(57)【要約】  少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株が提供される。弱毒化変異型ボルデテラ株は、ボルデテラ感染の治療または予防のための免疫原性組成物またはワクチンに使用することが可能である。ワクチンまたは免疫原性組成物の製造のための弱毒化ボルデテラ株の使用、ならびに、ボルデテラによる哺乳類を感染から防御する方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも変異型ペルツシス毒素（ｐｔｘ）遺伝子、欠失型または変異型皮膚壊死性毒素（ｄｎｔ）遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株。
【請求項２】
ボルデテラ・ペルツシス株である請求項１に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項３】
請求項１または２に記載の変異型ボルデテラ株であって、ボルデテラａｍｐＧ遺伝子がＥ．コリａｍｐＧ遺伝子に置換されている変異型ボルデテラ株。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株であって、得られる株が５％未満の残留ＴＣＴ活性を発現する変異型ボルデテラ株。
【請求項５】
請求項１から３の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株であって、得られる株が１％未満の残留ＴＣＴ活性を発現する変異型ボルデテラ株。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株であって、前記ｐｔｘ遺伝子の変異が、基質結合に関連する１アミノ酸および／または触媒に関連する１アミノ酸の置換に存する変異型ボルデテラ株。
【請求項７】
ボルデテラ・ペルツシス株である請求項６に記載の変異型ボルデテラ株であって、前記基質結合に関連するアミノ酸の置換がＫ９Ｒであり、且つ、前記触媒に関連するアミノ酸の置換がＥ１２９Ｇである変異型ボルデテラ株。
【請求項８】
３重変異株である請求項１から７の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項９】
２００６年３月９日に番号Ｉ−３５８５として国立培養微生物収集所（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）に寄託されたＢＰＺＥ１株である、請求項８に記載の３重変異型ボルデテラ株。
【請求項１０】
弱毒化された請求項１から９の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株を含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
更に、医薬的に適した賦形剤、媒体および／または担体を含む請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
更にアジュバントを含む請求項１１または１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ボルデテラ感染またはボルデテラ感染の有害な効果に対する予防的な効果を有する分子を更に含む請求項１１から１３の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記変異型ボルデテラ株がＢＰＺＥ１である請求項１１から１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１０に記載の弱毒化ボルデテラ株を含むワクチン。
【請求項１７】
鼻腔内投与のために処方された請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のワクチンおよび情報パンフレットを含むキット。
【請求項１９】
ボルデテラ種に起因する感染に対するワクチンとしての使用のための請求項１０に記載の弱毒化ボルデテラ株。
【請求項２０】
ボルデテラ種に起因する感染に対する予防ワクチンとしての使用のための請求項１９に記載の弱毒化ボルデテラ株。
【請求項２１】
前記ボルデテラ種がＢ．ペルツシスまたはＢ．パラペルツシスである、請求項１９または２０に記載の弱毒化ボルデテラ株。
【請求項２２】
前記変異型ボルデテラ株がＢＰＺＥ１である、請求項１０に記載のまたは請求項１９から２１の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラ株。
【請求項２３】
ボルデテラ感染の予防のためのワクチンの製造のための請求項１０に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２４】
Ｂ．ペルツシスおよびＢ．パラペルツシス感染に対する同時的予防のためのワクチンの製造のための請求項１０に記載の弱毒化ボルデテラ感染の使用。
【請求項２５】
前記弱毒化ボルデテラに対するＴｈ１経路に優先的に向けられる免疫応答の誘導のためのワクチンの製造のための請求項１０に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２６】
請求項２３から２５の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラの使用であって、前記ワクチンが、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、経口または鼻腔内投与によって、注射によって、あるいは、吸入によって投与される使用。
【請求項２７】
前記ワクチンが鼻腔内に投与される、請求項２３から２５の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項２８】
前記ワクチンが、ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を必要とする哺乳類に投与される、請求項２３から２５の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項２９】
前記ワクチンが新生児に投与される請求項２８に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項３０】
前記ワクチンが子供に投与される請求項２８に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項３１】
前記ワクチンが鼻腔内に投与される、請求項２８から３０の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項３２】
前記ワクチンが単一投与で１回投与される、請求項２８から３１の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項３３】
ａ）請求項１０に記載のまたは請求項１９から２２の何れか１項に記載の株の投与；および、ｂ）同一の株もしくは無細胞ワクチンまたは両者の組み合わせの何れかによる少なくとも１回のリコールの実行を含む、請求項２３から２７の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項３４】
前記ワクチンが、ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を必要とする哺乳類に投与され、前記防御免疫がワクチン接種後少なくとも２ヶ月にわたり増大する、請求項２３に記載の弱毒化ボルデテラの使用。
【請求項３５】
呼吸性疾患を治療するための多価ワクチンの製造のための、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株の使用。
【請求項３６】
前記変異型ボルデテラ株がＢＰＺＥ１である請求項２３から３５の何れか１項に記載の使用。
【請求項３７】
ボルデテラ感染に対する防御のレベルが９５％を超え、特に９９％を超える請求項２３から３６の何れか１項に記載の使用。
【請求項３８】
ボルデテラ感染に対する前記防御のレベルが９９．９９９％超に達する請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
ボルデテラによる感染に起因する疾病から哺乳類を防御する方法であって、そのような治療が必要な前記哺乳類に、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を投与することを含む方法。
【請求項４０】
ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を提供する方法であって、そのような治療を必要とする前記哺乳類に少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を投与することを含む方法。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の方法であって、前記ボルデテラ感染がボルデテラ・ペルツシスおよびボルデテラ・パラペルツシスに由来する方法。
【請求項４２】
前記哺乳類が新生児である請求項３９から４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳類が子供である請求項３９から４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３９から４３の何れか１項に記載の方法であって、前記変異型ボルデテラ株が、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、経口または鼻腔内投与され、注射によって投与され、あるいは、吸入によって投与される方法。
【請求項４５】
前記変異型ボルデテラ株が鼻腔内投与される請求項３９から４３の何れか１項に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳類におけるボルデテラ感染の治療のための粘膜応答および全身的応答を提供する方法であって、そのような治療を必要とする哺乳類に請求項１０に記載の弱毒化ボルデテラ株を投与する方法。
【請求項４７】
ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を提供する方法であって、そのような治療を必要とする前記哺乳類に少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を投与することを含み、前記方法は、ワクチン接種後少なくとも２ヶ月にわたる前記防御免疫の増大を更に提供する方法。
【請求項４８】
前記変異型ボルデテラ株がＢＰＺＥ１である請求項３９、４０または４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項３９から４１に記載のまたは請求項４７に記載の方法であって、ボルデテラ感染に対する防御のレベルが９５％を超え、特に９９％を超える方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ボルデテラ感染に対する前記防御のレベルが９９．９９９％超に達する方法。
【請求項５１】
請求項１から１０の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株であって、更に、ＲＮＡまたはタンパク質をコードする少なくとも１つの異種性核酸配列を含む変異型ボルデテラ株。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの異種性核酸配列が抗原をコードする請求項５１に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの異種性核酸配列がウイルスのまたは細菌の抗原をコードする請求項５２に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項５４】
