(57)【要約】  本発明は、液体中に懸濁された粒子を、原則として一つずつ、開口を通過させて、たとえばコールターカウントによりその粒子を特徴づけできるようにした粒子特徴づけ装置に関する。特に、本発明は、混合チャンバと収集チャンバの間の粒子の通過のための開口を含む壁により分離され混合部材を含む混合チャンバおよび収集チャンバ、開口を通る電流の伝導のための混合チャンバ内の第一電極と収集チャンバ内の第二電極、装置の測定シーケンスを制御すること、閉塞の検出において閉塞する粒子により引き起こされる電気パルスの延伸期間を検出することにより開口にありうる閉塞を検出すること、閉塞する粒子の除去のために混合チャンバ内で混合する間に液体を逆流させ粒子の計数を再開すること、に適合されるプロセッサーを備えたハウジングを備え、液体試料中に懸濁された粒子を特徴づけるための装置に関する。実験により、開口を閉塞する粒子のほとんどが、本発明による装置で除去されることが示されている。不成功測定の７５％の減少を実現した。【選択図】図１
2009509148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合チャンバと収集チャンバの間の粒子の通過のための開口を含む壁により分離され、混合部材を含む混合チャンバおよび収集チャンバ、
開口を通る電流の伝導のための混合チャンバ内の第一電極と収集チャンバ内の第二電極、
装置の測定シーケンスを制御するために適合されるプロセッサー
を備えたハウジングを備え、液体試料中に懸濁された粒子を特徴づけるための装置であって、
前記プロセッサーは、閉塞する粒子により引き起こされる電気パルスの延伸期間を検出することにより開口にありうる閉塞を検出し、
閉塞を検出すると、閉塞する粒子の除去のために混合チャンバ内で混合しながら液体を逆流させ、
粒子の計数を再開させることを特徴とする装置。
【請求項２】
混合部材が磁石である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記混合チャンバ、混合部材、収集チャンバ、電極、および開口を有するカートリッジと、前記カートリッジを離脱可能に受入れるドッキングステーションとを備え、ドッキングステーションは、
プロセッサーと、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられるとき電極に作動的に接続するコネクタと、
を含む請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
カートリッジが、開口を通る液体の流れを引き起こすために、収集チャンバに連通するポートをさらに含み、そして、
ドッキングステーションが、開口を通る液体の流れを引き起こす圧力を印加するために、  カートリッジがドッキングステーションに入れられたとき、カートリッジのポートと気体接続を形成するためのポートをさらに備える、
請求項３に記載した装置。
【請求項５】
プロセッサーが、電極信号の差分の計算および、計算値としきい値の比較により、オリフィスの閉塞を検出するようにさらに適合された
請求項１から４のいずれか１つに記載した装置。
【請求項６】
混合チャンバと収集チャンバの間の粒子の通路となる開口を含む壁により分けられた混合チャンバおよび収集チャンバを備えるハウジングを備え、液体試料中に懸濁された粒子を特徴づける装置の操作方法であって、
閉塞する粒子により引き起こされる電気パルスの延伸期間を検出することにより開口にありうる閉塞を検出し、
混合チャンバ内で混合し、
閉塞する粒子を取り除くために液体を逆流させ、そして、
粒子の計数を再開する、
ステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中に懸濁された粒子が、原則として一つずつ、オリフィス（開口（aperture）と呼ぶ）を通過させて、たとえばコールターカウントによりその粒子が特徴づけされるようにした粒子特徴づけ装置に関する。
【０００２】
電解液中に懸濁された粒子が、小さな開口を通り抜ける間に、コールターサイジング（sizing）（非特許文献１を参照）として広く知られる電気インピーダンス技術を使うことにより、サイズ、濃度、および導電率に関して特徴づけることができることはよく知られている。
