(57)【要約】  本発明は、（ａ）Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又は好ましくは５コイルを含むその一部及び（ｂ）アンチコドン認識ドメイン又は好ましくは１４コイルを含むその一部を含む単離されたチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアントを提供する。好ましくは、５コイルと１４コイルは、固有のヒトＴｙｒＲＳ中の対応する空間的分離に比べて、バリアントの三次構造中のより大きな空間的分離を有する。このバリアントは、好ましくは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）に比べて少なくとも約５０％のアミノ酸残基配列同一性を含み、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列に比べて少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、好ましくは、ポリペプチドの三次構造の外部部分上の５コイル中に露出されたＥＬＲモチーフを提示する。好ましいＴｙｒＲＳタンパク質バリアントは、配列番号４のアミノ酸残基配列又はその一部を含む。本発明のタンパク質及びタンパク質断片は、血管新生作用を有しており、哺乳動物組織中で血管新生を刺激するのに有用である。
2009519241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はその一部；及び
（ｂ）アンチコドン認識ドメイン又はその一部；
を含み、
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）に比べて少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、及び固有のヒトＴｙｒＲＳの血管新生活性より大きい血管新生活性を示す、
単離されたチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアント。
【請求項２】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも５０％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項３】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも８０％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項４】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも９５％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項５】
配列番号３の位置４６、３４０及び３４１に対応する位置の１つ又はそれ以上にアミノ酸残基の非保存的残基置換を含む、請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項６】
配列番号３の残基３４１に対応する位置に非極性アミノ酸残基を含む、請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項７】
（ａ）Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はα５コイルを含むその一部；及び
（ｂ）アンチコドン認識ドメイン又はα１４コイルを含むその一部
を含み；
前記バリアントが、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）に比べて少なくとも５０％のアミノ酸残基配列同一性を有し、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列に対して少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、並びに前記バリアントの三次構造中のα５コイルとα１４コイルの間に、固有のヒトＴｙｒＲＳ中のα５コイルとα１４コイルの分離より大きい分離を有する、
単離されたチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアント。
【請求項８】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも８０％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項９】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも９５％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１０】
配列番号３の位置４６、３４０及び３４１に対応する１つ又はそれ以上の位置にアミノ酸残基の非保存的残基置換を含む、請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１１】
配列番号３の残基３４１に対応する位置に非極性アミノ酸残基を含む、請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１２】
配列番号３の位置４６に対応する位置に大きな非極性側鎖を有するアミノ酸残基を含む、請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１３】
配列番号３の位置３４０に対応する位置に大きな非極性側鎖を有するアミノ酸残基を含む、請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１４】
（ａ）Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はＥＬＲモチーフを含むα５コイルを含むその一部；及び
（ｂ）アンチコドン認識ドメイン又はα１４コイルを含むその一部
を含み；
α１４コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素とα５コイルのＥＬＲモチーフの何れかのアミノ酸残基のα炭素との間の空間的分離によって測定された場合に、α５コイルのＥＬＲモチーフは、前記バリアントの三次構造中のα１４コイルから少なくとも約６オングストローム隔てられており、
前記バリアントは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比べて少なくとも５０％のアミノ酸残基配列同一性を有し、配列番号３の位置３４１に対応するチロシンの代わりに非極性アミノ酸残基を含み、及びポリペプチドの三次構造の外部部分上に露出されたＥＬＲモチーフを提示する、
単離されたチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアント。
【請求項１５】
非極性アミノ酸残基が脂肪族側鎖を有する、請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１６】
非極性アミノ酸残基が、グリシン残基、アラニン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びプロリン残基からなる群から選択される、請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１７】
非極性アミノ酸残基が、グリシン残基、アラニン残基及びプロリン残基からなる群から選択される、請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１８】
非極性アミノ酸残基がアラニン残基である、請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項１９】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも８０％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項２０】
ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比較して少なくとも９５％のアミノ酸残基配列同一性を有する、請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項２１】
