(57)【要約】  本発明は、肥満、特に腹部内臓肥満の処置に関する。より具体的には、本発明は、肥満または少なくとも腹部内臓肥満、および／またはその帰結の処置において有用な医薬の調製のための選択的１５−ＬＯ阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満の処置用の医薬組成物の調製のための、選択的に１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬剤の使用。
【請求項２】
肥満が、腹部内臓肥満に相当することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
１５−ＬＯが、１５−ＬＯ−１であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害できる化合物であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、１５−ＬＯの発現を部分的にまたは全体的に阻害できる化合物であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、１μＭ以下のＩＣ５０を有することを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、化合物ＰＤ１４６１７６であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、抗１５−ＬＯ抗体であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
１５−ＬＯの発現を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、アンチセンス核酸であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
１５−ＬＯの発現を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤が、干渉ＲＮＡであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満、特に腹部内臓肥満の処置に関する。より詳細には、本発明は、肥満、または少なくとも腹部内臓肥満、およびその帰結の処置において有用な医薬の調製のための、選択的１５−リポキシゲナーゼ（ＬＯ）阻害剤の使用に関する。
【０００２】
緒言
肥満は、工業化国における主要な公衆衛生問題になっている、漸増的に広まっている慢性疾患である。世界保健機構（ＷＨＯ）は、歴史上最初の非感染性流行病として肥満を認識している。特に、体重過多がますます若い年齢で見られているので、肥満の管理は優先すべきものであると考えられている。
【０００３】
世界的に、肥満の発生率は警告レベルに到達している。ＷＨＯのデータによれば、全米国人の半分近くが過体重であり、そして１／４が臨床的に肥満であり、これはいくつかの集団においては７０％ほど高くあり得る割合である。欧州では、成人の３０％が過体重であり、そして西欧の成人の１２％が肥満である。フランスでは１９８７年と１９９６年との間に肥満率の４５％の上昇が見られており、そして概算で８００万人が肥満である。肥満は若齢者も冒している：肥満児数は１９８０年代以来２倍になっており、そして６〜１２歳の児童における肥満の有病率は１０〜１２％と概算されている。いくつかの研究は、この速度で肥満は２０３０年までに欧州人口の半分を冒すと予測している。
【０００４】
肥満は、脂肪質量の過剰を特徴とする状態である。身長（ｍ）の２乗あたりの体重（ｋｇ）（ｋｇ／ｍ２）として定義されるボディマスインデックス（ＢＭＩ）は、体重過多および肥満を測定するための国際標準である。ＢＭＩは肥満の程度の指標を与え、それで肥満関連の健康上の危険の評価を可能にする（下記参照）。３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する人は肥満であるとみなされる。ＢＭＩに加えて、脂肪組織（ＡＴ）の身体分布を決定することも重要である。実際、肥満個体における増加した脂肪質量は、主に、体幹の腹腔内および内臓周囲領域において見出され、そして腹部内臓ＡＴとして知られている。腹部皮下ＡＴ質量は肥満対象においてわずかにのみ増加する。この結果、腹部内臓ＡＴと腹部皮下ＡＴとの間の割合が増加する。肥満ではないが、インスリン耐性を発達させている個体でさえ、腹部皮下ＡＴに対する腹部内臓ＡＴのより高い割合を有する。従って、米国コレステロール教育プログラム−成人治療委員会ＩＩＩ（National Cholesterol Education Program - Adult Treatment Panel III）（ＮＣＥＰ−ＡＴＰ  ＩＩＩ)によれば、女性で８８ｃｍ、男性で１０２ｃｍより大きなウエスト周囲長（民族によって変動する）が、腹部内臓肥満の指標であり、そして他の健康上の問題を発達させるより高い危険と関連している。国際糖尿病連合（International Diabetes Federation）（ＩＤＦ）は近年、臨海ウエスト周囲長閾値を女性で８０ｃｍ、男性で９４ｃｍまで下げた（Alberti KG et al., 2005）。この腹部内臓ＡＴの発達は、心血管系の危険の劇的な上昇と関連している（Larsson B et al., 1984）および（Lapidus L et al., 1984）。さらに、多数の疫学的研究および代謝研究によって、腹部領域におけるＡＴの有意な蓄積が、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、高血圧、胆嚢疾患、特定の癌（結腸直腸癌、乳癌、子宮内膜癌）、閉塞性睡眠時無呼吸および喘息等の呼吸器合併症、ならびに骨関節炎およびおそらくは運動の問題を発達させる主要な危険因子であることが確認されている。
【０００５】
腹部内臓ＡＴの量を減少させることは、メタボリックシンドローム患者の管理における処置の優先目的に違いない。実際、腹部内蔵質量のかなりわずかな減少（５〜１０％）でさえ、心血管系疾患および２型糖尿病についての危険因子の大部分に対して有利な効果を与え、脂質プロファイル、インスリン感受性指数、高血圧ならびに血栓症および炎症の増加した危険と関連した変数において改善が観察される。ＡＴの低下または予防のための薬理学的アプローチは、中枢神経系に作用する食欲不振誘発剤、または熱産生を増加させることによってエネルギー消費を増加させるかもしくは腸管腔中で食事性脂肪を隔離する薬物のいずれかに依存する。しかし、現在の薬理学的アプローチには、多かれ少なかれ、許容できる副作用を生じる欠点がある。
【０００６】
肥満、特に腹部内臓肥満および／またはその帰結を処置するための有効な治療ストラテジーを見出すことの必要性はそれゆえ、世界的にこの上なく緊急である。
【０００７】
脂肪細胞の分化は、細胞が前脂肪細胞期から脂肪細胞に進行するプロセスである。前記分化は以下の３段階で生じる：前脂肪細胞（増殖する唯一の細胞）の増生、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化、および最後に、肥大のプロセスの間の成熟脂肪細胞におけるトリグリセリドの蓄積。従って、成人における脂肪質量は、主として、脂肪細胞の肥大によって、よりまれには増生によって、増加する。一般則として、脂肪細胞の分化は通常、ホルモン、サイトカイン（またはアディポカイン）、増殖因子、ビタミン等のような、細胞培質中に存在する因子によって正および負両方の調節に供される。何名かの著者は、脂肪細胞の分化における、シクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ経路において産生されるアラキドン酸代謝産物の役割を示唆している（Shillabeer G et al., 1998）。さらに、脂肪細胞の分化は、転写因子ネットワークによって協調的に調節される。脂肪細胞の分化は、細胞周期からの退出ならびにＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）核受容体の発現を誘導する因子であるＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰδ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質）およびＳＲＥＢＰ−１の活性化によって開始される（Fajas L  et al., 1998）。
【０００８】
リポキシゲナーゼは、リポタンパク質中に見出されるものを含む多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシ誘導体への酸化を触媒する、植物および動物中に見出される酵素である（Kuhn H and Borngraber S, 1999）。ヒトでは、リポキシゲナーゼをコードする以下の６個の遺伝子が存在する：ｅ−ＬＯＸ−３（表皮型リポキシゲナーゼ３）、５−ＬＯ（５−リポキシゲナーゼ）、１２−ＬＯ（１２−リポキシゲナーゼ）、１２（Ｒ）−ＬＯＸ（１２（Ｒ）−リポキシゲナーゼ）、１５−ＬＯ−１（網状赤血球型  −  １５−リポキシゲナーゼ１）および１５−ＬＯ−２（１５−リポキシゲナーゼ２）。これらの様々なリポキシゲナーゼは、アラキドン酸上の酸化の位置の特異性に従って命名されている。１２−ＬＯおよび１５−ＬＯはそれぞれ、アラキドン酸を１２（Ｓ）−ヒドロキシペルオキシ−５，８，１０，１４（Ｚ，Ｚ，Ｅ，Ｚ）エイコサテトラエン酸（１２（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ）および１５（Ｓ）−ヒドロキシペルオキシ−５，８，１０，１４（Ｚ，Ｚ，Ｅ，Ｚ）エイコサテトラエン酸（１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ）に変換する。１２（Ｓ）−ＨＰＥＴＥおよび１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥの生化学的還元はそれぞれ、１２（Ｓ）−ＨＥＴＥ（１２−（Ｓ）−ヒドロキシ−エイコサテトラエン酸）および１５（Ｓ）−ＨＥＴＥ（１５−（Ｓ）−ヒドロキシ−エイコサテトラエン酸）（リポキシンとして知られる化合物のクラスの前駆体である）の形成を導く（Kuhn H and Borngraber S, 1999）。アラキドン酸が１５−ＬＯ−２の唯一の基質であるが（Brash AR et al., 1997）、１５−ＬＯ−１は優先的にリノール酸を１３（Ｓ）−ヒドロキシペルオキシ−９Ｚ，１１Ｅ−オクタデカジエン酸（１３（Ｓ）−ＨＯＤＥ）に代謝もする（Hsi LC et al., 2002）。いくつかのリポキシゲナーゼは、その相対的な割合が種に従って変動する生成物の混合物も生じさせ得る。例えば、ヒト１５−ＬＯ−１は、１５（Ｓ）−ＨＥＴＥに加えて、１２（Ｓ）−ＨＥＴＥを少量生じさせる（最終生成物の５〜１０％）。マウスにおいては、１２／１５−ＬＯは、アラキドン酸を３：１の割合で１２（Ｓ）−ＨＥＴＥおよび１５（Ｓ）−ＨＥＴＥに変換する（Kuhn H and Borngraber S, 1999）。同じことは、ラット由来の１２−ＬＯについても当てはまる（Watanabe T et al., 1993）。マウス１２／１５−ＬＯおよびラット１２−ＬＯの生化学的特性を考慮すると、これらの酵素は一般的に、ヒト１５−ＬＯ−１の機能的等価物であると考えられる（以下、本文において、マウス１２／１５−ＬＯおよびラット１２−ＬＯを、１２／１５−ＬＯという）。
