(57)【要約】本発明は、一部は、少なくとも２つのタンパク質の間の相互作用を検出、モニター、測定または評価するための方法に関する。本発明は、一部は、試験化合物または化合物の混合物が少なくとも２つのタンパク質の間の相互作用を調節するかどうかを決定するための方法にも関する。いくつかの実施形態では、決定は２つの組換え分子の使用を介して可能となり、例えばそのうちの一方はタンパク質分解分子に対する第１タンパク質切断部位、および遺伝子のアクチベーターを含む。第２組換え分子は、第２タンパク質およびタンパク質分解分子を含んでいてもよい。種々の他のフォーマットが本発明により提供される。いくつかの実施形態では、試験化合物が第１タンパク質に結合する場合に、反応が開始され、それによりアクチベーターが切断され、レポーター遺伝子が活性化される。2009529893.tif 000067
2009529893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物が、関心対象の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を調節するかどうかを測定するための方法であって、
前記化合物を
（ａ）（ｉ）第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）（Ｙ）細胞内で第２の不活性なタンパク質部分を完成させて、直接もしくは間接的なシグナルを生成する完全な機能的タンパク質を生成する、第１の不活性なタンパク質部分、または（Ｚ）細胞内における移動が決定できるタンパク質もしくはタンパク質の一部分、のいずれかをコードするヌクレオチド配列、
を含む、融合タンパク質をコードする第１核酸分子、および
（ｂ）（ｉｖ）前記試験タンパク質の存在下で前記第１タンパク質との相互作用を測定しようとしている第２試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｖ）前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列
を含む、融合タンパク質をコードする第２核酸分子
で形質転換またはトランスフェクトされた細胞に接触させる工程、ならびに
前記化合物による前記タンパク質／タンパク質相互作用の調節の決定として、（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）からの（ａ）（ｉｉｉ）の放出より生じるシグナルを測定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質またはタンパク質の一部分が、細胞小器官に局在化していることを測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ａ）（ｉｉｉ）のタンパク質またはタンパク質の一部分が、蛍光タンパク質または蛍光タンパク質の一部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質または蛍光タンパク質の一部分が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、またはそれらの一部分である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質の、第１非機能性部分および第２非機能性部分が、酵素の一部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、検出可能なシグナルをもたらす反応を触媒する酵素である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、ニトロ還元酵素、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、エクオリン、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、またはアルカリホスファターゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（Ｚ）が、抗体もしくは前記細胞内に位置した結合抗体フラグメントに特異的に結合するタンパク質もしくはタンパク質の一部分、または前記タンパク質のエピトープ部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（Ｚ）が、前記細胞内に位置したエピトープタンパク質に特異的に結合する抗体または結合抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）関連する第１試験タンパク質をプロテアーゼ相補対の第１部分と接触させる工程と、
（ｂ）関連する第２試験タンパク質をプロテアーゼ相補対の第２部分と接触させる工程と、
（ｃ）前記プロテアーゼ相補対のプロテアーゼ活性を検出する工程と
を含む、タンパク質相互作用に関して、タンパク質を評価する方法であって、
前記第１試験タンパク質と前記第２試験タンパク質との相互作用によって前記プロテアーゼの活性の増加がもたらされる、方法。
【請求項１１】
（ａ）プロテアーゼ切断部位、（ｂ）ユビキチン由来のアミノ酸配列、および（ｃ）β−ラクタマーゼについてのアミノ酸配列を含む融合タンパク質をさらに含む方法であって、
前記プロテアーゼ切断部位が（ｂ）および（ｃ）に隣接し、かつ
前記融合タンパク質が前記プロテアーゼ相補対によって切断される場合に前記β−ラクタマーゼ活性が増加する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年３月１６日出願の米国特許仮出願番号第６０／７８２，９８０号の恩典を主張する。この米国特許仮出願の開示は、全体として、参照によって本明細書中に引用したものとする。
【０００２】
本願は、２００４年４月２７日出願の米国特許仮出願番号第６０／５６６，１１３号の恩典を主張する２００４年７月９日出願の米国特許出願番号第１０／８８８，３１３号の一部継続出願であり、これは、２００３年１０月１５日出願の米国特許仮出願番号第６０／５１１，９１８号および２００３年７月９日出願の仮出願番号第６０／４８５，９６８号の優先権を主張する。これらは、全体として、参照によって本明細書中に引用したものとする。
【０００３】
発明の分野
本発明は、１つ以上の試験化合物が、特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を調節するかどうかを測定する方法に関する。具体的な実施形態では、この相互作用は、タンパク質またはタンパク質の一部分などの、分子の細胞内活性または細胞外活性の結果として測定される。これらの細胞内活性は、例えば関心対象の分子間の上述の相互作用によって始まる。本発明はまた、一部には、活性化の有無が調節の有無から生じる場合に細胞中のレポーター遺伝子の活性化を測定することによって、試験化合物と呼ぶ特定の物質が関心対象の２つ以上の特異的なタンパク質の相互作用を調節するかどうかを決定することにも関連する。具体的な実施形態では、測定は形質転換細胞またはトランスフェクト細胞を使用して行われる。この点もまた、細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用する薬剤と共に、本発明の特徴である。
【背景技術】
【０００４】
背景および関連技術
受容体に対するリガンドの同定が例に挙げられる、タンパク質／タンパク質相互作用の研究は、非常に興味深い領域である。所定の受容体に対する１つまたは複数のリガンドが公知である場合でさえも、より効果的またはより選択的なリガンドを同定することには興味が持たれている。本明細書中では、ＧＰＣＲがこの方法で研究することができるクラスのタンパク質の非排他的な例として考察される。これらの方法で研究することができる他のクラスのタンパク質としては、細胞受容体、イオンチャネル、増殖因子受容体、およびサイトカイン受容体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００５】
Ｇタンパク質共役受容体、または以下「ＧＰＣＲ」は、ヒトについて公知の最も大きいクラスの細胞表面受容体である。ホルモン、神経伝達物質、ペプチド、糖タンパク質、脂質、ヌクレオチド、およびイオンは、ＧＰＣＲによって認識されるリガンドの仲間である。これらは、光、臭い、フェロモン、および味覚に対する受容体としても作用する。これらは様々な役割を果たすので、それらが種々の病気に有用な薬物を探索する集中的な研究の対象であることは驚くことではない。その成功にはすでに目を見張るものがある。実際、Ｈｏｗａｒｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：１３２−１４０（２００１）では、市販されている薬物の５０％超が係る受容体に作用すると見積もっている。本明細書中で使用する「ＧＰＣＲ」は、７つの膜貫通領域（７ＴＭ）構造を特徴とする受容体のＧＰＣＲスーパーファミリーの任意のメンバーを指す。これらの受容体の例としては、クラスＡ受容体、すなわち「ロドプシン様受容体」、クラスＢ受容体、すなわち「セクレチン様受容体」、クラスＣ受容体、すなわち「代謝型グルタミン酸様受容体」、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連受容体およびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ関連受容体、接着受容体ファミリーまたはＥＧＦ−７ＴＭ／ＬＮＢ−７ＴＭ受容体、アディポネクチン受容体および関連する受容体、ならびに嗅覚受容体、味覚受容体、鋤鼻受容体、フェロモン受容体を含む化学感覚受容体が挙げられるがこれらに限定されない。例として、ヒトにおけるＧＰＣＲスーパーファミリーとしては、Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：４９０３−４９０８（２００３）；Ｔａｋｅｄａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５２０：９７−１０１（２００２）；Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６３：１２５６−１２７２（２００３）；Ｇｌｕｓｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１１：６８５−７０２（２００１）；およびＺｏｚｕｌｙａら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，２：００１８．１−００１８．１２（２００１）に記載される受容体分子が挙げられるがこれらに限定されない。これらの文献の全ては、参照によって本明細書中に引用したものとする。
【０００６】
ＧＰＣＲが機能する作用機構は、ある程度は解説されている。手短に言えば、ＧＰＣＲがリガンドに結合すると構造変化が起こり、細胞生理の変化を導く反応のカスケードを刺激する。ＧＰＣＲは、細胞内のヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質、すなわち「Ｇタンパク質」の活性を調節することによりシグナルを伝達すると考えられている。リガンドおよび受容体の複合体は、Ｇタンパク質へテロ三量体のグアニンヌクレオチド交換、ならびにαサブユニットおよびβγサブユニットへの解離を刺激する。
【０００７】
ＧＴＰ結合αサブユニットおよびβγ二量体は共に、アデニリルシクラーゼおよびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）などの種々の細胞エフェクタータンパク質を調節するように作用することができる。ＧＰＣＲについての従来の細胞ベースのアッセイでは、受容体活性は、Ｇタンパク質調節エフェクター経路の産生物（例えば、アデニリルシクラーゼによって生産されるｃＡＭＰの蓄積、またはＰＬＣ活性により刺激される細胞内カルシウムの放出）を測定することによりモニターされる。
【０００８】
ある場合には、従来のＧタンパク質ベースのシグナル伝達アッセイは、２つの主要な問題点の結果、ある標的に対しては開発することが困難であった。
【０００９】
第１に、異なるＧＰＣＲは異なるＧタンパク質調節シグナル伝達経路に共役し、かつＧタンパク質ベースのアッセイは、標的受容体のＧタンパク質特異性を知ることに依存するか、または細胞系を改変してその標的受容体を特定のエフェクター経路に強制的に共役させることを必要とする。第２に、全ての細胞は、多数の内因性ＧＰＣＲおよび他のシグナル伝達因子を発現する。結果として、測定されるエフェクター経路は、標的のＧＰＣＲに加えて他の内因性分子によっても調節される可能性があり、偽の結果が導かれることになりかねない。
【００１０】
Ｇタンパク質活性の制御は、リガンド／ＧＰＣＲ結合の唯一の結果ではない。Ｌｕｔｔｒｅｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１５：４５５−４６５（２００２）およびＦｅｒｇｕｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５３：１−２４（２００１）（これら両方の文献は、参照によって本明細書中に引用したものとする）では、ＧＰＣＲシグナルの終結に繋がる他の活性を概説している。これらの終結プロセスにより、過剰な細胞刺激が妨げられ、細胞外シグナルと対応する細胞内経路との間の一時的な連結が強化される。
【００１１】
アゴニストがＧＰＣＲに結合する場合には、ＧＰＣＲ分子のＣ末端のセリンおよびトレオニン残基がリン酸化される。このリン酸化はＧＰＣＲキナーゼすなわち「ＧＲＫ」ファミリーによってもたらされる。アゴニストが複合体を形成すると、Ｃ末端でリン酸化されたＧＰＣＲは、受容体シグナル伝達を「捕捉する」アレスチンファミリーのメンバーと相互作用する。この結合は受容体がＧタンパク質に共役することを阻害し、これにより内在化、さらには分解および／またはリサイクリングのために受容体を標的化する。従って、リガンドがＧＰＣＲに結合することは、ＧＰＣＲとアレスチンタンパク質との間の相互作用を「調節する」ことと言うことができる。なぜなら、リガンドがＧＰＣＲに結合すると、アレスチンがＧＰＣＲに結合することになり、これによりその活性が調節されるからである。以降、「調節する」またはそのあらゆる変化形を使用する時は、その語は、試験化合物が存在しない場合に本発明の２つのタンパク質が相互作用する程度と比較した、試験化合物が存在する場合にそれらの２つのタンパク質が相互作用する仕方の何らかの変化を単に指す。例えば、試験化合物が存在すると、それら２つのタンパク質の相互作用は、後に検出できる何らかの方法、様式または形式で強まるかまたは増強されるか、弱まるか、阻害されるか、または低下する場合がある。
【００１２】
この背景情報に基づき、ＧＰＣＲの活性化および阻害をアッセイする別の方法が導かれた。これらの方法は、アレスチンとの相互作用をモニターすることを含む。このアプローチの主な利点は、Ｇタンパク質経路を知る必要はないことである。
【００１３】
Ｏａｋｌｅｙら、Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２１−３０（２００２）および米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号（参照によってこれらを援用したものとする）は、細胞質中の、蛍光標識したアレスチン分子の、細胞表面上の活性化受容体への再分布を測定するアッセイを記載している。これらの方法は、アレスチン再局在化および受容体活性化を測定するため、細胞の高分解画像化に依存する。これが複雑で入り組んだ手順であることを当業者は理解すると考えられる。
【００１４】
これらの点を扱った種々の他の米国特許が発行され、そして特許出願が出願されている。例えば、Ｂｏｈｎらに対する米国特許第６，５２８，２７１号は、β−アレスチン結合の阻害剤を測定する、疼痛を制御する医薬をスクリーニングするためのアッセイを扱っている。例えば米国特許出願公開第２００４／０００２１１９号、同第２００３／０１５７５５３号、同第２００３／０１４３６２６号および同第２００２／０１３２３２７号、ならびに米国特許第７，０４９，０７６号は、ＧＰＣＲが関与する異なる形態のアッセイを記載している。米国特許出願公開第２００２／０１０６３７９号は以下の実施例で使用する構築物を記載しているが、本明細書中に記載する本発明を教示もしていなければ示唆もしていない。
【００１５】
タンパク質相補性に基づく方法は、細胞内のタンパク質−タンパク質相互作用の動力学を研究するための一般的な方法になりつつある（ＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３（１２）：９７７−９７９（２００６））。この戦略では、関心対象の２つのタンパク質をレポータータンパク質の相補性フラグメントへと融合させる。タンパク質が相互作用すると、レポーターフラグメントは一緒になり、天然の構造へと折り畳まれ、ＰＣＡレポーター活性が再構成される（例えば、Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：４７２−４７７（２００１）を参照）。シグナルは固有のフルオロフォアによってもたらされるので、蛍光タンパク質に基づくいくつかの関連する方法が存在する（例えば、Ｇｈｏｓｈら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５６５８−５６５９（２０００）；Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：７８９−７９８（２００２）；ＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２：３８１−３８８（２００４）；Ｒｅｍｙら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：３５８−３６５（２００４）；Ｍａｇｌｉｅｒｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１４６−１５７（２００５）；ならびにＭａｃｄｏｎａｌｄら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：３２９−３３７（２００６）を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
特異的なタンパク質／タンパク質相互作用の調節をモニターし、かつ／または決定するためのアッセイ（例えば、より簡単なアッセイ）を開発することが本発明の目的である。本発明におけるタンパク質としては、受容体、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、増殖因子受容体およびサイトカイン受容体のような膜結合性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。どのようにしてこれを実現するかを、以下の説明および実施例において明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
本発明は、一部は、少なくとも２つのタンパク質の、タンパク質−タンパク質相互作用に関する。本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも２つのタンパク質の相互作用が、検出可能なシグナル（例えば、蛍光、発色）をもたらす。本発明のいくつかの実施形態では、この少なくとも２つのタンパク質の相互作用が、２つの他のタンパク質（例えば、プロテアーゼおよびその認識部位）を分子の近接領域内に近づける。この２つの他のタンパク質の相互作用を検出してもよい。例えば、この特徴を利用して、１つ以上の試験タンパク質に関連する検出可能なタンパク質またはタンパク質フラグメントを、切断し放出することができる。
【００１８】
本発明は、一部は、少なくとも２つのタンパク質の間の相互作用を検出、モニター、測定または評価するための方法に関する。本発明はまた、一部は、試験化合物または化合物の混合物が、少なくとも２つのタンパク質の間の相互作用を調節するかどうかを決定する方法に関する。いくつかの実施形態では、この決定は、２つの組換え分子の使用によって可能になる。例えば、この組換え分子の一方は、タンパク質分解分子に対する第１タンパク質切断部位および遺伝子のアクチベーターを含む。もう一方の組換え分子は、第２タンパク質およびタンパク質分解分子を含んでいてよい。種々の他のフォーマットが本発明により提供される。いくつかの実施形態では、試験化合物が第１タンパク質に結合すると、反応が開始され、それによりアクチベーターが切断され、レポーター遺伝子を活性化する。
【００１９】
このようにして、本発明により、試験化合物が、関心対象の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を調節するかどうかを決定するための方法が一部提供される。本発明のいくつかの方法は、化合物を、
（ａ）（ｉ）第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）（ｘ）細胞内で刺激、活性化、もしくは抑制することによりレポーター遺伝子を調節するタンパク質、（ｙ）放出後、タンパク質の第２の不活性部分を完成させて、直接または間接的なシグナルを生成する完全なタンパク質を生成する、タンパク質の第１の不活性部分、または（ｚ）放出後、細胞内で移動、再分配、転座、もしくは別様に位置変更（例えば特異的細胞小器官への標的化された移動）する際に追跡することができるタンパク質またはタンパク質の一部分、のうちの１つをコードするヌクレオチド配列
を含む核酸分子、および
（ｂ）（ｉ）試験化合物の存在下での第１タンパク質との相互作用を測定しようとしている第２試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列と
を含む核酸分子
で形質転換またはトランスフェクトされた細胞に接触させる工程、ならびに
化合物がタンパク質／タンパク質相互作用を調節するかどうかの決定として、レポーター遺伝子の遺伝子産物の活性、完全タンパク質が直接もしくは間接的に生成する任意のシグナル、または細胞内で検出可能なシグナルを生成するタンパク質の移動のうちの１つを測定する工程、を含む。蛍光タンパク質（例えば、明確な色を生成する）は、追跡できるタンパク質の例である。
【００２０】
第１試験タンパク質は、膜貫通受容体（例えばＧＰＣＲ）のような膜結合性タンパク質であってもよい。具体的な膜貫通受容体としては、β２−アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２）、セロトニン受容体１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２受容体（ＤＲＤ２）、κオピオイド受容体（ＯＰＲＫ）、またはα１ａ−アドレナリン受容体  （ＡＤＲＡ１Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、全ての場合において、本発明はこれらの具体的な実施形態に限定されないことは理解すべきである。例えば、チロシンキナーゼであるインスリン増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のような分子、ならびに通常は膜結合性でないタンパク質（例えば、エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）およびエストロゲン受容体２（ＥＳＲ２））は、本発明において利用することができる。プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分は、タバコエッチウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）核内封入体Ａプロテアーゼであってもよい。この実施形態を使用する場合、レポーター遺伝子を調節、阻害または活性化するタンパク質は、転写因子（例えば、ｔＴＡまたはＧＡＬ４）であってもよい。レポーター遺伝子の調節は、例えば核酸レベル（例えばＲＮＡ）、タンパク質発現、光学的シグナル（例えば、蛍光または発色）および酵素反応を測定または検出することにより、決定することができる。この実施形態を使用する場合、タンパク質の第１の不活性な部分は、酵素の不活性な部分または直接に決定できるタンパク質（例えば、本明細書中で考察するものを含む蛍光タンパク質）の不活性な部分であってもよい。例えば、Ｃａｂａｎｔｏｕｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１０２−１０７（２００５）、Ｈｕら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９：７８９−９８（２００２）およびＧｈｏｓｈら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２２：５６５８−５６５９（２０００）を参照のこと。これらの文献は、参照によってその全体を本明細書に引用したものとする。この実施形態を使用する場合、検出可能なシグナルを生成するタンパク質またはタンパク質の一部分は、蛍光タンパク質、または細胞内での移動の際に直接または間接的に測定することができる任意のタンパク質であってよい。第２タンパク質はアレスチンのような阻害タンパク質であってもよい。細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ（Ｂｌａ）、またはルシフェラーゼのような外来遺伝子であってよい。
【００２１】
第２試験タンパク質との相互作用を高めるために、第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列を修飾してもよい。このような修飾としては、第１試験タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全てまたは一部を、元の配列よりも第２試験タンパク質に対して高い親和性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で置き換えることが挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｃ末端領域を、ＡＶＰＲ２、ＡＧＴＲＬＩ、ＧＲＰＲ、Ｆ２ＲＬ１、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ｂ、ＣＣＲ４、またはＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列で置き換えてもよい。
【００２２】
本発明のいくつかの方法は、複数の試験化合物を複数の細胞試料に接触させる工程であって、試料の各々が１つ以上の試験化合物によって接触され、細胞試料の各々が上述の核酸分子のいずれかで形質転換またはトランスフェクトされている工程と、前記複数の試料におけるレポーター遺伝子の活性を測定して、試験化合物のいずれかが特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を調節するかどうかを決定する工程とを含む。いくつかの方法は、全て互いに異なる前記試料の各々を１つの試験化合物と接触させる工程を含むか、または前記試料の各々を前記試験化合物の混合物と接触させる工程を含む。
【００２３】
別の実施形態では、試験化合物が関心対象の複数のタンパク質相互作用のうちの１つ以上を調節するかどうかを決定するための方法が提供される。これらの方法のいくつかは、試験化合物を複数の細胞試料に接触させる工程であって、その細胞試料の各々は（ａ）（ｉ）第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列はプロテアーゼに対する切断部位をコードする）と、（ｉｉ）その細胞中でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む第１核酸分子、（ｂ）（ｉ）関心対象の前記試験化合物の存在下での前記第１試験タンパク質との相互作用を測定しようとしている第２試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列とを含む第２核酸分子、で形質転換またはトランスフェクトされており、前記第１試験タンパク質は複数の試料の各々における他の第１試験タンパク質とは異なる工程、および前記複数の試料の少なくとも１つ以上における前記レポーター遺伝子の活性を、関心対象の１つ以上のタンパク質相互作用を調節するかどうかの決定として測定する工程とを含む。
【００２４】
第２試験タンパク質は各試料において異なっていてもよく、各試料において同一であってもよい。試料の全てを共通の容器中で混合してもよく、各試料は異なる対の第１試験タンパク質および第２試験タンパク質を含んでいてもよい。あるいは、各試料を異なる容器中で試験してもよい。所定の試料中のレポーター遺伝子は、他の試料中のレポーター遺伝子と異なっていてもよい。試験化合物の混合物は、脳脊髄液、尿、血液、血清、膿汁、腹水、滑液、組織抽出液、細胞溶解液または浸出液のような生物試料を含んでいてもよく、それら生物試料中に存在してもよい。
【００２５】
さらに別の実施形態では、（ａ）（ｉ）第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子、および（ｂ）（ｉ）試験化合物の存在下での第１タンパク質との相互作用を測定しようとしている第２試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子で、形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞が提供される。
【００２６】
上記核酸分子の一方または両方は、上記細胞のゲノム中に安定的に組込まれてもよい。この細胞は、レポーター遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされていてもよい。第１試験タンパク質は、膜貫通受容体のような膜結合性タンパク質、特にＧＰＣＲであってもよい。具体的な膜貫通受容体としては、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、またはＡＤＲＡ１Ａが挙げられる。
【００２７】
プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分は、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼであってもよい。レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は転写因子（例えば、ｔＴＡまたはＧＡＬ４）であってもよい。第２タンパク質は阻害タンパク質であってもよい。細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼのような外来遺伝子であってよい。第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、例えば第１試験タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全てまたは一部を元の配列よりも第２試験タンパク質に対して高い親和性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で置き換えることにより修飾して、第２試験タンパク質との相互作用を高めてもよい。Ｃ末端領域は、ＡＶＰＲ２、ＡＧＴＲＬＩ、ＧＲＰＲ、Ｆ２ＲＬ１、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ、ＣＣＲ４、またはＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列で置き換えてもよい。
