(57)【要約】  同時封入された多糖抗原及び無毒性にするよう修飾されたＴ細胞依存性タンパク質キャリア（例えば、破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイド）を含有する、リポソーム形成化合物で形成されるリポソームを含むリポソーム組成物、好ましくはワクチン。本発明は、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)又は髄膜炎菌(Neisseriameningitidis)に対するワクチンの生産に利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム内に同時封入された多糖抗原及びタンパク質キャリアを含むリポソーム組成物であって、該多糖抗原が水溶性であり、該タンパク質キャリアが少なくとも３５ｋＤａの分子量である少なくとも１つのＴ細胞エピトープを有し、且つ無毒性であり、該多糖抗原及び該タンパク質キャリアが結合されておらず、該リポソームが５０〜７００ｎｍの範囲の平均直径を有し、且つ組合せて全体的イオン電荷を有さず、且つ少なくとも１種のリン脂質を含むリポソーム形成化合物から形成される、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記リポソーム形成化合物が好ましくは総リポソーム形成化合物に基づいて少なくとも２５モル％の量のコレステロールを含む、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記リポソーム形成化合物が少なくとも１つの陽イオンに帯電した化合物を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リン脂質が必要に応じてホスファチジルエタノールアミンと組み合わせてホスファチジルコリンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記リポソームが８０〜５００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
多糖抗原対タンパク質キャリアの比が６：１〜１：６の範囲内である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
多糖抗原対タンパク質キャリアの比が４：１〜１：３の範囲内である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質がオボアルブミン、破傷風トキソイド及びジフテリアトキソイドから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
単位投薬形態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
各単位投薬形態がタンパク質キャリア１〜３０μｇを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記多糖抗原が全体的イオン電荷を有さない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記多糖抗原がＴ細胞非依存性抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記多糖抗原が感染性因子、好ましくは病原菌、好ましくはインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、大腸菌(E. coli)又はB群溶連菌(Group B Streptococcus)に由来する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
幾つかのこのような多糖抗原を含む、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が同じ細菌種に由来する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
各抗原がリポソームの別個の集団に被包される、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
幾つかの抗原が前記集団の同じリポソーム中に同時被包される、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が水性であり、且つ前記リポソームが連続水性媒質中に懸濁される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
乾燥形態、好ましくは粉末形態、好ましくは凍結乾燥粉末である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
１つ又は複数の糖をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
医薬組成物であり、且つ薬学的に許容可能な希釈剤又は賦形剤を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記多糖抗原が前記リポソームの小胞内空間中に封入される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記タンパク質キャリアが前記小胞内空間中に封入される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載のリポソームの使用であって、前記多糖抗原に対する免疫応答を誘発するための哺乳動物への投与用の組成物の製造における、使用。
