(57)【要約】  本発明は、アミノ酸産生微生物においてアミノ酸を産生する方法に関する。前記方法によれば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、伝達タンパク質により低下する。
2009507505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝達タンパク質により２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を低下させる、アミノ酸産生微生物においてアミノ酸を産生する方法。
【請求項２】
微生物が桿菌、好ましくはグラム陽性桿菌、特に好ましくはコリネバクテリア科またはマイコバクテリア科あるいはストレプトマイセス科であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物がコリネバクテリア属由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、オルニチン、アスパラギン、アルギニン、リジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システインおよび／またはプロリン、好ましくはグルタミン酸および／またはグルタミン、特に好ましくはグルタミン酸の産生を高めることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸のＬ−異性体の産生を高めることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
伝達タンパク質が、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号２に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
伝達タンパク質がリン酸化されていないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
伝達タンパク質が１４および／１５位、好ましくは１４位のトレオニンアミノ酸でリン酸化されていないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
伝達タンパク質がＰｋｎＧタンパク質キナーゼによりリン酸化されないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
伝達タンパク質が、
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号３と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされるＰｋｎＧタンパク質キナーゼによりリン酸化されないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性が低下することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性が、
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号３と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列を欠失することにより低下することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
微生物を、ビオチン欠乏、界面活性剤またはペニシリンの添加、エタンブトールの添加、ｄｔｓＲ１遺伝子もしくは他の脂肪酸生合成の遺伝子の機能停止または、温度上昇によりグルタミン酸の過剰産生を誘発する条件下において培養することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号２に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる伝達タンパク質。
【請求項１６】
微生物において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を制御するための請求項１５に記載の伝達タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、独国特許第１０２００５０４３９７９９号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、アミノ酸産生微生物においてアミノ酸を産生する方法に関し、この方法は、伝達タンパク質により低下する２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。
【０００３】
従来技術
アミノ酸は、経済的な関心が高く、様々な多くの方法で使用されており、これらを使用して基本食品および動物食品の質を改善することが好ましい。それゆえ、これらは、経済的重要性が高く、需要が増大している。例えば、Ｌ−リジンおよびＬ−トレオニン、Ｌ−メチオニンならびにＬ−トリプトファンは、動物食餌補助剤として必要とされ、Ｌ−グルタミン酸は、香辛料に添加され、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−チロシンは、製薬業界において必要であり、Ｌ−アルギニンおよびＬ−イソロイシンは、医薬品として必要とされ、またはＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸塩およびＬ−フェニルアラニンは、精製化学製品合成の出発物質として必要とされている。
【０００４】
これらのかなり様々なアミノ酸を産生する好ましい方法は、微生物によるバイオテクノロジー産生であり、それは、この方法において特定のアミノ酸の生物学的活性および光学活性形態が得られるためであり、簡単で安価な原材料を使用することが可能である。現在、１．５×１０6トン以上のアミノ酸が微生物により産生されている。アミノ酸は、コリネフォルム細菌株、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの発酵により産生されることが公知である。これらの重要性が高いことから、産生プロセスの改良に継続的な努力がなされている。手法的な改良には、撹拌および酸素供給等の発酵技術、もしくは発酵中の糖濃度等の栄養媒体の組成物、またはイオン交換クロマトグラフィーによる産物形態への後処理、あるいは微生物自体の固有の性能特性に関連する測定が関与しうる。
【０００５】
前記微生物の性能特性は、突然変異生成、淘汰および突然変異体選択の方法を応用することにより改良される。これは、代謝拮抗物質に耐性であり、例えばリジン類似体であるＳ−（２−アミノエチル）システイン、または調節に重要な代謝産物に栄養要求性であり、Ｌ−アミノ酸を産生する菌株をもたらす。
【０００６】
ここ数年、組み換えＤＮＡ法も同様に使用し、個々のアミノ酸生合成経路を増幅し、アミノ酸産生の効果を研究することにより、アミノ酸産生コリネバクテリア菌株を改良している。これに関する総説は、特に、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ（"Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ"，ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｄｅｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎ（Ｅｄｓ．），Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，１９８５，１１５−１４３），Ｈｉｌｌｉｇｅｒ（ＢｉｏＴｅｃ  ２，４０−４４（１９９１）），Ｅｇｇｅｌｉｎｇ（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ６：２６１−２７２（１９９４）），Ｊｅｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｎｓｋｅｙ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，７３−１０３（１９９５）），およびＳａｈｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７８２，２５−３９（１９９６））に見つけることができる。
【０００７】
通常、細菌は、成長に必要な量のみのアミノ酸を産生し、それゆえ、アミノ酸を過剰に産生および排泄しない。この理由は、細胞が多くの方法においてアミノ酸生合成を制御しているためである。その結果、制御機構を機能停止することにより産物形成を改良するために多くの種々のプロセスがすでに公知である。これらのプロセスは、例えばアミノ酸類似体を使用して、効率的な生合成調節を停止する。従って、例えば、記載のプロセスは、Ｌ−チロシン類似体およびＬ−フェニルアラニン類似体に耐性のあるコリネバクテリア菌株を利用する（日本特許第１９０３７／１９７６号および３９５１７／１９７８号）。また、Ｌ−リジン類似体またはＬ−トレオニン類似体に耐性のある細菌において記載されているプロセスを使用して、制御機構を打開する（欧州特許第０２０５８４９号、英国特許第２１５２５０９号）。
【０００８】
さらに、組み換えＤＮＡ技術により創製された微生物も開示しており、これは、もはやフィードバック抑制されることができない鍵酵素にコードする遺伝子をクローニングおよび発現させることにより、同様に、生合成調節を除去している。従って、例えば、組み換体である、プラスミドでコードしたフィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを有するＬ−リジン産生細菌を開示している（欧州特許第０３８１５２７号）。組み換体であるフィードバック耐性プレフェン酸デヒドロゲナーゼを有するＬ−フェニルアラニン産生細菌もまた記載されている（日本特許第１２３４７５／１９８６号、欧州特許第０４８８４２４号）。
【０００９】
さらに、アミノ酸収率を増加させることも、フィードバック感受性アミノ酸合成酵素をコードしない遺伝子を過剰発現させることにより実現している。したがって、例えば、リジン形成は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素の合成を増加することにより改良される（欧州特許第０１９７３３５号）。同様に、イソロイシン形成は、トレオニン脱水酵素合成を増加させることにより改良される（欧州特許第０４３６８８６号）。
【００１０】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３９：４２７−４３２に掲載されたＩｚｕｍｉ  Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｔ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  ＳＳ，Ｍｉｔｓｕｎａｇａ  Ｔ，Ｏｓｈｉｒｏ  Ｔ，Ｓｈｉａｍｏ  Ｍ，Ｍｉｙａｔａ  Ａ  ａｎｄ  Ｔａｎａｂｅ  Ｔ（１９９３）は、メチロトローフ細菌、例えばハイフォミクロビウム属を使用してメタノールおよびグリシンからのＬ−セリンの発酵産生について記載している。
【００１１】