【００２８】
なおさらに別の実施形態では、（ｉ）試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）細胞中のレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子が提供される。試験タンパク質は、膜貫通受容体のような膜結合性タンパク質であってもよい。特定のタイプの膜貫通タンパク質はＧＰＣＲである。特定の膜貫通受容体としては、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、またはＡＤＲＡ１Ａが挙げられる。プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分は、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼであってもよい。レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は転写因子（例えば、ｔＴＡまたはＧＡＬ４）であってもよい。上記のように、本発明はこれらの具体的な実施形態に限定されるものと見なされるべきではない。
【００２９】
さらに別の実施形態では、上述の（ａ）および（ｂ）で形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞が提供される。上記核酸分子の一方または両方は、上記細胞のゲノム中に安定的に組込まれてもよい。この実施形態を使用する場合、この細胞は、レポーター遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされていてもよく、すでに形質転換またはトランスフェクトされたものであってもよい。第１試験タンパク質は、膜貫通受容体、ＧＰＣＲ、細胞受容体、イオンチャネル、増殖因子受容体またはサイトカイン受容体のような膜結合性タンパク質であってもよい。具体的な膜貫通受容体としては、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、またはＡＤＲＡ１Ａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分は、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼであってもよい。この実施形態を使用する場合、レポーター遺伝子を調節するタンパク質は転写因子（例えば、ｔＴＡまたはＧＡＬ４）であってもよい。調節因子に由来する任意の遺伝子産物、例えば、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）またはタンパク質を測定することができる。第１構築物が（ｙ）、すなわちタンパク質の第２の不活性部分と組み合わさり機能性タンパク質を生成する第１の不活性部分を含有する場合、それは酵素の一部分、または蛍光タンパク質のような直接測定可能なタンパク質の一部分であってもよい。このタンパク質またはタンパク質の一部分が、以下で詳細に説明するように細胞内での移動によって検出可能なシグナルを与える時、すなわち構築物が（ｚ）を含む時、構築物は蛍光タンパク質もしくは蛍光タンパク質の一部分、または動きがモニターされ得る任意の他のタンパク質もしくはタンパク質の一部分をコードしてもよい。第２タンパク質は阻害タンパク質であってもよい。細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ニトロ還元酵素、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼまたはアルカリホスファターゼのような外来遺伝子であってよい。同様に、実施形態（ｙ）を使用する場合、これはエクオリン、ニトロ還元酵素、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼまたは当該分野で公知の任意の他の酵素の不活性部分であってもよい。（ｚ）、例えば検出可能なシグナルを生成するタンパク質をコードする核酸分子を使用する実施形態では、タンパク質は直接測定可能なタンパク質、例えば蛍光タンパク質（例としては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または測定することができる任意のタンパク質もしくはタンパク質の一部分が挙げられる）であってもよい。
【００３１】
係るタンパク質の例は、細胞を通る移動の際に標識した結合パートナー（例えば、蛍光標識した結合パートナーまたはハロゲン標識した結合パートナー）と相互作用して検出可能なシグナルを生成する、全タンパク質またはタンパク質のエピトープ部分のいずれかである。本明細書においては抗原−抗体相互作用を考察し、本発明の特徴である構築物は、抗体またはエピトープまたは全抗原タンパク質をコードしてもよい。第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば第１試験タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全てまたは一部を元の配列よりも第２試験タンパク質に対して高い親和性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で置き換えることにより修飾して、第２試験タンパク質との相互作用を高めてもよい。Ｃ末端領域は、ＡＶＰＲ２、ＡＧＴＲＬＩ、ＧＲＰＲ、Ｆ２ＲＬ１、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ、ＣＣＲ４、またはＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列で置き換えてもよい。
【００３２】
本発明の実施形態は、単離された核酸分子の提供に関する。これらの実施形態のいくつかは、（ｉ）試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）細胞中のレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。試験タンパク質は、膜貫通受容体のような膜結合性タンパク質であってもよい。特定のタイプの膜貫通タンパク質はＧＰＣＲである。特定の膜貫通受容体としては、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、またはＡＤＲＡ１Ａが挙げられる。プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分は、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼであってもよい。レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は転写因子（例えば、ｔＴＡまたはＧＡＬ４）であってもよい。上記のように、本発明はこれらの具体的な実施形態に限定されるものと見なされるべきではない。
【００３３】
なお別の実施形態では、単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。これらの実施形態のいくつかは、（ｉ）試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）細胞中のレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードし、さらにプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
さらに別の実施形態では、単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、（ｉ）試験化合物の存在下で別の試験タンパク質との相互作用を測定しようとしている試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）切断部位に特異的であるプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列とを含む。試験タンパク質は、アレスチンのような阻害タンパク質であってよい。
【００３５】
単離された核酸分子を含む発現ベクターも提供される。いくつかの実施形態では、これらの単離された核酸分子は、（ｉ）試験化合物の存在下で別の試験タンパク質との相互作用を測定しようとしている試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）切断部位に特異的であるプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列を含み、この核酸はさらにプロモーターに作動可能に連結されている。
【００３６】
さらなる実施形態は、本明細書中に記載される核酸分子構築物の発現により生産される融合タンパク質を含む。
【００３７】
さらに別の実施形態では、試験化合物が関心対象の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を調節するかどうかを決定するのに有用な試験キットが、提供される。このキットは、本明細書においてこれまでにまたは以下で説明される核酸分子構築物（ａ）および（ｂ）の各々の別個の部分を含む。
【００３８】
第１試験タンパク質は、膜貫通受容体のような膜結合性タンパク質であってもよい。特定のタイプの膜貫通タンパク質はＧＰＣＲである。特定の膜貫通タンパク質はＧＰＣＲである。特定の膜貫通受容体としては、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、またはＡＤＲＡ１Ａが挙げられる。プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分は、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼであってもよい。レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は転写因子（例えば、ｔＴＡまたはＧＡＬ４）であってもよい。第２タンパク質は、アレスチンのような阻害タンパク質であってよい。本発明のキットはさらに、レポーター遺伝子をコードする単離した核酸分子の別個の部分を含んでいてもよい。レポーター遺伝子は、任意のレポータータンパク質（例えば、Ｂｌａ、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）をコードしてもよい。第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば第１試験タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全てまたは一部を、元の配列よりも第２試験タンパク質に対して高い親和性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で置き換えることにより修飾して、第２試験タンパク質との相互作用を高めてもよい。Ｃ末端領域のヌクレオチド配列は、ＡＶＰＲ２、ＡＧＴＲＬＩ、ＧＲＰＲ、Ｆ２ＲＬ１、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ、ＣＣＲ４、またはＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列で置き換えてもよい。
【００３９】
（ｉ）試験化合物の存在下で別の試験タンパク質との相互作用を測定しようとしている試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）上記切断部位に特異的であるプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列を含み、さらにプロモーターに作動可能に連結されている、単離された核酸分子を含む発現ベクターも提供される。
【００４０】
さらなる実施形態は、以下の単離した核酸分子の発現により生産される融合タンパク質を含む：
（ｉ）試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）上記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードし、かつさらにプロモーターに作動可能に連結されている、ヌクレオチド配列とを含む単離した核酸分子、あるいは、
（ｉ）試験化合物の存在下で別の試験タンパク質との相互作用を測定しようとしている試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）上記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列とを含む単離した核酸分子。
【００４１】
さらに別の実施形態では、関心対象の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を試験化合物が調節するかどうかを決定するための試験キットが、提供される。このキットは、（ａ）前記第１試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉ）プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分に対する切断部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）その細胞中でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子とを含む核酸分子と、（ｂ）（ｉ）試験化合物の存在下で上記第１試験タンパク質との相互作用を測定しようとしている第２試験タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）上記切断部位に特異的なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子との各々の別々の部分と、（ａ）または（ｂ）の各々を互いから別々に保持するための容器手段とを含む。
【００４２】
本明細書中に記載する任意の方法または組成物は、本明細書中に記載する任意の他の方法または組成物についても実施できるということを想定している。請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用する場合、語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は「１つ（ｏｎｅ）」を意味することもあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つかまたは１つよりも多く」の意味と同じである。
【００４３】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の説明および添付の図面と合わせて考察するとよりよく認識かつ理解されると考えられる。しかしながら、以下の説明は本発明の種々の実施形態およびその多くの具体的な詳細な内容を示してはいるが、それらは説明のために提供されているのであって、限定のためのものではないことを理解すべきである。本発明の技術思想から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの置換、修正、追加および／または再配列がなされてもよく、本発明は全ての係る置換、修正、追加および／または再配列を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、関心対象の物質が、第１試験タンパク質（例えば、受容体（例えば膜貫通受容体）のような膜結合性タンパク質）と、アレスチンファミリーのメンバーのような第２試験タンパク質との相互作用を調節するかどうかを決定するための方法に関する。この方法は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい細胞を、２つの構築物で同時形質転換またはコトランスフェクトすることを含む。別の実施形態では、第１構築物は、（ｉ）膜貫通受容体のような第１試験タンパク質と、（ｉｉ）プロテアーゼに対する切断部位と、および（ｉｉｉ）（ｘ）細胞内でレポーター遺伝子を調節するタンパク質、（ｙ）放出の際にタンパク質の第２不活性部分を完成させて直接または間接的なシグナルを生成する完全タンパク質を生産するタンパク質の第１不活性部分、および（ｚ）その細胞内での移動によって検出可能なシグナルを生成するタンパク質またはタンパク質の一部分、のうちの１つをコードする配列とを含む。いくつかの実施形態では、第２構築物は、（ｉ）第１試験タンパク質との相互作用が測定および／または決定される第２試験タンパク質をコードする配列、および（ｉｉ）第１試験構築物の一部である切断部位に作用するのに十分なプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、これらの構築物は安定的に細胞中に一体化される。
【００４５】
さらには、本発明は、プロテアーゼのための認識および切断部位、ならびに検出可能なペプチド／ポリペプチドを含む第１試験タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、検出可能なペプチド／ポリペプチドは、認識および切断部位で認識／切断するプロテアーゼによって第１試験タンパク質から切断される。いくつかの実施形態では、検出可能なペプチド／ポリペプチドは、第２試験タンパク質と会合（例えば、融合）したプロテアーゼによって第１試験タンパク質から切断され得る。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質は、細胞中、動物中、動物の外部で、インビボで、エクスビボで、および／またはインビトロで膜に結合していてもよく、膜に結合していなくてもよい。
【００４６】
検出可能なペプチド／ポリペプチド（ＤＰＰ）は、直接または間接的な方法によって検出することができる。例えば、ＤＰＰは、切断された時と比較して融合タンパク質の一部である時とは蛍光が異なる蛍光タンパク質であってよい。例えば、ポリペプチドの蛍光は、切断された時増大することもあれば減少することもある。いくつかの実施形態では、ＤＰＰは、例えば基質および／または生成物が検出可能である基質を用いて検出可能である、酵素である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰは、その活性が融合タンパク質から切断された時に変化するタンパク質（例えば、Ｂｌａのような酵素）であってもよい。例えば、活性は、その融合タンパク質からの切断の際に増加または減少してよい。いくつかの実施形態では、ＤＰＰは、タンパク質フラグメント相補対のメンバーである。この実施形態では、ＤＰＰは第１試験タンパク質から切断され、タンパク質フラグメント相補対の第２メンバーと「自由に」相互作用して、レポータータンパク質（例えば、酵素または蛍光タンパク質）を生産する。
【００４７】
本発明の実施形態のいくつかの特徴を、絵を用いて図１に示す。手短に言えば、まず標準的な技法を用いて転写因子をコードするＤＮＡを、研究する第１試験タンパク質（例えば、膜貫通受容体分子）をコードするＤＮＡに融合させる。この融合は、実験で使用される宿主細胞によって発現されていないか、または比較的低いレベルで内因性発現されたプロテアーゼのための認識および切断部位を内包することを伴う。この第１融合タンパク質をコードするＤＮＡは、第１試験タンパク質（例えば、受容体）に融合された転写因子に依存するプロモーター要素の制御の下で、レポーター遺伝子配列をも含む細胞に導入され、その細胞によって発現される。外来性のプロテアーゼが存在せず、かつ／またはそれが第１試験タンパク質に近接しない場合は、転写因子は第１試験タンパク質に繋ぎ止められたままであり、核に侵入してレポーター遺伝子の発現を刺激することはできない。
【００４８】
組換え技法も第２融合タンパク質を生産するために使用することができる。例えば、図１に示す実施形態では、アレスチンファミリーのメンバーをコードするＤＮＡは、プロテアーゼ（例えば、外来性のもの）をコードするＤＮＡ分子に融合され、第２試験タンパク質（例えば、アレスチンファミリーのメンバー）を含む第２融合タンパク質を与える。
【００４９】
第２融合タンパク質が第１融合タンパク質と共に発現され、例えば特定の長さの時間の間試験化合物が細胞と接触させられるアッセイが、次いで実施される。例えば、第１試験タンパク質および第２試験タンパク質の会合を刺激、促進、または増強することによって、その試験化合物がこの２つの試験タンパク質の相互作用を調節する場合には、これは、例えばＤＰＰ（例えば、転写因子。これは次に核に移動してレポーター遺伝子の発現を誘発する）の放出を導き得る。レポーター遺伝子の活性は、測定することができる。
【００５０】
別の系では、２つの試験タンパク質は試験化合物の不存在下で相互作用してもよく、試験化合物が２つの試験タンパク質を解離させ、相互作用を低下させるかまたは相互作用を阻害してもよい。このような場合、試験化合物の存在下では、細胞中の機能的に活性な遊離の転写因子のレベルは低下し、タンパク質分解の低下、そしてレポーター遺伝子活性の測定可能な程度の低下が引き起こされる。
【００５１】
図１に示す実施形態では、第２試験タンパク質であるアレスチンタンパク質はアゴニストの存在下で受容体に結合する。しかしながら、受容体はただ１つのタンパク質であるため、アッセイは受容体分子の使用に依存しないし、アゴニストの結合は関与することができる唯一の相互作用でもないことを理解するべきである。膜貫通タンパク質の対象は明らかであるが、任意のタンパク質で十分である。さらに、受容体へのアゴニストの結合がアッセイできる唯一のタイプの結合ではない。アンタゴニスト自体を決定することができ、また本発明に係る異なるアンタゴニストおよび／またはアゴニストの相対強度を決定することもできる。
【００５２】
第１構築物の実施形態（ｙ）を使用する場合、タンパク質の第１の不活性部分は、放出の際にタンパク質の第２の不活性部分を細胞内で完成させ、直接（例えば、蛍光によって）または間接的に（例えば、活性な酵素を形成することにより）シグナルを生成する完全な活性タンパク質をもたらし、次いでこれが基質に作用してシグナル（例えば、色もしくは蛍光、または色もしくは蛍光の変化）を生成する。
【００５３】
構築物（ａ）の実施形態（ｚ）を使用する場合、検出可能なタンパク質は細胞内での場所を変え、そしてその破壊、転座、再局在化（例えば、特異的な細胞小器官）を決定することによって、研究しているタンパク質−タンパク質相互作用を決定または検出することができる。タンパク質の一部分の転座がどのように測定され得るかという具体的な例は、Ｗｅｈｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：５２１−５２７（２００５）に見ることができる。この文献を、参照により引用したものとする。他の系は当業者に公知である。
【００５４】
Ｉ．発現構築物および形質転換
用語「ベクター」は、核酸配列が複製され得る細胞への導入のために核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すために使用する。核酸配列は「外来性」であってもよく、これはベクターが導入されている細胞に対して外来であるか、またはその配列が、宿主細胞核酸内の位置に通常見られない細胞中の配列と相同的であることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当該分野の当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築するための素養を十分に身につけている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９６）を参照）。これらの文献を参照によって本明細書に引用したものとする。
【００５５】
用語「発現ベクター」は、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。いくつかの場合では、次いでＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生産においては翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含むことができる。この「制御配列」は、特定の宿主細胞において作動可能に連結されたコード配列の、転写および恐らくは翻訳のために必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能をも果たすヌクレオチド配列を含んでいてもよく、そしてこれらについては以下に説明する。
【００５６】
特定の実施形態では、プラスミドベクターは、クローニングおよび遺伝子導入において使用することが想定されている。一般に、宿主細胞と適合性である種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と関連して使用される。通常、ベクターは、複製部位と形質転換細胞における表現型選択を提供することができるマーキング配列とを保有する。非限定的な例では、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて、大腸菌がしばしば形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、そのため形質転換細胞を容易に同定するための手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物のプラスミドもしくはファージは、例えば微生物がそれ自身のタンパク質を発現するために使用することができるプロモーターをも含んでいなければならないか、または含むように修飾されていなければならない。
【００５７】
加えて、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主と関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ラムダファージＧＥＭ（商標）−１１は、例えばＥ．ｃｏｌｉＬＥ３９２のような宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えファージベクターを作製する際に、利用してもよい。
【００５８】
発現ベクターを含む微生物宿主細胞（例えば、大腸菌）は、多くの適切な培地の（例えば、ＬＢ）いずれの中でも増殖される。特定のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当該分野の当業者なら理解できるように、例えばＩＰＴＧをその培地に加えるか、またはインキュベーションをより高温に切り替えるかによって、宿主細胞を特定のプロモーターについて特異的な試薬と接触させることにより誘導してもよい。さらなる時間（一般には２〜２４時間）その細菌を培養したのち、その細胞を遠心分離によって集め、洗浄して培地の残渣を取り除く。
【００５９】
多くの原核生物のベクターも、真核生物の宿主細胞を形質転換するために使用することができる。しかしながら、真核生物の宿主細胞内でタンパク質を発現するという特定の目的のために修飾されたベクターを選択することが望ましいであろう。発現系は、係る細胞における制御された発現および／または高レベルの発現に向けて設計されている。例えば、昆虫細胞／バキュロ・ウイルス系は、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができる。この核酸セグメントとしては、例えば米国特許第５，８７１，９８６号および同第４，８７９，２３６号（これらは参照によって本明細書に引用されたものとする）に記載されるものが挙げられ、それらは例えばＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）のＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０およびＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）のＢＡＣＰＡＣＫ（商標）ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭの商品名で購入することができる。
【００６０】
発現系の他の例としては、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（商標）Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。これは、合成のエクジソン誘導受容体またはそのｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（これは大腸菌発現系である）を含む。誘導的発現系の別の例は、Ｔ−ＲＥＸ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（テトラサイクリン制御性の発現系）を保有するＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手できる。この発現系は、全長ＣＭＶプロモーターを使用する哺乳類の誘導的発現系である。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）はまた、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍと呼ぶ酵母発現系も提供している。これは、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の高レベル生産に向けて設計されている。当業者なら、どのようにベクター（例えば、ベクター構築物）を発現させて核酸配列またはその同種のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを生成するかを理解していると考えられる。
【００６１】
制御シグナル
構築物は、付加的な５’要素および／または３’要素（例えば、プロモーター、ポリＡ配列など）を含んでいてもよい。これらの要素は、宿主細胞（すなわち、宿主と同種である）から誘導されていてもよいし、別個の供給源（すなわち、異種である）から誘導されていてもよい。
【００６２】
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、核酸配列の特異的転写を開始するために制御タンパク質および分子が結合してもよい遺伝要素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子）を含んでいてもよい。語句「作動可能に配置されている」、「作動可能に連結されている」、「制御下で」および「転写制御下で」は、その配列の転写開始および／または発現を制御するために、核酸配列に対してプロモーターが正しい機能的場所および／または配向にあることを意味する。
