(57)【要約】  本発明は鳥類免疫系によって認識されるニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質エピトープ及びその抗体、抗体を用いたニューカッスル病ウイルス探知方法、そして前記エピトープ突然変異を含むニューカッスル病ウイルス及びこれを用いたワクチンに関するもので、本発明の鳥類免疫系認識ＨＮエピトープと前記エピトープ変異ニューカッスル病ウイルスはニューカッスル病ウイルスを用いて効果的なワクチンを開発することができるだけでなく、ニューカッスル病ウイルスを迅速で正確に診断することができる。
2009507787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示したアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープであるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質の３４５番目アミノ酸から３５８番目アミノ酸の配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する、変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープを含むニューカッスル病ウイルス（寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープを含むニューカッスル病ウイルス（寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）を含む鳥類ニューカッスル病ウイルス用ワクチン。
【請求項５】
前記ワクチンは生ワクチン、弱毒化ワクチンまたは死ワクチンであることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示したアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープを特異的に認識する抗体または抗体の断片。
【請求項７】
前記抗体または抗体の断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質のエピトープを含むポリペプチドを抗原にして製造され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識することを特徴とする、請求項６に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項８】
前記抗体または抗体の断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質のエピトープを含むポリペプチドを抗原にして製造され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識することを特徴とする、請求項６に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項９】
前記抗体または抗体の断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質のエピトープを含むポリペプチドを抗原にして製造され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識することを特徴とする、請求項６に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項１０】
前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることを特徴とする、請求項６に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項１１】
前記鳥類は鶏、キジ、鴨、七面鳥、ウズラまたはダチョウであることを特徴とする、請求項６に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項１２】
請求項６乃至１１のいずれかに記載の抗体または抗体の断片を鳥類ニューカッスル病ウイルスを含む試料に反応させ、前記抗体に対する陽性反応を示す試料をニューカッスル病として判断することを含む、鳥類ニューカッスル病の診断方法。
【請求項１３】
請求項６乃至１１のいずれかに記載の抗体または抗体の断片を鳥類ニューカッスル病ウイルスを含む試料に反応させ、鶏赤血球を反応させてニューカッスル病ウイルスによる赤血球凝集の抑制の有無を検査する前記抗体に対する赤血球凝集抑制反応法を用いてニューカッスルウイルスを探知することを含む、鳥類ニューカッスル病の診断方法。
【請求項１４】
前記陽性反応は、前記抗体または抗体の断片に放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素、クロモゲン及び染色物質からなる群より選択された標識物質で標識し、前記標識物質による反応結果を検出して行うことを特徴とする、請求項１３に記載の鳥類ニューカッスル病の診断方法。
【請求項１５】
請求項６乃至１１のいずれかに記載の抗体または抗体の断片を含む鳥類ニューカッスル病診断用ポリペプチドキット。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列を含む鳥類ニューカッスル病診断用核酸キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鳥類免疫系によって認識されるニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質エピトープ及びその抗体、抗体を用いたニューカッスル病ウイルス探知方法、そして前記エピトープ突然変異を含むニューカッスル病ウイルス及びこれを用いたワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ニューカッスル病は家禽に対して致命的で、伝染性の強い第１種家畜伝染病であって、ワクチンを接種しない鶏に感染する場合には１００％の致死率を招き、適切なワクチンを接種しない場合には呼吸器及び消化器症状と産卵鶏の産卵率低下で経済的被害をもたらす致命的な病気である。毎年、発生株の量を発表してはいるが、発生が継続して増加して全国的に発生する傾向にあり、養鶏農家に大きな被害を与えている。適切なワクチンを接種しない場合、ワクチン抗体価の低い産卵鶏や種鶏は産卵率が低下したり止まることもある。また、予防接種をしたとしても接種時期や方法が誤って抗体価の高くない鶏では、脚と頚部が麻痺する神経症状が発現することもある。
【０００３】
