(57)【要約】  本発明は、好ましくは高周波数のパルス電磁場による処理を含む、バラ属、セイヨウイラクサおよび／またはタンジーから薬草抽出物を調製する方法に関する。随意的にセレンおよび／または尿素を含む薬草抽出物は、たとえばＨＩＶ感染およびＡＩＤＳなどの免疫系の障害に関連する症状の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬草抽出物を調製するための方法であって、
（ａ）バラ属、セイヨウイラクサおよび／またはタンジーに由来する植物材料を提供し、
（ｂ）前記植物材料を乾燥し、
（ｃ）有機溶媒を加え、
（ｄ）前記植物材料および前記有機溶媒の混合物をインキュベートし、
（ｅ）薬草抽出物を得る、
各工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記バラ属に由来する植物材料が果実であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セイヨウイラクサおよび／またはタンジーに由来する植物材料が、葉および／または小茎であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）の乾燥が、約２０〜５０℃の範囲の温度にて実施されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の乾燥が、約３〜４日間、実施されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒が、約６０から９６％（ｖ／ｖ）のエタノールであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）のインキュベートが、約２０〜４０日間、実施されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）のインキュベートが、約２０〜５０℃の温度にて実施されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｆ）セレンおよび／またはその有機または無機塩を加える、
工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
遊離セレン濃度が約１〜１００ｍｇ／ｌになるように、セレンを加えることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｇ）尿素を加える、
工程をさらに含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｈ）薬草抽出物をパルス電磁場に曝露する、
工程をさらに含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電磁場のパルスが、正弦波、方形および／または確率的形状を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記パルス電磁場が、約５〜７５０ｋＨｚの周波数を有することを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記パルス電磁場が、約１０〜２００ワットの出力を有することを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記パルス電磁場が、１００〜１５０μテスラの磁場強度を有することを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｈ）の曝露が、約２〜５分間、実施されることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｈ）の曝露を反復することを特徴とする、請求項１２から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法によって調製された薬草抽出物。
【請求項２０】
対象の免疫系を刺激することを目的とした、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で調製された、請求項１９に記載の薬草抽出物の使用方法。
【請求項２１】
対象における免疫系障害に関連する疾患の治療を目的とした、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法で調製された、請求項１９に記載の薬草抽出物の使用方法。
【請求項２２】
対象における免疫系障害に関連する疾患の治療用の医薬組成物の製造を目的とした、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で調製された、請求項１９に記載の薬草抽出物の使用方法。
【請求項２３】
前記疾患がＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳであることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の使用方法。
【請求項２４】
前記対象が脊椎動物であることを特徴とする、請求項２０から２３のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項２５】
前記対象が妊娠していないことを特徴とする、請求項２０から２４のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項２６】
対象におけるウイルス感染の治療を目的とした、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で調製された、請求項１９に記載の薬草抽出物の使用方法。
【請求項２７】
対象におけるウイルス感染の治療用の医薬組成物の製造を目的とした、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で調製された、請求項１９に記載の薬草抽出物の使用方法。
【請求項２８】
前記疾患がＲＮＡウイルス感染であることを特徴とする、請求項２６または２７に記載の使用方法。
【請求項２９】
前記対象が脊椎動物であることを特徴とする、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項３０】
前記対象が妊娠していないことを特徴とする、請求項２６から２９のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項３１】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法で調製された、請求項１９に記載の薬草抽出物を含む医薬組成物。
【請求項３２】
医薬品として許容される担体をさらに含むことを特徴とする、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
経口投与用に調製された、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３１から３３のいずれか１項に記載の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくはパルス電磁場による処理を含む、バラ属（Rosa sp.）、セイヨウイラクサ（Urtica dioica）および／またはタンジー（Tanacetum vulgare）から薬草抽出物を調製するための方法に関する。本発明はさらに、随意的にセレンおよび／または尿素を含む、前記方法によって調製された薬草抽出物、および、免疫系障害に関連する疾患、好ましくはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療におけるその薬草抽出物の使用に関する。本発明はまた、医薬組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる慢性の重篤な疾患である。このレトロウイルスはさらに特定することができ、ＨＩＶ−１は西半球および欧州でのＡＩＤＳの原因であり、一方ＨＩＶ−２はアフリカおよび東南アジアでのＡＩＤＳの主原因である。
【０００３】
