(57)【要約】  化学的に修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体が開示され、ＨＡのグルクロン酸残基に直接的に連結されるヒドラジド基を含む。当該ヒドラジド基は、新規な架橋化および新規な標識化ＨＡ誘導体を得るために使用される。本発明はさらに、当該ＨＡ誘導体の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸（以後、ＨＡ）誘導体またはその塩であって、該誘導体は、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部がヒドラジド基に直接的に変換されたものである、ヒアルロン酸誘導体またはその塩。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸誘導体は、式：
ＨＡ−ＣＯ−ＮＲ１−ＮＨＲ２
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであるかまたは異なり、それぞれは、任意にハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオアルキル、ニトロ、シアノ、ＣＦ３、ＣＯＮＨ２、および−ＮＨ−ＮＨ２からなる群より選択される１つ以上のラジカルにより置換されていてもよいＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、アルカリル、アラルキル、またはヘテロ環であり、および／または、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニルのそれぞれは、ＯもしくはＳもしくは基Ｎ＋Ｒ３Ｒ４により中断されていてもよく、ここでＲ３およびＲ４は、同じであるかまたは異なり；それぞれは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ６−Ｃ１４アリールである］
により表わされる未架橋の化合物である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸誘導体は、式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２により表わされる、未架橋の、水溶性化合物である、請求項２に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項４】
前記未架橋の、水溶性化合物はさらに、Ｎ−アシル尿素基を含む、請求項３に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸誘導体は、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の一部と、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部との反応により形成される架橋化化合物であり、該カルボキシ基は、カルボジイミドにより活性化され、このことにより式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡにより表わされる架橋化化合物を生じる、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸誘導体は架橋化化合物であり、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部が、ヒドラジンを介して、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の別の一部と連結されて、式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡにより表わされる架橋化化合物を生じる、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸誘導体は、アミン特異的なまたはアミン反応性の同種二官能性または異種二官能性のリンカーＹを介して、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の一部と、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の別の一部との反応により形成される架橋化化合物であり、該架橋化ヒアルロン酸誘導体は、式：
ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡ
［式中、Ｙは、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、またはヘテロ環式の鎖である］
により表わされる、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項８】
アミン特異的なまたはアミン反応性の多官能性リンカーと、ヒドラジド基の一部との反応を介して共有結合的に架橋されたものである、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項９】
多官能性リンカーはポリアルデヒドである、請求項８に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１０】
ポリアルデヒドは、酸化ゼラチンおよび酸化コラーゲンからなる群より選択され、該コラーゲンは、天然、変性、または誘導体化コラーゲンの任意のタイプから選択される、請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１１】
ポリアルデヒドは酸化ゼラチンである、請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１２】
前記架橋されたヒアルロン酸誘導体はさらに、さらなる誘導体化に利用可能な未架橋のヒドラジド基を含む、請求項５〜１１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１３】
前記ヒアルロン酸誘導体は、薬理学的または生物学的に活性な薬剤と結合されている、請求項１〜１２のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１４】
薬理学的または生物学的に活性な薬剤は、抗生物質、抗感染薬、抗微生物剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、創傷治癒剤、麻酔薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、抗血栓剤、抗凝血剤、止血剤、線維素溶解剤、血栓溶解剤、増殖因子、サイトカイン、抗体、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、および高分子からなる群より選択される、請求項１３に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１５】
前記ヒアルロン酸は、約８００〜約４，０００，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１６】
前記ヒアルロン酸誘導体は、Ｄ−グルクロン基のカルボキシ部分の約０．５％から７０％がヒドラジド基に直接的に変換されている、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１７】
少なくともヒドラジド基の一部は、ヒドラジド官能基との共有結合を形成し得る官能基を有する検出可能な標識と共有結合されている、請求項３に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１８】
検出可能な標識は、蛍光標識、リン光性標識、親和性標識、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）標識、金属および半導体ナノ粒子、スペクトル比色標識、タンパク質、酵素、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド、高分子ビーズからなる群より選択される、請求項１７に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１９】
標識は、以下の非限定的リスト：フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、フルオレセインジクロロトリアジン（５−ＤＴＡＦ）、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ペリレン、ピレン、アントラセン、ナフタレン（例えば、ダンシル）、スチルベン、（ビス）−ベンゾキサゾール、クマリン誘導体（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）誘導体）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−誘導体、ピリジルオキサゾール、ジキソゲニン、フェノキサジン、トリアリールメタン、キサンテン、フラビン、ポルフィリン、シアニン、ナフトシアニン、ランタニド−錯体、遷移金属錯体、ＵＶ光線で励起可能なミクロスフェア、緑色蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である、請求項１８に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項２０】
蛍光標識は、式：
ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−フルオレセイン
により表わされるフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）の誘導体である、請求項１９に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項２１】