【０００９】
その基質特異性に加えて、ヒト１５−ＬＯ−１および１５−ＬＯ−２は、その組織分布に関しても異なっている。１５−ＬＯ−１は、多くの細胞および組織型において構成的に発現されており、網状赤血球、好酸球、肺胞マクロファージおよび気道内上皮において発現が最も高い。１５−ＬＯ−１は、多核白血球、炎症組織、ケラチノサイト、角膜上皮細胞、血管内皮細胞、子宮、胎盤および雄性生殖系の様々な細胞型においても検出されている（Kuhn H and Borngraber S, 1999）。１５−ＬＯ−２は、組織分布がより限定されており、前立腺、肺、皮膚、角膜およびマクロファージにおいてのみ転写物が見出される（Brash AR, Boeglin WE and Chang MS, 1997）（Rydberg EK et al., 2004）。
【００１０】
１５−リポキシゲナーゼは、アテローム性動脈硬化症（Harats D et al., 2000）、喘息（Shannon VR et al., 1993）、癌（Shureiqi I et al., 2000, Shureiqi I et al., 2000）、糸球体腎炎（Montero A and Badr KF, 2000）および骨粗鬆症（ＷＯ０３／０６６０４８）を含むいくつかの病態において以前に関係付けられている。１５−ＬＯ阻害剤の使用は、多くの病態の処置について、例えば、アテローム性動脈硬化症、特定の癌または炎症性疾患の処置について、特許ＵＳ２００５０７０５８９、ＵＳ２００５０７０５８８およびＵＳ２００５０６５１９８に以前に記載されている。
【００１１】
本発明者らは、腹部皮下ＡＴと比較しての腹部内臓ＡＴにおける１５−リポキシゲナーゼ１（１５−ＬＯ−１）の非常に高レベルの転写を検出した。本発明者らによって実施された研究によって、肥満の発達、より特定すると、脂肪細胞の分化および腹部内臓肥満の発達における１５−リポキシゲナーゼの潜在的な役割が明らかとなった。それゆえ、１５−ＬＯの阻害剤は、肥満および／またはその帰結の処置における有利な治療ツールを表す。
【００１２】
従って、本発明は、肥満、特に腹部内臓肥満、および／またはその帰結の処置に関する。より詳細には、本出願は、肥満および／またはその帰結の少なくとも１つの処置において有用な医薬の調製のための１５−リポキシゲナーゼ（ＬＯ）阻害剤の使用に関する。
【００１３】
発明の概要
本発明の１つの目的は、肥満および／またはその帰結の少なくとも１つの処置用の医薬組成物の調製のための、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬物の使用に関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、薬学的に許容される支持体中で、所望により１つ以上の治療活性成分および／または美容活性成分とともに、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬剤を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本出願において本発明者らは、肥満の発達、より特定すると脂肪細胞の分化および腹部内臓肥満の発達における１５−ＬＯの役割を実証した。
【００１６】
それゆえ、本発明の１つの目的は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満、および／またはその帰結の少なくとも１つの処置用の医薬組成物の調製のための、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬剤の使用に関する。
【００１７】
本発明の精神において、１５−ＬＯは、１５−ＬＯ−１および／または１５−ＬＯ−２を指し、好ましくは１５−ＬＯ−１を指す。本発明の好ましい実施態様によれば、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する前記薬剤は、１５−ＬＯ−１の発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤である。
【００１８】
本発明の関連で、肥満は、ウエスト周囲長が女性で８０ｃｍ以上、男性で９４ｃｍ以上、および／またはＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２以上であることを特徴とする。２７ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩは、それを上回ると心血管系の危険が急激に上昇する閾値である。
【００１９】
より具体的には、本発明は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満の処置用の医薬組成物の調製のための、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬剤の使用を目的として有する。
【００２０】
本発明の精神において、「肥満の帰結」は、２型糖尿病および／または心血管系疾患、高血圧、胆嚢疾患、特定の癌（直腸結腸癌、乳癌、子宮内膜癌）、閉塞性睡眠時無呼吸および喘息等の呼吸器合併症、ならびに骨関節炎および運動の問題を意味するものとして理解される。
【００２１】
１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、異なる性質、構造および起源の化合物、特に生物学的化合物、核因子、抗体、補因子、合成または天然の化学的化合物等であり得る。それは、ライブラリー、特に、化学療法剤のライブラリーまたはタンパク質、ペプチドもしくは核酸のライブラリー等でもあり得る。
【００２２】
本発明の精神において、酵素活性の阻害は、１５−ＬＯ活性を阻害する薬剤での処置の非存在下で測定されるコントロール活性と比較して低い測定された活性を指す。次に、発現の阻害は、１５−ＬＯ活性を阻害する薬物での処置の非存在下で測定されるコントロール発現と比較して低い測定された発現を指す。
【００２３】
本発明において、１５−ＬＯの発現および／または活性の阻害は、部分的または全体的であり得る。阻害剤による１５−ＬＯの発現および／または活性の全体的な阻害は、阻害剤での処置の非存在下で測定される発現および／または活性と比較して少なくとも８０％低い１５−ＬＯの発現および／または活性に相当する。阻害剤による部分的な阻害は、阻害剤による処置なしで測定される発現および／または活性と比較して８０％未満の、１５−ＬＯの発現および／または活性の低下に相当する。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害できる化合物である。
【００２５】
本発明は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満、および／またはその帰結の少なくとも１つの処置用の医薬組成物の調製のための、１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害できる少なくとも１つの化合物の使用も目的として有する。さらにより好ましくは、本発明は、脂肪細胞の分化を阻害するための、１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害できる化合物の使用に関する。
【００２６】
「１５−ＬＯの活性を阻害できる化合物」および「１５−ＬＯ阻害剤」なる用語は、好ましくは、１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下のＩＣ５０で１５−ＬＯを阻害する化合物を指す。ＩＣ５０は、観察される酵素活性の最大値を５０％低下させる検討中の化合物の濃度である。ＩＣ５０は、当業者に公知の標準的な方法によって測定できる。特に、比色アッセイは、前記測定を提供する：潜在的な１５−ＬＯ阻害剤を１５−ＬＯとともに１０分間プレインキュベートした後、リノール酸を基質として添加し、次いでさらに１０分間インキュベートする。ｐＨ５で、ヘミンの存在下で、ヒドロペルオキシド化された脂質の還元を、Ｎ−ベンゾイル−ロイコメチレンブルーの酸化と共役させることによって、生成物１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの形成を定量する。酸化メチレンブルーの吸光度は、１５−ＬＯによって形成される１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥの量に正比例する（Auerbach BJ et al., 1992）。当業者は、他のアッセイ、特に、共役ジエンの形成を測定することによる２３４ｎｍでの分光光度法（Gan QF et al., 1996）、または弱酸性条件下でヒドロペルオキシド化脂質の還元と共役したＦｅ２＋の酸化が、５６０ｎｍで強い吸光度を示すキシレノールオレンジによる発色団の形成によって検出される比色アッセイ（Jiang ZY et al., 1992）によって初期酵素反応が決定されるアッセイを想定できる。
【００２７】
好ましくは、本発明において使用される化合物は、選択的に１５−ＬＯ活性を部分的にまたは全体的に阻害する化合物である。「選択的」なる用語は、他のリポキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼについて観察されるものよりも少なくとも５倍低い、好ましくは少なくとも１０倍低い、より好ましくは少なくとも１００培低いＩＣ５０で１５−ＬＯ活性を阻害する化合物を指す。本発明の精神において、選択的１５−ＬＯ阻害剤のＩＣ５０は、１μＭ以上であり得る。
【００２８】
好ましくは、１５−ＬＯの阻害剤は選択的であり、そして１μＭ以下のＩＣ５０を有する。
【００２９】
いくつかの公知の１５−ＬＯ阻害剤が本発明において使用できる。特に上記阻害剤には、合成有機分子、植物抽出物および他の天然生成物ならびに１５−ＬＯに対する抗体またはアンチセンス分子が含まれる。
【００３０】
文献は、１μＭ以下のＩＣ５０を有する多くの１５−ＬＯ阻害剤を記載している。例には、（Brathe A et al., 2005）に記載されるプリン、（Gundersen L et al., 2003）および（Teklu S et al., 2005）に記載されるインドリジン、ジャスパキノール（Jaspaquinol）を含む（Carroll J et al., 2001）に記載されるテルペノイド、（Cornicelli JA and Trivedi BK, 1999）および（Weinstein DS et al., 2005）に記載される阻害剤、（Gutierrez-Lugo MT et al., 2004）に記載されるアナダントフラボン（anadanthoflavone）、アスペノン、ルペノン、ルペオール、α−アミリンおよびアスピゲニン（aspigenine）、（Gleason MM et al., 1995）に記載されるカフェー酸アナログ、ＲＧ−６８６６およびエスクレチン、（Segraves EN et al., 2004）に記載される有機臭化物、（Malterud KE et al., 1999）に記載されるフタレン、（Malterud KE and Rydland KM, 2000）に記載されるポリメトキシル化フラボノイド、（Walther M et al., 1999）に記載されるエブセレン、エイコサテトラエン酸および４−ニトロカテコール、（Bezuglov VV et al., 1996）に記載されるアラキドン酸のセロトニンアミド、シネンセチン、テトラメチルスクテラレインおよびケルセチンを含む（Lyckander IM and Malterud KE, 1992）に記載されるフラボノイドまたは（Kuhn H and Borngraber S, 1999）に記載されるブチルヒドロキシアニソール、ニトロカテコール、サリチルヒドロキサム酸、ナフチルヒドロキサム酸、５，８，１１，１４−エイコサテトライノアート（ＥＴＹＡ）、８，１１，１４−エイコサトリノアートが含まれる。
