(57)【要約】  癌細胞の上皮間葉転換に関与するタンパク質であるクラステリンを標的とする抗体が、同定及び特徴づけられる。当該抗体は、クラステリンへの結合を介して腫瘍細胞活性を調節するのに使用されてもよい。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラステリンへの結合親和性を有する薬剤であって、クラステリンへの該薬剤の結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤。
【請求項２】
前記薬剤がクラステリンのβ−サブユニットへの結合親和性を有する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記薬剤が前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分への結合親和性を有する、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分への特異的な結合親和性を有する、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分のアミノ酸３７５〜４４９の部位に結合する、請求項３に記載の薬剤。
【請求項６】
クラステリンへの前記薬剤の結合が、前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分中にコンフォメーション変化をもたらす、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記薬剤が抗体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
前記薬剤がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号６を含むアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号７を含むアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る群から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０のうちの少なくとも１つの相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１３】
癌細胞の活性を調節する方法であって、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤に該細胞を曝露する工程を含む、癌細胞の活性を調節する方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、クラステリンの前記β−サブユニットへの結合親和性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分への結合親和性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分への特異的な結合親和性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分のアミノ酸３７５〜４４９間の部位に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
クラステリンへの前記薬剤の結合が、前記クラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分中にコンフォメーション変化をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、配列番号６を含むアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、配列番号７を含むアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る群から選択される少なくとも１つの配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０のうちの少なくとも１つの相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
クラステリンへの結合親和性を有する薬剤の生成におけるアミノ酸配列の使用であって、該配列が、配列番号４又はその一部分を含む、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤の生成におけるアミノ酸配列の使用。
【請求項２６】
前記配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号５を含む、請求項２５に記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項２７】
前記配列が、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項２５に記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項２８】
前記配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項２５に記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項２９】
癌細胞における上皮間葉転換に関与するクラステリン又はその一部分及び薬学的に許容される担体を含むワクチン。
【請求項３０】
配列番号４又はその一部分及び薬学的に許容される担体を含む、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
癌腫の治療における使用のための、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３２】
ワクチンの調製におけるアミノ酸配列の使用であって、該配列が、配列番号４又はその一部分を含む、ワクチンの調製におけるアミノ酸配列の使用。
【請求項３３】
前記配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号５を含む、請求項３２に記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項３４】
前記配列が、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項３２に記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項３５】
前記配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項３２に記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項３６】
配列番号１〜配列番号３０のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列。
【請求項３７】
診断ツールとしてのクラステリンへの結合親和性を有する薬剤の使用であって、クラステリンへの該薬剤の結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、診断ツールとしてのクラステリンへの結合親和性を有する薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラステリンを結合する抗体、ペプチド及び小分子、並びに腫瘍細胞活性の調節におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も一般的なヒト悪性腫瘍である癌腫は、上皮細胞から生じる。上皮癌の進行は、細胞間接触の破壊及び移動性（間葉様）表現型の獲得から始まる。上皮間葉転換（ＥＭＴ）と呼ばれるこの現象は、後期の腫瘍進行及び腫瘍転移における重大な事象であると考えられる。
【０００３】
分泌タンパク質ＴＧＦ−βは、主として上皮起源の腫瘍細胞に対するその増殖阻害作用により、最初に腫瘍成長を抑制し、次に後期で腫瘍細胞進行及び転移を促進する。ＴＧＦ−βが腫瘍進行を促進することができる１つのメカニズムはＥＭＴの誘導によるものである。
【０００４】
ＴＧＦ−βが発癌において果たす２重の役割により、ＴＧＦ−βの直接的な阻害剤が後期腫瘍には役立つかもしれないが、その一方で前癌病変部を促進する可能性があるので、リスクが大きいかもしれない。よりよい治療薬は、ＴＧＦ−βの腫瘍抑制因子の増殖阻害作用に影響を与えないままである一方、ＴＧＦ−βの発癌性を支持する（pro-oncogenic）ＥＭＴを促進する作用が阻害されるものであり得る。そのような阻害剤を開発するために、経路の１つの支流におけるメディエータがＥＭＴ反応に関与するが、ＴＧＦ−βに対する増殖阻害反応に関与しないように、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の分岐のある点を同定することが必要だろう。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のＥＭＴを促進する支流にのみにあるメディエータを阻害する治療薬は、前癌病変部の亢進に対する効果がほとんど又はまったくないが、転移を減少させるだろう。
【０００５】
ＴＧＦ−βのＥＭＴ促進作用を促進又は媒介するが、ＴＧＦ−βの増殖阻害作用に関与しないＴＧＦ−βシグナル経路特異的な構成要素は、一般には同定されていない。
【０００６】
対照的に、腫瘍抑制作用（増殖阻害）はそのままであるが、ＴＧＦ−βの腫瘍形成性を支持する（protumorigenic）ＥＭＴ作用を妨害（促進に対立するものとして）することができる内因性タンパク質（ＹＹ１核因子）が同定された（Kurisaki他, 2004）。
【０００７】
ＴＧＦ−βリガンド、ＴＧＦ−β受容体及びＳｍａｄシグナル伝達タンパク質を標的とする阻害剤は既知である。具体的には、可溶性受容体の外部ドメイン、抗体及び他の結合タンパク質は、ＴＧＦ−βリガンドと相互作用し、それらを細胞表面受容体から遠ざけて隔離することによって、アンタゴニストとして作用することができる。Ｉ型ＴＧＦ−β受容体のキナーゼ活性を阻害する小分子が利用可能であり、Ｓｍａｄシグナル伝達タンパク質の内因性阻害剤もまた既知である。これらのシグナル伝達経路の構成要素のすべてがＴＧＦ−βの発癌を支持する作用及び抗発癌作用（pro- and anti-carcinogenic actions）の両方に関与するので、それらを標的とするこれらの阻害剤は後期腫瘍に役立つかもしれないが、前癌病変部を促進する可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の第１の目的は、ＴＧＦ−βの腫瘍抑制活性を阻害せずに、腫瘍細胞においてＥＭＴを阻害する方法を同定することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、ＴＧＦ−βの腫瘍抑制（supressing）活性を阻害せずに、腫瘍細胞においてＴＧＦ−β誘導性ＥＭＴを阻害し得る分子又は組成物を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、クラステリンへの薬剤の結合が癌細胞において上皮間葉転換を阻害する、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤を提供する。特に、薬剤はクラステリンのβ−サブユニットに結合してもよく、より具体的には、薬剤はクラステリンβ−サブユニットのＣ末端部分に結合してもよい。薬剤は、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む抗体であってもよい。
