(57)【要約】  単離ペプチドを提供する。配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えない単離ペプチド。これらのペプチドを含む組成物、およびウイルスの検出におけるその使用法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えない単離ペプチド。
【請求項２】
少なくとも1つの検出可能な成分と結合した、ウイルスプロテアーゼの基質を含む組成物であって、前記基質が請求項1に記載のアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項３】
前記少なくとも1つの検出可能な成分がプレ酵素であり、前記基質の切断が前記プレ酵素を活性化させる、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも1つの検出可能な成分がFRET対であり、前記基質の切断によって前記FRET対からシグナルが生成する、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
分離成分をさらに含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
一般式:
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記基質が請求項1に記載のアミノ酸配列を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物。
【請求項７】
前記検出可能な成分Xが酵素、蛍光色素分子、発色団、タンパク質、プロ酵素、化学発光物質および放射性同位体からなる群から選択される標識物質を含む、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記分離成分Zが免疫学的結合物質、磁性結合成分、ペプチド結合成分、親和性結合成分、核酸成分からなる群から選択される、請求項5または6に記載の組成物。
【請求項９】
一般式:
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記基質が請求項1に記載のアミノ酸配列を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
XまたはZがマーカー、検出可能な成分および/または切断された組成物と切断されていない組成物を適切な方法で分離することができる分離成分のいずれかを含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物。
【請求項１０】
前記マーカー、成分XまたはZが酵素、蛍光色素分子、発色団、タンパク質、化学発光物質、消光物質、FRET対、ビーズ、ペプチド、プレ酵素および放射性同位体、免疫学的結合物質、磁性結合成分、ペプチド結合成分、親和性結合成分、核酸成分からなる群から選択される標識物質を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出するための方法であって、
(a)前記基質を切断することができる条件下で請求項2、4、5、6、7、8、9または10に記載の組成物の少なくとも1つとサンプルを接触させる段階と、
(b)前記基質の切断をモニタリングする段階であって、前記基質の前記切断が前記サンプル中の前記少なくとも1種のウイルスの存在を示す段階とを含む方法。
【請求項１２】
段階(a)が異なるウイルスプロテアーゼの少なくとも2つの基質と前記サンプルを接触させる段階を含み、前記少なくとも2つの基質のいずれかの前記切断の不在が前記サンプル由来のウイルスの不在を示す、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが粘液、唾液、咽頭洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支洗浄液、膣液、涙液および生検組織からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプル中の前記切断活性の検出が医学的状態の診断である、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
ホモジニアスアッセイを使用して前記モニタリングを実施する、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
ヘテロジニアスアッセイを使用して前記モニタリングを実施する、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出するための診断キットであって、請求項2、4、5、6、7、8、9または10に記載の組成物の少なくとも1つおよび前記基質の切断を検出するための試薬を含むキット。
【請求項１８】
複数のウイルスの存在を検出するためのパッケージング材料および複数の組成物を含む診断キットであって、前記組成物のそれぞれが、一般式、
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
XまたはZがマーカー、検出可能な成分および/または切断された組成物と切断されていない組成物を適切な方法で分離することができる分離成分のいずれかを含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成せず、
前記XまたはZのそれぞれが少なくとも1つの明確に検出可能な成分を含み、前記パッケージング材料が、キットがサンプル中の複数のウイルスの検出用であることを示す標識またはパッケージ挿入体を含む、診断キット。
【請求項１９】
複数のウイルスの存在を検出するためのパッケージング材料および複数の組成物を含む診断キットであって、前記組成物のそれぞれが、一般式、
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成せず、
前記Xのそれぞれが明確に検出可能であり、前記パッケージング材料が、キットがサンプル中の複数のウイルスの検出用であることを示す標識またはパッケージ挿入体を含む、診断キット。
【請求項２０】
前記複数の組成物が1つの固体支持体に結合している、請求項18または19に記載の診断キット。
【請求項２１】
前記示差的な検出を前記1つの固体支持体上のアドレス可能な位置で実施する、請求項20に記載の診断キット。
【請求項２２】
前記示差的な検出を異なる検出可能な成分によって実施する、請求項20に記載の診断キット。
【請求項２３】
前記複数の組成物のそれぞれが固体支持体に結合している、請求項18、19または20に記載の診断キット。
【請求項２４】
前記固体支持体がビーズとして形成される、請求項23に記載の診断キット。
【請求項２５】
前記ビーズが着色ビーズ、磁気ビーズ、タグビーズおよび蛍光ビーズからなる群から選択される、請求項24に記載の診断キット。
【請求項２６】
コロナウイルス、SARSウイルス、HMPV(ヒトメタ肺炎ウイルス)、インフルエンザA+Bウイルス、鳥インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSV(呼吸器合胞体ウイルス)、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む呼吸器用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項２７】
ハンタウイルスおよびラクロス脳炎ウイルスを含む呼吸器用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項２８】
ロタウイルス、アデノ40/41ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、カルシウイルスおよびCMV(サイトメガロウイルス)からなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む胃腸用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項２９】
エンテロウイルス(1〜約80)、西ナイルウイルス、単純疱疹ウイルス1、2および6からなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む髄膜炎用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項３０】
トガウイルス、フラビウイルスおよび狂犬病ウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む髄膜炎用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項３１】
HIV系統ウイルス、単純疱疹ウイルス1、単純疱疹ウイルス2、HSV-1ウイルス、HSV-2ウイルス、HPV(ヒトパピローマウイルス)、およびHTLV-1ウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む性感染症用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項３２】
A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVウイルス、ヘルペスウイルス1および2からなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む旅行者用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項３３】
狂犬病ウイルスおよびジステンパーウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む獣医用キットである、請求項17、18または19に記載の診断キット。
【請求項３４】
前記少なくとも1つのサンプルが複数のサンプルを含む、請求項17に記載の診断キット。
【請求項３５】
前記少なくとも1種のウイルスが複数のウイルスを含む、請求項17に記載の診断キット。
【請求項３６】
前記ウイルスがアデノウイルスであり、前記基質が配列番号1または2を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項３７】
前記ウイルスがアルファウイルスであり、前記基質が配列番号3を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項３８】
前記ウイルスが風疹ウイルスであり、前記基質が配列番号4を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項３９】
前記ウイルスがHIVウイルスであり、前記基質が配列番号5を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４０】
前記ウイルスがHTLVウイルスであり、前記基質が配列番号6、7または8を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４１】
前記ウイルスがアルテリウイルスであり、前記基質が配列番号9を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４２】
前記ウイルスがコロナウイルスであり、前記基質が配列番号10を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４３】
前記ウイルスがSARSコロナウイルスであり、前記基質が配列番号11、12148または149を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４４】
前記ウイルスがトロウイルス属のウイルスであり、前記基質が配列番号13を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４５】
前記ウイルスがCMVウイルスであり、前記基質が配列番号14または15を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４６】
前記ウイルスがヘルペスウイルスであり、前記基質が配列番号16を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４７】
前記ウイルスがフラビウイルス属のウイルスであり、前記基質が配列番号17を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４８】
前記ウイルスがデング熱ウイルスであり、前記基質が配列番号18、19または20を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項４９】
前記ウイルスが西ナイルウイルスであり、前記基質が配列番号21、22または23を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５０】
前記ウイルスが黄熱ウイルスであり、前記基質が配列番号24、25または26を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５１】
前記ウイルスが日本脳炎ウイルスであり、前記基質が配列番号27、28または29を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５２】
前記ウイルスがダニ媒介性ウイルスであり、前記基質が配列番号30、31または32を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５３】
前記ウイルスがC型肝炎ウイルスであり、前記基質が配列番号33、34または35を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５４】
前記ウイルスがペスチウイルスであり、前記基質が配列番号36を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５５】
前記ウイルスがA型肝炎ウイルスであり、前記基質が配列番号37または38を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５６】
前記ウイルスがHRVウイルスであり、前記基質が配列番号39または40を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５７】
前記ウイルスがエンテロウイルスであり、前記基質が配列番号41、42、43、44、45、46または47を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５８】
前記ウイルスがHRVウイルスであり、前記基質が配列番号143〜147、150〜151を含む、請求項11、17、18または19に記載の方法またはキット。
【請求項５９】
ウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するための方法であって、
(a)少なくとも1種のウイルス系統のポリプロテインの複数の切断配列の中で、プロテアーゼによる最も迅速な切断速度論を示す切断配列を同定する段階と、
(b)最も迅速な切断速度論を示し、ウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するのに有用である、科全体の共通の切断配列を同定する段階とを含む方法。
【請求項６０】
前記ウイルスのプロテアーゼが、ウイルスがコードするプロテアーゼである、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルスがDNAウイルスおよびRNAウイルスからなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスがテクティウイルス科、パポバウイルス科、シルコウイルス科、パルボウイルス科、およびヘパドナウイルス科、シストウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、カルシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポチウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科およびブニヤウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科からなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスプロテアーゼがセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、3Cプロテイナーゼ、PAトランスクリプターゼ、アデニンプロテアーゼ、2Aプロテアーゼ、キモトリプシンまたはトリプシン、例えば:NS3、NS2、NS-プロシステインプロテアーゼ、nsP2システインプロテアーゼ、nsP23プロ、Cタンパク質プロテアーゼ、SFVNS、HIVアスパラギン酸プロテアーゼ、nsp4アルテリウイルスプロテアーゼ、HCMVプロテアーゼ、NS2-3、NS3-4Apプロテアーゼ、HTLV-1PRからなる群から選択される、請求項60に記載の方法。
【請求項６４】
(c)前記科全体の共通の切断配列を有する複数の切断配列を設計する段階と、
(d)前記複数の切断配列の中で前記プロテアーゼによる最も迅速な切断速度論を有する切断配列を同定する段階とをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６５】
前記設計が最適な溶解性、温度感受性および/またはpH感受性を有する前記切断配列を設計する段階を含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
前記段階(a)の同定段階が経験的実験を含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６７】
前記段階(a)の同定段階がデータマイニングを含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６８】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えず、各ウイルスプロテアーゼの活性を阻害するための模倣体を含む単離ペプチド。
【請求項６９】
ウイルス感染を治療すると認められる医薬品を製造するための、請求項68に記載のペプチドの使用。
【請求項７０】
請求項68に記載の単離ペプチドを活性成分として含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、触媒分子の切断活性を簡潔かつ迅速に検出するための新規な組成物に関する。これらの組成物を使用する診断試験およびキットについても提供する。
【背景技術】
【０００２】
疾患または健康上のリスクのマーカー、正常または発病プロセスまたは疾患のマーカーまたは物質、あるいは外来性病原体およびそれらの副生物の指標であれ、健康関連物質の迅速、特異的およびコスト効率の良い検出がますます必要とされている。これは世界中での、例えばHIV、SARS、鳥インフルエンザ、西ナイル熱、病原性耐性細菌疾患などの接触伝染病の蔓延の度重なる発生によってより一層明らかである。疾患の伝染的および流行的発生の増大する脅威に直面して、疾患物質の初期検出が適切なケアおよび予防に不可欠となっている。しかしながら、病原体検出および型分けの多くの現在利用可能な方法のコスト、複雑性および非能率性によって、時間を浪費し、労働集約的で、結局コストが高く不充分な政策、例えば成功が疑わしい検疫、ベクター根絶および予防接種などを実施せざる得ない状態である。さらに、疾患および発病プロセスの多数のマーカーが同定されてきており、例えば様々な癌におけるテロメラーゼ、白血病における末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)ならびにアルツハイマー病におけるβ-およびγ-セクレターゼなど、その幾つかは触媒活性を含む。
【０００３】
1918年、世界にスペイン風邪が流行し、ヨーロッパにおいて2千5百万を超える人々が犠牲になった。それ以来、医学的緊急事態の恐れが再発している。わずか数年前に、致死的SARSウイルスが東洋諸国で突然発生し、世界の経済を麻痺させる恐れがあった。SARSの発生は遅れ、最終的には抑えられたが、熱以外で隔離した健康な人と病人の同様の長期の検疫を含めた、非常に破壊的な措置の後に過ぎなかった。現在、鳥インフルエンザの発生は、危険な病原体を迅速に検出するための改良法の重要性を世界に再度思い出させるよう脅かすものである。
【０００４】
21世紀において、新たな流行病が蔓延する危険性は、飛行機旅行中の高い感染の可能性、ならびに個人、および集団の高い移動性のために非常に高い。病原性物質を検出するために現在使用されている方法には、初期感染後10〜20日間の抗病原体抗体の検出に頼る、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素免疫アッセイ(EIA)および免疫蛍光アッセイ(IFA)などの免疫学的検出法、コストが高く、時間を浪費し不正確であることが多いRT-PCR、およびこれも時間を浪費しコストが高い組織培養感染法がある。したがって、空港および他の公の場所において疾患に苦しむ、おそらく感染状態の個人を検出するための迅速かつ簡潔な診断法およびキットが緊急に必要とされる。病原性の高い種に突然変異しそれらを形成することができる非常に様々な性質の現在のウイルス性物質に直面して、方法は正確な検出が可能でなければならない。幾つかのウイルス性病原体を一度に検出して、交差感染の混合およびより凶暴な型のウイルスの生成の可能性を排除することが必要である。病原性物質の迅速かつ正確な型分けも優先事項である。治療の選択に関する正確なデータを与え、異なる病原性物質の混合および感染も妨げ、現場でのモニタリングおよび治療プロトコルの微調整を容易にするはずである、病院設定または家庭における幾つかの病原性物質の迅速な検出が必要である。
