(57)【要約】  本発明は、非経口的（液体又は凍結乾燥）に又は局所的（ゲル、軟膏、又はクリーム）に施用することが意図され、また悪性又は良性の非生理学的な組織又は器官の細胞成長に関わる病理学的事象を治療するための、種々の量の組換えγ及びαインターフェロンを高い割合で含む、安定な医薬品製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織又は器官の、良性の非生理学的な又は悪性の細胞成長を特徴とする、病理学的事象を治療するための、相乗効果を奏する割合で種々の量の組換えインターフェロンγ及びαを含み、さらに医薬品として許容される賦形剤又は担体を含む、非経口的（液体又は凍結乾燥）に又は局所的（ゲル、軟膏、クリーム）に施用される安定化医薬製剤。
【請求項２】
緩衝溶液と、少なくとも非還元糖化合物、アミノ酸、界面活性剤、及び安定化ポリマーから選択される成分とを含む、請求項１に記載の凍結乾燥安定化医薬製剤。
【請求項３】
酢酸アンモニウム若しくは酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び／又はカリウム塩、及びクエン酸−リン酸塩など、ｐＨを４．９から７．５の間に維持する能力を有する緩衝液が用いられ、非還元糖として、サッカロース又はトレハロースが用いられ、アミノ酸として、グリシン、ヒスチジン、又はロイシンが用いられ、界面活性剤として、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０が用いられ、安定化ポリマーとして、ポリエチレングリコール、又はデキストラン、又はヒドロキシメチルデンプンが用いられる、請求項２に記載の凍結乾燥安定化医薬製剤。
【請求項４】
緩衝液が、１０から２０ｍＭの間の濃度範囲で用いられ、サッカロース又はトレハロースが５から１００ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、グリシン、ヒスチジン、又はロイシンが１から２０ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、ポリソルベートが０．０１から１ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、ポリエチレングリコール、デキストラン、又はヒドロキシエチルデンプンが５から５０ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられる、請求項３に記載の凍結乾燥安定化医薬製剤。
【請求項５】
それぞれ均等に、５．６×１０８ＩＵから１．４×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮγ、及び６．８×１０８ＩＵから１．７×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮα２、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、リン酸水素２ナトリウム２水和物０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、並びに１００ｍＬ及び０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水からなる、請求項２に記載の凍結乾燥安定化医薬製剤。
【請求項６】
それぞれ均等に、２．０×１０８ＩＵから０．５×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮγ、及び１２．０×１０８ＩＵから３．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮα２、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、リン酸水素２ナトリウム２水和物０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、並びに１００ｍＬ及び０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水からなる、請求項２に記載の凍結乾燥安定化医薬製剤。
【請求項７】
それぞれ均等に、４．０×１０８ＩＵから１．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮγ、及び８０×１０８ＩＵから２０×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮα２、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、リン酸水素２ナトリウム２水和物０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、並びに１００ｍＬ、及び０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水からなる、請求項２に記載の凍結乾燥安定化医薬製剤。
【請求項８】
緩衝溶液と、少なくとも非還元糖化合物、アミノ酸、界面活性剤、安定化剤ポリマー、キレート化／酸化防止化合物、及び等張剤から選択される成分とを含み、メチル−パラベン又はプロピル−パラベンの混合物などの保存剤を含有してもしなくてもよい水溶媒を用いる、請求項１に記載の液体安定化医薬製剤。
【請求項９】
酢酸アンモニウム若しくは酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び／又はカリウム塩、及びクエン酸−リン酸塩など、ｐＨを４．９から６．５の間に維持する能力を有する緩衝液が用いられ、界面活性剤として、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０が使用され、酸化防止剤／キレート剤として、ＥＤＴＡ又はアセチル−システインが使用され、アミノ酸として、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、又はリシンが使用され、安定剤ポリマーとして、ヒドロキシエチルデンプン又はデキストランが使用され、等張剤として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、プロピレングリコール、マンニトール、グリセロール、サッカロース、又はトレハロースが使用される、請求項８に記載の液体安定化医薬製剤。
【請求項１０】
緩衝液が、１０から１００ｍＭの間の濃度範囲で用いられ、ポリソルベートが、０．０１から１ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、ＥＤＴＡ又はアセチル−システインが、０．０１から１ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、又はリシンが１から２０ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、ヒドロキシエチルデンプン及びデキストランが、５から５０ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられ、等張剤が、溶液を等張性にするのに十分な量である、請求項９に記載の液体安定化医薬製剤。
【請求項１１】
それぞれ均等に、５．６×１０８ＩＵから１．４×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮγ、及び６．８×１０８ＩＵから１．７×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮα２、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、並びに１００ｍＬ及び０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水からなる、請求項９に記載の液体安定化医薬製剤。
【請求項１２】
それぞれ均等に、２．０×１０８ＩＵから０．５×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮγ、及び１２．０×１０８ＩＵから３．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮα２、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、並びに１００ｍＬ及び０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水からなる、請求項９に記載の液体安定化医薬製剤。
【請求項１３】
それぞれ均等に、４．０×１０８ＩＵから１．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮγ、及び８０×１０８ＩＵから２０×１０８ＩＵの間の濃度範囲にあるＩＦＮα２、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、並びに１００ｍＬ及び０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水からなる、請求項９に記載の液体安定化医薬製剤。
【請求項１４】
悪性又は良性の充実性腫瘍を治療するために、独立に、又は化学療法、放射線療法、若しくは両方の組合せと併せて用いられる、請求項１から１３までに記載の安定化医薬製剤。
【請求項１５】
喉頭癌、喉頭乳頭腫症、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞白血病、中枢神経系リンパ腫、リンパ腫、類上皮腫、皮内腫、リンパ肉腫、神経線維腫、皮脂腺過形成、海綿状血管腫、肝細胞腺腫、限局性結節性過形成、星状細胞腫、多形グリア芽細胞腫、上衣細胞腫、神経節神経腫、若年性毛様細胞性星状細胞腫、混合膠腫、乏突起細胞腫、視神経グリア細胞腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腺腫、原始神経外胚葉性腫瘍、聴神経腫瘍、血管腫瘍、髄膜癌腫症、神経線維腫症、脳偽腫瘍、結節性硬化症、転移性脳腫瘍、チェリー様血管腫、皮脂腺過形成、基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維腫、化膿性肉芽腫、皮膚母斑、脂漏性角化腫、光線性角化症を治療するための、請求項１４に記載の安定化医薬製剤。
【請求項１６】
線維症、異形成、及び過形成のような増殖的事象を治療するための、請求項１から１３までに記載の安定化医薬製剤。
【請求項１７】
筋肉内、腫瘍内、及び病巣内に施用される、請求項１から１３までに記載の安定化医薬製剤。
【請求項１８】
半固体１ｇ当たり、０．３２×１０６ＩＵから０．０８×１０６ＩＵの間の濃度範囲内にある組換えＩＦＮγ、及び２．０×１０６ＩＵから０．５×１０６ＩＵの間の濃度範囲にある組換えＩＦＮα２を含む、請求項１に記載の局所安定化医薬製剤。
【請求項１９】
ＩＦＮγ２．２％、ＩＦＮα２ｂ０．５８％、セチルアルコール４％、ワセリン１０％、Ｔｗｅｅｎ６０  ２％、メチルパラベン、プロピルパラベン０．２％、及び蒸留水ｃｓｐ８１．２％を含む、請求項１８に記載の安定化医薬クリーム。
【請求項２０】
ＩＦＮγ２．２％、ＩＦＮα２  ０．５８％、白色固体ワセリン６０％、重液ワセリン１０％、Ｓｐａｎ２０  ３％、メチルパラベン及びプロピルパラベン０．２％、及び蒸留水ｃｓｐ２４．０２％を含む、請求項１８に記載の安定化軟膏。
【請求項２１】
ＩＦＮγ２．２％、ＩＦＮα２  ０．５８％、カルボポル９４０  ０．５％、メチルパラベン及びプロピルパラベン０．２％、水酸化ナトリウム０．２％、エチレンジアミノ４酢酸カルシウム２ナトリウム０．０１％、エタノール２％、及び蒸留水ｃｓｐ８４．３１％を含む、請求項１８に記載の安定化医薬製剤ゲル。
【請求項２２】
皮膚又は粘膜の悪性又は良性の充実性腫瘍を治療するために、独立に、又は化学療法、放射線療法、若しくは両方の組合せと併せて用いられる、請求項１８から２１までに記載の局所安定化医薬製剤。
【請求項２３】
リンパ腫、類上皮腫、皮内腫、リンパ肉腫、神経線維腫、皮脂腺過形成、血管腫、限局性結節性過形成、上衣細胞腫、神経節神経腫、若年性毛様細胞性星細胞腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腺腫、血管腫瘍、髄膜癌腫症、神経線維腫症、チェリー様血管腫、皮脂腺過形成、基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維腫、化膿性肉芽腫、皮膚母斑、脂漏性角化症、光線性角化症、及びコンジローマを治療するための、請求項２２に記載の局所安定化医薬製剤。