より詳細には、ＡＩＤＳはＨＩＶ感染の後期に発現する一連の症状によって特徴づけられる。治療無しでは、潜伏期間、すなわちＨＩＶ感染からＡＩＤＳの臨床的発現までの期間は、約１０年間である。ＨＩＶ感染は免疫系の進行性障害を引き起こし、最後には免疫不全を結果として生じる。結果的に、ＡＩＤＳの最も重要な臨床症状は、日和見感染および、さらに、カポジ肉腫、ＨＩＶ脳炎およびＨＩＶ消耗症候群などの特徴的な悪性病変である。免疫不全は、細胞性および体液性免疫の両方に必須であるＣＤ４+Ｔ細胞の喪失に基づく。循環血中のＣＤ４+Ｔリンパ球の定量分析は、流行の開始以来、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳを検出および評価するための不可欠な方法である。疾患の重症度の決定、予後診断および治療的観察のためには、ＣＤ４+Ｔリンパ球の割合およびその経時的変化（傾き）が有用なパラメーターとして働く。
【０００４】
ＡＩＤＳの最初の症例は、前世紀の８０年代初頭に報告された。その間に、ＡＩＤＳは世界に蔓延し、さらには、一部の地域、特に発展途上国の一部で流行している。今日、約４０００万人がＨＩＶに感染しており、うち約２２０万人が子どもである。２００４年には、約５００万件の新規感染が記録され、約３１０万人がＡＩＤＳで死亡し、うち５１万人が子どもであった（世界保健機関ＷＨＯによる）。
【０００５】
１９９５年以来、ＡＩＤＳの治療のための薬剤の数は３倍になっている。現在、効率の向上および副作用の減少をもたらす併用療法が一般に用いられている。新規の有効物質または医薬、および治療概念の開発は、疾患の進行の遅延、疾患後期の症状の逆行、および感染した母親から生まれる乳児の感染予防に成功した。３種類以上の薬剤を含む併用療法である、いわゆる「高活性抗レトロウイルス療法」（ＨＡＡＲＴ）が標準治療となっている。ＨＡＡＲＴはＡＩＤＳの進行を遅らせ、死亡率を低下させることが示された。通常、ＨＡＡＲＴに含まれる薬剤のうち２種類は逆転写酵素を標的とし、１種類の薬剤はウイルスプロテアーゼを標的とする。確立された逆転写酵素阻害剤は、ジドブジン（ＡＺＴ、Retrovir（登録商標））、ラミブジン（Epivir（登録商標））、およびジダノシン（Videx（登録商標））などのヌクレオシド類似体である。これらの転写酵素阻害剤は成長ＤＮＡ鎖に組み込まれ、その結果、以降のＤＮＡ合成が阻まれる。たとえば、Viramune（登録商標）のように、別の機構によって酵素を阻害する、他の逆転写酵素阻害剤が知られている。プロテアーゼ阻害剤はウイルスプロテアーゼを遮断し、そのため新しいウイルスの組み立てに必要なタンパク質を大きいタンパク質前駆体から開裂させることができない。この種の薬剤の例として、インジナビル（Crixivan（登録商標））、サキナビル（Invirase（登録商標））、リトナビル（Norvir（登録商標））、およびメシル酸ネルフィナビル（Viracept（登録商標））が挙げられる。治療的介入に有用な他の薬剤は、たとえばエンフビルチド（Fuzeon（登録商標））などの融合阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤である。
【０００６】
ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療における大きな進歩にもかかわらず、未だにいくつかの欠点および不利益が存在する。現在使用されている薬剤は非常に高価であり、したがって、それらは裕福な国々の資源を枯渇させるだけでなく、流行が猛威を振るう多数の貧しい国々ではまったく利用することができない。それらは多数の不快な副作用（たとえば吐き気、下痢）を有するが、それらはまた、重度の副作用（たとえば、時に致命的結果を伴う肝臓および膵臓障害）を示すこともある。それらは、たとえば一日に一ダース以上の錠剤（随伴する日和見感染に対応するのに必要なものを含めずに）といった非常に複雑な投薬計画を必要とする。最後に、患者に薬剤耐性ビリオンが発現することにより、それらはしばしば選択された効力を失う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このため、ＡＩＤＳ症状の改善、ＡＩＤＳ発現の遅延および／またはＨＩＶ感染における介入を提供する、別の、改善された、または優れた医薬的手段が必要とされている。さらには、より費用効率的な医薬的手段が必要とされている。
【０００８】
したがって、ウイルス感染および関連する徴候および症状、好ましくはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療に有効な医薬活性組成物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、
（ａ）バラ属、および／またはセイヨウイラクサおよび／またはタンジーに由来する植物材料を提供し、
（ｂ）前記植物材料を乾燥し、
（ｃ）有機溶媒を加え、
（ｄ）前記植物材料および前記有機溶媒の混合物をインキュベートし、
（ｅ）薬草抽出物を得る、
各工程を有してなる、薬草抽出物の調製方法によって解決される。
【００１０】
ある実施の形態では、植物材料はバラ属、セイヨウイラクサおよびタンジーに由来する。
【００１１】
ある実施の形態では、バラ属に由来する植物材料は、カニナバラ（Rosa canina）に由来する。
【００１２】
ある実施の形態では、バラ属に由来する植物材料は果実である。
【００１３】
ある実施の形態では、セイヨウイラクサおよび／またはタンジーに由来する植物材料は葉および／または小茎である。
【００１４】
ある実施の形態では、工程（ｂ）の乾燥は、約２０〜５０℃の、好ましくは約３７〜４５℃の、非常に好ましくは約４２℃の温度にて実施される。
【００１５】
ある実施の形態では、工程（ｂ）の乾燥は約３〜４日間、実施される。
【００１６】
ある実施の形態では、有機溶媒は、好ましくは約６０〜９６重量％の、より好ましくは約８０〜９６容積％の、非常に好ましくは約９６容積％のエタノールである。
【００１７】
ある実施の形態では、工程（ｄ）のインキュベートは、約２０〜４０日間、好ましくは約２２〜３８日間、非常に好ましくは約２５〜３５日間、実施される。
【００１８】
ある実施の形態では、工程（ｄ）のインキュベートは、約２０〜５０℃の、好ましくは約３７〜４５℃の、非常に好ましくは約４２℃の温度にて実施される。
【００１９】
ある実施の形態では、方法はさらに下記の工程を含む：
（ｆ）セレンおよび／またはその有機または無機塩を加える。
【００２０】
ある実施の形態では、セレンは約１〜１００ｍｇ／ｌの、好ましくは約５〜５０ｍｇ／ｌの、非常に好ましくは約１０〜２０ｍｇ／ｌの遊離セレン濃度となるように加えられる。
【００２１】
ある実施の形態では、方法はさらに下記の工程を含む：
（ｇ）尿素を加える。
【００２２】
ある実施の形態では、方法はさらに下記の工程を含む：
（ｈ）薬草抽出物をパルス電磁場に曝露する。
【００２３】
ある実施の形態では、電磁場パルスは正弦波、方形および／または確率的形状を有する。
【００２４】
ある実施の形態では、パルス電磁場は、約５〜７５０ｋＨｚの、好ましくは約５０〜３５０ＭＨｚの、非常に好ましくは約２５０ＭＨｚの範囲の周波数を有する。
【００２５】
ある実施の形態では、パルス電磁場は約１０〜２００ワットの、好ましくは約２０〜１００ワットの、非常に好ましくは約４５ワットの範囲の出力を有する。
【００２６】
ある実施の形態では、パルス電磁場は、１００〜１５０μテスラの範囲の磁場強度を有する。
【００２７】
ある実施の形態では、工程（ｈ）の曝露は、約２〜５分間、実施される。
【００２８】
ある実施の形態では、工程（ｈ）の曝露は、反復され、好ましくは３回実施される。
【００２９】
本発明の目的は、さらに、本発明に記載の方法で調製された薬草抽出物によって解決される。
【００３０】
本発明の目的は、対象の免疫系を刺激することを目的とした、本発明に記載の方法で調製された、本発明に記載の薬草抽出物の使用によってさらに解決される。
【００３１】
本発明の目的は、さらに、対象における免疫系障害に関連する疾患の治療用を目的とした、本発明に記載の方法で調製された、本発明に記載の薬草抽出物の使用によって解決される。
【００３２】
本発明の目的は、さらに、対象における免疫系障害に関連する疾患の治療用の医薬組成物の製造を目的とした、本発明に記載の方法で調製された、本発明に記載の薬草抽出物の使用によって解決される。
【００３３】