【請求項２５】
前記免疫応答が前記多糖抗原に特異的なＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ、好ましくはＩｇＡの産生を包含する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記組成物が皮下的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、鼻内に、吸入により、膣内に、口腔的に又は経口的に投与される、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記組成物が皮下的に投与される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記組成物がタンパク質キャリア１〜３０μｇを含む単位投薬量で投与される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記免疫応答が、前記多糖抗原が由来する微生物、好ましくは細菌による感染に対する防御反応である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒト、好ましくは幼児であり、より好ましくは２歳未満、例えば６ヶ月齢未満である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
請求項１８に記載の組成物を哺乳動物被験体へ投与することにより動物において免疫応答を誘発する方法であって、それにより細菌多糖抗原に対する免疫応答が誘発される、免疫応答を誘発する方法。
【請求項３２】
組成物の単位投薬量がタンパク質キャリア１〜３０μｇを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫応答が前記多糖抗原に特異的なＩｇＧ抗体の惹起である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載のリポソーム組成物を形成する方法であって、
（Ｉ）空のリポソームを多糖抗原及びタンパク質キャリアと混合すること、並びに
（ｉｉ）工程（Ｉ）からの混合物を乾燥させること、
を含む、方法。
【請求項３５】
脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）の懸濁液を形成するために工程（ｉｉ）からの混合物を再水和させる工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
非封入材料が前記ＤＲＶから少なくとも部分的に除去される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（Ｉ）において、糖が、空のリポソーム、タンパク質及び多糖抗原の前記混合物中に存在する、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム組成物、特に、とりわけ病原菌に由来する多糖抗原（例えば、肺炎球菌抗原及びＨｉｂ多糖抗原）に対して免疫応答を誘発するのに有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
被包性細菌により引き起こされる細菌感染は、主要な世界保健問題である。肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、又は髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)種は、莢膜多糖である主要表面抗原の胸腺非依存性に起因しそれに対してワクチン接種するのが困難である。
【０００３】
Ｔ細胞非依存性抗原は、有効なワクチンの開発に関し特に問題を提示する。抗体産生は低く、再免疫化により通常高められない。抗原アイソタイプは、ＩｇＭに限定されており、他のアイソタイプは概して、特異的抗原に対して低い親和性を有する。
【０００４】
主な問題は、Ｔ細胞非依存性ワクチンに対する幼児の反応にある。これらの個体は、中でもこのような細菌感染に最も攻撃されやすい。これらの年齢群は、Ｔ細胞非依存性抗原に対する反応性が最も乏しい。
【０００５】
多糖抗原を免疫賦活させる(adjuvantate)ために様々な方法が試されてきた。例えば、多糖を破傷風トキソイドのようなキャリアタンパク質に結合させると、免疫原効果において幾らか改善がもたらされる。代替的に、多糖をリポソームとともに配合することによりこれもまた免疫応答の増強を付与する。
【０００６】
Burgeot, C等は、Vaccine 2001, 19, 2092-2099において、α毒素とともにリポソーム中に同時封入された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の多糖ワクチンの免疫増強を開示している。リポソームは、７：２：１のモル比で卵ホスファチジルコリン、ステアリルアミン及びコレステロールを含有するリポソーム形成化合物で形成された。リポソームは、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中に懸濁された空のＳＵＶ及び抗原の混合物の脱水により、脱水再水和法を使用し形成された。多糖対毒素タンパク質の比は、２０〜５の範囲であった。α毒素は、非常に有毒な物質であり、且つ溶血性である。多糖抗原の抗原性を増強する際のその活性は、α毒素が、毒素として示す細胞膜の貫通を包含する特性に依存すると著者等は論じている。増強は、熱失活毒素誘導体では達成されないと著者等は、示している。α毒素は、約３３ｋＤａのサブユニット分子量を有する。