【００３１】
特許文献もまた、ＥＰ１５１２４０７に開示される発酵Glycine max (L.)抽出物、特許文献ＷＯ０１／９６３３６に開示される１５−ＬＯ阻害化合物、ＵＳ２００５０７０５８８、ＵＳ２００５０７０５８９およびＵ２００５０６５１９８にそれぞれ記載されるイミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリルおよびチアゾリル型の化合物、またはＷＯ２００４０８０９９９、特に実施例８、１４、２３および２６に記載されるピラゾール型の化合物など、多くの１５−ＬＯ阻害剤を記載している。
【００３２】
好ましくは、本発明の範囲において使用される１５−ＬＯ阻害剤は、１μＭ以下のＩＣ５０を有する。特定の例は、Warner-Lambertによって開発され、そしてＷＯ０１／９６２９９に記載されるインドールおよびベンズイミダゾール型の化合物、ＷＯ９６／３８１４４（特に、実施例２３、２４、２７〜３０、３３および３５）に記載されるようなイソチアゾロン型の化合物、化合物ＵＫ−３９９２７６（ＩＣ５０＝８３ｎＭ）およびコード名ＣＰ−６５００５の化合物、ＵＫ−３６９９９７およびＵＫ−３７０６０７などのWarner-Lambertによって開発された化合物ＰＤ１４８１０４のアナログ、ＷＯ９９／３２４３３に記載される３−アミノ−Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−４−メトキシ−ベンズアミド（ＩＣ５０＝１０ｎＭ）およびＩＣ５０≦１の２８０個の例示された化合物等のチオ尿素およびベンズアミド型の化合物、ＷＯ０３／０６６０４８に記載される１５−ＬＯ阻害剤化合物、特に６，１１−ジヒドロ−５−チア−１１−アザ−ベンゾ［ａ］フッ素（ＩＣ５０＝２００ｎＭ  −  化合物２）、３−アミノ−Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−４−メトキシベンズアミド（ＩＣ５０＝１０ｎＭ  −  化合物３）、［［［５−（５，６−ジフルオロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−２−メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］カラバミン酸イソブチルエステル（ＩＣ５０＝１４ｎＭ  −  化合物６）、［［［５−（５，６−ジフルオロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−２−メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］カラバミン酸イソブチルエステル（ＩＣ５０＝１４ｎＭ）を含むWarner-Lambertによって開発されそしてＷＯ０１／９６２９８に記載される１，２，４−三置換ベンゼン型の化合物、ＷＯ９７／１２６１３に記載される四環式インドール型の化合物およびベンゾピラノインドール、ＷＯ９７／１２６１５に記載されるベンズイミダゾール型の化合物、特に実施例１〜３、５〜９、１５、１７、１９〜２１、２７および３７における化合物などのＩＣ５０≦１μＭを有する化合物、ＤＥ４２３８２３３に記載されるＮ−スルホニル−アミノフェノールに由来する１５−ＬＯ阻害剤化合物、特に実施例３の化合物（ＩＣ５０＝０．５μＭ）である。
【００３３】
好ましくは、本出願の範囲において使用される阻害剤は、１５−ＬＯに関して選択的である。従って、本発明は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満、および／またはその帰結の少なくとも１つの処置用の医薬組成物の調製のための、以下の選択的阻害剤の使用を目的として有する：
【００３４】
・Bocan TM et al., 1998、Sendobry SM et al., 1997、ならびに特許ＵＳ３，３８８，１３３、ＷＯ９７／１２３６１３およびＵＳ５，９７２，９８０に記載されるParke-Davis（現Pfizer）製の化合物ＰＤ１４６１７６（６，１１−ジヒドロ−５−チア−１１−アザ−ベンゾ［ａ］−フルオレン）（ＩＣ５０＝０．５〜０．８μＭ）
【化１】
2009525314.tif 000002
・Gleason MM, Rojas CJ, Learn KS, Perrone MH and Bilder GE, 1995に記載される化合物ＲＰ−２７４９３、ＲＰ−６４８３５、ＲＰ−６４４０７、ＲＰ−６５２０８
・Gutierrez-Lugo MT, Deschamps JD, Holman TR, Suarez E and Timmermann BN, 2004に記載されるアスピゲニン
・Segraves EN, Shah RR, Segraves NL, Johnson TA, Whitman S, Sui JK, Kenyon VA, Cichewicz RH, Crews P and Holman TR, 2004に記載されるジオキシン４ａおよび４ｂ
・Cichewicz RH et al., 2004に記載されるコマロール（chomarole）Ａ〜Ｄ、ストロンギロホリン（strongylophorine）−２およびストロンギロホリン−３ならびにクロマン２５番、２６番および２７番
・Lin BB and Lin yS, 2004、Lin BB et al., 2004に記載される１−エトキシ−４−シアノ−５−エトキシカルボニル−３Ｈ−アズレノ［１，２−ｃ］ピラン−３−オン
・Weinstein DS, Liu W, Gu Z, Langevine C, Ngu K, Fadnis L, Combs DW, Sitkoff D, Ahmad S, Zhuang S, Chen X, Wang FL, Loughney DA, Atwal KS, Zahler R, Macor JE, Madsen CS and Murugesan N, 2005に記載される化合物２６、３７ｃ、３７ｆ、３７ｈ、３７ｌ、４０ａおよび４０ｈ、特にＮ−（（４−ｎ−ペンチルベンゼン）スルホニル）−２−（ベンゾフラン−２−イル）トリプタミン（化合物３７ｌ）
・Lin BB  and Lin yS, 1992に記載されるスクアレン
・Lin BB and Lin yS, 1993に記載されるtrans−フィトール
・Cornicelli JA and Trivedi BK, 1999に記載されるジクラニン（dieranine）。
【００３５】
さらにより好ましくは、本発明の範囲で使用される選択的阻害剤は、ＰＤ１４６１７６またはＮ−（（４−ｎ−ペンチルベンゼン）スルホニル）−２−（ベンゾフラン−２−イル）トリプタミンである。
【００３６】
１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害する前記薬剤には、１５−ＬＯに対する親和性を示す抗体または抗１５−ＬＯ抗体も含まれる。好ましくは、上記抗体は、遮断効果を有し、そして１５−ＬＯの活性を全体的にまたは部分的に阻害する。
【００３７】
それゆえ、本発明は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満、および／またはその帰結の少なくとも１つの処置用の医薬組成物の調製のための、１５−ＬＯの活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの抗体の使用に関する。
【００３８】
抗体は、当業者に公知の任意の方法によって得られるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。上記モノクローナル抗体は、リンパ球融合およびハイブリドーマ培養の古典的な方法によって、またはモノクローナル抗体調製の任意の他の公知の方法によって得られ得る。前記ポリクローナル抗体は、同定されたポリペプチド配列のいずれかまたはタンパク質全体の免疫原性を保存するそのフラグメントの１つで免疫化された動物、特に脊椎動物、好ましくは哺乳動物の血清から得られ得る。
【００３９】
本発明の別の局面によれば、１５−ＬＯの活性および／または発現を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、１５−ＬＯをコードする遺伝子の転写を部分的にまたは全体的に阻害することによって、１５−ＬＯの発現を部分的にまたは全体的に阻害できる化合物である。従って、本発明は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満、および／またはその帰結の少なくとも１つの処置用の医薬組成物の調製のための、１５−ＬＯの発現を部分的にまたは全体的に阻害できる少なくとも１つの化合物の使用を目的として有する。
【００４０】
様々な遺伝子発現阻害方法が当業者に周知である。好ましくは、本発明において使用される１５−ＬＯの発現を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、アンチセンス核酸である。アンチセンス療法は一般的に、その発現が阻害されるべきタンパク質をコードするｍＲＮＡのアンチセンス配列を有するウイルスベクター等のベクターを利用し、ベクターがゲノム中に組み込まれるので阻害は一般的に安定である。発現の一過性阻害を提供するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。リボザイムまたは、メッセンジャーＲＮＡを破壊することによって遺伝子が機能性タンパク質を産生するのを防止するＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）技術を利用することも可能である。
【００４１】
従って、本発明の特定の目的は、肥満の処置用の医薬組成物の調製のための、選択的に１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬剤の使用に関する。
【００４２】
本発明の別の目的は、所望により１つ以上の他の治療活性成分および／または美容活性成分とともに、上記のような１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する少なくとも１つの薬剤を、薬学的に許容される支持体中で含む医薬組成物である。
【００４３】
有利には、上記組成物は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満、および／またはその帰結の少なくとも１つを処置するための医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、脂肪細胞の分化を阻害するためにも使用できる。
【００４４】
一例として（限定するものではない）、他の治療剤および／または美容剤（商品化されたまたは開発中）を、以下からなる群において選択できる：
