(57)【要約】  本発明は、式Ｐ−Ｌ−Ｎ（ここでＰは細胞貫通ペプチドであり、Ｎは核酸、好ましくはオリゴヌクレオチド、さらに好ましくはｓｉＲＮＡであり、ＬはＰとＮとを連結する、親水性ポリマー、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである）の細胞貫通ペプチド−核酸（「ＣＰＰ−核酸」）結合体を提供する。かかる結合体の組成物、使用法、及び製造法も開示される。
2009519033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2009519033.tif 000019
（式中、
Ｐはチオール成分をさらに含む細胞貫通ペプチドであり、好ましくは成分はシステイン又はシステアミン残基であり、
Ｎは核酸、好ましくはオリゴヌクレオチドであり、
Ｒ1’及びＲ2’は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールから独立に選択される２価有機基であり；
ｚは１〜１００の整数、好ましくは１〜５０である）
を有する化合物。
【請求項２】
化合物の細胞貫通ペプチドは、インビトロ及び／又はインビボで哺乳動物細胞膜を移動させ、細胞及び／又は細胞の核に侵入する能力を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｐは、１００未満であるか又はこれに等しい、好ましくは２５アミノ酸の長さである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｐは、４より大きいか又はこれに等しい、好ましくは６アミノ酸の長さである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１５  配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｐは、ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ；ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ、及びｆ）（抗体断片）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで
各Ｂは独立に塩基性アミノ酸、好ましくはリジン又はアルギニンであり；
各Ｘは独立に非塩基性アミノ酸、好ましくは疎水性アミノ酸であり；
各ｍは独立に０〜５の整数であり；
各ｎは独立に１〜１０の整数であり；
そして各ｐは独立に０〜５の整数である、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
各Ｘは、独立にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、又はチロシンである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｐは、式ｃ）のアミノ酸配列を含む、請求項６又は７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｐは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｐは、式ｄ）のアミノ酸配列を含む、請求項６又は７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｐは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ1’は、Ｒ1とＰとの結合により得られ、Ｒ2’はＲ2とＮとの結合により得られ、Ｒ1とＲ2は、＝Ｏ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ3、ＳＲ3、−ＮＨＲ3、及び−ＯＲ3から独立に選択され、ここでＲ3は、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、アシル、−ＯＲ4、−Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ4、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ4）2、−Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ4Ｒ5、−ＮＲ4Ｒ5、−Ｎ（＋）Ｒ4Ｒ5Ｒ6、−ＳＲ4、又はＳｉＲ4Ｒ5Ｒ6であり、ここでＲ4、Ｒ5、及びＲ6は独立に、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールであり、ここでＲ4とＲ5はこれらが結合している窒素原子と場合により結合して、４〜６個のメンバーを有し、場合により２つ又はそれ以上のヘテロ原子を有する置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル環を形成する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
ｚは、１〜２０の整数、好ましくは１〜１０である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
ＰとＮとを一緒に連結するＰＥＧ系リンカーは、式ＩＩＩ：
【化２】
2009519033.tif 000020
（式中、ｚは１〜１００の整数、好ましくは１〜５０である）
を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物は、式Ｖ：
【化３】
2009519033.tif 000021
｛式中、
ｚは、１〜１００の整数、好ましくは１〜５０であり；
ｋは、１〜２５０の整数、好ましくは１〜１００であり；
ＸはＨ、ＣＯ（ＣＨ3）、任意のアミノ酸、又はアミノ酸配列であり、
ＹはＨ、ＯＨ、ＮＨ2、任意のアミノ酸、又はアミノ酸配列であり、及び
Ｘ又はＹの１つは細胞貫通ペプチドである｝
を有することを特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
ＲＮＡは、配列標的特異的ＲＮＡ干渉を指令する標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な配列を有するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ誘導体である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ誘導体と標的ｍＲＮＡ配列との配列同一性は、８０％より大きく、好ましくは９０％より大きい、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
ｍＲＮＡは、成長タンパク質、癌遺伝子にコードされるタンパク質、腫瘍抑制タンパク質、転写因子、酵素、ハウスキーピングタンパク質、細胞骨格タンパク質、受容体関連タンパク質、サイトカイン、血管形成タンパク質、成長因子タンパク質、又は病原性関連タンパク質よりなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列をコードする、請求項１７又は１８に記載の化合物。
【請求項２０】
ｍＲＮＡは、ＶＥＧＦのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をコードする、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
ｓｉＲＮＡは、１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
核酸にＰＥＧ系リンカーを結合させる工程、及び次にＰＥＧ系リンカー−核酸結合体に細胞貫通ペプチドを結合させる工程を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物の調製法であって、該ＰＥＧ系リンカーは、式ＩＩ：
【化４】
2009519033.tif 000022
（式中、
ｚは１〜１００の整数、好ましくは１〜５０であり、及び
Ｒ1とＲ2は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールから独立に選択される２価有機基である）
を有する前記方法。
【請求項２３】
細胞貫通ペプチドと核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ誘導体を一緒に結合させるためのＰＥＧ系リンカーの使用であって、該ＰＥＧ系リンカーは、式ＩＩ：
【化５】
2009519033.tif 000023
（式中、
ｚは１〜１００の整数、好ましくは１〜５０であり、及び
Ｒ1とＲ2は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールから独立に選択される２価有機基である）
を有する前記使用。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物と場合により医薬として許容される担体とを含む組成物。
【請求項２５】
細胞増殖及び／又は分化性障害、骨代謝に関連する障害、免疫障害、造血障害、心血管障害、肝障害、腎障害、筋肉障害、神経障害、血液障害、ウイルス疾患、疼痛又は代謝障害、から選択される障害を治療又は予防ための、好ましくは癌を治療するための、薬剤の製造のための請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２６】
Ｒ1は、マレイミド基、不飽和アルキル基、ＳＲ3、又は遊離チオール成分よりなる群から選択される、請求項１２、２１又は２２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、細胞貫通ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用する核酸の送達に関する。さらに詳しくは、本発明は、インビトロ及びインビボで細胞への該核酸の効率的な送達を可能にする細胞貫通ペプチド−核酸結合体に関する。
【０００２】
ヒトゲノム配列から現在利用できる遺伝情報は、遺伝障害又は疾患（例えば癌）を治療するために遺伝子又はそのタンパク質生成物の機能を調節する特定の物質を設計するのに使用される。遺伝子発現を操作するために多くの方策が開発されている：遺伝子治療、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、又は小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はＲＮＡｉ）。しかしこれらの方策は、体細胞又は培養細胞への遺伝物質の比較的非効率的な送達により妨害される。核酸を細胞に送達する方法には、微量注入法、電気穿孔法、粒子衝撃法、ウイルス系（例えばレトロウイルス及びアデノウイルス）又は非ウイルス系（例えば、陽イオン性リポソーム、陽イオン性脂質、コレステロール、又はポリマー、樹状細胞、又は細胞貫通ペプチド）を使用するトランスフェクションがある（Ｌｏｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．５８：２３７−２５１（２００４））。これらの方法のすべてに、一般に送達の効率、インビボで生物学的作用を示すために標的細胞若しくは臓器に送達される核酸の低濃度、輸送される核酸のサイズが限定される可能性、安全性問題、及び／又は生産スケールアップの困難性について限界がある。すなわち核酸送達系のさらなる開発に関して大きな関心が持たれている。
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が相同的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解を誘導する自然のプロセスである。小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、転写後に遺伝子発現をサイレンスさせる強力な手段である（Ｈａｒｍｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−２５１（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−７４７（２００２）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ａｇａｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：８２９−８３４（２００２））。ＲＮＡｉはＲＮａｓｅＩＩＩダイサー（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  Ｄｉｃｅｒ）と呼ぶ酵素による２本鎖ＲＮＡの２１〜２３ヌクレオチドの小干渉性ＲＮＡへのＡＴＰ依存性のプロセシング切断である。これらのｓｉＲＮＡは種々のタンパク質因子に取り込まれ、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する（Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３−２９６（２０００））。ｓｉＲＮＡ２本鎖のＡＴＰ依存性の巻き戻しは活性複合体ＲＩＳＣ＊を生成する（星印は複合体の活性コンフォメーションを示す）。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に支配されて、ＲＩＳＣ＊は、エンドリボヌクレアーゼの助けにより細胞質中の相補的ｍＲＮＡを認識し切断する。
【０００４】
アンチセンスＲＮＡ又は核酸ベースの方策におけるようなｓｉＲＮＡ応用の大きな限界は、核酸の細胞内取り込みの悪さと細胞膜の透過性が低いことである（Ｌｕｏ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７（２０００）；Ｎｉｉｄｏｍｅ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：９９１−９９８（２００２））。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、脂質ベースの調製物を使用して古典的な実験室培養細胞株で行われるが、多くの細胞株にとってｓｉＲＮＡ送達は大きな課題であり、インビトロ応用のための効率的方法を改良すべきニーズがいまだに存在する（Ｒｏｚｅｍａ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｔａｒｇｅｔ  ２：２５３−２６０（２００３））。
【０００５】
共有結合アプローチ又は混合（複合体）アプローチを使用して、インビトロ及びインビボの両方でオリゴヌクレオチドの送達を改良するためのいくつかのペプチドベースの方策が、開発されている（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：４６１−４６６（２０００）；Ｊａｒｖｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ９：３９５−４０２  （２００４）；Ｇａｉｔ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１−１０（２００３））。これらの方策の中で、いくつかのペプチドへの核酸の結合は、ペプチド−核酸複合体と比較して、細胞内送達を増強することができる（Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：１３２−１３６（２００５））。しかし現在、送達効率が向上したＣＰＰ−核酸結合体の合成と生物学的性質に大きな関心が持たれている。
【０００６】
本発明に至った研究の枠内で本出願人は、ＣＰＰとｓｉＲＮＡとの間に異なるリンカー基を使用して、細胞貫通ペプチド−小干渉性ＲＮＡ結合体を調製した。次にＣＰＰに結合したｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの取り込み効率と得られるｓｉＲＮＡ活性について、インビトロとインビボで評価した。
【０００７】
ペプチド−オリゴヌクレオチド結合体の合成については多くの方法が報告されており、例えばＺｕｂｉｎらの総説がある（Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７１：２３９−２６４（２００２））。しかし多くの場合、液相で塩基性アミノ酸リッチなペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させようとすると、２つの成分の静電的相互作用により引き起こされる多量の沈殿のために反応が進まない。
【０００８】
Ｃｈｉｕら（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：１１６５−１１７５（２００４））は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質内のアミノ酸４７〜５７に対応する１１個のアミノ酸の陽イオン性配列に結合したｓｉＲＮＡを使用して、細胞に機能性ｓｉＲＮＡを送達できると報告している。ｓｉＲＮＡ−ＴＡＴペプチド結合体は、２１ヌクレオチドの５’Ｃｙ３−標識センス鎖ｓｉＲＮＡを３’−Ｎ３修飾アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡにアニーリングすることにより作成された。次に３’−Ｎ３修飾を有する２本鎖ｓｉＲＮＡを、ヘテロ２官能性架橋剤であるスルホスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレートとインキュベートした。この工程中に、架橋剤のＮＨＳエステル基がｓｉＲＮＡの３’末端の１級アミノ基と反応した。ＴＡＴ（４７−５７）ペプチド又はＴＡＴ（４７−５７）由来オリゴカルバメートの３’末端に付加されたシステイン残基をｓｉＲＮＡ結合のために使用し、この間、架橋剤のマレイミド基はペプチドのシステイン残基のスルフヒドリル基と反応した。
【０００９】
ＭｕｒａｔｏｖｓｋａとＥｃｃｌｅｓ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５５８：６３−６８（２００４）  ａｎｄ  Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６６：３１７（２００４））は、細胞貫通ペプチドであるペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）とトランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）とを使用して原形質膜を介する送達によりｓｉＲＮＡを細胞の細胞質に直接標的化するための結合体を記載した。この著者らはジスルフィド結合ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡの合成を報告した。
【００１０】
Ｍｏｕｌｔｏｎら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１５：２９０−９（２００４））は、アルギニンリッチなペプチドに結合したアンチセンスモルホリノオリゴマーの細胞内取り込みを評価した。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）に結合したペプチドの細胞内分布と濃度に対するリンカーの作用はまた、以下の２官能性架橋剤を用いて評価された：Ｎ−［イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシニミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリルオキシ］スクシニミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−［カッパ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシニミドエステル（ＫＭＵＳ）、スクシニミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−スクシニミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシニミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣＳＰＤＰ）。より長いリンカーを用いてペプチドに結合した時、ＰＭＯのアンチセンス活性が上昇することが証明された。従って、（ＣＨ2）n成分のより長い鎖を有する結合体のアンチセンス活性がより高いことが、より短いリンカーを有するものより柔軟性が高く及び／又は疎水性が大きいことの結果であると推測された。さらに結果は、送達ペプチドが切断可能リンカー（ジスルフィドリンカー）と比較して、切断不可能リンカー（チオマレイミドリンカー）を有するＰＭＯの細胞内分布に対してより大きな影響を有することを示す。
【００１１】
米国仮特許出願第２００４／０１４７０２７号は、２本鎖リボ核酸分子、細胞貫通ペプチド、及び２本鎖リボ核酸分子を細胞貫通ペプチドに連結する共有結合を含む複合体を開示する。細胞貫通ペプチドとリボ核酸分子の修飾鎖を連結する結合は、ジスルフィド結合、エステル結合、カルバメート結合、又はスルホネート結合でもよい。
【００１２】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ０４／０４８５４５は、スルホスクシニミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート架橋剤（スルホ−ＳＭＰＢ）を使用して、ＴＡＴペプチド４７−５７と架橋したｓｉＲＮＡを記載する。
【００１３】
Ｚａｎｔａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：９１−６（１９９９））は、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）をリンカーとして使用して、１つの核局在化シグナルペプチドをキャップされたＣＭＶルシフェラーゼオリゴヌクレオチドに連結し、インビトロで細胞をトランスフェクトした。
【００１４】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０５３０２は、輸送ペプチド（例えばトランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）又はペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ））に連結した核酸類似体（例えばアンチセンス分子）を開示し、これは脂質膜を介する輸送を行い、次に核酸類似体を細胞内ポリヌクレオチドに提示し、こうして２本鎖又は３本鎖構造体が形成される。ハイブリダイズ性核酸類似体と輸送ペプチドは、細胞内環境で不安定な結合により結合され、従ってハイブリダイズ性核酸類似体が、切断、放出され、こうして核酸類似体とペプチド成分が物理的に分離される。不安定な結合の例はジスルフィド結合であり、内因性細胞内酵素又は還元剤（例えばグルタチオン又はＮＡＤＰＨ）に暴露されると、ジスルフィド結合は破壊又は切断され、ペプチドと核酸類似体成分が分離される。
【００１５】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０６６０６９は、治療薬を送達するのに適した親水性ポリマー、例えばポリオキサゾリン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を開示する。本出願のポリマーは以下で示される：Ｒ1−Ｘ−Ｒ2［ここでＸは親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）であり、Ｒ1は治療薬（例えば核酸）であり、Ｒ2は、ポリマーと治療薬の細胞への侵入を促進する膜融合成分でもよい］。この出願に記載されたＰＥＧリンカーは、アミン基と反応する酸性カルボキシル成分を含む。アミン基を含有するリジン、アスパラギン又はアルギニンアミノ酸を含むかかる完全に脱保護されたアミノ酸配列の使用は、各ペプチド（例えば、位置異性体、ポリマー）に結合した複数オリゴヌクレオチド−ＰＥＧ基を含有する生成物の異種混合物を与えるであろう。これらのアミノ酸配列へのオリゴヌクレオチド−ＰＥＧ成分の共有結合はまた、ペプチドに必須のペプチドの電荷を低下させ、従ってオリゴヌクレオチドの細胞内送達を低下させるであろう。またかかる異種生成物の生成は、治療薬開発に適合しない。保護されたアミノ酸配列が直面する問題は以下の通りである：１）アミノ酸の保護によりペプチドの電荷が低下し、従ってペプチドの細胞内送達が低下する；２）保護により、アミノ酸配列の溶解度が低下する；３）保護には結合体の調製のための補助工程が必要である。
【００１６】
Ｂｏｎｏｒａら（ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ，ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏｓ  ５−８，ｐｐ  １２５５−１２５７（２００３））は、オリゴヌクレオチド−ＰＥＧ−ペプチド結合体の作成のための繰り返しアプローチによる合成法を記載する。しかし１０アミノ酸より長いアミノ酸配列又は１０ヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチド配列を含有する結合体の合成のためにこの方法を適用することは、そのような方法の低収率のために困難であろう。さらにこの方法は、複数のオリゴヌクレオチド−ＰＥＧ−ペプチド結合体を平行してスクリーニングするコンビナトリアルアプローチを可能にしない。
【００１７】
本発明は、インビボ応用、特にヒトの治療的応用に重要な性質が、核酸、オリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ分子活性が犠牲になることなく改良されるように、オリゴヌクレオチド又は特異的ｓｉＲＮＡ分子のような核酸分子を、親水性ポリマー（好ましくはポリエチレングリコール系リンカー）を用いて、細胞貫通ペプチドに結合することができるという発見に基づく。
【００１８】
本発明の目的は、インビトロとインビボの両方で細胞への改良された送達効率を有する新しい細胞貫通ペプチド−核酸結合体である。
【００１９】