【００６３】
一般にプロモーターは、ＲＮＡ合成についての出発部位を配置する機能を果たす配列を含む。これの最もよく知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳類の末端デオキシヌクレオチド転移酵素遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーター）では、出発部位に重なる不連続な要素自身が開始の場所を固定するのを手助けする。付加的なプロモーター要素は転写開始の頻度を調節する。通常は、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流に位置しているが、多くのプロモーターは開始部位の下流にも同様に機能的要素を含んでいることが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下に置く」ために、転写のリーディングフレームの転写開始部位の５’末端は、選択したプロモーターの「下流」（すなわち、３’末端側）に置かれる。「上流の」プロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促す。
【００６４】
プロモーター要素間の空間は柔軟性がある場合が多く、要素が互いに対して反転または移動した場合にはプロモーターの機能は保存される。ｔｋプロモーターにおいては、プロモーター要素間の間隔は、活性が減衰し始める前に５０ｂｐ離れたところまで広げることができる。プロモーターに依存して、個々の要素はさらに、協働的にまたは独立に転写を活性化するように機能することができるようである。プロモーターは、「エンハンサー」と併用してもよいししなくてもよい。エンハンサーとは、核酸配列の転写活性に関与するシス作用性制御配列を指す。
【００６５】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られ得るように、核酸分子と天然に会合しているプロモーターであってもよい。係るプロモーターは「内因性」と呼ばれる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流に位置する核酸分子と会合したエンハンサーであってもよい。あるいは、コードする核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーター（これは、天然の環境では通常は核酸分子と会合していないプロモーターを指す）の制御下に置くことが有利な場合もある。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーも同様に、天然の環境では通常は核酸分子と会合していないエンハンサーを指す。係るプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー、ならびに任意の他のウイルス、または原核細胞および真核細胞から単離されたプロモーターもしくはエンハンサー、ならびに「天然には存在しない」（すなわち、異なる転写制御領域および／もしくは発現を変化させる突然変異を含む）プロモーターもしくはエンハンサーを含んでいてもよい。例えば、組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生成するのに加えて、本明細書中に開示する組成物（各々の米国特許は参照によって本明細書に引用されたものとする、米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号を参照）と合わせて組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（ＰＣＲ（商標）を含む）を使用して、配列を生成してもよい。さらに、非核細胞小器管（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）内での配列の転写および／または発現を指向する制御配列も、同様に用いることができるということを想定している。
【００６６】
当然のこととして、発現のために選択した細胞小器官、細胞型、組織、臓器または微生物において、ＤＮＡセグメントの発現を効果的に指向するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要である。一般に分子生物学分野の当業者は、タンパク質発現のためにプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組合せを使用することを知っているはずである（例えば、参照により本明細書中に引用されたものとする、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９を参照）。用いるプロモーターは、（組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産において有利であるように）導入したＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指向するための適切な条件下で、構成的であっても、組織特異的であっても、誘導性であっても、かつ／または有用なものであってもよい。プロモーターは、異種のものであっても内因性のものであってもよい。
【００６７】
さらには任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢ，ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のように）も発現を駆動するために使用することができる。別の実施形態では、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系を使用することができる。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝発現構築物としてのいずれかで提供されるならば、真核生物細胞は、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【００６８】
コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルも必要とされる場合がある。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列が挙げられる。外因性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供される必要がある場合がある。当業者は、容易にこれを決定し必要なシグナルを提供することができる。挿入断片全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームに対して「フレーム中」に存在しなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものであっても合成によるものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を内包することにより高めることができる。
【００６９】
本発明のある実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素を使用して、多重遺伝子、つまりポリシストロン性のメッセージが作製される。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソーム走査モデルを回避し、そして内部部位で翻訳を開始することができる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５（１９８８））。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎）に由来するＩＲＥＳ要素が記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、前出）、同様に哺乳動物メッセージに由来するＩＲＥＳも記載されている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４（１９９１））。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレームは共に転写され得、それぞれがＩＲＥＳにより分離され、ポリシストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳ要素によって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近し得る。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現され得る（各々参照により本明細書中に引用されたものとする、米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照）。
【００７０】
他のベクター配列要素
ベクターは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含んでいてもよい。これは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、その制限酵素部位のいずれかをベクターを消化するための標準的な組換え技術と併用して使用することができる（例えば、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７２（１）：７５−８２（１９９９）、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（８）：１２３３−１２３６（１９９８）、およびＣｏｃｅａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２３（５）：８１４−８１６（１９９７）を参照のこと）、これらは参照により本明細書に引用されたものとする）。「制限酵素での消化」とは、核酸分子の特異的位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。係る酵素を使用することは当業者に広く理解されている。ベクターは、外因性配列がそのベクターにライゲーションできるように、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して頻繁に線状化またはフラグメント化される。「ライゲーション」とは、２つの核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。これら２つの核酸フラグメントは隣接していてもしていなくてもよい。制限酵素およびライゲーション反応が関与する技法は、組換え技術の分野の当業者には周知である。
【００７１】
ほとんどの転写された真核生物のＲＮＡ分子は、一次転写産物からイントロンを取り除くためにＲＮＡスプライシングを受ける。真核生物のゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現についての転写産物の適切なプロセシングを確実にするために、ドナースプライシング部位および／またはアクセプタースプライシング部位を必要とすることがある（例えば、参照によって本明細書に引用されたものとする、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９９７を参照）。
【００７２】
本発明のベクターまたは構築物は、一般に少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写産物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列を含む。従って、ある実施形態では、ＲＮＡ転写産物の産生を終結させる終結シグナルが想定される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを実現するためにインビボで必要である場合がある。
【００７３】
真核生物系では、ターミネーター領域も、ポリアデニル化部位を露出させるように、新しい転写産物の部位特異的切断を許容する特異的ＤＮＡ配列を備えていてもよい。これは、長く伸びた約２００アデノシン残基（ポリＡ）を転写産物の３’末端に付加するための特別の内因性ポリメラーゼにシグナルを伝達する。ポリＡテイルで修飾されたＲＮＡ分子はより安定なようであり、より効率よく翻訳される。従って、真核生物が関与するいくつかの実施形態では、ターミネーターはＲＮＡの切断のためのシグナルを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ターミネーターのシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促す。いくつかの実施形態では、ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位要素は、メッセージレベルを増強し、そしてカセットから他の配列へのリードスルーを最小にするために役立ち得る。
【００７４】
本発明の使用について想定されるターミネーターには、本明細書中に記載される任意の公知の転写のターミネーターまたは当業者に公知のターミネーターが含まれ、例えば、遺伝子の終止配列（例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター）、ウイルスの終止配列（例えば、ＳＶ４０ターミネーター）が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態では、終結シグナルは、転写可能な配列または翻訳可能な配列を欠くもの（例えば、配列の切断により転写不可能／翻訳不可能な配列）であってもよい。
【００７５】
発現において、特に真核生物の発現においては、通常は転写産物の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を成功裏に実施するために重要であるとは考えられず、任意の係る配列を採用してよい。いくつかの実施形態は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。これらは共に好都合であり、容易に入手でき、そして種々の標的細胞において十分に機能することが公知である。ポリアデニル化は、転写産物の安定性を増すこともあるし、または細胞質輸送を容易にすることもある。
【００７６】
ベクターを宿主細胞に伝播させるために、ベクターは１つ以上の複製起点部位（しばしば「ｏｒｉ」部位と呼ばれる）を含んでいてもよい。複製起点部位は複製が開始される特異的ヌクレオチド配列である。あるいは、宿主細胞が酵母であるなら、自己複製配列（ＡＲＳ）を採用することもできる。
【００７７】
形質転換方法
本発明と共に使用するための適切な核酸送達方法には、核酸分子（例えばＤＮＡ）が本明細書中に記載するように細胞に導入され得る事実上任意の方法、または当業者に公知であろう事実上任意の方法が含まれると考えられる。係る方法としては、例えばエクスビボトランスフェクションによる（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６（１９８９）、Ｎａｂｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４２−１３４４（１９８９））、注入による（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号、各々は参照によって本明細書に引用されたものとする）、マイクロインジェクションによる（ＨａｒｌａｎおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１（３）：１０９４−１０９９（１９８５）、米国特許第５，７８９，２１５号、これらは参照によって本明細書に引用されたものとする）、エレクトロポレーションによる（米国特許第５，３８４，２５３号（参照によって本明細書に引用されたものとする）、Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８（１９８６）；Ｐｏｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５（１９８４））、リン酸カルシウム沈殿による（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７（１９７３）、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２（１９８７）、Ｒｉｐｐｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５（１９９０））、ＤＥＡＥ−デキストランさらにポリエチレングリコールを使用することによる（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１９０（１９８５））、直接的音波ローディングによる（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１７）：８４６３−８４６７（１９８７））、リポソーム媒介性トランスフェクションによる（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２１：１８５−１９０（１９８２）、Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２（１９７９）、Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１４９：１５７−１７６（１９８７）、Ｗｏｎｇら，Ｇｅｎｅ，１０：８７９−８９４（１９８０）、Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８（１９８９）、Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４（１９９１））および受容体媒介性トランスフェクションによる（ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２（１９８７）、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６３（２９）：１４６２１−４（１９８８））、プロトプラストのＰＥＧ媒介性形質転換による（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１（３）：４１５−４２８（１９８７）、米国��許第４，６８４，６１１号および同第４，９５２，５００号、各々参照によって本明細書に引用したものとする）、乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ摂取（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９（２）：１６９−１７７（１９８５））、ならびに係る方法に任意の組合せによる、ＤＮＡの直接送達が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
ＩＩ．アッセイシステムの構成要素
本明細書中に記載する方法の場合のように、本発明の特徴である産物は種々の実施形態を有する。本発明のいくつかの実施形態は、例えば試験タンパク質をコードする配列、切断部位およびＤＰＰを含む「３部構成の構築物」を提供する。いくつかの実施形態では、試験タンパク質は、膜貫通受容体（例えば、ＧＰＣＲファミリーのメンバー）のような膜結合性タンパク質である。いくつかの実施形態では、これらの配列を、それらがコードするタンパク質のＣ末端が第２タンパク質とより良好で強固な相互作用を有するように修飾することができる。修飾としては、例えば試験タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）のＣ末端コード配列を、ＡＶＰＲ２、ＡＧＴＲＬＩ、ＧＲＰＲ、Ｆ２ＰＬＩ、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８、ＣＣＲ４またはＧＲＰＲに対するＣ末端コード領域で置き換えることが挙げられる。これらの例を本明細書中に記載する。
【００７９】
レポーター遺伝子を調節するタンパク質を使用する実施形態では、産物は、転写因子（ｔＴＡ、ＧＡＬ４など）のような核内で作用するタンパク質であってもよく、またはそれは作動における反応のカスケードを設定、遅延または別様に調節する（例えば、別のタンパク質による核内反応を導くか、または例えば細胞内カルシウムもしくはｃＡＭＰレベルの変化のような検出可能な細胞変化に導く）分子であってもよい。当業者は、係るカスケードを熟知していると考えられる。
【００８０】
タンパク質の不活性部分を使用する実施形態では、産物は、構築物（例えば、融合タンパク質）からの放出の際に、それがタンパク質の第２の同様に不活性な部分と合わさり完全な活性タンパク質（タンパク質の相補性）を作製するように、選択される。この完全な活性タンパク質は、例えば発光または蛍光により検出可能なシグナルを生成するか、または例えば後で基質に作用して検出可能なシグナルをもたらす完全な酵素を形成することにより間接的なシグナルを生成する。
【００８１】
検出可能なタンパク質を使用する実施形態では、産物は、例えば融合タンパク質から放出される際に検出可能なタンパク質が、例えば特異的な細胞小器官への標的化された移動を介して、それが移動し、最分配し、再局在化し、または別様に細胞内で位置を変えるにつれて追跡できるように、選択される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質が明確な色を生成する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する第２構築物は、第１タンパク質と相互作用して何らかの測定可能な現象を導くタンパク質をコードする領域を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、前記第１タンパク質のアクチベーター、阻害剤、またはより一般的には「モジュレーター」であってよい。いくつかの実施形態では、例えば第１タンパク質がＧＰＣＲである場合はアレスチンファミリーのメンバーが使用される。しかし、例えば第１タンパク質がＧＰＣＲでない場合は、他のタンパク質をコードする配列を使用してもよい。いくつかの実施形態では、これら２つの部分構築物の第２部分は、プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分をコードし、それらは第１構築物によりコードされた融合タンパク質からＤＰＰを取り除くように作用する。
【００８３】
しかしながら、これらの実施形態は以下のさらなる実施形態で考察するように、本発明を限定しない。
【００８４】
宿主細胞
本明細書中で使用する場合、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は交換可能に使用してよい。これらの用語の全ては、任意かつ全ての後の世代であるその子孫をも含む。意図的な変異または偶然の変異のため、全ての子孫が同一でなくともよいことが理解される。一般に宿主細胞は、融合タンパク質の一部分である転写因子によって活性化されるスクリーニングマーカーまたは選択マーカーを、第１試験タンパク質と共に発現するように操作されている。
【００８５】
異種の核酸配列を発現するという文脈においては、「宿主細胞」とは、ベクターを複製しかつ／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することができる、原核細胞または真核細胞を指す。宿主細胞が核酸分子で「トランスフェクト」または「形質転換」されている場合、それらは「改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「組換えられた」細胞もしくは宿主細胞、例えば外来性核酸配列（例えばベクター）がすでに導入されている細胞と呼ばれる。それゆえ、組換え細胞は、組換え技術により導入された核酸を含まない天然に存在する細胞と区別可能である。
【００８６】
多くの細胞株および培養物が宿主細胞としての使用のために利用可能であり、それらは生体培養物および遺伝物質についての記録保管所としての役割を果たしている組織であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を通して入手可能である。適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づき当業者が決定することができる。例えばプラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために原核生物の宿主細胞中に導入することができる。ベクターの複製および／または発現のために利用可能な細胞型としては、大腸菌（例えば、大腸菌株ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ番号第３１５３７号）、およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（Ｆ−、ラムダ−、原栄養菌性、ＡＴＣＣ番号第２７３３２５号）、ＤＨ５α、ＪＭ１０９ならびにＫＣ８）、桿菌（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ならびに他の腸内細菌（例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種）、ならびに多くの市販の細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＣｅｌｌおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）  Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））のような細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２のような細菌細胞が、ファージウイルスのための宿主細胞として特に想定されている。
【００８７】
ベクターの複製および／または発現のための真核生物の宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、ＰｅｒＣ６、ＣＨＯおよびＰＣ１２細胞ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。種々の細胞型および微生物に由来する多くの宿主細胞が利用可能であり、当該分野の当業者には公知であると考えられる。同様に、真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞と併用して、特にそのベクターの複製または発現に対して許容状態にある宿主細胞と併用して、ウイルスベクターを使用してもよい。
【００８８】
試験タンパク質
本発明は、物理的な相互作用が公知であるか、疑われているか、または検討することが望まれている任意の２つ以上のタンパク質の使用を想定している。いくつかの実施形態では、その２つのタンパク質は融合タンパク質として存在している。例えば、第１試験タンパク質はＤＰＰ（例えば転写因子）に融合し、第２試験タンパク質は、第１融合タンパク質の切断部位を認識するプロテアーゼに融合しており、ＤＰＰ、直接もしくは間接的に測定可能なタンパク質またはタンパク質の不活性部分が、その切断によって放出される。転写因子を利用するいくつかの実施形態は、（ａ）切断に先立って第１試験タンパク質が核に局在化しないように、ならびに／または（ｂ）プロテアーゼが第２試験タンパク質への融合および第１試験タンパク質の第２試験タンパク質への結合もしくは会合の両方の後にも活性を保つように、設計されている。
【００８９】