−  抗糖尿病薬
−  インスリン
−  高脂血症治療分子またはコレステロール低下分子
−  降圧薬および血圧降下薬
−  抗血小板薬
−  抗肥満薬
−  抗炎症薬
−  抗酸化剤
−  心不全の処置において使用される薬剤
−  冠動脈不全を処置するために使用される薬剤
−  癌薬
−  抗喘息薬
−  皮膚病の処置において使用される副腎皮質ステロイド
−  血管拡張薬および／または抗虚血薬。
【００４５】
当業者は、本発明の組成物の有利な特性が変化しないかまたは実質的に変化しないように、上記の可能な他の治療剤および／またはその量を確実に選択することが理解される。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、有利には、当業者に周知の薬学的に許容される１つ以上の賦形剤またはビヒクルを含む。
【００４７】
投与の方法および経路ならびに用量は、患者および処置されるべき障害に従って、当業者によって適応させられ得る。選択される投薬強度は、使用される特定の化合物の活性、投与方法、投与期間、使用される特定の化合物の排泄率、処置期間、１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する特定の薬剤と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／またはデバイス、患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および病歴ならびに医学の専門家に周知の他の因子を含む種々の因子に依存する。当業者は、医薬組成物の必要な量を容易に決定しそして処方できる。例えば、医薬組成物中の１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤の開始用量は、所望の治療効果を得るために必要とされるものよりも低くあり得、そして投薬量は所望の効果が達成されるまで徐々に増加させることができる。
【００４８】
本発明は、対象、特にヒトに、上記で定義するような少なくとも１つの化合物または１つの医薬組成物の有効量を投与することを含む、肥満、好ましくは腹部内臓肥満を処置するための方法にも関する。本発明の精神において、「有効量」なる用語は、好ましくは非毒性の、所望の生物学的結果を生じるのに十分な化合物の量を指す。本発明の精神において、「対象」なる用語は、哺乳動物、より特定するとヒトを指す。
【００４９】
処置なる用語は、予防的、症候的または治癒的処置を指す。本発明において使用される１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、疾患の初期および／または後期を含む、示された疾患を罹患しているヒトにおいて使用できる。本発明において使用される１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、疾患を有する患者の治癒を必ずしも可能にしないが、進行を遅延もしくは減速させるかまたは疾患のさらなる進行を防止し、それにより患者の状態を改善することができる。本発明において使用される１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤は、病気ではないが、通常疾患を発達させ得るかまたは疾患を発達させる危険の高い個体に投与することもできる。処置は、年齢、家族歴、遺伝子もしくは染色体の異常、および／または組織もしくは液体中の公知の遺伝子変異などの疾患の１つ以上の生物学的マーカーのために疾患を発達させるかまたは疾患を発達させる危険にある個体において疾患の発達を遅延させることも含む。処置は、肥満、好ましくは腹部内臓肥満を発達させる素因があると考えられる個体に、本発明において使用される１５−ＬＯの発現および／または活性を部分的にまたは全体的に阻害する薬剤を投与することも含む。
【００５０】
本発明の他の局面および利点は、以下の実施例および添付の図面において明らかとなる。それらは例示目的のために与えられれ、限定するものではない。
【００５１】
実施例
実施例１：ＤＮＡチップ技術およびＲＴ−ＰＣＲによる１０名の男性の群におけるヒト腹部皮下脂肪組織（ＡＴ）と比較してのヒト腹部内臓ＡＴにおける１５−ＬＯ−１遺伝子の特異的過剰発現の実証
【００５２】
組織収集
生物医学的研究参加者の保護に関するユリエ法（Huriet Law）に従い、署名されたインフォームドコンセントを各患者から得た後、組織を収集した。患者についての人口統計学的および臨床的データも得た。各患者について、腹部内臓ＡＴ（網）および腹部皮下ＡＴを腹部手術の間に収集した。手術用鋏を用いて組織から皮膚および血管を直ちに除去し、そして得られたＡＴ試料を小片に切断し、そして液体窒素中で直ちに凍結させた。
【００５３】
ＡＴからの全ＲＮＡの抽出
改変チオシアン酸グアニジウム法によって、ＡＴからＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡをＤＮＡｓｅ  １で処理して、夾雑している微量のゲノムＤＮＡを全て除去し、次いで供給元（Qiagen, Courtaboeuf, France）によって示されるように、Quiagen Rneasyカラムで精製した。
【００５４】
ＤＮＡチップ
１０名の男性の群由来の腹部内臓ＡＴにおけるＲＮＡ発現を、腹部皮下ＡＴにおけるＲＮＡ発現と比較するために、ＤＮＡチップを調製する（患者の臨床的特徴に関しては表１参照）。
【００５５】
【表１】
2009525314.tif 000003
【００５６】
Superscript(SS)II逆転写酵素、SS choice system buffer（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）およびoligo-T-7(dt)24プライマー（MWG Biotech）を使用して、１０μｇの全ＲＮＡから二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。標識キット（RNA transcript labeling kit、Enzo, Farmingdale, NY）によりビオチン化相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成する。Affymetrix（登録商標）U133AおよびU133Bチップ上でＤＮＡチップ実験を実施する：Affymetrix（登録商標）Technical Manual（P/N 700222 rev. 4）において指示されるように、ハイブリダイゼーション、洗浄、標識化および走査を実施する。信号を可視化し、そしてMicroarray Analysis suite v4ソフトウェアを用いて定量する。ＡＩＣ（Akaike Information Criterion）予測統計分析モデルおよびＢＩＣ（Bayesian Information Criterion）予測統計分析は、１５−ＬＯ−１発現と腹部内臓ＡＴとの間の正の相関を示す。
【００５７】
ＲＴ（逆転写）
１．５ｍＭ  ＤＴＴ、１８７μＭ  ｄＮＴＰおよびＲｎａｓｅ阻害剤３０単位の存在下で、２００ｎｇのランダムヘキサヌクレオチドおよびＭＭＬＶ酵素（Sigma）２００単位とともに、３７℃で１時間インキュベートすることによって、１μｇのＲＮＡを逆転写した。
【００５８】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
次いで、２０μｌの最終容積中で、得られたＲＴ混合物１μｌを、特異的プライマー０．３ｍＭ（使用されるプライマーについては表２参照）、PLATINIUM Pfx  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, 11708-039）２．５単位、ＭｇＳＯ４  １ｍＭおよび各ｄＮＴＰ  ０．３ｍＭとともに使用するＰＣＲによって、１５−ＬＯ−１  ｃＤＮＡを増幅する。増幅サイクルは、９４℃で３０秒（変性）、各プライマー対について特異的なアニーリング温度で３０秒、および伸長のために６８℃で１分／ｋｂである。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析して、正しい大きさの単一アンプリコンの存在を確認し、そして増幅された遺伝子との相同性を確認するために配列決定した。
【００５９】
【表２】
2009525314.tif 000004
【００６０】
結果
表３に表されるＡffymetrix（登録商標）チップ分析の結果は、１０名の男性患者において、１５−ＬＯ−１が、腹部皮下ＡＴと比較して、Affymetrix（登録商標）データに対する統計分析によって決定したところ２．２の比および７．２５  １０−２５のｐ値で腹部内臓ＡＴにおいて優先的に発現されることを示す。
【００６１】
【表３】
2009525314.tif 000005
【００６２】
図１に示されるＲＴ−ＰＣＲデータは、研究された各患者に関して腹部皮下ＡＴと比較しての腹部内臓ＡＴにおける１５−ＬＯ−１の優先的な発現を確認する：実際、４１番の患者を除き、１５−ＬＯ−１の発現は、腹部皮下ＡＴにおいては古典的なＲＴ−ＰＣＲによって実質的に検出不能であるのに対し、患者全員の腹部内臓ＡＴにおいてはアンプリコンが見られた。
【００６３】
実施例２：８３名の患者の群についての定量的ＰＣＲによるヒト腹部皮下ＡＴに比較してのヒト腹部内臓ＡＴにおける１５−ＬＯ−１遺伝子の特異的発現、および他のリポキシゲナーゼに比較しての上記特異的発現の選択性の確認
【００６４】
組織収集およびＲＮＡ抽出
８３名の患者の群由来の腹部内臓および皮下ＡＴについて、ＤＮＡチップ技術によって得られた結果を確認した（患者の臨床データについては表４参照）。組織を収集し、そして実施例１におけるようにＲＮＡを抽出した。
【００６５】
【表４】
2009525314.tif 000006
2009525314.tif 000007
2009525314.tif 000008
【００６６】
ＢＭＩが、研究された８３名の患者において広範に変動したことを特筆すべきである（１７．９〜７２）。本発明によれば、肥満は３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを特徴とし、そして心血管系の危険の急激な増加が２７ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩについて観察される。
【００６７】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
ＱＰＣＲは、IQ-Cycler（Biorad）で供給元の説明書（SyberMix Biorad, Marnes la Coquette, France）に従ってSybergreen取り込みによって実施する。各遺伝子について、ＲＴ試料の段階希釈物について得られた融解曲線および標準曲線を分析することによって、特異性および効率（＞９０％）についてプライマーの使用（表５参照）を最適化した。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析して、正しいサイズの単一アンプリコンの存在を確認し、そして増幅された遺伝子との相同性を確認するために配列決定した。一旦最適化が完了すると、実施例１に記載されるように、１μｌのＲＴに対してＱＰＣＲを実施する：５−ＬＯ、１２−ＬＯおよび１５−ＬＯ−１の相対的発現を、内部コントロールとして使用されるシクロフィリン遺伝子の発現と比較する。