【００１１】
本発明の第２の態様は、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤に細胞を曝露する工程を含む、癌細胞の活性を調節する方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、配列が配列番号４又はその一部分を含む、クラステリンへの結合親和性を有する薬剤の生成におけるアミノ酸配列の使用を提供する。特にこの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号５を含む配列番号４のより短い部分を含んでもよい。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、癌細胞における上皮間葉転換に関与するクラステリン又はその一部分及び薬学的に許容される担体を含むワクチンを提供する。クラステリンの一部分は配列番号４又はその一部分を含んでもよい。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、配列が配列番号４又はその一部分を含む、ワクチンの調製におけるアミノ酸配列の使用を提供する。特にこの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号５を含む配列番号４のより短い部分を含んでもよい。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、配列番号１〜配列番号３０のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、クラステリンへの薬剤の結合が癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、診断ツールとしてクラステリンへの結合親和性を有する薬剤の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
クラステリンが治療の標的であり、その阻害はＴＧＦ−βの抗増殖的な腫瘍抑制作用を妨げずにＥＭＴを妨害することが本明細書において開示される。
【００１８】
クラステリンは、トランスクリプトーム解析を使用して、おそらくＥＭＴに関与するタンパク質として最初に同定され、次にクラステリン中の潜在的な結合部位を同定するために分析された。合成ペプチドをそれに応じて作製し、これらのペプチドに対する抗体調製物を作製又は購入した。さらに１２個のモノクローナル抗体が、抗原として全長組換えクラステリンを使用して単離された。抗ペプチド抗体調製物及び１２個のモノクローナル抗体の両方は、組換えクラステリンに結合することが確認された。抗ペプチドポリクローナル抗体調製物及び１２個のモノクローナル抗体のうちの５つはＥＭＴを阻害することが示された。これらの５つの中和モノクローナル抗体が抗ペプチド抗体と同じペプチドエピトープと相互作用することが示された。
【００１９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット及び免疫蛍光顕微鏡分析を使用して、マイクロアレイ分析によって検出されたＥＭＴに関連する転写の変化のいくつかが、メッセージ（message）及びタンパク質の存在量の変化に反映されていたことが確認された（クラステリン及びカベオリンは図３に示される）。抗ペプチド抗体は、クラステリンがＴＧＦ−βの増殖阻害経路に関与しない必須のＥＭＴメディエータであることを実証するために使用された（図４〜図６）。これらの結果は、クラステリンが接近可能な治療の標的であり、その阻害がＴＧＦ−βの抗増殖的な腫瘍抑制作用を妨げずにＥＭＴをブロックすることを示す。
【００２０】
ＥＭＴを阻害する薬剤の生成に重要なクラステリン中のエピトープは、中和アッセイにおいて抗ペプチド抗体調製物を使用して解明された。クラステリンβサブユニットのＣ末端部に対応する合成ペプチドに対して製造された２つの異なる市販のポリクローナル抗体調製物が使用された。第１の抗体（RDI Research Diagnostics Inc.製）は、クラステリンのアミノ酸４２１〜４３７（ＶＥＶＳＲＫＮＰＫＦＭＥＴＶＡＥＫ、配列番号１）に対応する合成ペプチドに対して製造され（ＲＤＩと名付けられる）、第２の抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.製）は、クラステリンのアミノ酸４３２〜４４３（ＥＴＶＡＥＫＡＬＱＥＹＲ、配列番号２）に対応する合成ペプチドに対して製造された（Ｃ−１８と名付けられる）。同じペプチド（配列番号２）に対する抗ペプチドモノクローナル抗体も購入した（Ｂ５と名付けられる）。これらの２つのエピトープの間の重複は以下で示される。これらの抗体調製物がＥＭＴをブロックする能力は、ＥＭＴの誘導におけるクラステリンβサブユニットのＣ末端部分の重要性を示す（図４〜図６、Ｃ−１８の結果が示され、同じような結果がＲＤＩで得られた）。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
構造的なバイオインフォマティクスに基づいたクラステリン中の推定上の機能的なサブドメインの予測
一般に、クラステリンはモルテングロビュール断片を含み、部分的にのみ構造化されるタンパク質であると考えられる。さらに、それは本質的に無秩序なタンパク質として分類されている。クラステリンは多数の他の結合パートナーと相互作用することができるいくつかの独立したクラスの結合部位を含むことが想定される。
【００２３】
クラステリンの配列はバイオインフォマティクスプログラム、すなわち
ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（Rost, 1996）、
ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Jones, 1999）、
ＣＯＩＬＳ（Lupas, 1996）、
ＰＯＮＤＲ（Li他, 1999）
を使用して試験した。
【００２４】
β−サブユニットのＣ末端断片が推定上の結合領域として同定された。第２のコイルドコイル領域後に始まる断片（アミノ酸３７５〜４４９、配列番号４）は、おそらく折畳まれないが、β−シート形成についてはある程度の傾向がある。
【００２５】
市販の抗体１調製物（ＲＤＩ）に類似するＢＲＩでポリクローナル抗体調製物を生成するために、クラステリンのアミノ酸４２１〜４３７に対応する合成ペプチドが作製された（これらの新しいポリクローナル抗体調製物はｐＡｂ＃９及びｐＡｂ＃１０と名付けられる）。さらに、全長ヒトクラステリンが２９３細胞において発現され、全長ヒトクラステリンに対するモノクローナル抗体を生成させる抗原として使用するために精製した。１２個のモノクローナル抗体が全長のクラステリンに対して作製され、ＥＬＩＳＡによってクラステリンと相互作用することが実証された。これらの１２個の抗体は、６Ｅ１２、７Ｂ７、２１Ｂ１２、２０Ｇ３、２０Ｅ１１、１８Ｆ４、１６Ｃ１１、１６Ｂ５、１１Ｅ２、８Ｆ６、７Ｄ６、７Ｃ１２と命名される。
【００２６】
アミノ酸４２１〜４３７のエピトープに対して作製されたポリクローナル抗体調製物（ｐＡｂ＃９及びｐＡｂ＃１０）は、ＥＭＴを阻害することが確認された（図８）。
【００２７】
全長ヒトクラステリンに対して作製された１２個のモノクローナル抗体調製物はすべて、クラステリンを免疫沈降させるそれらの能力によって証明されるように、組換えヒトクラステリンと相互作用することが確認された（図９Ａ）。１２個のモノクローナル抗体のうちの５つは、黒インク細胞運動性アッセイ（図９Ｂ）及び創傷治癒細胞運動性アッセイ（図示せず）においてクラステリンのＥＭＴ促進作用を中和することができることが示された。中和する５つのモノクローナル抗体は、１１Ｅ２、２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１、１６Ｂ５である。
【００２８】
２つの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたバイオセンサーエピトープマッピングアッセイ（図１０）は、全長クラステリンを使用して作製された５つの中和モノクローナル抗体が、抗ペプチド抗体調製物と同じクラステリンペプチドエピトープと相互作用したか否かを決定するのに使用された。
【００２９】
使用された２つのアプローチは以下のように記述される：
１）モノクローナル抗体（antibodes）は、ラビット抗マウスＦｃ抗体が共有結合で固定されたＣＭ５センサーチップ表面に別々に捕捉された（捕捉された場合、このｍＡｂはこの実験的なアプローチにおいてｍＡｂ１と名付けられる）。次にｍＡｂ１にクラステリンを結合させた。次に、５つのモノクローナル抗体はすべて、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の両方がクラステリンと同時に相互作用することができるか否かを決定するために、ｍＡｂ１に結合したクラステリンの上に連続して注入された（注入されたｍＡｂはこの実験的なアプローチにおいてｍＡｂ２と名付けられる）（図１１）。すべての５つの中和ｍＡｂ（いくつかの場合における２０Ｅ１１を除く）は、互いにクラステリンへの結合を競合する（ｍＡｂ１又はｍＡｂ２の両方として使用された場合）ことが見出された。さらにそれらの抗体は、Ｃ１８、ｐＡｂ＃１０及びＢ５抗ペプチド抗体と競合することが見出され、５つの中和ｍＡｂがｐＡｂ＃１０、ｐＡｂＣ１８及びｍＡｂ  Ｂ５の重複ペプチドエピトープと相互作用することを示唆する。Ａｂ  ２０Ｅ１１は、いくつかの場合において（ｍＡｂ１又はｍＡｂ２のいずれかとして使用された場合）、異なるエピトープを有すると思われたが、この結論は第２の実験的なアプローチの結果によって支持されなかったことは留意されるべきである。
２）モノクローナル抗体は、別々にアミンカップリングを使用して、ＣＭ５センサーチップ表面に共有結合で固定された（固定されたとき、このｍＡｂはこの実験的なアプローチにおいてｍＡｂ１と名付けられる）。次に、クラステリンへの結合についての競合を実証するために、Ａｂ（このアプローチにおいてＡｂ２名付けられる）は、ｍＡｂ１表面上への複合体の注入に先立ってクラステリンと共にインキュベートされた（図１１）。すべての５つの中和ｍＡｂが、クラステリンへの結合に関して互いに、並びにＣ１８抗ペプチド抗体、ｐＡｂ＃１０抗ペプチド抗体及びＢ５抗ペプチド抗体と競合したことが確認された。これにより、５つの中和ｍＡｂがｐＡｂ＃１０、ｐＡｂＣ１８及びｍＡｂ  Ｂ５の重複ペプチドエピトープと相互作用することが確認される。