【０００５】
多くの生物は増殖または分化、代謝などの特定段階と関係がある特徴的な触媒活性を有する。同様に発病プロセスは、その診断において利用することができる特徴的な酵素活性、癌マーカーおよび心臓酵素などを有することが多い。例えば病原性細菌(例えば、非特許文献１およびGodsey、et alへの特許文献１を参照)、発癌中のDNA-フィトリアーゼ(例えば、非特許文献２を参照)、アルツハイマー病におけるβ-セクレターゼ活性(Hazuda et alへの特許文献２を参照)、生存細胞中の代謝活性のマッピング(非特許文献３を参照)、カスパーゼおよび他のアポトーシス関連酵素(Weber et alへの特許文献３を参照)およびウイルスの検出(例えば、Kettner、et alへの特許文献４を参照)の診断および分類のための、診断および分類のための触媒活性の検出に基づく方法が開示されている。
【０００６】
このような触媒活性の有効な測定および臨床用途は、容易に検出可能にすることができる充分定義された特異的酵素を必要とする。1つのこのような考えられる診断用触媒活性は、ウイルス感染の特異的プロテアーゼ活性である。
【０００７】
SARSウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ライノウイルス、ピコマウイルス、コロナウイルス、C型肝炎ウイルス、およびその他の多くのウイルスの複製中、ウイルスの遺伝物質が転写されてポリプロテインを形成し、それは最終的に2つ以上の生物活性タンパク質に切断される。ウイルスポリプロテインの個々のタンパク質への切断は、ウイルスのライフサイクルの重要な一部である。アデノウイルス、バキュロウイルス、コモウイルス、ピコマウイルス、レトロウイルス、およびトガウイルス科のウイルスを含めた多くのウイルスは、ウイルスポリプロテインをこれらの特異的切断位置で切断してウイルス複製に必要とされる活性タンパク質を形成する、プロテアーゼをコードしている。例えば、オーチャードグラスモザイクウイルス(ソベモウイルス属)の複製中のポリプロテインのプロセシングは、参照によりその中身が本明細書に組み込まれている非特許文献４中に記載されている。参照用に、ウイルスプロテアーゼおよび他の酵素の、幾つかの知られている例の非網羅的な一覧表を、本明細書の以下に記載する。
【０００８】
幾つかのウイルスによってコードされるプロテアーゼは、特定ウイルスのポリプロテインのみを切断する。他のプロテアーゼは、2つ以上の型のウイルスのポリプロテインを切断する。プロテアーゼ作用の特異性は、ポリプロテインの切断領域におけるプロテアーゼの相互作用の性質から生じる。さらに、これらの位置における切断の速度は、切断位置周辺のポリプロテインのペプチド配列に応じて変わる。
【０００９】
これらのウイルスプロテアーゼによって認識されるウイルスタンパク質に沿った切断部位は、高度に保存されたアミノ酸配列を含むことが示されてきており、診断および治療法へのそれらの組み込みの可能性を示唆する。
【００１０】
例えば、Kettner、et alへの米国特許第4,952,493号は、ウイルスプロテアーゼによって認識される保存的切断部位に従って設計した、ウイルス特異的プロテアーゼ活性の検出用のペプチド基質を開示する。これらのペプチド基質の切断部位は、ウイルス特異的切断部位のアミノ酸配列に従って確定され、ウイルスポリペプチドのシークエンシングによって、あるいはウイルスゲノムのコード配列に従って決定され、他のウイルスポリペプチドの配列とのアラインメントによって比較することができる。幾つかのアミノ酸残基と他の生物学上類似した残基の保存的置換は、許容可能であると考えられる。
【００１１】
Tan et alへの特許文献５は、サンプル中の寄生虫、原生動物、ウイルスおよび他のプロテアーゼ活性を検出するためのマトリクス結合組換え蛍光融合基質の使用を開示し、この場合、検出は多数の基質のプロテアーゼ認識のパターンに基づく。切断および/または認識基質は、知られている共通の切断および/または結合配列から設計される。標的プロテアーゼの高度な検出は、多数の基質の同時アッセイによるものである。
【００１２】
しかしながら、前に記載した方法は、最適な親和性を得て、最終的に多数のサンプル、および多数のウイルスの迅速な同時分析、ならびに新規な系統の特異的認識をもたらすような、ウイルス基質の選択を記載、示唆または言及していない。
【００１３】
基質切断配列の最適設計によるプロテアーゼ検出アッセイの改善された有効性は、ウイルス感染の検出および特徴付けの優れた迅速性、感度および経済性をもたらすはずである。さらに、基質切断配列、およびその生成物を設計するための方法は、抗ウイルス薬のスクリーニングおよび開発において使用することができる。
【特許文献１】米国特許第5,888,760号
【特許文献２】米国特許出願第200302555号
【特許文献３】米国特許出願第20020150885号
【特許文献４】米国特許第4,952,493号
【特許文献５】米国特許出願第20050214890号
【特許文献６】米国特許出願第20050048473号
【特許文献７】米国特許第6,472,505号
【特許文献８】米国特許第6,243,980号
【特許文献９】米国特許第4,666,828号
【特許文献１０】米国特許第4,683,202号
【特許文献１１】米国特許第4,801,531号
【特許文献１２】米国特許第5,192,659号
【特許文献１３】米国特許第5,272,057号
【特許文献１４】米国特許第3,791,932号
【特許文献１５】米国特許第3,839,153号
【特許文献１６】米国特許第3,850,752号
【特許文献１７】米国特許第3,850,578号
【特許文献１８】米国特許第3,853,987号
【特許文献１９】米国特許第3,867,517号
【特許文献２０】米国特許第3,879,262号
【特許文献２１】米国特許第3,901,654号
【特許文献２２】米国特許第3,935,074号
【特許文献２３】米国特許第3,984,533号
【特許文献２４】米国特許第3,996,345号
【特許文献２５】米国特許第4,034,074号
【特許文献２６】米国特許第4,098,876号
【特許文献２７】米国特許第4,879,219号
【特許文献２８】米国特許第5,011,771号
【特許文献２９】米国特許第5,281,521号
【非特許文献１】Maiden et al、J.Clin.Micro、1996 ; 34 : 376〜84
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【非特許文献４０】「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」、Academic Press、San Diego、CA(1990)
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【非特許文献４２】Models structure and genome organization.Vol 5 ; November 19、2003、Cambridge University Press
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、広く認められている必要性が存在し、前述の制約がない、最適基質および切断活性によって特徴付けられる疾患および感染プロセスを迅速、特異的に検出するための、触媒分子の切断活性の検出法を有することが非常に有利であるはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によれば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えない単離ペプチドを提供する。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、少なくとも1つの検出可能な成分と結合した、ウイルスプロテアーゼの基質を含む組成物であって、基質がアミノ酸配列を含む組成物を提供する。
【００１７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、少なくとも1つの検出可能な成分はFRET対であり、基質の切断によってFRET対からシグナルが生成する。
【００１８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、組成物は分離成分をさらに含む。
【００１９】
本発明の更なる態様によれば、
一般式:
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、基質がアミノ酸配列を含み、ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
X-Y-Zがウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物を提供する。
【００２０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、検出可能な成分Xは酵素、蛍光色素分子、発色団、タンパク質、プロ酵素、化学発光物質および放射性同位体からなる群から選択される標識物質を含む。
【００２１】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、分離成分Zは免疫学的結合物質、磁性結合成分、ペプチド結合成分、親和性結合成分、核酸成分からなる群から選択される。
【００２２】
本発明のさらに他の態様によれば、
一般式:
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、基質がアミノ酸配列を含み、ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
XまたはZがマーカー、検出可能な成分および/または切断された組成物と切断されていない組成物を適切な方法で分離することができる分離成分のいずれかを含み、
X-Y-Zがウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物を提供する。
【００２３】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、マーカー、成分XまたはZは酵素、蛍光色素分子、発色団、タンパク質、化学発光物質、消光物質、FRET対、ビーズ、ペプチド、プレ酵素および放射性同位体、免疫学的結合物質、磁性結合成分、ペプチド結合成分、親和性結合成分、核酸成分からなる群から選択される標識物質を含む。
【００２４】
本発明の他の態様によれば、サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出するための方法であって、
(a)基質を切断することができる条件下で少なくとも1つの組成物とサンプルを接触させる段階と、
(b)基質の切断をモニタリングする段階を含み、基質の切断がサンプル中の少なくとも1種のウイルスの存在を示す方法を提供する。
【００２５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、段階(a)は異なるウイルスプロテアーゼの少なくとも2つの基質とサンプルを接触させる段階を含み、少なくとも2つの基質のいずれかの切断の不在はそのサンプル由来のウイルスの不在を示す。
【００２６】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、サンプルは粘液、唾液、咽頭洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支洗浄液、膣液、涙液および生検組織からなる群から選択される。
【００２７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、サンプル中の切断活性の検出は医学的状態の診断である。
【００２８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ホモジニアスアッセイを使用してモニタリングを実施する。
【００２９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ヘテロジニアスアッセイを使用してモニタリングを実施する。
【００３０】
本発明のさらに他の態様によれば、サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出するための診断キットであって、少なくとも1つの組成物、および基質の切断を検出するための試薬を含むキットを提供する。
【００３１】
本発明のさらに他の態様によれば、
複数のウイルスの存在を検出するためのパッケージング材料および複数の組成物を含む診断キットであって、組成物のそれぞれが、一般式、
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
XまたはZがマーカー、検出可能な成分および/または切断された組成物と切断されていない組成物を適切な方法で分離することができる分離成分のいずれかを含み、
X-Y-Zがウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成せず、
XまたはZのそれぞれが少なくとも1つの明確に検出可能な成分を含み、パッケージング材料が、キットがサンプル中の複数のウイルスの検出用であることを示す標識またはパッケージ挿入体を含む、診断キットを提供する。
【００３２】
本発明の他の態様によれば、
複数のウイルスの存在を検出するためのパッケージング材料および複数の組成物を含む診断キットであって、組成物のそれぞれが、一般式、
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成せず、
Xのそれぞれは明確に検出可能することが可能であり、パッケージング材料が、キットがサンプル中の複数のウイルスの検出用であることを示す標識またはパッケージ挿入体を含む、診断キットを提供する。
【００３３】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、複数の組成物が1つの固体支持体に結合している。
【００３４】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、示差的な検出は1つの固体支持体上のアドレス可能な位置で実施する。
【００３５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、示差的な検出は異なる検出可能な成分によって実施する。
【００３６】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、複数の組成物のそれぞれが固体支持体に結合している。
【００３７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、固体支持体はビーズとして形成される。
【００３８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ビーズは着色ビーズ、磁気ビーズ、タグビーズおよび蛍光ビーズからなる群から選択される。
【００３９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、コロナウイルス、SARSウイルス、HMPV(ヒトメタ肺炎ウイルス)、インフルエンザA+Bウイルス、鳥インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSV(呼吸器合胞体ウイルス)、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む呼吸器用キットである。
【００４０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ハンタウイルスおよびラクロス脳炎ウイルスを含む呼吸器用キットである。
【００４１】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ロタウイルス、アデノ40/41ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、カルシウイルスおよびCMV(サイトメガロウイルス)からなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む胃腸用キットである。
【００４２】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、診断キットは、エンテロウイルス(1〜約80)、西ナイルウイルス、単純疱疹ウイルス1、2、および6からなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む髄膜炎用キットである。
【００４３】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、診断キットは、トガウイルス、フラビウイルスおよび狂犬病ウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む髄膜炎用キットである。
【００４４】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、診断キットは、HIV系統ウイルス、単純疱疹ウイルス1、単純疱疹ウイルス2、HSV-1ウイルス、HSV-2ウイルス、HPV(ヒトパピローマウイルス)、およびHTLV-1ウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む性感染症用キットである。
【００４５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、診断キットは、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVウイルス、ヘルペスウイルス1および2からなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む旅行者用キットである。
【００４６】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、診断キットは、狂犬病ウイルスおよびジステンパーウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む獣医用キットである。
【００４７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、少なくとも1つのサンプルが複数のサンプルを含む。
【００４８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、少なくとも1種のウイルスが複数のウイルスを含む。
【００４９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはアデノウイルスであり、基質は配列番号1または2を含む。
【００５０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはアルファウイルスであり、基質は配列番号3を含む。
【００５１】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスは風疹ウイルスであり、基質は配列番号4を含む。
【００５２】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはHIVウイルスであり、基質は配列番号5を含む。
【００５３】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはHTLVウイルスであり、基質は配列番号6、7または8を含む。
【００５４】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはアルテリウイルスであり、基質は配列番号9を含む。
【００５５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはコロナウイルスであり、基質は配列番号10を含む。
【００５６】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはSARSコロナウイルスであり、基質が配列番号11または12を含む。
【００５７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはトロウイルス属のウイルスであり、基質は配列番号13を含む。
【００５８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはCMVウイルスであり、基質が配列番号14、または15を含む。
【００５９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはヘルペスウイルスであり、基質は配列番号16を含む。
【００６０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはフラビウイルス属のウイルスであり、基質は配列番号17を含む。
【００６１】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはデング熱ウイルスであり、基質は配列番号18、19または20を含む。