【請求項２４】
前記請求項で定義された濃度のＩＦＮγ及びＩＦＮαが維持されるようにＩＦＮバイアルの内容物を混合するために、組換えＩＦＮγの１つ又は複数のバイアルを、組換えＩＦＮα２の対応するバイアルと共に含み、さらに、注射用蒸留水のバイアル、注射器、ＩＦＮの混合及び患者への混合物の施用を実施するのに十分な針を含む、請求項５から７まで及び１１から１３までに記載の医薬形態。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び医学に関し、特に、人間の種々の組織又は器官における細胞成長を阻止するための相乗的な効果を奏する割合で組換えインターフェロンγ及びαを含有する安定した医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型インターフェロン（英語でｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）といい、ＩＦＮと短縮される）の様々な作用は、その利用において多大な治療可能性をもたらす。ＩＦＮの利用は、様々なタイプの癌、とりわけ白血病（ＵＳ５８３０４５５）、基底細胞腫（ＵＳ５０２８４２２）、扁平上皮癌（ＵＳ５２５６４１０）、乳癌（ＵＳ５０２４８３３）、胃腸腫瘍（ＵＳ５４４４０６４；５８１４６４０）、及び光線性角化症（ＵＳ５００２７６４）が含まれる様々なタイプの癌の治療に有益である。異なる細胞型は、ＩＦＮに対して異なる感受性を示し、その成長を阻害する濃度は、広範にわたって変化することがあり（Ｂｏｒｄｅｎ  Ｅ．ら（１９８１）、血液学の進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、ｖｏｌ  ＸＩＩ、Ｂｒｏｗｎ  ＥＢ．編、２９９〜３３９）、その範囲内では、細胞成長を阻害する能力（Ｄａｈｌ  Ｈ．（１９８３）、ヒトインターフェロン及び細胞成長阻害（Ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、ＶＩＩ、インターフェロン活性の可逆性（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｎｉｍａｌ、３：３２７〜３３２；Ｗｉｌｌｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．Ｖ．、Ｂｉｔｔｎｅｒら（１９８４）、ヒト腫瘍幹細胞アッセイにおける、卵巣癌細胞成長に対するヒトインターフェロンの抗増殖活性（Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｎｉｍａｌ、４：４４１〜４４７；Ｈｕ  Ｒ．、Ｇａｎ  Ｙ．ら（１９９３）、ヒトリンパ芽球腫インターフェロンαの、いくつかの成分に関する多数の結合部位に関する証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６８：１２５９１〜１２５９５）及び抗腫瘍活性（Ｑｕｅｓａｄａ  ＪＲ．、Ｔａｌｐａｚ  Ｍ．ら（１９８６）、癌患者におけるインターフェロンの臨床的毒性（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、４：２３４〜２４３参照）にその細胞成長を阻害する能力の差が示される。癌療法でのＩＦＮの使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究及びこれらの強力な生体分子が保有する性質からの期待を、満足させていない。種々の治療スケジュールについて試験をしたが、明らかな有益な効果及び効果は得られなかった（Ｓｔｒａｎｄｅｒ  Ｈ．及びＯｂｅｒｇ  Ｋ．（１９９２）、インターフェロンの臨床使用（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）、充実性腫瘍インターフェロン（Ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ）、原理及び医学的用途（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｂａｒｏｎ  Ｓ．、Ｃｏｐｐｅｎｈａｖｅｒ  ＤＨ．、Ｄｉａｎｚａｎｉ  Ｆ．、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ  ＷＲ．、Ｊｒ．Ｈｕｇｈｅｓ  ＴＫ．、Ｊｒ．Ｋｌｉｍｐｅｌ  ＧＲ．、Ｎｉｅｓｅｌ  ＤＷ．、Ｓｔａｔｏｎ  ＧＪ．、及びＴｙｒｉｎｇ  ＳＫ．版、５３３〜５６１）。
【０００３】
治療でより良好な効果を得るために、ＩＦＮを高用量で用いたが、様々な要因により、とりわけ前記用量でもたらされる副作用により、有益で可能性のある期待される応答は現れない（Ｌａｎｅ  Ｈ．Ｃ．（１９９０）、無症候性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の患者におけるインターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、無作為プラセボ対照試験（Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ）、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｅ、１１２：８０５〜８１１）。
【０００４】
さらに、ＩＦＮは、その相乗効果を活用する組合せ形態で使用されてきた。ＩＦＮα及びＩＦＮγの組合せについては、ケロイド線維芽細胞からの培養物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究で述べられている（Ｔｒｅｄｇｅｔ  ＥＥ．、Ｗａｎｇ  Ｒ．ら（２０００）、肥大性瘢痕組織及び線維芽細胞における成長因子−β  ｍＲＮＡ及びタンパク質の形質転換：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γによる拮抗作用（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｃａｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｂｙ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｉｍａｌ、２０：１４３〜１５１）。この研究では、ＩＦＮα及びγの組合せ利用について述べているが、得られたデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び子供のケロイド由来の細胞から得られたものである。これらの筆者は、いかなる臨床試験も行っておらず、インターフェロンに対する応答が少ない成人ケロイド細胞にＩＦＮの組合せが及ぼす影響については評価しなかった。
【０００５】
特許ＥＰ０１０７４９８は、メラノーマＨｓ２９４Ｔの細胞系におけるインターフェロンα及びγの組合せを示すが、基底細胞腫又はグリア芽細胞腫（ＧＬ−５）又は喉頭癌（ＨＥｐ−２）の初代培養物のような、その他の細胞タイプに対する影響について述べていない。
【０００６】
また天然ＩＦＮα及び組換えＩＦＮγの交互利用は、腎及び肺転移の治療に関しても述べられている（Ｆｕｊｉｉ  Ａ．、Ｙｕｉ−Ｉｎ  Ｋ．ら（１９９９）、転移性腎細胞癌に対する天然インターフェロン−α及び組換えインターフェロン−γの交互投与の予備結果（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）ＢＪＵ  Ｉｎｔ．；８４：３９９〜４０４）。ＩＦＮα２又はα４又はハイブリッドΔ４α２Ｂｇｌ  ＩＩ  α１とＩＦＮγとの組合せは、細胞系ＲＴ４（膀胱癌）及びＡ２１８２（肺腺癌）で述べられており、Ｉ型ＩＦＮ又はＩＦＮγ単独の場合よりも優れた抗増殖作用を保有する（Ｈｕｂｂｅｌｌ  Ｈ．Ｒ．、Ｃｒａｆｔ  Ｊ．ＴＯ．ら（１９８７）、組換えα−インターフェロンと組換えγ−インターフェロンとの相乗的抗増殖効果（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｌｐｈａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．、６：１４１〜１５３）。ＩＦＮγ（１０００ＩＵ／ｍＬ）及びＩＦＮα２（１０００ＩＵ／ｍＬ）の相乗的効果は、細胞系Ａ４５９（肺胞腫瘍）（Ｍａｒｔｙｒｅ  Ｍ．Ｃ．、Ｂｅａｕｐａｉｎ  Ｒ．ら（１９８７）、連続器官型培養で維持されたヒト癌結節における、ヒト組換えＩＦＮ−α及び−γの混合による抗増殖活性の増強（Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｍｉｘ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ２  ａｎｄ  −ｇａｍｍａ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｎｏｄｕｌｅｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏＵＳｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２３：９１７〜９２０）で、並びに非小細胞肺未分化癌から確立された細胞系（Ｈａｎｄ  Ａ．、Ｐｅｌｉｎ  Ｋ．ら（１９９３）、化学療法と組み合わせたインターフェロン−α及びインターフェロン−γ：非小細胞肺癌細胞系におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性研究（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ−ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ、４：３６５〜３６８）で示されている。
【０００７】
ＩＦＮα及びＩＦＮγの組合せは、細胞系ＨｅｐＧ２を用いた研究（Ｍｉｚｕｋｏｓｈｉ  Ｅ．、Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ．ら（１９９９）、ＩＦＮ−γによるＩ型インターフェロン受容体の上方制御（Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｉｍａｌ、１９：１０１９〜１０２３）、及び細胞系ＡＶＡ５を用いた研究（Ｏｋｕｓｅ  Ｃ．、Ｒｉｎａｕｄｏ  Ｊ．Ａ．ら（２００５）、インターフェロン併用療法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス活性の強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒＵＳｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ、６５：２３〜３４）で述べられている。これらの筆者は、細胞系ＨｅｐＧ２におけるα及びγインターフェロンの組合せについて、抗増殖作用を測定しておらず、またより有効な割合についても決定していない。さらに、その相乗効果は、細胞系Ｈｅｐａ１〜６、マウス肝細胞癌において、ＴＮＦα及びＩＦＮγに関して調査されてきた（Ｓａｓａｇａｗａ  Ｔ．、Ｈｌａｉｎｇ  Ｍ．ら（２０００）、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αによる、マウス肝細胞癌Ｈｅｐａ  １〜６細胞におけるアポトーシスの相乗的誘導（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｐａｔｏｍａ  Ｈｅｐａ  １−６  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＩＦＮ−ＧＡＭＭＡ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｎｉｍａｌ、２７２：６７４〜６８０）。
【０００８】