ニューカッスル病ウイルスは単一鎖ＲＮＡウイルスでアブラウイルス（ｇｅｎｕｓ  ＡｖｕｌａＶｉｒｕｓ）属に属する。ニューカッスル病ウイルスはエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を有しており、エンベロープにはウイルスが宿主細胞に結合できるようにするＨＮ（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）蛋白質とエンベロープと宿主細胞の融合を起こすＦ（ｆｕｓｉｏｎ：融合）蛋白質がある。Ｆ蛋白質とＨＮ蛋白質は糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）としてエンベロープの表面に分布している。
【０００４】
ニューカッスル病ウイルスはＦ遺伝子塩基配列の系統分析によってＩからＶＩＩＩまでの遺伝型に分類され、このうち遺伝型ＶＩ型とＶＩＩ型はアジア国家であるインドネシア、中国、台湾及び日本にあることが報告された。アジア地域のＶＩＩ型ウイルスはアフリカ菌株（ＶＩＩｂ）から分岐したＶＩＩａで表わす（Ｈｅｒｃｚｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。韓国内でＶＩＩａ遺伝型のウイルスが存在するという事実が明らかになったが、これらのＨＮ蛋白質線状エピトープは全てワクチン株と同一なアミノ酸配列を持っていることが報告されている（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｌｅｅ  ｅｔａｌ．，２００４）。中国の一部ＶＩＩ型ウイルスは、従来のワクチンでは防御を完ぺきに行えないと知られているが（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、その原因は確認されていない。
【０００５】
Ｆ蛋白質はＩ型膜糖蛋白質（ｔｙｐｅＩ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であって三量体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ）構造を形成する（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒｅｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＨＮ蛋白質はＩＩ型膜糖蛋白質（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）でウイルスエンベロープの表面に四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）構造を形成して細胞膜に進入する（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。Ｆ蛋白質は１３個のシステイン残基と５個のグリコシル化サイトがあり、ＨＮ蛋白質は１４個のシステイン残基と４個のグリコシル化サイトを有している。
【０００６】
蛋白質の構造でシステイン残基とグリコシレーション（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は蛋白質形態とオリゴマー形成で非常に重要な役割を果たすと知られている。また、システイン残基はエピトープ形成とペプチドのグリコシレーションの位置を決定するのに重要な役割を果たす。ＨＮ蛋白質のシステイン残基であるＣ１２３で突然変異が生じると、分子間でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を形成せず、共有結合したダイマーを形成することができない。また、他のシステイン残基での突然変異は抗原の構造に影響を与える（ＭｃＧｉｎｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９４、１９９７）。全てのニューカッスル病ウイルス菌株はシステイン残基が良好に保存されており、これは構造と機能の厳しい相互作用を意味する。Ｆ蛋白質における、それぞれのシステイン残基の生物学的役割が全て明確にされたのではない。単にＣ１９９がＣ７６ジスルフィド結合を形成し、この結合が、Ｆ蛋白質が切られた後にＦ１とＦ２ポリペプチドの間の連結を維持する役割を果たすという報告がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０００７】
Ｆ蛋白質とＨＮ蛋白質は重要な防御抗原であり、これらのエピトープはマウスモノクローナル抗体を用いて決定された。今までＦ蛋白質で３個の３次構造的エピトープとＨＮ蛋白質で２個の構造、１つの線状エピトープが明らかになった（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、１９８６；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ＨＮ蛋白質の線状エピトープをなす８個のアミノ酸配列は３４６アスパラギン酸−グルタミン酸−グルタミン−アスパラギン酸−チロシン−グルタミン−イソロイシン−アルギニン３５３と判明した。
【０００８】
Ｆ蛋白質とＨＮ蛋白質はニューカッスル病ウイルスの重要な防御抗原であるので、これら蛋白質を抗原として使用して鳥類を免疫化させることによって、ニューカッスル病ウイルスに対する感染及びこれによる斃死を予防することができる。また、Ｆ蛋白質とＨＮ蛋白質に対して生じた抗体を用いて、鳥類のニューカッスル病に対する血清学的な診断を行うことができる。特に、ＨＮ蛋白質に対する抗体は赤血球凝集抑制法によって全世界的に幅広く測定されており、抗体力価と防御能力との高い関連性が原因で、赤血球凝集抑制法が抗体検査に好まれているが、実験室ごとに抗体タイターの差異が激しく、自動化が難しくてＥＬＩＳＡ法に比べて短所がある。ＥＬＩＳＡ法は自動化及び結果の数値化が可能であるという長所があるが、全ウイルス抗原を使用するため、ＦやＨＮ蛋白質以外の非常に多くのヌクレオキャプシドに対する抗体が原因で、従来の赤血球凝集法によって測定された抗体タイターと相関関係が低くなる短所がある。
【非特許文献１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｔ．，ａｎｄ  Ａ．Ｐｏｒｔｎｅｒ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ，  １９９１，  ｐ．３４７−３７５．  Ｉｎ  Ｄ．Ｋｉｎｇｓｂｙｒｙ（ｅｄ．），  Ｔｈｅ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、従来のワクチン接種による防御率が低くて養鶏農家に被害を与える抗原性変異ニューカッスル病ウイルスの被害を減らすために、診断及びワクチン開発に有用に使用できる鳥類免疫系認識ＨＮ蛋白質エピトープと、変異された線状エピトープを有するニューカッスル病ウイルスとを提供することによって本発明を完成した。