【００６２】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスは西ナイルウイルスであり、基質は配列番号21、22または23を含む。
【００６３】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスは黄熱ウイルスであり、基質は配列番号24、25または26を含む。
【００６４】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスは日本脳炎ウイルスであり、基質は配列番号27、28または29を含む。
【００６５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはダニ媒介性ウイルスであり、基質は配列番号30、31または32を含む。
【００６６】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはC型肝炎ウイルスであり、基質は配列番号33、34または35を含む。
【００６７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはペスチウイルスであり、基質は配列番号36を含む。
【００６８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはA型肝炎ウイルスであり、基質は配列番号37または38を含む。
【００６９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはHRVウイルスであり、基質は配列番号39または40を含む。
【００７０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはエンテロウイルスであり、基質は配列番号41、42、43、44、45、46または47を含む。
【００７１】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはHRVウイルスであり、基質は配列番号143〜151を含む。
【００７２】
本発明のさらに他の態様によれば、ウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するための方法であって、
(a)少なくとも1種のウイルス系統のポリプロテインの複数の切断配列の中で、プロテアーゼによる最も迅速な切断速度論を示す切断配列を同定する段階と、
(b)最も迅速な切断速度論を示しウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するのに有用である、科全体の共通の切断配列を同定する段階とを含む方法を提供する。
【００７３】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスのプロテアーゼは、ウイルスがコードするプロテアーゼである。
【００７４】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはDNAウイルスおよびRNAウイルスからなる群から選択される。
【００７５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスはテクティウイルス科、パポバウイルス科、シルコウイルス科、パルボウイルス科、およびヘパドナウイルス科、シストウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、カルシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポチウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科およびブニヤウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科からなる群から選択される。
【００７６】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、ウイルスプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、3Cプロテイナーゼ、PAトランスクリプターゼ、アデニンプロテアーゼ、2Aプロテアーゼ、キモトリプシンまたはトリプシン、例えば:NS3、NS2、NS-プロシステインプロテアーゼ、nsP2システインプロテアーゼ、nsP23プロ、Cタンパク質プロテアーゼ、SFVNS、HIVアスパラギン酸プロテアーゼ、nsp4アルテリウイルスプロテアーゼ、HCMVプロテアーゼ、NS2-3、NS3-4Apプロテアーゼ、HTLV-1PRからなる群から選択される。
【００７７】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、方法は
(c)科全体の共通の切断配列を有する複数の切断配列を設計する段階と、
(d)複数の切断配列の中で、プロテアーゼによる最も迅速な切断速度論を有する切断配列を同定する段階をさらに含む。
【００７８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、設計は最適な溶解性、温度感受性および/またはpH感受性を有する切断配列を設計する段階を含む。
【００７９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、段階(a)の同定は経験的実験を含む。
【００８０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態中の他の特徴によれば、段階(a)の同定はデータマイニングを含む。
【００８１】
本発明のさらに他の態様によれば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えず、かつ各ウイルスプロテアーゼの活性を阻害するための模倣体を含む単離ペプチドを提供する。
【００８２】
本発明のさらに他の態様によれば、ウイルス感染を治療すると認められる医薬品を製造するための、ペプチドの使用を提供する。
【００８３】
本発明のさらに他の態様によれば、単離ペプチドを活性成分として含む医薬組成物を提供する。
【００８４】
本発明は、ウイルスを検出するための組成物および方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点を首尾良く処理する。
【００８５】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または均等の方法および物質を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、適当な方法および物質を以下に記載することとする。論争の場合、これらの定義を含む本特許明細書を照査する。さらに、物質、方法、および実施例は単なる例示的なものであり、制限することを目的とするものではない。
【００８６】
添付の図面を参照し、単なる実施例によって、本発明を本明細書に記載する。ここで図面を詳細に具体的に参照すると、示した個々の事項は実施例によるものであり、本発明の好ましい実施形態は単に例示的に論じる目的のものであって、本発明の原理および概念態様の最も有用であり容易に理解される記載事項であると考えられることを提供するために示すことが強調される。この点に関して、本発明の基本的理解に関して必要とされるよりも詳細に本発明の構造的詳細を示すための試みはなされておらず、図面を参照した記載事項によって、本発明の幾つかの形体を実際にどのように具体化するかについては、当業者に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
本発明は、ウイルスを検出するための組成物および組成物を使用する方法である。
【００８８】
図面および添付の記載事項を参照することによって、本発明の原理および操作をさらに良く理解することができる。
【００８９】
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその適用例が、以下の記載中に述べるかあるいは実施例により例示される詳細に限られないことを理解されたい。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実践または実施することができる。さらに、本明細書で使用する語法および述語は記載目的であり、制限的なものとしてみなすべきではないことを理解されたい。
【００９０】
急性感染を検出するための診断アッセイの範囲は、抗体検出から病原体検出まで、臨床検査室ベースからポイントオブケアベースまで、1つの検体検出から多数の検体検出まですぐに変わっていき、生物サンプル収集のための低侵襲性の手法を使用する検出により焦点を合わせている。新たなアッセイは典型的には従来のアッセイより感度が良く、病原体または病原体に対する宿主の応答性を特徴付けるより多くの情報を提供する能力を有する。公衆衛生の観点から、特有の遺伝子配列または抗原性に基づく病原体の追跡を可能にする分子疫学の出現によって、疫学者の流行の調査および評価の仕方ならびに流行病の判断の仕方に大変革が起こっている。さらに、ポイントオブケア(POC)デバイスの使用は感染の検出および監視に影響を与えることができ、病気の原因を正確に確認する我々の能力を向上させるはずである。
【００９１】
ウイルスの酵素活性の同定によるウイルスの検出は、Dorit Aradへの特許文献４および特許文献６中などで以前に示唆されている。酵素活性に基づくこのような診断アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの分子アッセイよりはるかに優れている。これは、後者は厄介であり、実施するのに数時間かかり、コストが高いからである。さらに、現在利用可能なPCR法は40%の偽陽性および陰性の結果を与え(それらは不活性ウイルスも同定するので)、方法は無効かつ危険なものとなる。一般に、生存サンプル中のウイルスプロテアーゼの検出は、身体中の生存および活性ウイルスの感染の存在を示す。これは、生存ウイルスとは無関係であるDNAまたはRNA配列を検出することができるPCR分析、およびウイルスに対する身体の免疫反応性の存在を測定する抗体検出アッセイと非常に対照的である。逆に、ウイルス抗原を検出する抗体アッセイは、ウイルス抗原が、一疾患のライフサイクル中でさえ特異的抗体に変化および突然変異するので、生存ウイルスの存在を常に示すわけではない。
【００９２】
本発明を設計するにあたり、本発明者らは、プロテアーゼ酵素活性アッセイの最適基質(すなわち、プロテアーゼ本来の基質)は、その切断速度論が最も迅速であるポリプロテインの共通切断部位に存在すると仮定した。この配列に適合する基質は、同じプロテアーゼを共有する可能な限り多くのウイルスを迅速かつ広範囲で同定するための、酵素診断試験において不定的に使用することができる。
【００９３】
本明細書で以下に示すように(およびC型肝炎NS3プロテアーゼに関して実施例1中に詳細に例示するように)、本発明者らは、多数のウイルス科(すなわち、DNAおよびRNAウイルス、実施例2参照)のこのような速度論的に最適な基質を同定した。このように同定したHRVおよびエンテロウイルスの基質は、鼻および脳脊髄液(CSF)サンプル中のそれぞれのウイルスを首尾良く検出するために使用し、RT-PCR分析と比較した(実施例4および5参照)。しかしながら、前述のように、RT-PCR検出の精度は疑わしく、一方、本明細書で上述したように、本発明のプロテアーゼ検出はRT-PCRによる検出に優る明確な利点を有する。
【００９４】
したがって、本発明の一態様によれば、ウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するための方法を提供する。
【００９５】
本明細書で使用する語句「速度論的に最適な基質」は、プロテアーゼにより最も迅速に切断される本来の切断部位に対応する保存的アミノ酸配列を指す(K(1M)、k(cat)およびk(cat)/K(m)によって定義される、酵素はミハエリス-メンテンの速度論に従うと仮定する)。
【００９６】
基質はアミノ酸基質(すなわち、アミノ酸配列を含む)またはその模倣体であってよい。
【００９７】
本明細書で使用する語句「ウイルスのプロテアーゼ」は、ウイルスにコードされるプロテアーゼを指す(プロテアーゼの例は以下に与える)。ウイルスはタンパク質分解酵素を発現する任意のウイルスであってよい(宿主プロテアーゼの切断特異性は示さないことが好ましい)。
【００９８】
本発明のこの態様の方法は、(a)少なくとも1種のウイルス系統のポリプロテインの複数の切断配列(例えば図11参照)の中で、プロテアーゼによる最も迅速な切断速度論を示す切断配列を同定する段階と、(b)最も迅速な切断速度論を示しウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するのに有用である、科全体の共通の切断配列を同定する段階によって実施する。
【００９９】
経験による速度論の特徴付けは、組換えまたは合成法を使用する可溶性、蛍光基質の調製を典型的に含む、当技術分野で知られている任意の方法(例えばHPLC系アッセイ)を使用して実施することができる。あるいは、ペプチド基質の細胞ライブラリーを使用することができる[例えば、非特許文献５を参照]。参照によりその中身が組み込まれている、非特許文献６も参照。
【０１００】
以下に続く実施例項の実施例1中に詳細に記載するように、代替的あるいは追加的に文献によるデータマイニングを、最も迅速な切断速度論を示す切断配列を明らかにするために利用することができる。
【０１０１】
ひとたび最も迅速な切断速度論を示す切断配列を入手した後、最も迅速な切断速度論を示す科全体の共通の切断配列を同定する。
【０１０２】
本明細書で使用する「科全体の共通の」は、同じウイルス科に属するポリプロテインの最も迅速な切断速度論の配列に対応する一直線上の配列の各位置に、最も一般的に存在するアミノ酸を指す。
【０１０３】
これは、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool、非特許文献７を介して入手可能)またはSmith-Watermanアルゴリズム(以下に続く実施例項の実施例1を参照)などの配列アラインメントアルゴリズムを利用する、一般的なバイオインフォマティクスツールを使用することによって行われる。
【０１０４】
ひとたび科全体の共通の配列を同定すると、この共通の配列を含むペプチドを設計することができ、それらの配列を必要な場合適合させて、当該の生化学的性質を示すことができる。例には最適な溶解性、温度安定性およびpH安定性がある。これらのペプチドは、本発明の基質として考えられる。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、原型ペプチド(分解生成物、合成により合成したペプチドまたは組換えペプチドのいずれか)およびペプチド模倣体(典型的には、合成により合成したペプチド)、ならびにペプチド類似体であり、例えば身体中でペプチドをより安定な状態にしながら細胞中に透過することができる修飾を有し得る、ペプトイドおよびセミペプトイドを含む。このような修飾には、CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S-C-NH、CH=CHまたはCF=CHだけには限られないがこれらを含めたN末端修飾、C末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾、および残基修飾があるが、これらだけには限られない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法は当技術分野でよく知られており、例えば参照によりその中身が完全に述べるが如く本明細書に組み込まれている非特許文献８中で詳述されている。この点における他の詳細については、本明細書で以下に与える。
【０１０６】
ペプチド内のペプチド結合(-CO-NH-)は、例えばN-メチル化結合(-N(CH3)-CO-)、エステル結合(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、ケトメチレン結合(-CO-CH2-)、α-aza結合(-NH-N(R)-CO-)によって置換することができ、この場合Rは任意のアルキル、例えばメチル、カルバ結合(-CH2-NH-)、ヒドロキシエチレン結合(-CH(OH)-CH2-)、チオアミド結合(-CS-NH-)、オレフィン二重結合(-CH=CH-)、レトロアアミド結合(-NH-CO-)、ペプチド誘導体(-N(R)-CH2-CO-)であり、かつRは炭素原子上に本来存在する「通常の」側鎖である。
【０１０７】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った任意の結合に、さらに同時に数箇所(2〜3箇所)に存在してよい。
【０１０８】
天然芳香族アミノ酸、Trp、TyrおよびPheは、フェニルグリシン、Tic、ナフチルアラニン(Nal)、フェニルイソセリン、スレオニノール、Pheの環状メチル化誘導体、Pheまたはo-メチル-Tyrのハロゲン化誘導体などの合成非天然アミノ酸に置換することができる。
【０１０９】
前述のアミノ酸以外に、本発明のペプチドは1つまたは複数の修飾アミノ酸あるいは1つまたは複数の非アミノ酸モノマー(例えば脂肪酸、複雑な炭水化物など)も含むことができる。
【０１１０】
本明細書で使用するように、本明細書中および以下の特許請求の範囲中では、用語「アミノ酸」または「アミノ酸(複数)」は、20個の天然に存在するアミノ酸;例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホスレオニンを含めたin vivoで翻訳後修飾されることが多いアミノ酸;および2-アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンだけには限られないがこれらを含めた他の異常アミノ酸を含むと理解されたい。さらに用語「アミノ酸」は、D-アミノ酸とL-アミノ酸の両方を含む。
【０１１１】
以下の表1および2は、本発明と共に使用することができる、天然に存在するアミノ酸(表1)および非従来型または修飾アミノ酸(例えば合成、表2)を列挙する。
【０１１２】
【表１】
2009507823.tif 000002
【０１１３】
【表２】
2009507823.tif 000003
2009507823.tif 000004
2009507823.tif 000005
2009507823.tif 000006
【０１１４】
本発明のペプチドは、ペプチドが可溶形であることを必要とする臨床試験において使用することが好ましいので、本発明のペプチドは、そのヒドロキシ含有側鎖によりペプチドの溶解性を増大することができるセリンおよびスレオニンだけには限られないが、これらを含めた1つまたは複数の非天然または天然極性アミノ酸を含むことが好ましい。
【０１１５】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野の当業者に知られている任意の技法によって合成することができる。固相ペプチド合成に関しては、非特許文献９および非特許文献１０中で、多くの技法の要約を見ることができる。古典的な溶液合成の総説に関しては、非特許文献１１を参照。
【０１１６】
一般にペプチド合成法は、1つまたは複数のアミノ酸あるいは適切に保護されたアミノ酸を、増大するペプチド鎖に連続的に加えることを含む。通常、第一アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護されている。したがって保護または修飾アミノ酸は、アミド結合を形成するのに適した条件下で適切に保護された相補的な(アミノまたはカルボキシル)基を有する配列中の次のアミノ酸を加えることによって、不活性固体支持体と結合させることができるか、あるいは溶液中で使用することができる。次いで保護基をこの新たに加えられたアミノ酸残基から除去し、(適切に保護された)次のアミノ酸を次いで加えるなどする。慣習的に、このプロセスは洗浄段階も伴う。全ての望ましいアミノ酸が適切な配列において結合した後、任意の残りの保護基(および任意の固体支持体)を連続的または同時に除去して、最終的なペプチド化合物を得る。この一般的な手順をわずかに改変することによって、例えば(キラル中心をラセミ化しない条件下で)保護トリペプチドと適切に保護されたジペプチドを結合させて、脱保護後にペンタペプチドを形成することなどによって、同時に2個以上のアミノ酸を増大する鎖に加えることができる。
【０１１７】
ペプチド合成の他の記載は、特許文献７中に開示されている。本発明のペプチド化合物を調製する好ましい方法は、固体支持体を使用する固相ペプチド合成を含む。大規模なペプチド合成については、非特許文献１２に記載されている。
【０１１８】
前述の教示を用いて、任意のウイルスの検出用に最終的に使用することができ、したがって無数の研究および臨床用途において使用することができる基質を同定することができる。
【０１１９】
本発明の教示に従い同定される最適基質の例は、以下の実施例項の実施例2中に与える(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47)。
【０１２０】
本発明の教示に従い同定される好ましいペプチドは、20を超えない、好ましくは19、好ましくは18、好ましくは17、好ましくは16、好ましくは15、好ましくは14、好ましくは13、好ましくは12、好ましくは11、好ましくは10、好ましくは9、好ましくは8、好ましくは7、好ましくは6、好ましくは5、好ましくは4、好ましくは3アミノ酸長で設計される。
【０１２１】