【０００７】
Pietrobon, P.J.F.等は、Immunomethods 4, 236-243 (1994)において、Ｔ非依存性抗原ＬＰＳ（これは、水溶性ではない）及びＴ細胞認識部位を有するポリペプチドである赤血球凝集素（ＨＡ）のリポソームへの同時封入について記載している。リポソームサイズは開示されていない。ＬＰＳ対ＨＡの重量比は、２：１〜１：１０の範囲内である。リポソームは、ＬＰＳ及びＨＡを含有する脂質被膜を形成すること、並びにｎ−オクチルグルコピラノシドを含有する水性懸濁液中でこれを水和させることにより作製される。ＨＡは不活性ではなく、シアル酸保有グリコンを介して様々な細胞表面受容体に結合し、先天性免疫応答を刺激する。先天性免疫応答を刺激する化合物は、望ましくない炎症を発生させる可能性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、リポソーム内に同時封入された多糖抗原及びタンパク質キャリアを含む新規のリポソーム組成物が提供され、この多糖抗原は水溶性であり、このタンパク質キャリアは、少なくとも３５ｋＤａの分子量である少なくとも１つのＴ細胞エピトープを有し、且つ無毒性であり、この多糖抗原及びタンパク質キャリアは結合されておらず、このリポソームは、５０〜７００ｎｍの範囲の平均直径を有し、且つ組合せて全体的イオン電荷を有さず、且つ少なくとも１つのリン脂質を含むリポソーム形成化合物から形成される。
【０００９】
本発明では、「同時封入される」という用語は、２つの活性物、即ち多糖抗原及びタンパク質キャリアが同じリポソームに付随(associated with)しなくてはならないことを意味する。付随(association)は、単にリポソームの外側表面によるものであってもよいが、活性物は、リポソームの小胞内空間中に少なくとも部分的に封入されることが望ましい。活性物はともに、水溶性であるべきであり、したがってリポソーム配合物の水相に位置する。リポソームが多重膜である場合、活性物はラメラ間に存在していてもよい。
【００１０】
本発明では、多糖抗原及びタンパク質キャリアが、互いに共有結合されてないことが重要である。このことは、多くの成分、特に種々の抗原の共配合が多価抗原組成物を形成するのを可能にし、またこのような結合に必要である化学的な結合工程を回避するという多大な利点を有する。
【００１１】
タンパク質キャリアは、哺乳動物身体にとって無毒性であり、哺乳動物身体へ投与される場合に先天性免疫応答を刺激すべきではない。したがって、キャリアは、哺乳動物身体中で事実上「不活性」である。このことは、生物学的に不活性でなく、宿主受容体を係合させ（それら自体で直接的に又はそれらが死滅宿主細胞から放出する構成成分を介して）、先天性免疫応答の形態で免疫系の細胞から細胞反応を誘発するタンパク質アジュバントとは対照的である。
【００１２】
キャリアタンパク質は、それがＴ細胞依存性抗原として作用するのに十分高い分子量を有する。分子量は、少なくとも３５ｋＤａ、例えば最大１０００ｋＤａ、例えば７５〜４００ｋＤａである。本発明は、オボアルブミン、破傷風トキソイド及びジフテリアトキソイドのような従来技術においてＴ細胞非依存性抗原用のキャリアとして使用されているタンパク質を使用することができる。タンパク質は概して、非溶血性且つ無毒性であるべきである。無毒性の観点では、例えばタンパク質は、４ｍｇ／ｋｇを超えるＬＤ５０を有する（マウスにて、静脈内又は皮下）。好ましくは、タンパク質は、ホッジ＆スターナースケールでレベル６、即ち比較的無害であるべきである。
【００１３】
適切なタンパク質としては、オボアルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びジフテリアＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の遺伝的突然変異体）が挙げられる。破傷風トキソイドは、約１００ｋＤａの分子量を有する。破傷風トキソイド及びジフテリアＣＲＭ１９７（毒素の遺伝的突然変異体）は、相当する毒素により誘発される著しい免疫応答を誘発することができない。これは、ホルムアルデヒド又は遺伝的突然変異による弱化に起因すると考えられる。しかしながら、これらのキャリアは、抗体反応に必要とされるＴ−ヘルパー細胞の活性化、続く増殖により適応免疫応答を誘発する。
【００１４】
好ましくは、リポソーム組成物は単位投薬形態であり、タンパク質キャリア１〜３０μｇ、より好ましくは１０〜３０μｇを含む。このような投薬量は、ヒトのような免疫化が必要な被験体への投与に適していると考えられる。
【００１５】
本発明では、多糖抗原は好ましくは、感染性因子、好ましくは、例えばインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、大腸菌(E. coli)又はB群溶連菌(group B Streptococcus)から選択される病原菌に由来する。最も好ましくは、抗原は、インフルエンザ菌(Haemophilusinfluenzae)又は肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する。多糖抗原は好ましくは、Ｔ細胞非依存性抗原である。本発明の組成物では、多糖抗原対タンパク質キャリアの重量比は好ましくは、６：１〜１：６、より好ましくは４：１〜１：３の範囲内である。好ましくは、該組成物においてタンパク質に対して過剰の多糖が存在する。