前記ヒアルロン酸誘導体は、ヒドロゲルの形態にある、請求項５〜１６のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含み、および任意に薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項２３】
化学的に結合されるかまたは結合されていない薬理学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
薬理学的に活性な薬剤の徐放または持続性放出を提供し得る、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含み、化粧品に許容される担体をさらに含み、および任意に化粧薬剤をさらに含む、化粧品組成物。
【請求項２６】
天然のまたは合成の高分子、タンパク質、またはポリペプチドからなる群より選択される追加の成分をさらに含む、請求項５〜１２のいずれかに記載の架橋化ヒアルロン酸誘導体を含む組成物。
【請求項２７】
組織工学のための、任意に細胞を伴う、足場材料として使用するための、請求項５〜１２のいずれかに記載の架橋化ヒアルロン酸誘導体を含む組成物。
【請求項２８】
請求項１８に記載の標識化ヒアルロン酸誘導体を製造する方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載のＨＡ誘導体と、アミン特異的なまたはアミン反応性の基を含有する検出可能な標識とを反応させる工程を含む方法。
【請求項２９】
請求項１９に記載の標識化ヒアルロン酸誘導体を製造する方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載のＨＡ誘導体と、アミン特異的なまたはアミン反応性の基を含有する蛍光標識とを反応させる工程を含む方法。
【請求項３０】
請求項２０に記載の標識化ヒアルロン酸誘導体を製造する方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載のＨＡ誘導体と、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）とを反応させる工程を含む方法。
【請求項３１】
未架橋の水溶性の形態である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体を製造する方法であって、カルボジイミドにより活性化されたヒアルロン酸と、ヒドラジンまたは式ＨＮＲ１−ＮＨＲ２の置換ヒドラジンとを、３．５−７．５のｐＨ範囲にて、好ましくは５．５−６．２にて、より好ましくはｐＨ５．７−５．９にて反応させる工程を含む方法。
【請求項３２】
前記カルボジイミドは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
反応は、水性緩衝液中で、または水性緩衝液と水混和性有機溶媒との混合液中で行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
水混和性有機溶媒は二極性非プロトン性溶媒である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
二極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリドン、１，１，３，３−テトラメチル尿素、ヘキサメチルホスホルアミド、およびアセトニトリルからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
反応は、ヒアルロン酸と、カルボジイミドと、ヒドラジンまたは置換ヒドラジンとの混合物の反応により一工程で行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
請求項５に記載のヒアルロン酸誘導体を製造する方法であって、ヒドラジド官能化ヒアルロン酸と、カルボジイミドとを、３．５−７．０のｐＨ範囲にて、好ましくは４．０−５．０にて、より好ましくは約４．７５にて活性化する工程を含む方法。
【請求項３８】
請求項６に記載のヒアルロン酸誘導体を製造する方法であって、カルボジイミドにより活性化されたヒアルロン酸と、ヒドラジンとを、３．５−７．０のｐＨ範囲にて、好ましくは４．０−５．０にて、より好ましくは約４．７５にて反応させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直接的に連結されたヒドラジド基を含む化学的に修飾されたヒアルロン酸誘導体、ならびにその標識化および架橋化誘導体に関する。本発明はさらに、当該ＨＡ誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外基質（ＥＣＭ）の一部分であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、化学的に修飾して医学的用途のために適合させることができる。
【０００３】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、唯一知られる未硫酸化ＧＡＧであり、すべての結合組織のＥＣＭの普遍的な構成成分である。これは、二糖反復単位から構成される線状の多糖である。二糖単位の構成成分は、β１−４およびβ１−３結合により連結されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸である。ＨＡは、数千から一千万ダルトンを超える、さまざまな天然に存在する分子量を有する。
【０００４】
ＨＡは、その独特な生理化学的性質に起因して、組織の水分平衡調節に、他の物質の透過性の調節に、および関節の潤滑化における関与が示唆されている。ＨＡは、ＥＣＭ中のおよび細胞表面上のタンパク質に特異的に結合する。これらの相互作用は、軟骨基質の安定化において、細胞運動において、細胞性増殖において、創傷治癒において、炎症において、ならびにガン転移において重要である（Ｍｏｒｒａ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ６：１２０５−１２２３、２００５年；ＶｅｒｃｒｕｙｓｓｅおよびＰｒｅｓｔｗｉｃｈ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５（５）：５１３−５５５，１９９８年；Ｅｎｔｗｉｓｔｌｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：５６９−５７７、１９９６）。ＨＡの独特の粘弾性の性質は、その生体適合性および非免疫原性とともに、多くの臨床的な適用におけるその使用につながり、これらとしては：膝の変形性関節症の処置、眼手術における外科的補助、ならびに外科的創傷の治癒および再生が挙げられる（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＢｕｃｋｗａｌｔｅｒ、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３（３）：２１６−２２４、２００５年；ＢｒｏｗｎおよびＪｏｎｅｓ、Ｊ．Ｅｕｒ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．１９（３）：３０３−３１８、２００５年）。
【０００５】
ネイティブなＨＡの多様な化学的修飾が、その機械的および化学的特性を改善するために提案されてきた。ＨＡの化学的修飾の主な標的は、水酸基およびカルボキシル官能基である。
【０００６】
水酸基を介する修飾は主に、二官能性架橋リンカー、例えば、ジビニルスルホンおよびジグリシジルエーテルとの反応による、架橋化ＨＡの製造のために使用される（米国特許第４，５８２，８６５号および同第４，７１３，４４８号）。
【０００７】
カルボン酸官能基の修飾は主に、ペンダント官能基を導入するために使用され、ペンダント官能基によって薬剤や生化学試薬をさらに付加することができる（Ｌｉら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５：８９５−９０２，２００４年；Ｓｈｕら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．６８Ａ：３６５−３７５、２００４年）。カルボン酸基の修飾はまた、架橋化生成物を得るために使用することができる（ＢｕｌｐｉｔｔおよびＡｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４７：１５２−１６９、１９９９年）。
【０００８】
これらの修飾は、ヒドラジドまたはアミンを使用してなされる。水性媒体中での、ヒドラジドまたはアミンによる求核攻撃に対するＨＡのカルボン酸基の活性化は、主に、水溶性カルボジイミド、特に１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）の使用により行われる。この活性化を行うための２つの主要な手順は、当該分野において知られている。第１の手順は、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈらにより開発され、米国特許第５，６１６，５６８号、米国特許第５，８７４，４１７号、（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：９３−１０３、１９９８年、およびＰｏｕｙａｎｉおよびＰｒｅｓｔｗｉｃｈ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３３９−３４７、１９９４年）において開示される。この手順に従って、ＨＡを、穏やかな酸性条件下（例えばｐＨ４．７５）でＥＤＣと反応させて、活性のある不安定なＯ−アシルイソ尿素中間体を生成する。３−４の低いｐＫａを有し、およびｐＨ４．７５でそれらの求核性を保持するヒドラジドは、Ｏ−アシルイソ尿素中間体と効率よく反応してグルクロン酸残基のヒドラジド誘導体を生成する。対照的に、このｐＨで求核性でない第１級アミンは、活性な中間体と反応できず、最終的に安定なＮ−アシル尿素誘導体に再配置する。
【０００９】
アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）のようなジヒドラジド化合物の使用は、薬物、生化学的プローブ、および架橋化試薬とのさらなる誘導体化のための、複数のペンダントヒドラジド基を有する式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２（ＨＡ−ＡＤＨ）の誘導体を提供する。
【００１０】
後の文献は、ＨＡ−ＡＤＨ誘導体への抗腫瘍薬タキソール（Ｔａｘｏｌ）の結合（ＬｕｏおよびＰｒｅｓｔｗｉｃｈ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：７５５−７６３、１９９９年）、およびポリ（エチレン  グリコール）プロピオンジアルデヒドで架橋されたＨＡ−ＡＤＨ誘導体からの、創傷治癒用の生体相互作用的な包帯としてのヒドロゲルフィルムの製造（Ｋｉｒｋｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３：３６６１−３６７１、２００２年）を示している。
【００１１】
ＨＡのカルボン酸官能基の活性化のための第２の手順は、ＢｕｌｐｉｔｔおよびＡｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４７：１５２−１６９、１９９９年）および米国特許第６，６３０，４５７号により開発された。この手順によれば、ＨＡを、ＥＤＣと添加剤１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）との組み合わせと、ｐＨ６．８で反応させる。最初に、カルボジイミドおよびカルボン酸陰イオンが反応して、活性のある不安定なＯ−アシルイソ尿素中間体を生成し、これはさらに、添加剤と反応して、より加水分解耐性の、および再配置可能でない活性なエステルを形成する。この活性なエステルは、ヒドラジドと、およびある種のアミン（これは約５．５−７．０のｐＨにて、非プロトン性の形態で存在する）と容易に反応する。この手順の使用により、ペンダントヒドラジド、アミノ、および他の官能基をもつＨＡ誘導体が形成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を用いる、ペンダントヒドラジド基の導入のための上記の方法は、ヒアルロン酸に非天然のリンカー成分を導入する。臨床適用のためのこのような誘導体の使用は、本質的に、これらの非天然のリンカー成分を（ヒト）生物体に導入し、このことは予期されない合併症につながるかもしれない。それゆえ、この様なリンカー部分の使用を回避することは非常に望ましい。本発明は、リンカーの使用を全く回避しながら、ＨＡにヒドラジド基を導入し、それにより、上述で示される起こり得る合併症を迂回する方法を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今回、本発明にしたがって、ヒドラジン自身または置換ヒドラジンが、カルボジイミドの存在下でヒアルロン酸と反応することができ、このことによりＨＡ分子のカルボキシル基がヒドラジド基に直接的に改変された化合物を生じることが見出された。
【００１４】
従って、本発明は、１つの側面において、ヒアルロン酸誘導体およびその塩に関し、
当該誘導体は、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部がヒドラジド基に変換されている。
【００１５】
本発明はさらに、スキーム１において記載される一般的な反応に従って、ヒドラジンまたは置換ヒドラジンを使用して、ＨＡのカルボン酸基をヒドラジド基に変換するための方法に関する。
スキーム１：
【化１】
2009529086.tif 000002
【００１６】
従って、本発明のＨＡヒドラジド誘導体は、スぺーサーを介さずに、ヒアルロン酸骨格のグルクロン酸残基にて直接的に連結されたヒドラジド基ＣＯ−ＮＨＮＨ２を有する点において、当該分野において従来記載されているＨＡヒドラジドとは異なる。
【００１７】
本発明によれば、ヒドラジドで修飾された水溶性または不水溶性の、架橋化ＨＡの生成は、反応のｐＨにより決定することができる。さらに、反応のｐＨは、ヒドラジドで修飾される水溶性ＨＡ分子におけるヒドラジド基の量を決定する。
【００１８】
反応が、酸性条件下（ｐＨ３．０−５．５）で行われる場合、５−１０％のヒドラジド基の推定量を有するゼリー状の不水溶性架橋化生成物が得られる。
【００１９】
反応が、わずかに酸性またはわずかに塩基性の条件下（ｐＨ６．０−７．５）で行われる場合、３％までのヒドラジド基を有する可溶性ＨＡ分子が得られる。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様において、反応は、約５．６〜約５．９のｐＨ範囲において行われ、水溶性のヒドラジド官能化ＨＡを生じる。最も好ましい実施態様において、反応は、ｐＨ５．７−５．９にて行われ、反応により１１−２０％のヒドラジド基を有する水溶性のＨＡ分子を生じる。
【００２１】
本発明の化学的に修飾された水溶性および未架橋のＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２誘導体は、ヒドラジド基のアミン部分を介して、生体適合性材料、検出可能な標識、および生物学的に活性な材料（例えば、医薬品および生体活性剤）のようなさらなる成分に結合させることができる。
【００２２】
１つの実施態様において、ヒドラジド基のアミン部分は、アミン特異的なまたはアミン反応性の基を含む検出可能な標識に共有結合的に結合される。この目的のために適切な検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、リン光性標識、放射性標識、親和性標識、電子スピン共鳴（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｓｐｉｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＥＳＲ））標識、例えば金および半導体ナノ粒子のような検出可能なナノ粒子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗体、酵素、高分子ビーズが挙げられる。
【００２３】
ヒドラジド基を含有する化学的に修飾された可溶性ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２誘導体はまた、当該分野において知られる任意の広範に多様なアミン特異的なまたはアミン反応性の同種二官能性および異種二官能性の架橋剤（例えば、ビスアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドおよびポリ（エチレン  グリコール）プロピオンジアルデヒド）、ビス−活性エステル（例えば、グルタル酸ジスクシンイミジルおよびスベリン酸ジスクシンイミジル）、ビスイミダート（スベリミド酸ジメチル）、ビスアクリラート（例えば、ポリ（エチレン  グリコール）ジアクリラート）、およびビスマレイミド（例えば、ビス−マレイミドヘキサン）であるが、これらに限定されない）を使用することにより、架橋してヒドロゲルを形成することができる。
【００２４】
ヒドラジド基を含む化学的に修飾された可溶性ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２誘導体はまた、天然の、変性された、または非天然（合成）の、多官能性のアミン特異的なまたはアミン反応性の架橋剤（例えば、ポリアルデヒド）を使用することにより、架橋してヒドロゲルを形成することができる。
【００２５】
ヒドラジド基を含む化学的に修飾された可溶性のＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２誘導体はまた、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣであるが、これに限定されない）を使用して、架橋してヒドロゲルを形成し、このことにより、式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡにより表わされる架橋化化合物を生じることができる。架橋化ヒドロゲルは、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の一部と、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部との反応により形成され、当該カルボキシ基は、カルボジイミドにより活性化される。
【００２６】
架橋されたヒドラジド官能化ヒアルロン酸は、架橋の前または後のいずれかで導入することができるさらなる成分を含んでいてもよい。これらの成分としては、医薬品、化粧薬剤、検出可能な標識、天然または合成の高分子、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、または細胞が挙げられる（ただしこれらに限定されない）。
【００２７】
従って、医薬品または生体活性剤を含む組成物は、ヒドラジド官能化ＨＡに化学的に結合してもよく、または未結合であってもよいことが理解されるべきである。医薬品または他の生体活性な部分を含む本発明のＨＡ組成物は、活性な薬剤の持続性放出、制御性放出、または徐々の放出のためのデポとして特に有用である。
【００２８】
架橋されたヒドラジド官能化ヒアルロン酸は、組織工学のための、創傷または骨折の治癒のための、不可欠な足場材料として、単独で、または細胞送達（例えば、軟骨障害を修復するための軟骨細胞の送達）のための基質として、作用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
先行技術は、リンカーを介してカルボン酸官能基に付着されるペンダントヒドラジド基を含むＨＡ誘導体を記載する。しかし、カルボン酸基がヒドラジド官能基に直接的に変換されたヒドラジド官能化ＨＡの開示はない。
【００３０】
ＨＡのグルクロン酸部位でのペンダントヒドラジド基の導入のための２つの一般的な方法が知られる。Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３３９−３４７、１９９４年）の第１の方法は、ｐＨ４．７５での、ＨＡとＥＤＣとの反応を含み、活性のある、不安定なＯ−アシルイソ尿素中間体を生成し、続いてこれをｐＨ４．７５にてそれらの求核性を保持する、３−４のｐＫａを有するヒドラジドと反応させる。