本発明は、特許文献６において開示および特許請求された任意のペプチドを含むことは意図せず、それらのペプチドは本発明から明らかに除かれ、任意の既知のペプチドが本明細書に開示する原理に従うものである。
【０１２２】
本発明のペプチドは組成物中に含めることができ、組成物は切断を検出するための手段(このような手段は本明細書で以下にさらに記載する、例えば検出可能な成分(本明細書ではシグナル成分および消光物質成分とも呼ぶ)ならびに分離成分をさらに含む。
【０１２３】
したがって、本発明の他の態様によれば、サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出する方法を提供する。
【０１２４】
本発明のこの態様によって検出することができるウイルスは、(宿主細胞によって発現されない)その切断活性が検出の基盤として働き得るプロテアーゼを含むウイルスである。本発明のこの態様によってその活性を検出することができるプロテアーゼの非制限的な一覧には、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、3Cプロテイナーゼ、PAトランスクリプターゼ、アデニンプロテアーゼ、2Aプロテアーゼ、キモトリプシンまたはトリプシン、例えば:NS3、NS2、NS-プロシステインプロテアーゼ、nsP2システインプロテアーゼ、nsP23プロ、Cタンパク質プロテアーゼ、SFVNS、HIVアスパラギン酸プロテアーゼ、nsp4アルテリウイルスプロテアーゼ、HCMVプロテアーゼ、NS2-3、NS3-4Apプロテアーゼ、HTLV-1PRが含まれるがこれらだけには限られない。
【０１２５】
本発明のこの態様によって検出することができるウイルスの非制限的な一覧は、以下の実施例項の実施例2中に与える。
【０１２６】
本明細書で使用する用語「検出すること」は、ウイルスの存在を同定すること、ウイルスを分類すること、およびウイルスと関係がある医学状態を診断することを指す。
【０１２７】
本明細書で使用する用語「診断すること」は、医学状態を分類すること、このような疾患の重度を決定すること、疾患の進行をモニタリングすること、疾患および/または回復の見通しの結果を予想することを指す。
【０１２８】
したがって、アデノウイルスを検出するために、基質は配列番号1または2を含むことができる。
【０１２９】
アルファウイルスを検出するために、基質は配列番号3を含む。
【０１３０】
風疹ウイルスを検出するために、基質は配列番号4を含む。
【０１３１】
HIVウイルスを検出するために、基質は配列番号5を含む。
【０１３２】
HTLVウイルスを検出するために、基質は配列番号6、7または8を含む。
【０１３３】
アルテリウイルスを検出するために、基質は配列番号9を含む。
【０１３４】
コロナウイルスを検出するために、基質は配列番号10を含む。
【０１３５】
SARSコロナウイルスを検出するために、基質は配列番号11または12を含む。
【０１３６】
トロウイルス属のウイルスを検出するために、基質は配列番号13を含む。
【０１３７】
CMVウイルスを検出するために、基質は配列番号14または15を含む。
【０１３８】
ヘルペスウイルスを検出するために、基質は配列番号16を含む。
【０１３９】
フラビウイルス属のウイルスを検出するために、基質は配列番号17を含む。
【０１４０】
デング熱ウイルスを検出するために、基質は配列番号18、19または20を含む。
【０１４１】
西ナイルウイルスを検出するために、基質は配列番号21、22または23を含む。
【０１４２】
黄熱ウイルスを検出するために、基質は配列番号24、25または26を含む。
【０１４３】
日本脳炎ウイルスを検出するために、基質は配列番号27、28または29を含む。
【０１４４】
ダニ媒介性ウイルスを検出するために、基質は配列番号30、31または32を含む。
【０１４５】
C型肝炎ウイルスを検出するために、基質は配列番号33、34または35を含む。
【０１４６】
ペスチウイルスを検出するために、基質は配列番号36を含む。
【０１４７】
A型肝炎ウイルスを検出するために、基質は配列番号37または38を含む。
【０１４８】
HRVウイルスを検出するために、基質は配列番号39または40を含む。
【０１４９】
エンテロウイルスを検出するために、基質は配列番号41、42、43、44、45、46または47を含む。
【０１５０】
異なるウイルスが類似のアミノ酸配列を有する場合、1つのプロテアーゼはこれらのウイルスのポリプロテインを切断することができることは理解される。したがって、本発明はこの特異性を利用して、1種のウイルス型または2つ以上のウイルス型に特異的な検出法を与える。以下の本明細書ならびに以下の実施例3および6中にさらに記載する一実施形態である、非同一科関連ウイルス、同じ症状を引き起こすウイルスなどを同定するために(多数のウイルスの検出)、本発明の方法を設計することもできることが、さらに理解されるはずである。
【０１５１】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、ウイルスを含むかウイルスの複製を許容する可能性がある任意の生物サンプル(例えば、組織培養サンプルまたは体液/組織サンプル)を指す。好ましくは生物サンプルは、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、呼吸器(例えば、鼻洗浄液サンプル)、腸、および尿生殖器官の様々な外分泌液、涙、唾液、精液、汗、糞便、および乳などの体液、ならびに血液細胞、悪性組織、羊水、および絨毛膜絨毛を指す。
【０１５２】
本発明のこの態様の方法は、前記基質を切断することができる条件下で本明細書に記載する基質のいずれかとサンプルを接触させること、および前記基質の切断をモニタリングすることによって実施し、前記基質の切断は前記サンプル中の前記少なくとも1種のウイルスの存在を示す。
【０１５３】
タンパク質分解基質の切断をモニタリングするための、当技術分野で知られている任意のアッセイを、本発明のこの態様に従い使用することができる。
【０１５４】
基質切断配列は、例えば、少なくとも1つの検出可能な成分を検出するための手段をさらに与える組成物中に含まれることが好ましい。本明細書にその全体が参照されるDorit Aradの特許文献６中に、例が記載されている。
【０１５５】
本明細書で使用する検出可能な成分は、直接検出することができる(例えば蛍光物質、放射性同位体)あるいは間接的に検出(視覚化、計数など)することができる(例えばプレ酵素)任意の分子を指す。
【０１５６】
したがってタンパク質分解切断のモニタリングは、ウイルスを検出するためのホモジニアスアッセイによって実施することができる。選択した基質を合成し、切断領域の片側でシグナル成分と、および切断領域の反対側で消光物質成分と結合させる。(検出の形態に応じて)必要とされる全ての成分を、切断配列の一端に置くことができることは理解される。
【０１５７】
本明細書で使用する語句「ホモジニアスアッセイ」は、他のアッセイ要素からのシグナル成分の分離を必要としないアッセイを指す。
【０１５８】
本発明の目的のため「消光物質成分」は、シグナル成分によって放射されたシグナルを低下させるあるいは除去することができる任意の物質である。例えば消光物質成分は、シグナル成分によって放射されたシグナルを吸収することによって、あるいはエネルギー伝達機構によって働くことができる。シグナル成分と消光物質成分の間の距離は、シグナル成分と消光物質成分の分離をもたらす位置で基質が切断されない限りは、消光物質成分の存在がシグナル成分から放射されたシグナルを実質的に低下させるあるいは除去するような距離である。
【０１５９】
一実施形態では、シグナル成分と消光物質成分とを3個又は５個を超えないアミノ酸残基隔てる。他の実施形態では、シグナル成分と消光物質成分とを10個を超えないアミノ酸残基隔てる。さらに他の実施形態では、シグナル成分と消光物質成分とを15個を超えないアミノ酸残基隔てる。さらに他の実施形態では、シグナル成分と消光物質成分とを20個を超えないアミノ酸残基隔てる。本明細書で以下にさらに記載する成分などの(例えば、ヘテロジニアスアッセイにおいても)検出用の手段として使用される他の成分は、これらのガイドラインに従い結合させることができる。さらに、任意の検出手段(例えば成分)を連続的に、あるいはペプチド切断配列自体のアミノ酸のいずれか1つに対するアミノ酸修飾によって、基質と直接的あるいは間接的に結合させることができることは理解される。
【０１６０】
組成物は、ウイルスの存在を試験するためにサンプルと接触させる。ウイルスがサンプル中に存在する場合、ウイルスプロテアーゼも存在する。このプロテアーゼは基質を切断し、シグナル成分からのシグナルの変化を観察することができる。このような相同的蛍光および比色定量アッセイは当業者に知られている。例えば、非特許文献１３、および非特許文献１４を参照。
【０１６１】
本発明の他の実施形態では、シグナル成分は化学発光シグナル成分である。化学発光シグナル成分は基質の切断領域の片側と結合し、蛍光を受容する消光物質成分は切断領域の反対側で結合する。参照によりその内容が組み込まれている特許文献８は、シグナル成分としての化学発光性1,2-ジオキセタン化合物の使用を含むような検出システムを記載している。ウイルスプロテアーゼがサンプル中に存在しない場合、基質の切断は起こらない。1,2-ジオキセタンの分解からのエネルギーは蛍光受容成分に移動し、1,2-ジオキセタンの発光スペクトルと異なる波長で放出される。基質が切断される場合、蛍光受容成分が1,2-ジオキセタンから分離され、ジオキセタン化合物からの化学発光の放出が観察される。
【０１６２】
他の実施形態では、シグナル成分は蛍光化合物であり、消光物質成分は、シグナル成分の発光スペクトルと重複する励起スペクトルを有する蛍光化合物である。ここで、この二成分は蛍光共鳴エネルギー移動と一致した距離で別々に分離し、したがって蛍光成分は、共鳴エネルギーのドナーとして作用することができる。
【０１６３】
他の実施形態では、非蛍光吸収色素などの消光群を、蛍光を受容する消光物質成分の代わりに使用する。適切な消光群は、参照によりその内容が組み込まれている特許文献８に記載されている。
【０１６４】
このような検出法を使用して、サンプル中にウイルスが存在する場合プロテアーゼにより基質を切断することができる条件下において、基質と試験サンプルを接触させる。一実施形態では、温度を制御する。例えば、温度を37℃に制御して、酵素反応に最適な条件を与えることができる。切断された基質断片からのシグナルを、使用する標識に適した検出デバイスを使用して次いで検出する。
【０１６５】
本発明の他の実施形態は、ウイルスを検出するためのヘテロジニアスアッセイを提供する。「ヘテロジニアスアッセイ」は、アッセイ中に他のアッセイ要素から固相を分離するアッセイである。ヘテロジニアスアッセイの全体的な記載および実施例は、以下の実施例項の実施例6中に与える。
【０１６６】
この場合基質は、
以下の一般式:
X-Y-Zを有し得る組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物中に含まれる。
【０１６７】
検出可能な成分Xは直接的または間接的に検出することができ、酵素、蛍光色素分子、発色団、タンパク質(例えば、エピトープタグ)、化学発光物質および放射性同位体などの標識物質を含むことができる。
【０１６８】
分離成分Zは、二相分離系の分離相(例えば、固相および液相)と直接的または間接的に結合することができる。分離成分Zの例には、免疫学的結合物質、磁性結合成分、ペプチド結合成分、親和性結合成分、核酸成分がある。他の例は、以下の実施例6中に与える。
【０１６９】
本発明の組成物は、サンプルとのインキュベーション前、それと同時あるいはその後に、分離系によってインキュベートすることができる。
【０１７０】
本発明のヘテロジニアスアッセイを使用する切断のモニタリングは、図7〜10中に図式的に示す実施例6のいずれかの実施形態を使用して実施することができる。
【０１７１】
検出可能な成分が分離成分と結合しない、対策を講じなければならない。
【０１７２】
一実施形態では、本発明の検出可能な成分はプレ酵素である。したがって基質の切断によって、(酵素の触媒活性の検出によって)酵素を活性化させ検出することができる。このようなプレ酵素の一例は、プロトロンビン(因子II)またはこのカスケード中の他の酵素である。
【０１７３】
本明細書に記載する任意の実施形態において、任意の成分を共有結合によって直接、あるいは各末端に結合官能基を有するスペーサー分子によって間接的にペプチドと結合させることができる。このようなリンカーの例には、アルキル、グリコール、エーテル、ポリエーテル、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド分子がある。
【０１７４】
ヘテロジニアスアッセイにおいて使用するのに適した固相には、試験管、マイクロタイタープレート、マイクロタイターウエル、ビーズ、ディップスティック、ポリマーマイクロ粒子、磁性マイクロ粒子、ニトロセルロース、チップアレイ、および当業者が熟知している他の固相があるが、これらだけには限られない。ヘテロジニアスアッセイにおいて使用するシグナル成分は、当業者に知られている任意の標識であってよい。このような標識には放射活性、熱量測定、蛍光および発光標識がある。
【０１７５】
プロテアーゼを検出するための異種間化学発光アッセイは、参照によりその内容が組み込まれている特許文献８中に記載されている。一実施形態では、本発明の同種間またはヘテロジニアスアッセイ法を、試験下でウイルス性疾患に感染していると考えられる対象に曝される医療スタッフを必要とせずに、結果を得ることができるように自動化する。例えば、(3型ルームだけに限られるものではないが)クリーンルーム内で対象を試験することができる。対象は入室前に診断キットをピックアップ、または入手することができ、診断キットは前に論じた型の標識ペプチドでコーティングした固相を含み得る。例えば、固相はペプチドを事前に浸した組織、または妊娠検査に使用する型由来の試験用スティックであってよい。事前に調製した固相上の場所において、対象は唾液サンプルなどのサンプルを供給し得る。
【０１７６】
したがってサンプルを含む固相をインキュベートして、酵素反応を起こすことができる。一実施形態では、反応温度を37℃に制御して酵素反応に最適な条件を与える。インキュベーション終了時に、リモートコントロール、または部屋の外から手動で操作する機械システムを使用して、分光光度計において試験するサンプルを測定することができる。定性の色またはUV検出に関して、サンプルを試験することができる。試験後は、サンプルを処分する自動システム、または遠隔操作ハンドルによって、サンプルを廃棄することができる。
【０１７７】
一度に幾つかのウイルスの存在を検出するために(特定の症状または特定の宿主と関係があるウイルスの検出などのために、例えば実施例3参照)、多数のウイルスを検出するのに適した当技術分野で知られている任意の方法または前に記載した方法を使用することができる。
【０１７８】
以下に、このような手段の非網羅的な例を与える。
【０１７９】
マイクロプレート-Xウエルプレート中。それぞれのウエルは、異なるウイルスに対応する異なる特異的なペプチド配列を含む。臨床サンプルを加えることによって、適切な波長で標準的なマイクロプレートリーダーを使用して反応をモニタリングし、どのウエルが酵素活性を示すかを記録する。それぞれのウエルが1つの特異的なペプチドを含むので、マイクロプレートリーダーによって与えられるデータに従い、どのウイルス酵素が臨床サンプル中に存在するかを解明することができる。酵素の存在によってウイルスの存在を確認する。
【０１８０】
Mediselのチップ技術(非特許文献１５)-Mediselの技術を使用することによって、チップ上に(当該のウイルスに対応する)特異的なペプチドを固定することができる。臨床サンプルを加えることによって、レーザービームを使用して反応をモニタリングする。チップ上のそれぞれの地点が1つの特異的なペプチドを含むので、Mediselのデバイスによって与えられるデータに従い、どのウイルス酵素が臨床サンプル中に存在するかを解明することができる。酵素の存在によってウイルスの存在を確認する。
【０１８１】
カラム上での分離-(当該ウイルスに対応する)特異的なペプチドを、特有のDNAスペーサーを有する市販の供給元からのビーズと結合させることができる。臨床サンプルを加えることによって、反応を実施する。ひとたび(臨床サンプル中で特異的なウイルス酵素による)特異的なペプチドの切断が起これば、消光物質が放出されビーズが蛍光を発する。ビーズは特有のDNAスペーサーとのハイブリダイゼーションによって次いでカラム上で分離され、適切な波長で標準的な蛍光計を使用して、(それぞれの異なるウイルスに対応する)それぞれの型のビーズに関して蛍光を測定する。ウイルス酵素によって切断されたビーズのみが蛍光を発する。したがって、どのウイルス酵素が臨床サンプル中に存在するかを解明することができる。酵素の存在によってウイルスの存在を確認する。
【０１８２】
ビーズFACS分離-カラムのみによる分離と同様に、それぞれの特異的なペプチドが異なる色を有するビーズと結合したとき、FACSによって分離段階を行う。この方法では、スペーサーはDNAまたはペプチドまたはペプチド模倣体または炭水化物または任意の有機成分のスペーサーであってよい（非特許文献１６）。
【０１８３】
本発明により使用することができる他の方法は、その各々が参照により本明細書にその全容が組み込まれる、非特許文献１７;非特許文献１８;非特許文献１９;非特許文献２０; 非特許文献２１;非特許文献２２;非特許文献２３に記載されている。
【０１８４】
本発明の教示によって同定したペプチド切断配列は、新たなウイルス系統を検出するために使用することができる。例えば、(コロナと同様の)元のウイルス科と相同性を示すSARS伝染病の検出などである。これは、流行病を引き起こす新たなウイルスに対する検出法の迅速な適合に頼るものである。
【０１８５】
したがって、ひとたび新生ウイルスのゲノムを同定し、その繁殖システムを知れば、ウイルスプロテアーゼ、およびこのようなプロテアーゼによって切断されるウイルスのポリプロテインの領域を、新生ウイルスの配列と既知のウイルスの配列の間の配列相同性を調べることによって測定することができる。このアラインメントに基づいて、最適な切断配列の選択を実施することができる。
【０１８６】
本発明はペプチドを含むキットも提供するものである。異なるキット要素を別々の容器中にパッケージし、使用の直前に混合することができる。このような要素のパッケージングは、活性要素の機能を消失させずに長期の保存を別々に可能にし得る。2つ以上の要素が同一容器内に見られる実施形態も企図する。代表的なキットは、以下の試薬、ヘテロジニアスアッセイに使用するための洗浄バッファー試薬;基質を切断することができるプロテアーゼを含まない陰性対照試薬;基質を切断することができるプロテアーゼを含む陽性対照;(d)シグナル成分からの検出可能なシグナルを現像するためのシグナル生成試薬;および(d)シリンジ、咽頭スワブ、または他のサンプル回収デバイスなどのサンプル回収手段の、1つまたは複数を含むことができる。
【０１８７】
1つまたは複数のウイルスを本明細書で前に記載したのと同様に検出する、多数のウイルスを検出するキットに関しては、各マルチパネル検出キットは、同一または類似の疾患を引き起こす異なるウイルス、同一組織または器官に感染するウイルス、近い系統関係のウイルス、同一科、亜科などに分類されるウイルスなど、例えば唾液、鼻分泌液、血液、尿、糞便などの同一の体液中で検出することができるウイルス、一般的で広範囲に及ぶウイルス、同一の体液によってさらに蔓延するウイルスなどの共通のテーマに従って設計することが好ましいはずである。
【０１８８】
キット中に含まれる試薬は、異なる要素の寿命が保たれ容器の材料によって吸着または改変されないように、任意の種類の容器内に供給することができる。例えば、密閉状態のガラス製アンプルは、凍結乾燥試薬、または窒素などの中性の無反応ガス下でパッケージしたバッファーを含むことができる。アンプルは、ガラス、例えばポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー;セラミック、金属、または同様の試薬を保持するために典型的に使用される任意の他の材料などの、任意の適切な材料からなっていてよい。適切な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から製造することができる単純なボトル、およびアルミニウムまたは合金などの金属箔で裏打ちされた内部を含み得るエンベロープがある。他の容器には試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどがある。皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有するボトルなどの容器は、滅菌アクセスポートを有することができる。他の容器は、除去時に区画の混合を可能にする容易に除去可能な膜によって隔てられた、2つの区画を有することができる。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴムなどであってよい。
【０１８９】
キットは教示書と共に与えられてもよい。教示書は紙または他の支持体上に印刷することができ、かつ/あるいはフロッピーディスク（登録商標）、CD-ROM、DVD-ROM、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電子可読媒体として与えることができる。詳細な教示書はキットと物理的に結びついていなくてよく、その代わりに、キットの製造者または販売者によって明記される、あるいは電子メールとして与えられる、インターネットのウエブサイトにユーザーを向けることができる。
