(57)【要約】イムノフィリンを用いた免疫抑制剤のための高度に特異的な均質アッセイ法を単一受容体フォーマットで提供する。もっとも簡単なフォーマットでは、単一受容体を、イムノフィリンを抗体の代わりに用いる競合免疫アッセイ法のように利用し、薬剤コンジュゲートと薬剤分析物との間で限られた数のイムノフィリン結合部位について競合が生じる。微粒子凝集アッセイフォーマットでは、イムノフィリンは、粒子に結合するか、又は溶液中に存在する。イムノフィリンが粒子に結合している場合、薬剤分析物の多価コンジュゲートが溶液中に存在する。【選択図】なし
2009507234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の免疫抑制剤の存在又は量を決定する方法であって、
免疫抑制剤を含有する疑いのあるサンプルを準備するステップ、
サンプルをコンジュゲート及び免疫抑制剤に特異的なイムノフィリン受容体と混合して懸濁液又は溶液を形成させるステップであって、前記コンジュゲートは外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物を含み、サンプル中に存在する免疫抑制剤及び前記外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物がイムノフィリン受容体との結合について競合するものである前記ステップ、
イムノフィリン受容体に結合した免疫抑制剤の量、又は遊離状態の免疫抑制剤の量を測定するステップ、並びに
測定された免疫抑制剤の量とサンプル中の免疫抑制剤の存在又は量とを相関させるステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
前記イムノフィリン受容体が検出粒子に結合し、前記コンジュゲートが高分子担体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コンジュゲートが検出粒子に結合し、前記イムノフィリン受容体が多量体型、好ましくは二量体型である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
粒子の凝集量が懸濁液中で測定される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記イムノフィリン受容体に結合した免疫抑制剤の量、又は遊離状態の免疫抑制剤の量が蛍光又は化学発光検出系を利用することにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが免疫抑制剤を投与されている患者から採取された血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記高分子担体がペプチド、タンパク質、及び多糖からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫抑制剤がシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、及びエベロリムスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫抑制剤がラパマイシン又はエベロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がラパマイシン特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫抑制剤がラパマイシンであり、前記イムノフィリン受容体がＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５Ｃからなる群より選択されるラパマイシン特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫抑制剤がタクロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がタクロリムス特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫抑制剤がタクロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がタクロリムス特異的ＦＫＢＰ１２変異体又はＦＫＢＰ１４からなる群より選択されるタクロリムス特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノフィリン受容体が蛍光共鳴エネルギー移動対の第１のメンバーと結合され、前記コンジュゲートが蛍光共鳴エネルギー移動対の第２のメンバーと結合されており、前記イムノフィリンタンパク質と前記外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物との結合によって蛍光共鳴エネルギー移動対のメンバーが蛍光エネルギー移動関係に配置されて検出可能なシグナルが発生するものであり、
溶液中で発生したシグナルの量を測定し、
測定されたシグナルの量とサンプル中の免疫抑制剤の存在又は量とを相関させる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物がフルオロフォアで標識され、イムノフィリンタンパク質と外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物との結合がフルオロフォアの蛍光偏光に変化を引き起こすものであって、
溶液中で発生した蛍光偏光の変化を測定し、
蛍光偏光の変化の量とサンプル中の免疫抑制剤の存在又は量とを相関させる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中のラパマイシンの存在又は量を決定するものであって、
ラパマイシンを含有する疑いのあるサンプルを準備するステップ、
サンプルをラパマイシン二量体及びラパマイシンに特異的なイムノフィリン受容体と混合して懸濁液を形成させるステップであって、前記イムノフィリン受容体は検出粒子と結合され、サンプル中のラパマイシン及びラパマイシン二量体がイムノフィリン受容体との結合について競合し、イムノフィリン受容体とラパマイシン二量体との結合によって検出粒子が凝集するものである前記ステップ、
懸濁液中の粒子の凝集量を測定するステップ、並びに
測定された凝集量とサンプル中のラパマイシンの存在又は量とを相関させるステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中の免疫抑制剤の存在又は量を決定するためのキットであって、
前記薬剤に特異的なイムノフィリン受容体、
外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物を含むコンジュゲート、及び
アッセイを実行するための使用説明書
を含んでなる前記キット。
【請求項１７】
前記イムノフィリン受容体が検出粒子に結合されており、前記コンジュゲートが高分子担体に結合されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記イムノフィリン受容体が多量体型であり、前記コンジュゲートが検出粒子に結合されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記免疫抑制剤がラパマイシン又はエベロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がラパマイシン特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
前記免疫抑制剤がラパマイシンであり、前記イムノフィリン受容体がＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５Ｃからなる群より選択されるラパマイシン特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２１】
前記免疫抑制剤がタクロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がタクロリムス特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２２】
前記免疫抑制剤がタクロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がタクロリムス特異的ＦＫＢＰ１２変異体又はＦＫＢＰ１４からなる群より選択されるタクロリムス特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２３】
前記免疫抑制剤がラパマイシン又はエベロリムスであり、前記イムノフィリン受容体がラパマイシン特異的ＦＫ結合タンパク質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２４】
前記イムノフィリン受容体が蛍光共鳴エネルギー移動対の第１のメンバーと結合され、前記コンジュゲートが蛍光共鳴エネルギー移動対の第２のメンバーと結合されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項２５】
外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物がフルオロフォアで標識されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項２６】
ラパマイシンに特異的なイムノフィリン受容体、検出粒子に結合されたイムノフィリン受容体
ラパマイシン二量体、及び
アッセイを実行するための使用説明書
を含んでなる、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬モニタリングの分野、特に免疫抑制剤を検出し、定量するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制剤は、免疫系の活性を抑制又は防止するために免疫抑制療法において使用される。臨床的には、それらは移植された器官や組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）の拒絶の防止に、及び自己免疫疾患又は恐らくは自己免疫起源であろうと思われる疾患（例えば、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、クローン病、及び潰瘍性大腸炎）の治療に使用される。
【０００３】