【非特許文献１】ブイ・ケイチェル、「電気抵抗パルスサイジング：コールターサイジング」、流れ血球計算と分類、第２版、ｐ．４５−８０、１９９０年、ウィリー・リス（V.Kachel, "Electrical Resistance Pulse Sizing: Coulter Sizing", Flow Cytometry and Sorting, Second Edition, pp.45-80, 1990 Wiley−Liss）
【０００３】
このインピーダンス原理による粒子の計数およびサイジングは、国際的に認められた方法であり、血球を計数する血液分析装置のほとんどで使われている。この方法は、電解液中の非導電性粒子により生じる電気インピーダンスにおける、測定可能な変化に基づく。「開口」または「オリフィス」と呼ばれる小さな穴が、２つの電気的に絶縁されたチャンバをつないでおり、これらチャンバには、電解液に接触するように電極が備えられている。この開口が電気経路を制限し、それによって、粒子が通過する感知区域が確立される。この感知区域において、それぞれの粒子が周囲の電解質の移動を引き起こすことになり、それによって、電流路の一部を妨害し、電圧パルスを引き起こす。この方法により、１秒当たり数千の粒子を高い精度で特徴づけることができる。
【０００４】
血液分析装置は、血球、たとえば血小板（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）の計数および識別に使用される。白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）は、３つの副次集団、すなわちリンパ球、単球、顆粒球に分けられる。これらの副次集団は、開口を通過する細胞のＤＣ電流に対する反応を記録することにより、細胞のサイズにより識別することができる。さらに、顆粒球もまた、３つの副次集団、すなわち好酸球、好塩基球、好中球に分けられる。これらの副次集団は、開口を通過する細胞のＲＦ電流に対する反応を記録することにより、細胞密度により識別することができる。
【０００５】
赤血球、白血球、それらの副次集団、および血小板の含有量の情報は、医師が異なる病気を診断し、治療を観察するために、重要な手段である。
【０００６】
開口のサイズに近いまたはそれを超えるサイズの大きな粒子は、開口を閉塞させ、測定を失敗させることもまたよく知られている。開口の閉塞（または詰まり）を除去する方法は、特許文献１に開示されており、そこでは、高い交流電流が、粒子（破片）を噴出除去（気体の噴出）するために使われている。
【特許文献１】米国特許第３，９６３，９８５号明細書（発明の概要）
【０００７】
本発明の目的は、開口の閉塞の検出およびその後の除去のための方法および装置を提供することである。
【０００８】
本発明の第１の観点によると、上記目的および他の目的が、液体試料中に懸濁された粒子を特徴づける装置を操作する方法により達成されるが、この装置は、混合チャンバおよび収集チャンバの間を粒子が通過するための開口を含む壁により分離された混合チャンバおよび収集チャンバを備えるハウジングを備え、上記操作方法は、
閉塞する粒子により引き起こされる電気パルスの延伸期間を検出することにより開口にありうる閉塞を検出するステップと、
混合チャンバ内で混合するステップと、
閉塞する粒子の除去のための液体を逆流させるステップと、
粒子の計数を再開するステップとを含む。
【０００９】
本発明の第２の観点によると、上記目的および他の目的が、液体試料中に懸濁された粒子を特徴づける装置によって達成されるが、
この装置は、混合チャンバおよび収集チャンバの間を粒子が通過するための開口を含む壁により分離された混合チャンバおよび収集チャンバであって、混合チャンバが混合部材をさらに含む混合チャンバおよび収集チャンバと、
開口部を通る電流の伝導のための、混合チャンバ内の第１電極および収集チャンバ内の第２電極と、
この装置の測定シーケンスを制御するように適合されたプロセッサーとを備えるハウジングを備え、
このプロセッサーが、
閉塞する粒子により引き起こされる電気パルスの延伸期間を検出することにより、開口にありうる閉塞を検出し、閉塞を検出した際に、
閉塞する粒子を除去するために、混合チャンバ内で混合を行いながら液体を逆流させ、
粒子の計数を再開するようにさらに適合されることを特徴とする。
【００１０】