【００３０】
１２個のすべてモノクローナルＡｂの超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）がシークエンシングされた。哺乳類の軽鎖Ｉｇ及び重鎖ＩｇはＣＤＲに隣接する保存領域を含んでおり、ＣＤＲは適切に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用によって、ＰＣＲを用いて特異的に増幅することができた（図１２）。次に、これらの産物は直接シークエンシングされた（配列番号８〜配列番号３０、図１３を参照）。
【００３１】
５つの中和モノクローナル抗体のうちの４つのＣＤＲ配列（１１Ｅ２、２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１）をアライメントさせることによって、これらの抗クラステリン抗体のＶＨ  ＣＤＲ１及びＶＨ  ＣＤＲ２についてのコンセンサス配列を決定することができた（図１４を参照）。以下のコンセンサス配列が決定された：ＣＤＲ−１：Ｇ−Ｙ−Ｓ／Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ｘ（配列番号６）及びＣＤＲ−２：Ｉ−Ｎ／Ｄ−Ｐ／Ｔ−Ｙ／Ｅ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｐ／Ｔ（配列番号７）。
【００３２】
本明細書において明らかにされたクラステリンのエピトープと相互作用する抗体又はペプチドは、治療薬として適用されてもよく、すなわちそれらは、クラステリンのＥＭＴ促進活性を中和するそれらの固有の能力によりそれら自体で、治療薬として作用することができる。さらに、これらの抗体及びペプチドは、分泌されたクラステリンとのそれらの相互作用を通して、腫瘍細胞の近辺への抗腫瘍活性を有する、毒素、自殺遺伝子又は他の薬剤を標的とするそれらの能力により、治療薬として使用され得る。
【００３３】
本明細書において明らかにされたクラステリンのエピトープと相互作用する小分子も、クラステリンのＥＭＴ促進活性をブロックすることによって治療薬として作用し得る。クラステリンのすべての活性を除去する他の薬剤（すなわちアンチセンス薬剤又はＲＮＡｉ薬剤）と比較して、このクラステリンエピトープの相互作用によってそれらの治療活性を発揮するこれらの抗体、ペプチド及び小分子は、このエピトープがブロックされる場合、クラステリンのＥＭＴ活性が中和されているが、クラステリンの他の活性が損なわれない可能性があるので、より少ない毒性又は副作用を示し得る。
【００３４】
本明細書において明らかにされたクラステリンのエピトープと相互作用する抗体及びペプチドの他の用途は、１）非画像診断（すなわちそれらは、癌における診断及び予後の用途のために、バイオマーカーとしてクラステリンを接近可能な体液又は組織／腫瘍サンプル中に検出してもよい）及び２）画像診断（すなわちそれらは、分泌されたクラステリンとの相互作用により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化用の腫瘍に対する造影剤の標的化に使用されてもよい）であり得る。
【００３５】
本明細書において同定された重鎖配列及び軽鎖配列を含む抗体、本明細書において同定されたＣＤＲ（相補性決定領域）を含む抗体（図１３）、及びコンセンサス配列を含む抗体（図１４）が、上述の目的に役立つと予想される。
【００３６】
クラステリン自体、又は上で論じられた抗体及びペプチドによって認識されるエピトープを含むその一部分は、ワクチンとして使用されてもよい。好ましくは、クラステリンは薬学的に許容される担体と組み合わせる必要がある。クラステリン又はクラステリンのエピトープ含有部分もワクチンの生成に使用されてもよい。同様に、配列番号４又は本明細書において同定されたクラステリンエピトープと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列も、それらが本明細書において同定された特異的配列に対して同様の機能性を有すると思われるので、有用である。
【００３７】
細胞培養、抗体及び薬剤
記述されるように、ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞は単離され特徴づけられた（Lenferink他, Breast Cancer Res., 6, R514-30 (2004)）。細胞を加湿された５％ＣＯ２環境中で３７℃で維持し、且つＤＦ／５％  ＦＢＳ（５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び抗生物質／抗真菌剤（anti-micotics）（共にWisent Inc.）を添加したハムＦ１２及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の１：１混合物）中で維持した。ヒト組換えＴＧＦ−β１及びｐａｎ−ＴＧＦ−β中和抗体１Ｄ１１は、製造業者の説明書（R&D Systems）に従って再構成された。精製ヒト血清クラステリンは、MR Wilson博士によって快く提供された（Wilson and Easterbrook-Smith, 1992）。精製ヒト組換えクラステリンは、ＨＥＫ−２９３細胞において産生された（Durocher他, 2002中で記述される一般的な発現系）。以下のタンパク質に対する抗体を購入し、示された容積／容積希釈で使用した：Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ、抗ウボモルリンクローンＤｅｃｍａ−１、Sigma）、閉鎖帯−１（ＺＯ−１、Chemicon））、ヒトクラステリンβ鎖のＣ末端に対して作製されたポリクローナル抗体（ｃｌｕβ、RDI及びSanta Cruz）、及びカベオリン−１（ｃａｖ−１、Santa Cruz）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体はJackson ImmunoResearch Laboratories Incから得られ、アレクサ−４８８（Alexa-488）標識抗体及びテキサスレッド標識ファロイジンはMolecular Probesから購入された。すべての実験は、ＤＦ／５％中で７５〜８０％コンフルエントのＢＲＩ−ＪＭ０１細胞の単層で行なわれた。指示された場合には、細胞は、それぞれ１００ｐＭ又は２００ｎＭの最終濃度のＴＧＦ−β１又は精製クラステリンにより２４時間又は４８時間処理された。
【００３８】
ＲＮＡの単離及び標識
ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞の単層を、ＴＧＦ−β１非存在下又は存在下において３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間又は２４時間増殖させた。ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡは、ＦａｓｔＴｒａｃｋ（商標）２．０キット（Invitrogen）を使用して、製造業者の説明書に従って抽出された（１時点当たり４×１５０ｍｍディッシュ）。ＲＮＡは、Schade他, 2004に従って単離及び標識された。
【００３９】
ハイブリダイゼーション及びデータ分析
ｃＤＮＡマイクロアレイ（１５，２６４配列が確認されたマウスＥＳＴ、http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/15k.html）はトロントの大学ヘルスネットワークマイクロアレイセンター（University Health Network Microarray Center in Toronto）（http://www.microarrays.ca/）から得られた。スライドは、記述されるようにＣｙ３又はＣｙ５で標識されたｃＤＮＡとハイブリダイズされ（Enjalbert他, 2003）、１０ミクロンの解像度でＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００（Perkin Elmer、ｖ２．１１）を使用してスキャンし、１６ビットＴＩＦＦファイルがＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（Perkin Elmer、ｖ３．０）を使用して定量化された。記述されるように、マイクロアレイのデータ正規化及び分析が実行された（Enjalbert他, 2003）。
【００４０】
ノーザンブロット及び半定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＳＱ−ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
ＳＱ−ＲＴ−ＰＣＲのために、３〜５μｇの全ＲＮＡは、修飾をともなう製造業者のガイドラインに従って、５０ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Invitrogen）を使用して、２０μｌのファーストストランドＲＴ−ＰＣＲ反応中で増幅された。サンプルをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩの追加前にプレインキュベートし（２分、４２℃）、ＲＮａｓｅＯＵＴ処理は省略した。サンプルをインキュベートし（９０分、４２℃）、次に氷上で冷却した。２μｌのファーストストランド反応物は、５０μｌの最終容積中でＰＣＲミックス（２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（New England Biolabs）、１０μＭのフォワード／リバースプライマー）に添加され、ＰＣＲ増幅に先立って加熱された（２分、９４℃）。ノーザンブロット及びＳＱ−ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプローブの生成のためのプライマーは、表１において列記される。
【００４１】
ウェスタンブロット解析
３５ｍｍのディッシュ中で増殖させたＢＲＩ−ＪＭ０１細胞を、ＴＧＦ−β１により処理した（２４時間）。細胞は熱した２％のＳＤＳ中で溶解した。５０μｇの総タンパク質又は３０μｌの馴化培地を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって分離した。タンパク質はニトロセルロース膜に転写され、膜は５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（容積／容積））中で一次抗体（ｃｌｕβ、ｃａｖ−１、１／５００）によりインキュベートされた（一晩、４℃）。膜をＴＢＳ−Ｔにより洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ＋５％ミルク（milk）中のＨＲＰ結合二次抗体（１／２０，０００）によりインキュベートし（１時間）、ＴＢＳ−Ｔにより洗浄した。免疫反応性のバンドは、増強化学発光（Enhanced Chemiluminescence）（ＥＣＬ、Perkin Elmer）を使用して可視化された。