ある実施の形態では、疾患はＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳである。
【００３４】
前記使用についてのある実施の形態では、対象は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、非常に好ましくはヒトである。
【００３５】
ある実施の形態では、対象は妊娠していない。
【００３６】
本発明の目的は、対象におけるウイルス感染の治療を目的とした、本発明に記載の方法で調製された、本発明に記載の薬草抽出物の使用によって解決される。
【００３７】
本発明の目的は、対象におけるウイルス感染の治療用の医薬組成物の製造を目的とした、本発明に記載の方法で調製された、本発明に記載の薬草抽出物の使用によって解決される。
【００３８】
ある実施の形態では、疾患はＲＮＡウイルス感染、好ましくはレトロウイルス感染、非常に好ましくはＨＩＶ感染である。
【００３９】
前記使用についてのある実施の形態では、対象は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、非常に好ましくはヒトである。
【００４０】
前記使用についてのある実施の形態では、対象は妊娠していない。
【００４１】
本発明の目的は、さらに、本発明に記載の方法で調製された、本発明に記載の薬草抽出物を含む医薬組成物によって解決される。
【００４２】
ある実施の形態では、医薬組成物は、医薬品として許容される担体をさらに含む。
【００４３】
ある実施の形態では、医薬組成物は、経口投与用に調製される。
【００４４】
本発明の目的は、さらに、本発明に記載の医薬組成物を含むキットによって解決される。
【００４５】
「確率的形状」の語は、電磁場パルスがノイズの形状であるという意味を含む。好ましくは、電磁場パルスは方形であり、内部の正弦波と組み合わされている。パルス電磁場の「出力」（ワット）は、たとえば有効電力を意味する。パルス電磁場の「磁場強度」（テスラ）の値はたとえばピークからピークまでを示す。
【００４６】
「免疫系の刺激」の効果および「免疫系障害」の症状は、本分野で公知の方法およびパラメーターを用いて測定することができる。これらの測定の標的は、Ｔリンパ球（ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔリンパ球）、Ｂリンパ球、抗体および補体系の成分など、細胞性および体液性（antibody-mediated）免疫系の任意の成分でありうる。測定方法の一例は、ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）分析である。ＣＤ４Ｔリンパ球は、細胞数または百分率で、非常に好ましくは時間依存的方法で測定されることが好ましい。
【００４７】
本明細書では「ＡＩＤＳ」の語は、ＨＩＶ感染の後期に関連する特徴的徴候を有する臨床症状をいう。
【００４８】
本明細書では「ＲＮＡウイルス感染」の語は、ＲＮＡウイルス、好ましくはレトロウイルスによる感染をいう。本発明によって考慮されるＲＮＡウイルスの例は、ポリオ、コクサッキー、カリシ、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、エンテロ、ライノ、風疹、ＣＥＥ（中央ヨーロッパ脳炎）、インフルエンザ、ＲＳ（呼吸器合胞体）、パラインフルエンザ、麻疹、ムンプス、コロナ、アレナ、ラッサ、ブニヤ、ハンタ、ラブド、フィロ、ボルナ、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病）、およびロタウイルスである。
【００４９】
本明細書では「医薬組成物」の語は、本発明の薬草抽出物を含むことが意図されている。本発明の薬草抽出物の少なくとも１つの医薬活性成分および／または前記活性成分の少なくとも１つの誘導体または類似体およびその対応する塩を含む医薬組成物もまた考慮されている。
【００５０】
医薬組成物は、たとえば、液剤、シロップ、エリキシル、乳剤、および懸濁剤などの液体、または、カプセル、カプレット、錠剤、丸剤、粉剤、および坐剤などの固形状でありうる。顆粒または半固形状およびジェルキャップもまた考慮される。医薬組成物が液体または粉末である場合は、用量単位は、随意的に、たとえばスプーン一杯という用量単位で測定する。薬草抽出物または医薬活性成分に加えて、医薬組成物は、たとえば、香料、甘味料、色素、保存料、安定剤、着色料、賦形剤、懸濁剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤を含んでもよい。錠剤はたとえばコーティングされて差し支えない。注射用液体は無菌でなければならない。経皮送達系およびリポソーム系もまた考慮される。記載されるすべての製剤は、即時放出、遅延放出、および持続放出を対象としてもよい。
【００５１】
本明細書では「医薬品として許容される」の語は、少なくとも無毒性であることを意味する。本開示が意味する「医薬品として許容される担体」は、所望の投与経路に応じてさまざまな形態を取りうる。その用語は、水またはエタノールなどの従来の医薬希釈剤、およびコーンスターチ、乳糖、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸一水素カルシウムまたはガムなどの従来の錠剤成分を含む。
【００５２】
本発明の医薬組成物の投与は、経口、舌下、非経口、経静脈、腹腔内、経鼻、経膣、直腸、皮下、皮内、筋肉内および局所など、さまざまな経路を使用して差し支えない。用量単位は、日、週、または月に１回または数回投与して構わない。送達もまた、たとえば注入または経皮徐放系を介して持続的に行なわれて差し支えない。
【００５３】
このように、本発明は、電磁場照射で処理された、バラ属、セイヨウイラクサおよび／またはタンジー由来の薬草抽出物の組合せを提供する。臨床データは、ＡＩＤＳの治療における本抽出物の有益な効果を示した。in vitroおよび実験動物モデルの両方で実施された試験は、本抽出物が毒性、変異原性、または発がん性を示さないことを明らかにした。しかしながら、妊娠には禁忌である。
【００５４】
本発明を例示することを意図する下記の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、実施例は、請求項の対象または保護の範囲を限定する効果を有しないことが意図される。
【実施例】
【００５５】
実施例１：薬草粗抽出物の調製
セイヨウイラクサ（Urtica dioica）およびタンジー（Tanacetum vulgare）の葉および小茎を野外で採集する。有用部分を分離し、最初の洗浄後、材料を木製ざる上で、暗所にて３〜４日間、好ましくは４２℃にて乾燥する。乾燥条件では、植物材料は変色無く緑色となり、葉および茎は脆くなる。抽出には、密閉ガラス容器を使用する。乾燥した植物材料を破砕して小片（２〜５ｃｍ）とし、ガラス容器に隙間が残らないように入れる。充填（圧縮）後、ＥｔＯＨ（９６％；ここではエタノール溶液の％は容積％をいう））を、容器が完全に満たされるまで入れる。容器をインキュベーター（３７〜４５℃、好ましくは４２℃）に２０〜４０日間、暗緑色の溶液が現れるまで入れる。
【００５６】
野バラ（カニナバラ）の抽出には、乾燥果実を使用する。別の実施形態では、バラ属の別種を代わりにまたは追加で使用してもよい。果実を密閉容器に半分まで入れ、ＥｔＯＨを加える。容器をインキュベーター（３７〜４５℃、好ましくは４２℃）で２０〜４０日間、橙赤色の抽出物が現れるまで保存する。
【００５７】
インキュベート期間後、植物材料が無色になったら、布フィルターを用いて植物材料から分離し、抽出物を回収する。
【００５８】
実施例２：電磁処理
カニナバラの抽出物を電磁場に３分間曝露する。次いで、照射したカニナバラ 抽出物５０〜７０ｍｌを、２Ｌのセイヨウイラクサおよびタンジーの各抽出物にそれぞれ加える。合わせたセイヨウイラクサ／カニナバラおよびタンジー／カニナバラ抽出物それぞれ１Ｌ当たり、１６ｍｇのセレンおよび１５０ｍｇの尿素を加える。別の実施形態では、セレンまたは尿素のどちらかを加える。次いで容器を再び密閉し、インキュベーターに２４時間４２℃にて保存する。インキュベート後、容器を電磁場に３分間ずつ４回曝露し、一緒に保管する。結果として得られる抽出物をそれぞれ５、０．４５および０．２２μｍのフィルターに順に通し、滅菌バイアルに分注する。ラベル付けおよび包装後、薬草抽出物は使用できる状態である。