少なくとも１つの異種性抗原を発現するためのベクターとしての、請求項１から１０の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株の使用。
【請求項５５】
ワクチンとしての使用のための、請求項５１から５３の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも、変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む、変異型ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）株に関する。弱毒化変異型ボルデテラ株は、ボルデテラ感染の治療または予防のための免疫原性組成物またはワクチンに使用することが可能である。ワクチンまたは免疫原性組成物の製造のための弱毒化ボルデテラ株の使用、ならびにボルデテラによる感染症から哺乳類を防御する方法もまた、本発明の一部を構成する。
【背景技術】
【０００２】
百日咳は、未だなお世界中の死の主要な原因の１つであり、その発生率はワクチンの普及率が高い国々でさえ増加している。感染の可能性は全ての年齢層にあるが、乳児は若すぎるために現在使用可能なワクチンで防御できないため、乳児は最も深刻である。
【０００３】
百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈまたはｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、２０世紀後半に有効なワクチンが導入される以前は高い死亡率をもたらす重篤な幼児期の疾病である。これらのワクチンの成功は、この疾病が本質的に制御可能であるという考えを生み出したが、まだなお年間に世界で２００，０００から４００，０００人が百日咳に関連して死亡しており、この疾病はまだ感染性の病原体による死亡の原因のなかで６番目に位置している[１]。発展途上国において最も流行しているものの、この疾病はまた、アメリカを含む先進国において再び発生しており[２，３]、アメリカでは、発生率は過去２年にわって５倍に増大している[４]。予想外なことに、百日咳の疫学はワクチンの普及率が高い国々において変化しており、そのような国々では、青年および成人の百日咳の症例の頻度がますます増大している[５]。これは、恐らく、青年期のワクチン仲介免疫の進行性の漸減が原因である。百日咳は、しばしば不規則でそれゆえに診断が困難であるため、一般に成人において命を脅かすものでなく、多くの場合知覚されないままとなる。しかしながら、感染した成人は、非常に若い子供に当該疾病を伝染させる重要な宿主と成る。そのような子供は、若すぎるため十分にワクチン接種することができず、それゆえ高い死亡率を有する重篤な疾病を発症する危険性がある。
【０００４】
百日咳のワクチン接種は通常生後２ヶ月から開始され、十分な防御のためには、１から２ヶ月間隔で少なくとも３回の免疫化を必要とする。それゆえ、乳児は、現在使用できるワクチンを使用して、生後６ヶ月より前では十分な防御を受けられない。従って、非常に若いおよび最も脆弱な年齢層における百日咳の発生率を低減するために、早期、恐らく出生時の免疫化が非常に望ましい。しかしながら、ヒトおよび動物モデルにおける莫大な研究から、新生児の免疫系は、未熟すぎて有効にワクチン仲介防御免疫を誘導できないことが示唆された[６，７]。特に、百日咳に対する防御免疫の発生に必須なＴｈ１応答を示す[８]ＩＦＮ−γ生産は、より成長した子供または成人と比較してヒトの新生児において有意に低減されたことがわかった[９]。このことはまた、有意な量の抗原特異的ＩＦＮ−γは、百日咳ワクチン、特に無細胞ワクチン（ａＰＶ）をワクチン接種した子供において、数ヵ月（≧６ヶ月）後にのみ生産されるという事実に反映される[１０]。
【０００５】
ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の自然な感染は、ワクチン誘導免疫よりも遅く減弱する、強くて持続的な免疫を誘導すると長らく考えられてきた[５，１１]。そのうえ、Ｂ．ペルツシスの感染は、非常に若い子供（生後１ヶ月）においてでさえ、測定可能な抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答を誘導する[１２]。これらの発見は、自然な感染を可能な限り模倣するために経鼻的に適用可能な生ワクチンは、現在使用可能なワクチンに代わる魅力的な代用となる可能性があることを示唆する。
【０００６】
当該分野において既知の、ボルデテラ感染を治療するためのワクチン接種組成物が多く存在する。しかしながら、これらの免疫原性組成物は、新生児の治療において、または伝染性のおよび迅速な防御免疫が必要である場合において使用することができない。
【０００７】
従って、フランス特許ＦＲ０２０６６６６は、ＰＴＸ、ＤＮＴ、ＡＣおよびＴＣＴから選択される少なくとも２つの毒素を欠損した生ボルデテラ株を開示している。この特許は、強力なプロモーターの添加による内因性ａｍｐＧ遺伝子の過剰発現、およびＥ．コリ由来のａｍｐＧ遺伝子の１１末端アミノ酸の添加を開示している。
【０００８】
Ｍｉｅｌｃａｒｅｋら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２００６；２４Ｓ２：Ｓ２／５４−Ｓ２−５５）は、マウスの免疫化に使用するためのＰＴＸ−、ＤＴＮ−およびＴＣＴ−が弱毒化されたボルデテラ・ペルツシスの株を開示している。この文献は、気管の細胞毒の生産を低減するために、ａｍｐＧ遺伝子を過剰発現しなければならない。しかしながら、更なる評価によって、筆者らは、ａｍｐＧ遺伝子の過剰発現によって気管の細胞毒は増大し当初の考えほど減少しないことを確認した。
【０００９】
Ｍｉｅｌｃａｒｅｋら（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５１  （２００１）ｐｇｓ．５５−６９）は、生ワクチンが、経口的または経鼻的に投与された場合に全身的および粘膜的応答を誘導できることを開示している。
【００１０】
Ｒｏｄｕｉｔら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２  Ｊｕｌ；７０（７）：３５２１−８））は、ＤＴＰ組成物を用いた変異型ボルデテラ株の新生児および乳児へのワクチン接種について記述している。
【００１１】
Ｍａｔｔｏら（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６，  ｅ１６８−ｅ１８６（２００１））は、ボルデテラの内因性ａｍｐＧ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのａｍｐＧ遺伝子に置き換えることを提案しており、このことは、生産されるＴＣＴの量を減少させる。
【００１２】
従って、先行技術は、様々なタイプのワクチン接種組成物を開示しているものの、生後６ヶ月前の新生児に防御を提供しうるワクチンまたは免疫原性組成物を提供するという問題に取り組めていない。その上、先行技術は、ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を提供する免疫原またはワクチンを開示していない。先行技術はまた、ボルデテラ感染に対する防御免疫であって、少なくともワクチン接種後の２ヶ月間にわたり増大する防御免疫を提供する免疫原性組成物またはワクチンを開示してない。
【００１３】
それゆえ、本発明の目的は、先行技術の欠陥を克服することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、コロニー形成能および防御免疫誘導能を維持しつつも、病原性を減少させるために、Ｂ．ペルツシスまたはＢ．パラペルツシス（ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）といったボルデテラ株の遺伝的弱毒化を通して、生弱毒化ワクチン候補または免疫原性組成物を製造することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、現在のａＰＶによって提供される防御よりも優れた防御を単一の鼻腔内投与後の新生児に誘導するワクチンまたは免疫原性組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、ボルデテラ・パラペルツシス、ならびにａＰＶのワクチン接種後には見られないボルデテラ・ペルツシスの感染に対する防御を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、新生児においてボルデテラ感染に対する強力な防御免疫を誘導することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、粘膜的および全身的免疫を誘導するワクチンまたは免疫原性組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、生涯の早期において単一用量の経鼻ワクチンとして投与される生弱毒化ボルデテラ・ペルツシス、いわゆるＢＰＺＥ１を製造することである。
【００２０】
本発明の更に別の目的は、新生児のワクチン接種に使用できるだけでなく、百日咳の流行の場合にあらゆる世代の全ての哺乳類に使用することができるワクチンを提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、迅速な防御免疫および／または少なくともワクチン接種後２ヶ月間にわたり増大する防御免疫を誘導する、ボルデテラ感染に対するワクチンを提供することである。
【００２２】
本発明の更に別の目的は、相対的に製造コストの低いボルデテラ感染に対する予防または治療を提供することである。
【００２３】
これらのおよびその他の目的は、発明の概要、発明の詳細な説明および特許請求の範囲によって証明されるような本願発明によって達成される。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、少なくとも変異型ペルツシス毒素（ｐｔｘ）遺伝子、欠失型または変異型皮膚壊死性毒素（ｄｎｔ）遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を提供する。
【００２５】
別の側面において、本発明は、少なくとも変異型ペルツシス毒素（ｐｔｘ）遺伝子、欠失型または変異型ペルツシス皮膚壊死性毒素（ｄｎｔ）遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を含む免疫原性組成物に関する。
【００２６】
さらに別の側面において、本発明は、少なくとも変異型ペルツシス毒素（ｐｔｘ）遺伝子、欠失型または変異型ペルツシス皮膚壊死性毒素（ｄｎｔ）遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む弱毒化ボルデテラ株を含むワクチンを提供する。
【００２７】
また別の側面において、本発明は、ボルデテラ感染の予防のためのワクチンの製造のための、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む弱毒化ボルデテラ株の使用を提供する。
【００２８】
また別の側面において、本発明は、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む弱毒化ボルデテラ株の使用であって、前記弱毒化ボルデテラに対する、Ｔｈ１経路に優先的に向けられる免疫応答の誘導のためのワクチンの製造のための使用を提供する。
【００２９】