ＵＳ５１９０７５１特許には、ＩＦＮα及びγの組合せによる、Ｂ型及びＴ型の白血病細胞系の成長の阻害が記述されている。評価されたＴ細胞系の中で、成長阻害作用の増強が観察されたものはなく、ある実験条件では、この組合せの作用が拮抗的であった。特許ＥＰ０１０７４９及び刊行物（Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉ  Ｃ．Ｗ．、Ｆｅｎｎｉｅ  Ｃ．Ｗ．ら（１９８４）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来ヒトα、β、及びγインターフェロンの相乗的抗ウイルス及び抗増殖活性（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ，ｂｅｔａ，ａｎｄ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．４９：４９０〜４９６）には、ＩＦＮα及びγの組合せが必ずしも相乗的であるとは限らず拮抗的になることがあることも示されている。非常に広範にわたる組合せの効力について述べられているが、それは実証されていない。
【０００９】
これらのデータは、所与の組織又は器官における不適切な細胞成長を治療するのに最適な組合せを確立するには、どの条件が好ましいものであるかを特定することを可能にする実験的定義についてＩＦＮα及びγの組合せの利用を評価すべきであることを示している。そのような理由で、療法及び適切な用量を裏付けるために、これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及び対照臨床試験で評価されるべきである。
【００１０】
グリオーマの細胞系を用いた研究では、ＩＦＮγが、研究された腫瘍細胞の増殖及び移動などの悪性腫瘍の特徴に影響を及ぼした（Ｋｎｕｐｆｅｒ  Ｍ．Ｍ．、Ｋｎｕｐｆｅｒ  Ｈ．ら（２００１）、インターフェロン−γがＡ１７２ヒトグリア芽細胞腫の成長及び移動を阻害する（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ１７２  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｎｉｍａｌ、２１：３９８９〜３９９４）。その他の点では、グリオーマの治療のためにＩＦＮγを用いた場合の負の結果が、報告されている（Ｍａｈａｌｅｙ  Ｍ．Ｓ．、Ｂｅｒｔｓｃｈ  Ｌ．，Ｊｒ．ら（１９８８）、再発性グリオーマの全身性γ−インターフェロン療法（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、６９：８２６〜８２９）。ＩＦＮγ及びＩＦＮβの同時使用は、細胞系ＧＢＭ−１８の成長、多剤耐性星状細胞腫の阻害に有効であった（Ｒｅｄｄｙ  Ｐ．Ｇ．ら（１９９１）、再発性グリオーマの全身性γインターフェロン療法（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇａｍｍ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ）、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、８３：１３０７〜１３１５）。その上、これらの腫瘍を治療するための、ＩＦＮγとα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）との組合せが記述されている（ＵＳ４４９９０７２）。特許ＵＳ５００２８７９は、リンホカイン及びＩＬ−２によって活性化されたキラー細胞のそばでＤＦＭＯを利用する、類似療法について述べている。ＩＦＮαに関し、その他の薬物との組合せは、グリオーマの治療において好ましくない作用をもたらし、有毒であることが示された（Ｂｃｋｎｅｒ  Ｊ．Ｃ．、Ｂｕｒｃｈ  Ｐ．Ａ．ら（１９９８）、再発性グリオーマ患者の、組換えインターフェロン−α−２ａ及びエフロールニチンの第２相臨床試験（Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ−２ａ  ａｎｄ  ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｍａ）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ、３６：６５〜７０；Ｃｈａｎｇ  Ｓ．Ｍ．、Ｂａｒｋｅｒ  Ｆ．Ｇ．ら（１９９８）、再発性グリオーマの高用量経口タモキシフェン及び皮下インターフェロンα−２ａ（Ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅ  ｏｒａｌ  ｔｅｍｏｘｉｆｅｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏＵＳｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２ａ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｍａ）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ、３７：１６９〜１７６）。次いで、このタイプの腫瘍の治療には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及び臨床試験に基づくその組合せの割合の適切な選択に基づいて、ＩＦＮα及びＩＦＮγを組み合わせた使用が向いている可能性がある。
【００１１】
喉頭は、口腔後の上気道消化管で、癌が２番目により頻発する場所である。喉頭癌は、頭部及び頸部で最も頻発する腫瘍であり、最も一般的な喉頭癌は、扁平上皮癌である（全ての症例の９５％）。喉頭腫瘍Ｔ３及びＴ４の症例での生存は、喉頭切除がなされた患者の約３０％でわずか約５年である（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ  Ｖ．、Ｍｉｌｏｖａｎｏｖｉｃ  Ｊ．ら（２００４）、悪性喉頭腫瘍の根治手術（Ｒａｄｉｃａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｔｕｍｏｒｓ）、Ｍｉｎｕｔｅｓ  Ｃｈｉｒ  Ｌｕｇｏｓｌ、５１：３１〜３５）。放射線療法及び化学療法は、この癌腫の治療に有効ではないことが示されている（Ｃｈｅｎ  Ｗ．、Ｇｕｏ  Ｘ．ら（２００４）、喉頭癌再発及び頸部転移に関する臨床療法の長期経過観察（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、Ｌｉｎ  Ｃｕａｎｇ  Ｅｒ  Ｂｉ  Ｙａｎ  Ｈｏｕ  Ｋｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ、１８：５３６〜５３７）。
【００１２】
それにも関わらず、ＩＦＮαを併用した多剤化学療法は、喉頭癌の治療に有益であった（Ｍａｎｔｚ  Ｃ．Ａ．、Ｖｏｋｅｓ  Ｅ．Ｅ．（２００１）、局所領域的に進行した喉頭癌の管理における、逐次誘導化学療法及び併用化学放射線療法（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ、１２：３４３〜３４７）。ＩＬ−２及びＩＦＮαの組合せは、喉頭癌の療法として第２相試験で評価されたが、その結果は満足のいくものではなかった（Ｃｌａｙｍａｎ  Ｇ．Ｌ．、Ｙｏｕｎｇ  Ｇ．ら（１９９２）、インターロイキン−２及びインターフェロンαで治療した頭頸部癌患者における、リンホカイン活性化キラー細胞活性の調節因子の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ）、Ａｎｎ  Ｏｔｏｌ  Ｒｈｉｎｏｌ  Ｌａｒｙｎｇｏｌ、１０１：９０９〜９１５）。喉頭腫瘍の療法では、あまり進歩がない。ＩＦＮα及びγの組合せ使用は、このタイプの腫瘍と闘うために、既存の療法を改善するのに寄与できると考えられる。
【００１３】
ＵＳ５５０３８２８特許は、ＩＦＮα２及びＩＦＮα８と、ＩＦＮα４、α７、α１０、α１６、α１７、及びα２１によって形成された群のＩＦＮの１つ又は複数の追加の種との、対立遺伝子を、少なくとも５０％含有することを特徴とする、インターフェロンの組成物について述べている。一方、特許ＵＳ４５０３０３５は、ＩＦＮαの一部の種の調製を示すが、α１、α５、α１４、及びＩＦＮωは含まない。これらの特許は、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２の組合せによって形成された製剤について述べていない。
【００１４】
ＵＳ５７６２９２３特許は、ＩＦＮαを安定化させるのに十分な量の非イオン性界面活性剤及びベンジルアルコールで水中に希釈され、更に酸緩衝液を含有するインターフェロン液状組成物について詳述する。一方、ＵＳ４８４７０７９特許は、インターフェロン及びチメロサールの医薬品組成物について述べているのに対し、特許ＵＳ４６７５１８４は、多価アルコール及び安定剤としての有機緩衝液及び従来の担体又はｐＨ３〜６の希釈剤を含むインターフェロン製剤を示している。組成物は、さらに、陰イオン界面活性剤及び／又はアルブミンを安定剤として有することができる。特許ＵＳ５２３６７０７及びＵＳ５４３１９０９には、安定剤としてのアミン（脂肪族第１級アミン）及びリチウムの有機塩が記載されており、これは、インターフェロンが分解するのを防止し、インターフェロンを安定させるものである。
【００１５】
ＵＳ４４９６５３７特許は、ヒト血清アルブミン組成物、及びアラニン又はグリシン、水、及びｐＨを６．５から８．０の間に維持することが可能な緩衝系を含む、インターフェロン−αの液状安定製剤に言及している。
【００１６】
ＵＳ５９３５５６６特許は、ｐＨを４．５から７．１の範囲内に維持することが可能な緩衝系、安定剤としてのポリソルベート８０、キレート剤としてのＥＤＴＡ、等張剤としての塩化ナトリウム、及び抗菌保存剤としてのｍ−クレゾールを組成物中に含む、インターフェロン−αの安定な製剤について述べている。
【００１７】
ＵＳ０１７０２０７特許は、ｐＨを４．５から９．０の範囲内に維持することが可能な緩衝系、安定剤、非イオン性界面活性剤、及び浸透圧の調節剤を組成物中に含む、インターフェロン−αの安定な製剤について述べている。
【００１８】
ＷＯ８９／０４１７７出願には、ｐＨを４．０から６．０の範囲内に維持する緩衝溶液、安定剤としてのポリヒドロキシル糖、及び非イオン性界面活性剤を含有する、インターフェロン−γの液状医薬製剤が記載されている。ＵＳ４８９５７１６特許は、緩衝グリシン／酢酸溶液中に溶かしたラクトビオン酸によるインターフェロン−γを安定化するための組成物及び方法に言及する。
【００１９】
ＵＳ５６７６９４２特許は、自然源から得られたＩ型インターフェロンのサブタイプによって形成され、しかしインターフェロンγとは組み合わされておらず且つこれらの組合せの割合が定められていない、医薬品組成物について述べており、これらの組成物は、腫瘍の治療ではなくウイルス感染に関してのみ記述されている。前述の報告の中で、相乗的な組合せで組換えＩＦＮγ及びα２を一緒に含有する医薬製剤の利用、特徴付け、又は言及がなされているものはない。組合せ利用の可能性は、ＩＦＮγ及びＩ型ＩＦＮが、確立された療法及び／又はそれらの組合せに対する耐性の種々の程度の細胞成長の治療のために、明確な割合で混合された場合に存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
これらの内容に留意して、良性又は悪性組織形成を有する個人での安全、効加的、簡単、広範な使用を可能にする割合で、これらＩＦＮを含有する、安定な医薬製剤の開発が必要である。本発明は、組合せのより最適な取り扱いを可能にし、これらの治療の患者への治療上の貢献が、より実現可能なものになる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、前述の問題を解決し、非経口的に（液体又は凍結乾燥）又は局所的な方法（ゲル、軟膏、又はクリーム）で、安定な医薬製剤を提供する。これらは、組織又は器官の生理学的良性又は悪性成長に拘らず、病理学的事象を治療するための相乗的な効果を奏する割合で組換えインターフェロンγ及びαを種々の量で含有し、更に医薬品として許容される賦形剤又はビヒクルも含有する。
【００２２】
これらの製剤は、ＩＦＮに対する種々の感受性の細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、及び種々の腫瘍の臨床試験、並びに医薬品として許容される種々の賦形剤又はビヒクルの存在下での、組換えＩＦＮγ及びα２の生物学的及び物理化学的安定性の評価の結果である。
【００２３】
凍結乾燥された安定な医薬製剤は、酢酸アンモニウム又はナトリウム、コハク酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び／又はカリウム、又はクエン酸／リン酸ナトリウムにすることができる、ｐＨを４．９から７．５の間に維持可能な緩衝溶液中に混合された、組換えＩＦＮγ及びα２からなる。