【００６８】
【表５】
2009525314.tif 000009
【００６９】
ＡＩＣおよびＢＩＣ分析
ＡＩＣ予測モデルおよびＢＩＣ予測分析は、１５−ＬＯ−１発現と腹部内臓ＡＴとの間の正の相関を示す（表６）。
【００７０】
【表６】
2009525314.tif 000010
【００７１】
結果
８３名の患者における腹部内臓および皮下ＡＴ由来のＲＮＡについて図２Ａに示されたＲＴ−ＱＰＣＲデータによって、腹部内臓ＡＴにおける優先的な発現が確認される。平均して、発現レベルは、腹部皮下ＡＴにおけるよりも腹部内臓ＡＴにおいて４０倍高い。腹部皮下ＡＴに対する腹部内臓ＡＴの優先的な発現は、５−ＬＯまたは１２−ＬＯについては見られない。さらに、図２ＢにおけるＲＴ−ＱＰＣＲデータ（腹部皮下ＡＴにおける平均１５−ＬＯ発現に対して標準化された相対的発現）は、１５−ＬＯが、患者のＡＴにおいて発現される主要な形態であることを示す。例えば、５−ＬＯは、腹部皮下ＡＴにおいて１５−ＬＯの発現レベルの約１２％および腹部内臓ＡＴにおいて１５−ＬＯの発現レベルの０．４％で発現されるのに対して、１２−ＬＯ発現は、無視できる（１５−ＬＯ発現の＜０．４％）。
【００７２】
８３名の患者についての個々のデータの分析を図２Ｃに示す（患者第１７番由来の腹部皮下ＡＴにおける平均発現に対して標準化された相対的発現）。結果は、腹部皮下ＡＴまたは腹部内臓ＡＴにおける基底１５−ＬＯ−１発現は個体によって異なるが、腹部皮下ＡＴに対して差次的な腹部内臓ＡＴにおける発現が、患者の大部分について観察されることを示す。これらの知見は、１０名の男性の試料について得られたデータを確認する。
【００７３】
大きな患者コホートに対するＱＰＣＲデータを、ステップワイズ分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって研究した。この方法は、発現データ（説明される変数）において見られるばらつきを説明する説明変数（臨床因子）の最良の組み合わせを同定することを目的としている。本発明者らの科学的主題と一致したより大きくより不均一な患者集団（ＢＭＩのより大きな範囲等）に対して、これらのさらなる検証研究を実施する。プロセスの過程の間、スコアを測定することによってモデルの質を評価し、そして変数の付加または欠失がもはやスコアを改善しない場合、プロセスを停止する。以下の２つのタイプのスコアを使用する：データに対して予測的なアプローチが与えられるより大きな最終モデルを生じるＡＩＣ（Akaike Information Criterion）スコア、およびデータに含有されるばらつきの説明アプローチによってより単純な最終モデルを提供するＢＩＣ（Bayesian Information Criterion）スコア。この高度な統計アプローチによって提唱される最終モデルにおいて非常に有意な変数（ｐ＜１０−６）のみを考慮した。
【００７４】
予測ＡＩＣモデルおよび予測ＢＩＣモデルは、１５−ＬＯ−１発現と腹部内臓ＡＴとの間に正の相関を示す。
【００７５】
まとめると、これらのデータは、ＡＴにおける主要な形態である１５−ＬＯのみが、腹部内臓ＡＴにおいて差次的に発現されることを示し、このことは特に他のリポキシゲナーゼと比較しての、ヒトにおけるＡＴの領域形成における１５−ＬＯの特異的な役割を示唆する。
【００７６】
実施例３：１５−ＬＯ−１発現は、脂肪細胞および前脂肪細胞を含むヒトＡＴの様々な画分中で検出され、そして血管間質画分中の主要な形態であるようである。
【００７７】
様々なヒトＡＴ画分の単離
実施例１に記載されるようにＡＴを収集する。皮膚および脈管構造を除去した後、組織分画において使用しようとするＡＴ断片を３７℃のペニシリン／ストレプトマイシン混合物（１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌ）を補充したＰＢＳ溶液中直ちに洗浄し、次いでFalconチューブ中で、消化緩衝液（クレープスリンガー緩衝液９．５ｇ／ｌ；２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ；ウシ血清アルブミン２０ｍｇ／ｍｌ；５ｍＭグルコース（Sigma）；１型コラゲナーゼ１．５ｍｇ／ｍｌ（Gibco））中でＡＴ質量／消化緩衝液の比１ｇ／１０ｍｌで、振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、消化溶解液をナイロンフィルター（ポアサイズ２００μｍ）で濾過して、残存する未消化の組織（＝マトリックスまたはＣＭ）を全て除去する。得られた細胞懸濁液を８００ｇで１５分間遠心分離して、浮遊脂肪細胞（ｆＡ）を分離し、これをペレット中に存在する血管間質（ＶＳ）画分の上清中に回収した。赤血球をＶＳ画分から除去するために、赤血球溶解緩衝液（１３１ｎＭ  ＮＨ４Ｃｌ（Carlo Erba）；９ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３（Prolabo Rectapur））５ｍｌ中にペレットを懸濁し、そしてこの溶液中で氷上で１５分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を８００ｇで１０分間遠心分離し、そしてペニシリン／ストレプトマイシン混合物（１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌ）を補充したＰＢＳ溶液中にペレットを懸濁する。ＲＮＡ（ＶＳ画分由来のＲＮＡ）を抽出するために、上記懸濁液のいくらかを回収し、懸濁液の別の部分をＣＤ１４磁気マイクロビーズ（CD14 MicroBeads、非ヒト霊長類：抗ヒトＣＤ１４  ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体にコンジュゲートしたマイクロビーズ）とともに氷上で１５〜３０分間インキュベートする。次いで、細胞懸濁液をMACS（登録商標）カラムにかけて、MACS Separator磁気カラムを使用することによって、ＡＴの単球／マクロファージ画分に相当するＣＤ１４＋細胞を回収する。次いで、供給元のプロトコル（MACS, Miltenyi Biotec, Paris, France）に従って、カラムに磁気的に保持されたＣＤ１４＋を溶出する。カラムに保持されない細胞画分は、ＣＤ１４＋細胞が枯渇しており、そして前脂肪細胞および他の細胞型が富化されており、そして前脂肪細胞（ＰＡ）富化画分と考えられた。
【００７８】
組織画分および細胞からの全ＲＮＡの抽出
供給元の説明書（Gibco BRL, Life Technologies）に従って、Trizol中での直接的均質化によって、様々な画分（ＣＭ、ｆＡ、ＶＳ、ＣＤ１４＋、ＰＡ）から全ＲＮＡを抽出し、次いでＤＮＡｓｅ  Ｉで処理し、そしてQuiagen Rneasyの手順によって、Quiagenカラム上で精製する。
【００７９】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＱＰＣＲによる１５−ＬＯ−１発現の分析
実施例１および２に記載される方法によって、１５−ＬＯ−１の相対的な発現を分析する。
【００８０】
結果
図３Ａに示される１名の患者からの１５−ＬＯ−１発現データの分析は、１５−ＬＯ−１発現が、腹部内臓ＡＴプール中に見出され、そして上記発現が全ての腹部内臓ＡＴ画分中で検出され、ＰＡおよびＣＤ４＋細胞（マクロファージ）を含有する血管間質（ＶＳ）画分中で発現がより高く、そして成熟脂肪細胞（ｆＡ）中で発現がより低いことを示す。
【００８１】
３名の患者由来のＡＴ画分に対するＲＴ−ＱＰＣＲにより１５−ＬＯ−１発現を分析することによって、これらのデータが確認される（結果を図３Ｂに示す）。
【００８２】
実施例４：１５−ＬＯ−１発現は、ヒト内臓ＰＡの成熟脂肪細胞への分化の間に調節される。
【００８３】
ヒト腹部内臓ＰＡの脂肪細胞への分化
PromocellまたはCambrex（ヒト白色前脂肪細胞（ＨＷＰ）、Promocell（Heidelberg, Germany）、Cambrex（Paris, France））からヒト腹部内臓ＰＡを得、そして供給元のプロトコールに従って培養する。
【００８４】
Promocell由来のＨＷＰを、ＰＡ増殖培地（０．４％ＥＣＧＳ／Ｈ、５％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）中でコンフルエントになるまで維持する。細胞がコンフルエンスに到達したときに、ＰＡ分化培地（８μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、０．５μｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン、４００ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン、４４μｇ／ｍｌ  ＩＢＭＸ、９ｎｇ／ｍｌ  Ｌ−チロキシン、３μｇ／ｍｌシグリタゾン、５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）中で３日間分化させ、次いで脂肪細胞栄養培地（３％ＦＣＳ、８μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、０．５μｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン、４００ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン、５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）中で最終分化期まで培養する。
【００８５】
Cambrex由来のＰＡを、ＰＡ増殖培地（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中でコンフルエントになるまで維持し、次いで分化プロセスを通して、培地を分化培地（１０％ＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン、１μＭデキサメタゾン、５００μＭ  ＩＢＭＸ、２００μＭインドメタシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）に置換する。
【００８６】
ＲＮＡの抽出ならびにＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＱＰＣＲによる１５−ＬＯ−１およびａＰ２の遺伝子発現の分析
実施例３に記載される方法に従って、分化の間の様々な時点で細胞から全ＲＮＡを抽出し、そして実施例１および２の方法に従ったＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＱＰＣＲによって１５−ＬＯ−１発現を分析する。ａＰ２遺伝子発現のキネティクスを、細胞分化のポジティブコントロールとして使用する（表７参照）。ＲＴ−ＱＰＣＲについては、１５−ＬＯ−１およびａＰ２の相対的発現を、コンフルエンスの日（Ｄ０）に関して報告し、そしてシクロフィリン発現に対して標準化する。
【００８７】
【表７】
2009525314.tif 000011
【００８８】
予想どおり、ａＰ２マーカー（脂肪細胞脂質結合タンパク質）の発現は、Ｄ０で非常に低く、Ｄ３でＤ７〜Ｄ１４まで急激に増加し、次いでＤ２１で減少する。
【００８９】
結果