【００３１】
Ｂｕｌｐｉｔｔら（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４７：１５２−１６９，１９９９年）は、ｐＨ６．８にて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢｔ）、またはｐＨ７．５にてスルフォ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）の存在下で、ＨＡのカルボキシ官能基をＥＤＣで活性化し、続いて、これらの条件下でなお求核性である（プロトン化されない）、ある種のヒドラジドおよびアミンと反応させた。
【００３２】
ＨＡのカルボキシ官能基とヒドラジンとを反応させるために上述の方法を使用する試みは首尾よくいかず、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈらの方法によっては、不水溶性の、架橋された、ヒドラジド官能化生成物が得られた。Ｂｕｌｐｉｔｔの手順は、水溶性のヒドラジド誘導体を与えたが、ヒドラジド官能基の量は３％を超えなかった。
【００３３】
今や驚くべきことに、ｐＨ５．７−５．９で、ＨＡと、ヒドラジンおよびカルボジイミドとを反応させることにより、２０％までのヒドラジド基を有する水溶性のヒドラジド誘導体が得られることが見出された。このことは、６．０−７．５のｐＨ範囲にて得られた量に比較して、ヒドラジド基の量の劇的な増加を表す。
【００３４】
上記のように、ヒドラジンでのＨＡの誘導体化が、酸性条件下（ｐＨ３．５−５．５）で行われる場合、ヒドラジド官能化ＨＡは常に不水溶性生成物として得られる。しかし、カルボン酸官能基の一部がヒドラジンでの誘導体化反応の前に修飾された点を除いて同じ酸性条件下で、水溶性ヒドラジド官能化ＨＡが得られたことが見出された。このような修飾は、ＨＡとＥＤＣとを反応させてＨＡのカルボキシ基の一部をＮ−アシル尿素基に変換させることにより得られた。
【００３５】
それゆえ、本発明は、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部がヒドラジド基に変換されてヒアルロン酸に直接的に結合したヒアルロン酸誘導体、およびそれらの塩に関する。
【００３６】
１つの実施態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式：
ＨＡ−ＣＯ−ＮＲ１−ＮＨＲ２
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであるかまたは異なり、それぞれは、任意にハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオアルキル、ニトロ、シアノ、ＣＦ３、ＣＯＮＨ２、および−ＮＨ−ＮＨ２からなる群より選択される１つ以上のラジカルにより置換されていてもよい、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、アルカリル、アラルキル、またはヘテロ環であり、および／または、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニルのそれぞれは、ＯもしくはＳもしくは基Ｎ＋Ｒ３Ｒ４により中断されていてもよく、ここでＲ３およびＲ４は、同じであるかまたは異なり；それぞれは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ６−Ｃ１４アリールである］
により表わされる未架橋の化合物である。
【００３７】
１つの好ましい実施態様において、Ｒ１およびＲ２はともに水素であり、ヒアルロン酸誘導体は、式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２により表わされる、未架橋の、水溶性化合物である。
【００３８】
別の実施態様において、Ｒ１およびＲ２はともに水素であり、ヒアルロン酸誘導体は、未架橋の、水溶性化合物であり、さらにＮ−アシル尿素残基を含む。
【００３９】
１つの実施態様において、本発明において使用することができる置換ヒドラジンは、それぞれ、式ＨＮＲ１−ＮＨ２およびＨＮＲ１−ＮＨＲ２の一置換または二置換ヒドラジンであり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、同じであるかまたは異なり、それぞれ、ハロゲンまたはヒドロキシにより任意に置換されていてもよいアルキル、またはシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロ環である。一置換ヒドラジンの例としては、メチルヒドラジン、２−フルオロエチルヒドラジン、シクロプロピルヒドラジン、１−メチルプロピルヒドラジン、２−ヒドラジノ−２−プロパノール、フェニルヒドラジン、２−ニトロ−フェニルヒドラジン、４−ニトロ−フェニル−ヒドラジン、２，４−ジニトロ−フェニルヒドラジン、ｐ−トリルヒドラジン、ベンジルヒドラジン、ｍ−ヒドロキシベンジルヒドラジン、ナフチルヒドラジン、および５−ヒドラジノ−１，２−オキサゾールが挙げられる。１，２−二置換ヒドラジンの例としては、１，２−ジメチルヒドラジン、１，２−ジエチルヒドラジン、１−メチル−２−ヒドロキシエチル−１−ヒドラジン、および２−（２−メチルヒドラジノ）−エタノールが挙げられる。
【００４０】
別の実施態様において、本発明において使用することができる置換ヒドラジンは、例えば、メチレンジヒドラジン、エチレンジヒドラジン、プロピレンジヒドラジン、ブチレンジヒドラジン、フェニレン−ジヒドラジン、６，７−ジヒドラジノ−キノキサリン、１−ピペリジノ−エチレンジヒドラジン、１−モルホリノ−エチレンジヒドラジン、１，１’−（１，２−エタンジイル）ビス［ヒドラジン］，６，７−ジヒドラジノ−キノキサリンのようなジヒドラジン、または１，１’，１’’−（１，２，４−ベンゼントリイル）トリスヒドラジンのようなトリヒドラジンであるが、これらに限定されない。
【００４１】
得られるヒアルロン酸誘導体は、２％と７０％との間の、好ましくは１０％以上のヒドラジド基を含むことができる。
【００４２】
別の実施態様において、ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２により表わされる未架橋の水溶性の化合物のヒドラジド基のアミン部分は、アミン特異的なまたはアミン反応性の部分を含む検出可能な標識に共有結合的に結合される。当該標識は、以下の（限定されない）リストから選択される：
蛍光標識、ここで蛍光部分としては：フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、フルオレセインジクロロトリアジン（５−ＤＴＡＦ）、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ペリレン、ピレン、アントラセン、ナフタレン（例えば、ダンシル）、スチルベン、（ビス）−ベンゾキサゾール、クマリン誘導体（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）誘導体）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−誘導体、ピリジルオキサゾール、ジキソゲニン、フェノキサジン、トリアリールメタン、キサンテン、フラビン、ポルフィリン、シアニン、ナフトシアニン、ランタニド−錯体、遷移金属錯体、ＵＶ光線で励起可能なミクロスフェア、緑色蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない、
リン光性標識、ここでリン光性部分としては：エオシン、エリスロシン、ルシフェリン、ルマジン、ランタニド錯体、遷移金属錯体が挙げられるが、これらに限定されない、
分子または複合体を含む放射性標識、ここで放射性核種部分としては：１０Ｂ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、３５Ｃｌ、１８Ｆ、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１８Ｏ、１５Ｏ、３２Ｐ、３５Ｓ、４６Ｓｃ、５１Ｃｒ、５２ｍＭｎ  ５７Ｃｏ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８５Ｓｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９５Ｎｂ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｃｄ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１３Ｓｎ、１１４Ｉｎ、１３３Ｘｅ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１５３Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２０３Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２２５Ａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
親和性標識、例えば、ビオチンおよび抗体。
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）標識：２，２，６，６−テトラメチル−４−ピぺラドン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）誘導体、ＤＯＸＹＬ−誘導体のような安定なニトロキシルラジカル。
金属および半導体ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、インジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ）ナノ粒子、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、硫化タングステン（ＷＳ）ナノ粒子、ヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）ナノ粒子、硫化亜鉛（ＺｎＳ）ナノ粒子。