他のアミノ酸産生を増加させる試みでは、中央代謝系の一次代謝産物細胞の改良を提供することを目的とする。従って、組み換え技術により実現されるトランスケトラーゼの過剰発現が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの産物形成を改良できることが公知である（欧州特許第０６００４６３号）。さらにコリネバクテリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の低下が、芳香族アミノ酸の形成を改良し（欧州特許第０３３３１１４５号）、この場合、コリネバクテリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増加がアスパルギン酸ファミリーのアミノ酸の排泄を高める結果となった（欧州特許第０３５８９４０号）。
【００１２】
また、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍも産業用に使用し、グルタミン酸ファミリーのＬ−アミノ酸、特にＬ−グルタミン酸を産生する。国際公開９９／１８２２８（Ａ２）は、酵素の遺伝的修飾によるピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増加後または、ピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子発現の増加後に、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸ファミリーのアミノ酸の微生物産生が増加することを開示している。
【００１３】
Ｌ−グルタミン酸は、クエン酸回路中間体である２−オキソグルタル酸により形成される。前記の２−オキソグルタル酸において、２つの反応が競合する：ＮＡＤＰＨ−依存性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が２−オキソグルタル酸とアンモニウムを環元反応させ、Ｌ−グルタミン酸を得る反応、およびクエン酸回路の構成物質として２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＤＨＣ）が２−オキソグルタル酸からカルボキシル基を除去し、本プロセスでＮＡＤＨに環元されたＮＡＤ+を持つスクシニルＣｏＡを得る反応。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、２−オキソグルタル酸のＧＤＨのＫｍ値は、５．７ｍＭであり（Ｓｈｉｉｏ  ａｎｄ  Ｏｚａｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）６８：６３３−６４７（１９７０））、従って、２−オキソグルタル酸のＯＤＨＣのＫｍ値８０μＭに比べおよそ７０倍大きい（Ｓｈｉｉｏ  ａｎｄ  Ｕｊｉｇａｗａｔａｋｅｄａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４４：１８９７−１９０４（１９８０））。最近の研究では、コリネバクテリアの２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性は、グルタミン酸産生に最も大きな影響を与える因子であり（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃ．Ｂｉｏｓｙｓ．Ｅｎｇ．２５：２９１−２９８（２００３））、これは、ＧＤＨ活性の増加がグルタミン酸合成に有利なシフトを生じないためであることが示されている。
【００１４】
ＯＤＨ複合体の影響をこの酵素活性は、グルタミン酸排泄をもたらす条件下、例えばビオチン限界、界面活性剤の添加またはペニシリンの添加において低下するとする文献の報告により確かめる（Ｋａｗａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１１０９−１１１２（１９９７））。ＧＤＨ活性は、同じ条件下において変化しない。ＯＤＨＣ活性の低下もまた、温度感受性Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株によりグルタミン酸形成を誘発することを示した（Ｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．２７：１５３−１６２（２００５））。
【００１５】
さらに、Ｋｉｍｕｒａ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｖｏｌ．９４，Ｎｏ．６，５４５−５５１，２００２）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｄｔｓＲ１遺伝子の欠失によりＯＤＨＣ活性が親菌株のものに比べ３０％低くなることを記載している（Ｋｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｅｎｇ．９４：５４５−５５１（２００２））。ｄｔｓＲ１欠失突然変異体は、オレイン酸およびオレイン酸エステルに栄養要求性であり、かなりの量のＬ−グルタミン酸、さらにビオチン過剰量を排泄する（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３４：１５７−１６１（１９９７））。
【００１６】
これまで、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を特異的に変化させることは、遺伝子ｇｄｈの発現を欠失または改変することによってのみ実現された（Ｂｏｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１７−３２６（１９９２））；Ｂｏｅｒｍａｎｎ−ＥｌＫｈｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：２３２９−２３３１（１９９３）およびｏｄｈＡ（ＯＤＨＣのＥｌｏをコードする；（Ｕｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３３４７−３３５４（１９９６））。
【００１７】
ほとんどの生物の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＤＨＣ）は、異なる酵素活性、すなわち、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｌｏ）、ジヒドロリポアミドＳ−スクシニルトランスフェラーゼ（Ｅ２）およびジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）を有する３つの異なるタンパク質からなる。コリネバクテリアのＥｌｏタンパク質（ｏｄｈＡ遺伝子によりコードされる）は、独特な構造を有し、これは、Ｅ２サブユニットのカルボキシ末端領域と相同なアミノ末端領域を有するためである（Ｕｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３３４７−３３５４（１９９６））。
【００１８】
Ｃｏｗｌｅｙら（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１６９１−１７０２（２００４））は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲｖのｐｋｎＧ遺伝子欠失により当該親菌株と比較し、グルタミン酸およびグルタミンの細胞濃度の合計量が２．６４倍に増加することを示した。しかし、個々のアミノ酸、グルタミン酸およびグルタミンの細胞内濃度の情報は得られない。セリン／トレオニンタンパク質キナーゼにコードするｐｋｎＧ遺伝子の細胞機能について、これまで報告されていない。唯一、細胞成長にＰｋｎＧタンパク質が重要であることが認められている。ｐｋｎＧ遺伝子を持たないＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ突然変異体は、Ｃｏｗｌｅｙら（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１６９１−１７０２（２００４））の明記した成長条件下において、６００ｎｍ時の光学密度により測定された場合、最大値が親菌株の細胞密度の半分のみである細胞密度に達した。
【００１９】
発明の課題
本発明の目的は、アミノ酸、特にグルタミン酸およびグルタミンの排泄を高めるさらなる可能性を提供し、これは、より効率的であり、もはや従来技術の諸問題を含まない。
【００２０】
発明の説明
本目的は、アミノ酸産生微生物においてアミノ酸を産生する方法により実現され、これは、伝達タンパク質により低下する２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を含む。
【００２１】
「活性」は、基質を産物に変換する酵素能を示す。前記活性を、産物の増加、基質（または反応物質）の減少または特定の共因子の減少あるいは時間の関数としての前記のパラメーターの少なくとも２つの組み合わせにより「活性分析」として測定できる。
【００２２】
本発明によれば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性は、２−オキソグルタル酸、補酵素ＡおよびＮＡＤ+の触媒による変換を意味し、スクシニルＣｏＡ、ＣＯ2、ＮＡＤＨおよびＨ+を得る。
【００２３】
本発明によれば、活性の増減、産生もしくは濃度、物質の増減、産物、反応物質または基質は、同一条件下の比較試験において親菌株との比較を指し、この親菌株は、本発明の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下しない。
【００２４】
親菌株は、出発菌株として作用する微生物の菌株を指し、これが修飾の対象となり、本発明の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の低下を実現する。
【００２５】
ＯＤＨＣ活性が低下する場合、２−オキソグルタル酸基質をグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）により、おもにアンモニウム、ＮＡＤＰＨおよびＨ+と反応させ、Ｌ−グルタミン酸およびＮＡＤＰ+を得、それにより細胞のグルタミン酸量を増加する。Ｌ−グルタミン酸は、当該２−ケト化合物からＬ−アミノ酸の合成において最も重要なアミノ供与体であるので、グルタミン酸濃度の増加はまた、次の産物として他のアミノ酸の産生を増加する。本明細書において挙げることができる例として、グルタミン、アスパラギン酸、オルニチン、アスパラギン、アルギニン、リジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システインおよび／またはプロリンがある。
【００２６】
本発明の主題である微生物は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロース由来またはグリセロールおよびエタノール由来のアミノ酸、特にＬ−グルタミン酸を産生できる。
【００２７】
使用微生物は、桿菌、好ましくは、グラム陽性桿菌、コリネバクテリア科、マイコバクテリア科、プロピオニバクテリア科、ストレプトマイセス科またはラクトバチルス科、特に好ましくは、コリネバクテリア科またはマイコバクテリア科あるいはストレプトマイセス科である。