【００１０】
本発明の目的は、鳥類のニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質エピトープ、前記エピトープに対する抗体または抗体の断片及び前記抗体を用いたニューカッスル病ウイルスの探知方法及び探知キットを提供することにある本発明の他の目的は、変異形ＨＮ蛋白質エピトープを有する新規の鳥類ニューカッスル病ウイルス、前記ウイルスに対するワクチン、前記ワクチンを含む飼料、飼料添加剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープであるポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質の３４５番目アミノ酸から３５８番目アミノ酸配列である。
【００１２】
また、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルス（寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）に関するものである。
【００１３】
また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルス（寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）を含む鳥類ニューカッスル病ウイルス用ワクチンに関するものである。本発明は、前記ワクチンが生ワクチン、弱毒化ワクチンまたは死ワクチンであってもよく、ワクチンを飼料または飼料添加剤として使用することもできる。
【００１４】
また、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープを特異的に認識する抗体または抗体の断片に関するものである。前記抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。
【００１５】
また、本発明は前記ＨＮ蛋白質のエピトープに対する抗体を鳥類ニューカッスル病ウイルスを含む試料に反応させ、前記抗体に対する陽性反応を用いてニューカッスル病ウイルスを探知することを含む、鳥類ニューカッスル病の診断方法に関するものである。
【００１６】
前記抗体に対する陽性反応は、抗原−抗体反応を検出する方法または赤血球凝集抑制反応法を用いて行うことができる。
【００１７】
また、本発明は本発明による抗体または抗体の断片を含む鳥類ニューカッスル病診断用ポリペプチドキットに関するものである。
【００１８】
また、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列を含む鳥類ニューカッスル病診断用核酸キットに関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００２０】
本発明による鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープであるポリペプチドは鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質の３４５番目アミノ酸から３５８番目アミノ酸で構成された１４個アミノ酸からなるペプチドである。本発明のＨＮ蛋白質のエピトープは従来に知られた８個ペプチド抗原である３４６アスパラギン酸−グルタミン酸−グルタミン−アスパラギン酸−チロシン−グルタミン−イソロイシン−アルギニン３５３より優れた抗原的特性を持っている。前記８個アミノ酸で構成されたＨＮ蛋白質エピトープはマウスのモノクローナル抗体を用いてエピトープ活性を確認したが、マウスと鳥類間には全く異なる免疫体系を持っていてマウスで確認したエピトープが必ず鳥類で認識可能なエピトープであることはない。本発明による１４個のアミノ酸で構成されたペプチドを含むＨＮ蛋白質エピトープは鳥類で認識可能であり、優れた免疫原性を示す。
【００２１】
本発明者らは、韓国内で分離された強病原性ニューカッスル病ウイルスの菌株からＲＮＡを抽出し、これをＲＴ−ＰＣＲした後に塩基配列を明らかにし、それからアミノ酸配列を得た。その結果、本発明のＨＮ蛋白質線状エピトープのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、これをコードする塩基配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示したアミノ酸配列を含むニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質線状エピトープアミノ酸配列をワクチン株、国内及び国外ニューカッスル病ウイルス菌株と比較分析した。
【００２２】
その結果、ＨＮ線状エピトープについて、ＳＮＵ０２０２はワクチン株と同一なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有し、ＳＮＵ５０７０はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有し、ＫＢＮＰ−４１５２とＳＮＵ５００５、ＳＮＵ５００９、ＳＮＵ５０７４は新規のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有していた（図１参照）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で記載される線状エピトープはＶＩＩ型国外株では発見されなかった。
【００２３】
本発明者らはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で記載されるペプチドをＦｍｏｃ−化学法を用いて合成し、合成されたペプチドを９６穴プレートにコーティングし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するラソタ（Ｌａ  Ｓｏｔａ）ワクチン株を免疫して得られた鶏の抗血清（抗ラソタ株抗血清）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を有するＫＢＮＰ−４１５２を免疫して得られた鶏の抗血清（抗ＫＢＮＰ−４１５２抗血清）を用いてＥＬＩＳＡ法を行った。
【００２４】