【００２４】
またこれらの製剤は、少なくとも、非還元糖化合物、アミノ酸、界面活性剤、及び安定化ポリマーから選択される成分からなる。非還元糖は、サッカロース又はトレハロースにすることができ、アミノ酸は、グリシン、ヒスチジン、又はロイシンにすることができ、一方、界面活性剤は、記述されたポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり、同様に安定化ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、又はヒドロキシエチルである。
【００２５】
本発明の具体例は、緩衝溶液を、１０から２０ｍＭの間の濃度範囲で用いるべきであると定義した。サッカロース又はトレハロースは、５から１００ｍｇ／ｍＬの間で使用すべきであり、グリシン、ヒスチジン、又はロイシンは、１から２０ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いるべきである。ポリソルベートは、０．０１から１ｍｇ／ｍＬの間で用いるべきであり、一方、ポリエチレングリコール、デキストラン、及びヒドロキシエチルデンプンでは、５から５０ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲で用いられる。
【００２６】
本発明のいくつかの具体例は、５．６×１０８ＩＵから１．４×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮγ、及び６．８×１０８ＩＵから１．７×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮα２を含有する、凍結乾燥した安定な医薬製剤について述べる。或いは、２．０×１０８ＩＵから０．５×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮγ、及び１２．０×１０８ＩＵから３．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮα２を含有する、凍結乾燥した安定な医薬製剤について述べる。或いは、４．０×１０８ＩＵから１．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮγ、及び８０．０×１０８ＩＵから２０×１０８ＩＶの間の濃度範囲の組換えＩＦＮα２を含有する、凍結乾燥した安定な医薬製剤について述べる。この製剤は、さらに、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、２水和リン酸水素２ナトリウム０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、及び１００ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水、またはそれぞれ均等な割合で、０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水を含有する。
【００２７】
定められた組合せの範囲で組換えＩＦＮγ及びＩＦＮαを混合する定義は、アイソボログラム分析の後に得られた。凍結乾燥した安定な医薬製剤の１つにおいて、５．６×１０８ＩＵから１．４×１０８ＩＵの間の組換えＩＦＮγ、及び６．８×１０８ＩＵから１．７×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮα２の濃度は、ケロイド（Ｋｅｌ  ５ａ、Ｋｅｌ  １７ａ）及びＣＢＣ  ＩＩＩ由来の初代培養物の成長阻害の研究の分析から達成された。アイソボログラム研究の後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞成長を２１％、４３％、及び４７％にそれぞれ低下させる１００ＩＵ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）の組換えＩＦＮγと１００ＩＵ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ）の組換えＩＦＮα２ｂとの組合せが、明らかにされた（実施例１、２、及び３、図１、表１参照）。
【００２８】
製剤用の、２．０×１０８ＩＵから０．５×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮγと１２．０×１０８ＩＵから３．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮα２との混合物は、臨床試験及び比較による治療症例の報告を利用して、定義された。無作為対照３重盲検臨床試験は、上記にて定義された安定な凍結乾燥製剤を利用して、基底細胞腫患者の病巣内（Ｉ．Ｌ．）治療の効力を評価した（実施例７、表９、１０、１１、及び１２参照）。
【００２９】
これらの割合の定義にも関与した、比較による治療症例の報告では、類表皮癌患者（患者１）と、多発性再発基底細胞腫及び移植を経た患者（患者２）とを治療した（それぞれ、実施例８、図５、ｂ、ｃ、ｄ；患者１、及び図６、ｂ、ｃ；患者２参照）。
【００３０】
４．０×１０８ＩＵから１．０×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮγ、及び８０×１０８ＩＵから２０×１０８ＩＵの間の濃度範囲の組換えＩＦＮα２を含有する製剤は、５０ＩＵ／ｍＬ（５ｎｇ／ｍＬ）の組換えＩＦＮγ及び１００ＩＵ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ）の組換えＩＦＮα２ｂによるグリア芽細胞腫（ＧＬ−５）細胞の成長阻害の研究結果の分析によって定義された。このようにして、５５％の成長阻害が実現される（実施例３）。さらに、細胞系ＨＥｐ−２による研究の分析を考慮した。この場合、ＩＦＮの量は、組換えＩＦＮγが５ＩＵ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ）であり、組換えＩＦＮα２ｂの量が７５ＩＵ／ｍＬ（０．３７５ｎｇ／ｍＬ）である。これによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞成長を７６％低下させるのに最適な組合せが実現される（実施例１、２、及び３参照）。
【００３１】
さらに、医薬品として安定な液状製剤が開発された。これらの製剤で、組換えＩＦＮγ及びαの割合は、凍結乾燥製剤に関して述べたように維持されたが、その医薬成分は、これらＩＦＮの混合物により大きな安定性をもたらすように、変化させた。
【００３２】
この研究の結果として、本発明の具体例は、緩衝溶液と、少なくとも非還元糖、アミノ酸、界面活性剤、安定化ポリマー、酸化防止／キレート化成分、及び等張化剤から選択される成分とを含有する、液体安定医薬製剤について述べている。これらの製剤は、ちょうどメチル−及びプロピル−パラベンの混合物のような保存剤を含有しても、しなくともよい水ベースの溶媒を用いる。
【００３３】
本発明の別の具体例は、４．９から６．５の間のｐＨを維持することが可能な緩衝溶液を用いる、液状安定医薬製剤を定義付ける。この緩衝液は、酢酸アンモニウム又はナトリウム、コハク酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び／又はカリウム塩、クエン酸塩／リン酸塩にすることができる。これらの製剤は、界面活性剤としてポリソルベート２０又はポリソルベート８０を、酸化防止剤／キレート剤としてＥＤＴＡ又はアセチル−システインを用いることができ、一方、アミノ酸は、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、又はリシンを含むことができる。安定化ポリマーとして、ヒドロキシエチルデンプン又はデキストランの利用が定められ、等張化剤として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、プロピレングリコール、マンニトール、グリセロール、サッカロース、又はトレハロースが定められる。
【００３４】
本発明の具体例は、液状安定医薬製剤が緩衝液を１０から１００ｍＭの間の濃度範囲で用いることに、重点を置く。この製剤中、ポリソルベートは、０．０１から１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で用いられ、ＥＤＴＡ又はアセチル−システインは、０．０１から１ｍｇ／ｍＬの間の濃度範囲内で用いられる。アミノ酸ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、又はリシンは、１から２０ｍｇ／ｍＬの間の濃度であり、ヒドロキシエチルデンプン及びデキストランは、５から５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で用いられ、等張化剤は、溶液を等張化するのに十分な量であることがわかる。
【００３５】
その他の具体例は、前述の組換えＩＦＮγ及びαの混合物の物理化学的及び生物学的安定性に必要な、液状安定医薬製剤の医薬成分全ての量について説明する。これらの液状製剤は、ＩＦＮの他に、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、並びにそれぞれ均等な割合で、１００ｍＬ、並びに０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、及び１０ｍＬになるよう十分な量の注射用蒸留水を含有する。
【００３６】
本発明は、細胞の良性又は悪性過成長の治療に役立てることができる、ＩＦＮγ及びαの混合物の割合を定める。これによって、腫瘍又はその他の細胞成長の異常事象の治療においてインターフェロンを用いることにより今日まで実現されてきた場合に比べ、より少ない用量、より少ない治療時間で、同じ治療効果を維持、又は優れた効果を発揮することが可能になる。用量の低下によって、より少ない副作用又はより低い強度が期待され、それにより、患者により良好な生活の質をもたらすことになり、これら強力な薬物の使用の利益を得ることが可能になる。
【００３７】
本発明は、これまでに記述されていない、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２の混合物の製剤であって、この治療的組合せの取り扱い及び臨床使用並びにそれらの商業化を容易にする、製剤を定義する。
【００３８】
本発明で記述される増殖阻害に相乗的な効果を奏する割合で組換えＩＦＮγ及びα２の混合物を含有する凍結乾燥及び液状の安定な医薬製剤は、広範にわたる臨床的用途を有する。これらの製剤をｉｎ  ｖｉｖｏで利用することにより、重要な腫瘍学的疾患では、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２の組合せが、同時に且つ腫瘍内で有効に利用されることが示される。
【００３９】
この組合せは、その個別の成分に関して得られた場合と比べ、腫瘍に対して、より短い時間でより高い審美的効果を伴って同等の治療効果を発揮することが可能である。これらの組合せの使用によって、癌と闘うためのより大きな治療可能性を提供することが可能になる。これは、本発明の具体例において、凍結乾燥又は液体の製剤を、独立した形態で、又は化学療法、放射線療法若しくは両方との組合せで充実性良性又は悪性腫瘍の治療において使用できることを明らかにした点で重要である。
【００４０】
その他の治療薬と組み合わせたこれらの製剤の利用は、シスプラチンと共に用いた組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２の組合せによる、巨大基底細胞腫瘍の患者の治療で得られた結果で支持されている（実施例１０及び図９参照）。
【００４１】
本発明では、インターフェロンγ及びα２の組合せ使用が、非常に悪い予測を持ち且つ審美的効果を歪める腫瘍をどのように減少させ且つ／又は治癒させるのか、記述されている。
【００４２】