ボルデテラ・ペルツシスおよびボルデテラ・パラペルツシスの感染によって引き起こされる疾病から哺乳類を防御する方法であって、そのような治療が必要な前記哺乳類に、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を投与することを含む方法も提供される。
【００３０】
ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を提供する方法であって、そのような治療が必要な前記哺乳類に、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株を投与することを含む方法も本発明の一部である。
【００３１】
ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を提供する方法であって、そのような治療が必要な哺乳類に、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子、および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株、または前記変異型ボルデテラ株を含むワクチンを投与することを含む方法であって、さらにワクチン接種後少なくとも２ヶ月にわたる前記防御免疫の増大を提供する方法は、本発明のさらに別の側面である。
【００３２】
呼吸性疾患を治療するための多価ワクチン（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）（すなわち、種々の病原体により引き起こされる感染症の予防または治療のためのワクチン）の製造のための、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株の使用は、本発明のまた別の側面である。
【００３３】
ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を必要とする哺乳類に投与することによる、本発明の弱毒化ボルデテラ株の使用であって、前記防御免疫が、投与後少なくとも２ヶ月間にわたり増大する使用も本発明の一部である。
【００３４】
哺乳類におけるボルデテラ感染の治療またはボルデテラ感染に対する防御のための粘膜的応答および全身的応答を提供する方法も、本発明のまた別の側面である。
【発明の詳細な説明】
【００３５】
本願で使用される「ＰＴＸ」という略語は、ＡＤＰリボシル化毒素を合成し分泌するペルツシス毒素を意味する。ＰＴＸは６つのポリペプチドＳ１からＳ５から成り、酵素活性成分はＳ１と呼ばれる。ＰＴＸは３４アミノ酸のシグナル配列を有すが、成熟鎖は３５から２６９番目のアミノ酸から成る。ＰＴＸは、Ｂ．ペルツシスから発現される主要な病原性因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ）である。これらの毒素のＡ成分はＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を示し、Ｂ部分は、毒素を宿主受容体に結合させ、Ａを作用部位に移行させることを仲介する（５７）。
【００３６】
本願で使用される「ＤＮＴ」という略語は、皮内に注入された場合にマウスおよびその他の実験動物において局所的な病変を誘導する熱不安定性毒素であるペルツシス皮膚壊死性毒素を意味する。低用量で静脈内に注射された場合、マウスにとっては致死的である（５８から６１）。ＤＮＴは、ブタの萎縮性の鼻炎における鼻甲介の萎縮の発生における病原性因子と考えられている（６２、６３）。
【００３７】
本願で使用される「ＴＣＴ」という略語は、ボルデテラによって合成される病原性因子である気管の細胞毒を意味する。ＴＣＴはペプチドグリカン断片であり、インターロイキン−１生成および一酸化窒素合成を誘導する能力を有する。それは、繊毛の静止を引き起こす能力を有し、呼吸器の上皮細胞に対して致死的効力を有する。
【００３８】
「哺乳類」という用語は、ヒトを含む、あらゆる哺乳綱の様々な温血脊椎動物であって、皮膚は毛で覆われ、メスは子供を育てるために乳を作り出す乳腺を有していることを特徴とする動物を包含する。
【００３９】
「弱毒化」という用語は、免疫応答を刺激しおよび防御免疫を作り出すことができるが、何れの病気ももたらさない、弱められ、毒性の低下したボルデテラ株を意味する。
【００４０】
「迅速な防御免疫」の用語は、ボルデテラに対する免疫が、本発明の変異型ボルデテラ株の投与後、短時間で与えられることを意味する。「短時間」とは、ワクチン接種され１週間後にチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）されることを意味する。より明確には、現存する病原体特異的末梢性リンパ球、ＣＤ８＋細胞障害性エフェクター（ＣＴＬｓ）およびＣＤ４＋ヘルパー細胞の急速な増殖がある。ＣＤ４＋ヘルパー細胞は、Ｂ細胞の成熟および抗体産生を誘導する。従って、記憶プールをもったリンパ球は、引き続く感染の時に急速に増殖する態勢が整う。
【００４１】
「ボルデテラ株」という用語は、ボルデテラ・ペルツシス、ボルデテラ・パラペルツシスおよびボルデテラ・ブロンキセプティカ（ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）由来の株を包含する。
【００４２】
「ボルデテラ感染」という用語は、以下の３つの株のうち少なくとも１つによって引き起こされる感染症である：ボルデテラ・ペルツシス、ボルデテラ・パラペルツシスおよびボルデテラ・ブロンキセプティカ。
【００４３】
「子供」とは、生後６ヶ月から１２歳までの人または哺乳類を意味する。
【００４４】
「新生児」とは、生後１日から２４週後までの人または哺乳類を意味する。
【００４５】
本願で使用される「治療」という用語は、疾病の治癒およびその原因の除去に限定されず、対象となる疾病に関係する症状の治癒、緩和、除去もしくは軽減、または宿主体の何れかの障害または機能不全にかかる可能性の防止もしくは減少する意味を特に包含する。
【００４６】
「防御」および「予防」という用語は、本願では互換的に使用され、ボルデテラによる感染が妨害されることを意味する。
【００４７】
「予防ワクチン」とは、このワクチンが、将来のチャレンジにおけるボルデテラ感染を予防することを意味する。
【００４８】
「Ｔｈ１経路に優先的に向けられる」とは、Ｔｈ１経路がＴｈ２経路よりも選択されることを意味する。
【００４９】
「免疫原性組成物」という用語は、当該組成物が、免疫応答を誘導でき、それゆえに抗原性であることを意味する。「免疫応答」とは、免疫系による何れかの応答を意味する。これらの応答には、抗原に対する応答における生物免疫系の活性の変化を含み、例えば、抗体産生、細胞性免疫の誘導、補体活性化または免疫寛容の発生を含んでよい。
【００５０】
より具体的には、本発明は、免疫原性組成物またはワクチンとして使用可能な少なくとも３重（ｔｒｉｐｌｅ）変異型ボルデテラ株を提供する。少なくとも３重変異型ボルデテラ株は、変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含むと理解されるだろう。異種性ａｍｐＧ遺伝子産物は、作られる気管細胞毒の量を大幅に減少させる。
【００５１】
本発明は上述の３重変異体だけに限られない。その他の付加的な突然変異を行うことが可能であり、それは、例えば、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）欠損変異体（６４）、リポ多糖（ＬＰＳ）欠損変異体（６５）、糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（６６）およびいずれかのｂｖｇ−制御成分（６７）である。
【００５２】
突然変異される開始菌株は、ボルデテラ・ペルツシス、ボルデテラ・パラペルツシスおよびボルデテラ・ブロンキセプティカを含む何れかのボルデテラ株とすることができる。一側面において、変異型ボルデテラ株を得るために使用される開始菌株は、Ｂ．ペルツシスである。
【００５３】
変異型ボルデテラ株の構築は、菌株のボルデテラａｍｐＧ遺伝子を異種性ａｍｐＧ遺伝子に取り替えることから始める。何かの異種性ａｍｐＧ遺伝子を本発明に使用することができる。これらは、一世代ごとに培地中に非常にわずかな量のペプチドグリカン断片を放出する全てのグラム陰性菌を含む。グラム陰性菌の例は、エシェリシア・コリ、サルモネラ、腸内細菌科、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ステノトロフォモナス、レジオネラ等を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
ボルデテラａｍｐＧ遺伝子を異種性ａｍｐＧ遺伝子に置換することで、得られる株により生産される気管細胞毒（ＴＣＴ）の量は、１％未満の残留ＴＣＴ活性である。別の実施態様において、得られる株により発現されるＴＣＴ毒素の量は、０．６％から１％の残留ＴＣＴ活性または０．４％から３％の残留ＴＣＴ活性または０．３％から５％の残留ＴＣＴ活性である。
【００５５】
ＰＴＸは、Ｂ．ペルツシス感染症の全身作用の原因となる主要な病原性因子である、ならびに主要な防御抗原のうちの１つである。その特性に起因して、天然のｐｔｘ遺伝子は変異型バージョンと取り替えられ、それにより、酵素的活性成分Ｓ１は酵素的に不活性な毒素をコードするが、ペルツシス毒素の免疫原性の特性は、影響されない。これは、配列位置９のリジン（Ｌｙｓ）をアルギニン（Ａｒｇ）と取り替えることによって達成することができる。さらに、位置１２９のグルタミン酸（Ｇｌｕ）は、グリシン（Ｇｌｙ）と取り替えられる。
【００５６】
その他の突然変異は、また、米国特許６，７１３，０７２（本願に援用される）に記述されるような方法、ならびに検出不可能なレベルに毒素活性を減少させることが可能な何れかの既知のまたはその他の突然変異を使用することが可能である。対立遺伝子の交換は、最初にｐｔｘオペロンを削除するために使用され、次に変異型バージョンの挿入のために使用される。
【００５７】
最後に、ｄｎｔ遺伝子は、その後、対立遺伝子の交換を使用して、ボルデテラ株から除去される。全体的な除去の他に、酵素活性は、点変異によって阻害することもできる。ＤＮＴはＮ末端領域の受容体結合ドメインおよびＣ末端部分の触媒ドメインから構成されるため、Ｃｙｓ−１３０５をＡｌａ−１３０５に取り替えるｄｎｔ遺伝子の点変異は、ＤＮＴの酵素活性を抑制する（６８）。ＤＮＴは、ボルデテラ・ブロンキセプティカの重要な毒素として同定され、わずかな量の注入で致死活性を示す（２６）。
【００５８】
変異型ｐｔｘ遺伝子を挿入してｄｎｔ遺伝子を阻害または除去する対立遺伝子の交換の他に、遺伝子の翻訳領域を、遺伝子配列またはプラスミドの挿入によって中断させることができる。この方法もまた本発明において意図される。
【００５９】
本発明の３重変異型株は、ＢＰＺＥ１株と呼ばれ、２００６年３月９日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５８５としてフランス、パリの国立培養微生物収集所（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）（ＣＮＣＭ）に寄託された。ＢＰＺＥ１に導入される突然変異は、急激な弱毒化をもたらすが、細菌のコロニー形成および残存を可能とする。従って、その他の実施態様において、本発明は、投与される場合に粘膜免疫および全身性免疫を誘導することができるＢＰＺＥ１を提供する。その他の側面において、ＢＰＺＥ１は鼻腔内に投与される。
【００６０】
本発明の変異型ボルデテラ株は、免疫原性組成物に使用できる。そのような免疫原性組成物は、哺乳類において抗体産生応答およびまたは好ましくはＴ細胞反応の何れかの免疫応答を生じさせるのに有用である。好都合に、Ｔ細胞反応は、ボルデテラ感染からまたはその結果から哺乳類を防御するようなものである。
【００６１】