第１構築物に関して、第１試験タンパク質は、例えば、天然の膜結合性タンパク質であってもよいし、標準的な技法により膜結合性になるように改変したものであってもよい。第１試験タンパク質は、例えばＧＰＣＲのいずれかのような膜貫通受容体であってもよく、任意の他の関心対象の膜貫通受容体であってもよく、例えば受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン・トレオニンキナーゼ、サイトカイン受容体などが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質および／または第２試験タンパク質は、細胞受容体、イオンチャネル、増殖因子受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ；例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２およびＴＬＲ１３）、ＮＦ−κＢシグナル経路タンパク質（例えば、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０とも呼ばれる）、ＮＦ−κＢ２（ｐ５２とも呼ばれる）、ＲｅｌＡ（ｐ６５とも呼ばれる）、ＲｅｌＢ、ＩκＢキナーゼおよびｃ−Ｒｅｌ）、サイトカイン受容体、インテグリン、細胞接着タンパク質またはエストロゲン受容体、および他の核ホルモン受容体／ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質／第２試験タンパク質は、例えば本明細書において記載する受容体に対するリガンドである。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質／第２試験タンパク質は、甲状腺ホルモン受容体様またはそのリガンドである。例えば、グループＡ：甲状腺ホルモン受容体（甲状腺ホルモン）、例えば甲状腺ホルモン受容体−α（ＴＲα；ＮＲ１Ａ１）または甲状腺ホルモン受容体−β（ＴＲβ；ＮＲ１Ａ２）；グループＢ：レチノイン酸受容体（例えば、ビタミンＡおよび関連化合物）、例えばレチノイン酸受容体−α（ＲＡＲα；ＮＲ１Ｂ１）、レチノイン酸受容体−β（ＲＡＲβ；ＮＲ１Ｂ２）およびレチノイン酸受容体−γ（ＲＡＲγ；ＮＲ１Ｂ３）；グループＣ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−α（ＰＰＡＲα；ＮＲ１Ｃ１）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−β（ＰＰＡＲβ；ＮＲ１Ｃ２）、およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ：ＮＲ１Ｃ３）；グループＤ：Ｒｅｖ−ｅｒｂ、例えばＲｅｖ−ｅｒｂα（Ｒｅｖ−ｅｒｂα；ＮＲ１Ｄ１）およびＲｅｖ−ｅｒｂβ（Ｒｅｖ−ｅｒｂβ；ＮＲ１Ｄ２）；グループＦ：レチノイド関連オーファン受容体、例えばレチノイド関連オーファン受容体−α（ＲＯＲα；ＮＲ１Ｆ１）、レチノイド関連オーファン受容体−β（ＲＯＲβ；ＮＲ１Ｆ２）およびレチノイド関連オーファン受容体−γ（ＲＯＲγ；ＮＲ１Ｆ３）；グループＨ：肝臓Ｘ受容体様、例えば肝臓Ｘ受容体−α（ＬＸＲα；ＮＲ１Ｈ３）、肝臓Ｘ受容体−β（ＬＸＲβ；ＮＲ１Ｈ２）、およびファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ；ＮＲ１Ｈ４）；ならびにグループＩ：ビタミンＤ受容体様、例えばビタミンＤ受容体（ＶＤＲ；ＮＲ１Ｉ１）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ；ＮＲ１Ｉ２），および構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ；ＮＲ１Ｉ３）。いくつかの実施形態では、第１試験タンパ���質／第２試験タンパク質は、レチノイドＸ受容体様またはそのリガンドである。例えば、グループＡ：肝細胞核因子−４（ＨＮＦ４）、例えば肝細胞核因子−４−α（ＨＮＦ４α；ＮＲ２Ａ１）および肝細胞核因子−４−γ（ＨＮＦ４γ；ＮＲ２Ａ２）；グループＢ：レチノイドＸ受容体（ＲＸＲα）、例えばレチノイドＸ受容体−α（ＲＸＲα；ＮＲ２Ｂ１）、レチノイドＸ受容体−β（ＲＸＲβ；ＮＲ２Ｂ２）、およびレチノイドＸ受容体−γ（ＲＸＲγ；ＮＲ２Ｂ３）；グループＣ：精巣受容体、例えば精巣受容体２（ＴＲ２；ＮＲ２Ｃ１）および精巣受容体４（ＴＲ４；ＮＲ２Ｃ２）；グループＥ：ＴＬＸ／ＰＮＲ、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ｔａｉｌｌｅｓｓ遺伝子のヒトホモログ（ＴＬＸ；ＮＲ２Ｅ１）および光受容体特異的核内受容体（ＰＮＲ；ＮＲ２Ｅ３）；ならびにグループＦ：ＣＯＵＰ／ＥＡＲ、例えばニワトリオボアルブミン上流プロモーター−転写因子Ｉ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩ；ＮＲ２Ｆ１）、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター−転写因子ＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ；ＮＲ２Ｆ２）およびＥＲＢＡ関連２（ＥＡＲ２；ＮＲ２Ｆ６）。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質／第２試験タンパク質は、エストロゲン受容体様（ステロイドホルモン受容体）またはそのリガンドである。例えば、グループＡ：エストロゲン受容体（性ホルモン受容体；性ホルモン：エストロゲン）、例えばエストロゲン受容体−α（ＥＲα；ＮＲ３Ａ１）およびエストロゲン受容体−β（ＥＲβ；ＮＲ３Ａ２）；グループＢ：エストロゲン関連受容体、例えばエストロゲン関連受容体−α（ＥＲＲα；ＮＲ３Ｂ１）、エストロゲン関連受容体−β（ＥＲＲβ；ＮＲ３Ｂ２）およびエストロゲン関連受容体−γ（ＥＲＲγ；ＮＲ３Ｂ３）；ならびにグループＣ：３−ケトステロイド受容体、例えば糖質コルチコイド受容体（ＧＲ；ＮＲ３Ｃ１）（コルチゾール）、電解質コルチコイド受容体（ＭＲ；ＮＲ３Ｃ２）（アルドステロン）、プロゲステロン受容体（ＰＲ；ＮＲ３Ｃ３）（例えば性ホルモン受容体；性ホルモン：プロゲステロン）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ；ＮＲ３Ｃ４）（例えば性ホルモン受容体；性ホルモン：テストステロン）。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質／第２試験タンパク質は、神経成長因子ＩＢ様またはそのリガンドである。例えば、グループＡ：ＮＧＦＩＢ／ＮＵＲＲ１／ＮＯＲ１、例えば神経成長因子ＩＢ（ＮＧＦＩＢ；ＮＲ４Ａ１）、核内受容体関連１（ＮＵＲＲｌ；ＮＲ４Ａ２）およびニューロン由来のオーファン受容体１（ＮＯＲ１；ＮＲ４Ａ３）。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質／第２試験タンパク質は、ステロイド合成因子様またはそのリガンドである。例えば、グループＡ：ＳＦ１／ＬＲＨ１、例えばステロイド合成因子１（ＳＦ１；ＮＲ５Ａ１）および肝受容体ホモログ１（ＬＲＨ１；ＮＲ５Ａ２）。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質／第２試験タンパク質は、胚細胞核因子（Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ）様またはそのリガンドである。例えば、ＧＣＮ１（例えば胚細胞核因子（ＧＣＮ１；ＮＲ６Ａ１）である。
【００９０】
さらに、タンパク質の一部分が全長の第１試験タンパク質と同様の機能を果たすことが公知であるので、第１試験タンパク質の係る活性な一部分は本明細書におけるタンパク質の定義に包含される。
【００９１】
当業者には明らかであるように、本発明は任意のタンパク質との相互作用をアッセイするために使用してもよく、本発明の範囲はＧＰＣＲのような膜結合性受容体をアッセイすることに限定されない。例えば、他のクラスの膜貫通受容体としては、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／Ｎｅｕまたは関連するＲＴＫのようなＩＧＦｌＲ）；受容体セリン／トレオニンキナーゼ（形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ））、アクチビンまたは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体；サイトカイン受容体（例えばインターロイキン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびレプチン受容体についてのインターフェロンファミリーに対する受容体）；必ずしも通常は膜結合性ではない他の受容体（例えば、エストロゲン受容体１（ＥＳＲｌ）、およびエストロゲン受容体２（ＥＳＲ２）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のいくつかの方法は、関心対象の受容体（またはその一部分）を含むキメラタンパク質の発現を指向する修飾した受容体構築物で、細胞をトランスフェクトすることを含む。この受容体にはプロテアーゼ切断部位およびＤＰＰ（例えば、転写因子）が付加されている。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば本明細書中に記載するように、部位を認識してそれを切断するプロテアーゼに融合された、相互作用タンパク質からなるキメラタンパク質の発現を指向する第２構築物で、コトランスフェクトされる。ＥＧＦＲのようなＲＴＫの場合には、この相互作用タンパク質は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）もしくはＳｒｃ相同２ドメイン含有形質転換タンパク質１（ＳＨＣ１）のようなタンパク質またはその一部分を含む、ＳＨ２（Ｓｒｃ相同ドメイン２）からなっていてもよい。受容体セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、ＴＧＦβ、アクチビン、ＢＭＰ受容体）の場合には、この相互作用タンパク質はＳｍａｄタンパク質またはその一部分であってもよい。サイトカイン受容体（例えば、インターフェロン−α／βまたはインターフェロン−γガンマ受容体）の場合には、この相互作用タンパク質はシグナル伝達および転写活性化（ＳＴＡＴ）タンパク質（例えば、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２；Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ）  タンパク質Ｊａｋｌ、Ｊａｋ２またはＴｙｋ２；またはこれらの一部分が挙げられるが、これらに限定されない）であってもよい。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、受容体に融合された転写因子によって制御されるレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態については、トランスフェクトされた細胞が特定の期間の間試験化合物で処理され、レポーター遺伝子の活性が試験期間の最後に測定されるアッセイが行われていてもよい。試験化合物が関心対象の受容体を活性化する場合は、関心対象の受容体と相互作用タンパク質との間の相互作用は刺激され、プロテアーゼ部位の切断および融合ＤＰＰ（例えば、転写因子）の放出が導かれ、これは次にレポーター遺伝子の活性の上昇として測定可能である。
【００９２】
他の可能な試験タンパク質対としては、抗体−リガンド、酵素−基質、キナーゼとリン酸化基質、ホスファターゼとリン酸化タンパク質、二量化タンパク質、シグナル伝達カスケード、および当該分野で周知の他のタンパク質対が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
細胞内のタンパク質の位置が決定されている実施形態では、例えば融合タンパク質から放出される際に、タンパク質が、例えば特異的な細胞小器官への標的化された移動によってそれが移動し、再分配し、再局在化し、または別様に細胞内で位置を変えるにつれて追跡できるように、そのタンパク質が選択される。本発明のいくつかの実施形態は、明確な色を生成する蛍光タンパク質を利用するが、他のタンパク質またはタンパク質の一部分（例えば、抗体エピトープ相互作用または（例えば、特異的に位置した）基質に対する酵素作用）も使用できる。
【００９４】
レポーターおよびＤＰＰ
レポーターおよびＤＤＰは、直接または間接的に検出可能なシグナルをもたらすことができるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰは、蛍光の増加または減少として直接検出することができる。いくつかの実施形態では、ＤＰＰは２つのポリペプチドに「分割」することができる。例えば、この分割された２つのポリペプチドが互いと会合する時、ＤＰＰはより高い活性を示す。多くの分割されたＤＰＰは当該分野で公知であり、例えば、β−ガラクトシダーゼ（例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＶａｒｓｈａｖｓｋｙ，ＰＮＡＳ  ９１：１０３４０−４４（１９９４）および米国特許第７，１６６，４２４号を参照）、ジヒドロ葉酸還元酵素（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら，ＰＮＡＳ  ９５：１２１４１−４６；ＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ，ＰＮＡＳ  ９６：５３９４−９９；および米国特許第６，８７２，８７１号を参照）、ＧＦＰおよび変異体などの蛍光タンパク質（例えばＨｕら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９：７８９−９８（２００２）；Ｇｈｏｓｈら，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２２：５６５８−５６５９（２０００）；および米国特許第７，１６６，４２４号を参照））、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼなどのプロテアーゼ（例えば、Ｗｅｈｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３（１２）：９８５−９９３（２００６）および米国特許出願公開第２００５００８４８６４号を参照）、Ｂｌａ（例えば、Ｗｅｈｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：３４６９−３４７４（２００２）；Ｇａｌａｒｎｅａｕら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６１９−６２２（２００２）；Ｓｐｏｔｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１５１４２−１５１４７（２００２）；および米国特許第６，８２８，０９９号を参照）、ルシフェラーゼ（例えばＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３（１２）：９７７−９７９（２００６）を参照）、インテイン（例えばＳｙｎｅｃｈｏｙｔｓｔｉｓ  ｄｎａＥインテイン（例えばＯｚａｗａら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５１６−２５２１（２００１）を参照）、ならびにルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼ、ＲｅｎｉｌｌａまたはＧ．ｐｒｉｎｃｅｐｓ（ＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：９７７−９７９（２００６）；ＰａｕｌｍｕｒｕｇａｎおよびＧａｍｂｈｉｒ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５：１５８４−１５８９（２００３）；ならびにＰａｕｌｍｕｒｕｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５６０８−１５６１３（２００２））。例えば、Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３（１２）：９６９−９７１（２００６）も参照のこと。
【００９５】
いくつかの場合には、例えばプロテアーゼによるタンパク質の切断が検出可能なシグナルの増加または減少をもたらす場合のような、プロテアーゼの活性を直接または間接的に検出することができるならば、プロテアーゼがＤＰＰであると考えることができる。本発明のいくつかの実施形態は、二次的なレポーターを活性化または不活性化するプロテアーゼを利用する。
【００９６】
レポーター遺伝子を調節するタンパク質を使用する本発明の実施形態では、タンパク質は、遺伝子、その発現または遺伝子発現に検出可能な変化をもたらす欠失に影響を及ぼす任意のタンパク質であってもよい。典型的なタンパク質レポーターとしては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ニトロ還元酵素、エクオリン、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素が挙げられる。緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質および化学発光タンパク質も想定されている。
【００９７】
種々のアッセイが、野生型β−ガラクトシダーゼまたはα−相補性またはω−相補性の現象に基づいて構築されてきた。β−ｇａｌは、１００万ダルトンまでの四量体および八量体を形成する多量体酵素である。β−ｇａｌサブユニットは、自己オリゴマー化を経て活性を示すようになる。この天然に存在する現象は、種々のインビトロの均一系アッセイを開発するために使用されてきた。β−ｇａｌの、α−相同性またはω−相同性は、抗体−抗原、薬物−タンパク質、タンパク質−タンパク質、および他の生体分子相互作用の検出のためのアッセイを開発するのに利用されてきた。しかしながら、その現象は生来的に起こり、有意なバックグラウンド活性を示すため、β−ｇａｌ相補性の生細胞アッセイへの適合は制限されていた。このバックグラウンド活性の問題は、天然に補完する能力を失ったかまたは無視できる程度に低下させた低親和性の変異体サブユニットを開発することにより一部は克服され、例えば生細胞におけるＥＧＦ受容体のリガンド依存性活性化の検出を含む種々のアッセイが可能になった。いくつかの実施形態では、β−ｇａｌは、例えば核局在化シグナルのような局在化シグナルと共に発現される。
【００９８】
発光シグナル、蛍光シグナルまたは生物発光シグナルは、種々の自動化されかつ／または高スループット計装システム（蛍光マルチウェルプレートリーダー、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）およびシグナルの空間的な分解能を提供する自動化された細胞ベースの画像化システムが挙げられる）のいずれかを用いて容易に検出および定量することができる。種々の計装システムがハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）を自動化するために開発されてきた。計装システムの例としては、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（現在はＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒの一部である）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（現在はＧＥの一部である）、ＴＴＰ、Ｑ３ＤＭ（現在はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒの一部である）、Ｅｖｏｔｅｃ（現在はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの一部である）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ（現在はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓの一部である）およびＺｅｉｓｓにより開発された、自動化蛍光イメージングおよび自動化顕微鏡システムが挙げられる。蛍光褪色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）および経時的蛍光顕微鏡検査法も、生細胞におけるタンパク質の移動度を研究するために使用されてきた。光学機器およびハードウェアは、実質的に全ての生物発光シグナルを高感度および高スループットで検出できるほどまで進歩した。
【００９９】
転写因子およびリプレッサー
本発明のいくつかの実施形態では、転写因子または他のＤＰＰは、改変された宿主細胞におけるレポーター遺伝子の発現を活性化するために使用される。転写因子は、通常はそのＤＮＡ結合ドメインの構造に従って分類される。それらは一般に、（ａ）ジンクフィンガー群、（ｂ）へリックス−ターン−へリックス群、（ｃ）ロイシンジッパー群、（ｄ）へリックス−ループ−へリックス群、または（ｅ）高移動度群である。転写因子の活性化ドメインは、転写装置（ＲＮＡポリメラーゼ）の要素および他の制御タンパク質と相互作用し、それによりＤＮＡ結合の効率に影響を及ぼす。
【０１００】
Ｒｅｌ／核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）および活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）は、最も研究されている転写因子ファミリーである。それらは、病気の結末（例えば炎症および腫瘍形成）に繋がるシグナル伝達経路の重要な要素であると認識されている。他の転写因子ファミリーとしては、熱ショック／Ｅ２Ｆファミリー、ＰＯＵファミリーおよびＡＴＦファミリーが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、転写因子はｔＴＡまたはＧＡＬ４である。
【０１０１】
転写因子は、使用することができる分子の１つのクラスであるが、アッセイを転写リプレッサー分子の使用を受け入れるように改変してもよい。その場合、検出可能なシグナルは、シグナル発生部分のダウンレギュレーションであるかまたは細胞死でさえある。
【０１０２】
タンパク質の不活性部分（例えば、タンパク質相補性）を使用する実施形態では、タンパク質の不活性部分は、構築物（例えば、融合タンパク質の一部分）からの放出の際に、それがタンパク質の第２の同様に不活性な部分と合わさり完全な活性タンパク質を作製するように、選択される。この完全な活性タンパク質は、例えば発光により検出可能なシグナルを生成するか、または例えば後で基質に作用して検出可能なシグナルをもたらす完全な酵素を形成することにより、間接的なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、タンパク質の２つの不活性部分は転写因子である。
【０１０３】
プロテアーゼおよび切断部位
プロテアーゼは、特定の部位で他のタンパク質を切断する、十分に特性解析された酵素である。ファミリーの１つであるＳｅｒ／Ｔｈｒプロテアーゼは、セリン残基およびトレオニン残基で切断する。他のプロテアーゼとしては、システインプロテアーゼまたはチオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびトリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼならびにペプチジルペプチダーゼが挙げられる。これらの選択は当業者に委ねられているが、特に本明細書中に記載する分子に限定される必要はない。酵素が触媒ドメインを有し、それらを全長プロテアーゼの代わりに使用できることは周知である。係る触媒ドメインも同様に本発明に包含される。具体的な実施形態は、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼ、またはその活性部分である。プロテアーゼについての他の特異的切断部位も使用することができるが、これは当業者には明らかであると考えられる。
【０１０４】
試験タンパク質の修飾
第１試験タンパク質は、このアッセイにおける相互作用タンパク質（例えば、第２試験タンパク質）へのその結合を強めるために修飾されてもよい。例えば、リガンド刺激の際に特定のＧＰＣＲがより安定的にまたはより大きい親和性をもってアレスチンに結合し、この強められた相互作用は離れたドメイン（例えば、Ｃ末端テイルのセリン残基およびトレオニン残基のクラスター）によって媒介されることが公知である（Ｏａｋｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３２２４８−３２２５７，１９９９およびＯａｋｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１９４５２−１９４６０，２００１）。これを例として用いて、受容体をコードする配列自体を修飾して、膜結合タンパク質（例えば受容体）の、結合するタンパク質に対する親和性を高めてもよい。このような修飾の例は、膜結合性タンパク質（例えば、本明細書中に記載する受容体）のＣ末端領域の修飾である。いくつかの実施形態は、結合タンパク質に対してはより高い親和性を有するが受容体の機能には影響を及ぼさない別のタンパク質（例えば、受容体）の対応する領域で、タンパク質の一部分を置き換えることを含む。上述の実施例１６および２０は、本発明のこの特徴の実施形態を示す。
【０１０５】
加えて、第２試験タンパク質を、その第１試験タンパク質との相互作用を高めるために修飾してもよい。例えば、このアッセイは、第２試験タンパク質（例えば、より安定的にまたはリン酸化に依存せずにアゴニストが占有したＧＰＣＲに結合することが公知であるアレスチン）の点突然変異体、切断体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または他の変異体を組み込んでいてもよい（Ｋｏｖｏｏｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：６８３１−６８３４，１９９９）。
【０１０６】
ＩＩＩ．アッセイフォーマット
上で考察したように、本発明はいくつかの実施形態において、例えば同一の細胞中で発現した場合、またはインビトロで試験した場合に、２つの試験タンパク質の相互作用を評価するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１構築物（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、プロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分のための切断部位をコードする配列に連結された、第１タンパク質をコードする配列を含み、このプロテアーゼまたはプロテアーゼの一部分のための切断部位をコードする配列自身は、本明細書中に記載するような第２タンパク質またはタンパク質の一部分（例えば、ＤＰＰ）をコードする配列に連結されている。「連結されている」とは、記載する配列が融合され、単一のポリペプチド（例えば融合タンパク質）へと翻訳されてもよい単一の無傷のオープンリーディングフレームを生成することを意味する。これらは、付加的なタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をコードしてもしなくてもよい付加的なヌクレオチド配列で隔てられていてもよいが、そうである必要はない。組換え細胞に挿入された第２構築物も本明細書中に記載する通りであり、例えば、それは第２タンパク質をコードする配列およびプロテアーゼまたはプロテアーゼ部分の両方を含んでいる。これらの要素は共にアッセイフォーマットを構成し、標的タンパク質の相互作用に対する効果を研究している候補因子と組み合わせることができる。
【０１０７】
アッセイフォーマットおよびタンパク質相互作用フォーマットの種々の例を図１１および図１２に示す。以下の略語を、図１１および図１２ならびに本明細書中において使用する。
ＴＰ１＝第１標的タンパク質
ＴＰ２＝第２標的タンパク質
ＰＣＳ＝タンパク質切断部位
Ｐｒｏｔ＝プロテアーゼ
Ｐｒｏｔ１＝プロテアーゼ相補対の第１部分
Ｐｒｏｔ２＝プロテアーゼ相補対の第２部分
ＤＰＰ＝検出可能なペプチド／ポリペプチド
ＤＰＰＡ＝ＤＰＰの第１部分（相補対の一部分ではない）
ＤＰＰＢ＝ＤＰＰの第２部分（相補対の一部分ではない）
ＤＰＰ１＝検出可能なタンパク質相補対の第１部分
ＤＰＰ２＝検出可能なタンパク質相補対の第２部分
ＰＣＡ１＝タンパク質相補対の第１部分
ＰＣＡ２＝タンパク質相補対の第２部分
ＤＯＮ＝ドナー分子（例えば、タンパク質／ポリペプチド）
ＡＣＣ＝アクセプター（例えば、タンパク質／ポリペプチド）
【０１０８】
図１１は、本発明のいくつかの実施形態に関連する一般的なフォーマットを図示する。これらの全ては、タンパク質切断部位（ＰＣＳ）を介してＤＰＰと会合する第２相互作用タンパク質に分子的に近接している相互作用タンパク質のうちの１つと会合するプロテアーゼをもたらす、少なくとも２つのタンパク質の相互作用に基づいている。この分子的近接により、プロテアーゼがＰＣＳを切断しＤＰＰを放出することができるようになる。ＤＰＰは、例えば本明細書中に記載するような種々の方法によって検出することができる。例えば、ＤＰＰの切断は、結合したＤＰＰに比べてＤＰＰ活性の変化（例えば活性の上昇または低下）をもたらし得る。
【０１０９】
例えば、ＤＰＰは、相互作用タンパク質の１つからの切断によって蛍光が強められるかまたは弱められる、蛍光タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質が第１試験タンパク質から切断されるまで蛍光を阻害または弱めるようにして、第１試験タンパク質に結合されている。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質が試験タンパク質に結合している間は蛍光活性が検出可能であるが、その試験タンパク質から切断されると蛍光が低下するようにして、第１試験タンパク質に結合されている。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰは検出可能な反応を触媒する酵素である。それゆえ、図１１を例として使用して、本発明のいくつかの実施形態は、第１試験タンパク質と会合した酵素であるＤＰＰを利用する。いくつかの実施形態では、相互作用タンパク質のうちの１つからの切断の際に、酵素の活性は上昇または低下する。いくつかの実施形態では、酵素は、相互作用タンパク質から酵素が切断された時と比べてその活性が低下するように、相互作用タンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、酵素は、相互作用タンパク質から酵素が切断された時と比べてその活性が上昇するように、相互作用タンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、酵素は、相互作用タンパク質と会合しており、酵素に対する基質は、酵素が会合している相互作用タンパク質から離れて位置しているかまたは隔離されている。例えば、相互作用タンパク質は、膜に存在しているかまたは基質が位置している場所とは異なる細胞小器官に存在しているが、切断の後には、酵素はその基質と相互作用することができる。いくつかの実施形態では、酵素の基質および／または産物は検出可能である。いくつかの実施形態では、基質および産物は共に検出可能であり、例えばレシオメトリック測定（例えば、ＢｌａおよびＣＣＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））が可能である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＤＰＰは検出可能な経路（例えば、細胞経路）を制御または調節することができる。例えばいくつかの実施形態では、ＤＰＰは、細胞内カルシウムレベルおよびｃＡＭＰレベルの変化をもたらす細胞経路を調節してもよい。これらの変化は、当該分野で公知の方法、例えばＮＦＡＴ応答要素および／またはカルシウム応答要素を使用して容易に検出され、レポーター遺伝子の転写が制御される。
【０１１２】
図１２Ａは、ＰＣＳ、およびプロテアーゼを含む第２試験タンパク質と相互作用するタンパク質相補対の第１部分を含む第１試験タンパク質を示す。相互作用する際に、プロテアーゼは、第１試験タンパク質からタンパク質相補対の第１部分を切断する。タンパク質相補対の第１部分は、タンパク質相補対の第２部分と自由に相互作用できるわけではない。いくつかの実施形態では、ＰＣＡ１およびＰＣＡ２は転写因子の一部分である。これらの実施形態のいくつかで、ＰＣＡ２は核局在化配列を保有し、ＰＣＡ１は細胞膜に繋がれているＴＰ１に融合されている。いくつかの実施形態では、ＴＰ１はＧＰＣＲのような細胞表面受容体である。いくつかの実施形態では、ＴＰ２は、ＴＰ１の誘導性相互作用パートナー（例えば、ｂ−アレスチンまたはＧ−タンパク質またはＧＲＫ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質相補対の第１部分および／または第２部分は、膜結合性である。いくつかの実施形態では、タンパク質相補対の第１部分および／または第２部分が結合しているかまたは相互作用している時、それらはＤＰＰを形成する。タンパク質相補対から形成され得る種々の検出可能なタンパク質およびそれらの検出方法は、当該分野で公知であり、かつ／または本明細書中に記載されている。
【０１１３】
図１２Ｂは、プロテアーゼ相補対の第１部分、ＰＣＳおよびＤＰＰを含む第１試験タンパク質を示す。プロテアーゼ相補対の第２部分を含む第２試験タンパク質も示されている。これらの実施形態のいくつかは、第１試験タンパク質および第２試験タンパク質が相互作用する時、プロテアーゼ相補対の第１部分および第２部分は、ＤＰＰを切断し放出する活性プロテアーゼを形成する。ＤＰＰは、本明細書中に記載するいずれのＤＰＰであってもよく、本明細書中に記載する任意の方法で検出することができる。
【０１１４】
