(57)【要約】  骨健康の維持、又は骨障害の予防、緩和、及び／若しくは治療のための組成物及び方法を示す。本発明は、骨成長を促進するため、若しくは骨健康を維持するための栄養製品、サプリメント、若しくは薬物の製造、又はそれに関する方法も提供する。一実施形態において、本発明は、骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を提供する。【選択図】図５【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物。
【請求項２】
前記植物又は植物抽出物が骨吸収をさらに阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記植物がローズマリーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記植物化学物質が、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
栄養バランス食品、ペットフード、食物サプリメント、トリート、医薬組成物、及びこれらの組合せから成る群から選択された形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
骨折治癒中の骨再生を補助し、成長中の骨形成及び骨塩量を増大させ、且つ最大骨量を最適化するか、又はヒト若しくはペットの骨減少、特に年齢に関連した骨減少を軽減させるように設計されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ヒト又はペットで軟骨を構築し、及び／又は軟骨減少を予防するように設計されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ヒト又はペットで骨関節炎を予防するように設計されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有するローズマリー植物又はローズマリー植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物。
【請求項１０】
前記植物化学物質が、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒト又はペットの骨障害の予防、緩和、及び／若しくは治療、又は骨健康の維持のための食物組成物を製造する方法であって、
食物組成物を準備するステップと、
骨形成タンパク質を刺激し、及び／又は骨吸収を阻害する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する植物又は植物抽出物を有する活性成分を食物組成物に添加して、前記組成物を調製するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記植物がローズマリーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物化学物質が、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、チコリ、茶、ココア、生理活性物質、酸化防止剤、脂肪酸、プレバイオティック繊維、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、及びこれらの組合せから成る群から選択された成分を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
骨障害を治療、緩和、若しくは予防するか、又は骨健康を維持する方法であって、
骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を、前記組成物を必要とする個体に治療有効量投与するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記植物又は植物抽出物が骨吸収をさらに阻害する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物がローズマリーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物化学物質が、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト又はペットで、成長中の骨形成、骨塩量を増大させ、且つ最大骨量を最適化する方法であって、
骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を個体に摂食させるステップ
を含む方法。
【請求項２０】
前記植物又は植物抽出物が骨吸収をさらに阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記植物がローズマリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記植物化学物質が、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ペット及びヒトで骨関節炎を治療、緩和、及び／又は予防する方法であって、
骨関節炎を有するか、又は骨関節炎の危険性がある個体に、前記個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を摂食させるステップ
を含む方法。
【請求項２４】
前記植物又は植物抽出物が骨吸収をさらに阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物がローズマリーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物化学物質が、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
骨粗鬆症を治療又は予防する方法であって、
骨粗鬆症を有するか、又は骨粗鬆症の危険性がある個体に、前記個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を治療有効量投与するステップ
を含む方法。
【請求項２８】
骨折治癒中の骨再生を刺激する方法であって、
骨折を有する個体に、前記個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を治療有効量摂食させるステップ
を含む方法。
【請求項２９】
骨減少を軽減させる方法であって、
骨減少を示す個体に、前記個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を摂食させるステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［背景］
[0001]本発明は、概ね、健康上の効用を提供する栄養組成物に関する。より詳細には、本発明は、例えば、骨密度及び骨形成を改善するのに使用できる有益な組成物、並びにそれらに関連した方法に関する。
【０００２】
[0002]骨量は、生涯を通して発達し、遺伝的、機械的、及びホルモン性の機序によって調節されている。骨塩の獲得は小児期中に起こり、最大骨量には２０歳頃に到達する。この期間中は、骨形成が骨吸収を超える。生涯のさらに後、特に閉経期の頃、又は高齢者集団では、過度の骨吸収を伴った骨代謝回転の上昇により、骨量及び骨質が損なわれ、それによって、骨の量、マイクロアーキテクチャ、構造、及び強度のゆるやかな減失がもたらされる。骨を維持するには、骨形成と骨吸収との間の均衡を回復することが重要である。この骨再構築過程は、骨細胞レベルで調節され、骨形成細胞（骨芽細胞）と骨吸収細胞（破骨細胞）との間の緊密な相互作用が関与する。