本目的は、式Ｐ−Ｌ−Ｎ（ここでＰは細胞貫通ペプチドであり、Ｎは核酸、好ましくはオリゴヌクレオチド、さらに好ましくはｓｉＲＮＡであり、ＬはＰとＮとを連結するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである）の細胞貫通ペプチド−核酸（「ＣＰＰ−核酸」）結合体を使用することにより達成される。
【００２０】
本発明において、式Ｉ：
【００２１】
【化１】
2009519033.tif 000003
【００２２】
（式中、
Ｐはチオール成分をさらに含む細胞貫通ペプチドであり、好ましくは成分はシステイン又はシステアミン残基であり、
Ｎは核酸、好ましくはオリゴヌクレオチド、さらに好ましくはｓｉＲＮＡであり、
Ｒ1’とＲ2’は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールから独立に選択される２価有機基であり；
ｚは１〜１００の整数、好ましくは１〜５０、例えば１〜２０、さらに好ましくは１〜１０である）の化合物が提供される。
【００２３】
Ｒ1’はＲ1とＰとの結合により得られ、Ｒ2’は、Ｒ2とＮとの結合により得られる。特にＲ1’はＲ1とＰとの反応により得られ、かかる反応は、結合さらに詳しくはこの２つの基の間に化学結合を形成してＲ1’−Ｐの形成を可能にし、Ｒ2’は、Ｒ2とＮとの反応により得られ、かかる反応は結合さらに詳しくはこの２つの基の間化学結合を形成してＲ2’−Ｎの形成を可能にする。
【００２４】
Ｒ1とＲ2は、より正確には以下で特に式（ＩＩ）に関連して定義される。
【００２５】
用語「結合体」又は「結合した」は、分子の成分が一緒に維持され、近傍に維持される、共有相互作用、イオン相互作用、又は疎水性相互作用を意味する。
【００２６】
用語「反応した」は、化学の分野の当業者にとって通常の意味を有する。
【００２７】
用語「リンカー」又は「架橋剤」は本明細書において同義で使用され、細胞貫通ペプチド、標識物、修飾物質安定化基などの成分に核酸又は核酸類似体を結合させる鎖を含む１つ又はそれ以上の原子を意味する。
【００２８】
用語「インビトロ」は当該技術分野で認識されている意味を有し、例えば精製された試薬又は抽出物（例えば細胞抽出物）を含む細胞培養を意味する。
用語「インビボ」もまた当該技術分野で認識されている意味を有し、例えば不死化された細胞、初代細胞、細胞株、及び／又は生体中の細胞を意味する。
【００２９】
用語「ペプチド」は、アミノ酸のポリマーを意味し、その慣習的書き方は、Ｎ（アミノ）末端を左に、Ｃ（カルボキシル）末端を右に書く。２０個の最も一般的は天然のＬ−アミノ酸は３文字又は１文字コードで記載される。本明細書においてペプチドは、Ｌ−アミノ酸側鎖又はアルファアミノ酸骨格への１つ又はそれ以上の修飾を含む構造修飾である「ペプチド類似体」を含むと考えられる。骨格修飾ペプチド類似体の例は、Ｎ−メチルグリシン「ペプトイド」である（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６−４７（１９９２））。
【００３０】
用語「細胞貫通ペプチド」（ＣＰＰ）は、生体膜又は生理学的バリアを通過することができるキャリアーペプチドとして定義される。細胞貫通ペプチドはまた細胞透過性ペプチド、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）又は膜移動配列（ＭＴＳ）とも呼ばれる。ＣＰＰはインビトロ及び／又はインビボで哺乳動物細胞膜を移動させ、細胞に侵入する能力を有し、目的の結合化合物（例えば薬剤又はマーカー）を所望の細胞目的、例えば細胞質（サイトゾル、小胞体、ゴルジ体など）又は核に向ける。従ってＣＰＰは目的の化合物がリン脂質、ミトコンドリア、エンドソーム、又は核膜を通過することを指令又は促進する。ＣＰＰはまた目的の化合物を、細胞の外から原形質膜を介して細胞質又は所望の細胞内の位置（例えば、核、リボゾーム、ミトコンドリア、小胞体、リゾチーム、又はペルオキシダーゼ）に向けることができる。あるいは又はさらに、ＣＰＰは目的の化合物を血液脳関門、経粘膜バリア、血液網膜バリア、皮膚バリア、消化管及び／又は肺バリアを通過するように指令することができる。
【００３１】
生物膜又は生理学的バリアの通過は、種々の方法、例えば培養細胞の存在下でマーカーに結合したＣＰＰの第１のインキュベーション工程、次に固定工程、次に細胞内のマークした細胞の存在の証明、を含む細胞貫通試験により測定することができる。別の実施態様においてこの証明工程は、ＣＰＰに対する標識された抗体の存在下でＣＰＰをインキュベートし、次に細胞質内又は細胞核のすぐ近傍又はその中でＣＰＰのアミノ酸配列と標識抗体の間の免疫反応を検出することにより行われる。証明はまた、ＣＰＰ中のアミノ酸配列にマークをして、細胞コンパートメント中でマークの存在を検出することにより行うこともできる。細胞貫通試験は当業者に公知である。しかし例えば、細胞貫通試験は、上記特許出願ＷＯ９７／０２８４０に記載された。
【００３２】
いくつかのタンパク質とそのペプチド誘導体が細胞インターナリゼーション性を有することが発見されており、特に限定されないが、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）タンパク質Ｔａｔ（Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，１−８（１９８９）、ヘルペスウイルス外被タンパク質Ｖｐ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８，２２３−２３３（１９９７））、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のアンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）のホメオティック（ｈｏｍｅｏｔｉｃ）タンパク質（ＣＰＰはペネトラチンと呼ばれる）（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１８１８８−１８１９３（１９９６））、プロテグリン１（ＰＧ−１）抗微生物ペプチドＳｙｎＢ（Ｋｏｋｒｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３２７，２３１−２３６（１９９３））、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（Ｊａｎｓ，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．８，８４１−８４７（１９９４））がある。多くの他のタンパク質やペプチド誘導体が、同様の細胞インターナリゼーション性を有することがわかっている。これらのタンパク質から得られるキャリアーペプチドは、互いにほとんど配列相同性を示さないが、すべて陽イオン性が高く、アルギニン又はリジンリッチである。実際合成ポリアルギニンペプチドは、高レベルの効率でインターナリゼーションされることが証明されている（Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１６，２６０−２６４（２００３）；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１））。
【００３３】
ＣＰＰは任意の長さでよい。例えばＣＰＰは、５００、２５０、１５０、１００、５０、２５、１０、又は６アミノ酸未満であるか又はこれに等しい長さである。例えばＣＰＰは、４、５、６、１０、２５、５０、１００、１５０、又は２５０アミノ酸より大きいか又はこれと等しい長さである。ＣＰＰの適切な長さと設計は、当業者が容易に測定することができる。ＣＰＰについて一般的文献として以下が引用される：ＣＥＬＬ  ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮＧ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、ＵＩｏ  Ｌａｎｇｅｌ編（２００２）；又はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：４８９−６６０（２００５）；又はＤｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｂａｈｒ，Ｍｏｌｌ  Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７：８５−１３１（２００４）。
【００３４】
好適な実施態様においてＣＰＰは、４、５、６、７、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸の長さである。
【００３５】
本発明の細胞貫通ペプチドは、特に限定されないが、以下に記載のもの又はその変種がある。「変種」は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％〜９９％同一である。例えばペプチドは、１、２、３、４、又はそれ以上の残基で置換基を有することができる。ＣＰＰは天然の型（上記したように）又はポリマー型（ダイマー、トリマーなど）で使用することができる。
【００３６】
【表１Ａ】
2009519033.tif 000004
【００３７】
【表１Ｂ】
2009519033.tif 000005
【００３８】
必要であれば、ＣＰＰを、向上したインビボ安定性、バイオアベイラビリティ、及び／又は生物活性を有する薬剤候補に変換するために、いくつかの周知の化学的方策を使用することができ、例えば：
【００３９】
−  エキソペプチダーゼ分解を防ぐためのＮ末端及びＣ末端修飾：
○  Ｃ末端アミド化
○  Ｎ末端アセチル化はペプチドの親油性を上昇させる、
−  ジスルフィド結合を形成することによる環化、
−  エンドペプチダーゼ分解を防ぐためのアミド窒素のアルキル化、
−  エンドペプチダーゼの認識部位を修飾するための非天然アミノ酸の導入（２−メチルアラニン、アルファ−ジアルキル化グリシン、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、グアニジノ又はアミジノ骨格・・・）、
−  ＣＰＰアミノ酸配列への非遺伝的コード化されたアミノ酸の取り込み（グリシン又はフェニルアラニンのメチル化、ハロゲン化、又は塩素化）、
【００４０】
−  一部の又はすべてのＬ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸又はベータアミノ酸類似体による置換。このようなペプチドは、「インベルソ（ｉｎｖｅｒｓｏ）」又は「レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」型として合成され、すなわち配列のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換するか、又はアミノ酸の配列を逆転させてＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換することにより合成される。構造的にレトロインベルソペプチドは、単純なＤ−類似体より元々のペプチドに非常に類似している。Ｄ−ペプチドは、ペプチダーゼに対して実質的により耐性であり、従ってＬ−ペプチド体と比較して血清や組織中でより安定である。好ましい実施態様において、Ｌ−アミノ酸を含有するＣＰＰは１つのＤ−アミノ酸でキャップされてエキソペプチダーゼ破壊を阻害する、
−  ＣＰＰ由来オリゴカルバメートの合成；オリゴカルバメート骨格は、比較的剛性のカルバメート基を介して連結されたキラルエチレン骨格からなる（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３−１３０５（１９９３））。
【００４１】
別の実施態様において、ＣＰＰは、連続性又は非連続的な塩基性アミノ酸又はアミノ酸類似体、特にグアニジル又はアミジニル成分を含有する。用語「グアニジル」及び「グアニジン」は同義で使用されて、式−ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ2）ＮＨ（非プロトン化型）を有する成分を意味する。例として、アルギニンはグアニジル（グアニジノ）成分を含有し、２−アミノ−５−グアニジノ吉草酸又はａ−アミノ−６−グアニジノ吉草酸とも呼ばれる。用語「アミジニル」と「アミニジノ」は同義で使用され、式−Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）を有する成分を意味する。「塩基性アミノ酸又はアミノ酸類似体」はｐＫａが１０より大きい。好適な高塩基性のアミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、及び／又はリジンである。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明のＣＰＰは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、５、６、７、８、９、１０個の塩基性アミノ酸又はアミノ酸類似体、特にリジン又はアルギニンを含む。
【００４３】
より好ましい実施態様では、ＣＰＰは、さらに、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（繰り返し二糖単位を含む長い非分岐状分子）、又は特にヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、若しくはコンドロイチン硫酸、及びこれらの誘導体に、反応又は結合する能力が特徴である。「ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はコンドロイチン硫酸誘導体」又は「グリコサミノグリカン」は、文献に引用された刊行物中に定義される任意の生成物又はサブ生成物を意味すると理解される（Ｃａｒｄｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ９：２１（１９８９）；Ｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３６５（１９９２）；Ｄａｖｉｄ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：１０２３（１９９３））。
【００４４】
ＣＰＰがグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に反応／結合する能力は、当該技術分野で公知の直接又は間接グリコサミノグリカン結合アッセイ、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ００／４５８３１に記載されたペプチドグリコサミノグリカン結合についての親和性同時電気泳動（ＡＣＥ）アッセイのような方法により、測定することができる。当該技術分野で公知のいくつかの他の方法が、ＧＡＧ−ペプチド相互作用を分析するのに適しており、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／６４７３８又はＷｅｉｓｇｒａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｉｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２（３３）：１１０９７−１０３）（アポリポタンパク質Ｂ−１００を用いる具体例）に記載された方法；又は修飾ＥＬＩＳＡ試験：９６ウェルプレートを特異的ＧＡＧ（コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、及びＣ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ケラチン硫酸、シンデカン）で被覆し、次にマーカーに結合したペプチドがある時間加えられ、充分洗浄後、マーカーに関連する特異的分析を使用してペプチド結合を測定する、がある。
【００４５】
インビトロ及び／又はインビボでグリコサミノグリカンに結合できるＣＰＰは、特許出願ＷＯ０１／６４７３８及びＷＯ０５／０１６９６０、及びＤｅ  Ｃｏｕｐａｄｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３９０：４０７−１８（２００５））に記載されている。これらのペプチドは、ヒトヘパリン結合タンパク質に由来するアミノ酸配列、及び／又は以下から選択される抗ＤＮＡ抗体である：リポタンパク質、例えばヒトアポリポタンパク質Ｂ又はＥ（Ｃａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｓｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５４：７４１（１９８８））、アルギニン（Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：１６６３−１６７２（１９９６））、インスリン成長因子結合タンパク質（Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２２８０−２２８５（１９９７））、ヒト血小板由来増殖因子（Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２２５１−２２５３（１９８９））、ヒト細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ２６９：８９−９２（１９９０））、ヒトヘパリン結合表皮増殖因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ａｒｋｏｎａｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４４００−４４０５（１９９８））、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．３４３：９２（１９９７））、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｙａｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ６４：８４１−８４８（１９９１））、ヒト小腸粘膜ムチン２配列（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｎｊｕｇ  Ｊ．１３：８１−９０（１９９６））、ヒトガンマインターフェロン（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ  ＆  Ｇｒｉｍａｕｄ，ＦＥＢＳ  ２８０：１５２−１５４（１９９１））、ヒトインターロイキン１２のサブユニットｐ４０（Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１０６４−１０７０（１９９９））、間質細胞由来因子１−アルファ（Ａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２００−２０４（１９９９））、ヒト好中球由来「ヘパリン結合タンパク質」（ＣＡＰ３７／アズロシジン）（Ｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ２７２：２００−２０４（１９９０））、抗ＤＮＡマウスモノクローナル抗体Ｆ４．１のＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３のような免疫グロブリン分子（Ａｖｒａｍｅａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５６０１（１９９８））、ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴＴ７９の超可変ＣＤＲ３領域（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：８０９（１９９３））、ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−Ｉの超可変領域ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：５３３（１９９３））、ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＲＴ７２の超可変領域ＣＤＲ３（Ｋａｌｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｕｐｕｓ  ４：３７５（１９９５））。
【００４６】
より好ましい実施態様では、ＣＰＰは、ａ）（ＸＢＢＢＸＸＢＸ）ｎ；ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ；ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ；ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ；ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ、及びｆ）（抗体断片）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで各Ｂは独立に塩基性アミノ酸、好ましくはリジン又はアルギニンであり；各Ｘは独立に非塩基性アミノ酸、好ましくは疎水性アミノ酸、例えばアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、又はチロシンであり；各ｍは独立に０〜５の整数であり；各ｎは独立に１〜１０の整数であり；そして各ｐは独立に０〜５の整数である。ある実施態様においてｎは２又は３であり、Ｘは疎水性アミノ酸でもよい。抗体断片は、完全長免疫グロブリンポリペプチドより小さいものを含み、例えば重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、Ｆｖ、又はＦｃを意味する。抗体は、例えばヒト又はマウスでもよい。好ましくは、抗体は抗ＤＮＡ抗体である。好ましくは、抗体断片は、抗体のＣＤＲ２領域のすべて又は一部、特に抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ２領域の少なくとも６又は１０アミノ酸の長さの部分を含む。あるいは抗体は、抗体のＣＤＲ３領域のすべて又は一部、特に抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲ３領域の少なくとも６又は１２アミノ酸の長さの部分を含む。さらに詳しくは抗体断片は、抗ＤＮＡヒト抗体（例えばＲＴＴ７９、ＮＥ−１、及びＲＴ７２）の少なくとも１つのＣＤＲ３領域を含む。かかる抗体断片はＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０７４１４に記載されている。さらに好ましくは抗体は、細胞タイプ特異的核酸送達を行うための特異的リガンド認識性（標的化）を有する。
【００４７】
好ましくは、本発明のＣＰＰは、ヒトタンパク質に由来することがさらなる特徴である（すなわち、天然にヒト細胞により発現されるタンパク質）。すなわち非ヒトタンパク質から得られるＣＰＰと比較してヒトタンパク質から得られるＣＰＰの特徴は、その免疫原性が避けられるか又は低下しているため、これらのＣＰＰの予定の用途についての主要な関心である。さらにＤｅ  Ｃｏｕｐａｄｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３９０：４０７−１８（２００５））はヒト由来ペプチドが、Ｔａｔペプチドのような既存のキャリアーペプチドとは異なり、治療用送達系としての使用に一致する低いインビボ毒性プロフィールを有することを証明した（Ｔｒｅｈｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｒｋｌｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５８，２０９−２２３（２００４））。
【００４８】
上記ＣＰＰの中では、細胞質中に特異的に貫通できるものが好ましい。細胞質へのＣＰＰの貫通は、当業者に公知の種々のインビトロの方法により測定できる：例えばＣＰＰを細胞とともにインキュベートし；次に、特異的抗ＣＰＰ標識抗体と特異的抗細胞質タンパク質標識抗体の存在下で細胞をインキュベートし、次にＣＰＰと標識抗体との免疫反応を細胞質中で検出する。別の方法は、ＣＰＰをコロイド金に結合させて、結合体を細胞とインキュベートする。次に細胞を電子顕微鏡用に普通に処理して、細胞内局在化を観察する。
【００４９】
従って、ヒトヘパリン結合タンパク質から得られ、標的細胞の細胞質に特異的に貫通できる好ましいＣＰＰは、以下よりなる群から選択される：
【００５０】
−  ＤＰＶ３（配列番号２）：ヘパリンと反応するＣＰＰであり、ヒト細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）の配列のＣ末端部分から得られるペプチドのダイマー（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  ２６９：８９−９２（１９９０））。これは式ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ（ここでｍ＝０、ｐ＝０，及びｎ＝１である）のアミノ酸配列を含む；
【００５１】
−  ＤＰＶ６（配列番号３）：ヘパリンと反応し、ヒト血小板由来増殖因子のＡ鎖のＣ末端部分のアミノ酸配列から得られるＣＰＰ（Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２２５１−２２５３（１９８９））。これは式ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ（ここでｍ＝０、ｐ＝０，及びｎ＝１である）のアミノ酸配列を含む；
【００５２】
−  ＤＰＶ７（配列番号４）とＤＰＶ７ｂ（配列番号５）：ヘパリンと反応し、ヒトヘパリン結合の上皮増殖因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の配列のＣ末端部分から得られるＣＰＰ（Ａｒｋｏｎａｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４４００−４４０５（１９９８））。両方ＣＰＰとも、ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ（ここでｍ＝０、ｐ＝０，及びｎ＝１である）のアミノ酸配列を含む；
【００５３】