【０１９０】
本発明はさらに、ウイルスのタンパク質分解活性に干渉し、したがってウイルスの複製および感染性に干渉する治療剤を設計するための、本発明のペプチドの使用を想定する。好ましくは、ペプチド配列を修飾して、プロテアーゼと結合させプロテアーゼの活性を阻害する(例えば、不可逆的阻害剤)。プロテアーゼの認識が保たれる限り、このようなペプチド模倣体を使用して、(本明細書で前に記載したのと同様の)少なくとも1つの非ペプチド結合の取り込みによって、切断配列と非切断配列を置換することができる。
【０１９１】
本発明の治療用ペプチドは、当該のウイルス性疾患の治療用に同定した医薬組成物中に取り込むことができる。
【０１９２】
本発明はさらに、本発明の組成物を使用する抗ウイルス剤のスクリーニングを想定するものである。
【０１９３】
したがって本発明は、治療および診断用途において使用することができるペプチド、ならびにそのペプチドを含む組成物およびキットを提供する。
【０１９４】
本発明の他の目的、利点、および新規な特徴は、制限することを意図しない以下の実施例の実験によって当業者に明らかとなるはずである。さらに、本明細書の前の部分で示し以下の特許請求の範囲で特許請求する、本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれが、以下の実施例中で実験により支持される。
【０１９５】
(実施例)
前述の記載事項と共に本発明を非制限的に例示する以下の実施例を、ここで参照されたい。
【０１９６】
一般に、本明細書で使用する用語および本発明中で使用する実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えDNA技法を含む。このような技法は文献中で詳細に説明されている。例えば、非特許文献２４;非特許文献２５;非特許文献２６;非特許文献２７;非特許文献２８;非特許文献２９; 特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２および特許文献１３中で述べられた方法;非特許文献３０;非特許文献３１;非特許文献３２;非特許文献３３を参照。利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献中に広く記載されている。例えば、いずれも完全に述べるがごとく参照により本明細書に組み込まれる、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８および特許文献２９、非特許文献３４; 非特許文献３５; 非特許文献３６; 非特許文献３７; 非特許文献３８; 非特許文献３９; 非特許文献４０; 非特許文献４１を参照。他の一般的な参考文献は、本明細書を通して与える。本明細書中の手順は当技術分野ではよく知られていると考えられ、読者の便宜上与える。本明細書中に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９７】
(実施例1)
C型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼの共通切断配列の同定
以下に、C型肝炎ウイルスのNS3プロテアーゼに関する最適切断配列の同定を記載する。
【０１９８】
ステージ1:そのウイルスプロテアーゼによるポリプロテインの切断機構、ウイルスのライフサイクル中の実質的に一連の切断事象の誘導(1,4、C型肝炎ウイルス(HCV)から適合させた図11を参照: 非特許文献４２)。
【０１９９】
ステージ2:Swiss prot.、Pubmed、Gene bank and OWLなどのデータベースを使用して、可能な限り多くの同じウイルス系統の切断配列の全てを比較し、FASTAソフトウェアを使用してそれらのアラインメントをとる(以下の表1を参照)。
【０２００】
【表３】
2009507823.tif 000007
2009507823.tif 000008
2009507823.tif 000009
【０２０１】
ステージ3:以下の表2中に列挙した参考文献に従ったデータマイニングによる、置換または速度論的に最適な部位に従った最も迅速な切断配列の誘導。HCVNS3プロテアーゼの場合、その部位はNS5A/B (3,4,5)である。
【０２０２】
【表４】
2009507823.tif 000010
【０２０３】
【表５】
2009507823.tif 000011
【０２０４】
【表６】
2009507823.tif 000012
2009507823.tif 000013
【０２０５】
【表７】
2009507823.tif 000014
【０２０６】
【表８】
2009507823.tif 000015
【０２０７】
【表９】
2009507823.tif 000016
【０２０８】
シス作用性プロテアーゼは、隣接する切断部位のみを切断する。トランス作用性プロテアーゼは、離れた切断部位に作用する。
【０２０９】
シス-
1. P1-スレオニンを有する。
2. P4-無極性の脂肪族側鎖を有する大部分の残基を受容した。
3. P2-帯電残基に対して優先性を示す。
4. プロテアーゼシス-切断部位NS4A/C接合部の特異性は非常に低下し(6)、その切断はポリプロテインのフォールディングにより阻止されることが示される。
【０２１０】
トランス
1. P1-システインは重要であり置換することはできない。
2. P3-バリン、グルタミン酸、スレオニン、およびイソロイシンのみを受容した。GluからAsnまたはLysへの置換は影響を有していなかった。
3. P4-大部分の残基を許容した。
4. P2-ロイシンに対して優先性を示した。GluからAsnまたはLysへの置換は影響を有していなかった。
5. P5-帯電残基を優先した(負に帯電した残基→アスパラギン酸)。
6. P6-酸性残基は重要である。(チロシン)
7. P3-残基は効率の良い基質認識に貢献する(gln)。
8. P4'-残基は効率の良い基質認識に貢献する(疎水性残基→Leu)。
9. P7-PheからHisまたはArgへの置換は影響を有していなかった。
10. P5-GluからLysへの置換は影響を有していなかった。
11. P2'--GlnからLysへの置換は影響を有していなかった。
12. P1'-SerからIle、Thr、Arg、Ala、Asp、またはHisへの置換は効率の良い切断を可能にした。しかしながら、Proに関する置換は切断を著しく阻害した(7)。
13. 効率の良いin vitroでの切断は、P6〜P4'に広がる少なくとも10残基のペプチド基質を必要とする。
【０２１１】
ステージ4:ステージ3からの2つの最も迅速な切断部位および置換によるコンセンサス配列部位の誘導、およびステージ3から得た変数によるステージ4からのコンセンサス配列式の一般化。以下の配列のHCVNS3プロテアーゼに関する組み合わせた全てのデータが得られる。
(T/S/酸性)X(E/T/I/N/K/D/V)(C/F)C-/-X(M/norL)(S/D)(Y/疎水性)(配列番号33)
【０２１２】
(実施例2)
本発明の教示により同定した速度論的に最適な基質
コンセンサス配列の提示において以下の記号を使用した。
疎水性:G、A、V、L、I、M、W、F、Y、H
塩基性:Q、N、K、H、R
HBドナー:K、R、S、C、T、Q、N、Y
酸性:E、D、Y
芳香族:Y、F、H、W
-/-:切断地点
【０２１３】
アデノウイルス科(1〜9):
サル:アデノウイルス25、アデノウイルス24、アデノウイルス23、アデノウイルス22、アデノウイルス21、アデノウイルス19。
ブタ:アデノウイルスC、アデノウイルスB、アデノウイルスA、アデノウイルス5、アデノウイルス4、アデノウイルス3、アデノウイルス2、アデノウイルス1。
ヒツジ:アデノウイルスB、アデノウイルスA、アデノウイルス5、アデノウイルス4、アデノウイルス3、アデノウイルス2、アデノウイルス1。
ネズミ:アデノウイルスA、アデノウイルス1。
ヒト:アデノウイルスF、アデノウイルスE、アデノウイルスD、アデノウイルスC、アデノウイルスB、アデノウイルスA、アデノウイルス9、アデノウイルス8、アデノウイルス7、アデノウイルス6、アデノウイルス51、アデノウイルス50、アデノウイルス5、アデノウイルス49、アデノウイルス48、アデノウイルス47、アデノウイルス46、アデノウイルス45、アデノウイルス44、アデノウイルス43、アデノウイルス42、アデノウイルス41、アデノウイルス40、アデノウイルス4、アデノウイルス39、アデノウイルス38、アデノウイルス37、アデノウイルス36、アデノウイルス35、アデノウイルス34、アデノウイルス33、アデノウイルス32、アデノウイルス31、アデノウイルス30、アデノウイルス3、アデノウイルス29、アデノウイルス28、アデノウイルス27、アデノウイルス26、アデノウイルス25、アデノウイルス24、アデノウイルス23、アデノウイルス22、アデノウイルス21、アデノウイルス20、アデノウイルス2、アデノウイルス19、アデノウイルス18、アデノウイルス17、アデノウイルス16、アデノウイルス15、アデノウイルス14、アデノウイルス13、アデノウイルス12、アデノウイルス11、アデノウイルス10、アデノウイルス1
ウマ:アデノウイルスB、アデノウイルスA、アデノウイルス2、アデノウイルス1
イヌ:アデノウイルス2、アデノウイルス1、アデノウイルス。
ウシ:アデノウイルスC、アデノウイルスB、アデノウイルスA、アデノウイルス9、アデノウイルス3、アデノウイルス2、アデノウイルス10、アデノウイルス1
【０２１４】
【表１０】
2009507823.tif 000017
【０２１５】
トガウイルス科(10〜33)
アルファウイルス:Auraウイルス、Barmah森林熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ミデルブルグウイルス、Ndumuウイルス、Bebaruウイルス、チクングンヤ熱ウイルス、ゲタウイルス、Mayaroウイルス、O'nyong-ニョングウイルス、Ross Riverウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、Unaウイルス、Trocaraウイルス、Cabassouウイルス、Mucamboウイルス、Pixunaウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、フォートモーガンウイルス、Highlands Jウイルス、シンドビスウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、Whataroaウイルス、アルファウイルスHBb17、ノルウェーサーモンアルファウイルス、リオネグロウイルス、Seal louseウイルス。
【０２１６】
【表１１】
2009507823.tif 000018
【０２１７】
ルビウイルス属:風疹ウイルス、風疹ウイルス(系統BRD1)、風疹ウイルス(系統BRDII)、風疹ウイルス(系統Cendehill)、風疹ウイルス(系統M33)、風疹ウイルス(系統RN-UK86)、風疹ウイルス(系統THERIEN)、風疹ウイルス(系統TO-336ワクチン)、風疹ウイルス(系統TO-336)、風疹ウイルス(ワクチン系統RA27/3)。
【０２１８】
【表１２】
2009507823.tif 000019
【０２１９】
レトロウイルス科(34〜60)
オルトレトロウイルス属、レンチウイルス、霊長類レンチウイルス属:
ヒト免疫不全ウイルス1:HIV-1 M:C_92BR025、HIV-1 M:C_ETH2220、HIV-1 M:F1_93BR020、HIV-1 M:F1_VI850、HIV-1 M:F2_MP255C、HIV-1 M:F2_MP257C、HIV-1 M:G_92NG083、HIV-1 M:G_SE6165、HIV-1 M:H_90CF056、HIV-1 M:H_VI991、HIV-1 M:J_SE9173、HIV-1 M:J_SE9280、HIV-1 M:K_96CM-MP535、HIV-1 M:K_97ZR-EQTB11、HIV-1 N_YBF106、HIV-1 N_YBF30、HIV-1 O_ANT70、HIV-1 O_MVP5180、ヒト免疫不全ウイルス3、ヒト免疫不全ウイルス1型(ARV2/SF2分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(BH10分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(BH5分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(BH7分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(BH8分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(BRAIN分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(BRU分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(CDC-451分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(クローン12)、ヒト免疫不全ウイルス1型(ELI分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(HXB2分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(HXB3分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(分離株YU2)、ヒト免疫不全ウイルス1型(JH3分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(JRCSF分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(KB-1分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(Lai分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(MAL分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(MFA分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(MN分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(NDK分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(ニューヨーク-5分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(NIT-A分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(OYI分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(PV22分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(RE/HAT分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(SC分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(SF162分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(SF33分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(STRAIN UGANDAN/分離株U455)、ヒト免疫不全ウイルス1型(WMJ1分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(WMJ2分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(Z-84分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(Z2/CDC-Z34分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(ZAIRE3分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(ZAIRE6分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型(ZAIREHZ321分離株)、ヒト免疫不全ウイルス1型1w12.3分離株。
【０２２０】
ヒト免疫不全ウイルス2型:ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株BEN)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株ROD)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株ST)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株ST/24.1C#2)、HIV-2B_EHO、HIV-2 B_UC1、HIV-2.D205、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株D205,7)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株7312A)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株CAM2)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株D194)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株GHANA-1)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株KR)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株NIH-Z)、ヒト免疫不全ウイルス2型(分離株SBLISY)。
【０２２１】
【表１３】
2009507823.tif 000020
【０２２２】
レトロウイルス科;オルトレトロウイルス属;デルタレトロウイルス属;霊長類Tリンパ球向性ウイルス
ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス1型(カリブ産分離株)、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス1型(分離株MT-2)、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス1型(ATK株)、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス1型(アフリカ産分離株)、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス1型(北アメリカ産分離株)。
【０２２３】
【表１４】
2009507823.tif 000021
【０２２４】
ニドウイルス目:アルテリウイルス科(78〜82)
アルテリウイルス:ウマ動脈炎ウイルスBucyrus、乳酸脱水素酵素上昇ウイルスC、乳酸脱水素酵素上昇ウイルスPlagemann、Lelystadウイルス、PRRSV16244B、PRRSVHB-1(sh)/2002、PRRSVHB-2(sh)/2002、PRRSVHN1、PRRSVVR2332、サル出血熱ウイルス。
【０２２５】
【表１５】
2009507823.tif 000022
【０２２６】
ニドウイルス目:コロナウイルス科(61〜77)
コロナウイルス:イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス229E、ブタ伝染性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、未分類ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスOC43、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、Puffinosisコロナウイルス、ラットコロナウイルス、SARSコロナウイルス、感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、コウモリコロナウイルスChina2005、コウモリコロナウイルス系統61、コウモリコロナウイルスZS-2005、鳥糞中コロナウイルス、ニワトリ腸管コロナウイルス、アヒルコロナウイルス、ガチョウコロナウイルス、ヒトコロナウイルスNO、オウムコロナウイルスAV71/99、ハトコロナウイルス。
【０２２７】
【表１６】
2009507823.tif 000023
【０２２８】
トロウイルス:ウシトロウイルス、ブレダウイルス、ウマトロウイルス、ベルンウイルス、ヒトトロウイルス、ブタトロウイルス、ブタトロウイルス(系統P10)。
【０２２９】
【表１７】
2009507823.tif 000024
【０２３０】
ヘルペスウイルス科(83〜105);
ベータヘルペスウイルス科:サイトメガロウイルス