ＦＫ５０６（タクロリムス）及びラパマイシン（シロリムス）のような免疫抑制剤に関する単一受容体アッセイには、イムノフィリン、例えばＦＫＢＰ（ＦＫ結合タンパク質）が使用されているが、ＦＫＢＰは、二以上の免疫抑制剤又は不活性な代謝産物に対して著しい交差反応性を示す。免疫抑制剤は、しばしば互いに併用されるので、親薬物に対する特異性は重要であり、前述のアッセイは、通常の治療薬モニタリングでの使用で大幅に制限されている。この問題は、単一受容体アッセイに特異的ＦＫＢＰを使用することで解決される。他には、抗体を用いた単一受容体アッセイ、すなわち、目的の免疫抑制剤に特異的な免疫アッセイを開発することによって、この問題を解決することが試みられている。免疫アッセイは、親薬物に対して優れた選択性を示すが、ほとんどの場合、一以上の不活性代謝産物に対して著しい交差反応性を示す。この交差反応性は、クロマトグラフィー基準アッセイと比較した場合に、免疫アッセイにおいて望ましくない正のバイアスを与える傾向にある。免疫抑制剤に関する特異的、高感度及び安定的なアッセイ、特にハイスループット臨床分析器に適用できるようなアッセイが必要とされている。
【０００４】
ＦＫＢＰ２５は、ラパマイシン特異的であることが知られていたが、この性質は、これまでラパマイシンに特異的なアッセイに利用されていなかった。ラパマイシン（シロリムス）及びＦＫ５０６（タクロリムス）の双方に対して高い交差反応性をもつＦＫＢＰが、異種単一受容体アッセイで使用されてきた。抗体を利用する同種又は異種フォーマットでの免疫抑制剤のための単一受容体アッセイは、当該分野では公知である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記背景において、本発明は、前記先行技術を超えるいくつかの自明でない利点と進歩性を提供する。特に、免疫抑制剤物質に関する単一受容体アッセイの改善が必要と考えられている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特定の利点又は機能性に限定はされないが、本発明がＦＫＢＰを用いる免疫抑制剤に関して高度に特異的な均質アッセイ法を単一受容体フォーマットで提供することに留意されたい。最も簡単なフォーマットでは、競合免疫アッセイに似た単一受容体が利用される。そのためイムノフィリンが抗体の代わりとなり、薬剤コンジュゲートと薬剤との間で、限られた数のイムノフィリン結合部位についての競合が起こる。微粒子凝集アッセイでは、イムノフィリンは、粒子に結合しているか又は溶液中に存在している。イムノフィリンが粒子に結合する場合には、薬剤の多価コンジュゲートを分析対象のサンプルに添加する。イムノフィリンが溶液中に存在する場合には、前記コンジュゲートを粒子に結合し、イムノフィリンは、粒子を架橋するために二量体化（又は重合化）する。これは、融合タンパク質技術又は化学的架橋によって達成される。
【０００７】
薬物ラパマイシン及びタクロリムスに関する単一受容体フォーマットの主な課題は、特異性である。これらの薬物に結合するイムノフィリンのクラス（いわゆるＦＫ結合タンパク質若しくはＦＫＢＰ）は、これらの薬物の構造的な類似性のため、通常、ラパマイシンとタクロリムス間のいかなる有意な程度も識別しない。唯一の例外が、ラパマイシン選択的イムノフィリンＦＫＢＰ２５である。ペプチジルプロリルイソメラーゼ（ロータマーゼ）アッセイでは、ラパマイシンに０．９ｎＭのＫｉであるのに対してタクロリムスには２００ｎＭのＫｉであることが報告されている（J. Liang et al, J. Am. Chem. Soc. 118. 1231-1232, 1996）。
【０００８】
タクロリムスについては、選択的なＦＫＢＰ１２変異体を設計することができる（M.T. DeCenzo et al, Protein Engineering, 9, 173-180, 1996参照）。あるいは、ＦＫＢＰ１４が、タクロリムスについてはシロリムス（４０ｎＭ）よりも約２０倍低いＫｄ（すなわち、１．８ｎＭ）を有することが報告されている（Davis, D. et al., Clin. Therapeutics 22, Suppl. B, B62-B70, 2000）。また、この報告に基づいて、ＦＫＢＰ１４がＦＫ５０６（タクロリムス）単一受容体アッセイの候補として提案されている。
【０００９】
本発明の第２の態様は、単一受容体フォーマットのＦＫＢＰを用いた免疫抑制剤のための高感度均質アッセイ法である。感度の増大は、アッセイ対象の免疫抑制剤、他の免疫抑制剤、又は免疫抑制剤の断片の二量体コンジュゲートの使用により達成できることが予想される。例えば、ラパマイシンは、様々なリンカーでＣ−４０の位置を介して二量体化でき、ＦＫＢＰ２５を用いたラパマイシン単一受容体アッセイで、通常三つ以上の薬物が付加されるアミノデキストランコンジュゲートの代わりに、使用される。遊離状態のラパマイシンは、通常のアミノデキストランコンジュゲートよりも、これらの二量体化したコンジュゲートと、より良好に競合することが期待される。
【００１０】
ＦＫＢＰ２５ペプチドのＣ末端（ＦＫＢＰ２５Ｃ）であるＰ１０９−Ｄ２２４（J. Liang et al.）もまた、ラパマイシンアッセイに有用である。J. Liangらは、「Ｃ末端ドメインは、全長タンパク質と同じ結合選好性を示すことから、Ｎ末端ドメインは、結合特異性に影響しない。」と報告している。ＦＫＢＰ２５のＮ末端ドメイン（Ｐ１０９の近くにある約１３ｋＤａのペプチド）は、結合したラパマイシンのＣ−４０位の近くに位置してもよく、また、Ｃ−４０位でコンジュゲートされたアミノデキストランラパマイシンの結合を妨げ、又は低減し、それによってアッセイの感度を低減する可能性がある。J. Liangは、論文の補足資料中で「組換えｈＦＫＢＰ２５は不安定であり、精製後すぐに分解する。時間経過と共に、オリジナルのＦＫＢＰ２５サンプル中で確認できるのは、分子量１３．７〜１５ｋＤａの断片の混合物のみとなる。」という状況を記載していることから、ＦＫＢＰ２５Ｃを使用する利点は、安定性を改善できることである。ＦＫＢＰ２５Ｃの他の可能性のある利点は、ＦＫＢＰ２５のＮ末端ドメインは、塩基性アミノ酸に富んでいるので、ｐＩ（等電点）の僅かな減少があり得る（Galat et. al.1992）。低ｐＩは、患者サンプル中のタンパク質（低ｐＩを有するもの）に対する非特異的結合を低減することができる。
【００１１】
ＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５Ｃは、それぞれラパマイシン用アッセイにおいて、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）融合タンパク質として有用である。ＧＳＴの完全アミノ酸配列を含む融合タンパク質は、二量体を形成できる（Amersham Biosciences, GST Gene Fusion System Handbook, page 27）。ＧＳＴは、天然には二量体酵素として見出される（D. B. Smith, K.S. Johnson, Gene, 67, 31, 1988）。二量体化したＦＫＢＰ２５を用いる利点は、ラパマイシン用アッセイの感度を改善することである。ＦＫＢＰ２５−ＧＳＴ又はＦＫＢＰ２５Ｃ−ＧＳＴ融合タンパク質の二量体化の結果、高分子あたり２つの結合部位が形成され、それにより交差反応又は抗体に類似した２つの同一リガンドとの結合が可能となる。二量体化したＦＫＢＰ２５−ＧＳＴ又はＦＫＢＰ２５Ｃ−ＧＳＴ融合タンパク質は、溶液中で使用され、ラパマイシン結合微粒子と交差反応する又はそれを凝集させることができる。サンプル中のラパマイシンは、溶液中で二量体化したＦＫＢＰ２５−ＧＳＴ又はＦＫＢＰ２５Ｃ−ＧＳＴと結合でき、それ故ラパマイシン結合微粒子の凝集を抑制することができる。
【００１２】
本発明の一実施形態によれば、サンプル中の標的免疫抑制剤の存在又は量を決定する方法であって、免疫抑制剤を含有する疑いのあるサンプルを準備するステップ、免疫抑制剤に特異的なイムノフィリン受容体と、免疫抑制剤又は免疫抑制剤の類似体及び高分子担体を含むコンジュゲートとをサンプルに加えるステップ（このステップでは、前記標的免疫抑制剤と前記コンジュゲートが限られた数の受容体結合部位について競合する）、イムノフィリンに結合したコンジュゲートの量を測定するステップ、並びに、測定されたコンジュゲートの量と、サンプル中の免疫抑制剤の存在又は量とを相関させるステップを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の実施形態において、サンプル中の標的免疫抑制剤の存在又は量を決定する方法であって、免疫抑制剤を含有する疑いのあるサンプルを準備するステップ、免疫抑制剤に特異的なイムノフィリン受容体、及び外来性免疫抑制剤又は薬剤類似物をサンプルに加えるステップ（このステップでは、前記イムノフィリンが二量体化され、前記免疫抑制剤と前記外来性薬剤又は薬剤類似物が限られた数の受容体結合部位について競合する）、並びにサンプル中の免疫抑制剤の存在又は量の測定として、イムノフィリンに結合した外来性薬剤又は薬剤類似物の量を測定するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明のこれらの又は他の特徴及び利点は、添付した特許請求の範囲と共に以下の本発明の詳細な説明からより十分に理解できるであろう。特許請求の範囲は、その詳述によって定義されるのであって、本明細書で説明する特定の特徴及び利点に関する議論によって定義されるのではないことに留意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
「好ましくは」、「一般的には」、及び「通常」のような用語は、本明細書では、発明の範囲を限定するために、或いはいくつかの特徴が発明の構造又は機能に重大であり、必須であり、又は重要でさえあることを意味するために用いるのではない。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態で利用することのできる又は利用することのできない別の又はさらなる特徴を単に強調することが目的である。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「検出粒子」とは、均質アッセイにおいて凝集状態と非凝集状態との区別が可能な直径約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲で、通常球形状態を有しているあらゆる粒子を言う。検出粒子のサイズ（直径）は、ナノメートル又はマイクロメートルの範囲にあるが、便宜上、このような粒子の全てを本明細書では「微粒子」と呼ぶ。検出粒子は、マイクロ粒子及びナノシェルを含む。検出粒子の表面は、官能化されていてもよく、様々な化合物がその表面に付着していてもよい。そのような化合物としては、例えば、フルオロフォア、化学発光物質、抗体、ビオチン、又はストレプトアビジンが含まれる。