【００４２】
免疫蛍光顕微鏡検査法
ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞を、ガラスチャンバースライド（Lab-Tek）に播種し、ｃｌｕβ抗体（８μｇ／ｍｌ）又は１Ｄ１１（１００ｎＭ）の存在下又は非存在下でプレインキュベートした（３０分）精製クラステリン又はＴＧＦ−β１で処理した。処理していないＢＲＩ−ＪＭ０１細胞及びＴＧＦ−β１処理したＢＲＩ−ＪＭ０１細胞（２４時間）から得られた馴化培地を、処理していないＢＲＩ−ＪＭ０１細胞とのインキュベートに先立って、これらの抗体でプレインキュベートした（３０分）。２４時間の曝露後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し（１０分）、２度すすぎ（ＰＢＳ）、透過性にし（２分、ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００）、再びすすぎ、及び非特異的部位をＰＢＳ中の１０％ＦＢＳでブロックした（４０分）。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、次にＰＢＳ／１０％  ＦＢＳ中の一次抗体（Ｅ−ｃａｄ、１／２００、ＺＯ−１、１／１００、ｃｌｕβ、ｃａｖ−１、１／５０）でインキュベートし（１時間）、すすぎ（ＰＢＳ中で４回）、蛍光的に結合した二次抗体（Molecular Probes）で最終的にインキュベートした。同時にＦ−アクチンフィラメントを、テキサスレッド標識ファロイジン（１／１００）で標識し、核を０．４μｇ／ｍｌ  ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Sigma）で対比染色した。スライドをすすぎ（ＰＢＳ）、プロロングアンチフェード（Prolong anti-fade）（Molecular Probes）を使用してマウントした。蛍光画像は、Leitzのアリストプラン（Aristoplan）顕微鏡に取り付けたPrinceton InstrumentのクールスナップＣＣＤデジタルカメラを使用して撮影し、エクリプス（Eclipse）（Empix Imaging Inc.）及びフォトショップ（Photoshop）（Adobe）ソフトウェアを使用して分析した。
【００４３】
細胞増殖アッセイ
ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）は２４ウェルプレート中に播種した。翌日培地を交換し、精製クラステリン、ＴＧＦ−β１、又は１Ｄ１１抗体（１００ｎＭ）若しくはｃｌｕβ抗体（８μｇ／ｍｌ）により３０分間プレインキュベートしたＴＧＦ−β１を細胞に添加した。２４時間後に、細胞を０．５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］チミジン（Amersham）によりパルス標識し、すすぎ（ＰＢＳ、４℃）、トリプシン処理し、［３Ｈ］チミジン取り込みを液体シンチレーションカウンタによって評価した。
【００４４】
細胞運動性アッセイ
細胞（２×１０４細胞／ウェル）を、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１＋ｃｌｕβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al-Moustafa他(1999)に記載のインクをコートした１２ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス９９５（Coolpix 995）デジタルカメラを使用して２４時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をＩｍａｇｅＪフリーウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用して定量化した。
【００４５】
黒インク運動性アッセイ
細胞（２×１０４細胞／ウェル）を、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１＋ｃｌｕβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al-Moustafa他(1999)に記載のインクをコートした１２ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス９９５デジタルカメラを使用して２４時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をＩｍａｇｅＪフリーウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用して定量化した。
【００４６】
創傷治癒運動性アッセイ
コンフルエント細胞単層（１２ウェルプレート）を２μＬピペットチップを使用して「傷つけた」。次に培地を細胞残屑を除去するために交換し、抗クラステリンｍＡｂ（４μｇ／ｍＬの最終濃度）を、１００ｐＭのＴＧＦ−βの非存在下又は存在下において添加した。創傷の画像は、Leitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス９９５デジタルカメラを使用して、インキュベート前に、及び２４時間のインキュベート後に撮影された。
【００４７】
ポリクローナル抗体産生
ペプチド（クラステリンタンパク質のうちのアミノ酸４２１〜４３７）は、カルガリー大学（University of Calgary）（http://peplab.myweb.med.ucalgary.ca/）で産生及び精製された。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ビアコア（Biacore）（商標）２０００）によるウサギ抗血清のスクリーニングに使用されたＣＭ−５センサーチップの表面に対する配向結合を容易にするために、余剰のシステインをペプチドのＣ末端に追加した。ペプチドは、グルタルアルデヒド（Sigma）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣＬ（Pierce）のいずれかを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、イムジェクト・マリカルチャー（Imject Mariculture）  ＫＬＨ、Pierce）に結合され、ＰＢＳに対して透析された（４℃で一晩）。２つの方法によって結合したペプチド調製物を混合した（１：１）。免疫前血清を２羽のメスのニュージーランドホワイトウサギ（１０ｍｌ）から採取し、次にＫＬＨ結合ペプチド調製物（１脚当たり１．２５μｇペプチド／０．５ｍｌフロインド不完全アジュバント又はＰＢＳ）を注射した。動物は３週ごとに追加免疫し（１脚当たり１．２５μｇのペプチド／０．５ｍｌフロインド不完全アジュバント又はＰＢＳ）、血清を各追加免疫後１０日ごとに採取し（６ｍｌ／ｋｇ）、抗体価が増加しなくなった時点で動物を安楽死させ放血させた。
【００４８】
血清をＳＰＲを使用して、抗体活性について検査した。このために、ペプチドはチオール結合方法（製造業者によって記述されたように）を使用して、ＣＭ−５センサーチップ（Biacore Inc.）に結合し、免疫前血清、抗体含有血清及び市販の抗クラステリン抗体（Santa Cruz）の希釈物（１／５０）を、ペプチド表面上に流した。
【００４９】
モノクローナル抗体産生
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、タイターマックス（TiterMax）アジュバント（Pierce）中で乳化した３５μｇの精製ヒトクラステリンを皮下（ｓ．ｃ．）及び腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。３週後に動物をｉ．ｐ．で再注射し、血清力価を１０日後に評価した。１０週後に、反応の良いマウスは、ｉ．ｐ．注射（５０μｇ精製クラステリン）によって追加免疫し、３日後に犠牲にした。脾臓細胞を採取し、ＮＳ０ミエローマ細胞と融合し、直ちに２０％ＦＢＳ、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジン（ＨＡＴ培地）、マウスＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したイスコフ培地中で平板培養した（９６ウェルマイクロプレート中に５×１０４細胞／ウェル、Costar）。上清（融合後１０〜２０日）を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、固定化した精製クラステリンに対する抗クラステリン活性について検査した。抗体産生細胞をクローニングし、抗クラステリン活性に対して２度再検査した。１３個の抗クラステリン抗体を産生するクローンを生成し、凍結されたストックを調製し、大規模抗体産生を開始した。
ＳＰＲに基づいたバイオセンサ（Biacore）エピトープマッピング
【００５０】
アプローチ１：
●ランニングバッファー：
○ＨＢＳ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）
○実験はすべて５μＬ／分で実行された。
●抗マウスＦｃ免疫グロブリンの標準的アミンカップリング：
○０．０５Ｍ  ＮＨＳ及び０．２Ｍ  ＥＤＣの混合物の３５μＬを注入する。
○適切な量が捕捉されるまで、３０μｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０中で希釈された抗体を注入する。
○３５μＬの１Ｍエタノールアミン−ＨＣＬ、ｐＨ８．５を注入する。
●エピトープマッピング：
○２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの濃度でｍＡｂ１の２５μＬを注入する。
○ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３の混合物の２５μＬを、２５μｇ／ｍＬの濃度で各々注入する。
○３０μｇ／ｍＬの濃度でヒト組換えクラステリンの２５μＬを注入する。
○２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬの濃度で２５μＬのｍＡｂ２を注入する。
●対照：
○各組の抗体に対し、ｍＡｂ２の非特異的な結合は、エピトープマッピングの項において記述されている注入すべての繰り返しであるが、クラステリンの代わりにランニングバッファーを注入することによって決定された。
○対照においてｍＡｂ２注入の終了２０秒後に得られた反応（ＲＵ）は、クラステリンの存在下において得られた反応から差引かれた。
●表面の再生：
○各サイクルの終わりで、１０μＬの２０ｍＭグリシンｐＨ１．７、続いて１０μＬの１００ｍＭ  ＨＣｌを注入する。