アカゲザルサイトメガロウイルス系統68-1、ヒトヘルペスウイルス5(系統1042)、ヒトヘルペスウイルス5(系統119)、ヒトヘルペスウイルス5(系統2387)、ヒトヘルペスウイルス5(系統4654)、ヒトヘルペスウイルス5(系統5035)、ヒトヘルペスウイルス5(系統5040)、ヒトヘルペスウイルス5(系統5160)、ヒトヘルペスウイルス5(系統5508)、ヒトヘルペスウイルス系統5AD169、ヒトヘルペスウイルス5系統Eisenhardt、ヒトヘルペスウイルス5系統Merlin、ヒトヘルペスウイルス5系統PT、ヒトヘルペスウイルス5系統Toledo、ヒトヘルペスウイルス5系統Towne、チンパンジーサイトメガロウイルス、Aotineヘルペスウイルス1、ヒヒサイトメガロウイルスOCOM4-37、ercocebus agilisサイトメガロウイルス1、Cercopithecus cephusサイトメガロウイルス1、Colobus badiusサイトメガロウイルス1、Colobus guerezaサイトメガロウイルス1、Crocidura russulaサイトメガロウイルス1、Macaca fascicularisサイトメガロウイルス1、Mandrillusサイトメガロウイルス、Phacochoerus afrieanusサイトメガロウイルス1、Pongo pygmaeusサイトメガロウイルス1、ブタサイトメガロウイルス、サルサイトメガロウイルス。
【０２３１】
【表１８】
2009507823.tif 000025
【０２３２】
アルファヘルペスウイルス:シンプレックスウイルス:
ウシヘルペスウイルス2型(系統BHM-1)、ウシヘルペスウイルス2型(系統BMV)、Cercopithecineヘルペスウイルス1(系統E2490)、Cercopithecineヘルペスウイルス16、Cercopithecineヘルペスウイルス2(SA8)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統17)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統A44)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統Angelotti)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統CL101)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統CVG-2)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統F)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統HFEM)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統HZT)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統MGH-10)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統MP)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統Patton)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統R19)、単純ヘルペスウイルス(1型/系統SC16)、単純ヘルペスウイルス1型系統R-15、ヒトヘルペスウイルス7型系統JI、ヒトヘルペスウイルス1型系統KOS、ヒトヘルペスウイルス2型(単純ヘルペスウイルス2型)、単純ヘルペスウイルス(2型/系統B4327UR)、ヒトヘルペスウイルス2型系統186、ヒトヘルペスウイルス2型系統333、ヒトヘルペスウイルス2型系統G、ヒトヘルペスウイルス2型系統HG52、ヒトヘルペスウイルス2型系統SA8、ヒトヘルペスウイルス2型系統SNO3、ヒトヘルペスウイルス2型系統SS01、ヒトヘルペスウイルス2型系統ST04。
【０２３３】
【表１９】
2009507823.tif 000026
【０２３４】
フラビウイルス科;フラビウイルス(106〜133)
Alfuyウイルス、Alkhurma出血性熱ウイルス、アポイウイルス、Aroaウイルス、Bagazaウイルス、Banziウイルス、Batu Caveウイルス、Boubouiウイルス、ブカラサコウモリウイルス、ブスクアラウイルス、CY1014ウイルス、Cacipacoreウイルス、Carey Islandウイルス、細胞融合物質ウイルス、Cowbone Ridgeウイルス、ダカールコウモリウイルス、シカダニウイルス、デング熱ウイルス、エッジヒルウイルス、エンテベコウモリウイルス、フラビウイルスCbaAr4001、フラビウイルスFSME、フラビウイルス種、Gadgets Gullyウイルス、ギリシャヤギ脳炎ウイルス、Iguapeウイルス、イリェウスウイルス、イスラエル産シチメンチョウ髄膜脊髄脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、Jugraウイルス、Jutiapaウイルス、Kadamウイルス、Kamiti Riverウイルス、Karshiウイルス、Kedougouウイルス、Kokoberaウイルス、Koutangoウイルス、Kumlingeウイルス、Kunjinウイルス、Kyasanur森林病ウイルス、Langatウイルス、Langatウイルス(系統TP21)、Langatウイルス(系統Yelantsev)、跳躍病ウイルス、Meabanウイルス、Modocウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、Naranjalウイルス、ネギシウイルス、Ntayaウイルス、オムスク出血性熱ウイルス、Phnom Penhコウモリウイルス、Potiskumウイルス、ポワサンウイルス、リオブラボーウイルス、Rocioウイルス、Royal Farmウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、Saboyaウイルス、Sal Viejaウイルス、San Perlitaウイルス、Saumarez Reefウイルス、Sepikウイルス、Sitiawanウイルス、Sokolukウイルス、スペイン産ヒツジ脳炎ウイルス、Spondweniウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ストラトフォードウイルス、Tamanaコウモリウイルス、Tembusuウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ダニ媒介性フラビウイルス、ダニ媒介性ポワサンウイルス(系統1b)、トルコ産ヒツジ脳炎ウイルス、Tyuleniyウイルス、ウガンダSウイルス、ウスツウイルス、Wang Thongウイルス、Wesselsbronウイルス、西ナイルウイルス、ヤウンデウイルス、黄熱病ウイルス、Yokoseウイルス、Zikaウイルス、蚊媒介性ウイルス。
【０２３５】
【表２０】
2009507823.tif 000027
【０２３６】
フラビウイルス科;肝炎ウイルス(134〜142);C型肝炎ウイルス
C型肝炎ウイルス亜型1a、C型肝炎ウイルス亜型1b、C型肝炎ウイルス亜型1c、C型肝炎ウイルス亜型1d、C型肝炎ウイルス亜型1e、C型肝炎ウイルス亜型1f、C型肝炎ウイルス亜型2a、C型肝炎ウイルス亜型2b、C型肝炎ウイルス亜型2c、C型肝炎ウイルス亜型2d、C型肝炎ウイルス亜型2f、C型肝炎ウイルス亜型2i、C型肝炎ウイルス亜型2k、C型肝炎ウイルス亜型3a、C型肝炎ウイルス亜型3b、C型肝炎ウイルス亜型3g、C型肝炎ウイルス亜型3k、C型肝炎ウイルス亜型4a、C型肝炎ウイルス亜型4c、C型肝炎ウイルス亜型4d、C型肝炎ウイルス亜型4f、C型肝炎ウイルス亜型4h、C型肝炎ウイルス亜型4k、C型肝炎ウイルス亜型5a、C型肝炎ウイルス亜型6a、C型肝炎ウイルス亜型6b、C型肝炎ウイルス亜型6d、C型肝炎ウイルス亜型6g、C型肝炎ウイルス亜型6h、C型肝炎ウイルス亜型6k、C型肝炎ウイルス(分離株EC1)、C型肝炎ウイルス(分離株EC10)、C型肝炎ウイルス(分離株Glasgow)、C型肝炎ウイルス(分離株HC-J2)、C型肝炎ウイルス(分離株HG-J5)、C型肝炎ウイルス(分離株HC-J7)、C型肝炎ウイルス(分離株HCT18)、C型肝炎ウイルス(分離株HCT27)、C型肝炎ウイルス(分離株HCV-476)、C型肝炎ウイルス(分離株HCV-KF)、C型肝炎ウイルス(分離株ヒト)、C型肝炎ウイルス(分離株TH)、C型肝炎ウイルス(分離株VT204)、C型肝炎ウイルス(分離株VT316)、C型肝炎ウイルス(分離株VT681)、C型肝炎ウイルス(分離株VT886)、C型肝炎ウイルス(分離株VT887)、C型肝炎ウイルス(分離株VT897)、C型肝炎ウイルス(分離株VT898)。
【０２３７】
【表２１】
2009507823.tif 000028
【０２３８】
フラビウイルス科;ペスチウイルス(143〜144);
ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、シャモアペスチウイルス、古典的ブタコレラウイルス、豚コレラウイルス、ヒツジペスチウイルス、ペスチウイルス、豚ペスチウイルス、Pronghorn antelopeペスチウイルス。
【０２３９】
【表２２】
2009507823.tif 000029
【０２４０】
ピコルナウイルス科;ヘパトウイルス;A型肝炎ウイルス(145〜151):
A型肝炎ウイルス(系統18F)、A型肝炎ウイルス(系統24A)、A型肝炎ウイルス(系統43C)、A型肝炎ウイルス(系統CR326)、A型肝炎ウイルス(系統GA76)、A型肝炎ウイルス(系統HM-175)、A型肝炎ウイルス(系統LA)、A型肝炎ウイルス(系統LCDC-1)、A型肝炎ウイルス(系統MBB)、A型肝炎ウイルス(系統MSM1)、サルA型肝炎ウイルス(系統AGM-27)、サルA型肝炎ウイルス(系統CY-145)。
【０２４１】
【表２３】
2009507823.tif 000030
【０２４２】
ピコルナウイルス科;ライノウイルス(152〜163);
ヒトライノウイルス10、ヒトライノウイルス100、ヒトライノウイルス11、ヒトライノウイルス12、ヒトライノウイルス13、ヒトライノウイルス15、ヒトライノウイルス16、ヒトライノウイルス18、ヒトライノウイルス19、ヒトライノウイルス1A、ヒトライノウイルス1B、ヒトライノウイルス2、ヒトライノウイルス20、ヒトライノウイルス21、ヒトライノウイルス22、ヒトライノウイルス23、ヒトライノウイルス24、ヒトライノウイルス25、ヒトライノウイルス28、ヒトライノウイルス29、ヒトライノウイルス30、ヒトライノウイルス31、ヒトライノウイルス32、ヒトライノウイルス33、ヒトライノウイルス34、ヒトライノウイルス36、ヒトライノウイルス38、ヒトライノウイルス39、ヒトライノウイルス40、ヒトライノウイルス41、ヒトライノウイルス43、ヒトライノウイルス44、ヒトライノウイルス45、ヒトライノウイルス46、ヒトライノウイルス47、ヒトライノウイルス49、ヒトライノウイルス50、ヒトライノウイルス51、ヒトライノウイルス53、ヒトライノウイルス54、ヒトライノウイルス55、ヒトライノウイルス56、ヒトライノウイルス57、ヒトライノウイルス58、ヒトライノウイルス59、ヒトライノウイルス60、ヒトライノウイルス61、ヒトライノウイルス62、ヒトライノウイルス63、ヒトライノウイルス64、ヒトライノウイルス65、ヒトライノウイルス66、ヒトライノウイルス67、ヒトライノウイルス68、ヒトライノウイルス7、ヒトライノウイルス71、ヒトライノウイルス73、ヒトライノウイルス74、ヒトライノウイルス75、ヒトライノウイルス76、ヒトライノウイルス77、ヒトライノウイルス78、ヒトライノウイルス8、ヒトライノウイルス80、ヒトライノウイルス81、ヒトライノウイルス82、ヒトライノウイルス85、ヒトライノウイルス88、ヒトライノウイルス89、ヒトライノウイルス9、ヒトライノウイルス90、ヒトライノウイルス94、ヒトライノウイルス95、ヒトライノウイルス96、ヒトライノウイルス98、ヒトライノウイルスB、ヒトライノウイルス14、ヒトライノウイルス17、ヒトライノウイルス26、ヒトライノウイルス27、ヒトライノウイルス3、ヒトライノウイルス8001、フィンランド、1995年11月、ヒトライノウイルス35、ヒトライノウイルス37、ヒトライノウイルス6253、フィンランド、1994年9月、ヒトライノウイルス9166、フィンランド、1995年9月、ヒトライノウイルス4、ヒトライノウイルス42、ヒトライノウイルス9864、フィンランド、1996年9月、ヒトライノウイルス5、ヒトライノウイルス52、ヒトライノウイルス7425、フィンランド、1995年12月、ヒトライノウイルス5928、フィンランド、1995年5月、ヒトライノウイルス70、ヒトライノウイルス72、ヒトライノウイルス79、ヒトライノウイルス83、ヒトライノウイルス8317、フィンランド、1996年8月、ヒトライノウイルス86、ヒトライノウイルス7851、フィンランド、1996年9月、ヒトライノウイルス92、ヒトライノウイルス93、ヒトライノウイルス97、ヒトライノウイルス99、アントワープライノウイルス98/99、ヒトライノウイルス263、ベルリン2004、ヒトライノウイルス、ハンクス系統、非分類ヒトライノウイルスOK88-8162、Amblyomma americanum、ヒトライノウイルスUC。
【０２４３】
【表２４】
2009507823.tif 000031
【０２４４】
ピコルナウイルス科;エンテロウイルス(164〜179)
ウシエンテロウイルス、ウシエンテロウイルス株K2577、ウシエンテロウイルス株SL305、ウシエンテロウイルス2型、コクサッキーウイルスA16、コクサッキーウイルスB3、エンテロウイルスA01-2A-1、エンテロウイルスH02-2A-3、エンテロウイルスH02-2B-1、エンテロウイルスH04-2B-2、エンテロウイルスHu、エンテロウイルスI01-1-2、エンテロウイルスS01-2A-1、エンテロウイルスS02-1-6、エンテロウイルスS03-1-3、エンテロウイルスS06-1-1、ヒトコクサッキーウイルスA16、ヒトコクサッキーウイルスA9、ヒトコクサッキーウイルスA9B、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス69、エンテロウイルス74、エンテロウイルス79、エンテロウイルス81、エンテロウイルス82、エンテロウイルス83、エンテロウイルス86、エンテロウイルスYanbian96-83csf、エンテロウイルスYanbian96-85csf、ヒトコクサッキーウイルスA1、ヒトコクサッキーウイルスA10、ヒトコクサッキーウイルスA11、ヒトコクサッキーウイルスA12、ヒトコクサッキーウイルスA13、ヒトコクサッキーウイルスA14、ヒトコクサッキーウイルスA15、ヒトコクサッキーウイルスA17、ヒトコクサッキーウイルスA18、ヒトコクサッキーウイルスA19、ヒトコクサッキーウイルスA2、ヒトコクサッキーウイルスA20、ヒトコクサッキーウイルスA21、ヒトコクサッキーウイルスA22、ヒトコクサッキーウイルスA24、ヒトコクサッキーウイルスA3、ヒトコクサッキーウイルスA4、ヒトコクサッキーウイルスA5、ヒトコクサッキーウイルスA6、ヒトコクサッキーウイルスA7、ヒトコクサッキーウイルスA8、ヒトコクサッキーウイルスB1、ヒトコクサッキーウイルスB2、ヒトコクサッキーウイルスB4、ヒトコクサッキーウイルスB5、ヒトコクサッキーウイルスB6、ヒトエコーウイルス1、ヒトエコーウイルス11、ヒトエコーウイルス12、ヒトエコーウイルス13、ヒトエコーウイルス14、ヒトエコーウイルス15、ヒトエコーウイルス16、ヒトエコーウイルス17、ヒトエコーウイルス18、ヒトエコーウイルス19、ヒトエコーウイルス2、ヒトエコーウイルス20、ヒトエコーウイルス21、ヒトエコーウイルス24、ヒトエコーウイルス25、ヒトエコーウイルス26、ヒトエコーウイルス27、ヒトエコーウイルス29、ヒトエコーウイルス3、ヒトエコーウイルス30、ヒトエコーウイルス31、ヒトエコーウイルス32、ヒトエコーウイルス33、ヒトエコーウイルス4、ヒトエコーウイルス5、ヒトエコーウイルス6、ヒトエコーウイルス7、ヒトエコーウイルス8、ヒトエコーウイルス9、ヒトエンテロウイルス68、ヒトエンテロウイルス69、ヒトエンテロウイルス70、ヒトエンテロウイルス71、ヒトエンテロウイルス73、ヒトエンテロウイルス74、ヒトエンテロウイルス75、ヒトエンテロウイルス77、ヒトエンテロウイルス78、ヒトエンテロウイルス89、ヒトエンテロウイルス90、ヒトエンテロウイルス91、ヒトエンテロウイルスB、ヒトポリオウイルス1、ヒトポリオウイルス2、ヒトポリオウイルス3、ブタエンテロウイルス10、ブタエンテロウイルス9、ブタエンテロウイルスJ10、ブタエンテロウイルスJ4、ブタエンテロウイルスJ6、サルピコルナウイルス7、サルピコルナウイルス7'、ブタ水疱病ウイルス、野生型ポリオウイルス3型。
【０２４５】
【表２５】
2009507823.tif 000032
【０２４６】
本明細書で与える配列に関するデータマイニングは、本明細書の最後にある参考文献に基づくものである。
(実施例３)
代表的なマルチパネル検出キット
【０２４７】
【表２６】
2009507823.tif 000033
【０２４８】
【表２７】
2009507823.tif 000034
【０２４９】
【表２８】
2009507823.tif 000035
【０２５０】
【表２９】
2009507823.tif 000036
【０２５１】
【表３０】
2009507823.tif 000037
【０２５２】
【表３１】
2009507823.tif 000038
【０２５３】
以下に、前述のキットを使用して検出することができる疾患の例を与える。
【０２５４】
【表３２】
2009507823.tif 000039
2009507823.tif 000040
2009507823.tif 000041
【０２５５】
【表３３】
2009507823.tif 000042
2009507823.tif 000043
【０２５６】
髄膜炎用キット
不特定の菌血症
菌血症
敗血症
肺炎球菌性敗血症
細菌性髄膜炎
肺炎球菌性髄膜炎
他の場所で分類されている他の細菌性疾患における髄膜炎
他の特定の細菌が原因である髄膜炎
髄膜炎、不特定
敗血症関節炎
眼窩周囲蜂巣炎
乳突炎および関連状態
急性乳突炎
急性乳突炎、合併症なし
肺炎球菌性腹膜炎
ヘルペス髄膜脳炎
ヘルペス敗血症
【０２５７】
性感染症(std)用キット
単純ヘルペス
瞼の単純ヘルペス皮膚炎
単純ヘルペス円板状角膜炎
単純ヘルペス虹彩毛様体炎
単純ヘルペス髄膜炎
単純ヘルペス外耳炎
単純ヘルペス、眼の合併症あり
単純ヘルペス、他の眼の合併症あり
単純ヘルペス、他の特定の合併症あり
単純ヘルペス、不特定の合併症あり
単純ヘルペス、不特定の眼の合併症あり
単純ヘルペス、合併症の言及なし
帯状疱疹
瞼の帯状疱疹皮膚炎
帯状疱疹虹彩毛様体炎
帯状疱疹角結膜炎
帯状疱疹および髄膜炎
帯状疱疹、眼の合併症あり
帯状疱疹、他の神経系の合併症あり
帯状疱疹、他の眼の合併症あり
帯状疱疹、他の特定の合併症あり
帯状疱疹、不特定の合併症あり
帯状疱疹、不特定の神経系の合併症あり
帯状疱疹、合併症の言及なし
ヘルペス性歯肉口内炎
陰茎のヘルペス性感染
ヘルペス髄膜脳炎
ヘルペス性敗血症
ヘルペス性外陰部潰瘍
ヘルペス性外陰部膣炎
ヘルペス性ひょうそ
【０２５８】
(実施例4)
プロテアーゼのクローニングおよび活性アッセイ
物質および実験法
プロテアーゼのアッセイ:
HRV3C: HRV3C活性の典型的なin vitroアッセイを、25mMHEPES、150mMのNaCl、1mMのEDTA、5%のグリセロール、PH7.5および合計体積=1ml中で室温において実施した。サンプル中、細胞溶解物中、形質転換細胞抽出物(組換え体)中、および精製、組換え体HRV163Cのサンプル中において、HRV3Cプロテアーゼの活性をモニタリングした。蛍光基質(pep1、5、6、8、Ori2;EDANS/DANCYL)は、4μMの濃度で典型的には使用した。検出可能な基質には、Ori2、PEP1があるが、これらだけには限られない。EDANS/DABCYL群に特徴的な励起/発光に対応する励起/発光340/490±15nmで、蛍光計を使用して反応をモニタリングした。酵素濃度は1μMから500pMまで変化した。
【０２５９】
あるいは、3Cプロテアーゼのアッセイは、25mMのトリスHClpH8.0、150mMのNaCl、1mMのEDTA pH 8.0、6mMのDTT、2〜6uMの基質、2%のDMSO、416nMの3Cプロテアーゼおよび必要に応じて阻害剤を含む100μl体積中96ウエル形式中で30℃において、7-メトキシクマリン-4-酢酸(MOC)蛍光色素で標識した基質およびジニトロフェノール(DNP)消光物質を使用して実施した。328nmでの励起および393nmでの発光および10nmでのカットオフによって、蛍光をモニタリングする。以下の等式を用いる非線形分析プログラムEnzFitter(BioSoft)によってデータを分析した:
Ki=(I/((VmaxxS)/V0)/Ks)-I-S
【０２６０】
使用する基質濃度は基質のKm(16.8uM)より低く、したがってS/Km項の補正は使用しなかった。
【０２６１】
反応への添加物はDTT、グリセロール、Na2SO4、BSAおよび鼻洗浄液を含んでいた。
【０２６２】