【００１７】
エピトープは、特定の免疫反応を刺激し、かつそれに対する反応を誘導する抗原性分子の表面上の領域である。エピトープタギングは、クローン化された遺伝子にコードされたタンパク質が公知の抗体に対して免疫反応性となるようにする組換えＤＮＡ法である。融合タグシステムの開発によって、アフィニティマトリクス及び特異的抗体を用いた簡便な精製及び組換えタンパク質の検出に大きな自由度がもたらされる。エピトープタグは、１０〜１５アミノ酸長であり、タンパク質に分子ハンドルを取り付けるように設計される。それらは、通常、アミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかに配置され、三次構造ひいてはそのタンパク質の機能におけるあらゆる潜在的な破壊を最小限にしている。前記タグは小さいので、さらに組換えタンパク質の構造及び機能を妨げる可能性は低い。したがって、エピトープタグは、一般的には、その後の実験を行う前に取り除く必要がない。多くの様々なタグが使用されている。例えば、Ｈｉｓ６（６つのヒスチジンの配列で、Ｎｉ＋２又はＣｏ＋２などの金属イオンを含むマトリクスに対して強いアフィニティを有する）、ＨＡ（ヒトインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質に由来するペプチド配列）、及びＡｖｉＴａｇ（大腸菌のビオチンタンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ）によってその内部のリジン残基を酵素的にモノビオチン化することができる配列）が挙げられる。酵素ＢｉｒＡは発現混合物に添加され、ビオチン化はｉｎ  ｓｉｔｕで行われる。
【００１８】
用語「特異的結合」とは、２つの対を成す種間の高アビディティ及び／又は高アフィニティ結合を言う。そのような対を成す種としては、例えば、リガンド／標的部分、酵素／基質、受容体／アゴニスト、抗体／抗原、及びレクチン／炭水化物（糖）等が挙げられる。結合相互作用は、共有結合性若しくは非共有結合性相互作用、又は共有結合性及び非共有結合性相互作用の組み合わせによって仲介されていてもよい。特に、特異的結合は、ある対の一方のメンバーが特定の種には結合するが、その結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物のファミリー内の他の種とは結合しないことを特徴とする。したがって、例えば、抗体は、タンパク質ファミリー内の単一エピトープと結合し、他のエピトープとは結合しないことが好ましい。
【００１９】
用語「受容体」又は「結合部分」とは、本明細書で使用する場合、標的化合物に特異的に結合する抗体以外のタンパク質又は糖タンパク質をいう。受容体の例は、免疫抑制剤と結合するイムノフィリンである。
【００２０】
用語「ナノシェル」とは、本明細書で使用する場合、超薄金属層（例えば、金）で被覆された誘電体コア（例えば、シリカ又はリン酸カルシウム）から構成される微粒子をいう。本発明での使用に適したナノシェルは、約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲から選択される直径をもつ。微粒子の表面は、官能化されていてもよく、また様々な化合物（例えば、抗体又はストレプトアビジンなど）がその表面に付着されていてもよい。
【００２１】
用語「微粒子」とは、本明細書で使用する場合、直径約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍの固体粒子をいう。本発明での使用には、通常、微粒子は約１００ｎｍ〜約６００ｎｍの直径を有する。微粒子は、様々な物質から形成することができ、例えばポリスチレン及びラテックス微粒子などである。その表面は、任意で官能化されてもよく、また様々な化合物（例えば、抗体又はストレプトアビジンなど）がその表面に付着されていてもよい。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、抗原との免疫反応を可能にする、少なくとも一の結合ドメインから構成されるポリペプチド又はポリペプチド群である。抗体の結合ドメインは、抗体分子の可変ドメインのフォールディング（折りたたみ）によって形成され、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形状及び電荷分布をもつ三次元結合空間を形成する。特に明記しない限り、抗体は、通常、ポリクローナル抗体、並びにモノクローナル抗体を包含する。用語「抗体」とは、結合ドメインを含む組換えタンパク質、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのを含む抗体フラグメントも含む。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、２つの分離した構成要素を互いに結合する結合分子、又は結合分子群をいう。リンカーは、２つの構成要素に最適な間隔を提供するものであってもよいし、又はさらに２つの構成要素が互いから分離できるようにする不安定な連結を供給するものであってもよい。不安定な連結としては、光分解基、酸不安定部分、塩基不安定部分、及び酵素切断基が挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「均質アッセイ」とは、サンプル中の化合物の存在又は濃度を決定するための定量又は定性検査をいう。このアッセイでは、未反応の検査試薬を、標的化合物を検出するため又は標的化合物の濃度を測定するために、標的化合物と反応した試薬から分離する必要はない。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「イムノフィリン」という総称は、特異的かつ可逆的に免疫抑制剤に結合する抗体以外のあらゆるタンパク質受容体を意味する。例えば、この用語は、免疫抑制剤であるシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、及びエベロリムスに結合する公知のタンパク質受容体にも及ぶことを目的としており、例えばＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、シクロフィリン、カルシニューリン、及びラパマイシンの標的タンパク質（ＴＯＲ）、又はそれらのイムノフィリンの免疫抑制剤結合類似体を含む。かかる類似体は、親イムノフィリンの標的免疫抑制剤に対して高いアフィニティを保持しているが、親タンパク質の断片若しくは融合タンパク質（親タンパク質の少なくとも一部を含む）に相当するタンパク質、又は親イムノフィリンの誘導体（このような誘導体は、親タンパク質と比較して一以上のアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を含んでいる）であるタンパク質を包含する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「免疫抑制剤類似物」とは、親薬剤のイムノフィリンに対し高いアフィニティを保持している親免疫抑制剤の二量体、断片、二量体化した断片、又は他の誘導体をいう。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「ラパマイシン特異的ＦＫＢＰ」とは、可逆的かつ特異的にラパマイシンに結合するタンパク質をいう。ラパマイシン特異的ＦＫＢＰの例としては、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ２５Ｃ、ＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５Ｃの断片、並びにＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５のラパマイシン結合断片を含む融合タンパク質が挙げられる。
【００２８】
用語「外来性免疫抑制剤」とは、免疫抑制剤の存在についてアッセイしようとするサンプル中に最初は存在していなかったが、通常、コンジュゲートの形で、アッセイの間に添加される免疫抑制剤をいう。外来性免疫抑制剤コンジュゲートは、イムノフィリンとの結合についてのサンプル中に存在する免疫抑制剤の競合相手として機能する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「高分子担体」とは、二以上の化合物と連結できるが、その連結した各化合物がそれらに対応する受容体と特異的に結合することを可能にし得る高度に分岐したポリマー骨格（例えば、ポリペプチド又は炭水化物など）をいう。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「蛍光エネルギー移動関係」とは、ドナーフルオロフォアが入射光によって励起された時に、ドナー由来の励起状態エネルギーがアクセプターフルオロフォアに移動するように互いが十分に近位に位置しているドナー及びアクセプターフルオロフォアをいう。
本発明は、サンプル中に存在する免疫抑制剤（標的薬物）を検出するための、及びその量を測定するための均質競合アッセイに関する。一実施形態において、サンプルは、血液のような患者から採取された生体液を意味している。前記アッセイは、サンプルをコンジュゲート（第二の部分に結合した免疫抑制剤類似物を含む）及び標的薬物に特異的な受容体タンパク質と混合することを含む。このコンジュゲートは、受容体タンパク質への結合についてサンプル中に存在する遊離状態の免疫抑制剤と競合する。そして、混合ステップ後に受容体タンパク質に結合したコンジュゲートの量を検出することを利用して、サンプル中の免疫抑制剤の最初の濃度を決定する。通常、２つのアッセイ試薬（すなわち、タンパク質受容体とコンジュゲート）が別々の成分としてサンプルに添加される。しかしながら、一実施形態では、この２つの試薬が一つの組成物として添加される。受容体タンパク質又はコンジュゲートのいずれかを、受容体がコンジュゲートへ結合したときに検出可能なシグナルを生じるマーカーで標識する。サンプル中に存在する免疫抑制剤は、受容体タンパク質への結合についてコンジュゲートと競合する。それにより、サンプル中に存在する免疫抑制剤の濃度に比例したシグナルの減少が生じる。それ故、本明細書で開示される方法は、サンプル中に存在する薬物の量を精製若しくは洗浄ステップなしに測定することを可能にする。