−  ＤＰＶ１０（配列番号１０）：ヘパリンと反応し、ヒト小腸ムチン２配列のＣ末端部分に対応するＣＰＰ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｎｊｕｇ  Ｊ．１３：８１−９０（１９９６））。これは式ｅ）（ＢＸＢＢ）ｎ（ここでｎ＝１である）のアミノ酸配列を含む；
【００５４】
−  ＤＰＶ３／１０（配列番号６）：ヘパリンと反応し、ヒト細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）（上記）の配列のＣ末端部分とヒト小腸ムチン２配列（上記）のＣ末端部分から得られるＣＰＰ。これは式ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ（ここでｍ＝１、ｐ＝１，及びｎ＝１である）のアミノ酸配列を含む；
【００５５】
−  ＤＰＶ１０／６（配列番号７）：ヘパリンと反応し、ヒト小腸ムチン２配列（上記）のＣ末端部分と血小板由来増殖因子（上記）のＡ鎖のＣ末端部分から得られるＣＰＰ。これは式ｃ）（ＢＢＸｍＢＢＸｐ）ｎ（ここでｍ＝１、ｐ＝１，及びｎ＝１である）のアミノ酸配列を含む；
【００５６】
−  ＤＰＶ１０４７（配列番号８）：ヘパリンと反応し、ヒトリポタンパク質Ｂ（Ｃａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｓｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５４：７４１（１９８８））のアミノ酸配列（３３５８〜３３７２）及びヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体ＮＥ−１（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：５３３（１９９３））の超可変領域ＣＤＲ３に対応するペプチドの配列から得られるＣＰＰ。これは式ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）ｎ（ここでｎ＝１である）のアミノ酸配列、式ｂ）（ＸＢＢＸＢＸ）ｎ（ここでｎ＝１である）の及び抗体断片又はアミノ酸配列を含む；
【００５７】
−  ＤＰＶ１５ｂ（配列番号１１）：ヘパリンと反応し、「ヘパリン結合タンパク質」（ＣＡＰ３７）の配列の一部を含むＣＰＰ。これは式ｄ）（ＸＢＢＸＸＢＸ）が２回繰り返されたアミノ酸配列を含む。
【００５８】
好適な実施態様において、１つのシステイン残基がＣＰＰのアミノ酸配列、好ましくはＣ末端又はＮ末端に加えられる。システイン残基は遊離スルフヒドリル基を提供し、本発明のＰＥＧ系リンカーへのＣＰＰの結合を可能にする。
【００５９】
用語「親水性ポリマー」は、水に対する親和性を有する任意のポリマーを意味する。これは一般に極性基を含む。親水性ポリマーは当業者に公知である；これらは、ポリアルキルグリコール、多糖、ポリオール、ポリカルボキシレート、又はポリ（ヒドロ）エステル、及び具体的にはポリエチレングリコール又はポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ｐＨＰＭＡ）を含む。
【００６０】
本明細書において用語「ポリエチレングリコール系リンカー」又は「ＰＥＧ系リンカー」は、式ＩＩ：
【００６１】
【化２】
2009519033.tif 000006
【００６２】
の構造を有する架橋剤を意味する。
【００６３】
式中、
ｚは１〜１００、好ましくは１〜５０、例えば１〜２０、さらに好ましくは１〜１０の整数である。
【００６４】
Ｒ1とＲ2は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールから独立に選択される２価有機基である。
【００６５】
好ましくは、Ｒ1とＲ2は、＝Ｏ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ3、ＳＲ3、−ＮＨＲ3、及び−ＯＲ3から独立に選択され、ここでＲ3は、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、アシル、−ＯＲ4、−Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ4、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ4）2、−Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ4Ｒ5、−ＮＲ4Ｒ5、−Ｎ（＋）Ｒ4Ｒ5Ｒ6、−ＳＲ4、又はＳｉＲ4Ｒ5Ｒ6である。記号Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は独立に、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、及び置換若しくは非置換アリールであり、ここでＲ4とＲ5はこれらが結合している窒素原子と場合により結合して、４〜６個のメンバーを有し、２つ又はそれ以上のヘテロ原子、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）成分を場合により含有する置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル環系を形成する。
【００６６】
より好ましくは、Ｒ1はチオール残基（例えばスルフヒドリル成分）に対して反応する官能基（これはマレイミド、ピリジルジチオ、クロロアセチル、ブロモアセチル、又はヨードアセチル官能基よりなる群から選択される）、遊離チオール成分、又はＳＲ3（上記したもの）、及び好ましくはマレイミド官能基又は不飽和アルキル基を含む。マレイミド官能基又は不飽和アルキル基は、ＣＰＰとＰＥＧ系リンカーの間で不可逆的チオエーテル結合を形成するのに有用である。ピリジルジチオ官能基は、可逆的ジスルフィド結合を形成するのに有用である。ブロモアセチル又はヨードアセチル官能基は、酸性条件下で加水分解性のチオエステル結合を形成するのに有用である。
【００６７】
より好ましくは、Ｒ1は、Ｐに属するチオール基に対して反応する官能基を含み、さらに詳しくはＲ1とＰの結合又は化学結合は、硫黄原子の存在を含む。
Ｒ2は好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）成分である。
【００６８】
本発明のＰＥＧ系リンカーは、チオール残基を有するＣＰＰと核酸とを一緒に連結するのに使用することができる。
【００６９】
有利には、本発明のＰＥＧ系リンカーは、柔軟性があり、非免疫原性であり、タンパク質分解酵素による切断を受けず、ＣＰＰ−核酸結合体の水性媒体中の溶解度を向上させる。
【００７０】
別の実施態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ核酸結合体の水性媒体中の溶解度を向上させる。
【００７１】
用語「アルキル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に明記しない場合は、直鎖若しくは分岐鎖、又は環状炭化水素基、又はこれらの組合せを意味し、これらは完全に飽和でも、モノ−、又はポリ不飽和でもよく、記載の数の炭素原子を有する２価及び多価の基を含むことができる（すなわち、Ｃ1〜Ｃ10は１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例には、特に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロペンチル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチルなどの同族体及び異性体がある。不飽和アルキル基は、１つ又はそれ以上の２重結合又は３重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例には、特に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、及び高次の同族体及び異性体がある。用語「アルキル」は特に明記しない場合は、「ヘテロアルキル」のように後述でより詳細に定義されるアルキルの誘導体を含む。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００７２】
用語「アルキレン」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に限定されないが、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−により例示されるように、アルカンから得られる２価の基を意味し、以下で「ヘテロアルキレン」として記載される基を含む。典型的にはアルキル（又はアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を含み、１０個又はそれ以下の炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、一般に８個又はそれ以下炭素原子を有する短鎖アルキル基又はアルキレン基である。
【００７３】
用語「ヘテロアルキル」はそれ自体で又は別の用語と組合せて、特に明記しない場合は、記載の数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、及びＳよりなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖又は分岐鎖、又は環状炭化水素基、又はこれらの組合せを意味し、ここで窒素、炭素、及び硫黄原子は場合により酸化されてよく、窒素ヘテロ原子は場合により４級化されてよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ、及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、又はアルキル基が分子の残りに結合している位置に置いてもよい。例としては特に限定されないが、−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ3、−Ｓｉ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ3、及びＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3がある。最大２つのヘテロ原子が連続してもよく、例えば−ＣＨ2−ＮＨ−ＯＣＨ3及び−ＣＨ2−Ｏ−Ｓ−（ＣＨ3）3がある。同様に用語「ヘテロアルキレン」はそれ自体で又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキルから得られる２価の基でもよく、例えば特に限定されないが、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−及び−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−がある。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた鎖の片方の端又は両端を占有してもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。用語「ヘテロアルキル」及び「ヘテロアルキレン」は、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体を包含する（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓカタログ、２００１参照）。さらにアルキレン及びヘテロアルキレン結合基について、結合基の式が記載されている方向は結合の配向を暗示しない。例えば式−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−は−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−−Ｒ’Ｃ（Ｏ）2−の両方を示す。
【００７４】
用語「アルキル」又は「ヘテロアルキル」と組合わされる用語「低級」は、１〜６個の炭素原子を有する成分を意味する。
【００７５】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）はその普通の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して分子の残りに結合したアルキル基を意味する。
【００７６】
一般に「アシル置換基」はまた、上記の基から選択される。本明細書中で使用するとき、用語「アシル置換基」は、本発明の化合物の多環式核に直接又は間接に結合したカルボニル炭素に結合し、その価を満たす基を意味する。
【００７７】
用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」は、それ自体で又は他の用語と組合せたとき、特に明記しない場合は、それぞれ置換若しくは非置換「アルキル」及び置換若しくは非置換「ヘテロアルキル」の環状体を意味する。さらにヘテロシクロアルキルについてヘテロ原子は、分子の残りに結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例には、特に限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどがある。ヘテロシクロアルキルの例には、特に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどがある。環状構造のヘテロ原子と炭素原子は場合により酸化される。
【００７８】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」はそれ自体で又は別の置換基の一部として、特に明記しない場合は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。さらに「ハロアルキル」という用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含む。例えば「ハロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル」は、特に限定されないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味する。
【００７９】
用語「アリール」は、特に明記しない場合は、互いに融合しているか又は共有結合している１つの環又は複数の環（好ましくは１〜３個の環）でもよい置換若しくは非置換多不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（又は環）を意味し、ここで窒素、炭素、及び硫黄原子は場合により酸化されてよく、窒素原子は場合により４級化されてよい。ヘテロアリール基はヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリールとヘテロアリール基の非限定例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルがある。
【００８０】
上記アリール及びヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、以下の許容される置換基の群から選択される。「アリール」及び「ヘテロアリール」はまた、１つ又はそれ以上の非芳香族環系がアリール又はヘテロアリール系に融合されるか、又はこれに結合される環系を包含する。
【００８１】
簡単に説明するために、用語「アリール」は他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）とともに使用されるとき、上記したアリール及びヘテロアリール環の両方を含む。
【００８２】
すなわち用語「アリールアルキル」は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど））で置換されたアルキル基を含むアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に、アリール基が結合している基を含むことを意味する。
【００８３】
上記用語のそれぞれ（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、及び「ヘテロアリール」）は、記載の基の置換型と非置換型の両方を含む。各タイプの基の好適な置換基は後述される。
【００８４】
アルキル及びヘテロアルキル基（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと呼ぶものも含む）の置換基は一般にそれぞれ「アルキル置換基」及び「ヘテロアルキル置換基」と呼ばれ、特に限定されないが、０〜（２ｍ’＋１）の数の−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’，−ＮＲ’Ｒ''、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ''Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ''、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ''Ｒ'''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ''）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−  Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ''、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、ＮＲＲ’ＳＯ2Ｒ''、−ＣＮ、及び−ＮＯ2（ここで、ｍ’はかかる基の炭素原子の総数である）から選択される種々の基の１つ又はそれ以上でもよい。Ｒ’、Ｒ''、Ｒ'''、及びＲ''''は、好ましくはそれぞれ独立に、水素、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ、若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む時、各Ｒ基は各Ｒ’、Ｒ''、Ｒ'''、及びＲ''''基の２つ以上が存在する時のように独立に選択される。Ｒ’とＲ''が同じ窒素原子に結合しているとき、これらは窒素原子と一緒になって５−、６−、又は７−員環を形成することができる。例えばＮＲ’Ｒ''は、特に限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことを意味する。置換基の上記説明から、用語「アルキル」が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば、−ＣＦ3及び−ＣＨ2ＣＦ3）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3など）を含むことを、当業者は理解するであろう。
【００８５】
アルキル基について記載された置換基と同様に、アリール置換基とヘテロアリール置換基は一般にそれぞれ「アリール置換基」及び「ヘテロアリール置換基」と呼ばれ、それぞれ変化し、例えば、ゼロ〜芳香環系上の空いている原子価の総数までの数の、ハロゲン、＝０、−ＯＲ’、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ''、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ''Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ''Ｒ'''、−ＮＲ''Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ''）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−  Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ''、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮ、及び−ＮＯ2、−Ｒ’、Ｎ3、−ＣＨ（Ｐｈ）2、フルオロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルから選択され；ここで、Ｒ’、Ｒ''、Ｒ'''、及びＲ''''は、好ましくは水素、（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリール及びヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、及び（非置換アリール）オキシ−（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルから独立に選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む時、例えば各Ｒ’、Ｒ''、Ｒ'''、及びＲ''''基の２つ以上が存在する時のように独立に選択される。
【００８６】
アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上のアリール置換基の２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（ここでＴとＵは独立にＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−、又は１重結合であり、ｑは０〜３の整数である）で場合により置換されてよい。あるいはアリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式−Ａ−（ＣＨ2）ｒ−Ｂ−（ここでＡとＢは独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−、又は１重結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基で場合により置換されてよい。こうして形成される新しい環の１重結合の１つは、２重結合で場合により置換されてよい。あるいはアリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式−（ＣＲＲ’）S−Ｘ−（ＣＲ''Ｒ'''）d−（ここでｓとｄは、独立に０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、又は−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−である）の置換基で場合により置換されてよい。置換基Ｒ’、Ｒ''、Ｒ'''、及びＲ''''は、好ましくは水素又は置換若しくは非置換（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルから独立に選択される。
【００８７】
本明細書において用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、及びケイ素（Ｓｉ）を含む。
【００８８】
記号「Ｒ」は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、及び置換若しくは非置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を示す一般的略語である。
【００８９】
好適な実施態様においてＰとＮとを連結するＰＥＧ系リンカーは式ＩＩＩを有する：
【００９０】
【化３】
2009519033.tif 000007
【００９１】
［式中、ｚ（エチレングリコールサブユニットの数を示す）は１〜１００の整数、好ましくは１〜５０、さらに好ましくは１〜１０である］。
【００９２】
例えばｚ＝４の場合、ＰＥＧ系リンカーは式ＩＶを有する：
【００９３】
【化４】
2009519033.tif 000008
【００９４】
以下の式Ｖは、アミノ酸配列（例えばＣＰＰ）と核酸分子（例えばｓｉＲＮＡ）に一回結合した式ＩＩＩのＰＥＧ系リンカーを示す：
【００９５】
【化５】
2009519033.tif 000009
【００９６】
［式中、
ｚは、１〜１００の整数、好ましくは１〜５０、さらに好ましくは１〜１０である；
ｋは、１〜２５０の整数、好ましくは１〜１００、さらに好ましくは１〜１０である；
Ｘ＝Ｈ、ＣＯ（ＣＨ3）、任意のアミノ酸、又はアミノ酸配列（例えばＣＰＰ）であり、
Ｙ＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、任意のアミノ酸、又はアミノ酸配列（例えばＣＰＰ）であり、
Ｘ又はＹの１つはＣＰＰである］。
【００９７】
用語「ヌクレオシド」は、リボース又はデオキシリボース糖に共有結合したプリン又はピリミジン塩基を有する分子を意味する。ヌクレオシドの例には、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、及びチミジンがある。用語「ヌクレオチド」は、１つ又はそれ以上のリン酸塩基がエステル結合で糖成分に結合したヌクレオシドを意味する。ヌクレオチドの例には、ヌクレオシド１リン酸、２リン酸、及び３リン酸がある。用語「ヌクレオチド類似体」（本明細書において「改変ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオシド」とも呼ぶ）は、標準的ではないヌクレオチドを意味し、天然に存在しないリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドがある。好適なヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドのいくつかの化学的性質を改変するが、ヌクレオチド類似体がその目的の機能を実行する能力を保持するように、任意の位置で修飾される。用語「ヌクレオチド」及び「ヌクレオチド類似体」は同義で使用される。
【００９８】
用語「オリゴヌクレオチド」（「ＯＮ」）は、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体の短いポリマーを意味する。
【００９９】
用語「核酸類似体」は、モノマーヌクレオチド類似体単位から化学合成により作成され、かつ核酸に関連する品質と性質のいくつかを有する、ＤＮＡ及びリボ核酸の構造が修飾されたポリマー類似体を意味する。
【０１００】