エンテロウイルス(非ポリオエンテロウイルスNPEV)活性アッセイ:(4℃で1〜2日間保存した)新たなCSFサンプルを、4℃で3×20秒間超音波処理した。100μlの溶解物を、基質として4μMのPep1を使用して100μlの2×反応バッファーに加えた。反応は室温で実施し、それぞれ励起/発光340/490±15nmで蛍光計を使用してモニタリングした。
【０２６３】
組織培養アッセイ;  H1HeLa細胞を、5%のFBS、1%のpen-strepおよび1%の非必須アミノ酸を補ったDMEM培地中で増殖させた。融合状態のフラスコのH1HeLa細胞に、1〜10PFU/細胞のMOIでHRV血清型l4およびlAを感染させた。トリプシン処理または掻き取りのいずれかによって、感染後48時間で細胞を採取した。細胞はPBSで3回洗浄し、反応バッファー中に再懸濁させた。細胞は氷上で3×15秒間の超音波処理によって破壊し、次に10分間、13000rpm、4℃で遠心分離にかけた。(可溶性3Cプロを含む)透明な溶解物をアッセイに使用した。
【０２６４】
SARSおよびHRV163Cプロテアーゼのクローニング:SARSおよびHRVプロテアーゼを、実験およびキット用のプロテアーゼの供給源としてクローニングした。
【０２６５】
HRV16: プライマーをゲノム中の4320〜4869bp位置に設計した。正方向プライマーを5'プライマー延長部、CACCと共に加えて、トポイソメラーゼクローニングベクターへの方向性クローニングを容易にした。逆方向プライマーを使用して、停止コドン(TGA)を3'プライマー端に導入した。これらのプライマーを使用する予想PCR産物は556bpである。使用した鋳型は、HRV16cDNA(GenBankアクセッション番号gi:3915817)を含むベクターに由来した
HRV16正方向:5'CACCGGTCCAGAAGAAGAAT3'配列番号48
HRV16逆方向:5'TCATTGTTGTTCAGTGAAGTAT3'配列番号49
【０２６６】
SARS: プライマーをゲノム中の9985〜10902bp位置に設計した(SARS3CL、GenBankアクセッション番号gi:37999886)。正方向プライマーを5'プライマー延長部、CACCと共に加えて、方向性クローニングを容易にした。逆方向プライマーを使用して、停止コドン(TAA)を3'プライマー端に導入した。これらのプライマーを使用する予想PCR産物は925bpである。使用した鋳型は、Dr.Av-Gay(Av Gay;バンクーバー、カナダ)から入手したcDNAライブラリーに由来した。
SARS正方向:5'CACCAGTGGTTTTAGGAAAATGGC3'配列番号50
SARS逆方向:5'TTATTGGAAGGTAACACCAGAGC3'配列番号51
【０２６７】
遺伝子のPCR増幅を、標準的な反応混合物(1×反応バッファー、0.5mMのdNTP、100pmolのプライマーおよび1単位のpfu)中に混合した校正活性ポリメラーゼ(Pfu)を使用して実施した。以下のサイクルのプロトコルを使用した。94℃で3分間、次に94℃で1分間、59℃で1分間、72℃で1分間の35サイクル、72℃において10分間で終了した。SARS3CLプロテアーゼとHRV163Cプロテアーゼ両方由来のPCR産物を、pET151/D-TOPO(Invitrogen、Carlsbad CA)に直接クローニングした(図1aおよび1b)。HRV163Cプロテアーゼに関してスクリーニングした35のコロニーのうち、1個が陽性であることが分かった。SARS3CLプロテアーゼに関しては、スクリーニングした15のコロニーのうち、3個が陽性であることが分かった。
【０２６８】
実験結果
SARSおよびHRV163Cプロテアーゼのクローニング:SARS3CLおよびHRV16プロテアーゼを、本明細書で前に記載したのと同様に、実験およびキット用のプロテアーゼの供給源としてpET151/D-TOPO(Invitrogen、Carlsbad CA)にクローニングした。図1aおよび1bは、それぞれSARS3CL(pMND2)およびHRV163C(pMND1)プラスミドを示す。HRV163Cプロテアーゼに関してスクリーニングした35のコロニーのうち、1個が陽性であることが分かった。SARS3CLプロテアーゼに関しては、スクリーニングした15のコロニーのうち、3個が陽性であることが分かった。組換えHRV163CおよびSARS3CLプロテアーゼの活性を、形質転換細菌由来の全細胞溶解物において検出した(図2)。
【０２６９】
最適切断配列の基質ペプチドを使用した優れた基質活性-in vitroアッセイ
ペプチドの設計: 当該のプロテアーゼの検出および特徴付け用の選択的な、最適有効性基質を与えるために、原型と設計ペプチド基質の切断をin-vitroアッセイで比較する。ペプチド基質は、HRV3Cプロテアーゼに関するアッセイにおいて使用するために設計した。ペプチド基質の配列は原型切断部位の配列に従って設計し、あるいは本発明の方法によって選択した。典型的には、基質の配列の設計は、複数の知られているHRV切断部位の多重配列アラインメントを実施すること、およびそのバイオインフォマティクス性に基づいて特定の位置における最適なアミノ酸を決定することによって決定した。以下の表14は、in-vitroアッセイにおいて使用した3Cプロテアーゼ基質、およびそれらの原型を示す。
【０２７０】
【表３４】
2009507823.tif 000044
【０２７１】
3Cプロテアーゼの最適ペプチド基質の決定: 3Cプロテアーゼの最適な切断基質を決定するために、組換え3Cプロテアーゼ(本明細書の前の実施例1参照)による合成ペプチド基質Pep1〜Pep9(前の表14参照)の切断を、原型基質の配列Ori2の切断と比較した。Pep1〜Pep9の中で最も迅速な速度論を示した基質は、多数のHRV3C切断部位およびバイオインフォマティクスに基づいて設計したPep1であった。図3は、Ori2と比較したときの3Cプロテアーゼアッセイの優れた速度論を示す。図4は、250nMの3Cプロテアーゼを使用した0.003μM〜4μMの基質濃度の範囲内での、組換え3CプロテアーゼによるPep1の切断の速度論を示す。アッセイした全ての基質濃度に関して、少なくとも3分間の反応で直線的な速度論を観察した。
【０２７２】
最適ペプチド基質を使用した3Cプロテアーゼアッセイに関する最適条件の決定: 設計した基質を使用して3Cプロテアーゼアッセイに関する最適条件を確立するために、反応条件の変化に対する感度を評価した。DTT、グリセロール、Na2SO4およびBSAなどの標準的な反応バッファーの重要要素の濃度を変え、反応速度(RFU/分)に対する影響を測定した。結果は、Pep1基質と共に使用するのに最適な反応バッファーは、6mMのDTT、5%のグリセロール、0.8MのNa2SO4、および0.1〜1mgのBSA/mlを含むことを示した。
【０２７３】
最適ペプチド基質を使用した3Cプロテアーゼアッセイの感度の測定:臨床サンプル中の酵素の濃度は、低いことが多いと予想される。設計したペプチド基質を使用した3Cプロテアーゼ活性の検出の下限を測定するために、4μMのPep1を組換え酵素の濃度の範囲でアッセイした。このアッセイにおけるプロテアーゼ検出の下限は、0.5〜1.0nMの3Cプロテアーゼであったと測定した。
【０２７４】
最適ペプチド基質を使用した3Cプロテアーゼアッセイの特異性の測定:所望の切断活性に対する設計した基質の特異性は、実際の臨床サンプルにおける切断活性を評価するのに重要である。Pep1に対するHRV3Cプロテアーゼの特異性を試験するために、Pep1基質とSARSプロテアーゼおよび大腸菌溶解物の酵素交差反応性を試験した。
【０２７５】
図5は、HRV16溶解物におけるHRV3Cプロテアーゼによる切断に対するPep1の特異性、およびSARS3CL溶解物または大腸菌溶解物との任意の検出可能な切断反応の不在を示す。
【０２７６】
特異性に関する他の試験を、H1HeLa細胞培養物を使用して実施して、in-situでの実際のHRV感染を刺激し、このような条件下での3C活性の検出における設計した基質の有効性を試験した。HRV感染HeLa細胞の透明な、超音波処理した溶解物を、基質Pep1、Ori2およびPep6を使用してアッセイした。これらの結果は、HeLa細胞は非特異的プロテアーゼ活性の高いバックグラウンドを有することを示した。
【０２７７】
HeLa細胞を用いた作業におけるこのような非特異的影響を排除するための試みでは、HeLa溶解物による設計した基質の切断に対する、様々な知られているプロテアーゼ阻害剤(EDTA、EGTA、PMSFおよびアプロチニン)の影響を評価した。以下の表15は、阻害剤PMSFおよびアプロチニンに対する、基質としてPep1を使用したタンパク質切断反応の相対的無感度を示す。EDTA/EGTAは、Pep1の3Cプロテアーゼによる切断を部分的に阻害した。
【０２７８】
【表３５】
2009507823.tif 000045
【０２７９】
臨床状態における最適ペプチド基質を使用した3Cプロテアーゼアッセイの有効性の測定: HRVプロテアーゼのアッセイに関する臨床状況を、粘液分泌の存在によって特徴付ける。実際の臨床状態下での3Cプロテアーゼによる設計した基質の切断の有効性を測定するために、加えた鼻部洗浄サンプルの存在下と不在下の、組換え3CプロテアーゼによるPep1の切断を比較した。図6は反応速度論に対する鼻部洗浄サンプルの影響がなかったことを示し、臨床用途に対する反応の適性を示す。
【０２８０】
臨床用鼻部洗浄サンプルにおける最適切断配列の基質ペプチドの切断によるライノウイルスのウイルス感染の正確な検出-臨床設定において使用するための設計したペプチド基質の適性を試験するために、(粘液抽出キット-Mucosafe Extractor、フィルター付き-Maersk Medical A/S-デンマークを使用して)対象から得た鼻部洗浄サンプルをウイルスの存在に関して評価し、次いでプロテアーゼの触媒活性に関して本発明の方法によって試験した。各サンプルの一部分を、市販のモノクローナル抗体(Chemicon International、Inc.、Temecula、CA)を使用した直接的な免疫蛍光アッセイ(IFA)によって、および組織培養によってRSV、インフルエンザAおよびBウイルス、パラインフルエンザウイルス、およびアデノウイルスの存在に関して評価した。HRVの存在に関して分析するまで、残りは-80℃で保存した。
【０２８１】
現在、HRV検出に関する「黄金の中庸」は存在しない。組織培養はウイルス感染性のため通常の試験法ではなく、利用可能な市販のイムノアッセイは存在しない。したがって、RT-PCR分析を選択して、The Central Laboraotry of Virology、Division of Infectious Diseases、Department of Internal Medicine、University Hospitals of Geneva、ジュネーブ、スイスにおいてサンプルを分析した。
【０２８２】
臨床的鼻部洗浄試験:アッセイは24個の臨床サンプル(鼻部洗浄液)を使用して実施した。合成ペプチド基質Pep1を使用して、3Cプロテアーゼの特異的活性を、全体のタンパク質濃度に対して計算した(ブラッドフォード法による)(特異的活性=RFU/分/タンパク質1mg)。
【０２８３】
以下の表16は、RT-PCRおよびプロテアーゼ活性(MNDアッセイ)による、サンプル中のHRVの検出の比較の結果を示す。24個のサンプルのうち17個が、RT-PCRの結果に関してプロテアーゼ陽性またはプロテアーゼ陰性を示した(それぞれ、0.5RFU/分/タンパク質1mgを超えるかあるいはそれ未満の特異的活性)。残りの7個のサンプルのうち、5個がRT-PCRにおいて陰性かつプロテアーゼアッセイにより陽性であり、2個がRT-PCRにおいて陽性かつプロテアーゼアッセイにより陰性であった。RT-PCRの絶対的精度を仮定する、これらの予備的結果の統計分析(表17)は、75%の感度の適合性および70%の特異性の適合性を示す。
【０２８４】
【表３６】
2009507823.tif 000046
【０２８５】
【表３７】
2009507823.tif 000047
【０２８６】
しかしながら、RT-PCR検出の精度には問題がある可能性があり、本発明の方法を使用するプロテアーゼ検出は、RT-PCRによる検出に優る明確な利点を有する。RT-PCRはウイルスのRNAのみを検出し、したがって不活性ウイルスを検出する可能性もある。したがって、RT-PCRにおいて陽性でありプロテアーゼ活性に関して陰性であったサンプルは、プロテアーゼアッセイがその活性形でのみウイルスを検出するという事実が原因である可能性がある。さらに、試験したサンプルは、使用前に3〜4年間-80℃で貯蔵庫に保ったことは理解されるはずである。したがって、RT-PCRにおいて陽性反応を示しプロテアーゼに関して陰性であったサンプルは、長期間の貯蔵が原因で不活性3Cプロテアーゼを有していた可能性がある。さらに他には、プロテアーゼ検出はRT-PCRより感度が良い可能性があり、これはRT-PCRにおいて陰性反応を示しプロテアーゼに関して陽性であったサンプルにおいて反映され得る。
【０２８７】
したがって、最適切断配列の基質ペプチドを使用した3Cプロテアーゼアッセイは、臨床サンプル中のHRV16を首尾良く検出した。
【０２８８】
(実施例5)
臨床用CSFサンプルにおける最適切断配列の基質ペプチドの切断によるエンテロウイルスのウイルス感染の正確な検出
非ポリオエンテロウイルス(NPEV)感染は毎年夏の後期および秋の初期中一般的であり、ヒトにおける最も一般的なウイルス感染物質としてライノウイルスに次ぐ。90%を超える無菌性髄膜炎の原因はNPEVによって引き起こされ、古典的症状は発熱、重度の頭痛、頸部硬直、頸部痛、悪心および嘔吐、明光に対する過敏症、およびおそらく発疹である。
【０２８９】
CSF中のNPEVの検出は現在、PCRおよび組織培養法によって実施している。NPEVのPCRは、ウイルス培養より高い感度および短時間で、サンプル採取の5〜24時間以内に結果を与えることができる。しかしながら、組織培養法とRT-PCRは両方共にコストがかかり、複雑な要件を必要とし、迅速な現場の診断には不適切である。最適切断配列の基質ペプチドを使用するプロテアーゼアッセイによる、エンテロウイルス検出の有効性を試験するために、ヒト脳脊髄液(CSF)のサンプルを本発明の方法によって、最終段階組織培養アッセイにおいてNPEVに関してアッセイした。
【０２９０】
臨床的CSF試験:表18は、本発明の方法の高い感度を示す。CSFの正確かつ高感度の検出用に、最適配列の基質ペプチドとしてPep9を選択した。Pep9は以下の理由で使用した;第1に、NPEVのプロテアーゼとHRVのプロテアーゼは同じファミリーに属しており、非最適アッセイ条件を使用するが、結果は依然として得られることを示す。第2に、HRVはCSF中に存在しないので、交差反応性の危険がない。新たなCSFは腰椎穿刺によって得た。
【０２９１】
【表３８】
2009507823.tif 000048
【０２９２】
7個の新たなCSFサンプルの中で、組織培養アッセイの結果とプロテアーゼ活性に基づく検出の結果の間に完全な相関関係を見出した。組織培養の結果とプロテアーゼ検出の結果の間の正の相関関係は、細胞密度(450細胞/mm3〜1細胞/mm3の範囲)によって影響を受けなかったことを記す。したがって、エンテロウイルスの正確かつ迅速な検出は、臨床条件下でのCSFサンプル中の最適切断配列の基質ペプチドの切断による、プロテアーゼ検出を使用して実施することができる。
【０２９３】
一緒に考えると、これらの結果は、比較可能な酵素速度論に従い設計および選択した最適なペプチド基質を使用して、高い感度および精度で診断対象の標的酵素を検出することができることを示す。このような診断対象の標的酵素の検出は、エンテロウイルスおよびライノウイルス、ならびにSARSウイルスおよび鳥インフルエンザウイルスなどの疑わしい伝染的および流行的物質などの一般的疾患の迅速な診断を大幅に改善し得る。
【０２９４】
(実施例6)
分離に基づくプロテアーゼ検出
本発明はさらに、記載する親和性分離に基づいて反応中に実施される特異的な基質の切断によって、1つまたは複数の反応物質(酵素または特異的化学物質)を同時に検出するための新規な方法を提供する。切断の検出は、その検出が必要とされる特異的反応の存在を示す。一実施形態では、このような方法の1つの適用例は、特異的反応を触媒する特異的酵素の検出である。他の実施形態では、酵素はその検出が必要とされる生物系の一部であり、他の実施形態では、生物系はウイルスまたは細菌または他の病原体である。検出法は2段階の組合せからなる。
第1段階: 反応中にプロセシングされる分子とプロセシングされない分子の分離。第2段階:プロセシング分子のみの検出。
【０２９５】
分離機構は、二成分、例えば抗体-基質の特異的親和性結合、核酸ハイブリダイゼーション、または固定表面、例えば膜、チップ、ビーズなどへの結合のいずれかを使用することができる。検出段階は、親和性あるいは任意の他の方法、例えば蛍光、比色、酵素法あるいは両方に基づくものであってよい。
【０２９６】
検出する特異的反応を経る基質は3部分: X、Y、ZおよびCからなる(図7)。特異的切断部位を有するコア分子(セグメントY、例えば速度論的に最適な基質、前に同定し記載したのと同様の基質など)は、その目的が切断基質を検出することであるタグ分子(セグメントX、すなわち検出可能な成分)と一端で結合させる。他端ではそれを、プロセシング基質と非プロセシング基質を分離する機構中のセグメント(セグメントZ、分離成分)と結合させる。分子Yの切断によって、基質の切断産物が形成される: (1)部分Xおよび部分Yを含むタグセグメント(TS、本明細書ではX-Y'とも呼ぶ)および(2)Zおよび部分Yを含む分離セグメント(SS.本明細書ではY''-Zとも呼ぶ)。分子切断および望ましいその検出を開始するプロセスは酵素反応、化学反応、変性または任意の他のプロセスであってよい。
【０２９７】
図8中に記載した基質は、その設計した切断成分と反応する。ひとたび切断が起これば、Zセグメント(分離セグメント)を使用してプロセシング基質と非プロセシング基質を分離する。したがって、(検出可能な成分を含む)プロセシング基質のTSのみが、その検出可能な分子に対して高親和性を有する成分と結合する。親和性結合のプロセスは、したがって切断基質に関してのみ検出される。検出は既存の、知られているまたは新規な方法に基づくものであってよい。このようにして、プロセシングされた分子のみを検出することができる(図8)。
【０２９８】
他の実施形態では、前に記載した方法を使用して、幾つかの基質の切断を同時に検出することもできる。基質がその分離機構(Z)中類似しているがその特異的切断分子(Y)中では異なる場合、この可能性が生じる。この場合、それぞれの基質は、そのコア分子(Y)と結合することができる特有かつ異なる検出可能な成分(X)を有する。切断およびプロセシング基質と非プロセシング基質の分離が起こった後、異なる(およびプロセシング)基質のTSのみを(前に記載した方法によって)親和性により結合させる。Z(非プロセシング基質またはプロセシング基質のSS)を含む任意の分子は、分離機構によって保持される。異なる基質の異なるTSへの他の分離は、その上でそれぞれ所定の場所がそれぞれ異なるTSと親和性を有する成分を含む、例えば、それぞれの場所がTSの一種のみと結合することができる、膜、チップなどを設計することによって実施する。次いで分離溶液がこのチップまたは膜と接触し、親和性による結合が生じ得る。どの所定の場所が親和性により異なるTSと結合するかを知ることによって、どの基質がプロセシングされたかを確認することができる。それぞれの基質は基質の切断を開始した酵素に特異的なので、どの酵素がその対応する基質を切断したかを確認し、どのプロテアーゼが溶液中に存在するかを推測し、したがってどの病原体または物質がその対応する酵素に対応するかを推測することができる(図9)。
【０２９９】
逆PH系(RPHS)-この実施形態では、Cセグメントは、バッファー溶液中の全基質に共通する特別な分子である。様々な基質に対応するAセグメントは、その異なる色が異なるPHに対して感受性がある色素分子体である。切断後、セグメントCと親和性を有するカラムによってバッファー溶液を濾過する。セグメントC(非プロセシング基質またはプロセシング基質のセグメントSS)を含む任意の分子が、(セグメントCに対応する親和性成分によって)カラムに保持されるはずである。(セグメントCを含まない)プロセシング基質のTSセグメントのみが、それぞれ異なるPH中の幾つかのセルを有するチャンバーにたどり着くことができるはずである。ひとたび(Aを含む)TSセグメントがセル(異なるPH)と接触すれば、セグメントAの性質によってセルは変色する。これは、どの基質がプロセシングされたかを示す。
【０３００】
分離の機構
分離機構の目的は、TSのみが検出可能な成分に対応する親和性を有する成分と結合することができるような方法で、TSとSSを分離することである。幾つかの基質を同時に検出する場合、分離機構は、切断がこれらの基質に関して開始されない場合に完全状態の基質を除去するための他の役割を有する。
【０３０１】
前に記載した系に関して、任意の分離法を使用することができる。以下に、そのような分離法の簡潔な記載を与える。
【０３０２】
1.固定分離系(ISS)-この系において、Zはビーズ、ニトロセルロース膜、ビオチン-アビジンまたは他の親和性のある対を介して固定表面と結合したスペーサーである。切断後、バッファー溶液中で、任意の非プロセシング基質またはプロセシング基質のSSを、バッファー溶液から(抽出、遠心分離、濾過などによって)固定表面を分離し、プロセシング基質のTSのみを残すことによって除去する。このようにして、各基質の速度論をモニタリングすることも可能である。
【０３０３】