その結果、抗ラソタ株抗血清はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のペプチドに対して高い反応性を示した反面、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するペプチドに対しては低い反応性を示した。そして、抗ＫＢＮＰ−４１５２抗血清はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するペプチドに対しては高い反応性を示した反面、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有するペプチドに対しては低い反応性を示した。これらの結果により、このような線状エピトープが鳥類免疫系によって認識されるという事実を初めに確認し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する最近の野外ウイルスは従来ワクチン抗体によって中和がほとんど起こらないという事実を確認した（図２参照）。
【００２５】
本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示したアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープを特異的に認識する抗体または抗体の断片を提供する。
【００２６】
具体的には、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示したアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質のエピトープを含むポリペプチドを抗原として製造され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体または抗体の断片である。
【００２７】
本発明の他の例において、前記抗体または抗体の断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示したアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質のエピトープを含むポリペプチドを抗原にして製造され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体または抗体の断片である。
【００２８】
本発明の他の例において、前記抗体または抗体の断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示したアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質のエピトープを含むポリペプチドを抗原にして製造され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体または抗体の断片である。
【００２９】
前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得、鶏、キジ、鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウなど鳥類の抗体であり得る。前記抗体は鶏、キジ、鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウなど鳥類のニューカッスル病ウイルスに使用することができる。
【００３０】
また、本発明は、前記抗体または抗体の断片を鳥類ニューカッスル病ウイルスを含む試料に反応させ、前記抗体に対する陽性反応を示す試料をニューカッスル病として判断することを含む鳥類ニューカッスル病の診断方法を提供する。前記陽性反応の確認は、通常の抗体−抗原反応を探知する方法で行うことができ、例えば前記抗体または抗体の断片に放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素、クロモゲン及び染色物質からなる群より選択された標識物質で標識し、前記標識物質による反応結果を検出して行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡである。
【００３１】
また、本発明は、前記抗体または抗体の断片を鳥類ニューカッスル病ウイルスを含む試料に反応させ、鶏赤血球を反応させてニューカッスル病ウイルスによる赤血球凝集抑制の有無を検査する前記抗体に対する赤血球凝集抑制反応法を用いて、ニューカッスルウイルスを探知することを含む、鳥類ニューカッスル病の診断方法に関するものである。本発明の一実施例による鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質エピトープに対する抗体を用いた赤血球凝集抑制反応法には、通常のウイルス赤血球凝集抑制反応方法を適用することができる。
【００３２】
また、本発明は、前記ＨＮ蛋白質のエピトープを認識する抗体または抗体の断片を含む鳥類ニューカッスル病診断用ポリペプチドキットまたは前記ＨＮ蛋白質のエピトープをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む前記ニューカッスル病ウイルス診断用核酸キットに関するものである。前記核酸キットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして、ポリ−Ｌ−リジン処理ガラス基板やニトロセルロース、ナイロン膜などの基板にコーティング緩衝溶液と共に滴下し、自然乾燥や紫外線で結合させて、ウイルスＲＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を蛍光染色剤、ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識した後、サザンまたはノーザンブロッティングに使用したり、リアルタイムＰＣＲに使用することができる。本発明によるＨＮ蛋白質エピトープをコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、通常のオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いたウイルス検出方法と同一に適用することができ、前記核酸キットも本発明によるＨＮ蛋白質エピトープをコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することを除いては通常の核酸キットと同様である。
【００３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルス（寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）を含む鳥類ニューカッスル病ウイルス用ワクチンを提供する。
【００３４】
