(57)【要約】【課題】新規なＳＭ及びＰＣの測定方法の提供。【解決手段】細菌のＳＭアーゼを用い、スフィンゴミエリンを、ホスホリルコリン及びｎ−アシルスフィンゴシンに加水分解し、アルカリ性ホスファターゼを用いてステップ１から生じるホスホリルコリンからコリンを生成させ、コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させ、過酸化水素と、ＤＡＯＳ、４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させる方法。並びに、細菌由来のホスホリパーゼＤを用い、ホスファチジルコリンを、コリン及びホスファチジン酸に加水分解し、コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させ、過酸化水素と、ＤＡＯＳ、４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させる方法。【選択図】図１
2009519713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿及び組織中のスフィンゴミエリン及びホスファチジルコリンの測定方法であって、
１）細菌由来のＳＭアーゼを用いて、スフィンゴミエリンを、ホスホリルコリン及びｎ−アシルスフィンゴシンに加水分解するステップと、
２）アルカリ性ホスファターゼを用いて、ステップ１から生じるホスホリルコリンからコリンを生成させるステップと、
３）コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
４）過酸化水素と、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）、４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させるステップを含んでなる方法。
【請求項２】
血漿及び組織中のスフィンゴミエリン及びホスファチジルコリンの測定方法であって、
１）細菌由来のホスホリパーゼＤを用いて、ホスファチジルコリンを、コリン及びホスファチジン酸に加水分解するステップと、
２）コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
３）過酸化水素と、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）、４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させるステップを含んでなる方法。
【請求項３】
ステップ１の細菌由来のホスホリパーゼＤを用いて、ホスファチジルコリンを、コリン及びホスファチジン酸に加水分解するステップを更に含んでなる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿中及び組織中のスフィンゴエミリン及びホスファチジルコリンの酵素的測定方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ蛋白質は、コレステロール及びトリグリセリドの他にリン脂質を含有し、それらの中でもホスファチジルコリン（ＰＣ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）の２つが主なものであり、それぞれ全リン脂質の約７０％及び２０％を占める。ヒトのケースコントロールに関する研究において、血漿中のＳＭ、及びＳＭ／ＰＣ比率が、虚血性心疾患に対する独立した危険因子であることが示されている。
【０００３】
ＳＭは、ヒトの及び動物性のモデルのアテロームに蓄積することが知られている。ヒトの動脈硬化性病巣から抽出される低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）は、血漿中のものと比較し、ＬＤＬよりＳＭが非常に豊富である。ａｐｏＥノックアウト（ａｐｏＥ  ＫＯ）マウスの血漿ＳＭレベルは、野生型マウスよりも４倍高く、これらの動物ではアテローム性動脈硬化症の増加の１つの原因として説明できる。高コレステロール血症のウサギ由来のＶＬＤＬでは、ＳＭ／ＰＣ比率が５倍高い。
【０００４】