【００２８】
これらは、コリネフォルム細菌、例えば、ノカルディア科、デイエッチア科、ゴルドニア科、ツカムレラ科、ロドコッカス科、スケルマニア属、ウィリアムシア科、好ましくはコリネバクテリア科、特にコリネバクテリア属が代表的なものでありうる。挙げることができるコリネバクテリア属の種は、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓであり、これらは、Ｌ−アミノ酸の産生能に関して当技術分野において公知である（Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｌ．ａｎｄ  Ｂｏｔｔ，Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ（２００５））。
【００２９】
コリネバクテリア属、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適切な菌株の例として、公知の野生型菌株がある。
【００３０】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９および
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０
基本的に、バイオテクノロジー産業のアミノ酸産生において公知であるいくつかの微生物を本発明の方法に使用できる。
【００３１】
他のコリネフォルム細菌の菌株、例えば、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ」、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ」、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ」、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ」、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ」、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ」、「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ」、「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ」、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ、「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ」および「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｒｃｕｌｉｓ」も適している。さらに本発明において使用できる細菌は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」，Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂｏｔｔ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ（２００５），Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．４に明記されており、例えば、Ｃ．ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、Ｃ．ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ、Ｃ．ａｔｙｐｉｃｕｍ、Ｔｕｒｉｃｅｌｌａ  Ｔ．ｏｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｃｙｓｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃ．ｐｉｌｏｓｕｍ、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃ．ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、Ｃ．ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｃ．ｉｍｉｔａｎｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｃｏｙｌｅａｅ、Ｃ．ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃ．ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｍ、Ｃ．ｍｕｃｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｃ．ｐｒｏｐｉｎｇｕｕｍ、Ｃ．ｃｏｎｆｕｓｕｍ、Ｃ．ｓｕｎｄｓｖａｌｌｅｎｓｅ、Ｃ．ｔｈｏｍｓｓｅｎｉｉ、Ｃ．ｇｌａｕｃｕｍ、Ｃ．ｌｉｐｏｐｈｉｌｏｆｌａｖｕｍ、Ｃ．ｍｙｃｅｔｏｉｄｅｓ、Ｃ．ａｐｐｅｎｄｅｃｉｓ、Ｃ．ｉｍｉｔａｎｓ、Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃ．ｆｌｃｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｃ．ｆａｌｓｅｎｉｉ、Ｃ．ｂｏｖｉｓ、Ｃ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｖｉｔａｅｒｕｍｉｎｉｓ、Ｃ．ｋｕｔｓｃｈｅｒｉ、Ｃ．ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｒｅｎａｌｅ、Ｃ．ｍａｓｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃ．ｄｕｒｕｍ、Ｃ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｃ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｃ．ｔｅｒｐｅｎｏｔａｂｉｄｕｍ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｃｏｙｌｅａｅである。
【００３２】
本発明において調製される微生物を、連続的もしくはバッチ法または流加法、あるいは反復流加法においてアミノ酸を産生する目的で培養できる。公知の培養方法の総説は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１）によるテキストまたはＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））のテキストに見つけることができる。
【００３３】
使用される培養培地は、適切な様式において、特定の菌株の必要条件を満たさなければならない。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）のマニュアル「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」に種々の微生物用培養培地の説明が含まれている。使用できる炭素源は、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油およびココナッツ脂肪、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えば、グリセロールおよびエタノールならびに有機酸、例えば、酢酸である。使用できる窒素源は、窒素を含有する有機化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆肉および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムである。窒素源は、個別にまたは混合物として使用できる。使用できるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムあるいは当該ナトリウム塩である。培養培地は、金属塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄をさらに含むものとし、これらは、成長に必要とされる。最後に、必須成長物質、例えば、アミノ酸およびビタミンを上記の物質に添加して使用できる。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加できる。前記使用物質を単回の添加形態において培養に取り込むことができ、または培養中の適切な様式においてフィードできる。
【００３４】
培養のｐＨは、適切な様式において、塩基性化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくは水性アンモニア、または酸性化合物、例えば、リン酸もしくは硫酸を使用することにより制御する。発泡物質を消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することにより制御できる。プラスミド安定性を培地に適切な選択作用性物質、例えば、抗生物質を添加することにより維持できる。好気条件は、培養酸素または酸素含有ガス混合物、例えば、空気に取り込むことにより維持される。一般に、培養温度は、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、アミノ酸、好ましくはグルタミン酸の最大量を産生するまで継続される。
【００３５】
上記に挙げた微生物を培養する場合、グルタミン酸排泄を、当業者に公知の方法、例えば、ビオチン限界、ペニシリンまたは他の抗生物質の添加、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ４０およびＴｗｅｅｎ６０の添加、エタンブトールの添加、ｄｔｓＲ１遺伝子および他の脂肪酸生合成の遺伝子の機能停止あるいは温度上昇により誘発できる。
【００３６】
グルタミン酸形成の誘発は、諸条件において上記の変化しない微生物を培養する場合と比べ、グルタミン酸排泄の増加を意味する。
【００３７】
Ｌ−グルタミン酸を、Ｌｉｎｄｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｐｐｅｒ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５１：１６６７−１６７４（１９７９）において記載されているように、蛍光検出を用いて、オルソフタルジアルデヒドを誘導体化後に逆相高圧液体クロマトグラフィーにより分析できる。
【００３８】
本発明における方法において、アミノ酸のＬ−異性体の産生を増加させることが好ましい。
【００３９】
これらのプロトン化形態、例えば、グルタミン酸、これらの脱プロトン化形態、例えば、グルタミン酸塩、およびこれらの塩形態、例えばグルタミン酸ナトリウムまたはアスパラギン酸ナトリウムのアミノ酸名は、同意義である。
【００４０】
本発明の一実施形態において、アミノ酸の産生を少なくとも１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；２．０；３．０、好ましくは４．０；５．０、特に好ましくは１０．０あるいはそれ以上の倍数で増加する。