【００５９】
粗抽出物を曝露する電磁場は、パルス状で、強力であり、磁気インパルス発生機(Magnetic Impulse Generator)（ＭＩＧ）装置で発生する電流の方向が変化しないという点で単極性である。パルス磁場は５ｋＨｚ〜７５０ｋＨｚの範囲の非常に高い周波数を有する。この実施例では、方形のパルスが使用された。とはいえ、別の実施形態では、正弦波または確率的形状も同様に考慮される。パルスは方形であり、内部で正弦波と組み合わされることが好ましい。いずれの理論にも拘束さることを意図しないが、生じた特殊なパルスが、分子内の原子の物理的配列および／または分子の配列に何らかの変化を引き起こし、それによって化学的性質の変化をもたらすという仮説が立てられる。
【００６０】
薬草抽出物の調製では、高周波数の電磁パルスの照射を３〜４回、各２〜５分間、用いられる。パルスの電気出力（たとえば有効電力）は約２０〜１００ワットであり、最良の効果は４５ワットにて得られる。
【００６１】
実施例３：前臨床試験
前臨床試験では、本発明の薬草抽出物を急性毒性および慢性毒性について試験した。薬物急性毒性を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびウィスターラットに単回筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を行った。薬物慢性毒性を、ウィスターラットで３ヶ月間、イヌで１ヶ月間試験した。薬草抽出物の潜在的変異原性、胎児毒性、催奇形性、アレルゲン性、および免疫毒性、ならびに薬草抽出物の生殖機能に対する作用を調べた。
【００６２】
実施した実験の結果として、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびウィスターラットへの単回ｉ．ｍ．注射後、本発明の薬草抽出物が低毒性薬物であることが明らかになった。急性毒性実験条件下では、生理食塩水で１：５に希釈して腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された抽出物のＬＤ50は、ラットで５１〜５４ｍｌ／ｋｇ、マウスで５６〜５９ｍｌ／ｋｇであった。
【００６３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはウィスターラットに薬草抽出物をｉ．ｍ．またはｉ．ｐ．注射した際、抽出物の毒性作用に対する被験動物の感度に特異的な差または性差は見られなかった。ＬＤ50に相当する用量でのＢＡＬＢ／ｃマウスおよびウィスターラットの中毒パターンは、エチルアルコール中毒のパターンと同様であった；エタノールは薬草抽出物調製において高濃度にて溶媒として使用された。ラットには、用量０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇ用量（ヒトの日用量より１０および３０倍多い）を１日１回、３ヶ月間、およびイヌには、０．０７ｍｌ／ｋｇ用量（ヒトの日用量より１０倍多い）を１日１回、１ヶ月間、ｉ．ｍ．投与後の薬草抽出物の慢性毒性を試験し、動物体の基本臓器および系には有害な作用は見られなかった。
【００６４】
本発明の薬草抽出物は明らかに変異原性を有せず、動物の生殖機能にも影響を及ぼさなかった。妊娠中のラット（妊娠１日目から出産まで）に薬草抽出物を０．２１ｍｌ／ｋｇ用量で１日１回、ｉ．ｍ．投与した場合には、薬物は胎児毒性および催奇形性を示した。したがって、薬物は妊娠時禁忌である。
【００６５】
さらには、モルモットに０．０７および０．１４ｍｌ／ｋｇ用量を１日おきに１０日間投与したが、薬草抽出物はアレルゲン性または免疫毒性を示さなかった。
【００６６】
結論として、毒性学的実験の結果、本発明の薬草抽出物が、妊娠時禁忌を考慮すれば、体系的な臨床試験に使用できることを示唆した。
【００６７】
３．１．急性毒性
試験は、１２８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄および雌、体重１８〜２０ｇ）および４７匹のウィスターラット（雄および雌、体重１８０〜２２０ｇ）で、薬草抽出物のｉ．ｍ．注射をマウスに、およびｉ．ｐ．注射をマウスおよびラットに用いて行なわれた。薬草抽出物を滅菌生理食塩水で１：１０および１：５に希釈し、次いでこれらの希釈液をさまざまな容量で被験動物に適用した。次いで１４日間、調製物の考えうる毒性作用について実験動物を観察した。
【００６８】
被験動物への単回注射後の薬草抽出物の毒性は、２段階方式で決定された：最初に、概算ＬＤ50をDeihmanおよびLeblancの方法によって確立し、次いでＬＤ16、ＬＤ50±ＳＤおよびＬＤ84の正確な指数をLitchfieldおよびWilcoxonに従ったプロビット分析によって決定した。
【００６９】
行なわれた実験により、ＢＡＬＢ／ｃマウスに生理食塩水で１：１０希釈した薬草抽出物を２５〜５０ｍｌ／ｋｇ用量で単回ｉ．ｍ．注射によっては動物の中毒および死亡を生じないことが明らかになった。用量を７５〜１００ｍｌ／ｋｇに増加した場合は、運動活性の低下が見られたが、動物の死亡は見られなかった。生理食塩水で１：５希釈した薬草抽出物を２５〜５０ｍｌ／ｋｇ用量で注射した後は、疼痛、重篤な沈鬱状態および最終的に数時間後の動物死亡が生じた。マウスにおける薬草抽出物の中毒プロファイルは、薬草抽出物中に溶媒として高濃度で存在するエチルアルコール（３７．３ｍｌ／ｋｇ）による中毒のプロファイルと同様であった。ウィスターラットの結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスで観察されたものと同様であった。
【表１】
2009525289.tif 000002
【００７０】
上記の表１に示すデータは、たとえば毒性定量評価のパラメーターに従った薬草抽出物の毒性が、ｉ．ｍ．およびｉ．ｐ．注射で有意差がないことを示す。
【００７１】
３．２．慢性毒性
３．２．１．ラットでの試験
３ヶ月間、ウィスターラットに調製物をｉ．ｍ．注射することにより、本発明の薬草抽出物に関する毒性試験を実施した。これらの実験は、９０匹のウィスターラット（雄および雌、体重１８０〜２００ｇ）を３０匹ずつ（雄１５匹および雌１５匹）３群に分けて実施した。第１群は対照（生理食塩水）とし、第２群には薬草抽出物０．０７ｍｌ／ｋｇを投与し、第３群には薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇを投与した。薬草抽出物の試験用量は、ヒトに推奨される治療の日用量（薬草抽出物０．５ｍｌを生理食塩水５ｍｌで希釈したもの、または調製物０．００７ｍｌ／ｋｇ）より、それぞれ１０倍および３０倍多い。
【００７２】
結果は、０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇ用量の薬草抽出物のｉ．ｍ．注射がラットの一般状態および行動に影響を与えないことを示す。慢性毒性実験中、薬草抽出物各０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇを投与されている動物には、対照と比較して赤血球、白血球、血小板の量、およびヘモグロビン濃度に統計的有意差は見られなかった（表２および３）。
【表２】
2009525289.tif 000003
【表３】
2009525289.tif 000004
【００７３】
ラットでの慢性毒性実験条件下、すなわち０．０７ｍｌ／ｋｇおよび０．２１ｍｌ／ｋｇ用量の調製物のｉ．ｍ．注射では、血清総タンパク質濃度に有意差は見られなかった。ラットに０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇ用量の薬草抽出物を長期投与しても有害な作用がないことは、慢性毒性実験の３ヶ月の間、アスパラギン酸およびアラニンアミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびアルカリホスファターゼなどの肝酵素の活性が安定していたことによって裏付けられる。薬草抽出物のラットへの長期投与は、実験動物の血清中のビリルビン、コレステロール、トリグリセリド、尿素、クレアチニン、およびグルコースの濃度に影響を与えなかった。
【００７４】
