーモコッカス属ＡＮ１種、サーモコッカス・セテッテリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｅｔｔｅｒｉ）、またはサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）から単離）またはＷＯ  Ａ  ９１／１９７９２号（スタフィロコッカス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）から単離）に記載の熱安定性プロテアーゼを酵素として使用することも可能である。熱安定性プロテアーゼに関するこれらの刊行物の開示は、本明細書中で引例として導入され、本発明の開示の一部を形成する。
【００４２】
固定サンプル由来のタンパク質を分析するために使用することができる本発明の方法の特定の実施形態では、プロテアーゼなどのタンパク質分解活性を有する化合物を使用しない。しかし、特定の実施形態では、ＤＮアーゼおよび／またはＲＮアーゼ、好ましくは安定性ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼをここで使用することが可能である。
【００４３】
水溶液中の酵素濃度は、それぞれ、水溶液の総重量に基づいて、好ましくは、０．００１〜５重量％、特に好ましくは０．０１〜２．５重量％、最も好ましくは０．０５〜０．２重量％の範囲である。
【００４４】
使用することが好ましい界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリエチレングリコールフェノールエーテル（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ１００など）、Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ４０、またはこれらの組み合わせを含む群から選択される化合物であり、ＳＤＳおよびＴｒｉｔｏｎＸ１００が界面活性剤として特に好ましい。生体サンプル中に存在する細胞を溶解するための界面活性剤の使用量は、生体サンプルの性質および量に依存し、当業者は、簡潔な日常的実験によって使用量を確認することができる。
【００４５】
固定サンプル由来のタンパク質を分析するために使用することができる本発明の方法の特定の実施形態で、界面活性剤としてＳＤＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０、またはＴｗｅｅｎ２０を使用することが特に非常に好ましい。これらの界面活性剤の濃度は、好ましくは、約０．１〜１０％、特に好ましくは１〜５％の範囲である。
【００４６】
好ましいカオトロピック物質は、特に、グアニジウムイソチオシアナートまたはグアニジウム塩酸塩であり、グアニジウムイソチオシアナートが特に好ましい。特に本発明の処置後に生体サンプルから核酸を単離する場合、カオトロピック物質を使用する。これに関して、カオトロピック化合物に加えて、還元化合物、特に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールも使用することがさらに好ましい。生体サンプルの処置におけるカオトロピック化合物の濃度は、好ましく０．１〜５０ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．５〜２０ｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌの範囲である。
【００４７】
酵素、界面活性剤、またはカオトロピック化合物と生体材料を、上記で説明のように、方法の工程ｉｉｉ）の加熱中、方法の工程ｉｉ）の前、または方法の工程ｉｉｉ）の後にインキュベートすることができる。
【００４８】
本発明の方法の特定の実施形態では、方法の工程ｉｉ）の前に、生体材料を、酵素、界面活性剤、および／またはカオトロピック化合物とインキュベートする。この目的のために、例えば、生体サンプルを、方法の工程ｉｉ）の前に、十分な酵素活性に必要な温度に加熱した溶解緩衝液の形態で、必要に応じて還元化合物（β−メルカプトエタノールなど）と共に、酵素、界面活性剤、カオトロピック化合物、もしくはこれらの少なくとも２つを含む水溶液と接触させ、次いで、この溶解緩衝液を、求核試薬を含む水溶液と置換するか、適量の求核試薬をこの溶解緩衝液に添加する。
【００４９】
本発明の方法の別の特定の実施形態では、方法の工程ｉｉｉ）の後に、生体材料を、酵素、界面活性剤、またはカオトロピック化合物とインキュベートする。この目的のために、求核試薬を含む水溶液を方法の工程ｉｉｉ）における加熱後に生体サンプルから除去し、次いで、この生体サンプルを溶解緩衝液と接触させるか、必要に応じて濃縮液の形態の酵素、界面活性剤、カオトロピック化合物、またはこれらの少なくとも２つを、求核試薬を含む水溶液に添加する。この後に、適切な溶解に必要な温度に加熱する。特にカオトロピック物質を使用する場合、これを方法の工程ｉｉｉ）後のみに添加することが好ましい。
【００５０】
本発明の方法のさらに特定の実施形態では、方法の工程ｉｉｉ）の間に、生体材料を、酵素、界面活性剤、またはカオトロピック化合物とインキュベートする。この目的のために、方法の工程ｉｉ）で使用される水溶液は、求核試薬に加えて、酵素、界面活性剤、カオトロピック化合物、もしくはこれらの少なくとも２つを含む水溶液であるか、必要に応じて濃縮水溶液の形態の酵素、界面活性剤、カオトロピック化合物、もしくはこれらの少なくとも２つを、方法の工程ｉｉｉ）における加熱前に水溶液に添加する。これに関して、この方法において酵素活性を損なうことなく架橋を十分に切断する温度（好ましくは、５０〜１００℃、特に好ましくは５５〜９５℃、さらに好ましくは６０〜９０℃、最も好ましくは６５〜８５℃）を維持することが可能であるので、酵素として上記熱安定性プロテアーゼまたはヌクレアーゼの１つを使用することが特に好ましい。