【００４１】
本発明における方法の本質的な特徴は、伝達タンパク質による２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性の低下である。
【００４２】
伝達タンパク質は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を阻害するが、前記２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子発現に影響しないタンパク質を指す。
【００４３】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号２に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる伝達タンパク質に関する。
【００４４】
核酸配列ｃ）は、配列番号１と好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、特に、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００４５】
「相同な」または「相同性」もまた、「同一性」の均等物として使用できる。
【００４６】
２つの核酸配列間またはポリペプチド配列間の同一性を、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１））によるアルゴリズムを基にしたＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用する比較を用いて算出し、以下のアミノ酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：８
ギャップ伸長ペナルティー：２
および以下の核酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：５０
ギャップ伸長ペナルティー：３
を設定する。
【００４７】
２つの核酸配列間またはポリペプチド配列間の同一性を各場合の全配列長にわたり、核酸配列／ポリペプチド配列の同一性により定義することが好ましく、この時、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３））によるアルゴリズムを基にしたＧＡＰプログラムを使用する比較を用いて算出し、以下のアミノ酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：８
ギャップ伸長ペナルティー：２
および以下の核酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：５０
ギャップ伸長ペナルティー：３
を設定する。
【００４８】
本発明は、配列番号１のさらなる同族体または機能的均等物に関し、これは、ストリンジェントな条件下においてこの核酸配列とハイブリット形成する。
【００４９】
本明細書において「機能的均等物」は、基本的に核酸配列を示し、これは、基本条件下において核酸配列または核酸配列の一部とハイブリット形成し、細胞または有機体のタンパク質発現を誘発することが可能であり、このタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＯｄｈＩ伝達タンパク質のものと同じ特性を有する。
【００５０】
ハイブリット形成を実施するために、例えば、変換または他の領域の、およそ１０〜５０ｂｐ、好ましくは１５〜４０ｂｐの短鎖オリゴヌクレオチドを使用することが有利であり、当業者に公知の様式において、これを他の関連遺伝子との比較により測定できる。しかし、１００〜５００ｂｐを有する本発明におけるより長い核酸断片または完全な配列もハイブリット形成に使用できる。使用される核酸／オリゴヌクレオチド、断片または完全な配列長に応じてあるいは、ハイブリット形成に使用される核酸のタイプ、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡに応じて、これらの基本条件は変化する。従って、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ混成物の融点は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡ混成物のものよりおよそ１０℃低い。
【００５１】
基本的なハイブリット形成条件とは、核酸に応じて、例えば、４２〜５８℃、０．１〜５×ＳＳＣ濃度の緩衝水溶液（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  Ｎａｃｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）またはさらに５０％ホルムアミドの存在下において、例えば、４２℃、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドを意味する。ＤＮＡ：ＤＮＡ混成種のハイブリット形成条件は、０．１×ＳＳＣおよび約２０〜６５℃、好ましくは約３０℃〜４５℃が有利である。ＤＮＡ：ＲＮＡ混成種のハイブリット形成条件は、０．１×ＳＳＣおよび約３０℃〜６５℃、好ましくは４５℃〜５５℃が有利である。これらの表示されたハイブリット形成温度は、例えばホルムアミド非存在下においておよそ１００ヌクレオチド長およびＧ＋Ｃ量５０％の核酸により算出された融点値である。ＤＮＡハイブリット形成の実験条件は、遺伝学の関連テキスト、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９に記載され、当業者に公知の公式を使用して、例えば、核酸長、混成種のタイプまたはＧ＋Ｃ量の関数として算出できる。当業者は、以下のテキストにハイブリット形成の情報をさらに見つけるだろう：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９８５，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ），１９８５，"Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ"，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ），１９９１，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．
さらに、機能的均等物はまた、定義された割合以下の特定の核酸配列（元の核酸配列）と相同であり、または同一であり、前記元の核酸配列と同じ活性を有する核酸配列、さらに、特に前記核酸配列の天然なまたは人工的な突然変異を意味する。
【００５２】
ＯｄｈＩアミノ酸配列モチーフＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒは，ＯｄｈＩ伝達タンパク質の機能に不可欠である。本発明は、さらに、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒアミノ酸配列モチーフを含有するＯｄｈＩの機能的均等物に関連する。
【００５３】
本発明においてＯｄｈＩ伝達タンパク質は、非リン酸化状態において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を阻害する。１４および／または１５、好ましくは１４位のトレオニン残基でリン酸化されていない伝達タンパク質を得ることが好ましい。
【００５４】
本実施形態において、活性の増減、産生もしくは濃度、物質の増減、産生物、反応物質または基質は、本発明において比較実験の親菌株との比較を指し、この親菌株が少なくとも部分的にリン酸化されるＯｄｈＩ伝達タンパク質を有する。
【００５５】
本発明の本実施形態において、アミノ酸の産生は、少なくとも１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；２．０；３．０、好ましくは４．０；５．０、特に好ましくは１０．０またはそれ以上の倍数で増加する。
【００５６】
本発明の一実施形態において、ＰｋｎＧタンパク質キナーゼを不活性化することにより、ＯｄｈＩのリン酸化を防ぐ。
【００５７】
ＰｋｎＧタンパク質キナーゼによりリン酸化されていない伝達タンパク質を得ることが好ましく、これは、
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号３と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる。
【００５８】
本発明における方法の好ましい実施形態において、ＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性は、低下する。
【００５９】
本発明によれば、ＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性の低下は、転写、翻訳および／または翻訳後段階の修飾により生じることができる。前記修飾は、例えば、調節要素の修飾、例えば、プロモーター活性、ヌクレアーゼもしくはプロテアーゼにより分解するｍＲＮＡもしくはタンパク質の安定性、またはリボソーム結合による翻訳の開始、または触媒酵素活性自体の低下、あるいは制御因子もしくは他のタンパク質の結合挙動の改変による修飾である。さらに、転写制御因子もしくはＲＮＡポリメラーゼサブユニットの不活性化または修飾による発現の修飾がある。
【００６０】
さらに、ｐｋｎＧ遺伝子の不活性化によりＰｋｎＧタンパク質キナーゼの低い活性もしくは完全な不活性も考えられ、本発明において好ましい。これは、本来公知の種々の遺伝操作手法、例えば、挿入突然変異もしくは欠失突然変異または突然変異誘発物質を用いて細胞を化学処理することにより実現できる。ｐｋｎＧ欠失変異体が好ましい。本明細書において上記の方法は、本発明を説明するにすぎず、限定するものではない。
【００６１】
特に、
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号３と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列を欠失することによりＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性を低下させることが好ましい。
【００６２】
核酸配列ｃ）は、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、特に、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることが好ましい。
【００６３】
「相同な」または「相同性」もまた、「同一性」に対して均等物として使用できる。
【００６４】
２つの核酸配列間またはポリペプチド配列間の同一性を、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１））によるアルゴリズムを基にしたＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用する比較を用いて算出し、以下のアミノ酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：８