近年では、ａｐｏＥ  ＫＯマウスへのミリオシン（ＳＭ合成の阻害剤）の投与により、血漿中のＳＭが劇的に減少し、ＰＣが増加し、その結果ＳＭ／ＰＣ比率が減少し、更にアテローム性動脈硬化の病巣範囲が著しく減少することが明らかとなっている。これらのデータは、アテローム性動脈硬化症において、ＳＭが亢進的な役割を演じ、一方、ＰＣが予防的な役割を演じうることを示唆するものである。それらを測定することにより、ヒト並びに様々なマウスモデルにおけるアテロームの発生に関する新規な病理的知見が得られることも考えられる。
【０００５】
両方のリン脂質の重要性が明らかであるにもかかわらず、それらを測定するための簡便な、迅速な、高感度の及び高いスループットの測定方法は現在存在しない。なお、血漿ＳＭ及びＰＣの古典的な測定方法としては、脂質の抽出、薄層クロマトグラフ及び単離されたＳＭ又はＰＣスポットのホスフェート定量による測定が存在する。しかしながらこの方法は多くの時間を要し、また感度にも問題が残る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上より、ＳＭ及びＰＣを測定する新規な方法に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は血漿及び組織中の、スフィンゴミエリン及びホスファチジルコリンの測定方法の提供に関する。当該方法は、
１）細菌由来のＳＭアーゼを用いて、スフィンゴミエリンをホスホリルコリン及びｎ−アシルスフィンゴシンに加水分解するステップと、
２）アルカリ性ホスファターゼを用いて、ステップ１から生じるホスホリルコリンからコリンを生成させるステップと、
３）コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
４）過酸化水素と、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）、４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色（好ましくは５９５ｎｍの最大吸収スペクトルを有する）を発色させるステップを含んでなる。
【０００８】
他の実施形態では、当該方法は、
１）細菌由来のホスホリパーゼＤを用いて、ホスファチジルコリンをコリン及びホスファチジン酸に加水分解するステップと、
２）コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
３）過酸化水素と、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）、４−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色（好ましくは５９５ｎｍの最大吸収スペクトルを有する）を発色させるステップを含んでなる。
【０００９】
他の実施形態では、上記の２つの方法を併用することによって、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンを同時に測定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
古典的に、ＳＭ及びＰＣは以下の４つのステップで測定されている。
１）脂質の抽出、
２）薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）、
３）薄層クロマトグラフィープレート上の対応するスポットからＳＭ及びＰＣ抽出、
４）各抽出のホスフェートの定量。全てのステップは多くの時間を要し、また感度が低い。全コリン含有リン脂質（ＰＣ＋ＳＭ）を測定する単純な方法であれば存在するが（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、直接ＳＭ及びＰＣを測定のための方法は存在しない。
【００１１】
本発明は、血漿中のＳＭ及びＰＣを測定するための、２つの、迅速な、特異的な、高感度の分析方法の提供に関する。本発明は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）を測定するための、２つの、迅速な、特異的な、高感度の酵素学的測定方法の提供に関する。ＳＭ及びＰＣは、血清リポ蛋白質を構成する２つの主要なリン脂質である。古典的には、それらの濃度は、脂質抽出、薄層クロマトグラフ及び単離されたＳＭ又はＰＣスポット上のホスフェート定量により測定される。
【００１２】