本発明は、また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルスに関するものである。前記ウイルスはＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに寄託して２００６年３月１０日に寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰを受けた。前記ウイルスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示したようにＨＮ蛋白質のエピトープである３４５番目アミノ酸から３５８番目アミノ酸を含むペプチドの中で３４７番目アミノ酸及び３５４番目アミノ酸がリジンに変更されている。また、蛋白質３次構造形成に重要な役割を果たすシステイン（ＨＮ：Ｃ１−Ｃ１３、Ｆ：Ｃ１−Ｃ１３）とＮ−グリコシレーション領域（ＨＮ：Ｇ１−Ｇ６、Ｆ：Ｇ１−Ｇ６）で、本発明による変異株ＳＮＵ４１５２とラソタ株を比較した結果、ＨＮでＣ１とＧ５、ＦでＣ２が異なっていた。
【００３５】
本発明は、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含む変形された鳥類ニューカッスル病ウイルスＨＮ蛋白質のエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むニューカッスル病ウイルス（寄託番号ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）を含む鳥類ニューカッスル病ウイルス用ワクチンを提供し、前記ワクチンは生ワクチン、弱毒化ワクチンまたは死ワクチンであり得る。本発明によるワクチンは、通常の鳥類ニューカッスル病ウイルス用ワクチンに含まれる追加的な賦形剤または添加剤など、例えばミネラルオイル、水酸化アルミニウムゲル、アジュバントとしてサポニン、ビタミン、グルタミン酸ナトリウム、脂質多糖体、ＢＣＧ、キトサン、グルカン、ペプチドグルカンなどを追加することができる。前記抗体は鶏、キジ、鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウなど鳥類のニューカッスル病ウイルスに使用することができる。前記ワクチンの鳥類投与方法は皮下や筋肉注射で接種し、育雛期、産卵前、産卵中に１回または繰り返して接種して行うことができ、接種量は通常の鳥類ニューカッスル病ウイルスのワクチン投与量と同一である。
【００３６】
ニューカッスル病ウイルスのＦ蛋白質は、不活性な前駆体形態（Ｆ０）で作られ、ゴルジ膜（Ｇｏｌｇｉ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を通って移動する間に活性形態のＦ１とＦ２に切り分けられる［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｔ．，ａｎｄ  Ａ．Ｐｏｒｔｎｅｒ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ，  １９９１，  ｐ．３４７−３７５．  Ｉｎ  Ｄ．Ｋｉｎｇｓｂｙｒｙ（ｅｄ．），  Ｔｈｅ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．］。このような過程は、Ｆ１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）のアミノ末端で疎水性ドメインを露出させ、これは成熟した蛋白質の生物学的活性に重要な役割を果たす（Ｓｃｈｅｉｄ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｐｉｎ，  １９７４；Ｓｃｈｅｉｄ  ａｎｄ  Ｃｈｏｐｐｉｎ，  １９７８）。融合ペプチドと呼ばれる疎水性ドメインはパラミクソウイルス  （ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）Ｆ蛋白質で良好に保存され、膜融合を媒介するのに直接的に関与していると思われる（Ｌａｍｂ，  １９９３）。パラミクソウイルスＦ蛋白質は、ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔを含み、アルファヘリックス構造を形成する可能性のある２つの地域を含むいくつかの共通の構造形態を有している（Ｌａｍｂ，  １９９３）。２つの反復の中で最も長いｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＡはＦ１のアミノ末端で疎水性融合ペプチドと隣接しており、ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ  Ｂは、貫通膜（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域の上部に密着している。ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ  Ｂは、毎７個残基ごとに良好に保存されたロイシンあるいはイソロイシンの連続で構成されている（Ｂｕｃｋｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄ、１９８９）。
【００３７】
ＨＮ蛋白質によって、ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）が、ｇｌｙｃｏｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅのシアル酸への結合を介して、宿主細胞表面に位置することとなる。ＨＮ蛋白質は貫通膜ドメイン、幹ドメイン及び球形ドメインの３つの地域に分れる。抗原性の受容体の結合部位と、ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）の活性部位は、両方とも、球形ドメインに位置している。融合誘導活性は、幹ドメインに位置しており、これはＦ蛋白質と相互作用する（Ｓｅｒｇｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。幹ドメインは予想される形態で、α−ヘリックスと共に２個のｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ  Ａ（７４−８８位置）とｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ  Ｂ（９６−１１０位置）を有している。また、構造を破壊するいずれの突然変異も、受容体結合とノイラミニダーゼ活性を減少させる原因となるという報告がある（Ｓｔｏｎｅ−Ｈｕｌｓｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９９）。