【００１６】
本発明では、単一多糖抗原が存在してもよいが、好ましくは組成物は多価であり、即ち組成物は、幾つかの多糖抗原を混合して含む。組成物は、２個以上、３個以上、５個以上、７個以上、例えば最大４０個、好ましくは７〜２３個の範囲の多糖抗原を含んでもよい。好ましくは、抗原は、同じ細菌種に由来する。抗原は、このような多価組成物においてリポソーム中に同時被包され得るか、又は幾つかの集団が存在してもよく、その集団のリポソームそれぞれが、他の集団とは異なる別個の抗原又は抗原混合物を含有する。好ましくは、抗原は、リポソーム中に個々に封入され、即ち各多糖抗原に対して別個の集団が存在する。これは、一般的な出発材料からそれらの多種多様な異なるワクチンを生成するという観点で最適な柔軟性を可能にする。
【００１７】
リポソームは、全体的イオン電荷を有さない化合物を含む。化合物は好ましくは中性である（１つの陰イオン電荷及び１つの陽イオン電荷を有する両性イオン性化合物を包含する）が、少量の陰イオン性化合物又は陽イオン性化合物を含有してもよい（但し、これらは、逆帯電した化合物で電荷平衡がとれている）。好ましくは、該化合物は、ホスファチジルコリン化合物及び／又はホスファチジルエタノールアミン化合物を含む。リポソーム形成化合物は通常、両親媒性であり、即ち疎水性構成成分及び親水性構成成分から成る。疎水性構成成分は概して、アシル鎖により提供されるが、リポソーム形成化合物は代替的に、グリセロール−エーテルベースの脂質化合物であってもよい。非脂質化合物（即ち、グリセロール化合物に基づかない）、例えば非イオン界面活性剤型材料は、所望であれば含まれていてもよい。好ましくは、該組成物は、総リポソーム形成構成成分に基づいて、例えば少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％のモル量でコレステロールを含む。
【００１８】
本発明の組成物は、水性懸濁液の形態で存在してもよく、即ちここではリポソームは、連続水性媒質中に懸濁される。代替的には、組成物は、このような水性組成物の前駆物質であってもよく、これは、水又は水性液体で希釈され、水性懸濁液を形成し得る。このような前駆物質は、乾燥材料の形態で、例えば噴霧乾燥又はフリーズドライ（凍結乾燥）により提供される特に粉末形態で存在し得る。
【００１９】
本発明の組成物は、（ａ）希釈剤（複数可）及び／又は賦形剤（複数可）をさらに含んでもよい。該組成物は、直接的に又は中間配合工程（例えば、希釈）後に、哺乳動物被験体へ投与されるよう意図されるため、希釈剤又は賦形剤は、好ましくは薬学的に許容可能である。適切な賦形剤は既知である。
【００２０】
組成物が糖を含むことは特に好ましい。糖は、リポソームの形成中に、及び／又は貯蔵中に、リポソームの安定化を助長し得る。好ましくは、リポソームは、脱水−再水和法により形成され、空の小さな単層小胞（ＳＵＶ）（例えば、多層小胞（ＭＬＶ）を形成するための乾燥脂質被膜の水和及びＳＵＶへの超音波処理により作製される）及び活性物（多糖抗原及びタンパク質キャリア）は、水性液体中に懸濁された後、好ましくは凍結乾燥により乾燥される。次に、乾燥生成物を再水和させて、必要に応じて、当業者に既知の方法により、非封入材料、大きすぎるリポソームを除去するため又は平均リポソームサイズを小さくするための工程に供される。
【００２１】
再水和された小胞サイズの制御の改善のために、使用される方法は、国際公開特許第ＷＯ９９／６５４６５号で論述されるように、脱水工程の懸濁液中に糖を含む。糖は、グルコース及びフルクトースのような単糖、ラクトース及びスクロースのような二糖、並びに多糖から選択され得る。特に好ましい糖は、トレハロース、スクロース又はラクトースのような二糖、或いはグルコースのような単糖である。特に、好ましい糖はスクロースである。
【００２２】
このような方法では、糖の量は、糖対リポソーム形成化合物の質量比が、１：１〜６：１ｗ／ｗ、最も好ましくは１：１〜５：１の範囲内であるようなものである。糖のレベルが高まるにつれ、上記方法の被包効率は低下される。しかしながら、糖の量が少なくなるにつれ、最終リポソームのサイズに対する制御が失われる。
【００２３】
本発明はさらに、多糖抗原及びタンパク質キャリアがリポソーム中に同時被包される新規の組成物を生産するプロセスを提供する。
【００２４】
好ましくは、上述の方法が被包に使用される。糖は、使用しなくてもよいが、好ましくはこれらの脱水−再水和法で使用される。空のリポソームは、好ましくは小又は中サイズであり、多層又は単層であり得る。
【００２５】
プロダクトリポソームは、５０〜７００ｎｍの範囲、好ましくは８０〜５００ｎｍの範囲、より好ましくは８０〜３００ｎｍの範囲の平均直径を有する。好ましくは、組成物は、非常に低レベルの１５００ｎｍよりも大きい直径を有するリポソーム、さらに好ましくは非常に低レベルの１０００ｎｍよりも大きい直径を有するリポソームを含有する。非常に小さなリポソーム（例えば、２０ｎｍ未満）のレベルも、できる限り低く保持されるべきである。サイズは、光子相関分光法により測定される。
【００２６】