2.速度論的分離系(DSS)-この系において、Zはバッファー溶液中の全基質に共通または特有である特別な分子である。ひとたび切断が起これば、バッファー溶液は特別に設計した膜またはチップと接触する。膜は垂直状態であり、その底部にZに対する親和性を有する成分を有する。膜の隣接部分は、異なる基質のXに対応する異なる場所を含む。次いでバッファー溶液を、毛管または電気の力によって膜またはチップの全長に沿って押し出す。Z(非プロセシング基質またはプロセシング基質のSS)を含む任意の分子は、(Zに対応する親和性部分によって)膜の底部に保持される。(Zを含まない)プロセシング基質のTSのみが膜を移動し、その所定の場所と親和性により結合することができる(図10)。
【０３０４】
3.親和性による濾過系(AFS)-この系では、Zと親和性を有するカラムによってバッファー溶液を濾過し、したがってZ(非プロセシング基質またはプロセシング基質のSS)を含む任意の分子が、カラム中に留まる。フロースルーは、プロセシング基質のTSのみを含む。
【０３０５】
親和性のある対の例
この系に関する親和性のある対は、当技術分野で知られている任意の親和性のある対であってよい。親和性のある対の例には、ビオチン-アビジン、抗体-基質;受容体-基質;核酸ハイブリダイゼーションに基づくセンス-アンチ-センスDNA/RNA鎖;PH依存性着色分子があるが、これらだけには限られない。蛍光-検出可能な成分は、FRETまたは他の蛍光検出法に基づくものであってよい。
【０３０６】
検出法の例
抗体/受容体-基質-蛍光または着色に基づく任意の既存または新規な免疫化学法が適している。
【０３０７】
マーカー-検出可能な成分(X)は色、蛍光を生み出す分子、FRETまたは任意の他の測定可能な、目に見えるまたは容易に検出可能な分子であってよく、あるいはこれらと結合することができる。
【０３０８】
DNAハイブリダイゼーション-蛍光または着色プローブに基づく方法などの、任意の既存または新規なハイブリダイゼーション法が適している。
【０３０９】
酵素反応-検出可能な成分(X)は、着色または蛍光または任意の他の測定可能な、目に見える、あるいは任意の他の容易に検出可能な反応を触媒する酵素と結合することができる。
【０３１０】
抗体の親和性に基づくプロテアーゼ検出
それらの特異的なプロテアーゼ活性に基づいて、臨床サンプル中の幾つかのウイルスの存在を検出する。多くのウイルス科は、そのライフサイクルの重要な一部として特異的なプロテアーゼ活性を利用する。例えばライノウイルス(3Cプロテアーゼ)、エンテロウイルス(3Cプロテアーゼ)およびSARS(3CLプロテアーゼ)はいずれも、そのウイルス科に特有な切断配列を有するプロテアーゼを利用する。
【０３１１】
この実施例では、基質は(Zに対応する)ビオチンと一端で結合した(Yに対応する)ペプチド切断配列である。他端は、(Xに対応する)特異的抗体と親和性を有する分子と結合している。この基質の切断は、(前に記載したように)SSとTSの分離をもたらすはずである。
【０３１２】
反応混合物は、異なる型の前に記載した基質を含む。全基質が一端にビオチン成分を含む。ペプチドは、特異的切断配列(例えばA1、A2、A3...)と結合することができる特異的プロテアーゼおよび特有の抗体基質に対応する切断配列が異なる。このようにして、それぞれの基質は異なるウイルスと結合することができる。
【０３１３】
反応混合物を臨床サンプルと接触させ、切断を起こすことができる。切断後、この目的のために断片として形を整え特別に設計した膜またはチップ上で、反応混合物を分析する(図10)。膜またはチップは底部に、アビジンを含む領域を有する。膜またはチップはこの領域の上に、異なる基質の異なる抗体基質に対応する抗体を含む異なる場所を有する[例えば、(抗X1に対応する)抗A1、(抗X2に対応する)抗A2、(抗X3に対応する)抗A3...]。次いでバッファー溶液を、毛管または電気の力によって膜またはチップの全長に沿って押し出す。ビオチン(非プロセシング基質またはプロセシング基質のSS)を含む任意の分子は、(ビオチンに対する親和性によって)膜の底部に保持されるはずである。(ビオチンを含まない)プロセシング基質のTSのみが膜を移動し、その所定の場所と親和性により結合することができるはずである(例えば、前に記載した命名に対応するA1-抗A1、A2-抗A2など)。
【０３１４】
それぞれの場所は異なるプロテアーゼを表すので、どのプロテアーゼが臨床サンプル中に存在するかを、プロセシング基質の存在から決定することができる。プロテアーゼの存在によって、対応する特異的ウイルスの存在を確認する。
【０３１５】
核酸ハイブリダイゼーションに基づくプロテアーゼ検出
DNAまたはRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、互いに対して高い親和性を有する。この系はこの性質を利用する。前に記載した抗体の実施例中で記載したのと同じガイドラインで、この系を設計する。
【０３１６】
違いは、親和性による結合が核酸ハイブリダイゼーションに基づくことである。この実施例では、基質は(Zに対応する)分離ssDNA鎖と一端で結合した(Yに対応する)ペプチド切断配列である。他端は、(Xに対応する)特有のssDNA鎖と結合している。この基質の切断は、(前に記載したように)SSとTSの分離をもたらす。
【０３１７】
反応混合物は、異なる型の前に記載した基質を含む。全基質が同じ分離ssDNA鎖を有する。ペプチドは、特異的切断配列と結合することができる特異的プロテアーゼおよび特有のssDNAに対応する切断配列(例えばA1ssDNA、A2ssDNA、A3ssDNA...)が異なる。このようにして、それぞれの基質は異なるウイルスと結合することができる。
【０３１８】
反応混合物を臨床サンプルと接触させ、切断を起こすことができる。切断後、この目的のために断片として形を整え特別に設計した膜またはチップ上で、反応混合物を分析する(図10)。膜またはチップは底部に、アンチセンス分離DNA鎖を含む領域を有する。膜またはチップはこの領域の上に、異なる基質の特有のssDNAに対応するアンチセンスDNA鎖を有する異なる場所を有する(例えば、アンチセンスA1ssDNA、アンチセンスA2ssDNA、アンチセンスA3ssDNA...)。次いでバッファー溶液を、毛管または電気の力によって膜またはチップの全長に沿って押し出す。分離ssDNA鎖(非プロセシング基質またはプロセシング基質のSS)を含む任意の分子は、(アンチセンス分離DNAに対する親和性によって)膜の底部に保持されるはずである。(分離ssDNA鎖を含まない)プロセシング基質のTSのみが膜を移動し、その所定の場所と親和性により結合することができるはずである(例えば、A1ssDNA-アンチセンスA1ssDNA、A2ssDNA-アンチセンスA2ssDNAなど)。
【０３１９】
それぞれの場所は異なるプロテアーゼを表すので、どのプロテアーゼが臨床サンプル中に存在するかを、プロセシング基質の存在から決定することができる。プロテアーゼの存在によって、対応する特異的ウイルスの存在を確認する。固相上のアッセイ産物のアドレス可能な位置のみに存在する1つの検出可能な成分を使用して、数種のウイルスを検出することができる。
【０３２０】
別個の実施形態の文脈で明確に記載する本発明の幾つかの特徴は、組み合わせて個々の実施形態で提供することもできることは理解される。逆に、個々の実施形態の文脈で明確に記載する本発明の様々な特徴は、別個または任意の適切なさらに小さな組合せで提供することもできる。
【０３２１】
本発明をその特定の実施形態に関して記載してきたが、多くの代替、変更形態および変形が当業者には明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲の範疇にある全てのこのような代替、変更形態および変形を含むことを意図するものである。本明細書で述べる全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許および特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが詳細かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書にその全容が組み込まれる。さらに、本出願中の参考文献の引用または認定は、そのような参考文献が本願発明に対する従来技術として利用可能であることを認めるものであると解釈されるべきではない。
(参考文献)
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【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１ａ】HRV163Cプロテアーゼを有するプラスミドpMND1のグラフ図である。
【図１ｂ】SARS3Clプロテアーゼを有するプラスミドpMND2のグラフ図である。
【図２】大腸菌におけるSARSおよびHRV由来の組換え3Cプロテアーゼの、発現の時間行程の図である。形質転換クローンを0.4mMのIPTGで誘導し、全細胞溶解物は、プロテイン200およびチップキット(Agilent Technologies、Inc、Palo Alto CA)を使用してBioanalyzer 2100 lab-on-chipにおいて電気泳動によって分析した。レーン1-分子量ラダー;レーン2〜4-pMND-2、それぞれ誘導後0、1、および6時間、レーン4〜6-pMND-1、それぞれ誘導後0、1、および6時間。経時的なSARS3CLおよびHRV163Cプロテアーゼの発現の安定した増大を記す。
【図３】原型切断部位(Ori2)の基質性と比較した、設計PEP1基質の優れた基質性のグラフ図である。340/490±15nmにおいて蛍光測定法により調べて、反応混合物は5μMの蛍光基質および500nMの組換え3Cプロテアーゼを含んでいた。酵素濃度は500pM〜1μMであった。Pep-1-黒楕円;Ori2-黒ひし形;Pep1対照-黒長方形;Ori2対照-黒三角形。Pep1に関する優れた基質切断性を記す。
【図４】3nM〜4μMの基質濃度の範囲内での、HRV3Cプロテアーゼ(250nM)および合成Pep1基質に関する優れた反応速度論のグラフ図である。
【図５】HRV3Cプロテアーゼによる切断に対する合成Pep1基質の特異性のグラフ図である。蛍光Pep1基質は、大腸菌溶解物(黒四角形)、組換えSARS3CL溶解物(黒丸)、組換えHRV3C溶解物(黒三角形)、および対照(溶解物なし)(黒ひし形)と共にインキュベートした。HRV3Cプロテアーゼに関するPep1の絶対特異性を記す。
【図６】鼻部洗浄条件下でのHRV3CプロテアーゼによるPep1基質の効率良い切断のグラフ図である。蛍光Pep1基質は、50%体積の鼻部洗浄液(サンプルE0052)の不在下(黒四角形)およびの存在下(黒丸)で組換えHRV3Cと反応させた。対照は鼻部洗浄液(E0052)のみであった(黒ひし形)。基質の切断に対して鼻部洗浄液の影響がなかったことを記す。
【図７】切断事象を検出するために使用することができる本発明の組成物の図である。
【図８】前の図7中に記載した組成物を利用する系の基本事象を示す図である。
【図９】多数のウイルスの分離機構を示す概略図である。
【図１０】3つの型の切断反応を経た3分子の同時検出の概略図である。
【図１１】NS3プロテアーゼによるC型肝炎ウイルスのポリプロテインの、一連のタンパク質分解を示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月20日(2008.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えない単離ペプチド。
【請求項２】
少なくとも1つの検出可能な成分と結合した、ウイルスプロテアーゼの基質を含む組成物であって、前記基質が請求項1に記載のアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項３】
前記少なくとも1つの検出可能な成分がプレ酵素であり、前記基質の切断が前記プレ酵素を活性化させる、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも1つの検出可能な成分がFRET対であり、前記基質の切断によって前記FRET対からシグナルが生成する、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
分離成分をさらに含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
一般式:
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記基質が請求項1に記載のアミノ酸配列を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物。
【請求項７】
前記分離成分Zが免疫学的結合物質、磁性結合成分、ペプチド結合成分、親和性結合成分、核酸成分からなる群から選択される、請求項5または6に記載の組成物。
【請求項８】
一般式:
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記基質が請求項1に記載のアミノ酸配列を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
XまたはZがマーカー、検出可能な成分および/または切断された組成物と切断されていない組成物を適切な方法で分離することができる分離成分のいずれかを含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成しない組成物。
【請求項９】
サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出するための方法であって、
(a)前記基質を切断することができる条件下で請求項2、4、5、6、7または8に記載の組成物の少なくとも1つとサンプルを接触させる段階と、
(b)前記基質の切断をモニタリングする段階であって、前記基質の前記切断が前記サンプル中の前記少なくとも1種のウイルスの存在を示す段階とを含む方法。
【請求項１０】
サンプル中の少なくとも1種のウイルスを検出するための診断キットであって、請求項2、4、5、6、7、8または9に記載の組成物の少なくとも1つおよび前記基質の切断を検出するための試薬を含むキット。
【請求項１１】
複数のウイルスの存在を検出するためのパッケージング材料および複数の組成物を含む診断キットであって、前記組成物のそれぞれが、一般式、
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
XまたはZがマーカー、検出可能な成分および/または切断された組成物と切断されていない組成物を適切な方法で分離することができる分離成分のいずれかを含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成せず、
前記XまたはZのそれぞれが少なくとも1つの明確に検出可能な成分を含み、前記パッケージング材料が、キットがサンプル中の複数のウイルスの検出用であることを示す標識またはパッケージ挿入体を含む、診断キット。
【請求項１２】
複数のウイルスの存在を検出するためのパッケージング材料および複数の組成物を含む診断キットであって、前記組成物のそれぞれが、一般式、
X-Y-Zである組成物であって、
上式で
Yがウイルスプロテアーゼの基質を含み、前記ウイルスプロテアーゼによるX-Y-Zの切断が切断産物X-Y'およびY''-Zを形成し、前式でY'がYの第1の切断産物であり、Y''がYの第2の切断産物であり、
Xが検出可能な成分を含み、
Zが二相分離系の分離相と結合することができる分離成分を含み、
前記X-Y-Zが前記ウイルスプロテアーゼの本来の基質の隣接部分を形成せず、
前記Xのそれぞれが明確に検出可能であり、前記パッケージング材料が、キットがサンプル中の複数のウイルスの検出用であることを示す標識またはパッケージ挿入体を含む、診断キット。
【請求項１３】
前記複数の組成物が1つの固体支持体に結合している、請求項11または12に記載の診断キット。
【請求項１４】
前記示差的な検出を前記1つの固体支持体上のアドレス可能な位置で実施する、請求項13に記載の診断キット。
【請求項１５】
前記示差的な検出を異なる検出可能な成分によって実施する、請求項13に記載の診断キット。
【請求項１６】
コロナウイルス、SARSウイルス、HMPV(ヒトメタ肺炎ウイルス)、インフルエンザA+Bウイルス、鳥インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSV(呼吸器合胞体ウイルス)、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルスからなる群から選択される少なくとも2種のウイルスを含む呼吸器用キットである、請求項10、11または12に記載の診断キット。
【請求項１７】
ロタウイルス、アデノ40/41ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、カルシウイルスおよびCMV(サイトメガロウイルス)からなる群から選択される少なくとも１種のウイルスを含む胃腸用キットである、請求項10、11または12に記載の診断キット。
【請求項１８】
エンテロウイルス(1〜80)、西ナイルウイルス、単純疱疹ウイルス1、2および6からなる群から選択される少なくとも１種のウイルスを含む髄膜炎用キットである、請求項10、11または12に記載の診断キット。
【請求項１９】
HIV系統ウイルス、単純疱疹ウイルス1、単純疱疹ウイルス2、HSV-1ウイルス、HSV-2ウイルス、HPV(ヒトパピローマウイルス)、およびHTLV-1ウイルスからなる群から選択される少なくとも１種のウイルスを含む性感染症用キットである、請求項10、11または12に記載の診断キット。
【請求項２０】
A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVウイルス、ヘルペスウイルス1および2からなる群から選択される少なくとも１種のウイルスを含む旅行者用キットである、請求項10、11または12に記載の診断キット。
【請求項２１】
狂犬病ウイルスおよびジステンパーウイルスからなる群から選択される少なくとも１種のウイルスを含む獣医用キットである、請求項10、11または12に記載の診断キット。
【請求項２２】
前記少なくとも1種のウイルスが複数のウイルスを含む、請求項10に記載の診断キット。
【請求項２３】
前記ウイルスがHIVウイルスであり、前記基質が配列番号5を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項２４】
前記ウイルスがCMVウイルスであり、前記基質が配列番号14または15を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項２５】
前記ウイルスが西ナイルウイルスであり、前記基質が配列番号21、22または23を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項２６】
前記ウイルスがC型肝炎ウイルスであり、前記基質が配列番号33、34または35を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項２７】
前記ウイルスがA型肝炎ウイルスであり、前記基質が配列番号37または38を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項２８】
前記ウイルスがHRVウイルスであり、前記基質が配列番号39または40を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項２９】
前記ウイルスがエンテロウイルスであり、前記基質が配列番号41、42、43、44、45、46または47を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項３０】
前記ウイルスがHRVウイルスであり、前記基質が配列番号143〜147、150〜151を含む、請求項9、10、11または12に記載の方法またはキット。
【請求項３１】
ウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するための方法であって、
(a)少なくとも1種のウイルス系統のポリプロテインの複数の切断配列の中で、プロテアーゼによる最も迅速な切断速度論を示す切断配列を同定する段階と、
(b)最も迅速な切断速度論を示し、ウイルスのプロテアーゼの速度論的に最適な基質を設計するのに有用である、科全体の共通の切断配列を同定する段階とを含む方法。
【請求項３２】
前記ウイルスプロテアーゼがセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、3Cプロテイナーゼ、PAトランスクリプターゼ、アデニンプロテアーゼ、2Aプロテアーゼ、キモトリプシンまたはトリプシン、例えば:NS3、NS2、NS-プロシステインプロテアーゼ、nsP2システインプロテアーゼ、nsP23プロ、Cタンパク質プロテアーゼ、SFVNS、HIVアスパラギン酸プロテアーゼ、nsp4アルテリウイルスプロテアーゼ、HCMVプロテアーゼ、NS2-3、NS3-4Apプロテアーゼ、HTLV-1PRからなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列が14アミノ酸長を超えず、各ウイルスプロテアーゼの活性を阻害するための模倣体を含む単離ペプチド。
【請求項３４】
ウイルス感染を治療すると認められる医薬品を製造するための、請求項33に記載のペプチドの使用。
【請求項３５】
請求項33に記載の単離ペプチドを活性成分として含む医薬組成物。