【００５１】
しかし、方法の工程ｉ）〜ｉｉｉ）における組織の処置様式に関係なく、通常、本発明の処置によって生体サンプルから溶出した生体分子の少なくとも一部が溶解する水溶液を、生体サンプルの加熱後に得る。この水溶液はまた、溶出した生体分子に加えて、さらなる成分（例えば、求核試薬、酵素、界面活性剤、およびカオトロピック化合物など）を含む。
【００５２】
本発明の方法の特定の実施形態では、これは、方法の工程ｉ）〜ｉｉｉ）に加えて、
ｉｖ）生体サンプルから溶出した生体分子を分析する工程も含み、ここで、生体分子は、タンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、ＲＮＡ、またはＤＮＡが好ましいが、ＲＮＡが最も好ましい。
【００５３】
これに関して、生体サンプルから溶出した生体分子の分析のために供給される出発組成物は、以下であり得る：
Ａ１）方法の工程ｉｉ）で使用され、生体分子の一部が方法の工程ｉｉｉ）の後に存在する求核試薬を含む水溶液、
Ａ２）方法の工程ｉｉｉ）の後に求核試薬を含む水溶液を適切な溶解緩衝液に置換した場合または方法の工程ｉｉｉ）の前または後に適切な溶解成分を求核試薬を含む水溶液に添加した場合の酵素、界面活性剤、および／またはカオトロピック化合物を含む水溶液、
Ａ３）例えば、濾過、透析、抽出、沈殿、クロマトグラフィ、またはこれらの精製方法の組み合わせ（しかし、好ましくは、吸着クロマトグラフィにより、特に好ましくは、特に、例えば、選択的沈殿、抽出、または吸着によるＡ１）またはＡ２）の水溶液のタンパク質画分、ＲＮＡ画分、およびＤＮＡ画分への分離（吸着による分離が最も好ましい））による２つの上記組成物Ａ１）およびＡ２）の１つにおける生体分子の精製後に得られた水溶液、または
Ａ４）方法の工程ｉｉｉ）の後に得た組織の適切な水相での抽出によって得た水溶液。
【００５４】
各組成物Ａ１）〜Ａ４）中の生体分子を、当業者に公知の分析方法によって分析することが好ましい。したがって、適切な分析方法は、特に、免疫学的方法（ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、またはアフィニティクロマトグラフィなど）、変異分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（特に、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ））、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＦＬＰ分析（制限フラグメント長多形分析）、サザンブロッティング、連続的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）、中厚液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ分光分析、ＳＥＬＤＩ質量分析、およびマイクロアレイ分析などである。
【００５５】
分析すべき生体分子に応じて、方法の工程ｉｉｉ）の加熱中、方法の工程ｉｉ）の前、または方法の工程ｉｉｉ）の後に、生体サンプルを少なくとも１つの酵素と接触させることができる。生体サンプルを、好ましくは、方法の工程ｉｉ）の前に少なくとも１つの酵素と接触させることができる。
【００５６】
上記で開示のように、分析すべき生体分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである場合、酵素はプロテアーゼであり得る。上記で開示のように、分析すべき生体分子がタンパク質である場合、酵素はヌクレアーゼであり得る。
【００５７】
本発明の特定の実施形態は、サンプル中に含まれるタンパク質のその後の分析のためにホルムアルデヒドで固定した生体サンプルを処置する方法であって、
ｉ）固定生体サンプルを準備する工程と、
ｉｉ）固定生体サンプルを少なくとも１つの求核試薬を含む水溶液と接触させる工程、および
ｉｉｉ）水溶液と接触させた前記生体サンプルを６５℃〜８５℃の範囲の温度で加熱する工程、
ｉｖ）生体サンプルから溶出した生体分子を分析する工程
を含む方法を含む。
【００５８】
ＳＤＳなどの界面活性剤を方法の工程ｉｉ）で添加し、そして／または界面活性剤が既に水溶液中に存在することが特に好ましい。生体サンプルを、好ましくは工程ｉｉｉ）の前に水溶液中で５〜４０分間ボイルし、好ましくは工程ｉｉｉ）で２０分間〜１６時間インキュベートする。
【００５９】
本発明の方法によって得ることができる生体サンプルは、最初に記載の目的の達成にも寄与する。
【００６０】
固定生体サンプルの処置、特に、ホルムアルデヒドで固定された生体サンプルの処置のための上記の求核試薬、特に、少なくとも１つの構造Ｉの第一級、第二級、または第三級アミノ基を含む求核試薬の使用も、最初に記載の目的の達成に寄与する。
【００６１】
固定生体サンプル、好ましくはホルムアルデヒドで固定された生体サンプルから生体分子を単離するためのキットであって、
（α１）求核試薬を含む緩衝液、
（α２）生体分子を吸着するためのマトリックス、
（α３）必要に応じて、溶離緩衝液、
（α４）必要に応じて、酵素、および
（α５）必要に応じて、カオトロピック物質
を含むキットは、最初に記載の目的の達成にさらに寄与する。
【００６２】