本発明はまた、多糖抗原に対する免疫応答を誘発するための哺乳動物への投与用の薬剤の製造におけるリポソーム及び組成物の使用を提供する。
【００２７】
好ましくは、免疫応答は、少なくとも多糖抗原に対するＩｇＧ、さらに好ましくはＩｇＭ及びＩｇＡの産生を包含し、好ましくはその結果、感染性微生物からの攻撃に対する防御効果がレシピエントにおいて達成される。
【００２８】
好ましくは、組成物は、皮下的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、鼻内に、吸入により、膣内に、口腔的に又は経口的に投与される。最も好ましくは、組成物は、皮下的に投与される。
【００２９】
概して、投与は、上述する型の感染性微生物、特に感染性細菌による感染に対する応答を提供するための防御目的に関するものである。組成物が投与される被験体は、防御免疫を有する必要のある任意の年齢の哺乳動物であり得る。本発明は、ヒトを処置するのに最も価値がある。例えば投与は、季節的な発生、感染の特定の発生に対する抵抗性を提供するためであってもよく、又は特に幼児に対する健康プログラムの一部であってもよい。本発明は、Ｔ細胞非依存性抗原、例えば多糖抗原に対する免疫応答が低減されたヒト幼児（例えば、２歳未満である）の処置に特に価値がある。
【００３０】
本発明はさらに、組成物を投与する方法を提供する。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施の形態は、特許請求の範囲で言及されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下の実施例は本発明を説明し、以下の図面を参照する。
実施例１
多糖の（ヒトにおいて）認可されている多糖ワクチン送達と比較した場合のリポソーム多糖ワクチンに対するマウスにおける抗多糖応答の実証。
実験の詳細：
以下のリポソーム配合物（ＩＤ１〜ＩＤ６）を、従来の脂質被膜乾燥／ＭＬＶへの水和／小さな単層小胞（ＳＵＶ）への超音波処理／ＤＲＶプロセス（国際公開特許第ＷＯ９９６５４６５号）を使用し調製した（表１）。ＤＲＶプロセスに先立ってＳＵＶ段階でＳＵＶ及び封入されるべき材料（複数可）に、スクロース（３倍脂質質量）を添加して、ＤＲＶ段階後に形成される生じるリポソームのサイズを小さくした。光子相関分光法によるＤＲＶの平均直径は約５００ｎｍである。
【００３３】
【表１】
2009510031.tif 000002
【００３４】
材料の詳細：脂質材料である卵ＰＣ（ＥＰＣ、純度９８％、Lipoid）及び水素化ダイズＰＣ（ＳＰＣ−３、純度９８％、Lipoid）は、Lipoid GmbHから入手した。ジオレオイルオキシホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）(Avanti製品番号：８５０７２５）は、Avanti（登録商標）Polar Lipidsから入手し、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）は、Merck Chemicals Ltd.から入手した。インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)ｂ型の精製ポリリボースリビトールリン酸莢膜多糖（ＰＲＰ−ＰＳ）及び破傷風トキソイド材料は、the Serum Institute of India（ＳＩＩ）から入手した。封入効率を、ＩＤ１及びＩＤ４に関してＰＳ及びタンパク質について試験した。ＩＤ１に関する両方の材料について、値は、およそ９０％であった。ＩＤ４に関する両方の材料について、値はおよそ７０％であった。
【００３５】
表１におけるコレステロールを有さないＥＰＣ配合物を、マウスにおける多糖抗原に対する抗体反応を誘導するそれらの能力に関して試験した。マウス（ＣＤ−１）に、投薬直前に混合されるａ）配合物ＩＤ１又はｂ）配合物ＩＤ２及びＩＤ３を皮下的に一度投薬した。ヒトにおける抗ＰＲＰ（ＰＳ）抗体の防御レベルの誘導用の認可されているワクチン製品であるＡｃｔ−Ｈｉｂ（登録商標）（破傷風トキソイドタンパク質に共有結合されているインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)ｂ型の精製ポリリボースリビトールリン酸莢膜多糖（ＰＲＰ）のワクチン）を比較用陽性対照として使用した。用量は全て、投与されるＰＲＰ（ＰＳ）及びＴＴの用量に関して標準化されそれぞれ２μｇ及び４μｇであった。
【００３６】
結果を図１に示す。
コメント
ａ）ＩＤ１、ｂ）ＩＤ２及びＩＤ３、並びにＡｃｔ−Ｈｉｂ（登録商標）による免疫化後に生成される抗ＰＳ（ＰＲＰ）抗体の結果は、
ａ）同じリポソーム小胞で同時送達されるＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）（ＩＤ１）配合物は、同じ材料ＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）用量であるが、別個のリポソーム小胞で投与されるもの（それぞれＩＤ２及びＩＤ３）よりも高い抗体反応を生じること、並びに
ｂ）同じリポソーム小胞で同時送達されるＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）（ＩＤ１）配合物は、タンパク質多糖結合体ワクチン（Ａｃｔ−Ｈｉｂ（登録商標））の形態で投与される同じ材料ＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）用量よりも高い抗体反応を生じること、