ギャップ伸長ペナルティー：２
および以下の核酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：５０
ギャップ伸長ペナルティー：３
を設定する。
【００６５】
２つの核酸配列間またはポリペプチド配列間の同一性を、各場合の全配列長にわたり、核酸配列／ポリペプチド配列の同一性により定義することが好ましく、この時、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３））によるアルゴリズムを基にしたＧＡＰプログラムを使用する比較を用いて算出し、以下のアミノ酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：８
ギャップ伸長ペナルティー：２
および以下の核酸のパラメーター
ギャップ挿入ペナルティー：５０
ギャップ伸長ペナルティー：３
を設定する。
【００６６】
Ｎｉｅｂｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔ  ｉｎ  Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７５，２８２−２９４（２００１）は、遺伝子を欠失するプロセスについて記載し、これも使用して、本発明におけるｐｋｎＧ遺伝子を欠失できる。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態において、ｐｋｎＧ遺伝子を当業者に公知のプロセス、例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術または遺伝子抑制により不活性化する。
【００６８】
さらに、ＯｄｈＩタンパク質のリン酸化に必要とされるこれらのアミノ酸残基を突然変異することにより、ｐｋｎＧ遺伝子を不活性化できる。
【００６９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ＯｄｈＩタンパク質のトレオニン残基１４および／または１５を突然変異させ、コリネバクテリアの突然変異したタンパク質を発現することにより、ＯＤＨＣ活性のＯｄｈＩ介在性阻害を実現できる。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＥＴＴＳ配列モチーフを含有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯｄｈＩタンパク質の一部のみを発現するが、タンパク質キナーゼの相互作用に必要とされるカルボキシ末端Ｆｈａドメインを発現しないことにより、ＯＤＨＣ活性のＯｄｈＩ介在性阻害を実現できる。
【００７１】
本発明における方法の利点は、それぞれの親菌株と比較してアミノ酸、好ましくはグルタミン酸の産生が明らかに増加することである。特に、具体的な産生力、すなわち、時間および細胞量の関数として培地に分泌されるアミノ酸量が増加する。
【００７２】
また、本発明における方法は、より高い産生力をもたらす（空間／時間  収率）。
【００７３】
本発明を以下の実施例を参照にしてより詳細に説明する。
【００７４】
実施例
１．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｋｎＧおよび／またはｏｄｈＩ遺伝子の欠失
Ｎｉｅｂｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔ（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７５：２８２−２９４（２００１））に記載された方法を使用してＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝子を欠失させた。
【００７５】
ｐｋｎＧ遺伝子の５´および３´側領域を増幅させるため、オリゴヌクレオチド対ＤｐｋｎＧ−１（配列番号５）およびＤｐｋｎＧ−２（配列番号６）（５´領域）および、ＤｐｋｎＧ−３（配列番号７）およびＤｐｋｎＧ−４（配列番号８）（３´領域）それぞれを使用した：
2009507505.tif 000003
【００７６】
ｐｋｎＧ遺伝子の欠失をオリゴヌクレオチドＤｐｋｎＧ−５（配列番号９）およびＤｐｋｎＧ−６（配列番号１０）を使用してＰＣＲによりモニターすることに成功した：
2009507505.tif 000004
【００７７】
欠失に成功する場合において予測されていたＤＮＡ断片１３６４ｂｐは得られたが、野生型において予測されていたＤＮＡ断片３．７６ｋｂは得られなかった。
【００７８】
さらに、ｐｋｎＧ遺伝子の欠失を、プローブとしてジゴキシゲニン標識された交差ＰＣＲ産物を使用して、サザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５））により確認することに成功した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型のＡＴＣＣ１３０３２のＨｉｎｄＩＩＩ消化された染色体ＤＮＡにおいて予測されたように、ハイブリット形成しているＤＮＡ断片６．５ｋｂおよび２．４ｋｂを検出し、この場合、ｐｋｎＧ変異体のＨｉｎｄＩＩＩ消化された染色体ＤＮＡにおいて、ＤＮＡ断片６．５ｋｂのみが検出された。
【００７９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｏｄｈＩ遺伝子の欠失は、オリゴヌクレオチド対ＤｏｄｈＩ−１（配列番号１１）およびＤｏｄｈＩ−２（配列番号１２）（５´領域）およびＤｏｄｈＩ−３（配列番号１３）ならびにＤｏｄｈＩ−４（配列番号１４）（３´領域）それぞれを使用して、ｏｄｈＩ遺伝子の５´および３´側領域を増幅することを含んだ：
2009507505.tif 000005
【００８０】
プローブとしてジゴキシゲニン標識された交差ＰＣＲ産物を使用して、ｏｄｈＩ遺伝子の欠失をサザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５））により確認することに成功した。野生型のＳｐｈＩ消化された染色体ＤＮＡにおいて予測されたように、ハイブリット形成するＤＮＡ断片２．６ｋｂを検出し、この場合、ｏｄｈＩ変異体のＳｐｈＩ消化された染色体ＤＮＡにおいて、ＤＮＡ断片２．３ｋｂのみを検出した。野生型のＰｓｔＩ消化した染色体ＤＮＡにおいて予測されたように、ハイブリット形成する断片０．７ｋｂおよび１．５ｋｂを検出し、この場合、ｏｄｈＩ変異体のＰｓｔＩ消化した染色体ＤＮＡにおいて、断片１．８ｋｂのみを検出した。
【００８１】
２．細胞内グルタミン酸およびグルタミン濃度におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｐｋｎＧ欠失の影響
プラスミドｐＥＫＥｘ２を用いて形質転換された菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０２：９３−９８（１９９１））、ｐＥＫＥｘ２を用いて形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧおよびプラスミドｐＥＫＥｘ２−ｐｋｎＧを用いて形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ（ｐＥＫＥｘ２に存在するイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−誘発性プロモーターの制御下において、それ自体のリボゾーム結合部位を含めたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｋｎＧ遺伝子を含有する）は、最初に、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ寒天培地で３０℃にて２４時間インキュベートした。この寒天平板培養から出発し、前培養（ガラス試験チューブにおいて２％（ｗ／ｖ）グルコース、カナマイシン２５ｍｇ／ｌおよびＩＰＴＧ１ｍＭを含むｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ培地５ｍｌ）を植菌した。これらの前培養を３０℃および１７０ｒｐｍにて１６時間振とう機でインキュベートした。本培養を、出発ＯＤ600値が１となるようにこれらの前培養から植菌した。改変されたＣＧＸＩＩ最少培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５−５６０３（１９９３））を本培養に使用し、これは、いかなる尿素およびいかなる硫酸アンモニウムを含有せず、炭素源およびそれぞれ炭素および窒素源としてグルコース５ｍＭおよびＬ−グルタミン１００ｍＭを含有した。さらに、カナマイシン２５ｍｇ／ｌおよびＩＰＴＧ１ｍＭを培地に添加した。本培養を３０℃および１５０ｒｐｍにて１２時間振とう機でインキュベートした。その後、培養は、６００ｎｍ時の光学密度（ＯＤ600）４．０〜５．６に達した。細胞内グルタミン酸およびグルタミン濃度をＷｉｔｔｍａｎｎら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２７：１３５−１３９（２００４））により記載された、細胞を急冷しない濾過法に従い測定した。これに関して、乾燥生物量０．５〜１ｍｇを含有する培養量をガラス繊維フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＰＦＣ０２５００）を通して真空により急速に濾過して除去し、フィルターに結合した細胞を０．９％ＮａＣｌ溶液で４回洗浄した（室温）。結合した細胞を含むフィルターを５０μＭオルニチン溶液１．３ｍｌにおいて９５℃にて１５分インキュベートすることにより内部の代謝産物を抽出した。遠心分離後、上清（細胞抽出物）のアミノ酸を上述のＨＰＬＣにより定量化した。乾燥細胞１．５ｍｌ／ｇの細胞量を使用して、細胞内濃度を算出した（Ｋｒａｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：９２９−９３５（１９９０））。図１は、この実験の結果を示す。３つの独立した培養から標準偏差を算出した。
【００８２】
図１は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ΔｐｋｎＧ／ｐＥＫＥｘ２（図１のΔｐｋｎＧ）が比較菌株であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／ｐＥＫＥｘ２のものより９４％高い細胞内グルタミン酸濃度を有することを示す（図１のＷｔ）。プラスミドｐＥＫＥｘ２−ｐｋｎＧとΔｐｋｎＧ  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株の相補性（図１のΔｐｋｎＧ／ｐｋｎＧ）により、細胞内グルタミン酸濃度の増加を反転させることができる。グルタミン酸の場合、ΔｐｋｎＧ  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株の細胞内濃度は、親菌株のものより２７％高い。
【００８３】
３．誘導因子エタンブトール５００ｍｇ／ｌの存在下において、成長およびグルタミン酸形成におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｐｋｎＧ欠失の影響
菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（図２のＷｔ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ（図２のＤｐｋｎＧ）を最初にｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ寒天培地で３０℃にて２４時間インキュベートした。この寒天平板培養から出発し、前培養を植菌し（ガラス試験チューブにおいてｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ培地５ｍｌ）、３０℃および１７０ｒｐｍにて６時間振とう機でインキュベートした。これらの前培養から、１００ｍｌ三角フラスコにおいて５％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＣＧＸＩＩ最少培地２０ｍｌを含有する２回目の前培養を植菌し、３０℃および１５０ｒｐｍにて１６時間振とう機でインキュベートした。これらの前培養から出発し、本培養を５００ｍｌ三角フラスコにおいて植菌し、ＯＤ600値１にし、３０℃および１５０ｒｐｍにて、表示された時間振とう機でインキュベートした。本培養に関して、炭素源として５％グルコース（ｗ／ｖ）を含むＣＧＸＩＩ最少培地５０ｍｌ（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５−５６０３（１９９３））を使用し、培地をエタンブトール５００ｍｇ／ｌと混合した。培地のＯＤ600およびグルタミン酸濃度を測定するための被検物質を表示された時間にて取り出した。例として、ｐｋｎＧ欠失突然変異体のグルタミン酸形成速度および最終グルタミン酸濃度が親菌株以上に顕著に増加していることを示す。対照に、突然変異体の細胞収率は減少する。
【００８４】
４．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの非突然変異および突然変異したＯｄｈＩタンパク質を発現するためのプラスミドの創製
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの非突然変異ＯｄｈＩタンパク質を発現するために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡから出発し、オリゴヌクレオチドｏｄｈＩ−ｆｏｒ−２およびｏｄｈＩ−ｒｅｖ−２を使用するＰＣＲにより、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｏｄｈＩ遺伝子を増幅した。これは、ｏｄｈＩ−ｒｅｖ−２オリゴヌクレオチド、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩ−コード配列を介して（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：２７１−３０４）、ｏｄｈＩ遺伝子の停止コドンの上流に取り込むことを含んだ。オリゴヌクレオチドｏｄｈＩ−ｆｏｒ−２およびｏｄｈＩ−ｒｅｖ−２を用いて取り込まれたＢａｍＨＩ切断部位を介して、ＰＣＲ産物をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベクターｐＪＣ１（Ｃｒｅｍｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：４７８−４８０（１９９０））にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を宿主細菌として使用する。
【００８５】
2009507505.tif 000006
【００８６】
組み換えプラスミド（ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ）のＯｄｈＩコード配列をＤＮＡ配列分析により試験し、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩコード配列を除いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムのＯｄｈＩコード配列と同一であることを示した（Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０４：５−２５）。続いてｐＪＣ１−ｏｄｈＩプラスミドを、電気穿孔法を介して所望のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に移し、当該菌株をカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有する培地において培養した。
【００８７】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの突然変異ＯｄｈＩタンパク質を発現するため、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯｄｈＩタンパク質の１４位のトレオニン残基のＡＣＣコドンを、アラニンにコードするＧＣＣコドンと置き換えることにおいて、最初に、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチド対ｏｄｈＩ−ｆｏｒ−２およびＴ１４Ａ−ｒｅｖならびにＴ１４Ａ−ｆｏｒおよびｏｄｈＩ−ｒｅｖ−２とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを使用して調製した。次いで、得られた２つのＰＣＲ産物を、交差ＰＣＲによりオリゴヌクレオチドｏｄｈＩ−ｆｏｒ−２およびｏｄｈＩ−ｒｅｖ−２と融合し、後者２つのオリゴヌクレオチドにより取り込まれていたＢａｍＨＩ切断部位を介してｐＪＣ１ベクターにクローン化した。本明細書において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、宿主生物として再度使用した。
【００８８】
2009507505.tif 000007
【００８９】
組み換えプラスミド（ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａ）のＯｄｈＩコード配列をＤＮＡ配列分析により試験し、ＯｄｈＩコドン１４（ＧＣＣ、ＡＣＣの置き換え）およびＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩコード配列の所望の突然変異を除いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のゲノム中のＯｄｈＩコード配列と同一であることを示した（Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０４：５−２５）。続いて、ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａプラスミドを、電気穿孔法を介して所望のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に移し、当該菌株をカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有する培地で培養した。
【００９０】
５．成長（ＯＤ600）およびグルタミン酸形成におけるトレオニン−１４−アラニン置換を有するＯｄｈＩタンパク質の影響
染色体ｏｄｈＩ遺伝子が上述の方法により欠失しているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｎｉｅｂｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７５：２８２−２９４（２００１））をプラスミドｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａと形質転換した。ｐＪＣ１ベクターのその天然のプロモーターおよびその天然のリボソーム結合部位の制御下において、このプラスミドが、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｏｄｈＩ遺伝子を運ぶ（Ｃｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：４７８−４８０（１９９０））。１４位のトレオニン残基をアラニンに突然変異することで、プラスミドコードしたＯｄｈＩ−Ｔ１４Ａタンパク質は、もはやＰｋｎＧタンパク質キナーゼによりリン酸化できない。使用された比較菌株は、ｐＪＣ１プラスミドと形質転換したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２野生型菌株であった。
【００９１】
菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＪＣ１（図３のＷｔ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａを、最初にカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有するｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ寒天培地において３０℃にて２４時間インキュベートした。この寒天平板培養から出発し、前培養を植菌し（１００ｍｌ三角フラスコにおいて、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地２０ｍｌ）、３０℃および１５０ｒｐｍにて１６時間振とう機でインキュベートした。これらの前培養から出発し、次いで、本培養を５００ｍｌ三角フラスコにおいて植菌し、ＯＤ600値１を得、３０℃および１５０ｒｐｍにて、表示された時間振とう機でインキュベートした。本培養に関して、炭素源として５％グルコース（ｗ／ｖ）およびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＣＧＸＩＩ最少培地５０ｍｌ（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５５９５−５６０３（１９９３））を使用し、培地をエタンブトール５００ｍｇ／ｌと混合した。次いで、培地のＯＤ600およびグルタミン酸濃度を測定するための被検物質を表示された時間にて取り出した。各場合において、２つの菌株の２つの独立した培養を分析した。
【００９２】
菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａは、ＯＤ600初期値０．５〜ＯＤ600値約２とあまり成長しない。しかし、この期間中、この実験中にＯＤ600値１６〜１９まで成長したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／ｐＪＣ１菌株の約２倍のグルタミン酸を形成する。それは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐＪＣ１菌株が乾燥細胞ｇ当たりグルタミン酸平均２．３ｍｍｏｌを形成し、この場合、菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａが乾燥細胞ｇ当たりグルタミン酸平均３７．６３ｍｍｏｌを形成することから算出できる。ＯＤ600値１は、リットル当たり乾燥細胞０．２５ｇに対応する。