【０００３】
[0003]植物栄養素、特にフラボノイドは、骨再構築過程に陽性の影響を与えることができる。最も報告されているデータは、ダイズのイソフラボンに関するものであり、それらは、閉経後の女性において、５０〜９０ｍｇ／日の用量で骨減少を予防し、骨塩量（ＢＭＤ）を改善することが一部の研究で示されている。しかし、イソフラボンを用いた研究のすべてが陽性なのではなく、それらの効力に関してはいまだに論争がある。さらに、以前の研究は、高齢者集団において、茶を飲む者は茶を飲まない者より高い平均ＢＭＤを有することを示したので、茶の効用に関するいくらかの疫学的証拠が存在するが、この新知見を実証する介入研究はまだ行われていない。
【０００４】
[0004]現在、骨形成を刺激できる薬剤の同定への強い関心が存在する。組換え体ＢＭＰ−２の送達は、骨又は軟骨形成を誘導することが示されている。例えば、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）は、ＴＧＦβファミリーの一員であり、胚発生中の骨成長、並びにさらなる骨成長及び骨修復の主要な調節因子である。スタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害を介してコレステロールを低減する有効薬）は、ＢＭＰ−２の誘導によって部分的に媒介される骨形成を改善する（Ｇ．Ｍｕｎｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１９４６〜１９４９（１９９９年）；Ｃ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｌａｎｃｅｔ、３５５：２２１８〜２２１９（２０００年））。スタチンは、閉経期女性における股関節骨折の危険性を低減することもできた（Ｐ．Ｓ．Ｗａｎｇら、ＪＡＭＡ  ２８３：３２１１〜３２１６（２０００年））。
【０００５】
［概要］
[0005]本発明は、概ね、骨健康の維持、又は骨障害の予防、緩和、及び／若しくは治療のための栄養組成物に関する。本発明は、骨成長を促進するため、若しくは骨健康を維持するための栄養製品、サプリメント、若しくは薬物の製造、又はそれに関する方法も提供する。詳細には、本発明は、骨成長にも、平衡のとれた骨再形成を介した骨健康の維持にも重要である骨形成を促進するための栄養製品、サプリメント、若しくは薬物の製造及びそれに関する方法を提供する。骨形成は、骨成長に重要であり、さらに平衡のとれた骨再形成を介した骨健康の維持にも重要である。
【０００６】
[0006]一実施形態において、本発明は、骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を提供する。
【０００７】
[0007]一実施形態において、植物又は植物抽出物は、骨吸収をさらに阻害する。
【０００８】
[0008]一実施形態において、植物は、ローズマリー又はキャラウェーである。
【０００９】
[0009]一実施形態において、植物化学物質は、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、ロスマリン酸、ロスマノール、シルシマリチン、ルテオリン、７−エピロスマノール、及び図７Ａの化合物Ｃ−００６３−Ｗ−０６、並びにこれらの組合せから成る群から選択される。
【００１０】
[0010]一実施形態において、組成物は、栄養バランス食品、ペットフード、食物サプリメント、トリート（ｔｒｅａｔ）、医薬組成物、及びこれらの組合せから成る群から選択された形態でありうる。
【００１１】
[0011]一実施形態において、組成物は、骨折治癒中の骨再生を補助し、成長中の骨形成及び骨塩量を増大させ、且つ最大骨量を最適化するか、又はヒト若しくはペットの骨減少、特に年齢に関連した骨減少を軽減させるように設計することができる。
【００１２】
[0012]一実施形態において、組成物は、ヒト又はペットで軟骨を構築するように設計することができる。
【００１３】
[0013]一実施形態において、組成物は、ヒト又はペットで骨関節炎を予防するように設計することができる。
【００１４】
[0014]別の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有するローズマリー植物又はローズマリー植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を提供する。例えば、植物化学物質は、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン、及びこれらの組合せから成る群から選択することができる。
【００１５】
[0015]代替の一実施形態では、本発明は、ヒト又はペットの骨障害の予防、緩和、及び／若しくは治療、又は骨健康の維持のための食物組成物を製造する方法であって、食物組成物を準備するステップと、骨形成タンパク質を刺激し、及び／又は骨吸収を阻害する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する植物又は植物抽出物を有する活性成分を食物組成物に添加して、組成物を調製するステップとを含む方法を提供する。例えば、組成物は、チコリ、茶、ココア、生理活性物質、酸化防止剤、脂肪酸、プレバイオティック繊維、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、及びこれらの組合せから成る群から選択された成分を含有しうる。
【００１６】
[0016]別の実施形態では、本発明は、骨障害を治療、緩和、若しくは予防するか、又は骨健康を維持する方法であって、骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を、前記組成物を必要とする個体に治療有効量投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
[0017]代替の一実施形態では、本発明は、ヒト又はペットで、成長中の骨形成、骨塩量を増大させ、且つ最大骨量を最適化する方法であって、骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を個体に摂食させるステップを含む方法を提供する。
【００１８】
[0018]別の実施形態では、本発明は、ペット及びヒトで骨関節炎を治療、緩和、及び／又は予防する方法であって、骨関節炎を有するか、又は骨関節炎の危険性がある個体に、個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を摂食させるステップを含む方法を提供する。
【００１９】
[0019]さらに別の実施形態では、本発明は、骨粗鬆症を治療又は予防する方法であって、骨粗鬆症を有するか、又は骨粗鬆症の危険性がある個体に、個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を治療有効量投与するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
[0020]さらに代替の実施形態では、本発明は、骨折治癒中の骨再生を刺激する方法であって、骨折を有する個体に、個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を治療有効量摂食させるステップを含む方法を提供する。