スペクトル比色標識、タンパク質、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド、高分子ビーズ。
【００４３】
より好ましい実施態様において、ヒドラジド基のアミン部分は、アミン特異的なまたはアミン反応性の基を含む蛍光標識と共有結合的に結合させる。ここで当該標識の蛍光部分としては：フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、フルオレセインジクロロトリアジン（５−ＤＴＡＦ）、ナフトフルオレセイン、ローダミン、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ペリレン、ピレン、アントラセン、ナフタレン（例えば、ダンシル）、スチルベン、（ビス）−ベンゾキサゾール、クマリン誘導体（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）誘導体）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−誘導体、ピリジルオキサゾール、ジキソゲニン、フェノキサジン、トリアリールメタン、キサンテン、フラビン、ポルフィリン、シアニン、ナフトシアニン、ランタニド−錯体、遷移金属錯体、ＵＶ光線で励起可能なミクロスフェア、緑色蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
さらにより好ましい実施態様において、ヒドラジド基のアミン部分は、アミン反応性の蛍光標識フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）に共有結合的に結合させる。得られる標識化化合物は、式：
ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−フルオレセイン
により表わすことができる。
【００４５】
ヒドラジド基を含む化学的に修飾された可溶性のＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２誘導体はまた、架橋してヒドロゲルを形成してもよい。
【００４６】
１つの実施態様において、ヒアルロン酸誘導体は、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の一部と、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部との反応により形成される、不水溶性の架橋化化合物であり、当該カルボキシ基は、カルボジイミドにより活性化され、このことにより式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡにより表わされる架橋化化合物を生じる。
【００４７】
別の実施態様において、ヒアルロン酸誘導体は、Ｄ−グルクロン残基のカルボキシ基の一部がヒドラジドを介してＤ−グルクロン残基のカルボキシ基の別の一部と架橋されている架橋化化合物であり、当該カルボキシ基は、カルボジイミドにより活性化されており、式ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡにより表わされる架橋化化合物を生じる。
【００４８】
さらに別の実施態様において、ヒアルロン酸誘導体は、アミン特異的なまたはアミン反応性の、同種二官能性または異種二官能性のリンカーＹを介して、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の一部と、Ｄ−グルクロン残基のヒドラジド基の別の一部とを反応させることにより形成される架橋化化合物であり、当該架橋化ヒアルロン酸誘導体は、式：
ＨＡ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＨＡ
［式中、Ｙは、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、またはヘテロ環式の鎖である］により表わされる。
【００４９】
同種二官能性架橋剤は、２つの同一の反応基を有する。異種二官能性架橋剤は、連続的な結合反応を許容する２つの異なる反応基を有するものとして規定される。本発明において使用することができるアミン特異的な同種二官能性架橋剤の例としては、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ビス［２−（スクシンイミドオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、アジミピド酸（ａｄｉｐｉｍａｔｅ）ジメチル二塩酸塩、ピメリミド酸ジメチル二塩酸塩、スベリミド酸ジメチル二塩酸塩、グルタルアルデヒド、ポリ（エチレン  グリコール）プロピオンジアルデヒド、ポリ（エチレン  グリコール）ジアクリラート、およびエチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシナート］］が挙げられるが、これらに限定されない。また本発明において使用することができるアミン反応性の同種二官能性架橋剤の例は、ビスマレイミド（例えば、ビス−マレイミドヘキサン）である。また本発明において使用することができるアミン反応性の異種二官能性架橋剤の非限定的例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキシラートである。
【００５０】
多官能性架橋剤は、架橋の形成のための２つよりも多い反応基を含む。
【００５１】
さらなる実施態様において、ヒアルロン酸誘導体は、多官能性化合物、例えばポリアルデヒドを介する、ヒドラジド基の一部と、ヒドラジド基の別の一部とを反応させることにより形成される架橋化化合物である。
【００５２】
より好ましい実施態様において、当該ポリアルデヒドは、酸化コラーゲン、酸化ゼラチン、および酸化ヒアルロン酸から選択される。最も好ましい実施態様において、当該ポリアルデヒドは、酸化ゼラチンである。
【００５３】
本発明の架橋化ヒアルロン酸誘導体はさらに、さらなる誘導体化に利用可能な、直接的に連結される遊離ヒドラジド基を含んでいてもよい。これらの遊離ヒドラジド基は、所望される薬理学的または生物学的に活性な薬剤、および上述で特定されるような検出可能な標識のさらなる結合のために使用することができる。あるいは、本発明の水溶性ヒアルロン酸誘導体の遊離ヒドラジド基の一部は、薬理学的にまたは生物学的に活性な薬剤、および検出可能な標識で誘導体化することができ、次いで架橋化してヒドロゲルとすることができる。
【００５４】
ヒドロゲルは、水中で膨張する、粘性または半固体のゼリー様の高分子網構造として認識されるべきである。高分子網は、親水性の高分子単位から構成され、これは非共有結合のみによるか、またはさらにある量の共有結合により、一緒に保持される。非共有結合ヒドロゲルは、未架橋の網としてよく知られ、水中で可溶性であってもよい。共有結合網は、架橋化ヒドロゲルとしてよく知られ、不水溶性である。架橋化ヒドロゲルは、相互に反応性の官能基の分子内または分子間の化学反応により、未架橋のヒドロゲルから製造することができる。必要であれば、架橋は、上記のような架橋剤を用いて行ってもよい。
【００５５】
それゆえ、本発明の重要な観点は、架橋されているかまたは水溶性のヒアルロン酸誘導体と、薬理学的にまたは生物学的に活性な薬剤、および検出可能な標識との結合に関する。
【００５６】
薬理学的または生物学的に活性な薬剤は、抗生物質、抗感染薬、抗微生物剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、創傷治癒剤、麻酔薬、コリン作動薬、コリン拮抗薬、アドレナリン作動薬、アドレナリン拮抗薬、抗血栓剤、抗凝血剤、止血剤、線維素溶解剤、血栓溶解剤、増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子）、サイトカイン、抗体、タンパク質（例えば、フィブリノゲン）、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、および高分子から選択することができる。
【００５７】
本発明はさらに、未架橋の、水溶性の形態における本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法に関し、カルボジイミドにより活性化されたヒアルロン酸と、ヒドラジンまたは式ＨＮＲ１−ＮＨＲ２の置換ヒドラジンとを、３．５−７．５のｐＨ範囲にて、好ましくは５．５−６．２にて、より好ましくは５．７−５．９にて、反応させる工程を含む。反応は、ヒアルロン酸と、カルボジイミドと、ヒドラジンまたは置換ヒドラジンとの混合物の反応により一工程において行ってもよい。
【００５８】
本発明の誘導体の製造のために使用されるヒアルロン酸は、約８００〜約４，０００，０００Ｄａの平均分子量（Ｍ．Ｗ）を有する。
【００５９】
本発明において使用されるカルボジイミドは、以下の式：
Ｒ１−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ２
により表わされる周知の化合物である。
【００６０】
この式を有するカルボジイミドが好ましく、ここではＲ１および／またはＲ２は、より詳細には、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはその置換された形を表す。最も好ましいものは、完全に水溶性であるカルボジイミド、または二極性非プロトン性溶媒と水との混合液中で可溶性であるカルボジイミドである。好ましいカルボジイミドの代表例は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、シクロヘキシル−β−（Ｎ−メチルモルホリノ）エチルカルボジイミド  ｐ−トルエンスルホナート（ＣＭＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などである。
【００６１】