上記混合部材は、磁石であってもよく、その場合、その混合部材は、混合チャンバ内の液体を攪拌するために外部から動く磁場により動かしてもよい。
【００１１】
もう一つの実施形態では、混合部材は、混合チャンバ内の液体を攪拌するために、混合部材に機械的に結合されたモーターにより駆動される。
【００１２】
さらにもう一つの実施形態では、混合は、泡、たとえば、混合チャンバ内の液体に吹き込まれた泡により行われる。
【００１３】
第１および第２の電極は、上記のコールターインピーダンス原理を利用して、粒子の特徴づけ、たとえば、血球の計数とサイジングを促進してもよい。
【００１４】
この電気インピーダンス技術によると、測定値から粒子の体積を解明することができる。開口に渡って一定の電流を維持することにより、開口部において電解質を移動させる粒子から記録される電圧パルスは、粒子の体積と比例した高さを持つことになる。これは、粒子が電解質に比べ非導電性と考えられるという事実のためである。開口の中心の電場（ＤＣまたはＲＦ）は均質であり、これは、開口の直径Ｄが開口の長さｌより小さく（ｌ／Ｄ＞１）、粒子の直径ｄが開口の直径に比べて小さいと考えられ（ｄ＜０．２＊Ｄ）、粒子が一度に１つだけ通過し、かつ、粒子が開口の長さに沿って開口を通過する場合の標準的な状況である。
【００１５】
普通、そのような装置は、開口を通る流れが収集チャンバに入るように操作される。
【００１６】
開口の長さは、１μｍから１０００μｍ、たとえば、約５０μｍであることが好ましい。開口の長さは、直径が０．１μｍから１００μｍの粒子を検出するときに、開口内に粒子が１つだけ存在するように選択するのが望ましい。しかし、開口における電場の均質性について検討すると、開口の直径より大きいまたは等しい開口の長さを要するかもしれない。２つの粒子が同時に計数される場合があるかもしれないが、この計数は、統計的推定を行うことにより数学的に修正できる。開口のアスペクト比（長さまたは深さ割る直径）は、好ましくは０．５：１から５：１、さらに好ましくは、１：１から３：１である。
【００１７】
開口の最も大きい断面の寸法は５μｍから２００μｍ、たとえば、１０μｍから５０μｍが好ましい。
【００１８】
本発明の好適な一実施形態において、開口を通る電流は粒子の計数の間、ほぼ一定に制御される。したがって、閉塞した開口の検出は、開口全体の電圧のモニタリングに基づいて行うことができる。粒子が開口に近づくのに伴って、すでに記載したとおり、電圧は増加し始めることになる。粒子が開口を通過していない場合は、電圧は最初のレベルにリセットされないことになる。電圧にそのような変化が検出された場合、それは粒子による閉塞を示しており、その閉塞を除去する方法が実行される。
【００１９】
もう一つの実施形態においては、上記の立ち上がり電圧パルスに対応する立ち下り電流パルスとして粒子が検出されえるように、開口の電圧がほぼ一定に制御される。
【００２０】
プロセッサーは、電極の信号、たとえば、第１および第２の電極が伝導する電流、または第１および第２の電極間の電圧の差分の計算を行い、しきい値とその計算値とを比較することにより、オリフィスの閉塞を検出するようにさらに適合される。計算値の絶対値がしきい値を超えた場合、閉塞が検出される。
【００２１】
閉塞を除去する方法は、流体力学の圧力と対流に基づく。開口における液体の逆流が、閉塞する粒子を押し戻すと考えられる。しかし、その後流れが前方に変化すると、その粒子が再び開口に掛止することがよくある。この粒子が再び開口に入るのを防止するために、混合、たとえば、対流による混合が始動される。磁石による攪拌の混合または類似した混合方法が、対流による混合を引き起こしえる。
【００２２】
実験により、開口を閉塞する粒子のほとんどが、本発明による方法により除去されることが示されている。本発明による方法を実行することにより、不成功測定の７５％の減少を実現した。
【００２３】
たとえば開口の閉塞を解消するための知られている噴出技術に比べ、電力消費が少ないことが、本発明の有利な点である。たとえば、本発明による方法は、電池式装置などの、電力供給が少ない小さな卓上用サイズの血液分析装置での利用に有効である。そのような装置の利用できる電力は限られているため、閉塞を除去するための知られている噴出技術はあまり適していない。しかし、本発明は、液体中に懸濁された粒子が通過するための開口を備えるどのようなタイプの装置においても、利用することができる。