【００３１】
２つの高分子が相互作用したときに検出可能なシグナルを生じる標識系は、当業者には公知であり、これを開示された組成物及び方法における使用に適合させることができる。一実施形態において、本方法は、均質粒子をベースとするアッセイを含む。この方法では、受容体タンパク質（例えば、イムノフィリン）又は免疫抑制剤コンジュゲートが検出粒子に結合されている。受容体タンパク質とコンジュゲート種との結合によって凝集が起こるが、サンプル中に存在する免疫抑制剤と受容体との結合が、コンジュゲートと受容体タンパク質との結合を置換又は阻害する結果、凝集の減少が起こる。この実施形態において、サンプル中に存在する免疫抑制剤の量は、検出された凝集の量に基づいて決定することができる。より具体的には、サンプル中の免疫抑制剤は、受容体タンパク質への結合について免疫抑制剤コンジュゲートと競合し、その結果サンプル中に存在する免疫抑制剤の増加によって、標準的な濁度解析によって検出できる凝集量が減少する。
【００３２】
一実施形態において、受容体タンパク質は、検出粒子で標識され、また免疫抑制剤コンジュゲートは、リンカーを介して互いが結合した二以上の免疫抑制剤化合物（又は２つの免疫抑制剤類似物）を含む。一実施形態において、免疫抑制剤コンジュゲートは、高分子担体に結合した複数の免疫抑制剤化合物を含む。一実施形態において、高分子担体は、アミノデキストランである。しかしながら、あらゆるポリマー構造を高分子担体として使用することができる。ただし、高分子担体は、免疫抑制剤がそれに対応するイムノフィリンと特異的に結合できるような形で、この担体上に多数の免疫抑制剤化合物を結合させることができるものである。あるいは、免疫抑制剤は、高分子担体に結合するよりもむしろ二量体として形成され得る。例えば、ラパマイシンは、様々なリンカーを用いてＣ−４０の位置を介して二量体化され、ラパマイシン単一受容体アッセイにおいてアミノデキストランコンジュゲートに代わって使用することができる。遊離ラパマイシンは、通常のアミノデキストランコンジュゲートを用いるよりも、これらの二量体コンジュゲートを用いた方がより良好な競合が期待される。
【００３３】
他の実施形態において、コンジュゲート種は、検出粒子に結合した標的免疫抑制剤を含む。そして、受容体タンパク質は、二以上の受容体タンパク質が互いに連結している複合体の形態で存在する。一実施形態において、受容体タンパク質多量体は、標的免疫抑制剤に特異的な２つの受容体タンパク質の間で形成される二量体である。他の実施形態において、受容体タンパク質多量体は、連結した各受容体タンパク質がその能力を維持して免疫抑制剤に特異的に結合するように、互いに連結された複数の受容体タンパク質を含む。
【００３４】
別の実施形態において、受容体タンパク質と免疫抑制剤コンジュゲートの結合を検出するアッセイステップは、蛍光又は化学発光検出系、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）を利用する。ＦＲＥＴは、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアへの励起状態エネルギーの距離依存的な移動に基づく。ドナーフルオロフォアは入射光によって励起され、アクセプターが２０Å〜６０Åの範囲内に存在する場合には、ドナー由来の励起状態エネルギーは移動することができる。分子間距離の最適範囲を超えると、エネルギー移動効率は、距離の６乗に反比例して減少する。この移動は、ドナーの蛍光強度及び励起状態の寿命の低減、並びにアクセプターの発光強度の増大をもたらす（Selvin,P.R., Nature Structural Biology, 2000,7,9,730-734）。このアッセイフォーマットは、一組のＦＲＥＴフルオロフォアで、それぞれ一方のメンバーが受容体タンパク質に、他方がコンジュゲートに結合していることが必要である。ユーロピウムのようなドナーフルオロフォア及びＣｙ５のようなアクセプターフルオロフォアでは、３４０ｎｍでの光励起、及び６６５ｎｍでの発光検出が用いられている（Pulli, T., et. al., Analytical Chemistry, 2005, 77, 2637-2642）。いくつかの市販のキットを、タンパク質をドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアで標識するために利用することができる。例えば、ＬＡＮＣＥ  Ｅｕ−Ｗ１０２４−ＩＴＣキレート（Perkin Elmer, AD0013）は、少なくとも１つの脂肪族第１アミン（Ｎ末端又はリジン残基）を有するタンパク質をユーロピウムで共有結合で標識するために最適化されている。さらに、ＣｙＤｙｅ  Ｃｙ５  ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ  ｐａｃｋ（Amersham, Product Code PA23500）は、タンパク質上のアミン基をＣｙ５で共有結合で標識するために利用できる。他の化学物質を利用して、アミノ基（ＮＨＳエステル色素を使用）、チオール基（マレイミド色素を使用）、又は、アルデヒド基（ヒドラジド色素を使用）を用いて標識することができる
。
【００３５】
受容体タンパク質及びコンジュゲートが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）フルオロフォア対のそれぞれ一のメンバーで標識された場合、受容体タンパク質とコンジュゲートの結合によって励起光によりドナーフルオロフォアを励起したときに２つのフルオロフォアが互いに十分近位な範囲内となり、蛍光エネルギー移動が生じる。このような事象は、ドナーフルオロフォア発光の減少、又はアクセプターフルオロフォア発光の増加を検出することで測定することができる。遊離状態の薬物の存在下では、蛍光共鳴エネルギー移動は、標識された受容体上の限られた数の結合部位についての遊離薬物と標識コンジュゲートの競合によって抑制される。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、蛍光偏光受容体法及び検査キットは、蛍光偏光の原理を利用した免疫抑制剤検出のための即時使用可能な液体試薬を含む。このアッセイフォーマットでは、免疫抑制剤がフルオロフォアでタグを付けられるか又は標識されている。そして、対応するイムノフィリン受容体がバッファ系内で調合される。薬物−フルオロフォアをもつ免疫抑制剤とサンプル中のあらゆる遊離状態の免疫抑制剤との間で、反応液中で限られた量の対応する特異的なイムノフィリンへの結合について競合反応が起こる。
【００３７】
蛍光分子、すなわちフルオロフォアが、適切な波長（励起波長）の光で照射されると、長波長（発光波長）でその光の一部が放射される。放射された光が偏光されているか否かは、溶液中で回転するフルオロフォアの自由度に依存する。フルオレセインのような小さな分子は、光放射が起こる以前に急速に回転することができ、その結果、放射光の脱分極をもたらす。一方、イムノフィリンに結合したフルオレセイン標識免疫抑制剤のような蛍光高分子は、よりゆっくりと回転する。それ故、励起から放射の時間枠内で前記高分子はほんの僅かだけ回転し、その放射光は偏光となる。蛍光偏光は、薬物濃度の再生可能な機能であり、サンプル中の薬物濃度の定量的測定に適している。したがって、このアッセイフォーマットにおいて、サンプル中の免疫抑制剤のレベルが増加したとき、蛍光偏光の量は減少する。
【００３８】
本発明において、サンプルは、免疫抑制剤を含むと考えられるあらゆる水性サンプルでありうる。一実施形態において、サンプルは、血液、血漿、血清、尿、精液、脳脊髄液、唾液等液を含む、患者から分離された生体液である。一実施形態において、サンプルは、全血である。一実施形態において、血液サンプルは、細胞に結合した免疫抑制剤を遊離させるためにアッセイ試薬と接触させる前に前処理される。より具体的には、一実施形態において、血液サンプルは、メタノール及び水性硫酸亜鉛を含む溶液で抽出され、細胞残屑は、サンプルを検出試薬と混合する前に除かれる。
【００３９】
全血をサンプルとして使用し、かつアッセイが微粒子凝集検出方法に基づく場合、血液サンプルは、通常、サンプルとアッセイ試薬とを接触させる前に、細胞に結合した薬物を遊離させるために前処理される。この手順は、全血サンプルと沈殿剤とを混合することを含む。沈殿剤は、当該分野で公知のものから選択され、それには、例えば、メタノール、エタノール、エチレングリコール、アセトニトリル又は同様の水混和性有機溶媒に溶解した水性の硫酸銅又は硫酸亜鉛が含まれる。その後、全血混合物を十分に混合し、遠心する。続いて、上澄をサンプルカップに移し、アッセイを実行するため分析器に置く。一実施形態において、全血サンプルを前処理するために用いる組成物は、メタノールと硫酸亜鉛を含む。サンプルを前処理した後、細胞残屑がアッセイ試薬を加える前に除去される。一実施形態において、細胞残屑は、低速（およそ１２，０００ｒｐｍ）での５分間の遠心によって除去される。一実施形態においては、検出粒子がナノシェルであり、かつ血液サンプルがアッセイ試薬の添加前に前処理されない凝集アッセイ法を、免疫抑制剤を検出するために用いる。
【００４０】
一実施形態によれば、溶液中に存在する免疫抑制剤の量を定量する方法は、サンプルを免疫抑制剤コンジュゲート及び標的免疫抑制剤に特異的なイムノフィリンと混合することを含む。一実施形態において、コンジュゲートは、高分子担体に結合した標的免疫抑制剤（又は免疫抑制剤類似物）を含み、イムノフィリンは、検出粒子に結合されており、ここで、サンプル中に存在する免疫抑制剤とコンジュゲートは、イムノフィリンとの結合について競合する。その後、イムノフィリンに結合したコンジュゲートの量を、懸濁液中に生じた凝集の量を検出することによって直接測定する。続いて、検出された凝集量を、サンプル中に存在する免疫抑制剤の量と相関させる。一実施形態において、高分子担体はアミノデキストランであり、検出粒子は微粒子又はナノシェルである。
【００４１】
一実施形態によれば、受容体タンパク質は、リガンド又はタグのいずれかに相当して検出粒子又は他の検出部分を受容体タンパク質と連結するのに使用されるペプチド配列を含む組換え融合タンパク質として発現される。一実施形態において、融合タンパク質は、ビオチン分子の付着に最適な部位を提供する。この実施形態において、ストレプトアビジン又はアビジンで標識された検出粒子は、検出粒子を受容体タンパク質に結合させるのに用いられる。例えば、受容体タンパク質は、ビオチン化シグナル配列の融合パートナーを含む組換えタンパク質とすることができる。この融合タンパク質は、大腸菌内で、又は無細胞系内で、ビオチンリガーゼ（例えば、ＡｖｉＴａｇ）と共に共発現される。このビオチンリガーゼは、シグナル配列中のリジン残基にビオチン部分を共有結合で付加するのを触媒する。一実施形態において、このアッセイで使用される受容体タンパク質は、ＡｖｉＴａｇでビオチン標識されたタンパク質であって、ＡｖｉＴａｇが付加される配列は、Ｃ末端又はＮ末端のいずれかに付着されている。