Promocell由来のＰＡ（ＰＡ培養物第１番、継代４；内臓ＰＡを継代４まで増殖させ、次いで継代４から分化を開始した）の分化の間の１５−ＬＯ−１の発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析する。図４Ａにおける結果は、ａＰ２マーカー（脂肪細胞脂質結合タンパク質）の発現が、Ｄ０で非常に低く、Ｄ３でＤ７〜Ｄ１４まで急激に増加し、次いでＤ２１で減少することを示す。Ｄ０での細胞の状態はＡＴから単離されたＰＡ画分と比較できないが、それにもかかわらず、１５−ＬＯ−１発現はＤ０で検出される。１５−ＬＯ−１の発現は、Ｄ３で増加し、次いでａＰ２遺伝子発現と同じキネティクスに従い、Ｄ１４までの分化の間に増加し、次いでＤ２１で減少する。脂肪細胞期（Ｄ２１）で、１５−ＬＯ−１はなお発現している。
【００９０】
同様に、図４Ｂは、ヒト腹部内臓ＰＡの３つの異なる培養物の分化の間の１５−ＬＯ−１発現を示す：脂肪細胞分化の間の１５−ＬＯ−１発現の調節は、３名の異なる患者由来の３つの独立した培養物について観察される（ＰＡ培養物に依存して、継代７、２または４から内臓ＰＡの分化を開始した）。３つの培養物全てについて、ａＰ２マーカーの発現は、Ｄ７までの分化の間、高レベルまで徐々に増加し、次いでＤ１４、Ｄ２１で減少する。１５−ＬＯ−１発現は、分化プロセスの間に増加するが、ずっと低い。Ｄ３での１５−ＬＯ−１発現のピークが、２名の患者において見出される。興味深いことに、同じ発現プロファイルが、継代４（図４Ａ）および継代７（図４Ｂ）での培養物第１番において見出される。脂肪細胞期で、１５−ＬＯ−１はなお発現している。
【００９１】
実施例５：選択的１５−ＬＯ阻害剤であるＰＤ１４６１７６は、ヒト内臓ＰＡの成熟脂肪細胞への分化を阻害する。
【００９２】
ＰＤ１４６１７６での細胞の処理
数名のドナーからのヒト腹部内臓ＰＡを実施例４に記載されるように分化させる。ＰＡがコンフルエンスに到達したときに（Ｄ０）、ＤＭＳＯ中で希釈したＰＤ１４６１７６を添加し、そしてＰＡの脂肪細胞への分化の間に培地中で維持する。０．１％の終濃度のＤＭＳＯをネガティブコントロールとして培地に添加する。
【００９３】
ＲＮＡの抽出およびａＰ２遺伝子発現の分析
ａＰ２（脂肪細胞脂質結合タンパク質）は、アディポネクチンと同様に、脂肪細胞分化のマーカーである。実施例３に記載されるように分化の間の様々な時点（Ｄ３、Ｄ７）で全ＲＮＡを細胞から抽出し、そして実施例１および２に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ＱＰＣＲによってａＰ２マーカーの発現を分析する。相対的発現を、コンフルエンスの日（Ｄ０）に関して報告し、そしてシクロフィリン発現に対して標準化する。
【００９４】
結果
図５Ａは、ＰＡ培養物（ＰＡ培養物第１番、継代７）の分化のＤ３でのａＰ２発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を表す。Ｄ０で、ａＰ２発現は、ＤＭＳＯコントロールに対して非常に低く、次いでＤ３で急激に増加する。分化の開始時（Ｄ０）でのＰＤ１４６１７６の添加は、用量依存的にａＰ２マーカーの発現を低下させる。
【００９５】
図５Ｂは、２つのＰＡ培養物（ＰＡ培養物第２番、継代５およびＰＡ培養物第３番、継代４）の分化のＤ７でのａＰ２発現のＲＴ−ＱＰＣＲ分析を表す。分化のＤ７でのａＰ２の発現を、ＤＭＳＯコントロールを受容する細胞（培養物第２番）または処理を受容しない細胞（培養物第３番）について１に設定する：Ｄ０から３μＭのＰＤ１４６１７６とのインキュベーションを開始した細胞において、ａＰ２発現は、ＤＭＳＯ処理された細胞または未処理の細胞と比較して強く阻害される。例えば、ＰＤ１４６１７６は、培養物第２番中ではほぼ完全に、そして培養物第３番中では９０％、１５−ＬＯ−１発現を阻害する。
【００９６】
図５Ａおよび５ＢにおけるＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＱＰＣＲのデータは、ＰＡ培養物の分化の間のａＰ２マーカーの発現が、ＰＤ１４６１７６の添加後に用量依存的に低下することを示す。
【００９７】
実施例６：選択的１５−ＬＯ阻害剤であるＰＤ１４６１７６は、ヒト内臓ＰＡの分化の間にアディポネクチン分泌を低下させる。
【００９８】
ＰＤ１４６１７６でのＰＡの処理
数名のドナーからのヒト腹部内臓ＰＡを実施例４に記載されるように分化させる。実施例５に記載されるようにコンフルエンスに到達したＰＡ（Ｄ０）をＰＤ１４６１７６とともにインキュベートする。
【００９９】
アディポネクチン分泌の分析
アディポネクチンは、脂肪細胞によって分泌される因子であり、そしてａＰ２と同様に、本発明者らの培養物中での脂肪細胞分化のマーカーとして機能する。供給元の説明書（R&D, Minneapolis, MN, USA）に従って、Quantikine human adiponectin/ACRP30キットを使用して、分化の間の様々な時点で培養上清中のアディポネクチンの濃度を決定する。
【０１００】
結果
図６Ａは、培養上清中のアディポネクチン分泌が、ヒト腹部内臓ＰＡの分化の間に増加し、Ｄ７で分泌がピークになることを示す。
【０１０１】
Ｄ０からＰＤ１４６１７６での処理を開始した細胞において、アディポネクチン分泌は、図６Ｂに示されるように、Ｄ７で急激に低下する。この知見は、分化のＤ７でａＰ２遺伝子発現を測定することによって観察される分化の阻害を確認する（図５）。
【０１０２】
実施例７：齧歯類における１５−ＬＯ−１の機能的等価物である１２／１５−ＬＯは、ラットおよびマウスのＡＴにおいて主に発現し、腹部皮下ＡＴよりも腸間膜、精巣上体および腎周囲のＡＴにおいて発現が高い。
【０１０３】
齧歯類の組織の摘出
Ｃ５７ＢＩ６マウスおよびスプラーグドーリーラット（Charles River Laboratories）を標準的な昼／夜周期で維持し、そして齧歯類用食餌を自由摂取させる。ペントバルビタール注射によってスプラーグドーリーラットを屠殺し、そしてイソフルラン麻酔後の頸椎脱離によってマウスを屠殺した。
【０１０４】
ＡＴの抽出
様々なＡＴ沈着物を収集し（腹部皮下ＡＴ、背側皮下ＡＴ、網ＡＴ、腸間膜ＡＴ、腎周囲ＡＴ、精巣上体ＡＴおよび莢膜間ＡＴ）、小片に切断し、そして液体窒素中に直接移す。
【０１０５】
ＲＮＡ抽出ならびにＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＱＰＣＲによる１２／１５−ＬＯ発現の分析
実施例３に記載されるように非ＡＴ組織由来の全ＲＮＡを抽出する。実施例１に記載されるようにＡＴ由来の全ＲＮＡを抽出した。実施例１におけるように逆転写を実施し、そして実施例１および２に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ＱＰＣＲによって齧歯類１２／１５−ＬＯ発現（表８参照）を分析する。
【０１０６】
【表８】
2009525314.tif 000012
【０１０７】
結果
ラットおよびマウスにおける１２／１５−ＬＯ組織発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を図７Ａに示す。１２／１５−ＬＯの組織分布は、ラットおよびマウスにおいてかなり限定されていることが理解され得る：肺、脾臓（ラットにおいて）、筋肉（ラットおよびマウス）およびＡＴにおいて発現が検出される。
【０１０８】
図７Ｂに示されるように、ラットにおける様々なＡＴ沈着物における１２／１５−Ｌｏｘ発現の分析は、遺伝子が様々なＡＴ沈着物中で発現することを確認する。背側腹部皮下ＡＴにおいて発現を任意に１に設定する。ヒトにおけるように、網ＡＴ、腸間膜ＡＴ、精巣上体ＡＴおよび腎周囲ＡＴ等の深部ＡＴ沈着物と比較して、腹部皮下ＡＴ（腹部および背側）において、発現はより低い。他の沈着物と比較して低い発現が褐色脂肪（莢膜間ＡＴ）において見られるので、１２／１５−ＬＯ発現は、ＡＴにおいて優先的に生じる。
【０１０９】
実施例８：１５−ＬＯ阻害剤であるＰＤ１４６１７６は、３Ｔ３−Ｌ１細胞において脂肪細胞分化を阻害する。
【０１１０】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養および脂肪細胞への分化
１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン混合物を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル最少必須培地）中で、マウスＰＡ  ３Ｔ３−Ｌ１細胞株（ＡＴＣＣ）を維持する。コンフルエンス（Ｄ０）で、デキサメタゾン（０．１μＭ）、イソブチルメチルキサンチン（０．２５ｍＭ）およびインスリン（０．４μＭ）の混合物での２日間の処理によって、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化させる。次いで、分化が完了するまでさらに１４日間、インスリン上で細胞を維持する。分化プロセスを視覚的に追跡するために、コンフルエンス後の様々な時点で写真を撮影する。
【０１１１】
ＰＤ１４６１７６での細胞の処理
３Ｔ３−Ｌ１細胞がコンフルエンスに到達するときに（Ｄ０）、ＰＤ１４６１７６を３Ｔ３−Ｌ１細胞に添加し、そしてインスリンと同時に１日おきに置換しながら、分化プロセスを通して維持する。
【０１１２】
AdipoRedを用いる分化の定量
細胞内液滴の徐々の蓄積も脂肪細胞への分化の機能的マーカーとして使用する。この蓄積を定量するために、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化させる。室温に再平衡化させるために、アッセイ当日にインキュベーターからプレートを取り出す。培地を除去し、２００μｌのＰＢＳで細胞を注意深くすすぎ、次いで２００μｌのＰＢＳ、続いて５μｌのAdipoRed試薬（Cambrex, Paris, France）を各ウェルに添加する。プレートを混合した後、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３５ｎｍで、蛍光光度計で蛍光を測定する。
【０１１３】
トリグリセリドのアッセイ
細胞内トリグリセリドをアッセイするために、２４ウェルマイクロタイタープレートにおいて、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化させる。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで均質化緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、トリスＨＣｌ  ｐＨ８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）５００μｌを各ウェルに添加する。細胞をチューブ中に掻き取り、そして４０Ｗで１０秒間超音波処理することによって溶解する。次いで、溶解液を０．２μＭミリポアフィルターで濾過する。得られた溶解液１２５μｌに対してTriglyceride L-type kit（Wako）を使用して、アッセイを実施する。溶解液のタンパク質含有量についてアッセイを標準化する。
【０１１４】
ＲＮＡ抽出ならびにＲＴ−ＱＰＣＲによるＬＰＬおよびａＰ２の発現の分析