生理食塩水で１：１０希釈された調製物の、０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇでの、動物の腿部筋肉への長期注射は、局所刺激作用を有しなかった。
【００７５】
肉眼的観察は、この群の動物に対する薬草抽出物の毒性作用または毒性アレルギー性作用を示さなかった。
【００７６】
０．２１ｍｌ／ｋｇ用量での薬草抽出物のｉ．ｍ．注射後の３ヶ月間にこの群の動物には、内臓（脳、下垂体、胸腺、気管、肺、心臓、食道、脾臓、肝臓、膵臓、副腎、腎臓、胃、および雌および雄の生殖器）の病理的変化は見られなかった。
【００７７】
３．２．２．イヌでの試験
実験は８匹（雄、当初体重１２〜１４．５ｋｇ）のイヌを各４匹の２群に分けて実施した：第１群−対照、第２群−薬草抽出物０．０７ｍｌ／ｋｇ。調製物の投与量は、ヒトでの最高治療日用量より１０倍多い。０．０７ｍｌ／ｋｇ用量で試験した調製物を、滅菌生理食塩水で１：１０に希釈し、１日１回、１ヶ月間、イヌの大腿筋に注射した。
【００７８】
イヌでの実験の開始前および０．０７ｍｌ／ｋｇ用量を用いた治療開始の１ヶ月後に実施した心電図（ＥＣＧ）試験は、心拍数の増加またはＥＣＧパラメーターの変化を示さなかった。対照動物と比較して、被験動物におけるすべてのＥＣＧパラメーターは、実験の前後で変化しなかった（表４）。
【表４】
2009525289.tif 000005
【００７９】
結果は、毎日、１ヶ月間、０．０７ｍｌ／ｋｇ用量（ヒトの日用量より１０倍多い）での薬草抽出物のｉ．ｍ．注射によるイヌへの投与が、動物の一般状態および行動に影響しないこと、および、この投与が動物体の主要臓器および系の機能を変化させないことを示した。
【００８０】
組織学的検査の我々のデータによると、イヌにおける０．０７ｍｌ／ｋｇ用量の1ヶ月のｉ．ｍ．注射の間に、薬草抽出物の毒性作用または局所刺激作用は示されなかった。
【００８１】
３．３．変異原性
３．３．１．微生物における遺伝子変異（エームス試験）
薬草抽出物の変異原活性の評価は、in vitroでの代謝活性化系で、また、そのような系無しで、指標微生物の遺伝子変異を誘導する物質の能力の方法によって実施された。変異を同定するプレート法を使用した。この方法はAmesらによって提供され、我々は、３種類のヒスチジン栄養要求性株、すなわちネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１５３７を指標微生物として使用した。
【００８２】
エームス試験を実施するために、薬草抽出物の希釈液を下記の方法で得た：調製物の原液を測定および秤量し、蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。さらなる希釈液を蒸留水で調製し、ペトリ皿に加えた。０．１〜１０００μｇ／枚の調製物濃度について調べた。陰性対照として蒸留水を使用した。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００８３】
上記のデータから、０．１〜１０００μｇ／枚の濃度における薬草抽出物が、ネズミチフス菌株ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３７において復帰変異株数の増加を生じないと結論づけることができる。したがって、薬草抽出物はエームス試験による変異原性を有しない。
【００８４】
３．３．２．マウス生殖細胞における優性致死変異
マウスハイブリッドＦ1（ＣＢＡ×Ｃ57ＢＩ6）における優性致死変異の研究を目的とした実験において、薬草抽出物の潜在的変異原性を評価するために実験を行った。
【００８５】
生理食塩水で希釈した薬草抽出物を、雄マウスに０．７ｍｌ／ｋｇ用量でｉ．ｍ．投与した。この用量は、ヒトの推奨日用量（０．００７ｍｌ／ｋｇ）の１００倍も多かった。
【表８】
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【００８６】
表８に見られるように、７００μｌ／ｋｇ用量での薬草抽出物の単回ｉ．ｍ．注射の作用を受けている動物における着床後損失の水準は、対照動物における水準を上回らない。
【００８７】
３．３．３．マウス骨髄細胞における染色体異常
この方法の本質は、化学物質および物理的要因の作用に感受性である骨髄細胞の遺伝系に対する、動物の体内に導入された被験物質の作用の評価にある。薬草抽出物の投与後に、「新規薬理物質の実験（前臨床）研究のための指示書（Instructions for experimental (pre−clinical） study of new pharmacologic substances）」に開示される方式に従って、染色体異常を分析した。
【表９】
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【００８８】
実験データから分かるように、試験用量の薬草抽出物の作用を受けているマウスの骨髄では、対照と比較して、染色体異常の程度に統計的有意差は見られなかった。したがって、骨髄細胞中の染色体異常の試験によると、薬草抽出物は変異原活性を有しない。
【００８９】
３．３．４．ＳＯＳ−染色体試験(chromotest)におけるＤＮＡ損傷作用
ＤＮＡ損傷の試験の１つは、被験物質の作用に対する細菌細胞のＳＯＳ応答の誘発を測定する試験、いわゆるＳＯＳ−染色体試験である。その試験は、ＤＮＡ損傷に対するＳＯＳ応答の知識に基づいている。試験の基礎となるのは、β−ガラクトシダーゼ酵素の合成を担うLacZを、ＳＯＳ系の一般的なリプレッサーによって調節される遺伝子sfiAと融合させることによって構築された、大腸菌ＰＱ３７株である。sfiA発現はＳＯＳ応答の一部としてＤＮＡ損傷後に誘発される。この試験では、ＳＯＳ発現は、発色反応によって測定可能な、β−ガラクトシダーゼの酵素活性の定性的測定によって測定される。この株の細胞増殖のマーカーはアルカリホスファターゼであり、その活性もまた発色反応によって測定することができる。分析の結果として、被験物質濃度に対するβ−ガラクトシダーゼ合成の依存曲線、およびこのような条件下での細菌増殖の変化を特徴づける曲線が得られる。これらの指標に従って、ＳＯＳ誘発能が計算される。この能力は、当該物質がsfiA遺伝子発現を誘発する能力を示す。
【００９０】
得られた結果は、薬草抽出物が、大腸菌ＰＱ ３７株では、試験したいずれの濃度でも、ＤＮＡ修復系の活性化を誘発しなかったことを示す。したがって、薬草抽出物はＤＮＡ損傷作用を有しない。
【００９１】
３．４．胎児毒性および催奇形性
実験は妊娠ウィスターラット３６匹を各１８匹の２群に分けて実施した：第１群−対照、第２群−薬草抽出物（ヒトの最大日用量より３０倍多い、０．２１ｍｌ／ｋｇ用量で）。調製物を生理食塩水で希釈し、妊娠の全期間にわたって（第１日から出産まで）、ラットに１日１回、ｉ．ｍ．投与した。対照動物は、適当な量の生理食塩水を、毎日、妊娠第１日から出産まで投与された。妊娠第２０日に、その後の胎仔の骨格および内臓の検査、ならびに着床前および着床後死亡の指標測定のため、妊娠ラットの７０％を頸椎脱臼によって屠殺した。
【表１０】
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【００９２】
表１０にまとめたように、０．２１ｍｌ／ｋｇ用量の薬草抽出物の妊娠雌へのｉ．ｍ．注射は、妊娠全期間にわたって、対照群と比較して、妊娠雌の体重の増加に影響しなかった。
【００９３】
生存胎仔数、着床部位数、黄体数、および胎仔体重といった妊娠期間中の薬草抽出物の胎児毒性の評価基準は、調製物を投与されたラットの群で低かった。実験群での着床前死亡の指数は、対照の指数よりも有意に高かったが、着床後死亡レベルでは低かった。０．２１ｍｌ／ｋｇ用量で調製物を投与された妊娠ラットの胎仔の頭尾長は、対照群におけるおおよその長さと、統計的有意差が無かった（表１１）。
【表１１】
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【００９４】
出生前期間に０．２１ｍｌ／ｋｇ用量で薬草抽出物の作用を受けた胎仔の目視および微小解剖検査（Wilson-Dibanに従った標準切開）では、事例の６．７％で胎仔が発育不全であることが明らかになった。妊娠中に薬草抽出物を投与されたラット群での水腎症および心嚢血腫などの病理の頻度は、対照群の頻度を上回った。