図１２Ｃは、第１試験タンパク質がＰＣＳで連結されたＤＰＰの第１部分および第２部分を含む場合の相互作用を示す。いくつかの実施形態では、ＤＰＰのこれらの第１部分および第２部分は、分離されるとそれらは相互作用して活性ＤＰＰを形成するような親和性を有していないという意味で、タンパク質相補対ではない。いくつかの実施形態では、ＤＰＰはＰＣＳで切断されるまでは活性であるかまたは検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＣＳを介して会合するＤＰＰの２つの部分は、活性ＤＰＰを形成する能力が低下しているかまたは失われており、例えば切断の際にＤＰＰの活性は低下する。いくつかの実施形態では、ＤＰＰは、切断の際にＤＰＰが、例えば会合して活性ＤＰＰを形成することができないかまたはその傾向がほとんどない２つの不活性ドメインに分離されるように、ＰＣＳによって分割される。いくつかの実施形態では、切断はシグナルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、切断はＤＰＰの不活性形態をもたらすか、または活性が低下したＤＰＰの形態をもたらす。
【０１１５】
図１２Ｄは、共鳴エネルギー移動および／またはクエンチ方法を示す。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質は、ドナー分子（例えば、ポリペプチド）からのシグナルをクエンチすることができ、かつ／または次にアクセプター分子を励起するドナー分子を励起することができるアクセプター分子（例えば、ポリペプチド）を含む。いくつかの実施形態では、第１試験タンパク質は、アクセプター分子（例えば、ポリペプチド）にエネルギーを移すことができるドナー分子（例えば、ポリペプチド）を含む。このエネルギーの移動によりアクセプター分子は励起される。ドナーおよび／またはアクセプターからのシグナルまたはシグナルの欠如は検出することが可能である。いくつかの実施形態では、このため、ドナー分子およびアクセプター分子の両方からのシグナル（例えば、蛍光）を測定／検出することによって、レシオメトリック分析を行うことができる。本発明のいくつかの実施形態では、アクセプター分子はドナー分子からのエネルギーを受け入れる（例えば、ドナー分子をクエンチする）が、アクセプター分子は検出可能なシグナルを発しない。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴスキームによって、個々の細胞において測定を実施することができる。
【０１１６】
図１２Ｅは、２つのタンパク質の相互作用により不活性なプロテアーゼが形成され放出される２段階反応を示す。試験タンパク質が無傷の時に、（例えば、相補的タンパク質によって形成されていない）プロテアーゼ全体が放出される、本発明の同様の実施形態を実施することができる。放出されたプロテアーゼは、多くの方法のいずれによって検出されてもよい。例えば、プロテアーゼは検出可能なタンパク質を切断する。いくつかの実施形態では、検出可能なタンパク質の切断により、例えば本明細書中に記載するような検出可能なタンパク質からのシグナルが減少または増加することがある。
【０１１７】
図１２Ｆは、検出可能なタンパク質相補対の第１部分および第２部分の相互作用を許容する、２つの試験タンパク質の相互作用を示す。相補性により、ＤＰＰが形成され、本明細書中に記載するようにそれを検出することができる。いくつかの実施形態では、この方法および関連する組成物は、例えば細胞質または核のような種々の細胞内区画におけるホモ二量体および／またはヘテロ二量体を評価、検出および／または測定するのに利用することができる。いくつかの実施形態では、（例えば、キナーゼシグナル伝達カスケードにおける）ＭＥＫ１とその基質ＥＲＫ１との相互作用は、補完して検出可能なシグナルを生成するＤＰＰのフラグメントに各々融合することにより検出することができる。
【０１１８】
図１２Ｇは、３つのタンパク質が関与する相互作用を測定、検出または評価するための方法を図示する。３つのタンパク質が分子的に近接した状態にある場合は、ＤＰＰが放出される。２つの試験タンパク質のみが近接している場合には、ＤＰＰは切断されない。本発明の方法および／または組成物を用いてモニターまたは評価することができる三量体のタンパク質の相互作用の１つの例は、Ｃｕｌｉｎ２と腫瘍抑制活性に寄与するＶＨＬ−ｅｌｏｇｉｎ  Ｂタンパク質およびＣタンパク質との相互作用である。
【０１１９】
図１２Ｈは、少なくとも２つのタンパク質が関与する相互作用を検出または評価するための方法を図示する。これらの実施形態のいくつかでは、検出可能なタンパク質相補対の第１部分および第２部分は、補完を許容しないようにしてＰＣＳを介して融合されている。第１試験タンパク質と第２試験タンパク質の相互作用の際に、検出可能なタンパク質相補対の第２部分が放出／切断され、それは第１部分を補完して、例えば本明細書中に記載するような検出可能なシグナルを生成することができる。いくつかの実施形態では、切断は補完されたＤＰＰからのシグナルを増加させる。いくつかの実施形態では、切断は、活性な形態のＤＰＰをもたらすか、ＤＰＰ由来の活性を高める。
【０１２０】
これまでまたは以下で考察する実施形態のいずれかでは、試験タンパク質の一方または両方が膜結合性であってもよい。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは膜結合性であるタンパク質を切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは膜結合性である。いくつかの実施形態では、このことは有利である場合がある。なぜなら、結合されるプロテアーゼおよび／またはタンパク質が膜結合性である場合、それらは（同一の膜上にないかぎり）分子的に近接した範囲内で拡散せず、それゆえ例えば所望のタンパク質−タンパク質相互作用に関連しないバックグラウンドの切断を低下させるかも知れないからである。いくつかの実施形態では、試験タンパク質の一方またはどちらも膜結合性ではない。
【０１２１】
それゆえ、本発明は、例えば図１、図１１および図１２に示すようなタンパク質−タンパク質相互作用を検出、測定および評価するための組成物および方法を提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ相補対の第１部分および第２部分により形成されるプロテアーゼは、融合タンパク質（例えば、試験タンパク質をまったく含まない別個の融合タンパク質）由来のＤＰＰを切断する。いくつかの実施形態では、ＤＰＰの切断によりＤＰＰの活性は高まるかまたは低下する。このようにしてＤＰＰを含む融合タンパク質を構築する方法は当該分野で公知であり、本明細書中でも記載されている。いくつかの実施形態では、ＢｌａのようなＤＰＰはユビキチンに融合される。いくつかの実施形態では、ＤＰＰ活性は、その融合タンパク質からの切断の際に上昇する。他の実施形態では、ＤＰＰ活性は低下する。Ｂｌａがユビキチンに融合されている間は「不安定化」され、ユビキチンから切断されると安定化されている、ユビキチン−Ｂｌａ融合タンパク質を作製する方法は当該分野で公知である。例えば、Ｗｈｉｔｎｅｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ７（２）：１４９−１５４（２００２）およびＳｔａｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１２９８−１３０２（２０００）を参照のこと。それゆえ、プロテアーゼおよびユビキチン−Ｂｌａ融合タンパク質は、本発明のいくつかの実施形態で利用される。係る実施形態では、例えば細胞質または核におけるタンパク質相互作用を、相互作用後すばやく（例えば、１５〜３０分）測定または検出することができる。
【０１２３】
プロテアーゼに関連するいくつかの実施形態（例えば、プロテアーゼを放出または活性化すること、プロテアーゼをＤＰＰのような別のタンパク質に分子的に近接させること、またはプロテアーゼ相補対を介して活性なプロテアーゼを形成（分離）すること）では、プロテアーゼは、切断によってＤＰＰの蛍光が変化するか部分的に変わる場合にＤＰＰを切断するために使用される。プロテアーゼにより切断された時に蛍光が変化する種々のタンパク質が当該分野で公知である。例えば、Ｖａｎｄｅｒｋｌｉｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：２２５３−２２５８（２０００）；Ｘｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２０３４−２０３５（１９９８）；およびＬｕｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８３：１０５４−１０６０（２００１）を参照のこと。
【０１２４】
プロテアーゼ全体もしくは無傷のプロテアーゼを用いて示されるかまたはそれらが関与するいくつかの実施形態では、プロテアーゼはプロテアーゼ相補対で置き換えることができる。例えば、相互作用タンパク質の１つにある全プロテアーゼを用いて記載する実施形態は、プロテアーゼ相補対の第１メンバーが第１試験タンパク質と会合し、プロテアーゼ相補対の第２メンバーが第２試験タンパク質と会合するように、改変することもできる。いくつかの実施形態では、タンパク質相補対の第２メンバーは、相互作用には関与しないが、（例えば拡散によって）移動しその対の他方のメンバーと接触することができる。従って、第１試験タンパク質および第２試験タンパク質が相互作用する時、プロテアーゼ相補対は、あたかも試験タンパク質の一方が全体／無傷のプロテアーゼからなるかのように、同様に作用する。
【０１２５】
特定のアッセイフォーマットを、何らかの特異的なタンパク質相互作用のために特に適合させてもよい。しかしながら、多くの例では、様々なアッセイフォーマットは多かれ少なかれ、特異的なタンパク質相互作用またはタンパク質相互作用自体の特異的なタイプを測定するように適合されている。例えば、本明細書中に記載する全てでなくとも多くのアッセイフォーマットは、ヘテロ二量化に対するホモ二量化を測定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、様々なアッセイフォーマットを同一のタンパク質相互作用を評価または測定するために使用することもあり得る。いくつかの実施形態では、どの方法を使用するかの選択は、技術的な問題、例えばアッセイ動力学、シグナル対バックグラウンド比、機器の使用などに依存する場合がある。
【０１２６】
適用できる場合には、本発明の方法のいくつかはインビボ（細胞中または動物中）またはインビトロで実施してもよい。
【０１２７】
本発明の種々の実施形態は、少なくとも１つのタンパク質−タンパク質相互作用に対する少なくとも１つの化合物の効果を分析するために利用することができる。例えば、本明細書中に記載する種々のフォーマットは、化合物（例えば、試験化合物）の存在下で実施することができる。これらの実験から得られた結果は、１）その化合物の不存在下で、２）同一化合物の異なる濃度で、３）異なる化合物を用いて、実施された類似または同一の方法と比較することができる。いくつかの実施形態では、複数の化合物が利用される。いくつかの実施形態では、化合物は、低分子、有機化合物、タンパク質、核酸、ペプチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＤＮＡ、または結合性分子（例えば、リガンドもしくは抗体、またはそれらの結合性フラグメント）である。
【０１２８】
本発明の方法および組成物のほとんどは、動物の細胞（すなわち、マウス、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）またはハエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などの無傷動物中）に適用できる。例えば、本明細書中に記載する種々のフォーマットおよび方法は、動物の細胞中に組込むことができる。本発明のいくつかの実施形態は、受精卵の前核注入および胚幹細胞における遺伝子標的法を利用することができる。これらは、本発明の組成物を動物細胞に組込むために利用することができる、広く行われている２つの手順である。細胞は、種々の方法で動物の中に組込むことができる。細胞を動物の中に組込むための方法は当該分野で公知である。例えば、細胞または細胞の集団を、例えば皮下に、皮内に、筋肉内に、頭蓋内に、静脈内になど、動物の中へ移植または注入することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を含む細胞は異種移植片、例えばマウスのような動物の中に移植されたヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞または形質転換細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚幹細胞または造血幹細胞である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞またはその核を使用して、トランスジェニック動物を生成することができる。これらの実施形態のいくつかでは、マウスの細胞の全てが本発明のタンパク質相互作用レポーター系を含むと考えられる。いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、ウイルスベクター）を使用して、本発明の構築物を生きた動物（例えば哺乳類）の細胞の中へ導入することができる。本明細書中に記載するアッセイフォーマットを生成するために、これを行うことができる。
【０１３０】
生きた動物において所望のタンパク質−タンパク質相互作用を評価、測定または検出することができるため、本発明の細胞を含む動物は有利である。いくつかの実施形態では、動物に化合物を与えてもよく、少なくとも１つのタンパク質−タンパク質相互作用をモニターまたは評価してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、β−ガラクトシダーゼが転写因子として使用される。いくつかの実施形態では、組織切片が動物から単離され、例えばその細胞を酵素活性について染色することによって、タンパク質−タンパク質相互作用が検出される。いくつかの実施形態では、タンパク質−タンパク質相互作用を生きた動物中で直接検出することができる。例えば、検出可能なシグナルはルシフェラーゼ反応の結果であってもよい。Ｘｅｎｏｇｅｎ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）は、生きた動物内で種々のルシフェラーゼ反応を検出するためのシステムを提供する。それゆえ、タンパク質−タンパク質相互作用を、動物中の種々の組織内で、かつ／またはリアルタイムでモニターすることができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、異なるレポーター遺伝子を同時に採用して複数のタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、受容体のような膜結合性）をアッセイするために上記方法および／または組成物を使用することができる。異なるレポーター遺伝子の各々は、本明細書中に記載するクラスのタンパク質などの、タンパク質の活性化により刺激される。例えば、これは、異なる受容体構築物および異なるシグナル発生タンパク質もしくは異なるタンパク質の不活性部分をコードする異なるレポーター遺伝子を含む細胞を混合することにより、または異なる転写因子を各試験受容体に融合し、シグナル発生タンパク質のレポーター遺伝子の移動の活性、もしくは例えば試験化合物での処理に際してなど、活性タンパク質の形成によりもたらされる活性を測定することにより、実現してもよい。例えば、関心対象の分子が第１受容体を活性化するかどうかを決定し、第２受容体との相互作用の結果として副作用が予想されるかどうかを決定することが望ましい場合がある。係る場合、例えば第１受容体および第１レポーター（例えばｌａｃＺ）をコードする第１細胞株、ならびに第２受容体および第２レポーター（例えばＧＦＰ）をコードする第２細胞株が関与してもよい。係るシステムのいくつかの実施形態は、実施例１７および実施例１８に記載されている。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞株（例えば、各々、少なくとも１つの異なるタンパク質−タンパク質相互作用を評価することができる）を混合し、例えば別の相互作用には何らの効果も及ぼさずに１つの相互作用に対する（正または負の）効果を探索するために、関心対象の化合物を添加することができる。これらの実施形態のいくつかでは、検出可能なシグナルはＦＡＣＳにより検出される。
【０１３２】
本発明は、相互作用する試験タンパク質の単一の対を検討するアッセイと、本明細書中で「多重」アッセイと呼ぶアッセイとの両方に関することが想定されている。多重タイプのアッセイは、種々の方法で行ってもよい。例えば、複数の試験タンパク質または複数のタンパク質−タンパク質相互作用が同時に評価／試験される。これは、複数の細胞試料を提供し、細胞試料の各々を構築、形質転換、またはトランスフェクトして、相互作用する各タンパク質対または各相互作用を試験することにより実現することができる。異なる形質転換細胞を組み合わせ、同時に１つの容器で試験してもよく、各々異なるタイプの形質転換細胞を異なるウェルに置き、その後試験してもよい。本明細書中に記載する多重アッセイに使用する細胞は同一であってもよいが、そうである必要はない。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、多重化は１つの細胞（例えばクローン細胞の集団）中で実施することができる。例えば、本明細書中に記載する種々の方法および／または組成物を組み合わせることにより、複数のタンパク質−タンパク質相互作用を、測定、評価および／または検出することができる。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質−タンパク質相互作用は、異なる区別可能なシグナル（例えば、異なる区別可能な蛍光シグナル）をもたらすと考えられる。例えば、検出可能なシグナルをもたらす少なくとも２つのアッセイフォーマットを含むように、細胞を構築することができる。例として、例えば１つのアッセイフォーマットが図１２Ａに示すものに類似しており、第２アッセイフォーマットが図１２Ｂに示すものに類似しているなど、２つの異なるタンパク質相互作用を評価するように細胞を構築することができる。各フォーマットが、２つの異なるおよび／または区別可能な蛍光シグナルをもたらすように設計することもあり得る。いくつかの実施形態では、両方のアッセイフォーマットは、２つの異なるおよび／または区別可能な蛍光シグナルをもたらす（例えば、図１２Ａ〜Ｈのいずれかにおけるような）類似のフォーマットであってもよい。
【０１３４】
使用するレポーターシステムは、各試料において同一であってもよいが、そうである必要はない。１つまたは複数の試料を容器（例えば、マイクロアレイのウェル）中に置いた後、容器中に置いた複数の相互作用タンパク質対に対して１つ以上の化合物をスクリーニングしてもよい。
【０１３５】
本発明の構築物により発現されるいくつかの融合タンパク質も本発明の特徴である。当業者には明らかな本発明の他の態様は、融合タンパク質を識別することができる抗体、およびタンパク質の存在を決定するための種々のタンパク質ベースのアッセイ、ならびに遺伝子の発現を決定するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＰＣＲに基づくアッセイ）である。
【０１３６】
ＩＶ．キット
本明細書中に記載するいずれの組成物もキットの中に含まれていてもよい。従って、キットは、本発明のベクターまたは細胞についての適切な容器手段の中に、本発明に従って使用することができる任意の付加的な薬剤を含む。
【０１３７】
このキットは適切に小分けされた本発明の組成物を含んでいてもよい。このキットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥した形態で包装されていてもよい。キットの容器手段は一般に、構成要素を入れそして必要に応じて適切に小分けしてもよい少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段を備える。キット中に複数の構成要素が存在する場合、そのキットは一般に、付加的な構成要素を別個に入れることができる第２、第３または他の付加的な容器をも含むと考えられる。しかしながら、構成要素の種々の組合せがバイアル中に含まれていてもよい。本発明のキットは、通常、市販のために厳重に梱包して試薬容器を収容するための手段をも備えるであろう。係る容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を備えていてもよい。
【０１３８】
このキットの構成要素が１つおよび／またはより多くの溶液に与えられる時、液体溶液は、例えば滅菌した水溶液を用いた水溶液であってもよい。いくつかの実施形態では、キットの構成要素は乾燥粉末として準備される。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として準備される場合、その粉末は適切な溶媒を添加することにより再構成され得る。溶媒を別の容器手段の中に準備していてもよいことも想定される。
【０１３９】
Ｖ．実施例
本発明を説明する具体的な実施形態を以下の実施例に示すが、本発明はそれらに限定されるわけではない。
【０１４０】
実施例１
ヒトβ２アドレナリン受容体（以後、標準的な命名法に従い「ＡＤＲＢ２」と呼ぶ）をコードするＤＮＡを用いて融合構築物を作製した。そのヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００００２４（配列番号１）でＧｅｎｂａｎｋに見出すことができる。Ｇｏｓｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５５４７−５５５１（１９９２）（参照により引用されたものとする）に記載されるテトラサイクリン制御性トランス活性化因子ｔＴＡも使用した。Ｐａｒｋｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６：４１３−４１７（１９９４）（参照により引用されたものとする）に記載されるタバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼに対する認識および切断部位をコードする配列を、融合コード遺伝子のこれらの配列の間に挿入した。ＣＭＶプロモーター領域をＡＤＲＢ２コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をｔＴＡ領域の下流に置いた。
【０１４１】
内部ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を欠くＡＤＲＢ２の形態を最初に生成することにより、融合構築物を調製した。さらに、内因性終止コドンをユニークなＢａｍＨＩ部位で置き換えた。
【０１４２】
オーバーラッピングＰＣＲ法を用いてこれを行った。詳細に言えば、コード領域の５’位を
2009529893.tif 000003
および
2009529893.tif 000004
で増幅し、他方、コード領域の３’位を
2009529893.tif 000005
および
2009529893.tif 000006
で増幅した。
【０１４３】
得られたＰＣＲ産物は２７ヌクレオチドの重複配列を有しており、標準的なアガロースゲル電気泳動によって精製した。これらを一緒に混合し、配列番号２および配列番号５を用いて増幅した。
【０１４４】
ＰＣＲを用いて、内因性開始コドンがＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏ切断部位で置き換えられるようにｔＴＡのコード領域を修飾した。７アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号６）で規定される切断部位が、Ｐａｒｋｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６：４１３−４１７（１９９４）（参照により引用されたものとする）により教示されている。この７番目のアミノ酸は、Ｐ１’位として公知であり、それを他のアミノ酸で置換するとＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏによる切断の効率が低下することは公知である。Ｋａｐｕｓｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９４：９４９−９５５（２００２）を参照のこと。
【０１４５】
７番目のアミノ酸をＴｙｒに変更した変異体、および７番目のアミノ酸をＬｅｕに変更した変異体を生成した。これらは、天然の高効率部位に比べて中効率および低効率な切断部位をもたらした。
【０１４６】
天然の高効率部位をコードするＤＮＡ配列を、２段階でｔＴＡコード領域に付加した。手短に言えば、
2009529893.tif 000007
および
2009529893.tif 000008
を用いたＰＣＲによってＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位をｔＴＡコード領域の５’に付加し、ＸｈｏＩ制限部位をｔＴＡコード領域の３’末端に付加し、配列
2009529893.tif 000009
を有するオリゴヌクレオチドをＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位との間にライゲーションすることによりＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏ切断部位を５’末端に付加した。
【０１４７】
ＥＮＬＹＦＱＹ（配列番号１２）についての
2009529893.tif 000010
および
2009529893.tif 000011
ならびにＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号１４）についての
2009529893.tif 000012
および
2009529893.tif 000013
を用いるＰＣＲによって、このＤＮＡ配列を中効率および低効率の切断部位をコードするように修飾した。
【０１４８】
これらのＰＣＲ工程により、各切断部位をコードする配列の５’にＢａｍＨＩ制限部位を、そしておよびｔＴＡ終止コドンの３’にＸｈｏＩ制限部位をも導入した。
【０１４９】
このように修飾したＡＤＲＢ２コード領域を、コード領域の２６０ヌクレオチド位で切断するＰｓｔＩ、およびＢａｍＨＩで消化した。この３’フラグメントをＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏ切断部位（これはすでにＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化されている）で修飾したｔＴＡの３つの変異体とライゲーションし、得られた複合体をすでにＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩにクローン化した。
【０１５０】
ＮｏｔＩ制限部位を、
2009529893.tif 000014
および
2009529893.tif 000015
を用いて、再度ＰＣＲにより、ＡＤＲＢ２コード領域の開始コドンの５’に導入した。
【０１５１】
修飾したＡＤＲＢ２コード領域の５’フラグメントをＮｏｔＩおよびＰｓｔＩによる消化によって単離し、以前に消化したＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断部位  ｔＴＡ融合物の３’フラグメントの構築物の各々にライゲーションして融合タンパク質をコードする３つの全長構築物を生成した。
【０１５２】
各構築物をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いでＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化した市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入した。
【０１５３】
実施例２
第２構築物を作製し、「βアレスチン２、以後ＡＲＲＢ２」についてのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ，ＮＭ＿００４３１３）（配列番号１７）をＴＥＶタンパク質のＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（すなわち、成熟したＮＩａプロテアーゼの１８９〜４２４アミノ酸、２０４０〜２２７９残基）にライゲーションした。これを行うため、ＢａｍＨＩ制限部位をその５’末端に付加するように、ＡＲＲＢ２をコードするＤＮＡ配列を修飾した。さらに、その配列を修飾して内因性終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換した。オリゴヌクレオチド
2009529893.tif 000016
および
2009529893.tif 000017
を使用した。得られたＰＣＲ産物を市販のベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクターの多重クローニング部位はＡＲＲＢ２の開始コドンの５’にＥｃｏＲＩ部位を含む。
【０１５４】
次いでＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域を修飾して、内因性開始コドンをＢｇｌＩＩ部位で置換し、そしてＫｏｌｏｄｚｉｅｊら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：５０８−５１９（１９９１）に従って３’末端にインフルエンザ赤血球凝集素エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２０）をコードする配列、次に終止コドン、およびＮｏｔＩ制限部位を挿入した。
2009529893.tif 000018
および
2009529893.tif 000019
を使用するＰＣＲにより、これを達成した。
【０１５５】
得られた修飾したＡＲＲＢ２コード領域をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、他方、修飾したＴＥＶコード領域をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断した。両方のフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターにライゲーションした。
【０１５６】
実施例３
ＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断部位−ｔＴＡおよびＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、およびＨＥＫ−２９３Ｔの誘導体である「クローン４１」にトランスフェクトした。クローン４１はｔＴＡ依存性プロモーターの制御下に安定的に組込んだβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する。約５×１０４個の細胞を、２４ウェルプレートの各ウェル中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８および５μｇ／ｍｌのプリマイシンを補ったＤＭＥＭ培地にプレートした。細胞を増殖させて、翌日に密集度５０％に到達させ、次いで０．４μｇのプラスミドＤＮＡおよび２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質および他の物質を含む、トランスフェクション試薬）を用いてトランスフェクトした。この混合物を１００μｌのＤＭＥＭ培地に混合し、細胞を加える前に室温で１５分間でインキュベーションした。受容体に対する公知のアゴニストである薬物を加えることにより試験する前に８〜２０時間トランスフェクトした細胞をインキュベーションし、次いで薬物添加後１６〜２４時間インキュベーションした。
【０１５７】
実施例４
ＭａｃＧｒｅｇｏｒら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１３：２５３−２６５（１９８７）（参照により引用されたものとする）が教示する発色基質、すなわち「Ｘ−ｇａｌ」で細胞を染色することにより、細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを最初に測定した。培養後、カルシウムおよびマグネシウムを含むＤ−ＰＢＳで２回細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定させ、次いでＤ−ＰＢＳ、カルシウムおよびマグネシウムでさらに２回（毎回１０分間）洗浄した。固定した細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含むＤ−ＰＢＳ中で、５ｍＭ  フェリシアン化カリウム、５ｍＭ  フェロシアン化カリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ジメチルホルムアミド中の４％Ｘ−Ｇａｌストックの１：４０希釈から調製した０．１％  Ｘ−Ｇａｌと共にインキュベーションした。
【０１５８】
この反応液を室温で暗所で、３〜４時間から一晩、インキュベーションした。基質溶液を除去し、細胞をｍｏｗｉｏｌ封入剤（１０％  ｍｏｗｉｏｌ、０．１％  １．４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、２４％グリセロール）を用いてガラスのカバースリップの下にマウントした。
【０１５９】
結果は、ＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断部位−ｔＴＡプラスミドのみまたはＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼプラスミドのみのいずれかでトランスフェクトした細胞はβ−ガラクトシダーゼを発現しないことを示した。両方のプラスミドでトランスフェクトした細胞のほんの一部分が、恐らくは刺激を受けていないＡＤＲＢ２とＡＲＲＢ２との間の基礎レベルの相互作用に起因してβ−ガラクトシダーゼを発現した。１０μＭ  イソプロテレノール、または１０μＭ  エピネフリン（共にＡＤＲＢ２アゴニストである）で処理した後、約３〜５倍多い細胞がレポーター遺伝子を発現した。
【０１６０】
ＡＤＲＢ２アンタゴニストであるアルプレノロール（１０μＭ）で細胞を５分間前処理した場合、アゴニストが誘導したβ−ガラクトシダーゼ発現細胞の増加は遮断され、アルプレノロールのみで処理した場合には目に見える効果はなかった。
【０１６１】
これらの結果は、アゴニスト結合およびＧＰＣＲ刺激をレポーター遺伝子の転写因子活性化に関連付けることができることを示す。
【０１６２】
実施例５
細胞におけるレポーター遺伝子活性のレベルをより正確に定量し、アッセイのシグナル対バックグラウンド比を最大にするために、一組の実験を実施した。これを、β−ガラクトシダーゼ活性についての市販の化学発光アッセイを使用してレポーター遺伝子誘導のレベルを測定することにより達成した。クローン４１細胞を、高効率、中効率または低効率のいずれかの切断部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物、および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を１μＭ  イソプロテレノールで処理するか未処理とし、薬物添加の２４時間後、化学発光アッセイを実施した。手短に言えば、細胞培養後、培地を除去し、５０μｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．８、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を各ウェルに加えた。ゆっくり攪拌しながら、室温での５分間のインキュベーションにより細胞を溶解させた。溶解液を集め、市販の製品によって分析した。
【０１６３】
全ての場合で、アゴニストによる処理によってβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルは上昇した。しかしながら、未処理の細胞におけるレポーター遺伝子活性のバックグラウンドレベルは、中効率部位および高効率部位に対して、低効率の切断部位を用いた時に最低となった。さらに、アゴニストで処理することにより、低効率切断部位でトランスフェクトした細胞においてレポーター遺伝子活性が４．８倍刺激された。これに対して、中効率切断部位については２．８倍刺激され、高効率切断部位については１．２倍刺激されたのみであった。このように、最高のシグナル対バックグラウンド比は、低効率のプロテアーゼ切断部位を使用することにより得られる。
【０１６４】
実施例６
アゴニストの刺激によるレポーター遺伝子発現の増加がアゴニストによる受容体の結合および活性化に依存していることを実証するために、これらの実験を設計した。
【０１６５】
これを行うため、各々が１１３位の１つのアミノ酸がＤからＳに変わっている受容体の変異体を含むこと以外は上記のプロトコルに従って、ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物の変異体を生成した。この変更によりアゴニストであるイソプロテレノールに対する親和性が大きく低下した。Ｓｔｒａｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：５−８（１９９１）を参照。各々が異なる切断部位を有する、変異受容体−ｔＴＡ融合構築物の３つの形態を形成した。
【０１６６】
Ｄ１１３Ｓ点突然変異体を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物および上で説明したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミドでコトランスフェクトしたクローン４１細胞中で、β−ガラクトシダーゼ活性のレベルを測定した。この活性試験を上で説明したのとまったく同様に実施した。結果は、アゴニストであるイソプロテレノールは変異体ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物を発現する細胞中ではレポーター遺伝子発現を刺激しないことを示した。
【０１６７】
実施例７
アゴニストの刺激によるレポーター遺伝子発現の増加がＴＥＶ  ＮＩａ−ＰｒｏのＡＲＲＢ２への融合に依存するかどうかを検討するためにこれらの実験を設計した。
【０１６８】
これを行うため、低効率切断部位、および上で説明したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミドまたはコントロールのホスホリパーゼＣのＳＨ２ドメインへのＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物のいずれかを含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物でコトランスフェクトしたクローン４１細胞中で、β−ガラクトシダーゼ活性のレベルを測定した。この活性試験を上で説明したのとまったく同様に実施した。結果は、アゴニストの刺激によるレポーター遺伝子発現の増加は、ＴＥＶプロテアーゼがＡＲＲＢ２に融合された時にのみ検出され、無関係のポリペプチドに融合している時には検出されないことを示した。
【０１６９】
実施例８
遺伝子発現が標的受容体のアゴニストにより選択的に誘導されるのかどうか、またはそれが他の分子によって刺激され得るのかどうかを決定するために、これらの実験を設計した。
【０１７０】
ＡＴＰは、Ｇタンパク質共役受容体Ｐ２Ｙ１およびＰ２Ｙ２のアゴニストである。これらはＨＥＫ−２９３Ｔ細胞により内因的に発現される。
【０１７１】
低効率切断部位および上で説明したアレスチン−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物でコトランスフェクトしたクローン４１細胞を使用して、実験を行った。この細胞をイソプロテレノール、ＡＴＰで処理したか、または処理しなかった。アッセイを上で説明したようにして実施した。
【０１７２】
結果は、レポーター遺伝子活性の誘導が標的受容体の活性化に特異的であることを示した。別のＧＰＣＲ経路の刺激は無関係であった。
【０１７３】
実施例９
低効率切断部位および上で説明したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構築物でコトランスフェクトしたクローン４１細胞を使用して、実験を行った。この細胞を、様々な量のアドレナリン受容体アゴニスト  イソプロテレノールおよびエピネフリンのうちの１つで処理した。アッセイを上で説明したようにして実施した。図２ａに呈示した結果は、これらの２つのリガンドによるレポーター遺伝子発現の刺激についての投与量−応答曲線を示す。各点は、３つの実験から得られた平均値を示す。
【０１７４】
上で説明したようにして、コトランスフェクトしたクローン４１細胞を様々な濃度のアドレナリン受容体アゴニスト  アルプレノロールで１５分間前処理し、その後１：Ｍ  エピネフリンで処理した一組の実験を実施した。図２ｂに示す結果は、このアンタゴニストについての投与量−阻害曲線を示す。
【０１７５】
実施例１０
Ｇタンパク質共役アルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２）についてのアッセイを設定するため、類似のセットの構築物を作製した。プライマー
2009529893.tif 000020
および
2009529893.tif 000021
を用いるＰＣＲを使用して、ＡＶＰＲ２コード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００００５４）（配列番号２３）を、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に置き、終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するように修飾した。
【０１７６】
修飾したＡＶＰＲ２コード領域を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩですでに切断した上述の３つのＡＤＲＢ２−  ｔＴＡ構築物にライゲーションした。これにより、ＡＤＲＢ２のコード配列全体をＡＶＰＲ２のコード配列で置換した。
【０１７７】
低効率切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＡＶＰＲ２−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、様々な濃度（１ｐＭ〜２μＭ）の［Ａｒｇ８］バソプレシン（ＡＶＰＲ２についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。図３に示すデータは、３．３ｎＭのＥＣ５０を有するこのアゴニストについての投与量−応答曲線を示し、この値は以前に公開されたデータ（Ｏａｋｌｅｙ，Ｒ．，ら，Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１：２１−３０，（２００２））と一致する。最大応答は、バックグラウンドレベルに対して約４０倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１７８】
実施例１１
Ｇタンパク質共役セロトニン受容体１ａ（ＨＴＲ１Ａ）についてのアッセイを設定するために、類似のセットの構築物を作製した。プライマー
2009529893.tif 000022
および
2009529893.tif 000023
を用いるＰＣＲを使用して、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に置き、終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するように、ＨＴＲ１Ａコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００５２４）（配列番号２６）を修飾した。
【０１７９】
修飾したＨＴＲ１Ａコード領域を、すでにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した、上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構築物にライゲーションした。これにより、ＡＶＰＲ２のコード配列全体をＨＴＲ１Ａのコード配列で置換した。得られた構築物を、以後「ＨＴＲ１Ａ−ｔＴＡ」と呼ぶ。
【０１８０】
低効率切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＨＴＲ１Ａ−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭの８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ  ＨＢｒ（ＯＨ−ＤＰＡＴ）（ＨＴＲ１Ａについてのアゴニストである）および１０μＭのセロトニン（ＨＴＲ１Ａについての天然のアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。アッセイを上で説明したようにして実施した。ＯＨ−ＤＰＡＴに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して６．３倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらし、セロトニンに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して４．６倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１８１】
実施例１２
Ｇタンパク質共役ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（ＣＨＲＭ２）についてのアッセイを設定するために、類似の構築物を作製した。プライマー
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および
2009529893.tif 000025
を用いるＰＣＲを使用して、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に置き、終止コドンをＢｇｌＩＩ部位で置換するように、ＣＨＲＭ２コード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００７３９）（配列番号２９）を修飾した。
【０１８２】
修飾したＣＨＲＭ２コード領域を、すでにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構築物にライゲーションした。これにより、ＡＶＰＲ２のコード配列全体をＣＨＲＭ２のコード配列で置換した。
【０１８３】
高効率切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＣＨＲＭ２−ｔＴＡ融合構築物で、クローン４１細胞をコトランスフェクトした。この場合、ＡＲＲＢ２−プロテアーゼ融合タンパク質は、単純ヘルペスウイルス  チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターの制御下に発現した。１０μＭのカルバミルコリンＣｌ（カルボコル（ｃａｒｂｏｃｈｏｌ））（上述のように、ＣＨＲＭ２についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。カルボコルに対する最大応答は、バックグラウンドに対して７．２倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１８４】
実施例１３
Ｇタンパク質共役ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）についてのアッセイを設定するために、α構築物も作製した。プライマー
2009529893.tif 000026
および
2009529893.tif 000027
を用いるＰＣＲを使用して、ＮｏｔＩ部位を５’末端に置き、終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するように、ＣＣＲ５コード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００５７９）（配列番号３２）を修飾した。
【０１８５】
プライマー
2009529893.tif 000028
および
2009529893.tif 000029
を使用して、切断された時ＥｃｏＲＩで切断したＤＮＡと適合性であるヌクレオチド突出部を残すＢｓａＩ部位を５’末端に置くように、ＣＣＲ５コード領域を修飾した。
【０１８６】
第１修飾コード領域をＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、第２修飾コード領域をＢｓａＩおよびＣｌａＩで切断した。両方のフラグメントを、すでにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構築物にライゲーションした。これにより、ＡＶＰＲ２のコード配列全体をＣＣＲ５のコード配列で置換した。
【０１８７】
低効率切断部位を含むＣＣＲ５−ｔＴＡ融合構築物を「クローン３４」細胞にトランスフェクトした。「クローン３４」細胞は、上述のＨＥＫ細胞株「クローン４１」の誘導体であるが、ＣＭＶプロモーターの制御下で安定的に組込まれたＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合遺伝子を含む。１μｇ／ｍｌの「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ」（ＲＡＮＴＥＳ）（ＣＣＲ５についての公知のアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。上述のようにして測定したＲＡＮＴＥＳに対する最大応答は、バックグラウンドに対して約４０倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１８８】
実施例１４
次に、Ｇタンパク質共役ドーパミン２受容体（ＤＲＤ２）についてのアッセイを設定するために、一組の構築物を作製した。プライマー
2009529893.tif 000030
および
2009529893.tif 000031
を用いるＰＣＲを使用して、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に置き、終止コドンをＢｇｌＩＩ部位で置換するように、ＤＲＤ２コード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００７９５）（配列番号３７）を修飾した。
【０１８９】
修飾したＤＲＤ２コード領域を、すでにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した、上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構築物にライゲーションした。これにより、ＡＶＰＲ２のコード配列全体をＤＲＤ２のコード配列で置換した。
【０１９０】
中効率切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）（ＤＲＤ２についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。上で説明したアッセイのようにして結果を測定した。ドーパミンに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して２．７倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１９１】
実施例１５
アゴニストに占有されたＧＰＣＲにより安定的に結合するアレスチン変異体を使用するアッセイの実施形態を示すために、これらの実験を設計した。まず、β−アレスチン−１（ＡＲＲＢ１）に対するＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼの融合物を構築した。プライマー
2009529893.tif 000032
および
2009529893.tif 000033
を用いるＰＣＲを使用して、Ａｓｐ７１８部位を５’末端に置き、終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するように、ＡＲＲＢ１のコード配列  （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００４０４１）（配列番号４０）を修飾した。
【０１９２】
得られた修飾したＡＲＲＢ１コード領域をＡｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩを用いて、およびＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断し、他方、上述の修飾したＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断した。全ての３つのフラグメントを、すでにＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩで消化した市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターにライゲーションした。
【０１９３】
中効率切断部位および上述のＡＲＲＢ１−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）（上述のように、Ｄ２受容体についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。ドーパミンに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して２．１倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１９４】
アミノ酸３８２以降のＡＲＲＢ１の切断により、ＧＲＫ媒介性リン酸化に関係なく、アゴニストが結合したＧＰＣＲに対する親和性が高まることが報告されている（Ｋｏｖｏｏｒ  Ａ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１１）：６８３１−６８３４（１９９９））。本発明のアッセイにおけるこのような「構成的に活性な」アレスチンの使用を例示するために、上述の配列番号４１および
2009529893.tif 000034
を用いるＰＣＲを使用して、Ａｓｐ７１８部位を５’末端に置き、ＢａｍＨＩ部位をアミノ酸３８２以降に置くように、β−アレスチン−１のコード領域を修飾した。
【０１９５】
これにより、全長コード領域よりも３６アミノ酸短いＡＲＲｂ１コード領域を得た。得られた修飾したＡＲＲＢ１コード領域（「ＡＲＲＢｌ（Δ３８３）」と呼ぶ）を、Ａｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩを用いてならびにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断し、他方、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断した。全ての３つのフラグメントをＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩで消化した市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターにライゲーションした。
【０１９６】
中効率切断部位および上述のＡＲＲＢ１（Δ３８３）−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）（上述のように、ＤＲＤ２受容体についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。ドーパミンに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して８．３倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０１９７】
ＡＲＲＢ２コード領域の相当する切断の効果を検討するため、プライマー
2009529893.tif 000035
および
2009529893.tif 000036
を用いるＰＣＲを使用して、Ａｓｐ７１８部位を５’末端に置き、３’末端の８１ヌクレオチドをＢａｍＨＩ部位で置換するように、ＡＲＲＢ２のコード領域を修飾した。
【０１９８】
これにより、全長コード領域よりも２７アミノ酸短いＡＲＲＢ２コード領域を得た。得られた修飾したＡＲＲＢ２コード領域を、Ａｓｐ７１８およびＢａｍＨＩを用いて切断し、他方、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで切断した。両方のフラグメントをＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩで消化した市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターにライゲーションした。
【０１９９】
中効率切断部位および上述のＡＲＲＢ２（Δ３８３）−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）（上述のように、ＤＲＤ２受容体についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。ドーパミンに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して２．１倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０２００】
図４に示すこれらの結果は、ＤＲＤ２ドーパミン受容体アッセイが、アレスチン変異体ＡＲＲＢ１（Δ３８３）を使用して最高のシグナル対バックグラウンド比を示すことを実証した。
【０２０１】
実施例１６
相互作用タンパク質に対する親和性を高めるように設計した受容体の修飾物を使用するアッセイの増強を実証するために、このセットの実験を実施した。この実施例では、試験受容体のＣ末端のテイルドメインをＡＶＰＲ２由来の対応するテイルドメイン（高親和性でアレスチンに結合することが公知の受容体）で置換した。これらの実施例では、７番目の膜貫通へリックスの末端で保存されたＮＰＸＸＹモチーフの１５〜１８アミノ酸後で融合物の接合を行った。この位置は、通常は受容体のＣ末端における想定されるパルミトイル化部位のすぐ後の位置に対応する。
【０２０２】
まず、ＰＣＲを使用して、ＡＶＰＲ２からＣ末端の２９アミノ酸、さらに低効率ＴＥＶ切断部位およびｔＴＡ転写因子をコードするＤＮＡフラグメントを生成した。このフラグメントを、最初の２つのアミノ酸（Ａｌａ、ＡおよびＡｒｇ、Ｒ）がＢｓｓＨＩＩ制限部位ＧＣＧＣＧＣによってコードされるようにも設計した。プライマー
2009529893.tif 000037
および
2009529893.tif 000038
を用いて、上述の低効率切断部位を備えたＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構築物を増幅することにより、これを達成した。
【０２０３】
次に、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に置き、ＢｓｓＨＩＩ部位をコード領域の最後のアミノ酸（Ｃｙｓ−４４３）の後に挿入するようにＤＲＤ２のコード領域を修飾した。プライマー
2009529893.tif 000039
および
2009529893.tif 000040
を用いるＰＣＲを使用して、これを実施した。
【０２０４】
得られた修飾したＤ２コード領域を、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、得られたＡＶＰＲ２のＣ末端テイル−低効率切断部位−ｔＴＡフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した。両方のフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した上述のＡＶＰＲ２−低効率切断部位−ｔＴＡフラグメント構築物にライゲーションした。
【０２０５】
低効率ＴＥＶ切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）（ＤＲＤ２受容体についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。ドーパミンに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して約６０倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０２０６】
５’末端にＡｓｐ７１８部位を挿入することにより、およびＢｓｓＨＩＩ部位をＣｙｓ−３４１の後に置くことにより、ＡＤＲＢ２受容体コード領域を修飾する構築物を作製したプライマー
2009529893.tif 000041
および
2009529893.tif 000042
を用いるＰＣＲを使用して、これを行った。
【０２０７】
修飾したＡＤＲＢ２受容体コード領域を、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、ＡＶＰＲ２  Ｃ末端テイル−低効率切断部位−ｔＴＡフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した。両方のフラグメントを、すでにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した、上述のＡＶＰＲ２−低効率切断部位−ｔＴＡ構築物にライゲーションした。得られた構築物は「ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡ」である（前出の米国特許出願公開第２００２／０１０６３７９号も参照のこと、特に配列番号３）。