制御されていない細胞成長が支配的である、いくつかの良性及び腫瘍学的部分の特徴によれば、これらは、上記製剤を用いた治療を受け易くすることができる。その中には、急性若しくは慢性骨髄性白血病、急性若しくは慢性リンパ球性白血病、並びにＴ若しくはＢ細胞の白血病及び中枢神経系のリンパ腫など、造血組織からの細胞の腫瘍がある。喉頭癌、喉頭乳頭腫症、リンパ腫、類表皮及び皮内腫、リンパ肉腫、神経線維腫、及び脂腺過形成も治療することができる。これら医薬製剤の使用により、星状細胞腫、多形グリア芽細胞腫、上衣細胞腫、神経節細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、混合膠腫、乏突起細胞腫、視神経のグリア細胞腫、原始神経外胚葉性腫瘍、聴神経腫瘍、脊索腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫症、脳の偽腫瘍、結節性硬化症、転移性脳腫瘍などの末梢及び中枢神経系の腫瘍に役立てることができる。治療を受け易いその他の腫瘍は、海綿状血管腫、肝細胞腺腫、限局性結節性過形成、松果体部腫瘍、下垂体腺腫、血管腫瘍、髄膜癌腫症、チェリー状血管腫、皮脂腺過形成である。基底細胞腫、扁平上皮癌、皮膚線維腫、化膿性肉芽腫、皮膚母斑、並びに脂漏性及び光線性角化症などの皮膚の腫瘍も、これら医薬製剤による治療から利益を受けることができる。
【００４３】
本発明の別の具体例は、これらの製剤を、線維症、異形成、及び過形成などの増殖事象の治療に用いることができることを述べている。
【００４４】
本発明の具体例として、実施７、８、及び１０で実施され且つ記述される臨床試験の結果によれば、筋肉内、腫瘍内、及び病巣周囲に製剤を施用する方法が定められる。その他の具体例は、半固体のグラム数で、０．３２×１０６ＩＵから０．０８×１０６ＩＵの間の濃度範囲のＩＦＮγ、及び２．０×１０６ＩＵから０．５×１０６ＩＵの間の濃度範囲のＩＦＮα２を含有する、局所安定医薬製剤の施用について述べている。製剤は、ＩＦＮγ２．２％、ＩＦＮα  ０．５８％、セチルアルコール４％、ワセリン１０％、Ｔｗｅｅｎ６０  ２％、及びメチルパラベン、プロピンパラベン０．２％によって構成されたクリームである。さらに、軟膏の組成は、ＩＦＮγ２．２％、ＩＦＮα  ０．５８％、白色固体ワセリン６０％、重液ワセリン１０％、スパン２０  ３％、メチルパラベン及びプロピルパラベン０．２％によって処方された。最後に、ゲル製剤は、ＩＦＮγ２．２％、ＩＦＮα  ０．５８％、カルボポル９４０  ０．５％、メチルパラベン及びプロピルパラベン０．２％、水酸化ナトリウム０．２％、エチレンジアミノ４酢酸２ナトリウムカルシウム０．０１％、及びエタノール２％によって構成される。
【００４５】
これらの製剤全ては、温度の変動に耐性があり、これは製品の製造、その輸送、及び貯蔵に有益である。インターフェロンの凝集が防止され、したがって、この製品の長期使用中に免疫原性をもたらすのに、より少ないリスクが提示される。半固体の製剤は、その非侵襲的で安全な形により、それを所有する患者が用いることが可能になる。本発明の別の具体例として、独立形態で又は化学療法、放射線療法、又は両方の併用と組み合わせて利用される、皮膚又は粘膜の充実性良性又は悪性腫瘍の治療におけるこれらの局所安定製剤の使用が定められる。
【００４６】
本発明の別の具体例は、リンパ腫、類表皮及び皮内腫、リンパ肉腫、神経線維腫、皮脂腺過形成、血管腫、限局性結節性過形成、上衣細胞腫、神経節細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、髄膜腫、松果体部腫瘍、下垂体腺腫、血管腫瘍、髄膜癌腫症、神経線維腫症、チェリー状血管腫、脂腺過形成、基底細胞腫、扁平上皮癌、皮膚線維腫、化膿性肉芽腫、皮膚母斑、脂漏性及び光線性角化症、及びコンジロームの治療に、この局所安定医薬製剤を使用できることについて述べている。
【００４７】
本発明の別の具体例は、前述の濃度及び関係を有する組換えＩＦＮγのバイアル、組換えＩＦＮαのバイアルと、ＩＦＮの希釈及び／又は溶解に十分な量の注射用蒸留水とを含むキットの構造について述べている。キットには、ＩＦＮの一方を含有するバイアルの１つで事前に混合される、ＩＦＮを同時投与するための、注射器及び適切な針が入っている。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）
初代細胞培養物での組換えＩＦＮγ又はαによる細胞成長の阻害
皮膚生検材料を、正常な皮膚から、及び手術又は火傷による損傷が原因で基底細胞腫又はケロイドを発症した患者から得た。外植片法により、この組織サンプルをすぐに培地ＤＭＥＭ中に置き、断片化して、初代培養物を得た。組換えＩＦＮγ及びαの抗増殖性効果の評価のため、下記の初代培養物、即ちケロイドからの線維芽細胞初代培養物（ＣＰＦ）（１、２、５、７、８、１５、１７、１９、２０、２４、２６、２７、３１、３２）、基底細胞腫（ＣＢＣ  ＩＩＩ）からのＣＰＦ、及び正常な皮膚からのＣＰＦ（ＦｉｂＮ３及びＦｉｂＮ５）を評価した。ＣＰＦを、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びウシ胎児血清（ＣＢＳ）１２％を含有する培地混合物ＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭ中で成長させた。全ての培養物を、湿度５％のＣＯ２インキュベータ内で、３７℃でインキュベートした。ＩＦＮの抗増殖作用を決定するために、細胞を、９６マイクロウェルプレートに５×１０４細胞／ｍＬで播いた。播いた後、２４時間後に、新鮮な培地に交換することによって同期させた。種々の濃度のＩＦＮの存在下、９６時間のインキュベーションの終わりに、クリスタルバイオレット染色法を利用し、５８０ｎｍでの吸光度を測定し、リーダプレートを利用して、評価された実験条件の３種の複製物の生存率を決定した。その結果を、生細胞のカウントを基にした成長％と定義した。
成長％＝（ＡＴ７２ｈ−ＡＣ０ｈ／ＡＣ７２ｈ−ＡＣ０ｈ）×１００
ＡＴ７２ｈ＝７２時間処理した細胞の吸光度
ＡＣ７２ｈ＝７２時間処理した対照細胞の吸光度
ＡＣ０ｈ＝ＩＦＮで処理する前の細胞の吸光度
【００４９】
図１には、ケロイドＣＰＦの成長に対する組換えＩＦＮγ又はαの抗増殖作用が示されている。観察されるように、ＩＦＮγ又はα２ｂは、様々な初代培養物で細胞増殖を阻害するが、その他は、この増殖を刺激する。対照として、初代培養物ＦｉｂＮ３及びＦｉｂＮ５を、並びにＣＢＣＩＩＩ、及びＨＥｐ−２、Ｕ１７５２、及びＧＬ−５細胞系生検材料からの初代培養物を評価した。
【００５０】
（実施例２）
確立された細胞系での組換えＩＦＮγ又はα組換え体による細胞成長の阻害
研究がなされたヒト細胞系は、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）、ＧＬ−５（Ｐｅｒｅａ  Ｓ．ら（１９９３）、Ｍｉｎｕｔｅｓ  Ｃｉｅｎｔ  Ｖｅｎｅｚ、４４：２２〜２７）、ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２３）であった。細胞ＧＬ−５をＤＭＥＭ中で培養し、ＨＥｐ−２は、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び１０％ＣＢＳを含有するＭＥＭ−ＣＡＮＥ中で培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ゲンタマイシン及び１０％ＣＢＳと共にＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。全ての培養物を、湿度５％のＣＯ２インキュベータ内で、３７℃でインキュベートした。ＧＬ−５及びＨＥｐ−２に対する抗増殖作用を評価するために、３×１０４細胞／ｍＬで細胞を播いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞の場合は、これらを１０５細胞／ｍＬまで播いた。種々の濃度のＩＦＮの存在下で、７２時間インキュベーションした後、バイオレットクリスタル染色法を利用し、５８０ｎｍでの吸光度を測定し、リーダプレートを利用して、３種の複製物の生存率を評価した。その結果は、実施例１に記述されるように、生細胞のカウントを基にした成長％と定義した。表１及び図１からわかるように、細胞系ＨＥｐ−２（喉頭癌）及びＧＬ−５（グリア芽細胞腫から）は、ＩＦＮγに対して非常に感受性があり、ＩＦＮαに対してはそうではなかった。
【００５１】
【表１】
2009513682.tif 000002
【００５２】
表１では、細胞系ＨｅｐＧ２（肝細胞腫）がこれらのＩＦＮには感受性がなく、細胞系Ｊｕｒｋａｔ（リンパ腫Ｔ）では、ＩＦＮαが最も有効なものであり、この結果は、リンパ組織からの腫瘍の治療にＩＦＮα２を首尾良く用いることに一致することが観察される。
【００５３】
（実施例３）
初代培養及び細胞系に対しより有効な抗増殖作用を有する組換えＩＦＮγ及びαの組合せ
ＣＢＣ−ＩＩＩ及びケロイド（Ｋｅｌ−５ａ及びＫｅｌ−１７ａ）ＣＰＦと細胞系ＨＥｐ−２及びＧＬ−５を利用して、細胞成長阻害の相乗的活性を有する最適な混合物を定めるために、組換えＩＦＮγ及びα２ｂによる組合せの研究を実施した。この研究で得られたデータは、アイソボログラムを構築して分析した。成人ケロイド（ｋｅｌ  ５ａ及びｋｅｌ  １７ａ）の生検材料由来のＣＰＦのアイソボログラム研究から、成長阻害に最適な相乗効果を奏する組合せは、１００ＩＵ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮγ及び１００ＩＵ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮα２ｂからなるべきことが定められた。この組合せにより、細胞成長は、インビトロで２１％（Ｋｅｌ  ５ａ）及び４３％（ｋｅｌ  １７ａ）低下する（図２及び３）。
【００５４】
図４のアイソボログラムには、１００ＩＵ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮγと１００ＩＵ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮα２ｂとの組合せが相乗的であり、ＣＢＣ  ＩＩＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞成長を４７％低下させる点で最も効加的であることが示されている。図５に示されるアイソボログラムによれば、ＧＬ−５の細胞の成長を阻害するのに最適な相乗的組合せは、５０ＩＵ／ｍＬ（３ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮγと６００ＩＵ／ｍＬ（５ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮα２ｂである。この組合せにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞成長が５５％低下する。
【００５５】
図６に示されるアイソボログラムには、ＨＥｐ−２細胞に対して最良の抗増殖作用を得るのに最適な、ＩＦＮγ及びαの相乗的組合せが示されている。ＩＦＮの量は、ＩＦＮγが５ＩＵ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ）であり、ＩＦＮα２ｂが７５ＩＵ／ｍＬ（０．３７５ｎｇ／ｍＬ）である。この最適な組合せにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞成長の低下は７６％に達する。
【００５６】
（実施例４）
水溶液中のインターフェロンα−２ｂ及びγの混合物の安定性に対する、緩衝溶液のｐＨ、イオン種、及び濃度の影響
組換えインターフェロンγ及びαの、相乗的組合せの液体及び凍結乾燥製剤の安定性を研究するために、ＩＦＮを、その対応する活性医薬成分（ＩＦＡ）から、種々のアッセイ製剤：緩衝溶液、個々の賦形剤を含む緩衝溶液混合物、及び様々な賦形剤を含む緩衝溶液混合物中に希釈した。種々の製剤のバイアルの代表的なサンプルを、インターフェロンの安定性を評価するために、種々の処理、即ち凍結−解凍、凍結乾燥、撹拌して３７℃にし、光及び温度の影響を与えるサイクルにかけた。種々の処理の後、種々のアッセイ、即ち物理的外観、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び分子排除クロマトグラフィー（ＭＥ−ＨＰＬＣ）を通じて、物理化学的安定性を評価した。生物学的安定性は、各インターフェロンに特異的な免疫−酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、及びウイルス細胞病原作用の阻害の生物学的アッセイによって評価した。
【００５７】
これらの製剤全てのデザインに関する研究を、中間濃度のインターフェロン（ＩＦＮγが０．５ＭＩＵ、及びＩＦＮα２ｂが３．０ＭＩＵ）の混合物に関して実施した。得られた製剤の最終的な変形例（２重に調製した）により、相乗的組成物が調製され、その安定性を評価した。
【００５８】
官能特性：製剤の外観の分析によって決定した（無色透明、且つタンパク質の凝集がない状態で維持された）。凍結乾燥製剤では、凍結乾燥した生成物の外観も分析した。