本発明の方法では、血漿を、細菌由来のスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭ測定用）又は細菌由来のホスホリパーゼＤ（ＰＣ測定用）、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン及び４−アミノアンチピリンと共に、好ましくは約４５分間インキュベートする。それにより、青い発色物質（５９５ｎｍの最適吸収スペクトルを有する）が形成される。
【００１３】
ＰＣの濃度はＳＭ測定に影響を与えず、またその逆も当てはまる。測定に用いる直線領域は、ＳＭでは約０．５〜５μｇであり、ＰＣでは約２．５〜約２０μｇである。アッセイ間での変動係数は、ＳＭでは約１．７＋０．０５％であり、ＰＣでは３．１±０．１３％である。これらの２つの方法は自動化することができ、大スケールのハイスループット試験アッセイとすることができる。
【００１４】
ＳＭアーゼ及びホスホリパーゼＤの採用により、本発明のアッセイの特異性が高いものとなった。しかしながら、すべての市販の酵素が利用可能というわけではない。ホスホリパーゼＤの中にはＳＭアーゼ活性のコンタミネーションを有するものもあり、又はその逆もありうる。好ましくは、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製のホスホリパーゼＤが、本発明の方法又はアッセイで用いられる。
【００１５】
用語「試験法」及び「方法」は本願明細書においては同じ意味であり、本願明細書において同義的に用いられる。
【００１６】
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＳＭアーゼ（好ましくはＳ−８８８９）が、本発明の方法で使用できる。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製の全てのアルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ及び過酸化酵素は、本発明の全ての方法において使用できる。
【００１７】
本発明の方法の最終工程（すなわちＨ2Ｏ2の測定可能な化合物への変換）では、幾つかの試薬を選択することができる。例えば、フェノールを、赤いキニーネ色素（５０５ｎｍの最大吸収スペクトル）の生成に使用でき、またＴＯＯＳ（３−（Ｎ−エチル−３−メチルアニリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）を紫色の色素（５５０ｎｍの最大吸収スペクトル）の生成に使用することができる。しかしながら、溶血が生じた血漿では、両方の波長の吸収に顕著な影響が生じうる。ＤＡＯＳを使用することにより、溶血を十分に回避できる（図４）。
【００１８】
本願明細書に記載する、血漿中のＳＭ及びＰＣ測定のための新規な方法は、簡便で、迅速で、特異性が高く、高感度で、高いスループットであることを特徴とする。それらは、より大規模な臨床サンプル測定又は薬物スクリーニングに適し、組織中のＳＭ及びＰＣ測定にも適応できる。
【実施例】
【００１９】
本発明を更に詳細に例示する目的で以下に実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２０】
材料及び方法
試薬：
ＳＭアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリン、並びにスタンダードＳＭ及びスタンダードＰＣは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ホスホリパーゼＤは、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から購入した。ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）は、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した
【００２１】
ＳＭ測定：
血漿中のＳＭレベルの酵素学的な測定を、以下の４ステップで行った（図１Ａ）：
１）細菌由来のＳＭアーゼでＳＭをホスホリルコリン及びｎ−アシルスフィンゴシンに加水分解させるステップと、
２）アルカリ性ホスファターゼでホスホリルコリンからコリンを生成させるステップと、
３）コリンを用い、コリンオキシダーゼによる触媒反応に供し、過酸化水素を生成させるステップと、