【００５１】
アプローチ２：
●ランニングバッファー：
○ＨＢＳ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）
●抗体の標準的アミンカップリング：
○０．０５Ｍ  ＮＨＳ及び０．２Ｍ  ＥＤＣの混合物の３５μＬを注入する。
○適切な量が捕捉されるまで、２０〜８０μｇ／ｍＬにわたる（raging）濃度で１０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５又はｐＨ５．０）中で希釈された抗体を注入する。
○３５μＬの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を注入する。
●対照表面の調製
○０．０５ＭのＮＨＳ及び０．２ＭのＥＤＣの混合物の３５μＬを注入する。
○３５μＬの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を注入する。
●競合
○５０ｎＭのヒト組換えクラステリンをＰＢＳ（Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋無し）中で２５０ｎＭ又は５００ｎＭの抗体と混合する。
○抗体単独のチューブを準備する。
○２５μＬのクラステリン単独、抗体単独、又は抗体表面及び対照表面の上に抗体とプレインキュベートされたクラステリンを、５μＬ／分のフローで注入する。
○抗体とプレインキュベートされたクラステリンに対して得られた反応から、同じ抗体単独の溶液に対して得られた反応を引く。
○抗体とプレインキュベートされたクラステリンに対して得られた反応を、クラステリン単独に対して得られた反応で割ることによって、％結合阻害を算出する。
●再生溶液
○各サイクルの終わりで、２０μＬ／分の流量で１０ｍＭ  ＨＣｌの１０μＬを注入する。
【００５２】
免疫沈降
５０ｎｇ又は１００ｎｇの様々なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体調製物（Ｃ１８）を、２０μＬのプロテインＧスラッシュ（ＰＢＳ中で１：１）と４℃で一晩インキュベートした。次に５００ｎｇのヒト組換えクラステリンを添加し、混合物を４℃でさらに２時間インキュベートした。免疫複合体を、１ｍＬのバッファー（１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス（ｐＨ  ８．０）、０．５５％ＮＰ−４０、５０ｍＭフッ化Ｎａ）により３回洗浄し、２０μＬの還元サンプルバッファーを添加した。サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに載せる前に５分間煮沸した。次に分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、膜は記述されたような抗クラステリン抗体によりプロービングされた（were probed）。
【００５３】
モノクローナル抗体の可変領域のシークエンシング
全ＲＮＡは１２個のハイブリドーマから単離され、ファーストストランドｃＤＮＡは逆転写酵素及びＩｇ−３定常領域プライマーにより調製され、その後適切なＩｇ−５’プライマーにより増幅された。ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼと併用して使用されるこれらのプライマーセットは、軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡの可変領域を特異的に増幅する。ＰＣＲ産物は、NovagenのｐＳＴＢｌｕｅ−１のパーフェクトリー・ブラント（Perfectly Blunt）（商標）クローニングキットにより直接クローニングするか、又はシングルｄＡ（Single dA）（商標）テーリングキットにより処理し、ｐＳＴＢｌｕｅ−１  ＡｃｃｅｐＴｏｒ（商標）ベクターへクローニングすることができる。詳細については、図１３を参照。
【００５４】
【表１】
2009507476.tif 000004
【００５５】
参照の包含は、本明細書において開示されたものすべての特許性に関連する承認及び提案のどちらでもない。
【００５６】
【表２】
2009507476.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＴＧＦ−βは、ＪＭ０１細胞における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導する。（Ａ）この転換は、伸長した形態、マーカーのＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）、β−カテニン（β−Ｃａｔ）及びＦ−アクチンの再局在化並びにマーカーの閉鎖帯−１（ＺＯ−１）のダウンレギュレーションによって特徴づけられる。（Ｂ）この形態変化には、「引っ掻いた（scratch：スクラッチ）」領域へ移動する細胞の能力がＴＧＦ−βの非存在下又は存在下でモニタリングされる創傷治癒のアッセイに示されるような細胞運動性の増大が伴う。（Ｃ）相補的な黒インク運動性アッセイも、ＴＧＦ−βの非存在下又は存在下における個々のＪＭ０１細胞の運動性を可視化及び定量するのに使用された。プラスチックをコートする黒インクは移動細胞に付着し、それによって白色の軌跡を生じさせる。両方のアッセイは、ＴＧＦ−βの存在がＪＭ０１細胞の運動性を増大させることを示す。
【図２】マイクロアレイ技術を使用する、ＴＧＦ−β誘導性の遺伝子発現変化の分析。（Ａ）転換の初期段階（０．５時間、１時間）、転換の中期段階（２時間、４時間、６時間）又は転換の後期段階（１２時間、２４時間）の間に調節される３２８個の遺伝子を同定させる、ＪＭ０１細胞ＥＭＴのＴＧＦ−βによる誘導の間の７時点（０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、及び２４時間）から得られたマイクロアレイデータの広範囲の分析。（Ｂ）これらの遺伝子のうちの５つのみが時間経過の全体にわたって影響される。（Ｃ）本発明者らの遺伝子リストを、ＮＣＩ−６０細胞株パネル（これらの細胞株のうちのいくつかは間葉の表現型を示す）の基礎遺伝子発現プロファイルに対するデータ、及び臨床的なサンプルからの発現プロファイリングデータと比較することによって、間葉腫瘍細胞表現型及び臨床的な腫瘍進行に関連する、リストから１５個の遺伝子を同定した。
【図３】選択された遺伝子発現及びタンパク質レベルのＴＧＦ−β調節の検証。（Ａ）半定量的ＰＣＲにより、ＴＧＦ−β誘導性のクラステリンのアップレギュレーション及びカベオリン−１のダウンレギュレーションを確認し、それによってマイクロアレイ分析を検証した（ＰＣＲ結果の下に示されたマイクロアレイデータ）。（Ｂ）ＴＧＦ−βにより２４時間処理されたＪＭ０１細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロット解析により、これらの転写の変化が、クラステリン（ｐ−ｃｌｕ＝プレクラステリン、ｓ−ｃｌｕ＝分泌された成熟クラステリン）タンパク質レベルの増加及びカベオリン−１（Ｃａｖ−１）タンパク質レベルの減少をもたらすことが実証された。（Ｃ）ＴＧＦ−βにより２４時間処理されたＪＭ０１細胞の免疫蛍光顕微鏡検査により、未処理細胞中のクラステリンタンパク質及びカベオリン−１タンパク質の視覚化を通して、クラステリンタンパク質レベル及びカベオリン−１タンパク質レベルの変化がさらに確認された。核は青く染色され、カベオリン−１及びクラステリンは緑に染色され、Ｆ−アクチン線維は赤く染色される。
【図４】ＴＧＦ−β誘導性ＥＭＴのメディエータとして分泌されたクラステリンの同定。（Ａ）免疫蛍光顕微鏡検査は、クラステリンがＪＭ０１細胞の分泌経路に局在化することを示し、馴化培地（ＣＭ）のウェスタンブロット解析は、クラステリンが分泌される（ｓ−ｃｌｕ）ことを示した。（Ｂ、Ｃ）ＪＭ０１細胞は、クラステリンβ鎖のＣ末端に対して作製された抗体（抗ｃｌｕ）の非存在下又は存在下で、ＴＧＦ−β、又はＴＧＦ−βで処理されたＪＭ０１細胞から得られたＣＭにより２４時間処理された。ＥＭＴのマーカーとしてＺＯ−１の免疫蛍光顕微鏡法を使用して、クラステリン抗体がＴＧＦ−β及びＣＭによるＥＭＴの誘導の両方をブロックすることが明らかにされ、分泌されたクラステリンがＴＧＦ−β  ＥＭＴ経路の必要なメディエータであることが示された。精製されたクラステリン単独でも、ＥＭＴを促進することが明らかにされ、クラステリンはＥＭＴ誘導の必要条件であるだけではなく、十分条件であることが示された。（Ｄ）クラステリン単独によるＥＭＴの誘導は、上皮マーカーのＥ−カドヘリンのＦＡＣＳアッセイを使用してＥＭＴをモニタリングすることによって、さらに確認された。
【図５】クラステリンはＪＭ０１細胞以外の細胞株でＥＭＴメディエータとして作用することを示した図である。４Ｔ１腫瘍細胞（乳房）及びＤＵ１４５腫瘍細胞（前立腺）は、ＴＧＦ−β刺激のない状態においてクラステリンを分泌し、運動性表現型を示すことが観察された。創傷治癒アッセイを使用して４Ｔ１細胞及びＤＵ１４５細胞の運動性をモニタリングすることにより、クラステリン抗体（抗ｃｌｕ）がこれらの細胞の運動性を阻害することが観察され、クラステリンがこれらの細胞のＴＧＦ−β非依存性の間葉表現型の維持に重要であることが示された。
【図６】クラステリンは、ＴＧＦ−βによる増殖阻害をもたらす経路においてではなく、ＥＭＴのＴＧＦ−βによる誘導をもたらす経路において極めて重要なメディエータである。（Ａ）黒インク運動性アッセイを使用してＪＭ０１細胞のＥＭＴをモニタリングすることにより、クラステリン抗体がＴＧＦ−β誘導性ＥＭＴをブロックすること、及びクラステリン単独でＥＭＴを促進することが確認された。（Ｂ）この結果は、１個の細胞当たりのインクの取り除かれた領域として運動性変化を定量することによってさらに確認された。（Ｃ）対照的に、トリチウム標識チミジンの取り込みによってモニタリングされるように、クラステリン抗体がＴＧＦ−βに誘導された増殖阻害をブロックせず、クラステリンが単独で増殖阻害を促進しないことが明らかにされ、クラステリンはＴＧＦ−βの増殖阻害経路においてはメディエータではないことが示された。
【図７】クラステリンは、ＴＧＦ−βにより腫瘍を抑制する経路においてではなく、ＴＧＦ−βにより腫瘍を促進する経路において不可欠なメディエータである。ＴＧＦ−βはクラステリンの分泌を誘導し、クラステリンβ鎖のＣ末端に対して作製された抗体は、ＴＧＦ−βに対する細胞の増殖阻害反応ではなく、ＴＧＦ−β１誘導性ＥＭＴをブロックする。これらの結果は、クラステリンがＴＧＦ−βのＥＭＴ経路において必要なメディエータであることを示すが、他のＴＧＦ−β誘導性メディエータが、ＥＭＴを誘導するためにクラステリンと協調して作用するか否かについては焦点を当てない。すなわち、クラステリンが単独でＥＭＴを仲介するか否かという問題には焦点を当てない。ＴＧＦ−β非存在下において、精製されたクラステリンがさらにＥＭＴを促進するという事実は、クラステリンがこの転換を誘導するのに十分であることを示す。