【００２４】
特許文献２において、液体中に懸濁された粒子を特徴づけるための使い捨てカートリッジが開示されている。特に、単回使用分析、たとえば少量の全血の単回使用分析に用いる内臓型使い捨てカートリッジが開示されている。この内臓型使い捨てカートリッジは測定手順を単純にし、特別な教育を受けていなくても、ほとんどの人々が実施することができる。さらに、このカートリッジを用いた測定を実行するために使われる装置は、シンプルで、メンテナンスの必要がなく、持ち運び可能である。
【特許文献２】国際公開第０３／１０４７７２号パンフレット
【００２５】
本発明の方法は、そのような装置に組み入れることができ、この装置は、カートリッジ、好ましくは使い捨てカートリッジと、ドッキングステーションとを備え、上記カートリッジは、混合チャンバと、混合部材と、収集チャンバと、電極と、開口とを備え、そのカートリッジを離脱可能に受け入れる上記ドッキングステーションは、プロセッサーと、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられたとき、電極と作動的に接続するためのコネクタとを備える。
【００２６】
このカートリッジは、開口を通る液体の流れを引き起こすために、収集チャンバに連通する第１ポートをさらに備えてもよく、一方、このドッキングステーションは、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられたとき、開口を通過する液体の流れを引き起こす圧力を印加するために、第１カートリッジポートとともに気体の接続を形成する第１ポートをさらに備える。
【００２７】
このカートリッジは、混合チャンバに連通する第２ポートをさらに備えてもよく、ドッキングステーションは、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられたとき、カートリッジ内に液体の流れ、たとえば混合チャンバへの液体の流れを引き起こす圧力を印加するために、第２カートリッジポートとともに気体の接続を形成する第２ポートをさらに備えてもよい。
【００２８】
一般的に、カートリッジおよびドッキングステーションの間の必要な電気的接続および流体的接続はすべて、カートリッジをドッキングステーションに嵌入することにより、好ましくは簡単な押し込みにより、確立できることが好ましい。
【００２９】
カートリッジは、一度使用したあとは使い捨てるようにデザインされていることが好ましい。使用後は、装置を清掃する必要なく、新しいカートリッジを用いて新しい分析手順において使うことができることが望ましい。したがって、ドッキングステーションへの嵌入にあたり、カートリッジから液体が漏れることは避けなければならない。この目的のために、望ましい粒子特徴づけのために十分な量の液体が、ハウジングの外へ出ていくことなく、開口を介してくみ出だされる、または送り出だされるように、ハウジング内での開口の位置決定が行われる。一般的に、カートリッジから液体が出ていかないように粒子特徴づけ測定を行いつつ、ある程度、すなわち少なくとも０．１ｍｌから１０ｍｌ、たとえば０．５ｍｌの液体に開口を通過させることが可能であろう。
【００３０】
本発明を、添付の図面に例示、図解した実施形態に基づいて、さらに説明かつ図解する。
【００３１】
図１を参照すると、血液分析用のハウジング８５を有する使い捨てカートリッジが、希釈液１１が入った液体貯蔵チャンバ１と、ハウジング８５内に配置され、血液試料８をサンプリングし、血液試料８を受け取って保持するための空洞１０を有する第１サンプリング部材２とを備え、この部材２が、ハウジング８５に関連して移動可能に配置されて、第１の位置において、空洞１０が穴９０と連通し、毛管力によって血液試料８を空洞１０の中に浸入させ、第２の位置において、空洞１０が液体貯蔵チャンバ１および混合チャンバ３と連通し、希釈液１１によって希釈された血液試料８を、撹拌混合用の混合部材９２を有する混合チャンバ３へ放出させる。混合チャンバ３は、混合チャンバ３および収集チャンバ５の間を血液試料８が通過するための開口５９を含む壁により収集チャンバ５と分離されている。開口５９を含むこの壁は、フロースルーセンサ４の一部を構成する。
【００３２】