を明らかに示している。
【００３７】
表１におけるコレステロールを有するダイズＰＣ配合物を、マウスにおける多糖抗原に対する抗体反応を誘導するそれらの能力に関して試験した。マウス（ＣＤ−１）に、投薬直前に混合されるａ）配合物ＩＤ４又はｂ）配合物ＩＤ１を皮下的に一度投薬した。ヒトにおける抗ＰＲＰ（ＰＳ）抗体の防御レベルの誘導用の認可されているワクチン製品であるＡｃｔ−Ｈｉｂ（登録商標）（破傷風（トキソイド）タンパク質に共有結合されているインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)ｂ型の精製ポリリボースリビトールリン酸莢膜多糖（ＰＲＰ）のワクチン）を比較用陽性対照として使用した。用量は全て、投与されるＰＲＰ（ＰＳ）及びＴＴの用量に関して標準化されそれぞれ２及び４ｍであった。
【００３８】
結果を図２に示す。
コメント
ａ）ＩＤ４、ｂ）ＩＤ１、及びＡｃｔ−Ｈｉｂ（登録商標）による免疫化後に生成される抗ＰＳ（ＰＲＰ）抗体の結果は、
ａ）同じリポソーム小胞で同時送達されるＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）（ＩＤ３）配合物（コレステロールを有する）は、タンパク質多糖結合体ワクチン（Ａｃｔ−Ｈｉｂ（登録商標））の形態で投与される同じ材料ＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）用量よりも高い抗体反応を生じること、並びに
ｂ）同じリポソーム小胞で同時送達されるＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）（ＩＤ４）配合物（コレステロールを有する）は、コレステロールを有さないリポソーム配合物（ＩＤ１）で投与される同じ材料ＴＴ及びＰＳ（ＰＲＰ）用量よりも高い抗体反応を生じること、
を明らかに示している。
実施例２
リポソーム内に同時封入された肺炎球菌多糖及びタンパク質ジフテリア毒素（１９７）ＣＲＭ突然変異体を含む単一血清型リポソーム組成物のブレンド（多価）の免疫化後のマウスにおける多価抗肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖血清ＩｇＧ反応の実証。
実験の詳細：
以下のリポソーム配合物（ＩＤ７〜ＩＤ２０）を、従来の脂質被膜乾燥／ＭＬＶへの水和／ＳＵＶへの超音波処理／ＤＲＶプロセス（即ち、実施例１と同様）を使用し調製した（表２）。ＤＲＶプロセスに先立ってＳＵＶ段階でＳＵＶ及び封入されるべき材料（複数可）に、スクロース（３倍脂質質量）（ＳＵＶ）を添加して、ＤＲＶ段階後に形成される生じるリポソームのサイズを小さくした。
【００３９】
各配合物（ＩＤ７〜ＩＤ２０）は、リポソーム内にタンパク質ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７突然変異体とともに同時封入された個々の肺炎球菌多糖血清型から成っている。ジフテリア毒素の突然変異形態は、Uchida, Jr., T., Pappenheimer, Jr., A.M., Greany, R., (1973) J. Biol. Chem. 248, 3838-3844及びUchida, Jr., T., Pappenheimer, Jr., A.M., Harper, A. A., (1973) J. Biol. Chem. B 248, 3845-3850として記載されており、単離された。ＣＲＭ１９７は、Ａ鎖中に損傷を含有する無毒性ＤＴ突然変異体であり、ＡＤＰリボシル化を阻止する。ＣＲＭは、構造遺伝子における塩基変化に起因しグリシンに代わるグルタミン酸の置換をもたらす。ＣＲＭは、酵素活性を示さない一方で、ＣＲＭは、ジフテリア毒素と免疫学的に同じである(Pappenheimer, Jr., A.M., Uchida, T. and Harper, A.A. (1972) Immunochem. 9, 891-906)。
【００４０】
ＣＲＭ１９７は、ジフテリアトキソイドに類似している。ＣＲＭ１９７は、特異的に架橋されていないホルムアルデヒド処理した毒素（トキソイド）と対比して明確に規定されたタンパク質である。ＳＤＳゲルゲル上で、ＣＲＭ１９７タンパク質は、およそ分子量６３０００ダルトンの単一主要バンドとして移動する。
【００４１】
【表２】
2009510031.tif 000003
【００４２】
材料の詳細：使用される脂質材料は、卵ＰＣ（ＥＰＣ、純度９８％、Lipiod）及びコレステロール(Sigma)であった。American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）材料と同等の肺炎球菌莢膜多糖（Ｐｎ  ＰＳ）及びジフテリア毒素ＣＲＭ１９７タンパク質は、the Serum Institute of India Limited（ＳＩＩＬ）から入手した。
【００４３】
リポソーム単一ＰＳ封入配合物（ＩＤ７〜ＩＤ２０）は、個々に再水和させ（ＤＲＶプロセス）、一緒にプールし多価配合物を作製した直後に、５匹のＣＤ１マウス（雌）に皮下注射により免疫化した。多価ワクチンの用量は、肺炎球菌多糖６μｇ及びジフテリア毒素ＣＲＭ１９７タンパク質１．５μｇ及び脂質０．５５９ｍｇを含有する１４個の一価配合物の等価体を含有していた。したがって、マウスに投与される多価（１４個の血清型）ワクチンは、総計で肺炎球菌多糖８４μｇ及びジフテリア毒素ＣＲＭ１９７タンパク質２１μｇ及び脂質７．８１ｍｇを含有する。