【０２０８】
低効率ＴＥＶ切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのイソプロテレノール（ＡＤＲＢ２受容体についてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。イソプロテレノールに対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して約１０倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０２０９】
ＢｓｓＨＩＩ部位をＣｙｓ−３４５後に置くことにより、κオピオイド受容体（ＯＰＲＫ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００９１２）（配列番号５１）コード領域を修飾する構築物を作製した。プライマー
2009529893.tif 000043
および
2009529893.tif 000044
を用いるＰＣＲを使用して、これを行った。
【０２１０】
修飾したＯＰＲＫ受容体コード領域を、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、ＡＶＰＲ２  Ｃ末端テイル−低効率切断部位−ｔＴＡフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。両方のフラグメントを、すでにＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した、Ａｓｐ７１８（５’）およびＸｈｏＩ（３’）でｐｃＤＮＡ３．１＋にクローン化した修飾したＯＰＲＫ受容体配列を含むプラスミドにライゲーションした。
【０２１１】
低効率切断部位および上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物を含むＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡ融合構築物でクローン４１細胞をコトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３（ＯＰＲＫについてのアゴニストである）を使用してアッセイを実施した。Ｕ−６９５９３に対する最大応答は、バックグラウンドレベルに対して約１２倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０２１２】
実施例１７
多重フォーマットを使用して２つの試験受容体の活性を同時に測定するためのアッセイの使用を実証するように、この実験を設計した。
【０２１３】
クローン４１細胞および「クローン１Ｈ１０」細胞（ｔＴＡ依存性プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子の安定な組込み体を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株の細胞である）を各々２４ウェルの培養皿にプレートし、それぞれ上述のキメラのＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡ融合構築物またはＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡ融合構築物で一過性にトランスフェクトした。１つのウェル当たりｌ００μｌの培地、０．４μｇのＤＮＡおよび２μｌのＦｕＧｅｎｅ試薬を使用して一過性トランスフェクションを実施した。２４時間のインキュベーション後、ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡを発現するクローン４１細胞およびＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２テイル−ｔＴＡを発現するクローン１Ｈ１０細胞をトリプシン処理し、等しい量を混合し、９６ウェルプレートの１２ウェルに再度プレートした。薬物を加えずに三連のウェルをインキュベーションするか、または１μＭのイソプロテレノール、１μＭのドーパミン、または１μＭでの両方のアゴニストの混合物で即座に処理した。リガンド添加の約２４時間後、レポーター遺伝子活性について細胞をアッセイした。培地を捨て、細胞を４０μｌの溶解緩衝液[１００ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．８、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００]に溶解し、市販の発光性検出試薬使用して、β−ガラクトシダーゼ活性およびルシフェラーゼ活性について細胞溶解液をアッセイした。
【０２１４】
結果を図５Ａおよび図５Ｂに呈示する。イソプロテレノールでの処理により約７倍のβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性の誘導をもたらしたが、他方ルシフェラーゼ活性は無変化のままであった。ドーパミンでの処理により３．５倍のルシフェラーゼ活性の誘導をもたらしたが、他方β−ガラクトシダーゼ活性は無変化のままであった。イソプロテレノールおよびドーパミンの両方での処理により、それぞれ７倍のβ−ガラクトシダーゼ活性および３倍のルシフェラーゼ活性をもたらした。
【０２１５】
実施例１８
多重フォーマットを使用して２つの試験受容体の活性を同時に測定するためのアッセイの使用を実証するように、この実験を設計した。
【０２１６】
クローン４１細胞の誘導体であり、安定に組込んだＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質遺伝子を含む「クローン３４．９」細胞を、上述のキメラのＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合構築物で一過性にトランスフェクトした。平行して、ｔＴＡ依存性プロモーターの制御下で安定に組込んだルシフェラーゼ遺伝子を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株である「クローンＨＴＬ５Ｂ８．１」細胞を、上述のＡＤＲＢ−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合構築物で一過性にトランスフェクトした。各々の場合、６ウェル皿の各ウェルに５×１０５個の細胞をプレートし、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および３μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったＤＭＥＭ中で２４時間培養した。１００μｌのＤＭＥＭ、０．５μｇのＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ  ＤＮＡ、および２．５μｌのＦｕｇｅｎｅ（「ｃｌｏｎｅ３４．９細胞」）、または１００μｌのＤＭＥＭ、０．５μｇのＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ  ＤＮＡ、０．５μｇのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼＤＮＡおよび５μｌのＦｕｇｅｎｅ（「クローンＨＴＬ５Ｂ８．１細胞」）を用いて、細胞を一過性にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトした細胞を２４時間インキュベーションし、次いでトリプシン処理し、等しい量を混ぜ、９６ウェルプレートのウェルに再度プレートした。細胞を２４時間インキュベーションした後、１０μＭのＵ−６９５９３、１０μＭのイソプロテレノール、または１０μＭでの両方のアゴニストの混合物で処理した。１６個のウェルを各実験条件についてアッセイした。２４時間後、細胞を溶解させ、上述のβ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方の活性をアッセイした。結果を図６に呈示する。Ｕ−６９５９３での処理により約１５倍のβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性の誘導をもたらしたが、他方ルシフェラーゼ活性は無変化のままであった。イソプロテレノールでの処理により１４５倍のルシフェラーゼ活性の誘導をもたらしたが、他方β−ガラクトシダーゼ活性は無変化のままであった。Ｕ−６９５９３およびイソプロテレノールの両方での処理により、それぞれ９倍のβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導および１３６倍のルシフェラーゼ活性の誘導をもたらした。
【０２１７】
実施例１９
本発明のアッセイにおける異なる転写因子およびプロモーターの使用を実証するために、この実験を設計した。
【０２１８】
ＡＶＰＲ２をコードするＤＮＡを含み、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏについての低効率切断部位を含むアミノ酸リンカーＧＳＥＮＬＹＦＱＬＲ（配列番号５４）をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合し、酵母  ＧＡＬ４タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ０４３８６）（配列番号５５）のアミノ酸２〜１４７、これに続くリンカーすなわち配列ＰＥＬＧＳＡＳＡＥＬＴＭＶＦ（配列番号５６）、これに続くマウス核因子κ−Ｂ鎖ｐ６５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ａ３７９３２）（配列番号５７）のアミノ酸３６８−５４９をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合する融合構築物を作製した。ＣＭＶプロモーターをＡＶＰＲ２コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をＧＡＬ４−ＮＦｋＢ領域の下流に置いた。この構築物をＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ  切断（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４と表記する。
【０２１９】
ＨＵＬ  ５Ｃ１．１は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の誘導体であり、ＧＡＬ４上流活性配列（ＵＡＳ）の制御下で安定的に組込んだルシフェラーゼレポーター遺伝子（市販のｐＦＲ−ＬＵＣ）を含む。
【０２２０】
このＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４プラスミドを上述のβ−アレスチン２−ＴＥＶ  Ｎｌａプロテアーゼと共にＨＵＬ  ５Ｃ１．１細胞にコトランスフェクトした。約２．５×１０４細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および３μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったＤＭＥＭにプレートした。細胞を増殖させて、翌日に密集度５０％に到達させ、８５μｌのＤＭＥＭ、０．１μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−Ｎｉａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４  ＤＮＡ、０．１μｇのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮｌａプロテアーゼＤＮＡおよび１μｌ  Ｆｕｇｅｎｅからなる混合物（細胞に添加するのに先立ってこれを室温で１５分間インキュベーションした）を１ウェル当たり１０μｌ用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を１６時間培養し、その後１０μＭのバソプレシンで処理した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述のようにアッセイした。これらの条件下で、バソプレシンでの処理によりレポーター遺伝子活性が１８０倍増加した。
【０２２１】
実施例２０
相互作用タンパク質に対する親和性を高めるように設計したさらなる受容体修飾物を使用するアッセイの増強を実証するために、このセットの実験を実施した。この実施例では、試験受容体のＣ末端テイルドメインを以下の受容体のうちの１つの対応するテイルドメインで置き換える：アペリンＪ受容体−ＡＧＴＲＬ１（受託番号：ＮＭ＿００５１６１）（配列番号５８）、ガストリン放出ペプチド受容体−ＧＲＰＲ（受託番号：ＮＭ＿００５３１４）（配列番号５９）、プロテイナーゼ活性化型受容体２−Ｆ２ＲＬ１（受託番号：ＮＭ＿００５２４２）（配列番号６０）、ＣＣＲ４（受託番号：ＮＭ＿００５５０８）（配列番号６１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４−ＣＸＣＲ４（受託番号：ＮＭ＿００３４６７）（配列番号６２）およびインターロイキン８受容体、β−ＣＸＣＲ２／ＩＬ８ｂ（受託番号：ＮＭ＿００１５５７）（配列番号６３）。
【０２２２】
まず、ＰＣＲを使用して上記受容体のＣ末端テイルをコードするＤＮＡフラグメントを生成した。最初の２つのアミノ酸（Ａｌａ、ＡおよびＡｒｇ、Ｒ）がＢｓｓＨＩＩ制限部位によりコードされるように、これらのフラグメントを設計した。
【０２２３】
プライマー
2009529893.tif 000045
および
2009529893.tif 000046
を用いてＡＧＴＲＬ１  Ｃ末端フラグメントを増幅した。
【０２２４】
プライマー
2009529893.tif 000047
および
2009529893.tif 000048
を用いてＧＲＰＲ  Ｃ末端フラグメントを増幅した。
【０２２５】
プライマー
2009529893.tif 000049
および
2009529893.tif 000050
を用いてＦ２ＲＬ１  Ｃ末端フラグメントを増幅した。
【０２２６】
プライマー
2009529893.tif 000051
および
2009529893.tif 000052
を用いてＣＣＲ４  Ｃ末端フラグメントを増幅した。
【０２２７】
プライマー
2009529893.tif 000053
および
2009529893.tif 000054
を用いてＣＸＣＲ２／ＩＬ８ｂ  Ｃ末端フラグメントを増幅した。
【０２２８】
プライマー
2009529893.tif 000055
および
2009529893.tif 000056
を用いてＣＸＣＲ４  Ｃ末端フラグメントを増幅した。
【０２２９】
これらの受容体の修飾したＣ末端テイルドメインをコードする、得られたＤＮＡフラグメントをＢｓｓＨＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フラグメントを、上述のＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ発現構築物においてフレーム内のＯＰＲＫ受容体コード領域にライゲーションし、ＡＶＰＲ２−Ｃ末端テイルフラグメントを置換した。
【０２３０】
上述のＨＴＬ  ５Ｂ８．１細胞を、上記の修飾したＯＰＲＫコード領域−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ構築物および上述のβ−アレスチン２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼ融合物の各々でコトランスフェクトした。１ウェルあたり約２．５×１０４細胞を、９６ウェルプレートの各ウェル中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および３μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったＤＭＥＭにプレートした。細胞を増殖させて、翌日に密集度５０％に到達させ、８５μｌのＤＭＥＭ、０．２５μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４  ＤＮＡ、０．２５μｇのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼＤＮＡおよび２．５μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ（脂質および他の物質を含むトランスフェクション試薬）からなる混合物（細胞に添加するのに先立ってこれを室温で１５分間インキュベーションした）を１ウェル当たり１０μｌ用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を１６時間培養し、その後１０μＭのＵ−６９５９３で処理した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述のようにアッセイした。これらの条件下で、Ｕ−６９５９３による処理によって、修飾したＯＰＲＫ受容体の各々についての以下のレポーター遺伝子活性の相対的増加がもたらされた：ＯＰＲＫ−ＡＧＴＲＬ１  Ｃ末端テイル−３０倍；ＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ  Ｃ末端テイル−３１２倍；ＯＰＲＫ−Ｆ２ＲＬ１  Ｃ末端テイル−６９．５倍；ＯＰＲＫ−ＣＣＲ４  Ｃ末端テイル−３．５倍；ＯＰＲＫ−ＣＸＣＲ４  Ｃ末端テイル−９．３倍；ＯＰＲＫ−ＩＬ８ｂ  Ｃ末端テイル−１１３倍。
【０２３１】
実施例２１
上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を生成するようにこの実験を設計した。
【０２３２】
ＥＦ１αプロモーターの制御下でＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質を発現し、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの制御下でハイグロマイシン耐性遺伝子をも発現するプラスミドを作製した。
【０２３３】
このプラスミドをＨＴＬ  ５Ｂ８．１にトランスフェクトし、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下で培養することにより、そのプラスミドの安定なゲノム組込み体を含むクローンを選択した。耐性クローンを単離し、増殖させ、上述のＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡプラスミドのトランスフェクションによりスクリーニングした。この手順を使用して選択した３つの細胞株を「ＨＴＬＡ  ４Ｃ２．１０」、「ＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６」および「ＨＴＬＡ  ５Ｄ４」と表記する。１ウェルあたり約２．５×１０４細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８、３μｇ／ｍｌのプロマイシン、および１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを補ったＤＭＥＭにプレートした。細胞を増殖させて、翌日に密集度５０％に到達させ、８５μｌのＤＭＥＭ、０．２５μｇのＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４  ＤＮＡ、および０．５μｌ  Ｆｕｇｅｎｅからなる混合物（細胞に添加するのに先立ってこれを室温で１５分間インキュベーションした）を１ウェル当たり１０μｌ用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を１６時間培養し、その後１０μＭのイソプロテレノールで処理した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述のようにアッセイした。これらの条件下で、イソプロテレノールでの処理により、３つの細胞株中でのレポーター遺伝子活性において、それぞれ１１２倍（「ＨＴＬＡ  ４Ｃ２．１０」）、５６倍（「ＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６」）および１８０倍（「ＨＴＬＡ  ５Ｄ４」）の増加がもたらされた。
【０２３４】
実施例２２
上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼおよびＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を生成するようにこの実験を設計した。
【０２３５】
ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＡＲＲＢ２−ＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼプラスミドを、上述のＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２テイル−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合タンパク質プラスミドと共にＨＴＬ  ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトし、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下で培養することによりこのプラスミドの安定なゲノム組込み体を選択した。耐性クローンを単離し、増殖させ、１０μＭのイソプロテレノールで処理し上述のレポーター遺伝子活性の誘導を測定することによりスクリーニングした。この手順を使用して選択した３つの細胞株を「ＨＴＬＡＲ  １Ｅ４」、「ＨＴＬＡＲ  １Ｃ１０」および「ＨＴＬＡＲ  ２Ｇ２」と表記する。６時間のイソプロテレノールでの処理により、３つの細胞株中でのレポーター遺伝子活性において、それぞれ２０８倍（「ＨＴＬＡＲ  １Ｅ４」）、１９７倍（「ＨＴＬＡＲ  １Ｃ１０」）および３９０倍（「ＨＴＬＡＲ  ２Ｇ２」）の増加がもたらされた。
【０２３６】
実施例２３
受容体チロシンキナーゼ上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性を測定するためのアッセイの使用を示すためにこの実験を設計した。
【０２３７】
上述のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子ｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した、ヒトＥＧＦＲをコードするＤＮＡ（これは、受託番号ＮＭ＿００５２２８（配列番号７６）でＧｅｎＢａｎｋで見出すことができる）を含む第１融合構築物を作製した。これらの配列の間に、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏについての低効率切断部位、ＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号７７）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターを上皮成長因子受容体コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をｔＴＡ領域の下流に置いた。この構築物をＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡと表記する。
【０２３８】
上述の成熟したＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（アミノ酸２０４０〜２２７９（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ４７９１０）（配列番号７９）に対応する）をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した、ヒトのホスホリパーゼＣ  γ１の２つのＳＨ２ドメイン（アミノ酸５３８〜７５９（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００２６５１．２）（配列番号７８）に対応する）をコードするＤＮＡを含む第２融合構築物を作製した。これらの配列の間に、アミノ酸ＮＳＳＧＧＮＳＧＳ（配列番号８０）をコードするリンカーＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターをＰＬＣ−γ  ＳＨ２ドメインコード配列の上流に置き、ポリＡ配列をＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼ配列の下流に置いた。この構築物をＰＬＣγ１−ＴＥＶと表記する。
【０２３９】
ＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡおよびＰＬＣγ１−ＴＥＶ融合構築物を上述のクローン化ＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトした。約２．５×１０４細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および３μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったＤＭＥＭにプレートした。細胞を増殖させて、翌日に密集度５０％に到達させ、１００μｌのＤＭＥＭ、０．４μｇのｐｃＤＮＡ３  ＤＮＡ  （「担体」ベクターＤＮＡ）、０．０４μｇのＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ  ＤＮＡ、０．０４μｇのＰＬＣγ１−ＴＥＶ  ＤＮＡ、および２μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ（脂質および他の物質を含む、トランスフェクション試薬）からなる混合物（細胞に添加するのに先立ってこれを室温で１５分間インキュベーションした）を１ウェル当たり１５μｌ用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を約１６時間培養し、その後特別の受容体アゴニストおよび阻害剤で処理した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述のようにアッセイした。結果を図７に示す。
【０２４０】
２．５ｎｇ／ｍｌのヒト上皮成長因子（このリガンドについてのＥＣ８０に対応する）を添加すると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の１２．３倍の増加がもたらされたが、他方、１００ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換成長因子−αの添加は１８．３倍の増加をもたらした。ヒト上皮成長因子の添加の前にチロシンキナーゼ阻害剤（７０μＭ  ＡＧ−４９４；０．３μＭ  ＡＧ−１４７８；２ｍＭ  ＲＧ−１３００２２）で前処理すると、レポーター遺伝子活性の誘導が遮断された。
【０２４１】
実施例２４
ヒトＩ型インターフェロン受容体の活性を測定するためのアッセイの使用を示すためにこの実験を設計した。
【０２４２】
上述のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子ｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合された、ヒトＩ型インターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）（５５７アミノ酸）（これは受託番号ＮＭ＿０００６２９でＧｅｎｂａｎｋに見出すことができる）（配列番号８１）をコードするＤＮＡを含む融合構築物を作製した。これらの配列の間に、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏについての低効率切断部位、ＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号８２）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターをヒトＩ型インターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をｔＴＡ領域の下流に置いた。この構築物をＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ｔＴＡと表記する。
【０２４３】
上述のＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（アミノ酸２０４０〜２２７９（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ４７９１０）（配列番号８４）に対応）をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した、ヒトインターフェロン受容体２スプライス変異２（ＩＦＮＡＲ２．２）（５１５アミノ酸）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号：Ｌ４１９４２（配列番号８３）に見出すことができる）をコードするＤＮＡを使用して第２融合構築物を作製した。これらの配列の間に、アミノ酸配列ＲＳ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーター領域をヒトインターフェロン受容体２（ＩＦＮＡＲ２．２）コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をＴＥＶ領域の下流に置いた。この構築物をＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶと表記する。
【０２４４】
受託番号ＮＭ＿００７３１５（配列番号８５）でＧｅｎｂａｎｋに見出されるヒトＳｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  １（ＳＴＡＴ１）についての遺伝子、受託番号ＮＭ＿００５４１９（配列番号８６）でＧｅｎｂａｎｋに見出されるヒトＳｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ２（ＳＴＡＴ２）についての遺伝子をＣＭＶプロモーター領域の制御下で発現させた発現構築物をも生成させた。これらの構築物をそれぞれＣＭＶ−ＳＴＡＴｌ  およびＣＭＶ−ＳＴＡＴ２と表記する。