【００２１】
[0021]さらなる実施形態では、本発明は、骨減少を軽減させる方法であって、骨減少を示す個体に、個体で骨形成タンパク質発現を誘導する能力を有する少なくとも１つの植物化学物質を含有する少なくとも１つの植物又は植物抽出物を有効量有する活性成分を含む組成物を摂食させるステップを含む方法を提供する。
【００２２】
[0022]追加の機能及び利点は、本明細書に記載されており、下記の詳細な説明及び図から明らかとなる。
【００２３】
［詳細な説明］
[0038]本発明は、例えば、骨密度及び骨形成を改善するのに使用できる有益な組成物、並びにそれらに関連した方法に関する。例えば、一実施形態では、本発明は、骨形成を刺激し、且つ骨の維持を改善する植物及び植物抽出物を対象とする。
【００２４】
[0039]植物では、多くのイソプレノイド（モノテルペン、セスキテルペンなど）が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素及びタンパク質プレニル化の両方の調節因子となっている。これらの機序は、おそらく、骨吸収阻害又は骨形成促進のいずれかと結びついている。したがって、特定の植物化学物質が、骨吸収の潜在的阻害剤及び／又は骨形成の促進物質でありうる。
【００２５】
[0040]本発明の複数の実施形態において、閉経期症状の鎮静に関する潜在的効用、又はコレステロール合成経路に影響を与え、且つ、それゆえ、ＢＭＰ−２及び骨形成を刺激する可能性を有するそれらの能力に基づいて提案された食用及び／又は薬用植物から抽出物を調製した。下記に、より詳細に論じる通り、抽出物は、概して、４ステップの過程、すなわち、（ａ）ヘキサン、（ｂ）メタノール−水、（ｃ）グリコシダーゼを用いたメタノール−水抽出物の加水分解及び酢酸エチルでの再抽出、並びに（ｄ）ＰＶＰＰカラムを用いた大きなポリフェノールの除去によって調製した。メタノール−水抽出物及び酢酸エチル抽出物をｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに用いた。フラボノイドアグリコン（生物学的活性型）の、それらのグリコシドからの遊離を確実にするために、抽出物は、酸ではなく、α−及びβ−グリコシダーゼで加水分解した。
【００２６】
[0041]骨形成分析には以下の生物検定を用いた。
・ＢＭＰ−２遺伝子レポーターアッセイ（高スループットスクリーニング）
・骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ
・頭蓋冠器官培養、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨形成
・頭蓋冠への注入、ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成。
【００２７】
[0042]例えば、抽出物は、骨形成に関して、ＢＭＰ−２の高スループット遺伝子レポーターアッセイによってスクリーニングし、その後、アルカリホスファターゼアッセイ及び器官培養モデル、そして最後に、マウス頭蓋冠へのｉｎ  ｖｉｖｏ注入によってスクリーニングした。陽性の抽出物及び／又は純化合物の細画分は、さらに活性に関して試験した。活性化合物を決定するために、１つの活性抽出物の化学的組成の分析を行った。
【００２８】
[0043]驚いたことに、ローズマリー植物から抽出された化合物が骨の発生、成長、及び／又は維持のための活性化合物として使用できることが見出された。例えば、上記ローズマリー抽出物の同化作用潜在能力は、少なくとも３種のフェノール（例えば、ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン）が寄与するものでありうる。ローズマリーの他のフェノールには、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチンが含まれる。上記ローズマリー植物抽出物及び純化合物は、骨芽細胞／破骨細胞共培養系で試験した。ローズマリー抽出物、及び上記と同じ３種のフェノールは、骨再構築を制御する主要なサイトカイン（すなわちＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ）を調節する活性を有することが示された。さらに、ローズマリー抽出物及びカルノソールが、おそらくＡＰ−１／Ｎｒｆ２シグナル伝達経路を介して、ヒト骨芽細胞におけるオステオポンチン（ＯＰＮ）発現を刺激することが見出された。
【００２９】
[0044]活性ローズマリー抽出物の３つの成分が新規のものであり、文献には一度も記載されていない。さらに、いくつかの化合物は同じ化学クラスに属するので、これらの成分の架橋生物学的評価は、ローズマリー抽出物に関して、また最も活性な既知成分を含有する他の植物種に関しても、さらなる戦略を提供できるかもしれない興味深い構造−活性相関をもたらすかもしれない（例えばカルノソール／ロスマノール／イソロスマノール）。
【００３０】
[0045]本発明の一実施形態では、ヘキサンを用いた脱脂ステップの後に得られたローズマリー植物のＭｅＯＨ／水抽出物（初期葉乾物量の２５％）が活性の原因となる分子を含有しており、食品製品中で使用できるであろう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、他の化合物による活性化合物の希釈のため、また部分的には結合型の存在のため、初期ＭｅＯＨ／水抽出物ではわずかに観測されるのみである。高活性は、酢酸エチル抽出を介した精製／濃縮、並びに／又はグルコシダーゼを用いた加水分解及びその後の酢酸エチル抽出の後に、ＢＭＰ−２アッセイで観測される。
【００３１】
[0046]本発明の実施形態による植物又は植物抽出物は、食物組成物の調製に使用できる。上記組成物は、栄養バランス食品、ペットフード、食物サプリメント、トリート、又は医薬組成物の形態でありうる。
【００３２】
[0047]上記植物又は植物抽出物は、単独で使用しても、例えば、チコリ、茶、ココアなどの他の植物と共に、又は酸化防止剤、脂肪酸、プレバイオティック繊維、グルコサミン、コンドロイチン硫酸などの他の生理活性分子と共に併用してもよい。
【００３３】
[0048]本発明の一実施形態では、ヒトが消費するための食物組成物又は栄養配合物を調製する。この組成物は、完全栄養配合物、乳製品、冷蔵又は貯蔵安定飲料、スープ、食物サプリメント、食事代用品、及び栄養バー又は菓子でありうる。
【００３４】
[0049]本発明によるローズマリー植物又はローズマリー植物抽出物の他に、上記栄養配合物は、タンパク質源を含みうる。タンパク質源としては、食物タンパク質を用いることが好ましい。上記食物タンパク質は、いかなる適した食物タンパク質でもよく、例えば、動物性タンパク質（乳タンパク質、肉タンパク質、及び卵タンパク質など）でも、植物性タンパク質（ダイズタンパク質、コムギタンパク質、コメタンパク質、エンドウタンパク質など）でも、遊離アミノ酸混合物でも、これらの組合せでもよい。カゼインなどの乳タンパク質、乳漿タンパク質、ダイズタンパク質が特に好ましい。上記組成物は、糖質源及び脂肪源を含有してもよい。
【００３５】
[0050]上記栄養配合物が脂肪源を含んでいる場合、脂肪源は、上記栄養配合物のエネルギーの約５％〜約５５％、例えば上記エネルギーの約２０％〜約５０％を提供することが好ましい。脂肪源を構成する脂質は、いかなる適した脂肪又は脂肪混合物でもよい。植物油脂、例えば、ダイズ油、パーム油、ココナツ油、サフラワー油、ヒマワリ油、コーン油、カノーラ油、レシチンなどは特に適している。乳脂肪などの動物油脂も、望ましい場合には、添加してもよい。