【００４４】
総計２回の免疫化用量を２１日隔ててマウスに施し、さらに第１の免疫化用量前及び第２の用量の１４日後に、表在尾静脈サンプリングにより血清サンプルをマウスから採取した。
【００４５】
得られたマウス血清サンプルを、多検体蛍光検出(Luminex)により肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)抗体であるＩｇＧ（７つの血清型：４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ（３３Ｆ反応を検出する）、１９Ｆ及び２３Ｆ）のいくつかに対してアッセイした。この研究は、the National Institute for Biological Standards and Control（ＮＩＢＳＣ）で実施した。他の血清型に関しては、キットは入手不可能であり、そのため反応を測定しなかった。
【００４６】
Luminexの多検体蛍光検出は、２つの異なる蛍光体で内部標識した微視的ビーズ（ミクロスフェア）に基づく。６３５ｎｍレーザにより励起されると、蛍光体は、異なる波長、即ち６５８ｎｍ及び７１２ｎｍで発光する。６５８／７１２発光比を変更させることにより、一連の最大１００個の異なる蛍光プロフィール（分類と呼ばれる）を創出することができる。精密流体素子、デジタルシグナルプロセッサ及び高度光学素子を使用し、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００アナライザを、その予め定義した分類に従って各ミクロスフェアに帰属させる。したがって、多重ビーズ分類は、単一のサンプルにおいて組み合わせることができる。用いられるアッセイでは、個々の肺炎球菌多糖血清型はそれぞれ、特有の分類を伴うミクロスフェアに共有結合される。アッセイ手順中、種々の肺炎球菌多糖血清型ミクロスフェアは全て、試験マウスサンプルの単一希釈物と組み合わせられる。マウスサンプル中の抗体は、ミクロスフェア上の肺炎球菌多糖抗原に結合する。ミクロスフェアに結合された抗体の量は、フィコエリトリンに結合された抗マウスＩｇＧにより測定される。５３２ｎｍで励起されると、フィコエリトリンは５７５ｎｍで発光する。５７５ｎｍでの蛍光強度は、ミクロスフェアに結合された抗体の量に正比例する。検体特異性及びアレイでの各ビーズ分類の位置が既知であるため、単一の蛍光レポーター分子を使用し、試験される全ての血清型に対する特異的抗体レベルを算出することができる（多糖ビーズ結合体で表される）。
結果：
図３は、多検体蛍光検出による算出肺炎連鎖球菌(streptococcus pneumoniae)抗体であるマウスＩｇＧ（血清型特異反応：４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ（＊図３を参照、３３Ｆ反応を検出する）、１９Ｆ及び２３Ｆ）を示す。棒は、投薬した５匹のマウスの平均反応を表し、誤差棒は、標準偏差であり、白抜き棒は、マウスの免疫化前のバックグラウンド反応である一方で、黒塗り棒は、免疫化スケジュール後の反応である。
コメント
試験した７つの血清型全てに対する平均反応は、リポソーム内に同時封入された肺炎球菌多糖及びタンパク質ジフテリア毒素（１９７）ＣＲＭ突然変異体を含む単一血清型リポソーム組成物のブレンド（多価）による免疫化後に上昇した。免疫化前の反応に対する免疫化後の反応の増加は、それぞれ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、３３Ｆ、１９Ｆ及び２３Ｆ倍に関して、１．８、６．３、１．４、１．５、２．５、５．３及び３．６倍であった。
【００４７】
したがって、記載する組成物は、リポソーム内に同時封入された肺炎球菌多糖及びタンパク質ジフテリア毒素（１９７）ＣＲＭ突然変異体を含む単一血清型リポソーム組成物のブレンド（多価）による免疫化後にマウスにおいて多価肺炎球菌多糖抗原に対する抗体反応を惹起させる能力を明示している。
実施例３
肺炎球菌多糖ワクチン（ニューモバックス(Pneumovax)）ブーストを伴う、リポソーム内に同時封入された肺炎球菌多糖及びタンパク質ジフテリア毒素（１９７）ＣＲＭ突然変異体を含む単一血清型リポソーム組成物のブレンド（多価）の免疫化後のマウスにおける生肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)（チャレンジ）に対する防御効力の実証。
実験の詳細：
以下のリポソーム配合物（ＩＤ２１〜ＩＤ３４）を、従来の脂質被膜乾燥／ＭＬＶへの水和／ＳＵＶへの超音波処理／ＤＲＶプロセス（実施例１と同様）を使用し調製した（表３）。ＤＲＶプロセスに先立ってＳＵＶ段階でＳＵＶ及び封入されるべき材料（複数可）に、スクロース（３倍脂質質量）（ＳＵＶ）を添加して、ＤＲＶ段階後に形成される生じるリポソームのサイズを小さくした。
【００４８】
各配合物（ＩＤ２１〜ＩＤ３４）は、リポソーム内にタンパク質ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７突然変異体とともに同時封入された個々の肺炎球菌多糖血清型から成っている。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
材料の詳細：