用語「ＲＮＡ」又は「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドのポリマーを意味する。用語「ＤＮＡ」又は「ＤＮＡ分子」又は「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。ＤＮＡとＲＮＡは天然に合成することができる（例えば、それぞれＤＮＡ複製又はＤＮＡの転写により）。ＲＮＡは転写後に修飾することができる。ＤＮＡとＲＮＡはまた化学合成することができる。ＤＮＡとＲＮＡは１本鎖（すなわちそれぞれｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ）又は複数鎖（例えば２本鎖、すなわちそれぞれｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ）でもよい。「ｍＲＮＡ」又は「メッセージＲＮＡ」は、１つ又はそれ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする１本鎖ＲＮＡである。この情報は、リボゾームがｍＲＮＡに結合する時、タンパク質合成中に翻訳される。
【０１０１】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」は、本明細書において同義に使用され、５’と３’炭素原子とのホスホジエステル結合により連結されたヌクレオチドのポリマーを意味する。ポリヌクレオチド、核酸、又は核酸分子、及びこれらの類似体は、線状、環状、又は高次のトポロジー（例えばスーパーコイルプラスミドＤＮＡ）を有してもよい。ＤＮＡは、アンチセンス、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの一部、ベクター（例えば、ｐ１由来人工染色体、細菌性人工染色体、酵母人工染色体、又は任意の人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらの群の誘導体でもよい。ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドＲＮＡ、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボゾームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、（妨害性）２本鎖及び１本鎖ＲＮＡ、リボザイム、キメラ配列、又はこれらの群の誘導体でもよい。核酸は１本鎖（「ｓｓＤＮＡ」）、２本鎖（「ｄｓＤＮＡ」）、３本鎖（「ＤＮＡ」）、又は４本鎖（「ｑｓＤＮＡ」）ＤＮＡ、及び１本鎖ＲＮＡ（「ＲＮＡ」）又は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ」）でもよい。「多重鎖」核酸は２つ又はそれ以上の鎖を含有し、２本鎖ＤＮＡとして均一であるか、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのように不均一でもよい。多重鎖核酸は、完全長の多重鎖又は部分的多重鎖でもよい。これはさらに、異なる数の核酸鎖を有するいくつかの領域を含むことができる。部分的１本鎖ＤＮＡは、ｓｓＤＮＡのサブグループと見なされ、１つ又はそれ以上の１本鎖領域ならびに１つ又はそれ以上の多重鎖領域を含有する。
【０１０２】
用語「プラスミドＤＮＡ」は、クローニングベクターとして使用される環状２本鎖ＤＮＡ構築体を意味し、これは、いくつかの真核生物で染色体外遺伝子要素を形成するか、又は宿主染色体中に組み込まれる。
【０１０３】
本明細書において用語「小干渉性ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）（当該技術分野において「短い干渉性ＲＮＡ」とも呼ばれる）は、ＲＮＡ干渉を指令又は仲介することができる約１０〜５０個のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（又はＲＮＡ類似体）を意味する。
【０１０４】
用語「ＲＮＡ類似体」は、対応する非改変若しくは非修飾ＲＮＡと比較して少なくとも１つの改変若しくは修飾ヌクレオチドを有するが、対応する非改変若しくは非修飾ＲＮＡと同じか若しくは同様の性質若しくは機能を保持するポリヌクレオチド（例えば、化学合成ポリヌクレオチド）を意味する。上記したようにオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子と比較してＲＮＡ類似体の加水分解速度を遅くする結合で連結される。例えば類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデート、及び／又はホスホロチオエート結合を含んでよい。ＲＮＡ類似体の例には、糖−及び／又は骨格−修飾リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドがある。かかる改変又は修飾は、例えばＲＮＡの末端に又は内部（ＲＮＡの１つ又はそれ以上のヌクレオチドで）への非ヌクレオチド物質の付加をさらに含む。ＲＮＡ類似体は、ＲＮＡ干渉を仲介する能力を有する（仲介する）天然のＲＮＡと充分に類似しているのみでよい。
【０１０５】
本明細書において用語「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）は、ＲＮＡの選択的細胞内分解を意味する。ＲＮＡｉは細胞内で自然に起きて外来ＲＮＡ（例えばウイルスＲＮＡ）を除去する。天然のＲＮＡｉは、分解機構を他のＲＮＡ配列に向ける遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進む。
【０１０６】
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指令する標的ｍＲＮＡ配列に充分相補的な配列」を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構又はプロセスにより標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに充分な配列を有することを意味し、すなわち好ましくは、ｓｉＲＮＡと、標的遺伝子によりコードされる標的ｍＲＮＡ配列の部分との間に、８０％を超える配列同一性、さらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えるか、又は１００％の配列同一性があることを意味する。
【０１０７】
用語「切断部位」は、その位置でＲＩＳＣ＊が標的ＲＮＡを切断する残基、例えばヌクレオチド、例えば標的ＲＮＡの相補的部分の中心近く、例えば標的ＲＮＡの相補的部分の５’末端から約８〜１２ヌクレオチドを意味する。
【０１０８】
用語「切断部位の上流」は、切断部位の５’方向にある、残基、例えばヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を意味する。アンチセンス鎖について切断部位の上流は、アンチセンス鎖中の切断部位の５’方向にある、残基、例えばヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を意味する。
【０１０９】
用語「切断部位の下流」は、切断部位の３’方向にある、残基、例えばヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を意味する。アンチセンス鎖について切断部位の下流は、アンチセンス鎖中の切断部位の３’方向にある、残基、例えばヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を意味する。
【０１１０】
用語「ミスマッチ」は、非相補的塩基からの塩基対、例えば正常な相補的Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、又はＡ：Ｕ塩基対ではない塩基対を意味する。
【０１１１】
用語「リン酸化された」は、少なくとも１つのリン酸塩基が化学的（例えば有機）化合物に結合していることを意味する。リン酸塩基は、例えば以下の反応を介してタンパク質若しくは糖成分に結合することができる：遊離ヒドロキシル基＋リン酸塩ドナーがリン酸エステ結合を与える。用語「５’リン酸化された」は、例えばエステル結合を介して５’糖（例えば５’リボース若しくはデオキシリボース、又はこれらの類似体）のＣ５ヒドロキシルに結合したリン酸塩基を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを示すのに使用される。１−、２−、及び３−リン酸塩が一般的である。また本発明の範囲には、天然に存在する１−、２−、及び３−リン酸塩基と同じか又は同様の方法で機能するリン酸塩基類似体（例えば、例示した類似体参照）が含まれる。
【０１１２】
標的遺伝子は、例えばＲＮＡｉ性遺伝子ノックダウンについて、本発明の化合物、例えば、ｓｉＲＮＡ（標的化ｓｉＲＮＡ）、候補ｓｉＲＮＡ誘導体、ｓｉＲＮＡ誘導体、修飾ｓｉＲＮＡなど、により標的化される遺伝子である。ｓｉＲＮＡの１つの部分は、標的遺伝子のｍＲＮＡのセクションと相補的（例えば完全に相補的）である。
【０１１３】
以下のサブセクションで  本発明の範囲内で核酸の種々の態様がさらに詳細に説明される。
【０１１４】
Ｉ．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＮ）
第１の態様において本発明は、細胞貫通ペプチド−アンチセンスオリゴヌクレオチド結合体（ＣＰＰ−ＡＳ−ＯＮ）に関する。
【０１１５】
ＡＳ−ＯＮは通常、その標的ｍＲＮＡに相補的な１５〜２０ヌクレオチドからなる。２つの主要な機構がそのアンチセンス活性に寄与する。最初の機構では、ほとんどのＡＳ−ＯＮがＲＮａｓｅＨを活性化するように設計され、これがＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ２本鎖のＲＮＡ成分を切断して、標的ｍＲＮＡを分解する。さらにＲＮａｓｅＨ切断を誘導しないＡＳ−ＯＮを使用して、リボゾームの立体障害により翻訳を阻害することができる。ＡＳ−ＯＮを５’末端に標的化すると、翻訳機構の結合とアセンブリーを妨害することができる。さらにＡＳ−ＯＮを使用して異常なスプライシングを修正することができる。
【０１１６】
一般にリボヌクレオチドの３タイプの修飾（天然ではない塩基を有する類似体、修飾糖（特にリボースの２’位）、又は改変リン酸塩骨格）を区別することができる。
【０１１７】
種々の複素環の修飾が記載されており、これはＡＳ−ＯＮに導入して塩基対合を強化することができ、こうしてＡＳ−ＯＮとその標的ｍＲＮＡとの２本鎖を安定化することができる。塩基修飾ＯＮを扱う包括的な総説が、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０：２９７−３１０（２０００）により公開されている。
【０１１８】
すなわち本発明は、修飾糖成分と後述のリン酸塩骨格を有するＡＳ−ＯＮに関する。
【０１１９】
ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドは、今日まで最もよく知られた最も広く使用されている「第１世代」ＤＮＡ類似体の主要な代表である（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０：１１７−１２１（２０００）の総説がある）。
【０１２０】
「第２世代」アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボースの２’位にアルキル修飾を有するヌクレオチドを含む。２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｏ−エチルＲＮＡはこのクラスの最も重要なメンバーである。これらの構成単位から作成されたＡＳ−ＯＮはホスホロチオエートＤＮＡより毒性が低く、その相補的ＲＮＡに対する親和性がわずかに上昇している（Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：１９１１−１９１８（２００２）；Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：５９９−６０８（１９９５））。
【０１２１】
ほとんどのアンチセンスアプローチでは、アンチセンス力価を上昇させるために、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡ切断が好ましい。従って「ギャプマー（ｇａｐｍｅｒ）技術」が開発された。ギャプマーは、ＤＮＡ又はホスホロチオエートＤＮＡモノマーの中心のストレッチと、その各末端の２’−Ｏ−メチルＲＮＡのような修飾ヌクレオチドとからなる。修飾末端はＡＳ−ＯＮの核酸分解を防ぎ、フランクする２’−Ｏ−メチルヌクレオチド間の少なくとも４又は５個のデオキシ残基の連続的ストレッチが、それぞれ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びヒトＲＮａｓｅＨの活性化に充分であることが報告された（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：５９９−６０８（１９９５）；Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４５１４−１４５２２（１９９３）；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８２７０−２８２７８（１９９９））。
【０１２２】
標的親和性、ヌクレアーゼ耐性、及び薬物動態のような性質を改良するために、修飾ヌクレオチドの「第３世代」が開発されている。親和性と生体安定性を増強するために、コンフォメーション制限の概念が広く使用されている。修飾リン酸塩結合若しくはリボースを有するＤＮＡ及びＲＮＡ類似体、ならびにフラノース環を置換している完全に異なる化学成分を有するヌクレオチドが開発されている。改良された性質を有する修飾ヌクレオチドの例が後述されるが、さらなる修飾（当業者に公知）がアンチセンス分子に大きな影響を与えることがある。
【０１２３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）。ＰＮＡでは、デオキシリボースリン酸塩骨格がポリアミド結合により置換される。ＰＮＡは市販されており、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手できる。ＰＮＡは、好適なハイブリダイゼーション性と高い生物学的安定性を有するが、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡ切断を誘発しない。総説については、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３：１５６−１６４（１９９９）；Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：４５０３−４５０９（２００２）Ｎ３’−Ｐ５’ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅｓ（ＮＰｓ）を参照されたい。
【０１２４】
Ｎ３’−Ｐ５’ホスホラミデート（ＮＰ）。Ｎ３’−Ｐ５’ホスホラミデート（ＮＰ）は修飾リン酸塩骨格の別の例であり、２’−デオキシリボース環の３’−ヒドロキシル基が３’−アミノ基により置換されている。ＮＰは相補的ＲＮＡ鎖に対する高親和性とヌクレアーゼ耐性とを示す（Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３１４３−３１４４（１９９４））。アンチセンス分子としてのこれらの力価はインビボで証明されており、ここでホスホラミデートＯＮがｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートするのに使用された（Ｓｋｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３９６６−３９７１（１９９７））。翻訳開始の立体障害によるホスホラミデート介在アンチセンス作用の配列特異性は、細胞培養と、標的配列がホタルルシフェラーゼ開始コドンのすぐ上流に存在する系を用いてインビボで証明することができた（Ｆａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４０−４４（２００１））。
【０１２５】
２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）。アラビノ核酸、ＲＮＡの２’エピマー、又は対応する２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−ｄ−アラビノ核酸類似体（ＦＡＮＡ）で作成されたオリゴヌクレオチドは、結合ＲＮＡ分子のＲＮａｓｅＨ切断を誘導することが報告された最初の糖修飾ＡＳ−ＯＮであった（Ｄａｍｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１２９７６−１２９７７（１９９８））。フルオロ置換基は、らせんの主要な溝に突出すると考えられ、ここではＲＮａｓｅＨに干渉しないはずである。
【０１２６】
ロックされた核酸（ＬＮＡ）。ＬＮＡは、リボースの２’酸素を４’炭素に結合させるメチレンブリッジを含有するリボヌクレオチドである（Ｅｌａｙａｄｉ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ２：５５８−５６１（２００１）；Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１−７（２００１）；Ｏｒｕｍ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：２３９−２４３（２００１）の総説がある）。ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドはＰｒｏｌｉｇｏ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ，ＵＳＡ）から販売されている。ＬＮＡをＤＮＡオリゴヌクレオチドに導入すると、ＤＮＡ／ＲＮＡ２本鎖のＡ型ラセンへのコンフォメーション変化を誘導（Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．６：２６８７−２６９５（２０００））し、従って標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を妨害する。ｍＲＮＡの分解が目的である場合、ＲＮａｓｅＨ活性を誘導するために中心にある７〜８個のＤＮＡモノマーのストレッチを含有するキメラＤＮＡ／ＬＮＡギャプマーを使用すべきである（Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：１９１１−１９１８（２００２））。しかし、ＲＮａｓｅＨを活性化しないキメラ２’−Ｏ−メチル−ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞内遺伝子依存性トランス活性化を阻害し、従って遺伝子発現を抑制するための立体ブロックとして使用することができる（Ａｒｚｕｍａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１４６４５−１４６５４（２００１））。キメラＤＮＡ／ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、核酸分解に対する増強された安定性と異常に高い標的親和性とを示す（Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：１９１１−１９１８（２００２）；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５６３３−５６３８（２０００））。相補的配列に対するその高い親和性のために、８ヌクレオチド長さという短いＬＮＡオリゴヌクレオチドでも細胞抽出物中の効率的なインヒビターである。完全なＬＮＡ及びキメラＤＮＡ／ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、核酸分解に対する安定性、高い標的親和性、強力な生物活性、及び急性毒性の見かけの欠如のような性質の魅力的なセットとなる。
【０１２７】
モルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＦ）。モルホリノＯＮは非イオン性ＤＮＡ類似体であり、ここではリボースがモルホリノ成分により置換され、ホスホジエステル結合の代わりにホスホラミデートサブユニット間結合が使用される。これらは、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯＲ，ＵＳＡ）から販売されている。これらの使用の総説は、Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３：２０９−２１４（２００２）；ａｎｄ  Ｉｎ  ＧＥＮＥＳＩＳ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，（２００１）に記載されている。ＭＦはＲＮａｓｅＨを活性化せず、従って遺伝子発現の阻害が好ましい場合、これらは開始コドンの下流の５’非翻訳領域又は最初の２５塩基を標的として、リボースが結合するのに妨害して翻訳をブロックする。
【０１２８】
シクロヘキセン核酸（ＣｃＮＡ）。５員フラノース環を６員環で置換することは、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）の基礎であり、これはオリゴマーの高度のコンフォメーション剛性が特徴である。これらは相補的ＤＮＡ又はＲＮＡと安定な２本鎖を形成し、核酸分解に対してオリゴヌクレオチドを防御する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：８５９５−８６０２（２０００））。
【０１２９】
三環式ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）。三環式ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）は相補的配列に対する結合が増強している別のヌクレオチドである（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１１５４８−１１５４９（１９９７）；Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：５９９３−６００２（２００２））。ｔｃＤＮＡは、標的ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を活性化しない。
【０１３０】
ＩＩ．リボザイムとＤＮＡ酵素
別の態様において本発明は、細胞貫通ペプチド−リボザイム結合体、及び細胞貫通ペプチド−ＤＮＡ酵素結合体に関する。
【０１３１】
リボザイムは、遊離基質の反応を触媒する、すなわちトランスの触媒活性を有するＲＮＡ酵素である。細胞内スプライシング又は切断反応を触媒する種々のリボザイムが、下等真核生物、ウイルス、及びいくつかの細菌で見つかっている。例えばハンマーヘッドリボザイムのように、異なるタイプのリボザイム及びその作用機構が包括的に記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，ＣＡＴＡＬＹＴＩＣ  ＲＮＡ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）；Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｂｌｏｏｄ  ９１：３７１−３８２（１９９８）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：３２５−３４７  （２０００）；Ｊｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｗｉｒｔｚ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８：３０７−３１９（２０００）；Ｄｏｕｄｎａ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２２２−２２８（２００２））。
【０１３２】
ハンマーヘッドリボザイムは、生体系への応用の大きな可能性を有する標的特異的トランス切断酵素に変換されるシス切断分子である。好ましくは最小化ハンマーヘッドリボザイムは４０ヌクレオチド未満の長さであり、２つの基質結合アームと触媒ドメインからなる。ハンマーヘッドリボザイムは、ＮＵＨトリプレット（ここでＨはグアノシン以外の任意のヌクレオチドである）を切断することが知られており、ＡＵＣとＧＵＣトリプレットが最も効率的に切断される。第２の位置にシチジンとアデノシンを有するトリプレットは、ハンマーヘッドリボザイムにより切断可能であることが報告された（Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：４１１６−４１２０（１９９８））が、これらの反応はより遅い速度で起きた。細胞培養又はインビボでの応用のために、リボザイムは標的細胞内のプラスミドから転写できるか、又は外から投与することができる。最初のアプローチは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有する発現カセットと、リボザイムを安定化するステム−ループ構造の設計を必要とする（Ｍｉｃｈｉｅｎｚｉ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４１：５８１−５９６（２００１）の総説）。ＲＮＡは生体系で迅速に分解されるという事実のために、あらかじめ合成されたリボザイムは、細胞培養又はインビボで使用する前に核酸分解攻撃に対して防御する必要がある（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２−２５７０８（１９９５））。好ましくはヌクレアーゼ耐性リボザイムは５つの非修飾リボヌクレオチドである２’−Ｃ−アリルウリジンを４位に、そしてすべての残りの位置に２’−Ｏ−メチルＲＮＡを有する。さらに３’末端は反転チミジンにより防御される。１つの基質認識アーム中に４つのホスホロチオエート結合と反転３’−３’ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃを有するわずかに改良されたこのリボザイムも使用することができる。