配列番号４のアミノ酸残基配列又は少なくとも配列番号４の残基１から３６４を含むその断片を含む単離されたチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアントであり、配列番号４の位置３４１の残基Ｘが、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びプロリン残基からなる群から選択される、前記ポリペプチドバリアント。
【請求項２２】
配列番号４の位置３４１の残基Ｘが、グリシン残基、アラニン残基及びプロリン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である、請求項２１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項２３】
配列番号４の位置３４１の残基Ｘが、アラニン残基である、請求項２１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸残基配列からなる単離されたチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアントであり、配列番号４の位置３４１の残基Ｘが、グリシン残基、アラニン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びプロリン残基からなる群から選択される、前記ポリペプチドバリアント。
【請求項２５】
配列番号４の位置３４１の残基Ｘが、グリシン残基、アラニン残基及びプロリン残基からなる群から選択される、請求項２４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項２６】
配列番号４の位置３４１の残基Ｘが、アラニン残基である、請求項２４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント。
【請求項２７】
哺乳動物の組織中の血管新生を刺激する方法であり、前記組織を請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの血管新生量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２８】
哺乳動物の組織中の血管新生を刺激する方法であり、前記組織を請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの血管新生量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２９】
哺乳動物の組織中の血管新生を刺激する方法であり、前記組織を請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの血管新生量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３０】
哺乳動物の組織中の血管新生を刺激する方法であり、前記組織を請求項２１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの血管新生量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３１】
哺乳動物の組織中の血管新生を刺激する方法であり、前記組織を請求項２４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの血管新生量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３２】
哺乳動物の組織中の内皮細胞遊走を促進する方法であり、前記組織を請求項１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの内皮細胞遊走刺激量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３３】
哺乳動物の組織中の内皮細胞遊走を促進する方法であり、前記組織を請求項７に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの内皮細胞遊走刺激量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３４】
哺乳動物の組織中の内皮細胞遊走を促進する方法であり、前記組織を請求項１４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの内皮細胞遊走刺激量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３５】
哺乳動物の組織中の内皮細胞遊走を促進する方法であり、前記組織を請求項２１に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの内皮細胞遊走刺激量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３６】
哺乳動物の組織中の内皮細胞遊走を促進する方法であり、前記組織を請求項２４に記載のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの内皮細胞遊走刺激量と接触させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／７４１，５８０号（参照により、本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての記述
本明細書に記載されている研究の一部は、国立衛生研究所からのグラント番号ＣＡ９２５７７によって支援された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、血管新生作用を有するチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）組成物に関する。より具体的には、本発明は、血管新生作用を有するＴｙｒＲＳタンパク質バリアント及び血管新生作用を有するその断片並びにこれらを用いて血管新生を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、タンパク質合成における第一段階として、アミノ酸をそれらの同族ｔＲＮＡへの付加を触媒する不可欠な酵素である。これらの不可欠な酵素は、特有の配列モチーフの存在及びそれらの触媒ドメインの全体的な構造に基づいて、２つのクラスに分けられる。クラスＩシンテターゼは、その１０個のメンバーの触媒ドメイン内に、２つの高度に保存されたアミノ酸モチーフ、すなわち配列ＨＩＧＨ（配列番号１）及びＫＭＳＫＳ（配列番号２）を有する。これに対して、クラスＩＩシンテターゼは、モチーフ１から３と称される３つの高度に縮重した配列モチーフを有する。過去２０年にわたって、ＲＮＡスプライシング、核外輸送及び遺伝子転写の制御など、ｔＲＮＡシンテターゼについての幾つかのさらなる役割が発見された。これらのさらなる機能は、これらの古い酵素の長い進化の間に獲得されてきた。これらの追加された機能の多くは、コアシンテターゼ配列に融合された、付加されたドメインの結果である。より高等な真核生物では、２つのシンテターゼの付加されたドメインは、コア酵素の機能とは無関係な機能的な生物学的役割を有することが示されている。例えば、２つのヒトｔＲＮＡシンテターゼ、すなわち、チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）及びトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）の断片は、サイトカイン様活性を有することが示されている。ミニ−ＴｒｐＲＳ及びＴ２−ＴｒｐＲＳとして知られるヒトＴｒｐＲＳの２つの関連する断片は、血管新生の負の制御因子である。ヒトＴｙｒＲＳ（配列番号３）は、容易に、活性な２つの断片に分離することが可能である。Ｃ末端の付加されたドメイン断片は、炎症促進性サイトカイン内皮細胞−単球−活性化ポリペプチドＩＩ（ＥＭＡＰＩＩ）と同様の活性を有するのに対して、Ｎ末端断片（ミニ−ＴｙｒＲＳ、配列番号３の残基１から３６４）は、血管新生を誘導する。
【０００５】