使用される脂質材料は、卵ＰＣ（ＥＰＣ、純度９８％、Lipoid）及びコレステロール(Sigma)であった。American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）材料と同等の肺炎球菌莢膜多糖（Ｐｎ  ＰＳ）及びジフテリア毒素ＣＲＭ１９７タンパク質は、the Serum Institute of India Limited（ＳＩＩＬ）から入手した。
【００５１】
リポソーム単一ＰＳ封入配合物（ＩＤ２１〜ＩＤ３４）は個々に再水和させ（ＤＲＶプロセス）、一緒にプールし多価配合物を作製した直後に、１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウス（雌）に皮下注射により免疫化した。多価ワクチンの用量は、肺炎球菌多糖０．２μｇ及びジフテリア毒素ＣＲＭ１９７タンパク質０．４８μｇ及び脂質０．１３８ｍｇを含有する１４個の一価配合物の等価体を含有していた。したがって、マウスに投与される多価（１４個の血清型）ワクチンは、総計で肺炎球菌多糖２．８μｇ及びジフテリア毒素ＣＲＭ１９７タンパク質６．７２μｇ及び脂質１．９３５ｍｇを含有する。
【００５２】
マウスの２つの群を以下のように免疫化した。
【００５３】
群１は、投薬間で１４日間隔での単一血清型リポソーム組成物のブレンド（多価）の３回用量、続く最終のリポソーム配合物投薬の８週後に投与される肺炎球菌多糖ワクチン（ニューモバックス）ブーストにより免疫化した。
【００５４】
投与されるニューモバックス用量は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の２３個の肺炎球菌型、即ち血清型（１  ２  ３  ４  ５  ６Ｂ  ７Ｆ  ８  ９Ｎ  ９Ｖ  １０Ａ  １１Ａ  １２Ｆ  １４  １５Ｂ  １７Ｆ  １８Ｃ  １９Ｆ  １９Ａ  ２０  ２２Ｆ  ２３Ｆ＆３３Ｆ）由来の高度に精製された莢膜多糖の混合物から成る。各精製莢膜多糖血清型に対して投与される用量レベルは７．５μｇであり、したがってニューモバックスの投与される総計多糖用量は１７２．５μｇであった。
【００５５】
群２は、投薬間で１４日間隔での肺炎球菌多糖ワクチン（ニューモバックス）の３回用量、続く第３のニューモバックス投薬の８週後に投与される肺炎球菌多糖ワクチン（ニューモバックス）ブーストにより免疫化した。
【００５６】
生肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)チャレンジを、最終投薬の４週後に全てのマウスに対して行った。簡潔に述べると、ウシブロス中に懸濁され、且つさらに４．０×１０７ＣＦＵ／ｍｌに希釈された５％ウマ血液寒天プレートからの新鮮なオーバーナイトコロニー（overnight colonies）から調製される肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)（血清型６Ｂ）懸濁液で、マウスを腹腔内でチャレンジした。
【００５７】
マウスは、細菌チャレンジの投与後６日間観察しそれらの挙動及び臨床的徴候に基づいて以下のように０〜４にスコア付けした。
【００５８】
スコア０：  健常
スコア１：  感染及び炎症の軽微な臨床的徴候、例えば苦痛及び疼痛の軽微な徴候の観察、活動の変化及び社会的離脱症状。
【００５９】
スコア２：  こわばった動き、好奇心の欠如、強制換気、体位の変化、皮膚における立毛又は動きの変化のような感染の重篤な徴候。
【００６０】
スコア３：  重篤な疼痛、動物の苦しみを最低限に抑えるために、マウスを即座に犠牲にした。
【００６１】
スコア４：  マウスは死亡した。
結果：
生肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)チャレンジ後のマウスにおいて観察された反応の結果を表４及び表５に示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５】
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【００６４】
コメント：
結果により、マウスは、肺炎球菌多糖ワクチン（ニューモバックス）単独による免疫化と比較して、肺炎多糖ワクチン（ニューモバックス）ブーストを伴う、リポソーム内に同時封入された肺炎球菌多糖及びタンパク質ジフテリア毒素（１９７）ＣＲＭ突然変異体を含む単一血清型リポソーム組成物のブレンド（多価）の免疫化後に、生肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)チャレンジ（血清型６Ｂ）に対して良好に防御されることが実証される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、配合物ＩＤ１、ＩＤ２及びＩＤ３、並びにＡｃｔ−Ｈｉｂ（コレステロール無し）を投与した場合のマウスの抗ＰＳ（ＰＲＰ）抗体反応を示す（実施例１）。
【図２】図２は、配合物ＩＤ４、ＩＤ１、及びＡｃｔ−Ｈｉｂ（コレステロールを有する）を投与した場合のマウスの抗ＰＳ（ＰＲＰ）抗体反応を示す（実施例１）。
【図３】図３は、試験した７つの血清型に対する免疫化前及び後のＩｇＧ抗体反応を示す（実施例２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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