【００５９】
湿分：凍結乾燥した生成物の残留湿分の含量を、湿分放射計（モデルＴＩＭ  ５５０）の計器を用いる、カールフィッシャーヨウ素還元滴定技法によって決定した。
【００６０】
化学安定性：タンパク質の純度及び分解の程度（ｔｈｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を、溶媒遊離のシステム、ダイオード配列検出器、オーブン、及びデータ処理システムを備えたＨＰＬＣシステム（メルク−日立）を使用して、保存カラムＣ８  Ｖｙｄａｃ（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を備えたカラムＣ８  ＶｙｄａｃでＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも決定した。
【００６１】
凝集の決定：組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの凝集を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５  ＨＲ  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、スウェーデン）を使用した分子排除ＨＰＬＣと、溶媒遊離システム、ダイオード配列検出器、オーブン、及びデータ処理システムを備えたＨＰＬＥシステム（メルク−日立）とによって測定した。共有結合凝集体の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。
【００６２】
αインターフェロンＥＬＩＳＡ：このアッセイは、本発明者らの実験室で開発された（Ｈ．Ｓａｎｔａｎａ、Ｅｓｐｉｎｏ  Ｙ．ら（１９９９）、組換えヒトインターフェロンα−２ｂの分析のための、サンドイッチ型酵素結合免疫吸着アッセイ（Ａ  ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｔｙｐｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  α−２ｂ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３、３４１〜３４６）。このアッセイは、モノクローナル抗体を用い、報告された方法に従って実施された。測定は、本明細書では、初期サンプルのＥＬＩＳＡ活性を１００％と見なして、各製剤変形例からの種々のサンプルにおける、インターフェロンα−２ｂの残留ＥＬＩＳＡ活性のパーセンテージとして報告する。
【００６３】
インターフェロンγＥＬＩＳＡ：このアッセイは、本発明者らの実験室で開発された（Ｂｏｕｙｏｎ  Ｒ．、Ｓａｎｔａｎａ  Ｈ．ら（２００３）、組換えヒトγインターフェロンに関する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の開発及び検証（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：１〜１０）。このアッセイは、モノクローナル抗体を用い、報告された方法に従って実施された。測定は、本明細書では、初期サンプルのＥＬＩＳＡ活性を１００％と見なして、各製剤変形例からの種々のサンプルにおける、インターフェロンγの残留ＥＬＩＳＡ活性のパーセンテージとして報告する。
【００６４】
抗ウイルス生物活性の定量：生物活性の測定は、Ｆｅｒｒｅｒｏ  Ｊ．、Ｏｃｈａｇａｖｉａ  ＭＥ．ら（１９９４、Ｔｉｔｕｌａｃｉｏｎ  ｄｅ  ｌａ  ａｃｔｉｖｉｄａｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｕｔｉｌｉｚａｎｄｏ  ｅｌ  ｓｉｓｔｅｍａ  ｄｅ  ｅｑｕｉｐｏｓ  ＳＵＭＡ、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ、１１：３４〜４２）に記述されるように実施した。生物活性の計算は、Ｆｅｒｒｅｒｏ  Ｊ．、Ｄｕａｎｙ  Ｌ．ら（１９９７、Ｎｕｅｖｏ  ｐｒｏｇｒａｍａ  ｄｅ  ｃａｌｃｕｌｏ，ｃｕａｎｔｉｆｉｃａｃｉｏｎ  ｄｅ  ｌａ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｅｓ  ｍａｄｉａｎｔｅ  ｌａ  ｉｎｈｉｂｉｃｉｏｎ  ｄｅｌ  ｅｆｅｃｔｏ  ｃｉｔｏｐａｔｏｇｅｎｉｃｏ  ｕｔｉｌｉｚａｎｄｏ  ｅｌ  ｓｉｓｔｅｍａ  ｄｅ  ｅｑｕｉｐｏｓ  ＳＵＭＡ、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ、１４：２６７〜２６９）に記述されるように実施した。生物活性は、本明細書では、初期サンプルの生物活性を１００％とみなして、残留生物活性のパーセンテージとして報告した。活性成分の安定性におけるｐＨの影響を知るために、種々の緩衝溶液中に、即ちクエン酸／リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、及び酢酸緩衝液中にＩＦＮγを０．５ＭＩＵ及びＩＦＮα２ｂを３．０ＭＩＵ含有する、種々の製剤を調製した。組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂと緩衝溶液との混合物を含有する製剤を、凍結−解凍のサイクルにかけ、４５℃で保存し、種々の時間間隔でＥＬＩＳＡによって分析した。製剤は、４から８の間のｐＨを有するように、且つ緩衝溶液が０．１Ｍの濃度にあるように調製した。表２、３、及び４は、凍結−解凍の３サイクル後に、且つ種々の時間間隔で、３から１２日まで、４５℃で実施されたアッセイの結果を報告している。
【００６５】
【表２】
2009513682.tif 000003
Ｄ＝日；ＮＤ＝不検出
ＩＦＮ／４＝クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ４．０中の製剤
ＩＦＮ／５＝クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ５．０中の製剤
ＩＦＮ／６＝クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６．０中の製剤
ＩＦＮ／７＝クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ７．０中の製剤
ＩＦＮ／８＝クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ８．０中の製剤
【００６６】
【表３】
2009513682.tif 000004
Ｄ＝日；ＮＤ＝不検出
ＩＦＮ／５＝リン酸緩衝液ｐＨ５．０中の製剤
ＩＦＮ／６＝リン酸緩衝液ｐＨ６．０中の製剤
ＩＦＮ／７＝リン酸緩衝液ｐＨ７．０中の製剤
ＩＦＮ／８＝リン酸緩衝液ｐＨ８．０中の製剤
【００６７】
これらの表（２、３、４）のデータは、５から８の間のｐＨ値、好ましくは５及び７に近いｐＨで、酢酸、リン酸、及び酢酸−リン酸緩衝液中の、製剤が、凍結−解凍サイクル中に適切な安定性を有することを示す。水溶液中の熱安定性は、好ましくは酢酸及びリン酸緩衝液中で、５から５．６の間のｐＨ値のときに、より大きかった。
【００６８】
表５のデータは、より高い緩衝液濃度の製剤が、ｐＨ５．５でより低い濃度の場合よりも、凍結−解凍サイクル中により良好な安定性を示したことを示し、特に、種々の評価された緩衝液中のＩＦＮγに対して良好な安定性を示した。それにも関わらず、熱安定性の結果は、酢酸緩衝液及びその後のリン酸緩衝液中で、ｐＨ５．５の場合により良好であった。クエン酸−リン酸緩衝液での熱安定性は、低濃度の緩衝液中でより良好であった。
【００６９】
【表４】
2009513682.tif 000005
Ｄ＝日；ＮＤ＝不検出
ＩＦＮ／Ｃ４＝クエン酸緩衝液ｐＨ４．０中の製剤
ＩＦＮ／Ｃ５＝クエン酸緩衝液ｐＨ５．０中の製剤
ＩＦＮ／Ｃ６＝クエン酸緩衝液ｐＨ６．０中の製剤
ＩＦＮ／Ａ４＝酢酸緩衝液ｐＨ４．０中の製剤
ＩＦＮ／Ａ５＝酢酸緩衝液ｐＨ５．０中の製剤
ＩＦＮ／Ａ５．６＝酢酸緩衝液ｐＨ５．６の製剤
【００７０】
【表５】
2009513682.tif 000006
Ｄ＝日；ＮＤ＝不検出
ＩＦＮ／Ｃ−Ｆ２５：クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．５、２５ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ｃ−Ｆ５０：クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．５、５０ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ｃ−Ｆ１００：クエン−リン酸酸緩衝液ｐＨ５．５、１００ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ｆｋ２５：リン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５、２５ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ｆｋ５０：リン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．５、５０ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ｆｋ１００：リン酸緩衝液５．５、１００ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／ＦＮＡ  ２５：リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、２５ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／ＦＮＡ  ５０：リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、５０ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／ＦＮＡ  １００：リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５、１００ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ａ  ２５：酢酸緩衝液ｐＨ５．５、２５ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ａ  ５０：酢酸緩衝液ｐＨ５．５、５０ｍＭ中の製剤
ＩＦＮ／Ａ  １００：酢酸緩衝液ｐＨ５．５、１００ｍＭ中の製剤
【００７１】
（実施例５）
凍結乾燥製剤（バイアル当たり、ＩＦＮγが１．４×１０６ＩＵ、ＩＦＮα２ｂが１．７×１０６ＩＵ）
組成：ＩＦＮγ２．８×１０８ＩＵ、ＩＦＮα２ｂ３．４×１０８ＩＵ、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、リン酸水素２ナトリウム２水和物０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、１００ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水。
【００７２】
インターフェロンを除く全ての成分について、測定し、注射用蒸留水で希釈した。この溶液のｐＨをチェックし、必要に応じて、希（１：２）酢酸又は１Ｍ  ＮａＯＨで７．２±０．２の値に調節する。ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの活性医薬品成分を添加し、適切な濃度まで希釈した。この溶液を、滅菌形態に濾過し、バイアルに充填し、栓で蓋をして、クラス１００領域で凍結乾燥し、そこで処理を実施した。最後に、バイアルを覆って密封し、生成物を、２から８℃の間で保存した。表６は、用いられた凍結乾燥サイクルの主なパラメータを示す。
【００７３】
【表６】
2009513682.tif 000007
【００７４】
確立された時間間隔で、サンプルを採取し、生成物の残留湿分の含量、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂ（ＥＬＩＳＡによる）、生物活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、及び凍結乾燥生成物の外観、並びにこれを溶かして元に戻したものについて、分析した。結果を表７に示す。
【００７５】
【表７】