実施例３に記載されるように分化の間の様々な時点で全ＲＮＡを抽出し、そして実施例２に記載される方法に従ったＲＴ−ＱＰＣＲによって、ａＰ２およびＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）遺伝子の発現を分析する（表９参照）。
【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
結果
脂肪細胞分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞形態の変化を図８Ａに示す。分化のＤ７から細胞は脂肪細胞の形態を獲得し始め、脂質負荷液滴が現れることが理解され得る。Ｄ０でのＰＤ１４６１７６の添加は、細胞における脂質蓄積の用量依存的阻害を誘導し、液滴は、より数が少なく、そして大きさがより小さい。
【０１１７】
図８Ｂは、AdipoRed染色が、分化の間にＤ１４で５０００ＲＬＵまで徐々に増加することを示し、これは３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂質負荷に対応する。Ｄ０でのＰＤ１４６１７６の添加は、AdipoRed染色を分化のＤ３から用量依存的に急激に低下させる。阻害は、Ｄ７でなお観察され、そして分化の１４日後により顕著であり、ここで１０μＭ  ＰＤ１４６１７６で処理した細胞は、Ｄ０で見られるものと同様のＡｄｉｐｏＲｅｄ染色のレベルを有する。
【０１１８】
図８Ｃは、脂肪細胞分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるトリグリセリド蓄積を示す：分化プロセスの間にトリグリセリドが徐々に細胞に負荷される。この増加は実際、AdipoRed染色と正確に同じキネティクスに従う（図８Ｂ）。Ｄ０でのＰＤ１４６１７６の添加によって、トリグリセリド蓄積の用量依存的な低下が導かれた。最高濃度（１０μＭ）について、コントロールに比較して８０％の低下がＤ１０で観察された。
【０１１９】
最後に、図８Ｄは、ａＰ２およびＬＰＭマーカーの発現が、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化の間に徐々に増加し、そしてＤ０でのＰＤ１４６１７６の添加によって、分化のＤ３から開始するこれら２つのマーカーの発現の用量依存的な低下が導かれることを示す。
【０１２０】
まとめると、これらのデータは、１５−ＬＯの阻害剤であるＰＤ１４６１７６が、３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化を阻害することを示す。これらの結果はそれゆえ、１５−ＬＯが、脂肪生成促進因子（pro-adipogenic factor）であり、そしてその活性の阻害によって脂肪細胞分化の阻害が導かれることを示す。
【０１２１】
実施例９：カフェー酸は、ラット初代ＰＡの成熟脂肪細胞への分化を阻害する。
【０１２２】
ラットＰＡの分化
ＶＳ画分由来の細胞（実施例３に記載されるものと同じ方法によって単離）を、１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン混合物を補充した培地１９９（Gibco）中で、８０，０００細胞／ｃｍ２の密度で６ウェルプレート中に播種する。１６時間インキュベートして細胞を接着させた後、ウェルをＰＢＳで穏やかにすすいで、全ての非接着物質を除去する。細胞をコンフルエンス（Ｄ０）まで増殖させ、その時点で培地１９９を除去し、そして血清添加なしのＩＴＴ培地（ＤＭＥ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３３μＭビオチン、１７μＭパントテン酸、０．５μＭヒトインスリン、０．２ｎＭトリヨードチロニンおよび抗生物質）に置換する。この培地中で細胞を維持して分化を可能にし；分化プロセスの間２〜３日毎に培地を交換する。
【０１２３】
カフェー酸での細胞の処理
ラットＰＡがコンフルエンスに到達するときに（Ｄ０）、カフェー酸（２．２μＭ）を添加し、そして脂肪細胞分化プロセスの間維持する。２．２μＭの濃度で、カフェー酸は、１５−ＬＯの選択的阻害剤として考えられている（Shureiqi I, Chen D, Lee JJ, Yang P, Newman RA, Brenner DE, Lotan R, Fischer SM and Lippman SM, 2000）。培地にネガティブコントロールとしてＤＭＳＯを０．１％の終濃度に添加する。
【０１２４】
ＲＮＡ抽出およびａＰ２遺伝子発現の分析
実施例３に記載される方法に従って分化の間の様々な時点で全ＲＮＡを抽出し、そして実施例２に記載されるように定量的ＲＴ−ＰＣＲによってａＰ２およびＬＰＬの遺伝子発現を分析する（表１０参照）。
【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
結果
図９Ａは、脂肪細胞分化の間のラットＰＡの形態に対するカフェー酸の効果を示す：３Ｔ３−Ｌ１細胞に見られるように、ラットＰＡの形態は、脂肪細胞分化プロセスの間に徐々に変化し、細胞は、Ｄ５で現れ始める脂質液滴の豊富な脂肪細胞の形態を獲得する。Ｄ０での２．２μＭのカフェー酸の添加によって、細胞中での脂質蓄積の阻害が導かれる（液滴は、より数が少なく、そして大きさはより小さい）。
【０１２７】
図９Ｂは、脂肪細胞分化の間のラットＰＡにおけるａＰ２発現に対するカフェー酸の効果を示す：ヒトＰＡまたは３Ｔ３−Ｌ１細胞について見られるように、ａＰ２発現は、Ｄ３で開始するラットＰＡの分化の間に増加する（コントロール点Ｄ０およびＤ３を比較）。Ｄ０での２．２μＭのカフェー酸の添加は、Ｄ３でａＰ２発現を低下させ、これは、顕微鏡による知見と相関する（図９Ａ）。
【０１２８】
実施例１０：３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるヒト１５−ＬＯの過剰発現は、脂肪細胞分化を刺激する。
【０１２９】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の一過性トランスフェクション
実施例８に記載されるように３Ｔ３−Ｌ１細胞を培養する。線維芽細胞期に、供給元の説明書（Polyplus transfection）に従った「jetPEI（商標）」キットによって、ａＰ２プロモーターの制御下でヒト１５−ＬＯをコードするプラスミド（プラスミドａｐ２−１５−ＬＯ）またはネガティブコントロールとしてのpBlueScript SKII+プラスミド２μｇで、３．１０５細胞／ｍｌの懸濁液を一過性にトランスフェクトする。ＲＮＡ抽出のために、トランスフェクトされた細胞１ｍｌを１２ウェルマイクロタイタープレート中に移し、そして細胞内トリグリセリドのアッセイのために、１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート中に移す。トランスフェクションの２日後に、実施例８に記載されるように細胞を成熟脂肪細胞へと分化させる。
【０１３０】
トリグリセリドアッセイ
「TG PAP 10003」キット（bioMerieux SA, France）を使用する改良プロトコールによって、トランスフェクトされた３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化の間の様々な時点での細胞内トリグリセリド蓄積を決定する。簡潔には、細胞を２０μｌのイソプロパノールとともに、室温で３０分間インキュベートする。次いで、トリグリセリド試薬（１００μｌ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で３０分間インキュベートする。吸光度を分光光度計で４９２ｎｍで測定する。
【０１３１】
ＲＮＡ抽出ならびにＲＴ−ＱＰＣＲによるａＰ２、ｃ／ＥＢＰαおよびアディポネクチンの発現の分析
実施例３に記載される方法に従って分化の間の様々な時点で全ＲＮＡを抽出し、そして実施例２に記載される方法に従って脂肪細胞分化マーカーであるａＰ２、Ｃ／ＥＢＰαおよびアディポネクチンの発現をＲＴ−ＱＰＣＲによって分析する（表１１参照）。
【０１３２】
【表１１】
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【０１３３】
アディポネクチン分泌
実施例６に記載されるヒト初代脂肪細胞の場合のように、アディポネクチンは、細胞培養における脂肪細胞分化のマーカーである。供給元の説明書（R&D, Minneapolis, MN, USA）に従ってDuoSet（登録商標）ELISA mouse adiponectin/ACRP30キットによって、分化の間の様々な時点での培養上清中のアディポネクチンの濃度を決定する。
【０１３４】
結果
脂肪細胞分化の間のトランスフェクトされた３Ｔ３−Ｌ１細胞中のトリグリセリドの蓄積を図１０Ａに示す。分化プロセスの間、トランスフェクトされた細胞には、トリグリセリドが徐々に負荷される。分化のＤ７から、１５−ＬＯを過剰発現する細胞は、コントロールのpBlueScript SKII+プラスミドでトランスフェクトされた細胞よりも有意に２倍高いレベルのトリグリセリドを示す。
【０１３５】
図１０Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１細胞中の１５−ＬＯの過剰発現が、コントロールプラスミドでトランスフェクトされた細胞中でのこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、試験した脂肪細胞分化マーカー（ａＰ２、Ｃ／ＥＢＰαおよびアディポネクチン）の全ての発現の非常に有意な増加を誘導することを示す。この有意な増加は、ａＰ２およびＣ／ＥＢＰαの発現に関して分化のＤ３で現れる。最後に、図１０Ｃは、アディポネクチンの発現の増加が、コントロールプラスミドでトランスフェクトされた細胞と比較しての１５−ＬＯを過剰発現する細胞におけるその増加した分泌と相関することを示す。
【０１３６】
まとめると、これらのデータは、１５−ＬＯの過剰発現が、３Ｔ３−Ｌ１細胞の成熟脂肪細胞への分化を刺激することを示す。それゆえ、これらの結果は、実施例５、６、８および９に記載される１５−ＬＯの活性の阻害についての薬理学的データと一緒に、１５−ＬＯの脂肪生成促進性の役割を確認する。
【０１３７】
実施例１１：１２／１５−ＬＯノックアウトマウスは、高脂肪食餌誘発性肥満に耐性である。
【０１３８】
動物の処置
Ｃ５７ＢＩ／６ｊの遺伝的背景の１２／１５−ＬＯノックアウトマウスをJackson Laboratory（Bar Harbor, Maine, US）から得た。以後、１２／１５−ＬＯ遺伝子欠損マウスをＬＯＫＯマウスという。コントロールとして使用したＣ５７ＢＩ／６ｊマウスは、Charles River Laboratories（L’Arbresle, France）由来であった。動物を１２時間の昼／夜周期で維持する。高脂肪食餌誘発性肥満プロトコールのために、雄性マウスのみを使用する。
【０１３９】
離乳から７週齢まで、７％の脂肪を含有する齧歯類食餌（ref. R0310；供給元：UAR, Villemoisson, France）をマウスに自由摂取させた。７週齢で、標準低脂肪食餌（１０．５ｋｃａｌ％、ref.: D12329；供給元：Research Diets）または飽和脂肪酸の豊富な食餌（５８ｋｃａｌ％；ref.: D1233；供給元：Research Diets）のいずれかをマウス（１群あたりｎ＝６〜７）に自由摂取させる。これらの食餌を１１〜１２週間マウスに給餌し、そして１週間に１回秤量する。
【０１４０】