【０２４５】
ＩＦＮＡＲｌ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ｔＴＡおよびＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ融合構築物を、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１およびＣＭＶ−ＳＴＡＴ２と共に上述のＨＴＬ５Ｂ８．１細胞に一過性にトランスフェクトした。約２．５×１０４細胞を９６ウェルプレートの各プレーウェルに播種し、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８および５μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったＤＭＥＭ中で培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を１５ｎｇの各ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ｔＴＡ、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１およびＣＭＶ−ＳＴＡＴ２  ＤＮＡ、または６０ｎｇのコントロールｐｃＤＮＡプラスミドで、１ウェル当たり０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を８〜２０時間培養し、その後５０００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−αまたは５０００Ｕ／ｍｌのヒトヒトインターフェロン−βで処理した。インターフェロンを添加した時、培地を吸引し、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、３μｇ／ｍｌ  プロマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を補った２９３ＳＦＭ  ＩＩ培地で置換した。インターフェロンで処理した細胞を、さらに１８〜２０時間培養し、その後それらを上述のようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性についてアッセイした。結果を図８に示す。５０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αでの処理はレポーター遺伝子活性の１５倍の増加をもたらしたが、他方、５０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βでの処理は１０倍の増加をもたらした。コントロールプラスミドｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトしたＨＴＬ５Ｂ８．１細胞をインターフェロン処理しても、レポーター遺伝子活性には効果がなかった。図９は、上述のＩＦＮＡＲ１（ＥＮＬＹＦＱ（Ｌ）−ｔＴａ、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２発現構築物でトランスフェクトしたＨＴＬ５Ｂ８．１細胞におけるＩＦＮ−αについての投与量−応答曲線を示す。
【０２４６】
実施例２５
異なる転写因子および異なる細胞株を使用してヒトＩ型インターフェロン受容体の活性を測定するためのアッセイの使用を実証するためにこの実験を設計した。
【０２４７】
上述のＧＡＬ４−ＮＦ−κＢ−融合物をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した、ヒトＩ型インターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）をコードするＤＮＡを使用して融合構築物を作製した。これらの配列の間に、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏについての低効率切断部位ＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号８７）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターをヒトＩ型インターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をＧＡＬ４−ＮＦ−κＢ領域の下流に置いた。この構築物をＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ＧＡＬ４−ＮＦ−κＢと表記する。
【０２４８】
次いでＣＨＯ−Ｋ１細胞を以下の５個のプラスミドの混合物で一過性にトランスフェクトした：ＩＦＮＡＲｌ  −ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ＧＡＬ４−ＮＦ−κＢ、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ２およびｐＦＲ−Ｌｕｃ（ＧＡＬ４依存性プロモーターの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子）。トランスフェクションの２４時間前に、１ウェル当たり約１．０×１０４細胞を９６ウェルプレート中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンを補ったＤＭＥＭ培地中に播種した。翌日、細胞を、１ウェルあたり１０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＦＲ−Ｌｕｃ）および２０ｎｇの上述の発現構築物の各々で、または１０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＦＲ−Ｌｕｃ）および８０ｎｇのコントロールｐｃＤＮＡ３プラスミドで、０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を８〜２０時間培養し、その後５０００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−αで処理した。インターフェロンを添加した時、培地を吸引し、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリンを補ったＤＭＥＭ培地で置換した。インターフェロンで処理した細胞を、さらに６時間培養し、その後それらを上述のようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性についてアッセイした。結果を図１０に示す。レポーター、ＩＦＮＡＲおよびＳＴＡＴ構築物でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のＩＦＮ−αでの処理により、レポーター遺伝子活性の３倍の増加がもたらされ、他方、レポーターおよびコントロールプラスミドでトランスフェクトした細胞をインターフェロン処理してもレポーター遺伝子活性には効果がなかった。
【０２４９】
実施例２６
相互作用タンパク質に対する試験受容体の親和性を高めるように設計した受容体修飾物を使用するアッセイのさらなる増強を実証するために、このセットの実験を実施した。これらの実施例では、試験受容体とＧＲＰＲのＣ末端テイルドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００５３１４）（配列番号５９））との間の融合物接合は、７番目の膜貫通へリックスの末端の保存されたＮＰＸＸＹモチーフの１７〜２３アミノ酸後に作製した。
【０２５０】
まず、ＰＣＲを使用して、想定されるパルミトイル化部位の２アミノ酸後に始まるＧＲＰＲからのＣ末端４２アミノ酸（以後、ＧＲＰＲ４２ａａと呼ぶ）をコードするＤＮＡフラグメントを生成した。Ｃ末端テイルの最初のアミノ酸がＸｂａＩ制限部位ＴＣＴＡＧＡによりコードされる２アミノ酸（Ｓｅｒ、ＳおよびＡｒｇ、Ｒ）だけ上流にあり、終止コドンがＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣによりコードされる２つのアミノ酸（Ｇｌｙ、ＧおよびＳｅｒ、Ｓ）で置換されるように、このフラグメントを設計した。ＧＲＰＲコード領域を含むプラスミドをプライマー
2009529893.tif 000057
および
2009529893.tif 000058
で増幅することにより、これを達成した。
【０２５１】
次に、ＯＰＲＫのコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００９１２）（配列番号５１）を、ＸｂａＩ部位をＰｒｏ−３４７の後に挿入するように修飾した。プライマー
2009529893.tif 000059
および
2009529893.tif 000060
を用いるＰＣＲを使用して、これを行った。
【０２５２】
加えて、ＡＤＲＡ１Ａのコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００６８０）（配列番号９０）を、ＸｂａＩ部位をＬｙｓ−３４９の後に挿入するように修飾した。プライマー
2009529893.tif 000061
および
2009529893.tif 000062
を用いるＰＣＲを使用して、これを行った。
【０２５３】
加えて、ＤＲＤ２のコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００７９５）（配列番号３７）を、２つのアミノ酸（ＬｅｕおよびＡｒｇ）ならびにＸｂａＩ部位をＣｙｓ−３４３の後に挿入するように修飾した。プライマー
2009529893.tif 000063
および
2009529893.tif 000064
を用いるＰＣＲを使用して、これを行った。
【０２５４】
修飾したＯＰＲＫ受容体コード領域をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、ＧＲＰＲ４２ａａ  Ｃ末端テイルフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断した。両方のフラグメントを、すでにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した上述のＡＶＰＲ２  Ｃ末端テイル−低効率切断部位−ｔＴＡを有するＯＰＲＫ受容体を含むプラスミドにライゲーションした。
【０２５５】
修飾したＡＤＲＡ１Ａ受容体コード領域をＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断し、低効率切断部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断した。両方のフラグメントを、すでにＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化した上述のＡＤＲＡ１Ａ受容体を含むプラスミドにライゲーションした。
【０２５６】
修飾したＤＲＤ２受容体コード領域をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、低効率切断部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断した。両方のフラグメントをすでにＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ６プラスミドにライゲーションした。
【０２５７】
上述のＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６細胞を、低効率切断部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物でトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３（ＯＰＲＫについてのアゴニスト）を使用してアッセイを実施した。Ｕ−６９５９３に対する最大応答は、約２００倍のレポーター遺伝子活性の増加をもたらした。
【０２５８】
ＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６細胞を、低効率切断部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物でトランスフェクトし、１０μＭのエピネフリン（ＡＤＲＡ１Ａについてのアゴニスト）を使用してアッセイを実施した。エピネフリンに対する最大応答は、約１４倍のレポーター遺伝子活性の増加をもたらした。
【０２５９】
ＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６細胞を、低効率切断部位を含むＤＲＤ２−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物でトランスフェクトし、１０μＭのドーパミン（ＤＲＤ２についてのアゴニスト）を使用してアッセイを実施した。ドーパミンに対する最大応答は、約３０倍のレポーター遺伝子活性の増加をもたらした。
【０２６０】
実施例２７
相互作用タンパク質に対する親和性を高めるように設計した異なるセットの試験受容体修飾物を使用するアッセイのさらなる増強を示すために、このセットの実験を実施した。これらの実施例では、試験受容体のＣ末端ドメインをＧＲＰＲの内因性Ｃ末端テイルドメインの一部で置換した。
【０２６１】
まず、ＰＣＲを使用して、切断したＧＲＰＲテイルをコードするＤＮＡフラグメント、具体的にはＧｌｙ−３４３からＡｓｎ−３６５までの２３アミノ酸をコードする配列を生成した。Ｃ末端テイルの最初のアミノ酸がＸｂａＩ制限部位ＴＣＴＡＧＡによりコードされる２アミノ酸（Ｓｅｒ、ＳおよびＡｒｇ、Ｒ）だけ上流にあり、Ｓｅｒ−３６６がＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣによりコードされる２つのアミノ酸（Ｇｌｙ、ＧおよびＳｅｒ、Ｓ）で置換されるように、このフラグメントを設計した。ＧＲＰＲコード領域を含むプラスミドをプライマー
2009529893.tif 000065
および
2009529893.tif 000066
で増幅することにより、これを達成した。
【０２６２】
次に、切断したＧＲＰＲフラグメント（以後、ＧＲＰＲ２３ａａテイルと呼ぶ）をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、本明細書中に記載する低効率切断部位を含む、すでにＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化したＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物に挿入した。
【０２６３】
同様に、ＧＲＰＲ２３ａａテイルフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、本明細書中に記載する低効率切断部位を含む、すでにＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化したＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ４２ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物に挿入した。
【０２６４】
ＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６細胞を、低効率切断部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ２３ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物でトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３（ＯＰＲＫについてのアゴニスト）を使用してアッセイを実施した。Ｕ−６９５９３に対する最大応答は、バックグラウンドに対して約１１５倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０２６５】
ＨＴＬＡ  ２Ｃ１１．６細胞を、低効率切断部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ２３ａａテイル−ｔＴＡ融合構築物でトランスフェクトし、１０μＭのエピネフリン（ＡＤＲＡ１Ａについてのアゴニスト）を使用してアッセイを実施した。エピネフリンに対する最大応答は、バックグラウンドに対して約１０２倍のレポーター遺伝子発現の誘導をもたらした。
【０２６６】
実施例２８
特に細胞内シグナル伝達タンパク質ＳＨＣ１（Ｓｒｃ相同２ドメイン含有形質転換タンパク質１）のリガンド誘導による動員をモニターすることにより、受容体チロシンキナーゼインスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の活性を測定するためのアッセイの使用を実証するために、この実験を設計した。
【０２６７】
上述のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子ｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合された、ヒトＩＧＦ−１ＲをコードするＤＮＡ（これは受託番号ＮＭ＿０００８７５でＧｅｎｂａｎｋに見出すことができる）（配列番号９６）を含む第１融合構築物を作製した。これらの配列の間に、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏについての低効率切断部位、ＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号８２）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターをＩＧＦ１Ｒコード領域の上流に置き、ポリＡ配列をｔＴＡ領域の下流に置いた。この構築物をＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡと表記する。
【０２６８】
上述の成熟したＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（アミノ酸２０４０〜２２７９（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ４７９１０）（配列番号７９）に対応する）をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した、ヒトＳＨＣ１のＰＴＢドメイン（アミノ酸１〜２３８（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０１４１５８（配列番号９７）に対応する）をコードするＤＮＡを含む第２融合構築物を作製した。これらの配列の間に、アミノ酸ＮＳＧＳ（配列番号９８）をコードするリンカーＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターをＳＨＣ１  ＰＴＢドメインコード配列の上流に置き、ポリＡ配列をＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼ配列の下流に置いた。この構築物をＳＨＣ１−ＴＥＶと表記する。
【０２６９】
ＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡおよびＳＨＣｌ−ＴＥＶ融合構築物を上述のクローン化ＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトした。約２．５×１０４細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および３μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったＤＭＥＭにプレートした。細胞を増殖させて、翌日に密集度５０％に到達させ、１００μｌのＤＭＥＭ、０．２μｇのＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ  ＤＮＡ、０．２μｇのＳＨＣ１−ＴＥＶ  ＤＮＡ、および２μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ（脂質および他の物質を含む、トランスフェクション試薬）からなる混合物（細胞に添加するのに先立ってこれを室温で１５分間インキュベーションした）を１ウェル当たり１５μｌ用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を１６時間培養し、その後特異的受容体アゴニストで処理した。２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述のようにアッセイした。
【０２７０】
１μＭのヒトインスリン様成長因子１を添加すると、９０倍のルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の増加がもたらされた。
【０２７１】
実施例２９
通常は膜結合性である２つの試験タンパク質の相互作用を測定するためのアッセイの使用を実証するために、この実験を設計した。この実施例では、アッセイを使用して、核ステロイドホルモン受容体、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１またはＥＲα）およびＥＳＲ２（エストロゲン受容体２またはＥＲβ）のリガンド誘導二量化を測定した。この実施例では、ＥＳＲ１は、転写因子ｔＴＡに融合され、ＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏプロテアーゼについての切断部位はＥＳＲ１とｔＴＡ配列との間に挿入されている。このＥＳＲ１−ｔＴＡ融合物は、膜貫通タンパク質ＣＤ８の細胞内Ｃ末端部への融合によって膜に繋ぎとめられている。ＣＤ８は、細胞膜の細胞質側にＥＳＲ１を繋ぎとめる本質的に不活性な足場としての役割を果たす。それに融合される転写因子は、ＥＳＲ２およびプロテアーゼと相互作用するまで核に入ることはできない。どの膜貫通タンパク質も使用することができた。このＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ  ＮＩａ  Ｐｒｏ切断−ｔＴＡ融合タンパク質を、ＥＳＲ２およびＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏプロテアーゼから構成される第２融合タンパク質と共にｔＴＡ依存性レポーター遺伝子を含む細胞株中で発現させる。ＥＳＲ１およびＥＳＲ２のエストロゲン誘導二量化は、それにより膜結合融合物からｔＴＡ転写因子の放出を誘発し、引き続くレポーター遺伝子活性の誘導によりこれを検出する。
【０２７２】
ヒトＥＳＲ１（５９６アミノ酸）（これは受託番号ＮＭ＿０００１２５でＧｅｎｂａｎｋに見出すことができる）（配列番号１００）をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合された、ヒトＣＤ８遺伝子（２３５アミノ酸）（これは受託番号ＮＭ＿００１７６８でＧｅｎｂａｎｋに見出すことができる）（配列番号９９）をコードするＤＮＡを含む融合構築物を作製した。これらの配列の間に、アミノ酸配列ＧＲＡ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。次いで得られた構築物を、上述のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子ｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した。これらの配列の間に、上述のＴＥＶ  ＮＩａ−Ｐｒｏについての低効率切断部位、ＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列番号８２）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーターをヒトＣＤ８コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をｔＴＡ領域の下流に置いた。この構築物をＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ｔＴＡと表記する。
【０２７３】
上述のＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（アミノ酸２０４０〜２２７９（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＡＡ４７９１０）（配列番号８４）に対応する）をコードするＤＮＡ配列にフレーム内で融合した、ヒトエストロゲン受容体β（ＥＳＲ２）（５３０アミノ酸）（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１４３７（配列番号１０１）でＧｅｎｅＢａｎｋに見出すことができる）をコードするＤＮＡを使用して第２融合構築物を作製した。これらの配列の間に、アミノ酸配列ＲＳ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ配列を挿入した。ＣＭＶプロモーター領域をヒトエストロゲン受容体β（ＥＳＲ２）コード領域の上流に置き、ポリＡ配列をＴＥＶ領域の下流に置いた。この構築物をＥＳＲ２−ＴＥＶと表記する。
【０２７４】
ＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ｔＴＡおよびＥＳＲ２−ＴＥＶ融合構築物を、ｐＣＤＮＡ３と共に上述のＨＴＬ５Ｂ８．１細胞に一過性にトランスフェクトした。約２．０×１０４細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８および５μｇ／ｍｌのプロマイシンを補ったフェノールを欠くＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を１ウェル当たり５ｎｇのＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ切断（Ｌ）−ｔＴＡ、１５ｎｇのＥＳＲ２−ＴＥＶおよび４０ｎｇのｐＣＤＮＡ３の混合物で、０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μｌのフェノールを欠くＤＭＥＭ中で血清なしに２４時間インキュベーションし、その後５０ｎＭの１７−βエストラジオールで処理した。リガンド処理した細胞をさらに１８〜２０時間培養し、その後それらを上述のようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性についてアッセイした。５０ｎＭの１７−βエストラジオールで処理することにより、レポーター遺伝子活性において１６倍の増加をもたらした。
【０２７５】
本発明の他の特徴は当業者には明らかであり、本明細書において繰返す必要はない。
【０２７６】
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により、あたかも各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に本明細書中に援用されたかの如くにその全体を引用したものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、それらは本発明のある態様を図示するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解されると考えられる。
【０２７８】
【図１】例としてリガンド−受容体結合を用いて、本発明の概念的な基盤を絵を用いて示す図である。
【図２Ａ】本発明に係るアッセイにおける標的の応答がアゴニストに対して投与量依存性であることを示す図である。
【図２Ｂ】本発明に係るアッセイにおける標的の応答がアンタゴニストに対して投与量依存性であることを示す図である。
【図３】異なる標的および異なるアゴニストを用いて投与量応答曲線が得られることを示す図である。
【図４】Ｄ２ドーパミン受容体を使用して、本発明に従い得た結果を示す図である。
【図５Ａ】２つの分子が同時に研究できることを示すアッセイ結果の図である。
【図５Ｂ】２つの分子が同時に研究できることを示すアッセイ結果の図である。
【図６】別の「多重」アッセイ、すなわち２つの分子が同時に研究されるアッセイの結果を示す図である。
【図７】ＥＧＦＲ活性を測定するアッセイから得られたデータを示す図である。
【図８】ヒトＩ型インターフェロン受容体の活性を促成するために設計された、本発明に係るアッセイから得られたデータを示す図である。
【図９】図７を生成するために使用した細胞におけるＩＦＮ−αについての投与量応答曲線を示す、図７の結果を詳細に示す図である。
【図１０】異なる転写因子および異なる細胞株を使用した追加的な実験の結果を示す図である。
【図１１】本発明のいくつかの実施形態に関連する３つの一般的スキームを示す図である。
【図１２Ａ】ＰＣＳと、プロテアーゼを含む第２試験タンパク質と相互作用するタンパク質相補対の第１部分とを含む第１試験タンパク質を示す図である。
【図１２Ｂ】プロテアーゼ相補対の第１部分、ＰＣＳおよびＤＰＰを含む第１試験タンパク質を示す図である。プロテアーゼ相補対の第２部分を含む第２試験タンパク質も示されている。
【図１２Ｃ】第１試験タンパク質がＰＣＳに連結されたＤＰＰの第１部分および第２部分を含む、相互作用を示す図である。
【図１２Ｄ】共鳴エネルギー移動（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動）および／またはクエンチ方法を示す図である。
【図１２Ｅ】２つのタンパク質の相互作用が生成し、プロテアーゼを放出する二段階反応を示す図である。
【図１２Ｆ】検出可能なタンパク質相補対の第１部分および第２部分の相互作用を許容する２つの試験タンパク質の相互作用を示す図である。
【図１２Ｇ】３つのタンパク質が関与する相互作用を測定、検出または評価するための方法の例を示す図である。
【図１２Ｈ】少なくとも２つのタンパク質が関与する相互作用を測定、検出または評価するための方法の例を示す図である。
【図１】
2009529893.tif 000068
【図２Ａ】
2009529893.tif 000069
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2009529893.tif 000074
【図６】
2009529893.tif 000075
【図７】
2009529893.tif 000076
【図８】
2009529893.tif 000077
【図９】
2009529893.tif 000078
【図１０】
2009529893.tif 000079
【図１１】
2009529893.tif 000080
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【国際調査報告】
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