【図８】ＢＲＩで産生された抗クラステリンポリクローナル抗体の中和活性の分析。クラステリンペプチド（アミノ酸４２１〜４３７）により免疫された２羽のウサギ（＃９及び＃１０）から回収された血清は、表面プラズモン共鳴（データ不掲載）を使用して、ペプチドと相互作用する抗体を含むことが確認され、創傷治癒アッセイにおいて細胞運動性を阻害するこれらの能力について試験された（ウサギ血清の１／２５希釈）。マウス乳房上皮細胞株、４Ｔ１（上部）はクラステリンを分泌し、ＴＧＦ−β非存在下において運動性であるが、ＪＭ０１細胞株（下部）はクラステリン産生及び細胞運動性を誘導するためにＴＧＦ−βによる刺激を必要とする。ウサギ＃９及び＃１０の両方の血清は運動性を阻害し、＃１０血清がより有効であった。予想通りに、両方のウサギの免疫前の血清は運動性に影響しない。市販のクラステリン抗体が陽性対照（抗ｃｌｕ、Santa Cruz）として示される。
【図９】ＢＲＩで産生された抗クラステリンモノクローナル抗体の活性の分析。（Ａ）１２個のＢＲＩが産生したモノクローナル抗体（市販のポリクローナル抗体（Ｃ１８）及び市販のモノクローナル抗体（Ｂ５）は陽性対照として使用された）の各々の５０ｎｇ又は１００ｎｇのいずれかを使用する、組換えヒトクラステリン（５００ｎｇ）の免疫沈降。サンプルを１２％の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。すべての抗体は、組換えクラステリンと相互作用することが免疫沈降によって観察された。（Ｂ）黒インク運動性アッセイ（市販のポリクローナル抗体（Ｃ１８）及び市販のモノクローナル抗体（Ｂ５）は陽性対照として使用された）を使用する、１２個のＢＲＩが産生したモノクローナル抗体がＪＭ０１細胞のＴＧＦ−βに誘導された運動性を阻害する能力の評価。棒グラフは、様々な抗体の存在下においてＴＧＦ−β処理されたＢＲＩ−ＪＭ０１細胞の運動性の相対値を示す。ＢＲＩが産生した５個のモノクローナル抗体（２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１、１６Ｂ５及び１１Ｅ２）は、ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞のＴＧＦ−βに誘導された運動性を阻害する。値は、ＴＧＦ−βで処理された（対照）細胞の値と比較してクリアランス／細胞／２４時間として表わされる。＊は、中和能を評価する場合、使用したカットオフ値を示す。黒インク運動性アッセイにおいてこのカットオフ値を使用する場合、創傷治癒運動性アッセイを使用するときのモノクローナル抗体の中和能の評価に良好に一致した（データ不掲載）。
【図１０】抗体のエピトープ間の関係の分析に対する２つのＳＰＲバイオセンサー（Biacore）アプローチ。（Ａ）第１のアプローチにおいて、ウサギ抗マウスＦｃ抗体（ＲＡＭＦｃ）は、センサーチップに共有結合で固定され、１つのモノクローナル抗体（Ａｂ１と名付けられる）が表面に捕捉される。クラステリンがＡｂ１と結合した後に、第２のモノクローナル抗体（Ａｂ２と名付けられる）は表面の上に流される。２つの抗体のエピトープが重なり合っていれば、Ａｂ２はＡｂ１に結合されたクラステリンに結合することができないだろう。２つの抗体に関連性のないエピトープが存在すれば、Ａｂ２はＡｂ１に結合されたクラステリンに結合することができるだろう。（Ｂ）第２のアプローチにおいて、１つのモノクローナル抗体（Ａｂ１と名付けられる）は、センサーチップ表面に共有結合で固定される。次に、クラステリンは溶液中で第２の抗体（Ａｂ２と名付けられるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）によりインキュベートされ、次に複合体はＡｂ１の上に流される。２つの抗体のエピトープが重なり合っていれば、Ａｂ２に結合されたクラステリンはＡｂ１に結合することができないだろう。
【図１１】５個のＥＭＴを中和するＢＲＩが産生した抗クラステリンモノクローナル抗体のエピトープとの互いの関係、並びにＣ１８抗体、ｐＡｂ＃１０抗体及びＢ５抗体のペプチドエピトープとの関係の分析結果。この表は、２つのＳＰＲバイオセンサ（Biacore）アプローチを使用して得られたエピトープマッピングの結果をすべて要約する。青色の＋は、Ａｂ１が第１のBiacoreアプローチにおいてＡｂ２とクラステリンへの結合を競合したことを示す（すなわち、結合したクラステリンのＲＵに対するＡｂ２のＲＵの比率は、０．１以下であった）。赤色の＋又は＋／−は、Ａｂ２が第２のBiacoreアプローチにおいてＡｂ１とクラステリンへの結合を競合したことを示す（すなわち、Ａｂ２でプレインキュベートされたときに、Ａｂ１へのクラステリンの結合は、＋については３０〜１００％、及び＋／−については１０〜３０％阻害された）。５個の中和モノクローナル（monolconal）抗体（２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１、１６Ｂ５及び１１Ｅ２）がすべて互いに、並びにｐＡｂ＃１０、ｐＡｂＣ１８及びｍＡｂ  Ｂ５に対して競合するので、これら５個の中和モノクローナル抗体はすべて、ｐＡｂ＃１０、ｐＡｂＣ１８及びｍＡｂ  Ｂ５の重複ペプチドエピトープと相互作用することは明白である。＊  Ａｂ２０Ｅ１１が（Ａｂ１又はＡｂ２のいずれかとして）使用された場合、第１のアプローチからのすべての陰性の結果（青色の−）が生じたことは留意されるべきであり、このＡｂはその実験的セットにおいて良好に作用しないことが示される。したがって、抗体２０Ｅ１１については、結論は主として第２の実験的アプローチから得られる。
【図１２】Ｉｇ可変領域ｃＤＮＡの単離。流れ図表示は、単離についての工程、シークエンシングについての工程、モノクローナル抗体の可変領域の配列アッセイについての工程である。
【図１３】モノクローナル抗体のアミノ酸配列。
【図１４】クラステリンＩｇ  ＶＨのＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアライメント。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１３−１２】
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【図１３−１３】
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【図１３−１４】
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【図１３−１５】
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【図１３−１６】
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【図１３−１７】
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【図１３−１８】
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【図１３−１９】
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【図１３−２０】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月13日(2007.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞における上皮間葉転換の阻害のための抗体又はペプチドの使用であって、ヒトクラステリンのβ-サブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１〜４４３の部位に対して特異的な結合親和性を有する抗体又はペプチドの使用。
【請求項２】
前記抗体が使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル又はポリクローナルである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号６を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数を含むアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
ヒトクラステリンのβ−サブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１〜４４３の間の部位に特異的な結合親和性を有する抗体又はペプチドにより癌細胞における上皮間葉転換を阻害することを含む、癌細胞の活性を調節する方法。
【請求項８】
阻害することが抗体により遂行される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、モノクローナル又はポリクローナルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号６を含むアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数を含むアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４の１つ又は複数の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号６を含むアミノ酸配列を有し、且つヒトクラステリンのβ−サブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１〜４４３の間の部位への特異的な結合親和性を有する抗体又はペプチドであって、クラステリンへの該抗体又は該ペプチドの結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する抗体又はペプチド。
【請求項１４】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０のうちの１つ又は複数を含むアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体。
【請求項１５】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数を含むアミノ酸配列を有し、且つクラステリンへの結合親和性を有するモノクローナル抗体であって、クラステリンへの該抗体の結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、モノクローナル抗体。
【請求項１６】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０のうちの１つ又は複数の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体。