血管新生は、血管新生促進因子と血管新生抑制因子との注意深いバランスが維持されなければならない、強固に制御されたプロセスである。血管の過剰な増殖又は不十分な増殖をもたらす、このバランスの崩壊には、加齢性黄斑変性、関節リウマチ、創傷治癒の遅延及び多くの他の症状などの疾病が付随する。制御は、転写及び翻訳調節、翻訳後修飾及びリガンドのプロセッシングなど、様々なプロセスを通じて調節される。腫瘍壊死因子α及び肝細胞成長因子などの他の血管新生促進性サイトカインは、前駆体タンパク質のタンパク分解切断によって生成される。同様に、プロテアーゼによる切断は、ヒトＴｒｐＲＳ及びＴｙｒＲＳからの活性なサイトカイン断片を放出する。
【０００６】
より高等な真核生物のＴｒｐＲＳ及びＴｙｒＲＳ酵素は、βシートセグメントが介在された多数のαコイルを有するＲｏｓｓｍａｎｎ折り畳みを含むコア触媒領域から構成される。ヒトＴｙｒＲＳ（配列番号３の残基１から２３０）のＲｏｓｓｍａｎｎ折り畳み触媒ドメインは、アンチコドン認識ドメインのＲｏｓｓｍａｎｎ折り畳みドメインのα５コイルとα１４コイルの間の水素結合係留を含む（図３、下部パネル及び図４、上部パネル参照）。係留は、タンパク質の活性部位ドメインのα５コイル中のＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）モチーフを部分的に封鎖する。
【０００７】
ヒトＴｙｒＲＳ及びＴｒｐＲＳの触媒ドメインは、各々、それぞれ、Ｃ末端又はＮ末端伸長が付加されたそれらの対応するそれぞれの細菌及び下等真核生物酵素の触媒ドメインに相同的である。ヒトＴｙｒＲＳのＣ末端伸長は、炎症促進性サイトカインＥＭＡＰＩＩに対して約５１％の配列同一性を共有する。各事例において、完全長の酵素は、シンテターゼとして機能的であるが、サイトカインとしては不活性である。高等な真核生物に特有の伸長が取り除かれると、酵素は、血管新生を調節することができる活性なサイトカインとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
固有のヒトＴｙｒＲＳ中の触媒性Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳みドメインのα５コイル及びアンチコドン認識ドメインのα１４コイルの分離に比べて、これらのコイル間の分離を開くことによって、タンパク質が血管新生作用を有するようになることがここに発見された。本発明は、哺乳動物の組織中の血管新生を刺激するのに有用であるＴｙｒＲＳタンパク質バリアント及びその断片を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物の組織中の血管新生を刺激するのに適している生物学的に活性なＴｙｒＲＳタンパク質バリアント及び血管新生作用を有するその断片（本明細書において、「ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントと総称される。）を提供する。本発明の単離されたチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）ポリペプチドバリアントは、Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳みドメイン又はその一部、アンチコドン認識ドメイン又はその一部を含み、及びヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）に対して、少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含む。バリアントは、固有のヒトＴｙｒＲＳの血管新生活性より大きい血管新生活性を示す。好ましくは、本発明のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比べて少なくとも５０％のアミノ酸残基配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、最も好ましくは、配列番号３と比べて少なくとも約９５％の配列同一性を有する。好ましくは、ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、配列番号３の位置４６、３４０及び３４１に対応する位置の１つ又はそれ以上にアミノ酸残基の非保存的残基置換を含む。
【００１０】
好ましい実施形態において、本発明のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はα５コイルを含むその一部及びアンチコドン認識ドメイン又はα１４コイルを含むその一部を含む。ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、固有のヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３、図１）と比較して少なくとも約５０％の配列同一性を有する、アミノ酸残基配列を有する。このバリアントは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列に対して少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、前記置換は、固有のヒトＴｙｒＲＳ中のα５コイルとα１４コイルの分離に比べて、α５コイルとα１４コイルの間の分離の間隔を開かせる。好ましくは、α１４コイルは、α１４コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素とα５コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素間の空間的分離によって測定された場合に、このバリアントの三次構造中のα５コイルから少なくとも約６オングストローム分離される。このバリアントは、好ましくは、α５コイルとα１４コイル間に水素結合を含まない。
【００１１】
本発明のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの別の好ましい実施形態において、α５コイルはＥＬＲモチーフを含み、及び、α１４コイルは、α１４コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素とα５コイルのＥＬＲモチーフの何れかのアミノ酸残基のα炭素間の空間的分離によって測定された場合に、このバリアントの三次構造中のα５コイルのＥＬＲモチーフから少なくとも約６オングストローム離れている。このバリアントは、ポリペプチド三次構造の外部部分上の露出されたＥＬＲモチーフを提示する。ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３、図１）と比べて少なくとも約５０％のアミノ酸残基配列同一性を有し、及びヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列と比べて少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、該置換は、ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントのα５コイルのＥＬＲモチーフとα１４コイルのアミノ酸残基との間に水素結合係留の形成を妨げ、又は、その他、バリアントの三次構造中にＥＬＲモチーフの露出をもたらす。
【００１２】
さらに別の好ましい実施形態において、ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、配列番号３の位置４６、３４０及び３４１の１つ又はそれ以上に対応するアミノ酸残基の非保存的アミノ酸残基置換を含む。特に好ましい置換は、配列番号３の位置３４１のチロシンに対応するアミノ酸を、脂肪族側鎖、好ましくはアラニン残基などの非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基で置換することである。
【００１３】
本発明のＴｙｒＲＳバリアントは、哺乳動物（例えば、ヒト）組織中で血管新生を刺激するのに適している。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載されているように、組織を本発明のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントと接触させることによって、哺乳動物の組織中における血管新生及び内皮細胞遊走を刺激する方法も提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