【００３６】
[0051]上記栄養配合物に糖質源を添加してもよい。それは、上記栄養組成物のエネルギーの約４０％〜約８０％を提供することが好ましい。いかなる適した糖質を用いてもよく、例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、及びこれらの混合物を用いてもよい。望ましい場合には、食物繊維を添加してもよい。使用される場合、それは、上記栄養配合物のエネルギーの最大約５％までを含むことが好ましい。上記食物繊維は、例えば、ダイズ、エンドウ、カラスムギ、ペクチン、グアルゴム、アラビアゴム、及びフルクトオリゴ糖を含めた、いかなる適した由来のものでもよい。適したビタミン及びミネラルが、適切なガイドラインに合致した量で上記栄養配合物中に含有されていてもよい。
【００３７】
[0052]望ましい場合には、１つ又は複数の食品グレードの乳化剤、例えば、モノグリセリド及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、レシチン、並びにモノグリセリド及びジグリセリドが上記栄養配合物中に組み込まれていてもよい。同様に、適した塩及び安定化剤が含有されていてもよい。ビタミン及びミネラルも、植物抽出物と共に併用してよい。
【００３８】
[0053]上記栄養組成物は、経腸的に投与可能であること、例えば、粉末、錠剤、カプセル、濃縮液、固体産物、又はすぐに飲める飲料の形態であることが好ましい。粉末の栄養配合物を産生することが望ましい場合には、ホモジナイズされた混合物を、スプレー乾燥機又は凍結乾燥機などの適した乾燥機に移し、粉末に変換する。
【００３９】
[0054]別の実施形態では、上記栄養組成物は、プレバイオティック配合物と共に乳ベースのシリアルを含む。乳ベースのシリアルは、プレバイオティック配合物の担体として働く幼児用シリアルであることが好ましい。
【００４０】
[0055]別の実施形態では、通常の食品製品が、本発明による少なくとも１つの植物又は植物抽出物に富んだものでありうる。例えば、発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネット乳（ｒｅｎｎｅｔｅｄ  ｍｉｌｋ）、菓子、例えば甘物若しくは甘飲料、菓子バー、朝食用シリアルフレーク若しくはバー、飲料、粉ミルク、ダイズベースの産物、非乳発酵製品、又は臨床栄養用の栄養サプリメント。
【００４１】
[0056]上記組成物中の植物又は植物抽出物の量は、その植物源、及びその使用に応じて様々でありうる。好ましい実施形態では、有効日用量が、少なくとも約１ｍｇの日用量、より好ましくは１日あたりの活性分子が１ｍｇ〜２００ｍｇである。
【００４２】
[0057]代替の一実施形態では、少なくともローズマリー抽出物又は上述の植物化学物質を、個体で望ましい効果が得られるのに十分な量で含有する医薬組成物を調製することができる。この組成物は、錠剤、液体、カプセル、軟カプセル、ペースト若しくは香錠、ガム、飲用溶液若しくは乳剤、乾性経口サプリメント、又は湿性経口サプリメントでありうる。上記医薬組成物は、様々な性質のそれぞれの活性分子を標的組織に送達するのに適した担体及び賦形剤をさらに含有しうる。上記担体／賦形剤の種類及び量は、その物質の性質、並びに企図されている薬物送達及び／又は投与の様式によるであろう。当業者ならば、その人の知識に基づいて、適切な成分及び生薬形態を選択するであろうことが理解されよう。
【００４３】
[0058]本発明による植物又は植物抽出物は、ペットフード組成物の調製に使用できる。前記組成物は、上記ペットに、その通常食へのサプリメントとして投与しても、栄養的に完全なペットフードの一成分として投与してもよく、より好ましくは、低カロリーペットフード中に投与してよい。それは医薬組成物でもよい。
【００４４】
[0059]上記植物又は植物抽出物は、単独で使用しても、例えば、チコリ、茶、ココアなどの他の植物と共に、又は酸化防止剤、脂肪酸、プレバイオティック繊維、グルコサミン、コンドロイチン硫酸などの他の生理活性分子と共に併用してもよい。
【００４５】
[0060]上記ペットフード組成物は、１５ｋｇのイヌ用の乾性ペットフード１グラムあたり約０．０１〜０．５ｇの乾燥植物を含有すること、及び１５ｋｇのイヌ用の湿性ペットフード１グラムあたり０．００１〜０．１ｇの乾燥植物を含有することが好ましい。本発明による栄養的に完全なペットフード組成物は、粉末の乾燥形態であるものでも、トリートでも、湿性の冷蔵又は貯蔵安定ペットフード製品でもよい。それは冷蔵されていても、貯蔵安定製品として提供されていてもよい。これらのペットフードは、当技術分野で知られている方法によって生産したものでよい。
【００４６】
[0061]上記ペットフードは、任意選択で、プレバイオティック、プロバイオティック微生物、又は別の活性薬、例えば長鎖脂肪酸を含有していてもよい。上記ペットフード中のプレバイオティックの量は、１０重量％未満であることが好ましい。例えば、上記プレバイオティックは、上記ペットフードの約０．１重量％〜約５重量％を構成しうる。プレバイオティック源としてチコリを使用するペットフードでは、チコリは、上記餌混合物の約０．５重量％〜約１０重量％、より好ましくは約１重量％〜約重量５％を構成するように含有されうる。
【００４７】
[0062]プロバイオティック微生物が使用される場合、上記ペットフードは、上記ペットフード１グラムあたり約１０４〜約１０１０細胞のプロバイオティック微生物、より好ましくは１グラムあたり約１０６〜約１０６細胞のプロバイオティック微生物を含有する。上記ペットフードは、約０．５重量％〜約２０重量％、好ましくは約１重量％〜約６重量％、例えば約３重量％〜約６重量％のプロバイオティック微生物混合物を含有しうる。
【００４８】
[0063]必要な場合には、栄養的に完全になるように、上記ペットフードにミネラル及びビタミンを添加できる。さらに、他の様々な成分、例えば、糖、塩、香辛料、調味料、着香料などを、所望に応じて上記ペットフードに取り込ませてもよい。
【００４９】
[0064]別の実施形態では、ペットフードの品質を改善するために食品添加物を調製してもよい。食品添加物として、それらは内部に封入しても、粉末形態で提供して、主食品が乾性か湿性かに関わらず、それと併せて、若しくはそれとは別々に梱包してもよい。例として、本発明による抽出物を含有する粉末は、粉末形態で、或いはゲル若しくは脂質又は他の適した担体中で、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）内に梱包してもよい。これらの別々に梱包されたユニットは、主食品と共に提供しても、取扱説明書に従って主食品又はトリートと共に使用するための多ユニットパックで提供してもよい。
【００５０】
[0065]有益な効果を得るためにペットが消費するべきペットフードの量は、ペットのサイズ、ペットのタイプ、及びペットの年齢に依存するであろう。しかし、イヌ及びネコには、通常、体重１ｋｇあたり約０．５〜５ｇ乾燥植物の日用量を与えるペットフードの量が適当であろう。
【００５１】
[0066]上述の食物組成物又はペットフード組成物は、それをヒト又は動物に投与すれば、骨折治癒中の骨再生の改善をもたらすことができる。それは、成長中の骨形成及び骨塩量の刺激、並びに最大骨量の最適化を補助できる。詳細には、それは、小児期中における、最適な骨成長を提供しうる。この食物組成物は、骨減少、特に哺乳動物における年齢に関連した骨減少、又は長期入院に関連した骨減少の予防を補助できる。それは、骨粗鬆症の危険性を低減し、骨折後に回復を改善できる。さらに、それは、哺乳動物における軟骨の構築、ペット及びヒトの骨関節炎の予防を補助でき、これが個体（例えばペット及び／又はヒト）の活動性又は可動性の改善をもたらす。