【００３８】
本発明者らは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するＫＢＮＰ−００２８とラソタ株を用いて交差赤血球凝集抑制検査法を行った。その結果、抗ラソタ株血清はラソタ株に対して高い赤血球凝集抑制力価を示したが、抗ＫＢＮＰ−４１５２血清は４倍乃至８倍低い赤血球凝集抑制力価を示し、抗ＫＢＮＰ−４１５２血清はＫＢＮＰ−４１５２ウイルスに対して抗ラソタ株血清と比較して４倍乃至８倍高い赤血球凝集抑制力価を示した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するラソタ株とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するＫＢＮＰ−４１５２間に抗原性の差があることが再確認された（図３参照）。
【００３９】
また、本発明者らは抗ラソタ株血清と抗ＫＢＮＰ−４１５２血清でそれぞれ中和させたＫＢＮＰ−４１５２を鶏胚繊維芽細胞に感染させてウイルス中和試験を行った。その結果、抗ラソタ株血清は抗ＫＢＮＰ−４１５２血清に比べてウイルス中和能力が１２８倍低く、２つのウイルス間の抗原性差が確認された（図４参照）。
【００４０】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１：ＨＮ蛋白質の線状エピトープ塩基配列分析＞
＜１−１＞ウイルス菌株の分離
ニューカッスル病ウイルス菌株は鶏から標準的方法（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、１９８９）によって分離した。具体的には、気管（ｔｒａｃｈｅａ）、前胃（ｐｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌｕｓ）、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）及び盲腸扁桃（ｃｅｃａｌ  ｔｏｎｓｉｌ）のような出血性病変部位のサンプルを使用してウイルスを分離した。前記分離したウイルスを１０％のＢＣＳ（ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）培地で培養した鶏胚繊維芽細胞に接種し、細胞は５％のＣＯ２、３７℃の加湿環境下で培養した。
【００４２】
合胞体（ｓｙｎｃｙｔｉａ）を観察した後、上澄み液を、１０乃至１１日齢のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）孵化鶏卵（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｃｏ．，ＮＹ）の尿膜腔（ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｃａｖｉｔｙ）に接種した後、３７℃で３日間培養して、４℃で静置した後、尿膜液を回収した。前記回収した尿膜液は鶏赤血球細胞の凝集反応とバクテリア感染をテストした。ＨＮ蛋白質線状エピトープ塩基配列を分析するためにＳＮＵ０２０２、ＫＢＮＰ−４１５２、ＳＮＵ５００５、ＳＮＵ５００９、ＳＮＵ５０７０、ＳＮＵ５０７４を使用し、ニューカッスル病ウイルスの最終的な同定は＜実施例１−３＞で決められた塩基配列に基づいて実施した。
ウイルス同定及び線状抗原分析のためのＨＮ部分塩基配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０乃至１５及び図５Ａ乃至図５Ｆに示した。
【００４３】
【表１】
2009507787.tif 000003
【００４４】
＜１−２＞ＲＮＡ分離とＲＴ−ＰＣＲ
ウイルスゲノムＲＮＡは、酸−グアニジウム−フェノール（ａｃｉｄ−ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｐｈｅｎｏｌ）法（Ｃｈｏｍｚｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｉ、１９８５）によって尿膜液から抽出した。具体的には、尿膜液１００μｌを１ｍｌのＴＲＩ反応物（ＭＲＣ  ｃｏ．，ＭＡ）に添加して抽出し、ＲＮＡ沈殿物を０．１％のＤＥＰＣ（ピロ炭酸ジエチル）処理された蒸留水（ＤＷ）５０μｌで溶かした。
【００４５】
前記で抽出したＲＮＡ１μｌ、ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ、２０ｎｇ／μｌ）１μｌ、５ｘ１ｓｔｓｔｒａｎｄｅｄバッファー２μｌ、ＤＥＰＣ処理されたＤＷ４．５μｌをよく混合して７２℃で１５分間反応させて氷で冷却した。ｄＮＴＰｓ（Ｂｉｏｎｅｅｒ  ｃｏ．，Ｋｏｒｅａ）１μｌとＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）０．５μｌを前記反応物に添加して４２℃で６０分間反応させ、逆転写酵素は９４℃で５分間処理して不活性化させた。
【００４６】
４倍希釈したｃＤＮＡ１μｌ、１０ｘＰＣＲバッファー１μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ０．２μｌ、それぞれのプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７乃至ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ  ｃｏ．，１Ｕ／μｌ）１μｌ及びＤＷ７．２μｌを混合した。前記反応液を９４℃で４分間変成させた後、９４℃で３０秒、５２℃で１０秒、７２℃で６０秒処理し、これを３５回反復して実施した後、７２℃で７分間さらに反応させた。ＰＣＲ産物は２％アガロスゲルで電気泳動してＥｔＢｒに染色して観察した。
【００４７】
その結果、予測される大きさの増幅産物を観察し、塩基配列を分析した結果、特異なバンドであることを確認した。
【００４８】
＜１−３＞塩基配列分析
ＨＮ蛋白質の遺伝子をＡＢＩ３７７ＤＮＡ自動分析装置とダイ・ターミネーター・キット（ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ）を使用して塩基配列を分析した（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。具体的には、ＰＣＲ産物５μｌを３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１μｌ、９５％のエタノール１２．５μｌに添加して氷に１０分間静置した後、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、７０％のエタノールで洗浄した後、沈殿物を乾燥させてこれを１ｘＰＣＲバッファー１０μｌに溶解させた。