タンパク質中のアミノ酸残基は、主として、アミノ酸の側鎖によって付与される物理化学的特性に基づいて、様々な方法で分類されてきた。例えば、１つの一般的な分類には、（１）グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン及びロイシンなどの疎水性（非極性）アミノ酸；（２）アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンなどの帯電したアミノ酸；（３）並びにセリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、システイン、アスパラギン、グルタミン及びトリプトファンなどの極性アミノ酸というアミノ酸の３つのカテゴリーが含まれ、グリシンは、それ自体、第四のカテゴリーに含まれることがある（Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｏｆ  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．  １９９８，  ｐａｇｅｓ  ３−１２を参照されたい。参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【００１６】
アミノ酸残基は、それらの側鎖が脂肪族又は芳香族であるか、小さいか又は大きいか、極性か又は非極性か、帯電しているか又は帯電していないか、これらの組み合わせなどに基づいてさらに分類することも可能である。本明細書において使用される非極性脂肪族アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びプロリンが含まれ、帯電していない大きいアミノ酸には、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンが含まれ、小さな非極性アミノ酸には、グリシン、アラニン及びプロリンが含まれる。
【００１７】
本明細書において、及び添付の特許請求の範囲において使用される「非保存的」という用語は、アミノ酸残基の置換に関連して使用される場合、野生型又は天然のタンパク質中のアミノ酸残基を、著しく異なる構造的カテゴリーのアミノ酸残基、例えば、著しく異なる極性分類（すなわち、非極性対極性）、サイズ分類、電荷分類、これらの組み合わせなどを有するアミノ酸残基で置換することを意味する。例えば、非保存的置換の場合、チロシンなどの極性アミノ酸は、非極性アミノ酸、比較的小さな非極性アミノ酸などによって置換することができるのに対して、グリシン又はアラニンなどの小さな非極性アミノ酸は、大きいアミノ酸、帯電したアミノ酸などによって置換することが可能である。
【００１８】
本発明を具体化する好ましい単離されたＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、哺乳動物組織中で血管新生を刺激するのに適しており、Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はα５コイルを含むその一部及びアンチコドン認識ドメイン又はα１４コイルを含むその一部を含む。このバリアントは、このバリアント中のα５コイルとα１４コイルの間に分離を含み、該分離は、固有のヒトＴｙｒＲＳ中のα５コイルとα１４コイルの間の分離より大きい。好ましくは、α１４コイルは、α１４コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素とα５コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素間の空間的分離によって測定された場合に、このバリアントの三次構造中のα５コイルから少なくとも約６オングストローム分離される。このバリアントは、好ましくは、α５コイルとα１４コイルの間に水素結合を含まない。ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、固有のヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３、図１）と比較して少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性のアミノ酸残基配列同一性を有する。このバリアントは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列に対して少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、前記置換は、固有のヒトＴｙｒＲＳ中のα５コイルとα１４コイルの分離に比べて、α５コイルとα１４コイルの間の分離の間隔を開かせ、このバリアントに血管新生活性を付与する。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、本発明のＴｙｒＲＳバリアントは、ポリペプチドの三次構造の外部部分の露出されたＥＬＲモチーフを提示し、及びヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比べて少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９５％の配列同一性のアミノ酸残基配列同一性を有するＲｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はその一部を含む。ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列に対して少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基置換を含み、前記置換は、触媒性Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳みドメインのα５コイルのＥＬＲモチーフを露出させ、これにより、ポリペプチドが血管新生作用を有するようにする。本発明のバリアントにおいて、好ましくは、α１４コイルの何れかのアミノ酸残基のα炭素とα５コイルのＥＬＲモチーフの何れかのアミノ酸残基のα炭素間の空間的分離によって測定された場合に、α５コイルのＥＬＲ残基は、好ましくは、それぞれ、バリアントの三次構造中のα１４コイルの残基から少なくとも約６オングストローム離れている。
【００２０】
好ましくは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸残基の置換は、配列番号３のアミノ酸残基４６、３４０及び３４１に対応する位置の１つ又はそれ以上におけるアミノ酸残基の置換である。例えば、配列番号３の位置３４１におけるチロシンは、好ましくは、非極性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びプロリンなどの非極性脂肪族アミノ酸）によって置換されている。配列番号３の位置４６のグリシン及び／又は位置３４０のアラニンに対応するアミノ酸残基は、好ましくは、大きな非極性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンなどの巨大な非帯電疎水性アミノ酸）によって置換される。本明細書において使用される、配列番号３などの指定された配列内のアミノ酸残基「に対応する」ＴｙｒＲＳポリペプチドバリアント中のアミノ酸という表記は、相同配列が指定された配列と比較された場合に、配列番号３中の指定された位置と（すなわち、対応して）並置されるＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの相同配列中に位置に存在するアミノ酸を意味する。タンパク質分野の当業者は、相同配列中のアミノ酸残基の付番が、指定された配列（例えば、配列番号３）中の付番と異なり得ることを理解する。