光学的または電気的手段により液体の出入りを記録するために、比較的小さい内部体積の２つの接続流路１２、１３による測定の間に計測される体積の大きさを実質的に有する計量チャンバ６を備える収集チャンバに計量装置が接続している。流路７は、計量チャンバ６から第１の接続ポート６７に通じており、ここでは、たとえば、開口５９を通る液体の流れを引き起こすため、圧力を印加することができる。
【００３３】
図２に示したように、フロースルーセンサ４は、液体６０の中に懸濁された粒子が通過するための、比較的狭い開口５９を備える隔壁９１を有する。その開口は、個々の細胞の検出および測定のための感知区域として働く。センサー内の開口は、コールターカウントとして知られるインピーダンス法により粒子を計数かつサイジングするための計数開口として形成してもよい。粒子は、圧力駆動流により、開口を通っていずれの方向へも吸引され得る。食塩水または他の電解溶液がこのチャンバに加えられたとき、この二つのチャンバは、開口５９の通路によりもたらされる電流フローの経路を除いて、互いに電気的に絶縁されている。
【００３４】
図３に示したように、フロースルーセンサの各サイドの両チャンバは、外部端子６１、６２から、使い捨てカートリッジの底壁６３を貫通し、それぞれのチャンバの内側に対向する構成になるように延びる電極３４、３５を備える。測定を実行するために、カートリッジが、持ち運び可能な装置の中のドッキングステーション６６に置かれている。ドッキングステーション６６は、基部７０および周囲の側壁７１を有するカップ状のハウジングを有している。基部７０には、カートリッジがドッキングステーションに押し込まれることにより受け入れられたとき、カートリッジの端子６１、６２に自動的に接触するばね式の電気接続子６４、６５がそれぞれある。そこにはまた、カートリッジの導管６７と位置を合わせ、基部の壁７０を通り抜けた導管６８がある。導管６７は、壁７０の上面の開口位置に、たとえば、カートリッジの底壁６３の下面と気密性の接続を形成するためのオーリングなどのシール６９を有する。真空ポンプ７２が、導管７３により導管６８の下端に接続されている。本装置の変形例として、真空ポンプ７２を、正の気体圧力を導管６８に加えるために、逆方向に動かすことができる。７４に概略的に示されているものは、プロセッサーならびに装置の操作に必要な追加的な電子回路およびディスプレー機器を含む、より従来のコールターカウンタの構成要素である。
【００３５】
図４は、大きな粒子９４により閉塞した開口９７を含む膜または壁９３の断面図である。電極９６が、インピーダンス粒子計数のための受信機９９に接続している。粒子９４が開口９７に近づくのに伴って、電圧は普通の粒子の通過による反応９８と比べて、長期間の間、９５に変化する。
【００３６】
図５は、開口を閉塞する粒子に起因する、長時間の電圧変化を記録したものである。
【００３７】
図６は、本発明よる方法のフローチャートである。
【００３８】
開口の電圧（Ｕ）のモニタリングおよびサンプリングの典型的なタイミングは、１０ミリ秒から１０秒とすることができ、通常は一秒ごとのサンプリングが好ましい。この時間間隔をｘと呼ぶとすると、時間ｘにおける電圧はＵ（ｘ）で表わされる。図１では、１試料／秒の時間分解能における電圧のモニタリングが使われている。
【００３９】
電圧の実際のレベルを見ることなしに、変化を検出する一つの方法は、差分を見ることであるが、その場合、サンプリングデータは、離散値となる。差分法を修正すると、ｄＵ（Ｘ）＝［Ｕ（Ｘ―３）＋Ｕ（Ｘ―２）］／［Ｕ（Ｘ−１）＋Ｕ（Ｘ）］で表わすことができ、ここで、ｄＵ（Ｘ）は、時間Ｘにおける電圧の修正差分を示す。電圧が安定している場合、この等式の右側は１となる。電圧に変化が生じると（図７を参照）、差分は、この変化を反映し（図８を参照）、差分が普通の状態でどれだけ変化し得るかについてしきい値（図８の点線）を設定することにより、粒子により引き起こされる変化が検出できる。開口の電圧が最初の値に再び安定したとき、差分はこの変化も同様に検出するが、これは閉塞としてみなすべきではない。まず、短期間電圧が安定した後で、閉塞の検出を再び始めることができる。
【００４０】