【００９３】
６．トレオニン残基１４におけるタンパク質キナーゼＧによるＯｄｈＩタンパク質のリン酸化
タンパク質キナーゼＧによるＯｄｈＩタンパク質のリン酸化を示すため、ＯｄｈＩタンパク質をカルボキシ末端ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩにより修飾し（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：２７１−３０４）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのｐＡＮ３Ｋ−ｏｄｈＩプラスミドを使用して過剰産生後、製造業者による仕様書（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）に従い、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのアフィニティークロマトグラフィーを介して明らかに均質になるまで精製した。同様に、２つの突然変異ＯｄｈＩタンパク質、すなわち１４位のトレオニン残基をアラニンと置き換えたＯｄｈＩ−Ｔ１４Ａ、１５位のトレオニン残基をアラニンと置き換えたＯｄｈＩ−Ｔ１５Ａを精製した。カルボキシ末端ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩにより修飾されたＰｋｎＧタンパク質をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のｐＥＫＥｘ２−ｐｋｎＧstプラスミドを使用して過剰産生後、製造業者による仕様書（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）に従い、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのアフィニティークロマトグラフィーを介して明らかに均質になるまで精製した。
【００９４】
精製タンパク質であるＯｄｈＩ、ＯｄｈＩ−Ｔ１４ＡおよびＯｄｈＩ−Ｔ１５Ａ（各場合、１μｇ）を精製ＰｋｎＧタンパク質（０．５μｇ）および［γ−32Ｐ］−ＡＴＰを用いて３７℃にて３０分間インキュベートした。さらに、精製ＯｄｈＩタンパク質（１μｇ）を［γ−32Ｐ］−ＡＴＰを含む精製ＰｋｎＧタンパク質の非存在下において３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ゲルを乾燥し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを使用して分析した。結果を図４に示す。ＯｄｈＩ−Ｔ１４Ａタンパク質ではなく、ＯｄｈＩとＯｄｈＩ−Ｔ１５Ａタンパク質をＰｋｎＧによりリン酸化する。また、ＯｄｈＩタンパク質は、自己リン酸化活性を持たないことが示された。
【００９５】
７．２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性におけるリン酸化および非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質の影響
ＯｄｈＩタンパク質による２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の阻害を検出するため、タンパク質キナーゼＧおよびＯｄｈＩタンパク質における遺伝子が欠失しているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ  ΔｏｄｈＩ菌株細胞の細胞非含有抽出物を調製した。従って、これらの細胞抽出物は、ＰｋｎＧタンパク質およびＯｄｈＩタンパク質のどちらも含有しない。細胞非含有抽出物をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のクロマトグラフィーにかけ、それにより細胞抽出物の低分子量構成物質からタンパク質を分離する。
【００９６】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の活性を、ＴＥＳ７．７  ５０ｍＭ、Ｌ−システイン３ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭ、チアミン二リン酸０．９ｍＭ、補酵素Ａ０．２ｍＭ、ＮＡＤ+２ｍＭおよび２−オキソグルタル酸１．５ｍＭを含有する分析緩衝液において３０℃にて、３４０ｎｍ時の吸光度の増加に基づいて分光光度法により測定した。ＮＡＤＨにおいて３４０ｎｍ時の消散係数６．３ｍＭ-1ｃｍ-1を使用して特異活性を算出した。１Ｕの活性は、１分間当たりＮＡＤＨ１μｍｏｌの形成に相当する。
【００９７】
ＯｄｈＩの非存在において、細胞抽出物は、タンパク質およそ３５ｍＵ／ｍｇの２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を有した（３５ｎｍｏｌ  ｍｉｎ-1（タンパク質ｍｇ）-1）。ＯｄｈＩ濃度の関数として、精製された非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質の添加は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を阻害した（図５）。
【００９８】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性におけるＯｄｈＩタンパク質の影響についてのさらなる実験において、前記複合体は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｏｄｈＡst）から濃縮され、これには、ＯＤＨＣのＥ１サブユニットのＯｄｈＡタンパク質がカルボキシ末端ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩを含有した。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体を製造業者による仕様書（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）に従い、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのアフィニティークロマトグラフィーにより濃縮した。濃縮された複合体は、タンパク質２．５Ｕ／ｍｇの２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有した。濃縮ＯＤＨＣ複合体２μｇを、追加の添加物なし（反応混合物１）、もしくは非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質０．２μｇおよびＡＴＰ２ｍＭ（反応混合物２）または非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質０．２μｇ、ＰｋｎＧタンパク質２．２μｇおよびＡＴＰ２ｍＭ（反応混合物３）のいずれかで３０℃にて６０分間インキュベート後、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した。図６に示したように、非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質の添加は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を阻害し、一方、ＯｄｈＩ、ＰｋｎＧおよびＡＴＰの添加は、阻害しなかった。
【００９９】
８．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるグルタミン酸産生におけるｏｄｈＩ遺伝子欠失の影響
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（野生型）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩ菌株を、グリセロール培養から出発し、ｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ寒天培地プレート上に撒き、３０℃にて一晩インキュベートした。各本培養において、前培養を、プレートからのシングルコロニーを用いて植菌されたｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ液体培地３０ｍｌに調製した。前培養を３０℃および１５０ｒｐｍにて１５〜１８時間インキュベートし、続いて細胞を遠心分離により採取し、０．９％ＮａＣｌで１回洗浄後、０．９％ＮａＣｌ５〜１０ｍｌに再懸濁した。これらの懸濁液の６００ｎｍ（ＯＤ600）時の光学密度を測定した。
【０１００】
Ｔｗｅｅｎ４０（図ｘのＡおよびＢ）またはエタンブトール（図ｘのＣおよびＤ）の添加により、グルタミン酸産生を誘発した場合、本培養を、前記懸濁液を用いて植菌し、ＯＤ600値０．５〜０．９にした。本培養は、２つのバッフルの付いた５００ｍｌ三角フラスコにおいて４％（ｗ／ｖ）を含むＣＧＸＩＩ最少培地６０ｍｌを含有し、３０℃および１５０ｒｐｍにてインキュベートした。グルタミン酸形成を誘発するため、６〜７時間後に培養に添加されたＴｗｅｅｎ４０  ２ｇ／ｌ、またはエタンブトール５００ｍｇ／ｌのどちらかを植菌直後に添加した。グルタミン酸産生がビオチン限界により誘発される場合（図ｘのＥおよびＦ）、前記懸濁液を使用して４％グルコースであるがビオチン２．５μｇ／ｍｌのみを含有するＣＧＸＩＩ最少培地（一般のＣＧＸＩＩ最少培地は、ビオチン３００μｇ／ｌを含有する）において、追加の前培養を植菌する。これらの前培養を３０℃および１５０ｒｐｍにて正確に２４時間インキュベートし、続いて、細胞を遠心分離により除去し、洗浄し、０．９％ＮａＣｌに再懸濁した。次いで、これらの懸濁液を使用して本培養を植菌し、ＯＤ600値０．５〜０．９にした。４％グルコースおよびビオチン１μｇ／ｌを含有するＣＧＸＩＩ最少培地を本培養に使用した。各１ｍｌの被検物質を本培養から０時間、４時間、６時間、７時間、２４時間および３０時間にて取り出し、ＯＤ600およびグルタミン酸濃度を細胞非含有上清において測定した。
【０１０１】
図７は、上述の本培養の成長およびグルタミン酸形成を示す。値は、少なくとも４つの独立した培養の平均である。Ｔｗｅｅｎ４０（図７Ａおよび７Ｂ）の存在下およびエタンブトール（図７Ｃおよび７Ｄ）の存在下、ならびにビオチン限界（図７Ｅおよび７Ｆ）で野生型と比較する場合、菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩがごく少量のグルタミン酸濃度のみを産生することが明らかである。これらの結果により、ＯｄｈＩタンパク質が、効率的なグルタミン酸形成に非常に重要であることを確認する。
【０１０２】
図面の簡単な説明
図１．菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／ｐＥＫＥｘ２（Ｗｔ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ／ｐＥＫＥｘ２（ΔｐｋｎＧ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ／ｐＥＫＥｘ２−ｐｋｎＧ（ΔｐｋｎＧ）／ｐｋｎＧ）のグルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）の細胞内濃度。３つの独立した培養からの標準偏差も同様に示す。