本発明の変異型ボルデテラ株は、ワクチンまたは免疫原性組成物において、生きた株として、または化学的に若しくは熱的に死滅させた株として使用することができる。一側面において、生きた株は経鼻投与に使用され、一方、化学的に若しくは熱的に死滅させた株は、全身的または粘膜的投与に使用することができる。
【００６２】
免疫原性組成物はさらに、全身または局所投与に使用される場合、医薬的に適した賦形剤または担体および／または媒体を含んでよい。医薬的に許容可能な媒体は、リン酸緩衝生理食塩水、蒸留水、乳剤（例えば油/水乳剤）、さまざまな種類の湿潤剤無菌液等を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の免疫原性組成物は、また、アジュバント、すなわち、Ｔ細胞に仲介される反応、および、特に本発明の活性成分に対するＣＤ４＋に仲介されるまたはＣＤ８＋に仲介される免疫応答を促進または増加させることができる何れかの物質または化合物を含むことができる。ムラミルペプチド、例えばＭＤＰ、ＩＬ−１２、アルミニウムリン酸塩、水酸化アルミニウム、Ａｌｕｍおよび／またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）といったアジュバントが、本発明の免疫原性組成物に使用することができる。
【００６４】
化学的にまたは熱的に処理した変異型ボルデテラ株をワクチンまたは免疫原性組成物に使用する場合、アジュバントおよび乳剤が免疫原性組成物に使用されることが、当業者に理解されるだろう。
【００６５】
本発明の免疫原性組成物はさらに、例えば核酸、タンパク質、ポリペプチド、ベクターまたは薬剤といった、ボルデテラ感染またはボルデテラ感染の有害な効果に対する予防的な効果を有する少なくとも１つの分子を含む。
【００６６】
本発明の免疫原性組成物は、組成物が投与される宿主において、Ｔ細胞免疫応答を誘発するために使用される。上述の全ての免疫原性組成物は、異なる経路を通して宿主に注入することができる：皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）注射、経口投与および鼻腔内投与または吸入。
【００６７】
皮下注射のために処方する場合、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、好ましくは、一回の注射において、注射用量あたり１０から１００μｇ、より好ましくは２０から６０μｇ／用量、特に約５０μｇ／用量のボルデテラ株を含む。
【００６８】
鼻腔内投与のために処方する場合、ボルデテラ株は、それを与えられる哺乳類の体重および年齢に依存して、約１×１０３から１ｘ１０６細菌の用量で投与される。別の側面において、１ｘ１０４から５ｘ１０６の用量が使用できる。
【００６９】
本発明の変異型ボルデテラ株は、将来的なボルデテラ感染に対して防御する弱毒化ワクチンとして使用することができる。この点に関して、本発明の利点は、哺乳類に単一用量を投与することができ、および、防御は、少なくとも２ヶ月よりも長い期間、特に６ヶ月よりも長い期間持続しうることである。本発明のワクチンは、新生児に投与することができ、および百日咳の感染から防御する。このことは特に重要なことである。というのは、ボルデテラ・ペルツシス感染症からの致死率は、生後１ヶ月未満の乳児で約１．３％であるためである。
【００７０】
そのうえ、本発明のワクチンは、伝染病がある場合の成体の哺乳類または６０歳を越えるより年老いた成体に使用することができる。というのは、これらの合併症のリスクは、年長児または健康的な成体よりも恐らく高いためである。
【００７１】
ワクチンは、免疫原性組成物の場合と同様に、上述したような生理的賦形剤とともに処方することができる。例えば、医薬的に許容可能な媒体は、リン酸緩衝生理食塩水、蒸留水、油／水乳剤といった乳剤、さまざまな種類の湿潤剤無菌液等を含むが、これらに限定されない。ＭＤＰといったムラミルペプチド、ＩＬ−１２、アルミニウムリン酸塩、水酸化アルミニウム、Ａｌｕｍおよび／またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）といったアジュバントをワクチンに使用することができる。
【００７２】
本発明のワクチンは高いタイターのＦＨＡに対する血清ＩｇＧを誘導することが可能である。抗原特異性のサイトカインパターンの分析から、本発明の変異型弱毒化ボルデテラ株の投与は、強いＴＨ１反応を助力することが明らかになった。
【００７３】
本発明のワクチンは、高レベルのボルデテラ感染からの防御、すなわち９０％を超える、特に９５％を超える、とりわけ９９％を超えるレベルの防御（例９に詳述されるように、感染から７日後に算出）を提供する。ＢＰＺＥ１株を含むワクチンの防御のレベルは、予防接種の後の少なくとも２ヵ月において、非接種の（未処置）マウスと比較して、９９．９９９％超に達する。
【００７４】
ワクチンは、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）注射、経口投与および鼻腔内投与または吸入によって投与することができる。ワクチンの投与は通常単一用量である。あるいは、本発明のワクチンの投与は、同じ菌株、組成物またはワクチンで、もしくは無細胞のワクチンで、または両者の組合せで、最初（初回ワクチン接種）、その後の少なくとも１回のリコール（ｒｅｃａｌｌ）（続く投与）が為される。
【００７５】
一側面において、ワクチンの鼻腔内投与または吸入であって、その投与のタイプは、コストが低くおよび下記の気道において本発明の弱毒化株によるコロニー形成が可能であるワクチンの鼻腔内投与または吸入が達成される：上気道（鼻部および鼻の通路、副鼻腔、およびのどまたは咽頭）および／または呼吸気道（喉頭（ｖｏｉｃｅ  ｂｏｘまたはｌａｒｙｎｘ）、気管、気管支および気管支梢）および／または肺（呼吸細気管支、腺胞管、肺胞嚢および肺胞）。
【００７６】
液体溶液、懸濁液、乳剤、リポソーム、クリーム、ゲルまたはそのような多相性の組成物の類似物の形態で、免疫原性組成物またはワクチンの鼻腔内投与は達成される。溶液および懸濁液はドロップとして投与される。溶液は、また、点鼻薬瓶からまたは鼻吸入器からの微細な霧として投与することができる。ゲルは、１回の投与に必要な用量を含む小さなシリンジにて調合される。
【００７７】
免疫原性組成物またはワクチンの吸入は、溶液、懸濁液および粉末の形態で達成することができ；これらの製剤は、エアロゾルまたは乾燥粉末吸入器によって投与される。配合粉末は、通気器またはパッファー（ｐｕｆｆｅｒｓ）にて投与される。
【００７８】
呼吸器疾患を治療するための多価ワクチンの製造のための、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株の使用は、本発明のまた別の側面である。この点に関して、上述の弱毒化変異型ボルデテラ株は、異種抗原を呼吸粘膜へ運ぶための異種性発現プラットフォームとして使用できる。従って、例えばナイセリア、ニューモフィラ(Ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ)、エルシニア、シュードモナス、マイコバクテリウム、インフルエンザ等の呼吸病原体は、担体としてＢＰＺＥ１を使用して感染を予防できる。
【００７９】
ボルデテラ感染の治療または予防のためのワクチンの製造のための、本願に記載される生弱毒化変異型ボルデテラ株の使用もまた、本発明に包含される。この点に関して、ワクチンは、Ｂ．ペルツシスおよびＢ．パラペルツシスによる感染症の同時的な治療または予防に使用することができる。
【００８０】
ペルツシス伝染病の場合における迅速な防御免疫を提供するワクチンの使用もまた本発明に包含される。
【００８１】
予防接種後少なくとも２ヶ月にわたり増加する、迅速な防御免疫を提供するワクチンの使用もまた本発明に包含される。
【００８２】
ワクチンまたは免疫原性組成物はまた、キットにて提供される。キットは、ワクチンまたは免疫原性組成物、および免疫化のための説明書を提供する情報パンフレットを含む。
【００８３】
本発明はまた、Ｔ細胞仲介免疫応答および特にＣＤ４＋仲介免疫応答またはＣＤ８＋仲介免疫応答を誘導する方法であって、ヒト以外の哺乳類またはヒト哺乳類において本発明の生弱毒化ボルデテラ株を投与することを含む方法に関する。
【００８４】
ボルデテラによる感染によって起こされる疾病から哺乳類を防御する方法であって、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株をそのような治療を必要とする前記哺乳類に投与することを含む方法は、本発明の別の実施態様である。この方法は、ボルデテラ・ペルツシスおよび／またはボルデテラ・パラペルツシスに対する感染症の治療または予防を含む。一側面において、ＢＰＺＥ１株がこの方法に使用される。
【００８５】
また、ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を提供する方法であって、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子および異種性ａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株をそのような治療を必要とする前記哺乳類に投与することを含む方法は本発明に包含される。一側面において、ＢＰＺＥ１株がこの方法に使用される。
【００８６】
そのうえ、本発明の変異型生弱毒化ボルデテラ株は、粘膜免疫、ならびに全身性免疫を誘導する。従って、別の側面において、本発明はまた、粘膜性および全身性免疫を誘導する方法であって、そのような治療を必要とする哺乳類に、本発明の変異型生弱毒化ボルデテラ株を投与することで誘導する方法に関する。一側面において、ＢＰＺＥ１株がこの方法に使用される。
【００８７】
ボルデテラ感染の予防および／または治療におけるその役割の他に、本発明の変異型株は、関心対象のＲＮＡ（例えばアンチセンスＲＮＡ）またはタンパク質をコード化する、少なくとも１つの更なる異種性核酸配列を有するベクターとして使用してよい。これは、変異型株が、異種性ａｍｐＧ遺伝子に加えて少なくとも１つの更なる異種性の核酸配列を有することを意味する。一側面において、この少なくとも１つの更なる異種性の核酸配列によってコードされるタンパク質は、その発現が気道において望まれるタンパク質である。別の側面において、関心あるタンパク質は、免疫応答が望まれる抗原、例えばウィルスの、細菌の、または腫瘍の抗原である。従って、少なくとも１つの更なる異種性核酸配列を有する変異型ボルデテラ株もまたワクチンとして使用してよい。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与に対する上記の定義は、また、少なくとも１つの更なる異種性核酸配列を有する変異型ボルデテラ株を含むワクチンに適用される。異種性タンパク質の例は、呼吸路の感染症または呼吸路に関連した疾病を引き起こす病原体の抗原：灰白髄炎、インフルエンザ（オルソミクソウイルス科ファミリー由来のインフルエンザウイルス）または肺炎球菌（例えば肺炎連鎖球菌）由来の抗原である。
【００８８】
多くの本発明の実施態様を記述した。にもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変を行ってもよいことが理解されるであろう。
【実施例】
【００８９】
材料および方法
例１−ボルデテラ株および増殖条件