【０１３３】
好ましくは、１５ヌクレオチドの触媒性コアとそれぞれのアームに６〜１２ヌクレオチドの２つの基質認識アームからなる「１０−２３」と呼ぶデオキシリボザイムを使用することができる。このデオキシリボザイムは高度に配列特異的であり、プリンとピリミジンとの間を結合部分を切断することができる（Ｊｏｙｃｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４１：５０３−５１７（２００１））。
【０１３４】
３’−３’反転チミジンを有するＤＮＡ酵素も使用することができる（Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１２６４−１２６９（１９９９））。最適化された基質認識アームと部分的に防御された触媒ドメインを有するＤＮＡ酵素は、ヌクレオチド耐性を上昇させただけでなく、触媒活性を上昇させた。
【０１３５】
ＩＩＩ．ＲＮＡ干渉
ＩＩＩ−Ａ．ｓｉＲＮＡ分子
別の実施態様において本発明は、細胞貫通ペプチド−小干渉性ＲＮＡ分子（「ｓｉＲＮＡ分子」又は「ｓｉＲＮＡ」）結合体、該ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ分子結合体の製造方法、及び該ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ分子結合体の使用方法（例えば、研究及び／又は治療法）に関する。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖と相補的アンチセンス鎖からなる２本鎖であり、アンチセンス鎖はＲＮＡｉを仲介するのに充分な、標的ｍＲＮＡに対する相補性を有する。好ましくは鎖は、鎖をアニーリングした時２本鎖の１端又は両端で１、２、又は３個の残基のオーバーハングが起きるように、鎖の末端に整列しない（すなわち、反対の鎖に相補的塩基が存在しない）少なくとも１、２、又は３個の塩基があるように、整列される。好ましくはｓｉＲＮＡ分子は約１０〜５０又はそれ以上のヌクレオチドの長さ、すなわち各鎖が１０〜５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含む。さらに好ましくはｓｉＲＮＡ分子は約１５〜３０ヌクレオチドの長さを有する。さらに好ましくはｓｉＲＮＡ分子は約１８〜２５ヌクレオチドの長さを有する。本発明のｓｉＲＮＡ分子はさらに、本明細書に記載のように、ｍＲＮＡ配列を標的化して標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指令するのに「充分に相補的」な配列をさらに有し、すなわちｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機構又はプロセスにより標的ｍＲＮＡの破壊を開始させるのに充分な配列を有する。
【０１３６】
ｓｉＲＮＡにより支配される標的ＲＮＡ切断反応は、配列特異的が高い。一般に、阻害には標的遺伝子の一部と同一であるヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡが好ましい。しかしながら、本発明を実施するのに、ｓｉＲＮＡと標的遺伝子との１００％未満の同一性も許容される。例えば標的配列に対して挿入、欠失、及び１つの点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列が阻害に有効であることがわかっている。さらにｓｉＲＮＡの必ずしもすべての位置が同等に標的認識に寄与するわけではない。ｓｉＲＮＡの中心のミスマッチは決定的に重要であり、標的ＲＮＡ切断を基本的に排除してしまう。中心より上流又はアンチセンス鎖を対象とする切断部位より上流のミスマッチは許容されるが、標的ＲＮＡ切断を大きく低下させる。中心より下流又はアンチセンス鎖を対象とする切断部位より下流のミスマッチ、好ましくはアンチセンス鎖の３’末端の近傍のミスマッチ（例えばアンチセンス鎖の３’末端から１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド）は許容され、標的ＲＮＡ切断をほんのわずかに低下させるのみである。
【０１３７】
配列同一性は、配列比較と当該技術分野で公知の整列アルゴリズムにより決定される。２つの核酸配列（又は２つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを求めるために、最適な比較目的のために配列は整列される（例えば、最適整列のために第１の配列又は第２の配列にギャップを導入してもよい）。次に、対応するヌクレオチド（又はアミノ酸）位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置で同じ残基により占められるなら、その位置で分子が同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）であり、場合により、導入したギャップの数及び／又は導入したギャップの長さにより、スコアを下げていく。
【０１３８】
２つの配列間の配列比較と同一性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを使用して行われる。ある実施態様において、整列は、充分な同一性を有する整列された配列のある部分に対して作成されるが、同一性が低い部分（すなわち局所的整列）に対しては作成されない。配列の比較のために使用される局所的整列の好適な非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７で改変された）である。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に取り込まれる。別の実施態様において整列は、適切なギャップを挿入することにより最適化され、整列された配列の長さ（すなわち、ギャップのある整列）について同一性パーセントが決定される。比較目的にギャップのある整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：  ３３８９−３４０２に記載されたようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用することができる。別の実施態様において整列は、適切なギャップを導入することにより最適化され、整列された配列の全長さ（すなわち全体的整列）にわたって同一性パーセントが決定される。配列の全体的比較のために使用される数学的アルゴリズムの好適な非限定例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に取り込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する時は、ａＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  表、ギャップ長さペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用することができる。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の部分との９０％を超える配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％の配列同一性が好ましい。あるいはｓｉＲＮＡは、標的遺伝子転写体の一部とハイブリダイズ（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃でハイブリダイゼーションを１２〜１６時間、次に洗浄）することができるヌクレオチド配列（又はオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義される。さらなる好適なハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中で７０℃、又は１×ＳＳＣ中で５０℃で５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション後０．３×ＳＳＣで７０℃洗浄するか、又は４×ＳＳＣ中で７０℃、又は４×ＳＳＣ中で５０℃で５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション後、１×ＳＳＣで６７℃で洗浄する。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くすべきであり、ここでＴｍは以下の式に従って決定される。１８塩基対未満の長さのハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８〜４９塩基対の長さのハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここでＮはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの厳密性条件のさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１，及び  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６  Ａに記載されている。同一ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３、３７、４０、４２、４５、４７、又は５０塩基である。
【０１３９】
別の態様において本発明は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関し、ここでアンチセンス鎖は標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指令する標的ｍＲＮＡ配列に充分な相補的な配列を有し、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡと比較してインビボ安定性が向上するように、内部ヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置換することにより修飾される。
【０１４０】
本明細書に記載のように「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端以外の位置に存在するものである。内部ヌクレオチドは、１本鎖分子内でも二重鎖又は２本鎖分子内でもよい。ある実施態様においてセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも１つの内部ヌクレオチドの置換により修飾される。別の実施態様においてセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上内部ヌクレオチドの置換により修飾される。別の実施態様においてセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。さらに別の実施態様においてセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドのすべての置換により修飾される。
【０１４１】
別の実施態様において、修飾ヌクレオシドはアンチセンス鎖内にのみ存在する。さらに別の実施態様において修飾ヌクレオシドはセンス鎖内にのみ存在する。別の実施態様において修飾ヌクレオシドはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在する。
【０１４２】
好適な修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体には、糖−及び／又は骨格−修飾リボヌクレオチドがある（すなわち、リン酸塩−糖骨格への修飾を含む）。例えば天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾される。好適な骨格修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドを接続するホスホエステル基は、例えばホスホロチオエート基の修飾基により置換される。好適な糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’成分はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、又はＯＮから選択される基であり、ここでＲはＣ1〜Ｃ6アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである。
【０１４３】
２’−フルオロ、２’−アミノ、及び／又は２’−チオ修飾が好適である。特に好適な修飾には、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノニン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン；及び／又は５−アミノ−アリル−ウリジンがある。修飾のさらなる例には、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、及び５−フルオロ−ウリジンがある。２’−デオキシ−ヌクレオチドは本発明の修飾ｓｉＲＮＡ内で使用できるが、好ましくはｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス鎖内に含まれる。さらなる修飾残基が当該技術分野で記載及び市販されており、デオキシ−脱塩基、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチル−アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオチド、及びリバビリンがある。
【０１４４】
ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体間の結合の修飾もまた好適であり、例えばホスホロチオエート結合のホスホジエステル結合による置換がある。
【０１４５】
またヌクレオ塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在するヌクレオ塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオ塩基を含有するリボヌクレオチドも可能である。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように修飾される。修飾ヌクレオ塩基の例には、特に限定されないが、５位で修飾されたウリジン及び／又はシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／又はグアノニン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンが適している。
【０１４６】
本明細書に記載のすべての修飾は組合せることができることに注意すべきである。好適な実施態様において２’−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び２’−デオキシリボヌクレオチドは組合わされ、両方ともアンチセンス鎖中に存在する。
【０１４７】
好ましくは本発明のｓｉＲＮＡ分子は、Ａ型ＲＮＡらせんに似た３次元構造を有するであろう。さらに好ましくは本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）と結合した時、Ａ型らせんを取ることができるアンチセンス鎖を有するであろう。このために、かかる修飾ヌクレオチドで作成したｓｉＲＮＡはＡ型らせんコンフォメーションを取るため、２’−フルオロ修飾ヌクレオチドが好ましい。特に、ＲＮＡ自体ではなく切断部位でＡ型らせんにより形成される大きな溝がＲＮＡｉの基本的な決定因子であることが発見されているため、ｓｉＲＮＡは標的切断部位に相補的な部分でＡ型らせんを取ることができることが重要である。
【０１４８】
さらに好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、非修飾ｓｉＲＮＡ分子と比較して安定性の上昇（すなわち細胞のヌクレアーゼに対する耐性）を示すであろう。
【０１４９】
ＩＩＩ．Ｂ．ｓｉＲＮＡ誘導体
別の実施態様において本発明は、細胞貫通ペプチド−小干渉性ＲＮＡ誘導体結合体に関する。
【０１５０】
ｓｉＲＮＡ誘導体は、ｓｉＲＮＡの特徴ではない以下の少なくとも１つを有するｓｉＲＮＡである：３’末端の標識物（例えばビオチン、又は蛍光分子）、３’末端がブロックされている、３’末端が共有結合した基若しくは化合物を有する（例えばナノ粒子）、ｓｉＲＮＡ誘導体が完全なＡ型らせんを形成しないが、ｓｉＲＮＡ誘導体２本鎖のアンチセンス鎖が標的ＲＮＡとＡ型らせんを形成するか、又はｓｉＲＮＡ誘導体が架橋している（例えばソラーレンにより）。ＲＮＡ及び修飾及びｍＲＮＡを合成する方法は当該技術分野で公知である（例えば、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１２９９７−１３００２；及びＨｕｑ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１２５９２−１２５９９）。
【０１５１】
いくつかの化学修飾は、ｓｉＲＮＡに有用な性質を付与する。例えば非修飾ｓｉＲＮＡと比較して上昇した安定性、又はｓｉＲＮＡを追跡、ｓｉＲＮＡを精製、及びｓｉＲＮＡとこれが結合した細胞成分を精製するのに使用できる標識物。
【０１５２】
ビオチンのようないくつかの官能基を含有するｓｉＲＮＡ誘導体は、ＲＮＡｉ機構に関与するタンパク質及び分子複合体の親和性精製に有用である。
【０１５３】
架橋したｓｉＲＮＡ誘導体：いくつかの実施態様は、ｓｉＲＮＡの相補鎖中の核酸間に１つ又はそれ以上の架橋を含むｓｉＲＮＡの使用を含む。架橋は当該技術分野で公知の方法を使用してｓｉＲＮＡに導入することができる。ソラーレン（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６９９５−１６９９８）を使用する架橋以外に、他の架橋法が使用できる。ある実施態様において、チオウラシル（例えば４−チオウリジン）又はチオグアノシン塩基を含む光架橋が作成される。別の実施態様において、塩基又は糖骨格に−ＳＨリンカーを付加することができ、これはＳ−Ｓ架橋を作成するのに使用される。ある場合には、糖骨格、又はＵ、ＣのＣ５位のアミノ基をベンゾフェノンや他の光架橋剤又は化学架橋剤で標識することができる。かかる架橋を作成する方法は当該技術分野で公知である（例えば、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：４２３５−４２４３；ＢｉｏＭｏｓａｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＴ）。一般に架橋ｓｉＲＮＡ誘導体の細胞又は無細胞系の安定性は、対応するｓｉＲＮＡの安定性より大きい。ある場合には、架橋ｓｉＲＮＡ誘導体は対応するｓｉＲＮＡより活性が低い。架橋ｓｉＲＮＡが標的配列の発現を阻害する能力は、ｓｉＲＮＡの活性を試験するための当該技術分野で公知の方法を使用して、又は２重蛍光レポーター遺伝子アッセイのような本明細書に開示の方法により測定することができる。
【０１５４】
一般に、架橋しているｓｉＲＮＡ誘導体は、ｄｓＲＮＡ配列の２つのヌクレオチド間に１つの架橋を含有する。ある実施態様では、２つ又はそれ以上の架橋がある。架橋は一般に、アンチセンス鎖の３’末端に位置し、例えばアンチセンス鎖の３’末端の約１０ヌクレオチド以内、及び一般にはアンチセンス鎖の３’末端の約２〜７ヌクレオチド以内に位置する。架橋は、ｓｉＲＮＡの２つの鎖の末端を結合する結合とは区別すべきである。ｓｉＲＮＡの真ん中又はアンチセンス鎖の５’末端近くの遺伝子座で架橋したいくつかの分子を含有する架橋ｓｉＲＮＡ誘導体の混合物もまた有用である。かかる混合物は、３’末端でのみ架橋しているｓｉＲＮＡ誘導体の混合物より活性が低いが、標的配列の発現に影響を与える充分な活性を保持する。
【０１５５】
ｓｉＲＮＡの３’修飾：親和性精製に使用されるか又は検出可能なタグとして使用される分子は、ＲＮＡｉの３’末端に共有結合して、ｓｉＲＮＡ誘導体を作成することができる。かかるＲＮＡｉ誘導体は、例えば３’末端に検出可能なタグを含むｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ誘導体で細胞をトランスフェクトし、当該技術分野で公知の方法を使用してタグを検出することにより、ｓｉＲＮＡを測定するのに有用である。誘導体ｓｉＲＮＡの検出又は親和性精製に使用できるかかるタグの例には、ビオチンがある。
【０１５６】
ｓｉＲＮＡを修飾するのに使用できる方法は当該技術分野で公知である。例えば架橋剤はアミノ−アリル結合法、例えばイソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用して結合することができる（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。架橋剤は、同様の化学を使用して糖のアミノ−アリルウリジン又はアミノ基に結合することができる。
【０１５７】
ある実施態様において光架橋剤（例えば、チオウラシル、チオグアノシン、ソラーレン、ベンゾフェノン）をｓｉＲＮＡの３’末端で結合して、ｓｉＲＮＡ誘導体が作成される。かかる修飾物を合成する方法は当該技術分野で公知である。かかるｓｉＲＮＡ誘導体は、インビトロ及びインビボで細胞機構を標的とするように架橋することができる。
【０１５８】
別の実施態様においてｓｉＲＮＡの３’末端に色素を連結することができる。かかる色素には、エネルギー移動及び機能的アッセイ（例えばヘリカーゼ活性）で有用なものがある。例えばフルオレセインイソチオシアネートのような蛍光ドナー色素は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に結合することができる。アクセプター色素（例えばローダミンイソチオシアネート）は、５’末端に結合することができる。３’末端又は５’末端のＲＮＡ含有アミノ基は、市販品を入手することができるか、又は適切な色素を購入し、分子が合成される（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）。かかる修飾ｓｉＲＮＡは、ヘリカーゼを含有するＲＩＳＣ複合体とインキュベートすることができる。修飾ｓｉＲＮＡのＲＮＡらせんが巻き戻されると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルが変化するであろう。
【０１５９】
３’末端の修飾はまた、ビオチンのような光切断性カルボキシル基の結合を含む。光切断性ビオチンは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０４／０２９１２に記載の方法に従って合成することができる。
【０１６０】
ＩＩＩ．Ｃ．産生
ＲＮＡは酵素的又は部分的／全体的有機合成により産生され、任意の修飾リボヌクレオチドをインビトロ酵素的又は有機合成により導入することができる。ある実施態様においてｓｉＲＮＡは化学的に調製される。ＲＮＡ分子を合成する方法は当該技術分野で公知であり、特にＶｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）Ａｎｎｕｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：  ９９−１３４により記載された化学合成法がある。別の実施態様においてｓｉＲＮＡは酵素的に調製される。例えばｄｓ−ｓｉＲＮＡは、所望の標的ｍＲＮＡと充分な相補性を有する長いｄｓＲＮＡの酵素的処理により調製することができる。長いｄｓＲＮＡの処理は、例えば適切な細胞溶解物を使用してインビトロで行われ、次に、ｄｓ−ｓｉＲＮＡはゲル電気泳動又はゲルろ過により精製することができる。次に、当該技術分野で認識されている方法を使用して、ｄｓ−ｓｉＲＮＡを変性することができる。ある実施態様においてＲＮＡは混合物から、溶媒若しくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はこれらの組合せにより精製することができる。あるいはＲＮＡは、試料処理によるロスを避けるために、精製せずに又は最小の精製で使用される。
【０１６１】
あるいは１本鎖ＲＮＡは、合成ＤＮＡ鋳型から又は組換え細菌から単離されたＤＮＡプラスミドから、酵素的転写により調製することもできる。典型的には、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのようなファージＲＮＡポリメラーゼが使用される（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０：５１−６２）。ＲＮＡは乾燥して保存されるか、又は水溶液に溶解される。溶液は、１本鎖のアニーリングを抑制し、及び／又は安定化を促進するために、緩衝液又は塩を含有してもよい。
【０１６２】
ある実施態様においてｓｉＲＮＡは、インビボ、インサイチュ、又はインビトロで合成される。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼはインビボ又はインサイチュで転写を仲介し、クローン化ＲＮＡポリメラーゼはインビボ又はインビトロの転写で使用することができる。インビボでのトランス遺伝子からの又は発現構築体からの転写には、制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナー、及びアクセプター、ポリアデニル化）を使用してｓｉＲＮＡが転写される。阻害は、臓器、組織、又は細胞タイプ中の特異的転写；環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度、化学インデューサー）；及び／又は成長段階又は年齢での工学作成的転写、により標的化される。組換え構築体からｓｉＲＮＡを発現するトランスジェニック生物が、構築体を接合体、胚幹細胞、又は適切な生物由来の他の多能性細胞に導入することにより産生される。
【０１６３】
ＩＩＩ．Ｄ．標的