特に、本発明の方法に関して好ましい試薬として既に最初に記載の試薬が求核試薬として好ましい。
【００６３】
本発明のキットの好ましい実施形態では、キットはまた、細胞溶解のための成分、特に酵素（α４）、好ましくは、本発明の方法に関する上記のタンパク質分解酵素の１つ、界面活性剤、またはカオトロピック物質（α５）、好ましくは、本発明の方法に関する上記のカオトロピック物質の１つを含む。特に、酵素およびカオトロピック物質が、求核試薬を含む緩衝液（α１）中に単独または組み合わせて既に存在することが可能である。しかし、キットがこれらの化合物を含み、生体サンプルを破壊するために使用することができる適切な溶解緩衝液（α１’）を含むことも可能である。本発明のキットはまた、濃縮形態で酵素、界面活性剤、またはカオトロピック化合物を含み、キットの使用の適切な時期に緩衝液（α１）に添加することができる溶解濃縮物（α１’’）を含むことができる。
【００６４】
生体分子、特にタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡを吸着するための当業者に公知の全ての材料を、生体分子を吸着するためのマトリックス（α２）として使用することが可能である。セルロースベースの材料（特に、カルボキシル官能基を有するセルロース材料またはジエチルアミノエチル−セルロース）、アガロース、または無機物支持体（シリカ、ガラス、石英、ゼオライト、または金属酸化物など）もしくはイオン交換材料でコーティングした支持体が特に好ましい。前記材料は、例えば、膜または磁性もしくは非磁性の粒子の形態で存在し得る。このマトリックスは、好ましくは、充填済みのカラム中のカラム材料または懸濁液としてキット中に存在する。マトリックスの性質は、分析すべき生体分子の化学構造に決定的に依存し、当業者は、特定の使用目的（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡの分析）に適切な吸着材料を承知している。
【００６５】
本発明のキット中に存在することができる溶離緩衝液は、同様に、当業者に公知であり、且つカラムクロマトグラフィにおける溶離のために通常使用される全ての緩衝液である。溶離緩衝液は、好ましくは塩水溶液、特に、アルカリ金属ハライド（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＬｉＣｌなど）、アルカリ土類金属ハライド（例えば、ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２など）、アンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウムなど）または少なくとも２つのこれらの塩の混合物を含む水溶液である。溶離緩衝液は、必要に応じて緩衝系（例えば、アルカリ金属酢酸塩／酢酸またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンに基づいた緩衝系など）を含むことも可能である。固定サンプルからＲＮＡを単離するためにキットを使用し、マトリックスとしてシリカ膜を使用する場合、水、特に、無ＲＮアーゼ水を溶離緩衝液として使用することが特に好ましい。
【００６６】
本発明のキットのさらに特定の実施形態では、分析すべき生体分子を結合した後、溶離緩衝液で溶離する前にマトリックスを洗浄する洗浄緩衝液も含むことができる。
【００６７】
固定生体サンプル、好ましくはホルムアルデヒドで固定された生体サンプルから生体分子を単離する方法での本発明のキットの使用は、最初に記載の目的の達成に寄与する。
【００６８】
（β１）生物、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトまたは動物から生体サンプルを取り出す工程、
（β２）生体サンプルを好ましくはホルムアルデヒドで固定する工程、
（β３）本発明の方法（方法の工程ｉｖ）が含まれる）によって固定生体サンプル由来の生体分子を分析する工程、
（β４）分析の結果に基づいて疾患を診断する工程、および
（β５）診断した疾患を治療する工程
を含む疾患の処置方法も最初に記載の目的の達成に最終的に寄与する。
【００６９】
本発明の方法に関して既に最初に記載された生体サンプルおよび生体分子も生体サンプルおよび生体分子として好ましい。
【００７０】
制限されない図面および実施例によって、本発明をここでより詳細に説明する。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
ラットの肺由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片（１０μｍ）を、それぞれ、５ｍｏｌ／ｌ塩酸グアニジンおよびそれぞれ異なる求核試薬（１３ｍＭ  ＴＲＩＳ、３５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、５重量％トリメチルアミン、１０ｍｇ／ｍｌアミノグアニジン、または５０ｍｇ／ｍｌアミノグアニジン）を含む２５０μｌの水溶液（水溶液はそれぞれｐＨ７．５である）と接触させた。切片を、適切な溶液と７０℃で６０分間インキュベートした。
【００７２】
ＲＮＡを、得られた細胞溶解物から単離した。このために、ゲノムＤＮＡを、最初に、ｇＤＮＡ  ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって除去し、通過物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、４００μｌのエタノールと混合し、この方法で選られた組成物をＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にロードした。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット中に含まれるＲＰＥ緩衝液で２回洗浄した後、膜を乾燥させ、３０μｌの無ＲＮアーゼ水でＲＮＡを溶離した。溶離液中のＲＮＡを、２６０ｎｍでのＯＤの測定によって決定した。結果を図１に示す。