【０１０３】
図２．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｗｔ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ突然変異体（ΔｐｋｎＧ）による成長（ＯＤ600）およびグルタミン酸形成。値は、３つの独立した培養からの平均であり、標準偏差は、２０％以下である。
【０１０４】
図３．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＪＣ１（野生型／ｐＪＣ１）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａ（ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａ）による成長（ＯＤ600）およびグルタミン酸形成。それぞれ２つの独立した培養からの値を示す。
【０１０５】
図４．タンパク質キナーゼＧによるＯｄｈＩおよびＯｄｈＩ−Ｔ１５Ａタンパク質のリン酸化の検出。タンパク質ＯｄｈＩおよびＰｋｎＧ（レーン１）、ＯｄｈＩ（レーン２）、ＯｄｈＩ−Ｔ１４ＡおよびＰｋｎＧ（レーン３）ならびにＯｄｈＩ−Ｔ１５ＡおよびＰｋｎＧ（レーン４）を［γ−32Ｐ］−ＡＴＰを用いて３７℃にて３０分間インキュベート後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画した。乾燥ＳＤＳゲルを、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを使用して分析した。
【０１０６】
図５．精製した非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質による菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ  ΔｏｄｈＩの細胞抽出物の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性の阻害。
【０１０７】
図６．添加物の非存在下（Ｎｏ．１）、非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質の存在下（Ｎｏ．２）およびＯｄｈＩ、ＰｋｎＧおよびＡＴＰの存在下（Ｎｏ．３）において濃縮された２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性。ＰｋｎＧおよびＡＴＰの存在下において、ＯｄｈＩはリン酸化され、ＯＤＨＣの活性を阻害せず、一方、非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質は阻害する。
【０１０８】
図７．菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（野生型）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩによる成長（Ａ、Ｃ、Ｅ）およびグルタミン酸形成（Ｂ、Ｄ、Ｆ）をＴｗｅｅｎ４０  ２ｇ／ｌを添加（ＡおよびＢ）、エタンブタール０．５ｇ／ｌを添加（ＣおよびＤ）およびビオチン限界（１μｇ／ｌ）（ＥおよびＦ）を用いて比較。これらの菌株を、４％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＣＧＸＩＩ最少培地において３０℃および１５０ｒｐｍにて培養した。成長は、６００ｎｍ（ＯＤ600）時の光学密度に基づいて測定し、グルタミン酸濃度をＨＰＬＣ分析により培養上清において測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／ｐＥＫＥｘ２（Ｗｔ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ／ｐＥＫＥｘ２（ΔｐｋｎＧ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ／ｐＥＫＥｘ２−ｐｋｎＧ（ΔｐｋｎＧ）／ｐｋｎＧ）のグルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）の細胞内濃度を示す。
【図２】図２は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（Ｗｔ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ突然変異体（ΔｐｋｎＧ）による成長（ＯＤ600）およびグルタミン酸形成を示す。
【図３】図３は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＪＣ１（野生型／ｐＪＣ１）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａ（ΔｏｄｈＩ／ｐＪＣ１−ｏｄｈＩ−Ｔ１４Ａ）による成長（ＯＤ600）およびグルタミン酸形成を示す。
【図４】図４は、タンパク質キナーゼＧによるＯｄｈＩおよびＯｄｈＩ−Ｔ１５Ａタンパク質のリン酸化の検出を示す。
【図５】図５は、精製した非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質による菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｐｋｎＧ  ΔｏｄｈＩの細胞抽出物の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性の阻害を示す。
【図６】図６は、添加物の非存在下（Ｎｏ．１）、非リン酸化ＯｄｈＩタンパク質の存在下（Ｎｏ．２）およびＯｄｈＩ、ＰｋｎＧおよびＡＴＰの存在下（Ｎｏ．３）において濃縮された２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を示す。
【図７】図７は、菌株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（野生型）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ΔｏｄｈＩによる成長（Ａ、Ｃ、Ｅ）およびグルタミン酸形成（Ｂ、Ｄ、Ｆ）をＴｗｅｅｎ４０  ２ｇ／ｌを添加（ＡおよびＢ）、エタンブタール０．５ｇ／ｌを添加（ＣおよびＤ）およびビオチン限界（１μｇ／ｌ）（ＥおよびＦ）を用いて比較したものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月11日(2007.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝達タンパク質により２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を低下させる、アミノ酸産生微生物においてアミノ酸を産生する方法。
【請求項２】
微生物が桿菌、好ましくはグラム陽性桿菌、特に好ましくはコリネバクテリア科またはマイコバクテリア科あるいはストレプトマイセス科であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物がコリネバクテリア属由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、オルニチン、アスパラギン、アルギニン、リジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システインおよび／またはプロリン、好ましくはグルタミン酸および／またはグルタミン、特に好ましくはグルタミン酸の産生を高めることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸のＬ−異性体の産生を高めることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
伝達タンパク質が、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号２に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
伝達タンパク質がリン酸化されていないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
伝達タンパク質が１４および／１５位、好ましくは１４位のトレオニンアミノ酸でリン酸化されていないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
伝達タンパク質がＰｋｎＧタンパク質キナーゼによりリン酸化されないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
伝達タンパク質が、
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号３と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされるＰｋｎＧタンパク質キナーゼによりリン酸化されないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性が低下することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰｋｎＧタンパク質キナーゼ活性が、
ａ）配列番号３に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号３と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列を欠失することにより低下することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
微生物を、ビオチン欠乏、界面活性剤またはペニシリンの添加、エタンブトールの添加、ｄｔｓＲ１遺伝子もしくは他の脂肪酸生合成の遺伝子の機能停止または、温度上昇によりグルタミン酸の過剰産生を誘発する条件下において培養することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
微生物において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体活性を制御するための伝達タンパク質の使用であって、該伝達タンパク質が、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、または
ｂ）遺伝子コードの縮重により、配列番号２に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により得ることができる核酸配列、あるいは
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％同一である核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる使用。
【国際調査報告】
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