ヒドラジンまたは置換ヒドラジン  対  ＨＡカルボキシ基のモル比は、１：１〜８０：１の間、好ましくは１０：１〜６０：１の間、より好ましくは４０：１であり得る。カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）  対  ＨＡカルボキシ基のモル比は、０．１：１〜１０：１の間、より好ましくは４：１〜８：１の間であり得る。一般に、カルボジイミド  対  ＨＡカルボン酸基のモル比が上昇するほど、より高い程度のヒドラジド基形成につながる。
【００６２】
反応は、水中で、または水性緩衝液、好ましくはＢｉｓ−Ｔｒｉｓ水性緩衝液中で行うことができる。緩衝液の濃度は、５０ｍＭ〜５００ｍＭの間、好ましくは、２００ｍＭ〜３００ｍＭの間にわたり得る。反応はまた、水性緩衝液と、水混和性有機溶媒（例えば、ヒドロカルビルアルコール、ジオール、グリセロール、または二極性非プロトン性溶媒）との混合液中で行うことができる。好ましくは、水混和性有機溶媒は、二極性非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリドン、１，１，３，３−テトラメチル尿素、ヘキサメチルホスホルアミド、およびアセトニトリルである。
【００６３】
ヒドラジド基形成の程度は、限定されないが、Ｑｉら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５：１３９−１４４、１９８８年）により記載されるＴＮＢS（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）手順のような比色技術を使用して測定することができる。この手順において、試薬ＴＮＢＳは、ヒドラジド基と共有結合的に反応して、非常に発色性の誘導体を形成し、その色素を分光光度法で定量することができる。不水溶性の、架橋された、ヒドラジド官能化ＨＡを用いる場合、ＴＮＢＳと不水溶性誘導体との間の反応により、アッセイの溶液から一部沈殿する発色性粒子が生成するので、ヒドラジド基の定性的評価しか得られない。
【００６４】
別の観点において、本発明は、本発明のヒアルロン酸誘導体を、任意に別の薬理学的な薬剤、および薬学的に許容される担体とともに含む、医薬組成物を提供する。
【００６５】
薬学的に許容される担体は、従来使用される任意の担体であり、溶解度、および本発明の化合物との反応性の欠如のような化学的−物理的考慮によって、ならびに投与の経路によってのみ制限される。担体の選択は、医薬組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。適切な担体のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、およびメチルセルロースが挙げられる。他の薬学的担体は、水および油（石油、動物、植物、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが含まれる）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような滅菌液体であり得る。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩水溶液ならびに水性のデキストロースおよびグリセロールの溶液はまた、液体担体として、特に注射可能な溶液に用いることができる。
【００６６】
さらなる観点において、本発明は、任意に、別の化粧薬剤、および化粧品に許容される担体とともに、本発明のヒアルロン酸誘導体を含む化粧品組成物を提供する。
【００６７】
本発明に従って使用することができる化粧薬剤の例としては、キサンチン、レチノイド、α−ヒドロキシ酸、β−ヒドロキシ酸、ハイドロキノン、アスコルビン酸、コウジ酸、コルチコステロイド、ムコ多糖、コラーゲン、イソフラボノイド、桂皮酸、過酸化ベンゾイル、トロポロン、カテコール、メルカプトアミン、ナイアシンアミド、トコフェロール、フェルラ酸、アゼライン酸、ボツリヌス菌、尿素、それらの誘導体または塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
適切な化粧品担体の例としては、スクアレン、オリーブ油、コーン油、キャノーラ油、ピーナッツ油、紅花油、亜麻油、ヒマワリ油、鉱油、ヒマシ油、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびステアリン酸、ならびにグリセリン、水、アルコール、プロピレングリコールなどのような水ベースの担体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
別の観点において、本発明は、ヒドラジド官能化ＨＡを含む治療薬の徐々の放出のためのベヒクルを提供し、当該治療薬は当該官能化ＨＡのバルク中に存在する。
【００７０】
さらに別の観点において、本発明の架橋されたヒドラジド官能化ＨＡは、組織工学のための、および創傷または骨折の治癒のための、不可欠な足場材料として、単独で、または細胞送達（例えば、軟骨障害を修復するための軟骨細胞の送達）のための基質としてのいずれかで、作用し得る。
【００７１】
以下に、非限定的実施例により本発明を説明する。
【００７２】
実施例においては以下の略語が使用される：
ＥＤＣ      １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド
ＨＯＢｔ    １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＮＨＳ      Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＴＮＢＳ    ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸
ＤＴＳＳＰ  ３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオナート］
ＥＤＴＡ    エチレンジアミンテトラ酢酸
ＤＴＴ      ジチオスレイトール
ＦＩＴＣ    フルオレセインイソチオシアナート
ＰＥＧＤＡ  ポリ（エチレン  グリコール）−ブチルジアルデヒド（Ｍ.Ｗ.３４００Ｄａ）
ＤＭＳ      スベリミド酸ジメチル・２ＨＣｌ
ＰＢＳ      リン酸緩衝化生理食塩水
Ｂｉｓ−Ｔｒｉs  ２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール
ＢＳＡ      ウシ血清アルブミン
ｂＦＧＦ    組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子
ＥＬＩＳＡ  酵素免疫吸着測定法
【００７３】
試薬のＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＮＨＳ、ＴＮＢＳ、ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＦＩＴＣ、ＢＳＡ、およびヒドラジン水和物、緩衝液のＰＢＳおよびＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、溶媒のＤＭＳＯおよび１−メチル−２−ピロリドン、ならびに酵素のヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼは、全て、Ｓｉｇｍａ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ、Ｉｓｒａｅｌ）から入手された。
【００７４】
同種二官能性架橋剤のＤＴＳＳＰ、ＤＭＳ、およびグルタルアルデヒドは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）から入手された。
【００７５】
同種二官能性架橋剤のＰＥＧＤＡは、Ｎｅｋｔａｒ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＵＳＡ）から入手された。
【００７６】
ｂＦＧＦは、ＰｒｏＳｐｅｃ  ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ、Ｉｓｒａｅｌ）から入手された。
【００７７】
ヒアルロン酸（Ｍ．Ｗ．３，０００，０００Ｄａ）は、市販のナトリウム塩（ヒアルロン酸ナトリウム）として入手され、そして、そうでないと示されない限り、実験の全体で使用された。
【実施例】
【００７８】
実施例１  水溶液中、ｐＨ４．７５での、ヒドラジンでのＨＡの修飾
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、水（１００ｍｌ）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌの添加により、４．７５に調節した。溶液を１０分間攪拌し、その後、ＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、ｐＨを４．７５に維持しながら（０．１Ｎ  ＨＣｌ）、さらに３時間攪拌した。ｐＨを７．０に上昇することにより（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）、反応を停止した。
【００７９】
３５００ダルトンのＭＷカットオフを備える透析チューブを、室温にて水中に３時間浸し、次いで水でリンスした。反応混合物をこのチューブに移し、そして徹底的に水に対して透析した。
【００８０】
澄んだ透明な混合物を０．４５μｍメンブランを介して濾過した。ゼリー様の不水溶性の架橋化生成物を単離した。生成物を真空下で乾燥して、ＴＮＢＳ法により定性的に確認されたように遊離ヒドラジド基を含む、４２０ｍｇの白色繊維を得た。
【００８１】
実施例２  緩衝化溶液中、ｐＨ４．７５での、ヒドラジンでのＨＡの修飾
Ａ．ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（４００ｍＭ、ｐＨ４．７５）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。この混合物のｐＨを４．７５に調節した後（１Ｎ  ＨＣｌ）、ＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を、一晩攪拌した。ｐＨを続いて、７．０に調節した（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）。