【００９５】
出生前期間に０．２１ｍｌ／ｋｇ用量で薬草抽出物の作用を受けたラット胎仔における骨格系の発達を試験する目的で、アリザリン染色した胎仔の全身調製物を分析した際には、骨格の発達上の欠陥は見られなかった。しかしながら、調査した骨中心（foci of bone）の大部分で、骨化の阻害が観察された。
【００９６】
結論として、０．２１ｍｌ／ｋｇ用量（この用量はヒトの最大治療量より３０倍多い）での薬草抽出物の、妊娠ラットへの妊娠第１日から第２０日までのｉ．ｍ．投与は、妊娠ラットの体重の変化、および妊娠期間に対して悪影響を与えたことに注目しなければならない。生存胎仔数、胎仔体重、着床部位数、および黄体数、着床前および後の死亡のパラメーター、および骨中心の骨化の阻害といった胎児毒性の指標に対する調製物の作用を観察した。
【００９７】
幼若ラットの生後発達中に、身体的発達の有意な遅滞が見られた。実験群では、胎仔の６．７％に発育不全がみられた。この発育不全は、胎仔の発育欠陥とみなすことができる。
【００９８】
このように、０．２１ｍｌ／ｋｇ用量での薬草抽出物の胎児毒性および催奇形性が明らかになった。これに関連して、調製物の投与について妊娠は禁忌と考えなければならない。
【００９９】
３．５．生殖機能に対する作用
ウィスターラット（雄および雌；初期体重１８０〜２００ｇ）で試験を実施した。６０匹から成る雌の１群を、２つの下位群に分けた：対照群（４０匹）および実験群（２０匹）。２週間（性周期３〜４回）の期間中毎日、実験群の雌に薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇをｉ．ｍ．注射した。注射前に、調製物を生理食塩水で希釈した。
【０１００】
雄および雌ラットへの薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇの筋肉内注射は、黄体、着床、生存胎仔、および再吸収の量といったラットの生殖機能の指標を変化させなかった。着床前および着床後の死亡の値は、対照値とあまり差が無かった；これは、調製物を投与された雌について、および調製物を注射された雄が妊娠させた雌についての両方に当てはまった。
【０１０１】
本試験は、薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇ（ヒトに推奨される最大日用量より３０倍多い）のｉ．ｍ．注射が、性活動、生殖指標（生存胎仔数、その体重、黄体量、頭尾比、着床位置、再吸収）、またはラットの新生仔発育のいずれにも影響しないことを確立する助けとなった。このように、性的に健常な成熟ラットの生殖機能に対して、被験調製物の影響は示されなかった。
【０１０２】
３．６．免疫関連作用
３．６．１．アレルゲン性およびアナフィラキシー性作用
この試験は、“Methodical instructions for evaluating allergenic properties of pharmacological substances”（Experimental study guide of new pharmacological substances．Moscow，2000，pp．25-32）に準拠して実施された。
【０１０３】
試験は、１５匹のモルモット（雄、体重は２７０〜３２０ｇ相当）を３群に分けて実施した。各群は５匹で構成された：第１群−対照（生理食塩水）、第２群−薬草抽出物０．０７ｍｌ／ｋｇ、第３群−薬草抽出物０．１４ｍｌ／ｋｇ。使用した調製物の用量は、ヒトについて推奨される日用量より１０および２０倍多い量に相当した。試験は、薬草抽出物０．１４ｍｌ／ｋｇ（ヒトの治療日用量より２０倍多い）が、感作第１４日および第２１日目におけるｉ．ｍ．注射の際にアナフィラキシーショックを起こさないことを示した。
【０１０４】
３．６．２．遅延型過敏反応
白色皮膚のモルモット１５匹（雄、体重は２６０〜３１０ｇ相当）の皮膚で試験を実施した。モルモットを３群各５匹に分けた：第１群−対照、第２群−薬草抽出物０．００７ｍｌ／ｋｇ、第３群−薬草抽出物０．０３５ｍｌ／ｋｇ。上記の薬草抽出物の用量を滅菌生理食塩水で希釈し、次いでフロイント完全アジュバントと１：１の比で混合し、動物に注射した。前記試験の結果によると、上記薬草抽出物用量における遅延型の過敏反応は、モルモットについて陰性であった。
【０１０５】
４９匹のハイブリッドマウスＦ１（ＣＢＡ*Ｃ５７Ｂ１６）（雄、体重は１８〜２０ｇ相当）を７群に分け、各群７匹とした。ＲＣＲ（用量：マウス１匹に２×１０8細胞）の肩胛骨間領域への皮下（ｓ．ｃ．）注射でマウスを免疫した。質量の差が、浮腫の程度および遅延型過敏反応の強度を特徴づけた。反応の指数を下記の式に従って計算した：
Ｕ＝（Ｐ0−Ｐ対照／Ｐ対照）×１００
ここでＰ０は実験足の質量であり、およびＰ対照は対照足の質量である。
【０１０６】
データ分析は、薬草抽出物の試験用量、すなわち０．１８および０．０７ｍｌ／ｋｇが、マウスについての遅延型の過敏反応または細胞性免疫の形成に影響しないことを証明した。したがって、実験の結果は、薬草抽出物が免疫毒性を有しないことを示した。
【０１０７】
３．６．３．マウスにおける膝窩リンパ節の質量および細胞数に対する作用
薬草抽出物のアレルゲン性を評価するために、抗原性刺激物質に対する応答として、ラットの膝窩リンパ節重量および質量変化の方法、いわゆる「膝窩リンパ節測定法」、ＰＬＮＡを使用した。１０匹のハイブリッドマウスＦ１（ＣＢＡ*Ｃ５７Ｂ１６）（雄、体重は１８〜２０ｇ相当）に、滅菌生理食塩水５０μｌ（対照）、および薬草抽出物０．０７ｍｌ／ｋｇをそれぞれ注射した。
【０１０８】
７日後、マウスの右および左膝窩リンパ節の重量および細胞数(cellularity)を測定した。左リンパ節指数を右リンパ節の同様の指数で割ることによって、相対指数を算出した。実験群および対照群の両方について、リンパ節の重量および細胞数の相対指数は０．９５および０．９８に等しい。このように、リンパ節の重量および細胞数に対する薬草抽出物の影響を評価し、調製物がアレルゲン性を有しないことが確立された。
【０１０９】
３．６．４．免疫毒性作用
薬草抽出物のさまざまな免疫毒性についての試験をＷＨＯの勧告に準拠して実施した。体液性免疫応答に対する薬草抽出物の影響の試験を、Erneに従って脾臓中の抗体形成細胞の数によって測定した。細胞性免疫に対する薬草抽出物の影響を、マウスについての遅延型の過敏反応によって測定した。Arlingtonでの作業部会の勧告に従って、バックグラウンド抗原性刺激に対する、脾臓細胞数に及ぼす調製物の影響が定義された。
【０１１０】
３．６．５．抗体形成マウス脾臓細胞量に対する作用
マウスの脾臓中の抗体形成細胞の量に対する薬草抽出物の影響を試験するため、局所溶血の直接法を用いた。それは、高い溶血活性を有する免疫グロブリンＭ抗体を形成する細胞を定義するのに役立つ。４９匹のハイブリッドマウスＦ１（ＣＢＡ*Ｃ５７Ｂ１６）を選択した（雄、体重１８〜２０ｇ相当）。マウスは７群に分けられ、各群は７匹で構成された。マウスをヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のｉ．ｖ．注射で免疫した。免疫後４日目に、マウス脾臓中の抗体形成コロニー（ＡＦＣ）の数をJerneの方法に従って決定した。得られた結果から、我々は、薬草抽出物が、上記の用量および方式を用いてＳＲＢＣによって免疫されたマウス脾臓中のＡＦＣの量に影響せず、同様にも、一時免疫応答に影響しなかったことが分かった。
【０１１１】
３．６．６．マウス脾臓有核細胞数に対する影響
Ｆ１マウス４９匹（ＣＢＡ*Ｃ５７Ｂ１６；雄、体重１８〜２０ｇ相当）について試験を実施した。動物は７群に分けられ、各群は７匹で構成された。１匹当たり５×１０8細胞のＳＲＢＣのｉ．ｖ．注射でマウスを免疫した。データは、０．１８、０．０７ｍｌ／ｋｇに等しい用量の調製物を、免疫の日前、当日、およびその日後に投与した場合に、マウスへの薬草抽出物の単回ｉ．ｍ．注射が脾臓の細胞数に影響しなかったことを証明した。
【０１１２】
３．７．結論
免疫調節薬と考えられる薬草抽出物についての毒性試験の結果をまとめると、調製物は実験動物への薬草抽出物の単回ｉ．ｍ．注射にて無毒性であり、また、ウィスターラットおよびイヌによって、ｉ．ｍ．注射で良好に吸収されたといえる。
【０１１３】