【００７３】
（実施例２）
ラット肝臓由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片（１０μｍ）を、それぞれ、異なる求核試薬（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳおよび１重量％エタノールアミン、１０ｍＭ  ＴＲＩＳおよび０．１％エタノールアミン、ならびに１０ｍＭ  ＴＲＩＳおよび０．０１％  エタノールアミン）を含む２５０μｌの水溶液（水溶液はそれぞれｐＨ７．５である）と接触させた。細胞を、適切な溶液と７０℃で６０分間インキュベートした。次いで、最終濃度５ｍｏｌ／ｌの塩酸グアニジンを添加した。
【００７４】
得られた細胞溶解物からＲＮＡを単離し、ＰＣＲにおけるＲＮＡの挙動を、Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプローブＲＴ  ＰＣＲキットおよび適切なプライマー／プローブ組を使用したＴａｑＭａｎ分析によって決定した。このために、ゲノムＤＮＡを、最初に、ｇＤＮＡ  ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって除去し、通過物を回収し、４００μｌのエタノールと混合し、この方法で選られた組成物をＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にロードした。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット中に含まれるＲＰＥ緩衝液で２回洗浄した後、膜を乾燥させ、３０μｌの無ＲＮアーゼ水でＲＮＡを溶離した。ＰＣＲの結果を、図２に示す。ＰＣＲにおけるＲＮＡの挙動の分析に加えて、単離されたＲＮＡの量も、実施例２における２６０ｎｍでのＯＤの測定によって決定した。結果を、図３に示す。
【００７５】
図２および３により、本発明によるサンプルの処置によって大量のＲＮＡを単離することができ、単離ＲＮＡはＰＣＲ分析においてより良好な挙動を示すことが明らかである。
【００７６】
（実施例３）
ホルマリン固定パラフィン包埋組織由来のインタクトな全長タンパク質の定量的抽出のための温度範囲の検証
ラットの腸および脳由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片（１０μｍ）を、それぞれ、求核試薬である１．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および４％ＳＤＳを含む２５０μｌの水溶液と接触させた。切片を、１００℃で２０分間ボイルし、次いで、８０℃で２時間インキュベートした。
【００７７】
２つの異なる組織の例について異なる温度でインキュベーション工程を行った。次に、同体積の得られた溶解物を、ウェスタンブロット分析に供した。Ｅａｓｙ  ｗｉｎを使用したデンシトメトリーによってアクチンシグナルを測定し、比較した。この場合、８０℃サンプルのシグナルを、常に、１００％に設定した。
【００７８】
８０℃で抽出したサンプルは、種々の組織において、アクチンおよびチューブリンの両方について最も強いシグナルを示した。
【００７９】
（実施例４）
本実施例では、第２のインキュベーション工程の温度差を、より小さくなるように選択した（ラット脳）。実施例３に記載のプロトコールと同様に実験を行った。
【００８０】
７０〜８５℃の範囲、特に８０℃または８５℃でインキュベートしたサンプルで最も強いシグナルが検出されることが明らかに証明された。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、本発明の処置後のラットの肺由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片由来のＲＮＡの収量（ｎｇ）を示す。
【図２】図２は、ＰＣＲ分析における本発明の方法によってラットの肝臓由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片から単離したＲＮＡの挙動（特定の量のＤＮＡに到達するのに必要なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析におけるＰＣＲサイクル数）を示す。
【図３】図３は、本発明の処置後のラットの肝臓由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片由来のＲＮＡの収量（ｎｇ）を示す。
【図４】図４は、本発明の処置後のラットの腸および肺由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片由来のインタクトなタンパク質の収量を示す。
【図５】図５は、インキュベーション工程における温度の関数としての、本発明の処置後のラットの心臓由来のホルマリン固定および脱パラフィン組織切片由来のインタクトなタンパク質の収量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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