【００８２】
ゼリー様の不水溶性の架橋化生成物を、実施例１において記載されるように精製および単離した。生成物は、ＴＮＢＳ法により確認されたように遊離ヒドラジド基を含んでいた。
【００８３】
Ｂ．半分の量のＥＤＣ（４２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を用いて、同じ手順を行っても、遊離ヒドラジド基を含む不水溶性の架橋化化合物を生じた。
【００８４】
実施例３  ｐＨ４．７５での水溶性ヒドラジドＨＡの製造
Ｎ−アシル尿素基で誘導体化されたＨＡ（ＨＡ−ＥＤＣ）を、確立された手順（Ｂｙｓｔｒｉｃｋｙら、Ｃｈｅｍ．Ｐａｐ．１：４９−５２、２００１年；Ｓｏｌｔｅｓら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１７：３７６−３８４、２００３年）に従って、ヒアルロン酸ナトリウムおよびＥＤＣから製造した。生成物は、約４０％のブロックされたカルボン酸基を含んでいた。
【００８５】
ＨＡ−ＥＤＣ（４４０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌカルボン酸基）を、同じ量のヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（４２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を使用して、実施例２Ｂにおいて記載されるように正確に誘導体化した。
【００８６】
反応混合物を、実施例１において記載されるように、水（２リットル、６交換）に対して、７２時間透析した。透析した溶液を、０．４５μｍメンブレンを介して濾過した。ＮａＣｌを濾液に添加して、５％ｗ／ｖ溶液を生成し、そして修飾したＨＡを、エタノールの３当容量の添加により沈殿した。生成物を、真空下で乾燥して、３９０ｍｇの白色繊維を得た。これは、ＴＮＢＳ法により確認されたように、１５％のヒドラジド基を含んでいた。
【００８７】
実施例４  ｐＨ５．５での、ヒドラジンでのＨＡの修飾
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（４００ｍＭ、ｐＨ５．５）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。この混合物のｐＨを５．５に調節した後（１Ｎ  ＨＣｌ）、ＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を一晩攪拌した。ｐＨを続いて７．０に調節した（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）。
【００８８】
ゼリー様の不水溶性の架橋化生成物を、実施例１において記載されるように精製および単離した。生成物は、ＴＮＢＳ法により確認されたように、遊離ヒドラジド基を含んでいた。
【００８９】
実施例５  ｐＨ７．５での、ヒドラジンでのＨＡの修飾
この修飾を、アミンおよびヒドラジドでのＨＡの誘導体化についての確立された手順（ＢｕｌｐｉｔｔおよびＡｅｓｃｈｉｍａｎｎ、１９９９；米国特許第６，６３０，４５７号）に従って試みた。
【００９０】
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、水（１００ｍｌ）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。反応混合物のｐＨを７．５に調節した（０．１Ｎ  ＨＣｌ）。Ｈ２Ｏ（２ｍｌ）中のＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）とＮＨＳ（５０６ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）との混合物を添加し、そしてｐＨを７．５に調節した。反応を一晩進行させた。反応混合物を水に対して透析し、そして可溶性生成物を、実施例３において記載されるように単離した。
【００９１】
生成物は、ＴＮＢＳ法により確認されたように、ヒドラジド基のゼロ置換を伴った未変化のＨＡであることが証明された。
【００９２】
実施例６  ｐＨ６．８での、ヒドラジンでのＨＡの修飾
この修飾をまた、以前の実施例において記載されるように、ＢｕｌｐｉｔｔおよびＡｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ（１９９９年）に従って行った。
【００９３】
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、水（１００ｍｌ）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。反応混合物のｐＨを６．８に調節した（０．１Ｎ  ＨＣｌ）。次いで、ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍｌ）中のＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢＴ（５９４ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）との混合物を添加し、そしてｐＨを６．８に再調節した。反応を一晩進行させた。反応混合物を水に対して透析し、そして可溶性生成物を実施例３において記載されるように単離した。
【００９４】
生成物を真空下で乾燥して、４００ｍｇの白色繊維を得た。これは、ＴＮＢＳ法により確認されたように、３％のヒドラジド基を含んでいた。
【００９５】
実施例７  ｐＨ６．２での、ヒドラジンでのＨＡの修飾
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（４００ｍＭ、ｐＨ６．２）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。この混合物のｐＨを６．２に再調節した後（１Ｎ  ＨＣｌ）、ＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を一晩攪拌した。続いてｐＨを７．０に調節した。（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）。
【００９６】
水溶性の生成物を実施例３において記載されるように精製および単離した。生成物を真空下で乾燥して、４００ｍｇの白色繊維を得た。これは、ＴＮＢＳ法により確認されたように、３％のヒドラジド基を含んでいた。
【００９７】
実施例８  ｐＨ５．８での、水溶性ヒドラジドＨＡの製造
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（４００ｍＭ、ｐＨ５．８）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。この混合物のｐＨを５．８に再調節した後（１Ｎ  ＨＣｌ）、ＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を一晩攪拌した。続いてｐＨを７．０に調節した。（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）。
【００９８】
水溶性生成物を実施例３において記載されるように精製および単離した。生成物を真空下で乾燥して、４００ｍｇの白色繊維を得た。ＴＮＢＳ法により確認されたように、１２％のヒドラジド基を含んでいた。
【００９９】
ＥＤＣの量を８．８ｍｍｏｌに増加すると、２０％のヒドラジド基を含む生成物を生じた。
【０１００】
同一の条件下での、３，０００，０００Ｄａ以外の分子量を有するＨＡの誘導体化はまた、約１２％のヒドラジド基を有する水溶性ＨＡ生成物を生じた。以下の分子量を伴うＨＡを使用した：
ａ．Ｍ．Ｗ．７００，０００Ｄａ
ｂ．Ｍ．Ｗ．２５０，０００Ｄａ、Ｓｈｕら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３：１３０４−１３１１、２００２年に従ってＨＡ（Ｍ．Ｗ．３，０００，０００Ｄａ）の酸性加水分解により得られた。
【０１０１】
実施例９  緩衝液と二極性非プロトン性溶媒との混合液中での水溶性ヒドラジドＨＡの製造
ヒドラジン水和物（４４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（４００ｍＭ、ｐＨ５．８）中のヒアルロン酸ナトリウム（４４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌカルボン酸基）の溶液に添加した。この混合物のｐＨを５．８に再調節した後（１Ｎ  ＨＣｌ）、ＤＭＳＯ（５０ｍｌ）、続いてＥＤＣ（８４０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩攪拌した。続いてｐＨを７．０に調節した（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）。
【０１０２】
水溶性生成物を実施例３において記載されるように精製および単離した。生成物を真空下で乾燥して、４００ｍｇの白色繊維を得た。ＴＮＢＳ法により確認されたように、２０％のヒドラジド基を含んでいた。
【０１０３】
さらなる実験を、ＤＭＳＯが１−メチル−２−ピロリドンにより置き換えられた以外は同一の条件下で行った。水溶性ヒドラジドＨＡが得られ、１９％のヒドラジド基を含んでいた。
【０１０４】
実施例１０  同種二官能性架橋剤を使用するヒドラジドＨＡの架橋
ＨＡ骨格上の反応性ヒドラジド部分の存在は、市販のアミン特異的同種二官能性架橋剤（例えば、ＤＴＳＳＰ、ＤＭＳ、グルタルアルデヒド、またはＰＥＧＤＡ）を使用する、個々のＨＡ鎖間への多様な共有結合性架橋の導入を可能にする。
【０１０５】
同種二官能性架橋剤でのヒドラジド−官能化ＨＡの架橋のための一般的な手順：