実施した試験は、マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）１匹当たり０．５〜１．０ｍｌ用量の、生理食塩水で１：１０希釈した薬草抽出物の単回ｉ．ｍ．注射が、動物の中毒および死亡を起こさなかったことを示した。調製物の用量を増加させると（生理食塩水で１：１０希釈し、マウス１匹当たり１．５〜２．０ｍｌ用量、７５〜１００ｍｌ／ｋｇ）、運動活性の低下および抑うつ症状を生じたが、動物の死亡は見られなかった。
【０１１４】
１：５生理溶液で溶解した薬草抽出物のＢＡＬＢ／ｃマウスへの筋肉内およびｉ．ｐ．注射は、動物の重度の抑うつ症状、昏睡および睡眠を伴った。ＬＤ50濃度での薬草抽出物の動物の中毒は、エチルアルコールによる中毒と同様であり、エチルアルコールは調製物の成分であった。
【０１１５】
ＬＤ50指数に従って、薬草抽出物は、生理溶液で１：５溶解後に調製物質の５１〜６６ｍｌ／ｋｇのｉ．ｍ．注射を行う場合、安全な調製物群に属すると分類することができる。同時に、０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇの調製物のｉ．ｍ．注射によって３ヶ月間毎日処理されたウィスターラット、および、薬草抽出物０．０７ｍｌ／ｋｇのｉ．ｍ．注射によって１ヶ月間毎日処理されたイヌにおける、慢性実験の条件下での感受性に有意な特異的差異および性差は見られなかった。調製物の記載用量は、注射前に滅菌生理食塩水で１：１０に希釈された。慢性実験でマウスおよびイヌに試験された薬草抽出物の用量は、ヒトの治療日用量を上回った（０．５ｍｌ／人または０．００７ｍｌ／ｋｇ；１０または３０倍）。
【０１１６】
試験の結果は、マウスにおける３ヶ月間慢性実験での薬草抽出物の０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇ用量、およびイヌにおける１ヶ月間慢性実験での０．０７ｍｌ／ｋｇ用量は、動物に良く吸収され、また、被験動物の血液学的指標または主要臓器の機能状態に影響しなかったことを示した（使用した生化学検査およびＥＣＧのデータに基づく）。薬草抽出物の作用に関係する、内臓における毒性障害、全身および局所毒性アレルギー性反応が無いことは、慢性実験の終了後に実施された病理形態学的試験の結果によって確認された。０．０７および０．２１ｍｌ／ｋｇ用量を滅菌生理食塩水で１：１０に希釈し、長期間にわたるｉ．ｍ．注射したマウスおよびイヌにおける慢性実験では、調製物の局所刺激作用は見られなかった。保健省(Ministry of Public Health)の薬理委員会(Pharmacological State Committee)の要請に従って、薬草抽出物の変異原性の試験を実施した。
【０１１７】
さらに、我々は、エームス試験において、調製物がネズミチフス菌の望ましい培養液で遺伝子変異を生じる能力、ハイブリッドＦ１（ＣＢＡ*Ｃ５７Ｂ１６）マウス骨髄細胞において染色体異常を刺激する能力、胚マウス細胞において優性致死変異の量に影響を与える能力、およびＳＯＳ−染色体試験において大腸菌ＰＱ３７株のＤＮＡ修復系に影響を与える能力を試験した。
【０１１８】
実施した試験の間に、薬草抽出物は変異原性を有しないことが確立された。
【０１１９】
０．２１ｍｌ／ｋｇ（ヒトについて推奨される日用量より３０倍多い）に等しい用量では、薬草抽出物は、妊娠第１日から第２０日までのｉ．ｍ．注射に際し、妊娠ラットの体重の増加を低下させ、また妊娠期間、生存胎仔数、着床部位数、黄体数および胎仔体重を低下させた。同時に、着床前死亡の指数は、妊娠中に薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇを投与されたマウスで、対照マウスよりもはるかに低く、着床後死亡の指数は第１群のほうが低かった。
【０１２０】
出生前期間に薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇの作用を受けた胎仔の標準切片（Wilson- Dibanに従った）の目視検査および顕微鏡検査では、全事例の６．７％で胎仔の発育不全を示唆しえた。その作用は胎仔の発育欠陥と評価することができる。
【０１２１】
出生前期間に薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇに曝露されたラット胎仔における骨格系の発達を試験するために必要とされた、アリザリンで染色した調製物の分析は、骨格の発育欠陥を示さなかった。しかしながら、同時に、石灰化点の大部分で、骨化の遅滞が見られた。
【０１２２】
妊娠第１日から第２０日までの薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇのｉ．ｍ．注射の影響下で、対照と比較してラット新生仔の減少および死産ラットの増加が記録された。出生前期間に薬草抽出物に曝露されたラットの体重は、対照の指数よりも低かった。子孫の発育に関する実験の結果は、この種類の動物の正常な身体発育に典型的な時間の制約から逸脱しなかった。
【０１２３】
したがって、実験により、妊娠第１日から第２０日までの薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇ（ヒトの最高用量の３０倍）のｉ．ｍ．注射が、薬草抽出物に曝露された動物における胎児毒性および催奇形性作用を有することが確立された。したがって、妊娠は、薬草抽出物の処方について禁忌とみなすことができる。
【０１２４】
雄ラットに１０週間および雌ラットに２週間の薬草抽出物０．２１ｍｌ／ｋｇの毎日のｉ．ｍ．注射では、動物の生殖機能に対する調製物の影響は確立されなかった。
【０１２５】
モルモットに対する薬草抽出物のアレルゲン性の試験では、感作用量０．０７および０．１４ｍｌ／ｋｇでの薬草抽出物の５倍ｉ．ｍ．注射および感作後第１４日および第２１日の薬草抽出物の決定因子用量(determinant dose)０．１４ｍｌ／ｋｇのｉ．ｐ．注射にて、調製物はアナフィラキシーショックを生じなかったことを示した。
【０１２６】
試験用量および感作スケジュールでの薬草抽出物は、モルモットで、またマウスにおける膝窩リンパ節反応で、遅延型過敏反応のアレルゲン性作用を有しなかった。
【０１２７】
０．０７ｍｌ／ｋｇおよび０．１８ｍｌ／ｋｇの用量では、薬草抽出物は、脾臓において抗体形成細胞および有核細胞の数に影響せず、またマウスにおける過敏性反応に影響しなかった。データは、体液性および細胞性免疫において薬草抽出物の悪影響がなく、したがって調製物の免疫毒性がないことの証拠である。
【０１２８】
最後に、実施したすべての実験および得られた結果に基づき、薬草抽出物は、妊娠のみを禁忌とした臨床試験に推奨される。
【０１２９】
実施例４：薬草抽出物の薬理作用
患者における薬草抽出物の潜在能力を測定することを目的として、試験を実施した。
【０１３０】
最初の試験は２０００年に行われた。この試験は臨床試験用に設計された。この計画の第一の目的は、ＨＩＶ患者における薬草抽出物の毒性または副作用の測定であり、次の目的は、ＨＩＶ感染者における疾患の経過および体液性、細胞性および非特異的免疫に対する薬草抽出物の見込まれる有効性の測定であった。
【０１３１】
一般検査でＡＩＤＳを発症する危険性の高い１６〜４０歳のＨＩＶ陽性患者が、試験のために選択された。患者は薬草抽出物を８０日間使用した。このプロジェクトでは、生理食塩水で４ｍｌに希釈された薬草抽出物０．４ｍｌを毎日ｉ．ｍ．およびｉ．ｖ．注射した。この期間中、患者は毎日検査され、治療の作用が記録された。３ヶ月間の治療期間後、患者は追跡され、患者の前臨床因子が研究された。Ｔリンパ球ＣＤ４の百分率は試験の初日に２１±１％、薬草抽出物での治療３０日後に２３±１．５％、治療６０日後に３２±０．８％、治療８０日後に３２±０．７％、治療期間の終了後３ヶ月では３９±１．６％と測定された。これらのデータは、薬草抽出物で治療中のＣＤ４Ｔリンパ球の量の増加を示している。患者におけるＣＤ８リンパ球の百分率は、試験の初日に２５±１．５％、薬草抽出物での３０日間の治療後に２４±１．５％、６０日間の治療後に２２±０．８％であり、８０日間の治療後に２３±０．８％であった。治療の終了後３ヶ月の追跡調査では２０±２％であった。
【０１３２】