【実施例】
【００５２】
[0067]以下の実施例は、限定ではなく、例として、本発明の様々な実施形態を例示するものであり、本発明の実施形態に従って行った実験的試験を例示する。
【００５３】
実施例１
[0068]選択された植物及び純化合物
[0069]植物は、それらのフェノールに関する知識に基づいて選択した。すなわち、
（ｉ）植物含有エストロゲン物質のデータベース（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）から、ダイズの他、２５種の植物を選択した（表１Ａ）
（ｉｉ）コレステロール合成経路に影響を与え、それによってＢＭＰ−２及び骨形成を間接的に刺激する能力を有する物質を含有する９種の植物＋ダイズ（表１Ｂ）
（ｉｉｉ）純化合物：エストラジオール−１７β、ゲニスタイン、ダイゼイン、２０種のフラボノイド、チコリ化合物（セスキテルペンラクトン）
【００５４】
【表１】
2009545513.tif 000002
【００５５】
【表２】
2009545513.tif 000003
【００５６】
【表３】
2009545513.tif 000004
【００５７】
[0070]植物抽出手順
[0071]図１を参照して、抽出手順は概ね以下のステップを含んでいた。
・ヘキサン、脱脂（抽出物はスクリーニングされない）
・ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１ａ）
・ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、α，β−グリコシダーゼで加水分解され、酢酸エチルで抽出される（１ｂ）
・高分子量ポリフェノールを除去するためにＰＶＰＰカラムで精製された１ａ（２ａ）
・高分子量ポリフェノールを除去するためにＰＶＰＰカラムで精製された１ｂ（２ｂ）
【００５８】
[0072]抽出物２ａ及び２ｂは、抽出物１ａ及び１ｂと同様な結果を与えた。それゆえ、ポリフェノール精製ステップは後に中止された。上記抽出手順は、（酸加水分解の代わりに）グリコシダーゼ処理を含め、アグリコンへのフラボノイド配糖体の変換を確実にした。
【００５９】
[0073]細分画−様々な極性の溶媒、すなわち、酢酸エチルの次に酢酸エチル／メタノール（９５／５）、その後、酢酸エチル／メタノール（５０／５０）、最後にメタノールによる溶離を用いたシリカゲルカートリッジ上での分画によって４つの細画分を調製した（図２）。
【００６０】
[0074]スクリーニングステップ及び生物検定
[0075]骨形成に関するスクリーニングは、以下に示すいくつかの段階で行った。
（ｉ）非加水分解ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ抽出物（１ａ）、及びそれらに対応するグリコシダーゼ加水分解酢酸エチル抽出物（１ｂ）のＢＭＰ−２高スループット遺伝子レポーターアッセイ。抽出物は、１〜１００μｇ／ｍＬの濃度で２回試験し、ＤＭＳＯ中に５０ｍｇ／ｍＬで調製した植物抽出物保存液から、培養培地中に希釈した。
（ｉｉ）ＢＭＰ−２スクリーニングで陽性だった抽出物を新規に調製し、「ヒット」であることを確認するために用量反応を用いて再度スクリーニングした。
（ｉｉｉ）陽性／ヒットの細分画及び候補純化合物のＢＭＰ−２試験
（ｉｖ）ＢＭＰ−２アッセイで陽性を示した抽出物は、骨芽細胞分化に関してアルカリホスファターゼアッセイを用いて、そして骨形成の実証のために、Ｔｒａｉａｎｅｄｅｓら（１９９８年）によって記載の通り、骨形成の器官型モデルで頭蓋冠骨の培養及び組織形態計測を用いてさらに試験した。
（ｖ）マウス頭蓋冠骨内への「ヒット」抽出物の最終ｉｎ  ｖｉｖｏ注入並びに骨の面積及び厚さのモニタリング。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの新生児マウス頭蓋冠アッセイで、抽出物を４日間評価した。４日間全体を通して骨を抽出物と共にインキュベートした。
（ｖｉ）破骨細胞が骨を消化する際に培地中に放出されるＩ型コラーゲンの量を測定することによってモニターされた吸収活性。
（ｖｉｉ）ウシ関節軟骨外植片における、サイトカイン誘導ＩＩ型コラーゲン分解、ＭＭＰ媒介アグリカン分解、及びアグレカナーゼ媒介分解への影響
【００６１】
[0076]結果：ＢＭＰ−２遺伝子レポーター及び器官培養における植物抽出物スクリーニング
[0077]表２及び３は、以下の通りのＢＭＰ−２スクリーニングの結果を詳細に示す。
−１５種の抽出物がＢＭＰ−２陽性であると判明した。それらのうち、２ラウンドのＢＭＰ−２スクリーニングから、ヒット及び活性が確認された５つの細画分（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｌｉｎｄｅｒａ  ｂｅｎｚｏｉｎ、Ｃｙｐｅｒｕｓ  Ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｉｒｉｓ  ｐａｌｌｉｄａ）と、さらに５つの興味深い陽性のもの（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃａｒｕｍ  ｃａｒｖｉ、Ｔｈｙｍｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ、及びＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）とを同定した。
−２ラウンドのＢＭＰ−２スクリーニングから得られた、ヒット及び活性が確認された細画分（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｌｉｎｄｅｒａ  ｂｅｎｚｏｉｎ、Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｉｒｉｓ  ｐａｌｌｉｄａ）、及びさらに５つの興味深い陽性のもの（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃａｒｕｍ  ｃａｒｖｉ、Ｔｈｙｍｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ、及びＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）は、マウス頭蓋冠器官培養モデルでも活性と同定された。
−活性抽出物又は細画分、すなわちＩｒｉｓ  ｐａｌｌｉｄａ、Ｃｙｐｅｒｕｓ  Ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  （ローズマリー）、Ｔｈｙｍｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（タイム）、Ｃａｒｕｍ  ｃａｒｖｉ（キャラウェー）が頭蓋冠器官培養モデルで骨形成を刺激することもさらに確認した。
【００６２】
【表４】
2009545513.tif 000005
【００６３】
【表５】
2009545513.tif 000006
【００６４】
[0078]植物抽出物スクリーニングの結論
[0079]器官培養骨形成アッセイで確認されたＢＭＰ−２ヒットは、ダイズ種子、ローズマリー葉、タイム葉、キャラウェー種子の抽出物であった。
【００６５】