本研究で使用されるＢ．ペルツシス株は、全てＢ．ペルツシスＢＰＳＭ［１３］に由来し、Ｂ．パラペルツシスは、菌株１２８２２のストレプトマイシン耐性誘導体である（Ｎ．Ｇｕｉｓｏ博士（パスツール研究所、フランス、パリ）による好意的な提供による）。全てのボルデテラ株は、１％のグリセリン、繊維素を除いた２０％のヒツジ血液および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ（ＢＧ）寒天（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）で増殖させた。細胞付着アッセイのために、指数関数的に増殖しているＢ．ペルツシスを、６００ｎｍにおいて０．１５の光学濃度で、１ｇ／ｌのヘプタキス（ｈｅｐｔａｋｉｓ）（２，６−ジ−ｏ−メチル）β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ）を含み、６５μＣｉ／ｍｌのＬ−［３５Ｓ］メチオニン  プラス  Ｌ−［３５Ｓ］システイン（ＮＥＮ、マサチューセッツ州ボストン）を補充した２．５ｍｌの改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地［１４］に播種し、３７℃で２４時間増殖させた。その後、細菌を遠心分離によって回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、所望の濃度でＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）に再懸濁した。
【００９０】
例２−Ｂ．ペルツシスＢＰＺＥ１の構築
Ｂ．ペルツシスＢＰＺＥ１を構築するために、Ｂ．ペルツシスａｍｐＧ遺伝子を、対立遺伝子の交換を使用して、Ｅ．コリａｍｐＧと取り替えた。ｍｅｔと名付けられ、かつＢ．ペルツシスゲノムの位置４９，１４９から４９，９９０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｂ＿ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ／）（Ｂ．ペルツシスａｍｐＧ遺伝子の上流）に位置するＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＡ：５’−ＴＡＴＡＡＡＴＣＧＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）およびＢ：５’−ＴＡＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＧＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）、ならびにテンプレートとしてのＢ．ペルツシスＢＰＳＭ［１３］ゲノムＤＮＡを使用して増幅した。この６３４ｂｐの断片を、Ｔｏｐｏ  ＰＣＲＩＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、フローニンゲン、オランダ）に挿入し、その後、ＣｌａＩ−ＮｈｅＩ断片として切り出し、ＣｌａＩおよびＮｈｅＩで消化したｐＢＰ２３［５０］（Ｅ．コリａｍｐＧ遺伝子を含み、その５’および３’末端にそれぞれ、６１８ｂｐ（Ｂ．ペルツシスゲノムの位置５０，４７４から５１，０９２）のおよび３７９ｂｐ（Ｂ．ペルツシスゲノムの位置５２，５８１から５２，９６０）のＢ．ペルツシスＤＮＡが隣接した自殺ベクター）に挿入した。得られたプラスミドを、Ｅ．コリＳＭ１０［５１］に移し、その後ＢＰＳＭを包含させ、記述されるように［５２］、２つの連続した相同組換えを選択した。１０個の独立したコロニーを、以下の通りにＰＣＲによってスクリーニングした。コロニーを１００μｌのＨ２Ｏに懸濁し、９５℃で２０分間加熱し、１５，０００ｘｇで５分間遠心した。１μｌの上清を、その後、ＰＣＲのテンプレートとして使用した。そのとき、Ｅ．コリａｍｐＧの存在を検証するために、オリゴヌクレオチドＡおよびＣ：５’−ＴＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）を使用し、Ｂ．ペルツシスａｍｐＧがないことを検証するために、オリゴヌクレオチドＤ：５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）およびＥ：５’−ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）を使用した。その後、Ｅ．コリａｍｐＧを含み且つＢ．ペルツシスａｍｐＧがなくなった菌株のうちの１つを選択し、完全なａｍｐＧの遺伝子座について配列決定した。その後、この株を更なる設計に使用した。
【００９１】
［２１］に記述されるように、ｐｔｘ遺伝子をこの菌株の染色体から除去し、その後、不活性ＰＴＸをコードする変異型ｐｔｘに置き換えた。ｐＰＴ−ＲＥ［１６］由来の変異型ｐｔｘ遺伝子座を含むＥｃｏＲＩ断片を、ｐＪＱ２００ｍｐ１８ｒｐｓｌ［５３］のＥｃｒｏＲＩサイトに挿入した。得られたプラスミドを、Ｅ．コリＳＭ１０を介したコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）後、相同組換えによってｐｔｘ遺伝子座においてＢ．ペルツシス染色体に組み込んだ。得られたＢ．ペルツシス株の染色体のｐｔｘ遺伝子座について配列決定し、所望の変異の存在を確認した。ＰＴＸのサブユニットＳ１に特異的なＩＢ７［５４］ならびにサブユニットＳ２およびＳ３に特異的な１１Ｅ６［５５］のモノクローナル抗体の混合物を使用した免疫ブロットにより、毒素生成を分析した。
【００９２】
最後に、テンプレートとしてＢＰＳＭゲノムのＤＮＡ、ならびに、プライマーとして、ｄｎｔ上流領域のためのオリゴヌクレオチドＦ：５’−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＧＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）およびＧ：５’−ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）ならびにｄｎｔ下流領域のためのＨ：５’−ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２）およびＩ：５’−ＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３）を使用したＰＣＲによりｄｎｔ隣接領域を増幅して、得られたＢ．ペルツシス株からｄｎｔ遺伝子を削除した。得られた７９９ｂｐおよび７１２ｂｐ  ＤＮＡ断片を、それぞれＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩおよびＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｆａｓｔ  Ｌｉｎｋキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）を使用してつないだ。結合した断片をオリゴヌクレオチドＦおよびＩを使用してＰＣＲによって増幅し、その後、１５０５ｂｐのＰＣＲ断片をｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、得られたプラスミドから再度ＥｃｏＲＩ断片を単離し、ｐＪＱｍｐ２００ｒｐｓＬ１８のユニークなＥｃｏＲＩサイトに挿入した。得られたプラスミドは、Ｅ．コリＳＭ１０を介したコンジュゲーションによってＢ．ペルツシスに導入した。プローブとしてｄｎｔ上流領域に相当するＰＣＲ断片を使用して、ＰｖｕＩＩ−消化Ｂ．ペルツシスのゲノムＤＮＡにおけるサザンブロット分析により、対立遺伝子の交換によるｄｎｔ遺伝子の良好な欠失を確認した。プローブは、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ標識化キット（Ｒｏｃｈｅ、メラン、フランス）を使用して、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルした。ハイブリダイズしたバンドのサイズを、Ｄｉｇ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒ  ＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）の移動距離から決定した。ＢＰＺＥ１と名付けたこの最終的な株のｄｎｔ遺伝子座について配列決定した。
【００９３】
例３−ＴＣＴ生産の分析
ＴＣＴ生成の高感度の定量化のために、対数期まで増殖したＢ．ペルツシスの培養上清を回収し、固相抽出に供し［１５］およびイソチオシアン酸フェニル（ＰＩＴＣ，Ｐｉｅｒｃｅ）で誘導体化した。得られたフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）誘導体を、Ｃ８カラム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した逆相ＨＰＬＣによって分離し、２５４ｎｍで検出した。各々のサンプルのＢ．ペルツシスＰＴＣ−ＴＣＴの量を、ピーク領域および溶出時間を同様に処理したＴＣＴ標準物質と比較することによって測定した。
【００９４】
例４−細胞接着アッセイ
Ｂ．ペルツシス株の接着特性を分析するため、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ｎ°ＣＣＬ−１８５）およびマウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４（ＡＴＣＣ  ｎ°ＴＩＢ−６７）に対するそれらの接着率を、以前の記述［１６］の通りに測定した。
【００９５】
例５−透過型電子顕微鏡
単一の液滴−ネガティブ染色方法を、以下の改変を加えて以前の記述［１７］に従って使用した。約１０９細菌／ｍｌの懸濁液２０μｌを、ホルムバール炭素コートニッケルグリッド（ｆｏｒｍ  ｆｏｒｍｖａｒｄ  ｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｎｉｃｋｅｌ  ｇｒｉｄｓ）（４００  ｍｅｓｈ；  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＥＭＳ，ペンシルベニア、ワシントン）に、２分間吸着させた。３０秒間の空気乾燥の後、グリッドを２０μｌの２％リンタングステン酸（ｐＨ７；  ＥＭＳ）で２分間染色し、空気乾燥の後、６０ｋボルトおよび高分解能で、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  ７５００、日本）で試験した。
【００９６】
例６−鼻腔内感染およびワクチン接種
３週齢および８週齢のメスのＢａｌｂ／Ｃを、特定の病原体がない条件に維持し、全ての実験はパスツール研究所リール動物研究会議（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅ  ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｂｏａｒｄ）のガイドラインの下で行った。マウスにおいて、２０μｌのＰＢＳに入った約４ｘ１０６細菌を鼻腔内に感染させ、肺のＣＦＵの動力学を以前の記述［１８］の通りに測定した。ａＰＶ（Ｔｅｔｒａｖａｃ；  Ａｖｅｎｔｉｓ−Ｐａｓｔｅｕｒ，  Ｆｒａｎｃｅ）によるワクチン接種のために、マウスに、ヒト用量の２０％で腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫し、および１ヵ月後同じ用量でブーストをかけた。
【００９７】
例７−抗体定量
血清を回収し、抗体のタイターを、以前の記述[１８]の通りに酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で推定した。
【００９８】
例８−サイトカインアッセイ