ある実施態様において標的ｍＲＮＡは、細胞タンパク質（例えば、核、細胞質、膜貫通、又は膜結合タンパク質）のアミノ酸配列をコードする。別の実施態様において標的ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質（例えば、細胞外マトリックスタンパク質又は分泌タンパク質）のアミノ酸配列をコードする。本明細書において用語、タンパク質の「アミノ酸配列をコードする」は、ｍＲＮＡ配列が、遺伝コードの規則に従ってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下のクラスのタンパク質が例示目的で列記される：成長タンパク質（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、翼状らせん（Ｗｉｎｇｅｄ−ｈｅｌｉｘ）ファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカイン、及びこれらの受容体、成長因子／分化因子及びこれらの受容体、神経伝達物質及びこれらの受容体）；癌遺伝子にコードされるタンパク質（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ  Ｉ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ）；腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＡＰＣ，ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢＩ、ＴＰ５３、及びＷＴＩ）；転写因子；ハウスキーピングタンパク質；細胞骨格タンパク質；成長因子タンパク質；及び酵素（例えば、ＡＣＣシンターゼ及びオキシダーゼ、ＡＣＰデサツラーゼ及び水酸化酵素、ＡＤＰ−グルコースホスホリラーゼ、ＡＴＰａｓｅ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、脱炭酸酵素、デキストリナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、ＧＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌニナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物増殖調節シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼ、及びキシラナーゼ）。
【０１６４】
本発明の別の態様において、本発明の標的ｍＲＮＡ分子は、病理的症状に関連するタンパク質のアミノ酸配列をコードする。例えば、タンパク質は、病原体結合タンパク質（例えば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の感染、又は感染の維持に関与するウイルスタンパク質）、又は宿主への病原体の侵入、病原体又は宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製若しくは組み込み、宿主中の感染の樹立又は拡散、又は病原体の次世代のアセンブリーを促進する宿主タンパク質でもよい。あるいはタンパク質は、腫瘍関連タンパク質又は自己免疫疾患関連タンパク質でもよい。
【０１６５】
ある態様において標的ｍＲＮＡ分子は、内因性タンパク質（すなわち、細胞又は生物のゲノム中に存在するタンパク質）のアミノ酸配列をコードする。別の実施態様において標的ｍＲＮＡ分子は、組換え細胞又は遺伝子改変生物（例えばトランスジェニック又はノックアウト技術により改変された）中に発現される異種タンパク質のアミノ酸配列をコードする。別の実施態様において標的ｍＲＮＡ分子は、トランス遺伝子（すなわち、細胞のゲノムの異所部位で挿入された遺伝子構築体）によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をコードした。さらに別の実施態様において本発明の標的ｍＲＮＡ分子は、細胞に感染又は細胞が得られる細胞に感染することができる病原体のゲノムによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をコードする。
【０１６６】
ＩＩＩ．Ｅ．ＶＥＧＦを標的化
血管形成は、ヒトの腫瘍における増殖と転移の可能性の上昇に特異的に関連している（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：１０−４５（２００２））。無数の成長因子が関与するが、腫瘍の血管形成においては「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」が主要な役割を果たすことが証明されている（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０：３９−５０６（２００３））。ＶＥＧＦのその受容体への結合は、正常な内皮細胞の分裂と化学走化性を誘導し、血管透過性を上昇させ、これらのすべては新しい血管形成と腫瘍増殖に寄与する（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４２−８７（２０００））。ＶＥＧＦはまた、骨髄由来内皮細胞の前駆体細胞を動員することにより血管新生に寄与する（Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：３９６４−７２８（１９９９））。今日まで、ヒトＶＥＧＦの６個の選択的スプライシングアイソフォームが同定されている（ＶＥＧＦ121、ＶＥＧＦ145、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ183、ＶＥＧＦ189、ＶＥＧＦ206；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１８：４−２５  １９９７））。ＶＥＧＦ発現レベルの上昇が、ほとんどのヒトの腫瘍（肺、消化管、腎臓、甲状腺、膀胱、卵巣、及び子宮頚部の腫瘍を含む）で見つかっている（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７−４３１０（１９９９））。
【０１６７】
別の態様において本発明は、好ましくない細胞増殖を特徴とする症状、例えば癌、例えば癌腫、肉腫、転移疾患、及び造血新生物疾患（例えば白血病）、年齢関連黄斑変性症、又は増殖皮膚疾患（例えば乾癬）を有する被験体を治療する方法であって、ＶＥＧＦ発現、分泌、又は活性を阻害するのに有効な量の本発明の結合体、例えば本発明の治療用組成物を、被験体に投与することを含んでなる方法を特徴とする。本明細書において、ＶＥＧＦ発現又は活性の阻害は、ＶＥＧＦ活性の例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の低下を意味する。
【０１６８】
ＶＥＧＦ核酸標的：１つの態様において本発明は、ＶＥＧＦ  ＲＮＡを標的とする組成物（例えばｓｉＲＮＡ−、ｓｉＲＮＡ誘導体−、修飾ｓｉＲＮＡ−ＣＰＰ結合体）を特徴とする。
【０１６９】
ＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列は、ＶＥＧＦの任意のオーソログ、例えばヒトＶＥＧＦに実質的に同一の配列であり、特に限定されないが、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号：ＮＭ ００１０２５３６７、ＮＭ ００１０２５３６８、ＮＭ ００１０２５３６９、又はＮＭ ００１０２５３７０を含む。
【０１７０】
ｓｉＲＮＡ分子
本発明のｓｉＲＮＡは、各鎖に１６〜３０ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含み、鎖の１つはＶＥＧＦのｍＲＮＡの標的領域と実質的に、例えば少なくとも８０％同一であり、他の鎖は、第１の鎖と同一又は実質的に同一である。
【０１７１】
組成物のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ誘導体、修飾ｓｉＲＮＡは、化学合成できるか、又はＤＮＡ鋳型からインビトロで、又は例えばｓｈＲＮＡからインビボで転写することができる。ｄｓＲＮＡ分子は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して設計することができる。
【０１７２】
ｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野で公知の非修飾ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡと修飾ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（例えば架橋ｓｉＲＮＡ誘導体）の両方を含む。架橋は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ誘導体、又は修飾ｓｉＲＮＡの薬物動態を改変するのに使用することができる。
【０１７３】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、これらの鎖の１つとして以下の配列、及びその対立遺伝子変種の対応する配列を含むことができる：
【０１７４】
センス鎖：５’ＡＵＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ−ｄＴｓｄＴ（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３９１９−２２（２００３））。
【０１７５】
上記配列（例えばセンス配列）は、本明細書に記載のその標的ｍＲＮＡの標的化部分に対応する。当該技術分野で認められた原理に従って逆相補配列（例えば、アンチセンス配列）を作成することができる。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、好ましくは１つのセンス配列又はセンス鎖、及び１つの各アンチセンス配列又はアンチセンス鎖を含む。
【０１７６】
さらにＲＮＡｉは少なくとも１つの１本鎖ＲＮＡ中間体を介して進行すると考えられているため、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ（例えば、ｄｓ−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖）を本明細書に記載のように設計し、記載の方法に従って利用できることを当業者は理解するであろう。
【０１７７】
ＩＩＩ．Ｆ．  ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体の使用法
本発明のＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体は、当該技術分野で公知の方法により細胞又は生物に導入することができる。
【０１７８】
哺乳動物では、ｓｉＲＮＡ分子は腎臓により迅速に排出される。本発明のＣＰＰ−ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ血漿クリアランスを低下させることができるため有利である。
【０１７９】
別の実施態様においてＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体は、以下の活性の１つ又はそれ以上を行う成分とともに導入される：細胞による結合体取り込みを増強する、１本鎖のアニーリングを阻害する、１本鎖を安定化させる、又は標的遺伝子の阻害を上昇させる。
【０１８０】
本発明のＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体は、細胞外から空洞（例えば腹腔内）間質腔に、生物の循環流中に、経口的、又は細胞、臓器、又は生物を結合体含有溶液に浸漬することにより、導入することができる。血管又は血管外循環、血液、又はリンパ系、及び髄液は、ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体が導入される部位である。
【０１８１】
標的遺伝子を有する細胞は、任意の生物から得られるか又はそこに含有される。生物は、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス、又は真菌でもよい。動物は、脊椎動物又は無脊椎動物でもよい。脊椎動物の例には、魚、哺乳動物、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、げっ歯動物、ハムスター、マウス、ラット、霊長類、及びヒトがある。
【０１８２】
標的遺伝子を有する細胞は、生殖細胞系又は体細胞由来で、全能性又は多能性であり、分裂性又は非分裂性、実質組織、上皮、不死化又は形質転換細胞などでもよい。細胞は幹細胞又は分化細胞でもよい。分化される細胞タイプには、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチン細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、上皮、異形成組織、及び内分泌又は外分泌腺の細胞でもよい。
【０１８３】
送達される特定の標的遺伝子及び２本鎖ＲＮＡ物質の用量に依存して、この方法は、標的遺伝子の機能の部分的又は完全な消失を与える。例えば、少なくとも３０％、４０％、５６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％、又はそれ以上の標的化細胞の遺伝子発現の低下又は消失がある。遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子からのタンパク質レベル及び／又はｍＲＮＡ生成物レベルの欠如（又は観察される低下）を意味する。特異性は、細胞の他の遺伝子への明らかな作用無しで標的遺伝子を阻害する能力を意味する。阻害の結果は、細胞又は生物（実施例に後述される）の外的性質の観察により、又は生化学的方法、例えばＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ防御、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現追跡、抗体結合、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）により確認することができる。
【０１８４】
例えば阻害効率は、細胞中の又は細胞により排泄される遺伝子産物の量を評価することにより測定される；ｍＲＮＡは、阻害２本鎖ＲＮＡに使用される領域以外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて検出されるか、又は翻訳されたポリペプチドは、この領域のポリペプチド配列に対して作成された抗体を用いて検出される。
【０１８５】
ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体は、細胞当たり少なくとも１つのｓｉＲＮＡコピーの送達を可能にする量で導入される。より高用量（例えば、細胞当たり、少なくとも５、１０、１００、５００、又は１０００コピー）の物質は、より有効な阻害を与える；特定の応用には低用量も有用である。
【０１８６】
別の目的として本発明は、式Ｐ−Ｌ−Ｎ（ここでＰは細胞貫通ペプチドであり、ＬはＰとＮとを連結するＰＥＧ系リンカーであり、Ｎは核酸、好ましくはオリゴヌクレオチド及びさらに好ましくはｓｉＲＮＡである）を有する化合物の調製法を有する。
【０１８７】
第１の実施態様において本方法は、適切な緩衝液（好ましくは、そのｐＨが６．５〜８．５であるリン酸緩衝液）中で核酸（例えばｓｉＲＮＡ）にＰＥＧ系リンカーをつなぐ（すなわち結合させる）工程、及び次に適切な緩衝液（好ましくは、そのｐＨが６．５〜８．５であるリン酸緩衝液）中でＰＥＧ系リンカー−核酸結合体に細胞貫通ペプチドをつなぐ（すなわち結合させる）工程を含む。
【０１８８】
第２の実施態様において本発明は、適切な緩衝液（好ましくは、そのｐＨが６．５〜８．５であるリン酸緩衝液）中で細胞貫通ペプチドにＰＥＧ系リンカーをつなぐ（すなわち結合させる）工程、及び次に適切な緩衝液（好ましくは、そのｐＨが６．５〜８．５であるリン酸緩衝液）中でＰＥＧ系リンカー−細胞貫通ペプチド結合体に核酸（例えばｓｉＲＮＡ）をつなぐ（すなわち結合させる）工程を含む。
【０１８９】
好ましくは核酸をＰＥＧ系リンカーに結合させるために、核酸は少なくとも１つの−ＮＨＳ又は−ＳＨ成分を含み、ＰＥＧ系リンカーは少なくとも１つの−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ成分を含む。
【０１９０】
好ましくはＰＥＧ系リンカーを細胞貫通ペプチドに結合させるために、細胞貫通ペプチドは少なくとも１つの−ＳＨ又は−ＮＨ2成分を含み、ＰＥＧ系リンカーは少なくとも１つのマレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ成分を含む。
【０１９１】
ペプチド又はタンパク質へのＰＥＧの結合は、当業者に公知である；例えばＮ−スクシンイミドカーボネート誘導体に変換されるＰＥＧを記載するＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／１３５４０を参照。
【０１９２】
ＰＥＧ−核酸結合体の合成は当業者に公知である；例えばＪａｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４８１０−７（１９９４）又はＪｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．９３：１８３−９１（２００３）を参照。
【０１９３】
詳細な方法は実施例に記載される。
【０１９４】
本発明はまた、異常な又は好ましくない標的遺伝子発現又は活性に関連する障害のリスクが有るか又は障害を有する被験体を治療するための予防と治療法を提供する。本明細書において「治療」又は「治療する」は、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害に対する素因を有する患者からの単離された組織若しくは細胞株に、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、改変、矯正、改善、改良、又は作用することを目的とした、本発明のＣＰＰ−核酸結合体（例えばＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）の適用若しくは投与として定義される。ｓｉＲＮＡについて、治療は、１つ又はそれ以上の標的部位にｓｉＲＮＡを投与することを含む。異なるｓｉＲＮＡ−ＣＰＰ結合体の混合物は、一緒に又は順に投与することができ、混合物は経時的に変化してもよい。
【０１９５】
治療の予防と治療方法の両方について、かかる治療は、薬理ゲノミクス分野の知見に基づき、特異的に調整又は修飾される。本明細書において用語「薬理ゲノミクス」又は「薬理遺伝学」は同義に使用され、臨床開発中の及び市場の薬剤への遺伝子配列決定、統計的遺伝学、及び遺伝子発現分析のようなゲノミクス技術の適用を意味する。さらに詳しくはこの用語は、患者の遺伝子が薬剤に対する彼若しくは彼女の応答（例えば、患者の「薬剤応答表現型」又は「薬剤応答遺伝子型」）を決定する方法の研究を意味する。すなわち本発明の別の態様は、本発明の標的遺伝子分子を用いて、又は個体の薬剤応答遺伝子型に従って標的遺伝子調節物質を用いて、個体の予防又は治療法を調整する方法を提供する。薬理ゲノミクスは臨床家又は医師が、治療で最も利益を受ける患者への予防又は治療を標的化し、毒性薬剤に関連する副作用を経験する患者の治療を避けることを可能にする。
【０１９６】
予防法：
１つの態様において本発明は、本発明のＣＰＰ−核酸結合体（例えばＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）を被験体に投与することにより、被験体の異常な又は好ましくない標的遺伝子発現又は活性に関連する疾患又は症状を予防する方法を提供する。異常な又は好ましくない標的遺伝子発現又は活性により引き起こされるか又はこれが寄与する疾患のリスクのある被験体は、例えば本明細書に記載の任意の診断又は予測アッセイ又はこれらの組合せにより、同定することができる。
【０１９７】
予防薬の投与は、疾患若しくは障害が予防されるか、又はその進行を遅らせることができるように、標的遺伝子の異常に特徴的な症状が現れる前に行われる。標的遺伝子の異常のタイプにより、被験体を治療するために、例えば標的遺伝子、標的遺伝子アゴニスト、又は標的遺伝子アンタゴニストが使用される。適切な薬剤は、スクリーニングアッセイにより当業者が決定することができる。
【０１９８】
治療法：
本発明の別の態様は、治療目的で標的遺伝子発現、タンパク質発現、又は活性を調節する方法に関する。従ってある実施態様において本発明の調節法は、標的タンパク質の発現又は１つ又はそれ以上の活性が調節されるように、標的遺伝子を発現できる細胞に、標的遺伝子又はタンパク質に特異的な本発明のＣＰＰ−核酸結合体（例えばＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）を接触させることを含む（例えば、核酸がｓｉＲＮＡの場合、ｓｉＲＮＡは、該遺伝子によりコードされるか又は該タンパク質のアミノ酸配列を特定するｍＲＮＡに特異的である）。これらの調節法は、インビトロ（例えば細胞を結合体と培養することにより）で、又はインビボ（結合体を被験体に投与することにより）で行われる。従って本発明は、標的遺伝子ポリペプチド又は核酸分子の異常な又は好ましくない発現若しくは活性を特徴とする疾患若しくは障害に罹った個体を治療する方法を提供する。標的遺伝子活性の阻害は、標的遺伝子が異常に制御されていないか、及び／又は低下した標的遺伝子活性が有利な作用を有する可能性がある状況で、好ましい。
【０１９９】
薬理ゲノミクス：
本発明のＣＰＰ−核酸結合体（例えばＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）は、異常な又は好ましくない標的遺伝子活性に関連する疾患を治療（予防的又は治療的）するために、個体に投与することができる。かかる治療に関連して、「薬理ゲノミクス」又は「薬理遺伝学」（両方の用語は同義で使用される）（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物又は薬剤に対する個体の応答との関係の研究）が考慮される。治療薬の代謝の差は、薬理活性薬剤の用量と血液濃度との関係を変えることにより、重症の毒性又は治療の失敗に至ることがある。すなわち医師又は臨床家は、治療薬を投与すべきかどうかを決定するのに、ならびに治療薬を用いて用量及び／又は治療法を調整するのに、関連する薬理ゲノミクス試験で得られた知見を適用することを考慮する。薬理ゲノミクスは、罹患した患者の改変された薬剤の性質と異常な作用による、薬剤に対する応答の臨床的に重要な遺伝的変化を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：９８３−９８５（１９９６）、及びＬｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：２５４−２６６（１９９７）を参照。一般に２つのタイプの薬理遺伝学症状が区別される。薬剤が体に作用する方法を変化させる単一の要因として伝搬される遺伝症状（改変された薬剤作用）、又は体が薬剤に作用する方法を変化させる単一の要因として伝搬される遺伝症状（改変された薬剤代謝）。これらの薬理遺伝学症状は、まれな遺伝的欠陥として、又は天然に存在する多型性として起きることがある。例えばグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素欠損（Ｇ６ＰＤ）は、主要な臨床的合併症が、酸化物薬剤（抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン剤）及びソラマメの摂取後の溶血である一般的遺伝酵素病である。
【０２００】
疾患適応：
本発明の組成物は、細胞増殖及び／又は分化性障害、骨代謝に関連する障害、免疫障害、造血障害、心血管障害、肝障害、腎障害、筋肉障害、血液障害、ウイルス疾患、疼痛若しくは神経障害、又は代謝障害の１つ又はそれ以上を制御するための新規治療薬として作用することができる。細胞増殖及び／又は分化性障害の例には、癌、例えば癌腫、肉腫、転移疾患、又は造血新生物疾患（例えば白血病）がある。転移腫瘍は、多くの原発性腫瘍タイプ（特に限定されないが、前立腺、結腸、肺、乳房、及び肝臓起源のものがある）から発生する。
【０２０１】
本明細書において用語「癌」、「高増殖性」、及び「新生物性」は、自律的増殖の能力、すなわち異常状態、又は迅速に増殖する細胞増殖を特徴とする症状を有する細胞を意味する。高増殖性及び新生物疾患状態は、病原性（すなわち、疾患状態を特徴とするか又はこれを構成する）又は非病原性（すなわち正常からは逸脱するが疾患状態には関連しない）として分類される。この用語は、浸潤の組織病理タイプ又は段階に無関係に、すべてのタイプの癌増殖又は癌遺伝子プロセス、転移組織、又は悪性腫瘍形質転換細胞、組織、又は臓器を含む。
【０２０２】
「病原性高増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖と特徴とする疾患状態で起きる。非病原性高増殖細胞の例には、創傷治癒に関連する細胞の増殖がある。
【０２０３】
用語「癌」又は「新生物」は、種々の臓器、例えば肺、乳房、甲状腺、リンパ系、消化管、及び尿生殖器の悪性腫瘍、ならびにほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、及び／又は睾丸腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、及び食道の癌のような悪性腫瘍を含む腺癌を含む。
【０２０４】
用語「癌」は当該技術分野で認められており、上皮又は内分泌組織（呼吸系癌、消化管系癌、尿生殖器系癌、睾丸癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、及び黒色腫を含む）の悪性腫瘍を意味する。癌の例には、子宮頚部、肺、腎臓、前立腺、乳房、頭部と首、結腸、及び卵巣の組織から生成されるものを含む。この用語はまた癌肉腫、例えば癌性及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む。「腺癌」は、腺組織からの癌、又は腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌を意味する。
【０２０５】
用語「肉腫」は当該技術分野で認められており、間葉性由来の悪性腫瘍を意味する。
【０２０６】