2009513682.tif 000008
＊充填された体積は、０．５ｍＬ／バイアル；ＳＴＩ：凍結乾燥すると均一な白色；溶かして元に戻した後は、透明無色溶液、本質的に粒子を含まない。
【００７６】
（実施例６）
凍結乾燥製剤（バイアル当たり、ＩＦＮγ０．５×１０６ＩＵ、及びＩＦＮα２ｂ３．０×１０６ＩＵ）
組成：１．０×１０８  ＩＵ、ＩＦＮα２ｂ６．０×１０８  ＩＵ、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、リン酸水素２ナトリウム２水和物０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、１００ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水。この調製方法は、実施例５の凍結乾燥製剤で述べたものと同じであった。
【００７７】
確立された時間間隔で、サンプルを採取し、生成物の残留湿分の含量、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの含量（ＥＬＩＳＡによる）、生物活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、及び凍結乾燥生成物の外観、並びにこの凍結乾燥生成物を溶かして元に戻したものについて、分析をした。この結果を、表８に示す。
【００７８】
【表８】
2009513682.tif 000009
＊充填された体積は、０．５ｍＬ／バイアル；ＳＴＩ：凍結乾燥すると均一な白色；溶かして元に戻した後は、透明無色溶液、本質的に粒子を含まない。
【００７９】
（実施例７）
安定化凍結乾燥医薬製剤（バイアル当たり、ＩＦＮγが０．５×１０６ＩＵ、ＩＦＮα２ｂが３．０×１０６ＩＵ）による臨床試験。ＣＢＣにおける病巣内施用。
実施例６で述べた安定な凍結乾燥医薬製剤を、直径４ｃｍ未満の病巣を有する皮膚の任意の部位及びタイプのＣＢＣについて臨床及び組織診断がなされた５９名の患者を含む、３重盲検対照無作為臨床試験の実施の際に用いた。これらの患者を、無作為に３つの治療群に割り当てた。病巣は、組換えＩＦＮα２ｂの用量の半分（１．５×１０６ＩＵ／ｍＬ）、又は組換えＩＦＮγの用量の半分（０．２５×１０６ＩＵ／ｍＬ）、又は安定な凍結乾燥製剤（バイアル当たり、ＩＦＮγを０．５×１０６ＩＵ、ＩＦＮα２ｂを３．０×１０６ＩＵを含む）で病巣内治療した。それぞれＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ群である。ＩＦＮを、週当たり３回、連続して３週間、連続して９週間、１週間に１回、又は病巣全体が消失するまでで治療の臨床効果を評価する。ＩＦＮα２ｂ、ＩＦＮγ、及び製剤（バイアル当たり、ＩＦＮγを０．５×１０６ＩＵ、ＩＦＮα２ｂを３．０×１０６ＩＵ）により、それぞれ、群の病巣の９．５％、３５．３％、及び５．３％が病巣サイズの５０％未満に縮小した。残りの病巣では、客観的奏効率（全体的な消失又は減少が、初期サイズの５０％超である）９０．５％、５７．９％、及び９４．７％（それぞれＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ群）が観察された。どの病巣も、進行しなかった（表９参照）。「治療が終了しなかった患者」の層では、相乗的抗増殖作用を有する組換えＩＦＮγ及びα２ｂを含有した製剤での治療の優位性が、観察される（ＩＦＮα２Ｂによる治療に対しては、差が１７％であり、ＩＦＮγに対しては、差が２７％である）。「治療が１１週間未満の患者」の層では、製剤の優位性が観察される。ＩＦＮγに対しては差が約３０％であり、ＩＦＮα２ｂに対しては２７％である。完全応答の割合は、より高い（ＩＦＮα２ｂ治療に対する優位性は＞４０％、ＩＦＮγ治療に対しては＞３０％）。注射が１２回未満の患者では、製剤で治療した群において１００％の好ましい応答が実現した（そのうち、５０％がＲＣ）。他の２つの群では、好ましい応答のパーセンテージが６７％であり（そのうち、３３．３％がＲＣ）、即ち、併用療法では約３３％の差が実現された。表９参照。
【００８０】
【表９】
2009513682.tif 000010
【００８１】
表１０からわかるように、組換えＩＦＮγ及びα２ｂを含有する安定な凍結乾燥製剤では、インターフェロンの場合よりも短時間で、臨床的完全応答を得ることが可能であり、ＩＦＮαよりも約４週間前という差があった。
【００８２】
【表１０】
2009513682.tif 000011
【００８３】
治療なしの症例では、ケロイドの形成が観察され、これに対して治療がなされた全ての症例は、通常の感受性、通常の弾性を有し、又は乾燥、脆弱性、及び粗さがわずかに減少し存在しない、病巣の良好な瘢痕形成が生じた。色に関しては、製剤で治療した患者の大多数において、治療箇所に通常の発色が観察され（４７．４％）、これはＩＮＦ  αによる群で観察された場合（２８．６％）の２倍であった。試験の終わりに、製剤で治療した群では、表１１に示されるＩＦＮα２ｂ単独で治療した群（５２．４％）よりも、大きな割合で、平らな創傷が観察された（６３．２％）。
【００８４】
【表１１】
2009513682.tif 000012
【００８５】
インターフェロンの組合せは、その生成又は強度に関して治療群間で統計的な差が検出されなかったので、有害事象を増強しなかった。一般に、それらは軽く（７１．２％）、又は適度であり、十分に耐用性があった。有害で重篤な事象も非常に重篤な事象も示さなかった（表１２）。
【００８６】
【表１２】
2009513682.tif 000013
【００８７】
この表からわかるように、各治療群で最も頻繁な有害事象は、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、及びこれらの組合せに関して、それぞれ、熱（３８．５％、６０．８％、及び２６．２％）、筋肉痛（３８．５％、３．９％、及び３１％）、及び悪寒（１２．８％、１９．６％、及び２１．４％）であった。示される有害事象の合計は、ＩＦＮγで治療した患者の群において、わずかに上回った。
【００８８】
一般に併用治療では、ＩＦＮα群に対し、４週間前で完全応答が３２％優れており、注入量は２５％未満であった。この組合せは、有害事象を増強せず、完全臨床応答による患者の治療を終了させた後１年の経過観察中に、いくらかの再発が見られた。美容上の観点から、この結果は非常に良く、ほとんどが平らで正色素性の創傷をもたらした。
【００８９】
（実施例８）
皮膚腫瘍を持ち、標準的な治療を受けていない患者における、組換えＩＦＮγ及びα２ｂの混合物の同時使用（ｃｏｍｐａｓｉｏｎａｌｕｓｅ）の結果。症例報告。
患者１
患者ＥＰＲ：ＨＣ：３０２３９６  年齢：８２才、性別：男性、個人的病理前駆症状（ＡＰＰ）：ｎ／ｒ  国立腫瘍及び放射線研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）（ＩＮＯＲ）に、胸部前部領域の皮膚の腫瘍が付託された（１７／１０／０１）者に、電子高周波療法を施し、潰瘍形態に成長した後、０３／０７／０１に外科的に切除した。結果：有棘細胞癌が不完全に切除された。患者は、高い縁部を有する当初の腫瘍の場所に３ｃｍの残留腫瘍病巣を持つに到った。物理的観察では、局所的な転移性結節腫を示さなかった。腫瘍に対する放射線療法が示され、２９／０１／０２に終了した：６０ｃｏ  ５０Ｇｙ＋Ｘ線  １２Ｇｙ。腫瘍当たりの総用量は、６２ｇｙであった。
【００９０】
１カ月後、患者は、鎖骨及び胸鎖乳突筋の下３分の１に、固定腫瘍を示し、短時間で腫瘍は素早く成長し、０４／０３／０２には、右鎖骨の内側３分の１、首の付け根、及び胸骨の一部に１０×８ｃｍの大きな潰瘍化創傷を示し、全ては胸部前部に向かっていた。外科的介入を患者に提示した。患者の年齢が８２才であり、手術によるリスクが高いことから、外科的介入を行うことは拒否された。次いで病巣内ＩＦＮによる治療を推奨した。
【００９１】
サイズの大きい腫瘍（１２．５×９ｃｍ及び厚さ１〜１．５ｃｍ）が、骨及び筋肉に固定された。ＩＦＮの施用を、周囲の３セクターに計画した。各セクターには、約５ｃｍ３の組織（１．５×１．５）に溶液１．５ｍＬを浸潤させて、注射用蒸留水６ｍＬ中、０．５×１０６ＩＵのＩＦＮγ＋６×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂの用量にし、３週間にわたって週当たり３回注射した（図７ａ）。生成物を５回施用した後（２週間）、より高い用量のＩＦＮγを施用することを決定した（２倍、１×１０６ＩＵ）。前回の投薬量では有害事象がなかったこと、及び前回の臨床研究の情報では両方のインターフェロンの相乗効果が示されたことから、用量の上昇を提示して、非常の大きい腫瘍により良好な結果を得ることを試みた。
【００９２】
全体として、患者には、治療の２カ月で、全用量が２５×１０６ＩＵのＩＦＮγ＋１６２×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂになるように、２７回施用した。５回目の施用で、創傷縁部が正常な皮膚と同レベルになる平坦化が認められた。（図７ｂ）。治療開始から１カ月後、患者は、上腕神経叢の浸潤、鎖骨の暴露、壊死、及び骨折が観察される右上部に、強い痛みを訴えた。＃２０の施用では、注射した場所に腫瘍成長の停止が観察されたが、このように腫瘍の中心部では、小葉状の形に成長した（図７ｃ）。この状態は、２４回目の施用時にも観察された。その他に、敗血症及び壊死が、腫瘍性潰瘍の中心に現れた。治療開始から正確に２カ月後（施用＃２７）、患者は、鎖骨下動脈の浸潤による動脈出血に罹患し、患者のヘモグロビンは８０ｇ／Ｌに低下し、治療を１５日間中断し、その終わりに、連続出血のために元に戻り、進行性無力症になった。患者は、動脈切断によって２カ月後に死亡した。注射部位は、腫瘍成長がない状態で維持された。最初の８回の施用では、いくつかの有害事象は熱（３９℃）、悪寒、病巣周辺の紅斑のように現れたが、その全ては強度が軽微で、短時間であった。結論：注射部位での臨床応答が達成され、少なくとも２カ月間続き、副作用は、重要なものではなくなった。
【００９３】
患者２
患者ＬＧＲ：ＨＣ：１５８３９０  年齢：６５才  性別：女性、ＡＰＰ：ｎ／ｒ。顔全面が多数の癌に罹患している患者。患者は、外科的介入を受け、移植片を持つ左眼の下眼瞼に数回放射線治療を行った。現在、眼瞼縁部に直径５ｍｍの腫瘍再発が見られ、別の平らな瘢痕状創傷が、眼瞼の下に頬骨に向かって生じている（図８ａ）。代替の治療は、既に多数の治療がなされた対象に対する新しい手術である。同じ眼の上眼瞼には、前に治療しなかった７ｍｍの別の基底癌がある。
【００９４】
０８／０５／０２に、４ｍＬの病巣内ＩＦＮ（０．５×１０６ＩＵのＩＦＮγ＋３×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）による、３週間にわたり週３回の治療を提示した。全体として、患者は、インターフェロンの総用量３５×１０６ＩＵ（５×１０６ＩＵのＩＦＮγ＋３０×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）を１０回に分けて受けた。４分の１の浸潤では、瘢痕状創傷が消失し、眼瞼には、腫瘍の場所に壊死した潰瘍があった（図８ｂ）。治療の２カ月後、眼瞼には腫瘍がなく、頬骨の瘢痕状の平らな創傷の消失が観察された（図８ｃ）。局所領域効果が得られた。ＩＦＮでは直接治療されなかったので外科的に切除していた左眼の上眼瞼の基底癌に、５０％の減少が観察された。３年後、患者は依然として、ＩＦＮによる浸潤病巣の制御下にあった。光強度及び短時間といういくつかの有害事象が、熱（３９℃）、悪寒、及び結膜浮腫のように治療した眼に現れたが、冷湿布により緩和された。
【００９５】
結論：患者は、２００５年８月までに完全臨床寛解となり（最後の対照）、副作用は最小限に抑えられた。
【００９６】
（実施例９）
凍結乾燥製剤（バイアル当たり、０．５×１０６ＩＵのＩＦＮγ及び１０×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）
組成：ＩＦＮγ１．０×１０８ＩＵ、ＩＦＮα２ｂ２０×１０８ＩＵ、リン酸２水素カリウム０．０８０２ｇ、リン酸水素２ナトリウム２水和物０．２４９ｇ、サッカロース４ｇ、グリシン０．８ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０３ｇ、ポリエチレングリコール６０００  １ｇ、１００ｍＬになるまで十分な量の注射用蒸留水。
【００９７】
調製方法は、実施例５の凍結乾燥製剤で述べたものと同じであった。
【００９８】