[0080]アルカリホスファターゼアッセイ及び器官培養で確認された、ＢＭＰ−２活性のローズマリー及びキャラウェーヒットの例
[0081]図３Ａ〜Ｃは、ローズマリー及びキャラウェー抽出物のヒットの骨形成アッセイ結果を示す。
【００６６】
[0082]ＢＭＰ−２活性への抽出手順の影響
[0083]予め脱脂された葉における、メタノール／水を用いたローズマリーの最初の抽出（抽出物２１２７）の後では、ＢＭＰ−２遺伝子発現の誘導は、１０μｇ／ｍＬで、１．５×であった（図４）。酢酸エチルによる、この抽出物の特異的抽出（２１８８）は、ＢＭＰ−２発現の増大をもたらした（８×誘導）。これは、ＥｔＯＡｃ抽出工程が、元のＭｅＯＨ／水抽出物からの、活性化合物の濃縮をもたらしたことを示唆する。グリコシダーゼを用いた加水分解の後、その結果得られた酢酸エチル（２１８９）抽出物も活性である。これは、別の活性分子が抽出されていることを示す。抽出物２１８９は、加水分解されていないものより、わずかに高活性でさえある。
【００６７】
[0084]これらの結果は、両抽出物（非加水分解：２１８８及び加水分解：２１８９）中にある活性を明白に示しており、それは、元の抽出物中に、２つの形態、すなわち遊離型及び／又は結合型（グリコシル化）の活性分子が存在していたことを示唆している。
【００６８】
[0085]ｉｎ  ｖｉｖｏ感染後の頭蓋冠での骨形成
[0086]Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ローズマリー抽出物）は、３通りの独立した骨形成ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（ＢＭＰ−２、アルカリホスファターゼ、骨器官培養）、並びに頭蓋冠ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで、骨形成活性を示している（図５を参照）。
【００６９】
[0087]ローズマリー抽出物（ここでは、葉を最初に水で抽出し、水抽出物を加水分解し、その後、酢酸エチルで抽出した）をマウス頭蓋冠頭部に注入し、その後、ｅｘ  ｖｉｖｏ骨形成分析を行った。
【００７０】
[0088]純化合物スクリーニング
[0089]フェノールは１〜１０μＭの濃度で試験した。
【００７１】
[0090]ＢＭＰ−２アッセイで活性のフェノールを表４に示す。図６Ａ〜Ｃは、骨形成アッセイで陽性であった特定のフェノールを示す。
【００７２】
【表６】
2009545513.tif 000007
【００７３】
[0091]ローズマリー組成分析
[0092]表５はローズマリー抽出物中に見出された純化合物を示す。
【００７４】
【表７】
2009545513.tif 000008
【００７５】
[0093]ＢＭＰ−２活性ローズマリー抽出物の分析
[0094]分析用の抽出物は、酵素加水分解あり（２１８９）又はなし（２１８８）のメタノール／水抽出物から調製された酢酸エチル抽出物中に骨形成活性が濃縮されていたこを示す以前の結果に従って選択した（図４を参照）。
【００７６】
[0095]酢酸エチル抽出物２１８８を、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＵＶ／ＭＳによる化合物の同定及び精製を含めた、その主成分の植物化学検査用に選択した。この専門的技術は、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社（独国ポツダム（Ｐｏｔｓｄａｍ）所在）が行った。その後、ＢＭＰ−２アッセイで活性であった上記ローズマリー抽出物に関して徹底的な植物化学評価を完遂した。予備結果は、１３種の化合物の単離をもたらした。９種の化合物が同定された。他の４種はさらなる検査を必要とした。さらなる検査とは、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社（独国ポツダム（Ｐｏｔｓｄａｍ）所在）によるＨ−ＮＭＲ及び２Ｄ−ＮＭＲ（Ｈ、Ｈ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ）を介したこれら４種の化合物の構造解明を指す。
【００７７】
[0096]Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ社は、骨健康に関するそれらの生物活性の評価を行うために、１３種の同定された純粋な分子を提供した。これらの化合物を表６に列挙し、それらの構造を図７Ａ〜Ｂに図示する。それらのうち、３種は新規の化合物であり、文献には記載されていない（ＸＩ、ＸＩＩ、及びＸＩＩＩ）。これら１３種の成分の化学構造−生物活性相関は、骨健康研究におけるさらなる開発のための興味深く且つ重要なツールを提供しうる。
【００７８】
[0097]
【表８】
2009545513.tif 000009
【００７９】
[0098]構造解明が達成され、確認されている、ローズマリー抽出物（２１８８）の１３種の成分は、いまでは骨健康アッセイにおける、それらの生物活性の評価に利用可能となっている。
【００８０】
[0099]ローズマリー抽出物とその抗骨吸収活性
[00100]骨粗鬆症は、ゆっくりとした骨減少を特徴とした慢性病である。骨は死組織ではない。反対に、それは絶えず再構築されており、古い骨組織が新規の組織によって置換されている。この再構築は、骨を沈着させる細胞である骨芽細胞と、骨を溶解する細胞である破骨細胞とによって制御されている。通常、骨形成と骨吸収との間には、正味の骨減少が起こらないように、緊密な共役がある。骨粗鬆症では、骨減少が骨形成より顕著であるので、この共役が完全でない。骨粗鬆症を治療するには、骨形成の増大、骨減少の低減、又は両方を目標にすることができる。この実施例では、ローズマリー抽出物が骨減少を低減できることを示す。
【００８１】
[00101]ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から分化した破骨細胞をウシ骨切片上で培養した。それらが骨を消化した際に培地中に放出したＩ型コラーゲンの量を測定することによって、それらの吸収活性をモニターした。
【００８２】
[00102]Ｉ型コラーゲンは、骨の主要有機分子である。骨が消化される際に、骨の無機質相が溶解され、上記コラーゲン繊維がマトリックスメタロプロテイナーゼのタンパク質分解活性に曝される。ひとたび消化されれば、上記コラーゲン繊維は可溶性になり、培地中に放出され、培地中では、ＥＬＩＳＡアッセイ−ＣＴＸ−Ｉアッセイによって、それらの存在を定量化することができる。
【００８３】
[00103]図８Ａは、以下の通りの、ヒト破骨細胞の活性へのローズマリー抽出物の影響に関する詳細を示す。すなわち、濃度１０μｇ／ｍＬのローズマリー抽出物１（Ｒｏｂｅｒｔｅｔ社から購入可能な抽出物Ｐ３１）は、培養培地のみ（対照（ＣＴＬ））と比較して、骨切片から放出されるＩ型コラーゲンの量を減少させた（図８Ａ）。
【００８４】
[00104]ローズマリー抽出物と骨関節炎
骨関節炎は、関節軟骨のゆっくりとした破壊を特徴とする疾患である。この軟骨破壊は、軟骨細胞の同化活性と異化活性との間の不均衡による。軟骨細胞は、軟骨に存在する独特な細胞型であり、軟骨細胞外マトリックスの維持を行っている。骨関節炎では、異化作用が増大しており、それが軟骨減失の原因である。軟骨の細胞外基質は、ＩＩ型コラーゲンとアグリカンという２つの主要分子で構成されている。コラーゲンは主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって消化されるが、アグリカンは、ＭＭＰと、アグレカナーゼと呼ばれる別のクラスの酵素との両方によって分解されうる。