【００４９】
塩基配列分析を経済的に実施するために、ダイ・ターミネーター・キット（Ｔａｑポリメラーゼ、ＦＳ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）をＤＷで２．５倍希釈し、希釈されたキット２μｌをＤＮＡ１μｌ、１ｘＰＣＲバッファー２μｌ、塩基配列決定用プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、３ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌに添加した。ＰＣＲは、９６℃で１０秒間反応した後、９６℃で１０秒、５６℃で５秒、６０℃で２０秒の反応を行い、これを２５回反復して実施してから、４℃で反応を終了させた。ＰＣＲが終わった後、ＰＣＲ産物はエタノール沈澱を実施し、沈殿物を乾燥した後、ブルーデキストラン／ＥＤＴＡ（Ｂｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ／ＥＤＴＡ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）ローディングバッファー（ホルムアミド５体積、ブルーデキストラン／ＥＤＴＡ１体積）２μｌに溶かした。変成後、ＡＢＩ３７７ＤＮＡ自動分析装置で反応を実施した。
【００５０】
その結果、ＳＮＵ０２０２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有し、ＳＮＵ５０７０はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有し、ＫＢＮＰ−４１５２とＳＮＵ５００５、ＳＮＵ５００９、ＳＮＵ５０７４はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有していた（図１参照）。
【００５１】
＜１−４＞他の菌株と比較分析
前記で分析されたＨＮ蛋白質の線状エピトープアミノ酸配列は、蛋白質−蛋白質ＢＬＡＳＴ検索（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を通じて分析した。
【００５２】
その結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で記載されるＨＮ線状エピトープは、ワクチン株であるラソタ、Ｂ１、ウルスターなどを含む大部分のニューカッスル病ウイルスで観察され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で記載される線状エピトープは、ＳＬ０３（ＡＢＢ４５８１５）、ＪＳ０６（ＡＢＢ４５８２５）、ＳＧＭ０１（ＡＢＢ４５８２８）、ＴＪ０３（ＡＢＢ５１１４４）、ＳＢＺ０２（ＡＢＢ５１１４５）、ＪＳ０１（ＡＢＢ５１１４６）、ＪＳ０２（ＡＢＢ５１１４７）、ＪＳ０４（ＡＢＢ５１１４８）、ＪＳ０５（ＡＢＢ５１１４９）、ＳＣＬ０３（ＡＢＢ５１１５１）、ＳＱＤ０４（ＡＢＢ５１１５２）、ＪＳ０３（ＡＢＢ５１１５４）、ＧＤ０５（ＡＢＣ８６６９３）、ｗｆａｎ−３−０１（ＡＡＹ４６２４４）、ｙｔａｎ−１−０１（ＡＡＡＹ５６３７８）、Ｐ３５７４２（ＩＢＡ／８５）、ＳＮＵ９３５８ＧＧ（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ＳＮＵ９４４４（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ＳＮＵ９５９８（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）で観察され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で記載される線状エピトープは、国外のニューカッスル病ウイルスでは観察されなかった。
【００５３】
＜実施例２：ＨＮ線状エピトープの鶏抗体反応性調査＞
＜２−１＞ペプチド合成
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に相当するペプチドをＦｍｏｃ−化学法（Ｇｌｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を用いて合成（ペップトロン社、大田、韓国）し、９６穴プレートでコーティング効率を上げるために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ末端に７個のリシンを付け、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のカルボキシル末端にはアミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）４個を付けた。
【００５４】
＜２−２＞抗血清製造
ラソタウイルス（赤血球凝集力価１、０２４／２５μｌ）は０．２％ホルマリンで不活化して、ＫＢＮＰ−４１５２（赤血球凝集力価２４８／２５μｌ）は０．０２５％ホルマリンで不活化し、それぞれＳＰＦ発育卵５個に２００μｌずつ接種して３日間観察し、尿膜液を収穫して赤血球凝集検査を実施して陰性であることを確認した。フロイント完全アジュバントと不活化ウイルス同量を混合して油中に水を乳濁させた液を作ってそれぞれＳＰＦ鶏２匹に１匹当たり２００μｌずつ接種し、２匹は陰性対照群として実験期間の間つづけて飼育し、ニューカッスル病ウイルス抗体陰性の有無を確認した。ワクチン接種４週後、採血して血清を分離して冷蔵または冷凍して実験に使用した。
【００５５】
＜２−３＞ＥＬＩＳＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で記載されるペプチドを５０ｍＭの炭酸塩・重炭酸塩（ｐＨ９．６）緩衝溶液に懸濁させて、９６穴プレートの穴毎に１２５ｎｇと４μｇを室温で４時間コーティングした後、３％の牛血清アルブミン２００μｌを添加して４℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング溶液をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）で洗浄した後、抗ラソタ血清と抗ＫＢＮＰ−４１５２血清を１６倍、３２倍、１２８倍、２５６倍希釈してそれぞれのペプチドがコーティングされた穴に添加して室温で１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した。抗鶏免疫グロブリン−ＨＲＰ結合２次抗体を添加した後、室温で１時間反応させてから、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した後、基質溶液（ＴＭＢ、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン）を添加し、停止容液を入れて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。測定した吸光度は、血清を入れない穴の吸光度とペプチドをコーティングしない穴の吸光度を差し引きして数値を補正した。