個々のマウス由来の脾臓細胞を、免疫化後、異なる時点において、熱死滅Ｂ．ペルツシスＢＰＳＭ（１０６細胞／ｍｌ）、５．０μｇ／ｍｌ  ＰＴＸ（以前の記述［２０］の通りにＢ．ペルツシスＢＰＧＲ４［１９］から精製し、８０℃２０分間の加熱により不活性化した）、５．０μｇ糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ、以前の記述［２２］の通りにＢ．ペルツシスＢＰＲＡ［２１］から精製）、５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミズーリ、セントルイス）またはコントロールとしての培地のみに応答したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン生成について試験した。３７℃および５％ＣＯ２での７２時間のインキュベーションの後、上清を３重の培養からとり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５濃度をイムノアッセイ（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ｓｅｔ，  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって測定した。
【００９９】
例９−鼻腔内感染およびワクチン接種：１、２、３および４週時でのチャレンジ
小児（３週齢）マウスモデル［２９］を、ＢＰＺＥ１によるワクチン接種の効率と、無細胞百日咳ワクチン（ａＰｖ）によるワクチン接種の効率との比較のために使用した。メスのＢａｌｂ／Ｃマウスに、２０μｌ  ＰＢＳ中の約１ｘ１０６のＢＰＺＥ１株を鼻腔内に感染させた。ａＰｖ（Ｔｅｔｒａｖａｃ；  Ａｖｅｎｔｉｓ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｆｒａｎｃｅ）によるワクチン接種のために、マウスに対しヒト用量の２０％で腹腔内に免疫した。ＢＰＺＥ１またはａＰｖによるワクチン接種の後の１、２、３または４週後、マウスに対し、病原性のＢ．ペルツシスＢＰＳＭ／ｂｃｔＡ−ｌａｃＺ株を鼻腔内にチャレンジした［５３］。この株は、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＢＧｇｓ）を含むＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ寒天プレート上でのＢＰＺＥ１（ゲンタマイシン感受性）の識別が可能な、ＢＰＳＭ−誘導型ゲンタマイシン耐性株である。対照群は、ＢＰＳＭ／ｂｃｔＡ−ｌａｃＺにチャレンジされた未処置マウスに相当する。チャレンジ感染から１週間後、以前の記述［１８］の通りに、肺を無菌的に摘出し、均質化しおよびＣＦＵ決定のためのＢＧｇｓにプレーティングした。
【０１００】
マウスに、ＢＰＺＥ１またはａＰｖでワクチン接種し、摂取から１、２、３または４週後に病原性Ｂ．ペルツシスにチャレンジさせた。肺ＣＦＵカウントを、３時間後または７日後に測定した。結果は、グループあたり３から５個体のマウスからの平均（標準誤差）ＣＦＵとして表す。防御のレベルは、それぞれのチャレンジ感染について、チャレンジ感染から７日後の、非免疫群のＣＦＵの平均に対するそれぞれの群のＣＦＵの平均パーセンテージとして算出する（表２〜５）。
【０１０１】
例１０−統計分析
結果は、適宜、対応のないＴ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）およびクラスカル−ワーリス検定、その後のダンのポスト検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して分析した。差は、Ｐ≦０．０５で有意であるとみなした。
【０１０２】
結果
Ｂ．ペルツシスＢＰＺＥ１の構築
３つの病原性因子を一般に標的とした：気管細胞毒（ＴＣＴ）、ペルツシス毒素（ＰＴＸ）および皮膚壊死性毒素（ＤＮＴ）。
【０１０３】
ＴＣＴは、感染した宿主の気管における繊毛細胞の破壊の原因となり［２４、２５］、このため咳症候群に関係する可能性がある。ＴＣＴは、グラム陰性菌の細胞壁におけるペプチドグリカンの分解生成物であり、一般にＡｍｐＧトランスポータータンパク質によって細胞質内に取り入れられ、細胞壁の生合成の間に再利用される。Ｂ．ペルツシスのＡｍｐＧは、ペプチドグリカン分解生成物の内部移行において非効率的である。我々は、従って、Ｂ．ペルツシスａｍｐＧ遺伝子をＥ．コリａｍｐＧと取り替えた。得られた株は、１％未満の残留ＴＣＴ活性を示した（図１）。
【０１０４】
ＰＴＸは、Ｂ．ペルツシス感染の全身的作用の原因となる主要な病原性因子であり、酵素活性部分、Ｓ１と呼ばれる部位および標的細胞の受容体への結合の原因となる部分から成る（２６参照）。しかしながら、それはまた主要な防御抗原のうちの１であり、このことから、我々は、天然のｐｔｘ遺伝子を酵素的に不活性な毒素をコードする変異型バージョンに取り替えることを考えた。これは、Ｓ１においてＬｙｓ−９をＡｒｇにおよびＧｌｕ−１２９をＧｌｙに取り替えることで達成された。これらの２つの鍵となる残基は、それぞれ基質結合および触媒に関与する。対立遺伝子の交換は、最初にｐｔｘオペロンを削除するために使用し、その後、変異型バージョンを挿入するために使用した。Ｂ．ペルツシス培養上清中の関連した毒素類似体の存在を、免疫ブロット分析によって評価した（図２）。
【０１０５】
最後に、対立遺伝子の交換をｄｎｔ遺伝子の除去に使用した（図３）。Ｂ．ペルツシスの病原性におけるＤＮＴの役割は確かでないものの、それは、密接に関連する種であるボルデテラ・ブロンキセプティカにおいて重要な毒素として同定され、わずかな量の注入にて致死活性を示す（２６参照）。
【０１０６】
Ｂ．ペルツシスＢＰＺＥ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴づけ
ＢＰＺＥ１において一部の遺伝子の変化は細菌の細胞壁合成に潜在的に影響する可能性があるため、ＢＰＺＥ１のサイズおよび形状並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長速度を、親株ＢＰＳＭのそれらと比較した。ＢＰＺＥ１の成長速度は、ＢＰＳＭのそれと異なることはなく（図４）、および、細菌の形状またはサイズの違いは、ＢＰＺＥ１およびＢＰＳＭの間では検出されないことが、電子顕微鏡検査法分析によって証明された（図５）。しかしながら、ＢＰＺＥ１の細胞壁は、一貫してＢＰＳＭのそれより幾分薄いようであった。
【０１０７】
ＢＰＺＥ１において何らかの標的とする毒素が欠如したことまたは変化したことが、Ｂ．ペルツシスの接着特性に影響するかどうかを決定するために、ＢＰＺＥ１の接着率を、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９およびマウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４（これら２つの細胞モデルはしばしばＢ．ペルツシスの接着の研究に使用される）を使用して、ＢＰＳＭの接着率と比較した。どちらの細胞株に対しても接着能力の有意な差は、２つの株の間でみられなかった（図６）。
【０１０８】
Ｂ．ペルツシスＢＰＺＥ１の弱毒化
Ｂ．ペルツシスＢＰＺＥ１に導入した変異が弱毒化をもたらし、さらに当該生物の気道でのコロニー形成を可能としたどうかを決定するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに鼻腔内にＢＰＺＥ１またはＢＰＳＭを感染させ、時間とともにコロニー形成させた。ＢＰＺＥ１は、コロニー形成し、ＢＰＳＭと同様の長さの間マウスの肺で残存することが可能だった（図７）。しかしながら、ＢＰＳＭの感染から７日後に観察された増殖のピークは、一貫して、ＢＰＺＥ１を感染させたマウスでは起こらなかった。個々の毒素遺伝子に変異をもった株で行った研究から、これは、ｐｔｘ遺伝子座での突然変異に起因することが示された（データ示さず）。肺を組織病理学的な変化および炎症性浸潤について調べた際、ＢＰＳＭの感染は、細気管支の上皮細胞の強い肥大と関連して、感染から７日後において、強いペリ−ブロンキオバスキュラー（ｐｅｒｉ−ｂｒｏｎｃｈｉｏｖａｓｃｕｌａｒ）浸潤および炎症細胞の動員を誘導することがわかった（図８）。対照的に、そのような変化は、ＢＰＺＥ１感染した動物で観察されず、ＢＰＺＥ１感染したマウスの組織学は、細菌の代わりにＰＢＳを受けたコントロールマウスのそれと類似していた。ＢＰＳＭ−感染は、少なくとも２ヵ月間持続する炎症を誘導した（データ示さず）。これらの結果は、ＢＰＺＥ１に導入された突然変異は、急激な弱毒化をもたらすが、肺において細菌がコロニー形成し残存することを可能とすることを示す。
【０１０９】
ＢＰＺＥ１による成体マウスの鼻腔内ワクチン接種後のＢ．ペルツシスチャレンジに対する防御
ＢＰＺＥ１によって提供される防御を評価するために、８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに対するこの株の単一の鼻腔内投与の、野生型チャレンジ株ＢＰＳＭによる、続くコロニー形成における効果を、１／５ヒト用量のａＰＶによる２つのｉ．ｐ．免疫化のそれと比較した。このａＰＶ免疫化プロトコールは、ヒト臨床試験における百日咳ワクチンの有効性に関して最も優れたものとして記述されている［２７、２８］。チャレンジ感染から７日後における肺の細菌コロニー数の総クリアランスから示されるように、ＢＰＺＥ１の単一の鼻腔内投与およびａＰＶによる２回のｉ．ｐ．免疫化は、同レベルの防御を提供した（図９ａ）。細菌の高い負荷は、ワクチンの代わりに２回のＰＢＳ注射を受けたコントロールマウスにおいて見られた。
【０１１０】
ＢＰＺＥ１による乳児マウスの鼻腔内ワクチン接種後のＢ．ペルツシスチャレンジに対する防御
新規の百日咳ワクチンの主要な標的は、現在利用できるワクチンで防御されない若い乳児であるため、小児（３週齢）マウスモデル［２９］を開発し、ＢＰＺＥ１によるワクチン接種の効率とａＰＶによるワクチン接種による効率とを比較するために使用した。完全な細菌の除去がチャレンジから１週後の肺において認められたため、ＢＰＺＥ１の単一の経鼻投与は、完全に小児マウスをチャレンジ感染から防御した（図９ｂ）。対照的に細菌の実質的な数は、チャレンジ感染から１週間後においてａＰＶ感染動物において維持された。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとａＰＶワクチン接種マウスとの間の細菌の負荷の差は統計的に有意であり、このことは、小児マウスモデルにおいて、ＢＰＺＥ１による単一の鼻腔内投与が、２回のａＰＶの全身的投与よりも良好な防御を与えることを意味する。
【０１１１】
加えて、ａＰＶ免疫動物と比較して、マウスをＢＰＺＥ１で免疫した場合、投与から３時間後において、チャレンジ株の細菌負荷の強い減少が一貫して観察され（図９ｃ）、このことは、ＢＰＺＥ１によるワクチン接種は、チャレンジ株による感染に対する感受性を減少させることを示す。この効果は、８週齢および幼いマウスの両方で見られた。対照的に、ａＰＶは、コントロールマウスと比較して、感染から３時間後において、細菌数に何の効果も示さなかった。
【０１１２】
ＢＰＺＥ１による経鼻ワクチン接種後のＢ．パラペルツシスチャレンジに対する防御
小児、特に免疫化集団において、Ｂ．パラペルツシス感染についての関心が増加している［３０，３１］。Ｂ．パラペルツシスは、より穏やかな百日咳様症候群（その頻度はおそらく大部分は低く見積もられている）を引き起こす。さらに、Ｂ．パラペルツシス感染症の発病率は、最近数十年にわたって増加しており、それは恐らく、ペルツシスワクチンは、Ｂ．パラペルツシスに対しての防御効果が非常にわずかであり、または防御効果がないことが知られるという事実を原因とする［３２、３３］。対照的に、Ｂ．ペルツシスによる感染は、近年、Ｂ．パラペルツシス感染から防御することが報告された［３４］。ＢＰＺＥ１もまた、小児マウスモデルを用いて、Ｂ．パラペルツシスに対する防御について評価された。以前報告されたように、ａＰＶの２回の投与は、Ｂ．パラペルツシスに対して全く防御を提供しなかったにも関わらず、ＢＰＺＥ１の単一の鼻腔内投与は、チャレンジから１週間後のワクチン接種マウスの肺における低いＢ．パラペルツシス数によって測定されるように、強力な防御を提供する（図９ｄ）。