【００８５】
[00105]本発明者らはここで、２種の異なったローズマリー抽出物、及びこの抽出物の主成分の１つであるカルノソールが、関節軟骨の培養外植片において、コラーゲン及びアグリカンの分解を抑制できるかどうか調査した。健康なウシ関節軟骨からの外植片を培養物中に入れた。しかし、そのような外植片は、当然、非常に低い異化活性を示す。これは、潜在的生理活性の抗異化活性（ａｎｔｉ−ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を試験するのに理想的ではない。アッセイの感度を向上させるためには、ＴＮＦ−α及びオンコスタチンという２つの炎症誘発性サイトカインの存在下で上記外植片を培養する。両サイトカインは、ＭＭＰ活性及びアグレカナーゼ活性の効果的誘導因子として協働することが知られている。
【００８６】
[00106]関節軟骨異化作用へのローズマリー抽出物及びカルノソールの影響
図９Ａ、Ｂ、Ｃは、以下の通りの、関節軟骨代謝へのローズマリー抽出物及びカルノソールの影響に関する詳細を示す。
【００８７】
濃度１０μｇ／ｍＬのローズマリー抽出物１（Ｒｏｂｅｒｔｅｔ社から購入可能な抽出物Ｐ３１）は、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α及びオンコスタチンによって誘導されたコラーゲン分解（対照（ＣＴＬ））を完全に抑制した（図９Ａ）。
濃度１０μｇ／ｍＬのローズマリー抽出物１（Ｒｏｂｅｒｔｅｔ社から購入可能な抽出物Ｐ３１）は、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α及びオンコスタチンによって誘導された、ＭＭＰ媒介のアグリカン分解（対照（ＣＴＬ））を完全に抑制した（図９Ｂ）。
濃度１０μｇ／ｍＬのローズマリー抽出物１（Ｒｏｂｅｒｔｅｔ社から購入可能な抽出物Ｐ３１）は、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α及びオンコスタチンによって誘導された、アグレカナーゼ媒介のアグリカン分解（対照（ＣＴＬ））も抑制した。同様に、濃度１又は５μｇ／ｍＬの、別のローズマリー抽出物であるローズマリー抽出物２（Ｎｅｓｔｅｃ社Ｒ＆Ｄセンター（仏国トゥール（Ｔｏｕｒｓ）所在）から上述の通りに入手した）、及び濃度１又は５μＭのカルノソールも、サイトカイン誘導のコラーゲン分解を抑制した（図９Ｃ）。
【００８８】
[00107]ＯＰＮ  ｍＲＮＡ誘導：
[00108]細胞培養−コラーゲンコーティングされたプレート上にｈＰＯＢＴｅｒｔ骨芽細胞を播種し、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中において、１０％ウシ胎児血清、１％  Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭ  β−グリセロールリン酸並びに５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を補足したＭＥＭイーグルα修飾培地中で、３７℃で培養した。カルノソール及び阻害剤を添加した場合には、溶媒コントロールとして、等量のＭｅ２ＳＯを用いた。
【００８９】
[00109]リアルタイムでＰＣＲによるｍＲＮＡレベルの分析−全細胞ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、スイス国所在）を用いて抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ用のＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、独国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在）を用いて、様々な処置に由来する等量（１μｇ）のＲＮＡを逆転写した。各試料に対して、１０×反応緩衝液２μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ４μＬ、ヌクレオチド混合物２μＬ、ランダムプライマー２μＬ、ＲＮＡｓｅ阻害剤１μＬ、及びＡＭＶ逆転写酵素０．４μＬをキットから試料に添加した。逆転写酵素反応は、（２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、そして７５℃で５分間）という熱サイクル条件で、ＰＴＣ−１００ＴＭ（Ｃｏｎｃｅｐｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。
【００９０】
[00110]リアルタイム定量ＰＣＲ−定量ＰＣＲは、三連で、２５μＬで行った。これは、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国所在）１２．５μＬ、Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）プライマー及びプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国所在）１．２５μＬ、及びＲＮＡｓｅフリー水６．２５μＬから成った。増幅は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルという熱プロフィールを用いて、ＡＢＩ  ７０００機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。遺伝子発現レベルは、β−アクチン発現レベルに対して正規化した。
【００９１】
[00111]図１０は、ローズマリー抽出物又はカルノソールが用量依存的にＯＰＮ発現を誘導することを、ＯＰＮ  ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ測定によって示している。示されている用量のローズマリー抽出物又はカルノソール中に、ｈＰＯＢｔｅｒｔ細胞を４８時間維持した。
【００９２】
[00112]ＮＱＯ１誘導
[00113]細胞質抽出物の調製−ｈＰＯＢｔｅｒｔ細胞を、冷たいリン酸緩衝食塩水で、２回洗浄し、溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、２０ｍＭトリス／ＨＣＬ  ｐＨ８、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、及び新たに添加されたプロテアーゼ阻害剤、すなわち１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．１５Ｕ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチド（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｄｅ）、及び１０μｇ／ｍＬペプスタチン）を用いて採取した。試料を１３０００ｒｐｍ、４℃で、５分間、遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて測定した。約５０μｇの各試料を、適した容積の試料緩衝液中に混和させ、５μＬのタンパク質標準物質と共に９５℃で５分間変性させ、氷上で冷却し、用意のできている１０％ゲル上に添加し、抗ＮＱＯ１抗体を用いたイムノブロット分析で分析した。
【００９３】