４）過酸化水素を、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）、４−アミノアンチピリン及び触媒としてのペルオキシダーゼと共に用いて、青紫色の発色物質（５９５ｎｍの最大吸収スペクトル）を生成させるステップ。反応バッファを、０．０５ＭのＴｒｉｓ塩酸、５ｍｇ／ｄｌの塩化カルシウム（ｐＨ８）とした。５０ｍｌの反応バッファ中の酵素濃度を以下の通りとした：
ＳＭアーゼ：２５Ｕ、
アルカリ性ホスファターゼ：５００Ｕ、
コリンオキシダーゼ：２５Ｕ及び
ペルオキシダーゼ：１０００Ｕ。
ＤＡＯＳの濃度を０．７３ｍＭとし、４−アミノアンチピリンの濃度を０．７３ｍＭとした。５μｌの血漿を１００μｌ反応バッファ（＋酵素）に添加し、３７℃で４５分インキュベートした後、５９５ｎｍの吸光度を分光光度測定用のプレートリーダーで測定した。
【００２２】
スタンダードＳＭ溶液（５０ｍｇ／ｄｌ）の調製：
５ｍｇのＳＭを、１０ｍｌの２％トリトンＸ−１００／エタノール溶液に溶解させて調製した。
【００２３】
ＰＣ測定：
血漿中のＰＣレベルの酵素学的な測定を、以下の３ステップで行った（図２Ｂ）：
１）細菌由来のホスホリパーゼＤ（ＰＣ特異的、ＳＭと反応しない）を用いて、ＰＣをコリン及びホスファチジン酸に加水分解させるステップと、
２）コリンを用い、コリンオキシダーゼによる触媒反応に供し、過酸化水素を生成させるステップと、
３）過酸化水素を、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン  ナトリウム塩）、４−アミノアンチピリン及び触媒としてのペルオキシダーゼと共に用いて、青紫色の発色物質（５９５ｎｍの最大吸収スペクトル）を生成させるステップ。反応バッファを、０．０５ＭのＴｒｉｓ塩酸、５ｍｇ／ｄｌの塩化カルシウム（ｐＨ７）とした。５０ｍｌの反応バッファ中の酵素濃度を以下の通りとした：
ホスホリパーゼＤ：６０００Ｕ（測定時に添加）、
コリンオキシダーゼ：２５Ｕ、
ペルオキシダーゼ：１０００Ｕ。
ＤＡＯＳの濃度を０．７３ｍＭとし、４−アミノアンチピリンの濃度を０．７３ｍＭとした。５μｌの血漿を１００μｌ反応バッファ（＋酵素）に添加し、３７℃で４５分インキュベートした後、５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２４】
スタンダードＰＣ溶液（１００ｍｇ／ｄｌ）の調製：
１０ｍｇのＰＣを、１０ｍｌの２％トリトンＸ−１００／エタノール溶液に溶解させて調製した。
【００２５】
全リン脂質の測定：
血漿中のコリン含有リン脂質（ＰＣ＋ＳＭ）の全量を酵素的方法（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）で測定した。
【００２６】
結果：
血漿中のＳＭ又はＰＣ濃度の酵素学的測定を、新規な４ステップ又は３ステップによる方法を用いて実施した（図１）。図２に示すように、ＳＭ測定の直線領域は０．５〜５μｇであり、ＰＣでは２．５〜２０μｇであった（図２）。ＳＭ及びＰＣ濃度は、プールされた異なる量の血漿について測定し、両方のアッセイの直線領域が２．５μｌ〜１０μｌであることを見出した（図３）。
【００２７】
両方法は、最初のステップ以外は非常に類似するため（図１）、両方の測定において、各々が互いに阻害し合うという事態も考えられる。そこで、ＳＭの測定方法の特異性を解析するため、標準ＰＣを基質として用いて（又はその逆）解析した結果、両方法での交差測定は見られなかった（図４Ａ及び４Ｂ）。
【００２８】
溶血は、血液の収集の際に常に生じる。血漿中のＳＭ濃度はコレステロール及びＰＣより顕著に低いため、溶血した血漿の使用は、アッセイにおいて測定される光吸収を著しく阻害しうる。この効果を解析するため、低い、中程度及び高い程度の溶血血漿サンプル１０μｌを用い、３７℃で４５分間、ＳＭアッセイ溶液（但しＳＭアーゼを含まない）でインキュベートし、それらの吸光度を５９５ｎｍで測定した。溶血によってもＳＭアッセイが阻害されないことが判明した（図５）。
【００２９】
測定方法の再現性：
ＳＭ及びＰＣは、１つのサンプルあたり２０回測定した。ＳＭアッセイのアッセイ間の変動係数は１．７＋０．０５％であり、ＰＣアッセイでは３．１±０．１３％であった。
【００３０】