脂肪質量の決定
食餌での１２週間の後、異なるエネルギーの２つのＸ線ビームが、脂肪質量（脂質）、除脂肪質量（タンパク質および水）および骨質量の測定を可能にするPiximus（Lunar Corp., Madison, WI, US）によるデンシトメトリーによって、各群２匹のマウスの脂肪質量を決定する。これらの測定値を取るために、ケタミン／キシラジン混合物でマウスを麻酔する。麻酔誘発後、マウスを秤量および測定し、そして腹側を下にしてＸ線ビーム下に配置する。頭部は測定する様々なパラメーターに含まれていない。測定が完了すると、これらのマウスおよび残りのマウス（ｎ＝２〜３）を頸椎脱臼によって屠殺し、そして精巣上体および腎周囲のＡＴを収集し秤量する。
【０１４１】
脂肪細胞の大きさの決定
食餌での１１週間の後、各群２匹の動物をイソフルラン麻酔後の頸椎脱臼によって屠殺する。精巣上体ＡＴの試料を各マウスから取り、そして４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中で固定し、次いでTissue-Tek（登録商標）OCT中に包埋する。次いで、ＡＴを７μｍ切片に切断し、これをヘマトキシリンで染色する。脂肪細胞の大きさ（ｎ＝１０００）をQuips Image Analysisシステム（Leica Mikroskopic und System GmbH, Wetzlar, Germany）で決定する。
【０１４２】
結果
図１１Ａにおける結果は、１２週間高脂肪食餌のＬＯＫＯマウスが、コントロールのＣ５７ＢＩ／６ｊマウスよりも有意に少ない体重増加をすることを示す。標準食餌を用いてさえ、ＬＯＫＯマウスとコントロールマウスとの間で体重増加は異なるが、この差異は、ずっと小さく、そして統計的有意性には到達しなかった。体重増加の差異は、高脂肪食餌のＬＯＫＯマウスと標準食餌のＬＯＫＯマウスとの間では観察されない。
【０１４３】
図１１Ｂに示されるように、体組成のデンシトメーター分析は、食餌に関係なく、ＬＯＫＯマウスにおける脂肪質量が、Ｃ５７ＢＩ／６ｊマウスにおけるよりもずっと低いことを示す。さらに、高脂肪食餌はＣ５７ＢＩ／６ｊマウスにおける脂肪質量の増加を誘導するが、この同じ食餌のＬＯＫＯマウスは標準食餌のＬＯＫＯマウスより多くの脂肪質量を発達させない。図１１Ｃは、標準食餌または高脂肪食餌のＣ５７ＢＩ／６ｊマウスおよびＬＯＫＯマウスにおける精巣上皮および腎周囲のＡＴの重量を示す。これらの重量は、デンシトメーターデータと完全に相関していることが理解されれ得る（図１１Ｂ）。ＬＯＫＯマウスにおける精巣上皮および腎周囲のＡＴの重量は、食餌に関係なくＣ５７ＢＩ／６ｊマウスにおけるよりも低く、そして高脂肪食餌は、Ｃ５７ＢＩ／６ｊコントロールにおいてのみ、精巣上皮および腎周囲のＡＴ重量の有意な増加を誘導する。これらの結果は、ＬＯＫＯマウスとＣ５７ＢＩ／６ｊマウスとの間の体重の差異および体重増加の差異が、主として、脂肪組織の発達の低下に起因することを示す。
【０１４４】
図１１Ｄは、１２週間標準食餌または高脂肪食餌のＣ５７ＢＩ／６ｊマウスおよびＬＯＫＯマウス由来の精巣上皮ＡＴについての組織学的知見を表す。高脂肪食餌のＬＯＫＯマウス由来の脂肪細胞は、Ｃ５７ＢＩ／６ｊコントロール由来の脂肪細胞よりも顕著に小さい。脂肪細胞の大きさを定量的に測定するために、脂肪組織切片の形態計測分析を実施した。図１１Ｅにおける結果は、ＬＯＫＯマウス由来の脂肪細胞の平均的な大きさが、高脂肪食餌によって影響を受けないのに対し、Ｃ５７ＢＩ／６ｊコントロール由来の精巣上皮ＡＴにおいて、脂肪細胞の平均的な大きさが標準食餌について見られた効果と比較して有意に増加することを示す。
【０１４５】
まとめると、これらの知見は、１２／１５−ＬＯ発現の非存在、より具体的には１５−ＬＯ活性の非存在が、インビボでの脂肪細胞中のトリグリセリドの貯蔵および腹部内臓ＡＴの発達に影響し、そして高脂肪食餌によって誘発される肥満の発達を防止することを示す。
【０１４６】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】１０名の男性の群における腹部皮下および内臓脂肪組織（ＡＴ）におけるＲＴ−ＰＣＲによって決定された１５−ＬＯ−１発現を示すゲルの写真である。ＳＣ：腹部皮下ＡＴ；Ｖ：腹部内臓ＡＴ。
【図２Ａ】８３名の患者の群における腹部皮下および内臓ＡＴにおける５−ＬＯ、１２−ＬＯおよび１５−ＬＯ−１発現のグラフである：平均ＲＴ−ＱＰＣＲデータ。ＳＣ：腹部皮下ＡＴ；Ｖ：腹部内臓ＡＴ。
【図２Ｂ】８３名の患者の群における腹部皮下および内臓ＡＴにおける５−ＬＯ、１２−ＬＯおよび１５−ＬＯ−１の相対的発現を比較するグラフである：平均ＲＴ−ＱＰＣＲデータ。白線：腹部皮下ＡＴ；黒線：腹部内臓ＡＴ。
【図２Ｃ】８３名の患者の群における腹部皮下および内臓ＡＴにおける１５−ＬＯ−１発現のグラフである：個々のＲＴ−ＱＰＣＲデータ。
【図３Ａ】患者の腹部内臓ＡＴの画分におけるＲＴ−ＰＣＲによって決定された１５−ＬＯ−１発現を示すゲルの写真である。ＰＡ：前脂肪細胞；ｆＡ：成熟脂肪細胞；ＶＳ：血管間質；ＣＭ：細胞マトリックス。
【図３Ｂ】患者のＡＴ画分におけるＲＴ−ＱＰＣＲによって決定された１５−ＬＯ−１発現を示すゲルのグラフである。
【図４Ａ】ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたPromocell由来ヒト内蔵前脂肪細胞（ＰＡ）（ＰＡ培養物第１番、継代４）の分化の間の１５−ＬＯ−１発現を示すゲルの写真である。Ｄ０：コンフルエンス；Ｄ０〜Ｄ３：分化培地での細胞のインキュベーション；Ｄ３〜Ｄ２１：脂肪細胞栄養培地での細胞のインキュベーション。
【図４Ｂ】ＲＴ−ＱＰＣＲによって決定されたPromocell由来（ＰＡ培養物第１番、継代７）およびCambrex由来（ＰＡ培養物第２番、継代２、およびＰＡ培養物第３番、継代４）の３つの異なるヒト内臓ＰＡ培養物の分化の間の１５−ＬＯ−１発現を示すグラフを表す。
【図５Ａ】選択的１５−ＬＯ阻害剤ＰＤ１４６１７６の漸増濃度の非存在下または存在下でヒト内臓ＰＡ培養物（ＰＡ培養物第１番、継代７）の分化の３日目に、ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたａＰ２マーカーの発現を示すゲルの写真である。
【図５Ｂ】選択的１５−ＬＯ阻害剤ＰＤ１４６１７６の漸増濃度の非存在下または存在下で、２つのヒト内臓ＰＡ培養物（ＰＡ培養物第２番、継代５およびＰＡ培養物第３番、継代４）の分化の７日目に、ＲＴ−ＱＰＣＲによって決定されたａＰ２マーカーの発現を示すグラフを表す。
【図６Ａ】腹部内臓ＰＡの分化の間のアディポネクチン分泌を示すグラフである（ＰＡ培養物第３番、継代４）。
【図６Ｂ】ＰＤ１４６１７６の存在下での分化の７日目のアディポネクチンの分泌を示すグラフである（ＰＡ培養物第３番、継代４）。
【図７Ａ】ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたラットおよびマウスにおけるヒト１５−ＬＯ−１の齧歯類の機能的等価物である１２／１５−ＬＯの組織発現を示すゲルの写真である。１：腎周囲ＡＴ；２：精巣上体ＡＴ；３：肝臓；４：心臓；５：筋肉；６：腎臓；７：皮質；８：小脳；９：脾臓；１０：精巣；１１：十二指腸；１２：空腸；１３：回腸；１４：肺。
【図７Ｂ】ＲＴ−ＱＰＣＲによって決定されたラットにおける様々なＡＴ沈着物中の１２／１５−ＬＯ発現を示すグラフである。１：背側皮下ＡＴ；２：腹部皮下ＡＴ；３：網ＡＴ；４：腸間膜ＡＴ；５：精巣上体ＡＴ；６：腎周囲ＡＴ；７：肩甲骨間ＡＴ。
【図８Ａ】脂肪細胞分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞の形態に対するＰＤ１４６１７６の効果を示す写真を表す。
【図８Ｂ】脂肪細胞分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積に対するＰＤ１４６１７６の効果を示すグラフである：AdipoRedアッセイ。
【図８Ｃ】脂肪細胞分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞中のトリグリセリド蓄積に対するＰＤ１４６１７６の効果を示すグラフである。
【図８Ｄ】脂肪細胞分化の間の３Ｔ３−Ｌ１細胞によるａＰ２およびＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）の発現に対するＰＤ１４６１７６の効果を示すグラフを表す。
【図９Ａ】脂肪細胞分化の間のラットＰＡ形態に対するカフェー酸の効果を表す写真を示す。
【図９Ｂ】脂肪細胞分化の間のラットＰＡによるａＰ２発現に対するカフェー酸の効果を示すゲルの写真である。
【図１０Ａ】３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化の間の細胞内トリグリセリド蓄積に対するヒト１５−ＬＯ−１の過剰発現の効果を示すグラフである。白線：pBlueScript SKII+プラスミドでトランスフェクトされた細胞；黒線：プラスミドａＰ２−１５−ＬＯでトランスフェクトされた細胞；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０Ｂ】３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化の間のａＰ２、ｃ／ＥＢＰαおよびアディポネクチンの発現に対するヒト１５−ＬＯの過剰発現の効果を示すグラフを表す。白線：pBlueScript SKII+プラスミドでトランスフェクトされた細胞；黒線：プラスミドａＰ２−１５−ＬＯでトランスフェクトされた細胞；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０Ｃ】３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化の間のアディポネクチン分泌に対するヒト１５−ＬＯの過剰発現の効果を示すグラフである。白線：pBlueScript SKII+プラスミドでトランスフェクトされた細胞；黒線：プラスミドａＰ２−１５−ＬＯでトランスフェクトされた細胞；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１Ａ】標準食餌またはＤＩＯ（食餌誘発性肥満）とも呼ばれる高脂肪肥満誘発食餌での１２／１５−ＬＯ遺伝子欠損マウス（以下ＬＯＫＯマウスと称する）およびＣ５７ＢＩ／６ｊマウスにおける体重変化を示すグラフである。
【図１１Ｂ】標準食餌または高脂肪食餌を給餌されたＬＯＫＯマウスおよびＣ５７ＢＩ／６ｊマウスにおける脂肪質量の割合を示す。
【図１１Ｃ】標準食餌または高脂肪食餌を給餌されたＬＯＫＯマウスおよびＣ５７ＢＩ／６ｊマウスにおける精巣上体および腎周囲の脂肪組織質量を示す。＊＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１Ｄ】標準食餌または高脂肪食餌を給餌されたＬＯＫＯマウスおよびＣ５７ＢＩ／６ｊマウス由来の精巣上体脂肪組織の組織学切片の写真を示す。
【図１１Ｅ】標準食餌または高脂肪食餌を給餌されたＬＯＫＯマウスおよびＣ５７ＢＩ／６ｊマウス由来の精巣上体組織中の平均脂肪細胞サイズを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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