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明の単離されたＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、タンパク質又は断片の外部部分の露出されたＥＬＲモチーフを提示するＲｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域又はその一部を含み、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）と比べて少なくとも約５０％のアミノ酸残基配列同一性を有する。好ましくは、このバリアントのアミノ酸残基配列は、配列番号３と比べて少なくとも約８０％、より好ましくは約９５％の配列同一性を有し、配列番号３の位置３４１に対応する位置に非極性側鎖を有するアミノ酸残基を含む。好ましくは、アミノ酸残基は、非極性脂肪族側鎖を有する。例えば、ヒトＴｙｒＲＳのチロシン残基３４１に対応するバリアントのアミノ酸残基は、グリシン残基、アラニン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基又はプロリン残基であり得る。幾つかの実施形態において、ヒトＴｙｒＲＳのチロシン３４１に対応するアミノ酸残基は、グリシン残基、アラニン残基又はプロリン残基、好ましくはアラニン残基である。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、単離されたＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、配列番号４のアミノ酸残基配列（図２）又はその断片を含み、配列番号４の位置３４１の残基Ｘは、グリシン残基、アラニン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基又はプロリン残基、好ましくはグリシン、アラニン又はプロリン残基、より好ましくはアラニン残基である。好ましくはＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、配列番号４のＮ末端領域全体（すなわち、残基１から３６４）を含む。好ましくは、断片は、少なくともＲｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域のα５鎖の残基、すなわち、配列番号４の位置８７から１０４に対応する残基を含む。より好ましくは、断片は、Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み領域全体（配列番号４の残基１から２３０）を包含する。
【００２３】
血管新生作用を有する本発明の特に好ましいＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントは、配列番号４のアミノ酸残基配列からなり、配列番号４の位置３４１の残基Ｘは、グリシン残基、アラニン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びプロリン残基からなる群から選択される。より好ましくは、配列番号４の位置３４１の残基Ｘは、グリシン残基、アラニン残基及びプロリン残基からなる群から、最も好ましくはアラニン残基から選択される。
【００２４】
本発明は、哺乳動物の組織中の血管新生を刺激する方法も提供する。本方法は、本明細書に詳しく記載されているような、本発明のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの血管新生量と組織を接触させることを含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は、哺乳動物の組織中の内皮細胞遊走を刺激する方法を提供する。本方法は、本明細書に詳しく記載されているような、本発明のＴｙｒＲＳポリペプチドバリアントの内皮細胞遊走刺激量と組織を接触させることを含む。
【００２６】
方法及び操作
プラスミドの構築。ＴｙｒＲＳ−３４１Ａ及びミニ−ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａプラスミドは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ位置指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いて構築した。テンプレートは、それぞれ、野生型ＴｙｒＲＳ及びミニ−ＴｙｒＲＳを含有するｐＥＴ２０ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｓｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターであった。全てのタンパク質は、ポリペプチドの単離を促進するために、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグとともに発現された。合成オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。
【００２７】
タンパク質の酸性及びエンドトキシンの除去。イー・コリＢ１２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中で組換えポリペプチドを発現させた。０．８のＯＤ６００になるまで細胞を増殖させ、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで３時間誘導した（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。次いで、細胞を沈降させ、緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、３０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ）中に再懸濁した。音波処理による溶解後に、７４，０００ｇでの３０分間の遠心によって、細胞破片を分離した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｈｉｓタグを付加されたポリペプチドを精製した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）上に上清をかけ、１００ｍＬ緩衝液Ｂ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた緩衝液Ａ）及び１５０ｍＬ緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ａと緩衝液Ｃ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ）の線形グラジエントによってポリペプチドを溶出した。９５％超純粋なポリペプチドを含有する画分をプールし、濃縮し、保存緩衝液（５０％リン酸緩衝化生理的食塩水ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトールＤＴＴ）中に濃縮及び透析した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を標準として、Ｂｉｏ−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定された。エンドトキシン濃度は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて測定した。
【００２８】
小角度Ｘ線散乱。Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＳＲＬ）のビームライン４−２上で、野生型ＴｙｒＲＳ及び本発明のＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａバリアントに対して、小角度Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）測定を実施した。様々な濃度（２から２０ｇ／Ｌ）で、試料に対してＸ線散乱曲線を測定した。Ｘ線波長（λ）は１．３８Åであり、検出装置チャンネルの数字は、運動量移行Ｑ＝４π＊ｓｉｎθ／λ（２＊θは、散乱角度である。）へ変換された。極めて小さい散乱角度から中程度の散乱角度までをカバーするために（すなわち、約０．０１から０．２５Å−１のＱ域をカバーする２．５メートル及び約０．０３から０．９３Å−１のＱ域をカバーする０．５メートル）、試料から検出装置までの２つの異なる距離を使用した。
【００２９】