１２％のヒドラジド基を含むヒドラジド官能化ＨＡ（実施例８において記載されるように製造した）を、０．２％〜１．５％に変化する濃度にて、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した。
【０１０６】
同種二官能性架橋剤を澄明な無色の溶液に添加し、そして混合物を数秒間攪拌した。ヒドラジド−ＨＡ：架橋剤の当量比は典型的に、１：０．５〜１：１０の範囲であった。
【０１０７】
いくつかの個々の反応の詳細が以下に記載される：
ａ．グルタルアルデヒドでの架橋。ヒドラジド−ＨＡ（１６ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍｌ、ｐＨ７．４）中に溶解した。次いで、ＰＢＳ（２００μｌ）で希釈したグルタルアルデヒドを添加した。ヒドラジド基：グルタルアルデヒドのモル比は、１：０．５であった。混合物を数秒間攪拌した。澄んだ透明なヒドロゲルが１分後に形成された。
ｂ．ＰＥＧＤＡでの架橋。  ヒドラジド−ＨＡ（１６ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍｌ、ｐＨ７．４）中に溶解した。次いで、ＰＢＳ（８０μｌ）で希釈したＰＥＧＤＡ（６．８ｍｇ）を添加した。ヒドラジド基：ＰＥＧＤＡのモル比は、１：０．５であった。混合物を数秒間攪拌した。澄んだ透明なヒドロゲルが数分後に形成された。
ｃ．ＤＴＳＳＰでの架橋。ヒドラジド−ＨＡ（１６ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍｌ、ｐＨ７．４）中に溶解した。次いで、ＤＴＳＳＰ（５ｍｇ）を固体の形態において添加した。ヒドラジド基：ＤＴＳＳＰのモル比は、１：１．６であった。混合物を３０秒間攪拌した。澄んだ透明なヒドロゲルが３０分後に形成された。
ｄ．ＤＭＳでの架橋。ヒドラジド−ＨＡ（２０ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍｌ、ｐＨ７．４）中に溶解した。次いで、Ｈ２Ｏ（１００μｌ）中のＤＭＳ（１３ｍｇ）の溶液を添加した。ヒドラジド基：ＤＭＳのモル比は、１：１０であった。混合物を３０秒間攪拌した。澄んだ透明なヒドロゲルが４５分後に形成された。
【０１０８】
実施例１１  ネイティブなＨＡとの比較実験
コントロール実験を、上記の架橋化実験と並行して行った。ネイティブな（未修飾の）ＨＡを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解した。ＤＭＳ、ＤＴＳＳＰ、グルタルアルデヒド、またはＰＥＧＤＡを、粘性混合物に添加し、そして室温で攪拌させた。溶液のゲル化は、経時的に観察されず、そして混合物成分は完全に水溶性のままであり、ヒドラジド官能化ＨＡの不在下で、共有結合性の架橋はなんら生じなかったことを示す。
【０１０９】
実施例１２  ポリアルデヒドを使用するヒドラジド−ＨＡの架橋
Ａ．酸化ＡＨでの架橋。Ｈ２Ｏ（３ｍｌ）中のヒアルロン酸ナトリウム（１５ｍｇ、３７．５μモル）の溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム（８ｍｇ、３７．５μモル）を添加し、そして反応を、２時間、室温にて進行させた。次いで、未反応の過ヨウ素酸塩を破壊するためにＤＴＴ（１２ｍｇ）を添加した。１５分後、反応混合物を透析チューブ（ＭＷカットオフ３５００ダルトン）に移し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して徹底的に透析した。ＰＢＳ（１ｍｌ、ｐＨ７．４）中のヒドラジド−ＨＡの溶液（１５ｍｇ、Ｍ．Ｗ.２．５×１０５、１５％のヒドラジド基）を、上述の酸化ＨＡの調製された溶液に添加した。混合物を短時間攪拌した。澄んだ透明なヒドロゲルが一晩で形成された。
Ｂ．酸化ゼラチンでの架橋。アルデヒド基を、以下の手順に従って、そのヒドロキシリジン残基を酸化することによりゼラチン中に作製した；過ヨウ素酸ナトリウム（７．５ｍｇ）を、酢酸緩衝液（５００μｌ、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）中のゼラチン（２５ｍｇ、Ｍｅｒｃｋ  カタログ番号１０４０８０）の溶液に添加した。反応を３時間進行させた。次いで、未反応の過ヨウ素酸塩を破壊するために、ＤＴＴ（３８ｍｇ）を添加した。室温にて６０分後、溶液を、酢酸緩衝液（５００μｌ、５０ｍＭ、ｐＨ４．５）中のヒドラジド−ＨＡ（５ｍｇ、Ｍ．Ｗ．３×１０６、２０％のヒドラジド基）とともに混合した。澄んだ透明なヒドロゲルが、数分後に形成された。
酢酸緩衝液がＰＢＳ（ｐＨ７．４）により置き換えられた以外は同一の条件下で、さらなる実験を行った。しかし、このわずかに塩基性のｐＨでは、ヒドロゲルは１２時間後にしか形成されなかった。
【０１１０】
実施例１３  ＥＤＣでのヒドラジドＨＡのゼロ長架橋
２０％のヒドラジド基を含むヒドラジド官能化ＨＡ（実施例９において記載されるように製造した）を、０．２％〜１．５％にわたる種々の濃度にて、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．７５）中に溶解した。
【０１１１】
固体ＥＤＣを、０．５：１〜４：１の範囲におけるＥＤＣ：カルボン酸基の当量比にて添加した。混合物を数秒間攪拌した。ゲル化時間は、ＥＤＣの濃度に依存した。２つの個々の反応の詳細は以下に記載される：
ａ．ヒドラジド−ＨＡ（１６ｍｇ）を、２ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．７５）中に溶解した。ＥＤＣ（４ｍｇ）を添加し、そして混合物を数秒間、勢いよく攪拌した。ＥＤＣ  対  カルボン酸基のモル比は、０．５：１であった。澄んだ透明なヒドロゲルが３時間後に形成された。
ｂ．ヒドラジド−ＨＡ（１６ｍｇ）を、２ｍｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．７５）中に溶解した。ＥＤＣ（３２ｍｇ）を添加し、そして混合物を数秒間、勢いよく攪拌した。ＥＤＣ  対  カルボン酸基のモル比は、４：１であった。澄んだ透明なヒドロゲルが１分後に形成された。
【０１１２】
上記の正確な条件を使用して、ネイティブな（未修飾の）ＨＡをＥＤＣと反応させた場合、ヒドロゲルは何ら形成されなかった。
【０１１３】
実施例１４  ヒアルロニダーゼでの架橋化ＨＡヒドロゲルの消化
以前の実施例（１３ａおよびｂ）において記載される２つのヒドロゲルを、ＰＢＳ（ｐＨ４．８）での４８時間の反復洗浄により精製した。ヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼ（ＰＢＳ中の２００ｕ／ｍｌ、５００μｌ）を各ヒドロゲルに添加し、そして３７℃にてインキュベートした。４ｍｇのＥＤＣを使用して調製したヒドロゲル（実施例１２ａ）は、４時間以内に完全に溶解された。第２のヒドロゲル（３２ｍｇＥＤＣを使用して調製した、実施例１２ｂ）は２６時間以内に完全に溶解された。
【０１１４】
実施例１５  ＦＩＴＣ標識化ヒアルロン酸の製造
炭酸緩衝液（５００μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ９）中のＦＩＴＣ（０．５ｍｇ、１．２５μモル）を、同じ緩衝液（２ｍｌ）中のヒドラジド−ＨＡ（２０ｍｇ、Ｍ．Ｗ．２．５×１０５、１０％のヒドラジド基）の溶液に添加した。反応を、暗所下、室温にて進行させた。１時間後、反応混合物を透析チューブ（Ｍ．Ｗ．カットオフ３５００ダルトン）に移し、そして生成物が完全に未反応のＦＩＴＣおよびその低分子量の副生成物を有しなくなるまで、暗所下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して徹底的に透析した。透析物を凍結乾燥して生成物を黄色の固体として得た。ＦＩＴＣ誘導体化ヒドラジド基の程度は、Ａｋｉｒａら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１０５：６９−８５，１９８２年）により記載される手順に従って決定され、そして約１０％であることが見出された。上記の反応におけるヒドラジド基の誘導体化の程度は、ＦＩＴＣ：ヒドラジド基の比率により制御される。例えば、ＦＩＴＣの量を２ｍｇ（５μモル）に増加すると、約４０％の程度の誘導体化が得られ、一方４ｍｇ（１０μモル）のＦＩＴＣを使用すると、約６０％の程度の誘導体化が得られる。
【０１１５】
実施例１６  架橋化ヒドラジド−ＨＡヒドロゲルにおけるｂＦＧＦの取り込みおよびヒドロゲルからのその放出
ヒドラジド−ＨＡ（２０ｍｇ、Ｍ．Ｗ．２．５×１０５、１０％のヒドラジド基）を、ＰＢＳ（２ｍｌ、ｐＨ７．４）中に溶解した。次いで、ＰＢＳ（２５７μｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡが補充される、ｐＨ７．４）中のｂＦＧF（８５０μｇ）の溶液、続いてＰＢＳ（１１０μｌ、ｐＨ７．４）中の同種二官能性架橋剤ＰＥＧＤＡ（９ｍｇ）の溶液を添加した。澄んだ混合物を数秒間攪拌した。透明なヒドロゲルが３０分以内に形成された。ｂＦＧＦは、ヒドロゲルを、室温で、１００ｒｐｍにて、ＰＢＳ（２ｍｌ、１％ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡが補充される、ｐＨ７．４）とともに攪拌することにより、放出した。放出媒体を、２４時間毎に置き換え、そして回収したサンプル（各２ｍｌ）を測定まで−７０℃にて保存した。回収されたサンプルそれぞれにおける放出されたｂＦＧＦの量を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ、ＵＳＡ、カタログ番号ＤＹ２３３）により供給される、ｂＦＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の指示に従って測定した。２４０時間の累積放出時間後に、取り込まれたｂＦＧＦの７７．６％（６６０μｇ）が放出されたことが見出された。
【国際調査報告】
2009529086.tif 000003
2009529086.tif 000004
2009529086.tif 000005
2009529086.tif 000006