【００４２】
本明細書で記載された方法を使用して、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、及びエベロリムスからなる群より選択される免疫抑制剤を、これらの薬剤に特異的な受容体タンパク質を用いて検出することができる。一実施形態において、凝集アッセイ試薬が、サンプル中のラパマイシン又はエベロリムスの量を定量するために提供される。この実施形態において、タンパク質受容体は、検出粒子に結合されたラパマイシン特異的ＦＫＢＰを含む。ラパマイシン特異的ＦＫＢＰは、標準的方法（共有結合、受動的結合、又はビオチン／（ストレプト）アビジンのような二次的結合相互作用を介する方法など）を用いて検出粒子に結合される。一実施形態において、検出粒子は微粒子であり、さらなる実施形態においては、検出粒子は、ビオチン−ストレプトアビジン又はビオチン−アビジン連結を介してイムノフィリンと結合する。ストレプトアビジン微粒子は、購入することもできるし、あるいは活性化微粒子とある量のストレプトアビジンとの反応を用いることによって調製することもできる。一実施形態によれば、ラパマイシン特異的ＦＫＢＰは、ＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５Ｃからなる群より選択される。アミノデキストラン（ＡＤ）又は別の高分子担体（すなわち、ペプチド、タンパク質、及び他の多糖）と結合したラパマイシンを含むコンジュゲートが、他のアッセイ試薬として用いられる。典型的なアミノデキストランコンジュゲートを図１に示す。図２、３及び４は、ラパマイシンのアミノデキストランコンジュゲートの合成を説明している。ラパマイシンのＣ−４０位におけるヒドロキシル基を、ピリジンに溶解したｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを用いて活性化した。その生成物をジメチルアミノピリジンの存在下でＤＭＳＯ中でアミノデキストランと結合させた。図２は、Ｃ−４０位でウレタン結合を介したアミノデキストラン−ラパマイシンコンジュゲートの合成を説明している。アミノデキストラン−ラパマイシンコンジュゲートは、ラパマイシンとアミノデキストランとの間にリンカーを用いて作製することもできる（図３）。免疫抑制剤をアミノデキストラン分子から分離するのに親水性ＰＥＧリンカーを用いることによって、より高い感度が予測される（図４）。あるいは、ラパマイシン二量体（ラパマイシン−Ｌ−ラパマイシン、Ｌはリンカー）又は他の適当なラパマイシン多量体をラパマイシン−アミノデキストランと置換することができる（図５）。粒子凝集がコンジュゲートの存在下で生じ、サンプル中に存在する遊離状態のラパマイシンによって抑制される。
【００４３】
１つの典型的なアッセイフォーマットにおいて、ＦＫＢＰ２５を、共有結合でポリスチレン微粒子に結合した。ＦＫＢＰ２５の共有結合は、まず、カルボキシ基で修飾した微粒子を活性化剤（例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳ：１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を用いて活性化し、続いてＦＫＢＰ２５との反応によって行った。この粒子は、ラパマイシン−アミノデキストランコンジュゲートの存在下で凝集した。凝集は、分析対象のサンプル中に存在する遊離ラパマイシンの存在下で抑制される。ラパマイシンアッセイは、０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲で達成された（図７参照）。
【００４４】
親水性リンカーを共有結合によって粒子に連結し、その後ＦＫＢＰ２５と結合することもできる。この設計は、ポリスチレン微粒子上に共有結合で連結されている一方で、十分なタンパク質活性を保持しているだけでなく、アッセイにおいてもより良好な感度を実現する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、親水性スペーサーとして利用され、非特異的結合を低減することが文献で知られている。
【００４５】
上述したように、微粒子へのタンパク質の付着は、ストレプトアビジン微粒子及びビオチン標識された受容体タンパク質を使用しても達成することができる。ＦＫＢＰ２５は、化学的に、モノビオチン化することができ、また、それを用いてストレプトアビジン微粒子と反応させることができる。ＦＫＢＰ２５のモノビオチン化は、ビオチンマレイミド又はビオチンＮＨＳエステルを等量で適量用いて達成することができる。
【００４６】
他のアッセイフォーマットにおいて、ラパマイシンは、共有結合で微粒子に結合している。これは、まず、ラパマイシンの活性化エステルとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との反応と、続くカルボキシ基で修飾された微粒子へのＢＳＡの共有結合による付着によって達成される。また、ラパマイシン−微粒子試薬を提供するために、ラパマイシンのビオチン化（図６）及びストレプトアビジン微粒子との反応によって達成することもできる。
【００４７】
他の実施形態においては、凝集アッセイ試薬をサンプル中のタクロリムスの量を定量するために提供する。この実施形態において、タンパク質受容体は、検出粒子に結合したタクロリムス特異的ＦＫＢＰを含む。より具体的には、一実施形態において、タクロリムス特異的ＦＫＢＰは、タクロリムスに選択性を有するように改変されたＦＫＢＰ１２変異体（M.T. DeCenzo et al, Protein Engineering 9, 173-180, 1996参照）を含む。他の実施形態において、タクロリムス特異的ＦＫＢＰは、ＦＫＢＰ１４である。タクロリムス特異的ＦＫＢＰは、標準的方法（共有結合、受動的結合、又はビオチン／（ストレプト）アビジンのような二次的結合相互作用を介する方法など）を用いて検出粒子に結合される。一実施形態において、検出粒子は微粒子であり、またさらなる実施形態において、検出粒子はビオチン−ストレプトアビジン又はビオチン−アビジン連結を介して受容体タンパク質に結合されている。アミノデキストラン（ＡＤ）又は別の高分子担体（すなわち、ペプチド、タンパク質、及び他の多糖）に結合されたタクロリムスを含むコンジュゲートが、他のアッセイ試薬として用いられる。アミノデキストラン−タクロリムスコンジュゲートは、タクロリムスとアミノデキストランとの間に親水性リンカーを用いて作ることもできる。
【００４８】
本発明は、親薬物に対する選択性を強化した受容体変異体の作製をも意図している。一実施形態によれば、ＦＫＢＰ１２ペプチド変異体を、ラパマイシンの親薬物に対するアッセイの特異性を強化するために部位特異的変異誘発を用いて作製する。ラパマイシンの親薬物に対する受容体複合体の特異性を強化するために受容体タンパク質を変異させるという概念は、本明細書で開示されたいずれの受容体タンパク質にも適用することができる。したがって、免疫抑制剤タクロリムスを検出するために、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）変異体が用いられ、免疫抑制剤シクロスポリンについては、シクロフィリン変異体が用いられる。
【００４９】
結晶構造の刊行物を、突然変異誘発の研究補助として使用することができる。変異体結合タンパク質は、当該分野で周知の組換え方法を用いて作製することができ、また、当該分野で周知の方法を用いてその精製を容易にするために組換え方法によって付加されるアフィニティータグを有していてもよい。したがって、以下の表を参照して、以下のアミノ酸残基（すなわち、ＦＫＢＰ１２の５４位のグルタミン酸、及び８７位のヒスチジン）を修飾し、ラパマイシン受容体タンパク質の特異性を強化できることが期待される。
【００５０】
以下の表は、ラパマイシン代謝産物とＦＫＢＰ１２間で測定されたＣ−Ｃ距離を示す。ＲＣＳＢ  ＰＤＢ（タンパク質データベース）で公開された結晶構造ｌｆａｐを用いてラパマイシン代謝産物のＣ−Ｃ距離を測定した。
【表１】
2009507234.tif 000003
【００５１】
他の実施形態によれば、サンプル中の免疫抑制剤の存在又は量を決定する方法が提供される。この方法では、検出試薬は、免疫抑制剤に特異的なタンパク質受容体、及び検出粒子に結合した免疫抑制剤を含むコンジュゲートを含む。この実施形態では、タンパク質受容体が、多量体型（例えば、受容体タンパク質の二量体型）である。アッセイ試薬は、サンプルと混合され、コンジュゲートと免疫抑制剤が受容体結合部位への結合について競合する懸濁液を形成する。通常、２つの試薬（すなわち、タンパク質受容体とコンジュゲート）は、別々の成分としてサンプルに加えられる。しかしながら、一実施形態において、２つの試薬は単一組成物として添加される。前記懸濁液中で受容体タンパク質に結合したコンジュゲートの量を直接測定することによって（凝集を測定することによって検出されるように）、サンプル中の標的免疫抑制剤の濃度を決定することができる。一実施形態において、検出粒子は、微粒子又はナノシェルであり、また一実施形態において、検出粒子は、ポリスチレンラテックス微粒子である。さらなる実施形態において、サンプルは、免疫抑制剤を投与されている患者から採取される血液サンプルである。ここで、血液サンプルは、メタノールと水性硫化亜鉛を含む溶液で抽出され、細胞残屑は、サンプルをアッセイ試薬と混合する前に除去される。さらなる実施形態において、検出対象の免疫抑制剤は、ラパマイシンであり、イムノフィリンは、ＦＫＢＰ２５の二量体又はより高次の多量体である。他の実施形態において、検出対象の免疫抑制剤は、タクロリムスであり、イムノフィリンは、タクロリムス特異的ＦＫＢＰ１２変異体又はＦＫＢＰ１４の二量体若しくはより高次の多量体である。受容体タンパク質二量体及び多量体複合体は、個々の受容体タンパク質を当業者に公知の標準的なリンカーを用いて種々の長さのリンカーで互いに連結することによって形成することができる。
【００５２】