【請求項１７】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含み、且つクラステリンへの結合親和性を有するモノクローナル抗体であって、クラステリンへの該抗体の結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、モノクローナル抗体。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体及び配列番号４又はその一部分から成るアミノ酸配列を有するペプチドを含む、癌細胞における上皮間葉転換を阻害するワクチン。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号５から成る、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
癌腫の治療における使用のための、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
癌腫治療のための癌細胞における上皮間葉転換を阻害するワクチンの調製に関して、配列番号４又はその一部分から成るアミノ酸配列を有するペプチドの使用。
【請求項２２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号５から成る、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
癌腫の治療のためのワクチンの調製に関する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドの使用。
【請求項２４】
配列番号１〜配列番号３０のうちの１つ又は複数をコードする核酸配列。
【請求項２５】
癌腫の診断のための抗体又はペプチドの使用であって、該抗体又は該ペプチドが、ヒトクラステリンのβ−サブユニットのＣ末端部分のアミノ酸４２１〜４４３の間の部位に対して特異的な結合親和性を有し、且つクラステリンへの該抗体又は該ペプチドの結合が、癌細胞における上皮間葉転換を阻害する、癌腫の診断のための抗体又はペプチドの使用。
【請求項２６】
前記抗体が使用される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル又はポリクローナルである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗体が、配列番号６を含むアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数を含むアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２４のうちの１つ又は複数の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である、請求項２６に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ハイブリダイゼーション及びデータ分析
ｃＤＮＡマイクロアレイ（１５，２６４配列が確認されたマウスＥＳＴ、National Institute of AgingのＮＩＡＫマウスｃＤＮＡクローンセット、National Insitute of Health、米国、http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/15k.html）はトロントの大学ヘルスネットワークマイクロアレイセンター（University Health Network Microarray Center in Toronto）、オンタリオ、カナダ（http://www.microarrays.ca/）から得られた。スライドは、記述されるようにＣｙ３又はＣｙ５で標識されたｃＤＮＡとハイブリダイズされ（Enjalbert他, 2003）、１０ミクロンの解像度でＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００（Perkin Elmer、ｖ２．１１）を使用してスキャンし、１６ビットＴＩＦＦファイルがＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（Perkin Elmer、ｖ３．０）を使用して定量化された。記述されるように、マイクロアレイのデータ正規化及び分析が実行された（Enjalbert他, 2003）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
細胞運動性アッセイ
細胞（２×１０４細胞／ウェル）を、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１＋ｃｌｕβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al-Moustafa他(1999)に記載のインクをコートした１２ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス９９５（Coolpix 995）デジタルカメラを使用して２４時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をＩｍａｇｅＪフリーウェア（National Institute for Health、ベセスダ、マリーランド、米国、http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用して定量化した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
黒インク運動性アッセイ
細胞（２×１０４細胞／ウェル）を、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１＋ｃｌｕβ抗体、又は精製クラステリンの非存在下又は存在下において、Al-Moustafa他(1999)に記載のインクをコートした１２ウェルプレート中に播種した。画像をLeitzのアリストプラン顕微鏡に取り付けた株式会社ニコンのクールピクス９９５デジタルカメラを使用して２４時間後に撮影し、粒子の無い軌跡をＩｍａｇｅＪフリーウェア(National Institute for Health、ベセスダ、マリーランド、米国、http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用して定量化した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ポリクローナル抗体産生
ペプチド（クラステリンタンパク質のうちのアミノ酸４２１〜４３７）は、カルガリー大学（Integrated Peptide Services, Faculity of Medicine,University of Calgary、カルガリー、アルバータ、カナダ）（http://peplab.myweb.med.ucalgary.ca/）で産生及び精製された。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ビアコア（Biacore）（商標）２０００）によるウサギ抗血清のスクリーニングに使用されたＣＭ−５センサーチップの表面に対する配向結合を容易にするために、余剰のシステインをペプチドのＣ末端に追加した。ペプチドは、グルタルアルデヒド（Sigma）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣＬ（Pierce）のいずれかを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、イムジェクト・マリカルチャー（Imject Mariculture）  ＫＬＨ、Pierce）に結合され、ＰＢＳに対して透析された（４℃で一晩）。２つの方法によって結合したペプチド調製物を混合した（１：１）。免疫前血清を２羽のメスのニュージーランドホワイトウサギ（１０ｍｌ）から採取し、次にＫＬＨ結合ペプチド調製物（１脚当たり１．２５μｇペプチド／０．５ｍｌフロインド不完全アジュバント又はＰＢＳ）を注射した。動物は３週ごとに追加免疫し（１脚当たり１．２５μｇのペプチド／０．５ｍｌフロインド不完全アジュバント又はＰＢＳ）、血清を各追加免疫後１０日ごとに採取し（６ｍｌ／ｋｇ）、抗体価が増加しなくなった時点で動物を安楽死させ放血させた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図１】ＴＧＦ−βは、ＪＭ０１細胞における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導する。（Ａ）この転換は、伸長した形態、マーカーのＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）、β−カテニン（β−Ｃａｔ）及びＦ−アクチンの再局在化並びにマーカーの閉鎖帯−１（ＺＯ−１）のダウンレギュレーションによって特徴づけられる。（Ｂ）この形態変化には、「引っ掻いた（scratch：スクラッチ）」領域へ移動する細胞の能力がＴＧＦ−βの非存在下又は存在下でモニタリングされる創傷治癒のアッセイに示されるような細胞運動性の増大が伴う。（Ｃ）相補的な黒インク運動性アッセイも、ＴＧＦ−βの非存在下又は存在下における個々のＪＭ０１細胞の運動性を可視化及び定量するのに使用された。プラスチックをコートする黒インクは移動細胞に付着し、それによって白色の軌跡を生じさせる。両方のアッセイは、ＴＧＦ−βの存在がＪＭ０１細胞の運動性を増大させることを示す。
【図２】マイクロアレイ技術を使用する、ＴＧＦ−β誘導性の遺伝子発現変化の分析。（Ａ）転換の初期段階（０．５時間、１時間）、転換の中期段階（２時間、４時間、６時間）又は転換の後期段階（１２時間、２４時間）の間に調節される３２８個の遺伝子を同定させる、ＪＭ０１細胞ＥＭＴのＴＧＦ−βによる誘導の間の７時点（０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、及び２４時間）から得られたマイクロアレイデータの広範囲の分析。（Ｂ）これらの遺伝子のうちの５つのみが時間経過の全体にわたって影響される。（Ｃ）本発明者らの遺伝子リストを、ＮＣＩ−６０細胞株パネル（これらの細胞株のうちのいくつかは間葉の表現型を示す）の基礎遺伝子発現プロファイルに対するデータ、及び臨床的なサンプルからの発現プロファイリングデータと比較することによって、間葉腫瘍細胞表現型及び臨床的な腫瘍進行に関連する、リストから１５個の遺伝子を同定した。
【図３】選択された遺伝子発現及びタンパク質レベルのＴＧＦ−β調節の検証。（Ａ）半定量的ＰＣＲにより、ＴＧＦ−β誘導性のクラステリンのアップレギュレーション及びカベオリン−１のダウンレギュレーションを確認し、それによってマイクロアレイ分析を検証した（ＰＣＲ結果の下に示されたマイクロアレイデータ）。（Ｂ）ＴＧＦ−βにより２４時間処理されたＪＭ０１細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロット解析により、これらの転写の変化が、クラステリン（ｐ−ｃｌｕ＝プレクラステリン、ｓ−ｃｌｕ＝分泌された成熟クラステリン）タンパク質レベルの増加及びカベオリン−１（Ｃａｖ−１）タンパク質レベルの減少をもたらすことが実証された。（Ｃ）ＴＧＦ−βにより２４時間処理されたＪＭ０１細胞の免疫蛍光顕微鏡検査により、未処理細胞中のクラステリンタンパク質及びカベオリン−１タンパク質の視覚化を通して、クラステリンタンパク質レベル及びカベオリン−１タンパク質レベルの変化がさらに確認された。核は青く染色され、カベオリン−１及びクラステリンは緑に染色され、Ｆ−アクチン線維は赤く染色される。