雲母ウィンドウを有するポリカーボナートのセルに、分取試料を満たし、測定を通じて２０℃に保った。データ収集を通じて、ＭａｒＣＣＤ１６５検出装置を使用した。データ収集の典型的な群は、それぞれ１０秒間連続して記録された２４の二次元散乱画像からなった。マッチする緩衝液の散乱データとともに、一連のデータを処理し、典型的には、タンパク質溶液測定の直後又は直前に記録した。積算された光線強度に対して、データのスケールを調節し、方位的に平均化し、照射による損傷によって通常引き起こされる時間依存性の変化を調べ、統計的に解析した。マッチさせた緩衝液データの変動に比べて約１．５倍高いタンパク質データの統計学的変動が、平均化において許容された。そのレベルを超えて、第一のタンパク質散乱データ枠に関して偏差のより高いレベルを示した全てのデータ枠は、拒絶された。上記データプロセッシング後に、対応するタンパク質散乱曲線から処理された緩衝液散乱曲線を差し引いた。
【００３０】
小角度及び高角度データのスケール調節は、ＰＲＩＭＵＳソフトウェアプログラム（Ｋｏｎａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．“ＰＲＩＭＵＳ：ａ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＰＣ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．３６：１２７７−１２８２）によって行い、これは、０．４５から１．３のＱ＊Ｒｇ域中でのＧｕｉｎｉｅｒプロットによってＲｇ及びＩ（Ｑ＝０）を計算するためにも使用した。ＳｖｅｒｇｕｎらのＧＮＯＭ小角度散乱データプロセッシングプログラム（ｅｍｂｌ−ｈａｍｂｕｒｇ（ｄｏｔ）ｄｅ  ｗｅｂｓｉｔｅから入手可能）を用いて（当初、小角度データは、最大距離（Ｄｍａｘ）の正確な推定を得るためのみに使用）、実験データの間接Ｆｕｒｉｅｒ変換によって、電子対距離分布関数（Ｐ（ｒ）を得た。次いで、モデル構築に関して上で指定されたＤｍａｘ値を有する高角度データなど、Ｐ（ｒ）を再計算した。
【００３１】
プロテアーゼ消化。野生型ＴｙｒＲＳ及びＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａを、約３２μｇ／プラスミン１μｇのタンパク質対プロテアーゼ比及びエラスターゼに対して２５００μｇ／単位で、プラスミン又は白血病エラスターゼと混合した。０．１％の最終濃度になるように、ギ酸の添加によって反応を停止させる前に、２０℃で約２時間、混合物を温置した。混合物中の切断断片は、ＭＡＬＤＩＴＯＦ質量分光法によって、及びＥｄｍａｎ分解を用いたＮ末端配列決定によって分析した。
【００３２】
ＣＡＭ血管新生アッセイ。ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）血管新生アッセイは、以下の操作によって行った。トリ白血症ウイルスに対する補体固定（ＣＯＦＡＬ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｖｉａｎ  ｌｅｕｋｏｓｉｓ）陰性の受精卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｓｔｏｒｒｓ，ＣＴ）を、３８℃／６０％湿度で、３．５日間温置した。次いで、卵を開封し、無菌のプラスチック舟形秤中に胚を移した。胚を覆い、３７．５℃／９０％湿度で温置した。５日後に、ＰＢＳ約３０μＬ、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ（それぞれ、約０．１５及び０．５μｇ）又はＴｙｒＲＳポリペプチド（１μＭ）を含有するコラーゲン／メッシュオンプラントを、胚のＣＡＭ膜上に配置し、さらに６６時間温置した。インプラントの上部メッシュ層を立体顕微鏡下で検査し、箱の総数に対する、血管を含有する「箱」（すなわち、メッシュファイバーによって画される三次元領域）の割合を計数した。
【００３３】
マウスマトリゲル血管新生アッセイ。胸腺欠損ｗｅｈｉマウスの皮下に、ＰＢＳ、２０ｎＭＶＥＧＦ又は２５０ｎＭＴｙｒＲＳ、ミニ−ＴｙｒＲＳ、ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａ又はミニ−ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａが補充された、成長因子が枯渇されたＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）４００μＬを移植した。５日後に、フルオレセイン標識された内皮結合レクチングリフォニア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ）（バンデイラエア）（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）シンプリシフォリア（Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）Ｉ、イソレクチンＢ４（ＧＳＬ−Ｂ４）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）をマウスに静脈内注射した。Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを切除し、ラジオイムノ沈降（ＲＩＰＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）中にホモゲナイズした。ホモゲナイゼーション後、分光光度分析によって各プラグのフルオレセイン含量を定量した。
【００３４】
内皮細胞遊走アッセイ。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＥＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中の６ウェルプレートのウェル当り約３×１０５細胞の密度で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）を播種し、集密状態の単層になるまで増殖させた。ＦＢＳを含有しない培地中で、１６時間、細胞を飢餓状態とし、ピペットチップを用いて、ウェル全体にわたって傷をつけた。細胞破片を除去するために、無血清培地で、傷をつけた層を２回洗浄し、ＴｙｒＲＳバリアント及び対照因子の存在下及び不存在下で、細胞を遊走させた。傷をつけてから０及び６時間後に、傷をつけた無細胞領域の画像を撮影し、画像分析ソフトウェア（ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ１．３３）を用いて分析した。内皮細胞の遊走は、最初の傷の領域と比較した残りの無細胞領域の％として計算され、そこから、各条件に対して閉鎖された％領域を求めた。
【００３５】
アミノ酸活性化。アミノ酸活性化は、ＡＴＰ−ピロリン酸（ＰＰｉ）交換反応によってアッセイを行った。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）、ＫＦ（１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＮａＰＰｉ（２ｍＭ、１３０ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）、β−メルカプトエタノール（５ｍＭ）、チロシン（２ｍＭ）及びポリペプチド２００ｎＭを含有する緩衝液中、３７℃で反応を行った。
【００３６】
結果と考察