本発明は、サンプル中の免疫抑制剤を測定するためのアッセイ試薬を含む検査キットも包含する。キットは、さらに、様々な容器（例えば、バイアル、チューブ、ボトル等）を含んでいてもよい。キットは、使用説明書も含んでいることが好ましい。一実施形態において、キットは、標的免疫抑制剤に特異的なタンパク質受容体、及びコンジュゲートを含んでいる。このキットでは、タンパク質受容体が検出粒子に結合しており、またコンジュゲートは多量体型の標的免疫抑制剤を含んでいる。より具体的には、一実施形態において、多量体型の免疫抑制剤は、高分子担体に結合したその薬剤の二量体又は複数の薬剤化合物である。別の実施形態において、キットは、標的免疫抑制剤に特異的なタンパク質受容体、及びコンジュゲート種を含む。このキットでは、タンパク質受容体は、二量体又はより高次の多量体として提供され、コンジュゲートは、検出粒子に結合した標的免疫抑制剤を含んでいる。一実施形態において、ラパマイシンに特異的なタンパク質受容体、及びコンジュゲート種を含むラパマイシン検出用キットが提供される。このキットでは、タンパク質受容体は、検出粒子に結合されており、またコンジュゲートは、高分子担体に結合したラパマイシンを含んでいる。より具体的には、一実施形態において、ラパマイシン特異的なタンパク質受容体は、ＦＫＢＰ２５及びＦＫＢＰ２５Ｃからなる群より選択される。他の実施形態において、ラパマイシン特異的なタンパク質受容体は、ＦＫＢＰ２５である。他の実施形態において、タクロリムスに特異的なタンパク質受容体及びコンジュゲート種を含むタクロリムス検出用キットが提供される。このキットでは、タンパク質受容体は検出粒子に結合されており、またコンジュゲートは高分子担体に結合したタクロリムスを含んでいる。より具体的には、一実施形態において、タクロリムス特異的なタンパク質受容体は、ＦＫＢＰ１４である。
【００５３】
本発明をより容易に理解できるように、以下に実施例を挙げて説明する。以下の実施例は、本発明を説明することを目的としており、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５４】
＜ラパマイシン４０−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（１）の調製＞
１００ｍｇ（０．１０９ｍｍｏｌ）のラパマイシンに２．５ｍＬの新たに蒸留したジクロロメタン（ＣａＨ２を通して蒸留されたもの）、３３μＬ（０．４０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン、及び３３ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを−７８℃で加えた。反応混合物を−７８℃で１時間、その後室温にて１時間攪拌した。５０ｍｌの水を用いて室温で反応を止めた。生じた混合物を４×５０ｍｌのジクロロメタンで抽出した。有機部分を（無水Ｎａ２ＳＯ４）乾燥して濃縮した。残渣を０．１％トリフルオロ酢酸を含む水及びアセトニトリルの勾配管を用いて分取ＨＰＬＣで精製した。生成物を含んだ分画を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレータ内で濃縮した。その後、凍結乾燥して８２ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ、６９％）のラパマイシンｐ−ニトロフェニルカーボネート（１）を白色固体として得た（LC-MS: M+H 1101.5）。
【実施例２】
【００５５】
＜４０−Ｏ−ウレタン結合ラパマイシン−アミノデキストランコンジュゲート（２）の調製＞
５０ｍｇ（１．２５×１０−３ｍｍｏｌ）のアミノデキストラン（４０，０００）（米国特許第６，６５３，４５６号に記載のように調製）に２ｍＬの無水ＤＭＳＯを加えた。混合物を５分間室温で攪拌した。反応混合物に１０．７ｍｇ（０．０８７ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンを、続いて０．５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した２０ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）のラパマイシンｐ−ニトロフェニルカーボネートの溶液を添加した。室温で２日間攪拌して反応を行った。生じた黄色溶液をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ透析チューブ（分子量カットオフ２０００）に入れ、脱イオン水に溶解した９０％ＤＭＳＯ（２×３時間）、脱イオン水に溶解した７０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した５０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した３０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、及び脱イオン水に溶解した１０％ＤＭＳＯ（１×３時間）で透析した。続いて、これを脱イオン水で透析し（６×６時間）、得られた溶液を凍結乾燥して、３９ｍｇのラパマイシン−アミノデキストランコンジュゲート（２）を白色固体として得た。アミノデキストランへのラパマイシン誘導体の組み込みをＵＶ光２８０ｎｍ（ε＝５６，５２２）で測定したところ、アミノデキストラン分子あたり３．８モルのラパマイシンが組み込まれた。
【実施例３】
【００５６】
＜ラパマイシン４０−Ｏ−グルタレートＮＨＳエステル（３）の調製＞
４ｍＬのジクロロメタン（新たにＣａＨ２を通して蒸留されたもの）に溶解した１５０ｍｇ（０．１６４ｍｍｏｌ）のラパマイシンの溶液を−７８℃に冷却した。反応混合物に、６１ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のスクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリルクロリド、１５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジン、及び５０μＬのピリジンを加えた。スクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリルクロリド、すなわち、５−（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル−オキシ）−５−オキソ−ペンタノイルクロリドを、Ａｎｔｏｎｉａｎらの欧州特許第０５０３４５４号に従って調製した。生じた反応混合物を−７８℃で２時間攪拌した。粗製反応混合物のＬＣ−ＭＳは、不完全な反応を示した。反応混合物に、さらに６１ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のスクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリルクロリドと５０μＬ（０．６０ｍｍｏｌ）のピリジンを−７８℃で添加した。得られた反応混合物を−７８℃で２時間攪拌し、その後、５０ｍｌの水で反応を止めた。水層を５×５０ｍＬのジクロロメタンで抽出し、有機層と合わせ、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）した後、減圧下で濃縮した。生じた無色油を５ｍｌの４：１アセトニトリル：水に溶解し、分取ＲＰ  ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水とアセトニトリルから成る溶媒系で勾配管を用いて精製した。生成物を含む分画を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレータで濃縮した。そして凍結乾燥して７０ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ，３８％）のラパマイシンＮＳＨエステル（３）を白色固体として得た（LR-ES; M+Na 1147.2）。
【実施例４】
【００５７】
＜４０−Ｏ−グルタリルラパマイシンアミノデキストランコンジュゲート（４）の調製＞
５０ｍｇ（２．５×１０−５ｍｍｏｌ）のアミノデキストラン（４０，０００）、及び７．５ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンに２ｍＬの無水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を加え、室温で１５分間攪拌した。反応混合物に、１ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した２０ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のラパマイシン４０−Ｏ−グルタレートＮＨＳエステル（３）を滴下し、反応混合物を室温で２日間攪拌した。生じた反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ透析チューブ（分子量カットオフ２０００）に入れ、脱イオン水に溶解した９０％ＤＭＳＯ（２×３時間）、脱イオン水に溶解した７０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した５０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した３０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、及び脱イオン水に溶解した１０％ＤＭＳＯ（１×３時間）で透析した。続いて、これを脱イオン水で透析し（６×６時間）、得られた溶液を凍結乾燥して、４９ｍｇのアミノデキストランコンジュゲート（４）を白色固体として得た。アミノデキストランへのラパマイシン誘導体の組み込みをＵＶ光２８０ｎｍ（ε＝５６，５２２）で測定したところ、アミノデキストラン分子あたり５．４モルのラパマイシンが組み込まれた。
【実施例５】
【００５８】
＜Ｎ−スクシニル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ−トリチル（６）の調製＞