【図４】ＴＧＦ−β誘導性ＥＭＴのメディエータとして分泌されたクラステリンの同定。（Ａ）免疫蛍光顕微鏡検査は、クラステリンがＪＭ０１細胞の分泌経路に局在化することを示し、馴化培地（ＣＭ）のウェスタンブロット解析は、クラステリンが分泌される（ｓ−ｃｌｕ）ことを示した。（Ｂ、Ｃ）ＪＭ０１細胞は、クラステリンβ鎖のＣ末端に対して作製された抗体（抗ｃｌｕ）の非存在下又は存在下で、ＴＧＦ−β、又はＴＧＦ−βで処理されたＪＭ０１細胞から得られたＣＭにより２４時間処理された。ＥＭＴのマーカーとしてＺＯ−１の免疫蛍光顕微鏡法を使用して、クラステリン抗体がＴＧＦ−β及びＣＭによるＥＭＴの誘導の両方をブロックすることが明らかにされ、分泌されたクラステリンがＴＧＦ−β  ＥＭＴ経路の必要なメディエータであることが示された。精製されたクラステリン単独でも、ＥＭＴを促進することが明らかにされ、クラステリンはＥＭＴ誘導の必要条件であるだけではなく、十分条件であることが示された（白い棒：ＣＴＬ、黒い棒：＋抗−ＴＧＦ−β、斜線の棒：抗クラステリン、グレーの棒：精製クラステリン）。（Ｄ）クラステリン単独によるＥＭＴの誘導は、上皮マーカーのＥ−カドヘリンのＦＡＣＳアッセイを使用してＥＭＴをモニタリングすることによって、さらに確認された。
【図５】クラステリンはＪＭ０１細胞以外の細胞株でＥＭＴメディエータとして作用することを示した図である。４Ｔ１腫瘍細胞（乳房）及びＤＵ１４５腫瘍細胞（前立腺）は、ＴＧＦ−β刺激のない状態においてクラステリンを分泌し、運動性表現型を示すことが観察された。創傷治癒アッセイを使用して４Ｔ１細胞及びＤＵ１４５細胞の運動性をモニタリングすることにより、クラステリン抗体（抗ｃｌｕ）がこれらの細胞の運動性を阻害することが観察され、クラステリンがこれらの細胞のＴＧＦ−β非依存性の間葉表現型の維持に重要であることが示された。
【図６】クラステリンは、ＴＧＦ−βによる増殖阻害をもたらす経路においてではなく、ＥＭＴのＴＧＦ−βによる誘導をもたらす経路において極めて重要なメディエータである。（Ａ）黒インク運動性アッセイを使用してＪＭ０１細胞のＥＭＴをモニタリングすることにより、クラステリン抗体がＴＧＦ−β誘導性ＥＭＴをブロックすること、及びクラステリン単独でＥＭＴを促進することが確認された。（Ｂ）この結果は、１個の細胞当たりのインクの取り除かれた領域として運動性変化を定量することによってさらに確認された。（Ｃ）対照的に、トリチウム標識チミジンの取り込みによってモニタリングされるように、クラステリン抗体がＴＧＦ−βに誘導された増殖阻害をブロックせず、クラステリンが単独で増殖阻害を促進しないことが明らかにされ、クラステリンはＴＧＦ−βの増殖阻害経路においてはメディエータではないことが示された。
【図７】クラステリンは、ＴＧＦ−βにより腫瘍を抑制する経路においてではなく、ＴＧＦ−βにより腫瘍を促進する経路において不可欠なメディエータである。ＴＧＦ−βはクラステリンの分泌を誘導し、クラステリンβ鎖のＣ末端に対して作製された抗体は、ＴＧＦ−βに対する細胞の増殖阻害反応ではなく、ＴＧＦ−β１誘導性ＥＭＴをブロックする。これらの結果は、クラステリンがＴＧＦ−βのＥＭＴ経路において必要なメディエータであることを示すが、他のＴＧＦ−β誘導性メディエータが、ＥＭＴを誘導するためにクラステリンと協調して作用するか否かについては焦点を当てない。すなわち、クラステリンが単独でＥＭＴを仲介するか否かという問題には焦点を当てない。ＴＧＦ−β非存在下において、精製されたクラステリンがさらにＥＭＴを促進するという事実は、クラステリンがこの転換を誘導するのに十分であることを示す。
【図８】ＢＲＩで産生された抗クラステリンポリクローナル抗体の中和活性の分析。クラステリンペプチド（アミノ酸４２１〜４３７）により免疫された２羽のウサギ（＃９及び＃１０）から回収された血清は、表面プラズモン共鳴（データ不掲載）を使用して、ペプチドと相互作用する抗体を含むことが確認され、創傷治癒アッセイにおいて細胞運動性を阻害するこれらの能力について試験された（ウサギ血清の１／２５希釈）。マウス乳房上皮細胞株、４Ｔ１（上部）はクラステリンを分泌し、ＴＧＦ−β非存在下において運動性であるが、ＪＭ０１細胞株（下部）はクラステリン産生及び細胞運動性を誘導するためにＴＧＦ−βによる刺激を必要とする。ウサギ＃９及び＃１０の両方の血清は運動性を阻害し、＃１０血清がより有効であった。予想通りに、両方のウサギの免疫前の血清は運動性に影響しない。市販のクラステリン抗体が陽性対照（抗ｃｌｕ、Santa Cruz）として示される。
【図９】ＢＲＩで産生された抗クラステリンモノクローナル抗体の活性の分析。（Ａ）１２個のＢＲＩが産生したモノクローナル抗体（市販のポリクローナル抗体（Ｃ１８）及び市販のモノクローナル抗体（Ｂ５）は陽性対照として使用された）の各々の５０ｎｇ又は１００ｎｇのいずれかを使用する、組換えヒトクラステリン（５００ｎｇ）の免疫沈降。サンプルを１２％の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。すべての抗体は、組換えクラステリンと相互作用することが免疫沈降によって観察された。（Ｂ）黒インク運動性アッセイ（市販のポリクローナル抗体（Ｃ１８）及び市販のモノクローナル抗体（Ｂ５）は陽性対照として使用された）を使用する、１２個のＢＲＩが産生したモノクローナル抗体がＪＭ０１細胞のＴＧＦ−βに誘導された運動性を阻害する能力の評価。棒グラフは、様々な抗体の存在下においてＴＧＦ−β処理されたＢＲＩ−ＪＭ０１細胞の運動性の相対値を示す。ＢＲＩが産生した５個のモノクローナル抗体（２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１、１６Ｂ５及び１１Ｅ２）は、ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞のＴＧＦ−βに誘導された運動性を阻害する。値は、ＴＧＦ−βで処理された（対照）細胞の値と比較してクリアランス／細胞／２４時間として表わされる。＊は、中和能を評価する場合、使用したカットオフ値を示す。黒インク運動性アッセイにおいてこのカットオフ値を使用する場合、創傷治癒運動性アッセイを使用するときのモノクローナル抗体の中和能の評価に良好に一致した（データ不掲載）。
【図１０】抗体のエピトープ間の関係の分析に対する２つのＳＰＲバイオセンサー（Biacore）アプローチ。（Ａ）第１のアプローチにおいて、ウサギ抗マウスＦｃ抗体（ＲＡＭＦｃ）は、センサーチップに共有結合で固定され、１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ１と名付けられる）が表面に捕捉される。クラステリンがｍＡｂ１と結合した後に、第２のモノクローナル抗体（ｍＡｂ２と名付けられる）は表面の上に流される。２つの抗体のエピトープが重なり合っていれば、ｍＡｂ２はｍＡｂ１に結合されたクラステリンに結合することができないだろう。２つの抗体に関連性のないエピトープが存在すれば、ｍＡｂ２はｍＡｂ１に結合されたクラステリンに結合することができるだろう。（Ｂ）第２のアプローチにおいて、１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ１と名付けられる）は、センサーチップ表面に共有結合で固定される。次に、クラステリンは溶液中で第２の抗体（ｍＡｂ２と名付けられるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）によりインキュベートされ、次に複合体はｍＡｂ１の上に流される。２つの抗体のエピトープが重なり合っていれば、ｍＡｂ２に結合されたクラステリンはｍＡｂ１に結合することができないだろう。
【図１１】５個のＥＭＴを中和するＢＲＩが産生した抗クラステリンモノクローナル抗体のエピトープとの互いの関係、並びにＣ１８抗体、ｐＡｂ＃１０抗体及びＢ５抗体のペプチドエピトープとの関係の分析結果。この表は、２つのＳＰＲバイオセンサ（Biacore）アプローチを使用して得られたエピトープマッピングの結果をすべて要約する。青色の＋は、Ａｂ１が第１のBiacoreアプローチにおいてＡｂ２とクラステリンへの結合を競合したことを示す（すなわち、結合したクラステリンのＲＵに対するＡｂ２のＲＵの比率は、０．１以下であった）。赤色の＋又は＋／−は、Ａｂ２が第２のBiacoreアプローチにおいてＡｂ１とクラステリンへの結合を競合したことを示す（すなわち、Ａｂ２でプレインキュベートされたときに、Ａｂ１へのクラステリンの結合は、＋については３０〜１００％、及び＋／−については１０〜３０％阻害された）。５個の中和モノクローナル（monolconal）抗体（２１Ｂ１２、２０Ｅ１１、１６Ｃ１１、１６Ｂ５及び１１Ｅ２）がすべて互いに、並びにｐＡｂ＃１０、ｐＡｂＣ１８及びｍＡｂ  Ｂ５に対して競合するので、これら５個の中和モノクローナル抗体はすべて、ｐＡｂ＃１０、ｐＡｂＣ１８及びｍＡｂ  Ｂ５の重複ペプチドエピトープと相互作用することは明白である。＊  Ａｂ２０Ｅ１１が（Ａｂ１又はＡｂ２のいずれかとして）使用された場合、第１のアプローチからのすべての陰性の結果（青色の−）が生じたことは留意されるべきであり、このＡｂはその実験的セットにおいて良好に作用しないことが示される。したがって、抗体２０Ｅ１１については、結論は主として第２の実験的アプローチから得られる。
【図１２】Ｉｇ可変領域ｃＤＮＡの単離。流れ図表示は、単離についての工程、シークエンシングについての工程、モノクローナル抗体の可変領域の配列アッセイについての工程である。
【図１３】モノクローナル抗体のアミノ酸配列。
【図１４】クラステリンＩｇ  ＶＨのＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアライメント。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2009507476.tif 000039
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2009507476.tif 000040
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2009507476.tif 000041
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2009507476.tif 000042
【国際調査報告】
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