【０１１３】
ＢＰＺＥ１ワクチン接種により誘導される免疫応答
Ｂ．ペルツシス感染症に対する防御免疫の機構はまだ完全に理解されていないものの、Ｂ細胞およびＩＦＮ−γの両者に対する役割の明確な証拠がマウスにて実証された［２８］。ＢＰＺＥ１の１回の経鼻投与量またはａＰＶの２回のｉ．ｐ．投与の何れかによるワクチン接種は、ＦＨＡ、Ｂ．ペルツシスの主要な表面抗原［３５］に対する血清ＩｇＧを高いタイターで誘導し、これはａＰＶにおいても見られた（図１０ａ）。Ｂ．ペルツシスチャレンジの後、Ｂ．ペルツシス感染前の最初の応答と比較して、抗ＦＨＡ  ＩｇＧタイターの増大から示されるように、陽性の既往症反応がＢＰＺＥ１およびａＰＶでワクチン接種した動物において観察された。抗ＦＨＡ  ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率の試験から、ＢＰＺＥ１ワクチン接種後よりも、ａＰＶワクチン接種後（Ｔｈ２型応答の特徴）にて、これらの比率が高いことが示された（図１０ｂ）。抗ＦＨＡ−ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａはａＰＶワクチン接種マウスにおいてチャレンジ後に減少したにも関わらず、Ｂ．ペルツシスチャレンジ後のＢＰＺＥ１ワクチン接種動物よりも、実質的に高いままであった。
【０１１４】
ＢＰＺＥ１またはａＰＶワクチン接種によって誘導されるＢ．ペルツシス抗原特異的サイトカインパターンの分析から、ＢＰＺＥ１投与が、ａＰＶワクチン接種よりも、より強いＴｈ１型応答を支持することが確認された。このことは、ＦＨＡもしくはＰＴによって、またはポリクローナル活性化因子ＣｏｎＡによって刺激された脾細胞により生産されるＩＬ−５に対するＩＦＮ−γの比率は、ａＰＶワクチン接種マウスよりも、ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスにおいて有意に高いという事実により明らかとなった（図１０ｃ）。
【０１１５】
時間ごとの（１週間から４週間）ＢＰＺＥ１の防御免疫
下記の表１〜５に示されるように、ａＰｖの投与は、Ｂ．ペルツシスに対して限定された防御（１週目において、非接種のマウスと比較して７５％の細菌負荷の減少）を提供するにも関わらず、ＢＰＺＥ１の単一の鼻腔内投与は、すでに、ワクチン接種の１週後に行われるＢ．ペルツシスのチャレンジ感染に対して、高いレベルの防御（９７．６４％の細菌負荷の減少）を提供する。チャレンジ感染をワクチン接種の２週間後に行った場合、ＢＰＺＥ１によって誘導される防御のレベルは、非ワクチン接種マウスと比較して９９．９９９％を超え、ａＰｖワクチンによって誘導される防御より有意に優れている（非接種マウスと比較して約９２％）。従って、Ｂ．ペルツシスチャレンジに対するＢＰＺＥ１のワクチンの有効性は、ワクチン接種の１週間後にすでに有意であり、且つ少なくとも次の２ヵ月にわたって増加している。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１１６】
考察
百日咳は、その発生率が広くワクチンが普及した国で増加している、最初の感染症である。この逆説的な状況は、有効性の高いワクチンの広範囲な導入以来観察される、疫学的な変化に最も関連があるようである。プレ−ワクチン接種（ｐｒｅ−ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）年代と対照的に、青年期および成人の百日咳の症例は、現在、次第に頻繁が高まっている。一般に、その世代群にとっては生命を脅かされるものではないものの、Ｂ．ペルツシスに感染した成人は、若すぎてワクチン接種による防御が行えない非常に若い子供の感染に対する重要な保有者である。それゆえ、早期（おそらく出生時）のワクチン接種が非常に望ましいものの、それは、新生児および乳児の免疫系の未熟さによって阻まれる。しかしながら、天然のＢ．ペルツシス感染症は、非常に若い頃であっても、乳児における強いＴｈ１反応を誘導することが可能であるという事実［１２］は、我々が現在利用できるワクチンの代替物として経鼻投与される生弱毒化Ｂ．ペルツシスワクチン株の開発するきっかけとなった。
【０１１７】
霊長類の実験的な感染症に基づいて、Ｈｕａｎｇらは、１９６２年にすでに、百日咳に対する究極的な防御は生Ｂ．ペルツシス接種におそらく最も伴うという結論に達している［３６］。獣医学において、弱毒化ボルデテラ株は、イヌおよび子ブタにおける気管支敗血症菌病に対するワクチン接種に使用されてきた。生弱毒化ボルデテラ・ブロンキセプティカ株は、経鼻投与の後、イヌにおける犬小屋咳（ｋｅｎｎｅｌ  ｃｏｕｇｈ）に対する強い防御を提供することが示された［３７］。この防御は、ワクチン接種から４８時間後という早い時期に見られた。生弱毒化Ｂ．ブロンキセプティカによる鼻腔内ワクチン接種は、２日齢の子ブタにおいて萎縮性鼻炎に対する防御を与えることがわかっており、このことは、生きた弱毒化の形態においてボルデテラワクチンが、動物新生仔にて非常に活性を有することを示している。
【０１１８】
生ワクチン候補として遺伝的にＢ．ペルツシスを弱毒化しようとする以前の試みは、かなり限定された成功に終わった。サルモネラワクチン株の良好な弱毒化に使用された戦略に基づいて［３９］、Ｒｏｂｅｒｔｓらは、Ｂ．ペルツシスのａｒｏＡ遺伝子を削除した［４０］。ａｒｏＡ変異体は、実際、非常に弱毒化されたが、また、鼻腔内にワクチン接種された動物の気道にコロニーを作る能力を失い、高用量の反復投与後にだけ防御免疫を誘導した。我々は、Ｂ．ペルツシスの病原性の分子機構の知識を利用し、高度に弱毒化された株ＢＰＺＥ１を開発した。この株は、３つの主要な毒素、ＰＴＸ、ＴＣＴおよびＤＮＴを持たないまたは不活性化された遺伝的変化を含む。ａｒｏＡ変異体と対照的に、この株は、マウス気道にコロニーを作ることができ、単一の鼻腔内投与後に完全な防御を提供することが可能だった。成体マウスの防御は、ヒト用量の１／５のａＰＶの２回の投与によって誘導されたそれと区別不能であった。重要な違いは、しかしながら、幼いマウスにおいて、ＢＰＺＥ１の単一投与は完全に防御した一方、ａＰＶは部分的な防御を提供するだけだったことであった。若い頃において、現在利用できるワクチンによる乳児における防御を誘導することが困難な状況では、これらの結果は、非常に若い小児（おそらく出生時）にて使用可能な新規のワクチン接種戦略の開発に対する希望を提供する。加えて、ＢＰＺＥ１はＢ．パラペルツシスを防御した一方、ａＰＶはそうではなかった。従って、ＢＰＺＥ１の使用はまた、乳児におけるＢ．パラペルツシスが原因となる百日咳の発病率に影響を及ぼすはずである。
【０１１９】
多くの国々における、第一世代の細胞全体のワクチンを新規のａＰＶとする近年の置換は、細胞全体のワクチンに認められる全身的な有害反応を有意に減少させたにも関わらず、それは、防御の達成のための反復するワクチン接種の必要性を消さなかった。このことは、重篤な疾病を発病するリスクが最も高い非常に若い子供（＜６ヶ月）において、防御を得る可能性を低くする。加えて、ａＰＶの広範な使用は、新規の思いがけない問題を明らかにした。ａＰＶの反復投与は、注射部位において、細胞全体のワクチンで認められなかった広範な膨張を生じさせる可能性がある［４１］。症例の約５％において、この膨張は、ほとんど肢全体に関与し、１週を超えて持続する。この膨張の機構はまだ特徴づけできていないにも関わらず、一次免疫法によって誘導される高い抗体レベルに起因するアルサス過敏反応が原因となることが提唱された［４２］。しかしながら、それはまた、免疫応答のＴｈ２スキューイング（ｓｋｅｗｉｎｇ）に関連する可能性があった。というのは、細胞全体のワクチンと比較して、ａＰＶ投与は、ワクチン接種された小児においてより多くのＴｈ２型サイトカインを誘導し［１０］およびＴｈ１発達の遅れを起こすためである（Ｍａｓｃａｒｔら、準備中）。Ｔｈ１機能の遅延性の成熟は、遺伝的素因のある個人において、アトピーのリスクと関係していた［３３］。２つの機構は、互いに相容れないわけではない。ａＰＶと比較して、ＢＰＺＥ１投与に対する免疫応答はＴｈ２アームにさほど偏らず、および、ＢＰＺＥ１は粘膜投与されるため、膨化反応は起こり得ない。
【０１２０】
ワクチンとしての生弱毒化細菌の使用は、それらの生物学的安全性の問題を引き起こす。それ自体、それらは、環境に放出されやすい遺伝子改変生物のための指導およびガイドラインに管理される。これらのガイドラインおよび指導は、傷害性確認および環境リスクアセスメントを含む、満たさなければならない幾つかの目的を記述する［４４］。潜在的な病原性は、特に免疫無防備状態の個人（例えば、ＨＩＶに感染した個人）において、慎重に考えられる必要がある。Ｂ．ペルツシスの天然の生物学は、特にその事について興味深い。ＨＩＶ感染者におけるペルツシスが時々記述されてきたものの、それはエイズ患者ではかなり珍しい［４５］。その遺伝的に弱毒化された形態において、Ｂ．ペルツシスは、従って、特に現に多くのワクチンがそうであるように重篤なエイズが除外基準である場合、ＨＩＶ感染した小児において大きな問題を起こすとは予想されない。Ｂ．ペルツシスのコロニー形成は、細菌が肺外に伝播することなく厳密に気道上皮に限られており、これは本来ＢＰＺＥ１ワクチン株の全身菌血症を除外する。にもかかわらず予知できない安全上の問題が起こる場合、ワクチン株は、マクロライド系抗生物質（例えばエリスロマイシン）の使用によって容易に除去でき、本質的に全てのＢ．ペルツシス分離株はこれに対して非常に感受性が高い。
【０１２１】
例えば何かの生ワクチンについての更なる懸念は、環境へのワクチン株の潜在的放出およびそのような放出の結果である。Ｂ．ペルツシスは厳密にヒト病原体であり、動物ベクターまたは保有体は存在しない。そのうえ、Ｂ．ブロンキセプティカと異なり、環境中の野生型Ｂ．ペルツシスの生存は非常に限定されている［４６］。ペルツシスは、咳をする個人によってのみ広がり、無症候性の保因は存在しないようである［４７］。本研究で使用したマウスモデルでは、咳を評価することができない。しかしながら、ＢＰＺＥ１の遺伝子の変化の性質、特にＴＣＴの強い減少およびＰＴＸの遺伝子の不活性化により、この株は咳を誘導しないと期待される。活性ＰＴＸは、咳をするラットモデルにおける咳誘導のために必要であることが示されたが、その機構は未知である［４８］。にもかかわらず、ワクチン株が非ワクチン接種個人に伝染された場合、これは、最悪の場合、ワクチン適用範囲の増大をもたらす。従って、これらの潜在障害の各々の結果は無視できるとして類別でき、容易におよび迅速に必要に応じて抗生物質の治療によって制御される。
【０１２２】
ＢＰＺＥ１の使用の利点は、比較的安い生産コスト（発展途上国にとって、それは特に魅力的である）、針が不要であり容易でおよび安全な投与の様式、ならびに全身性免疫に加えて粘膜免疫を誘導するその潜在性を含む。ペルツシスに対する粘膜免疫の役割は、意外にもそれほど言及されていないにもかかわらず、Ｂ．ペルツシスが厳密に粘膜の病原体であるという事実は、粘膜の免疫応答は有意に防御に関与するかもしれないことの可能性を高める。どの現在利用できるワクチンも、何かの有意な粘膜反応を誘導しない。
【０１２３】
ワクチン接種におけるＢＰＺＥ１の使用のその他の利点は、以下の通りである：
−  免疫の誘導がワクチン接種から１週間後に検出できることによる、ＢＰＺＥ１の単一の鼻腔内の投与の後で得られる迅速な防御免疫応答、
−  ワクチン接種後の少なくとも次の２ヵ月にわたる防御免疫の増加、および
−  ワクチン接種から２週間後において、９９．９９９％を超える防御のレベルが得られることによる、完全な防御免疫。
【０１２４】