新規なＳＭ及びＰＣ試験法を評価するため、マウス血漿中のコリン含有リン脂質（ＳＭ＋ＰＣ）の全レベルを市販のキット（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を使用して測定し、これらの結果を、本発明の方法で測定されたＳＭ及びＰＣ濃度を添加することによって得られた結果と比較した。２つの方法の相関関係が良好である（ｒ＝０．９１、ｎ＝７）ことが判明した（図６）。更に、マウス血漿中のＳＭ濃度が３８＋１０ｍｇ／ｄｌであり、ＰＣ濃度が１５０＋２１ｍｇ／ｄｌであり、ＰＣ／ＳＭ比率が３．９であった（表１）。これらの全ての結果は、古典的な方法（７）によって得られた結果と同等であった。
【００３１】
表１：全コリン含有リン脂質（ＰＣ＋ＳＭ）測定用の市販のキットと、新規な血漿中のＳＭ及びＰＣ測定方法との、測定結果の比較
【表１】
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＊新規な方法で測定。
＊＊市販のキット（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で測定。
ＳＭ：スフィンゴミエリン、ＰＣ：ホスファチジルコリン。値を平均＋ＳＤ（ｎ＝１７）で示す。
【００３２】
ＳＭ測定法の改良：
ＳＭ測定法の感度を増加させ、溶血を回避するために、フェノールの代わりに、ＤＡＯＳ（５９５ｎｍの最大吸収スペクトル）を反応の最終ステップに用いた。この変更により、測定感度の増加（１０ｍｇ／ｄｌ未満のＳＭを検出できる）のみならず、溶血も回避することが可能となる。
【００３３】
ＳＭ及びＰＣ測定用の標準曲線：
スタンダードＳＭ（０．３５〜３．５μｇ）を用いた標準曲線は、ＳＭ測定法において直線性を有していた。スタンダードＰＣ（６〜２４μｇ）を用いた標準曲線は、ＰＣ測定法において直線性を有していた。血漿中ＳＭのアッセイの直線領域は１０〜１２０ｍｇ／ｄｌであった。血漿中ＰＣのアッセイの直線領域は１０〜２５０ｍｇ／ｄｌであった。
【００３４】
測定結果の再現性：
新規な測定方法により、ＳＭ及びＰＣを、１サンプルあたり２０回測定した。ＳＭアッセイにおけるアッセイ間の変動係数は１．７＋０．０５％であった。ＰＣアッセイにおけるアッセイ間の変動係数は３．１＋０．１３％であった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＳＭ及びＰＣ測定のストラテジーを示す。Ａ．ＳＭアーゼはＳＭのホスホリルコリンへの加水分解を触媒し、アルカリ性ホスファターゼは第２のステップにおいて触媒し、Ｐ−コリンからコリンを生じさせる。次のステップで、コリンオキシダーゼの触媒によるコリンの酸化が行われる。この反応により２分子の過酸化水素が生じる。最終工程ではペルオキシダーゼによる触媒反応が行われ、測定対象の青紫の発色物質が生じる。Ｂ．ホスホリルコリンＤは、ＰＣのコリン及びホスファチジン酸への加水分解を触媒する。残りの反応はＳＭ測定と同様である。
【図２】ＳＭ及びＰＣ測定用の標準曲線。異なる量のＳＭ又はＰＣ標準溶液（＋生理的食塩水）（〜２０μｌまで）を、１００μｌの反応バッファと３７℃で４５分間インキュベートし、５９５ｎｍの吸光度を測定した。Ａ．ＳＭの標準曲線。Ｂ．ＰＣの標準曲線。
【図３】血漿中ＳＭ及びＰＣ測定における、直線領域。プールしたマウス血漿を用いた。異なる量の血漿（＋生理的食塩水）（〜２０μｌまで）を、１００μｌの反応バッファと３７℃で４５分間インキュベートし、５９５ｎｍの吸光度を測定した。Ａ．ＳＭ測定における血清直線領域。Ｂ．ＰＣ測定における血清直線領域。
【図４】ＳＭ及びＰＣ測定の特異性。Ａ．ＳＭ測定で異なる濃度のＰＣを用いた。Ｂ．ＰＣ測定で異なる濃度のＳＭを用いた。
【図５】ＯＤ＝５９５ｎｍで測定した、溶血の影響。低い程度、中程度及び高い程度の溶血を有する血漿サンプル１０μｌを、３７℃で４５分間、ＳＭアッセイ用の溶液（ＳＭアーゼフリー）１００μｌと共にインキュベートし、それらの５９５ｎｍの吸光度を測定した。ＢＫＧ：バックグラウンド、ＬＯＷ：低い程度の溶血、ＭＥＤ：中程度の溶血、ＨＩＧＨ：高い程度の溶血。
【図６】全コリン含有リン脂質測定用の市販のキット（Ｗａｋｏ社製）と、本発明の新規な血漿中ＳＭ及びＰＣ測定方法との比較（ｒ＝０．９１、ｎ＝１７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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