ＣＤ９５を含むＴリンパ球の百分率は、試験の初日に４０±９．２％、薬草抽出物での３０日間の治療後に４７±２％、６０日間の治療後に２５±１．４％、８０日間の治療後に３０±１．３％であった。治療の終了後３ヶ月の追跡調査では２５±１．５％であった。初日および薬草抽出物での治療８０日後の統計的比較では、患者中のＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ９５に明らかな差があった（Ｐ＜０．０１）。
【０１３３】
次の試験は、ＡＩＤＳ患者およびＨＩＶ感染者における薬草抽出物の早発性および遅発性の副作用を検討するために実施された。このプロジェクトでは、ＨＩＶ陽性であるボランティア６名が選択された。選択基準は、重度真菌または他の日和見感染、１０％を越える体重減少、二次性帯状疱疹、１ヶ月を越える発熱を伴うＨＩＶ陽性であった。患者の選択およびプロジェクトへの参加後、前臨床パラメーターを最初に測定し、その後、毎週、測定を繰り返した。
【０１３４】
薬草抽出物０．４ｍｌを５ｍｌシリンジに取り、温生理食塩水３．５ｍｌで希釈し、ｉ．ｍ．で２日間、次いでｉ．ｖ．でさらに２日間注射した。注射の完了後、薬物副作用およびＡＩＤＳ関連臨床徴候および症状の発現について患者を検査した。データを表１２に示す。
【表１２】
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【０１３５】
次の試験は、ＡＩＤＳ患者での免疫因子の回復において、薬草抽出物の有効性および早発性の副作用を、通常のＨＡＡＲＴ治療と比較するために実施された。この試験では、ボランティア２７名を試験した。患者は薬草抽出物またはＨＡＲＲＴのどちらかで治療される２つの治療群に無作為に割り付けられた（無作為化ブロックの４ブロックの選択で）。患者２名がＨＡＡＲＴに耐容性を示さず、したがって、彼らは薬草抽出物群に移された。患者の参加および終了基準は：ＨＩＶ陽性、現在または過去の真菌または日和見感染による重度の疾患、１０％を越える体重減少、二次性帯状疱疹、１ヶ月を越える発熱および軽度の日和見症であった。これらの患者は、抗ＡＩＤＳ薬または免疫系の増強薬を使用したことがなかった。しかしながら、ＡＩＤＳの影響を除去するための抗生物質または他の薬剤は禁じられなかった。患者の選択およびプロジェクトへの参加後に、血球数、トリグリセリド、コレステロール、尿酸、クレアチニン、血中尿素窒素、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、空腹時血糖、ＲＮＡウイルス量、ＣＤ４（Ｔｈ１、Ｔｈ２）、ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ８、尿分析／尿培養といった前臨床因子を治療前ならびに治療後１、２、および３ヶ月に測定した。
【０１３６】
薬草抽出物群では、薬草抽出物０．４ｍｌを５ｍｌシリンジに取り、温生理食塩水３．５ｍｌで希釈し、その混合物を１日１回、９０日間ｉ．ｍ．またはｉ．ｖ．注射した。ＨＡＡＲＴ治療は標準的な投与計画に従って実施した。治療は、ネルフィナビルのカプレット２５０ｍｇ９錠を９０日間、ジドブジン３００ｍｇ２カプセル９０日間、およびラミブジン１５０ｍｇ２錠を９０日間併用した。すべての患者を薬剤の副作用およびＡＩＤＳ関連臨床徴候および症状の発現について検査した。データは、関連する質問について記録した。薬草抽出物群の患者１６名およびＨＡＡＲＴ群の患者１１名を調べた。２群間の特徴の比較を表１３に示す。
【表１３】
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【０１３７】
表１４の結果は、ＣＤ４の数が両群で増加していることを示すが、群間に有意差は無い。
【表１４】
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【０１３８】
表１５は薬草抽出物を投与された患者の群におけるさまざまなパラメーターを示す。ＣＤ４の百分率の増加は明らかであり、疑いの余地はない。
【表１５】
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【０１３９】
実施例５：薬草抽出物の最大耐容量の決定
この試験は、ＨＩＶ感染患者における薬草抽出物の最大耐容量（ＭＴＤ）、および用量制限を生じる可能性のある、起こりうる副作用および毒性（用量規制毒性、ＤＬＴ）を決定することを目的として実施された。
【０１４０】
試験のプロトコルは用量増加法に基づいた。患者のウイルス量およびＣＤ４の数に対する薬草抽出物の作用を、副産物として評価した。患者の４コホート（それぞれ患者３名）を選択し、抽出物の増加用量で２８日間（４週間）治療した。抽出物の基本用量は、以前の動物実験でのＬＤ10（致死量の１０％）に従って決定されている。プロトコルに従った身体検査および臨床検査によって、副作用および毒性の徴候および症状について患者を注意深く観察した。
【０１４１】
すべての患者は年齢２８〜６０歳（平均値：４１．６歳）の男性であった。第１コホートでは、２８日間、温生理食塩水１００ｍｌ中の抽出物２ｍｌの日用量を、０．５〜１時間かけて点滴静注した。患者２名における発汗および体重減少を除いて、毒性または重大な副作用は見られなかった。第２コホートでは、別の患者３名が日用量４ｍｌを投与された。この群では、重大な副作用および毒性は無かった。第３コホートでは、最初は患者４名であったが、１名が不遵守および毎日の定期参加不能により除外され、日用量６．７ｍｌが投与された。この群では、重大な用量規制毒性および副作用が無かっただけでなく、軽度のものも無かった。第４コホートでは、別の患者３名が日用量１０ｍｌを投与され、この群でも重大な副作用および毒性は無かった。
【０１４２】
要約すると、患者計１２名が試験に組み入れられ、薬草抽出物の増加用量で４週間治療された。すべてのコホートで毒性または副作用は無かった。
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月27日(2009.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬草抽出物を調製するための方法であって、
（ａ）バラ属、セイヨウイラクサおよび／またはタンジーに由来する植物材料を提供し、
（ｂ）前記植物材料を乾燥し、
（ｃ）有機溶媒を加え、
（ｄ）前記植物材料および前記有機溶媒の混合物をインキュベートし、
（ｅ）薬草抽出物を得て、
（ｆ１）セレンおよび／またはその有機または無機塩を加え、及び／または、
（ｆ２）尿素を加え、
（ｇ）薬草抽出物をパルス電磁場に曝露する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記電磁場のパルスが、正弦波、方形および／または確率的形状を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パルス電磁場が、約５〜７５０ｋＨｚの周波数を有することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記パルス電磁場が、約１０〜２００ワットの出力を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記パルス電磁場が、１００〜１５０μテスラの磁場強度を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程（ｇ）の曝露が、約２〜５分間、実施されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程（ｇ）の曝露を反復することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
対象におけるＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療用の医薬組成物の製造を目的とした、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法で調製された薬草抽出物の使用方法。
【請求項９】
前記対象が脊椎動物であることを特徴とする、請求項８記載の使用方法。
【請求項１０】
前記対象が妊娠していないことを特徴とする、請求項８または９記載の使用方法。
【国際調査報告】
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