粘膜のワクチン接種のための生弱毒化Ｂ．ペルツシスの使用は、さらにもう一つの利点を提供する。Ｂ．ペルツシスは、呼吸粘膜に対する異種抗原の提示のために使用できる（４９参照）。異種性の発現プラットフォームとしてのＢＰＺＥ１の使用は、従って、種々の呼吸病原体に対する多価ワクチンの産生に有益であってよい。しかしながら、本願で抗ＦＨＡ抗体および抗原特異性ＩＦＮ−γ生産の両者の高いレベルに示されるように、ＢＰＺＥ１の鼻腔内の送達も、強い全身性免疫応答を誘導するため、それは、また、全身性免疫応答が要求される抗原の生産のために使われてもよい。
【０１２５】
本発明が様々な好ましい実施態様に関して記述された一方で、様々な改変、置換、省略および変化を、それの範囲から逸脱することなく行ってよいことが当業者は認めるであろう。従って、本発明の範囲は本願の特許請求の範囲に限定されず、それの等価物を含むことが意図される。
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、ＢＰＳＭおよびＢＰＺＥ１の培養上清に存在するＴＣＴを示す棒グラフであり、それぞれの株について、３つの独立した培養のｎＭ／ＯＤ５４０ｎｍ（±標準誤差）の平均として表される。
【図２】図２は、ＢＰＳＭ（レーン１）およびＢＰＺＥ１（レーン２）の培養上清中のＰＴＸ生産の免疫分析である。ＭｒマーカーのサイズはｋＤａで表され、左の余白に示される。
【図３】図３は、ＢＰＳＭ（レーン１）およびＢＰＺＥ１（レーン２）における、ｄｎｔ遺伝子座のサザンブロット分析である。サイズマーカーの長さは、塩基対（ｂｐ）で表され、左の余白に示される。
【図４】図４は、液体培養におけるＢＰＳＭ（黒線）およびＢＰＺＥ１（破線）の増殖速度を表すグラフである。
【図５】図５は、液体培地で２４時間培養したＢＰＳＭ（左）およびＢＰＺＥ１（右）の代表的な電子顕微鏡写真である。
【図６】図６は、ヒト肺上皮Ａ５４９細胞（左）およびマウスマクロファージ様Ｊ７７４細胞（右）に対する、ＢＰＳＭ（黒カラム）およびＢＰＺＥ１（白カラム）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ接着を示すグラフである。結果は、３回の異なる実験に基づいた、接種材料中に存在する細菌に対する結合した細菌のパーセンテージの平均として表す。
【図７】図７は、１０６ＣＦＵでＢＰＺＥ１またはＢＰＳＭを鼻腔内的に感染させた成体マウスの、ＢＰＳＭ（黒線）およびＢＰＺＥ１（破線）による肺コロニー形成を表すグラフである。結果は、１群あたり３から４個体のマウスのＣＦＵの平均（±標準誤差）で表され、２つの独立した実験を表す。＊は、Ｐ＝０．００４である。
【図８】図８は、ＰＢＳを与えられたコントロール（下パネル）と比較した、ＢＰＺＥ１感染（上パネル）またはＢＰＳＭ感染（中パネル）成体マウス由来の肺の組織学的分析の写真である。感染から１週間後、肺を無菌的に取り出し、ホルムアルデヒドで固定した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡で観察した。
【図９】図９は、（ａ）成体および（ｂ）乳児のマウスにおけるＢ．ペルツシスに対する防御、または（ｄ）乳児のマウスにおけるＢ．パラペルツシスに対する防御を示すグラフである。ＢＰＺＥ１、ａＰＶまたはＰＢＳ（未処置）で免疫したマウスをＢＰＳＭ（ａおよびｂ）またはＢ．パラペルツシス（ｄ）によるチャレンジに供し、および肺のＣＦＵ数値を３時間後（白バー）または７日後（黒バー）に決定した。結果は、１群あたり３−４マウスの平均（±標準誤差）ＣＦＵとして表され、２つの独立した実験を表す（ｂの＊はＰ＝０．００９であり；ｄの＊はＰ＝０．００７である）。（ｃ）ＢＰＺＥ１またはａＰＶでワクチン接種した成体マウスにおけるＢＰＳＭチャレンジから３時間後において、ＣＦＵを計測し、コントロールと比較した。３つの異なる実験から得た結果は、同じ実験による非免疫化群におけるＣＦＵの平均との比較による、それぞれのマウスのＣＦＵのパーセンテージとして表される。
【図１０】図１０は、ＢＰＺＥ１またはａＰＶ免疫化による誘導される免疫応答を表す棒グラフである。（ａ）および（ｂ）は、ＢＰＺＥ１またはａＰＶ免疫化マウスでのＢＰＳＭチャレンジ前（白バー）または１週間後（黒バー）における、コントロールとの比較による、（ａ）抗ＦＨＡＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）タイターおよび（ｂ）ＩｇＧ１／ＩｇＧ２比である。（ｃ）は、コントロール（グレーバー）との比較による、２ヶ月前にＢＰＺＥ１（黒バー）またはａＰＶ（白バー）をワクチン接種したマウス由来の、ＦＨＡ、ＰＴＸまたはＣｏｎＡ刺激した脾細胞により生産されたＩＦＮ−γとＩＬ−５との比である。抗体およびサイトカインは個々のマウスで測定し、結果は、１群あたり４個体のマウスを３重で試験し、その平均値（±標準誤差）で表した。
【図１１】図１１は、ペルツシス毒素のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（島活性タンパク質Ｓ１）である。最初の３４アミノ酸はシグナル配列であり、３５から２６９アミノ酸は成熟鎖（ｍａｔｕｒｅ  ｃｈａｉｎ）である。
【図１２】図１２は、皮膚壊死性毒素のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。
【図１３】図１３は、ボルデテラ・ペルツシス由来のＡｍｐＧのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）である。
【図１４】図１４は、エシェリシア・コリ由来のＡｍｐＧのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月21日(2009.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも変異型ペルツシス毒素（ｐｔｘ）遺伝子、欠失型または変異型皮膚壊死性毒素（ｄｎｔ）遺伝子、およびボルデテラａｍｐＧ遺伝子に取って代わるＥ．コリａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株であって、前記株が投与される場合、強いＴＨ１反応が助力される、変異型ボルデテラ株。
【請求項２】
ボルデテラ・ペルツシス株である請求項１に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項３】
請求項１または２に記載の変異型ボルデテラ株であって、得られる株が５％未満の残留ＴＣＴ活性を発現する変異型ボルデテラ株。
【請求項４】
３重変異株である請求項１から３の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項５】
２００６年３月９日に番号Ｉ−３５８５として国立培養微生物収集所（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）に寄託されたＢＰＺＥ１株である、請求項４に記載の３重変異型ボルデテラ株。
【請求項６】
弱毒化された請求項１から５の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項７】
請求項１から６の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株であって、更に、ＲＮＡまたはタンパク質をコードする少なくとも１つの異種性核酸配列を含む変異型ボルデテラ株。
【請求項８】
前記少なくとも１つの異種性核酸配列が抗原である請求項７に記載の変異型ボルデテラ株。
【請求項９】
ボルデテラ種に起因する感染に対するワクチンとしての使用のための請求項６に記載の弱毒化ボルデテラ株。
【請求項１０】
ボルデテラ種に起因する感染に対する予防ワクチンとしての使用のための請求項９に記載の弱毒化ボルデテラ株。
【請求項１１】
請求項１から６の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株を含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
更に、医薬的に適した賦形剤、媒体および／または担体を含む請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
更にアジュバントを含む請求項１１または１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項６に記載の弱毒化ボルデテラ株を含むワクチン。
【請求項１５】
鼻腔内投与のために処方された請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のワクチンおよび情報パンフレットを含むキット。
【請求項１７】
ボルデテラ感染の予防のためのワクチンの製造のための請求項６に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項１８】
Ｂ．ペルツシスおよびＢ．パラペルツシス感染に対する同時的予防のためのワクチンの製造のための請求項６に記載の弱毒化ボルデテラ感染の使用。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用であって、前記ワクチンが、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、経口または鼻腔内投与によって、注射によって、あるいは、吸入によって投与される使用。
【請求項２０】
前記ワクチンが鼻腔内に投与される、請求項１７または１８に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２１】
前記ワクチンが、ボルデテラ感染に対する迅速な防御免疫を必要とする哺乳類に投与される、請求項１７または１８に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２２】
前記ワクチンが新生児に投与される請求項２１に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２３】
前記ワクチンが子供に投与される請求項２１に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２４】
前記ワクチンが鼻腔内に投与される、請求項２１から２３の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２５】
前記ワクチンが単一投与で１回投与される、請求項２１から２４の何れか１項に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２６】
ａ）請求項６に記載の株の投与；および、ｂ）同一の株もしくは無細胞ワクチンまたは両者の組み合わせの何れかによる少なくとも１回のリコールの実行を含む、請求項１７または１８に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項２７】
呼吸性疾患を治療するための多価ワクチンの製造のための、少なくとも変異型ｐｔｘ遺伝子、欠失型または変異型ｄｎｔ遺伝子およびボルデテラａｍｐＧ遺伝子に取って代わるＥ．コリａｍｐＧ遺伝子を含む変異型ボルデテラ株の使用。
【請求項２８】
ボルデテラ感染に対する防御のレベルが９５％を超える請求項１７から２７の何れか１項に記載の使用。
【請求項２９】
ボルデテラ感染に対する防御のレベルが９９％を超える請求項１７から２７の何れか１項に記載の使用。
【請求項３０】
哺乳類におけるボルデテラ感染の治療のための粘膜応答および全身的応答を提供するためのワクチンの製造のための、請求項６に記載の弱毒化ボルデテラ株の使用。
【請求項３１】
少なくとも１つの異種性抗原を発現するためのベクターとしての、請求項１から８の何れか１項に記載の変異型ボルデテラ株。
【国際調査報告】
2009529338.tif 000021
2009529338.tif 000022
2009529338.tif 000023
2009529338.tif 000024