３ｍＬの新たに蒸留したジクロロメタンに溶解した１００ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）のＮ−トリチル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカン−ジアミン（Ｔｒｔ−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ２；NOVA Biochem）（５）の溶液に、３５μＬ（０．４２ｍｍｏｌ）のピリジン、１３．２ｍｇ（０．１０８ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジン及び３２．４ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）の無水コハク酸を加えた。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、濃縮した。残渣を分取ＲＰ  ＨＰＬＣでアセトニトリルと水から成る勾配を用いて精製した。所望の生成物を含む分画を混ぜ合わせた後、凍結乾燥し、１１９ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ，９９％）のＮ−スクシニル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ−トリチル（６）を無色油として得た（LC-MS: M+H 563.3）。
【実施例６】
【００５９】
＜トリチル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（７）の調製＞
１１５ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）のＮ−スクシニル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ−トリチル（６）に、５ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦ及び１１４μＬ（０．６４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び１９２ｍｇ（０．６３ｍｍｏｌ）のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトエラフルオロボレートを加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌し、濃縮した。残渣に１５ｍＬの水を加え、水性反応混合物を２×１５ｍＬのジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせて、２×１５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液、続いて１×１５ｍＬの水で洗浄した。有機層を乾燥させ（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、９０ｍｇ（０．１３６ｍｍｏｌ、６７％）のトリチル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（７）を無色油として得た。これを、さらに精製をすることなく直ちに次のステップで用いた（LC-MS: M+H 660.3）。
【実施例７】
【００６０】
＜トリチル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲート（８）の調製＞
２００ｍｇ（５×１０−３ｍｍｏｌ）のアミノデキストラン（４０，０００）に、１０ｍＬのＤＭＳＯを加え、室温で攪拌して溶解した。そして、２８０μＬ（１．９ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。反応混合物に、５ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した９０ｍｇ（０．１３６ｍｍｏｌ）のトリチル−ＮＨ（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（７）の溶液を加え、生じた反応混合物を室温で３日間攪拌した。得られた反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ透析チューブ（分子量カットオフ２０００）に入れ、脱イオン水に溶解した９０％ＤＭＳＯ（２×３時間）、脱イオン水に溶解した７０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した５０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した３０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、及び脱イオン水に溶解した１０％ＤＭＳＯ（１×３時間）で透析した。続いて、これを脱イオン水で透析し（６×６時間）、生じた溶液を凍結乾燥して、１８０ｍｇの白色固体を得た。アミノデキストランへのトリチルＰＥＧ誘導体の組み込みをＵＶ光２３０ｎｍ（ε＝２７２７）で測定したところ、アミノデキストラン分子あたり９．６モルのＴｒｉｔ−ＰＥＧが組み込まれた。
【実施例８】
【００６１】
＜アミノ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲート（９）の調製＞
１８０ｍｇのトリチル−ＮＨ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲート（８）に１０ｍＬのジクロロメタンを添加し、室温で１５分間攪拌した。この反応混合物に１０ｍＬのトリフルオロ酢酸を加え、室温で４５分間攪拌した。反応混合物を濃縮し、１０ｍＬのジクロロメタンを加えて、減圧下で濃縮した。ジクロロメタンの添加及び濃縮工程をさらに２回繰り返した。残渣に１０ｍＬの水を加え、生じた反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ透析チューブ（分子量カットオフ２０００）に入れ、脱イオン水に溶解した９０％ＤＭＳＯ（２×３時間）、脱イオン水に溶解した７０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した５０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した３０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した１０％ＤＭＳＯ（１×３時間）で透析した。続いて、これを脱イオン水で透析し（６×６時間）、生じた溶液を凍結乾燥して、１４０ｍｇのアミノ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲートトリフルオロ酢酸塩（９）を白色固体として得た。
【実施例９】
【００６２】
＜ラパマイシン−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲート（１０）の調製＞
５０ｍｇ（１．２５×１０−３ｍｍｏｌ）のアミノ−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲートトリフルオロ酢酸塩（９）に２ｍＬの無水ＤＭＳＯを加え、５分間攪拌して溶解させた。反応混合物に、７．６ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンを含む１ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した２０ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）のラパマイシンｐ−ニトロフェニルカーボネート（１）の溶液を加えて、室温で２日間攪拌した。得られた反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ透析チューブ（分子量カットオフ２０００）に入れ、脱イオン水に溶解した９０％ＤＭＳＯ（２×３時間）、脱イオン水に溶解した７０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した５０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、脱イオン水に溶解した３０％ＤＭＳＯ（１×３時間）、及び脱イオン水に溶解した１０％ＤＭＳＯ（１×３時間）で透析した。続いて、これを脱イオン水で透析し（６×６時間）、生じた溶液を凍結乾燥して、５２ｍｇのラパマイシン−（ＰＥＧ）２−Ｎ−スクシニル−アミノデキストランコンジュゲート（１０）を白色固体として得た。アミノデキストランへのラパマイシンの組み込みは、ＵＶ光２８０ｎｍ（ε＝５６，５２２）で測定したところ、アミノデキストラン分子あたり２．９モルのラパマイシンが組み込まれた。
【実施例１０】
【００６３】
＜ラパマイシンビオチンコンジュゲート（１１）の調製＞
２．５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した５９ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）のラパマイシン４０−Ｏ−グルタレートＮＨＳエステル（３）に、３０ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）のＥＺ連結５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、続いて１０ｍｇ（０．０８１ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジン及び２３μＬ（０．２７ｍｍｏｌ）の無水ピリジン加えた。得られた反応混合物を室温で２時間攪拌して、濃縮した。残渣を分取ＲＰ  ＨＰＬＣで０．１％トリフルオロ酢酸を含む水とアセトニトリルから成る勾配を用いて精製した。所望の生成物を含む分画を濃縮して凍結乾燥し、２３ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ、３３％）のラパマイシンビオチンコンジュゲート（１１）を白色固体として得た（LC-MS: M+Na 1361.7）。
【実施例１１】
【００６４】
＜ラパマイシン二量体（１２）の調製＞
６ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦに溶解した２．０ｍｇのｐ−キシレンジアミンのストック溶液を調製した。混合物を１０分間室温で攪拌した後、２０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを添加した。別のフラスコで５ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦに溶解した３０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）のラパマイシン４０−Ｏ−グルタレートＮＨＳエステル（３）の溶液を調製した。反応混合物に、２．５ｍＬのｐ−キシレンジアミン（６．１×１０−３ｍｍｏｌ）／４−ジメチルアミノピリジン（０．０６８ｍｍｏｌ）ストック溶液を４℃で加え、反応混合物を４℃で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、分取薄層クロマトグラフィーにより、溶離液として酢酸エチルを用いて精製し、２０ｍｇ（９．２７×１０−３ｍｍｏｌ、３５％）のラパマイシン二量体（１２）を白色固体として得た（HR-MS (+) C120H178N4O30 [M+2Na]2+ 計算値1100.6155; 実測値1100.6151）。
【実施例１２】
【００６５】
＜ＦＫＢＰ２５微粒子の調製＞
０．２１６ｍＥｑ／ｇのカルボキシル含有量を有する１０％カルボキシル基修飾ポリスチレン微粒子（０．３０２ｍｍ）（Seradyn, Indianapolis）５ｍｌに、４５ｍＬの脱イオン水を加えた。これを１４，０００ｒｐｍにて４℃で４５分間遠心し、上清を注ぎ除いた。これを５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．３）に再懸濁し、遠心した。この工程を２回繰り返し、微粒子の濃度を１％（ｗ／ｖ）に調整した。濃度測定は、ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡアナライザ（Roche Diagnostics, Indianapolis）で行った。４５ｍＬの１％カルボキシル化微粒子調製物の懸濁液に、４５ｍＬの５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．３）に溶解した９３９ｍｇのＥＤＣ及び５６３ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液を室温で加えた。反応混合物を１８時間室温で攪拌した。反応混合物を遠心チューブに注ぎ、１４，０００ｒｐｍで４℃にて４５分間遠心した。固形物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）バッファに再懸濁し、上記のように遠心した。この工程を２回繰り返し、活性化微粒子調製物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）中１％（ｗ／ｖ）の濃度に調整した。
【００６６】
５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ（ｐＨ７．９）に懸濁した１％活性化微粒子調製物８ｍｌに４ｍＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ中に溶解した１ｍｇのＦＫＢＰ２５溶液を室温で一度に全量加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌し、反応混合物を５ｍＬの１Ｍ水性エタノールアミン（ｐＨ９）でクエンチさせた。反応物を室温で１８時間攪拌した。これを遠心チューブに移し、１４，０００ｒｐｍで４℃にて４５分間遠心した。固形物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）バッファに再懸濁し、上記のように遠心した。この工程を２回繰り返し、活性化微粒子調製物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）中０．１４％（ｗ／ｖ）の濃度に調整した。総計３８ｍＬの０．１４％（ｗ／ｖ）ＦＫＢＰ２５微粒子調製物が得られた。このＦＫＢＰ２５微粒子調製物を以下の実施例１４で記載したようにラパマイシンアッセイの開発におけるＲ２試薬として用いた。
【実施例１３】
【００６７】
＜ＰＥＧ修飾ＦＫＢＰ２５微粒子の調製＞
５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ（ｐＨ７．９）に懸濁した１％（ｗ／ｖ）活性化微粒子（実施例１２に記載したように調製されたもの）１０ｍｌに、ｐＨ９で５０ｍＭリン酸カルシウム溶液中の２１ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）のｄＰＥＧ８（Quanta Biodesign）の１０ｍＬ溶液を加えた。反応混合物を室温で１８時間攪拌した。これを遠心チューブに移し、１４，０００ｒｐｍで４℃にて４５分間遠心した。固形物を５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．３）バッファに再懸濁し、上記のように遠心した。この工程を２回繰り返し、ＰＥＧ修飾微粒子調製物を５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．３）中０．９％（ｗ／ｖ）の濃度に調整した。０．９％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ修飾微粒子調製物が総計１０ｍＬ得られた。
【００６８】
上記の全てに、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ（ｐＨ６．３）に溶解した１８７ｍｇのＥＤＣと１１２ｍｇのＮＨＳの１０ｍＬの溶液を加えた。反応混合物を室温で１８時間攪拌した。反応混合物を遠心チューブに注ぎ、１４，００００ｒｐｍで４℃にて４５分間遠心した。固形物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）バッファに再懸濁し、上記のように遠心した。この工程を２回繰り返し、活性化微粒子を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）中０．８８％（ｗ／ｖ）の濃度に調整した。５０ｍＭ  ＭＰＯＳバッファ（ｐＨ７．９）中０．８８％（ｗ／ｖ）の濃度の活性化ＰＥＧ結合微粒子調製物が総計で１０ｍＬ得られた。
【００６９】
４ｍＬの０．８８％（ｗ／ｖ）活性化ＰＥＧ−微粒子に、２ｍＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）に溶解した４２４μｇのＦＫＢＰ２５の溶液を加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌し、反応を５ｍＬの１Ｍエタノールアミン（ｐＨ９）で止めた。これを遠心チューブに注ぎ、１４，０００ｒｐｍで４℃にて４５分間遠心した。固形物を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）バッファに再懸濁し、上記のように遠心した。この工程を２回繰り返し、活性化微粒子を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）中０．１４％（ｗ／ｖ）の濃度に調整した。０．１４％（ｗ／ｖ）のＦＫＢＰ２５−ＰＥＧ微粒子調製物が総計１６ｍＬ得られた。このＦＫＢＰ２５−ＰＥＧ微粒子調製物をラパマイシンアッセイの開発でＲ２試薬として使用した。
【実施例１４】
【００７０】
＜ＦＫＢＰ２５微粒子及びラパマイシン−アミノデキストランに関する用量反応曲線（ラパマイシン用アッセイ）＞
第１標準試薬（Ｒ１試薬）は、１７５ｍＭ  ＰＩＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）を作製することによって調製された。これに、ラパマイシン−アミノデキストランコンジュゲートを４００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように加えた。また、これに、ポリアクリル酸を１．３％の濃度となるように添加した。
【００７１】
第２標準試薬（Ｒ２試薬）については、実施例１２で記載したように調製し、ｐＨ７．９の５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファに懸濁して最終濃度０．１４％（ｗ／ｖ）で使用した。
【００７２】
ラパマイシンのストック溶液は、ＤＭＳＯ（１００μｇ／ｍＬ）に溶解して作製された。較正溶液は、ストックから０．９％の食塩水に溶解した５０、１００及び２００ｎｇ／ｍＬのラパマイシン溶液を作製することによって調製された。
【００７３】
アッセイは、Ｈｉｔａｃｈｉ９１７自動アナライザ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis）を使用し、３５μＬのサンプル容量、１８０μＬの第１標準試薬及び８０μＬの第２標準試薬を用いて（ＯＤ８００ｎｍで測定）行われた。その結果を図７に示す。
【００７４】
次に、既知量のタクロリムスを上記のようにアッセイした。得られたラパマイシン曲線からの測定値とアッセイしたサンプル中のタクロリムスの実際の量とを比較することによって、タクロリムス交差反応性が、このアッセイでは７％であることが決定された。つまり、１０００ｎｇ／ｍｌのタクロリムスを含むサンプルは、７０ｎｇ／ｍｌのラパマイシンの曲線から読み取れる。それ故、交差反応性は、（７０／１０００）×１００％＝７％である。
【００７５】
本発明を詳細に、かつ特定の実施形態に関して説明したが、これらは、添付の特許請求の範囲で明示した本発明の範囲を逸脱しない範囲で、修飾及び変化することができることは明らかである。特に、本明細書では本発明のいくつかの態様を好ましい又は特に有利なものとしているが、本発明は、必ずしもこれらの好ましい態様に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
前述した本発明の実施形態における詳細な説明は、以下の図によって一層よく理解できる。
【図１】本発明の代表的なアミノデキストランコンジュゲートを説明する図である。
【図２】ウレタン結合型ラパマイシンアミノデキストランコンジュゲートの調製を説明する図である。
【図３】エステル結合型ラパマイシンアミノデキストランコンジュゲートの調製を説明する図である。
【図４】ＰＥＧリンカーを用いたラパマイシンアミノデキストランコンジュゲートの調製を説明する図である。
【図５】ラパマイシン二量体の調製を説明する図である。
【図６】ラパマイシンビオチンの調製を説明する図である。
【図７】実施例１４に記載の用量反応曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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