ＴｙｒＲＳの残基ＹＳ４１は、ＥＬＲモチーフ周囲の構造を保護した。ミニ−ＴｙｒＲＳ（すなわち、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基１から３６４）は、血管新生促進性サイトカインとして作用するが、完全長ＴｙｒＲＳは作用しないことが知られている。血管新生促進活性は、ＩＬ−８などのＣＸＣケモカイン中にも存在し、その活性に必要とされるＥＬＲモチーフの存在に依存する。Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み触媒ドメイン（黄色、残基１から２３０）、アンチコドン認識ドメイン（緑、残基２３１から３６４）及びＣ末端ドメイン（紫、残基３６４から５２８）という３つのドメインから構成されるＴｙｒＲＳのアミノ酸配列の模式図が、図３の上部パネルに示されている。第一の２つのドメインは、活性なコア酵素を形成し、これは、ミニＴｙｒＲＳ（残基１から３６４）と呼ばれる。ミニ−ＴｙｒＲＳの最近解明された三次構造は、ＥＬＲモチーフの周囲に、タンパク質のアンチコドン認識と活性部位ドメインを係留する水素結合ネットワークを明らかにしている（図３、下部パネル参照）。ＥＬＲモチーフのＲ９３の側鎖とアンチコドン認識ドメインの主鎖Ａ３４０の間に、α５コイルをα１４コイルに係留する２つの水素結合相互作用が存在する。さらに、Ｙ３４１の芳香環と主鎖Ｇ４６の積層的相互作用は、これらのドメインの間に接触を作り出す。これら４つの残基のうち、これまで同定された全ての真核生物のＴｙｒＲＳタンパク質中で、Ｒ９３、Ｇ４６及びＹ３４１が保存されている。図３（下部パネル）に示されているように、各断片の表面静電電位の相補性が、α５コイルとα１４コイル間の係留に対する証拠を与える。（へリックスα５上）のＥＬＲモチーフは、Ｃドメインによって遮蔽されており、Ｃドメインが除去されると露出される。この理由のため、ミニＴｙｒＲＳは血管新生に対して活性であるのに対して、完全長ＴｙｒＲＳは血管新生に対して不活性である。（ヘリックスα１４上のアンチコドン認識ドメインからの）Ｔｙｒ３４１残基はＥＬＲと相互作用し、ＥＬＲを封鎖するためにＣドメインを係留する上で重要な役割を果たしている。Ａ３４０も高度に保存されており、Ｓ．セレビシアエにおいて、別の小さなアミノ酸であるグリシンによってのみ置換されている。
【００３７】
Ｙ３４１Ａ変異によるＴｙｒＲＳの三次元構造の開放を実証するために、２つの独立した方法を使用した。第一の方法は、小角度Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）であった。電磁放射の波長が試料粒子のものと同じ長さスケールである場合に、粒子は放射を散乱する。この散乱パターンの検出及び分析は、粒子のサイズ、形状及び内部構造について貴重な情報を与えることができる。ＳＡＸＳ技術は、溶液中での（タンパク質のような）高分子の全体的な立体構造変化を検出するための強力な技術である。野生型ヒトＴｙｒＲＳとＹ３４１Ａ変異の両方で測定された散乱曲線から、各試料に対する電子対距離分布関数を計算した（図５）。続いて、分布関数Ｐ（ｒ）から、回転運動の半径（Ｒｇ）及び最大距離（Ｄｍａｘ）に対する値を求めた。
【００３８】
図４は、Ｒ９３とＹ３４１の間の水素結合係留を示している。水素結合係留の破壊は、三次構造を開放し、ＥＬＲモチーフを露出させる。野生型ヒトＴｙｒＲＳ及びＹ３４１がアラニンによって置換されたバリアント（ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａ）に関する小角度Ｘ線散乱研究は、このような開放に対する直接の証拠を与える（図５参照）。Ｘ線散乱研究は、電子対距離分布が、野生型タンパク質に比べて、バリアントで広がっていることを示した。ＴｙｒＲＳＹ３４１Ａは、野生型ＴｙｒＲＳのＲｇより、約４オングストローム大きいＲｇを有し、約２０オングストローム大きいＤｍａｘを有する。これは、ＴｙｒＲＳＹ３４１Ａが、野生型ＴｙｒＲＳに比べて、より開放され、伸長された立体構造を有することを示している。
【００３９】
野生型ヒトＴｙｒＲＳに比したＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１中の開放構造に対するさらなる裏づけは、プラスミンとエラスターゼを用いた消化研究から得られた。プロテアーゼは、一般に、αヘリックス又はβストランドのような確定された二次構造が存在しない柔軟なループ領域においてタンパク質を切断する。Ｙ３４１Ａ変異に伴ってＥＬＲモチーフを露出させる構造的な開放が存在することは、より弛緩された開放構造上のさらなる切断部位の結果として観察されたさらなる切断断片によって確認された。プラスミンと白血球エラスターゼの両方を使用して、野生型ＴｙｒＲＳに比べて、Ｙ３４１Ａ変異上にさらなる切断部位が観察された。観察されたさらなる切断部位は、Ｌ３３３、Ｋ３３４及びＡ３３７であり、これらは全て、変異部位３４１に近いアンチコドン認識ドメインのヘリックスα１４上に位置している。これは、Ｙ３４１Ａ変異において、α１４が弛緩されており、それ自体を柔軟なループとして提示し、もはやＥＬＲ領域に係留されていないことを確認した。図６は、ヒトＴｙｒＲＳの全体的三次構造に対するＹ３４１Ａ変異の開放効果を模式的に示している。
【００４０】
Ｙ３４１Ａ変異は、完全長ＴｙｒＲＳ上に血管新生活性を付与した。真核生物間でのその保存及びＥＬＲモチーフ周囲の領域中での三次元構造の安定性におけるその関与に鑑みると、Ｙ３４１は、変異に対する理想的な標的である。係留の破壊がサイトカイン及び酵素活性をどの程度変化させるかを測定するために、この残基は、完全長ＴｙｒＲＳ及びミニ−ＴｙｒＲＳ中でアラニンに変異された。サイトカイン活性は、血管新生に対するニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）及びＭａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいて検査された。
【００４１】
ミニ−ＴｙｒＲＳ中へのＹ３４１Ａ変異の導入は、ＣＡＭアッセイ中でのその活性に対して観察可能な効果をもたらさなかった。血管新生は、正常なポリペプチドとバリアントの両方によって促進された。完全長の野生型ヒトＴｙｒＲＳは、このアッセイでは非活性である。しかしながら、ヒトＴｙｒＲＳのＹ３４１をアラニンに変異させることによって（すなわち、ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａ）、この酵素は血管新生促進性サイトカインへと転化された。ＣＡＭアッセイで見られた結果を確認するために、このポリペプチドは、マウスＭａｔｒｉｇｅｌプラグモデル中においても検査した。このアッセイでは、ＰＢＳ又はその他のタンパク質を含有するコラーゲンプラグを皮下に注射した。プラグ内に血管新生促進因子が存在しない場合には、血管は、プラグ内に灌流する。蛍光内皮細胞結合レクチンを注射すると、分光光度分析によって各プラグ内の血管密度を定量することができる。このモデルでは、ＶＥＧＦ及びミニＴｙｒＲＳは何れも、血管新生活性について陽性であった。野生型ＴｙｒＲＳは非活性であり、血管新生のレベルはＰＢＳと同様であった。これに対して、ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａは血管新生を誘導した。これらのデータは、ＣＡＭアッセイの結果を独立に確認した。
【００４２】
Ｙ３４１Ａ変異を有するＴｙｒＲＳバリアントは、インプラントを含有するＣＡＭ膜の領域の新血管新生の顕著な増加を引き起こしたのに対して、野生型ポリペプチド及びＰＢＳは何れも応答を遊蕩しなかった（ポリペプチドは、ナイロンメッシュに包埋されたコラーゲンインプラント中に、１μＭの濃度で付与した。）。
【００４３】
図７は、さらに、マウスＭａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイ中でのＴｙｒＲＳポリペプチドのインビボ活性をさらに特徴付ける。マウスには、成長因子によって還元されたＭａｔｒｉｇｅｌのみで、又は２５０ｎＭタンパク質と混合して、４００μＬの皮下注射を投与した。５日の温置後、プラグを除去し、血管の存在について評価した。ＶＥＧＦ１６５（２０ｎＭ）を、陽性対照として使用した。以前に報告されたように、ミニ−ＴｙｒＲＳは、このアッセイにおいて血管新生応答を促進した。ミニーＴｙｒＲＳ中のＹ３４１のアラニンへの変異（すなわち、ミニ−ＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａ）は、この応答に影響を与えなかった。しかしながら、Ｙ３４１Ａ変異が完全長ＴｙｒＲＳ中で成された場合には、野生型ＴｙｒＲＳに比べて、血管新生応答の２倍の増加が認められた。
【００４４】
Ｙ３４１Ａ変異は、ＴｙｒＲＳがチロシンを活性化する能力を不活化した。アミノ酸活性化は、チロシン依存性のＡＴＰ−ＰＰｉ交換反応を測定することによって評価した。図８に示されているように、Ｙ３４１Ａ点変異は、完全長ＴｙｒＲＳ及びミニ−ＴｙｒＲＳがチロシルアデニラートを形成する能力を喪失させる。したがって、ｔＲＮＡのアミノアシル化に関与する構造要素は、サイトカイン機能に関与する構造要素と異なっている。
【００４５】