[00114]イムノブロッティング−５０μｇのタンパク質細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動の後に、製造会社のプロトコールに従って、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に移した。ＯＰＮ及びＮＱＯ１に関して検査された膜は、５％の乳を含有するトリス緩衝食塩水／トゥイーン（２０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．６、１３７ｍＭ、０．１％トゥイーン２０）中でブロッキング及びプロービングした。ブロットは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた化学発光によって可視化した。
【００９４】
[00115]抗体−ＮＱＯ１（ｓｃ−１６４６４）特異抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国カリフォルニア州サンタクルス（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）所在）から購入した。β−アクチン抗体（Ａ−５４４１）はＳｉｇｍａ社から購入した。２次抗体はＳｉｇｍａ社から購入した。
【００９５】
[00116]図１１は、通常Ｎｒｆ−１で調節される遺伝子／タンパク質である第二相酵素ＮＱＯ１の発現を、カルノソールが誘導することを示す。
【００９６】
[00117]安全性状態
[00118]耐性試験
[00119]耐性試験は若い雄性ＳＤラットで行った。「胃管栄養法」によって経口的に５日間、ラットに給餌し、それと共に、動物体重１ｋｇあたり１ｇの（抽出物２１２７、ＭｅＯＨ／水）を毎日投与した。異常行動、死亡、又は毒性の徴候は、処置期間中にも、その後の１０日間の観察期間中にも観察されなかった。したがって、これらの条件下では、Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓは安全であると考えられた。
【００９７】
[00120]結論
[00121]３２の植物種から得られた１２０種の抽出物をＢＭＰ−２アッセイでスクリーニングして、１５種が陽性ヒットとして同定された。Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ローズマリー）由来のものが最も有望なものであり、Ｃｙｐｅｒｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｉｒｉｓ  ｐａｌｌｉｄａ、Ｔｈｙｍｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（タイム）、及びＣａｒｕｍ  ｃａｒｖｉ（キャラウェー）由来のものがそれに準じた。これらは、マウス頭蓋冠器官培養モデルでも活性であった。ＢＭＰ−２アッセイで見出されたヒットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨形成に関するアルカリホスファターゼアッセイ及び器官培養機能アッセイでも確認された。
【００９８】
[00122]Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ローズマリー抽出物）が最も有望なヒットであった。それは、３通りの独立した骨形成ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（ＢＭＰ−２、アルカリホスファターゼ、骨器官培養）、及び頭蓋冠ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで骨形成活性を示した。例えば、ローズマリー抽出物は、マウス頭蓋冠へのｉｎ  ｖｉｖｏ注入後に骨形成を刺激した。
【００９９】
[00123]ローズマリーの成分である６種のフェノール（ユーパフォリン、カルノソール、スクテラレイン、ゲンクワニン、ケンフェロール、アカセチン）が３通りの骨形成アッセイで活性である。最も高活性のものは、ユーパフォリン及びカルノソールである。同定された１３種の純粋な分子は、活性ローズマリー抽出物から単離された。それらのうち、３種は新規化合物（ＸＩ、ＸＩＩ、及びＸＩＩＩ）であり、以前には文献に記載されていない。
【０１００】
[00124]提示したデータは、ローズマリー抽出物及びカルノソールが軟骨の破壊を減速できることをさらに実証している。それらは、この特性によって、ヒト又はペットで骨関節炎を予防するか、その進行を減速させるための興味深い候補物質となっている。
【０１０１】
[00125]提示したデータは、ローズマリー抽出物が骨形成を増大でき、且つ骨吸収を減速できることも示す。両方の特性を示す単一の化合物／抽出物を見出すことは一般的なことではない。これによって、ローズマリー抽出物は、ヒト又はペットで骨粗鬆症を予防するか、その進行を減速させるための非常に興味深い候補物質となっている。
【０１０２】
[00126]本明細書に記載した現在好ましい実施形態への様々な改変及び修正が当業者には明らかであろうことを理解するべきである。そのような改変及び修正は、現在対象となっていることの趣旨及び範囲から逸脱せず、且つそれの意図されている利点を低減することなく実施できる。したがって、そのような改変及び修正は、添付されている特許請求項の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】抽出プロトコールを示す図である。
【図２】抽出手順及び最初の分画の概要を示す図である。
【図３Ａ】ローズマリー及びキャラウェー抽出物に関するＢＭＰ−２結果を示す図である。
【図３Ｂ】ローズマリー及びキャラウェー抽出物に関するアルカリホスファターゼ結果を示す図である。
【図３Ｃ】ローズマリー及びキャラウェー抽出物に関する、器官培養での骨形成を示す図である。
【図４】ＮＲＣ初期ＭｅＯＨ／水抽出物からの抽出手順及び抽出物のＢＭＰ−２活性（８０ｇ干葉（ヘキサン６ｇ）からの活性）を示す図である。
【図５】ローズマリー抽出物存在下でのｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成を示す図である。
【図６Ａ】ＢＭＰ−２アッセイで陽性と判明したフェノールを示す図である。
【図６Ｂ】ＢＭＰ−２陽性フェノールのアルカリホスファターゼアッセイを示す図である。
【図６Ｃ】器官培養骨形成を示す図である。ユーパフォリン及びカルノソールを用いた例。
【図７Ａ】ローズマリー抽出物２１８８から単離された化合物を示す図である。
【図７Ｂ】ローズマリー抽出物２１８８から単離された化合物を示す図である。
【図８Ａ】ヒト破骨細胞の活性への、ローズマリー抽出物の影響の詳細を示す図である。
【図９Ａ】関節軟骨代謝への、ローズマリー抽出物及びカルノソールの影響の詳細を示す図である。
【図９Ｂ】関節軟骨代謝への、ローズマリー抽出物及びカルノソールの影響の詳細を示す図である。
【図９Ｃ】関節軟骨代謝への、ローズマリー抽出物及びカルノソールの影響の詳細を示す図である。
【図１０】ローズマリー抽出物又はカルノソールによる、ヒト骨芽細胞（ｈＰＯＢｔｅｒｔ）でのオステオポンチン（ＯＰＮ）ｍＲＮＡ誘導を示す図である。
【図１１】通常、Ｎｉｆ−１で調節される遺伝子／タンパク質の１つである第二相酵素ＮＱＯ１の発現をカルノソールが誘導することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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