増殖性障害の追加の例には、造血新生物障害がある。本明細書において用語「造血新生物障害」は、造血系起源の、例えば骨髄系、リンパ系、又は赤血球系統の増殖性／新生物細胞、又はこれらの前駆細胞を含む。好ましくは疾患は、あまり分化していない急性白血病、例えば赤芽球性白血病及び急性巨核球性白血病から発生する。骨髄系障害の追加の例には、特に限定されないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）がある（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）ＣｒｉｔＲｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７の総説）；リンパ球系悪性腫瘍には、特に限定されないが、Ｂ系統ＡＬＬとＴ系統ＡＬＬとを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）、及びワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）がある。追加の型の悪性リンパ腫には、特に限定されないが、非ホジキンリンパ腫及びその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、及びリード−ステルンベルグ病がある。
【０２０７】
一般に本発明の組成物は、特定の障害に関連する遺伝子を標的化するように設計される。標的化される増殖性障害に関連するかかる遺伝子の例には、活性化ｒａｓ、ｐ５３、ＢＲＣＡ−１、及びＢＲＣＡ−２がある。標的化できる他の具体的な遺伝子は、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ；例えばスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１））；ハンチントン舞踏病（例えば、ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、パーキンソン病（ｐａｒｋｉｎ）に関連するもの、及び常染色体優性障害に関連する遺伝子がある。
【０２０８】
本発明の組成物は、種々の免疫疾患、特に遺伝子の過剰発現又は変異遺伝子の発現に関連する疾患を治療するのに使用することができる。造血疾患の例には、特に限定されないが、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい反転反応、血節性紅斑らい、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性量促成進行性感音性聴力損失、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴェンズ‐ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺繊維症を含む）、移植片対宿主病、移植症例、及びアレルギー（例えばアトピー性アレルギー）がある。
【０２０９】
心臓を含む障害すなわち「心血管障害」の例には、特に限定されないが、心血管系（例えば、心臓、血管、及び／又は血液）を含む疾患、障害、状態がある。心血管障害は、動脈圧の平衡異常、心臓の機能不全、血管閉塞、例えば血栓により引き起こされる。かかる障害の例には、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈発作、うっ血性心不全、冠動脈疾患、弁膜症、不整脈、及び心筋症がある。
【０２１０】
本明細書に記載の方法で治療される障害には、特に限定されないが、既存の繊維の崩壊と凝縮に伴う細胞外マトリックスの産生と分解のアンバランスによるような繊維性組織の肝臓での蓄積に関連する障害がある。
【０２１１】
さらに本発明の分子を使用して、ウイルス疾患、特に限定されないがＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、ポリオウイルス、及び天然痘ウイルスを含む疾患を治療することができる。本発明の分子は、本明細書に記載のように工学作成して、ウイルスの発現された配列を標的化して、ウイルス活性と複製とを抑える。分子は、ウイルス感染組織の治療及び／又は診断で使用することができるまたかかる分子は、ウイルスに関連した癌、例えば肝細胞癌の治療に使用することができる。
【０２１２】
本発明は、上記した治療法での上記ＣＰＰ−核酸結合体の使用に関する。すなわち本発明の範囲は、上記した障害を治療又は予防するための薬剤（医薬）製造用の本発明のＣＰＰ−核酸結合体の使用を包含する。従って本発明のＣＰＰ−核酸結合体は、投与に適した組成物、好ましくは医薬組成物に取り込むことができる。かかる組成物は典型的には、本発明の少なくとも１つの結合体、又は結合体と場合により医薬として許容される担体との混合物を含む。本明細書において「医薬として許容される担体」は、薬剤投与に適合する任意のかつすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤と抗真菌剤、等張剤と吸収遅延剤などを含む。薬理活性物質のかかる媒体や物質の使用は当該技術分野で公知である。従来の媒体又は物質が活性化合物と適合しない場合以外は、組成物におけるこれらの使用が企図される。補助活性化合物もまた、組成物中に取り込むことができる。
【０２１３】
本発明の組成物、好ましくは医薬組成物は、予定の投与経路に適合するように調製される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、眼内、及び腫瘍内投与がある。非経口、皮内、又は皮下投与に使用される液剤又は懸濁剤は以下の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩、及び張性の調整のための物質、例えば塩化ナトリウム又はブドウ糖がある。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、又はガラス若しくはプラスチックでできた多回投与用バイアルに封入することができる。
【０２１４】
注射用途に適した医薬組成物には、無菌注射溶液又は分散剤の即時調製用の無菌溶液（水溶性）若しくは分散物、及び無菌粉末がある。静脈内投与用の適当な担体には、生理食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）がある。すべての場合に組成物は無菌で、容易なシリンジ操作性が得られる程度に液体でなければならない。これは、製造と保存条件下で安定で、かつ細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存できなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体でもよい。レシチンのようなコーティングの使用、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用により、正しい流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることにより行われる。
【０２１５】
無菌注射溶液は、活性化合物を必要量、必要に応じて上記成分の１つ又は組合せとともに適切な溶媒に取り込み、次に無菌ろ過して調製することができる。一般に分散物は、基礎的分散媒体と上記の必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合は好適な調製法は、活性成分の粉末とあらかじめ無菌ろ過した溶液からの追加の所望の成分を与える真空乾燥と凍結乾燥である。
【０２１６】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。これらはゼラチンカプセルに封入されるか又は圧縮して錠剤にされる。治療用投与のために、活性化合物は賦形剤とともに取り込むことができ、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形で使用される。経口組成物はまた、口内洗浄剤として使用される液体担体を使用して調製することができ、ここで液体担体中の化合物は経口的に投与され、うがいをして、吐き出されるか又は飲み込まれる。薬剤学的に適合性の生物学的物質及び／又はアジュバント物質は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の任意の成分又は同様の性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴム、又はゼラチン；賦形剤、例えばデンプン又は乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、又はコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ；直打用滑沢剤、例えばコロイド性二酸化ケイ素；甘味剤、例えばショ糖又はサッカリン；又は香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ色風味。
【０２１７】
吸入による投与用に化合物は、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のような気体を含有する加圧容器又はディスペンサー、又はネブライザーから、エアゾル噴霧剤の形で投与される。
【０２１８】
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮的手段により行われる。経粘膜又は経皮投与用に、透過されるバリアに適した浸透剤が調製物中で使用される。かかる浸透剤は当該技術分野で公知であり、例えば経粘膜投与用に、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は、鼻スプレー又は坐剤を使用して行うことができる。経皮投与用に活性化合物は、当該技術分野で公知の軟膏剤、膏薬、ゲル剤、又はクリーム剤に調製される。
【０２１９】
化合物はまた坐剤（例えば、ココア脂や他のグリセリドのような従来の坐剤用基剤）又は直腸投与のための保留浣腸剤の形で調製することもできる。
【０２２０】
ある実施態様において活性化合物は、体からの急速な排除に対して化合物を防御する担体、例えば制御放出製剤（インプラント及びマイクロ封入送達系）を用いて調製される。
【０２２１】
生体分解性、生体適合性ポリマーは当業者に公知である。これらの物質はまた、例えばＡｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入でき、医薬として許容される担体として使用することもできる。これらは当業者に公知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように調製することができる。
【０２２２】
投与の容易さと用量の均一性から、経口又は非経口組成物を単位投与剤型で調製することが特に有利である。本明細書において単位投与剤型は、治療される被験体にとって一回の投与として適した物理的に分かれた単位を意味する；各単位は、必要な薬剤学的担体とともに所望の治療効果を示すように計算された活性化合物のあらかじめ決められた量を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物のユニークな特性と達成すべき具体的な治療効果、及び個体の治療のためにかかる活性化合物を調合する技術に固有の限界に支配され、かつこれに直接依存する。
【０２２３】
このような化合物の毒性と治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準的薬学的方法、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）とＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）を決定するための方法により測定することができる。毒性作用と治療効果との用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０で示される。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用してもよいが、感染していない細胞に対する傷害の可能性を最小にするために、従って副作用を低下させるために、患部組織の部位に化合物を標的化する送達系を設計するように注意すべきである。
【０２２４】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを、ヒトで使用される用量範囲を調製するのに使用することができる。かかる化合物の用量は好ましくは、ほとんど又は全く毒性無しでＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は、使用される剤形と投与経路に依存して変動する。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療的有効用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で測定した時、動物モデルでＥＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、半最大応答を達成する試験化合物の濃度）を達成する用量が調製される。このような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーを使用して測定することができる。
【０２２５】
本発明のＣＰＰ−核酸結合体（例えばＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）を含有する組成物の治療的有効量（すなわち有効用量）は、当業者が容易に決定することができる。例えばＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体について、治療的有効量は、少なくとも１０パーセントだけ標的遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を阻害する量である。例えば４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５パーセント又はそれ以上のより高い比率の阻害が好ましい。用量の例には、被験体又は試料重量１ｋｇ又は１ｍ2当たり、ミリグラム又はマイクログラム量の結合体を含む（例えば、１ｋｇ又は１ｍ2当たり約１マイクログラム〜１ｋｇ又は１ｍ2当たり約５００ミリグラム、１ｋｇ又は１ｍ2当たり約１００マイクログラム〜１ｋｇ又は１ｍ2当たり約５ミリグラム、又は１ｋｇ当たり約１マイクログラム〜１ｋｇ又は１ｍ2当たり約５０マイクログラム）。組成物は少なくとも週に１回、約１〜１０週間投与することができる。
【０２２６】
当業者は、被験体を有効に治療するのに必要な用量とタイミングに影響を与えるいくつかの要因（特に限定されないが、疾患若しくは障害の重症度、治療歴、被験体の全身的健康及び／又は年齢、及び存在する他の疾患）があることを理解するであろう。さらに治療的有効量の組成物による被験体の治療は、一回の治療又は一連の治療を含むことができる。
【０２２７】
組成物の適切な用量は、調節される発現又は活性と比較して組成物の効力に依存することがさらに理解されるであろう。
【０２２８】
本発明のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節するために、本発明のこれらの結合体の１つ又はそれ以上が動物（例えばヒト）に投与される時、医師、獣医師、又は研究者は、例えば最初は比較的低用量を処方し、次に適切な応答が得られるまで用量を挙げていく。さらに特定の被験体の特定の用量レベルは、種々の要因（例えば、使用される具体的な化合物の活性、被験体の年齢、体重、全身的健康、性、及び食事、投与時間、投与経路、排泄率、併用薬剤、及び調節される発現又は活性の程度を含む）に依存するであろう。
【０２２９】
医薬組成物は、容器、パック、又はディスペンサーに、投与の説明書とともに入れることができる。
【０２３０】
実施例
本発明の他の利点や特徴は、上記図面を参照する以下の例から明らかであろう。これらの例は本発明を例示するものであって、決して請求の範囲を限定するものではない。
【０２３１】
Ｉ−結合プロトコール
Ｉ−１  一般式Ｐ−Ｌ−Ｎの構造で示される結合体の調製法（ここで、Ｐは細胞貫通ペプチドであり、ＮはｓｉＲＮＡであり、Ｌは、ＰとＮとを連結するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである）：１本鎖アプローチ
【０２３２】
１）５’アミノＣ３センスｓｉＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖の遊離の５’成分上に固定されたＮＨ2−（ＣＨ2）3−リン酸塩成分）を無菌水に溶解する（２ｍＭ）、
２）５’アミノＣ３センスｓｉＲＮＡ鎖をリン酸緩衝液、ｐＨ８．２（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ）で最終ｓｉＲＮＡ濃度を２ｍｇ／ｍＬに希釈する、
３）４００当量のＰＥＧ系リンカー（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中１０ｍｇ／ｍＬで可溶化）を添加後、混合物を室温（約２０℃）で９０分間インキュベートする、
４）アンチセンスｓｉＲＮＡを無菌水に溶解（２ｍＭ）し、１当量を活性化センスｓｉＲＮＡ鎖に８０℃で１５分間インキュベートしてハイブリダイズさせ、次に室温（約２０℃）までゆっくり冷却してｓｉＲＮＡ２本鎖を形成させる、
５）０．３容量のＮａＣｌ（１Ｍ）と２．５容量の無水エタノールを加えて（−８０℃で４５分間）２本鎖を沈殿させる、
【０２３３】
６）遠心分離（２００００ｇで４５分間、４℃）して沈降物を採取する、
７）上清を除去し、沈殿したｓｉＲＮＡをエタノール７０％（ｖ／ｖ）水溶液で３回洗浄する（各洗浄の間に遠心分離、２０００ｇ、４℃で１０分間、を行い、上清を除去する）、
８）沈殿したｓｉＲＮＡを室温で乾燥させる、
９）２本鎖活性化ｓｉＲＮＡをリン酸緩衝液、ｐＨ７．１（ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ）に溶解して、最終ｓｉＲＮＡ濃度を２ｍｇ／ｍＬにする、
１０）ＵＶ２６０ｎｍで正確なｓｉＲＮＡ濃度を測定する、
１１）少なくとも１つのシステイン残基を含む３当量のＣＰＰ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．１中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、次に室温で１時間インキュベートして、活性化された２本鎖ｓｉＲＮＡをペプチドと結合させる、
１２）場合により、反応混合物を−２０℃で保存する、
１３）場合により、ＰＡＧＥにより反応混合物を分析して結合効率を評価する、
１４）結合体を沈殿させ、上記したように洗浄（０．３容量のＮａＣｌ（１Ｍ）と２．５容量の無水エタノール）して、空気乾燥する。
【０２３４】
Ｉ−２  一般式Ｐ−Ｌ−Ｎの構造で示される結合体の調製法（ここで、Ｐは細胞貫通ペプチドであり、ＮはｓｉＲＮＡであり、Ｌは、ＰとＮとを連結するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである）：２本鎖アプローチ
【０２３５】
１）センス鎖の５’アミノＣ３修飾（すなわち、センス鎖の遊離の５’成分上に固定されたＮＨ2−（ＣＨ2）3−リン酸塩成分）を有するハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ（凍結乾燥）を無菌水に溶解する（２ｍＭ）、
２）リン酸緩衝液、ｐＨ８．２（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ）で最終ｓｉＲＮＡ濃度を２ｍｇ／ｍＬに希釈し、４００当量のＰＥＧ系リンカー（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中１０ｍｇ／ｍＬで可溶化）を添加した後、反応混合物を室温（約２０℃）で９０分間インキュベートし、次に８０℃で１５分間インキュベートする、
３）反応混合物を室温（約２０℃）までゆっくり冷却してｓｉＲＮＡ２本鎖を形成させる、
４）０．３容量のＮａＣｌ（１Ｍ）と２．５容量の無水エタノールを加えて（−８０℃で４５分間）２本鎖を沈殿させる、
５）遠心分離（２００００ｇで４５分間、４℃）して沈降物を採取する、
６）上清を除去し、沈殿したｓｉＲＮＡをエタノール７０％（ｖ／ｖ）水溶液で３回洗浄する（各洗浄の間に、２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を除去する）、
７）沈殿したｓｉＲＮＡを室温で乾燥させる、
８）２本鎖活性化ｓｉＲＮＡをリン酸緩衝液、ｐＨ７．１（ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ）に溶解して、最終ｓｉＲＮＡ濃度を２ｍｇ／ｍＬにする、
９）ＵＶ２６０ｎｍで正確なｓｉＲＮＡ濃度を測定する、
１０）少なくとも１つのシステイン残基を含む３当量のＣＰＰ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．１中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、次に室温で１時間インキュベートして、活性化された２本鎖ｓｉＲＮＡをＣＰＰと結合させる、
１１）場合により、反応混合物を−２０℃で保存する、
１２）場合により、ＰＡＧＥにより反応混合物を分析して結合効率を評価する、
１３）結合体を沈殿させ、上記したように洗浄（０．３容量のＮａＣｌ（１Ｍ）と２．５容量の無水エタノール）して、空気乾燥する。
【０２３６】
Ｉ−３  一般式Ｐ−Ｌ−Ｎの構造で示される結合体の調製法（ここで、Ｐは細胞貫通ペプチドであり、Ｎはアンチセンスヌクレオチドであり、Ｌは、ＰとＮとを連結するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである）
【０２３７】
１）５’アミノＣ３センスオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドの遊離の５’成分上に固定されたＮＨ2−（ＣＨ2）3−リン酸塩成分）を無菌水に溶解する（２ｍＭ）、
２）５’アミノＣ３オリゴヌクレオチドをリン酸緩衝液、ｐＨ８．２（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ）で最終ｓｉＲＮＡ濃度を２ｍｇ／ｍＬに希釈する、
３）４００当量のＰＥＧ系リンカー（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中１０ｍｇ／ｍＬで可溶化）を添加後、混合物を室温（約２０℃）で９０分間インキュベートする、
４）０．３容量のＮａＣｌ（１Ｍ）と２．５容量の無水エタノールを加えて（−８０℃で４５分間）オリゴヌクレオチドを沈殿させる、
５）遠心分離（２００００ｇで４５分間、４℃）して沈降物を採取する、
【０２３８】
６）上清を除去し、沈殿したオリゴヌクレオチドをエタノール７０％（ｖ／ｖ）水溶液で３回洗浄する（各洗浄の間に、２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を除去する）、
７）沈殿したオリゴヌクレオチドを室温で乾燥させる、
８）オリゴヌクレオチドをリン酸緩衝液、ｐＨ７．１（ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ）に溶解して、最終ｓｉＲＮＡ濃度を２ｍｇ／ｍＬにする、
９）ＵＶ２６０ｎｍで正確なオリゴヌクレオチド濃度を測定する、
１０）少なくとも１つのシステイン残基を含む３当量のＣＰＰ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．１中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、次に室温で１時間インキュベートして、活性化されたオリゴヌクレオチドをペプチドと結合させる、
１１）場合により、反応混合物を−２０℃で保存する、
１２）場合により、ＰＡＧＥにより反応混合物を分析して結合効率を評価する、
１３）場合により、結合体を沈殿させ、上記したように洗浄（０．３容量のＮａＣｌ（１Ｍ）と２．５容量の無水エタノール）して、空気乾燥する。
【０２３９】
Ｉ−４  以下で使用されるＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体の調製法
上記方法（段落Ｉ−１）に記載の方法に従ってＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体を調製した。
【０２４０】
リンカーは以下の通りである：
−  以下の式ＩＩＩのＰＥＧ系リンカー：
【０２４１】
【化６】
2009519033.tif 000010
【０２４２】
（式中、ｋ＝３でありｚ＝４、１２、又は８０である）、
【０２４３】
−  以下の式ＶＩのスルホＳＭＣＣリンカー（結合プロトコールでＰＥＧ系リンカーがスルホＳＭＣＣリンカーで置換されている）：
【０２４４】
【化７】
2009519033.tif 000011
【０２４５】
以下の式ＶＩＩのＳＰＤＰリンカー（結合プロトコールでＰＥＧ系リンカーがＳＰＤＰリンカーで置換されている）：
【０２４６】
【化８】
2009519033.tif 000012
【０２４７】
以下の式Ｖ、ＶＩＩＩ、及びＩＸは、Ｎ末端又はＣ末端に１つのシステイン残基と、ｓｉＲＮＡとを含有するＣＰＰに１回結合した式ＩＩＩ、ＶＩ、及びＶＩＩのリンカーを示す：
【０２４８】
−  式Ｖ：
【０２４９】
【化９】
2009519033.tif 000013
【０２５０】
−  式ＶＩＩＩ：
【０２５１】
【化１０】
2009519033.tif 000014
【０２５２】
−  式ＩＸ：
【０２５３】
【化１１】
2009519033.tif 000015
【０２５４】
（式中、
−  ｋ＝３；ｚ＝４、１２、又は８０であり、そして
−  Ｘ＝Ｈなら、Ｙ＝ＣＰＰアミノ酸配列であり、又はＸ＝ＣＰＰアミノ酸配列なら、Ｙ＝ＯＨである（システイン残基がＣＰＰのＣ末端又はＮ末端にあるかによる）。
【０２５５】
ＩＩ−  増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）のための小干渉性ＲＮＡのインビトロ送達
この試験の目的は、異なるリンカー（本発明のＰＥＧ系リンカーと公知のスルホＳＭＣＣ及びＳＰＤＰリンカー）を用いて作成した活性ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体のインターナリゼーションと細胞内送達の効率を、ＣＰＰとｓｉＲＮＡの間で比較することである。この目的のために、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子が選択された。