【００５６】
その結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で記載されるペプチドは抗ラソタ株血清に対して高い反応性を示した反面、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で記載されるペプチドに対しては反応を示さず、抗ＫＢＮＰ−４１５２血清はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で記載されるペプチドに高い反応性を示した（図４参照）。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で記載されるペプチドは鳥類免疫系によって全て認識されるという事実を初めに確認し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列の変化は抗原性に変化を起こして従来のワクチン株に対する抗体に対する反応性が急激に低下するという事実を証明した。
【００５７】
＜実施例３：交差赤血球凝集抑制検査＞
ユニダイレクショナル（ｕｎｉｄｉｅｒｃｔｉｏｎａｌ）−赤血球凝集抑制検査のために、まずラソタ株とＫＢＮＰ−４１５２の赤血球凝集力価を測定した。具体的には、９６穴プレートのそれぞれの穴にリン酸緩衝溶液を５０μｌずつを噴霧し、第１穴にウイルス５０μｌを添加して混合した後、再び５０μｌを採取して次の穴に添加して混合する過程を繰り返し、最後の穴では５０μｌを採取して除去する方法で連鎖希釈を実施した。前記のようにウイルスが２倍単位で希釈された各穴に０．５％の鶏赤血球（ｖ／ｖ）５０μｌを添加して混合した後、４℃で３０分間反応させて完ぺきな赤血球凝集が起こった穴の希釈倍数（２ｎ、ｎ＝希釈倍数）を赤血球凝集力価にした。
【００５８】
前記で設定した力価に基づいて交差−赤血球凝集抑制検査を実施した。つまり、４−赤血球凝集単位のラソタ株２５μｌと抗ラソタ株血清２５μｌ、ラソタ株２５μｌと抗ＫＢＮＰ−４１５２血清２５μｌ、ＫＢＮＰ−４１５２２５μｌと抗ＫＢＮＰ−４１５２血清２５μｌ、ＫＢＮＰ−４１５２  ２５μｌと抗ラソタ株血清２５μｌを混合して室温で３０分間反応させた後、０．５％の鶏赤血球５０μｌを添加して４℃で３０分経過した後、赤血球凝集が完全に抑制された穴の数を赤血球凝集抑制力価にした。
【００５９】
その結果、抗ラソタ株血清はラソタ株に対して高い赤血球凝集抑制力価を示したが、抗ＫＢＮＰ−４１５２血清は４倍乃至８倍低い赤血球凝集抑制力価を示し、抗ＫＢＮＰ−４１５２血清はＫＢＮＰ−４１５２ウイルスに対して抗ラソタ株血清と比較して４倍乃至８倍高い赤血球凝集抑制力価を示して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有するラソタ株とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するＫＢＮＰ−４１５２間に抗原性の差があることを再確認した（図３参照）。
【００６０】
＜実施例４：ユニダイレクショナル（ｕｎｉｄｉｅｒｃｔｉｏｎａｌ）−ウイルス中和試験＞
ラソタ株とＫＢＮＰ−４１５２接種で生成された抗体のＫＢＮＰ−４１５２に対する中和能力を評価するために、ユニダイレクショナル（ｕｎｉｄｉｅｒｃｔｉｏｎａｌ）−ウイルス中和試験を実施した。つまり、試験管で血清をＰＢＳで２倍希釈した後、９６穴プレートに１００μｌずつ移して同量のウイルス（１００  ＴＣＩＤ５０／２５μｌ）を添加して３７℃で１時間続けて中和させる。中和材料２５μｌと繊維芽細胞懸濁液１００μｌを各穴に接種する。３７℃で４日間培養後に、完全中和が起こって細胞変性効果が全く現れない最高希釈倍数の逆数を中和力価にした。
【００６１】
その結果、抗ラソタ株血清は抗ＫＢＮＰ−４１５２血清に比べてウイルス中和能力が１２８倍低くて２つのウイルス間の抗原性差を確認した（図４参照）。
【００６２】
以上のように、本発明の鳥類免疫系認識ＨＮエピトープと前記エピトープ変異ニューカッスル病ウイルスは、効果的なワクチンを開発することができるだけでなく、ニューカッスル病ウイルスを迅速で正確に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ニューカッスル病ウイルス菌株の間でＨＮ蛋白質の線状エピトープアミノ酸配列（３４５−３５５）を比較したものである。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、ワクチン株（ラソタ株、Ｂ１株、ウルスターなど）および過去大部分の病原性野外株（コンヒョクチュン、２０００、ソウル大学校大学院博士学位論文）のＨＮ蛋白質の線状エピトープアミノ酸配列を有するペプチドと、変異株のアミノ酸配列を有するペプチドとに対する、抗ラソタ血清と抗ＫＢＮＰ−４１５２血清の反応性差をＥＬＩＳＡ法で比較した試験結果である。
【図２Ｂ】図２Ａの説明参照。
【図３】図３はラソタワクチン株と抗原性変異野外株であるＫＢＮＰ−４１５２の新規ＨＮ線状エピトープペプチドに対する抗ラソタ血清と抗ＫＢＮＰ−４１５２血清の反応性を赤血球凝集抑制反応法で比較したものである。
【図４】図４はＫＢＮＰ−４１５２に対する抗ラソタ血清と抗ＫＢＮＰ−４１５２血清のウイルス中和試験の結果である。
【図５Ａ】図５Ａ乃至図５Ｆは本発明によるニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質の配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの説明参照。
【図５Ｃ】図５Ａの説明参照。
【図５Ｄ】図５Ａの説明参照。
【図５Ｅ】図５Ａの説明参照。
【図５Ｆ】図５Ａの説明参照。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2009507787.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【配列表】
2009507787000001.app
【国際調査報告】
2009507787.tif 000015
2009507787.tif 000016
2009507787.tif 000017