確立された時間間隔でサンプルを採取し、生成物の残留湿分の含量、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの含量（ＥＬＩＳＡによる）、生物活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、及び凍結乾燥生成物の外観、並びにこの凍結乾燥生成物を溶かして元に戻したものについて分析した。結果を表１３に示す。
【００９９】
【表１３】
2009513682.tif 000014
＊充填された体積は、０．５ｍＬ／バイアル；ＳＴＩ：凍結乾燥すると均一な白色；溶かして元に戻した後は、透明無色溶液、本質的に粒子を含まない。
【０１００】
（実施例１０）
シスプラチンと組み合わせた、０．５ＭＩＵのＩＦＮγ及び１０．０ＭＩＵのＩＦＮα２ｂ／バイアルによって構成された、安定な凍結乾燥製剤の使用。症例の報告。
患者３
患者ＪＧＡ：ＨＣ：年齢：３３才、性別：男性、ＡＰＰ：患者ｎ／ｒ、ＩＮＯＲに記録、左眼の内角に侵入した基底細胞癌を有し、数回の外科的介入及び放射線治療を受けた。ここで、この患者は、頭蓋骨の基部の骨に達した潰瘍化腫瘍を有する（図９ａ）。軸方向コンピュータ断層撮影（ＴＡＣ）による検証では、鼻及び眼窩内壁の骨に空洞が観察され、耐えられない悪臭が左鼻孔に放たれ、化膿した黄色分泌物が同じ場所に存在していた。
【０１０１】
創傷の拡大により、２１日間隔で６サイクルの用量を投じるシスプラチンを用いた全身化学療法と同時に、製剤（０．５ＭＩＵのＩＦＮγ及び１０．０ＭＩＵのＩＦＮα２ｂ／バイアル）を、３週間にわたって週３回、局所的に浸潤させる併用療法を行うことを決定した。
【０１０２】
３回目の施用の終わりに、既に重要な一部の臨床応答が観察され、眼瞼を開かせ、悪臭を低下させた。これと同時に、結膜浮腫の強度が中程度であることが示された。完全臨床寛解は１カ月後に認められる。この応答は、化学療法の終わりまで維持される。熱及び悪寒などと、創傷の瘢痕の場所に現れる痛みなど、有害事象はごくわずかであった。１年後、患者は完全臨床寛解を維持している（図９ｂ）。
【０１０３】
（実施例１１）
液状安定医薬製剤（バイアル当たり１．４×１０６ＩＵのＩＦＮγ及び１．７×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）
組成：ＩＦＮγ２．８×１０８ＩＵ、ＩＦＮα２ｂ３．４×１０８ＩＵ、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、１００ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水。
【０１０４】
インターフェロンを除く全ての成分を計量し、注射用蒸留水に懸濁した。溶液のｐＨをチェックし、必要に応じて、希酢酸（１：２）又は１Ｍ  ＮａＯＨで５．５±０．２の値に調節した。組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの活性医薬成分を添加し、適切な濃度に希釈した。
【０１０５】
溶液を、滅菌状態で濾過した。バイアルに製剤を充填し、カバーし、クラス１００領域で密封した。最後に、生成物を２から８℃の間で保存する。いくつかのサンプルを、製造された製剤から採取し、８℃及び２℃で６カ月間保存した。
【０１０６】
確定された時間間隔で、サンプルを採取し、生成物の残留湿分の含量、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの含量（ＥＬＩＳＡによる）、生物活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、及び凍結乾燥生成物の外観、並びにこの凍結乾燥生成物を溶かして元に戻したものについて分析した。結果を表１４に示す。
【０１０７】
【表１４】
2009513682.tif 000015
＊充填された体積は、０．５ｍＬ／バイアル；ＳＴＩ：凍結乾燥すると均一な白色；溶かして元に戻した後は、透明無色溶液、本質的に粒子を含まない。
【０１０８】
（実施例１２）
液体安定医薬製剤（バイアル当たり０．５×１０６ＩＵのＩＦＮγ及び３．０×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）
組成：ＩＦＮγ２．０×１０８ＩＵ、ＩＦＮα２ｂ１２．０×１０８ＩＵ、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、１００ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水。
【０１０９】
調製方法は、実施例１１の凍結乾燥製剤で述べたものと同じであった。
【０１１０】
確定された時間間隔で、サンプルを採取し、生成物の残留湿分の含量、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの含量（ＥＬＩＳＡによる）、生物活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、及び凍結乾燥生成物の外観、並びにこの凍結乾燥生成物を溶かして元に戻したものについて分析した。結果を表１５に示す。
【０１１１】
【表１５】
2009513682.tif 000016
＊充填された体積は、０．５ｍＬ／バイアル；ＳＴＩ：凍結乾燥すると均一な白色；溶かして元に戻した後は、透明無色溶液、本質的に粒子を含まない。
【０１１２】
（実施例１３）
液体安定医薬製剤（バイアル当たり０．５×１０６ＩＵのＩＦＮγ及び１０×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）
組成：ＩＦＮγ２．０×１０８ＩＵ、ＩＦＮα２ｂ４０×１０８ＩＵ、酢酸ナトリウム０．７０８ｇ、酢酸０．０７９ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１ｇ、マンニトール５ｇ、１００ｍＬにするのに十分な量の注射用蒸留水。
【０１１３】
調製方法は、実施例１１の凍結乾燥製剤で述べたものと同じであった。
【０１１４】
確定された時間間隔で、サンプルを採取し、生成物の残留湿分の含量、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの含量（ＥＬＩＳＡによる）、生物活性、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、及び凍結乾燥生成物の外観、並びにこの凍結乾燥生成物を溶かして元に戻したものについて分析した。結果を表１６に示す。
【０１１５】
【表１６】
2009513682.tif 000017
＊充填された体積は、０．５ｍＬ／バイアル；ＳＴＩ：凍結乾燥すると均一な白色；溶かして元に戻した後は、透明無色溶液、本質的に粒子を含まない。
【０１１６】
（実施例１４）
半固体医薬製剤（半固体１ｇ当たり０．１６×１０６ＩＵのＩＦＮγ及び１．０×１０６ＩＵのＩＦＮα２ｂ）
好ましくはクリーム、軟膏、又はゲルとしての、局所施用のための医薬製剤。医薬品調製物は、組換えインターフェロンγ及びαインターフェロン２ｂを、活性成分として含有する。その組成は、ＩＦＮγが１．６×１０７ＩＵ、及びＩＦＮα２ｂが１×１０８ＩＵであり、半固体１００ｇにするのに十分な量である。
【０１１７】
クリームの調製：クリームを調製するために、固体ワセリン及びセチルアルコールを７５℃で融解し、絶え間なく撹拌しながら混合し、このプロセスの終わりまで維持する。均質化したら、Ｔｗｅｅｎ  ６０を混合物に組み込む。その一方で、メチル−及びプロピル−パラベンを９０℃の水に溶解し、この温度が７５℃まで下がったら、先の混合物に組み込む。引き続き、エマルジョンを３７℃までゆっくりと冷却し、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂを含有する水溶液に組み込む。得られたクリームを、１５ｇのチューブに４℃で保存する（表１７参照）。
【０１１８】
【表１７】
2009513682.tif 000018
【０１１９】
軟膏の調製：容器内で、パラベンを９０℃の水に溶解し、次いで放置して３７℃に冷却する。別の容器内で、液体ワセリン及びＳｐａｎ  ２０を、絶え間なく撹拌しながら混合する。引き続き、両方の容器の内容物を混合し、温度が３７℃よりも下がったら、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂを組み入れ、絶え間ない撹拌を維持する。次いで、均質化が実現するまで白色ワセリンを組み入れる。得られた軟膏を、１５ｇのチューブ内で４℃で保存する（表１８参照）。
【０１２０】
【表１８】
2009513682.tif 000019
【０１２１】
ゲルの調製：ＥＤＴＡ、パラベン、及びアルコールを別々の容器で溶解し、次いでプロピレングリコールを添加する。次いでこれらの溶液を、絶え間なく撹拌しながら混合し、塊が存在しない濁った分散液が得られるまで、激しく撹拌しながらカルボポル９４０をゆっくりと組み入れる。これとは別に、適切な容器内で１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を調製し、製剤の残りの成分を含有する分散液に、撹拌しながらゆっくりと添加する。引き続き、ＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂを、穏やかに撹拌しながら組み入れる。ゲルが形成されたら、４℃で１５ｇのチューブに詰める（表１９参照）。
【０１２２】
【表１９】
2009513682.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】１０００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＦＮγ又はＩＦＮα２による、ケロイドを持つ成人患者の生検由来の線維芽細胞初代細胞培養物の、成長阻害を示す図である。
【図２】ケロイド（Ｋｅｌ５ａ）からの線維芽細胞初代細胞培養物での、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せによる細胞成長阻害のアイソボログラムである。
【図３】ケロイド（Ｋｅｌ１７ａ）からの線維芽細胞初代細胞培養物での、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せによる細胞成長阻害のアイソボログラムである。
【図４】基底細胞腫（ＣＢＣ  ＩＩＩ）からの線維芽細胞初代細胞培養物での、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せによる細胞成長阻害のアイソボログラムである。
【図５】グリア芽細胞腫ＧＬ−５の細胞系での、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せによる細胞成長阻害のアイソボログラムである。
【図６】喉頭ＨＥｐ−２からの細胞系での、組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せによる細胞成長阻害のアイソボログラムである。
【図７】組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せで治療した、類表皮癌の患者である。
【図８】組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せで治療した、再発性基底細胞腫の患者である。
【図９】組換えＩＦＮγ及びＩＦＮα２ｂの組合せ及びシスプラチンで治療した、再発性基底細胞腫の患者である。Ａ：治療前、Ｂ：治療から１年後。
【図１】
2009513682.tif 000021
【図２】
2009513682.tif 000022
【図３】
2009513682.tif 000023
【図４】
2009513682.tif 000024
【図５】
2009513682.tif 000025
【図６】
2009513682.tif 000026
【図７】
2009513682.tif 000027
【図８】
2009513682.tif 000028
【図９】
2009513682.tif 000029
【国際調査報告】
2009513682.tif 000030
2009513682.tif 000031
2009513682.tif 000032
2009513682.tif 000033
2009513682.tif 000034
2009513682.tif 000035
2009513682.tif 000036
2009513682.tif 000037
2009513682.tif 000038