【０２５６】
ＩＩ−１  材料と方法
ＩＩ−１−１  ヌクレオチド配列
ｓｉＲＮＡは以下の修飾を有するものをＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃに注文した：
【０２５７】
センス鎖：
５プライム端：アミノＣ３
３プライム端：ｄＴｄＴオーバーハングとｃｙ５標識物（以下の説明を参照）
アンチセンス鎖：３プライム端：ｄＴｄＴオーバーハング
【０２５８】
配列＃１、ｓｉＧＦＰ１と呼ぶ：５’−ＧＡＡＣＧＧＣＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＡＣ−３’（１９ヌクレオチド）
（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：Ｗ１３５−１４１（２００４））。
【０２５９】
配列＃２、ｓｉＧＦＰ２と呼ぶ：５’−ＡＣＵＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣ−３’（１９ヌクレオチド）
（Ｍｕｒａｔｏｖｓｋａ，ａｎｄ  Ｅｃｃｌｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５８：６３−６８（２００４））。
【０２６０】
配列＃３、不活性ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ｓｉＧＦＰｓと呼ぶ：５’−ＧＣＡＣＧＡＣＵＧＧＡＣＣＡＡＧＵＣＣ−３’（１９ヌクレオチド）
（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ３２７：７６１−７６６  （２００３））。
【０２６１】
インビトロスクリーニングと活性試験のために、センス鎖とアンチセンス鎖の３’位でホスホロチオエート結合によりいくつかのｓｉＲＮＡを安定化（３プライムオーバーハングの２つのチミン間のホスフェート代わりにホスホロチオエート）させ、これらをｐｓＧＦＰ  ｓｉＲＮＡと名付けた；ｓｉＲＮＡは８０％を超える結合比でＣＰＰ−ｓｉＲＮＡに結合した。
【０２６２】
ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体の細胞内の運命を追跡するために、シアニン５（ｃｙ５）標識ｓｉＲＮＡを設計した。細胞はすでにフルオレセイン陽性（ｅＧＦＰ発現のため）であったため、より短い波長を放射する蛍光物質より発光が広く分離するため、Ｃｙ５色素を選択した。しかし６７０ｎｍでの発光極大のために、ｃｙ５は励起のための正しいレーザー（例えばクリプトン／アルゴンイオンレーザー）を備えた共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。
【０２６３】
ＩＩ−１−２  細胞貫通ペプチド
ＤＰＶ：
ＤＰＶ１５ｂ（２３ａａ：ＮＨ2−（Ｃ）ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ−ＣＯＯＨ）＝配列番号１２とＮ末端に付加された１つのシステイン残基、
ＤＰＶ３（１７ａａ：ＮＨ2−ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳ（Ｃ）−ＣＯＯＨ）＝配列番号２とＣ末端に付加された１つのシステイン残基、
【０２６４】
ＤＰＶ１０４８（１９ａａ：ＮＨ2−（Ｃ）ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＤＶ−ＣＯＯＨ）＝配列番号９とＮ末端に付加された１つのシステイン残基、
【０２６５】
ペネトラチン長いバージョン（１６ａａ：ＮＨ2−（Ｃ）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＣＯＯＨ）＝配列番号２８とＮ末端に付加された１つのシステイン残基、「ｐ１６」と呼ぶ
【０２６６】
ＩＩ−１−３  リンカー
安定なリンカー：
−スルホＳＭＣＣ、
式ＩＩＩ（下記）の（ＰＥＧ）ｚ系リンカー、ここでｚ＝４、１２、又は８０である（それぞれ−ＰＥＧ4−、−ＰＥＧ12−、及び−ＰＥＧ80−と呼ぶ）
【０２６７】
【化１２】
2009519033.tif 000016
【０２６８】
還元可能なリンカー：−ＳＰＤＰ−（ジスルフィド結合）
【０２６９】
ＩＩ−１−４  細胞株
ＧＦＰ−ＥＯＭＡ：ｐＥＧＦＰ−ＮＩで安定にトランスフェクトした血管内皮腫からのマウス内皮細胞、増強された緑色蛍光タンパク質をコードする；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２５８７。細胞は低レベルのｅＧＦＰ蛍光のために、ウェスタンブロットで分析した。
【０２７０】
標識ｓｉＲＮＡによるインターナリゼーションを定量するために非ＧＦＰ細胞株を試験に含めた：
【０２７１】
ＨｅＬａ：子宮腺癌からのヒト上皮細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２）
ＮＣＩ−Ｈ４６０：肺癌からのヒト上皮細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７）
ＰＣ−３：前立腺腺癌からのヒト上皮細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２６）
細胞はフローサイトメトリーとウェスタンブロットで分析した。
【０２７２】
ＩＩ−１−６  方法
ＩＩ−１−６−Ａ  ｅＧＦＰ一過性トランスフェクション細胞（ＨｅＬａ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＰＣ−３、又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１）
【０２７３】
０日目：細胞を１×１０5細胞／ウェル／ｍｌで２４ウェルプレートで血清を有する培地に蒔いて、トランスフェクションの日に９０％コンフルエンスを得る。
【０２７４】
１日目：リポフェクタミン（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ＃  １１６６８−０２７）を用いて、製造業者の説明書に従って一過性トランスフェクション
【０２７５】
日常的に、１２．５ｐｍｏｌのＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ対照又はＣＰＰ−ｓｉＲＮＡの同等のｓｉＲＮＡ）＋１．６μｇのｅＧＦＰプラスミドを、製造業者のプロトコールに従って再懸濁し、別のチューブで５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）に希釈した。２μｌのリポフェクタミン（登録商標）２０００を４８μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）で希釈した。希釈したｓｉＲＮＡと希釈したリポフェクタミン（登録商標）２０００を一緒にし、静かに混合し、室温で３０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン（登録商標）２０００混合物（１００μｌ）を新鮮な培地（４００μｌ）とともに直接細胞に加えた。トランスフェクションの４時間後、培地を新鮮な培地で交換し（１ｍｌ）、細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、次に細胞分析を行った。
【０２７６】
ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体処理のために、結合体を培地で所望の濃度で３７℃で４８時間加え、次に採取した。
【０２７７】
ＩＩ−１−６−Ｂ  ＧＦＰ発現細胞（ＧＦＰ−ＥＯＭＡ）
０日目：細胞を１×１０5細胞／ウェル／ｍｌで２４ウェルプレートで血清を有する培地に蒔く。
【０２７８】
１日目：ＤＰＶ−ｓｉＲＮＡ処理のために、結合体を新鮮な培地で所望の濃度で直接細胞に加え、３７℃で３又は７時間インキュベートし、次にペネトラチン−ｓｉＲＮＡについて報告されたように採取した（Ｍｕｒａｔｏｖｓｋａ，ａｎｄ  Ｅｃｃｌｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５５８：６３−６８（２００４））。
【０２７９】
ＩＩ−１−６−Ｃ  フローサイトメトリー分析
細胞を１×１０5細胞／ウェル／ｍｌで２４ウェルプレートに蒔き、既に記載されているように処理した。次に細胞をＰＢＳ  １×で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して採取した。細胞を氷冷ＰＢＳ−１％ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメーターで測定するまで氷で保存した。
【０２８０】
ＩＩ−１−６−Ｄ  共焦点分析
細胞を１×１０4細胞／ウェルの密度でガラス−Ｌａｂｔｅｃｋ  ８ウェルに蒔いた（二重測定で）。ＤＰＶ−ｓｉＲＮＡシアニン5結合体を２５又は１００ｎＭで試験し、３７℃で数時間インキュベートした（２４時間、又は経時変化実験で記載の時間）。細胞をＰＢＳ  １×で３回洗浄し、次に４％ＰＦＡ溶液で１０分間固定した。最後に細胞をＰＢＳ  １×３で３回洗浄し、ＤＡＰＩ  ｓｌｏｗｆａｄｅキットでマウントした後、共焦点観察を行った。
【０２８１】
ＩＩ−２  結果
ＩＩ−２−１  ＤＰＶ−ｓｉＲＮＡ結合体の細胞インターナリゼーション
共焦点顕微鏡は、スルホＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、ＰＥＧ4−、ＰＥＧ12−、又はＰＥＧ80−系リンカーを使用して、ＤＰＶ３、ＤＰＶ１５ｂ、及びＤＰＶ１０４８（上記説明参照）に結合した時、裸のｓｉＲＮＡと比較して、マウス内皮細胞（ＧＦＰ−ＥＯＭＡ）とヒト癌細胞株（ＨｅＬａ、ＰＣ−３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でｓｉＧＦＰ配列の増強された細胞内送達を明瞭に示す。ＤＰＶ−リンカー−ｓｉＧＦＰ結合体はすべてうまくインターナリゼーションされ、細胞質中にのみ明瞭に存在し、ｐｕｎｔａｃｔｅ染色（エンドソーム／サイトゾル）を示す（データは示していない）。
【０２８２】
ＩＩ−２−２  ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体活性
インターナリゼーションしたＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ結合体の細胞内活性を、まずＧＦＰ−ＥＯＭＡ細胞で試験した。ＤＰＶ−リンカー−ｓｉＧＦＰ１（リンカー＝スルホＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、ＰＥＧ4系リンカー）で処理後３日間は、ｅＧＦＰタンパク質発現の阻害は無かった（又は１０％未満）が、処理の７日後にフローサイトメトリーによりｅＧＦＰの中程度のダウンレギュレーションとタンパク質（ウェスタンブロット）が観察された（最大３７％）。ＤＰＶ３とＤＰＶ１０４８  ｓｉＲＮＡ結合体で同様の活性が観察得られた（データは示していない）。ＤＰＶ間でほとんど差はなかったが（ＤＰＶ１０４８はインビトロでわずかに効率が低かった）、ＰＥＧ4リンカーは明らかに、ｅＧＦＰ発現の最も効率的なダウンレギュレーションを示した（３７％のサイレンス化作用）。さらに試験した濃度範囲（２５、１２５、４００、５００ｎＭ）ではＤＰＶ−リンカー−ｓｉＲＮＡについて明らかな二酸−ジアミン比は証明されず、ＲＮＡｉ系がすでに飽和していることを示唆する。
【０２８３】
ｅＧＦＰ蛍光又はタンパク質発現の中程度のダウンレギュレーションが、ｅＧＦＰトランスフェクション後にＤＰＶ−ｓｉＲＮＡ処理した４８時間に一過性トランスフェクション細胞で観察された（表２）。
【０２８４】
ＰＥＧ4系リンカーは、スルホＳＭＣＣやＳＰＤＰリンカーより良好な活性を示した。
【０２８５】
表２：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いる一過性トランスフェクションＰＣ−３中のＤＰＶ−リンカー−ｓｉＲＮＡ  ｅＧＦＰのサイレンス化活性。ＧＦＰ蛍光強度を評価するために、分析はトランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリーにより行った。値は「ｎ」個の独立した実験から編集した。
【０２８６】
【表２】
2009519033.tif 000017
【０２８７】
ＩＩ−２−３  ＣＰＰ−リンカー−ｓｉＲＮＡ結合体効率
ｅＧＦＰ一過性トランスフェクションＰＣ−３細胞で、ＳＰＤＰ又はＰＥＧ4系リンカーを介してｓｉＲＮＡ  ｅＧＦＰに結合したペネトラチン（長いバージョン、ｐ１６）とＤＰＶ１５ｂとを比較する効率試験を行った。結果を図１に示す。
【０２８８】
ＩＩＩ−  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株中のＶＥＧＦ分泌に対するＤＰＶ１５ｂ−ＳＭＣＣ−ｓｉＶＥＧＦ、ＤＰＶ１５ｂ−ＳＰＤＰ−ｓｉＶＥＧＦ、ＤＰＶ１５ｂ−ＰＥＧ4−ｓｉＶＥＧＦ、ＤＰＶ１５ｂ−ＰＥＧ80−ｓｉＶＥＧＦのインビトロ評価
３つの実験でＤＰＶ１５ｂ（配列番号１２）を代表的細胞貫通ペプチドとして使用した。ＤＰＶ１５ｂとＶＥＧＲに特異的なｓｉＲＮＡ（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３９１９−２２（２００３））を、４つの異なるリンカー分子（スルホＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、ＰＥＧ4系リンカー、及びＰＥＧ80系リンカー）を使用して結合させた。
【０２８９】
ＩＩＩ−１  材料と方法
ＩＩＩ−１−１  細胞培養
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ番号＃ＨＴＢ−２６）から得られた。これらを、１０％熱不活性化ＦＢＳ、グルタミン（２ｍＭ）を補足したＬｅｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地で培養した。細胞を３７℃で０％ＣＯ2雰囲気で９０％湿度でインキュベートした。
【０２９０】
ＩＩＩ−１−２  化学物質
ＤＰＶ１５ｂ−ポリ（エチレングリコール）4−ｓｉＶＥＧＦ（ＤＰＶ１５ｂ−ＰＥＧ4−ｓｉＶＥＧＦ）、ＤＰＶ１５ｂ−ポリ（エチレングリコール）80−ｓｉＶＥＧＦ２（ＤＰＶ１５ｂ−ＰＥＧ80−ｓｉＶＥＧＦ）、ＤＰＶ１５ｂ−（Ｎ−スクシニミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）−ｓｉＶＥＧＦ（ＤＰＶ１５ｂ−ＳＰＤＰ−ｓｉＶＥＧＦ）、及びＤＰＶ１５ｂ−スルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート−ｓｉＶＥＧＦ（ＤＰＶ１５ｂ−ＳＭＣＣ−ｓｉＶＥＧＦ）化合物の合成と分析は、上記したように行った。
【０２９１】
ｓｉＶＥＧＦセンス鎖とアンチセンス鎖はＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから供給され、Ｄｉａｔｏｓによりハイブリダイズされた。
センス鎖：５’ＡＵＧ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ−ｄＴｓｄＴ
【０２９２】
ＩＩＩ−１−３  トランスフェクションアッセイ
ｓｉＲＮＡとＤＰＶ−リンカー−ｓｉＶＥＧＦのトランスフェクションをリポフェクタミン（登録商標）２０００（ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行い、結合後に活性の消失が無いこと、又はリポフェクタミン無しでＤＰＶ特異的細胞内送達を証明した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（７×１０4）を７０％コンフルエンスに達するまで、２４ウェルプレートに一晩蒔いた。リポフェクタミン２０００を用いるトランスフェクションをＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ還元血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。簡単に説明するとトランスフェクションの日に、細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳを含有する４００μｌの培地でトランスフェクションまで維持した。２５ｎＭのｓｉＶＥＧＦ／又はＤＰＶ−リンカー−ｓｉＶＥＧＦと５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地を混合し、別のチューブで１μｌのリポフェクタミン（登録商標）２０００と５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地も混合した。これらのチューブを室温でインキュベートした。
【０２９３】
ＩＩＩ−１−４  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ
トランスフェクト細胞の上清中のＶＥＧＦ分泌を評価するために、２０時間後培地を採取し、遠心分離して細胞破片を除去し、ＶＥＧＦについて測定するまで−２０℃で保存した。ＶＥＧＦは  Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットを使用して製造業者のプロトコールに従って定量した。４５０ｎｍと５４０ｎｍで吸光度をプロットして、未知の値を標準物質の値と比較して、ＶＥＧＦ値を計算した。アッセイ当たりの総タンパク質濃度を使用してＶＥＧＦ発現を標準化した。総細胞タンパク質は以下のように単離した：細胞ペレットを冷ＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍＬの溶解バッファー（冷ＮａＯＨ  １Ｍ）に再懸濁した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用してタンパク質を定量した。データは、ｐｇ  ＶＥＧＦ／ｍｌ／ｍｇタンパク質で表す。
【０２９４】
ＩＩＩ−２  結果
リポフェクタミン（登録商標）２０００を使用して細胞内送達後、ＤＰＶ−ｓｉＲＮＡ結合体のｓｉＲＮＡ活性を確認した。この試験は、ＰＥＧ4系リンカーとの結合体のみが裸のｓｉＲＮＡに活性に等しい活性を与えることを証明した。スルホＳＭＣＣとＳＰＤＰは、裸のｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ活性の消失を示した（図２）。
【０２９５】
活性ｓｉＲＮＡをインビトロで送達するＤＰＶ−ｓｉＲＮＡ結合体の能力を評価するために、リポフェクタミン（登録商標）トランスフェクション試薬無しで同じ実験を行った。この試験は、ＰＥＧ4系リンカーとＰＥＧ80ベースのリンカーを含有するＤＰＶ−ｓｉＲＮＡ分子が最も大きいインビトロ活性を示す（対照に対して分泌ＶＥＧＦの２５％の阻害が観察された、図２）ことを証明し、これはスルホＳＭＣＣ又はＳＰＤＰリンカーについて観察されたものより大きかった。
【０２９６】
ＩＶ−  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデル中のＤＰＶ１５ｂ−ＰＥＧ４−ｓｉＲＮＡVEGF結合体の用量依存性効力の評価
インビトロスクリーニング後にＤＰＶ１５ｂ−ＰＥＧ4−ｐｓＶＥＧＦ２（ＤＰＶ１５ｂ−ｓｉＲＮＡVEGF）結合体が選択された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、結合体がインビトロでより高いＶＥＧＦ阻害効率を示した細胞株であった。
【０２９７】
動物は１日に１回で連続５日間、大型丸薬静脈内注射、マウス１匹当たり２５、５０、及び１００μｇ当量のｓｉＲＮＡの結合体を担癌動物に投与し、マウス１匹当たり５０及び１００μｇの裸のｓｉＲＮＡと比較した。
【０２９８】
ＩＶ−１  材料と方法
ＩＶ−１−１  腫瘍モデル
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−２６）をＮＭＲＩヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍が成長し始めた時、治療を開始した（移植の６日後）。
【０２９９】
ＩＶ−１−２  治療
治療前に動物ユニットで動物を７日間観察した。動物実験の倫理ガイドラインに従って動物実験を行った。最初の注射の日（移植の６日後）に、マウスをランダムに７群に分けた。マウスの側方尾静脈に１０μｌ／ｇの一定容量で静脈内注射により治療した。
群は以下の通りである：
【０３００】
【表３】
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【０３０１】
ＩＶ−１−３  毒性と抗腫瘍効力の評価
実験の経過中、体重と腫瘍サイズを２日又は３日毎（週末を除く）にコントロールした。罹患の症状を示した時、３０％の体重低下が観察された時、又は腫瘍容積が体重の約１０％に達した時、動物を屠殺した。週末を除いて、毎日動物の死亡率を記録した。
【０３０２】
腫瘍容積は、２次元キャリパー測定値から式［長さ×幅2］／２を使用して決定した。
ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍ  ３．０２ソフトウェアを使用して毎週、腫瘍増殖の統計解析（ＡＮＯＶＡ１の後にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定）を行った。
【０３０３】
ＩＶ−２  結果
ＩＶ−２−１  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデルでのＤＰＶ１５ｂ−ｓｉＲＮＡVEGF又は裸のｓｉＲＮＡＶＥＧＦのインビボ効力
毎週行った腫瘍容積の変化と統計解析を以下に示す（図３）。
【０３０４】
実験の経過中、裸のｓｉＲＮＡは活性の兆候は示さなかった。一方、ＤＰＶ１５ｂ−ｓｉＲＮＡVEGF結合体は、１６日目に始まる腫瘍増殖の低下（図３ｂ参照）を示し、対照動物を屠殺した後も存在した（図３ａ）。この作用は用量依存性であり、最大効力は１００μｇで観察され、５０μｇは中程度の活性を誘導し、２５μｇは不活性であった。４９、５８、及び６６日目に１００μｇの裸のｓｉＲＮＡVEGFで処理した動物の腫瘍増殖と比較して、ＤＰＶ１５ｂ−ｓｉＲＮＡVEGF（１００μｇ）の効力は有意であった。
【０３０５】
ＩＶ−２−２  体重変化、見かけの毒性
効力実験の間、体重を週２回追跡した。治療毒性は、臨床症状と体重変化に基づいて評価した。
【０３０６】
どの群でも急性毒性は観察されなかった。実験期間中（８０日間）、イリノテカンで治療したマウス（これはほぼ２０％の体重低下を示した）以外は、毒性症状（体重低下又は死亡）は報告されなかった。
【０３０７】
ＩＶ−３  結論
この実験は、ＰＥＧ4系リンカーを使用してＤＰＶ１５ｂ（配列番号１２）に結合させる時、ｓｉＲＮＡVEGFの抗腫瘍効力を証明した。実際裸のｓｉＲＮＡVEGFは両方の試験用量で完全に不活性であり、一方ＤＰＶ１５ｂ−ｓｉＲＮＡVEGFは、その２つの高用量（マウス１匹当たり５０及び１００μ当量ｓｉＲＮＡ）で用量依存的に活性であった。さらに、注射の時も実験の経過中も、結合体による毒性は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１】図１は、ＳＰＤＰ又はＰＥＧ4系リンカーを介してｓｉＲＮＡ  ｅＧＦＰ（ｓｉＧＦＰ１）に結合した、２つのＣＰＰであるペネトラチン（長いバージョン、ｐ１６と記載）とＤＰＶ１５ｂを比較する効力試験（ＲＦＩ（相対蛍光強度）を測定することによる）を、ｅＧＦＰで一過性トランスフェクトしたＰＣ−３細胞で行った。ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ分子の連続的インキュベーション後４８時間、ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡの活性を評価した。「Ｌ」はリポフェクタミン（登録商標）２０００によるトランスフェクションを意味する。
【図２】図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中のＶＥＧＦ分泌に対するリンカーの影響を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、記載のＤＰＶ１５ｂ−系−ｓｉＶＥＧＦ（ＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ、ＰＥＧ4系リンカー、及びＰＥＧ80系リンカー）で２０時間処理した。調整培地をＥＬＩＳＡで分析した。細胞を溶解し、タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより内部標準化して定量した。次に細胞を溶解し、上清を材料と方法に記載のようにＶＥＧＦ分泌について分析した。対照として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１未処理細胞の上清を、２０時間インキュベーション後分析した。データは平均±ＳＥとして示す（ｎ＝３）。「Ｌ」はリポフェクタミン（登録商標）２０００によるトランスフェクションを意味する。
【図３】図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌モデルで、ＤＰＶ−（ＰＥＧ4系リンカー）−ｓｉＲＮＡVEGF結合体と裸のｓｉＲＮＡVEGFのインビボ効力試験を示す。治療は静脈内経路で６〜１０日間（Ｑ１Ｄ５投与スケジュール、矢頭参照）行い、マウスに一定量（１０μＬ／ｇ）の食塩水（−）又は異なる投与溶液［ＤＰＶ１５ｂ−ｓｉＲＮＡVEGFを１００（−黒三角−）、５０（−−黒三角−−）、又は２５（−−△−−）μｇ当量ｓｉＲＮＡ／マウスで、ｓｉＲＮＡVEGFを１００（−−◆−−）又は５０（−−◇−−）μｇ／マウスで、又はイリノテカンを４８．１５μｍｏｌ／ｋｇ（−−●−−）］を投与した。結果は平均腫瘍容積の０〜８０日（図３Ａ）又は０〜３５日（図３Ｂ）の変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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