流れを逆流させ、混合を始めることによって、開口の近傍から粒子を取り除く。図６は、特定の分析装置（図９参照）における、この処置の一連の実行方法の一例を示している。この装置は、使い捨てカートリッジおよびカートリッジを受け入れるドッキングステーションを備える。カートリッジは、粒子が通過するための開口を含む壁により仕切られ、気体の加圧または減圧の源に接続する入口／出口を有する収集チャンバおよびハウジングの外側から接続でき、開口を通り抜ける粒子を特徴づける電極をもつハウジングを備える。ドッキングステーションは、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられているとき、第１カートリッジポートとともに気体接続を形成し、気体の加圧もしくは減圧の源と接続するための第１ポートと、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられているとき電極と作動的に接続するための電気のコネクタとを備える。プロセッサーは、機器の測定サイクルを制御する。それは、パルス波高分析器および開口を通る血液試料を吸引するためのバルブへ開始信号および終了信号を送信する。したがって、電圧のサンプリング、流れの管理、および測定のモニタリングは、プロセッサーにより実行される。
【００４１】
図７は、閉塞が生じ、そして解消されたときの電圧の記録である。
【００４２】
図８は、起こりうる開口の閉塞のモニタリングに使われる記録された電圧の修正差分である。点線は、閉塞の確認に使われるしきい値を示している。
【００４３】
図９は、本発明による使い捨てカートリッジ１００を備える卓上装置１０２の一例である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】カートリッジと称される使い捨てユニットの構成要素の断面側面図である。
【図２】フロースルーセンサの概念を概略的に示す図である。
【図３】本発明による使い捨てカートリッジおよびドッキングステーションを備えた装置を概略的に示す図である。
【図４】閉塞した開口を概略的に示す図である。
【図５】開口の閉塞中に測定された電圧のプロットである。
【図６】本発明による方法のフローチャートである。
【図７】閉塞の除去による電圧のその後の再安定を含む、閉塞中の電圧のプロットである。
【図８】開口の閉塞状態を規定するしきい値とともに示した、開口の電圧の差分のプロットである。
【図９】本発明による典型的な血液分析装置を示す図である。
【図１】
2009509148.tif 000003
【図２】
2009509148.tif 000004
【図３】
2009509148.tif 000005
【図４】
2009509148.tif 000006
【図５】
2009509148.tif 000007
【図６】
2009509148.tif 000008
【図７】
2009509148.tif 000009
【図８】
2009509148.tif 000010
【図９】
2009509148.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月19日(2008.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記混合チャンバ、混合部材、収集チャンバ、電極、および開口を有するカートリッジと、前記カートリッジを離脱可能に受入れるドッキングステーションとを備え、ドッキングステーションは、
プロセッサーと、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられるとき電極に作動的に接続するコネクタと、
を含む請求項１に記載の装置。
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月28日(2008.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記混合チャンバ、混合部材、収集チャンバ、電極、および開口を有するカートリッジと、前記カートリッジを離脱可能に受入れるドッキングステーションとを備え、ドッキングステーションは、
プロセッサーと、カートリッジがドッキングステーションに受け入れられるとき電極に作動的に接続するコネクタと、
を含む請求項１または２に記載の装置。
【国際調査報告】
2009509148.tif 000012
2009509148.tif 000013
2009509148.tif 000014