本発明のＴｙｒＲＳバリアントが内皮細胞遊走を刺激する能力（創傷治癒に付随する。）を評価するために、内皮細胞遊走アッセイを使用した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、１０％ＦＢＳを含有するＥＧＭ培地中に播種し、集密状態の単層になるまで増殖させた。ＦＢＳを含有しない培地中で、細胞を飢餓状態とし、次いで、ピペットチップを用いて、ウェル全体にわたって傷をつけた。細胞破片を除去するために、無血清培地で、傷をつけた層を洗浄し、ＴｙｒＲＳバリアント及び対照因子の存在下及び不存在下で、細胞を遊走させた。傷をつけてから０及び６時間後に、傷をつけた無細胞領域の画像を撮影し、画像分析ソフトウェア（ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ，ｖｅｒｓｉｏｎ１．３３）を用いて分析した。内皮細胞の遊走は、最初の傷の領域と比較した残りの無細胞領域の％として計算され、そこから、各条件に対して閉鎖された％領域を求めた。図９は、本発明のＴｙｒＲＳバリアント及び対照処理で処理された、傷をつけられた内皮細胞培養中の初期創傷の領域と比べた残りの無細胞領域の％（縦線）のグラフを示している。無細胞領域の相対的により小さなパーセントは、内皮細胞遊走及び創傷治癒の改善を示している。図９に示されているように、本発明のＴｙｒＲＳバリアントは、ミニＴｙｒＲＳと同程度まで、及び野生型ＴｙｒＲＳを上回る程度まで、内皮細胞遊走を刺激した。
【００４６】
本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施形態の多数の変形及び改変を実施し得る。本明細書に例示されている具体的な実施形態に関する限定は意図されておらず、又は推論すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基配列（配列番号３）を示している。
【図２】図２は、本発明の好ましいヒトＴｙｒＲＳバリアントのアミノ酸残基配列（配列番号４）を示している。
【図３】図３（上部パネル）は、Ｒｏｓｓｍａｎｎ折り畳み触媒ドメイン（黄色、残基１から２３０）、アンチコドン認識ドメイン（緑、残基２３１から３６４）及びＣ末端ドメイン（紫、残基３６４から５２８）という３つのドメインから構成される野生型ヒトＴｙｒＲＳ配列の模式図を示している。第一の２つのドメインは、活性なコア酵素を形成し、これは、ミニＴｙｒＲＳ（残基１から３６４）と呼ばれる。下のパネルは、実験的に決定された、ミニＴｙｒＲＳ及びＣドメインの両方の結晶構造に基づくヒトＴｙｒＲＳの二量体モデルを示している。
【図４】図４（上パネル）は、Ｙ３４１などの他の残基とのＥＬＲ領域の相互作用の詳細を示している。下部パネルは、多岐にわたる生物から得たＴｙｒＲＳの部分的配列の並置を示しており、ヒトＴｙｒＲＳの３つの領域に対応する残基、すなわち、残基３９から５５（領域１）、残基８７から９７（領域２）及び残基３３７から３４（領域３）が並置されている。ドメインの接触に関与する保存された残基は、強調表示されている。列１は、ヒトＴｙｒＲＳのアミノ酸残基を含み、領域１は配列番号５に対応し、領域２は配列番号６に対応し、及び領域３は配列番号７に対応する。列２は、マウスＴｙｒＲＳの並置を示し、ヒトＴｙｒＲＳと同様に、領域１は配列番号５に対応し、領域２は配列番号６に対応し、及び領域３は配列番号７に対応する。列３は、ウシＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号５に対応し、領域２は配列番号８に対応し、及び領域３は配列番号９に対応する。列４は、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号５に対応し、領域２は配列番号１０に対応し、及び領域３は配列番号１１に対応する。列５は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号１２に対応し、領域２は配列番号１３に対応し、及び領域３は配列番号１４に対応する。列６は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号１５に対応し、領域２は配列番号１６に対応し、及び領域３は配列番号１７に対応する。列７は、サッカロミセス・ポンベ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｐｏｍｂｅ）ＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号１８に対応し、領域２は配列番号１９に対応し、及び領域３は配列番号２０に対応する。列８は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号２１に対応し、領域２は配列番号２２に対応し、領域３は配列番号２３に対応する。列９は、バチルス・スブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴｙｒＲＳの並置を示し、領域１は配列番号２４に対応し、領域２は配列番号２５に対応し、及び領域３は配列番号２６に対応する。
【図５】図５は、ヒトＴｙｒＲＳ及びＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａに対するＸ線散乱分布を示している。電子対距離分布関数は、ヒトＴｙｒＲＳ及びＴｙｒＲＳのＹ３４１Ａ変異に対して、それらの測定された小角度Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ；ｓｍａｌｌ  ａｎｇｅｌ  ｘ−ｒａｙ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）曲線を用いて計算した。両分子に対して回転運動の半径（Ｒｇ）及び最大距離（Ｄｍａｘ）を計算した。Ｙ３４１Ａは、野生型ＴｙｒＲＳのＲｇ及びＤｍａｘより、約４オングストローム大きいＲｇ及び約２０オングストローム大きいＤｍａｘを有する。
【図６】図６は、ＥＬＲモチーフを露出させる、ヒトＴｙｒＲＳの全体的三次構造に対するＹ３４１Ａ変異の開放効果を模式的に示している。Ｙ３４１Ａ変異は、図に示されているとおり、ＳＡＸＳ分析及びプロテアーゼ消化研究によって、ＴｙｒＲＳ構造を開放することが示された。
【図７】図７は、マウスＭａｒｔｉｇｅｌ血管新生モデルにおけるＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａの活性を示している。マウスには、成長因子によって還元されたＭａｔｒｉｇｅｌのみで、又は２５０ｎＭＴｙｒＲＳタンパク質と混合して、４００μＬの皮下注射を与えた。ヒトＶＥＧＦ１６５（２０ｎＭ）を、陽性対照として使用した。５日間の温置後に、フルオレセイン標識された内皮結合レクチングリフォニア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ）（バンデイラエア）（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）シンプリシフォリア（Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）Ｉ、イソレクチンＢ４をマウスに静脈内注射した。プラグを切り出し、可溶化し、分光法によってフルオレセイン含量を評価した。開放されたＴｙｒＲＳＹ３４１Ａバリアントは、野生型ＴｙｒＲＳに比べて、増加した血管新生活性を有することが観察された。
【図８】図８は、ニワトリの絨毛尿膜アッセイ中のヒトＴｙｒＲＳ及びＴｙｒＲＳ−Ｙ３４１Ａの活性を示している。ＴｙｒＲＳタンパク質の血管新生活性は、ニワトリ絨毛尿膜アッセイを用いて、インビボで検査した。ＴｙｒＲＳバリアント（１μＭ）、ＶＥＧＦとｂＦＧＦの組み合わせからなる陽性対照及び緩衝液のみからなる陰性対照を、ナイロンメッシュに包埋されたコラーゲンオンプラント（ｏｎｐｌａｎｔ）中のＣＡＭに適用した。
【図９】図９は、本発明のＴｙｒＲＳバリアント及び対照処理で処理された、傷を受けた内皮細胞培養物中の初期創傷の面積と比べた残りの無細胞面積の％面積（縦線）のグラフを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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